Масс-спектрометрия изопреноидов

УДК 543.51+547.913

В. М. Бабаев, Р. З. Мусин, В. И. Гаврилов

МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЯ ИЗОПРЕНОИДОВ

«Если химическую задачу нельзя решить с помощью масс-спектрометрии, ее вообще нельзя решить»

Фред Мак-Лафферти

Ключевые слова: масс-спектрометрия, фрагментация, изопреноиды, стероиды.

Рассмотрены литературные данные по масс-спектрометрии изопреноидов. Обсуждаются особенности масс-спектрометрической идентификации этих соединений в условиях электронной ионизации, а также с помощью современных методов ионизации.

Keywords: mass-spectrometry, fragmentation, isoprenoids, steroids.

Reviewed published data on mass spectrometry isoprenoids. The features of mass-spectrometric identification of these compounds under electron ionization, as well as using modern methods of ionization are discussed.

В настоящее время инструментальные физико-химические методы анализа стали неотъемлемой частью экспериментальной работы исследователя, работающего в области естественных наук. Наиболее мощными и многоцелевыми среди них, безусловно, являются спектроскопия ядерного магнитного резонанса и масс-спектрометрия. Оба метода активно используются в химии, биологии, медицине, экологии, контроле технологических процессов, криминалистике и т. д. Характеризуя вновь синтезированное вещество, исследователь обязан получить и описать его ЯМР и масс-спектры.

Традиционно органическая масс-спектрометрия используется для решения двух основных проблем: идентификация веществ и изучение фрагментации ионизированных молекул органических соединений в газовой фазе в ионном источнике [1]. С появлением хромато-масс-спектрометрии, ионно-циклотронного резонанса [2] возможности классического метода значительно увеличились. Соединение масс-спектрометра с жидкостным хроматографом еще более расширило круг изучаемых объектов. Новые методы ионизации, в частности «электроспрей» (ИЭР) [3] и матрично-активированная лазерная десорбция / ионизация (МАЛДИ) [4], появившиеся к концу XX века, позволили успешно работать со сложнейшими биоорганическими молекулами, такими как полипептиды, белки, полисахариды, нуклеиновые кислоты, молекулярные массы которых составляют миллионы дальтон [5]. Сегодня можно проанализировать соединение практически любой сложности.

Целый ряд задач решается с помощью данного метода и в стенах технологического университета [6, 7].

Модификация функциональных групп позволяет также использовать масс-спектрометрию для качественного и количественного анализов. Производные могут иметь иную фрагментацию или дают информативное смещение масс ионов в отличие от недериватизированного соединения.

Использование ГХ-МС позволяет выявить особенности строения, а также преимуществом является высокая чувствительность метода.

Масс-спектрометрия считается самым избирательным методом для быстрого качественного определения известных, а также идентификации неизвестных соединений, выделяемых из экстрактов природных соединений [8, 9].

В данной статье отражены направления использования данного метода в исследованиях строения изопреноидов, к которым можно отнести терпены (в том числе функциональнозамещенные) и стероиды.

Масс-спектрометрия электронной ионизации

Применение масс-спектрометрии для изучения природных соединений широко используется с середины прошлого века.

Детальные изучения чистых стероидов и их аналогов, меченых изотопами устанавливают главные пути фрагментации под действием электронной ионизации [10]. Полученные в результате данных исследований корреляции имеют большое значение для охарактеризования стероидов и их метаболитов.

В статье [11] авторы приводят результаты исследования стероидов. Некоторые основные закономерности фрагментации стероидов будут изложены ниже. Основной пик m/z 217 в масс-спектре 5а-холестана обусловлен ионом, образующимся разрывом связей с раскрытием пяти-членного цикла D [12]. Подобно этому, ионы [M-15]+ получены в результате отрыва ангулярной метильной группы.

