Способ оценки имплантационной состоятельности эндометрия при пролиферативно-воспалительных нарушениях в эндометрии при эндометриозе, ассоциированном с эндометриальным фактором бесплодия
METHOD FOR ASSESSMENT OF ENDOMETRIAL IMPLANTATION CONSISTENCY IN PROLIFERATIVE-INFLAMMATORY DISORDERS IN ENDOMETRIUM IN ENDOMETRIOSIS ASSOCIATED WITH ENDOMETRIAL FACTOR OF INFERTILITY

Изобретение относится к области медицины, а именно к патоморфологии, гинекологии и репродуктологии и может быть использовано для выявления нарушений имплантационных возможностей эндометрия при эндометриозе на основании оценки маркеров клеточной пролиферации и воспаления с целью специфической диагностики эндометриального фактора инфертильности, ассоциированного с эндометриозом.
В ряде научных работ, посвященных исследованию эутопического эндометрия при эндометриозе, были продемонстрированы характерные изменения, опосредованные превалированием процессов пролиферации и воспаления, которые негативно влияли на имплантационный потенциал эндометрия, что приводило к инфертильности [1-5]. Данные изменения вызваны дисрегуляцией стероидных гормонов в реализации их ключевого влияния на структурно-функциональные особенности эндометрия в период «окна имплантации», что проявляется в десинхронизации развития желез и стромы эндометрия и свидетельствует о его неготовности к имплантации [6]. Существующие методики диагностики рецептивности эндометрия не идеальны, так как не обладают набором эндометриоз-специфичных маркеров воспаления и пролиферации, что диктует необходимость поиска последних для возможности определения наличия и прогнозирования преодоления эндометриального фактора инфертильности при эндометриозе.
Среди известных в научно-медицинской и патентной литературе методов диагностики пролиферативно-воспалительных нарушений в эндометрии при эндометриозе, ассоциированном с эндометриальным фактором бесплодия, нет ни одного, но общие методы диагностики рецептивности эндометрия известны.
Известен способ прогнозирования рецептивности эндометрия на основании оценки уровня экспрессии и внутриклеточной локализации эзрина в эндометрии женщин с бесплодием и повторными неудачами программы ЭКО (патент РФ 2580629, 15.05.2015 г.). Установлено, что в период «окна имплантации» рецепторный эндометрий характеризуется средней стадией фазы секреции, зрелыми пиноподиями более чем на 20% поверхностного эпителия и высоким уровнем экспрессии эзрина, как в эпителиальном компартменте, так и в пиноподиях. Изобретение позволяет прогнозировать наступления беременности в программах экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) и естественных циклах у женщин с бесплодием.
Недостатком данного способа прогнозирования является ориентация только на один из показателей из целого спектра молекул рецептивности эндометрия - экспрессию фактора адгезии - эзрина. Кроме того, способ прогнозирования основан только на исследовании пациенток с трубно-перитонеальным фактором бесплодия и не учитывал другие факторы нарушения рецептивности эндометрия, такие как эндометриоз.
Известен способ прогнозирования рецептивности эндометрия на основании оценки экспрессии GnRG и GnRGR в "окно имплантации" в эндометрии женщин с бесплодием и неудачными попытками программы ЭКО (патент РФ. 2617515, 22.04.2016 г.). Прогностически неблагоприятными показателями рецептивности эндометрия считают отставание секреторной трансформации эндометрия, снижение количества клеток, содержащих зрелые пиноподии в поверхностном эпителии, менее чем 20%, а также низкую экспрессию (<2 баллов) GnRG и GnRGR.
Недостатками способа являются отсутствие системной патогномоничной детерминации специфических молекул, характеризующих рецептивность эндометрия, лежащих в основе регуляции имплантации, а также отсутствием специфичных для эндометриоз-ассоциированного бесплодия маркеров. Установленная модель с целью прогнозирования имплантационных нарушений базировалась только на анализе эндометриального паттерна у женщин с трубно-перитонеальным фактором бесплодия.
