Микробные пленки Staphylococcus epidermidis ATCC 29887 на поверхности диоксида циркония. Экспериментальное исследование

Эти напряжения возникают между культевой вкладкой и тканями опорного зуба. Максимальное напряжение с наблюдается у верхушки культевой вкладки и может привести к ее расцементировке и отколу стенки зуба.

При подготовке первого опорного зуба под культе-вую вкладку нужно стремиться к уменьшению диаметра сечения этой вкладки. Также необходимо больше оставлять диаметр стенки корня при подготовке корневого канала под культевую вкладку.

При использовании полулабильной системы фиксации Ми изгибающий момент полностью исключается в зоне соединения замкового крепления, но достигает своих максимальных значений в середине участка фронтальной группы зубов.

ЛИТЕРАТУРА

1. Лебеденко И.Ю., Перегудов А.Б., Хапилина Т.Э. Замковые крепления зубных протезов. М.: Молодая гвардия; 2001.

2. Гинали Н.В. Патогенетические механизмы нарушения амортизирующей функции периодонта в биомеханических системах зуб-челюсть и их практическое значение: Дис. ... д-ра мед. наук. М.; 2000.

3. Строганов Г.И. Теоретические и клинические предпосылки использования корней многокорневых зубов в качестве опоры различных конструкций зубных протезов: Дис. ... канд. мед. наук. Ставрополь; 2002.

4. Ремизова А.А. Ортопедические методы лечения в стоматологии. Основы бюгельного протезирования: Пособие для врачей. М.: Человек; 2012.

5. Вульфес Х. Ошибки при изготовлении бюгельных протезов. Зубной техник. 2006; 1: 28-31.

6. Козлов С.В., Ремизова А.А., Гончаров С.О. Особенности эндо-донтической подготовки опорных зубов под комбинированные протезы с расчетом на прочность, конструктивные схемы соединения. Эндодонтия Today. 2012; 3: 57-62.

7. Макеева И.М., Жохова Н.С. Ошибки эндодонтического лечения и пути их устранения. В кн.: ЦНИИ стоматологии - 40 лет. История развития и перспективы: Материалы юбилейной сессии ЦНИИС. М.; 2002: 76-8.

8. Боровский Е.В. Ошибки эндодонтического лечения зубов. Клиническая эндодонтия. 2003, 3: 44-7.

Поступила 05.06.14

REFERENCES

1. Lebedenko I.Yu., Peregudov A.B., Hapilina T.E. Castle fixing dentures. [Zamkovye kreplenija zubnyh protezov]. Moscow: Molodaya gvardiya; 2001.

2. Ginali N.V. Pathogenetic Mechanisms of Damping Function Disorders of the Periodontium in Biomechanical Systems Tooth-Jaw and Their Practical Significance: Diss. Moscow; 2000.

3. Stroganov G.I. Theoretical and clinical background of multirooted tooth roots use as a support of various designs of dentures: Diss. ... Stavropol'; 2002.

4. Remizova A.A. Orthopedic Treatments in Dentistry. Basics Clasp Prosthetics. Manual for Ohysicians. [Ortopedicheskie metody lech-eniya v stomatologii. Osnovy buugel'nogoprotezirovaniya. Posobie dlya vrachey]. Moscow: Chelovek; 2012.

5. Vul'fes Kh. Errors in the manufacture of clasp dentures. Zubnoy tekhnik. 2006; 1: 28-31.

6. Kozlov S.V., Remizova A.A., Goncharov S.O. Features endodontic preparation of the abutment teeth for combined dentures with the expectation of strength, structural schemes of connection. Endodontiya Today. 2012; 3: 57-62.

7. Makeeva I.M., Zhohova N.S. Errors of endodontic treatment and ways to overcome them. In: Central Research Institute of Dentistry - 40 years. History of development and prospects: Materials of the anniversary session CRID [CNII .stomatologii - 40 let. Istoriya raz-vitiya i perspektivy: Materialy yubileynoy sessii CNIIS]. Moscow; 2002: 76-8.