Такая фрагментация наблюдается во многих стероидах и их производных, например в соединениях с увеличенным до шести-, семичленного цикла D. Установлено, что в 5а- и 5Р-холестане, разрыв боковой углеводородной цепочки не является характеристичным процессом. Наличие двойных связей в цикле ведет к увеличению относительной интенсивности пиков молекулярных ионов, и также приводит к образованию ионов, обусловленных процессами отрыва боковой цепи. - Этот эффект объясняется локализацией положительного заряда [11]. Наличие атома кислорода в стероидах оказывает влияние на характер фрагментации. Так для холестерола авторами выделены восемь наиболее интенсивных пиков и пути образования соответствующих им ионов (рис. 1): M+ (m/z 386, 100%), [M-15]+ (m/z 371, 21%), [M-18]+ (m/z 368, 31%), [M-33]+ (m/z 353, 17%), [M-85]+ (m/z 301, 29%), [M-111]+ (m/z 275, 34%), [M-113]+ (m/z 273, 14%), [M-173]+ (m/z 213, 16%).

Me3SiO-^

/ I / 1

____________________________H____________________________________________________________

Рис. 1 - Основные пути фрагментации холестерола [11]

Масс-спектр холестерола является очень характерным (как «отпечаток пальца» -«fingerprint»), что позволяет установить строение как скелета, так и боковой цепи. В то же время масс-спектры не дают возможность обнаружить особенности, указывающие на положение двойной связи. Однако, такая информация может быть получена из анализа масс-спектров триметилсилиловых (ТМС) эфиров, легко получаемых из 3-гидрокси-Д5-стероидов. Характерной особенностью масс-спектров является наличие пары ионов m/z 129 и [M-129], образующихся по путям, указанным на рис. 2а [11].

Для анализа смеси использовалась газовая хроматография силилированных производных стеролов. Масс-спектрометрический анализ дает необходимую информацию о строении соединений, в особенности для установления строения боковой цепочки.

При изучении масс-спектров триметилсилиловых эфиров стероидов Gaskell [13] обнаружил несколько неожиданный пик m/z 196 (рис. 2б). Этот пик соответствует иону, образующемуся вследствие миграции триметилсилильной группы из боковой цепи к фрагменту, образованному разрывом связей кольца B. Процесс образования этого иона фактически представляет замещение атома водорода триметилсилильной группой в ионе m/z 124 из 4-ен-3-онов. Отмечено, что ионы m/z 196 наблюдаются во многих триметилсилильных производных с гидрокси-енон боковой цепочкой [13, 11].

13

Рис. 2 - Основные пути фрагментации (а) и перегруппировки ТМС-группы (б) триметилсилиловых производных стероидов

Перегруппировки с участием триметилсилильной группы могут служить примером появления структуры, включающей макроциклическое переходное состояние. Очень часто происходят перегруппировки с участием триметилсилильной группы с макроциклическим переходным состоянием, содержащим от 5 до 8 членов. Некоторые из таких процессов являются характеристическими. Например, 18-триметилсилилоксиандростан-17-оны

характеризуются ионами [М-30]+ (рис. 3а), тогда как ЗР-триметилсилилоксиандрост-5ен-17-оны претерпевают распад кольца А с перегруппировкой ТМС-группы, с появлением ионов [М-56]+. (рис. Зб) [14].

Ме35Юч +: л \ О

“I

•+

81Ме^

.Н

МезЭ|б' Ме35К

т/г 182

Рис. 3 - Перегруппировки ТМС-группы

Еще один из примеров перегруппировки с участием ТМС-группы по предполагаемому механизму показан на рис. 3в.

Новые методы ионизации в исследовании терпеноидов

Большинство сложных соединений, в частности многие терпеноиды и стероиды имеют низкую летучесть и не содержат полярных групп, что в результате ухудшает хроматографические характеристики и снижает эффективность ионизации. Дериватизация стероидов с образованием более летучих, термостабильных и заряженных продуктов решает эту проблему. Разработано много различных дериватизирующих агентов и методик для различных функциональных групп [15-17]. В то же время, дериватизация соединений с неизвестной структурой не облегчает ситуацию.

