тм
Способ получения иммуногенных компонентов культурального вируса ящура типов А, О, Азия-1 с применением бессывороточной среды "Cellvento ВНК-200" для изготовления противоящурных вакцин
TM
METHOD FOR OBTAINING IMMUNOGENIC COMPONENTS OF CULTURAL A, O, ASIA-1 TYPE FOOT-AND-MOUTH DISEASE VIRUS USING A SERUM-FREE MEDIUM "CELLVENTO BHK-200" FOR PRODUCTION OF VACCINES AGAINST FOOT-AND-MOUTH DISEASE

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу получения иммуногенных компонентов культурального вируса ящура типов А, О, Азия-1 с применением бессывороточной среды «Cellvento™ ВНК-200» («Merck») для изготовления противояшурных вакцин.
Ящур занимает первоочередное место в системе мер борьбы и профилактики вирусных болезней крупного рогатого скота во многих государствах. Данное заболевание представляет собой мировую проблему, которой особое внимание уделяют ветеринарные службы многих стран и международные организации (ФАО/МЭБ) [1].
Возбудитель принадлежит к порядку Picornavirales, семейству Picornaviridae, роду Aphthovirus [2]. Вирус ящура характеризуется высокой антигенной изменчивостью за счет мутаций в генах капсидных белков и представлен 7 типами: О, А, С, Азия-1, САТ-1, САТ-2, САТ-3 и множеством подтипов [3].
При репродукции в биологических системах, в том числе в суспензионной перевиваемой клеточной линии из почки новорожденного сирийского хомячка (ВНК-21), вирус ящура образует 4 варианта структурных компонентов, для которых установлены следующие значения констант седиментации:
1
2
3
4
1) 146S компонент (полные частицы), состоящие из одной молекулы вирусной РНК и 60 копий полипептида, каждая из которых представлена комплексом белков VP (ID), VP (IB), VP (1С), VP (1A); отвечает за иммуногенные свойства антигена;
0
1
3
2) 75S частицы («пустые» капсиды), лишенные РНК и включающие в себя 60 копий, состоящих из полипептидов VP (1АВ), VP (ID), VP (1С); отвечают за иммуногенные свойства антигена;
1
2
3
3) 12S частицы (капсомеры), представленные структурными белками VP(1D), VP (1B), VP (1C);
g
4) 3,8S субъединицы, представленные неструктурным белком VP [1].
Вирус ящура легко распространяется, по этой причине данное заболевание может приобретать размах эпизоотий [2]. В Российской Федерации применяется система мероприятий по борьбе и профилактике ящура, которая направлена на предупреждение заноса вируса в страну, систематическую иммунизацию крупного и мелкого рогатого скота в буферной зоне, а также проведение мониторинга иммунного статуса привитых животных.
Рутинная вакцинация против ящура проводится во многих странах или зонах, признанных свободными от ящура с вакцинацией, и в странах, где данная болезнь является эндемичной. Напротив, в ряде стран, свободных от болезни, никогда не проводилась вакцинация своих сельскохозяйственных животных, а предпочтение отдавалось использованию строгого контроля перемещения животных и выбраковке инфицированных и контактирующих с ними животных в случае вспышек. При этом многие страны, свободные от болезни, не отказываются от проведения иммунизации животных и имеют свои собственные стратегические запасы инактивированных вирусных препаратов, содержащих высокие концентрации 146S и 146S+75S иммуногенных компонентов. Такие запасы антигена обеспечивают возможность поставки полученных вакцин в чрезвычайной ситуации и в короткие сроки.
Традиционные противоящурные инактивированные вакцины должны быть изготовлены на основе эпизоотического штамма вируса ящура, включать в свой состав определенные количества иммуногенных компонентов вируса ящура, полученных в результате репродукции вируса в чувствительной клеточной линии, адъюванта и дополнительных соединений. В соответствии с требованиями МЭБ (OIE) готовые вакцинные препараты для профилактики ящура исследуют на безвредность, стерильность, идентичность заявляемому(ым) штамму(ам) вируса ящура, проводят исследования на чистоту (отсутствие неструктурных белков вируса ящура), безопасность на животных, иммуногенность, а также осуществляют оценку протективных свойств готового препарата, определяют процент защиты поголовья от заражения вирусом [2].
Для получения иммуногенных компонентов вируса ящура применяют перевиваемую суспензионно-монослойную клеточную линию из почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/2-17, свободную от контаминирующих микроорганизмов [1,2].
Культивирование клеток осуществляют с применением различных ростовых сред, содержащих питательные вещества, факторы роста и гормоны, а также соединения, которые регулируют водородный показатель (рН) и осмотическое давление в клетках [4].
В зависимости от необходимости добавления сыворотки крови крупного рогатого скота (КРС) выделяют несколько типов сред:
- основные (базовые) среды (basal media), требующие добавления 10% сыворотки крови КРС;
- улучшенные среды (advanced media), требующие добавления 1-5% сыворотки крови КРС;
- бессывороточные среды (serum-free medium), не требующие добавления сыворотки [5].
3
3
Традиционно клетки перевиваемой суспензионно-монослойной линии ВНК-21/2-17 выращивают с применением улучшенных сред. Качественный и количественный состав данной среды отражен в таблице 1 [6] (прототип). Представленная среда включает в себя белки, пептиды и липиды, входящие в состав сыворотки крови КРС (5,0%), гидролизата белков крови (15-20 см/л) и перевара по Хоттингеру (2-10 см/л), 8 протеиногенных аминокислот, глюкозу, 8 витаминов и витаминоподобных соединений, минеральные соли.
3
3
При использовании данной улучшенной ростовой среды для выращивания клеток линии ВНК-21 (клон 2-17) с посевной концентрацией 0,6-0,7 млн клеток/см за 48 ч получали 4,0-4,3 млн клеток/см [6,7].
3
3
3
3
3
3
Для репродукции вируса ящура разных типов используют поддерживающие среды, содержащие 2% сыворотки крови КРС (прототип). Качественный и количественный состав данной среды представлен в таблице 2 [6, 7]. Представленная среда включает в себя белки, пептиды и липиды, входящие в состав сыворотки крови КРС (2,0%), гидролизата белков крови (5,0 см/дм) и перевара по Хоттингеру (2 см/дм), 4 протеиногенных аминокислот, глюкозу, 8 витаминов и витаминоподобных соединений, минеральные соли. При использовании данной среды для репродукции вируса ящура типов А, О, Азия-1 с 1 млн клеток ВНК-21 (клон 2-17) концентрация 146S компонента составляет 0,57-0,59; 0,64-0,68; 0,69-0,72 мкг/см, соответственно, а концентрация 146S+75S компонентов для тех же типов вируса ящура - 0,71-0,75; 0,75-0,79; 0,85-0,88 мкг/см, соответственно [6, 7, 8].
Однако данный прототип при культивировании клеток ВНК-21 (клон 2-17) и вируса ящура в присутствии сыворотки крови КРС обнаруживает ряд недостатков:
- сыворотка крови может быть цитотоксичной, поскольку содержит фермент полиаминоксидазу, действующую на полиамины (спермин, спермидин), являющиеся продуктами секреции быстро пролиферирующих клеток;
- значительная вариабельность состава сывороток крови разных партий;
- сыворотка может содержать недостаточное количество специфических ростовых факторов, что вызывает необходимость их дополнительного введения в состав базовой среды;
- сыворотка крови может быть контаминирована вирусами, что является дополнительным неизвестным фактором, который невозможно контролировать;
- сыворотка является самой дорогой составляющей питательной среды [5].
Все перечисленные проблемы могут быть разрешены путем удаления сыворотки крови КРС и других продуктов животного происхождения с переходом на применение бессывороточных сред.
Бессывороточные среды в последние годы привлекают все больше внимания для культивирования клеток и репродукции вируса в них. Данные среды имеют определенные преимущества: улучшение воспроизводимости результатов опыта вследствие большей стабильности состава среды; снижение риска заражения культуры вирусами, бактериями, грибами и микоплазмами; облегчение очистки продуктов клеточного метаболизма; снижение влияния дополнительных протеинов на результаты биологических исследований; отсутствие цитотоксического влияния сыворотки по причине ее отсутствия. Поэтому в последние два десятилетия ведутся интенсивные исследования по разработке бессывороточных питательных сред для выращивания клеток и репродукции вируса в них [9, 10].
