Условия функционирования амперометрического биосенсора на основе моноаминоксидазы

УЧЕНЫЕ ЗАПИСКИ КАЗАНСКОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО УНИВЕРСИТЕТА

Том 148, кн. 2

Естественные науки

2006

УДК 543.866

УСЛОВИЯ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ АМПЕРОМЕТРИЧЕСКОГО БИОСЕНСОРА НА ОСНОВЕ МОНОАМИНОКСИДАЗЫ

Э.П. Медянцева, Р.М. Варламова, Д.А. Гималетдинова, А.Н. Фаттахова, Г.К. Будников

Аннотация

Найдены приемы и рассмотрены подходы к разработке амперометрического биосенсора на основе иммобилизованной моноаминоксидазы (МАО) и электродов из стек-лоуглерода и платины. Выбраны наилучшие условия его функционирования: фоновый электролит-ацетатный буфер рН 5.5, концентрация субстрата - 1-10-3. Аналитические возможности биосенсора показаны на примере определения антидепрессантов петили-ла и пиразидола с нижней границей определяемых содержаний (Сн) 8-10-8 моль/л и 8-10-7 моль/л соответственно.

Введение

Для решения фундаментальных проблем биологической и медицинской химии, непосредственно связанных с актуальными задачами современной теоретической и клинической медицины, первостепенное значение имеет изучение природы ключевых ферментов, нарушение функций которых представляет собой ведущее звено в механизме расстройств процессов обмена веществ при патологических состояниях. К числу таких веществ принадлежат аминоксида-зы - окислительные ферменты, которые катализируют дезаминирование важнейших нейромедиаторов и биогенных аминов, участвующих также в регуляции функции сердечно-сосудистой системы, роста и деления клетки [1].

Среди большого числа биологически активных веществ биогенные амины занимают особое место. Это группа азотсодержащих органических соединений, образующихся в организме человека путем декароксилирования аминокислот. Многие из биогенных аминов - гистамин, серотонин, норадреналин, адреналин, тирамин - оказывают воздействие на процессы торможения и возбуждения в коре головного мозга и подкорковых центров, вызывают сдвиг кровяного давления расширением или сужением сосудов и другие изменения в организме. Биогенные амины, образующиеся в толстом кишечнике человека и животных под действием гнилостных бактерий, токсичны для организма. Некоторые биогенные амины входят в состав лекарственных препаратов, биологических жидкостей; нарушение обмена аминов в организме приводит к различным заболеваниям соматического и психического характера, что вызывает необходимость контроля их метаболизма в организме, а также необходимость разработки селективных и чувствительных методов определения аминосоединений для про-

ведения клинических анализов. Поэтому изучение действия ингибиторов и активаторов аминоксидаз, представляется перспективным направлением исследований в области биологической и медицинской химии.

Наиболее часто для определения биогенных аминов используют различные варианты хроматографии, а также методы анализа, основанные на вольтампе-рометрических измерениях. В то же время примеры биосенсоров на основе иммобилизованной моноаминооксидазы (МАО) немногочисленны и относятся, в основном, к биосенсорам с потенциометрической регистрацией аналитического сигнала [2-4]. Поэтому разработка новых аналитических устройств, сочетающих избирательность действия моноаминооксидазы с чувствительными амперометрическими способами детекции, представляется актуальной задачей.

Анализ литературных данных показывает, что методы количественного определения биогенных аминов постоянно находятся в поле зрения исследователей. Однако все существующие методы их определения имеют определенные недостатки: сложная пробоподготовка образца, трудоемкость выполнения анализов, высокие требования к квалификации персонала и относительно высокая стоимость применяемого (хроматографического) оборудования.

Вольтамперометрическое определение биогенных аминов не отличается в большинстве случаев высокой избирательностью, особенно в случае сложных органических матриц. Несколько лучшие результаты по избирательности и чувствительности определений позволяют получить модифицированные электроды с заданными свойствами [5, 6]. Однако получение модифицированных поверхностей требует определенного навыка работы, т. к. от качества поверхности зависит воспроизводимость результатов и форма наблюдаемых вольтам-перограмм. Кроме того, наилучшие результаты наблюдаются, зачастую, для узкого круга соединений.

Таким образом, разработка новых аналитических устройств, позволяющих с высокой чувствительностью и избирательностью определять биогенные амины, лекарственные соединения, оценивать уровень каталитической активности жизненно важного фермента, обладающих определенной универсальностью действия, представляет интерес для биомедицинских исследований, пищевой и фармацевтической промышленностей. Можно ожидать, что разработка и применение амперометрических биосенсоров на основе иммобилизованной МАО, особенно в сочетании с приемами иммуноэкстракции, будут относиться именно к тем разработкам, которые удовлетворяют современным требованиям, предъявляемым к методам контроля качества жизни.

