СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ПРОИНСУЛИНА ДЛЯ ПЕРОРАЛЬНОГО ПРИМЕНЕНИЯ
METHOD FOR MAKING ORAL PROINSULIN PREPARATION

Изобретение относится к фармакологии и медицине, в частности к эндокринологии, и может быть использовано для получения гипогликемического препарата на основе проинсулина для перорального и парэнтерального применения.
Проинсулин является предшественником гормона инсулина и имеет молекулярную массу около 9000 Да (Далт). Проинсулин оказывает влияние на все виды обмена веществ в организме: повышает проникновение глюкозы в ткани организма и ее использование ими, снижает содержание гликогена в печени и повышает его количество в мышцах, повышает интенсивность синтеза белка и т.д. Образуется проинсулин в островковых бета-клетках поджелудочной железы, выделяется в кровь в виде инсулина и С-пептида. Входящий в состав проинсулина пептид С, как было показано, является биологически активным веществом. В частности, С-пептид предотвращает развитие осложнений диабета. Кроме того, С-пептид обладает иммуномодулирующим эффектом и участвует в развитии толерантности к инсулину и проинсулину. Установлено, что модификация С-пептида сопровождается развитием аутоиммунного диабета у части мышей. Поэтому проинсулин наиболее подходит для лечения больных сахарным диабетом (СД) первого типа (1 типа).
Действительно, использование интраназально проинсулина для индукции энтеральной (oral tolerance) толерантности у лабораторных животных показало более высокую эффективность, по сравнению с энтеральным инсулином. Однако проинсулин нестоек, легко разрушается в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ), в связи с чем попытки его использования энтерально для индукции иммунологической толерантности к инсулину и проинсулину у людей закончились безрезультатно (A.Hanninen, L.С.Harrison «Mucosal Tolerance to Prevent Type 1 Diabetes: Can the Outcome Be Improved in Humans? Rev Diabet Stud. 2004; 1(3):113-121).
Кроме того, при парэнтеральном введении обычного проинсулина отмечается быстрое появление антител к проинсулину в связи с его высокой иммуногенностью.
Основным путем введения как инсулина, так и проинсулина в организм человека являются подкожные или внутримышечные инъекции препарата. Попытки введения инсулина наиболее физиологическим и удобным для больных пероральным (через рот) путем оказались безуспешными, поскольку инсулин легко гидролизуется пищеварительными ферментами с потерей активности. Вместе с тем, существует теоретическая возможность улучшить фармакокинетику и устойчивость проинсулина путем конъюгации его с водорастворимыми полимерами (Katre N.V. The conjugation of proteins with polyethylene glycol and other polymers. Adv. Drug. Delivery Res. - 1993. - v. - 91-114; Harris J.M., Martin N.E., Modi M. Pegilation: a novel process for modifying pharmacokinetics. Clin Pharmacokinet. 2001; v. 40. - 539-531).
Преимущества перорального проинсулина очевидны, поскольку длительные ежедневные инъекции могут вызывать различные серьезные осложнения: сопровождаются болевыми синдромами; приводят к развитию липодистрофии, представляющей не только косметический дефект, но и вызывающей потребность в увеличении доз гормона; травмируют психику, особенно у детей; вызывают стрессовые состояния, приводящие к еще более выраженной гипергликемии, что, в свою очередь, увеличивает потребность в гормоне и т.д. В то же время, энтеральный способ введения проинсулина способствует развитию энтеральной толерантности к инсулину и проинсулину и стиханию аутоиммунного процесса.
Известен способ получения препарата проинсулина, пригодного для перорального применения (WO 2004083234, оп. 30.09.2004), заключающийся в том, что сначала химическим путем активируют олигомер, содержащий гидрофильный участок и/или липофильный участок, в качестве которого используют полиэтиленгликоль, затем обеспечивают контактирование проинсулинового полипептида с активированным олигомером в условиях, достаточных для присоединения олигомера к проинсулиновому полипептиду и создания конъюгата проинсулиновый полипептид-олигомер, для чего используют такие растворители как диметилсульфоксид (dimethylsulfoxide) и триэтиламин (triethylamine). Кроме того, способ требует использования активирующих химических агентов, таких как N-гидроксисукцинимид (N-hydroxysuccinimide), р-нитрофенилхлороформиат (р-nitrophenylchloroformate), 1,3-дициклогексилкарбодиимид (1,3-dicyclohexylcarbodiimide), гидроксибензотриазид (hydroxybenzotriazide).
Применение высокотоксичных реагентов для химической активации полимеров требует для очистки продуктов синтеза применения сложных и дорогих хроматографических методов очистки. Кроме того, многие из указанных реактивов не производятся в промышленных масштабах и поэтому дороги и малодоступны.