Известен способ оценки рецептивности эндометрия в период "имплантационного окна" (патент РФ 2651762, 23.04.2018 г. - прототип). Для достижения этой цели исследователи методом пайпель-биопсии эндометрия на 20-23 день менструального цикла проанализировали на основании метода иммуногистохимии с использованием двухэтапного стрептавидин-биотин-пероксидазного метода с демаскировкой антигена и с применением ключевых биомолекул, отвечающих за имплантацию: стандартный набор моноклональных и поликлональных антител ERα в строме, PR в строме, р53 в железах, bcl 2 в строме, CD95 в строме, Ki67 в строме, LIFR в железах, LIF в железах эндометрия. На основании полученных результатов исследования авторы рассчитали прогноз рецептивности эндометрия по формуле: d=-1,389x1+0,022x2-0,044x3-0,019x4+0,041x5+0,006x6+0,015x7-3,248, где x1 - индекс ER/PR в строме эндометрия (баллы H-score для определения ядерной экспрессии ER и PR), х2 - р53 в железах эндометрия (% окрашенных ядер в поле зрения), х3 - bcl 2 в строме эндометрия (% окрашенных ядер в поле зрения), х4 - CD95+ в строме эндометрия (% окрашенных клеток), x5 - Ki67 в строме эндометрия (% окрашенных ядер в поле зрения), х6 - LIF-R в железах эндометрия (баллы H-score), х7 - LIF в железах эндометрия (баллы H-score). При значениях d>0 эндометрий характеризовали как рецептивный, при d≤0 эндометрий характеризуется как нерецептивный.
Недостатками данного метода являлось отсутствие оценки патогномоничных для эндометриоз-ассоциированной инфертильности биомолекул, отражающих эпителиомезенхимальные взаимоотношения в эутопическом эндометрии, приводящие к ложным результатам при исследовании рецептивности эндометрия у данной когорты пациенток.
Решаемой технической проблемой явилась необходимость повышения точности оценки имплантационной состоятельности эндометрия при пролиферативно-воспалительных нарушениях в эутопическом эндометрии при эндометриозе, ассоциированном с эндометриальным фактором бесплодия в период «окна имплантации».
В связи с отсутствием высокоспецифичных и чувствительных способов оценки имплантационной состоятельности эндометрия при эндометриоз-ассоциированной инфертильности, предлагаемый способ, основанный на анализе комплекса патогномоничных маркеров эндометриального фактора несостоятельности, расширяет возможности оценки рецептивности у данной когорты пациенток и позволяет прогнозировать восприимчивость эндометрия к имплантации бластоцисты в период «имплантационного окна».
Согласно проведенному собственному исследованию, была продемонстрирована высокая специфичность для эндометриоз-ассоциированного бесплодия такого белка как Cyclin Е и его ингибитора р27, а также транскрипционного фактора BCL6, детерминирующих пролиферативно-воспалительные нарушения в эндометрии. Предлагаемый способ основан на иммуногистохимическом исследовании в эутопическом эндометрии в период «окна имплантации» уровней экспрессии ключевых молекул, отвечающих за воспаление - BCL6, пролиферацию - Cyclin Е и дифференцировку клеток эндометрия - р27.
Учитывая, что Cyclin Е высоко экспрессируется в митотически активных клетках железистого эпителия эндометрия и положительно регулируется эстрогенами, его преимущественная экспрессия в норме наблюдается в 1-ую фазу менструального цикла (пролиферации), которая стихает во 2-ую фазу (секреции). В фазу секреции в связи с начинающейся дифференцировкой клеток с целью подготовки эндометрия к имплантации в норме наблюдается высокая экспрессия р27 - специфического ингибитора Cyclin Е, который находится под непосредственным положительным влиянием прогестерона. В связи с тем, что в эутопическом эндометрии при эндометриоз-ассоциированном бесплодии происходят нарушения соотношений рецепторов к половым гормонам и нарушения в ремоделировании эндометрия, проявляющиеся в десинхронизации развития желез и стромы, в период «окна имплантации» наблюдается обратная зависимость: экспрессия Cyclin Е будет превалировать над р27.
BCL6 является специфичным для эндометриоз-опосредованного воспаления маркером. Нами и зарубежными коллегами была продемонстрирована высокая корреляция гиперэкспрессии BCL6 в эутопическом эндометрии у женщин с эндометриозом и бесплодием в период «окна имплантации» [7].
Достигаемым техническим результатом является точное определение вероятности определения восприимчивости эндометрия к имплантации бластоцисты в период «имплантационного окна» на основании оценки его пролиферативно-воспалительного паттерна у пациенток с эндометриальным фактором бесплодия, обусловленного эндометриозом.
• Разработан способ оценки рецептивности эндометрия в период «имплантационного окна», согласно которому на 7 день после пика лютеинизирующего гормона, определяемого в сыворотке крови при динамическом исследовании в околоовуляторный период (как правило, этот период соответствует 20-22 дням менструального цикла) производят пайпель-биопсию эндометрия. Полученный материал исследуют методом иммуногистохимии с применением наборов моноклональных антител к следующим маркерам: Cyclin Е и р 27 в железах эндометрия, BCL6 в строме и в железах. Производится подсчет процента окрашенных клеток, после чего производится оценка реакции: нет реакции - ≤1%, низкая экспрессия - 2-10%, умеренная экспрессия - 11-50%, выраженная экспрессия - ≥51%. Трактовка ИГХ реакции проводится путем сравнения полученных данных с нормами значений, полученных от здоровых фертильных женщин без эндометриоза.
