СПОСОБ ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКОГО ОКРАШИВАНИЯ ТОТАЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ ОБРАЗЦОВ БИОЛОГИЧЕСКИХ ТКАНЕЙ (ВАРИАНТЫ)
METHOD FOR IMMUNOHISTOCHEMICAL COLOURING OF WHOLE AMOUNTS OF BIOLOGICAL TISSUE SAMPLES (VERSIONS)

Предлагаемая группа изобретений относится к области экспериментальной биологии и медицины, где необходимо приготовление тотальных препаратов биологических тканей для оптической проекционной томографии, конфокальной, мультифотонной и светоплоскостной микроскопии с целью получения трехмерных карт гистологической и цитологической локализации антигенов (белков, пептидов, моноаминов, аминокислот, нуклеиновых кислот, полисахаридов). Изобретения могут быть использованы для предклинических испытаний фармакологических препаратов и оценки физиологических воздействий на организм, а также для работы с материалом биопсий в диагностических и исследовательских целях.
В последние годы в связи с развитием методов трехмерной микроскопии и оптической томографии возникла потребность в новых методах детекции антигенов в исследуемых образцах биологической ткани. Однако в настоящее время во всем мире иммуногистохимические исследования проводятся на гистологических срезах, потому что образцы толщиной более 50 мкм обладают низкой проницаемостью для антител и других высокомолекулярных маркеров.
Известен способ иммуногистохимического окрашивания, в котором в качестве образца ткани использовали эмбрионов шпорцевой лягушки до 26 стадии, которых фиксировали впервые описанным в этой работе фиксатором Дента (метанол: диметилсульфоксид в соотношении 4:1) в течение 2-12 ч, затем обесцвечивали в отбеливателе Дента (метанол: диметилсульфоксид (ДМСО): 30% перекись водорода в соотношении 4:1:1) в течение 48 ч. Хранили в метаноле при -20°C. После регидратации в Трис-буфере (2 раза по 5 мин) проводили иммуногистохимическую реакцию. Для этого инкубировали образцы в растворе первичных антител, приготовленном на 20% сыворотке новорожденного теленка, при 4°C в течение ночи. Затем образцы отмывали буфером пять раз не менее 1 ч каждый, после чего инкубировали в растворе вторичных антител, конъюгированных с пероксидазой хрена или щелочной фосфатазой (условия как для первичных антител). После этого производили энзиматические реакции, дегидратировали эмбрионы в метаноле 2 раза по 5-15 мин и просветляли в растворе бензил бензоат: бензиловый спирт в соотношении 2:1 [Dent J.A., Polson A.G., Klymkowsky M.W. A whole-mount immunocytochemical analysis of the expression of the intermediate filament protein vimentin in Xenopus // Development. - 1989. - V. 105. - №1. - P. 61-74].
Однако описанный в данной работе способ применялся к образцам малого размера (толщина до 100 мкм), использовались эмбрионы, а не ткани взрослых животных, в то время как использование иммуногистохимии в зрелой нервной системе, в отличие от эмбриональной ткани, сильно затруднено вследствие высокой гидрофобности миелина. Также данный способ является нефлуоресцентным, вследствие чего он не подходит для изготовления препаратов для оптической проекционной томографии, конфокальной, мультифотонной и светоплоскостной микроскопии.
2
2
Известен способ иммуногистохимического окрашивания, в котором окрашивали образцы мозга тритона - препараты спинного мозга толщиной до 400 мкм. Тритонов перфузировали сначала 1.5 мл 85% фосфатного буфера, затем 3 мл буфера, содержащего периодат-лизин и 0.5% параформальдегид, после чего постфиксировали иммерсией в течение 2 ч в растворе того же состава. Отмывали препараты в фосфатном буфере 3 раза по 30 мин, последняя отмывка в течение ночи при 4°C. Отбеливали препараты в растворе, содержащем 6% НО, 3% формамида, 0.1% Triton Х-100 в фосфатном буфере в течение нескольких часов. Затем отмывали препараты в фосфатном буфере 3 раза по 30 мин, последняя отмывка в течение ночи при 4°C. Пермеабилизировали образцы инкубацией в фосфатном буфере, содержащем 0.5-2% Triton Х-100 и 20% DMSO в течение 4-12 ч, а затем инкубировали в течение 10 суток в растворе первичных антител, приготовленном на пермеабилизационном буфере и содержащем 1% бычий сывороточный альбумин и 0.1% рыбий желатин. Отмывали пермеабилизационным буфером 5 раз по 30 мин и затем инкубировали с флуоресцентными вторичными антителами, также как и с первичными антителами. Отмывали пермеабилизационным буфером 4 раза по 30 мин и один раз в TNT-буфере: 100 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 тМ NaCl, 0.05% Tween-20. Дегидратировали образцы последовательной проводкой в 20%, 50%, 75%, 100% метаноле по 15 мин в каждом спирте и просветляли препараты в растворе бензил бензоат: бензиловый спирт в соотношении 2:1. [Zukor К.A., Kent D.T., Odelberg S.J. Fluorescent whole-mount method for visualizing three-dimensional relationships in intact and regenerating adult newt spinal cords // Dev. Dyn. - 2010. - V. 239. - №11. - P. 3048-3057].
Данный способ использовался для окраски ткани мозга амфибий и не был апробирован на мозге млекопитающих, миелинизация которого сильно отличается. В способе используются детергенты высоких концентраций, которые могут разрушительно сказываться на морфологии образца. В способе отсутствует этап низкотемпературной заморозки, и, таким образом, не предусматривает длительное накопление и хранение материала до осуществления окраски, что может быть необходимым при проведении медико-биологических экспериментов и клинических испытаний. Способ требует больших временных затрат - не менее 24 суток.