Авторы [18] применили метод масс-спектрометрия МАЛДИ с использованием в качестве матрицы фуллерен С70. Представлено применение этого метода для шести общих (половых) стероидов и для синтетических стероидных соединений в отрицательном и положительном режиме. Фуллерены, дериватизированные фуллерены и углеродные нанотрубки являются хорошими матрицами. ОЬоНроиг [19] проанализировал недериватизированные природные соединения с использованием углеродных нанотрубок в качестве матрицы, и показал, что при низкой энергии лазера получаются хорошо интерпретируемые спектры, сравнимые со спектрами, получаемыми при использовании обычных матриц: 2,5-дигидроксибензойной и а-циано-4-гидроксикоричной кислот.

В другой работе [20] представлены исследования дитерпеноидов, выделенных из АсошШш Каре11ш. Авторы использовали тандемную масс-спектрометрию с ионизацией электрораспылением (ИЭР) для изучения дитерпеновых алкалоидов. Данная техника позволяет последовательно фрагментировать соединения. Основные пути фрагментации С19-нордитепеновых алкалоидов в условиях ИЭР заключаются в отщеплении молекул H2O, MeOH и AcOH. Относительная интенсивность пиков, образующихся вследствие элиминирования указанных выше молекул, зависит от природы и положения заместителя. Для соединений, содержащих метоксильные группы основные пики соответствуют ионам, образующимся при отщеплении молекул MeOH (независимо от того где расположена метоксильная группа - присоединена к кольцу или боковой цепочке). Для некоторых соединений авторы отмечают возможность образования ионов, связанных с отщеплением CзH8 и О из иона ^+^+, а также отщеплением CзH8 и Н2О. Указанные процессы протекают с разрывом связей колец С и D.

Масс-спектрометрия с ИЭР является эффективным методом не только для установления структуры, но и для изучения механизмов межмолекулярных взаимодействий. В работе [21] масс-спектрометрия с ИЭР использована для изучения самоассоциации и комплексообразования тритерпеновых гликозидов - хедерина и хедеракозида С. Полученные авторами результаты демонстрируют возможность использования масс-спектрометрии для ускорения разработки лекарственных форм нового поколения, в том числе путем получения комплексов фармацевтических препаратов с тритерпеновыми гликозидами по типу «хозяин-гость».

Изучены тритерпеноиды, выделенные из Оаиоёегша 1ис1ёиш [22]. Соединения исследованы методом тандемной масс-спектрометрии ИЭР с ионной ловушкой.

Тритерпеноиды были классифицированы на пять типов в зависимости от их структуры и фрагментации. При работе в отрицательном режиме (Е81) все соединения образуют ионы [M-H]- и [2M-H]-. Наряду с этим в некоторых соединениях наблюдается пик иона [M-H-H2O]-.

Доминирующими путями фрагментации являются процессы отщепления молекул H2O и СО2, а также раскрытие колец С и D, с образованием ионов a, Ь, ^ d, e и др. (рис. 4). Авторы приводят основные пути фрагментации. Каждый тип тритерпеноидов имеет особенную фрагментацию, и как следствие, присущие ему характеристические ионы.

Рис. 4 - Химические структуры терпеноидов и характеристичные пути их фрагментации

На основании установленных закономерностей распада указанных соединений авторами идентифицирован ряд тритерпеноидов различной структуры.

Выявленные закономерности в путях фрагментации изученных авторами соединений можно перенести на тритерпеноиды, имеющие подобную структуру. Информация о структуре получена при использовании тандемной масс-спектрометрии (MSn анализа). Авторы отмечают, что создание библиотек, содержащих MSn- спектры известных тритерпеноидов будет значительно способствовать в идентификации соединений в реальных образцах.

Указанные выше работы по масс-спектрометрическому исследованию сложных природных соединений указывают на большие возможности метода масс-спектрометрии при определении строения молекул.

