Иммуногенная композиция, включающая синтетические пептиды, повторяющие последовательности V3-петли оболочечного белка gp120 ВИЧ1
IMMUNOGENIC COMPOSITION CONTAINING SYNTHETIC PEPTIDES REPEATING SEQUENCE OF V3-LOOP OF SHELL PROTEIN GP120 HIV1

Изобретение относится к иммунологии, в частности к композиции, вызывающей иммунный ответ на протективные эпитопы из оболочечного белка ВИЧ gp120.
Создание эффективной вакцины против ВИЧ/СПИД остается приоритетной задачей. С момента открытия вируса и расшифровки его генома ведутся работы по ее созданию. Однако эффективной вакцины не получено до сих пор. Считается, что она должна индуцировать образование как нейтрализующих антител, так и активировать цитотоксические лимфоциты. Антитела, связываясь с вирусом, мешают его проникновению в клетку, а ЦТЛ уничтожают уже зараженные клетки. Выбор антигенных детерминант для вакцинных препаратов против ВИЧ представляет определенную трудность, т.к. неизвестны случаи выздоровления от ВИЧ-инфекции. Показано, что пассивное введение антител с широкой нейтрализующей активностью макам резус предотвращало их заражение химерным вирусом иммунодефицита обезьян/человека (Xu W., Hofmann-Lehmann R, McClure НМ, Ruprecht RM. Passive immunization with human neutralizing monoclonal antibodies: correlates of protective immunity against HIV // Vaccine, 2002 May 6; 20(15): 1956-60).
Проникновение вируса в клетку - сложный многоступенчатый процесс, ключевую роль в котором играет связывание оболочечного белка вируса gp120, а именно его V3-петли, с корецепторами CCR5 или CXCR4. Мутации, приводящие к удалению этого участка, делают вирус неинфекционным (Ivanoff LA, Dubay JW, Morris JF, Roberts SJ, Gutshall L, Sternberg EJ, Hunter E, Matthews TJ, Petteway SR, Jr. 1992. V3 loop region of the HIV-1 gp120 envelope protein is essential for virus infectivity // Virology 187:423-432). Хотя этот участок относится к вариабильной части белка, около 60% аминокислот являются консервативными (Zolla-Pazner S. 2004. Identifying epitopes of HIV-1 that induce protective antibodies. Nat Rev 4:199-210). Антитела к V3-петле обнаруживаются почти у всех ВИЧ-инфицированных. К этому участку получен ряд моноклональных антител (447-52D, 2219, F425-B4e8, 2557, и 3074), обладающих широкой нейтрализующей активностью (Kirby КА, Ong YT, Hachiya A, Laughlin TG, Chiang LA, Pan Y, Moran JL, Marchand B, Singh K, Gallazzi F, Quinn TP, Yoshimura K, Murakami T, Matsushita S, Sarafianos SG.Structural basis of clade-specific HIV-1 neutralization by humanized anti-V3 monoclonal antibody KD-247. FASEB J. 2015 Jan; 29(1):70-80).
Проведенные сравнительные исследования нейтрализующей активности моноклональных антител к V3-, V2-петле и участку CD4bs, оболочечного белка вируса gp120, полученных из хронически ВИЧ - инфицированных людей, показали, что наилучшей активностью и широтой нейтрализации обладали антитела, направленные к V3-петле. Исследование проводилась на панели вирусов, относящихся к изолятам, циркулирующих а различных регионах (Li L, Wang ХН, Williams С, Volsky В, Steczko О, Seaman MS, Luthra K, Nyambi P, Nadas A, Giudicelli V, Lefranc MP, Zolla-Pazner S, Gorny MK. A broad range of mutations in HIV-1 neutralizing human monoclonal antibodies specific for V2, V3, and the CD4 binding site. Mol. Immunol. 2015; 66:364-374). Введение моноклональных антител против V3-петли приводило к снижению вирусной нагрузки у ряда ВИЧ-инфицированных людей, а у одного вызвало длительную вирусную супрессию (Matsushita S, Yoshimura K, Ramirez KP, Pisupati J, Murakami T, Group KDS Passive transfer of neutralizing mAb KD-247 reduces plasma viral load in patients chronically infected with HIV-1. AIDS. 2015; 29:453-462).
