Оптимизация хроматографических методов анализа лекарственных препаратов из группы органических нитратов

ЭКСПЕРТИЗА ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

ОПТИМИЗАЦИЯ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИХ МЕТОДОВ АНАЛИЗА ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ ИЗ ГРУППЫ ОРГАНИЧЕСКИХ НИТРАТОВ

А.С. Осипов, Е.Б. Нечаева

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздравсоцразвития России, Москва

Резюме: Обобщены результаты опубликованых авторами в 2006—2010 гг. печатных работ. Было установлено, что для анализа лекарственных препаратов из группы органических нитратов можно применять колонки с нитрильными и фениль-ными сорбентами. Разработаны методики анализа неорганических примесей в препаратах органических нитратов методом ион-парной хроматографии. Показано, что нитроэтан наиболее подходит для цели проверки пригодности хроматографической системы при анализе препаратов, содержащих изосорбида мононитрат и изосорбида динитрат.

Ключевые слова: ВЭЖХ, изосорбида мононитрат, изосорбида динитрат, нитроглицерин.

OPTIMIZATION OF CHROMATOGRAPHIC METHODS FOR THE ANALYSIS OF ORGANIC NITRATE DRUGS

A.S. Osipov, E.B. Nechaeva

Abstract: The results of articles published in 2006—2010 have been summarized. It has been determined, that columns with nitrile and phenyl sorbents can be used for the analysis of organic nitrate drugs. Methods for analysis of inorganic impurities in organic nitrate drugs by ion-pair chromatography have been developed. It has been demonstrated that nitroethane is the most suitable for chromatographic system suitability test when performing the assay of drugs, containing isosorbide mononitrate and isosorbide dinitrate.

Key words: HPLC, isosorbide mononitrate, isosorbide dinitrate, nitroglycerine.

Лекарственные средства, содержащие органические нитраты, применяют в медицинской практике для лечения ишемической болезни сердца, сердечной недостаточности и некоторых других патологических состояний. В настоящее время применяют препараты, содержащие следующие действующие вещества: тринитрат глицерина (нитроглицерин), изосорбида динитрат (ИСДН), изосорбида 5-мононитрат (ИСМН) и пентаэритрита тетранитрат (ПЭТН).

В зарубежных фармакопеях для анализа препаратов данной группы применяются колонки, содержащие сорбент октадецилсилил силикагель (фаза С18). Только для анализа субстанций ИСДН и ИСМН в соответствующих статьях Британской фармакопеи предложено использовать колонку ЫсЬгобогЪ NN2 250 х 4,6 мм, 10 мкм в условиях нормально-фазовой хроматографии.

В настоящей статье обобщены печатные работы авторов, посвященные некоторым модификациям методов анализа органических нитратов.

ВОЗМОЖНОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИХ КОЛОНОК ОТЕЧЕСТВЕННОГО ПРОИЗВОДСТВА

Контроль качества лекарственных препаратов (ЛП), содержащих органические нитраты, по показателям «однородность дозирования», «растворение», а также исследование кинетики высвобождения действующих веществ из пролонгированных лекарственных форм методом высокоэффективной

жидкостной хроматографии связаны с большим объемом аналитической работы. В этих условиях снижение себестоимости исследований имеет немаловажное значение.

Одной из целей данного исследования была проверка возможности применения хроматографических колонок отечественного производства, имеющих значительно меньшую стоимость, чем их импортные аналоги (в 2—2,5 раза), для анализа ЛП из группы органических нитратов [1,2]. На рис. 1 приведена хро-

Min

Рис. 1. Хроматограмма лекарственного препарата Карниланд. Условия анализа: колонка (250 х 4мм), заполненная сорбентом Диасфер 110 С16 (5 мкм); подвижная фаза — смесь ацетонитрила с водой (1:1); скорость потока 0,8мл/мин; детектирование при 210 нм. 1 — нитроглицерин

матограмма ЛП Карниланд (капли для приема внутрь производства ФГУП «Межбольничная аптека» МЦ УДП РФ), полученная на колонке с сорбентом Диасфер 110 С16. Несмотря на то что концентрация нитроглицерина в препарате составляет всего 0,04%, он достаточно четко детектируется на фоне компонентов настоек валерианы и ландыша.

