Breg при гуморальном иммунном ответе

«Дни иммунологии в СПб 2017» Immunology Days in St. Petersburg 2017

Медицинская Иммунология Medical Immunology (Russia)/Meditsinskaya Immunologiya

ровали методом Сэнгера, при этом были получены отдельные сиквенсы генов иммуноглобулинов.

Выводы. Были отработаны некоторые этапы технологии получения человеческих моноклональных антител путем секвенирования генов иммуноглобулина из единичных клеток.

ГАЛЕКТИН-3 МОДУЛИРУЕТ ПРОДУКЦИЮ ЦИТОКИНОВ Th-ЛИМФОЦИТАМИ IN VITRO

Васильева О.А., Прохоренко Т.С., Зима А.П., Новицкий В.В.

ФГБОУ ВО «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения РФ, Томск, Россия

Введение. Галектин-3 функционирует как экстра-целлюлярная регуляторная молекула и принимает участие в активации различных типов клеток, таких как моноциты, макрофаги, тучные клетки, нейтрофилы и лимфоциты.

Цель. Оценить влияние рекомбинантного галектина-3 на продукцию профильных цитокинов Th-лимфоцитами здоровых доноров in vitro.

Материалы и методы. Исследование проведено на лимфоцитах, выделенных методом градиентного центрифугирования из крови здоровых доноров (n = 25), с дальнейшим культивированием в течение 72 ч в питательной среде с добавлением рекомбинантного галектина-3 в дозах 0,5 и 1 мкг/мл (R&D, США). Для создания in vitro условий, близких к естественным, использовали моно-клональные активирующие антитела — анти-CD3/анти-CD28 (BD Pharmingen™, США). За 4 ч до окончания инкубации к клеткам добавляли стимуляторы синтеза цитокинов ФМА (50 нг/мл) и кальция иономицин (1 мкг/мл). Определение уровня продукции интерлейкинов (IL) 17А, IL-10, интерферона (IFN) у и IL-13, IL-22, TGF-Pp TNFa в культуральных супернатантах осуществляли методом твердофазного иммуноферментного анализа типа «сэндвич» согласно протоколам фирмы-производителя (R&D, США).

Результаты. Установлено, что при действии галек-тина-3 на лимфоциты здоровых доноров концентрация Thl-цитокинов — IFNy и TNFa — достоверно увеличивалась относительно соответствующих значений в контрольной группе. Стимулирующее влияние отмечалось при исследовании влияния галектина-3 на продукцию IL-13, свойственного 1Ь2-лимфоцитам. При анализе влияния галектина-3 на Th-17 лимфоциты регистрировалось статистически значимое повышение концентрации профильных цитокинов — IL-17A и IL-22 (при дозе галектина-3 0,5 мкг/мл). Увеличение дозы данного лек-тина до 1 мкг/мл приводило к снижению концентрации IL-17 и IL-22 относительно значений соответствующих показателей в культуре с меньшей концентрацией галек-тина-3 и было достоверно ниже значений в контрольной группе (только для IL-17). Влияние галектина-3 на функциональную активность субпопуляции Т-регуляторных лимфоцитов проводили путем анализа продукции IL-10 и TGF-P1. В результате экспериментов наблюдалось достоверное уменьшение концентрации IL10 и TGF-P1 относительно значений данных показателей в группе контроля.

Заключение. Проведенные эксперименты свидетельствуют о том, что влияние рекомбинантного галектина-3 является дозозависимым, и с увеличением его концентрации до 1 мкг/мл степень стимулирующего влияния на Th-лимфоциты становится менее выраженной, и преоб-

ладает ингибирующее действие на лимфоциты, что может быть обусловлено активацией апоптотической гибели клеток.

Исследование выполнено при финансовой поддержке Совета по грантам Президента Российской Федерации (№ НШ-7906.2016.7, МД-3455.2017.7).

Breg ПРИ ГУМОРАЛЬНОМ ИММУННОМ ОТВЕТЕ

Гаврилова М.В., Чернышова И.Н., Снегирева Н.А.

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова», Москва, Россия

Введение. В последние годы выяснилось, что В-клетки, также как и Т-лимфоциты, обладают регуля-торными функциями. В основном их роль сводится к угнетению воспалительных и аутоиммунных процессов. Влияние регуляторных В-клеток (Breg) на патологические процессы, главным образом, обусловлено синтезируемым ими IL-10. Основным источником Breg являются, по-видимому, В1-лимфоциты. Роль Breg в развитии гуморального иммунного ответа практически не изучена. Исследования такого рода удобно проводить в системе in vitro. Ранее нами была разработана модельная система, позволяющая использовать минимальное количество В1-лимфоцитов при изучении их взаимодействий с другими клетками in vitro. В этой системе в качестве клеток-«филлеров» используются спленоциты XID-мышей CBA/N, не имеющих В1-клеток. С другой стороны, адоптивный перенос Breg мышей линии СВА мышам конген-ной линии CBA/N позволяет исследовать влияние этих клеток на гуморальный иммунный ответ in vivo.