Результаты и обсуждение

Продуктами ферментативной реакции окислительного дезаминирования моноаминов являются альдегид и пероксид водорода, которые, согласно литературным данным [7], при определенных условиях проявляют электрохимическую активность, что может быть использовано в аналитических целях для разработки устройств, позволяющих регистрировать физиологически активные концентрации биогенных аминов:

МАО

Я-СШ-КШ + 02 +Н2О

ЯСНО + 1ЧНз + Н2О2.

Экспериментально показано, что альдегиды (на примере бензальдегида) на электродах из стеклоуглерода (платины) электрохимически не окисляются в доступной области потенциалов. Поэтому на данном этапе исследования, регистрацию аналитического сигнала осуществляли по величине электрохимического сигнала окисления пероксида водорода.

Окисление пероксида водорода на стеклоуглеродном и платиновом электродах протекает по следующему уравнению:

Н2О2 = О2 + 2Н+ + 2е.

Предварительные исследования электрохимического окисления пероксида водорода в области рН от 4 до 5.5 (на фоне ацетатных буферных растворов) на стеклоуглеродном и платиновом электродах показали, что максимум аналитического сигнала проявляется при Е = 0.8 0.9 В.

Именно ток при потенциале 0.8 В был использован в дальнейшем для контроля за свойствами иммобилизованной МАО (рис. 1, 2). Линейная зависимость между величиной тока и концентрацией пероксида водорода сохраняется в интервале концентраций 5-10 - 110-4 моль/л.

I, мкА 40 -|

Е, мВ

Рис. 1. Электрохимическое поведение пероксида водорода на стеклоуглеродном электроде. Концентрация пероксида водорода - 5-10-3 М. Ацетатный буферный раствор с рН 5.5. Скорость изменения потенциала 1 В/с

Таким образом, проведенные исследования показали, что и стеклоуглерод-ный и платиновый электроды могут быть использованы в качестве первичного физического преобразователя при разработке соответствующего биохимического сенсора. Разработка такого вида биохимических сенсоров связана с необходимостью использования образцов иммобилизованной МАО (ИМАО).

Для получения образцов ИМАО применяли частично очищенную микро-сомальную фракцию моноаминоксидазы фронтальной коры головного мозга человека с активностью 43-10- мкмоль серотонина / мин.-мг белка.

/, мкА

2

1.8 -

1.6 -

1.4 -

1.2

3.5

—I—

4.5

5.5

РН

Рис. 2. Зависимость тока окисления пероксида водорода от рН

Для иммобилизации моноаминоксидазы в качестве матрицы использовали пищевой желатин марки П-11, из которого получали пленки с включенным в их состав ферментом.

Исходя из биокаталитической реакции с участием МАО и литературных данных можно утверждать, что в качестве специфичных субстратов МАО могут выступать несколько соединений. Некоторые из них и были экспериментально опробованы в различных условиях.

В частности, к числу таких соединений относятся: дофамин, адреналин, норадреналин, серотонин. Дофамин - один из доступных и недорогих субстратов МАО.

В роли электрохимически активной детектирующей системы применяли фермент-субстратную систему моноаминооксидаза типа А (МАО) - дофамин. Для детекции конечного аналитического сигнала использовали амперометри-ческий биосенсор на основе стеклоуглеродного электрода и биочувствительной части из желатиновой мембраны с включенной в нее МАО.

МАО катализирует реакции окислительного дезаминирования дофамина. Продуктами такой реакции являются альдегид, пероксид водорода и аммиак.

Биокаталитическая реакция с использованием дофамина в качестве субстрата может быть представлена в следующем виде:

ОН

МАО

ОН

О

ОН

СН2—СН2—|\1Н2

СН2— С.

+1ЧНз+ Н2О2 О

\

Н

В рассматриваемых условиях наблюдается электроокисление и самого дофамина на стеклоуглероде при потенциале +0.55 В. В присутствии же иммоби-лизованой МАО в растворах дофамина можно наблюдать появление дополни-

Рис. 3. Вольтамперограммы ацетатного буферного раствора с рН 5.5

тельного аналитического сигнала при потенциале +0.8 В, что соответствует окислению пероксида водорода (рис. 3).

Известно, что кислород воздуха легко окисляет гидрохиноновый фрагмент молекул катехоламинов, а в щелочных средах это окисление значительно ускоряется, а ИМАО проявляет наибольшую каталитическую активность именно в слабо-щелочной среде [2]. При рН 5.5 не наблюдается окисления самого дофамина, в то же время ИМАО проявляет еще достаточную каталитическую активность. Буферные растворы с таким значением рН использовали в качестве фоновых электролитов.

Большая разница в потенциалах (почти 0.3 В) позволяет получать аналитические сигналы, достаточно хорошо различимые по потенциалам, что не мешает фиксированию каждого отдельного сигнала в присутствии другого.

