Использование новых производных бетулина в комбинации с ремантадином для ингибирования репродукции вируса гриппа

e

Использование новых производных бетулина в комбинации с ремантадином для ингибирования репродукции вируса гриппа

О. В. САВИНОВА, Н. И. ПАВЛОВА, Е. И. БОРЕКО

Институт эпидемиологии и микробиологии Минздрава Республики Беларусь, Минск

New Betulin Derivatives in Combination with Rimantadine for Inhibition of Influenza Virus Reproduction

O. V. SAVINOVA, N. I. PAVLOVA, E. I. BOREKO

Institute of Epidemiology and Microbiology of the Ministry of Health of the Byelorussian Republic, Minsk

В предварительных исследованиях установлена в основном сравнимая ингибирующая активность 3-оксима бетулоновой кислоты, 30-О-ацетил-28-О-гемифталата бетулина и 3,28-диоксима бетулина в отношении репродукции вирусов гриппа А (H1N1), А (H7N1), А (H3N2) и В, а также в отношении штаммов вируса гриппа А (H1N1), природноустойчивого к действию ремантадина, и вируса А (H7N1) с приобретенной устойчивостью к этому препарату. Степень установленной активности варьировала в зависимости от использованной системы для репродукции вирусов и была наиболее высока в условиях, обеспечивающих более высокую пермиссивность — в культуре клеток фибробластов эмбрионов кур (ФЭК) для вируса А (H7N1) и в фрагментах хорионаллантоисных оболочек (ХАО) куриных эмбрионов (для всех вирусов). При выполнении настоящей работы в экспериментах с вирусом A/FPV/Rostock/34 (H7N1) на ФЭК среднеэффективные концентрации (ЕС50) названных тритерпеновых соединений составили 10,4-17,5 мкМ в сравнении с ЕС50 ремантадина — 0,014 мкМ. Комбинированное использование каждого из этих веществ с ремантадином сопровождалось снижением величины их ЕС50 в 2—16 раз, а также коррекцией зависимости «концентрация-эффект» ремантадина, у которого при индивидуальном использовании в верхнем диапазоне нетоксических концентраций (11,6—57,6 мкМ) противовирусные свойства существенно снижены. В результате разность титра вируса в сравнении с контролем в этом диапазоне концентраций ремантадина возросла с <1 до >2,35 lg БОЕ/мл, отношения максимальной переносимой концентрации веществ к их ЕС50 увеличились в 1,7—15,9 раз.

Ключевые слова: вирусы гриппа, производные бетулина, ремантадин, комбинации.

The preliminary studies mainly revealed comparable inhibition activities of 3-oxime of betulonic acid, 3^-O-acetyl-28-O-hemiph-thalate of betulin and 3,28-dioxime of betulin against reproduction of influenza viruses A (H1N1), A (H7N1), A (H3N2) and B, as well as against the strains of influenza virus A (H1N1) with intrinsic resistance to rimantadine and A (H7N1) with acquired resistance to the drug. The level of the activity depended on the system used for the virus reproduction. The highest level was observed under conditions providing higher permissibivity, i.e. in the chick embryo fibroblast cell culture for A (H7N1) and in fragments of chick embryo chorioallantoic membranes (for all the viruses). In the experiments with virus A/FPV/Rostock/34 (H7N1) in the chick embryo fibroblast cell culture the average effective concentrations (EC50) of the triterpene compounds were 10.4—17.5 mcM in comparison to EC50 of rimantadine (0.014 mcM). The use of every of the compounds in combination with rimantadine resulted in a 2-16 times decrease of their EC50 and correction of the concentration-effect relation of rimantadine. However, when rimantadine was used alone within the higher range of the nontoxic concentrations (11.6—57.6 mcM). its antiviral properties were significantly less pronounced. As a result the virus titer difference in comparison to the control within the above range of the rimantadine concentrations increased from < 1 to > 2.35 lg PPU/ml and the relations of the maximal tolerance concentrations of the compounds to their EC50 increased 1.7—15.9 times.

