СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ ПРОТИВОТУБЕРКУЛЕЗНЫМ ДЕЙСТВИЕМ
MEANS, POSSESSING ANTI-TUBERCULOSIS ACTION

Изобретение относится к медицине и фармацевтике промышленности, а именно к созданию лекарственных препаратов на основе новогаленовых средств, обладающих противотуберкулезной активностьюя. и может быть применено для доклинических и клинических исследований по лечению туберкулеза, в том числе вызванного устойчивыми штаммами М. tuberculosis ко многим препаратам.
Борьба с туберкулезом относится к одному из наиболее приоритетных направлений современной медицины (Приймак А.А. Размышления о туберкулезе // Пульмонология - 2005. - С.35-38; Туберкулез - национальное руководство / Под ред. М.И. Перельмана. - М.: ГЭОТАР. - 2007. - 752 с.). В последние десятилетия значимость этой проблемы возросла в связи с формированием высокой устойчивости к лечению туберкулеза (Туберкулез / Под ред. Б. Блума. - М.: Медицина, 2002. - 677 с.). Одной из основных причин, обусловливающих развитие эпидемии туберкулеза во всем мире, служит распространение лекарственно-устойчивых форм заболевания, плохо поддающихся лечению ограниченным набором известных противотуберкулезных препаратов.
Лечение пациентов с лекарственно-устойчивым туберкулезом и особенно туберкулезом с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ), по крайней мере к двум основным препаратам - изониазиду и рифампицину - требует значительно более дорогостоящего и длительного лечения с применением препаратов, нередко вызывающих серьезные побочные реакции (Туберкулез в Российской Федерации 2011 г.Аналитический обзор статистических показателей, используемых в Российской Федерации и в мире. - М., 2013; Васильев А.В., Гришко А.Н. // Туберкулез и город: проблемы профилактики, диагностики и лечения. - СПб., 1996. - С.9-16). Такие реакции проявляются выраженным гепатотоксическим действием, а также тошнотой, рвотой, болевыми ощущениями в области сердца, психозами, появлением периферических невритов с атрофией мышц и параличей конечностей и др. Кроме того, противопоказаниями к назначению ряда препаратов являются сахарный диабет, воспаление зрительного нерва и глаза, беременность, детский возраст и др. Все это обусловливает необходимость поиска новых безопасных антибактериальных средств с противотуберкулезным действием (Лекарственные средства: пособие по фармакотерапии для врачей: (В 2-х т.) / М.Д. Машковский. - 11-е изд., стер. - М.: Медицина. Ч.1. - 621 с.). Одним из источников нетоксичных лекарственных препаратов антимикробного действия, в том числе и в отношении устойчивых к известным препаратам микроорганизмов, могут стать экстракты из лекарственного растительного сырья (ЛРС).
Авран лекарственный (Gratiola officinalis L.) - травянистое растение семейства Норичниковые, широко распространено в Евразии и Северной Америке. Растение очень ядовито. Качество сырья аврана лекарственного регламентировано фармакопейной статьей 42-2358-85. Ранее трава аврана входила в состав сбора Здренко как симптоматическое средство при лечении папилломатозного гастрита и применялась как слабительное, антигельминтное, кардиотоническое, желчегонное и антисептическое средство (Машковский М.Д., Бабаян Э.А., Обоймакова А.Н, Булаев В.М., Северцев С.Д., Тенцова А.И. Государственная фармакопея Союза Советских Социалистических республик. М.: «Медицина», 1989. 2 издание. Выпуск 2. 400 с.; http://www.dorogaistin.ru>index.php). В основном применялись водные настои травы и 15% спиртовая настойка (http://www.dorogaistin.ru>index.php). Полученные извлечения из травы аврана обладали достаточно высокой токсичностью, поэтому при внутреннем применении использовались вместе со слизистыми отварами, большой осторожностью и под обязательным врачебным контролем (http://www.travolekar.ru/articles.php).
