Моноклональные антитела к белку Тамма-Хорсфолла: эпитопная специфичность и применение в иммуноанализе

РЕГУЛЯЦИЯ ИММУНИТЕТА

© коллектив авторов, 2014 удк 612.461.017.1.083.33

Крутецкая и.Ю., Самойлович М.П., Климович В.Б., Климович А.В.

МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА К БЕЛКУ ТАММА-ХОРСФОЛЛА: ЭПИТОПНАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬ И ПРИМЕНЕНИЕ В ИММУНОАНАЛИЗЕ

ФГБУ Российский научный центр радиологии и хирургических технологий Минздрава России, 197758, г Санкт-Петербург

Создана панель моноклональных антител (МКАТ), распознающих не менее четырех эпитопов белка Тамма-Хорсфолла (БТХ), или уромодулина, специфического почечного антигена, доминирующего компонента белков нормальной мочи. Все эпитопы после дегликозилирования БТХ сохраняют способность связываться с МКАТ. Три МКАТ направлены к пространственно сближенным конформационно-зависимым эпитопам. Взаимодействие с ними усиливается после восстановления БТХ дитиотреитолом. Среди остальных одно МКАТ распознает линейный эпитоп участка, включающего домен zona pellucida (ZP), второе связывает эпитоп отрезка, чувствительного к перевариванию эластазой, третье специфично к детерминанте, топографически удаленной от всех других эпитопов. На основе полученных МКАТ разработана тест-система иммуноферментного анализа (ИФА) для определения концентрации БТХ в моче. Для захвата БТХ из пробы использована смесь из трех адсорбированных на твердой фазе МКАТ, распознающих три разных эпитопа. В качестве выявляющего реагента использовано меченное пероксида-зой МКАТ, направленное к эпитопу, пространственно наиболее удаленному от остальных. БТХ для калибрующих проб выделен из мочи здоровых лиц и растворен в буфере, предотвращающем его агрегацию. Порог детекции БТХ составляет 30 нг/мл. Линейный диапазон выявляемых концентраций находится в пределах от 80 до 5000 нг/мл. Воспроизводимость анализа в intra-assay менее 7,8%, в inter-assay менее 9,6%. Тест-система позволяет определять сдвиги в концентрации БТХ в моче при различных нарушениях функций почек. Созданные МКАТ могут также использоваться для изучения структуры и для аффинной очистки БТХ.

Ключевые слова: белок Тамма-Хорсфолла; уромодулин; моноклональные антитела; иммуноферментный анализ. Krutetskaya I.Yu., Samoylovich M.P., Klimovich V.B., Klimovich A.V.

MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST TAMM-HORSFALL PROTEIN: EPITOPE SPECIFICITY AND IMMUNOANALYTIC APPLICATION

Federal State Budgetary Institution «Russian Research Center for Radiology and Surgical Technologies» of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation, 197758, St.-Petersburg, Russian Federation

A panel of monoclonal antibodies (Mab) recognizing at least four epitopes of Tamm-Horsfall protein (THP), or Uromodulin, the specific kidney antigen and most abundant urine protein, was developed. All epitopes retain their ability to bind Mab after protein deglycosilation.

Three Mab are directed to a cluster of conformation-dependent spatially close epitopes. The interaction with these determinants was increased after reduction of THP by means of dithiothhreitol

Among others the first Mab recognizes linear epitope in the stretch including Zona pellucid domain, the second one interacts with epitope located in elastase-sensitive part of molecule, the third is specific to determinant topographically isolated from all other mentioned epitopes.

On the basis of developed Mab a multideterminant ELISA system for THP determination in urine was constructed. The mixture of three Mab recognizing different epitopes of THP were used for capture the antigen on the solid phase. As developing reagent the peroxidase-labelled Mab directed to most spatially isolated epitope was used. Calibrating samples were prepared on the basis of THP purified from the urine of healthy individuals and solibilised in the buffer preventing its aggregation. Mab also may be used for affinity purification and for investigation of THP structure.

Keywords: Tamm-Horsfall protein; Uromodulin; monoclonal antibodies; ELISA.

Белок Тамма-Хорсфолла, известный также как уромодулин, - специфический почечный антиген, гликопротеин апикальной мембраны эпителия почечных канальцев, формирующих толстое восходящее колено петли Генле. БТХ имеет молекулярную массу 80-90 кД, около 30% которой приходится на П-связанные гликаны и сиаловые кислоты [1].

