СТЕРОИДЫ, ИМЕЮЩИЕ СМЕШАННЫЙ АНДРОГЕННЫЙ И ПРОГЕСТАГЕННЫЙ ПРОФИЛЬ
STEROIDS WITH MIXED ANDROGENIC AND PROGESTAGENIC PROFILE

Настоящее изобретение относится к соединениям, имеющим смешанный профиль андрогенной и прогестагенной активностей, к фармацевтическим композициям, включающим эти соединения и их применению в терапии.
Найдено, что мужская контрацепция подавляет сперматогенез через подавление гонадотропинов лютеинизирующих гормонов (ЛГ)(LH) и фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) (FSH). Это приводит к истощению интратестикулярного тестостерона и прекращению сперматогенеза.
Назначение прогестагена приводит, в зависимости от дозировки, подавлению гонадотропинов гипофиза и, следовательно, уменьшению уровней тестостерона и обратимому ингибированию сперматогенеза. Требуется экзогенный андроген, для того чтобы компенсировать уровни тестостерона.
Таким же образом может быть осуществлена мужская гормональная заместительная терапия (ГЗТ) (HRT), приводя к замещению тестостерона экзогенным андрогеном, который менее опасен для простаты, чем эндогенный тестостерон.
Как для мужской контрацепции, так и для мужской ГЗТ было бы отчасти полезно применить соединения, имеющие смешанный профиль андрогенной и прогестагенной активностей, т.е. соединений которые обладают обеими активностями, по сути, в пределах одной молекулы. Целью изобретения является предложение соединений с оптимальной эффективностью, пероральной активностью и безопасностью. Что касается безопасности, то особенно важно минимизировать риск разрушения костей и печеночную токсичность.
Соединения как с андрогенными, так и с прогестагенными свойствами известны в данной области. Например, 7α, 17α-диметилнандролон (Miboleron) является высокоактивным андрогеном, к тому же имеющим прогестагенную активность (см., например, L.Markiewich et al., Method and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology (1997), 19(4), 215-222). Оно является орально активным, но имеет недостаток - высокую печеночную токсичность (смотри, например, J.Seaman, Toxicologic Pathology (1985), 13(3), 177-180).
Также известно, что определенные D-гомостероиды обладают смешанным андрогенным и прогестагенным профилем. Например, (17аβ)-13-этил-17а-гидрокси-D-гомогонен-4-он-3, (17аβ)-13- этил-17а-гидрокси-17а-метил-D-гомогонен-4-он-3 и (17аβ)-13,17а-диэтил-17а-гидрокси-D-гомогонен-4-он-3, которые описаны в US 3959322 и которые, как утверждается, обладают как андрогенной, так и прогестагенной активностями. Авторы изобретения показали, однако, что эти соединения не являются перорально активными.
7α-метил-19-нор-D-гомотестостерон раскрывается как синтетический интермедиат в WO 85/05361. Авторы изобретения показали, что это соединение обладает смешанным андрогенным и прогестагенным профилем. Авторы изобретения также показали, что это соединение также не является перорально активным.
Показано, что 7α-метил-19-нор-D-гомотестостерон обладает анаболической активностью, также имеющий прогестагенную активность, как описано S.A.Anachenko et.al. in Tetrahedron (1962),18,1355-67. Мы показали, однако, что соединение обладает низкой активностью при пероральном назначении и неспособе предотвращать потерю минеральной плотности костной ткани (МПКТ) (BMD) губчатой кости.
Неожиданно было найдено, что среди серий 19-нор-гомостероидов существуют смешанные андрогенные/прогестагенные стероиды, которые являются перорально активными, которые предотвращают потери минеральной плотности костной ткани губчатой кости, у которых отсутствует печеночная токсичность. Таким образом, в первом аспекте изобретение предлагает ряд соединений согласно формуле I:
где
1
1-6
1-6
R представляет собой O или NOR(нор) с R, представляющим собой водород, алкил(С) или ацил(С),
2
R представляет собой метил или этил и
3
1-15
R представляет собой водород или ацил(С).
