СРЕДСТВО ПЕПТИДНОЙ СТРУКТУРЫ, ОБЛАДАЮЩЕЕ АНАЛЬГЕТИЧЕСКИМ, ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫМ ДЕЙСТВИЕМ, И ЛЕКАРСТВЕННЫЕ ФОРМЫ НА ЕГО ОСНОВЕ
PEPTIDE AGENT POSSESSING ANALGESIC ANTI-INFLAMMATORY ACTION, AND BASED DOSAGE FORMS

Изобретение относится к медицине и ветеринарии, в частности к лекарственным препаратам, и может быть использовано для купирования воспалительного процесса и обезболивания.
По данным ВОЗ, болевые синдромы составляют одну из ведущих причин обращений к врачу в системе первичной медицинской помощи, а выраженными болевыми синдромами страдают около 20 млн. человек. Однако, несмотря на интерес к проблемам аналгезии, качество обезболивания остается неудовлетворительным. Анальгетическим действием обладают препараты из различных классов. Наркотические анальгетики характеризуются сильным обезболивающим действием, что обеспечивает возможность их использования при травмах и заболеваниях, сопровождающихся выраженным болевым синдромом (злокачественные новообразования, инфаркт миокарда и другие). Однако, наряду с анальгетическим эффектом, они оказывают влияние на центральную нервную систему человека, проявляющееся в развитии эйфории, а при их повторном применении возникает привыкание, наблюдаются синдромы психической и физической зависимости. Кроме того, увеличение дозы препарата сопровождается риском угнетения дыхательного центра (Опиоидные анальгетики: пути совершенствования терапии болевых синдромов [Текст] / М.Б.Звартау, Э.Э.Пчелинцев, А.Н.Кубынин. // Анестезиология. - 2007. - Т.5. - 417; Pain management for the opioid-dependent patient [Текст] / D. Wintle // The British journal of nursing. - 2008. - V.17. - N 1. - P.47-51).
Ненаркотические анальгетики не оказывают влияния на дыхательный центр, не вызывают эйфории и явлений физической и психической зависимости. Однако их анальгетическая активность проявляется, главным образом, при невралгических, мышечных, суставных болях, головной и зубной боли, а при сильной боли, связанной с травмами, полостными оперативными вмешательствами, злокачественными новообразованиями и т.п. они практически не эффективны; некоторые ненаркотические анальгетики характеризуются хорошими жаропонижающим и противовоспалительным эффектами. Нежелательным побочным действием этих препаратов является негативное влияние на желудочно-кишечный тракт, систему кроветворения, выводящую систему (Е.Л.Насонов. Специфические ингибиторы циклооксигеназы-2 и воспаления: перспективы применения препарата целебрекс. // Российская ревматология. - 1999. - №4. - С.2-13; B.C.Шухов О нестероидных противовоспалительных средствах // Лечащий врач. - 2001. - Т.2. - С.26-30; D.A.Krenzischek, C.J.Dunwoody, R.C. Polomano, J.P.Rathmell Pharmacotherapy for acute pain: implications for practice // Pain management nursing: official journal of the American Society of Pain Management Nurses. - 2008. - V.9. - N 1 Suppl. - S22-S32).
В настоящее время общепризнанна ведущая роль эндогенных пептидов в регулировании различных систем организма (И.П.Ашмарин, М.Р.Обухова. Регуляторные пептиды, функционально-непрерывная совокупность // Биохимия. -1986. - Т. 51, №4. - С.531-544). В нашей стране успешно развивается направление создания лекарственных средств на основе регуляторных пептидов. Внедрены в клиническую практику ноотроп и нейропротектор семакс (ИМГ РАН (Н.Ф. Мясоедов, И.П.Ашмарин, А.А.Каменский, В.Н.Незавибатько и др., 1982)), ноотроп ноопепт (НИИ фармакологии имени В.В.Закусова РАМН (СБ. Середенин, Т.А.Воронина, Т.А.Гудашева, Р.У.Островская и др., 1995), противоязвенный препарат даларгин (ИЭК РКНПК МЗ РФ (М.И.Титов, Ж.Д.Беспалова и др., 1983), иммуномодулятор тимоген (ИБХ им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН и Военно-медицинская академия им. СМ. Кирова (В.И. Дейгин, В.Х. Хавинсон и др., 1989).
7
Особый интерес представляют соединения на основе структуры эндогенного опиоидного пептида дерморфина. Дерморфины проявляют анальгетическое действие при центральном и периферическом введении (М.Broccardo, V.Erspamer, F.G.Erspamer, G.Improta, G.Linari, P.Melchiorri, P.СMontecucchi Pharmacological * data on dermorphins, a new class of potent opioid peptides from amphibian skin //British journal of pharmacology. - 1981. - V. 73. - N 3. - P. 625-631; L. Negri, P.Melchiorri, R.Lattanzi Pharmacology of amphibian opiate peptides // Peptides. - 2000. - V.21. - N 11. - P.1639-1647), при этом не влияют на частоту дыхания даже в кататонических дозах (P.Paakkari, I.Paakkari, A.L.Siren, G.Feuerstein Respiratory and locomotor stimulation by low doses of dermorphin, a mu1 receptor-mediated effect // The Journal of pharmacology and experimental therapeutics. - 1990. - V.252. - N1. - P.235-240), вызывают более медленное развитие толерантности по анальгетическому действию и менее выраженный синдром отмены по сравнению с морфином (М. Broccardo, G. Improta Cross-tolerance between dermorphin and morphine to analgesia and catalepsy in rats // Peptides. - 1985. - V.6, Suppl 3. - P.165-169; L. Negri, R. Lattanzi, P. Melchiorri Production of antinociception by peripheral administration of [Lys]dermorphin, a naturally occurring peptide with high affinity for mu-opioid receptors //British journal of pharmacology. - 1995. -V. 114. - N 1. - P. 57-66; P.Riba, Y. Ben, T.M.Nguyen, S.Furst, P.W.Schiller, N.M.Lee [Dmt(1)]DALDA is highly selective and potent at mu opioid receptors, but is not cross-tolerant with systemic morphine // Current medicinal chemistry. - 2002. - V.9. - N 1. - P.31-39).
