Разработка системы дифференциации B. bronchiseptica и B. pertussis на основе мультиплексной ПЦР в режиме «Реального времени»

жизнедеятельности.-2007.-№ 2.-С. 13-18.

4. Романова, Е. М. Экологическая обусловленность распространения дирофиля-риоза в Ульяновской области / Е. М. Романова, Т. А. Индирякова, Н. В. Зонина // Известия Самарского научного центра Российской академии наук.-2009.-Том 11.-№ 1-4.-С.793-795.

5. Видеркер, М. А. Биобезопасность окружающей среды при формировании гельминтофаунистических комплексов паразитарных систем в Ульяновской области: автореферат дисс. ... канд. биологических наук / М. А. Видеркер. - Ульяновск, 2005. -21 с.

6. Эпизоотологические и экологические аспекты трематодозов в Ульяновской области / Д. С. Игнаткин, Е. М. Романова, Т. А. Индирякова, М. А. Видеркер // Ветеринарный врач. - 2008. - № 4. - С. 53-55.

7. Роль моллюсков рода LYMNAEA в формировании очагов трематодозной инвазии в Ульяновской области / Д. С. Игнаткин, Е. М. Романова, Т. А. Индирякова, М. А. Видеркер // Вестник Российского университета дружбы народов. Серия: Экология и безопасность жизнедеятельности.-2007.-№ 2.-С. 60-65.

8. Романова, Е. М. Перспективность использования моллюсков в биоиндикации загрязнения водных объектов / Е. М. Романова, О. А. Индирякова, А. П. Куранова // Известия Оренбургского государственного аграрного университета.-2008.-Том 4. -№ 20-1.-С. 157-159.

9. Индирякова, Т.А. Оценка экологического состояния пригородных биотопов р. Свияга по показателям биоразнообразия паразитофауны RANA RIDIBUNDA PALLAS, 1971 / Т. А. Индирякова, Е. М. Романова, О. А. Индирякова // Вестник Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии. - 2012.-№1 (17). - С. 49-54.

10. Рассадина, Е. В. Особенности биологии, экологии, этологии и разведения медицинской пиявки в лабораторных условиях [монография] / Е. В. Рассадина, Е. М. Романова. - Ульяновск: Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия, Ульяновский государственный университет, 2008. - 185 с.

11. Беэр, С. А. Биология возбудителя описторхоза / С. А. Беэр. - М.: Товарищество научных изданий КМК, 2005. - 336 с.

УДК 579:57.083:576.85

РАЗРАБОТКА СИСТЕМЫ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ B.BRONCHISEPTICA И B. PERTUSSIS НА ОСНОВЕ МУЛЬТИПЛЕКСНОЙ ПЦР В РЕЖИМЕ «РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ»

Мастиленко Андрей Владимирович, кандидат биологических наук, старший преподаватель кафедры «Микробиология, вирусология, эпизоотология и ветеринарно-санитар-ная экспертиза»*

Васильев Дмитрий Аркадьевич, доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой «Микробиология, вирусология, эпизоотология и ветеринарно-санитарная экспертиза»*

Борисова Ольга Юрьевна, доктор медицинских наук, руководитель центра по дифтерии и коклюшу **

Васильева Юлия Борисовна, кандидат ветеринарных наук, доцент кафедры «Микробиология, вирусология, эпизоотология и ветеринарно-санитарная экспертиза»*

* ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А. Столыпина»

432017, г. Ульяновск, бульвар Новый Венец, 1; тел.: 8(8422)559547

e-mail: mav0608@yandex.ru

** ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора

125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10

Ключевые слова: бактерии рода Bordetella, видовая дифференциация, мультиплексная ПЦР.

Статья посвящена проблеме разработки системы молекулярно-генетической дифференциации патогенных бактерий рода Bordetella, являющихся возбудителями респираторных заболеваний человека и животных. Авторами показано, что использование прай-меров и флуоресцентных зондов, фланкирующих фрагмент гена bfrZ позволяет проводить видовую дифференциацию B. bronchiseptica. Использование в качестве видоспецифической мишени праймеров и флуоресцентного зонда, фланкирующих фрагмент гена транспозазы IS481 не позволяет проводить видовую идентификацию B. pertussis.

Введение

Микробиологическая дифференциация бактерий рода Bordetella, являющихся возбудителями респираторных заболеваний человека и животных, в настоящее время представляет определенную сложность, обусловленную слабой биохимической активностью данных возбудителей, а также высокой гомологией генетического состава бактериального нуклеоида. Установлено, что бактериальные виды Bordetella pertussis и Bordetella parapertussis, по данным ряда исследователей [1], являются самостоятельными ответвлениями Bordetella bronchiseptica, потерявшими в ходе эволюционного процесса часть генов, отвечающих за метаболические процессы, или их промотеры претерпели значительные для своего выражения изменения.