Разные способы экстракции из одного и того же растительного сырья могут приводить к получению биологически активных композиций (БАК) с разными химическим составом и свойствами (Пономарев В.Д. Экстрагирование лекарственного сырья. Медицина. 1976. 186 с.). Так, при получении экстракта из сырья аврана путем экстракции сырья 96% этанолом (или метанолом или н/(изо)-пропанолом) и хлороформом (Пат. 1063118 (A) Great Britain, МПК 7 А61К 36/00 А61К 36/80. Plant extract / MEN JEAN LE.; заявитель и патентообладатель ROGER BELLON. - № GB 19640048825; заявл. 01.12.1964; опубл. 30.03.1967), в результате которого получается и используется хлороформная фракция с неполярными соединениями, включая ядовитые соединения (алкалоиды и гликозиды), экстрактивные вещества остаются токсичными. Кроме того, экстракт, полученный данным способом, обладает значительным слабительным эффектом, обусловленным содержанием в нем токсичных веществ - алкалоидов и гликозидов, оказывающих раздражающий эффект на кишечник, за счет чего резко снижается область его применения. Известны также способы получения водных настоев, спиртовой настойки и экстракта из сырья аврана, включающие использование этилового спирта разной концентрации и хлороформа, при которых экстракты из аврана содержат гликозиды грациозид (грациолин), грациотоксин, кукурбитациновый гликозид - элатерицид, жирное масло, сапонины, яблочную и бетулиновую кислоты, углеводы (стахиоза), терпеноиды (элатеризид, дезацетилэлатеринид, кукурбитацин Е и I), карденолиды, сапонины, флавоноиды (лигнозид, изолигнозид, апигенин, космосиин, лигнозид, аврозид, изоаврозид, неоаврозид, изонеоаврозид), а также алкалоиды (0,2%) пока неустановленного состава, в разном соотношении, в зависимости от способа выделения (http://www.travolekar.ru/articles.php; GB 1063118, 01.12.1964; US 5.804.575. 1997; Ruzicka L., Lamberton A.H., Christe Ruzicka C.W. Synthetic approach to betulinic acid. Helv. Chim. Acta. 1938. Vol.21. P.1706-1717; Куркин В.А. Фармакогнозия: Учебник для студентов фармацевтических вузов. Самара: ООО «Офорт» СамГМУ, 2004. 1180 с.; Алефиров A.H. Фитотерапия против онкологии. СПб: Издательство Крылов. Серия: Медицина XXI века. 2010 г. 240 с.).
-4
Среди других препаратов из растительного сырья известен водно-спиртовой экстракт корней и надземных частей солодки голой Glycyrrhiza glabra, обладающий выраженной противотуберкулезной активностью (патент №2362577, 2007 г., Сухенко Л.Т., Урляпова Н.Г., Назарова Г.Н.), в котором содержатся: тритерпеновый сапонин глицирризин, Са и К соли глицирризиновой кислоты (до 20-30%); глицирретиновая кислота (до 10-20%), в т.ч. и соединения группы флавоноидов. Активность данного экстракта сравнительно высокая - концентрация менее 2,5×10 мг/мл активных веществ полностью подавляла рост МБТ.
Недостатком данного экстракта корней и надземных частей солодки голой Glycyrrhiza glabra служит высокое содержание глицирризина и глицирризиновой кислоты, которые, как известно (Солодки корень. Описание препарата в справочнике Видаль), нарушают метаболизм кортизола в организме, что способствует развитию псевдоальдостеронизма и может привести к сердечно-сосудистым заболеваниям. Кроме того, в процессе получения экстракт подвергался автоклавированию, в результате чего под действием высоких температур многие активные компоненты (в т.ч. флавоноиды), которые могли бы оказать антиоксидантное действие, разрушались, а в лечении туберкулеза не маловажным аспектом является и снижение интоксикации, так как на фоне этого заболевания, как общеизвестно, возможно развитие вторичного амилоидоза и кахексии.
