Активность in vitro противогрибковых препаратов в отношении дрожжевых грибов - возбудителей оппортунистических микозов

Кулько А.Б., Федорова Н.И.

АКТИВНОСТЬ IN VITRO ПРОТИВОГРИБКОВЫХ ПРЕПАРАТОВ В ОТНОШЕНИИ ДРОЖЖЕВЫХ ГРИБОВ - ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ОППОРТУНИСТИЧЕСКИХ МИКОЗОВ

АКТИВНОСТЬ IN VITRO ПРОТИВОГРИБКОВЫХ ПРЕПАРАТОВ В ОТНОШЕНИИ ДРОЖЖЕВЫХ ГРИБОВ - ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ОППОРТУНИСТИЧЕСКИХ МИКОЗОВ

Кулько А.Б.1, Федорова Н.И.2 УДК: 615.282

1 Московский городской научно-практический центр борьбы с туберкулезом Департамента здравоохранения города Москвы

2 Национальный медико-хирургический Центр им. Н.И. Пирогова, Москва

Резюме

Определены и проанализированы уровни чувствительности к современным противогрибковым препаратам клинических штаммов дрожжевых оппортунистических грибов из родов Candida (5 видов), Cryptococcus (1 вид) и Saccharomyces (1 вид). Проведенное тестирование чувствительности выявило высокую активность препаратов группы эхинокандинов (анидулафунгин, каспофунгин, микафунгин), амфотерицина В и вориконазола в отношении возбудителей кандидоза у ВИЧ-инфицированных пациентов. Установлено, что активность флуконазола и итраконазола в отношении различных видов возбудителей кандидоза имела отличия по диапазонам МПК. Препараты группы эхинокандинов не активны против возбудителя криптококкоза Cryptococcus neoformans.

Ключевые слова: оппортунистические микозы; ВИЧ-инфекция; чувствительность грибов Candida, Cryptococcus, Saccharomyces к противогрибковым препаратам; тест-система «Sensititre».

Введение

К возбудителям вторичных микозов относят условно-патогенные (оппортунистические) виды грибов - распространенные во внешней среде, которые также могут сохраняться и в тканях человека. Развитию инфекционного процесса, вызванного условно-патогенным грибом, обычно предшествует первичная болезнь или снижение иммунного статуса [1, 4]. В последние годы расширился состав вероятных возбудителей оппортунистических микозов, часть из которых первично устойчивы к широко применяющимся в лечении противогрибковым препаратам [5, 6, 10]; разработаны новые препараты с различным спектром действия [1-4]. Вызывающая иммунодефицит ВИЧ-инфекция и СПИД предрасполагают к развитию у пациентов данной группы ряда тяжелых оппортунистических микозов: криптококкоза центральной нервной системы (ЦНС), кандидоза полости рта и глотки, системного и диссеминированного кандидоза и других, менее распространенных грибковых заболеваний [1, 2, 5]. Природную чувствительность возбудителя микоза во многом определяет его родовая и видовая принадлежность [5, 6, 10].

Цель данного исследования - анализ уровней чувствительности к противогрибковым препаратам штаммов дрожжевых грибов, выделенных при диагностике микозов различной локализации у ВИЧ-инфицированных больных туберкулезом в ГКУЗ МНПЦ борьбы с туберкулезом ДЗМ (2013-2014 гг.).

Материалы и методы

Материалом для исследования послужили: - четыре штамма Cryptococcus neoformans - возбудителя

IN VITRO ACTIVITY OF ANTIMYCOTICS AGAINST YEAST FUNGI, WHICH CAUSE OPPORTUNISTIC MYCOSES

Kulko A.B., Fedorova N.I.

We established and analyzed levels of susceptibility to modern antimycotics for clinical strains of yeast opportunistic fungi of the families: Candida (5 species), Cryptococcus (1 species) and Saccharomyces (1 species). Susceptibility testing revealed high activity of echinocandins (anidulafungin, caspofungin, micafungin), amphotericin B and voriconazole against causative agents of candidosis in HIV-infected patients. It was shown that MIC ranges of fluconazole and itraconazole vary for different Candida species. Echinocandins was inactive against causative agents of cryptococcosis Cryptococcus neoformans.

Keywords: opportunistic mycoses; HIV infection; susceptibility of fungi Candida, Cryptococcus, Saccharomyces to antimycotics; the «Sensititre» test system.

