Влияние сульфатированныгх полисахаридов из бурой водоросли Fucus evanescens и продукта их ферментативной трансформации на функциональную активность клеток врожденного иммунитета

Влияние сульфатированных полисахаридов из бурой водоросли Fucus evanescens и продукта их ферментативной трансформации на функциональную активность клеток врожденного иммунитета

Т. А. КУЗНЕЦОВА', Т. П. СМОЛИНА', Н. Н. БЕСЕДНОВА', А. С. СИЛЬЧЕНКО2, Т. И. ИМБС2, С. П. ЕРМАКОВА2

1 НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г. П. Сомова, Владивосток

2 Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г. Б. Елякова ДВО РАН, Владивосток

Effect of Sulfated Polysaccharides from Brown Alga Fucus evanescens and Their Enzymatic Transformation Product on Functional Activity of Innate Immunity Cells

T. A. KUZNETSOVA1, T. P. SMOLINA1, N. N. BESEDNOVA1, A. S. SILCHENKO2, T. I. IMBS2, S. P. ERMAKOVA2

1 G.P. Somov Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Vladivostok

2 G.B. Elyakov Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, Vladivostok

Проведено сравнительное изучение влияния сульфатированных полисахаридов (ПС) из бурой водоросли Fucus evanescens и низкомолекулярного продукта ферментативной трансформации на функциональную активность клеток врождённого иммунитета — полиморфноядерных лейкоцитов периферической крови человека (NF). В результате контакта NF in vitro с образцами ПС зарегистрированы значимые изменения функционального состояния клеток. Это выражалось в усилении плотности молекул CD69, CD14, CD11b на клеточных мембранах с одновременным снижением CD62L и в увеличении показателей фагоцитарной и бактерицидной активности NF. Низкомолекулярный образец, полученный из фукоидана с применением фукоиданаз, оказывает более выраженный эффект на уровень экспрессии молекул CD14, CD11b и CD62L по сравнению с высокомолекулярным.

Ключевые слова: сульфатированные полисахариды, фукоиданы, врождённый иммунитет, нейтрофилы, молекулы адгезии, фагоцитарная и бактерицидная активность.

The effect of sulfated polysaccharides (PS) from brown alga Fucus evanescens and their enzymatic transformation and low molecular weight product on the functional activity of the innate immunity cells, i.e. polymorphonuclear leukocytes of human peripheral blood (NF) was comparatively studied. The in vitro NF contact with PS resulted in significant changes in the functional activity of NF, evident from higher density of molecules CD69, CD14, CD11b on the cell membranes with simultaneous lowering of that of CD62L and increased phagocytic and bactericidal activity of NF. The low molecular weight product resulting from fucoidan transformation with fucoidanases showed a higher effect on the level of the molecules CD14, CD11b and CD62L expression vs. the high molecular weight PS.

Key words: sulfated polysaccharides, fucoidans, innate immunity, neutrophils, adhesion molecules, phagocytic and bactericidal activity.

Введение

Сульфатированные полисахариды (фукоиданы) из бурых водорослей — не токсичные, безопасные и биосовместимые вещества, проявляющие широкий спектр биологической активности, в связи с чем являются перспективным объектом для биомедицинского и фармацевтического применения [1—4]. В частности, активно проводятся исследования по оценке влияния фукоиданов на систему врождённого и адаптивного иммунитета и их адъювантной активности для усиления про© Коллектив авторов, 2016

Адрес для корреспонденции: 690087, Владивосток, ул. Сельская, д. 1. НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г. П. Сомова, Владивосток

тивоинфекционного и противоопухолевого иммунного ответа [5—7].

Структура и содержание фукоиданов существенно различается у разных видов водорослей и даже в пределах одного вида в зависимости от климатических условий, местообитания, стадии развития водоросли и способа экстракции [8—10], в то время, как использование сульфа-тированных полисахаридов (фукоиданов) в качестве лекарственных препаратов, адъювантов и др. ограничено и связано с решением вопросов получения структурно охарактеризованных и однородных образцов с низкой молекулярной массой или их олигомерных фракций.

