Способ получения капсулярного полисахарида Haemophilus influenzae типа b, применение капсулярного полисахарида и способ получения вакцинной композиции
METHOD FOR PRODUCING CAPSULAR HAEMOPHILUS INFLUENZAE TYPE B POLYSACHHARIDE, APPLICATION OF CAPSULAR POLYSACCHARIDE AND METHOD FOR PRODUCING VACCINE FORMULATIONS

Изобретение относится к способу получения в промышленном масштабе капсулярных полисахаридов Haemophilus influenzae типа b (Hib), согласно которому штамм Hib культивируют в особой культуральной среде, которая имеет определенный химический состав и которая не содержит каких-либо сложных источников азота или углерода.
В уровне техники, в частности из заявки WO 2009007641, известны улучшенные среды для культивирования Haemophilus influenzae типа b, которые не содержат компонентов из животных источников, как это рекомендуется, когда культура Haemophilus influenzae типа b имеет целью получение капсулярного полисахарида, который будет затем вводиться как антиген в состав вакцины. В средах, описанных в этом документе уровня техники, источник азота, обычно состоящий из животных пептонов, заменен растительными пептонами.
Такие среды представляют большой прогресс для безопасности фармацевтических продуктов в том, что касается, в частности, устранения риска переноса таких заболеваний, как бычий губчатый энцефалит; таким образом, они позволяют отвечать рекомендациям органов здравоохранения.
Однако состав пептонов может варьировать в зависимости от поставляемых партий, что может повлечь за собой изменения количеств образованных бактерий, а также изменение выхода по желаемым антигенам, что производители вакцин пытались ограничить или скорректировать, модифицируя некоторые параметры при осуществлении способа. Однако в рамках промышленного получения фармацевтического продукта желательно располагать надежными способами, требующими как можно меньше модификаций при каждом применении, и результаты которого на каждой стадии воспроизводятся от партии к партии.
Такие способы должны также позволять получать выходы, совместимые с промышленной рентабельностью, причем критерием является в случае получения антигенов из бактерий не только получить как можно большее количество бактерий, но также получить лучшее соотношение между титром антигенов и количеством полученных бактерий; таким образом, желательно, чтобы бактерии культивировались в условиях, ориентирующих их метаболизм на получение капсулярного полисахарида.
С этой целью объектом изобретения является способ получения в промышленном масштабе капсулярного полисахарида Haemophilus influenzae типа b (PRP), предназначенного для вакцинальных целей, согласно которому культивируют штамм Haemophilus influenzae типа b (Hib) в культуральной среде, собирают супернатант культуры, который обрабатывают для экстрагирования капсулярного полисахарида, причем указанная культуральная среда содержит по меньшей мере:
- один источник углерода,
- протопорфирин,
- соли,
- аминокислоты,
- NAD или NADH,
- витамины,
- средства регулирования pH,
отличающийся тем, что указанная культуральная среда имеет определенный химический состав.
Благодаря изобретению можно одновременно иметь надежный промышленный способ и повысить образование капсулярного полисахарида без необходимости соответственно увеличивать биомассу, что позволяет уменьшить количество получаемых липополисахаридов (LPS) относительно количества получаемого PRP.
Кроме того, отсутствие белков в составе культуральной среды снижает необходимую потребность в противовспенивающих средствах и упрощает стадию очистки, что позволяет, исходя из супернатанта культуры, получить антиген, образованный из капсулярного полисахарида.
Согласно изобретению культуральная среда содержит средства регулирования pH. Эти средства регулирования pH могут представлять собой буферные соли и/или являться средствами измерения pH в комбинации со средствами добавления к среде кислоты или основания. Благодаря регулированию pH можно оптимизировать производительность.
Согласно одному варианту осуществления способ по изобретению дополнительно включает конъюгирование полученного PRP с белком-носителем, таким как столбнячный белок.
Объектом изобретения является также способ получения вакцинной композиции, согласно которому:
- готовят в промышленном масштабе антиген к Haemophilus influenzae типа b (Hib), состоящий из капсулярного полисахарида (PRP), путем культивирования штамма Hib в среде с заданным химическим составом, природа и количество каждого компонента в которой вполне определено и которая содержит по меньшей мере:
- один источник углерода,
- протопорфирин,
- соли,
- аминокислоты,
- NAD или NADH,
- витамины,
- а также средства регулирования pH,
- собирают супернатант культуры, который обрабатывают для экстрагирования очищенного капсулярного полисахарида,
- конъюгируют капсулярный полисахарид с белком-носителем.
Согласно одному варианту осуществления полученный конъюгат дополнительно комбинируют с по меньшей мере одним или несколькими антигенами, предназначенными для вакцинации от одной или нескольких следующих инфекций: дифтерии, столбняка, полиомиелита, гепатита B, ветряной оспы, свинки, краснухи, инфекций, вызванных Neisseria meningitidis или Streplococcus pneumoniae, инфекций, вызванных ротавирусом, чтобы получить вакцинальную композицию, позволяющую одновременную иммунизацию от нескольких болезней.
Согласно изобретению культуральная среда является химически определенной, то есть известна химическая структура, а также количество каждого компонента. Такая среда не содержит сложного источника азота или углерода, такого как пептоны, казеины, сыворотки или другое, и, следовательно, при желании можно гарантировать, что она не содержит каких-либо элементов, напрямую происходящих от животных.
2
Изобретение относится к способу получения в промышленном масштабе капсулярного полисахарида Haemophilus influenzae типа b. Такой способ позволяет получить выходы по биомассе и капсулярным полисахаридам или PRP, совместимые с промышленными требованиями. Такой способ позволяет, в частности, получить антиген, исходя из штамма Haemophilus influenzae типа b, содержащего в своем генетическом коде по меньшей мере 2 копии локуса cap, кодирующего функции, позволяющие синтез капсул, без особого регулирования среды (например, регуляторы pH или pO), причем через 12 ч культивирования биомасса соответствует оптической плотности D.O. при 694 нм по меньшей мере 2,4, и количество связанного PRP составляет по меньшей мере 240 мг/л культуральной среды. Определение количества полученного PRP производилось методом анионообменной хроматографии высокого разрешения в сочетании с амперометрическим детектором (HPAEC-PAD) (Dionex) или методом, дающим эквивалентные результаты. Предпочтительно способ согласно изобретению позволяет получить количество PRP по меньшей мере 270 мг/л среды и еще более предпочтительно количество по меньшей мере 300 мг/л.