+
+
Синтетические пептиды являются хорошей основой для создания вакцин. Пептиды способны активировать CD4 и CD8 клетки. Показано, что пептиды способны вызывать ВИЧ-специфический клеточный иммунный ответ у лабораторных животных. Смесь пептидов, введенная в полном адъюванте Фрейнда макакам резус приводила к формированию ЦТЛ, что вело к защите от заражения патогенным штаммом ВИОЧ. (Nehete PN, Chitta S, Hossain MM, Hill L, Bernacky BJ, Baze W, et al. Protection against chronic infection and AIDS by an HIV envelope peptide-cocktail vaccine in a pathogenic SHIV-rhesus model. Vaccine. 2001 Dec 12; 20(56):813-25).
IIIB
3IIIb
IIIB
MN
MN
MN
IIIB
306
321
301
325
К настоящему времени создано и исследовано ряд иммуногенов на основе последовательности V3-петли. Так, например, Conley и др. изучали иммуногенные свойства циклических V3-пептидов, относящихся к лабораторно адаптированным штаммам Х4 ВИЧ1 - IIIB и MN. После иммунизации животных (кролики и обезьяны), было выявлено, что V3 пептид SIRIQRGPGRAFVTIG, состоящий из 16 V аминокислотных остатков, вызывал образование антител, способных нейтрализовать вирус HIV-1 в разведении сыворотки 1:320 - 1:2560, но не HIV-1. Пептид V3YNKRKRIHIGPGRAFYTTNKIIG, состоящий из 23 аминокислотных остатков, индуцировал антитела, нейтрализующие ВИЧ-1 в разведении сыворотки 1:160-1:640, однако для нейтрализации ВИЧ-1 необходима была более высокая концентрация антител (примерно в 10 раз больше). Кроме того, полученные сыворотки были способны нейтрализовать штаммы AL-1 and SF-2 (Conley AJ, Conard P, Bondy S, Dolan CA, Hannah J, Leanza WJ, Marburg S, Rivetna M, Rusiecki VK, Sugg EE, et al. Immunogenicity of synthetic HIV-1 gp120 V3-loop peptide-conjugate immunogens. Vaccine. 1994; 12:445-451.).
Для улучшения иммуногенных свойств синтетических пептидов была разработана конструкция C4-V3, где С4 - фрагмент из 18 аминокислот консервативного участка С4 оболочечного белка gp120, являющегося эпитопом для T-helper, V3 - V3-петля различных вирусных изолятов.
89.6
89.6P
89.6Р
389.6P
89.6Р
+
Иммунизация лабораторных животных (морские свинки и обезьяны) пептидами C4-V3 с V3 петлей gp120 и gp120 индуцировала образование антител, нейтрализующие ВИО/Ч in vitro (Н.-Х. Liao, В. Etemad-Moghadam, D.C. Montefiori, Y. Sun, J. Sodroski, R.M. Scearce, R.W. Doms, J.R. Thomasch, S. Robinson, N.L. Letvin, B.F. Hayneslnduction of antibodies in guinea pigs and rhesus monkeys against the human immunodeficiency virus type 1 envelope: neutralization of non-pathogenic and pathogenic primary isolate simian/human immunodeficiency virus strains /// J. Virol., 74 (2000), pp. 254-263). Показано, что макаки-резус, иммунизированные C4-V были защищены от ВИО/Ч - индуцированного снижения CD4-клеток (N.L. Letvin, S. Robinson, D. Rohne, M.K. Axthelm, J.W. Fanton, M. Bilska, T.J. Palker, H.X. Liao, B.F. Haynes, D.C. MontefioriVaccine-elicited V3 loop-specific antibodies in rhesus monkeys and control of a simian-human immunodeficiency virus expressing a primary patient human immunodeficiency virus type 1 isolate envelope // J. Virol., 75 (2001), pp. 4165-4175).
Изучение на морских свинках иммуногенных свойств ряда пептидов C4-V3, с V3 петлей относящей к различным штаммам субтипа В, выявило, что они способны индуцировать иммунный ответ и нейтрализовать изоляты, принадлежащие субтипу В, но не к другим субтипам. Кроме того, было отмечено, что пептиды, не содержащие последовательность GPG, не вызывали образование нейтрализующих антител (Haynes BF, Ma В, Montefiori DC, Wrin T, Petropoulos CJ, Sutherland LL, Scearce RM, Denton C, Xia SM, Korber ВТ, Liao HX. Analysis of HIV-subtype В third variable region peptide motifs for induction of neutralizing antibodies against HIV-1 primary isolates // Virology. 2006 Feb 5; 345(1):44-55).
