Способ прогнозирования ответной реакции яичников коров-доноров эмбрионов на стимуляцию полиовуляции экзогенными гонадотропинами
METHOD FOR PREDICTION OF OVARIAN RESPONSE OF EMBRYO DONOR COWS TO STIMULATION OF POLYOVULATION BY EXOGENOUS GONADOTROPHINS

Изобретение относится к воспроизводству сельскохозяйственных животных, а именно к области репродукции крупного рогатого скота, и может быть использовано в научной и практической работе по управлению физиологией размножения животных.
Метод стимуляции полиовуляции экзогенными гонадотропинами, осуществляемый в составе промышленно применимой технологии трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота, широко распространен в животноводстве многих стан мира уже более чем полувека. Технология трансплантации эмбрионов, являясь одним из способов ускоренного разведения крупного рогатого скота, позволяет от одной коровы-донора получать до 80-140 эмбрионов в год, при пересадке которых у телок-реципиентов рожаются 40-70 телят (Воронин, Е.С. Иммунология. /Е.С. Воронина, A.M. Петров, М.М. Серых, Д.А. Девришов. - М.: Колос-Пресс, 2002. - С-340-359).
Применение технологии трансплантации эмбрионов, оцениваемой по наличию рожденных телят, направлено на получение максимально возможного количества зародышей от генетически ценных, высокопродуктивных коров-доноров с целью пересадки эмбрионов телкам-реципиентам, в качестве которых, как правило, используют беспородных и низкопродуктивных животных, не предназначенных для воспроизводства ремонтного молодняка. Данная технология включает в себя поэтапно выполняемый технологический процесс, в котором результативность каждого последующего этапа в значительной мере зависит от эффективности исполнения предыдущего. Рассматривая весь алгоритм процесса данной технологии, стоит подчеркнуть, что начальный этап состоит в отборе коров-доноров эмбрионов с высокой племенной ценностью, а также в отборе коров-реципиентов. Последующие технологические этапы включают проведение стимуляции полиовуляции у доноров и их искусственное осеменение, извлечение эмбрионов у доноров, проведение оценки полученных эмбрионов по качеству, пересадку эмбрионов реципиентам при предварительном проведении синхронизации половых циклов реципиентов и доноров, криоконсервацию эмбрионов (при необходимости). Реализуемый технологический процесс осуществляют с применением комплекса методов и конструктивно-технологических решений.
Метод стимуляции полиовуляции экзогенными гонадотропинами разработан в качестве составного элемента технологии трансплантации эмбрионов на основе природных процессов, детально изученных в отношении репродуктивной функции одноплодных самок крупного рогатого скота, биологической особенностью которых является наличие в яичниках большого количества гамет (ооциты), до сотни тысяч на яичник (так (называемый овариальный резерв, присутствующий в яичнике в заданное время). При наступлении естественного полового цикла у коровы большинство растущих фолликулов уничтожаются посредством апоптоза, приводящего к их инволюции. При этом созревает (овулирует) на одном из двух яичников только один фолликул (в 2-3% случаев -двойни, в 1% случаев - тройни) с образованием на его месте желтого тела, обуславливая после оплодотворения яйцеклетки, вышедшей из фолликула, рождение одного теленка в год, что согласуется с нормальной физиологией организма данного вида животных. В течение репродуктивной жизни при естественном размножении корова производит, в среднем, от 8 до 10 телят (Трансплантация эмбрионов крупного рогатого скота. Информационно-консультационная служба агропромышленного комплекса Ярославской области. Ресурсы Интернет http://yariks.info/pi_jivotnovodstvo/jiv_068/, 2018 г.). При разработке метода стимуляции полиовуляции удалось ослабить искусственным путем действие механизма апоптоза фолликулов за счет обработки животного экзогенными гонадотропинами и получать от одной коровы в течение одного полового цикла большое количество зрелых ооцитов для последующего оплодотворения. Например, известно применение фолликулостимулирующго гормона (ФСГ), овуляторные дозы которого в сочетании с лютеинизирующим гормоном (ЛГ) являются триггером роста и овуляции большого количества фолликулов, при этом, препараты ФСГ/ЛГ общепризнаны наиболее эффективными на проявление положительной ответной реакции со стороны яичников. От одной коровы или телки, обработанной экзогенным фолликулостимулирующим гормоном за один сеанс стимуляции (с последующим осеменением животного) возможно получить от 3-х до 40, в отдельных случаях и более 50 эмбрионов, пригодных к пересадке.