Известен способ иммуногистохимического окрашивания, в котором окрашивали блоки мозга взрослой мыши толщиной 1 мм, залитых в полиакриламидный гель, из которых предварительно электролитически вымыта липидная фракция клеточным мембранам (технология CLARITY). Мозг фиксировали перфузией 16% параформальдегида с неполимеризованным полиакриламидным гелем. Затем постфиксировали в том же составе. После осуществления процедур CLARITY изготавливали блоки толщиной 1 мм. Отмывали препараты фосфатным буфером, содержащим 0.1% Triton Х-100, 2 раза по 24 ч каждый. Инкубировали образцы с раствором первичных антител, приготовленном на 0.5 М боратном буфере, pH 8.5 с 0.1% Triton Х-100, при 37°С, в течение 2-14 сут. Отмывали препараты 0.5 М боратным буфером в течение 1-7 сут. Инкубировали образцы с флуоресцентными вторичными антителами (условия как для первичных антител). Отмывали препараты 0.5 М боратным буфером в течение 1-7 сут. Просветляли образцы с помощью FocusClear или 80% глицерин в течение 2 сут. [Chung К, Wallace J, Kim SY, Kalyanasundaram S., Andalman A.S., Davidson T.J., Mirzabekov J.J., Zalocusky K.A., Mattis J., Denisin A.K., Pak S., Bernstein H., Ramakrishnan C, Grosenick L., Gradinaru V., Deisseroth K. Structural and molecular interrogation of intact biological systems // Nature. - 2013.- V. 16. - №497(7449). - Р. 332-337].
Описанный способ показывает наилучшие показатели иммуногистохимической окраски толстых образцов мозга, однако является технически трудновыполнимым: требует специального дорогостоящего оборудования для осуществления экстракции липидов с помощью электрофореза целого мозга и специальных навыков у персонала. Метод в коротком исполнении занимает 7 суток, однако в полном варианте продолжительность составляет до 42 суток.
Известен способ, в котором окрашивали крупные образцы мозга - препараты целого мозжечка взрослой мыши. После глубокой анестезии мышей перфузировали раствором 4% параформальдегида и затем изолированные образцы постфиксировали в 4% растворе парформальдегида в течение 24-48 ч при 4°C. Затем постфиксировали в фиксаторе Дента в течение 12-18 ч, инкубировали в отбеливателе Дента в течение 8 ч и дегидратировали в 100% метаноле 2 раза по 30 мин. Потом проводили циклы замораживания - оттаивания (4-5 циклов заморозки до температуры -80°C и оттаивания до комнатной температуры) и оставляли на 12-18 ч в метаноле при -80°C. Для проведения иммуногистохимической реакции препараты регидратировали последовательно в 50%, 15% метаноле на 0,1 М фосфатном буфере, при комнатной температуре, 90 мин в каждом растворе, затем 0,1 М фосфатным буфером, также 90 мин при тех же условиях. Для пермеабилизации образцы инкубировали при комнатной температуре в растворе протеиназы К (10 мкг/мл), в течение 5 мин, после чего производили 3 отмывки фосфатным буфером по 10 мин каждая. Неспецифическое связывание антител блокировали инкубацией препаратов в течение 4-8 ч при комнатной температуре в фосфатном буфере, содержащем: 2% обезжиренное сухое молоко, 0,1% Triton Х-100 и 5% ДМСО. Осуществляли 2-3 смены раствора. Затем инкубировали в растворе антител, приготовленном на блокирующем буфере, в течение 48 ч, при 4°C .После этого отмывали препараты блокирующим буфером 2-3 раза по 2-3 ч каждый при 4С и осуществляли инкубацию с вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена, при тех же условиях, что и с первичными антителами. После этого отмывали препараты 3-4 раза по 2-3 ч каждый при 4С, последнюю отмывку оставляли на ночь, затем отмывали фосфатным буфером, содержащим 0.2% бычий сывороточный альбумин, 0.1% Triton X-100, в течение ночи при 4°C  или 2 ч при комнатной температуре. После этого осуществляли энзиматическую реакцию при помощи диаминобензидина и отмывали фосфатным буфером с 0,04% азидом натрия. Для оптического просветления образцы вновь дегидратировали в 30%, 50%, 80% и 100% метаноле по 30-60 мин в каждом и просветляли в растворе бензил бензоат: бензиловый спирт в соотношении 2:1 [R.V. Sillitoe, R. Hawkes. Whole-mount immunohistochemistry: a high-throughput screen for patterning defects in the mouse cerebellum // J. Histochem. Cytochem. - 2002. - V. 50. - 2. - P. 235-244.].
Данный способ иммуногистохимического окрашивания является нефлуоресцентным, что не позволяет его использовать для изготовления препаратов для оптической проекционной томографии, конфокальной, мультифотонной и светоплоскостной микроскопии. Также для пермеабилизации использовалась обработка протеолитическим ферментом, разрушающим ряд антигенов, что сильно ограничивает области применения данного способа. Для пермеабилизации используется несколько циклов заморозки-разморозки образца, что может негативно сказываться на сохранности морфологии образца. Способ обладает относительно невысокой глубиной прокрашивания мозга - не более 300 мкм. Продолжительность процедуры окрашивания по данному способу составляет не менее 15 суток.