Из возможных источников углерода можно назвать любые источники, метаболизируемые штаммом Haemophilus influenzae типа b, в частности глюкозу, фруктозу, галактозу, глицерин, ксилозу, рибозу, фукозу, сиаловую кислоту, лактат. Можно также использовать 2 или более разных источников, в частности лактат и глюкозу. Согласно изобретению количество глюкозы, присутствующей в исходной среде, составляет от 5 до 25 г/л, в частности от 10 до 20 г/л, в частности от 12 до 16 г/л.
Количество лактата, присутствующего в исходной среде, может составлять от 0 до 15 г/л, в частности от 0,5 до 10 г/л.
Согласно одному варианту осуществления изобретения протопорфирин в среде представляет собой синтетический протопорфирин, например, поставляемый компанией Sigma Aldrich под индексом 258385 (Protoporphyrin disodium salt - динатриевая соль протопорфирина). Таким образом, можно использовать среду, для которой можно гарантировать, что она полностью лишена веществ животного происхождения. Альтернативно используют синтетический протопорфирин IX следующей формулы:
где R означает H или противоион, предпочтительно противоион щелочного металла, в частности натрия.
Такой протопорфирин IX и способ его получения описаны в патентной заявке FR2914302.
Согласно изобретению количество протопорфирина, присутствующего в исходной среде, предпочтительно составляет от 0,1 до 10 мг/л, в частности от 0,25 до 2 мг/л.
Культуральная среда согласно изобретению содержит соли, которые вносят минералы, необходимые для роста клеток, позволяют обеспечить осмотическое давление, благоприятное для бактерии, и которые дополнительно оказывают буферное действие на pH.
+
+
++
++
++
++
++
++
2-
-
2-
2-
-
-4
4
2
4
4
4
Предпочтительно использовать смесь одновалентных катионов, таких как Na и/или K, двухвалентных катионов, как Ca, Mg, Co, Zn, Mn, Fe, фосфатных анионов в виде HPO, HPO и/или PO, анионов SO, и Cl, в виде солевых растворов, причем молярность каждого из них обычно может варьироваться в диапазоне концентраций от 10 мМ до 1000 мМ.
2
4
2
4
4
2
2
4
2
2
4
2
2
2
4
2
4
2
2
2
4
2
Соли, присутствующие в культуральной среде, выбраны, в частности, из KHPO, KHPO, MgSO⋅7HO, NaHPO⋅12HO, NaHPO⋅2HO, CaCl⋅2HO, FeSO⋅7HO, ZnSO⋅7HO, CoCl⋅6HO, MnSO⋅HO.
Концентрации солей выбирают так, чтобы иметь осмолярность в интервале от 200 до 700 мосм/л, в частности от 300 до 400 мосм/л, в частности 350 мосм/л, и pH от 6,5 до 7,5.
Для этого культуральная среда согласно изобретению может содержать, в частности:
4
2
- MgSO⋅7HO в концентрации от 150 до 1500 мг/л,
2
2
- CaCl⋅2HO в концентрации от 6,5 до 52 мг/л,
4
2
- FeSO⋅7HO в концентрации от 1,25 до 10 мг/л,
4
2
- ZnSO⋅7HO в концентрации от 2,5 до 80 мг/л,
2
2
- CoCl⋅6HO от 0,5 до 2 мг/л,
4
2
- MnSO⋅HO от 2,5 до 10 мг/л,
- натрий, в частности, в форме 60%-ного лактата натрия, в количестве от 0 до 4 мл/л,
2
4
2
4
2
4
2
2
4
2
- KHPO и KHPO в концентрации, составляющей для каждого от 100 до 1200 мг/л, когда буферный эффект обеспечивается парой NaHPO⋅12HO/NaHPO⋅2HO.
2
4
2
- NaHPO⋅12HO в концентрации от 15 до 120 г/л,
2
4
2
2
4
2
- NaHPO⋅2HO в концентрации в 10-30 раз меньшей концентрации NaHPO⋅12HO.
2
4
2
4
2
4
2
4
2
4
2
4
2
2
4
2
Альтернативно буферный эффект можно обеспечить парой KHPO/KHPO; в этом случае концентрация KHPO составляет от 15 до 120 г/л, и концентрация KHPO в 10-30 раз ниже концентрации KHPO; концентрация NaHPO⋅12HO и NaHPO⋅2HO может тогда составлять от 100 до 1200 мг/л.
Можно отметить, что присутствие цинка среди названных солей было особенно выгодным для получения биомассы и PRP, в частности, в концентрации от 2,5 до 80 мг/л или, в частности от 5 до 20 мг/л. Очень хорошие результаты были получены при концентрации 20 мг/л.
2
4
2
4
2
4
2
4
В случае, когда pH культуральной среды регулируют в фазе культивирования путем добавления, в частности, сильно концентрированного основания, такого как NaOH или KOH, можно снизить количество солей, присутствующих в среде, в частности количество буферных пар NaHPO/NaHPO или KHPO/KHPO, при условии, однако, сохранения осмолярности на приемлемом уровне, то есть в интервале от 200 до 700 мосм/л, путем возможного добавления NaCl.
Согласно изобретению культуральная среда содержит также NAD или источник NAD, или любой другой эквивалентный коэнзим. NAD (или (β-никотинамид адениндинуклеотида), называемый также коэнзимом I или фактором V, является незаменимым фактором роста для культуры Haemophilus influenzae типа b. Он предпочтительно присутствует в концентрации от 0,5 до 50 мг/л, в частности от 2 до 10 мг/л, в частности в концентрации 5 мг/л культуральной среды. Он может быть внесен в среду в своей восстановленной форме NADH. Вместо NAD культуральная среда согласно изобретению может содержать предшественники NAD, которые будут способны утилизировать, такие как NADP/NADPH (β-никотинамид фосфата адениндинуклеотида), или NMN ((β-никотинамид аденинмононуклеотида), или NR (никотинамид рибозида), β-ацетилпиридинадениндинуклеотид (APAD), или β-ацетилпиридинмононуклеотид (APMN).
