Роль полиморфизма гена IL6 -174C/G в развитии хронической HCV-инфекции

Роль полиморфизма гена IL6 -174C/G в развитии хронической HCV-инфекции

Семёнова Н.А., Рязанцева Н.В., Новицкий В.В., Бычков В.А., Чечина О.Е.

Role of IL6 -174C/G gene polymorphism in development of chronic HCV infection

SemyonovaN.A., RyazantsevaN.V., Novitsky V.V., Bychkov V.A., Chechina O.Ye.

Исследована функциональная значимость полиморфизма гена интерлейкина-6 (IL6) в развитии хронической hepatitis C virus (HCV) инфекции. Проведен анализ частот встречаемости полиморфизма -174C/G промотерной области гена IL6 у здоровых доноров и больных хронической HCV-инфекцией европеоидной популяции Томской области. Среди пациентов с высокой степенью активности воспалительного процесса достоверно преобладали носители генотипа G/G, что говорит о влиянии носительства G-аллеля на усугубление активности воспалительного процесса в печени при HCV-инфекции. Напротив, носительство генотипов C/G и С/С полиморфизма -174C/G гена IL6 чаще встречалось у пациентов с минимальной и умеренной степенью воспалительного процесса.

Ключевые слова: IL6, полиморфизм гена, HCV-инфекция.

In the investigation it has been estimated the functional importance of gene interleukin 6 (IL6) polymorphism in progressing the chronic hepatitis C virus (HCV) infection. It has been determined the analysis of polymorphism -174 C/G frequency in gene IL6 promote zone at healthy donors and patients with chronic HCV-infection who are the Caucasian representatives of Tomsk region. The genotype GG carriers definitely dominated at patients with high activity rate of inflammatory process: it shows that G allele car-riership have an impact on aggravation of inflammatory process activity in the liver patients with HCV-infections. In contrast to, carriership of C/G and C/C genotypes of polymorphism -174 C/G of gene IL6 have met more often at patients with minimal and moderate degree of inflammatory process.

Key words: IL6, gene polymorphism, HCV infection.

Сибирский государственный медицинский университет, г. Томск

© Семёнова Н.А., Рязанцева Н.В., Новицкий В.В. и др.

УДК 616.36-002.2-02:575.174.015.3

Введение

сти человека к различным неблагоприятным экзогенным факторам.

Хроническая ИСУ-инфекция представляет одну из важнейших проблем здравоохранения во всем мире. Заболеваемость и смертность от хронического вирусного гепатита С и его осложнений в Российской Федерации и в мире в целом достигли высокого уровня и имеют тенденцию к повышению [3].

В последние годы внимание исследователей сконцентрировано на генетических факторах, которые определяют характер взаимодействия возбудителя и макроорганизма, влияют на хронизацию ИСУ-инфекции и модифицируют скорость фиброгенеза в печени при хроническом вирусном гепатите С (ХВГС). Изучена ассоциация полиморфизма примерно 20 генов-кандидатов с ХВГС, особенностями течения этого заболевания и его осложнениями [7, 8]. При этом особая значимость придается роли полиморфизма генов цитокинов — важных участников иммунопа-тогенеза вирусных гепатитов.

Наряду с решающими успехами международной программы «Геном человека» все большее внимание привлекает и проблема разнообразия генома человека, т.е. генетического полиморфизма. Научное и прикладное значение этого сравнительно нового направления носит преимущественно прикладной характер и касается выяснения генетических основ индивидуальной чувствительности или устойчиво-

Интерлейкин-6 (1Ь-6) является цитокином, участвующим в реализации иммунного ответа и воспаления

Роль полиморфизма гена IL6 -174C/G в развитии... HCV-инфекции

Семёнова Н.А., Рязанцева Н.В., Новицкий В.В. и др.

при патологических процессах и состояниях разного генеза. Доказана роль полиморфизма гена IL6 в патогенезе ряда заболеваний. В частности, наличие полиморфизма G174C в промотерной зоне гена IL6 является фактором риска развития осложнений при трансплантации тканей и снижения выживаемости после алло-генной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток у пациентов с заболеваниями системы крови [9]. Существуют данные о более высокой распространенно -сти диабетической ретинопатии у пациентов с сахарным диабетом и наличием генотипа CC по сравнению с пациентами с генотипом GC [17]. В исследованиях A. Manginas и соавт. была найдена статистически значимая встречаемость полиморфного варианта G174C гена IL6 у пациентов с инфарктом миокарда, что было рассмотрено авторами как фактор генетической предрасположенности развития инфаркта миокарда [15].