Ближайшим аналогом заявляемого способа является способ, в котором окрашивали целые полушария мозга молодых (в возрасте 8 недель) мышей. После анестезии мышей перфузировали сначала 0,1 М фосфатным буфером, содержащим гепарин (10 ед/мл), затем раствором 1% параформальдегида, после чего извлекали мозг и постфиксировали его в 1% растворе параформальдегида в течение 2 ч. Затем образцы непосредственно дегидратировали в течение дня в серии спиртов до 100% метанола. Потом проводили циклы замораживания - оттаивания (4 циклов заморозки до температуры -80°C и оттаивания до комнатной температуры по 1 ч каждый), после чего препараты регидратировали последовательно в серии спиртов до 0,1 М фосфатного буфера в течение дня. Для пермеабилизации образцы инкубировали при комнатной температуре в растворе протеиназы К (10 мкг/мл), в течение 5 мин, после чего производили отмывку фосфатным буфером. Восстановление антигена производили в микроволновой печи в 0.01 М цитратном буфере, pH 6.0, в режиме: 0-90°C 11 мин, 90-98°C 3 мин, 98°C 10 мин. Затем образцы были охлаждены до комнатной температуры и отмыты. Далее все операции производили в микроволновой печи. Образцы были инкубированы при 37°C  в течение 48 ч в растворе первичных антител, содержащем 5% нормальную сыворотку, 5% ДМСО и 0.01% Triton Х-100. Затем образцы были отмыты при 37°C в течение 48 ч в растворе, содержащем 5% нормальную сыворотку и 0.01% Triton Х-100, смену раствора производили спустя 24 ч инкубации. Затем образцы были инкубированы при 37°C в течение 72 ч в растворе вторичных антител, содержащем 5% нормальную сыворотку, 5% ДМСО и 0.01% Triton Х-100, после чего отмыты при 37°C в течение 48 ч в растворе, содержащем 5% нормальную сыворотку и 0.01% Triton Х-100, смену раствора производили спустя 24 ч инкубации. После этого образцы дегидратировали и просветляли в растворе бензил бензоат: бензиловый спирт в соотношении 2:1 [J.A. Gleave, J.P. Lerch, R.M. Henkelman, B.J. Nieman. A method for 3D immunostaining and optical imaging of the mouse brain demonstrated in neural progenitor cells // PLoS One. - 2013. - V. 8. - 8. - e72039].
Данный способ был апробирован только для мозга молодых животных, обладающего лучшей проницаемостью для антител, чем мозг взрослых животных. При окрашивании по этому способу для пермеабилизации используют обработку протеолитическим ферментом и инкубации при высокой температуре, разрушающими ряд антигенов, что ограничивает области применения данного способа. Для пермеабилизации также используют несколько циклов заморозки-разморозки образца, что может негативно сказываться на сохранности морфологии образца. Также образцы, окрашенные данным способом, обладают высокой аутофлуоресценцией, что может ограничивать использование его для изготовления препаратов для количественного анализа. Продолжительность процедуры окрашивания по данному способу составляет не менее 15 суток.
Техническим результатом предлагаемой группы изобретений является иммуногистохимическое окрашивание тотальных препаратов образцов биологических тканей (в частности, мозга) животных разного возраста толщиной до 1,5 мм с сохранением морфологии образцов и более широким охватом выявляемых антигенов, возможность проведения количественного анализа иммуногистохимически выявленных меток за счет высокого соотношения фон - сигнал и снижения аутофлуоресценции, уменьшение продолжительности процесса окрашивания.
2
2
Указанный технический результат достигается тем, что в предлагаемом способе иммуногистохимического окрашивания тотальных препаратов образцов биологической ткани, включающем фиксацию ткани раствором параформальдегида, постфиксацию, дегидратацию в метаноле, регидратацию в растворах метанола, пермеабилизацию, отмывку фосфатным буфером, инкубацию в растворе первичных антител, отмывку в буфере, инкубацию в растворе флуоресцентных вторичных антител, отмывку в буфере, дегидратацию, просветление в смеси бензил бензоата:бензиловый спирт, взятых в соотношении 2:1, постфиксацию сначала проводят 0,5-1%-ным параформальдегидом в течение 48 ч при 4°C, а затем после трехкратной отмывки фосфатным буфером при комнатной температуре, в растворе 20%-ного диметилсульфоксида в 100%-ном метаноле в течение 1-2 ч при комнатной температуре, после этого образец ткани отбеливают в растворе, содержащем 100%-ный метанол:диметилсульфоксид: 30% НО в соотношении 4:1:1, в течение 2-4 ч на ярком свету при комнатной температуре до полного обесцвечивания, затем отмывают 3 раза по 60 мин в 100%-ном метаноле при комнатной температуре и замораживают не менее чем на 1 час при -70…-80°C , после чего регидратируют последовательно в 50, 25 и 12,5%-ных растворах метанола в фосфатном буфере по 45-60 мин в каждом при комнатной температуре, затем образцы трижды отмывают от метанола фосфатным буфером, причем два раза отмывают по 1-2 ч при комнатной температуре, а последнюю отмывку проводят в течение ночи при 4°C, последующую пермеабилизацию образца проводят в фосфатном буфере, содержащем 2%-ный Triton Х-100, 5%-ную нормальную сыворотку, 5%-ный диметилсульфоксид, в течение 2 ч при комнатной температуре, затем образец отмывают трижды в фосфатном буфере, содержащем 0,2%-ный Triton Х-100, причем два раза отмывают по 30-60 мин при комнатной температуре, а последнюю отмывку проводят в течение ночи при 4°C, после этого проводят инкубацию последовательно в растворах первичных и вторичных антител, приготовленных на буфере, состоящем из 0.05 М Tris-HCl с pH 7.5; 0.15 М NaCl; 0.2% Triton Х-100, 5% диметилсульфоксид и 2.5-5.0% нормальной сыворотки животного-хозяина вторичных антител, при 4°C в течение 2-7 суток, с отмывками после каждой инкубации в буфере, состоящем из 0.05 М Tris-HCl с pH 7.5; 0.15 М NaCl; 0.2% Triton Х-100, сначала 3 раза по 60 мин при комнатной температуре, а затем в течение ночи при 4°C, окрашенные образцы дегидратируют последовательно в 50, 96%-ных растворах этанола в фосфатном буфере по 45-60 мин в каждом при комнатной температуре, затем выдерживают сначала в 100%-ном этаноле при комнатной температуре 2-3 раза по 45-60 мин, а затем в 2-бутоксиэтаноле при 4°C в течение 12-18 ч, дегидратированные образцы просветляют при комнатной температуре в течение 3-4 ч, способ окрашивания, начиная с операции постфиксации, проводят при помешивании со скоростью 650-800 об/мин.