Согласно изобретению культуральная среда содержит аминокислоты, которые предпочтительно выбраны из аргинина, аланина, лизина, гистидина, триптофана, валина, изолейцина, лейцина, тирозина, фенилаланина, цистина (или эквивалента), аспарагина, глутамина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты. Рецептура культуральной среды согласно изобретению включает только аргинин, аланин, гистидин, триптофан, тирозин, фенилаланин, цистин, аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту. Альтернативно в культуральной среде присутствуют все вышеназванные аминокислоты.
Согласно одному частному варианту изобретения цистин заменен глутатионом или цистеином.
Согласно одному предпочтительному варианту осуществления в способе согласно изобретению применяется культуральная среда, не содержащая следующих аминокислот: L-метионина, L-глицина, L-пролина, L-серина и L-треонина. Действительно, присутствие этих аминокислот приводило к увеличению биомассы, но не к соответствующему увеличению выработки PRP.
Аминокислоты поставляются компанией Sigma в виде очень чистых порошков. Особенно предпочтительно эти аминокислоты имеют синтетическое происхождение или получены способами, гарантирующими, что они не содержат каких-либо элементов, напрямую поступающих от животного, чтобы исключить любой риск заражения передаваемыми инфекциями, в частности ESB (бычий губчатый энцефалит). Количество каждой аминокислоты выбирают так, чтобы оптимизировать рост клеток и образование PRP. Количество аспарагиновой кислоты, аспарагина и глутамина выбирают так, чтобы вызвать дефицит в клеточной культуре, что позволяет ориентировать метаболизм клетки на получение капсулярного полисахарида, и количества других аминокислот выбирают так, чтобы не было нехватки в фазе культивирования.
Согласно изобретению культуральная среда содержит, кроме того, витамины, которые выбраны из тиамина, пантотената, урацила, пироксантина, биотина, рибофлавина и пиридоксина. В контексте изобретения термин витамины охватывает также урацил и пироксантин, которые представляют собой азотсодержащие основания.
Особенно предпочтительно, что витамины, присутствующие в культуральной среде согласно изобретению, имеют неживотное происхождение, в частности являются синтетическими, что позволяет исключить любой риск заражения передающимися инфекциями, в частности ESB (бычий губчатый энцефалит). Используют, в частности, витамины, поставляемые компанией Sigma, степень чистоты которых точно известна, что позволяет иметь очень точную дозировку при приготовлении культуральной среды.
Количества витаминов, присутствующих в среде, выбирают так, чтобы оптимизировать получение биомассы и PRP.
Согласно одному частному варианту изобретения культуральная среда содержит цитруллин, который может заменить аргинин и урацил.
В этом случае количество цитруллина, содержащегося в культуральной среде, предпочтительно составляет от 150 до 500 мг/л.
Благодаря культуральной среде согласно изобретению удалось получить полирибосил-рибитол-фосфат в большем количестве, чем при использовании сред согласно уровню техники, не расходуя при этом больше углевода и не образуя больше загрязняющих веществ, в частности LPS.
Согласно одному варианту осуществления изобретения культивируемый штамм Haemophilus influenzae типа b является капсулярным штаммом, содержащим в своем генетическом коде по меньшей мере 2 копии локуса cap. Этот локус cap размером от 17 до 18 кб объединяет гены, экспрессия которых связана с синтезом и выносом капсулы. Экспрессия капсулы придает белый цвет бактерии, когда ее культивируют на особом агаре, поэтому колонии бактерий, обладающих локусом cap, называются белыми колониями, тогда как бактерии, не выносящие капсулярный полисахарид на поверхность капсулы, называются серыми колониями. Экспрессия капсулы потенциально подвержена генетической нестабильности, которая может вызвать появление мутантов, лишенных капсулы, что как следствие приводит к снижению образования PRP. Исследования позволили продемонстрировать, что среда с определенным химическим составом, используемая в способе по изобретению, позволяет обеспечить хорошую генетическую стабильность используемого штамма в течение примерно двадцати репликаций клеток.
Согласно изобретению культивирование бактерии Haemophilus influenzae типа b можно осуществить в несколько последовательных стадий для постепенного увеличения биомассы.
2
В этом случае производят посев бактерий, происходящих из лиофилизата или замороженного продукта, в объем среды, обычно не превышающий 1 л. По истечении ночи культивирования или когда оптическая плотность среды станет достаточной, эту первую культуру переводят во вторую культуральную среду, идентичную первой, но объем которой может быть до 10-20 раз больше. Количество бактерий, засеваемых во вторую среду, подбирают так, чтобы начальная оптическая плотность (D.O.) второй культуральной среды при 694 нм составляла от 0,2 до 0,4, чтобы облегчить быстрый рост популяции бактерий. Это второе культивирование обычно производят в ферментере, но можно использовать и другие типы резервуаров (колбы, роллерные колбы и т.п.). Когда культивирование осуществляют в ферментере, обычно в течение всего периода культивирования используют температуру 37°C±1°C, постоянное перемешивание, давление 0,1 бар, pO 30% и расход воздуха 0,25 объема газа на объем среды в минуту. В компетенции специалиста выбрать другие параметры для этого типа культивирования. К концу фазы экспоненциального размножения бактерий можно еще больше увеличить биомассу, переводя ее в другой ферментер большей емкости, применяя тот же порядок действий и т.д. Объемы полученной культуры могут достигать и даже превосходить 1000 л. Культивирование обычно осуществляют в периодическом режиме.
Наконец, из последней культуры после инактивации бактерий отбирают супернатант. Инактивацию классически реализуют с помощью раствора формалина в конечной концентрации 0,35-0,37% (об./об.). Супернатант классически отделяют от бактерий посредством стадии центрифугирования. PRP, содержащийся в полученном супернатанте, затем экстрагируют и очищают классическими способами, хорошо известными специалисту в данной области.
