СПОСОБ ИНКУБИРОВАНИЯ ПОПУЛЯЦИИ КЛЕТОК И РЕАГЕНТ ДЛЯ МУЛЬТИМЕРИЗАЦИИ

1. Способ инкубирования популяции клеток, включающий инкубирование образца, содержащего популяцию Т-клеток, с реагентом для мультимеризации, обратимо связанным с первым средством, в условиях для стимуляции Т-клеток в популяции Т-клеток, где:
Т-клетки предусматривают CD3+ Т-клетки;
первое средство содержит первого партнера по связыванию, обратимо связанного с первым связывающим участком реагента для мультимеризации; и
первое средство связывается с рецепторной молекулой на поверхности Т-клетки в популяции для стимулирования сигнала к Т-клетке.
2. Способ по п. 1, где:
реагент для мультимеризации обратимо связан со вторым средством,
второе средство содержит второго партнера по связыванию, обратимо связанного со вторым связывающим участком реагента для мультимеризации, и
второе средство связывается с дополнительной молекулой на поверхности Т-клетки с обеспечением костимулирующего сигнала к Т-клетке.
3. Способ по п. 1 или 2, где Т-клетки предусматривают CD4+ Т-клетки и CD8+ Т-клетки.
4. Способ по любому из пп. 1-3, дополнительно включающий обогащение или осуществление очистки CD4+ Т-клеток и CD8+ Т-клеток в образце.
5. Способ по любому из пп. 1-4, где Т-клетки обогащены или очищены из образца цельной крови или продукта афереза.
6. Способ по любому из пп. 1-5, где:
первое средство содержит комплекс MHC I:пептид или
первое средство стимулирует сигнал, ассоциированный с комплексом TCR/CD3, в Т-клетках.
7. Способ по любому из пп. 1-6, где первое средство представляет собой связывающий реагент, который специфически связывает CD3.
8. Способ по любому из пп. 1-7, где вспомогательной молекулой в Т-клетке является CD28.
9. Способ по любому из пп. 2-8, где второе средство, которое связывает вспомогательную молекулу, представляет собой связывающий реагент, который специфически связывает CD28.
10. Способ по любому из пп. 1-9, где:
указанное первое средство выбрано из группы, состоящей из антитела к CD3, фрагмента двухвалентного антитела к CD3, фрагмента одновалентного антитела к CD3 и белковой CD3-связывающей молекулы с антителоподобными свойствами связывания, и/или
второе средство выбрано из группы, состоящей из антитела к CD28, фрагмента двухвалентного антитела к CD28, фрагмента одновалентного антитела к CD28 и белковой CD28-связывающей молекулы с антителоподобными свойствами связывания.
2
11. Способ по п. 10, где фрагмент двухвалентного антитела представляет собой F(ab')-фрагмент или двухвалентный одноцепочечный Fv-фрагмент.
12. Способ по п. 10, где фрагмент одновалентного антитела выбран из группы, состоящей из Fab-фрагмента, Fv-фрагмента и одноцепочечного Fv-фрагмента (scFv).
13. Способ по любому из пп. 2-12, где первое средство содержит Fab, связывающий CD3, и второе средство содержит Fab, связывающий CD28.
14. Способ по п. 10, где белковая CD3- или CD28-связывающая молекула с антителоподобными связывающими свойствами выбрана из группы, состоящей из аптамера, мутеина на основе полипептида из семейства липокалинов, аналога антитела на основе глутатион-S-трансферазы, белка на основе анкиринового каркаса, белка на основе кристаллического каркаса, аднектина и авимера.
15. Способ по любому из пп. 2-14, где первый и второй связывающие участки реагента для мультимеризации являются идентичными.
16. Способ по п. 15, где применяют отдельно взятый реагент для мультимеризации.
17. Способ по любому из пп. 1-16, где реагент для мультимеризации иммобилизован на твердой поверхности.
18. Способ по п. 17, где твердая поверхность выбрана из группы, состоящей из магнитной гранулы, полимерной гранулы, планшета для культуры клеток, титрационного микропланшета, мембраны, полого волокна и их комбинаций.