Несмотря на перспективность использования бессывороточных питательных сред, ни одна из них не может считаться универсальной при работе с несколькими линиями клеток, одним из возможных путей решения данной проблемы может быть получение новых сублиний клеток, адаптированных к росту в разрабатываемых бессывороточных питательных средах. Перевод клеток к бессывороточным условиям культивирования затрагивает биохимические и морфологические характеристики клеточных линий. Однако разные линии клеток индивидуально реагируют на переход к культивированию в бессывороточных средах [4, 5].
В настоящее время представлено несколько способов культивирования клеток линии ВНК-21/2-17 и получения 146S и 146S+75S иммуногенных компонентов вируса ящура в них с применением бессывороточных сред.
В 1975 году американский исследователь Л. Дэвид Томей зарегистрировал противоящурную вакцину [11], которую получали путем выращивания клеток линии ВНК-21 в питательной ростовой среде без L-глутамина и сыворотки крови КРС. Качественный и количественный состав данной термостабильной среды отражен в таблице 3. Данная среда включает в свой состав 17 протеиногенных аминокислот, глюкозу, 10 витаминов и витаминоподобных соединений, метилцеллюлозу и феноловый красный.
Среду стерилизуют автоклавированием в течение 30 минут (120°С, 1 бар) при рН 4,3 и хранят при температуре 4°С до момента использования. Суспензию клеток линии ВНК-21 выращивали при температуре 35°С и рН 7,0-7,2 со скоростью перемешивания 104 об./мин в указанной среде.
При использовании данной бессывороточной ростовой среды для выращивания клеток линии ВНК-21 (клон 2-17) с посевной концентрацией 0,6-0,7 млн клеток/см за 48 ч получали 3,0-3,5 млн клеток/см (таблица 7).
Для получения иммуногенных компонентов использовали вирусы ящура типов А, О и Азия-1, первоначально выделенные из бычьего языка. Эпителий языка размалывали в стерильной фарфоровой ступе с кварцевым песком в среде гидролизата лактоальбумина и среды Хэнкса с антибиотиками (пенициллин 1000 ед./мл и стрептомицин 1000 мкг/мл), затем центрифугировали при lg в течение 10 минут для удаления остатков тканей и песка. Супернатант использовали для инокуляции клеточных культур. Предпосевной материал был получен в первичной монослойной культуре клеток бычьей почки (ВК) в течение семи пассажей и в монослойной культуре ВНК-21 в роллерных флаконах в течение 2 пассажей. Полученные суспензии вируса хранили при температуре -70±1°С до момента использования.
50
3
3
Доза заражения вирусом составляла 0,10 ТЦД/клетка. Репродукцию вируса осуществляли в течение 12 часов, после этого определяли количества иммуногенных компонентов возбудителя ящура. С 1 млн клеток концентрация 146S компонента вируса ящура типов А, О, Азия-1 составляла 0,41-0,45; 0,54-0,57; 0,61-0,65 мкг/см, соответственно, а концентрация 146S+75S компонентов для тех же типов вируса ящура - 0,67-0,72; 0,64-0,69; 0,71-0,73 мкг/см, соответственно (таблица 7).
Вирус инактивировали 0,05% ацетилэтиленимином в течение 72 часов при температуре 25°С при постоянном перемешивании. Для исследования кинетики инактивации образцы отбирали и исследовали на инфекционность вначале инактивации, через 30, 60 и 90 минут и 24 часа после нейтрализации ацетилэтиленимина в образцах путем добавления тиосульфата натрия до конечной концентрации 2%.
Полученный антиген вируса ящура подвергали фильтрации с применением фильтров с диаметром пор 0,45 мкм и далее смешивали с неполным адъювантом Фрейнда в соотношении 50/50. Тем самым получали эмульсию типа «вода в масле». В качестве бактерицидного компонента применяли трихлорметан в количестве 0,5% (по объему) [11].
В 1997 году Motono Mitsuru, Yamamoto Ryohel, Takase Kozo, Miyahara Tokuji была представлена бессывороточная среда [12], пригодная для животных клеток, в том числе ВНК-21, и получения на их основе иммуногенных компонентов вируса ящура.
Качественный и количественный состав данной среды отражен в таблице 4. Данная среда включает в свой состав фактор роста фибробластов (0,5-20,0 нг/мл), инсулин (0,1-20,0 мкг/мл), 17 протеиногенных аминокислот, глюкозу, 9 витаминов и витаминоподобных соединений, неорганические соли и краситель феноловый красный.
Фактор роста фибробластов представляет собой протеин, способствующий пролиферации широкого спектра клеток (мезенхимальных клеток, нейрональных клеток эктодермы, эндотелиальных клеток и др.). Количество данного фактора роста, добавляемого в среду, составляет от 0,5 до 20,0 нг/мл, но 10,0 нг/мл достаточно для активной пролиферации и с экономической точки зрения. Количество инсулина, добавляемого в среду, составляет 0,1-20,0 мкг/мл, но 10 мкг/мл также достаточно для активного деления и роста клеток, а также с экономической точки зрения.
3
3
3
3
При использовании данной бессывороточной ростовой среды для выращивания клеток линии ВНК-21 (клон 2-17) с посевной концентрацией 0,6-0,7 млн клеток/см за 48 ч получали 3,8-4,2 млн клеток/см. С 1 млн клеток концентрация 146S компонента вируса ящура типов А, О, Азия-1 составляла 0,50-0,55; 0,62-0,66; 0,70-0,75 мкг/см, соответственно, а концентрация 146S+75S компонентов для тех же типов вируса ящура - 0,7-0,75; 0,75-0,80; 0,84-0,87 мкг/см, соответственно (таблица 7).
В 2011 году авторами Ren Zhang, Wenqing Chen, Jlanchao Wang была зарегистрирована вакцина CN102115729, полученная при использовании бессывороточной среды для выращивания клеток ВНК-21 и репродукции в них вируса ящура [13] (наиболее близкий прототип). Данная среда включает в свой состав основную культуральную среду, содержащую необходимый набор протеиногенных аминокислот, минеральных солей, глюкозу, витамины, и дополнительно следующие компоненты в пересчете на 100 л среды: 100-200 г соевого белка, 100-200 г растительного белка семейства бобовых, 0-100 г картофельного белка, 0-200 г пшеничного глютенового белка и 50-100 г рисового белка (таблица 5).
При использовании представленной бессывороточной ростовой среды для выращивания клеток линии ВНК-21 (клон 2-17) с посевной концентрацией 0,6-0,7 млн клеток/см за 48 ч получали 4,0-4,3 млн клеток/см (таблица 7). Клетки, выращенные в данной среде, имели высокую плотность культуры, а среда - низкую себестоимость по сравнению с бессывороточной средой, отраженной в патентах US 4049494 (А) [11], JPH09154571 (А) [12].
3
3
С 1 млн клеток концентрация 146S компонента вируса ящура типов А, О, Азия-1 составляла 0,51-0,56; 0,63-0,67; 0,69-0,75 мкг/см, соответственно, а концентрация 146S+75S компонентов для тех же типов вируса ящура - 0,74-0,78; 0,85-0,88; 0,87-0,89 мкг/см, соответственно (таблица 7).
В 2013 году Zhang Shu и L.V. Hongliang зарегистрировали способ получения очищенной противоящурной вакцины CN103374547 с применением бессывороточной среды [14]. Качественный и количественный состав среды отражен в таблице 6 и включает в себя 9 протеиногенных аминокислот, сахарозу, 4 варианта солей и краситель феноловый красный.
