Способ предотвращения развития инфаркта миокарда мышей с меланомой, развившейся на фоне хронической нейрогенной боли
METHOD FOR PREVENTING THE DEVELOPMENT OF MYOCARDIAL INFARCTION IN MICE WITH MELANOMA THAT DEVELOPED AGAINST THE BACKGROUND OF CHRONIC NEUROGENIC PAIN

Изобретение относится к онкологии, а именно к экспериментальной онкологии, и может быть использовано для изучения воздействия на сердечную мышцу в эксперименте.
Сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ) считаются одной из основных причин смертности среди населения (см. Virani S.S., Alonso A., Benjamin E.J., Bittencourt M.S., Callaway C.W., Carson A.P., Chamberlain A.M., Chang A.R., Cheng S., Delling F.N., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2020 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 2020;141:e139-e596. doi: 10.1161/CIR.0000000000000757). В возникновении и развитии сердечных заболеваний участвуют многочисленные и сложные патологические факторы, вместе с тем, в последние годы дисфункция митохондрий была признана отличительной чертой физиопатологии сердца (см. Brown D.A., Perry J.B., Allen M.E., Sabbah H.N., Stauffer B.L., Shaikh S.R., Cleland J.G.F., Colucci W.S., Butler J., Voors A.A., et al. Expert consensus document: Mitochondrial function as a therapeutic target in heart failure. Nat. Rev. Cardiol. 2017;14:238-250. doi: 10.1038/nrcardio.2016.203; см. Bonora M., Wieckowski M.R., Sinclair D.A., Kroemer G., Pinton P., Galluzzi L. Targeting mitochondria for cardiovascular disorders: Therapeutic potential and obstacles. Nat. Rev. Cardiol. 2019;16:33-55. doi: 10.1038/s41569-018-0074-0).
Ранее на экспериментальных моделях было показано, что опухолевый процесс в сочетании с хроническим болевым синдромом приводит к поражению сердечной мышцы и инфаркту миокарда в сопряжении с нарушениями функций митохондрий (см. Frantsiyants E.M., Neskubina I.V., Shikhlyarova A.I., Yengibaryan M.A., Vashchenko L.N., Surikova E.I., Nemashkalova L.A., Kaplieva I.V., Trepitaki L.K., Bandovkina V.A., Pogorelova Y.A. Content of apoptosis factors and self-organization processes in the mitochondria of heart cells in female mice C57BL/6 under growth of melanoma b16 / f10 linked with comorbid pathology. Cardiometry. 2021. № 18. С. 121-130.). Известно, что митохондрии ответственны за длительную буферизацию Ca2+ (см. Hopper R.K., Carroll S., Aponte A.M., Johnson D.T., French S., Shen R.-F., Witzmann F.A., Harris R.A., Balaban R.S. Mitochondrial matrix phosphoproteome: Effect of extra mitochondrial calcium. Biochemistry. 2006;45:2524-2536. doi: 10.1021/bi052475e). В частности, в сердце mCa2+ выполняет важную роль не только в производстве энергии миокардом и метаболизме митохондрий, активируя чувствительные к Ca2+ дегидрогеназы (PDH, IDH, KGDH) (см. Hopper R.K., Carroll S., Aponte A.M., Johnson D.T., French S., Shen R.-F., Witzmann F.A., Harris R.A., Balaban R.S. Mitochondrial matrix phosphoproteome: Effect of extra mitochondrial calcium. Biochemistry. 2006;45:2524-2536. doi: 10.1021/bi052475e), но также в регуляции сократительной способности кардиомиоцитов (см. Cao J.L., Adaniya S.M., Cypress M.W., Suzuki Y., Kusakari Y., Jhun B.S., O-Uchi J. Role of mitochondrial Ca2+ homeostasis in cardiac muscles. Arch. Biochem. Biophys. 2019;663:276-287. doi: 10.1016/j.abb.2019.01.027). Следовательно, нарушения гомеостаза mCa 2+ (повышенные или пониженные уровня) способствуют возникновению и развитию многих ССЗ, таких как инфаркт миокарда, гипертрофия сердца, кардиомиопатии и аритмия (см. Giorgi C., Marchi S., Pinton P. The machineries, regulation and cellular functions of mitochondrial calcium. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2018;19:713-730. doi: 10.1038/s41580-018-0052-8; Modesti L., Danese A., Angela Maria Vitto V., Ramaccini D., Aguiari G., Gafà R., Lanza G., Giorgi C., Pinton P. Mitochondrial Ca2+ Signaling in Health, Disease and Therapy. Cells. 2021; 10(6): 1317. https://doi.org/10.3390/cells10061317).
