Способ снижения агрегационной способности тромбоцитов
METHOD FOR REDUCING AGGREGATION ABILITY OF PLATELETS

Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной фармакологии.
Появление информации о том, что эритропоэтическое действие и цитопротективные эффекты эритропоэтина реализуются через разные рецепторы (гомодимерный и гетеродимерный), привело исследователей к идее поиска коротких молекул, имитирующих спираль B эритропоэтина для получения пептидов с цито- и эндотелиопротективными свойствами. В исследовании, опубликованном Michael Brines et al. показано, что 11-членный пептид pHBSP (QEQLERALNSS (Pyr-Glu-Gln-Leu-Glu-Arg-Ala-Leu-Asn-Ser-Ser)) имитирует особенности трехмерной структуры спирали B эритропоэтина и оказывает тканезащитные эффекты без гемопоэтической активности [Brines M., Patel N.S., Villa P., Brines C., Mennini T., De Paola M., Erbayraktar Z., Erbayraktar S., Sepodes B., Thiemermann C., Ghezzi P., Yamin M., Carla C. Hand, Qiao-wen Xie, Coleman T., Cerami F. Nonerythropoietic, tissue-protective peptides derived from the tertiary structure of erythropoietin // Proc Natl Acad Sci USA. 2008. №105(31). Р. 10925-10930.].
С учетом предполагаемых областей применения дополнительным положительным свойством у подобных производных эритропоэтина является антиагрегантная активность. Путем присоединение к исходному 11-членному пептиду pHBSP (QEQLERALNSS) трипептидов с заданными свойствами RGD (Arg-Gly-Asp) и KGD (Lys-Gly-Asp) [Preclinical study of innovative peptides mimicking the tertiary structure of the α-helix B of erythropoietin / I.V. Golubev, V.V. Gureev, M.V. Korokin [et al.] //  Research Results in Pharmacology. – 2020. – Vol. 6, Iss. 2. – P. 85-96. https://doi.org/10.3897/rrpharmacology.6.55385] были получены пептиды с выраженной антиагрегантной активностью с сохранением цитопротективных свойств [Ivan V. Golubev, Vladimir V. Gureev, Liliya V. Korokina, Oleg S. Gudyrev, Tatiana G. Pokrovskaia, Olga N. Pokopeiko, … Mikhail V. Korokin. (2020). The anti-aggregation activity of new 11-amino acid of erythropoietin derivate containing tripeptide motifs. http://doi.org/10.5281/zenodo.4264989]. Однако такой способ получения приводит к удлинению полипептидной цепи, а значит и размера молекулы. Это может приводить к нарушению их транспорта через тканевые барьеры. Другим путем получения пептидов с выраженной антиагрегантной активностью и сохранением цитопротективных свойств может быть модификация аминокислотного состава без изменения числа аминокислот. После проведения скрининга были отобраны полипептидные соединение с аминокислотной последовательностью EP-11-1 (UEHLERALNSS) и EP-11-3 (UEQLERALNTS) обладающие антиагрегантной активностью. У последних полипептидная цепочка содержит такое же количество аминокислотных остатков, как и у исходного пептида, что является преимуществом.
Прототипом заявленного решения является способ снижения агрегационной способности тромбоцитов с помощью производных пептида pHBSP (QEQLERALNSS) с лабораторным шифром Pα-B1 -  Pα-B4 полученных путем присоединения к последнему трипептидных мотивов RGD (Arg-Gly-Asp) и KGD (Lys-Gly-Asp) с заданными свойствами [Ivan V. Golubev, Vladimir V. Gureev, Liliya V. Korokina, Oleg S. Gudyrev, Tatiana G. Pokrovskaia, Olga N. Pokopeiko, … Mikhail V. Korokin. (2020). The anti-aggregation activity of new 11-amino acid of erythropoietin derivate containing tripeptide motifs. http://doi.org/10.5281/zenodo.4264989]. В данном способе снижение агрегационной способности тромбоцитов производится полипептидами с более длинной полипептидной цепочкой по отношению к исходному пептиду, а значит результаты не удовлетворительные.
Задачей изобретения является снижение агрегационной способности тромбоцитов, включающий использование полипептидов производных pHBSP с 11-членной аминокислотной последовательностью обладающих цитопротективным действием.
Техническим результатом изобретения является  способ снижения агрегационной способности тромбоцитов, включающий использование в качестве антиагрегантов полипептидными соединениями с аминокислотной последовательностью UEHLERALNSS и UEQLERALNTS.
