СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЦЕЛЕСООБРАЗНОСТИ ПРОВЕДЕНИЯ ИММУНОЛОГИЧЕСКОГО ОБСЛЕДОВАНИЯ У ПАЦИЕНТОВ НЕАЛКОГОЛЬНОЙ ЖИРОВОЙ БОЛЕЗНЬЮ ПЕЧЕНИ
METHOD FOR DETERMINATION OF FEASIBILITY OF IMMUNOLOGICAL STUDY IN PATIENTS WITH NONALCOHOLIC FATTY LIVER DISEASE

Изобретение относится к области медицины, а именно гепатологии и клинической лабораторной диагностике, и может использоваться для определения целесообразности проведения иммунологического обследования у пациентов неалкогольной жировой болезнью печени (НАЖБП).
В последнее время возрос интерес к проблеме неалкогольной жировой болезни печени, что связано с неуклонным ростом заболеваемости данной патологией. Чаще, в 19% случаев, НАЖБП встречается у лиц с избыточной массой тела, как взрослых, так и детей, но в 9% и у лиц, имеющих нормальный индекс массы тела. Распространенность НАЖБП в различных странах варьирует, и составляет 10-24% в общей популяции населения и 57-74% среди тучных людей [1]. За последние 40 лет в общей популяции наметилась тенденция к увеличению числа людей с избыточной массой тела с 10 до 25% и у 2/3 из них диагностируется стеатоз печени. В действительности распространенность НАЖБП может быть еще выше, поскольку заболевание длительное время может протекать бессимптомно или в большинстве случаев оно выявляется случайно при обследовании по поводу проявлений других заболеваний: ожирении, ИБС, гипертонической болезни, сахарного диабета 2-го типа, ЖКБ, при выявлении повышенных уровней печеночных трансаминаз, гепатомегалии, признаков портальной гипертензии [2]. Результаты проведенного в 2007 году исследования частоты обнаружения НАЖБП в РФ свидетельствуют о том, что среди лиц, обращающихся к терапевту поликлиники, заболевание встречается в 27%, при этом у 80,3% выявлен стеатоз, у 16,8% - стеатогепатит, у 2,9% пациентов заболевание регистрируется на стадии цирроза.
На сегодняшний день по-прежнему остается дискутабельным вопрос, касающийся изучения причин появления и прогрессирования НАЖБП. Одной из ведущих причин НАЖБП названо нарушение липидного обмена. Но нет сомнений и в том, что, помимо нарушения липидного обмена, важная роль, особенно в прогрессировании заболевания, принадлежит нарушению регуляции иммунного ответа. На сегодняшний день НАЖБП рассматривается как сложное заболевание со многими взаимодействующими путями метаболизма, что обусловлено взаимодействием генетической предрасположенности и факторами окружающей среды. Совершенно четко прослеживается общность молекулярных механизмов, участвующих в развитии и прогрессировании НАЖБП, с механизмами, участвующими в развитии метаболического синдрома, ожирения, сахарного диабета 2 типа и др. Также прямое влияние на течение хронических заболеваний печени имеет кишечный микробиоценоз. Так, у больных НАЖБП нарушения состава кишечной микрофлоры встречаются в 97% случаев, при этом выявляется взаимосвязь тяжести течения заболевания и клинической картины со степенью нарушений кишечного микробиоценоза. Известно, что основными органами детоксикации в организме являются печень и кишечная микрофлора. Именно взаимодействие этих двух систем обеспечивает нормальное выполнение детоксицирующей функции организма. Кишечная микрофлора является первым барьером, сталкивающимся с токсинами и способствующим трансформации токсических соединений в нетоксические химические соединения, либо в легко разрушаемые вещества, конечная детоксикация которых происходит в печени. Изменения в структуре печени или составе кишечной микрофлоре оказывают прямое влияние друг на друга и организм в целом. Нарушение детоксикационной функции кишечной микрофлоры приводит к увеличению поступления токсических веществ в печень, увеличивая нагрузку на гепатоциты, что способствует их повреждению и возникновению воспалительной реакции, а также органическим изменениям в ткани печени. Бактериальные токсины патогенной и условно-патогенной микрофлоры кишечника способны вызывать сенситизацию жировой печени к воздействию TNF-α, ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-8, что приводит к некрозу гепатоцитов, развитию фиброза и способствует изменению иммунологического статуса организма.