В настоящее исследование были включены 65 женщин в возрасте от 29 до 40 лет (средний возраст составил 35±4,2 года) с морфологически и лапароскопически верифицированным диагнозом наружный генитальный эндометриоз (код по МКБ10 - N80.0), а также инфертильностью (код по МКБ10 N 97.7, установленные в рубрике другие формы женского бесплодия).
Основную группу (n=32) составили пациентки с наружным генитальным эндометриозом и бесплодием, вызванным эндометриальным фактором (средняя продолжительность бесплодия 4,5±0,8), имеющие de facto в анамнезе 2 и более безуспешные попытки переноса 1 эмбриона хорошего качества в полость матки при проведении программ ЭКО (группа ЭАБ - эндометриоз-ассоциированного бесплодия).
Группу сравнения (n=33) составили пациентки с наружным генитальным эндометриозом, реализовавшие свою репродуктивную функцию и не имевшие в анамнезе инфертильности, которые обратились для хирургического лечения тазовой боли, ассоциированной эндометриозом (группа ЭФ - фертильные женщины с эндометриозом).
Группу морфологического контроля (n=13) составили фертильные женщины без эндометриоза, имеющие в анамнезе 2 и более родов доношенными здоровыми детьми, давшие добровольное информированное согласие на участие в исследовании.
Иммуногистохимическое исследование биоптатов эндометрия, взятых методом пайпель-биопсии в период предполагаемого «окна имплантации» - на 7 день после пика лютеинизирующего гормона, определяемого в сыворотке крови при динамическом исследовании в околоовуляторный период (как правило, этот период соответствует 20-22 дням менструального цикла) - проводилось с использованием двухэтапного стрептавидин-биотин-пероксидазного метода с демаскировкой антигена и применением стандартных наборов моноклональных и поликлональных антител фирмы «Ventana», «Cell Marque» и «Diagnostic BioSystems» США. Иммуногистохимическое окрашивание производилось в иммуностейнере Ventana BenchMark ULTRA IHC/ISH (США) на парафиновых срезах по стандартной методике с предварительной демаскировкой антигенов в СВЧ-печи с использованием соответствующих стандартных антител выявляли маркеры (таблица 1).
Был проведен анализ рецепторного аппарата эндометрия у женщин с эндометриоз-ассоциированным бесплодием, фертильных женщин с эндометриозом и фертильных женщин без эндометриоза, последние составили группу морфологического контроля (Таблица 2).
В эутопическом эндометрии в период «окна имплантации» у пациенток с эндометриальным фактором эндометриоз-ассоциированного бесплодия (группа ЭАБ) в сравнении с биоптатами женщин с эндометриозом и сохранной фертильной функцией (группа ЭФ) установлены достоверные иммуногистохимические пролиферативные детерминанты. На фоне десинхронной трансформации эпителиально-мезенхимального компартмента определяется статистически значимое повышение экспрессии Cyclin Е в железах в группах ЭАБ и ЭФ (в 6,5 раза; 46,6% против 7,2%, соответственно) при низкой экспрессии его ингибитора - р 27 в железах (в 2,2 раза; 76,1% против 35%, соответственно), что нарушает имплантационный паттерн эндометрия (р<0,05).
Кроме этого, в эутопическом эндометрии женщин исследуемых когорт на фоне прогрессирующей локальной пролиферации высокая экспрессия BCL6 в железах (в 2,3 раза; 75,5% против 33,2% в группах ЭАБ и ЭФ) и BCL6 в строме (в 2,6 раза; 15,6% против 6%, соответственно, р<0,05) свидетельствовала о ее усилении и потенциировании локальных гиперергических реакций, препятствующих имплантации.
Таким образом, на основании полученных статистически значимых результатов установлены признаки пролиферативно-воспалительных нарушений и имплантационной несостоятельности эутопического эндометрия у женщин с эндометриальным фактором инфертильности, вызванной эндометриозом.
При иммуногистохимическом исследовании биоптатов эутопического эндометрия у женщин с эндометриоз-ассоциированным бесплодием были установлены патогномоничные пределы чувствительности для маркера пролиферации (Cyclin Е), эндометриоз-опосредованного воспаления (BCL6) и маркера дифференцировки клеток (р 27) (таблица 3).