криптококкоза ЦНС [диагностический материал - спинномозговая жидкость];

- два штамма Candida glabrata - возбудителя кандиде-мии (диагностический материал - кровь);

- 33 штамма грибов рода Candida [C. albicans (11 штаммов), C. glabrata (9), C. krusei (4), C. rugosa (1), C. tropicalis (8)] и штамм Saccharomyces cerevisiae, выделенные при диагностике грибковых инфекций органов дыхания (диагностические материалы - жидкость бронхоаль-веолярного лаважа, мокрота и мазок из зева).

Определение чувствительности клинических штаммов дрожжевых грибов к противогрибковым препаратам проводили методом микроразведений в бульоне со средой RPMI 1640 с определением минимальных подавляющих концентраций (МПК) в мкг/мл с помощью системы «Sensititre» (колориметрический тест «YeastOne»), TREK Diagnostics Systems. Система «Sensititre» соответствует международному стандарту тестирования чувствительности дрожжевых грибов Института клинических и лабораторных стандартов (CLSI) [7] и включает современные противогрибковые препараты группы азолов (флуконазол, итраконазол, вори-коназол, позаконазол, кетоконазол), группы эхинокандинов (анидулафунгин, каспофунгин, микафунгин), амфотери-цин В и флуцитозин (5-фторцитозин). Для клинической интерпретации результатов определения чувствительности грибов Candida spp. к антимикотикам были использованы пограничные значения МПК, установленные CLSI для стандартного метода M27-A3 [7-9].

Результаты и обсуждение

Полученные данные определения чувствительности клинических штаммов родов Candida, Cryptococcus

Кулько А.Б., Федорова Н.И.

АКТИВНОСТЬ IN VITRO ПРОТИВОГРИБКОВЫХ ПРЕПАРАТОВ В ОТНОШЕНИИ ДРОЖЖЕВЫХ ГРИБОВ - ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ОППОРТУНИСТИЧЕСКИХ МИКОЗОВ

и Saccharomyces к противогрибковым препаратам представлены в таблицах 1-3.

Высокая фунгицидная активность в отношении штаммов грибов рода Candida была характерна для всех трех препаратов группы эхинокандинов - аниду-лафунгина, каспофунгина и микафунгина (табл. 1). Все штаммы четырех видов Candida с установленными пограничными значениями МПК препаратов (C. albicans, C. glabrata, C. krusei, C. tropicalis) были определены как чувствительные к анидулафунгину, каспофунгину и микафунгину.

В сравнении с эхинокандинами, активность азоль-ных препаратов против штаммов Candida spp. была, в целом, ниже (табл. 2, 3).

Наибольшей активностью в отношении клинических штаммов рода Candida обладал вориконазол (относительно высокое значение МПК вориконазола равное 4 мкг/мл было выявлено только у одного штамма C. glabrata, выделенного из крови).

Отметим, что устойчивые к флуконазолу штаммы были выделены не только среди видов с пониженной и вариативной чувствительностью к данному препарату (C. glabrata, C. krusei, C. tropicalis), но и у двух из 11 про-

Табл. 1. Активность препаратов группы эхинокандинов, амфотерицина В и флу-цитозина в отношении клинических штаммов грибов родов Candida, Cryptococcus и Saccharomyces

Вид Препарат, диапазон МПК

AND CAS MF AB 5FC

C. albicans 0,03-0,12 0,03-0,06 <0,008-0,03 0,12-0,5 <0,03-0,12

C. glabrata <0,015-0,03 0,06-0,12 <0,008-0,015 0,25-0,5 <0,03

C. krusei 0,03 0,06-0,25 0,12 0,12-0,5 2-8

C. rugosa 0,06 0,06 0,03 0,5 0,06

C. tropicalis 0,03-0,12 0,015-0,12 0,015-0,03 0,25-0,5 <0,03->64

Cr. neoformans >8 16 >8 0,25-1 2-8

S. cerevisiae 0,12 0,25 0,06 0,5 0,06

Примечание: AND - анидулафунгин, CAS - каспофунгин, MF - микафунгин, AB - ам-фотерицин В, 5-FC - флуцитозин; МПК - минимальная подавляющая концентрация (в мкг/мл).