Таким образом, выполнение иммунологических исследований у больных НАЖБП стало неотъемлемой частью обследования, и проводится с целью прогнозирования течения заболевания, проведения дифференциальной диагностики заболеваний печени и подбора терапии. Наличие дисбаланса микрофлоры кишечника у пациентов с НАЖБП в сторону условно-патогенной свидетельствует о наличии вторичной недостаточности иммунной системы и приводит к тому, что иммунологическое исследование выполняется практически всем обследуемым больным данной группы.
В настоящее время не существует критериев для определения целесообразности выполнения иммунологического исследования у данной категории больных.
Техническим результатом изобретения является разработка критериев для определения целесообразности назначения иммунологического исследования у пациентов НАЖБП, что позволит избежать излишнего назначения дорогостоящего исследования иммунного статуса у данной категории пациентов, что, в свою очередь, упростит и сократит время обследования, проводимого с целью подбора медикаментозной терапии.
Технический результат изобретения достигается тем, что у пациентов НАЖБП выполняют клинический анализ крови и определяют лейкоцитарные индексы - индекс соотношения нейтрофилов и лимфоцитов (ИСНЛ) и лимфогранулоцитарный индекс (ИЛГ). Осуществляют полимеразную цепную реакцию, заключающуюся в выявлении ДНК микроорганизмов толстой кишки в кале пациента, таких как Faecalibacterium prausnitzii, Klebsiella, Enterobacter, Proteus, Citrobacter, а также дрожжевых грибов рода Candida. При одновременном повышенном значении ИЛГ и сниженном значении ИСНЛ, соответственно по сравнению с референсными значениями, а также снижении количества микроорганизмов Faecalibacterium prausnitzii и повышении количества микроорганизмов Klebsiella, Enterobacter, Proteus, Citrobacter и количества дрожжевых грибов рода Candida, определяют целесообразное выполнение иммунологического исследования у данной категории больных.
Способ осуществляется следующим образом.
Выполняют клинический анализ крови у пациентов неалкогольной жировой болезнью печени. Для этой цели нами использовался анализатор LH-500 (Beckman Coulter, US). После получения результатов клинического анализа крови на основании относительного содержания клеток в лейкоцитарной формуле клинического анализа крови производят расчет лейкоцитарных индексов: Индекс соотношения нейтрофилов и лимфоцитов (ИСНЛ) = нейтрофилы / лимфоциты и лимфогранулоцитарный индекс (ИЛГ) = лимфоциты × 10 / (нейтрофилы сегментоядерные + эозинофилы + базофилы).
Затем выполняют полимеразную цепную реакцию (ПЦР) кала пациента. Из кала пациента выделяют ДНК микроорганизмов толстой кишки, далее копируют участки ДНК микроорганизмов, катализируемых ДНК-полимеразой. На первом этапе производят термическое разделение двухнитиевой молекулы ДНК на отдельные цепочки. Далее в пробирку с разделенной двухнитиевой молекулой ДНК вносят праймеры, комплементарные нуклеотидным последовательностям определяемых микроорганизмов, а также ag-полимеразу для наращивания недостающих нитей ДНК, что позволяет получить множественные копии ДНК микроорганизмов для дальнейшей идентификации копий ДНК с помощью электрофореза.
При анализе полученных данных ПЦР, а также рассчитанных лейкоцитарных индексов производят оценку целесообразности выполнения иммунологического обследования. При выявлении дисбаланса облигатной и условно-патогенной микрофлоры в выявленной ДНК микроорганизмов толстой кишки в кале пациента, а именно снижении количества микроорганизмов Faecalibacterium prausnitzii и повышении количества микроорганизмов Klebsiella, Enterobacter, Proteus, Citrobacter и количества дрожжевых грибов рода Candida при одновременном повышенном значении ИЛГ и сниженном значении ИСНЛ, соответственно по сравнению с референсными значениями, определяют целесообразное проведение иммунологического исследования у больных неалкогольной жировой болезнью печени.