Key words: influenza viruses, betulin derivatives, rimantadine, combinations.

Противогриппозные препараты, представленные производными адамантана (амантадин и ремантадин — ингибиторы М2 белка вирусов гриппа А), применяются в лечении и экстренной профилактике гриппа уже не одно десятилетие.

Недостатком амантадина и ремантадина изначально считалась неэффективность при профилактике гриппа В, хотя лечебный эффект при

© Коллектив авторов, 2009

Адрес для корреспонденции: 220114, Минск, ул. Филимонова, 23. НИИ эпидемиологии и микробиологии.

данной разновидности инфекции доказан. Позднее проблемой первого плана явилась природная устойчивость значительной части циркулирующих возбудителей гриппа А, а также стало известно о возможности быстрого появления лекарственно-устойчивых вариантов вируса и снижении эффективности применения препаратов в коллективах, где они первоначально использовались для лечения первых заболевших.

Согласно данным СБС, в США устойчивость вирусов гриппа А к амантадину и ремантадину

О

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

возросла с 1,9% в сезон 2003—2004 гг. до 11% в сезон 2004—2005 гг. С октября 2005 г. по январь 2006 г. среди 120 изолятов вируса гриппа А (Н3Ш) из 23 штатов 109 (91%) были устойчивы к ингибиторам М2 белка. Исследованные вирусы гриппа А (Н1Ш) не имели мутаций, связанных с устойчивостью к этим препаратам [1]. Снижение эффективности производных адамантана по причине резистентности возбудителя обеспокоило мировую общественность настолько, что их использование было отменено в некоторых странах. Призывы к отмене использования производных адамантана в качестве противогриппозных препаратов имеются также в публикациях российских авторов [2]. Однако более поздние сообщения СБС по состоянию на январь 2007 г. свидетельствуют о снижении уровня резистентности к данной группе средств (с 92% в 2005 г. до 44% среди вирусов подтипа А (Н3Ш) и с 15,5% в 2005—2006 гг. до 3% среди вирусов А (Н1Ш) [3].

Лекарственная устойчивость вирусов гриппа к средствам группы ингибиторов М2 белка послужила лишь поводом для такой радикальной меры как отказ от применения препаратов, а основной её причиной явилось появление на рынке новых лекарственных средств — ингибиторов нейрами-нидазы вирусов гриппа (занамивир, оселтами-вир). Ингибиторы нейраминидазы эффективны при гриппе А и гриппе В, и первоначально казалось, что применению этих препаратов не будет препятствовать проблема лекарственной устойчивости. Однако позднее при более детальном изучении эффективности препаратов этого ряда было установлено, что резистентность вирусов гриппа к ним развивается не менее быстро, и часть популяции циркулирующих штаммов вируса исходно нечувствительна к действию препаратов. Так, на основе анализа более 4 тыс. изолятов вирусов гриппа, циркулировавших в период 2004—2008 гг., установлено, что наиболее распространённые вирусы гриппа А (Н1Ш) в среднем в

2 раза менее чувствительны к действию оселтами-вира, чем вирусы А (Н3Ш), а вирусы гриппа В менее чувствительны в 8 раз [4]. Вирусы птичьего гриппа Н5Ш, выделенные в 2005 г. в Камбодже, оказались в 6 раз менее чувствительны к оселта-мивиру в сравнении с изолятами 2004 г., а вирусы, выделенные в Индонезии — в 30 раз [5]. Устойчивость вирусов гриппа А (Н1Ш) к оселтамивиру в прошедшем эпидемическом сезоне (2006—2007 гг.) была наиболее высока в Европе (усреднённый показатель — 25%), в том числе в Норвегии — 66,5% и во Франции — 46,6% [6]. Эти данные разительно отличаются от результатов, полученных в предыдущих сезонах (от 0 до <1%).

На фоне этой информации отношение к применению противогриппозных препаратов ада-мантанового ряда может быть не столь категорич-

ным, тем более что в отличие от ингибиторов нейраминидазы, которые массового применения в странах СНГ пока еще не находят, они не так дороги.

