СРЕДСТВО ДЛЯ УЛУЧШЕНИЯ СОСТОЯНИЯ ПИЩЕВАРЕНИЯ
DIGESTIVE AGENT

Настоящее изобретение относится к композициям, содержащим молочнокислые бактерии для применения при улучшении состояния пищеварения. В частности, такие композиции содержат штамм Lactococcus lactis, подходящий для лечения и/или профилактики расстройств желудочно-кишечного тракта.
Желудочно-кишечные инфекции чрезвычайно распространены во всем мире. У подавляющего большинства пострадавших полное восстановление происходит быстро. Однако у существенной доли пациентов, страдающих от гастроэнтерита, развиваются продолжительные желудочно-кишечные симптомы, такие как синдром раздраженного кишечника (IBS). Действительно, предполагается, что после бактериального или вирусного гастроэнтерита у 3,7-36% индивидуумов развивается IBS (Spiller and Garsed, 2009).
Желудочно-кишечные инфекции также относятся к числу наиболее частых причин диареи. В тяжелых случаях вызывающая понос инфекция может в дальнейшем привести к воспалению желудка.
Желудочно-кишечные инфекции также включают болезнь Крона (CD) и неспецифический язвенный колит (UC), совместно именуемые как воспалительные заболевания кишечника (IBD).
Синдром раздраженного кишечника (IBS)
IBS представляет собой хронические функциональные расстройства кишечника, которые характеризуются диареей или запором, болью в животе, вздутием живота и проходом слизи в стул.
Считается, что воспаление и инфекция играют роль в возникновении IBS (Ohman and Simren, 2010). Семейство Enterobacteriaceae, как было замечено, чаще встречается у субъектов с IBS по сравнению со здоровыми субъектами (Si et al., 2004). Однако это наблюдение не повторялось в других исследованиях (Malinen et al., 2005), демонстрирующих, что в случае, когда бактерии семейства Enterobacteriaceae играют роль в патогенезе IBS, это не является единственным фактором. Кроме того, было показано, что субъекты с IBS несут более энтероагрегативные Escherichia coli (т.е. патогенные штаммы Escherichia coli), чем здоровые субъекты (Sobieszczanska et al., 2006).
Принимая во внимание, что существует исключительная связь между количеством бактерий семейства Enterobacteriaceae и подгруппой IBS, появляется все больше доказательств того, что представители семейства Enterobacteriaceae могут вызывать IBS в случае послеинфекционных IBS (PI-IBS) (Ji et al., 2005; Marshall et al., 2010 и Thabane et al., 2010). В этих исследованиях было показано, что пациенты, страдающие от гастроэнтерита, вызванного бактериями семейства Enterobacteriaceae (Escherichia coli, Campylobacter, Shigella), представляют больший риск получить IBS.
Поскольку активация иммунной системы рассматривается, как предполагают с недавнего времени, в качестве предполагаемой патофизиологической причины IBS исследователи начали оценивать применение противовоспалительных препаратов в качестве терапии IBS (Camilleri, 2010). Например, противовоспалительное средство Mesalamine продемонстрировало весьма обнадеживающие результаты у субъектов IBS (Corinaldesi et al., 2009). В этом исследовании было показано, что Mesalamine смягчает симптомы IBS, улучшая общее самочувствие.
Далее пробиотики, в частности, штаммы молочнокислых бактерий, как сообщалось, являются полезными для лечения и/или профилактики IBS. Примеры таких штаммов раскрыты в Международных заявках WO 2007/036230, WO 03/010297 и WO 2009/080800.
Послеинфекционный синдром раздраженного кишечника (PI-IBS)
PI-IBS является подгруппой синдрома раздраженного кишечника, который развивается после желудочно-кишечной инфекции.
О PI-IBS сообщалось, в основном, в Европе, особенно в Великобритании. Тем не менее, в двух недавних исследованиях, одно из Китая и одно из Кореи, сообщалось, что PI-IBS также происходит и в восточных странах с преобладанием, сходным с тем, что обнаружено на западе.
