ШТАММ БАКТЕРИЙ Bacillus licheniformis, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОБИОТИЧЕСКОЙ КОРМОВОЙ ДОБАВКИ, ПРЕДНАЗНАЧЕННОЙ ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ВЫСОКОКАЧЕСТВЕННЫХ КОРМОВ, ПОВЫШАЮЩИХ ПРОДУКТИВНОСТЬ И СНИЖАЮЩИХ РИСК ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ЖИВОТНЫХ, ПТИЦЫ И РЫБ
Bacillus licheniformis BACTERIA STRAIN USED FOR MAKING PROBIOTIC SUPPLEMENT FEED USED FOR PRODUCING HIGH-QUALITY FODDER IMPROVING PERFORMANCE AND REDUCING RISK OF GASTROINTESTINAL DISTURBANCES IN ANIMALS, BIRDS AND FISHES

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в микробиологической промышленности для получения пробиотической кормовой добавки, предназначенной для производства высококачественных кормов, повышающих продуктивность и снижающих риск желудочно-кишечных заболеваний животных, птицы и рыб.
Известен штамм бактерий Bacillus licheniformis № 31 (Институт микробиологии и вирусологии им. академика Д.З.Заболотного НАН Украины), используемый в качестве одного из компонентов препарата биоспорин, предназначенного для лечения гнойно-септических заболеваний (SU 1722502, 30.03.1992).
Известен штамм бактерий Bacillus licheniformis ВКПМ В-7038, используемый в качестве компонента кормовой добавки, обладающего широким спектром антивирусной и антибактериальной активности (RU 2142287, 10.12.1999).
Однако недостатком данного штамма можно считать особенности проявления его активности в составе комплексной бактериальной кормовой добавки, поскольку из-за наличия рекомбинантных свойств его применение в комбикормовом производстве требует получения специальных разрешений.
Известен штамм Bacillus licheniformis ВКМ В-2252Д, предназначенный для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний животных, птицы, рыб (RU 2203947, 10.05.2003). Однако этот штамм не имеет достаточной активности, что ограничивает его применение в качестве компонента кормовой добавки.
Задачей изобретения является выделение нового штамма Bacillus licheniformis, обладающего антибактериальной активностью по отношению к широкому спектру Гр+ и Гр- микроорганизмов, продуцирующего антибиотические вещества широкого спектра действия, для использования его в качестве компонента пробиотической кормовой добавки.
Технический результат, достигаемый при реализации изобретения, заключается в повышении продуктивности и снижении риска желудочно-кишечных заболеваний животных, птицы, рыб.
Указанный технический результат достигается в штамме бактерий Bacillus licheniformis ВКМ В-2414Д, используемом для получения компонента пробиотической кормовой добавки, предназначенной для производства высококачественных кормов, повышающих продуктивность и снижающих риск желудочно-кишечных заболеваний животных, птицы и рыб.
Штамм бактерий Bacillus licheniformis BL-03 депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ им. К.С.Скрябина РАН, рег. номер ВКМ В-2414Д.
Штамм получен из природного изолята (почва). Подвергался селекции на подавление роста патогенных штаммов: стафилококка, синегнойной палочки, сальмонелл, трихофитов, протея, эпидермисов, кандидамикозов и др.
Культурально-морфологические и биохимические свойства штамма Bacillus licheniformis ВКМ В-2414Д.
Грамположительная палочка, способная образовывать споры. Размеры вегетативных клеток 3-5 мкм. Споры одиночные, центральные или овальные, подвижные. Жгутикование - перитрих.
Вегетативные клетки Bacillus licheniformis ВКМ В-2414Д хорошо растут на богатых питательных средах - мясопептонный агар (МПА), мясопептонный бульон (МПБ) и полужидкий агар (ПЖА) при температурах 50°С, рН 5,0-8,0. На МПА образует колонии белого цвета. Пигмент в среду не выделяет. Наблюдается рост до 8% NaCl.
Гидролизует глюкозу, мальтозу, сахарозу, оксидазо- и каталазоположителен.
Не сбраживаемые соединения углерода: лактоза, маннит, сахароза.
Утилизирует ацетат и цитрат при аэробном выращивании.
Штамм нетоксичен для животных, человека и растений.
Штамм Bacillus licheniformis ВКМ В-2414Д продуцирует антибиотик широкого спектра действия, подавляющий стафилококки, грибки и синегнойную палочку.
Характеризуется показателями задержки роста тест-культуры, мм (метод перпендикулярных штрихов), представленными в Таблице.
Для культивирования штамма Bacillus licheniformis ВКМ В-2414Д используют жидкую питательную среду на основе 0,3% ферментативных гидролизатов мышц сухого (ФГМС), рН 6,0, содержащую 0,2% глюкозу (по сухому веществу), 0,005% аминопептид или 0,02% сыворотку крови.
