СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СТАБИЛЬНЫХ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР
METHOD OF STABLE CELL CULTURES MANUFACTURE

Изобретение относится к биологии и медицине и может быть использовано в биотехнологии и вирусологии для получения штаммов диплоидных клеток из первично-трипсинизированных клеточных культур, в том числе для заместительной терапии.
Известно, что первично-трипсинизированные клеточные культуры являются простым и доступным субстратом для выделения и накопления вирусов человека и животных. В частности, культуры фибробластов эмбриона свиней (ПЭС) используют при работе с арбовирусами и энтеровирусами, фибробласты куриных эмбрионов (ФЭК) используют при работе с арбовирусами, а эпителиоподобные клетки почек эмбриона телят (ПЭТ) - с вирусами респираторной группы.
2
Известен способ получения клеточных культур из фетального материала. При этом используют ткани животных первой половины срока беременности. Их отмывают, измельчают, далее дезагрегируют в растворе, содержащем раствор коллагеназы II типа и трипсина в течение 40-90 минут, полученную суспензию диссоциированных клеток культивируют до достижения конфлюэнтного монослоя, затем осуществляют пассирование. Дезагрегацию монослоя проводят раствором трипсина. Суспензию клеток засевают с плотностью не менее 1×10 кл/мл на ростовую среду ДМЕМ/F12, 20% эмбриональной телячьей сыворотки, 1% ИТС (инсулин, трансферин, селенит) и 5 нг/мл фактора роста эпидермиса. Процесс культивирования ведут 18-25 дней при 37°С в атмосфере 9-10% CO. Среду в процессе культивирования неоднократно меняют, а культивирование ведут, избегая накопления в культуре клеток зрелой стромы. В качестве фетального материала могут быть использованы ткани печени, тимуса, костного мозга, подкожной жировой ткани [Патент РФ №2268062, МПК А61К 35/54; А61З 9/00, 2006 г.].
Известный метод не обеспечивает возможность стабилизации штаммов диплоидных клеток.
Широко известен метод получения первичных клеточных линий из тканей кожи или эмбрионального материала, полученного при хирургических абортах, путем измельчения исходных тканей в присутствии 0,04%-ного раствора трипсина с последующей инкубацией при эпизодическом пипетировании образующейся суспензии клеток, последнюю центрифигируют, осадок ресуспендируют в 1-2 мл среды А (среда 199 с антибиотиками, сыворотка крови группы АВ и куриный эмбриональный экстракт) и помещают во флаконы Карреля, которые инкубируют при 37°С в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа [Дж.Хаймен, А.Полдинг. Культивирование фибробластов человека для исследования хромосом. В кн.: Новые методы культуры животных тканей / Под ред. Дж.Уосли. М.: Мир, 1976, с.208].
Известный метод не позволяет стабильно получать стандартные клеточные культуры и, как следствие, обеспечить возможность стабилизации штаммов.
Наиболее близким к предлагаемому, является способ выделения и стабилизации диплоидных клеток из однородной ткани 12-14-недельного эмбриона человека. Перед приготовлением определяют пол донора по набору хромосом, ткань измельчают и промывают 0,25-0,30%-ным раствором трипсина при температуре 18-22°С в течение 20-30 минут, проводя многократную экстракцию клеток путем обработки ткани новой порцией трипсина при температуре 37°С в соотношении 1/10 к массе ткани при перемешивании до полного истощения ткани, собранные порции экстрагированных клеток нейтрализуют в питательной среде Игла и центрифугируют, полученный осадок ресуспендируют и культивируют в ростовой среде на основе среды Игла с 10% телячьей сывороткой и антибиотиками, полученную суспензию высевают в матрасы и инкубируют при 37°С со сменой среды на 3-4 сутки, съем клеток для пассирования осуществляют на 5-7 сутки после образования их монослоя путем обработки 0,25%-ным раствором трипсина при температуре 18-22°С в течение 1-2 минут с последующим пипетированием, нейтрализацией трипсина и центрифугированием и последующим пассированием. Готовые клеточные линии подвергают криоконсервации в среде Игла с добавлением 10% сыворотки телят и 10% глицерина при концентрации клеток 1,5-2,0 млн кл./мл [Выделение, культивирование и контроль штаммов диплоидных клеток. Методические указания. Министерство здравоохранения СССР, М., 1979 г., с.2-4].
Известная методика позволяет получать перевиваемые клеточные линии, тогда как постоянно получать стабильные штаммы диплоидных клеток по описанной методике весьма затруднительно. Это связано с тем, что однородные клетки со стабильными свойствами в процессе выделения и культивирования подвергаются такому воздействию трипсина, которое приводит к частичному разрушению клетки, и, как следствие, отсутствуют успешные результаты в получении стабильных штаммов диплоидных клеток.