Способ получения очищенной вакцины против ящура включает следующие стадии:
- выращивание суспензии клеток ВНК-21 в бессывороточной среде CN103374547;
- репродукция вируса ящура;
- микрофильтрация, ультрафильтрация;
- концентрирование в 50-200 раз, проведение хроматографии с молекулярным ситом Sephawse6FF или зональным центрифугированием в градиенте плотности с непрерывным потоком;
- инактивация 0,05% β-пропиолактоном.
3
3
При использовании представленной бессывороточной ростовой среды для выращивания клеток линии ВНК-21 (клон 2-17) с посевной концентрацией 0,6-0,7 млн клеток/см за 48 ч получали 3,5-4,0 млн клеток/см (таблица 7).
50
3
3
Клетки линии ВНК-21/2-17 заражали вирусом ящура в дозе 0,10-0,50 ТЦД/клетка. С 1 млн клеток концентрация 146S компонента вируса ящура типов А, О, Азия-1 составляла 0,43-0,48; 0,47-0,50; 0,49-0,54 мкг/см, соответственно, а концентрация 146S+75S компонентов для тех же типов вируса ящура - 0,65-0,67; 0,68-0,70; 0,72-0,75 мкг/см, соответственно (таблица 7).
Фильтрацию полученной вирусной суспензии проводили с помощью фильтра с диаметром пор 0,22 мкм. Фильтрат очищали и концентрировали центрифугированием в градиенте плотности сахарозы в непрерывном потоке или колонкой молекулярной хроматографии. Концентрирование проводили в 50-200 раз.
Представленные способы получения иммуногенных компонентов вируса ящура с применением описанных бессывороточных сред имеют недостатки. Существенными недостатками являются: 1) за 48 ч культивирования клеток линии ВНК-21/2-17 с посевной концентрацией 0,6-0,7 млн клеток/мл получают суспензию с концентрацией не более 4,3 млн клеток/мл; 2) концентрация 146S и 146S+75S компонентов вируса ящура типа А при использовании данных сред с 1 млн клеток составляет не более 0,59 и 0,78 мкг/мл, соответственно; 3) концентрация 146S и 146S+75S компонентов вируса ящура типа О при использовании данных сред с 1 млн клеток составляет не более 0,68 и 0,88 мкг/мл, соответственно; 4) концентрация 146S и 146S+75S компонентов вируса ящура типа Азия-1 при использовании данных сред с 1 млн клеток составляет не более 0,75 и 0,89 мкг/мл, соответственно. В связи с этим целесообразно провести поиск способа получения иммуногенных компонентов культурального вируса ящура для изготовления противоящурных вакцин с применением бессывороточной среды, характеризующейся более высоким урожаем клеток линии ВНК-21 и более высоким накоплением 146S и 146S+75S иммуногенных компонентов вируса ящура типов А, О. Азия-1.
Проблемой является отсутствие способа получения иммуногенных компонентов культурального вируса ящура с применением бессывороточных сред для изготовления противоящурных вакцин с целью устранения вышеуказанных недостатков.
Данная проблема была решена благодаря разработке нового способа получения иммуногенных компонентов культурального вируса ящура с использованием перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, которая была задепонирована в «Коллекции культур клеток позвоночных ЦКП» 23.04.19 под номером РККК(П) 797 Д, и с применением бессывороточной среды «Cellvento™ ВНК-200» («Merck») для изготовления противоящурных вакцин. Данная возможность позволит повысить урожай клеток суспензионной перевиваемой линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, увеличить размер данных клеток, повысить накопление 146S и 146S+75S иммуногенных компонентов вируса ящура типов А, О. Азия-1.
Сущность изобретения заключается в новом подходе по получению 146S и 146S+75S иммуногенных компонентов вируса ящура типов А, О, Азия-1 для производства противоящурных инактивированных вакцин. Заявляемый способ основан на адаптации перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH к культивированию в бессывороточной среде «Cellvento™ ВНК-200» («Merck»); получении урожая клеток линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH более 4,3 млн клеток/мл; репродукции вируса ящура в полученной клеточной системе с целью получения 146S иммуногенных компонентов в количествах более 0,59, 0,68 и 0,75 мкг/мл с 1 млн клеток для типов вируса ящура А, О, Азия-1, соответственно; репродукции вируса ящура в полученной клеточной системе с целью получения 146S+75S иммуногенных компонентов в количествах более 0,78, 0,88 и 0,89 мкг/мл с 1 млн клеток для типов вируса ящура А, О, Азия-1, соответственно.
Для культивирования клеток линии ВНК-21/2-17 и получения 146S и 146S+75S иммуногенных компонентов вируса ящура типов А, О, Азия-1 применяют улучшенную и поддерживающую среды (таблицы 1, 2) (прототип). Для повышения урожая клеток линии ВНК-21/2-17 и увеличения количества 146S и 146S+75S иммуногенных компонентов вируса ящура применяют бессывороточную среду (CN102115729, 2011 г. ) [13] (наиболее близкий прототип). По сравнению с прототипами способ получения иммуногенных компонентов вируса ящура типов А, О, Азия-1 позволяет проводить репродукцию вируса ящура в клетках линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, адаптированной к выращиванию в бессывороточной среде «Cellvento™ ВНК-200» («Merck»), с более высоким выходом 146S и 146S+75S иммуногенных компонентов, определяющих иммуногенность вакцинного препарата. Исходя их этого, актуально применять способ получения иммуногенных компонентов культурального вируса ящура типов А, О, Азия-1 с использованием бессывороточной среды «Cellvento™ ВНК-200» («Merck») для изготовления противоящурных вакцин.
Ключевым элементом заявляемого способа является адаптация перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH к выращиванию в бессывороточной среде «Cellvento™ ВНК-200» («Merck») в течение 6 последовательных пассажей с уменьшением количества сыворотки крови КРС с 5 до 0%, культивирование клеток полученной линии в бессывороточной среде «Cellvento™ ВНК-200» («Merck»), репродукция вируса ящура типов А, О, Азия-1 в данных клетках для получения высокого количества 146S и 146S+75S иммуногенных компонентов, используемых для изготовления противоящурных вакцин.
Сопоставительный анализ с прототипами позволяет сделать вывод, что новизна и изобретательский уровень заявляемого изобретения заключается в адаптации клеток линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH к культивированию в бессывороточной среде «Cellvento™ ВНК-200» («Merck») и репродукции вируса ящура типов А, О, Азия-1 в подобранных условиях для получения с помощью адаптированных клеток высоких количеств 146S и 146S+75S иммуногенных компонентов, используемых для изготовления противоящурных вакцин.
Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в увеличении количества 146S и 146S+75S иммуногенных компонентов вируса ящура и производстве на их основе более широкого арсенала противоящурных инактивированных вакцин.
Сущность изобретения отражена на графических изображениях:
Фиг. 1 - Концентрации клеток перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH при адаптации к выращиванию в бессывороточной среде «Cellvento™ ВНК-200» («Merck») в течение 144 ч в сравнении с контролем.
Фиг. 2 - Размеры клеток перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, адаптированных к выращиванию в бессывороточной среде «Cellvento™ ВНК-200» («Merck») (А), в сравнении с контролем (Б).
Фиг. 3 - Результаты культивирования клеток перевиваемой суспензионной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH после адаптации к компонентам бессывороточной среды «Cellvento™ ВНК-200» («Merck»).
Фиг. 4 - Концентрации 146S и 146S+75S иммуногенных компонентов культурального вируса ящура штамма А/Забайкальский/2013 в неинактивированных (А) и инактивированных (Б) суспензиях после репродукции в клетках линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, адаптированных к культивированию в бессывороточной среде «Cellvento™ ВНК-200» («Merck»), в бессывороточной среде CN102115729, 2011 г., в улучшенной среде.
Фиг. 5 - Концентрации 146S и 146S+75S иммуногенных компонентов культурального вируса ящура штамма О/Саудовская Аравия/2008 в неинактивированных (А) и инактивированных (Б) суспензиях после репродукции в клетках линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, адаптированных к культивированию в бессывороточной среде «Cellvento™ ВНК-200» («Merck»), в бессывороточной среде CN102115729, 2011 г., в улучшенной среде.
