ГУМАНИЗИРОВАННЫЕ АНТИТЕЛА С ПОВЫШЕННОЙ СТАБИЛЬНОСТЬЮ
HUMANISED ANTIBODIES WITH INCREASED STABILITY

Область изобретения
В настоящем изобретении предложены антитела, обладающие повышенной стабильностью. Изобретение включает антитела, способные связываться с полипептидами KIR3DL2. Указанные антитела пригодны для лечения расстройств, характеризующихся клетками, экспрессирующими KIR3DL2, в частности, CD4+ Т-клетками, в том числе злокачественных опухолей, например, фунгоидной гранулемы и синдрома Сезари, а также аутоиммунных расстройств, сопровождающихся экспрессией KIR3DL2.
ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
Настоящая заявка испрашивает приоритет согласно предварительной заявке США №61/953035, поданной 14 марта 2014 года, описание которой, включая чертежи, полностью включено в настоящий документ посредством ссылки.
ССЫЛКА НА СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
Настоящая заявка подана вместе со списком последовательностей в электронном формате. Список последовательностей представлен в виде файла с именем «KIR-5 PCT_ST25», созданного 11 марта 2015 года, размер которого составляет 49 КБ. Информация о списке последовательностей в электронном формате полностью включена в настоящий документ посредством ссылки.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Иммуноглобулин-подобные рецепторы киллеров (KIR) представляют собой семейство рецепторов, которые, наряду с рецепторами лектинов С-типа (CD94-NKG2), используются NK-клетками и субпопуляциями Т-лимфоцитов человека для специфического распознавания молекул МНС I класса. Некоторые ингибиторные и активаторные КИР обладают весьма сходными внеклеточными доменами и распознаются одними и теми же моноклональными антителами, например, и KIR2DL1, и KIR2DS1 распознаются ЕВ6, a 2DL2 и 2DS2-GL183. Три критерия (количество внеклеточных Ig-подобных доменов (домены D0, D1, D2), длина цитоплазматического хвоста, а также аналогия последовательности) используются для подразделения белков KIR на 13 групп, а именно KIR3DL1-2, KIR3DS1, KIR2DL1-5 и KIR2DS1-5. Номенклатура 2D для 2 доменов или 3D для 3 доменов обозначает количество Ig-подобных доменов; рецепторы с длинными или короткими цитоплазматическими доменами дополнительно классифицируются как L или S. (Pascal V. et al., 2007 J. Immunol. 179: 1625-1633). Ингибиторные рецепторы обладают длинными (L) цитоплазматическими хвостами (т.е. KIR2DL или KIR3DL), содержащими канонический мотив ITIM, который фосфорилируется по тирозину при взаимодействии KIR с их лигандами - HLA I класса. Фосфорилированный ITIM вербует протеинтирозинфосфатазы, содержащие домен гомологии Src 2, - фосфатазу 1, содержащую домен гомологии Src 2, и/или фосфатазу 2, содержащую домен гомологии Src 2, которые дефосфорилируют клеточные субстраты, тем самым блокируя сигнал активации NK, т.е. защищая клетки-мишени с соответствующей экспрессией МНС-аутоантигенов I класса. Рецепторы с короткими (S) цитоплазматическими хвостами (т.е. KIR2DS или KIR3DS) не содержат мотива ITIM. Трансмембранный домен этих активаторных KIR содержит заряженный остаток, облегчающий взаимодействие с сигнальной цепью KARAP/DAP12. Показано, что вовлечение рецепторов семейства KIR2DS приводит к каскаду KARAP/DAP12-опосредованных сигнальных событий, завершающихся увеличением цитолитической активности NK-клеток и продукции провоспалительных цитокинов, например, ИФН-τ (Pascal et al. 2007) J. Immunol. 179: 1625-1633). Зрелые NK-клетки потенциально получают по меньшей мере один ингибиторный рецептор, специфичный по отношению к аутоантигену МНС I класса, который, как правило, функционально преобладает среди потенциально аутореактивных активирующих молекул. Предполагается, что ответ NK-клеток представляет собой комплексный результат как активирующих, так и ингибирующих сигнальных путей, опосредованных KIR и другими рецепторами.
KIR3DL2 исследован в качестве мишени для лечения злокачественных опухолей, связанных с CD4+ Т-клетками, экспрессирующими рецепторы KIR3DL2, в частности, CD4+ Т-клетками, в том числе таких злокачественных опухолей, как фунгоидная гранулема и синдром Сезари (см., например, публикации РСТ WO 2010/081890 и WO 02/50122). Лиганд KIR3DL2, HLA-В27, тесно связан со спондилоартритами (SpA), группой тяжелых воспалительных артрогенных расстройств, типичным примером которых является анкилозирующий спондилит (АС). Лигирование KIR3DL2 димерами В27 способствует выживанию субпопуляций Th17 и NK-клеток (Bowness, et al. (2011) Journal of immunology 186: 2672-2680; Chan, et al. (2005) Arthritis Rheum 52: 3586-3595). Показано, что пациентов с SpA повышена доля патогенных субпопуляций Th17 и NK-клеток, экспрессирующих KIR3DL2. Исследования убедительно показывают, что взаимодействие KIR3DL2-B27 играет центральную роль в SpA, и что KIR3DL2 является перспективной терапевтической мишенью.
Сообщалось о существовании антител против различных KIR3D-полипептидов. Сообщалось о существовании двух антител против KIR3DL2: Q241 и Q66 (Pende, et al. (1996) J Exp Med 184: 505-518). Однако эти два антитела принадлежат к изотипу IgM (являются пентамерами) и не особенно подходят для фармацевтического применения; кроме того, если их вариабельные области располагаются в форме, характерной для двухвалентного антитела типа IgG, их ожидаемое сродство является низким. Сообщалось, что клетки под названием «AZ158» продуцируют еще одно антитело (Parolini, S., et al. (2002) In Leucocyte typing VII. D. Mason, editor. Oxford University Press, Oxford. 415-417; публикация РСТ WO 2010/081890). Антитело 5.133 можно получить в Miltenty Biotech (Оберн, штат Калифорния, США). Антитела AZ158 и 5.133 связывают KIR3DL2, а также KIR3DL1 (и, кроме того, высокогомологичный KIR3DS1). Как KIR3DL2, так и KIR3DL1 характеризуются относительно высокой идентичностью аминокислотных последовательностей, и различные HLA-лиганды, связывающиеся с KIR3DL2, также распознаются KIR3DL1. Несмотря на иммунизацию, позволившую получить AZ158, Q241 и Q66, существует потребность в улучшенных антителах для терапевтического и другого применения.
Сущность изобретения
В одном из аспектов предложены антитела против KIR3DL2 с каркасными областями человека, которые обладающие как высокой степенью сродства связывания с антигеном, так и стабильностью в фармацевтических составах. Авторы настоящего изобретения разработали антитела с различными каркасными структурами человека как на основе одного гена, так и мозаичных генов, и обнаружили, что некоторые аминокислоты в положениях 39 тяжелой цепи и 38 легкой цепи (Abnum) обладают существенно повышенной физической стабильностью.
Разработаны типичные антитела с использованием антигенсвязывающих областей антител 2В12 и 10G5. CDR антител 2В12 и 10G5 описаны в заявке РСТ номер РСТ/ЕР 2013/069302, поданной 17 сентября 2013 г. Моноклональные антитела 2В12 и 10G5 против KIR3DL2 имеют выгодное свойство не связываться с близкородственным (по гомологии) рецептором KIR3DL1 и не вызывать интернализацию KIR3DL2. Интернализация KIR3DL2 сильно затрудняет подходы на основе ADCC. Антитела способны опосредовать ADCC в случае их принадлежности к соответствующему изотипу (например, IgG1), а также способны ингибировать взаимодействие KIR3DL2-димер HLA В27 с KIR3DL2. Следует отметить, что блокада лиганда может достигаться без интернализации рецептора. Таким образом, антитела, блокирующие один или несколько природных лигандов KIR3DL2, хорошо подходят для лечения или профилактики воспалительных заболеваний в формате истощающих или неистощающих мАт. Выявлены эпитопы KIR3DL2, связываемые указанными антителами, поскольку антитела 10G5 и 2В12 теряют способность связываться с мутантами KIR3DL2, содержащими замены в положениях I60 и G62. Кроме того, антитело 10G5 теряет способность связываться к мутантами KIR3DL2, содержащими замены в положениях Р14, S15 и Н23, а также положениях R13, А25 и Q27. Антитела конкурируют друг с другом за связывание с полипептидами KIR3DL2 в нативной конфигурации, экспрессируемой на поверхности клеток.
В одном варианте реализации настоящего изобретения предложено гуманизированное антитело 2В12 или 10G5. В одном варианте реализации настоящего изобретения предложено гуманизированное антитело 2В12 или 10G5. c мозаичным каркасом легкой цепи и/или тяжелой цепи человека. Предложены типичные остатки или последовательности области, определяющей комплементарность (CDR) и/или сайты аминокислотных замен в каркасной области (FR) таких гуманизированных антител с улучшенными свойствами, например, пониженной иммуногенностью, улучшенным связыванием антигена или другими функциональными свойствами, и/или улучшенными физико-химическими свойствами, например, улучшенной стабильностью. В одном варианте реализации последовательность каркасной области человека содержит обратную мутацию.
Каркасные и вариабельные области, предложенные в настоящем документе, придают 2В12 и 10G5 высокую физическую стабильность и низкую склонность к агрегации в условиях, характерных для фармацевтических составов. В частности, предложены антитела, содержащие антигенсвязывающие области антител 2В12 или 10G5 с каркасными областями, в основном характерными для человека, причем тяжелая цепь антитела содержит глутамин (Q) в положении 39, а легкая цепь - глутамин в положении 38 (нумерация Abnum). Безотносительно к теоретическим представлениям, считается, что при наличии глутамина в положении 38 легкой цепи (нумерация Abnum) возникают Н-связи между VH_Q39 и VL_Q38 (см. фигуру 1), что приводит к повышению физической стабильности антитела. Эти две Н-связи могут стабилизировать четвертичную структуру мАт, предотвращая экспозицию гидрофобных участков, ответственных за агрегацию белка.
В одном варианте реализации антитело содержит акцепторные каркасные области VH и VL человека, причем тяжелая цепь антитела содержит остаток глутамина в положении 39, а легкая цепь - остаток глутамина в положении 38. Акцепторные каркасные области VH и VL человека могут содержать обратную мутацию (например, одну, две, три или четыре или более аминокислотные замены на соответствующий донорный остаток в одной или нескольких каркасных областях) по сравнению с природной акцепторной каркасной областью человека. Антитело необязательно связывается с тем же эпитопом, что и антитела 2В12 или 10G5.
В одном варианте реализации антитело содержит каркасные области тяжелой цепи 1 (FW1) и 2 (FW2), происходящие от подгруппы VH7 человека. Антитело необязательно содержит каркасную область тяжелой цепи 3 (FW3), происходящую от подгруппы VH7 человека. Антитело необязательно содержит каркасную область тяжелой цепи 4 (FW4), происходящую от подгруппы JH6. В одном варианте реализации антитело содержит акцепторные каркасные области легкой цепи подгруппы VK1 и/или VK4, необязательно в комбинации с подгруппой VK4. Антитело необязательно содержит FW1 легкой цепи, происходящую от подгруппы VK1 человека, и FW2 легкой цепи и FW3 легкой цепи, происходящие от подгруппы VK4 человека. Антитело необязательно содержит FW4 легкой цепи, происходящую от подгруппы JK4.
В одном варианте реализации предложено выделенное моноклональное антитело, связывающее KIR3DL2 и содержащее тяжелую цепь, содержащую CDR1, 2 и 3 тяжелой цепи антитела 2В12 и акцепторную каркасную область тяжелой цепи человека подгруппы VH7 человека, необязательно в комбинации с подгруппой JH6, и легкую цепь, содержащую CDR1, 2 и 3 легкой цепи антитела 2В12 и акцепторную каркасную область легкой цепи человека подгруппы VK1 и/или VK4, необязательно в комбинации с подгруппой JK4. В одном варианте реализации каркасные области тяжелой цепи содержат одну или более обратных мутаций. В одном варианте реализации каркасные области легкой цепи содержат одну или более обратных мутаций. В одном варианте реализации каркасные области тяжелой цепи содержат (совместно) одну, две или три обратные мутации. В одном варианте реализации каркасные области легкой цепи содержат (совместно) одну или две обратные мутации.
В одном варианте реализации антитело содержит тяжелую цепь, содержащую CDR1, 2 и 3 тяжелой цепи антитела 2В12 и акцепторную каркасную область тяжелой цепи человека, причем каркасные области 1 (FW1) и 2 (FW2) происходят от подгруппы VH7 человека. Каркасная область 3 (FW3) необязательно происходит от подгруппы VH7 человека. Каркасная область 4 (FW3) необязательно происходит от подгруппы JH6. Антитело необязательно содержит тяжелую цепь, содержащую CDR1, 2 и 3 тяжелой цепи антитела 2В12 и акцепторную каркасную область тяжелой цепи человека, причем каркасные области 1 (FW1) и 2 (FW2) происходят от подгруппы VH7 человека. FW1 легкой цепи необязательно происходит от подгруппы VK1 человека, a FW2 легкой цепи и FW3 легкой цепи происходят от подгруппы VK4 человека. FW4 легкой цепи необязательно происходит от подгруппы JK4. В одном варианте реализации каркасные области тяжелой цепи содержат одну или более обратных мутаций. В одном варианте реализации каркасные области легкой цепи содержат одну или более обратных мутаций. В одном варианте реализации каркасные области тяжелой цепи содержат (совместно) одну, две или три обратные мутации. В одном варианте реализации каркасные области легкой цепи содержат (совместно) одну или две обратные мутации.
В одном варианте реализации ген подгруппы VH7 представляет собой IGHV7-4 (например, IGHV7-4-1* 02, ген, кодирующий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 53). В одном варианте реализации ген подгруппы VK1 представляет собой IGKV1-39, например, ген, кодирующий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 44. В одном варианте реализации ген подгруппы VK4 представляет собой IGKV4-1, например, ген, кодирующий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 45.
В одном варианте реализации предложено выделенное моноклональное антитело, связывающее KIR3DL2 и содержащее тяжелую цепь, содержащую CDR1, 2 и 3 тяжелой цепи антитела 10G5 и акцепторную каркасную область тяжелой цепи человека, происходящую от подгруппы VH1 человека (например, IGHV1-46), и легкую цепь, содержащую CDR1, 2 и 3 легкой цепи антитела 10G5 и акцепторную каркасную область легкой цепи человека, происходящую от подгруппы VK1 (например, IGKV1-NL1). В одном варианте реализации каркасные области тяжелой цепи содержат одну или более обратных мутаций. В одном варианте реализации каркасные области легкой цепи содержат одну или более обратных мутаций.
В одном варианте реализации антитело содержит акцепторную каркасную область тяжелой цепи человека подгруппы VH1 и/или VH7 в комбинации с подгруппой JH6 и акцепторную каркасную область легкой цепи человека подгруппы VK1 и/или VK4 в комбинации с подгруппой JK4.
В еще одном аспекте изобретения предложено выделенное гуманизированное антитело, связывающее полипептид KIR3DL2 человека и содержащее CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3; остаток глутамина (Q) в положении 39 VH-домена и остаток глутамина в положении 38 VL-домена. Остаток глутамина (Q) в положении 39 может существовать в естественной последовательности каркасной области VH человека или может быть введен посредством аминокислотной замены или другой модификации последовательности.
В одном варианте реализации предложено гуманизированное антитело, содержащее CDR1, 2 и 3 тяжелой и легкой цепи антитела 2В12 или 10G5. В одном варианте реализации предложено антитело, содержащее акцепторную каркасную область человека, связывающее полипептид KIR3DL2 без существенного связывания с полипептидом KIR3DL1, причем указанное антитело содержит CDR1, 2 и 3 тяжелой и легкой цепи антитела 2В12 или 10G5, и одна или более из каркасных областей человека содержит аминокислотную замену. Замена необязательно является обратной мутацией. Замена необязательно является заменой, описанной в настоящем документе. Тяжелая цепь антитела необязательно содержит глутамин в положении 39, а легкая цепь - глутамин в положении 38.
В одном аспекте предложено гуманизированное моноклональное антитело 2В12, содержащее:
(a) CDR 1, 2 и 3 тяжелой цепи (HCDR1, HCDR2, HCDR3), содержащие последовательность SEQ ID NOS: 18 (HCDR1), SEQ ID NOS: 19 (HCDR2) и SEQ ID NO: 20 (HCDR3), соответственно, и
(b) CDR 1, 2 и 3 легкой цепи (LCDR1, LCDR2, LCDR3), содержащие последовательность SEQ ID NO: 21, 22 и 23, соответственно. Антитело необязательно содержит акцепторную каркасную область тяжелой цепи человека подгруппы VH1 и/или VH7 в комбинации с подгруппой JH6 и акцепторную каркасную область легкой цепи человека подгруппы VK1 и/или VK4 в комбинации с подгруппой JK4. Акцепторные каркасные области легкой и/или тяжелой цепи человека необязательно содержат замену (например, обратную мутацию).
