Средство для коррекции нарушений в эритроидном ростке кроветворения, вызванных цитостатическим воздействием
MEANS FOR CORRECTION OF VIOLATIONS IN HEMOGENESIS ERYTHROID LINEAGE CAUSED BY CYSTOSTATIC IMPACT

Изобретение относится к области медицины, конкретно к гематологии, и может быть использовано для фармакологической коррекции нарушений эритропоэза, развивающихся при цитостатических воздействиях.
Согласно последним клиническим исследованиям, анемия является одним из основных проявлений различных патологических процессов (1, 2). Так, анемия относится к числу важнейших синдромов, развивающихся у пациентов со злокачественными новообразованиями (3, 4). Угроза развития тяжелых анемических состояний у онкологических пациентов еще более возрастает в ходе проведения противоопухолевой химиотерапии, что связано с высокой чувствительностью эритрона к токсическому действию большинства известных цитостатических препаратов (5, 6). Известно, что наиболее чувствительным к угнетающему действию цитостатиков, в частности, противоопухолевых антибиотиков антрациклинового ряда (доксорубицин) и препаратам платины (карбоплатин), является эритроидный росток кроветворения (7, 8).
Основным методом лечения анемии является гемотрансфузия, при использовании которой возникает риск развития инфекций, а также аллергических и иммунологических реакций (9, 10). Альтернативным способом коррекции нарушений эритропоэза, вызванных использованием цитостатиков, может быть применение предшественников нуклеиновых кислот, витаминов группы В, зимозана, рекомбинантного эритропоэтина, иммуномодуляторов и др. (11). Несмотря на высокую эффективность указанных фармакопейных препаратов, они могут вызвать побочные эффекты. Так, при использовании в клинической практике эритропоэтина возможен гипертонический криз с явлениями энцефалопатии, увеличение числа тромбоцитов, снижение показателей обмена железа, аллергические проявления в виде сыпи, зуда, крапивницы, реакции в месте инъекции, индивидуальная непереносимость препарата (12).
Задачей, решаемой настоящим изобретением, является расширение арсенала средств растительного происхождения для использования с целью фармакологической коррекции нарушений в эритроидном ростке кроветворения, вызванных цитостатическим воздействием.
Для решения этой задачи используют жидкий спиртовый экстракт плодов рябины обыкновенной (Sorbus aucuparia L.), полученный методом динамической дробной мацерации. Для получения экстракта использовали лабораторный реактор с паровой рубашкой («Radleys», Германия), подключенный к погруженному циркуляционному блоку регулирования температуры «МO1» («Термэкс», Россия), верхнеприводной мешалке RZR 2020 («Heidolph», Германия) и шариковому холодильнику. Плоды рябины измельчали до размера частиц диаметром 0,3-0,5 см. Экстракт готовили в соотношении 1:5 на 95%-ном подкисленном этиловом спирте. В ходе экстрагирования получили 500 мл жидкого экстракта. Подкисленный этиловый спирт готовили из расчета 6,49 г концентрированной кислоты хлористоводородной на 200 мл 95% спирта этилового. Готовый экстракт отстаивали при температуре не выше 10°С не менее 2 сут до получения прозрачной жидкости, затем фильтровали и хранили при температуре не выше 5°С в защищенном от света месте.
Экстракт на 95% подкисленном спирте представляет собой темно-вишневую жидкость, со специфическим фруктовым запахом кисловато-горького вкуса.
Сухой остаток жидкого экстракта плодов рябины обыкновенной определяли с помощью весового влагомера MS-70 («AND», Япония). Сухой остаток исследуемого экстракта составляет 14±0,22%.
По данным химического анализа, проведенного общепринятыми методами (13), основными действующими веществами экстракта являются фенолокислоты и антоцианы. Количественное определение данных групп БАВ в исследуемом экстракте проводили методом прямой спектрофотометрии (14, 15). Содержание суммы фенолокислот (в пересчете на хлорогеновую кислоту) в экстракте рябины обыкновенной составляет 2,97±0,15%, а суммы антоцианов (в пересчете на цианид-3-о-глюкозид) - 4,30±0,20%.