Патогенные бактерии были выявлены в большинстве исследований в качестве этиологических факторов, участвующих в развитии PI-IBS. Бактерии семейства Enterobacteriaceae, такие как Salmonella, Shigella и Campylobacter, встречались среди наиболее часто выделяемых бактерий. Потенциально могут быть вовлечены другие бактерии, вызывающие гастроэнтерит, такие как Listeria или патогенные E. coli. Недавние исследования показывают, что также могут быть вовлечены другие инфекционные агенты, включая вирусы (например, ротавирус, аденовирус, кальцивирус) и паразиты (Giardia lamblia, Blastocystis hominis). Гипотеза заключается в том, что снижение заболеваемости кишечными инфекциями в целом может снизить заболеваемость PI-IBS и, возможно, степень тяжести симптомов PI-IBS.
Механизм, лежащий в основе PI-IBS, не был четко идентифицирован. Особое внимание было уделено роли постоянного умеренного воспаления. Spiller и Garsed (2009) обнаружили увеличение числа внутриэпителиальных лимфоцитов, Т-лимфоцитов собственной пластинки слизистой оболочки, тучных клеток и кальпротектин-положительных макрофагов, которое не снижалось у пациентов, у которых развивается PI-IBS. Несколько пробиотических штаммов, как было показано, обладают противовоспалительными свойствами.
Эпителиальная выстилка кишечника, состоящая из эпителиальных клеток и плотных соединений, является полупроницаемой, позволяет прохождению мелких частиц, а также участвует в поддержании барьерной функции слизистой. Исследования in vitro и in vivo свидетельствуют о том, что активированная иммунная система кишечника при PI-IBS является результатом усиления местного воздействия антигена, связанного с повышенной проницаемостью эпителиального слоя кишечника. Пациенты с PI-IBS обладают повышенной проницаемостью по сравнению со здоровыми субъектами. Снижение кишечной проницаемости может непосредственно привести к улучшению симптомов PI-IBS. Несмотря на то, что в некоторых исследованиях было показано, что несколько штаммов видов Lactobacilli способны увеличить целостность эпителиального барьера, нет прямых доказательств того, что штаммы L. lactis обладают сходными свойствами. В противоположность этому существуют доказательства того, что генетически модифицированные штаммы L. lactis могут быть пагубны для эпителия (Shao and Kaushal, 2004).
Воспалительные заболевания кишечника (IBD)
IBD представляет собой любое из двух воспалительных заболеваний кишечника: болезнь Крона или неспецифический язвенный колит.
Болезнь Крона и неспецифический язвенный колит представляют собой хронические идиопатические расстройства, обусловленные иммунитетом, с генетическими и экологическими воздействиями (факторами), в особенности микробными воздействиями. Болезнь Крона часто ассоциируется с диареей, судорогами, потерей аппетита и веса с местными абсцессами и образованием рубцов. Язвенный колит также связан с диареей, но с выделением слизи и крови, схваткообразной болью в животе и воспалением и отеком мембраны слизистой с пятнами язвы. Болезнь Крона и неспецифический язвенный колит имеют место главным образом в районах с наибольшей концентрацией преимущественно анаэробных бактерий в дистальном отделе подвздошной кишки и толстой кишке. Серологические реакции на микробные антигены присутствует у 80% пациентов с болезнью Крона, и высокие титры антибактериальных серологий связаны с тяжелым заболеванием (Mow et al., 2004).
Продолжающаяся полемика, связанная с болезнью Крона, состоит в том, ответствен ли патогенный микроорганизм за хронический рецидивирующий характер воспалительного ответа. Полученные недавно значительные данные непосредственно связывают функционально аномальные штаммы E. coli (принадлежащих к семейству Enterobacteriaceae) с патогенезом болезни Крона (Sartor, 2008). Приросшие/инвазивные E. coli (AIEC) прилипают и поражают эпителиальные клетки и удерживаются внутри клеток кишечного эпителия и макрофагов (Darfeuille-Michaud et al., 1998). В ходе исследований in vitro были разработаны факторы вирулентности и молекулярные механизмы, которые способствуют эпителиальной адгезии, инвазии и персистированию (Darfeuille-Michaud et al., 1998 и Baumgart et al., 2007).