Под ответной реакцией яичников на стимуляцию полиовуляции экзогенными гонадотропинами понимают индуцированный физиологический процесс роста и созревания на двух яичниках множества фолликулов, количество которых является учетным показателем яичникового ответа. Однако способы подсчета активированных стимуляцией фолликулов (способы ректопальпаторный и ультразвукового исследования) имеют существенные недостатки. При использовании ректопальпаторного способа, как показывает практика, большая часть фолликулов при их пальпировании разрываются, фолликулярная жидкость вытекает и недозревшие яйцеклетки (ооциты) погибают, что негативно влияет не только на точность подсчета, но на исход мероприятия по стимуляции полиовуляции. УЗИ-сканер дает изображение только в одной плоскости сканирования, где не могут быть отображены все имеющиеся на яичнике фолликулы, а при сканировании в Разных проекциях на изображениях могут быть отражены одни и те же фолликулы совместно с теми фолликулами, которые не были запечатлены в других проекциях, что влечет за собой искажение результатов подсчета созревающих фолликулов. В связи с изложенным, ответную реакцию яичников оценивают по иному показателю - по показателю «количество желтых тел», определяемому на стадии созревания и овуляции фолликулов. Так как каждый из множества созревших и овулировавших фолликулов (активированных стимуляцией полиовуляции) продуцирует одну яйцеклетку, пригодную для оплодотворения, то количество желтых тел (число овуляций), образованных на месте созревших фолликулов на поверхности яичников, ассоциируют с идентичным количеством созревших и овулировавших фолликулов. Желтые тела отчетливо пальпируются, не повреждаются и сохраняют свою структуру при подсчете ректопальпаторным способом
Из ветеринарной практики известно, что ответная реакция яичников на экзогенные гонадотропины имеет довольно широкий диапазон значений: число овуляций может составлять от 0 до 50 желтых тел на яичниках (на одну корову). При этом, порядка 30% коров-доноров имеют низкое число овуляций (от 1 до 3-х желтых тел на яичниках, на одну корову) и извлечение эмбрионов становится нецелесообразным, а еще одна треть доноров не реагирует на введенный гонадотропин (число овуляций - 0 желтых тел на яичниках, на одну корову) (Bovine Embryo Transfer and Its Application: Arwiew./ T. Bekele, E. Mekuriaw, B. Walelegn.// Journal of Health, Medicine and Nursing, 2016. - Vol. 26. - P. 48-60). Стоит отметить, что тот или иной вышеописанный результат ответной реакции яичников на введенные гонадотропины становится очевидным лишь по факту окончания мероприятия по стимуляции полиовуляции. В связи с изложенным, исходное поголовье телок или коров для использования в качестве доноров эмбрионов должно превышать планируемое число доноров в 2-3 раза (Попов Д.В., Бригида А.В., Косовский Г.Ю. Руководство по получению и трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота. - М.: КлабПринт, 2017 г., страница 8. Сайт Интернет: http://ceerb.ru/Rukovodstvo.pdf, 2018 г.), что влечет за собой значительные дополнительные затраты (трудовые, временные, финансовые) не только на проведение стимуляции полиовуляции, но и на содержание поголовья крупного рогатого скота.
До настоящего времени нерешенной проблемой при выполнении технологии трансплантации эмбрионов остается отсутствие надежных методов прогнозирования ответной реакции яичников на введение гонадотропинов, что значительно снижает эффективность данной технологии. В течение десятилетий активно и в различных направлениях ведется поиск эффективных прогностических критериев ответной реакции яичников, с помощью которых можно было бы предсказать результативность мероприятия по стимуляции полиовуляции. Но вследствие того, что качество реакционного ответа яичников имеет многофакторную зависимость (индивидуальные физиологические и анатомические особенности животного, генетическая предрасположенность к низкой суперовуляторной реакции яичников на гонадотропины, передаваемая потомству, гормональный статус, температурные условия содержания, кормовой рацион и др.), проблема разработки методов прогноза в настоящее время остается актуальной (Факторы, влияющие на реакционный ответ яичников коров-доноров эмбрионов при введении экзогенных гонадотропинов/ А.В. Бригида, С.А. Бурсаков, О.А. Скачкова, и др.// Достижения науки и техники АПК, 2018. - Т. 32. №6. - С. 56-63.).
В качестве предиктора ответной реакции яичников на экзогенные гонадотропины рассматривают, например, показатель концентрации антимюллерова гормона (АМГ) в крови животного, влияющего на результат роста и количества фолликулярных клеток (The BOC-ELISA, a ruminant specific АМН immunoassay, improves the determination of plasma АМН concentration and correlation with embryo production in cattle / N. Arouche, J-Y. Picard, D. Monniaux, etc. // Theriogenology. 2015. Vol. 84. No. 8. Pp. 1397-1404; Regulation of Anti-Mullerian Hormone and its Receptor Expression around Follicle Deviation in Cattle / G. F. Ilha, M. T. Rovani, B. G. Gasperin, etc. // Reproduction in Domestic Animals. 2016. Vol. 51. №2. Pp. 188-194; Relationship between follicle population, АМН concentration and fertility in cattle / P. S. Baruselli, E. O. S. Batista, L. M. Vieira, etc. // Animal Reproduction. 2015. Vol.12. No. 3. Pp.487-497). Однако роль АМГ в фолликулогенезе крупного рогатого скота разнообразна и до конца не изучена, отсутствуют точные интервалы в значении уровня АМГ, при которых может быть надежно спрогнозирован уровень реакционного ответа яичников коров на введенные экзогенные гонадотропины.