В любом варианте реализации антитела 2В12, описанном в настоящем документе, каркасная область тяжелой цепи необязательно может содержать одну или несколько замен в положении(ях), выбранном(ых) из группы, состоящей из: остатков 2, 38, 39, 40, 43, 48, 68, 72с, 9 и 108 (нумерация Abnum), включая любые их комбинации. В любом варианте реализации антитела 2В12, описанном в настоящем документе, каркасная область легкой цепи необязательно содержит одну или несколько замен в положении(ях), выбранном(ых) из группы, состоящей из: остатков 3, 8, 9, 21, 43, 71, 78 и 104 (нумерация Abnum), включая любые их комбинации. В одном варианте реализации замена(ы) является обратной мутацией.
В одном варианте реализации предложено гуманизированное моноклональное антитело 2В12, содержащее:
(a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 2В12-Н0, -H1, -Н2, -Н3 и -Н4; и
(b) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 2B12-L0, -LI, -L2, -L3 и -L4.
В одном варианте реализации предложено гуманизированное моноклональное антитело 2В12, содержащее:
(a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOS: 29-33, и
(b) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOS: 24-28.
В одном варианте реализации предложено гуманизированное моноклональное антитело 2В12, содержащее:
(a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID N: 29, и
(b) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID N: 24.
В одном варианте реализации предложено гуманизированное моноклональное антитело 2В12, содержащее:
(a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID N: 31, и
(b) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25.
В одном варианте реализации предложено гуманизированное моноклональное антитело 2В12, содержащее:
(a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31, и
(b) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26.
В одном варианте реализации предложено гуманизированное моноклональное антитело 2В12, содержащее:
(a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32, и
(b) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26.
В одном варианте реализации предложено гуманизированное моноклональное антитело 2В12, содержащее:
(a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33, и
(b) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26.
В одном варианте реализации вариабельная область тяжелой цепи содержит одну или более обратных мутаций в одной, двух, трех или четырех из ее каркасных областей. В одном варианте реализации вариабельная область легкой цепи содержит одну или более обратных мутаций в одной, двух, трех или четырех из ее каркасных областей.
В одном аспекте предложен фармацевтически приемлемый и активный состав, содержащий (а) от приблизительно 0,05 мг/мл до приблизительно 10 мг/мл IgG-антитела, содержащего тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 2В12-Н0, -H1, -Н2, -Н3 и -Н4; и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 2B12-L0, -L1, -L2, -L3 и - L4; (b) буферную систему, например, фосфат натрия, цитрат натрия, борат натрия; (с) изотонический агент, необязательно NaCl; и (d) полисорбат 80, при рН от 6,5 до 8, необязательно приблизительно 7,4. В одном аспекте предложен фармацевтически приемлемый и активный состав, содержащий (а) от приблизительно 0,05 мг/мл до приблизительно 10 мг/мл антитела; (b) приблизительно 10 мМ буфер, например, фосфат натрия, цитрат натрия, борат натрия; (с) изотонический агент, необязательно приблизительно 9 мг/мл NaCl; и (d) полисорбат 80, при рН от 6,5 до 8, необязательно приблизительно 7,4.
В одном аспекте предложено гуманизированное моноклональное антитело 10G5, содержащее:
(a) CDR 1, 2 и 3 тяжелой цепи (HCDR1, HCDR2, HCDR3), содержащие последовательность SEQ ID NO: 2 (HCDR1), SEQ ID NO: 3 (HCDR2) и SEQ ID NO: 4 (HCDR3), соответственно, и
(b) CDR 1, 2 и 3 легкой цепи (LCDR1, LCDR2, LCDR3), содержащие последовательность SEQ ID NO: 5, 6 и 7, соответственно. Антитело необязательно содержит акцепторную каркасную область тяжелой цепи человека подгруппы VH1 в комбинации с подгруппой JH6 и акцепторную каркасную область легкой цепи человека подгруппы VK1 в комбинации с подгруппой JK2. Антитело необязательно содержит тяжелую цепь, содержащую акцепторную каркасную область человека, содержащую замену (например, обратную мутацию).
В любом варианте реализации антитела 10G5, описанном в настоящем документе, каркасная область тяжелой цепи необязательно может содержать одну или несколько замен в положении(ях), выбранном(ых) из группы, состоящей из: остатков 5, 11, 12, 13, 20, 38, 40, 48, 66, 67, 69, 71, 72а и 75 (нумерация Abnum), включая любые их комбинации. В любом варианте реализации антитела 10G5, описанном в настоящем документе, каркасная область легкой цепи необязательно содержит одну или несколько замен в положении(ях), выбранном(ых) из группы, состоящей из: остатков 17, 18, 40, 45, 48, 70, 76 и 100 (нумерация Abnum), включая любые их комбинации. В одном варианте реализации замена(ы) является обратной мутацией.
В одном варианте реализации предложено гуманизированное моноклональное антитело 10G5, содержащее:
(a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 10G5-H0, -H1, -Н2, -Н3, -Н4, -Н5 и -Н6; и
(b) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 10G5-L0, -L1, -L2, -L3, -L4 и -L5.
В одном варианте реализации предложено гуманизированное моноклональное антитело 10G5, содержащее:
(a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOS: 13-17, и
(b) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOS: 8-12.
В одном варианте реализации предложено гуманизированное моноклональное антитело 10G5, содержащее:
(a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, и
(b) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8.
В одном варианте реализации предложено гуманизированное моноклональное антитело 10G5, содержащее:
(a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, и
(b) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9.
В одном варианте реализации предложено гуманизированное моноклональное антитело 10G5, содержащее:
(a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, и
(b) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9.
В одном аспекте предложен фармацевтически приемлемый и активный состав, содержащий (а) от приблизительно 0,05 мг/мл до приблизительно 10 мг/мл IgG-антитела, содержащего тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 10G5-H0, -H1, -Н2, -Н3, -Н4, -Н5 и -Н6; и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 10G5-L0, -L1, -L2, -L3, -L4 и - L5; (b) буферную систему, например, фосфат натрия, цитрат натрия, борат натрия; (с) изотонический агент, необязательно NaCl; и (d) полисорбат 80, при рН от 6,5 до 8, необязательно приблизительно 7,4. В одном аспекте предложен фармацевтически приемлемый и активный состав, содержащий (а) от приблизительно 0,05 мг/мл до приблизительно 10 мг/мл антитела; (b) приблизительно 10 мМ буфер, например, фосфат натрия, цитрат натрия, борат натрия; (с) изотонический агент, необязательно приблизительно 9 мг/мл NaCl; и (d) полисорбат 80, при рН от 6,5 до 8, необязательно приблизительно 7,4.
В одном варианте реализации антитела связываются с 1, 2, 3, 4 или 5 аллелями полипептидов KIR3DL2 *002, *003, *005, *007, и/или *008. Антитела необязательно обладают ЕС50 не более 5 мкг/мл, необязательно не более 3 мкг/мл, не более 2 мкг/мл, не более 1 мкг/мл или не более 0,5 мкг/мл для связывания с клетками, модифицированными с целью экспрессии конкретного аллеля KIR3DL2 на их поверхности (например, аллелей *001, *002, *003, *005, *007 и/или *008). В одном аспекте предложены антитела, связывающие полипептид KIR3DL2 в лиганд (HLA)-связывающей области (например, HLA-связывающем кармане) или по меньшей мере частично в HLA-связывающей области белка KIR3DL2.
В одном аспекте предложены антитела, связывающие эпитоп, содержащий остатки 160 и/или G62 (по отношению к SEQ ID NO: 1), и/или антитела, обладающие пониженным связыванием с полипептидом KIR3DL2, содержащим мутацию остатков 160 и/или G62 (по отношению к SEQ ID NO: 1, например, I60N, G62S). В одном аспекте предложены антитела, связывающие эпитоп, содержащий остатки R13, А25 и/или Q27 полипептида KIR3DL2 и/или обладающие пониженным связыванием с полипептидом KIR3DL2, содержащим мутацию остатков R13, А25 и/или Q27 (по отношению к SEQ ID NO: 1). Например, антитело может обладать пониженным связыванием с полипептидом KIR3DL2, содержащим мутации R13W, А25Т и/или Q27R. Указанный эпитоп дополнительно или в качестве альтернативы необязательно содержит один или несколько из остатков Р14, S15 и/или Н23 (по отношению к SEQ ID NO: 1), и/или антитела, обладающие пониженным связыванием с полипептидом KIR3DL2, содержащим мутацию остатков Р14, S15 и/или Н23 (по отношению к SEQ ID NO: 1, например, P14S, S15A, H23S).
В других аспектах изобретения предложены фармацевтические композиции, содержащие такие агенты и носитель, а также конъюгаты, содержащие такие агенты, конъюгированные, например, с цитотоксическим или обнаруживаемым агентом. В других аспектах изобретения предложены нуклеиновые кислоты и векторы, кодирующие такие агенты, и клетки-хозяева, содержащие такие нуклеиновые кислоты и/или векторы. Кроме того, предложены рекомбинантные способы продукции агентов путем культивирования таких клеток-хозяев, приводящего к продукции нуклеиновых кислот. В других аспектах изобретения предложены промышленные изделия, содержащие контейнер, содержащий такие агенты и инструкции, помогающие пользователю лечить расстройство, например, рак или аутоиммунное заболевание, у пациента. Изделие необязательно может содержать еще один контейнер, содержащий еще один агент, причем инструкции помогают пользователю лечить расстройство с применением антитела в комбинации с агентом. В настоящем изобретении предложены способы применения агентов согласно настоящему изобретению при лечении расстройств, например, рака, воспалительного заболевания или аутоиммунного расстройства, у пациента, необязательно в комбинации с еще одним противораковым или противовоспалительным агентом.
Эти и дополнительные выгодные аспекты и особенности изобретения могут быть дополнительно описаны в другом месте настоящего документа.
Краткое описание чертежей
На фигуре 1 показано моделирование структуры антитела, показывающее, что при наличии глутамина в положении 38 легкой цепи и положении 39 тяжелой цепи могут возникать Н-связи между VH_Q39 и VL_Q38, что может объяснить повышенную физическую стабильность таких антител.
На фигуре 2 показаны кривые выживания мышей СВ17-ТКИН после в/в трансплантации 5М клеток Raji-KIR3DL2 high, в/б обработанных антителом 2B12-H2L1, в зависимости от дозы (n=8/группу). Лечение начинали в день 1. Эксперимент окончили через 58 дней
Подробное описание изобретения
Введение
Антитела согласно настоящему описанию могут непосредственно и специфически воздействовать на KIR3DL2-экспрессирующие клетки, особенно CD4+, KIR3DL2+ Т-клетки, без адресного воздействия на другие клетки, например, KIR3DL1+-клетки (или KIR3DL2+KIR3DL1+-клетки, KIR3DS1+-клетки; или KIR3DS1 KIR3DL2+-клетки) и не интернализироваться в KIR3DL2+-клетки. Кроме того, предложены антитела, ингибирующие связывание природных лигандов KIR3DL2 (или лиганд-индуцированные сигнальные пути KLR3DL2). В настоящем описании предложены антитела, обладающие такими свойствами и конкурирующие друг с другом за связывание с областью KIR3DL2+, включающей домены 0, заданные аминокислотными остатками 1-98 зрелых полипептидов KIR3DL2, соответствующими SEQ ID NO: 1.
2
KIR3DL2 (CD158k) представляет собой дисульфид-связанный гомодимер из трех Ig-доменов размером приблизительно 140 кДа, описанных в статье Pende et al. (1996) J. Exp. Med. 184: 505-518, содержание которой включено в настоящий документ посредством ссылки. KIR3DL1 (CD158e1) представляет собой мономерную молекулу размером приблизительно 70 кДа, описанную в работе Colonna and Samaridis (1995) Science 268 (5209), 405-408; HLA-связывающий карман описан в статье Vivian et al. (2011) Nature 479: 401-405. Природные лиганды KIR3DL2 включают, в числе прочего, полипептиды HLA-A и HLA-B, особенно HLA-A3 и HLA-A11 (см. Hansasuta и др. (2004) Eur. J. Immunol. 34: 1673-1679 и HLA-B27. HLA-B27 (см., например, Weiss et al. (1985) Immunobiology 170(5): 367-380 для получения сведений об организации, последовательности и экспрессии гена HLA-B27; для получения сведений о мультимерах HLA-В27 и гомодимерах HLA-B27 см. статью Allen et al. (1999) J. Immunol. 162: 5045-5048 и Kollnberger et al. (2007) Eur. J. Immunol. 37: 1313-1322. В настоящем документе «KIR3D» относится к любому рецептору KIR3D (например, KIR3DL1, KIR3DL2, KIR3DS1) по отдельности или совместно, и термин «KIR3D» можно заменить термином «KIR3DL1, KIR3DL2 и/или KIR3DS1». Аналогично, «KIR3DL» относится к любому рецептору KIR3DL (например, K1R3DL1, KIR3DL2) по отдельности или совместно, и термин «KIR3DL» можно заменить термином «KIR3DL1 и/или K1R3DL2». Более того, каждый из терминов "KIR3D", "KIR3DL", "KIR3DL1", "KIR3DL2", "KIR3DS1" включает любой вариант, производное или изоформу гена KIR3D или кодируемый(е) белок/белки, к которым они относятся. Для полипептидов KIR3D зарегистрировано несколько аллельных вариантов (например, KIR3DL2), каждый из которых охвачен соответствующими терминами. Аминокислотная последовательность зрелого KIR3DL2 человека (аллель *002) показана в SEQ ID NO: 1, соответствующей последовательности с номером доступа ААВ52520 в Genbank, не содержащей лидерной последовательности из 21 аминокислотного остатка, и соответствующей последовательности с номером доступа KIR00066 в базе данных IPD KIR (опубликовано EMBL-EBI, Европейский институт биоинформатики, Великобритания).
SEQ ID NO: 1
кДНК KIR3DL2 (аллеля *002) показана в последовательности с номером доступа в Genbank U30272. Аминокислотная последовательность предшественника (включая лидерную последовательность) аллеля *002 KIR3DL2 человека показана в последовательности с номером доступа ААВ52520 в Genbank. Аминокислотная последовательность аллеля *001 KIR3DL2 человека показана в последовательности с номером доступа KIR00065 в базе данных IPD KIR. Аминокислотная последовательность аллеля *003 KIR3DL2 человека показана в последовательности с номером доступа ААВ36593 в Genbank и в последовательности с номером доступа KIR00067 в базе данных IPD KIR. Аминокислотная последовательность аллеля *004 KIR3DL2 человека показана в последовательности с номером доступа KIR00068 в базе данных IPD KIR. Аминокислотная последовательность аллеля *005 KIR3DL2 человека показана в последовательности с номером доступа KIR00069 в базе данных IPD KIR. Аминокислотная последовательность аллеля *006 (зрелого) KIR3DL2 человека показана в последовательности с номером доступа AAK30053 в Genbank и в последовательности с номером доступа KIR00070 в базе данных IPD KIR. Аминокислотная последовательность аллеля *007 (зрелого) KIR3DL2 человека показана в последовательности с номером доступа AAK30052 в Genbank и в последовательности с номером доступа KIR00071 в базе данных IPD KIR. Аминокислотная последовательность аллеля *008 KIR3DL2 человека показана в последовательности с номером доступа AAK30054 в Genbank и в последовательности с номером доступа KIR00072 в базе данных IPD KIR. Аминокислотная последовательность аллеля *009 KIR3DL2 человека показана в последовательности с номером доступа KIR00457 в базе данных IPD KIR. Аминокислотная последовательность аллеля *011 KIR3DL2 человека показана в последовательности с номером доступа KIR00544 в базе данных IPD KIR. кДНК, кодирующая полипептид KIR3DL1 (CD158e2) (аллель *00101), показана в последовательности с номером доступа L41269 в Genbank; кодируемая аминокислотная последовательность показана в последовательности с номером доступа ААА69870 в Genbank. При наличии лидерной последовательности в конкретной SEQ ID NO, описывающей полипептидную последовательность KIR3DL2, упоминания положений аминокислотных остатков в настоящем документе относятся к зрелому полипептиду KIR3DL. Каждая из записей базы данных с вышеуказанными номерами доступа включена в настоящий документ посредством ссылки.