Сердце - орган с высокими потребностями в энергии, следовательно, неудивительно, что митохондрии занимают 30% от общего объема кардиомиоцитов и генерируют примерно 95% аденозинтрифосфата (АТФ) в организме (см. Cao Y.-P., Zheng M. Mitochondrial dynamics and inter-mitochondrial communication in the heart. Arch. Biochem. Biophys. 2019;663:214-219. doi: 10.1016/j.abb.2019.01.017). Митохондрии распределены среди сердечных волокон и организованы в три разные подгруппы в зависимости от их функций и местоположения: субарколеммальные (под сарколеммой), перинуклеарные (вокруг ядра) и межфибриллярные (между миофибриллами) митохондрии. Межфибриллярные митохондрии являются наиболее многочисленными, и участвуют в производстве АТФ, чтобы поддерживать сокращение миоцитов, регулируя Ca 2+ для передачи сигналов во время связи возбуждения-сокращения сердца (см. Kohlhaas M., Nickel A.G., Maack C. Mitochondrial energetics and calcium coupling in the heart. J. Physiol. 2017;595:3753-3763. doi: 10.1113/JP273609; Cao J.L., Adaniya S.M., Cypress M.W., Suzuki Y., Kusakari Y., Jhun B.S., O-Uchi J. Role of mitochondrial Ca2+ homeostasis in cardiac muscles. Arch. Biochem. Biophys. 2019;663:276-287. doi: 10.1016/j.abb.2019.01.027).
Митохондрии управляют различными аспектами клеточной функции, обеспечивая необходимое поступление АТФ, регулируя передачу сигналов Ca 2+, контролируя уровни активных форм кислорода (АФК) и т.д. (см. Marchi S., Patergnani S., Missiroli S., Morciano G., Rimessi A., Wieckowski M.R., Giorgi C., Pinton P. Mitochondrial and endoplasmic reticulum calcium homeostasis and cell death. Cell Calcium. 2018;69:62-72. doi: 10.1016/j.ceca.2017.05.003; см. Рark A., Oh M., Lee S. J., Oh K. J., Lee E. W., Lee S. C., Bae K. H., Han B. S., Kim W. K. Mitochondrial Transplantation as a Novel Therapeutic Strategy for Mitochondrial Diseases. International journal of molecular sciences. 2021;22(9):4793. doi: 10.3390/ijms22094793). Митохондрии присутствуют во всех тканях и органах организма, таких как печень, сердце и мозг, которым требуется энергия (см. Van Der Bliek A.M., Sedensky M.M., Morgan P.G. Cell Biology of the Mitochondrion. Genetics. 2017;207:843-871. doi: 10.1534/genetics.117.300262). Митохондрии обладают определенной функциональной гибкостью, поскольку при необходимости могут переключаться с регуляции нормальных функций клеток на стимулирование апоптоза. Они играют центральную роль в некрозе и апоптозе.
Интересно, что, как и дифференцированные клетки, митохондрии выполняют специализированные функции, уникальные для определенных тканей. Например, митохондрии в печени в основном участвуют в биосинтетических функциях, а митохондрии в сердце или мышцах в основном производят АТФ. Кроме того, митохондрии в адипоцитах принимают активное участие в регуляции дифференцировки адипоцитов, чувствительности к инсулину и адаптивном термогенезе (см. Lee S.C., Park A., Oh K.-J., Kim W.K., Bae K.-H. The Role of Adipose Tissue Mitochondria: Regulation of Mitochondrial Function for the Treatment of Metabolic Diseases. Int. J. Mol. Sci. 2019;20:4924. doi: 10.3390/ijms20194924). Анализ митохондриального протеома, выделенного из различных тканей, таких как мозг, печень, сердце и почки крыс, показал митохондриальную гетерогенность, специализирующуюся на различных функциях присущих этим тканям. Авторы этого исследования предположили, что тканеспецифическая функция митохондрий регулируется тканеспецифичными ядерно-кодируемыми белками (см. Johnson D.T., Harris R.A., French S., Blair P.V., You J., Bemis K.G., Wang M., Balaban R.S. Tissue heterogeneity of the mammalian mitochondrial proteome. Am. J. Physiol. Physiol. 2007;292:689-C697. doi: 10.1152/ajpcell.00108.2006). Другой возможный способ модуляции специфичности митохондрий - контроль межклеточной концентрации Ca 2+. Помимо производства энергии, митохондрии участвуют в различных сигнальных путях, регулирующих поток Ca 2+ в живых клетках. Ранее предполагалось, что митохондрии по-разному контролируют поток Ca 2+ в зависимости от типа тканей. Эти данные указывают на факт существования тканеспецифичности митохондрий, которая требуют дальнейшего изучения (см. Pizzo P., Drago I., Filadi R., Pozzan T. Mitochondrial Ca2+ homeostasis: Mechanism, role, and tissue specificities. Pflügers Arch. Eur. J. Physiol. 2012;464: 3-17. doi: 10.1007/s00424-012-1122-y).
