Микробиота пристеночного муцина и ее модификация пробиотиками

Enikeyev D.A., Fayurshin A.Z., Enikeyeva S.A., Enikeyev O.A.

Latent sensibilization and evaluation of allergenspecific

immunoglobulin E in patients with hay fever..............

........................................................74

Churnosov M.I., Efimova I.S., Balanovskaya E.V., Lependina I.N., Tsapkova L.A.

Distribution of haplogroups of Y-chromosomes among

population of Central Russia.............................

80

Zhilina S.V., Mironov A.Yu., Polikarpova S.V.,

Pivkina N. V.

The role of Pseudomonas aeruginosa in infections of

the skin and soft tissues...............................88

Pereverzeva I.V., Bobyntsev I.I., Silina L.V.

Clinical effectiveness of complex therapy of atopic

dermatitis with Semax....................................

......................................................98

Gritsenko V.F., Andreichev V.V.

Clinical and laboratory characteristics of men with chronic urogenital trichomoniasis and estimation of effectiveness of microscopical or cultural methods of its

laboratory diagnostics...................................

......................................................104

GavrilyukE.V., KonoplyaA.I., Mikhin V.P.

Use of cytoprotectors in immuno modulating therapies

of patients with acute myocardial infarction.............

......................................................109

Yushina I.A., Kalmykova E. V., Nekipelova E.V., Churnosov M.I.

The role of genetic and immunological factors in chronic renal failure on the background of chronic glomerulonephritis....................................

....................................................116

Poddubnaya O.N.

The indices of antioxidative defence in women with external endometriosis...............................125

QUESTIONS OF PHARMACY

Belikov V. G., Larsky M. V.

Photometric method for determination of y-amino-P-

phenylbutyric acid in saliphen substance................

.....................................................130

Lapochkin O.V., Pogorely V.E., Vergeichik E.N. Synthesis of vanadyl complex compounds with amino acids and investigation of their effects at glucose level

in experimental alloxan diabetes........................

.....................................................135

Stepanova E.F., Saenko A. Yu., Petrov A. Yu.,

Kool' I.Ya.

The development of technology and standardization of suppositories with Drotaverine hydrochloride and Paracetamol........................................140

Экспериментальная биология и медицина УДК 616.916.5.616.5

МИКРОБИОТА ПРИСТЕНОЧНОГО МУЦИНА И ЕЕ МОДИФИКАЦИЯ ПРОБИОТИКАМИ

© Корнеев М.Л., Миронов А.Ю., Селезнев А.С., Горохов М.С.

Кафедра микробиологии, вирусологии, иммунологии Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова, Москва

E-mail: microbio@mma.ru

Разработана биологическая модель для изучения микрофлоры пристеночного муцина для коррекции дисбактериозов и понимания механизмов их возникновения. Изучена модификация микробного пейзажа пристеночного муцина вследствие перорального использования колибактерина. Данная модель пригодна для конструирования и апробации новых пробиотических препаратов.

Ключевые слова: лабораторные животные, пробиотики, муцин, желудочно-кишечный тракт.

MICROBIOTA THE PARIETAL MUCIN AND ITS MODIFICATION BY THE PROBIOTICS Kornejev M.L., Mironov A.Yu., Seleznev A.S., Gorokhov M.S.

Microbiology, Virusology, Immunology Department of the I.M. Sechenov Moscow Medical Academy, Moscow The biological model has been developed for studying the microflora of the parietal mucin for correcting the dysbacteriosis and understanding the mechanisms of their occurrence. The modification of the microbial picture due to using Colibacterinum per os has been studied. This model can be used for developing new probiotics.

Key words: laboratory animals, probiotics, mucin, gastrointestinal tract.

