БИОИНЖЕНЕРНЫЙ КОНСТРУКТ ДЛЯ ИМПЛАНТАЦИИ ТКАНИ И СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ НАЗВАННОГО БИОИНЖЕНЕРНОГО КОНСТРУКТА (ВАРИАНТЫ)
BIOENGINEERED CONSTRUCT FOR TISSUE IMPLANTATION AND METHOD FOR MAKING SAID BIOENGINEERED CONSTRUCT (VERSIONS)

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к области тканевой инженерии. Настоящее изобретение направлено на способ изготовления биоинженерного конструкта. Указанные бионженерные конструкты биологически совместимы и способны к биоремоделированию, а также могут использоваться в клинических целях.
Уровень техники
Объект настоящего изобретения имеет отношение к дисциплинам тканевой инженерии, регенерации ткани и регенеративной медицины, объединяющей методы биоинженерии с принципами наук о жизни для понимания структурных и функциональных связей в нормальных и патологических тканях млекопитающих. Общая цель этих дисциплин - развитие и конечное применение биологических заместителей для восстановления, поддержания или улучшения функций ткани. Таким образом, возможно спроектировать и изготовить биоинженерную ткань в лаборатории. Биоинженерные ткани могут включать клетки, которые обычно связываются с природными тканями млекопитающих или человека и синтетическими или естественными матричными подложками. Новая биоинженерная ткань должна быть функциональной после трансплантации в организм и быть надолго инкорпорирована в организм или постепенно ремоделирована (сделана заново) клетками биоинженерной ткани или организма реципиента. Изготовление биоинженерных тканевых конструктов без инкорпорации или опоры на экзогенные опорные элементы или подложки приводит к научным проблемам, заключающимся в создании новых биоинженерных тканевых конструктов.
Раскрытие изобретения
Изобретение относится к биоинженерным конструктам ткани, продуцированным культивированными клетками и эндогенно продуцированным внеклеточным матричным компонентам без необходимости в экзогенных матричных компонентах или поддержки среды или компонентов подложки. Изобретение, таким образом, предпочтительно может быть сделанным полностью из клеток человека и человеческих матричных компонентов, продуцированных этими клетками, например, когда биоинженерный конструкт ткани разработан для использования у людей.
Изобретение также относится к способам производства конструктов ткани посредством стимуляции клеток в культуре, таких как фибробласты, для продуцирования внеклеточнах матричных компонентов без добавления экзогенных матричных компонентов, поддержки среды или элементов подложки.
Изобретение также относится к способам производства конструктов ткани посредством стимуляции клеток в культуре, таких как фибробласты, для производства внеклеточных матричных компонентов в системе среды определенного состава и/или без использования неопределенных или "полученных не из человека" биологических компонентов, таких как бычья сыворотка или экстракты органов.
Дополнительно, изобретение относится к биоинженерным конструктам, включающим девитализированный и/или децеллюляризированный слой внеклеточного матрикса, продуцированный и собранный культивированными клетками, продуцирующими внеклеточный матрикс.
Также дополнительно, изобретение относится к способу создания биоинженерного конструкта, включающему производство двух или более слоев эндогенно продуцированных внеклеточных матриксов и последующей девитализации и/или децеллюляризации клеток, продуцирующих внеклеточный матрикс и объединения этих двух или более слоев посредством связывающих и/или биологически совместимых и способных к биологическому ремоделированию адгезивных растворов.
Биоинженерный конструкт ткани произведен и самособран культивированными клетками без необходимости в поддержке подложкой или дополнении экзогенными внеклеточными матричными компонентами.
Ранее сконструированные конструкты живой ткани были собраны не полностью из клеток и должны были поддерживаться или на дополнении или на инкорпорации экзогенных матричных компонентов или синтетических элементов для структурирования или поддержки, или и того и другого.
Биоинженерные конструкты ткани, описаные здесь, демонстрируют многие из врожденных особенностей ткани, из которой получены их клетки. Конструкты ткани, полученные таким образом, могут использоваться для трансплантации субъекту или для тестирования in vitro.
В одном предпочтительном воплощении изобретение представляет собой клеточно-матричный конструкт, включающий клетки первого типа и эндогенно продуцированный внеклеточный матрикс, где клетки первого типа способны к синтезу и секреции внеклеточного матрикса для получения клеточно-матричного конструкта.
В другом предпочтительном воплощении изобретение представляет собой двухслойный конструкт, включающий клетки первого типа и эндогенно продуцированный внеклеточный матрикс, и слой клеток второго типа, расположенного вслед за или внутри клеточно-матричного конструкта, сформированного первым типом клеток.
Более предпочтительное воплощение настоящего изобретения представляет собой клеточно-матричный конструкт, включающий фибробласты, такие как произведенные дермой, для формирования культивированного конструкта кожи.
Другое более предпочтительное воплощение представляет собой клеточно-матричный конструкт, включающий фибробласты, такие как полученные из дермы, для формирования выращиваемого конструкта кожи со слоем кератиноцитов, культивированных для последующего формирования эпидермального слоя, чтобы в результате получить культивированный двухслойный конструкт кожи. Культивированные конструкты кожи изобретения обладают многими физическими, морфологическими и биохимическими особенностями природной кожи.
В еще более предпочтительном воплощении клеточно-матричный конструкт представляет собой конструкт ткани, который подобен дерме кожи, конструкт человеческой кожи, который сформирован в определенной системе, включающей клетки, полученные от человека, без использования химически неопределенных компонентов во время их культивирования.
В наиболее предпочтительном воплощении изобретения конструкты ткани изобретения изготовлены в химически определенной системе, включающей клетки, полученные от человека, без химически неопределенных или отличных от человеческих биологических компонентов или клеток.
В одном предпочтительном воплощении изобретение включает структурный слой по крайней мере одного типа клеток, продуцирующих внеклеточный матрикс, и эндогенно продуцированные внеклеточные матричные компоненты, для удобства названные "матрикс", где матрикс полностью синтезируется клеткой и собирается при культивировании клеток. Этот слой далее называют "клеточно-матричным конструктом", "клеточно-матричным слоем" или "клеточно-матричной пластиной", потому что клетки секретируют и сами находятся в пределах и по всему объему их матрикса. Культивированные конструкты ткани не нуждаются, и, таким образом, не содержат экзогенные матричные компоненты, то есть матричные компоненты, произведенные не культивированными клетками, а введенные другими способами. В более предпочтительном воплощении у клеточно-матричного конструкта, произведенного фибробластами кожи человека, как показано, имеется преобладающее содержание коллагена, подобного коллагену натуральной кожи. По данным электронной микроскопии матрикс является волокнистым по природе и включает коллаген, который показывает четвертной характер исчерченности с периодом 67 нм, также как и организацию упаковки фибрилл и связки фибрилл подобные натуральному коллагену. Отсроченная репозиция SDS-PAGE электрофореза показала наличие как типа I, так и типа III коллагена в этих конструктах, преобладающих типов коллагена, найденных в натуральной коже человека. Используя стандартные методы иммуногистохимии, клеточно-матричный конструкт кожи положительно окрашивается на присутствие декорина, дерматансульфатного протеогликана, ассоциированного, как известно, с фибриллами коллагена и, как предполагается, регулирующего диаметр фибрилл in vivo. Декорин может также визуализироваться в конструкте с помощью ТЭМ (туннельной элктронной микроскопии). Продуцированная ткань также окрашивается положительно на присутствие тенасцина, гликопротеида внеклеточного матрикса, найденного, например, в мезенхиме или тканях после репарации. Очень похожая на ткань после репарации in vivo ткань, произведенная в культуре, как было показано, увеличивала отношение содержания коллагена типа I к коллагену типа III по мере формирования матрикса. Не желая быть связанным теорией, считается, что клетки быстро заполняют открытое пространство между собой рыхлым матриксом, аналогичным гранулированной ткани, состоящей главным образом из коллагена III типа и фибронектина, и затем модифицируют этот рыхлый матрикс в более плотный матрикс, состоящий главным образом из коллагена I типа. Полученный клеточный матрикс, как показано, содержал глюкозаминогликаны (ГАГ), такие как гиалуроновая кислота, фибронектин, протеогликаны помимо декорина, такие как бигликан и верзикан и профиль сульфатированных глюкозаминогликанов, таких как дигиалуроновая кислота, ди-хондроитин-0-сульфат, ди-хондроитин-4-сульфат, ди-хондроитин-6-сульфат, ди-хондроитин-4,6-сульфат, ди-хондроитин-4-сульфат-UA-23; и дихондроитин-6-сульфат-UA-2S. Эти структурные и биохимические особенности проявляются, поскольку конструкт развивается в культуре и отчетливо видно, когда конструкт приближается к своей конечной форме. Наличие указанных компонентов в полностью сформированном культивированном клеточно-матричном конструкте кожи указывает, что конструкт обладает структурными и биохимическими особенностями, приближающимися к таковым особенностям нормальной дермы.
В то время как вышеупомянутый список является списком
биохимических и структурных особенностей культивируемого клеточно-матричного конструкта, сформированного из фибробластов кожи, должно быть понятно, что культивированные клеточно-матричные конструкты, сформированные из других типов фибробластов, воспроизведут многие из этих особенностей, а также другие фенотипические особенности типов ткани, из которых они получены. В некоторых случаях фибробласты могут быть индуцированы для экспрессии нефенотипических элементов посредством химического воздействия или контакта, физическим стрессом или трансгенными средствами. Другое предпочтительное воплощение изобретения представляет собой клеточно-матричный слой, имеющий второй слой клеток, расположенных вслед за первым. Второй слой клеток культивируется на клеточно-матричном слое для формирования биоинженерного двухслойного конструкта ткани. В более предпочтительном воплощении клетки второго слоя имеют эпителиальное происхождение. В наиболее предпочтительном воплощении второй слой клеток включает культивированные человеческие кератиноциты, которые находятся вместе с первым клеточно-матричным слоем, клеточно-матричный конструкт, сформированный из фибробластов кожи, и эндогенный матрикс для формирования слоя дермы включает конструкт живой кожи. После полного формирования эпидермальный слой является многослойным, стратифицированным и представляет собой высокодифференцированный слой кератиноцитов, которые формируют базальный слой, супрабазальный слой, зернистый слой и роговой слой. У конструкта кожи есть хорошо развитая базальная мембрана, представленная как дерма-эпидермальный переход как показала туннельная электронная микроскопия. Базальная мембрана является наиболее толстой вокруг гемидесмосом, отмеченных фиксирующими фибриллами, которые состоят из коллагена типа VII, как визуализируют с помощью ТЭМ. Фиксирующие фибриллы можно увидеть выходящими из базальной мембраны и переходящими в фибриллы коллагена в слое дермы. Эти фиксирующие фибриллы, так же как и другие компоненты базальной мембраны, секретируются кератиноцитами. Также известно, что, в то время как кератиноциты способны к самостоятельной секреции компонентов базальной мембраны, распознаваемая базальная мембрана не будет формироваться в отсутствие фибробластов. Иммуногистохимическое окрашивание конструкта кожи существующего изобретения также показало присутствие белка базальной мембраны ламинина.
В предпочтительном способе изобретения для формирования клеточно-матричного конструкта клетки первого типа (тип клеток, продуцирующих внеклеточный матрикс) засеваются на подложку, культивируются и индуцируются для того, чтобы синтезировать и секретировать организованный внеклеточный матрикс вокруг себя для формирования клеточно-матричного конструкта. В другом предпочтительном способе изобретения поверхность клеточно-матричного конструкта засевается клетками второго типа и культивируется для формирования двухслойного конструкта ткани. В более предпочтительном способе конструкт, имеющий характеристики, подобные натуральной человеческой коже, сформирован на полную толщину кожи культивированными фибробластами, такими как фибробласты кожи человека в условиях, достаточных для индуцирования синтеза матрикса для формирования клеточно-матричного слоя кожи из клеток кожи и матрикса, на который засеваются и клуьтивируются человеческие эпителиоциты, такие как кератиноциты, в условиях, достаточных для формирования полностью дифференцированного, стратифицированного эпидермального слоя.
Таким образом, один из способов получения биоинженерных конструктов ткани существующего изобретения включает: (а) культивирование по крайней мере одного типа клеток, производящих внеклеточный матрикс в отсутствие экзогенных внеклеточных матричных компонентов или структурного элемента поддержки; (b) стимулирование клеток стадии (а) для синтеза, секреции и организации компонентов внеклеточного матрикса для формирования конструкта ткани, включающего клетки и матрикс, синтезированный этими клетками; в котором стадии (а) и (b) могут осуществляться одновременно или последовательно и, (с) девитализирование или децеллюляризация конструкта ткани, содержащего компоненты матрикса, для клинического использования. Два или более девитализированных или децеллюляризированных конструкта ткани могут быть соединены вместе и связаны вместе каждый посредством сшивания или с использованием биосовместимого или биорассасывающегося связующего вещества.
Приготовление питательных сред
Клеточно-матричные конструкты сформированы культивированными клетками в питательной среде, которая поддерживает жизнеспособность клеток, пролиферацию и синтез внеклеточных матричных компонентов клетками. Питательная среда состоит из питательной основы, обычно дополнительно подкрепленной другими компонентами. Квалифицированный специалист может подобрать соответствующие питательные основы в области культивирования клеток животных с приемлемыми ожиданиями успешного производства конструкта ткани по изобретению. Множество коммерчески доступных питательных сред могут использоваться в способах осуществления существующего изобретения. Они включают коммерчески доступные питательные источники, которые поставляют неорганические соли, источники энергии, аминокислоты и В-витамины, например питательная среда Игла в модификации Дульбекко (DMEM), минимальная поддерживающая среда (MEM), M199, РПМИ 1640, среда Дульбекко в модификации Исков (EDMEM). Минимальная поддерживающая среда и M199 требуют дополнительного включения предшественников фосфолипидов и заменимых аминокислот. Коммерчески доступные богатые витаминами смеси, которые служат источником дополнительных аминокислот, нуклеиновых кислот, кофакторов ферментов, предшественников фосфолипидов и неорганических солей включают среды Хэма F-12 и F-10, NCTC 109 и NCTC 135. Хоть и в различных концентрациях, все базальные среды поставляют основные питательные вещества для клеток в форме глюкозы, аминокислот, витаминов и неорганических ионов вместе с другими основными компонентами питательных сред. Самая предпочтительная базальная питательная среда для изобретения включает питательную основу или без кальция или с низким содержанием кальция: питательную среду Игла в модификации Дульбекко (DMEM) или, альтернативно, DMEM и среду Хэма F-12 при соотношении от 3:1 до 1:3 соответственно.
Базальная питательная среда дополняется такими компонентами, как аминокислоты, факторы роста и гормоны. Определенные питательные среды для культивирования клеток по изобретению описаны в патенте США №5712163, Международной публикации PCT № WO 95/31473 и публикации РСТ № WO 00/29553, содержание которых включены здесь посредством ссылки. Другие питательные среды известны в уровне техники, например раскрытые в статье Ham и McKeehan, Methods in Enzymology, 58:44-93 (1979), или другие подходящие среды определенного химического состава у Bottenstein et al., Methods in Enzymology, 58:94-109 (1979). В предпочтительном воплощении базальная питательная среда дополнена следующими компонентами, известными квалифицированному специалисту в области культивирования клеток животных: инсулин, трансферрин, трийодтиронин (ТЗ), и вместе или по отдельности этаноламин и о-фосфорил-этаноламин, где концентрации и замены добавок могут быть определены квалифицированным специалистом.
Составы питательных сред, подходящие для использования в существующем изобретении, выбираются в зависимости от типов клеток, которые будут культивироваться и в зависимости от структуры ткани, которая будет продуцирована. Используемая питательная среда и определенные условия культивирования должны поддерживать рост клеток, синтез матрикса, и их жизнеспособность будет зависеть от типа клеток или комбинаций типов клеток, которые должны быть выращены.
В некоторых случаях, таких как изготовление биоинженерных двухслойных конструктов кожи существующего изобретения, состав питательных сред меняется в зависимости от каждой стадии изготовления, поскольку различные добавки необходимы для различных задач. В предпочтительном способе клеточно-матричный слой сформирован в определенных условиях, то есть культивируется в средах определенного химического состава. В другом предпочтительном способе конструкт ткани включает клеточно-матричный слой, предусматривающий второй слой клеток, расположенных и культивируемых вслед за первым, где оба типа клеток культивируются в системе питательной среды с определенным химическим составом. Альтернативно, конструкт ткани включает клеточно-матричный слой, изготовленный в условиях среды определенного (химического) состава и второй слой, сформированный вслед за первым в условиях питательной среды неопределенного состава. С другой стороны конструкт ткани включает клеточно-матричный слой, который может быть изготовлен в условиях питательной среды неопределенного состава и второй слой, сформированный вслед за первым в условиях питательной среды определенного состава.
Использование питательных сред с определенным химическим составом предпочтительно, то есть питательные среды, свободные от неопределенных экстрактов органов и тканей животных, например, сыворотки, экстракта гипофиза, гипоталамического экстракта, плацентарного экстракта или зародышевого экстракта или белков и факторов, секретированных питающими клетками. В самом предпочтительном воплощении питательные среды свободны от неопределенных компонентов и биологических компонентов, полученных из животных источников, отличных от человека. Несмотря на то что добавление неопределенных компонентов нежелательно, они могут использоваться в соответствии с раскрытыми способами на любой стадии культивирования для успешного изготовления конструкта ткани. Когда изобретение выполнено, использующиеся скринированные клетки человека, культивируются с использованием химически определенных компонентов, полученных только из человеческих источников, с получением в результате конструкта ткани, который представляет собой конструкт определенной ткани человека. Синтетические или рекомбинантные функциональные эквиваленты могут также быть добавлены для поддержания среды определенного химического состава в пределах области определения химической определенности для использования в наиболее предпочтительном способе изготовления. В целом, любой квалифицированный в области клеточного культивирования специалист будет в состоянии определить подходящие натуральные человеческие, человеческие рекомбинантные или синтетические эквиваленты широко известным компонентам животных для поддержания питательной среды изобретения без неуместного исследования или экспериментирования. Преимущества в использовании такого конструкта в клинике состоят в том, что уменьшается риск адвентициального животного или межвидового вирусного загрязнения и инфекции. В сценарии тестирования преимущества химически определенного конструкта состоят в том, что при проведении тестирования нет никаких ошибок в результатах из-за наличия неопределенных компонентов.
Инсулин является полипептидным гормоном, который способствует поглощению глюкозы и аминокислот для обеспечения длительного благоприятного воздействия посредством многочисленных путей. Добавление инсулина или инсулиноподобного фактора роста (ИФР) необходимо для длительного культивирования, поскольку есть риск истощения способности клеток к поглощению глюкозы и аминокислот и возможен риск деградации фенотипа клеток. Инсулин может быть получен или из животных организмов, например бык и человеческие источники, или рекомбинантными средствами, например человеческий рекомбинантный инсулин. Таким образом, человеческий инсулин признавался бы как химически определенный компонент, не полученный из биологического источника, отличного от человека. Добавление инсулина желательно для последовательного культивирования и добавляется к питательным средам в широком диапазоне концентраций. Предпочтительный диапазон концентрации от приблизительно 0,1 мкг/мл до приблизительно 500 мкг/мл, более предпочтительно в концентрации от приблизительно 5 мкг/мл до приблизительно 400 мкг/мл и наиболее предпочтительно приблизительно 375 мкг/мл. Подходящие концентрации для добавления инсулиноподобного фактора роста, такого как ИФР-1 или ИФР-2 и т.п. могут быть легко определены любым из квалифицированных специалистов в области типов клеток, выбранных для культивирования.
Трансферрин добавляется в питательную среду для регуляции транспорта железа. Железо представляет собой важный микроэлемент, найденный в сыворотке. Поскольку железо в его свободной форме может быть токсичным для клеток, в сыворотке, из которой оно поставляется клеткам, железо связано с трансферрином в диапазоне концентраций предпочтительно от приблизительно 0,05 до приблизительно 50 мкг/мл, более предпочтительно приблизительно 5 мкг/мл.
Трийодтиронин (ТЗ) является основным компонентом и представляет собой активную форму гормона щитовидной железы, который включается в питательную среду для поддержания нормального метаболизма клеток. Трийодтиронин добавляется к питательной среде в диапазоне концентраций от приблизительно 0 до приблизительно 400 пМ, более предпочтительно от приблизительно 2 до приблизительно 200 пМ и наиболее предпочтительно приблизительно 20 пМ.
