Способ выделения опухолевых клеток из периферической крови
METHOD FOR ISOLATION OF TUMOR CELLS FROM PERIPHERAL BLOOD

Изобретение относится к области молекулярной/клеточной биологии и диагностической медицины, а именно к разработке способов выделения клеток определенного типа из биологических образцов и может быть  использовано для диагностики онкологических заболеваний, пренатальной диагностики и др.
Задачи выделения малочисленных диагностически значимых клеток из периферической крови актуальны в различных областях медицины. В частности,  разработка методов выделения и характеризации опухолевых клеток, отделившихся от основной опухоли и циркулирующих в периферической крови (так называемых циркулирующих клеток опухоли), является активно развивающейся областью науки и биотехнологии. Хотя происхождение метастазов и факторы, определяющие их развитие в том или другом органе, до конца не изучены, не вызывает сомнения, что циркулирующие опухолевые клетки играют основную роль в их образовании. В то время как обнаружение микрометастазов является дорогостоящим и ограничено по чувствительности возможностями существующих методов визуализации, анализ периферической крови для обнаружения циркулирующих клеток опухоли призван обнаружить предпосылки к метастазированию до фактического образования метастазов, а в силу своей малоинвазивности может проводиться так часто, как требуется. Поэтому, в случае достаточной чувствительности и специфичности, выделение и исследование циркулирующих клеток опухоли может быть в дальнейшем использовано для контроля прогресса и хода лечения онкологических заболеваний. Установление опухолевой принадлежности детектируемых клеток требует цитологического, а в ряде случаев иммуноцитохимического и генетического анализа обнаруженных клеток. Поэтому среди способов выделения циркулирующих опухолевых клеток из периферической крови наиболее пригодными для клинического применения являются те из них, которые позволяют проведение цитологического исследования выделенных клеток с целью подтверждения их опухолевой природы.
Известен способ селективного выделения популяции жизнеспособных клеток из биологических жидкостей, защищенный  патентом РФ № 2 423 698 C1, кл. G01N 33/48, G01N 33/53 , опубл 10.07.2011.
Для выделения популяции жизнеспособных клеток образец биологической жидкости помещают в ячейку микрофлюидного устройства, содержащую в качестве фильтрующего материала кремниевую микроканальную матрицу со сквозными отверстиями размером 3-30 мкм и длиной каналов 50-300 мкм, и пропускают ее через матрицу со скоростью 0,1-4 мл/мин. В случае разделения клеток по размеру, фракцию клеток, имеющих размер меньше, чем размер сквозных отверстий в матрице, собирают после прохождения микроканальной матрицы, а более крупные клетки элюируют с каналов микроканальной матрицы обратным током элюента. В случае рецептор-специфичного выделения клеток поверхность матрицы предварительно модифицируют антителами против специфических рецепторов клеток, а целевые клетки элюируют с каналов матрицы изотипическими иммуноглобулинами или гаптенами.
Недостатком известного способа является непрозрачность используемой кремниевой матрицы и, как следствие, невозможность цитологического исследования задержанных ей клеток.
Известен способ обнаружения или выделения/получения циркулирующей опухолевой клетки, использующий метод пролиферации клеток, защищенный патентом РФ № 2 707 083 С1, кл. G01N 33/487, C12N 5/09, C12N 5/095, опубл. 03.03.2016.
В известном способе для выделения циркулирующих опухолевых клеток сначала производят выделение мононуклеарной фракции периферической крови, затем производят посев полученной фракции в луночный планшет, в который предварительно вводят культуральную среду для культивирования циркулирующих опухолевых клеток и инкубируют посеянные клетки. После инкубации культуральную среду удаляют и обнаруживают адгезивные опухолевые клетки, прикрепленные к лунке планшета.
Недостатком описанного способа является длительность проведения анализа.