В толстом кишечнике количество бактериальных клеток превышает количество клеток организма в 10 раз и составляет >1011 КОЕ/г фекалий. По меткому выражению академика РАМН А.А. Воробьева: "Мы находимся в плену у прокариот". Они участвуют в процессах метаболизма, постнатального развития, иммунного ответа, возникновении воспалительных заболеваний и др. В связи с этим важное значение приобретает микро-биом кишечника (т.е. коллективный геном всех индигенных микробов), который зависит от видового и количественного состава микрофлоры кишечника. Термин "микробиом" предложен нобелевским лауреатом Иошуа Ледербергом, который выдвинул идею, что полная генетическая картина Homo sapiens, как форма жизни, должна включать и гены нашего микробиома [6]. Микробиом кишечника может содержать в 100 и более раз больше генов, чем геном человека, обеспечивая организм различными генетическими и метаболическими факторами, отсутствующими у хозяина [2, 5]. Стабильность микрофлоры кишечника является существенным фактором, поддерживающим постоянство

внутренней среды организма человека. Нарушения видового и количественного состава кишечной микрофлоры ведёт к развитию дисбактериоза, что является одной из актуальных проблем клинической медицины.

Дисбактериозы желудочно-кишечного тракта человека в настоящее время являются одним из распространенных среди населения Российской Федерации клинико-лабораторных синдромов, сопровождающих широкий круг заболеваний и патологических состояний, характеризующихся снижением качества жизни. Несмотря на достаточно большое количество методов диагностики и коррекции дисбактериоза ЖКТ, патогенетические механизмы данной нозологии остаются недостаточно изученными. В частности, не до конца исследованы изменения пристеночной микрофлоры ЖКТ и её роль в развитии дисбактериоза.

Проблема нарушения кишечной микробиоты приобрела особую значимость в связи с ростом хронических заболеваний органов пищеварения, а также широкого применения антибиотиков. Возникновению дисбактериозов кишечника способствует недостаточность

кишечного пищеварения, моторики кишечника, местного иммунитета и т.д.

Спектр существующих препаратов пробиотиков, пребиотиков и синбиотиков, предназначенных для лечения дисбактериозов, охватывающий основные формы микроэко-логических нарушений, не позволяет решить проблему массовой коррекции дисбактериозов. Основными причинами этого являются: ограниченная антагонистическая активность используемых в производстве пробиотических препаратов штаммов микроорганизмов, узкий спектр дисбиотической коррекции этих препаратов, низкая приживляемость пробиотических штаммов в кишечнике.

Целью настоящего исследования явилась разработка биологической модели для изучения влияния колибактерина (одного из широко используемых пробиотиков) на пристеночную микрофлору ЖКТ и установление сроков выведения данного препарата из организма.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование выполнено на крысах линии Вистар. Использованы самки в возрасте от 9 до 12 месяцев массой 260-290 г. Животные по условию эксперимента были разделены на три группы. I группа экспериментальных животных до исследования содержалась в одной клетке на стандартном пищевом рационе и являлась контрольной. II и III группы (опыт) тоже содержались в отдельных клетках, и им при помощи желудочного зонда ин-трагастрально вводили 1 мл суспензии коли-бактерина (производство "Биомед", г. Пермь), содержащий 108 КОЕ Escherichia coli, штамм М-17.

Перед экспериментом для очищения желудка от пищи крысы в течение 2 часов голодали при обеспечении потребности в питьевой воде. Затем вводилась суспензия E. coli или изотонический раствор хлорида натрия. Животные I и II групп в течение суток содержались в отдельных клетках и не получали пищи, III группа содержалась в клетках в течение 3-х суток. После чего осуществляли взятие биологического материала от животных. Крыс выводили из эксперимента с предварительной премедикацией эфиром согласно

правилам гуманного обращения с животными.

Исследовали биоптаты слизистых оболочек желудка, двенадцатиперстной кишки, тощей, подвздошной, слепой и прямой кишки, а также фекалии. Использовались участки ЖКТ, полностью свободные от химуса. Всего было получено 356 образцов.

Микробиологическое исследование пристеночного муцина проводили согласно ранее описанной методике [1, 2, 3]. Видовой состав микрофлоры фекалий определяли по общепринятому методу [3, 5]. Выделяли бифидобактерии, лактобактерии, эшерихии, энтерококки, стафилококки, клостридии и дрожжеподобные грибы рода Candida. Для идентификации использовали диагностические наборы "Энтеротест 24", "Стафитест 24" (Ла-хема, Чехия), API 20 C (BioMeriux, Франция).