БТХ относится к семейству склонных к полимеризации

Для корреспонденции: Крутецкая Ирина Юрьевна, e-mail: 3136086@mail.ru

For correspondence: Krutetskaya Irina Yur'evna, e-mail: 3136086@mail.ru

белков, содержащих домен zona pellucida (ZP) [2]. На поверхности эпителия он образует полианионные гелеобразные структуры, возможно, обеспечивающие непроницаемость эпителия для воды [3]. После отщепления от клеточной мембраны БТХ переходит в растворимую форму и выделяется с мочой, представляя доминирующую белковую фракцию мочи здоровых людей. Объем суточной экскреции БТХ составляет около 50 мг в сутки [1]. В моче БТХ вносит свой вклад в регуляцию коллоидно-осмотического давления, предотвращение восходящих инфекций мочевого тракта и влияет на образование супернасыщенных растворов солей и их кристаллов. Полимеризуясь, БТХ участвует в образовании гиалиновых мочевых цилиндров и патогенезе нефропатий [1, 4-7].

В исследованиях in vitro показано, что БТХ с высоким аффинитетом связывается с различными компонентами иммунной системы (фактор некроза опухоли а, интерлейкин (IL)-ip, IL-8, компонентами комплемента С1, C1q и С3, IgG и легкими цепями Ig). Но физиологическая роль этих взаимодействий до сих пор обсуждается. Предполагается, что БТХ может выступать в качестве активатора механизмов врожденного иммунитета при воспалительных процессах в уро-генитальном тракте [1, 7].

Роль БТХ в функционировании выделительной системы и развитии почечной патологии также остается предметом дискуссий, однако отклонения в уровне его экскреции рассматриваются как информативный диагностический признак, сопряженный с нарушениями структуры или функций почек [1, 3, 8-11].

Для обнаружения БТХ в моче применяют электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ) в денатурирующих условиях с последующей окраской Кумасси синим или переносом на мембрану и проявлением с помощью специфических антител. Выявление БТХ на срезах почечной ткани и в культивируемых клетках выполняют с помощью стандартных методов иммуногистохимической, иммунофлюоресцентной техники или иммуноэлектронной микроскопии. Наиболее востребованным и практичным методом количественного определения уровня БТХ в моче является иммунофермент-ный анализ (ИФА) [3], воспроизводимость и специфичность которого существенно возрастают при применении МКАТ.

Цель настоящего исследования состояла в получении семейства МКАТ к БТХ, изучении их эпитопной специфичности и разработке на их основе тест-системы ИФА для количественного определения уровня БТХ в моче.

Материал и методы. Очистка БТХ и электрофорез в ПААГ. БТХ выделяли методом солевой преципитации из мочи клинически здоровых доноров, не имеющих патологии почек [12]. Преципитат отделяли центрифугированием, растворяли в дистиллированной воде и высушивали лиофильно. Чистоту препарата контролировали с помощью электрофореза в ПААГ в денатурирующих условиях. Использовали 10% гель, содержащий 0,1% додецил сульфата натрия. Для калибровки использовали маркеры молекулярной массы белков НПО "СибЭнзим".

Модификация БТХ. Для дегликозилирования БТХ использовали пептид N-гликозидазу F (PNGase F; Sigma, США) в соотношении 2 U на 1 мкг БТХ в 25 мМ фосфатно-солевом буфере, рН 8, содержащем 5 мМ ЭДТА. Ферментативное воздействие осуществляли в течение 24 ч при 370С [2].

Для восстановления дисульфидных связей БТХ инкубировали с дитиотреитолом в конечной концентрации 50 мМ в темноте при комнатной температуре в течение 2 ч. Для алки-лирования использовали 0,3 М йодацетамида.

Ограниченный протеолиз БТХ проводили с помощью панкреатической эластазы из поджелудочной железы свиньи (type III; Sigma, США). БТХ растворяли в 25 мМ трис-НС1-буфере, рН 8,5, и смешивали с ферментом в соотношении

БТХ/эластаза 25/1. Протеолиз осуществляли в течение 5 ч при 370c. Реакцию останавливали добавлением ингибитора протеаз (1,4 мМ PMSF) и инкубацией с ним в течение 1 ч при 250С [2].