Фиг. 6 - Концентрации 146S и 146S+75S иммуногенных компонентов культурального вируса ящура штамма Азия-1/Таджикикстан/2011 в неинактивированных (А) и инактивированных (Б) суспензиях после репродукции в клетках линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, адаптированных к культивированию в бессывороточной среде «Cellvento™ ВНК-200» («Merck»), в бессывороточной среде CN102115729, 2011 г., в улучшенной среде.
Бессывороточная среда «Cellvento™ ВНК-200» представляет собой светло-коричневый мелкодисперсный порошок, который хорошо растворяется в воде. Среда «Cellvento™ ВНК-200» отличается наличием L-глутамина и HEPES и отсутствием гидрокарбоната натрия и фенолового красного. Качественный и количественный аминокислотный состав данной среды отражен в таблице 8, из данных которой видно, что по сравнению с бессывороточной средой 2011 г., CN102115729 [13] (относится к наиболее близкому прототипу) количества L-аланина, L-аргинина, L-аспарагина, L-валина, L-гистидина, L-глицина, L-глутаминовой кислоты, L-изолейцина, L-лейцина, L-пролина, L-серина, L-тирозина, L-фенилаланина в 1,16; 1,06; 1,15; 1,56; 1,44; 1,07; 1,41; 8,00; 1,26; 1,90; 1,70; 6,62; 1,43 раз больше, соответственно. Содержание L-аспарагиновой кислоты, L-глутамина, L-триптофана, L-метионина, L-треонина, L-цистина в 1,09; 3,10; 1,37; 1,25; 1,03; 2,00 раз меньше, соответственно. Концентрация L-лизина для данных сред одинакова (15 мг/л). По сравнению с улучшенной средой с наличием белков животного происхождения количества L-аланина, L-аргинина, L-гистидина, L-глутамина, L-глутаминовой кислоты, L-изолейцина, L-лизина, L-пролина, в 1,25; 1,27; 1,08; 1,06; 2,28; 1,78; 2,80; 1,26 раз больше, соответственно. Содержание L-аспарагина, L-аспарагиновой кислоты, L-валина, L-глицина, L-лейцина, L-триптофана, L-метионина, L-серина, L-тирозина, L-треонина, L-фенилаланина в 1,13; 1,73; 1,59; 1,31; 1,70; 1,45; 1,21; 1,02; 1,66; 1,03 раз меньше, соответственно. Концентрация L-цистина для данных сред одинакова (20 мг/л).
Показано, что состав среды «Cellvento™ ВНК-200» является оптимальным для культивирования и поддержания клеточных линий ВНК-21, используемых для производства вирусных вакцин, и подходит, для экспрессии вируса ящура. При достижении линией клеток ВНК-21 необходимой концентрации, вирус может быть добавлен непосредственно в биореактор, без замены питательной среды за счет чего достигается высокая эффективность производства вирусных частиц.
На первом этапе работы готовят раствор бессывороточной среды «Cellvento™ ВНК-200». Для этого к 9,5 л деионизированной воды (Milli-Q) медленно добавляют 216,655 г порошковой питательной среды «Cellvento™ ВНК-200» при медленном помешивании (300 об/мин) в течение 15 минут. Добавляют 20 г гидрокарбоната натрия и перемешивают до полного растворения в течение 15 минут. Измеряют значение рН, которое равно 6,85±0,02 и доводят рН до 7,10-7,20 с помощью 7,5%-ого раствора гидрокарбоната натрия. Конечный объем доводят до 10 л. Полученную среду подвергают стерилизационной фильтрации с применением мембранного фильтра Millipore Express Plus (0,22 мкм, полиэфирсульфон).
Проводят адаптацию перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH к выращиванию в бессывороточной среде «Cellvento™ ВНК-200» («Merck») в течение 6 последовательных пассажей в колбах Эрленмейера перед масштабированием в биореакторе. Для адаптации используют суспензию клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH 1-2 пассажа после криозаморозки. Посевная концентрация клеток перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH составляет 0,6-0,7 млн клеток/мл. Ежедневно в улучшенную среду добавляют  объема среды «Cellvento™ ВНК-200» («Merck») и в течение 5 пассажей (120 ч) концентрация сыворотки крови КРС уменьшается по схеме: 5,0→2,5%→1,25%→0,625%→0,3125%. Затем проводят осаждение клеток при 1000 об./мин для того, чтобы освободить клетки от среды с сывороткой крови КРС и полностью перевести в среду «Cellvento™ ВНК-200» («Merck») без добавления сыворотки (шестой пассаж). Иными словами, осуществляют полный перевод клеток на выращивание в бессывороточной среде «Cellvento™ ВНК-200» («Merck»). В качестве контроля используют клетки линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, выращенные согласно «Промышленному регламенту на производство вакцины против ящура различных типов» с применением улучшенной среды, состав которой отражен в таблице 1.
Перевод клеток к бессывороточным условиям культивирования затрагивает биохимические и морфологические характеристики клеточных линий. В ходе исследования через 24 ч в течение 6 последовательных пассажей оценивают концентрацию клеток и анализируют их размеры с помощью световой микроскопии.
На следующем этапе проводят культивирование клеток линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH с бессывороточной среде «Cellvento™ ВНК-200» («Merck») при рН 7,10-7,20, умеренном обогащении среды очищенным воздухом в процессе барботирования. Посевная концентрация клеток составляет 0,6-0,7 млн/мл. Продолжительность каждого пассажа составляет 48 ч. Через каждые 48 ч определяют конечную концентрацию клеток и сравнивают ее с контролем. В качестве контроля используют клетки линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, выращенные согласно «Промышленному регламенту на производство вакцины против ящура различных типов» с применением улучшенной среды, состав которой отражен в таблице 1.
50
На следующем этапе работы проводят репродукцию вируса ящура в клетках перевиваемой суспензионной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, адаптированной к выращиванию в бессывороточной среде «Cellvento™ ВНК-200» («Merck»). Доза заражения вирусом составляет 0,05 ТЦД/клетка. Культивирование вируса проводят в бессывороточной среде «Cellvento™ ВНК-200» («Merck») при рН 7,5-7,6. Водородный показатель регулируют с помощью 7,5%-ого раствора гидрокарбоната натрия. Репродукцию вируса ящура оценивают по количеству клеток, подвергнутых специфическому разрушению, и выражают в %.
После культивирования вируса ящура в обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) подтверждают штаммоспецифичность [2].
В обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ОТ-ПЦР-РВ) исследуют полученные суспензии вируса ящура и определяют концентрацию 146S иммуногенного компонента [15]. Количество 146S+75S иммуногенных компонентов определяют в реакции связывания комплемента (РСК).
Проводят процесс инактивации антигена вируса ящура. В качестве инактиванта первого порядка используют 1,2-аминоэтилэтиленимин (АЭЭИ) в концентрации 0,025-0,050%. Инактивацию осуществляют в течение 12 ч.
Оценивают полноту процесса инактивации антигена вируса ящура при инокуляции перевиваемой клеточной линии из почки свиньи (IB-RS-2) в соответствии с требованиями МЭБ (OIE) [2].
После подтверждения полноты инактивации антигена вируса ящура проводят определение концентрации 146S и 146S+75S иммуногенных компонентов вируса ящура в инактивированной суспензии с помощью реакции связывания комплемента (РСК), которую проводят в соответствии с требованиями МЭБ (OIE) [2, 16]. Осуществляют пересчет концентрации иммуногенных компонентов с 1 млн клеток.
Для изготовления противоящурной инактивированной сорбированной вакцины в качестве адъювантов используют гель гидроокиси алюминия (ГОА) и дополнительно сапонин, эмульсионной вакцины - масляный адъювант Montanide ISA-206 («Seppic») в количестве 500000,0-575000. Проводят концентрирование антигенного материала из расчета, что в 1 мл готового препарата должно содержаться не менее не менее 3,0 мкг 146S+75S иммуногенного компонента вируса ящура. Содержание ГОА в 1,0 мл готового препарата находится в диапазоне 1132,0-2108,0 мкг. К полученному концентрату добавляют дополнительно 10% водный раствор сапонина до конечной концентрации 0,075%, что соответствует 750,0 мкг его содержания в 1 мл готового препарата.