С целью прогноза наступления имплантации подсчитывается сумма полученных баллов:
• 4 балла - экстремально высокий риск имплантационной несостоятельности (прогноз отрицательный);
• 3 балла - высокий риск имплантационной несостоятельности (прогноз отрицательный);
• 2 балла - умеренный риск имплантационной несостоятельности (прогноз сомнительный);
• 0-1 балл - низкий риск имплантационной несостоятельности (прогноз положительный).
Таким образом, у пациенток с эндометриозом и эндометриоз-ассоциированном бесплодием наблюдается нарушение рецептивности эндометрия в связи с локальными пролиферативно-воспалительными процессами, дезорганизующими синхронизацию развития желез и стромы эндометрия, что реализуется в имплантационной недостаточности.
Способ осуществляют следующим образом.
Проводят биопсию эндометрия в период предполагаемого «окна имплантации» - на 7 день после пика лютеинизирующего гормона, определяемого в сыворотке крови при динамическом исследовании в околоовуляторный период (как правило, этот период соответствует 20-22 дням менструального цикла) в спонтанном цикле, либо в цикле, предшествующем проведению ЭКО, с помощью аспирационной кюретки. Полученный материал после гистологической проводки в автоматическом гистопроцессоре Leica ASP 30, заливают в парафин на станции Leica EG 1150 (Германия). ИГХ окрашивание производят в иммуностейнере Ventana BenchMark ULTRA IHC/ISH (США) на депарафинизированных и дегидратированных срезах толщиной 4-6 мкм с использованием авидин-биотинового иммунопероксидазного метода. Уровень экспрессии ERα, ERβ, PR, BCL6 в строме и железах, Cyclin Е и р27 только в железах эндометрия определяют в соответствие с описанными выше методиками с применением соответствующих моноклональных и поликлональных антител. Производится подсчет процента окрашенных клеток, после чего производится оценка реакции: нет реакции - ≤1%, низкая экспрессия - 2-10%, умеренная экспрессия - 11-50%, выраженная экспрессия - ≥ 51%. Трактовка результатов ИГХ реакции проводится с по стандартным методам оценки эстрогеновых и прогестероновых рецепторов. Трактовка ИГХ реакции для эндометриоз-специфических маркеров и маркера рецептивной несостоятельности проводится путем сравнения полученных данных со следующими параметрами:
• если экспрессия Cyclin Е ≥ 46%, то риск имплантационной несостоятельности высокий - 1 балл, если < 46%, низкий - 0 баллов;
• если экспрессия р27 ≤ 35%, то риск имплантационной несостоятельности высокий - 1 балл, если > 35%, низкий - 0 баллов;
• если экспрессия BCL6 в железах ≥ 75%, то риск имплантационной несостоятельности высокий - 1 балл, если < 75%, низкий - 0 баллов;
• если экспрессия BCL6 в строме ≥ 15%, то риск имплантационной несостоятельности высокий - 1 балл, если < 15%, низкий - 0 баллов.
Далее с целью прогноза наступления беременности подсчитывается сумма полученных баллов Cyclin Е + р27 + BCL6 в железах + BCL6 в строме и делаются следующие заключения:
• 4 балла - очень высокий риск имплантационной несостоятельности (прогноз отрицательный);
• 3 балла - высокий риск имплантационной несостоятельности (прогноз отрицательный);
• 2 балла - умеренный риск имплантационной несостоятельности (прогноз сомнительный);
• 0-1 балл - низкий риск имплантационной несостоятельности (прогноз положительный).
Клинический пример 1
Пациентка М., 33 лет с жалобами на отсутствие наступления беременности в течение 5 лет регулярной половой жизни без контрацепции. Бесплодие первичное. Супруг обследован, мужской фактор бесплодия исключен. Соматически не отягощена. Из гинекологического анамнеза менархе с 14 лет, менструации по 5-6 дней через 28 дней, болезненные (по ВАШ 6-7 б), умеренные, регулярные. Боль во время цикла компенсирует ежемесячным применением НПВС в течение 3 дней. Половая жизнь с 19 лет, в браке. В анамнезе 2 операции по поводу эндометриомы левого яичника и ее рецидива - была произведена лапароскопия, энуклеация капсулы эндометриомы, адгезиолизис и морфологическая верификация диагноза. Получала курсами адъювантную гормональную терапию (аГнРГ). С целью преодоления бесплодия было проведено ЭКО и криоконсервация полученных эмбрионов. В анамнезе 3 неудачных попытки переноса эмбрионов высокого качества. При гистероскопии после 3-х неудачных попыток и прицельной биопсии эндометрия - патологии не выявлено. Перед проведением следующей попытки переноса эмбрионов была произведена контрольная пайпель-биопсия эндометрия на 21 день менструального цикла.
