ГЕННАЯ ТЕРАПИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ГЕМОФИЛИИ A
GENE THERAPY FOR THE TREATMENT OF HEMOPHILIA A

ВКЛЮЧЕНИЕ МАТЕРИАЛА, ПОДАННОГО В ЭЛЕКТРОННОЙ ФОРМЕ, ПУТЕМ ССЫЛКИ
Заявитель тем самым включает путем ссылки материал с перечнем последовательностей, поданный с данной заявкой в электронной форме.  Данный файл назван UPN-16-7798PCT_ST25.txt.
ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
Данная заявка испрашивает приоритет согласно предварительных заявок на патент США: № 62/323,336, поданной 15 апреля 2016 г., № 62/331,807, поданной 4 мая 2016 г., и № 62/428,866, поданной 1 декабря 2016 г.  Эти три заявки на патент включены в данный документ в полном объеме путем ссылки.
1. ВВЕДЕНИЕ
Данная заявка относится к вариантам реализации изобретения, используемым для генной терапии для лечения гемофилии A.
2. УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Гемофилия A (HA или HemA) представляет собой наиболее распространенное наследственное нарушение свертывания крови. В соответствии с Центрами США контроля и профилактики заболеваний, гемофилия A встречается приблизительно в 1 случае на 5000 новорожденных.  В США существует около 20 000 людей с гемофилией A. Гемофилия A встречается в четыре раза чаще, чем гемофилия B, и у более чем половины пациентов с гемофилией A наблюдается тяжелая форма гемофилии.  HA вызвана дефицитом фактора VIII (FVIII), а также поддается для лечения подходом с замещением генов в первую очередь благодаря тому, что увеличение уровня FVIII (>1 % от нормального) может облегчать фенотип, для которого характерно возникновение тяжелых кровотечений. В настоящее время аденоассоциированные (AAV) вирусные векторы демонстрируют наибольшую перспективу для применения в генной терапии благодаря их превосходному профилю безопасности и способности к прямой долговременной трансгенной экспрессии из постмитотических тканей, таких как печень.
Однако применение векторов AAV для генной терапии HA вызывает новые сложности из-за отличающихся молекулярных и биохимических свойств человеческого FVIII (hFVIII).По сравнению с другими белками сходного размера экспрессия hFVIII является в высшей степени неэффективной. Применение методов биоинженерии к молекуле FVIII привело к улучшению экспрессии FVIII.Например, удаление B-домена, который не нужен для проявления кофакторной активности, и замена его коротким линкером из 14 аминокислот (FVIII SQ) приводила к 17-кратному увеличению уровней мРНК по сравнению с полноразмерным FVIII нормального типа и 30 % увеличению секретированного белка. См., Ward, Natalie J., et al. "Codon optimization of human factor VIII cDNAs leads to high-level expression." Blood 117.3 (2011): 798–807 и патент США № 9,393,323, также опубликованный как WO 2011/005968.Рекомбинантный FVIII-BDD-SQ обеспечивает клиническое применение в качестве заместительного рекомбинантного продукта FVIII (Refacto, Wyeth Pharma; Xyntha, Pfizer).
Другое препятствие для опосредованного AAV переноса генов для генной терапии HA состоит в размере кодирующей FVIII последовательности, которая составляет 7,0 т. н., что намного превышает нормальную емкость упаковки векторов AAV.  Сообщалось об упаковке больших экспрессионных кассет в векторы AAV, но это очень нестабильный процесс, приводящий к низким выходам векторных частиц с пониженной инфицирующей способностью и требующий высокой дозы, что может вызывать повреждение печени.  См., например, Sarkar, R., W. Xiao, and H. H. Kazazian. "A single adeno‐associated virus (AAV)‐murine factor VIII vector partially corrects the hemophilia A phenotype." Journal of Thrombosis and Haemostasis 1.2 (2003): 220-226; и McIntosh, Jenny, et al. "Therapeutic levels of FVIII following a single peripheral vein administration of  rAAV vector encoding a novel human factor VIII variant." Blood 121.17 (2013): 3335–3344.
Таким образом, для лечения HA требуются более эффективные векторы AAV.FVIII.
3. СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Данные варианты реализации изобретения относятся к вектору AAV для генной терапии для доставки нормального человеческого FVIII нуждающемуся в нем субъекту с последующим внутривенным введением такого вектора, приводящим к долговременной, вероятно на 10 лет или более, клинически значимой коррекции нарушения свертывания крови. Популяция субъектов-пациентов представляет собой пациентов, болеющих от умеренной до тяжелой формами гемофилии A. Предполагаемая доза вектора предназначена для увеличения уровней FVIII в крови приблизительно на 3–10 % или 5 %. Цель лечения вектором AAV заключается в переводе тяжелой гемофилии A у пациентов до умеренной или слабой гемофилии A, таким образом облегчая состояние таких пациентов до необходимости нахождения в режиме профилактики.
Продукт генной терапии, описанный в данном документе, обеспечивает множество важных преимуществ по сравнению с доступными в настоящее время профилактическими подходами для контроля тяжелой гемофилии A. Во-первых, результаты доклинических исследований исследуемого продукта согласовывались с его потенциалом достижения уровней циркуляции фактора VIII до 10 % или более от нормы, это уровни, которые могли быть революционными для целевой популяции пациентов. Во-вторых, данный продукт должен приводить к эффективному достижению постоянных уровней фактора VIII в крови, избегая падения уровней, наблюдаемых в настоящее время при введении экзогенного фактора. В-третьих, это достигается только одним введением, причем необходимость частых внутривенных введений может снижаться на продолжительный период времени, вероятно на десятилетие или дольше.
Данная заявка обеспечивает применение репликационно дефектного аденоассоциированного вируса (AAV) для доставки гена человеческого фактора VIII (hFVIII или hF8) в клетки печени пациентов (субъектов-людей) с диагностированной гемофилией A. Рекомбинантный вектор AAV (rAAV), применяемый для доставки гена hFVIII (rAAV.hFVIII), должен обладать тропизмом по отношению к печени (например, rAAV, несущий капсид AAVhu.37 или AAVrh.10), а трансген hFVIII должен управляться специфическими для печени элементами контроля экспрессии.  В одном варианте реализации изобретения элементы контроля экспрессии включают один или более из следующих элементов: энхансер транстиретина (enTTR); промотор транстиретина (TTR) и сигнал полиA.  В другом варианте реализации изобретения элементы контроля экспрессии включают один или более из следующих элементов: энхансер предшественника укороченного α1-микроглобулина/бикунина (ABPS) и enTTR; промотор транстиретина (TTR) и сигнал полиA.  В одном варианте реализации изобретения элементы контроля экспрессии включают один или более из следующих элементов: энхансер транстиретина (enTTR); промотор антитрипсина альфа-1 (A1AT) и сигнал полиA.  В другом варианте реализации изобретения элементы контроля экспрессии включают один или более из следующих элементов: энхансер ABPS и enTTR; промотор A1AT и сигнал полиA.  Такие элементы описаны далее в данном документе.
В одном варианте реализации изобретения ген hFVIII кодирует форму фактора VIII с удаленным B-доменом (BDD), в котором B-домен замещен коротким аминокислотным линкером (FVIII-BDD-SQ, также называемым в данном документе как hFVIII).  В одном варианте реализации изобретения белковая последовательность FVIII-BDD-SQ показана в SEQ ID NO: 3.  В одном варианте реализации изобретения кодирующая последовательность FVIII-BDD-SQ показана в SEQ ID NO: 1.  В одном варианте реализации изобретения кодирующая последовательность hFVIII является кодон-оптимизированной для экспрессии у людей.  Такая последовательность может иметь 80 % идентичности с нативной кодирующей последовательностью hFVIII (SEQ ID NO: 1).  В одном варианте реализации изобретения кодирующая последовательность hFVIII показана в SEQ ID NO: 2.
12
14
В другом аспекте изобретения в данном документе предложена водная суспензия, подходящая для введения пациенту с гемофилией A, которая содержит rAAV, описанный в данном документе.  В некоторых вариантах реализации изобретения данная суспензия содержит водную суспендирующую жидкость и от около 1 x 10 до около 1 x 10геномных копий (ГК) rAAV/мл.  В одном варианте реализации изобретения суспензия пригодна для внутривеннной инъекции.  В другом варианте реализации изобретения суспензия дополнительно содержит поверхностно-активное вещество, консервант и/или буфер, растворенные в водной суспендирующей жидкости.
11
13
В еще одном варианте реализации изобретения в данном документе предложен способ лечения пациента, болеющего гемофилией A, с помощью rAAV, как описано в данном документе.  В одном варианте реализации изобретения в водной суспензии в организм пациента доставляют от около 1 x 10 до около 3 x 10 геномных копий (ГК) rAAV/кг массы тела пациента.
Цель лечения заключается в функциональном замещении дефектного hFVIII пациента посредством основанной на rAAV направленной на печень генной терапии в качестве целесообразного подхода для лечения данного заболевания и улучшения ответа на существующие виды терапий.  Варианты реализации изобретения, описанные в данной заявке, в частности основаны на разработке терапевтических композиций и способов, позволяющих безопасно доставлять эффективные дозы, и усовершенствованных способов промышленного получения для соответствия требованиям по очистке продукции для эффективного введения доз субъектам-людям.
4. КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
На ФИГ. 1 показано схематическое представление цис-плазмиды pAAV.E03.P3.hF8co-SQ.PA75.
На ФИГ. 2 показано схематическое представление цис-плазмиды pAAV.E12.P3.hF8co-SQ.PA75.
На ФИГ. 3 показано схематическое представление цис-плазмиды pAAV.E03.P2.hF8co-SQ.PA75.
На ФИГ. 4 показано схематическое представление цис-плазмиды pAAV.E12.P2.hF8co-SQ.PA75.
10
На ФИГ. 5 показана вариация активности hFVIII перед образованием антител у мышей FVIII KO. Мышам FVIII KO внутривенно (в/в) вводили 10 ГК векторов AAVrh10, экспрессирующих hFVIIIco-SQ из одной из 42 комбинаций энхансеров/промоторов.  Каждый из наборов энхансеров (отмеченных как E01–E14, в таблице 1) комбинировали с промоторами TBG-S1 (левая когорта из каждой группы), A1AT (средняя когорта) и TTR (правая когорта).  Анализом COATEST и твердофазным ИФА с IgG против hFVIII определяли, соответственно, активность hFVIII (A) и титры IgG против hFVIII (B).  Анализы выполняли на мышиной плазме, выделенной на неделе 2 после введения векторов.  Строят график по данным отдельных мышей со средними значениями ± стандартная ошибка среднего (SEM) для показанной активности (n = 10/группу).
10
На ФИГ. 6 показана активность hFVIII и титр антител против hFVIII на неделю 8 после в/в введения вектора у мышей FVIII KO.  Мышам FVIII KO внутривенно (в/в) вводили 10 ГК векторов AAVrh10, экспрессирующих hFVIIIco-SQ из одной из 42 комбинаций энхансеров/промоторов.  Каждый из наборов энхансеров (отмеченных как E01–E14, в таблице 1) комбинировали с промоторами TBG-S1 (левая когорта из каждой группы), A1AT (средняя когорта) и TTR (правая когорта).  Анализом COATEST и твердофазным ИФА с IgG против hFVIII определяли, соответственно, активность hFVIII (A) и титры IgG против hFVIII (B).  Анализы выполняли на мышиной плазме, выделенной на неделе 8 после введения векторов.  Строят график по данным отдельных мышей со средними значениями ± стандартная ошибка среднего (SEM) для показанной активности (n = 10/группу).
10
На ФИГ. 7 показана в динамике активность hFVIII у мышей FVIII KO с после в/в введение 42 энхансерных/промоторных комбинаций векторов.  Мышам FVIII KO внутривенно (в/в) вводили 10 ГК векторов AAVrh10, экспрессирующих hFVIIIco-SQ из одной из 42 комбинаций энхансеров/промоторов.  Каждый из наборов энхансеров (отмеченных как E01–E14, в таблице 1) комбинировали с промоторами TBG-S1 (левая когорта из каждой группы), A1AT (средняя когорта) и TTR (правая когорта).  Анализом COATEST определяли активность hFVIII на плазме мышей, выделяемой каждые две недели после введения векторов.  Строили график по данным отдельных мышей со средними значениями ± SEM (n = 10/группу).
10
На ФИГ. 8 показаны в динамике титры антител против hFVIII у мышей FVIII KO с последующим в/в введением 42 энхансерных/промоторных комбинаций векторов. Мышам FVIII KO внутривенно (в/в) вводили 10 ГК векторов AAVrh10, экспрессирующих hFVIIIco-SQ из одной из 42 комбинаций энхансеров/промоторов.  Каждый из наборов энхансеров (отмеченных как E01–E14, в таблице 1) комбинировали с промоторами TBG-S1 (левая когорта), A1AT (средняя когорта) и TTR (правая когорта).  Титры IgG против hFVIII определяли твердофазным ИФА с IgG против hFVIII на мышиной плазме, выделяемой каждые две недели.  Строили график по данным отдельных мышей (n = 10/группу).
10
На ФИГ. 9 представлено сравнение активности hFVIII и титра антител против hFVIII с последующим в/в введением генома E06.TTR.hFVIIIco-SQ с помощью различных векторных капсид. Мышам FVIII KO в/в вводили 10 ГК векторов AAVrh10, AAV8, AAV9, AAVhu37 или AAVrh64R1, экспрессирующих hFVIIIco-SQ из E06.TTR.  Собирали плазму каждые две недели и анализом COATEST и твердофазным ИФА с IgG против hFVIII определяли, соответственно, активность hFVIII (A) и титры IgG против hFVIII (B).  Строят график по данным отдельных мышей со средними значениями ± стандартная ошибка среднего (SEM) для показанной активности (n = 10/группу).
12
На ФИГ. 10 представлена экспрессия hFVIII в предварительных исследованиях на приматах, не являющихся людьми (NHP). (A) Двум самцам макака-резус в/в вводили 3x10 ГК/кг AAVrh10.ABP2.TBG-S1.hFVIIIco-SQ.  (B) Двум самцам яванского макака в/в вводили 3x1012 ГК/кг AAVhu37.ABP2.TBG-S1.hFVIIIco-SQ.  Для оценки экспрессии hFVIII и наличия антител против трансгена hFVIII у макак еженедельно или раз в две недели отбирали кровь.  Твердофазным ИФА измеряли в плазме экспрессию hFVIII (сплошная линия), а значения выражали в виде среднего ± SEM.  В плазме твердофазным ИФА также определяли титры IgG против hFVIII (штриховая линия).
13
На ФИГ. 11 представлена экспрессия hFVIII у яванских макак. Пяти самцам макака-резус в/в вводили 1,2x10 ГК/кг одного из вариантов AAVrh10.E03.TTR.hFVIIIco-SQ.PA75, AAVrh10.E12.A1AT.hFVIIIco-SQ.PA75, AAVhu37.E03.TTR.hFVIIIco-SQ.PA75, или AAVhu37.E12.A1AT.hFVIIIco-SQ.PA75.  У макак каждые две недели отбирали кровь для оценки экспрессии hFVIII в плазме твердофазным ИФА, а значения выражали в виде среднего ± SEM.
13
На ФИГ. 12 показано образование антител против hFVIII у яванских макак. Пяти самцам макака-резус в/в вводили 1,2x10 ГК/кг одного из вариантов AAVrh10.E03.TTR.hFVIIIco-SQ.PA75, AAVrh10.E12.A1AT.hFVIIIco-SQ.PA75, AAVhu37.E03.TTR.hFVIIIco-SQ.PA75, или AAVhu37.E12.A1AT.hFVIIIco-SQ.PA75.  Для оценки наличия антител против трансгена hFVIII у макак каждые две недели отбирали кровь.  В плазме твердофазным ИФА оценивали титры IgG против hFVIII.  Статистический анализ показан на ФИГ. 14.
На ФИГ. 13 представлена технологическая схема.
На ФИГ. 14 представлен анализ времени до наступления события образования антител против FVIII, показанного на ФИГ. 12.  С использованием лог-рангового критерия (Мантела-Кокса) отмечена статистически значимая разница между AAVrh.10 и AAVhu.37.
На ФИГ. 15 показано сравнение уровней экспрессии rhCG векторами AAVrh10, AAV8, AAV3B и AAV5 (первая инъекция вектора).
На ФИГ. 16A–16D показаны ДНК-копии векторов rhCG в печени в различные моменты времени (AAVrh10, ФИГ. 16A; AAV8, ФИГ. 16B; AAV3B, ФИГ. 16C; AAV5, ФИГ. 16D).
На ФИГ. 17A–17B показаны уровни rhAFP после повторного введения (вторая инъекция вектора) векторов AAV3B (ФИГ. 17A) или AAV5 (ФИГ. 17B), экспрессирующих rhAFP.
На ФИГ. 18A–18B показаны геномные копии вектора rhAFP в печени (ФИГ. 18A, AAV3B.TBG.rhAFP; ФИГ. 18B, AAV5.TBG.rhAFP).
На ФИГ. 19 показаны различные Nab-ответы на AAV у макак.
На ФИГ. 20A–20B представлены уровни векторных ГК (Фиг. 20A) или РНК-транскриптов (Фиг. 20B) в печени мышей, которым инъецировали векторы с энхансером/промотором AAVrh10, экспрессирующие hFVIIIco IV, как описано в разделе 6.3.8.
На ФИГ. 21 представлены уровни РНК-транскриптов hFVIII в мышце (правая икроножная), правом яичке, поджелудочной железе, правой почке, селезенке, правом легком и сердце мышей, которым инъецировали векторы с энхансером/промотором AAVrh10, экспрессирующие hFVIIIco IV, как описано в разделе 6.3.8.
12
На ФИГ. 22 показан график, демонстрирующий долговременную стабильную экспрессию человеческого FVIII у яванского макака (35 месяцев) после однократной внутривенной инъекции AAVhu37.TBG-S1.hFVIII-SQ.PA75 с дозой 3x10 ГК/кг.
На ФИГ. 23 показан график, демонстрирующий уровни ферментов в печени (АЛТ, Ед/мл, квадраты; АСТ, Ед/мл, круги) у макак из ФИГ. 22.
На ФИГ. 24 показан график, демонстрирующий ответ в виде нейтрализующих антител (Nab) на капсид AAVhu.37.
На ФИГ. 25 представлено выравнивание последовательности hFVIIIco (SEQ ID NO: 2) по сравнению с нативной последовательностью hFVIII (SEQ ID NO: 1).
5. ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Варианты реализации, описанные в данной заявке, относятся к применению репликационно дефектного аденоассоциированного вируса (AAV) для доставки гена человеческого фактора VIII (hFVIII) в клетки печени пациентов (субъектов-людей) с диагностированной гемофилией A.  Рекомбинантный вектор AAV (rAAV), применяемый для доставки гена hFVIII (rAAV.hFVIII), должен обладать тропизмом по отношению к печени (например, rAAV, несущий капсид AAVhu.37 или AAVrh.10), а трансген hFVIII должен управляться специфическими для печени элементами контроля экспрессии.  В одном варианте реализации изобретения элементы контроля экспрессии включают один или более из следующих элементов: энхансер транстиретина (TTR); промотор транстиретина (TTR) и сигнал полиA.  Такие элементы описаны далее в данном документе.
Как используется в данном документе, «капсид AAVhu.37» относится к hu.37, имеющему аминокислотную последовательность из Genbank, номер регистрации: AAS99285, SEQ ID NO: 17, которая включена в данный документ путем ссылки.  Допускается некоторая вариация этой кодирующей последовательности, которая может включать последовательности с около 99 % идентичности к эталонной аминокислотной последовательностью в AAS99285 и US 2015/0315612 (которые включены в данный документ путем ссылки) (т. е. менее чем около 1 % вариации от эталонной последовательности). Поэтому были описаны способы получения капсидных кодирующих последовательностей и способы продукции вирусных векторов rAAV.  См., например, Gao, et al, Proc. Natl. Acad. Sci. США 100 (10), 6081-6086 (2003) и US 2015/0315612.
Как используется в данном документе, «капсид AAVrh10» относится к rh.10, имеющему аминокислотную последовательность из Genbank, номер регистрации: AAO88201, SEQ ID NO: 18, которая включена в данный документ путем ссылки.  Допускается некоторая вариация этой кодирующей последовательности, которая может включать последовательности с около 99 % идентичности к эталонной аминокислотной последовательностью в AAO88201 и US 2013/0045186A1 (т. е. менее чем около 1 % вариации от эталонной последовательности), при условии, что поддерживается целостность лигандсвязывающего сайта для очистки с аффинным захватом, а изменение в последовательностях существенно не изменяет диапазон pH для капсида для обеспечения очистки на ионообменной смоле (как обсуждается далее в данном документе).  Поэтому были описаны способы получения капсидных кодирующих последовательностей и способы продукции вирусных векторов rAAV.  См., например, Gao, et al, Proc. Natl. Acad. Sci. США 100 (10), 6081–6086 (2003) и US 2013/0045186A1.
Как используется в данном документе, термином «титр NAb» определяется величина продуцирования нейтрализующего антитела (например, Nab против AAV), которое нейтрализует физиологические действие своего целевого эпитопа (например, AAV).  Титры NAb против AAV можно измерять, как описано, например, в Calcedo, R., et al., Worldwide Epidemiology of Neutralizing Antibodies to Adeno-Associated Viruses. Journal of Infectious Diseases, 2009. 199(3): p. 381–390, которая включена в данный документ путем ссылки.
Термины «процент (%) идентичности», «идентичность последовательностей», «процент идентичности последовательностей» или «процентная идентичность», в контексте аминокислотных последовательностей, относится к остаткам в двух последовательностях, которые являются одинаковыми при выравнивании для определения соответствия.  Процент идентичности можно легко определять для аминокислотных последовательностей для полной длины белка, полипептида, около 32 аминокислот, около 330 аминокислот или их пептидного фрагмента, или соответствующих кодирующих секвенированных последовательностей нуклеотидных последовательностей.  Подходящий аминокислотный фрагмент может в длину содержать по меньшей мере около 8 аминокислот и может содержать до около 700 аминокислот.  В целом, при упоминании терминов «идентичность», «гомология» или «сходство» между двумя различными последовательностями, то «идентичность», «гомология» или «сходство» определяют в отношении «выровненных» последовательностей.  «Выровненные» последовательности или «выравнивания» относятся к множеству последовательностей нуклеиновых кислот или белков (аминокислот), часто содержащих корректировки по отсутствующим или дополнительным основаниям или аминокислотам, по сравнению с эталонной последовательностью.  Выравнивания выполняют с использованием любого из разнообразия общедоступных или коммерчески доступных программ для множественного выравнивания последовательностей.  Для аминокислотных последовательностей доступны программы выравнивания последовательностей, например программы Clustal Omega, Clustal X, MAP, PIMA, MSA, BLOCKMAKER, MEME и Match-Box.  Как правило, любую из этих программ используют с настройками по умолчанию, хотя специалист в данной области может при необходимости изменять эти настройки. В альтернативном варианте специалист в данной области может использовать другой алгоритм или компьютерную программу, которая обеспечивает по меньшей мере тот же уровень идентичности или выравнивания, которые предоставляются эталонными алгоритмами и программами.  См., например, J. D. Thomson et al, Nucl. Acids. Res., “A comprehensive comparison of multiple sequence alignments”, 27(13):2682-2690 (1999).
Как используется в данном документе, термин «функционально связанный» относится как к последовательностям контроля экспрессии, которые примыкают к интересующему гену, так и последовательностям контроля экспрессии, которые действуют в транс-положении или на расстоянии контролируют интересующий ген.
«Дефектный по репликации вирус» или «вирусный вектор» относится к рекомбинантной, синтетической или искусственной вирусной частице, в которой в вирусный капсид или оболочку упакована экспрессионная кассета, содержащая интересующий ген, причем упакованы также в этот вирусный капсид или оболочку любые вирусные геномные последовательности также являются дефектными по репликации, т. е. они не могут создавать вирионы потомства, но сохраняют способность инфицировать клетки-мишени. В одном варианте реализации изобретения геном вирусного вектора не включает гены, кодирующие ферменты, требуемые для репликации (геном может быть сконструирован так, чтобы быть «выпотрошенным» — содержащим только интересующий трансген, фланкированный сигналами, необходимыми для амплификации и упаковки искусственного генома), но эти гены могут предоставляться во время продукции. Поэтому считается, что его безопасно использовать в генной терапии, поскольку не может происходить репликация и инфицирование вирионами потомства, за исключением того случая, когда присутствует требуемый для репликации вирусный фермент.
Следует отметить, что термины в единственном числе относится к одному или более элементам. По существу, термины в единственном числе, термины «один или более» и «по меньшей мере один» применяются в данном документе взаимозаменяемо.
Слова «содержать», «содержит» и «содержащий» должны толковаться как включающие, а не исключающие.  Слова «состоит», «состоящий» и их варианты должны толковаться как включающие, а не исключающие.  При том что различные варианты реализации изобретения в данном описании представлены с использованием стиля «содержащий», в других обстоятельствах родственный вариант реализации изобретения также подразумевает необходимость интерпретации и описания с использованием стиля «состоящий из» или «состоящий по существу из».
Как используется в настоящем описании термин «около» означает вариабельность на 10 % от данного эталонного значения, если не указано иное.
Если в данном документе не указано иное, технические и научные термины, использованные в данном документе, имеют то же самое значение, которое обычно понимается средним специалистом в данной области, и учитывая ссылки на опубликованные тексты, которые предоставляют специалисту в данной области общим руководством для множества терминов, использованных в настоящей заявке.
5.1 Векторы для генной терапии
В одном аспекте для применения в генной терапии предложен рекомбинантный аденоассоциированный вирусный (rAAV) вектор, несущий ген фактора 8 сворачивания крови человека (hF8 или hFVIII).  Вектор rAAV.hFVIII должен обладать тропизмом по отношению к печени (например, rAAV, несущий капсид AAVhu.37 или AAVrh.10), а трансген hFVIII должен управляться специфическими для печени элементами контроля экспрессии.  Вектор готовится в виде препарата в буфере/носителе, подходящем для инфузии субъектам-людям.  Буфер/носитель должен содержать компонент, который предотвращает прилипание rAAV к трубке для инфузии, но не влияет на активность связывания rAAV in vivo.
5.1.1. Вектор rAAV.hFVIII
5.1.1.1. Последовательность hFVIII
Человеческий фактор коагуляции VIII продуцируется в виде большого гликопротеина массой 330 кДа с доменной структурой A1-A2-B-A3-C1-C2, в которой и A и C домены обладают внутренней гомологией последовательностей и приблизительно 40 % идентичностью последовательностей с доменами A и C фактора V (FV), который несет аналогичную доменную структуру. Для прокоагулянтной активности необязателен B-домен, который составляет 38 % от общей последовательности.  FVIII, в котором удален B-домен (BDD) и замещен коротким линкером из 14 аминокислот (FVIII SQ), находится в клиническом применении в качестве заместительного рекомбинантного продукта FVIII, и было показано, что это привело к 17-кратному увеличению уровней мРНК по сравнению с полноразмерным FVIII нормального типа и 30 % увеличению секретированного белка.  См., McIntosh et al, Therapeutic levels of FVIII following a single peripheral vein administration of rAAV vector encoding a novel human factor VIII variant, Blood, 121(17):3335-44 (Feb 2013) и Ward et al, Codon optimization of human factor VIII cDNAs leads to high-level expression, Blood, 117(3):798-807 (Jan 2011), которые включены в данный документ путем ссылки.