Для изготовления эмульсионной вакцины используют антигенный материал с содержанием 146S+75S иммуногенных компонентов вируса ящура не менее 3,0 мкг/мл. Необходимую концентрацию иммуногенных компонентов в эмульсионной вакцине получают путем концентрирования антигена методом проточной ультрафильтрации. Эмульсионную вакцину получают путем диспергирования на коллоидных мельницах концентрата антигена вируса ящура и масляного адъюванта Montanide ISA-206 VG в соотношении 50/50 по массе, соответственно.
Полученный вакцинный препарат исследуют на безвредность с применением перевиваемой монослойной клеточной линии из почки свиньи IB-RS-2 для подтверждения отсутствия инфекционности антигена. Проводят оценку стерильности с помощью высевов на твердые и жидкие питательные среды.
Методом твердофазного иммуноферментного анализа (ТФ ИФА) в блокирующем варианте оценивают отсутствие неструктурных белков вируса ящура в конечном продукте [2]. Для определения серонегативности к неструктурным белкам вируса ящура от животных до иммунизации отбирают кровь и тестируют полученные сыворотки с помощью ИФА. На 14 день после иммунизации 3 головам КРС вводили усредненную из 3 флаконов пробу эмульсионной вакцины из штамма А/Забайкальский/2013 вируса ящура в количестве одной прививной дозы в область верхней средней трети шеи внутримышечно. Через 14 суток после последней вакцинации от животных производили отбор проб крови. Тестирование полученных сывороток проводили с использованием тест-системы для ИФА «PrioCHECK FMDV NS ELISA for in vitro detection of antibodies against Foot and Mouth Disease Virus in serum of cattle, sheep and pigs» (Prionics Lelystad B.V., Нидерланды). Для контрольных и исследуемых образцов после проведения реакции на спектрофотометреридере измеряли значения оптических плотностей и преобразовывали их в процент ингибиции, пользуясь формулой:
S
КО
РI=(1-ОП/ОП)*100, где
PI - процент ингибиции (%),
S
ОП - оптическая плотность исследуемой сыворотки крови,
КО
ОП - оптическая плотность отрицательного контроля.
Сыворотки крови КРС в отношении наличия антител к неструктурным белкам вируса ящура следует считать положительными, если значение РI≥50%, отрицательными - при РI<50%. При этом значение оптической плотности отрицательного контроля должно быть >1,000. Процент ингибиции слабоположительного контроля должен составлять >50,00%, положительного контроля - >70,00% [17, 18].
3
Вакцинный препарат исследуют на животных для оценки безопасности. Для тестирования вакцины на безвредность 5 головам КРС внутримышечно в область верхней трети шеи в дозе 6,0 см (трехкратная доза) вводят препарат и наблюдают за клиническим состоянием животного в течение 6 суток. Вакцина признается безвредной в том случае, если все животные по итогам наблюдения остаются клинически здоровыми, и на месте введения препарата не происходит некроза тканей.
На 0 и 21 сутки после введения противоящурной вакцины от животных отбирают кровь и получают сыворотки, которые исследуют на наличие вирусонейтрализующих антител (ВНА) с применением реакции микронейтрализации (РМН) вируса. Постановку РМН для определения титра нейтрализующих антител против вируса ящура осуществляют с использованием клеточной линии IB-RS-2 по стандартной процедуре [19].
50
Вакцину исследуют также на иммуногенность и проводят оценку протективных свойств конечного продукта [2]. Иммуногенную дозу (ИмД50) вакцины определяют по общепринятой методике Рида и Менча, в модификации И.П. Ашмарина [20]. Количество протективных доз (PD50) вычисляют путем деления прививной дозы (2,0 см) на ИмД.
Пример 1. Адаптация перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH к культивированию в бессывороточной среде «Cellvento™ ВНК-200» («Merck»).
Проводили адаптацию перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH к выращиванию в бессывороточной среде «Cellvento™ ВНК-200» («Merck») в течение 6 последовательных пассажей в колбах Эрленмейера. Для адаптации использовали суспензию клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH первого пассажа после криозаморозки. Посевная концентрация клеток перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH составляла 0,6 млн клеток/мл. Ежедневно в улучшенную среду добавляли Vi объема среды «Cellvento™ ВНК-200» («Merck») и в результате в течение 5 последовательных пассажей концентрация сыворотки крови КРС уменьшалась по схеме: 5,0→2,5%→1,25%→0,625%→0,3125%. Затем проводили осаждение клеток при 1000 об/мин, чтобы освободить клетки от среды с сывороткой крови КРС и полностью перевести в бессывороточную среду «Cellvento™ ВНК-200» («Merck»). В качестве контроля использовали клетки линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, выращенные согласно «Промышленному регламенту на производство вакцины против ящура различных типов» с применением улучшенной среды, состав которой отражен в таблице 1. В ходе исследования через 24 ч в течение 5 пассажей оценивали концентрацию клеток и анализировали их размеры с помощью световой микроскопии (таблица 9, фиг. 1).
Из данных таблицы 9 следует, что контрольные клетки линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, выращенные в среде состава, отраженного в таблице 1, с посевной концентрацией 0,6 млн клеток/мл через 24, 48, 72, 96, 120, 144 ч при уменьшении количества сыворотки крови КРС с 5 до 0% имели конечную концентрацию 1,80; 1,70; 1,50; 1,00; 0,85; 0,80 млн клеток/мл. Опытные клетки линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH с посевной концентрацией 0,6 млн клеток/мл через 24, 48, 72, 96, 120, 144 ч при уменьшении количества сыворотки крови КРС с 5 до 0% и замене ее на бессывороточную среду «Cellvento™ ВНК-200» («Merck») имели концентрацию 2,9; 2,8; 2,6; 2,5; 2,4; 2,4 млн клеток/мл, что в 1,61; 1,65; 1,73; 2,50; 2,82; 3,00 раз выше по сравнению с контролем. Результаты исследований также показали, что клетки, выращенные в бессывороточной среде «Cellvento™ ВНК-200» («Merck») (количество сыворотки 0% через 6 пассажей), были крупнее и имели размеры около 18-20 мкм, а клетки, полученные в среде с продуктами животного происхождения (5% сыворотки крови КРС) - 8-12 мкм.
Проводили седьмой пассаж адаптированных к бессывороточной среде «Cellvento™ ВНК-200» («Merck») клеток, после которого клетки заморозили с 10% ДМСО и создали банк данных клеток.
Таким образом, была проведена адаптация клеток линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH к выращиванию в бессывороточной среде «Cellvento™ ВНК-200» («Merck») в течение 6 последовательных пассажей (144 часа) и создан банк адаптированных клеток.
Пример 2. Процесс культивирования клеток перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH в бессывороточной среде «Cellvento™ ВНК-200» («Merck»).
После адаптации клеток линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH к бессывороточной среде «Cellvento™ ВНК-200» («Merck») в течение 6 последовательных пассажей в колбах Эрленмейера проводили культивирование клеток в биореакторах объемом 40 л в течение 3 последовательных пассажей, каждый из которых длился 48 ч. Выращивание клеток осуществляли при рН 7,0-7,2, умеренном обогащении среды очищенным воздухом в процессе барботирования. Посевная концентрация клеток составляла 0,6 млн клеток/мл. Через каждые 48 ч определяли конечную концентрацию клеток и сравнивали ее с контролем. В качестве контроля использовали клетки линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, выращенные согласно «Промышленному регламенту на производство вакцины против ящура различных типов» с применением улучшенной среды, состав которой отражен в таблице 1 (5% сыворотки крови КРС). Исследования проводили в трех повторениях. Полученные результаты представлены в таблице 10 и на фиг.2, 3.
Из данных, отраженных в таблице 10 и на фиг.2, 3 видно, что клетки линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, адаптированные к бессывороточной среде «Cellvento™ ВНК-200» («Merck»), в течение 3 последовательных пассажей по сравнению с контролем имели большую концентрацию (в среднем на 12,0%) и больший размер клеток (в среднем в 1,67-2,25 раз).
