СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНАЛИТИЧЕСКОЙ ТЕСТ-СИСТЕМЫ НА ОСНОВЕ СУСПЕНЗИОННЫХ МИКРОЧИПОВ ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ МАРКЕРОВ ЗАБОЛЕВАНИЙ
METHOD FOR OBTAINING OF ANALYTICAL TEST SYSTEM BASED ON SUSPENSION MICROCHIPS FOR DISEASES MARKERS DETECTION

Изобретение относится к области медицинских исследований методами проточной цитометрии с применением суспензионных микрочипов. Предлагаемый способ служит для получения тест-системы, позволяющей детектировать и количественно определять множество различных белковых маркеров заболеваний, например онкологических заболеваний женской репродуктивной системы, методами проточной цитометрии на стандартных проточных цитометрах.
Известен способ создания тест-системы на основе популяций спектрально кодированных микросфер для одновременного определения различных аналитов [1]. Для спектрального кодирования микросфер применяют не менее двух органических флуоресцентных красителей различного спектра флуоресценции, нанесенных в разных пропорциях на микросферы. При этом флуоресцентные красители наносят на микросферы путем их осаждения на поверхности микросфер из раствора, содержащего не менее двух органических красителей. На поверхность описанных микросфер методом пассивной адсорбции или ковалентного конъюгирования наносят биологические распознающие молекулы, аффинные к детектируемым маркерам заболеваний. Описанный способ позволяет создать тест-систему, содержащую как минимум 64 различные популяции микросфер, имеющих различные флуоресцентные коды, для одновременной детекции различных маркеров заболеваний. Недостатками упомянутого выше способа являются, во-первых, применение органических флуоресцентных красителей, которые имеют малое время высвечивания флуоресцентного сигнала, а также различную эффективность возбуждения при заданной длине волны, а во-вторых, т.к. флуоресцентные красители наносятся методом осаждения из раствора, то невозможно провести разделение флуоресцентных красителей в пространстве для более прецизионного оптического кодирования.
Способ, наиболее близкий к предлагаемому, описанный в патенте [2], был взят за прототип. Оптическое кодирование микросфер в прототипе осуществляется использованием флуоресцентных красителей различного спектра испускания флуоресценции, а также применением микросфер различного диаметра. Стоит отметить, что в указанном прототипе для спектрального кодирования каждой отдельной популяции микросфер применяется флуоресцентный краситель одного определенного спектра испускания, и использованы микросферы, покрытые слоем золота, для усиление флуоресцентного сигнала красителей для обеспечения более чувствительного обнаружения маркеров. В качестве биологических распознающих молекул, конъюгированных с поверхностью микросферы, применены антитела, антигены, нуклеиновые кислоты, карбогидраты или связывающие белки. При этом для флуоресцентного мечения детектирующих компонент и микросфер применены флуоресцентные красители, испускающие в ближней инфракрасной области спектра. К недостаткам описанного выше способа стоит отнести то, что для флуоресцентного мечения микросфер одновременно используется всего один флуоресцентный краситель, что значительно сокращает количество различных цветовых кодов и ограничивает количество одновременно детектируемых различных маркеров, а также применение флуоресцентных красителей, флуоресцирующих в ближней инфракрасной области спектра, флуоресценция которых может детектироваться не на всех стандартных проточных цитометрах, которые, как правило, имеют возможность возбуждения и детекции сигнала в видимой области спектра.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является способ получения аналитической тест-системы для одновременной высокочувствительной детекции различных маркеров заболеваний, совместимой с большинством стандартных проточных цитометров.