Задача достигается тем, что перед индукцией агрегации тромбоцитов с помощью  аденозиндифосфата (АДФ) кровь предварительно инкубируется с исследуемыми полипептидами с аминокислотной последовательностью: UEHLERALNSS и UEQLERALNTS в конечной концентрации 30 мкг/мл.
СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЯЕТСЯ СЛЕДУЮЩИМ ОБРАЗОМ
Экспериментальное исследование проведено на базе НИИ фармакологии живых систем НИУ «БелГУ». Все эксперименты были одобрены Этическим комитетом НИУ «БелГУ». Вивисекцию проводили в соответствии с этическими принципами обращения с лабораторными животными «European Convention for the Protection of Vertebral Animals Used for Experimental and Other Scientific Purposes. CETS No. 123».
До и во время выполнения исследования животные содержались в помещениях с искусственным освещением (режим 12ч/12ч) при температуре 21-23°С, влажности 38-50% и имели свободный доступ к корму и воде.
Исследование антиагрегантной активности in vitro производных 11-членного пептида pHBSP (QEQLERALNSS): EP-11-1 (UEHLERALNSS) и EP- 11-3 (UEQLERALNTS) проведено на модели АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов при предварительной инкубации цельной крови с изучаемыми пептидами. Антиагрегантную активность определяли по методу G. Born в модификации З.А. Габбасова на двухканальном лазерном анализаторе агрегации тромбоцитов АЛАТ-2 «Биола» с использованием реактивов производства НПО «Ренам». Кровь забирали из брюшного отдела аорты в пробирку с 3,8% раствором цитрата натрия в соотношении 9:1 с последующим добавлением исследуемых полипептидов в конечной концентрации 30 мкг/мл. Инкубировали 30 минут. Затем центрифугировали при 1000 оборотов 10 минут. После этого вносили 270 мкл обогащенной тромбоцитами плазмы в кювету агрегометра объемом 0,3 мл. При изучении АДФ индуцированной агрегации в пробирку добавляли 30 мкл динатриевой соли аденозин-5-дифосфорной кислоты (АДФ) в конечной концентрации 5 мкМ. Регистрацию агрегации тромбоцитов осуществляли на протяжении 5 мин. Получали кривые, отражающие падение оптической плотности плазмы. Степень агрегации тромбоцитов оценивали по величине максимальной амплитуды агрегатограммы и времени наступления максимальной светопропускной способности и времени наступления уровня 85% от максимальной светопропускной способности.
Статистическая обработка результатов исследования
Статистическую обработку проводили с использованием программной среды вычислений R. Характер распределения признаков в статистической выборке определяли с помощью критерия Шапиро-Уилка и критерия Шпигельхальтера (библиотека normtest), оценку равенства дисперсий – с помощью критерия Левене (библиотека lawstat). В зависимости от типа распределения признаков и равенства дисперсий значимость полученных результатов оценивали с применением параметрического (ANOVA) или непараметрического (критерий Краскела-Уоллиса) однофакторного дисперсионного анализа, а в качестве post-hoc анализа для выявления различий при межгрупповых сравнениях использовали непарный t-критерий Стьюдента или критерий Манна-Уитни, соответственно, с поправкой Бенджамини-Хохберга на множественную проверку гипотез. Результаты считали достоверными при p≤0,05.
ПРИМЕР КОНКРЕТНОГО ВЫПОЛНЕНИЯ
Инкубирование крови с исследуемыми пептидами: EP-11-1 или EP-11-3 приводило к ослаблению агрегационной способности тромбоцитов. Об этом свидетельствует статистически значимое уменьшение максимальной светопропускной способности плазмы с 36,9±1,79% до 31,5±0,85% и 30,4±0,62%  соответственно, и отсрочивание во времени ее наступления с 123,4±3,33 с до 132,6±2,73 с и 137,5±3,80 с соответственно. Закономерная тенденция наблюдается и при анализе времени наступления 85% от максимального уровня светопропускания. У образцов EP-11-1 и EP-11-3 время его наступления больше по отношению к группе интактных животных (таблица 1).
Таким образом, на основании проведенного исследования выявлена антиагрегантная способность у образцов EP-11-1 и EP-11-3, о чем свидетельствуют удлинение времени агрегации тромбоцитов и снижение ее степени.
Таблица 1