Применение биотехнологических методов в получении селекционных форм персика ( Prunus persica (L. ) Batch) и абрикоса ( Prunus armeniaca L. )

16. Ndhlalaa A.R., Kasiyamhurua A., Mupurea C., Chitindingua K. Phenolic composition of Flacourtia indica, Opuntia megacantha and Sclerocarya birrea // Food Chemistry. - 2006. - Vol. 93. - P. 248-283.

17. Sepulvedaa E., Saenz C. Extraction and characterization of mucilage in Opuntia spp. // Arid Environments. - 2006. - Vol. 67. - P. 428-438.

18. Kuti Joseph. Antioxidant compounds from four Opuntia cactus pear fruit varieties // Food Chemistry. -2004. - Vol. 85. - P. 527-533.

Biochemical characteristics of fruits of species of genus Opuntia (Tournef). Mill. in the connection of evaluation theis perspectiveness of their use in alimentary products.

Voloshina I.V., Yezhov V.N., Polonskaya A.K.

In the result of biochemical analysis of some species in genus Opuntia the biochemical characteristics of fruits in the process of their formation have been given. Maximum content of mono- and disacharides and also water soluble pectin according hydrolysis of protopectin in the dynamics of fruits' maturing of Opuntia are detected. The certain species' specificity in the dynamics of the of the sum of organic acids' content and their structure expressed in maximum accumulation of a citric acid in the period of maturing have been established. Maximum of Acidum ascorbinicum accumulation is observed in the moment of fruits' maturing. Content of common phenolic matters in Opuntia fruits' has no legible species' dependence. The structure and contents of volatile compounds of Opuntia fruits is determined by species' specificity. Prevailing compounds are methylevgenol, sabinene, elemicyn, pinokamphon. Seeds in Opuntia fruits make 18,7 % of fruits weight and contain six fatty acids, 86 % of which are non-saturated acids. Predominant macroelement of Opuntia fruits is calcium, microelement is magnesium. Dynamics of mineral components in the period of fruit formation testify their active implication in the processes of exchange and structural transformations.

ПРИМЕНЕНИЕ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДОВ В ПОЛУЧЕНИИ СЕЛЕКЦИОННЫХ ФОРМ ПЕРСИКА

Н.П. ЛЕСНИКОВА-СЕДОШЕНКО;

О.В. МИТРОФАНОВА, доктор биологических наук;

А.В. СМЫКОВ, кандидат сельскохозяйственных наук;

В.МГОРИНА, кандидат сельскохозяйственных наук Никитский ботанический сад - Национальный научный центр УААН

Одним из важнейших направлений в селекции косточковых плодовых культур является создание генетического разнообразия и получение новых форм растений. В связи с возрастающей потребностью в сортах растений с широким спектром созревания, высокой продуктивностью и другими хозяйственно ценными признаками в Никитском ботаническом саду проводятся работы по селекции косточковых плодовых культур. При этом большое внимание уделяется созданию селекционных форм с ранним сроком созревания плодов. Одним из биотехнологических приемов, используемых в селекции, является эмбриокультура. Известно, что получению новых форм часто препятствует явление несовместимости исходных генотипов при гибридизации, что в большинстве случаев приводит к формированию семян с неполноценными зародышами, которые достигают лишь начальных этапов развития, не позволяющих получить взрослые растения при традиционных приемах выращивания [3, 4]. Большое значение придается всестороннему изучению

морфогенетических процессов, происходящих в тканях таких зародышей и получению из них полноценных растений в условиях in vitro. Несмотря на большое число публикаций по эмбриокультуре и микроразмножению растений in vitro, для ряда косточковых плодовых культур, таких как персик и абрикос, они по-прежнему остаются проблемой и требуют дополнительных исследований. Наиболее перспективным направлением повышения всхожести семян, получения жизнеспособных растений и генетического разнообразия является применение биотехнологических методов и разработка новых методов селекции in vitro, что позволяет не только ускорять процесс получения раннеспелых форм, но и размножать новые высокоурожайные сорта и перспективные формы [3, 5, 7, 8]

Целью настоящего исследования было получение генетического разнообразия и новых селекционных форм персика и абрикоса с использованием эмбриокультуры и микроразмножения in vitro.