Аномалии в митохондриях нарушают основные физиологические функции, такие как производство АТФ, окислительное фосфорилирование, производство активных форм кислорода и регуляция Ca 2+. Это считается митохондриальной дисфункцией (см. Brand M.D., Nicholls D.G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem. J. 2011;435:297-312. doi: 10.1042/BJ20110162). Выявлено более 100 митохондриальных заболеваний, вызванных митохондриальными дефектами, включая ожирение, диабет, болезни сердца, нейродегенеративные заболевания и старение. Недавнее исследование показало, что существует клеточно-специфический ответ, вызванный дефектами митохондриальных белков или митохондриальной ДНК (мтДНК) (см. Suomalainen A., Battersby B.J. Mitochondrial diseases: The contribution of organelle stress responses to pathology. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2018; 19: 77-92. doi: 10.1038/nrm.2017.66). Вследствие этого развитие различных типов митохондриальных заболеваний зависит от тканеспецифической митохондриальной дисфункции (см. Wada J., Nakatsuka A. Mitochondrial Dynamics and Mitochondrial Dysfunction in Diabetes. Acta Med. Okayama. 2016;70:151-158; Zong W.-X., Rabinowitz J.D., White E. Mitochondria and Cancer. Mol. Cell. 2016; 61: 667-676. doi: 10.1016/j.molcel.2016.02.011).
В последние годы достижения в области молекулярных и биохимических технологий привели к лучшему пониманию митохондриальных дефектов и их механизмов как причины различных заболеваний, но методов лечения митохондриальных нарушений все еще недостаточно. Были опробованы некоторые препараты для улучшения функции митохондрий и симптомов митохондриальной дисфункции. Такие агенты, как кофермент Q10, идебенон, рибофлавин, дихлорацетат и тиамин, использовались для улучшения функции ETC, а моногидрат креатина использовался в качестве энергетического челнока для движения высокоэнергетического фосфата от митохондрий к цитоплазме. Кроме того, использовались антиоксиданты, такие как витамин C, витамин E и липоевая кислота, были протестированы в качестве добавок для выявления митохондриальных нарушений, а ряд других препаратов является предметом текущих клинических испытаний (см. Horvath R. Update on clinical aspects and treatment of selected vitamin-responsive disorders II (riboflavin and CoQ10) J. Inherit. Metab. Dis. 2012;35:679-687. doi: 10.1007/s10545-011-9434-1; Klopstock T., Metz G., Yu-Wai-Man P., Büchner B., Gallenmüller C., Bailie M., Nwali N., Griffiths P.G., Von Livonius B., Reznicek L., et al. Persistence of the treatment effect of idebenone in Leber’s hereditary optic neuropathy. Brain. 2013;136:e230. doi: 10.1093/brain/aws279; см. Potgieter M., Pretorius E., Pepper M.S. Primary and secondary coenzyme Q10 deficiency: The role of therapeutic supplementation. Nutr. Rev. 2013;71:180-188. doi: 10.1111/nure.12011; El-Hattab A.W., Zarante A.M., Almannai M., Scaglia F. Therapies for mitochondrial diseases and current clinical trials. Mol. Genet. Metab. 2017;122:1-9. doi: 10.1016/j.ymgme.2017.09.009). Однако все исследуемые агенты могут обеспечивать очень ограниченную защиту, и большинство митохондриальных заболеваний считаются необратимыми, поскольку они вызваны повреждением, например мутацией мтДНК. В связи, с чем методы лечения с использованием этих агентов имеют определенные ограничения.
Трансплантация митохондрий - это инновационная стратегия лечения митохондриальной дисфункции, позволяющая преодолеть ограничения методов лечения с использованием химических агентов. Трансплантация митохондрий направлена на перенос функциональных экзогенных митохондрий в митохондриально-дефектные клетки для восстановления или предотвращения митохондриальных заболеваний. Проще говоря, замена старого «двигателя» на новый для восстановления его работоспособности.
