СПОСОБЫ ТЕРАПИИ НА ОСНОВЕ CAR Т-КЛЕТОК С ПОВЫШЕННОЙ ЭФФЕКТИВНОСТЬЮ

1. Клетка (например, популяция клеток), модифицированная способами инженерии для экспрессии химерного рецептора антигена (CAR), где CAR содержит антигенсвязывающий домен, трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен, и где экспрессия и/или функция Tet1, Tet2 и/или Tet3 в указанной клетке снижена или устранена.
2. Клетка по п.1, где антигенсвязывающий домен, связывающийся с опухолевым антигеном, выбран из группы, состоящей из: TSHR, CD19, CD123, CD22, CD30, CD171, CS-1, CLL-1, CD33, EGFRvIII, GD2, GD3, BCMA, Tn Ag, PSMA, ROR1, FLT3, FAP, TAG72, CD38, CD44v6, CEA, EPCAM, B7H3, KIT, IL-13Ra2, мезотелина, IL-11Ra, PSCA, PRSS21, VEGFR2, LewisY, CD24, PDGFR-бета, SSEA-4, CD20, рецептора фолатов альфа, ERBB2 (Her2/neu), MUC1, EGFR, NCAM, простазы, PAP, ELF2M, эфрина B2, рецептора IGF-I, CAIX, LMP2, gp100, bcr-abl, тирозиназы, EphA2, фукозил-GM1, sLe, GM3, TGS5, HMWMAA, o-ацетил-GD2, рецептора фолатов бета, TEM1/CD248, TEM7R, CLDN6, GPRC5D, CXORF61, CD97, CD179a, ALK, полисиаловой кислоты, PLAC1, GloboH, NY-BR-1, UPK2, HAVCR1, ADRB3, PANX3, GPR20, LY6K, OR51E2, TARP, WT1, NY-ESO-1, LAGE-1a, MAGE-A1, легумаина, HPV E6,E7, MAGE A1, ETV6-AML, белка спермы 17, XAGE1, Tie 2, MAD-CT-1, MAD-CT-2, Fos-родственного антигена 1, p53, мутанта p53, простеина, сурвивина и теломеразы, PCTA-1/галектина 8, MelanA/MART1, мутанта Ras, hTERT, точек разрыва при транслокации саркомы, ML-IAP, ERG (слитый ген TMPRSS2 ETS), NA17, PAX3, рецептора андрогенов, циклина B1, MYCN, RhoC, TRP-2, CYP1B1, BORIS, SART3, PAX5, OY-TES1, LCK, AKAP-4, SSX2, RAGE-1, обратной транскриптазы теломеразы человека, RU1, RU2, кишечной карбоксилэстераы, mut hsp70-2, CD79a, CD79b, CD72, LAIR1, FCAR, LILRA2, CD300LF, CLEC12A, BST2, EMR2, LY75, GPC3, FCRL5 и IGLL1.
3. Клетка по п.2, где опухолевым антигеном является CD19.
4. Клетка по п.1, где антигенсвязывающий домен представляет собой антитело или фрагмент антитела, как описано, например, в WO2012/079000 или WO2014/153270.
5. Клетка по любому из предшествующих пунктов, где трансмембранный домен содержит:
аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации, но не более 20, 10 или 5 модификаций аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 12 или последовательности, обладающей 95-99% идентичностью с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 12; или
последовательность SEQ ID NO: 12.
6. Клетка по любому из предшествующих пунктов, где антигенсвязывающий домен связан с трансмембранным доменом шарнирной областью, где указанная шарнирная область содержит SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 6, или последовательность, обладающую 95-99% идентичностью с ними.
7. Клетка по любому из предшествующих пунктов, где внутриклеточный сигнальный домен содержит первичный сигнальный домен и/или костимулирующий сигнальный домен, где первичный сигнальный домен содержит функциональный сигнальный домен белка, выбранного из CD3-зета, CD3-гамма, CD3-дельта, CD3, общего FcR-гамма (FCER1G), FcR-бета (Fc-эпсилон R1b), CD79a, CD79b, Fc-гамма RIIa, DAP10 или DAP12.
