Роль эндоканнабиноидных рецепторов в регуляции иммунного ответа

Медицинская иммунология 2012, Т. 14, № 3, стр. 189-194 © 2012, СПб РО РААКИ

Оригинальные статьи

РОЛЬ ЭНДОКАННАБИНОИДНЫХ РЕЦЕПТОРОВ В РЕГУЛЯЦИИ ИММУННОГО ОТВЕТА

Лобанова Е.Г.

Владивостокский филиал Учреждения РАМН Дальневосточного научного центра физиологии и патологии дыхания СО РАМН — Научно-исследовательский институт медицинской климатологии и восстановительного лечения, г. Владивосток

Резюме. Изучена экспрессия эндоканнабиноидных рецепторов (СВ1, СВ2) на иммунокомпетентных клетках при стимуляции иммунной системы in vivo. Для стимуляции иммунной системы использовали интракорпоральное облучение крови и обогащение крови озоно-кислородной смесью. Установлено, что в норме содержание мононуклеарных лейкоцитов (МЛ), экспрессирующих на своей поверхности дифференцирующий антиген к рецептору СВ2, составило более 90%. Мононуклеар-ных лейкоцитов, имеющих дифференцирующий антиген к рецептору СВ1, не выявлено. Стимуляция иммунной системы in vivo приводит к подавлению экспрессии эндоканнабиноидного СВ2-рецептора на поверхности МЛ, что является прямым доказательством участия эндоканнабиноидной системы в регуляции иммунного ответа.

Ключевые слова: мононуклеарные лейкоциты, эндоканнабиноидные рецепторы СВ1 и СВ2, иммунный ответ.

Lobanova E.G.

ROLE OF ENDOCANNABINOID RECEPTORS IN IMMUNE RESPONSE REGULATION Abstract. Expression of endocannabinoid receptors

Keywords: mononuclear leukocytes, СВ1 and СВ2endocannabinoid receptors, immune response.

Введение

В последние годы достигнут большой прогресс в изучении физиологической роли и механизмов функционирования в организме эндоканнабино-идной системы (ЭКС) [9, 10]. Эндоканнабино-идная система является эндогенной сигнальной системой, принимающей участие в поддержании энергетического, метаболического, иммунного баланса организма. Эндоканнабиноидная система включает в себя G-протеин (удвоенный), кан-набиноидные рецепторы 1 и 2 типов, эндоканна-

Адрес для переписки:

Лобанова Елена Григорьевна

690105, г. Владивосток — 105, ул. Русская, 73г.

Тел./факс: (4232) 34-55-02.

E-mail: isachenko1@yandex.ru

биноиды и энзимы, ответственные за их синтез и разрушение [15, 17]. Показано, что рецепторы 1 типа (СВ1) преимущественно экспрессируют в области головного и спинного мозга, отвечают за двигательные и когнитивные функции, развитие положительных эмоциональных реакций, температуру тела, сон и бодрствование и т.д. Каннабиноидные рецепторы 2 типа (СВ2) локализуются главным образом в клетках иммунной системы, в связи с чем предполагается их участие в регуляции иммунных реакций [10, 12].

В настоящее время известно, что эндокан-набиноиды способны регулировать различные физиологические процессы: поддержание тонуса гладкой мускулатуры сосудов и половых органов, агрегацию и адгезию тромбоцитов, свертываемость крови, высвобождение биологически

189

Лобанова Е.Г.

Медицинская Иммунология

активных веществ — медиаторов воспаления — цитокинов, эйкозаноидов, СО, NO и т.д. Эндо-каннабиноиды участвуют в иммунном ответе: определяют выживаемость клеток, стимуляцию или подавление их роста, дифференциацию, функциональную активность иммунного ответа [13, 14].

В исследованиях, проведенных в Научноисследовательском институте медицинской климатологии и восстановительного лечения СО РАМН (НИИ МКВЛ СО РАМН), установлена роль лигандов каннабиноидных рецепторов в регуляции иммунного ответа. Показано in vitro, что синтетические лиганды каннабиноидных рецепторов — WIN-55,212-2 и анандамид проявляют дозозависимое иммуносупрессорное действие на клетки иммунной системы через подавление экспрессии провоспалительных цитокинов [4]. В литературе встречаются сведения о том, что агонисты каннабиноидных рецепторов способны подавлять выработку медиаторов воспаления, взаимодействуя с СВ2-рецепторами или блокируя их экспрессию [16]. Однако до конца не определена роль СВ2-рецепторов в регуляции иммунного ответа, данный вопрос остается открытым до сих пор.