-6
-2
-4
Этаноламин и/или о-фосфорил-этаноламин, которые являются фосфолипидами, добавляются из-за их функции - каждый из них является важным предшественником в пути инозитола и метаболизме жирных кислот. Добавление липидов, которые обычно находятся в сыворотке, необходимо в бессывороточной питательной среде. Этаноламин и о-фосфорил-этаноламин добавляются к питательным средам в диапазоне концентраций от приблизительно 10 до приблизительно 10 М, более предпочтительно приблизительно 1×10 М.
В течение всего процесса культивирования базальная питательная среда дополнительно подкрепляется другими компонентами для индуцирования синтеза или дифференцирования или улучшения роста клеток, такими как гидрокортизон, селен и L-глютамин.
Гидрокортизон, как было показано, при культивировании кератиноцитов индуцировал фенотип кератиноцита и поэтому увеличивал характеристики дифференцирования, такие как содержание инволюкрина и трансглютаминазы кератиноцитов (Rubin et al., J. Cell Physiol., 138:208-214 (1986)). Таким образом, гидрокортизон представляет собой желательную добавку в случаях, когда необходимы указанные характеристики, например при формировании пластинчатых кератиноцитовых трансплантатов или конструктов кожи. Гидрокортизон может быть представлен в среде в диапазоне концентраций от приблизительно 0,01 мкг/мл до приблизительно 4,0 мкг/мл, наиболее предпочтительно от приблизительно 0,4 мкг/мл до 16 мкг/мл.
-9
-7
-8
Селенистая кислота добавляется к бессывороточным питательным средам для дополнения микроэлементами селена, обычно обеспечиваемого сывороткой. Селенистая кислота может быть представлена в диапазоне концентрации от приблизительно 10 М до приблизительно 10 М, наиболее предпочтительно приблизительно 5,3×10 М.
Аминокислота L-глютамин присутствует в некоторых питательных основах и может быть добавлена в случаях, когда отсутствует или представлено недостаточное количество аминокислоты. L-глютамин также может добавляться в устойчивой форме, такой как продающейся под маркой GlutaMAX-1™ (Gibco BRL, Grand Island, NY). GlutaMAX-1™ является устойчивой формой дипептида L-аланил-L-глутамин и может использоваться попеременно с L-глютамином или добавляться в эквимолярных концентрациях как замена L-глютамину. Дипептид обеспечивает стабильность L-глютамину от деградации в течение долгого времени при хранении и во время инкубации, которая может привести к неуверенности в эффективной концентрации L-глютамина в питательной среде. Как правило, базальная питательная среда обогащена предпочтительно от приблизительно 1 мМ до приблизительно 6 мМ, более предпочтительно от приблизительно 2 мМ до приблизительно 5 мМ и наиболее предпочтительно 4-мМ L-глютамином или GlutaMAX-1™.
Факторы роста, такие как эпидермальный фактор роста (ЭФР), также могут быть добавлены к питательной среде, чтобы помочь в приживаемости культур посредством роста и отбора клеток. ЭФР может использоваться в нативной или рекомбинантной формах. Человеческие формы ЭФР, природные или рекомбинантные, предпочтительны для использования в питательной среде, в случае когда изготовляют эквивалент кожи, не содержащий биологических компонентов, отличных от человеческих. ЭФР представляет собой дополнительный компонент и может быть представлен в концентрации от приблизительно 1 до 15 нг/мл, более предпочтительно от приблизительно 5 до 10 нг/мл.
Другие добавки также могут быть добавлены к питательной среде, такие как один или более простагландинов, трансформирующие факторы роста (включая трансформирующий фактор роста α или β), фактор роста кератиноцитов (ФРК), фактор роста соединительной ткани (ФРСТ) или манноза-6-фосфат (М6Ф) или их комбинации.
2
2
2
2
2
2
2
Простагландин Е (ПГЕ) генерируется воздействием синтазы простагландина Е на простагландин Н (ПГН). Было обнаружено несколько синтаз простагландинов Е. На сегодняшний день синтаза-1 микросомального простагландина Е выступает в качестве ключевого фермента в формировании ПГЕ. ПГЕ добавляется к питательной среде предпочтительно в диапазоне от приблизительно 0,000038 мкг/мл до приблизительно 0,760 мкг/мл, более предпочтительно от приблизительно 0,00038 мкг/мл до приблизительно 0,076 мкг/мл, наиболее предпочтительно от приблизительно 0,0038 мкг/мл до приблизительно 0,038 мкг/мл. 16,16 форма ПГЕ может также быть добавлена в указанных диапазонах концентрации.
Альфа-трансформирующий фактора роста (ТФР-α) производится в макрофагах, клетках мозга и кератиноцитах и индуцирует развитие эпителия. Эти свойтва тесно связаны с ЭФР и также могут быть связаны с рецептором ЭФР, обладающими подобными эффектами. В изобретении предпочтительно используется длинная форма цепи ТФР-α. ТФР-α представляет собой маленький (около 50 остатков) белок, который обладает 30% структурной гомологией с ЭФР и конкурирует с ним за один и тот же поверхностно-связывающий сайт рецептора. Указанные процессы вовлечены в заживление ран и вызывают фенотипические изменения в определенных клетках. ТФР-α или длинная цепь ТФР-α добавляются к питательной среде предпочтительно в диапазоне от приблизительно 0,0005 мкг/мл до приблизительно 0,30 мкг/мл, более предпочтительно от приблизительно 0,0050 мкг/мл до приблизительно 0,03 мкг/мл, наиболее предпочтительно от приблизительно 0,01 мкг/мл до приблизительно 0,02 мкг/мл.
Дополнение базовой питательной среды фактором роста кератиноцитов в концентрации 5 мкг/мл может использоваться для поддержания эпидермализации (роста кожи). Фактор роста кератиноцитов добавляется к питательной среде предпочтительно в диапазоне от приблизительно 0,001 мкг/мл до приблизительно 0,150 мкг/мл, более предпочтительно от приблизительно 0,0025 мкг/мл до приблизительно 0,100 мкг/мл, наиболее предпочтительно приблизительно от 0,005 мкг/мл до приблизительно 0,015 мкг/мл.
Добавление к базовой питательной среде манноза-6-фосфата (М6Ф) может использоваться для поддержки эпидермализации (образования кожи). Манноза-6-фосфат добавляется к питательной среде предпочтительно в диапазоне от приблизительно 0,0005 мг/мл до приблизительно 0,0500 мг/мл.
ФРСТ (фактор роста соединительной ткани) является богатым цистеином, матрикс-ассоциированным, гепарин-связывающим белком. In vitro, ФРСТ повторяет некоторые из эффектов ТФР-β на фибробластах кожи, такие как стимуляция продукции внеклеточного матрикса, хемотаксиса, пролиферации и экспрессии интегринов. ФРСТ может вызвать рост эндотелиальных клеток, миграцию, адгезию и выживание и таким образом участвует в функции эндотелиальных клеток и ангиогенезе. ФРСТ связывается с перлеканом - протеогликаном, который был найден в синовиальной оболочке, хряще и многочисленных других тканях. ФРСТ участвует во внеклеточном ремоделировании матрикса в процессе заживления ран, склеродермии и других фиброзных процессах, благодаря своей способности к активированию матричных металлопротеиназ (ММП) и их ингибиторов. Таким образом, у ФРСТ есть потенциал для активирования как синтеза, так и деградации внеклеточного матрикса.
Питательные среды, описанные выше, обычно готовятся как показано далее. Однако нужно понимать, что компоненты существующего изобретения могут быть получены и собраны с использованием обычных способов, совместимых с их физическими свойствами. В уровне техники известна замена определенных компонентов подходящими аналогами или функционально эквивалентными действующими средствами с целью доступности или экономики и получением аналогичных результатов. Естественные факторы роста можно заменить рекомбинантными или синтетическими факторами роста, у которых есть аналогичные качества и результаты при использовании в исполнении изобретения.
Питательные среды в соответствии с существующим изобретением стерильны. Стерильные компоненты были куплены стерильными или стерилизовались обычными процедурами, такими как фильтрация, после получения. Надлежащие асептические процедуры использовались в каждом из следующих примеров. DMЕМ и среда Хэма F-12 были сначала объединены, и затем к ним добавили отдельные компоненты для получения готовой питательной среды. Основные (стоковые) растворы всех компонентов могут храниться при -20°С, за исключением источника питательных веществ, который может храниться при 4°С. Все основные растворы, упомянутые выше, были получены в 500Х конечной концентрации. Основные растворы инсулина, трансферрина и трийодтиронина (все куплены у Sigma) получали следующим образом: трийодтиронин первоначально растворяли в абсолютном этаноле в 1 н. соляной кислоте (HCl) при соотношении 2:1. Инсулин был растворен в разбавленной HCl (приблизительно 0,1 н.), и трансферрин был растворен в воде. Указанные три белка затем смешали и разбавили водой до 500Х концентрации. Этаноламин и о-фосфорил-этаноламин были растворены в воде до 500Х концентрации и были стерилизованы фильтрацией. Прогестерон растворили в абсолютном этаноле и разбавили водой. Гидрокортизон был растворен в абсолютном этаноле и разбавлен фосфатно-солевым буферным раствором (ФСБ). Селен был растворен в воде до 500Х концентрации и стерилизован фильтрацией. ЭФР был куплен стерильным и разводился в ФСБ. Аденин является малорастворимым, но может быть растворен любым из способов, известных квалифицированным в области техники специалистам. Сывороточный альбумин может добавляться к определенным компонентам для их стабилизации в растворах и может быть получен или от человека или из животных источников. Например, человеческий сывороточный альбумин (ЧСА) или бычий сывороточный альбумин (БСА) могут быть добавлены, чтобы поддержать активность прогестерона и основных растворов ЭФР при длительном хранении. Были разработаны рекомбинантные формы альбумина, такие как человеческий рекомбинантный альбумин, и предпочтительно их использование вместо форм, полученных из сыворотки человека или быка. Питательная среда может использоваться или сразу после приготовления или храниться при температуре 4°С. Если питательная среда находится на хранении, ЭФР не должен быть добавлен до времени использования.
Для формирования клеточно-матричного слоя посредством культивирования производящих матрикс клеток в питательную среду добавляются дополнительные средства, которые вызывают синтез матрикса и депонирование клетками. Эти дополнительные средства совместимы с клетками, определены с высокой степенью чистоты и свободны от примесей. Питательную среду, используемую, чтобы произвести клеточно-матричный слой, называют "средой продукции матрикса".
Чтобы приготовить среду продукции матрикса, базовая питательная среда дополняется производными аскорбата, такими как аскорбат натрия, аскорбиновая кислота или одна из ее более химически устойчивых производных, таких как n-гидрат магниевой соли фосфат L-аскорбиновой кислоты. Аскорбат добавляется для гидроксилирования пролина и секреции проколлагена, растворимого предшественника депонированных молекул коллагена. Аскорбат, как было показано, является важным кофактором для пост-трансляционного процессинга других ферментов также как он является активатором синтеза коллагена типа I и III типа.
Не связывая себя никакими теориями, добавление в питательную среду аминокислот, вовлеченных в синтез белка, сохраняет клеточную энергию, не требуя непосредственного производства аминокислот самими клетками. Добавление пролина и глицина предпочтительно, поскольку они, также как и гидроксилированная форма пролина, гидроксипролин, являются основными аминокислотами, которые формируют структуру коллагена.
Хотя и необязательно, среда продукции матрикса дополнительно содержит нейтральный полимер. Клеточно-матричные конструкты изобретения могут быть произведены без нейтрального полимера, но, не связывая никакой теорией, его наличие в среде продукции матрикса может сделать процессинг и депонирование коллагена между образцами более согласованным. Одним из предпочтительных нейтральных полимером является полиэтиленгликоль (ПЭГ), который показал активирование in vitro процессинга растворимого предшественника проколлагена, произведенного культивированными клетками в депонированный коллаген матрикса. Питательные среды по изобретению предпочтительно содержат ПЭГ тканевых культур в диапазоне от приблизительно 1000 до приблизительно 4000 Да (молекулярная масса), более предпочтительно от приблизительно 3400 до приблизительно 3700 Да. Предпочтительные концентрации ПЭГ для использования в способе по изобретению может быть приблизительно 5 мас./об.% или менее, предпочтительно от приблизительно 0,01 мас./об.% до приблизительно 0,5 мас./об.%, более предпочтительно от приблизительно 0,025 мас./об.% до приблизительно 0,2 мас./об.%, наиболее предпочтительно приблизительно 0,05 мас./об.%. Другой класс нейтрального полимера для культивирования представляет собой подобный декстрану, предпочтительно декстран Т-40, или поливинилпирролидон (ПВП), предпочтительно с молекулярной массой в диапазоне 30000-40000 Да, может также использоваться в концентрациях приблизительно 5 мас./об.% или меньше, предпочтительно от приблизительно 0,01 мас./об.% до приблизительно 0,5 мас./об.%, более предпочтительно от приблизительно 0,025 мас./об.% до приблизительно 0,2 мас./об.%, наиболее предпочтительно приблизительно 0,05 мас./об.%. Другие классы средств для клеточного культивирования и совместимых с клетками средств, которые увеличивают процессинг и депонирование коллагена, могут быть определены квалифицированным специалистом в области клеточных культур млекопитающих.
В случае, когда клетки, продуцирующие клеточный матрикс, являются конфлюэнтными, и питательная среда подкреплена компонентами, которые помогают в матричном синтезе, секреции или организации, указанные клетки стимулируются для формирования конструкта ткани, состоящего из клеток и матрикса, синтезируемого указанными клетками.
-4
-4
Таким образом, предпочтительный состав среды продукции матрикса включает: основу, включающую питательную среду Игла в модификации Дульбекко (DMEM) (состав с высоким содержанием глюкозы, без L-глютамина) с добавлением 4 мМ L-глютамина или его эквивалента, 5 мкг/мл эпидермального фактора роста, 0,4 мкг/мл гидрокортизона, 1×10 М этаноламина, 1×10 М о-фосфорил-этаноламина, 5 мкг/мл инсулина, 5 мкг/мл трансферрина, 20 пМ трийодтиронина, 6,78 нг/мл селена, 50 нг/мл L-аскорбиновой кислоты, 0,2 мкг/мл L-пролина и 0,1 мкг/мл глицина. К среде продукции могут быть добавлены другие фармакологические средства для изменения природы, количества или типа секретированного внеклеточного матрикса. Эти средства могут включать полипептидные факторы роста, факторы транскрипции или неорганические соли для активирования транскрипции коллагена. Примеры полипептидных факторов роста включают β-1 трансформирующий фактор роста (ТФР-β1) или тканевый активатор плазмогена, каждый из которых, как известно, активируют синтез коллагена. Raghow et al., Journal of Clinical Investigation, 79:1285-1288(1987); Pardesetal., Journal of Investigative Dermatology, 100:549(1993). Примером неорганической соли, которая стимулирует продукцию коллагена, является церий. Shivakumar et al., Journal of Molecular and Cellular Cardiology 24:775-780 (1992).
Типы клеток
Тип клеток, продуцирующих внеклеточный матрикс для использования в изобретении, может быть любым типом клеток, способных к продуцированию и секретированию внеклеточных матричных компонентов и организации внеклеточных матричных компонентов для формирования клеточно-матричного конструкта. Для формирования клеточно-матричного конструкта может использоваться более чем один тип клеток, продуцирующих внеклеточный матрикс. Клетки различных клеточных типов или различного тканевого происхождения могут культивироваться вместе в виде смеси для продукции дополнительных компонентов и структур, аналогичных таковым, найденным в нативных тканях. Например, тип клеток, продуцирующих внеклеточный матрикс, может содержать смешанный с ним другой тип клеток для продукции внеклеточного матрикса, который обычно не производится первым типом клеток. Альтернативно, тип клеток, продуцирующих внеклеточный матрикс, может также быть смешан с другими типами клетки, которые формируют специализированные тканевые структуры в ткани, но существенно не способствуют полному формированию матричного аспекта клеточно-матричного конструкта, такого как в определенных конструктах кожи изобретения.
Несмотря на то что любой тип клеток, продуцирующих внеклеточный матрикс, может использоваться в соответствии с настоящим изобретением, предпочтительный тип клеток для использования в нестоящем изобретении получен из мезенхимы. Более предпочтительные типы клеток для продукции конструкта кожи человека представляют собой фибробласты, клетки стромы и другие опорные клетки соединительной ткани, наиболее предпочтительно фибробласты кожи человека, обнаруженные в дерме человека. Фибробласты, в основном, производят много внеклеточных матричных белков, прежде всего коллаген. Есть несколько типов коллагена, производимых фибробластами, однако, коллаген 1 типа является самым распространенным in vivo. Фибробласты человека могут быть получены из многих источников, включая, но не ограничиваясь крайней плотью полового члена новорожденных, дермой, сухожилиями, легкими, пуповиной, хрящом, уретрой, стромой роговицы, слизистой оболочкой ротовой полости и кишечником. Клетки человека могут включать, но не ограничены фибробластами, также могут включать: гладкомышечные клетки, хондроциты и другие клетки соединительной ткани мезенхимального происхождения. Предпочтительно, но не обязательно, чтобы производящие матрикс клетки, использующиеся в производстве конструкта ткани, были получены из типа ткани, который имеет сходство или подражает после использования способов культивирования изобретения ткани конструкта. Не желая быть связанными теорией, фибробласты кожи, такие как полученные из фибробластов новорожденных, могут применяться для большинства тканей в теле. Преимущество фибробластов кожи новорожденных заключается в том, что у них, как полагают, есть пластические качества, что означает то, что они способны к трансдифференцировке; являются идеальными для гипоксической среды, и, как полагают, безопасны, биологически совместимы, и привилегированны иммунно, поскольку не вызывают отторжение субъектом. В другом предпочтительном воплощении фибробласты, изолированные микродиссекцией из сосочков кожи или фолликулов волос, могут сами использоваться для продукции матрикса или вместе с другими фибробластами. В воплощении, в котором производится конструкт роговицы, продуцирующие матрикс клетки получены из стромы роговицы. Доноры клеток могут варьироваться по развитию и возрасту. Клетки могут быть получены из донорских тканей эмбрионов, новорожденных или более старших людей, включая взрослых. Зародышевые клетки-предшественники, такие как мезенхимальные стволовые клетки, могут использоваться в изобретении и индуцироваться для дифференцировки с целью развития в желательную ткань.
Несмотря на то что клетки человека предпочтительны для использования в изобретении, клетки, которые будут использоваться в способе изобретения, не ограничены клетками из человеческих источников. Клетки от других видов млекопитающих включают, без ограничения, лошадиные, собачьи, свиные, бычьи и овечьи источники, или могут использоваться клетки грызунов, таких как мышь или крыса. Кроме того, клетки, которые являются клетками спонтанно, химически или вирусно трансфицированные, или рекомбинантные, или генно-инженерные клетки также могут использоваться в настоящем изобретении. В тех воплощениях, которые включают более чем один тип клеток, могут использоваться химерные смеси нормальных клеток из двух или более источников, такие как химерная смесь аутогенных и аллогенных клеток, смеси нормальных и генетически модифицированных или трансфицированных вирусом клеток, смеси клеток, полученных из различных тканей или типов органов, или смеси клеток двух или более видов или источников ткани могут использоваться.
Рекомбинантные или генно-инжененрные клетки могут использоваться в продукции клеточно-матричного конструкта для создания конструкта ткани, который действует в качестве трансплантата для доставки лекарств у субъекта, который нуждается в увеличении уровня естественных продуктов клетки или терапевтическом лечении. Клетки могут производить и поставлять субъекту посредством трансплантата продукты рекомбинантных клеток, факторы роста, гормоны, пептиды или белки непрерывно с течением времени или по мере необходимости, когда присутствует биологическая, химическая или температурная сигнализация определенных условий у субъекта. Желательна как длительная, так и кратковременная экспрессия продукта гена, в зависимости от использования критериев относительно культивируемого конструкта ткани. Длительная экспрессия желательна в случае, когда культивируемый конструкт ткани имплантирован для поставки терапевтических продуктов субъекту в течение длительного периода времени. Наоборот, краткосрочная экспрессия желательна в случаях, когда культивируемый конструкт ткани трансплантирован субъекту, имеющему рану, когда клетки культивируемого конструкта ткани должны активировать нормальное или околонормальное заживление или уменьшить скарификацию участка раны. Как только рана зажила, продукты генов культивируемого конструкта ткани больше не нужны или больше не нежелательны на участке раны. Клетки также могут быть созданы с помощью генной инженерии для экспрессии белков или различного типа внеклеточных матричных компонентов, которые 'нормальны', но при этом обладают высокой экспрессией или изменены каким-либо образом с целью продукции трансплантата, включающего внеклеточный матрикс и живые клетки, который терапевтически выгоден для улучшенного заживления раны, облегчает или контролирует неоваскуляризацию, или минимизирует образование рубцов или келоидов. Указанные способы являются общеизвестными в уровне техники и описаны в Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1989), включенным сюда посредством ссылки. Все вышеупомянутые типы клеток находятся в пределах определения "продуцирующей матрикс клетки" как используется в настоящем изобретении.