В последнее время уделяется большое внимание разработкам молекулярно-генетических маркеров, обладающих предиктивной способностью и позволяющих эффективно предсказывать уровень полиовуляторной реакции яичников у доноров.
Известны исследования по поиску геномных ассоциаций у молочного скота по признакам суперовуляторного ответа. В качестве предикторов суперовуляции сообщалось о генах рецептора фолликулостимулирующего гормона (РФСГ), ингибина альфа (INHA), гена прогестерона (PGR), фактора роста и дифференциации 9 (GDF9), лютеинизирующего гормона/рецептора хориогонадотропина (ЛГХГЧР) и рецептора прогестерона (An Mspl polymorphism in the inhibin alpha gene and its associations with superovulation traits in Chinese Holstein cows / K. Q. Tang, S. J. Li, W. C. Yang, etc. // Molecular Biology Reproduction. 2011. Vol. 38. №1. Pp. 17-21; Polymorphisms of the bovine luteinizing hormone/choriogonadotropin receptor (LHCGR) gene and its association with superovulation traits / W. C. Yang, K. Q. Tang, S. J. Li, etc. // Molecular Biology Reports. 2012. Vol. 39. №3. Pp. 2481-2487; Two novel SNPs of the type I gonadotropin releasing hormone receptor gene and their associations with superovulation traits in Chinese Holstein cows / W. C. Yang, S. J. Li, Y. H. Xie, etc. // Livestock Science. 2011. Vol.136. Pp.164-168). Во всех случаях авторы указывают на ассоциации между полиморфизмами в этих генах и различными характеристиками (признаками) суперовуляции (тотальное количество яйцеклеток, количество неоплодотворенных яйцеклеток, количество дегенерированных эмбрионов, количество переносимых эмбрионов). Так, был обнаружен однонуклеотидный полиморфизм (ОНП) в гене рецептора ФСГ (РФСГ), расположенном на хромосоме 11, перспективный для выявления коров-доноров (Identification of single nucleotide polymorphisms in the bovine follicle-stimulating hormone receptor and effects of genotypes on superovulatory response traits / A. T. Cory, C. A. Price, R. Lefebvre, etc. // Animal Genetics. 2013. Vol. 44. №2. Pp. 197-201). Также был обнаружен ОНП G-278A, расположенный в 5'- нетранслируемой области гена РФСГ, служащий маркером суперовуляторного ответа (Polymorphisms in 5' upstream rigion of the FSH receptor gene, and their association with superovulation traits in Chinese Holstein cows / W. C. Yang, S. J. Li, K. Q. Tang, etc. // Animal Reproduction Science. 2010. Vol.119. №3-4. Pp.172-177). Эти результаты показали, что ген рецептора ФСГ представляет собой потенциальный маркер реакции на суперовуляцию и может быть использован в качестве предиктора для суперовуляции. Однако вышеперечисленные работы, представляющие интерес для разработки экспресс-тестов, позволяющих предсказать полиовуляторный ответ у коров-доноров еще до момента введения экзогенных гонадотропинов, на данный момент времени находятся на стадии экспериментальных исследований. Кроме того, методы полимеразной цепной реакции (ПЦР), с помощью которых идентифицируют упомянутые маркеры, не являются на сегодняшний день методами, массово применяемыми в животноводческих хозяйствах.
Одним из способов, наиболее часто применяемых в производственной практике на технологическом этапе отбора коров-доноров, является способ прогнозирования яичникового ответа на введенные гонадотропины, согласно которому учитывают индивидуальные особенности суперовуляции за счет проведения разовой гормональной обработки животного, отобранного в качестве донора эмбрионов по селекционным признакам и клиническому состоянию здоровья (Попов Д.В., Бригида А.В., Косовский Г.Ю. Руководство по получению и трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота. -М.:КлабПринт, 2017 г., страницы 7-9. Сайт Интернет: http://ceerb.ru/Rukovodstvo.pdf, 2018 г.). Для проведения разовой гормональной обработки, аналогично общепринятой процедуре стимуляции полиовуляции, животному вводят гонадотропный препарат, после чего стимулируют половую охоту препаратами простогландинового ряда, осеменяют животного и на 7-й день индуцированного полового цикла проводят подсчет количества желтых тел (число овуляций) на поверхности яичников. При диагностированном числе овуляций 4 и более желтых тел на яичниках животное определяют в специализированную группу коров-доноров. Коров с более низким числом овуляций (менее 4-х желтых тел на яичнике) не переводят в группу доноров, так как при таком реакционном ответе ооциты часто неравноценны по качеству (незрелые ооциты, нарушение структуры клеток), что может быть причиной сбоев на этапе оплодотворения. Коров не переводят в группу животных-доноров также при отсутствии реакции яичников на гормональную обработку.