Вышеописанные пептиды имели линейную структуру. Для улучшения их иммуногенных свойств, в области V3 петли были введены одна или две дисульфидные связи для воспроизведения β-гарпиновой конформации. Полученные пептиды вызывали у лабораторных животных иммунный ответ с более высокой широкой нейтрализующей активностью, по сравнению с их линейными аналогами (An Optimally constrained V3 peptide is a better immunogen than its linear homolog or HIV-1 gp120 Virology. 2010 June 5; 401(2): 293-304).
Основываясь на результатах клинических исследований RV144, где впервые была показана возможность индуцировать иммунный ответ вакцинными препаратами, были созданы два пептида C4-V3. Оба пептида содержат последовательность для Т-клеток (С4). V3 - часть одного пептида, С4-447 повторяет верхушку V3-петли, и распознается моноклональным антителом 447-52D, имеющее широкий спектр нейтрализующей активности, KQIINMWQEVGKAMYARCRIHIGPGRAFYACG. Второй пептид, C4-VH5-51, повторяет гидрофобную часть V3-петли. У этого пептида последовательность GPGR заменена на ASSP, для сохранения β-изгиба,  Пептиды распознавались моноклональнми антителами человека, направленных к V3-петле, в ИФА. Были исследованы их иммуногенные свойства. Животным, макак резус, вводили пептиды в неполном адъюванте Фрейнда. Полученные в результате антитела нейтрализовали вирусные изоляты в модели псевдовирусной инфекции. Наилучшим спектром нейтрализации обладали антитела, полученные на пептид С4-447. Кроме того, этот пептид индуцировал более высокие титры антител, по сравнению с C4-VH5-51. Иммуногенность обоих пептидов зависела от их V3-части, т.к. последовательность для Т-клеток (С4) была идентичной (Hessell AJ, McBurney S, Pandey S, Sutton W, Liu L, Li L, Totrov M, Zolla-Pazner S, Haigwood NL, Gorny MK. Induction of neutralizing antibodies in rhesus macaques using V3 mimotope peptides. Vaccine. 2016 May 23; 34(24):2713-21)
Известен патент (US 2014302081 A1) в котором описан пептид, копирующий последовательность  штамма JR-FL ВИЧ1 и включающий в себя пролин. Данный пептид способен связываться с антителами, имеющих широкий спектр нейтрализующей активности против различных штаммов ВИЧ1.
В патенте (US 2012034255 А1) описаны полипептиды и последовательности их молекул нуклеиновых кислот, оболочечного белка gp120 ВИЧ1. Некоторые полипептиды представлены в виде стабилизированных структур, имеющих конформацию связывания с CD4 за счет включения не встречающихся в природе остатков цистеина. В других примерах, gp120 имеет V3 петлю в расширенной конформации. Данные вещества могут быть использованы в иммуногенной композиции для индукции нейтрализующих антител против ВИЧ.
В патенте (WO 2005090391 А) описан комплекс содержащий V3-петлю gp120 и Tat ВИЧ. Данная композиция распознавалась моноклональными антителами против Tat и V3-петли в ИФА. Кроме того, при иммунизации мышей Tat, пептидом V3-петли или сочетанием Tat и пептида петли V3 в квасцах, было выявлено, что пептид V3-петли сам по себе не обладал иммуногенностью, не проявлял или демонстрировал лишь пограничные титры антител, тогда как сочетание Tat и пептида петли V3 в значительной мере повышал титры антител против петли V, не оказывая воздействия на титры антител против Tat.
IIIB
В патенте (US 7094405 В1) описан антиген, представляющий собой полипетид, в состав которого входят последовательность Th эпитопа (US 751,998), эпитоп ЦТЛ (US 07/847, 311) и эпитопа для нейтрализующих антител - V3 петлю. Иммунизация мышей линии balb/c или В10, приводила к образованию антител, способных нейтрализовать ВИЧ1 IIIB и MN в культуре in vitro, на клеточной линии CEM-SS. Кроме того, было выявлено формирование специфического ЦТЛ ответа. ЦТЛ иммунных животных лизировли клетки-мишени, несущие антигены ВИЧ.
