Уровень экспрессии фактора роста эндотелия сосудов (vegf) и тетрат-резистентной кислой фосфатазы (traсp) в костной ткани головки бедра при коксартрозе

Статья поступила в редакцию 05.02.2016 г.

УРОВЕНЬ ЭКСПРЕССИИ ФАКТОРА РОСТА ЭНДОТЕЛИЯ СОСУДОВ (VEGF) И ТЕТРАТ-РЕЗИСТЕНТНОИ КИСЛОЙ ФОСФАТАЗЫ (ТкАСР) В КОСТНОЙ ТКАНИ ГОЛОВКИ БЕДРА ПРИ КОКСАРТРОЗЕ

THE LEVEL OF EXPRESSION OF VASCULAR ENDOTHELIAL GROWTH FACTOR (VEGF) AND TARTRATE-RESISTANT ACID PHOSPHATASE (TRACP) IN FEMORAL HEAD BONE TISSUE IN COXARTHROSIS

Давыдов Д.А. Устьянцева И.М. Агаджанян В.В.

Авдалян А.М. Лушникова Е.Л

ГАУЗ КО «Областной клинический центр охраны здоровья шахтеров»,

г. Ленинск-Кузнецкий, Россия, Лаборатория молекулярно-генетических характеристик опухолей Алтайского филиала РОНЦ им. Н.Н. Блохина

Минздрава РФ,

г. Барнаул, Россия, Институт молекулярной патологии и патоморфологии СО РАН,

г. Новосибирск, Россия

Davydov D.A. Ustyantseva I.M. Agadzhanyan V.V. Avdalyan A.M. Lushnikova E.L.

Regional Clinical Center of Miners' Health Protection,

Leninsk-Kuznetsky, Russia

Laboratory of molecular and genetic characteristics of tumors, Altay department of Blokhin Russian Cancer Research Center

Barnaul, Russia

Institute of Molecular Pathology and Pathologic Morphology

Novosibirsk, Russia

Определение уровня экспрессии TRAcP - это классический метод в оценке резорбтивной активности остеокластов. Гипоксия, развивающаяся вследствие гемодинамических нарушений в костной ткани головки бедра, вносит свой вклад в прогрессирование коксартроза. Одним из активаторов анги-огенеза является фактор роста эндотелия сосудов. Определение уровня его экспрессии является объективным способом оценки ответной реакции ткани на гипоксию.

Цель исследования - провести анализ экспрессии VEGF и TRAcP в костной ткани головки бедра при деформирующем артрозе тазобедренного сустава.

Материалы и методы. В морфологическое исследование включали 95 головок бедренных костей, удаленных при эндопротезировании тазобедренного сустава у пациентов с клинически выставленным диагнозом «коксартроз III-IV стадии», поступавших в отделение травматологии и ортопедии ГАУЗ КО ОКЦОЗШ. Для выявлении сосудов микроциркуляторного русла использовали антитело CD34 (QBEnd/10, «Ventana»), определение фактора роста эндотелия сосудов проводили с помощью антитела к VEGF (SP28, «Spring Bio»), оценку резорбтивной активности остеокластов выполняли с применением антитела к TRAcP (9C5, «Cell Marque»). Измерение оптической плотности (в условных единицах) уровня цитоплазматической экспрессии VEGF и TRAcP, а также определение площади сосудов микроциркуляторного русла (в мкм2) выполняли при помощи программного обеспечения «NIS-Elements» (версия BR 4.30.00).

Результаты и обсуждение. Выполненная оценка экспрессии VEGF и TRAcP указывает на характерные особенности костной ткани при вышеуказанных нозологических формах коксартроза.

Заключение. Проведенный сравнительный анализ морфометрических и молекулярно-биологических характеристик ткани головки бедра при различных нозологических формах коксартроза указывает на ряд специфических особенностей.

Estimation of the level of TRAcP expression is a conventional method for assessment of resorption activity of osteoclasts. Hypoxia after hemodynamic disorders in bone tissue of the femoral head influences on progression of coxarthrosis. One of the promoters of angiogenesis is vascular endothelial growth factor. Estimation of its expression level is an objective way of estimation of tissue response to hypoxia.