В одном варианте реализации изобретения ген hFVIII, кодирующий белок hFVIII, показан в SEQ ID NO: 3, являющейся последовательностью FVIII, у которой удален B-домен (BDD) и замещен коротким линкером из 14 аминокислот (FVIII-BDD-SQ).  Таким образом, в одном варианте реализации изобретения трансген hFVIII может включать, но не ограничиваться, одной или более последовательностей, представленных SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO: 2, которые представлены в приложенном перечне последовательностей, который включен в данный документ путем ссылки.  В SEQ ID NO: 1 предложена кДНК для нативного человеческого FVIII-BDD-SQ.  В SEQ ID NO: 2 предложена сконструированная кДНК для человеческого FVIII-BDD-SQ, который прошел кодон-оптимизацию для экспрессии у людей (иногда называемый в данном документе как hFVIIIco-SQ или hFVIIIco-BDD-SQ).  Необходимо понимать, что ссылка на hFVIII в данном документе, в некоторых вариантах реализации изобретения, относится к нативной или кодон-оптимизированной последовательности hFVIII-BDD-SQ.  Альтернативно или дополнительно, могут использоваться доступные в сети или коммерчески доступные компьютерные программы, а также предоставляющие услуги компании для обратной трансляции аминокислотных последовательностей в нуклеотидные кодирующие последовательности, включая как РНК, так и/или кДНК.  См., например, обратно транслированные последовательности от компаний EMBOSS, www.ebi.ac.uk/Tools/st/ ; Gene Infinity (www.geneinfinity.org/sms-/sms_backtranslation.html); ExPasy (www.expasy.org/tools/).  Предполагается, что охвачены все нуклеиновые кислоты, кодирующие описанные полипептидные последовательности hFVIII, включая нуклеотидные последовательности, которые были оптимизированы для экспрессии у необходимого целевого субъекта (например, методом оптимизации кодонов).  В одном варианте реализации изобретения нуклеотидная последовательность, кодирующая hFVIII, имеет по меньшей мере 95 % идентичность с нативной кодирующей hFVIII последовательностью SEQ ID NO: 1.  В другом варианте реализации изобретения нуклеотидная последовательность, кодирующая hFVIII, имеет по меньшей мере 90, 85, 80, 75, 70 или 65 % идентичность с нативной кодирующей hFVIII последовательностью SEQ ID NO: 1.  В одном варианте реализации изобретения нуклеотидная последовательность, кодирующая hFVIII, имеет около 77 % идентичность с нативной кодирующей hFVIII последовательностью SEQ ID NO: 1.  В одном варианте реализации изобретения нуклеотидная последовательность, кодирующая hFVIII представляет собой SEQ ID NO: 2.  В другом варианте реализации изобретения нуклеотидная последовательность, кодирующая hFVIII, имеет по меньшей мере 99 %, 97 %, 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 %, 70 % или 65 % идентичность с нативной кодирующей hFVIII последовательностью SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2.  В другом варианте реализации изобретения нуклеотидная последовательность, кодирующая hFVIII представляет собой SEQ ID NO: 19.  В другом варианте реализации изобретения нуклеотидная последовательность, кодирующая hFVIII, имеет по меньшей мере 90, 85, 80, 75, 70 или 65 % идентичность с кодирующей hFVIII последовательностью SEQ ID NO: 19.  В еще одном варианте реализации изобретения нуклеотидная последовательность, кодирующая hFVIII, имеет по меньшей мере 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99 % идентичность с кодирующей hFVIII последовательностью SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2.  В еще одном варианте реализации изобретения нуклеотидная последовательность, кодирующая hFVIII, имеет по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99 % идентичность с кодирующей hFVIII последовательностью SEQ ID NO: 19.  См. Ward et al, Codon optimization of human factor VIII cDNAs leads to high-level expression, Blood, 117(3):798-807 (Jan 2011), которая включена в данный документ путем ссылки для обсуждения различных вариантов FVIII-SQ, включая кодон-оптимизированные варианты.
Кодон-оптимизированные кодирующие области могут конструироваться различными разнообразными методами.  Эту оптимизацию можно выполнять, используя методы, которые доступны онлайн (например, GeneArt), опубликованные методы или компании, которые обеспечивают услуги по оптимизации кодонов, например DNA2.0 (г. Менло-Парк, штат Калифорния, США).  Один подход для оптимизации кодонов описан, например, в международной публикации патента № WO 2015/012924, которая включена в данный документ путем ссылки.  См. также, например, публикацию патента США № 2014/0032186 и публикацию патента США № 2006/0136184.  Соответственно модифицируют всю длину открытой рамки считывания (ORF) для данного продукта.   Тем не менее, в некоторых вариантах реализации изобретения, можно изменять только фрагмент ORF. Путем использования одного из этих методов, специалист может применять значения частоты встречаемости к любой заданной полипептидной последовательности и получать фрагмент нуклеиновой кислоты кодон-оптимизированного кодирующей области, которая кодирует данный полипептид.
Для выполнения фактических изменений в кодоны или для синтеза сконструированных кодон-оптимизированных кодирующих области доступен ряд вариантов, описанных в данном документе.  Такие модификации или синтез можно выполнять с использованием стандартных и обычных молекулярных биологических манипуляций, хорошо известных средним специалистам в данной области. В одном подходе стандартными способами синтезируются наборы комплементарных олигонуклеотидных пар из 80–90 нуклеотидов, каждый по длине и протяженности длины соответствующий требуемой последовательности. Эти олигонуклеотидные пары синтезируют таким образом, чтобы при ренатурации они образовывали двухцепочечные фрагменты из 80–90 пар оснований, содержащие липкие концы, например, каждый олигонуклеотид в паре синтезируют до размера 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более оснований больше области, которая является комплементарной к другому олигонуклеотиду в этой паре. Одноцепочечные концы каждой пары олигонуклеотидов разработаны для ренатурации с одноцепочечным концом другой пары олигонуклеотидов. Олигонуклеотидным парам позволяют ренатурировать и затем приблизительно от пяти до шести из этих двухцепочечных фрагментов позволяют ренатурировать вместе посредством липких одноцепочечных концов, а потом их лигируют вместе и клонируют в стандартном бактериальном векторе клонирования, например векторе TOPO, предлагаемом Thermo Fisher Scientific Inc. Затем полученную конструкцию секвенируют стандартными способами. Получают несколько из этих конструкций, состоящих из от 5 до 6 фрагментов из от 80 до 90 пар лигированных вместе фрагментов, т. е. фрагментов из около 500 пар оснований, таким образом, чтобы в наборе плазмидных конструкций была представлена полная требуемая последовательность. Затем вставки этих плазмид разрезают соответствующими ферментами рестрикции и лигируют вместе с образованием готовой конструкции. Готовую конструкцию потом клонируют в стандартном бактериальном векторе клонирования и секвенируют. Дополнительные способы будут непосредственно очевидны специалисту в данной области. В дополнение к этому, синтез генов легко доступен в коммерческой сфере.
5.1.1.2. Вектор rAAV
Поскольку hFVIII изначально экспрессируется в печени, желательно использовать AAV, который проявляет тропизм к печени.  В одном варианте реализации изобретения поставляемый AAV капсид представляет собой AAVrh.37.  В другом варианте реализации изобретения поставляемый AAV капсид представляет собой AAVrh.10.  Однако можно применять любое количество векторов rAAV с тропизмом к печени.
В конкретном варианте реализации изобретения, описанном в примерах ниже, вектор для генной терапии представляет собой вектор AAVhu.37, экспрессирующий трансген hFVIII под контролем промотора транстиретина, называемый rAAVhu.37.TTR.hFVIII.  Внешний компонент вектора AAV представляет собой серотип hu.37, T = 1 икосаэдрального капсида, состоящего из 60 копий трех вирусных белков AAV VP1, VP2 и VP3 в соотношении 1:1:10.  Капсид содержит одноцепочечную ДНК векторного генома rAAV.
Геном rAAVhu.37.TTR.hFVIII содержит трансген hFVIII, фланкированный двумя инвертированными концевыми повторами (ITR) AAV.  Трансген hFVIII содержит энхансер, промотор, кодирующую hFVIII последовательность и сигнал полиаденилирования (полиA).  Эти контрольные последовательности являются «функционально связанными» с генными последовательностями hFVIII.  Экспрессионную кассету можно встраивать в плазмиду, которая используется для продукции вирусного вектора.
ITR представляют собой генетические элементы, отвечающие за репликацию и упаковку генома во время продукции вектора, и они являются единственными вирусными цис-элементами, необходимыми для образования rAAV.  Минимальные последовательности, требуемые для упаковки экспрессионной кассеты в вирусную частицу AAV, представляют собой 5’ и 3’ ITR AAV, которые могут быть того же происхождения, что и капсид, или которые имеют другое происхождение AAV (для получения псевдотипа AAV).  В одном варианте реализации изобретения применяются последовательности ITR из AAV2 или их версия с делецией (∆ITR).  Однако могут выбирать ITR из других источников. Если источник ITR происходит из AAV2, а капсид AAV происходит из другого источника AAV, то получаемый вектор может называться псевдотипным.  Как правило, экспрессионная кассета для вектора AAV содержит 5’ ITR AAV, кодирующие hFVIII последовательности, любые регуляторные последовательности и 3’ ITR AAV.  Тем не менее могут подходить другие конфигурации этих элементов.  Была описана укороченная версия 5’ ITR, называемая ∆ITR, у которой удалены D-последовательность и концевой сайт распознавания (trs).  В других вариантах реализации изобретения применяют полноразмерные 5’ и 3’ ITR AAV.  В одном варианте реализации изобретения последовательность 5' ITR показана в SEQ ID NO: 11.  В одном варианте реализации изобретения последовательность 3' ITR показана в SEQ ID NO: 12.
Экспрессия кодирующей hFVIII последовательности управляется специфическим для печени промотором.  Из-за размера трансгена hFVIII желательно применение промотора относительно малого размера.  Иллюстративная плазмида и вектор, описанные в данном документе, используют промотор транстиретина (TTR) (также называемый в данном документе P3) или его модифицированную версию.  В одном варианте реализации изобретения последовательность промотора TTR показана в SEQ ID NO: 7.  В альтернативном варианте можно применять специфические для печени промоторы, такие как промотор тироксин-связывающего глобулина (TBG) (также называемый в данном документе как P1) или его укороченную версию, TBG-S1, последовательность которой показана в SEQ ID NO: 8.  Другой подходящий промотор представляет собой промотор антитрипсина альфа 1 (A1AT) или его модифицированную версию (также называемый P2), показанную в SEQ ID NO: 9.  Другие подходящие промоторы включают промотор альбумина человека (Miyatake et al., J. Virol., 71:5124 32 (1997)), humAlb; и промотор корового белка вируса гепатита B (Sandig et al., Gene Ther., 3:1002 9 (1996).  См., например, базу данных промоторов специфических промоторов печени, г. Колд Спринг Харбор, rulai.schl.edu/LSPD, которая включена путем ссылки.  Хотя и менее желательно, в описанных в данном документе векторах могут использоваться другие промоторы, такие как вирусные промоторы, конститутивные промоторы, регулируемые промоторы [см., например, WO 2011/126808 и WO 2013/04943] или промотор, восприимчивый к физиологическим сигналам.
В одном варианте реализации изобретения последовательности контроля экспрессии включают один или более энхансеров.  В одном варианте реализации изобретения включена последовательность энхансера транстиретина (enTTR) (100 п. н. последовательности энхансера транстиретина), данная последовательность показана в SEQ ID NO: 5.  См. Wu et al, Molecular Therapy, 16(2):280–289, Feb. 2008, которая включена в данный документ путем ссылки.  В другом варианте реализации изобретения включен энхансер En34 (коровый энхансер размером 34 п. н. аполипопротеина человека из контрольной области печени), который показан в SEQ ID NO: 4.  В еще одном варианте реализации изобретения включен энхансер ABPS (укороченная до 42 п. н. версия дистального энхансера размером 100 п. н. предшественника α1-микроглобулина/букинина [ABP]).  Такая последовательность показана в SEQ ID NO: 6. В другом варианте реализации изобретения представлено более одного энхансера.  Такая комбинация может включать более одной копии любого из описанных в данном документе энхансеров и/или более одного типа энхансеров.  В различных вариантах реализации изобретения энхансеры представлены в одной из следующих комбинаций.
Таблица 1. Комбинации энхансеров
<b>Название комбинации</b>
<b>En34</b>
<b>ABPS</b>
<b>EnTTR</b>
<b>Чистая длина (п. н.)</b>
<b>E01</b>
1
0
0
34
<b>E02</b>
0
1
0
42
<b>E03</b>
0
0
1
100
<b>E04</b>
1
1
0
76
<b>E05</b>
0
1
1
142
<b>E06</b>
1
0
1
134
<b>E07</b>
2
0
0
68
<b>E08</b>
0
2
0
84
<b>E09</b>
0
0
2
200
<b>E10</b>
1
1
1
176
<b>E11</b>
2
0
1
168
<b>E12</b>
0
2
1
184
<b>E13</b>
1
2
0
118
<b>E14</b>
2
1
0
110
В одном варианте реализации изобретения энхансеры комбинируют в следующей последовательности: 5’-EnTTR-ABPS-En34-промотор-3’.  В другом варианте реализации изобретения энхансеры комбинируют в следующей последовательности: 5’-промотор-EnTTR-ABPS-En34-3’. В одном варианте реализации изобретения последовательности контроля экспрессии включают enTTR.  В другом варианте реализации изобретения последовательности контроля экспрессии включают две копии ABPS и 1 копию enTTR.
В дополнение к этому промотор, экспрессионная кассета и/или вектор могут содержать соответствующие сигналы инициации транскрипции, терминации, энхансерные последовательности и сигналы эффективного процессинга РНК.  Такие последовательности включают сигналы сплайсинга и полиаденилирования (полиA); стабилизирующие цитоплазматическую мРНК последовательности; усиливающие эффективность трансляции последовательности (т. е. консенсусная последовательность Козак); усиливающие белковою стабильность последовательности и, при необходимости, последовательности, которые усиливают секрецию кодированного продукта.  В одном варианте реализации изобретения включен сигнал полиаденилирования (полиA) для опосредования терминации мРНК-транскриптов hFVIII.  Сигнал полиA, используемый в данном документе, представляет собой искусственную полиA, которая представляет собой по размеру около 75 п. н. (PA75), показанную в SEQ ID NO: 10.  Примеры других подходящих последовательностей полиA включают в себя среди прочих, например, полиA бычьего гормона роста, SV40, бета-глобина кролика и TK.
В одном варианте реализации изобретения выбирают регуляторные последовательности таким образом, чтобы полный геном вектора rAAV составлял по размеру от около 5 до 5,5 тысяч пар нуклеотидов.  В другом варианте реализации изобретения выбирают регуляторные последовательности таким образом, чтобы полный геном вектора rAAV составлял по размеру около 5,1 т. п. н.  В другом варианте реализации изобретения выбирают регуляторные последовательности таким образом, чтобы полный геном вектора rAAV составлял по размеру около 5,2 т. п. н.  В другом варианте реализации изобретения полный геном вектора rAAV составляет по размеру менее 5 т. п. н.
В одном варианте реализации изобретения геном вектора содержится от нуклеотида 1 до нуклеотида 5110 SEQ ID NO: 13. В одном варианте реализации изобретения геном вектора содержится от нуклеотида 1 до нуклеотида 5194 SEQ ID NO: 14. В одном варианте реализации изобретения геном вектора содержится от нуклеотида 1 до нуклеотида 5138 SEQ ID NO: 15. В другом варианте реализации изобретения геном вектора содержится от нуклеотида 1 до нуклеотида 5222 SEQ ID NO: 16.
5.1.2. Лекарственная форма rAAV.hFVIII
В одном варианте реализации изобретения предложен вектор rAAV.hFVIII в фармацевтической композиции, которая содержит водный носитель, наполнитель, разбавитель или буфер.  В одном варианте реализации буфер представляет собой фосфатно-солевой буфер (ФСБ).  В конкретном варианте реализации изобретения лекарственная форма rAAV.hFVIII представляет собой суспензию, содержащую эффективное количество вектора rAAV.hFVIII, суспензированного в водном растворе, содержащем 0,001 % плюроник F-68 в TMN200 (200 мM хлорида натрия, 1 мM хлорида магния, 20 мM трис, pH 8,0).Однако известны различные подходящие растворы, включая те, которые содержат один или более из следующих компонентов:забуференный солевой раствор, поверхностно-активное вещество и физиологически совместимую соль или смесь солей, подобранных по ионной силе, эквивалентной раствору от около 100 мМ хлорида натрия (NaCl) до около 250 мМ хлорида натрия, или физиологически совместимую соль, подобранную до эквивалентной ионной концентрации.
Например, предложенная в данном документе суспензия может содержать как NaCl, так и KCl.  Значение pH может находиться в диапазоне от 6,5 до 8,5 или от 7 до 8,5, или от 7,5 до 8.  Подходящее поверхностно-активное вещество или комбинацию поверхностно-активных веществ можно выбирать из полоксамеров, т. е. неионогенных триблоксополимеров, состоящих из центральной гидрофобной цепи полиоксипропилена (поли(пропиленоксид)), фланкированного двумя гидрофильными цепями полиоксиэтилена (поли(этиленоксид)), СОЛЮТОЛА HS 15 (макрогол-15 гидроксистеарат), ЛАБРАСОЛА (глицерид полиоксикаприловой кислоты), полиокси-10-олеилового эфира, ТВИНА (сложные эфиры жирных кислот и полиоксиэтиленсорбитана), этанола и полиэтиленгликоля.  В одном варианте реализации изобретения лекарственная форма содержит полоксамер.  Эти сополимеры обычно обозначаются буквой «P» (полоксамер) с последующими тремя цифрами: первые две цифры x 100 дают приблизительную молекулярную массу полиоксипропиленового ядра, а последняя цифра x 10 дает процентное содержание полиоксиэтилена. В одном варианте реализации изобретения выбран полоксамер 188. Поверхностно-активное вещество может присутствовать в количестве от около 0,0005 % до около 0,001 % суспензии.  В другом варианте реализации изобретения вектор суспендируется в водном растворе, содержащем 180 мМ хлорид натрия, 10 мМ фосфат натрия, 0,001 % полоксамер 188, pH 7,3.
В одном варианте реализации изобретения лекарственная форма пригодна для применения для субъектов-людей и вводится внутривенно.  В одном варианте реализации изобретения лекарственную форму доставляют через периферическую вену посредством болюсной инъекции. В одном варианте реализации изобретения лекарственную форму доставляют через периферическую вену посредством инфузии в течение около 10 минут (±5 минут).  В одном варианте реализации изобретения лекарственную форму доставляют через периферическую вену посредством инфузии в течение около 90 минут (±10 минут).  В другом варианте реализации изобретения лекарственную форму доставляют через периферическую вену посредством инфузии в течение около 20 минут (±5 минут). В другом варианте реализации изобретения лекарственную форму доставляют через периферическую вену посредством инфузии в течение около 30 минут (±5 минут). В другом варианте реализации изобретения лекарственную форму доставляют через периферическую вену посредством инфузии в течение около 40 минут (±5 минут). В другом варианте реализации изобретения лекарственную форму доставляют через периферическую вену посредством инфузии в течение около 50 минут (±5 минут). В другом варианте реализации изобретения лекарственную форму доставляют через периферическую вену посредством инфузии в течение около 60 минут (±5 минут). В другом варианте реализации изобретения лекарственную форму доставляют через периферическую вену посредством инфузии в течение около 70 минут (±5 минут). В другом варианте реализации изобретения лекарственную форму доставляют через периферическую вену посредством инфузии в течение около 80 минут (±5 минут). Однако данный период времени может, при необходимости или желании, корректироваться.  Для введения содержащей AAV композиции, описанной в данном документе, и необязательно для совместного введения других активных лекарственных средств или применения терапий в сочетании с опосредованной AAV доставки hFVIII, описанной в данном документе, может применяться любой подходящий способ или путь.  Пути введения включают, например, системный, пероральный, ингаляционный, интраназальный, внутритрахеальный, внутриартериальный, интраокулярный, внутривенный, внутримышечный, подкожный, внутрикожный и другие парентеральные пути введения.
11
14
11
13
12
14
13
В одном варианте реализации изобретения состав может содержать, например, от около 1,0 x 10 геномных копий на килограмм массы тела пациента (ГК/кг) до около 1 x 10 ГК/кг, от около 5 x 10 геномных копий на килограмм массы тела пациента (ГК/кг) до около 3 x 10 ГК/кг или от около 1 x 10 до около 1 x 10 ГК/кг, при измерении методом окПЦР или цифровой капельной ПЦР (цкПЦР), как описано, например, в M. Lock et al, Hum Gene Ther Methods. 2014 Apr;25(2):115–25. doi: 10.1089/hgtb.2013.131. Epub 2014 Feb 14, которая включена в данный документ путем ссылки.  В одном варианте реализации изобретения лекарственная форма rAAV.hFVIII представляет собой суспензию, содержащую по меньшей мере 1x10геномных копий (ГК)/мл или больше, при измерении окПКЦ или цифровой капельной ПЦР (цкПЦР), как описано в, например, в M. Lock et al, выше.
С целью обеспечения удаления пустых капсидов из дозы AAV.hFVIII, которую вводили пациентам, пустые капсиды отделяют от векторных частиц во время процесса очистки вектора, используя, например, обсуждаемый в данном документе метод.  В одном варианте реализации изобретения векторные частицы, содержащие упакованные геномы, очищают от пустых капсидов с использованием процесса, описанного в международной заявке на патент № PCT/US2016/066013, поданной 9 декабря 2016 г. и заявке на патент США № 62/322,055, поданной 13 апреля 2016 г. и озаглавленной «Scalable Purification Method for AAVrh.10 (масштабируемый метод очистки AAVrh.10)», которые включены в данный документ путем ссылки.  Вкратце, описана двухстадийная схема очистки, которая избирательно захватывает и выделяет содержащие геном векторные частицы rAAV из осветленного концентрированного супернатанта клеточной культуры, продуцирующей rAAV.  В процессе используется метод аффинного захвата, проводимый при высокой концентрации солей, с последующим методом с использованием анионообменной смолы, проводимым при высоком значении pH, что обеспечивает получение векторных частиц rAAV практически не содержащих промежуточных продуктов rAAV.  Для векторов на основе AAVhu.37 могут применяться аналогичные методы очистки.  Другие методы очистки описаны, например, в заявках на патент США № 62/266,347, 62/266,357, 62/322,071, 62/266,351, 62/322,083, 62/266,341 и 62/322,098, каждая из которых включена в данный документ путем ссылки.
12
12
12
12
12
13
Поскольку может применяться любой традиционный технологический процесс, то описанный в данном документе процесс (и в международной заявке на патент № PCT/US2016/066013) обеспечивает выходы векторных препаратов, в которых от 50 до 70 % частиц содержат векторный геном, т. е. от 50 до 70 % заполненных частиц. Таким образом примерная доза составляет 1,6x10 ГК/кг, а общая доза частиц будет составлять от 2,3x10 до 3x10частиц. В другом варианте реализации изобретения предложенная доза оказывается на половину логарифма выше или равна 5x10 ГК/кг, а общая доза частиц будет составлять от 7,6x10 до 1,1x10 частиц. В одном варианте реализации изобретения лекарственная форма характеризуется содержанием концентрата rAAV, имеющего соотношение «пустых» к «полным» равным 1 или меньше, предпочтительно менее 0,75, предпочтительнее 0,5, предпочтительно менее 0,3.
Вкратце, в одном варианте реализации изобретения предложен способ отделения вирусных частиц AAV от капсидных промежуточных продуктов AAV, который включает: проведение для смеси, содержащей рекомбинантные вирусные частицы AAV и капсидные промежуточные продукты AAV, жидкостной хроматографии быстрого разрешения, в ходе которой вирусные частицы AAV и промежуточные продукты AAV связываются с анионообменной смолой, уравновешенной при pH около 10,0, и проведение солевого градиента при контроле элюата на поглощение в ультрафиолете при длине волны от около 260 до около 280, причем полные капсиды AAV собирают из фракции, которая элюируется, когда соотношение A260/A280 достигает точки перегиба.
В одном варианте реализации изобретения данный метод дополнительно включает (a) смешивание суспензии, содержащей рекомбинантные вирусные частицы AAV и капсидные промежуточные продукты AAV, и буфера A, содержащего от 20 мМ до 50 мМ бис-триспропана (BTP) и pH около 10,0; (b) нанесение суспензии из (a) на колонку с сильной анионообменной смолой; (c) промывку нагруженной анионообменной смолы 1 % буфером B, который содержит соль с ионной силой от 10 мМ до 40 мМ NaCl и BTP с pH около 10,0; (d) приложение градиента с возрастающей концентрацией соли к нагруженной и промытой анионообменной смоле, причем солевой градиент эквивалентен от около 10 мМ до около 40 мМ NaCl, и (e) сбор частиц rAAV из элюата, полученного при концентрации солей, эквивалентной по меньшей мере 70 мМ NaCl, при этом частицы rAAV являются по меньшей мере на около 90 % очищенными от промежуточных продуктов AAV. В одном варианте реализации изобретения это значение определяется по числу геномных копий.
В одном варианте реализации изобретения промежуточные продукты элюируют из анионообменной смолы, когда концентрация солей эквивалентна более чем около 50 мМ NaCl. В еще одном варианте реализации изобретения буфер A дополнительно смешан с NaCl до конечной концентрации 1M с целью образования или получения буфера B. В еще одном варианте реализации изобретения солевой градиент имеет ионную силу эквивалентную от 10 мМ до около 190 мМ NaCl. Градиент элюирования может составлять от 1 % буфера B до около 19 % буфера B. Необязательно емкость, содержащая анионообменную смолу представляет собой монолитную колонку, причем буфер A, буфер B и солевой градиент составляют около 60 объемов колонки.
Концентрат или препарат частиц rAAV (с упакованным геномом) является «практически свободным» от пустых капсидов AAV (и других промежуточных продуктов), когда частицы rAAV в концентрате составляют по меньшей мере от около 75 % до около 100 %, по меньшей мере около 80 %, по меньшей мере около 85 %, по меньшей мере около 90 %, по меньшей мере около 95 % или по меньшей мере 99 % rAAV в концентрате, а «пустые капсиды» составляют в концентрате или препарате менее около 1 %, менее около 5 %, менее около 10 %, менее около 15 % rAAV.
В дополнительном варианте реализации изобретения средний выход частиц rAAV составляет по меньшей мере около 70 %.  Это значение можно рассчитывать путем определения титра (геномных копий) в данной смеси, нагруженной на колонку, и количества, присутствующего в конечных элюатах.  Дополнительно это можно определять на основе к-ПЦР анализа и/или методик ДСН-ПААГ-электрофореза, таких как описанные в данном документе, или таких, которые описаны в данной области.
Например, для расчёта содержания пустых и полных частиц, объемы в полосе VP3 выбранного образца (например, препарата очищенного на градиенте йодиксанола, в котором число ГК = числу частиц) отмечали на графике по сравнению с внесенным количеством ГК-частиц.  Полученное линейное уравнение (y = mx+c) используют для расчета количества частиц в объемах полос пиков исследуемого препарата. Затем количество частиц (част.) во внесенных 20 мкл умножают на 50 для получения количества частиц (част.) /мл. Значение частиц/мл, деленное на ГК/мл, дает соотношение частиц к геномным копиям (част./ГК). Вычисление част./мл–ГК/мл дает величину пустых част./мл. Значение пустых част./мл, деленное на част./мл и x 100, дает процентное содержание пустых частиц.