Впервые попытка переноса митохондрий была предпринята Кларком и Шэем. Они совместно инкубировали митохондрии, очищенные от клеток, устойчивых к хлорамфениколу и эфрапептину, и клеток млекопитающих, чувствительных к этим антибиотикам. В результате была подтверждена опосредованная митохондриями передача устойчивости к антибиотикам посредством эндоцитоза (см. Clark M.A., Shay J.W. Mitochondrial transformation of mammalian cells. Nat. Cell Biol. 1982;295:605-607. doi: 10.1038/295605a0.). Этот феномен доставки органелл к клеткам-реципиентам может быть применен к митохондриальным заболеваниям. Замена нефункциональных митохондрий в поврежденных тканях или клетках функциональными могла бы стать новым терапевтическим подходом.
Несколько исследований in vitro показали, что межклеточный перенос митохондрий происходит естественным образом. Когда DsRed-меченные митохондрии, выделенные из мезенхимальных клеток (EMC), происходящих из эндометриальных желез матки человека, были совместно инкубированы с изогенными EMC в течение 24 часов, с помощью визуализации живых флуоресцентных клеток наблюдали накопление экзогенных митохондрий в цитоплазме реципиентов (см. Kitani T., Kami D., Kawasaki T., Nakata M., Matoba S., Gojo S. Direct Human Mitochondrial Transfer: A Novel Concept Based on the Endosymbiotic Theory. Transplant. Proc. 2014;46:1233-1236. doi: 10.1016/j.transproceed.2013.11.133). В другом исследовании также было замечено, что ксеногенный перенос митохондрий, выделенных из ткани печени мыши, в клетки человека, лишенные функциональных митохондрий (клетки ρ 0), восстанавливает функцию дыхания (см. Katrangi E., D’Souza G., Boddapati S.V., Kulawiec M., Singh K.K., Bigger B., Weissig V. Xenogenic transfer of isolated murine mitochondria into human rho0 cells can improve respiratory function. Rejuvenation Res. 2007;10:561-570. doi: 10.1089/rej.2007.0575). Представленные результаты доказывают возможность лечения митохондриальных заболеваний с помощью митохондриальной трансплантации.
Терапевтический эффект трансплантации митохондрий оценивали на модели сердечного заболевания. Группа McCully продемонстрировала, что ишемия вызывает дисфункцию митохондрий и подавляет жизнеспособность клеток и восстановление функций кардиомиоцитов после реперфузии (см. Levitsky S., Laurikka J., Stewart R.D., Campos C.T., Lahey S.J., McCully J.D. Mitochondrial DNA deletions in coronary artery bypass grafting patients. Eur. J. Cardiothorac. Surg. 2003;24:777-784. doi: 10.1016/S1010-7940(03)00501-3). Исследователи изолировали митохондрии из ткани, не затронутой ишемией, а затем вводили их в ишемическую зону непосредственно перед реперфузией. Это привело к значительному улучшению постишемического функционального восстановления и жизнеспособности клеток (см. McCully J.D., Cowan D.B., Pacak C.A., Toumpoulis I.K., Dayalan H., Levitsky S. Injection of isolated mitochondria during early reperfusion for cardioprotection. Am. J. Physiol. Circ. Physiol. 2009;296:H94-H105. doi: 10.1152/ajpheart.00567.2008). Продолжая работать в данном направлении, авторы сравнили локализацию митохондрий при двух способах доставки: прямая инъекция митохондрий сердечных фибробластов человека в ишемизированную ткань сердца кролика и сосудистая доставка митохондрий через коронарные артерии в начале реперфузии. Как и ожидалось, непосредственно инъецированные митохондрии были локализованы рядом с местом доставки, тогда как митохондрии, доставленные по сосудам, были обнаружены широко рассредоточенными по всему сердцу, и оба способа доставки обеспечивали кардиопротекцию от ишемии-реперфузионного повреждения (см. Cowan D.B., Yao R., Akurathi V., Snay E.R., Thedsanamoorthy J.K., Zurakowski D., Ericsson M., Friehs I., Wu Y., Levitsky S., et al. Intracoronary Delivery of Mitochondria to the Ischemic Heart for Cardioprotection. LoS ONE. 2016;11:e0160889. doi: 10.1371/journal.pone.0160889).