Целью работы явилось изучение влияния сульфатированных полисахаридов из бурой водо-

Таблица 1. Характеристики полисахаридов (ПС) из бурой водоросли Fucus evanescens

Полисахарид SO3Na*, (%) Нейтральные сахара, мольные %

Fuc Gal Xyl Man Glc

Образец 1 27,0 94,1 3,8 2,1 0 0

Образец 2 28,1 94,4 3,5 2,1 0 0

Образец 3 29,7 97,8 2,2 0 0 0

Примечание. * — % от массы.

росли Fucus evanescens и продукта их ферментативной трансформации на функциональную активность нейтрофильных лейкоцитов периферической крови человека (NF).

Материал и методы

Исследовано три образца полисахаридов (ПС), выделенных из бурой водоросли Fucus evanescens. Образец 1 — фукои-дан в комплексе с полифенолами [11]; образец 2 — фукоидан, освобождённый от полифенолов [12]; образец 3 — продукт ферментативного гидролиза фукоидана [13] (табл. 1). Молекулярная масса образца 1 находится в интервале 130—430 кДа, для образца 2 — в интервале 130—400 кДа, для образца 3 — около 9 кДа.

Влияние образцов ПС in vitro на экспрессию поверхностных маркеров NF осуществляли с использованием лейкоцитов периферической крови здоровых доноров. Кровь разводили 1:2 полной питательной средой RPMI-1640, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 0,01 М HEPES, 200 мМ L-глутамина, 100 мг/мл гентамицина, и вносили в стерильные пластиковые 24-луночные планшеты («CellStar»). Образцы ПС вносили в лунки в конечной концентрации 100 мкг/мл и инкубировали при 37°С в течение 24 ч с 5% СО2, затем кровь ресуспендировали, переносили по 100 мкл в цитометрические пробирки и добавляли по 10 мкл моноклональных антител к поверхностным антигенам лейкоцитов периферической крови CD69-PE, CD14-FITC, CD11b-PE, CD62L-FITC, а также соответствующих изотипических контролей («Beckman Coulter»). Лизис эритроцитов производили с помощью раствора (BD FACS™ Lysing Solution). Клетки анализировали на проточном цитофлуориметре «FACS Calibur» (Becton Dickinson, США). Гейтирование субпопуляций гранулоцитов (основную часть которых составляют NF), осуществляли по прямому (FSC) и боковому (SSC) светорассеянию. В качестве контроля использовали кровь в полной питательной среде, инкубируемую без образцов ПС. В каждой пробе анализировали не менее 104 клеток. Результаты, отражающие плотность молекул на поверхности клеток, представлены в виде условных единиц средней интенсивности флуоресценции (MFI mean fluorescence intensity).

Влияние образцов ПС на фагоцитарную и бактерицидную активность исследовали по ранее описанной методике [14], с этой целью из крови здоровых доноров выделяли лейкоциты путём седиментации эритроцитов и доводили до конечной концентрации 2х106/мл, клетки инкубировали с образцами ПС в конечной концентрации 10 и 100 мкг/мл при 37°С в течение 1 ч. Объектом фагоцитоза служил латекс 1,5 мкм (10% полистерольная суспензия, ДИА-М, Россия) в разведении 1:80. Учёт результатов осуществляли микроскопически путём подсчёта фагоцитоза в 100 клетках. Полученные результаты оценивали по фагоцитарному показателю (ФП%) — процент клеток, участвующих в фагоцитозе и фагоцитарному числу (ФЧ) — среднее число латексных частиц, поглощённых одним фагоцитом. Бактерицидную активность NF (продукцию активных форм кислорода) исследо-

вали в тесте восстановления нитросинего тетразолия (НСТ) путём измерения оптической плотности (0Dx10-3) на спектрофотометре «Multiscan RC «Labsystems» при длине волны 492 нм (референсная волна 620 нм). В качестве контроля использовали лейкоциты, инкубируемые в физиологическом растворе без образцов ПС.