Наличие аллельных вариантов в промотерной области гена IL6 приводит к различным уровням транскрипции данного гена. Так, гиперпродукция IL-6 чаще сочетается с носительством аллеля гена IL6-174G, чем аллеля IL6-1740, указывая на наличие генетической предрасположенности к повышению продукции IL-6 [2, 4, 12].

На сегодняшний день убедительные данные об ассоциации однонуклеотидных замен с особенностями течения ХВГС получены только для малого числа полиморфизмов и не существует однозначных данных о влиянии полиморфизма в промотерной области гена IL6 на патогенез хронической HCV-инфекции и развитие осложнений. Особо следует отметить крайнюю немногочисленность отечественных работ по изучению генетического полиморфизма при заболеваниях печени, которые представлены лишь исследованиями по установлению генетических маркеров быстрого развития цирроза печени у пациентов с HCV-инфекцией [1].

Учитывая наличие патогенетической взаимосвязи течения хронического вирусного гепатита С с особенностями функционирования провоспалительного ци-токина IL-6, целью настоящего исследования явилась оценка роли полиморфизма промотерной области гена IL6 в развитии ХВГС и его осложнений у представителей европеоидной популяции.

Материал и методы

Обследованы 98 пациентов (56 мужчин и 42 женщины) с диагнозом «хронический вирусный гепатит С», находящихся на стационарном лечении и диспансерном учете в отделении гастроэнтерологии Томской областной клинической больницы и клинической больницы № 81 г. Северска; все представители европеоидной популяции в возрасте от 18 до 56 лет (средний (33 ± 4) года). Контрольную группу составил 171 здоровый донор (из них 98 мужчин и 73 женщины), сопоставимый по возрасту и расе.

Диагноз устанавливали на основании данных инструментального исследования (сцинтиграфическое и ультразвуковое исследования печени), морфологического исследования биоптата печени, серологического (определяли анти-НСУсог и антитела к N83, N85 ИСУ методом иммуноферментного анализа) и генетического (полимеразная цепная реакция (ПЦР)) методов.

Для гистологического исследования печени использовали биопсийный фрагмент печеночной паренхимы. Степень активности процесса в печени определялась в соответствии с полуколичественным гистологическим индексом активности (ИГА) по Кnodell с оценкой в баллах по шкале: 1—3 балла — минимальная, 4—8 — слабовыраженная, 9—12 — умеренно выраженная, 13—18 — выраженная. Оценка стадии фиброза проводилась согласно системе МЕТАУТЯ по шкале: 0 — нет фиброза, 1 — перипортальный фиброз, 2 — порто-портальный фиброз, 3 — портоцентральный фиброз, 4 — цирроз печени [11].

Венозную кровь собирали в вакуумные пробирки, содержащие ЭДТА. Геномную ДНК выделяли с помощью метода фенол-хлороформной экстракции. Для исследования ДНК на наличие полиморфизма -174С/С в промотерной области гена 1Ьб использовали методику ПЦР-ПДРФ (полимеразная цепная реакция с последующей обработкой специфическими рестриктаза-ми и определением длин фрагментов рестрикции).

Амплификацию промотерной области гена 1Ьб, содержащего полиморфный сайт С174 в, осуществляли методом ПЦР, используя структуру следующих прай-меров: 5'^4са^а-са^сс-ааа^с-'3 (прямой) и 5Чса-gac-atc-tcc-agt-cct-ata-'3 (обратный) («СибЭнзим», г. Новосибирск) в амплификаторе «Терцик МС2» («ДНК-технология», Россия). Реакционная смесь содержала 15—20 нг геномной ДНК; 0,2 ммоль смеси dNTP-mix; 3,5 ммоль хлорида магния и 1 ед.а. Taq-полимеразы в

общем объеме 25 мкл. Реакция проводилась при следующих условиях: денатурация при температуре 95 °С в течение 5 мин, 35 циклов амплификации (30 с при температуре 94 °С, 30 с при 60 °С и 45 с при 65 °С) с последующей 5-минутной элонгацией при температуре 72 °С. Фрагмент амплификации, содержащий полиморфный участок С174в, был размером в 300 п.о. Аликвоты продуктов ПЦР подвергали электрофорезу в 1%-м агарозном геле для подтверждения наличия ожидаемых фрагментов.