Пример 3. Получение иммуногенных компонентов культурального вируса ящура штамма А/Забайкальский/2013 с применением перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, адаптированной к выращиванию в бессывороточной среде «Cellvento™ ВНК-200» («Merck»).
50
В полученных клетках, адаптированных к выращиванию в бессывороточной среде «Cellvento™ ВНК-200» («Merck), проводили репродукцию вируса ящура штамма А/Забайкальский/2013 в биореакторах объемом 40 л. Доза заражения вирусом составляла 0,05 ТЦД/клетка. Культивирование вируса осуществляли в бессывороточной среде «Cellvento™ ВНК-200» («Merck») при рН 7,5-7,6. Водородный показатель регулировали с помощью 7,5%-ого раствора гидрокарбоната натрия. Цитопатическое действие (ЦПД) оценивали по количеству клеток, подвергнутых специфическому разрушению. Исследование проводили в трех повторениях. Культивирование осуществляли до 95% ЦПД. В качестве контроля использовали клетки линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, выращенные в улучшенной среде, состав которой представлен в таблице 1 (прототип), а также в бессывороточной среде CN102115729 (2011 г.) (наиболее близкий прототип). Из данных таблицы 11 следует, что время репродукции вируса ящура для предложенного способа составило 11,5-12,0 ч, для двух прототипов - 12,5-13,0 ч.
После культивирования вируса ящура в ОТ-ПЦР подтверждали штаммоспецифичность [2]. В результате исследования в суспензии подтверждено наличие только вируса ящура штамма А/Забайкальский/2013.
В обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ОТ-ПЦР-РВ) и в РСК исследовали полученные суспензии вируса ящура и определяли концентрацию 146S иммуногенного компонента [15].
Проводили процесс инактивации антигена вируса ящура. В качестве инактиванта первого порядка использовали 1,2-аминоэтилэтиленимин (АЭЭИ) в концентрации 0,050%. Инактивацию осуществляли в течение 12 ч.
Оценивали полноту процесса инактивации антигена вируса ящура при инокуляции перевиваемой монослойной клеточной линии из почки свиньи IB-RS-2 в соответствии с требованиями МЭБ (OIE) [2].
После подтверждения полноты инактивации антигена вируса ящура определяли концентрации 146S и 146S+75S иммуногенных компонентов вируса ящура в инактивированной суспензии с помощью реакции связывания комплемента (РСК), которую проводили в соответствии с требованиями МЭБ (OIE) [2, 16]. Осуществляли пересчет концентрации иммуногенных компонентов с 1 млн клеток.
Результаты определения концентрации 146S и 146S+75S компонентов вируса ящура штамма А/Забайкальский/2013 отражены в таблице 11, из которой следует, что количества 146S частиц в неинактивированной суспензии, полученных с помощью предложенного способа, больше по сравнению с прототипом и наиболее близким прототипом на 23-27 и 34-37%, соответственно. Концентрации 146S частиц в инактивированной суспензии, полученных с помощью предложенного способа, больше по сравнению с прототипом и наиболее близким прототипом на 26-27 и 36-38%, соответственно. Накопления 146S+75S частиц в неинактивированной суспензии, полученных с помощью предложенного способа, больше по сравнению с прототипом и наиболее близким прототипом на 15-18 и 14-15%, соответственно. Концентрации 146S+75S иммуногенных компонентов в инактивированной суспензии, полученных с помощью предложенного способа, больше по сравнению с прототипом и наиболее близким прототипом на 15-16 и 13-15%, соответственно. Иными словами, предложенный способ позволяет значительно увеличить накопление 146S и 146S+75S иммуногенных частиц вируса ящура штамма А/Забайкальский/2013 по сравнению с прототипными вариантами.
Таким образом, предложенный способ по сравнению с прототипами позволяет увеличить накопление 146S и 146S+75S иммуногенных компонентов вируса ящура типа А в неинактивированных и инактивированных суспензиях.
Пример 4. Получение иммуногенных компонентов культурального вируса ящура штамма О/Саудовская Аравия/2008 с применением перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21 /SUSP/ARRIАН, адаптированной к выращиванию в бессывороточной среде «Cellvento™ ВНК-200» («Merck»).
50
В полученных клетках, адаптированных к выращиванию в бессывороточной среде «Cellvento™ ВНК-200» («Merck), проводили репродукцию вируса ящура штамма О/Саудовская Аравия/08 в биореакторах объемом 40 л. Доза заражения вирусом составляла 0,05 ТЦД/клетка. Культивирование вируса проводили в бессывороточной среде «Cellvento™ ВНК-200» («Merck») при рН 7,5-7,6. Водородный показатель регулировали с помощью 7,5%-ого раствора гидрокарбоната натрия. Цитопатическое действие оценивали по количеству клеток, подвергнутых специфическому разрушению. Исследование проводили в трех повторениях. Культивирование осуществляли до 95% ЦПД. В качестве контроля использовали клетки линии ВНК-21 /SUSP/ARRIAH, выращенные в улучшенной среде, состав которой представлен в таблице 1 (прототип), а также в бессывороточной среде CN102115729 (2011 г. ) (наиболее близкий прототип). Из данных таблицы 12 следует, что время репродукции вируса ящура для предложенного способа составило 10,0-10,5 ч, для двух прототипов - 11,5-12,0 ч.
После культивирования вируса ящура в ОТ-ПЦР подтверждали штаммоспецифичность [2]. В результате исследования в суспензии подтверждено наличие только вируса ящура штамма О/Саудовская Аравия/08.
В обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ОТ-ПЦР-РВ) и в РСК исследовали полученные суспензии вируса ящура и определяли концентрацию 146S иммуногенного компонента [15].
Проводили процесс инактивации антигена вируса ящура. В качестве инактиванта первого порядка использовали 1,2-аминоэтилэтиленимин (АЭЭИ) в концентрации 0,025-0,050%. Инактивацию осуществляли в течение 12 ч.
Оценивали полноту процесса инактивации антигена вируса ящура при инокуляции перевиваемой монослойной клеточной линии IB-RS-2 в соответствии с требованиями МЭБ (OIE) [2].
После подтверждения полноты инактивации антигена вируса ящура определяли концентрации 146S и 146S+75S иммуногенных компонентов вируса ящура в инактивированной суспензии с помощью реакции связывания комплемента (РСК), которую проводили в соответствии с требованиями МЭБ (OIE) [2, 16]. Осуществляли пересчет концентрации иммуногенных компонентов с 1 млн клеток.
Результаты определения концентрации 146S и 146S+75S компонентов вируса ящура штамма О/Саудовская Аравия/2008 отражены в таблице 12, из которой следует, что количества 146S частиц в неинактивированной суспензии, полученных с помощью предложенного способа, больше по сравнению с прототипом и наиболее близким прототипом на 13-16 и 17-18%, соответственно. Концентрации 146S частиц в инактивированной суспензии, полученных с помощью предложенного способа, больше по сравнению с прототипом и наиболее близким прототипом на 15-16 и 17-18%, соответственно. Накопления 146S+75S частиц в неинактивированной суспензии, полученных с помощью предложенного способа, больше по сравнению с прототипом и наиболее близким прототипом на 13-19 и 5-7%, соответственно. Концентрации 146S+75S компонента в инактивированной суспензии, полученного с помощью предложенного способа, больше по сравнению с прототипом и наиболее близким прототипом на 16-20 и 6%, соответственно. Иными словами, предложенный способ позволил значительно увеличить накопление полных 146S и 146S+75S иммуногенных частиц вируса ящура штамма О/Саудовская Аравия/2008 по сравнению с прототипными вариантами.
Таким образом, предложенный способ по сравнению с прототипами позволил увеличить накопление 146S и 146S+75S иммуногенных компонентов вируса ящура типа О в неинактивированных и инактивированных суспензиях.