Активная область исследования IBD оценивает возможность дисбактериоза, представляющего собой ненормальную микробную композицию или функцию, в качестве причины хронического воспалительного процесса в кишечнике. Дисбактериоз может вызывать воспаление кишечника при помощи нескольких механизмов (Sartor, 2009). Нарушение продуцирования бутирата и других короткоцепочечных жирных кислот может коренным образом повлиять на эпителиальные функции кишечника и барьерные характеристики слизистой. Относительный баланс полезных и вредных бактерий может оказаться решающим фактором в индукции воспаления в противоположность гомеостазу слизистой оболочки. Способность энтеральной микробиоты продуцировать токсичные метаболиты может иметь отношение к патогенезу язвенного колита. Кишечные бактерии также могут продуцировать реактивные формы кислорода, которые могут вызывать повреждение тканей, особенно у хозяев с нарушенной деградацией метаболитов кислорода.
Некоторые исследования документально подтверждают отмеченные изменения микробиоты кишечника у пациентов с IBD (Peterson et al., 2008). С использованием молекулярных технологий было показано уменьшение определенных бактериальных популяций при IBD, особенно подмножеств клостридий, и увеличение других, в том числе Enterobacteriaceae (Sartor, 2009). Swidsinski с соавт. (2009) отметили высокий уровень Enterobacteriaceae в микробиоте пациентов с CD и UC.
При этом определение микробных функций, которые связаны с или инициируют IBD, осложняется генетикой организма-хозяина, состоянием воспаления и диетой (Peterson et al., 2008). Разработка перспективных исследований IBD человека для определения микробных сообществ, которые провоцируют воспаление, не была возможной даже у генетически чувствительных групп населения.
Как следствие, за последние несколько лет были разработаны различные модели на мышах хронического воспалительного процесса в кишечнике, напоминающие IBD, и была предоставлена информация о IBD и разбалансировании микробиоты. Различные модели IBD на мышах, в том числе генетически модифицированных животных с дефектами иммунной системы или гликанов слизистой, которых выращивали обычным способом с микробиотой и затем подвергали лечению антибиотиками, или которых выращивали стерильными, а затем колонизировали кишечной микробиотой от здоровых доноров, показывают, что наличие микробиоты играет важную роль в выявлении патологии (Garrett et al., 2007; Kang et al., 2008 года и Sartor, 2008). Важно подчеркнуть, что, хотя модели колита на грызунах, как правило, зависят от присутствия кишечной микробиоты, не все микробы вызывают заболевание (Kim et al., 2007). Исследования на животных моделях показывают, что некоторые бактериальные штаммы являются вредными, в то время как другие обладают защитным действием, а многие из них не являются ни агрессивными, ни полезными (Sartor, 2009).
Группа Л. Глимчер разработала устойчивую модель язвенного колита на мышах, чьи патологические особенности и ответ на лечение анти-TNF напоминают это заболевание у человека. Они обнаружили, что отсутствие определенных регуляторных генов природной иммунной системы (полученное в результате двойного нокаута генов T-bet и RAG2; названа TRUC для язвенного колита T-bet RAG2) приводило в результате к агрессивному, спонтанному и передающемуся контактным путем UC и повышенной восприимчивостью к колитам у иммунологически интактных хозяев (Garrett et al., 2007).
Эти результаты in vivo находятся в соответствии с клиническими наблюдениями: виды Klebsiella и Proteus чаще наблюдаются в стуле больных с UC, чем здоровых субъектов (Dorofeyev et al., 2009). Существуют также многочисленные сообщения о повышенных титрах антител против бактерий семейства Enterobacteriaceae у пациентов с IBD (Cooper et al., 1988; Ibbotson et al, 1987 и Tiwana et al, 1998).
В заключение баланс полезных и вредных видов бактерий определяет гомеостаз в противоположность воспалению. Была продемонстрирована вовлеченность бактерий семейства Enterobacteriaceae в эти механизмы. Для лечения и профилактики рецидивов IBD этим балансом можно манипулировать, в частности, при помощи пробиотиков.
Кроме того, было показано, что во время активных периодов IBD воспаление желудочно-кишечного тракта вызывает повышенную проницаемость эпителия, что приводит к повреждению барьерной функции эпителия (Madsen et al, 2001).
Использование противовоспалительных веществ (также называемых биологиками) для лечения воспалительных заболеваний кишечника наконец увеличилось, и в настоящее время они применяются гастроэнтерологами и врачами при уходе за пациентами с IBD (в качестве обзора: Bosani et al., 2009). Альтернативно для облегчения IBD были использованы пробиотики, и противовоспалительные механизмы были предложены в качестве механизма действия (Vanderpool et al., 2008).