Преобладающий главный внеклеточный компонент матрикса, продуцируемый фибробластами, является фибриллярным коллагеном, в частности коллагеном I типа. Фибриллярный коллаген представляет собой ключевой компонент в клеточно-матричной структуре, однако, настоящее изобретение не должно быть ограничено матриксами, состоящими только из этого белка или вида белков. Например, другие коллагены, и фибриллярный и нефибриллярный коллаген из семейства коллагенов, такие типы коллагена, как IV, V, VI, VII, VIII, IX, X, XI, XII, XIII, XIV, XV, XVI, XVII, XVIII, XIX и другие, насколько они могут быть идентифицированы, могут быть продуцированы при помощи подходящего типа клеток. Точно так же другие матричные белки, которые могут быть продуцированы и депонированы, использующиеся в настоящем способе включают, но не ограничены эластином, протеогликанами, такими как декорин или бигликан или гликопротеидами, такими как тенасцин, витронектин, фибронектин, ламинин, тромбоспондин I и глюкозаминогликаны (ГАГ), такие как гиалуроновая кислота (ГК).
Поскольку вышеупомянутые типы клеток могут использоваться для производства клеточного матрикса по изобретению, они могут также быть представлены в клеточно-матричной композиции изобретения, где один или более клеточно-матричных слоев, в живой, девитализированной или децеллюляризированной форме используется в изготовлении устройства доставки клеток. Указанные типы клеток могут доставляться в контакте с клеточным матриксом изобретения в нужный участок у субъектов, нуждающихся в функциональных клетках или продуктах клеток. Поскольку клеточно-матричные композиции изобретения включают коллаген, а коллаген представляет собой естественную подложку для адгезии клеток, указанные клетки будут естественно прилегать к клеточно-матричной композиции. Поскольку клеточно-матричная композиция также управляема, она позволяет доставку клеток и действует как средство для доставки клеток точно к участку доставки.
Способы и условия культивирования
Система для продукции клеточно-матричного слоя может быть статичной или может использовать перфузионные средства для питательных сред, с целью создания механической силы против формирующегося клеточно-матричного слоя для того, чтобы имитировать in vivo условия. Использование подходящих стимулов может приводить к желательным свойствам, например увеличению прочности, по сравнению со статическими культурами. В статической системе питательная среда относительно неподвижна в противоположность перфузионной системе, где питательная среда находится в движении. Перфузия питательной среды влияет на жизнеспособность клеток и увеличивает развитие матричного слоя. Средства перфузии включают, но не ограничены: использование магнитной мешалки или моторизованного рабочего колеса в чашке для культуры, расположенном ниже или смежным с носителем субстрата, содержащим мембрану культуры для того, чтобы перемешать питательную среду, перекачка питательной среды в пределах или через чашку для культуры или камеру, мягко качая чашку с культурой на шейкерной или вращающей платформе, или вращения, если культивирование осуществляется в роллер-флаконе. Другие средства перфузии могут быть определены квалифицированным специалистом в уровне техники для использования в способах изобретения. Другие механические силы могут обеспечиваться путем пульсации, сгибания, волнения или растяжения пористой мембраны во время культивирования.
2
Культуры поддерживаются в инкубаторе для гарантии подходящих окружающих условий: контролируемой температуры, влажности и газовой смеси для культивирования клеток. Предпочтительные условия находятся от приблизительно 34°С до приблизительно 38°С, более предпочтительно 37±1°С в атмосфере приблизительно 5-10±1%-ного СО и относительной влажности (ОВ) приблизительно 80-90%. Квалифицированный специалист может легко определить окружающие условия, которые могут быть в пределах или за пределами вышеупомянутых окружающих условий в зависимости от культивируемых клеток или стадии выполняемого культивирования. Культуры могут быть удалены из этих условий в условия окружающей комнатной температуры, воздуха и влажности, например, во время прикормки, отбора дополнительных клеток или другой обработки без ущерба для культур или их способности формировать клеточно-матричную пластину или слой.
В предпочтительном воплощении клеточно-матричный конструкт представляет собой конструкт кожи, сформированный фибробластами кожи и секретированного ими матрикса. Предпочтительно используются фибробласты кожи человека, полученные как первичные клетки из дермы или более предпочтительно из серийно перевитых или пересеянных из общепризнанных запасов или банков клеток, которые были скринированы на вирусную и бактериальную контаминацию и проверены на чистоту. Клетки культивируются при достаточных условиях в среде для выращивания, для их пролиферации до подходящего количества для посева клеток на подложку для культивирования, с целью формирования клеточно-матричного конструкта. Альтернативно, клетки из замороженных клеточных стоков могут быть посеяны непосредственно на подложку для культивирования.
5
2
5
2
5
2
5
2
5
2
Как только достаточное количество клеток было получено, клетки были собраны и засеяны на подходящую поверхность для культивирования и культивировались при подходящих условиях роста для формирования непрерывного слоя клеток. В предпочтительном воплощении клетки засеваются на пористую мембрану, которая погружена в подходящую питательную среду, контактирующую как с нижней стороны клеточной культуры через поры, так и сверху с верхней поверхностью клеточной культуры. Предпочтительно, клетки суспендированы или в базовой или в ростовой среде и посеяны на поверхность для культивирования клеток с плотностью от приблизительно 1×10 клеток/см до приблизительно 6,6×10клеток/см, более предпочтительно от приблизительно 3×10 клеток/см до приблизительно 6,6×10 клеток/см и наиболее предпочтительно приблизительно 6,6×10 клеток/см (клеток на квадратный сантиметр поверхности). Культуры культивируются в питательной среде для становления культуры от приблизительно 80% до 100%-ной конфлюэнции, во время которой они химически активируются изменением питательной среды в матрикс-продуцирующую питательную среду для активирования синтеза и секреции внеклеточного матрикса. В дополнительном способе клетки посеяны непосредственно в матрикс-продуцирующую питательную среду при по меньшей мере 80%-ной конфлюэнции для того, чтобы избавиться от необходимости изменения основной питательной среды в продуцирующую питательную среду, однако данный способ требует более высоких плотностей засева. Высокие засевные плотности достигают уровня суперконфлюэнции, означая, что клетки засеяны в более чем со 100% конфлюэнцией до приблизительно 900% конфлюэнции, включая диапазон от приблизительно 300% до приблизительно 600% конфлюэнции. Когда посев производится при суперконфлюэнции, пропускается фаза роста культивируемых клеток на мембране, и клетки засеваются в матрикс-продуцирующую питательную среду, с целью начать продукцию матрикса во время посева.
Во время культивирования фибробласты секретируют молекулы эндогенного матрикса и организуют секретированные молекулы матрикса с формированием трехмерной подобной ткани структуры, но не проявляют значительную сократительную способность, чтобы формирующийся клеточно-матричный конструкт сокращался и очищал себя от субстрата культивирования. Замена питательной среды производится каждые два-три дня на новую матрикс-продуцирующую питательную среду и на время, пока секретируемый матрикс увеличивается в толщине и организации. Время, необходимое для того, чтобы создать клеточно-матричный конструкт, зависит от начальной плотности посева, типа клеток, возраста клеточной линии и способности клеточной линии синтезировать и секретировать компоненты матрикса. После того как клеточно-матричный конструкт изобретения полностью сформировался, он обладает объемной толщиной из-за фиброзного матрикса, продуцированного и организованного клетками; они обычно не являются конфлюэнтными или сверхконфлюэнтными клеточными культурами, в которых клетки могут свободно присоединяться друг к другу. Фиброзность дает конструктам связывающую способность подобно ткани в отличие от обычных культур, потому что они сопротивляются физическому повреждению, такому как разрывание или раскалывание, при обычной обработке в клинических условиях. При изготовлении культивированной клеточно-матричной пластины из фибробластов кожи для формирования конструкта кожи, клетки формируют организованный матрикс вокруг себя на поверхности клеточной культуры предпочтительно по меньшей мере приблизительно 30 микрон в толщине или больше, более предпочтительно от приблизительно 60 до приблизительно 120 микрон толщины между поверхносями мембраны; однако, были получены значения толщины более 120 микрон, подходящие для использования в тестировании или клиническом использовании, где такие большие значения толщины необходимы.
Субстраты культуры
Матрикс-продуцирующие клетки культивируются в сосудах, подходящих для клеток или культур тканей животных, таких как чашка для культивирования, флакон или роллер-флакон, которые позволяют формирование трехмерной тканеподобной структуры. Подходящие поверхности для роста клеток, на которых могут быть выращены клетки, могут представлять собой любой биологически совместимый материал, к которому клетки могут прилипать и который обеспечивает средства для фиксации для формирования клеточно-матричного конструкта. В качестве поверхностей для роста клеток могут использоваться такие материалы, как стекло, нержавеющая сталь, полимеры, включая поликарбонат, пенопласт, поливинилхлорид, поливинилиден, полидиметилсилоксан, фторполимеры и фторированный этиленпропилен, а также силиконовые субстраты, включая аморфный кварц, полисиликон или силиконовые кристаллы. Материал поверхности для роста клеток может быть химически обработан или модифицирован, заряжен электростатически или покрыт биологическими веществами, такими как поли-L-лизин или пептиды. Примером пептида для покрытия может служить RGD-пептид.
Несмотря на то что конструкт ткани изобретения может быть выращен на твердой поверхности для роста клеток, предпочтительна поверхность для роста клеток с порами, которые связывают как верхнюю, так и нижнюю поверхность мембраны, чтобы обеспечить двусторонний контакт питательной среды с развивающимся конструктом ткани или контакт только с нижней поверхностью культуры. Двусторонний контакт позволяет питательной среде контактировать и с верхней и с нижней поверхностями развивающегося клеточно-матричного конструкта для воздействия питательных веществ, содержащихся в питательной среде, на максимальную площадь поверхности. Также питательная среда может контактировать с формирующимся культивированным конструктом ткани только снизу таким образом, чтобы верхняя поверхность могла быть подвергнута воздействию воздуха, также как в развитии культивированного конструкта кожи. Предпочтительный сосуд для культивирования использует вставку носителя или культуры, представляющую собой проницаемый для обработанной культуры элемент, такой как пористая мембрана, которая зафиксирована в сосуде для культивирования, содержащем питательную среду. Как правило, мембрана защищена с одного конца трубчатым элементом или каркасом, который вставлен внутрь и связан с основой, такой как чашка Петри или чашка для культивирования, которые могут быть накрыты крышкой. Сосуды для культивирования, включающие вставку носителя с пористой мембраной, известны в уровне техники и предпочтительны для осуществления изобретения, они также описаны в некоторых патентах США в области техники, некоторые из которых стали коммерчески доступны, включая например: 5766937, 5466602, 5366893, 5358871, 5215920, 5026649, 4871674, 4608342, раскрытия которых здесь включены. В случае, когда используются указанные типы сосудов для культивирования, конструкт ткани продуцируется на одной поверхности мембраны, предпочтительно верхней, верхняя поверхность и культура связываются клеточной питательной средой и на верхней и на нижней поверхностях. Поры в поверхности для роста обеспечивают проход питательной среды через мембрану для обеспечения питательными веществами нижней стороны культуры, позволяя таким образом питание клеток с двух сторон или исключительно с нижней стороны. Предпочтительный размер пор является таким, который достаточно мал, чтобы не допускать рост клеток через мембрану, но все же достаточно большой, чтобы допустить свободный проход питательных веществ, содержащихся в питательной среде, к нижней поверхности клеточно-матричного конструкта, например, посредством капиллярных сил. Предпочтительные размеры пор приблизительно менее чем 3 микрона, но в диапазоне от приблизительно 0,1 микрона до приблизительно 3 микрон, более предпочтительно от приблизительно 0,2 микрона до приблизительно 1 микрона, и наиболее предпочтительно используются поры размером от приблизительно 0,4 микрона до приблизительно 0,6 микрона. В случае фибробластов кожи человека, самый предпочтительный материал представляет собой поликарбонат, имеющий размеры пор от приблизительно 0,4 до приблизительно 0,6 микрона. Максимальный размер пор зависит не только от размера клеток, но также и от способности клеток изменять свою форму и проходить через мембрану. Важно, что подобный ткани конструкт приклеен к поверхности, но не включает или обволакивает подложку, таким образом, что конструкт является съемным по отношению к подложке, например, отслаиванием с минимальным усилием. Размер и форму сформированного конструкта ткани определяет размер поверхности сосуда или мембраны, на которой он выращен. Подложки могут быть круглыми, квадратными, прямоугольными или ангулярными или имеющими форму с закругленными углами, или неправильной формы. Также подложки могут быть плоскими или очерченными формой для продукции конструкта, с целью согласования с раной или подражения физической структуре натуральной ткани. С целью создания большей площади поверхности подложки для роста на подложку высевается пропорционально большее число клеток, и необходим больший объем питательной среды для достаточного обмывания и питания клеток. Когда клеточно-матричный конструкт ткани наконец сформирован, он удаляется отслаиванием от мембранной подложки прежде, чем трансплантируется субъекту.
Культивированные клеточно-матричные конструкты изобретения не опираются на синтетические или саморассасывающиеся элементы, такие как сетчатый элемент для формирования. Сетчатый элемент организован как сплетенный, связанный или войлочный материал. В системах, в которых используется сетчатый элемент, клетки культивируются на сетчатом элементе и растут с обеих сторон и внутри промежутков сетки, с целью охватить и включить сетку внутрь культивированного конструкта ткани. Конечный конструкт, сформированный способами, которые включают такую сетку, опираются на нее для физической и массовой поддержки. Примеры конструктов ткани культур, которые опираются на синтетические сетчатые элементы, описаны в патентах США 5580781, 5443950, 5266480, 5032508, 4963489 на имя Naughton, и др.
Химические модификации
Клеточно-матричные конструкты изобретения являются либо девитализированными, чтобы умертвить клетки, либо децеллюляризированными, чтобы удалить клетки, в зависимости от их конечного использования в лечении субъекта.
Клеточный матрикс изобретения может быть девитализированным или децеллюляризированным как на мембране или вставке культуры, так и после удаления с них. Поскольку вставка культуры суспендирует клеточный матрикс в чашке для культивирования, для обеспечения двустороннего контакта с питательной средой, двусторонний контакт может усиливаться, когда клеточный матрикс обрабатывается с использованием химических девитализирующих или децеллюляризирующих агентов или когда клеточно-матричный конструкт высушивается с использованием воздуха, света или облучения. Вставка культуры является удобно сменной для аппарата культивирования, таким образом она может быть перенесена в другие сосуды, где она может быть подвергнута воздействию или приведена в контакт с девитализирующими или децеллюляризирующими агентами.
Девитализировать клетки в клеточном матриксе означает умерщвлять, но не удалять клетки для формирования неживого клеточного матрикса. Конструкты изобретения могут быть девитализированными, другими словами, продуцирующие матрикс клетки, которые продуцируют эндогенные внеклеточные компоненты матрикса для формирования клеточно-матричных конструктов, умерщвляются. Когда клетки умерщвлены, они остаются в матриксе, который они сформировали. Девитализирующие агенты и способы предпочтительно сохраняют целостность и структуру клеточного матрикса.
Один из способов для девитализации клеток в клеточно-матричном конструкте - использование обезвоживания или сушки конструкта, чтобы удалить всю или существенно необходимую влажность из конструкта. Средства для удаления влажности включают дегидратацию на воздухе, замораживание или сублимационную сушку. Чтобы удалить воду из конструкта воздушной сушкой, питательная среда удаляется из сосуда, в котором сформирован клеточно-матричный конструкт, и клеточно-матричный конструкт просто обезвоживается в течение достаточного количества времени для того, чтобы клетки умерли. Условия дегидратации варьируются с точки зрения температуры и относительной влажности. Предпочтительные температуры дегидратации находятся в диапазоне от температуры заморозки до температуры денатурации коллагена (как измерено дифференциальной сканирующей калориметрией) в клеточно-матричном конструкте, например, от приблизительно 0°С до приблизительно 60°С. Более предпочтительная температура дегидратации - это окружающая комнатная температура, от приблизительно 18°С до приблизительно 22°С. Предпочтительны низкие значения относительной влажности в диапазоне от приблизительно 0% до приблизительно 60%, однако, относительная влажность, сравнимая с комнатной относительной влажностью, приблизительно от 10% ОВ до приблизительно 40% ОВ также предпочтительна. Когда дегидратация проводится посредством сушки на воздухе при комнатной температуре и влажности, клеточно-матричный конструкт будет обладать влажностью от приблизительно 10% до приблизительно 40% по массе, или менее. Поэтому, когда осуществляется сушка клеточно-матричных конструктов изобретения на воздухе, сохраняется некоторый уровень влажности. Для проведения сублимационной сушки конструкта, также называемой "лиофилизация", клеточный матрикс замораживают и затем помещают в вакуумную среду для удаления влажности. Методы лиофилизации могут применяться к конструктам, раскрытым в существующем изобретении таким образом, чтобы биологическая активность разнообразных факторов роста внутри конструктов осталась нетронутой. В одном аспекте существующего изобретения однослойные клеточно-матричные конструкты могут браться непосредственно из культуры и замораживаться при -80°С, лиофилизироваться в течение ночи, например от приблизительно 6-ти до приблизительно 15-ти часов или дольше. В другом аспекте однослойные клеточно-матричные конструкты могут сначала быть высушены на воздухе в течение приблизительно восьми часов и затем заморожены при -80°С и лиофилизированы в течение ночи, например от приблизительно 6-ти до приблизительно 15-ти часов или дольше.
После сушки в окружающих условиях или сублимационной сушки, клеточный матрикс является омертвевшим, но все еще сохраняет омертвевшие клетки и остатки клеток. Лиофилизация может также придать характеристики, отличные от тех, которые могут появиться при обезвоживании в окружающих условиях. Такие характеристики, в одном из воплощений изобретения, показывают более пористую и открытую волокнистую структуру матрикса.
Для девитализации клеток в клеточно-матричном конструкте также могут использоваться химические средства. Может использоваться вода для осмотического умерщвления клеток. Клеточно-матричные конструкты погружаются в стерильную, чистую воду на время, достаточное для обеспечения гипотонического набухания для разрушения клеток. После того как клетки разрушились, клеточный матрикс является омертвевшим, но все еще сохраняет омертвевшие клетки и остатки клеток. В случае, когда используется вода, она также может быть смешана с другими веществами, такими как надуксусная кислота или перекись водорода, или соли, или их комбинации. Например, может использоваться девитализирующий раствор надуксусной кислоты в воде от приблизительно 0,05 до приблизительно 3 об.%. Указанный девитализирующий агент также может быть буферизован или содержать высокую концентрацию солей, для предотвращения чрезмерного набухания клеточного матрикса, когда происходит умерщвление клеток.
В качестве девитализирующих агентов в изобретении могут использоваться органические растворители и растворы органических растворителей. Органические растворители способны к вытеснению воды в клеточно-матричном конструкте для умерщвления и, следовательно, девитализации клеток в клеточном матриксе. Предпочтительно, органический растворитель, используемый для удаления воды, является таким, который не оставляет остатков после удаления из конструкта. Предпочтительные органические растворители включают спирты, такие как этиловый спирт, метиловый и изопропиловый спирт, или ацетон. В целях иллюстрации, клеточно-матричные конструкты погружаются в стерильный этиловый спирт на время, достаточное для вытеснения воды из клеточно-матричного конструкта и девитализирования клеток. После удаления из этилового спирта клеточно-матричные конструкты подвергаются воздействию воздуха на время, достаточное, чтобы позволить поглощенному клеточно-матричным конструктом этиловому спирту испариться. После испарения растворителя клеточный матрикс является омертвевшим, но все еще сохраняет омертвевшие клетки и остатки клеток, также клеточный матрикс является обезвоженным.
Другие средства девитализации включают воздействие на клеточно-матричные конструкты ультрафиолетового света или облучение гамма-лучами. Эти средства могут использоваться совместно с гипотоническим набуханием клеточно-матричного конструкта из-за воздействия воды или других химических девитализирующих средств или воздуха и замораживающих девитализирующих средств.
