Исследование биотехнологических факторов биотеста на базе термотаксиса инфузорий для контроля токсичности водных сред

УДК 556.3.01 + 574.24

И. С. Захаров, А. Н. Величко, Т. В. Кустов

Исследование биотехнологических факторов биотеста на базе термотаксиса инфузорий для контроля токсичности водных сред

Ключевые слова: термотаксис, инфузория, биотест, экспресс-метод, термочувствительность, биотехническая система. Keywords: thermotaxis, ciliate, bioassay, rapid-method, temperature sensitivity, biotechnical system.

Рассмотрены вопросы разработки экспресс-метода проверки термочувствительности инфузорий для создания биотестовой системы контроля загрязнений водных сред. С помощью нового метода исследована термочувствительность инфузорий Paramecium caudatum разного возраста.

Введение

Биотестирование — методы и средства исследования общей токсичности среды с помощью биологических тест-объектов [1]. Широкое распространение в биотестировании получили тесты на инфузориях Paramecium caudatum на базе тест-реакций хемотаксиса и гальванотаксиса.

Перспективной тест-реакцией является термотаксис инфузорий, который представляет собой перемещение популяции в зону комфортных температур и изучается с конца XIX века [2, 3]. Современные исследования выявили сходство между воздействием ряда биохимических соединений и химических веществ на температурные реакции многоклеточных и одноклеточных организмов. Диапазон комфортных температур меняется при воздействии ингибиторов окислительного фосфорили-рования (в результате которого образуется АТФ), например азида натрия [4].

В работе [5] предложены метод проверки способности инфузорий к термотаксису на базе теоретических положений термодинамики, информативные параметры контроля биотеста, определен необходимый возраст культуры.

Цель исследования

Развитие подхода к разработке биотеста и изучение его биотехнологических факторов.

Методы исследования

Для достижения поставленной цели необходимо создать методы и средства предварительного экспресс-тестирования термочувствительности, исследовать зависимость термотаксиса от фаз роста культуры, автоматизировать процессы обработки данных эксперимента, сформировать биотехническую систему контроля токсичности водных сред на базе тест-реакции термотаксиса Paramecium caudatum.

Используемая в исследовании схема экспресс-метода проверки термотаксической реакции представлена на рис. 1. Экспресс-метод основан на свойстве инфузорий при гипоксии (температура воды 26±1 °С) двигаться к зоне с пониженной температурой [2, 6]. Метод включает три фазы:

1) начальное распределение инфузорий по узкой протяженной кювете, близкое к равномерному, условно показано на графике в виде аппроксимирующей линейной функцией с наклоном а = 0;

2) термотаксис при перемещении инфузорий к охлаждающему элементу аппроксимируется линейной функцией с наклоном +а;

3) при перемещении популяции от охлаждающего элемента у аппроксимирующей линейной функции наклон —а.

Для контроля реакции использована установка видеорегистрации внутрипопуляционного взаимодействия инфузорий. В качестве устройства контроля реакции использована цифровая камера Canon PowerShot SX10IS с матрицей 10 мегапикселей, «супермакро» съемкой до 1 см. Установка способна экспортировать файлы на персональный компьютер для дальнейшей цифровой обработки изображений в разработанной программе в интерактивной системе Matlab (рис. 2).

Программа производит цифровую и статистическую обработку данных. Для реализации цифровой обработки используется пакет для обработки изображений Image Processing Toolbox интерактивной

О ООО О о со ^о0°о Охлаждающий элемент

Цифровая видеокамера

L, пкс

о °сопсо Охлаждающий элемент

Цифровая видеокамера

N, шт.

N, шт..

L, пкс

о О ООО О °о<г>о о ° Охлаждающий элемент

Цифровая видеокамера

L, пкс

Рис. 1 \ Формирование термотаксической реакции

системы Matlab. Матрица преобразуется в одномерный массив, характеризующий сумму яркостей пикселей вертикальных (ЕЯПВ). Статистическая

обработка данных включает сглаживание распределения ЕЯПВ методом скользящего среднего и расчет аппроксимирующих линейных функций, угол наклона которых является информативным параметром термотаксиса.

Диалоговое окно разработанной программы представлено на рис. 2. Программа изображает распределение инфузорий по узкой протяженной кювете, затем графически преобразует это распределение в ЕЯПВ, получает ее сглаженную функцию по заданному параметру сглаживания и рассчитывает информативный параметр к.

