СОЕДИНЕНИЕ ДЛЯ АНТИМИКРОБНОЙ ФОТОДИНАМИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ И СПОСОБ ПРИМЕНЕНИЯ
COMPOUND FOR ANTIMICROBIAL PHOTO DINAMIC THERAPY AND METHOD OF APPLICATION

Предпосылки изобретения
1. Область изобретения
Изобретение относится к области фотодинамической терапии, в частности к применению фотодинамической терапии при селективном разрушении бактерий у больных людей и животных.
2. Описание предшествующего уровня техники
Фотодинамическая терапия (ФДТ) хорошо известна и использовалась для борьбы с многочисленными заболеваниями, в целом связанными с избыточной пролиферацией ткани, такими как рак и различные заболевания кожи. ФДТ также использовалась в качестве антимикробного лечения. Однако существуют две основные проблемы, связанные с антимикробной ФДТ. Первая проблема заключается в трудности обнаружения фотоактивных веществ, которые можно эффективно использовать против и грамположительных, и грамотрицательных бактерий. Грамотрицательные бактерии создают гораздо более трудное препятствие, прежде всего вследствие двухслойной структуры их наружной мембраны.
Первостепенное различие между грамположительными и грамотрицательными бактериями заключено в клеточных стенках, как показано на фиг.1 и 2. Как показано на фиг.1, грамположительные клетки имеют толстую пептидогликановую клеточную стенку 101, состоящую из множества отдельных пептидогликановых слоев 103 (например, 20-40 слоев), окружающих клеточную мембрану 105. Напротив, как показано на фиг.2, грамотрицательные клетки имеют лишь тонкий слой пептидогликана 201, окружающий клеточную мембрану 203, которая, кроме того, окружена дополнительной наружной мембраной 205. Этот дополнительный слой обеспечивает возможность дифференцировки грамотрицательных и грамположительных бактерий с использованием способа Грама. Из-за наружной мембраны грамотрицательных бактерий кристаллический фиолетово-йодный краситель не может достичь пептидогликанового слоя клеточной стенки и удерживаться в грамотрицательных бактериях после использования способа Грамма, как это происходит в грамположительных бактериях. Наружная мембрана в первую очередь ответственна за ингибирование проникновения многих веществ в грамотрицательные бактерии. И это является причиной трудности обнаружения фотосенсибилизаторов, которые эффективны против обоих типов бактерий.
Вторая проблема возникает в результате трудности обнаружения подходящего фоточувствительного соединения, которое сохраняет по меньшей мере некоторую активность в присутствии многокомпонентных сред, таких как сыворотка крови, кровь или слюна. Большинство фоточувствительных соединений (фотосенсибилизаторов), которые проявляют высокую активность против клеточных суспензий в бедных средах, таких как солевой раствор с фосфатным буфером, по существу не проявляет эффекта в присутствии сыворотки крови, крови или слюны. Это происходит потому, что компоненты в этих многокомпонентных средах (например, белки, клетки крови) конкурируют с бактериями за аффинитет соединения ФДТ.
Сафранин О представляет собой красный краситель, который поглощается в сине-зеленом диапазоне 450-600 нм. Он используется в качестве биологического красителя при таких процессах как микрофотография. Например, сафранин О окрашивает ядра, хромосомы, лигнифицированные и кутинизированные клеточные стенки в красный цвет. Он также используется в сочетании с йодом Грама для дифференцировки бактерий и используется при электронной микроскопии. Продукты сафранина также использовались в чернильных композициях, используемых для индикации состояний, включающих время, давление, энергию или присутствие/отсутствие определенных химических веществ при методиках стерилизации (патент США №5990199).
Сафранин О, сафранин и родственные красители использовались при способах лечения периодонта, при которых выявляются и лечатся микробы и полости на зубах и деснах и вокруг них. В патенте США №6337357 раскрывается антимикробная выявляющая кариес композиция, включающая воду, смешиваемый с водой растворитель или их комбинацию, краситель, способный окрашивать пораженные кариесом части зубов, и антимикробное средство. Это система и выявления, и стерилизации полости кариеса. Можно использовать краситель, такой как сафранин О, который относится к подходящим красителям, растворимым в растворителе или растворителях и способным визуально указывать на присутствие и локализацию полостей. Для настоящего изобретения сафранин используется исключительно в качестве окрашивающего средства и не предусматривается в качестве антимикробного средства.
