Способ определения состояния липидной компоненты мембраны клетки
METHOD FOR DETERMINING THE CONDITION OF A LIPID COMPONENT OF A CELL MEMBRANE

Изобретение относится к области медицины, а именно к биохимии и может быть использовано для определения состояния липидной компоненты мембраны при установлении ее функциональной характеристики.
Мембрана - важнейший элемент клетки, осуществляющий координацию ее работы в зависимости от физических и химических сигналов, поступающих к ней в организме. Развитие различных по патогенезу патологических процессов сопровождается молекулярными изменениями плазматических мембран клеток, являющихся как мишенью непосредственного действия патогенных факторов, так и вовлеченных в патологический процесс клеток в связи с универсальными механизмами их повреждения (В.В. Новицкий, Н.В. Рязанцева и др. Молекулярные нарушения мембраны эритроцитов при патологии разного генеза являются типовой реакцией организма: контуры проблемы. / Бюл. сибирской медицины, - 2006, - №2. С. 62-69).
Известно, что плазматическая мембрана играет ключевую роль в поддержании гомеостаза и функциональной способности клетки, так как представляет собой композитную структуру, основу которой составляет липидный бислой с ассиметрично встроенными белками. Липидные молекулы, являясь структурными и функциональными компонентами клетки, регулируют подвижность и активность внутримембранных белков, обеспечивая в клетке селективную проницаемость, нормальное функционирование мембранассоциированных ферментов и рецепторного аппарата (Сим Э. Биохимия мембран. - 1982. - С. 35-54).
Известен способ оценки состояния липидного обмена в клетке путем определения содержания продуктов перекисного окисления: малонового диальдегида (МДА), диеновых и кетодиеновых коньюгатов. Определение МДА основано на взаимодействии тиобарбитуровой кислоты с малоновым диальдегидом с образованием комплекса, окрашенного в розовый цвет, который имеет максимальное поглощение при 535 нм. Содержание диеновых и кето-диеновых коньюгатов измеряют по изменению интенсивности поглощения в области 232-234 нм, обусловленной коньюгированными диеновыми структурами (предварительно экстрагированными из эритроцитов), возникающими при образовании гидроперекисей полиненасыщенных жирных кислот. Повышенные цифры этих показателей свидетельствуют об интенсификации процессов перекисного окисления липидов (Справочник по лабораторным методам исследования под ред. Даниловой Л.А., СПБ: Питер, - 2003, - С. 396, 398-399).
К недостаткам данного способа следует отнести отсутствие специфичности, т.к. увеличение содержания продуктов перекисного окисления липидов сопровождает многие патологические процессы и состояния, такие как стресс, воспаление, травма, атеросклероз, ишемия и др.
Кроме этого изменение содержания продуктов перекисного окисления липидов не свидетельствует об изменении липидного бислоя клетки.
Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому является способ определения структурного состояния мембраны эритроцитов, включающий взятие пробы крови, отделение эритроцитов трехкратными отмыванием и центрифугированием, получение суспензии эритроцитов и определение фосфорсодержащих компонентов в них. Экстракт эритроцитов и стандарты фосфатидилхолина и фосфатидилэтаноламина наносят на хроматографическую пластинку, которую помещают в хроматографическую камеру и по длине пробега пятен пробы в сравнении с длиной пробега пятен стандартов идентифицируют фосфатидилхолин и фосфатидилэтаноламин пробы, а по превышению размера пятна фосфатидилэтаноламина по сравнению с пятном фосфатидилхолина устанавливают нарушение структуры мембраны эритроцитов (Пат. 2528909 Российская Федерация, МПК G01N 33/50. Способ определения структурного состояния мембраны эритроцитов. / Горохова В.Г., Кузнецова Э.Э., Чашкова Е.Ю.; заявитель и патентообладатель ФГБУ НЦРВХ СО РАМН. - №2013128050/15; заявл. 18.06.2013; опубл. 20.09.2014, Бюл. №26).
Известный способ основан на определении количественного содержания основных компонентов эритроцитарной мембраны - фосфатидилхолина (ФХ) и фосфатидилэтаноламина (ФЭ).
К недостаткам известного способа, как и аналогичного, следует отнести отсутствие возможности оценки структурного состояния именно липидной компоненты мембраны клетки.
Задачей заявляемого данного технического решения является определение состояния липидной компоненты мембраны клетки.
Техническим результатом предлагаемого способа является обеспечение возможности оценки состояния липидной компоненты мембраны клетки, за счет регистрации изменения содержания маркеров дезорганизации липидного матрикса мембраны - окисленных и неокисленных липидов.
Технический результат достигается тем, что способ определения состояния липидной компоненты мембраны клетки включает взятие пробы крови, отделение эритроцитов трехкратным отмыванием и центрифугированием, получение суспензии эритроцитов.
