ТЕРАПЕВТИЧЕСКОЕ СРЕДСТВО ДЛЯ БОКОВОГО АМИОТРОФИЧЕСКОГО СКЛЕРОЗА
THERAPEUTIC AGENT FOR AMYOTROPHIC LATERAL SCLEROSIS

Область техники
[0001] Настоящее изобретение относится к терапевтическому средству для бокового амиотрофического склероза, содержащему агонист рецепторов стимулятора секреции гормона роста в качестве активного ингредиента.
Предшествующий уровень техники
[0002] Боковой амиотрофический склероз (далее в настоящем описании обозначаемый как ALS), наиболее распространенная болезнь мотонейронов взрослых, представляет собой нейродегенеративное заболевание, включающее избирательную и общую гибель верхних и нижних мотонейронов. В результате гибели мотонейронов возникает мышечная атрофия и мышечная слабость верхних и нижних конечностей, при этом в большинстве случаев прогрессирование заболевания также включает симптомы бульбарного паралича, такие как трудности речи или проглатывания, и паралич дыхательных мышц. ALS преимущественно развивается в среднем возрасте или позже. Это заболевание является настолько тяжелым, что многие пациенты погибают от дыхательной недостаточности через 2-3 года после начала заболевания, если не проводят контроль за дыханием с использованием респираторов. Высшие функции, такие как интеллект и чувствительность, сохраняются, несмотря на системную атрофию и слабость мышц, включая дыхательные мышцы (непатентная литература 1).
G93A
[0003] Ген Cu/Zn-супероксиддисмутазы (SOD1) считают одним из каузативных генов ALS. На трансгенных мышах или крысах, несущих мутантные гены SOD1, выделяемые у пациентов с ALS, в качестве патологии ALS человека было выявлено, что мотонейроны избирательно гибнут после созревания, и развивается атрофия скелетных мышц или мышечная слабость, что является причиной смерти. Эти трансгенные мыши или крысы, несущие мутантные гены SOD1, были признаны в качестве моделей ALS на животных, и их общепринято использовали в патологическом анализе ALS или исследовании терапевтических средств для этого заболевания. В частности, наиболее развивалось исследование с использование трансгенных мышей, у которых экспрессируются мутантные белки, получаемые из SOD1 человека заменой Gly (G) в положении 93 на Ala (A), т.е. трансгенных мышей, несущих мутантный ген SOD1 (G93A) (далее в настоящем описании обозначаемых как мыши SOD1), и испытание с использованием этих животных рекомендовано Европейской группой по ALS/MND (непатентная литература 2).
[0004] Единственным терапевтическим средством для ALS ободренным в настоящее время во всем мире является рилузол. Это лекарственное средство антагонизирует токсичность глутамата, которая, как опубликовано, является одним из факторов, вызывающих начало ALS. Однако лекарственное средство оказывает продлевающий жизнь эффект только на несколько месяцев и, таким образом, является эффективным только в ограниченной степени (непатентная литература 1).
[0005] Грелин представляет собой пептидный гормон, открытый как эндогенный лиганд рецептора стимулятора секреции гормона роста (далее в настоящем описании обозначаемого как GHS-R) (непатентная литература 3). Грелин способствует секреции гормона роста (далее в настоящем описании обозначаемого как GH) у людей и животных (непатентная литература 4 и т.д.).
G93A
G93A
Известно, что GH способствует продукции инсулиноподобного фактора роста-1 (далее в настоящем описании обозначаемого как IGF-1) в печени и скелетных мышцах, кроме того IGF-1 известен как трофический фактор мотонейронов. Инъекция рекомбинантного вирусного вектора AAV4, содержащего ген IGF-1, в боковые желудочки мышей SOD1 значительно увеличивает периоды их выживания и значительно подавляет снижение двигательной функции и мышечной силы (патентная литература 1). Хотя этот доклад, демонстрировал, что такие эффекты являлись обусловленными усиленной экспрессией IGF-1 в головном мозге, сверхэкспрессия IGF-1 человека в скелетных мышцах мышей SOD1 не оказывала влияния на гибель мотонейронов или периоды выживаемости (непатентная литература 5). Когда GH или IGF-1 вводили пациентам с ALS в клинических испытаниях, терапия GH являлась неэффективной (непатентная литература 6), и для IGF-1 не выявляли эффективности в отношении любого из параметров, таких как мышечная сила, функциональные исходы и периоды выживаемости пациентов с ALS (непатентная литература 7). Таким образом, активация периферической системы GH или IGF-1 не является эффективной для ALS. Грелин также способствует секреции GH из гипофиза и повышает концентрации GH в крови (например, непатентная литература 3 и 4), но не известно, оказывает ли он эффект повышения IGF-1 в головном мозге или спинном мозге. Таким образом, точно неизвестно, является ли грелин эффективным для патологии ALS.
Также грелин является единственным известным периферическим орексигенным пептидом, который по имеющимся данным увеличивает потребление пищи у людей и животных (например, непатентная литература 4). ALS представляют собой заболевание, включающее атрофию скелетных мышц и потерю мышечной силы, вызываемую гибелью мотонейронов, приводящую к смерти. Введение грелина может увеличивать потребление пищи и, таким образом, поддерживать массу тела или массу скелетных мышц. Однако взаимосвязь таких эффектов грелина и подавления гибели мотонейронов остается неизвестной. Таким образом, точно неизвестно, является ли грелин эффективным в отношении патологии ALS.
[0006] Опубликовано, что среди пациентов с ALS для пациенты, у которых отмечают высокое отношение LDL/HDL в крови и у которых выявляют гиперлипидемию, обнаруживают больший период выживания, по меньшей мере на 12 месяцев, по сравнению с другими пациентами с ALS, что свидетельствует о том, что гиперлипидемия является прогностическим фактором выживания пациентов с ALS (непатентная литература 8). Аналогично, было опубликовано, что для пациентов с ALS с высокой концентрацией холестерина или триглицерида в крови существует хороший прогноз (непатентная литература 9).