Все вышеуказанное определяет актуальность поиска и изучения лекарственных веществ среди новых пептидных соединений, обладающих анальгетической и противовоспалительной активностью. В числе таких соединений следует упомянуть соединение по патенту РФ №2286169, предложенное в качестве наиболее близкого аналога.
Задачей настоящего изобретения является создание анальгетического и противовоспалительного средства, удобного и эффективного в применении, при этом техническим результатом, достигаемым при решении такой задачи, является получение эффективного обезболивающего и противовоспалительного средства.
3
2
5
3
2
5
Предметом заявки является применение трипептида общей формулы Туг-Pro-D-Ser-X, где X - ОН, ОСН, ОСН, в качестве противовоспалительного и анальгетического средства. Кроме того, для достижения поставленного результата предлагается лекарственная форма, содержащая в качестве действующего вещества трипептид общей формулы Tyr-Pro-D-Ser-X, где X - ОН, ОСН, ОСН, для лечения острых и хронических болей и воспалительных процессов; предпочтительные, но не обязательные варианты такой формы предполагают ее выполнение в виде одной из следующих лекарственных форм: раствор для инъекций, назальный спрей, назальные капли, сублингвальные таблетки, вагинальные или ректальные суппозитории, кишечнорастворимые таблетки и капсулы, трансдермальные системы для резорбтивного применения.
3
2
5
3
2
5
Заявляемый в настоящем изобретении трипептид Tyr-Pro-D-Ser-X, где X - ОН, ОСН, ОСН, их свойства и способ получения в литературе не описаны. Возможность достижения поставленного результата обусловлена тем, что у трипептида и его аналогов общей формулы Tyr-Pro-Ser-X, где X - ОН, ОСН, ОСН, замещается Ser на D-стереоизомер и проводится направленный скрининг веществ по стандартной программе.
3
2
5
Синтез Tyr-Pro-D-Ser-X, где X - ОН, ОСН, ОСН.
Синтез Tyr-Pro-D-Ser-oMe осуществляли с применением тетрабутиламмонийных солей (ТБА) и пивалоил хлорида (PivCL). Для синтеза использовали производные D; L; DL аминокислот. Упаривание растворов проводили на вакуумном испарителе при 40°С. Температуры плавления, определенные на столике для плавления Boetiys, даны без исправления. Контроль за синтезом и индивидуальность полученных соединений проверяли с помощью тонкослойной хроматографии на пластинках с силикагелем фирмы Silufol (ЧСФР) при опрыскивании раствором нингидрина в системах растворителей:
1 - гексан: ацетон (3:2);
2 - этилацетат:ацетон:50% уксусная кислота (2:1:1);
3 - бензол:этанол (8:2);
4 - хлороформ:метанол:аммиак (7:2.5:0.5);
5 - хлороформ:метанол:аммиак (6:4:1);
6 - хлороформ:метанол:уксусная кислота (42:7:1);
7 - ацетон:бензол:уксусная кислота (2:1:1);
8 - хлороформ:метанол:аммиак (8:1.75:0.25);
9 - хлороформ:метанол (9:1);
10 - этанол:аммиак (7:3).
11 - изо-пропанол:муравьиная кислота:вода (20:1:5).
Далее по тексту в скобках после Rf указана система растворителей. Все растворители абсолютировали соответствующим образом. Точки плавления не корректировали. Колоночную хроматографию проводили с использованием носителей Силикагель L-40/100 m и Silasorb 600 [LC] фирмы Chemapol (ЧСФР).
Принятые сокращения:
Ас - ацетат;
Вос - трет-бутилоксикарбонильная группа;
ОБТ - 1-оксибензтриазол;
ДМФА - диметилформамид;
ДЦГК - дициклогексилкарбодиимид;
PivCI - пивалоил хлорид;
ТБА - тетрабутиламмоний;
ТЭА - триэтиламин;
OSu - N-оксисукцинимидный эфир;
ДЦГК - N.N-дициклогексикарбодиимид;
ОМе - метиловый эфир;
DiBoc - трет-бутилоксикарбонил; ТСХ - тонкослойная хроматография.
Этап 1. Получение трипептида Tyr-Pro-D-Ser-OMe.
4
4
4
К Pro 150 мг (1.326 ммоль) добавляли 2.83 мл (1.326 моль) 13% ТБА, упаривали 1 раз с этанолом, 1 раз с изо-пропанолом, 1 раз с бензолом, охлаждали до 0°С. К охлажденному раствору ТБА Pro в 10 мл абс. этилацетата при охлаждении добавляли в сухом виде DiBoc-Tyr-OSu 634.5 мг (1.326 моль), перемешивали 1 час при комнатной температуре на магнитной мешалке, за ходом реакции следили по ТСХ в системе (7). По окончании реакции растворитель упаривали, добавляли воду, подкисляли NaHSO (пятикратный избыток), до рН 3, экстрагировали 5 раз по 50 мл этилацетатом. Объединенные фракции этилацетата, промывали водой, 10% раствором KHSO, водой, сушили над MgSO, упаривали, высаждали из эфира гексаном (дважды). Осадок в виде порошка сушили в вакууме. Выход 1.32 г (2.76 ммоль). Rf=0.382 (7).
Этап 2. Получение трипептида DiBoc-Tyr-Pro-D-Ser-OMe.