Терапевтические эффекты митохондриальной трансплантации были подтверждены на нескольких моделях животных, а также в клинике. Группа врачей выполнила аутологичную трансплантацию митохондрий, выделенных из неишемических прямых мышц живота в зону поврежденного миокарда, пациентам с ишемически-реперфузионным повреждением. В результате у четырех из пяти пациентов наблюдалось восстановление функции желудочков и не наблюдалось краткосрочных осложнений, таких как аритмия, внутримиокардиальная гематома или рубцевание, связанных с трансплантацией митохондрий (см. Emani S.M., Piekarski B.L., Harrild D., del Nido P.J., McCully J.D. Autologous mitochondrial transplantation for dysfunction after ischemia-reperfusion injury. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 2017;154: 286-289. doi: 10.1016/j.jtcvs.2017.02.018).
Было показано, что аутологичная трансплантация митохондрий не вызвала какой-либо иммунной реакции на различных моделях животных. Ряд авторов исследовали иммунный ответ, связанный с аллогенной трансплантацией митохондрий. Они вводили митохондрии, выделенные из икроножной мышцы и четырехглавой мышцы бедра, сингенным или аллогенным мышам путем однократной и последовательной внутрибрюшинной инъекции. В результате не было прямой или косвенной, острой или хронической аллореактивности, иммунологической реактивности определенных классов Т-лимфоцитов против трансплантированных митохондрий или реакций молекул молекулярного паттерна, ассоциированных с повреждениями (DAMP), на однократные или последовательные инъекции аутогенных или аллогенных митохондрий (см. Ramirez-Barbieri G., Moskowitzova K., Shin B., Blitzer D., Orfany A., Guariento A., Iken K., Friehs I., Zurakowski D., del Nido P.J., et al. Alloreactivity and allorecognition of syngeneic and allogeneic mitochondria.Мitochondrion. 2019; 46: 103-115. doi: 10.1016/j.mito.2018.03.002). Таким образом, показано, что терапевтический эффект трансплантации митохондрий является потенциальным методом лечения заболеваний, связанных с митохондриальными дефектами, как обсуждается в этом обзоре. Однако есть несколько проблем, которые необходимо преодолеть, чтобы лечение болезни с помощью трансплантации митохондрий могло быть эффективно применено в клинике.
В большинстве исследований подчеркивается, что изоляция митохондрий должна быть завершена в короткие сроки при низкой температуре, поскольку они очень чувствительны, а их активность и выживаемость быстро снижаются. Кроме того, в настоящее время не существует метода длительного хранения митохондрий, поэтому их следует использовать сразу после выделения.
Следовательно, протокол оптимального метода выделения и хранения митохондрий, который поддерживает целостность митохондрий и обеспечивает более длительную выживаемость, должен быть разработан для обеспечения возможности клинического использования (см. Park A., Oh M., Lee S. J., Oh K. J., Lee E. W., Lee S. C., Bae K. H., Han B. S., Kim W. K. Mitochondrial Transplantation as a Novel Therapeutic Strategy for Mitochondrial Diseases. International journal of molecular sciences. 2021;22(9): 4793. https://doi.org/10.3390/ijms22094793).
Техническим результатом настоящего изобретения является создание способа экспериментальной биотерапии, препятствующей развитию инфаркта миокарда у самцов мышей линии С57ВL/6 с меланомой В16/F10, растущей на фоне хронической нейрогенной боли и основанной на трансплантации митохондрий, выделенных из сердца интактных крыс.
Поставленная цель достигается тем, что самцам мышей линии С57ВL/6 сначала воспроизводят хроническую нейрогенную боль, через 2 недели подкожно под лопатку слева вводят суспензию опухолевых клеток мышиной меланомы В16/F10 в 0,5 мл физиологического раствора в разведении 1:20, через 24 часа после перевивки меланомы В16/F10 мышам внутрибрюшинно вводят свежевыделенные митохондрии из сердца интактных крыс: 3,3 мг белка на 1 животное в 0,3 мл физиологического раствора, далее митохондриальную терапию проводят ежедневно.
Изобретение «Способ предотвращения развития инфаркта миокарда у мышей с меланомой развившейся на фоне хронической нейрогенной боли» является новым, так как оно неизвестно в области экспериментальных исследований в онкологии о предотвращении поражения сердца у самцов с сочетанной патологией, приводящей к развитию инфаркта миокарда в 100% случаев, с помощью внутрибрюшинного введения митохондрий, выделенных их сердца крыс обоего пола.
Новизна изобретения заключается в использовании мышей самцов линии С57ВL/6 при развитии у них злокачественного процесса - меланомы В16/F10 на фоне хронической нейрогенной боли и проведении экспериментальной биотерапии митохондриями, выделенными из сердца крыс. Проведение экспериментальной митохондриальной трансплантации приводило к предотвращению развития инфарктов миокарда в 75% случаев, доказанным при морфологическом исследовании.