Существенные отличительные признаки заявляемого способа и причинно-следственная связь между ними и достигаемым результатом:
- выполняют клинический анализ крови и определяют лейкоцитарные индексы - индекс соотношения нейтрофилов и лимфоцитов и лимфогранулоцитарный индекс;
- осуществляют полимеразную цепную реакцию, заключающуюся в выявлении ДНК микроорганизмов толстой кишки в кале пациента, таких как Faecalibacterium prausnitzii, Klebsiella, Enterobacter, Proteus, Citrobacter, а также дрожжевых грибов рода Candida;
- при одновременном повышенном значении ИЛГ и сниженном значении ИСНЛ соответственно по сравнению с референсными значениями, а также при снижении количества микроорганизмов Faecalibacterium prausnitzii, и повышении количества микроорганизмов Klebsiella, Enterobacter, Proteus, Cltrobacter и количества дрожжевых грибов рода Candida, соответственно по сравнению с референсными значениями, определяют целесообразное проведение иммунологического исследования у пациентов НЖБП.
Нами обследованы больные НАЖБП, имеющие дисбаланс состава кишечной микрофлоры в сторону увеличения числа условно-патогенной микрофлоры. По литературным данным, имеются различные сведения по частоте встречаемости иммунологических изменений периферической крови у больных с нарушением микрофлоры толстой кишки. Так, по данным А.А. Воробьева и соавторов [3], в 35% отмечаются изменения в иммунном статусе у пациентов с нарушением микробиоциноза толстой кишки, касающиеся Т- и особенно В-клеточного иммунитета, изменение гуморального иммунитета (Ig A, M, G) встречались в 17-47,5% случаев, что свидетельствует о нецелесообразности выполнения иммунологического анализа крови каждому пациенту. По данным Селиверстова П.В. [4], у пациентов с неалкогольной жировой болезнью печени на фоне дисбиоза кишечника отмечается увеличение провоспалительных цитокинов (ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-8, ФНО-α по спонтанной и индуцированной продукции и содержанию в сыворотке крови), пропорционально нарастанию дисбаланса аблигатной и условно-патогенной микрофлоры толстой кишки. Так же Селиверстов П.В. и Тимофеева Е.А. [4, 5], отмечают взаимосвязь степени дисбиоза толстой кишки с прогрессированием частоты жировой дистрофии гепатоцитов, степени развития фиброза, что свидетельствует о дисфункции клеточного и гуморального звеньев иммунитета.
Нами было установлено, что у пациентов неалкогольной жировой болезнью печени значимых сдвигов в гемограмме не наблюдалось. Так при анализе гемограмм пациентов НЖБП в 430 историях болезни выявлено, что лейкоцитоз имелся только у 7,2% пациентов, в 92% случаев содержание лейкоцитов соответствовало нормальным значениям. Лимфоцитоз был выявлен только в 25%, лимфопения в 8% случаев. Количество нейтрофилов в 88% случаев оставалось нормальным, нейтрофилез и нейтропения обнаружены у 4,5% и 7,5%. Похожие данные были получены при проспективном анализе (176 пациентов с неалкогольной жировой болезнью печени), отклонения в показателях клинического анализа крови выявлены в 10% случаев, средние значения лейкоцитов, лимфоцитов, нейтрофилов не отличались от референсных значений. Увеличение СОЭ отмечалось у всех пациентов с неалкогольной жировой болезнью с разной степенью активности при ретроспективном и проспективном исследованиях клинического анализа крови. Но ускорение СОЭ не является специфичным для неалкогольной жировой болезни печени, а также может быть признаком аутоиммунного поражения печени, поэтому увеличение СОЭ не может быть узко-специфическим показателем НЖБП и являться прямым показанием выполнения развернутого иммунологического анализа у пациентов неалкогольной жировой болезнью печени. По данным различных авторов, описано, что лимфопения является признаком вторичного иммунодефицита, а моноцитоз встречается при инфекционно-воспалительных заболеваниях [6, 7].