Предложены способы применения антиген-связывающих соединений; например, способ ингибирования пролиферации или активности клеток, доставки молекулы в клетку (например, токсичного соединения, обнаруживаемого маркера и т.д.), для адресного воздействия, выявления или очистки клеток, для истощения, уничтожения или ликвидации клеток, для снижения пролиферации клеток, способ, включающий воздействие на клетку, например, Т-клетку, экспрессирующую полипептид KIR3DL2, антигенсвязывающего соединения согласно настоящему описанию, связывающего полипептид KIR3DL2. Следует принимать во внимание, что для целей настоящего описания термин «пролиферация клеток» может относиться к любому аспекту роста или пролиферации клеток, например, росту клеток, делению клеток или любому аспекту клеточного цикла. Клетка может находиться в клеточной культуре ((in vitro) или в организме млекопитающего (in vivo), например, млекопитающего, страдающего от патологии, сопровождающейся экспрессией KIR3DL2. Кроме того, предложен способ индукции гибели клетки или ингибирования пролиферации или активности клетки, экспрессирующей полипептид KIR3DL2, включающий воздействие на клетку антигенсвязывающего соединения, связывающего полипептид KIR3DL2 и связанного с токсическим агентом, в количестве, эффективном для индукции гибели и/или ингибирования пролиферации или активности клетки. Таким образом, предложен способ лечения млекопитающего, страдающего от пролиферативного заболевания и любого состояния, характеризующегося патологическим размножением или активацией клеток, экспрессирующих полипептид KIR3DL2, причем указанный способ включает введение фармацевтически эффективного количества антигенсвязывающего соединения, описанного в настоящем документе, млекопитающему. Примеры таких состояний включают синдром Сезари, фунгоидную гранулему, CTCL, периферическую Т-клеточную лимфому, орто-висцеральную внеузловую PTCL (например, НК/Т-лимфому или Т-клеточную лимфому, ассоциированную с энтеропатией (ЕАТС)), анапластическую крупноклеточную лимфому (ALCL), PTCL-NOS (без дополнительных уточнений) и аутоиммунные или воспалительные состояния, например, артрит, анкилозирующий спондилит, сердечно-сосудистые заболевания.
Предложены способы получения и применения антител и других соединений, пригодных для лечения расстройств (например, раковых заболеваний, воспалительных и аутоиммунных расстройств), при которых целесообразно устранение клеток, экспрессирующих KIR3DL2. В рамки настоящего изобретения входят антитела, производные антител, фрагменты антител и клетки, продуцирующие их, а также способы их получения и способы лечения пациентов с применением указанных антител и соединений.
Поскольку данные антитела специфичны по отношению к KIR3DL2, их можно применять для различных целей, в том числе очистки клеток, экспрессирующих KIR3DL2 или KIR3DL2, модуляции (например, активации или ингибирования) рецепторов KIR3DL2 in vitro, ex vivo или in vivo, адресное воздействие на клетки, экспрессирующие KIR3DL2, с целью их уничтожения in vivo, или специфическое мечение/связывание KIR3DL2 in vivo, ex vivo или in vitro, в том числе для таких способов, как иммуноблоттинг, иммуногистохимический анализ, т.е. в замороженных биоптатах, FACS-анализ и иммунопреципитация.
Определения
В настоящем описании формы единственного числа могут означать один или более определяемых объектов. Использование форм единственного числа в формуле изобретения в сочетании со словом «содержащий» может означать один или более одного определяемого объекта. В настоящем документе термин «еще один» может означать по меньшей второй или более отдаленный по порядку.
Термин «содержащий» необязательно можно заменять термином «состоящий главным образом из» или «состоящий из».
В настоящем документе термины «рак» и «опухоль» определяются как новый рост клеток или тканей, включающий их неконтролируемое и прогрессирующее размножение. В конкретном варианте реализации при естественном ходе событий рак приводит к смерти. В конкретных вариантах реализации рак является инвазивным, метастатическим и/или анапластическим (потеря дифференцировки и ориентации по отношению друг к другу и осевому расположению).
«Аутоиммунные» расстройства включают любое расстройство, состояние или заболевание, при котором иммунная система поддерживает реакцию против собственных клеток или тканей из-за сбоя способности различать «свое» и «не свое» или иным образом. Примеры аутоиммунных расстройств включают ревматоидный артрит, ревматический васкулартрит, системную красную волчанку, рассеянный склероз, гранулематоз Вегенера, спондилоартрит и др. «Воспалительное расстройство» включает любое расстройство, характеризующееся нежелательным иммунным ответом. Аутоиммунные и воспалительные расстройства могут вовлекать любой компонент иммунной системы, и могут поражать клетки или ткани любого типа в организме.
L
H
В настоящем описании термин «антитело» относится к поликлональным и моноклональным антителам. В зависимости от типа константного домена тяжелых цепей антитела относятся к одному из пяти основных классов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM. Некоторые из них далее подразделяются на подклассы или изотипы, например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 и т.п. Типичная структурная единица иммуноглобулина (антитела) включает тетрамер. Каждый тетрамер состоит из двух идентичных пар полипептидных цепей, причем каждая пара содержит одну «легкую» (приблизительно 25 кДа) и одну «тяжелую» цепь (приблизительно 50-70 кДа). N-концевой фрагмент каждой цепи содержит вариабельную область из приблизительно 100-110 аминокислот, главным образом отвечающих за распознавание антигена. Термины «вариабельная область легкой цепи» (V) и «вариабельная область тяжелой цепи» (V) относятся к указанным легкой и тяжелой цепям, соответственно. Константные домены тяжелой цепи, соответствующие различным классам иммуноглобулинов, называются «альфа», «дельта», «эпсилон», «гамма» и «мю», соответственно. Хорошо известны субъединичная структура и трехмерная конфигурация различных классов иммуноглобулинов. IgG и/или IgM являются предпочтительным классами антител, используемыми в настоящем изобретении, причем IgG являются особенно предпочтительными, поскольку они являются наиболее распространенными антителами в физиологических условиях, и их проще всего получить в лабораторных условиях. Антитело предпочтительно является моноклональным антителом. Особенно предпочтительными являются гуманизированные, химерные антитела, антитела человека или антитела, подходящие для человека по иным причинам. Термин «антитело» также включает любой фрагмент или производное любого из антител, описанных в настоящем документе.
Термин «специфически связывается с» означает, что антитело может предпочтительно связываться при анализе конкурентного связывания с партнером по связыванию, например, KIR3DL2, согласно оценке с использованием рекомбинантных форм белков, их эпитопов или нативных белков, присутствующих на поверхности выделенных клеток-мишеней. Анализ конкурентного свзывания и другие способы определения специфического связывания дополнительно описаны ниже и хорошо известны в данной области техники.
Когда говорят, что антитело «конкурирует с» конкретным моноклональным антителом (например, 2В12, 10G5), это означает, что антитело конкурирует с указанным моноклональным антителом при анализе связывания с использованием рекомбинантных молекул KIR3DL2 или молекул KIR3DL2, экспрессированных на поверхности клеток. Например, если тестируемое антитело снижает связывание 2В12 или 10G5 с полипептидом KIR3DL2 или клеткой, экспрессирующей KIR3DL2, при анализе связывания, то говорят, что антитело «конкурирует» с 2В12 или 10G5, соответственно.
а
В настоящем описании термин «сродство» означает силу связывания антитела с эпитопом. Сродство антитела задается константой диссоциации Kd, определяемой как [Ab]×[Ag]/[Ab-Ag], где [Ab-Ag] - молярная концентрация комплекса антитело-антиген, [Ab] - молярная концентрация свободного антитела и [Ag] - молярная концентрация свободного антигена. Константа сродства К определяется как 1/Kd. Примеры способов определения сродства мАт можно найти в Harlow, et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988), Coligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, N.Y., (1992, 1993), и Muller, Meth. Enzymol. 92: 589-601 (1983), включенных в настоящий документ посредством ссылок. Один стандартный способ определения сродства мАт, хорошо известный в данной области техники, представляет собой использование скрининга на основе поверхностного плазменного резонанса (ППР) (например, посредством анализа с помощью аналитического ППР-устройства BIAcore™).
В настоящем документе термин «детерминанта» означает сайт взаимодействия или связывания в составе полипептида.
Термин «эпитоп» относится к антигенной детерминанте и представляет собой область или регион антигена, с которым связывается антитело. Эпитоп белка может содержать аминокислотные остатки, непосредственно участвующие в связывании, а также аминокислотные остатки, эффективно блокируемые специфическим антигенсвязывающим антителом или пептидом, т.е. аминокислотные остатки в области распознавания антитела. Это - простейшая форма или наименьшая структурная область сложной молекулы антигена, которая может взаимодействовать с, например, антителом или рецептором. Эпитопы могут быть линейными или конформационными/структурными. Термин «линейный эпитоп» определяется как эпитоп, состоящий из аминокислотных остатков, которые находятся рядом друг с другом на линейной последовательности аминокислот (первичной структуре). Термин «конформационный или структурный эпитоп» определяется как эпитоп, состоящий из аминокислотных остатков, не все из которых расположены рядом друг с другом и, таким образом, представляют собой отдельные части линейной последовательности аминокислот, которые сближаются друг с другом за счет фолдинга молекулы (вторичной, третичной и/или четвертичной структуры). Конформационный эпитоп зависит от 3-мерной структуры. Поэтому термин «конформационный» часто используется на равных основаниях с термином «структурный».
Термин «внутриклеточная интернализация», или «интернализация» по отношению к полипептиду KIR3DL2 и/или антителу, связывающему его, относится к молекулярным, биохимическим и клеточным событиям, связанным с процессом транслокации молекулы с внеклеточной поверхности клетки на внутриклеточную поверхность клетки. Процессы, отвечающие за внутриклеточную интернализацию молекул, хорошо известны и могут включать, в числе прочего, интернализацию внеклеточных молекул (например, гормонов, антител и низкомолекулярных органических соединений); мембрано-связанных молекул (например, рецепторов клеточной поверхности); и комплексов мембрано-связанных молекул с внеклеточными молекулами (например, лиганда, связанного с трансмембранным рецептором, или антитела, связанного с мембрано-связанной молекулой). Таким образом, «индукция и/или усиление внутриклеточной интернализации» включает события инициации внутриклеточной интернализации и/или увеличения скорости и/или степени внутриклеточной интернализации.
Термин "истощение" по отношению к клеткам, экспрессирующим KIR3DL2, означает процесс, способ или соединение, способное уничтожать, ликвидировать, лизировать или индуцировать такое уничтожение, ликвидацию или лизис, отрицательно влияя на количество клеток, экспрессирующих KIR3DL2, в образце или в организме субъекта.
В настоящем документе термин «агент» используется для обозначения химического соединения, смеси химических соединений, биологической макромолекулы или экстракта биологических материалов. Термин «терапевтический агент» относится к агенту, обладающему биологической активностью.
Термины «токсический агент» и «цитотоксический агент» включают любое соединение, способное замедлять, останавливать или вызывать регрессию пролиферации клеток, снижать их активность, что обнаруживается любым способом, или непосредственно или косвенно уничтожать их. Цитотоксические агенты предпочтительно вызывают гибель клеток главным образом за счет непосредственного вмешательства в функционирование клеток и включают алкилирующие агенты, ингибиторы факторов некроза опухолей, интеркалирующие агенты, ингибиторы микротрубочек, ингибиторы киназ, ингибиторы протеасом и ингибиторы топоизомеразы. В настоящем описании термин «токсическая нагрузка» относится к достаточному количеству цитотоксического агента, которое при доставке к клетке приводит к гибели клетки. Доставку токсической нагрузки можно выполнить путем введения достаточного количества иммуноконъюгата, содержащего антитело или антигенсвязывающий фрагмент и цитотоксический агент. Доставку токсической нагрузки также можно выполнить путем введения достаточного количества иммуноконъюгата, содержащего цитотоксический агент, причем иммуноконъюгат содержит вторичное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, распознающий и связывающий антитело или антигенсвязывающий фрагмент.
Для целей настоящего изобретения термины «гуманизированное» антитело или антитело «человека» относятся к антителу, константная и вариабельная каркасная области которого, происходящие от одного или более иммуноглобулинов человека, объединены со связывающей областью, например, CDR, иммуноглобулина животного. Такие антитела сконструированы с целью поддержания специфичности связывания нечеловеческого антитела, производными которого являются связывающие области, при избегании иммунного ответа против нечеловеческого антитела. Такие антитела можно получить о трансгенных мышей или других животных, «сконструированных» с целью продукции специфических антител человека в ответ на антигенную стимуляцию (см., например, Green et al. (1994) Nature Genet 7:13; Lonberg et al. (1994) Nature 368:856; Taylor et al. (1994) Int Immun 6:579, информация из которых полностью включена в настоящий документ посредством ссылки). Кроме того, полностью человеческое антитело можно сконструировать с использованием способов трансфекции генов или хромосом, а также технологии фагового дисплея, которые известны в данной области техники (see, e.g., McCafferty et al. (1990) Nature 348:552-553). Кроме того, антитела человека можно получить in vitro с применением активированных В-клеток (см., например, патенты США №5567610 и 5229275, полностью включенные в настоящий документ посредством ссылок).
«Химерное антитело» представляет собой молекулу антитела, в которой (а) константная область или ее фрагмент модифицированы, замещены или заменены таким образом, что антигенсвязывающий сайт (вариабельная область) связан с константной областью, относящейся к другому или измененному классу, обладающей другой эффекторной функцией и/или характерной для другого вида, или с совершенно другой молекулой, придающей химерному антителу новые свойства, например, ферментом, токсином, гормоном, фактором роста, лекарственным веществом и т.д.; либо (b) вариабельная область или ее фрагмент модифицированы, замещены или заменены вариабельной областью, обладающей специфичностью по отношению к другому или модифицированному антигену.
Термины «Fc-домен», «Fc-фрагмент» и «Fc-область» относятся к С-концевому фрагменту тяжелой цепи антитела, например, от приблизительно 230 до приблизительно 450 аминокислоты (АК) γ тяжелой (гамма) цепи человека, или аналогичной ему последовательности в тяжелых цепях антител других типов (например, α, δ, ε и μ для антител человека), либо их аллотипу, встречающемуся в природе.
Термин «антитело-зависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность» или «ADCC» представляет собой термин, хорошо изученный в данной области техники, и относится к клеточно-опосредованной реакции, при которой неспецифические цитотоксические клетки, экспрессирующие Fc-рецепторы (FcR), распознают связанное антитело на клетке-мишени и затем взывают лизис клетки-мишени. Неспецифические цитотоксические клетки, опосредующие ADCC, включают естественные киллеры (NK-клетки), макрофаги, моноциты, нейтрофилы и эозинофилы.
Термины «выделенный», «очищенный» или «биологически чистый» относятся к материалу, в основном или практически не содержащему компонентов, обычно сопутствующих ему в нативном состоянии. Чистоту и однородность обычно определяют с помощью методик аналитической химии, например, электрофореза в полиакриламидном геле или высокоэффективной жидкостной хроматографии. Белок, являющийся преобладающим в препарате соединением, является в основном очищенным.
Термины «полипептид», «пептид» и «белок» используются в настоящем документе на равных основаниях для обозначения полимера, состоящего из аминокислотных остатков. Эти термины относятся к аминокислотным полимерам, в которых один или более из аминокислотных остатков является искусственным соединением, имитирующим соответствующую природную аминокислоту, а также природным аминокислотным полимерам и аминокислотным полимерам, не встречающимся в природе.
Термин «рекомбинантный», используемый по отношению к, например, клетке, нуклеиновой кислоте, белку или вектору, означает, что указанная клетка, нуклеиновая кислота, белок или вектор модифицированы путем внедрения гетерологичной нуклеиновой кислоты или белка или изменения нативной нуклеиновой кислоты или белка, или что клетка происходит от клетки, модифицированной таким образом. Так, например, рекомбинантные клетки экспрессируют гены, не встречающиеся в нативной (не рекомбинантной) форме данной клетки, или экспрессируют нативные гены, в противном случае экспрессирующиеся аномальным образом, в недостаточном количестве или вообще не экспрессирующиеся.
Термин «модификация» по отношению к аминокислотной последовательности (например, «аминокислотная модификация») означает замену, инсерцию и/или делецию аминокислоты в последовательности полипептида. Под «модификацией» или «аминокислотной модификацией» подразумевают замену, инсерцию или делецию аминокислоты в последовательности полипептида. Под «аминокислотной заменой» или «заменой» в настоящем документе подразумевают замену аминокислоты в заданном положении последовательности белка другой аминокислотой. Например, замена P14S относится к варианту исходного полипептида, в котором пролин в положении 14 замещен серином. «Вариант» полипептида относится к полипептиду, обладающему аминокислотной последовательностью, в основном идентичной последовательности эталонного полипептида, обычно нативного или «исходного» полипептида. Вариант полипептида может содержать одну или более аминокислотных замен, делеций и/или инсерций в некоторых положениях нативной аминокислотной последовательности.
В настоящем описании термин «антитело, связывающее» полипептид или эпитоп, означает антитело, связывающее указанную детерминанту с определенной специфичностью и/или сродством.