Удельное содержание микроорганизмов вычисляли как концентрацию микроба в единице массы биологического материала и выражали в lg КОЕ/г. Концентрация микроорганизмов менее 102 КОЕ/г не учитывалась.

Статистическую обработку данных проводили с использованием методов вариационного и сравнительного анализа [4].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Фекальный микробиоценоз.

Введение колибактерина крысам II группы, приводило к модификации фекального микробиоценоза и появлению E. coli в фекалиях в 100% случаев (p<0,001). Удельное содержание эшерихий составляло 5,05 lg КОЕ/г. Частота встречаемости прочих представителей фекального микробного сообщества у животных II группы оставалась неизменной. Снижалось удельное содержание всех инди-генных микроорганизмов: бифидобактерий

на 25% (p<0,05), лактобактерий на 34% (p<0,01), энтерококков на 27% (p<0,05). Удельное содержание стафилококков, кло-стридий и дрожжеподобных грибов рода Candida не изменялось.

У животных III группы эшерихии обнаруживались в фекалиях в 80% случаев (p<0,001) в концентрации 6,72 lg КОЕ/г. При этом частота встречаемости других видов исследуемых микробов не изменялась, за ис-

Рис. 1. Микрофлора пристеночного муцина и фекалий (%).

ключением дрожжеподобных грибов рода Candida, у которых данный показатель снижался с 100% до 80% (p<0,05). Удельное содержание всех исследуемых компонентов фекального микробиоценоза оставалось без изменений.

У крыс III группы в сравнении со II группой вводимый микроб в фекалиях обнаруживался на 40% реже. При этом в III группе крыс изменения в составе фекального микробного сообщества были минимальны и касались лишь снижения частоты встречаемости дрожжеподобных грибов рода Candida. У крыс II группы существенно снижалось удельное содержание всех изучаемых инди-генных бактерий.

Пристеночный микробиоценоз.

Влияние колибактерина на пристеночную микрофлору ЖКТ крыс при пероральном введении показано на рис. 1.

Поступление эшерихий в ЖКТ крыс II группы приводило к их появлению в пристеночном муцине желудка и двенадцатиперстной кишки в 82,4% случаев (p<0,001), концентрация составляла 3,0-3,9 lg КОЕ/г. У крыс III группы эшерихии в этих биотопах

обнаруживались в 60,0% случаев (р<0,01) в концентрации 2,4-2,6 1§ КОЕ/г. Видовой и количественный состав прочих представителей микробного сообщества пристеночного муцина желудка и двенадцатиперстной кишки не менялся.

В пристеночном муцине тощей кишки крыс II группы вводимый микроб выявлялся в 85% случаев (р<0,01) в концентрации 3,8 1§ КОЕ/г, при этом из биотопа исчезали бифидобактерии и энтерококки. У крыс III группы в пристеночном муцине тощей кишки эшерихии обнаруживались в 60,0% случаев (р<0,05) в концентрации 4,0 1§ КОЕ/г. В данном биотопе повышалась частота встречаемости бифидобактерий в 13,8 раза (р<0,01), лактобактерий в 4,8 раза, энтерококков на 80%.

В пристеночном муцине подвздошной кишки у крыс II группы вводимый микроб встречался в 85,5% случаев в концентрации 4,2 1§ КОЕ/г. Снижалась частота встречаемости бифидобактерий с 35,0 до 0%, эшерихий на 38,0%, энтерококков на 48% (р<0,05).Частота встречаемости и удельное содержание выделяемых микроорганизмов не изменилась.

У крыс, входящих в III группу, эшерихии из пристеночного муцина подвздошной кишки выделены всего в 50% случаев (р<0,05) в концентрации 4,53 lg КОЕ/г.

Частота встречаемости индигенных микроорганизмов в этом биотопе в III группе животных претерпевала незначительные изменения: у бифидобактерий и лактобактерий этот показатель увеличивался на 30-50%, а у энтерококков снижался на 55-60%. Помимо этого, здесь увеличивалась частота встречаемости дрожжеподобных грибов рода Candida в 5,8 раза (р<0,05) и снижалась у грамполо-жительных споровых палочек рода Clostridium с 18% до 0. Частота встречаемости стафилококков не изменялась.