Генотипирование гена 1Ьб осуществляли с помощью рестриктазы Бае1 («Сибэнзим», г. Новосибирск). Рестрикцию проводили в течение 3 ч при температуре 37 °С. В случае присутствия аллеля С в сайте -174С/в фермент разрезал продукты амплификации на фрагменты длиной 165 и 135 п.о., а в случае наличия аллеля в — фрагменты длиной 54 и 246 п.о. Продукты рестрикции фракционировали в 3%-м агарозном геле посредством электрофореза. В качестве маркера размера фрагментов ДНК использовали плазмиду риС19, расщепленную рестриктазой МБр1 («Сибэнзим», г. Новосибирск).

Имеющиеся данные типа «случай — контроль» относились к качественным, выборки были независимы. Распределение генотипов по исследуемым полиморфным локусам проверяли на соответствие равновесию Харди—Вайнберга с помощью точного теста Фишера. Для сравнения частот аллелей между различными группами использовали критерий х2 Пирсона. Обработку результатов генетического исследова-

ния осуществляли с использованием критерия отношения шансов (ОШ) с расчетом для него 95%-го доверительного интервала.

Результаты и обсуждение

В результате проведенного анализа полиморфизма -174С/в в промотерной области гена 1Ьб выявлено, что частота встречаемости аллеля в у больных ИСУ-инфекцией составляла 68,4%, у здоровых доноров — 62,6%. Аллель С у больных хроническим вирусным гепатитом С встречался в 31,4%, в группе контроля в 37,4% случаев. Данные различия в исследованных группах не были достоверны (р > 0,05) (табл. 1).

При оценке значения полиморфизма —174С/в в промотерной области гена 1Ьб в развитии фиброза также были получены недостоверные различия частот встречаемости вариантных аллелей и генотипов гена у больных ИСУ-инфекцией с различной степенью фиброза печени (р > 0,05). Так, частоты встречаемости аллеля в у пациентов без фиброза печени, слабовыраженным перипортальным фиброзом и с умеренным фиброзом с порто-портальными септами были равны 66,1; 70,4 и 68,8% соответственно. Аллель С в исследованных группах пациентов с ХВГС встречался со следующей частотой: у пациентов без фиброза печени в 33,9% случаев, у больных со слабовыраженным перипор-тальным фиброзом — в 29,6% и с умеренным фиброзом с порто-портальными септами — в 31,2% (табл. 2).

Таблица 1

Распределение частот аллелей и генотипов гена 1Ь6 среди здоровых доноров и больных хронической ИСУ-инфекцией, %

Генотипы и аллели Контроль Больные ХГС Р ОЯ

Генотип вв 39,8

Генотип вС 45,6

Генотип СС 14,6

Аллель О 62,6

Аллель С 37,4

Примечание. р — достоверность различий показателей по сравнению с их значениями у здоровых доноров.

Таблица 2

Частота полиморфных генотипов и аллелей гена 1Ь6 в зависимости от степени фиброза печени у больных хронической ИСУ-

инфекцией, %

Генотипы и аллели

Степень фиброза

Нет фиброза Слабовыраженный перипортальный фиброз Умеренный фиброз с порто-портальными септами

X

О/О 41,9

С/О 48,4

С/С 9,7

в 66,1

51,9

37.0

11.1 (3) 70,4

50,0 (20) 37,5 (15) 12,5 (5) 68,8

1,117 0,9

Семёнова Н.А., Рязанцева Н.В., Новицкий В.В. и др.

Роль полиморфизма гена ТЬ6 -174С/С в развитии... ИСУ-инфекции

С I 33,9 29,6 31,2

Примечание. Здесь и в табл. 3: р — уровень статистической значимости различий параметров между подгруппами больных НСУ-инфекцией с различной стадией фиброза.

Таблица 3

Распределение генотипов и аллелей гена 1Ь6 в зависимости от активности воспаления печени у больных хронической ИСУ-инфекцией,

%

Регистрируемый генотип Гистологический индекс активности воспаления х2 р

1—3 1 4—8 | 9—18

О/О 37,7

О/С 51,0

С/С 11,3 (6) 14,8 (4) 5,6* **(1) 15,464 0,004

О 63,2 63,0 91,6*, **

С 36,8 37,0 8 4*, **

* Достоверность различий по сравнению с пациентами с активностью воспаления 1—3 балла (р < 0,05). ** Достоверность различий по сравнению с пациентами с активностью воспаления 4—8 балла (р < 0,05).