Термин «идентичность» или «идентичный» при использовании по отношению к связи между последовательностями двух или более полипептидов относится к степени родства последовательностей полипептидов, определенной по количеству совпадений между двумя или более цепями аминокислотных остатков. «Идентичность» измеряет процент идентичных совпадений между меньшей из двух последовательностей при выравнивании промежутков (при их наличии), рассчитываемый определенной математической моделью или компьютерной программой (т.е. «алгоритмами»). Идентичность родственных полипептидов легко рассчитать известными способами. Такие способы включают способы, описанные в Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York, 1991; и Carillo et al., SIAM J. Applied Math. 48, 1073 (1988), но не ограничиваются ими.
Предпочтительные способы определения идентичности выдают степень максимального совпадения между тестируемыми последовательностями. Способы определения идентичности описаны в общедоступных компьютерных программах. Предпочтительные программные способы определения идентичности между двумя последовательностями включают программный пакет GCG, включающий GAP (Devereux et al., Nucl. Acid. Res. 12, 387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.), BLASTP, BLASTN, и FASTA (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403-410 (1990)). Программа BLASTX общедоступна в Национальном центре биотехнологической информации С (NCBI) и других источниках (BLAST Manual, Altschul et al. NCB/NLM/NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul et al., supra). Кроме того, для определения идентичности можно использовать хорошо известный алгоритм Смита-Уотермана.
Антитела и эпитопы
Настоящее изобретение частично основано на обнаружении модифицированных акцепторных каркасных последовательностей человека, в которые можно встраивать CDR антител, причем полученная вариабельная область против KIR3DL2 сохраняет способность связывать домен DO KIR3DL2 человека.
Такие гуманизированные вариабельные области и антитела, содержащие их, могут связываться с сегментом KIR3DL2 (SEQ ID NO: 1), содержащим остатки 160 и/или G62. Указанные антитела необязательно связывают эпитоп, содержащий один или более из остатков 160 и/или G62, но не остатки R13, А25 и/или Q27. Указанные антитела необязательно связывают эпитоп, содержащий один или более из остатков 160 и/или G62, а также один или более из остатков Р14, S15 и/или Н23.
th
Если не указано иное, в данном описании используется номенклатура нумерации аминокислот иммуноглобулинов Abnum (см. Abhinandan and Martin, (2008) Molecular Immunology 45: 3832-3839, содержание которой включено в настоящий документ посредством ссылки). Можно автоматически сгенерировать нумерацию последовательности по системе Abnum на сайте http://www.bioinfo.org.uk/abs/abnum. Однако следует принимать во внимание, что специалист в данной области техники может использовать альтернативную систему нумерации и выявлять положения, соответствующие нумерации Abnum. Для остатков 38 и 39 в соответствующих легкой и тяжелой цепях положения по Abnum соответствуют тем же положениям по системе нумерации Кабата (Kabat et al. (1991) Sequences of Protein of Immunological Interest, 5 ed., United States Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, MD).
Если антитело содержит глутамин в положении 38 последовательности VL-домена, предпочтительная акцепторная каркасная VH-область человека содержит глутамин в положении 39 последовательности VH-домена.
В одном варианте реализации гуманизированное антитело содержит каркасную область тяжелой цепи подгруппы VH1 человека в комбинации с JH6, причем антитело необязательно содержит IGHV1 -46*03 в комбинации с IGHJ6*01. В одном варианте реализации гуманизированное антитело содержит каркасную область легкой цепи подгруппы VK1 человека, необязательно IGKV1-NL1*01.
В одном варианте реализации гуманизированное антитело содержит каркасную область тяжелой цепи подгруппы VH1 и/или VH7 человека в комбинации с JH6, причем антитело необязательно содержит IGHV7-4-l*02 и IGHVT-c*01 в комбинации с IGHJ6*01. В одном варианте реализации гуманизированное антитело содержит каркасную область легкой цепи подгруппы VK1 и VK4 человека, необязательно IGKV4-1*01 и IGKV1-39*01 в комбинации с JH4, необязательно IGKJ4*01.
Каркасные последовательности человека в составе гуманизированного антитела могут дополнительно содержать одну или более обратных мутаций с целью, например, повышения сродства, стабильности или других свойств гуманизированного антитела.
В еще одном аспекте предложены конкретные гуманизированные антитела, являющиеся гуманизированными версиями 2В12 или 10G5. Такие антитела обычно характеризуются наличием ключевых аминокислотных остатков CDR 2В12 или 10G5 в каркасных последовательностях человека.
Антитело 10G5
Примеры гуманизированных аминокислотных VH- и VL-последовательностей антитела 10G5 показаны в SEQ ID NOS: 13-17 и 8-12, соответственно. В одном аспекте предложено выделенное гуманизированное антитело, связывающее полипептид KDA3DL2 человека, причем указанное антитело содержит: область HCDR1, содержащую аминокислотную последовательность SYTMH, представленную в SEQ ID NO: 2, или последовательность из по меньшей мере 3 или 4 ее аминокислот; область HCDR2, содержащую аминокислотную последовательность YINPSSGYTENNRKF, представленную в SEQ ID NO: 3, или непрерывную последовательность из по меньшей мере 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 ее аминокислот; область HCDR3, содержащую аминокислотную последовательность LGKGLLPPFDY, представленную в SEQ ID NO: 4, или непрерывную последовательность из по меньшей мере 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 ее аминокислот; область LCDR1, содержащую аминокислотную последовательность RASENIYSNLA, представленную в SEQ ID NO: 5, или непрерывную последовательность из по меньшей мере 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 ее аминокислот; область LCDR2, содержащую аминокислотную последовательность AATNLAD, представленную в SEQ ID NO: 6, или непрерывную последовательность из по меньшей мере 3, 4 или 5 ее аминокислот; область LCDR3, содержащую аминокислотную последовательность QHFWGTPYT, представленную в SEQ ID NO: 7, или непрерывную последовательность из по меньшей мере 5, 6, 7 или 8 ее аминокислот
В одном аспекте настоящего изобретения предложено выделенное гуманизированное антитело 10G5, связывающиеся с полипептидом KIR3DL2 человека и содержащее:
(a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2;
(b) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3;
(c) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4;
(d) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:5;
(e) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6;
(f) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7; и
(g) каркасные последовательности человека.
В одном варианте реализации гуманизированное антитело содержит каркасную область тяжелой цепи подгруппы VH1 человека в комбинации с JH6, причем антитело необязательно содержит IGHV1 -46*03 в комбинации с IGHJ6*01. В одном варианте реализации гуманизированное антитело содержит каркасную область легкой цепи подгруппы VK1 человека, необязательно IGKV1-NL1*01.
Каркасная область человека необязательно содержит одну или более мутаций, например, обратных мутаций. В примере 1 показано выявление каркасных областей и обратных мутаций в вариабельных областях 10G5. По сравнению с химерным антителом 10G5, указанные протестированные мутанты продемонстрировали сопоставимый профиль связывания при двух концентрациях мАт, использованных при анализе. Варианты реализации настоящего изобретения, таким образом, включают варианты тяжелой цепи 10G5, содержащие обратные мутации в одном или более (или любой их комбинации) из следующих остатков по нумерации Abnum: 10G5 VH: 5, 11, 12, 13, 20, 38, 40, 48, 66, 67, 69, 71, 72а, 75.
Дополнительные варианты реализации настоящего изобретения, таким образом, включают варианты легкой цепи 10G5, содержащие обратные мутации в одном или более (или любой их комбинации) из следующих остатков:
10G5 VL: 17, 18, 40, 45, 48, 70, 76, 100.
Каркасные последовательности человека в составе гуманизированного антитела могут дополнительно содержать одну или более дополнительных мутаций (например, обратных мутаций) с целью, например, повышения сродства, стабильности или других свойств гуманизированного антитела.
В одном аспекте предложено выделенное гуманизированное антитело 10G5, связывающееся с полипептидом KIR3DL2 человека и содержащее:
(a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2;
(b) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3;
(c) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4;
(d) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5;
(e) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6;
(f) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7; и
(g) каркасные последовательности человека, причем остаток глутамина (Q) находится в положении 39 VH-домена и в положении 38 VL-домена. Последовательности каркасной области человека необязательно дополнительно содержат одну или более обратных мутаций.
Остаток глутамина (Q) в положении 39 может существовать в естественной последовательности каркасной области VH человека или может быть введен посредством аминокислотной замены или другой модификации последовательности.
В еще одном аспекте настоящего изобретения предложены гуманизированные антитела, содержащие VH-домен, обладающий по меньшей мере приблизительно 80% идентичностью последовательности (например, по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95%, 97%, 98% или большей идентичностью) VH-домену 10G5 SEQ ID NOS: 13-17. В еще одном конкретном аспекте настоящего изобретения предложено гуманизированное антитело, связывающее KIR3DL2 и содержащее (а) VH-домен, содержащий остатки CDR нечеловеческого происхождения, встроенные в VH-домен человека, причем указанный VH-домен по меньшей мере приблизительно на 80% (например, по меньшей мере на 90%, 95%, 97%, 98%) идентичен VH-домену гуманизированного антитела 10G5 SEQ ID NOS: 13-17, и (b) VL-домен, содержащий остатки CDR нечеловеческого происхождения, встроенные в VL-домен человека, причем указанный VL-домен по меньшей мере приблизительно на 80% (например, по меньшей мере на 90%, 95%, 97%, 98%) идентичен VL-домену гуманизированного антитела 10G5 SEQ ID NOS: 8-12.
Антитело 2В12
Примеры гуманизированных аминокислотных VH- и VL-последовательностей антитела 2В12 показаны в SEQ ID NOS: 24-28 и 29-33, соответственно. В одном аспекте предложено выделенное гуманизированное антитело, связывающее полипептид KIR3DL2 человека, причем указанное антитело содержит: область HCDR1, содержащую аминокислотную последовательность TAGMQ, представленную в SEQ ID NO: 18, или непрерывную последовательность из по меньшей мере 3 или 4 ее аминокислот; область HCDR2, содержащую аминокислотную последовательность WJNSHSGVPKYAEDFK, представленную в SEQ ID NO: 19, или непрерывную последовательность из по меньшей мере 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 ее аминокислот; область HCDR3, содержащую аминокислотную последовательность GGDEGVMDY, представленную в SEQ ID NO: 20, или непрерывную последовательность из по меньшей мере 5, 6, 7 или 8 ее аминокислот; область LCDR1, содержащую аминокислотную последовательность KASQDVSTAVA, представленную в SEQ ID NO: 21, или непрерывную последовательность из по меньшей мере 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 ее аминокислот; область LCDR2, содержащую аминокислотную последовательность WTSTRHT, представленную в SEQ ID NO: 22, или непрерывную последовательность из по меньшей мере 3, 4 или 5 ее аминокислот; область LCDR3, содержащую аминокислотную последовательность QQHYSTPWT, представленную в SEQ ID NO: 23, или непрерывную последовательность из по меньшей мере 4, 5, 6, 7 или 8 ее аминокислот.
В любом из вариантов реализации, описанных в настоящем документе, любая из CDR 1, 2 и 3 тяжелой и легкой цепей может характеризоваться непрерывной последовательностью из по меньшей мере 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот, и/или наличием аминокислотной последовательности, обладающей по меньшей мере 70%, 80%, 85%, 90% или 95% идентичностью последовательности конкретной CDR или набору CDR, перечисленных в соответствующих SEQ ID NO.
В одном аспекте настоящего изобретения предложено выделенное гуманизированное антитело 2В12, связывающееся с полипептидом KIR3DL2 человека и содержащее:
(a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18;
(b) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19;
(c) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20;
(d) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21;
(e) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22;
(f) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23; и
(g) каркасные последовательности человека.
В одном варианте реализации гуманизированное антитело содержит каркасную область тяжелой цепи подгруппы VH1 и/или VH7 человека в комбинации с JH6, причем антитело необязательно содержит IGHV7-4-1*02 и/или IGHV1-c*01 в комбинации с IGHJ6*01. В одном варианте реализации гуманизированное антитело содержит каркасную область легкой цепи подгруппы VK1 и/или VK4 человека, необязательно IGKV4-1*01 и/или IGKV1-39*01 в комбинации с JH4, необязательно IGKJ4*01.
Каркасная область человека необязательно содержит одну или более мутаций, например, обратных мутаций. В примере 1 показано выявление каркасных областей и обратных мутаций в вариабельных областях 2В12. По сравнению с химерным антителом 2В12, указанные протестированные мутанты продемонстрировали сопоставимый профиль связывания при двух концентрациях мАт, использованных при анализе. Варианты реализации настоящего изобретения, таким образом, включают варианты тяжелой цепи 2В12, содержащие обратные мутации в одном или более (или любой их комбинации) из следующих остатков по нумерации Abnum:
2В12 VH: 2, 38, 39, 40, 43, 48, 68, 72с, 91, 108.
Дополнительные варианты реализации настоящего изобретения, таким образом, включают варианты легкой цепи 2В12, содержащие обратные мутации в одном или более (или любой их комбинации) из следующих остатков:
2В12 VL: 3, 8, 9, 21, 43, 71, 78, 104.
Каркасные последовательности человека в составе гуманизированного антитела могут дополнительно содержать одну или более дополнительных мутаций (например, обратных мутаций) с целью, например, повышения сродства, стабильности или других свойств гуманизированного антитела.
В одном аспекте предложено выделенное гуманизированное антитело 2В12, связывающееся с полипептидом KIR3DL2 человека и содержащее:
(a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18;
(b) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19;
(c) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20;
(d) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21;
(e) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22;
(f) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23; и
(g) каркасные последовательности человека, причем остаток глутамина (Q) находится в положении 39 VH-домена и в положении 38 VL-домена. Последовательности каркасной области человека необязательно дополнительно содержат одну или более обратных мутаций.
В еще одном аспекте настоящего изобретения предложены гуманизированные антитела, содержащие VH-домен, обладающий по меньшей мере приблизительно 80% идентичностью последовательности (например, по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95%, 97%, 98% или большей идентичностью) VH-домену 2В12 или гуманизированного антитела 2В12 SEQ ID NOS: 29-33. В еще одном конкретном аспекте настоящего изобретения предложено гуманизированное антитело, связывающее KIR3DL2 и содержащее (а) VH-домен, содержащий остатки CDR нечеловеческого происхождения, встроенные в VH-домен человека, причем указанный VH-домен по меньшей мере приблизительно на 80% (например, по меньшей мере на 90%, 95%, 97%, 98%) идентичен VH-домену гуманизированного антитела 2В12 SEQ ID NOS: 29-33, и (b) VL-домен, содержащий остатки CDR нечеловеческого происхождения, встроенные в VL-домен человека, причем указанный VL-домен по меньшей мере приблизительно на 80% (например, по меньшей мере на 90%, 95%, 97%, 98%) идентичен VL-домену гуманизированного антитела 2В12 SEQ ID NOS: 24-28.
Остаток глутамина (Q) в положении 39 может существовать в естественной последовательности каркасной области VH человека или может быть введен посредством аминокислотной замены или другой модификации последовательности.
Антитело 10G5 или 2В12 может дополнительно содержать константный домен IgG человека (например, IgG1, IgG4). Константный домен необязательно является доменом IgG1, содержащим модификацию с целью усиления связывания Fc-рецептора. Константный домен необязательно является доменом IgG (например, IgG1, IgG4), содержащим модификацию с целью снижения связывания Fc-рецептора.
nd
Для рекомбинантной продукции гуманизированных антител гуманизированные VH- и VL-области или их вариантные версии можно клонировать в экспрессирующих векторах, кодирующих полноразмерные или укороченные константные области антитела человека, согласно стандартным рекомбинантным способам (см., например, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989). В результате получают трансфицированную линию клеток, экспрессирующую и секретирующую исследуемое гуманизированное антитело, содержащее выбранные VH- и VL-области и константные области. Известны последовательности кДНК, кодирующие константные области антител человека.
При желании можно также «переключить» класс гуманизированного антитела с помощью известных способов. Методики по переключению класса можно применять для преобразования одного подкласса IgG в другой, например, IgG1 в IgG2. Так, эффекторную функцию антител согласно изобретению можно изменить путем переключения изотипа антитела, например, на IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 для различных вариантов терапевтического применения.
Предусмотрены различные формы гуманизированных антител (например, 10G5 и 2В12). Например, гуманизированное антитело может представлять собой фрагмент антитела, например, Fab или фрагмент другого типа, описанный в настоящем документе. В качестве альтернативы, гуманизированное антитело может представлять собой полноразмерное или интактное антитело, например, полноразмерное или интактное антитело IgG1 или IgG4. Константную область можно дополнительно модифицировать в соответствии с известными способами. Например, в константной области IgG4 остаток S241 можно смутировать в остаток пролина (Р) с целью обеспечить возможность формирования полного дисульфидного мостика в шарнирной области (см., например, Angal et al., Mol Immunol. 1993;30:105-8).
