Противоопухолевое средство
ANTITUMOR AGENT

Изобретение относится к новой группе соединений, представляющих собой моноаддукты фактора некроза опухолей-альфа (ФНО-альфа) человека и аминобисфосфоната, имеющие повышенное сродство к костной ткани, и может быть использовано в биотехнологии, фармакологии и медицине.
На основании существующего уровня знаний проблема создания эффективных и безопасных средств лечения метастазов костей может быть подразделена на несколько самостоятельных проблем. Первая из них заключается в необходимости выбора противоопухолевого препарата, обладающего высокой активностью и максимально возможной селективностью воздействия на опухолевые клетки. Это проблема является общей для лечения злокачественных опухолей разного генеза и локализации. Вторая - необходимость ингибирования процесса разрушения костной ткани, индуцированной опухолевым процессом, и инициации ее восстановления. И наконец, третья проблема-проблема доставки лекарственного вещества в патологический очаг кости.
Формирование и развитие метастазов опухоли в костную ткань вызывает прогрессивно развивающееся изменение структуры костей скелета и, как следствие, ухудшение либо утрату опорно-двигательной функции костной системы. Известно, что патологический процесс, протекающий в кости, является результатом опосредованной индукции разрушения костной ткани под действием факторов, выделяемых злокачественными клетками.
Проникая в кость, опухолевая клетка формирует метастатический очаг в костном мозге, который выделяет биологически активные вещества, стимулирующие остеокласты. В норме остеокласты необходимы для костного ремоделирования - процесса «обновления» костной ткани путем разрушения «изношенных» участков, которые практически синхронно воссоздаются заново при помощи остеобластов. За счет баланса между активностью остеобластов и остеокластов в течение всей жизни человека происходит обновление костной ткани. Опухолевые клетки нарушают этот баланс, и разрушение костных структур начинает превалировать. В результате даже если опухоль подавлена эффективной терапией, активность остеокластов может препятствовать восстановлению поврежденной кости или замедлять его достаточно длительное время. В конечном итоге появляется очаг деструкции в костной ткани, т.е. остеолитический метастаз [Coleman R.E. Adjuvant bisphosphonates in breast cancer: are we witnessing the emergence of a new therapeutic strategy? // Eur. J. Cancer. - 2009. - Vol. 45. - P. 1909-1915.].
Очевидно, что залогом успешного лечения костных метастазов, с одной стороны, является направленное и эффективное воздействие на опухолевые клетки, вызывающее их гибель, и, с другой стороны, дополнительное воздействие в виде веществ, ингибирующих активность остеокластов и/или активирующих созревание и функцию остеобластов.
В настоящее время известен широкий спектр противоопухолевых препаратов, способных оказывать цитотоксическое воздействие на клетки солидных опухолей, имеющих способность к метастазированию. Противоопухолевые химиопрепараты позволяют получить хорошие результаты торможения опухолевого процесса. Однако эти лекарственные средства, как правило, синтетические, обладают выраженной токсичностью, их длительное использование может приводить к иммуносупрессии и возникновению вторичных опухолей. Поэтому обосновано внимание исследователей к биологически активным веществам природного происхождения, обладающим противоопухолевым потенциалом. К ним можно отнести интерфероны альфа и гамма, факторы некроза опухоли (ФНО), интерлейкин 12, 24, факторы дифференцировки [Сысоева Г.М., Даниленко Е.Д., Левагина Г.М., Масычева В.И. Влияние композиционного препарата интерферона-гамма с его индуктором на пролиферативную активность лимфоцитов // Вест. Урал. мед. академ. науки - 2009. - №2/1(24). - (тематич. вып. по аллергологии и иммунологии). - С. 228-229.]. Несомненным преимуществом использования в лечебных целях природных противоопухолевых препаратов или их рекомбинантных аналогов является избирательность их действия, биодеградируемость, что позволяет обеспечить более естественный, а значит, с меньшими нежелательными эффектами способ лечения злокачественных новообразований.
Существенным моментом является также то, что цитокины, обладающие противоопухолевыми свойствами, такие как ФНО-альфа, принимают активное участие в регуляции процессов ремоделирования кости, обеспечивая поддержание баланса между активностью остеобластов и остеокластов. Есть данные о том, что фактор некроза опухолей альфа наряду с IL-1β, IL-6 и IL-11 является стимулятором остеокластогенеза [Риггз Б.Л., Мелтон Л.Д. 3-й. Остеопороз. Пер. с англ. М. - Спб.: ЗАО «Издательство БИНОМ», «Невский диалект», 2000; Храмцова С.Н., Щеплягина Л.А. Роль цитокинов и гормонов в формировании костной ткани // Рос. педиатр. журн. - 2005. - №5. - С. 25-29]. С другой стороны, показано, что ФНО-альфа - антирезорбтивный цитокин [Насонов Е.Л., Скрипникова И.А., Насонова В.А. Проблема остеопороза в ревматологии. Москва, «Стин», 1997; Ishizuka S., Kurihara N., Hiruma Y., Miura D., Namekawa J., Tamura A., Kato-Nakamura Y., Nakano Y., Takenouchi K., Hashimoto Y., Nagasawa K., Roodman G.D. 1-alpha,25-Dihydroxyvitamin D(3)-26,23-lactam analogues function as vitamin D receptor antagonists in human and rodent cells // J. Steroid Biochem. Mol. Biol. - 2008. - Vol. 110, N. 3-5. - P. 269-277], который участвует в обеспечении кооперации лимфоцитов и мезенхимальных стволовых клеток, стимулируя тем самым продукцию основных модуляторов ремоделирования костной ткани (IL-4, 10 и INF-γ).
