ПОЛУЧЕНИЕ МОНАТИНА И ПРЕДШЕСТВЕННИКОВ МОНАТИНА

1. Способ получени  монатина или его соли, где способ предусматривает:
(a) культивирование микроорганизма в культуральной среде, где микроорганизм содержит, по меньшей мере, одну нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид альдолазу, и, по меньшей мере, одну нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид аминотрансферазу; и
(b) экстракцию монатина или его соли из культуральной среды или культивируемого микроорганизма.
2. Способ по п.1, где полипептид альдолазу выбирают из ProA альдолазы (4-гидрокси-4-метил-2-оксоглутаратальдолазы, EC 4.1.3.17) и KHG альдолазы (4-гидрокси-2-оксоглутаратглиоксилатлиазы, EC 4.1.3.16).
3. Способ по п.1, где микроорганизм выбирают из Sinorhizobium meliloti, Comamonas testosteroni, Psendomonasstraminea, Corynebacterium glutamicum и E. coli.
4. Способ по п.1, где микроорганизм выбирают из рода Corynebacterium и Brevibacterium.
5. Способ по п.3, где микроорганизм представл ет собой Corynebacterium glutamicum.
6. Способ по п.3, где культуральна  среда содержит неионное поверхностно-активное вещество, пенициллин, производное пенициллина или их сочетание.
7. Способ по п.6, где неионное поверхностно-активное вещество выбирают из Tween, Triton X-100 и додецилацетата аммони .
8. Способ по п.5, где культуральна  среда содержит биотин в концентрации менее 5 мкг/л.
9. Способ по п.6, где производное пенициллина представл ет собой ампициллин.
10. Способ по п.3, где pH культуральной среды на стадии (a) до культивировани  микроорганизма находитс  в пределах от около pH 7 до около pH 8.
11. Способ по п.5, где культуральна  среда содержит мелассу, кукурузный экстракт или их сочетание.
E. coli
12. Способ по п.3, где микроорганизм представл ет собой  и где культуральна  среда содержит Trp-1+глюкозна  среда.
13. Способ по п.1, где дл  роста микроорганизма необходимы фенилаланин и тирозин, и где культуральна  среда содержит фенилаланин и тирозин.
aspC
proA
14. Способ по п.1, где микроорганизм содержит гены  и .
15. Способ по п.5, где Corynebacterium glutamicum представл ет собой штамм Corynebacterium glutamicum, который продуцирует и секретирует глутамат.
16. Способ по п.15, где культуральна  среда содержит неионное поверхностно-активное вещество, пенициллин, производное пенициллина или их сочетание.
17. Способ по п.15, где монатин или его соли секретируютс  из Corynebacterium glutamicum.
18. Способ получени  монатина или его соли, где способ предусматривает:
(a) культивирование Corynebacterium glutamicum (ATCC 13058) в культуральной среде; и
(b) экстракцию монатина или его соли из культуральной среды или культивируемого микроорганизма.
19. Способ по п.18, где культуральна  среда содержит Tween, пенициллин, производное пенициллина или их сочетание.
20. Способ по п.1, где культуральна  среда содержит триптофан, пировиноградную кислоту, неионное поверхностно-активное вещество, пенициллин, производное пенициллина или их сочетание.
21. Способ по п.20, где неионное поверхностно-активное вещество представл ет собой Tween.
22. Способ по п.1, где культуральна  среда содержит пировиноградную кислоту, Tween и производное пенициллина.
23. Способ по п.1, где полипептид аминотрансферазу выбирают из полипептида триптофанаминотрансферазы (EC 2.6.1.27), полипептида аспартатаминотрансферазы (EC 2.6.1.1), полипептида ароматической аминотрансферазы (EC 2.6.1.5) и полипептида D-аланинаминотрансферазы (EC 2.6.1.21).
24. Способ по п.1, где микроорганизм секретирует монатин или его соль.
25. Способ по п.1, где микроорганизм культивируют в ферментере.