Технический результат достигается тем, что известный способ получения аналитической тест-системы на основе суспензионных микрочипов для детекции маркеров заболеваний, включающий создание суспензионных микрочипов, путем оптического кодирования микросфер различного диаметра флуоресцентными красителями с последующим конъюгированием их с биологическими распознающими молекулами и создания детектирующих компонент путем конъюгирования биологических детектирующих молекул с флуоресцентными красителями, дополнен тем, что для оптического кодирования микросфер различного диаметра используют полупроводниковые флуоресцентные нанокристаллы, которые наносят послойно на поверхность микросфер, при этом слой полупроводниковых флуоресцентных нанокристаллов одного цвета пространственно отделяют от соседнего слоя полупроводниковых флуоресцентных нанокристаллов другого цвета тремя и более слоями полиэлектролитов, причем для формирования внешнего слоя полиэлектролита используют полимер, включающий функциональные группы для специфического и/или ориентированного конъюгирования биологических распознающих молекул, а для маркирования биологических детектирующих молекул используют флуоресцентные красители, возбуждаемые на одной длине волны с используемыми полупроводниковыми флуоресцентными нанокристаллами.
Возможность одновременной детекции множества различных маркеров заболеваний обусловлена путем создания суспензионных микрочипов с одновременным применением двух различных подходов для осуществления оптического кодирования, так, во-первых, использованы популяции микросфер различного диаметра, что позволяет различать микросферы по углу рассеивания света в канале проточного цитометра, а во-вторых, применено спектральное кодирование путем включения флуоресцентных меток на основе водорастворимых полупроводниковых нанокристаллов различного спектра испускания флуоресцентного сигнала, что позволяет различать микросферы еще и по спектру флуоресцентного сигнала. Данный способ оптического кодирования дает возможность создавать суспензионные микрочипы, оптические коды которых хорошо различимы при их определении на стандартных проточных цитометрах, а в силу применения оптического кодирования по диаметру микросфер и их спектральному коду, при этом конъюгирование различных по оптическим кодам популяций микросфер с заданными биологическими распознающими молекулами позволяет проводить одновременную детекцию множества различных маркеров заболеваний. Высокая чувствительность достигается, во-первых, применением флуоресцентных меток на основе полупроводниковых флуоресцентных нанокристаллов, которые обладают высоким квантовым выходом и длительным временем свечения, а послойное нанесение флуоресцентных нанокристаллов позволяет снизить перенос энергии между нанокристаллами различного цвета и повысить точность спектрального кодирования. Кроме того, применение ориентированного конъюгирования биологических распознающих молекул позволяет улучшить эффективность связывания детектируемых маркеров на поверхности микросфер и тем самым повысить чувствительность определения маркеров заболеваний.
Возможен частный случай, в котором в качестве микросфер используют популяции полимерных микросфер с диаметром от 2 до 15 микрометров, поверхность которых предварительно функционализируют введением аминогрупп и/или карбоксильных групп.
Также возможен частный случай, в котором в качестве полупроводниковых флуоресцентных нанокристаллов используют полупроводниковые флуоресцентные нанокристаллы типа «ядро-оболочка», состоящие из атомов элементов II-VI или III-V групп периодической таблицы Менделеева и имеющие размер меньше радиуса экситона Бора для данного материала.
Существует частный случай, когда для оптического кодирования микросфер одного диаметра применяют полупроводниковые флуоресцентные нанокристаллы различного цвета в различных количественных соотношениях.
Возможен частный случай, в котором слои полупроводниковых флуоресцентных нанокристаллов разных цветов разделяют между собой слоями положительно и отрицательно заряженных полиэлектролитов.
В частном случае, в качестве отрицательно заряженных полиэлектролитов используют поликислоты, например, такие как поливинилсульфоновая кислота, полистиролсульфоновая кислота, полиакриловая кислота, полиметакриловая кислота, полиглутаминовая кислота или полифосфорная кислота и/или соли этих поликислот.
Возможен частный случай, когда в качестве положительно заряженных полиэлектролитов используют полиоснования, например, такие как полиаллиламин, поливиниламин, политриметил-аммоний-этилметакриалат, полилизин, поли-4-винилпиридин, гидроксид поли-N-триметилвиниламмония и/или соли этих полиоснований.
Также возможен частный случай, в котором между слоями полупроводниковых флуоресцентных нанокристаллов различных цветов наносят слои полиэлектролитов разных зарядов, таким образом, чтобы суммарная толщина слоев полиэлектролитов разных зарядов между соседними слоями полупроводниковых флуоресцентных нанокристаллов различных цветов превышала 10 нанометров.