Известно также средство (RU 2223107, 05.09.2007), обладающее противотуберкулезным действием, содержащее лист алоэ (Aloe perfoliata L.), корневище аира (Acorus calamus L.), листья березы (Betula pendula L.), цветки гибискуса (Hibiscus moscheutos L.), корневища и корни девясила (Jnula helenium L.), цветки липы (Tilia cordata Mill.), плоды лимонника (Schisandra glabra (Brickell) Rehder), лист крапивы (Urtica dioica L.), траву фиалки (Viola tricolor L.,), лист мяты (Mentha xpiperita L.), корень солодки (Glycyrrhiza glabra L.), траву хвоща (Equisetum arvense L.,) и траву череды (Bidens tripartita L.). Фитохимический анализ заявленного средства установил наличие в нем таких биологически активных веществ, как флавоноиды, дубильные вещества, полисахариды, сапонины, эфирные масла, витамины, органические кислоты. Основным биологически активным компонентом являются флавоноиды и полисахариды.
Недостатком данной композиции является невозможность достоверно определить химические соединения, оказавшие противотуберкулезное действие. Экстрагирование до получения сухого экстракта производилось при температуре 90-95 градусов, что разрушающе действует на флавоноиды, заявленные как одни из основных действующих веществ данной композиции.
Проведенный анализ литературы показал, что преимущества имеют растительные экстракты, полученные многоступенчатым способом очистки от балластных соединений, направленным на увеличение выхода определенных соединений с определенным действием. Одной из перспективных групп противомикробного действия являются биофлавоноиды {Куркин В.А. Фармакогнозия: учебник для фармацевтических вузов (факультетов) / В.А. Куркин / 2-е изд., перераб. и доп. Самара, 2007. - 1239 с.), представляющие собой растительные фенольные соединения с широким спектром биологического действия.
В настоящей работе анализируется экстракт, полученный нами ранее способом, позволяющим получать нетоксичные экстрактивные вещества из ядовитых растений (RU 2482863, 15.02.2012). Для полученного экстракта из травы аврана нами уже описаны положительные эффекты на организм животных с перевиваемым раком печени и, в то же время, негативное воздействие на опухолевые клетки, проявляющиеся как в виде цитотоксического, так и цитостатического эффектов (Полуконова Н.В., Меркулова Е.П., Дурнова Н.А., Романтеева Ю.В., Бородулин В.Г. Изучение антиоксидантной активности экстракта аврана лекарственного на крысах с перевитой опухолью печени PC-1 // Тезисы докладов научно-практической конференции «Биологически активные вещества: фундаментальные и прикладные вопросы получения и применения». Новый Свет, Крым, Украина 23-28 мая 2011. Киев. 2011. С. 585; Наволокин Н.А., Павлова А.В. Морфологические изменения в мышцах у лабораторных крыс и определение токсичности при введении экстракта аврана // Бюллетень медицинских Интернет-конференций. 2012. Т., Вып. 2. - С.82-83; Navolokin N.A., Polukonova N.V., Maslyakova G.N., Bucharskaya А.В., Durnova N.A. Effect of extracts of Gratiola officinalis and Zea mays on the tumor and the morphology of the internal organs of rats with trasplanted liver cancer //Russian Open Medical Journal 2012. P.1-4. http://www.romj.ors/2012-0203).
Исследования противотуберкулезной активности травы аврана лекарственного в доступной нами литературе не обнаружена.
Технической задачей настоящего изобретения служит расширение арсенала средств из растительного сырья, обладающих противотуберкулезной активностью, экономически более доступных и нетоксичных.
Преимуществом предлагаемого лекарственного экстракта служит низкая токсичность и доступность сырья, из которого получают средство, наличие антиоксидантной активности и общего положительного влияние на организм, что является важным аспектом, при лечении туберкулеза.
Нами впервые установлены свойства средства, представляющего собой сухой экстракт листьев и цветков аврана лекарственного, полученного путем их измельчения, экстракцией спиртом 96%, выпариванием экстракта, добавлением хлороформа, удаление хлороформа, причем экстракцию спиртом проводят на водяной бане до кипения и кипятят в течение 14-15 минут, выпаривают при температуре 55-60°С, выпаренный экстракт разводят сначала дистиллированной водой 40-50°С, затем добавляют хлороформ в пропорции 4/5 части воды и 1/5 части хлороформа, охлаждают до комнатной температуры и центрифугируют со скоростью 1500 оборотов в минуту в течение 15 минут, далее отделяют водную фракцию и высушивают ее. Полученная биологическая активная композиция обладает новым свойством: противотуберкулезным действием.
