СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ ФИЗИЧЕСКОЙ НАГРУЗКИ ДЛЯ ОЦЕНКИ РАБОТОСПОСОБНОСТИ ЛАБОРАТОРНЫХ КРЫС ПРИ ДИСБИОТИЧЕСКИХ НАРУШЕНИЯХ КИШЕЧНИКА
METHOD OF SIMULATION OF PHYSICAL LOAD FOR EVALUATION OF WORKABILITY OF LABORATORY RATS WITH DYSBIOTIC INTESTINAL DISORDERS

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Изобретение относится к экспериментальной медицине, и может быть использовано для исследования изменений толерантности к физической нагрузке организма мелких лабораторных грызунов и тестирования способов ее коррекции факторами различной природы в условиях дисбиотических нарушений кишечника.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Выяснение закономерностей ответа организма на физические нагрузки, изучение их последствий - одна из актуальных проблем современной биологии и медицины. Известны экспериментальные модели посттравматических стрессовых расстройств на лабораторных животных с использованием интенсивной физической нагрузки.
Известно оказание физичекой нагрузки с помощью принудительного плавания животного в емкости с водой; при которой нагрузку осуществляют в два этапа: на первом этапе проводят индукцию экспериментального десинхроноза путем содержания крыс в течение 12 суток круглосуточно при искусственном освещении либо в полной темноте, после чего животных подвергают принудительному плаванию при естественном освещении в стеклянном аквариуме прямоугольной формы размерами 100 см × 100 см × 20 см, разделенном на отсеки, соединяющиеся у дна, и снабженном двумя вентилями - по одному сверху и снизу одной из боковых стенок, с грузом, закрепленным на хвосте, вес которого составляет 10% веса тела животного, при температуре воды 26-28°С в течение 5 дней до полного утомления, критерием которого являются три безуспешные попытки всплыть на поверхность либо отказ от таких попыток с опусканием на дно.(Описание изобретения к патенту РФ № 26017206, МПК G09B 23/28, опубликовано 21.04.2017).
В данном техническом решении задача - моделирование физического переутомления у крыс в условиях десинхроноза, в ходе формирования которого животные достигают состояния тренированности и резистентности к нагрузке. Полученная модель в достаточной мере отражает проблемы спортивной физиологии, создание принудительной физической нагрузки является режим воздействия 1 раз через 24 часа, что соответствует больше спортивной медицине; т. е. ограничивает спектр использования данной модели в других областях исследования, а именно использование физических нагрузок при дисбактериозе кишечника для изучения проблем спортивной физиологии.
Известно воздействие антибактериальным препаратом гентамицином на кишечную микрофлору, и определение количества жизнеспособных микроорганизмов кишечной микрофлоры в начале и конце опыта, и сравнивание их численные значения, при этом создают селективное давление антибактериальным препаратом гентамицином при пероральном его введении лабораторным животным 1 раз в сутки в течение 5 дней в дозах, превышающих его суточную терапевтическую дозу при парентеральном введении в 4,8 раза у мышей и в 4 раза - у морских свинок. (Описание изобретения к патенту РФ № 2477894, МПК G09B 23/28, опубликовано 20.03.2013).
Отличие заключается в том, что определение жизнеспособных микроорганизмов кишечника проводится только в начале и в конце опыта без оценки интенсивности естественного восстановления микрофлоры через длительный промежуток времени после введения последней дозы антимикробного препарата. Не используют для сравнительного анализа моделирование физического переутомления у животных в условиях десинхроноза.
Предложенное техническое решение дает возможность создания такой экспериментальной модели, позволяющей изучение влияния нарушения нормальной микрофлоры кишечника на физическую работоспособность и поиска способов и средств профилактики и коррекции снижения физической работоспособности под влиянием факторов, приводящих к нарушению микрофлоры кишечника.
РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Задача изобретения – разработка способа, позволяющего моделировать физическую нагрузку в условиях дисбиотического нарушения у лабораторных крыс с оценкой изменения физической работоспособности.
Поставленная задача достигается сочетанием введения гентамицина с физической плавательной нагрузкой, которая приводит к модификации микрофлоры кишечника животных (крыс). Способ моделирования физической нагрузки у крыс при дисбиотических нарушениях кишечника осуществляют путем перорального введения антимикробного препарата гентамицин в дозе 30 мг 1 раз в день на протяжении 5 сут, начиная с 1 дня эксперимента; животные также подвергаются принудительному плаванию с грузом, закрепленным на хвосте и составляющем 7% веса тела животного, путем четырех кратного принудительного плавания с интервалом 1 раз через 5 суток; используют установку, представляющую собой бассейн из непрозрачного материала, высотой 98 см и диаметром 50 см, высота столба воды в бассейне составляет 60 см; температура поддерживается на уровне 29-30°С; животных подвергают плаванию до полного утомления, критерием которого являются неудачные попытки животного всплыть на поверхность воды в течение более чем 10 секунд и/или опускание на дно бассейна.
ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Способ осуществляют следующим образом.
У экспериментальных животных моделировали состояние дисбактериоза кишечника путем перорального введения антимикробного препарата гентамицинв дозе 30 мг 1 раз в день на протяжении 5 сут, начиная с 1 дня эксперимента. С 1 дня эксперимента животные начинали также подвергаться вынужденным физическим нагрузкам с мониторингом изменения работоспособности для чего применялся тест «Вынужденное плавание с грузом». Для проведения теста использовали установку, представляющую собой бассейн из непрозрачного материала, высотой 98 см и диаметром 50 см. Высота столба воды в бассейне составила 60 см, температура поддерживалась на уровне 29-30°С. В качестве утяжелителей использовали «грузики» из свинца. Прикрепление утяжелителя осуществлялось на основании хвоста животного посредством резиновой лигатуры и лески. Длина лески от места крепления до утяжелителя примерно соответствовала длине хвоста животного, при которой не происходило соскальзывание «грузика» с хвоста во время теста, и крысы не опускали утяжелитель на дно бассейна для снятия с себя нагрузки. Использованная масса грузика, которая составила 7% от индивидуальной массы тела животного. Животных подвергают плаванию до полного утомления, критерием которого являются неудачные попытки животного всплыть на поверхность воды в течение более чем 10 секунд и/или опускание на дно бассейна. Животные подвергались вынужденному плаванию с утяжелением четырехкратно с интервалом 1 раз через 5 суток. Общее время плавания крыс использовали как параметр для оценки физической выносливости.
Экспериментальное исследование выполнено на 16 половозрелых нелинейных крысах-самцах массой 438[423; 496] г, содержащихся в стандартных условиях конвенционального вивария при температуре 23±2°С и влажности 65% с естественным режимом освещения на полнорационном коммерческом гранулированном комбикорме для содержания (ООО «Лабораторкорм», г. Москва) со свободным доступом к питьевой водопроводной воде и пище. Все манипуляции проводили согласно Директиве 2010/63/EU Европейского парламента и совета Европейского Союза от 22 сентября 2010 г. по охране животных, используемых в научных целях.
Все животные были разделены на 3 группы по 5-6 особей:
1) крысы, которые не подвергались действию антимикробного препарата и физической нагрузке; интактная группа;
2) крысы, которые подвергались физической нагрузке до переутомления; группа №1;
3) крысы, у которых моделировали дисбиотические нарушения в кишечнике и которые подвергались физической нагрузке до переутомления; группа №2.
-1
Физическая нагрузка у животных была реализована путем 4-х кратного принудительного плавания с интервалом 5 суток в круглом непрозрачном бассейне с грузом в 7% от веса тела при температуре воды 29-30°С до полного утомления. Индукцию экспериментального дизбиоза кишечника у животных группы №2 осуществляли пероральным введением коммерческого 4% раствора гентамицин сульфата с помощью инсулинового шприца без иглы в дозе 30 мг в сутки в течение 5 дней, начиная с первого дня эксперимента. Для мониторинга изменения микрофлоры кишечника под воздействием физической нагрузки и антимикробного препарата на 1, 6 и 16 день эксперимента, т.е. до введения, после завершения курсового введения и через 10 дней после завершения введения гентамицина соответственно, у каждого животного индивидуально осуществляли отбор фекалий, взвешивали их, после чего суспендировали в 9,0 мл изотонического 0,9 % раствора хлорида натрия и высеивали в разных разведениях на селективные питательные среды. После инкубации подсчитывали количество выросших колоний. С учетом массы фекалий от каждого животного и числа выросших колоний делали перерасчет общего числа микроорганизмов (ОМЧ), бифидобактерий, лактобактерий и эшерихий на 1 г фекалий (КОЕ·г). Сбор биоматериала осуществлялся согласно МУ 4.2.2039-05. Идентификация микроорганизмов толстой кишки проводилось в соответствии с Приказом Минзрава СССР от 22.04.1985 № 535 «Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений» и МУ «Бактериологическая диагностика дисбактериоза кишечника», по методу, разработанному Р.В. Эпштейн-Литвак и Ф.Л. Вильшанской (1977). Окончательный результат количественного содержания бактерий в грамме фекалий выражали как lgKOE/г.