Собранный и очищенный PRP затем предпочтительно конъюгируют с белком-носителем, таким как столбнячный белок, чтобы сделать его T-зависящим и позволить, в частности, провести иммунизацию маленьких детей. Полученный таким образом антиген PRP-T можно затем использовать самостоятельно в моновакцине или комбинировать с другими антигенами, чтобы можно было провести одновременную вакцинацию от нескольких болезней.
Особенно предпочтительно изобретение предлагает способ получения вакцинной композиции, согласно которому полученный конъюгат комбинируют с по меньшей мере одним или нескольким антигенами, обычно присутствующими в детских прививках, в частности антигенами против дифтерии, столбняка, полиомиелита, гепатита B, инфекций, вызванных Neisseria meningitidis или Streplococcus pneumoniae, ветряной оспы, свинки, краснухи, инфекций, вызванных ротавирусом, и т.д. Согласно одному варианту осуществления конъюгат PRP-T находится в виде порошка, и другие антигены находятся в жидкой форме, причем все антигены смешивают непосредственно перед введением; согласно одному альтернативному варианту осуществления вакцинная композиция является полностью жидкой.
Таким образом, предлагаемый изобретением способ получения позволяет изготовить четырехвалентную вакцинную композицию, содержащую наряду с конъюгатом PRP-T антигены против дифтерии, столбняка, гепатита B. Альтернативно можно изготовить четырехвалентную вакцинную композицию, содержащую помимо конъюгата PRP-T, дифтерийный анатоксин, столбнячный анатоксин, бесклеточные антигены Bordetella pertussis в числе 2 (анатоксин и нитевидный гемагглютинин), или 3 (2 предыдущих+пертактин), или 5 (3 предыдущих+агглютиногены). Способ позволяет также изготовить пятивалентную вакцинную композицию, содержащую наряду с конъюгатом PRP-T дифтерийный анатоксин, столбнячный анатоксин, бесклеточные антигены Bordetella pertussis в числе 2, 3 или 5, а также инактивированные вирусы полиомиелита типа 1, 2 и 3.
Указанный способ позволяет также изготовить шестивалентную вакцинную композицию, содержащую помимо конъюгата PRP-T дифтерийный анатоксин, столбнячный анатоксин, бесклеточные антигены к Bordetella pertussis в числе 2, 3 или 5, гепатиту B, а также инактивированные вирусы полиомиелита типа 1, 2 и 3. Такая шестивалентная композиция может быть, в частности, жидкой и содержать на дозу 0,5 мл:
- дифтерийный анатоксин в количестве 20 МЕ,
- столбнячный анатоксин в количестве 40 МЕ,
- поверхностный антиген гепатита B из расчета 10 мкг,
- анатоксин Pertussis из расчета 25 мкг,
- нитевидный гемагглютинин Pertussis из расчета 25 мкг,
- PRP-T из расчета 12 мкг PRP,
- инактивированные вирусы полиомиелита типа 1, 2 и 3 в количестве соответственно 40, 8 и 32 D-антигенных единиц,
3+
- гидроксид алюминия из расчета 0,6 мг Al.
Альтернативно способ позволяет получить вакцинные композиции, в которых антигены коклюша образованы из цельных бактерий Bordetella pertussis.
Благодаря предлагаемому изобретением способу культивирования можно повысить образование полирибозил-рибитол-фосфата без увеличения количества биомассы, что позволяет уменьшить количество загрязнителей LPS; это преимущество способа по изобретению особенно важно для промышленности вакцин, где эти продукты вводят в качестве антигенов в вакцинные композиции и где количество LPS должно быть сведено к минимуму. Располагая способом, позволяющим обойтись без увеличения количества полученного LPS при большем количестве PRP, можно упростить последующий процесс очистки.
Пример 1. Приготовление культуральной среды согласно изобретению
Культуральную среду согласно изобретению готовили, исходя из базовой среды, в которую непосредственно перед приготовлением добавляли обогащающие растворы.
Состав базовой среды приведен в таблице I.
Таблица I
Соединения
Количество, мг на 1 л
Поставщик
Индекс продукта
Лактат натрия 60%
1,5 мл
Prolabo
27925.292
K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>
300
VWR Prolabo
26931.263
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>
300
VWR Prolabo
26923.298
MgSO<sub>4</sub>⋅7H<sub>2</sub>O
368
VWR Prolabo
25165.260
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>⋅12H<sub>2</sub>O
28620
VWR Prolabo
28028.298
NaH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>⋅2H<sub>2</sub>O
1870
VWR Prolabo
28015.294
L-аргинин
87
Sigma
A5006 или A8094
L-аланин
134
Sigma
A7627 или A7469 или A4349
L-аспарагин
198
Sigma
A0884 или A7094
L-лизин
140
Sigma
L5626 или L8662 или L7039
L-глутамин
220
Sigma
G3126 или G8540 или G5792
L-гистидин
78
Sigma
H8000 или H6034 или H3911
L-триптофан
200
Sigma
T0254 или T8941 или T4196
L-валин
115
Sigma
V0500 или V0513 или V4638
L-изолейцин
130
Sigma
12752 или 17403 или 15281
L-лейцин
130
Sigma
L8000 или L6914 или L8912
L-тирозин
180
Sigma
T3754 или T8566 или T4321
L-фенилаланин
165
Sigma
P5482
L-цистин
61
Sigma
C8755 или C7602 или C5735
L-аспарагиновая кислота
1065
Sigma
A9256 или A5474
L-глутаминовая кислота
1471
Sigma
G1251 или G8415
Пиридоксин HCl
4
Sigma
P5669
Рибофлавин
0,2
Sigma
R4500
Тиамин HCl
4
Sigma
T4625
Биотин
4
Sigma
B4501
Пантотенат Ca
4,5
Sigma
P5710
Урацил
70
Sigma
U0750
Пироксантин
20
Sigma
H9377
FeSO<sub>4</sub>⋅7H<sub>2</sub>O
2,5
Adrich
450278
ZnSO<sub>4</sub>⋅7H<sub>2</sub>O
5
Sigma
Z4750
CoCl<sub>2</sub>⋅6H<sub>2</sub>O
1
Fulka
60818
MnSO<sub>4</sub>⋅H<sub>2</sub>O
5
Sigma
M7634
CaCl<sub>2</sub>⋅2H<sub>2</sub>O
13
Panreac
131232.1211
Для приготовления 1 л среды добавляют в примерно 100 мл деминерализованной воды, при перемешивании на магнитной мешалке различные соединения, следуя порядку, описанному в таблице. Перед добавлением все порошки были предварительно растворены в небольшом объеме деминерализованной воды, в некоторых случаях с добавлением кислоты или основания.
