Исследование цитотоксичности молочнокислых и пропионовокислых бактерий в тесте in vitro

7. Dorozhkin, V.I. Printsipy toksikologicheskoy otsenki novykh lekarstvennykh sredstv [Principles of toxicological evaluation of new drugs] / V.I.Dorozhkin, D.N.Urazayev //Veterinarnaya meditsina. - 2006. - № 1. - P. 26-27.

8.Zakomyrdin,A.A. EkonomicheskoyeobosnovaniyekprimeneniyuustanovokSTELdlyasintezadezinfitsiruyushchikh rastvorov vzhivotno-vodstve [Economical substantiation of using installments STELfor synthesis of disinfecting solutions in livestock.] /A.A.Zakomyrdin //Veterinarnaya patologiya. - 2009. - № 1(28). - P. 43-46.

9. Vliyaniye virotsida na kachestvo myasa i produktov uboya krolikov [Influence of Virotsid on meat quality and slaughter products of rabbits.] / I.I.Kochish, S.L.Smirnov, M.A.Gerasimov, A.N. Semikrasova//Veterinariya. - 2015. -№5.-P. 55-57.

10. Vliyaniye novogo dezinfitsiruyushchego sredstva na organizm laboratornykh zhivotnykh pri ingalyatsionnom primenenii [Influence of a new disinfectant on the body of laboratory animals when Inhalation use ] / AlMlroshnikova, V.V.Mikhaylenko, I.V.Kireev [et al.] //Veterinarny vrach. - 2016. - № 1. - P. 50-55.

11. Popov, N.I. Dezinfektsiya bakteritsidnymi penami pri tuberkuleze [Disinfection by bactericidal foams in tuberculosis] / N.I.Popov, P.V.Chesnokova//Veterinarnaya patologiya. - 2007. - № 3(22). - P. 231-235.

12. Smirnov, A.M. Zashchita selskokhozyaystvennykh zhivotnykh ot bolezney - vazhnyy faktor povysheniya effektivnosti zhivotnovodstva [Farm animals protection against diseases - an important factor of increasing of the livestock efficiency] /A.M. Smirnov//Veterinariya i kormleniye. - 2012. - № 3. - P. 4-12.

13. Ugryumova, V.S. Effektivnost dezinfitsiruyushchego sredstva Natopen v broylernom proizvodstve ptitsevodstva [Efficacy of the disinfectant Natopen in broiler production of poultryfarming]/V.S.Ugryumova, R.Kh.Ravilov//Veterinariya. -2012,- №6. -P. 15-17.

14. Khudyakov, A.A. Elfektivnaya dezinfektsiya i podbor dezinfektanta [Effective disinfection and the choice of disinfectant] /A.A.Khudyakov//Veterinariya. - 2010. - № 2. - P. 18-22.

15. Shestopalov, N.V. Dezinfektologiya kak molekulyarno-epidemiologicheskoye napravlenlye borby s infektsiyami [Disinfectology as a molecular-epidemiologic trend of the infectious control] / N.V.Shestopalov, M.G.Shandala //Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunologii. - 2014. - № 1. - P. 66-70.

УДК: 619:615:579:576.3

ИССЛЕДОВАНИЕ ЦИТОТОКСИЧНОСТИ МОЛОЧНОКИСЛЫХ и ПРОПИОНОВОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ В ТЕСТЕ IN VITRO

Рин.С. Мухаммадиев-кандидат биологических наук, н.с.;Риш.С. Мухаммадиев-мл.н.с.;

Е.В. Скворцов - кандидат биологических наук, ст.н.с.; И.И.Идиятов - кандидат биологических наук,

ст.н.с.; Л.Р.Валиуллин - кандидат биологических наук, зав сектором.

ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности», г. Казань (420075, г.Казань, Научный городок-2, тел. +7(843) 239-53-20, e-mail: vnM@mail.ru).