Лекарственная устойчивость возбудителей вирусных инфекций к противовирусным препаратам является их общим недостатком. Это вызывает необходимость реализовывать новые подходы к ингибированию репродукции вирусов и создавать новые препараты. Вместе с тем преодоление резистентности вирусов возможно при использовании сочетаний препаратов и веществ, обладающих различным механизмом противовирусного действия. В свете современных научных представлений комбинированной терапии вирусных инфекций отводится главенствующая роль.

Относительно новой группой ингибиторов вирусов являются природные и синтетические соединения тритерпенового ряда, в частности производные бетулина, бетулиновой и бетулоно-вой кислот. Наряду с противовирусной активностью в отношении вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) и вируса герпеса простого, уже описанной в мировой литературе для бетулино-вой кислоты и ее производных, нами обнаружена способность многих соединений этого ряда подавлять репродукцию вируса гриппа [7]. Среди них — 3-оксим бетулоновой кислоты, 3^-О-аце-тил-28-О-гемифталат бетулина и 3,28-диоксим бетулина, которые исследованы более детально в сравнении с известными противогриппозными препаратами, ремантадином и оселтамивир фосфатом (тамифлю) на культурах клеток фибробла-стов эмбрионов кур (ФЭК), почек собак (МБСК), а также на фрагментах хорионалланто-исных оболочек (ХАО) куриных эмбрионов в отношении репродукции ряда вирусов гриппа А и В. Установлены противовирусные свойства три-терпеновых соединений в отношении вирусов гриппа А (Н1Ш), А (Н3Ш) и В, а также в отношении штаммов вируса гриппа А (Н1Ш), природноустойчивого к действию ремантадина, и вируса А (Н7Ш) с приобретенной устойчивостью к этому препарату. Новые вещества проявляли в целом сравнимую противовирусную активность в экспериментах со всеми использованными вирусами и существенно проигрывали в выраженности эффекта препаратам сравнения, особенно ремантадину. Степень установленной активности в соответствии со схемой оценки [8, 9] варьировала от высокой до слабой в зависимости от использованной системы для репродукции вирусов и была наиболее высока в условиях, обеспечивающих более высокую пермиссивность: ФЭК для вируса А (Н7Ш) и ХАО — для всех вирусов. Более подробно эти результаты представлены в нашей публикации [10].

О

e

Вирусингибирующее действие 3-оксима бетулоновой кислоты

Второе соединение (препарат) EC50 (I95), EC,S (I95), мкМ

IV VI XVII ремантадин

— 10,4

40,6

+ 0,1 мкг/мл ремантадина (0,46 мкМ) 2,8 (3,4+3,0) 4,7 (6,0+3,8) 1,1 (2,1+0,6) —

5,5

+ 3 мкг/мл IV

1,0

+ 6 мкг/мл VI

0,55

+ 6 мкг/мл XVII

7,8

Примечание. 195 - доверительный интервал, н.и. - не исследовали.

Целью настоящей работы явилось исследование возможности сложения или взаимоусиления противовирусного эффекта при комбинированном использовании новых соединений с ремантадином.

Результаты и обсуждение

Материал и методы

Новые тритерпеновые производные (3-оксим бетулоновой кислоты, 3/3-0-ацетил-28-0-гемифталат бетулина и 3,28-диоксим бетулина) синтезированы в Институте органической химии УНЦ РАН (Уфа). Ремантадин приобретён в аптечной сети. Оригинальные вещества предварительно растворяли в 10% этаноле, ремантадин — в бидистиллированной воде, и затем из этих растворов (1 мг/мл) готовили двукратные последовательные разведения на среде поддержки (среда 199, Sigma Chemical Co.).