Указанный технический результат достигается также тем, что ткань фиксируют методом транскардиальной перфузии 0,5-1% раствором параформальдегида, охлажденным до 4-10°C.
Указанный технический результат достигается также тем, что ткань фиксируют методом погружения образца в 0,5-1% раствор параформальдегида в течение 48 ч при 4°C .
Указанный технический результат достигается также тем, что дегидратированные образцы до окрашивания накапливают и хранят в 100% метаноле в условиях глубокой заморозки при -70…-80°C.
Указанный технический результат достигается также тем, что дегидратированные образцы до окрашивания просветляют в смеси бензил бензоат: бензиловый спирт в соотношении 2:1 в течение 30 мин при комнатной температуре до состояния полной прозрачности, а затем экспонируют прозрачные образцы под ультрафиолетом в течение 1 ч, при 4-10°C, после чего препараты отмывают дважды в абсолютном метаноле в течение 30 мин при комнатной температуре, а затем регидратируют и инкубируют с антителами.
Указанный технический результат достигается также тем, что растворы первичных и/или вторичных антител дополнительно содержат 0.5-1% сапонин.
Указанный технический результат достигается также тем, что инкубационные растворы первичных и вторичных антител заменяют на свежие 2-3 раза через 36-48 ч инкубации.
Указанный технический результат достигается также тем, что инкубационные растворы первичных и вторичных антител освежают добавлением новой порции антител.
Указанный технический результат достигается также тем, что образцы ткани перед просветлением хранят в 2-бутоксиэтаноле при 4°C.
Указанный технический результат достигается тем, что в способе иммуногистохимического окрашивания тотальных препаратов образцов биологической ткани, включающем фиксацию ткани раствором параформальдегида, постфиксацию, дегидратацию в метаноле, регидратацию в растворах метанола, пермеабилизацию, отмывку фосфатным буфером, инкубацию в растворе первичных антител, отмывку в буфере, дегидратацию, просветление в смеси бензил бензоата:бензиловый спирт, взятых в соотношении 2:1, постфиксацию сначала проводят 0,5-1%-ным параформальдегидом в течение 48 ч при 4°C, а затем после трехкратной отмывки фосфатным буфером при комнатной температуре, в растворе 20%-ного диметилсульфоксида в 100%-ном метаноле в течение 1-2 ч при комнатной температуре, после этого образец ткани отбеливают в растворе, содержащем 100%-ный метанол:диметилсульфоксид: 30% Н2О2 в соотношении 4:1:1, в течение 2-4 ч на ярком свету при комнатной температуре до полного обесцвечивания, затем отмывают 3 раза по 60 мин в 100%-ном метаноле при комнатной температуре и замораживают не менее чем на 1 час при -70…-80°C, после чего регидратируют последовательно в 50, 25 и 12,5%-ных растворах метанола в фосфатном буфере по 45-60 мин в каждом при комнатной температуре, затем образцы трижды отмывают от метанола фосфатным буфером, причем два раза отмывают по 1-2 ч при комнатной температуре, а последнюю отмывку проводят в течение ночи при 4°C, последующую пермеабилизацию образца проводят в фосфатном буфере, содержащем 2%-ный Triton Х-100, 5%-ную нормальную сыворотку, 5%-ный диметилсульфоксид, в течение 2 ч при комнатной температуре, затем образец отмывают трижды в фосфатном буфере, содержащем 0,2%-ный Triton Х-100, причем два раза отмывают по 30-60 мин при комнатной температуре, а последнюю отмывку проводят в течение ночи при 4°C, после этого проводят инкубацию в растворе флуоресцентно-меченных первичных антител, приготовленных на буфере, состоящем из 0.05 М Tris-HCl с pH 7.5; 0.15 М NaCl; 0.2% Triton Х-100, 5% диметилсульфоксид и 2.5-5.0% нормальной сыворотки, при 4°C  в течение 2-7 суток, после чего окрашенный образец отмывают в буфере, состоящем из 0.05 М Tris-HCl с pH 7.5; 0.15 М NaCl; 0.2% Triton Х-100, сначала 3 раза по 60 мин при комнатной температуре, а затем в течение ночи при 4°C, образцы дегидратируют последовательно в 50, 96%-ных растворах этанола в фосфатном буфере по 45-60 мин в каждом при комнатной температуре, затем выдерживают сначала в 100%-ном этаноле при комнатной температуре 2-3 раза по 45-60 мин, а затем в 2-бутоксиэтаноле при 4°C в течение 12-18 ч, дегидратированные образцы просветляют при комнатной температуре в течение 3-4 ч, способ окрашивания, начиная с операции постфиксации, проводят при помешивании со скоростью 650-800 об/мин.
Указанный технический результат достигается также тем, что ткань фиксируют методом транскардиальной перфузии 0,5-1% раствором параформальдегида, охлажденным до 4-10°C .
Указанный технический результат достигается также тем, что ткань фиксируют методом погружения образца в 0,5-1% раствор параформальдегида в течение 48 ч при 4°C.
Указанный технический результат достигается также тем, что дегидратированные образцы до окрашивания накапливают и хранят в 100% метаноле в условиях глубокой заморозки при -70…-80°C.