Недостатками известного способа являются технологическая сложность получения конъюгатов проинсулина с олигомером, необходимость использования для активации полиэтиленгликоля высокотоксичных химических агентов, от которых необходимо очищать препарат хроматографическими методами, а также высокая стоимость полученных препаратов. Кроме того, авторы изобретения, описанного в заявке WO 2004083234, не подтвердили наличие гипогликемической активности у конъюгатов проинсулина с полиэтиленгликолем.
Технической задачей предлагаемого изобретения является упрощение и удешевление способа получения препарата проинсулина для перорального применения, а также повышение его терапевтической эффективности при пероральном применении.
Решение поставленной задачи достигается тем, что предложен способ получения препарата проинсулина для перорального применения с использованием активированного полиэтиленгликоля, в котором согласно изобретению полиэтиленгликоль активируют путем облучения ионизирующим излучением в кислой среде в присутствии катионов кальция и/или цинка до конечной концентрации 5-10 мМ, а затем смешивают с проинсулином, при этом берут полиэтиленгликоль с мол. массой 0,4-40 кДа и концентрацией 1,0-50,0%, в соотношении проинсулин-полиэтиленгликоль, равном 1:(1-500) до конечной концентрации проинсулина в смеси 1-10 мг/мл.
Полиэтиленгликоль активируют путем облучения потоком ускоренных электронов или гамма-излучением в дозах 1,0-5,0 Мрад.
Для подкисления полиэтиленгликоля берут преимущественно органическую кислоту, например уксусную, лимонную, яблочную, и поддерживают при активации полиэтиленгликоля pH 2,5-4,5.
Для подкисления полиэтиленгликоля можно использовать и другие органические кислоты, например фумаровую, янтарную, молочную и другие, не токсичные для организма кислоты.
В качестве водорастворимого полимера кроме полиэтиленгликоля можно также использовать декстраны, поливинилпирролидон, изопренолы, полиакриламид, полиуретан.
Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.
Готовят 1-50% водный раствор полиэтиленгликоля с молекулярной массой от 400 до 4000 Да. Затем раствор подкисляют до рН 2,5-4,5, добавляют катионы кальция и/или цинка до конечной концентрации 5-10 мМ и облучают высокоэнергетическим ионизирующим излучением, преимущественно гамма-излучением или потоком ускоренных электронов в дозах, обеспечивающих протекание свободно-радикальных реакций, преимущественно 1,0-5,0 Мрад. Далее в раствор радиационно-активированного полиэтиленгликоля вводят проинсулин до конечной концентрации (по белку) от 1-10 мг/мл (или по активности проинсулина 10-100 МЕ/мл соответственно), в соотношении полиэтиленгликоль:проинсулин, равном (1-500):1, смесь перемешивают в течение 10-30 минут до получения однородного прозрачного или слегка опалесцирующего раствора. Полученный препарат нейтрализуют. При облучении в ходе радиационно-химического окисления полиэтиленгликоля образуются высокоактивные карбонильные группы. Активированный таким способом полимер образует с проинсулином водорастворимый препарат, который эффективно снижает уровень глюкозы при пероральном введении. Вследствие высокой растворимости в водных растворах препарат проинсулина с полиэтиленгликолем полностью всасывается в кровь без диффузионных ограничений.
Полученный технический результат не является очевидным из известных научно-технических данных о свойствах полиэтиленгликоля и проинсулина, так как в результате образования препарата могла бы произойти полная потеря специфической гипогликемической активности проинсулина за счет изменения его конформации в присутствии активированного полиэтиленгликоля и его взаимодействия с инсулиновым рецептором клеток.
Однако экспериментальным путем установлено, что полученный предлагаемым способом препарат проявляет специфическую гипогликемическую активность при пероральном его применении.
Кроме того, оказалось неожиданным, что присутствие при активировании полиэтиленгликоля катионов кальция и цинка позволило увеличить гипогликемическую активность препарата, длительность сохранения гипогликемической активности и устойчивость в кислой среде.
В качестве источника ионизирующего излучения можно использовать электронное излучение (направленный поток ускоренных электронов), гамма-излучение, рентгеновское излучение, лазерное излучение и ультрафиолетовое излучение. Необходимая аппаратура и методики ионизации описаны в следующих публикациях (Gonchar A.M. and Auslender V.L. 1996; Gonchar A.M. and Auslender V.L., 1998, Vereschagin E.I., et al., 2001).