1
В одном варианте осуществления изобретение предлагает соединения согласно формуле I, где R представляет собой O.
В другом варианте осуществления изобретение предлагает соединения согласно формуле I, где R
представляет собой O и R
представляет собой водород, т.е соединения
1
3
(7α,17аβ)-17а-гидрокси-7,17а-диметил-D-гомоэстрен-4-он-3 и (7α,17аβ)-17а- этил-17а-гидрокси-7-метил-D-гомоэстрен-4-он-3 , в особенности соединение (7α,17аβ)-17а-гидрокси-7,17а-диметил-D-гомоэстрен-4-он-3.
1-6
Термин алкил(С) представляет собой разветвленную и неразветвленную алкильную группу, состоящую из 1-6 атомов углерода. Примеры алкильных
1-6
групп(С) включают метил, этил, пропил, изопропил, бутил и третичный бутил.
1-6
1-15
1-6
1-15
1-6
1-15
Термин ацил(С) и ацил(С) представляет ацильную группу, производную карбоновой кислоты, имеющую соответственно 1-6 или 1-15 атомов углерода. Ацильная группа может включать углеводород, который может быть разветвленным и неразветвленным, насыщенным и ненасыщенным. Примеры ацильных групп (С) включают формил, ацетил, пропаноил, пропеноил и пивалоил и примеры ацильных групп (С) включают деканоил и ундеканоил. Также под определение ацилов (С) и ацилов (С) попадают ацильные группы, которые являются производными от дикарбоновых кислот, например, геми-малоил, геми-сукциноил и геми-глутароил.
1
1
3
1
1-6
1-6
1-6
in vivo
Соединения, в которых R представляет собой NOR(нор) с R, представляющим собой водород, алкил(С) или ацил(С), являются предшественниками лекарственных средств, в которых R представляет собой О. Также соединения, где R представляет собой ацил(С), являются предшественниками лекарственных средств, в которых R представляет собой водород. Упомянутые предшественники лекарственных средств обычно представляют собой неактивное производное исходных соединений, которое превращается в активную форму .
19-нор-D-гомостероидные производные настоящего изобретения имеют природную конфигурацию 8β, 9α, 10β, 13β и 14α. Конфигурация при С-7 представляет собой 7α и конфигурация при С-17а представляет собой 17аβ.
1
2
3
Соединения из изобретения могут быть синтезированы согласно хорошо известным способам в области органической химии и в особенности в области химии стероидов. См., например, Fried J. и Edwards J.A. ”Organic reaction in steroid chemistry”, Volum I и II, van Nostrand Reinhold Company, New York, 1972. Удобным исходным веществом для получения соединений формулы I , в которых R представляет собой О, в которых R имеет значение, описанное выше, и R представляет собой водород, является, например, (7α)-3-метокси-7-метилэстртриен-1,3,5(10)-он-17 (т.е. соединение формулы II). Это соединение может быть синтезировано с использованием хорошо известных в данной области способов, см., например, FR 1434172.
2
Гомологизация D-кольца в (7α)-3-метокси-7-метилэстртриен-1,3,5(10)-он-17 может быть осуществлена рядом способов. Например, он может быть превращен в (7α)-17-(аминометил)-3-метокси-7-метилэстртриен-1,3,5(10)-он-17 с последующей обработкой, например, NaNO/AcOH для получения (7α)-3-метокси-7-метил-D-гомоэстртриен-1,3,5(10)-он-17а (см., например, Avery M.A. c соавт., Steroids, 1990, 55, 59). Альтернативно, он может быть превращен в (7α,17β)-3-метокси-7-метил-16,17-метилен-17-[(триметилсилил)окси]эстртетраен-1,3,5(10),16-он-17а с последующей обработкой, например, хлоридом железа (III) для получения (7α)-3-метокси-7-метил-D-гомоэстртетраен-1,3,5(10),16-он-17а(см., например, Jons W.F. с соавт., J.Org.Chem., 1971, 36, 1952 и Ito Y. с соавт., J.Org.Chem., 1976, 41, 2073). Последний может быть превращен в (7α)-3-метокси-7-метил-D-гомоэстртриен-1,3,5(10)-он-17а, например, каталитической гидрогенизацией.
