Способ диагностики наружного генитального эндометриоза у женщин с бесплодием
METHOD FOR DIAGNOSTICS OF EXTERNAL GENITAL ENDOMETRIOSIS IN WOMEN SUFFERING FROM INFERTILITY

Изобретение относится к области медицины, а именно к гинекологии, и найдет широкое применение для объективной диагностики наружного генитального эндометриоза (НГЭ).
Проблема наружного генитального эндометриоза, особенно у женщин с бесплодием, является чрезвычайно важной, поскольку он является весьма распространенным заболеванием женщин репродуктивного возраста, частота которого достигает 10% в популяции (Адамян Л.В., Кулаков В.И., Андреева Е.Н. Эндометриозы: Руководство для врачей. - М.: Медицина, 2006. - 416 с.; Giudice L.C. Endometriosis. // N. Engl. J. Med. - 2010. - Vol.362. - P. 2389-2398). В свою очередь, бесплодие, которое в значительной степени (до 39%) обусловлено эндометриозом (Кулаков В.И., Овсянникова Т.В. Проблемы и перспективы лечения бесплодия в браке // Акушерство и гинекология. - 1997. - №3. - С.5-8, Устинкина Т.И. Этиологическая и патогенетическая структура бесплодия в семье: Автореф. дис.… д-ра мед. наук. - Л., 1990. - 36 с.), имеет не только медицинское, но и социальное значение. При частоте бесплодных браков от 15% и выше проблема бесплодия приобретает государственный масштаб, что подчеркивает особую важность выявления новых высокоинформативных биомаркеров для неинвазивной диагностики эндометриоза.
При отсутствии таких диагностических маркеров задержка инвазивного инструментального исследования (лапароскопии или лапаротомии) подтверждения эндометриоза от начала болевого синдрома может составлять до 8 лет. Однако даже в этих случаях частота гистологического подтверждения диагноза колеблется от 70 до 85%, причем зачастую только в поздние стадии заболевания (Sinaii N., Plumb K., Cotton L., Lambert A., Kennedy S., Zondervan K. et al. Differences in characteristics among 1,000 women with endometriosis based on extent of disease // Fertil Steril. - 2008. - Vol.89. - P. 538-545).
Среди известных в научно-медицинской и патентной литературе методов диагностики наружного генитального эндометриоза можно отметить следующие.
В патенте РФ №2164687 (27.03.2001) предложен способ диагностики наружного генитального эндометриоза путем исследования периферической крови, отличающийся тем, что в крови определяют спонтанную НСТ-активность нейтрофилов после их инкубации с ПАМГ-2 и при показателях ее 24% и более диагностируют наружный генитальный эндометриоз.
Недостатками данного способа являются: субъективность метода оценки спонтанной НСТ-активности нейтрофилов, поскольку расчет диагностического показателя осуществляется с помощью светового микроскопирования; использование в реакции ПАМГ-2, не имеющего сертификата и не относящегося к числу химических препаратов, включенных в «Реестр новых медицинских изделий, разрешенных к применению МЗ РФ».
Известен способ диагностики наружного генитального эндометриоза (патент РФ №2211454, 27.08.2003) у женщин путем исследования биологического материала, отличающийся тем, что в пробе сыворотки периферической венозной крови определяют концентрацию интерферона-γ и при его содержании, равном 1000 пкг/мл и менее, диагностируют наружный генитальный эндометриоз.
Недостатками данного способа являются: неспецифичность, поскольку содержание интерферона-γ в крови изменяется в зависимости от многих эндо- и экзогенных факторов: стресса, наличия аутоиммунных заболеваний, вирусных инфекций, иммунодефицитных состояний и даже воспаления пародонта (Ершов Ф.И. Система интерферона в норме и при патологии. - М.: Медицина, 1996. - 240 с.), которое имеет место у очень многих людей и характеризуется недостаточно высокой точностью (77%).