При изучении распределения аллелей и генотипов полиморфизма -174С/О гена 1Ьб в зависимости от степени активности воспаления получены статистически значимые различия у пациентов с выраженной, средней и минимальной степенью воспалительного процесса. У пациентов с минимальной и средней степенями активности воспаления частота встречаемости аллеля С была достоверно выше (р < 0,05) в 4 раза, а частота встречаемости аллеля в была достоверно ниже (р < 0,05) в 1,5 раза по сравнению с аналогичными показателями у больных с выраженной степенью активности воспаления печени (табл. 3).

]Ь-6 является фактором дифференцировки В-клеток, способствуя созреванию В-лимфоцитов в антитело-продуцирующие клетки. Он индуцирует синтез белков острой фазы, в связи с чем (так же как и интерлейкин-1 (1Ь-1) и фактор некроза опухоли альфа (ТОТ-а)) может быть отнесен к цитокинам воспаления [5].

Повышение уровня 1Ь-6 наблюдается при многих патологических состояниях, в том числе при НСУ-инфекции. В исследованиях С. Миловановой и соавт. было выявлено повышение уровня в сыворотке крови у больных хронической ИСУ-инфекцией [6]. Гиперпродукция 1Ь-6 с повышением его уровня в сыворотке крови достоверно чаще сочеталась с носительством аллеля гена 1Ьб -174О, чем аллеля 1Ьб -174С (р < 0,05). Кроме того, была обнаружена ассоцияция наличия криоглобулинемии и связанных с ней системных проявлений, включая прогрессирование фиброза и поражение почек, среди больных с повышенным уровнем сывороточного 1Ь-6 по сравнению с больными без его повышения [6]. В исследованиях А.

АПопеШ и соавт. содержания 1Ь-6 в сыворотке крови у пациентов с хронической НСУ-инфекцией также был зарегистрирован повышенный уровень данного цитокина по сравнению с группой здоровых доноров.

1Ь-6 участвует в регуляции процессов пролиферации эпителиальных клеток желчных протоков, клеток печени, образования гранулем и развития фиброза печени. Повышение продукции 1Ь-6 отмечено при обострениях язвенной болезни, панкреатита, глютеновой энтеропатии, болезни Крона, неспецифического язвенного колита, вирусного гепатита, первичного би-лиарного цирроза. Наряду с другими провоспалитель-ными цитокинами (Т№-а и 1Ь-1) 1Ь-6 секретируются клетками Купфера при действии различных стимулов, индуцирующих развитие гепатитов. Этот эффект сопряжен с синтезом белков острой фазы и повышением адгезии нейтрофилов в синусоидах. Считают, что Т№-а и 1Ь-1 определяют механизмы некроза и нарушения транспортных систем, а 1Ь-6 стимулирует синтез белков острой фазы [14, 18].

Доминирование провоспалительных цитокинов ассоциировано с быстрым прогрессированием фиброза печени и лучшим ответом на противовирусную терапию, тогда как преобладание противовоспалительных цитокинов — с медленным развитием фиброза и более низкой эффективностью противовирусной терапии [13, 16].

Заключение

Полученные результаты являются подтверждением роли ТЬ-6 в патогенезе поражения печени при хро-

нической HCV-инфекции. Установлена связь наличия аллеля G полиморфного варианта -174C/G промотер-ного региона гена IL6 с активностью воспалительного процесса в печени при HCV-инфекции.

Исследования реализованы в рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» (ГК№ 02.740.11.03.11).

Литература

1. Абдуллаев С.М., Целищева Ю.И., Самоходская Л.М. и др. Генетические факторы агрессивного течения хронического гепатита С // Вестн. РАМН. 2007. № 1. C. 8—13.

2. Виноградова С.В. Роль полиморфизма генов цитокинов в развитии заболеваний печени // Сучасна гастроентеро-лопя. 2004. Т. 5, № 19. С. 15—20.

3. Ивашкин В.Т., Буеверов А.О., Грязин А.Е. Механизмы устойчивости вируса гепатита С к противовирусным препаратам // Мол. медицина. 2004. № 2. С. 18—23.