В связи с отсутствием выраженных отклонений (лимфопения, моноцитоз и др.) в гемограмме у пациентов с неалкогольной жировой болезнью печени, нами были рассчитаны интегральные гематологические показатели лейкоцитарной формулы (лейкоцитарные индексы - индекс соотношения нейтрофилов и лимфоцитов и лимфогранулоцитарный индекс. Гематологические показатели лейкоцитарной формулы на основании данных Бурбелло А.Т. [8] позволяют оценить активность воспалительного процесса и иммунного реагирования у пациентов хроническими инфекционно-воспалительными заболеваниями (ХИВЗ).
Для выявления специфических признаков воспаления у больных неалкогольной жировой болезнью печени нами были рассчитаны и сравнены лейкоцитарные индексы у пациентов ХИВЗ различной локализации и НАЖБ (Таблица 1).
Нами было установлено, что у пациентов с неалкогольной жировой болезнью печени индекс соотношения ИСНЛ достоверно ниже, чем у пациентов с ХИВЗ различной локализации, а ИЛГ достоверно выше (6,17 [3,97; 8,65] и 2,58 [1,38; 2,68] при референсных значениях 4,19-4,93, различия между группами достоверны, р<0,0001). Высокий лимфогранулоцитарный индекс свидетельствует о высокой активности воспалительного процесса при инфекционно-бактериальном воспалении. Индекс соотношения нейтрофилов и лимфоцитов у пациентов с ХИВЗ различной локализации оказался ниже, чем у пациентов с неалкогольной жировой болезнью печени (1,52 [1,08; 2,29] и 4,06 [3,7; 7,26] при референсных значениях 2,27-2,74, различия между группами достоверны, р<0,0001), что, вероятно, отражает тенденцию к развитию нейтропении и лимфоцитоза при хроническом инфекционно-воспалительном процессе. При получении подобных изменений требуется выполнение более глубоких иммунологических исследований для уточнения количественных и качественных изменений иммунокомпетентных клеток.
Так, при выполнении полимеразной цепной реакции нами выявлен дисбаланс условно-патогенной и облигатной микрофлоры в 94% случаев (у 165 пациентов из 176). Наиболее выраженные иммунологические изменения отмечались у пациентов с неалкогольной жировой болезнью печени с изменениями, а именно - снижении количества микроорганизмов Faecalibacterium prausnitzii и повышении количества микроорганизмов Klebsiella, Enterobacter, Proteus, Citrobacter и количества дрожжевых грибов рода Candida, соответствующими 2-ой степени дисбиоза. У данной категории пациентов отмечалось снижении уровня Т-хелперов при одновременном увеличении числа Т-цитотоксических клеток, с пропорциональным изменением иммунорегуляторного индекса. Также отмечалось изменение гуморального звена иммунитета, а именно, уменьшение количества иммуноглобулинов класса А и G, ЦИК, а также увеличение числа иммуноглобулинов М. Кроме того, у пациентов с выявленным дисбиозом толстой кишки была обнаружена лимфоцитарная инфильтрация печени, особенно выражена инфильтрация CD 3+-лимфоцитами.
Таким образом, нами были выявлены наиболее выраженные изменения в иммуннограмме у пациентов неалкогольной жировой болезнью печени, при одновременном повышенном значении ИЛГ и сниженном значении ИСНЛ соответственно по сравнению с референсными значениями, а также при снижении количества микроорганизмов Faecalibacterium prausnitzii, и повышении количества микроорганизмов Klebsiella, Enterobacter, Proteus, Citrobacter и количества дрожжевых грибов рода Candida, соответственно по сравнению с референсными значениями, что является показанием для выполнения иммунологического обследования такой группе пациентов.