На основании этих данных можно заключить, что ФНО-альфа является перспективным противоопухолевым и антирезорбтивным препаратом для использования в качестве активного компонента при разработке лекарственных средств направленной терапии костных метастазов.
Одной из главных проблем с точки зрения лечения метастазов костей является способ эффективной доставки этих веществ в опухоль. В настоящее время во многих лабораториях мира ведутся работы по созданию средств доставки противоопухолевых препаратов с целью получения средств направленного действия или так называемых таргетных препаратов (target preparation).
Среди таргетированных (адресованных) препаратов ФНО-альфа привлекают внимание моноаддукты этого цитокина, которые характеризуются ковалентным присоединением к молекуле цитокина одной молекулы адресного агента любой химической природы для минимизации возможных побочных эффектов, связанных с избыточной модификацией молекулы цитокина. Одновременно решается задача повышения устойчивости цитокина к протеолизу и, следовательно, уменьшения эффективной дозы ФНО-альфа, имеющего выраженное цитотоксическое действие.
В литературе описаны примеры таргетированных к опухоли производных цитокинов, полученных с применением методологии рекомбинантных ДНК. Такие гибридные цитокины имеют строго детерминированную первичную структуру и, следовательно, строго определенное пространственное расположение составляющих гибридную молекулу частей, что гарантирует воспроизводимость физико-химических свойств и биологических эффектов препаратов. Этот подход дал толчок развитию иммунотерапии опухолей, позволяющей направленно доставлять иммунорегуляторные лиганды в опухоль или дистантно расположенные метастазы [см., например, Khawli L.A., Hu P., Epstein A.L. Cytokine, chemokine, and co-stimulatory fusion proteins for the immunotherapy of solid tumors // Handb. Exp. Pharmacol. - 2008. - Vol. 181. - P. 291-328].
Известен гибрид ФНО-альфа мыши и фрагмента антитела L19scFv, высокоаффинного к экстрадомену В (ED-B) фибронектина - маркера ангиогенеза, который иммуногистохимически не детектируется в здоровых тканях. Гибридный белок представлял собой конструкцию, состоящую из сигнального пептида, фрагмента L19scFv, линкера из 15 аминокислот и ФНО-альфа мыши. Гибридная молекула селективно доставлялась в кровеносные сосуды опухоли, где иммунореактивный и биологически активный гомотример ФНО-альфа накапливался. Противоопухолевая активность гибридного белка L19mTNF-альфа была выше таковой интактного ФНО-альфа и его гибрида с фрагментом антитела, неспецифичного к использованной в эксперименте опухолевой модели (клетки эмбриональной тератосаркомы мыши Т9, введенные подкожно). Действие гибрида ФНО-альфа с фрагментом антитела значительно усиливается при комбинированной терапии с доксорубицином [Hemmerle Т., Probst P., Giovannoni L., Green A.J., Meyer Т., Ner D. The antibody-based targeted delivery of TNF in combination with doxorubicin eradicates sarcomas in mice and confers protective immunity // British J. Cancer - 2013. - Vol. 109. - P. 1206-1213].
Таргетирование ФНО-альфа к клеткам карциномы толстого кишечника было осуществлено гибридными молекулами цитокина, соединенного с С-концевой частью антитела chTNT-3, специфичного к внутриклеточным компонентам некротизированных областей опухолей (однонитевой ДНК) [Sharifi J., Khawli L.A., Hu P., Li J., Epstein A.L. Generation of human interferon gamma and tumor necrosis factor alpha chimeric TNT-3 fusion proteins // Hybrid Hybridomics. - 2002. - Vol. 21. - P. 421-432].
Y
В целом к 2012 г. было описано порядка десятка примеров иммунных гибридов ФНО-альфа [Pasche N., Neri D. Immunocytokines: a novel class of potent armed antibodies // Drug Discovery Today. - 2012. - Vol. 17. - P. 583-590], один из которых (L19-TNF) находился на II фазе клинических испытаний. Среди мишеней для иммунотоксина были: высокомолекулярный ассоциированный с меланомой гликопротеин gp240, неэкспрессирующийся или очень слабо экспрессирующийся в нормальных клетках; фибробласт-активирующий белок (FAP) FAP-положительных эндотелиальных клеток опухолевых капилляров; поверхностный антиген G250 карбоангидразы IX (СА IX), связанный с ангиогенезом почечной карциномы; карциноэмбриональный антиген CEA; рецептор эпидермального фактора роста (EGFR) трансплантатов EGFR-позитивной меланомы; Le-антиген ксенографтов опухоли молочной железы человека MCF-7 и уже упомянутые выше однонитевая ДНК и экстрадомен В (EDB) фибронектина [Pasche N., Neri D., 2012]. Как видно, иммунотоксины на основе ФНО-альфа, созданные генно-инженерным способом, пока не имеют мишеней, связанных с костной тканью.