Objective - to make the analysis of expression of VEGF and TRAcP in bone tissue of the femoral head with deforming arthrosis of the hip joint.

Materials and methods. The morphologic study included 95 femoral heads which were removed during hip endoprosthetics in the patients with clinically confirmed diagnosis of coxarthrosis of stages 3-4 who were admitted to the department of traumatology and orthopedics, Regional Clinical Center of Miners' Health Protection. For identification of the vessels of microcirculatory bed we used CD34 antibody (QBEnd/10, Ventana). Vascular endothelial growth factor was estimated with VEGF antibody (SP28, Spring Bio). Resorption activity of osteoclasts was made with TRAcP antibody (9C5, Cell Marque). NIS-Elements software (version BR 4.30.00) was used for measurement of optical density (conventional units) of the level of cytoplasmic expression of VEGF and TRAcP and for estimation of the square of the vessels of microcirculatory bed (Mm2).

Results and discussion. The conducted estimation of expression of VEGF and TRAcP indicates the specific characteristics of bone tissue with the above mentioned nosologic types of coxarthrosis.

Conclusion. The comparative analysis of the morphometric and molecular biologic characteristics of femoral head tissues with various nosologic types of coxarthrosis shows some specific features. The most specific manifestations of the certain morphologic and molecular

46

ПОЛИТРАВМА

Для каждой нозологической формы коксартроза выявлены наиболее специфичные проявления определенных морфологических и молекулярно-био-логических признаков.

Ключевые слова: фактор роста эндотелия сосудов; кислая фосфатаза; остеокласт; остеобласт; коксартроз.

biologic signs were identified for each nosologic type of coxarthrosis.

Key words: vascular endothelial growth factor; acid phosphatase; osteoclast; osteoblast; coxarthrosis.

Деформирующий артроз тазобедренного сустава относится к группе дегенеративно-дистрофических заболеваний [4]. С прогресси-рованием данного патологического процесса меняется баланс в системе ремоделирования костной ткани с дальнейшем нарушением опорной функции кости и сустава в целом.

В настоящее время одним из доступных методов оценки процессов костного ремоделирования является иммуногистохимия [8].

Тетрат-резистентная кислая фосфатаза (ТИАсР) является лизосо-мальным ферментом остеокластов, под действием которого происходит резорбция костной ткани. Остеокласт создает изолированную полость резорбции на поверхности кости, в которую происходит выделение кислой фосфатазы путем экзоцитоза. Определение уровня экспрессии ТИАсР является классическим методом не только в идентификации остеокластов, но и в оценке их резорбтивной активности [2]. Отмечено, что уровень экспрессии ТИАсР в остеокластах способен изменяться как в физиологических условиях, так и под действием лекарственных препаратов [5, 6]. Имеющиеся научные работы, посвященные определению резорбтивной активности остеокластов в костной ткани головки бедра при различных нозологических формах коксартроза, достаточно противоречивы и не дают однозначной оценки данному процессу [12].

Неизбежно развивающаяся гипоксия в костной ткани головки бедра вследствиие гемодинамиче-ских нарушений также вносит свой вклад в прогрессирование коксар-троза [10, 3]. В свою очередь, одним из активаторов ангиогенеза является фактор роста эндотелия сосудов (VEGF). Определение уровня его экспрессии при различных патологических процессах является достаточно объективным способом оценки ответной реакции ткани на гипоксию [9, 7].

Цель исследования — провести анализ экспрессии VEGF и TRAcP в костной ткани головки бедра при коксартрозе.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В морфологическое исследование включали 95 головок бедренных костей, удаленных при эндопротезировании тазобедренного сустава у пациентов с клинически выставленным диагнозом «коксартроз III-IV стадии», поступавших в отделение травматологии и ортопедии ГАУЗ КО ОКЦОЗШ. Возраст больных составил 56 (49-64) лет. Распределение по полу было следующим: 51 (53,7 %) мужчина и 44 (46,3 %) женщины. По нозологическим формам коксартроз был распределен примерно равномерно: дис-пластический — 34 случая, пости-шемический — 31 случай и посттравматический — 30 случаев.