Пример 5. Получение иммуногенных компонентов культурального вируса ящура штамма Азия-1/Таджикистан/2011 с применением перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, адаптированной к выращиванию в бессывороточной среде «Cellvento™ ВНК-200» («Merck»).
В полученных клетках, адаптированных к выращиванию в бессывороточной среде «Cellvento™ ВНК-200» («Merck), проводили репродукцию вируса ящура штамма Азия-1/Таджикистан/2011 в биореакторах объемом 40 л. Доза заражения вирусом составляла 0,05 ТЦД5о/клетка. Культивирование вируса проводили в бессывороточной среде «Cellvento™ ВНК-200» («Merck») при рН 7,5-7,6. Водородный показатель регулировали с помощью 7,5%-ого раствора гидрокарбоната натрия. Цитопатическое действие оценивали по количеству клеток, подвергнутых специфическому разрушению. Исследование проводили в трех повторениях. Культивирование осуществляли до 95% ЦПД. В качестве контроля использовали клетки линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, выращенные в улучшенной среде, состав которой представлен в таблице 1 (прототип), а также в бессывороточной среде CN102115729 (2011 г.) (наиболее близкий прототип). Из данных таблицы 14 следует, что время репродукции вируса ящура для предложенного способа составило 9,5-10,0 ч, для двух прототипов -11,0-12,0 ч.
После культивирования вируса ящура в ОТ-ПЦР подтверждали штаммоспецифичность [2]. В результате исследования в суспензии было обнаружено наличие только вируса ящура штамма Азия-1/Таджикистан/2011.
В обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ОТ-ПЦР-РВ) и в РСК исследовали полученные суспензии вируса ящура и определяли концентрацию 146S иммуногенного компонента [15].
Проводят процесс инактивации антигена вируса ящура. В качестве инактиванта первого порядка использовали 1,2-аминоэтилэтиленимин (АЭЭИ) в концентрации 0,025-0,050%. Инактивацию осуществляли в течение 12 ч. Оценивали полноту процесса инактивации антигена вируса ящура при инокуляции перевиваемой монослоной клеточной линии IB-RS-2 в соответствии с требованиями МЭБ (OIE) [2].
После подтверждения полноты инактивации антигена вируса ящура определяли концентрации 146S и 146S+75S иммуногенных компонентов вируса ящура в инактивированной суспензии с помощью реакции связывания комплемента (РСК), которую проводили в соответствии с требованиями МЭБ (OIE) [2, 16]. Осуществляли пересчет концентрации иммуногенных компонентов с 1 млн клеток.
Результаты определения концентрации 146S и 146S+75S компонентов вируса ящура штамма Азия-1/Таджикистан/2011 отражены в таблице 14, из которой следует, что количества 146S частиц в неинактивированной суспензии, полученных с помощью предложенного способа, больше по сравнению с прототипом и наиболее близким прототипом на 14-15 и 11-14%, соответственно. Концентрации 146S частиц в инактивированной суспензии, полученных с помощью предложенного способа, больше по сравнению с прототипом и наиболее близким прототипом на 13-14% для каждого. Накопления 146S+75S частиц в неинактивированной суспензии, полученных с помощью предложенного способа, больше по сравнению с прототипом и наиболее близким прототипом на 18-19 и 15-18%, соответственно. Концентрации 146S+75S компонентов в инактивированной суспензии, полученных с помощью предложенного способа, больше по сравнению с прототипом и наиболее близким прототипом на 17-18 и 16-18%, соответственно. Иными словами, предложенный способ позволяет значительно увеличить накопление 146S и 146S+75S иммуногенных частиц вируса ящура штамма Азия-1/Таджикистан/2011 по сравнению с прототипными вариантами.
Таким образом, предложенный способ по сравнению с прототипами позволяет увеличить накопление 146S и 146S+75S иммуногенных компонентов вируса ящура типа Азия-1 в неинактивированных и инактивированных суспензиях.
Пример 6. Изготовление и исследование противоящурной инактивированной эмульсионной вакцины против ящура из штамма А/Забайкальский/2013, получение иммуногенных компонентов которого проведено с применением перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21 /SUSP/ARRIAH, адаптированной к выращиванию в бессывороточной среде «Cellvento™ ВНК-200» («Merck»).
Проводили получение противоящурной инактивированной эмульсионной вакцины из штамма А/Забайкальский/2013. Для изготовления вакцинного препарата использовали инактивированный антиген вируса ящура штамма А/Забайкальский/2013 с концентрациями 146S и 146S+75S иммуногенных компонентов 0,75 и 0,86 мкг/мл с 1 млн клеток, соответственно, (пример 3, таблица 11). Компоненты были получены с применением перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, адаптированной к выращиванию в бессывороточной среде «Cellvento™ ВНК-200» («Merck»). Требованием для антигена при изготовлении противоящурной вакцины является концентрация 146S+75S иммуногенных компонентов не менее 3,0 мкг/мл. Номинальное 146S и 146S+75S количество компонентов составляло 3,38 и 3,87 мкг/мл и было получено с 4,5 млн клеток линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, адаптированной к выращиванию в бессывороточной среде «Cellvento™ ВНК-200» («Merck»). Иными словами, концентрирование проводить не требовалось.
В качестве масляного адъюванта применяли Montanide ISA-206 («Seppic») в количестве 500000,0-575000,0. Эмульсионную вакцину получали путем диспергирования на коллоидных мельницах концентрата антигена вируса ящура и масляного адъюванта Montanide ISA-206 VG в соотношении 50/50 по массе, соответственно.
Полученный вакцинный препарат исследовали на безвредность для подтверждения отсутствия инфекционности антигена. Вакцину разрушали и отделяли антиген, которым инокулировали перевиваемую монослойную клеточную линию из почки свиньи IB-RS-2. Выявили, что по итогам 3 последовательных пассажей в культуре клеток IB-RS-2 вирулентный вирус ящура не был выявлен, иными словами, препарат безвреден.
Проводили оценку стерильности с помощью высевов на твердые и жидкие питательные среды. При использовали соево-казеинового агара (СКА), соево-казеинового бульона (СКБ), тиогликолевой среды (ТГС) подтвердили стерильность вакцинного препарата.
Методом твердофазного иммуноферментного анализа (ТФ ИФА) [17, 18] оценивали отсутствие неструктурных белков вируса ящура в конечном продукте. Вакцину разрушали на отдельные компоненты и в ИФА исследовали антиген. Результаты исследования представлены в таблице 13, из которой следует, что средняя оптическая плотность 1,020±0,006, процент ингибиции (PI) 29,143±0,423% (Р1<50%). Иными словами, было доказано полное отсутствие неструктурных белков вируса ящура в полученной противоящурной эмульсионной вакцине.
Для тестирования вакцины на безвредность 5 головам КРС внутримышечно в область верхней трети шеи в дозе 6,0 см (трехкратная доза) вводили препарат и наблюдали за клиническим состоянием животных в течение 6 суток. Вакцина была признана безвредной, поскольку все животные по итогам наблюдения оставались клинически здоровыми, и на месте введения препарата не происходило некроза тканей.
3
2
Иммуногенность вакцины исследовали на 17 головах КРС количественным методом с контрольным заражением против гомологичного штамма А/Забайкальский/2013 (генетическая линия A/ASIA/Sea-97) вируса ящура. Для вакцинации животных готовили 3 образца: 1) противоящурную эмульсионную вакцину из штамма А/Забайкальский/2013 вируса ящура без разведения; 2) вакцину, разбавленную «Плацебо» в соотношении 1:4; 3) вакцину, разбавленную «Плацебо» в соотношении 1:16. Приготовленные образцы вводили внутримышечно в верхнюю треть шеи в дозе 2,0 см. КРС с порядковыми номерами с 1 по 5 инокулировали вакциной без разведения, животным с номерами с 6 по 10 вводили вакцину, разведенную 1:4, животным с номерами с 11 по 15 - вакцину, разведенную 1:16, животных с номера 16 и 17 - не иммунизировали (контроль). Спустя 21 сутки после иммунизации от вакцинированных животных отбирали кровь и полученные сыворотки анализировали в РМН с целью определения уровня вируснейтрализующих антител (ВНА). Результаты исследования отражены в таблице 15, из которой следует, что при введении цельной дозы вакцины, а также в разведениях  и 1/16 средний титр антител составил 5,34±0,11; 4,04±0,07 и 3,20±0,04 log, соответственно.