19. Способ по п. 17 или 18, где реагент для мультимеризации выбран из группы, состоящей из стрептавидина; авидина; мутеина стрептавидина, который обратимо связывает биотин; мутеина авидина, который обратимо связывает биотин; реагента, который содержит по меньшей мере две хелатные группы, где по меньшей мере две хелатные группы способны связываться с ионом переходного металла, тем самым делая реагент способным к связыванию с аффинной меткой олигогистидина; мультимерной глутатион-S-трансферазы; мультимерного кальмодулина и биотинилированного белка-носителя.
20. Способ по любому из пп. 1-16, где реагент для мультимеризации находится в растворимой форме.
21. Способ по п. 20, где реагент для мультимеризации содержит олигомер или полимер стрептавидина; олигомер или полимер авидина; олигомер или полимер мутеина стрептавидина, который обратимо связывает биотин; олигомер или полимер мутеина авидина, который обратимо связывает биотин; реагент, который содержит по меньшей мере две хелатные группы, где по меньшей мере две хелатные группы способны связываться с ионом переходного металла, тем самым делая реагент способным к связыванию с аффинной меткой олигогистидина; мультимерную глутатион-S-трансферазу; мультимерный кальмодулин или биотинилированный белок-носитель.
22. Способ по п. 21, где отдельные субъединицы олигомера или полимера стрептавидина, авидина, мутеина стрептавидина или мутеина авидина сшиты полисахаридом или посредством бифункционального линкера.
23. Способ по п. 21 или 22, где олигомер или полимер содержат три или более мономеров стрептавидина, авидина, мутеина стрептавидина или мутеина авидина.
24. Способ по любому из пп. 1-23, где:
(a) указанный партнер по связыванию содержит независимо от другого биотин, и указанный реагент для мультимеризации содержит мутеин стрептавидина или мутеин авидина, которые обратимо связываются с биотином,
(b) указанный партнер по связыванию содержит независимо от другого аналог биотина, который обратимо связывается со стрептавидином или авидином, и при этом указанный реагент для мультимеризации содержит стрептавидин, или авидин, или мутеин стрептавидина, или мутеин авидина, которые обратимо связываются с указанным аналогом биотина, или
(c) указанный партнер по связыванию содержит независимо от другого стрептавидин- или авидин-связывающий пептид, и при этом указанный реагент для мультимеризации содержит стрептавидин, или авидин, или мутеин стрептавидина, или мутеин авидина, которые обратимо связываются с указанным стрептавидин- или авидин-связывающим пептидом.
25. Способ по любому из пп. 1-24, где указанный первый партнер по связыванию и/или указанный второй партнер по связыванию содержат независимо друг от друга последовательную группировку из двух стрептавидин-связывающих модулей связывания.
26. Способ по п. 25, где каждый из двух стрептавидин-связывающих модулей содержит аминокислотную последовательность SAWSHPQFEK.
2
27. Способ по любому из пп. 1-24, где указанный первый партнер по связыванию и/или указанный второй партнер по связыванию содержат независимо друг от друга стрептавидин-связывающий пептид Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 1) или стрептавидин-связывающий пептид SAWSHPQFEK(GGGS)GGSAWSHPQFEK (SEQ ID NO: 7).
28. Способ по любому из пп. 1-27, где:
указанный первый партнер по связыванию сопряжен с С-концом легкой цепи первого средства или
указанный первый партнер по связыванию сопряжен с С-концом тяжелой цепи первого средства.
29. Способ по любому из пп. 2-28, где:
указанный второй партнер по связыванию сопряжен с С-концом легкой цепи второго средства или
указанный второй партнер по связыванию сопряжен с С-концом тяжелой цепи второго средства.