Новым является то, что в качестве средства, препятствующего развитию депрессии эритроидного ростка кроветворения, вызванной использованием цитостатика, применяют жидкий спиртовый экстракт плодов рябины обыкновенной.
Использование жидкого спиртового экстракта плодов рябины обыкновенной по новому назначению стало возможным благодаря выявленным авторами новым свойствам, препятствующим депрессии в отношении эритроидного ростка кроветворения на фоне цитостатического воздействия.
Новое свойство явным образом не вытекает из уровня техники в данной области, не очевидно для специалиста и не обнаружено в патентной и научно-медицинской литературе. Предлагаемое в качестве изобретения средство может быть использовано в клинической гематологии и онкологии.
Предлагаемое изобретение соответствует условиям патентоспособности «Новизна», «Изобретательский уровень» и «Промышленная применимость».
Данное средство прошло экспериментальное исследование в лаборатории онкофармакологии НИИФиРМ им. Е.Д. Гольдберга (Томск) и на кафедре фармакогнозии с курсами ботаники и экологии ФГБОУ ВО СибГМУ Минздрава России.
Новые свойства жидкого спиртового экстракта плодов рябины обыкновенной были обнаружены экспериментальным путем. Изучение проведено на мышах-самках линии C57BL/6 массой 20-22 г в возрасте 3 мес. Согласно Руководству по проведению доклинических исследований лекарственных средств (16), моделью угнетения эритроидного ростка кроветворения явилась цитостатическая миелосупрессия, вызванная введением интактным животным доксорубицина (антибиотик антрациклинового ряда) в максимально переносимой дозе (МПД) - 6 мг/кг.
Для проведения эксперимента животные (мыши-самки линии C57BL/6) были распределены на группы:
1. Интактный контроль - здоровые мыши.
2. Доксорубицин - мышам однократно внутрибрюшинно вводили доксорубицин в дозе 6 мг/кг в 0,1 мл физиологического раствора. Животные получали 0,2 мл дистиллированной воды внутрижелудочно, через 24 часа после инъекции цитостатического препарата ежедневно в течение 14 сут.
3. Доксорубицин + экстракт рябины - мышам однократно внутрибрюшинно вводили доксорубицин в дозе 6 мг/кг в 0,1 мл физиологического раствора. Животные получали экстракт плодов рябины обыкновенной в дозе 5 мл/кг в 0,2 мл дистиллированной воды внутрижелудочно, через 24 часа после инъекции цитостатического препарата ежедневно в течение 14 сут.
Оценка специфической активности препаратов, избирательно стимулирующих процессы костномозгового эритропоэза, проводилась с использованием следующих показателей (16):
1) определение в периферической крови количества эритроцитов и ретикулоцитов, содержание гемоглобина, гематокрита производили с помощью гематологического анализатора «Muchic 18vet» (Cormay, Франция).
2) подсчет общей клеточности костного мозга и миелограмм.
У здоровых мышей (интактный контроль), а также животных, получавших доксорубицин (на 3, 5, 7, 10, 12 и 15 сут после введения цитостатика), определяли показатели периферической крови (ретикулоциты, эритроциты, гемоглобин, гематокрит) и костного мозга (общее количество кариоцитов, незрелые и зрелые нейтрофильные гранулоциты, эозинофилы, моноциты, лимфоциты, эритроидные клетки) стандартными гематологическими методами (17, 18).
Статистическая обработка результатов проводилась путем расчета средней (X) и стандартной ошибки (m) с использованием непараметрических методов Вилкоксона-Манна-Уитни (U). Различие считали достоверным при Р<0,05 (19).
Для выявления фармакологического действия жидкого спиртового экстракта плодов рябины обыкновенной на эритроидный росток кроветворения в условиях доксорубицин-индуцированного анемического синдрома у здоровых мышей линии C57BL/6 был поставлен следующий эксперимент.
