ДОПОЛНЕННЫЕ МАТРИКСЫ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ПЕРЕЛОМОВ КОСТЕЙ
COMPLEMENTED MATRIXES FOR TREATING BONE FRACTURES

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящая заявка относится к дополненным матриксам и их применению для консолидации и заживления переломов костей.
Уровень техники
По статистике, ежегодно у 5-6 миллионов людей в Европе и Соединенных Штатах Америки происходят переломы костей из-за различных травм, в том числе связанных со спортивной или другой физической активностью, а также с остеопорозом. Для лечения большинства этих повреждений достаточно ручной репозиции и внешней иммобилизации (например, с помощью гипсовой повязки). Однако примерно 20-25% переломов требуют оперативного вмешательства в условиях стационара.
Перелом - это, по определению, нарушение целостности наружного компактного слоя кости, обычно в результате внешнего механического воздействия. Полный перелом - это такое нарушение целостности, когда разлом проходит сквозь всю структуру кости с образованием двух или более отдельных костных отломков. Костные фрагменты не обязательно должны быть разделены пространственно, чтобы травма считалась переломом. В некоторых случаях надкостница удерживает фрагменты кости в изначальном, анатомически нормальном положении. В других случаях конечность сгибается в месте перелома, и отломки разрывают надкостницу, а иногда даже и окружающие мышцы и кожу. При пулевых или осколочных ранениях и при травмах в результате серьезных аварий большие части кости иногда бывают раздроблены или значительно смещены. Основные цели лечения переломов - прочное сращение и восстановление функции кости без деформации. Скорейшее достижение этих целей тем более важно, что оно связано с проблемами инвалидности и стоимости лечения. Между тем достижение обеих целей - и прочного сращения кости, и восстановления функции - проблематично у значительной части пациентов из-за преклонного возраста, плохого общего состояния здоровья, типа и локализации перелома. В частности, при остеопорозе консолидация перелома, скорее всего, будет долгой, при этом велик риск несращения перелома. Для остеопороза, являющегося заболеванием всего скелета, характерны снижение костной массы и структурные нарушения костной ткани, что приводит к повышенной ломкости костей и увеличению длительности консолидации и вероятности несращения.
Костные трансплантаты и их заменители широко используются для различных ортопедических манипуляций при разрушении костей, медленном сращении или несращении переломов, а также в качестве имплантируемого материала для фиксации отломков. При тяжелых или осложненных переломах костные трансплантаты и их заменители используются для того, чтобы укрепить кость перед тем, как окончательно ее стабилизировать шиной или гипсовой повязкой. Трансплантационный материал может быть аутогенным аллогенным, или ксеногенным; могут использоваться деминерализованный костный матрикс (ДКМ), синтетические материалы, а также смеси всех этих материалов. Костные трансплантационные материалы можно разделить на остеокондуктивные, остеоиндуктивные и остеогенные. Остеокондуктивные материалы сами не образуют кость; вместо этого они стимулируют миграцию близлежащих живых костных клеток внутрь трансплантационного материала. Остеоиндуктивные материалы стимулируют формирование костной ткани организмом пациента. Остеогенные материалы состоят только из остеобластов и мезенхимных стволовых клеток, которые генерируют костную ткань. Некоторые материалы сочетают в себе названные выше свойства.
Аутотрансплантатом называется любая ткань или кость, взятая из организма самого пациента для использования в качестве трансплантата в месте повреждения. Чаще всего костные трансплантаты получают из подвздошного гребня. Хотя у аутотрансплантатов много преимуществ: они биосовместимы, безопасны, содержат сосудистую сеть и обладают остеоиндуктивными свойствами, - у них есть и серьезные недостатки. Чтобы получить аутотрансплантат, нужна еще одна хирургическая операция, а значит, возможны и послеоперационные осложнения: кровопотеря, инфицирование, болевой синдром. Применять аутотрансплантаты дорого из-за более длительной госпитализации и дополнительных операций. Объем аутотрансплантата для каждого данного пациента ограничен, а боли после операции по забору трансплантационного материала часто сильнее, чем боль, вызванная самим переломом. Несмотря на эти недостатки, аутотрансплантат считается "золотым стандартом" костного трансплантационного материала. Аллотрансплантат - это трупный костный материал, участок ткани, полученный из той или иной кости, которому можно затем искусственно придать желаемую структуру и форму. Аллотрансплантаты лишь в минимальной степени остеоиндуктивны, количество их ограничено, а пациенты подвергаются риску инфицирования донорскими патогенами. Существуют синтетические заменители -"стандартные", "серийные" искусственные трансплантаты, разрабатываемые как альтернатива аутогенному костному материалу. В качестве синтетических заменителей костного материала для трансплантации применяют различные виды керамики и самоотверждаемые полимеры, имитирующие свойства человеческой кости, например гидроксиапатит, полиметилметакрилат, коллаген, трикальцийфосфат и другие фосфаты кальция, сульфаты кальция. Эти материалы плохо поддаются обработке и лишены остеоиндуктивных свойств.
В последние годы большое внимание уделялось разработке заменителей костного материала с остеоиндуктивными свойствами, которые были бы полноценной "стандартной" альтернативой аутотрансплантатам. ДКМ - один из примеров остеоиндуктивного заменителя костного трансплантата. Однако ДКМ, будучи аллогенным материалом, имеет те же недостатки, что любая аллогенная кость. Другие примеры - OP-1 (Stryker Corp.), который выделяет рекомбинантный костный морфогенетический белок 7 (BMP7) из коллагенового матрикса, и заменитель костного трансплантата INFUSE (Medtronic Sofamor Danek), в котором рекомбинантный белок BMP2 содержится в коллагеновой губке. Помимо того, что получение костных морфогенетических белков дорого и требует больших затрат времени, оба материала выделяют белки из коллагенового матрикса в слишком высоких концентрациях. Коллагеновые матриксы, получаемые из тканей крупного рогатого скота, имеют все недостатки, связанные с риском использования ксеногенного материала, и плохо поддаются обработке, необходимой для хирургических манипуляций с ними (в частности, их трудно подогнать по форме к поврежденному участку кости), а высокие концентрации попадающих в организм пациента костных морфогенетических белков могут иногда привести к кальцификации органов или образованию костей в других частях тела.
in situ
В других видах матрикса, применяемого для местного лечения костных дефектов, используется паратиреоидный гормон (ПТГ) человека или его производные в составе фибриновых пломбировочных композиций, образующихся  из инъецируемых компонентов. Паратиреоидный гормон - это пептид, состоящий из 84 аминокислотных остатков, синтезируемый и секретируемый паращитовидными железами. Полноразмерный гормон регулирует уровень кальция в крови и обновление костной ткани. Он является мощным анаболическим фактором прямого действия по отношению к предшественникам остеобластов и анаболическим фактором непрямого действия по отношению к остеокластам. Регулируя баланс остеобластов и остеокластов, ПТГ тем самым непосредственно воздействует на обновление костного материала и последующее высвобождение кальция в кровоток. Результаты многих исследований на животных говорят о том, что ПТГ может оказывать анаболическое действие в отношении плотности костного вещества (ПКВ). Действие ПТГ на клетки опосредовано его связыванием с поверхностными рецепторами. Эти рецепторы обнаружены на остеобластах - клетках, ответственных за образование новой кости.
1-34
1-34
1-34
1-34
Есть данные о том, что N-концевой домен ПТГ человека, состоящий из 34 аминокислотных остатков, биологически эквивалентен полноразмерному гормону. Первые данные о ПТГ и его действии появились в патенте США № 4086196. Известно, что ПТГ - полностью биологически активный вариант ПТГ с усеченной аминокислотной последовательностью, лишенный дисульфидных связей и выраженной третичной структуры. У него прослеживается умеренно выраженная вторичная структура, в том числе несколько альфа-спиралей. В многочисленных клинических исследованиях больные остеопорозом получали курс ПТГ для увеличения общей костной массы. В большинстве случаев ПТГ или ПТГ требовалось вводить - в чистом виде или в сочетании с другими биологически активными веществами - ежедневно в течение многих месяцев. Более подробно ПТГ и ПТГ описаны в международной заявке WO 03/052091, содержание которой включено в настоящее описание в виде ссылки. Другие усеченные варианты: 1-25, 1-31 и 1-38 - также обладают биологической активностью ПТГ.
В то время как системное действие ПТГ исследовали достаточно интенсивно, его местный эффект оставался почти без внимания. В международной заявке WO 03/052091 описаны матриксы для местного введения ПТГ. Гормон, ковалентно связанный с синтетическим или натуральным матриксом (в частности, фибриновым или полиэтиленгликолевым), высвобождается точно в заданном месте, причем этот процесс контролируется.
Однако в международной заявке WO 03/052091 нет описания матриксов, которые можно было бы применить для консолидации переломов костей, особенно тяжелых переломов, с высоким риском замедленного сращения или несращения.
Поэтому цель настоящего изобретения - создать матрикс, применимый для местного лечения переломов костей.
Сущность изобретения
Неожиданно было обнаружено, что матрикс, содержащий ПТГ (далее "дополненный матрикс"), можно применять для местного введения ПТГ в месте перелома для консолидации и заживления последнего.