Помимо этого, предлагается частный случай, в котором для формирования внешнего слоя полиэлектролита используют поликислоту или соль этой поликислоты, содержащую одну или несколько карбоксильных групп или аминогрупп.
Возможен частный случай, в котором одну или несколько карбоксильных групп или аминогрупп внешнего слоя полиэлектролита химически связывают с аминогруппами или карбоксильными группами биологических распознающих молекул.
Существует частный случай, когда для химического связывания карбоксильных групп или аминогрупп внешнего слоя полиэлектролита и аминогрупп или карбоксильных групп биологических распознающих молекул используют карбодиимиды.
Возможны частные случаи, когда в качестве биологических распознающих молекул применены:
- нативные белки;
- модифицированные белки;
- поликлональные антитела;
- моноклональные антитела;
- однодоменные антитела;
- высокоаффинные биологические компоненты;
- стрептавидин;
- биотин;
- пептиды;
- нуклеиновые кислоты;
- биологические распознающие молекулы, аффинные к белковым маркерам онкологических заболеваний женской репродуктивной системы.
Ниже на фиг. 1 приведен конкретный пример реализации предлагаемого способа, иллюстрирующий один суспензионный микрочип, полученный по предлагаемому способу. Суспензионный микрочип состоит из микросферы 1, покрытой слоями полупроводниковых флуоресцентных нанокристаллов 2, чередующихся со слоями полиэлектролитов 3, и слоя внешнего полимера 4, покрывающего микросферу, к функциональным группам которого ориентированно конъюгированы биологические распознающие молекулы 5. Детектируемый маркер 6, связанный с биологическими распознающими молекулами 5, и биологическими детектирующими молекулами 7, конъюгированными с флуоресцентным красителем 8.
7
Конкретный пример поэтапного создания восьми популяций микросфер различного диаметра, спектрально кодированных флуоресцентными нанокристаллами, поясняется фиг. 2 и включает выполнение нижеследующих действий. Водную суспензию, содержащую 3,1×10 меламин-формальдегидных карбоксилированных микросфер диаметром 4,08 мкм, содержащих на поверхности карбоксильные группы, доводят до объема 0,5 мл и смешивают с 0,5 мл раствора поливиниламина в качестве положительно заряженного полиэлектролита с концентрацией 2 мг/мл. Смесь вортексируют в течение 30 секунд, затем помещают в ультразвуковую баню на 1 минуту, затем инкубируют в течение 20 минут при мягком перемешивании. После этого суспензию осаждают путем центрифугирования в течение 5 минут при 3000 об/мин, отбирают супернатант и ресуспендируют в 1 мл воды. Процедуру отмывки водой повторяют 3 раза для удаления избытка несвязавшегося полиэлектролита. После этого ресуспендируют микросферы в 0,5 мл воды и добавляют 0,5 мл раствора полиакриловой кислоты в качестве отрицательно заряженного полиэлектролита с концентрацией 2 мг/мл. Повторяют процедуры инкубаций и отмывки для формирования пяти полиэлектролитных слоев, последний из которых является положительно заряженным. После этого микросферы ресуспендируют в 1 мл воды и разделяют на две равные части, к каждой добавляют по 0,5 мл водных растворов водорастворимых отрицательно заряженных флуоресцентных нанокристаллов с максимумом флуоресценции 525 нм с концентрациями 0,05 мг/мл и 0,5 мг/мл. Смеси вортексируют в течение 30 секунд, затем инкубируют в темноте в течение 20 минут при мягком перемешивании. Смеси трехкратно отмывают от избытка несвязавшихся нанокристаллов, затем наносят еще по три полиэлектролитных слоя. Каждую популяцию микросфер ресуспендируют в 1 мл воды и разделяют на две равные части, к каждой части добавляют по 0,5 мл водных растворов водорастворимых отрицательно заряженных флуоресцентных нанокристаллов с максимумом флуоресценции 585 нм с концентрациями 0,05 мг/мл и 0,5 мг/мл. Смеси вортексируют в течение 30 секунд, инкубируют в темноте в течение 20 минут при мягком перемешивании затем повторяют процедуры отмывки и наносят 5 полиэлектролитных слоев, последним из которых является слой полимера, в качестве которого выступает полиметакриловая кислота. В результате получают четыре различные популяции двухцветных микросфер диаметром 4,08 мкм с условными спектральными кодами: 22, 21, 12, 11. Для получения четырех популяций двухцветных микросфер с условными спектральными кодами - 22, 21, 12, 11, диаметром 6,1 мкм, необходимо повторить описанные выше действия с аналогичными меламин-формальдегидными карбоксилированными микросферами диаметром 6,1 мкм.