Статистическую обработку цифровых данных проводили непараметрическим методом для связанных групп с помощью пакета программы «Statistica-7». Критическое значение уровня значимости принималось равным 5% (р<0,05).

Результаты и обсуждение

При инкубировании исследуемых образов ПС с цельной кровью наблюдались выраженные изменения функционального состояния NF, регистрируемые по экспрессии поверхностных антигенов (табл. 2). Так, при контакте в течение 24 ч с образцами 1, 2 и 3 в концентрации 100 мкг/мл выявлено статистически значимое увеличение, по сравнению с контролем (р<0,01), плотности маркеров CD69 и CD14 на мембране NF.

CD69 — самый ранний маркер активации, который уже через 30 мин после начала стимуляции траслоцируется из цитоплазмы на клеточную мембрану. Основные функции этого маркера на нейт-рофилах сводятся к запуску сигнала трансдукции для продукции провоспалительных цитокинов и оксида азота, стимуляции выхода Са2+ через мембрану, регулированию экзоцитоза гранул нейтрофи-лов. Рецептор CD14 так же, как и CD69, в основном находится внутри нейтрофилов. При активации клеток CD14 может быстро транслоци-роваться на клеточную мембрану и в дальнейшем синтезироваться de novo. Его роль в активации ней-трофилов заключается в индукции сигнала, приводящего к продукции TNF-a.

Все образцы в исследуемой концентрации также вызывали статистически значимое увеличение, по сравнению с контролем (р<0,01), плотности молекул CD 11b, которые относятся к семейству в2-интегринов, участвующих в адгезии лейкоцитов к внеклеточному матриксу и к эндотелию, но преимущественно вовлечённых во взаимодействие лейкоцитов между собой. Активация NF сопровождалась снижением плотности молекул L-селек-тинов (CD62L), что может являться отражением процесса шеддинга (слущивания с мембраны) и свидетельствовать о готовности NF к миграции. Снижение уровня этих молекул также может быть

Таблица 2. Экспрессия мембранных молекул нейтрофилами цельной крови под влиянием ПС in vitro

№ образца (концентрация _Антигены (маркеры) клеточной мембраны (MFI)_

100 мкг/мл) CD69 CD14 CD11b CD62L SSC

1 86**

2 91**

3 90**

4

Примечание. Показатели Ме (медиана) и тт-тах; п=6; справа * - значимость различий по отношению к контрольным показателям (* - р<0,05; ** - р<0,01); слева * - значимость различий 1 и 2 образца по отношению к 3 образцу (* - р<0,05).

Таблица 3. Показатели фагоцитарной и бактерицидной активности нейтрофильных лейкоцитов под влиянием ПС in vitro

№ образца ФП

(концентрация 10 100 10 100 10 100

10 и 100 мкг/мл)

1 78,0+5,1* 81,2+5,4* 2,84+0,65* 3,07+0,6* 1642+198** *1936+109*

2 72,4+4,9 76,6+1,95* 2,66+0,63 2,9+0,29* 1155+126* 1543+363*

3 72,8+7,01 81,0+4,4* 2,62+0,55 2,82+0,38* 1460+180** 1637+172**

4 (контроль) 66,4+3,85 2,14+0,22 775,4+159

Примечание. Показатели М±ап=5; справа * - значимость различий по отношению к контрольным показателям (* - р<0,05; ** - р<0,01); слева * - значимость различий 1 и 2 образца по отношению к 3 образцу (* - р<0,05).

обусловлено связываем молекул СБ62Ь с исследуемыми веществами, поскольку известно, что фуко-иданы являются лигандами Ь-селектинов. Кроме того, отмечено увеличение под влиянием всех образцов интенсивности флуоресценции по 88С (показатель бокового светорассеивания) (р<0,05), что может свидетельствовать об усилении гранулярности популяции КБ.