Таким образом, настоящее изобретение связано с композицией следующего состава:
а) пептид, выбранный из группы, включающей в себя ПТГ и пептид слияния ПТГ;
б) гранулярный материал, представляющий собой кальцийсодержащее минеральное вещество;
в) композиция, способная образовывать фибриновый матрикс в физиологических условиях, содержащая компонент-предшественник фибриногена и компонент-предшественник тромбина и где ПТГ или пептид слияния ПТГ присутствуют в диапазоне концентраций от 0,01 до 2 мг/мл фибринового матрикса или компонентов-предшественников, образующих матрикс, при условии, что концентрация 0,4 мг/мл фибринового матрикса или компонентов-предшественников, образующих матрикс, не включена в указанный интервал значений.
Настоящее изобретение связано также с дополненным матриксом следующего состава:
а) ПТГ или пептид слияния ПТГ;
б) гранулярный материал, представляющий собой кальцийсодержащее минеральное вещество;
в) фибрин,
в который включен вышеупомянутый ПТГ или пептид слияния ПТГ в диапазоне концентраций от 0,01 до 2 мг/мл фибринового матрикса, при условии, что концентрация 0,4 мг/мл фибринового матрикса не включена в указанный интервал значений.
В настоящем изобретении вышеупомянутые композиция и дополненный матрикс применяются для изготовления лекарственного средства, предназначенного для местного введения при лечении переломов костей.
1-84
1-38
1-34
1-31
1-25
1-34
В предпочтительном варианте осуществления паратиреоидный гормон встраивается в матрикс таким образом, чтобы он мог оттуда высвобождаться, и дополненный матрикс наносится на место перелома либо непосредственно там образуется. В предпочтительных вариантах ПТГ ковалентно связан с матриксом. В одном из вариантов матрикс является фибриновым матриксом. В качестве паратиреоидного гормона может применяться ПТГ (нативный гормон), ПТГ, ПТГ, ПТГ, ПТГ или же любой модифицированный или аллельный вариант ПТГ, проявляющий те же свойства, что и вышеупомянутые пептиды, т.е. так же стимулирующий остеогенез (далее "ПТГ"). Предпочтительным типом ПТГ является ПТГ. В предпочтительном варианте в качестве ПТГ используется пептид слияния (далее "пептид слияния ПТГ"), содержащий по меньшей мере два домена, где первый домен содержит ПТГ, а второй домен содержит субстратный домен, способный к образованию ковалентных поперечных сшивок с матриксом во время или после его образования.
В одном из вариантов дополненный фибриновый матрикс образуется из композиции, содержащей а) гранулярный материал, б) композицию, содержащую фибриноген и тромбин, из которой может образовываться фибриновый матрикс, и в) ПТГ в диапазоне концентраций от 0,01 до 2 мг/мл фибринового матрикса, что является оптимальным для сращения и консолидации переломов костей, при условии, что концентрация 0,4 мг/мл фибринового матрикса не включена в указанный интервал значений.
Предложен набор, содержащий упомянутую композицию, где по меньшей мере один из компонентов, образующих матрикс, хранится отдельно от других формирующих матрикс компонентов.
Композиции и дополненные матриксы предпочтительно применяются для сращения и консолидации переломов костей, особенно при повышенном риске замедленного сращения или несращения. Предпочтительные показания для их применения включают в себя переломы запястья (дистальные переломы лучевой кости), длинных костей, таких как большеберцовая, и бедра.
Краткое описание чертежей
1-34
1-34
Биологическая активность вариантов ПТГ показана на Фиг. 1. Клетки, трансфицированные репортерным геном, сцепленным с промотором гена рецептора ПТГ, обрабатывали одинаковым количеством ПТГ, ТГ-pl-ПТГ (описан ниже) или ПТГ, содержащим 84 аминокислотных остатка, который соответствует международному стандарту ПТГ. Измеряли ингибирование экспрессии репортерного гена люциферазы и сравнивали его степень со степенью ингибирования в трансфицированных клетках, находящихся в среде без ПТГ (контроль).
Результаты измерения высвобождения ПТГ из фибринового матрикса показаны на Фиг. 2.
На Фиг. 3 показаны результаты теста на стабильность у подопытных животных с сегментарными дефектами большеберцовой кости при лечении с помощью дополненного матрикса, представленные как степень консолидации перелома (в баллах).
На Фиг. 4 показаны результаты теста на стабильность у подопытных животных с сегментарными дефектами большеберцовой кости при лечении с помощью дополненного матрикса, представленные как процент животных, у которых суставы остаются нестабильными.
Подробное описание изобретения
in vitro,
in vivo,
Ниже описаны дополненные матриксы, содержащие встроенный ПТГ, способный высвобождаться из них, и, необязательно, гранулярное вещество. ПТГ встраивается посредством либо ковалентного связывания с матриксом, либо нековалентного взаимодействия с матриксом и/или гранулами. Эти дополненные матриксы сокращают время заживления по сравнению со способами, в которых применяют аутотрансплантаты, или стимулируют консолидацию переломов костей, которые иначе не могли бы консолидироваться. Матриксы биосовместимы и биоразлагаемы и могут формироваться как  так и  в процессе имплантации. ПТГ можно включить в матрикс при полном сохранении его биологической активности. ПТГ может быть включен таким образом, чтобы он высвобождался из матрикса. Для этого применяются методы, позволяющие регулировать способ, время и степень высвобождения ПТГ, с использованием матрикса в качестве носителя с регулируемым высвобождением ПТГ для консолидации переломов костей.
Определения
"Сайт адгезии или сайт прикрепления клеток"
означает здесь пептидную последовательность, с которой связывается молекула, например, рецептор прикрепления на поверхности клетки. Неограничивающими примерами сайтов адгезии являются последовательности RGD из фибронектина и YIGSR (SEQ ID NO. 1) из ламинина. Адгезивные сайты могут необязательно встраиваться в матрикс путем включения субстратного домена, образующего поперечные сшивки с фибриновым матриксом.
"Биологическая активность"
означает здесь функциональные процессы, в которых участвует рассматриваемый белок. В некоторых вариантах осуществления это процессы, количественно оцениваемые по интенсивности взаимодействия одного полипептида с другим. Сюда также входит оценка влияния рассматриваемого белка на рост, дифференцировку, гибель, миграцию и прикрепление клеток, взаимодействие с другими белками, ферментативную активность, фосфорилирование и дефосфорилирование белков, транскрипцию или трансляцию.
"Перелом кости"
означает здесь нарушение целостности или разлом по всей структуре кости, в результате которого образуется два или более отдельных отломков.
"Кальцийсодержащее минеральное вещество"
5
4
3
означает здесь гомогенные вещества природного происхождения, содержащие ионы кальция. Пример кальцийсодержащего минерального вещества - гидроксиапатит (Са[(ОН)(РO)]) - основной компонент зубов и костей.
"Поперечное связывание"
означает здесь образование ковалентных сшивок.
"Замедленное сращение"
означает здесь ситуацию, когда перелом не консолидировался в течение 3-4 месяцев - времени, считающегося достаточным для нормальной консолидации перелома. При этом подразумевается, что, хотя и медленно, кость в конце концов срастется без какого-либо дополнительного вмешательства, хирургического или нехирургического. Однако в отдаленные сроки замедленное сращение может иногда перейти в несращение.
"Фибриновый матрикс"
означает здесь продукт формирования поперечных сшивок между большей частью молекул предшественников - фибриногена и тромбина - в присутствии источника кальция и фактора XIIIa, с образованием трехмерной сети.
"Матрикс"
означает здесь материал, предназначенный для связывания с биологическими системами с целью лечения, усиления или замещения ткани или функции ткани постоянно или временно, в зависимости от природы материала. Матрикс может служить устройством для локального введения включенного в него ПТГ и/или каркасом для врастания в него клеток. Описанные здесь матриксы образуются из жидких компонентов-предшественников, которые способны сформировать подобие каркаса в требуемом месте внутри организма. Термины "матрикс", "гель" и "биоматериалы" используются здесь как синонимы. Термины "матрикс" и "гель" означают композиции, образующиеся при смешивании предшественников. Таким образом, термины "матрикс" и "гель" охватывают все полимерные сети, частично или полностью скрепленные поперечными сшивками. Они могут быть жидкими, полужидкими (в виде пасты) или твердыми. В зависимости от типа предшественников, матрикс может набухать в воде, но не растворяться в ней, т.е. может образовывать гидрогель, который сохраняется в организме в течение какого-то времени.
"Компоненты-предшественники или полимеры природного происхождения"
относятся здесь к веществам, встречающимся в природных условиях.
"Несращение"
относится здесь к ситуации, когда в течение 3-6 месяцев с момента травмы (в зависимости от типа и локализации перелома кости) ежемесячное рентгеновское исследование не обнаруживает никаких признаков консолидации перелома.
"ПТГ"
1-84
1-38
1-34
1-31
1-25
1-34
означает здесь ПТГ человека, а также все усеченные, модифицированные и аллельные варианты ПТГ, стимулирующие остеогенез, в частности, будучи включенными в фибриновый матрикс (в предпочтительном варианте осуществления - путем ковалентного связывания). Предпочтительные варианты ПТГ с усеченной аминокислотной последовательностью - ПТГ, ПТГ, ПТГ и ПТГ. Наиболее предпочтительный вариант - ПТГ. В предпочтительном варианте осуществления применяется ПТГ человека, хотя можно, вероятно, применять ПТГ и из других источников, например крупного рогатого скота.