Доклинические исследования лечебных препаратов на основе биологически активных веществ, изготовленных биотехнологическими способами, определяются требованиями к существующим препаратам, полученным по новой технологии и должны базироваться на изучении безопасности на адекватных in vivo и in vitro моделях. Проведено исследование цитотоксичности in vitro молочнокислых и пропионовокислых бактерий на клеточных линиях эпителия легкого эмбриона крупного рогатого скота (LEK), фибробластов кожи (HSF) и почек эмбриона человека (НЕК-293). В качестве молочнокислых и пропионовокислых бактерий использовали штаммы Lactobacillus saiivarus, Lactobacillus plantarum, Enterococcus faecium, Lactococcus lactis и Propionibacterium freudenreichii. Цитотоксический эффект штаммов молочнокислых и пропионовокислых бактерий определяли по выживаемости культур клеток методами МТТ-теста и окрашивания трипановым синим. Совместная инкубация штаммов молочнокислых и пропионовокислых бактерий в диапазоне концентрации общего белка 0,25-1050 мкг/ мл с клетками эпителия легкого эмбриона крупного рогатого скота LEK, фибробластов кожи HSF и почек эмбриона человека НЕК-293 не приводило к подавлению роста клеток исследуемых культур. Морфология клеток эпителия легкого эмбриона крупного рогатого скота, фибробластов кожи и почек эмбриона человека после совместной инкубации со штаммами молочнокислых и пропионовокислых бактерий существенно не отличалась от морфологии контрольных клеток. Полученные данные методами МТТ-теста, окрашивания трипановым синим подтверждаются результатами морфологии клеток, полученные световой микроскопией и указывают на безопасность штаммов молочнокислых и пропионовокислых бактерий и возможность их дальнейшего применения в качестве пробиотиков в ветеринарии и медицине.

VETERINARY PHARMACOLOGY WITH TOXICOLOGY

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: пробитики, молочнокислые, пропионовокислые бактерии, культура клеток, морфология, выживаемость, цитотоксичность.

DOI: 10.33632/1998-698Х.2019-4-17-21

Молочнокислые и пропионовокислые бактерии являются важными компонентами коммен-сальной микрофлоры людей, животных и в зависимости от штамма микроорганизмов используются в качестве пробиотиков [1]. Пробиотики, согласно определению, введенному экспертами Всемирной организации по продовольствию ООН (ВОП) и Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) - «живые штаммы строго отобранных микроорганизмов, которые при назначении в достаточных количествах оказывают благоприятное действие на здоровье хозяина» [2]. Живые микроорганизмы и вещества, содержащие в пробиотиках, оказывают положительное действие на физиологические, иммунные и биохимические реакции организма хозяина за счет стабилизации и оптимизации функции его нормальной микробиоты и обменных процессов. Многие пробиотические бактериальные штаммы и их метаболиты полезны для здоровья организма хозяев при расстройствах желудочно-кишечного тракта [3], воспалительных заболеваний кишечника [4], а также для профилактики аллергических реакций [5]. Недавние исследования показали, что пероральное введение видов Lactobacillus sp. эффективно при защите от вирусной инфекции [6]. Некоторые пробиотики усиливают клеточную цитотоксическую активность в отношении опухолевых и инфицированных вирусом клеток, препятствуя развитию злокачественных опухолей [7] и инфекционных заболеваний [8]. Кроме того, пробиотики способны секретировать антимикробные вещества, пептиды и белки, которые обеспечивают защиту от патогенов, подавляя действие продуцируемых ими специфических токсинов.

В настоящее время исследовано значительное количество микроорганизмов, которые широко используются в ветеринарной и медицинской практике в составе пробиотических препаратов. Согласно ВОЗ, ВОП и ЕАБП (Европейского агентства по безопасности продовольствия), выбор пробиотических микроорганизмов должен основываться на критериях, как эффективность и безопасность [2]: сохранение стабильности, жизнеспособности, отсутствие токсичности и патогенных эффектов.