В целом, методы для оценки количества пустых капсидов и векторных частиц AAV с упакованными геномами, известны в данной области.См., например, Grimm et al., Gene Therapy (1999) 6:1322-1330; Sommer et al., Molec. Ther. (2003) 7:122–128. Для испытания на денатурированные капсиды, методы включают проведение для обработанного концентрата AAV электрофореза на ДСН-полиакриламидном геле, состоящем из любого геля, способного разделять три капсидных белка, например гель с градиентом, содержащим в буфере 3–8 % трис-ацетата, затем обработка геля до разделения исследуемого материала и блоттинг геля на нейлоновые или нитроцеллюлозные мембраны, предпочтительно нейлоновые.Затем антитела против капсидов AAV применяют как первичные антитела, которые связываются с денатурированными капсидными белками, предпочтительно моноклональное антитело против капсида AAV, наиболее предпочтительно моноклональное антитело B1 против AAV-2 (Wobus et al., J. Virol. (2000) 74:9281–9293). Затем используют вторичное антитело, которое связывается с первичным антителом и содержит средство для определения связывания с первичным антителом, предпочтительнее антитело против IgG, содержащее ковалентно связанную с ним молекулу детекции, наиболее предпочтительно антитело овцы против мышиного IgG, ковалентно связанное с пероксидазой хрена. Метод для выявления связывания используется для полуколичественного определения связывания между первичными и вторичными антителами, предпочтительно метод выявления способен определять эмиссию радиоактивных изотопов, электромагнитное излучение или колориметрические изменения, наиболее предпочтительно — это набор для выявления хемилюминесценции. Например, можно брать образцы из фракций колонки для ДСН-ПААГ-электрофореза и нагревать в буфере для внесения, содержащем восстанавливающий агент (например, ДТТ) и разделять капсидные белки на готовых градиентных полиакриламидных гелях (например, Novex).Можно выполнять окрашивание серебром с использованием набора SilverXpress (Invitrogen, штат Калифорния) в соответствии с инструкциями производителя. В одном варианте реализации изобретения концентрацию векторных геномов (вг) в фракциях колонки можно измерять количественным ПЦР в реальном времени (К-ПЦР).Образцы разбавляют и обрабатывают ДНКазой I (или другой подходящей нуклеазой) для удаления экзогенной ДНК.После инактивации нуклеазы, образцы дополнительно разбавляют и амплифицируют с использованием праймеров и флуорогенного зонда TaqMan™, специфического к последовательности ДНК между праймерами. Количество циклов, требуемое для достижения определенного уровня флуоресценции (пороговый цикл, Ct), измеряется для каждого образца на системе выявления последовательностей Prism 7700, Applied Biosystems.Для получения стандартной кривой в реакции К-ПЦР применяют плазмидную ДНК, содержащую последовательности, идентичные к последовательностям, содержащимся в векторе AAV.Значения порогового цикла (Ct), полученные из образцов, используют для определения титра векторного генома путем нормализации его со значением Ct стандартной кривой для плазмиды.Можно также использовать анализы по конечной точке, основанные на цифровой ПЦР.
В одном аспекте в данном документе предложен оптимизированный метод к-ПЦР, в котором используется широкий спектр сериновых протеаз, например протеиназа K (такая как коммерчески доступная у Qiagen). Более конкретно, анализ титра генома оптимизированной кПЦР аналогичен стандартному анализу, за исключением того, что после расщепления ДНКазой I образцы разбавляют буфером для протеиназы K и обрабатывают протеиназой K, с последующей ее инактивацией нагреванием. Подходящие образцы разбавляют буфером для протеиназы K в количестве равном объему образца. Буфер для протеиназы K можно концентрировать в 2 раза или выше. Как правило, обработка протеиназой K составляет около 0,2 мг/мл, но может варьировать от 0,1 мг/мл до около 1 мг/мл. Этап обработки обычно проводят при температуре около 55 °C в течение около 15 минут, но могут выполнять при более низкой температуре (например, от около 37 °C до около 50 °C) в течении более длительного периода времени (например, от около 20 минут до около 30 минут) или при более высокой температуре (например, до около 60 °C) в течение более короткого периода времени (например, от около 5 до 10 минут). Аналогичным образом инактивацию нагреванием обычно проводят при температуре около 95 °C в течение около 15 минут, но могут выполнять при более низкой температуре (например, от около 70 до около 90 °C) в течении продолжительного периода времени (например, от около 20 минут до около 30 минут). Затем образцы разбавляют (например, 1000-кратно) и подвергают анализу TaqMan, как описано в стандартном анализе.
Дополнительно или альтернативно можно использовать капельный цифровой ПЦР (кцПЦР).  Например, были описаны методы для определения титров одноцепочечного и самокомплементарного генома вектора AAV с помощью кцПЦР.  См., например, M. Lock et al, Hu Gene Therapy Methods, Hum Gene Ther Methods. 2014 Apr;25(2):115–25. doi: 10.1089/hgtb.2013.131. Epub 2014 Feb 14.
5.1.3 Промышленное получение
Вектор rAAV.hFVIII можно промышленно получать как показано на технологической схеме, показанной на ФИГ. 13.  Вкратце, клетки (например, клетки HEK 293) размножают в подходящей системе для культивирования и трансфицируют для получения векторов.  Затем собирают вектор rAAV.hFVIII, концентрируют и очищают для получения субстанции вектора, которую потом разливают и готовят готовый препарат в финишном технологическом процессе.
Способы промышленного получения векторов для генной терапии, описанные в данном документе, включают способы, хорошо известные в данной области, такие как получение плазмидной ДНК, используемой для продукции векторов для генной терапии, получения и очистки этих векторов.  В некоторых вариантах реализации изобретения вектор для генной терапии представляет собой вектор AAV, а полученные плазмиды представляют собой цис-плазмиду AAV, кодирующую геном AAV и интересующий ген, транс-плазмиду AAV, содержащую гены rep и cap AAV, и аденовирусную хелперную плазмиду.  Процесс получения вектора может включать такие стадии способа, как размножение клеточной культуры, пересев клеток, высевание клеток, трансфекция клеток плазмидной ДНК, замена среды после трансфекции на бессывороточную среду и сбор содержащих вектор клеток и культуральной среды.  Собранные содержащие вектор клетки и культуральную среду называют в данном документе неочищенным урожаем клеток.
После этого неочищенный урожай клеток подвергают таким стадиям способа, как концентрирование урожая векторов, диафильтрация урожая векторов, микрофлюидизация урожая векторов, расщепление нуклеазами урожая векторов, фильтрация микрофлюидизированного промежуточного продукта, очистка хроматографией, очистка ультрацентрифугированием, замена буфера фильтрацией с тангенциальным потоком и приготовление лекарственной формы и фильтрация для получения субстанции вектора.
В одном варианте реализации изобретения продуцирующая плазмида, является такой как показана в SEQ ID NO: 13. В одном варианте реализации изобретения продуцирующая плазмида, является такой как показана в SEQ ID NO: 14. В одном варианте реализации изобретения продуцирующая плазмида, является такой как показана в SEQ ID NO: 15. В другом варианте реализации изобретения продуцирующая плазмида является такой, как показана в SEQ ID NO: 16.
В конкретном варианте реализации изобретения способы, используемые для промышленного получения векторов для генной терапии описаны в разделе 8, ниже.
5.2 Популяция пациентов
По нескольким причинам выбранной исследуемой популяцией являются пациенты с тяжелой или умеренной гемофилией A (HemA).  Пациенты с тяжелой гемофилией A определены как имеющие менее 1 % от нормальной активности фактора VIII (FVIII), таким образом, требующие частых инфузий FVIII для контроля их предрасположенности к кровотечениям. Это представляет значительное затруднение в отношении ведения нормального образа жизни и, в дополнение к этому, уровни FVIII в крови проходят через хорошо известные пики и имеют снижающийся профиль, что неоптимально. Тот факт, что уровни FVIII в крови у тяжелых пациентов оказываются меньше 1 %, дает возможность легко измерять даже от низкого до умеренного увеличения уровней FVIII в крови после введения rAAV.hVIII.  Недавние клинические исследования подтвердили действенность этого подхода. Пациенты с умеренной HemA определены, как имеющие уровни от 1 % вплоть до 5 % FVIII в крови.
Пациенты, которые являются кандидатами для проведения лечения предпочтительно представляют собой взрослых мужчин возрастом ≥18 с диагностированной умеренной/тяжелой или тяжелой гемофилией A. В одном варианте реализации изобретения пациент имеет базовую активность FVIII ≤2 % от нормальной или задокументированной истории активности FVIII ≤2 %.  В некоторых вариантах реализации изобретения можно лечить пациента возрастом <18 лет.  Кандидаты для лечения включают субъектов, у которых было по меньшей мере 3 эпизода с кровотечением за год, которые требуют лечения FVIII по необходимости.  Другие кандидаты для лечения, включают субъектов, которых лечат FVIII в профилактическом режиме.  Другие критерии демонстрируют, что для субъекта подходит лечение, включающее по меньшей мере 100 дней истории лечения FVIII; в истории болезни отсутствует образование ингибиторов (нейтрализирующих антител) к экзогенному FVIII; отсутствуют известные аллергические реакции к экзогенному FVIII или любому компоненту векторной композиции rAAV.FVIII.
Перед лечением пациента с гемофилией A необходимо оценивать на наличие NAb к серотипу AAV, используемому для доставки гена hFVIII, (например, AAVhu.37 или AAVrh.10).  Такие NAb могут влиять на эффективность трансдукции и снижать терапевтическую эффективность.  Пациенты с гемофилией A, которые имеют базовый титр NAb ≤ 1:5 являются хорошими кандидатами для лечения с помощью протокола генной терапии rAAV.hFVIII.
Субъектам могут позволять продолжать их стандартные виды лечения (-ий) (например, терапия рекомбинантным FVIII) перед и во время лечения генной терапией по усмотрению лечащего врача.  В альтернативном варианте врач может предпочесть прекратить стандартные виды лечения перед проведением лечения генной терапией и, необязательно, возобновить стандартные виды лечения в качестве котерапии после проведения генной терапии.
Желательные конечные критерии оценки схемы генной терапии определяются по увеличению активности FVIII до 3 % от нормы от базового уровня в течение до 52 недель после проведения лечения генной терапией.  В одном варианте реализации изобретения у пациентов достигаются уровни циркулирующего FVIII (например, 5 % или выше) после лечения с помощью rAAV.hFVIII, самостоятельно и/или в комбинации с использованием дополнительных видов лечения. В другом варианте реализации изобретения у пациентов достигаются уровни циркулирующего FVIII 10 %, 15 %, 20 % или выше после лечения с помощью rAAV.hFVIII самостоятельно и/или в комбинации с использованием дополнительных видов лечения.  В другом варианте реализации изобретения у пациентов достигаются уровни циркулирующего FVIII 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 95 %, 95 % или выше после лечения с помощью rAAV.hFVIII самостоятельно и/или в комбинации с использованием дополнительных видов лечения.
Несмотря на это, пациенты имеющие одну или более из следующих особенностей могут исключаться из лечения по усмотрению их лечащего врача:
1. В истории болезни серьезное заболевание печени (т. е. портальная гипертензия).
2. Серьезное воспаление или цирроз печени.
3. Подтверждение инфекции с активным вирусом гепатита B (ВГB) или вирусом гепатита C (ВГC).
3
4. В истории болезни инфекция вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ) И любой анализ из следующего: число клеток CD4+ <350 клеток/мм, изменение режима антиретровирусной терапии в пределах 6 месяцев до дня 0 или вирусная нагрузка в плазме >200 копий/мл в 2 отдельных случаях при измерении ПЦР.
5. Титр нейтрализирующих антител против AAVhu.37 (или против AAVrh10, соответственно) >1:5 или ≥1:10.
6. Участие (текущее или предыдущее) в другом исследовании генной терапии.
7. Участие в исследовании другого исследуемого лекарственного средства в течение 3 месяцев до скрининга.
В других вариантах реализации изобретения лечащий врач может определить, что наличие одной или более из этих физических особенностей (история болезни), не должно исключать лечение, предложенное в данном документе.
5.3. Дозирование и путь введения
В одном варианте реализации изобретения вектор rAAV.hFVIII доставляется в виде однократной дозы для одного пациента.  В другом варианте реализации изобретения вектор rAAV.hFVIII доставляется в виде множества доз для одного пациента.  В дополнительном варианте реализации изобретения вектор rAAV.hFVIII доставляется в виде двух доз для одного пациента. В одном варианте реализации изобретения субъекту доставляется минимальная эффективная доза (МЭД) (определяемая доклиническим исследованием, описанным в данном документе в примерах). Как используется в данном документе, МЭД относится к дозе rAAV.hFVIII, требуемой для достижения 5 % от нормальной активности фактора VIII.
11
13
11
12
11
12
12
12
12
12
12
12
12
12
12
12
12
12
12
9
15
Как принято, титр векторов определяют на основе содержания ДНК векторного препарата. В одном варианте реализации изобретения для определения содержания ДНК препаратов векторов rAAV.hFVIII используют количественную ПЦР или оптимизированную ПЦР, как описано в примерах. В одном варианте реализации изобретения для определения содержания ДНК препаратов векторов rAAV.hFVIII используют цифровую капельную ПЦР, как описано в примерах. В одном варианте реализации изобретения дозировка составляет от около 1x10 геномных копий (ГК)/кг массы тела до около 1x10 ГК/кг, включая конечные критерии оценки. В одном варианте реализации изобретения дозировка составляет 5x10 ГК/кг. В другом варианте реализации изобретения дозировка составляет 5x10 ГК/кг. В конкретных вариантах реализации изобретения дозировка rAAV.hFVIII, введенного пациенту составляет по меньшей мере 5 x 10 ГК/кг, 1 x 10 ГК/кг, 1,5 x 10 ГК/кг, 2,0 x 10 ГК/кг, 2,5 x 10 ГК/кг, 3,0 x 10 ГК/кг, 3,5 x 10 ГК/кг, 4,0 x 10 ГК/кг, 4,5 x 10 ГК/кг, 5,0 x 10 ГК/кг, 5,5 x 10 ГК/кг, 6,0 x 10 ГК/кг, 6,5 x 10ГК/кг, 7,0 x 10 ГК/кг или 7,5 x 10 ГК/кг. Композиции с дефектными по репликации вирусами также можно готовить в виде дозированных единиц, содержащих количество дефектного по репликации вируса, которое находится в диапазоне от около 1,0 x 10 ГК до около 1,0 x 10 ГК. Как используется в данном документе, термин «дозировка» может относится к общей дозировке, доставляемой субъекту в ходе лечения, или количеству, доставляемому в ходе однократного (или многократных) введения (-ий).
В другом варианте реализации изобретения композицию повторно вводят в более поздний срок.  Необязательно допускается более одного повторного введения.  Такое повторное введение может происходить с тем же типом вектора или с другим вирусным вектором, как описано в данном документе.  В одном варианте реализации изобретения вектор повторно вводят через около 6 месяцев после первого введения.  В другом варианте реализации изобретения вектор повторно вводят через около 1 год после первого введения.  В другом варианте реализации изобретения вектор повторно вводят через около 2 года после первого введения.  В другом варианте реализации изобретения вектор повторно вводят через около 3 года после первого введения.  В другом варианте реализации изобретения вектор повторно вводят через около 4 года после первого введения.  В другом варианте реализации изобретения вектор повторно вводят через около 5 лет после первого введения.  В другом варианте реализации изобретения вектор повторно вводят через около 6 лет после первого введения.  В другом варианте реализации изобретения вектор повторно вводят через около 7 лет после первого введения.  В другом варианте реализации изобретения вектор повторно вводят через около 8 лет после первого введения.  В другом варианте реализации изобретения вектор повторно вводят через около 9 лет после первого введения.  В другом варианте реализации изобретения вектор повторно вводят через около 10 лет после первого введения.
В одном варианте реализации изобретения дозировка достаточна для увеличения уровней фактора VIII у пациента до 1 % от нормального.  В одном варианте реализации изобретения дозировка достаточна для увеличения уровней фактора VIII у пациента до 2% от нормального.  В одном варианте реализации изобретения дозировка достаточна для увеличения уровней фактора VIII у пациента до 3% от нормального.  В другом варианте реализации изобретения дозировка достаточна для увеличения уровней фактора VIII у пациента до 4 % от нормального.  В другом варианте реализации изобретения дозировка достаточна для увеличения уровней фактора VIII у пациента до 5% от нормального.  В другом варианте реализации изобретения дозировка достаточна для увеличения уровней фактора VIII у пациента до 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 % или больше от нормального.
В некоторых вариантах реализации изобретения rAAV.hFVIII вводят в комбинации с одним или более видами терапии для лечения гемофилии A, например с введением рекомбинантного FVIII.
5.4. Измерение клинических критериев
Определение эффективности лечения можно измерять экспрессией и активностью трансгена, что определяется по уровням фактора VIII в плазме и активности фактора VIII.  Дополнительную оценку эффективности можно определять клинической оценкой потребности в заместительной терапии фактора VIII и частотой эпизодов спонтанных кровотечений.  Такие оценивания можно проводить дважды в неделю в течение 4 недель после введения продукта, еженедельно с недели 6 до недели 12, ежемесячно в течение оставшегося периода времени в первый год и с интервалами по 6 месяцев в течение общего периода времени в 5 лет.
Безопасность вектора для генной терапии можно оценивать по количеству нежелательных явлений, отмеченных при медицинском осмотре изменений и/или параметров, определяемых в клинической лаборатории, оцениваемых в множество моментов времени вплоть до около 52 недели после введения вектора.  Хотя физиологическое действие можно наблюдать раньше, например, через около одну неделю, в одном варианте реализации изобретения постоянные устоявшиеся уровни экспрессии достигаются до около 12 недель.  Последующие оценивания можно проводить дважды в неделю в течение 4 недель после введения продукта, еженедельно с недели 6 до недели 12, ежемесячно в течение оставшегося периода времени в первый год и с интервалами по 6 месяцев в течение общего периода времени в 5 лет. Такие оценивания включают:
a. Медицинский осмотр
b. Электрокардиограмму (ЭКГ)
c. Биохимические анализы: Уровни электролитов в сыворотке, АМК, креатинина, кальция, фосфата, общего белка, альбумина, ЛДГ, КФК, АСТ, АЛТ, щелочной фосфатазы, билирубина
d. Гематологический анализ: ОАК и лейкограмма, профиль коагуляции
e. Общий анализ мочи
f. Иммунологическую оценку:
g. Серологическая реакция на капсид hu.37 (или капсид rh.10, соответственно) и на фактор VIII
h. Реакция T-клеток на капсид hu.37 (или капсид rh.10, соответственно) и антигены фактора VIII
i. Оценка векторной ДНК; измерения кПЦР в плазме, моче и слюне.
Увеличение hFVIII, достигаемое вместе с введением rAAV.hFVIII, можно оценивать в виде определенного процентного изменения уровня hFVIII в течение около 12 недель или в другие требуемые моменты времени, по сравнению с уровнями hFVIII у пациента, не болеющего гемофилией A, т. е. так называемыми нормальными уровнями hFVIII равными около 100 %.  В другом варианте реализации изобретения изменение сравнивают с базовыми уровнями hFVIII у пациента.  В одном варианте реализации изобретения желаемая эффективность заключается в увеличении у пациента уровней фактора VIII до 3 % от нормального.  В одном варианте реализации изобретения желаемая эффективность заключается в увеличении у пациента уровней фактора VIII до 4% от нормального.  В одном варианте реализации изобретения желаемая эффективность заключается в увеличении у пациента уровней фактора VIII до 5% от нормального.  В одном варианте реализации изобретения желаемая эффективность заключается в увеличении у пациента уровней фактора VIII до 6% от нормального.  В одном варианте реализации изобретения желаемая эффективность заключается в увеличении у пациента уровней фактора VIII до 7% от нормального.  В одном варианте реализации изобретения желаемая эффективность заключается в увеличении у пациента уровней фактора VIII до 8% от нормального.  В одном варианте реализации изобретения желаемая эффективность заключается в увеличении у пациента уровней фактора VIII до 9% от нормального.  В другом варианте реализации изобретения дозировка достаточна для увеличения уровней фактора VIII у пациента до 10% от нормального.  В другом варианте реализации изобретения дозировка достаточна для увеличения уровней фактора VIII у пациента до 15% от нормального.  В другом варианте реализации изобретения дозировка достаточна для увеличения уровней фактора VIII у пациента до 20 % или больше от нормального.  В одном варианте реализации изобретения проводили исследования на панелях коагуляции как часть стандартного испытания по установлению активности FVIII.
Как используется в данном документе, вектор rAAV.hFVIII «функционально замещает» или «функционально дополняет» организм пациентов с недостаточностью по FVIII активным FVIII, когда в организме пациентов экспрессируется достаточный уровень FVIII для достижения по меньшей мере одного из этих клинических конечных критериев.  Функциональное замещение могут обеспечивать уровни экспрессии hFVIII, которые достигаются всего лишь от около 1 % до менее 100 % от нормальных уровней клинических конечных критериев нормального типа у пациента без гемофилии.
В одном варианте реализации изобретения экспрессию можно наблюдать как ранний ответ через от около 8 часов до около 24 часов после введения дозы.  Один или более из желаемых клинических эффектов, описанных выше, могут наблюдаться в течение от нескольких дней до нескольких недель после введения дозы.
Долговременную (до 260 недель) безопасность и эффективность можно оценивать после введения rAAV.hFVIII.
В одном аспекте предложена схема доставки генного продукта hFVIII в организм пациента-человека.  Данная схема включает (a) доставку вектора rAAV.hFVIII, содержащего экспрессионную кассету, как описано в данном документе, и (b) доставку второго вектора rAAV.hFVIII, содержащего экспрессионную кассету, как описано в данном документе, причем первый рекомбинантный вектор AAV или второй рекомбинантный вектор AAV содержит капсид AAV3B.  Последовательность AAV3B показана в SEQ ID NO: 20, имеющая № регистрации AAB95452.1. В одном варианте реализации изобретения один из первого или второго вектора AAV содержит капсид rh.10.  В одном варианте реализации изобретения один из первого или второго вектора AAV содержит капсид AAVhu.37.  Такие схемы описаны в международной заявке на патент № PCT/US16/42472, которая включена в данный документ путем ссылки.
Вирусные векторы, описанные в данном документе, можно использовать для получения лекарственного средства для доставки hFVIII нуждающемуся в этом субъекту (например, пациенту-человеку), как поставляющие функциональный hFVIII субъекту и/или для лечения заболевания гемофилией A.
В другом аспекте для лечения гемофилии A предложен вектор rAAV.hFIII, описанный в данном документе. В одном варианте реализации изобретения для лечения гемофилии A предложено введение множества доз. В другом аспекте предложен вектор rAAV.hFIII, описанный в данном документе, для производства лекарственного средства для лечения гемофилии A.
В одном варианте реализации изобретения обеспечивается второе введение вектора rAAV.hFVIII.  В одном варианте реализации изобретения вектор rAAV.hFVIII для второго введения имеет тот же капсид AAV, который дается с первой дозировкой.  В одном варианте реализации изобретения вектор rAAV.hFVIII для второго введения имеет капсид AAVrh.10.  В другом варианте реализации изобретения вектор rAAV.hFVIII для второго введения имеет отличающийся от вектора первой дозы капсид AAV.  В одном варианте реализации изобретения вектор rAAV.hFVIII для второго введения обладает тропизмом в отношении печени.  В одном варианте реализации изобретения вектор rAAV.hFVIII для второго введения имеет капсид AAV3B.
В дополнительном аспекте в изобретении обеспечивается нацеливание на гепатоциты пациента.
В одном аспекте доставка первого rAAV и второго rAAV временно разделяется периодом в по меньшей мере один месяц, по меньшей мере около трех месяцев или от около 1 года до около 10 лет.
Следующие примеры предназначены для иллюстрации и не предназначены для ограничения настоящего изобретения.
ПРИМЕРЫ
6. Пример 1. Доклиническое исследование
6.1 Вектор hFVIII
В отличие от человеческого фактора FIX (hFIX) кДНК hFVIII намного больше и необходимо вносить изменения для подгонки этого трансгена к стандартному геному AAV.  Так как трансген hFVIII с удаленным B-доменом (BDD) и с исключением других необходимых элементов транскрипции содержит 1457 аминокислот, то вектор AAV все еще имеет ограниченную емкость упаковки.  Следовательно, были предприняты шаги для снижения размера других элементов, включая элементы контроля экспрессии трансгена.
Для ограничения экспрессии hFVIII в печени при сохранении размера элементов насколько возможно меньшими с целью получения 42 комбинаций энхансеров/промоторов было укорочено и скомбинировано несколько сильных специфических для печени промоторов с сочетаниями до трех специфических для печени энхансерных последовательностей.  После введения векторов AAV на мышах FVIII KO оценивали активность и иммуногенность hFVIII данного трансгена.
6.1.1 Продукция векторов AAV для доклинического исследования
Получали 42 плазмиды, содержащие одну из комбинаций энхансера/промотора.  Получали 14 энхансерных комбинаций, используя три энхансерные последовательности; En34 (коровый энхансер размером 34 п. н. аполипопротеина человека из контрольной области печени), ABPS (укороченная до 42 п. н. версия дистального энхансера размером 100 п. н. предшественника α1-микроглобулина/букинина [ABP]) и EnTTR (энхансерная последовательность размером 100 п. н. из транстиретина).  Ряд энхансерных комбинаций ограничен из-за общего размера ITR-ITR и комбинации энхансеров в следующей последовательности: 5’-EnTTR-ABPS-En34-промотор-3’. Таблица 1. Каждую из 14 энхансерных комбинаций вставляли выше по ходу транскрипции от одного из трех промоторов: TBG-S1 (P1, укороченная версия специфического для печени промотора тироксин-связывающего глобулина или TBG), A1AT (P2, модифицированный промотор SERINA1 [α1-антитрипсин]) и TTR (P3, промотор транстиретина).  Полученные конструкции были сконструированы для экспрессии кодон-оптимизированной версии человеческого белка-фактора FVIII, у которой удален B-домен (BDD) и замещен коротким линкером из 14 аминокислот hFVIIIco-SQ (SEQ ID NO: 2).
Все векторы AAV получали, как описано в Gao G, Lu Y, Calcedo R, et al. Biology of AAV serotype vectors in liver-directed gene transfer to nonhuman primates. Mol Ther. 2006;13(1):77-87, которая включена в данный документ путем ссылки.  Вкратце, экспрессирующие hFVIII плазмиды из одной из 42 комбинаций энхансеров/промоторов упаковывали с вирусным капсидом AAVrh10.  Экспрессирующие hFVIII плазмиды из E06.TTR также упаковывали в вирусные капсиды AAV8, AAV9, AAVhu37 и AAVrh64R1.
6.1.2 Анализ векторов методом ДСН-ПААГ-электрофореза
9
Серии векторов AAVrh10 с комбинациями энхансеров/промоторов, использованные в исследовании, подвергали оценке на чистоту методом электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ДСН-ПААГ), как описано в Lock M, Alvira M, Vandenberghe LH, et al. Rapid, simple, and versatile manufacturing of recombinant adeno-associated viral vectors at scale. Hum Gene Ther. 2010;21(10):1259–1271, которая включена в данный документ путем ссылки.  Вкратце, на ДСН-ПААГ наносили денатурированные и восстановленные векторные образцы, содержащие 5x10 ГК.  Белки окрашивали красным красителем SYPRO (Invitrogen, г. Карслбад, штат Калифорния, США) с последующей фиксацией, визуализацией, а затем количественным определением с использованием системы для анализа изображений Syngene и программного обеспечения GeneTool (Syngene, г. Фредерик, штат Мэриленд, США).  Рассчитывали процент чистоты капсида (белки (VP1, VP2 и VP3, определяемые к общему белку).  Процентное значение чистоты 42 векторов находилось в диапазоне от 29 % (AAVrh10.E12.P3) до 100 %, со средним значением чистоты равным 90 % (данные не показаны).
6.1.3 Мыши
10
Размножающиеся пары мышей FVIII KO получали у The Jackson Laboratory (г. Бар Харбор, штат Мэн, США) и колонию поддерживали в Лабораториях исследования трансляции университета штата Пенсильвания, размещая в специальных условиях без проникновения патогенов).  Все процедуры и протоколы обхождения с животными утверждены Институциональным комитетом по содержанию и использованию животных (IACUC) университета штата Пенсильвания.  Самцам FVIII KO в возрасте 6–12 недель в/в в хвостовую вену инъецировали 10ГК вектора на мышь.  Разбавляли вектор в фосфатно-солевом растворе (ФСБ) и инъецировали 100 мкл этого разведения вектора.  Каждые две недели собирали плазму в пробирки для сбора с цитратом натрия путем отборов крови из ретроорбитального синуса.