Сафранин также использовался в качестве фотосенсибилизатора при антимикробных видах применения ФДТ. В патенте США №6558653 (и в заявке на патент США №2003/0059379) описан способ ФДA и фоточувствительные соединения для разрушения некротической ткани и бактерий на зубах. Способ включает нанесение композиции красителя, такого как сафранин, который поглощает световую энергию с длиной волны от 450 до 600 нм. Краситель контактирует с некротической тканью, бактериями и окружающей тканью для селективного окрашивания ткани. Таким образом, окрашенная инфицированная ткань легко поглощает подаваемое световое излучение и термически разрушает пораженную ткань и бактерии. Это изобретение ограничено обработкой поверхностных бактерий в кармане периодонта с использованием фототермических эффектов.
Цели и краткое изложение сущности изобретения
Целью настоящего изобретения является разработка способа для эффективного и селективного разрушения вредных микробов, в частности бактерий, у человека или животного.
Другой целью настоящего изобретения является разработка способа борьбы с бактериями, который может контролируемо и селективно активироваться электромагнитным излучением.
Еще одной целью настоящего изобретения является разработка способа, который эффективен для разрушения и грамположительных, и грамотрицательных бактерий.
Настоящее изобретение относится к способу и композиции для разрушения микробов, в частности бактерий, в организме с использованием сафранина О в сочетании с электромагнитным излучением. В предпочтительном способе композиция, включающая сафранин О, вводится в область лечения. По прошествии достаточного периода времени облучение подходящей длины волны подается на область для активации сафранина О и фотодинамическим взаимодействием разрушает бактерии. Предпочтительное излучение имеет длину волны примерно 530 нм. Этот способ эффективен для разрушения и грамотрицательных, и грамположительных бактерий, и особенно эффективен в областях, где также присутствуют многокомпонентные среды, такие как сыворотка крови, кровь или слюна.
Указанные выше и другие цели, признаки и преимущества настоящего изобретения станут очевидны из следующего описания, прочитанного в сочетании с сопровождающими чертежами.
Краткое описание чертежей
Фиг.1 представляет собой вид в разрезе клеточной оболочки грамположительной бактериальной клетки.
Фиг.2 представляет собой вид в разрезе клеточной оболочки грамотрицательной бактериальной клетки.
Фиг.3 представляет собой график, показывающий фотодинамическую инактивацию Staphylococcus aureus DSM1104 сафранином О.
Фиг.4 представляет собой график, показывающий фотодинамическую инактивацию Pseudomonas aeruginosa DSM1117 сафранином О.
Фиг.5 представляет собой график, показывающий фотодинамическую инактивацию Escherichia coli DSM8698 сафранином О.
Подробное описание предпочтительных вариантов осуществления
Ввиду трудностей, обнаруженных в способах и соединениях предшествующего уровня техники, в частности, в нахождении путей разрушения и грамположительных, и грамотрицательных бактерий и во избежание вредных воздействий многокомпонентных сред, таких как сыворотка крови, кровь или слюна, желательно обнаружить соединение, которое позволило бы преодолеть эти недостатки. Было обнаружено, что сафранин О можно эффективно применять для разрушения и грамположительных, и грамотрицательных микроорганизмов в сочетании с электромагнитным облучением. Другое отмеченное преимущество состояло в том, что присутствие многокомпонентных компонентов среды (например, сыворотки крови, крови или слюны) не нейтрализует эффективность сафранина О в направленности на бактерии, как часто происходит в случае применения других фотосенсибилизаторов. Таким образом, сафранин О представляет собой часть эффективного антибактериального лечения в соответствии с настоящим изобретением. Антибактериальная композиция ФДТ, включающая сафранин О, также является частью настоящего изобретения.
В предпочтительном варианте осуществления антибактериальное лечение включает 3 общие стадии. Первая стадия заключается во введении композиции сафранина О в среду, содержащую бактерии. Вторая стадия состоит в предоставлении возможности прохождения достаточного периода времени для того, чтобы позволить сафранину О проникнуть в бактериальные клетки в области обработки или, по меньшей мере, связаться с компонентами их клеточной оболочки. Конечная стадия заключается в подаче излучения подходящей длины волны для инициации фотодинамического механизма активацией сафранина О, вызывающей продукцию реактивных видов кислорода и свободных радикалов, приводящей к разрушению бактерий.
Предпочтительный период времени между нанесением композиции сафранина О и облучением вариабелен и может меняться в зависимости от таких факторов как тип бактерий, подлежащих обработке, и способ введения композиции сафранина О. Обычно этот период должен составлять по меньшей мере 15 мин. Для лечения внутренних бактериальных инфекций композицию можно инъецировать в поток крови для системного применения или инъецировать местно, если инфекция ограничена определенной областью. По поводу инфекций на коже или около нее композиция может быть в форме раствора, крема, геля или лосьона для местного применения.