Целью настоящей работы было исследование цито-токсичности in vitro молочнокислых и пропионовокислых бактерий на линиях клеток млекопитающих и человека.

Материалы и методы. В работе использовали штаммы молочнокислых и пропионовокислых бактерий музея культур микроорганизмов Федерального центра токсикологической, радиационной и биологической безопасности (ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ»), Клеточные линии эпителия легкого эмбриона крупного рогатого скота (LEK), фибробластов кожи (HSF) и почек эмбриона человека (НЕК-293) были предоставлены

из коллекции культур клеток Научно-образовательно-го центра фармацевтики Казанского (Приволжского) федерального университета и Всероссийского научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии (г. Москва).

Культивирование штаммов молочнокислых и пропионовокислых микроорганизмов проводили на средах для роста молочнокислых и пропионовокислых бактерии при температуре 30°С в течение 72 часов [9].

Получение метаболитов штаммов молочнокислых и пропионовокислых бактерий осуществляли путем отделения биомассы микроорганизмов от культу-ральной жидкости центрифугированием (10000 д, 4°С, 20 мин) с последующим фильтрованием полученного супернатанта через стерильные мембранные насадки Millex (d 3 Змм, d пор 0,45 мкм, полиэтилсульфон, Millipore). Получение бесклеточных экстрактов проводили по методу Shuang с соаворами [10].

Определение цитотоксического эффекта молочнокислых и пропионовокислых бактерий проводили по выживаемости культуры клеток общепринятыми методами: МТТ - теста и окрашивания трипановым синим [11 ].

Культивирование клеточных линий, цитотоксичность штаммов молочнокислых и пропионовокислых бактерий методом МТТ-теста осуществляли, как описано ранее [12].

Для определения количества живых и мертвых клеток методом окрашивания трипановым синим вносили равные объемы суспензий клеток и 0,4% раствора красителя в фосфатно-солевом буфере. Полученную смесь инкубировали в течение 10 минут, при температуре 37°С. Подсчет процента окрашенных клеток проводили в камере Горяева оптическим микроскопом Zeiss Axio Vert.AI. Расчет жизнеспособности клеток осуществляли по формуле: V=(a-b)x100%/a, где: а - общее количество клеток;

b - количество мертвых клеток.

Цитотоксичность на клетках в условиях in vitro выражали через параметр IC^,, наименьшая концентрация общего белка экстракта или культуральной жидкости, вызывающая 50% ингибирование роста и развития популяции клеток изучаемой культуры.

Содержание общего белка в бесклеточных экстрактах и культуральной жидкости определяли спек-трофотометрическим методом [13].

Изучение морфологии культур клеток после их инкубации со штаммами пробиотиков и их метаболитов осуществляли с использованием микроскопа Nikon Eclipse TS 100 (Япония) и программного обеспечения Scope Photo 3.0.

Статистическую обработку результатов производили программой Microsoft Office Excel 2013. Определе-

ние значения 1С50 проводили на основе дозозависимых кривых с применением программы Origin™. Контролем являлись клетки, выдержанные без добавления экстракта или культуральной жидкости бактерий.

Результаты исследований. В наших исследованиях цитотоксическое действие молочнокислых и пропионовокислых бактерий определяли на клетках эпителия легкого эмбриона крупного рогатого скота LEK, фибробластов кожи HSF и почек эмбриона человека НЕК-293 общепринятыми методами МТТ-теста и окрашивания трипановым синим. Для получения метаболитов и бесклеточных экстрактов, в работе использовали штаммы молочнокислых (Lactobacillus

salivarus, Lactobacillus plantarum, Enterococcus faecium, Lactococcus lactis) и пропионовокислых бактерий (Propionibacterium freudenreichii).