8. Borovskiy E.V. Errors of endodontic treatment of teeth. Kliniches-kaya endodontiya. 2003; 3: 44-7.

Received 05.06.14

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014

УДК 615.46.03:616.314-089.28-022:579.862.1].076

Рогожников А.Г.1, Рогожников Г.И.1, Порозова С.Е.2, Коробов В.П.3, Лемкина Л.М.3, Шулятникова О.А.1, Гуров А.А.2, Морозов И.А.4

МИКРОБНЫЕ ПЛЕНКИ STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDIS ATCC 29887 НА ПОВЕРХНОСТИ ДИОКСИДА ЦИРКОНИЯ

ТБОУ ВПО «Пермская государственная медицинская академия им. акад. Е.А. Вагнера» Минздрава России, 614990, г. Пермь; 2ФГБОУ ВПО «Пермский национальный исследовательский политехнический университет», 614990, г. Пермь; 3ФГБУН «Институт экологии и генетики микроорганизмов» УрО ФАНО, 614081, г. Пермь; 4ФГБУН «Институт механики сплошных сред» УрО РАН, 614013, г. Пермь

Исследовано воздействие образования и роста биопленок Staphylococcus epidermidis ATCC 29887 на поверхность диоксида циркония, стабилизированного оксидом иттрия и оксидом церия. Установлена выраженная зависимость жизнеспособности биомассы пленок от вида стабилизирующей добавки. С помощью методов спектроскопии комбинационного рассеяния света (КР-спектроскопия), атомно-силовой микроскопии и сканирующей электронной микроскопии показано, что биопленки не влияют на фазовый состав поверхности, но способствуют изменению ее структурных элементов.

Ключевые слова: диоксид циркония; оксид иттрия; диоксид церия; фазовый состав; поверхность, биопленка; биомасса; жизнеспособность биопленок; эпидермальный стафилококк; имплантаты; зубные протезы.

Для корреспонденции: Шулятникова Оксана Александровна, anasko06@mail.ru For correspondence: Shulyatnikova OksanaAleksandrovna, anasko06@mail.ru

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Rogozhnikov A.G.1, Rogozhnikov G.I.1, Prozorova S.E.2, Korobov V.P.3, Lemkina L.M.3, Shulyatnikova O.A.1, Gurov A.A.2, Morozov I.A.4

MICROBIAL FILMS STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDIS ATCC 29887 ON THE SURFACE OF ZIRCONIUM DIOXIDE. EXPERIMENTAL STUDY

1 Acad. E.A. Wagner Perm state medical Academy, Ministry of health of Russia, 614990, Perm; 2 Perm national research Polytechnic University, 614990, Perm, Russia; 3 Institute of ecology and genetics of microorganisms, Federal Agency of scientific organizations, 614081, Perm,Russia; 4 Institute of continuous media mechanics Ural branch of the RAS, 614013, Perm Impact of education and growth of biofilms of Staphylococcus epidermidis ATSS 29887 on a surface of dioxide of the zirconium stabilized by oxides of yttrium and cerium is investigated. The expressed dependence of viability of biomass of films on a type of a stabilizing additive is established. By methods of spectroscopy of combinational dispersion of light, nuclear and power microscopy and scanning electronic microscopy it is shown that biofilms don't influence phase structure of a surface, but promote change of its structural elements.

Keywords: zirconium dioxide; yttrium oxide; cerium dioxide; phase structure; surface; biofilm; biomass; viability biofilms; Staphylococcus epidermidis; implants; dentures.