После заданного периода времени излучение подается на участок обработки для активации сафранина О и разрушения бактерий. Предпочтительная длина волны активирующего излучения составляет от 500 нм до 580 нм, а еще предпочтительнее составляет примерно 530 нм. Излучение может представлять собой несфокусированное излучение, такое как от лампы, или сфокусированное лазерное излучение. Для обработки поверхностных или находящихся под поверхностью структур лампа может быть эффективна при облучении определенных инфицированных областей, в то время как для инфицированных областей, находящихся глубже внутри тела, для доставки лазерного излучения к этим внутренним областям предпочтителен оптоволоконный прибор, включающий одно или несколько оптических волокон, который может, кроме того, содержать диффузоры или другие устройства, требуемые для облучения определенной внутренней области. Предпочтительный лазерный источник представляет собой лазер с накачкой светодиодами 532 нм.
Настоящее изобретение далее иллюстрируется следующими примерами, но не ограничивается ими.
Пример 1
Фотодинамическая инактивация суспензий бактериальных клеток сафранином О.
Несколько исследований продемонстрировали, что грамотрицательные бактерии (например, Staphylococcus aureus) особенно восприимчивы к фотодинамической инактивации, в то время как грамотрицательные бактерии (например, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa) значительно более устойчивы ко многим обычно используемым фотосенсибилизаторам. Более того, заявители обнаружили, что и грамположительные, и грамотрицательные бактериальные клетки в более многокомпонентных средах (например, крови, плазме, сыворотке крови, слюне) также более защищены от фотодинамического действия.
Организмы, использованные в исследованиях заявителей, представляли собой 3 члена микрофлоры ран: Staphylococcus aureus DSM1104 (АТСС 25923), грамположительные; Escherichia coli DSM8698, грамотрицательные; Pseudomonas aeruginosa DSM1117 (АТСС 27853), грамотрицательные. Все штаммы выращивали в аэробных условиях при 37°С в триптоновом соевом бульоне (Merck KGaA Darmstadt, Germany). Клетки собирали центрифугированием и ресуспендировали в стерильном солевом растворе с фосфатным буфером (PBS) или стерильно PBS с добавкой 10% стерильной лошадиной сыворотки крови (Oxoid) и соответственно 10% человеческой плазмы или 10% человеческой крови (обе полученные в свежем виде у доноров). Конечная OD (оптическая плотность) при 600 нм, 1 см во всех случаях составила 0,03.
Аликвотные количества (190 мкл) бактериальных суспензий помещали в стерильные черные 96-луночные планшеты с прозрачным дном (Costar 3603, Corning Inc., USA). Добавляли 10 мкл трех различных маточных растворов сафранина О для получения конечной концентрации фотосенсибилизатора соответственно 10 мкМ, 100 мкМ и 1 мМ. Планшеты инкубировали в течение 30 мин в темноте при комнатной температуре.
2
2
После инкубации на образцы воздействовали светом от лазера Ceralas G2 (Biotec AG, Germany), 532 нм, питание, установленное на 0,5 Вт, время облучения 85 с через световое волокно со дна планшеты. Скорость текучести для этих установок составила примерно 1,2 Вт/см (измеренная прибором Optometer P-9710, Gigahertz-Optik GmbH, Puchheim, Germany). При этом времени облучения полученная текучесть энергии составила примерно 100 Дж/см.
Контрольные лунки не содержали сафранин О и не подвергались воздействию лазерного света. Контрольные образцы для определения токсичности в темноте подвергались воздействию только сафранина О (конечная концентрация 1 мМ) без освещения.
После освещения образцы удаляли из лунок планшеты, растворяли триптоновым соевым бульоном и высевали на чашки, используя спиральное устройство для посева Eddy Jet (Iul Instruments Barcelona, Spain) на агаровые планшеты триптоновой сои. Количества колониеобразующих единиц (CFU/мл) подсчитывали после адекватной инкубации использованием счетчика колоний Countermat Flash (Iul Instruments, Barcelona, Spain).
Результаты экспериментов показаны на фиг.3, 4 и 5.
Заявители обнаружили выраженный эффект уничтожения бактерий воздействием ФДТ сафранином О в случае суспензий грамположительных клеток Staphylococcus aureus в PBS + 10% человеческая плазма (см. фиг.4). Более того, наблюдалось также достаточное уничтожение клеточных суспензий грамотрицательных клеток Pseudomonas aeruginosa и Escherichia coli в присутствии сыворотки крови или плазмы в обрабатывающих суспензиях (см. соответственно фиг.4 и 5).
Описав предпочтительные варианты осуществления изобретения со ссылкой на сопровождающие чертежи, следует понимать, что изобретение не ограничивается определенными вариантами осуществления, и что в него могут быть внесены различные изменения и модификации без отхода от диапазона и сущности изобретения, как определено прилагаемой формулой изобретения.