Действие штаммов молочнокислых и пропионовокислых бактерий на клетки определяли через 72 ч совместной инкубации. Концентрация общего белка экстракта или культуральной жидкости в реакционных смесях составляла 0,25-1050 мкг/мл. Результаты определения цитотоксичности штаммов молочнокислых и пропионовокислых бактерий на клетках эпи-телиях легкого эмбриона крупного рогатого скота, фибробластов кожи и почек эмбриона человека представлены в таблице и рисунке.

Таблица

Величина 1С50 штаммов молочнокислых и пропионовокислых бактерий в отношении линий клеток эпителия легкого эмбриона крупного рогатого скота

Вещества, IC^,, мкг/мл LEK HSF HEK-293

Молочнокислые

Lactobacillus salivarus >1050 >1050 >1050

Lactobacillus plantarum >1050 >1050 >1050

Enterococcus faecium >1050 >1050 >1050

Lactococcus lactis >1050 >1050 >1050

Пропионовокислые

Propionibacterium freudenreichii >1050 >1050 >1050

v.

Рис. Действие метаболитов молочнокислых и пропионовокислых бактерий на клетки почек эмбриона человека НЕК-293. Слева направо: контроль; метаболиты Lactobacillus plantarum 1050 мкг/мл; метаболиты Propionibacterium freudenreichii 1050 мкг/мл. Ув. х400.

Как видно из рисунка, клетки имели свойственные размеры и форму; потери контактов между клетками, деградации клеточных мембран и образования неоформленных клеточных агрегатов и фрагментов (апоптозныхтел), дебриса обнаружено не было. Клетки эпителия легкого эмбриона крупного рогатого скота, фибробластов кожи и почек эмбриона человека по структуре монослоя были представлены клетками эпи-телиоподобного типа.

Заключение. Исследование цитотоксическо-го действия штаммов молочнокислых и пропионовокислых бактерий методами МТТ-теста и окраски

трипановым синим показало, что их экстракты в диапазоне концентрации общего белка 0,25-1050 мкг/мл не проявляют токсического эффекта в отношении клеток эпителия легкого эмбриона крупного рогатого скота ЬЕК, фибробластов кожи НБР и почек эмбриона НЕК-293 человека. Отсутствие цитотоксичности наблюдалось и при совместной инкубации клеток с метаболитами культуральной жидкости исследуемых микроорганизмов. Полученные результаты методами МТТ-теста и окрашивания трипановым синим подтверждаются данными морфологии клеток, полученные световой микроскопией.

VETERINARY PHARMACOLOGY WITH TOXICOLOGY

Литература

1. Панин, A.H. Пробиотики - неотъемлемый компонент рационального кормления животных /А.Н.Панин, Н.И. Малик// Ветеринария. - 2006. - №7. - С. 19-22.

2. Современные бактериологические препараты: влияние на микробиоту кишечника и роль в лечении заболеваний / К.В.Раскина, Е.Ю.Мартынова, И.Р.Фатхутдинов [и др.] // Русский медицинский журнал. - 2018. -№5 (2).-С. 86-91.

3. Thetherapeutic effect of probiotic bacteria on gastrointestinal diseases/J.Sarowska,I.Choroszy-Krol,B.Regulska-llow [et al.] //AdvClin Exp. - 2013. - Vol. 22 (5). - P. 759-766.

4. Reddy, V.S. Role of probiotics in short bowel syndrome in infants and children-asystematic review / V.S.Reddy, S.K.Patole, S.Rao// Nutrients. - 2013. - Vol. 5 (3). - P. 679-699.

5. Probiotic therapy as a novel approach for allergic disease/Z.Q.Toh, A.Anzela, M.LTang [et al.] // Front Pharmacol. -2012.-Vol.3.-P. 1-14.

6. Oral administration of Lactobacillus plantarum strain AYA enhances IgA secretion and provides survival protection against influenza virus infection in mice. YKikuchi, A.Kunitoh-Asari, K.Hayakawa [et al.] // PLoS. - 2014. - Vol. 9(1).-P. 1-9.

