Способ прогнозирования риска рецидивирования у ВПЧ16-позитивных больных с плоскоклеточным интраэпителиальным поражением тяжелой степени на основе определения физического статуса вируса
METHOD FOR PREDICTING THE RISK OF RECURRENCE IN HPV16-POSITIVE PATIENTS WITH SQUAMOUS INTRAEPITHELIAL HIGH-GRADE DISEASE ON THE BASIS OF DETERMINING THE PHYSICAL STATUS OF THE VIRUS

Изобретение относится к области медицины, конкретно к онкологии, и может быть использовано для прогнозирования риска рецидивирования у ВПЧ16-позитивных больных с плоскоклеточным интраэпителиальным поражением тяжелой степени.
На сегодняшний день достоверно установлено, что вирус папилломы человека (ВПЧ) высокого канцерогенного риска (ВКР) является важнейшим фактором канцерогенеза шейки матки [1]. Данный вирус является эпителиотропным, и, при проникновении в организм, инфицирует базальный слой эпителия шейки матки. При этом главной мишенью для воздействия онкогенных типов вируса является зона трансформации шейки матки. Как следствие инфицирования ВПЧ ВКР наблюдаются морфологические изменения эпителия шейки матки, что приводит к развитию цервикальных интраэпителиальных неоплазий различной степени тяжести - LSIL (Low grade squamous intraepitelial lesion, низкая степень интраэпителиального повреждения плоского эпителия) и HSIL (High grade squamous intraepitelial lesion, высокая степень интраэпителиального повреждения плоского эпителия) с возможным последующим озлокачествлением [2]. Согласно данным мировой литературы, именно пациенткам с высокой степенью интраэпителиального повреждения плоского эпителия (HSIL) необходимо максимально четкое и быстрое назначение терапевтического и проведение хирургического лечения с учетом всех сопутствующих клинических показателей. Кроме того, именно у этих пациентов существует высокий риск рецидивирования и малигнизации, а прогнозирование этого риска является актуальной задачей.
В качестве стандартного показателя инфицирования вирусом применяется оценка вирусной нагрузки ВПЧ ВКР. Многократно показано, что клинически значимая вирусная нагрузка (>3 lg) - статистически чаще наблюдается у больных с высокой степенью интраэпителиального повреждения плоского эпителия, по сравнению с пациентами с LSIL. Более того, подобная закономерность прослеживается и при уже сформировавшейся злокачественной патологии шейки матки - у больных раком шейки матки (РШМ) статистически чаще наблюдается клинически значимая вирусная нагрузка, чем у пациентов с интраэпителиальной неоплазией [3]. Однако, согласно результатам собственных предыдущих исследований, вирусная нагрузка не может выступать в качестве прогностического фактора при раке шейки матки и с ее помощью нельзя прогнозировать безрецидивную выживаемость [4]. Другим показателем вирусной инфекции, который исследуется в настоящее время, является физический статус вируса. Согласно современным литературным данным, ВПЧ после проникновения в клетку, может существовать в 3-х различных функциональных состояниях: эписомальная (свободная) форма (вне хромосом клетки), интегрированная (встроенная) (встроена в геном клетки) и смешанная форма (одновременное наличие свободного и встроенного в ДНК клетки-хозяина вируса) [5]. Нами было показано, что физический статус является прогностическим фактором при РШМ и с помощью его определения можно прогнозировать исход у больных РШМ [4]. Таким образом, для формирования групп риска и планирования терапии прогноз возникновения рецидивов важен не только при опухолевых заболеваниях шейки матки, но и при интраэпителиальной неоплазий с высокой степенью интраэпителиального повреждения плоского эпителия - HSIL.