Изобретение «Способ предотвращения развития инфаркта миокарда у мышей с меланомой В16/F10 развившейся на фоне хронической нейрогенной боли» является промышленно применимым, так как может быть использовано в научно-исследовательских учреждениях онкологического профиля для воспроизведения экспериментальной митохондриальной трансплантации, изучения ее воздействия на миокард.
Для лучшего понимания способа предлагаем фигуры.
Фигура 1. Фрагменты сердца мыши на 3-й неделе роста меланомы В16 в условиях ХНБ: кровоизлияния, некробиоз, базофилия, фиброз в медии ветвей венечных артерий сердца, значительные поля некротически измененной ткани. Окр. гематоксилин-эозином, ув х40, х100.
Фигура 2. Фрагменты сердца мыши на 3-й неделе роста меланомы В16 в условиях ХНБ: эозинофильная инфильтрация, кровоизлияния, фиброз, стирание клеточной структуры кардиомиоцитов и дегенерация ядер. Окр. гематоксилин-эозином, ув.х 100.
Фигура 3. Фрагменты ткани миокада мышей-самцов после проведения МХТ растущей меланомы В16 на фоне хронической нейрогенной боли. Плотное расположение кардиомиоцитов с четкими ядрами и элементами активации деления. В большинстве полей зрения видна значительная активация клеток соединительной ткани, вступающих в межклеточные отношения, образование тяжей молодой соединительной ткани. Окр. гематоксилин-эозином, ув.х 100.
Фигура 4. Фрагменты ткани миокада мышей-самцов после проведения МХТ растущей меланомы В16 на фоне хронической нейрогенной боли. Значительные скопления структурообразующих элементов: фибробластов, гистиоцитов, лимфоцитов, образующих комплексы-ассоциаты, участки рыхлой соединительной ткани.Окр.гематоксилин-эозином, ув.х 100.
Фигура 5. Фрагменты ткани миокада мышей-самцов после проведения МХТ растущей меланомы В16 на фоне хронической нейрогенной боли. Формирование стенок артериол и венул гладкомышечными клетками веретеновидной формы и эластическими волокнами, «сшивание» фиброзированных мелких участков миокарда на фоне развития рыхлой соединительной ткани. Окр. гематоксилин-зозином, ув.х 100.
«Способ предотвращения развития инфаркта миокарда у мышей с меланомой развившейся на фоне хронической нейрогенной боли» выполняется следующим образом.
Воспроизведение хронической нейрогенной боли.
Все манипуляции с животными производятся в боксе. Инструменты, посуду, руки дезинфицируют общепринятым способом. Каждому животному вводят ксилазолетиловый наркоз: за 10 минут до основного наркоза с целью премедикации животному внутримышечно вводят ксилазин (препарат Ксила) в дозе 0,05 мл/кг массы тела (по инструкции), затем - Золетил-50 в дозе 10 мг/100 г массы тела. После наступления медикаментозного сна ассистент фиксирует мышь в положении на животе, удаляет шерсть сзади в районе проекции седалищных нервов и смазывает кожу 70% спиртом. Экспериментатор в стерильных условиях выделяет седалищный нерв, накладывает на него лигатуру, ушивает рану послойно и обрабатывает шов 5% спиртовым раствором йода. Через 2 недели после заживления операционной раны воспроизводили меланому В16/F10.
Воспроизведение меланомы В16/F10.
Самцам мышей линии С57ВL/6 кожу спины ниже угла левой лопатки вводят 0,5 мл взвеси опухолевых клеток мышиной меланомы В16/F10 в физиологическом растворе в разведении 1:20. Для этого, соблюдая все условия асептики, ассистент фиксирует мышь спиной кверху, предварительно обработав кожу 5% спиртовым раствором йода. Экспериментатор рукой в стерильной перчатке захватывает кожную складку, в центре которой прокалывает кожу и вводит опухолевую взвесь В16/F10. После извлечения иглы места введения плотно прижимает ватным тампоном, смоченным в 70% спирте с небольшим добавлением йода, на 1 минуту, чтобы исключить вытекание опухолевого материала.
Выделение митохондрий.