Задачей настоящего изобретения является повышение эффективности и качества процесса получения стабильных штаммов диплоидных клеток.
Поставленная задача решается тем, что предлагаемый способ получения стабильного клеточного штамма включает использование предварительно измельченной эмбриональной ткани, промытой ферментным раствором, с последующей трипсинизацией ткани путем многократной обработки раствором трипсина при перемешивании, сливы отделившихся клеток обрабатывают питательной средой и центрифугируют, образовавшийся осадок ресуспендируют и культивируют в монослое в ростовой среде на основе среды Игла, инкубируют с последующим пассированием в течение не менее пяти раз, целевой продукт обрабатывают ферментным раствором с целью съема с поверхности матраса, полученную взвесь центрифугируют и осадок подвергают криогенной консервации, отличающийся тем, что промывку эмбриональной ткани ферментным раствором ведут при температуре 25-37°С, а трипсинизацию ведут не менее трех, но не более пяти раз путем обработки кусочков ткани раствором трипсина с протеолитической активностью в пределах 65-80 Ед.
Промывка эмбриональной ткани ферментным раствором при температуре 25-37°С позволяет повысить качество эксплантации клеток. В процессе получения штамма используют 0,25%-ный раствор трипсина, удовлетворяющий требованиям ФС 42-3321-96, с протеолитической активностью в пределах 65-80 Ед. (по степени расщепления казеина).
Использование раствора трипсина с указанной активностью, по меньшей мере, трехкратно позволяет провести процесс трипсинизации при температуре трипсина, близкой к 37°С. Такой режим позволяет обеспечить высокую степень извлечения клеток без разрушения их оболочек, что, в конечном счете, способствует повышению выхода жизнеспособных клеток и числа положительных первичных отвивок клеток для получения штамма. Максимальный количественный эффект достигается при длительности каждого цикла трипсинизации, равной 30 минутам.
Промывка ферментным раствором эмбриональной ткани при повышенной температуре и проведение стадии трипсинизации при заявляемых режимах обеспечивают возможность получения установившегося штамма уже с 5-ого пассажа.
В качестве эмбриональной ткани используют ткани млекопитающих животных, преимущественно ткани эмбрионов свиньи. Для проведения заявленного способа наиболее предпочтительными являются эмбриональные ткани первой половины срока беременности. Клетки, полученные из эмбриональной ткани такого раннего возраста, менее дифференцированы, что положительно влияет на качество и количество конечного продукта. В качестве источника эмбриональной ткани могут быть использованы эмбрионы второй половины срока беременности (10-12 недель), однако в этом случае качество клеток ухудшается, а время эффективного культивирования существенно уменьшается.
Для первичной промывки эмбриональной ткани используют раствор Хенкса или раствор трипсина или химопсина. В качестве питательной ростовой среды используют среду, состоящую, предпочтительно, из равных количеств сред Игла MEM и 0,5% раствора гидролизата лактальбумина (ГЛА) с 10% эмбриональной сывороткой крупного рогатого скота (ЭСКРС). Для приготовления ростовой среды может быть использована смесь среды Игла MEM и среды 199. Использование указанных сред обеспечивает сохранение жизнеспособности клеточных культур и выход максимального числа положительных первичных отвивок клеток для получения штамма.
Дополнительный результат, связанный с оптимизацией режимов получения клеточного штамма, обеспечивается также тем, что съем клеток для пассирования производят на 5-6 сутки смесью растворов 0,25% трипсина и 0,02% Версена в соотношении 1:1 при температуре не более 37°С при экспозиции 0,5-1 минуты с последующим добавлением среды Игла или ГЛА и центрифугируют при 1000-1200 об/мин в течение 10-15 минут. Указанный режим съема клеток способствует гомогенизации монослоя при культивировании и обеспечивает ровный рост клеток, что, в конечном счете, позволяет увеличить количество и качество снимаемой клеточной суспензии и последующее качественное осаждение клеточной массы.
Заявляемый способ реализуют следующим образом.