В наиболее предпочтительным варианте предлагается воздействовать на полиэтиленгликоль направленным потоком ускоренных электронов. В конкретном случае осуществления способа облучение полиэтиленгликоля проводили тормозным излучением, генерируемым ускорителем ИЛУ-6 или ИЛУ-10 с энергией электронов 2,5 МэВ, поглощенная доза от 2 до 10 кГр, скорость набора дозы 1,65 кГр/час.
Предлагаемое изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного получения предлагаемого препарата.
Пример 1
2+
10% водный раствор полиэтиленгликоля (ПЭГ) с молекулярной массой 1500 Да (ПЭГ-1500) облучают потоком ускоренных электронов в дозе 2,0 Мрад в кислой среде в присутствии 5 мМ катионов кальция. Подкисление ведут 0,1 М раствором уксусной кислоты до рН 3, а катионы кальция вводят за счет добавления в раствор хлористого кальция до достижения концентрации в пересчете на Са до 5 мМ, проверяют рН и, при необходимости, подтитровывают. В облученный раствор полиэтиленгликоля вносят рекомбинантный проинсулин до конечной концентрации 10 мг в 1 мл (соотношение полиэтиленгликоль:проинсулин равно 10:1). Смесь перемешивают 10 минут и получают препарат проинсулина в виде слегка опалесцирующего раствора. Полученный препарат нейтрализуют 0,1 М раствором NaOH. Выход готового продукта составляет 98%.
Пример 2
2+
50,0% водный раствор полиэтиленгликоля с молекулярной массой 400 Да облучают тормозным гамма-излучением в дозе 1,0 Мрад в кислой среде рН 2,5 в присутствии катионов цинка. Для чего подкисление ведут 1 М раствором лимонной кислоты и добавляют к раствору полиэтиленгликоля 1 М раствор хлористого цинка до достижения концентрации 10 мМ Zn, проверяют рН и, при необходимости, подтитровывают 1М лимонной кислотой. В облученный раствор полиэтиленгликоля вносят проинсулин до конечной концентрации 1 мг в 1 мл (соотношение полиэтилгликоль:проинсулин равно 500: 1). Смесь перемешивают 30 минут и получают препарат проинсулина в виде прозрачного раствора. Полученный препарат нейтрализуют 0,1 М NaOH. Выход готового продукта составляет 97%.
Пример 3
Для сравнения гипогликемической активности готовили также препарат проинсулина, смешанного с раствором полиэтиленгликоля, активированного путем облучения потоком ускоренных электронов в нейтральной среде в отсутствии двухвалентных ионов металлов.
Для этого 10% водный раствор полиэтиленгликоля (ПЭГ) с молекулярной массой 1500 Да (ПЭГ-1500) облучали потоком ускоренных электронов в дозе 2,0 Мрад. В облученный раствор вносили рекомбинантный проинсулин до конечной концентрации 10 мг в 1 мл (соотношение полиэтиленгликоль:проинсулин равно 10:1). Смесь перемешивали 10 минут и получали препарат проинсулина в виде слегка опалесцирующего раствора. Выход готового продукта составлял 98%.
Пример 4. Исследование влияния внутрижелудочного введения препарата проинсулина, полученного, как описано в Примере 1, на содержание глюкозы в крови у крыс в сравнении с исходным проинсулином (Контроль) и проинсулином, полученным по примеру 3.
Эксперименты проведены на 60 крысах-самцах Вистар массой 300-350 г. Животных содержали на стандартном пищевом рационе вивария, при свободном доступе к воде и пище, в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей. Кровь для исследования забирали из надрезов на хвосте. Содержание глюкозы в крови определяли на приборе "SmartScan" ("Johnson & Johnson company", USA). Препарат проинсулина, полученный по примеру 1, вводили однократно внутрижелудочно в дозе 20 мг/кг одной группе животных (опыт 1). Препарат проинсулина, полученный по примеру 3, также вводили однократно внутрижелудочно в дозе 20 мг/кг другой группе животных (опыт 2).
Животные контрольной группы получали эквиобъемное количество исходного проинсулина (контроль). Содержание глюкозы определяли до введения препарата (в период с 9 до 10 часов утра) и через 1 ч, 2 ч, 3 ч, 5 ч, 7 ч и 10 ч после введения. Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета статистических программ "Statistica for Windows 5.0". Рассчитывали средние значения показателей и стандартную ошибку среднего значения. Межгрупповые различия оценивали с использованием Т-критерия Стьюдента.