Из доставленного материала выпиливался фрагмент суставной поверхности и субхондральной костной ткани размерами 1,5 х 1,0 х0,5 см. Фиксацию и декальцинацию выпиленных фрагментов проводили в растворе ЭДТА согласно инструкции производителя.

После декальцинации проводилась стандартная процедура изготовления гистологических препаратов с последующей окраской гематоксилин-эозином и гематокси-лин-пикрофуксином. Исследование проводилось на световом микроскопе с использованием цифровой фотокамеры (Nikon DS-Fi2).

Постановка иммуногистохими-ческих реакций проводилась в автоматическом режиме на имму-ногистостейнере Bench Mark XT с соблюдением протокола исследования к каждому антителу. После проведения реакции срезы подвергали дегидратации и помещали под покровное стекла.

Для выявлении сосудов микро-циркуляторного русла использовали антитело CD34. Определение

фактора роста эндотелия сосудов проводили с помощью антитела к VEGF. Оценку резорбтивной активности остеокластов выполняли с применением антитела к кислой фосфатазе — ТИАсР. Измерение оптической плотности (в условных единицах) уровня цито-плазматической экспрессии VEGF в остеобластах и остеокластах, и ТИАсР в остеокластах, а также определение площади сосудов ми-кроциркуляторного русла (в мкм2) выполняли при помощи специализированного программного обеспечения «Ш$-Е1ете^з» (версия ВИ 4.30.00).

Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью прикладного пакета программ Statistica 6.0.

Проверку нормальности распределения количественных (непрерывных и порядковых) данных выполняли с помощью критерия Шапиро-Уилка (W). При получении значимых показателей критерия нулевую гипотезу о соответствии анализируемых данных нормальному закону распределения отвергали, и данные были представлены в виде Ме — иО), где Ме — медиана, — иО) — интерквартильный разброс. Для выявления различий между группами по количественным показателям использовали непараметрические критерии Краскела-Уоллеса и Манна-Уитни. Различия считали статистически значимыми при значении р < 0,05.

Корреляционный анализ в представленном исследовании проводили с использованием коэффициентов ранговой корреляции Спирмена. По величине коэффициента ранговой корреляции условно оценивали тесноту связи между признаками, считая значения коэффициента равные 0,3 и менее — показателями слабой тесноты связи; значения более 0,4, но менее 0,7 — показателями умеренной тесноты связи, а значения 0,7 и более — показателями высокой тесноты связи.

№ 1[март]2016

47

Рисунок

Молекулярно-биологические особенности ткани головки бедра при коксартрозе, ув. 100

а — экспрессия VEGF остеобластами (отмечены стрелкой) при диспластическом коксартрозе; b — экспрессия VEGF остеокластами (отмечены стрелкой) при постишемическом коксартрозе; c — сосуды микроциркуляторного русла (CD34+ эндотелий) костной ткани головки бедра при постишемическом коксартрозе; d — экспрессия TRAcP остеокластами (отмечены стрелкой) при постишемическом коксартрозе. The figure

The molecular and biological features of femoral head tissue with coxarthrosis, 100-fold magnification

a — osteoblast VEGF expression (indicated with the arrow) in dysplastic coxarthrosis; b — osteoclast VEGF expression (indicated with the arrow) in postischemic coxarthrosis; c — vessels of microcirculatory bed (CD34+ endothelium) of femoral head bone tissue in postischemic coxarthrosis; d — osteoclast TRAcPexpression (indicated with the arrow) in posttraumatic coxarthrosis.

РЕЗУЛЬТАТЫ

И ОБСУЖДЕНИЕ

При гистологическом исследовании головки бедра посттравматического коксартроза отмечено чередование участков неизмененного гиалинового хряща с зонами нарушения архитектоники хондроцитов. В субхондральных отделах костной ткани чередуются очаги отека и фиброза костного мозга.