44
45
46
47
44
45
46
47
30. Способ по любому из пп. 1-29, где реагент для мультимеризации содержит мутеин стрептавидина, который содержит аминокислотную последовательность Va1-Thr-Ala-Arg в положениях последовательности 44-47 стрептавидина дикого типа, или мутеин стрептавидина, который содержит аминокислотную последовательность lle-Gly-Ala-Arg в положениях последовательности 44-47 стрептавидина дикого типа.
31. Способ по п. 30, где N-концевой аминокислотный остаток мутеина стрептавидина находится в области аминокислот 10-16 аминокислотной последовательности стрептавидина дикого типа, и С-концевой аминокислотный остаток мутеина стрептавидина находится в области аминокислот 133-142 аминокислотной последовательности стрептавидина дикого типа.
32. Способ по любому из пп. 1-31, где связывание между указанным первым партнером по связыванию и указанным первым связывающим участком указанного реагента для мультимеризации и/или связывание между указанным вторым партнером по связыванию и указанным вторым связывающим участком указанного реагента для мультимеризации происходит в присутствии двухвалентного катиона.
33. Способ по п. 32, где:
указанный первый партнер по связыванию или второй партнер по связыванию содержат независимо друг от друга кальмодулин-связывающий пептид, и указанный реагент для мультимеризации содержит кальмодулин, или
указанный первый партнер по связыванию или второй партнер по связыванию содержат независимо друг от друга пептид FLAG, и указанный реагент для мультимеризации содержит антитело, связывающееся с пептидом FLAG, или
указанный первый партнер по связыванию или второй партнер по связыванию независимо друг от друга содержат олигогистидиновую метку, и указанный реагент для мультимеризации содержит антитело, связывающееся с олигогистидиновой меткой.
34. Способ по п. 33, где хелатирование металлов осуществляют с помощью добавления EDTA или EGTA.
35. Способ по любому из пп. 2-34, где первый и второй партнеры по связыванию являются различными.
36. Способ по любому из пп. 2-34, где первый и второй партнеры по связыванию являются идентичными.
37. Способ по любому из пп. 1-36, дополнительно включающий нарушение связывания между указанным первым партнером по связыванию первого средства и указанным первым связывающим участком указанного реагента для мультимеризации и/или нарушение связывания между указанным вторым партнером по связыванию второго средства и указанным вторым связывающим участком указанного реагента для мультимеризации.
38. Способ по п. 37, где нарушение связывания между указанным первым партнером по связыванию первого средства и указанным первым связывающим участком указанного реагента для мультимеризации и/или нарушение связывания между указанным вторым партнером по связыванию второго средства и указанным вторым связывающим участком указанного реагента для мультимеризации вызывает прекращение стимуляции T-клеток.
d
d
-2
-13
39. Способ по любому из пп. 1-38, где константа диссоциации (K) для обратимого связывания между указанным первым партнером по связыванию и указанным первым связывающим участком и/или K для обратимого связывания между указанным вторым партнером по связыванию и указанным вторым связывающим участком находится в диапазоне от 10 М до 10 М.
40. Способ по любому из пп. 1-39, где указанное обратимое связывание между указанным первым партнером по связыванию и указанным первым связывающим участком указанного реагента для мультимеризации нарушается приведением в контакт указанной популяции Т-клеток с первым партнером по связыванию в свободной форме или аналогом указанного первого партнера по связыванию, способного нарушить связывание между первым партнером по связыванию и первым связывающим участком, и/или
где указанное обратимое связывание между указанным вторым партнером по связыванию и указанным вторым связывающим участком указанного реагента для мультимеризации нарушается приведением в контакт указанной популяции Т-клеток со вторым партнером по связыванию в свободной форме или аналогом указанного второго партнера по связыванию, способным нарушить связывание между вторым партнером по связыванию и вторым связывающим участком.
41. Способ по п. 40, где первый партнер в свободной форме и/или второй партнер в свободной форме представляет собой соединение, не являющееся вредным для T-клеток.