Хроматографирование ИСДН было изучено более детально. Параметры пиков ИСДН, полученные на отечественных колонках, были близки к параметрам пиков, полученных на колонках известных зарубежных изготовителей при использовании аналогичных по составу подвижных фаз.

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИХ КОЛОНОК С РАЗЛИЧНЫМИ ТИПАМИ СОРБЕНТОВ

В зарубежных фармакопеях для анализа препаратов данной группы применяются колонки, содержащие сорбент С18. Для контроля разнообразных взрывчатых веществ в объектах окружающей среды наряду с колонками С18 могут применяться колонки с нитрильными группами. Нами проведена оценка возможности применения колонок с иными типами сорбентов для анализа ЛП из группы органических нитратов [3]. На рис. 2 приведена хроматограмма разделения модельной смеси стандартных образцов органических нитратов на колонке с фенильным сорбентом Бупе^1 РОЬАК-ЯР. Порядок элюирования компонентов анализируемой смеси осуществляется в соответствии с числом нитрогрупп в молекуле соединения. Разделение компонентов смеси на колонках с сорбентами типа С18 и нитрильными сорбентами имело аналогичный порядок элюирования (табл. 1).

Из всех протестированных хроматографических колонок наилучшее разделение органических нитратов было достигнуто на колонке Бупе^1 РОЬАЯ-ЯР (см. рис. 2). Анализ значений К’, приведенных

mAU

Min

Рис. 2. Анализ лекарственных препаратов из группы органических нитратов. Условия хроматографии: колонка 4 мкм 8упвщ1 РОЬЛВ^-ЯР 250 х 4,6 мм, 4 мкм; скорость потока 1 мл/мин; подвижная фаза — ацетонитрил-25 мМ фосфат (рН 6,5) 1:1; детектирование при 210 нм. 1 — изосорбида мононитрат, 2 — изосорби-да динитрат, 3 — нитроглицерин

в табл. 1, показывает, что хроматографирование органических нитратов можно проводить на колонках существенно меньшей длины. Параметры разделения смеси органических нитратов на колонках с размерами 50 х 4 мм представлены в табл. 2. Даже при сокращении длины колонки в 3—5 раз анализируемые соединения уверенно разделяются.

Несомненный практический интерес представляет анализ препаратов на минимально коротких колонках (см. табл. 2). Для этих целей была использована одна из самых коротких серийно изготовляемых колонок — предколонка Берагоп С18, 10 мкм, (8 х 4 мм). Подобный подход (рис. 3) может быть вполне приемлемым для повседневных, рутинных анализов по исследованию кинетики высвобождения ИСДН и нитроглицерина из лекарственных форм пролонгированного действия.

Таблица 1

КОЭФФИЦИЕНТЫ ЕМКОСТИ (К’), ПОЛУЧЕННЫЕ ПРИ АНАЛИЗЕ ОРГАНИЧЕСКИХ НИТРАТОВ НА КОЛОНКАХ РАЗЛИЧНЫХ ТИПОВ

Условия анализа: колонка, скорость потока, подвижная фаза К’ ИСМН К’ ИСДН К’нитроглицерина

Диасфер-110-С18 150 х 4,6 мм, 5 мкм, 1 мл/мин, ацетонитрил-25 мМ K2HPO4 (рН 6,5) 1:1 0,84 4,7 7,02

Диасфер-ПО-OOCN 250 х 4,0 мм, 5 мкм, 0,8 мл/мин, ацетонитрил-25 мМ KjHPO^j (рН 6,5) 1:1 1,05 4,52 6,86

Диасфер-110-нитрил 250 х 4,0 мм, 5 мкм, 0,8 мл/мин, ацетонитрил-25мМ K2HPO4 (рН 6,5) 1:1 1,16 2,81 3,75

Диасфер-110-фенил 250 х 4,0 мм, 5 мкм, 0,8 мл/мин, ацетонитрил-25мМ KjHPO4 (рН 6,5) 1:1 1,3 4,44 5,94

Synergi POLAR-RP 250 х 4,6 мм, 4 мкм, 1 мл/мин, ацетонитрил-25мМ KjHPO4 (рН 6,5) 1:1 1,16 5,96 7,11