Указанный технический результат достигается также тем, что дегидратированные образцы до окрашивания просветляют в смеси бензил бензоат:бензиловый спирт в соотношении 2:1 в течение 30 мин при комнатной температуре до состояния полной прозрачности, а затем экспонируют прозрачные образцы под ультрафиолетом в течение 1 ч, при 4-10°C , после чего препараты отмывают дважды в абсолютном метаноле в течение 30 мин при комнатной температуре, а затем регидратируют и инкубируют с антителами.
Указанный технический результат достигается также тем, что раствор первичных антител дополнительно содержит 0.5-1% сапонин.
Указанный технический результат достигается также тем, что инкубационный раствор первичных антител заменяют на свежий 2-3 раза через 24-48 ч инкубации.
Указанный технический результат достигается также тем, что инкубационный раствор первичных антител освежают добавлением новой порции антител.
Указанный технический результат достигается также тем, что образцы ткани перед просветлением хранят в 2-бутоксиэтаноле при 4°C.
Сущность настоящей группы изобретений поясняется иллюстративным материалом в виде графиков с показателями глубины прокраски образцов и микрофотографий, окрашенных по способу образцов биологической ткани на фиг. 1-2, где:
на фиг. 1 представлены трехмерные изображения цельного гиппокампа взрослой мыши с экспрессией белка c-Fos, выявленной с помощью заявленного способа иммуногистохимической окраски, визуализация осуществлена при помощи светоплоскостной микроскопии;
на фиг. 2 представлено трехмерное изображение гиппокампа 14-суточного мышонка линии Nestin-CFPnuc, окрашенного заявленным способом, во вставках справа представлены увеличенные фрагменты гранулярного слоя зубчатой фасции гиппокампа с экспрессией CFP в ядрах нервных стволовых клеток.
2
2
Первый вариант заявленного способа иммуногистохимического окрашивания тотальных препаратов образцов биологических тканей осуществляют следующим образом. Образцы биологической ткани (мозг новорожденных, молодых, взрослых и старых мышей) фиксируют транскардиальной перфузией сначала 0.1 М фосфатным буфером при pH 7.4 (далее по тексту фосфатный буфер) в объеме 30 мл, а затем охлажденным до 4-10°C 0,5-1%-ным параформальдегидом в фосфатном буфере при pH 7.4, также в объеме 30 мл. Далее все операции проводят при помешивании со скоростью 650-800 об/мин (меньшая скорость недостаточна для равномерного прокрашивания, а большая может вызвать повреждение образца). Образцы постфиксируют сначала 0,5-1%-ным параформальдегидом в течение 48 ч при 4°C (при меньшем времени фиксации образцы могут разрушаться в процессе окраски, при более длительной фиксации появляется аутофлуоресценция в сосудах), а затем после трехкратной отмывки фосфатным буфером при комнатной температуре, в растворе 20%-ного диметилсульфоксида (ДМСО) в 100%-ном метаноле в течение 1-2 ч при комнатной температуре (при комнатной температуре происходит дополнительная делипидизация ткани). Ткань также можно фиксировать методом погружения образца в 0,5-1% раствор параформальдегида в течение 48 ч при 4°C , а затем постфиксировать в растворе 20%-ного ДМСО в 100%-ном метаноле, как описано выше. Фиксированные образцы ткани отбеливают в растворе, содержащем 100%-ный метанол: ДМСО: 30% НО в соотношении 4:1:1, в течение 2-4 ч на ярком свету при комнатной температуре до полного обесцвечивания (пока образцы не станут белыми), после чего их отмывают 3 раза по 60 мин в 100%-ном метаноле при комнатной температуре и замораживают не менее чем на 1 час при -70…-80°C. На этом этапе дегидратированные образцы можно накапливать и хранить длительное время в 100% метаноле в условиях глубокой заморозки при -70…-80°C. Для снижения аутофлуоресценции в сосудах дегидратированные образцы до окрашивания просветляют в смеси бензил бензоат:бензиловый спирт в соотношении 2:1 в течение 30 мин при комнатной температуре до состояния полной прозрачности, а затем экспонируют прозрачные образцы под ультрафиолетом в течение 1 ч, при 4-10°C (высокая температура может негативно влияет на антигенность), после чего препараты отмывают дважды в абсолютном метаноле в течение 30 мин при комнатной температуре. Данный этап является обязательным, если препараты окрашиваются с целью последующего количественного анализа. Далее дегидратированные препараты регидратируют последовательно в 50, 25 и 12,5%-ных растворах метанола в фосфатном буфере по 45-60 мин в каждом при комнатной температуре, а затем трижды отмывают от метанола фосфатным буфером, причем два раза отмывают по 1-2 ч при комнатной температуре, а последнюю отмывку проводят в течение ночи при 4°C . Регидратированные образцы пермеабилизируют в фосфатном буфере, содержащем 2%-ный Triton Х-100, 5%-ную нормальную сыворотку, 5%-ный ДМСО, в течение 2 ч при комнатной температуре, после чего образцы отмывают трижды в фосфатном буфере, содержащем 0,2%-ный Triton Х-100, причем два раза отмывают по 30-60 мин при комнатной температуре, а последнюю отмывку проводят в течение ночи при 4°C. Далее проводят инкубацию образцов в растворе первичных антител, приготовленном на буфере, состоящем из 0.05 М Tris-HCl с pH 7.5; 0.15 М NaCl; 0.2% Triton Х-100, 5% ДМСО и 2.5-5.0% нормальной сыворотки животного-хозяина вторичных антител, при 4°C  в течение 2-7 суток (время зависит от (1) размера образца: крупный размер образца требует большего времени для диффузии антител вглубь образца; (2) возраста животного: образцы старых животных требуют большего времени инкубации, чем молодых, вследствие большей гидрофобности их нервной ткани, и (3) размера конкретных антител: промышленные антитела отличаются по молекулярной массе, чем крупней антитела, тем большее время инкубации требуется), заменяя инкубационный раствор на свежий 2-3 раза через 24-48 ч инкубации.