Исследование противовирусной активности сочетаний тритерпеновых соединений и ремантадина выполняли с использованием метода редукции бляшек. Монослойную культуру фибробластов эмбрионов кур (ФЭК) выращивали в течение 48 ч во флаконах из суспензии клеток, полученных измельчением эмбрионов и обработкой 0,25% раствора трипсина, отмывали от питательной среды, инфицировали 0,01—0,00001 БОЕ/кл вируса путем нанесения вируссодержащей суспензии в объёме 0,1 мл на 1 ч при 37°С. Затем жидкость удаляли и клетки покрывали расплавом питательной среды на основе концентрата среды 199 с добавлением 1% бактагара и 0,005% нейтрального красного (все реагенты производства фирмы Sigma) и исследуемых соединений в различных концентраций. После застывания покрытия флаконы помещали в термостат на 36 ч и затем подсчитывали количество бляшек, видимых благодаря присутствию в покрытии витального красителя. На основе количества бляшек вычисляли титр вируса в присутствии исследуемых веществ и в контроле. Критерием противовирусного действия считали наличие различий в сравнении с контролем вируса. На основании значений титра вируса в присутствии ряда последовательно уменьшающихся концентраций веществ вычисляли 50 и 95% эффективные концентрации (EC50 и EC95 соответственно) и отношение максимально переносимой концентрации к ЕС50 и ЕС95. ЕС50 и ЕС95 вычисляли с использованием компьютерной программы K. P. Fung [11], основанной на пробит-анализе и взвешенной линейной регрессии. Максимально переносимую концентрацию (МПК) определяли как максимальную концентрацию веществ, не оказывающую влияния на морфологию неокрашенной культуры клеток и не вызывающую нарушения поглощения ею витального красителя за время инкубации.

Характер наблюдаемого действия оценивали на основе фракционного индекса ингибирования (ФИИ): ФИИ = ЕС50 препарата «А» в комбинации/EC50 препарата «А» в отдельности + EC50 препарата «Б» в комбинации/EC50 препарата «Б» в отдельности [12].

При исследовании сочетаний каждого из три-терпеновых соединений с ремантадином, чтобы иметь возможность вычислить количественные показатели установленного противовирусного действия, использовали два варианта постановки экспериментов, предусматривающих использование одного из веществ сочетания в фиксированной концентрации, а второго вещества — в нескольких концентрациях, и наоборот: первого вещества — в нескольких концентрациях, а второго — в одной фиксированной концентрации.

Результаты выполненных исследований приведены в таблице. Установлено, что совместное использование каждого из тритерпеновых соединений с ремантадином приводит к увеличению их противовирусного действия, выражающемуся в уменьшении величин ЕС50 и ЕС95. Активность

3 -оксима бетулоновой кислоты в присутствии 0,1 мкг/мл ремантадина возросла в 4—7 раз, 3в-О-ацетил-28-О-гемифталата бетулина — в 1,4—3 раза, 3,28-диоксима бетулина — в 2—16 раз.

Если судить по величине ЕС50 ремантадина, его активность в присутствии 3-оксима бетулоновой кислоты возросла в 1,7 раз, 3в-О-ацетил-28-О-гемифталата бетулина — в 2 раза, в присутствии 3,28-диоксима бетулина — в 12 раз.

Вычисленные значения ФИИ сочетаний три-терпеновых соединений с ремантадином составили: 0,8 в случае использования 3-оксима бетулоновой кислоты или 3в-О-ацетил-28-О-гемифталата бетулина и 0,15 — для 3,28-диоксима бетулина. Поскольку эти значения меньше 1, все они свидетельствуют о синергизме комбинированного использования исследованных новых веществ и ремантадина.

Уменьшение ЕС95 ремантадина в присутствии тритерпеноидов было не столь отчетливым, что может быть связано с широким диапазоном концентраций ремантадина с высоким (более 1,25 1§ БОЕ/мл) снижением титра вируса и большой погрешностью вычисления этой величины, и имело

-о-

е

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

Рис. 1. Репродукция вируса гриппа А/FPV (H7N1) в культуре фибробластов эмбрионов кур в присутствии изучаемых веществ.