Фрагменты антител являются не единственным видом адресующих агентов для направленной доставки ФНО-альфа в опухоли, которые могут быть получены с применением методов генетической инженерии. Другим типом моноаддуктов ФНО-альфа, создаваемых генно-инженерными методами, являются гибридные молекулы, состоящие из цитокина и пептидных лигандов для клеточных рецепторов. Подход основан на том, что многие пептиды, которые узнаются рецепторами опухолей или опухолевого микроокружения, имеют общие мотивы, такие как NGR и RGD, узнаваемыми факторами ангиогенеза [см. обзоры Kapoor Р, Singh Н, Gautam A, Chaudhary К, Kumar R, Raghava G.P. TumorHoPe: a database of tumor homing peptides // PLoS One. - 2012. - Vol. 7(4): e35187; Corti A., Curnis F., Rossoni G., Marcucci F., Gregorc V. Peptide-mediated targeting of cytokines to tumor vasculature: the NGR-hTNF example // BioDrugs. - 2013. - Vol. 27. - P. 591-560]. Описаны производные ФНО-альфа, предназначенные для адресной доставки в сосуды опухолей и имеющие в качестве мишени аминопептидазу N (CD 13). Этот подход позволяет использовать низкие дозы цитокина. Гибрид ФНО-альфа, присоединенный к С-концу пептида CNGRCG (NGR-TNF), доставлялся в пикограммовых дозах в сосуды опухолей RMA-T лимфомы или B16F1 меланомы у мышей [Curnis F., Sacchi A., Corti А. Improving chemotherapeutic drug penetration in tumors by vascular targeting and barrier alteration // J. Clin. Invest. - 2002. - Vol. 110. - P. 475-482] и способствовал усилению проникновения химиотерапевтических препаратов (доксорубицина и мелфалана) при комбинированной терапии.
Другим примером является конструирование гибридной молекулы, в которой к N-концу ФНО-альфа был присоединен фрагмент из гексагистидинового якоря (для облегчения очистки гибридного белка) и циклического пептида ТСР-1 - CTPSPFSHC. Этот пептид, как и пептид NGR, способен образовывать цикл за счет внутримолекулярной дисульфидной связи между остатками цистеина [Lu L., Li Z.J., Li L.F., Wu W.K., Shen J., Zhang L., Chan R.L., Yu L., Liu Y.W., Ren S.X., Chan K.M., Cho C.H. Vascular-targeted TNFα improves tumor blood vessel function and enhances antitumor immunity and chemotherapy in colorectal cancer // J. Control. Release. - 2015. - Vol. 210. - P. 134-146]. Пептид ТСР-1 был обнаружен с использованием методологии фагового дисплея на сосудах ортотопической опухоли прямой кишки, благодаря которой специфический лиганд может быть идентифицирован без точного знания его рецептора [Li Z.J., Wu W.K., Ng S.S., Yu L., Li H.T., Wong C.C., Wu Y.C., Zhang L., Ren S.X., Sun X.G., Chan K.M., Cho C.H. A novel peptide specifically targeting the vasculature of orthotopic colorectal cancer for imaging detection and drug delivery // J. Control. Release. - 2010. - Vol. 148. - P. 292-302]. TCP-1/TNFα индуцировал апоптоз, уменьшал количество микрокапилляров в опухоли и повышал эффективность комбинированной с 5-фторурацилом терапии в гораздо большей степени, чем интактный ФНО-альфа [Lu L., et al., 2015].
Как и в случае иммунотоксинов на основе ФНО-альфа, созданные генно-инженерным способом гибридные молекулы, содержащие пептидные лиганды к опухолевым рецепторам, пока не имеют выраженной адресации к костной ткани.
Генно-инженерный подход может быть использован для получения таргетированных производных ФНО-альфа, содержащих адресующий фрагмент белковой природы. В иных случаях аддукты ФНО-альфа получают с использованием химических реакций in vitro. Как и для многих других белков, для ФНО-альфа эффективным оказалось получение конъюгатов с синтетическими или природными полимерами - полиэтиленгликолем [Tsutsumi Y., Kihira Т., Tsunoda S., Kamada H., Nakagawa S., Kaneda Y., Kanamori Т., Mayumi T. Molecular design of hybrid tumor necrosis factor-alpha III: polyethylene glycol-modified tumor necrosis factor-alpha has markedly enhanced antitumor potency due to longer plasma half-life and higher tumor accumulation // J. Pharmacol. Exp. Ther. - 1996. - Vol. 278. - P. 1006-1011], поливинилпирролидоном [Kamada H., Tsutsumi Y., Yamamoto Y., Kihira Т., Kaneda Y., Mu Y., Kodaira H., Tsunoda S.I., Nakagawa S., Mayumi T. Antitumor activity of tumor necrosis factor - a conjugated with polyvinylpyrrolidone on solid tumors in mice // Cancer Res. - 2000. - Vol. 60. - P. 6416-6420], желатином [Tabata Y, Uno K, Ikada Y, Muramatsu S. Suppressive effect of recombinant TNF-gelatin conjugate on murine tumour growth in vivo // J. Pharm. Pharmacol. - 1993. - Vol. 45. - P. 303-308]. Химическая модификация ФНО-альфа водорастворимыми нетоксичными полимерами позволяет повысить устойчивость цитокина к протеолизу, увеличить время полужизни в крови, значительно повысить его терапевтический потенциал. В то же время, химическая реакция модификации протекает по всем доступным сайтам белка (аминогруппам лизина), что приводит к получению множественных аддуктов и значительному уменьшению специфической активности ФНО-альфа - тем большей, чем выше степень модификации. Моноаддукты в этих условиях являются одними из продуктов реакции модификации, часто не основными.