После инкубации с антителами образцы отмывают в буфере, состоящем из 0.05 М Tris-HCl с pH 7.5; 0.15 М NaCl; 0.2% Triton Х-100, сначала 3 раза по 60 мин при комнатной температуре, а затем в течение ночи при 4°C . Затем проводят инкубацию образцов в растворе вторичных флуоресцентно меченных антител, приготовленном на буфере, состоящем из 0.05 М Tris-HCl с pH 7.5; 0.15 М NaCl; 0.2% Triton Х-100, 5% ДМСО и 2.5-5.0% нормальной сыворотки животного-хозяина вторичных антител, при 4°C  в течение 2-7 суток, заменяя инкубационный раствор на свежий 2-3 раза через 24-48 ч инкубации. После инкубации с вторичными антителами образцы снова отмывают в буфере, состоящем из 0.05 М Tris-HCl с pH 7.5; 0.15 М NaCl; 0.2% Triton Х-100, сначала 3 раза по 60 мин при комнатной температуре, а затем в течение ночи при 4°C. Растворы первичных и/или вторичных антител могут дополнительно содержать 0.5-1% сапонин для повышения проницаемости образцов для антител. Инкубационные растворы первичных и вторичных антител можно освежать также добавлением новой порции антител. Окрашенные образцы дегидратируют последовательно в 50, 96%-ных растворах этанола в фосфатном буфере по 45-60 мин в каждом при комнатной температуре, затем выдерживают сначала в 100%-ном этаноле при комнатной температуре 2-3 раза по 45-60 мин, а затем в 2-бутоксиэтаноле при 4°C в течение 12-18 ч. На этом этапе окрашенные образцы ткани можно хранить в 2-бутоксиэтаноле при 4°C. Дегидратированные образцы просветляют при комнатной температуре в течение 3-4 ч в смеси бензил бензоата:бензиловый спирт, взятых в соотношении 2:1.
2
2
Второй вариант заявленного способа иммуногистохимического окрашивания тотальных препаратов образцов биологических тканей осуществляют следующим образом. Образцы биологической ткани (мозг новорожденных, молодых, взрослых и старых мышей) фиксируют транскардиальной перфузией сначала 0.1 М фосфатным буфером при pH 7.4 (далее по тексту фосфатный буфер) в объеме 30 мл, а затем охлажденным до 4-10°C 0,5-1%-ным параформальдегидом в фосфатном буфере при pH 7.4, также в объеме 30 мл. Далее все операции проводят при помешивании со скоростью 650-800 об/мин (меньшая скорость недостаточна для равномерного прокрашивания, а большая может вызвать повреждение образца). Образцы постфиксируют сначала 0,5-1%-ным параформальдегидом в течение 48 ч при 4°C (при меньшем времени фиксации образцы могут разрушаться в процессе окраски, при более длительной фиксации появляется аутофлуоресценция в сосудах), а затем после трехкратной отмывки фосфатным буфером при комнатной температуре, в растворе 20%-ного ДМСО в 100%-ном метаноле в течение 1-2 ч при комнатной температуре (при комнатной температуре происходит дополнительная делипидизация ткани). Ткань также можно фиксировать методом погружения образца в 0,5-1% раствор параформальдегида в течение 48 ч при 4°C, а затем постфиксировать в растворе 20%-ного ДМСО в 100%-ном метаноле, как описано выше. Фиксированные образцы ткани отбеливают в растворе, содержащем 100%-ный метанол:ДМСО: 30% НО в соотношении 4:1:1, в течение 2-4 ч на ярком свету при комнатной температуре до полного обесцвечивания (пока образцы не станут белыми), после чего их отмывают 3 раза по 60 мин в 100%-ном метаноле при комнатной температуре и замораживают не менее чем на 1 час при -70…-80°C. На этом этапе дегидратированные образцы можно накапливать и хранить длительное время в 100% метаноле в условиях глубокой заморозки при -70…-80°C. Для снижения аутофлуоресценции в сосудах дегидратированные образцы до окрашивания просветляют в смеси бензил бензоат:бензиловый спирт в соотношении 2:1 в течение 30 мин при комнатной температуре до состояния полной прозрачности, а затем экспонируют прозрачные образцы под ультрафиолетом в течение 1 ч, при 4-10°C (высокая температура может негативно влияет на антигенность), после чего препараты отмывают дважды в абсолютном метаноле в течение 30 мин при комнатной температуре. Данный этап является обязательным, если препараты окрашиваются с целью последующего количественного анализа. Далее дегидратированные препараты регидратируют последовательно в 50, 25 и 12,5%-ных растворах метанола в фосфатном буфере по 45-60 мин в каждом при комнатной температуре, а затем трижды отмывают от метанола фосфатным буфером, причем два раза отмывают по 1-2 ч при комнатной температуре, а последнюю отмывку проводят в течение ночи при 4°C. Регидратированные образцы пермеабилизируют в фосфатном буфере, содержащем 2%-ный Triton Х-100, 5%-ную нормальную сыворотку, 5%-ный ДМСО, в течение 2 ч при комнатной температуре, после чего образцы отмывают трижды в фосфатном буфере, содержащем 0,2%-ный Triton Х-100, причем два раза отмывают по 30-60 мин при комнатной температуре, а последнюю отмывку проводят в течение ночи при 4°C . Далее проводят инкубацию образцов в растворе первичных флуоресцентно меченных антител, приготовленном на буфере, состоящем из 0.05 М Tris-HCl с pH 7.5; 0.15 М NaCl; 0.2% Triton Х-100, 5% ДМСО и 2.5-5.0% нормальной сыворотки, при 4°C в течение 2-7 суток (время зависит от (1) размера образца: крупный размер образца требует большего времени для диффузии антител вглубь образца; (2) возраста животного: образцы старых животных требуют большего времени инкубации, чем молодых, вследствие большей гидрофобности их нервной ткани, и (3) размера конкретных антител: промышленные антитела отличаются по молекулярной массе, чем крупней антитела, тем большее время инкубации требуется), заменяя инкубационный раствор на свежий 2-3 раза через 24-48 ч инкубации. После инкубации с антителами образцы отмывают в буфере, состоящем из 0.05 М Tris-HCl с pH 7.5; 0.15 М NaCl; 0.2% Triton Х-100, сначала 3 раза по 60 мин при комнатной температуре, а затем в течение ночи при 4°C. Раствор антител может дополнительно содержать 0.5-1% сапонин для повышения проницаемости образцов для антител. Инкубационный раствор первичных антител можно освежать также добавлением новой порции антител. Окрашенные образцы дегидратируют последовательно в 50, 96%-ных растворах этанола в фосфатном буфере по 45-60 мин в каждом при комнатной температуре, затем выдерживают сначала в 100%-ном этаноле при комнатной температуре 2-3 раза по 45-60 мин, а затем в 2-бутоксиэтаноле при 4°C в течение 12-18 ч. На этом этапе окрашенные образцы ткани можно хранить в 2-бутоксиэтаноле при 4°C. Дегидратированные образцы просветляют при комнатной температуре в течение 3-4 ч в смеси бензил бензоата:бензиловый спирт, взятых в соотношении 2:1.