ЭКСПЕРТИЗА ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

ЭКСПЕРТИЗА ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

Таблица 2

КОЭФФИЦИЕНТЫ ЕМКОСТИ (К’), ПОЛУЧЕННЫЕ ПРИ АНАЛИЗЕ ОРГАНИЧЕСКИХ НИТРАТОВ НА КОРОТКИХ КОЛОНКАХ

Условия анализа: колонка, скорость потока, подвижная фаза К’ ИСМН К’ ИСДН К’нитроглицерина

Диасфер-110-С10СЫ (50 х 4 мм) 5 мкм; 1 мл/мин; ацетонитрил—вода (35:65) 1,12 9,24 19,40

Диасфер-110-С18 (50 х 4 мм), 7 мкм; 1 мл/мин; ацетонитрил—вода (35:65) 0,90 11,44 24,45

Берагоп С18 (8 х 4 мм), 10 мкм; 1 мл/мин; ацетонитрил—вода (20:80) 1,64 22,46 56,26

Берагоп С18 (8 х 4 мм), 10 мкм; 1 мл/мин; ацетонитрил—вода (30:70) 1,03 10,42 23,12

Мт

Мт

Рис. 3. Разделение органических нитратов на предколонке (8 х 4мм), заполненной сорбентом 8ерагоп С18, 10 мкм; а — подвижная фаза — ацетонитрил—вода (20:80); б — подвижная фаза — ацетонитрил—вода (30:70); скорость потока 1 мл/мин; детектирование при 210нм. 1 — изосорбида мононитрат, 2 — изосорбида динитрат, 3 — нитроглицерин

Мт

Рис. 4. Хроматограмма разделения смеси неорганических ионов: 1 — нитрит, 2 — бромид, 3 — нитрат. Условия хроматографии: колонка Диасфер-110-С18 250 х 4,6 мм, 5мкм; скорость потока 1 мл/мин; подвижная фаза — ацетонитрил—3мМ тетрабутиламмоний 10мМ КНр04 в воде (рН 6,5) 2:98; детектирование при 210 нм.

ПРИМЕНЕНИЕ ИОН-ПАРНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ ДЛЯ АНАЛИЗА НЕОРГАНИЧЕСКИХ ПРИМЕСЕЙ

В нормативных документах на большинстве зарегистрированных в Российской Федерации ЛП ИСМН и ИСДН контролируется содержание неорганических нитратов. При этом используется методика ТСХ, описанная в Европейской и Британской фармакопеях. Методика обладает сравнительно невысокой чувствительностью и, кроме того, не позволяет полностью разделять нитрат- и нитрит-ионы. Необходимо отметить, что данные ионы обладают значительным поглощением в области 200—210 нм, и собственно сама возможность детектирования органических нитратов обусловлена присутствием в молекулах этих соединений нитрогрупп.

Следует отметить, что наиболее рационально было бы использовать одно хроматографическое разделение для анализа примесей органической и неорганической природы в ЛП этой группы.

Для этих целей может быть использована ион-парная хроматография на обращенно-фазовых колонках [4, 5]. Нами было проведено исследование возможности применения те-траалкиламинов в подвижных фазах для анализа препаратов органических нитратов. На рис. 4 представлена хроматограмма разделения модельной смеси, содержащей нитрат-, нитрит-и бромид-ионы.

Следует отметить, что ИСДН, являясь уже гидрофобным соединением, не десорбируется с колонки при содержании ацетонитрила в подвижной фазе менее 13—15%. Для хроматографирования ИСДН и

нитроглицерина необходимо использование тетра-алкиламинов с более объемными заместителями. Применение в составе подвижных фаз цетилтри-метиламмония гидрогенсульфата (ЦТА) и тетра-гексиламмония гидрогенсульфата (ТГА) позволяет увеличить концентрацию ацетонитрила до тех значений, при которых становится возможен анализ нитроглицерина и ИСДН на примеси органической природы (рис. 5).