Материалы и методы

Объектами исследования служили развитые и недоразвитые гибридные зародыши персика (Prunus pérsica (L.) Batch) и абрикоса (Prunus armeniaca L.) и проростки, полученные в процессе культивирования in vitro зародышей этих культур.

В опытах использовали гибридные зародыши персика шести комбинаций скрещивания („Армголд' х „Фаворита Mоpeттини', „Спринголд' х „Фаворита Mоpeттини', „Эрли Ред' х „Фаворита Mоpeттини', „Фаворита Mоpeттини' х „Армголд', „Прекрасный' х „Крымский Фейерверк', „Чехов' х „Крымский Фейерверк') и двух сортов (Пламенный и Санхейвен) от свободного опыления, а также абрикоса сортов Дионис, Наследник, Салют и Эффект от свободного опыления.

Основным методом исследований являлся метод культуры зародышей in vitro. Получение стерильной культуры осуществляли по общепринятой методике [l, 2, б] и с применением методов, разработанных в отделе биотехнологии растений НБС-ННЦ [б]. Все опыты осуществляли с соблюдением условий асептики. Стерилизацию косточек абрикоса проводили путем погружения на l-2 секунды в 90-95%-ный этанол и последующего обжига в пламени спиртовки. Зародыши извлекали путем раскрытия косточек с помощью специально сконструированного прибора для разрушения каменистых околоплодников [2]. Семенные покровы и неизрасходованные зародышами ткани (нуцеллус и эндосперм) удаляли в стерильных условиях, а затем зародыши помещали в культуральные сосуды. При изучении морфогенетических потенций персика и абрикоса в условиях in vitro использовали модифицированные нами питательные среды Mоньe [l0] (Ml, M2), Mуpаcигe и Скуга [ll] (MOl, MC2), В5 [9], QL [l2], Уайта [l3]. Для инициации развития эксплантов и получения множественных адвентивных побегов в питательные среды вводили фитогормоны цитокининового (БАП, кинетин) и ауксинового (НУК, HM^ типов действия, добавляя гибберелловую кислоту (ГК), L-глутамин, глицин, гидролизат казеина.

Первоначально культуральные сосуды с зародышами помещали в холодильную камеру с пониженными положительными температурами (4+1 °С) и отсутствием освещения. Через 2-3 месяца их выставляли в культуральную комнату с освещенностью 2-3 клк, среднесуточной температурой 25+1 °С, фотопериодом 16 часов и относительной влажностью воздуха 70-80%. Субкультивирование эксплантов осуществляли каждые 2-3 недели. Полученный в условиях in vitro растительный материал оценивали по качественным и количественным показателям.

Результаты и обсуждение

Первоначально опыты были направлены на выявление оптимальной питательной среды для культивирования зародышей персика и абрикоса. Испытывали различные составы питательных сред, наиболее часто применяемых в эмбриокультуре: Mоньe, Mуpаcигe и Скуга (MC), Уайта. Лучшие результаты для развитых зародышей персика и абрикоса получены на безгормональной среде Mоньe, дополненной 2,5% сахарозы, 0,7% агара и 0,04% гидролизата казеина. При культивировании недоразвитых зародышей на этой среде формировались единичные неполноценные проростки. На питательных средах Mоньe

и МС, содержащих кинетин в концентрации 0,93-4,60 мкМ, ГК - 0,29-2,89 мкМ, L-глутамин - 34,22-68,44 мкМ, НУК - 0,027 мкМ, гидролизат казеина - 0,4%, наблюдали различные пути реализации морфогенетического потенциала. Так, на питательной среде МС отмечали образование каллуса, чаще всего неморфогенного. После 6-7 пассажей на среде с добавками регуляторов роста в различных сочетаниях и концентрациях вызвать морфогенетические процессы в таком каллусе не удалось. Зародыши персика и абрикоса, помещенные на модифицированную питательную среду Монье, более активно прорастали и формировали полноценные проростки. При этом генотип и размер первичного экспланта оказывали существенное влияние на регенерацию растений. Так, при культивировании зиготических зародышей длиной до 0,3 см наблюдали образование единичных проростков, однако полноценных растений получено не было. Лучшее развитие проростков отмечено из зародышей размером 0,8-2,0 см.