4. КоротчаеваЮ.В., Самоходская Л.М., Сперанский А.И. и др. Прогностическое значение определения ИЛ-6 в сыворотке крови и цитохрома Р450 в ткани печени у больных хроническим вирусным гепатитом С // 2008. Т. 18, № 2. С. 42—47.

5. Лейдерман И.Н., Руднов В.А, Клейн А.В., Николаев Э.К. Синдром гиперметаболизма — универсальное звено патогенеза критических состояний // Вестн. интенсив. терапии. 1997. № 3. С. 17—23.

6. Милованова С., Тэгай С., Коротчаева Ю., Козловская Л. Поражение почек, ассоциированное с инфицированием вирусами гепатита В и С // Врач. 2007. № 6. С. 70—74.

7. Рязанцева Н.В., Новицкий В.В., Белоконь В.В. и др. Цито-кины и противовирусный иммунитет // Успехи физиолог. наук. 2006. Т. 37, № 4. С. 1—11.

8. Фрейдин М.Б., Гончарова И.А., Рудко А.А. и др. Геном-

ные основы подверженности инфекционным заболеваниям // Молекуляр. медицина. 2006. № 3. С. 39—46.

9. Ambruzova Z., MrazekF., Raida L. et al. Association of IL-6 gene polymorphism with the outcome of allogeneic haematopoietic stem cell transplantation in Czech patients // Intern. J. of Immunogenetics. 2008. № 35. Р. 401—403.

10.Antonelli А., Ferri С., Ferrari S. et al. High interleukin-6 and tumor necrosis factor-alpha serum levels in hepatitis C infection associated or not with mixed cryoglobulinemia // Clin. Rheumatol. 2009. № 28. Р 1179—1185.

11. Bedossa P., Poynard T. An algorithm for the grading of activity in chronic hepatitis C. The METAVIR Cooperative Study Group // Hepatology. 1996. V. 24. Р. 289—293.

12. Ben-Ari Z., Mor E., Papo O. et al. Cytokine gene polymorphisms in patients infected with hepatitis B virus // Am. J. Gastroenterol. 2003. V. 98, № 1. P. 144—150.

13. Cecere A., Marotta F., Vangieri B. et al. Progressive liver injury in chronic hepatitis C infection is related to altered cellular immune response and to different citokine profile // Panminerva Med. 2004. № 46. Р. 171—187.

14. Decker K. Mechanisms and mediators in hepatic necrosis // Gastroenterol. Jpn. 1993. № 28. Р. 20—25.

15. Manginas A., Tsiavou A., Chaidaroglou A. et al. Inflammatory cytokine gene variants in coronary artery disease patients in Greece // Coronary Artery Disease. 2008. V. 19, № 8. Р. 575—582.

16. Neuman M., Sha K., Esguerra R. et al. Inflammation and repair in viral hepatitis C // Digestive Diseases and Sciences. 2008. № 53. Р. 1468—1487.

17. Rudofsky G., Schlotterer A., Reismann P. et al. The -174G/C IL-6 gene promoter polymorphism and diabetic microvascu-lar complications // Horm. Metab. Res. 2009. V. 41, № 4. P. 308—313.

18. Thornton A., Ham J., Kunkel S. Kupffer cell-derived cyto-kines induce the synthesis of a leukocyte chemotactic pep-tide, interleukin-8, in human hepatoma and primary hepato-cyte cultures // Hepatology. 1991. № 14. Р. 1112—1122.

Поступила в редакцию 19.02.2010 г. Утверждена к печати 13.05.2010 г.

Сведения об авторах

Н.А. Семёнова — аспирант кафедры патофизиологии СибГМУ (г. Томск).

Н.В. Рязанцева — д-р мед. наук, профессор, зав. кафедрой фундаментальных основ клинической медицины СибГМУ (г. Томск).

В.В. Новицкий — заслуженный деятель науки РФ, д-р мед. наук, профессор, академик РАМН, зав. кафедрой патофизиологии СибГМУ (г. Томск).

В.А. Бычков — аспирант кафедры патофизиологии СибГМУ (г. Томск).

О.Е. Чечина — канд. мед. наук, руководитель научно-образовательного центра молекулярной медицины СибГМУ (г. Томск). Для корреспонденции

Семёнова Надежда Андреевна, тел. 8-906-947-63-88; e-mail: nadfix@mail.ru.