2
2,5(10)
(7α)-3-метокси-7-метил-D-гомоэстртриен-1,3,5(10)-он-17а может быть обработан метиллитием, или этиллитием, или соответствующими реактивами Гриньяра, необязательно в присутствии хлорида церия (III) с получением производного (7α,17β)-17а-алкил-3-метокси-7-метил-D-гомоэстртриен-1,3,5(10)-ол-17а. Последний может быть получен вместе с соответствующим 17аα-ОН, 17аβ-алкил изомером, и в этом случае требуемый 17аα-ОН, 17аβ-алкил изомер отделяется от нежелательного соединения хроматографически или кристаллизацией. Альтернативно, (7α)-3-метокси-7-метил-D-гомоэстртриен-1,3,5(10)-он-17а можно подвергнуть взаимодействию с, например, иодидом триметилсульфония и основанием для получения 17а-эпоксида, который затем может быть превращен в соединение 17аα-ОН, 17аβ-метил реакцией с восстановителем (например, гидридом лития, алюминия или триэтилборатом лития) или соединением метилмеди ( например, MeCuLi), соответственно. Реакция Берча (Birch reduction) с полученным (7α,17β)-17а-алкил-3-метокси-7-метил-D-гомоэстртриен-1,3,5(10)-ол-17а производным, как описано в Caine, D. Org. Reactions, Wiely, New york, 1976, 23, 1 с последующим гидролизом Δ диеновых производных и таким образом полученных, затем приводит к (7α,17аβ)-17а-гидрокси-7,17а-диметил-D-гомоэстрен-4-он-3 и (7α,17аβ)-17а-этил-17а-гидрокси-7-метил -D-гомоэстрен-4-он-3.
1
3
3
3
1-6
1-6
1-15
1-15
Соединения настоящего изобретения, в которых R представляет собой NOR, причем R представляет собой водород, алкил(С) или ацил(С), и соединения изобретения, где R представляет собой ацил(С), уже получены хорошо известными в этой области способами. Например, соединения настоящего изобретения, где R представляет собой ацил(С), уже получены ацилированием соответствующих прекурсоров, в которых R представляет собой водород с использованием ацилирующего агента, например, требуемый хлорангидрид кислоты в присутствии такого основания, как триэтиламин.
19-нор-D-гомотестероиды настоящего изобретения являются подходящими для применения в терапии, например, помимо прочего, в мужской контрацепции и мужской ГЗТ. Мужская ГЗТ означает дополнение адрогена, а также замещение тестостерона.
th
nd
Назначению соединения согласно изобретению в большой мере будет способствовать изготовление фармацевтических композиций. Следовательно, настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, включающей соединение согласно изобретению, смешанной с подходящим фармацевтическим наполнителем, таким как, например, описанным в Gennaro et al., Remmington: Sience and Practice of Pharmacy, 20 Edition, Lippincott, Wilyams and Wilkins, 2000; предпочтительно часть 5: фармацевтическое производство. Сделаны подходящие доступные наполнители, например, в Handbook Pharmaceutical Excipients, 2 Edition; Editors A. Wade and P.J.Weller, American Pharmaceutical Association, Washington, The Pharmaceutical Press, London, 1994. Смеси соединения согласно настоящему изобретению и подходящий фармацевтический наполнитель могут быть спрессованы в твердые единичные дозировки, такие как таблетки, или переработаны в капсулы и суппозитории. Для изготовления единичных дозировок, например, таблеток, рассматривается применение традиционных добавок, таких как наполнители, красители и полимерные связующие. В общем, может применяться любая фармацевтически приемлемая добавка, которая не пересекается с функциями активных соединений. Подходящие наполнители, с которыми могут быть приготовлены фармацевтические композиции и которые могут назначаться, включают лактозу, крахмал, целлюлозу и их производные или смеси из них, применяемые в подходящих количествах.