26. Микроорганизм, содержащий, по меньшей мере, одну нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид альдолазу и, по меньшей мере, одну нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид аминотрансферазу, где нуклеиновые кислоты выбирают из экзогенных нуклеиновых кислот, рекомбинантных нуклеиновых кислот и их сочетани , и где микроорганизм продуцирует монатин или его соль.
27. Микроорганизм по п.26, где полипептид альдолазу выбирают из ProA альдолазы (4-гидрокси-4-метил-2-оксоглутаратальдолазы, EC 4.1.3.17) и KHG альдолазы (4-гидрокси-2-оксоглутаратглиоксилатлиазы, EC 4.1.3.16).
28. Микроорганизм по п.26, где полипептид аминотрансферазу выбирают из полипептида триптофанаминтрансферазы (EC 2.6.1.27), полипептида аспартатаминтрансферазы (EC 2.6.1.1), полипептида ароматической аминтрансферазы (EC 2.6.1.5) и полипептида D-аланинаминтрансферазы (EC 2.6.1.21).
29. Микроорганизм по п.26, где микроорганизм сверхпродуцирует пируват.
30. Микроорганизм по п.29, где микроорганизм представл ет собой ауксотроф по тиамину.
31. Микроорганизм по п.26, где микроорганизм представл ет собой ауксотроф по фенилаланину и тирозину.
32. Микроорганизм по п.29, где микроорганизм выбирают из Candida glabrata, Trichosporon cutaneum, Candida lipolytica и Saccharomyces cerevisiae.
33. Микроорганизм по п.29, где микроорганизм представл ет собой ауксотроф по липоевой кислоте.
34. Микроорганизм по п.33, где микроорганизм содержит гены aspC и proA.
35. Микроорганизм по п.33, где микроорганизм содержит гены aspC и proA и, по меньшей мере, один ген оперона триптофана.
36. Микроорганизм по п.33, где микроорганизм представл ет собой E. coli.
-
37. Микроорганизм по п.29, где микроорганизм содержит дефектный ген F1АТФазы.
38. Микроорганизм по п.33. где микроорганизм содержит нарушение в эндогенном гене lipA.
39. Микроорганизм по п.26, где микроорганизм сверхпродуцирует триптофан.
40. Микроорганизм по п.26, где микроорганизм содержит две или более копий одного или нескольких генов биосинтеза триптофана.
41. Микроорганизм по п.39, где микроорганизм содержит нарушенный ген pheA.
42. Микроорганизм по п.39, где микроорганизм содержит нарушенный эндогенный ген триптофаназы (tna).
43. Микроорганизм по п.39, где микроорганизм сверхэкспрессирует ген ppsA.
44. Микроорганизм по п.39, где микроорганизм представл ет собой E. coli или Corynebacterium glutamicum.
45. Микроорганизм по п.44, где микроорганизм содержит повышенное количество активности синтазы 3-дезокси-D-арабиногепатулосоновой кислоты 7-фосфата (DAHP) по сравнению с соответствующим контрольным микроорганизмом.
46. Микроорганизм по п.26, где микроорганизм дополнительно содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, имеющий активность фосфоенолпируват(PEP)синтазы, где нуклеиновую кислоту выбирают из экзогенных нуклеиновых кислот, рекомбинантных нуклеиновых кислот и их сочетани .
47. Микроорганизм по п.46, где микроорганизм дополнительно содержит ген tkt.
48. Микроорганизм по п.26, где микроорганизм дополнительно содержит экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, имеющий активность триптофаназы.
49. Микроорганизм по п.26, где микроорганизм секретирует монатин или его соль.
50. Микроорганизм по п.49, где микроорганизм представл ет собой ауксотроф по жирной кислоте.
51. Микроорганизм по п.26, где микроорганизм представл ет собой штамм бактерии, предусматривающий нуклеиновую кислоту, экспрессирующую альдолазу, где альдолаза, экспрессируема  из нуклеиновой кислоты, способна продуцировать стереоизомерно-обогащенную смесь монатина.