К отличительным приемам заявляемого способа относится то, что к отмытым эритроцитам добавляют ацетонитрил в соотношении 1:1, перемешивают и центрифугируют при 3000 об/мин. в течение 30 мин. Затем надосадочную жидкость отбирают в кювету и добавляют дистиллированную воду в соотношении 1:9, после чего спектрофотометрируют при 215 нм и 235 нм и определяют оптическую плотность окисленных и неокисленных липопротеидов.
Отличительным приемом предлагаемого способа является и то, что величину показателя окисленности липидов устанавливают по формуле:
235
215
Покл=λ/λ, где:
Покл - показатель окисленности липидов;
215
λ - содержание неокисленных липидов, регистрируемое при длине волны 215 нм
235
λ - содержание окисленных липидов, регистрируемое при длине волны 235 нм.
Отличие заявляемого способа так же заключается и в том, что величина Покл равная или менее 0,43±0,04 указывает на нормальное состояние липидного бислоя, а величина Покл более 0,43±0,04 свидетельствует о нарушении липидной компоненты мембраны клетки.
Сопоставительный анализ с прототипом показал, что предлагаемый способ отличается от известного вышеперечисленными приемами и, следовательно, соответствует критерию изобретения «новизна».
Анализ патентной и специальной литературы выявил, что предлагаемый способ имеет признаки, отличающие его не только от прототипа, но и от других технических решений в данной и смежных областях биохимии и медицины. В доступной литературе авторами предлагаемого технического решения не найдено способа оценки состояния липидной компоненты мембраны клетки.
Авторами предлагаемого способа установлено, что состояние бислоя клетки, а именно липидную компоненту ее мембраны характеризует содержание неокисленных и окисленных (модифицированных) липидов, что позволило использовать ультрафиолетовую спектрофотометрию для их определения.
Области поглощения, характерные для соединений с непредельными сопряженными связями, принадлежащими к липидной компоненте мембран, регистрируются в интервале длин волн от 200 до 300 нм.
215
235
Так, авторами установлено, что содержание неокисленных липидов регистрируется при длине волны 215 нм (λ), содержание окисленных липидов - при длине волны 235 нм (λ).
Идентификацию выделенных липидных компонентов авторы провели следующими методами: экстракцией, хроматографией, УФ- и ЯМР-спектроскопией. Это позволило обосновать определение содержания неокисленных и окисленных (модифицированных) липидов методом ультрафиолетовой спектрофотометрии.
На основании проведенных исследований авторами установлено, что у клинически здоровых людей показатель оптической плотности при 215 нм равен 0.316±0,14 при 235 нм - 0,138±0,11. Величины установленных показателей приближены к показателям оптической плотности стандартных фосфолипидов. Обозначенный авторами как показатель окисленности липидов (Покл), представляет собой отношение показателей плотности при длине волны 235 к показателю плотности при 215 нм, составил 0,43±0,04. Показатель окисленности стандартных растворов фосфолипидов равен 0,42±0,025.
Авторами установлено, что при величине этого показателя равной или меньше 0,43±0,04 состояние липидного бислоя оценивают сбалансированным, а при величине показателя окисленности липидов выше 0,43±0,04 устанавливают нарушение липидной компоненты мембраны клетки.
Следовательно, отличительные приемы заявляемого способа обеспечивают возможность специфической оценки состояния липидной компоненты мембраны.
Изложенное позволяет сделать вывод о соответствии технического решения критерию «изобретательский уровень».
Способ, составляющий заявляемое изобретение, предназначен для использования в медицине, а именно в биохимии, физиологии, кардиологии. Возможность его осуществления подтверждена описанными в заявке приемами и средствами, следовательно, предлагаемое решение соответствует критерию «промышленная применимость».
Предлагаемый способ осуществляют следующим образом. Утром (натощак) у пациента забирают кровь из локтевой вены в пробирку, содержащую 3,8% раствор цитрата натрия, центрифугируют при 1500 об/мин в течение 15 мин. Отбирают плазму и продолжают работать с эритроцитами. Эритроцитарную массу трижды отмывают физиологическим раствором, каждый раз центрифугируют при 1500 об/мин. в течение 5 мин. К отмытым эритроцитам добавляют равное количество ацетонитрила (соотношение 1:1), осторожно перемешивают и центрифугируют при 3000 об/мин. в течение 30 мин. Затем отбирают 0,5 мл надосадочной жидкости в кювету на 5 мл, добавляют 4,5 мл дистиллированной воды, т.е. соотношение 1:9. Далее кювету спектрофотометрируют при длинах волн 215 нм и 235 нм. Величину показателя окисленности липидов устанавливают по формуле:
235
215
Покл=λ/λ, где:
Покл - показатель окисленности липидов;
215
λ - содержание неокисленных липидов, регистрируемое при длине волны 215 нм;
235
λ - содержание окисленных липидов, регистрируемое при длине волны 235 нм.