Известен способ диагностики тяжести наружного генитального эндометриоза (патент РФ №2219548, 20.12.2003) путем спектрофотометрического определения в перитонеальной жидкости уровня молекул средней массы и на длине волны 280 нм и показателях экстинкции в пределах 0,100-0,210 е.о.п. диагностируют наружный генитальный эндометриоз I стадии; 0,211-0,310 е.о.п. - наружный генитальный эндометриоз II стадии; 0,311-0,526 е.о.п. - наружный генитальный эндометриоз III стадии; 0,527-0,726 е.о.п. - наружный генитальный эндометриоз IV стадии.
Недостатком данного способа является его инвазивность (взятие перитонеальной жидкости); неспецифичность (изменение уровня молекул средней массы, как маркера эндогенной интоксикации, имеет место при различных патологических и даже, функциональных состояниях организма) (Энциклопедия клинических лабораторных тестов. Под ред. Н. Тица. - М.: Издательство «Лабинформ». - 1997. - 960 с.); недостаточная чувствительность (измерение определяемых продуктов в относительных величинах оптической плотности).
Известен способ диагностики стадии наружного генитального эндометриоза (патент РФ №2242002, 10.12.2004) путем исследования сыворотки крови, отличающийся тем, что определяют содержание -макроглобулина и при его уровне от 600,0 мг/дл и выше диагностируют I стадию, при значении от 599,0 до 480,0 мг/дл - эндометриоз II стадии, от 479,0 до 360,0 мг/дл - эндометриоз III стадии и от 359,0 мг/дл - эндометриоз IV стадии.
Недостатками этого способа являются низкая специфичность, поскольку изменение содержания α2-макроглобулина в сыворотке крови может быть отражением воспалительных процессов не только в репродуктивных тканях, но и в любом другом органе (печени, поджелудочной железе, желудочно-кишечном тракте) (Энциклопедия клинических лабораторных тестов. Под ред. Н. Тица. М.: Издательство «Лабинформ», - 1997. - 960 с. Иванова О.М. Значение α2-макроглобулина в патогенезе ишемической болезни сердца. - Вестник новых медицинских технологий. - 2008. - №4. - С.109-112; Зорина В.Н. и др. Роль альфа-2-макроглобулина в патогенезе ревматоидного артрита и системной красной волчанки. - Бюллетень сибирской медицины. - 2010. - №5. - С.39-44). Не указаны чувствительность и достоверность способа.
Также не лишен недостатков способ ранней диагностики наружного генитального эндометриоза у женщин путем исследования биоптата эндометрия (патент РФ №2247391, 27.02.2005), отличающийся тем, что в пробе ткани определяют активность катепсина D и при его значении 0,1 Ед. ферм. акт/ч и менее диагностируют наружный генитальный эндометриоз.
Способ инвазивен (взятие ЦУГа эндометрия), характеризуется ограниченной информативностью (использование одного фермента только из группы кислых лизосомальных эндопептидаз без учета нейтральных экзопептидаз), недостаточными точностью и специфичностью. Чрезвычайно низкие относительные величины продуктов реакции (десятые и сотые единицы) свидетельствуют о низкой чувствительности способа.
Известен диагностический тест, при котором определяется содержание основного фактора роста фибробластов-2 в сыворотке крови и перитонеальной жидкости, повышение которого в обеих биологических жидкостях используется для диагностики наружного генитального эндометриоза (Бурлев В.А., Larsson A., Olovsson М. Фактор роста фибробластов-2 в диагностике перитонеальной формы эндометриоза // Акушерство и гинекология. - 2007. - №3. - С.50-54).