4
3
4
DiBoc-Tyr-Pro 1,32 г (2.76 ммоль) растворяли в 20 мл ацетонитрила, добавляли избыток (1.3) N-гидроксисукцинимида 412.8 мг (3.59 ммоль), охлаждали до 0°С и добавляли избыток (1.3) ДЦГК 810.88 мг (3.59 ммоль). Перемешивали на магнитной мешалке 1 час, охлаждали до 0°С, добавляли избыток (1.3) D-Ser-OMe 558.22 мг (3.59 ммоль) и избыток (1.3) ТЭА 0.5 мл (3.59 ммоль), перемешивали 1 час при охлаждении и двое суток при комнатной температуре. Реакционную смесь отфильтровывали, упаривали, добавляли 100 мл этилацетата, экстрагировали водой, 10% раствором KHSO, водой, 5% раствором МаНСО, водой, насыщ. раствором NaCl. Раствор этилацетата сушили над MgSO, отфильтровывали, упаривали. Переосаждали дважды из ацетона гексаном. Полученный осадок сушили в вакууме. Выход 1.38 г (2.38 ммоль) - 86.56%. Rf=0.238 (7), Rf=0.812 (8).
Этап 3. Удаление Вос-защит с DiBoc-Tyr-Pro-D-Ser-OMe.
3
К 1.38 г (2.38 ммоль) DiBoc-Tyr-Pro-D-Ser-OMe добавляли 7.14 мл 1 н. СНСООН и 2% анизола (0.14 мл анизола). Выдерживали 45 минут при комнатной температуре, упаривали, высаждали из метанола эфиром. Выход: 860 мг (1.93 ммоль). Rf=0.512 (8).
2
3
2
5
Нижеследующие примеры фармакологических исследований подтверждают возможность применения заявленного трипептида и его аналогов общей формулы Tyr-Pro-D-Ser-X, где X - ОН, NH, ОСН, ОСН, в качестве лекарственных средств с анальгетической и противовоспалительной активностью.
2
Пример 1. Изучение анальгетической активности Tyr-Pro-D-Ser-X, где X - ОН, NH, в тесте отдергивания хвоста (tail flick).
Исследования проводили на белых беспородных крысах самцах массой 230-280 г с использованием теста «отдергивания хвоста» - tail flick (Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. - Москва, ОАО Издательство «Медицина». - 2005). Животное помещали в индивидуальную пластиковую камеру, хвост погружали на 5 см в воду с температурой 55±1°С. Рефлекс отдергивания хвоста замыкается на уровне спинного мозга. В тесте фиксировали латентный период избавления от болевого раздражителя - период времени (с), в течение которого животное выдергивало хвост из воды полностью. Максимальное время предъявления болевого раздражителя - 30 с. Исходную болевую чувствительность определяли как среднее арифметическое из показателей, зафиксированных на 60, 40 и 20 минут до инъекции. Латентный период избавления от болевого раздражителя фиксировали через 20, 40 и 60, 90, 120, 180 и 240 минут после введения. Анальгетическую активность оценивали по изменению латентного периода реакции по формуле: А=ЛПоп-ЛПисх, где ЛПоп - латентный период избавления после введения вещества, ЛПисх - среднее арифметическое латентных периодов избавления до введения вещества.
2
2
5
3
2
3
2
5
Исследуемые образцы Tyr-Pro-D-Ser-X, где X - NH (образец 1), ОН (образец 2), ОСН (образец 3), ОСН (образец 4) в дозах 0.001, 0.01, 0.1 1 и 10 мг/кг вводили внутрибрюшинно в водном растворе. Контрольным животным вводили внутрибрюшинно дистиллированную воду. Полученные результаты влияния трипептида Tyr-Pro-D-Ser-X, где X - NH, ОН, ОСН, ОСН на болевую чувствительность в тесте отдергивания хвоста приведены в таблице 1.
Таблица 1
Испытуемый образец
Отдергивание хвоста (изменение чувствительности, с)
20 мин
40 мин
60 мин
90 мин
120 мин
180 мин
240 мин
Контроль
0.4±0.2
0.5±0.2
0.3±0.1
0.1±0.1
0.1±0.1
0.1±0.1
0.1±0.1
Образец 1
0.01 мг/кг
1±0.2
1.3±0.3
1.2±0.2
1.0±0.4
0.9±0.3
0.5±0.2
0.1±0.1
1 мг/кг
4.2±1.6*
5.0±1.8*
4.8±1.7*
3.2±1.1
1.3±0.3
0.6±0.2
0.2±0.1
10 мг/кг
6.4±2.0*
4.7±1.7*
4.1±1.9*
3.8±1.6*
2.6±0.8
1.1±0.5
0.3±0.1
Образец 2
0.01 мг/кг
2.0±1.3
1.9±0.5
1.3±0.8
1.5±0.8
0.5±0.1
0.2±0.1
0.1±0.1
0.1 мг/кг
3.3±1.5*
3.5±1.2*
2.9±0.9*
1.6±0.5
1.1±0.4
0.5±0.2
0.1±0.1
1 мг/кг
5.7±2.2*
4.2±1.6*
3.1±1.1*
2.1±0.8*
1.1±0.3
0.6±0.3
0.2±0.1
10 мг/кг
6.3±2.1*
4.9±2.1*
3.9±1.9*
3.3±0.9*
2.0±0.8*
1.1±0.6
0.7±0.3
Образец 3
0.001 мг/кг
3.8±1.2*
3.7±1.4*
2.8±1.2*
1.9±0.8
1.1±0.3
0.6±0.3
0.2±0.1
0.01 мг/кг
4.2±2.3*
3.7±1.3*
3.4±1.3*
3.0±1.3*
2.4±1.2
1.8±0.9
0.9±0.3
0.1 мг/кг
5.3±2.4*
4.6±2.3*
4.3±2.1*
4.0±1.8*
3.5±1.3*
2.5±1.6
0.9±0.3
1 мг/кг
6.2±3.2*
5.8±3.3*
4.9±2.7*
4.2±2.3*
3.9±2.0*
3.5±2.6*
2.8±1.3
10 мг/кг
7.2±3.6*
6.3±3.5*
5.8±2.9*
4.9±2.5*
4.2±2.1*
3.8±1.7*
3.2±1.4*
Образец 4
0.001 мг/кг
2.1±0.8
1.9±0.6
1.5±0.8
1.4±0.7
0.9±0.4
0.7±0.3
0.1±0.1
0.01 мг/кг
4.6±2.4*
3.4±1.8*
2.9±1.4*
2.0±1.1
1.7±0.7
1.2±0.4
0.8±0.3
0.1 мг/кг
4.9±2.3*
4.8±2.2*
4.0±2.1*
3.3±1.8*
2.5±1.3
1.6±0.4
0.7±0.1
1 мг/кг
5.9±3.0*
5.5±2.6*
4.6±2.2*
4.0±1.7*
3.4±1.5*
2.2±1.0
0.810.4
10 мг/кг
6.4±3.2*
5.8±3.1*
5.1±2.3*
4.3±2.1*
4.3±2.0*
3.3±1.4*
1.2±0.8
* - достоверность по сравнению с контролем при Р<0.05.