Табл. 2. Активность препаратов группы азолов в отношении клинических штаммов грибов родов Candida, Cryptococcus и Saccharomyces

Вид Препарат, диапазон МПК

FZ IZ VOR PZ KZ

C. albicans 0,25-128 0,03-0,25 <0,008-0,25 <0,008-0,12 <0,008-0,03

C. glabrata 8-128 0,5->16 0,25-4 1->8 0,5-4

C. krusei 32-64 0,12-0,25 0,06-0,25 0,12-0,25 0,12-0,25

C. rugosa 8 0,12 0,06 1 0,06

C. tropicalis 1-32 0,03-0,5 0,015-0,5 0,015-1 <0,008-0,5

Cr. neoformans 2-16 0,03-0,06 0,015-0,06 0,03-0,25 0,015-0,06

S. cerevisiae 8 0,25 0,06 0,5 0,015

Примечание: FZ - флуконазол, IZ - итраконазол, VOR - вориконазол, PZ - позакона-зол, KZ - кетоконазол; МПК - минимальная подавляющая концентрация (в мкг/мл).

тестированных штаммов C. albicans (18%). Согласно современным подходам к интерпретации лабораторных данных, все обнаруженные штаммы гриба C. krusei обозначаются как устойчивые к препарату флуконазол без интерпретации значения МПК (вид C. krusei обладает природной устойчивостью к флуконазолу) [9].

Устойчивые к итраконазолу штаммы были обнаружены только у вида C. glabrata - возбудителя, с характерно низкой природной чувствительностью к препаратам группы азолов. Обращает на себя внимание высокий уровень дозозависимых к итраконазолу штаммов C. glabrata, C. krusei и C. tropicalis (табл. 3).

Установленные крайне высокие значения МПК ани-дулафунгина (>8 мкг/мл), каспофунгина (16 мкг/мл) и микафунгина (>8 мкг/мл) против штаммов Cr. neoformans подтверждают имеющиеся в литературе сведения об исходной устойчивости гриба к эхинокандинам [1, 2, 10]. Природную устойчивость главного возбудителя криптококкоза к эхинокандинам определяет наличие у Cr. neoformans мукополисахаридной капсулы и низкое содержание 1,3-Р^-глюкана в клеточной стенке [1, 2]. Отметим, что инкапсулированный гриб Cryptococcus neoformans способен вызывать тяжелые и диссемини-рованные формы криптококкоза у больных с клеточным иммунодефицитом, причем на фоне СПИД наиболее распространенной формой криптококкоза является криптококкоз центральной нервной системы [1, 2, 5].

Клинические пограничные значения МПК триазольных препаратов для вида Cr. neoformans и S. cerevisiae не определены. Отметим низкие значения МПК ворикона-зола (от 0,015 до 0,06 мкг/мл) и итраконазола (от 0,03 до 0,06 мкг/мл) против штаммов Cryptococcus neoformans, не предполагающие наличие устойчивости in vitro к данным препаратам, а также относительно высокую активность флуконазола с МПК 2, 4, 4 и 16 мкг/мл. Вместе с тем, одно из четырех установленных значений МПК флуконазола равное 16 мкг/мл следует расценивать как относительно высокое.

Среди протестированных клинических штаммов родов Candida, Cryptococcus и Saccharomyces не было выявлено ни одного штамма, вероятно устойчивого к препарату амфотерицин B. Активность флуцитозина была также высока - обнаружен единственный штамм C. tropicalis, устойчивый к флу-цитозину с МПК >64 мкг/мл.

Клинические пограничные значения МПК антимикотиков для вида S. cerevisiae не определены, однако высоких значений МПК, предполагающих наличие устойчивости in vitro у протестированного штамма выявлено не было.

Кулько А.Б., Федорова Н.И.

АКТИВНОСТЬ IN VITRO ПРОТИВОГРИБКОВЫХ ПРЕПАРАТОВ В ОТНОШЕНИИ ДРОЖЖЕВЫХ ГРИБОВ - ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ОППОРТУНИСТИЧЕСКИХ МИКОЗОВ

Табл. 3. Интерпретация показателей минимальных подавляющих концентраций флуконазола, итраконазола и вориконазола в отношении клинических штаммов грибов рода Candida (тест-система «Sensititre» YeastOne) *