6.1.4 Определение активности hFVIII
В плазме измеряли активность hFVIII с помощью набора COATEST SP4 в соответствии с протоколом производителя (DiaPharma, штат Огайо, США).  На неделю 2 после инъекции у мышей обнаруживали широкий диапазон активности hFVIII 0,12–2,12 ИЕ/мл (ФИГ. 5).
Среди прочих пять конструкций демонстрировали значительное увеличение уровней активности: E03.TTR, E05.A1AT, E05.TTR, E06.TTR и E12.A1AT (ФИГ. 5A).  Вариация уровней активности hFVIII, отмеченная на неделе 2, возникла перед образованием антител к трансгену (ФИГ. 5B).  Следовательно существовали зависимые от конструкции значительные отличия в уровнях активности.
6.1.5 Выявление IgG против hFVIII в плазме мышей
Антитела-IgG против hFVIII в плазме мышей измеряли методом твердофазного ИФА, причем все реактивы были получены, если не указано иное, у Sigma-Aldrich (г. Сент-Луис, штат Миссури, США).  Планшеты для твердофазного ИФА покрывали 1 мкг/мл BDD-hFVIII-SQ (Xyntha, Wyeth Pharmaceuticals Inc., г. Даллас, штат Техас, США) в 0,1 M карбонатном буфере (pH 9,6) и инкубировали в течение ночи при 4 °C. Промывали лунки пять раз с помощью 0,05 % Твина 20 в ФСБ и блокировали их с помощью 5 % обезжиренного молока (Bio Rad, г. Геркулес, штат Калифорния, США) в ФСБ в течение одного часа при комнатной температуре.  После удаления блокирующего буфера образцы плазмы, разбавленные в 5 % обезжиренном молоке, добавляли в планшеты и инкубировали в течение одного часа при комнатной температуре.  В качестве контроля использовали образцы плазмы, полученные от наивных мышей.  Затем планшеты промывали пять раз и добавляли конъюгированный с HRP IgG против антител мыши при разведении 1:1000 в обезжиренном молоке.  После инкубации при комнатной температуре в течение 90 минут планшеты промывали восемь раз и для выявления добавляли 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (ТМБ).  После выдержки в течение 5 минут при комнатной температуре останавливали реакцию с использованием 2N серной кислоты, и планшеты считывали при 450 нм с использованием устройства для считывания планшетов BioTek µQuant (г. Уинуски, штат Вермонт, США).
У мышей FVIII KO отмечено образование антител к hFVIII на неделю 4 после введения вектора, а на неделю 8 у мышей в большинстве из 42 групп векторов обнаружили выявляемые уровни IgG против hFVIII с соответствующим снижением уровней активности hFVIII (ФИГ. 6).  Временная динамика активности hFVIII и образования антител, количественно определенная по титру, представлена на ФИГ. 7 и 8, соответственно.  Более 50 % мышей, которым инъецировали конструкции E05.A1AT, E10.A1AT и все промоторы с комбинацией энхансеров E06, синтезировали антитела к трансгену на неделю 8.  Однако антитела к трансгену были обнаружены не во всех группах.  Для 6 из 42 векторных групп (E11.TTR, E13.TBG-S1, E13.A1AT и все конструкции с использованием E01) на неделе 8 не было выявлено антител к hFVIII (ФИГ. 6), а у двух групп не было обнаружено выявляемых антител на протяжении 12 недель исследования (E01.A1AT и E11.TTR).  Выполняли также анализ времени до наступления события для образования антител к hFVIII.  У мышей, которым инъецировали вектор с использованием для экспрессии E01.A1AT, E11.TTR, E01.TBG-S1, E11.A1AT и E13.TBG-S1, оказалось самое длительное время до экспрессии антител, тогда как конструкции, содержащие E06.TTR, E06.A1AT, E05.A1AT, E09.TBG-S1 и E14.TTR показали самое короткое время до экспрессии антител.
6.1.6 Статистический анализ
Для выявления сходных групп лечения, в соответствии с активностью hFVIII в плазме на неделю 2, анализировали данные с использованием модели дисперсионного анализа (ANOVA) с одним фиксированным критерием с ретроспективными анализами с критерием Тьюки для идентификации средних уровней активности, которые отличаются друг от друга.  Выполняли анализ времени до наступления события — образования антител против hFVIII.
6.1.9 Сравнение активности и иммуногенности для различных капсидов AAV
Далее определяли разницу в уровнях активности и устанавливали потенциальное распределение по иммуногенности использованных капсидов AAV.  Для этого исследования был отобран наиболее иммуногенный геном из предыдущих исследований — E06.TTR.  Интересно, что эта конструкция продуцировала значительно более высокую экспрессию, чем большинство других конструкций на неделю 2, но в последующие недели образовывались антитела против трансгена hFVIII у 80 % мышей с инъекциями конструкций.
10
Тот же самый векторный геном с использованием энхансерной комбинации E06 со специфическим для печени промотором TTR упаковали с одним из пяти капсидов AAV; AAVrh10, AAV8, AAV9, AAVhu37 и AAVrh64R1.  Снова мышам FVIII KO в/в инъецировали дозу 10 ГК на мышь и в течение всего 12-недельного исследования отслеживали уровни активности hFVIII в плазме и титры IgG против hFVIII.  Четкие различия в экспрессии и иммуногенности трансгена видны на основе вектора AAV, используемого для переноса гена (ФИГ. 9).  На неделю 2 после введения вектора активность hFVIII в плазме варьировала от 0,51 ИЕ/мл после введения AAVrh64R1 до 1,26 ИЕ/мл после AAVrh10 (ФИГ. 9A).  В течение проведения исследования у нескольких мышей синтезировались антитела против hFVIII в диапазоне от 20 % мышей, которым ввели векторы AAV8 или AAV9, до 63 % мышей, которые получили AAVrh10 (ФИГ. 9B).  Следовательно даже с высокоиммуногенной комбинацией энхансера и промотора иммунный ответ к трансгену может варьировать в зависимости от капсида AAV, использованного для переноса гена.
6.1.10 Обсуждение
Предыдущие исследования мышей FVIII KO, у которых для экспрессии использовался промотор HLP, не выявили антитела к трансгену на протяжении всего исследования.  Данная промоторная последовательность HLP сходна с такой у комбинации энхансера/промотора E01.A1AT, причем у мышей, которым вводили этот вектор AAVrh10 не обнаружили выявляемых антител на протяжении 12 недель исследования.  К сожалению, активность этого вектора у мышей FVIII KO была относительно низкой только с выявляемыми 0,189 ИЕ/мл в плазме на неделе 2 после введения вектора и пиковым уровнем 0,303 ИЕ/мл на неделе 6.
Интересно, что капсид AAV, используемый для переноса гена из той же трансгенной кассеты значимо влиял как на иммуногенность к hFVIIII, так и на пиковую активность hFVIII.  Для того чтобы исследовать влияние капсида на образование антител против hFVIII была использована наиболее иммуногенная трансгенная кассета (E06.TTR).  Пять исследованных векторных капсидов можно разделить на две группы: в одной у ≤ 20 % мышей синтезировались антитела против hFVIII (AAV8 и AAV9), а в другой у > 20 % мышей вырабатывалась гуморальная иммунная реакция (AAVrh10, AAVhu37 и AAVrh64R1).  Переносимость по отношению к трансгену hFVIII, связанная с капсидом AAV8, вероятно оказывается ожидаемой благодаря предыдущим исследованиям, которые демонстрируют, что в/в доставка этого капсида может активировать специфические к трансгену регуляторные T-клетки в контексте толерогенной природы печени.  В дополнение к этому авторы раннее показали, что не существует выявляемых ингибиторов FIX после в/м инъекции AAV8 у мышей с гемофилией B.  Следовательно даже с высокоиммуногенной комбинацией энхансера и промотора иммунный ответ к трансгену может варьировать в зависимости от капсида AAV, использованного для переноса гена.
Уровни активности hFVIII в плазме после введения пяти различных капсидов AAV также значительно варьировали от 0,51 ИЕ/мл с AAVrh64R1 до 1,26 ИЕ/мл с AAVrh10 на неделю 2 после введения векторов.  Экспрессия вектора AAVrh10 была значительно увеличенной по сравнению с AAV8 и совпадала с образованием антител против hFVIII у 63 % мышей.  Эта сравнительное исследование капсидов выполняли с использованием высокоиммуногенной трансгенной кассеты, и вероятно оно не моделирует то, что наблюдается у людей, для которых у ~30 % пациентов образуются антитела к рекомбинантному белку.  Следовательно высокие уровни экспрессии, продуцируемые после введения вектора AAVrh10, могут быть более выгодными для клинической ситуации, при которой может требоваться низкая доза вектора для значимых улучшений в отношении возникновения событий кровотечения и дополнительного введения рекомбинантного белка hFVIII.
По результатам этого исследования для дополнительного изучения были выбраны конструкции E03.TTR (ФИГ. 1; SEQ ID NO: 13), E03.A1AT (ФИГ. 3; SEQ ID NO: 15), E12.TTR (ФИГ. 2; SEQ ID NO: 14) и E12.A1AT (ФИГ. 4; SEQ ID NO: 16).
6.2 Исследования по определению дозировок
6.2.1 Исследования на мышах FVIII KO для определения приблизительной МЭД
10
11
12
13
Мыши FVIII KO линий C57BL/6 и 129 исходно получают в хвостовую вену инъекцию одной из четырех доз AAVhu37.E03.TTR.hFVIIIco-SQ.PA75.  Дозы таких векторов составляют 5x10 ГК/кг, 5x10 ГК/кг, 5x10 ГК/кг и 5x10 ГК/кг.  В качестве контроля носителя включена когорта животных, получающая только контрольный препарат (буфер-носитель).  После введения вектора ежедневно исследуют животных путем общего осмотра.  У животных в соответствующие моменты времени отбирают кровь для определения уровней активности hFVIII.  Животных из подгруппы A умерщвляют на день 60 после введения доз, животных из подгруппы B умерщвляют на день 28 после введения доз, а животных из подгруппы C умерщвляют на день 3 после введения доз.   Кровь также собирают при аутопсии для химического анализа сыворотки с помощью панелей и гематологического анализа.  Умерщвленных животных вскрывают и отбирают органы для изучения биораспределения и гистопатологии, такие как правый паховый лимфоидный узел, правое яичко, поджелудочная железа, двенадцатиперстная кишка, толстая кишка, головной мозг, правая икроножная мышца, желудок, правая почка, правое легкое, селезенка, сердце, печень и обширные поражения, если они есть.  Из органов мышей, которые получали самую высокую дозу вектора и которые получали контрольный препарат, экстрагируют общую клеточную ДНК и РНК.  Выполняют анализы кПЦР и ОТ-кПЦР на экстрагированной ДНК/РНК для измерения количества копий векторного генома и уровни транскриптов в этих органах, соответственно.  Эффективность исследуемого препарата определяют по уровням активности в плазме белка hFVIII анализом COATEST.  Антитела против hFVIII также повторно определяют анализом твердофазного ИФА с IgG против hFVIII, а внешний путь коагуляции оценивают в анализе определения протромбинового времени (PT).
6.3 Исследования на нечеловеческих приматах (NHP)
6.3.1 Исследования экспрессии на NHP
Первичной целью этого не предусматривающего требований GLP исследования является оценивание потенциального вектора относительно токсичности и биораспределения у NHP.
Для этого исследования использовали самцов макака-резус и яванского макака. В этом исследовании использовали только животных самцов поскольку гемофилия A является сцепленным с X-хромосомой генетическим нарушением. В начале исследования у всех макак наблюдали титры NAb <1:5, определенные как описано раннее(CALCEDO et al. (2009) Worldwide epidemiology of neutralizing antibodies to adeno-associated viruses. J Infect Dis, 199, 381-90).Перед введением вектора макаки получали анестезию смесью кетамина (10–15 мг/кг) и дексмедетомидина (0,05–0,10 мг/кг), инъецируемую в/м. Макакам в/в вводили векторы через подкожную вену бедра.Перед началом исследования и дважды в неделю в течение исследования путем пункции бедренной вены отбирали образцы крови. Все клинические анализы по определению патологии в образцах крови проводили в Antech Diagnostics (г. Ирвайн, штат Калифорния, США), включая полный анализ крови и лейкограмму, полные клинические химические показатели и панели коагуляции.
12
На NHP выполняли пилотные исследования экспрессии hFVIII.  Двум макакам-резус и двум яванским макакам в/в вводили 3x10 ГК/кг AAVrh10 (ФИГ. 10A) и AAVhu37 (ФИГ. 10B) векторы, экспрессирующие hFVIII из комбинации энхансера/промотора ABP2.TGB-S1, соответственно.  У всех животных отмечена высокая пиковая экспрессия, но до недель 6–8. У макак, которым инъецировали AAVrh10, наблюдали гуморальный иммунный ответ к hFVIII.  У одного животного, которое получило AAVhu37, была задержка в образовании антител против hFVIII, которая происходила на 12 неделю после введения вектора, и они не образовывались у других животных в течение всего хода исследования. За макаком, который получал AAVhu37.TBG-S1.hFVIII-SQ.PA7, наблюдали в течение 35 месяцев после введения (ФИГ. 22–24).
На основании исследований на мышах FVIII KO и этого пилотного исследования на макаках-резус, отобрали две из исходных 42 комбинаций энхансеров/промоторов для дополнительной оценки на яванский макаках, используя для экспрессии разные капсиды клада E.
6.3.2 Дополнительные исследования на NHP
13
Далее 20 самцам яванского макака вводили дозы одного из четырех векторов: AAVrh10.E03.TTR.hFVIIIco-SQ.PA75, AAVrh10.E12.A1AT.hFVIIIco-SQ.PA75, AAVhu37.E03.TTR.hFVIIIco-SQ.PA75 и AAVhu37.E12.A1AT.hFVIIIco-SQ.PA75 (n = 5 макак на вектор). Вектор в/в вводили в дозе 1,2x10 ГК/кг (на основе среднего титра по окПЦР). На неделю 2 после введения векторов наблюдали пиковую экспрессию равную 37 % от нормальных уровней FVIII для одного капсида плюс комбинации энхансера/промотора, которая потом выходила на плато 20 % от нормы (ФИГ. 11).  В то время когда антитела к hFVIII выявляли у большинства макак на неделю 8, антитела не выявлялись у двух животных на неделю 30 после введения вектора (ФИГ. 12).  Эти методы обсуждаются ниже.Применяя анализ времени до наступления события для образования антител, определили, что существует значимая разница между AAVrh10 и AAVhu37 (ФИГ.14).
6.3.3 Определение экспрессии hFVIII в плазме NHP
Экспрессию hFVIII измеряли методом твердофазного ИФА, причем все реактивы были получены, если не указано иное, у Sigma-Aldrich (г. Сент-Луис, штат Миссури, США).  Планшеты для твердофазного ИФА покрывали IgG против hFVIII (Green Mountain Antibodies, штат Вермонт, США) при разведении 1:500 в 0,1 M карбонатном буфере (pH 9,6) и инкубировали в течение ночи при 4 °C. Промывали лунки четыре раза с помощью 0,1 % твина 20 в ФСБ и блокировали их с помощью 5 % обезжиренного молока (Bio Rad, г. Геркулес, штат Калифорния, США) в ФСБ в течение одного часа при комнатной температуре.  После удаления блокирующего буфера образцы плазмы, разбавленные в 5 % обезжиренном молоке, добавляли в планшеты и инкубировали в течение одного часа при комнатной температуре.  Затем планшеты промывали четыре раза и добавляли IgG против hFVIII (ThermoFisher Scientific, штат Массачусетс, США) при разведении 1:1000 в обезжиренном молоке.  После инкубации в течение одного часа при комнатной температуре планшеты промывали четыре раза и добавляли конъюгированный с HRP IgG против антител овцы при разведении 1:1000 в обезжиренном молоке.  После инкубации при комнатной температуре в течение 90 минут планшеты промывали пять раз и для выявления добавляли 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (ТМБ).  После выдержки в течение 5 минут при комнатной температуре останавливали реакцию с использованием 2N серной кислоты, и планшеты считывали при 450 нм с использованием устройства для считывания планшетов BioTek µQuant (г. Уинуски, штат Вермонт, США). На ФИГ. 11.
Результаты долговременной стабильной экспрессии человеческого FVIII у яванского макака (35 месяцев) после однократной внутривенной инъекции AAVhu37.TBG-S1.hFVIII-SQ.PA75 показаны на ФИГ. 22.  Результаты показывают стабильную экспрессию до аутопсии через 35 месяцев.  Результаты исследования активности ферментов печени показаны на ФИГ. 23. Данные результаты показывают, что уровни активности ферментов печени находятся в пределах диапазона нормы, за исключением временного повышения после биопсии печени.  Реакция образования нейтрализующих антител (Nab) на капсид AAVhu.37 показана на ФИГ. 24.
Применяли технологию с использованием одиночных клеток для выявления ДНК и РНК вектора AAV в гепатоцитах NHP M11269, упомянутого выше, который получил внутривенное введение AAVhu37.TBG-S1.hFVIII-SQ.PA75 в дозе 3E12 ГК/кг.  Для оценки наличия геномов и экспрессии AAV выделяли одиночные клетки гепатоцитов. Через 150 недель после введения вектора выделяли гепатоциты из клиновидного фрагмента печени путем перфузии со смесью коллагеназы/протеазы.  Одиночные клетки распределяли в отдельные лунки 96-луночного планшета. Для клеток из одного 96-луночного планшета провели амплификацию целого генома (WGA), а геномы AAV в клетках количественно определяли методом цифровой ПЦР, используя зонд к FVIII человека.  Второй 96-луночный планшет был использован для целых амплифицированных транскриптом (WTA) для оценки экспрессии FVIII.
Результаты показаны в таблице 3.  Геномы AAV можно было выявить у ~25 % выделенных одиночных клеток.  Экспрессию РНК обнаружили только у ~4 % или 20 % клеток, которые приняли ДНК.  Экспрессирующие РНК клетки можно разделить на два типа с низкой и высокой экспрессией.  Остается неясно, почему значительное количество клеток приняло вектор, но не способно экспрессировать трансген.  Эти результаты были подтверждены исследованиями с гибридизацией in situ, выполненными на подложке CMC (данные не показаны).
Таблица 3. Процент ДНК и РНК у одиночных позитивных клеток
Одиночная клетка (w152)
Образец
Позитивных/общее кол-во
Процент позитивных
ДНК
23/96
24 %
РНК
4/96
4%
РНК/ДНК-позитивные клетки
4/23
17%
гомогенат печени
Образец
биоптат w42
аутоптат w152
ДНК (ГК/клетку)
10
7.6 +/-1.1
РНК hFVIII (копий в мкг РНК)
4.4 +/- 1.1 E4
6.4 +/- 0.7E4
6.3.4 Выявление IgG против hFVIII в плазме NHP
Антитела-IgG против hFVIII в плазме NHP измеряли методом твердофазного ИФА, как описано раннее, за исключением добавления для выявления конъюгированного с HRP IgG против антител NHP в разведении 1:2000 в обезжиренном молоке (ФИГ. 12).
6.3.5 Выявление титров анализом Бетезда в плазме NHP
Ингибирующее антитело против FVIII человека измеряли модифицированным Ниджмегеном (Nijmegen) анализом Бетезда (Giles et al., 1998). Одна единица Бетезда представляет ингибирование коагуляционной активности нормальной человеческой плазмы на 50 %.
6.3.6 Проведение биопсии печени
Двум NHP из каждой группы проводили биопсию печени, выполняемую минилапаротомией на неделю 5 после введения вектора.  Выбор животных основывался на экспрессии hFVIII в плазме на неделю 4.  Первое отобранное животное представляло собой животное с медианным уровнем hFVIII, второе отобранное животное представляло собой животное с ближайшим уровнем hFVIII или вторым ближайшим (если ближайший был медианным) к среднему значению.  Отбирали образцы ткани печени для гистопатологического исследования, биораспределения вектора и анализа трансгенной мРНК.  На день 3 после биопсии печени отбирали кровь для общего анализа крови и лейкограммы, полного анализа клинических химических показателей и панелей коагуляции.
6.3.7 Протокол иммуносупрессии
2
2
Начинали схему иммуносупрессии, в объеме необходимом животным, когда после введения вектора возможность выявлять экспрессию hFVIII была утрачена в присутствии выявляемых антител к hFVIII (единица Бетезда >1).  Схему иммуносупрессии выполняли с ритуксимабом (250 мг/м, в/в с интервалами в 4 недели, всего 4 инфузии) и циклофосфамидом (300 мг/м, медленная внутривенная инфузия каждые 15 дней, всего 8 доз в течение 4 месяцев), как описано раннее(Mcintosh et al. (2013) Therapeutic levels of FVIII following a single peripheral vein administration of rAAV vector encoding a novel human factor VIII variant. Blood, 121, 3335-44.).
6.3.8 Биораспределение вектора
Во время проведения аутопсии быстро замораживали образцы тканей (паховые лимфоузлы, поясничные лимфоузлы, мышца [правая икроножная], правое яичко, поджелудочная железа, правая почка, селезенка, правое легкое, сердце и печень) мышей C57BL/6J и экстрагировали ДНК с использованием мининабора для выделения ДНК QIAamp (Qiagen, г. Валенсия, штат Калифорния, США). Выполняли выявление и количественное определение геномных копий (ГК) векторов в экстрагированной ДНК и относительную экспрессию транскриптов hFVIII в экстрагированной РНК методом ПЦР в реальном времени, как описано раннее.  Вкратце, векторные ГК и РНК количественно определяли с использованием праймеров/зонда, предназначенных для трансгенной последовательности hFVIII вектора.  Количественное определение ГК из печени выполняли на одном образце печени из каждой мыши (n = 3/группу).  Относительную экспрессию транскриптов РНК определяли с использованием ΔΔCT каждого образца, нормализованного по экспрессии 18S.
11
Биораспределение векторов оценивали для субпопуляции из 18 векторов AAVrh10 с вариантами энхансеров/промоторов.  Векторы AAVrh10, экспрессировавшие hFVIIIco IV, вводили в дозе 10 ГК на мышь в организм от 6 до 8 недельных мышей C57BL/6J дикого типа.  Мышам проводили аутопсию на день 14 после введения векторов и отбирали мышцу (правую икроножную), правое яичко, поджелудочную железу, правую почку, селезенку, правое легкое, сердце и печень.  Экстрагировали ДНК и РНК и количественно определяли уровни векторных ГК и транскриптов РНК, соответственно, с использованием праймеров/зонда, предназначенных для трансгенной последовательности hFVIII вектора.  Не обнаружено значимых отличий в печени для уровней векторных ГК (Фиг. 20A) или РНК-транскриптов (ФИГ. 20B) среди получавших векторы групп, и отсутствовали выявляемые количества ГК и РНК в получавших контрольный препарат (ФСБ) групп.  Однако отмечена тенденция к повышенным уровням транскриптов РНК в печени для векторов, в которых для экспрессии использован промотор A1AT, независимо от энхансерных последовательностей (ФИГ. 20B).  Для других отобранных тканей уровни РНК-транскриптов hFVIII были в среднем в 1000 раз ниже, чем в печени, но высокая экстрагепатическая экспрессия отмечалась в мышцах и сердцах мышей C57BL/6J после введения E01.TBG-S1, E02.A1AT, E09.A1AT и E09.TTR (ФИГ. 21).
Исследование вектора
6.4.
Выполняли анализы по определению характеристик, включающие идентификацию серотипа, содержание пустых частиц и идентификацию продукта трансгена.  Описания всех этих анализов приведены ниже.
6.4.1 Титр геномных копий (ГК)
Для определения титра геномных копий использовали оптимизированную количественную ПЦР (окПЦР) путем сравнения распознаваемого плазмидного стандарта.  В анализе окПЦР применяли последовательное расщепление с помощью ДНКазы I и протеиназы K с последующим проведением анализа кПЦР для измерения инкапсидированных векторных геномных копий.  Выявления ДНК выполняли с использованием специфических к последовательности праймеров, таргетирующих полиA-область PA75, в комбинации с флуоресцентно меченным зондом, гибридизирующимся с той же областью.  Сравнение стандартной кривой плазмидной ДНК позволяет проводить определение титров без необходимости какой-либо манипуляции с образцом после ПЦР. В данном анализе были применены ряд стандартов, образцов для валидации и контролей (для фонового уровня и загрязнения ДНК). Для этого анализа провели квалификацию путем принятия и определения аналитических характеристик, включающих чувствительность, предел обнаружения, диапазон количественного определения и межлабораторную и внутрилабораторную прецизионность анализа.  Была квалифицирована внутренняя эталонная серия AAVrh.10 и использована для выполнения количественных исследований.
6.4.2 Идентификация векторных капсидов Масс-спектрометрия капсида AAV из VP3
Подтверждение серотипа AAV2/hu.37 или AAV2/rh.10 вектора достигали исследованием на основе анализа пептидов белка капсида VP3 методом масс-спектрометрии (МС). В данном методе использовали мультиферментное расщепление (трипсин, химотрипсин и эндопротеаза Glu-C) полосы белка VP3, вырезанной из гелей ДСН-ПААГ с последующим определением характеристик СВЭЖХ-МС/МС на масс-спектрометре Q-Exactive Orbitrap для секвенирования капсидного белка.  Разработали метод тандемной масс-спектрометрии (МС), позволяющий проводить идентификацию определенных загрязняющих белков и выводить пептидную последовательность из масс-спектров.
6.4.3 Соотношение пустых-полных частиц
Профили векторных частиц получали с использованием скорости седиментации при аналитическом ультрацентрифугировании (AUC), измеренной на аналитической центрифуге, что является превосходным методом для получения информации о гетерогенности макромолекулярной структуры, отличия при подтверждении и состояния ассоциации или агрегации. Образец вносили в ячейки и проводили седиментацию при 12 000 об/мин на аналитической центрифуге Beckman Coulter Proteomelab XL-I.  Каждые две минуты в течение 3,3 часов записывали сканы показателей преломления. Анализировали данные с помощью модели c(s) (программа Sedfit) и рассчитывали коэффициенты седиментации, построенные по отношению к нормализованным значениям c(s).  Должен наблюдаться основной пик, представляющий мономерный вектор. Появление пиков, мигрирующих медленнее основного мономерного пика, показывает пустые/неправильно собранные частицы. Коэффициент седиментации пика пустых частиц определяют с использованием препаратов с пустыми частицами AAV8. Прямое количественное определение основного мономерного пика и предшествующих пиков обеспечивает определение соотношения пустых-полных частиц.
6.4.4 Инфекционный титр
Для определения продуктивного поглощения и репликации вектора в клетках RC32 (клетки HeLa, экспрессирующие rep2) использовали анализ инфекционных единиц (ИЕ). Вкратце, клетки RC32 в 96-луночных планшетах совместно инфицировали серийными разведениями вектора и одинаковым разведением Ad5 с 12 репликатами для каждого разведения rAAV. Через 72 часа после инфицирования клетки лизировали и выполняли кПЦР для выявления амплификации векторов rAAV превышающей исходное введение. Для определения репликативного титра, выраженного в ИЕ/мл, выполняли расчет конечного разведения TCID50 (Спирмена-Кербера). Поскольку значения «инфекционности» зависят от вида частиц, входящих в контакт с клетками, связывания рецепторов, интернализации, транспорта в ядро и репликации генома, они находятся под влиянием конфигурации анализа и наличия соответствующих рецепторов и механизмов ответа после связывания в используемой линии клеток.  Рецепторы и механизмы ответа после связывания, критически важные для импорта векторов AAV, обычно поддерживаются в иммортализированных линиях клеток, и поэтому анализы титров инфекционности не являются абсолютным показателем количества присутствующих «инфекционных» частиц. Однако соотношение инкапсидированных ГК к «инфекционным единицам» (описанным как соотношение ГК/ИЕ) можно применять как показатель однородности продукта от серии к серии.