Плавание животных проводили в специальной установке, представляющей собой бассейн из непрозрачного материала, высотой 98 см и диаметром 50 см. Высота столба воды в бассейне составила 60 см, температура поддерживалась на уровне 29-30°С. В качестве утяжелителей использовали «грузики» из свинца. Прикрепление утяжелителя осуществлялось на основании хвоста животного посредством резиновой лигатуры и лески. Длина лески от места крепления до утяжелителя примерно соответствовала длине хвоста животного, при которой не происходило соскальзывание «грузика» с хвоста во время теста, и крысы не опускали утяжелитель на дно бассейна для снятия с себя нагрузки. Использованная масса грузика, которая составила 7% от индивидуальной массы тела животного. Животных подвергают плаванию до полного утомления, критерием которого являлись неудачные попытки всплыть на поверхность воды в течение более чем 10 секунд и/или опускание на дно бассейна, после чего крыса извлекалась из бассейна.
Через 2 суток после последнего дня физической нагрузки крыс выводили из эксперимента одномоментным декапитированием и собирали кровь для оценки изменения энергообмена по уровню лактата в плазме с использованием набора реагентов «Молочная кислота – Ольвекс» (ООО ОльвексДиагностикум, г. Санкт-Петербург, Россия.) согласно инструкции.
Статистическая обработка данных проводилась с использованием программы STATISTICA 8.0. Для выявления статистических различий двух независимых групп применяли критерий Манна–Уитни (р≤0,05). В качестве предварительного статистического метода при множественном сравнении зависимых групп применяли критерий Фридмана, с последующим попарным сравнением с помощью критерия Уилкоксона, при сравнении независимых групп - Н-тест Краскела–Уоллиса,с последующим попарным сравнением с помощью критерия Манна–Уитни. Различия считали статистически значимыми при р≤0,017(после пересчета на число сравнений). Результаты представляли в виде Me [МКИ] (где Ме — медиана, МКИ — межквартильный интервал).
Таблица 1
Динамика изменения физической работоспособности лабораторных животных в исследовательских группах
Название группы
Плавание в 1 день эксперимента, с
Плавание в 6 день эксперимента, с
Плавание в 11 день эксперимента, с
Плавание в 16 день эксперимента, с
Группа №1
109,0[89,6; 109,9]
98,0 [83,0; 105,0]
133,0 [115,0; 154,0]
157,0 [140,0; 167,0]
Группа №2
87,0 [79,0; 95,0]
93,9 [83,0; 120,0]
88,0 [79,0; 98,0] •
105,0 [89,0; 133,0]
•p=0,019 по U-критерию Манна-Уитни при сравнении с группой №1 на 11 день эксперимента
Таблица 2
Динамика изменения микробиоты толстого кишечника крыс при моделировании физической нагрузки и дисбактериоза
Группы МО,lg КОЕ/г
Инт. группа
1 сутки
6 сутки
16 сутки
№1
№2
№1
№2
№1
№2
Bifidobacterium
3[3; 5]
3[3;4]
4[3;6]
3[3;3]
3[3;4]
3[3;3]
3[3;5]
Lactobacillus
9[9; 9]
9[9;9]
9[7;9]
9[7;9]
9[7;9]
6[3;9]
7[4;9]
E. coli
4,9[0;5,5]
4,6 [2,3;5,0]
5,3 [5,1;5,5]
4,2 [2,0;4,6]
0 [0;0]х
2,2 [0,0; 4,5]
0 [0;0]х
ОМЧ
8,4[8,0;8,6]
8,5 [8,3;8,6]
8,6 [8,5;8,6]
7,7 [7,5;7,7]^,*
0 [0;0]^,х
8,2 [8,0;8,4]*, &
8,2 [7,9; 8,2]х,#
Примечание: МО – Микроорганизмы, ОМЧ – Общее микробное число, №1 – группа №1, №2 –Группа №2;
p≤0,013
^  по критерию Манна-Уитни при сравнении с интакными крысами;
р<0,012
*по критерию Уилкоксонапри сравнении с группой №1 в 1 сутки;
х
р<0,012
по критерию Уилкоксона при сравнении с группой №2 в 1 сутки;
&
р<0,012
по критерию Уилкоксонапри сравнении с группой №1 на 6 сутки;
#
р<0,012
по критерию Уилкоксонапри сравнении с группой №2 на 6 сутки.
