СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГАПЛОИДНЫХ РАСТЕНИЙ-РЕГЕНЕРАНТОВ ИЗ РЕПРОДУКТИВНЫХ ОРГАНОВ BRASSICA OLERACEA L. IN VITRO
METHOD OF PRODUCING HAPLOID PLANTS-REGENERANTS OF REPRODUCTIVE ORGANS OF BRASSICA OLERACEA LINNAEUS IN VITRO

Изобретение относится к области биотехнологии, предназначено для культивирования in vitro пыльников и завязей Brassica oleracea L. и может быть использовано для получения нового исходного материала для создания сортов.
Известен ряд способов получения гаплоидов у растений: отдаленная гибридизация, внутривидовая гибридизация, выявление среди близнецов, при воздействии на пыльцу рядом физических и химических факторов, при межвидовых скрещиваниях с использованием генетических маркеров (Патент РФ №2175189, патент РФ №2035134, патент РФ №2084135, патент РФ №2142013).
Однако все данные методы позволяют получать гаплоидные растения в небольшом количестве (единицы и десятки). Получение гаплоидных растений возможно посредством андрогенеза и гиногенеза in vitro, гаплоиндуктора, партеногенеза (апомиксис), полиэмбрионии. Наиболее перспективным подходом к разработке технологии получения гаплоидных растений - это культивирование изолированных пыльников или завязей in vitro.
Работы по получению гаплоидных растений у представителей рода Brassica ведутся во многих странах. Однако факторы, от которых зависит эффективность пыльцевого эмбриогенеза, еще недостаточно изучены. В связи с этим работы по выявлению сортов, гибридов, линий, обладающих высокой гаплоидной способностью и установление факторов, оказывающих влияние на этот процесс, являются актуальными.
Известен способ получения гаплоидных растений капусты белокочанной, заключающийся в культивировании изолированных микроспор на безгормональной питательной среде Гамборга В5, содержащей 13% сахарозы. Для изолирования микроспор применяют метод центрифугирования фильтрата (Шмыкова Н.А. Разработка системы биотехнологических методов, направленных на ускорение селекционного процесса овощных культур / Диссертация, Москва, 2006). Недостатком данного метода является трудоемкость технологии выделения микроспор из пыльников.
Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ получения гаплоидных растений Brassica oleracea L, заключающийся в культивировании изолированных пыльников на питательной среде Мурасиге и Скуга (МС), содержащей БАЛ в концентрации 4 мг/л, НУК - 0,3 мг/л, аскорбиновую кислоту - 1 мг/л, сахарозу - 120 г/л (Зонтиков, Д.Н. Эмбриоидогенез капусты белокочанной (Brassica oleracea L.) в культуре микроспор / А.В. Поляков, Д.Н. Зонтиков, С.А. Зонтикова // Тезисы IX Международной конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология» (Звенигород, 8-12 сентября 2008 г.). - М.: ИД ФБК-ПРЕСС, 2008. - С. 306-307). Недостатком известного аналога является применение дорогостоящих гормонов (6-бензиламинопурин (БАП), α-нафтилуксусной кислоты (НУК)), а также получение растений-регенерантов из гетерогенной каллусной ткани, которая является источником сомаклональной вариабельности растений, а следовательно частота образования гаплоидных растений резко уменьшается.
Задача предполагаемого изобретения - ускорение процесса селекции за счет повышения ча стоты возникновения гаплоидных растений Brassica oleracea L in vitro, используемых в качестве нового исходного материала для создания сортов.
Поставленная задача достигается за счет того, что пыльники и завязи культивируют на безгормональной питательной среде по прописи МС, при этом в качестве индукторов эмбриогенеза добавляют растительные экстракты, полученные из репродуктивных органов Brassica oleracea L, с применением в качестве растворителя DMSO в концентрации 1-1,5 мл/100 мл питательной среды.
Конкретный пример осуществления предлагаемого способа.
Растительные экстракты получали из сырой биомассы образцов (от 200 до 350 мг), которые экстрагировали 100% растворителем DMSO, путем растирания ее в ступке. После этого полученную массу выдерживали в течении 1 часа при температуре 23°C, фильтровали через фильтровальную бумагу и затем стерилизовали путем пропускания их через бактериальный фильтр (Millipore, pore size 0,45 дМ). Полученный растительный экстракт добавляли в питательную среду в концентрации 1-1,5 мл/100 мл. Пыльники и завязи асептически извлекали из бутонов в условиях ламинар-бокса и культивировали на индуцирующих питательных средах МС в чашках Петри, которые помещали в климакамеру (Binder, Германия) и инкубировали в темноте при температуре 35°C в течение 5-ти суток, после чего температурный режим уменьшали до 25°C. В этих условиях экспланты выращивали в течение 25 суток и затем переносили в световую комнату, где был установлен 16-часовой фотопериод и освещение белыми люминесцентными лампами с интенсивностью света 5 тыс.лк. При добавлении растительного экстракта в концентрациях меньше 1 мл/100 мл формирование эмбриоидов не происходило, а в концентрациях больше 1,5 мл/100 мл этот процесс был менее интенсивным. В дальнейшем сформированные эмбриоиды отделяли от первичного экспланта и переносили на среду, содержащую минеральные соли по прописи МС, а также гормоны ИУК - 2 мг/л, БАП - 1 мг/л, сахарозу - 3%, агар - 7 г/л. В этих условиях формировались растения, которые проявили высокую способность к последующему размножению.
Предлагаемый способ получения растений-регенерантов сочетает ряд положительных свойств, которые позволяют использовать ее в практической селекционной работе:
1. Технология предполагает применение доступного растворителя.
2. Отсутствие в использовании дорогих фитогормонов и регуляторов роста (дешевая технология).
3. Предлагаемый способ легок в исполнении по сравнению с ранее предложенными известными авторами.
Заявляемое изобретение направлено на устранение недостатков, которые свойственны наиболее распространенным способам получения гаплоидных растений. Известных в научно-технической и патентной литературе способов с аналогичной технологией не обнаружено. Результат, полученный у данного решения и обусловленный применением растительных экстрактов, не достигался в известных решениях.
Использование изобретения позволит увеличить частоту возникновения гаплоидных растений в 2-3 раза, что дает возможность получать их в количестве, достаточном для ведения селекционных работ, что в значительной степени ускоряет процесс селекции. Так как в контрольном варианте данный показатель составляет в культуре пыльников и завязей 1,85% и 3,7% соответственно. В то время как, в предлагаемом способе учитываемый показатель составил 2.5% и 8,6% соответственно.