Иммунизация и создание МКАТ. Для иммунизации и получения МКАТ использовали мышей F1 (Balb/с х SJL/J), выращенных в виварии ФГБУ Российский научный центр радиологии и хирургических токсикологий. Животных содержали и использовали в соответствии с правилами и нормами гуманного обращения с объектами исследований.

Иммунизацию проводили 3-кратно из расчета 20 мкг БТХ на мышь с использованием адъюванта Фрейнда. Срок от первой иммунизации до гибридизации составил 11 мес. Гибридизацию клеток проводили с помощью полиэтиленгликоля по общепринятой методике [13]. Партнерами при слиянии служили клетки миеломного штамма 653.А и клетки селезенки и паховых лимфоузлов иммунизированных мышей. Приемы селекции, скрининга, клонирования и пассирования гибридом описаны ранее [14].

Изотипы мышиных иммуноглобулинов, синтезируемых клетками гибридом, определяли с помощью ИФА на основе моноклональных изотипирующих реагентов Sigma (США).

ИФА. Свойства МКАТ исследовали с помощью различных вариантов твердофазного ИФА (прямой, непрямой, двухдетер-минантный, ингибиторный). В качестве твердой фазы использовали планшеты фирмы NUNC ( ). Белки адсорбировали на поверхности лунок из раствора (1-10 мкг/мл) в 0,1 М натрий-карбонат-бикарбонатном буфере, рН 9,5, в ходе инкубации в течение 18 ч при 40c. Несвязавшиеся компоненты отмывали с помощью изотонического раствора Nacl, забуференного 0,05 М трис (рН 7,5) и содержащего 1% твин-20 (ТСР-твин). Для приготовления калибрующих проб навеску лиофилизата БТХ растворяли в соответствующем объеме буфера, содержащего Triton, EDTA, Alkaline (ТЕА) и предотвращающего агрегацию БТХ [15]. Выявляющими реагентами служили конъюгаты антител с пероксидазой хрена, приготовленные методом перйо-датного окисления по P. Nakane [16]. Активность пероксидазы определяли по превращению 3,3'5,5'-тетраметилбензидина (Sigma, США) в окрашенное производное. Значения оптической плотности (ОП) регистрировали с помощью планшетного фотометра при длине волны 450 нм.

Эпитопную специфичность определяли по степени ин-гибиции немечеными МКАТ связывания меченых МКАТ с антигеном, иммобилизованным на твердой фазе. Контролем служили лунки, в которые вместо немеченых МКАТ вносили раствор ТСР-твин. Показатели ОП в этих лунках принимали за 100%. Ингибирование взаимодействия более чем на 75% рассматривали как свидетельство распознавания пространственно сближенных эпитопов или одного и того же эпито-па. Отсутствие ингибиции или подавление связывания менее чем на 25% считали свидетельством распознавания пространственно удаленных эпитопов.

Иммуноблоттинг. Для выявления БТХ, подвергнутого разделению в ПААГ, гель помещали на нитроцеллюлозную

Ингибирование нативными МКАТ связывания меченных пероксидазой МКАТ с БТХ

Шифры в изотипы нативных МКАТ Шифры меченных пероксидазой МКАТ

1А5 1Н7 1В11 2D9 3E6 6B9

1А5

Примечание. Ингибирование связывания более чем на 75% выделено темным цветом; отсутствие ингибирования или ингибирование менее чем на 25% отмечено отсутствием цвета.

1,4 -1,2 -1 -0,8 -0,6 -0,4 -0,2 -

ЭЛЕКТРОФОРЕЗ 1 2 3

ИММУНОБЛОТТИНГ а б в г

1А5 1А7 1В11 2D9 ЗЕ6 6В9

БТХ-дегликозилированный

БТХ-нативный БТХ-восстановленный

Рис. 1. Взаимодействие МКАТ с дегликозилированным и восстановленным БТХ в непрямом ИФА.

По оси абсцисс - шифры МКАТ; по оси ординат - оптическая плотность при длине волны 450 нм.

БТХ иммобилизован на твердой фазе. Выявляющий реагент - меченные пероксидазой козьи антитела к ^ мыши.

мембрану (Sigma, США). Полусухой электроперенос выполняли в течение 1,5 ч при силе тока 2 мА/см2. Затем мембрану инкубировали в ТСР-твин, содержащем 10% сыворотки крупного рогатого скота и от 0,2 до 2 мкг/мл МКАТ, в течение 15-20 ч при 4oC. Несвязавшиеся МКАТ отмывали ТСР-твин. Далее мембрану инкубировали 60 мин с меченными перокси-дазой козьими антителами к мышиным иммуноглобулинам. Пероксидазную активность выявляли с помощью раствора 3,3'5,5'-тетраметилбензидина для мембран (Sigma, США).