Цель. Изучение роли Breg в гуморальном иммунном ответе. В задачи исследования входило: определение влияния Breg на иммунный ответ субпопуляций В-лимфоцитов на Т-зависимый антиген (ТЗ АГ) в модельной системе in vitro и на модели адоптивного переноса in vivo.

Материалы и методы. В1-лимфоциты выделяли из перитонеальной полости, В2 — из селезенки мышей линии СВА методом иммуномагнитной сепарации. При культивировании in vitro В1- и В2-клетки смешивали со спленоцитами линии мышей CBA/N в соотношении 1:9 соответственно. Breg выделяли из перитонеальной полости мышей линии СВА с использованием Regulatory B cell isolation kit. Методом проточной цитометрии было определено, что > 90% Breg синтезировало IL-10. Контрольные В-лимфоциты (Вконтр), получали так же, как и Breg, за исключением добавления активаторов. Вконтр содержали не более 4% синтезирующих IL-10 В-клеток. В качестве ТЗ АГ использовали водорастворимый антиген бараньих эритроцитов (ВРАБЭ), который добавляли в конечной концентрации 25 мкг/мл. Для раздельного культивирования Breg использовали мембранные вставки с полупроницаемой мембраной. Breg или Вконтр вносили в верхнюю камеру в количестве 1 х 106, в нижнюю помещали 5 х 106 клеток смешанных культур. Клетки инкубировали в полной среде в СО2-инкубаторе при 37 °С в течение 4 дней с АГ или без него. Функциональную активность В-лимфоцитов оценивали по числу АТ-и ИГ-образующих клеток (АОК и ИГОК соответственно) в культурах методом ELISPOT.

В опытах in vivo Breg вводили конгенным XID-мышам линии CBA/N по 1,5 млн внутривенно (в/в). Одновременно мышей иммунизировали в/в ВРАБЭ в дозе 50 мкг/мышь. В качестве контроля использовали нормальных мышей линии CBA/N и мышей CBA/N, получивших Вконтр и ВРАБЭ, и только Вконтр. На 4-й день

2017, Т. 19, Специальный выпуск 2017, Vol. 19, Special Issue

Экспериментальные модели Experimental models

после адоптивного переноса клеток и иммунизации у мышей-реципиентов получали селезенки и определяли в них число АОК и ИГОК.

Результаты. Добавление ВРАБЭ индуцировало иммунный ответ в смешанных культурах: прирост числа АОК для культуры с В2-клетками составил 478±190/106 клеток, а числа ИГОК — 3745±2565/106 клеток. Для культуры с В1-лимфоцитами соответствующие показатели составили для АОК 345±186/106, а для ИГОК — 13133±6023/106 клеток. Внесение в верхнюю камеру Вконтр в культуре с В2-лимфоцитами приводило к увеличению прироста АОК и ИГОК ~ в 2 раза. Добавление Вreg значительного влияние на прирост АОК и ИГОК не оказывало. На культуру, содержащую В1-клетки, Вконтр и Вreg действовали по-другому. Внесение в верхнюю камеру Вконтр почти не влияло на образование АОК и ИГОК, индуцированных ВРАБЭ. В то же время добавление в верхнюю камеру Breg уменьшало в смешанной культуре с В1-лимфоцитами прирост АОК с 344±185/106 до значения 201±94/106 и ИГОК -с 13133±6023/106 до 7045±1924/106 клеток.

Таким образом, Вreg угнетали индуцированный ВРА-БЭ специфический и поликлональный иммунный ответ в культурах с В1-лимфоцитами. Очевидно, что это угнетение в значительной степени обусловлено выделяемым Вreg-клетками IL-10.

Для исследования влияния Breg на иммунный ответ на ВРАБЭ in vivo была использована модель адоптивного переноса. Оказалось, что Breg, перенесенные одновременно с введением ТЗ АГ конгенной линии мышей CBA/N, способствовали снижению прироста числа АОК на 31%. Это свидетельствует о том, что in vivo Breg могут угнетать первичный специфический ответ на ТЗ АГ. Вконтр не оказывали такого влияния на иммунный ответ. Таким образом, данные in vivo о влиянии Breg на иммунный ответ согласуются с результатами исследований, полученными в модельной системе in vitro.

