Полимерные комплексы офлоксацина и их антибактериальная активность

Полимерные комплексы офлоксацина и их антибактериальная активность

Е. П. АНАНЬЕВА', С. С. БАРАНОВ', А. В. КАРАВАЕВА', М. С. БОРИСЕНКО23, М. В. СОЛОВСКИЙ23, Н. В. ЗАХАРОВА2, Т. А. ПРАЗДНИКОВА2, Е. Б. ТАРАБУКИНА2

' Санкт-Петербургская Государственная химико-фармацевтическая академия, Санкт-Петербург

2 Институт высокомолекулярных соединений РАН, Санкт-Петербург

3 Санкт-Петербургский государственный политехнический университет, Санкт-Петербург

Polymer Complexes of Ofloxacin and Their Antibacterial Activity

E. P. ANANYEVA, S. S. BARANOV, A. V. KARAVAEVA, M. S. BORISENKO, M. V. SOLOVSKIY, N. V. ZACHAROVA, T. A. PRAZDNIKOVA, E. B. TARABUKINA

St.Petersburg State Chemico-Pharmaceutical Academy, St. Petersburg

Institute of High Molecular Compounds, Russian Academy of Sciences, St. Petersburg

St.Petersburg State Polytechnical University, St. Petersburg

С целью создания малотоксичных пролонгированных форм монофторхинолона офлоксацина получены его водорастворимые полимерные комплексы. В качестве полимеров-комплексообразователей синтезированы катионные сополимеры N-винилпирролидона (ВП) с 2-аминоэтилметакрилатом и его гидрохлоридом (2-АЭМ • HCl), содержащие 10,9—28,3 мол. % -NH2 или -NH3Cl группы с молекулярными массами (ММ) 10500—89000, проявляющие собственную антимикробную активность. Полимерные комплексы содержали 18—36% фторхинолона и обладали высокой антимикробной активностью в отношении стафилококка и кишечной палочки, возрастающей с увеличением содержания офлоксацина в комплексе и с уменьшением его ММ. При исследовании кинетики высвобождения офлоксацина из его полимерного комплекса с ММ 60000, содержащего 36% фторхинолона, в буфере с рН 2,0 при 37°С обнаружено пролонгированное выделение лекарственного вещества из комплекса. При определении острой токсичности офлоксацина и сополимера ВП, содержащего 20,8 мол. %-NH3Cl групп, с ММ 51000, в опытах на мышах при внутрибрюшинном введении установлено, что офлоксацин является нетоксичным антимикробным препаратом, а полимерный носитель — малотоксичным веществом.

Ключевые слова: полимерные комплексы офлоксацина, катионные полимеры, антибактериальная активность, острая токсичность.

To lower the toxicity and to prolong the action of the monofluoroquinolone ofloxacin, its water-soluble polymer complexes were developed. Cationic copolymers of N-vinylpyrrolidone (VP) with 2-aminoethylmethacrylate (2-AEM) and its hydrochloride (2-AEM-HCl), containing 10.9—28.3 mol. % -NH2 or -NH3Cl group with the molecular mass (MM) of 10500 to 89000 were synthesized as the complex-forming polymers. The cationic copolymers showed their own antimicrobial activity. The polymer complexes contained 18—36% of fluoroquinolone and had high antimicrobial activity against S.aureus and E.coli, that increased with an increase of the ofloxacin content in the complex and a decrease of its MM. The kinetic studies on the ofloxacin release from its polymer complex with MM of 60000, containing 36% of fluoroquinolone revealed prolongation of the medicinal substance release from the complex in the buffer solution at pH 2.0 and a temperature of 37°C. The acute toxicity tests on mice with intraperitoneal administration of ofloxacin and copolymer VP containing 20.8 mol. % -NH3Cl group (MM of 51000) showed that ofloxacin was a nontoxic antimicrobial and the polymer carrier was a low toxic substance.