В одном варианте реализации, где желательна блокада KIR3DL2 (например, ингибирование или связывание KIR3DL2 его HLA-лигандами) без истощения (например, посредством CDC или ADCC) клеток, экспрессирующих KIR3DL2, гуманизированное антитело представляет собой полноразмерное антитело IgG4 или его фрагмент. В одном варианте реализации, где желательно истощение (например, посредством CDC или ADCC) клеток, экспрессирующих KIR3DL2, гуманизированное антитело представляет собой полноразмерное антитело IgG1 или его фрагмент, содержащий Fc-область, связывающуюся с Fc-рецепторами (например, CD 16). Антитело может необязательно дополнительно содержать константный домен IgG1 человека, содержащий модификацию, например, с целью усиления связывания Fc-рецептора.
Ввиду способности антител против KIR3DL2 (в частности, неинтернализирующихся антител) индуцировать ADCC и CDC, также можно получить антитела, содержащие модификации, усиливающие их способность связывать Fc-рецепторы, что может влиять на эффекторные функции, например, антитело-зависимую цитотоксичность, дегрануляцию тучных клеток и фагоцитоз, а также иммуномодулирующие сигналы, например, регуляцию пролиферации лимфоцитов и секрецию антител. Типичные модификации включают модифицированные константные области IgG1 человека, содержащие по меньшей мере одну аминокислотную модификацию (например, замену, делеции, инсерции) и/или модификации типов гликозилирования, например, гипофукозилирование. Такие модификации могут влиять на взаимодействие с Fc-рецепторами: FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) и FcγRIII (CD 16). FcγRI (CD64), FcγRIIA (CD32A) и FcγRIII (CD 16) являются активирующими (т.е. стимулирующими иммунную систему) рецепторами, в то время как FcγRIIB (CD32B) является ингибирующим (т.е. подавляющим иммунную систему) рецептором. Модификация может, например, усилить связывание Fc-домена с FcγRIIIa на эффекторных (например, NK) клетках. Примеры модификаций предложены в заявке РСТ/ЕР 2013/069302, поданной 17 сентября 2013 г., описание которой включено в настоящий документ посредством ссылки.
В некоторых вариантах реализации антитело содержит вариантную Fc-область, содержащую по меньшей мере одну аминокислотную модификацию (например, содержащую 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или более аминокислотных модификаций) в СН3-домене Fc-области. В других вариантах реализации антитело содержит вариантную Fc-область, содержащую по меньшей мере одну аминокислотную модификацию (например, содержащую 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или более аминокислотных модификаций) в СН2-домене Fc-области, который расположен за аминокислотами 231-241. В некоторых вариантах реализации антитело содержит по меньшей мере две аминокислотные модификации (например, содержит 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или более аминокислотных модификаций), причем по меньшей мере одна из таких модификаций находится в СН3-области, и по меньшей мере одна из таких модификаций находится в СН2-области. Изобретение также включает аминокислотные модификации в шарнирной области. В одном варианте реализации изобретение включает аминокислотную модификацию в СН1-домене Fc-области, который находится за аминокислотами 216-230. Можно получить любую комбинацию модификаций Fc-области, например, любую комбинацию различных модификаций, описанных в патентах США №7632497; 7521542; 7425619; 7416727; 7371826; 7355008; 7335742; 7332581; 7183387; 7122637; 6821505 и 6737056; в публикациях РСТ № WO 2011/109400; WO 2008/105886; WO 2008/002933; WO 2007/021841; WO 2007/106707; WO 06/088494; WO 05/115452; WO 05/110474; WO 04/1032269; WO 00/42072; WO 06/088494; WO 07/024249; WO 05/047327; WO 04/099249 и WO 04/063351; и в статьях Lazar et al. (2006) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 103(11): 405-410; Presta, L.G. et al. (2002) Biochem. Soc. Датчик 30(4):487-490; Shields, R.L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 26; 277(30):26733-26740 и Shields, R.L. et al. (2001) J. Biol. Chem. 276(9):6591-6604).
Антитела против KIR3DL2 могут содержать вариантную Fc-область, причем указанная вариантная Fc-область содержит по меньшей мере одну аминокислотную модификацию (например, содержит 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или более аминокислотных модификаций) по сравнению с Fc-областью дикого типа, так что молекула обладает усиленной эффекторной функцией по сравнению с молекулой, содержащей Fc-область дикого типа, причем вариантная Fc-область необязательно содержит замену в одном или более из положений 221, 239, 243, 247, 255, 256, 258, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 300, 301, 303, 305, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 316, 320, 322, 326, 329, 330, 332, 331, 332, 333, 334, 335, 337, 338, 339, 340, 359, 360, 370, 373, 376, 378, 392, 396, 399, 402, 404, 416, 419, 421, 430, 434, 435, 437, 438 и/или 439. В одном варианте реализации антитела против KIR3DL2 могут содержать вариантную Fc-область, причем вариантная Fc-область содержит по меньшей мере одну аминокислотную модификацию (например, содержит 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или более аминокислотных модификаций) по сравнению с Fc-областью дикого типа, так что молекула обладает усиленной эффекторной функцией по сравнению с молекулой, содержащей Fc-область дикого типа, причем вариантная Fc-область необязательно содержит замену в одном или более из положений 239, 298, 330, 332, 333 и/или 334 (например, замены S239D, S298A, A330L, I332E, Е333А и/или K334A).
В одном варианте реализации антитела, содержащие вариант или Fc-области дикого типа могут характеризоваться модифицированной картиной гликозилирования, усиливающей способность антител к связыванию Fc-рецептора. Такие углеводные модификации можно выполнить, например, путем экспрессии антитела в клетке-хозяине с модифицированным механизмом гликозилирования. Клетки с модифицированным механизмом гликозилирования описаны в данной области техники и могут использоваться в качестве клеток-хозяев для экспрессии рекомбинантных антител с целью продукции антитела с модифицированным гликозилированием. См., например, Shields, R.L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740; Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-1, а также европейский патент № ЕР 1176195; публикации РСТ WO 06/133148; WO 03/035835; WO 99/54342, каждая из которых полностью включена в настоящий документ посредством ссылки. В одном аспекте антитела гипофукозилированы по константной области. Такие антитела могут содержать или не содержать аминокислотную модификацию, но продуцироваться или обрабатываться в условиях, обеспечивающих такое гипофукозилирование. В одном аспекте композиция антитела содержит химерное или гуманизированное антитело или антитело человека, описанное в настоящем документе, причем по меньшей мере 20, 30, 40, 50, 60, 75, 85, 90, 95% или практически все молекулы антитела в композиции содержат константную область, содержащую первичную углеводную структуру (например, комплексные, гибридные структуры или структуры с высоким содержанием маннозы), не содержащую фукозы. В одном варианте реализации предложена композиция антитела, не содержащая антител, характеризующихся первичной углеводной структурой, содержащей фукозу. Первичный углевод предпочтительно представляет собой углеводную цепь при Asn297.
Получение антител против KIR3DL2
Антитела можно получить, используя различные методики, известные в данной области техники. Обычно их получают путем иммунизации животного, не являющегося человеком, предпочтительно мыши, иммуногеном, содержащим полипептид KIR3DL2, предпочтительно полипептид KIR3DL2 человека. Антитела также можно получить путем выбора из комбинаторных библиотек иммуноглобулинов.
В настоящем изобретении также предложены выделенные нуклеиновые кислоты, кодирующие антитела против KIR3DL2, описанные в настоящем документе, а также векторы и клетки-хозяева, содержащие такие нуклеиновые кислоты. В одном аспекте предложен фрагмент нуклеиновой кислоты, кодирующий агент согласно настоящему изобретению. В одном аспекте предложен фрагмент нуклеиновой кислоты, кодирующий агент согласно настоящему изобретению, выбранный из фрагмента ДНК и РНК. Кроме того, предложены способы получения таких антител против KIR3DL2 с использованием рекомбинантных методик, например, культивирования подходящих клеток-хозяев, содержащих такие нуклеиновые кислоты или векторы, обеспечивающие экспрессию нуклеиновой кислоты и продукцию гуманизированного антитела. Перед культивированием клетки-хозяева можно, например, совместно трансфицировать вектором, содержащим нуклеиновые кислоты, кодирующие вариабельный домен тяжелой цепи, и вектором, содержащим нуклеиновую кислоту, кодирующую вариабельный домен легкой цепи. Кроме того, антитело можно выделить и/или очистить из культуры клетки-хозяина с использованием известных методик. Подходящие векторы, клетки-хозяева и методики дополнительно описаны ниже.
В общем случае для рекомбинантной продукции антитела нуклеиновую кислоту, кодирующую его, выделяют и вставляют в реплицируемый вектор для дальнейшего клонирования (амплификации ДНК) или для экспрессии, обычно функционально связав ее с одним или более элементами, управляющими экспрессией. ДНК, кодирующую моноклональное антитело, легко выделить и секвенировать с использованием общепринятых процедур (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, способных специфически связываться с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи антитела). Известно и доступно большое количество векторов. Компоненты вектора обычно включают один или более из следующих элементов: сигнальной последовательности, сайта инициации репликации, одного или более маркерных генов, энхансера, промотора и последовательности терминации транскрипции, но не ограничиваются ими.
Выявление одного или более из антител, связывающихся с KIR3DL2, в особенности главным образом или практически с тем же эпитопом, что и моноклональное антитело 10G5 или 2В12, легко выполнить с помощью любого из множества иммунологических скрининговых анализов, позволяющих оценить конкуренцию антител. Многие из таких анализов вошли в повседневную практику и хорошо известны в данной области техники (см., например, патент США №5660827). Следует понимать, что фактически определение эпитопа, с которым связывается антитело, описанное в настоящем документе, никоим образом не требуется для выявления антитела, связывающегося с тем же или по большей части с тем же эпитопом, что и моноклональное антитело, описанное в настоящем документе. Для оценки связывания антитела с KIR3DL2 человека можно использовать любой из множества видов анализа. Для этого подходят, в числе прочего, протоколы на основе твердофазного ИФА, радиоиммуноанализа, вестерн-блоттинг, BIACORE и другие конкурентные виды анализа, хорошо известные в данной области техники.
Например, если тестируемые антитела получены из различных исходных животных или даже принадлежат к различным изотипам Ig, можно использовать простой конкурентный анализ, при котором контрольные (такое антитело, как 10G5 или 2В12) и тестируемые антитела смешивают (или заранее адсорбируют) и вносят в образец, содержащий полипептиды KIR3DL2. Для таких конкурентных исследований подходят протоколы на основе вестерн-блоттинга и использования BIACORE.
В некоторых вариантах реализации контрольные антитела (10G5 или 2В12) смешивают с различным количеством тестируемых антител (например, в соотношении приблизительно 1:10 или приблизительно 1:100) на некоторое время перед внесением в образец антигена KIR3DL2. В других вариантах реализации контроль и различные количества тестируемых антител можно просто смешать перед воздействием образца антигена KIR3DL2. При возможности различить связанные и свободные антитела (например, с использованием методик разделения или промывки с целью удаления несвязанных антител) и (10G5 или 2В12 от тестируемых антител (например, с использованием видоспецифичных или изотип-специфичных вторичных антител или путем специфического мечения 10G5 или 2В12 обнаруживаемой меткой) можно определить, снижают ли тестируемые антитела связывание 10G5 и 2В12 с антигенами, что указывает на то, что тестируемое антитело распознает главным образом тот же эпитоп, что и антитело 10G5 или 2В12. Связывание (меченых) контрольных антител в отсутствие полностью неродственного антитела может использоваться в качестве высокого контрольного значения. Контрольное низкое значение можно получить путем инкубирования меченых (10G5 или 2В12) антител с немечеными антителами точно того же типа (10G5 или 2В12), при котором должна возникнуть конкуренция и снижается связывание меченых антител. При тестовом анализе значительное снижение реакционной способности меченого антитела в присутствии тестируемого антитела указывает на то, что тестируемое антитело распознает по большей части тот же эпитоп и перекрестно реагирует или конкурирует с меченым (10G5 или 2В12) антителом. Любое тестируемое антитело, снижающее связывание 10G5 или 2В12 с антигенами KIR3DL2 по меньшей мере приблизительно на 50%, по меньшей мере приблизительно на 60%, или, более предпочтительно, по меньшей мере приблизительно на 80% или 90% (например, приблизительно 65-100%), в любом соотношении тестируемых антител 10G5 or 2В12 между приблизительно 1:10 и приблизительно 1: 00 считается антителом, связывающимся по большей части с тем же эпитопом или детерминантой, что и как 10G5 или 2В12 Такое тестируемое антитело предпочтительно снижает связывание 10F6 с антигеном KIR3DL2 по меньшей мере приблизительно на 90% (например, приблизительно 95%).
Конкуренцию также можно оценить, например, посредством проточной цитометрии. В таком тесте клетки, несущие заданный полипептид KIR3DL2, можно вначале инкубировать, например, с 10G5 или 2В12, а затем с тестируемым антителом, меченым флюрохромом или биотином. Говорят, что антитело конкурирует с 10F6, если связывание при предварительном инкубировании с насыщающим количеством 10G5 или 2В12 составляет приблизительно 80%, желательно приблизительно 50%, приблизительно 40% или менее (например, приблизительно 30%, 20% или 10%) связывания (при измерении по флуоресценции), полученного для антитела без предварительного инкубирования с 10G5 или 2В12. В качестве альтернативы, говорят, что антитело конкурирует с 10G5 или 2В12, если связывание, полученное для меченого антитела 10G5 или 2В12 (флюрохромом или биотином) на клетках, предварительно инкубированных с насыщающим количеством тестируемого антитела, составляет приблизительно 80%, желательно приблизительно 50%, приблизительно 40% или менее (например, приблизительно 30%, 20% или 10%) от связывания, полученного без предварительного инкубирования с тестируемым антителом.
Кроме того, можно использовать простой конкурентный анализ, в котором тестируемое антитело предварительно адсорбируют и вносят в насыщающей концентрации на поверхность, где иммобилизован антиген KIR3DL2. Поверхность в простом конкурентном анализе предпочтительно представляет собой чип BIACORE (или другой носитель, подходящий для анализа на основе поверхностного плазменного резонанса). Затем контрольное антитело (например, 10G5 или 2В12) вступает в контакт с поверхностью при насыщающей концентрации KIR3DL2, и измеряют связывание KIR3DL2 и поверхности с контрольным антителом. Это связывание контрольного антитела сравнивают со связыванием контрольного антитела с KIR3DL2-содержащей поверхностью в отсутствие тестируемого антитела. В тестовом анализе значительное снижение связывания KIR3DL2-содержащей поверхности с контрольными антителами в присутствии тестируемого антитела указывает, что тестируемое антитело распознает главным образом тот же эпитоп, что и контрольное антитело, так что тестируемое антитело «перекрестно реагирует» с контрольным антителом. Любое тестируемое антитело, снижающее связывание контрольного (например, 10G5 или 2В12) антитела с антигеном KIR3DL2 по меньшей мере приблизительно на 30% или более, предпочтительно приблизительно на 40%, можно считать антителом, связывающимся главным образом с тем же эпитопом или детерминантой, что и контрольное антитело (например, 10G5 или 2В12). Такое тестируемое антитело предпочтительно снижает связывание контрольного антитела (например, 10G5 или 2В12) с антигеном KIR3DL2 по меньшей мере приблизительно на 50% (например, по меньшей мере приблизительно на 60%, по меньшей мере приблизительно на 70% или более). Следует принимать во внимание, что контрольное и тестируемое антитело можно поменять местами: т.е. при конкурентном анализе можно вначале связать контрольное антитело с поверхностью и ввести тестируемое антитело в контакт с поверхностью. Предпочтительно, вначале связывают с поверхностью антитело с более высоким сродством к антигену KDA3DL2, поскольку следует ожидать, что снижение связывания, наблюдаемое для второго антитела (с учетом предполагаемого перекрестного реагирования антител) будет более выраженным. Дополнительные примеры таких анализов предложены, например, в статье Saunal (1995) J. Immunol. Methods 183: 33-41, содержание которой включено в настоящий документ посредством ссылки.
Предпочтительно, моноклональные антитела, распознающие эпитоп KIR3DL2, должны реагировать с эпитопом, присутствующим на значительной доле или даже на всех соответствующих клетках, например, злокачественных CD4+ Т-клетках, клетках пациента с SS или MF, однако не должны в значительной степени реагировать с другими клетками, т.е. клетками, не экспрессирующими KIR3DL2. В одном аспекте антитела против KIR3DL2 связывают KIR3DL2, но не связывают KIR3DL1 и/или KIR3DS1.