Ниже приведены конкретные примеры реализации заявленных способов.
Пример 1.
Окрашивали образцы изолированного гиппокампа взрослых мышей линии 129sv в возрасте около 60-и постнатальных суток. Для индукции экспрессии c-Fos мышь помещали в незнакомую экспериментальную камеру и через 2.5 мин наносили удар током 0.5 А по лапам длительностью 2 с. После этого животное выдерживали в камере еще 30 с, а затем возвращали в домашнюю клетку. Декапитацию производили на пике индуцируемой экспрессии - через 90 мин от начала эксперимента. Мозг фиксировали методом погружения образца в 1% раствор параформальдегида в течение 24 ч при 4°C . После этого из мозга извлекали гиппокамп и постфиксировали его в том же растворе дополнительно 24 ч. Далее все операции проводили при помешивании со скоростью 750 об/мин. После трехкратной отмывки фосфатным буфером при комнатной температуре, препараты гиппокампа дополнительно постфиксировали в растворе 20%-ного диметилсульфоксида (ДМСО) в 100%-ном метаноле в течение 2 ч при температуре 4°C. Фиксированные препараты отбеливали в растворе, содержащем 100%-ный метанол: ДМСО: 30% Н2О2 в соотношении 4:1:1, в течение 2 ч на ярком свету при комнатной температуре до полного обесцвечивания, после чего их отмывали 3 раза по 60 мин в 100%-ном метаноле при комнатной температуре и замораживали на 18 ч при -80°C. Далее дегидратированные препараты регидратировали последовательно в 50, 25 и 12,5%-ных растворах метанола в фосфатном буфере по 60 мин в каждом при комнатной температуре, а затем трижды отмывали от метанола фосфатным буфером, причем два раза отмывали по 1 ч при комнатной температуре, а последнюю отмывку проводили в течение ночи при 4°C. Далее проводили инкубацию образцов в растворе кроличьих первичных антител к белку c-Fos (sc-52, Santa Cruz, США, в разведении 1:500), приготовленном на буфере, состоящем из 0.05 М Tris-HCl с pH 7.5; 0.15 М NaCl; 0.2% Triton Х-100, 5% ДМСО и 2.5% нормальной козьей сыворотки, при 4°C в течение 72 ч. После инкубации с антителами образцы отмывали в буфере, состоящем из 0.05 М Tris-HCl с pH 7.5; 0.15 М NaCl; 0.2% Triton Х-100, сначала 3 раза по 60 мин при комнатной температуре, а затем в течение ночи при 4°C. Затем проводили инкубацию образцов в растворе вторичных козьих противокроличьих антител, конъюгированных с Alexa Fluor 488 (F(ab′)2-фрагменты, А-11070, Molecular Probes, США, 1:500), приготовленном на буфере, состоящем из 0.05М Tris-HCl с pH 7.5; 0.15 М NaCl; 0.2% Triton Х-100, 5% ДМСО и 2.5% нормальной сыворотки животного-хозяина вторичных антител, при 4°C в течение 24 ч. После инкубации с вторичными антителами образцы снова отмывали в буфере, состоящем из 0.05 М Tris-HCl с pH 7.5; 0.15 М NaCl; 0.2% Triton Х-100, сначала 3 раза по 60 мин при комнатной температуре, а затем в течение ночи при 4°C. Далее окрашенные образцы дегидратировали последовательно в 50, 96%-ных растворах этанола в фосфатном буфере по 60 мин в каждом при комнатной температуре, затем выдерживали сначала в 100%-ном этаноле при комнатной температуре 3 раза по 60 мин, а затем в 2-бутоксиэтаноле при 4°C в течение 18 ч. Дегидратированные образцы просветляли при комнатной температуре в течение 12 ч в смеси бензил бензоата:бензиловый спирт, взятых в соотношении 2:1 Съемку препаратов проводили на светоплоскостном микроскопе, построение трехмерных реконструкций окрашенных гиппокампов осуществляли в Imaris 6.0 (Bitplane AG, Швейцария).