Заключение. Установлено, что Breg оказывают угнетающее действие на образование АТ-продуцентов на ТЗ АГ (ВРАБЭ) в модельной системе in vitro и при адоптивном переносе in vivo.

ВЛИЯНИЕ МП-5 И МП-6 НА МИКРОБИЦИДНУЮ АКТИВНОСТЬ И ПРОДУКЦИЮ IL-1 ß И IL-10 ПЕРИТОНЕАЛЬНЫМИ МАКРОФАГАМИ ПРИ СТРЕССЕ

Гаврилова Т.В.4, Гейн C.B.1, 3, Никитина A.A.3, Гейн О.Н.6, Черешнева М.В.2, Черешнев В.А.2, Кирилина Е.А.4

1ФГБУН«Институт экологии и генетики микроорганизмов» УрО РАН, Пермь, Россия

2 ФГБУН «Институт иммунологии и физиологии» УрО РАН, Екатеринбург, Россия

3 ФГБОУВПО «Пермский государственный научно-исследовательский университет», Пермь, Россия

4 ФГБОУ ВПО «Пермский государственный медицинский университет им. академика Е.А. Вагнера», Пермь, Россия

5 ФГБУН «Институт биоорганической химии им.

М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова» РАН, Пермь, Россия

6 ФГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия», Пермь, Россия

Введение. Миелопептиды - группа короткоцепочных биорегуляторных молекул пептидной природы, обладающая широким спектром иммунорегуляторной активности за счет возможного направленного влияния отдель-

ных пептидных фракций на различные звенья иммунной системы.

Цель. Исследовать влияние миелопептидов МП-5 и МП-6 на продукцию активных форм кислорода, IL-ip и IL-10 перитонеальными макрофагами мышей на фоне иммобилизационного стресса in vivo.

Материалы и методы. Эксперименты в системе in vivo выполнены на мышах-самцах породы Swiss, массой 17-22 г. В качестве стрессорного воздействия использовался 2-часовой иммобилизационный стресс. МП-5 или МП-6 вводили внутрибрюшинно за 30 минут до начала стресса в дозе 40 мкг/кг. Оценку продукции активных форм кислорода перитонеальными клетками производили с помощью реакции люминолзависимой хемилю-минесценции. Для оценки продукции цитокинов пери-тонеальные макрофаги культивировали в 24-луночных планшетах 106 клеток в 1 мл полной культуральной среды. Количественное определение IL-ip и IL-10 проводили с помощью наборов (R&D, США).

Результаты. Уставновлено, что иммобилизационный стресс не влиял на спонтанную продукцию активных форм кислорода. Миелопептид МП-5 стимулировал спонтанную продукцию активных форм кислорода макрофагами, в то время как статистически значимых эффектов МП-6 на спонтанную ЛЗХЛ зарегистрировано не было. При анализе стимулированной ЛЗХЛ было установлено, что стресс угнетал продукцию активных форм кислорода в зимозан-стимулированных культурах, а МП-5 отменял эффект стресса. В группах животных, подвергнутых стессу на фоне введения МП-6, наблюдалось усиление продукции активных форм кислорода по сравнению с контрольной группой и с группой животных, подвергнутых стрессу. В дальнейшем мы оценивали влияние МП-5 и МП-6 при стрессе на продукцию IL-ip и IL-10. Стресс угнетал зимозан-ин-дуцированную продукцию IL-ip, предварительное введение мышам МП-5 и МП-6 стресс-индуцированное угнетение IL-ip отменяло. На продукцию IL-10 стресс влияния не оказывал, в то же время наблюдалось выраженное снижение спонтанной и стимулированной продукции IL-10 в группе животных, подвергнутых стрессу на фоне введения МП-5.

Заключение. Таким образом, миелопептиды МП-5 и МП-6 оказывают модулирующее действие на функции стимулированных зимозаном перитонеальных макрофагов, отменяя стресс-индуцированное угнетение продукции активных форм кислорода и IL-ip. В общем полученные нами данные указывают на перспективность дальнейшего исследования иммуномодулирующих эффектов МП-5,6 и других отдельных миелопептидов.

Работа поддержана грантом РФФИ !6-44-590!56-р-а.

ВЛИЯНИЕ ХОЛОДОВОГО СТРЕССА НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ ПЕРИТОНЕАЛЬНЫХ МАКРОФАГОВ В УСЛОВИЯХ БЛОКАДЫ ОПИАТНЫХ РЕЦЕПТОРОВ

Гейн С.В.1 2, Шаравьева И.Л.1

1 Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь, Россия

2 Пермский государственный научно-исследовательский университет, Пермь, Россия

Введение. Холодовой стресс — стрессорное воздействие, вызванное низкой температурой окружающей