Частичное решение проблемы было предложено [Tsunoda S., Ishikawa Т., Yamamoto Y., Kamada H., Koizumi К., Matsui J., Tsutsumi Y., Hirano Т., Mayumi T. Enhanced antitumor potency of polyethylene glycolylated tumor necrosis factor - α: a novel polymer-conjugation technique with a reversible amino-protective reagent // J. Pharmacol. Exp. Ther. - 1999. - Vol. 290. - P. 368-372], которые перед реакцией конъюгации аминогруппы остатков лизина в ФНО-альфа защищали обратимой реакцией с амино-протективным реагентом - диметилмалеиновым ангидридом (DMMAn). После защиты аминогрупп ФНО-альфа конъюгировали с активированным полиэтиленгликолем, затем снимали защиту с аминогрупп. Полученный с применением DMMAn ПЭГелированный ФНО-альфа имел на 20-40% более высокую специфическую активность, чем ПЭГелированый белок без предварительной обработки DMMAn.
Дальнейшим развитием направления стало получение ПЭГелированных производных, чувствительных к катепсину В [Dai С., Fu Y, Li В., Wang Y., Zhang X., Wang J., Zhang Q. Linkage with cathepsin B-sensitive dipeptide promotes the in vitro and in vivo anticancer activity of PEGylated tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) against murine fibrosarcoma // Sci. China Life Sci. - 2011. - Vol. 54. - P. 128-138], что достигалось введением линкера, состоящего из остатков валина и цитруллина. Зависимое от катепсина высвобождение ФНО-альфа улучшало фармакокинетику и фармакодинамику препарата. Как и «обычный» ПЭГелированный ФНО-альфа, высвобождаемый ПЭГелированный ФНО-альфа (rPEG-TNF-α) имел примерно в 60 раз большее время полужизни, чем интактный цитокин. Кроме того, активность rPEG-TNF-α была выше, чем у ПЭГелированного ФНО-альфа с той же степенью модификации. rPEG-TNF-α на линиях клеток В16 и L929 был в 5 и 9 раз более активным, чем ПЭГелированный ФНО-альфа [Dai С., Fu Y., Chen S., Li В., Yao В., Liu W., Zhu L., Chen N., Chen J., Zhang Q. Preparation and evaluation of a new releasable PEGylated tumor necrosis factor-α (TNF-α) conjugate for therapeutic application // Sci China Life Sci. - 2013. - Vol. 56. - P. 51-58].
Несмотря на значительное усиление терапевтического потенциала ФНО-альфа его конъюгаты с различными полимерами не являются таргетированными к костной ткани. Очевидно, что для выполнения функции средства направленной доставки в костную ткань вещества-переносчики должны обладать высоким аффинитетом к гидроксиапатиту костного матрикса. В качестве одного из таких перспективных векторов можно рассматривать бисфосфонаты (бифосфонаты).
3
1
2
3
1
2
Бисфосфонаты - производные фосфоновых кислот, синтетические аналоги эндогенных пирофосфатов, участвующих в остеогенезе, имеющие общую формулу OP-C(RR)-PO, где R и R представляют собой атом водорода, гидроксильную группу или радикал. Механизм действия этих препаратов обусловлен сходностью их структуры со структурой пирофосфатов. Однако в отличие от пирофосфатов бисфосфонаты, имеющие связи Р-С-Р, устойчивы к действию гидролитических ферментов. Молекулы бисфосфонатов соединяются с кальцием и накапливаются только в костях, что объясняет их высокую селективность к костной ткани. Доказанным свойством бисфосфонатов является быстрое и массированное накопление в кости (около 55% от введенной дозы после однократного внутривенного введения) [Caraglia М., Marra М., Naviglio S., Botti G., Addeo R., Abbruzzese A. Zoledronic acid: an unending tale for an antiresorptive agent // Expert. Opin. Pharmacother. - 2010. - Vol. 11, N. 1. - Р. 141-154].
Применение бисфосфонатов, ингибирующих резорбцию кости, прогрессию костных метастазов и снижающих риск развития осложнений, обусловленных метастатическим поражением костей, в течение последних десятилетий стало общепринятым компонентом лечения [Polascik T.J. Bisphosphonates in oncology: evidence for the prevention of skeletal events in patients with bone metastases // Drug Des. Devel. Ther. - 2009. - Vol. 3. - P. 27-40].