Введение

Материалы, используемые в ортопедической стоматологии для изготовления имплантатов, должны обладать не только комплексом физико-механических характеристик, но и параметрами биоинертности к тканям пациента и его сапрофитной микрофлоре. Так, ротовая полость является местом жизнедеятельности разнообразных микроорганизмов [1], в том числе патогенных, способных формировать на поверхностях конструкционных материалов особые многослойные биологические структуры, представляющие собой специфические сообщества микроорганизмов - бактериальные пленки [2]. Такие пленочные структуры не только изолируют вводимый чужеродный материал от тканей организма, но и могут вызывать патологические процессы [3, 4], которые приводят к развитию осложнений и хронизации воспалительных заболеваний при установке имплантационных систем и зубных протезов. Активными образователями биопленок являются коагулазонегативные стафилококки вида Staphylococcus epidermidis, представители которого известны как наиболее частые возбудители нозоко-миального сепсиса и инфекций, ассоциированных с полимерными и металлическими имплантируемыми устройствами [5].

На современном этапе развития ортопедической стоматологии в качестве материала для изготовления имплантационных систем и зубных протезов широко используется диоксид циркония. Однако в литературе до сих пор отсутствуют данные (помимо результатов физико-механических испытаний) о влиянии различных стабилизирующих добавок в композитах циркония на эксплуатационные характеристики изделий из этого материала и атакуемости их поверхностей сапрофитной бактериальной микрофлорой.

Цель работы - изучение образования и роста пленок Staphylococcus epidermidis ATCC 29887 на поверхности диоксида циркония, стабилизированного оксидами иттрия и церия.

Материал и методы

Образцы керамики для исследований получали на кафедре «Материалы, технологии и конструирование машин» Пермского национального исследовательского политехнического университета. Использовали нанопорошки диоксида циркония, стабилизированного 3 мол.% оксида иттрия (далее ZrO2-3Y2O3), производства фирмы «TOSOH" (Япония) и диоксида циркония, стабилизированного 15 мол.% диоксида церия (далее ZrO2-15CeO2), полученного в лабораторных условиях по золь-гель технологии с введением полимерных добавок [6]. Порошки компактировали методом полусухого

прессования при давлении 200 МПа и спекали при изотермической выдержке при 1350oC. Получены образцы d = 7 мм и h = 1 мм.

Фазовый состав образцов исследовали методом спектроскопии комбинационного рассеяния света (КР-спект-роскопии). КР-спектры получали на многофункциональном спектрометре комбинационного рассеяния света SENTERRA "Bruker" при длине волны излучающего лазера 532 нм и интенсивности излучения 5 mV. Микроструктуру материалов изучали методом сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) на аналитическом автоэмиссионном растровом электронном микроскопе ULTRA 55 ("Karl Zeiss", Германия). Шероховатость образцов изучали на атомно-силовом микроскопе Dimension Icon ("VEECO", США) в полуконтактном режиме работы прибора. Радиус острия зонда - 10 нм.

Для исследований роста пленок S. epidermidis образцы диоксида циркония автоклавировали в индивидуальных стеклянных завинчивающихся флаконах при 121oC в течение 60 мин. В стерильные флаконы с образцами вносили по 2 мл питательной среды LB (контроль) или по 2 мл инокулума бактерий S. epidermidis ATCC 29887 в среде LB, содержащей 107 КОЕ/мл. Флаконы помещали в термостат (37oC) на 24 или 48 ч. По истечении выбранного срока инкубации планктонную культуру удаляли, таблетки переносили в стерильные флаконы, дважды аккуратно промывали 10 мМ фосфатным буфером (рН 7,2).

Детекцию образовавшихся в процессе инкубации биопленок осуществляли двумя методами. Биомассу пленок определяли путем их окрашивания 0,1% раствором ген-циановым фиолетовым с последующей экстракцией связавшегося красителя 96% этанолом в течение 12 ч и измерением оптической плотности (OD) спиртового экстракта на спектрофотометре PD-303 (Япония) при длине волны 570 нм. Количество жизнеспособных клеток в биопленках определяли по уровню восстановления водорастворимого тетразолия в системе Cell Proliferation Assay ("Promega", США) при 490 нм, который оценивали по прописи фирмы-производителя. Все исследования проведены троекратно [7]. Для повышения корректности сравнения полученных экспериментальных данных их выражали в условных единицах (усл. ед.), отражавших отношение OD растворов генцианового фиолетового или формазана (восстановленного тетразолия) на 1 см2 поверхности таблеток обоих составов. Результаты, характеризующие неспецифическую сорбцию генцианового фиолетового и формазана образцами модифицированных циркониевых таблеток, вычитали из данных, полученных при определении динамики роста биопленок.