Сравнительная оценка активности трёх образцов ПС показала, что уровень экспрессии мембранных молекул СБ69 и показателя 88С под их влиянием сопоставим (различия показателей между собой статистически незначимы). При сравнении активности образцов 1 и 2 установлено, что образец 2 эффективнее повышал уровень молекул СБ14 и снижал уровень СБ62Ь (р<0,05). Показатели плотности молекул СБ14 и СБ11Ъ при инкубировании КБ с образцом 1 были выше (р<0,05), а молекул СБ62Ь — ниже (р<0,05) по сравнению с образцом 3 (табл. 2).

Основными процессами, осуществляемыми КБ при фагоцитозе, являются миграция, поглощение объектов фагоцитоза, дегрануляция, внутриклеточный киллинг, образование активных форм кислорода и продукция цитокинов и хемокинов.

При анализе показателей фагоцитарной активности КБ, инкубированных с образцом 1 в концентрации 10 и 100 мкг/мл, выявлено статистически значимое увеличение ФП и ФЧ (р<0,05). Образцы 2 и 3 оказывали стимулирующее влияние на показатели фагоцитоза только в концентрации 100 мкг/мл (р<0,05). Значимых различий в зависимости от вносимой концентрации ПС (10 или 100 мкг/мл) пока-

зателей фагоцитарной активности NF не зарегистрировано (табл. 3).

В отношении показателей бактерицидной активности, регистрируемых в НСТ-тесте, выявлено, что под влиянием всех трёх образцов, инкубированных с лейкоцитами как в концентрации 10 мкг/мл, так и 100 мкг/мл, наблюдалось их статистически значимое увеличение по сравнению с контролем (р<0,05), свидетельствующее об усилении продукции активных форм кислорода. Образец 1 продемонстрировал дозозависимость различий показателей НСТ-теста (р<0,05).

Сравнительная оценка функциональной активности NF под влиянием исследуемых образцов ПС свидетельствует об отсутствии статистически значимых различий показателей между собой за исключением показателя НСТ-теста под влиянием образца 1 в концентрации 100 мкг/мл, которые были значимо выше по сравнению с таковыми под влиянием образца 3 в той же концентрации (p<0,05) (табл. 3).

Работы по изучению биологической (в т. ч. им-муноадьювантной) активности фукоиданов с различными структурными характеристиками и молекулярными массами разноречивы, а касающиеся активности олигосахаридов фукоидана к тому же и немногочисленны. Например, в работе J. Y. Jang et al. [15], 2014 обьектами исследования были высокомолекулярный фукоидан (средняя молекулярная масса 130 кДа) и низкомолекулярный фукоидан (30 кДа), выделенные из Undaria pinnatifida. Авторами показано, что 1-й повышал выживаемость спленоцитов мышей и продукцию ими IFN-y и оксида азота, в то время как 2-ой обладал низкой

иммуномодулирующей активностью и относительно высокой токсичностью по отношению к спле-ноцитам. В отношении низкомолекулярных фуко-иданов, полученных из нативного полисахарида Sargassumfulvellum, выявлено предотвращение связывания Р-селектина с антигеном Sialyl Lewis X пропорционально снижению молекулярной массы [16]. Показана дозозависимость эффектов низкомолекулярного фукоидана (4 кДа) по ингибирова-нию выживаемости и индукции апоптоза фиброб-ластоподобных синовиоцитов ревматоидного артрита, стимулированных IL-1/3, снижению экспрессии и секреции металлопротеиназ-1, -3 и -9 и подавлению ДНК-связывающей активности ядерного фактора NF-kB [17].

В работах, посвящённых оценке функциональной активности фагоцитов, было показано усиление под влиянием фукоиданов экспрессии мембранных рецепторов (маркеров адгезии и продукции цитокинов), а также поглотительной и микробицидной активности [18, 19, 20], однако, вопросы структурно-функциональных взаимосвязей в них не освещались.