Гистологический анализ головок бедренных костей при постише-мическом коксартрозе указывает на асептический некроз жировой ткани, костного мозга и костных балок. Некротически измененные участки представлены эозинофиль-ными массами без ответной воспалительной реакции. На неравномерно истонченной трабекулярной поверхности определяются остеокласты в большом количестве.

При коксартрозе диспластиче-ского генеза поверхность головки бедра представлена склерозирован-ной компактной субхондральной костной пластинкой. Межбалочные пространства выполнены фиброзной тканью, костные балки губчатого вещества с явлением остеосклероза. Выполненная оценка таких молекулярно-биологических показателей, как уровень экспрессии VEGF и TRAcP, указывает на характерные особенности костной ткани при вышеуказанных нозологических формах коксартроза. Данные представлены в таблице и отображены на рисунке.

Полученные данные свидетельствуют о том, что максимальный уровень экспрессии VEGF в остеобластах регистрируется при кок-сартрозе диспластического генеза. В то же время уровень экспрессии VEGF и TRAcP в остеокластах, а также количество самих остеокластов при данной нозологии минимальны. Схожие данные получены в результате других исследовательских работ [1, 11].

В наименьшей степени уровень экспрессии VEGF в остеобластах выявлялся при коксартрозе посттравматического генеза. Характерной особенностью явилось наличие самых мелких сосудов микроцир-куляторного русла в костной ткани при вышеуказанной нозологической форме коксартроза.

Постишемический коксартроз характеризуется максимальными уровнем экспрессии VEGF в остеокластах, площадью сосудов ми-кроциркуляторного русла, уровнем экспрессии TRAcP и количеством остеокластов.

Проведенный корреляционный анализ позволил выявить некоторые взаимосвязи исследованных показателей. Так, в случае дис-пластического коксартроза определяется высокой тесноты прямая корреляционная связь между уровнем экспрессии VEGF остеобластами и площадью сосудов (г = 0,7; р < 0,00001). Наличие обратной корреляционной связи умеренной тесноты между уровнем экспрессии VEGF в остеобластах с уровнем экспрессии VEGF в остеокластах и

их количеством (г = -0,4; р = 0,02 и г = -0,4; р = 0,03 соответственно) указывает на больший вклад остеобластов в формирование сосудов микроциркуляторного русла при данном патологическом процессе.

При посттравматическом кок-сартрозе прямая корреляционная связь умеренной тесноты оказалась между уровнем экспрессии VEGF в остеобластах и площадью сосудов (г = 0,4; р < 0,027).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, проведенный анализ экспрессии VEGF и TRAcP в костной ткани головки бедра указывает на ряд специфических особенностей, характерных для каждой нозологической формы кок-сартроза.

ПОЛИТРАВМА

48

Таблица

Уровень экспрессии VEGF и TRAcP в костной ткани головки бедра при различных нозологических формах коксартроза,

Ме (LQ - UQ). Table

The level of VEGF and TRAP expression in femoral head bone tissue with various nosologic types of coxarthrosis,

Ме (LQ - UQ).

Нозологическая форма коксартроза Nosologic type of coxarthrosis, (n) VEGF в остеобластах, у.е. VEGF in osteoblasts, c.u. VEGF в остеокластах, у.е. VEGF in osteoclasts, c.u. Площадь сосудов, мкм2 Vascular square, pm2 TRAcPв остеокластах, у.е. TRAcP in osteoclasts, c.u. Количество остеокластов Amount of osteoclasts, n

Диспластический Dysplastic,

Посттравматический Posttraumatic,

Постишемический Postischemic, (31) 0.64 (0.5-0.68) 0.92 (0.63-0.95)b 2759 (2310-6572)c 0.98 (0.97-1.02)d 11.4 (10-13)e

Примечание: а - статистически достоверные различия между уровнем экспрессии VEGF остеобластами в ткани головки бедра при коксартрозе диспластического и посттравматического генеза (р = 0,03);

b - статистически достоверные различия между уровнем экспрессии VEGF остеокластами в ткани головки бедра при коксартрозе постишемического и диспластического генеза (р < 0,0001);

c - статистически достоверные различия между средней площадью сосудов в головки бедра при коксартрозе постишемического и посттравматического генеза (р = 0,001);

d - статистически достоверные различия между уровнем экспрессии TRAcP остеокластами головки бедра при коксартрозе постишемического и диспластического генеза (р < 0,0001);

e - статистически достоверные различия между количеством остеокластов в ткани головки бедра при коксартрозе постишемического и диспластического генеза (р < 0,0001).