Key words: ofloxacin polymer complexes, cationic polymers, antibacterial activity, acute toxicity.

Введение

С практической точки зрения важнейшим является создание пролонгированных лекарственных форм современных антимикробных препаратов, способных обеспечить поддержание в организме необходимые концентрации на протяжении всего срока развития инфекционного процесса за счёт иммобилизации препаратов поли-

© Коллектив авторов, 2014

Адрес для корреспонденции: 197022 Санкт-Петербург, Набережная реки Карповки, дом 13, офис 28. СПб Государственная химико-фармацевтическая академия

мерными носителями. Важно создание не только пролонгированных, но и малотоксичных форм антимикробных средств.

В настоящей работе в качестве такого средства выбран монофторхинолон офлоксацин. Как и другие фторхинолоны, офлоксацин обладает широким спектром антибактериального действия, влияет и на микобактерии туберкулёза, включая резистентные формы [1]. Он эффективен в отношении микроорганизмов, устойчивых к большинству антибиотиков и сульфаниламидов, оказывает бактерицидное действие. Механизм

Таблица 1. Характеристика полимеров-носителей и их комплексов с офлоксацином

Сополимер-носитель Полимерный комплекс

обозначение содержание [п]*, ММ, обозначение выход, % содержание офлоксацина, %

NH3Cl или дл/г Да обнаружено вычислено

NH2 групп, мол. %

I-1 20,8 0,27 51000 III-1 74,7 29,6 30,0

I-2 27,9 0,44 89000 III-2 74,8 32,3 30,0

I-3 10,9 0,09 10500 III-3 74,6 28,1 25,0

II-1 34,6 0,25 60000 IV-1 91,0 36,1 35,0

II-1 34,6 0,25 60000 IV-2 98,6 26,0 25,0

II-1 34,6 0,25 60000 IV-3 96,0 17,7 16,0

Примечание. * [п] — характеристическая вязкость, определена в 0,1 н растворе ацетата натрия в воде при 25°С.

антимикробного действия офлоксацина, как и всех фторхинолонов, заключается в ингибирова-нии фермента ДНК-гиразы — ключевого фермента бактериальной клетки, ответственного за процесс суперспирализации ДНК. Офлоксацин часто назначают внутрь (при лечении туберкулёза, раневой инфекции мягких тканей) [1, 2].

Цель настоящей работы — создание водорастворимых полимерных форм офлоксацина для перорального применения, исследование их антимикробного действия, острой токсичности и скорости выделения из них офлоксацина в модельных средах.

В качестве метода получения таких форм офлоксацина, содержащего карбоксильную группу, было выбрано комплексообразование его с кати-онными полимерами-носителями: сополимерами М-винилпирролидона (ВП) с гидрохлоридом 2-аминоэтилметакрилата (ГХ 2-АЭМ) — I и с сополимерами ВП с 2-аминоэтилметакрилатом (2-АЭМ) — II, содержащими первичные -МН2 группы. Выбор сополимеров М-винилпирроли-дона, содержащих функциональные группы, для модификации офлоксацина не случаен, поскольку ввиду биосовместимости, гидрофильности и нетоксичности они широко и успешно используются в качестве полимеров-носителей многих лекарственных препаратов [3].

Материал и методы

Химические методы. Сополимеры I синтезировали путём радикальной сополимеризации ВП с ГХ 2-АЭМ в пропаноле-2 при 60°С, инициируемой 2,2'-азо-бис-изобутиронитрилом. Состав сополимеров I определяли по данным элементного анализа на содержание С1, молекулярные массы (ММ) — методами вискозиметрии [4] (сополимеры 1-1 и 1-3), а также сочетания диффузии и седиментации [5] (сополимеры 1-2 и 11-1). Сополимеры II получали путём пропускания водных растворов сополимеров I через колонку с анионитом ЭДЭ-10П в ОН-форме, выделяя их из фильтрата с рН 8,5—9,5 путём лиофиль-ной сушки. Состав сополимеров II устанавливали титрованием -КН2 групп 0,1 н раствором НС1. Полимерные комплексы офлоксацина III получали или путём частичной нейтрализации -КН2 групп сополимеров II офлоксацином в водных растворах, или путем взаимодействия сополимеров I с № солью офлоксацина в воде. В обоих случаях массовое соотношение офлоксацин/сополимер составляло 0,3—0,6/1. Целевой раствор (рН 7,5—7,9) подвергали лиофильной сушке. Содержание