К+!У - ремантадин + 3 мкг/мл (6,4 мкМ) 3-оксима бетулоновой кислоты;

К+У! - ремантадин + 6 мкг/мл (9,5 мкМ) 3/в-О-ацетил-28-О-гемифталата бетулина;

К+ХУ!! - ремантадин + 6 мкг/мл (12,8 мкМ) 3,28-диок-сима бетулина;

К - ремантадин;

IV - 3-оксим бетулоновой кислоты;

V! - 3/в-О-ацетил-28-О-гемифталат бетулина;

XV!! - 3,28-диоксим бетулина.

По оси ординат - снижение титра вируса в сравнении с контролем, 1д БОЕ/мл; по оси абсцисс - концентрация ремантадина или тритерпеновых соединений (при индивидуальном применении), мкМ.

место с 3-оксимом бетулоновой кислоты (в 2,8 раз) и 3в-О-ацетил-28-О-гемифталатом бетулина (в 5 раз), но не с 3,28-диоксимом бетулина. Позитивным моментом сочетанного использования ремантадина и тритерпеновых соединений является «исправление» дозовой зависимости эффекта ремантадина в верхней части диапазона нетоксичных концентраций (рис. 1).

Как видно из данных, представленных на рис. 1, противовирусные свойства ремантадина без дополнения тритерпеновыми соединениями в концентрациях выше 6,9 мкМ (1,5 мкг/мл) существенно снижены. Выход на «плато» линий, отражающих эффект комбинаций ремантадина с тритерпеноидами в верхнем диапазоне концентраций, объясняется ограниченным количеством разведений вируса, использованных при постановке экспериментов.

Следует отметить, что не всякое сочетание с препаратами, даже с кардинально различающимся механизмом противовирусного действия, приводит к устранению данной особенности ремантадина. В частности, ранее авторами настоящей работы установлено, что одновременное присутствие рибавирина в целом не меняет характер зависимости «доза — эффект» ремантадина [13].

Рис. 2. Увеличение диапазона нетоксичных концентраций с противовирусным действием (МПК/ЕС50) при сочетанном применении веществ.

3 ~ одно соединение или препарат;

1 I - комбинация.

а - производные бетулина:

1- 3-оксим бетулоновой кислоты;

2 - 3в-О-ацетил-28-О-гемифталат бетулина;

3- 3,28-диоксим бетулина и их комбинации с ремантадином. б:

1 - ремантадин;

2 - комбинации ремантадина с 3-оксимом бетулоновой кислоты;

3 - с 3в-О-ацетил-28-О-гемифталатом бетулина;

4 - с 3,28-диоксимом бетулина.

Диапазоны нетоксичных концентраций исследованных веществ и их комбинаций отражены на рис. 2. Полученные данные свидетельствуют о вза-имоусилении противовирусного действия исследованных тритерпеновых соединений и ремантадина и являются, таким образом, экспериментальной основой перспективы комбинированного использования известного препарата и новых соединений. Оба типа веществ, амантадин и ремантадин (ингибиторы М2 белка вируса гриппа) и тритерпеновые соединения (ингибитор слияния ВИЧ на примере бетулиновой кислоты и ее производных [14—16]), в общих чертах воздействуют на начальные и/или заключительные стадии репродукционного цикла вируса. Полученные нами данные позволяют полагать, что в деталях точки их приложения, вероятнее всего, различаются.

Выводы

1. Совместное использование новых тритерпеновых соединений — 3-оксима бетулоновой кислоты, 3в-О-ацетил-28-О-гемифталата бетулина или

е

3,28-диоксима бетулина с ремантадином приводит к увеличению противовирусного действия в отношении вируса гриппа, выражающемуся в уменьшении величин ЕС50 и ЕС95 веществ от 2 до 16 раз.

2. Согласно вычисленным значениям фрак-ционального индекса ингибирования (менее 1) характер противовирусного действия при комбинированном использовании исследованных новых веществ с ремантадином может быть расценен как синергический.

ЛИТЕРАТУРА

1. Conly J. M, Johnston B. L. Ode to oseltamivir and amantadine? Can J Infect Dis Med Microbiol 2006: 17: 1: 11—14.

2. Гендон Ю. 3. Вакцины и химиопрепараты для профилактики гриппа. Вопр вирусол 2007; 52: 1: 4—10.