Децеллюляризация клеточного матрикса по изобретению означает удаление клеток из клеточного матрикса таким образом, что клетки и остатки клеток удаляются из клеточного матрикса, с целью получения внеклеточного матрикса без клеток, которые его произвели. Клеточно-матричные конструкты изобретения могут быть децеллюляризованными, другими словами, продуцирующие матрикс клетки, которые производят эндогенные внеклеточные компоненты матрикса для формирования клеточно-матричных конструктов удаляются из клеточного матрикса. После удаления клеток клеточный матрикс, эндогенно продуцированный культивированными клетками, остается, но не содержит тех клеток, которые его сформировали. В одном предпочтительном способе для децеллюляризации клеточно-матричных конструктов изобретения используется ряд химических воздействий для удаления клеток, остатков клеток и остаточных клеточных ДНК и РНК. Другие неколлагеновые и неэластичные компоненты внеклеточного матрикса также могут быть удалены или их количество может быть уменьшено агентами и способами, используемыми для децеллюляризации клеточно-матричных конструктов, например, такие как гликопротеиды, глюкозаминогликаны, протеогликаны, липиды и другие неколлагеновые белки. Удаление клеток и неколлагеновых и неэластичных компонентов из клеточного матрикса приводит к клеточному матриксу, который является бесклеточным и весь или по большей части состоит из коллагена с некоторым меньшим количеством эластина.
2
Клеточно-матричный конструкт сначала обрабатывается контактированием с эффективным количеством хелатирующего агента, предпочтительно физиологически щелочного для контролируемо ограниченного набухания клеточного матрикса. Хелатирующие агенты усиливают удаление клеток, клеточного детрита и структур базальной мембраны из матрикса, уменьшая концентрацию двухвалентных катионов. Обработка щелочью отделяет гликопротеиды и глюкозаминогликаны от коллагеновой ткани и омыляет липиды. Хелатирующие агенты, известные в уровне техники, которые могут использоваться, включают, но не ограничены, этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА) и этиленбис(оксиэтиле-нитрило)тетрауксусной кислототой (ЭГТА). ЭДТА представляет собой предпочтительный хелатирующий агент и может быть сделана более щелочной посредством добавления гидроксида натрия (NaOH), гидроксида кальция Са(ОН), карбоната натрия или пероксида натрия. Концентрации ЭДТА или ЭГТА предпочтительно находятся в диапазоне от приблизительно 1 до приблизительно 200 мМ, более предпочтительно от приблизительно 50 до приблизительно 150 мМ, наиболее предпочтительно около приблизительно 100 мМ. Предпочтительная концентрация NaOH находится в диапазоне от приблизительно 0,001 до приблизительно 1 М, более предпочтительно от приблизительно 0,001 до приблизительно 0,10 М, наиболее предпочтительно приблизительно 0,01 М. Другие щелочные или основные агенты для регулирования рН хелатирующего раствора в пределах основного эффективного диапазона рН могут быть определены квалифицированным специалистом. Конечный рН основного хелатирующего раствора должен быть предпочтительно от приблизительно 8 до приблизительно 12, но более предпочтительно от приблизительно 11,1 до приблизительно 11,8. В наиболее предпочтительном воплощении клеточный матрикс контактирует с раствором 100 мМ ЭДТА/10 мМ NaOH в воде. Клеточный матрикс предпочтительно контактирует щелочным хелатирующим агентом путем погружения в него, однако более эффективная обработка получается нежным взбалтыванием конструкта и раствора вместе в течение эффективного для обработки времени.
3
2
4
2
Кроме того, клеточный матрикс контактирует с эффективным количеством кислого раствора, предпочтительно содержащего соль. Обработка кислотой участвует в удалении гликопротеидов и глюкозаминогликанов, так же как и в удалении неколлагеновых белков и нуклеиновых кислот, таких как ДНК и РНК. Обработка солями контролирует набухание коллагенового матрикса во время обработки кислотой и связана с удалением некоторых гликопротеидов и протеогликанов из коллагенового матрикса. Могут использоваться кислотные растворы, известные в уровне техники, они могут включать, но не ограничены соляной кислотой (HCl), уксусной кислотой (СНСООН) и серной кислотой (HSO). Предпочтительная кислота - соляная (HCl) в концентрации предпочтительно от приблизительно 0,5 до приблизительно 2 М, более предпочтительно от приблизительно 0,75 до приблизительно 1,25 М, наиболее предпочтительно приблизительно 1 М. Конечный рН раствора кислоты/соли находится предпочтительно в диапазоне от приблизительно 0 до приблизительно 1, более предпочтительно между приблизительно 0 и 0,75, и наиболее предпочтительно от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,5. Соляная кислота и другие сильные кислоты являются самыми эффективными для того, чтобы разрушить молекулы нуклеиновых кислот, в то время как более слабые кислоты менее эффективны. Соли, которые могут использоваться, являются предпочтительно неорганическими солями и включают, но не ограничены хлористыми солями, такими как хлорид натрия (NaCl), хлорид кальция (CaCl) или хлорид калия (KCl), в то время как другие эффективные соли могут быть определены квалифицированным в уровне техники специалистом. Предпочтительно хлориды используются в концентрации предпочтительно от приблизительно 0,1 до приблизительно 2 М, более предпочтительно от приблизительно 0,75 до приблизительно 1,25 М, наиболее предпочтительно приблизительно 1 М. Предпочтительные хлористые соли для использования в способе изобретения представляют собой хлорид натрия (NaCl). В наиболее предпочтительном воплощении клеточный матрикс контактирует с 1 М HCl/1 М NaCl в воде. Клеточный матрикс контактирует предпочтительно погружением в кислотный/солевой раствор, при этом эффективная обработка достигается при осторожном взбалтывании конструкта вместе с раствором в течение времени, эффективного для обработки.
3
4
Кроме того, клеточный матрикс контактирует с эффективным количеством раствора, который предпочтительно буферизован до приблизительно физиологического рН. Буферный раствор соли нейтрализует материал, в то же время уменьшая набухание. Соли, которые могут использоваться, являются предпочтительно неорганическими солями и включают, но не ограничены хлористыми солями, такими как хлорид натрия (NaCl), хлорид кальция (CaCl) и хлорид калия (KCl), и азотистые соли, такие как сульфат аммония (NHSO), в то время как другие эффективные соли могут быть определены квалифицированным специалистом. Предпочтительно хлористые соли используются в концентрации предпочтительно от приблизительно 0,1 до приблизительно 2 М, более предпочтительно от приблизительно 0,75 до приблизительно 1,25 М, наиболее предпочтительно приблизительно 1 М. Предпочтительная хлористая соль для использования в способе это хлорид натрия (NaCl). Буферные агенты известны в уровне техники и включают, но не ограничены фосфатными и боратными растворами, в то время как другие агенты для использования в способе изобретения могут быть определены квалифицированным специалистом. Один предпочтительный способ для буферизации солевого раствора представляет собой добавление фосфатно-солевого буфера (ФСБ), в котором предпочтительная концентрация фосфата находится в диапазоне от приблизительно 0,001 до приблизительно 0,02 М и концентрация соли находится в диапазоне от приблизительно 0,07 до приблизительно 0,3 М в солевом растворе. Предпочтительный рН для раствора находится в диапазоне от приблизительно 5 до приблизительно 9, более предпочтительно от приблизительно 7 до приблизительно 8, наиболее предпочтительно от приблизительно 7,4 до приблизительно 7,6. В наиболее предпочтительном воплощении ткань контактирует с 1 М хлоридом натрия (NaCl)/10 мМ фосфатно-солевой буфер (ФСБ) при рН от приблизительно 7,0 до приблизительно 7,6. Клеточный матрикс контактирует предпочтительно погружением в буферный раствор, при этом эффективная обработка достигается при осторожном взбалтывании конструкта вместе с раствором в течение времени, эффективного для обработки.
После химической очистки клеточный матрикс предпочтительно ополаскивается свободным от агентов химической очистки раствором, контактируя с эффективным количеством агента для полоскания. Агенты, такие как вода, изотонические физиологические растворы и физиологические буферные растворы могут использоваться и контактируют с клеточным матриксом в течение времени, достаточного для удаления агентов химической очистки. Предпочтительный раствор для полоскания - буферизированный солевой раствор с физиологическим рН, такой как фосфатно-солевой буфер (ФСБ). Другие средства для ополаскивания клеточного матрикса от химических средств очистки могут быть определены квалифицированным в уровне техники специалистом. Стадии очистки контактирования клеточного матрикса с щелочным хелатирующим агентом и контактирования клеточного матрикса с кислотным раствором, содержащим соль, могут быть выполнены в любом порядке для достижения, по существу, того же самого эффекта очистки. Растворы не могут быть объединены и выполнены в виде одной стадии никаким образом.
Результат децеллюляризации клеточно-матричного конструкта представляет собой эндогенно продуцированный коллагеновый матрикс, продуцированный культивированными клетками, который был децеллюляризирован от клеток, которые его произвели. Дополнительный результат децеллюляризированного клеточно-матричного конструкта - эндогенно продуцированный коллагеновый матрикс, продуцированный культивированными клетками, который был децеллюляризирован от клеток, которые его произвели и не имеет вообще или имеет сокращенное количество неколлагеновых и неэластиновых внеклеточных компонентов матрикса.
В некоторых воплощениях клеточно-матричные конструкты могут быть сначала девитализированы, для умерщвления клеток и затем децеллюляризированы, чтобы удалить омертвевшие клетки.
Девитализированные или децеллюляризированные клеточно-матричные конструкты могут использоваться в таком виде, но они также могут быть дополнительно модифицированы химической обработкой, физической обработкой, добавлением других веществ, таких как лекарства, факторы роста, культивируемые клетки, других компонентов матрикса естественного, биосинтетического или полимерного происхождения, также они могут быть комбинированы с медицинскими устройствами, такими как стенты и устройства закрытия для лечения дефектов овального окна в сердце.
Сшивание. Децеллюляризированный или девитализированный клеточный матрикс может быть сшит с использованием сшивающих агентов, чтобы управлять скоростью его биоремоделирования или увеличить его устойчивость после внедрения или трансплантации в живой организм. Клеточный матрикс может быть сшит и использоваться в качестве однослойного конструкта, или он может быть комбинирован или управляться для создания различных типов конструктов. Способы сшивания изобретения также предусматривают способы соединения клеточно-матричных пластин или их частей вместе посредством поперечных связей.
Клеточный матрикс предпочтительно представляет собой плоскую пластинчатую структуру, которая может использоваться для изготовления различных типов клеточно-матричных конструктов, которые будут использоваться в качестве протеза с формой, зависящей главным образом от его намеченного использования. Чтобы сформировать протез изобретения, девитализированные или децеллюларизированные клеточно-матричные пластины должны быть изготовлены, используя способ, который сохраняет способность матричных пастин к биоремоделлированию, а также в состоянии увеличить его прочность и структурные особенности для его работы в качестве заменяемой ткани. Плоскопластинчатые конструкты изобретения включают либо девитализированные, либо децеллюларизированные клеточно-матричные пластины, либо девитализированные и децеллюляризированные матричные пластины (например, одна девитализированная клеточно-матричная пластина и одна децеллюляризированная клеточно-матричная пластина) расположены слоями для контактирования с другим, и связаны вместе. Трубчатые конструкты изобретения включают либо девитализированную либо децеллюляризированную матричную пластину, завернутую вокруг себя до по меньшей мере минимальной степени, чтобы с собой контактировать. Область контакта между матричными пластинами или матричной пластиной самой к себе - область связывания.
Многослойные сшитые конструкты. В предпочтительном воплощении у протезного устройства настоящего изобретения есть две или более совмещенных пластины матрикса, которые связаны вместе для формирования плоскопластинчатого конструкта. Как используется здесь, "связанные слои коллагена" означают составленные из двух или более клеточно-матричных пластин одинакового или различного происхождения или профиля обработки таким образом, чтобы пластины были наложены друг на друга и были достаточно скреплены самослоистостью и химическим связыванием.
Предпочтительное воплощение изобретения относится к плоскому пластинчатому протезу и способам для создания и использования плоского пластинчатого протеза, включающего две или более пластин матрикса, которые сцеплены и сшиты. Из-за плоской пластинчатой структуры матричных пластин протез легок для изготовления, чтобы включить любое количество пластин, предпочтительно от 2 и до 20 слоев, более предпочтительно между 2 и 10 слоями, с количеством слоев в зависимости от прочности и массы, необходимой для конечного предназначенного использования конструкта. Альтернативно, поскольку конечный размер наслоенного окружения ограничен размером матричных пластин, они могут быть размещены ступенчато в комбинированных условиях для формирования пластинчатых конструктов с площадью поверхности, большей, чем площадь любой отдельной матричной пластины, но без непрерывных слоев через область окружения.
В производстве многослойного конструкта, включающего матричные пластины, асептическая среда и стерильные инструменты предпочтительно используются, чтобы поддержать стерильность. Чтобы сформировать многослойный конструкт матричных пластин, устанавливается первый стерильный твердый элемент поддержки, такой как твердый лист поликарбоната. Если матричные пластины все еще не находятся в гидратированном состоянии из-за процессов девитализации или децеллюляризации, они гидратируются в водном растворе, таком как вода или фосфатно-солевой буфер. Матричные пластины промакиваются стерильными гигроскопичными тканями, чтобы абсорбировать избыток воды из материала. Первая матричная пластина располагается на листе поликарбоната и вручную приглаживается к листу поликарбоната, чтобы удалить любые воздушные пузыри, сгибы и складки. Вторая матричная пластина располагается сверху первой пластины, снова вручную удаляя любые воздушные пузыри, сгибы и складки. Такое иерархическое расположение повторяется, пока не получено желательное количество слоев для определенного применения.
После иерархического расположения желательного количества матричных пластин, они обезвоживаются вместе. Не желая быть связанными теорией, предполагается, что дегидратация приводит к внеклеточным компонентам матрикса, таким как волокна коллагена, совместно в слоях, когда вода удаляется из волокон смежных матричных пластин. Слои могут быть обезвожены как с открытым верхом первого элемента поддержки или, между первым элементом поддержки и вторым элементом поддержки, таким как второй лист поликарбоната, размещенного перед высушиванием поверх верхнего слоя и закрепленного на первом элементе поддержки, чтобы хранить все слои в плоском окружении вместе с или без сжатия. Чтобы облегчить дегидратацию, элемент поддержки может быть пористым для того, чтобы позволить воздуху и влажности проходить к обезвоживающимся слоям. Слои могут быть высушены на воздухе, в вакууме или химическими средствами, такими как ацетон или спирт, такой как этиловый спирт или изопропиловый спирт. Дегидратация воздушной сушкой может быть выполнена при комнатной влажности, от приблизительно 0% ОВ до приблизительно 60% ОВ, или менее, или от приблизительно 10% до приблизительно 40% мас./мас. влажности, или менее. Дегидратация может быть легко выполнена поворачиванием наслоенных матричных слоев в стерильном потоке воздуха кабинета ламинарного потока в течение по крайней мере приблизительно от 1 часа до 24 часов при комнатной температуре, равной приблизительно 20°С и при комнатной влажности. Дегидратация, осуществленная вакуумом или химическими средствами, обезвоживает слои до уровней влажности, которые ниже чем обеспечиваемые воздушной сушкой.
В дополнительной стадии обезвоженные слои регидратированы или, альтернативно, регидратированы и обезвожены снова. Как упомянуто выше, дегидратация приводит к соединению компонентов внеклеточного матрикса смежных матричных слоев вместе и сшивание этих слоев вместе формирует химические связи между компонентами, чтобы связать слои. Чтобы регидратировать слои, они снимаются с пористого элемента поддержки вместе и регидратируются в водном регидратационном агенте, предпочтительно воде, посредством их переноса в контейнер, содержащий водный регидратационный агент на, по крайней мере, от приблизительно 10 до приблизительно 15 минут при температуре от приблизительно 4°С до приблизительно 20°С, чтобы регидратировать слои, не отделяя или не расслаивая их. Матричные слои затем сшиваются вместе посредством контактирования слоистых матричных пластин со сшивающим средством, предпочтительно химическим сшивающим средством, которое сохраняет способность к биоремоделированию матричных слоев.
Сшивание связанных протезных устройств также обеспечивает прочность и долговечность устройств для улучшения потребительских свойств. Различные типы сшивающих агентов известны в уровне техники и могут использоваться, например, карбодиимиды, генипин, трансглутаминаза, рибоза и другие сахара, нордигидрогваяретовая кислота, окислительные агенты, ультрафиолетовый (УФ) свет и дегидротермальные способы. Помимо химических сшивающих агентов, слои могут быть связаны вместе биологически совместимыми, основанными на фибрине клеями или медицинскими клеями, такими как полиуретан, винилацетат или полиэпоксидная смола. Один предпочтительный биологически совместимый клей представляет собой фиброин шелка, который является 4-8% раствором фиброина шелка, помещаемый в область связывания между смежными слоями матрикса ткани, который активизируется с использованием метанола. Биологически совместимые клеи или адгезивы могут использоваться для того, чтобы связать вместе сшитые или несшитые слои, или и те и другие, для формирования биоинженерных конструктов изобретения.
n
Предпочтительный биологически совместимый клей это фиброин шелка, который является 2-8% раствором фиброина шелка, помещаемый в область связывания между смежными слоями матрикса ткани. В одном аспекте два или более клеточно-матричных конструкта, описанных выше, могут быть объединены, с использованием биологически совместимых адгезивных биоматериалов. Как пример, раствор фиброина шелка может быть получен из тутового шелкопряда Bombyx mori, который может быть обработан, с целью получения бессерицинового вещества, которое, в одном аспекте, может использоваться как биологически совместимый шелковый клей. Bombyx mori состоит прежде всего из глицина и повторений аланина, которые преобладают в структуре. Цепочка фиброина состоит из двух основных полипептидных последовательностей, кристаллических и менее значимых полипептидов, которые регулярно заменяются. Основная последовательность 'кристаллических' полипептидов имеет повтор -(Ala-Gly)-, который образует бета-складчатую структуру, тогда как 'менее значимые' полипептиды содержат дополнительные аминокислоты, в частности тирозин, валин, а также кислые и основные аминокислоты. Необходимо отметить, что может использоваться фиброин шелка, полученный из рекомбинантного источника для того, чтобы достигнуть подобных биологически совместимых адгезивных свойств для выполнения изобретения.
2
3
Кратко, в одном аспекте, коконы В. mori кипятятся в течение 20-30 минут в водном растворе, включающем 0,02 М NaCO. Чтобы извлечь подобные клею серициновые белки, коконы впоследствии ополаскиваются. В одном воплощении извлеченный фиброин шелка растворяется в 9,3 М растворе бромида лития (LiBr) при приблизительно 60°С в течение приблизительно 4 часов, что дает 20%-ный вес/объем раствор. Конечный раствор впоследствии диализуется против дистиллированной воды, используя кассету диализа Slide-a-Lyzer (MWCO 3,500, Pierce) при комнатной температуре в течение 48 часов, чтобы удалить соль, однако любая процедура диализа находится в пределах рассмотрения изобретения. Полученный диализат центрифугируется дважды, каждый при -20°С в течение 20 минут, чтобы удалить примеси и агрегаты, сформированные во время стадии диализа.
Предпочтительный сшивающий агент 1-этил-3-(3-диметиламинопропила) карбодиимид гидрохлорид (ЭДК). В другом предпочтительном способе сульфо-N-гидроксисукцинамид добавляют к сшивающему агенту ЭДК, как описано Staros J.V., Biochem. 21, 3950-3955, 1982. В самом предпочтительном способе ЭДК является растворимым в воде при концентрации предпочтительно от приблизительно 0,1 мМ до приблизительно 100 мМ, более предпочтительно от приблизительно 1,0 мМ до приблизительно 10 мМ, наиболее предпочтительно приблизительно 1,0 мМ. Помимо воды, могут использоваться фосфатно-солевой буфер или солевой буфер (2-[N-морфолино]этансульфоновой кислоты) (МЭС) для того, чтобы растворить ЭДК. Другие агенты могут быть добавлены к раствору, такие как ацетон или спирт, до 99 об.% в воде, обычно 50 об.%, с целью сделать сшивку более однородной и эффективной. Эти агенты удаляют воду из слоев для того, чтобы объединить матричные волокна, для активации сшивания между указанными волокнами. Соотношение указанных агентов с водой в сшивающем агенте может использоваться для регуляции сшивания. Сшивающий раствор ЭДК готовят непосредственно перед использованием так как ЭДК теряет свою активность с течением времени. Для контактирования сшивающего агента с матричными слоями, гидратированные, связанные матричные слои помещаются в емкость, такую как плоская кювета, и сшивающий агент мягко декантируется в кювете, с обеспечением того, что матричные слои покрыты и свободно плавают и что никакие пузырьки воздуха не присутствуют под или между матричными слоями. Емкость закрывается и матричным слоям позволяют сшиваться в течение от приблизительно 4 до приблизительно 24 часов, более предпочтительно от 8 до приблизительно 16 часов при температуре от приблизительно 4°С до приблизительно 20°С. Сшивание может быть отрегулировано с помощью температуры: при более низких температурах сшивка более эффективна, поскольку замедляется реакция, при более высоких температурах сшивка менее эффективна, поскольку ЭДК менее устойчив.