8. Клетка по любому из предшествующих пунктов, где первичный сигнальный домен содержит:
аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере одной, двумя или тремя, но не более чем 20, 10 или 5 модификациями аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 18 или SEQ ID NO: 20, или последовательность, обладающую 95-99% идентичностью с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 18 или SEQ ID NO: 20; или
аминокислотную последовательность SEQ ID NO:18 или SEQ ID NO: 20.
9. Клетка по любому из предшествующих пунктов, где внутриклеточный сигнальный домен содержит костимулирующий сигнальный домен, или первичный сигнальный домен и костимулирующий сигнальный домен, где костимулирующий сигнальный домен содержит функциональный сигнальный домен белка, выбранного из группы, состоящей из CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, ассоциированного с лимфоцитарной функцией антигена-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, лиганда, который специфически связывается с CD83, CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), CD160, CD19, CD4, CD8-альфа, CD8-бета, IL2R-бета, IL2R-гамма, IL7R-альфа, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, NKp44, NKp30, NKp46 и NKG2D
10. Клетка по любому из предшествующих пунктов, где костимулирующий сигнальный домен указанного CAR содержит аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере одной, двумя или три модификациями, но не более чем 20, 10 или 5 модификациями аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 16, или последовательность, обладающую 95-99% идентичностью с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 16.
11. Клетка по любому из предшествующих пунктов, где костимулирующий сигнальный домен содержит последовательность SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 16.
12. Клетка по любому из предшествующих пунктов, где внутриклеточный домен содержит последовательность SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 16 и последовательность SEQ ID NO: 18 или SEQ ID NO: 20, где последовательности, содержащие внутриклеточный сигнальный домен, экспрессируются в одной рамке считывания и в виде единой полипептидной цепи.
13. Клетка по любому из предшествующих пунктов, дополнительно содержащая лидерную последовательность, которая содержит последовательность SEQ ID NO: 2.
14. Клетка по любому из предшествующих пунктов, где клетка представляет собой иммунную эффекторную клетку (например, популяцию иммунных эффекторных клеток).
15. Клетка по п.14, где иммунная эффекторная клетка представляет собой T-клетку или NK-клетку.
16. Клетка по п.15, где иммунная эффекторная клетка представляет собой T-клетку.
17. Клетка по п.16, где T-клетка представляет собой CD4+ T-клетку, CD8+ T-клетку или их комбинацию.
18. Клетка по любому из предшествующих пунктов, где клетка представляет собой клетку человека.
19. Клетка по любому из предшествующих пунктов, где клетка содержит ингибитор Tet1, Tet2 и/или Tet3.
20. Клетка по п.19, где ингибитор Tet1, Tet2 и/или Tet3 представляет собой (1) систему редактирования генов, нацеленную на один или несколько участков в гене, кодирующем Tet1, Tet2 и/или Tet3, или в их регуляторных элементах, например, в Tet2 или его регуляторных элементах; (2) нуклеиновую кислоту, кодирующую один или несколько компонентов указанной системы редактирования генов; или (3) их комбинации.
21. Клетка по п.20, где система редактирования генов выбрана из группы, состоящей из: системы CRISPR/Cas9, системы нуклеазы с цинковыми пальцами, системы TALEN и системы мегануклеазы.
22. Клетка по п.20 или 21, где система редактирования генов связывается с последовательностью-мишенью в раннем экзоне или интроне гена, кодирующего Tet1, Tet2 и/или Tet3, например, Tet2.
23. Клетка по п.22, где система редактирования генов связывает последовательность-мишень гена, кодирующего tet2, и последовательность-мишень находится выше по направлению транскрипции относительно экзона 4, например, в экзоне 1, экзоне 2 или экзоне 3, например, в экзоне 3.
24. Клетка по любому из пп.20-23, где система редактирования генов связывается с последовательностью-мишенью в позднем экзоне или интроне гена, кодирующего Tet1, Tet2 и/или Tet3, например Tet2.
25. Клетка по п.24, где система редактирования генов связывает последовательность-мишень гена, кодирующего tet2, и последовательность-мишень расположена ниже по направлению транскрипции относительно экзона 8, например, находится в экзоне 9, экзоне 10 или экзоне 11, например, находится в экзоне 9.