Notes: a - statistically significant differences between osteoblast VEGF expression level in the femoral head with coxarthrosis of dysplastic and traumatic origin (p = 0.03);

b - statistically significant differences between osteoclast VEGF expression level in the femoral head with coxarthrosis of postischemic and dysplastic origin (p < 0.0001);

c - statistically significant differences between mean square of vessels in the femoral head with coxarthrosis of postischemic and posttraumatic origin (p = 0.001);

d - statistically significant differences between osteoclast TRAcP expression level in the femoral head with coxarthrosis of postischemic and dysplastic origin (p < 0.0001);

e - statistically significant differences between amount of osteoclasts in the femoral head with coxarthrosis of postischemic and dysplastic origin (p < 0.0001).

Коксартроз диспластического ге-неза характеризуется максимальной экспрессией VEGF остеобластами, составляющей 0,66 (0,62-0,69) у.е. и минимальной экспрессией VEGF и ТИАсР остеокластами — 0,48 (0,38-0,53) у.е. и 0,84 (0,730,89) у.е. соответственно. Наличие прямая корреляционной связи высокой тесноты при диспластиче-ском коксартрозе между уровнем

экспрессии VEGF остеобластами и площадью сосудов указывает на большой вклад остеобластов в формирование сосудов микроциркуля-торного русла при данном патологическом процессе.

При посттравматическом кок-сартрозе экспрессии VEGF в остеобластах и площадь сосудов микроциркуляторного русла минимальны — 0,55 (0,5-0,69) у.е. и

1539,5 (1104-4242) мкм2 соответственно.

Постишемический коксартроз характеризуется максимальной экспрессией VEGF в остеокластах, площадью сосудов микроциркуля-торного русла, уровнем экспрессии ТИАсР и количеством остеокластов. Данные показатели являются характерными признаками для пости-шемического коксартроза.

ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES:

1. Cui M, Kanemoto S, Cui X, Kaneko M, Asada R, Matsuhisa K, et al. OASIS modulates hypoxia pathway activity to regulate bone angio-genesis. Sci. Rep. 2015; 12(5): 16455. doi: 10.1038/srep16455.

2. Endo-Munoz L, Cumming A, Rickwood D, Wilson D, Cueva1 C, Ng C, et al. Microenvironment and immunology loss of osteoclasts contributes to development of osteosarcoma pulmonary metastases. Cancer Res. 2010; 70(18): 7063-7072. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-09-4291.

3. Hadi HA, Smerdon G, Fox SW. Osteoclastic resorptive capacity is suppressed in patients receiving hyperbaric oxygen therapy. Acta Orthop. 2015; 86(2): 264-269. doi: 10.3109/17453674.2014.964621.

4. Lane NE, Brandt K, Hawker G, Peeva E, Schreyer E, Tsuji W, et al. OARSI-FDA initiative: defining the disease state of osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 2011; 19: 478-482.

5. Lee HP, Lin YY, Duh CY, Huang SY, Wang HM, Wu SF, et al. Lemnalol attenuates mast cell activation and osteoclast activity in a gouty

№ 1[март] 2016

arthritis model. J. Pharm. Pharmacol. 2015; 67(2): 274-285. doi: 10.1111/jphp.12331

6. Lin YY, Jean YH, Lee HP, Chen WF, Sun YM, Su JH, et al. A soft coral-derived compound, 11-epi-sinulariolide acetate suppresses inflammatory response and bone destruction in adjuvant-induced arthritis. PLOS ONE. 2013; 8(5): e62926. doi: 10.1371/journal/pone.0062926

7. Ma WY, Zhuang L, Cai DX, Zhong H, Zhao C, Sun Q. Inverse correlation between caveolin-1expression and clinical severity in psoriasis vulgaris. J. Int. Med. Res. 2012; 40(5): 1745-1751.