Наиболее близким к заявляемому изобретению, выбранным в качестве прототипа, является способ осторожного отделения жизнеспособных спорадических клеток  из жидкостей организма, таких как кровь, от злокачественных выпотов, жидкости бронхоальвеолярного лаважа, жидкости перитонеального лаважа и околоплодных вод. описанный  в  WO 2014/198242 Al, опубл.2014.12.18. Al
В способе используется  фильтрующая мембрана, которая находится в тесном контакте с абсорбирующим материалом. Используя настоящий способ, можно изолировать, например, циркулирующие и диссеминированные опухолевые клетки, клетки эндометрия и циркулирующие клетки трофобласта, что дает возможность последующего обнаружения, количественной оценки, характеризации и культивирования указанных клеток.
Недостатком известного способа является недостаточная достоверность определения опухолевой принадлежности изолированных клеток, связанная с невозможностью их полноценного цитологического анализа непосредственно на трековой мембране, без их культивирования.
Техническая проблема, решаемая предлагаемым изобретением,  - создание эффективного способа выделения опухолевых клеток из периферической крови с помощью фильтрации.
Технический результат от использования изобретения заключается в повышении достоверности определения патологической природы опухолевых клеток, циркулирующих в периферической крови, за счет сохранности и повышения качества цитологической картины задерживаемых трековой мембраной клеток.
Указанный технический результат достигается тем, что в способе выделения опухолевых клеток из периферической крови, включающем разбавление буфером периферической крови и фильтрацию через трековую мембрану с порами диаметром меньшим, чем диаметр выделяемых клеток, фильтрацию осуществляют из разбавленной буфером периферической крови в буфер при пониженном давлении, трековую мембрану с задержанными на ней опухолевыми клетками заливают раствором, сохраняющим структуру клеток, таким как сыворотка крови человека или животных,  высушивают путем вращения трековой мембраны вокруг оси, перпендикулярной ее поверхности и проводят цитологическое исследование опухолевых клеток непосредственно на трековой мембране .
В качестве раствора, сохраняющего структуру клеток, используют  фетальную телячью сыворотку.
Предварительно на трековой мембране могут быть иммобилизованы антитела к поверхностным антигенам выделяемых опухолевых клеток, отсутствующим на поверхности нормальных клеток крови, например, к эпителиальной молекуле адгезии (EpCAM).
Изобретение поясняется клиническими примерами и иллюстрациями.
На фиг. 1 изображена фильтр-кассета, общий вид
На фиг. 2 – цитологическая картина к примеру 2 задержанных трековой мембраной клеток, когда до фильтрации фильтр-кассету не заполняют фосфатным буфером;
На  фиг. 3 – цитологическая картина к примеру 3 задержанных трековой мембраной клеток, когда после окончания фильтрации трековую мембрану высушивают на воздухе и окрашивают по Паппенгейму,
На фиг. 4 - цитологическая картина к примеру 1  задержанных трековой мембраной клеток, когда фильтрацию осуществляют предлагаемым способом.
Фиг. 5 - цитологическая картина к примеру 4  задержанных трековой мембраной циркулирующих опухолевых клеток пациента с плоскоклеточной карциномой слизистой оболочки полости рта.
Фильтр-кассета (фиг. 1) состоит из верхней части 1, содержащей трубку для загрузки образца периферической крови 2, расположенной между двумя кольцевыми силиконовыми прокладками 3 трековой мембраны 4 с порами диаметром меньшим, чем диаметр выделяемых клеток, и нижней части 5, содержащей трубку 6 для подключения к шприцевому насосу 7. Винты 8 и гайки 9 служат для скрепления обеих половин 1 и 5 фильтр-кассеты между собой. В шприцевом насосе 7 установлен шприц 10.
Способ выделения опухолевых клеток из периферической крови осуществляют следующим образом.