4,0
3
50
Затем КРС заражали гомологичным штаммом А/Забайкальский/2013 в слизистую оболочку языка в дозе 10 ИД/0,20 см (в две точки по 0,10±0,05 см). В течение 7 суток после заражения за животными вели наблюдение и ежедневно измеряли температуру. Через 7 суток после заражения всех животных подвергли эвтаназии и проводили патологоанатомический осмотр. Защищенными от ящура считали животных, у которых на конечностях отсутствовали поражения, характерные для ящура. По результатам исследования (таблица 15) ни у одного из 15 вакцинированных животных не было выявлено генерализованных признаков ящура. Первичные афты не учитывали.
50
50
3
Иммуногенная доза (ИМД50) вакцины, которую определяли по общепринятой методике Рида и Менча, в модификации И.П. Ашмарина [20], составила 0,04. Количество протективных доз (PD), которое вычисляли путем деления прививной дозы (2,0 см) на ИмД, составило 50. Иными словами, вакцинный препарат обладал высокой иммуногенностью и на 100% защищал животных от заражения гомологичным штаммом вируса ящура.
Таким образом, противоящурная эмульсионная вакцина, изготовленная из антигена вируса ящура штамма А/Забайкальский/2013, который получен с применением предложенного способа получения иммуногенных компонентов культурального вируса ящура с применением бессывороточной среды «Cellvento™ ВНК-200», является безвредной, стерильной, свободной от неструктурных белков, высокоиммуногенной и обеспечивает 100% защиту от заражения гомологичным штаммом вируса ящура.
Основным преимуществом предлагаемого изобретения является применение бессывороточной среды «Cellvento™ ВНК-200» («Merck») для адаптации клеток перевиваемой суспензионной линии ВНК-21/ARRIAH/SUSP к выращиванию в данной среде без наличия продуктов животного происхождения, для культивирования клеток линии ВНК-21 /ARRIAH/SUSP с целью получения клеток большего размера и с большей концентрацией. В предлагаемом изобретении подразумевается применение клеток линии ВНК-21/ARRIAH/SUSP, адаптированных к выращиванию в бессывороточной среде «Cellvento™ ВНК-200» («Merck»), для репродукции вируса ящура типов А, О, Азия-1 с целью повышения количеств 146S и 146S+75S иммуногенных компонентов с 1 млн клеток для производства безопасной, очищенной, высокоиммуногенной вакцины с высокими протективными свойствами.
Предлагаемое изобретение позволяет получать антиген вируса ящура типа А с концентрациями 146S и 146S+75S иммуногенных компонентов по сравнению с прототипами большими на 23-38 и 13-18%, соответственно. Предлагаемое изобретение позволяет получать антиген вируса ящура типа О с концентрациями 146S и 146S+75S иммуногенных компонентов по сравнению с прототипами большими на 15-18 и 5-20%, соответственно. Предлагаемое изобретение позволяет получать антиген вируса ящура типа Азия-1 с концентрациями 146S и 146S+75S иммуногенных компонентов по сравнению с прототипами большими на 11-15 и 15-19%, соответственно.
Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Способ получения иммуногенных компонентов культурального вируса ящура типов А, О, Азия-1 с применением бессывороточной среды «Cellvento™ ВНК-200» для изготовления противоящурных вакцин»:
1. Пономарев А.П., Узюмов В.Л., Груздев К.Н. Вирус ящура: структура, биологические и физико-химические свойства. - Владимир: Фолиант, 2006. - 250 с.
2. OIE. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. 7th ed. Paris, 2017.
3. Способ определения концентрации 146S компонента вируса ящура в сырье для вакцины с применением метода ОТ-ПЦР-РВ / М.И. Доронин, A.M. Тимина, Д.А. Лозовой, В.А. Стариков, Д.В. Михалишин, Н.Н. Медведева, А.В. Борисов // Ветеринария сегодня. - 2018. - №2. - С.26-35.
4. Влияние изменений аминокислотного состава гидролизата белков крови на продуктивность клеточной линии ВНК-21/2-17 и количество иммуногенных компонентов вируса ящура / М.А. Шевченко, М.Н. Гусева, Д.А. Лозовой, М.И. Доронин [и др.] // Ветеринария сегодня. - 2018. - №1. - С.55-59.
5. Фрешни Р.Я. Культура животных клеток. Практическое руководство. - М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2011. - 691 с.
6. Патент РФ №2699671, 09.09.2019. Вакцина для ранней защиты против ящура типа О инактивированная эмульсионная // Заявка №2019116929. 31.05.2019. Бюл. №25 / Стариков В.А., Лозовой Д.А., Доронин М.И. [и др.].
7. Патент РФ №2681815, 12.03.2019. Вакцина инактивированная сорбированная против ящура типа А // Заявка №2017145756. 2017. Бюл. №8 / Лозовой Д.А., Стариков В.А., Доронин М.И. [и др.].
8. Патент РФ №2682876, 22.03.2019. Вакцина инактивированная эмульсионная против ящура типа О // Заявка №2017144458. 18.12. 2017. Бюл. №9 / Лозовой Д.А., Михалишин Д.В., Доронин М.И. [и др.].
9. Трошкова Г.П. Бессывороточная питательная среда для культивирования клеток VERO / Г.П. Трошкова, Л.Д Мартыней, Е.В. Кирова [и др.] // - Фундаментальные исследования. - 2005. - №5 - С.94-94.
10. Шаманская Т.В. Культивирование мезенхимальных стволовых клеток EX VIVO в различных питательных средах (обзор литературы и собственный опыт) / Т.В. Шаманская, Е.Ю. Осипова, Б.Б. Пурбуева [и др.] // Онкогематология. - 2010. - №3. - С.65-71.
11. Патент US №4049494 (А), 04.09.1975. Vaccine production process // L. David Tomei, Buffalo N.Y.
12. Патент JPH №09154571 (A), 17.06.1997. Бессывороточная среда для производства антигенов вирусов. // Motono Mitsuri, Yamamoto Ryohei, Takase Kozo, Miyahra Tokuji.
13. Патент CN №102115729, 06.07.2011. Способ получения вакцины с применением среды без сыворотки крови животных // Ren Zhang, Wenqing Chen, Jlanchao Wang.
14. Патент CN №103374547, 30.10.2013. Способ получения очищенной вакцины против ящура с применением бессывороточных сред // Zhang Shu, L.V. Hongliang.
15. Патент РФ №2619878/13, 18.05.2017. Способ определения концентрации 1468-компонента вируса ящура в вируссодержащем сырье для вакцины с применением метода обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции в режиме реального времени // Патент России №2016140460/15. 2017. Бюл. №14 / Лозовой Д.А., Михалишин Д.В., Доронин М.И. [и др.].
16. Бондаренко А.Ф. Качественный и количественный иммунохимический анализ вирусных белков. - Суздаль, 1994. - 92 с.
17. Эпизоотологические особенности ящура типа А, вызванного гетерологичными штаммами вируса / А. В. Мищенко, В.А. Мищенко, В.В. Дрыгин [и др.] // Ветеринария. - 2014. - №11. - С.20-24.
18. Comparative evaluation of non-structural protein-antibody detecting ELISAs for foot-and-mouth disease sero-surveillance under intensive vaccination/G.K. Sharma, J.K. Mohapatra, S. Mahajan [et al] // J. Virol. Methods. - 2014. - V. 207. - P. 22-28.
19. Официальный сайт The FAO World Reference Laboratory for Foot-and-Mouth Disease - URL:http://www.fao.org/fileadmin/user_upload/eufmd/Pirbright_reports/JM20170IE-FAO_FMD_Ref_Lab_Report_January-March_2017.pdf (дата обращения 20.12.2019).
20. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. - Л.: Медицина, 1962. - 179 с.