"Пептид слияния ПТГ"
1-34
означает здесь пептид, содержащий по крайней мере первый и второй домены. Один домен содержит ПТГ, предпочтительно ПТГ, а другой - субстратный домен, способный к образованию поперечных ковалентных сшивок с матриксом во время или после его образования. Между первым и вторым доменами может также располагаться сайт ферментативной или гидролитической деградации.
"Надкостница"
означает здесь внешний слой кости, образующий плотный волокнистый слой, покрывающий всю кость, за исключением участков, участвующих в формировании сустава; он содержит сосудистую сеть и питает внешние слои костной ткани.
"Физиологический"
здесь относится к условиям, существующим в организме позвоночных. В частности, физиологическими условиями называют такие характеристики организма человека как температуру и pH. Физиологическими температурами в данном случае называют диапазон температур от 35 до 42°C, главным образом, в районе 37°C.
"Заживление и консолидация переломов костей"
означает здесь воссоединение концов костных отломков и восстановление структуры кости.
"Дополненные матриксы"
или биоматериалы означают здесь матрикс с включенным в него ПТГ.
I. Дополненные матриксы
А. Материал матрикса
Чтобы ткань восстановилась или регенерировала, на раневую поверхность должны мигрировать клетки, которые затем вырабатывают компоненты внеклеточного матрикса (формируют матрикс), с последующим формированием окончательной структуры ткани. Часто в этой морфогенетической реакции должно участвовать много различных клеточных популяций, нередко при участии сосудистых и нервных клеток. Показано, что матрикс при этом значительно увеличивается в размере и что в некоторых случаях он необходим для осуществления реакции.
Делались попытки разработать матриксы из синтетических или природных материалов или из смеси тех и других. Было обнаружено, что фибриновый матрикс, описанный в международной заявке WO 03/052091, можно применять при лечении переломов костей.
Матрикс формируется в результате поперечных сшивок - ионных, ковалентных, либо тех и других - между молекулами предшественников и/или набухании одного или нескольких полимерных материалов (матриксов) с образованием полимерных сетей, внутри которых остается достаточно пространства для прорастания или миграции в него клеток. В одном из вариантов осуществления матрикс формируют белки, предпочтительно белки, в норме присутствующие в организме пациента, которому имплантирован матрикс. Наиболее предпочтительный белок для матрикса - фибрин, хотя можно применять и матриксы, построенные из других белков, например коллагена и желатина. Для формирования матрикса можно также применять полисахариды и гликопротеиды.
Фибриновые матриксы
et al.
Фибрин - природный материал, применяемый для различных целей в медицине и биологических исследованиях. Матриксы, построенные из фибрина, описаны в качестве субстрата для прорастания клеток в патенте США № 6331422, выданном Hubbell  Фибрин применяется в качестве пломбировочного материала благодаря его способности связываться со многими тканями и его роли в естественном заживлении ран. Он также применяется в качестве пломбировочного материала для прикрепления трансплантатов сосудов и сердечных клапанов. Кроме того, фибриновые матриксы применяются как устройства точечного введения лекарственных средств и для регенерации нервной ткани. Фибриновый матрикс применяется как механическая основа для регенерации тканей и врастания клеток, но лишь немногие аминокислотные последовательности в его мономере непосредственно стимулируют эти процессы.
Процесс полимеризации фибриногена с образованием фибрина также подробно охарактеризован. Сначала протеаза расщепляет димерную молекулу фибриногена по двум симметричным сайтам. Существует несколько протеаз, способных расщеплять фибриноген: тромбин, пептидаза, протеаза III, - и каждая из них разрезает белковую молекулу по своему сайту. После расщепления фибриногена начинается стадия автополимеризации, на которой мономеры фибрина собираются вместе и образуют полимерный гель с нековалентными поперечными сшивками. Самосборка становится возможной, когда расщепление протеазой открывает доступ к сайтам связывания. Когда сайты связывания в середине молекулы раскрываются, они могут связываться с другими сайтами на концах пептидных цепей фибриногена. Таким образом формируется полимерная сеть. Фактор XIIIa - трансглутаминаза, активируемая при протеолизе фактора XIII тромбином - может затем образовывать ковалентные поперечные сшивки в полимерной сети. Существуют другие трансглутаминазы, возможно, также участвующие в формировании ковалентных поперечных связей и трансплантации в фибриновую сеть.
2
2
Когда фибриновый матрикс с поперечными сшивками уже сформирован, последующая деградация жестко контролируется. Одна из ключевых молекул, контролирующих деградацию фибрина, - ингибитор α-плазмина. Его эффект опосредован поперечной сшивкой с α-цепью фибрина при воздействии фактора XIIIa. За счет прикрепления ингибитора к матриксу он может накапливаться в матриксе в больших концентрациях. Тогда ингибитор препятствует связыванию плазминогена с фибрином и инактивирует плазмин. Ингибитор α-плазмина содержит субстрат - остаток глутамина. Точная аминокислотная последовательность идентифицирована как NQEQVSPL (SEQ ID NO. 2), и первый глутамин в ней служит активным аминокислотным остатком для поперечных сшивок.
in vitro.
Показано, что двухдоменные пептиды, которые содержат последовательность субстрата фактора XIIIa и биологически активную пептидную последовательность, могут встраиваться внутрь фибринового матрикса посредством поперечных сшивок и что этот биологически активный пептид сохраняет свою активность
2
2
Концентрация тромбина может варьироваться в зависимости от медицинских показаний и веществ, добавляемых в фибриновый матрикс. В одном из предпочтительных вариантов осуществления фибриновый матрикс содержит фибриноген в концентрациях от 5 до 65 мг/мл матрикса, предпочтительно - 15-60 мг/мл матрикса, а в наиболее предпочтительном варианте - 30-45 мг/мл фибринового матрикса. Концентрация тромбина находится в диапазоне от 0,5 до 5 МЕд/мл фибринового матрикса, предпочтительно - 1,25-3,25 МЕд/мл матрикса, а в наиболее предпочтительном варианте - 1,5-2 МЕд/мл фибринового матрикса. Кроме того, источник ионов кальция также помогает формировать фибриновый матрикс. Предпочтительный источник ионов кальция - CaCl · 2HO в диапазоне концентраций от 0,5 до 5 мг/мл фибринового матрикса; более предпочтительный диапазон концентраций - 2-3,5 мг/мл матрикса, а наиболее предпочтительный - 2,5-3 мг/мл фибринового матрикса. В этой композиции не учитывается вода, которой смачиваются любые добавляемые в фибриновый матрикс гранулы, эта вода остается в порах гранул в течение всего времени формирования матрикса, и поэтому не участвует в разбавлении и не влияет на концентрации фибриногена и тромбина в фибриновом матриксе. МЕд означает международную единицу (МЕд) тромбина и, по определению, составляет 0,0853 мг тромбина, соответствующего Первому международному стандарту тромбина человека.
Компоненты-предшественники фибриновых матриксов
2
2
В предпочтительном варианте осуществления фибриновый матрикс образуется из двух компонентов-предшественников, которые могут применяться в виде растворов. Первый компонент, который, как правило, является раствором, содержит фибриноген в диапазоне концентраций предпочтительно от 10 до 130 мг/мл раствора предшественника (более предпочтительный диапазон концентраций - 50-110 мг/мл раствора, наиболее предпочтительный - 60-90 мг/мл раствора предшественника). Если для образования матрикса нужно добавить тромбин, добавляется второй компонент-предшественник, тоже, как правило, в виде раствора. Этот раствор содержит тромбин в диапазоне концентраций, предпочтительно, от 1 до 10 МЕд/мл раствора предшественника (более предпочтительный диапазон концентраций - 2,5-6,5 МЕд/мл раствора, наиболее предпочтительный - 3-5 МЕд/мл раствора предшественника). Кроме того, один из растворов предшественников содержит источник ионов кальция. Предпочтительный источник ионов кальция - CaCl · 2HO в диапазоне концентраций от 1 до 10 мг/мл раствора предшественника; более предпочтительный диапазон концентраций - 4-7 мг/мл раствора, а наиболее предпочтительный - 5-6 мг/мл раствора предшественника. Необязательно, добавляется еще фермент, катализирующий образование матрикса, например, фактор XIIIa. Его предпочтительная концентрация - от 0,5 до 100 МЕд/мл раствора предшественника; более предпочтительный диапазон концентраций - 1-60 МЕд/мл раствора, а наиболее предпочтительный - 1-10 МЕд/мл раствора предшественника.
Б. Сайты прикрепления клеток
in vivo
in vitro,
Взаимодействие клеток с окружающей средой опосредовано взаимодействиями белков с белками, белков с олигосахаридами или белков с полисахаридами на поверхности клеток. Биологически активные сигналы, получаемые клеткой, связываются белками внеклеточного матрикса. Эта плотная сеть необходима для поддержания жизнедеятельности клеток; известно, что многие белки матрикса регулируют прикрепление, распластывание, миграцию и дифференцировку клеток. Среди наиболее активных белков - ламинин, витронектин, фибронектин, фибрин, фибриноген и коллаген. Ламинин был предметом многочисленных исследований, показавших, что он играет решающую роль в развитии и регенерации нервов  и нервных клеток  а также в ангиогенезе. Идентифицированы отдельные аминокислотные последовательности, которые непосредственно взаимодействуют с клеточными рецепторами, приводя к адгезии, распластыванию или передаче сигнала.