В некоторых вариантах реализации антитела должны связываться с клетками, экспрессирующими KIR3DL2, полученными у лица или лиц с заболеванием, характеризующимся экспрессией KIR3DL2-положительных клеток, т.е. лица, являющегося кандидатом для лечения с применением одного из описанных в настоящем документе способов и антитела против KIR3DL2. Соответственно, после получения антитела, специфически распознающего KIR3DL2 на клетках, можно проверить его способность связываться с KIR3DL2-положительными клетками (например, злокачественными CD4+ Т-клетками), полученными у пациента с таким расстройством, как SS или MF. В частности, перед лечением пациента с одним из настоящих антител, полезно проверить способность антитела связывать злокачественные клетки, взятые у пациента, например, в образце крови, с целью максимизации вероятности того, что лечение будет полезно для пациента.
В одном варианте реализации антитела подвергают валидации посредством иммуноанализа для проверки их способности связываться с клетками, экспрессирующими KIR3DL2, например, злокачественными CD4+ Т-клетками, провоспалительными CD4+-клетками. Например, у множества пациентов выполняют отбор лимфоцитов периферической крови (ЛПК), и из ЛПК выделяют фракцию CD4+ Т-клеток, например, посредством проточной цитометрии с использованием соответствующих антител (для злокачественных CD4+ клеток см., например, статью Bagot et al. (2001) Blood 97:1388-1391, описание которой включено в настоящий документ посредством ссылки), или выделяют фракции CD4+CD28- клеток путем магнитного разделения на колонке MACS (Miltenyi Биотек). Затем оценивают способность данного антитела связываться с клетками с использованием стандартных способов, хорошо известных специалистам в данной области техники. Антитела, связывающиеся со значительной долей (например, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или более) клеток, заведомо экспрессирующих KIR3DL2, например, Т-клеток, от значительной доли лиц или пациентов (например, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50% или более), пригодны для применения согласно настоящему изобретению как для диагностических целей, для определения наличия или уровня злокачественных Т-клеток у пациента, так и для применения в способах лечения, описанных в настоящем документе, например, для увеличения или снижения количества или активности злокачественных Т-клеток. Для оценки связывания антител с клетками антитела можно метить прямым или непрямым образом. При непрямом мечении обычно добавляют вторичное меченое антитело. Связывание антител с клетками можно обнаружить с помощью, например, цитофлуорометрического анализа (например, FACScan). Такие способы хорошо известны специалистам в данной области техники.
Определение способности антитела связываться в пределах области эпитопа можно осуществить способами, известными специалисту в данной области техники. В одном из примеров таких способов картирования/оценки характеристик, область эпитопа для антитела против KIR3DL2 можно определить посредством эпитопного футпринтингас использованием химической модификации открытых амино/карбоксигрупп белка KIR3DL2. См., например, Ehring Н, Analytical Biochemistry, Vol. 267 (2) pp. 252-259 (1999) Engen, J.R. and Smith, D.L. (2001) Anal. Chem. 73, 256A-265A. Еще одним примером подходящей методики выявления эпитопа является картирование эпитопа посредством ядерно-магнитного резонанса (ЯМР). См., например, Ernst Schering Res Found Workshop. 2004; (44): 149-67; Huang et al. Journal of Molecular Biology, Vol. 281 (1) pp. 61-67 (1998); и Saito and Patterson, Methods. 1996 Jun; 9 (3): 516-24. Картирование/оценку характеристик эпитопа также можно выполнить с помощью масс-спектрометрии. См., например, Downard, J Mass Spectrom. 2000 Apr; 35 (4): 493-503 и Kiselar and Downard, Anal Chem. 1999 May 1; 71 (9): 1792-801. Еще одной методикой, применяемой для уточнения эпитопа связывания, является сайт-специфический мутагенез. Например, при «сканировании с помощью аланина» каждый остаток в сегменте белка замещают остатком аланина и измеряют последствия для сродства связывания. См., например, Clackson and Wells, Science 1995; 267:383-386; and Wells, Proc Natl Acad Sci USA 1996; 93:1-6. Другие формы «безметочного» анализа для оценки эпитопа включают поверхностный плазмонный резонанс (ППР, BIACORE) и рефлектометрическую интерференционную спектроскопию (RifS). См., например,  et al., Journal Of Molecular Recognition 1990; 3:208-14; Nice et al., J. Chromatogr. 1993; 646:159-168; Leipert et al., Angew. Chem. Int. Ed. 1998; 37:3308-3311; Kroger et al., Biosensors and Bioelectronics 2002; 17:937-944.
Кроме того, следует отметить, что антитело, связывающееся с тем же или главным образом с тем же эпитопом, что и антитело, описанное в настоящем документе, можно выявить при одном или более из типичных конкурентных анализов или анализов связывания с мутантными полипептидами KIR3DL2, описанных в заявке РСТ № РСТ/ЕР 2013/069302, поданной 17 сентября 2013 г. Связывание антитела против KIR3DL2 с клетками, трансфицированными мутантами KIR3DL2, измеряют и сравнивают со способностью антитела против KIR3DL2 связываться с полипептидом KIR3DL2 дикого типа (SEQ ID NO: 1). Снижение связывания между антителом против KIR3DL2 и мутантным полипептидом KIR3DL2 в настоящем описании означает, что имеет место снижение сродства связывания (например, измеряемого известными способами, например, при FACS-анализе клеток, экспрессирующих конкретный мутантный полипептид, или Biacore-анализе связывания с мутантными полипептидами) и/или снижение общей связывающей способности антитела против KIR3DL2 (например, выявляемого по снижению Вшах на графике зависимости концентрации антитела против KIR3DL2 от концентрации полипептида). Значительное снижение связывания означает, что мутированный остаток непосредственно участвует в связывании с антителом против KIR3DL2 или находится в непосредственной близости от связывающего белка при связывании антитела против KIR3DL2 с KIR3DL2. Таким образом, эпитоп антитела предпочтительно содержит такой остаток и может содержать дополнительные остатки, прилегающие к такому остатку.
4
11
-1
8
10
-1
-9
-8
-10
-9
-11
d
d
Как правило, сродство антитела против KIR3DL2 к полипептиду KIR3DL2 находится в диапазоне от приблизительно 10 до приблизительно 10 М (например, от приблизительно 10 до приблизительно 10 М). Например, антитело может характеризоваться средней константой диссоциации (K) по отношению к KIR3DL2 менее 1×10 М, согласно определению, например, с помощью скрининга на основе поверхностного плазмон резонанса (ППР) (например, с помощью ППР-аналитического устройства BIAcore™). В более типичном аспекте антитело может обладать K по отношению к KIR3DL2, составляющей от приблизительно 1×10 до приблизительно 1×10 М, или от приблизительно 1×10 до приблизительно 1×10 М.
d
d
Антитела могут характеризоваться, например, средней K, не превышающей (т.е. обладать лучшим сродством) приблизительно 100, 60, 10, 5 или 1 наномоль. K можно определить, например, путем иммобилизации рекомбинантно продуцированных белков человека KIR3DL2 на поверхности чипа с последующим внесением тестируемого антител в раствор.
После получения антигенсвязывающего соединения, его обычно оценивают на предмет интернализации (антитело предпочтительно не должно подвергаться интернализаци) в KIR3DL2-экспрессирующие клетки-мишени и/или способности вызывать интернализацию KIR3DL2 в KIR3DL2-экспрессирующих клетках-мишенях, индуцировть ADCC или CDC по отношению к ним, ингибировать провоспалительную активность и/или пролиферацию и/или устранять KIR3DL2-экспрессирующие клетки-мишени. Оценку способности антигенсвязывающего соединения интернализироваться или индуцировать ADCC, CDC или в целом приводить к устранению или ингибированию активности KIR3DL2-экспрессирующих клеток-мишеней можно выполнить на любом подходящем этапе способа, например, как описано в примерах, приведенных в настоящем документе. Эта оценка может быть полезной на одном или нескольких различных этапах выявления, получения и/или разработки антитела (или другого соединения) для терапевтического применения.
В настоящем документе не «интернализирующееся» антитело против KIR3DL2 представляет собой антитело, не поглощаемое клеткой (т.е. не проникающее в нее) в значительной степени при связывании с KIR3DL2 на клетке млекопитающего (т.е. с KIR3DL2 клеточной поверхности). Неинтернализирующееся антитело, разумеется, включает фрагменты антител, гуманизированное антитело или антитело человека и конъюгат антитела.
Возможность интернализации антитела против KIR3DL2 после связывания с KIR3DL2 на клетке млекопитающего или способность полипептида KIR3DL2 подвергаться внутриклеточной интернализации (например, после связывания с антителом) можно определить с помощью различных видов анализа, в том числе описанных в экспериментальных примерах в заявке РСТ № РСТ/ЕР2013/069302, поданной 17 сентября 2013 г., описание которой включено в настоящий документ посредством ссылки.
Тестирование ADCC обычно включает оценку клеточно-опосредованной цитотоксичности, при которой KIR3DL2-экспрессирующие клетки-мишени (например, клетки Cou-L, клетки синдрома Сезари или любая клетка, сконструированная для экспрессии KIR3DL2 на ее поверхности) со связанными антителами против KIR3DL2 распознаются эффекторными клетками, несущими Fc-рецепторы, без участия комплемента. Клетку, не экспрессирующую антиген KIR3DL2, необязательно можно использовать в качестве контроля. Активацию цитотоксичности NK-клеток оценивают путем измерения увеличения продукции цитокина (например, продукции ИФН-γ) или маркеров цитотоксичности (например, мобилизации CD107). Антитело предпочтительно должно вызывать увеличение продукции цитокина, экспрессии маркеров цитотоксичности или лизиса клеток-мишеней по меньшей мере на 20%, 50%, 80%, 100%, 200% или 500% в присутствии клеток-мишеней по сравнению с контрольным антителом (например, антителом, не связывающимся с KIR3DL2, антителом против KIR3DL2, содержащим константные области мыши). В еще одном примере обнаруживают лизис клеток-мишеней, например посредством анализа высвобождения хрома, причем антитело предпочтительно должно вызывать лизис по меньшей мере 10%, 20%, 30%, 40% или 50% клеток-мишеней. При тестировании способности антигенсвязывающего соединения (а) индуцировать ADCC и (b) интернализироваться в KIR3DL2-экспрессирующие клетки и/или вызывать интернализацию KIR3DL2 можно выполнять анализы в любом порядке.
2
В других вариантах реализации тестируют способность антител мешать связыванию HLA-лиганда KIR3DL2 (например, тетрамера димера В27 (В27)) с полипептидом KIR3DL2. См., например, анализы, описанные в заявке РСТ № РСТ/ЕР 2013/069302.
Фармацевтические составы
В одном аспекте предложен агент согласно изобретению для применения в качестве фармацевтического средства.
В одном аспекте предложен агент согласно изобретению для применения в качестве фармацевтического средства для лечения злокачественных новообразований, воспалительного расстройства или аутоиммунного заболевания.
В одном аспекте предложен агент согласно изобретению для применения в качестве фармацевтического средства для устранения или истощения клеток, экспрессирующих KIR3DL2, у пациента-человека.
В одном варианте реализации настоящего изобретения предложен фармацевтический состав, содержащий антитела, описанные в настоящем документе, вместе с одним или более носителями.
Соответственно, одна из целей настоящего изобретения состоит в предложении фармацевтического состава, содержащего такое антитело в концентрации от 1 мг/мл до 500 мг/мл, причем рН указанного состава составляет от 2,0 до 10,0. Состав может также содержать буферную систему, консервант(ы), регулятор(ы) тоничности, хелатирующий(е) агент(ы), стабилизаторы и поверхностно-активные вещества. В одном варианте реализации фармацевтический состав является водным составом, например, составом, содержащим воду. Такой состав обычно представляет собой раствор или суспензию. В дополнительном варианте реализации фармацевтический состав представляет собой водный раствор. Термин «водный состав» означает состав, содержащий по меньшей мере 50 масс. % воды. Аналогичным образом, термин «водный раствор» означает раствор, содержащий по меньшей мере 50 масс. % воды, а термин «водная суспензия» означает суспензию, содержащую по меньшей мере 50 масс. % воды.
В еще одном варианте реализации фармацевтический состав представляет собой лиофилизированный состав, к которому врач или пациент добавляет растворители и/или разбавители перед применением.
В еще одном варианте реализации фармацевтический состав представляет собой высушенный состав (например, лиофилизированный или высушенный посредством распылительной сушки), готовый к применению без предварительного растворения.
В другом аспекте фармацевтический состав содержит водный раствор такого антитела и буфер, причем антитело присутствует в концентрации от 1 мг/мл и выше, а рН указанного состава составляет от 6,0 до 8,0.
В одном варианте реализации используется состав, рН которого составляет по меньшей мере приблизительно 6 и менее приблизительно 8 (а в более общем случае - менее приблизительно 7,7, 7,6 или 7,5) (например, в диапазоне 6-7,4, например, 6-7,4, например, 6-7, 6,2-7, 6,4-7,4, 6,5-7,5, 6,7-7,7 или приблизительно 7, приблизительно 7,4 и т.д.).
В дополнительном варианте реализации буфер выбирают из группы, состоящей из ацетата натрия, карбонат натрия, цитрата, глицилглицина, гистидина, глицина, лизина, аргинина, дигидрофосфата натрия, гидрофосфата натрия, фосфата натрия, цитрата натрия, бората натрия, трис(гидроксиметил)аминометана, бицина, трицина, яблочной кислоты, сукцината, малеиновой кислоты, фумаровой кислоты, винной кислоты, аспарагиновой кислоты или их смесей. Каждый из этих конкретных буферов представляет собой альтернативный вариант реализации изобретения.
th
В дополнительном варианте реализации состав дополнительно содержит фармацевтически приемлемый консервант. Консервант можно выбрать из, например, группы, состоящей из фенола, о крезола, м крезола, п крезола, метил-п-гидроксибензоата, пропил-п-гидроксибензоата, 2-феноксиэтанола, бутил-п-гидроксибензоата, 2-фенилэтанола, бензилового спирта, хлорбутанола и тиомерсала, бронопола, бензойной кислоты, имидомочевины, хлоргексидина, дегидроацетата натрия, хлоркрезола, этил-п-гидроксибензоата, хлорида бензэтония, хлорфенезина (3р-хлорфеноксипропан-1,2-диола) или их смесей. Консервант может присутствовать, например, в концентрации от 0,1 мг/мл до 20 мг/мл, от 0,1 мг/мл до 5 мг/мл, от 5 мг/мл до 10 мг/мл, или от 10 мг/мл до 20 мг/мл. Каждый из этих конкретных консервантов представляет собой альтернативный вариант реализации изобретения. Применение консервантов в фармацевтических композициях хорошо известно специалистам. Для удобства приведена ссылка на Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19 edition, 1995.
th
В дополнительном варианте реализации состав дополнительно содержит изотонический агент. Изотонический агент можно выбрать, например, из группы, состоящей из соли (например, хлорида натрия), углевода или сахароспирта, аминокислоты (например, L-глицина, L-гистидина, аргинина, лизина, изолейцина, аспарагиновой кислоты, триптофана, треонина), альдита (например, глицерина, 1,2-пропандиола (пропиленгликоля), 1,3-пропандиола, 1,3-бутандиола), полиэтиленгликоля (например, ПЭГ400), или их смесей. Можно использовать любой углевод, например, моно-, ди- или полисахариды или водорастворимые глюканы, включая, например, фруктозу, глюкозу, маннозу, сорбозу, ксилозу, мальтозу, лактозу, сахарозу, трегалозу, декстран, пуллулан, декстрин, циклодекстрин, растворимый крахмал, гидроксиэтилкрахмал и Na-карбоксиметилцеллюлозу. В одном варианте реализации углеводная добавка представляет собой сахарозу. Сахароспирт по определению представляет собой С4-С8-углеводород, содержащий по меньшей мере одну ОН-группу и включает, например, маннит, сорбит, инозит, галактит, дульцит, ксилит и арабит. В одном варианте реализации добавка на основе сахароспирта представляет собой маннит. Вышеупомянутые углеводы или сахароспирты можно использовать по отдельности или в комбинации. Фиксированного ограничения на используемое количество не существует, при условии, что углевод или сахароспирт растворяется в жидком препарате и не оказывает отрицательного влияния на стабилизирующий эффект, достигаемый с помощью способов согласно изобретению. Концентрация углевода или сахароспирта может составлять, например, от приблизительно 1 мг/мл до приблизительно 150 мг/мл. Изотонический агент может присутствовать, например, в концентрации от 1 мг/мл до 50 мг/мл, от 1 мг/мл до 7 мг/мл, от 8 мг/мл до 24 мг/мл, или от 25 мг/мл до 50 мг/мл. Каждый из этих конкретных изотонических агентов представляет собой альтернативный вариант реализации изобретения. Применение изотонического агента в фармацевтических композициях хорошо известно специалистам. Для удобства приведена ссылка на Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19 edition, 1995.
th
В дополнительном варианте реализации состав также содержит хелатирующий агент. Хелатирующий агент можно выбрать, например, из солей этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), лимонной кислоты и аспарагиновой кислоты и их смесей. Хелатирующий агент может присутствовать, например, в концентрации от от 0,1 мг/мл до 5 мг/мл, от 5 мг/мл до 2 мг/мл или от 2 мг/мл до 5 мг/мл. Каждый из этих конкретных хелатирующих агентов представляет собой альтернативный вариант реализации изобретения. Применение хелатирующего агента в фармацевтических композициях хорошо известно специалистам. Для удобства приведена ссылка на Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19 edition, 1995.
th
Состав может содержать или не содержать стабилизатор. Применение стабилизатора в фармацевтических композициях хорошо известно специалистам. Для удобства приведена ссылка на Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19 edition, 1995. В частности, композиции согласно настоящему изобретению могут представлять собой стабилизированные жидкие фармацевтические композиции, терапевтически активные компоненты которых включают полипептид, возможно, демонстрирующий образование агрегатов при хранении в жидких фармацевтических составах. Под «образованием агрегатов» подразумевают физическое взаимодействие между молекулами полипептида, ведущее к образованию олигомеров, которые могут оставаться растворимыми, или крупных видимых агрегатов, которые выпадают в осадок из раствора. Под термином «во время хранения» подразумевают, что жидкую фармацевтическую композицию или состав после получения не сразу вводят субъекту. Вместо этого после получения их упаковывают для хранения в жидкой форме, в замороженном состоянии или в высушенной форме для последующего восстановления в жидкой форме или в другой форме, пригодной для введения субъекту. Под термином «высушенная форма» подразумевают, что жидкую фармацевтическую композицию или состав высушивают путем сублимационной сушки (т.е. лиофилизации), распылительной сушки или на воздухе. Образование агрегатов полипептида при хранении жидкой фармацевтической композиции может неблагоприятно влиять на биологическую активность этого полипептида, что приводит к потере терапевтической эффективности фармацевтической композиции. Кроме того, образование агрегатов может вызвать другие проблемы, например, засорение трубок, мембран или насосов при введении фармацевтической композиции, содержащей полипептид, с помощью системы вливания.