2
3
2
5
Установлено, что Tyr-Pro-D-Ser-X, где X - NH, ОН, ОСН, ОСН вызывает достоверное увеличение латентного периода реакции отдергивания хвоста в ответ на болевое раздражение. Образец 1 оказывает обезболивающее действие в дозах 1-10 мг/кг, протяженностью 60-90 мин. Образецы 2 и 4 проявляют обезболивающее действие в более низких дозах 0.1-10 мг/кг, при этом длительность эффекта в дозе 10 мг/кг сохранялась более 2 часов. Образец 3 вызывал обезболивание в дозах 0.001-10 мг/кг длительностью более 4 часов.
3
2
5
Таким образом, трипептид Tyr-Pro-D-Ser-X, где X - ОН, ОСН, ОСН обладает выраженным анальгетическим действием в тесте отдергивания хвоста.
2
3
2
5
Пример 2. Изучение анальгетической активности Tyr-Pro-D-Ser-X, где X - NH, ОН, ОСН, ОСН в тесте уксусных корчей.
Исследования проводили на белых беспородных мышах самцах массой 20-25 г с использованием теста уксусных корчей (Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. - Москва, ОАО Издательство ″Медицина″. - 2005). Животных случайным образом разделяли на две группы по 10 мышей. Исследуемые образцы вводили за 20 минут до внутрибрюшинного введения 0,6% раствора уксусной кислоты. Контрольным животным вводили внутрибрюшинно дистиллированную воду также за 20 минут до внутрибрюшинного введения 0,6% раствора уксусной кислоты. Животные помещались в индивидуальные боксы. Регистрировалось число корчей на протяжении 30 минут после внутрибрюшинного введения 0,6% раствора уксусной кислоты введения (из расчета 10 мл на 1 кг веса). Число корчей в контрольной группе принималось за 100%.
2
3
2
5
2
3
2
5
Исследуемые образцы Tyr-Pro-D-Ser-X, где X - NH (образец 1), ОН (образец 2), ОСН (образец 3), ОСН (образец 4) в дозах 0.001, 0.01, 0.1, 1 и 10 мг/кг вводили внутрибрюшинно в водном растворе. Полученные результаты влияния трипептида и его аналогов общей формулы Tyr-Pro-D-Ser-X, где X - NH, ОН, ОСН, ОСН на болевую чувствительность в тесте уксусных корчей приведены в таблице 2.
Таблица 2.
Испытуемый образец
Уксусные корчи (% от контроля)
Контроль
100
Tyr-Pro-D-Ser-NH<sub>2</sub> (Образец 1)
0.01 мг/кг
78
1 мг/кг
16*
10 мг/кг
7*
Образец 2
0.01 мг/кг
64
0.1 мг/кг
46*
1 мг/кг
13*
10 мг/кг
7*
Образец 3
0.01 мг/кг
52*
0.1 мг/кг
43*
1 мг/кг
19*
10 мг/кг
3*
Образец 4
0.01 мг/кг
47*
0.1 мг/кг
23*
1 мг/кг
11*
10 мг/кг
2*
* - достоверность по сравнению с контролем при р<0,05.
2
3
2
5
Из таблицы 1 видно, что Tyr-Pro-D-Ser-X, где X - NH, ОН, ОСН, ОСН вызывает достоверное снижение числа корчей в ответ на болевое раздражение уксусной кислотой. Выраженность эффекта зависит от дозы. Известное соединение Tyr-Pro-D-Ser-NH2 проявляет  активность в дозах 1-10 мг/кг (Гузеватых, 2011), тогда как заявляемые образцы 2, 3 и 4 оказывают обезболивающее действие в меньших дозах и более широком диапазоне доз (образец 2 в дозах 0.1-10 мг/кг, а образцы 3 и 4 в дозах 0.01-10 мг/кг).
3
2
5
Таким образом, трипептид Tyr-Pro-D-Ser-X, где X - ОН, ОСН, ОСН показывают анальгетическое действие в тесте уксусных корчей.
2
3
2
5
Пример 3. Изучение анальгетической и противовоспалительной активности Tyr-Pro-D-Ser-X, где X - NH, ОСН, OCH в тесте формалиновой боли.