Преимуществом бисфосфонатов перед другими известными веществами, отличающимися сродством к гидроксиапатиту, является то, что помимо способности к высокой степени аккумуляции в костной ткани бисфосфонаты обладают самостоятельной фармакологической активностью. Показано, что при лечении бисфосфонатами в адъювантном режиме наблюдается снижение уровня костного метастазирования и/или значимое увеличение выживаемости, что дало основание предположить наличие у них противоопухолевого эффекта [Coleman R.E. Adjuvant bisphosphonates in breast cancer: are we witnessing the emergence of a new therapeutic strategy? // Eur. J. Cancer. - 2009. - Vol. 45. - P. 1909-1915]. Противоопухолевая активность бисфосфонатов была продемонстрирована в культурах клеток рака молочной железы, простаты и миеломы [Marra М., Salzano G., Leonetti С., et al. New self-assembly nanoparticles and stealth liposomes for the delivery of zoledronic acid: a comparative study // Biotechnol. Adv. - 2012. - Vol. 30. - P. 302-309].
1
2
2
2
2
2
Среди аминобисфосфонатов различных поколений авторами была выбрана алендроновая кислота (4-амино-1-гидроксибутилиден)-дифосфоновая кислота) - бисфосфонат, в котором заместитель R представляет собой гидроксильную группу, а боковой радикал R содержит первичную аминогруппу (-CHCHCHNH) (формула 1).
Сравнение эффективности связывания аминобисфосфонатов с гидроксилапатитом, проведенное различными методами, показало, что аминоалкилбифосфонаты, такие как паминдронат, алендронат и неридронат, имеют наибольшую связывающую способность [Ebetino F.H., Hogan A.M., Sun S., et al. The relationship between the chemistry and biological activity of the bisphosphonates // Bone. - 2011. - Vol. 49. - P. 20-33]. Помимо повышенной тропности к костной ткани алендроновая кислота привлекательна наличием первичной аминогруппы, что позволяет достаточно просто получать ее конъюгаты с белками. При этом не затрагиваются фосфонатные группы, определяющие эффективность связывания бисфосфоната с костным матриксом. Белки, конъюгированные с аминобисфосфонатами, в экспериментах in vitro проявляли высокое сродство к гидроксилапатиту, находясь в течение длительного времени в связанном с носителем состоянии [Zhang Х.-М., Weber I., Chen М. - J. Site-directed mutational analysis of human tumor necrosis factor-α receptor binding site and structure-functional relationship // J. Biol. Chem. - 1992. - Vol. 267. - P. 24069-24075].
Данных, описывающих конъюгаты ФНО-альфа и бисфосфонатов, в научной и патентной литературе не найдено.
Наиболее близким аналогом (прототипом) является противоопухолевое средство, включающее ФНО-альфа и бисфосфонаты (заявка Японии JP 2012205581, МПК А61Р 35/04, опубликовано 25.10.2012 г.). В заявке приведены данные по использованию средства для целей клеточной терапии. Композиция представляет собой смесь цитокинов (интерлейкины 2 и 18, ФНО-альфа, бисфосфоната золендроновой кислоты и фибронектина). Установлено, что внесение данной композиции в среду культивирования мононуклеарных клеток человека способствует активации натуральных киллеров, что повышает эффективность клеточной противоопухолевой терапии онкологических больных.
Недостатком противоопухолевого средства-прототипа является невозможность использования для лечения опухолевых метастазов костей вследствие отсутствия ковалентной связи ФНО-альфа с бисфосфонатом, в результате чего бисфосфонат в составе данной композиции не обладает свойствами векторной молекулы. Кроме того, по данным разработчика композиции действие ее ограничено системой in vitro.
Техническим результатом заявляемого изобретения является создание средства против метастазов костей на основе ФНО-альфа и аминобисфосфоната со свойствами векторной молекулы, направленного против опухолевых метастазов костной ткани.
Указанный технический результат достигается получением средства против метастазов костей, включающего аминобисфосфонат и фактор некроза опухолей альфа (ФНО-альфа) человека, согласно изобретению в качестве аминобисфосфоната средство содержит алендроновую кислоту, а алендроновая кислота и фактор некроза опухолей - альфа (ФНО-альфа) человека связаны между собой через спейсерный участок (Y) в виде моноаддукта, имеющего высокое сродство к гидроксилапатиту и следующую структуру:
где: Y - спейсерный участок, структура которого зависит от способа конъюгации;
АЛН - алендроновая кислота.
В первом варианте алендроновая кислота присоединена к ФНО-альфа через аминогруппу белка, моноаддукт получен реакцией в присутствии глутарового альдегида и имеет следующую структуру:
где: АЛН - алендроновая кислота.
2
3
-N=CH-(CH)-CH=N- спейсерный участок (Y).
Во втором варианте алендроновая кислота присоединена к ФНО-альфа через тиогруппу белка, моноаддукт получен с помощью бифункционального сшивающего агента Sulfo-SMCC (сульфосукцинимидил-4-[N-малеимидометил]-циклогексан-1-карбоксилата), способен расщепляться в присутствии восстанавливающих агентов с освобождением интактного ФНО-альфа и имеет следующую структуру:
где: АЛН - алендроновая кислота.