Далее появляется все больше свидетельств того, что некоторые пробиотические и симбиотические бактерии улучшают ослабление кишечного барьера (снижение проницаемости) in vitro (Resta-Lenert and Barratt, 2006 и Miyauchi et al., 2008) и in vivo и способствуют облегчению симптомов IBS и IBD.
Из вышеизложенного следует, что патогенные микроорганизмы могут вызывать желудочно-кишечные инфекции (включая IBS, PI-IBS и IBD) и что соединения или пробиотики, обладающие противопатогенной активностью, могут предотвращать и/или излечивать эти нарушения. Далее целостность эпителиального барьера, связанная с противопатогенной активностью, может в дальнейшем предотвратить воспаление.
Бактерии Lactococcus lactis представляют собой молочнокислые бактерии, обычно встречающиеся в молочных продуктах, таких как сыр или ферментированные молочные продукты (в том числе йогурты). Некоторые бактерии Lactococcus lactis были описаны как обладающие активностью в отношении патогенных бактерий семейства Enterobacteriaceae, таких как Salmonella enteritidis и Escherichia coli (Olasupo et al., 2003; Ganzle et al., 1999).
Авторы настоящего изобретения показали in vitro, что два штамма Lactococcus lactis subsp. lactis, а именно штаммы DN 030 066 и DN 030 087, улучшают целостность эпителиального барьера по сравнению со штаммами бактерий, известными своими противовоспалительными свойствами, и далее, что штамм DN 030 066 обладает превосходной антимикробной активностью по сравнению со штаммами, известными своей антимикробной активностью.
Штамм DN 030 066 был передан на хранение, в соответствии с Будапештским договором, в CNCM (Национальная коллекция культур микроорганизмов, 25 Rue du Docteur Roux, Париж) 24 октября 1995 года, под номером 1-1631. Этот штамм раскрыт в Международной заявке WO 97/16529.
В CNCM штамм 1-1631 имеет следующие характеристики:
- Морфология: Грамположительный микроорганизм, в основном диплококки небольшого размера;
- Ферментация следующих сахаров (результаты, полученные на среде API 50 CH strip - API MRS при 30°C в течение 48 часов): рибозы, галактозы, глюкозы, маннозы, маннитола, N-ацетилглюкозамина, амигдалина, арбутина, эскулина, салицина, целлобиозы, мальтозы, лактозы, трегалозы, амидона, бета-гентибиозы.
Штамм DN 030 087 был передан на хранение, в соответствии с Будапештским договором, в CNCM (Национальная коллекция культур микроорганизмов, 25 Rue du Docteur Roux, Париж) 19 февраля 2002 года под номером 1-2807.
В CNCM штамм 1-2807 имеет следующие характеристики:
- Морфология: Грамположительный микроорганизм, в основном диплококки небольшого размера;
- Ферментация следующих сахаров (результаты, полученные на среде API 50 CH strip - API MRS при 37°C в течение 72 часов): рибозы, галактозы, глюкозы, маннозы, маннитола, N-ацетилглюкозамина, амигдалина, арбутина, эскулина, салицина, целлобиозы, мальтозы, лактозы, трегалозы, амидона, бета-гентибиозы.
Соответственно, настоящее изобретение предоставляет штамм Lactococcus lactis, выбранный из группы, состоящей из штаммов DN 030 066 (CNCM 1-1631) и DN 030 087 (CNCM 1-2807), для применения при лечении или профилактике нарушения пищеварения.
В варианте осуществления указанное применение используется для ингибирования роста патогенных микроорганизмов, предпочтительно патогенных бактерий семейства Enterobacteriaceae, и/или улучшения целостности эпителиального барьера кишечника.
Указанный патогенный микроорганизм предпочтительно выбирают из группы, включающей роды Escherichia, Salmonella, Listeria, Campylobacter, Shigella, Proteus (например, P. mirabilis) и Klebsiella, предпочтительно из группы, состоящей из видов E. coli, L. monocytogenes и S. enteritidis.
Указанное расстройство пищеварительного тракта может представлять собой, в частности, желудочный или кишечный дискомфорт; желудочную или кишечную инфекцию; диарею, запоры; IBS; PI-IBS или IBD (т.е. болезнь Крона и/или неспецифический язвенный колит).