Наблюдаемые пики тока необратимы и контролируются скоростью протекания биокаталитической реакции (СЕ-механизм).

Изучение аналитического сигнала (ток электроокисления пероксида водорода) при использовании различных концентраций субстрата показало, что наиболее удобный для расчетов аналитический сигнал (по величине и форме) наблюдался при концентрации субстрата 1-10" М. Использование меньших концентраций (1-10 М) приводило к получению небольшого по величине аналитического сигнала. Выбранное значение концентрации субстрата использовали при всех дальнейших измерениях и определениях с помощью МАО-биосенсора.

Линейная зависимость между величиной тока окисления продукта реакции (пероксид водорода) при соответствующем потенциале и концентрацией субстрата наблюдается в области концентраций 5-10 - 1-10 с выходом на предел при концентрации 110-3 М (рис. 4).

Полученные результаты показывают, что биокаталитическая реакция протекает во времени (рис. 5). Система приходит в равновесное состояние через 14-15 мин., что отражается в выходе на предел аналитического сигнала.

I, мкА 2.00

1.801.601.401.20-

2.8 3 3.2 3.4 3.6 3.8 4 -1д С

Рис. 4. Зависимость аналитического сигнала от концентрации субстрата

Наилучшие условия функционирования разработанного биосенсора: оптимальная концентрация субстрата - 1 • 10-3 М, рН = 5.5, время инкубирования фермент-субстратного комплекса - 15 мин.

Подтверждением того, что наблюдаемый аналитический сигнал относится к пику окисления пероксида водорода, служит и то, что использование других соединений, относящихся к субстратам МАО, из перечисленных в начале этого раздела в качестве субстратов, также дает его после соответствующей инкубации.

Рис. 5. Зависимость тока окисления пероксида водорода от времени инкубации фермента с субстратом рН = 5.5 ацетатный буферный раствор

Полученные результаты позволяют рассчитать изменение удельной каталитической активности иммобилизованной МАО. Для этого использовали формулу:

А = Сх • V /(г -1000 • т),

где А - активность фермента в мМоль/мин.-см2, С - концентрация субстрата (дофамина) в моль/л, V - объем исследуемого раствора в мл, ^ - время фикси-

Табл. 1

Изменение удельной каталитической активности ИМАО во времени

Время хранения ИМАО Удельная активность, мкмоль/мин.-см2

1 неделя 3.1 ± 0.2

2 неделя 3.0 ± 0.2

1 месяц 2.8 ± 0.2

рования аналитического сигнала в мин., - площадь, используемой в составе биосенсора мембраны с иммобилизованным ферментом в см .

Концентрацию субстрата, участвующую в реакции окислительного деза-минирования, находили из зависимости тока окисления пероксида водорода от концентрации субстрата. Время ферментативной реакции варьировали от 5 до 10 мин.

Полученные результаты приведены в табл. 1.

Согласно литературным данным, к соединениям, оказывающим влияние на соответствующую биокаталитическую реакцию, можно отнести вещества, влияющие на электрохимическое поведение дофамина, например, трицикличе-ский антидепрессант дезипрамина гидрохлорид (петилил). Он ингибирует обратный захват норадреналина, дофамина, серотанина, что приводит к их накоплению в синаптической щели и усилению физиологической активности.

Предварительные исследования показали, что в присутствии петилила наблюдается изменение высоты пика дофамина при Е = +0.55 В. В определенной области концентраций петилила наблюдается увеличение величины аналитического сигнала дофамина и уменьшение сигнала от пероксида водорода, что указывает на его ингибирующее действие на МАО. Установлено, что такое действие петилила проявляется в области концентраций от 1-10 - 110-моль/л.

Градуировочный график, построенный для определения петилила, имел линейный участок, описываемый уравнением

I р10 = (135 ± 2) + (-(17.0 ± 0.3))(-^ С), г = 0.9997.

Правильность определения петилила с помощью разработанной методики была оценена на модельных растворах способом «введено - найдено» (табл. 2).

Согласно литературным данным [8], в качестве ингибиторов МАО могут выступать некоторые из лекарственных соединений, например, пиразидол, являющийся ингибитором моноаминоксидазы обратимого действия.

Показана возможность определения пиразидола в интервале концентраций 110-4 - 1-10-6 моль/л, что может быть использовано для оценки качества содержащих его фармакологических форм и содержания остаточных количеств этого лекарственного препарата в физиологических жидкостях.

Градуировочный график, построенный для определения пиразидола, имел линейный участок, описываемый уравнением

1р10 = (8.5 ± 0.3) + (-(8 ± 1))(- С), г = 0.9997.

Правильность определения петилила с помощью разработанной методики была оценена на модельных растворах способом «введено - найдено» (табл. 3).