Выявленная нами активация NF в результате контакта с ПС и продуктом их ферментативной трансформации регистрировалась как по экспрессии поверхностных антигенов, так и при оценке эффекторных функций (фагоцитарной и бактерицидной активности).

Сравнительная оценка исследуемых образцов показала большую активность образца 3 по сравнению с образцом 1 по экспрессии на мембране NF сигнальных молекул CD14 и молекул адгезии

ЛИТЕРАТУРА

1. Fitton J.H., Stringer D.N., Karpiniec S.S. Therapies from fucoidan: an update. Mar Drugs 2015; 13: 9: 5920—5946.

2. Jiao G, Yu G, Zhang J., Ewart H.S. Chemical structures and bioactivi-ties of sulfated polysaccharides from marine algae. Mar Drugs 2011; 9: 2: 196—223.

3. Pomin V.H. Marine non-glycosaminoglycan sulfated glycans as potential pharmaceuticals. Pharmaceuticals 2015; 8: 4: 848—864.

4. Raposo M.F.J, Morais A.M.B.M., Morais R.M.S.C. Marine polysaccharides from algae with potential biomedical applications. Marine Drugs 2015; 13: 5: 2967—3028.

5. Jin J.O., Zhang W, Du J.Y. et al. Fucoidan can function as an adjuvant in vivo to enhance dendritic cell maturation and function and promote antigen-specific T cell immune responses. PLoS One 2014; 9 (6).

6. Kim S.Y., Joo H.G. Evaluation of adjuvant effects of fucoidan for improving vaccine efficacy. J Vet Sci 2015; 16: 2: 145—150.

7. Lin C.C., Pan I.H., Li Y.R. et al. The adjuvant effects of high-molecule-weight polysaccharides purified from Antrodia cinnamomea on dendritic cell function and DNA vaccines. PLoS One 2015; 10 (2).

8. Cumashi A., Ushakova N.A., Preobrazhenskaya M.E. et al. A comparative study of antiinflammatory, anticoagulant, antiangiogenic, and antiadhe-sive activities of nine different fucoidans from brown seaweeds. Glycobiology 2007; 31: 2: 541—552.

9. Zvyagintseva T.N., Shevchenko N.M., Chizhov A.O. et al. Water-soluble polysaccharides of some far-eastern brown seaweeds. Distribution, structure, and their dependence on the developmental conditions. J Exp Marine Biol Ecol 2003; 294: (1): 1—13.

10. SkriptsovaA.V., ShevchenkoN.M., Imbs T.I., Zvyagintseva T.N. Monthly changes in the content and monosaccharide composition of fucoidan from Undariapinnatifida. J Appl Phyc 2010; 22: 1: 79-86.

11. Anastyuk S.D., Shevchenko N.M., Dmitrenok P.S., Zvyagintseva T.N. Structural simi-larities of fucoidans from brown algae Silvetia babingtonii

CD11b и CD62L, в то же время уровень экспрессии молекул CD69 и показателя SSC статистически не различались. Также не выявлено значимых различий показателей фагоцитоза и бактерицидности NF под влиянием исследуемых ПС.

Это заключение представляет большой практический интерес, поскольку низкомолекулярный продукт, полученный из фукоидана с применением фукоиданаз (образец 3), имеет стабильную структуру, что позволяет рассматривать возможность его использования в качестве фармацевтической субстанции или адьюванта в составе вакцинных препаратов.

Выводы

1. Влияние образцов сульфатированных ПС и продукта их ферментативной трансформации на рецепторы клеток врождённого иммунитета (NF) приводит к изменению уровня их экспрессии: увеличению плотности маркеров CD69 и CD14 и молекул адгезии CD11b, снижению плотности молекул L-селектина CD62L.

2. Исследуемые образцы ПС оказывают стимулирующее влияние на показатели фагоцитарной (ФП и ФЧ) и бактерицидной активности (в НСТ-тесте).