Наиболее близкими к предлагаемому является способ оценки риска прогрессирования интраэпителиальной цервикальной неоплазий и развития рака шейки матки на основе определения уровней мРНК генов человека (патент RU 2660360 С2, опубликован 05.07.2018 года). Согласно указанному способу, в образцах из мест поражений измеряют уровень экспрессии мРНК генов человека MKI67, CDKN2A, CCNB1, BIRC5, AURKA, ESR1, PGR, BCL2, ВАХ, BAG1, NDRG1, PTEN, CD68, SCUBE, PTGS2. Полученные в ходе реакции значения подставляют в формулу. Если значение p менее или равно пороговому значению (p≤cut-off), делают заключение об отсутствии риска прогрессирования цервикальной интраэпителиальной неоплазий. Если значение p>cut-off, делают заключение о высоком риске прогрессирования цервикальной интраэпителиальной неоплазий. Изобретение позволяет оценить вероятность риска прогрессии цервикальной интраэпителиальной неоплазий и последующей малигнизации. Однако область способ недостат043Ено точен и информативен, что обусловлено тем, что не учитываются вирусологические показатели заболевания, как важного этиологического фактора РШМ. Кроме того, анализ ассоциативных связей не представляется возможным из-за малочисленности групп исследования, не прослежены отдаленные результаты, не проведена валидация полученных результатов на независимой выборке.
Новый технический результат - повышение точности и информативности способа прогнозирования риска рецидивирования цервикальных интраэпителиальных неоплазий тяжелой степени у ВПЧ16-позитивных больных.
Для достижения нового технического результата в способе прогнозирования риска рецидивирования у ВПЧ16-позитивных больных с плоскоклеточным интраэпителиальным поражением тяжелой степени на основе определения физического статуса вируса, включающем молекулярно-генетическое исследование биологический материала соскобов эпителия цервикального канала и наружной части шейки матки и последующий расчет диагностического показателя, исследование биологического материала проводят с помощью проведения ПЦР в режиме реального времени с последующим выделением ДНК, далее определяют наличие и типирование вируса папилломы человека (ВПЧ), осуществляют анализ внутриклеточного статуса ВПЧ 16 типа и при определении эписомальной формы ВПЧ 16 типа прогнозируют благоприятный исход заболевания, при наличии интегрированной формы прогнозируют возникновение рецидива заболевания.
Способ осуществляют следующим образом.
Для молекулярно-генетических исследований используют - биологический материал (соскоб эпителия цервикального канала и наружной части шейки матки).
Забор соскоба эпителия цервикального канала и наружной части шейки матки осуществляют стандартными методами (методические рекомендации по технике сбора и транспортирования биоматериалов в микробиологические лаборатории МУ 4.2.2039-05 от 01.07.2006 г.). Соскоб помещают в реагент для транспортировки и хранения клинического материала «Транспортная среда с муколитиком (ТСМ)» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) в пробирку типа эппендорф на 1.5 мл (с 0,5 мл транспортной среды). Пробирка помещают в холодильник на +4°С.
Биологический материал должен быть обработан не позднее, чем через 1 сутки. Если обработка задерживается более чем на сутки, то пробирки с образцами следует поместить в морозильную камеру с температурой не выше минус 20°С. Допускается использование свежего/замороженного биологического материала. В случае заморозки, разморозить пробирку с образцом, отделить 100 мкл соскоба простым центрифурированием.
260
280
260
230
Выделение ДНК осуществляют в соответствии с инструкцией к набору реагентов для выделения ДНК из клинического материала «ДНК-сорб-АМ» (http://www.interlabservice.ru/catalog/reagents/?sid=1402&id=8692). Концентрацию и чистоту выделения ДНК оценивают на спектрофотометре NanoDrop-2000 (Thermo Scientific, USA). Концентрация ДНК должна быть не менее 50 нг/мкл, А/А не менее 2,10; А/А не менее 2,15. Целостность ДНК оценивают при помощи капиллярного электрофореза на приборе TapeStation (Agilent Technologies, USA) ДНК должна иметь массу более 48 kbp.
ПЦР-анализ проводят при помощи набора реагентов «Amplisens» ВПЧ ВКР скрин-титр-FL» (с дифференциацией 16 генотипа), кат# R-V31-F (Москва, Россия) в соответствии с инструкцией производителя http://www.interlabservice.ru/catalog/reagents/?sid=1418&id=6002, если выделенная ДНК показала высокое качество при исследовании на спектрофотометре и капиллярном электрофорезе.