42. Способ по любому из пп. 1-41, где обратимое связывание между указанным первым партнером по связыванию и указанным первым связывающим участком и/или обратимое связывание между указанным вторым партнером по связыванию и указанным вторым связывающим участком нарушается приведением в контакт Т-клеток с биотином или аналогом биотина, и где:
(a) указанный партнер по связыванию содержит независимо от другого биотин, и указанный реагент для мультимеризации содержит мутеин стрептавидина или мутеин авидина, которые обратимо связываются с биотином,
(b) указанный партнер по связыванию содержит независимо от другого аналог биотина, который обратимо связывается со стрептавидином или авидином, и при этом указанный реагент для мультимеризации содержит стрептавидин, или авидин, или мутеин стрептавидина, или мутеин авидина, которые обратимо связываются с указанным аналогом биотина, или
(c) указанный партнер по связыванию содержит независимо от другого стрептавидин- или авидин-связывающий пептид, и при этом указанный реагент для мультимеризации содержит стрептавидин, или авидин, или мутеин стрептавидина, или мутеин авидина, которые обратимо связываются с указанным стрептавидин- или авидин-связывающим пептидом.
43. Способ по любому из пп. 24-42, где биотин представляет собой D-биотин; и/или аналог биотина представляет собой дестиобиотин или иминобиотин.
44. Способ по любому из пп. 1-41, где обратимое связывание между указанным первым партнером по связыванию и указанным первым связывающим участком и/или обратимое связывание между указанным вторым партнером по связыванию и указанным вторым связывающим участком нарушается приведением в контакт Т-клеток с металлохелатором, в случае если связывание между указанными первым партнером по связыванию, соответственно, и вторым партнером по связыванию и указанными первым и вторым связывающими участками, соответственно, указанного реагента для мультимеризации происходит в присутствии двухвалентного катиона.
45. Способ по любому из пп. 1-44, где приведение в контакт образца с реагентом для мультимеризации приводит в результате к специфическому связыванию Т-клеток с реагентом для мультимеризации.
46. Способ по п. 45, дополнительно включающий отделение Т-клеток, связанных с реагентом для мультимеризации, от несвязанных клеток популяции.
47. Способ по любому из пп. 1-46, где приведение в контакт образца с реагентом для мультимеризации осуществляют в биореакторе, таком как культуральный планшет, половолоконный биореактор или биореактор в виде пластикового мешка.
48. Способ по п. 46 или 47, дополнительно включающий приведение в контакт Т-клеток, связанных с реагентом для мультимеризации посредством первого средства и второго средства, с (i) первым партнером по связыванию в свободной форме или его аналогом, способными нарушать связывание между первым партнером по связыванию и первым связывающим участком, и/или (ii) вторым партнером по связыванию в свободной форме или его аналогом, способными нарушать связывание между вторым партнером по связыванию и вторым связывающим участком,
где указанное обратимое связывание между указанным первым партнером по связыванию и указанным первым связывающим участком и обратимое связывание между указанным вторым партнером по связыванию и указанным вторым связывающим участком нарушается с высвобождением тем самым связанных Т-клеток из реагента для мультимеризации и/или из первого средства и второго средства.
49. Способ по п. 48, включающий сбор элюата, содержащего высвобожденные Т-клетки, реагента для мультимеризации, первого средства и/или второго средства, первого партнера по связыванию в свободной форме или его аналога и/или второго партнера по связыванию в свободной форме или его аналога.
50. Способ по п. 49, дополнительно включающий:
проведение в отношении элюата хроматографии на первой неподвижной фазе, содержащей первый аффинный реагент, где первый аффинный реагент содержит связывающий участок, способный специфически связываться с первым и/или вторым партнером по связыванию, с иммобилизацией тем самым первого средства, второго средства, первого партнера по связыванию в свободной форме или его аналога и/или второго партнера по связыванию в свободной форме или его аналога на первой неподвижной фазе; и/или
проведение в отношении элюата хроматографии на второй неподвижной фазе, содержащей второй аффинный реагент, где второй аффинный реагент содержит партнера по связыванию, способного специфически связываться с первым и/или вторым связывающим участком реагента для мультимеризации, с иммобилизацией тем самым реагента для мультимеризации на второй неподвижной фазе.