Liao и др. была создана последовательность - CON-S, которая была получена путем выравнивания консенсуса последовательности оболочечного белка env субтипов А (A, A1, А2), В, С, D, F (F1 и F2) и G группы М на основании базы данных 2001 HIV sequence database (http://hiv-web.lanl.gov/content/hiv-b/CONSENSUS/M_GROUP/Consensus-html) (Virology. 2006 Sep. 30 V. 353 №2 p. 268-82). A group M consensus envelope glycoprotein induces antibodies that neutralize subsets of subtype В and С HIV-1 primary viruses. Liao HX, Sutherland LL, Xia SM, Brock ME, Scearce RM, Vanleeuwen S, Alam SM, McAdams M, Weaver EA, Camacho Z, Ma BJ, Li Y, Decker JM, Nabel GJ, Montefiori DC, Hahn BH, Korber ВТ, Gao F, Haynes BF).
Прототипом заявленного изобретения является иммуногенная композиция, содержащая синтетические пептиды, повторяющие как консенсусную последовательность группы М, так и последовательность российского изолята RUA022a2 (V3-петля) (субтип A1) (RU 2577132 С1). Данные полипептиды распознавались сыворотками людей, инфицированных ВИЧ, а также вызывали образование антиген-специфических антител у лабораторных животных (мышей).
Однако генетическое разнообразие ВИЧ1 является одним их препятствием для разработки вакцины против ВИЧ/СПИД. При разнице в аминокислотных последовательностях оболочечного белка ВИЧ1 gp120 между различными субтипами в 30%, маловероятно, что будет образовываться одинаково эффективная иммунная защита на все циркулирующие штаммы.
Поэтому, создание вакцин на основе консенсусных последовательностей может способствовать индукции иммунного ответа широкой специфичности и задачей данного изобретения является разработка композиции, вызывающей иммунный ответ на протективные эпитопы из оболочечного белка ВИЧ gp120.
Предложенная иммуногенная композиция содержит пептиды, повторяющих последовательность V3-петли российского изолята RUA022a2 (V3-петля) и консенсусную последовательность группы М.
Данные пептиды отличаются от ближайшего аналога тем, что пептид  содержит на N-конце три дополнительные аминокислоты TVN, а пептид  содержит дополнительные аминокислоты EI на С-конце и IS и на N-конце.
Техническими результатами предлагаемого изобретения являются расширение специфичности иммунного ответа, путем введения дополнительных аминокислот в состав пептидов (SEQ ID NO 1 и SEQ ID NO 2), что меняет конформацию данных антигенов. Кроме того, описываемая нами иммуногенная композиция не содержит последовательности V1- и V2- петли, что дает возможность активировать иммунную систему только на V3- эпитоп, ответственный за индукцию нейтрализующих антител и ЦТЛ, а также увеличивает средний титр антител на пептиды V3-петли. Использование иммуноадъювантов не только усиливает иммунный ответ, но и способно сдвигать его направленность (Th1 или Th2).
Краткое описание фигур
Фиг. 1. Титры антител животных, иммунизированных смесью пептидов, повторяющих консенсусную последовательность V3- петли группы М и V3-петлю российского изолята RUA 022а2 с различными иммуноадъювантами.
Фиг. 2. Сравнительный анализ титров антител животных, иммунизированных смесью пептидов, повторяющих консенсусную последовательность V3 - петли группы М и V3-петлю российского изолята RUA 022а2, описанных в настоящем изобретении и группы сравнения (укороченный вариант данных пептидов).
Ниже указана последовательность пептидов:
1. Аминокислотная последовательность V3-петли российского изолята RUA022a2 (субтип А1):
2. Аминокислотная последовательность V3-петли консенсусной:
Подробное описание изобретения.
Для лучшего понимания сущности предлагаемого изобретения ниже приведены примеры его осуществления.
Пример 1. Индукция антиген-специфических антител пептидами, копирующими V3-петлю.