После сшивания сшивающий агент декантируется и убирается, и сшитые многослойные матричные конструкты промываются контактированием со средством полоскания для того, чтобы удалить остаточное количество сшивающего агента. Предпочтительное средство полоскания - вода или другой водный раствор. Предпочтительно, достаточное ополаскивание достигается контактированием сшитого многослойного матричного конструкта три раза с равными объемами стерилизованной воды в течение приблизительно пяти минут для каждого полоскания.
Трубчатые конструкты. В другом предпочтительном воплощении матричный конструкт настоящего изобретения представляет собой трубчатый конструкт, который сформирован из единственной, в основном прямоугольной матричной пластины. Матричная пластина скручивается так, чтобы один край встретил и наложился на противоположный край. Перекрытие служит областью связывания. Трубчатый конструкт, который сформирован из матричной пластины, может быть изготовлен с различными диаметрами, длинами и количеством слоев и может включать другие изделия в зависимости от показаний для его использования.
Для формирования трубчатого конструкта сердечник выбирается с размером диаметра, который определит диаметр сформированного конструкта. Сердечник является предпочтительно цилиндрическим или овальным в поперечном сечении и сделан из стекла, нержавеющей стали или из нереакционного, медицинского состава. Сердечник может быть прямым, изогнут, угловым, у него могут быть ветви или раздвоения, или несколько указанных свойств. Количество слоев, предназначенных для трубчатого конструкта, который формируют, соответствует количеству раз оборачивания матричной пластины вокруг сердечника и самого себя. Число раз, на которое матричная пластина может быть обернута, зависит от размеров созданной матричной пластины. Для двух слоев трубчатого конструкта ширина матричной пластины должна быть достаточной для того, чтобы обернуть пластину вокруг сердечника по крайней мере дважды. Предпочтительно, ширина является достаточной для оборачивания пластины вокруг сердечника необходимое количество раз и дополнительно на несколько процентов больше для перекрытия, от приблизительно 5% до приблизительно 20% окружности сердечника, чтобы обеспечить область связывания и гарантировать плотный шов. Точно так же длина сердечника определяет длину трубы, которая может быть на нем сформирована. Для облегчения обращения с конструктом на сердечнике, сердечник должен быть длиннее, чем конструкт, таким образом, сердечник, а не конструкт, который сформировали, входит в контакт при дальнейшей обработке.

Предпочтительно сердечник покрывают не реагирующим, медицинским, эластичным, резиновым или латексным материалом в форме рукава. В то время как трубчатый конструкт из матричных пластин можно сформировать непосредственно на поверхности сердечника, рукав облегчает удаление сформированной трубы от сердечника и не прилегает к, реагирует с или оставляет остатки на матричной пластине. Чтобы удалить сформированный конструкт, рукав можно потянуть с одного конца сердечника, для снятия конструкта с сердечника. Поскольку матричная пластина только слегка прилегает к рукаву и в большей степени связана с другой матричной пластиной, изготовление труб из матричных пластин облегчено, поскольку трубчатый конструкт может быть удален от сердечника, не растягиваясь или иначе не подвергая напряжению или риску повреждения конструкта. В самом предпочтительном воплощении рукав включает KRATON (Shell Chemical Company) - термопластичный каучук, составленный из стирен-этилен/бутилен-стирен сополимеров с очень устойчивыми насыщенными промежуточными блоками.

Для простоты иллюстрации двухслойный трубчатый конструкт с диаметром 4 мм и 10%-ным перекрытием сформировали на сердечнике, имеющем диаметр около 4 мм. Сердечник покрыт рукавом KRATON с приблизительной длиной сердечника, большей, чем у конструкта, который формируют на указанном сердечнике. Матричная пластина отрезана так, чтобы значение ширины составило приблизительно 28 мм, и значение длины могло изменяться в зависимости от желательной длины конструкта. В стерильной области камеры ламинарного потока матричную пластину формировали в трубу согласно следующему способу. Матричную пластину увлажнили вдоль одного края и выровняли на покрытом рукавом сердечнике и, усиливая адгезивную природу матричной пластины, она была "примята" вдоль покрытого рукавом сердечника и высушивалась в указанном положении в течение, по крайней мере, 10 минут или более. После примятая матричная пластина была гидратирована и обернута вокруг сердечника и затем закручена вокруг себя на один полный оборот плюс 10% окружности для 110%-ного перекрытия, чтобы служить областью связывания и обеспечить плотный шов.
Для формирования однослойного трубчатого конструкта матричная пластина должна быть в состоянии сделать вокруг сердечника одно полное вращение и по крайней мере приблизительно 5% дополнительного вращения для перекрытия, чтобы обеспечить область связывания, которая равна приблизительно 5% окружности конструкта. Для двухслойного конструкта матричная пластина должна быть в состоянии обернуться вокруг сердечника по крайней мере дважды и предпочтительно дополнительно от 5% до 20% полного оборота в качестве перекрытия. В то время как двухслойное оборачивание обеспечивает 100% область связывания между поверхностями матричных пластин, дополнительный процент для перекрытия гарантирует плотный, непроницаемый шов. Для конструкта с тремя слоями матричная пластина должна быть в состоянии обернуться вокруг сердечника по крайней мере три раза. Конструкт может быть изготовлен с любым количеством слоев, ограниченных только габаритами матричной пластины и желательными спецификациями. Как правило, у трубчатого конструкта будет 10 слоев или менее, например от 2 до 6 слоев или между 2 и 3 слоями с различными степенями перекрытия. После обертывания любые воздушные пузыри, сгибы и складки устраняются посредством сглаживания из-под материала и между слоями.
Матричные пластины могут быть накручены на сердечник или вручную или с помощью прибора, который помогает убирать натяжение и сглаживает воздушные или водные пузырьки или складки, которые могут встречаться под сердечником или между слоями обернутой матричной пластины. Прибор может обладать поверхностью, с которой сердечник может войти в контакт вдоль своей длины, так как он поворачивается, чтобы обернуть матричную пластину.
Слои обернутой матричной пластины связываются вместе, используя способы и средства, обычно используемые в связывании и сшивке плоскопластинчатых конструктов, сделанных из матричных пластин. После сшивки и ополаскивания обернутые дегидратированные интестинальные коллагеновые конструкты (ИКЛ), могут быть затем стянуты с сердечника посредством рукава или оставлены на нем для дальнейшей обработки. Конструкты могут быть регидратированы в водном растворе, предпочтительно воде, посредством их переноса в контейнер, содержащий водный регидратационный агент на по крайней мере от приблизительно 10 до приблизительно 15 минут при температуре от приблизительно 4°С до приблизительно 20°С, чтобы регидратировать слои, не отделяя или не расслаивая их.
Добавление веществ. Девитализированные или децеллюляризированные однослойная клеточно-матричная пластина или многослойный клеточно-матричный конструкт изобретения могут дополнительно содержать одно или более дополнительных веществ, для придания различных манипуляционных или функциональных качеств или придания различных особенностей материала так, чтобы клетки и ткани в живущем теле реагировали желательным способом с указанными пластиной или конструктом, когда они внедрены или привиты к или в организм.
Гепарин. В воплощениях, где конструкт будет использоваться в контакте с кровью, например в кровеносной системе, конструкт изготавливается нетромбообразующим, посредством накладывания гепарина на все поверхности конструкта или только одну сторону в плоскопластинчатом конструкте или в полость или снаружи для трубчатого конструкта. Гепарин может быть нанесен на конструкт множеством известных методик. Для иллюстрации гепарин может быть нанесен на конструкт следующими тремя способами. Во-первых, раствор гепарина с бензалконием (БА-гепарин) в изопропиловом спирте наносится на протез, вертикальным заполнением полости или опусканием протеза в раствор и последующей его сушкой на воздухе. Эта процедура обрабатывает коллаген ионносвязанным комплексным соединением БА-гепарина. Во-вторых, может использоваться ЭДК, чтобы активировать гепарин и затем ковалентно присоединить гепарин к волокнам коллагена. В-третьих, ЭДК может использоваться, чтобы активизировать коллаген, для ковалентной связи протамина с коллагеном и последующего ионного связывания гепарина с протамином.
Антимикробные препараты, лекарства, факторы роста, цитокины, генетический материал и культивируемые клетки могут быть включены в или на матричные слои. Дополнительные слои материалов могут быть помещены по крайней мере на одну поверхность конструктов, такие дополнительные слои материалов включают белки и другие внеклеточные компоненты матрикса в очищенной или сырой форме.
Белки. Белки внеклеточного матрикса - предпочтительный класс белков для использования в существующем изобретении. Примеры включают, но не ограничены коллагеном, фибрином, эластином, ламинином и фибронектином, протеогликанами. Например, белок фибриноген при комбинировании с тромбином формирует фибрин. Гиалуронан (также названный гиалуроновой кислотой или гиалуронатом) является несульфатированным глюкозаминогликаном, широко распространенным в соединительной ткани, эпителиальной и нервной тканях. Он представляет собой один из главных компонентов внеклеточного матрикса, значительно способствует пролиферации и миграции клеток и используется для того, чтобы уменьшить послеоперационные спайки. Существует множество типов каждого из указанных белков, которые встречаются в природе, также как типы, которые могут быть произведены синтетическим путем и продуцированы с помощью генной инженерии. Например, коллаген встречается во многих формах и типах. Все эти типы и субпопуляции входят в использование белков, которые здесь указываются. Термин белок также включает, но не ограничен, фрагменты, аналоги, консервативные аминокислотные замены и замены с ненатурально встречающимися аминокислотами относительно каждого названного белка. Термин "остаток" использован здесь, чтобы назвать аминокислоту (D или L) или миметик аминокислоты, который включен в белок амидной связью. Также аминокислота может быть естественной аминокислотой или, если иначе не определено, может охватывать известные аналоги естественных аминокислот, которые функционируют подобно естественным аминокислотам (то есть миметик аминокислоты). Кроме того, миметики амидной связи включают модификации пептидной основы, известные квалифицированным в области техники специалистам.
Синтетические материалы могут быть расположены на по крайней мере одной поверхности клеточно-матричных конструктов. Синтетический материал может быть в форме листа, наслоенного или нанесенного ступенчато на клеточно-матричный конструкт, чтобы сформировать синтетический слой на клеточно-матричном слое. Один из классов синтетических материалов, предпочтительно биологически совместимых синтетических материалов, включает полимеры. Такие полимеры включают, но не ограничены следующими: поли-(уретаны), поли-(силоксаны) или кремнийорганические материалы, поли-(этилен), поливинилпирролидон, поли-(2-гидрокси этилметакрилат), поли-(N-винил пирролидон), поли-(метиловый эфир метакриловой кислоты), поли-(виниловый спирт), поли-(акриловая кислота), полиакриламид, поли-(этиленвинилацетат), поли-(этиленгликоль), поли-(метакриловая кислота), полилактиды, полигликолиды, поли-(лактид-ко-гликолиды), полиангидриды, и полиорто-эфиры или любые другие подобные синтетические полимеры, которые могут быть разработаны и которые биологически совместимы. Термин "биологически совместимые, синтетические полимеры" должен также включать сополимеры и смеси и любые другие комбинации вышеуказанных веществ или вместе или с другими полимерами. Использование этих полимеров будет зависеть от данных применений и требуемых спецификаций. Например, биологически совместимые синтетические материалы также могут быть разлагаемыми микроорганизмами таким образом, чтобы, когда они внедрены в организм субъекта, они разложились с течением времени. При расположении на клеточно-матричном конструкте комбинированный конструкт включает биоразлагаемый слой и способный к биоремоделированию слой. Более детально обсуждения этих полимеров и типов полимеров сформулированы в Brannon-Peppas, Lisa, "Polymers in Controlled Drug Delivery," Medical Plastics and Biomaterials, November 1997, который включен сюда ссылкой как будто сформулирован полностью здесь.
Примером другого синтетического материала, который может использоваться как поддерживающий слой, является силикон. Слой силикона в форме пористой или микропористой мембраны или не имеющей пор пленки наложен и прилегает к матричному конструкту. При использовании для заживления ран слой силикона может использоваться для нанесения и манипуляции матричного конструкта на кожную рану и изолировать окружность раны, чтобы инкорпорировать матричный конструкт для лечения раны. Силикон также формирует барьер для влажности для того, чтобы препятствовать высыханию раны. После успешного формирования излеченной раневой ткани, обычно в пределах 21 дня, силикон осторожно отслаивают от краев вылеченной или заживающей раны с помощью пинцета.
Стерилизация. Конструкты стерилизуются, с использованием средств, известных в уровне техники в области стерилизации медицинских устройств. Предпочтительный способ стерилизации это контактирование конструктов со стерильной 0,1% надуксусной кислотой, нейтрализованной достаточным количеством 10 н. гидроксида натрия (NaOH), согласно Патенту США №5460962, раскрытие которого включено здесь посредством ссылки. Деконтаминация выполняется в емкости на платформе аппарата для встряхивания, такой как 1-литровый Nalge контейнер в течение приблизительно 18±2 часов. Конструкты затем промываются, контактируя с тремя объемами стерилизованной воды в течение 10 минут для каждого полоскания.
Конструкты изобретения могут стерилизоваться облучением гамма-лучами. Конструкты упаковываются в контейнеры, сделанные из материала, подходящего для облучения гамма-лучами, и герметизируются с использованием вакуум-закаточной машины, которые в свою очередь помещаются в герметические мешки для облучения гамма-лучами между 25,0 и 35,0 кГр. Облучение гамма-лучами значительно, но без ущерба, уменьшает температуру сокращения и модуль продольной упругости (модуль Юнга). Механические свойства после облучения гамма-лучами все еще достаточны для использования в диапазоне применений, и гамма-излучение представляет собой предпочтительное средство для стерилизации, поскольку оно широко используется в области имплантируемых медицинских устройств.
Физические модификации

Конструкт существующего изобретения может также быть сделан сетчатым перед пересадкой к субъекту, нуждающемуся в лечении раны. При использовании в заживлении ран, сетчатость улучшает конформацию конструкта на ране и обеспечивает средство для дренажа раневого эксудата из-под трансплантата. Термин 'придание сетчатости' определяется как механический способ, в котором ткань перфорируется продольными разрезами для того, чтобы сформировать сетчатую форму. Придание сетчатости предпочтительно осуществляется при помощи обычного кожного перфоратора (ZIMMER; BIOPLASTY). Сетчатые конструкты могут быть растянуты при растяжении кожи так, что продольные разрезы были открыты и затем прикладывались к поверхности раны. Растянутые сетчатые конструкты предоставляют раневой зоне максимальное покрытие. Альтернативно, сетчатые конструкты могут быть наложены без растягивания, просто как пластина с наличием нерастянутых продольных разрезов. Сетчатый конструкт может быть наложен один или с собственной кожей субъекта из другой области тела. У конструктов изобретения могут также быть перфорации или фенестрации и поры, сделанные другими средствами. Фенестрации могут быть сделаны вручную, используя лазер, перфорирующую иглу, скальпель, иглу или булавку.
Конструктам существующего изобретения можно также придать отверстия, которые сообщаются между обеими сторонами конструкта. Отверстия - перфорации, которые представлены в регулярной или нерегулярной структуре. Можно было также вручную процарапать или перфорировать ткань скальпелем или иглой.
Способы лечения
Биоинженерные конструкты изобретения могут использоваться при заживлении ран, таких как сильные раны, включая хирургические раны или обгоревшие области, или хронические раны, такие как венозные язвы, диабетические язвы, пролежни могут залечиваться при применении раскрытого конструкта кожи. Другие врожденные кожные заболевания, такие как врожденный буллезный эпидермолиз также могут лечиться. Биоинженерные конструкты изобретения могут использоваться в кардиальном применении, периодонтальном применении, хирургическом применении и косметическом применении, а также неврологическом применении, таком как репарационная накладка твердой мозговой оболочки или трансплантат для репарации периферических нервов, обертка для нервных пучков или трубка для управляемой регенерации нервов.
Клеточная доставка. Биоинженерные конструкты изобретения могут быть сформированы для и использоваться в клеточной доставке. Девитализированные или децеллюларизированные конструкты изобретения могут использоваться в качестве культуральной подложки для клеток. Поскольку конструкты изобретения прежде всего включают коллаген, они - естественный субстрат для клеточной культуры. Матричный конструкт изобретения может быть помещен и зафиксирован в приборе для культуры и суспензия клеток в питательной среде наносится на матричный конструкт и может присоединиться и распространяться на поверхности матричного конструкта, или внутри и ниже поверхности матричного конструкта, или в обоих направлениях. Выбранные клетки для культивирования с матричным конструктом являются теми, у которых есть свойства, желательные для лечения поврежденного или патологически измененного органа или ткани с целью восстановить орган или ткань для восстановления их функций. Для примера другой конфигурации конструкта изобретения для клеточной доставки матричные слои могут формироваться в виде кармана или обертки для доставки стволовых или клеток - предшественников или функциональных клеток.
Осуществление изобретения
Следующие примеры приводятся для лучшего понимания практики существующего изобретения и не должны интерпретироваться в любом случае для ограничения охвата существующего изобретения.
Квалифицированному специалисту в уровне техники понятно, что различные модификации могут быть применены к способам, описанным здесь, не отступая от духа и охвата существующего изобретения.
Примеры
Пример 1. Формирование коллагенового матрикса человеческими фибробластами крайней плоти полового члена новорожденного.
5
2
2
Человеческие фибробласты крайней плоти полового члена новорожденного (полученные в Organogenesis, Inc. Canton, MA) были посеяны в количестве 5×10 клеток/162 см культуральной ткани в колбу для обработки (Costar Corp., Cambridge, MA, cat # 3150) и выращивались в среде для выращивания. Среда для выращивания включала: питательную среду Игла, модифицированную по способу Дульбекко (DMEM) (высокое содержание глюкозы, без L-глютамина, BioWhittaker, Walkersville, MD) с добавлением 10%-ной сыворотки новорожденного теленка (HyClone Laboratories, Inc., Logan, Utah) и 4 мМ L-глютамина (BioWhittaker, Walkersville, MD). Клетки содержались в инкубаторе при температуре 37±1°С в атмосфере 10±1%-ного СО. Питательная среда заменялась свежеприготовленной питательной средой каждые два-три дня. После 8 дней культивирования клетки доросли до конфлюэнции, то есть клетки формировали заполненный монослой вдоль основания колбы для культивирования тканей, и питательная среда была аспирирована из культуральной колбы. Для промывания монослоя стерильно-фильтрованный раствор фосфатно-солевого буфера добавлялся к основанию каждой культуральной колбы и затем аспирировался из колб. Клетки были отделены от колбы добавлением 5 мл трипсин-ЭДТА глютамина (BioWhittaker, Walkersville, MD) к каждой колбе и осторожным покачиванием, чтобы гарантировать полное покрытие монослоя. Культуры были возвращены в инкубатор. Как только клетки были отделены, было добавлено 5 мл SBTI (соевый трипсиновый ингибитор) к каждой колбе и перемешано с суспензией для остановки действия трипсин-ЭДТА. Суспензия клеток была удалена из колб и равномерно разделялась между стерильными, коническими тубами центрифуги. Клетки были собраны центрифугированием приблизительно при 800-1000 g в течение 5 минут.
6

6
5
2
2
Клетки были ресуспендированы, используя новую питательную среду при концентрации 3,0×10 клеток/мл, и посеяны на вставку для обработки культивируемых тканей с диаметром 24 мм и размером пор 0,4 микрона (TRANSWELL, Corning Costar) в шестиячеечные планшеты с плотностью 3,0×10 клеток на вставку (6,6×10 клеток/см). Клетки находились в инкубаторе при температуре 37±1°С в атмосфере 10±1%-ного СО и снабжались свежей продукционной средой каждые 2-3 дня в течение 21 дня.