51. Способ по п. 50, где:
первая и/или вторая неподвижная фаза содержат матрицу для гель-фильтрации и/или матрицу для аффинной хроматографии и/или
первая и/или вторая неподвижная фаза находятся в жидкостном соединении с биореактором.
52. Способ по любому из пп. 1-51, дополнительно включающий введение нуклеиновой кислоты, кодирующей Т-клеточный рецептор или химерный антигенный рецептор, в Т-клетки либо после инкубации, либо во время инкубации.
53. Способ по п. 52, где Т-клеточный рецептор или рецептор химерного антигена вводят путем трансфекции Т-клеток ретровирусным вектором.
54. Способ по п. 52 или 53, где Т-клетки стимулируют третьим средством, которое связывается с введенным Т-клеточным рецептором или рецептором химерного антигена.
55. Реагент для мультимеризации, где:
реагент для мультимеризации находится в растворимой форме и обратимо связан с первым средством,
причем первое средство представляет собой первое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент и содержит первого партнера по связыванию, (i) сопряженного с С-концом тяжелой или легкой цепей первого антитела или его антигенсвязывающего фрагмента и (ii) обратимо связанного с первым связывающим участком реагента для мультимеризации, и
при этом первое средство связывается с рецепторной молекулой на поверхности Т-клетки в популяции Т-клеток для стимулирования сигнала к Т-клетке, стимулируя тем самым Т-клетки в популяции.
56. Реагент для мультимеризации по п. 55, где:
реагент для мультимеризации дополнительно обратимо связан со вторым средством,
причем второе средство представляет собой второе антитело или его антигенсвязывающий фрагмент и содержит второго партнера по связыванию, (i) сопряженного с С-концом тяжелой или легкой цепей второго антитела или его антигенсвязывающего фрагмента и (ii) обратимо связанного со вторым связывающим участком реагента для мультимеризации, и
при этом второе средство связывается с дополнительной молекулой на поверхности Т-клетки с обеспечением костимулирующего сигнала к Т-клетке.
57. Реагент для мультимеризации по п. 55 или 56, где:
первое средство содержит комплекс MHC I:пептид или
первое средство стимулирует сигнал, ассоциированный с комплексом TCR/CD3 в Т-клетках.
58. Реагент для мультимеризации по любому из пп. 55-57, где первое средство содержит связывающий реагент, который специфически связывает CD3.
59. Реагент для мультимеризации по любому из пп. 56-58, где второе средство, которое связывает вспомогательную молекулу, содержит связывающий реагент, который специфически связывает CD28.
60. Реагент для мультимеризации по любому из пп. 55-59, где:
первое средство выбрано из группы, состоящей из антитела к CD3, фрагмента двухвалентного антитела к CD3 и фрагмента одновалентного антитела к CD3, и/или
второе средство выбрано из группы, состоящей из антитела к CD28, фрагмента двухвалентного антитела к CD28 и фрагмента одновалентного антитела к CD28.
2
61. Реагент для мультимеризации по п. 60, где фрагмент двухвалентного антитела представляет собой F(ab')-фрагмент или двухвалентный одноцепочечный Fv-фрагмент.
62. Реагент для мультимеризации по п. 60, где фрагмент одновалентного антитела выбран из группы, состоящей из Fab-фрагмента, Fv-фрагмента и одноцепочечного Fv-фрагмента (scFv).
63. Реагент для мультимеризации по любому из пп. 56-62, где первое средство содержит Fab, связывающий CD3, и второе средство содержит Fab, связывающий CD28.
64. Реагент для мультимеризации по любому из пп. 56-63, где первый и второй связывающие участки реагента для мультимеризации являются идентичными.