Цель исследования: изучить экспрессию эндо-каннабиноидных рецепторов (СВЬ СВ2) на иммунокомпетентных клетках при стимуляции иммунной системы in vivo.

Материалы и методы

Работу проводили на базе лаборатории биомедицинских исследований (руководитель — профессор, д.б.н. Т.П. Новгородцева) НИИ МКВЛ СО РАМН. Исследование было одобрено этическим комитетом, все добровольцы подписали форму добровольного информированного согласия.

В исследовании принимали участие 28 здоровых добровольцев в возрасте 23-55 лет (32,2±8,2 лет) (из них 9 мужчин [32%] и 19 женщин [68%]).

Гематологические параметры периферической крови определяли на анализаторе Абакус (Австрия). Фенотипирование лимфоцитов периферической крови проводили с помощью моноклональных антител к молекулам CD3, CD4, CD8, CD16, CD22, СD25, HLA-DR (Беларусь). Фагоцитарную активность нейтрофилов определяли по методу Д.Н. Маянского и соавт [7]. Для оценки кислородзависимых механизмов бак-терицидности нейтрофилов использовали тест восстановления нитросинего тетразолия (НСТ), определяли НСТ-спонтанный, НСТ резерв, индекс активации нейтрофилов (ИАН) и резерв индекса активации нейтрофилов по методу Park в модификации У.В. Шмелева. Уровень провос-

палительных цитокинов (TNFa, IL-8) определяли иммуноферментным методом (тест-система фирмы INVITROGEN, Бельгия).

Для стимуляции иммунной системы проводили нагрузочные тесты in vivo. В качестве нагрузочного теста in vivo применяли два метода иммуностимуляции: интракорпоральное облучение крови и внутривенное введение озонированного физиологического раствора. Интракорпораль-ное облучение крови проводили путем введения одноразового стерильного катетера через пункционную иглу непосредственно в кровеносное русло. Облучение крови проводили однократно с помощью аппарата «Иволга — ОМС-01», использовали спектральный диапазон 650-2000 нм с экспозицией 20 мин. Озонирование физиологического раствора осуществляли на аппарате «Медозон». Раствор в количестве 200 мл предварительно озонировали, пропуская через него озоно-кислородную смесь до достижения концентрации озона в жидкости — 6 мкг/мл, после чего вводили внутривенно капельно.

В зависимости от метода стимуляции были сформированы две группы. В первую группы вошли лица, получавшие световую иммуностимуляцию: 15 человек (из них 6 мужчин и 9 женщин). Лица, получавшие озонотерапию, составили вторую группу: 13 человек (из них 3 мужчин и 10 женщин).

Забор периферической крови проводили дважды до облучения крови или введения озоно-кислородной смеси и через три часа после процедур. Ранее было показано [3], что при стимуляции in vivo увеличение концентрации провоспалительных цитокинов в крови наступает через 3 часа. Кровь отбирали из локтевой вены в стерильные силиконизированные пробирки с антикоагулянтом (ЭДТА — 0,1М 0,02 мл/мл крови; «Venoject»). Для удаления эритроцитов пробоподготовку проводили по безотмывочной технологии с использованием лизирующего 0,83% раствора NH4CL [5]. Цельную кровь разбавляли 1:10 лизирующим раствором, тщательно перемешивали при комнатной температуре в течение 10 минут. Взвесь клеток осаждали центрифугированием при 600 g и температуре 20 °С. Клетки дважды отмывали средой 199. Отмытые клетки разводили средой RPMI-1640 (Sigma, США) до рабочей концентрации 1 х 105 кл/мл. Определение экспрессии поверхностных маркеров эн-доканнабиноидных рецепторов проводили при помощи соответствующих антител (Santa Cruz Biotechnology, США), результаты учитывали методом проточной цитофлюорометрии на проточном цитометре FACSСalibur (Becton Dickinson, США). На мононуклеарных лейкоцитах (МЛ) исследовали уровень эндоканнабиноидных ре-

190

2012, Т. 14, № 3

Эндоканнабиноидные рецепторы на иммунокомпетентных клетках

что эндоканнабиноидный рецептор СВ2 экспрессируется на поверхность МЛ, а эндоканнабиноидный рецептор СВ1 — нет [12]. Следовательно, наличие эндоканнабиноидных СВ2-рецепторов на МЛ является маркером лейкоцитарного пула клеток.