Недостатком вышеизложенного метода является то, что, учитывая производственную ветеринарную практику центров, занимающихся получением эмбрионов, где корова-донор подлежит гонадотропной обработке 4-6 раз в год, вышеприведенные предиктивные критерии, определяемые на технологическом этапе отбора при проведении разовой гормональной обработки, недостаточно точно отражают репродуктивные возможности коров на момент поочередно проводимых в течение года мероприятий по стимуляции полиовуляции. Функциональное состояние половой системы коровы-донора изменяется после каждой сессии стимуляции полиовуляции и практически не коррелирует с показателями, полученными при проведении предыдущих процедур индуцирования полиовуляции. Каждая инициированная фармакологическим способом полиовуляция донора может привести к такому осложнению как синдром гиперстимуляции яичников, в результате которого образуется большое количество неовулировавших фолликулов, что приводит к образованию поликистозных гинекологических патологий, к изменению в структурах тканей яичников и нарушению их функциональной деятельности. Кроме того, факторами риска, приводящими к снижению или к отсутствию числа овуляций, могут служить производственные условия содержания доноров (алиментарные, экологические, климатические и т.п.), сезон года, физиологические особенности животных, их метаболический и гормональный статус в заданное время.
Известен способ прогнозирования ответной реакции яичников на введенные гонадотропины с возможностью оценки вариабельности яичникового ответа непосредственно перед началом стимуляции полиовуляции (прототип Прогнозирование эмбриопродуктивности коров-доноров на основании эхографической характеристики яичников/ А.В. Бригида, В.И. Сорокин, С.Н. Ковальчук, и др.// Сельскохозяйтсвенная биология, 2018. Т. 53. №4. - С. 753-761.). Согласно способу, до начала стимуляции полиовуляции, осуществляемой на 10-е сутки полового цикла, у коровы-донора проводят эндоректальное исследование яичников и желтых тел с использованием УЗИ-сканера. Затем проводят постпроцессинговую морфометрию полученных эхографических изображений путем обработки с использованием графического редактора Image J (National Institute of Health, США). Определяют длину, ширину и площадь яичников и желтых тел в качестве параметров их функциональной активности. Показатели рассчитывают с учетом длины прямого отрезка, ломаной линии, длины окружности неправильной формы, площади геометрической фигуры, угла проекции двух отрезков. Схематично отображают проекции структур на эхограмме. Определяют площадь яичника, а также площадь желтого тела по формуле для эллипсоида: S=πRr, где R и r - соответственно большая и малая полуоси. Затем проводят вычисление соотношения площади желтого тела к площади яичника в процентном выражении, по показателю которого прогнозируют ответную реакцию яичников на введенные гонадотропные препараты. При значении соотношения 30,2±2,56% прогнозируют количество желтых тел на яичнике 1,8±0,18 шт., при 42,1±2,95% - 5,7±1,24 шт. желтых тел на яичнике, при 57,1±3,01% - 11,6±1,26 шт. желтых тел на яичнике.
Недостатком прототипа является то, что в нем представлена только небольшая часть значений предикторного критерия ответной реакции яичников на введенные гонадотропные препараты. Предикторным критерием, согласно способу по прототипу, является расчетный показатель отношения площади желтого тела к площади яичника в процентном выражении, которому соответствует определенное значение количества желтых тел на яичниках. При этом, отсутствуют точные диапазоны значений предикторного критерия, в пределах которых можно было бы более точно определять прогнозируемое количество желтых тел на яичнике. Кроме того, морфометрические параметры яичников и желтых тел (длина, ширина и площадь) определяют в разрезе одной плоскости без учета объемного изображения яичников и желтых тел, что снижает информативность метода.
Техническим результатом изобретения является повышение точности и надежности прогнозирования индивидуальной ответной реакции яичников коров-доноров на экзогенные гонадотропины, осуществляемого до начала проведения стимуляции полиовуляции гонадотропными препаратами.