Указанный технический результат достигается также тем, что средство для лечения метастазов костей, включающее аминобисфосфонат и фактор некроза опухолей-альфа (ФНО-альфа) человека, согласно изобретению в качестве аминобисфосфоната средство содержит алендроновую кислоту, а алендроновая кислота и фактор некроза опухолей-альфа (ФНО-альфа) человека связаны между собой в виде моноаддукта, имеющего высокое сродство к гидроксилапатиту, причем, алендроновая кислота присоединена к ФНО-альфа через карбоксигруппу белка, моноаддукт получен реакцией в присутствии водорастворимого карбодиимида и имеет следующую структуру:
где: АЛН - алендроновая кислота.
Моноаддукт характеризуется стехиометрией: 1 моль алендроновой кислоты на 1 моль ФНО-альфа.
Алендроновая кислота обеспечивает адресную доставку ФНО-альфа к костной ткани. Выбор алендроната среди аминобисфосфонатов обусловлен его высокой активностью и наименьшими побочными эффектами, а также наличием первичной аминогруппы, облегчающей проведение реакции ковалентного связывания с белковой молекулой. Производные ФНО-альфа человека, представленные в виде моноаддутов с алендроновой кислотой, характеризующихся строгой стехиометрией (1 моль алендроновой кислоты на 1 моль ФНО-альфа), сохраняют высокую специфическую активность, сопоставимую с таковой для интактного белка, и имеют повышенное сродство к основному минеральному компоненту костей - гидроксилапатиту.
Присоединение аминобисфосфоната, в частности алендроновой кислоты, к ФНО-альфа может производиться различными методами и затрагивать амино- и карбоксильные группы белка. Ковалентное связывание фактора некроза опухолей-альфа и аминобисфосфоната в стехиометрическом отношении 1:1 должно в наименьшей степени влиять на специфическую активность цитокина, придавая ему повышенное сродство к гидроксилапатиту.
Присоединение аминобисфосфоната к ФНО-альфа может быть произведено через аминогруппу белка с использованием такого сшивающего агента как глутаровый альдегид. Полученный таким образом моноаддукт аминобисфосфоната и ФНО-альфа химически стабилен, сохраняет высокую специфическую активность и имеет высокое сродство к гидроксилапатиту.
Присоединение аминобисфосфоната через его аминогруппу к ФНО-альфа может быть произведено через карбоксильную группу белка с использованием такого конденсирующего агента, как карбодиимид. Полученный таким образом моноаддукт аминобисфосфоната и ФНО-альфа химически стабилен, сохраняет высокую специфическую активность и имеет высокое сродство к гидроксилапатиту.
Присоединение аминобисфосфоната к ФНО-альфа может быть произведено через сульфгидрильную группу белка с использованием бифункционального сшивающего агента, например сульфосукцинимидил-4-[N-малеимидометил]-циклогексан-1-карбоксилата (Sulfo-SCMM), образующего мостик между аминогруппой аминобисфосфоната и тиогруппой белка. Полученный таким образом моноаддукт аминобисфосфоната и ФНО-альфа химически стабилен в физиологических условиях, но может подвергаться специфическому расщеплению в присутствии таких восстанавливающих агентов, как цистеин или глутатион. Аддукт сохраняет высокую специфическую активность и имеет высокое сродство к гидроксилапатиту.
Действие моноаддуктов ФНО-альфа с алендроновой кислотой, полученных в стехиометрическом отношении 1:1 в реакциях с использованием глутарового альдегида или водорастворимого карбодиимида, предполагается следующим образом.
1) После введения в организм препарата моноаддукта ФНО-альфа с алендроновой кислотой происходит его накопление в костной ткани, которое может достигать значительной величины. Так как моноаддукт ФНО-альфа с аминобисфосфонатом прочно фиксирован на гидроксилапатите за счет фосфонатных групп, а концентрация белка в зоне связывания с костью относительно низка, тример ФНО-альфа может подвергаться диссоциации на мономерные молекулы. Интактные мономерные молекулы белка, не зафиксированные прочно на гидроксилапатите, могут покинуть зону связывания с гидроксилапатитом и в последующем в процессе реассоциации образовать активный тример, способный связываться со специфическими рецепторами опухолевых клеток. Процесс диссоциации и реассоциации тримера ФНО-альфа является концентрационно зависимым [Narhi L.O., Arakawa Т. Dissociation of recombinant tumor necrosis factor-alpha studied by gel permeation chromatography // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1987. - Vol. l47(2). - P. 740-746; Corti A., Fassina G., Marcucci F., Barbanti E., Cassani G. Oligomeric tumour necrosis factor alpha slowly converts into inactive forms at bioactive levels // Biochem. J. - 1992. - Vol. 284 (Pt 3). - P. 905-910] и может протекать с обменом мономерных цепей [Kenig М., Peternel S., Gaberc-Porekar V., Menart V. Influence of the protein oligomericity on final yield after affinity tag removal in purification of recombinant proteins // J.Chromatography A. - 2006. - Vol. 1101. - P. 293-306]. Иммобилизация ФНО-альфа не препятствует диссоциации тримера [Poiesi С., Albertini A., Ghielmi S., Cassani G., Corti A. Kinetic analysis of TNF-alpha oligomer-monomer transition by surface plasmon resonance and immunochemical methods // Cytokine. - 1993. - Vol. 5(6). - P. 539-545].