B. bronchiseptica так же, как и B. pertussis и B. parapertussis, экспрессирует ряд факторов патогенности: адгезины (филаментоз-ный гемагглютинин, пертактин и фимбрии), токсины (дермонекротический, аденилат-циклазу-гемолизин и липополисахарид) [2, 3]. Однако нуклеотидный состав генов, кодирующих эти факторы, имеет гомологию не менее 90% среди данных возбудителей [1], поэтому их использование в качестве мишеней для систем молекулярно-генети-ческой идентификации нецелесообразно.

Результаты исследований [1, 4, 5] свидетельствуют, что молекулярно-генетиче-ская дифференциация B. bronchiseptica, B. pertussis и B. parapertussis может быть основана на вставочных элементах (IS), делеци-

ях или тандемных повторах отдельных элементов генома. Так, авторы считают, что для B. pertussis уникальными являются IS481 и IS1663, а для B. parapertussis IS1001; IS1002 имеет до 90 включений в геном B. parapertussis и до 6 - в геном B. pertussis.

Основываясь на этих данных, мы разработали олигонуклеотиды и флуоресцентные зонды для дифференциации B. bronchiseptica и B. pertussis при использовании метода ПЦР в режиме «реального времени». В качестве мишени для B. pertussis был выбран участок гена транспозазы IS481, а для B. bronchiseptica - фрагмент гена bfrZ системы утилизации железа. Специфичность гена bfrZ в отношении B. bronchiseptica была доказана в ранее опубликованных работах авторов [6, 7, 8, 9].

Объекты и методы исследований

Работа была выполнена на базе отдела молекулярной биотехнологии кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Ульяновской ГСХА им П.А. Столыпина.

В работе использованы штаммы B. bronchiseptica, B. pertussis и B. parapertussis из музея кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-са-нитарной экспертизы Ульяновской ГСХА им П.А. Столыпина. Для выделения ДНК использовали «ДНК-сорб-АМ» («ИнтеЛабСервис», Москва), в основе метода лежит лизис бактериальных клеток, сорбция ДНК на сили-кагеле и отмывка ДНК спиртово-солевым буфером. Подбор и дизайн олигонуклеоти-дов и флуоресцентных зондов проводили

при помощи программы Primer-Blast web-ресурса NCBI, а проверку их специфичности при помощи программы Nucieotide-Blast данного web-ресурса. В работе были использованы олигонуклеотиды BPR-f TTCCGCAT-GAATGTCTTCGC, BPR-r CACCTAGTGGCGTCT-GCAC, BFR-f GGACGACCAGGATCACATCTTCC, BFR-r GCTTTCCTGGTAGTTGGCGTAGG, и флуоресцентные зонды BPR-oligo CAGCACAG-GCTGTGGGTCCG-Fam-BHQ, BBR-oligo AACAA-CATGCGCATCAGCAACCGGAACA-R6G-BHQ. Для амплификации в работе использовали «Набор реагентов для проведения ПЦР-РВ с Taq-ДНК-полимеразой и ингибирующи-ми активность фермента антителами» (состав набора: дезоксинуклеозидтрифосфаты, 2.5 мМ, 500 мкл; 10-кратный ПЦР буфер, 500 мкл; MgCl2, 25 мМ, 500 мкл; Taq ДНК-полимераза с ингибирующими активность фермента антителами, 5 Е/мкл, 50 мкл; де-ионизированная вода, 2х1,7 мл.) («Синтол», Москва), а также детектирующий амплифи-катор ДТ-96 («ДНК-Технология», Москва).

Результаты исследований

Согласно данным исследований [2, 4, 5], в системе web-ресурса NCBI нами были определены полные нуклеотидные последовательности генов транспозазы IS481 B. pertussis и bfrZ B. bronchiseptica. После этого они были просканированы системой Blast на предмет совпадения с последовательностями депонированных бактериальных штаммов известных родов и видов. Полного совпадения по вышеуказанным последовательностям с исследуемыми бактериальными патогенами данной системой обнаружено не было. Аналогичным алгоритмом нами были определены наиболее консервативные участки генов транспозазы IS481 и bfrZ, которые были представлены у всех депонированных в данной системе штаммов B. pertussis и B. bronchiseptica.