ПРИМЕНЕНИЯ НИТРОМЕТАНА И ЕГО ГОМОЛОГОВ ДЛЯ АНАЛИЗА НИТРОЭФИРОВ ИЗОСОРБИДА

Оценивали возможности применения нитроалканов для оценки пригодности хроматографической системы при анализе препаратов, содержащих ИСМН и ИСДН. Действующим веществом ИСМН является 5-изомер. Содержание примеси 2-изомера ИСМН, а также ИСДН контролируется в субстанции и ЛП ИСМН. При определении примесей в ЛП необходимой частью исследования является подтверждение способности используемой в анализе колонки разделять пики ближайшей примеси и действующего вещества. Следует отметить, что 2-изомер ИСМН малодоступен и является взрывчатым веществом.

В отличие от него нитроалканы не взрывоопасны при обычных условиях и без существенных ограничений поставляются многими фирмами-изготовителями. Таким образом, исследование было направлено на поиск условий применения нитро-алканов, при которых их хроматографические характеристики были бы максимально близки характеристикам 2- и 5-изомеров ИСМН с целью замены 2-изомера ИСМН при проведении анализа ЛП данной группы [6, 7, 8].

Проведено исследование по разделению модельных смесей, содержащих 2-нитроэтанол, нитрометан, нитроэтан и 1-нитропропан. Более полное разделение изомеров ИСМН было достигнуто с использованием в качестве подвижных фаз смесей метанол—вода как в изократиче-ском, так и в градиентных условиях для всех типов колонок. Наилучшее разделение изомеров (рис. 6) было

получено на колонках Диасфер-110-С18 и Диасфер-110-С10СК. В ходе исследования была выявлена следующая закономерность: при использовании в составе подвижной фазы метанола нитроэтан всегда элюируется с колонки раньше 2-изомера ИСМН; при использовании ацетонитрила — позднее 5-изомера ИСМН. Подобная закономерность справедлива для всех типов исследованных колонок.

Из полученных данных следует, что полное совпадение величин коэффициентов емкостей нитроэта-

Рис. 5. Хроматограмма разделения смеси органических нитратов и неорганических анионов: 1 — изосорбида мононитрат 2 — нитрит,

3 — бромид, 4 — нитрат, 5 — изосорбида динитрат, 6 — нитроглицерин. Условия хроматографии: колонка Диасфер-110-С18 250 х 4,6мм, 5мкм; скорость потока 1 мл/мин; подвижная фаза — ацетонитрил—3мМ ЦТА 10мМКИр04 в воде (рН 6,5) (40:60); детектирование при 210 нм

Рис. 6. Хроматограмма разделения смеси нитроэфиров изосорбида и нитропарафинов. Условия анализа: колонка — Диасфер-110-С10СШ 250 х 4,0мм, 5мкм; скорость потока — 0,8 мл/мин; подвижная фаза — метанол—вода (30:70); детектирование при 210 нм. 1 — нитроэтанол; 2 — нитрометан; 3 — нитроэтан; 4 — 2-изомер изосорбида мононитрата; 5 — 5-изомер изосорбида мононитрата; 6 — 1-нитропропан;

7 — изосорбида динитрат

ЭКСПЕРТИЗА ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

ЭКСПЕРТИЗА ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

Рис. 7. Хроматограмма разделения смеси изомеров изосорбида мононитрата и нитропарафинов (совпадение времен удерживания нитроэтана и 2-изомера ИСДН). Условия анализа: колонка — Диасфер-110-С18 250 х 4,0 мм, 5мкм.; скорость потока — 0,8мл/мин; подвижная фаза — метанол—ацетонитрил—вода (20:10:70); детектирование при 210 нм. 1 — 2-нитро-1-пропанол; 2 — 2-изомер изосорбида мононитрата совместно с нитроэтаном; 3 — 5-изомер изосорбида мононитрата

на и 2-изомера ИСМН может быть достигнуто с использованием подвижных фаз, состоящих из смесей метанола, ацетонитрила и воды. Кроме того, исходя из соотношения величин коэффициентов емкостей нитроэтана и нитроэтанола следует, что и нитропропанол также может быть компонентом смеси для проверки пригодности хроматографической системы. Действительно, увеличение содержания ацетонитрила в подвижной фазе до 5—10% приводит к совпадению коэффициентов емкости нитроэтана и 2-изомера ИСМН (рис. 7). Однако даже при использовании подвижных фаз, содержащих смесь ацетонитрила с водой, 2-нитро-1-пропанол непригоден для цели проверки пригодности хроматографической системы.