7. Takeda, K. Effects of a fermented milk drink containing Lactobacillus casei strain Shirota on the human NK-cell activity/KTakeda, K.Okumura //J Nutr. - 2007. - Vol. 137 (3 Suppl 2). - P. 791-793.

8. Effects of Bifidobacterium longum BB536 administration on influenza infection, influenza vaccine antibody titer, and cell-mediated immunity in the elderly / K.Namba, M.Hatano, TYaeshima [et al.] // Biosci Biotechnol Biochem. -2010.-Vol. 74 (5).-P. 939-945.

9. Нетрусов, А.И. Практикум по микробиологии / А.И Нетрусов. - М: Академия, 2005. - 608 с.

10. Isolation, identification, and evaluation of new lactic acid bacteria strains with both cellular antioxidant and bile salt hydrolase activities in vitro //X.Shuang [et al.] / Journal of Food Protection. - 2016. - Vol. 79. - P. 1919-1928.

11. Mather, J.P. Introduction to cell and tissue culture. Theory and technique / J.P.Mather, P.E.Roberts. - New York: Plenum Press, 1998.-194 p.

12. Изучение избирательной чувствительности культур клеток in vitro к действию Т-2 токсина / Р.С.Мухамма-диев, Р.С.Мухаммадиев, В.В.Бирюля [и др.] // Ветеринарный врач. - 2018. - № 5. - С. 24-27.

13. Семак, И.В. Биохимия белков: методическое пособие по спец. практикуму для студентов биологического факультета/ И.В.Семак, Т.Н.Зырянова, О.И.Губич. - Минск: БГУ. - 2007. - 52 с.

STUDY OF THE IN VITRO CYTOTOXICITY TESTING OF LACTIC AND PROPIONIC ACID BACTERIA

MukhammadievRin.S. - Candidate of Biological Sciences; MukhammadievRish.S. - Candidate of Biological Sciences; Birulya V.V. - Candidate of Biological Sciences; SkvortsovE.V. - Candidate of Biological Sciences;

Idiyatovl.l. - Candidate of Biological Sciences; Valiullin L.R. - Candidate of Biological Sciences.

Federal Center for Toxicological, Radiation and Biological Safety, Kazan (e-mail: mm@mail.ru).

Preclinical study involving new drugs based on biologically active substances produced by using biotechnological methods are determined by the requirements for existing drugs obtained by the new technology and should be based on safety studies on adequate in vivo and in vitro models. A study was made concerning the cytotoxicity in vitro of lactic and propionic acid bacteria against embryonic cow embryo lung epithelial cell lines (LEK), human skin fibroblast (HSF), and human embryo kidney (HEK-293). Strains Lactobacillus salivarus, Lactobacillus plantarum, Enterococcus faecium, Lactococcus lactis and Propionibacterium freudenreichii were used as lactic acid and propionic acid bacteria. The cytotoxic effect of lactic and propionic acid bacteria was determined by survival of cell cultures using the standard MTT assay and staining cells with trypan blue. The combined incubation of lactic and propionic acid bacteria at concentrations of total protein of 0,25-1050 iig/ml with against HEK-293 human embryonic kidney, HSF human skin fibroblast and LEK cow embryo lung epithelial cell lines did not lead to suppression of cell growth in culture. The morphology of cell cultures after their combined incubation with lactic and propionic acid bacteria was not significantly different from the morphology of control cells. The data obtained by MTT assay and staining cells with trypan blue are confirmed by the results of cell morphology, obtained by light microscopy and indicate the safety of strains of lactic acid and propionic acid bacteria and the possibility of using these microorganisms as probiotics in veterinary medicine.

KEYWORDS: probiotics, lactic acid, propionic acid bacteria, cell culture, morphology, survival, cytotoxicity.