Вид

Препарат, пограничные значения МПК, интерпретация n,

n FZ IZ VOR

S SDD R S SDD R S SDD R

C. albicans <2 4 >8 <0,125 0.25-0.5 >1 <0.125 0.25-0.5 >1

11 9

C. glabrata - <32 >64 <0,125 0.25-0.5 >1 _ _ _

11 - 9 (81,8) 2 (18,2) 0 (0,0) 7 (63,6) 4 (36,4) _ _ _

C. krusei _i _i <0,125 0.25-0.5 >1 <0.5 1 >2

4 - _ 4

C. rugosa _ _ _ <0,125 0.25-0.5 >1 _ _ _

1 _ _ _ 1 (100) 0 (0,0) 0 (0,0) _ _ _

C. tropicalis <2 4 >8 <0,125 0.25-0.5 >1 <0.125 0.25-0.5 >1

8 4

Примечание: FZ - флуконазол, IZ - итраконазол, VOR - вориконазол; n - число протестированных штаммов; МПК - минимальная подавляющая концентрация (в мкг/мл); S - чувствительные к препарату штаммы, SDD - чувствительные-дозозависимые штаммы, R - устойчивые штаммы. 1 - штаммы C. krusei обозначаются как устойчивые к флуконазолу без интерпретации значения МПК [9]. * - критерии интерпретации CLSI документов M27-S3 и M27-S4 [8, 9].

Заключение

Проведенное исследование выявило высокий уровень фунгицидной активности анидулафунгина, каспофунгина и микафунгина в отношении штаммов различных болезнетворных видов грибов рода Candida, что предполагает использование эхинокандинов для эмпирической терапии системных и диссеминированных форм кандидоза, в том числе у ВИЧ-инфицированных пациентов.

С учетом вариабельной активности флуконазола и итраконазола в отношении клинических штаммов Candida spp., в алгоритм лабораторной диагностики глубокого кандидоза следует включать определение лекарственной чувствительности штаммов Candida spp. стандартизованным методом, позволяющим проводить клиническую интерпретацию получаемых результатов in vitro.

Возбудитель криптококкоза гриб Cr. neoformans обладает природной устойчивостью к препаратам группы эхинокандинов, что подтвердили полученные результаты исследования чувствительности четырех штаммов-возбудителей криптококкоза ЦНС. Системные противогрибковые препараты вориконазол и амфотерицин В возможно использовать для терапии криптококкоза без определения лекарственной чувствительности возбудителя к антимикотикам, а в случае применения флуконазола целесообразно определять у возбудителя чувствительность in vitro.

Литература

1. Атлас грибковых заболеваний. Под ред. К.А. Кауфман, Д.Л. Манделла (Kauffm-ann C.A., Mandell G.L.). Пер. с англ. под ред. Ю.В. Сергеева. - М.: ГЭОТАР-Ме-диа. - 2010. - 240 с.

2. Диагностика и лечение микозов. Под ред. Д. Р. Хоспентала, М. Дж. Риналди (D.R. Hospenthal, M.G. Rinaldi.) Пер. с англ. под ред. Ю.В.Сергеева. - М.: ГЭО-ТАР-Медиа. - 2013. - 448 с.

3. Климко Н.Н. Микозы: диагностика и лечение. Руководство для врачей. 2-е изд. перераб. и доп. - М.: Ви Джи Групп, 2008. - 336 с.

4. Кулько А.Б. Спектр возбудителей глубоких микозов человека // Онкогематоло-гия. - 2012. - № 3. - С. 55-61.

5. Сергеев А.Ю., Сергеев Ю.В. Грибковые инфекции. Руководство для врачей. - М.: Изд-во Бином, 2008. - 480 с.

6. Саттон Д., Фотергилл А., Ринальди М. (Sutton D., Fothergill A., Rinaldi M.) Определитель патогенных и условно патогенных грибов: Пер. с англ. - М.: Издательство Мир. - 2001. - 468 с.

7. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts: approved standard - Third edition. CLSI document M27-A3, 2008. - 30 p.

8. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts; Third Informational Supplement. CLSI document M27-S3. CLSI: Wayne, PA., 2008.

9. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts; Fourth Informational Supplement. CLSI document M27-S4. CLSI: Wayne, PA., 2012. - 30 p.

10. Hoog de G.S., Guarro J., Gene J., Figueras M.J. Atlas of clinical fungi. Electronic Version 3.1 - CBS: Reus, 2011.

КОНТАКТНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Кулько Александр Борисович e-mail: kulko-fungi@yandex.ru