Недостатками метода являются: его инвазивность (исследование перитонеальной жидкости); неспецифичность - он играет важную роль не только для ангиогенеза в эндометрии, но и для ангиогенеза во всех тканях организма человека (Ferriari R.A., Charnock-Jones D.S., Prentice A. et al. Immunohistochemical localization of acidic and basic firoblast growth factors in normal human endometrium and endometriosis and the detection of their mRNA by polymerase chain reaction. // Hum. Reprod. - 1993. - Vol.8. - P. 11-16, Moller В., Rasmusessen C, Lindblom В., Olovsson M. Expression of the angiogenic growth factors VEGF, FGF-2, EGF and their receptors in normal human endometrium during the menstrual cycle // Mol. Hum. Reprod. - 2001. - Vol.5. - P. 681-684); ограниченные возможности применения метода (только в крупных перинатальных центрах, для его выполнения необходим высококвалифицированный специалист).
Известен способ диагностики генитального эндометриоза (патент РФ №2363000, 27.07. 2009), включающий исследование сыворотки крови и перитонеальной жидкости, отличающийся тем, что в полученных образцах иммуноферментным методом определяют содержание сосудисто-эндотелиального фактора роста (СЭФР) и, если отношение содержания СЭФР в сыворотке к содержанию СЭФР в перитонеальной жидкости превышает значение 4,35, диагностируют наружный генитальный эндометриоз.
К недостаткам метода относятся его инвазивность (исследование перитонеальной жидкости), а также недостаточная специфичность, поскольку ангиогенный СЭФР играет весьма важную роль не только в локальных процессах ангиогенеза в эндометрии, но и на системном уровне в организме женщины (Costa N., Paramanathan S., Mac Donald D., Wierzbicki A.S., Hampson G. Factors regulating circulating vascular endothelial growth factor (VEGF): association with bone mineral density (BMD) in post-menopausal osteoporosis. // Cytokine. - 2009. - Vol.46, N 3. - P.376-381; Thielemann A., Baszczuk A., Kopczynski Z., Kopczynski P., Grodecka-Gazdecka S. Clinical usefulness of assessing VEGF and soluble receptors sVEGFR-1 and sVEGFR-2 in women with breast cancer // Ann. Agric Environ Med. - 2013. - Vol.20, N 2. - P. 293-297).
Прототипом заявляемого изобретения выбран способ диагностики наружного генитального эндометриоза у женщин с бесплодием (патент РФ №2291439, 10.01.2007) путем исследования периферической венозной крови, отличающийся тем, что в крови определяют относительное количество CD 16+ моноцитов в моноцитарном гейте и при значениях этого показателя, равного или менее 45%, диагностируют наружный генитальный эндометриоз.
Данный способ, как и предыдущие, имеет ряд недостатков:
- неспецифичность, поскольку количество CD 16+ моноцитов значительно варьирует в венозной крови при различных заболеваниях, патологических и экстремальных состояниях (вирусные инфекции, аутоиммунные заболевания, гастроэнтерологические заболевания, воспалительные процессы, стресс) (Мамедова Л.Н. Клинико-патогенетическое обоснование оптимизации диагностики и лечения воспалительных заболеваний кишечника: Дисс.… кан. мед. наук. - Ростов на Дону, 2014. -180 с. Последние достижения в клинической иммунологии. Под ред. Р.А. Томпсона. М.: Медицина, 1983. - 199 с.);
- недостаточная чувствительность (измерение диагностического показателя в относительных количествах).
- недостаточная точность (снижена в связи с отсутствием абсолютных величин), почти 20% составляют ложноположительные и ложноотрицательные результаты.
Указанные недостатки предлагается устранить в заявляемом способе.
Задача изобретения состоит в разработке высокоинформативного способа, позволяющего с высокой точностью диагностировать наружный генитальный эндометриоз у женщин с бесплодием.
Поставленная задача решается следующим образом: в сыворотке крови женщины с бесплодием определяют содержание агматина и при его величине ниже 2,2 диагностируют наружный генитальный эндометриоз.
Технический результат, получаемый в ходе использования изобретения, состоит в повышении точности и специфичности способа диагностики наружного генитального эндометриоза у женщин с бесплодием, что позволит своевременно назначать соответствующую адекватную патогенетическую терапию.
Новизна заявляемого способа заключается в том, что впервые предлагается диагностировать наружный генитальный эндометриоз по однократному определению в сыворотке крови женщины с бесплодием содержания агматина.