По данным иммуногистохимического исследования получены следующие результаты: Cyclin Е в железах=55,% (1б); р27 в железах=12%(1б); BCL6 в железах=81%(1б); BCL6 в строме=22%(1б).
Сумма баллов составляет 4 балла, что свидетельствует об очень высоком риске имплантационной несостоятельности эндометрия и отрицательном прогнозе о вероятности имплантации.
После переноса эуплоидного эмбриона хорошего качества (было проведено преимплантационное генетическое тестирование на анеуплоидии) в полость матки в следующем менструальном цикле беременность не наступила.
Клинический пример 2
Пациентка А., 34 лет. с жалобами на отсутствие наступления беременности в течение 7 лет регулярной половой жизни без контрацепции. Бесплодие первичное. Супруг обследован, мужской фактор бесплодия исключен. Соматическая патология: субклинический гипотиреоз, медикаментозная компенсация. Гинекологические заболевания: наружный генитальный эндометриоз - билатеральные эндометриомы (проведена лапароскопия, энуклеация капсул). С целью профилактики рецидива получала курсовую гормональную терапию (аГнРГ, диеногест в стандартных дозировках) в течение 12 месяцев. В анамнезе 3 неудачных попытки имплантации при переносе эмбрионов высокого качества (4АВ): 1 перенос в стимулированном цикле, 2 - в криоцикле. По данным сонографического исследования перед переносом эмбрионов не было выявлено признаков рецидива наружного генитального эндометриоза и пролиферативных болезней эндометрия (толщина, структура и кровоснабжение эндометрия соответствовали дню менструального цикла на момент исследования). Результаты диагностической гистероскопии на 9 день менструального цикла после 3-х неудачных попыток переноса эмбрионов не выявили патологии в полости матки; аспират из полости матки показал соответствие пролифертивной фазе менструального цикла. С целью оценки имплантационных возможностей эндометрия перед проведением следующей попытки переноса эмбрионов была произведена контрольная пайпель-биопсия эндометрия на 22 день менструального цикла. По данным иммуногистохимического исследования получены следующие результаты:
По данным иммуногистохимического исследования получены следующие результаты: Cyclin Е в железах=33% (0б); р27 в железах=62%(0б); BCL6 в железах=25%(0б); BCL6 в строме=6%(0б).
Сумма баллов составляет 0 баллов, что свидетельствует о низком риске имплантационной несостоятельности эндометрия и положительном прогнозе о вероятности имплантации.
В следующем менструальном цикле был произведен перенос эмбриона хорошего качества, наступила клиническая прогрессирующая маточная беременность (подтвержденная визуализацией сердцебиения эмбриона и соответствующему сроку уровню ХГЧ в крови), таким образом фертильность была достигнута.
Список литературы
1. Lessey ВА, Lebovic DI, Taylor RN. Eutopic endometrium in women with endometriosis: ground zero for the study of implantation defects. Seminars in reproductive medicine. 2013; 31: 109-24.
2. Bruce A Lessey, J. Julie Kim. Endometrial Receptivity in Eutopic Endometrium of Women with Endometriosis It is affected, let me show you why. Fertil Steril. 2017 Jul; 108(1): 19-27.
3. Evans MB, Decherney AH. Fertility and endometriosis. Clin Obstet Gynecol. 2017; 60: 497-502.
4. McKinnon B, Mueller M, Montgomery G. Progesterone Resistance in Endometriosis: an Acquired Property? Trends Endocrinol Metab. 2018 Aug;29(8):535-548.
5. M.P. Оразов, М.Б. Хамошина, Л.М. Михалева, С.В. Волкова, М.З. Абитова, В.Б. Шустова, Т.Н. Хованская. Молекулярно-генетические особенности состояния эндометрия при эндометриоз-ассоциированном бесплодии. Трудный пациент; 1(18): 6-15. 2020.
6. Kliman HJ, Frankfurter D. Clinical approach to recurrent implantation failure: evidence-based evaluation of the endometrium. Fertil Steril. 2019 Apr; 111(4):618-628.
7. Evans-Hoeker E, Lessey BA, Jeong JW, Savaris RF, Palomino WA, Yuan L, Schammel DP, Young SL. Endometrial BCL6 Overexpression in Eutopic Endometrium of Women With Endometriosis. Reprod Sci. 2016 Sep;23(9): 1234-41.