Сравнительная характеристика общего химического состава и активности протеаз северной Pandalus borealis, углохвостой Pandalus goniurus и антарктической Euphausia spp. креветок

2006

Известия ТИНРО

Том 147

УДК 664.951.014:639.281.2

А.А. Зюзьгина, А.П. Ярочкин

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ОБЩЕГО ХИМИЧЕСКОГО СОСТАВА И АКТИВНОСТИ ПРОТЕАЗ СЕВЕРНОЙ PANDALUS BOREALIS, УГЛОХВОСТОЙ PANDALUS GONIURUS И АНТАРКТИЧЕСКОЙ EUPHAUSIA SPP. КРЕВЕТОК

Исследован общий химический состав северной P. borealis и углохвостой P. goniurus креветок, определена активность комплекса протеолитических ферментов печени и их зависимость от рН среды и температуры. Показано, что у северной креветки наиболее активны кислые протеазы при температуре 50-60 0С, в то время как у углохвостой креветки — нейтральные и щелочные при 40 0С, а у криля — нейтральные и щелочные протеазы при 50-60 0С. Повышение температуры инкубации до 50-60 0С снижает активность ферментов углохвостой креветки в нейтральной и щелочной областях рН и активизирует кислые протеазы. Установлено, что увеличение температуры до 70-80 0С инактивирует протеазы креветок всего спектра рН.

Zyuz'gina A.A., Yarochkin A.P. Comparative characteristic of general chemical compound and proteases activity of northern shrimp Pandalus borealis, humpy shrimp Pandalus goniurus, and antarctic shrimp Euphausia spp. // Izv. TINRO. — 2006. — Vol. 147. — P. 354-360.

General chemical compound of northern shrimp P. borealis and humpy shrimp P. goniurus is investigated and activity of the proteolytic enzymes complex of pancreatic tissue is determined for various рН and thermal conditions. The northern shrimp has the most active acid proteases at 50-60 0С, while the proteases of humpy shrimp are the most active at neutral and alkaline conditions at 40 0С. These results are compared with the data for antarctic shrimp, which has the most active proteases at neutral and alkaline conditions at 50-60 0С. Rise of incubation temperature to 5060 0С reduces the activity of humpy shrimp enzymes in neutral and alkaline conditions and activates the acid proteases. The temperature rise up to 70-80 0С inactivates the shrimps proteases for the whole range of рН.

Перспективным направлением переработки морских гидробионтов, в том числе мелких видов креветок, является получение новых форм пищевой продукции (изоляты, гидролизаты и др.), ферментных препаратов и БАД (Kimoto et al., 1986; Новикова и др., 1989; Baek, Cadwallader, 1995; Пивненко, 1998; Simpson et al., 1998; Антарктический криль ..., 2001).

В настоящее время опубликовано большое количество работ, посвященных биологии, химическому составу и пищевой ценности некоторых видов мелкой креветки, в том числе антарктической (криля) Euphausia spp. (Yamagata, Low, 1995; Антарктический криль ..., 2001; Ярочкин, 2001; Giani et al., 2003). Исследования же самых массовых видов рода Pandalus: северной Pandalus borealis и еще более мелкой углохвостой Pandalus goniurus креветок, обитающих в Беринговом и Охотском морях, — ограничены главным образом их биологией. В насто-

ящее время промысел этих видов, вследствие трудностей с их реализацией из-за малого размера, практически не ведется (Иванов, 2001).

Исследование активности комплекса протеолитических ферментов креветок может иметь большое практическое значение как для первичной обработки сырья, так и для других целей, в том числе изготовления автолизатов из этих и других мелких креветок.

Целью настоящей работы явилось исследование общего химического состава северной и углохвостой креветок и определение влияния рН и температуры среды на активность комплекса протеаз в сравнении с крилем как хорошо исследованным представителем мелких креветок.

Объектом исследования служили северная P. borealis и углохвостая P. goni-urus креветки, выловленные в июле—августе 2005 г. в аяно-шантарском районе Охотского моря.