Ранее нами выявлено, что синтетические лиганды каннабиноидных рецепторов (WIN55,212-2 и анандамид) модулируют сигнальную функцию клеток иммунной системы через эндоканнабиноидный рецептор СВ2, подавляющий выработку провоспалительных цитокинов (IL-2, IL-8, TNFa) [4, 11]. Возможно, что интенсивность иммунного ответа опосредована через активность экспрессии эндоканнабиноидного рецептора СВ2. Отсутствие данных об особенностях выработки СВ2-рецептора при различных состояниях иммунного ответа побудила нас изучить активность экспрессии СВ2-рецептора на иммунокомпетентных клетках в норме и при стимуляции иммунной системы нагрузочными тестами in vivo физическими методами.

Из совокупности современных методов, стимулирующих иммунный ответ, было выбрано два физических метода: интракорпоральное облучение крови и обогащение крови озоно-кислородной смесью. По данным литературы [6, 8] и ранним исследованиям НИИ МКВЛ СО РАМН [1], оба метода влияют на изменение секреции цитокинов, активность клеток эндотелия микрососудов, сосудистых макрофагов, внутрисосудистых

ТАБЛИЦА 1. ИЗМЕНЕНИЕ ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ ПАРАМЕТРОВ У ЗДОРОВЫХ ДОНОРОВ ДО И ПОСЛЕ СТИМУЛЯЦИИ

Параметры До воздействия физических методов После воздействия физических методов

Интракорпоральное облучение крови Внутривенное воздействие озоно-кислородной смеси

Лейкоциты, х 109/л 6,0±0,28 7,1±0,36 6,6±0,18

Лимфоциты, % 27,5±1,34 29,5±1,58*** 28,5±1,04**

CD3, % 45,0±4,9 49,77±1,57* 46,81±1,2

CD4, % 40,0±3,13 44,08±1,89 42±1,11

CD8, % 22±1,21 20,82±1,07 20,0±1,81

CD4/CD8, у.е. 1,8±0,08 2,20±0,05 2,1±0,01

CD22, % 24,85±1,3 26,5±1,47 25,45±2,3

CD16, % 17,5±1,06 19,28±1,26 18,9±2,12

CD25, % 9±0,8 12,55±1,05*** 11,04±0,08**

HLA-DR, % 11,2±0,5 13,18±0,65** 12,2±0,15*

Фагоцитоз, % 60,2±1,41 88,5±1,46*** 78,2±1,81***

ФР, у.е. 1,04±0,01 1,23±0,03*** 1,22±0,02***

TNFa, пг/мл 23±1,6 64,2±8,1*** 43±4,6***

IL-8, пг/мл 115±12,6 218±22,8*** 188±32,4***

Примечание. Достоверность в сравнении с группой до воздействия физических методов; * - р < 0,05; ** - р < 0,01;

*** - р < 0,001.

цепторов (СВЬ СВ2). Гейт (окно) популяции клеток устанавливали на основе комбинации прямого и бокового светорассеяния и размера клеток. При учете результатов подсчитывали 10 000 клеток в гейте. Статистическая обработка материала проведена при помощи программного пакета WinMDI 2,8.

Результаты и обсуждение

Для выявления иммуностимулирующих свойств физических методов была проведена оценка иммунологических и гематологических параметров периферической крови у здоровых доноров до и после воздействия интракорпораль-ным облучением крови и внутривенным введением озонированного физиологического раствора. Выявлено повышение уровня провоспалительных цитокинов, количества клеток белой крови и фагоцитирующих нейтрофилов (табл. 1). Следовательно, общая направленность изменений иммунологических показателей характеризовалась повышением эффективности защитных реакций.

Проведенный цитометрический анализ мо-нонуклеарных лейкоцитов здоровых доноров показал, что процентное содержание клеток, экспрессирующих на своей поверхности дифференцирующий антиген к рецептору СВ2, составило более 90% от всех исследуемых клеток (рис. 1). Число МЛ, имеющих дифференцирующий антиген к рецептору СВЬ не выявлено (рис. 1). Данный факт подтверждают литературные данные о том,

191

Лобанова Е.Г.

Медицинская Иммунология

I. A

II. A

100 101

102

FL2-H

103 104

III. A

100 1 01 102 1 03 1 04

FL2-H

со; о

CB2

100 1 01 102 1 03

FL2-H

=>— III. Б

96%

100 1 01 102 1 03 1 04

FL2-H

Рисунок 1. Цитофлуорометрическое определение эндоканнабиноидных рецепторов до стимуляции

Примечание. А - гистограмма МЛ; Б - распределение МЛ по популяциям; I. Анализ проводился без использования тестирования по рецепторам (СВ,, СВ2); II. Анализ проводился с использованием гейтирования по СВ,-рецептору; III. Анализ проводился с использованием гейтирования по СВ2-рецептору.

лейкоцитов и тромбоцитов, различных стромальных клеток в зоне микроциркуляторного русла.