Технический результат достигается тем, что способ прогнозирования ответной реакции яичников коровы-донора эмбрионов на стимуляцию полиовуляции экзогенными гонадотропинами включает проведение индивидуальной оценки вариабельности яичникового ответа непосредственно до начала стимуляции полиовуляции путем проведения у коровы-донора эндоректального исследования яичника и желтого тела с использованием метода ультразвуковой эхографии и проведения морфометрических измерений параметров яичника и желтого тела, в котором согласно изобретению, морфометрически измеряют объем желтого тела и объем яичника, выполняют расчет отношения объема желтого тела к объему яичника в процентном выражении и при значении отношения 30% и менее прогнозируют вариабельность яичникового ответа в диапазоне от 0 до 2 желтых тел, что является прогностической вероятностью отрицательной или низкой ответной реакции яичников, при значении отношения от 31 до 40% прогнозируют вариабельность яичникового ответа в диапазоне от 3 до 9 желтых тел, что является прогностической вероятностью средней ответной реакции яичников, при значении отношения от 41 до 50% прогнозируют вариабельность яичникового ответа в диапазоне от 10 до 23 желтых тел, что является прогностической вероятностью высокой ответной реакции яичников, при значении отношения более 50% прогнозируют вариабельность яичникового ответа 0 желтых тел, что является прогностической вероятностью отрицательной ответной реакции яичников, связанной с наличием овариальной патологии.
Способ прогнозирования ответной реакции яичников коров-доноров эмбрионов на стимуляцию полиовуляции экзогенными гонадотропинами (далее - способ прогнозирования, патентуемый способ) предназначен для применения у коров, предварительно отобранных в группу доноров эмбрионов по ветеринарным, зоотехническим и селекционным характеристикам. Предикторным критерием ответной реакции яичников, согласно патентуемому способу, является расчетный показатель (отношение объема желтого тела к объему яичника в процентном выражении), коррелирующий с определенным значением количества желтых тел на яичнике (таблица 1).
Способ прогнозирования осуществляют у коровы-донора в день проведения планируемого мероприятия по стимуляции полиовуляции, которую проводят, как правило, на 10-й день полового цикла. Выбор 10-го дня полового цикла для цели проведения стимуляции полиовуляции обусловлен тем, что, у телки или коровы, отобранной в качестве донора эмбрионов, в соответствии с общепринятой методикой выявляют признаки половой охоты (естественная охота или вызванная искусственно посредством введения животному гормональных препаратов). День проявления признаков половой охоты (рефлекс неподвижности, течка, набухание вульвы и т.д.), которая длится у самок крупного рогатого скота, в среднем, 12-24 часа (примечание: в данный период времени животное не подлежит осеменению), регистрируют как условно нулевой день полового цикла у донора, с которого начинают отсчет дней этого полового цикла. С 9-го по 12-й день полового цикла (лютеиновая фаза, фаза желтого тела) проводят стимуляцию полиовуляции у доноров. При этом, 10-й день полового цикла является оптимальным днем для начала работ по стимуляции полиовуляции у доноров, так как на 11-й полового цикла при отсутствии оплодотворения начинается процесс лютеолиза (рассасывание желтого тела).
Непосредственно до начала стимуляции полиовуляции (до момента введения препаратов, содержащих гонадотропины) должен быть обеспечен период времени, предшествующий началу стимуляции полиовуляции и достаточный для проведения способа прогнозирования, на реализацию которого необходимо, в среднем, 10-30 минут. В данный промежуток времени у коровы-донора проводят эндоректальное исследование яичника с желтым телом посредством метода ультразвуковой эхографии с использованием УЗИ-сканера (примечание: до начала стимуляции поливуляции желтое тело присутствует только на одном из двух яичников). Затем при помощи графического редактора (программа, позволяющая обрабатывать и редактировать цифровые изображения на компьютере, например, ImageJ, AutoCAD) проводят постпроцессинговую морфометрию полученного ультразвукового изображения, на котором схематично отображают проекции структур желтого тела и яичника и определяют их объемы с помощью функции обвода или эллипса, которая позволяет вычислять объем в одной плоскости сканирования. Затем проводят вычисление отношения объема желтого тела к объему яичника в процентном выражении (расчетный показатель), по показателю которого осуществляют индивидуальную оценку вариабельности яичникового ответа. Для этого расчетный показатель, полученный индивидуально у каждого животного, сопоставляют с значениями в таблице 1 (первый столбец) и подбирают соответствующий ему прогнозируемый диапазон количества желтых тел (второй столбец).
Согласно показателям, отраженным в прогностической таблице (таблица 1), при значении расчетного показателя 30% и менее прогнозируют вариабельность яичникового ответа в диапазоне от 0 до 2 желтых тел, что является прогностической вероятностью отрицательной или низкой ответной реакции яичников, при значении расчетного показателя от 31 до 40% прогнозируют вариабельность яичникового ответа в диапазоне от 3 до 9 желтых тел, что является прогностической вероятностью средней ответной реакции яичников, при значении расчетного показателя от 41 до 50% прогнозируют вариабельность яичникового ответа в диапазоне от 10 до 23 желтых тел, что является прогностической вероятностью высокой ответной реакции яичников, при значении расчетного показателя более 50% прогнозируют вариабельность яичникового ответа 0 желтых тел, что является прогностической вероятностью отрицательной ответной реакции яичников, связанной с наличием овариальной патологии.