5
2
Трековую мембрану 4 с порами диаметром меньшим, чем диаметр выделяемых клеток, например, трековую мембрану в виде диска диаметром 25 мм из полиэтилентерефталата толщиной 18 мкм с порами диаметром 7±0,4 мкм и плотностью пор 10/см производства Лаборатории ядерных реакций ОИЯИ, г. Дубна, вкладывают между двумя кольцевыми прокладками 3, например, кольцами из пищевого силикона толщиной 1 мм с внешним диаметром 25 мм и внутренним диаметром 16 мм. Кольцевые прокладки 3 с трековой мембраной 4 между ними вкладывают между верхней частью 1 фильтр-кассеты  и нижней частью 5 фильтр-кассеты  и скрепляют с помощью винтов 8 и гаек 9.
Затем с помощью силиконовой трубки 6 подключают нижнюю часть 5 фильтр-кассеты  к шприцевому насосу 7, например SPLab01, Shenchen Precision Pump Co., Ltd., со шприцем 10, наполненным фосфатным буфером рН 7.2-7.4, и, включив шприцевой насос 7 на инфузию в направлении от шприца 10, заполняют фильтр-кассету буфером. После этого заливают в трубку 2 для загрузки образца в верхней части 1 фильтр-кассеты  образец периферической крови пациента, разбавленной в 2 – 2,5 раза фосфатным буфером рН 7.2-7.4. Начинают фильтрацию разбавленной буфером периферической крови в буфер при пониженном давлении, созданном за счет включения шприцевого насоса 7 в режим инфузии в направлении к шприцу 10  со скоростью не более 0.5 мл/мин. После прохождения всей разбавленной периферической крови через трековую мембрану 4, разбирают фильтр-кассету, вынимают трековую мембрану 4 с задержанными на ней опухолевыми клетками и заливают ее 50-100 мкл  раствора, сохраняющего структуру клеток, таким как сыворотка крови человека или животных (например, фетальная телячья сыворотка, Sigma-Aldrich, USA). Затем сливают с трековой мембраны 4 излишки раствора, сохраняющего структуру клеток, кладут мембрану 4 клетками вверх на предметное стекло, и высушивают ее путем вращения мембраны на предметном стекле вокруг оси, перпендикулярной его поверхности со скоростью 4000-6000 об/мин с помощью специальной центрифуги, например Microarray High-Speed Centrifuge, Arrayit corporation, USA. После высушивания трековую мембрану 4 на стекле окрашивают по Паппенгейму для цитологического исследования, которое проводят непосредственно на трековой мембране 4.
Использование буфера с рН 7.2-7.4 объясняется тем, что данный диапазон рН является физиологическим для плазмы крови, при другом рН возможно изменение объема или повреждение клеток. При разбавлении периферической крови перед фильтрацией менее, чем в два раза, могут забиваться поры трековой мембраны 4 вследствие слишком высокой концентрации клеток в образце. Разбавление более, чем в два раза, возможно, но большее, чем в 2,5 раза,   разбавление приводит к увеличению общего объема фильтруемого образца и, как результат, к увеличению времени фильтрации.
Давление, создаваемое в буфере под трековой мембраной, определяется скоростью откачки жидкости и параметрами системы, например, диаметром трубок.
Максимальная рекомендуемая скорость откачки 0.5 мл/мин выбрана как приблизительно в 10 раз меньшая, чем скорость фильтрации в той же фильтр-кассете, если не подключать шприцевой насос 7, и трубка 6, присоединенная к нижней части 5 фильтр-кассеты, будет открытой снизу. Поскольку фильтрация эритроцитов и лейкоцитов через трековую мембрану 4 сопряжена с значительной обратимой деформацией клеток, увеличение скорости фильтрации выше определенного порога может приводить к повреждению фильтруемых клеток за счет создания высокой концентрации клеток и повышенного давления в области непосредственно над мембраной. Фильтрация со скоростью меньшей, чем 0.5 мл/мин, не влияет на результаты, но увеличивает общее время фильтрации.
Пример 1
Выделение опухолевых клеток из смеси нормальной периферической крови и клеточной линии рака молочной железы MCF7 по предлагаемому способу.