При проведении исследований целую (неразделанную) креветку измельчали на волчке с решеткой, имеющей диаметр отверстий 3 мм. Далее в работе использовали полученный фарш.

Общий химический состав креветки (массовая доля воды, азотсодержащих веществ), рН ткани определяли по общепринятым методикам (Лазаревский, 1955; ГОСТ 7636-85).

Экстракцию липидов проводили по методу Фолча смесью растворителей хлороформ — этанол (2 : 1 об/об) (Folch, Lees, 1957).

Определение доли депротеинизированного панциря в общей массе креветки проводили по методу, описанному в нормативной документации (ТУ 15-529-83).

Для определения протеолитической активности ферментного комплекса креветки использовали модифицированный метод Ансона (Полыгалина и др., 2003). Удельную активность пептидгидролаз выражали по приросту тирозина в миллиграммах на 1 г белка в час.

При проведении исследований протеазы из печени креветки экстрагировали соответствующим буферным раствором.

Ферментативную активность определяли при рН среды: в кислой — 3, слабокислой — 5, нейтральной — 7 и щелочной — 8. Для создания рН среды использовали следующие буферные растворы: для кислых с рН 3 и 5 — растворы, содержащие лимонную кислоту и фосфат натрия — Na2HPO4; для нейтральной с рН 7 и щелочной с рН 8 — фосфатные растворы (Досон и др., 1991). Инкубацию проб проводили при температурах 30, 40, 50, 60, 70 и 80 0С.

Статистическая обработка результатов экспериментов включала определение средних значений величин и стандартной средней ошибки. Достоверный интервал различий между средними величинами оценивали с помощью критерия Стьюдента (Дерффель, 1997). Статистическую обработку результатов, построение диаграмм, корреляционных кривых и калибровочных графиков проводили с помощью пакета программ "Microsoft Excel-2000".

Исследования криля М.С. Биденко с соавторами (1981а), В.М. Быковой с соавторами (Антарктический криль ..., 2001) и др. показали, что его химический состав и активность комплекса протеолитических ферментов зависят от сезона вылова, района промысла, стадии зрелости особей, условий нагула в вегетационный период и других факторов, поэтому в своей работе мы использовали литературные данные по крилю и сырье Pandalus spp. одной стадии зрелости. По данным биологических исследований, в летний период (июль—август) Pandalus spp. находятся на V стадии зрелости — икрометание (Иванов, 1964).

Выявлено более значительное различие химического состава исследованных видов креветок, принадлежащих к разным родам, чем видов одного рода. Так, северная креветка по сравнению с углохвостой содержит больше белка на 0,6 % и депротеинизированного панциря на 0,9 %. Различия химического со-

355

става северной и углохвостой креветок — рода пандалид, — по сравнению с крилем — рода эвфаузиид, — более значительны. Их ткань содержит на 1,23,1 % меньше белка и на 1,0-1,5 % больше минеральных веществ, содержание воды и липидов в тканях этих креветок сопоставимо с крилем, а содержание депротеинизированного панциря больше в 5-8 раз, что определяется в первую очередь размерами особей (табл. 1).

Таблица 1

Химический состав северной, углохвостой креветок и криля (% от массы ткани), среднее ± S

Table 1

Chemical compound of the northern, humpy and antarctic shrimps, (% of weight of the tissue), average ± S

Вид креветки Вода Доля депро-теинизиро-ванного панциря Белковые в-ва, N6  6,25 белк.. ' Липиды Минеральные в-ва

Северная креветка Углохвостая креветка Криль* 73,1±0,4 74,6±0,3 75,6-79,9 13,7±0,3 12,8±0,2 1,7-2,6 8,1±0,2 7,5±0,3 8,7-10,6 1,1±0,1 1,2±0,1 1,2-6,9 4,0±0,1 3,9±0,1 2,5-3,0

* Литературные данные (О работе ..., 1983; Антарктический криль ..., 2001).