26. Клетка по любому из пп.18-25, где система редактирования генов представляет собой систему CRISPR/Cas, содержащую молекулу гРНК, содержащую нацеливающую последовательность, которая гибридизуется с последовательностью-мишенью гена Tet2.
27. Клетка по п.26, где нацеливающая последовательность представляет собой нацеливающую последовательность, приведенную в таблице 3.
28. Клетка по п.26, где нацеливающая последовательность представляет собой нацеливающую последовательность, приведенную в таблице 5.
29. Клетка по п.19, где ингибитор Tet2 представляет собой миРНК или кшРНК, специфичную к Tet1, Tet2, Tet3, или нуклеиновую кислоту, кодирующую указанную миРНК или кшРНК.
30. Клетка по п.29, где миРНК или кшРНК содержит последовательность, комплементарную последовательности мРНК Tet2, например, содержит последовательность-мишень кшРНК, приведенную в таблице 4.
31. Клетка по п.19, где ингибитор Tet1, Tet2 и/или Tet3 представляет собой низкомолекулярное соединение.
32. Клетка по п.19, где ингибитор Tet1, Tet2 и/или Tet3 представляет собой белок, например, представляет собой доминантно-негативный партнер по связыванию для Tet1, Tet2 и/или Tet3 (например, деацетилаза гистонов (HDAC), которая взаимодействует с Tet1, Tet2 и/или Tet3), или нуклеиновую кислоту, кодирующую указанный доминантно-негативный партнер по связыванию для Tet1, Tet2 и Tet3.
33. Клетка по п.19, где ингибитор представляет собой белок, например, представляет собой доминантно-негативный (например, каталитически неактивный) Tet1, Tet2 или Tet3, или нуклеиновую кислоту, кодирующую указанный доминантно-негативный Tet1, Tet2 или Tet3.
34. Способ повышения терапевтической эффективности экспрессирующей CAR клетки, например, клетки по любому из предшествующих пунктов, например, экспрессирующей CAR19 клетки (например, CTL019), включающий стадию снижения уровня 5-гидроксиметилцитозина в указанной клетке.
35. Способ повышения терапевтической эффективности экспрессирующей CAR клетки, например, клетки по любому из предшествующих пунктов, например, экспрессирующей CAR19 клетки (например, CTL019), включающий стадию приведения указанной клетки в контакт с ингибитором Tet, например, ингибитором Tet1, Tet2 и/или Tet3.
36. Способ по п.34, где указанная стадия включает приведение указанных клеток в контакт с ингибитором Tet.
37. Способ по п.35 или 36, где указанный ингибитор Tet представляет собой ингибитор Tet2.
38. Способ по п.36, где ингибитор Tet выбран из группы, состоящей из: (1) системы редактирования генов, нацеленной на один или несколько участков в гене, кодирующем Tet1, Tet2 или Tet3, или в его соответствующих регуляторных элементах; (2) нуклеиновой кислоты (например, миРНК или кшРНК), которая ингибирует экспрессию Tet1, Tet2 или Tet3; (3) белка (например, доминантно-негативного, например, каталитически неактивного) Tet1, Tet2 или Tet3, или партнера по связыванию для Tet1, Tet2 или Tet3; (4) низкомолекулярного соединения, которое ингибирует экспрессию и/или функцию Tet1, Tet2 или Tet3; (5) нуклеиновой кислоты, кодирующей любой из (1)-(3); и (6) любой комбинации (1)-(5).
39. Способ по п.38, где ингибитором Tet является ингибитор Tet2.
ex vivo
40. Способ по любому из пп.36-39, где указанное приведение в контакт происходит .
in vivo
41. Способ по любому из пп.36-39, где указанное приведение в контакт происходит .
in vivo
42. Способ по п.41, где приведение в контакт происходит  перед доставкой нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR, в клетку.
in vivo
43. Способ по п.41, где приведение в контакт происходит  после введения клеток индивидууму, нуждающемуся в этом.
44. Клетка для применения в способе лечения индивидуума, нуждающегося в этом, причем способ включает введение указанному индивидууму эффективного количества клеток по любому из пп.1-33.
45. Клетка для применения по п.44, где способ дополнительно включает введение указанному индивидууму ингибитора Tet1, Tet2 и/или Tet3.