Фармацевтические композиции согласно изобретению могут дополнительно содержать или не содержать аминокислотную основу в количестве, достаточном для снижения образования агрегатов полипептида при хранении композиции. Под «аминокислотной основой» подразумевают аминокислоту или комбинацию аминокислот, где любая заданная аминокислота присутствует в своей основной свободной форме или в форме соли. При использовании комбинации аминокислот все аминокислоты могут присутствовать в своей свободной основной форме, все аминокислоты могут присутствовать в форме их солей, или некоторые из них могут присутствовать в свободной основной форме, в то время как другие присутствуют в форме их солей. В одном варианте реализации аминокислоты, применяемые для получения композиций согласно изобретению, представляют собой аминокислоты, несущие заряженную боковую цепь, например, аргинин, лизин, аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту. Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению могут содержать любой стереоизомер (т.е. L, D или их смеси) конкретной аминокислоты (метионина, гистидина, имидазола, аргинина, лизина, изолейцина, аспарагиновой кислоты, триптофана, треонина и их смесей) или комбинацию этих стереоизомеров, при условии, что указанные конкретные аминокислоты присутствуют в своей свободной основной форме или в форме их солей. В одном варианте воплощения используют L-стереоизомер. Композиции согласно изобретению также можно составить с использованием аналогов этих аминокислот.
В дополнительном варианте реализации изобретения можно добавить метионин (или другие серусодержащие аминокислоты или аналоги аминокислот) для ингибирования окисления остатков метионина с образованием метионинсульфоксида, если полипептид, выступающий в качестве терапевтического агента, содержит по меньшей мере один остаток метионина, чувствительный к такому окислению. Под термином «ингибирование» подразумевают минимальное накопление окисленных форм метионина с течением времени. Ингибирование окисления метионина приводит к лучшему удерживанию полипептида в надлежащей молекулярной форме. Можно использовать любой стереоизомер метионина (L или D) или их комбинации. Добавляемое количество должно представлять собой количество, достаточное для ингибирования окисления остатков метионина, так что количество метионинсульфоксида является приемлемым для регулирующих органов. Как правило, это означает, что композиция содержит не более чем от приблизительно 10% до приблизительно 30% метионинсульфоксида. Как правило, этого можно достичь путем добавления метионина таким образом, что соотношение добавленного метионина к остаткам метионина колеблется от приблизительно 1:1 до приблизительно 1000: 1, например, от 10:1 до приблизительно 100:1.
В дополнительном варианте реализации состав дополнительно содержит стабилизатор, выбранный из группы высокомолекулярных полимеров или низкомолекулярных соединений. В дополнительном варианте реализации изобретения стабилизатор выбирают из полиэтиленгликоля (например, ПЭГ 3350), поливинилового спирта (ПВС), поливинилпирролидона, карбокси-/гидроксицеллюлозы или их производных (например, НРС, HPC-SL, HPC-L и НРМС), циклодекстринов, серусодержащих соединений, например, монотиоглицерина, тиогликолевой кислоты и 2-метилтоэтанола, и различных солей (например, хлорида натрия). Каждый из этих конкретных стабилизаторов представляет собой альтернативный вариант реализации изобретения.
Фармацевтические композиции могут также содержать дополнительные стабилизирующие агенты, которые дополнительно повышают стабильность терапевтически активного полипептида в их составе. Стабилизирующие агенты, представляющие особый интерес для настоящего изобретения, включают метионин и ЭДТА, защищающие полипептид от окисления метионина, и неионогенное ПАВ, которые защищает полипептид против агрегации, связанной с замораживанием-размораживанием или механическим гидродинамическим фрагментированием, но не ограничиваются ими.
α
α
α
В дополнительном варианте реализации состав дополнительно содержит поверхностно-активное вещество. Поверхностно-активное вещество можно выбрать, например, из детергента, этоксилированного касторового масла, полигликозилированных глицеридов, ацетилированных моноглицеридов, сложных эфиров сорбитана и жирных кислот, блок-полимеров полиоксипропилена-полиоксиэтилена (например, полоксамеров, например, Pluronic F68, полоксамера 188 и 407, Triton Х-100), сложных эфиров полиоксиэтиленсорбитана и жирных кислот, полиоксиэтилена и производных полиоксиэтилена, например, алкилированных и алкоксилированных производных (твинов, например, Tween-20, Tween-40, Tween-80 и Brij-35), моноглицеридов или их этоксилированных производны, диглицеридов или их производных полиоксиэтилена, спиртов, глицерина, лектинов и фосфолипидов (например, фосфатидилсерина, фосфатидолхолина, фосфатидилэтаноламина, фосфатид ил инозита, дифосфатидилглицерина и сфингомиелина), производных фосфолипидов (например, дипальмитоилфосфатидной кислоты) и лизофосфолипидов (например, пальмитоиллизофосфатидил-L-серина и сложных эфиров 1-ацил-sn-глицеро-3-фосфата и этаноламина, холина, серина или треонина) и алкильных, алкоксильных (алкоксиэфирных), алкокси-(алкилэфирных) производных лизофосфатидила и фосфатидилхолинов, например, лаурильных и миристильных производных лизофосфатидилхолина, дипальмитоилфосфатидилхолина, и модификаций полярной головной группы, представляющей собой холины, этаноламины, фосфатидную кислоту, серины, треонины, глицерин, инозит и положительно заряженные DODAC, DOTMA, DCP, BISHOP, лизофосфатидилсерин и лизофосфатидилтреонин, и глицерофосфолипидов (например, цефалинов), глицерогликолипидов (например, галактопиранозида), сфингогликолипидов (например, церамидов, ганглиозидов), додецилфосфохолина, лизолецитина куриного яйца, производных фузидовой кислоты (например, тауродигидрофузидата натрия и т.д.), длинноцепочечных жирных кислот С6-С12 (например, олеиновой кислоты и каприловой кислоты), ацилкарнитинов и производных, N-ацилированных производных лизина, аргинина или гистидина, или производных лизина или аргинина, ацилированных по боковой цепи, N-ацилированных производных дипептидов, содержащих любую комбинацию лизина, аргинина или гистидина и нейтральной или кислой аминокислоты, N-ацилированного производного трипептида, содержащего любую комбинацию нейтральной аминокислоты и двух заряженных аминокислот, DSS (докузата натрия, № в реестре CAS [577-11-7]), докузата кальция, № в реестре CAS [128-49-4]), докузата калия, № в реестре CAS [7491-09-0]), ДСН (додецилсульфата натрия или лаурилсульфата натрия), каприлата натрия, холевой кислоты или ее производных, желчных кислот и их солей и конъюгатов глицина или таурина, урсодезоксихолевой кислоты, холата натрия, дезоксихолата натрия, таурохолата натрия, гликохолата натрия, N-гексадецил-N,N-диметил-3-аммоний-1-пропансульфоната, анионных (алкиларилсульфонатов) одновалентных поверхностно-активных веществ, цвиттерионных поверхностно-активных веществ (например, N-алкил-N,N-диметиламмоний-1-пропансульфонатов, 3-холамид-1-пропилдиметиламмоний-1-пропансульфоната, катионных поверхностно-активных веществ (четвертичных солей аммония) (например, бромида цетилтриаммония, хлорида цетилпиридиния), неионогенных поверхностно-активных веществ (например, додецилβ-D-глюкопиранозида), полоксаминов (например, Tetronic), представляющих собой тетрафункциональные блок-сополимеры, полученные путем последовательного добавления пропиленоксида и этиленоксида к этилендиамииу, либо поверхностно-активное вещество можно выбрать из группы производных имидазолина или смесей вышеперечисленного. Каждое из этих конкретных поверхностно-активных веществ представляет собой альтернативный вариант реализации изобретения.
В дополнительном варианте реализации состав дополнительно содержит ингибиторы протеаз, например, ЭДТА (этилендиаминтетрауксусную кислоту) и бензамидин-HCl, однако можно использовать и другие доступные для приобретения ингибиторы протеаз. Использование ингибитора протеаз особенно полезно в фармацевтической композиции, содержащей проферменты протеаз, для ингибирования автокатализа. В пептидном фармацевтическом составе согласно настоящему изобретению могут присутствовать другие ингредиенты. Такие дополнительные ингредиенты могут включать увлажнители, эмульгаторы, антиоксиданты, наполнители, модификаторы тоничности, хелатирующие агенты, ионы металлов, масляные носители, белки (например, человеческий сывороточный альбумин, желатин или белки) и цвиттерион (например, такую аминокислоту, как бетаин, таурин, аргинин, глицин, лизин и гистидин). Такие дополнительные ингредиенты, разумеется, не должно оказывать нежелательного влияния на общую стабильность фармацевтического состава согласно настоящему изобретению. Фармацевтические композиции, содержащие антитело согласно настоящему изобретению, можно вводить пациенту, нуждающемуся в таком лечении, в различные области, например, наружно, например, на участки кожи и слизистых оболочек, в области, которые позволяют избежать поглощения, например, путем введения в артерию, в вену, в сердце и в области, где происходит поглощение, например, путем введения в кожу, под кожу, в мышцу или в брюшную полость.
Введение фармацевтической композиции согласно изобретению пациентам, нуждающимся в лечении, можно осуществлять любым из нескольких путей введения, например, подкожно, внутримышечно, внутрибрюшинно, внутривенно, лингвально, сублингвально, буккально, в ротовую полость, перорально, в желудок и кишечник, назально, пульмонально, например, в бронхиолы и альвеолы или их комбинацию, эпидермально, дермально, трансдермально, вагинально, ректально, в глаза, например, через конъюнктиву, уретрально и парентерально.
Композиции согласно настоящему изобретению можно вводить в виде любой из нескольких лекарственных форм, например, в виде растворов, суспензий, эмульсий, микроэмульсий, множественных эмульсий, пен, мазей, паст, пластырей, притираний, таблеток, таблеток в оболочке, полосканий, капсул, например, твердых желатиновых капсул и мягких желатиновых капсул, суппозиториев, ректальных капсул, капель, гелей, спреев, порошков, аэрозолей, ингалянтов, глазных капель, глазных мазей, офтальмологических полосканий, вагинальных пессариев, вагинальных колец, вагинальных мазей, раствора для инъекций, растворов, преобразующихся in situ, например, путем гелеобразования in situ, сгущения in situ, преципитации in situ, кристаллизации in situ, раствора для вливаний и имплантатов. Стабильность состава согласно любому из аспектов, описанных в настоящем документе, можно, в числе прочего, характеризовать по отсутствию высокомолекулярных примесей (например, примесей, которые указывают на агрегацию (мультимеров) молекул антитела в составе). В одном аспекте состав согласно изобретению можно характеризовать состав с содержанием высокомолекулярных (ВМ) примесей менее приблизительно 10% (например, приблизительно 5% или менее) в течение по меньшей мере одного дня, например, по меньшей мере приблизительно одной недели, например, по меньшей мере приблизительно 2 недель, по меньшей мере приблизительно 1 месяца, по меньшей мере приблизительно 2 месяцев или даже по меньшей мере приблизительно 3 месяцев хранения при температуре приблизительно 5°С.
В одном варианте реализации изобретения фармацевтический состав, содержащий антитело, стабилен в течение более чем 1 года, необязательно 2 лет хранения, необязательно 3 лет хранения. В еще одном варианте реализации изобретения фармацевтический состав, содержащий антитело, стабилен в течение более чем 4 недель использования и более чем 3 лет хранения. В дополнительном варианте реализации изобретения фармацевтический состав, содержащий антитело, стабилен в течение более чем 4 недель использования и более чем двух лет хранения. В дополнительном варианте реализации изобретения фармацевтический состав, содержащий антитело, стабилен в течение более чем 2 недель использования и более чем двух лет хранения.
В одном аспекте изобретения предложен состав, содержащий хлорид натрия в качестве модификатора тоничности.
В одном варианте реализации изобретения предложен состав, содержащий буфер на основе фосфата натрия или цитрата натрия (основание).
В одном варианте реализации изобретения предложен состав, содержащий полисорбат 80 в качестве поверхностно-активного вещества.
Состав согласно любому из аспектов изобретения может содержать любую подходящую концентрацию антитела. Как правило, концентрация составляет о приблизительно 0,05 мг/мл до приблизительно 10 мг/мл (например, от приблизительно 1 мг/мл до приблизительно 5 мг/мл). В одном типичном аспекте предложен состав в виде относительно концентрированного состава антитела, который может представлять собой, например, состав с концентрацией приблизительно 10 мг/мл, который следует разбавить перед введением (обычно путем внутривенного введения или прямого парентеральной инъекции). В еще одном типичном аспекте предложен состав в виде относительно разбавленного состава, например, состава, готового для вливания/инъекции, причем концентрация антител в составе составляет приблизительно 0,05 мг/мл или приблизительно 0,1 мг/мл.
В одном аспекте состав содержит концентрацию антител приблизительно 1 мг/мл.
В типичном аспекте изобретения предложен фармацевтически приемлемый и активный состав, полученный из смеси ингредиентов, включающий (а) количество IgG-антитела согласно описанию, обеспечивающее концентрацию антитела в составе от приблизительно 0,5 мг/мл до приблизительно 10 мг/мл; (b) фосфат натрия (например, двухосновный натрия фосфат/одноосновный фосфат калия), цитрат натрия (например цитрат натрия / лимонную кислоту) или борат натрия (борат натрия / борную кислоту); (с) хлорид натрия; и (е) полисорбат 80, причем рН состава составляет величину между приблизительно 6,7 и 7,7, или приблизительно 7,4.
Дополнительные аспекты и преимущества описаны в следующем экспериментальном разделе, который следует рассматривать в качестве иллюстративного и не ограничивающего область действия настоящей заявки.
ПРИМЕРЫ
Пример 1 - Получение гуманизированных антител против KIR3DL2 путем пересадки CDR
Антитела против KIR3DL2 были получены в заявке РСТ № РСТ/ЕР 2013/069302, поданной 17 сентября 2013 как кандидаты для гуманизации.
Гуманизацию впервые выполняли путем пересадки области, определяющей комплементарность (CDR) тяжелой и легкой цепей, с последующим введением обратных мутаций. Исходные гены мыши и гены человека, использованные для моделирования и конструирования, приведены ниже в таблице 1. Антитела продуцировали с использованием клеток СНО.
Антитело 10G5
Выравнивание гуманизированных белковых последовательностей легких цепей 10G5 показано ниже. 10G5-LC показана в SEQ ID NO: 34. IGKV1-NL1 показана в SEQ ID NO: 35. Hum2C4 показана в SEQ ID NO: 36. 3RKD показана в SEQ ID NO: 37. CDR подчеркнуты в 10G5-LC, обратные мутации подчеркнуты в вариантах от -L1 до -L5.