Для обработки результатов использовали компьютерные программы 0RIGIN50 и EXCEL.

результаты и обсуждение. В результате двух экспериментов по гибридизации и селекции отобрали шесть стабильных гибридом-продуцентов МКАТ разных изотипов (см. таблицу).

Результаты ингибиторного теста (см. таблицу) позволили установить, что три МКАТ распознают один общий эпитоп или кластер из двух-трех сближенных эпитопов, остальные связывают еще три эпитопа, топографически удаленных друг от друга и от упомянутого кластера.

Сведения о высокой степени гликозилирования БТХ позволяли предположить, что распознаваемые МКАТ эпитопы могут быть сформированы как белковой, так и углеводной частью молекулы. Важно отметить, что при почечных патологиях описаны значительные изменения и вариации углеводной части БТХ [1, 17]. При сопоставлении взаимодействия МКАТ с нативным и дегликозилированным БТХ установили, что удаление углеводных компонентов не влияет на связывание МКАТ с антигеном (рис. 1).

Наличие или отсутствие изменений при взаимодействии МКАТ с восстановленным БТХ позволило оценить зависимость изучаемых эпитопов от конформации молекулы. Из представленных на рис. 1 данных следует, что три МКАТ с восстановленным БТХ взаимодействуют сильнее, чем с на-тивным. Полученный результат свидетельствует о конфор-мационной зависимости эпитопов, распознаваемых МКАТ 1А5, 1Н7, 1В11. Взаимодействие МКАТ 2D9, 3E6 и 6В9 с БТХ не зависит от конформации молекулы до и после восстановления.

Связывание МКАТ с денатурированным БТХ оценивали в иммуноблоттинге. Только МКАТ 2D9 и 3E6 взаимодействуют с БТХ в данном тесте (рис. 2) и, следовательно, распознают линейные эпитопы. Четыре МКАТ (1А5, 1Н7, 1В11 и 6В9) в иммуноблоттинге не активны, что может свидетельствовать о значительном изменении или разрушении соответствующих эпитопов после денатурации БТХ.

Рис. 2. Разделение нативного и подвергшегося протеолизу эластазой БТХ в ПААГ с последующим выявлением с помощью МКАТ. 1 - маркеры молекулярной массы; 2 - БТХ нативный; 3 - БТХ, подвергшийся протеолизу эластазой. Увеличение х1. Окраска Кумасси синим. а - выявление нативного БТХ с помощью МКАТ 2D9; б - выявление БТХ, подвергшегося протеолизу эластазой, с помощью МКАТ 2D9; в - выявление нативного БТХ с помощью МКАТ 3Е6; г - выявление БТХ, подвергшегося протеолизу эластазой, с помощью МКАТ 3Е6.

Для уточнения локализации и природы эпитопов, распознаваемых МКАТ, изучали их взаимодействие с БТХ, обработанным панкреатической эластазой. В 2002 г. L. Jovine и соавт. показали, что пептидная часть БТХ, сформированная АКО 1-291, разрушается под воздействием панкреатической эластазы, а С-концевой пептид, включающий домен ZP, устойчив к протеолизу [2]. Взаимодействие МКАТ 2D9 и 3Е6 с БТХ после его ограниченного протеолиза эластазой оценивали с помощью метода иммуноблоттинга (см. рис. 2). МКАТ 2D9 взаимодействовало с обработанным эластазой БТХ. Следовательно, эпитоп, распознаваемый указанным реагентом, находится в пределах сохранившегося домена

3,5 п

3 2,5 2 1,5 1

0,5

61 185 -О- Смесь МКАТ

555 1666 5000 ЦВ11 Д 2D9 • 6В9

Рис. 3. Сравнение вариантов двухдетерминантного ИФА, основанных на применении иммобилизованных МКАТ с разной эпитопной специфичностью или их смеси.

По оси абсцисс - концентрация БТХ (в нг/мл), по оси ординат - оптическая плотность при длине волны 450 нм.

В легенде обозначены шифры иммобилизованных МКАТ. Выявляющий реагент - меченное пероксидазой МКАТ 3Е6.

Рис 4. Калибровочный график для количественного определения БТХ в моче.