-4
-4
Продукционная среда включала: 3:1 основной смеси DMEM и питательной среды Хэма F-12 (Quality Biologies Gaithersburg, MD), 4 мМ GlutaMAX-1™ (Gibco BRL, Grand Island, NY) и добавку в конечной концентрации: 5 нг/мл человеческого рекомбинантного эпидермального фактор роста (Upstate Biotechnology Lake Placid, NY), 2%-ная сыворотка новорожденных телят (Hyclone, Logan, Utah), 0,4 мкг/мл гидрокортизона (Sigma St. Louis, МО), 1×10М этаноламина Fluka, Ronkonkoma, NY ACS grade), 1×10 M о-фосфорил-этаноламина (Sigma, St. Louis, МО), инсулин 5 нг/мл (Sigma, St. Louis, МО), 5 мкг/мл трансферрина (Sigma, St. Louis, МО), 20 пМ трийодтиронина (Sigma, St. Louis, МО) и 6,78 нг/мл селена (Sigma Aldrich Fine Chemicals Co., Milwaukee, WI), L-аскорбиновая-кислота 50 нг/мл (WAKO Chemicals USA, Inc. #013-12061), 0,2 мкг/мл L-пролина (Sigma, St. Louis, МО), 0,1 мкг/мл глицина (Sigma, St. Louis, МО) и 0,05% полиэтиленгликоля (ПЭГ) с молекулярной массой 3400-3700 (марка для клеточных культур) (Sigma, St. Louis, МО).
Образцы для гистологического анализа брались на 7, 14 и 21 день и фиксировались в формалине, затем заливались в парафин. Зафиксированные формалином образцы были залиты в парафин, и 5-микрометровые срезы были окрашены гематоксилин-эозиновым красителем (ГЭ) согласно процедурам, известным в уровне техники. Используя окрашенные ГЭ препараты, были сделаны измерения толщины в десяти случайно выбранных полях зрения микроскопа, используя 10Х окуляр с 10 мм/ 100 мкм сеткой. Результаты для двух различных клеточных штаммов фибробластов кожи человека суммированы в Таблице 1, в которой показана толщина клеточно-матричных конструктов по мере их развития.
Таблица 1
Толщина (в микронах)
День 0
День 7
День 14
День 21
В119 Среднее(n-3)
0
30,33±2,61
63,33±4,40
84,00±4,67
В156 Среднее(n=4)
0
42,00±5,14
63,85±4,50
76,25±8,584
Образцы были также представлены для анализа концентрации коллагена на 7, 14, и 21 день. Содержание коллагена оценивалось, используя колориметрическую пробу для содержания гидроксипролина, известную в уровне техники (Woessner, 1961). В тех же временных интервалах было определено количество клеток. Таблица 2 отражает концентрации коллагена и Таблица 3 отражает данные количества клеток для клеточно-матричных конструктов, продуцированных двумя различными штаммами клеток (В156 и В119) с использованием способов, описанных выше.
Таблица 2
Коллаген (мкг/см<sup>2</sup>)
День 0
День 7
День 14
День 21
В119 Среднее (n=3)
0
93,69±22,73
241,66±21,08
396,30±29,38
В156 Среднее (n=4)
0
107,14±22,73
301,93±23,91
457,51±25,00
Таблица 3
Клетки (клеток/см<sup>2</sup>)
День 0
День 7
День 14
День 21
В119 Среднее (n=3)
6,6×10<sup>5</sup>
11,8±4,4×10<sup>5</sup>
11,4±1,7×10<sup>5</sup>
13,9±1,2×10<sup>5</sup>
В156 Среднее (n=4)
6,6×10<sup>5</sup>
13,1±0,5×10<sup>5</sup>
14,0±2,1×10<sup>5</sup>
17,1±1,7×10<sup>5</sup>
Образцы клеток человека получали из матрикса кожи на 7, 14, и 21 день и анализировали SDS-PAGE с отсроченной репозицией для того, чтобы определить состав коллагена, содержащего альфа-спирали I и III типа коллагена в образцах.
2
Биохимические особенности матрикса кожи были изучены с использованием иммуногистохимических методов. Идентификация фибронектина проводилась на фиксированных парафиновых срезах, используя стрептавидин-биотиновую систему Zymed Histostain (Zymed Laboratories Inc., South San Francisco, CA). Наличие тенасцина было установлено окрашиванием первичных антител к тенасцину (Dako, Carpintheria, CA) в присутствии антимышиных антител, меченых пероксидазой хрена (Calbiochem) в качестве вторичного антитела. Образцы визуализировались с применением диаминобензола (Sigma St. Louis, МО) и докрашены ядерным быстрым красным (красителем). Количественный анализ глюкозаминогликана (GAG) проводился на 21-дневных образцах, используя ранее описанный способ (Farndale, 1986). Анализ показал наличие 0,44 г GAG на см в образце клеток человека, полученных из матрикса кожи, взятых на 21 день после посева.
Пример 2. In Vitro формирование коллагенового матрикса человеческими фибробластами крайней плоти полового члена новорожденного в среде с определенным химическим составом.
6
6
5
2
Человеческие фибробласты крайней плоти новорожденного были растянуты, используя процедуру, описанную в Примере 1. Затем клетки повторно суспендировались до концентрации 3×10 клеток/мл и посеяны на мембранную вставку для обработки культивируемых тканей с диаметром 24 мм и размером пор 0,4 микрона в шестиячеечные планшеты с плотностью 3,0×10 клеток на вставку (6,6×10 клеток/см). Эти клетки были затем инкубированы как в Примере 1 с сывороткой новорожденных телят, опущенной из питательных сред повсюду.
-4
-4
Более подробно, питательная среда содержала: 3:1 основной смеси DMЕМ и питательной среды Хэма F-12 (Quality Biologies Gaithersburg, MD), 4 мМ GlutaMAX-1™ (Gibco BRL, Grand Island, NY) и добавку в конечной концентрации: 5 нг/мл человеческий рекомбинантный эпидермальный фактор роста (Upstate Biotechnology Lake Placid, NY), 2%-ная сыворотка новорожденных телят (Hyclone, Logan, Utah), 0,4 мкг/мл гидрокортизона (Sigma St. Louis, МО), 1×10М этаноламина Fluka, Ronkonkoma, NY ACS grade, 1×10 M о-фосфорил-этаноламина (Sigma, St. Louis, МО), инсулин 5 нг/мл (Sigma, St. Louis, МО), 5 мкг/мл трансферрина (Sigma, St. Louis, МО), 20 пМ трийодтиронина (Sigma, St. Louis, МО) и 6,78 нг/мл селена (Sigma Aldrich Fine Chemicals Co., Milwaukee, WI), L-аскорбиновая-кислота 50 нг/мл (WAKO Chemicals USA, Inc. #013-12061), 0,2 мкг/мл L-пролина (Sigma, St. Louis, МО), 0,1 мкг/мл глицина (Sigma, St. Louis, МО) и 0,05% полиэтиленгликоля (ПЭГ) с молекулярной массой 3400-3700 (марка для клеточных культур) (Sigma, St. Louis, МО). Образцы были проверены на 7, 14, и 21 день для исследования концентрации коллагена и количества клеток, используя описанные процедуры. Полученные результаты суммированы в таблицах 4 (количество клеток) и 5 (коллаген). Образцы были также зафиксированы формалином и подготовлены окрашиванием гемотоксилином и эозином для анализа оптическим микроскопом, как описано в Примере 1. Гистологическая оценка продемонстрировала, что конструкты, выращенные в среде с определенным составом, были подобны выращенным в присутствии 2%-ной сыворотки новорожденных телят. Образцы также окрашивались положительно на фибронектин, используя способ, описанный в Примере 1.
Таблица 4
Коллаген (мкг/см<sup>2</sup>)
День 0
День 7
День 14
День 21
Среднее содержание коллагена в каждом конструкте (n=3)
0
107,63±21,96
329,85±27,63
465,83±49,46
Таблица 5
Клетки (клеток/см<sup>2</sup>)
День 0
День 7
День 14
День 21
Среднее количество клеток в каждом конструкте (n=3)
6,6×10<sup>5</sup>
7,8±2,2×10<sup>5</sup>
9,6±2,5×10<sup>5</sup>
1,19±2,1×10<sup>5</sup>
Помимо эндогенно продуцированного фибриллярного коллагена, декорин и глюкозаминогликан также присутствовали в клеточно-матричном конструкте.
Пример 3. In Vitro формирование коллагенового матрикса человеческими фибробластами ахиллова сухожилия.
Клеточно-матричные конструкты формировали, используя тот же самый способ, как описано в Примере 1, заменой человеческих фибробластов крайней плоти полового члена новорожденных человеческими фибробластами ахиллова сухожилия. По истечении 21 дня в продукционной среде образцы также подвергались ГЭ окрашиванию и определению толщины, с использованием процедуры, описанной в Примере 1. Финальный конструкт визуализировался как клеточно-матричный подобный ткани конструкт с толщиной 75,00±27,58 микрон (n=2). Эндогенно продуцированные фибриллярный коллаген, декорин и глюкозаминогликан также присутствовали в конструкте.
Пример 4. In Vitro формирование коллагенового матрикса трансфицированными человеческими фибробластами крайней плоти новорожденных.
6
2
6
2
6
2
6
2
Трансфицированные фибробласты кожи человека были получены, используя следующий способ. Размораживали одну пробирку с JCRIP-43 фактором роста тромбоцитов (ФРТ) продуцированного вирусом (Morgan J. et al.) и клетки были посеяны в количестве 2×10 клеток/162 см в колбу (Coming Costar, Cambridge, MA). Указанные колбы дополнялись средой для выращивания и инкубировались в инкубаторе при 37±1°С в атмосфере 10±1%-ного CO. Среда для выращивания включала: питательную среду Игла, модифицированную по способу Дульбекко (DMEM) (высокое содержание глюкозы, без L-глютамина, BioWhittaker, Walkersville, MD) с добавлением 10%-ной сыворотки новорожденных телят (CKHT) (HyClone Laboratories, Inc., Logan, Utah) и 4 мМ L-глютамина (BioWhittaker, Walkersville, MD). В тот же самый день 1 пробирка с человеческими фибробластами крайней плоти новорожденного (HDFB156) размораживалась и помещалась в колбу в количестве 1,5×10 клеток/162 см (Corning Costar, Cambridge, MA). После трех дней jCRJJP ФРТ-43 вирусный производитель подкармливался свежей средой для выращивания. HDFB156 питались вышеупомянутой средой для выращивания плюс 8 мкг/мл полибрена (Sigma, St. Louis, МО). На следующий день клетки HDFB156 были инфицированы следующим образом. Обедненная питательная среда от jCRIP ФРТ-43 вирусного производителя была собрана и отфильтрована на 0,45 микрон фильтре. 8 мкг/мл полибрена были добавлены к указанной фильтрованной обедненной питательной среде. Обедненная питательная среда была затем помещена к клеткам HDF. В следующие два дня клетки HDF питались свежей средой для выращивания. День спустя клетки HDF пассировали от р5 до р6 и производили посев при плотности 2,5×10 клеток/162 см в колбу (Corning Costar, Cambridge, MA). Клетки пассировали следующим образом; обедненная питательная среда была аспирирована. Колбы затем промывались фосфатно-солевым буфером, чтобы удалить любую остаточную сыворотку новорожденных телят. Клетки были высвобождены из колбы добавлением 5 мл трипсин-ЭДТА к каждой колбе и мягким покачиванием, чтобы гарантировать полное покрытие монослоя. Культуры были возвращены в инкубатор. Как только клетки были отделены, 5 мл СИТ (соевый ингибитор трипсина) было добавлено к каждой колбе и смешано с суспензией, чтобы остановить действие трипсин-ЭДТА. Суспензия клетки/трипсин/СИТ была удалена из колб и равномерно разделялась между стерильными, коническими тубами для центрифугирования. Клетки были собраны центрифугированием приблизительно при 800-1000 g в течение 5 минут. Клетки повторно суспендировались в средах для выращивания для того, чтобы отобрать их в упомянутой выше плотности. После двух дней культивирования клетки питались свежей средой для выращивания. На следующий день клетки были собраны как указано выше, и разбавлены до плотности 1,5×10 клеток/мл в среде для выращивания, содержащей 10% сыворотки новорожденных телят с 10%-ным диметилсульфоксидом (ДМСО) (Sigma, St. Louis, МО). Затем клетки были заморожены в 1 мл криопробирках приблизительно при -80°С.
Продукция коллагенового матрикса для этого примера использует ту же самую процедуру, как в Примерах 1 и 3, только с заменой человеческих фибробластов крайней плоти новорожденных человеческими фибробластами крайней плоти новорожденных, трансформированных для продукции высокого уровня фактора роста тромбоцитов, как описано выше. Образцы были взяты для окрашивания ГЭ, как описано выше, на 18 день после посева. Образцы были также окрашены с использованием способа авидин-биотина для обнаружения наличия фибронектина, упомянутого в Примере 10. Образцы были взяты на 18 день после посева для окрашивания ГЭ, как описано в Примере 1, и показали аналогичную клеточно-матричную макроскопическую картину, как описано в Примере 1, с измеренной толщиной 123,6 микрон (N=1). Выход ФРТ трансфицированных клеток в клеточно-матричном конструкте был измерен и составлял 100 нг/мл по данным ELISA в течение всей продолжительности культивирования (18 дней), в то время как выход ФРТ у контроля не был невыявлен.
Пример 5. In Vitro формирование матрикса кератоцитами роговицы человека.
6
6
2
-4
-4
-4
-4
Клетки кератоцитов человека (полученные в Organogenesis, Inc. Canton, МА) использовались в продукции стромального конструкта роговицы. Конфлюэнтные культуры человеческих кератоцитов были освобождены от их культуральных субстратов, используя трипсин-ЭДТА. После освобождения использовался соевый ингибитор трипсина для того, чтобы нейтрализовать трипсин-ЭДТА, суспензия клеток центрифугировалась, супернатант отбрасывался и клетки затем повторно суспендировались в базовых питательных средах при концентрации 3×10 клеток/мл. Клетки были посеяны на вставку для обработки культивируемых тканей с диаметром 24 мм и размером пор 0,4 микрона в шестиячеечные планшеты с плотностью 3,0×10 клеток на вставку (6,6×105 клеток/см). Эти культуры держались в течение ночи в среде для посева. Питательная среда для посева была составлена из: 3:1 основной смеси DMЕМ и питательной среды Хэма F-12 (Quality Biologies Gaithersburg, MD), 4 мМ GlutaMAX-1™ (Gibco BRL, Grand Island, NY) и добавки: 5 нг/мл человеческого рекомбинантного эпидермального фактор роста (Upstate Biotechnology Lake Placid, NY), 2%-ная сыворотка новорожденных телят (Hyclone, Logan, Utah), 0,4 мкг/мл гидрокортизона (Sigma St. Louis, МО), 1×10М этаноламина Fluka, Ronkonkoma, NYACS grade), 1×10 M о-фосфорил-этаноламина (Sigma, St. Louis, МО), инсулин 5 нг/мл (Sigma, St. Louis, МО), 5 мкг/мл трансферрина (Sigma, St. Louis, МО), 20 пМ трийодтиронина (Sigma, St. Louis, МО) и 6,78 нг/мл селена (Sigma Aldrich Fine Chemicals Co., Milwaukee, WI). После этого культуры подкармливались свежей продукционной средой. Продукционная среда включала: 3:1 основной смеси DMЕМ и питательной среды Хэма F-12 (Quality Biologies Gaithersburg, MD), 4 мМ GlutaMAX-1™ (Gibco BRL, Grand Island, NY) и добавку в конечной концентрации: 5 нг/мл человеческого рекомбинантного эпидермального фактор роста (Upstate Biotechnology Lake Placid, NY), 2%-ной сыворотки новорожденных телят (Hyclone, Logan, Utah), 0,4 мкг/мл гидрокортизона (Sigma St. Louis, МО), 1×10М этаноламина Fluka, Ronkonkoma, NYACS grade), 1×10M о-фосфорил-этаноламина (Sigma, St. Louis, МО), инсулин 5 нг/мл (Sigma, St. Louis, МО), 5 мкг/мл трансферрина (Sigma, St. Louis, МО), 20 пМ трийодтиронина (Sigma, St. Louis, МО) и 6,78 нг/мл селена (Sigma Aldrich Fine Chemicals Co., Milwaukee, WI), L-аскорбиновая-кислота 50 нг/мл (WAKO Chemicals USA, Inc. #013-12061), 0,2 мкг/мл L-пролина (Sigma, St. Louis, МО), 0,1 мкг/мл глицина (Sigma, St. Louis, МО) и 0,05% полиэтиленгликоля (ПЭГ) (марка для клеточных культур) (Sigma, St. Louis, МО).
2
Клетки содержались в инкубаторе при температуре 37+1°С в атмосфере 10±1%-ного СО. Питательная среда заменялась свежеприготовленной питательной средой каждые два-три дня в течение 20 дней (в течение в общей сложности 21 дня культивирования). После 21 дня культивировния кератоциты наносили на матричный слой приблизительно 40 микрон толщиной, как измерено способом, описанным в Примере 1. Эндогенно продуцированный фибриллярный коллаген, декорин и глюкозаминогликан также присутствовали в клеточно-матричном конструкте.
Пример 6. In Vitro формирование коллагенового матрикса человеческими фибробластами крайней плоти новорожденных, посеянными в продукционные среды.
5
-4
-4
2
2
Человеческие фибробласты крайней плоти новорожденных (полученные в Organogenesis, Inc. Canton, MA) были посеяны на носитель для обработки культивируемых тканей с диаметром 24 мм и размером пор 0,4 микрона в шестиячеечные планшеты с плотностью 1×10 клеток и росли в среде для выращивания. Среда для выращивания включала: питательную среду Игла, модифицированную по способу Дульбекко (DMEM) (высокое содержание глюкозы, без L-глютамина, BioWhittaker, Walkersville, MD) с добавлением 10%-ной сыворотки новорожденных телят (HyClone Laboratories, Inc., Logan, Utah) и 4 мМ L-глютамина (BioWhittaker, Walkersville, MD). Клетки содержались в инкубаторе при температуре 37±1°С в атмосфере 10±1%-ного СО. Питательная среда заменялась каждые два-три дня. После 9 дней культивирования питательная среда была аспирирована из чашки для культивирования и замещена продукционной средой. Клетки содержались в инкубаторе при температуре 37±1°С в атмосфере 10±1%-ного СО и продукционная среда заменялась свежей каждые два-три дня в течение 21 дня. Продукционная среда включала: 3:1 основной смеси DMEM и питательной среды Хэма F-12 (Quality Biologies Gaithersburg, MD), 4 мМ GlutaMAX-1™ (Gibco BRL, Grand Island, NY) и добавки: 5 нг/мл человеческого рекомбинантного эпидермального фактор роста (Upstate Biotechnology Lake Placid, NY), 2%-ная сыворотка новорожденных телят (Hyclone, Logan, Utah), 0,4 мкг/мл гидрокортизона (Sigma St. Louis, МО), 1×10 М этаноламина Fluka, Ronkonkoma, NYACS grade, 1×10M о-фосфорил-этаноламина (Sigma, St. Louis, МО), инсулин 5 нг/мл (Sigma, St. Louis, МО), 5 мкг/мл трансферрина (Sigma, St. Louis, МО), 20 пМ трийодтиронина (Sigma, St. Louis, МО) и 6,78 нг/мл селена (Sigma Aldrich Fine Chemicals Co., Milwaukee, WI), L-аскорбиновая-кислота 50 нг/мл (WAKO Chemicals USA, Inc. #013-12061), 0,2 мкг/мл L-пролина (Sigma, St. Louis, МО), 0,1 мкг/мл глицина (Sigma, St. Louis, МО) и 0,05% полиэтиленгликоля (ПЭГ) (марка для клеточных культур) (Sigma, St. Louis, МО).
Образцы брались на 21 день и фиксировались в формалине, затем заливались в парафин. Зафиксированные формалином образцы были залиты в парафин, и 5-микрометровые срезы были окрашены гематоксилин-эозиновым красителем согласно процедурам, известным в уровне техники. Используя окрашенные ГЭ препараты, измерения толщины были сделаны в десяти случайно выбранных полях зрения микроскопа, используя 10Х окуляр (Olympus America Inc., Melville, NY) с 10 мм / 100 мкм сеткой (Olympus America Inc., Melville, NY). Конструкты, созданные с использованием этого способа, были аналогичны по структуре и биохимическому составу с конструктами Примера 1 и имели измеренную толщину 82,00±7,64 микрон.
Пример 7. In Vitro формирование коллагенового матрикса фибробластами кожи свиньи.