Для разработки прогноза ответной реакции яичников коров-доноров эмбрионов на стимуляцию полиовуляции экзогенными гонадотропинами провели исследование, результаты которого отображены в таблице 2. Исследовали 100 коров мясного и молочного направлений продуктивности, которые были отобраны в группу доноров эмбрионов по следующим ветеринарным, зоотехническим и селекционным характеристикам: без признаков нарушения обмена веществ (ожирение, дистрофия и т.д.), наличие данных о происхождении не менее чем по трем рядам предков, крепкая конституция, оценка экстерьера не менее 8 баллов, живая масса не ниже стандарта породы, в возрасте 3-6-ти отелов, легкие отелы и неосложненное течение послеродового периода. Все коровы прошли обследование на инфекционные заболевания (бруцеллез, туберкулез, вирусные респираторные заболевания, лейкоз, трихомоноз, вибриоз, ящур и др.). В рамках данного исследования у каждой из коров-доноров до начала стимуляции полиовуляции (до момента введения гонадотропинов) был проведено на 10-й день полового цикла эндоректальное исследование яичников и желтых тел с использованием метода ультразвуковой эхографии. Использовали УЗИ-сканер Tringa Linear («ESA OTES р.А», Италия) с линейными датчиками (рабочая частота - 7,5 МГц). Фиксировали черно-белые ультразвуковые изображения репродуктивных органов. Провели постпроцессинговую обработку с использованием графического редактора ImageJ (National Institute of Health, США) и морфометрически измерили объем желтого тела и объем яичника. У каждой коровы-донора определили расчетный показатель путем вычисления отношения объема желтого тела к объему яичника в процентном выражении. Для лучшей градации всех остальных результатов проведенного исследования значения расчетного показателя в таблице 2 изложили в диапазонах с шагом в 10% (столбец 1). В рамках этих диапазонов отразили общее количество коров, у которых было получено соответствующее значение их индивидуального расчетного показателя (столбец 2). Кроме того, для этих животных (сгруппированных в рамках указанных диапазонов) приведены результаты ректогенитального обследования методом эхографической визуализации в режиме реального времени и эндоректальной пальпации репродуктивных органов (столбец 3). Далее, непосредственно после окончания проведения метода ультразвуковой эхографии были начаты работы по стимуляции полиовуляции с введением препарата «ФСГ-супер», содержащего ФСГ/ЛГ(1000-1500 ед. ФСГ/1 ед. ЛГ) гормональной активностью 1000 ME в соответствии с инструкцией по применению (Инструкция к препарату «ФСГ-супер», производитель ООО «Агробиомед», г. Боровск, Россия, сайт http://www.vettorg.net/pharmacy/62/81/, 2018 г.). Был применен классический протокол с 8-кратным введением в организм коровы-донора «ФСГ-супер» каждые 12 часов в течение 4-х дней. При этом, на 3-й день от начала введения ФСГ/ЛГ, животным был введен в соответствии с инструкцией по применению препарат простогландинового ряда F2α «Эстрофан» для вызывания (индуцирования) у животных половой охоты (Инструкция к препарату «Эстрофан», производитель АО «Биовета», Чешская Республика, сайт Интернет: http://www.veterinarka.ru/vetmedicaments/estrofan.html, 2018 г.). После введения препарата «Эстрофан» половая охота у всех животных следуемой группы наступила через 48-72 часов, в результате чего синхронно овулировали множество выросших и созревших фолликулов и на их месте образовались желтые тела, которые отчетливо пальпировались ректальным способом. На седьмой день индуцированного полового цикла у животных был проведен подсчет образовавшихся желтых тел ректопальпаторным способом. Количество желтых тел на яичниках в диапазоне из значений отражено в таблице 2 (столбец 4).
На основании данных таблицы 2 была проанализирована корреляционная зависимость значений расчетного показателя (отношение объема желтого тела к объему яичника в процентном выражении) и значений количества желтых тел (число овуляций), подсчитанных после проведения стимуляции полиовуляции. Как видно из таблицы 2, снижение значений расчетного показателя (отношение объема желтого тела к объему яичника в процентном выражении) менее 30% свидетельствует об уменьшении доли желтого тела в яичнике у тех коров-доноров, у которых была отмечена гипофункция яичников и отсутствовал множественный рост фолликулов. Значение расчетного показателя (отношение объема желтого тела к объему яичника в процентном выражении) в диапазоне от 31 до 50% свидетельствует о полноценно протекающем половом цикле и нормальной функциональной работе яичников с множественным ростом и созреванием фолликулов (от 3-х до 23 и более желтых тел на яичниках). Повышение значений расчетного показателя (отношение объема желтого тела к объему яичника в процентном выражении) более 50% свидетельствует об увеличении доли желтого тела в яичнике у тех коров-доноров, у которых были отмечены лютеальные кисты с изменениями структуры яичников и отсутствовал множественный рост фолликулов. Известно, что наличие лютеальных кист способствует развитию патологических процессов не только в яичниках, но и в эндометрии матки животного. У таких животных из-за повышенного уровня прогестерона, выделяемого желтым телом, экзогенный фолликулостимулирующий гормон не может поддерживать рост примордиальных фолликулов, которые впоследствии подвергаются атрезии, что влечет отсутствие множественного роста фолликулов и их полиовуляции.