Настоящее изобретение также предоставляет мутантный штамм Lactococcus lactis, полученный из штамма DN 030 066 или штамма DN 030 087 путем мутагенеза или генетической трансформации этого для ингибирования роста патогенных микроорганизмов, предпочтительно патогенных Enterobacteriaceae, и/или улучшения целостности эпителиального барьера кишечника, при лечении или профилактике нарушения пищеварения, как определено выше.
Указанный мутантный штамм Lactococcus lactis можно получить путем мутирования одного или нескольких эндогенных(ого) генов(а) штамма DN 030 066 или штамма DN 030 087, например для того, чтобы изменить некоторые его свойства (например, его способность ферментировать сахара, его устойчивость к кислотности, его выживание при транспорте в желудочно-кишечном тракте или его выживание после ацидификации). Это также может быть мутантный штамм, полученный в результате генетической трансформации штамма DN 030 066 или штамма DN 030 087 одним или несколькими представляющими интерес генами(ом), например для того, чтобы предоставить указанному штамму дополнительные физиологические особенности.
Указанные штаммы могут быть использованы в виде целых бактерий, которые могут быть мертвыми или живыми, предпочтительно живыми.
Настоящее изобретение также предоставляет фракцию клеток или метаболит, полученные из штамма DN 030 066 или штамма DN 030 087, для ингибирования роста патогенного микроорганизма, предпочтительно патогенных бактерий семейства Enterobacteriaceae, и/или улучшения целостности эпителиального барьера кишечника, при лечении или профилактике нарушения пищеварения, как определено выше.
Указанная фракция клеток может представлять собой, например, фракцию клеточной стенки, цитоплазматическую фракцию или культуральный супернатант или фракцию этого.
Указанный метаболит может представлять собой, например, короткоцепочечные жирные кислоты, пептиды (например, бактериоцины) и/или соединения, образующиеся в процессе ферментации штаммов DN 030 066 или DN 030 087.
Настоящее изобретение также предоставляет композицию, содержащую
- штамм Lactococcus lactis, выбранный из группы, состоящей из штаммов DN 030 066 (CNCM 1-1631) и DN 030 087 (CNCM 1-2807), как определено выше, или
- мутантный штамм Lactococcus lactis, как определено выше, или
- клеточную фракцию или метаболит, полученные из штамма DN 030 066 или штамма DN 030 087, как определено выше,
для ингибирования роста патогенного микроорганизма, предпочтительно патогенной бактерии семейства Enterobacteriaceae, и/или улучшения целостности эпителиального барьера кишечника, при лечении или профилактике нарушения пищеварения, как определено выше.
Указанная композиция может включать, по меньшей мере, один другой штамм Lactococcus lactis, отличный от штаммов, которые определены выше, и/или, по меньшей мере, одни молочнокислые бактерии видов, отличных от Lactococcus lactis, таких как молочнокислые бактерии рода Lactobacillus или Bifidobacterium.
Указанная композиция может быть в любой форме, пригодной для введения, в частности, перорального введения. Она включает в себя, например, твердые вещества, полутвердые вещества, жидкости и порошки. Жидкая композиция, как правило, является предпочтительной для облегченного введения, например, в виде напитков.
5
13
6
7
8
9
7
12
5
6
7
9
Указанная композиция может включать от 10 до 10 колониеобразующих единиц (cfu), по меньшей мере, одного штамма L. lactis или мутантного штамма L. lactis, как определено выше, предпочтительно, по меньшей мере, 10 cfu, более предпочтительно, по меньшей мере, 10 cfu, еще более предпочтительно, по меньшей мере, 10 cfu и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 10 cfu на грамм сухой массы состава. В случае жидкой композиции это соответствует, как правило, 10-10 колониеобразующих единиц (cfu), предпочтительно, по меньшей мере, 10 cfu, более предпочтительно, по меньшей мере, 10 cfu, еще более предпочтительно, по меньшей мере, 10 cfu и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 10 cfu/мл.
Указанная композиция может представлять собой пищевой продукт или фармацевтический продукт.
Указанная композиция также может представлять собой молочный продукт или ферментированный продукт, предпочтительно ферментированный молочный продукт, такой как кисломолочный продукт, или ферментированный продукт из молочной сыворотки.