46. Терапия экспрессирующими CAR клетками для применения в способе лечения индивидуума, нуждающегося в этом, причем способ включает проведение у указанного индивидуума терапии экспрессирующими CAR-клетками и введение ингибитора Tet1, Tet2 и/или Tet3.
47. Терапия экспрессирующими CAR клетками для применения по п.46, где индивидууму проводят предварительное лечение ингибитором Tet1, Tet2 и/или Tet3 перед началом терапии экспрессирующими CAR клетками.
48. Терапия экспрессирующими CAR клетками для применения по п.46, где указанному индивидууму проводят одновременное лечение ингибитором Tet1, Tet2 и/или Tet3 и терапию экспрессирующими CAR клетками.
49. Терапия экспрессирующими CAR клетками для применения по п.46, где индивидууму проводят лечение ингибитором Tet1, Tet2 и/или Tet3 после терапии экспрессирующими CAR клетками.
50. Терапия экспрессирующими CAR клетками для применения по любому из пп.44-49, где индивидуум имеет заболевание, ассоциированное с экспрессией опухолевого антигена, например, пролиферативное заболевание, предзлокачественное состояние, злокачественную опухоль и не связанное со злокачественной опухолью заболевание, ассоциированное с экспрессией опухолевого антигена.
51. Терапия экспрессирующими CAR клетками для применения по п.50, где злокачественная опухоль представляет собой гематологическую злокачественную опухоль, выбранную из одного или нескольких из хронического лимфоцитарного лейкоза (CLL), острых лейкозов, острого лимфоидного лейкоза (ALL), B-клеточного острого лимфоидного лейкоза (B-ALL), T-клеточного острого лимфоидного лейкоза (T-ALL), хронического миелогенного лейкоза (CML), B-клеточного пролимфоцитарного лейкоза, новообразования из бластных плазмацитоидных дендритных клеток, лимфомы Беркитта, диффузной крупноклеточной B-клеточной лимфомы, фолликулярной лимфомы, волосатоклеточного лейкоза, мелкоклеточной или крупноклеточной фолликулярной лимфомы, злокачественных лимфопролиферативных состояний, MALT-лимфомы, лимфомы из клеток мантийной зоны, лимфомы из клеток маргинальной зоны, множественной миеломы, миелодисплазии и миелодиспластического синдрома, неходжскинской лимфомы, лимфомы Ходжкина, плазмабластной лимфомы, новообразования из плазмацитоидных дендритных клеток, макроглобулинемии Валденстрема или предлейкоза.
52. Терапия экспрессирующими CAR клетками для применения по п.50, где злокачественная опухоль выбрана из группы, состоящей из рака толстого кишечника, рака прямой кишки, почечно-клеточного рака, рака печени, немелкоклеточной карциномы легкого, рака тонкого кишечника, рака пищевода, меланомы, рака кости, рака поджелудочной железы, рака кожи, рака головы и шеи, кожной или внутриглазной злокачественной меланомы, рака тела матки, рака яичника, рака прямой кишки, рака анальной области, рака желудка, рака яичка, рака тела матки, карциномы фаллопиевых труб, карциномы эндометрия, карциномы шейки матки, карциномы влагалища, карциномы вульвы, болезни Ходжкина, неходжскинской лимфомы, злокачественной опухоли эндокринной системы, рака щитовидной железы, рака паращитовидной железы, рака надпочечника, саркомы мягких тканей, рака мочеиспускательного канала, рака полового члена, солидных опухолей детского возраста, рака мочевого пузыря, рака почки или мочеточника, рака почечной лоханки, новообразования центральной нервной системы (ЦНС), первичной лимфомы ЦНС, ангиогенеза опухоли, опухоли позвоночника, глиомы ствола головного мозга, аденомы гипофиза, саркомы Капоши, эпидермоидного рака, плоскоклеточного рака, T-клеточной лимфомы, злокачественных опухолей, индуцируемых факторами внешней среды, комбинаций указанных злокачественных опухолей и метастатических очагов указанных злокачественных опухолей.
53. Ингибитор Tet1, Tet2 и/или Tet3 для применения для лечения индивидуума, где указанному индивидууму проводили, проводят или намереваются проводить терапию, включающую экспрессирующие CAR клетки.