Совокупность существенных отличительных признаков является новой и позволила разработать критерии для определения целесообразности назначения иммунологического исследования у пациентов неалкогольной жировой болезнью печени, что позволит избежать излишнего назначения дорогостоящего исследования иммунного статуса у данной категории пациентов, что, в свою очередь, упростит и сократит время обследования, проводимого с целью подбора медикаментозной терапии.
Примеры конкретного выполнения
Пример 1. Пациент Ш., 38 лет. Диагноз: Неалкогольная жировая болезнь печени. Стеатогепатит, минимальной степени активности. Дисбактериоз 2-ой степени.
Считает себя больным около 4 лет, когда впервые отметил боли в правом подреберье, субиктеричность кожных покровов, при обследовании выявлен синдром цитолиза и холестаза. В ходе диагностики маркеры вирусных гепатитов отрицательны, аутоиммунные показатели без отклонений от нормальных значений.
На основании результатов обследования поставлен диагноз Стеатогепатит.
Жалобы на тянущие боли в правом подреберье, усиливающиеся при погрешности в диете. Общая слабость, повышенная утомляемость, поносы.
Объективно: Состояние удовлетворительное, кожные покровы обычной окраски и влажности. Язык обложен белым налетом, сосочки выражены. Тоны сердца приглушены, ритмичные. Пульс 76 уд. в мин. АД 130/90 мм рт.ст.
Дыхание жесткое, проводится во все отделы, хрипов нет. ЧДД 18 в минуту. Печень +2 см из-под края реберной дуги. При пальпации живот мягкий, умеренно болезненный в правом подреберье.
На основании данных обследования был выставлен диагноз: Неалкогольная жировая болезнь печени. Стеатогепатит, минимальной степени активности.
По данным лабораторно-инструментального обследования:
Клинический анализ крови:
Биохимический анализ крови:
УЗИ печени: Жировой гепатоз III по Бацкову С.С.
Фибромакс: Фиброз 2; Активность гепатита 3; Стеатоз 3; Неалкогольный компонент 1; Алкогольный тест 0.
ПЦР RT ЖКТ: Анаэробный дисбаланс: количество бактероидов значительно превышает F. prausnitzii.
Биопсия печени:
Иммуногистохимия
Морфология
ПЦР RT ЖКТ:
Иммунологические показатели крови:
Как видно из таблицы ПЦР RT ЖКТ, у данного больного наблюдалось снижение количества Faecalibacterium prausnitzii и увеличение Klebsiella, Enterobacter, Proteus, Candida, Citrobacter, но в клиническом анализе крови ИЛГ ниже референсных значений, что свидетельствует об отсутствии воспалительной реакции, индекс ИСНЛ выше референсных значений, что указывает на нормальное соотношении всех элементов лейкоцитарной формулы. Поэтому проведение иммунологического исследования крови в данном случае не целесообразно, что и подтверждает развернутое иммунологическое исследование у данного пациента, где все значения в пределах референсных показателей.
Пример 2. Пациент В., 42 года. Диагноз: Неалкогольная жировая болезнь печени. Стеатогепатит, минимальной степени активности. Дисбактериоз 2-ой степени.
Жалобы на выраженную слабость, снижение работоспособности, тянущие боли в правом подреберье, тошноту, горечь во рту.
Из анамнеза:
При объективном осмотре: Сознание ясное, кожные покровы обычной окраски и влажности, телосложение нормостеническое.
Язык обложен желтым налетом, сосочки выражены. Склеры обычной окраски.
Пульс 72 уд. в мин.
АД 120/80 мм рт.ст.
Тоны сердца приглушены, ритмичные.
Дыхание жесткое, хрипов нет. ЧДД 18 в мин.
Живот при пальпации мягкий, дискомфортный в правом подреберье. Край печени выступает на 3 см из-под края реберной дуги, край печени плотный, ровный, болезненный при пальпации.
Отеков нет.