При величине Покл равной или меньше 0,43±0,04 состояние липидного бислоя оценивают сбалансированным, а при величине этого показателя более 0,43±0,04 устанавливают нарушение липидной компоненты мембраны клетки.
Среднее время выполнения анализа составляет 60 минут.
Предлагаемый способ оценки состояния липидной компоненты клетки поясняется примерами конкретного выполнения.
Пример 1. Больной К. Диагноз: распространенный гнойный перитонит. Утром натощак у этого пациента из локтевой вены взяли кровь в пробирку, содержащую 3,8% цитрата натрия, центрифугировали при 1500 об/мин. Плазму удалили, эритроцитарную массу трижды отмыли физиологическим раствором. К 1 мл отмытой эритроцитарной массы добавили 1 мл ацетонитрила, осторожно перемешали, после чего центрифугировали при 3000 об/мин в течение 30 мин. Затем к 0.5 мл надосадочной жидкости внесли 4,5 мл дистиллированной воды (соотношение 1:9) и сняли спектрограмму при 215 и 235 нм.
Уф-спектры пациента К. при поступлении: показатель оптической плотности при 215 нм - 1,951; при 235 нм - 1,745.
235
215
Покл=λ/λ=1,745/1,951=0,894.
Установленная величина Покл. составила 0,894, т.е. в 2.08 раза выше, чем у клинически здоровых людей.
Липидограмма больного К. выявила снижение содержания липопротеидов высокой плотности и увеличение уровня липопротеидов низкой и очень низкой плотности, что свидетельствовало об активации процессов перекисного окисления липидов, т.е. о нарушении липидного обмена.
Тяжесть клинического состояния больного К. была подтверждена: индексом тяжести Манхаймера (MPI), который составил 15 баллов; показателем альбуминового индекса - 7,19; высоким лейкоцитозом - 17.000 и СОЭ - 45 мм/ч.
Пациенту К. была выполнена радикальная хирургическая операция с последующими санациями брюшной полости. Клиническое состояние больного улучшилось, так на 9-е сутки показатель MPI снизился до 9 баллов, альбуминовый индекс - 6,05, СОЭ - 35. Показатель окисленности липидов снизился до 0,70, что указывало на уменьшение токсических продуктов в плазме крови. Назначенная антиоксидантная терапия позволила снизить показатель окисленности липидов с 0.70 до 0.60, что указывало на положительную динамику в восстановлении состояния липидной компоненты мембраны клетки.
Пример 2. Больная М. Диагноз: железодефицитная анемия. Показатель оптической плотности при длинах волн 215 нм составил 1,83; при 235 нм - 2,06.
235
215
Покл=λ/λ=2,06/1,83=1,12.
Установленный показатель окисленности липидов в 2,6 раза превышал таковой клинически здоровых людей. Это указывало на дезорганизацию структуры липидного бислоя клетки и свидетельствовало о тяжести клинического состояния больной.
Пример 3. Клинически здоровый пациент - донор. Утром (натощак) была забрана кровь, выделены эритроциты, высокомолекулярные соединения были осаждены ацетонитрилом. После центрифугирования надсадочную жидкость спектрофотометрировали, показатель оптической плотности при длинах волн 215 нм был равен 0,047, при 235 нм - 0,020.
235
215
Показатель окисленности липидов Покл=λ/λ=0,020/0,047=0,42.
Установленная величина Покл свидетельствовала об отсутствии нарушений в липидной компоненте мембраны клетки донора.
Авторами предлагаемого способа было обследовано 98 образцов крови пациентов, проходивших лечение в Иркутской ОКБ, из них с распространенным гнойным перитонитом - 20, лимфома - 15, с ожоговой болезнью II-III степени - 9, ИБС со стабильной формой стенокардии напряжения - 15, гипертонической болезнью II-III степени заболевания - 17, доноров (волонтеров) - 22. Полученные данные представлены в таблице.
Представленные патологии характеризуются дезорганизацией липидной структуры мембраны клетки, обусловленной изменением соотношения окисленных (модифицированных) и неокисленных липидов, приводящих к нарушению селективной проницаемости и нормального функционирования клетки. Исходя из этого, увеличение показателя окисленности указывает на изменение липидной структуры мембраны клетки.
Таким образом, предлагаемый способ позволяет оценить состояние липидного бислоя путем регистрации содержания окисленных и неокисленных липидов. Повышенные значения показателя окисленности служат маркером дезорганизации липидной компоненты клетки.