Исследования проводили на белых беспородных крысах самцах массой 230-280 г с использованием теста формалиновой боли (Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. - Москва, ОАО Издательство ″Медицина″. - 2005). Самцов беспородных крыс массой 230-280 г помещали в индивидуальные пластиковые боксы. Острую воспалительную реакцию (отек) вызывали субплантарным (под подошвенный апоневроз) введением 50 мкл 5% формалина. Изучаемый образец или растворитель вводили за 20 мин до субплантарного введения формалина. Регистрировали число болевых реакций (постукивание лапой об пол, грызение лапы и т.д.) в первые 5-10 минут - I фаза (воздействие на первичные афференты боли) и с 30-50 минуту - II фаза (боль, возникающая в результате воспалительной реакции) (Bannon et al., 1998). Критерием анальгетического эффекта считали достоверное уменьшение числа болевых реакций в опытной группе относительно контрольной группы.
2
3
2
5
2
3
2
5
Исследуемые образцы Tyr-Pro-D-Ser-X, где X - NH (образец 1), ОСН (образец 2), ОСН (образец 3) в дозах 0.1, 1 и 10 мг/кг вводили внутрибрюшинно в водном растворе самцам нелинейных белых крыс весом 200-250 г. Контрольным животным вводили внутрибрюшинно дистиллированную воду. Полученные результаты влияния трипептида общей формулы Tyr-Pro-D-Ser-X, где X - NH, ОСН, ОСН на болевую чувствительность в тесте формалиновых болей приведены в таблице 3.
Таблица 3
Испытуемый образец
I фаза
II фаза
Контроль
4.1±0,3
7,4±1,1
Образец 1
0.1 мг/кг
2,9±0,4*
4,4±0,3*
1 мг/кг
2,1±0,3*
2,1±0,3*
10 мг/кг
0,3±0,1*
2,5±0,6*
Образец 2
0.1 мг/кг
2,8±0,3*
4,7±0,6*
1 мг/кг
2,3±0,3*
3,3±0,5*
10 мг/кг
0,8±0,2*
2,6±0,5*
Образец 3
0.1 мг/кг
1,7±0,2*
2,1±0,3*
1 мг/кг
0,6±0,1*
1,5±0,6*
10 мг/кг
0,4±0,1*
0,6±0,1*
* - достоверность по сравнению с контролем при р<0.05.
2
3
2
5
Из таблицы 3 видно, что Tyr-Pro-D-Ser-X, где X - NH, ОСН, ОСН вызывает достоверное снижение болевой чувствительности в I и II фазу формалиновых болей. Образцы 1 и 2 в дозах 0.1-10 мг/кг уменьшают болевую чувствительность в I фазу, характеризующую воздействие на первичные афференты боли, и во II фазу, обуславливающую развитие воспаления. Выраженность эффекта зависит от дозы.
2
3
2
5
Таким образом, трипептид Tyr-Pro-D-Ser-X, где X - NH, ОСН, ОСН показывает анальгетическое и противовоспалительное действие в тесте формалиновых болей.
2
3
2
5
Пример 4. Изучение противовоспалительной активности Tyr-Pro-D-Ser-X, где X - NH, ОН, ОСН, ОСН в тесте экссудативного воспаления, вызванного каррагенином.
Исследования проводили на белых беспородных мышах самцах массой 20-25 г с использованием теста уксусных корчей (Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. - Москва, ОАО Издательство ″Медицина″. - 2005). Животных случайным образом разделяли на две группы по 10 мышей. Исследуемые образцы вводили за 20 минут до внутрибрюшинного введения. Острую воспалительную реакцию (отек) воспроизводят субплантарным (под подошвенный или плантарный апоневроз) введением 0,1 мл 1% раствора каррагенина (сульфатированный полисахарид из ирландского морского мха). Выраженность воспалительной реакции оценивают через 3 ч после индукции воспаления по изменению объема лапы (онкометрически).
3
2
5
3
2
5
Исследуемые образцы Tyr-Pro-D-Ser-X, где X - NH2 (образец 1), ОН (образец 2), ОСН (образец 3), ОСН (образец 4) в дозах 0.001, 0.01, 0.1, 1 и 10 мг/кг вводили внутрибрюшинно в водном растворе. Полученные результаты влияния трипептида общей формулы Tyr-Pro-D-Ser-X, где X - NH2, ОН, ОСН, ОСН на экссудативное воспаление в тесте каррагенинового отека приведены в таблице 4.
Таблица 4.
Испытуемый образец
Прирост объема отечной конечности (%)
Контроль
220±23
Образец 1
0.1 мг/кг
158±14*
1 мг/кг
126±12*
10 мг/кг
100±9*
Образец 2
0.01 мг/кг
144±13
0.1 мг/кг
126±12*
1 мг/кг
113±9*
10 мг/кг
107±9*
Образец 3
0.01 мг/кг
152±14*
0.1 мг/кг
133±12*
1 мг/кг
110±9*
10 мг/кг
93±7*
Образец 4
0.01 мг/кг
145±12*
0.1 мг/кг
122±10*
1 мг/кг
107±9*
10 мг/кг
92±9*
* - достоверность по сравнению с контролем при р<0.05.
2
3
2
5
Из таблицы 4 видно, что Tyr-Pro-D-Ser-X, где X - ОН, NH, ОСН, ОСН вызывает достоверное снижение объема отека в ответ на раздражение каррагенином. Выраженность эффекта зависит от дозы. Образцы 1, 2, 3 и 4 оказывают противовоспалительное действие в дозах 0.01-10 мг/кг.
2
3
2
5
Таким образом, трипептид Tyr-Pro-D-Ser-X, где X - ОН, NH, ОСН, ОСН показал противовоспалительное действие в тесте каррагенинового отека.