Знание путей фрагментации различных изопреноидов позволили нам перейти к исследованию соединений, имеющих сложную структуру и представляющих интерес как потенциальные биологически-активные агенты. В ходе наших работ были установлены основные пути распада производных дитерпеноида изостевиола [23].

Литература

1. Бейнон, Дж. Масс-спектрометрия и ее применение в органической химии / Дж. Бейнон. - М.: Мир, 1964. - 701 с.

2. Леман, Т. А. Спектрометрия ионно-циклотронного резонанса / Т. А. Леман, М. М. Берси. - М: Мир, 1980. - 215 с.

3. Snyder, P. Biochemical and biotechnological applications of electrospray ionization mass spectrometry / P.Snyder. - Washington D. C.: ACS. -1995, 601 p.

4. Karas, M. Advances in Mass Spectrometry / M. Karas, F. Hillenkamp; Ed. by P. Longevialle. - London: Heyden & Son, - 1989. - 416 p.

5. Chen, R. Trapping, detection, and mass determination of coliphage T4 DNA ions of 108 Da by electrospray ionization fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry / R. Chen, X. Cheng, D.W. Mitchell, S.A. Hofstadler, Q. Wu, A.L. Rockwood, M.G. Sherman, R.D. Smith // Analytical Chemistry. - 1995. - Vol. 67. - N 7. - Р. 1159-1163.

6. Гуревич, П.А. Установление строения фосфорилированных гидроксамовых кислот методом масс-

спектрометрии / П.А. Гуревич, Л.Ф. Саттарова, Р.З. Мусин, Н.А. Фролова, Б.П. Струнин, Л.М.

Юсупова // Вестник Казанского технологического университета. - 2009. - № 6. - С. 113-114.

7. Рылова, М. В. Масс-спектрометрическое исследование строения олигомеров дициклопентадиена и серы / М.В.Рылова, Я.Д.Самуилов, Д.Р.Шарафутдинова, Ю.Я.Ефремов, Ф.М.Палютин // Вестник Казанского технологического университета. - 2006. - № 2. - С. 61-66.

8. Yang, M Characterization of Tanshinones in the Roots of Salviamiltiorrhiza (Dan-shen) by High-Performance Liquid Chromatography with Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry / M. Yang, A.H. Liu, S.H. Guan, J.H. Sun, M. Xu, D.A. Guo // Rapid Commun. Mass Spectrom. - 2006. - № 20. -Р. 1266-1280.

9. Liu, R.X. Liquid Chromatography / Electrospray Ionization Mass Spectrometry for the Characterization of Twenty-Three Flavonoids in the Extract of Dalbergiaodorifera / R.X. Liu, M.Ye, H.Z. Guo, K.S. Bi, D.A. Guo // Rapid Commun. Mass Spectrom. - 2005. - № 16. - РР. 1557-1565.

10 Beynon, J.H. The use of the mass spectrometer for the identification of organic compounds / J.H. Beynon // Mikrochimica Acta. - 1956. - Vol. 44. - Р. 437-453.

11 Brooks, C. J. W. Some Aspects of Mass Spectrometry in Research on Steroids / C. J. W. Brooks // Phil. Trans. R. Soc. Lond. A. - 1979. - Vol. 293. - Р. 53-67.

12 Eadon, G. Mass spectrometry in structural and stereochemical problems. CCXI. The effect of structural variations on the electron impact induced fragmentations of steriod hydrocarbons / G.Eadon, S.Popov, C.Djerassi // Journal of the American Chemical Society. - 1972. - Vol. 94. - N 4. - Р. 1282-1292.

13 Smith, A.G. Trimethylsilyl group migration during electron impact and chemical ionization mass spectrometry of the trimethylsilyl ethers of 20-hydroxy-5a-pregnan-3-ones and 20-hydroxy-4-pregnen-3-ones / A.G.Smith, S.J. Gaskell, C.J.W. Brooks // Biomedical Mass Spectrometry. - 1976. - Vol. 3, № 4. -Р. 161-165.

