Способ детекции ионов меди в окружающей среде и биосенсор для его осуществления
METHOD FOR DETECTION OF COPPER IONS IN THE ENVIRONMENT AND BIOSENSOR FOR ITS IMPLEMENTATION

Область техники
Изобретение относится к области охраны окружающей среды, а именно к способам и устройствам для экспресс-анализа проб на наличие ионов меди, а также к биосенсорам на базе микрожидкостных систем, проводящих химикобиологическую детекцию с использованием малых объемов жидких реагентов и бактериальных клеток, выступающих как биоселективный элемент биосенсора.
Уровень техники
Известны способы определения загрязнителей в окружающей среде химическими методами [Лурье Ю.Ю. Аналитическая химия промышленных сточных вод. М.: Химия, 1984. 448 с.; Практикум по агрохимии / Под ред. В.Г. Минеева. М.: Изд-во МГУ, 2001. 689 с.]. Данные методы основаны на определении загрязнителей в среде с помощью спектрофотомерии, атомно-абсорбциононной спектрофотомерии, высокоразрешающей хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием и др. Недостатком данных методов является необходимость использования дорогостоящей аппаратуры, а также сложность проведения анализа в полевых условиях.
Известен способ, где [Патент US №6329160, 12.11.2001] предлагается в качестве основы биосенсора использовать клетки генномодифицированной бактерии E. coli, содержащей luxCDABE-гены, находящиеся под контролем регуляторных элементов оперона/гена деградации толуола. При этом по изменению интенсивности свечения клеток бактерий в биосенсоре возможна оценка концентрации в среде бензола, толуола, ксилола. С помощью соответствующих генетических конструкций в генномодифицированных клетках бактерий предлагается измерять концентрацию в среде взрывчатых веществ [Патент US №5972638, 26.10.1999], органических и неорганических соединений мышьяка [Патент ЕР №1367134, 12.03.2003], детергентов [Патент РФ №2355760, 20.05.2009], гептила [Патент РФ №2297450, 20.04.2007] и ионов тяжелых металлов [Патент US №8697388, МПК C12Q 1/02; G01N 33/20, опубл. 15.04.2014]. Последний взят нами за прототип для способа. Предложен состав биосенсоров, содержащих бактериальные клетки, и способы обнаружения некоторых тяжелых металлов.
Биосенсоры на основе генетически модифицированных бактериальных клеток Caulobacter crescentus, содержащих ген, кодирующий репортерный белок (зеленый флуоресцентный белок (GFP). Данный ген экспрессируется в присутствии ионов тяжелых металлов.
Недостатком способа прототипа является трудоемкость и продолжительность процесса, при этом гибель клеток из-за присутствия токсичных веществ может вызывать ошибку измерения концентрации тяжелых металлов в растворе.
Задача, на решение которой направлена группа изобретений, заключается в разработке биосенсора, состоящего из генномодифицированных клеток бактерий и микрожидкостного устройства как платформы, на которой осуществляется процесс детекции, а также расширение арсенала средств для определения ионов меди в окружающей среде.
Поставленная задача решается с помощью предлагаемого в п. 1 формулы изобретения биосенсор для детекции ионов меди в анализируемой жидкой среде, который включает корпус (1) из прозрачного материала, такого как пластмасса или стекло, или полидиметилсилоксан, с микроканалами (2) для анализируемой жидкой среды, причем внутри микроканалов выполнены ловушки, представляющие собой заграждение в виде ряда микропилларов (3), в которых иммобилизованы агарозные сферы (5), содержащие генномодифицированные клетки бактерий Escherichia coli BL21 DE3 pClcRFP, представляющие собой биоселективный элемент, способный к синтезу флуоресцентного белка RFP.
Особенности выполнения биосенсора нашли отражение в пунктах 2-3 формулы изобретения, а именно: Биосенсор включает три микроканала с 10 ловушками в каждом, а ряд микропилларов (4) выполнен в форме подковы.
Поставленная задача решается с помощью признаков, указанных в пункте 4 формулы изобретения, общих с прототипом, таких как способ детекции ионов меди в анализируемой жидкой среде с помощью биосенсора по пп. 1-3, характеризующийся тем, что клетки бактерий Escherichia coli BL21 DE3 pClcRFP иммобилизуют в агарозные сферы с диаметром от 50 до 70 мкм, помещают их в ловушки биосенсора, осуществляют подачу анализируемой жидкой среды в биосенсор, измеряют свечение агарозных сфер с помощью флуоресцентного микроскопа с камерой или флуориметра, после чего полученные в анализируемой жидкой среде результаты обрабатывают и сравнивают с контрольными, при этом контрольными считают результаты флуоресцентного свечения агарозных сфер в ловушках до заполнения их анализируемой жидкой среды для детекции.