3. При сравнительной оценке активности исследуемых образцов ПС установлено, что низкомолекулярный образец, полученный из фукои-дана с применением фукоиданаз, оказывает более выраженный эффект на уровень экспрессии молекул CD14, CD11b и CD62L по сравнению с высокомолекулярным.

and Fucus evanescens, determined by tandem MALDI-TOF mass spectrometry. Carbohydrate Research 2012; 358: 78—81.

12. Imbs T.I., Skriptsova AV., Zvyagintseva T.N.Antioxidant activity offucoise-containing sulfated polysaccharides obtained from Fucus evanescens by different extraction methods. J App Phycol 2015; 27: 1: 545—553.

13. Силъченко A.C. Фукоиданазы и альгинат-лиазы морской бактерии Formosa algae KMM 3553T и морского моллюска Lambis sp.: авто-реф. дис. канд. хим. наук: Владивосток. 2014; 24. / Sil'chenko A.S. Fukoidanazy i al'ginat-liazy morskoj bakterii Formosa algae KMM 3553T i morskogo molljuska Lambis sp.: avtoref. dis. kand. him. nauk: Vladivostok. 2014; 24. [in Russian]

14. Хаитов P.M., Пинегин Б.В., Истамов ^.^Экологическая иммунология. М.: ВНИРО. 1995; 219. / Haitov R..M, Pinegin B.V., Istamov H.I. Jekologicheskaja immunologija. M.: VNIRO. 1995; 219. [in Russian]

15. Jang J.Y., Moon S.Y., Joo H.G. Differential effects of fucoidans with low and high molecular weight on the viability and function of spleen cells. Food Chem Toxicol 2014; 68: 234—238.

16. Jo B.W., Choi S.K.Degradation of fucoidans from Sargassumfulvellum and their biological activities. Carbohydr Polym 2014; 111: 822—829.

17. Shu Z, Shi X., Nie D, Guan B. Low-molecular-weight fucoidan inhibits the viability and invasiveness and triggers apoptosis in IL-1/?-treated human rheumatoid arthritis fibroblast synoviocytes. Inflammation 2015; 38: 5: 1777—1786.

18. Teruya T, Takeda S, Tamaki Y, Tako M. Fucoidan isolated from Laminaria angustata var. longissima induced macrophage activation. Biosci Biotechnol Biochem 2010; 74: 9: 1960—1962.

19. Jiang Z, Okimura T, Yamaguchi K, Oda T. The potent activity of sul-fated polysaccharide, ascophyllan, isolated from Ascophyllum nodosum to induce nitric oxide and cytokine production from mouse macrophage RAW264.7 cells: comparison between ascophyllan and fucoidan. Nitric Oxide 2011; 25: 4: 407—415.

20. Jin J.O., Yu Q. Fucoidan delays apoptosis and induces pro-inflammatory cytokine production in human neutrophils. Int J Biol Macromol 2015; 73: 65—71.

СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ:

Кузнецова Татьяна Алексеевна — д.м.н., зав. лаб. иммунологии НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г. П. Сомова; Владивосток

Смолина Татьяна Павловна — к.б.н, ведущий научный сотрудник. лаборатории иммунологии НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г. П. Сомова, Владивосток Беседнова Наталия Николаевна — академик РАН, д.м.н., профессор, главный научный сотрудник лаборатории иммунологии НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г. П. Сомова, Владивосток

Сильченко Артем Сергеевич — к.х.н., научный сотрудник лаборатории химии ферментов Тихоокеанского института биоорганической химии им. Г. Б. Елякова ДВО РАН, Владивосток

Имбс Татьяна Игоревна — к.х.н., старший научный сотрудник лаборатории химии ферментов Тихоокеанского института биоорганической химии им. Г. Б. Елякова ДВО РАН, Владивосток

Ермакова Светлана Павловна — д.м.н., зав. лабораторией химии ферментов Тихоокеанского института биоорганической химии им. Г. Б. Елякова ДВО РАН, Владивосток