Пример различного оптического кодирования конкретных популяций микросфер, полученных по предлагаемому способу и различающихся по размеру (использованы популяции микросфер трех различных диаметров - 4,08 мкм, 6,1 мкм и 8,24 мкм) и спектральным кодам (использованы два различных спектральных кода для популяции микросфер каждого диаметра), показан на фиг. 3. Видно, что при анализе популяций на проточном цитометре при детекции флуоресцентного сигнала и определении угла светорассеивания популяции микросфер с различными спектральными кодами формируют две хорошо различимые группы, в каждой из которых различимы популяции микросфер трех различных размеров.
6
Процесс ориентированной конъюгации биологических распознающих молекул с функциональными группами внешнего слоя полиэлектролита раскрыт на примере конъюгирования однодоменных антител к CEA (раково-эмбриональный антиген) и меламин-формальдегидных карбоксилированных микросфер, покрытых внешним слоем полиаллиламин гидрохлорида. Для реакции берут 70 мкг однодоменных антител, несущих на своем С-конце аминокислотную последовательность с большим числом карбоксильных групп, растворяют их в 100 мкл натрий-фосфатного буферного раствора, добавляют 0,9 мкг 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимида (EDC) и инкубируют 10 минут при комнатной температуре. Затем однодоменные антитела очищают от избытка EDC на колонках для обессоливания белков, уравновешенных натрий-фосфатным буферным раствором. К полученным таким образом антителам сразу же добавляют суспензию, содержащую 4⋅10 микросфер, и инкубируют их смесь на холоде, в темноте в течение 12 часов при мягком перемешивании. На следующий день суспензию центрифугируют 4 мин при 1200 g, ресуспендируют и отмывают в натрий-фосфатном буфере. Для блокирования не специфического связывания маркеров на поверхности микросферы ресуспендируют в натрий-фосфатном буфере, содержащем 2% казеина, затем инкубируют при комнатной температуре в течение 1 часа, а затем однократно отмывают микросферы в натрий-фосфатном буфере. Полученные микросферы с иммобилизованными на поверхности однодоменными антителами можно хранить в натрий-фосфатном буфере (с добавлением 0,5% казеина) при +4°С в темноте.
Таким образом, предложенный способ получения аналитической тест-системы на основе суспензионных микрочипов для одновременной детекции различных маркеров заболеваний позволяет добиться создания тест-систем с высокой чувствительностью, а также совместимых с большинством стандартных проточных цитометров, в силу использования оптического кодирования с помощью диаметра частиц и различных спектральных кодов, полученных применением полупроводниковых флуоресцентных нанокристаллов. Также предлагаемый способ служит для создания тест-систем для одновременного определение концентраций раково-эмбрионального антигена (CEA), специфических маркеров рака молочной железы (СА15-3, СА27-29), маркера рака яичников (СА125), маркера рака шейки матки (SCCA), а также маркера агрессивности рака молочной железы и яичников (фрагмент р105 белка HER2/neu) для целей научных исследований в области онкологии или проведения диагностики.
Источники информации
1. Don J. Chandler et al. Precision fluorescently dyed particles and methods of making and using same. Патент US 6599331 B2.
2. Bo Zhang et al. Plasmonic beads for multiplexed analysis by flow detection systems. Патент WO 2015038797 A1.