Анализ результатов исследования ДНК биологического материала осуществляют при помощи программы, заложенной в стандартную инструкцию к набору реагентов «Amplisens» ВПЧ ВКР скрин-титр-FL» (с дифференциацией 16 генотипа) (http://www.interlabservice.ru/catalog/reagents/?sid=1402&id=8692).
Обработка полученных данных в указанной выше программе позволяет оценить вирусную нагрузку и физическое состояние (степень интеграции) для ВПЧ 16 генотипа. При выявлении в соскобе цервикального канала и шейки матки только интегрированной формы ВПЧ16, прогнозируют высокий риск возникновения рецидива заболевания (57%), в случае определения только эписомальных форм вируса риск рецидивирования отсутствует, больные со смешанной формой ВПЧ16 типа имеют промежуточный риск возникновения рецидива (25%) в течение 5 лет с момента возникновения первичного очага диспластических изменений HSIL.
Предлагаемый способ основан на анализе данных молекулярно-вирусологического метода исследования биологического материала, анализе амбулаторных и медицинских карт стационарного больного.
В исследование была включена 131 пациентка с наличием высокой степени интраэпителиального повреждения плоского эпителия (HSIL) (средний возраст 33,1±0,4 лет), проходивших обследование и лечение в Томском НИИ онкологии. Всем пациенткам было проведено комплексное обследование, которое включало следующие этапы: гинекологический осмотр, кольпоскопию, проведение цитологического и гистологического исследования для последующей верификации диагноза. После проведения генотипирования ДНК ВПЧ, среди всех обследованных пациенток была выделена группа с носительством ВПЧ 16 генотипа (n=112).
5
5
Материалом для исследования служили соскобы эпителия цервикального канала и наружной части шейки матки. Выявление и генотипирование ДНК ВПЧ проводили методом мультиплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени на приборе RotorGene 6000 («Corbett Research)), Австралия) с использованием комплектов реагентов фирмы «Amplisens» ("АмплиСенс ВПЧ ВКР скрин-титр-FL", кат# R-V31-T-4x (RG,iQ,Mx); "АмплиСенс ВПЧ ВКР генотип-FL", кат# R-V25(RG,iQ,Mx)) (Москва, Россия). Физический статус ДНК ВПЧ16 определялся с использованием набора реагентов «Amplisens» ВПЧ ВКР скрин-титр-FL» (с дифференциацией 16 генотипа), кат# R-V31-F (Москва, Россия). Значение вирусной нагрузки рассчитывали в геномных эквивалентах ДНК ВПЧ/10 клеток, порог релевантного количества вируса принимали равным 3 lg ДНК ВПЧ/10 клеток в соскобе.
Для оценки статистической значимости различий в распределении частот качественных признаков между группами использовали двусторонний критерий Фишера калькулятор http://vassarstats.net/fisher2×3.html был использован для таблицы 2×3 (тест хи-квадрат). Для оценки влияния внутриклеточного статуса ВПЧ 16, вирусной нагрузки и тяжести дисплазии на частоту рецидивирования применяли лог-ранговый критерий, для построения прогностической модели риска развития рецидивов использовали критерий Кокса.
В ходе нашего исследования был проведен анализ частоты возникновения рецидивов при HSIL в зависимости от изученных вирусологических показателей. Было проанализировано влияние на частоту рецидивирования следующих показателей: внутриклеточный статус ВПЧ (физический статус) и вирусная нагрузка. Статистический анализ (log rank test) показал, что среди HSIL ВПЧ16-позитивных пациентов частота рецидивирования зависит от формы интеграции вируса (р=0,000) (на Фиг 1 представлена частота рецидивирования интраэпителиальной неоплазий в зависимости от внутриклеточного статуса ВПЧ).
Было проведено сравнение основных клинико-патологических параметров у больных всех 3-х представленных групп (эписомальной, смешанной и интегрированной формой вируса), не установлено статистически значимых различий в распределении параметров (данные не представлены). Это показывает, что физический статус ВПЧ является независимым фактором риска рецидивирования при цервикальных интраэпителиальных неоплазиях тяжелой степени.