Поставленная задача решается согласно п. 5 формулы изобретения, а именно с помощью штамма бактерий Escherichia coli BL21 DE3 pClcRFP, представляющего собой биоселективный элемент для детекции ионов меди.
5
Преимуществом предлагаемого способа детекции является использование вновь созданного компактного, миниатюрного биосенсора, содержащего внутри генномодифицированные клетки бактерий; снижение объема анализируемой жидкой среды (до 1 микролитра), который требуется для введения в устройство (на 1 ловушку микрожидкостного чипа необходимо до 40 нанолитров); уменьшение количества генномодифицированных клеток бактерий (до 3×10), необходимых для анализа одной пробы; снижение времени детекции до 10 минут.
Технический результат, который может быть получен при использовании предлагаемой группы изобретений, заключается в том, что детекция, проводимая на биосенсоре, позволяет обнаружить наличие ионов меди в среде и оценить степень загрязненности среды с использованием малого объема пробы, вводимой в биосенсор, и малого количества генномодифицированных клеток бактерий, необходимых для детекции одной пробы. Различия в объеме пробы и количестве генномодифицированных клеток бактерий, используемых для работы биосенсора, между предлагаемым изобретением и ранее созданными аналогами, в т.ч. прототипом, составляют до 10 и более раз.
Изобретение иллюстрируется следующими чертежами.
На фиг. 1 представлен эскиз общего вида корпуса биосенсора (позиция 1) с тремя микроканалами (позиция 2) по 10 ловушек в каждом микроканале (позиция 3).
На фиг. 2 представлен увеличенный эскиз одной ловушки биосенсора, выполненной в виде микропилларов (позиция 4) диаметром 40 мкм расположенных в форме подковы с расстоянием менее 40 мкм между микропилларами таким образом, что общий объем одной ловушки не превышает 40 нл. В центре ловушки размещены агарозные сферы с клетками бактерий (позиция 5).
На фиг. 3 представлена фотография оптического изображения одной ловушки биосенсора с агарозными сферами, содержащими генномодифицированные клетки бактерий (позиция 4).
На фиг. 4 представлена фотография флуоресцентного изображения ловушки биосенсора в начальный момент детекции и спустя 10 минут.
На фиг. 5 представлен график зависимости ответа биосенсора на основе клеток бактерий Escherichia coli BL21 DE3 pClcRFP от содержания ионов меди в пробе.
Осуществление изобретения
Биосенсор (фиг. 1) выполнен в виде микрожидкостного устройства, содержащего корпус 1 из прозрачного материала с микроканалами (2) для анализируемой жидкой среды, внутри которых выполнены ловушки (3) для агарозных сфер (5) (фиг. 2 и 3), содержащих генномодифицированные клетки бактерий Escherichia coli BL21 DE3 pClcRFP (биоселективный элемент) (фиг. 3), способные к синтезу флуоресцентного белка.
Корпус (1) выполнен из пластмассы или стекла, или полидиметилсилоксана.
Корпус биосенсора выполнен с тремя микроканалами (позиция 2 фиг. 1) по 10 ловушек в каждом.
Ловушки представляют собой заграждение в виде ряда микропилларов (5) в форме подковы.
Иммобилизованные агарозные сферы (5) используют диаметром от 50 до 70 мкм. Как для способа, так и для биосенсора, в качестве биоселективного элемента для детекции ионов меди, используют штамм бактерий Escherichia coli BL21 DE3 pClcRFP.
Осуществление группы изобретений заключается в том, что для детекции загрязненности среды используют оптически прозрачный корпус биосенсора с микроканалами, по которым подается анализируемая жидкая среда. Внутри микроканалов имеются специально сконструированные ловушки для агарозных сфер диаметром от 50 до 70 мкм. Агарозные сферы содержат в себе генетически модифицированные клетки бактерий (биоселективный элемент), способные к синтезу флуоресцентного белка. При взаимодействии клеток бактерий, заключенных в агарозные сферы, с анализируемой жидкой средой происходит изменение интенсивности флуоресцентного свечения.