Средство, полученное данным способом из аврана лекарственного имеет следующий химический состав: 4-винил-2-метоксифенол; 2,3-дигидро-3,5-дигидрокси-6-метил-4Н-пиран-4-он; 2,3-дигидробензофуран; 3-фуранкарбоновая кислота; 5-гидроксиметил-2-фуральдегид; этил-α-d-рибозид; 4-пропилфенол; пирокатехин; L-луксоза (пентоза); 6-деоксигексоза L-галактоза; бензоилуксусной кислоты этиловый эфир; гексадекановая кислота (пальмитиновая кислота); гомованилиновая кислота; глюкоза; 1,4-ангидро-d-маннитол; бензойная кислота; кверцетин.
Полученный таким образом экстракт представляет собой биологически активную композицию с новым фармакологическим свойством противотуберкулезным, ранее не известным как для растения аврана лекарственного, так и для описанного выше средства.
Средство представляет собой сухой экстракт, желто-коричневого цвета, смешивается с водой и спиртом этиловым в любых соотношениях.
Параметры подлинности и качества средства.
Подлинность препарата подтверждается качественными реакциями на содержание биофлавоноидов и отсутствие алкалоидов в водном растворе сухого экстракта аврана.
Качественные реакции на флавоноиды: к 1 мл препарата добавили 1 мл воды очищенной, 10 мг кристаллического магния и 5 капель кислоты хлористо-водородной концентрированной, нагрели на кипящей водяной бане 3 мин, появилось красно-коричневое окрашивание, положительная проба Синода, что говорит о содержание в полученном растворе флаваноидов.
Качественные реакции на алкалоиды: а) с реактивом Вагнера-Бушарда отрицательна (при наличии алкалоидов в раствор должен пожелтеть); б) с раствором 1% пикриновой кислоты отрицательна (при наличии алкалоидов в растворе должно быть пожелтение); в) с раствором кислоты фосфорномолибденовой отрицательная (при наличии алкалоидов в раствор мутнеет).
Проведенные все 3 качественные реакции отрицательные, следовательно, в полученном экстракте отсутствуют алкалоиды.
По сравнению с получаемыми ранее водными и спиртовыми извлечениями из травы аврана полученный нами упаренный экстракт листьев и цветков аврана нетоксичен, что обусловлено химическим составом и подтверждено ранее на крысах (N.A. Navolokin, N.V. Polukonova, G.N. Maslyakova, A.B. Bucharskaya, N.A. Dumova / Effect of extracts of Gratiola officinalis and Zea mays on the tumor and the morphology of the internal organs of rats with transplanted liver cancer // Russian Open Medical Journal 2012; 1: 0203).
Определение противотуберкулезного действия экстракта аврана лекарственного.
Определение противотуберкулезного действия экстракта проводили по стандартной методике оценки лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза (МБТ) на плотной яичной питательной среде Левенштейна-Йенсена, не содержащей крахмал (HiMedia, Индия) методом абсолютных концентраций (приказ МЗ РФ, 2003; Руководящие методические материалы по экспериментальному и клиническому изучению новых лекарственных средств. Ч. 6, Москва, 1986) с некоторыми модификациями. Собственная модификация стандартного метода заключалась в замене абсолютных концентраций серийным разведением с целью определения порога концентраций экстракта, при преодолении которого рост МБТ не определялся.
Анализ проводили на следующих штаммах: первом - музейном штамме-H37Rv, не имеющем антибактериальной резистентности (для определения динамики роста и целесообразности дальнейших исследований), а также штаммах, имеющих резистентность, для которых методами бактериологического исследования (методом абсолютных концентраций) предварительно нами была установлена степень устойчивости клинических штаммов к противотуберкулезным препаратам первого ряда (рифампицину, изониазиду, стрептомицину и этамбутолу).