По оси абсцисс - концентрация БТХ (в нг/мл), стрелкой показан рабочий диапазон калибровочного графика при определении нормальных значений концентраций; по оси ординат - оптическая плотность при 450 нм. Данные представлены как средние значения ±SD.

(АКО 292-585). МКАТ 3Е6 не связывалось с сохранившейся после протеолиза частью БТХ, из чего следует, что эпитоп, связывающий это МКАТ, находится в пределах разрушенной части молекулы (АКО 1-291). Результаты, полученные с помощью иммуноблоттинга, подтверждают и дополняют данные об эпитопной специфичности МКАТ, основанные на результатах конкурентного ингибирования. Количество и пространственная удаленность эпитопов, распознаваемых созданными МКАТ, позволяет конструировать мультицен-тровую систему выявления БТХ на основе сэндвич-ИФА.

Точность количественного ИФА во многом зависит от качества и стандартности калибратора. Высокая склонность БТХ к образованию агрегатов различной степени полимерности затрудняет его выявление и адекватное определение его концентрации. На степень агрегации БТХ может оказывать влияние рН и концентрация ионов кальция и натрия. ТЕА-буфер с рН 7,5, в состав которого включены хелатирую-щий агент и детергент, позволяет полностью ингибировать агрегацию БТХ [15]. ТЕА-буфер использовали для разведения калибрующих проб БТХ и образцов мочи при разработке двухдетерминантного ИФА.

В ходе разработки тест-системы ИФА для определения концентрации БТХ провели испытание нескольких вариантов двухдетерминантного анализа. Для выявления БТХ использовали меченное пероксидазой МКАТ 3Е6. На твердой фазе адсорбировали одно из пяти МКАТ, отличающихся от МКАТ 3Е6 по эпитопной специфичности. Три варианта ИФА на основе иммобилизованных МКАТ 1В11, 2Б9, 6В9 практически равноценны и могут быть использованы для количественного определения БТХ. Линейный диапазон зависимости у этих трех сочетаний МКАТ совпадает (рис. 3).

Распознавание одного единственного эпитопа на молекуле антигена обеспечивает высокую специфичность имму-нохимического анализа на основе МКАТ. Это же свойство может и ограничивать возможности применения МКАТ в лабораторной практике, если распознаваемый эпитоп оказывается маскированным в биологических жидкостях сложного состава. Использование сразу трех различных иммобилизованных МКАТ при захвате БТХ из раствора помогает избежать таких ограничений и ложных результатов.

По данным литературы, нормальный уровень БТХ в моче от 55 до 96 мкг/мл [18]. Калибровочная кривая БТХ в муль-тидетерминантном ИФА на основе смеси из трех МКАТ, адсорбированных на твердой фазе, представлена на рис. 4. Линейный диапазон выявляемых в разработанном тесте концентраций находится в пределах 80-5000 нг/мл. Минималь-

ная граница определения уровня БТХ составляет 30 нг/мл. Для определения нормальных значений концентрации БТХ в моче c помощью разработанного ИФА исследуемые образцы необходимо предварительно разводить в 50 раз. Тогда при расчетах концентрации БТХ рабочий диапазон на калибровочном графике составляет 400-2500 нг/мл. Изменение степени разведения исследуемого образца в случае существенного отклонения от нормы позволяет оставаться в том же рабочем диапазоне концентраций. Оценка воспроизводимости анализа в ходе лабораторных испытаний показала, что коэффициент вариации составляет в intra-assay менее 7,8%, а в inter-assay менее 9,6%. Продолжительность постановки анализа не превышает 3,5 ч.

Заключение. Созданное семейство МКАТ обеспечивает распознавание не менее четырех различных топографически удаленных участков молекулы БТХ. Два МКАТ распознают линейные, независимые от конформации эпитопы, и наряду с ИФА могут быть использованы для выявления денатурированных форм БТХ в исследованиях с помощью иммуно-блоттинга и иных методов. Одно из них распознает эпитоп в домене БТХ, содержащем ZP и ответственном за его полимеризацию. Разработанный на основе четырех МКАТ с разной эпитопной специфичностью мультицентровой тест для количественного определения БТХ в моче позволяет установить концентрации БТХ, близкие к нормальным значениям, и выявлять сдвиги, направленные как в сторону повышения, так и снижения содержания БТХ у пациентов с нарушениями почечных функций.