Гуманизированное антитело 2С4 (против ErbB2, pdb 1S78 и 1L7I) и антитело 8С11 мыши (против белка капсида вируса гепатита Е, pdb 3RKD) использовали в качестве матрицы для структурной перспективной оценки. Исходный JK-сегмент и остатки зоны Вернье исходной каркасной области 2 (FW2) (в том числе смежные фланкирующие остатки) оставляли без изменений. Таким образом, легкую цепь L2 использовали в качестве основной исходной матрицы для дополнительных обратных мутаций.
В конечном итоге для получения антитела окончательно выбирали четыре легкие цепи L2, L3, L4 и L5.
Выравнивание гуманизированных белковых последовательностей тяжелых цепей 10G5 показано ниже. 10G5-HC показана в SEQ ID NO: 38. IGHV1-46 показана в SEQ ID NO: 39. 1i9r показана в SEQ ID NO: 40. 1it9 показана в SEQ ID NO: 41. 1Е60 показана в SEQ ID NO: 42. CDR подчеркнуты в последовательности 10G5-LC, обратные мутации подчеркнуты в вариантах от -HI до -Н6.
Гуманизированное антитело HFE7A против Fas (pdb 1IT9), гуманизированное антитело 5С8 против CD40-L (pdb 1I9R) и антитело 13В5 мыши против белка р24 капсида ВИЧ-1 (pdb 1Е60) использовали в качестве матриц для структурной перспективной оценки. На основе обследования 3D-структуры, три из пяти остатков зоны Вернье FW3 оставляли без изменений. Остатки зоны Вернье FW2 также не модифицировали. Таким образом, тяжелую цепь Н3 использовали в качестве основной исходной матрицы для дополнительных обратных мутаций. В конечном итоге для получения антитела окончательно выбирали четыре тяжелые цепи Н3, Н4, Н5 и Н6.
Антитело 2В12
Два гена VK человека использовали для пересадки CDR при мозаичном подходе. FW1 брали из IGKV 1-39, a FW2 и FW3 - из IGKV4-1.
Выравнивание гуманизированных белковых последовательностей легкой цепи показано ниже. 2B12-LC показана в SEQ ID NO: 43. IGKV 1-39 показана в SEQ ID NO: 44. IGKV4-1 показана в SEQ ID NO: 45. 1NCA показана в SEQ ID NO: 46. 1ZA6 показана в SEQ ID NO: 47. 1PG7 показана в SEQ ID NO: 48. 1b2w показана в SEQ ID NO: 49. 1fvd показана в SEQ ID NO: 50. 2fgw показана в SEQ ID NO: 51. CDR подчеркнуты в последовательности 2B12-LC, обратные мутации подчеркнуты в вариантах от -L0 до -L4.
Гуманизированное антитело СС49 против TAG-72 (pdb 1ZA6), гуманизированное антитело D3H44 против тканевого фактора (pdb 1PG7), гуманизированное антитело 4D5 против p185HER2 (pdb 1FVD), гуманизированное антитело против гамма-интерферона (pdb 1B2W), гуманизированное антитело против CD 18 (pdb 2FGW) и антитело NC41 мыши против нейраминидазы вируса гриппа подтипа N9 (pdb 1NCA) использовали в качестве матриц для структурной перспективной оценки. Остатки зоны Вернье FW3 оставляли без изменений. Таким образом, легкую цепь L1 использовали в качестве основной исходной матрицы для дополнительных обратных мутаций. В конечном итоге для получения антитела окончательно выбирали четыре легкие цепи L1, L2, L3 и L4.
Два гена VH человека использовали для пересадки CDR при мозаичном подходе. FW1 и FW3 взяли из IGHV7-4-1*02, a FW2 - из IGHV1-c*01.
Выравнивание гуманизированных белковых последовательностей тяжелой цепи показано ниже. 2В12-НС показана в SEQ ID NO: 52. IGHV7 показана в SEQ ID NO: 53. IGHV1-c показана в SEQ ID NO: 54. 1BJ1-H показана в SEQ ID NO: 55. 9046-Н показана в SEQ ID NO: 56. CDR подчеркнуты в последовательности 2В12-НС, обратные мутации подчеркнуты в вариантах от -H1 до -Н4.
Гуманизированное нейтрализующее антитело против ФРЭС (pdb 1BJ1) и антитело цитатузумаб богатокс (9046-Н), соответственно, использовали в качестве матрицы для структурной перспективной оценки и сравнения первичных последовательностей. На основе оценки 3D-структуры 1BJ1 остаток Lys39 области взаимодействия VH/VL FW2, а также Phe FW3, расположенный непосредственно перед последним Cys, оставляли без изменений. Таким образом, тяжелую цепь H1 использовали в качестве основной исходной матрицы для дополнительных обратных мутаций и получения вариантов Н3 и Н4. В качестве альтернативы также включали вариант, содержащий три FW IGHV7-4-1 (Н2).
В конечном итоге для получения антитела окончательно выбрали четыре тяжелые цепи 2 В12-Н1, Н2, Н3 и Н4.
Полученные аминокислотные последовательности вариабельных областей легкой и тяжелой цепи 2В12 и 10G5 приведены ниже (L обозначает легкую цепь, Н обозначает тяжелую цепь).
Конструировали шестнадцать гуманизированных вариантов каждого из антител 2В12 и 10G5, содержавшие различные обратные мутации (аминокислоты мышиного происхождения вместо остатков каркасных областей человека) по сравнению с исходной химерной версией. Все варианты антител успешно продуцировались в клетках СНО как IgG1-антитела человека в комбинациях, показанных ниже в таблицах 2 и 3.
-3
Варианты антител очищали и анализировали титрованием в ходе проточной цитометрии с использованием линии KIR3DL2-положительных клеток. Вкратце, клетки линии RAJI-KIR3DL2 подсчитывали при окрашивании трипановым синим. Концентрацию клеток доводили до I миллиона на мл. 100 мкл предыдущей суспензии переносили в 96-луночный микропланшет с U-образным дном лунок (100000 клеток на лунку). Клетки IX промывали буфером для окрашивания (SB) в количестве 100 мкл/лунку и осаждали в течение 2 мин при 400 g. Выполняли разбавление каждого очищенного антитела в диапазоне 1/3 с концентрации 100 мкг/мл до 2.10 мкг/мл. 50 мкл каждого разведения добавляли в каждую лунку. Клетки инкубировали в течение 1 ч при 4°С. Клетки 3Х промывали SB (100 мкл) и осаждали в течение 2 мин при 400 g. В планшет добавляли антитело козы против РЕ человека (Fc-SPE), разбавленное в соотношении 1/200, и инкубировали клетки в течение 30 мин при температуре 4°С. Клетки 2Х промывали и немедленно анализировали на цитометре FACS CANTO. Все супернатанты в данном анализе были положительными, что указывает на сохранение связывания всех гуманизированных вариантов с антигеном-мишенью.
Было обнаружено, что все варианты антител 2В12 и 10G5 одинаково хорошо связываются с клетками-мишенями по сравнению с исходными химерными версиями и не отличаются друг от друга и от химерных антител в этом анализе.
Для сравнения, у другого гуманизированного антитела против KIR3DL2 наблюдали полную потерю сродства. Для некоторых вариантов этого клона, например, H4L1, H4L2 и H4L3, повторное введение остатков мыши в каркасные последовательности человека (обратная мутация) немного улучшило кажущееся связывание с антигенами клеточной поверхности, но не восстановило полную связывающую активность.
Пример 2 - Выявление гуманизированных антител против KIR3DL2 со сниженной склонностью к агрегации
Склонность к агрегации гуманизированных вариантов 2В12 и 10G5, продуцированных в формате IgG1 человека, изучали по отношению к рН их состава. Для анализа склонности каждого мАт к агрегации требовалось приблизительно 1 мг очищенного материала.
Были изучены следующие моноклональные антитела (мАт): 2B12-H1L1; 2B12-H1L2; 2В12-H2L1; 2B12-H2L2; 10G5-H3L2; и 10G5-H4L2.
Склонность этих моноклональных антител к агрегации оценивали в зависимости от рН их состава. Отбирали в общей сложности пять фармацевтически приемлемых буферных растворов в диапазоне рН от 5,5 до 8; таким образом, каждое мАт получали в виде пяти составов при конечной концентрации 1 мг/мл, как показано в таблицах 4-8.
Исходные растворы каждого очищенного мАт подготавливали в составе с PBS IX; другие составы получали путем замены буфера с помощью диализа.
agg
agg
Склонность каждого состава мАт к агрегации экспериментально оценивали путем измерения и сравнения их температуры агрегации (T). T измеряли с использованием анализа стабильности при тепловом сдвиге (TSSA). TSSA измеряет температуру агрегации пептидов и белков в водных растворах, используя набор "ProteoStat Thermal Shift Stability Assay" (доступный в Enzo Life Sciences Inc., Фармингдэйл, штат Нью-Йорк, США). Образец, подлежащий анализу, нагревали от 0 до 100°С и считывали флуоресценцию при повышении температуры. При достижении температуры агрегации обнаруживали значительное увеличение флуоресценции образца. Для этого измерения флуоресценции использовали молекулярный роторный зонд с возбуждением при 480 нм. Он совместим с широким диапазоном рН (4-10), и устойчив к поверхностно-активным веществам, например, полисорбату 80, при нормальных концентрациях.
Результаты
agg
Результаты показаны ниже в таблице 9. Исходную чистоту (%) измеряли с помощью SE-ВЭЖХ для состава каждого мАт, содержащего PBS IX + полисорбат 80 в концентрации 0,1 мг/мл, рН=7,4. Циклы анализа обозначали как отмененные, поскольку полученное значение слишком сильно отличалось от среднего значения, согласно протоколу исследования. Прерванный цикл 1 для 2B12-H2L1 при рН 5,5 остановили, считая, что полученный результат был аномальным, поскольку значение T казалось очень высоким. Фактически был получен нормальный результат, однако оставшегося мАт было недостаточно для выполнения третьего достоверного цикла анализа.
Все антитела продемонстрировали стабильность при значениях рН, соответствующих составам, которые позволяют избежать риска химического разложения мАт в течение длительного срока хранения. Антитела продемонстрировали стабильность при рН=7,4, равном рН крови; риск химического разложения мАт в течение длительного срока хранения низок. Для всех протестированных вариантов экспериментальные значения pi, измеренные с помощью гель-ИЭФ, находились в щелочном диапазоне рН (более рН 9). Следовательно, антитела 2В12 и 10G5 несут суммарный положительный заряд при всех протестированных рН. Выбранные значения рН (рН 7,0 или 7,4), которые существенно ниже экспериментальных значений pf, также должны обеспечивать высокую растворимость обоих вариантов антител в воде.
С точки зрения склонности к агрегации имел место неожиданно большой разрыв между вариантами 2В12-H1L1 или H1L2 и H2L1 или H2L2. H2L1 или H2L2 характеризовались значительно более высокой температурой агрегации, чем H1L1 или H1L2 и, таким образом, должны были обладать значительно лучшей физической стабильностью. Это можно объяснить наличием глутамина (Q) в положении 39 тяжелой цепи Н2 (нумерация Abnum). Действительно, при моделировании мАт с использованием программного обеспечения Discovery Studio между VH_Q39 и VL_Q38 образуются две Н-связи, как показано на фигурах 1А и 1В. Эти две Н-связи могут стабилизировать четвертичную структуру мАт, предотвращая экспозицию некоторых гидрофобных областей, которые могут вызывать агрегацию белка.
Аналогично вариантам 2В12, для вариантов H3L2 и H4L2 МАВ 10G5, также содержащих две Н-связи между VH_Q39 и VL_Q38, наблюдались высокие температуры агрегации. Они также демонстрировали хорошую физическую стабильность.
Пример 3 - Эффективность ответа 2B12-H2L1 в зависимости от дозы у СВ17-ТКИН-мышей с трансплантатами Raji-KIR3DL2 high в модели в/в введения
Целью данного исследования являлась оценка возможности увеличения продолжительности жизни СВ17-ТКИН-мышей с внутривенной (в/в) трансплантацией В-опухолевых клеток человека Raji-KIR3DL2 с помощью антитела 2B12-H2L1 в зависимости от дозы.
После проверки экспрессии KJJR3DL2 на поверхности клеток и связывания антитела 2В12-H2L1, 48 ТКИН-мышей подвергли в/в трансплантации 5М клеток Raji-KIR3DL2 high (пересев №5, 97% жизнеспособность). В/б лечение начали через день после трансплантации; антитела вводили однократно в дозе 0,01, 0,1, 1 мкг и 10 мкг/мышь.
Организовали 6 групп (n=8):
- Контрольной группе вводили изотипический контроль (IC) в дозе 10 мкг/мышь
- Экспериментальной группе вводили 2B12-H2L1 в дозе 0,01 мкг/мышь
- Экспериментальной группе вводили 2B12-H2L1 в дозе 0,1 мкг/мышь
- Экспериментальной группе вводили 2B12-H2L1 в дозе 1 мкг/мышь
- Экспериментальной группе вводили 2B12-H2L1 в дозе 10 мкг/мышь
После в/в трансплантации клеток Raji-KIR3DL2 high мыши группы, обработанной изотопическим контролем, быстро погибли; медиана выживаемости составила 20 дней (таблица 10).
Кривые выживаемости и медианы выживаемости групп, получавших 2В12 во всех дозах, продемонстрировали значительное повышение по сравнению с контрольными группами (фигура 2). Тем не менее процентное увеличение продолжительности жизни (ILS) было значительно выше при обработке мышей 1 и 10 мкг мАт, но не 0,01 и 0,1 мкг мАт (таблица 10). 2В12 могло индуцировать ADCC даже при низких концентрациях.
Результаты показаны на Фигуре 2. Кривые выживания мышей СВ17-ТКИН после в/в трансплантации 5М клеток Raji-KIR3DL2 high, в/б обработанных антителом 2В12, в зависимости от дозы (n=8/группу). Лечение начинали с 1 дня. Эксперимент окончили через 58 дней.
Данное исследование показало, что обработка с применением 2В12 значительно увеличивала выживаемость СВ17-ТКИН-мышей в модели в/в введения даже при низких дозах.
Все заголовки и подзаголовки используются в настоящем документе лишь для удобства; не следует подразумевать, что они ограничивают изобретение каким-либо образом. Любая комбинация вышеописанных элементов во всех их возможных вариантах входит в состав изобретения, если иное не указано в данном документе, или не противоречит контексту явным образом. Диапазоны значений указаны в настоящем документе лишь для сокращения отдельных упоминаний каждого отдельно взятого значения, входящего в указанный диапазон, если иное не указано в настоящем документе; каждое отдельное значение входит в описание изобретения, как если бы оно было отдельно указано в настоящем документе. Если не указано иное, все точные значения, представленные в настоящем документе, являются типичными примерами соответствующих приближенных значений (например, все точные типичные значения конкретного фактора или измерения можно считать также относящимися к соответствующему приблизительному измерению при добавлении слова «приблизительно» в соответствующих случаях).
Все способы, описанные в настоящем документе, можно выполнять в любом подходящем порядке, если в настоящем документе не указано иное или иное не противоречит контексту явным образом.
Использование всевозможных примеров или типичных выражений (например, выражения «такой как») в настоящем документе предназначено только для лучшего освещения изобретения и не накладывает ограничений на область изобретения, если не указано иное. Ни одно выражение в описании не следует толковать как указание на какой-либо элемент, имеющий важное значение для практической реализации изобретения, если только это не указано явным образом.
Цитирование и включение патентных документов в настоящий документ выполнено лишь для удобства и не отражает точку зрения о действительности, патентоспособности и/или исполнимости таких патентных документов. Приведенное в настоящем документе описание любого аспекта или варианта реализации настоящего изобретения с использованием таких терминов, как ссылка на элемент или элементы, предназначено для подтверждения за счет подобного аспекта или варианта реализации изобретения, который «состоит из», «главным образом состоит из» или «главным образом содержит» данный конкретный элемент или элементы, если не указано иное или иное не противоречит контексту явным образом (например, если в настоящем документе описано, что композиция содержит определенный элемент, следует понимать, что это также относится к композиции, состоящей из этого элемента, если не указано иное или иное не противоречит контексту явным образом).
Настоящее изобретение включает все модификации и эквиваленты предмета изобретения, упомянутые в аспектах или формуле изобретения, представленных в настоящем документе, в максимально возможной степени, разрешенной действующим законодательством.
Все публикации и патентные заявки, упомянутые в настоящем описании, полностью включены в настоящий документ посредством ссылок для всех целей, как если бы каждая отдельная публикация, патент или патентная заявка были специально и по отдельности включены посредством ссылки.
Хотя настоящее изобретение подробно описано посредством иллюстрации и примера для целей ясности понимания, для специалиста в данной области техники в свете идей настоящего изобретения очевидно, что в него можно внести определенные изменения и модификации без отступления от сущности или области прилагаемой формулы изобретения.