Разработанная программа позволила автоматизировать процесс обработки данных (до 10 изображений в минуту).

В качестве биотехнологического фактора исследована зависимость термочувствительности от возраста культуры, фаз роста и времени тестирования. Одноклеточный организм при размножении проходит несколько стадий роста: лаг-фазу (зарождение организма), лог-фазу (период роста), фазу насыщения (стационарную) и фазу деградации (замедления роста). В качестве тест-объекта использовались инфузории P. caudatum разных фаз роста (рис. 3), культивированные согласно стандартным методикам [4].

Для исследования влияния биотехнологических факторов на термотаксис поставлено 14 серий экспериментов по 5 опытов в каждом, при регистрации которых отснято 8 ч видеоматери-

Рис. 2 \ Программа обработки изображений биотестовых реакций

биотехносфера

| № 5(353/2014

5 6 7 8 9 Возраст культуры, дни

Рис. 3

Кривая роста популяции инфузорий и показатель термочувствительности

алов объемом 90 Гб. Полученный материал преобразован в серии видеокадров с периодичностью 30 с. Общее количество кадров составило порядка 1000 кадров. Они были обработаны с помощью описанной выше программы, затем рассчитаны информативные характеристики каждого опыта и получена зависимость термочувствительности инфузорий (полученная в экспресс-методе) от их возраста и фаз роста.

Результаты исследования

При анализе результатов программной обработки установлено, что наибольшее количество максимальных значений наклона линейного тренда функции £ЯПВ достигалось при длительности реакции термотаксиса 1,5 мин.

На рис. 4 и 5 представлены распределения £ЯПВ после тест-реакции длительностью 1,5 мин

1400 -1200 -1000 800 600 400 200

0

50

1 день

2 дня

100 150

Длина изображения, пкс 4 дня

200

250

5 дней

6 дней

Рис. 4

Распределение инфузорий по узкой протяженной кювете после тест-реакции

длительностью 1,5 мин (возраст культуры 1—6 дней); ас

0,03+0,22

1400 1200 1000 800 600 400 200

0

7 дней

50

8 дней

100

150

200

Длина изображения, пкс 9 дней 10 дней 11 дней 12 дней

250

14 дней

Рис. 5

Распределение инфузорий по узкой протяженной кювете после тест-реакции длительностью 1,5 мин (возраст культуры 7—14 дней); аср = 1,45+0,72

Рис. 6

Структура БТС биотестирования водных сред на основе тест-реакции термотаксиса:

П — проба; Т-О — тест-объект; МП — материалы и принадлежности; ИИ — источник излучения; К — кювета; Т-Р — тест-реакция; БУТ — блок управления температурой; ЦВК — цифровая видеокамера; ПК — персональный компьютер; БЦОИ — блок цифровой обработки изображений; БСОД — блок статистической обработки данных; СОИ — система отображения информации; ОИ — оператор-исследователь

при возрасте культуры 1 — 6 и 7 — 14 дней соответственно. Из данных графиков видно, что тест-реакция термотаксиса наблюдается у инфузорий, находящихся в фазе насыщения и деградации (7 — 14 дней).

Результаты расчетов отражены на рис. 5, где показаны вид кривой роста и среднее значение углов в различных фазах роста инфузорий.

Выводы

Полученные результаты позволяют сделать вывод, что способность инфузорий к термотаксису может быть быстро выявлена с помощью разработанного экспресс-метода.

Техническая реализация биотеста требует подхода, предложенного Гертером [5], так как необходимо выявить диапазон зон комфортных температур, на которые, как показано в работе [4], влияют ингибиторы и разобщители дыхательной цепи. На рис. 6 представлена биотестовая система на основе термотаксиса.

ность разработки биотеста на основе термотаксиса инфузорий. Предложенный экспресс-метод контроля термочувствительности инфузорий позволяет за несколько минут провести контрольную оценку пригодности применения культуры в биотесте.

Для данного экспресс-метода тестирования инфузорий на термочувствительность разработано программное обеспечение, позволяющее рассчитать информативные параметры, на основе которых делается оценка наличия тест-реакции термотаксиса за несколько минут.

Биотехническая система, основанная на тест-реакции термотаксиса инфузорий, включает средства формирования термотаксиса с помощью модифицированного метода Гертера, что позволяет выявить диапазон комфортных температур при воздействии на инфузорий тестируемых вредных факторов.

