Влияние ампициллина на состав и активность молекулярных форм малатдегидрогеназы активного ила

УДК 615.076.7

ВЛИЯНИЕ АМПИЦИЛЛИНА НА СОСТАВ И АКТИВНОСТЬ МОЛЕКУЛЯРНЫХ ФОРМ МАЛАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ АКТИВНОГО ИЛА.

З.Е. Мащенко1, Е.В. Маслова1, И. Ф. Шаталаев2, Н.В. Расцветова2, А.А. Косарева1

1 ФГБОУ ВО Самарский государственный технический университет, Самара, Россия;

2 ФГБОУ ВО Самарский государственный медицинский университет Минздрава России, Самара, Россия. Аннотация. Лекарственные вещества попадают в водоемы в составе сточных вод городов, агропромышленных предприятий, крупных медицинских центров и других учреждений здравоохранения. По состоянию ферментных систем микроорганизмов, используемых при биологической очистке сточных вод, можно судить о качестве очистки и токсичности загрязнителей, содержащихся в воде. В работе изучено влияние ампициллина на состав и динамику активности молекулярных форм (МФ) малатдегидрогеназы (МДГ) активного ила. Результаты экспериментов показали мобилизацию аэробных процессов окисления и увеличение активности молекулярных форм фермента при действии ампициллина на микроорганизмы активного ила. Возникновение большего числа активных зон фермента в зависимости от концентрации ампициллина и времени инкубации свидетельствует об увеличении количества метаболитов в период эксперимента.

Ключевые слова: ампициллин, активный ил, малатдегидрогеназа, электрофорез в полиакриламидном геле.

Фармацевтические средства - относительно новый вид загрязнителей водных экосистем. Лекарственные вещества попадают в водоемы в составе сточных вод городов, агропромышленных предприятий, крупных медицинских центров и других учреждений здравоохранения. По литературным данным [1] концентрация лекарственных средств в поверхностных и грунтовых водах обычно составляет менее 0,1 ^/1 .

В рамках «Руководящих принципов по качеству питьевой воды» [1] Всемирная организация здравоохранения не регламентирует количественное содержание фармацевтических препаратов в воде.

Тем не менее, в ряде исследований подтверждается возможность неблагоприятного влияния малых концентраций лекарственных веществ и их метаболитов на гидроэкосистему, а также наличие кумулятивного эффекта в живых системах [2,3,4].

Одним из способов оценки влияния ксенобиотиков на живые организмы является энзимо-индикация. Известно, что активность многих ферментов зависит от множества факторов внешней среды.

Существуют данные о том, что по состоянию ферментных систем микроорганизмов, используемых при биологической очистке сточных вод, можно судить о качестве очистки и токсичности загрязнителей, содержащихся в воде [5, 6].

Достаточно часто в энзимоиндикации факторов внешней среды на микроценозы гидроэкосистем используется НАД-зависимая малатдегидрогеназа (НАД-МДГ) ^-малат:НАД-оксидоре-дуктаза; КФ 1.1.1.37). МДГ обнаружена в клетках практически всех аэробно живущих организмов и играет важную роль в преодолении стрессов, возникающих в экстремальных условиях их жизнедеятельности.

Возможность существования молекулы МДГ в виде различных молекулярных форм - важный

регуляторный механизм, обеспечивающий приспособляемость живых систем к меняющимся условиям внешней среды [7,9].

Цель работы - изучение влияния ампициллина на состав и динамику активности молекулярных форм малатдегидрогеназы активного ила в моделях.

1ЧН7

Материал и методы исследования. Объектом исследования является антибиотик группы пенициллинов - ампициллин, химическое строение которого представлено на рисунке 1.

ОН

о

Рис. 1. Химическое строение ампициллина.

В экспериментах использовали активный ил городской станции аэрации г. Самары.

Иловую суспензию инкубировали в течение 24 часов при температуре 200С в аэробно-анаэробных условиях в растворах ампициллина с концентрациями 10; 40 и 70 мг/г биомассы ила. Пробы отбирали через 1 и 24 часа.

Ферментные образцы получали по следующей методике: 10 мл иловой суспензии двукратно отмывали от фоновых загрязнений водой очищенной, центрифугировали при 5000 об/мин течение 5 мин. Осадок переносили в механический дезинтегратор (стеклянная ступка и пестик на шлифах) и проводили дезинтеграцию клеток ила 5 мин при 4 оС. Дезинтеграт переносили в колбу, добавляли тритон Х-100, колбу помещали на магнитную мешалку на 1 час для солюбилиза-ции фермента. Гомогенат центрифугировали при 5000 об/мин 5 мин.