В опытах по получению новых селекционных форм персика были использованы зародыши трех комбинаций скрещивания, в которых одной из родительских форм был сорт Фаворита Мореттини или Крымский Фейерверк с ранним сроком созревания плодов. При введении эксплантов персика в условия in vitro приблизительно 50% зародышей были на стадии сердечко или торпедо длиной 0,5-1,0 мм. Известно, что у косточковых плодовых культур отмечена закономерность - чем менее развит зародыш, тем труднее получить из него полноценный проросток, а тем более взрослое растение [3, 6]. Кроме того, раносозревающим сортам свойственно растрескивание тканей мезокарпия и эндокарпия. Зародыши, вычлененные из таких плодов, при введении в условия in vitro часто погибают от грибной и бактериальной инфекции. Недоразвитые зародыши персика были спассированы на модифицированную питательную среду Монье с добавлением кинетина, L-глутамина и увеличенным содержанием хелата железа и сахарозы. У зародышей в комбинации скрещивания „Фаворита Мореттини' х 'Армголд' сформировавшиеся растеньица были получены в условиях in vitro из зародышей длиной от 6 до 13 мм. Результаты культивирования недоразвитых зародышей персика этой комбинации скрещивания представлены в таблице 1.

Таблица 1

Влияние состава питательных сред на развитие недоразвитых зародышей персика гибрида Фаворита Мореттини х Армголд

Питательная среда К-во полученных проростков, % Средняя длина, мм

побега корня

Монье (контроль) 57,8 0,78±0,08 4,1±0,2

Монье + кинетин 0,93 мкМ НУК 0,027 мкМ 61,4 1,18±0,06 4,7±0,4

Монье + кинетин 1,86 мкМ НУК 0,027 мкМ 59,5 0,89±0,09 4,2±0,3

Монье + кинетин 0,93 мкМ НУК 0,054 мкМ 78,5 2,06±0,07 6,8±0,6

МС + кинетин 0,93 мкМ НУК 0,027 мкМ 55,4 1,06±0,07 4,0±0,2

МС + кинетин 1,86 мкМ НУК 0,027 мкМ 52,2 0,72±0,08 3,8±0,3

МС + кинетин 0,93 мкМ НУК 0,054 мкМ 58,8 1,77±0,06 5,2+0,4

Уайта + кинетин 0,93 мкМ НУК 0,054 мкМ 22,0 0,42±0,03 1,1+0,2

Уайта + кинетин 1,86 мкМ НУК 0,027 мкМ 21,8 0,33±0,04 1,0+0,4

Уайта + кинетин 0,93 мкМ НУК 0,027 мкМ 27,6 0,90±0,06 2,8+0,3

Наблюдения показали, что лучший рост был у проростков, полученных из зародышей комбинации скрещивания 'Чехов' х „Крымский Фейерверк', 'Прекрасный' х „Крымский Фейерверк' и 'Эрли Ред' х 'Фаворита Мореттини' (табл. 2). В этом случае у проростков развивались главные и боковые корни, наблюдалось нормальное развитие побега и листьев. Начало развития проростков отмечено у всех культур через 2-2,5 месяца культивирования в условиях отсутствия света и пониженной положительной температуры (4±1 °С).