Крысу умерщвляют с помощью гильотины. Сердце перфузируют ледяным стерильным 0,9% раствором KCl. Митохондрии выделяют с применением дифференциального центрифугирования на высокоскоростной рефрижераторной центрифуге Avanti J-E, BECMAN COULTER, USA по методу Егоровой М.В. и Афанасьева С.А. (Егорова М.В., Афанасьев С.А. Выделение митохондрий из клеток и тканей животных и человека: Современные методические приемы. Сибирский медицинский журнал. 2011;26(1-1):22-28). Для разрушения межклеточных связей, клеточной стенки и плазматических мембран применяют механическую обработку тканей с измельчением ножницами и гомогенизацией в стеклянном гомогенизаторе с тефлоновым пестиком (гомогенизатор Поттера-Эльвегейма). На каждый грамм ткани добавляют по 10 мл стерильной среды выделения (0,22 М маннитол, 0,3 М сахароза, 1мМ ЭДТА, 2 мМ TRIS-HCL, 10мМ HEPES, pH 7,4). Ткани гомогенизируют и центрифугируют первый раз 10 мин при скорости 1000 g, температура 0-2 °С, второе и третье центрифугирование осуществляется при 20000 g, 20 мин, температура 0-2 °С. Между центрифугированием проводят процедуру ресуспендирования осадка митохондрий в среде выделения. Митохондрии дополнительно очищают от лизосом, пероксисом, меланосом и т.п., центрифугируя в 23% градиенте Перколла. Суспензию субклеточных структур наслаивают на градиент Перколла, центрифугируют 15 мин при 21000 g, после этого наблюдается разделение на 3 фазы, оставляют нижний слой митохондрий и ресуспендируют средой выделения. Следующую промывку митохондрий осуществляют путем центрифугирования в течение 10 мин при 15000 g, температура 0-2 °С. Митохондриальные образцы разводят 0,9% раствором NaCl до концентрация белка 3,3 мг белка в 0,3 мл физиологического раствора.
Проведение биотерапии митохондриями.
Через 24 часа после перевивки меланомы В16/F10 мышам внутрибрюшинно вводили свежевыделенные митохондрии сердца (3,3 мг белка на 1 животное в 0,3 мл физиологического раствора). Далее митохондриальную терапию (МХ-терапия) проводили ежедневно до окончания эксперимента.
Контролем служат мыши-самцы линии С57ВL/6 с хронической нейрогенной болью и меланомой В16/F10, которым ежедневно внутрибрюшинно вводят 0,3 мл физиологического раствора.
Особенности динамики роста опухолей при росте меланомы В16/F10 на фоне хронической нейрогенной боли при проведении биотерапии митохондриями сердца у мышей линии С57ВL/6 представлены в таблице.
Таблица.
Динамика роста опухолей у мышей линии С57ВL/6 на фоне проведения митохондриальной терапии
Группы
Хроническая нейрогенная боль + В16/F10
Хроническая нейрогенная боль + В16/F10+Митохондриальная терапия
1 неделя n=17
3 неделяn=10
1 неделяn=10
3 неделяn=10
Средний размер опухоли в см<sup>3</sup>
0,06±0,01
3,00±0,58
0,042±0,007<sup>1</sup>
2,65±0,97
Минимальный размер опухоли в см<sup>3</sup>
0,0001
0,45
0,0001
1,24
Максимальный размер опухоли в см<sup>3</sup>
0,125
6,5
0,12
5,47
Наличие повреждения сердца
нет
<b>100%</b>
нет
<b>25%</b>
Наличие метастазов
нет
есть (легкие селезенка 95%)
нет
нет
Наличие некрозов
нет
20%
нет
50%
Примечание: 1 - статистически значимые отличия относительно группы без митохондриальной терапии.
Подкожная опухоль у самцов стала определяться на 7 сутки с момента перевивки меланомы В16/F10. При этом объем опухоли в группе самцов с митохондриальной терапией (МХ-терапией) в этот срок был в 1,4 раза меньше (p<0,05), чем в группе животных без МХ-терапии. На данном этапе эксперимента остальные патологические параметры, характеризующие опухолевый процесс были идентичны во всех исследуемых группах животных. По окончании эксперимента на 21 сутки (3 недели) было определено большее количество некрозов на ткани меланомы (в 2,5 раза) в группе животных с МХ-терапией, чем в группе без МХ-терапии. В ходе ревизии всех органов фиксировали отсутствие метастазов у животных получавших МХ-терапию, при этом у животных без МХ-терапии метастазы были (легкие, селезенка 95%). Особое внимание привлек факт отсутствия повреждения сердечной мышцы у животных с МХ-терапией, в то время как в группе животных без МХ-терапии макроскопически фиксировали наличие повреждений на поверхности сердца у 100% животных.