Пусковым механизмом в сложной цепи молекулярных нарушений, приводящих к развитию эндометриоза, может быть модификация метаболизма нуклеиновых кислот, и, как следствие, нарушение процессов биосинтеза белка в эндометрии. К числу соединений, активно влияющих на эти процессы, относятся биогенные амины, среди них важное место принадлежит агматину, который наряду с собственными регуляторными функциями выполняет роль регулятора обмена других полиаминов: спермина, спермидина, путресцина (Satriano J. Agmatine: at the crossroads of the arginine pathways // Ann. N.Y. Acad. Sci. - 2003 - Vol.1009. - P34-43). Биогенные амины инициируют синтез ДНК, оказывают действие на активность ДНК-зависимой РНК-полимеразы, а также ДНК-азы и РНК-азы (Thomas Т., Thomas T.J. Polyamines in cell growth and cell death: molecular mechanisms and therapeutic applications // Cell Mol. Life Sci. -2001. - Vol.58, N 2. - P. 244-258; Igarashi K., Kashiwagi K. Modulation of cellular function by polyamines // Int. J. Biochem. Cell Biol. - 2010 - Vol.42, N 1. - P.39-51). Являясь компонентами белоксинтезирующего аппарата, они участвуют в синтезе белка и действуют как на уровне трансляции, так и на уровне транскрипции (Minois N., Carmona-Gutierrez D., Madeo F. Polyamines in aging and disease // Aging (Albany NY). - 2011. - Vol.3, N 8. - P. 716-732). Кроме того, ингибируя активность протеиназ рибосом, они влияют на постсинтетическую модификацию белков (Левянт М.И., Былинский B.C., Орехович В.Н. Ингибиторы катепсина (протеиназы рибосом). Полиамины - естественные ингибиторы протеиназы // Биохимия. - 1979. - Т.446, №8. - С. 1454-1459). Наряду с регуляцией нуклеинового и белкового обменов, полиамины, в том числе агматин, влияют на состояние биомембран и содержание циклоАМФ - важного посредника в реализации многих гормональных эффектов (Kah S.M., Hryb D.J., Nakaha A.M. et al. Sex hormone-binding globulin is synthesized in target cells. J. Endocrinol. 2002; 175(1): 113-120). Изменение уровня циклоАМФ может влиять на функционирование эндометриальных клеток, в том числе локализованных вне полости матки, специфичных именно для эндометриоза.
Все эти процессы, очевидно, отражаются на формировании и поддержании роста гетеротопического эндометрия, наличие которого характерно для эндометриоза.
Определение в сыворотке крови у женщин с бесплодием содержания агматина позволяет объективно судить о создании условий для развития дисбаланса, прежде всего, в обмене нуклеиновых кислот и белков, играющего важную роль в развитии эндометриоза.
Нами установлены диагностические параметры развития наружного генитального эндометриоза у женщин с бесплодием по определению содержания в сыворотке крови агматина и при его значении ниже 2,2 мкг/мл диагностируют наружный генитальный эндометриоз.
Подробное описание способа и примеры его клинического выполнения.
Способ осуществляют следующим образом.
В сыворотке крови, взятой из локтевой вены женщины у женщин с бесплодием с подозрением на наружный генитальный эндометриоз (бесплодие, тазовые боли, дисменорея, диспаразия, меноррагия), определяют содержание агматина методом капиллярного электрофореза на аппарате «Капель-105» (Санкт-Петербург, Россия). Перед проведением исследования к образцам сыворотки (0,5 мл) добавляют равный объем 10% раствора трихлоруксусной кислоты с целью депротеинизации, пробы центрифугируют 15 минут при 3,5 тыс. об/с. Используется кварцевый капилляр с внешней полиамидной пленкой длиной 60 см и внутренним диаметром 75 мкм, в котором вводится 0,6 мл центрифугата. Проводят прямое спектрофотометрическое определение при 200 нм. Количественное определение агматина выполняют методом внешнего стандарта - коммерческого препарата агматина («Sigma Reagent Plus») с использованием линейной зависимости между концентрацией стандарта и площадью хроматографического пика. Время исследования 30 минут.