Описывается, что мужская контрацепция часто включает баланс назначения гормонов, в которых прогестаген служит, для достижения конрацептивного эффекта и андроген служит для дополнения результата по снижению уровня тестостерона. Сочетающаяся андрогенно/прогестагенная природа соединений изобретения позволяет достигнуть мужской контрацепции через прогестаген-андрогенную систему на основе одного единственного соединения.
Таким образом, изобретение также относится к применению стероидного соединения согласно изобретению для производства медикамента, имеющего контрацептивную активность (для которого в этой области медицины также применяется термин “контрацептивный агент”).
Изобретение относится к способу контрацепции, включающим назначение мужской особи, способной к воспроизводству себе подобных, в особенности человеческой, соединения согласно изобретению в единичных дозировках и балансе, который является обоснованным для упомянутого соединения, чтобы оно само по себе являлось конрацептивно эффективным и которое одновременно служит для поддержания значительного андрогенного уровня в мужской особи, которая подвергается этому конрацептивному способу. Альтернативно, способ контрацепции, предложенный настоящим изобретением, включает назначение мужской особи, способной к воспроизводсиву себе подобных, особенно человеческой, контрацептивно эффективного сочетания стерилитанта, такого как прогестаген и соединения по изобретению. В качестве второй альтернативы, способ контрацепции включает назначение соединения по изобретению, в качестве (прогестагенного) стерилитанта, в котором поддержание значительного андрогенного уровня является функцией, в частности, андрогенной активности соединения данного изобретения и которое дополняется дополнительным андрогеном.
Изобретение также касается набора лекарственных средств для мужской контрацепции, включающей средства для назначения прогестагена и средства для назначения андрогена, отличающиеся тем, что одно из средств является фармацевтической композицией, включающей соединение согласно настоящему изобретению.
Андрогенно/прогестагенные соединения изобретения могут применяться для дополнения тестостерона, в частности, при адрогенном дефиците (возрастном) у мужской особи.
Андрогенно/прогестагенные соединения по изобретению могут также применяться для (частичного) замещения эндогенного тестостерона. Прогестагенная активность является преимуществом соединений изобретения, при которой подавляется производство эндогенного тестостерона. Андрогенная активность служит для того, чтобы компенсировать дефицит тестостерона. Это позволяет заместить тестостерон экзогенным андрогеном, который является более безопасным, чем эндогенный тестостерон. Эндогенный тестостерон превращается с помощью 5α-редуктазы в более сильнодействующий 5α-дигидротестостерон, что в результате приводит к хорошо известным таким вредным эффектам, как проблемы простаты, появление угрей и выпадение волос. Следовательно, действием андрогенно/прогестагенных соединений изобретения можно преимущественно уменьшить существенные вредные эффекты эндогенных тестостеронов. Следовательно, и более специфично соединения изобретения могут применяться для лечения доброкачественной гипертрофии простаты (ДГП)(ВРН).
Необязательно, андрогенно/прогестагенные соединения изобретения могут сочетаться с андрогенами известными в данной области медицины, которые не являются 5α-восстановленными, такие как MENT или андрогены, раскрытые в WO 99/67271, WO 00/53619, WO 00/59920 или WO 01/5806, или простагены, известные в этой области медицины.
Таким образом, изобретение относится к применению соединения по изобретению для производства медикамента для лечения недостатка андрогена или медикамента для замещения тестостерона. Специалист в данной области будет принимать во внимание, что такое использование может включать комбинированное назначение соединения по изобретению и андрогена или, альтернативно, комбинированное применение соединения по изобретению и прогестагена. Соответственно, изобретение также включает способ лечения в области мужской гормональной заместительной терапии, включающей назначение мужской особи соединения, как описано выше (в подходящей фармацевтической дозированной форме).
Изобретение также описывает способ лечения, включающий назначение при необходимости мужской особи андрогенного дополнения или замещения тестостерона терапевтически эффективным количеством соединения по изобретению, необязательно в сочетании с андрогеном, известным в данной области, или прогестагеном, известным в данной области.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1.