Поскольку пептиды, имея небольшой молекулярный вес, являются слабыми иммуногенами, то для усиления иммунного ответа на исследуемые синтетические пептиды, нами была использованы различные иммуноадъюванты. Адъюванты - не только усиливают иммунный ответ, но и могут переключать его направленность, например, с гуморального на клеточный. Наиболее часто используемый в клинической практике иммуноадъювант - гидроокись алюминия. Однако его недостатком является активация только гуморального звена. Механизм действия гидроокиси алюминия основан на образовании депо в месте введения, что приводит к увеличению доступности вакцинных антигенов иммунной системе и активации антиген-представляющих клеток. Полинозиновая-полицитидиловая кислота (poly(I:C)) является синтетическим аналогом двуцепочечной РНК (dsRNA), молекулярной структуры, ассоциированной с вирусной инфекций. Известно, что природные и синтетические аналоги dsRNA индуцируют секрецию интерферонов первого типа и других цитокинов. poly(I:C) распознается TLR3. TLR3 является рецептором врожденного иммунитета и экспрессируется на поверхности В-клеток, макрофагов и дендридных клеток. Полный адъювант Фрейнда (ПАФ) представляет собой инактивированную бактерию Mycobacterium tuberculosis в неметаболизируемых маслах (парафиновое и моноолеат маннида). ПАФ содержит лиганды для рецептров врожденного иммунитета - TLR2, TLR4, и TLR9. Данный иммуноадъювант не разрешен для применения у людей.
Животных (мыши линии balb/c, 18-20 г) иммунизировали три раза с интервалом 2 недели смесью пептидов, повторяющих консенсусную последовательность V3- петли группы М и V3-петлю российского изолята RUA022a2. Пептиды вводились совместно со следующими иммуноадъювантами: гидроокись алюминия, poly(I:C)) и ПАФ. Иммунный ответ определяли после третьей иммунизации. Иммунизирующая доза была 100 мкг каждого пептида/мышь. Сравнением служили животные, иммунизированные без иммуноадъювантов. Антигены вводились внутрибрюшинно, за исключением группы с ПАФ, в данном случае смесь вводилась подкожно. Титр антител (IgG, IgM, IgA) определяли с помощью твердофазного непрямого иммуноферментного анализа (ИФА). В качестве твердофазного иммуносорбента использовали смесь пептидов, использованных для иммунизации, которые сорбировали на полистироловых планшетах фирмы «Greiner» (Германия) в 0,05 М растворе карбонантно-бикарбонантного буфера рН 9,5, внося по 100 мкл раствора в концентрации 5 мкг/мл каждого антигена в лунку. Выдерживали 24 часа при комнатной температуре во влажной камере. После окончания инкубации содержимое лунок стряхивали. Готовили ряд последовательных двоичных разведений сывороток на 0,01 М фосфатно-солевом буфере, содержащем 0,05% раствора Твин-20 (ФСБ-Т) и 0,02% бычьего сывороточного альбумина (ФСБ-AT). Образцы вносили в лунку в трех параллелях для каждого разведения, и выдерживали 60 мин при 37°С.
Далее планшеты отмывали ФСБ-Т для удаления не связавшихся антител. В качестве детектирующего реагента использовали конъюгат пероксидазы хрена с козьими антителами против молекулы IgG, IgM или IgA мыши (Sigma). Конъюгат в рабочем разведении на ФСБ-АТ вносили в лунку. Инкубировали 60 мин при 37°С. После этого лунки вновь промывали пятикратно ФСБ-Т. Реакцию проявляли внесением в каждую лунку 0,2% раствора ортофенилендиамина в субстратном буфере. Развитие цветной ферментативной реакции останавливали после 15-минутной инкубации в темноте, внося в каждую лунку 50 мкл 10% раствора серной кислоты. Учет реакции производили с помощью спектрофотометраридера при длине волны 492 нм.
Результат считали положительным, если ОП (оптическая плотность) в анализируемой лунке превышала ОП крит., рассчитанную по формуле:
ОП крит. = ср. знач. ОП К(-)+0,2,
где 0,2 - коэффициент, определяемый методом статистической обработки результатов постановки ИФА,
ОП К(-) - оптическая плотность сыворотки интактной мыши, в рабочем разведении 1:10.