54. Способ производства экспрессирующих CAR клеток, включающий введение нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR, в клетку, так чтобы указанная нуклеиновая кислота (или ее кодирующая CAR часть) встраивалась в геном клетки в ген Tet1, Tet2 и/или Tet3 (например, в интрон или экзон гена Tet1, Tet2 и/или Tet3), так чтобы экспрессия и/или функция Tet1, Tet2 и/или Tet3 снижалась или устранялась.
ex vivo
55. Способ производства экспрессирующей CAR клетки, включающий приведение в контакт указанной экспрессирующей CAR клетки  с ингибитором Tet1, Tet2 и/или Tet3.
56. Способ по любому из пп.40-55, где ингибитором является ингибитор Tet2.
57. Вектор, содержащий последовательность, кодирующую CAR, и последовательность, кодирующую ингибитор Tet, например, ингибитор Tet1, Tet2 и/или Tet3.
58. Вектор по п.57, где ингибитор Tet представляет собой (1) систему редактирования генов, нацеленную на один или несколько участков в гене, кодирующем Tet1, Tet2 или Tet3, или в его соответствующих регуляторных элементах; (2) нуклеиновую кислоту (например, миРНК или кшРНК), которая ингибирует экспрессию Tet1, Tet2 или Tet3; (3) белок (например, доминантно-негативный, например, каталитически неактивный) Tet1, Tet2 или Tet3, или партнер по связыванию для Tet1, Tet2 или Tet3; и (4) нуклеиновую кислоту, кодирующую любой из (1)-(3), или их комбинации.
59. Вектор по п.57 или 58, где последовательность, кодирующая CAR, и последовательность, кодирующая ингибитор Tet, разделены участком 2A.
60. Cистема редактирования генов, которая является специфичной к последовательности гена Tet или его регуляторных элементов, например, гена Tet1, Tet2 или Tet3 или его регуляторных элементов.
61. Система редактирования генов по п.60, где система редактирования генов является специфичной в отношении последовательности гена Tet2.
62. Система редактирования генов по п.60 или 61, где система редактирования генов представляет собой (1) систему редактирования генов CRISPR/Cas, (2) систему нуклеазы с цинковыми пальцами, систему TALEN и систему мегануклеазы.
63. Система редактирования генов по п.62, где система редактирования генов представляет собой систему редактирования генов CRISPR/Cas.
64. Cистема редактирования генов по п.63, содержащая:
молекулу гРНК, содержащую нацеливающую последовательность, специфичную к последовательности гена Tet2 или его регуляторных элементов, и белок Cas9;
молекулу гРНК, содержащую нацеливающую последовательность, специфичную к последовательности гена Tet2 или его регуляторных элементов, и нуклеиновую кислоту, кодирующую белок Cas9;
нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу гРНК, содержащую нацеливающую последовательность, специфичную к последовательности гена Tet2 или его регуляторных элементов, и белок Cas9; или
нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу гРНК, содержащую нацеливающую последовательность, специфичную к последовательности гена Tet2 или его регуляторных элементов, и нуклеиновую кислоту, кодирующую белок Cas9.
65. Система редактирования генов по любому из пп.60-64, дополнительно содержащая матричную ДНК.
66. Система редактирования генов по п.65, где матричная ДНК содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую CAR, например, CAR, как описано в настоящем описании.
ex vivo
67. Композиция для производства экспрессирующей CAR клетки , содержащая ингибитор Tet, например, ингибитор Tet1, Tet2 и/или Tet3, например, ингибитор Tet2.
68. Композиция по п.67, где ингибитор Tet выбран из N-[3-[7-(2,5-диметил-2H-пиразол-3-иламино)-1-метил-2-оксо-1,4-дигидро-2H-пиримидо[4,5-d]пиримидин-3-ил]-4-метилфенил]-3-трифторметилбензамида, 2-[(2,6-дихлор-3-метилфенил)амино]бензойной кислоты и 2-гидроксиглутарата.
69. Популяция клеток, содержащая одну или несколько клеток по любому из пп.1-33, где популяция клеток содержит более высокий процент клеток Tscm (например, CD45RA+CD62L+CCR7+CD27+CD95+ T-клетки), чем популяция клеток, которая не содержит одну или несколько клеток, в которых экспрессия и/или функция Tet1, Tet2 и/или Tet3 снижена или устранена.