СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУММАРНОГО СОДЕРЖАНИЯ АНТИОКСИДАНТОВ ТИОЛОВОЙ ПРИРОДЫ В РАСТИТЕЛЬНЫХ ОБЪЕКТАХ МЕТОДОМ КАТОДНОЙ ВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИИ
METHOD FOR DETERMINING TOTAL CONTENT OF THIOL ANTIOXIDANTS IN PLANT OBJECTS BY CATHODIC VOLTAMMETRY

Способ относится к области количественного определения суммарного содержания антиоксидантов тиоловой природы в растительном сырье как тест на действие тяжелых металлов, позволяющий оценить состояние окружающей среды по содержанию SH-групп в белках. Метод определения - вольтамперометрия.
Загрязнение окружающей среды различными канцерогенами, в том числе тяжелыми металлами, постоянно увеличивается. В последнее время активно изучаются биологические механизмы аккумуляции и детоксикации избытка тяжелых металлов, поступающих в почву, атмосферу, водную среду. Один из известных способов защиты растений от вредного влияния тяжелых металлов является биосинтез низкомолекулярных белков и пептидов, обогащенных SH-группами (металлотионеинов, фитохелатинов, цистеин и глутатион). Металлсвязывающие белки и пептиды синтезируются в норме в незначительном количестве. Их содержание в клетке резко возрастает при действии тяжелых металлов и снижается в случае уменьшения их концентрации в питательном субстрате. Поэтому количественное определение суммарного содержания соединений тиоловой природы представляет собой актуальную задачу.
Электрохимические методы определения характеризуются высокой чувствительностью, экспрессностью и простотой в аппаратурном оформлении. Они успешно применяются для количественного химического определения веществ органической и неорганической природы. Для обеспечения контроля содержания тиоловых соединений в биологических объектах необходимо разработать вольтамперометрическую методику количественного определения SH-групп в белках растительного сырья.
В настоящее время из методик количественного определения суммарного содержания тиоловых соединений в биологических объектах используются методы хроматографии с различными способами детектирования и спектрофотометрии.
Известен метод высокоэффективной жидкостной хроматографии определения суммарного содержания тиоловых соединений в биологических объектах с флуоресцентным способом детектирования (S.R.Kawakami, M.Gledhill, E.P.Achterberg. Determination of phytochelatins and glutathione in phytoplankton from natural waters using HPLC with fluorescence detection // Trac-Trends Anal. Chem., 2006, V.25, p.133-142).
Широко распространен метод высокоэффективной жидкостной хроматографии определения суммарного содержания тиоловых солединений в биологических объектах с электрохимическим способом детектирования на золотом электроде. (Y.Hiraku, M.Murata, S.Kawanishi. Determination of intracellular glutathione and thiols byhigh performance liquid chromatography with a gold electrode at the femtomole level: comparison with a spectroscopic assay // BBA-Gen. Subjects, 2002, V.1570, p.47-52.
Несмотря на хорошую чувствительность и селективность определения тиоловых соединений в биологических объектах, перечисленные хроматографические методы имеют ряд недостатков: оборудование и растворители для высокоэффективной жидкостной хроматографии имеют высокую стоимость, для проведения специальной пробоподготовки требуются дорогостоящие реактивы.
Спектрофотометрический метод количественного определения SH-групп в растворимых и высокополимерных соединениях клетки основан на способности реактива Элмана или 5,5-дитиобис(2-нитробензойной) кислоты (ДТНБ) с SH-группами белков и пептидов растительного сырья образовывать окрашенное соединение, интенсивность окраски которого сравнивается с эталонными растворами глутатиона на спектрофотометре при λ 412 нм. Образующийся 5-тио-2-нитробензойный анион имеет интенсивную окраску желтого цвета. Недостатком метода является его недостаточная чувствительность для определения тиоловых соединений в растительном сырье (Методы экологического мониторинга // Большой специальный практикум: Учеб. пособие. - Екатеринбург: Изд-во Урал, ун-та, 2005, с.236).
Перспективно использование вольтамперометрии для количественного определения суммарного содержания тиоловых соединений в биологических объектах простого, чувствительного и экспрессного метода.
Наиболее близок к теме изобретения является дифференциально-импульсный метод вольтамперометрии определения тиоловых соединений в растительном сырье (V.Supalkova, P.Huska, V.Diopan. Electroanalysis of plant thiols // Sensors, 2007, V.7, p.932-959) - прототип.
2+
Сущность метода состоит в съемке вольтамперограмм тока окисления комплексных тиоловых соединений с ионами Cd 0,001 моль/л через SH-группу в присутствии ацетатного буферного раствора pH 5.6. Определение проводили на ртутно-капающем электроде при E -0.7 B. Концентрацию тиоловых соединений оценивали методом градуировочного графика, используя зависимость концентрация глутатиона от значения тока окисления (высоты пика) глутатиона.
2+
Недостатком метода является использование токсичной металлической ртути в качестве материала рабочего электрода в способе-прототипе. Кроме того, процесс взаимодействия тиоловых соединений растительного сырья и ионов Cd требует длительного времени (до 3 часов в сутки) и зависит от условий эксперимента. Длительность и трудоемкость пробоподготовки также являются недостатками метода.
Новая техническая задача - увеличение чувствительности и экспрессности способа определения суммарного содержания тиоловых соединений в растительном сырье методом катодной вольтамперометрии.