Так, для валина, изолейцина и лейцина оказалось необходимым добавить к количествам, указанным в таблице, 140 мкл 10 н. KOH; к тирозину потребовалось добавить 280 мкл 10 н. KOH; к фенилаланину потребовалось добавить 210 мкл 37%-ной HCl, и к цистину потребовалось добавить 70 мкл 37%-ной HCl.
В конце устанавливали величину pH 7,2±0,1 добавлением 10 н. KOH (в случае, когда pH был слишком высоким, использовали 37%-ную HCl), затем добавляли деминерализованную воду до достижения желаемого объема.
Затем среду стерилизовали путем фильтрования через фильтр с порогом отсечки 0,22 мкм.
В результате среду можно было хранить 72 ч при 5°C.
Перед инокуляцией среды добавляли:
- 27,3 мл глюкозы концентрацией 512,8 г/л, полученной из безводной глюкозы D(+), поставляемой компанией VWR под индексом 24379.294,
- 5 мл раствора NAD 1 г/л, поставляется компанией Sigma под названием β-никотинамид гидрата адениндинуклеотида (индекс 43410),
- 4 мл маточного раствора, содержащего протопорфирин в концентрации 0,25 г/л и гидроксид аммония в концентрации 5 мл/л; причем протопорфирин поставляется компанией Sigma Aldrich под названием динатриевая соль протопорфирина IX (индекс 258385), и гидроксид аммония поставляется компанией VWR под названием аммиачный раствор 28% (индекс 21190.292),
с получением 1 л среды, готовой для инокуляции и содержащей наряду с компонентами, описанными в таблице I, дополнительные элементы в концентрациях, указанных в таблице II.
Таблица II
Соединения
Концентрация перед инокуляцией среды
Протопорфирин
1 мг/л
Гидроксид аммония
17,7 мкг/л
Безводная глюкоза
14 г/л
NAD
5 мг/л
Пример 2. Приготовление культуральной среды согласно уровню техники
Культуральную среду согласно уровню техники готовили, добавляя в базовую среду особые обогащающие растворы.
Состав базовой среды указан в таблице III.
Таблица III
Соединения
Концентрация в базовой среде
Пептон гороха
7,42 г/л
Лактат натрия 60%
1,5 мл/л
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>⋅12H<sub>2</sub>O
31,14 г/л
NaH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>⋅H<sub>2</sub>O
2,03 г/л
Цистин (L)
0,07 г/л
HCl (10н)
0,07 мл/л
Триптофан (L)
0,02 г/л
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
1 г/л
MgSO<sub>4</sub>⋅7H<sub>2</sub>O
0,4 г/л
CaCl<sub>2</sub>⋅2H<sub>2</sub>O
0,02 г/л
Для получения этой базовой среды к 100 мл деминерализованной воды, поддерживаемой при перемешивании на магнитной мешалке, добавляли каждый из элементов, следуя порядку, в каком они указаны в таблице. До этого каждый из элементов, поставляемых в виде порошка, был растворен в небольшом объеме деминерализованной воды.
4
2
4
Пептон гороха получен от компании Kerry, он продается под индексом Hy-pea 7404. (NH)SO поставляется компанией VWR под индексом 21333.296.
Другие компоненты приобретены у тех же поставщиков, они поставляются под теми же индексами, как описано в примере 1 для получения среды согласно изобретению.
Конечный pH устанавливали на значение 7,2±0,1 добавлением 10 н. KOH (в случае, когда pH был слишком высоким, использовали 37%-ную HCl).
Затем добавляли деминерализованную воду с получением желаемого объема, после чего стерилизовали в автоклаве, следуя циклу 30 мин при 120°C.
После стерилизации среду можно было хранить 15 дней при 4°C.
К этой базовой среде добавляли обогащающие растворы A, B, C и D.
Раствор A представляет собой раствор, содержащий безводную глюкозу в концентрации 512,8 г/л, поставляется компанией VWR под названием глюкоза D(+) безводная (индекс 24379.294).
Раствор B является маточным раствором, содержащим NAD в концентрации 1 г/л, поставляется компанией Sigma под названием β-никотинамид гидрата адениндинуклеотида (индекс 43410).
Раствор C является маточным раствором, содержащим NAD в концентрации 0,25 г/л и гидроксид аммония в концентрации 5 мл/л; причем протопорфирин поставляется компанией Sigma Aldrich под названием протопорфирин IX динатриевая соль (индекс 258385), и гидроксид аммония компанией VWR под названием аммиачный раствор 28% (индекс 21190.292),
Раствор D представляет собой концентрированный раствор, содержащий ультрафильтрат автолитического экстракта дрожжей (Ufel) концентрации 125 г/л; он поставляется компанией Biospringer под названием ультрафильтрат автолитического экстракта дрожжей (Ufel) (индекс Springer 0701).
Каждый из этих растворов стерилизовали фильтрованием на фильтре с порогом отсечки 0,22 мкм.
К 1 л базовой среды добавляли:
- 35,1 мл раствора A,
- 5 мл раствора B,
- 4 мл раствора C,
- 40 мл раствора D.
Добавление каждого раствора в базовую среду осуществляли под вытяжкой в ламинарном потоке, что привело к культуральной среде, содержащей перед инокуляцией помимо элементов, указанных в таблице III, дополнительные элементы в концентрациях, указанных в таблице IV.