офлоксацина в полимерном комплексе определяли методом УФ-спектроскопии. Процесс выделения офлоксацина из полимерного комплекса изучали по методике [6].

Исследование острой токсичности. Выполнено согласно «Методическим указаниям по изучению общетоксического действия фармакологических веществ» [7]. Сравнительное определение острой токсичности (расчёт однократной полулетальной дозы — ЛД50 при внутрибрюшинном введении мышам) офлоксацина и полимерного носителя (сополимера I-1) проводили по экспресс-методу Прозоровского. В эксперименте было использовано 27 беспородных белых мышей самцов (Musmusculus) массой тела 14—25 г в возрасте 9—12 недель к моменту введения препаратов. Мышей выдерживали на карантине в течение 14 дней до постановки эксперимента.

Определение антимикробной активности офлоксацина и его полимерных комплексов. Применяли метод серийных разведений [8] в мясо-пептонном бульоне с последующим высевом на плотную питательную среду — мясо-пептонный агар. В качестве тест-микроорганизмов использовали стандартные штаммы Escherichia coli АТСС 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, Staphylococcus aureus ATCC 6538-P. Микробная нагрузка составляла 5*104 микробных клеток/мл.

Результаты и обсуждение

Образование комплексов III офлоксацина с сополимерами I представлено ниже схемой:

P—NH3Cl + NaOOC-офлоксацин

P—NH+ -OOC-офлоксацин + NaCl

Получение комплексов IV офлоксацина с сополимерами II также представлено ниже:

P-NH2 + HOOC-офлоксацин

P—NH+ -OOC—офлоксацин

Некоторые характеристики полимерных комплексов III и IV приведены в табл. 1. Комплексы получены с выходом 75—96% на основе сополимеров I и II, содержащих 10,9—28,3 мол.% реак-ционноспособных -NH3Cl или -NH3 групп, с ММ 10500—89000. Содержание фторхинолона в комплексе, вычисленное по загрузке компонентов, удовлетворительно совпадало с содержанием оф-локсацина, определённым методом УФ-спектро-скопии. Образование комплексов сополимера I с Na солью офлоксацина подтверждено вискози-

Таблица 2. Антимикробная активность офлоксацина, его полимерных комплексов и полимеров-носителей

Препарат Содержание офлоксацина, % МПК, мкг/мл

E.coli S.aureus P.aeruginosa

МБСК МБЦК МБСК МБЦК МБСК МБЦК

Офлоксацин 100 1,56 3,12 2,5 5,0 37,5 75,0

Комплекс 1У-3 18 12,50 25,0 7,5 15,0 — 150,0

Комплекс 1У-2 26 3,12 6,25 5,0 10,0 50,0 100,0

Комплекс 1У-1 36 1,56 3,12 5,0 10,0 50,0 100,0

Комплекс Ш-2 32 6,25 12,50 5,0 10,0 150 300

ММ=89000

Комплекс Ш-1 30 3,12 6,25 5,0 10,0 75 150

ММ=51000

Комплекс Ш-3 28 — 3,12 2,5 5,0 — 75

ММ=10500

Носитель 11-1 0 125 200 125 200 625 1250

Носитель 1-1 0 125 200 125 200 625 1250

Примечание. МБСК - минимальная бактериостатическая концентрация, мкг/мл; МБЦК - минимальная бактерицидная концентрация, мкг/мл.