Иммуностимулирующий эффект интракор-порального облучения крови проявляется в поглощении клетками фотонов и переходе их в возбужденное состояние как в результате прямого взаимодействия энергии кванта с веществом клетки, так и в результате изменения структуры липидного бислоя цитомембраны, увеличения биосинтеза нуклеиновых кислот, сигнальных молекул, активности экспрессии ферментов. Кроме того, образующиеся в крови фрагменты разрушенных и вновь синтезируемых белков могут играть роль антигенов, вызывая соответствующие иммунные реакции в организме [2, 6].

Внутривенное введение озоно-кислородной смеси сопровождается повышением содержания озонидов в крови, способствующих окислению макромолекул (белки, липиды, ДНК), образованию пероксидов, которые и участвуют в развитии воспалительного процесса. В свою очередь, стимуляция клеток иммунной системы озонидами приводит к активации синтеза провоспалительных медиаторов (лейкотриены, простагланди-ны), которые также обеспечивают формирование воспаления [8]. Следовательно, выбранные нами два метода, независимо от механизма их действия, имеют однонаправленный эффект на реактивность иммунокомпетентных клеток, что позволяет использовать их в установлении роли СВ2-рецептора в иммунном ответе.

Проведенные исследования по индуцированию клеток иммунной системы in vivo показали, что в первой группе после интракорпорального облучения крови количество клеток, имеющих СВ2-рецепторы, составило менее 60% (рис. 2). Сравнительный анализ до воздействия интракор-порального облучения и после показал достоверное снижение СВ2-рецептора на 30% (р < 0,001). Полученные результаты свидетельствуют о блокаде экспрессии эндоканнабиноидного СВ2-ре-цептора на поверхности МЛ. Во второй группе после введения внутривенно озоно-кислородной смеси количество клеток, содержащих СВ2-ре-цептор (рис. 3), также снизилось и не превышало 70%, что имело достоверное различие до воздействия данного физического фактора (р < 0,001). Таким образом, в двух группах наблюдения отмечается снижение числа клеток, экспрессирующих эндоканнабиноидный СВ2-рецептор. Вероятно, что такая однонаправленная реакция иммунной системы, независимо от механизма действия эффектора, свидетельствует об универсальности механизма иммунного ответа на флогоген и формирование воспалительной реакции.

Установленное подавление экспрессии эндоканнабиноидного СВ2-рецептора на поверхности МЛ при нагрузочных тестах in vivo является прямым доказательством того, что ЭКС участвует в регуляции иммунного ответа. Учитывая, что СВ2-рецепторы обладают иммунодепрессирую-щим действием на синтез провоспалительных медиаторов, снижение их экспрессии под дей-

192

2012, Т. 14, № 3

Эндоканнабиноидные рецепторы на иммунокомпетентных клетках

О о .— о . I. A

о : о . со .

о : о . со • . Ж-

о ^ О '

II. A

III. A

100 101

102 1 03 1 04

FL2-H

I. Б

О

О

х°°

мй

о8

\

. 1

А

100 101

102

FL2-H

II. Б

103 104

100

3 О _ О CN

о :

101 102

FL2-H

III. Б

1

103 104

38%

100 101

102

FL2-H

103 104

Рисунок 2. Цитофлуорометрическое определение эндоканнабиноидных СВ2-рецепторов после интракорпорального облучения крови

Примечание. А - гистограмма МЛ; Б - распределение МЛ по популяциям; I. Анализ проводился без использования тестирования по рецептору СВ2; II. Анализ проводился с использованием гейтирования по СВ2-рецептору; III. Анализ проводился с использованием гейтирования по СВ-рецептору после интракорпорального облучения крови.

I. A

II. A

О _ О.

со.

О"

Л 6 <Л со СО 03 О

о:

.

O'

о.

CNJ.

III. A

104

100 101

102

FL2-H

II. Б

103 104

102

FL2-H

III. Б

Рисунок 3. Цитофлуорометрическое определение эндоканнабиноидных СВ2-рецепторов после введения внутривенно озоно-кислородной смеси

Примечание. А - гистограмма МЛ; Б - распределение МЛ по популяциям; I. Анализ проводился без использования гейтирования по рецептору СВ2; II. Анализ проводился с использованием гейтирования по СВ2-рецептору; III. Анализ проводился с использованием гейтирования по СВ2-рецептору после ведения внутривенно озоно-кислородной смеси.

ствием экзогенных иммуностимуляторов является первичной реакцией организма, которая запускает воспалительную реакцию и активирует иммунную систему. Возможно, гиперреактивность иммунного ответа обусловлена активацией

синтеза эндоканнабиноидов, обладающих блокирующим действием на экспрессию СВ2-ре-цепторов.