3. Deyde V. M, Gubareva I. V., Xu X. et al. Surveillance of resistance to amantadines among influenza A (H2N2) and A (H1N1) viruses isolated worldwide (2005-2007). Цит. по: Ротанов М., Гребенникова Т. В., Бурцева Е. И., Шевченко Е. С. Молекулярно-генетический анализ эпидемических штаммов вируса гриппа А, характеризующихся различной чувствительностью к римантадину, на основе нуклеотидной последовательности М2 белка. Клин микробиол антимикроб химиотер 2007; 9: 4: 369—374.

4. Sheu T. G, Deyde V. M., Okomo-Adhiambo M. et al. Surveillance for neuraminidase inhibitor resistance among human influenza A and B viruses circulating worldwide in 2004—2008. Antimicrob Agents Chemother 2008; 52: 9: 3284—3292.

5. McKimm-Breschkin J. L., Sellek P. W., Usman T. B., Johnson M. A. Reduced sensitivity of influenza A (H5N1) to oseltamivir. Emerg Infect Dis 2007; 13: 9: 1354—1357.

6. Rameix-Welti M.-A.., Enouf V., Culevier F. et al. Enzymatic properties of the neuraminidase of seasonal H1N1 influenza viruses provide insights for the emergence of natural resistance to oseltamivir. PLOS Pathogens 2008; 4: 7: 1—5.

7. Boreko E. I., Pavlova N. I., Savinova O. V. et al. Inhibition of virus reproduction and proteinase activity by lupane and some other terpenes. News of Biomed. Sci. (Весщ НАН Беларусь Сер. Мед-биол. навук), 2002; 3: 86—90.

3. Феномен снижения противовирусного действия ремантадина с увеличением концентрации выше 6,9 мкМ не имеет места в присутствии суб-ингибиторных концентраций (ниже ЕС50) 3-окси-ма бетулоновой кислоты, 3в-О-ацетил-28-О-ге-мифталата бетулина или 3,28-диоксима бетулина.

Работа выполнена при финансовой поддержке БРФФИ (проект № Б07-62).

8. Вотяков В. И. Актуальные задачи в научной разработке соединений с антивирусными свойствами. Молекулярн. биол. вирусов, химиотерапия и химиопрофилактика вирусн. инфекций: Мат. объед. сессии отд. гигиены, микробиол. и эпидемиол. Минск, 1974; 10—28.

9. Вотяков В. И., Бореко Е. И., Владыко Г. В. и др. Первичное изучение антивирусных свойств синтетических и природных соединений: Метод рек. Минск, 1986; 26.

10. Савинова О. В., Павлова Н. И., Бореко Е. И. Активность тритерпено-вых соединений и известных противогриппозных препаратов в отношении вирусов гриппа. Здравоохранение (Минск), 2008; 11: 65—67.

11. Fung K. P. A computer program in basic for estimation of ED50 and LD50. Comput Biol Med 1989; 19: 2: 131—135.

12. Janz C., Wigand R. Combined interaction of antiherpes substances and interferon beta on the multiplication of herpes simplex virus. Arch. Virol 1982; 73: 135—143.

13. Бореко Е. И., Павлова H. И., Вотяков В. И. Изменение чувствительности вируса гриппа, размножившегося в присутствии ремантадина, к противовирусным препаратам. Вопр вирусол 1999; 3: 115-119.

14. Aiken C., Ho C. C. Betulinic acid derivatives as HIV-1 antivirals. Trends in Mol. Med 2005; 11: 1: 31—36.

15. Huang L., Yuan X., Aiken C., Chen C. H. Bifunctional anti-human immunodeficiency virus type I small molecules with two novel mechanisms of action. Antimicrob Agents Chemother 2004; 48: 2: 663—665.

16. Kanamoto T., Kashiwada Y., Kanbara K. et al. Anti-human immunodeficiency virus activity of YK-FH312 (a betulinic acid derivative), a novel compound blocking viral maturation. Ibid; 2001; 45: 4: 1225—1230.