Табл. 2

Результаты определение петилила с помощью биосенсора на основе ИМАО

Введено, моль/л Найдено, моль/л Sr

5-10-5 (5.3 ± 0.2)-10-5 0.020

5-10-6 (5.2 ± 0.2)-10-6 0.030

5-10-7 (4.7 ± 0.4)-10-7 0.032

Примечание. Сн = 810-8 моль/л.

Табл. 3

Результаты определение пиразидола с помощью биосенсора на основе ИМАО

Введено, моль/л Найдено, моль/л Sr

2-10-5 (2.3 ± 0.2)-10-5 0.021

5-10-5 (4.8 ± 0.2)-10-5 0.028

5-10-6 (5.2 ± 0.4)-10-6 0.032

Примечание. Сн = 810-7 моль/л.

Таким образом, полученные экспериментальные результаты послужили основой для разработки амперометрического биосенсора на основе иммобилизованной МАО и стеклоуглеродного или платинового электродов. Выбранные условия получения биочувствительной части сенсора и его функционирования обеспечивают получение устойчивого максимального аналитического сигнала и возможность определения отдельных ингибиторов МАО с Сн на уровне 8-10-7 - 8-10-8 моль/л.

Полученные результаты будут в дальнейшем использованы для иммуно-экстракционного определения лекарственных препаратов - ингибиторов МАО.

Работа выполнена при частичной финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проект № 03-03-33116).

Summary

E.P. Medyantseva, R.M. Varlamova, D.A. Gimaletdinova, A.N. Fattakhova, H.C. Budni-kov. The conditions of functioning of the amperometric biosensor based on monoaminoxi-dase.

The approaches for the development of the amperometric biosensor based on immobilized monoaminooxidase and carbon glass and platinum electrodes have been obtained. Functioning conditions of the sensor: acetate buffer (pH 5.5), substrate concentration - 5-10-3 M, potential of the analytical signal registration were chosen. The analytical possibilities of the biosensor were showed to determine antidepressants pethylil and pyrasidol; the detection limits were 8-10-8 M and 8-10-7 M respectively.

Литература

1. Горкин В.З. Аминоксидазы и их значение в медицине. - М.: Медицина, 1981. -

336 с.

2. Кугушева Л.И., Кузнецова Л.П., Никольская Е.Б., Ягодина О.В. Применение фер-ментсодержащих мембран для определения органических соединений // Журн. ана-лит. химии. - 1992. - Т. 47, № 8. - C. 1478-1482.

3. Никольская Е.Б., Ягодина О.В., Искандеров Р.Р. Зависимость аналитических характеристик биоспецифических и газочувствитльных сенсоров от выбора потенциоме-трического датчика // Журн. аналит. химии. - 1995. - Т. 50, № 12. - С. 1275-1279.

4. BudantsevA.Yu. Biosensor for catecholamines with immobilized monoamine oxidase in tissue sections // Analytica Chim. Acta. - 1991. - V. 249. - P. 71-76.

5. Hong Z., Yuzhong Z., Zhuobin Y. Determination of dopamine in the presence of ascorbic acid using poly (hipuric acid) modified glassy carbon electrode // Electroanalysis. -2002. - V. 14, No 14. - P. 1031-1034.

6. Шайдарова Л.Г., Гедмина А.В., Челнокова И.А., Будников Г.К. Электрокаталитическое окисление гидрохинона и пирокатхина на электроде, модифицированном по-ливинилпиридиновой пленкой с электроосажденным родием, и его использование для анализа фармпрепаратов // Журн. аналит. химии. - 2004. - Т. 59, № 11. -С. 1137-1144.

7. Кулис Ю.Ю. Аналитические системы на основе иммобилизованных ферментов -Вильнюс: Мокслас, 1981. - 200 c.

8. Машковский М.Д. Лекарственные средства: в 2 т. - М.: ООО Новая Волна, 2002.

Поступила в редакцию 14.06.05

Медянцева Эльвина Павловна - доктор химических наук, профессор кафедры аналитической химии химического института им. А.М. Бутлерова Казанского государственного университета.

E-mail: Elvina.Medyantseva@ksu.ru

Варламова Р.М. - аспирант кафедры аналитической химии химического института им. А.М. Бутлерова Казанского государственного университета.

E-mail: Regina.Varlamova@ksu.ru

Гималетдинова Д.А. - студент химического института им. А.М. Бутлерова Казанского государственного университета.

Фаттахова Альфия Нурлимамовна - кандидат биологических наук, доцент кафедры биохимии Казанского государственного университета.

Будников Герман Константинович - доктор химических наук, профессор, заведующий кафедрой аналитической химии Химического института им. А.М. Бутлерова Казанского государственного университета.

E-mail: Herman.Budnikov@ksu.ru