Таблица IV
Соединения
Концентрация перед инокуляцией среды
Ультрафильтрат автолитического экстракта дрожжей (Ufel)
4,9 г/л
Протопорфирин
1 мг/л
Гидроксид аммония
17,7 мкг/л
Безводная глюкоза
18 г/л
NAD
5 мг/л
Пример 3. Сравнение образования PRP в среде согласно изобретению, описанной в примере 1, и в среде согласно уровню техники, описанной в примере 2
Эти сравнительные эксперименты проводили согласно протоколу культивирования в 2 стадии:
стадию предварительного культивирования проводили в стеклянной колбе Эрленмейера объемом 1 л без перегородок, при 36°C и перемешивании на 130 об/мин в течение 8 ч, по истечении которых штамм находился в конце линейной фазы роста; эту предкультуру инициировали путем инокуляции 280 мл культуральной среды инокулятом бактерии Haemophilus influenzae типа b, содержащим по меньшей мере 2 копии локуса cap, в концентрации 0,5% (об./об.);
затем перенос 90 мл предкультуры позволил произвести посев в ферментер Biostat B объемом более 2 л, содержащий 1,8 л культуральной среды. Этот ферментер поддерживали при 37°C, перемешивании на 400 об/мин с аэрацией 0,45 л/мин в течение 12 ч.
После 12 ч культивирования измеряли оптическую плотность (D.O.) на 694 нм, что позволило определить биомассу. Действительно, в предыдущих опытах удалось определить, что одна единица оптической плотности, измеренной при 694 нм, соответствует 0,64 г биомассы в сухой массе на литр.
Полное количество PRP в супернатанте культуры определяли анионообменной хроматографией высокого разрешения в сочетании с импульсным амперометрическим детектором (HPAEC-PAD, по методу, очень близкому к описанному в публикации Sturgess et al. (Vaccine 17 (1999) 1169-1178). Супернатант культуры фильтровали, проводя через фильтр с порогом отсечки 0,22 мкм, затем 500 мкл супернатанта подвергали ультрафильтрации, используя колонки Amicon ultra с порогом отсечки 10 кДа (ультратонкий фильтр, позиция UFC5010BK), и затем подвергали стадии основного гидролиза путем добавления NaOH.
Гидролиз протекал при температуре окружающей среды в течение минимум 4 ч.
3
3
Достоверность дозировки контролировали, используя внутренний эталон глюкозамин 1 фосфат (GlcN1P), присутствующий в растворе для гидролиза, и путем регулярного прохождения внутреннего контроля, имеющего известную концентрацию PRP. В сравнении с указаниями Sturgess et al., подвижная фаза состояла из NaOH 35 мМ и CHCOONa 114 мМ, и стадию регенерации осуществляли в течение 10 мин с NaOH 100 мМ и CHCOONa 400 мМ.
Полученные результаты приведены в таблице V.
Таблица V
Среда по изобретению(4 опыта)
Среда согласно уровню техники(1 опыт)
D.O. при 694 нм
2,52±0,14
3,9
Биомасса, г сухой массы на литр культуральной среды
1,74±0,09
2,6
Концентрация PRP, мг/л культуральной среды
349±22
169
Удельная производительность, мг PRP/г биомассы
199±3
66
Эти результаты показывают выгоду способа согласно изобретению для образования PRP: действительно, отметим, что хотя при одинаковом объеме культуральной среды полученная биомасса была больше, чем с культуральной средой согласно уровню техники, но количество PRP, напротив, было меньше.
Пример 4. Сравнение количества PRP и LPS, присутствующих в супернатанте культуры согласно способу по изобретению и в супернатанте культуры согласно способу уровня техники
Культивирование Haemophilus influenzae типа b осуществляли для сравнения на среде согласно изобретению и на среде согласно уровню техники по способу, описанному в примере 3, но с тем отличием, что базовая среда в способе по уровню техники содержала 10 г/л продукта кислотного гидролиза казеина, поставляемого компанией Solabia (индекс A1434), вместо пептона гороха, присутствовавшего в среде согласно примеру 3.
Время предварительного культивирования, как и в примере 3, составило 8 ч, и время культивирования 12 ч.
Количественное определение как PRP, так и LPS осуществляли по методу HPAEC-PAD; но количественное определение LPS проводили путем количественной оценки особого моносахарида, гептозы, исходя из спектра эталонов очищенного LPS, обработанного согласно тому же протоколу, причем внутренним контролем для этого количественного анализа была рамноза.
Полученные результаты указаны в таблице VI.
Таблица VI
Среда по изобретению(4 опыта)
Среда согласно уровню техники(3 опыта)
D.O. при 694 нм
2,5±0,1
3,9±0,3
Биомасса, г сухой массы на литр среды
1,7±0,1
2,5±0,2
Концентрация LPS, мг/л среды
5±1
4,6±1
Концентрация PRP, мг/л среды
349±22
17±5
Отношение PRP/LPS
74±15
38±6
Полученные результаты показывают выгоду способа согласно изобретению, который позволяет снизить количество полученного LPS по сравнению с количеством PRP.
Это является большим преимуществом способа по изобретению, так как это во многом упрощает операции очистки при сохранении надлежащего уровня безопасности.
Пример 5. Опыт, позволяющий оценить важность цинка
Изучали важность присутствия цинка в культуральной среде.
Для этого сравнивали три среды:
- среда, описанная в примере 1, обозначенная MS,
4
- среда, имеющая состав, идентичный составу из примера 1, но без ZnSO, обозначенная MS Zn-,
4
- среда, описанная в примере 1, но с концентрацией ZnSO в 4 раза выше, то есть 20 мг/л, обозначенная MS Zn++.
Указанные среды затем стерилизовали путем фильтрации через фильтр с порогом отсечки 0,22 мкм.
Сначала осуществляли одностадийный способ предварительного культивирования в 1-литровой колбе Эрленмейера без перегородок, в течение 16 ч при 36°C и перемешивании на 130 об/мин, засеивая 280 мл среды, описанной в примере 4, замороженными бактериями Haemophilus influenzae типа b, имеющими в своем генетическом коде по меньшей мере 2 копии локуса cap. Затем 9,5 мл предкультуры промывали в каждой из тестируемых культуральных сред перед засеванием культуры, что проводилось каждый раз в 500-мл колбе Эрленмейера из поликарбоната, с перегородкой, содержащей 170 мл тестируемой культуральной среды; культивирование проводили в течение 12 ч при 37°C и перемешивании на 150 об/мин.
Для каждой среды определяли биомассу, концентрацию PRP, а также количество LPS в конце культивирования, тем же способом, как описано в примерах 3 и 4, и рассчитывали отношения PRP/биомасса, а также LPS/биомасса и PRP/LPS.