Результаты и обсуждение

Исследование процессов формирования бактериальных пленок на поверхности диоксида циркония, стабилизированного ZrO2-3Y2O3 и ZrO2-15CeO2, пока-

1 Часы

1 Часы

-♦- Жизнеспособность -- Биомасса пленок

-Д- Неспецифическое связывание формазана -О- Неспецифическое связывание генцианового фиолетового

Рис. 1. Динамика роста биопленок epidermidis АТСС 29 887 на таблетках диоксида циркония, стабилизированного ZrO2-15CeO2 (а) и ZrO2-3Y2O3 (б).

зало выраженную зависимость биологических характеристик этих процессов от вида используемых добавок. Полученные результаты представлены на рис. 1.

Таблетки из ZrO2-15CeO2, как показывают экспериментальные данные, обладают значительно менее выраженной неспецифической сорбцией использованных для детекции биологических свойств бактериальных пленок специальных красителей - генцианового фиолетового и тетразолия. Образующиеся на этом типе таблеток бактериальные пленки обладают в оба срока наблюдения и значительно меньшей биомассой, и жизнеспособностью по сравнению с пленками на таблетках диоксида циркония, стабилизированного ZrO2-3Y2O3.

На рис. 2 представлены СЭМ-изображения образцов ZrO2-15CeO2 до и после инкубации биопленок. На рис. 2, б четко фиксируется спиралевидная структура агломератов, образующих поверхность материала. Обычно такая структура на образцах диоксида циркония, стабилизированного ZrO2-15CeO2, хорошо выделяется при относительно свободной укладке агломератов наночастиц, например в условиях гелевого литья образцов [8], но значительно хуже видна при получении образцов методом полусухого прессования. Спиралевидная структура указывает на иерархи-

ческое строение спекшихся агломератов и материала в целом. Появление такой структуры, возможно, имеет значение для формирования бактериальных пленок и при отсутствии деструкции поверхности такого материала.

На рис. 3 показаны СЭМ-изображения поверхности образцов ZrO2-3Y2Oз после инкубации биопленок. Агломераты бактерий, сформированные на этом материале, характеризуются меньшими размерами и округлой формы. Видимые изменения в самих агломератах после возникновения биопленок отсутствуют, однако на снимках зафиксированы образования квадратной (преимущественно) или треугольной формы размером 200-250 нм. Образования почти прозрачные или очень тонкие, но в них можно выделить полосчатую структуру типа структур Лизеганга (рис. 3, б). Наличие таких образований позволяет предполагать взаимодействие микробной пленки с материалом и его растворение-переосаждение в ходе этого взаимодействия. Возможно, выявленные образования возникают в местах прикрепления отдельных микроорганизмов к поверхности.

На рис. 4 представлены КР-спектры поверхности образцов до и после инкубации биопленок. Спектры последних не отличаются от спектров исходных образцов, что позволяет сделать вывод о неизменности кристаллического

Рис. 2. СЭМ-изображения поверхности образцов ZrO2-15CeO2 до (а) и после (б) инкубации биопленок. Ув. 15 000 и 20 000.

КЛИНИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Рис. 3. СЭМ-изображения поверхности образцов ZrO2-3Y2O3 после инкубации биопленок. Ув. 34 000 и 65 000.

состава поверхности, в частности не зафиксировано появление моноклинной модификации диоксида циркония, так называемая расстабилизация поверхности материала.

Данные о шероховатости поверхности исходных образцов приведены на рис. 5. Образцы состава ZrO2-15CeO2 отличаются большей шероховатостью, однако разница очень незначительна и не оказывает какого-либо влияния на взаимодействие микробной пленки с поверхностью.