5
2
6
6
5
2
-4
-4
-4
-4
2
2
Фибробласты кожи свиньи (полученные в Organogenesis, Inc. Canton, МА) были посеяны в количестве 5×10 клеток/162 см культуральной ткани в колбу для обработки (Costar Corp., Cambridge, МА, cat # 3150) и выращивались в среде для выращивания, как описано ниже. Среда для выращивания включала: питательную среду Игла, модифицированную по способу Дульбекко (DMEM) (высокое содержание глюкозы, без L-глютамина, BioWhittaker, Walkersville, MD) с добавлением 10%-ной сывороткой новорожденных телят (HyClone Laboratories, Inc., Logan, Utah) и 4 мМ L-глютамина (BioWhittaker, Walkersville, MD). Клетки содержались в инкубаторе при температуре 37±1°С в атмосфере 10±1%-ного СО. Питательная среда заменялась каждые два-три дня. После конфлюэнции, при которой клетки формировали заполненный монослой вдоль основания колбы для культивирования тканей, питательная среда была аспирирована из культуральной колбы. Для промывания монослоя стерильно-фильтрованный раствор фосфатно-солевого буфера добавлялся к основанию каждой культуральной колбы и затем аспирировался из колб. Клетки были отделены из колбы добавлением 5 мл трипсин-ЭДТА глютамина (BioWhittaker, Walkersville, MD) к каждой колбе и осторожным покачиванием, чтобы гарантировать полное покрытие монослоя. Культуры были возвращены в инкубатор. Как только клетки были отделены, было добавлено 5 мл СИТ (соевый трипсиновый ингибитор) к каждой колбе и смешаны с суспензией для остановки действия трипсин-ЭДТА. Суспензия клетки была удалена из колб и равномерно разделялась между стерильными, коническими тубами центрифуги. Клетки были собраны центрифугированием приблизительно при 800-1000 g в течение 5 минут. Клетки были ресуспендированы, используя новую питательную среду при концентрации 3,0×10 клеток/мл, и посеяны на вставку для обработки культивируемых тканей с диаметром 24 мм и размером пор 0,4 микрона в шестиячеечные планшеты с плотностью 3,0×10 клеток на вставку (6,6×10 клеток/см). Клетки находились на среде для посева в течение ночи. Среда для посева включала: 3:1 основной смеси DMEM и питательной среды Хэма F-12 ((Quality Biologies Gaithersburg, MD), 4 мМ GlutaMAX-1™ (Gibco BRL, Grand Island, NY) и добавки: 5 нг/мл человеческого рекомбинантного эпидермального фактор роста (Upstate Biotechnology Lake Placid, NY), 2%-ная сыворотка новорожденных телят (Hyclone, Logan, Utah), 0,4 мкг/мл гидрокортизона (Sigma St. Louis, МО), 1×10М этаноламина Fluka, Ronkonkoma, NY ACS grade, 1×10 M о-фосфорил-этаноламина (Sigma, St. Louis, МО), инсулин 5 нг/мл (Sigma, St. Louis, МО), 5 мкг/мл трансферрина (Sigma, St. Louis, МО), 20 пМ трийодтиронина (Sigma, St. Louis, МО) и 6,78 нг/мл селена (Sigma Aldrich Fine Chemicals Co., Milwaukee, Wl), L-аскорбиновая-кислота 50 нг/мл (WAKO Chemicals USA, Inc. #013-12061), 0,2 мкг/мл L-пролина (Sigma, St. Louis, МО), 0,1 мкг/мл глицина (Sigma, St. Louis, МО). Клетки содержались в инкубаторе при температуре 37±1°С в атмосфере 10±1%-ного СО и продукционная среда заменялась каждые два-три дня в течение 7 дней. Продукционная среда включала: 3:1 основной смеси DMEM и питательной среды Хэма F-12 (Quality Biologies Gaithersburg, MD), 4 мМ GlutaMAX-1™ (Gibco BRL, Grand Island, NY) и добавки: 5 нг/мл человеческого рекомбинантного эпидермального фактор роста (Upstate Biotechnology Lake Placid, NY), 2%-ная сыворотка новорожденных телят (Hyclone, Logan, Utah), 0,4 мкг/мл гидрокортизона (Sigma St. Louis, МО), 1×10М этаноламина Fluka, Ronkonkoma, NYACS grade, 1×10 M о-фосфорил-этаноламина (Sigma, St. Louis, МО), инсулин 5 нг/мл (Sigma, St. Louis, МО), 5 мкг/мл трансферрина (Sigma, St. Louis, МО), 20 пМ трийодтиронина (Sigma, St. Louis, МО) и 6,78 нг/мл селена (Sigma Aldrich Fine Chemicals Co., Milwaukee, WI), L-аскорбиновая-кислота 50 нг/мл (WAKO Chemicals USA, Inc. #013-12061), 0,2 мкг/мл L-пролина (Sigma, St. Louis, МО), 0,1 мкг/мл глицина (Sigma, St. Louis, МО) и 0,05% полиэтиленгликоля (ПЭГ) (марка для клеточных культур) (Sigma, St. Louis, МО). Через 7 дней среда была замещена продукционной средой без сыворотки новорожденных телят. Указанные среды заменялись новыми для клеток каждые 2-3 дня в течение еще 20 дней, в течение в общей сложности 28 дней культивирования.
Образцы брались на 21 день и фиксировались в формалине, затем заливались в парафин. Зафиксированные формалином образцы были залиты в парафин, и 5-микрометровые срезы были окрашены гематоксилин-эозиновым красителем (ГЭ) согласно процедурам, известным в уровне техники. Используя окрашенные ГЭ препараты, измерения толщины были сделаны в десяти случайно выбранных полях зрения микроскопа, используя 10Х окуляр (Olympus America Inc., Melville, NY) с 10 мм/ 100 мкм сеткой. (Olympus America Inc., Melville, NY). Образцы показали структуру, составленную из клеток и матрикса с измеренной толщиной 71,20±9,57 микрон. Помимо эндогенно произведенного фибриллярного коллагена, декорин и глюкозаминогликан также присутствовали в клеточно-матричном конструкте.
Пример 8. In Vitro формирование коллагенового матрикса человеческими фибробластами крайней плоти полового члена новорожденных в среде химически определенного состава.
6
6
5
2
Человеческие фибробласты крайней плоти полового члена новорожденных были растянуты, используя процедуру, описанную в Примере 1. Клетки ресуспендировались до концентрации 3×10 клеток/мл и посеяны на мембранную вставку для обработки культивируемых тканей с диаметром 24 мм и размером пор 0,4 микрона в шестиячеечные планшеты с плотностью 3,0×10 клеток на вставку (6,6×10 клеток/см). Клетки в этом примере всегда культивировались в среде химически определенного состава.
-4
-4
Питательная среда содержала: 3:1 основной смеси DMEM и питательной среды Хэма F-12 ((Quality Biologies Gaithersburg, MD), 4 мМ GlutaMAX-1™ (Gibco BRL, Grand Island, NY) и добавки: 5 нг/мл человеческого рекомбинантного эпидермального фактор роста (Upstate Biotechnology Lake Placid, NY), 1×10М этаноламина Fluka, Ronkonkoma, NYACS grade), 1×10M о-фосфорил-этаноламина (Sigma, St. Louis, МО), 5 мкг/мл трансферрина (Sigma, St. Louis, МО), 20 пМ трийодтиронина (Sigma, St. Louis, МО) и 6,78 нг/мл селена (Sigma Aldrich Fine Chemicals Co., Milwaukee, WI), L-аскорбиновая-кислота 50 нг/мл (WAKO Chemicals USA, Inc. #013-12061), 0,2 мкг/мл L-пролина (Sigma, St. Louis, МО), 0,1 мкг/мл глицина (Sigma, St. Louis, МО).
К основной питательной среде, указанной выше, добавлялись другие компоненты по отдельности. Варианты:
1. 5 мкг/мл инсулин (Sigma, St. Louis, МО), 0,4 мкг/мл гидрокортизон (Sigma, St. Louis, МО), 0,05% полиэтиленгликоль (ПЭГ) (Sigma, St. Louis, МО);
2. 5 мкг/мл инсулин (Sigma, St. Louis, МО), 0,4 мкг/мл гидрокортизон (Sigma, St. Louis, МО);
3. 375 мкг/мл инсулин (Sigma, St. Louis, МО), 6 мкг/мл гидрокортизон (Sigma, St. Louis, МО).
2
2
Образцы были зафиксированы формалином и подготовлены гемотоксилиновым и эозиновым окрашиванием для анализа под световым микроскопом. Визуальная гистологическая оценка продемонстрировала, что Вариант 2 с отсутствием ПЭГ продемонстрировал сравнительно подобный матрикс Варианту 1, содержащему ПЭГ. Биохимический анализ, измеряющий содержание коллагена конструкта, показал почти то же самое количество коллагена для обоих сред: 168,7±7,98 мкг/см для Варианта 1 с ПЭГ по сравнению с 170,88±9,07 мкг/см для Варианта 2 без ПЭГ. Вариант 3, содержащий высокие уровни инсулина и гидрокортизона, показал более высокую экспрессию матрикса, включая коллаген, во временной точке более ранней, чем другие два условия. Помимо эндогенно произведенного фибриллярного коллагена, декорин и глюкозаминогликан также присутствовали в клеточно-матричных конструктах во всех Вариантах.
Во всех Вариантах этого примера культивированные конструкты кожи, которые были сформированы, включают фибробласты кожи и эндогенно продуцированный матрикс. Все конструкты имеют полностью сформированные фибриллы коллагена в упакованной организации, распределенной между клетками. Их волокнистые свойства, толщина и связанная целостность придают конструкту значительную прочность, чтобы позволить ему быть удаленным от культуральной мембраны отслаиванием и обработанным, поскольку он передается субъекту, который будет лечиться конструктом, в качестве трансплантата или импланта.
Пример 9. Формирование коллагенового матрикса буккальными фибробластами человека.
6
Цель этого эксперимента состоит в том, чтобы продуцировать клеточно-матричный конструкт из буккальных фибробластов, изолированных из ткани щеки человека. Буккальные клетки культивировались в колбах Т-150 в DMEM, содержащем 10%-ную питательную среду СКНТ. Через 7 дней, для увеличения количества клеток, буккальные клетки были собраны и пассированы в девять колб Т-150 при концентрации 4,0×10 клеток в DMEM, содержащем 10%-ную питательную среду СКНТ, и культивировались до конфлюэнции, после которой клетки были собраны.
Чтобы собрать клетки, питательная среда была аспирирована из культуральной колбы. Для промывки монослоя стерильно фильтрованный фосфатно-солевой буфер был добавлен к основанию каждой культуральной колбы и затем аспирировался из колб. Клетки были отделены от колб добавлением 5 мл трипсин-ЭДТА к каждой колбе и мягким покачиванием, чтобы гарантировать полное покрытие монослоя. Культуры были возвращены в инкубатор. Как только клетки были отделены, 5 мл СИТ (соевый ингибитор трипсина) было добавлено к каждой колбе и смешано с суспензией, чтобы остановить действие трипсин-ЭДТА. Суспензия клетки/трипсин/СИТ была удалена из колб и равномерно разделялась между стерильными, коническими тубами для центрифугирования. Клетки были собраны центрифугированием приблизительно при 800-1000 g в течение 5 минут.
6

6
5
2
-4
-4
2
Клетки были ресуспендированы, используя новую питательную среду при концентрации 3,0×10 клеток/мл, и посеяны на вставку для обработки культивируемых тканей с диаметром 24 мм и размером пор 0,4 микрона (TRANSWELL, Corning Costar) в шестиячеечные планшеты с плотностью 3,0×10 клеток на вставку (6,6×10 клеток/см). Клетки находились в инкубаторе при температуре 37±1°С в атмосфере 10±1%-ного СО и снабжались питательной средой, включающей: 3:1 основной смеси DMEM и питательной среды Хэма F-12 (Quality Biologies Gaithersburg, MD), 4 мМ GlutaMAX-1™ (Gibco BRL, Grand Island, NY) и добавку в конечной концентрации: 5 нг/мл человеческого рекомбинантного эпидермального фактор роста (Upstate Biotechnology Lake Placid, NY), 0,4 мкг/мл гидрокортизона (Sigma St. Louis, МО), 1×10М этаноламина Fluka, Ronkonkoma, NY ACS grade, 1×10 M о-фосфорил-этаноламина (Sigma, St. Louis, МО), инсулин 5 нг/мл (Sigma, St. Louis, МО), 5 мкг/мл трансферрина (Sigma, St. Louis, МО), 20 пМ трийодтиронина (Sigma, St. Louis, МО) и 6,78 нг/мл селена (Sigma Aldrich Fine Chemicals Co., Milwaukee, Wl), L-аскорбиновая-кислота 50 нг/мл (WAKO Chemicals USA, Inc. #013-12061), 0,2 мкг/мл L-пролина (Sigma, St. Louis, МО), 0,1 мкг/мл глицина (Sigma, St. Louis, МО) и 0,05% полиэтиленгликоля (ПЭГ) (Sigma, St. Louis, МО).
На первый день после посева питательная среда была замещена продукционной средой, свободной от сыворотки, заменяемой каждые 2-3 дня в течение 21 дня. На 21 день образцы были зафиксированы в формалине для гистологии. Три образца использовались для анализа белков и продукции коллагена.
Продукция коллагена для конструктов с 24-миллиметровым диаметром составляла в среднем 519 нг на конструкт после 21 дня культивирования. Продукция общего белка для конструктов с 24-миллиметровым диаметром составляла в среднем 210 нг на конструкт после 21 дня культивирования. Морфологически клеточно-матричный конструкт буккальных фибробластов, культивированный конструкт ротовой соединительной ткани, показал буккальные фибробласты, окруженные матриксом, в то время как физически, у конструкта были физическая структура и целостность.
Пример 10. Способы для умерщвления фибробластов в эндогенно продуцированных матричных конструктах для формирования девитализирванных клеточно-матричных конструктов.
Умерщвление фибробластов в эндогенно продуцированных клеточно-матричных конструктах анализировалось, используя AlamarBlue™ пробу. AlamarBlue™ проба включает окислительно-восстановительные индикаторы, которые изменяют цвет в ответ на химическое восстановление среды для выращивания, как прямого следствия метаболизма клеток. Метаболическая активность клеток приводит к восстановлению alamarBlue ™ до красноватого или розового цвета, в зависимости от времени экспозиции. Отсутствие жизнеспособных клеток должно приводить к небольшим или вовсе не приводить к изменению цвета.
Двенадцать матричных конструктов диаметром 24 мм, изготовленных согласно способу Примера 1 (клеточно-матричный конструкт), были выращены на 24 мм культуральных вставках, имеющих поры 0,4 микрона с нахождением каждой культуральной вставки в глубокой плашке в течение 25 дней. Четыре способа умерщвления фибробластов были выполнены в течение ночи (n=3 для каждого варианта): (1) воздушная сушка в окружающей комнатной температуре и влажности; (2) полоскание в 100%-ном этаноле; (3) мгновенное замораживание после сушки на воздухе, и (4) лиофилизция. 24-миллиметровые мембранные культуральные вставки были возвращены в первоначальные 6-ячеечные плашки. Каждая ячейка содержала 11,0 мл питательной среды Игла, модифицированной по способу Дульбекко (DMEM) (высокое содержание глюкозы, без L-глютамина, BioWhittaker, Walkersville, MD) с 10% AlamarBlue™. Питательные среды были отобраны из каждой ячейки через 8 часов и 24 часа в 200 мкл образцы, которые были аликвотированы в 96-ячеечные плашки и хранились при 2-8°С. После того как образец второго временного интервала был взят, образцы в 96-ячеечных плашках сканировались на спектрофотометре для планшетов при двух длинах волн. Процент восстановления AlamarBlue™ был рассчитан по значениям поглощения света, полученных спектрофотометром для планшетов.
После 24 часов инкубации ни один из проверенных вариантов не показывал значительную метаболическую активность, предполагая, что клетки в каждом клеточно-матричном конструкте были успешно умерщвлены с использованием указанных способов умерщвления. Результатом для данного примера были девитализированные однослойные матричные конструкты, которые могут использоваться в производстве многослойных, или трубчатых, или комплексных биоинженерных конструктов изобретения. Способы девитализации этого примера могут быть применены к любому из живых матричных конструктов предыдущих примеров для получения девитализированного матричного конструкта.
Пример 11. Сшивка матрикса, полученного от клеток кожи человека.
Два клеточно-матричных конструкта с диаметром 75 мм изготовили согласно способу Примера 1 посредством их культивирования на мембранах поликарбоната с диаметром 75 мм и размером пор 0,4 микрона. Один клеточно-матричный конструкт был девитализирован сушкой на воздухе при комнатной температуре и влажности, а другой был девитализирован быстрым погружением в 100%-ный этанол и последующей сушкой на воздухе, чтобы позволить этанолу испариться из клеточно-матричного конструкта. Оба клеточно-матричных конструкта были затем регидратированы с использованием стерилизованной воды для инъекций. Для формирования двухслойного конструкта клеточно-матричные конструкты были очищены от их соответствующих мембран, используя изогнутые микропинцеты, и наложены путем наслаивания друг на друга с использованием 100-миллиметровой крышки от чашек для культивирования. Приблизительно 15 мл 1,0 мМ раствора ЭДК было добавлено к наслоенному клеточно-матричному конструкту, сшивание проводили в течение ночи, или приблизительно 15-18 часов. Двухслойный конструкт был удален из раствора ЭДК, промыт в стерилизованной воде и высушен на воздухе, с целью получить сшитый девитализированный клеточно-матричный двухслойный конструкт, эндогенно произведенный фибробластами человека.
Затем конструкт был регидратирован. При регидратации двухслойный конструкт быстро набрал водную массу и был гладким в текстуре. Процесс регидратации протекал быстро, занимая менее чем минуту. Двухслойный конструкт смотрелся и вел себя как единая часть ткани. Конструкт был разрезан на четыре полосы примерно 1,25×5 см и затем тестировался на машинке для проверки прочности на разрыв марки "Instron". Средняя прочность для каждой полосы, зарегистрированная машинкой "Instron", была 4,9 Н.
Пример 12. Наслаивание и сшивание девитализированных конструктов ткани для формирования многослойных конструктов.
Шестнадцать матричных конструктов были выращены на 75-миллиметровых культуральных мембранных вставках, имеющих поры приблизительно 0,4 мкм, используя способы и материалы, в основном подобные Примеру 1. Для девитализации конструкты ткани были высушены на воздухе в течение ночи при окружающей комнатной температуре и влажности для того, чтобы гарантировать умерщвление фибробластов. Девитализированные конструкты ткани были затем гидратированы водой для инъекции (ВДИ), а после были очищены от каждой мембраны, используя изогнутые микропинцеты или прямые пинцеты. Девитализированный конструкт ткани был полностью развернут на 100 мм крышку культуральной чашки (в качестве удобной рабочей поверхности), и последующие слои были добавлены, наслаивая девитализированные конструкты ткани поверх друг друга, чтобы получить 2 или 3 слоя. Слоям позволяли высохнуть на воздухе при окружающей комнатной температуре и влажности в течение ночи, или приблизительно между 15-18 часами.
После высыхания добавленные слои прилегали друг к другу. Прилегаемые слои были гидратированы и затем наслаивались на другие прилегаемые слои и затем снова им позволяли высохнуть в течение ночи, или приблизительно между 15-18 часами. Из шестнадцати однослойных девитализированных конструктов ткани были сформированы 10-слойные, 5-слойные и однослойные конструкты, при этом для 5- и 10-слойных конструктов слои прилегали друг к другу в результате процессов регидратации и высыхания. Затем конструкты были сшиты сшивающим агентом. Конструкты находились в сосуде, и к каждому сосуду было добавлено приблизительно 10 мл 1,0 мМ ЭДК в растворе ВДИ. Наслоенные девитализированные внеклеточно-матричные конструкты ткани (ВКМ) сшивались в течение ночи (приблизительно между 15-18 часами). Конструкты ткани были удалены из раствора ЭДК, промыты ВДИ и высушены на воздухе при окружающей комнатной температуре и влажности, давая в конечном счете сшитый, многослойный, девитализированный полученный из клеток человека конструкт ткани.
Два многослойных конструкта были разрезаны на три полосы примерно 1,25×5 см, и затем тестировались на машинке для проверки прочности на разрыв марки "Instron". Нормализованная прочность для каждой полосы 5-слойных конструктов ткани была определена 1,425 Н/слой, для 10-слойного конструкта ткани прочность при растяжении была 1,706 Н/слой.
Комбинация сушки на воздухе, наслаивания и сшивания ЭДК неклеточного ВКМ конструкта ткани была успешной для придания прочности и однородности неклеточному ВКМ. Неклеточные конструкты ткани ВКМ могут быть успешно наслоены, высушены и регидратированы. Поведение и форма неклеточных конструктов ткани ВКМ не ухудшались от многократного высыхания и стадий регидратации. Увеличение числа неклеточных слоев конструкта ткани ВКМ до пяти и целых десяти увеличивало общую прочность конструкта так же как сохраняло форму ткани после разрезания.