Обнаружено, что ламинин является полидоменным белком, состоящим из трех аминокислотных цепей с несколькими доменами, связывающими рецепторы. Среди этих доменов - последовательности YIGSR (SEQ ID NO. 1) B1-цепи, LRGDN (SEQ ID NO. 3) A-цепи и PDGSR (SEQ ID NO. 4) B1-цепи ламинина. Идентифицировано также несколько других последовательностей узнавания для клеток. Это, например, IKVAV (SEQ ID NO. 5) A-цепи и RNIAEIIKDI (SEQ ID NO. 6) B2-цепи ламинина. Наиболее предпочтительна последовательность RGD фибронектина.
В более предпочтительном варианте осуществления в матрикс встраивают пептидные сайты адгезии клеток, а именно, пептиды, которые связываются с рецепторами адгезии на поверхности клеток. В число этих рецепторов адгезии входят рецепторы, описанные выше. Особенно предпочтительны последовательности RGD фибронектина и YIGSR (SEQ ID NO. 1) ламинина. Сайты прикрепления клеток могут быть включены в матриксы природного происхождения. Они могут встраиваться, например, за счет смешивания цистеинсодержащего пептида прикрепления клеток с предшественником, молекула которого содержит сопряженную ненасыщенную группу, например, полиэтиленгликоль-акрилат, полиэтиленгликоль-акриламид или полиэтиленгликоль-винилсульфонат. Это может быть сделано незадолго (например, за несколько минут) до смешивания с остатком компонента-предшественника, содержащего нуклеофильную группу, например, тиол-содержащего предшественника. Если сайт прикрепления клетки не содержит цистеина, можно химически синтезировать этот сайт, включив в него цистеин. На этой стадии пептид адгезии встраивают в один из концов молекулы предшественника, обогащенной реакционно-способными группами за счет сопряженной ненасыщенности; когда в систему добавляют компонент с множественными тиоловыми группами, образуется поперечно связанная сеть.
Концентрация сайтов адгезии, находящихся внутри матрикса и ковалентно связанных с ним, может влиять на скорость клеточной инфильтрации. Например, в случае данного гидрогеля, RGD можно включить в матрикс в концентрациях, оптимальных для того, чтобы стимулировать врастание и миграцию клеток. Оптимальный диапазон концентраций таких сайтов адгезии, как RGD, - от 0,04 до 0,05 мМ, предпочтительнее - 0,05 мМ, особенно для матрикса, содержание воды в котором находится в пределах между равновесным и 92 весовыми процентами после окончания поглощения воды.
В. ПТГ
1-84
1-38
1-34
1-31
1-25
1-34
Здесь термин "ПТГ" относится как к последовательности ПТГ человека, так и ко всем усеченным, модифицированным и аллельным вариантам ПТГ, стимулирующим остеогенез, будучи ковалентно связанными с биоразлагаемыми природными или синтетическими матриксами. Предпочтительные варианты ПТГ с усеченной аминокислотной последовательностью - ПТГ, ПТГ, ПТГ и ПТГ. Наиболее предпочтительным вариантом является ПТГ. В предпочтительном варианте осуществления применяется ПТГ человека, хотя можно, вероятно, применять ПТГ и из других источников, например, крупного рогатого скота. Для заживления и консолидации переломов костей ПТГ следует применять в диапазоне концентраций от 0,01 до 2 мг/мл матрикса, при условии, что концентрация 0,4 мг/мл фибринового матрикса не включена в указанный интервал значений.
Предпочтительный диапазон концентраций ПТГ - от 0,1 до 1,7 мг/мл матрикса, более предпочтительный - от 0,3 до 1,5 мг/мл матрикса и наиболее предпочтительный - от 0,4 до 1,1 мг/мл матрикса, при условии, что концентрация 0,4 мг/мл фибринового матрикса не включена в указанный интервал значений. В предпочтительном варианте осуществления применяется фибриновый матрикс.
Г. Пептиды слияния ПТГ
В предпочтительном варианте осуществления ПТГ - это пептид слияния ПТГ, содержащий по меньшей мере два домена, где первый домен содержит ПТГ, а второй домен содержит субстратный домен, способный к образованию поперечных ковалентных сшивок с матриксом во время или после его образования. Субстратный домен является субстратом для фермента. В предпочтительном варианте это субстрат трансглутаминазы ("домен субстрата трансглутаминазы"); в более предпочтительном - тканевой трансглутаминазы ("домен субстрата тканевой трансглутаминазы"), и в самом предпочтительном - фактора XIIIa ("домен субстрата фактора XIIIa"). Трансглутаминазы катализируют реакции переноса ацила между γ-карбоксиламидной группой глутаминовых остатков в молекуле белка и ε-аминогруппой лизиновых остатков, в результате образуются мостики из N-ε-(γ-глутамил)лизиновых изопептидных боковых цепей. Аминокислотная последовательность пептида слияния ПТГ может быть еще доработана: в нее можно включить сайт ферментативного или гидролитического расщепления, который бы позволил высвобождать ПТГ без изменения - или с минимальным изменением - первичной структуры.
Домены субстратов трансглутаминаз, особенно субстратные домены фактора XIIIa, служат для связывания пептидов слияния с матриксами природного происхождения, такими как фибриновый матрикс. В случае применения совместно с фибриновым матриксом, сайт деградации пептида слияния должен быть, в предпочтительном варианте, ферментативно деградируемым, чтобы высвобождение ПТГ регулировалось специфическими для клетки процессами, такими как строго локализованный протеолиз.
Субстратным доменом, образующим поперечные сшивки, может быть GAKDV (SEQ ID NO. 7), KKKK (SEQ ID NO. 8), YRGDTIGEGQQHHLGG (SEQ ID NO. 9) или NQEQVSPL (SEQ ID NO. 2).
Наиболее предпочтительный домен субстрата фактора XIIIa имеет аминокислотную последовательность NQEQVSPL (SEQ ID NO. 2). Ниже он будет обозначаться "ТГ" или "ТГ-ПТГ".
1-34
Пептид слияния ПТГ может быть получен путем рекомбинации или химического синтеза. Пептид слияния ПТГ предпочтительно получают с помощью химического синтеза.
Домены субстратов трансглутаминаз, удовлетворяющие целям настоящего изобретения, включая их аминокислотные последовательности, подробно описаны в международной заявке WO 03/052091, содержание которой включено в настоящее описание в виде ссылки.
1-34
1-34
1-34
Как здесь отмечалось, в предпочтительном варианте осуществления домен субстрата фактора XIIIa либо непосредственно химически связан с ПТГ, либо может содержать сайт деградации между ПТГ (первый домен) и последовательностью NQEQVSP (SEQ ID NO. 2) (второй домен). В такой форме пептид слияния ПТГ может быть встроен внутрь фибринового матрикса, соединяясь с фибрином через субстрат фактора XIIIa, в процессе коагуляции и высвобождаться в виде ПТГ.
1-34
Сайты деградации позволяют высвобождать ПТГ, почти или совсем не меняя его первичную аминокислотную последовательность, что может повысить активность этого фактора. Кроме того, высвобождение фактора может в этом случае регулироваться специфичным для клетки процессом. Это позволяет высвобождать фактор из одного и того же материала с различной интенсивностью, в зависимости от локализации клеток в этом материале. Это также уменьшает необходимое количество ПТГ, поскольку его высвобождение контролируют клеточные процессы. Согласно одному из возможных объяснений эффективной консолидации дефектов костей при применении ПТГ, включенного в матрикс и, в предпочтительном варианте, химически связанного с ним, важным фактором является то, что ПТГ вводится местно в течение длительного периода времени (не как одна разовая доза), но и не непрерывно. Это достигается медленной деградацией в форме ферментативного или гидролитического расщепления матрикса. В результате молекулы ПТГ доставляются к клеткам в псевдоимпульсном режиме в течение продолжительного периода времени. Когда преостеобласт проникает в матрикс, он контактирует с молекулой ПТГ, которая индуцирует дальнейшую пролиферацию преостеобластов, а также синтез большого количества факторов роста, необходимых для формирования новой костной ткани. Однако если данная конкретная клетка не продолжит высвобождать из матрикса связанный ПТГ, она не начнет вырабатывать интерлейкин-6, а в этом случае будет устранен катаболический эффект на формирование остеокластов на более поздней стадии. Конечным итогом будет более высокая плотность костного материала и более интенсивное образование костного матрикса. В результате все лечебное действие пептида оказывается локализовано в области поражения и в последующем усиливается.