Таблица 2

Развитие гибридных зародышей персика на модифицированной питательной среде Монье

Генотип Количество зародышей, %

проросших, но не сформировавших растения сформировавших растения

Армголд х Фаворита Мореттини 26,2±3,1 9,8±0,8

Спринголд х Фаворита Мореттини 14,2±2,4 36,2±4,2

Эрли Ред х Фаворита Мореттини 29,9+3,9 46,7+4,7

Прекрасный х Крымский Фейерверк 10,1+2,4 68,7+3,8

Чехов х Крымский Фейерверк 9,4+1,1 79,8+3,7

Так, через 2,5 месяца культивирования в темноте при низких положительных температурах развитие зародышей в проростки было только у сорта Санхейвен. Средняя длина главного корня у сортов Санхейвен и Пламенный составила 0,97±0,4 и 1,01±0,7 см, побега - 0,49±0,2 и 0,91±0,7 см, соответственно. Однако через 4,5 месяца культивирования лучшее развитие наблюдали у зародышей в комбинации скрещивания 'Прекрасный' х „Крымский Фейерверк' и сорта Пламенный от свободного опыления (рис. 1, а, б). Проростки сорта Пламенный характеризовались формированием большого количества боковых корней (до 19 шт.) длиной от 0,5 до 8,1 см. При развитии зародыши персика сорта Санхейвен формировали корни коричневого цвета, что практически делает невозможной адаптацию in vivo. Экспланты генотипов персика, сформировавших неполноценные проростки, были расчеренкованы и помещены на модифицированную среду В5 для клонального микроразмножения с целью получения множественных адвентивных побегов и дальнейшего укоренения.

Для получения новых селекционных форм абрикоса в условия in vitro были введены зародыши, полученные от свободного опыления сортов Дионис, Наследник, Салют и Эффект. При культивировании зародышей абрикоса на средах Монье и МС, содержащих кинетин в концентрации 0,93-4,60 мкМ, ГК - 0,29-2,89 мкМ, L-глутамин - 34,22-68,44 мкМ, гидролизат казеина - 0,4%, наблюдали различные пути реализации морфогенетического потенциала. Зародыши абрикоса, помещенные на питательную среду Монье в нашей модификации, более активно прорастали и формировали полноценные проростки. Лучшее развитие проростков отмечено из зародышей размером 0,8-2,0 см. У сортов абрикоса Дионис, Наследник, Салют и Эффект полноценные проростки развивались спустя 2-2,5 месяца культивирования на питательной среде Монье (модификация М1). При этом установлено, что более высокими регенерационными способностями обладали зародыши сортов Дионис и Эффект, у которых через 2 месяца культивирования количество полученных проростков составило 92,4% и 72,2% соответственно. Результаты развития зародышей абрикоса на различных питательных средах приведены на рисунке 2.

а

1,6-/

1,4-'

1,2-'

2

о

«в" 1-'

S

с 0,8-'

К

О) 0,6-'

О

0,4-'

0,2-'

ц

2,5 4,5

Время культивирования, мес

IПламенный ПСанхейвен  Прекрасный х Крымский Фейерверк

0

б

2

о

<0

Ц Ч

К

к

X

ч

О)

о.

о

3 2,5 2 1,5 1

0,5 0

¿1

2,5

4,5

Время культивирования, мес  Пламенный ПСанхейвен  Прекрасный х Крымский Фейерверк

Рис. 1. Развитие корня (а) и побега (б) из зародышей персика сортов Пламенный, Санхейвен и гибрида Прекрасный х Крымский Фейерверк на питательной среде Монье в условиях in vitro

100

80

m о х н о о а о а с

о m

60

40

20

ШДионис

Салют

Эффект

Наследник

М1 М2 МС1 МС2

Питательная среда

Рис. 2. Развитие проростков из зародышей 4-х сортов абрикоса через 2,5 месяца культивирования на питательных средах: М1 - среда Монье + 0,93 мкМ кинетина + 0,027 мкМ НУК + 0,29 мкМ ГК; М2 - среда Монье + 1,86 мкМ кинетина + 0,054 мкМ НУК + 0,29 мкМ ГК;МС1 - среда МС + 0,93 мкМ кинетина + 0,027 мкМ НУК + 0,29 мкМ ГК; МС2 -среда МС + 1,86 мкМ кинетина + 0,054 мкМ НУК + 0,29 мкМ ГК

В ряде случаев (30-52%) при развитии зародышей сортов Салют и Эффект было отмечено формирование слабо развитых проростков, что выражалось в отмирании апикальной части и недоразвитии корневой системы. Чтобы сохранить такой растительный материал, нами был использован способ микрочеренкования. Для получения множественных адвентивных почек и побегов неполноценные проростки микрочеренковали, и сегменты с 23 междоузлиями помещали на питательные среды В5 и QL, содержащие различные сочетания и концентрации БАП, НУК и ИМК (рис. 3).