2) После введения в организм препарата моноаддукта ФНО-альфа с алендроновой кислотой тример ФНО-альфа может контактировать непосредственно с опухолевой клеткой и связываться со специфическим рецептором. Как показано в экспериментах in vitro, моноаддукты ФНО-альфа с алендроновой кислотой сохраняют свою специфическую активность (см. ниже примеры 2 и 3).
Действие моноаддукта ФНО-альфа с алендроновой кислотой, связанных через сульфгидрильную группу белка в результате реакции с использованием бифункционального сшивающего агента, например Sulfo-SMCC, полученного в стехиометрическом отношении 1:1, предполагается следующим образом.
1) Согласно механизмам 1 и 2, описанным для действия моноаддуктов ФНО-альфа с алендроновой кислотой, полученных в стехиометрическом отношении 1:1 в реакциях с использованием глутарового альдегида или водорастворимого карбодиимида. Моноаддукт со связью аминобисфосфоната через сульфгидрильную группу белка, как показано в экспериментах in vitro, сохраняет свою специфическую активность (см. ниже пример 1).
2) Расщепление моноаддукта, зафиксированного на поверхности гидроксилапатита эндогенными сульфгидрильными агентами, такими как цистеин или восстановленный глутатион, присутствующими в биологических жидкостях. Образующийся в результате расщепления активный тример может связываться непосредственно со специфичным к ФНО-альфа рецептором.
Изобретение иллюстрируется следующими графическими материалами. На фиг. 1 представлены графики десорбции свободного ФНО-альфа и ФНО-альфа в составе конъюгата с гидроксилапатита. На фиг. 2 изображены графики определения молекулярной массы конъюгатов ФНО-альфа с алендроновой кислотой гель-хроматографией на сефакриле S-200. На фиг. 3 приведены результаты иммуноферментного анализа, подтверждающие сохранение конъюгатом (моноаддуктом) способности к связыванию со специфическими антителами к ФНО-альфа. На фиг. 4 приведены изображения гистологических срезов эпифиза бедренной кости мыши с привитой меланомой B16-F10 после введения физиологического раствора (контроль, А) или конъюгата ФНО-альфа с алендроновой кислотой, полученного с помощью 1-этил-3-[3-диметиламинопропил]карбодиимид гидрохлорида (Б). Окраска гематоксилином и эозином. Обозначения: (А) К - компактное костное вещество, КМ - костномозговая полость, заполненная опухолевыми клетками. Стрелками показаны костные трабекулы, звездочкой - надкостница с метастазом; (Б) стрелками показаны бесклеточные участки костных трабекул (костные секвестры), звездочками отмечены участки некроза опухолевых клеток.
Сущность изобретения поясняется, но не ограничивается, следующими примерами 1-4. Полученные моноаддукты характеризовали по молярному отношению ФНО-альфа/алендроновая кислота, чистоте продукта, определенной методом гель-электрофореза в полностью денатурирующих условиях, способности к образованию тримеров, к связыванию со специфическими антителами, сохранению специфической биологической активности в опытах in vitro по цитотоксическому действию препаратов на клетки линии L929, по эффективности связывания с гидроксилапатитом - основным минеральным компонентом костей (по увеличению ионной силы раствора, необходимой для элюции конъюгата по сравнении с интактным ФНО-альфа - соответственно 0,8 и 0,2 М фосфат калия), по уровню противоопухолевой активности на экспериментальной модели костных метастазов меланомы B16-F10.
Пример 1. Аддукт ФНО-альфа с алендроновой кислотой по тиогруппе белка, полученный реакцией в присутствии бифункционального сшивающего агента Sulfo-SMCC (сульфосукцинимидил-4-[N-малеимидометил]-циклогексан-1-карбоксилата):
где: АЛН - алендроновая кислота.
спейсерный участок.
7
Определение содержания белка и бисфосфоната дало весовое отношение 91,5:1 или молярное ФНО-альфа : алендроновая кислота 1:0,74. Чистота и гомогенность конъюгата 95,7%. Специфическая активность - 2,2×10 МЕ/мг. Связывание с гидроксилапатитом не менее 1 мг/мл смолы, конъюгат элюируется со смолы значительно позднее интактного ФНО-альфа (фиг. 1). По результатам гель-хроматографии на сефакриле S-200 конъюгат представляет собой тример с кажущейся молекулярной массой 53 кДа (фиг. 2). Согласно результатам иммуноферментного анализа конъюгат сохраняет способность к связыванию со специфическими антителами к ФНО-альфа (фиг. 3).
Пример 2. Аддукт ФНО-альфа с алендроновой кислотой по карбоксигруппе белка, полученный реакцией в присутствии водорастворимого карбодиимида:
где: АЛН - алендроновая кислота.