метрическим методом. Определение характеристической вязкости [п] полимерного комплекса III-1 дало значение [п] = 0,11 дл/г. В тех же условиях [п] исходного сополимера I-1 составляла 0,27 дл/г. Наблюдаемое явление связано с ком-пактизацией макромолекул носителя в результате его комплексообразования с фторхинолоном. Гидродинамические размеры клубка макромолекул сополимера уменьшаются, что приводит к снижению характеристической вязкости раствора сополимера.

При микробиологическом исследовании in vitro офлоксацина-контроля было установлено (табл. 2), что наиболее выраженное антимикробное действие этот фторхинолон оказывает на гра-мотрицательные бактерии — Escherichia coli, не столь выраженное — на грамположительные кокки — Staphylococcus aureus и наименее выраженное — на Pseudomonas aeruginosa, что согласуется с данными литературы [9]. Полученные полимерные комплексы офлоксацина проявляли активность в отношении исследованных тест-культур с той же тенденцией. Антимикробная активность полимерных комплексов возрастала с увеличением содержания в них фторхинолона. Наиболее чётко эта зависимость проявлялась для комплексов IV-3, IV-2, IV-1 в отношении E.coli. При одинаковом содержании офлоксацина в комплексах III-3 и III-2 действие этих полимерных комплексов на все изученные тест-микроорганизмы уменьшалось при увеличении ММ полимерных комплексов с 10500 до 89000 Да. Это, по-видимому, связано с уменьшением скорости диффузии офлоксацина из полимерного комплекса в микробную клетку с ростом его ММ.

Таким образом, наибольшую антимикробную активность в отношении трёх использованных тест-культур проявляли, как это видно из табл. 2, комплексы IV-1 (36% фторхинолона, ММ 60000) и III-3 (28% фторхинолона, ММ 10500).

Следует отметить, что синтезированные катионные сополимеры-носители I-1 и II-1 обладали заметной собственной антимикробной активностью (см. табл. 2), особенно в отношении стафилококка и кишечной палочки.

Антимикробную активность синтетических поликатионов впервые обнаружили Е. Ф. Пана-рин с сотр. [10] на примере полимеров четвертичных аммониевых солей аминоалкиловых эфиров метакриловой кислоты. Впоследствии антимикробная активность была найдена и у других поликатионов [3] и было показано, что она обусловлена их мембранотропностью [11]. В связи с этим наблюдаемая высокая активность комплексов IV-1 и III-3 в отношении E.coli (для обоих комплексов МБЦК составляла 3,12 мкг/мл), равная активности офлоксацина-контроля, может быть обусловлена синергид-ным эффектом действия на клетку E.coli офлоксацина и полимера-носителя.

При проведении токсикологических исследований было установлено, что ЛД50 использованного в работе офлоксацина >2000 мг/кг, что позволяет отнести его к разряду нетоксичных веществ. Определение острой токсичности сополимера-носителя I-1 позволило установить значение его ЛД50, равное 328 мг/кг, что, согласно [12], свидетельствует о его невысокой токсичности. Поскольку офлоксацин не токсичен, можно считать, что его ионный полимерный комплекс с сополимером I-1 также будет характеризоваться значением ЛД50 (при внутрибрюшинном введении) >328 мг/кг.

Изучен процесс отщепления офлоксацина от полимера-носителя в полученных полимерных комплексах в модельной среде (гликоколовый буфер с pH 2,0). Температура эксперимента 37°С. В качестве объекта исследования выбран полимерный комплекс офлоксацина IV-1 с высокой антимикробной активностью, содержащий 36% фтор-

хинолона, с ММ 60000. Процесс выделения оф-локсацина из комплекса ГУ-1 изучали методом диализа через полупроницаемую целлофановую мембрану, пропускающую молекулы фторхиноло-на и задерживающую молекулы полимера-носителя. Результатах этого эксперимента свидетельствуют о достаточно медленном высвобождении офлоксацина из полимерного комплекса в модельной среде: 16,2% — за 4 часа, 40,8% — за 24 часа и 45,1% — за 50 часов. Это может обеспечить пролонгирование антимикробного действия оф-локсацина при внутреннем использовании полученной его полимерной формы.