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта ФЦП "Научные и научно-педагогические кадры инновационной России" (соглашение № 8725).

литература

14. Самойлович М.П., Крутецкая И.Ю., Климович В.Б., Шмидт Е.Н., Пашкова С.Ф. Котова Т.С. Моноклональные антитела против подклассов IgG человека. Получение и определение специфичности. Иммунология. 1998, 3: 27-30.

Поступила 19.11.13

references

1. Serafini-Cessi F., Malagolini N., Cavallone D. Tamm-Horsfall glycoprotein: Biology and clinical relevance. Am. J. Kidney Dis. 2003; 42 (4): 658-76.

2. Jovine L., Qi H., Williams Z., Litscher E., Wassarman P.M. The ZP domain is a conserved module for polymerization of extracellular proteins. Nature Cell Biol. 2002; 4: 457-61.

3. Vyletal P., Bleyer A.J., Kmoch S. Uromodulin biology and pathophysiology. An update. Kidney Blood Press Res. 2010; 33: 456-75.

4. Carvalho M., Mulinari R.A., Nakagawa Y. Role ofTamm-Horsfall protein and uromodulin in calcium oxalate crystallization. Braz. J. Med. Biol. Res. 2002; 35 (10): 1165-72.

5. Leeker A., Kreft B., Sandmann J., Bates J., Wasenauer G., Muller H., Sack K., Kumar S. Tamm-Horsfall protein inhibits binding of S- and P-fimbriated Escherichia coli to human renal tubular epithelial cells. Exp. Nephrol. 1997; 5 (1): 38-46.

6. Bleyer A.J., Zivna M., Kmoch S. Uromodulin-associated kidney disease. Nephron. Clin. Pract. 2011; 118 (1): 31-6.

7. Saemann M.D., Weichhart T., Horl W.H., Zlabinger G.J. Tamm-Horsfall protein: a multilayered defence molecule against urinary tract infection. Eur. J. Clin. Invest. 2005; 35: 227-35.

8. Tarek M., El-Achkar M.D.1, Xue-Ru Wu. Uromodulin in kidney injury: An instigator, bystander, or protector? Am. J. Kidney Dis. 2012; 59 (3): 452-61.

9. Prajczer S., Heidenreich U., Pfaller W., Kotanko P., Lhotta K., Jennings P. Evidence for a role of uromodulin in chronic kidney disease progression. Nephrol. Dial. Transplant. 2010; 25: 1896-903.

10. Lens X.M., Banet J.F., Outeda P., Barrio-Lucia V. A novel pattern of mutation in uromodulin disorders: autosomal dominant medullary

cystic kidney disease type 2, familial juvenile hyperuricemic nephropathy, and autosomal dominant glomerulocystic kidney disease. Am. J. Kidney Dis. 2005; 46: 52-7.

11. Sejdiu I., Torffvit O. Decreased urinary concentration of Tamm-Horsfall protein is associated with development of renal failure and cardiovascular death within 20 years in type 1 but not in type 2 diabetic patients. Scand. J. Urol. Nephrol. 2008; 42: 168-74.

12. Tamm I., Horsfall F.L., Jr. A mucoprotein derived from human urine which reacts with influenza, mumps, and Newcastle disease viruses. J. Exp. Med. 1952; 95: 71-97.

13. Gefter M. L., Margulies D.H., Scharff M.D. A simple method for polyethylene glycol-promoted hybridization of mouse myeloma cells. Somat/Cell Genet. 1977; 3: 231-6.

14. Samoylovich M.P., Krutetskaya I.Yu., Klimovich V.B., Shmidt E.N., Pashkova S.F., Kotova T.S. Monoclonal antibodies against human IgG subclasses. Receiving and determining specificity. Immunologiya. 1998; 3: 27-30.

15. Kobayashi K., Fukuoka S. Conditions for solubilization of Tamm-Horsfall protein/uromodulin in human urine and establishment of a sensitive and accurate enzyme-linked immunosorbent Assay (ELISA) method. Arch. Biochem. Biophys. 2001; 388 (1): 113-20.

16. Nakane P.K., Kawaoi A. Peroxidase labeled antibody. A new method of conjugation. J. Histochem. Cytochem. 1974; 22: 1084-91.

17. Viswanathan P., Rimer J.D., KolbachA.M., Ward M.D., Kleinman J.G., Wesson J.A. Calcium oxalate monohydrate aggregation induced by aggregation of desialylated Tamm-Horsfall protein. Urol. Res. 2011; 39 (4): 269-82.