Иммунизация животных вызывала образование антител класса IgG, IgM и IgA во всех группах (Фигура 1). Наименьший титр IgG и IgM антител выявлялся в группе, где пептиды вводились без иммуноадъювантов, наибольший - в группе с poly (I:С). Максимальный титр IgA антител определялся в группе, где была использована гидроокись алюминия. Таким образом, на развитие иммунного ответа, его уровень и направленность влияет использование тех или иных иммуноадъювантов.
Пример 2. Сравнительный анализ иммуногенности пептидов, копирующих V3 - петлю с разной аминокислотной последовательностью.
Проведены сравнительные исследования иммуногенности пептидов, описываемых в данном изобретении ( и ), с их укороченным вариантом пептидами, отличающимися от них тем, что последовательность  не содержит на N-конце три дополнительные аминокислоты TVN, а пептид  не содержит дополнительные аминокислоты EI на С-конце и IS и на N-конце.
Животных (мыши линии balb/c, 18-20 г) иммунизировали три раза с интервалом 2 недели смесью пептидов, описываемых в данном изобретении с группой сравнению (смесью пептидов с более короткой аминокислотной последовательностями). Иммунный ответ определяли после третьей иммунизации. Иммунизирующая доза была 100 мкг каждого пептида/мышь. Антигены вводились внутрибрюшинно. Титр антител (IgG) определяли с помощью твердофазного непрямого иммуноферментного анализа (ИФА). Реакцию ставили так же, как описано в примере 1. Показано, что наличие дополнительных аминокислот влияло на развитие ответа (Фигура 2). Так, смесь пептидов, описываемая в данном изобретении и имеющая более длинную аминокислотную последовательность, вызывала образование более высокого титра антител (1:26), по сравнению с группой сравнения (1:10). Таким образом, было показано влияние увеличения количества аминокислот в составе пептидов на их иммуногенные свойства.
Пример 3. Индукция клеточного ответа синтетическими пептидами, копирующими V3-петлю.
2
Показателем Th1 (клеточное звено) активации является секреция клетками IFNγ, Th2 (гуморальное звено) - IL4. Животных иммунизировали как описано в примере 1. На 14 день после последнего введения антигена, отбирали селезенки, выделяли спленоциты. Клетки иммунных животных, в концентрации 2,5 млн/ лунку, инкубировали 3 дня в 24 луночном планшете в 5% CO при 37°С, в полной питательной среде совместно со смесью пептидов (10 или 1 мкг/мл каждого пептида). Контролем функциональной активности лимфоцитов служила стимуляция клеток конковалином А (10 мкг/мл). Через 72 часа отбирали супернатант, центрифугировали его 10 минут при 1000 об/мин, отбирали надосадочную жидкость и хранили на -20°С до проведения ИФА. Цитокины (IFNγ, IL4) определяли в коммерческих наборах (Mabtech) согласно приложенной инструкции. Группой равнения служили клетки интактных животных. Результаты представлены в таблице 1.
Использование иммуноадъювантов poly (I:С) и ПАФ приводит к активации Th1 звена иммунного ответа. Так, уровень IFNγ в лунках с клетками, стимулированных антигенами, был в несколько раз выше (примерно в 6 раз в группе poly (I:С)), по сравнению со спонтанной продукцией цитокина. Уровень продукции IFNγ у животных, иммунизированных только пептидами или совместно с гидроокисью алюминия не отличался от интактных животных. Уровень продукции IL4 во всех группах достоверно не отличался от группы интактных животных.
Таким образом, иммуногенная композиция вызывала иммунный ответ у лабораторных животных (мышей) (пример 1). Антитела индуцировались на каждый пептид, входящий в состав композиции. Помимо, образования специфических антител класса IgG, иммунизация вызывала продукцию специфических IgM антител и сывороточных IgA. Использование иммуноадъювантов не только усиливают иммунный ответ, но и способно сдвигать его направленность (Th1 или Th2). Так введение в состав композиции полного адъюванта Фрейнда (ПАФ) и poly (I:С) значительно увеличило титр антител. Кроме того, отмечена активация Th1-клеток в группе, где применялся адъювант poly (I:С) (Пример 2). В этой группе выявлена антигенспецифическая продукция клетками (спленоцитами) IFNγ. Таким образом, данная композиция может вводиться с любыми разрешенными к использованию в клинической практике иммуноадъювантами.
Другим важным моментом является способ доставки композиции, композиция может быть введена нагруженными пептидами дендридными клетками.