У крыс III группы повышалось удельное содержание бифидобактерий на 25%, лактобактерий на 14%, энтерококков на 35% (р<0,05). Удельное содержание стафилококков, клостридий и дрожжеподобных грибов рода Candida не менялось.

В пристеночном муцине тонкой кишки крыс II группы вводимый микроб выявился в 69,27% случаев (р<0,001) в концентрации 1,85 lg КОЕ/г. При этом в микробиоценозе пристеночного муцина тонкой кишки отмечалось снижение частоты встречаемости бифидобактерий (с 15,4% до 0), энтерококков (на 68%; р<0,001). Введение колибактерина не влияло на удельное содержание обнаруженных микробов.

У крыс III группы вводимый микроб выделялся из пристеночного муцина тонкой кишки в 61,2% случаев в концентрации 4,12 lg КОЕ/г. В этом биотопе незначительно увеличивалась частота встречаемости бифидобактерий (в 1,8 раза), лактобактерий (в 2,5 раза), а частота встречаемости клостридий снижалась с 18,8% до 0 (р<0,05). Кроме того, повышалось удельное содержание бифидобактерий на 19% (р<0,05), лактобактерий на 20,0% (р<0,05) и энтерококков на 19% (р<0,05).

Из пристеночного муцина слепой кишки крыс II группы эшерихии выделялись в 100% случаев (р<0,001) в концентрации 4,07 lg КОЕ/г. Частота встречаемости большинства видов индигенных микроорганизмов резко падала: бифидобактерий на 66% (р<0,01), энтерококков на 50% (р<0,05). Снижалось удельное содержание лактобактерий на 39%

(р<0,05), энтерококков на 15%. Частота встречаемости и удельное содержание других видов исследуемых микробов не изменялась.

У крыс III группы эшерихии обнаруживались в пристеночном муцине слепой кишки в 70% случаев (р<0,001) в концентрации 4,1 lg КОЕ/г. В этой группе животных частота встречаемости микроорганизмов, выделяемых из пристеночного муцина слепой кишки, не изменялась, за исключением стафилококков, у которых этот показатель возрастал с 0 до 30%. Повышалось удельное содержание бифидобактерий на 33% (р<0,01), лактобактерий на 16% (р<0,05), кроме того, в пристеночном муцине слепой кишки увеличивалось удельное содержание дрожжеподобных грибов рода Candida на 15% (р<0,05).

В пристеночном муцине прямой кишки крыс II группы вводимый микроб появлялся в 100% случаев, его концентрация составила 6,Q lg КОЕ/г. В этой группе животных в пристеночном муцине прямой кишки незначительно снижалась частота встречаемости большинства индигенных бактерий: бифидобактерий на 53%, энтерококков на 47%. Снижалось и их удельное содержание: бифидобактерий на 60% (р<0,05), энтерококков на 41% (р<0,05).

В пристеночном муцине прямой кишки III группы экспериментальных животных эше-рихии обнаруживались всего в 50,0% случаев в концентрации 4,8 lg КОЕ/г. Это сопровождалось небольшим снижением частоты встречаемости лактобактерий на 51%, энтерококков на 68% и повышением удельного содержания энтерококков на 45% (р<0,01).

В пристеночном муцине толстой кишки крыс II группы эшерихии появлялись в 100% случаев (р<0,001) в концентрации 4,0 lg КОЕ/г. При этом снижалась частота встречаемости бифидобактерий на 66% (р<0,001), энтерококков на 60% (р<0,001). Также падало их удельное содержание: бифидобактерий на 36%, лактобактерий на 33% (р<0,01), энтерококков на 37% (р<0,05).

У крыс III группы вводимый микроб адге-зировался к пристеночному муцину и колонизировал толстую кишку всего в 60% случаев, а его концентрация составляла 5,5 lg КОЕ/г. В этой группе животных частота встречаемости исследуемых видов микробов практически не изменялась. Однако здесь ре-

гистрировалось повышение удельного содержания некоторых видов микроорганизмов: бифидобактерий на 39% (р<0,001), лактобактерий на 31% (р<0,01), энтерококков на 30% (р<0,05) и дрожжеподобных грибов рода Candida 14% (р<0,05).