3
Однородные ткани исходного образца берут от млекопитающего животного - донора, преимущественно 4-6-недельные эмбрионы свиньи. В момент сбора ткань трехкратно промывают стерильным раствором Хенкса или 0,25%-ным раствором трипсина или 0,02%-ным раствором химопсина с гентамицином при температуре 25-37°С, собирают в стерильную колбу, отмывают до возможно полного обескровливания и измельчают скальпелем на кусочки величиной 2-3 мм. Отмытые кусочки ткани помещают в стерильную колбу с магнитиком для проведения процесса трипсинизации на магнитной мешалке. В колбу с кусочками ткани добавляют 0,25% раствор трипсина с протеолитической активностью в пределах 65-80 Ед., подогретый до температуры 32-37°С в таком количестве, чтобы осевшая ткань была покрыта слоем жидкости на 1,5-2,0 см (предпочтительно 1/20 к массе ткани) и устанавливают на предварительно подогретую до 35-37°С магнитную мешалку. Перемешивание ведут в течение 3-10 минут, не допуская вспенивания. Цикл трипсинизации повторяют не менее 3-х раз. Для ослабления переваривающей активности трипсина в сливаемые порции взвеси клеток до 1/2 объема добавляют 0,5% раствор гидролизата лактальбумина (ГЛА). После каждого цикла трипсинизации взвесь клеток помещают в предварительно охлажденные до температуры не более +6°С стерильные центрифужные стаканы и заливают средой Игла или смесью питательных сред Игла и 0,5% ГЛА. Центрифугирование отобранной взвеси клеток проводят при 1200-1500 об/мин в течение 10 минут в охлаждаемой центрифуге при температуре +4-+6°С. Полученный осадок ресуспендируют в 0,5% растворе ГЛА и клеточную взвесь тщательно пипетируют. Отбирают пробу и проводят контрольный подсчет клеток в камере Горяева. Пипетированную клеточную взвесь готовят в концентрации 300 тыс. кл. /мл в среде Игла MEM с добавлением 10% ЭСКРС и разливают в стерильные одноразовые пластиковые матрасы. Инкубирование ведут в термостате при 37°С. Через 1 сутки проводят смену ростовой среды для удаления детрита. Монослой клеток формируется на 5-е сутки. Пересев проводят по стандартной методике в соотношении 1:2. На втором и третьем пассажах клетки пересевают на 5 сутки независимо от плотности монослоя. С 4-го пассажа формируется плотный монослой с ориентированными зонами роста униморфных фибробластоподобных клеток с четкими границами. Съем клеток при пассировании ведут 0,25% раствором трипсина или 0,02% раствором версена или их смесью при соотношении 1:1 при температуре около 37°С в течение 0,5-1,0 минуты с добавлением среды Игла MEM или ГЛА с последующим центрифугированием при 1000-1200 об/мин в течение 10-15 минут.
Проведенный количественный кариологический анализ полученной культуры клеток показал, что относительное число клеток с хромосомным набором, соответствующим набору хромосом животного-донора, составляет 95-97%. Таким образом, становление культуры происходит в процессе 1-5 пассажей, накопление полученных диплоидных штаммов клеток ведут с 6 по 20 пассажи. Рост установившейся культуры диплоидных штаммов клеток надлежащего качества происходит не менее чем до 45 пассажа.
Криоконсервацию установившейся клеточной культуры проводят по стандартной методике в среде роста с добавлением 10% глицерина в программном замораживателе по стандартному режиму с последующим помещением в низкотемпературный холодильник (не менее -86°С) или в жидкий азот (-196°С). Контрольное восстановление полученных клеток показало, что жизнеспособность восстановленной культуры составляет 85-95%.
Пробы культуры, не подвергшиеся криоконсервации, продолжают пассировать до начала проявления в монослое признаков неспецифической дегенерации или заметных изменений морфологических показателей.
Контроль клеточного штамма на бактериологическую и вирусологическую стерильность осуществляют по утвержденным методикам МУК 1/4.2.588-96 методом прямого посева; методом окраски ДНК флуорохромами по РД 42-28-10-89 или методом электронной микроскопии в соответствии с МУ МЗ СССР, М., 1979; реакцией гемадсорбции с эритроцитами морской свинки по МУК 1/4.2.588-96. Подготовку препаратов для определения кариологических параметров культуры проводят согласно требованиям РД 42-28-10-89, контроль кариологических параметров ведут по известным методикам (см., например, «Выделение, культивирование и контроль штаммов диплоидных клеток». Методические указания. Министерство здравоохранения СССР, М., 1979 г., с.16-22).
При получении клеток фибробластов свиньи (ПЭС)/ легкого эмбрионов свиньи (ЛЭС) вышеописанным способом средний выход клеток с 1 г ткани составляет 30-40 миллионов клеток.
Ниже приведены примеры конкретного выполнения заявленного способа. Полученные данные представлены в таблицах.
Для определения влияния протеолитической активности (сроков использования) раствора трипсина на выход клеток с 1 г. эмбриональной ткани (при проведении трипсинизации в течение 3-х циклов в течение 30 минут), а также режимов трипсинизации при минимальном значении активности раствора трипсина были проведены опыты с использованием тканей 4-6-недельных эмбрионов, полученных от здоровых особей свиней. Активность трипсина определена по степени расщепления казеина по ФС 42-3321-96. Подсчет клеток проведен в камере Горяева по утвержденной методике. Данные приведены в таблицах №1-3
Таблица 1
Влияние сроков использования 0,25% раствора трипсина после фильтрации на выход клеток при трипсинизации (3 цикла по 30 минут)
№ опыта
Давность приготовления трипсина, сут
Протеолитическая активность, Ед.