2
3
2
5
Пример 5. Изучение противовоспалительной активности Tyr-Pro-D-Ser-X, где X - NH, ОН, ОСН, ОСН в тесте экссудативного перитонита, вызванного уксусной кислотой.
Исследования проводили на белых беспородных мышах самцах массой 20-25 г с использованием теста уксусных корчей (Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. - Москва, ОАО Издательство ″Медицина″. - 2005). Животных случайным образом разделяли на две группы по 10 мышей. Исследуемые образцы вводили за 20 минут до внутрибрюшинного введения. Острая экссудативная реакция - перитонит - вызывалась внутрибрюшинным введением 1% раствора уксусной кислоты (1 мл на 100 г массы тела). Через 3 ч животных подвергали эвтаназии, вскрывали брюшную полость и собирали экссудат. Антиэксудативный эффект оценивали по уменьшению объема экссудата в процентах относительно контроля.
2
3
2
5
2
3
2
5
Исследуемые образцы Tyr-Pro-D-Ser-X, где X - NH (образец 1), ОН (образец 2), ОСН (образец 3), ОСН (образец 4) в дозах 0.001, 0.01, 0.1, 1 и 10 мг/кг вводили внутрибрюшинно в водном растворе. Полученные результаты влияния трипептида общей формулы Tyr-Pro-D-Ser-X, где X - NH, ОН, ОСН, ОСН на экссудативное воспаление, вызванное уксусной кислотой, приведены в таблице 5.
Таблица 5
Испытуемый образец
Объем эксудата (%)
Контроль
100
Образец 1
0.1 мг/кг
68*
1 мг/кг
52*
10 мг/кг
41*
Образец 2
0.01 мг/кг
66*
0.1 мг/кг
51*
1 мг/кг
48*
10 мг/кг
41*
Образец 3
0.01 мг/кг
52*
0.1 мг/кг
46*
1 мг/кг
30*
10 мг/кг
23*
Образец 4
0.01 мг/кг
65*
0.1 мг/кг
57*
1 мг/кг
48*
10 мг/кг
41*
* - достоверность по сравнению с контролем при р<0.05.
2
3
2
5
Из таблицы 5 видно, что Tyr-Pro-D-Ser-X, где X - NH, ОН, ОСН, ОСН вызывает достоверное снижение объема экссудата в ответ на раздражение уксусной кислотой. Выраженность эффекта зависит от дозы. Образцы 1, 2, 3 и 4 оказывают противовоспалительное действие в дозах 0.01-10 мг/кг.
2
3
2
5
Таким образом, трипептид Tyr-Pro-D-Ser-X, где X - NH, ОН, ОСН, ОСН показывает противовоспалительное действие в тесте уксуснокислого перитонита.
2
2
5
Пример 6. Изучение анальгетической и противоспалительной активности Tyr-Pro-D-Ser-X, где X - NH, ОСН на модели нейропатической боли, вызванной перерезкой седалищного нерва.
Исследования проводили на белых беспородных крысах самцах массой 230-280 г с использованием модели нейропатической боли, вызванной перерезкой седалищного нерва (Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. - Москва, ОАО Издательство ″Медицина″. - 2005, Г.Н. Крыжановский, В.К. Решетняк, М.Л. Кукушкин, М.П. Горизонтова, B.C. Смирнова. Болевой синдром у крыс после повреждения седалищного нерва // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. - 1991. - Т.6. - С.8-9). Нейрогенный болевой синдром у самцов беспородных крыс массой 250-280 г создавали перерезкой седалищного нерва на уровне подколенной ямки выше места его трифуркации на n. tibialis, n. peroneus и n. suralis и последующем его лигированием для предотвращения регенерации. Развитие болевого синдрома определяли по появлению признаков аутотомий на оперированной лапе. Интенсивность аутотомий оценивали по 11-балльной шкале: 1 балл - повреждение 1-го когтя; 2, 3, 4 и 5 баллов - повреждение 2-х, 3-х, 4-х и 5-ти когтей; 6 баллов - повреждение фаланги одного пальца; 7, 8, 9 и 10 баллов - повреждение фаланг соответственно на 2-х, 3-х, 4-х и 5-ти пальцах; 11 баллов повреждение плюсневых костей. Динамику развития болевого синдрома у крыс опытных и контрольной групп наблюдали в течение 25 дней. Животным контрольной группы в день перерезки седалищного нерва и последующие 10 дней после операции в/б вводили физиологический раствор объемом 1 мл, а животные опытных групп в те же сроки получали изучаемые соединения в дозе 1 мг/кг (в/б) (Крыжановский Г.Н. и др., 1991).
2
2
5
Исследуемые образцы Tyr-Pro-D-Ser-X, где X - NH (образец 1), ОСН (образец 2) в дозе 1 мг/кг вводили внутрибрюшинно в водном растворе. Контрольным животным вводили внутрибрюшинно дистиллированную воду.
В контрольной группе крыс развитие аутотомии после перерезки седалищного нерва появилось у 50% животных на 6 день после операции. Интенсивность болевых реакций составила 2.8±0.4 балла. На 9 день введения болевая реакция наблюдалась у 60% животных, соответствующая интенсивности 3.5±0.4 балла. После прекращения введения дистиллированной воды на 18 сутки болевые реакции развивались у 70% и составили 5.6+1.1 балла.
Введение образца 1 в дозе 1 мг/кг (в/б) препятствовало развитию болевого синдрома. На 6 и 9 день введения пептида болевые реакции не наблюдались. На 13 сутки эксперимента на 5 день после отмены введения соединения появилась болевая реакция у 10% животных средней интенсивности 4 балла, а на 18 день - у 100% животных, средняя интенсивность реакции составила 3.0±0.6 балла.