Ферментированный продукт может быть представлен в виде жидкости или представлен в виде сухого порошка, полученного путем высушивания ферментационной жидкости.
Введение в виде ферментированного молочного продукта имеет дополнительное преимущество - низкий уровень лактозы, что является дополнительным преимуществом для исправления расстройства пищеварения, как определено выше.
Указанный ферментированный продукт может представлять собой свежий продукт. Свежий продукт, который не подвергался стадии глубокой термообработки, имеет преимущество в том, что присутствующие штаммы бактерий находятся в живом виде.
Указанный кисломолочный продукт может представлять собой йогурт или кислое молоко в установленной, перемешанной или питьевой форме или сыр.
Указанный кисломолочный продукт также может представлять собой ферментированный овощной продукт, такой как ферментированные соевые, крупы и/или фрукты в установленной, перемешанной или питьевой форме.
В другом варианте осуществления указанная композиция представляет собой продукт детского питания, детскую молочную смесь или детскую последующую смесь.
В другом варианте осуществления указанная композиция представляет собой нутрицевтик или питательную добавку.
Питательные композиции по изобретению также включают пищевые добавки и функциональные продукты питания.
Как используется в настоящем документе, «пищевая добавка» относится к продукту, полученному из соединений, обычно используемых в пищевых продуктах, но которые находятся в форме таблеток, порошка, капсул, порций или в любой другой форме, как правило, не связанной с продуктами питания, и которые оказывают благотворное влияние на здоровье.
Как используется в настоящем документе, «функциональные продукты питания» представляют собой продукты питания, которые также благотворно влияют на здоровье. В частности, пищевые добавки и функциональные продукты питания могут оказывать физиологический эффект - защитный или лечебный - в отношении болезни, например, в отношении хронического заболевания.
Указанная композиция предназначена предпочтительно для применения людьми, включая, в частности, младенцев, лиц пожилого возраста и субъектов, страдающих разбалансировкой метаболизма, например, субъектов, страдающих ожирением.
Настоящее изобретение также предоставляет способ получения мутантного штамма Lactococcus lactis, способного ингибировать рост патогенного микроорганизма, предпочтительно патогенных Enterobacteriaceae, и/или улучшать целостность эпителиального барьера кишечника, включающий стадию мутагенеза или генетической трансформации штамма Lactococcus lactis, выбранного из группы, состоящей из штаммов DN 030 066 (CNCM 1-1631) и DN 030 087 (CNCM 1-2807).
Способы мутагенеза или генетической трансформации штамма Lactococcus lactis хорошо известны любому специалисту в рассматриваемой области.
Настоящее изобретение также предоставляет штамм Lactococcus lactis, отличающийся тем, что он является штаммом, депонированным в CNCM под номером 1-2807.
Указанный штамм способен ингибировать рост патогенного микроорганизма, предпочтительно патогенной Enterobacteriaceae, как определено выше, и/или улучшать целостности эпителиального барьера кишечника.
Настоящее изобретение также предоставляет композицию, включающую штамм Lactococcus lactis CNCM 1-2807.
Настоящее изобретение также предоставляет штамм Lactococcus lactis CNCM 1-2807 или композицию, содержащую указанный штамм, для применения в качестве лекарственного средства.
Настоящее изобретение также предоставляет способ лечения или предупреждения нарушения пищеварения, как определено выше, у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение штамма L. lactis или композиции, как определено выше, указанному субъекту.
Помимо вышеперечисленных особенностей изобретение включает другие особенности, которые будут выявлены из последующего описания, которое относится к примерам, иллюстрирующим противопатогенную активность и активность по трансэпителиальному электрическому сопротивлению (TEER) штаммов DN 030 066 и DN 030 087.
ПРИМЕР 1: ОЦЕНКА ПРОТИВОПАТОГЕННЫХ АКТИВНОСТЕЙ ШТАММА L. LACTIS DN 030 066
Противомикробную активность в отношении Salmonella enteritidis B1241, Listeria и патогенной E. coli определяли в перекрывающихся тестах. Три штамма Lactococcus lactis оценивались в этом тесте: штамм в соответствии с настоящим изобретением DN 030 066, Lactococcus lactis subsp. lactis DSMZ 20729 и Lactococcus lactis subsp. cremoris DSMZ 4645, описанные ранее в качестве штаммов-продуцентов бактериоцина (соответственно низина и лактицина) (Bartoloni et al., 2004 и Park et al, 2003).