Клинический анализ крови:
ИСНЛ-6,61, ИЛГ-1,5
Биохимический анализ крови
:
УЗИ печени: Жировой гепатоз III по Бацкову С.С.
Фибромакс: Фиброз 2; Активность гепатита 3; Стеатоз 3; Неалкогольный компонент 1; Алкогольный тест 0.
ПЦР RT ЖКТ: Анаэробный дисбаланс: количество бактероидов значительно превышает F. prausnitzii.
Биопсия печени.
Иммуногистохимия
Морфология
ПЦР RT ЖКТ:
Иммунологические показатели крови
Как видно из таблицы ПЦР RT ЖКТ, у данного больного наблюдалось снижение количества Faecalibacterium prausnitzii и увеличение Klebsiella, Enterobacter, Proteus, Candida, Citrobacter, в клиническом анализе крови ИЛГ ниже референсных значений, что свидетельствует о воспалительной реакции, индекс ИСНЛ выше референсных значений, что показывает наличие нейтрофилии и лимфопении у данного пациента. Поэтому проведение углубленного иммунологического исследования крови в данном случае целесообразно. В иммунологическом обследовании пациента выявляется увеличение Т-хелперов (CD3+ CD4+) отн., Иммунорегуляторного индекса (Тх/Тс), Т-лимфоциты CD3+ HLA DR+ (поздняя активация) отн., Т-лимфоциты CD3+ HLA DR+ (поздняя активация) абс, и снижение Т-Цитотоксических лимфоцитов (CD3+ CD8+) отн. Развернутое иммунологическое исследование у данного пациента подтвердило целесообразность его выполнения.
Таким образом, впервые разработаны критерии для определения целесообразности назначения иммунологического исследования у больных неалкогольной жировой болезнью печени, что позволит избежать излишнего назначения дорогостоящего исследования иммунного статуса у данной категории больных, что, в свою очередь, упростит и сократит время обследования, проводимого с целью подбора медикаментозной терапии.
Список литературы
1. Карнейро де Мур М. Неалкогольный стеатогепатит // Клинические перспективы в гастроэнтерологии, гепатологии. - 2001. - №2. - С. 12-15.
2. Leuschner U., James O.F.W., Dancygier H. Steatohepatitis (NASH and ASH): Dr. Falk Pharma Gmbh, 2005. - 35 P.
3. Дисбактериозы - актуальная проблема медицины / А.А. Воробьев, Η.Α. Абрамов, Β.Μ. Бондаренко, Б.А. Шендеров // Вестник РАМН. - 1997. - №3. - С. 4-7.
4. Селиверстов П.В. Дисбиоз кишечника и пути коррекции у больных с хроническими заболеваниями печени // автореферат диссертация канд. мед. наук / П.В. Селиверстов. - СПб, 2011. - 23 с.
5. Тимофеева Е.А. Клинико-морфологические особенности хронического гепатита, ассоциированного с нарушениями кишечного микробиоценоза // автореферат диссертация канд. мед. наук / П.В. Селиверстов. - СПб, 2006. - 95 с.
6. Воробьев А.И. Клинико-диагностическое значение лабораторных показателей в гематологии. - РАМН ГНЦ, 2001. - 17 с.
7. Шиффман Ф.Дж. Патофизиология крови, пер. с англ. / Ф.Дж. Шиффман. - М. - СПб. «Издательство БИНОМ» - «Невский Диалект», 2000. - 448 с.
8. Пат. 2496108 Российская Федерация, МПК G01N 33/49. Способ определения целесообразности проведения иммунологического обследования у больных хроническими инфекционно-воспалительными заболеваниями различной локализации [Текст] / Федоренко А.С., Бурбелло А.Т., Гайковая Л.Б., Каргальцева Н.М.; заявитель и патентообладатель Гос. бюджетное образовательное учреждение высшего проф. образования «Северо-Западный гос. мед. университет им. И.И. Мечникова» Министерства здравоохранения и социального развития РФ. - №2012123801/15; заявл. 07.06.12; опубл. 20.10.13, Бюл. №29. - 13 с.