lac
Пример 1. В качестве примера использованы генномодифицированные клетки Escherichia coli BL21 DE3 pClcRFP, несущие в геноме репортерное clc::rfp-слияние, способные к продукции флуоресцентного белка RFP (длина волны света возбуждения флуоресценции - 585; длина регистрируемой волны - 610) для определения в среде ионов меди. Синтез RFP белка в клетках Е. coli BL21 DE3 («Stratagen», США), трансформированных плазмидой pClcRFP, созданной на основе вектора pGEM-T («Promega», США), происходит в результате ИПТГ-зависимой активации транскрипции с T7-промотора. Под этот промотор, лежащий перед полилинкерным участком плазмиды pGEM-T, введено трансляционное слияние промоторной области clc-оперона с беспромоторным геном красного флуоресцентного белка RFP. При периодическом культивировании клеток Е. coli BL21 DE3 pClcRFP в экспоненциальной фазе в культуру вводится неметаболизируемый аналог лактозы ИНН, что приводит к наработке ClcA::Rfp-гибридного белка и накоплению его в цитоплазме. Затем бактериальные клетки включают в состав агарозных сфер и помещают в ловушку микрофлюидного чипа, где RFP белок уже и подвергается воздействию ионов меди, что приводит к детектируемому изменению его флуоресценции.
9
Пример 2. Для определения ионов меди в анализируемой жидкой среде культуру клеток Е. coli BL21 DE3 pClcRFP выращивали с единичной колонии на среде LB в присутствии 100 мкг/мл ампициллина в течение 18 часов при 37°C с аэрацией на термошейкере при 100 об/мин. Рост культуры оценивали на спектрофотометре UV-Visible BioSpec-mini («Shimadzu», Япония), определяя оптическую плотность при длине волны 600 нм в кюветах с длиной оптического пути 1,0 см. Оптическая плотность культуры составляла 1,5 о.е. (около 4×10 клеток бактерий на 1 мл среды).
11
В дальнейшем культуру клеток отмывали дважды физиологическим раствором. Полученный клеточный осадок ресуспендировали в 1 мл физиологического раствора. Конечная оптическая плотность клеточной суспензии составляла около 150 о.е. (около 4×10 клеток бактерий на 1 мл среды).
Затем проводили инкапсуляцию полученной суспензии репортерных клеток в агарозные сферы с последующим их фракционированием до размера 50-70 мкм.
Штамм Escherichia coli BL21 DE3 pClcRFP отличается следующими признаками: Грамотрицательные палочки. Перитрихи. Колонии на питательном агаре правильной округлой формы с ровными краями, плоские, полупрозрачные, бело-серого цвета, при длительном культивировании слегка красноватые, консистенция мягкая. Выделяемый в среду пигмент отсутствует. Факультативный анаэроб. Клетки способны расти как на полноценных питательных средах (Luria-Bertani, мясо-пептонный бульон), так и на синтетических (среда М-9 с глюкозой, лактозой, ацетатом, сукцинатом и другими сахарами или короткоцепочечными органическими кислотами в качестве единственного источника углерода и энергии). Устойчивы к ампициллину вследствие наличия в плазмиде гена bla. Является коммерческим штаммом BL21 DE3, трансформированным рекомбинантной плазмидной ДНК pClcRFP. Трансформация штамма Е. coli BL21 DE3 («Stratagen», США) плазмидой pClcRFP, полученной на основе плазмиды pGEM-T («Promega», США), в которую был клонирован участок clc-оперона Rhodococcus opacus 1СР, слитый с геном красного флуоресцентного белка rfp. Хранение на скошенном LB-агаре под вазелиновым маслом - до полугода, в столбиках полужидкого агара - до года. Необходимы периодические пересевы. Возможно замораживание на -70°C в 10-20% растворе глицерина.
Пример 3. Инкапсулирование бактерий
1. В микроцентрифужную пробирку (объемом 10 мл) добавляли при непрерывном перемешивании на приборе Vortex V-1 plus («BioSan», Латвия) 200 мкл бактериальной культуры, 30 мкл 10% плурониковой кислоты («Sigma», США), 1 мл 2% TopVision агарозы, («Thermo Scientific)), США) температура, которой не превышала 39-40°C.
2. Полученную суспензию замешивали 1-2 минуты в однокомпонентном масле вязкостью 60-110 мПа×с, капая по 10-20 мкл суспензии.
3. Пробирку помещали в водно-ледяную баню на 5 минут.
4. Образовавшиеся агарозные сферы собирали центрифугированием 2200 об/мин 10 минут, с последующей промывкой физиологическим раствором.