Сайты деградации пептида слияния
m
cat
Сайт ферментативной или гидролитической деградации может находиться между первым и вторым доменами пептида слияния. Расщепление по сайтам деградации может катализироваться специфическими ферментами деградации. Благодаря этому, высвобождение ПТГ находится под контролем клеточно-специфических процессов, таких как локальный протеолиз. Это делает возможным высвобождение ПТГ внутри матрикса с различной интенсивностью, в зависимости от локализации клеток в материале. В предпочтительном варианте пептид расщепляется в сайте деградации ферментом, выбранным из группы, состоящей из плазмина и металлопротеиназы матрикса. Тщательно подбирая K и k этого сайта ферментативной деградации, можно контролировать деградацию, заставляя ее происходить либо до, либо после деградации матрикса и/или с применением одинаковых или разных ферментов. Эти деградируемые сайты позволяют сделать высвобождение ПТГ из фибриновых матриксов более специфичным. Деградируемый сайт может расщепляться ферментами, высвобождаемыми клетками, которые заселяют матрикс. Сайт деградации позволяет менять интенсивность поступления ПТГ в разных точках в зависимости от активности клеток в данной точке и/или внутри матрикса. Дополнительные преимущества - меньшая доза лекарственного средства внутри системы его адресной доставки и пространственная регуляция его высвобождения, которая позволяет высвобождать больший процент лекарственного средства во время наибольшей активности клеток. В описании настоящего изобретения сайт деградации обозначается "pl."
Протеолитически деградируемые сайты могут быть субстратами коллагеназы, плазмина, эластазы, стромелизина или активаторов плазминогена. Примеры субстратов перечислены ниже (см. таблицу 1). N1-N5 означают положения аминокислотных остатков (от первого до пятого) относительно сайта, где происходит протеолиз, по направлению к N-концу белковой молекулы. N1'-N4' означают положения аминокислотных остатков (от первого до четвертого) относительно сайта, где происходит протеолиз, по направлению к C-концу молекулы белка.
Таблица 1:Примеры аминокислотных последовательностей субстратов протеазы
Протеаза
N5
N4
N3
N2
N1
N1'
N2'
N3'
N4'
SEQ ID NO.
Плазмин<sup>1</sup>
L
I
K
M
K
P
SEQ ID NO. 10
Плазмин<sup> 1</sup>
N
F
K
S
Q
L
SEQ ID NO. 11
Стромелизин<sup>2</sup>
Ac
G
P
L
A
L
T
A
L
SEQ ID NO. 12
Стромелизин<sup> 2</sup>
Ac
P
F
E
L
R
A
NH<sub>2</sub>
SEQ ID NO. 13
Эластаза<sup>3</sup>
Z-
A
A
F
A
NH<sub>2</sub>
SEQ ID NO. 14
Коллагеназа<sup>4</sup>
G
P
L
G
I
A
G
P
SEQ ID NO. 15
t-PA<sup>5</sup>
P
H
Y
G
R
S
G
G
SEQ ID NO. 16
u-PA<sup>5</sup>
P
G
S
G
R
S
A
S
G
SEQ ID NO. 17
Список источников:
Biochemistry
1. Takagi and Doolittle, 1975.  14:5149-5156.
J. Biol. Chem.
2. Smith et al., 1995.  270:6440-6449.
Analytical Biochemistry
3. Besson et al., 1996.  237:216-223.
J. Biol. Chem.
4. Netzel-Arnett et al., 1991.  266:6747-6755.
J. Biol. Chem.
5. Coombs et al., 1998.  273:4323-4328.
В предпочтительном вариант осуществления первый и второй домены соединены последовательностью YKNR (SEQ ID NO. 18), благодаря чему их связь может расщепляться плазмином.
Наиболее предпочтительный пептид слияния ПТГ - ТГ-pl-ПТГ: NQEQVSPLYKNRSVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNF (SEQ ID NO. 19).
Другие предпочтительные пептиды слияния:
1-34
ТГ-ПТГ - модифицированная форма ПТГ, содержащая аминокислоты 1-34 нативного ПТГ и домен субстрата трансглутаминазы (ТГ): NQEQVSPLSVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNF (SEQ ID NO. 20);
1-34
1-34
ТГ-pl-ПТГ - форма, сходная с ТГ-ПТГ, за исключением того, что она дополнительно содержит деградируемую плазмином последовательность (pl) между последовательностями ТГ и ПТГ: NQEQVSPLYKNRSVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNF (SEQ ID NO. 19).
Для протеолитической деградации могут применяться разные ферменты. В качестве протеолитически деградируемых сайтов могут служить субстраты коллагеназы, плазмина, эластазы, стромелизина или активаторов плазминогена.
В другом предпочтительном варианте между первым и вторым доменами может быть встроен олигоэфирный домен. Такими доменами могут быть, например, олигомеры молочной кислоты.
Комбинации матриксов или компонентов-предшественников с ПТГ
Предпочтительный диапазон концентраций ПТГ или пептида слияния ПТГ - от 0,01 до 2 мг/мл матрикса или компонентов-предшественников, что является оптимальным для консолидации и заживления переломов костей, при условии, что концентрация 0,4 мг/мл фибринового матрикса или компонентов-предшественников, образующих матрикс, не включена в указанный интервал значений. В предпочтительном варианте осуществления концентрация ПТГ находится в диапазоне от 0,1 до 1,7 мг/мл фибринового матрикса или компонентов-предшественников, образующих матрикс; более предпочтительный диапазон концентраций - 0,3-1,5 мг/мл фибринового матрикса или компонентов-предшественников, а наиболее предпочтительный - 0,4-1,1 мг/мл фибринового матрикса или компонентов-предшественников, при условии, что концентрация 0,4 мг/мл фибринового матрикса или компонентов-предшественников, образующих матрикс, не включена в указанный интервал значений. Предпочтительные концентрации ПТГ или пептида слияния ПТГ в матриксе зависят от возраста пациента. Если композиция применяется для лечения переломов у детей, то предпочтительная концентрация ПТГ или пептида слияния ПТГ ниже 0,4 и выше 0,01 мг/мл фибринового матрикса или компонентов-предшественников, образующих матрикс. Более точно, концентрация ПТГ или пептида слияния ПТГ находится в пределах от 0,01 до 0,35 мг/мл фибринового матрикса или компонентов-предшественников, образующих матрикс; более предпочтительный диапазон концентраций - 0,1-0,3 мг/мл фибринового матрикса или компонентов-предшественников матрикса, а наиболее предпочтительный - 0,05-0,15 мг/мл фибринового матрикса или компонентов-предшественников матрикса. Если же композиция применяется для лечения взрослых пациентов, то предпочтительная концентрация ПТГ или пептида слияния ПТГ выше 0,4, но не выше 2 мг/мл фибринового матрикса или компонентов-предшественников, образующих матрикс. Более точно, концентрация ПТГ или пептида слияния ПТГ находится в пределах от 0,45 до 2 мг/мл фибринового матрикса или компонентов-предшественников, образующих матрикс; более предпочтительный диапазон концентраций - 0,7-1,5 мг/мл фибринового матрикса или компонентов-предшественников матрикса, а наиболее предпочтительный - 0,9-1,1 мг/мл фибринового матрикса или компонентов-предшественников матрикса. В предпочтительном варианте осуществления применяется фибриновый матрикс.
Д. Гранулярный материал
Матрикс может также содержать гранулярный материал; в предпочтительном варианте гранулярный материал содержит кальцийсодержащее минеральное вещество. Этот гранулярный материал в основном обеспечивает механические свойства фибринового матрикса, адаптируя матрикс к конкретным требованиям, вытекающим из медицинских показаний. Гранулярный материал может быть любым биосовместимым материалом, обеспечивающим необходимую механическую поддержку композиции, поэтому степень механической поддержки может варьироваться в зависимости от показаний. Предпочтительный гранулярный материал - керамическое соединение. Хорошие результаты дает добавление в матрикс биоразлагаемых керамических соединений. Предпочтительно, керамическое соединение представляет собой кальцийсодержащее минеральное вещество, такое как гидроксиапатит, фосфат кальция или сульфат кальция. Подходящими материалами являются биоразлагаемые пористые смеси гидроксиапатита и трикальцийфосфата, такие как TRICOS (Biomatlante, Франция) или CAMCERAM from Cam Implants (Leiden, Нидерланды). Наиболее предпочтительна разлагаемая смесь гидроксиапатита и трикальцийфосфата. Один из примеров - продукт с торговой маркой TRICOS, содержащий 60% гидроксиапатита и 40% трикальцийфосфата. CAMCERAM - также пористые гранулы смеси гидроксиапатита и трикальцийфосфата.
Можно также применять непористые гранулы смеси гидроксиапатита и трикальцийфосфата, гранулы чистого гидроксиапатита (пористые или непористые), гранулы трикальцийфосфата (пористые или непористые), гранулы сульфата кальция, мелкие фрагменты костей (ауто- или аллотрансплантат) или ксенотрансплантат фрагментов кости.
Количество гранул в дополненном матриксе зависит от мертвого пространства гранул. В предпочтительном варианте осуществления объем мертвого пространства гранул и объем жидкостей в матриксе относятся друг к другу как 1: 1; это составляет верхний предел количества гранул в матриксе. Может применяться любое меньшее количество гранул, если конкретный вид перелома требует лишь небольшой механической поддержки.