Введение образца 2 в дозе 1 мг/кг (в/б) также препятствовало развитию болевого синдрома. На 6 и 9 день введения пептида болевые реакции не наблюдались. На 15 сутки эксперимента на 7 день после отмены введения соединения появилась болевая реакция у 10% животных средней интенсивности 1 балла, а на 20 день - у 30% животных, средняя интенсивность реакции составила 1.5±0.3 балла.
2
2
5
Пример 7. Изучение нежелательных (побочных) эффектов Tyr-Pro-D-Ser-X, где X - NH, ОСН.
2
2
Частота дыхания в контрольных группах животных соответствует 211±4 и 209.5±5.7 движений в минуту. Tyr-Pro-D-Ser-NH не изменяют частоту дыхания ненаркотизированных беспородных мышей в дозах 1, 10, 100, 500 и 800 мг/кг (внутрибрюшинно, однократно). В группе наркотизированных кроликов частота дыхания до введения пептида соответствует 30±2.4 движения в минуту. После введения Tyr-Pro-D-Ser-NH в дозе 10 мг/кг (внутривенно, однократно) частота дыхания значимо не изменяется.
2
Хроническое 14- и 28-дневное введение Tyr-Pro-D-Ser-NH в дозе 1.0 мг/кг (в/б) не приводит к развитию толерантности по анальгетическому эффекту в тесте отдергивания хвоста (рис.9). 7-дневное введение трипептидов в дозах 1.0 и 10.0 мг/кг (внутрибрюшинно) не вызывает развитие толерантности по анальгетическому эффекту в тесте уксусных корчей. На протяжении 28 дней введения пептидов в дозе 1 мг/кг и после их отмены не наблюдаются симптомы синдрома отмены, сохраняются параметры активности в открытом поле и анальгетическая активность в тесте отдергивания хвоста.
2
При провокации налоксоном синдрома отмены после введения Tyr-Pro-D-Ser-NH в дозах 3×50, 3×75 и 3×100 мг/кг в течение 5 дней прыжки и птоз наблюдаются у меньшего числа животных по сравнению с поведением морфин-зависимых животных.
2
2
При однократном введении Tyr-Pro-D-Ser-NH показывают высокий терапевтический индекс. Пептиды не вызывают гибели животных в дозах до 800 мг/кг (внутрибрюшинно). В дозе 100 мг/кг (внутрибрюшинно) Tyr-Pro-D-Ser-NH не влияют на двигательную активность, ориентировочно-исследовательскую реакцию и не вызывают миорелаксации, нарушения координации движений, нарушений ушного и корнеального рефлексов, судорог, тремора, птоза, прыжков, встряхиваний, стука зубами, синдрома Штрауба, чесания, чихания и бокового положения.
Нижеследующие примеры иллюстрируют различные варианты лекарственных препаратов на основе заявленного трипептида.
2
3
2
5
2
3
2
5
Пример 8. На 100 суппозиториев: 3 мл раствора вещества трипептида общей формулы Tyr-Pro-D-Ser-X, где X - ОН, NH, ОСН, ОСН с концентрацией с=10 мг/мл вводят в 55,0 г расплава смеси ПЭГ 1500 и ПЭГ 400 с 5,0 г эмульгатора, затем перемешивают 10 минут. К смеси постепенно прибавляют 275 г, предварительно расплавленной гидрофобной основы (витепсол) с 15,0 г стабилизатора (нипагин) и перемешивают 30 минут. Полученную взвесь разливают в предварительно охлажденные суппозиторные формы и помещают в холодильник при -4°С. Препарат используют в качестве суппозиториев. В 1 суппозитории содержится 30 мг вещества трипептида общей формулы Tyr-Pro-D-Ser-X, где X - ОН, NH, ОСН, ОСН.
2
3
2
5
2
3
2
5
Пример 9. На 100 суппозиториев: 3 мл раствора вещества трипептида общей формулы Tyr-Pro-D-Ser-X, где X - ОН, NH, ОСН, ОСН с концентрацией с=10 мг/мл постепенно прибавляют к 275 г, предварительно расплавленной дифильной основы основы (Supposire АР) с 15,0 г стабилизатора (нипагин) и перемешивают 30 минут. Полученную взвесь разливают в предварительно охлажденные суппозиторные формы и помещают в холодильник при -4°С. Препарат используют в качестве суппозиториев. В 1 суппозитории содержится 30 мг вещества трипептида общей формулы Tyr-Pro-D-Ser-X, где X - ОН, NH, ОСН, ОСН.
2
3
2
5
2
3
2
5
Пример 10. На 100 мл раствора для инъекций: 500 мг вещества трипептида общей формулы Tyr-Pro-D-Ser-X, где X - ОН, NH, ОСН, ОСН, 250 мг натрия гидрофосфата, 500 мг натрия дигидрофосфата, 10 мг бензалкония хлорида растворяют в воде для инъекций и тщательно перемешивают. После растворения объем полученного раствора доводят до 100 мл и фильтруют через антибактериальный фильтр с диаметром пор 0,2 мкм. В 1 мл раствора содержится 5 мг вещества трипептида общей формулы Tyr-Pro-D-Ser-X, где X - ОН, NH, ОСН, ОСН.
2
3
2
5
2
3
2
5
Пример 11. На 100 мл назального спрея: 50 мг раствора трипептида общей формулы Tyr-Pro-D-Ser-X, где X - ОН, NH, ОСН, ОСН, 5 мг натрия гидрофосфата, 50 мг натрия дигидрофосфата, 150 мг сорбитола, 5 мг бензалкония хлорида растворяют в воде очищенной, тщательно перемешивают в течение 10 минут, доводят объем полученного раствора до 100 мл и заправляют в полипропиленовый флакон, с дозирующим насосом и насадкой. Препарат используют в виде назального спрея, в котором содержится 50 мг вещества трипептида общей формулы Tyr-Pro-D-Ser-X, где X - ОН, NH, ОСН, ОСН.