14 Brooks, C.J.W. The origin of the [M - 56]+ ion in the mass spectra of trimethylsilyl ethers of dehydroepiandresterone and related compounds / C.J.W.Brooks, D.J. Harvey, B.S. Middleditch // Journal of Organic Chemistry. - 1972. - Vol. 37. - N 21. - РР. 3365-3378.

15 Griffiths, W.J. Derivatisation for the characterisation of neutral oxosteroids by electrospray and matrix-assisted laser desorption/ionisation tandem mass spectrometry: The Girard P derivative / W.J. Griffiths, S.Liu, G.Alvelius, J.Sjovall. - Rapid Communications in Mass Spectrometry. - 2003. - Vol. 17. - N 9. - Р. 924-935.

16 Wang, Y. Matrix-assisted laser desorption/ionization high-energy collision-induced dissociation of steroids: Analysis of oxysterols in rat brain / Y. Wang, M.Hornshaw, G.Alvelius, K.Bodin, S.Liu, J. Sjovall, W.J. Griffiths. - Analytical Chemistry. - 2006. - Vol. 78. - N 1. - Р. 164-173.

17 Buiarelli, F. Development of a liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for the identification of natural androgen steroids and their conjugates in urine samples / F.Buiarelli, F.Coccioli, M.Merolle, B.Neri, A.Terracciano // Analytica Chimica Acta. - 2004. - Vol. 526. - N 2. - Р. 113-120.

18 Montsko, G. Analysis of nonderivatized steroids by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry using C70 fullerene as matrix / G.Montsko, A.Vaczy, G.Maasz, E.Mernyak, E.Frank, C.Bay, Z.Kadar, L.Mark. - Analytical and Bioanalytical Chemistry. - 2009. - Vol. 395. - N 3. - РР. 869-874.

19 Gholipour, Y. In situ analysis of plant tissue underivatized carbohydrates and on-probe enzymatic degraded starch by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry by using carbon nanotubes as matrix / Y.Gholipour, H.Nonami, R.Erra-Balsells. - Analytical Biochemistry. - 2008. -Vol. 383. - N 2. - Р. 159-167.

20 Chen, Y. Isolation of diterpenoid alkaloids from herb and flowers of Aconitum napellus ssp. vulgare and electrospray ion trap multiple MS study of these alkaloids / Y.Chen, S.Koelliker, M. Oehme, A.Katz. -Journal of Natural Products. - 1999. - Vol. 62, № 5. - Р. 701-704.

21 Лекарь, А. В. Масс-спектрометрия самоассоциации и комплексообразования тритерпеновых сапонинов и холестерина / А.В.Лекарь, Л.А.Яковишин, Е.В.Ветрова, М.И.Руднев, Н.И.Борисенко // Масс-спектрометрия. - 2010. - № 3. - С. 213-216.

22 Yang, M. Analysis of Triterpenoids in Ganoderma lucidum Using Liquid Chromatography Coupled with Electrospray Ionization Mass Spectrometry / M. Yang, X. Wang, S. Guan, J. Xia, J. Sun, H. Guo, D. Guo // J. Am. Soc. Mass. Spectrom. - 2007. - № 18. - Р. 927-939.

23 Мусин, Р.З. Масс-спектрометрическое исследование производных изостевиола. I. Фрагментация изостевиольных производных, имеющих фрагмент основания Шиффа у атома С4, под действием электронного удара / Р.З.Мусин, В.М.Бабаев, И.Ю.Стробыкина, В.Е.Катаев, В.И.Гаврилов, Р.Р.Мусин // Журнал общей химии. - 2009. - № 11. - С. 1855-1860.

© В. М. Бабаев - асп. каф. технологии основного органического и нефтехимического синтеза КГТУ, babaev-84@mai1.ru; Р. З. Мусин - канд. хим. наук, ст. науч. сотр. Института органической и физической химии им. А.Е.Арбузова КНЦ РАН; В. И. Гаврилов- д-р хим. наук, проф., зав. каф. технологии основного органического и нефтехимического синтеза КГТУ.