II. Способы применения
in situ,
in situ
Дополненный матрикс может формироваться  (непосредственно в точке внутри или на поверхности тела, где требуется лечебное воздействие) или же быть сформирован заранее и затем имплантирован туда, где он необходим, т.е. в место перелома. Добиться застывания/формирования матрикса  можно путем смешивания ПТГ с гранулами (если они применяются) и нанесения матрикса на место перелома. В другом варианте осуществления матрикс может быть сформирован вне тела, а затем нанесен на место перелома в заранее приданной ему форме. Если формируется фибриновый матрикс, компоненты-предшественники до применения следует хранить по отдельности, чтобы не допустить преждевременной полимеризации. Для предотвращения контакта компонентов между собой до введения пациенту можно подготовить специальный набор, в котором растворы предшественников будут разделены. После смешивания в условиях, при которых возможна полимеризация, растворы предшественников образуют трехмерную сеть, содержащую ПТГ. Меняя компоненты-предшественники и варьируя их концентрации, можно получить требуемое время застывания.
В одном из вариантов осуществления матрикс формируется из фибриногена. При контакте с тромбином и источником кальция при соответствующих температуре и pH фибриноген, после каскада различных химических реакций, полимеризуется в матрикс. Эти три компонента - фибриноген, тромбин и источник кальция - следует хранить отдельно. Однако любые два из этих компонентов можно смешивать между собой до введения, при условии, что третий компонент от них изолирован.
Форма выпуска дополненного матрикса должна позволять его введение в виде жидкостей или пастообразной субстанции, которая проникает в место перелома и заполняет дефект кости. Образующийся матрикс затвердевает, в результате чего он, а значит, и действующее вещество, остаются в месте перелома.
До, во время или даже после имплантации, во время или после образования поперечных сшивок, формирующих матрикс, в дополненный матрикс можно также добавить клетки. Это может быть как дополнением, так и заменой образования поперечных сшивок для создания интерстициального пространства, с целью стимуляции пролиферации клеток и их врастания в матрикс.
В одном из вариантов осуществления фибриноген (возможно, с добавлением апротинина для стабилизации) растворяется в буферном растворе при физиологическом pH (в диапазоне от 6,5 до 8,0; предпочтительно от 7,0 до 7,5) и хранится отдельно от раствора тромбина в буфере, содержащем хлорид кальция. В качестве буферного раствора для фибриногена может применяться гистидиновый буферный раствор, дополнительно содержащий NaCl и солевой буфер Tris. Оба раствора обычно хранят в замороженном виде и перед применением размораживают.
В предпочтительном варианте осуществления предложен набор, содержащий ПТГ (предпочтительно пептид слияния ПТГ), гранулярный материал (предпочтительно с кальцийсодержащим минеральным компонентом), фибриноген, тромбин и источник кальция. Необязательно, в набор можно также включить поперечно-связывающий фермент, например, фактор XIIIa. ПТГ (предпочтительно пептид слияния ПТГ) может присутствовать в растворе либо фибриногена, либо тромбина. В предпочтительном варианте осуществления ПТГ (предпочтительно пептид слияния ПТГ) содержится в растворе фибриногена.
Растворы фибриногена и тромбина смешиваются, в предпочтительном варианте, с помощью устройства с двойным шприцем, где смешивание происходит за счет продавливания содержимого обоих шприцев сквозь камеру смешивания и/или иглу, и/или статическую мешалку.
В предпочтительном варианте осуществления и фибриноген, и тромбин хранятся по отдельности в лиофилизированной форме. Любой из двух компонентов-предшественников может содержать пептид слияния и гранулярный материал. Перед использованием к фибриногену добавляются Tris или гистидиновый буфер для образования фибриногенового раствора-предшественника; буфер может дополнительно содержать апротинин. Лиофилизированный тромбин перед использованием растворяется в растворе хлорида кальция для образования тромбинового раствора-предшественника. Затем фибриногеновый и тромбиновый растворы-предшественники помещаются в отдельные контейнеры, флаконы или шприцы и смешиваются с помощью двустороннего соединительного устройства, например двойного шприца. Необязательно, контейнеры, флаконы и шприцы разделяются на два отсека подвижной перегородкой, перпендикулярной их стенкам. Один отсек содержит лиофилизированный фибриноген или тромбин, а другой - соответствующий буферный раствор. При нажатии поршня перегородка сдвигается, впуская буферный раствор в отсек с фибриногеном, и фибриноген растворяется. Когда растворятся и фибриноген, и тромбин, оба двухкамерных шприца присоединяются к двустороннему соединительному устройству, и их содержимое смешивается при продавливании сквозь иглу соединительного устройства. Необязательно, в соединительное устройство может быть встроена статичная мешалка для лучшего смешивания содержимого.
Гранулярный материал может находиться в отдельном шприце. В предпочтительном варианте осуществления гранулярный материал смачивается стерильной водой, вводимой в шприц. Затем вышеупомянутый двойной шприц, содержащий растворы предшественников фибрина и ПТГ, соединяется со шприцем, содержащим смоченный гранулярный материал. Все содержимое двойного шприца переносится в шприц, содержащий гранулярный материал. После этого все его содержимое впрыскивается в место перелома и формуется в течение нескольких минут.
Кроме упомянутых ингредиентов, в растворы предшественников и/или образовавшиеся матриксы могут добавляться и другие компоненты. Например, можно использовать материал, включающий в себя кальцийсодержащее минеральное вещество, т.е. гомогенное природное вещество, содержащее ионы кальция, такое как гидроксиапатит.
Композиции и способы применения описаны применительно к предпочтительным вариантам осуществления, однако, для специалистов в данной области очевидно, что композиции, способы и стадии или последовательность стадий описанной здесь процедуры могут быть изменены без отступления от общей концепции, идеи и содержания изобретения.
Примеры
Пример 1: Биологическая активность ПТГ
и ТГ-pl-ПТГ
1-34
1-34
1-34
1-84
Биологическая активность пептида ПТГ сходна с таковой полноразмерного пептида ПТГ, а белки такой длины можно получать стандартными методами твердофазного синтеза.
1-34
1-34
1-34
1-34
1-34
1-34
1-34
1-34
1-34
Все пептиды синтезировали на твердых смолах в автоматическом синтезаторе пептидов с использованием стандартного 9-флуоренилметилоксикарбонильного метода. Пептиды очищали с помощью c18-хроматографии и анализировали с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой для оценки чистоты и с помощью масс-спектроскопии с лазерной ионизацией и десорбцией из матрицы (MALDI) для определения молекулярной массы каждого продукта. С помощью этого способа получили ПТГ, а также ТГ-pl-ПТГ (NQEQVPLYKNRSVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNF, SEQ ID NO. 19) и ТГ-ПТГ (NQEQVPLSVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNF, SEQ ID NO. 20). ТГ-pl-ПТГ и ТГ-ПТГ отличаются от ПТГ тем, что дополнительно содержат домен субстрата фактора XIIIa, который связан с ПТГ - через деградируемую плазмином pl-последовательность YKNR (SEQ ID NO. 18) в случае ТГ-pl-ПТГ и напрямую в случае ТГ-ПТГ.
1-34
1-34
Для изучения биологической активности пептидов слияния ПТГ провели анализ с использованием репортерного гена. Согласно этому методу клетки трансфицируют плазмидой, содержащей репортерный ген люциферазы, сцепленный с промотором гена рецептора ПТГ. Затем, если клетки обрабатывают ПТГ, и он связывается с соответствующим рецептором клеточной поверхности, запускается каскад реакций передачи сигнала, опосредуемый повышением концентрации цАМФ. Это, в свою очередь, через естественный механизм обратной связи, приводит к уменьшению количества рецепторов ПТГ. Поскольку в этом уменьшении задействован промотор гена рецептора ПТГ, это также приводит к снижению экспрессии сцепленного репортерного гена. Этот аналитический метод использовали для оценки активностей нативного ПТГ и ТГ-pl-ПТГ и сравнения их с международным стандартом. Было обнаружено, что активность обоих агентов примерно одинакова, поскольку оба они одинаково снижали экспрессию репортерного гена, и равна международному стандарту. Результаты представлены на Фиг. 1.
Пример 2: Высвобождение ПТГ из фибринового матрикса
1-34
1-34
1-34
1-34
Фибриновый матрикс был получен из набора предшественников фибрина TISSEEL Kit (Baxter AG, CH-8604 Volketswil/ZH). Состав приведен в Таблице 2. Затем, в присутствии 0,1 мкг/мл ПТГ или ТГ-ПТГ, в смесь добавляли тромбин и перемешивали для получения равномерной концентрации по всему объему. ТГ-ПТГ содержит только трансглутаминазную последовательность на N-конце, без сайта деградации. Поэтому ТГ-ПТГ может высвобождаться только за счет деградации самого фибринового матрикса. Этот пептид был синтезирован как описано в Примере 1.
В первом эксперименте по анализу высвобождения ПТГ 50 мкл фибринового матрикса с 0,1 мг ПТГ или ТГ-ПТГ на миллилитр фибринового матрикса инкубировали при 37°C в 10 мл буферного раствора. Таким образом, концентрация ПТГ или ТГ-ПТГ в буфере в случае их полного высвобождения должна была быть 0,5 мкг/мл. Для сравнения стабильности ПТГ или ТГ-ПТГ в процессе анализа пробы ПТГ или ТГ-ПТГ растворяли непосредственно в буфере до концентрации 0,5 мкг/мл. Проверяли различные буферы: дистиллированную воду, фосфатный буфер, Tris-буфер.