Штаммы L. lactis высевали из замороженных стоков на свежие чашки с агаризованной средой при помощи репликатора. Чашки выращивали в течение ночи, пока не появлялись видимые колонии. Затем верхний агар, содержащий питательную среду с экстрактом из мозга-сердца, и разведение выделенных патогенных микроорганизмов выливали на чашки с агаризованной средой. Чашки инкубировали при 37°C. На следующий день измеряли диаметры зон ингибирования патогенных микроорганизмов.
Балльная оценка 1 соответствует диаметру от 1 до 3 мм, балльная оценка 2 - диаметру от 4 до 6 мм и балльная оценка 3 - диаметру более 6 мм. Эксперименты проводились на трех различных средах: MRS (De Man Rogosa and Sharpe), Elliker и TGV (Триптон-глюкоза-мясной экстракт). Каждый эксперимент проводили независимо в трех повторностях. Балльные оценки, полученные для каждой среды, суммировали выявления конкретной балльной оценки для каждого штамма и каждого патогенного микроорганизма. Затем суммировали балльные оценки, полученные для каждого патогенного микроорганизма, чтобы получить для каждого штамма общую оценку противомикробной активности. Результаты показаны в таблице 1 ниже.
Таблица 1
Антимикробная активность выбранных штаммов Lactococcus lactis
Виды
Ссылка
E. coli
L.monocytogenes
S.enteritidis
Общая противомик-робная балльная оценка
L.lactis subsp. lactisDN 030 066
PCTзаявкаWO 97/16529
3
8
4
15
L.lactis subsp. lactisDSMZ 20729
Harris et al.,1992
3
7
2
2
L.lactis subsp. cremoris DSMZ 4645
Ryan et al.,1996
1
1
2
14
Приведенные выше результаты показывают, что штамм в соответствии с изобретением DN 030 066 обладает противомикробной активностью, превосходящей активности двух штаммов Lactococcus lactis, известных тем, что они обладают противопатогенной активностью.
ПРИМЕР 2: TEER-ОЦЕНКИ ШТАММОВ L. LACTIS DN 030 066 И DN 030087
Целостность кишечного барьера можно оценивать путем измерения разности потенциалов, наблюдаемой между апикальной и базальной сторонами монослоя клеток T84. Эта экспериментальная модель называется трансэпителиальное электрическое сопротивление (TEER) (Hirotani et al., 2008).
Суспензии культур различных штаммов бактерий промывали PBS. Затем бактерии (100 cfu/клетку) добавляли к апикальной части монослоя клеток T84. В анализе были протестированы 96 штаммов, в том числе 64 Bifidobacteria, 32 Lactobacilli и 2 Lactococcus lactis (DN 030 0664 и DN 030 087). Через 4 ч и 6 ч инкубации с различными бактериями определяли значение TEER, чтобы оценить эпителиальную барьерную функцию. Все эксперименты проводили три раза независимо и в трех повторностях. Значение клеток T84 при t=0 было принято за 100%. Результаты для 7 штаммов, имеющих высшее значение TEER, приведены в таблице 2 ниже.
Таблица 2
Оценка TEER выбранных штаммов бактерий
Штаммы
Ссылка
TEER (%) при t=4 ч
TEER (%) при t=4 ч
L.lactisDN 030 066
PCT заявкаWO 97/16529
110,90
113,94
L.lactisDN 030 087
Настоящее изобретение
108,54
102,79
L.rhamnosusLGG ATCC 53103
ПатентUS 4839281
96,94
101,43
L.acidophilus LA1
Link-Amster et al., 1994
93,29
100,78
T84 клетки (контроль)
100
100,49
Bifidobacteriumlongum NCC2705
PCT заявкаWO 2002/074798
99,83
94,87
BifidobacteriumLongum W11
ПатентEP 1609852
100,81
87,68
BifidobacteriumLongum BB536
Патентная заявкаJP 2006081429
87,50
77,89
Вышеприведенные результаты показывают, что штаммы в соответствии с изобретением DN 030 0664 и DN 030 087 улучшают целостность эпителиального барьера по сравнению с известными штаммами (включающими штаммы, обладающие противовоспалительной активностью).
ССЫЛКИ