Результаты исследования азотсодержащих веществ северной и углохвостой креветок (табл. 2) показали, что содержание небелковых азотсодержащих соединений в этих креветках сопоставимо с таковым криля и составляет 31,9-41,8 % общего содержания азотистых веществ. При этом на долю небелкового азотсодержащего компонента хитина приходится 42-58 % общего содержания небелкового азота в ткани исследованных креветок. В ткани антарктической креветки этот показатель составляет 18-21 % (О работе ..., 1982; Ярочкин, 2001).

Таблица 2

Содержание азотсодержащих веществ в северной, углохвостой креветках и криле, среднее ± S

Table 2

The content of nitrogencontaining substances in the northern, humpy and antarctic shrimps, average ± S

Вид креветки Nобщ, % мг/100 г N б от N б , % общ N . хитина . мг/100 г от N6, % общ

Северная креветка Углохвостая креветка Криль* Криль** 2,6 ± 0,1 2,2 ± 0,1 2,5 ± 0,1 2,3 837 ± 23 717 ± 17 710 ± 80 710 31,9 ± 0,9 41,8 ± 0,8 27,8 ± 0,9 30,9 487 ± 13 302 ± 6 130 ± 20 150 18,6 ± 5,0 17,6 ± 0,4 5,1 ± 0,8 6,5

* Литературные данные

Таким образом, доля панциря в северной и углохвостой креветках гораздо выше, чем в антарктической. Содержание воды, азотсодержащих веществ и липидов сопоставимо с их содержанием в ткани этих видов креветок.

При исследовании активности комплекса протеолитических ферментов из северной и углохвостой креветок установили их высокую активность в различных зонах рН (см. рисунок) по сравнению с другими морскими организмами (Пивненко, 1998; Антарктический криль ..., 2001). Полученные результаты согласуются с данными аналогичных исследований протеолитической активности тканей антарктической креветки (Бобровская и др., 1981; Ярочкин, 2001).

Н.Д. Бобровская с соавторами (1981) показали, что протеолитическая активность ферментов у взрослой креветки, особенно в стадии икрометания

1 — рН 3; 2 — рН 5; 3 — рН 7; 4 — рН 8

Распределение протеолитической активности ферментного комплекса: а — северной, b — углохвостой креветок, с — криля (Ярочкин, 2001) в зависимости от рН и температуры среды

Distribution of proteases activity of enzyme complex of the: a — northern, b — humpy and с — antarctic shrimps (Ярочкин, 2001) depending on pH medium and temperature

(V стадия), ниже, чем у отнерестившейся. Как уже упоминалось, в летний период (июль—август) виды рода Pandalus находятся в стадии икрометания (Иванов, 1964), поэтому при выборе способа технологической обработки креветочного сырья и условий его хранения очень важно учитывать влияние биологического состояния, в том числе питания, на его ферментативную активность. Авторами установлена наиболее высокая активность ферментов у молоди креветок, так как рост особи сопровождается повышением обмена веществ, включающим реакции с участием ферментов (Биденко и др., 1981 б; Антарктический криль ..., 2001).

Наибольшая активность комплекса протеаз северной креветки при температуре 30 0С наблюдается в слабокислой и нейтральной областях рН, наименьшая — в кислой. Протеазы углохвостой креветки при этой температуре наиболее активны в нейтральной и щелочной областях рН, наименее — в кислой и слабокислой. Аналогичная зависимость была обнаружена у криля (Бобровская и др., 1981; Ярочкин, 2001).

Увеличение температуры инкубации проб до 40 0С позволяет повысить про-теолитическую активность образцов в кислой и слабокислой среде северной креветки соответственно в 10 и 6 раз, углохвостой — в 6-7 раз и в нейтральной и щелочной среде соответственно в 1,5-2,0 раза и более чем в 5-6 раз. При этом показано, что с повышением температуры от 30 до 40 0С сохраняется установленная зависимость распределения активности в различных областях рН.