Аликвоты отбирали на нулевой, 1-й, 2-й, 4-й и 6-й дни и анализировали с помощью ИФА (ELISA). Результаты показали, что ПТГ был стабилен не более двух суток в любом из буферных растворов. Поэтому невозможно было сделать никаких выводов из данных по его высвобождению. На стабильность ПТГ, безусловно, повлияли его низкая концентрация и неоптимальные буферные растворы.
Эксперимент по высвобождению ПТГ повторили с использованием стабилизирующего буферного раствора, содержащего 50 мМ маннитола и 10 мМ ацетатного буфера. Кроме того, раз в 2 суток буфер заменяли для предотвращения распада пептида. Концентрация ПТГ или ТГ-ПТГ была увеличена до 1 мг/мл фибринового матрикса в 100 мкл фибринового матрикса, а инкубацию проводили в 1 мл буферного раствора. Концентрация ПТГ или ТГ-ПТГ в буфере в случае их полного высвобождения должна была быть 100 мкг/мл (в 200 раз выше, чем в предыдущем случае). Как и в первом эксперименте, приготовили положительный контроль (то же самое количество ПТГ или ТГ-ПТГ, растворенного в буфере) для оценки стабильности ПТГ или ТГ-ПТГ в ходе эксперимента (100 мкг/мл). Пробы отбирали раз в 2-4 суток (заменяя при этом буферный раствор) в течение 2 недель и анализировали методом прямого ИФА. Контрольные пробы также отбирали раз в 2 суток. Полученные результаты показали, что в этих условиях ПТГ и ТГ-ПТГ остаются стабильными более 2 недель.
Как показано на Фиг. 2, основное количество фибринового матрикса высвобождалось в течение первых 3 суток. По истечении 3 суток было высвобождено 60% всего ПТГ и 13% всего ТГ-ПТГ. Эти данные говорят о том, что добавление последовательности ТГ значительно усиливало удержание ПТГ в фибриновом матриксе.
Пример 3: Дефект большеберцовой кости овцы как экспериментальная модель
Фибриновый матрикс в количестве 4 мл был получен на основе набора TISSEEL Kit (Baxter AG, CH-8604 Volketswil/ZH). TISSEEL производится из плазмы крови человека, собранной от разных доноров, и содержание активных ингредиентов варьирует, в определенных границах, от партии к партии.
Матрикс.
Матрикс был приготовлен с помощью трех отдельных шприцев: двойного шприца, содержащего раствор предшественника фибрина и пептид слияния ПТГ (шприцы 1 и 2), и двух одинарных шприцев, содержащих гранулы (шприцы 3 и 4). Окончательная композиция представлена в Таблице 2.
Таблица 2:Окончательная композиция, содержащая TISSEEL и активный компонент
Ингредиенты
Доза на 2 мл геля
<i>Шприц 1 (1 мл)</i>
Активный компонент:
Пептид слияния ПТГ<sub>1-34</sub> (ТГ-pl-ПТГ<sub>1-34</sub>)
0,4-10 мг
Свертывающие агенты
Фибриноген (человеческий)
66-100 мг
Другие белки
Апротинин (бычий)
2046-3409 кМЕд
Альбумин (человеческий)
9,1-18,2 мг
Компоненты буфера
НикотинамидL-ГистидинЦитрат натрияПолисорбат 80Вода для инъекций
2,7-8,2 мг9,1-22,7 мг4,4-8,8 мг0,6-1,7 мгдо 1 мл
<i>Шприц 2 (1 мл)</i>
Свертывающие агенты
Тромбин (человеческий)
2,5-6,5 МЕд
Компоненты буфера
Хлорид кальцияХлорид натрияСывороточный альбумин(человеческий)Вода для инъекций
5,88 ± 0,6 мг3,5-5,5 мг45-55 мгдо 1 мл
<i>Шприц 3</i>
Вода для инъекций
1 мл
<i>Шприц 4</i>
Гранулы гидроксиапатита/фосфата кальция (трикальцийфосфатные гранулы)
1,75-2 г
1-34
1-34
Сначала гранулы гидроксиапатита/фосфата кальция в шприце 4 были смочены водой, впрыснутой из шприца 3. Раствор предшественника фибрина из шприца 1 (фибриноген и ПТГ, взвешенные в растворе вместе с апротинином - ингибитором сериновой протеиназы, замедляющим фибринолиз для сохранения целостности фибринового матрикса) был смешан с раствором предшественника фибрина из шприца 2 (тромбин в растворе хлорида кальция). ТГ-pl-ПТГ был добавлен в фибриногеновый компонент в таком количестве, чтобы получить конечную концентрацию в матриксе в пределах от 0,1 до 10 мг/мл фибринового матрикса; в процессе застывания ТГ-pl-ПТГ связался с матриксом поперечными сшивками. Растворы предшественников фибрина содержали также другие компоненты фибринового матрикса, такие как фибронектин плазмы, фактор XIIIa, плазминоген и альбумин человека. Когда растворы предшественников равны по объему, происходит свертывание с образованием фибрина. Процесс свертывания занимает несколько минут, что оставляет время для одновременного введения смеси растворов из шприца 4, содержащего смоченные гранулы. Затем матрикс может быть введен в место его применения, где он застывает. В дефект кости было введено достаточное количество матрикса, чтобы заполнить его.
Животные.
1-34
Подопытными животными были 42 овцы швейцарской альпийской породы (Swiss Alpine), самки, весом от 44 до 83 кг (в среднем 62,8 кг) в возрасте 2,25-4,75 лет. Животных разделили на семь групп. Положительным контролем служили животные с аутотрансплантатами, а отрицательным - животные с введенными в место костного дефекта фибриновым матриксом и гранулами гидроксиапатита/фосфата кальция (трикальцийфосфатные гранулы, ТКФ гранулы). В других группах применяли те же фибриновый матрикс и ТКФ гранулы, с различиями только в дозе ТГ-pl-ПТГ. По истечении 12 недель животные были забиты на принадлежащей университету бойне. Все эксперименты на животных проводились в соответствии со швейцарскими законами об охране животных и были санкционированы местными Комитетом по этике и Ветеринарным управлением.
Операция.
Медиальный доступ к диафизу большеберцовой кости был открыт непосредственно над костью, от дистальной стороны колена до скакательного сустава средняя большеберцовая фасция была иссечена, и медиальная сторона большеберцовой кости была открыта без нарушения надкостницы. Вдоль диафиза кости была приложена компрессионная пластина (Synthes) шириной 3,5 мм с 11 отверстиями, таким образом, что дистальный конец пластины находился над скакательным суставом. Пластину фиксировали к кости одиннадцатью 3,5-мм винтами в нейтральном положении, располагая пять отверстий для винтов дистально и шесть - проксимально от места намечаемого дефекта. Винты и пластину удаляли. После этого намечали на кости дефект скальпелем по лекалу с тем, чтобы дефект стандартной величины в 1 см находился между 5-м и 6-м отверстиями от винтов. Дефект наносили, разрезая кость вибрационной пилой при постоянном орошении, защищая от повреждения мягкие ткани. Сегмент величиной 1 см вместе с круговым слоем надкостницы аккуратно удаляли; местное кровотечение из костного мозга и мягких тканей было остановлено прижиманием марлевых салфеток. Пластина была возвращена на место, и все винты снова ввернуты перед заполнением костного дефекта матриксом, как описано выше. При этом тщательно следили, чтобы матрикс равномерно распределялся под пластиной, на латеральной стороне и кортикальном слое кости.
В положительном контроле с аутотрансплантатом аутогенную кость получали через разрез непосредственно над подвздошным гребнем. Костный мозг подвздошной кости открывали, просверливая множественные отверстия 3,5-мм сверлом. Губчатое вещество кости собирали кюретажной ложкой и немедленно помещали в хирургический дефект на большеберцовой кости. После заполнения дефекта срединная фасция была закрыта обычным способом, а кожа сшита скобками (Signet 35W, Auto Sutures, Connecticut, USA). Пока животные еще находились под наркозом, были сделаны рентгеновские снимки большеберцовой кости в медиолатеральной и каудокраниальной проекциях. Были наложены сплошные иммобилизационные повязки (Scotch Cast™Plus, Laboratoires 3M Santé, France), охватывающие всю дистальную часть конечности до коленного сустава на уровне коленной чашечки. Подошвенная часть была оставлена открытой, чтобы место перелома несло на себе вес тела, в то время как скручивающие и сдвигающие нагрузки были полностью исключены благодаря иммобилизации диафиза большеберцовой кости.
Выздоравливающих животных помещали в специальное подвешивающее приспособление, которое не давало им ложиться, поскольку, поспешно встав из этого положения, они могли бы снова сломать заживающую конечность. В подвешивающем приспособлении животные находились 4-5 недель. Это не мешало их сну, еде, дефекации и мочеиспусканию. После этого животных содержали в небольших стойлах, по 2-3 животных на стойло, до конца исследования.
Иммобилизационные повязки меняли каждые 7-10 дней или чаще, если животным было очевидно трудно стоять на ногах. Всего иммобилизационные повязки оставляли минимум на 4 и максимум на 12 недель. Повторные рентгенограммы делали спустя 4 и 8 недель. Когда животных забивали (через 12 недель), делали рентгенограмму на рентгеновской установке Faxitron (HP Electronics) после удаления мягких тканей, пластины и винтов.