Пример 13. Производство многослойных клеточно-матричных конструктов, сшитых с использованием трансглутаминазы или транслутаминазы/ЭДК.
Девитализированные клеточно-матричные конструкты были наслоены и сшиты с использованием трансглутаминазы или трансглутаминазы, сопровождаемой ЭДК в буфере МЭС, чтобы связать слои вместе. Трансглутаминаза ("ТГМ") является общим понятием для семейства естественных ферментов, действие которых заключается в связывании белков. ТГМ катализирует формирование ковалентной связи между свободными группами аминной и гамма-карбоксамидной группой, специфично действуя на лизин и глютамин. Есть несколько форм ТГМ, но тип, на котором сосредотачиваются в этом эксперименте, будет пищевая ТГМ Activa™, которая получена посредством процесса ферментации и используется как связующий агент. Она готова к использованию в виде сухого порошка, но также может быть приготовлена как суспензия или раствор.
Двенадцать клеточно-матричных конструктов были выращены на культуральных вставках диаметром 75 мм, имеющих 0,4 мкм пористые мембраны, и культивировались в течение 25 дней согласно способам и используя материалы, в основном подобные представленным в Примере 1. Клеточно-матричные конструкты были девитализированы сушой на воздухе в течение ночи, приблизительно 15-18 часов, при окружающей комнатной температуре и влажности. Высушенные, девитализированные клеточно-матричные конструкты были гидратированы стерилизованной водой для инъекций, конструкты были очищены от их соответствующих мембран, используя прямой пинцет. Клеточно-матричные конструкты были полностью развернуты на 100 мм крышку культуральной чашки с наслоением клеточно-матричных конструктов для формирования трех конструктов с 4 слоями. При наслоении каждый клеточно-матричный слой контактировал с 5,0 мл раствора ТГМ различной концентрации (концентрации для каждого конструкта с 4 слоями были 28U, 280U и 700U), добавленным между отдельными слоями, чтобы гарантировать, что весь клеточно-матричный слой обработался сшивающим агентом. Клеточно-матричные конструкты были свободно наслоены в растворе сшивания для определения склеивания слоев без применения давления или стадии высыхания. Три клеточно-матричных конструкта с 4 слоями были помещены при 40°С в инкубатор в течение ночи, или приблизительно на 15-18 часов. Три клеточно-матричных конструкта с 4 слоями были удалены из 40°С инкубатора и им было позволено высохнуть на воздухе при окружающей комнатной температуре и влажности. После полного высыхания на воздухе клеточно-матричные конструкты были гидратированы со стерильной ВДИ. Клеточно-матричные конструкты были разрезаны напополам с последующей обработкой каждой половины конструкта 1,0 мМ ЭДК в буфере МЭС и конструктам позволяли сшиваться в течение ночи при 4°С. Другие половины каждого конструкта, которые были сшиты только ТГМ, были также сохранены в течение ночи при 4°С в ВДИ. На следующий день все 6 частей были проверены на прочность при растяжении и прочности шва на машинке для проверки прочности на разрыв марки "Instron".
Хотя результаты изменялись от образца к образцу, в общем все варианты четырехслойных, связанных конструктов из девитализированных эндогенно продуцированных клеточно-матричных слоев, имели сопоставимую прочность на слой, при сравнивании обработки одной ТГМ или вместе ТГМ/ЭДК сшитых и связанных конструктов.
Пример 14. Производство многослойных клеточно-матричных конструктов, сшитых с использованием пищевой трансглутаминазы или рекомбинантной трансглутаминазы.
Сравнивались две формы трансглутаминазы (ТГМ) на многослойных, девитализированных клеточно-матричных конструктах. Формы сравниваемых ферментов были пищевая Activa™ и рекомбинантная трансглутаминаза человека (рчТГМ).
Тридцать два клеточно-матричных конструкта были выращены на культуральных вставках диаметром 75 мм, имеющих 0,4 мкм пористые мембраны, и культивировались в течение 25 дней согласно способам и используя материалы, в основном подобные представленным в Примере 1. Все клеточно-матричные конструкты были девитализированы сушкой на воздухе при окружающей комнатной температуре и влажности. Высушенные, девитализированные однослойные клеточно-матричные конструкты были гидратированы 24 часа спустя стерилизованной водой для инъекций (ВДИ), затем конструкты были очищены от их соответствующих мембран, используя прямой пинцет. После были изготовлены клеточно-матричные конструкты, имеющие восемь слоев.
Клеточно-матричные конструкты, имеющие восемь слоев, были изготовлены. Клеточно-матричные пластины были наслоены попарно, таким образом, чтобы получить шестнадцать клеточно-матричных конструктов с 2-мя слоями. Им снова позволяли сушиться на воздухе при окружающей комнатной температуре и влажности в асептических условиях. Четыре набора 2-слойных конструктов были развернуты в 100-миллиметровую плашку, и к каждому было добавлено 20 мл ТГМ или рчТГМ растворов определенного типа и активности: (1) 8 слоев пищевая ТГМ 5U; (2) 8 слоев пищевая ТГМ 10U; (3) 8 слоев рчТГМ 15U и (4) 8 слоев рчТГМ 30U. Конструкты были помещены в 40°С инкубатор и сшивались в течение ночи. На следующий день каждый вариант 2-слойных конструктов был наслоен для получения конструктов с 4 слоями. Этот процесс был повторен снова, но без ТГМ, чтобы получить один конструкт с 8 слоями для каждого варианта сшивки. Они были высушены на воздухе при окружающей комнатной температуре и влажности и обработаны тем же самым сшивающим агентом ТГМ второй и последний раз. Конструкты были помещены в 40°С инкубатор и сшивались в течение ночи, приблизительно 18-24 часа. После заключительной воздушной сушки конструкты были гидратированы стерильной ВДИ. Толщина каждого конструкта была измерена с использованием лазера. Три части каждой 8-слойной единицы были проверены на прочность при растяжении и прочности шва на машинке для проверки прочности на разрыв марки "Instron".
Перекрестное сшивание с рчТГМ было более успешным, чем с пищевой ТГМ для 8-слойных конструктов в данном эксперименте. Более низкая концентрация рчТГМ давала лучшую прочностью при растяжении и лучшую прочность шва, чем другие варианты.
Пример 15. Конструкт соединительной ткани.
7
2
Фибробласты были засеяны снова из увеличивающихся культур, в которых фибробласты культивировались на микроносителях в биореакторах. Фибробласты были отфильтрованы, используя сито из нержавеющей стали, чтобы отделить фибробласты от микроносителей. Фильтрация удалила все микроносители и скопления клеток от суспензии клеток. Приблизительно 3,0×10 клеток были посеяны на 0,4 мкм пористые мембраны с поверхностью приблизительно 44 см, находящихся приблизительно в 140 мл матрикс продуцирующей среды с определенным химическим составом. Эта плотность посева была при суперконфлюэнции.
-4
-4
Матрикс-продуцирующая питательная среда с определенным химическим составом включала основу из DMEM (высокий уровень глюкозы, без L-глютамина), подкрепленную с приблизительным количеством следующих компонентов: 4-мМ L-глютамин, 10 нг/мл человеческий рекомбинантный эпидермальный фактор роста, 1×10 М этаноламин, 1×10М о-фосфорил-этаноламин, 5 мкг/мл трансферрин, 20 пМ трийодтиронин, 5 мкг/мл инсулин, 6,78 нг/мл селенистая кислота, 50 нг/мл аскорбат магния, 0,2 мкг/мл L-пролин, 0,1 мкг/мл глицин; 0,02 мкг/мл человеческая рекомбинантная длинная цепь ТФР-α, 0,0038 мкг/мл простагландина Е2 (ПГЕ2), 0,4 мкг/мл гидрокортизона. Среда продукции матрикса заменялась свежей средой продукции матрикса каждые 3-4 дня в течение 18 дней. В это время эндогенный клеточно-матричный конструкт формировался клетками.
Пример 16. Двухслойный конструкт кожи.
7
2
Конструкт кожи, имеющий слой фибробластов и слой кератиноцитов, сформировали в системе питательной среды с полностью определенным химическим составом. Фибробласты были засеяны снова из увеличивающихся культур, в которых фибробласты культивировались на микроносителях в биореакторах. Фибробласты были отфильтрованы, используя сито из нержавеющей стали, чтобы отделить фибробласты от микроносителей. Фильтрация удалила все микроносители и скопления клеток от суспензии клеток. Приблизительно 3,0×10 клеток были посеяны на 0,4 мкм пористые мембраны с поверхностью приблизительно 44 см, находящихся приблизительно в 140 мл матрикс продуцирующей среды с определенным химическим составом. Указанная плотность посева была при суперконфлюэнции.
Среда продукции матрикса с определенным химическим составом содержала:
Компонент
Концентрация
DMEM
96,0%
L-глутамин
1060 мг/л
Гидрокортизон
0,4 мг/л
Селенистая кислота
6,78 мкг/л
Этаноламин
0,1 мМ
о-фосфорил-этаноламин
14,0 мг/л
ЭФР
10,0 мкг/л
Mg Аскорбат
50 мг/л
L-пролин
213,6 мг/л
Глицин
101,4 мг/л
Длинноцепочечный ТФРα
10,0 мкг/л
Фибробласты культивировались в среде продукции матрикса в течение 11 дней с заменой питательной среды, производимой периодически каждые 3-4 дня.
6
На 11 день суспензия кератиноцитов была посеяна на поверхность клеточно-матричного конструкта в приблизительной плотности 3,3×10 клеток в среду, содержащую приблизительно:
Компонент
Концентрация
DМЕМ: среда Хэма F-12 3:1
96,10%
L-глутамин
1060 мг/л
Гидрокортизон
0,4 мг/л
Инсулин
5,0 мг/л
Трансферрин
5,0 мг/л
Трийодтиронин
13,5 нг/л
Компонент
Концентрация
Этаноламин
0,1 мМ
о-фосфорил-этаноламин
14,0 мг/л
Селенистая кислота
6,78 мкг/л
Аденин
24,4 мг/л
Mg Аскорбат
50,0 мг/л
Прогестерон
0,63 мкг/л
ЭФР
10,0 мкг/л
Длинноцепочечный ТФРα
10,0 мкг/л
Липидный концентрат
Арахидоновая кислота
0,004 мг/л
Холестерин
0,220 мг/л
DL-α-токоферол-ацетат
0,140 мг/л
Линолевая кислота
0,020 мг/л
Линоленовая кислота
0,020 мг/л
Миристиновая кислота
0,020 мг/л
Олеиновая кислота
0,020 мг/л
Пальмитиновая кислота
0,020 мг/л
Пальминовая кислота
0,020 мг/л
Pluronic<sup></sup> F-68
200,0 мг/л
Стеариновая кислота
0,020 мг/л
Tween<sup></sup> 80
4,4 мг/л
На 13 день было индуцировано дифференцирование добавлением среды дифференцирования, содержащей следующие компоненты:
Компонент
Концентрация
DМЕМ: среда Хэма F-12 3:1
96.3%
L-глутамин
1060 мг/л
Гидрокортизон
0,40 мг/л
Инсулин
5,0 мг/л
Трансферрин
5,0 мг/л
Трийодтиронин
13,5 нг/л
Селенистая кислота
0,00678 мг/л
Этаноламин
0,1 мМ
о-фосфорил-этаноламин
14,0 мг/л
Аденин
24,4 мг/л
Mg Аскорбат
50,0 мг/л
Прогестерон
0,63 мкг/л
CaCl2
265 мг/л
Липидный концентрат
Арахидоновая кислота
0,004 мг/л
Холестерин
0,220 мг/л
DL-α-токоферол-ацетат
0,140 мг/л
Линолевая кислота
0,020 мг/л
Линоленовая кислота
0,020 мг/л
Миристиновая кислота
0,020 мг/л
Олеиновая кислота
0,020 мг/л
Пальмитиновая кислота
0,020 мг/л
Пальминовая кислота
0,020 мг/л
Pluronic<sup></sup> F-68
200,0 мг/л
Стеариновая кислота
0,020 мг/л
Tween<sup></sup> 80
4,4 мг/л
На 15 день состав питательной среды был изменен, чтобы вызвать ороговение развивающегося слоя кератиноцитов в среде, содержащей приблизительно:
Компоненты
Концентрация
DMEM
48,0%
среда Хэма F-12
48,0%
L-глутамин
658 мг/л
Гидрокортизон
0,4 мг/л
Инсулин
5,0 мг/л
Трансферрин
5,0 мг/л
Трийодтиронин
13,5 нг/л
Этаноламин
0,1 мМ
о-фосфорил-этаноламин
14,0 мг/л
Селенистая кислота
6,78 мкг/л
Аденин
24,4 мг/л
Mg Аскорбат
50,0 мг/л
Длинноцепочечный ТФР-α
10,0 мкг/л
MEM раствор незаменимых аминокислот
L-аланин
1,78 мг/л
L-аспарагин
2,64 мг/л
L-аспарагиновая кислота
2,66 мг/л
L-глутаминовая кислота
2,94 мг/л
Глицин
1,5 мг/л
L-пролин
2,3 мг/л
L-серин
2,1 мг/л
Компоненты
Концентрация
MEM раствор витаминов
NaCl
17 мг/л
D-Ca пантотенат
0,2 мг/л
Хлорид холина
0,2 мг/л
Фолиевая кислота
0,2 мг/л
i-инозитол
0,4 мг/л
никотинамид
0,2 мг/л
Пиридоксаль HCl
0,2 мг/л
Рибофлавин
0,020 мг/л
Тиамин HCl
0,2 мг/л
Липидный концентрат
Арахидоновая кислота
0,004 мг/л
Холестерин
0,220 мг/л
DL-α-токоферол-ацетат
0,140 мг/л
Линолевая кислота
0,020 мг/л
Линоленовая кислота
0,020 мг/л
Миристиновая кислота
0,020 мг/л
Олеиновая кислота
0,020 мг/л
Пальмитиновая кислота
0,020 мг/л
Пальминовая кислота
0,020 мг/л
Pluronic<sup></sup> F-68
200,0 мг/л
Стеариновая кислота
0,020 мг/л
Tween<sup></sup> 80
4,4 мг/л
Среда для ороговения заменялась каждые 2-3 дня.
Конструкты кожи созревали и поддерживались от 22 до 35 дней, среду заменяли каждые 2-3 дня на свежую среду следующего состава:
Компоненты
Концентрация
DMEM
48,0%
Компоненты
Концентрация
среда Хэма F-12
48,0%
L-глутамин
658 мг/л
Гидрокортизон
0,4 мг/л
Инсулин
5,0 мг/л
Трансферрин
5,0 мг/л
Трийодтиронин
13,5 мкг/л
Этаноламин
0,1 мМ
о-фосфорил-этаноламин
14,0 мг/л
Селенистая кислота
6,78 мкг/л
Аденин
24,4 мг/л
Длинноцепочечный ТФР-α
10,0 мкг/л
MEM раствор незаменимых минокислот
L-аланин
1,78 мг/л
L-аспарагин
2,64 мг/л
L-аспарагиновая кислота
2,66 мг/л
L-глутаминовая кислота
2,94 мг/л
Глицин
1,5 мг/л
L-пролин
2,3 мг/л
L-серин
2,1 мг/л
MEM раствор витаминов
NaCl
17 мг/л
D-Ca пантотенат
0,2 мг/л
Хлорид холина
0,2 мг/л
Фолиевая кислота
0,2 мг/л
i-инозитол
0,4 мг/л
никотинамид
0,2 мг/л
Пиридоксаль HCl
0,2 мг/л
Рибофлавин
0,020 мг/л
Тиамин HCl
0,2 мг/л
Компоненты
Концентрация
Липидный концентрат
Арахидоновая кислота
0,004 мг/л
Холестерин
0,220 мг/л
DL-α-токоферол-ацетат
0,140 мг/л
Линолевая кислота
0,020 мг/л
Линоленовая кислота
0,020 мг/л
Миристиновая кислота
0,020 мг/л
Олеиновая кислота
0,020 мг/л
Пальминовая кислота
0,020 мг/л
Pluronic<sup></sup> F-68
0,020 мг/л
Стеариновая кислота
200,0 мг/л
Tween<sup></sup> 80
0,020 мг/л
Пальминовая кислота
4,4 мг/л
После полного формирования культивируемые конструкты кожи показали клеточно-матричный слой эндогенно произведенного внеклеточного матрикса и фибробласты с дифференцированным слоем кератиноцитов, расположенным на клеточно-матричном слое.
Пример 17. Изготовление коллагеновых материально-синтетических полимерных конструктов, с использованием связывающего раствора фиброина шелка.
Связывающие свойства очищенного ксеногенного слоя коллагена (например, "ИКЛ") были проверены на различных объектах. Более подробно, не имея намерение быть ограниченными следующими воплощениями, были проанализированы связывающие свойства между (а) двумя слоями ИКЛ; (b) по крайней мере одним слоем ИКЛ и по крайней мере одной полигидроксиалканол-(ПГА) основанной полимерной структурой и (с) по крайней мере одним слоем ИКЛ и по крайней мере одной полимерной цепочкой на основе ПГА. Подготовка образцов описана в следующих примерах:
(a) Высушенный монослойный ИКЛ был разрезан на лоскуты размером 1×2,5 см. Два лоскута ИКЛ были соединены с перекрывающимся размером 0,5 см, и политы раствором шелка между слоями. Нужно понимать, что размеры отрезанных лоскутов ИКЛ и перекрывающийся размер не ограничены вышеупомянутыми примерами.
(b) Полимерную структуру на основе ПГА опустили в раствор фиброина шелка на по крайней мере одну минуту, чтобы покрыть слой поверхности структуры тонким слоем раствора фиброина шелка. Лоскут ИКЛ (приблизительно 1,5×1,5 см) был затем присоединен к переднему концу структуры.
(c) Полимерную цепочку на основе ПГА опустили в раствор фиброина шелка на по крайней мере одну минуту, чтобы покрыть слой поверхности цеочки тонким слоем раствора фиброина шелка. Лоскут ИКЛ (приблизительно 1×1,5 см) был затем присоединен к цепочке.
Впоследствии все образцы были высушены при комнатной температуре в течение приблизительно 1,5 часов. Образцы были затем погружены в основанный на метаноле растворитель в течение 5-10 минут, и впоследствии высыхали в течение 10 минут. Вышеупомянутые образцы были пропитаны деминерализованной водой в течение по крайней мере 24 часов. Связывающие свойства, достигнутые раствором фиброина шелка, оценивались предоставлением механического напряжения образцам, используя процедуры, известные квалифицированному в области техники специалисту.
Не имея намерения быть ограниченным, нужно понимать, что, используя водный раствор фиброина шелка, связывание также может быть осуществлено, например, между ИКЛ и электроспряденным коллагеном, электроспряденным фибрином, материалами на основе металлов, керамическими материалами, тканеинженерными конструктами, синтетическими полимерными материалами и естественными материалами.
Пример 18. Изготовление многослойных клеточно-матричных конструктов с использованием связывающего раствора фироина шелка.
Чтобы сделать многослойные клеточно-матричные конструкты, однослойные клееточно-матричные конструкты были сначала удалены от культуры, ростовая и/или среда продукции матрикса были аспирированы, и конструктам было позволено высохнуть на воздухе по крайней мере, пока клетки не были девитализированы. Затем однослойные клеточно-матричные конструкты были регидратированы в 10 мл ВДИ в течение приблизительно 10 минут. Дополнительно и/или альтернативно, конструкты были регидратированы в 5 мл или подвергались воздействию приблизительно 0,5 мл приблизительно 8%-ного раствора шелка, и конструкты были наслоены вместе. Конструкты сушились в течение ночи и затем были опущены в 3 мл метанола в течение по крайней мере 10 минут. Вышеупомянутые стадии могут быть повторены, пока 5-слойные или более клеточно-матричные конструкты не будут сформированы. Как альтернатива, нужно понимать, что между слоями многослойных клеточно-матричных конструктов может быть добавлена трансглутаминаза. Дополнительно, после стадии обработки слоев 8%-ным раствором шелка, конструкты могут быть скручены, используя роллер. 5-слойные или более клеточно-матричные конструкты могут впоследствии быть лиофилизированными помещением конструктов в лиофилизатор на по крайней мере приблизительно 17 часов. Нужно понимать, что раствор шелка служит связывающим веществом для предотвращения деламинации слоистого конструкта.
Несмотря на то что настоящее изобретение было описано в некоторых деталях посредством иллюстраций и примеров в целях ясности и понимания, для квалифицированного специалиста очевидно, что определенные изменения и модификации могут практиковаться в рамках формулы изобретения.