5
2
На трековой мембране 4 из полиэтилентерефталата толщиной 18 мкм с порами диаметром 7±0,4 мкм и плотностью пор 10/см производства Лаборатории ядерных реакций ОИЯИ, г. Дубна, иммобилизуют антитела к поверхностному антигену выделяемых опухолевых клеток, эпителиальной молекуле адгезии (EpCAM), отсутствующему на поверхности нормальных клеток крови.
0
Для этого трековую мембрану обрабатывают кислородной плазмой (Harrick plasma PDC-002-CE, давление кислорода в камере -  400 mTorr, режим “HIGH” (частота 12 МГц))  в течении 3 минут. Затем заливают обработанную плазмой трековую мембрану 4 раствором антител к EpCAM в концентрации 50 мкг/мл в фосфатном буфере рН 7.2-7.4. Залитую раствором антител трековую мембрану 4 помещают во влажную камеру и инкубируют в течение 10-14 часов при +4 С, затем отмывают 3 раза пятикратным объемом фосфатного буфера рН 7.2-7.4 и высушивают.
0
2
3
Клеточную линию MCF7 культивируют при температуре 37 С при 5% СО в среде DMEM с GlutaMAX-1, Gibco, USA, с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки, Sigma-Aldrich, USA, и раствора пенициллина-стрептомицина, BioWest, USA. Клетки отделяют от стенок культивационных флаконов с использованием раствора TrypLE, Gibco, USA, и определяют их концентрацию с помощью камеры Горяева. Венозную кровь здорового донора, взятую на КЭДТА в качестве антикоагулянта, разбавляют в 2 раза фосфатным буфером рН 7.2-7.4, и добавляют суспензию клеток клеточной линии MCF7 из расчета 100 клеток на 1 мл конечного объема.
Сборку фильтр-кассеты (фиг. 1) осуществляют следующим образом. Модифицированную трековую мембрану 4 вкладывают между двумя кольцевыми прокладками 3. Кольцевые прокладки 3 и трековую мембрану 4 помещают между верхней частью 1 и нижней частью 5 фильтр-кассеты и скрепляют обе части фильтр-кассеты с помощью винтов 8 и гаек 9. Затем с помощью силиконовой трубки 6 подключают нижнюю часть 5 фильтр-кассеты к шприцевому насосу 7 SPLab01, Shenchen Precision Pump Co., Ltd., со шприцем 10, наполненным фосфатным буфером рН 7.2-7.4. После этого, включив шприцевой насос 7 на инфузию в направлении от шприца 10, заполняют фильтр-кассету буфером. После этого заливают в трубку 2 для загрузки образца  приготовленную ранее смесь разбавленной крови здорового донора с клеточной линией MCF7. Начинают фильтрацию, включив шприцевой насос 7 в режим инфузии в направлении к шприцу 10 со скоростью не более 0.5 мл/мин. После прохождения всей разбавленной периферической крови через трековую мембрану 4, разбирают фильтр-кассету, вынимают трековую мембрану с задержанными на ней опухолевыми клетками и заливают ее 100 мкл фетальной телячьей сыворотки, Sigma-Aldrich, USA.
Затем сливают с трековой мембраны 4 излишки фетальной телячьей сыворотки, кладут мембрану клетками вверх на предметное стекло, и высушивают ее путем вращения вокруг оси, перпендикулярной ее поверхности со скоростью 5000 об/мин с помощью центрифуги Microarray High-Speed Centrifuge, Arrayit corporation, USA. После высушивания трековую мембрану 4 на стекле окрашивают по Паппенгейму для цитологического исследования клеток непосредственно на трековой мембране. Типичный результат  проведения описанной процедуры представлен на фиг. 4. На фиг. 4 можно видеть мономорфную популяцию эпителиальных клеток с частично вакуолизированной цитоплазмой, ядрами округлой формы с одним или несколькими ядрышками, полностью соответствующую виду клеточной линии MCF7 в стандартных цитологических препаратах.
Пример 2.