Получение (7α,17а)-17а-гидрокси-7,17a-диметил-D-гомоэстр-4-ен-3-он
(7α,17а)-17а-гидрокси-7,17а-диметил-D-гомоэстр-4-ен-3-он
i) раствор диизопропиламина(42,4 мл) в сухом тетрагидрофуране (294 мл) охладили до 30°С, добавили по каплям н-бутиллитий (16 М раствор в гексане, 173 мл) (Т < -10°С) и перемешивали при -30°С в течение 10 мин. Реакционную смесь охлаждили до -78°С и добавляли по каплям раствор (7α)-3-метокси-7-метилэстртриен-1,3,5(10)-он-17 [см. FR 1434172; 25,0 г] в сухом тетрагидрофуране (398 мл). Перемешивали в течение 1 ч при -78°С. Добавили хлортриметилсилан (31,5 мл свежеперегнанного с СаН) и довели до комнатной температуры. Смесь перемешивали 30 мин после добавления ТМСС1, охлаждали до 0°С и затем гасили насыщенным раствором хлорида аммония. Смесь экстрагировали этилацетатом. Объединенные органические фазы промывали насыщенным раствором соли, сушили над сульфатом натрия и концентрировали при пониженном давлении с получением 7α-3-метокси-7-метил-17-[(триметилсилил)окси]эстртетра-1,3,5(10),16-ен (35,5 г). Продукт использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.
ii) Раствор, состоящий из продукта, полученного в предыдущей стадии (35,5 г) и дииодметана (27,3 мл) в сухом дихлорметане охлаждали до 0°С. Добавляли (Т<5°С) раствор диэтилцинка в гексане (15 мас.%, 305 мл), ледяную баню убирали и перемешивали реакционную смесь при комнатной температуре 1 час. Добавляли лед, реакционную смесь выливали в насыщенный водный раствор хлорида аммония и смесь экстрагировали этилацетатом. Объединенные органические фазы промывали насыщенным раствором соли, сушили над сульфатом натрия и концентрировали при пониженном давлении с получением 7α-3-метокси-7-метил-16,17-метилен-17-[(триметилсилил)окси]эстртри-1,3,5(10)-ен (35,5 г). Продукт использовали в следующей стадии без дополнительной очистки.
iii) Раствор продукта, полученного на предыдущей стадии (35,5 г) в сухом диметилформамиде (169 мл), добавляли в охлажденный льдом раствор хлорида железа (III) (очень сухой, 40,8 г) в том же растворителе (169 мл). Ледяную баню убирали и перемешивали реакционную смесь при комнатной температуре 1,5 часа. При охлаждении смесь гасили каплями водной хлороводородной кислоты (2М). Смесь выливали в воду и экстрагировали этилацетатом; объединенные органические фазы промывали водой и насыщенным раствором соли, сушили над сульфатом натрия и концентрировали при пониженном давлении. Колоночной хроматографией выделили (7α)-3-метокси-7-метил-D-гомоэстртетра-1,3,5(10),16-ен-17а-она.
iv) Суспензию (10%; 5 г) палладия на активированном угле в воде (50 мл) добавляли в раствор продукта, полученного на предыдущей стадии (67 г), в смесь этанола (1250 мл) и ТГФ (250 мл) и смесь перемешивали в токе водорода (5 бар) при комнатной температуре в течение ночи. Образец реакционной смеси отфильтровали на целите и фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Н-ЯМР показало 70% превращение. Добавляли другую часть Pd/C (10%, 2,5 г) и продолжали перемешивание в токе водорода (5 бар) в течение ночи. Действия, описанные выше, позволили получить (7α)-3-метокси-7-метил-D-гомоэстртри-1,3,5(10)-ен-17а-она (61 г). Продукт применяли в следующей стадии без дополнительной очистки.