В целом введение эшерихий крысам II группы приводило к появлению этого микроба во всех отделах ЖКТ. Причём в тощей и подвздошной кишке частота встречаемости эшерихий была минимальна (65%), а в слепой, прямой кишке и в фекалиях максимальна и составляла 100%. Удельное содержание этих бактерий в желудке и тонкой кишке было около 4 lg КОЕ/г, в слепой и прямой около 6 lg КОЕ/г. Появление эшерихий в ЖКТ крысы существенно влияло на частоту встречаемости и удельное содержание индигенной микрофлоры этого биотопа. Так, после введения эшерихий значительно снижалась частота встречаемости бифидобактерий в пристеночном муцине всех отделов кишечника, но особенно заметно в пристеночном муцине слепой кишки. В данном биотопе этот показатель снижался со 100% до 15,3%. Удельное содержание бифидобактерий также существенно снижалось. Частота встречаемости лактобактерий оставалась неизменной, но снижалось их удельное содержание в слепой кишке. Энтерококки также встречались реже, чем до введения колибактерина. Максимальное падение частоты встречаемости энтерококков регистрировалось в подвздошной и слепой кишке, кроме того, в прямой кишке снижалось их удельное содержание. Частота встречаемости и удельное содержание дрожжеподобных грибов рода Candida, стафилококков и клостридий оставались неизменными.

У крыс II и III групп введение колибакте-рина вело к появлению этих микробов в пристеночном муцине всех отделов ЖКТ. Минимальные показатели частоты обнаружения эшерихий регистрировались в тощей и подвздошной кишке (всего 50-60%), а максимальные в желудке, двенадцатиперстной и слепой кишке (70%). Удельное содержание этих бактерий в тонкой кишке было 4,0-4,5 lg КОЕ/г, в слепой 6 lg КОЕ/г. В группе редко встречающихся видов микробов обращает на себя внимание повышение частоты встречаемости дрожжеподобных грибов рода Candida

в подвздошной кишке и её удельное содержание в слепой кишке. Частота встречаемости и удельное содержание стафилококков и клостридий практически не изменялись.

Сравнение эффектов, вызываемых введением колибактерина, показало, что эшерихии способны адгезироваться к пристеночному муцину всех отделов ЖКТ крысы независимо от исходного состояния микробиоценоза. При этом удельное содержание вводимого микроба одинаково как при эубиозе, так и при дисбиотических нарушениях. Следует отметить, что в тощей и подвздошной кишке наблюдается снижение частоты встречаемости эшерихий. Вероятно, на этом участке ЖКТ существуют механизмы препятствующие прикреплению и персистенции данного микроба. Представители индигенной микрофлоры пристеночного муцина кишки на введение колибактерина реагировали прямо противоположно. Во II группе бифидобактерии, энтерококки практически исчезали из пристеночного муцина (частота их встречаемости составляет всего 15,5-40,5%). В III группе частота их обнаружения и удельное содержание не изменялась, а в некоторых случаях даже увеличивалась.

Видовые и количественные показатели содержания стафилококков и клостридий оставались неизменными. В III группе отмечалось небольшое увеличение частоты встречаемости дрожжеподобных грибов рода Candida в подвздошной кишке и её удельного содержания в слепой, хотя в фекалиях эти показатели снижаются. По-видимому, в фекалиях после приёма колибактерина создаются менее благоприятные условия для роста грибов, которые не выдерживают антагонистического действия E. coli, в то время как в пристеночной области эти условия улучшаются.

Таким образом, введение колибактерина является мощным модифицирующим фактором, влияющим на микробный состав как пристеночной, так и просветной микрофлоры. Характер изменений, наблюдающийся в микробном составе кишечного микробиоценоза, во многом зависит от исходного состава модифицируемого микробного сообщества.

На основании проведенного исследования можно сделать следующие выводы.

1. Пероральное введение пробиотика меняет видовой и количественный состав при-