В результате проведенного исследования, были получены данные о частоте рецидивирования при плоскоклеточном интраэпителиальном поражении тяжелой степени (HSIL) в зависимости от физического статуса ВПЧ16+ больных. Было показано, что наилучший прогноз имеют ВПЧ16+ пациентки с эписомальной формой вируса, наихудший - ВПЧ16+ пациентки с интегрированной формой с 57% вероятностью рецидивирования.
Таким образом, проведение с помощью предлагаемого способа возможно корректировать оптимальный выбор персонализированной терапии для данной категории больных.
Примеры на осуществление способа.
Пример 1. Больная Р., 31 год в августе 2013 поступила на лечение в клиники НИИ онкологии Томского НИМЦ с диагнозом HSIL шейки матки. По результатам клинического опроса, установлены следующие особенности - эрозия шейки матки, количество родов - 2, количество абортов - 3, количество выкидышей - 0, в качестве сопутствующих заболеваний выявлено наличие варикозное расширение вен нижних конечностей. Было проведено оперативное лечение в объеме радиоволновой резекции шейки матки с выскабливанием цервикального канала. С целью определения прогноза исхода заболевания было проведено исследование согласно предлагаемому способу, в результате чего было показано, что у пациентки присутствует ВПЧ 16 типа эписомальной формы. Вывод: прогнозировали благоприятный исход. При динамическом наблюдении данной пациентки (60 месяцев) не было выявлено рецидива HSIL.
Пример 2 Больная Д., 38 лет в мае 2012 поступила на лечение в клиники НИИ онкологии Томского НИМЦ с диагнозом HSIL шейки матки. По результатам клинического опроса, установлены следующие особенности - наличие воспалительных заболеваний малого таза, эрозия шейки матки, количество родов - 0, количество абортов - 0, в качестве сопутствующих заболеваний выявлено наличие хронической почечной недостаточности, эссенциальная (первичная) гипертензия и ожирение. Было проведено оперативное лечение в объеме радиоволновой резекции шейки матки с выскабливанием цервикального канала. С целью определения прогноза исхода заболевания было проведено исследование согласно предлагаемому способу, по результатам которого прогнозировали риск развития рецидива с 57% вероятностью. В реальной ситуации у пациентки зарегистрировано возникновение рецидива заболевания в течение 14 месяцев с момента проведения лечения.
Таким образом, предлагаемый способ с высокой долей достоверности и информативности позволяет прогнозировать возникновение рецидивов при цервикальных интраэпителиальных неоплазиях тяжелой степени, что позволит для больных HSIL оптимизировать выбор персонализированной терапии.
Источники информации, принятые во внимание при составлении описания:
1. BoschFX. Human papillomavirus: science and technologies for the elimination of cervical cancer. Expert opinion on pharmacotherapy. 2011; 12 (14): 2189-2204.
2. Apgar BS, Zoschnick L, Wright TC Jr. The 2001 Bethesda System terminology. American family physician. 2003; 68 (10): 1992-1998.
3. Bruni L, Diaz M,  M, Ferrer E, Bosch FX, de  S. Cervical human papillomavirus prevalence in 5 continents: meta-analysis of 1 million women with normal cytological findings. Journal of Infectious Diseases. 2010; 202 (12): 1789-1799.
4. Ibragimova M, Tsyganov M, Shpileva O, Churuksaeva O, Bychkov V, Kolomiets L, Litviakov N. HPV status and its genomic integration affect survival of patients with cervical cancer//Neoplasma. 2018; 65 (3):441-448
5. Jiang M, Baseman JG, Koutsky LA, Feng Q, Mao C, Kiviat NB, Xi LF. Sequence variation of human papillomavirus type 16 and measurement of viral integration by quantitative PCR. Journal of clinical microbiology. 2009; 47 (3): 521-526.
Приложение
Фиг. 1 Частота рецидивирования HSIL в зависимости от внутриклеточного статуса ВПЧ (р=0,000).