v) Смесь метиллития (1,4 М раствор в диэтиловом эфире, 475 мл) и сухого ТГФ (5000 мл) охлаждали до -40°С. Добавляли раствор продукта, полученного на предыдущей стадии (54 г) в сухом ТГФ (1000 мл), и перемешивали реакционную смесь при комнатной температуре в течение ночи. Реакционную смесь выливали в насыщенный водный раствор хлорида аммония (7500 мл) и экстрагировали этилацетатом. Объединенные органические фазы промывали насыщенным раствором соли, сушили над сульфатом натрия и концентрировали при пониженном давлении. Колоночной хроматографией выделили (7α,17β)-3-метокси-7,17а-диметил-D-гомоэстртри-1,3,5(10)-ен-17а-ола (19,9 г).
vi) Продукт, полученный на предыдущей стадии (1,0 г) в сухом тетрагидрофуране (25 мл) добавляли в жидкий аммиак (100 мл), охлаждали до -45°С. Добавляли литий (0,65 г) и реакционную смесь перемешивали при -45°С в течение 2 ч. Смесь пропанола-2 (10 мл) и сухого ТГФ (10 мл) добавляли по каплям и смесь перемешивали в течение ночи, позволяя аммиаку испариться. Сначала добавили насыщенный водный раствор хлорида аммония (100 мл) и затем (250 мл) этилацетата. Смесь экстрагировали этилацетатом. Объединенные органические фазы промывали насыщенным раствором соли, сушили над сульфатом натрия и концентрировали при пониженном давлении с получением (7α,17β)-3-метокси-7,17а-диметил-D-гомоэстрди-2,5(10)-ен-17а-ола (1,02 г). Продукт применяли в следующей стадии без дополнительной очистки.
vii) Раствор продукта, полученного в предыдущей стадии (1,02 г) в ацетоне (50 мл), обрабатывали хлороводородной кислотой (6 М, 5 мл). После 2 ч перемешивания при комнатной температуре реакционную смесь нейтрализовали насыщенным водным раствором гидрокарбоната натрия и продукт экстрагировали этилацетатом. Объединенные органические фазы промывали насыщенным раствором соли, сушили над сульфатом натрия и концентрировали при пониженном давлении. Кристаллизацией выделили (7α,17а)-17а-гидрокси-7,17а-диметил-D-гомоэстр-4ен-3-она (т.пл. 152°С).
Пример 2
Получение (7α,17а)-17а-этил-17а-гидрокси-7-метил-D-гомоэстр-4-ен-3-она.
(7α,17а)-17а-этил-17а-гидрокси-7-метил-D-гомоэстр-4-ен-3-он.
i) Суспензию хлорида церия (III) (1,8 г) в сухом тетрагидрофуране (40 мл) перемешивали в течение ночи и затем охладили до -78°С. Добавили хлорид этилмагния в тетрагидрофуране (25%, 3,3 мл) и перемешивали 1 ч. Добавляли твердый (7α)-3-метокси-7-метил-D-гомоэстртриен-1,3,5(10)-он-17а [Пример 1, стадия iv; 0,50 г] и реакционную смесь довели до комнатной температуры в течение 1,5 ч. Смесь вылили в насыщенный водный раствор хлорида аммония и продукт экстрагировали этилацетатом. Объединенные органические фазы промывали насыщенным раствором соли, сушили над сульфатом натрия и концентрировали при пониженном давлении. Колоночной хроматографией выделили (7α,17а)-17а-этил-3-метокси-7-метил-D-гомоэстртри-1,3,5(10)-ен-17а-ола (0,11 г).
ii) Продукт, полученный на предыдущей стадии (0,11 г) в сухом тетрагидрофуране (10 мл), добавили к перегнанному с обратным холодильником жидкому аммиаку (50 мл). Добавили литий (0,65 г) и реакционную смесь перемешивали в течение 10 мин. Добавили раствор трет-бутанола в тетрагидрофуране и премешивание продолжали еще 1,5 ч после охлаждения до -78°С, смесь гасили этанолом и аммиаку позволили испариться. Добавили воду и продукт экстрагировали этилацетатом. Объединенные органические фазы промывали насыщенным раствором соли, сушили над сульфатом натрия и концентрировали при пониженном давлении с получением (7α,17а)-17а-этил-3-метокси-7-метил-D-гомоэстрен-4-ол-17а. Продукт применяли на следующей стадии без дополнительной очистки.
iii) Следующая стадия аналогична описанной в vii примера 1, продукт, полученный в предыдущей стадии, превращали в (7α,17а)-17а-этил-17а-гидрокси-7-метил-D-гомоэстр-4-ен-3-она (0,071 г). 1Н-ЯМР (CDCl3) 5,83 (ушир.с, 1Н), 2,43-0,94 (м), 0,90 (т, 3Н, J=7,8 Гц), 0,72 (д, 3Н, J=7,4).