2+
-5
3
2
Поставленная задача достигается тем, что первоначально проводят стадию пробоподготовки растительного сырья в водорастворимую форму и проводят вольтамперометрическое определение суммарного содержания тиоловых соединений. Используют катодную вольтамперометрию при постоянно-токовой форме развертки потенциала со скоростью 0.05 В/с с использованием индикаторного стеклоуглеродного электрода на фоне боратного буферного раствора pH 9.18 в присутствии ионов Cu (концентрация Cu(NO) 4.2·10 моль/л) при потенциале E -0.4 B. Для разработки методики количественного определения суммарного содержания тиоловых соединений в биологических объектах в качестве стандартного вещества тиоловой природы был выбран глутатион.
2+
-5
-9
-8
Фиг.1. Вольтамперограммы восстановления ионов Cu(4.2·10 моль/л) в отсутствии (2) и в присутствии глутатиона в растворе: 1.37·10 моль/л (3); 6.8·10 моль/л (4). (1) - линия остаточного тока. W 0.05 В/с; рН 9.18 боратный буфер; Трехэлектродная ячейка. Рабочий электрод стеклоуглеродный.
2+
2+
На фиг.1 показаны вольтамперограммы восстановления ионов меди Cu на СУЭ в отсутствии и в присутствии тиоловых соединений в растворе. В отсутствии GSH в растворе ионы меди Cu восстанавливаются на стеклоуглеродном электроде в одну стадию по механизму (фиг.1, кривая 2):
-9
-8
2
1
При введении в электрохимическую ячейку раствора глутатиона 1.37·10 M (фиг.1, кривая 3) появляется новый пик при E -0.4 B, который так же, как и первый при E -0.18 B, увеличивается с добавлением концентрации глутатиона 6.8·10 M (фиг.1, кривая 4). Замечено, что потенциал пика восстановления при E -0.18 B в присутствии глутатиона смешается в сторону более отрицательных значений потенциалов.
-
2
Данные электрохимические явления связаны с тем, что при введении глутатиона в раствор образуется комплексное соединение состава Cu(GS), которое адсорбируется на поверхности стеклоуглеродного электрода:
-
0
Адсорбированный комплекс восстанавливается на стеклоуглеродном электроде в две стадии. При этом следует отметить, что анионы GS выступают в качестве катализатора процесса восстановления ионов меди из комплекса до Cu:
-9
-8
-12
2
Прямолинейная зависимость тока восстановления комплекса глутатиона от концентрации глутатиона в растворе сохранялась в области от 1.0·10 до 2.0·10 M (фиг.2), предел обнаружения GSH по току восстановления комплекса Cu(GS) составил 1.0·10 M. Эти условия эксперимента могут быть использованы для количественного определения суммарного содержания тиоловых соединений в биологических объектах.
2
-9
-8
Фиг.2. Зависимость тока восстановления комплекса Cu(GS) от концентрации GSH в растворе в области от 1.0·10 до 2.0·10 моль/л. W 0.05 В/с; pH 9.18 боратный буфер; Трехэлектродная ячейка. Рабочий электрод стеклоуглеродный.
Пример 1. Определение суммарного содержания тиоловых соединений в листьях элодеи методом катодной вольтамперометрии.
Листья элодеи отделяют от стебля и помещают в чашку Петри на смоченную дистиллированной водой фильтровальную бумагу. Растительный материал (300 мг сырых листьев) растирают на льду в ступке с небольшим количеством 0,1M боратного буферного раствора pH 9.18 (1-2 мл), с добавлением стеклянного песка. Гомогенат переносят в центрифужную пробирку, обмывая ступку небольшим (0,5 мл) количеством буфера. Общий объем используемого буфера - 4 мл. Гомогенат центрифугируют 10 мин при 9 тысячах оборотах в минуту. Супернатант сливают в пробирку.
-4
В кварцевый стаканчик вместимостью 20 мл вносят 10,0 мл раствора фонового электролита боратного буферного раствора рН 9,18, 1 мл раствора нитрата меди (4.2 10 моль/л) и помещают в электрохимическую ячейку вольтамперометрического анализатора. Опускают в раствор электроды: индикаторный - стеклоуглеродный, вспомогательный и электрод сравнения - насыщенные хлорид-серебряные. С помощью стеклянной трубки фоновый раствор продувают газом азотом в течение 10 минут с целью вытеснения кислорода. Перемешивают 10 с, успокаивают 20 с, затем фиксируют катодную вольтамперограмму при потенциале -0,4 В (фиг.1) при скорости развертки напряжения 0.05 В/с. Отсутствие пиков свидетельствует о чистоте фона.
Концентрацию суммарного содержания тиоловых соединений определяют методом градуировочного графика (фиг.2), определяя высоту катодного тока при потенциале -0,4 В.
В таблице представлены результаты сравнительных определений суммарного содержания тиоловых соединений в листьях элодеи и измеренных методами вольтамперометрии и спектрофотометрии.
Концентрация (моль/л) суммарного содержания тиоловых соединений в листьях элодеи в пересчете на 1 г сухой массы, определенные вольтамперометрическим и спектрофотометрическим методами.
По результатам, представленным в таблице, видно, что полученные данные хорошо коррелируют между собой.
Предложенный способ количественного определения суммарного содержания тиоловых соединений в растительном сырье отличается простотой, не требует больших трудозатрат, значительного количества реактивов и отличается высокой селективностью, экспрессностью и чувствительностью.
Предложенный способ может быть использован как косвенный способ оценки состояния почв по уровню содержания тяжелых металлов.
Таблица
Концентрация тиоловых соединений, С·10<sup>-8</sup> моль/л, измеренная вольтамперометрическим методом
Концентрация тиоловых соединений, С·10<sup>-8</sup> моль/л, измеренная спектрофотометрическим методом
1.3±0.2
1.4±0.3