318 314

261 251

147 141

700

600

500 400 300 Волновое число, см-1

200

100

Рис. 4. КР-спектры поверхности образцов ZrO2-15CeO2 (1, 2) и ZrO2-3Y2O3 (3, 4) до (1, 3) и после (2, 4) инкубации биопленок.

"1-1-1-1

0 2000 6000 10 000 14 000 18 000

4000 8000 12 000 16 000 20 000

Размер области, нм

Рис. 5. Зависимость средней шероховатости поверхности образцов составов 2г02-15Се02 (1) и ZrO2-3Y2O3 (2) от размеров области измерения.

Таким образом, исследование стабилизированных ZrO2-3Y2O3 и ZrO2-15CeO2 образцов диоксида циркония до и после инкубации биопленки показало, что поверхность образцов состава ZrO2-15CeO2, по-видимому, подвержена меньшей атакуемости бактериальными клетками и как следствие образованию и росту на ней биопленок S. epidermidis ATCC 29887. При этом формирующаяся биопленка микроорганизмов, по-видимому, способствует самоорганизации элементов поверхности с образованием спиралевидных структур. Проведенные ранее исследования [9] показали, что под воздействием агрессивных сред (кислых и щелочных растворов) происходит незначительное растворение ZrO2-15CeO2, что может способствовать снижению интенсивности образования биопленок на поверхности, так как ZrO2-15CeO2 известен как биологически активный материал [10]. В отличие от обнаруженных закономерностей формирования бактериальных пленок на поверхностях ZrO2-15CeO2, биопленки на поверхностях образцов ZrO2-3Y2O3 имеют более высокую биомассу и жизнеспособность.

Заключение

Исследование процессов формирования биопленок коагулазонегативных стафилококков Staphylococcus epidermidis ATCC 29887 на поверхности диоксида циркония, стабилизированного оксидом иттрия и диоксидом церия, показало выраженную зависимость биологических характеристик этих процессов от вида стабилизирующей добавки. Биопленки на поверхности диоксида циркония, стабилизированного диоксидом церия, обладают значительно меньшей биомассой и жизнеспособностью их клеточных элементов по сравнению с пленками на поверхности диоксида циркония, стабилизированного оксидом иттрия. Таким образом, проведенные экспериментальные исследования воздействия микробных пленок S. epidermidis ATCC 29887 на поверхность диоксида циркония, стабилизированного диоксидом церия, свидетельствуют о целесообразности соответствующих клинических испытаний.

Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ № 01-02431-а и проектов УрО РАН - «МКБ», инициативных и междисциплинарных исследований.

ЛИТЕРАТУРА

1. Покровский В.И. Медицинская микробиология. М.: ГЭОТАР-МЕД; 2007.

2. Арутюнов С.Д., Царев В.Н., Ипполитов Е.В., Апресян Б.В., Трефилов А.Г. Формирование биопленки на временных зубных протезах: соотношение процессов первичной микробной адгезии, коаггрегации и колонизации. Стоматология. 2012; 5: 28-35.

3. Ушаков Р.В., Царев В.Н. Микрофлора полости рта и ее значение в развитии стоматологических заболеваний. Стоматология для всех. 1998; 3: 22-4.

4. Tarsi R., Muzzarelli R.A., Guzman C.A., Pruzzo C. Inhibition of Streptococcus mutans adsorbtion to hydroxyapatite by low-molecular-weight chitosans. J. Dent. Res. 1997: 76 (2): 665-72.

5. Leonhard A., Olsson J., Dahlen G. Bacterial colonozation on titanium, hydroxyapatite, and amalgam surfaces in vivo. J. Dent. Res. 1995; 74 (9): 1607-12.

6. Antsiferov V.N., Porozova S.E., Kul'met'eva V.B. Effect of water soluble polymer additives on the phase composition and size of zir-conia particles during precipitation from salt solutions. Glass Physics Chem. 2012; 38 (3): 322-6.