7. Пример 2. Протокол лечения людей
Этот пример относится к лечению генной терапией пациентов с генетически подтвержденной сцепленной с Х-хромосомой гемофилией A из-за мутаций в гене фактора свертывания 8 (FVIII). В этом примере вектор для генной терапии, AAVhu.37.hFVIII, дефектный по репликации аденоассоциированный вирусный вектор hu.37 (AAVhu.37), экспрессирующий hFVIII, вводили пациентам с гемофилией A. Эффективность лечения можно оценивать с использованием уровней FVIII, как заменителе показателя трансгенной экспрессии. Первичные оценки эффективности включают уровни FVIII через около 12 недель после лечения с сохранением эффекта после этого в течение по меньшей мере 1 года. Долгосрочную безопасность и сохранение трансгенной экспрессии можно определять в образцах биопсии печени после лечения.
7.1.
Вектор для генной терапии AAV.hFVIII
7.1.1. AAVhu.37.hFVIII
Вектор AAVhu.37.hFVIII состоит из активного ингредиента вектора AAV и буфера лекарственной формы. Внешний компонент вектора AAV представляет собой серотип hu.37, T = 1 икосаэдрального капсида, состоящего из 60 копий трех вирусных белков AAV VP1, VP2 и VP3 в ожидаемом соотношении 1:1:10. Капсид содержит рекомбинантный геном вектора AAV (rAAV) из одноцепочечной ДНК (ФИГ.1–ФИГ.4).
Геном содержит трансген человеческого фактора VIII (FVIII), фланкированный двумя инвертированными концевыми повторами (ITR) AAV. Кодон-оптимизированный трансген FVIII человека с удаленным B-доменом содержит энхансер, промотор, кодирующая человеческий фактор VIII (hFVIII) последовательность и сигнал полиаденилирования (полиA).  ITR представляют собой генетические элементы, отвечающие за репликацию и упаковку генома во время продукции вектора, и они являются единственными вирусными цис-элементами, необходимыми для образования rAAV.  В одном варианте реализации изобретения экспрессия кодирующей человеческий FVIII последовательности управляется промотором транстиретина (SEQ ID NO: 7).  В другом варианте реализации изобретения экспрессия кодирующей человеческий FVIII последовательности управляется модифицированным промотором A1AT (SEQ ID NO: 9).  Данная конструкции включает по меньшей мере один энхансерный элемент для стимуляции промоторной активности.  В одном варианте реализации изобретения включен энхансер EnTTR (SEQ ID NO: 5).   В другом варианте реализации изобретения две копии энхансера ABP-S (SEQ ID NO: 6) идут за одной копией энхансера EnTTR (SEQ ID NO: 5).  Включен синтетический сигнал полиA из около 75 нуклеотидов (SEQ ID NO:10) для опосредования терминации транскриптов мРНК человеческого FVIII.
Вектор представлен в виде суспензии вектора AAVhu.37.hFVIII в буфере лекарственной формы. В одном варианте реализации изобретения буфер лекарственной формы представляет собой 0,001 % плюроник F-68 в TMN200 (200 мM хлорида натрия, 1 мM хлорида магния, 20 мM трис, pH 8,0).
Подробная информация о промышленном получении и определении характеристик векторов описана ниже в разделах.
7.1.2. AAVrh.10.hFVIII
Вектор AAVrh.10.hFVIII состоит из активного ингредиента вектора AAV и буфера лекарственной формы. Внешний компонент вектора AAV представляет собой серотип rh.10, T = 1 икосаэдрального капсида, состоящего из 60 копий трех вирусных белков AAV VP1, VP2 и VP3 в ожидаемом соотношении 1:1:10. Капсид содержит рекомбинантный геном вектора AAV (rAAV) из одноцепочечной ДНК (ФИГ.1–ФИГ.4).
Геном содержит трансген человеческого фактора VIII (FVIII), фланкированный двумя инвертированными концевыми повторами (ITR) AAV. Кодон-оптимизированный трансген FVIII человека с удаленным B-доменом содержит энхансер, промотор, кодирующая человеческий фактор VIII (hFVIII) последовательность и сигнал полиаденилирования (полиA).  ITR представляют собой генетические элементы, отвечающие за репликацию и упаковку генома во время продукции вектора, и они являются единственными вирусными цис-элементами, необходимыми для образования rAAV.  В одном варианте реализации изобретения экспрессия кодирующей человеческий FVIII последовательности управляется промотором транстиретина (SEQ ID NO: 7).  В другом варианте реализации изобретения экспрессия кодирующей человеческий FVIII последовательности управляется модифицированным промотором A1AT (SEQ ID NO: 9).  Данная конструкции включает по меньшей мере один энхансерный элемент для стимуляции промоторной активности.  В одном варианте реализации изобретения включен энхансер EnTTR (SEQ ID NO: 5).   В другом варианте реализации изобретения две копии энхансера ABP-S (SEQ ID NO: 6) идут за одной копией энхансера EnTTR (SEQ ID NO: 5).  Включен синтетический сигнал полиA из около 75 нуклеотидов (SEQ ID NO:10) для опосредования терминации транскриптов мРНК человеческого FVIII.
Вектор представлен в виде суспензии вектора AAVrh.10.hFVIII в буфере лекарственной формы.  В одном варианте реализации изобретения буфер лекарственной формы представляет собой 0,001 % плюроник F-68 в TMN200 (200 мM хлорида натрия, 1 мM хлорида магния, 20 мM трис, pH 8,0).
7.2. Популяция пациентов
По нескольким причинам выбранной исследуемой популяцией являются пациенты с тяжелой гемофилией A.  Пациенты с тяжелой гемофилией A определены как имеющие менее 1 % от нормальной активности фактора VIII (FVIII), таким образом, требующие частых инфузий FVIII для контроля их предрасположенности к кровотечениям. Это представляет значительное затруднение в отношении ведения нормального образа жизни и, в дополнение к этому, уровни FVIII в крови проходят через хорошо известные пики и имеют снижающийся профиль, что неоптимально. Тот факт, что уровни FVIII в крови у тяжелых пациентов оказываются меньше 1 %, дает возможность легко измерять даже от низкого до умеренного увеличения уровней FVIII в крови после введения AAV.hFVIII. Недавние клинические исследования подтвердили действенность этого подхода.
Пациенты, которые являются кандидатами для проведения лечения предпочтительно представляют собой взрослых мужчин возрастом ≥18 с диагностированной умеренной/тяжелой или тяжелой гемофилией A. В одном варианте реализации изобретения пациент имеет базовую активность FVIII ≤2 % от нормальной или задокументированной истории активности FVIII ≤2 %.  В некоторых вариантах реализации изобретения можно лечить пациента возрастом <18 лет.  Кандидаты для лечения включают субъектов, у которых было по меньшей мере 3 эпизода с кровотечением за год, которые требуют лечения FVIII по необходимости.  Другие кандидаты для лечения, включают субъектов, которых лечат FVIII в профилактическом режиме.  Другие критерии демонстрируют, что для субъекта подходит лечение, включающее по меньшей мере 100 дней истории воздействия к FVIII; в истории болезни отсутствует образование ингибиторов (нейтрализирующих антител) к экзогенному FVIII; отсутствуют известные аллергические реакции к экзогенному FIX или любому компоненту AAV.hFVIII.
Получающие лечение пациенты могут иметь в сыворотке базовый уровень нейтрализующего антитела к AAVhu.37 или AAVrh.10 (соответствуют выбранному вектору) ≤ 1:5.
Субъектам могут позволять продолжать их стандартные виды лечения (-ий) (например, введение заместительного FVIII) перед и во время лечения генной терапией по усмотрению лечащего врача.  В альтернативном варианте врач может предпочесть прекратить стандартные виды лечения перед проведением лечения генной терапией и, необязательно, возобновить стандартные виды лечения в качестве котерапии после проведения генной терапии.
7.3. Дозирование и путь введения
11
12
12
13
Пациенты получают однократную дозу AAVrh.10.hFVIII или AAVhu.37.hFVIII, вводимые посредством инфузии через периферическую вену. Вводимая пациенту доза AAVrh.10.hFVIII или AAVhu.37.hFVIII составляет около 5x10 ГК/кг или 1,6x10 ГК/кг, или 5x10 ГК/кг, или 1x10 ГК/кг.  С целью обеспечения удаления пустых капсидов из дозы AAVrh.10.hFVIII или AAVhu.37.hFVIII, которую вводили пациентам, пустые капсиды отделяют от векторных частиц путем ультрацентрифугирования в градиенте хлорида цезия или ионообменной хроматографии во время процесса очистки вектора, как обсуждается выше.
7.4. Измерение клинических критериев
Первичное оценивание безопасности вводимого продукта. Последующие оценивания проводят дважды в неделю в течение 4 недель после введения продукта, еженедельно с недели 6 до недели 12, ежемесячно в течение оставшегося времени в первый год и с интервалами по 6 месяцев в течение общего периода времени в 5 лет.
a. Медицинский осмотр
b. Электрокардиограмма (ЭКГ)
c. Биохимические анализы: Уровни электролитов в сыворотке, АМК, креатинина, кальция, фосфата, общего белка, альбумина, ЛДГ, КФК, АСТ, АЛТ, щелочной фосфатазы, билирубина
d. Гематологический анализ: ОАК и лейкограмма, профиль коагуляции
e. Общий анализ мочи
f. Иммунологическая оценка:
g. Серологическая реакция на капсид hu.37 или rh.10 и на фактор VIII
h. Реакция T-клеток на капсид hu.37 или rh.10 и антигены фактора VIII
i. Оценка векторной ДНК; измерения кПЦР в плазме, моче и слюне.
Вторичное оценивание основано на измерениях экспрессии и активности трансгена, определяемых по
a. Уровням фактора VIII в плазме и активности фактора VIII;
b. Клинической оценке потребности в заместительной терапии фактора VIII и частотой эпизодов спонтанных кровотечений.
8. Пример 3. Промышленное получение AAV.hFVIII
8.1. Используемые для продукции AAV.hFVIII плазмиды
AAVrh.10.hFVIII продуцируют трансфекцией 3 плазмидных ДНК в человеческие клетки HEK 293 MCB с помощью:
(i) векторной плазмиды, описанной в разделах 8.2.1.1–8.2.1.4
(ii) хелперной плазмиды AAV, называемой pAAV2.rh10.KanR и содержащей гены rep2 и cap rh10 AAV дикого типа, описанной в разделе 8.2.2.1, и
(iii) хелперной аденовирусной плазмиды, называемой pAdDeltaF6(Kan), описанной в разделе 8.2.3.
AAVhu.37.hFVIII продуцируют трансфекцией 3 плазмидных ДНК в человеческие клетки HEK 293 MCB с помощью:
(i) векторной плазмиды, описанной в разделах 8.2.1.1–8.2.1.4
(ii) хелперной плазмиды AAV, называемой pAAV2.hu.37.KanR и содержащей гены rep2 и cap hu.37 AAV дикого типа, описанной в разделе 8.2.2.2, и
(iii) хелперной аденовирусной плазмиды, называемой pAdDeltaF6(Kan), описанной в разделе 8.2.3.
8.2.1 Цис-плазмиды
(экспрессионная конструкция векторного генома)
8.2.1.1
pAAV.E03.p3.hF8co-SQ.PA75, содержащая экспрессионную кассету человеческого FVIII (ФИГ. 1).  Эта цис-плазмида кодирует геном вектора rAAV.  Экспрессия кДНК человеческого FVIII-SQco управляется промотором TTR с энхансером enTTR. Сигнал полиA экспрессионной кассеты является искусственной последовательностью полиA из около 75 нуклеотидов.
Описание элементов последовательностей
Инвертированные концевые повторы (ITR)
1.: ITR AAV представляют собой последовательности, идентичные на обоих концах, но расположенные в противоположной ориентации. Функции последовательностей ITR (GenBank № NC001401) AAV2 как во отношении точки репликации векторной ДНК, так и сигнала упаковки для векторного генома, при которой функционируют AAV и аденовирусный (ad) хелпер, представлены в положении транс. По сути последовательности ITR представляют только цис-действующие последовательности, требуемые для репликации и упаковки векторного генома.  Последовательность 5' ITR используется в примере вектора, показанном в SEQ ID NO: 11.  Последовательность 3' ITR используется в примере вектора, показанном в SEQ ID NO: 12.
Промотор TTR
2.: Транстиретиновый промотор (SEQ ID NO:7) используется для управления высокоэффективной специфической для печени экспрессии гена hFVIII.
Энхансер TTR (enTTR)
3. : Энхансерная последовательность размером 100 п. н. (SEQ ID NO:5) из транстиретина присутствует в экспрессионной кассете вектора для увеличения экспрессии FVIII.
кДНК человеческого фактора коагуляции VIII (FVIII)
4.  (SEQ ID NO: 1 демонстрирует нативную последовательность; SEQ ID NO: 2 демонстрирует кодон-оптимизированную последовательность). кДНК человеческого фактора коагуляции 8 (FVIII) кодирует фактор коагуляции, необходимый для образования сгустков крови.  hFVIII представляет собой последовательность с удаленным B-доменом, в которой домен B был замещен короткой последовательностью SQ, как описано в данном документе.  кДНК hFVIII является кодон-оптимизированной для экспрессии у людей.
. Искусственный сигнал полиаденилирования
5: (SEQ ID NO: 10) В искусственном сигнале полиаденилирования размером 75 п. н. представлены цис-последовательности для эффективного полиаденилирования мРНК hFVIII. Этот элемент функционирует как сигнал для транскрипционной терминации, специфического события отщепления на 3’-конце образующегося транскрипта после добавления полиаденильного хвоста.
8.2.1.2
pAAV.E12.p3.hF8co-SQ.PA75, содержащая экспрессионную кассету человеческого FVIII (ФИГ. 2).  Эта цис-плазмида кодирует геном вектора rAAV.  Экспрессия кДНК человеческого FVIII-SQco управляется промотором TTR с энхансером ABPS и enTTR. Сигнал полиA экспрессионной кассеты является искусственной последовательностью полиA из около 75 нуклеотидов.
Описание элементов последовательностей
Инвертированные концевые повторы (ITR)
1.: Такие как у 8.2.1.1
Промотор TTR
2.:Такой как у 8.2.1.1
Энхансер
3.: Укороченная до 42 п. н. версия дистального энхансера размером 100 п. н. предшественника α1-микроглобулина/букинина [ABP] (SEQ ID NO: 6) с двумя копиями энхансерной последовательности размером 100 п. н. из энхансера транстиретина (enTTR) (SEQ ID NO:5) присутствует в экспрессионной кассете вектора для увеличения экспрессии FVIII.
кДНК человеческого фактора коагуляции VIII (FVIII)
4.: Такая как у 8.2.1.1
Искусственный сигнал полиаденилирования
5.: Такой как у 8.2.1.1
8.2.1.3 pAAV.E03.p2.hF8co-SQ.PA75, содержащая экспрессионную кассету человеческого FVIII (ФИГ. 3).  Эта цис-плазмида кодирует геном вектора rAAV.  Экспрессия кДНК человеческого FVIII-SQco управляется модифицированным промотором A1AT с энхансером enTTR. Сигнал полиA экспрессионной кассеты является искусственной последовательностью полиA из около 75 нуклеотидов.
Описание элементов последовательностей
1. Инвертированные концевые повторы (ITR)
: Такие как у 8.2.1.1
2. Промотор A1AT
: Модифицированный промотор SERINA1 [α1-антитрипсин] (SEQ ID NO:9) используется для управления высокоэффективной специфической для печени экспрессии гена hFVIII.
3. Энхансер TTR (enTTR)
: Энхансерная последовательность размером 100 п. н. из транстиретина присутствует в экспрессионной кассете вектора для увеличения экспрессии FVIII.
4. кДНК человеческого фактора коагуляции VIII (FVIII)
: Такая как у 8.2.1.1
5. Искусственный сигнал полиаденилирования
: Такой как у 8.2.1.1
8.2.1.4
pAAV.E12.p2.hF8co-SQ.PA75, содержащая экспрессионную кассету человеческого FVIII (ФИГ. 4).  Эта цис-плазмида кодирует геном вектора rAAV.  Экспрессия кДНК человеческого FVIII-SQco управляется промотором TTR с энхансером ABPS и enTTR. Сигнал полиA экспрессионной кассеты является искусственной последовательностью полиA из около 75 нуклеотидов.
Описание элементов последовательностей
1. Инвертированные концевые повторы (ITR)
: Такие как у 8.2.1.1
2. Промотор A1AT
: Такой же как у 8.2.1.3
3. Энхансер
: Такой как у 8.2.1.1
4. кДНК человеческого фактора коагуляции VIII (FVIII)
: Такая как у 8.2.1.1
5. Искусственный сигнал полиаденилирования
: Такой как у 8.2.1.1
8.2.2 Хелперная плазмида
8.2.2.1 AAVrh10-хелперная плазмида pAAV2.rh10.KanR
Эта хелперная плазмида AAVrh10 (8036 п. н.) кодирует 4 белка rep AAV2 дикого типа и 3 капсидных белка VP AAV дикого типа серотипа rh10. Новую последовательность AAV получали из ДНК ткани печени макака-резус и установили AAV-серотип rh10. Для образования химерной упаковывающей конструкции ген cap AAV2 удаляли из плазмиды p5E18 и замещали ПЦР-фрагментом гена cap AAVrh10, амплифицированного из ДНК печени примата для получения плазмиды p5E18VD2/rh10. Следует отметить, что промотор p5 AAV, который в норме управляет экспрессией rep, перемещен в этой конструкции из 5’-конца rep к 3’-концу гена cap rh10. Это расположение служит для введения спейсера между промотором и геном rep (т. е. в остов плазмиды) для снижения регуляции экспрессии rep и увеличения способности поддерживать продукцию вектора с высокими титрами. Остов плазмиды в p5E18 взят у pBluescript KS. Все части компонентов плазмиды были проверены прямым секвенированием. Наконец, для получения pAAV2/rh10 (Kan) ген устойчивости к ампициллину был замещен геном устойчивости к канамицину.
8.2.2.2 AAVhu.37-хелперная плазмида pAAV2.hu.37.KanR
Эта хелперная плазмида AAVhu.37 (8036 п. н.) кодирует 4 белка rep AAV2 дикого типа и 3 капсидных белка VP AAV дикого типа серотипа hu.37. Схематический вид плазмиды pAAV2.rh10.KanR показан ниже. Для образования химерной упаковывающей конструкции ген cap AAV2 удаляли из плазмиды p5E18 и замещали ПЦР-фрагментом гена cap AAVhu.37, амплифицированного из ДНК печени примата для получения плазмиды p5E18VD2/hu.37. Остов плазмиды в p5E18 взят у pBluescript KS. Все части компонентов плазмиды были проверены прямым секвенированием. Наконец, для получения pAAV2/hu.37 (Kan) ген устойчивости к ампициллину был замещен геном устойчивости к канамицину.
8.2.3 Аденовирусная хелперная плазмида pAdDeltaF6(Kan)
Плазмида pAdDeltaF6(Kan) имеет размер 15 774 п. н. Данная плазмида содержит участки аденовирусного генома, который является важным для репликации AAV, а именно РНК E2A, E4 и VA (функции аденовируса E1 обеспечиваются клетками 293), но не содержит другие гены для репликации или структурные гены аденовируса. Плазмида не содержит цис-элементы, критически важные для репликации, такие как аденовирусные инвертированные концевые повторы и, поэтому, не предполагается возможный синтез инфекционного аденовируса. Она получена из молекулярного клона Ad5 с удаленными E1, E3 (pBHG10, на основе плазмиды pBR322). В ДНК Ad5 проводили делеции для удаления экспрессии ненужных аденовирусных генов и снижения количества аденовирусной ДНК от 32 т. н. до ~12 т. н. Наконец, для получения pAdΔF6(kan) ген устойчивости к ампициллину был замещен геном устойчивости к канамицину. Идентичность этих 3 аденовирусных генов подтверждали секвенированием плазмидной ДНК, выполненным Qiagen Genomic Services на исходном плазмидном материале, который отправили в Aldevron Inc. для промышленной наработки плазмидной ДНК. Анализ ДНК выявил 100 % гомологию с 3 генными областями аденовируса типа 5 (GenBank, номер регистрации AF369965).
8.2.4 Главный банк клеток (ГБК) бактерий
ГБК бактерии для продукции этих трех продуцирующих ДНК плазмид, которые используются для поддержания производства DTX101, получали с помощью Aldevron Inc. Банки клеток получали в результате размножения выбранных культур и проводили дорогостоящие исследования для квалификации каждого ГБК бактерий, следуя СОП Aldevron в соответствии с рекомендациями CBER. Выполняли тестирования для каждой из трех плазмид и фиксировали информацию, касающуюся особенностей получения ГБК бактерий.
8.2.5 Промышленное получение плазмидной ДНК
Все плазмиды, используемые в технологическом процессе, получали с помощью Aldevron Inc. под контролем системы контроля качества GMP-S™ и инфраструктуры, использующей актуальные особенности производства cGMP; прослеживаемость, контроль за документацией и разделение материалов. Выполняли тестирования для каждой плазмиды и фиксировали информацию, касающуюся особенностей получения плазмидной ДНК.
8.2.6 Главный банк клеток (ГБК) почки эмбриона человека (HEK) 293
Клетки HEK 293 исходно созданы путем трансформации клеток HEK расщепленной ДНК аденовируса типа 5 Фрэнком Грэхемом (Frank Graham) с коллегами. Для продуцирования rAAV с высокими титрами требуются клетки, экспрессирующие генные продукты E1a и E1b. Клетки HEK293 являются адгезивными и в высшей степени трансфицируемыми с образованием высоких титров rAAV при трансфекции плазмидной ДНК.
8.3 Промышленное получение вектора AAV
8.3.1 Описание производственного процесса
1. Высаживание клеток
2
. Для технологического процесса используют квалифицированную линию клеток 293 почки эмбриона человека. Клетки культивируют в среде, состоящей из среды Игла в модификации Дюльбекко (DMEM) с добавкой 10 % фетальной бычьей сыворотки (FBS), облученной гамма-радиацией. Клетки являются субстратзависимыми и диссоциацию клеток выполняют с использованием TrypLE Select, реактива для диссоциации неживотных клеток. Клетки поддерживают при 37 °C (+/- 1 °C) в атмосфере 5 % (+/- 0,5 %) CO.
2. Временная трансфекция
. Через 3 дня выращивания (среда DMEM + 10 % FBS), клеточную культуральную среду в камере Hyperstack замещают свежей бессывороточной средой DMEM и трансфецируют 3 продуцирующими плазмидами с использованием оптимизированного метода преципитации с PEI.
2
Полный комплекс для трансфекции ДНК-плазмид готовят в BSC для трансфекции двадцати 36-слойных камер HyperStack Corning (на серию BDS). Вначале готовят смесь ДНК/PEI, содержащую 3,0 мг векторной плазмиды pDTX.hFIX.101, 60 мг pAdDeltaF6(Kan), 30 мг хелперной плазмиды pAAV2.rh10.KanR AAV и PEI, уровня качества для GMP (PEIPro, PolyPlus Transfection SA). После интенсивного перемешивания раствору дают отстояться при комнатной температуре в течение 25 мин, а затем добавляют к бессывороточной среде для гашения реакции и потом добавляют его в 36-слойные камеры Hyperstack Corning. Среду для трансфекции распределяют между всеми 36 слоями камеры Hyperstack и клетки поддерживают при 37 °C (+/- 2 °C) в атмосфере 5 % (+/- 0,5 %) CO 5 дней.
3. Сбор среды с клетками
2
. Трансфицированные клетки и среду собирают из каждой камеры Hypertack, используя одноразовые пакеты для биопроцессов путем асептического слива среды из модулей. После сбора среды в объем ~ 80 литров добавляют MgCl до конечной концентрации 2 мМ (кофактор бензоназы) и добавляют нуклеазу бензоназу (№ 1.016797.0001 по кат. Merck Group) до конечной концентрации 25 единиц/мл. Продукт (в одноразовом пакете для биопроцессов) инкубируют при 37 °C в течение 2–3 ч в инкубаторе для предоставления достаточного времени для ферментативного расщепления остаточной клеточной и плазмидной ДНК в урожае, полученном в результате процедуры трансфекции.Эту стадию выполняют для минимизации количества остаточной ДНК в готовом векторе DP.После инкубационного периода добавляют NaCl до конечной концентрации 500 мМ, чтобы способствовать выделению продукта во время фильтрации и последующей фильтрации в тангенциальном потоке.
4. Осветление
. Удаляют клетки и клеточный дебрис из продукта с использованием погружной фильтровальной капсулы (1,2 мкм/0,22 мкм), присоединенной последовательно в виде набора из стерильной закрытой трубки и пакета, используемого с перистальтическим насосом. Среда проходит через капсульный фильтр Sartorius Sartoguard из PES (1,2 мкм/0,22 мкм) (Sartorius Stedim Biotech Inc.).
5. Крупномасштабная фильтрация в тангенциальном потоке
. Снижение объема (в 10–20 раз) осветленного продукта достигают с использованием фильтрации в тангенциальном потоке (TFF), используя специальную набор из стерильной закрытой трубки для биопроцессов, пакет и мембрану, изготовленный Spectrum Labs.
8.4 Повторное введение второго вектора
8.4.1 Повторное введение AAV3B или AAV5
Оценивали эффективность повторного введения вектора с использованием AAV3B или AAV5 у макак-резус, которых ранее лечили векторами AAVrh10 или AAV8.  Векторы, показанные в таблице 4, получали, как описано ранее, когда вектор выделяли из супернатанта после тройной трансфекции в клетках HEK293 и очищали на градиенте йодиксанола. Определяли титр векторов методом цифровой ПЦР.
13
В исследовании на 8 группах (n=3/группу; таблица 1) было задействовано 24 макака-резус (возрастом 3–5 лет) на основании их статуса по предварительно имеющимся NAb. На день 0 макакам инъецировали 1,0x1013 ГК/кг AAV.TBG.hCG.WPRE с вектором AAV, как показано в таблице 4.  На неделю 12 макаки получали вторую инъекцию 1,0x10 ГК/кг AAV.TBG.hCG.WPRE с вектором AAV, как показано в таблице 4.  Выполняли биопсию печени на неделю 2 и неделю 14, а аутопсию выполняли на неделю 26.
Таблица 4. Краткое описание когорт и векторов
Уровни экспрессии трансгенов (rhCG — хорионический гонадотропин макака-резус, b-субъединица; rhAFP — альфа-фетопротеин макака-резус) в сыворотке измеряли твердофазным иммуноферментным анализом (твердофазный ИФА). Для измерения ДНК-копий векторов в печени выполняли анализы кПЦР на общей клеточной ДНК, экстрагированной из образцов печени, собранных во время биопсии и аутопсии печени.  Выполняли анализ на NAb к AAV как описано раннее.  Для визуализации окрашивали срезы печени антителом против CG.
На ФИГ. 15 показано сравнение уровней экспрессии rhCG векторами AAVrh10, AAV8, AAV3B и AAV5 (первая инъекция вектора).  На ФИГ. 16A–16D показаны ДНК-копии векторов rhCG в печени в различные моменты времени.  На ФИГ. 17A–17B показаны уровни rhAFP после повторного введения (вторая инъекция вектора) векторов AAV3B (ФИГ. 17A) или AAV5 (ФИГ. 17B), экспрессирующих rhAFP.  На ФИГ. 18A и ФИГ. 18B показаны геномные копии вектора rhAFP в печени.  На ФИГ. 19 показаны различные Nab-ответы на AAV у макак.
У наивных животных векторы клада E (AAVrh10 и AAV8) продемонстрировали наибольшие уровни перипортального переноса генов по сравнению с векторами AAV5 с наименьшими уровнями; перипортальная зона располагается ближе всего к входу кровотока, получает наиболее оксигенированную кровь и является самой важной областью печени для обеспечения метаболических процессов.  Векторы AAVrh10 и AAV5 проявили более высокие уровни нейтрализирующих антител (NAb), чем AAV8 и AAV3B.  У серонегативных животных отмечена значимая вариация экспрессии трансгенов, включая AAV3B, среди разных животных.  В течение исследованного короткого временного промежутка оказывается, что образующееся к AAVrh10 NAb, впоследствии ингибировало трансдукцию in vivo серологически отличающегося серотипа AAV3B; а предыдущее воздействие AAV8 не влияло на трансдукцию AAV3B.