Выделение опухолевых клеток из смеси нормальной периферической крови и клеточной линии рака молочной железы MCF7 с фильтрацией из жидкой фазы в воздушную
5
2
3
Модификацию трековой мембраны 4 из полиэтилентерефталата толщиной 18 мкм с порами диаметром 7±0,4 мкм и плотностью пор 10/см производства Лаборатории ядерных реакций ОИЯИ, г. Дубна, осуществляют аналогично примеру 1. Клеточную линию MCF7 культивируют аналогично примеру 1. Венозную кровь здорового донора, взятую на КЭДТА в качестве антикоагулянта, разбавляют в 2 раза фосфатным буфером рН 7.2-7.4, и добавляют суспензию клеток клеточной линии MCF7 из расчета 100 клеток на 1 мл конечного объема. Фильтр-кассету (фиг. 1) собирают аналогично примеру 1. Затем с помощью силиконовой трубки 6 подключают нижнюю часть фильтр-кассеты к шприцевому насосу 7 SPLab01, Shenchen Precision Pump Co., Ltd., с шприцем 10. Заливают в трубку 2 для загрузки образца  приготовленную ранее смесь разбавленной крови здорового донора с клеточной линией MCF7. Начинают фильтрацию, включив шприцевой насос 7 в режим инфузии в направлении к шприцу 10 со скоростью не более 0.5 мл/мин. После прохождения всей фильтруемой клеточной смеси через трековую мембрану 4, разбирают фильтр-кассету, вынимают трековую мембрану с задержанными на ней опухолевыми клетками и заливают ее 100 мкл фетальной телячьей сыворотки, Sigma-Aldrich, USA. Затем сливают с трековой мембраны излишки фетальной телячьей сыворотки, кладут мембрану клетками вверх на предметное стекло, и высушивают ее путем вращения вокруг оси, перпендикулярной ее поверхности со скоростью 5000 об/мин с помощью центрифуги Microarray High-Speed Centrifuge, Arrayit corporation, USA. После высушивания трековую мембрану 4 на стекле окрашивают по Паппенгейму для цитологического исследования клеток непосредственно на трековой мембране. Типичный результат  проведения описанной процедуры представлен на фиг. 3. На фиг. 3 можно видеть голое ядро клетки (внизу) и безъядерный фрагмент цитоплазмы (в центре), что свидетельствует о повреждении клеток в процессе фильтрации по данному протоколу.
Пример 3.
Выделение опухолевых клеток из смеси нормальной периферической крови и клеточной линии рака молочной железы MCF7 без последующей сушки в цитоцентрифуге.
5
2
3
Модификацию трековой мембраны 4 из полиэтилентерефталата толщиной 18 мкм с порами диаметром 7±0,4 мкм и плотностью пор 10/см производства Лаборатории ядерных реакций ОИЯИ, г. Дубна, осуществляют аналогично примеру 1. Клеточную линию MCF7 культивируют аналогично примеру 1. Венозную кровь здорового донора, взятую на КЭДТА в качестве антикоагулянта, разбавляют в 2 раза фосфатным буфером рН 7.2-7.4, и добавляют суспензию клеток клеточной линии MCF7 из расчета 100 клеток на 1 мл конечного объема. Фильтр-кассету (фиг. 1) собирают аналогично примеру 1. Затем с помощью силиконовой трубки 6 подключают нижнюю часть 5 фильтр-кассеты к шприцевому насосу 7 SPLab01, Shenchen Precision Pump Co., Ltd., с шприцем 10, наполненным фосфатным буфером рН 7.2-7.4. После этого, включив шприцевой насос 7 на инфузию в направлении от шприца 10, заполняют фильтр-кассету буфером. После этого заливают в трубку 2 для загрузки образца приготовленную ранее смесь разбавленной крови здорового донора с клеточной линией MCF7. Начинают фильтрацию в буфер при пониженном давлении, созданном за счет включения шприцевого насоса 7 в режим инфузии в направлении к шприцу 10  со скоростью не более 0.5 мл/мин. После прохождения всей фильтруемой клеточной смеси через трековую мембрану 4, разбирают фильтр-кассету, вынимают трековую мембрану 4 с задержанными на ней опухолевыми клетками, помещают на предметное стекло и высушивают на воздухе при комнатной температуре. После высушивания трековую мембрану 4 на стекле окрашивают по Паппенгейму для цитологического исследования клеток непосредственно на трековой мембране. Типичный результат  проведения описанной процедуры представлен на фиг. 4. На фиг. 4 видна полностью разрушенная клетка (внизу), а также клетки с частично отсутствующей цитоплазмой и разрыхленной структурой хроматина ядра (в центре).