Как показали исследования, термочувствительность усиливается с увеличением возраста культуры и соответствует фазам насыщения (стационарная фаза) и деградации (фаза замедления роста) — 7-14 дней у Paramecium caudatum.

Заключение

Термочувствительность у одноклеточных организмов отражает важные аспекты воздействия токсичных веществ, относящихся к категории ингибиторов дыхательного цикла, что определяет актуаль-

Литература

1. Биологический контроль окружающей среды. Биоиндикация и биотестирование / О. П. Мелехова, Е. И. Сарапуль-цева, Л. В. Цаценко [и др.]; под ред. О. П. Мелеховой. 3-е изд. М.: Академия, 2010. 288 с.

биотехносфера

| № 5(35)/2014

12

Биотехнические системы

2. Konrad Herter. Untersuchungen über den temperatursinn einiger insekten / / Ausdem zoologischen Institut der Universität GSttlngen und dem zoologischen Institut der Universitut Berlin. Germany. 1923. P. 221-288.

3. Mendelssohn M. Uber den Thermotropismuseinzeller Organismen. Pflüger'sArch. // Ges. Physiol. 1895. N 60. P. 1-27.

4. Nitric Oxide Production and Thermoregulation in Paramecium caudatum / G. M. Malvin [et al.] // ActaProtozoologica —

Internation Journal on Protistology. 2003. N 42. P. 259267.

5. Захаров И. С., Величко А. Н. Исследование методов формирования тест-реакции термотаксиса инфузорий // Изв. СПбГЭТУ «ЛЭТИ». Сер. Биотехнические системы в медицине и экологии. 2014. № 1. С. 69-73.

6. Gordon Ch. J. Temperature and toxicology: an integrative, comparative, and environmental approach. CRC Press LLC, 2005. 338 р.

УДК 617.574-089.28

С. Ф. Курдыбайло, Ю. И. Замилацкий, Р. Р. Гайнуллина

Сравнительный анализ распределения удельного давления по внутренней поверхности приемных гильз протезов предплечья

Ключевые слова: верхняя конечность, протез, приемные гильзы, биомеханические исследования. Keywords: upper extremity, prosthesis, sockets, biomechanical studies.

Верхняя конечность человека в процессе онтогенеза достигла совершенства анатомического строения и функции. При ампутации на уровне предплечья кисть полностью утрачивает свои функции. Протезирование позволяет частично компенсировать последние. При этом особо важное значение имеет качество изготовления приемной гильзы протеза. Проведены биомеханические исследования по изучению распределения удельного давления по внутренней поверхности приемной гильзы. Методом тензометрии доказаны значительное снижение пиковых нагрузок в локальных зонах и увеличение площади контакта кожных покровов с внутренней поверхностью приемной гильзы при изменении ее конструкции. Наилучшие результаты получены при использовании комбинированных приемных гильз с силиконовым чехлом. Полученные результаты позволяют рекомендовать этот вариант приемной гильзы для широкого внедрения в практику протезирования.

Введение

Верхняя конечность в процессе развития человека подвергалась наиболее специфическому развитию и достигла совершенства функции и анато-

мического строения. На верхнюю конечность приходится огромная часть двигательной деятельности человека: в быту, на производстве, в общественной и спортивной жизни и т. д. Рука является также познавательным органом. Благодаря осязанию пальцами человек получает точную информацию о форме, объеме поверхности, консистенции, температуре используемых предметов. При помощи зрения, слуха и рук формируется представление о внешнем мире [1].

Верхняя конечность состоит из плеча, предплечья и кисти и относительно плечевого пояса имеет 27 степеней свободы. С точки зрения биомеханики верхняя конечность представляет собой незамкнутую биокинематическую цепь, снабженную кинематическими парами. Двадцать степеней свободы приходится на суставы кисти, остальные семь — на другие суставы верхней конечности.

После перенесенной ампутации на уровне предплечья полностью утрачивается функция кисти, снижаются двигательная активность локтевого и лучелоктевого суставов, биоэлектрическая и сократительная функции мышц предплечья, кожная, тактильная и проприоцептивная чувствительность предплечья. Без применения специальных технических средств реабилитации крайне затруднительно элементарное самообслуживание, выполнение бытовых и трудовых действий, обучение и т. д. [2].