Через 5-6 недель на питательной среде В5, дополненной БАП в концентрации 0,44-22,20 мкМ, наблюдали образование адвентивных почек и развитие микропобегов. Однако дальнейшее субкультивирование на этой питательной среде не способствовало регенерации множественных побегов. Данные, приведенные в таблице 3, показывают, что активная регенерация микропобегов происходила на модифицированной питательной среде QL, содержащей 2,22-3,33 мкМ БАП и 0,054 мкМ НУК, на которой спустя 4-6 недель микропобеги достигали длины 1,5-2,5 см.

Для получения полноценных регенерантов после этапа собственно микроразмножения микропобеги помещали на среды с веществом ауксинового типа действия. Активное образование корней в основании микропобегов отмечали на питательной среде, содержащей ^ состава макро- и микросолей по прописи МС, дополненной 0,049-1,23 мкМ ИМК. Увеличение концентрации ИМК способствовало обильному каллусообразованию, что делало практически невозможной адаптацию регенерантов in vivo.

Рис. 3. Образование адвентивных микропобегов абрикоса сорта Эффект на модифицированной питательной среде QL

0

Таблица 3

Влияние различных концентраций БАП и НУК на регенерацию микропобегов 4-х сортов абрикоса

Питательная среда Количество образовавшихся микропобегов, шт./эксплант

Дионис Наследник Салют Эффект

В5 (0,44 мкМ БАП+0,049 мкМ ИМК) 1,7±0,8 1,5±0,3 1,6±0,8 1,7±0,1

В5 (2,22 мкМ БАП+0,049 мкМ ИМК) 5,4±0,7 3,7±0,6 4,1±0,7 3,1±0,2

В5 (3,33 мкМ БАП+0,049 мкМ ИМК) 4,2±0,6 2,9+0,4 3,1+0,4 2,1+0,4

QL (0,44 мкМ БАП+0,054 мкМ НУК) 3,8±0,5 2,1±0,6 1,8±0,5 2,7±0,4

QL (2,22 мкМ БАП+0,054 мкМ НУК) 10,2±0,9 6,9±0,8 7,2±0,6 8,0±0,6

QL (3,33 мкМ БАП+0,054 мкМ НУК) 7,4±0,7 6,0+0,6 6,3±0,4 6,1+0,7

Через 4-5 месяцев культивирования миниатюрные растеньица высаживали в стерильную почвенную смесь. Проведенные испытания по определению влияния ряда почвенных субстратов на адаптацию in vivo растений, выращенных in vitro, показал, что все составленные смеси не получили преимущества перед смесью почва:песок:торф в объемном соотношении 3:1:1.

Таким образом, использование биотехнологических методов открывает большие перспективы по получению новых селекционных форм растений персика и абрикоса.

Список литературы

1. Бутенко Р.Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений. -М.: Наука, 1964. - 270 с.

2. Здруйковская-Рихтер А.И. Культура изолированных зародышей и некоторые другие приемы выращивания растений in vitro. - М.: ВАСХНИЛ, 1974. - 60 с.

3. Здруйковская-Рихтер А.И. Эмбриокультура изолированных зародышей, генеративных структур и получение новых форм растений. - Ялта: Крым-Фарм-Трейдинг, 2003. - 368 с.

4. Лесникова-Седошенко Н.П., Митрофанова О.В. Особенности морфогенеза в культуре органов и тканей абрикоса (Prunus armeniaca L.) // Бюл. Никит. ботан. сада. - 2006. - Вып. 92. - С. 12-15.

5. Митрофанова О.В., Лесникова-Седошенко Н.П., Ходаков Г.В. Биотехнология в селекции и оздоровлении косточковых плодовых и субтропических культур // Фактори експериментально'1 еволюцп органiзмiв: Зб. наук. праць Укр. т-ва генетиюв i селекцiонерiв iм. М.1. Вавилова / За ред. М.В. Ро!ка. - Кшв: Логос, 2006. - Т. 3. - С. 619-624.

6. Митрофанова О.В., Митрофанова И.В., Смыков А.В., Лесникова Н.П. Методы биотехнологии в селекции и размножении субтропических и косточковых плодовых культур // Труды Никит. ботан. сада. - 1999. - Т. 118. - С. 189-199.