Препараты гиппокампа, окрашенные по заявленному способу, прокрашены полностью, после просветления в растворе Мюррея не наблюдается потеря флуоресцентного сигнала, достигается клеточное разрешение по всей глубине образца, а также высокое соотношение сигнал:фон, пригодные для осуществления количественного анализа (Фиг. 1).
Пример 2.
2
2
Окрашивали образцы изолированного гиппокампа взрослых мышей линии NestinCFPnuc в возрасте около 60 постнатальных суток, в геном которых встроен голубой флуоресцентный белок CFP под регулирующей последовательностью гена nestin-маркера стволовых клеток мозга. Проводили транскардиальную перфузию сначала 0.1 М фосфатным буфером при pH 7.4 в объеме 30 мл, а затем охлажденным до 10°C 1%-ным параформальдегидом в фосфатном буфере при pH 7.4, также в объеме 30 мл. После этого извлекали головной мозг и постфиксировали его 1%-ным параформальдегидом в фосфатном буфере при 4°C в течение 24 ч. После этого из мозга извлекали гиппокамп и постфиксировали его в том же растворе дополнительно 24 ч. Далее все операции проводили при помешивании со скоростью 650 об/мин. После трехкратной отмывки фосфатным буфером при комнатной температуре, образцы постфиксировали в растворе 20%-ного ДМСО в 100%-ном метаноле в течение 2 ч при температуре 4°C .Фиксированные препараты гиппокампа отбеливали в растворе, содержащем 100%-ный метанол: ДМСО: 30% НО в соотношении 4:1:1, в течение 2 ч на ярком свету при комнатной температуре до полного обесцвечивания, после чего их отмывали 3 раза по 60 мин в 100%-ном метаноле при комнатной температуре и замораживали не менее чем на 1 час при -70…-80°C. Для снижения аутофлуоресценции в сосудах дегидратированные образцы до окрашивания просветляли в смеси бензил бензоат:бензиловый спирт в соотношении 2:1 в течение 30 мин при комнатной температуре до состояния полной прозрачности, а затем экспонировали прозрачные образцы под ультрафиолетом в течение 1 ч, при 10°C , после чего препараты отмывали дважды в абсолютном метаноле в течение 30 мин при комнатной температуре. Далее дегидратированные препараты гиппокампа регидратировали последовательно в 50, 25 и 12,5%-ных растворах метанола в фосфатном буфере по 60 мин в каждом при комнатной температуре, а затем трижды отмывали от метанола фосфатным буфером, причем два раза отмывали по 1 ч при комнатной температуре, а последнюю отмывку проводили в течение ночи при 4°C. Регидратированные образцы пермеабилизировали в фосфатном буфере, содержащем 2%-ный Triton Х-100, 5%-ную нормальную козью сыворотку, 5%-ный ДМСО, в течение 2 ч при комнатной температуре, после чего гиппокампы отмывали трижды в фосфатном буфере, содержащем 0,2%-ный Triton Х-100, два раза отмывали по 30 мин при комнатной температуре, а последнюю отмывку проводили в течение ночи при 4°C. Далее препараты инкубировали в растворе кроличьих поликлональных антител к белку GFP, конъюгированных с флуорофором AlexaFluor488 (Molecular Probes, 1:500), приготовленном на буфере, состоящем из 0.05М Tris-HCl с pH 7.5; 0.15 М NaCl; 0.2% Triton Х-100, 5% ДМСО, 1% сапонин и 2.5% нормальной козьей сыворотки при 4°C в течение 72 ч, заменяя инкубационный раствор на свежий через 36 ч инкубации. После инкубации с антителами образцы отмывали в буфере, состоящем из 0.05 М Tris-HCl с pH 7.5; 0.15 М NaCl; 0.2% Triton Х-100, сначала 3 раза по 1 ч при комнатной температуре, а затем в течение ночи при 4°C. Окрашенные препараты дегидратировали последовательно в 50, 96%-ных растворах этанола в фосфатном буфере по 60 мин в каждом при комнатной температуре, затем выдерживали сначала в 100%-ном этаноле при комнатной температуре 2 раза по 60 мин, а затем в 2-бутоксиэтаноле при 4°C в течение 18 ч. На этом этапе окрашенные образцы ткани хранили в 2-бутоксиэтаноле при 4°C. Дегидратированные образцы просветляли при комнатной температуре в течение 4 ч в смеси бензил бензоата:бензиловый спирт, взятых в соотношении 2:1. Анализ и съемку образцов осуществляли с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа (Olympus FluoView 1000, Япония). Послойное панорамное сшивание и построение трехмерных реконструкций окрашенных гиппокампов осуществляли в Imaris 6.0 (Bitplane AG, Швейцария).
В препаратах гиппокампа, окрашенных по заявленному способу, отчетливо видны ядра стволовых клеток в субгранулярной зоне зубчатой фасции гиппокампа, экспрессирующие CFP (Фиг. 2). После просветления в растворе Мюррея не наблюдается потери флуоресцентного сигнала, ядерное разрешение наблюдается по всей глубине образца (Фиг. 2, справа), достигается высокое соотношение сигнал:фон, что делает принципиально возможным осуществление количественного анализа.
Предлагаемые варианты способа иммуногистохимического окрашивания тотальных препаратов образцов биологических тканей позволяют окрашивать тотальные препараты образцов биологических тканей как молодых, так и взрослых животных. Использование предлагаемых способов окрашивания позволяет сохранять морфологию образцов и расширить область применения за счет более широкого охвата выявляемых антигенов, а также сократить продолжительность процесса окрашивания препаратов до 12-15 суток по первому варианту и до 9-11 суток - по второму варианту. Препараты образцов, окрашенные предлагаемыми способами, обладают высоким соотношением сигнал:фон, что позволяет использовать их, в отличие от образцов, окрашенных ранее известными способами, для проведения количественного анализа иммуногистохимически выявленных меток.