Все публикации, цитируемые в этом описании, а также предварительных заявках на патенты США с номерами 62/323,336, 62/331,807 и 62/428,866, включены в данный документ путем ссылки.  Аналогичным образом, номера SEQ ID NO, которые упомянутые в данном документе и оказываются в прилагаемом перечне последовательностей и самом перечне последовательностей, включены путем ссылки. Несмотря на то, что изобретение было описано со ссылкой на конкретные варианты реализации изобретения, следует понимать, что можно выполнять различные модификации, не отступая от сущности данного изобретения.  Подразумевается, что такие модификации входят в объем прилагаемой формулы изобретения.
(Перечень последовательностей в произвольном формате)
Следующая информация представлена для последовательностей в произвольном формате под числовым идентификатором <223>.
SEQ ID NO: (содержит произвольный формат)
Произвольный формат под <223>
4
<223>  сконструированная последовательность
5
<223>  сконструированная последовательность
6
<223>  сконструированная последовательность
7
<223>  сконструированная последовательность
8
<223>  сконструированная последовательность
9
<223>  сконструированная последовательность
10
<223>  сконструированная последовательность
11
<223>  сконструированная последовательность
12
<223>  сконструированная последовательность
13
<223>  сконструированная последовательность
14
<223>  сконструированная последовательность
15
<223>  сконструированная последовательность
16
<223>  сконструированная последовательность
17
<223> Капсид AAVhu.37
18
<223> Капсид AAVrh.10
19
<223>  сконструированная последовательность
20
<223> Капсид AAV3B
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>ЗЕ ТРАСТИС ОФ ЗЕ ЮНИВЕРСИТИ ОФ ПЕНСИЛЬВАНИЯ
<120>  ГЕННАЯ ТЕРАПИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ГЕМОФИЛИИ A
<130>  UPN-16-7798PCT
<150>  US 62/323,336
<151>  2016-04-15
<150>  US 62/331,807
<151>  2016-05-04
<150>  US 62/428,866
<151>  2016-12-01
<160>  20
<170>  PatentIn, версия 3.5
<210>  1
<211>  4371
<212>ДНК
<213>  Homo sapiens
<400>  1
atgcaaatag agctctccac ctgcttcttt ctgtgccttt tgcgattctg ctttagtgcc       60
accagaagat actacctggg tgcagtggaa ctgtcatggg actatatgca aagtgatctc      120
ggtgagctgc ctgtggacgc aagatttcct cctagagtgc caaaatcttt tccattcaac      180
acctcagtcg tgtacaaaaa gactctgttt gtagaattca cggatcacct tttcaacatc      240
gctaagccaa ggccaccctg gatgggtctg ctaggtccta ccatccaggc tgaggtttat      300
gatacagtgg tcattacact taagaacatg gcttcccatc ctgtcagtct tcatgctgtt      360
ggtgtatcct actggaaagc ttctgaggga gctgaatatg atgatcagac cagtcaaagg      420
gagaaagaag atgataaagt cttccctggt ggaagccata catatgtctg gcaggtcctg      480
aaagagaatg gtccaatggc ctctgaccca ctgtgcctta cctactcata tctttctcat      540
gtggacctgg taaaagactt gaattcaggc ctcattggag ccctactagt atgtagagaa      600
gggagtctgg ccaaggaaaa gacacagacc ttgcacaaat ttatactact ttttgctgta      660
tttgatgaag ggaaaagttg gcactcagaa acaaagaact ccttgatgca ggatagggat      720
gctgcatctg ctcgggcctg gcctaaaatg cacacagtca atggttatgt aaacaggtct      780
ctgccaggtc tgattggatg ccacaggaaa tcagtctatt ggcatgtgat tggaatgggc      840
accactcctg aagtgcactc aatattcctc gaaggtcaca catttcttgt gaggaaccat      900
cgccaggcgt ccttggaaat ctcgccaata actttcctta ctgctcaaac actcttgatg      960
gaccttggac agtttctact gttttgtcat atctcttccc accaacatga tggcatggaa     1020
gcttatgtca aagtagacag ctgtccagag gaaccccaac tacgaatgaa aaataatgaa     1080
gaagcggaag actatgatga tgatcttact gattctgaaa tggatgtggt caggtttgat     1140
gatgacaact ctccttcctt tatccaaatt cgctcagttg ccaagaagca tcctaaaact     1200
tgggtacatt acattgctgc tgaagaggag gactgggact atgctccctt agtcctcgcc     1260
cccgatgaca gaagttataa aagtcaatat ttgaacaatg gccctcagcg gattggtagg     1320
aagtacaaaa aagtccgatt tatggcatac acagatgaaa cctttaagac tcgtgaagct     1380
attcagcatg aatcaggaat cttgggacct ttactttatg gggaagttgg agacacactg     1440
ttgattatat ttaagaatca agcaagcaga ccatataaca tctaccctca cggaatcact     1500
gatgtccgtc ctttgtattc aaggagatta ccaaaaggtg taaaacattt gaaggatttt     1560
ccaattctgc caggagaaat attcaaatat aaatggacag tgactgtaga agatgggcca     1620
actaaatcag atcctcggtg cctgacccgc tattactcta gtttcgttaa tatggagaga     1680
gatctagctt caggactcat tggccctctc ctcatctgct acaaagaatc tgtagatcaa     1740
agaggaaacc agataatgtc agacaagagg aatgtcatcc tgttttctgt atttgatgag     1800
aaccgaagct ggtacctcac agagaatata caacgctttc tccccaatcc agctggagtg     1860
cagcttgagg atccagagtt ccaagcctcc aacatcatgc acagcatcaa tggctatgtt     1920
tttgatagtt tgcagttgtc agtttgtttg catgaggtgg catactggta cattctaagc     1980
attggagcac agactgactt cctttctgtc ttcttctctg gatatacctt caaacacaaa     2040
atggtctatg aagacacact caccctattc ccattctcag gagaaactgt cttcatgtcg     2100
atggaaaacc caggtctatg gattctgggg tgccacaact cagactttcg gaacagaggc     2160
atgaccgcct tactgaaggt ttctagttgt gacaagaaca ctggtgatta ttacgaggac     2220
agttatgaag atatttcagc atacttgctg agtaaaaaca atgccattga accaagaagc     2280
ttctcccaga atccaccagt cttgaaacgc catcaacggg aaataactcg tactactctt     2340
cagtcagatc aagaggaaat tgactatgat gataccatat cagttgaaat gaagaaggaa     2400
gattttgaca tttatgatga ggatgaaaat cagagccccc gcagctttca aaagaaaaca     2460
cgacactatt ttattgctgc agtggagagg ctctgggatt atgggatgag tagctcccca     2520
catgttctaa gaaacagggc tcagagtggc agtgtccctc agttcaagaa agttgttttc     2580
caggaattta ctgatggctc ctttactcag cccttatacc gtggagaact aaatgaacat     2640
ttgggactcc tggggccata tataagagca gaagttgaag ataatatcat ggtaactttc     2700
agaaatcagg cctctcgtcc ctattccttc tattctagcc ttatttctta tgaggaagat     2760
cagaggcaag gagcagaacc tagaaaaaac tttgtcaagc ctaatgaaac caaaacttac     2820
ttttggaaag tgcaacatca tatggcaccc actaaagatg agtttgactg caaagcctgg     2880
gcttatttct ctgatgttga cctggaaaaa gatgtgcact caggcctgat tggacccctt     2940
ctggtctgcc acactaacac actgaaccct gctcatggga gacaagtgac agtacaggaa     3000
tttgctctgt ttttcaccat ctttgatgag accaaaagct ggtacttcac tgaaaatatg     3060
gaaagaaact gcagggctcc ctgcaatatc cagatggaag atcccacttt taaagagaat     3120
tatcgcttcc atgcaatcaa tggctacata atggatacac tacctggctt agtaatggct     3180
caggatcaaa ggattcgatg gtatctgctc agcatgggca gcaatgaaaa catccattct     3240
attcatttca gtggacatgt gttcactgta cgaaaaaaag aggagtataa aatggcactg     3300
tacaatctct atccaggtgt ttttgagaca gtggaaatgt taccatccaa agctggaatt     3360
tggcgggtgg aatgccttat tggcgagcat ctacatgctg ggatgagcac actttttctg     3420
gtgtacagca ataagtgtca gactcccctg ggaatggctt ctggacacat tagagatttt     3480
cagattacag cttcaggaca atatggacag tgggccccaa agctggccag acttcattat     3540
tccggatcaa tcaatgcctg gagcaccaag gagccctttt cttggatcaa ggtggatctg     3600
ttggcaccaa tgattattca cggcatcaag acccagggtg cccgtcagaa gttctccagc     3660
ctctacatct ctcagtttat catcatgtat agtcttgatg ggaagaagtg gcagacttat     3720
cgaggaaatt ccactggaac cttaatggtc ttctttggca atgtggattc atctgggata     3780
aaacacaata tttttaaccc tccaattatt gctcgataca tccgtttgca cccaactcat     3840
tatagcattc gcagcactct tcgcatggag ttgatgggct gtgatttaaa tagttgcagc     3900
atgccattgg gaatggagag taaagcaata tcagatgcac agattactgc ttcatcctac     3960
tttaccaata tgtttgccac ctggtctcct tcaaaagctc gacttcacct ccaagggagg     4020
agtaatgcct ggagacctca ggtgaataat ccaaaagagt ggctgcaagt ggacttccag     4080
aagacaatga aagtcacagg agtaactact cagggagtaa aatctctgct taccagcatg     4140
tatgtgaagg agttcctcat ctccagcagt caagatggcc atcagtggac tctctttttt     4200
cagaatggca aagtaaaggt ttttcaggga aatcaagact ccttcacacc tgtggtgaac     4260
tctctagacc caccgttact gactcgctac cttcgaattc acccccagag ttgggtgcac     4320
cagattgccc tgaggatgga ggttctgggc tgcgaggcac aggacctcta c              4371
<210>  2
<211>  4374
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  сконструированная последовательность
<400>  2
atgcagatcgagctgagcacctgcttcttcctgtgcctgctgcggttctgcttctccgcc       60
acccggcggtactacctgggagccgtggagctgagctgggattacatgcagagcgatctg      120
ggagagctgccagtggatgcccggttcccaccacgggtgccaaagagcttcccattcaac      180
accagcgtggtgtacaagaagaccctgttcgtggagttcaccgatcacctgttcaacatc      240
gccaagccacggccaccctggatgggactgctgggaccaaccatccaggccgaggtgtac      300
gataccgtggtgatcaccctgaagaacatggcctctcatcctgtgtccctgcacgccgtg      360
ggagtgagctactggaaggccagcgagggagccgagtacgatgatcagaccagccagcgg      420
gagaaggaggatgataaggtgttcccaggaggaagccacacctacgtgtggcaggtgctg      480
aaggagaacggaccaatggccagcgatccactgtgcctgacctacagctacctgagccac      540
gtggatctggtgaaggatctgaacagcggactgatcggagccctgctggtgtgccgggag      600
ggaagcctggccaaggagaagacccagaccctgcacaagttcatcctgctgttcgccgtg      660
ttcgatgagggaaagagctggcacagcgagaccaagaacagcctgatgcaggatcgggat      720
gccgccagcgcccgggcctggccaaagatgcacaccgtgaacggatacgtgaaccggagc      780
ctgccaggactgatcggatgccaccggaagagcgtgtactggcacgtgatcggaatggga      840
accaccccagaggtgcactctatcttcctggagggacacacctttctggtgcggaaccac      900
cggcaggccagcctggagatcagcccaatcaccttcctgaccgcccagaccctgctgatg      960
gatctgggacagttcctgctgttctgccatatcagcagccaccagcacgatggaatggag     1020
gcctacgtgaaggtggatagctgcccagaggagccacagctgcggatgaagaacaacgag     1080
gaggccgaggattacgatgatgatctgaccgatagcgagatggatgtggtgcggttcgat     1140
gatgataacagcccaagcttcatccagatccggagcgtggccaagaagcacccaaagacc     1200
tgggtgcactacatcgccgccgaggaggaggattgggattacgccccactggtgctggcc     1260
cctgatgatcggagctacaagagccagtacctgaacaacggaccacagcggatcggacgg     1320
aagtacaaaaaagtgcggttcatggcctacaccgatgagaccttcaagacccgggaggcc     1380
atccagcacgagagcggaatcctgggaccactgctgtacggagaggtgggagataccctg     1440
ctgatcatcttcaagaaccaggccagccggccatacaacatctacccacacggaatcacc     1500
gatgtgcggccactgtacagccggcggctgccaaagggagtgaagcacctgaaggatttc     1560
ccaatcctgccaggagagatcttcaagtacaagtggacagtgacagtggaggatggacca     1620
accaagtctgatccaagatgcctgaccagatactacagcagctttgtgaacatggagaga     1680
gacctggcctctggactgattggaccactgctgatctgctacaaggagtctgtggatcag     1740
agaggaaaccagatcatgtctgataagagaaatgtgatcctgttctctgtgtttgatgag     1800
aacagaagctggtacctgacagagaacatccagagattcctgccaaacccagccggagtg     1860
cagctggaggatccagagttccaggccagcaacatcatgcacagcatcaacggatacgtg     1920
ttcgatagcctgcagctgagcgtgtgcctgcacgaggtggcctattggtatatcctgagc     1980
atcggagcccagaccgatttcctgagcgtgttcttcagcggatacaccttcaagcacaag     2040
atggtgtacgaggataccctgaccctgttcccattctccggagagaccgtgttcatgagc     2100
atggagaacccaggactgtggatcctgggatgccacaactctgatttcagaaacagagga     2160
atgactgccctgctgaaagtgtccagctgtgataagaacactggagattactatgaggat     2220
agctatgaggatatctctgcctacctgctgagcaagaacaatgccattgagccaagaagc     2280
ttcagccagaacccaccagtgctgaagagacaccagagagagatcaccagaaccaccctg     2340
cagtctgatcaggaggagattgattatgatgataccatctctgtggagatgaagaaggag     2400
gattttgatatctatgatgaggatgagaaccagagcccaagaagcttccagaagaagacc     2460
agacactacttcatcgctgcagtggagagactgtgggattatggaatgagcagcagccca     2520
cacgtgctgagaaacagagcccagagcggatctgtgccacagttcaagaaggtggtgttc     2580
caggagttcaccgatggaagcttcacccagccactgtaccggggagagctgaacgagcac     2640
ctgggactgctgggaccatacatccgggccgaggtggaggataacatcatggtgaccttc     2700
cggaaccaggccagccggccatacagcttctacagcagcctgatcagctacgaggaggat     2760
cagcggcagggagccgagccacggaagaacttcgtgaagccaaacgagaccaagacctac     2820
ttctggaaggtgcagcaccacatggccccaaccaaggatgagttcgattgcaaggcctgg     2880
gcctacttcagcgatgtggatctggagaaggatgtgcacagcggactgatcggaccactg     2940
ctggtgtgccacaccaacaccctgaacccagcccacggacggcaggtgaccgtgcaggag     3000
ttcgccctgttcttcaccatcttcgatgagaccaagagctggtacttcaccgagaacatg     3060
gagcggaactgccgggccccttgcaacatccagatggaggatccaaccttcaaggagaac     3120
taccggttccacgccatcaacggatacatcatggataccctgccaggactggtgatggcc     3180
caggatcagcggatccggtggtacctgctgagcatgggaagcaacgagaacatccacagc     3240
atccacttcagcggacacgtgttcaccgtgcggaagaaggaggagtacaagatggccctg     3300
tacaacctgtacccaggagtgttcgagaccgtggagatgctgccaagcaaggccggaatc     3360
tggcgggtggagtgcctgatcggagagcacctgcacgccggaatgagcaccctgttcctg     3420
gtgtacagcaacaagtgccagaccccactgggaatggccagcggacacatccgggatttc     3480
cagatcaccgccagcggacagtacggacagtgggccccaaagctggcccggctgcactac     3540
agcggaagcatcaacgcctggagcaccaaggagccattcagctggatcaaagtggatctg     3600
ctggccccaatgatcatccacggaatcaagacccagggagcccggcagaagttcagcagc     3660
ctgtacatcagccagttcatcatcatgtacagcctggatggaaagaagtggcagacctac     3720
cggggaaacagcaccggaaccctgatggtgttcttcggaaacgtggatagcagcggaatc     3780
aagcacaacatcttcaacccaccaatcatcgcccgatacatccggctgcacccaacccac     3840
tacagcatcagaagcaccctgcggatggagctgatgggatgtgatctgaacagctgctcc     3900
atgccactgggaatggagagcaaggccatcagcgatgcccagatcaccgccagcagctac     3960
ttcaccaacatgttcgccacctggagcccaagcaaggcccggctgcacctgcagggacgg     4020
agcaacgcctggcggccacaggtgaataacccaaaggagtggctgcaggtggatttccag     4080
aagaccatgaaggtgaccggagtgaccacccagggagtgaagagcctgctgactagcatg     4140
tatgtgaaggagttcctgatcagcagcagccaggatggacaccagtggaccctgttcttc     4200
cagaacggaaaggtgaaggtgttccagggaaaccaggatagcttcaccccagtggtgaac     4260
agcctggatccaccactgctgacccgatacctgcggatccacccacagagctgggtgcac     4320
cagatcgccctgagaatggaggtgctgggatgcgaggcccaggatctgtactga           4374
<210>  3
<211>  1457
<212>ПРТ
<213>  Homo sapiens
<400>  3
Met Gln Ile Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe
1               5                   10                  15
Cys Phe Ser Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser
20                  25                  30
Trp Asp Tyr Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg
35                  40                  45
Phe Pro Pro Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val
50                  55                  60
Tyr Lys Lys Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile
65                  70                  75                  80
Ala Lys Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln
85                  90                  95
Ala Glu Val Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser
100                 105                 110
His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser
115                 120                 125
Glu Gly Ala Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp
130                 135                 140
Asp Lys Val Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu
145                 150                 155                 160
Lys Glu Asn Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser
165                 170                 175
Tyr Leu Ser His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile
180                 185                 190
Gly Ala Leu Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr
195                 200                 205
Gln Thr Leu His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly
210                 215                 220
Lys Ser Trp His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp
225                 230                 235                 240
Ala Ala Ser Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr
245                 250                 255
Val Asn Arg Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val
260                 265                 270
Tyr Trp His Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile
275                 280                 285
Phe Leu Glu Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser
290                 295                 300
Leu Glu Ile Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met
305                 310                 315                 320
Asp Leu Gly Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His
325                 330                 335
Asp Gly Met Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro
340                 345                 350
Gln Leu Arg Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp
355                 360                 365
Leu Thr Asp Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser
370                 375                 380
Pro Ser Phe Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr
385                 390                 395                 400
Trp Val His Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro
405                 410                 415
Leu Val Leu Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn
420                 425                 430
Asn Gly Pro Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met
435                 440                 445
Ala Tyr Thr Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu
450                 455                 460
Ser Gly Ile Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu
465                 470                 475                 480
Leu Ile Ile Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro
485                 490                 495
His Gly Ile Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys
500                 505                 510
Gly Val Lys His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe
515                 520                 525
Lys Tyr Lys Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp
530                 535                 540
Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg
545                 550                 555                 560
Asp Leu Ala Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu
565                 570                 575
Ser Val Asp Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val
580                 585                 590
Ile Leu Phe Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu
595                 600                 605
Asn Ile Gln Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp
610                 615                 620
Pro Glu Phe Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val
625                 630                 635                 640
Phe Asp Ser Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp
645                 650                 655
Tyr Ile Leu Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe
660                 665                 670
Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr
675                 680                 685
Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro
690                 695                 700
Gly Leu Trp Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly
705                 710                 715                 720
Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp
725                 730                 735
Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys
740                 745                 750
Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Pro Pro Val Leu
755                 760                 765
Lys Arg His Gln Arg Glu Ile Thr Arg Thr Thr Leu Gln Ser Asp Gln
770                 775                 780
Glu Glu Ile Asp Tyr Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu Met Lys Lys Glu
785                 790                 795                 800
Asp Phe Asp Ile Tyr Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe
805                 810                 815
Gln Lys Lys Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp
820                 825                 830
Asp Tyr Gly Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln
835                 840                 845
Ser Gly Ser Val Pro Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr
850                 855                 860
Asp Gly Ser Phe Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu His
865                 870                 875                 880
Leu Gly Leu Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile
885                 890                 895
Met Val Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser
900                 905                 910
Ser Leu Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu Pro Arg
915                 920                 925
Lys Asn Phe Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp Lys Val
930                 935                 940
Gln His His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys Ala Trp
945                 950                 955                 960
Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His Ser Gly Leu
965                 970                 975
Ile Gly Pro Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu Asn Pro Ala His
980                 985                 990
Gly Arg Gln Val Thr Val Gln Glu  Phe Ala Leu Phe Phe  Thr Ile Phe
995                 1000                 1005
Asp Glu  Thr Lys Ser Trp Tyr  Phe Thr Glu Asn Met  Glu Arg Asn
1010                 1015                 1020
Cys Arg  Ala Pro Cys Asn Ile  Gln Met Glu Asp Pro  Thr Phe Lys
1025                 1030                 1035
Glu Asn  Tyr Arg Phe His Ala  Ile Asn Gly Tyr Ile  Met Asp Thr
1040                 1045                 1050
Leu Pro  Gly Leu Val Met Ala  Gln Asp Gln Arg Ile  Arg Trp Tyr
1055                 1060                 1065
Leu Leu  Ser Met Gly Ser Asn  Glu Asn Ile His Ser  Ile His Phe
1070                 1075                 1080
Ser Gly  His Val Phe Thr Val  Arg Lys Lys Glu Glu  Tyr Lys Met
1085                 1090                 1095
Ala Leu  Tyr Asn Leu Tyr Pro  Gly Val Phe Glu Thr  Val Glu Met
1100                 1105                 1110
Leu Pro  Ser Lys Ala Gly Ile  Trp Arg Val Glu Cys  Leu Ile Gly
1115                 1120                 1125
Glu His  Leu His Ala Gly Met  Ser Thr Leu Phe Leu  Val Tyr Ser
1130                 1135                 1140
Asn Lys  Cys Gln Thr Pro Leu  Gly Met Ala Ser Gly  His Ile Arg
1145                 1150                 1155
Asp Phe  Gln Ile Thr Ala Ser  Gly Gln Tyr Gly Gln  Trp Ala Pro
1160                 1165                 1170
Lys Leu  Ala Arg Leu His Tyr  Ser Gly Ser Ile Asn  Ala Trp Ser
1175                 1180                 1185
Thr Lys  Glu Pro Phe Ser Trp  Ile Lys Val Asp Leu  Leu Ala Pro
1190                 1195                 1200
Met Ile  Ile His Gly Ile Lys  Thr Gln Gly Ala Arg  Gln Lys Phe
1205                 1210                 1215
Ser Ser  Leu Tyr Ile Ser Gln  Phe Ile Ile Met Tyr  Ser Leu Asp
1220                 1225                 1230
Gly Lys  Lys Trp Gln Thr Tyr  Arg Gly Asn Ser Thr  Gly Thr Leu
1235                 1240                 1245
Met Val  Phe Phe Gly Asn Val  Asp Ser Ser Gly Ile  Lys His Asn
1250                 1255                 1260
Ile Phe  Asn Pro Pro Ile Ile  Ala Arg Tyr Ile Arg  Leu His Pro
1265                 1270                 1275
Thr His  Tyr Ser Ile Arg Ser  Thr Leu Arg Met Glu  Leu Met Gly
1280                 1285                 1290
Cys Asp  Leu Asn Ser Cys Ser  Met Pro Leu Gly Met  Glu Ser Lys
1295                 1300                 1305
Ala Ile  Ser Asp Ala Gln Ile  Thr Ala Ser Ser Tyr  Phe Thr Asn
1310                 1315                 1320
Met Phe  Ala Thr Trp Ser Pro  Ser Lys Ala Arg Leu  His Leu Gln
1325                 1330                 1335
Gly Arg  Ser Asn Ala Trp Arg  Pro Gln Val Asn Asn  Pro Lys Glu
1340                 1345                 1350
Trp Leu  Gln Val Asp Phe Gln  Lys Thr Met Lys Val  Thr Gly Val
1355                 1360                 1365
Thr Thr  Gln Gly Val Lys Ser  Leu Leu Thr Ser Met  Tyr Val Lys
1370                 1375                 1380
Glu Phe  Leu Ile Ser Ser Ser  Gln Asp Gly His Gln  Trp Thr Leu
1385                 1390                 1395
Phe Phe  Gln Asn Gly Lys Val  Lys Val Phe Gln Gly  Asn Gln Asp
1400                 1405                 1410
Ser Phe  Thr Pro Val Val Asn  Ser Leu Asp Pro Pro  Leu Leu Thr
1415                 1420                 1425
Arg Tyr  Leu Arg Ile His Pro  Gln Ser Trp Val His  Gln Ile Ala
1430                 1435                 1440
Leu Arg  Met Glu Val Leu Gly  Cys Glu Ala Gln Asp  Leu Tyr
1445                 1450                 1455
<210>  4
<211>  34
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  сконструированная последовательность
<400>  4
tgtttgctgcttgcaatgtttgcccattttaggg                                   34
<210>  5
<211>  100
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  сконструированная последовательность
<400>  5
ctacctcgtgatcgcccggcccctgttcaaacatgtcctaatactctgtctctgcaaggg       60
tcatcagtagttttccatcttactcaacatcctcccagtg                            100
<210>  6
<211>  42
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  сконструированная последовательность
<400>  6
aggttaatttttaaactgtttgctctggttaataatctcagg                          42
<210>  7
<211>  190
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  сконструированная последовательность
<400>  7
atttcatagaacgaatgttccgatgctctaatctctctagacaaggttcatatttgtatg       60
ggttacttattctctctttgttgactaagtcaataatcagaatcagcaggtttgcagtca      120
gattggcagggataagcagcctagctcaggagaagtgagtataaaagccccaggctggga      180
gcagccatca                                                             190
<210>  8
<211>  176
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  сконструированная последовательность
<400>  8
actcaaagttcaaaccttatcattttttgctttgttcctcttggccttggttttgtacat       60
cagctttgaaaataccatcccagggttaatgctggggttaatttataactaagagtgctc      120
tagttttgcaatacaggacatgctataaaaatggaaagatgttgctttctgagaga          176
<210>  9
<211>  218
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  сконструированная последовательность
<400>  9
tggacacaggacgctgtggtttctgagccagggggcgactcagatcccagccagtggact       60
tagcccctgtttgctcctccgataactggggtgaccttggttaatattcaccagcagcct      120
cccccgttgcccctctggatccactgcttaaatacggacgaggacagggccctgtctcct      180
cagcttcaggcaccaccactgacctgggacagtgaata                              218
<210>  10
<211>  75
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  сконструированная последовательность
<400>  10
aataaagtctgagtgggcggcagcctgtgtgtgcctgggttctctctgtcccggaatgtg       60
caaacaatggaggtg                                                        75
<210>  11
<211>  168
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  сконструированная последовательность
<400>  11
ctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgaccttt       60
ggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcact      120
aggggttccttgtagttaatgattaacccgccatgctacttatctact                   168
<210>  12
<211>  164
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  сконструированная последовательность
<400>  12
gataagtagcatggcgggttaatcattaactacaaggaacccctagtgatggagttggcc       60
actccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgc      120
ccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcag                       164
<210>  13
<211>  7920
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  сконструированная последовательность
<400>  13
ctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgaccttt       60
ggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcact      120
aggggttccttgtagttaatgattaacccgccatgctacttatctacttaagctacctcg      180
tgatcgcccggcccctgttcaaacatgtcctaatactctgtctctgcaagggtcatcagt      240
agttttccatcttactcaacatcctcccagtggaattcatttcatagaacgaatgttccg      300
atgctctaatctctctagacaaggttcatatttgtatgggttacttattctctctttgtt      360
gactaagtcaataatcagaatcagcaggtttgcagtcagattggcagggataagcagcct      420
agctcaggagaagtgagtataaaagccccaggctgggagcagccatcagcggccgccacc      480
atgcagatcgagctgagcacctgcttcttcctgtgcctgctgcggttctgcttctccgcc      540
acccggcggtactacctgggagccgtggagctgagctgggattacatgcagagcgatctg      600
ggagagctgccagtggatgcccggttcccaccacgggtgccaaagagcttcccattcaac      660
accagcgtggtgtacaagaagaccctgttcgtggagttcaccgatcacctgttcaacatc      720
gccaagccacggccaccctggatgggactgctgggaccaaccatccaggccgaggtgtac      780
gataccgtggtgatcaccctgaagaacatggcctctcatcctgtgtccctgcacgccgtg      840
ggagtgagctactggaaggccagcgagggagccgagtacgatgatcagaccagccagcgg      900
gagaaggaggatgataaggtgttcccaggaggaagccacacctacgtgtggcaggtgctg      960
aaggagaacggaccaatggccagcgatccactgtgcctgacctacagctacctgagccac     1020
gtggatctggtgaaggatctgaacagcggactgatcggagccctgctggtgtgccgggag     1080
ggaagcctggccaaggagaagacccagaccctgcacaagttcatcctgctgttcgccgtg     1140
ttcgatgagggaaagagctggcacagcgagaccaagaacagcctgatgcaggatcgggat     1200
gccgccagcgcccgggcctggccaaagatgcacaccgtgaacggatacgtgaaccggagc     1260
ctgccaggactgatcggatgccaccggaagagcgtgtactggcacgtgatcggaatggga     1320
accaccccagaggtgcactctatcttcctggagggacacacctttctggtgcggaaccac     1380
cggcaggccagcctggagatcagcccaatcaccttcctgaccgcccagaccctgctgatg     1440
gatctgggacagttcctgctgttctgccatatcagcagccaccagcacgatggaatggag     1500
gcctacgtgaaggtggatagctgcccagaggagccacagctgcggatgaagaacaacgag     1560
gaggccgaggattacgatgatgatctgaccgatagcgagatggatgtggtgcggttcgat     1620
gatgataacagcccaagcttcatccagatccggagcgtggccaagaagcacccaaagacc     1680
tgggtgcactacatcgccgccgaggaggaggattgggattacgccccactggtgctggcc     1740
cctgatgatcggagctacaagagccagtacctgaacaacggaccacagcggatcggacgg     1800
aagtacaaaaaagtgcggttcatggcctacaccgatgagaccttcaagacccgggaggcc     1860