Полученные результаты приведены в таблице VII.
Таблица VII
MS
MS Zn-
MS Zn++
Биомасса, г сухой массы на литр культуральной среды
1,98
1,23
2,22
Концентрация PRP, мг/л культуральной среды
319
203
372
Удельная производительность, мг PRP/г биомассы
160
165
167
Концентрация LPS, мг/л культуральной среды
11,5
8,8
12,1
Отношение LPS/биомасса, мг/г биомассы
6,1
7,2
5,5
Отношение PRP/LPS, мг/мг
30
23
31
Эти результаты показали, что присутствие цинка в культуральной среде позволяет значительно повысить образование биомассы, а также образование PRP, однако без пропорционального увеличения количества LPS.
Пример 6. Опыт в ферментере на 5 л
Проводили культивирование Haemophilua injluenzae типа b в культуральной среде, описанной согласно изобретению в примере 1, используя только продукты, которые согласно гарантиям поставщиков не содержат животных источников, и используя синтетический протопорфирин, как описано в патентной заявке FR2914302 и поставляется компанией SOLVIAS AG под названием: протопорфирин IX динатриевая соль (индекс SOL20402). Затем проводили опыты способом, описанным в примере 3, за исключением того, что использовали ферментеры объемом 5 л, поддерживаемые при 37°C, перемешивании 550 об/мин и аэрации 0,5 л/мин. Объем инокулята составлял в таком случае 280 мл, то есть весь объем предкультуры из колбы Эрленмейера.
Определение концентрации PRP и LPS производили, следуя протоколам, описанным в примерах 3 и 4.
Полученные результаты приведены в таблице VIII.
Таблица VIII
Среда без животных источников согласно изобретению
D.O. при 694 нм
3,58
Биомасса, г сухой массы на литр среды
2,29
Концентрация PRP, мг/л среды
567
Удельная производительность, мг PRP/г биомассы
247
Эти результаты подтверждают предыдущие результаты и демонстрируют выгоду от способа согласно изобретению для получения больших количеств PPR.
Пример 7. Сравнение образования биомассы и PRP на среде согласно изобретению, описанной в примере 1, и на химически определенных средах, описанных в уровне техники
Проводили культивирование Haemophilus influenzae типа b в культуральной среде согласно изобретению, описанной в примере 1, а также в 8 средах, описанных в публикациях в связи с культурой Haemophilus influenzae и представленных как имеющие определенный химический состав.
Эти 8 сред готовили, следуя рекомендациям авторов. Речь идет о средаx в хронологическом порядке:
Talmadge, Herriott: Biochemical and Biophysical Research Communications, (March 1960), Vol. 2 N°3, p. 203-206),
Butler: J. gen. Microbiol. (1962), 27, 51-60,
Wolin: J. Bacteriol. Vol. 85, (1963) Notes, p. 253-254,
Herriott et al.: Journal of Bacteriology, (Feb. 1970), Vol. 101, N°2, 513-516,
Klein, Luginbuhl: Journal of General Microbiology (1979), 113, 409-411,
Coleman et al.: Journal of Clinical Microbiology, (Sept 2003), Vol. 41, N°9 p. 4408-4410.
Сведения относительно продуктов, использованных для получения этих 8 сред, приводятся в таблице IX.
Таблица IX
Продукты
Поставщик
Индекс продукта
Уридин
Sigma
U3003
Инозин
Sigma
14125
Аденозин
Sigma
A4036
Гуанин
Sigma
G6779
Гуанозин
Sigma
LG6264
Витамин B12
Sigma
V2876
Цитруллин
Sigma
C7629
Холинхлорид
Fulka
26978
Тимидин
Sigma
T9250
Инозитол
Sigma
15125
Путресцина дигидрохлорид
Sigma
P5780
Никотинамид
Sigma
N0636
Гематин свиной
Sigma
H3281
Гемин
Fulka
51280
Олеат натрия
Sigma
O7501
Ацетат натрия
Fulka
71185
Фолиевая кислота
Sigma
F7876
Поливиниловый спирт
Sigma
341584
Триэтаноламин
Sigma
90278
Глицилглицин буфер
libios
B-GLYGLY250
Tween 40
Sigma
P1504
Tween 80
Sigma
P1754
Буфер Tris
VWR
33621,260
Этилендиамина тетраацетат
VWR
20302.180
HEPES
Sigma
H3375
Глутатион
Sigma
G6013
Аденин
Sigma
A8626
Пралин
Sigma
P0380
Треонин
Sigma
T8625
Глицин
Sigma
G7126
Метионин
Sigma
M9625
Серин
Sigma
S4500
Глицерин
VWR
24387.292
K<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
VWR
26994.293
KCl
VWR
26764.298
MgCl<sub>2</sub>⋅6H<sub>2</sub>O
Panreac
131396.1211
NaCl
VWR
27810.295
NaHCO<sub>3</sub>
VWR
27778.260
NH<sub>4</sub>Cl
VWR
21236.291
RPMI 1640 с L-глутамином и 25 мМ HEPES
Invitrogen
Старый индекс, приведенный в публикации Coleman (2003) индекс 61870036 => новый индекс 52400025
Пируват натрия MEM 100 мМ
Invitrogen
Старый индекс, приведенный в публикации Coleman (2003) индекс 11360070 => новый индекс 11360039
Затем среды стерилизовали путем фильтрования через фильтр с порогом отсечки 0,22 мкм.
Сначала осуществляли одностадийный способ предварительного культивирования в 1-литровой колбе Эрленмейера без перегородок, в течение 16 ч при 36°C с перемешиванием на 130 об/мин, засеивая 280 мл среды, описанной в примере 4, замороженными бактериями Haemophilus influenzae типа b, имеющими в своем генетическом коде по меньшей мере 2 копии локуса cap. Затем 9,5 мл предкультуры промывали в каждой из тестируемых культуральных сред перед засеванием для культивирования, которое проводится каждый раз в 500-мл колбе Эрленмейера из поликарбоната, с перегородкой, содержащей 170 мл испытуемой культуральной среды; культивирование проводили в течение 12 ч при 37°C и перемешивании на 150 об/мин. Каждый опыт проводили по меньшей мере 3 раза.