Сухую биомассу микроорганизмов предварительно высевают в пробирку с МПБ. При появлении видимого роста колонии пересевают на мясо пептонный агар в пробирки.
Отбирают типичные колонии и пересевают их на жидкую среду М во флаконах. Через сутки выросшую биомассу переносят в 15-литровую бутыль с 9-ю литрами питательной среды и культивируют 22 часа при 37-40°С, получая посевной материал.
Питательную среду на основе ФГМС помещают в биореактор, стерилизуют, охлаждают и засевают полученным материалом. Проводят аэробное культивирование при рН 6,8-7,2 с поддержкой 40% раствором глюкозы.
При достижении концентрации 20 млрд. бактериальных клеток прекращают подачу глюкозы и отключают подачу воздуха при достижении рН 4,6. Полученную культуральную жидкость с биомассой охлаждают до 20°С, перекачивают в емкости или расфасовывают во флаконы.
При указанном способе культивирования получают штамм для компонента кормовой добавки, названной «Проваген», с содержанием 85-90% спор бактерий Bacillus licheniformis ВКМ В-2414Д.
Кормовая добавка с компонентом на основе предлагаемого штамма безвредна и не содержит посторонней микрофлоры. Безвредность проверена на белых мышах массой тела 18-20 г и на годовиках карпах, которым перорально вводили 1,0 мл кормовой добавки.
Пробиотическая активность кормовой добавки «Проваген» в одной дозе (10-12) млрд. клеток/мл.
Предлагаемый штамм Bacillus licheniformis ВКМ В-2414Д может быть использован как производственный в качестве компонента кормовой добавки пробиотического действия, рекомендуемой для получения высококачественных кормов, повышающих продуктивность и снижающих риск желудочно-кишечных заболеваний животных, птицы и рыб.
Изобретение поясняется примерами.
Пример 1. Бактериальная геморрагическая септицемия карпа.
В прудовом хозяйстве заболела рыба с клиническими признаками (краснухи) бактериальной геморрагической септицемии. Лабораторный анализ патматериала показал наличие патогенной микрофлоры во внутренних органах рыб. Количество больных рыб (двухлетки карпа) достигало 25% от общего количества. Назначено лечение с добавлением в корм путем его смачивания 3,0 млн. микробных клеток (спор) «Провагена» на 1 кг живой массы тела рыбы. Корм с «Провагеном» давали рыбе 1 раз в день в течение 7 дней. Через 14 дней после окончания курса лечения установлено, что количество больных рыб уменьшилось до 9%, а признаки острого воспаления остались лишь у отдельных экземпляров.
Пример 2. Сохранность цыплят.
Проведены производственные испытания «Провагена» на сохранность цыплят в первые две недели после их посадки. «Проваген» применялся перорально в жидком виде путем выпаивания с 5% раствором глюкозы и в лиофильно высушенном виде путем добавления в корм. Отход цыплят контрольной группы составил 3,8%. Усредненный отход в опытных группах при введении в корм сухого «Провагена» - 2,1%, при выпаивании жидкого «Провагена» - 0,5%. В опытных группах цыплята более интенсивно набирали вес: после первых трех дней для контрольной группы средний вес составил 57 г, для опытной - 71 г.
Пример 3. Сохранность поросят.
В хозяйстве наблюдался значительный отход поросят в связи с заболеваниями желудочно-кишечного тракта (ЖКТ). Проведенные микробиологические и патологоанатомические исследования выявили несколько видов заболеваний ЖКТ поросят бактериальной этиологии. Назначен курс лечения: применение «Провагена» перорально сразу после рождения из расчета 1 доза на 3-х поросят на 8% глюкозе в течение 5 дней. Курс профилактики: применение «Провагена» внутрь из расчета 1 доза на 10 новорожденных поросят на 8% глюкозе в течение 3-х дней. Сохранность поросят поднялась на 65% и достигла стабилизации на уровне 95%, который поддерживается на этом уровне профилактикой.
Проведенные исследования показали эффективность кормовой добавки «Проваген» с компонентом на основе предложенного штамма Bacillus licheniformis BКM В-2414Д.
Спектр антагонистической активности штамма Bacillus licheniformis BКM В-2414Д.
Таблица
Тест культуры
Зоны задержки роста, мм
Staphylococcus aureus
30-35
Pseudomonas aeragenose
15-16
Salmonella typhimarium
28-33
S.stenly
20-25
S.derby
20-24
Klebsiella pneumoniae
14-18
Proteus vulgaris
18-22
Candida albicans
31-35
C.tropicalis
28-31
Shigella sonnei
25-29