После этого с использованием системы Primer-Blast был проведен подбор и дизайн олигонуклеотидов и флуоресцентных зондов для исследуемых последовательностей [10]. Флуоресцетные зонды были разработаны таким образом, что специфичность реакции для B. bronchiseptica детектируется по каналу Hex, а для B. pertussis - по

каналу Fam.

Одним из этапов подготовки к амплификации была экстракция геномной ДНК из проб биоматериала (суспензии бактериальных клеток и исходного клинического материала). Для этого нами был использована методика сорбции ДНК на силикагеле после предварительного лизиса бактериальных клеток и клинического материала. Методика экстракции заключалась в следующем:

1) по 100 мкл суспензии бактериальных клеток или клинического материала помещали в конические микропробирки типа «Eppendorf», имеющих маркировку «DNA/ RNA free»;

2) в каждую из микропробирок вносили по 300 мкл лизирующего раствора и по 20 мкл сорбента (силикагеля);

3) после тщательного встряхивания и гомогенизации на вортексе все пробы инкубировали 5 минут при 56°С;

4) затем все пробы центрифугировали 1 минуту при 13000 об/мин при комнатной температуре;

5) супернатант удаляли с помощью колбы-ловушки, а полученный осадок промывали 1,0 мл спирто-солевого буфера;

6) после повторного центрифугирования в течение 1 минуты при 13000 об/мин при комнатной температуре удаляли супер-натант;

7) полученный осадок подсушивали при открытых крышках при 56°С в течение 10 минут;

8) к осадку добавляли по 100 мкл трис-ЭДТА буфера и инкубировали в течение 10 минут при 56°С;

9) после гомогенизации осадка в буфере все пробы центрифугировали 1 минуту при 13000 об/минуту при комнатной температуре;

10) супернатант, содержащий ДНК, использовали в дальнейших исследованиях.

После выделения ДНК из бактериальных культур B. bronchiseptica, B. pertussis и B. parapertussis нами была проведена одновременная амплификация фрагментов генов транспозазы IS481 и bfrZ в микропробирках 0,2 мл с реакционной смесью, содержащей по 10 пмоль каждого из олигонукле-

52

Таблица 1 Программа для амплификации ДНК

№ цикла Шаг Температура Длительность Детекция Количество повторов

1 1 95°С 5 мин 1

2 1 95°С 10 сек

2 62°С 40 сек * 40

отидов и по 2,5 пмоль каждого из флуоресцентных зондов. После ряда экспериментов по оптимизации температуры отжига прай-меров была определена программа амплификации (табл. 1).

Использование детектирующего ам-плификатора позволило в данной работе регистрировать уровень роста флуоресцентного сигнала на каждом цикле реакции. В методе ПЦР с регистрацией в режиме «реального времени» основной величиной является не количество флуоресцентного сигнала, а номер цикла, на котором уровень сигнала начал экспоненциальный рост по сравнению с фоновой величиной. При этом в данной работе нами была учтена также эффективность самой реакции, которая составила более 95%. Однако применяемый в большинстве случаев метод оценки результатов с использованием порогового уровня (Ct) был заменен нами на метод прямого сравнения графиков накопления флуоресцентного сигнала с использованием первой и второй производной (Cp). Преимуществом использования производных является то, что при умножении кривой на любые множители положение максимумов производных не меняется. Это позволило нам избежать неоднородности расчета коэффициента пропорциональности числа молекул ДНК в реакции к уровню сигнал флуоресценции.

Результаты роста флуоресцентного сигнал по каналам Fam и Hex представлены на рис. 1 и 2.

Результаты обработки данных экспоненциального роста флуоресценции по каналам Fam и Hex отражены в таблице 2.

Выводы

В результате проведенных экспери-

2500-

=г г

'D

о 150fr

а

о

? 1000-е-

л-

ш

II

M ¡ж 7/ Ь

eu к Ш. /

11

Ii 11 Ii Номер цикла

Рис. 1 - Кривая роста флуоресценции по каналу FAM в эксперименте с праймера-ми к участку гена транспозазы iS481 B. pertussis

Рис. 2 - Кривая роста флуоресценции по каналу HEX в эксперименте с праймера-ми к участку гена bfrZ B. bronchiseptica

ментов нами было обнаружено, что оли-гонуклеотиды и флуоресцентный зонд с красителем R6G, фланкирующие фрагмент гена bfrZ, являются видоспецифичными для B. bronchiseptica. Олигонуклеотиды и флуоресцентный зонд, фланкирующие специфический фрагмент гена транспозазы IS481 B. pertussis, не являются видоспецифичными; при их отжиге наблюдается экспоненциальный рост флуоресцентного сигнала красителя Fam также для B. bronchiseptica и B. parapertussis. Исходя из этого, использование гена транспозазы IS481 в качестве видоспецифичной мишени для B. pertussis, по нашему мнению, нецелесообразно, однако возможно использование данных оли-

1!