7. Основы сельскохозяйственной биотехнологии / Муромцев Г.С., Бутенко Р.Г., Тихоненко Т.И., Прокофьев М.И. - М.: Агропромиздат, 1990. - 384 с.

8. Burgos L., Ledbetter C.A. Improved efficiency in apricot breeding: Effects of embryo development and nutrient media on in vitro germination and seedling establishment // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. - 1993. - Vol. 35, N 3. - P. 217-222.

9. Gamborg O.L., Eveleigh D.E. Culture methods and deletion of glucanases in cultures of wheat and barley // Can. J. Biochem. - 1968. - Vol. 46, N 5. - P. 417-421.

10. Monnier M. Croissance et developpement des embryons globulaires de Capsella Bursapastoris cultives in vitro dans un milieu a la base d'une nouvelle solution mineral // Bull. Soc. Bot. France, Memoires, Coll. Morphologie. - 1973. - P. 179-194.

11. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant. - 1962. - Vol. 15, N 3. - P. 473-497.

12. Quoirin M., Lepoivre P. Etude de milieux adaptes aux cultures in vitro de Prunus // Acta Hort. - 1977. - Vol. 78. - P. 437-442.

13. White P.R. Handbook of plant tissue culture. - Jaques Cattel Press, 1943. - Vol. 4. - P. 791-794.

Using of biotechnology methods for obtaining of peach (Prunus persica (L.) Batch) and apricot (Prunus armeniaca L.) selection forms

Lesnikova-Sedoshenko N.P., Mitrofanova O.V., Smykov A.V., Gorina V.M.

The biotechnological methods of obtaining of peach and apricot new selection forms for acceleration of breeding process and propagation have been represented.

БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ВЕЩЕСТВА АЗИМИНЫ ТРЕХЛОПАСТНОЙ [ASIMINA TRILOBA (L.) DUNAL]

А.К. ПОЛОНСКАЯ, кандидат биологических наук;

В.Н. ЕЖОВ, доктор технических наук, профессор, академик УААН;

С.Ю. ХОХЛОВ, кандидат сельскохозяйственных наук; Б.А. ВИНОГРАДОВ Никитский ботанический сад - Национальный научный центр

В связи с актуальностью расширения сортимента плодовых растений культурами с высоким содержанием биологически активных веществ (БАВ), интерес исследователей обратился к азимине [Asimina triloba (L.) Dunal] - культуре, сравнительно недавно интродуцированной на юг Украины.

Азимина трехлопастная [Asimina triloba (L.) Dunal] - невысокое листопадное дерево, встречающееся в Северной Америке от южной части провинции Онтарио (Канада) до штата Флорида. Азимина обычно произрастает на глубоких плодородных, рыхлых и влажных почвах в лесистых местностях, по берегам рек, как деревья подлеска, образуя густые заросли [12, 13].

Плоды азимины очень питательны, они содержат больше белка, аскорбиновой кислоты и растительного жира, чем яблоки, бананы и апельсины. Это прекрасный источник калия, магния, железа, меди, марганца, фосфора, цинка, ряда незаменимых аминокислот, а также рибофлавина и ниацина [15].

Особый интерес к азимине трехлопастной заключается в том, что это растение способно выдерживать длительные понижения температуры воздуха до -25-28°С; кроме этого, она устойчива к болезням и вредителям.

Интродукция Asimina triloba (L.) Dunal началась в 1819 г., когда несколько разновозрастных экземпляров этого растения впервые появились среди насаждений Сада [8]. В 1939 году, по сообщению Ф.К. Калайды, диаметры стволов этих растений равнялись 16 см, а площадь их крон составляла 5х5 м. Они характеризовались хорошим ростом и ежегодным плодоношением. К сожалению, в 1994 году в результате установившегося аномально засушливого лета растения азимины погибли. Но уже осенью того же года из питомниководческого хозяйства "Northwoods Nursery Inc." (США) были получены привитые саженцы двух лучших сортов азимины трехлопастной Prolific и Sunflower. Растения высадили на участок отдела субтропических плодовых и орехоплодных культур Сада, а в 1996 году были сделаны первые посадки азимины в Опытном хозяйстве НБС "Новокаховское" Херсонской области.