Для каждой среды каждый час измеряли D.O. при 694 нм и определяли концентрацию PRP в конце культивирования тем же способом, как описано в примере 3. Результаты по D.O. воспроизведены на фиг. 1.
Результаты определения PRP приведены в таблице X.
Таблица X
Через 12 ч
D.O. при 694 нм
PRP (мг/л)
Среда по изобретению
2,86±0,12
320±15
Talmadge
0,28±0,10
20±1
Butler
0,04±0,00
2±0
Wolin
0,04±0,00
6±0
Herriot Mic-cit
1,26±0,15
138±7
Herriot Mie
0,98±0,13
101±5
Klein MMA (cit)
0,38±0,01
40±2
Klein MME
0,20±0,03
27±1
Coleman
1,43±0,04
204±10
Пример 8. Получение PRP в промышленном масштабе (1000 л)
Готовили культуральную среду согласно изобретению, имеющую состав как в примере 1 за исключением цинка, концентрация которого составляет 20 мг/л вместо 5 мг/л. Действительно, пример 5 показал, что эта концентрация позволяла получить больше PRP без увеличения количества LPS.
Среда для предварительного культивирования и культивирования была одинаковой за исключением pH (начальный pH 7,2±0,1, затем произвольный pH для предкультур и установка pH на значение 6,7±0,1 для продуктовой культуры).
Среду готовили как в примере 1. После смешения соединений, предварительно растворенных в небольшом объеме очищенной воды, в некоторых случаях с добавлением кислоты или основания (ср. пример 1), и перед добавлением очищенной воды до 100% pH устанавливали на значение 7,2±0,1 для предкультур и на 6,7±0,1 для окончательной культуры (10 н. гидроксидом калия или натрия  или 37%-ной HCl).
Затем среду стерилизовали путем фильтрования через фильтр с порогом отсечки 0,22 мкм.
Полученную так среду можно хранить 72 ч при 5°C.
Перед инокуляцией среды добавляли:
глюкозу 512,8 г/л, полученную из безводной глюкозы D(+), поставляемой компанией VWR под индексом 24379.294,
раствор NAD 1 г/л, поставляется компанией Sigma под названием β-никотинамид гидрата адениндинуклеотида (индекс 43410),
маточный раствор, содержащий протопорфирин в концентрации 0,25 г/л и гидроксид аммония в концентрации 5 мл/л; причем протопорфирин поставляется компанией Sigma Aldrich под названием протопорфирин IX динатриевая соль (индекс 258385), и гидроксид аммония компанией VWR под названием аммиачный раствор 28% (индекс 21190.292),
с получением среды, готовой к инокуляции и содержащей помимо элементов, описанных в таблице I из примера 1, дополнительные элементы в концентрациях, указанных в таблице II из примера 1 (за исключением глюкозы с конечной концентрацией 14,87 г/л вместо 14 г/л).
Способ в масштабе 1000 л содержал 3 серии предкультур:
первые предкультуры получали в колбе Эрленмейера на 1 л без перегородок, содержащей 290 мл полной культуральной среды, при 37°C, перемешивании на 130 об/мин, в течение 17-18 ч. Эти предкультуры инициировали путем инокуляции культуральной среды инокулятом бактерии Haemophilus influenzae типа b, содержащей по меньшей мере 2 копии локуса cap, со степенью инокуляции, соответствующей целевой начальной оптической плотности D.O. при 694 нм 0,014;
2
2
вторую серию предкультур получали в ферментере на 6,8 л. Два ферментера, содержащие 5,2 л полной культуральной среды, засеивали каждый 260 мл предкультуры из серии 1. Эти ферментеры поддерживали в течение 4 ч при 37°C±1°C, при начальном pH 7,2±0,2, парциальном давлении кислорода pO, удерживаемом на значении 30% согласно каскадной схеме, включающей усиление перемешивания (от 500 до 800 об/мин), затем повышение аэрации (от 0,5 до 2,5 л/мин) и затем увеличение расхода чистого O от 0 до 6 л/мин;
2
2
третью серию предкультур получали в ферментере на 120 л, содержащем 57 л полной среды, которую засеивали 5,8 л предкультуры из серии 2. Этот ферментер поддерживали в течение 3 ч 10 мин при 37°C±1°C, при начальном pH 7,2±0,2, pO удерживали на значении 30% согласно каскадной схеме, включающей усиление перемешивания (от 300 до 425 об/мин), затем повышение аэрации (от 6 до 28 л/мин) и затем увеличение расхода чистого O от 0 до 50 л/мин.
2
2
Промышленное культивирование реализовали в ферментере на 1000 л, содержащем 778 л полной среды, которую засеивали 39 л предкультуры из серии 3. Этот ферментер поддерживали при 32°C±1°C, с установкой pH на значение 6,7±0,2 (2,5 н. раствором гидроксида натрия), pO удерживали на 70% согласно каскадной схеме, включающей усиление перемешивания (от 100 до 230 об/мин), затем повышение аэрации (от 70 до 150 л/мин) и затем увеличение расхода чистого O от 0 до 500 л/мин. Кроме того, при необходимости добавляли противовспениватель (Biospumex 4%-ный) в зависимости от уровня пены.
После 12 ч культивирования измеряли D.O. при 694 нм, что позволило определить биомассу (согласно соответствию одной единицы D.O. 0,64 г сухой биомассы). Определение концентрации PRP и LPS проводили, следуя протоколам, описанным в примерах 3 и 4.
Полученные результаты приведены в таблице XI.
Таблица XI
Среда согласно изобретению(1 опыт)
D.O. при 694 нм
3,45
Биомасса, г сухой массы на литр культуральной среды
2,21
Концентрация PRP, мг/л культуральной среды
865
Удельная производительность, мг PRP на г биомассы
392
Концентрация LPS, мг/л культуральной среды
35,6
Отношение LPS/биомасса, мг/г биомассы
16,1
Отношение PRP/LPS, мг/мг
24,3
Эти результаты показали преимущество способа согласно изобретению для образования PRP и для отношения PRP/LPS, причем результаты продемонстрированы в промышленном масштабе.