atccagcacgagagcggaatcctgggaccactgctgtacggagaggtgggagataccctg     1920
ctgatcatcttcaagaaccaggccagccggccatacaacatctacccacacggaatcacc     1980
gatgtgcggccactgtacagccggcggctgccaaagggagtgaagcacctgaaggatttc     2040
ccaatcctgccaggagagatcttcaagtacaagtggacagtgacagtggaggatggacca     2100
accaagtctgatccaagatgcctgaccagatactacagcagctttgtgaacatggagaga     2160
gacctggcctctggactgattggaccactgctgatctgctacaaggagtctgtggatcag     2220
agaggaaaccagatcatgtctgataagagaaatgtgatcctgttctctgtgtttgatgag     2280
aacagaagctggtacctgacagagaacatccagagattcctgccaaacccagccggagtg     2340
cagctggaggatccagagttccaggccagcaacatcatgcacagcatcaacggatacgtg     2400
ttcgatagcctgcagctgagcgtgtgcctgcacgaggtggcctattggtatatcctgagc     2460
atcggagcccagaccgatttcctgagcgtgttcttcagcggatacaccttcaagcacaag     2520
atggtgtacgaggataccctgaccctgttcccattctccggagagaccgtgttcatgagc     2580
atggagaacccaggactgtggatcctgggatgccacaactctgatttcagaaacagagga     2640
atgactgccctgctgaaagtgtccagctgtgataagaacactggagattactatgaggat     2700
agctatgaggatatctctgcctacctgctgagcaagaacaatgccattgagccaagaagc     2760
ttcagccagaacccaccagtgctgaagagacaccagagagagatcaccagaaccaccctg     2820
cagtctgatcaggaggagattgattatgatgataccatctctgtggagatgaagaaggag     2880
gattttgatatctatgatgaggatgagaaccagagcccaagaagcttccagaagaagacc     2940
agacactacttcatcgctgcagtggagagactgtgggattatggaatgagcagcagccca     3000
cacgtgctgagaaacagagcccagagcggatctgtgccacagttcaagaaggtggtgttc     3060
caggagttcaccgatggaagcttcacccagccactgtaccggggagagctgaacgagcac     3120
ctgggactgctgggaccatacatccgggccgaggtggaggataacatcatggtgaccttc     3180
cggaaccaggccagccggccatacagcttctacagcagcctgatcagctacgaggaggat     3240
cagcggcagggagccgagccacggaagaacttcgtgaagccaaacgagaccaagacctac     3300
ttctggaaggtgcagcaccacatggccccaaccaaggatgagttcgattgcaaggcctgg     3360
gcctacttcagcgatgtggatctggagaaggatgtgcacagcggactgatcggaccactg     3420
ctggtgtgccacaccaacaccctgaacccagcccacggacggcaggtgaccgtgcaggag     3480
ttcgccctgttcttcaccatcttcgatgagaccaagagctggtacttcaccgagaacatg     3540
gagcggaactgccgggccccttgcaacatccagatggaggatccaaccttcaaggagaac     3600
taccggttccacgccatcaacggatacatcatggataccctgccaggactggtgatggcc     3660
caggatcagcggatccggtggtacctgctgagcatgggaagcaacgagaacatccacagc     3720
atccacttcagcggacacgtgttcaccgtgcggaagaaggaggagtacaagatggccctg     3780
tacaacctgtacccaggagtgttcgagaccgtggagatgctgccaagcaaggccggaatc     3840
tggcgggtggagtgcctgatcggagagcacctgcacgccggaatgagcaccctgttcctg     3900
gtgtacagcaacaagtgccagaccccactgggaatggccagcggacacatccgggatttc     3960
cagatcaccgccagcggacagtacggacagtgggccccaaagctggcccggctgcactac     4020
agcggaagcatcaacgcctggagcaccaaggagccattcagctggatcaaagtggatctg     4080
ctggccccaatgatcatccacggaatcaagacccagggagcccggcagaagttcagcagc     4140
ctgtacatcagccagttcatcatcatgtacagcctggatggaaagaagtggcagacctac     4200
cggggaaacagcaccggaaccctgatggtgttcttcggaaacgtggatagcagcggaatc     4260
aagcacaacatcttcaacccaccaatcatcgcccgatacatccggctgcacccaacccac     4320
tacagcatcagaagcaccctgcggatggagctgatgggatgtgatctgaacagctgctcc     4380
atgccactgggaatggagagcaaggccatcagcgatgcccagatcaccgccagcagctac     4440
ttcaccaacatgttcgccacctggagcccaagcaaggcccggctgcacctgcagggacgg     4500
agcaacgcctggcggccacaggtgaataacccaaaggagtggctgcaggtggatttccag     4560
aagaccatgaaggtgaccggagtgaccacccagggagtgaagagcctgctgactagcatg     4620
tatgtgaaggagttcctgatcagcagcagccaggatggacaccagtggaccctgttcttc     4680
cagaacggaaaggtgaaggtgttccagggaaaccaggatagcttcaccccagtggtgaac     4740
agcctggatccaccactgctgacccgatacctgcggatccacccacagagctgggtgcac     4800
cagatcgccctgagaatggaggtgctgggatgcgaggcccaggatctgtactgatgagca     4860
tgcaataaagtctgagtgggcggcagcctgtgtgtgcctgggttctctctgtcccggaat     4920
gtgcaaacaatggaggtgctcgagtagataagtagcatggcgggttaatcattaactaca     4980
aggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgagg     5040
ccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagc     5100
gagcgcgcagccttaattaacctaattcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactggg     5160
aaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggc     5220
gtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcg     5280
aatgggacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcg     5340
tgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttc     5400
tcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttcc     5460
gatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgta     5520
gtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttcttta     5580
atagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttg     5640
atttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaa     5700
aatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgcttacaatttaggtggcacttttcgggg     5760
aaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgct     5820
catgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtat     5880
tcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgc     5940
tcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtggg     6000
ttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacg     6060
ttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattga     6120
cgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagta     6180
ctcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgc     6240
tgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggacc     6300
gaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttg     6360
ggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagc     6420
aatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggca     6480
acaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggccct     6540
tccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtat     6600
cattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggg     6660
gagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgat     6720
taagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaact     6780
tcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaat     6840
cccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatc     6900
ttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgct     6960
accagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactgg     7020
cttcagcagagcgcagataccaaatactgttcttctagtgtagccgtagttaggccacca     7080
cttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggc     7140
tgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccgga     7200
taaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaac     7260
gacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccga     7320
agggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgag     7380
ggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctg     7440
acttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccag     7500
caacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcc     7560
tgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgc     7620
tcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgccc     7680
aatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacag     7740
gtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactca     7800
ttaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgag     7860
cggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgccagatttaattaagg     7920
<210>  14
<211>  8004
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  сконструированная последовательность
<400>  14
ctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgaccttt       60
ggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcact      120
aggggttccttgtagttaatgattaacccgccatgctacttatctacttaagctacctcg      180
tgatcgcccggcccctgttcaaacatgtcctaatactctgtctctgcaagggtcatcagt      240
agttttccatcttactcaacatcctcccagtgaggttaatttttaaactgtttgctctgg      300
ttaataatctcaggaggttaatttttaaactgtttgctctggttaataatctcagggaat      360
tcatttcatagaacgaatgttccgatgctctaatctctctagacaaggttcatatttgta      420
tgggttacttattctctctttgttgactaagtcaataatcagaatcagcaggtttgcagt      480
cagattggcagggataagcagcctagctcaggagaagtgagtataaaagccccaggctgg      540
gagcagccatcagcggccgccaccatgcagatcgagctgagcacctgcttcttcctgtgc      600
ctgctgcggttctgcttctccgccacccggcggtactacctgggagccgtggagctgagc      660
tgggattacatgcagagcgatctgggagagctgccagtggatgcccggttcccaccacgg      720
gtgccaaagagcttcccattcaacaccagcgtggtgtacaagaagaccctgttcgtggag      780
ttcaccgatcacctgttcaacatcgccaagccacggccaccctggatgggactgctggga      840
ccaaccatccaggccgaggtgtacgataccgtggtgatcaccctgaagaacatggcctct      900
catcctgtgtccctgcacgccgtgggagtgagctactggaaggccagcgagggagccgag      960
tacgatgatcagaccagccagcgggagaaggaggatgataaggtgttcccaggaggaagc     1020
cacacctacgtgtggcaggtgctgaaggagaacggaccaatggccagcgatccactgtgc     1080
ctgacctacagctacctgagccacgtggatctggtgaaggatctgaacagcggactgatc     1140
ggagccctgctggtgtgccgggagggaagcctggccaaggagaagacccagaccctgcac     1200
aagttcatcctgctgttcgccgtgttcgatgagggaaagagctggcacagcgagaccaag     1260
aacagcctgatgcaggatcgggatgccgccagcgcccgggcctggccaaagatgcacacc     1320
gtgaacggatacgtgaaccggagcctgccaggactgatcggatgccaccggaagagcgtg     1380
tactggcacgtgatcggaatgggaaccaccccagaggtgcactctatcttcctggaggga     1440
cacacctttctggtgcggaaccaccggcaggccagcctggagatcagcccaatcaccttc     1500
ctgaccgcccagaccctgctgatggatctgggacagttcctgctgttctgccatatcagc     1560
agccaccagcacgatggaatggaggcctacgtgaaggtggatagctgcccagaggagcca     1620
cagctgcggatgaagaacaacgaggaggccgaggattacgatgatgatctgaccgatagc     1680
gagatggatgtggtgcggttcgatgatgataacagcccaagcttcatccagatccggagc     1740
gtggccaagaagcacccaaagacctgggtgcactacatcgccgccgaggaggaggattgg     1800
gattacgccccactggtgctggcccctgatgatcggagctacaagagccagtacctgaac     1860
aacggaccacagcggatcggacggaagtacaaaaaagtgcggttcatggcctacaccgat     1920
gagaccttcaagacccgggaggccatccagcacgagagcggaatcctgggaccactgctg     1980
tacggagaggtgggagataccctgctgatcatcttcaagaaccaggccagccggccatac     2040
aacatctacccacacggaatcaccgatgtgcggccactgtacagccggcggctgccaaag     2100
ggagtgaagcacctgaaggatttcccaatcctgccaggagagatcttcaagtacaagtgg     2160
acagtgacagtggaggatggaccaaccaagtctgatccaagatgcctgaccagatactac     2220
agcagctttgtgaacatggagagagacctggcctctggactgattggaccactgctgatc     2280
tgctacaaggagtctgtggatcagagaggaaaccagatcatgtctgataagagaaatgtg     2340
atcctgttctctgtgtttgatgagaacagaagctggtacctgacagagaacatccagaga     2400
ttcctgccaaacccagccggagtgcagctggaggatccagagttccaggccagcaacatc     2460
atgcacagcatcaacggatacgtgttcgatagcctgcagctgagcgtgtgcctgcacgag     2520
gtggcctattggtatatcctgagcatcggagcccagaccgatttcctgagcgtgttcttc     2580
agcggatacaccttcaagcacaagatggtgtacgaggataccctgaccctgttcccattc     2640
tccggagagaccgtgttcatgagcatggagaacccaggactgtggatcctgggatgccac     2700
aactctgatttcagaaacagaggaatgactgccctgctgaaagtgtccagctgtgataag     2760
aacactggagattactatgaggatagctatgaggatatctctgcctacctgctgagcaag     2820
aacaatgccattgagccaagaagcttcagccagaacccaccagtgctgaagagacaccag     2880
agagagatcaccagaaccaccctgcagtctgatcaggaggagattgattatgatgatacc     2940
atctctgtggagatgaagaaggaggattttgatatctatgatgaggatgagaaccagagc     3000
ccaagaagcttccagaagaagaccagacactacttcatcgctgcagtggagagactgtgg     3060
gattatggaatgagcagcagcccacacgtgctgagaaacagagcccagagcggatctgtg     3120
ccacagttcaagaaggtggtgttccaggagttcaccgatggaagcttcacccagccactg     3180
taccggggagagctgaacgagcacctgggactgctgggaccatacatccgggccgaggtg     3240
gaggataacatcatggtgaccttccggaaccaggccagccggccatacagcttctacagc     3300
agcctgatcagctacgaggaggatcagcggcagggagccgagccacggaagaacttcgtg     3360
aagccaaacgagaccaagacctacttctggaaggtgcagcaccacatggccccaaccaag     3420
gatgagttcgattgcaaggcctgggcctacttcagcgatgtggatctggagaaggatgtg     3480
cacagcggactgatcggaccactgctggtgtgccacaccaacaccctgaacccagcccac     3540
ggacggcaggtgaccgtgcaggagttcgccctgttcttcaccatcttcgatgagaccaag     3600
agctggtacttcaccgagaacatggagcggaactgccgggccccttgcaacatccagatg     3660
gaggatccaaccttcaaggagaactaccggttccacgccatcaacggatacatcatggat     3720
accctgccaggactggtgatggcccaggatcagcggatccggtggtacctgctgagcatg     3780
ggaagcaacgagaacatccacagcatccacttcagcggacacgtgttcaccgtgcggaag     3840
aaggaggagtacaagatggccctgtacaacctgtacccaggagtgttcgagaccgtggag     3900
atgctgccaagcaaggccggaatctggcgggtggagtgcctgatcggagagcacctgcac     3960
gccggaatgagcaccctgttcctggtgtacagcaacaagtgccagaccccactgggaatg     4020
gccagcggacacatccgggatttccagatcaccgccagcggacagtacggacagtgggcc     4080
ccaaagctggcccggctgcactacagcggaagcatcaacgcctggagcaccaaggagcca     4140
ttcagctggatcaaagtggatctgctggccccaatgatcatccacggaatcaagacccag     4200
ggagcccggcagaagttcagcagcctgtacatcagccagttcatcatcatgtacagcctg     4260
gatggaaagaagtggcagacctaccggggaaacagcaccggaaccctgatggtgttcttc     4320
ggaaacgtggatagcagcggaatcaagcacaacatcttcaacccaccaatcatcgcccga     4380
tacatccggctgcacccaacccactacagcatcagaagcaccctgcggatggagctgatg     4440
ggatgtgatctgaacagctgctccatgccactgggaatggagagcaaggccatcagcgat     4500
gcccagatcaccgccagcagctacttcaccaacatgttcgccacctggagcccaagcaag     4560
gcccggctgcacctgcagggacggagcaacgcctggcggccacaggtgaataacccaaag     4620
gagtggctgcaggtggatttccagaagaccatgaaggtgaccggagtgaccacccaggga     4680
gtgaagagcctgctgactagcatgtatgtgaaggagttcctgatcagcagcagccaggat     4740
ggacaccagtggaccctgttcttccagaacggaaaggtgaaggtgttccagggaaaccag     4800
gatagcttcaccccagtggtgaacagcctggatccaccactgctgacccgatacctgcgg     4860
atccacccacagagctgggtgcaccagatcgccctgagaatggaggtgctgggatgcgag     4920
gcccaggatctgtactgatgagcatgcaataaagtctgagtgggcggcagcctgtgtgtg     4980
cctgggttctctctgtcccggaatgtgcaaacaatggaggtgctcgagtagataagtagc     5040
atggcgggttaatcattaactacaaggaacccctagtgatggagttggccactccctctc     5100
tgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttg     5160
cccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagccttaattaacctaattcactggccg     5220
tcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcag     5280
cacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttccc     5340
aacagttgcgcagcctgaatggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcgg     5400
cgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctc     5460
ctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaa     5520
atcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaac     5580
ttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctt     5640
tgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactca     5700
accctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggt     5760
taaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgctta     5820
caatttaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttcta     5880
aatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataata     5940
ttgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgc     6000
ggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctga     6060
agatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatcct     6120
tgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatg     6180
tggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacacta     6240
ttctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcat     6300
gacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaactt     6360
acttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatggggga     6420
tcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacga     6480
gcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcga     6540
actacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgc     6600
aggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagc     6660
cggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccg     6720
tatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagat     6780
cgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcata     6840
tatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcct     6900
ttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcaga     6960
ccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctg     7020
cttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctacc     7080
aactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgttcttct     7140
agtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgc     7200
tctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggtt     7260
ggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtg     7320
cacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagct     7380
atgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcag     7440
ggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatag     7500
tcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggg     7560
gcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctg     7620
gccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattac     7680
cgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagt     7740
gagcgaggaagcggaagagcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgat     7800
tcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgc     7860
aattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggc     7920
tcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgacca     7980
tgattacgccagatttaattaagg                                            8004
<210>  15
<211>  7948
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  сконструированная последовательность
<400>  15
ctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgaccttt       60
ggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcact      120
aggggttccttgtagttaatgattaacccgccatgctacttatctacttaagctacctcg      180
tgatcgcccggcccctgttcaaacatgtcctaatactctgtctctgcaagggtcatcagt      240
agttttccatcttactcaacatcctcccagtggaattctggacacaggacgctgtggttt      300
ctgagccagggggcgactcagatcccagccagtggacttagcccctgtttgctcctccga      360
taactggggtgaccttggttaatattcaccagcagcctcccccgttgcccctctggatcc      420
actgcttaaatacggacgaggacagggccctgtctcctcagcttcaggcaccaccactga      480
cctgggacagtgaatagcggccgccaccatgcagatcgagctgagcacctgcttcttcct      540
gtgcctgctgcggttctgcttctccgccacccggcggtactacctgggagccgtggagct      600
gagctgggattacatgcagagcgatctgggagagctgccagtggatgcccggttcccacc      660
acgggtgccaaagagcttcccattcaacaccagcgtggtgtacaagaagaccctgttcgt      720
ggagttcaccgatcacctgttcaacatcgccaagccacggccaccctggatgggactgct      780
gggaccaaccatccaggccgaggtgtacgataccgtggtgatcaccctgaagaacatggc      840
ctctcatcctgtgtccctgcacgccgtgggagtgagctactggaaggccagcgagggagc      900
cgagtacgatgatcagaccagccagcgggagaaggaggatgataaggtgttcccaggagg      960
aagccacacctacgtgtggcaggtgctgaaggagaacggaccaatggccagcgatccact     1020
gtgcctgacctacagctacctgagccacgtggatctggtgaaggatctgaacagcggact     1080
gatcggagccctgctggtgtgccgggagggaagcctggccaaggagaagacccagaccct     1140
gcacaagttcatcctgctgttcgccgtgttcgatgagggaaagagctggcacagcgagac     1200
caagaacagcctgatgcaggatcgggatgccgccagcgcccgggcctggccaaagatgca     1260
caccgtgaacggatacgtgaaccggagcctgccaggactgatcggatgccaccggaagag     1320
cgtgtactggcacgtgatcggaatgggaaccaccccagaggtgcactctatcttcctgga     1380
gggacacacctttctggtgcggaaccaccggcaggccagcctggagatcagcccaatcac     1440
cttcctgaccgcccagaccctgctgatggatctgggacagttcctgctgttctgccatat     1500
cagcagccaccagcacgatggaatggaggcctacgtgaaggtggatagctgcccagagga     1560
gccacagctgcggatgaagaacaacgaggaggccgaggattacgatgatgatctgaccga     1620
tagcgagatggatgtggtgcggttcgatgatgataacagcccaagcttcatccagatccg     1680
gagcgtggccaagaagcacccaaagacctgggtgcactacatcgccgccgaggaggagga     1740
ttgggattacgccccactggtgctggcccctgatgatcggagctacaagagccagtacct     1800
gaacaacggaccacagcggatcggacggaagtacaaaaaagtgcggttcatggcctacac     1860
cgatgagaccttcaagacccgggaggccatccagcacgagagcggaatcctgggaccact     1920
gctgtacggagaggtgggagataccctgctgatcatcttcaagaaccaggccagccggcc     1980
atacaacatctacccacacggaatcaccgatgtgcggccactgtacagccggcggctgcc     2040
aaagggagtgaagcacctgaaggatttcccaatcctgccaggagagatcttcaagtacaa     2100
gtggacagtgacagtggaggatggaccaaccaagtctgatccaagatgcctgaccagata     2160
ctacagcagctttgtgaacatggagagagacctggcctctggactgattggaccactgct     2220
gatctgctacaaggagtctgtggatcagagaggaaaccagatcatgtctgataagagaaa     2280
tgtgatcctgttctctgtgtttgatgagaacagaagctggtacctgacagagaacatcca     2340
gagattcctgccaaacccagccggagtgcagctggaggatccagagttccaggccagcaa     2400
catcatgcacagcatcaacggatacgtgttcgatagcctgcagctgagcgtgtgcctgca     2460
cgaggtggcctattggtatatcctgagcatcggagcccagaccgatttcctgagcgtgtt     2520
cttcagcggatacaccttcaagcacaagatggtgtacgaggataccctgaccctgttccc     2580
attctccggagagaccgtgttcatgagcatggagaacccaggactgtggatcctgggatg     2640
ccacaactctgatttcagaaacagaggaatgactgccctgctgaaagtgtccagctgtga     2700
taagaacact ggagattact atgaggatag ctatgaggat atctctgcct acctgctgag     2760
caagaacaat gccattgagc caagaagctt cagccagaac ccaccagtgc tgaagagaca     2820
ccagagagag atcaccagaa ccaccctgca gtctgatcag gaggagattg attatgatga     2880
taccatctct gtggagatga agaaggagga ttttgatatc tatgatgagg atgagaacca     2940
gagcccaaga agcttccaga agaagaccag acactacttc atcgctgcag tggagagact     3000
gtgggattat ggaatgagca gcagcccaca cgtgctgaga aacagagccc agagcggatc     3060
tgtgccacag ttcaagaagg tggtgttcca ggagttcacc gatggaagct tcacccagcc     3120
actgtaccgg ggagagctga acgagcacct gggactgctg ggaccataca tccgggccga     3180
ggtggaggat aacatcatgg tgaccttccg gaaccaggcc agccggccat acagcttcta     3240
cagcagcctg atcagctacg aggaggatca gcggcaggga gccgagccac ggaagaactt     3300
cgtgaagcca aacgagacca agacctactt ctggaaggtg cagcaccaca tggccccaac     3360
caaggatgag ttcgattgca aggcctgggc ctacttcagc gatgtggatc tggagaagga     3420
tgtgcacagc ggactgatcg gaccactgct ggtgtgccac accaacaccc tgaacccagc     3480
ccacggacgg caggtgaccg tgcaggagtt cgccctgttc ttcaccatct tcgatgagac     3540
caagagctgg tacttcaccg agaacatgga gcggaactgc cgggcccctt gcaacatcca     3600
gatggaggat ccaaccttca aggagaacta ccggttccac gccatcaacg gatacatcat     3660
ggataccctg ccaggactgg tgatggccca ggatcagcgg atccggtggt acctgctgag     3720
catgggaagc aacgagaaca tccacagcat ccacttcagc ggacacgtgt tcaccgtgcg     3780
gaagaaggag gagtacaaga tggccctgta caacctgtac ccaggagtgt tcgagaccgt     3840
ggagatgctg ccaagcaagg ccggaatctg gcgggtggag tgcctgatcg gagagcacct     3900
gcacgccgga atgagcaccc tgttcctggt gtacagcaac aagtgccaga ccccactggg     3960
aatggccagc ggacacatcc gggatttcca gatcaccgcc agcggacagt acggacagtg     4020
ggccccaaag ctggcccggc tgcactacag cggaagcatc aacgcctgga gcaccaagga     4080
gccattcagc tggatcaaag tggatctgct ggccccaatg atcatccacg gaatcaagac     4140
ccagggagcc cggcagaagt tcagcagcct gtacatcagc cagttcatca tcatgtacag     4200
cctggatgga aagaagtggc agacctaccg gggaaacagc accggaaccc tgatggtgtt     4260
cttcggaaac gtggatagca gcggaatcaa gcacaacatc ttcaacccac caatcatcgc     4320
ccgatacatc cggctgcacc caacccacta cagcatcaga agcaccctgc ggatggagct     4380
gatgggatgt gatctgaaca gctgctccat gccactggga atggagagca aggccatcag     4440
cgatgcccag atcaccgcca gcagctactt caccaacatg ttcgccacct ggagcccaag     4500
caaggcccgg ctgcacctgc agggacggag caacgcctgg cggccacagg tgaataaccc     4560
aaaggagtgg ctgcaggtgg atttccagaa gaccatgaag gtgaccggag tgaccaccca     4620
gggagtgaag agcctgctga ctagcatgta tgtgaaggag ttcctgatca gcagcagcca     4680
ggatggacac cagtggaccc tgttcttcca gaacggaaag gtgaaggtgt tccagggaaa     4740
ccaggatagc ttcaccccag tggtgaacag cctggatcca ccactgctga cccgatacct     4800
gcggatccac ccacagagct gggtgcacca gatcgccctg agaatggagg tgctgggatg     4860
cgaggcccag gatctgtact gatgagcatg caataaagtc tgagtgggcg gcagcctgtg     4920
tgtgcctggg ttctctctgt cccggaatgt gcaaacaatg gaggtgctcg agtagataag     4980
tagcatggcg ggttaatcat taactacaag gaacccctag tgatggagtt ggccactccc     5040
tctctgcgcg ctcgctcgct cactgaggcc gggcgaccaa aggtcgcccg acgcccgggc     5100
tttgcccggg cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcagcc ttaattaacc taattcactg     5160
gccgtcgttt tacaacgtcg tgactgggaa aaccctggcg ttacccaact taatcgcctt     5220
gcagcacatc cccctttcgc cagctggcgt aatagcgaag aggcccgcac cgatcgccct     5280
tcccaacagt tgcgcagcct gaatggcgaa tgggacgcgc cctgtagcgg cgcattaagc     5340
gcggcgggtg tggtggttac gcgcagcgtg accgctacac ttgccagcgc cctagcgccc     5400
gctcctttcg ctttcttccc ttcctttctc gccacgttcg ccggctttcc ccgtcaagct     5460
ctaaatcggg ggctcccttt agggttccga tttagtgctt tacggcacct cgaccccaaa     5520
aaacttgatt agggtgatgg ttcacgtagt gggccatcgc cctgatagac ggtttttcgc     5580
cctttgacgt tggagtccac gttctttaat agtggactct tgttccaaac tggaacaaca     5640
ctcaacccta tctcggtcta ttcttttgat ttataaggga ttttgccgat ttcggcctat     5700
tggttaaaaa atgagctgat ttaacaaaaa tttaacgcga attttaacaa aatattaacg     5760
cttacaattt aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt     5820
tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat     5880
aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt     5940
ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg     6000
ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga     6060
tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc     6120
tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac     6180
actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg     6240
gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca     6300
acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg     6360
gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg     6420
acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg     6480
gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag     6540
ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg     6600
gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct     6660
cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac     6720
agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact     6780
catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga     6840
tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt     6900
cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct     6960
gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc     7020
taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgttc     7080
ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc     7140
tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg     7200
ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt     7260
cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg     7320
agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg     7380
gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt     7440
atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag     7500
gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt     7560
gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta     7620
ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt     7680
cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc     7740
cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca     7800
acgcaattaa tgtgagttag ctcactcatt aggcacccca ggctttacac tttatgcttc     7860
cggctcgtat gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg     7920
accatgattacgccagatttaattaagg                                        7948
<210>  16
<211>  8032
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  сконструированная последовательность
<400>  16
ctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgaccttt       60
ggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcact      120
aggggttccttgtagttaatgattaacccgccatgctacttatctacttaagctacctcg      180
tgatcgcccggcccctgttcaaacatgtcctaatactctgtctctgcaagggtcatcagt      240
agttttccatcttactcaacatcctcccagtgaggttaatttttaaactgtttgctctgg      300
ttaataatctcaggaggttaatttttaaactgtttgctctggttaataatctcagggaat      360
tctggacacaggacgctgtggtttctgagccagggggcgactcagatcccagccagtgga      420
cttagcccctgtttgctcctccgataactggggtgaccttggttaatattcaccagcagc      480
ctcccccgttgcccctctggatccactgcttaaatacggacgaggacagggccctgtctc      540
ctcagcttcaggcaccaccactgacctgggacagtgaatagcggccgccaccatgcagat      600
cgagctgagcacctgcttcttcctgtgcctgctgcggttctgcttctccgccacccggcg      660
gtactacctgggagccgtggagctgagctgggattacatgcagagcgatctgggagagct      720
gccagtggatgcccggttcccaccacgggtgccaaagagcttcccattcaacaccagcgt      780
ggtgtacaagaagaccctgttcgtggagttcaccgatcacctgttcaacatcgccaagcc      840
acggccaccctggatgggactgctgggaccaaccatccaggccgaggtgtacgataccgt      900
ggtgatcaccctgaagaacatggcctctcatcctgtgtccctgcacgccgtgggagtgag      960
ctactggaaggccagcgagggagccgagtacgatgatcagaccagccagcgggagaagga     1020
ggatgataaggtgttcccaggaggaagccacacctacgtgtggcaggtgctgaaggagaa     1080
cggaccaatggccagcgatccactgtgcctgacctacagctacctgagccacgtggatct     1140
ggtgaaggatctgaacagcggactgatcggagccctgctggtgtgccgggagggaagcct     1200
ggccaaggagaagacccagaccctgcacaagttcatcctgctgttcgccgtgttcgatga     1260
gggaaagagctggcacagcgagaccaagaacagcctgatgcaggatcgggatgccgccag     1320
cgcccgggcctggccaaagatgcacaccgtgaacggatacgtgaaccggagcctgccagg     1380
actgatcggatgccaccggaagagcgtgtactggcacgtgatcggaatgggaaccacccc     1440
agaggtgcactctatcttcctggagggacacacctttctggtgcggaaccaccggcaggc     1500
cagcctggagatcagcccaatcaccttcctgaccgcccagaccctgctgatggatctggg     1560
acagttcctgctgttctgccatatcagcagccaccagcacgatggaatggaggcctacgt     1620
gaaggtggatagctgcccagaggagccacagctgcggatgaagaacaacgaggaggccga     1680
ggattacgatgatgatctgaccgatagcgagatggatgtggtgcggttcgatgatgataa     1740
cagcccaagcttcatccagatccggagcgtggccaagaagcacccaaagacctgggtgca     1800