Пример 1
В эксперименте обнаружено, что однократное внутрибрюшинное введение доксорубицина в дозе 6 мг/кг оказывает угнетающее действие на эритроидный росток кроветворения. Динамика содержания ретикулоцитов характеризовалась развитием ретикулоцитопении (3-7 сут), с последующим восстановлением к 10 сут исследования. Максимальное падение числа ретикулоцитов наблюдалось на 5 сут эксперимента: их количество в периферической крови мышей, получавших доксорубицин, снизилось в 3,3 раза (Р<0,01) относительно этого показателя у здоровых животных. На 3, 5 и 7 сут эксперимента количество эритроцитов, а также содержание гемоглобина в периферической крови мышей группы монохимиотерапии оказались достоверно ниже этих значений у интактных животных. Уменьшение количества эритроцитов зафиксировано и на 12 сут после введения цитостатика. Уровень гематокрита, на протяжении всего эксперимента был достоверно ниже значений у здоровых мышей (таблица 1).
Примечание: здесь и далее перед уровнем значимости Р указаны номера сравниваемых групп.
Курсовое применение экстракта плодов рябины обыкновенной в дозе 5 мг/кг оказало как защитное, так и стимулирующее влияние на процесс эритропоэза. Так, на 3, 5 и 12 сут эксперимента количество ретикулоцитов у мышей, получавших растительный экстракт после введения доксорубицина, оказалось в 1,3 (Р<0,01), 1,9 (Р<0,05) и 1,1 (Р<0,05) раза выше таковых у животных группы монохимиотерапии. На эти же сроки исследования отмечено достоверное повышение количества эритроцитов, уровня гемоглобина и гематокрита в периферической крови животных, получавших на фоне доксорубицина экстракт плодов рябины, по сравнению с этими показателями у леченных только цитостатиком мышей (таблица 1).
Анализ миелограмм животных показал, что развитие гипоплазии костномозгового кроветворения под влиянием цитостатика было обусловлено глубоким подавлением всех ростков гемопоэза. Так, после однократной внутрибрюшинной инъекции мышам доксорубицина в дозе 6 мг/кг сниженное количество кариоцитов регистрировалось с 3 по 7 сут, достигая значений животных в группе интактного контроля к 10 сут (таблица 2).
Отмечено достоверное снижение количества зрелых непрофильных гранулоцитов в 1,3 раза на 3 и 5 сут исследования. Количество незрелых (на 7, 12, 15 сут) и зрелых (на 12, 15 сут) форм нейтрофильных лейкоцитов превосходило показатели здоровых мышей. Достоверное уменьшение количества лимфоидных элементов костного мозга наблюдалось вплоть до 12 сут с максимальным падением их числа (в 1,7 раза, Р<0,01) к 3 сут исследования (таблица 2).
Введение мышам доксорубицина приводило также к развитию глубокой депрессии эритроидного ростка кроветворения. Так, на 3, 5, 7, 10, 12 сут после инъекции цитостатика число эритроидных клеток оказалось сниженным в 3,2; 2,0; 2,4; 2,1; 1,5 раза (Р<0,01) соответственно относительно этого показателя у животных интактного контроля (таблица 2).
При использовании экстракта плодов рябины обыкновенной на фоне введения доксорубицина повышенное количество кариоцитов в костном мозге мышей отмечалось на 5, 7 и 12 сут эксперимента по сравнению с таковым у мышей группы монохимиотерапии. Анализ миелограмм показал, что экстракт плодов рябины обыкновенной обладает защитными свойствами, а также стимулирует процессы регенерации эритроидного и гранулоцитарного ростков гемопоэза. Количество эритроидных клеток в костном мозге мышей, получавших растительный препарат, на 3, 5 и 12 сут превосходило в 1,5; 1,5 и 1,4 раза значения данного показателя у получавших только цитостатик животных (таблица 2).
На 5 и 12 сут эксперимента регистрировалось увеличение содержания зрелых и/или незрелых форм нейтрофильных гранулоцитов в костном мозге мышей, получавших на фоне доксорубицина экстракт плодов рябины обыкновенной, по сравнению с таковыми у животных группы монохимиотерапии. Растительный экстракт способствовал также восстановлению клеточности лимфоидного ростка кроветворения после повреждения цитостатиком: на 5 и 7 сут исследования число костномозговых лимфоидных клеток было достоверно выше (в 1,3 раза) этого показателя у мышей, получавших доксорубицин (таблица 2).