Микроскопия гистологических срезов миокарда мышей контрольной группы (ХНБ+меланома В16/F10) указывала на выраженные дистрофические изменения кардиомиоцитов (Фиг. 1). В полях зрения наблюдались признаки мутного набухания, жировой дистрофии, вплоть до миолиза и некроза. Дистрофические процессы могли носить очаговый и диффузный характер, нередко локализуясь в субэндокардиальных слоях миокарда. Микроскопически, помимо изменений мышечных волокон, обнаруживалось полнокровие, отек стромы миокарда, выраженная клеточная дистрофия. В сердечной мышце присутствовали резко расширенные полости, тусклость мышцы, о чем свидетельствовало слабое окрашивание клеток. Наряду с отеком обнаруживались скопления лейкоцитов, эозинофилов, лимфоцитов, плазматических клеток, гистиоцитов. Среди особенностей клеточных реакций можно было выделить эозинофильную инфильтрацию, которая напоминала аллергические эозинофильные миокардиты. Таким образом, можно утверждать о некоронарогенном повреждении миокарда.
Особое внимание было уделено состоянию ядер кардиомиоцитов (Фиг. 2). При ишемической болезни сердца крайне редко может наблюдаться деление ядер мышечных клеток сердца путем митоза или амитоза, причем митозы бывают патологическими и завершаются образованием множества микроядер, что можно было ожидать в кардиомиоцитах. Однако, практически невозможно определить участки митотически делящихся клеток.
На исследованных препаратах наблюдалась патологическая картина гибели кардиомиоцитов, сопровождающейся осветлением ядер с рассеянными или линейно собранными вдоль ядерной мембраны крупными зернами хроматина. Обращало внимание наличие васкулизации и утраты четких контуров разобщенных волокон, разлитое пространство некротически измененной ткани на фоне активации фибринолиза в межклеточном пространстве.
Структурные изменения в сердце у мышей линии С57ВL/6 основной группы при росте меланомы В16/F10 на фоне хронической нейрогенной боли под влиянием митохондриальной терапии.
В морфологических образцах сердца основной группы мышей с МХ-терапией не было отмечено ни мелких, ни, тем более, крупных участков некротических процессов (Фиг. 3). При исследовании препаратов сердца с увеличением объектива х100 были проанализированы морфологические события, которые могли свидетельствовать о механизмах и точках приложения митохондриальной терапии.
На представленных фото отчетливо видны волокна кардиомиоцитов, тесно контактирующие с активно растущими фибробластами и гистиоцитами, в буквальном смысле «сшивающими» волокна и восстанавливающими целостность ткани сердца. Форма ядер молодых фибробластов могла быть овальная с большим количеством базофильной цитоплазмы, окружающей ядро. На препаратах в участках развития молодой соединительной ткани определялось значительное скопление лимфоцитов, моноцитов, эозинофилов, которые образовывали комплексы-ассоциаты, необходимые для передачи сигнальной информации в отношении самоорганизации структуры миокарда (Фиг. 4).
Обращает внимание четко проявляющиеся структуры цилиндрических волокон соединительной ткани, в которых не было поперечной исчерченности, характерной для коллагеновых волокон. Эти волокна имели гомогенную аморфную структуру и, очевидно, строились из эластина в непосредственной близости от фибробластов и образовывали свой каркас.
В препаратах сердца основной группы с митохондриальной терапией усиливалась восстановительная динамика высокоорганизованной структуры кардиомиоцитов, наблюдались изменения сосудистой системы коронарного кровообращения, а также «сшивки» разрозненных фиброзированных участков. В поле зрения (Фиг. 5) можно видеть формирование стенок артериол и венул, выполняемую, по-видимому, гладкомышечными клетками веретеновидной формы с центрально расположенным продолговатым ядром, выстроенными в последовательности «косички», оплетающей периметр сосуда или эластическими волокнами, которые четко разграничивали линию территориальной целостности миокарда и просвета кровеносного сосуда.
Технико-экономическая эффективность «Способ предотвращения развития инфаркта миокарда мышей с меланомой, развившейся на фоне хронической нейрогенной боли» заключается в том, что применение внутрибрюшинной митохондриальной терапии у мышей-самцов линии С57ВL/6 с меланомой В16/F10 на фоне хронической нейрогенной боли предотвращает развитие инфаркта миокарда. Это дает возможность изучать патогенез злокачественного роста под влиянием введения суспензии митохондрий и механизм митохондриального воздействия, что важно для клиники.
Способ экономичен, доступен.