18. Lau Wai-Hoe, Leong Wing-Seng, Ismail Zhari, Gam Lay-Harn. Qualification and application of an ELISA for the determination of Tamm-Horsfall protein (THP) in human urine and its use for screening of kidney stone disease. Int. J. Biol. Sci. 2008; 4 (4): 215-22.

Received 19.11.13

© коллектив авторов, 2014 удк 615.31:547.466.6].015.46.076.9

Тюренков и.Н.1, гумилевский Б.Ю.2, Филина и.С.1, Самотруева М.А.3, Бакулин ДА.1

ВЛИЯНИЕ ГИДРОХЛОРИДА БЕТА-ФЕНИЛГЛУТАМИНОВОЙ КИСЛОТЫ (РГПУ-135, НЕЙРОГЛУТАМ) НА ИММУННУЮ СИСТЕМУ И ПСИХОЭМОЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ ЖИВОТНЫХ

1Кафедра фармакологии и биофармации ФУВ ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» Минздрава России, 400131, г Волгоград, Российская Федерация; 2кафедра клинической лабораторной диагностики ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» Минздрава России, 400131, г. Волгоград, Российская Федерация; 3ГБОУ ВПО «Астраханская государственная медицинская академия» Минздрава России, 414000, г. Астрахань, Российская Федерация

На мышах линии BALB/c изучено влияние нейроглутама на психоэмоциональное состояние животных в условиях развития иммунного ответа при иммунизации корпускулярным антигеном - эритроцитами барана. Анализ изменения психоэмоционального статуса у животных под влиянием нейроглутама проводили в тестах «Открытое поле» и «Черно-белая камера». Исследовано влияние нейроглутама на формирование антигенспецифического иммунитета (оценка гуморального и Т-клеточного звена иммунного ответа) и неспецифическую (оценка фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови) резистентность организма. Полученные результаты свидетельствуют о способности нейроглутама устранять тревожность животных, возникшую после иммунизации антигеном. Показано, что исследуемое соединение РГПУ-135 в дозах 26 и 78 мг/кг оказывает стимулирующее влияние на специфический иммунный ответ, а в дозах 78 и 234 мг/кг повышает фагоцитарную активность нейтрофилов.

Ключевые слова: нейроглутам; иммунная система; психоэмоциональный статус; BALB/c мыши. Tiurenkov I.N.1, Gumilevskiy B.Yu.2, Filina I.S.1, Samotrueva M.A.3, Bakulin D.A.1

THE INFLUENCE OF BETA-PHENYLGLUTAMIC ACID HYDROCHLORIDE (RGPU-135, NEUROGLUTAM) ON IMMUNE SYSTEM AND PSYCHOEMOTIONAL STATE OF ANIMALS.

'Volgograd state medical university, Department of Pharmacology and Biopharmacy, 400131, Volgograd, Russian Federation; 2Volgograd state medical university, Department of Clinical Laboratory Diagnosis, 400131, Volgograd, Russian Federation; 3Astrakhan state medical academy, 414000, Astrakhan, Russian Federation

The main purpose of this article is to evaluate the influence of neuroglutam (RGPU-135) on psychoemotional state during the development of the immune response in Balb/c mice. The "open field" test and "light/dark box" test were used to the evaluation of psychoemotional state of mice. Analysis of formation of antigen specific (humoral and T cells part of immunity) and non-specific (the phagocytic activity of neutrophils) immune resistance was used to the evaluation of development of the immune response in mice. We observed the neuroglutam ability to decrease animal anxiety after antigen immunization. Neuroglutam showed stimulating effect on specific immune response in dose 26 and 78 mg/kg; and increased the phagocytic activity of neutrophils in dose 78 и 234 mg/kg.

Keywords: neuroglutam; immune system; psychoemotional state; BALB/c mouse.

введение. Нервная и иммунная системы, играющие важную роль в процессах поддержания гомеостаза, характеризуются тесным и сложным двухсторонним взаимодействием посредством гормонов, нейромедиаторов и цитокинов воспаления [1, 2]. Подтверждением наличия тесных интегратив-

ных нейроиммунных взаимосвязей является доказанная роль центральных нейромедиаторных систем, таких как ГАМКер-гическая, глутаматергическая, серотонинергическая, допа-минергическая, в регуляции функционирования иммунной системы [3, 4].