Изменяя содержание ацетонитрила в подвижной фазе более дискретно, можно достичь совпадения данных коэффициентов и на других колонках. Так, при хроматографировании соединений на колонке Бупе^1

ЛИТЕРАТУРА

РОЬАК-ЯР с применением подвижной фазы метанол—ацетонитрил—вода (18:12:70) также наблюдается совпадение величин коэффициентов емкости нитроэтана и 2-изомера ИСМН.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

1. Хроматографические параметры пиков ИСДН и нитроглицерина, полученные на отечественных колонках, практически не отличаются от параметров пиков данных соединений, полученных на аналогичных колонках известных зарубежных изготовителей. Наряду с колонками С18 для анализа ЛП из группы органических нитратов можно применять колонки с нитрильными и фенильными сорбентами. Среди исследованных колонок наилучшим разрешением при анализе органических нитратов обладает колонка Бупе^1 РОЬАК-ЯР 250 х 4,6 мм, 4 мкм.

2. Размер хроматографических колонок для анализа ИСДН и нитроглицерина в ЛП может быть уменьшен, что позволит сократить стоимость измерений по исследованию кинетики высвобождения препаратов из лекарственных форм пролонгированного действия.

3. Разработаные методики анализа неорганических примесей в препаратах органических нитратов методом ион-парной хроматографии позволят совместно определять примеси органической и неорганической природы в препаратах нитроглицерина, ИСДН и ИСМН.

4. Среди протестированных соединений только нитроэтан наиболее подходит для цели проверки пригодности хроматографической системы при анализе препаратов, содержащих ИСМН и ИСДН. Варьируя соотношение метанола и ацетонитрила в подвижной фазе можно достичь полного совпадения коэффициентов емкости нитроэтана и 2-нитроизомера ИСМН.

1. Нечаева Е.Б., Осипов А.С. Применение колонок с новыми типами сорбентов для анализа органических нитратов // XIV Рос. нац. конгресс «Человек и лекарство». Тез. докл. Москва. 2007. С. 856.

2. Осипов А.С., Нечаева Е.Б., Дёмина Н.Б, и др. Применение хроматографических колонок отечественного производства для анализа препаратов органических нитратов // Хим.-фарм. журнал. 2008. Т. 42, № 1. С. 46-49.

3. Нечаева Е.Б., Осипов А.С., Дёмина Н.Б. Анализ лекарственных препаратов из группы органических нитратов на хроматографических колонках с различными типами сорбентов // Вопр. биол. мед. и фармацев-тич. химии. 2008. № 4. С. 47-50.

4. Осипов А.С., Нечаева Е.Б., Дёмина Н.Б. Применение ион-парной хроматографии для анализа примесей в препаратах органических нитратов // Сб. научн. трудов «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции».

Вып. 63. Пятигорск. 2008. С. 313-316.

5. Осипов А.С., Нечаева Е.Б., Дёмина Н.Б. Применение солей тетраалкиламмониевых соединений для анализа примесей

в препаратах органических нитратов методом ВЭЖХ // Вопр. биол. мед. и фармацевтич. химии. 2010. № 3. С. 21-24.

6. Осипов А.С., Нечаева Е.Б., Дёмина Н.Б. Применение нитроалканов для анализа препаратов нитратов изосорбида // Сб. научн. трудов «Разработка, исследование

и маркетинг новой фармацевтической продукции». Выпуск 64. Пятигорск. 2009.

С. 316-319.

7. Осипов А.С., Нечаева Е.А., Орлов Е.Н, Оптимизация условий анализа при определении примесей в препаратах нитратов изосорбида методом ВЭЖХ // Сб. научн. трудов «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции». Вып. 65. Пятигорск. 2010.

С. 363-366.

8. Осипов А.С., Орлов Е.Н. Применение нитроалканов для анализа примесей

в лекарственных препаратах нитратов изосорбида методом ВЭЖХ // Вопр. биол. мед. и фармацевтич. химии. 2010. № 11.

С. 28-32.