65. Реагент для мультимеризации по любому из пп. 56-64, где реагент для мультимеризации содержит олигомер или полимер стрептавидина; олигомер или полимер авидина; олигомер или полимер мутеина стрептавидина, который обратимо связывает биотин; олигомер или полимер мутеина авидина, который обратимо связывает биотин; реагент, который содержит по меньшей мере две хелатные группы, где по меньшей мере две хелатные группы способны связываться с ионом переходного металла, тем самым делая реагент способным к связыванию с аффинной меткой олигогистидина; мультимерную глутатион-S-трансферазу; мультимерный кальмодулин или биотинилированный белок-носитель.
66. Реагент для мультимеризации по п. 65, где олигомер или полимер стрептавидина, авидина, мутеина стрептавидина или мутеина авидина сшиты полисахаридом или посредством бифункционального линкера.
67. Реагент для мультимеризации по п. 65 или 66, где олигомер или полимер содержат три или более мономеров стрептавидина, авидина, мутеина стрептавидина или мутеина авидина.
68. Реагент для мультимеризации по любому из пп. 55-67, где:
(a) указанный партнер по связыванию содержит независимо от другого биотин, и указанный реагент для мультимеризации содержит мутеин стрептавидина или мутеин авидина, которые обратимо связываются с биотином,
(b) указанный партнер по связыванию содержит независимо от другого аналог биотина, который обратимо связывается со стрептавидином или авидином, и при этом указанный реагент для мультимеризации содержит стрептавидин, или авидин, или мутеин стрептавидина, или мутеин авидина, которые обратимо связываются с указанным аналогом биотина, или
(c) указанный партнер по связыванию содержит независимо от другого стрептавидин- или авидин-связывающий пептид, и при этом указанный реагент для мультимеризации содержит стрептавидин, или авидин, или мутеин стрептавидина, или мутеин авидина, которые обратимо связываются с указанным стрептавидин- или авидин-связывающим пептидом.
69. Реагент для мультимеризации по п. 68, где биотин представляет собой D-биотин; и/или аналог биотина представляет собой дестиобиотин или иминобиотин.
70. Реагент для мультимеризации по любому из пп. 55-69, где указанный первый партнер по связыванию и/или указанный второй партнер по связыванию содержат независимо друг от друга последовательную группировку из двух стрептавидин-связывающих модулей.
71. Реагент для мультимеризации по п. 70, где каждый из двух стрептавидин-связывающих модулей содержит аминокислотную последовательность SAWSHPQFEK.
2
72. Реагент для мультимеризации по любому из пп. 55-71, где указанный первый партнер по связыванию и/или указанный второй партнер по связыванию содержат независимо друг от друга стрептавидин-связывающий пептид Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 1) или стрептавидин-связывающий пептид SAWSHPQFEK(GGGS)GGSAWSHPQFEK (SEQ ID NO: 7).
73. Реагент для мультимеризации по любому из пп. 55-72, где:
указанный первый партнер по связыванию связан с C-концом тяжелой цепи первого средства; и/или
указанный второй партнер по связыванию связан с С-концом тяжелой цепи второго средства.
44
45
46
47
44
45
46
47
74. Реагент для мультимеризации по любому из пп. 55-73, где реагент для мультимеризации содержит мутеин стрептавидина, который содержит аминокислотную последовательность Va1-Thr-Ala-Arg в положениях последовательности 44-47 стрептавидина дикого типа, или мутеин стрептавидина, который содержит аминокислотную последовательность lle-Gly-Ala-Arg в положениях последовательности 44-47 стрептавидина дикого типа.
75. Реагент для мультимеризации по п. 74, где N-концевой аминокислотный остаток мутеина стрептавидина находится в области аминокислот 10-16 аминокислотной последовательности стрептавидина дикого типа, и С-концевой аминокислотный остаток мутеина стрептавидина находится в области аминокислот 133-142 аминокислотной последовательности стрептавидина дикого типа.
d
d
-2
-13
76. Реагент для мультимеризации по любому из пп. 55-75, где константа диссоциации (K) для обратимого связывания между указанным первым партнером по связыванию и указанным первым связывающим участком и/или K для обратимого связывания между указанным вторым партнером по связыванию и указанным вторым связывающим участком находится в диапазоне от 10 М до 10 М.