7
Определение содержания белка и бисфосфоната дало весовое отношение 73:1 и молярное отношение ФНО-альфа : алендроновая кислота 1:0,93. Чистота и гомогенность конъюгата 95,3%. Специфическая активность - 2,2×10 МЕ/мг. Связывание с гидроксилапатитом - не менее 1 мг/мл смолы, конъюгат элюируется 0,8 М калий-фосфатом и не содержит интактного ФНО-альфа. По результатам гель-хроматографии на сефакриле S-200 конъюгат представляет собой тример с кажущейся молекулярной массой 53 кДа. Конъюгат сохраняет способность к связыванию со специфическими антителами к ФНО-альфа (фиг. 3).
Пример 3. Аддукт ФНО-альфа с алендроновой кислотой по аминогруппе белка, полученный реакцией в присутствии глутарового альдегида:
где: АЛН - алендроновая кислота;
2
3
-N=CH-(CH)-CH=N- спейсерный участок.
7
Определение содержания белка и бисфосфоната дало весовое отношение 73:1 или молярное ФНО-альфа: алендроновая 1:0,92. Чистота и гомогенность конъюгата 95,7%. Специфическая активность 2,1×10 МЕ/мг. Связывание с гидроксилапатитом - не менее 1 мг/мл смолы, конъюгат элюируется 0,8 М калий-фосфатом и не содержит интактного ФНО-альфа. По результатам гель-хроматографии на сефакриле S-200 конъюгат представляет собой тример с кажущейся молекулярной массой 53 кДа. Конъюгат сохраняет способность к связыванию со специфическими антителами к ФНО-альфа (фиг. 3).
Следовательно, моноаддукт аминобисфосфоната и ФНО-альфа химически стабилен в физиологических условиях, сохраняет высокую специфическую активность, имеет высокое сродство к гидроксилапатиту, способен расщепляться в присутствии восстанавливающих агентов с освобождением интактного ФНО-альфа (пример 1), сохраняет характерную тримерную структуру нативного ФНО-альфа.
5
5
Пример 4. На фиг. 4 приведены светооптические изображения костных метастазов бедренных костей мышей линии С57Вl/6, полученных после трансплантации клеток меланомы B16-F10 (10 клеток/мышь, внутрисердечно) и трехкратного введения физиологического раствора (А) или конъюгата ФНО-альфа с алендроновой кислотой (10 МЕ/мышь, внутривенно, на 14, 16 и 18 сутки после перевивки опухоли) (Б). В качестве препарата сравнения в эксперименте использовали исходный ФНО-альфа в эквивалентной дозе. Взятие биологического материала проводили через двое суток после третьей инъекции (21 сутки после прививки опухоли). Бедренные кости подвергали декальцинации в растворе «Биодек», после чего обрабатывали стандартными методами и окрашивали гематоксилином и эозином. Парафиновые срезы бедренных костей для светооптического исследования делали на одинаковом уровне относительно дистального эпифиза бедренной кости, в области локализации метастазов.
На изображении среза эпифиза бедренной кости мыши контрольной группы с привитой меланомой B16-F10, представленном на фиг. 4А, отчетливо видны резорбция костной ткани и трабекул и заполнение костномозговой полости и слоя надкостницы метастазами. В компактном костном веществе отмечено расслоение и отделение костных пластинок друг от друга, расширение пространства лакун. Образовавшиеся полости занимают около 20-30% от площади компактного костного вещества, в них выявляются опухолевые клетки. Компактное костное вещество фрагментируются, появляется его зернистость. Все это свидетельствует о том, что меланома B16-F10 формирует крупные метастазы в полостях эпифиза бедренных костей мышей и вызывает существенные повреждения костной ткани.
На срезах эпифизов костей мышей, которым прививали меланому В16-F10 и вводили конъюгат ФНО-альфа с алендроновой кислотой, отмечаются зоны некроза опухоли, которые составляют от 40 до 90% площади метастаза (фиг. 4Б). Полости кости, заполненные жидкостью и веществом, окрашиваемым в серый цвет при окраске срезов гематоксилин и эозином, в опытной группе занимают около 2-5% от площади кости, что в 6-10 раз ниже показателей контрольной группы. По морфологическим признакам трабекулы костей опытных мышей повреждены меньше, чем у мышей контрольной группы.
Трехкратное введение препарата сравнения ФНО-альфа мышам с экспериментальными костными метастазами меланомы B16-F10 не оказывало видимого эффекта на рост метастазов опухоли в бедренных костях мышей.
Таким образом, на примере экспериментальной модели костных метастазов меланомы B16-F10 показано, что моноаддукт ФНО-альфа и алендроновой кислоты в отличие от препарата сравнения ФНО-альфа вызывает некроз опухолевых метастазов и снижает степень повреждения костной ткани эпифизов бедренных костей, что выражается в уменьшении полостей в компактном костном веществе, меньшей степени повреждения костного вещества компактной кости и костных трабекул.
Вышеприведенные примеры 1-4 подтверждают достижение заявляемого технического результата, а именно: создано противоопухолевое средство в виде моноаддукта ФНО-альфа и бисфосфоната со свойствами векторной молекулы, направленного против опухолевых метастазов костной ткани, которое может быть использовано для лечения опухолей, метастазирующих в костную систему, в частности меланомы.