Фракционирование полученного материала осуществляли с помощью фильтрования через нейлоновые фильтры с размерами пор 70 и 50 мкм («BD Falcon», США).
Готовые агарозные сферы с бактериальными клетками были иммобилизованы в ловушки биосенсора следующим образом.
1. Шприц заправляли физиологическим раствором, содержащим агарозные сферы.
2. Шприц устанавливали в систему дозирования TS-1B/W0109-1B («Baoding Longer Presion Pump Co., Ltd», Китай) и соединяли при помощи тефлоновой трубки (внутренний диаметр 100 мкм) с биосенсором.
3. Биосенсор помещали под микроскоп для визуального контроля заполнения агарозными сферами ловушек.
4. Устанавливали расход жидкости на системе дозирования TS-1B/W0109-1B в 1,5 мкл/мин.
5. Отслеживали заполнение сферами ловушек биосенсора.
Устройство работает следующим образом.
1. В микроканалы (2) биосенсора подают анализируемую жидкую среду на выявление наличия ионов меди.
2. Измеряют свечение агарозных сфер (5) в ловушках (3) микрожидкостного чипа (1), содержащих генномодифицированные клетки бактерий. Для измерения свечения используют флуоресцентный микроскоп с камерой или флуориметр.
3. Полученные результаты в исследуемых образцах обрабатывают и сравниваются с контрольными. Контрольным считается флуоресцентное свечение агарозных сфер в ловушках биосенсора до заполнения анализируемой жидкой средой.
4
На фиг. 5 представлены зависимости ответа биосенсора на основе клеток бактерий Е. coli BL21 DE3 pClcRFP от содержания ионов меди в пробе. Флуоресценцию измеряли с помощью микроскопа Nikon LV100D («Nikon», Япония). Изображение фиксировали при помощи видео/фотокамеры DS-Fil Nikon, интегрированной с микроскопом, до внесения растворов CuSO и через 10 мин. Расчет флуоресценции проводили с использованием программного обеспечения NIS-Elements BS («Nikon», Япония), яркость флуоресценции сфер с клетками бактерий выражали в условных единицах свечения (УЕС).
Для оценки жизнеспособности бактериальных клеток в агарозных сферах использован набор красителей Live/Dead BacLight Bacterial Viability kit («Invitrogen», США). Известно, что токсическое действие ионов меди обусловлено, прежде всего, образованием связи с SH-группами аминокислотных остатков белков [Лужников Е.А., Костомарова Л.Г. Острые отравления. М.: Медицина, 1989. 419 с.; Maksymiec W. Effect of copper on cellular processes in higher plants // Photosynthetica, 1997, V. 34, P. 132-342]. В результате этого происходит изменение конформации белков и потеря выполняемой ими функции, в частности, происходит снижение флуоресценции RFP белка, продуцируемого бактериями Е. coli BL21 DE3 pClcRFP. Ответ на наличие тяжелых металлов (в том числе и меди) в среде, демонстрируемый биосенсором, предложенным ранее [Патент US №8697388, 15.04.2014], основан на индукции ионами тяжелых металлов синтеза в клетках генномодифицированной бактерии Caulobacter crescentus зеленого флуоресцирующего белка (GFP) и на измерении свечения клеток. В данном случае гибель клеток из-за присутствия токсичных веществ в растворе будет снижать свечение клеточной культуры, что будет вызывать ошибку в измерении концентрации ионов тяжелых металлов. Так как ответ биосенсора, предлагаемого в данной заявке, основан на действии ионов меди на белок RFP, нахождение клеток бактерий Е. coli BL21 DE3 pClcRFP в жизнеспособном состоянии для работы биосенсора не является необходимым условием. Например, введение в чип 75% этанола вызывало гибель около 90% клеток, но не снижало их флуоресценцию (данные не представлены).
Таким образом, наличие токсичных веществ в анализируемой жидкой среде не оказывает влияния на работу биосенсора на основе клеток бактерий Е. coli BL21 DE3 pClcRFP, в отличие от биосенсоров, предложенных в прототипе. Кроме того, время ответа ранее разработанного биосенсора [Патент US №8697388, 15.04.2014] составляет от 2 часов и более, а время ответа предлагаемого биосенсора на основе клеток бактерий Е. coli BL21 DE3 pClcRFP составляет 10 минут.
Изобретение создано в результате работ, выполненных по проекту в рамках реализации ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014-2020 годы», соглашение №14.574.21.0028 от 17.06.2014 (уникальный идентификатор RFMEFI57414X0028).