2
3
2
5
2
3
2
5
Пример 12. На 100 мл назальных капель: 10 мг раствора вещества трипептида общей формулы Tyr-Pro-D-Ser-X, где X - ОН, NH, ОСН, ОСН, 5 мг натрия гидрофосфата, 50 мг натрия дигидрофосфата, 150 мг сорбитола, 05 мг бензалкония хлорида, 150 мг масла лавандового растворяют в воде очищенной, тщательно перемешивают в течение 10 минут, доводят объем полученного раствора до 100 мл и заправляют в полипропиленовый флакон, с насадкой. Препарат используют в виде назальных капель, в котором содержится 10 мг вещества трипептида общей формулы Tyr-Pro-D-Ser-X, где X - ОН, NH, ОСН, ОСН.
2
3
2
5
2
3
2
5
Пример 13. На 100 пластырей: 5 г вещества трипептида общей формулы Tyr-Pro-D-Ser-X, где X - ОН, NH, ОСН, ОСН вводят в смесь, состоящую из 9,72 г поли(DL-лактид) и/или поли(DL-лактид-согликолид) с молекулярной массой 30 кДа и соотношением 50:50 с 1,0 г стабилизатора (бензоат натрия) в 60 мл хлороформа. Смесь тщательно перемешивают и разливают тонким слоем, после чего сушат теплым воздухом до полного удаления органического растворителя. Полученную пленку соединяют с тканной основой. Препарат используют в виде пластыря, в котором содержится 1-50 мг вещества трипептида общей формулы Tyr-Pro-D-Ser-X, где X - ОН, NH, ОСН, ОСН.
2
3
2
5
Пример 14. На 100 сублингвальных таблеток: таблетки получали методом прямого прессования на таблеточном прессе смеси, содержащей 1 г вещества трипептида общей формулы Tyr-Pro-D-Ser-X, где X - ОН, NH, ОСН, ОСН и 20 г комбнированного наполнителя ″Ludiflash″.
2
3
2
5
Пример 15. На 100 сублингвальных таблеток: таблетки получали методом влажной грануляции таблеточной смеси, содержащей 1 г вещества трипептида общей формулы Tyr-Pro-D-Ser-X, где X - ОН, NH, ОСН, ОСН и 20 г комбнированного наполнителя ″Ludiflash″.
2
3
2
5
Пример 16. На 100 сублингвальных таблеток: таблетки получали методом сухой грануляции таблеточной смеси, содержащей 1 г вещества трипептида общей формулы Tyr-Pro-D-Ser-X, где X - ОН, NH, ОСН, ОСН и 20 г комбнированного наполнителя ″Ludiflash″.
2
3
2
5
Пример 17. На 100 кишечнорастворимых таблеток: таблетки получали методом прямого прессования на таблеточном прессе смеси, содержащей 1 г вещества трипептида общей формулы Tyr-Pro-D-Ser-X, где X - ОН, NH, ОСН, ОСН и 35 г комбнированного наполнителя ″Prosolv Easytab″. Таблетки покрывали кишечно растворимой оболочкой состоящей из 20,0 г этилметакрилата и 30,0 г двуокиси титана в коаторе.
2
3
2
5
Пример 18. На 100 кишечнорастворимых таблеток: таблетки получали методом влажной грануляции таблеточной смеси, содержащей 1 г вещества трипептида общей формулы Tyr-Pro-D-Ser-X, где X - ОН, NH, ОСН, ОСН и 35 г комбнированного наполнителя ″Prosolv Easytab″. Таблетки покрывали кишечно растворимой оболочкой состоящей из 20,0 г этилметакрилата и 30,0 г двуокиси титана в коаторе.
2
3
2
5
Пример 19. На 100 кишечнорастворимых таблеток: таблетки получали методом сухой грануляции таблеточной смеси, содержащей 1 г вещества трипептида общей формулы Tyr-Pro-D-Ser-X, где X - ОН, NH, ОСН, ОСН и 35 г комбнированного наполнителя ″Prosolv Easytab″. Таблетки покрывали кишечно растворимой оболочкой состоящей из 20,0 г этилметакрилата и 30,0 г двуокиси титана в коаторе.
2
3
2
5
Пример 20. На 100 кишечнорастворимых твердых капсул: капсулы получали методом макания; 1 г вещества трипептида общей формулы Tyr-Pro-D-Ser-X, где X - ОН, NH, ОСН, ОСН, 10 г маннита, 1 г нипагина засыпали на капсульной машине в твердую капсульную оболочку, состоящую из 40,0 г этилметакрилата, 30,0 г желатина, 10,0 г глицерина, 20,0 г двуокиси титана.
2
3
2
5
Пример 21. На 100 кишечнорастворимых твердых капсул: капсулы получали методом штампования; 1 г вещества трипептида общей формулы Tyr-Pro-D-Ser-X, где X - ОН, NH, ОСН, ОСН, 10 г маннита, 1 г нипагина засыпали на капсульной машине в твердую капсульную оболочку, состоящую из 40,0 г этилметакрилата, 30,0 г желатина, 10,0 г глицерина, 20,0 г двуокиси титана.
2
3
2
5
Пример 22. На 100 кишечнорастворимых твердых капсул: капсулы получали капельным методом; 1 г вещества трипептида общей формулы Tyr-Pro-D-Ser-X, где X - ОН, NH, ОСН, ОСН, 10 г маннита, 1 г нипагина засыпали на капсульной машине в твердую капсульную оболочку, состоящую из 40,0 г этилметакрилата, 30,0 г желатина, 10,0 г глицерина, 20,0 г двуокиси титана.