В супернатанте определяли молекулярные формы МДГ методом электрофореза в плоских

блоках 7,5% полиакриламидного геля. В качестве электродного буфера использовали 1М трис-ЭДТА-боратный буфер (рН 9,2). Выявление изоформ МДГ проводили с помощью феназин-метасульфаттетразолиевой реакции в чашках Петри [8]. Обработку фореграмм проводили с использованием компьютерной программы «ТСХ-менеджер».

Изменение относительной активности молекулярных форм МДГ рассчитывали как процентное отношение разницы относительных активностей в опытной и контрольной пробах к относительной активности фермента в опытной пробе.

Результаты и их обсуждение.

В таблице 1 представлены данные о составе и относительной активности молекулярных форм МДГ микроценоза активного ила при действии ампициллина после 1 часа и 24 часов инкубации.

Таблица 1

Фракционный состав и относительная активность молекулярных форм МДГ микроценоза активного ила

Молекулярные формы МДГ Относительная активность молекулярных форм МДГ, %

Контроль Концентрация ампициллина, мг/г биомассы ила

10 40 70

Инкубация 1 час

МДГ-2 31,81 71,41 52,12 33,91

15,64

МДГ-3 26,2 28,05 21,07 44,88

30,46 0,54 26,81 0,7

Инкубация 24 часа

МДГ-2 38,87 54,43 6,76 3,67

38,45 40,3

МДГ-3 12,73 32,10 10,36 26,53

48,4 13,47 37,52 29,08

По истечению одного часа инкубации в исследуемых образцах активного ила обнаружены две молекулярные формы фермента - МДГ-2 и МДГ-3. При этом в области МДГ-3 определены две активные зоны. В образце с концентрацией антибиотика 70 мг/г биомассы ила МДГ-2 также представлена двумя активными зонами.

Уменьшение концентрации ампициллина приводило к активации МДГ-2. В пробе с концентрацией антибиотика 10 мг/ г биомассы ила

активность МДГ-3 падала в два раза по сравнению с контролем.

По истечении суток в контрольной пробе также определены две молекулярные формы -МДГ-2 и МДГ-3. В образце с концентрацией ампициллина 10 мг/г биомассы фермент представлен одной активной зоной МДГ-2 и двумя зонами МДГ-3. В других пробах обе молекулярные формы представлены двумя зонами активности.

Динамика относительной активности молекулярных форм МДГ представлена в таблице 2.

Таблица 2

Динамика относительной активности молекулярных форм МДГ микроценоза активного ила

Молекулярные формы МДГ Изменение относительной активности молекулярных форм МДГ, %

Концентрация ампициллина, мг/г биомассы ила

10 40 70

Инкубация 1 час

МДГ-2 -44,35 +24,99 +16,15

МДГ-3 -48 -67,4 -77,85

Инкубация 24 часа

МДГ-2 +150,54 +185 +198

МДГ-3 +15,47 +98,77 +133,83

После 1 часа инкубации с увеличением концентрации ампициллина во всех образцах установлено ингибирование активности молекулярной формы МДГ-3. В пробе с концентрацией ан-тибиотика10 мг/г биомассы наблюдали снижение активности и МДГ-2.

По истечении 24 часов по мере увеличения концентрации ампициллина во всех образцах установлен рост активности как МДГ-2, так и МДГ-3.

Выводы. Снижение активности МДГ-3 в пробах, взятых через 1 час, свидетельствует о токсическом действии ампициллина на мем-браносвязанную форму фермента.

Инкубация в течение 24 часов приводит к мобилизации аэробных процессов окисления и увеличению активности молекулярных форм фермента.

Полученные данные позволяют объяснить биохимические адаптационные механизмы микроценозов активного ила, заключающиеся в синтезе низкомолекулярных субъединиц фермента. Возникновение большего числа активных зон фермента в зависимости от концентрации ампициллина и времени инкубации соответствуют

имеющимся литературным данным об их связи с растущим количеством метаболитов [7].

Полученные сведения о структуре и изменении активности МДГ могут быть использованы для биотестирования вод, содержащих в качестве загрязнителей фармацевтические вещества, в частности, антибиотики пенициллинового ряда.

ЛИТЕРАТУРА

1. Официальный сайт Всемирной организации здравоохранения. URL: http://www.who.int/water_sanitation_health/emerging/in fo_sheet_pharmaceuticals/ru (дата обращения: 28.08.16).

2. Radjenovic J., Petrovic M., Barcelo D. Complementary mass spectrometry and bioassays for evaluating pharmaceutical-transformation products in treatment of drinking water and wastewater // Trends in Analytical Chemistry. 2009. №5. P. 562-580.

3. Michael I., Hapeshi E., Michael C., Varela A.R. et al. Solar photo-Fenton process on the abatement of antibiotics at a pilot scale: Degradation kinetics, ecotoxicity and phytotoxicity assessment and removal of antibiotic resistant enterococci // Waterresearch. 2012. vol. 46. №17. P. 5621-5634.