Штаммы микобактерий туберкулеза с различной степенью лекарственной устойчивости были получены при посеве респираторного материала (мокрота) от больных, проходящих лечение в ГБУЗ «Тамбовский областной клинический противотуберкулезный диспансер». Из них первый штамм оказался чувствительным к следующим химиопрепаратам: изониазиду, рифампицину, стрептомицину и этамбутолу и обозначен, как чувствительный штамм. Второй штамм оказался резистентным к противотуберкулезным препаратам (изониазиду, рифампицину, стрептомицину и этамбутолу), что было определено культурально, поэтому обозначен как штамм МЛУ.
Культуру микобактерий расценивали, как устойчивую к данной концентрации препарата только при наличии на пробирке с этой концентрацией 20 колоний и более при обильном росте в контрольной пробирке, не содержащей лекарственного препарата.
7
7
Исследовали динамику роста музейного штамма под действием аврана лекарственного в концентрации 14 мг/мл. Наблюдения проводили в течение 30 суток, но засевали на питательную среду 2 титра клеток МБТ, соответствующее 50×10 и 500×10 микробных тел в 1 мл.
Культура, оцененная как устойчивая к основным противотуберкулезным препаратам, протестирована с помощью генно-молекулярного метода (метод гибридизации на биочипах «ТБ-БИОЧИП») для определения мутаций вызвавших резистентность. Молекулярно-генетическое исследование анализируемых штаммов с МЛУ проводили с помощью метода гибридизации на биочипах «ТБ-БИОЧИП» (ООО «Биочип-ИМБ», Россия) по методике рекомендованной производителем. Метод включает в себя выделение ДНК М. tuberculosis из респираторных образцов, проведение двух последовательных мультиплексных ПЦР, гибридизации продуктов амплификации второй стадии ПЦР на биочипе. Результаты гибридизации регистрировали на портативном анализаторе биочипов (ООО «БИОЧИП-ИМБ», Россия) с соответствующим программным обеспечением. В результате штамм с МЛУ устойчив к рифампицину (Кодон гена rpoB 531; аминокислотная замена Ser→Leu) и к изониазиду Кодон гена katG 315; аминокислотная замена Ser→Thr(1))
При исследовании активной бактериостатической/бактерицидной концентрации было заложено четыре линии культур: первая линия представляла собой положительный контроль (ряд из четырех пробирок с каждым штаммом в отдельности без воздействия), вторая линия - ряд из четырех пробирок без засева штаммами для исключения случайного роста МБТ (отрицательный контроль). Третья и четвертая линии были экспериментальными (культуры с двумя клиническими штаммами) и содержали по шесть пробирок с разными разведениями экстракта.
7
Установление минимальной подавляющей концентрации (МПК) для экстракта аврана на устойчивые штаммы проводили по методу серийных разведений на плотной яичной среде Левенштейна-Йенсена, не содержащей крахмал (производство HiMedia, Индия) {приказ МЗ РФ №109, 2003). Водный раствор сухого спиртового экстракта добавляли к среде во время ее приготовления при температуре 20-25°С. МБТ засевали стандартного титра (содержание клеток, соответствующее 1×10 микробных тел). Контроль роста колоний возбудителя туберкулеза проводили в течение 28 суток (приказ МЗ РФ №109, 2003).
Изучение динамики роста музейного штамма М. tuberculosis под действием экстракта аврана лекарственного.
7
7
В обеих повторностях наблюдалось полное отсутствие роста колоний МБТ на среде с добавлением экстракта аврана в течение 28 суток при титре МБТ 50×10 (бактерицидный эффект), в то время, как в контрольных группах рост колоний отмечался с 10 дня (табл.1). При титре МБТ 500×10 в первой повторности отмечалось бактерицидное действие (отсутствие роста на всех сроках наблюдения), а во второй повторности единичные колонии МБТ на среде с добавлением экстракта аврана появлялись только на 10 сутки наблюдения, то время, как в контроле с 7 дня наблюдался уже умеренный рост, а на 10 день обильный рост колоний (2+ и 3+ соответственно).