Как показали эксперименты, при физической плавательной нагрузке до полного утомления в режиме 1 раз в 5 суток без моделирования дисбиотических нарушений в группе №1 к 16-му дню эксперимента наблюдается тенденция увеличения времени активного плавания (табл. 1). Полученные результаты свидетельствуют, что выбранный режим воздействия не способствует быстрой выработке у животных состояния тренированности и резистентности к нагрузке, что является необходимым условиям для оценки роли микробиотического состояния кишечника вприспособлении к возрастающим физическим нагрузкам.
В группе №2 динамика показателей физической работоспособности на 11 день эксперимента была нарушена. Наблюдалось статистически значимое снижение времени плавания животных (табл. 1). Это связано с антибиотик-ассоциированным дисбактериозом кишечника у крыс, развитие которого было подтверждено при проведении бактериологического анализа (табл. 2).
Бактериальный анализ показал, что физические плавательные нагрузки привели к модуляции кишечной микрофлоры: на 6 сутки наблюдалось статистически значимое снижение показателя ОМЧ на 0,7-0,8 порядка по сравнению с интактными крысами и относительно своих исходных значений до плавания, а на 16 день эксперимента наблюдалось статистически значимое восстановление показателя ОМЧ относительно уровня на 6 сутки, но тенденция к уменьшению содержания E.coli.Такие изменения, вероятно, являются частью естественных приспособительных реакций организма во время стадии физиологического напряжения (Картышева, С. И. Физиология физических упражнений : учебно-методическое пособие для студентов, обучающихся по специальности 050720 «Физическая культура» и направлению «Педагогическое образование», профиль «Физическая культура»  / С. И. Картышева. – Воронеж : Воронежский государственный педагогический университет, 2012. – 176 с.; GubertC., KongG., RenoirT., HannanA. J. Exercise, dietandstressasmodulatorsofgutmicrobiota: Implicationsforneurodegenerativediseases // NeurobiologyofDisease. 2020. Vol. 134. №104621. DOI: 10.1016/j.nbd.2019.104621).Через 12 часов послезавершения курсового введения гентамицина показатель ОМЧ статистически значимо снизился до неопределяемого уровня как относительно интактных животных, так и своих исходных значений. При этом статистически значимо снизилось содержание в толстом кишечнике E. coli по сравнению со значениями до введения препарата, а также наблюдалась тенденция снижения содержания бифидобактерий (табл. 2). Стоит отметить, что через 10 суток после завершения введения антимикробного препарата наблюдалось самопроизвольное количественное восстановление микрофлоры толстого кишечника крыс, однако со смешением доли отдельных ее представителей: E. coli не регистрировались, а была характерна тенденция снижения лактобактерий.
Таким образом, дисбиотическое нарушение, характеризующиеся общим снижением количества представителей кишечной микрофлоры и выраженным дисбалансом в количестве эшерихий, вызывало нарушение адаптации к физической нагрузке, выразившемся в снижении времени плавания крыс на 11 день эксперимента. Полученные данные свидетельствуют, что дисбактериоз ускорял развитие физического переутомления у крыс в плавательном тесте.
Участие микрофлоры в поддержании физической работоспособности животных подтвердилось также параллельным восстановлением этих двух показателей к 16 дню эксперимента (табл. 1 и 2).
Исследование изменений метаболизма в восстановительный период после 4-х сеансов физической нагрузки показалотенденцию снижения концентрации лактата в плазме крови животных группы №1 (2,1 [1,6; 2,9]ммоль/л) по сравнению с интактной (4,4 [3,4; 5,4] ммоль/л; p = 0,050, U-критерий Манна-Уитни).При этом, изменения в энергообмене на фоне физических нагрузокпри нарушениях микробиома кишечника были более выражены: концентрация молочной кислоты в плазме крови на 18-е сутки эксперимента статистически значимо была в 3 раза ниже (1,3 [1,2; 1,7]ммоль/л) по сравнению с интактными животными (p = 0,014, U-критерий Манна-Уитни). Эти данные свидетельствуют, что при дисбиозе кишечника снижается скорость восстановления энергообмена после физических нагрузок.
Таким образом, предлагаемый способ позволяет создать модель, в ходе формирования которой у животных происходит нарушение нормального адаптационного сдвига в организме при воздействии физических нагрузок. Полученная модель в достаточной мере отражает проблемы изменения физиологии труда, связанные с нарушением адаптивных процессов организма вследствие дисбиотических нарушений кишечника, и в большей мере может служить для поиска способов и средств профилактики и коррекции снижения физической работоспособности под влиянием факторов, в том числе вредных факторов трудового процесса, приводящих к нарушению микрофлоры кишечника.