7. Коробов В.П., Лемкина Л.М., Филатова Л.Б., Полюдова Т.В. Разрушение биопленок коагулазонегативных стафилококков кати-онным пептидом варнерином. Известия Самарского научного центра Российской академии наук. 2011; 13 (5): 156-9.

8. Порозова С.Е., Кульметьева В.Б., Зиганьшин И.Р., Сметкин А.А. Формирование структуры пористой керамики из нанодисперс-ных порошков диоксида циркония. В кн.: Тезисы докладов VII Международной научной конференции «Кинетика и механизм кристаллизации. Кристаллизация и материалы нового поколения». Иваново; 2012: 95.

9. Гуров А.А., Кульметьева В.Б., Макарова Е.Н. и др. Изучение деградации свойств керамики системы ZrO2-Y2O3-CeO2. В кн.: Материалы Российской конференции (с международным участием) «Высокотемпературная химия оксидных наносистем»: СПб.; 2013: 80.

10. Иванов В.К., Федотов Г.Н., Никулина М.В. и др. Биологическая активность нанокристаллического диоксида церия. Доклады РАН. Серия «Химия». 2008: 420 (5): 628-31.

Поступила 01.07.14

REFERENCES

1. Pokrovskiy V.I. Medical Microbiology [Meditsinskaya mikrobiologi-ya]. Moscow: GEOTAR-MED; 2007.

2. Arutyunov S.D., Tsarov V.N., Ippolitov E.V., Apresyan B.V., Trefilov A.G. Biofilm formation on temporary dentures: ratio of processes of primary microbic adhesion, koaggregation and colonization. Stoma-tologiya. 2012; 5: 28-35.

3. Ushakov R.V., Tsarev V.N. Mikroflora oral cavities and its value in development of stomatologic diseases. Stomatologiya dlya vsekh. 1998; 3: 22-4.

4. Tarsi R., Muzzarelli R.A., Guzman C.A., Pruzzo C. Inhibition of Streptococcus mutans adsorbtion to hydroxyapatite by low-molecular-weight chitosans. J. Dent. Res. 1997: 76 (2): 665-72.

5. Leonhard A., Olsson J., Dahlen G. Bacterial colonozation on titanium, hydroxyapatite, and amalgam surfaces in vivo. J. Dent. Res. 1995; 74 (9): 1607-12.

6. Antsiferov V.N., Porozova S.E., Kul'met'eva V.B. Effect of water soluble polymer additives on the phase composition and size of zir-conia particles during precipitation from salt solutions. Glass Physics Chem. 2012; 38 (3): 322-6.

7. Korobov V.P., Lemkina L.M., Filatova L.B., Polyudova T.V. Destruction of biofilms of Stafilococcus koagulazonegatives in cationic peptide of varneriny [Razrushenie bioplenok koagulazonegativnykh stafilokokkov kationnym peptidom varnerinom]. News of the Samara scientific center of the Russian Academy of Sciences. 2011; 13

8. Porozova S.E., Kulmetyev V. B., Ziganshin I.R., Smetkin A.A. Formation of structure of porous ceramics from nanodisperse powders of dioxide of zirconium. In: Theses of Reports of the International Scientific Conference "Kinetics and Crystallization Mechanism. Crystallization and Materials of New Generation" [V kn.: Tezisy dokladov VII Mezhdunarodnoy nauchnoy konferentsii "Kinetika i mekhanizm kristallizatsii. Kristallizatsiya i materialy novogo poko-leniya"]. Ivanovo; 2012: 95.

9. Gurov A.A., Kul'met'yeva V.B., Makarov E.N. et al. Studying of degradation ofproperties of ceramics of ZrO2-Y2O3-CeO2 system. In: Materials Russian Conference

10. Ivanov V.K., Fedotov G.N., Nikulina M.V. et al. Biological activity of nanocrystal dioxide of cerium. Doklady RAN. Seriya "Khimiya". 2008; 420

Received 01.07.14