£ & ES SS »1

Si

Р и ш Sä ;ii H  i

са s!

Таблица 2

Ср Fam/Hex при RT-PCR проб с содержанием ДНК B. bronchiseptica, B. pertussis и

B. parapertussis

Лунка Идентификатор Cp Fam Cp Hex

A1 B. bronchiseptica 123 21,5 20,4

A2 B. bronchiseptica 107 22,3 22

A3 B. bronchiseptica 342 34,3 29,9

A4 B. bronchiseptica 45 26,7 25,4

A5 B. bronchiseptica 156 25,9 23,2

A6 B. bronchiseptica 178 24,8 22,1

A8 B. bronchiseptica 112 25 24,8

A9 B. pertussis 24/08 29,2

A10 B. pertussis 256/3 31,4

A11 B. pertussis 124 27,5

A12 B. pertussis 36/11 26,4

B1 B. parapertussis 109 22,6

B2 B. parapertussis 34 27,2

B3 B. parapertussis 413 26,8

F12 К-

гонуклеотидов и флуоресцентного зонда в качестве родоспецифической мишени при проведении ПЦР в режиме «реального времени» для идентификации B. bronchiseptica, B. pertussis и B. parapertussis без видовой дифференцировки.

Библиографический список

1. A real-time PCR assay with improved specificity for detection and discrimination of all clinically relevant B. species by the presence and distribution of three Insertion Sequence elements / L. Roorda [et al.] // BMC Res Notes. - 2011. - V.21. - P.4-11.

2. Comparative analysis of the genome sequences of B. pertussis, B. parapertussis and B. bronchiseptica / J. Parkhill [et al.] // Nature genetics Advance online publication. - 2003. -V.10. - P.1038-1227.

3. Gueirard, P. Human B. bronchiseptica infection related to contact with infected animals: Persistence of bacteria in host / P. Gueirard, C. Weber, N. Guiso // J Clin Microbiol. -1995. - V.33. - P.2002-2006.

4. Triplex real-time PCR assay for detection and differentiation of B. pertussis and B.

parapertussis / Y. Xu [et al.] // Apmis. - 2010.

- V.118. - P.685-91.

5. Woolfrey, B.F. Human infections associated with B. bronchiseptica / B.F. Woolfrey, J.A. Moody // Clin. Microbiology. Rev. - 1991.

- V.4. - P.243-255.

6. Использование количественной ПЦР для идентификации Bordetella bronchiseptica / Д.А. Васильев, А.В. Мастиленко, Ю.Б. Васильева, Д.Г. Сверкалова // Молекулярная диагностика - 2010: Сборник трудов VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, 24-26 ноября, 2010. - Москва, 2010. - С.68-70.

7. Разработка методики выявления специфического участка ДНК Bordetella bronchiseptica с помощью ПЦР в режиме «реального времени» / Д.А. Васильев, А.В. Мастиленко, Д.Г. Сверкалова, Ю.Б. Никуль-шина // Современный мир, природа и человек: Сборник научных трудов. - Томск, 2009.

- С. 115-117.

8. Разработка методики идентификации Bordetella bronchiseptica с помощью по-лимеразной цепной реакции в режиме «реального времени» / Д.А. Васильев, А.В. Мастиленко, Ю.Б. Васильева, Д.Г. Сверкалова // Актуальные проблемы инфекционной патологии ветеринарной медицины: Материалы конференции молодых ученых, посвященной памяти члена-корреспондента РАСХН Вишнякова И.Ф. 70-летию со дня рождения, 3-4 декабря, 2009. - Покров, 2009. - С. 78-80.

9. Определение эффективности разработанных зондов в реакции РВ-ПЦР для повышения специфичности выявления Bordetella bronchiseptica / А.В. Мастиленко, Д.А. Васильев, Ю.Б. Васильева, Д.Г. Свер-калова / «Молекулярная эпидемиология актуальных инфекций»: материалы международной конференции, Санкт-Петербург, 5-7 июня 2013 года. - Санкт-Петербург: НИИ Эпидемиологии и микробиологии им. Па-стера. - «Инфекция и иммунитет». -Том 3. -№2. - С. 152.

10. ПЦР «в реальном времени» / Д.В.Ребриков [и др.] - М.: Бином. Лаборатория знаний, 2009. - 223 с.

УТ