Макроскопческая оценка.
После забоя животных заращение дефекта оценивали макроскопически, обращая внимание в первую очередь на стабильность пластины и перелома, а также симптомы воспаления и образования костной мозоли в области надкостницы. Все кости фотографировали цифровым фотоаппаратом (Minolta, Dimage 7). Механическую стабильность оценивали только вручную, но с осторожностью, чтобы не повредить ткань, подлежащую гистологическому исследованию.
Рентгенологическая оценка.
Для оценки рентгенограмм была разработана полуколичественная система баллов. Высокий балл соответствовал благоприятному ходу консолидации перелома. Рентгенограммы независимо оценивали трое исследователей, которые не знали, из какой группы было животное и на каком сроке сделана рентгенограмма. Все рентгенограммы оценивали за один прием; если оценки расходились, для последующей статистической обработки брали среднее арифметическое.
Гистология.
Говоря вкратце, срезы кости были сделаны таким образом, чтобы охватывать всю область бывшего дефекта; разрез проводили проксимальнее и дистальнее отверстия от первого винта. После фиксации в 4% параформальдегиде в течение 3-4 недель вырезанные фрагменты кости были промыты, обезвожены в батарее спиртов возрастающей концентрации, обезжирены ксилолом и затем пропитаны акриловой смолой. После завершения пропитки была проведена полимеризация в тефлоновых формах. Ленточной пилой Exacta были сделаны срезы в середине и параллельно длинной оси кости. Срезы помещали на пластиковые предметные стекла (Acropal) и делали микрорентгенограммы с помощью рентгеновской установки Faxitron на специальной пленке (Kodak PPL-2). Затем срезы шлифовали и полировали, доводя до толщины 30-40 мкм. Окраска поверхности толуидиновым синим позволяла различить старый и новый костный матрикс, а также ТКФ гранулы.
Для получения тонких срезов (5 мкм) куски кости разрезали на более мелкие части, содержащие по крайней мере один кортикальный слой и части периостеальной и эндостеальной костных мозолей. Срезы помещали на положительно заряженные стеклянные предметные стекла, покрытые хромалоном (chromalaune), депластифицировали и окрашивали либо толуидиновым синим, либо серебром по von Kossa с контрастной окраской по McNeal. В последнем случае минерализованный костный матрикс окрашен черным, а некальцифицированная остеоидная ткань - сине-бирюзовым.
качественной гистологической оценке
При  особое внимание уделяли типам клеток, симптомам воспаления, и механизмам деградации матрикса.
полуколичественную оценку
количественной оценки.
Проводили  появления клеток различных типов с помощью специально разработанной балльной системы, а также гистоморфометрические измерения, результаты которых использовались для
1-34
in situ
Матрикс (содержащий ТГ-pl-ПТГ в различных концентрациях) проверяли на регенерационную способность на сегментарном дефекте кости овец. В этом случае на большеберцовые кости овец наносили односторонние 1-см дефекты на всю толщину кости. После остеоэктомии аккуратно удаляли надкостницу, чтобы обеспечить несращение дефекта в течение периода исследования. После формирования дефекта был нанесен отверждаемый  материал, как описано в разделе "Способы применения".
1-34
Для сравнения испытывали разные дозы ТГ-ПТГ: 0,4; 1; 2; 5 и 10 мг/мл. Контрольным животным вводили тот же сложный матрикс, содержащий фибрин и гранулы, но без добавления ТГ-pl-ПТГ (0 мг/мл) или аутотрансплантат (обозначен как "АТ" на Фиг. 3 и 4; положительный контроль).
Каждые 4 недели делали рентгеновские снимки; через 12 недель животных забивали. В каждой временной точке анализировали рентгеновские фотографии и оценивали степень сращения. Кроме того, после забоя животных извлекали большеберцовую кость для проведения компьютерной томографии и гистологического исследования. Наконец, поскольку была проведена полная односторонняя остеотомия и на место дефекта была прикреплена пластина, этот участок подвергался большому механическому напряжению и нагрузке. Если материал, применяемый для заживления дефекта, не увеличил бы в значительной степень прочность кости, пластина должна была погнуться, и угол между частями кости изменился бы. Это еще один параметр, который оценивали на рентгеновских снимках и непосредственно в кости после забоя животных.
Результаты этих экспериментов представлены на Фиг. 3.
Когда в данной модели применяли только фибрин с ТКФ гранулами (отрицательный контроль), дефект залечивался лишь в небольшой степени. Из четырех животных, которых лечили этим способом, ни у одного не было полного клинического восстановления. У одной овцы модельный перелом консолидировался лишь в умеренной степени, у остальных трех были классические признаки несращения после 12 недель лечения. Кроме того, у всех четырех овец наложенная на кость пластина погнулась, и место дефекта деформировалось в первые 4 недели.
1-34
1-34
1-34
1-34
В следующей группе животных проверяли лечебный эффект матрикса с 0,4; 1; 2; 5 или 10 мг/мл ТГ-pl-ПТГ. В качестве оценки консолидации дефекта использовали степень консолидации надкостницы (образование костной мозоли), определяемую рентгенографически. Анализ рентгенограмм, сделанных в процессе лечения, показал, что действие ТГ-pl-ПТГ зависит от дозы. Так, консолидация перелома на уровне надкостницы была значительно более выраженной при дозах от 0,4 до 2 мг/мл на всех этапах лечения, причем степень консолидация при дозах 0,4 и 1 мг/мл через 12 недель лечения была статистически достоверно выше, чем в отрицательном контроле и эквивалентна степени консолидации при применении аутотрансплантата. Кроме того, у большинства животных, которым ТГ-pl-ПТГ был введен в дозе 1 мг/мл, через 12 недель лечения были все клинические признаки стабильного сращения (см. Фиг. 4). Первые признаки консолидации перелома у животных, леченных ТГ-pl-ПТГ в дозе 1 мг/мл, наблюдались уже через 4 недели. Степень консолидации перелома достоверно возрастала к сроку 8 недель, когда у одного животного уже были клинические признаки сращения, а в лечении остальных пяти наблюдался хороший прогресс. Эта тенденция сохранялась и дальше, так что после 12 недель лечения у пяти животных было получено стабильное, клинически выраженное сращение кости. У этих животных наблюдалось достоверное увеличение стабильности, тогда как сгибание пластины обнаружили только у одного животного, причем произошло это в течение первых 4 недель.
1-34
На Фиг. 4 показана стабильность сращения сегментарного дефекта большеберцовой кости после 12 недель лечения. После того, как овцы были забиты на 12-й неделе, пластину удаляли и оценивали стабильность консолидации исходного дефекта при легком механическом воздействии. Определяли процент дефектов, которые были явно нестабильны. Как видно из полученных результатов, ни у одного животного, леченного с помощью аутотрансплантата, не было обнаружено нестабильного дефекта, что подтверждает адекватность используемой экспериментальной модели. Из животных, получавших лечение ТГ-pl-ПТГ в дозе 1 мг/мл, только у одного обнаружился нестабильный дефект. Это доказывает, что консолидация перелома была примерно столь же выраженной, как в положительном контроле. Дозы, близкие к 1 мг/мл, также давали некоторый лечебный эффект, тогда как при использовании более высоких доз, а также нулевой дозы стабильность в конце эксперимента была гораздо ниже.
1-34
1-34
1-34
1-34
Окончательной мерой качества консолидации перелома служила интенсивность эндостеального костеобразования (формирования костной ткани во внутреннем слое длинной кости, т.е. внутри дефекта) и резорбции гранул, которые оценивали методами гистоморфометрии. Было обнаружено, что при дозе ТГ-pl-ПТГ 1 мг/мл интенсивность костеобразования в эндостеальном слое была выше, чем при других концентрациях ТГ-pl-ПТГ, т.е. при более высоких дозах образовывалось меньше новой костной ткани. Кроме того, интенсивность резорбции гранул была прямо пропорциональна интенсивности костеобразования в эндостеальном слое. В этом случае тоже доза ТГ-pl-ПТГ 1 мг/мл давала наилучший эффект (т.е. обеспечивала самую высокую интенсивность резорбции). Анализ всего диапазона доз показал, что при более высоких дозах интенсивности и костеобразования в эндостеальном слое, и резорбции гранул были ниже, а дозы ТГ-pl-ПТГ, близкие к 1 мг/мл, давали наилучший эффект.
1-34
1-34
1-34
Лучшие результаты в группе животных, леченных ТГ-pl-ПТГ, по сравнению с контролем говорят о том, что включение клинически эффективных доз ТГ-pl-ПТГ в дополненный матрикс может значительно увеличить эффективность консолидации перелома. Более быстрая консолидация, более эффективный остеогенез и большая стабильность в используемой модели, где кость подвергалась значительным механическим нагрузкам, могут служить обоснованием целесообразности применения дополненного матрикса для лечения дистальных компрессионных переломов лучевой кости. Кроме того, из данных по костеобразованию в надкостнице и эндостеальном слое, резорбции гранул и общей стабильности кости следует, что наиболее предпочтительный диапазон концентраций ТГ-pl-ПТГ - от 0,4 до 1,1 мг/мл фибринового матрикса.