52. Микроорганизм по п.51, где стереоизомерно-обогащенна  смесь монатина представл ет собой в основном S,S монатин или его соль.
53. Микроорганизм по п.51, где стереоизомерно-обогащенна  смесь монатина представл ет собой в основном R,R монатин или его соль.
54. Микроорганизм по п.26, где микроорганизм сверхэкспрессирует, по меньшей мере, одну нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид усвоени  триптофана.
55. Способ получени  монатина или его соли, где способ предусматривает:
(a) культивирование микроорганизма, который продуцирует монатин или его соль, в культуральной среде при услови х, в которых продуцируетс  монатин или его соль, и
(b) получение монатина или его соли из культуральной среды или культивируемых микроорганизмов.
56. Способ по п.55, где микроорганизм секретирует монатин или его соль.
57. Способ по п.55, где микроорганизм представл ет собой ауксотроф по жирной кислоте.
58. Способ идентификации клетки, способной синтезировать монатин или его соль, где способ предусматривает:
(a) культивирование клетки в присутствии углеродного/энергетического источника, выбранного из монатина или его соли, 2-гидрокси-2-(индол-3-илметил)-4-кетоглутаровой кислоты или ее соли, аналога монатина или его соли, аналога 2-гидрокси-2-(индол-3-илметил)-4-кетоглутаровой кислоты или его соли и их сочетани ; и
(b) анализ роста клетки, где рост клетки показывает, что клетка преобразовывает углеродный/энергетический источник в пируват, тем самым показыва , что клетка способна синтезировать монатин или его соль.
59. Способ по п.58, где клетка представл ет собой ауксотроф по пирувату, и пируват продуцируетс  в клетке в результате метаболизма углеродного/энергетического источника.
.
60. Способ по п.59, где клетка содержит нарушени  в генах pykAи pykF
61. Способ идентификации клетки, способной синтезировать монатин или его соль или 2-гидрокси-2-(индол-3-илметил)-4-кетоглутаровую кислоту или ее соль или их сочетание из триптофана, где способ предусматривает:
(a) культивирование клетки, котора  представл ет собой ауксотроф по триптофану в отсутствие триптофана и в присутствии монатина или его соли, 2-гидрокси-2-(индол-3-илметил)-4-кетоглутаровой кислоты или ее соли или их сочетани ; и
(b) анализ роста клетки, котора  представл ет собой ауксотроф по триптофану, где рост клетки показывает, что клетка синтезирует триптофан из монатина или его соли, 2-гидрокси-2-(индол-3-илметил)-4-кетоглутаровой кислоты или ее соли или их сочетани , тем самым, показыва , что клетка способна синтезировать монатин или его соль или 2-гидрокси-2-(индол-3-илметил)-4-кетоглутаровую кислоту или ее соль, или их сочетание из триптофана.
62. Способ получени  монатина или его соли, где способ предусматривает:
(a) культивирование микроорганизма в культуральной среде, где микроорганизм выбирают из Sinorhizobium meliloti, Comamonastestosteroni, Pseudomonas straminea и Corynebacterium glutamicum; и
(b) экстракцию монатина или его соли из культуральной среды или культивируемого микроорганизма.
63. Способ по п.62, где микроорганизм не  вл етс  генетически модифицированным.
64. Способ по п.62, где культуральна  среда содержит среду PHB.
65. Способ по п.62, где культуральна  среда дополнительно содержит триптофан, пируват, неионное поверхностно-активное вещество, пенициллин, производное пенициллина или их сочетание.
66. Способ по п.64, где микроорганизм представл ет собой Sinorhizobium meliloti или Comamonas testosteroni.
67. Способ по п.64, где микроорганизм представл ет собой Comamonas testosteroni, и культуральна  среда дополнительно содержит триптофан и пируват.
68. Способ по п.62, где культуральна  среда содержит среду TY.
69. Способ по п.68, где культуральна  среда дополнительно содержит триптофан, пируват или их сочетание.