Выход клеток с 1 г ткани, млн клеток.
1
1
>100
50,0±1,4
2
5
80
58,4±1,2
3
9
59,1±2,1
4
13
47,4±0,18
5
29
40,7±1,4
6
40
65
36,0±0,8
7
45
34,0±0,20
8
63
30,2±0,13
9
84
22,0±0,17
10
100
59
18,0±0,15
При хранении трипсина его биологическая активность снижается. Оптимальная активность трипсина - 4-7 недель после приготовления, что соответствует протеолитической активности 65-80 Ед. При использовании трипсина с большей активностью увеличивается вероятность разрушения клеточных структур в процессе трипсинизации. При использовании раствора трипсина с активностью меньше заявляемой выход клеток с единицы веса ткани не позволяет обеспечить полноту извлечения жизнеспособных клеток, т.е. процесс менее эффективен. Использование трипсина с активностью в пределах 65-80 Ед. позволяет получить оптимальный результат по качеству клеток и их выходу с 1 г ткани.
Таблица №2
Выход клеток с 1 г ткани 4-6-недельных эмбрионов в зависимости от температуры трипсинизации (3 цикла по 30 минут)
Температура трипсина (С°)
Количество опытов
Количество ткани (г)
Выход с 1 г ткани (млн клеток)
20-22
8
3-4
23,3±0,72
30-32
6
3-5
31,3±0,45
37
7
3-4
37,2±0,60
Проведение процесса при температуре трипсина выше 37°С приводит к разрушению клеточных элементов, проведение процесса при температуре ниже 30°С не обеспечивает оптимального результата.
Таблица №3
Выход клеток (млн) с 1 г ткани в зависимости от режима трипсинизации
Режим
Количество опытов
Выход клеток с 1 г (млн)
6 раз по 15 мин
5
16,6±1,0
4 раза по 20 мин
5
18,2±0,72
3 раза по 15 мин
5
36,3±0,9
Как видно из представленных данных, проведение не менее 3-х циклов трипсинизации длительностью по 30 минут каждый обеспечивает максимальный количественный результат процесса трипсинизации. Увеличение длительности каждого цикла свыше 30 минут приводит к разрушению клеточных элементов.
Таблица №4
Влияние спелы роста на длительность жизненного цикла (в пассажах) клеток ЛЭС
Состав среды роста, %
Число пассажей
Митотический индекс, ‰
Среда Игла MEM
Среда 199
ГЛА
ЭСКЗС
90
-
-
10
40-42
10,6±0,08
45
45
-
10
14-15
9,8±0,6
-
-
90
10
18-19
8,3±0,16
45
-
45
10
40-45
18,2±0,12
-
-
45
10
16
4,0±0,06
Как видно из представленных данных, выращивание клеток с использованием различных сред роста влияет на активность пролиферации, а следовательно, на качество и однородность выращенной клеточной культуры. Выращивание клеток на смеси, состоящей из равных количеств среды Игла и 0,5% раствора ГЛА с 10% ЭСКРС, обеспечивает формирование сплошного монослоя фибробластоподобных клеток на 3-4 сутки роста. Границы клеток хорошо выражены. Цитоплазма светлая, равномерно окрашенная. Количество аномальных интерфаз не более 25,2‰. Число патологий митоза составило до 1% от числа делящихся клеток, число генераций не менее 40-45.
Использование заявляемого способа позволяет получить стабильные результаты по получению однородных штаммов диплоидных клеток. Промывание ткани ферментным раствором при повышенной температуре и проведение трипсинизации по стадиям при заявляемых режимах снижает риск разрушения клетки и обеспечивает возможность становления штамма уже с 5-го пассажа. Достигаемый результат обеспечивается тем, что на стадии подготовки клеточной ткани заявленные температурные режимы позволяют примерно на 30% повысить долю жизнеспособных клеток, а на стадии трипсинизации заявленные режимы обеспечивают увеличение числа положительных первичных отвивок на 30-40%. Повышение выхода жизнеспособных клеток связано, на наш взгляд, с тем, что при оптимальной температуре сокращается время контакта эмбриональной ткани с ферментным раствором, а использование трипсина заявленной активности позволяет снизить риск разрушения клетки.
Используемые ростовые среды позволяют создать оптимальные условия сохранения жизнеспособности клеток в процессе культивирования.