Сравнение цитологической картины клеток линии MCF7 на фиг. 2 (после фильтрации по предлагаемому способу) с результатами неполного протокола (фиг. 3-4) показывает, что проведение фильтрации из разбавленной фосфатным буфером периферической крови в фосфатный буфер, заливка трековой мембраны с  задержанными на ней опухолевыми клетками фетальной телячьей сывороткой с последующим высушиванием путем вращения трековой мембраны вокруг оси, перпендикулярной ее поверхности, уменьшает количество поврежденных опухолевых клеток и приближает их цитологическую картину к виду соответствующих клеток в стандартных цитологических препаратах.
Пример 4.
Выделение циркулирующих опухолевых клеток из периферической крови пациента с плоскоклеточной карциномой слизистой оболочки полости рта.
4
2
Сборку фильтр-кассеты (фиг. 1) осуществляют аналогично примеру 1 за исключением того, что в качестве трековой мембраны 4 используют трековую мембрану  iPORE из поликарбоната толщиной 19 мкм с порами диаметром 7±0,5 мкм и плотностью пор 2•10/см производства it4ip S.A., Belgium. После сборки фильтр-кассеты и подключению ее к шприцевому насосу 7, заполняют фильтр-кассету буфером, включив шприцевой насос 7 на инфузию в направлении от шприца 10.
После этого заливают в трубку 2 для загрузки образца  кровь пациента c раком слизистой оболочки дна полости рта справа T4aN2aM0 стадия IV, разбавленную в 2 раза фосфатным буфером рН 7.2-7.4. Начинают фильтрацию разбавленной буфером периферической крови в буфер при пониженном давлении, включив шприцевой насос 7 в режим инфузии в направлении к шприцу 10 со скоростью не более 0.5 мл/мин. После прохождения всей разбавленной крови через трековую мембрану 4, разбирают фильтр-кассету, вынимают трековую мембрану 4 с задержанными на ней опухолевыми клетками и заливают ее 100 мкл фетальной телячьей сыворотки, Sigma-Aldrich, USA. Затем сливают с трековой мембраны 4 излишки фетальной телячьей сыворотки, кладут мембрану клетками вверх на предметное стекло, и высушивают ее путем вращения вокруг оси, перпендикулярной ее поверхности со скоростью 5000 об/мин с помощью центрифуги Microarray High-Speed Centrifuge, Arrayit corporation, USA. После высушивания трековую мембрану 4 на стекле окрашивают по Паппенгейму для цитологического исследования.  Цитологическая картина задержанных трековой мембраной клеток, полученная непосредственно на мембране, представленная на фиг. 5, полностью соответствует цитологической картине плоскоклеточной карциномы в стандартных цитологических препаратах. Сохранность клеток на фиг. 5 и отсутствия среди них артефактов, представленных на фиг. 3-4 к примерам 2 и 3, позволяет с высокой степенью уверенности отнести представленные на фиг. 5 клетки к плоскому эпителию и сделать вывод об их патологической природе.
Таким образом, предлагаемый способ выделения опухолевых клеток из периферической крови является более достоверным за счет сохранности и повышения качества цитологической картины задерживаемых трековой мембраной клеток, что позволяет цитологу надежно определять опухолевое происхождение задержанных клеток.