ctacatcgccgccgaggaggaggattgggattacgccccactggtgctggcccctgatga     1860
tcggagctacaagagccagtacctgaacaacggaccacagcggatcggacggaagtacaa     1920
aaaagtgcggttcatggcctacaccgatgagaccttcaagacccgggaggccatccagca     1980
cgagagcggaatcctgggaccactgctgtacggagaggtgggagataccctgctgatcat     2040
cttcaagaaccaggccagccggccatacaacatctacccacacggaatcaccgatgtgcg     2100
gccactgtacagccggcggctgccaaagggagtgaagcacctgaaggatttcccaatcct     2160
gccaggagagatcttcaagtacaagtggacagtgacagtggaggatggaccaaccaagtc     2220
tgatccaagatgcctgaccagatactacagcagctttgtgaacatggagagagacctggc     2280
ctctggactgattggaccactgctgatctgctacaaggagtctgtggatcagagaggaaa     2340
ccagatcatgtctgataagagaaatgtgatcctgttctctgtgtttgatgagaacagaag     2400
ctggtacctgacagagaacatccagagattcctgccaaacccagccggagtgcagctgga     2460
ggatccagagttccaggccagcaacatcatgcacagcatcaacggatacgtgttcgatag     2520
cctgcagctgagcgtgtgcctgcacgaggtggcctattggtatatcctgagcatcggagc     2580
ccagaccgatttcctgagcgtgttcttcagcggatacaccttcaagcacaagatggtgta     2640
cgaggataccctgaccctgttcccattctccggagagaccgtgttcatgagcatggagaa     2700
cccaggactgtggatcctgggatgccacaactctgatttcagaaacagaggaatgactgc     2760
cctgctgaaagtgtccagctgtgataagaacactggagattactatgaggatagctatga     2820
ggatatctctgcctacctgctgagcaagaacaatgccattgagccaagaagcttcagcca     2880
gaacccaccagtgctgaagagacaccagagagagatcaccagaaccaccctgcagtctga     2940
tcaggaggagattgattatgatgataccatctctgtggagatgaagaaggaggattttga     3000
tatctatgatgaggatgagaaccagagcccaagaagcttccagaagaagaccagacacta     3060
cttcatcgctgcagtggagagactgtgggattatggaatgagcagcagcccacacgtgct     3120
gagaaacagagcccagagcggatctgtgccacagttcaagaaggtggtgttccaggagtt     3180
caccgatggaagcttcacccagccactgtaccggggagagctgaacgagcacctgggact     3240
gctgggaccatacatccgggccgaggtggaggataacatcatggtgaccttccggaacca     3300
ggccagccggccatacagcttctacagcagcctgatcagctacgaggaggatcagcggca     3360
gggagccgagccacggaagaacttcgtgaagccaaacgagaccaagacctacttctggaa     3420
ggtgcagcaccacatggccccaaccaaggatgagttcgattgcaaggcctgggcctactt     3480
cagcgatgtggatctggagaaggatgtgcacagcggactgatcggaccactgctggtgtg     3540
ccacaccaacaccctgaacccagcccacggacggcaggtgaccgtgcaggagttcgccct     3600
gttcttcaccatcttcgatgagaccaagagctggtacttcaccgagaacatggagcggaa     3660
ctgccgggccccttgcaacatccagatggaggatccaaccttcaaggagaactaccggtt     3720
ccacgccatcaacggatacatcatggataccctgccaggactggtgatggcccaggatca     3780
gcggatccggtggtacctgctgagcatgggaagcaacgagaacatccacagcatccactt     3840
cagcggacacgtgttcaccgtgcggaagaaggaggagtacaagatggccctgtacaacct     3900
gtacccaggagtgttcgagaccgtggagatgctgccaagcaaggccggaatctggcgggt     3960
ggagtgcctgatcggagagcacctgcacgccggaatgagcaccctgttcctggtgtacag     4020
caacaagtgccagaccccactgggaatggccagcggacacatccgggatttccagatcac     4080
cgccagcggacagtacggacagtgggccccaaagctggcccggctgcactacagcggaag     4140
catcaacgcctggagcaccaaggagccattcagctggatcaaagtggatctgctggcccc     4200
aatgatcatccacggaatcaagacccagggagcccggcagaagttcagcagcctgtacat     4260
cagccagttcatcatcatgtacagcctggatggaaagaagtggcagacctaccggggaaa     4320
cagcaccggaaccctgatggtgttcttcggaaacgtggatagcagcggaatcaagcacaa     4380
catcttcaacccaccaatcatcgcccgatacatccggctgcacccaacccactacagcat     4440
cagaagcaccctgcggatggagctgatgggatgtgatctgaacagctgctccatgccact     4500
gggaatggagagcaaggccatcagcgatgcccagatcaccgccagcagctacttcaccaa     4560
catgttcgccacctggagcccaagcaaggcccggctgcacctgcagggacggagcaacgc     4620
ctggcggccacaggtgaataacccaaaggagtggctgcaggtggatttccagaagaccat     4680
gaaggtgaccggagtgaccacccagggagtgaagagcctgctgactagcatgtatgtgaa     4740
ggagttcctgatcagcagcagccaggatggacaccagtggaccctgttcttccagaacgg     4800
aaaggtgaaggtgttccagggaaaccaggatagcttcaccccagtggtgaacagcctgga     4860
tccaccactgctgacccgatacctgcggatccacccacagagctgggtgcaccagatcgc     4920
cctgagaatggaggtgctgggatgcgaggcccaggatctgtactgatgagcatgcaataa     4980
agtctgagtgggcggcagcctgtgtgtgcctgggttctctctgtcccggaatgtgcaaac     5040
aatggaggtgctcgagtagataagtagcatggcgggttaatcattaactacaaggaaccc     5100
ctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcga     5160
ccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgc     5220
agccttaattaacctaattcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccct     5280
ggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagc     5340
gaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatgggac     5400
gcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgct     5460
acacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacg     5520
ttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagt     5580
gctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggcca     5640
tcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtgga     5700
ctcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataa     5760
gggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaac     5820
gcgaattttaacaaaatattaacgcttacaatttaggtggcacttttcggggaaatgtgc     5880
gcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagac     5940
aataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatt     6000
tccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccag     6060
aaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcg     6120
aactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaa     6180
tgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggc     6240
aagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccag     6300
tcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataa     6360
ccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagc     6420
taaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccgg     6480
agctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaa     6540
caacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaa     6600
tagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctg     6660
gctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcag     6720
cactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcagg     6780
caactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcatt     6840
ggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcattttt     6900
aatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaac     6960
gtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgag     7020
atcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcgg     7080
tggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagca     7140
gagcgcagataccaaatactgttcttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaaga     7200
actctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgcca     7260
gtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgc     7320
agcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctaca     7380
ccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaa     7440
aggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttc     7500
cagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagc     7560
gtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcgg     7620
cctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttat     7680
cccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgca     7740
gccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcccaatacgca     7800
aaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccg     7860
actggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcac     7920
cccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataac     7980
aatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgccagatttaattaagg             8032
<210>  17
<211>  738
<212>  ПРТ
<213>  Неизвестный
<220>
<223>  Капсид AAVhu.37
<400>  17
MetAlaAlaAspGlyTyrLeuProAspTrpLeuGluAspAsnLeuSer
1               5                   10                  15
Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Asp Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro
20                  25                  30
Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro
35                  40                  45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50                  55                  60
Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65                  70                  75                  80
Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala
85                  90                  95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100                 105                 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115                 120                 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130                 135                 140
Pro Val Glu Pro Ser Pro Gln Arg Ser Pro Asp Ser Ser Thr Gly Ile
145                 150                 155                 160
Gly Lys Lys Gly Gln Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln
165                 170                 175
Thr Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro
180                 185                 190
Pro Ala Gly Pro Ser Gly Leu Gly Ser Gly Thr Met Ala Ala Gly Gly
195                 200                 205
Gly Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser
210                 215                 220
Ser Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val
225                 230                 235                 240
Ile Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His
245                 250                 255
Leu Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Gly Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Asp
260                 265                 270
Asn Thr Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn
275                 280                 285
Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn
290                 295                 300
Asn Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Ser Phe Lys Leu Phe Asn
305                 310                 315                 320
Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Gln Asn Glu Gly Thr Lys Thr Ile Ala
325                 330                 335
Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln
340                 345                 350
Leu Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe
355                 360                 365
Pro Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn
370                 375                 380
Asn Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr
385                 390                 395                 400
Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Glu Phe Ser Tyr
405                 410                 415
Thr Phe Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser
420                 425                 430
Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu
435                 440                 445
Ser Arg Thr Gln Ser Thr Gly Gly Thr Gln Gly Thr Gln Gln Leu Leu
450                 455                 460
Phe Ser Gln Ala Gly Pro Ala Asn Met Ser Ala Gln Ala Lys Asn Trp
465                 470                 475                 480
Leu Pro Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Leu Ser
485                 490                 495
Gln Asn Asn Asn Ser Asn Phe Ala Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His
500                 505                 510
Leu Asn Gly Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Val Ala Met Ala Thr
515                 520                 525
His Lys Asp Asp Glu Glu Arg Phe Phe Pro Ser Ser Gly Val Leu Met
530                 535                 540
Phe Gly Lys Gln Gly Ala Gly Arg Asp Asn Val Asp Tyr Ser Ser Val
545                 550                 555                 560
Met Leu Thr Ser Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr
565                 570                 575
Glu Gln Tyr Gly Val Val Ala Asp Asn Leu Gln Gln Thr Asn Thr Gly
580                 585                 590
Pro Ile Val Gly Asn Val Asn Ser Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val
595                 600                 605
Trp Gln Asn Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile
610                 615                 620
Pro His Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe
625                 630                 635                 640
Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val
645                 650                 655
Pro Ala Asp Pro Pro Thr Thr Phe Ser Gln Ala Lys Leu Ala Ser Phe
660                 665                 670
Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu
675                 680                 685
Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr
690                 695                 700
Ser Asn Tyr Tyr Lys Ser Thr Asn Val Asp Phe Ala Val Asn Thr Glu
705                 710                 715                 720
Gly Thr Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg
725                 730                 735
AsnLeu
<210>  18
<211>  738
<212>  ПРТ
<213>  Неизвестный
<220>
<223>  Капсид AAVrh.10
<400>  18
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser
1               5                   10                  15
Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Asp Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro
20                  25                  30
Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro
35                  40                  45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50                  55                  60
Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65                  70                  75                  80
Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala
85                  90                  95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100                 105                 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115                 120                 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130                 135                 140
Pro Val Glu Pro Ser Pro Gln Arg Ser Pro Asp Ser Ser Thr Gly Ile
145                 150                 155                 160
Gly Lys Lys Gly Gln Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln
165                 170                 175
Thr Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro
180                 185                 190
Pro Ala Gly Pro Ser Gly Leu Gly Ser Gly Thr Met Ala Ala Gly Gly
195                 200                 205
Gly Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser
210                 215                 220
Ser Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val
225                 230                 235                 240
Ile Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His
245                 250                 255
Leu Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Gly Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Asp
260                 265                 270
Asn Thr Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn
275                 280                 285
Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn
290                 295                 300
Asn Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn
305                 310                 315                 320
Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Gln Asn Glu Gly Thr Lys Thr Ile Ala
325                 330                 335
Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln
340                 345                 350
Leu Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe
355                 360                 365
Pro Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn
370                 375                 380
Asn Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr
385                 390                 395                 400
Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Glu Phe Ser Tyr
405                 410                 415
Gln Phe Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser
420                 425                 430
Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu
435                 440                 445
Ser Arg Thr Gln Ser Thr Gly Gly Thr Ala Gly Thr Gln Gln Leu Leu
450                 455                 460
Phe Ser Gln Ala Gly Pro Asn Asn Met Ser Ala Gln Ala Lys Asn Trp
465                 470                 475                 480
Leu Pro Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Leu Ser
485                 490                 495
Gln Asn Asn Asn Ser Asn Phe Ala Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His
500                 505                 510
Leu Asn Gly Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Val Ala Met Ala Thr
515                 520                 525
His Lys Asp Asp Glu Glu Arg Phe Phe Pro Ser Ser Gly Val Leu Met
530                 535                 540
Phe Gly Lys Gln Gly Ala Gly Lys Asp Asn Val Asp Tyr Ser Ser Val
545                 550                 555                 560
Met Leu Thr Ser Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr
565                 570                 575
Glu Gln Tyr Gly Val Val Ala Asp Asn Leu Gln Gln Gln Asn Ala Ala
580                 585                 590
Pro Ile Val Gly Ala Val Asn Ser Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val
595                 600                 605
Trp Gln Asn Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile
610                 615                 620
Pro His Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe
625                 630                 635                 640
Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val
645                 650                 655
Pro Ala Asp Pro Pro Thr Thr Phe Ser Gln Ala Lys Leu Ala Ser Phe
660                 665                 670
Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu
675                 680                 685
Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr
690                 695                 700
Ser Asn Tyr Tyr Lys Ser Thr Asn Val Asp Phe Ala Val Asn Thr Asp
705                 710                 715                 720
Gly Thr Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg
725                 730                 735
AsnLeu
<210>  19
<211>  4371
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  сконструированная последовательность
<400>  19
atgcagatcgagctgtctacctgcttcttcctgtgcctgctgcggttctgcttcagcgcc       60
accagacggtactatctgggcgccgtggaactgagctgggactacatgcagagcgacctg      120
ggcgagctgcccgtggacgccagattccctccaagagtgcccaagagcttccccttcaac      180
acctccgtggtgtacaagaaaaccctgttcgtggaattcaccgaccacctgttcaatatc      240
gccaagcccagacccccctggatgggcctgctgggacctacaattcaggccgaggtgtac      300
gacaccgtcgtgatcaccctgaagaacatggccagccaccccgtgtctctgcacgccgtg      360
ggagtgtcctactggaaggcctctgagggcgccgagtacgacgatcagaccagccagcgc      420
gagaaagaggacgacaaggtgttccctggcggcagccacacctacgtgtggcaggtgctg      480
aaagaaaacggccccatggcctccgaccctctgtgcctgacatacagctacctgagccac      540
gtggacctcgtgaaggacctgaacagcggcctgatcggagccctgctcgtgtgtagagag      600
ggcagcctggccaaagagaaaacccagaccctgcacaagttcatcctgctgttcgccgtg      660
ttcgacgagggcaagagctggcacagcgagacaaagaacagcctgatgcaggaccgggac      720
gccgcctctgctagagcctggcccaaaatgcacaccgtgaacggctacgtgaacagaagc      780
ctgcccggactgatcggctgccaccggaagtctgtgtactggcacgtgatcggcatgggc      840
accacccctgaggtgcacagcatctttctggaaggacacacctttctcgtgcggaaccac      900
cggcaggccagcctggaaatcagccctatcaccttcctgaccgcccagacactgctgatg      960
gacctgggccagtttctgctgttctgccacatcagctcccaccagcacgacggcatggaa     1020
gcctacgtgaaggtggacagctgccccgaggaaccccagctgcggatgaagaacaacgag     1080
gaagccgaggactacgacgacgacctgaccgacagcgagatggacgtggtgcgcttcgac     1140
gacgataacagccccagcttcatccagatcagaagcgtggccaagaagcaccccaagacc     1200
tgggtgcactatatcgccgccgaggaagaggactgggattacgcccctctggtgctggcc     1260
cccgacgacagaagctacaagagccagtacctgaacaacggcccccagcggatcggccgg     1320
aagtataagaaagtgcggttcatggcctacaccgacgagacattcaagaccagagaggcc     1380
atccagcacgagagcggcatcctgggccctctgctgtatggcgaagtgggcgacaccctg     1440
ctgatcatcttcaagaaccaggccagcagaccctacaacatctaccctcacggcatcacc     1500
gacgtgcggcccctgtactctagaaggctgcccaagggcgtgaaacacctgaaggacttc     1560
cccatcctgcccggcgagatcttcaagtacaagtggaccgtgaccgtggaagatggcccc     1620
accaagagcgaccccagatgcctgacacggtactatagcagcttcgtgaacatggaacgg     1680
gacctggcctccggcctgattggcccactgctgatctgctacaaagaaagcgtggaccag     1740
cggggcaaccagatcatgagcgacaagcggaacgtgatcctgtttagcgtgttcgatgag     1800
aaccggtcctggtatctgaccgagaatatccagcggttcctgcccaaccctgccggcgtg     1860
cagctggaagatcctgagttccaggcctccaacatcatgcactccatcaatggctatgtg     1920
ttcgacagcctgcagctgagcgtgtgcctgcacgaggtggcctactggtacatcctgagc     1980
atcggggcccagaccgacttcctgtccgtgttcttctccggctacaccttcaagcacaag     2040
atggtgtacgaggataccctgaccctgttcccctttagcggcgaaaccgtgttcatgagc     2100
atggaaaaccccggcctgtggatcctgggctgccacaacagcgacttccggaacagaggc     2160
atgaccgccctgctgaaggtgtccagctgcgacaagaacaccggcgactactacgaggac     2220
agctatgaggacatcagcgcctacctgctgagcaagaacaacgccatcgagcccagaagc     2280
ttcagccagaacccccccgtgctgaagcggcaccagagagagatcacccggaccaccctg     2340
cagtccgaccaggaagagatcgattacgacgacaccatcagcgtggaaatgaagaaagaa     2400
gatttcgacatctacgacgaggacgagaaccagagcccccggtcctttcagaaaaagacc     2460
cggcactacttcattgccgctgtggaacggctgtgggactacggcatgagcagcagccct     2520
cacgtgctgagaaacagggcccagagcggcagcgtgccccagttcaagaaagtggtgttc     2580
caggaattcacagacggcagcttcacccagcctctgtaccgcggcgagctgaacgagcac     2640
ctgggactgctgggcccctatatcagagccgaagtggaagataacatcatggtcaccttc     2700
cggaatcaggcctcccggccctacagcttctacagctccctgatcagctacgaagaggac     2760
cagagacagggcgctgagccccggaagaacttcgtgaagcccaacgagactaagacctac     2820
ttttggaaggtgcagcaccacatggcccctacaaaggacgagttcgactgcaaggcctgg     2880
gcctacttctccgacgtggacctggaaaaggacgtgcactctgggctgatcggccccctg     2940
ctcgtgtgccacaccaacaccctgaatcccgcccacggcagacaggtgacagtgcaggaa     3000
ttcgccctgttcttcaccatcttcgacgaaacaaagagctggtacttcaccgaaaacatg     3060
gaaagaaactgccgggctccctgcaacatccagatggaagatcccaccttcaaagagaac     3120
taccggttccacgccatcaacggctacatcatggacacactgcccggcctcgtgatggct     3180
caggatcagcggatccggtggtatctgctgtccatgggctccaacgagaacatccacagc     3240
atccacttcagcggccacgtgttcaccgtgcggaaaaaagaagagtacaaaatggccctg     3300
tacaacctgtaccctggggtgttcgagacagtggaaatgctgcccagcaaggccggcatc     3360
tggcgggtggagtgtctgatcggcgagcacctgcacgctgggatgagcacactgtttctg     3420
gtgtacagcaacaagtgccagacacctctgggcatggcctctggccacatccgggacttt     3480
cagatcacagccagcggccagtacggccagtgggccccaaaactggccagactgcactac     3540
agcggcagcatcaacgcctggtccaccaaagagcccttcagctggatcaaggtggacctg     3600
ctggctcccatgatcatccacggaatcaagacccagggcgccagacagaagttcagcagc     3660
ctgtacatcagccagttcatcatcatgtacagcctggacggcaagaagtggcagacctac     3720
cggggcaatagcaccggcaccctgatggtgttcttcggcaacgtggactccagcggcatt     3780
aagcacaacatcttcaacccccccatcattgcccggtacatccggctgcaccccacccac     3840
tacagcatccggtccaccctgagaatggaactgatgggctgcgacctgaactcctgctcc     3900
atgcccctggggatggaaagcaaggccatctccgacgcccagatcaccgcctccagctac     3960
ttcaccaacatgttcgccacctggtccccatccaaggcccggctgcacctgcagggcaga     4020
agcaatgcttggaggcctcaggtgaacaaccccaaagagtggctgcaggtggacttccag     4080
aaaaccatgaaagtgaccggcgtgaccacccagggcgtgaagtctctgctgacctctatg     4140
tacgtgaaagagttcctgatctccagcagccaggacggccaccagtggaccctgtttttc     4200
cagaacggcaaagtgaaagtgtttcaggggaaccaggactccttcacccccgtcgtgaat     4260
agcctggaccctccactgctgaccagatacctgcggatccaccctcagagttgggtgcac     4320
cagattgctctgcggatggaagtgctgggatgcgaggcccaggacctgtac              4371
<210>  20
<211>  736
<212>  ПРТ
<213>  Неизвестный
<220>
<223>  Капсид AAV3B
<400>  20
MetAlaAlaAspGlyTyrLeuProAspTrpLeuGluAspAsnLeuSer
1               5                   10                  15
Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Val Pro Gln Pro
20                  25                  30
Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Arg Arg Gly Leu Val Leu Pro
35                  40                  45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50                  55                  60
Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65                  70                  75                  80
Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85                  90                  95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100                 105                 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Ile Leu Glu Pro
115                 120                 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130                 135                 140
Pro Val Asp Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Val Gly
145                 150                 155                 160
Lys Ser Gly Lys Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr
165                 170                 175
Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro Pro
180                 185                 190
Ala Ala Pro Thr Ser Leu Gly Ser Asn Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly
195                 200                 205
Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser
210                 215                 220
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile
225                 230                 235                 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu
245                 250                 255
Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr
260                 265                 270
Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His
275                 280                 285
Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp
290                 295                 300
Gly Phe Arg Pro Lys Lys Leu Ser Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val
305                 310                 315                 320
Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu
325                 330                 335
Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr
340                 345                 350
Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp
355                 360                 365
Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser
370                 375                 380
Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser
385                 390                 395                 400
Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Thr Phe Glu
405                 410                 415
Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg
420                 425                 430
Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Asn Arg Thr
435                 440                 445
Gln Gly Thr Thr Ser Gly Thr Thr Asn Gln Ser Arg Leu Leu Phe Ser
450                 455                 460
Gln Ala Gly Pro Gln Ser Met Ser Leu Gln Ala Arg Asn Trp Leu Pro
465                 470                 475                 480
Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Leu Ser Lys Thr Ala Asn Asp Asn
485                 490                 495
Asn Asn Ser Asn Phe Pro Trp Thr Ala Ala Ser Lys Tyr His Leu Asn
500                 505                 510
Gly Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys
515                 520                 525
Asp Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Met His Gly Asn Leu Ile Phe Gly
530                 535                 540
Lys Glu Gly Thr Thr Ala Ser Asn Ala Glu Leu Asp Asn Val Met Ile
545                 550                 555                 560
Thr Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln
565                 570                 575
Tyr Gly Thr Val Ala Asn Asn Leu Gln Ser Ser Asn Thr Ala Pro Thr
580                 585                 590
Thr Arg Thr Val Asn Asp Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp Gln
595                 600                 605
Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His
610                 615                 620
Thr Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu
625                 630                 635                 640
Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Met Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala
645                 650                 655
Asn Pro Pro Thr Thr Phe Ser Pro Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr
660                 665                 670
Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln
675                 680                 685
Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn
690                 695                 700
Tyr Asn Lys Ser Val Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val
705                 710                 715                 720
Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu
725                 730                 735
<---