8. Sung B, Prasad S, Yadav VR, Gupta SC, Reuter S, Reuter S, et al. RANKL signaling and osteoclastogenesis is negatively regulated by cardamonin. PLoS One. 2013; 8: e64118.

9. Walsh DA, McWilliams DF, Turley MJ, Dixon MR, Franse's RE, Mapp PI, et al. Angiogenesis and nerve growth factor at the os-

teochondral junction in rheumatoid arthritis and osteoarthritis. Rheumatology. 2010; 49: 1852-1861. doi:10.1093/rheumatology/ keq188

10. Waris V, Sillat T, Waris E, Virkki L, Mandelin J, Takagi M, et al. Role and regulation of VEGF and its receptors 1 and 2 in the aseptic loosening of total hip implants. J. Orthop. Res. 2012; 30(11): 1830-1836. doi: 10.1002/jor.22138

11. Xing Y, Wang R, Chen D, Mao J, Shi R, Wu Z, et al. COX2 is involved in hypoxia-induced TNF-a expression in osteoblast. Sci. Rep. 2015; 12(5): 10020. doi: 10.1038/srep10020.

12. Yamaguchi R, Yamamoto T, Motomura G, Ikemura S, Iwasaki K, Zhao G, Bone and cartilage metabolism markers in synovial fluid of the hip joint with secondary osteoarthritis. Rheumatology (Oxford). 2014; 53(12): 2191-2195. doi: 10.1093/rheumatology/keu253

Сведения об авторах:

Давыдов Д.А., врач патологоанатом, патологоанатомическое отделение, ГАУЗ КО «Областной клинический центр охраны здоровья шахтеров», г. Ленинск-Кузнецкий, Россия.

Устьянцева И.М., д.б.н, профессор, заместитель главного врача по клинической лабораторной диагностике, ГАУЗ КО «Областной клинический центр охраны здоровья шахтеров», г. Ленинск-Кузнецкий, Россия.

Агаджанян В.В., д.м.н., профессор, главный врач ГАУЗ КО «Областной клинический центр охраны здоровья шахтеров», г. Ленинск-Кузнецкий, Россия.

Авдалян А.М., д.м.н., профессор, заведующий лабораторией, лаборатория молекулярно-генетических характеристик опухолей Алтайского филиала РОНЦ им. Н.Н. Блохина Минздрава РФ, г. Барнаул, Россия.

Лушникова Е.Л., д.б.н, профессор, директор Института молекулярной патологии и патоморфологии СО РАН, г. Новосибирск, Россия.

Адрес для переписки:

Давыдов Д. А., 7-й Микрорайон, № 9, г. Ленинск-Кузнецкий, Кемеровская область, Россия, 652509

Тел: +7 (384-56) 9-55-80

E-mail: denis260586@rambler.ru

Information about authors:

Davydov D.A., anatomical pathologist, anatomic pathology department, Regional Clinical Center of Miners' Health Protection, Leninsk-Kuznetsky, Russia.

Ustyantseva I.M., Doctor of Biological Sciences, professor, deputy chief physician of clinical laboratory diagnostics, Regional Clinical Center of Miners' Health Protection, Leninsk-Kuznetsky, Russia.

Agadzhanyan V.V., MD, PhD, professor, chief physician, Regional Clinical Center of Miners' Health Protection, Leninsk-Kuznetsky, Russia.

Avdalyan A.M., MD, PhD, professor, head of laboratory, laboratory of molecular and genetic characteristics of tumors, Altay department of Blokhin Russian Cancer Research Center, Barnaul, Russia.

Lushnikova E.L., Doctor of Biological Sciences, professor, director of Institute of Molecular Pathology and Pathologic Morphology, Novosibirsk, Russia.

Address for correspondence:

Davydov D.A., 7th district, 9, Leninsk-Kuznetsky, Kemerovo region, Russia, 652509

Tel: +7 (384-56) 9-55-80

E-mail: denis260586@rambler.ru

m

50

ПОЛИТРАВМА