Таким образом, в эксперименте на мышах-самках линии C57BL/6 с доксорубицин-индуцированным анемическим синдромом выявлена способность спиртового экстракта плодов рябины обыкновенной препятствовать развитию депрессии эритроидного ростка кроветворения за счет его защитных свойств на 3, 5 сут исследования и стимуляции регенерации клеток эритропоэза в более поздние сроки (12 сут).
Список использованной литературы
1. Weems Md R., Johnson Md D. ANEMIA IN AN HIV INFECTED PATIENT: PARVO THE COURSE? // J La State Med Soc. - 2015. - 167 (3). - P. 148.
2. , Abad S., Vega A. New expectations in the treatment of anemia in chronic kidney disease // Nefrologia. - 2016. - S0211-6995 (16). - P. 30009-30011.
3. Новицкий B.B., Степовая E.A., Гольдберг B.E. и др. Эритроциты и злокачественные новообразования. - Томск: «STT», 2000. – C. 9.
4. Птушкин В.В. Дискуссионные вопросы применения эритропоэтинов в лечении анемии у пациентов с опухолевыми заболеваниями // Онкогематология. - 2007. - № 2. - С. 31-36.
5. Королева И.А., Копп М.В., Шаплыгин Л.В. Профилактика и коррекция нейтропении и анемии, вызванных противоопухолевой химиотерапией // Клиническая онкогематология. - 2012. - Т.5 - №3. - С. 246-254.
6. Lai-Tiong F., Brami С, Dubroeucq О., Scotte F., Cure H., JoveninN. Management of anemia and iron deficiency in a cancer center in France // Support Care Cancer. - 2016. - Vol. 24 (3). - P. 1091-1096.
7. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Жданов B.B. Роль гемопоэзиндуцирующего микроокружения в регуляции кроветворения при цитостатических миелосупрессиях. - Томск: STT, 1999. - С. 63.
8. Дыгай A.M., Жданов В.В., Удут Е.В. Фармакологическая регуляция эритропоэза - М.: Изд-во РАМН, 2009. - С. 30, 43.
9. Barrett-Lee P.J., Bailey N.P., О Brien М.Е. et al. Large-scale UK audit of blood transfusion requirements and anemia in paticents receiving cytotoxic chemotherapy // Br. J. Cancer. - 2000. - Vol. 82. - № 1. - P. 93-97.
10. Птушкин B.B. Совершенствование методов поддерживающей терапии при проведении цитостатического лечения // Современная онкология.-2002. - Т.4. - № 2. - С. 28-30.
11. Воробьев П.А. Анемический синдром в клинической практике. - М.: Ньюдиамед, 2001. - С. 28-35.
12. Козловская Л.В., Милованов Ю.С., Фомин В.В., Милованова Л.Ю. Сердечно-сосудистые эффекты эритропоэтина у больных с консервативной стадией ХПН // Врач. - 2004. - № 10. - С. 57-59.
13. Государственная фармакопея СССР. Вып. 2. Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье / МЗ СССР. - 11-е изд., доп. М., 1989. С. 160-161, 323-325.
14. Коломиец Н.Э. Калинкина Г.И., Сапронова Н.Н. Стандартизация листьев крапивы двудомной // Фармация. - 2011. - № 6. - С. 22-24.
15. Исайкина Н.В., Калинкина Г.И., Андреева В.Ю. и др. Рябина обыкновенная: определение антоцианов в плодах // Фармация. - 2015. -№ 1. - С. 19-22.
16. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. - М.: «Гриф и К», 2013. - 944 с.
17. Новицкий В.В. Методические разработки практических занятий по курсу гематологии для студентов медико-биологического факультета с элементами УИРС. - Томск, 1986. - С. 30-35.
18. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Шахов В.П. Методы культуры ткани в гематологии. - Томск: Изд-во Томского Университета, 1992. - С. 211-212; 214.
19. Гланц С. Медико-биологическая статистика. Пер. с англ. - М.: Практика, 1998. - С. 251.