7
7
7
Отсутствие роста МВТ на среде с добавлением экстракта аврана лекарственного в обеих проворностях при титре МБТ 50×10 и в первой повторности при титре МБТ 500×10 с 1 по 28 сутки наблюдения по сравнению с контролем, позволяют судить о наличии выраженного бактерицидного эффекта экстракта аврана. Появление слабого роста при титре МБТ 500×10 во второй повторности с 7 дня и сохранение слабого роста (менее 20 КОЕ) до 28 дня под действием экстракта, по сравнению с контролем говорит о бактериостатическом действии экстракта аврана лекарственного на музейный штамм МБТ.
Таблица 1
Динамика роста музейного штамма М. tuberculosis под действием экстракта аврана лекарственного
Повторность
Дни наблюдений
7 день
10 день
17 день
28 день
Титр МКБ
50×10<sup>7</sup>
500×10<sup>7</sup>
50×10<sup>7</sup>
500×10<sup>7</sup>
50×10<sup>7</sup>
500×10<sup>7</sup>
50×10<sup>7</sup>
500×10<sup>7</sup>
1
Контроль
-
-
+
++
++
+++
+++
+++
Экстракт аврана
-
-
-
-
-
-
-
-
2
Контроль
-
++
++
+++
+++
+++
+++
+++
Экстракт аврана
-
-
-
+
-
+
-
+
(4КОЕ)
(4КОЕ)
(18КОЕ)
Примечание: (1+) - 1-20 КОЕ - скудный рост МБТ
(2+) - 21-100 КОЕ - умеренный рост МБТ
(3+) - более 100 КОЕ - обильный рост МБТ
Нами установлено, что при концентрации экстракта 13,3 мг/мл отмечается выраженный бактериостатический эффект на чувствительный клинический штамм (без МЛУ), а при 26,6 мг/мл бактерицидный эффект в соответствии с критериями оценки чувствительности МБТ.
При концентрации экстракта 26,6 мг/мл отмечается бактериостатическое действие (18 КОЕ) экстракта на штамм МБТ с МЛУ, а при концентрации 53 мг/мл наблюдается полное подавление роста культур МБТ с МЛУ (бактерицидное действие) (Табл. 2).
Таким образом, экстракт аврана лекарственного в концентрации - 26,6 мг/мл обладает бактерицидным эффектом на клинический штамм, чувствительный к противотуберкулезным препаратам, и бактериостатическим на клинический штамм с МЛУ. Бактерицидный эффект на штамм с МЛУ наблюдается с концентрации 53,1 мг/мл.
Таблица 2
Результаты анализа противотуберкулезной активности экстракта аврана лекарственного на клинических штаммах
Концентрация экстракта в среде(мг/мл)
Учет результата
№ тестируемой культуры
Чувствительный штамм
Штамм с МЛУ
число КОЕ* в контроле
95%
95%
212.5
число КОЕ
-
-
результат
S
S
106.3
число КОЕ
-
-
результат
S
S
53.1
число КОЕ
-
-
результат
S
S
26.6
число КОЕ
-
18
результат
S
S/R
13.3
число КОЕ
2
35
результат
S
R
6.6
число КОЕ
30
80%
результат
R
R
Примечание: *Число КОЕ указано, если его можно подсчитать. При большом числе КОЕ, не поддающемся подсчету, указана приблизительная доля (%) поверхности питательной среды с ростом МБТ. Результат: S - штамм чувствителен, R - штамм устойчив.
Таким образом, полученный экстракт аврана лекарственного обладает противотуберкулезным действием in vitro. Нами доказана высокая противотуберкулезная (бактериостатическая и бактерицидная) активность экстракта аврана лекарственного, исследуемая in vitro. Данный эффект был показан, как на музейном штамме с оценкой динамики роста колоний, так и с помощью метода серийных разведении на штаммах с МЛУ. Нами определена МПК минимально подавляющая концентрация экстракта аврана на штаммах без и с МЛУ. Так, при концентрации аврана в среде 14 мг/мл отмечается полный бактерицидный эффект в отношении музейного штамма МБТ и при 53,1 мг/мл происходит полное подавление роста культур МБТ с МЛУ, что является безусловно перспективной почвой для дальнейшего изучения действия экстракта аврана лекарственного, содержащего флавонойды, на экспериментальных моделях туберкулезного процесса, а в дальнейшем и на клиническом уровне при разработке эффективного способа и формы доставки экстракта в организм больного туберкулезом.