Полученные данные свидетельствуют о значимой роли ЭКС в регуляции иммунного ответа

193

Лобанова Е.Г.

Медицинская Иммунология

и могут быть использованы для целенаправленного воздействия на воспалительную реакцию организма через СВ2-рецептор.

Список литературы

1. Виткина Т.И., Хмелева Е.В., Антонюк М.В., Новгородцев А.Д. Влияние медицинского озона на иммунометаболический статус больных хроническим бронхитом и артериальной гипертензией // Бюллетень физиологии и патологии дыхания. — 2011. — № 40. — C. 81-86.

2. Иванов Е.М., Эндакова Э.А. Аутотрансфузия ультрофиолетом облученной крови. — Владивосток: Дальнаука, 1993. — 103 с.

3. Исаченко Е.Г., Виткина Т.И., Герони-на С.А. Потапов В.Н., Бердышев Е.В. Спонтанный и липополисахарид индуцированный синтез цитокинов клетками крови человека в норме и при аллергопатологиях // Иммунология. — 1999. - № 5. - C. 37-39.

4. Исаченко Е.Г., Виткина Т.И., Бердышев Е.В. Влияние лигандов каннабиноидных рецепторов WIN 55,212-2 и анандамида на выработку TNF-a и ИЛ-8 лейкоцитами крови здоровых лиц и больных с аллергопатологией // Иммунопатология, аллергология, инфектология. -2003. - Т 2. - С. 86-91.

5. Клауса Дж. Лимфоциты: методы. - М.: Мир, 1990. - 395 с.

6. Клебанов Г.И., Теселкин Ю.О., Бабенкова И.В., Башкуева Т.Ю., Модестова Т.М., Стеклова Л.С., Владимиров Ю.А. Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на функциональный потенциал лейкоцитов // Бюлл. эксперим. биологии и медицины. - 1997. - Т 123 (4). -С. 395-398.

7. Моделирование и клиническая характеристика фагоцитарных реакций / Под ред. А.Н. Маянского. - Горький: Изд-во Горьк. мед. института, 1989. - 242 с.

8. Техника озонотерапии: Методич. ре-

комендации / С.П. Перетягин, Г.А. Бояринов, Д.М. Зеленов и др. - Н. Новгород, 1991. - 15 с.

9. Чурюканов М.В., Чурюканов В.В. Функциональная организация и терапевтический потенциал эндогенной каннабиноидной системы // Эксперим. и клинич. фармакология. - 2004. -Т. 67 (2). - С. 70-78.

10. Devane W.A., Hanu L., Breuer A. et al. Isolation and structure of a brain constituent that binds to the cannabinoid receptor // Science. -1992. - Vol. 258. - P. 1946-1949.

11. Galiegue S., Mary S., Marchand J. et al. Expression of central and peripheral cannabinoid receptors in human immune tissues and leukocyte subpopulations // Eur. J. Biochem. - 1995. -Vol. 232. - P. 54-61.

12. Han K.H., Lim S., Ryu J., Lee C.-W., Kim Y., Kang J.-H., Kang S.-S., Ahn Y.K., Park C.-S., Kim J.J. CB1 and CB2 cannabinoid receptors differentially regulate the production of reactive oxygen species by macrophages // J. Cardiovasc Res. December 1. - 2009. - Vol. 84 (3). - P. 378-386.

13. Kurihara R., Tohyama Y., Matsusaka S. et al. Effects of peripheral cannabionoid receptor ligands on motility and polarization in neutrophil-like HL60 cells and human neutrophils // J. Biol. Chem. -2006. - Vol. 281. - P. 12908-12918.

14. M&rquez L., Abanades S., Andreu M. Endocannabinoid system and bowel inflammation // Med. Clin. (Barc). - 2008. - Vol. 131 (13). - P. 513517.

15. Munro S., Thomas K.L., Abu-Shaar M. Molecular characterization of a peripheral receptor for cannabinoids // Nature. - 1993. - Vol. 365. -P. 61-65.

16. Orgado J.M., Fern&ndez-Ruiz J., Romero J. The endocannabinoid system in neuropathological states // Int. Rev. Psychiatry. - 2009. - Vol. 21 (2). -Р. 172-180.

17. Pertwee R.G. Pharmacology of cannabinoid receptor ligands // Cur. Med. Chem. - 1999. -Vol. 6. - P. 635-664.

поступила в редакцию 14.08.2011 отправлена на доработку 28.09.2011 принята к печати 04.10.2011

194