—--—

Журнал включен в Перечень рецензируемых научных изданий ВАК

4. Медицинский портал «Ремедиум». URL: http://www.remedium.ru/pharmacy (дата обращения 28.08.16).

5. Тимофеева С.С. Окислительно-восстановительные ферменты активных илов, способы определения и их значение в очистке сточных вод// Химия и технология воды. 1984. т.6. № 4. С.367-370.

6. Тимофеева С.С. Энзимоиндикация качества очистки сточных вод в аэротенках// Химия и технология воды. 1987. т.9. № 5. С.445-448.

7. Телитченко М.М., Шаталаев И.Ф., Волгина Т.Б. Динамика молекулярных форм лактат-, малат- и

глюкозо-6-фосфатдегидрогеназ в моделях экосистемы активного ила// Гидробиологический журнал. 1992. т.28. № 3. С. 32-39.

8. Корочкин Л.И., Серов О.Л., Пудовкин А.И. Генетика изоферментов. М.: Наука, 1977.

9. Мащенко З.Е., Шаталаев И.Ф. Влияние бен-зилпенициллина натриевой соли на состав и активность молекулярных форм малатдегидрогеназы активного ила// Биодиагностика в экологической оценке почв и сопредельных сред: Тезисы докладов международной конференции, Москва, 4-6 февраля 2013 г. М., БИНОМ. Лаборатория знаний, 2013. С. 142.

THE EFFECT OF AMPICILLIN ON THE COMPOSITION AND ACTIVITY OF MOLECULAR FORMS OF ACTIVE SLUDGE MALATE DEHYDROGENASE.

Z.E. Mashchenko1, E V. Maslova1,1.F. Shataaev2, N.V. Rastsvetova2, A.A. Kosareva1

1 Samara state technical University, Samara, Russia;

2 Samara state medical University, Samara, Russia.

Annotation. Medicinal substances fall into water in the wastewater of cities, farms, hospitals and other healthcare institutions. As the enzyme systems of the microorganisms used in biological treatment of wastewater can be judged on the quality of cleaning and toxicity of pollutants contained in the water. The effect of ampicillin on the composition and dynamics of the activity of activated sludge's malate dehydrogenase (MDH) molecular forms (MF) was examined in the study. The results of the experiments showed mobilization of aerobic oxidation and increasing the activity of the molecular forms of the enzyme by the action of ampicillin on activated sludge microorganisms. The emergence of the more active areas of the enzyme depends on the ampicillin concentration and incubation time and indicates an increase in the number of metabolites in the period of the experiment.

Key words: ampicillin, activated sludge, malate dehydrogenase, electrophoresis in polyacrylamide gel.

REFERENCES

1. Official website of the World health organization. URL: http://www.who.int/water_sanita-tion_health/emerging/info_sheet_pharmaceuticals/ru (date of access: 28.08.16).

2. Radjenovic J., Petrovic M., Barcelo D. Complementary mass spectrometry and bioassays for evaluating pharmaceutical-transformation products in treatment of drinking water and wastewater // Trends in Analytical Chemistry. 2009. №5. P. 562-580.

3. Michael I., Hapeshi E., Michael C., Varela A.R. et al. Solar photo-Fenton process on the abatement of antibiotics at a pilot scale: Degradation kinetics, ecotoxicity and phytotoxicity assessment and removal of antibiotic resistant enterococci// Waterresearch. 2012. vol. 46. .№17. P. 5621-5634.

8. Korochkin L. I., Serov O. L., Pudovkin, A. I., Genetics of isoenzymes. M.: Nauka, 1977.

9. Mashchenko Z. E., Shatalaev I. F. Influence ben-zylpenicillium natrium on structure of molecular form

4. Medical portal "Remedium". URL: http://www.remedium.ru/pharmacy (date of access: 28.08.16).

5. Timofeeva S. S. Redox enzymes of active sludge, methods of determination and their significance in wastewater treatment// Himija i tehnologija vody. 1984. vol. 6. № 4. P.367-370.

6. Timofeeva S. S. Antimonite quality of sewage treatment in aerotanks// Himija i tehnologija vody. 1987. vol.9. № 5. P.445-448.

7. Telitchenko, M. M., Shatalaev I. F., Volgina T. B. Dynamics of molecular forms of lactate, malate and glu-cose-6-fosfatdegidrogenaze in models of ecosystem with activated sludge// Gidrobiologicheskij zhurnal. 1992. vol. 28. № 3. P.32-39.

malatdehydrogenase of active silt // Bioindication in the Ecological Assesment of Soils and Related Habitants. Book of Abstracts of the International Conference, Moscow, 4-6 February 2013. Moscow, 2013. P. 142.