Пример 3
Андрогенная и прогестагенная агонистическая активность соединений изобретения
Соединения согласно изобретению протестировали на андрогенную активность и прогестагенную активность.
Трансактивированную андрогенную агонистическую активность соединений изобретения измеряли на клетках яичника китайского хомячка (СНО), трансфектированных с человеческим андрогенным рецептором (hAR), в сочетании с вирусами опухоли молочной железы мышей (MMTV) и люциферазным рецепторным геном (время инкубации 16 ч, температура 37°С) и сравнивали с активностью 5α-дигидротестостеронов [согласно методике, описанной Schoonen W.J.E. et. al., Analyt. Biochem. 261, 222-224 (1998)].
Трансактивированную андрогенную агонистическую активность соединений изобретения измеряли на клетках яичника китайского хомячка (СНО), трансфектированных с человеческим прогестеронным рецептором В (hPRB), в сочетании с вирусами опухоли молочной железы мышей (MMTV) и люциферазным рецепторным геном (время инкубации 16 ч, температура 37°С) и сравнивали с активностью (16α)-16-этил-21-гидрокси-19-норпрегнен-4-дион-3,20 [согласно методике, описанной Schoonen W.J.E. et. al., Analyt. Biochem. 261, 222-224 (1998)]. Результаты собраны в таблице 1.
Анализ на подавление LH
in vivo
Определяли эффективность соединений изобретения  на модели зрелого кастрированного самца крысы.
В такой модельной сыворотке LH является высоким (примерно 20-кратное превышение, по сравнению с неповрежденными крысами, из-за отсутствия негативной обратной связи тестикулярного тестостерона). Этих крыс перорально (р.о.) лечили в течение 4 дней, ежедневно давая соединение по изобретению в жидкой суспезии арахисового масла или арахисового масла +5 или 10% этанола. Перед принятием дозы и через 3 часа после последнего приема пероральной дозы отбирали кровь из кровеносного сосуда хвоста и определяли содержание в сыворотке LH. Эффективность (р.о.) соединений изобретения (минимальная активная доза, MAD) выражается как количество (мг/кг) соединения изобретения, которое подавляет сывороточный LH на 65% (с 95% доверительным интервалом).
Иммунный флуориметрический анализ LH крысы с временным разрешением (TR-IFMA) проводили в доме, применяя реагенты, сделанные в домашних условиях, моноклональное захваченное антитело направляли против β-субъединицы человеческого гонадотропного хориона (hCG, который дает перекрестную реакцию с β-субъединицей крысы) и меченное биотином определяющее антитело (поликлональное антитело крысы, направленное против альфа-субъединицы рекомбинанта LH крысы).
Рекомбинант LH крысы приготовлен согласно известным способам, например, способом, описанным Hacla et al Molecular & Cellular Endocrinology (1997), 128, 47-56. В этом двухцентровом IFMA определяется только исходный LH крысы посредством терминальной инкубации со стрептавидин-европием. Обнаружение в IFMA основано на флуоресценции лантанида европия в течение относительно длительного периода возбуждения. Диапазон концентраций стандарта LH крысы составляет 0,001-10 нг/мл, для лучшей точности измерений сыворотки LH образцы сыворотки разбавляли в 8 раз буфером для анализа (J.I. van Casteren et al., Biol. Reprod. (2000), 62, 886-894). Результаты приведены в таблице 1.