Работоспособность заявляемого способа подтверждается следующими клиническими примерами.
Пример 1.
Больная К-ва А.Б., 28 лет, поступила в гинекологическое отделение ФГБУ РНИИАП с жалобами на отсутствие беременности в течение 3-х лет. Из анамнеза известно, что менструации с 14 лет по 3-4 дня, через 28 дней, безболезненные; в браке 3 года, в течение 3-х лет при регулярной половой жизни беременность не наступает; эндокринный и мужской факторы бесплодия исключены. Учитывая отсутствие данных за видимую причину бесплодия, подозрение на хронический двусторонний сальпингит, больной рекомендована и в последующем проведена диагностическая лапароскопия. До оперативного вмешательства в сыворотке крови женщины определено содержание агматина, которое было равно 2,2 мкг/мл, что по заявляемому способу свидетельствовало об отсутствии наружного генитального эндометриоза. При гистероскопии выявлен хронический эндометрит, подтвержденный гистологией (№2523464). Поставлен диагноз: Хронический двусторонний сальпингит. Хронический эндометрит. Вторичное бесплодие.
Таким образом, диагноз по заявляемому способу подтвердился.
Пример 2.
Больная Ив-ко Л.К., 29 лет, поступила в гинекологическое отделение ФГБУ РНИИАП с жалобами на отсутствие беременности в течение 3-х лет. Гинекологический анамнез: менструации с 13 лет, по 5 дней, через 30 дней, болезненные, обильные; исключен воспалительный, эндокринный и мужской факторы бесплодия; при метросальпингографии - маточные трубы проходимы с обеих сторон, тест на овуляцию положительный. Подозрение на наружный генитальный эндометриоз, рекомендована диагностическая лапароскопия. В ходе предоперационный подготовки в сыворотке крови было исследовано содержание агматина, которое составило 2,1, что согласно заявляемому способу свидетельствовало о наличии наружного генитального эндометриоза. Во время операции выявлены множественные поверхностные очаги эндометриоза диаметром до 0,5 см на обоих яичниках. Гистологическое исследование (№34876/85) подтвердило наличие у пациентки эндометриоза. Поставлен диагноз: Наружный генитальный эндометриоз I-II стадии. Ретроцервикальный эндометриоз.
Таким образом, диагноз по заявляемому способу подтвердился.
По заявляемому способу нами обследовано 82 женщины с бесплодием, у которых в сыворотке крови было определено содержание агматина. Из обследованных пациенток у 62 содержание агматина было ниже 2,2 мкг/мл, что свидетельствовало о наличии наружного генитального эндометриоза. Из них у 61 гистологически был подтвержден наружный генитальный эндометриоз (истинно положительный результат) и лишь у одной женщины из этой группы данный диагноз не был подтвержден гистологически (ложноположительный результат). Ложноотрицательный результат у всех женщин с наружным генитальным эндометриоза отсутствовал. У 20 женщин содержание агматина было 2,2 мкг/мл и выше, гистологический анализ не показал наличия у этих пациенток наружного генитального эндометриоза.
Из приведенных данных следует, что точность и специфичность способа - 98%.
Вышеизложенное подтверждает прогностическую ценность заявляемого метода.
Таким образом, заявляемый способ более эффективен по сравнению с известными и обладает рядом преимуществ:
1. Высокая точность - 98%, специфичность - 98%.
2. Неинвазивность.
3. Не требует дорогостоящего оборудования.
4. Быстрота выполнения - 30 минут.
5. Однократность проведения исследования.
Заявляемый способ позволяет своевременно диагностировать наружный генитальный эндометриоз уже на ранних стадиях его формирования и может быть рекомендован к использованию в гинекологической практике.