Выводы

1. В качестве полимеров-носителей офлок-сацина синтезированы сополимеры М-винил-пирролидона (ВП) с 2-аминоэтилметакрилатом (2-АЭМ) и с его гидрохлоридом (ГХ 2-АЭМ). Сополимеры содержали 10,9—28,3 мол.% -МН3С1 или -МН2 групп, имели молекулярные массы 10500—89000 Да.

2. На основе синтезированных сополимеров впервые получены водорастворимые полимерные комплексы офлоксацина с содержанием фторхинолона 18—36%.

ЛИТЕРАТУРА

1. Машковский М.Д. Лекарственные средства. Изд 15-е, М.: 2005; 846.

2. Блатун Л. А., Яковлев В. П., Елагина Л. В. Офлоксацин в комплексной терапии осложнённых форм раневой инфекции. Антибиотики и химиотер 1994; 1: 33—37.

3. Соловский М.В. Модификация физиологически активных веществ полимерами, СПб.: 2012; 80—90.

4. Павлов Г.М., Панарин Е.Ф., Корнеева Е.В. и др. Высокомолекулярные соединения. Сер. А. 1990; 6: 1190—1196.

5. Тарабукина Е.Б., Амирова А.И., Шулъцева Е.Л. и др. Влияние условий синтеза на молекулярные характеристики сополимеров акри-ламида с акриловой кислотой — носителей катионных биологически активных веществ. ЖПХ 2009; 82: 9: 1506—1513.

6. Соловский М.В., Николъская Н.В., Заикина Н.А. Синтез и свойства полимерных шиффовых оснований антибиотика спирамицина. Хим-фарм журн 2002; 36: 2: 9—12.

3. Исследована кинетика высвобождения офлоксацина из его полимерного комплекса, содержащего 36% фторхинолона, с молекулярной массой 60000 в буферном растворе (рН 2,0) при 37°С. Обнаружено пролонгированное выделение лекарственного вещества из комплекса.

4. Установлена высокая антимикробная активность полученных полимерных комплексов в отношении использованных тест-микроорганизмов (особенно кишечной палочки), возрастающая с увеличением содержания офлоксацина в комплексе и с уменьшением его молекулярной массы.

5. Выявлено наличие собственной антимикробной активности у полученных сополимеров-носителей, обеспечивающей синергидный эффект действия на микробную клетку офлоксацина и ка-тионного полимера.

6. Определены значения ЛД50 в опытах на мышах при внутрибрюшинном введении офлоксацина и исходного сополимера ВП с ГХ 2-АЭМ (с ММ 51000, содержанием -МН3С1 групп 20,8 мол.%), позволяющие отнести офлоксацин к нетоксичным препаратам, а сополимер-носитель — к малотоксичным веществам.

7. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под ред. Р.У. Хабриева. М.: 2005; 41-54.

8. Навашин С.М., Фомина И.П. Рациональная антибиотикотерапия. М.: 1982; 495.

9. Падейская Е.Н., Яковлев В.П. Фторхинолоны. М.: 1995; 18—52.

10. Панарин Е.Ф., Соловский М.В., Экземпляров ОН. Синтез и антимикробные свойства полимеров, содержащих четвертичные аммониевые группы. Хим-фарм журн 1971; 5: 7: 24—26.

11. Panarin E.F., Solovskiy M.V., Zaikina N.A., Afinogenov G.E. Macromol Chem Suppl 1985; 9: 25-33.

12. Березовская И В. Классификация химических веществ по параметрам острой токсичности при парентеральных способах введения Научная библиотека диссертаций и авторефератов. Хим-фарм журн 2003; 37: 3: 32—34.