<b>Таблица 1</b><b>Андрогенная и прогестагенная агонистическая активность/данные по подавлению LH соединениями данного изобретения (Примеры 1 и 2) и соединениями-прототипами (A-C)</b>
<b>Соединение</b>
<b>Андрогенная активность (%)</b>
<b>Прогестагенная активность (%)</b>
<b>Подавление LH</b><b>MAD p.o. (мг/кг)</b>
Соед. примера 1
42,9
53,3
8,5
Соед. примера 2
9,9
29,7
10
Соединение для сравнения А
71,6
98,0
>30
Соединение для сравнения В
25,3
10,6
>30
Соединение для сравнения С
220
45
1,0
Соединение для сравнения А: (17аβ)-17а-гидрокси-17а-метил-D-гомоэстрен-4-он-3
Соединение для сравнения В: (7α,17аβ)-17а-гидрокси-7-метил-D-гомоэстрен-4-он-3
Соединение для сравнения С: (7α,17β)-17-гидрокси-7,17-диметилэстрен-4-он-3 (Miboleron)
Антиостеопорозный тест на зрелых кастрированных самцах крыс (лечение в течение 6 недель).
В этом тесте оценивали пероральную эффективность соединения изобретения по предотвращению потери минеральной плотности костной ткани (МПКТ) (BMD) губчатой кости самцов крыс, вызванную кастрированием.
Применяли зрелых самцов крыс Wistar (350-400 г). Операцию по удалению яичка (orx) или симулирующую операцию проводили при анестезии фторированным простым эфиром. После восстановления от анестезии в течение 24 часов крыс лечили ежедневно в течение 6 недель р.о. различными дозами соединений изобретения или только наполнителями (безвредными плацебо, плацебо orx) объемом 1 мл/кг (n=5). Через день после последнего назначения выполнили аутопсию и исследовали правую бедренную кость. Измерили минеральную плотность костной ткани губчатой кости метафизарной части бедренной кости по pQCT (аппарат периферической количественной компьютерной томографии; XCT 960A,Stratec, Birkenfeld, Germany). Результаты приведены в таблице 2.
<b>Таблица 2</b><b>Результаты остеопорозного анализа</b>
<b>Соединение</b>
<b>Доза</b>
<b>BMD</b><b>(gmean ± sem)</b><b>(ср.знач. ± ст. откл)</b>
<b>Значение, пропорциональное разнице в плотности костной ткани</b>
Плацебо интакт
0 мг/кг
217±27
100%
Плацебо orx
0 мг/кг
100±17
0%
Соед. Примера 1
8 мг/кг
255±22
133%
Соединение для сравнения А
16 мг/кг
133±20
28%
Определение безопасности печени: проба на удержание BSP
Основная цель этого теста состояла в оценке функции печени с помощью измерения клиренса разовой введенной в/в дозы бромсульфофталеина (BSP) после 7 дней (раз в день) р.о. лечения самцов кастрированных кроликов.
2
1/2
Вкратце, этот тест выполняли на зрелых самцах кастрированных кроликов NZW. По меньшей мере, через две недели после кастрации животных лечили в течение семи дней (раз в день) соединением изобретения в таблетках или в среде арахисового масла +5% этанола в дозах по 10 мг/кг. Через двадцать четыре часа после последнего назначения кроликов слегка усыпили с помощью 0,15 мл Hypnorm в/м и ввели BSP (15 мг/кг в/в, растворенный в 5% (мас./об.) маннитол/HO). Кровь отбирали через 5, 10, 15 и 20 минут и содержание BSP в плазме определяли с помощью спектрофотометра. Т по отношению к BSP рассчитали из полученных данных (см. таблицу 3).
<b>Таблица 3</b><b>BSP данные соединения изобретения</b>
<b>Соединение</b>
<b>Носитель</b>
<b>Т</b><sub>1/2 </sub><b>BSP (мин)</b>
Соед. Примера 1
Таблетка
6,3
Тестостерон
Таблетка
5,2
Соединение С для сравнения
Таблетка
13,6
Соед. Примера 1
Арахисовое масло + 5% этанола
4,6
Тестостерон
Арахисовое масло + 5% этанола
4,2
Соединение для сравнения С
Арахисовое масло + 5% этанола
7,1