Таким образом, на основании результатов исследования, отраженных в таблице 2, показано, что доля желтого тела в объеме яичника помогает узнать, насколько эффективно работает репродуктивная система, отвечая на экзогенные гонадотропные препараты. На основании результатов таблицы 2 была составлена вышеприведенная прогностическая таблица (таблица 1), при помощи которой обеспечивается индивидуальная оценка вариабельности яичникового ответа за счет сопоставления вычисленного расчетного показателя (отношение объема желтого тела к объему яичника в процентном выражении) с прогнозируемым диапазоном количества желтых тел (число овуляций).
Согласно показателям, отраженным в прогностической таблице, возможно с большей вероятностью прогнозировать ответную реакцию яичников коров-доноров эмбрионов на стимуляцию полиовуляции экзогенными гонадотропинами, что обосновано следующим. Для сравнения патентуемого способа и способа-прототипа у всех коров, участвующих в вышеприведенном исследовании, помимо морфометрических измерений объема яичника и объема желтого тела и вычисления расчетного показателя (отношение объема желтого тела к объему яичника в процентном выражении), до начала стимуляции полиовуляции были проведены также измерения площади яичника и площади желтого тела и вычислено отношение площади желтого тела к площади яичника в процентном выражении (способ-прототип). Было установлено, что предлагаемый способ повышает точность прогнозирования ответной реакции яичников коровы-донора эмбрионов на стимуляцию полиовуляции экзогенными гонадотропинами на 16,1-27,5% по сравнению с прототипом (таблица 3).
Работоспособность патентуемого способа подтверждается следующими примерами.
Пример 1. Корова №42361, порода черно-пестрая (молочное направление продуктивности), возраст 5 лет, была отобрана в качестве донора эмбрионов по ветеринарным, зоотехническим и селекционным характеристикам. В день планируемого мероприятия по проведению стимуляции полиовуляции (10-й день полового цикла), за 15 минут до начала стимуляции полиовуляции у данного животного провели патентуемый способ, включающий проведение индивидуальной оценки вариабельности яичникового ответа. Для этого у коровы-донора провели эндоректальное исследование яичников и желтых тел с использованием метода ультразвуковой эхографии. Использовали УЗИ-сканер Tringa Linear («ESA OTES р.А», Италия) с линейными датчиками (рабочая частота - 7,5 МГц), фиксировали черно-белые ультразвуковые изображения репродуктивных органов. Провели постпроцессинговую обработку данных изображений с использованием графического редактора ImageJ (National Institute of Health, США), морфометрически измерили объем желтого тела и объем яичника. На основании полученных данных вычислили расчетный показатель (отношение объема желтого тела к объему яичника в процентном выражении), который составил 37,9%. Согласно прогностической таблице (таблица 1), данный показатель соответствовал прогнозируемому диапазону количества желтых тел на яичниках, составляющему 3-9 шт., что является прогностической вероятностью средней ответной реакции яичников. После завершения патентуемого способа провели процедуру стимуляции полиовуляции по классическому протоколу 8-кратного введения препарата «ФСГ-супер» каждые 12 часов в течение 4-х дней (Инструкция к препарату «ФСГ-супер», производитель ООО «Агробиомед», г. Боровск, Россия, сайт Интернет: http://www.vettorg.net/pharmacy/62/81/, 2018 г.). В препарате «ФСГ-супер» соотношение ФСГ к лютеинизирующему гормону (ЛГ) составляло 1000 - 1500 ед. ФСГ/1 ед. ЛГ, гормональная активность -1 ООО ME. На 3-й день от начала введения ФСГ/ЛГ животным для вызывания (индуцирования) половой охоты был введен в соответствии с инструкцией по применению препарат простогландинового ряда F2a «Эстрофан» (Инструкция к препарату «Эстрофан», производитель АО «Биовета», Чешская Республика, сайт Интернет: http://www.veterinarka.ru/vetmedicaments/estrofan.html, 2018 г.). После введения препарата «Эстрофан» половая охота наступила через 48 часов, в результате чего синхронно овулировали множество выросших и созревших фолликулов и на их месте образовались желтые тела, которые отчетливо пальпировались ректальным способом. У животного провели подсчет образовавшихся желтых тел, количество которых у данной коровы составило 7 штук (два на левом яичнике, пять - на правом). Таким образом, количество желтых тел после проведения стимуляции полиовуляции экзогенными гонадотропинами (7 шт. ) соответствовало диапазону количества желтых тел, который был спрогнозирован при помощи проведения патентуемого способа, осуществленного до начала стимуляции полиовуляции.