У криля увеличение активности протеаз при таком же повышении температуры значительно ниже и составляет в кислой среде 1,7 раза, в нейтральной и щелочной среде — 2,0 раза, при этом выявлена инактивация слабокислых протеаз (Ярочкин, 2001).

Повышение температуры инкубации проб при автопротеолизе северной креветки до 50 0С приводит к увеличению активности протеаз всего спектра рН. При этом наиболее заметно это увеличение в кислой и слабокислой среде.

Такое же повышение температуры инкубации проб углохвостой креветки приводит к некоторому увеличению активности кислых и слабокислых протеаз и снижению активности ферментов в нейтральной среде. Снижение протеолити-ческой активности в щелочной среде наиболее заметно и составляет 2,5 раза.

Дальнейшее увеличение температуры до 60 0С приводит к уменьшению активности протеолитических ферментов северной креветки во всех областях рН. Наиболее значительно снижение активности щелочных протеаз, которое составляет 1,7 раза.

Повышение температуры инкубации проб углохвостой креветки до 60 0С приводит к незначительному увеличению активности кислых протеаз, при этом активность слабокислых, нейтральных и щелочных протеаз снижается соответственно в 1,5, 3,0 и 2,5 раза.

Температура инкубации 50 и 60 0С практически полностью инактивирует слабокислые протеазы криля и незначительно увеличивает активность кислых протеаз. Активность нейтральных и щелочных ферментов увеличивается соответственно в 2,0-2,5 и 1,5-2,5 раза (Ярочкин, 2001).

Увеличение температуры инкубации проб северной и углохвостой креветок до 70 0С инактивирует протеазы всего спектра рН, так же как у криля (Ярочкин, 2001), и по значениям приближается к уровню, установленному при температуре 30 0С. В эксперименте при температуре 80 0С протеолитическая активность образцов нами не была обнаружена.

Следовательно, мы приходим к выводу, что активность протеолитических ферментов возрастает в ряду углохвостая — антарктическая — северная креветки и достигает максимума у северной креветки, при этом набор протеаз панкреатической ткани креветок неодинаков. Протеолитические ферменты углохвостой и антарктической креветок наиболее активны в нейтральной и щелочной среде рН. Оптимум действия протеаз этих областей рН у антарктической креветки

358

обнаружен при температуре 50-60 0С, а углохвостой — при температуре 40 0С, при этом увеличение температуры до 50-80 0С инактивирует ферменты углохвостой креветки. У северной креветки оптимум действия нейтральных и щелочных протеаз установлен, так же как у криля, при температуре 50-60 0С. Однако, в отличие от углохвостой и антарктической креветок, у северной креветки кислые и слабокислые протеазы наиболее активны при температуре 50-60 0С. В этой области рН у углохвостой креветки и криля обнаружена меньшая активность протеолитических ферментов, оптимум их действия установлен при температуре 50-60 0С, при этом у криля протеазы не термостабильны.

Полученные результаты, а также успешное использование криля в качестве сырья для изготовления автолизатов (О работе ..., 1983) позволяют предположить возможность производства вкусо- и ароматической добавки из этих и других мелких креветок методом автопротеолиза.

Литература

Антарктический криль: Справочник / Под ред. В.М. Быковой. — М.: ВНИРО, 2001. — 207 с.

Биденко М.С., Андреев М.П., Маклыгин Л.Г. Технохимическая характеристика антарктического криля // Исследования технологических характеристик и процессов обработки антарктического криля. — Калининград: АтлантНИРО, 1981а. — С. 3-14.

Биденко М.С., Расулова Т.А., Одинцов А.Б. Об активности протеолитических ферментов антарктического криля // Исследования технологических характеристик и процессов обработки антарктического криля. — Калининград: АтлантНИРО, 1981б. — С. 15-18.