Исходное содержание глюкозы в контрольной и опытных группах составило 5,0±0,2 ммоль/л и 4,8±0,1 ммоль/л соответственно, что укладывается в пределы физиологической нормы для данного вида лабораторных животных (таблица 1). У крыс, получивших внутрижелудочно препарат полученного по примерам 1 и 3 проинсулина, в период с 1 до 2 часа включительно уровень глюкозы в крови статистически значимо от значений в контрольной группе не отличался. Через 5 ч после введения препарата содержание глюкозы в крови животных, получивших проинсулин, приготовленный по примеру 1, составило 4,0±0,1 ммоль/л и было достоверно ниже (на 25%) по сравнению с контролем. Данные различия сохранялись и к 10 ч после введения полученного по примеру 1 препарата проинсулина. В то же время к 10 ч концентрация глюкозы в крови животных контрольной и опытной (опыт 2 - проинсулин, приготовленный по примеру 3) групп выравнивалась.
Таким образом, исходный проинсулин статистически достоверного влияния на уровень глюкозы крови не оказывал, препарат проинсулина, полученный по примеру 3 (опыт 2), проявлял гипогликемическое действие, нивелирующееся к 10 ч наблюдения. В то же время препарат проинсулина, полученный согласно предлагаемому изобретению (опыт 1), при внутрижелудочном введении крысам не только проявляет гипогликемическое действие, но и является более эффективным, чем препарат, полученный по примеру 3.
Таблица 1
Группа
Исходные значения
Время после введения, ч
1
2
3
5
7
10
Контроль
5,0±0,2
5,2±0,1
5,0±0,2
5,1±0,2
5,2±0,1
5,2±0,1
4,9±0,2
Опыт 1
4,8±0,3
4,9±0,1
5,0±0,1
4,5±0,2
4,0±0,1
4,0±0,2
4,5±0,2
Опыт 2
4,8±0,3
4,9±0,1
5,0±0,1
4,9±0,2
4,1±0,1
4,3±0,2
5,0±0,2
Примечание: * - р<0,05 в сравнении с контролем
Также была проведена сравнительная оценка анафилактогенной активности препарата проинсулина, полученного, как описано в примере 1, и исходного проинсулина в соответствии с «Методическим указанием по оценке аллергизирующих свойств фармакологических веществ» [Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. - М., 2005. - 827 с.].
Реакцию общей анафилаксии (анафилактический шок) проводили на 30 морских свинках массой 250-300 г (3 группы по 10 животных - 2 дозы препарата проинсулина, полученного по примеру 1 (терапевтическая - 1 мг и 10 терапевтических доз), и контроль (исходный проинсулин); опытный и контрольный препараты вводили подкожно и 2 раза внутримышечно, разрешающую инъекцию - внутривенно; срок наблюдения - 3 недели;
В контрольной группе отмечен анафилактический шок со смертельным исходом у 4 из 10 животных, анафилактический шок без смертельного исхода у 2 животных. В группах, где животным вводился препарат полученного по примеру 1 проинсулина, анафилактического шока не наблюдали ни в одном из случаев.
Изучение активной кожной анафилаксии проводили на 30 мышах линии BALB/c (3 группы по 10 животных - 2 дозы (терапевтическая и 10 терапевтических доз препарата, полученного по примеру 1 проинсулина) и контроль (исходный проинсулин в терапевтической дозе), опытный и контрольный препараты вводили подкожно. В качестве адъюванта использовали адъювант Фрейнда. Разрешающую дозу вводили подкожно.
В контрольной группе отмечали выраженную гиперемию и образование папул у 5 животных; выраженную гиперемию и отек у 4 животных. При использовании полученного согласно изобретению препарата проинсулина у двух животных отмечали гиперемию и отек в группе с использованием высоких (10 терапевтических) доз.
Кроме того, препарат проинсулина, полученный предлагаемым способом, обладает следующими свойствами, появление которых обусловлено, в частности, тем, что активация полиэтиленгликоля ионизирующим излучением осуществляется в кислой среде в присутствии катионов кальция и/или цинка. Было экспериментально показано, что препараты проинсулина, полученные предлагаемым способом, сохраняли свою активность при хранении в течение суток при рН 2-3 даже при комнатной температуре.
Заявляемый способ получения препарата проинсулина для перорального применения, в отличие от способа прототипа, отличается простотой и экономичностью, так как его получение состоит всего из двух стадий, активация полиэтиленгликоля ионизирующим излучением в кислой среде и в присутствии катионов кальция и/или цинка и смешивание его с проинсулином до требуемой концентрации (активности). Для его осуществления не требуется применение высокотоксичных реактивов. Препарат проинсулина, получаемый заявляемым способом, обладает терапевтической активностью, определяемой по снижению концентрации глюкозы в крови, и может быть использован для перорального, парентерального и интраназального введения.
Кроме того, препарат не обладает аллергогенностью, высокостабилен, и вследствие этого может использоваться для индукции иммунологической толерантности к инсулину и проинсулину у больных сахарным диабетом 1 типа.