Пример 2. Корова-донор №36724 казахская белоголовая порода (мясное направление продуктивности), возраст 8 лет, была отобрана в состав коров-доноров эмбрионов по ветеринарным, зоотехническим и селекционным характеристикам. В день планируемого мероприятия по проведению стимуляции полиовуляции (10-й день полового цикла), за 15 минут до начала стимуляции полиовуляции у данного животного провели патентуемый способ, а затем стимуляцию полиовуляции аналогично примеру 1. Расчетный показатель (отношение объема желтого тела к объему яичника в процентном выражении), вычисленный в результате проведения патентуемого способа, составил 42,4%. Согласно прогностической таблице (таблица 1), данный показатель соответствовал прогнозируемому диапазону количества желтых тел на яичниках, составляющему 10-23, что является прогностической вероятностью высокой ответной реакции яичников. После завершения процедуры стимуляции полиовуляции путем ректопальпаторного исследования у животного провели подсчет образовавшихся желтых тел, количество которых у данной коровы их количество составило 19 штук (12 на левом яичнике, 7 - на правом). Таким образом, количество желтых тел после проведения стимуляции полиовуляции экзогенными гонадотропинами (19 шт. ) соответствовало спрогнозированному диапазону количества желтых тел при помощи проведения патентуемого способа, осуществленного до начала стимуляции полиовуляции.
Пример 3. Телка симментальской породы №36724 (мясо-молочное направление продуктивности), возраст 13 месяцев, была отобрана в состав коров-доноров эмбрионов по ветеринарным, зоотехническим и селекционным характеристикам. В день планируемого мероприятия по проведению стимуляции полиовуляции (10-й день полового цикла), за 15 минут до начала стимуляции полиовуляции у данного животного провели патентуемый способ, а затем стимуляцию полиовуляции аналогично примеру 1. Расчетный показатель (отношение объема желтого тела к объему яичника в процентном выражении), вычисленный в результате проведения патентуемого способа, составил 26,4%. Согласно прогностической таблице (таблица 1), данный показатель соответствовал прогнозируемому диапазону количества желтых тел на яичниках, составляющему 0-2 шт, что является прогностической вероятностью отрицательной или низкой ответной реакции яичников. После завершения процедуры стимуляции полиовуляции при ректопальпаторном исследовании было определено, что у данной телки отсутствовал полиовуляторный ответ яичников на введенные гонадотропины (количество желтых тел составило 0 штук), была отмечена гипофункция яичников. Таким образом, значение количества желтых тел, составляющее 0 шт. после проведения стимуляции полиовуляции экзогенными гонадотропинами, находилось в диапазоне количества желтых тел на яичниках, составляющем 0-2 шт., вероятность которого была предсказана при помощи патентуемого способа, осуществленного до начала стимуляции полиовуляции.
Пример 4. Корова-донор №15560 голштинской породы (молочное направление продуктивности), возраст 4 года, была отобрана в состав коров-доноров эмбрионов по ветеринарным, зоотехническим и селекционным характеристикам. В день планируемого мероприятия по проведению стимуляции полиовуляции (10-й день полового цикла), за 15 минут до начала стимуляции полиовуляции у данного животного провели патентуемый способ, а затем стимуляцию полиовуляции аналогично примеру 1.. Расчетный показатель (отношение объема желтого тела к объему яичника в процентном выражении), вычисленный в результате проведения патентуемого способа, составил 55,8%. Согласно прогностической таблице (таблица 1), данный показатель соответствовал прогнозируемому диапазону количества желтых тел на яичниках, составляющему 0 шт., что является прогностической вероятностью отрицательной ответной реакции яичников, связанной с наличием овариальной патологии. После завершения процедуры стимуляции полиовуляции при ректопальпаторном исследовании была диагностирована лютеальная киста, что подтвердило адекватность результата, спрогнозированного при помощи патентуемого способа, осуществленного до начала стимуляции полиовуляции.
Предлагаемый способ позволяет повысить на 16,1-27,5% точность способа прогнозирования ответной реакции яичников коров-доноров эмбрионов на стимуляцию полиовуляции экзогенными гонадотропинами. Способ достаточно прост и доступен для производственной практики животноводческих хозяйств. Он дает возможность своевременно скорректировать тактику ведения процесса технологии трансплантации как до начала начала протокола овариальной стимуляции экзогенными гонадотропинами, так и на этапе формирования группы коров-доноров эмбрионов.