Таким образом, данный экстракт может быть рекомендован и рассмотрен для проведения доклинических исследований по лечению туберкулеза, в т.ч. может стать перспективным препаратом для лечения туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью, как самостоятельное лекарственное средство или в составе комплексной терапии с другими противотуберкулезными препаратами.
Пример 1.
Листья и цветки аврана измельчали и просеивали через сито с размером ячеек не более 3 мм. Взвесили 10 г измельченного сырья, поместили его в колбу объемом 500 мл, добавили 100 мл этилового спирта 96%, на водяной бане довели до кипения и кипятили в течение 14 мин. Экстракт из колбы процедили в стеклянную емкость через 4 слоя широкого бинта, остаток растительного материала тщательно отжали, залили еще 100 мл этилового спирта 96%. Довели до кипения и снова профильтровали в ту же стеклянную емкость. Полученный экстракт выпарили досуха в термостате при температуре 55°С. В стеклянную емкость с выпаренным экстрактом добавили 8 мл т дистиллированной воды, затем с помощью шприца перенесли полученный раствор в пластиковую центрифужную пробирку объемом 11 мл, добавили 2 мл хлороформа, встряхнули несколько раз до однородности, остудили до комнатной температуры и центрифугировали в течение 15 мин (для удаления неполярных примесей (хлорофилла) и др.) при скорости 1500 оборотов в минуту. Водную фракцию собирали с помощью шприца, поместили в заранее взвешенную чашку Петри, высушили и в таком виде хранили до начала эксперимента. Вес сухого экстракта подсчитали как разницу между весом чашки Петри с сухим экстрактом и весом пустой чашки Петри. Получили 225 мг сухого экстракта аврана.
7
На плотной яичной питательной среде Левенштейна-Йенсена, не содержащей крахмал (HiMedia, Индия) был посеян музейный штамм М. tuberculosis (приказ МЗ РФ, 2003; Руководящие методические материалы по экспериментальному и клиническому изучению новых лекарственных средств. Ч. 6, Москва, 1986). Водный раствор сухого спиртового экстракта добавляли к среде во время ее приготовления при температуре 20-25°С, равномерно распределяя его с конечной концентрацией в среде 14 мг/мл. МБТ засевали стандартного титра (содержание клеток, соответствующее 50×10 микробных тел /мл.). На 28 сутки рост микобактерий не определялся.
Пример 2.
Экстракт, полученный способом описанном в примере 1, исследовали на клиническом штамме МБТ.
7
На плотной яичной питательной среде Левенштейна-Йенсена, не содержащей крахмал (HiMedia, Индия) был посеян клинический штамм М. tuberculosis резистентный к противотуберкулезным препаратам первого ряда (изониазиду, рифампицину, стрептомицину и этамбутолу) (приказ МЗ РФ №109, 2003; Руководящие методические материалы по экспериментальному и клиническому изучению новых лекарственных средств. Ч. 6, Москва, 1986). Водный раствор сухого спиртового экстракта добавляли к среде во время ее приготовления при температуре 20-25°С, равномерно распределяя его с конечной концентрацией в среде 100 мг/мл. МБТ засевали титром с содержанием клеток, соответствующим 1×10 микробных тел /мл. На 28 сутки рост микобактерий не определялся.
Таким образом, экстракт, полученный путем экстрагирования 96% этиловым спиртом листьев и цветков аврана лекарственного, при определенных условиях, с очисткой хлороформом от ядовитых веществ с их полным последующим удалением вместе с растворителем с помощью центрифугирования, упариванием водной фракции на водяной бани при температуре не более 60°С, обладает новым свойством - бактерицидным и бактериостатическим эффектом на М. tuberculosis, в том числе и устойчивые к стандартным противотуберкулезным препаратам первого ряда (изониазиду, рифампицину, стрептомицину и этамбутолу), при этом экстракт не токсичен и обладает антиоксидантной активностью.