Бобровская Н.Д., Кардашев А.В., Вайман Г.А. Об изучении протеолитической активности протеолитических и липолитических ферментов криля // Технология переработки криля. — М.: ОНТИ ВНИРО, 1981. — С. 16-20.

ГОСТ 7636-85. Рыба, морские млекопитающие, морские беспозвоночные и продукты их переработки. Методы анализа. — М.: Изд-во Стандартов, 1985.

Дерффель К. Статистика в аналитической химии. — М.: Мир, 1997. — 268 c.

Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. — М.: Мир, 1991. — 544 с.

Иванов Б.Г. Некоторые итоги изучения биологии и распределения креветок в При-быловском районе Берингова моря // Тр. ВНИРО. — Т. 49: Изв. ТИНРО. — Т. 51. — 1964. — C. 113-122.

Иванов Б.Г. Десятиногие ракообразные (Crustacea, Decapoda) Северной Паци-фики как фонд для интродукции в Атлантику: интродукция возможна, но целесообразна ли? // Исследование биологии промысловых ракообразных и водорослей морей России. — М.: ВНИРО, 2001. — С. 32-74.

Лазаревский А.А. Техно-химический контроль в рыбообрабатывающей промышленности. — М.: Пищепромиздат, 1955. — 326 с.

Новикова М.В., Рехина Н.И., Горбунов К.А. и др. Создание продуктов новых форм из криля и рыбы пониженной товарной ценности // Новые белковые продукты на основе гидробионтов. — М.: ВНИРО, 1989. — С. 24-29.

О работе в двадцать четвертом рейсе с 7 января по 16 июня 1982: Отчет о НИР / ТИНРО. — № 18173. — Владивосток, 1982. — 136 с.

О работе в двадцать пятом рейсе с 8 января по 17 июня 1983: Отчет о НИР / ТИНРО. — № 18647. — Владивосток, 1983. — 122 с.

Пивненко Т.Н. Сравнительные исследования панкреатических сериновых проте-иназ гидробионтов Тихого океана: Автореф. дис. ... д-ра биол. наук. — Владивосток: ТИНРО-центр, 1998. — 40 с.

Полыгалина Г.В., Чередниченко В.С., Римарева Л.В. Определение активности ферментов. Справочник. — М.: ДеЛи принт, 2003. — 375 с.

ТУ 15-529-83 Консервы. Мясо антарктической креветки (криля) натуральное (Взамен ТУ 15-01 809-78).

Ярочкин А.П. Научно-практические основы технологии комплексной переработки маломерных гидробионтов и вторичного сырья от разделки рыб: Автореф. дис. . д-ра техн. наук. — М., 2001. — 51 с.

Baek H.H., Cadwallader K.R. Enzymatic hydrolysis of crayfish processing by-products // Journal of Food Science. — 1995. — Vol. 60, № 5. — Р. 929-935.

Folch J., Lees M. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues // Journal of Biological Chemistry. — 1957. — Vol. 226, № 1. — Р. 497-509.

Giani I., Turchini G.M., Moretti V.M., Valfre F. Chemical and biochemical characteristics of the commercial species sea and fresh-water crustaceans // Industrial Alimentary. — 2003. — Vol. 42, № 430. — P. 1145-1152.

Kimoto K., Fukamizu A., Murakami K. Partial purification and characterization of proteinases from abdomen part muscle of Antarctic krill // Bull. Jap. Soc. Sci. Fish. — 1986. — Vol. 52, № 4. — Р. 745-749.

Simpson B.K., Nayeri G., Yaylayan V., Ashiel I.N.A. Enzymatic Hydrolysis of shrimp meat // Food Chemistry. — 1998. — Vol. 61, № 1-2. — Р. 131-138.

Yamagata M., Low L.K. Banana shrimp, Penaeus merguiensis, quality changes during iced and frozen storage // Journal of Food Science. — 1995. — Vol. 60, № 4. — Р. 721-726.

Поступила в редакцию 1.08.06 г.