Согласно одному из докладов введение грелина мышам не оказывало влияния на их концентрации триглицерида в крови, но повышало концентрации общего холестерина в крови (непатентная литература 10). Согласно другому докладу грелин является пригодным для лечения гиперлипидемии (патентная литература 2).
Также повторное введение грелина в течение 3 недель пациентам с хроническим воспалением органов дыхания приводило к увеличению их массы тела или состоянию питания, но не оказывало влияние на концентрации холестерина в крови (непатентная литература 11).
Как указано выше, еще не были получены определенные данные касательно влияния грелина на уровни холестерина или триглицерида в крови.
in vitro
[0007] По имеющимся данным в случае, когда гибель клеток индуцировали повышением внутриклеточных уровней кальция (Ca) посредством обработки иономицином эмбриональных нейронов гиппокампа крыс, для соединений агонистов GHS-R грелина крысы, пралморелина (релизинг-пептид гормона роста-2 (далее в настоящем описании обозначаемый как GHRP-2)), гексарелина и MK-0677 демонстрировали подавляющее действие в отношении гибели клеток. В этом докладе ALS обозначают как неишемическое нейродегенеративное заболевание, для которого группа соединений является эффективной (патентная литература 3). ALS представляет собой заболевание зрелого возраста, включающее избирательную гибель мотонейронов, при которой клетки гиппокампа не повреждаются. Таким образом, даже если GHRP-2 или грелин подавляли  гибель эмбриональных нейронов гиппокампа крыс, индуцированную повышением концентраций Ca, точно неизвестно, являются ли эти соединения эффективными для ALS.
in vitro
in vitro
[0008] Опубликовано, что грелин подавляет гибель мотонейронов, индуцируемую глутаматом в системе органотипической культуры спинного мозга  крыс (непатентная литература 12 и 13). К сожалению, система органотипической культуры спинного мозга не может в достаточной степени отражать патологию сложного заболевания, такого как ALS.
[0009] Опубликовано, что пралморецин (GHRP-2) увеличивает отношение получаемых из феохромоцитома надпочечников крыс клеток PC-12, содержащих дендриты и аксоны в 1,5 раза больше, чем размер клеток, приблизительно в 1,2 раза по сравнению с контрольной группой (патентная литература 4). Вследствие того, что клетки не являются мотонейронами, невозможно оценить, является ли пригодным GHRP-2 для ALS или не является.
[0010] Согласно докладу по модели проксимальной аксонопатии на мышах, индуцируемой введением 1,2-диацетилбензола, одномоментное введение релизинг-пептида-6 гормона роста агониста GHS-R (далее в настоящем описании обозначаемого как GHRP-6) и фактор роста клеток EGF улучшало с точки зрения поведения способность мышей передвигаться, а также значительно улучшало потенциалы действия скелетных мышц, тогда как введение каждого соединения отдельно только ускоряло восстановление измененного паттерна походки (непатентная литература 14). Вследствие того, что используемые в этом эксперименте модели на животных имели отличную клиническую патологию по сравнению с ALS, невозможно оценить, является ли GHRP-6 пригодным или является непригодным для ALS.
[0011] В дополнительных докладах описано, что антагонисты рецептора GHS-R на основе грелина являются пригодными для лечения ALS (патентная литература 5 и 6). Таким образом, невозможно сделать вывод, что агонисты GHS-R, включая грелин, являются пригодными для лечения ALS.
Список цитирования
Патентная литература
[0012] Патентная литература 1: WO2007/146046
Патентная литература 2: выложенный патент Японии № 2008-127377
Патентная литература 3: WO01/047558
Патентная литература 4: выложенный патент Японии № 2005-239712
Патентная литература 5: US7829589
Патентная литература 6: US2012/0080747
Непатентная литература
[0013] Непатентная литература 1: Expert Opinion on Emerging Drugs (2011), vol. 16 (No. 2), p. 537-558
Непатентная литература 2: Amyotrophic Lateral Sclerosis (2010), vol. 11, p. 38-45
Непатентная литература 3: Nature (1999), vol. 402, p. 656-660
Непатентная литература 4: Physiological Reviews (2005), vol. 85, p. 495-522
Непатентная литература 5: Experimental Neurology (2007), vol. 207, p. 52-63
Непатентная литература 6: Muscle & Nerve (1993), vol. 16 (№6), p. 624-633
Непатентная литература 7: Neurology (2008), vol. 71, p. 1770-1775
Непатентная литература 8: Neurology (2008), vol. 70, p. 1004-1009
Непатентная литература 9: Journal of Neurology (2011), vol. 258 (№4), p. 613-617
Непатентная литература 10: Nature Neuroscience (2010), vol. 13 (№7), p. 877-883
Непатентная литература 11: Pulmonary Pharmacology & Therapeutics (2008), vol. 21 (№5), p. 774-779
Непатентная литература 12: Experimental Neurology (2011), vol. 230, p. 114-122
Непатентная литература 13: Korean Journal of Physiology and Pharmacology (2012), vol. 16 (№1), p. 43-48
Непатентная литература 14: Neurotoxicity Research (2011), vol. 19, p. 195-209
Сущность изобретения
Техническая проблема
[0014] Рилузол, существующее терапевтическое средство для ALS, является клинически эффективным в ограниченной степени. Несмотря на то, что уже прошло 15 или более лет с момента выпуска этого лекарственного средства, тем временем были клинически разработаны различные соединения, все еще необходимо разрабатывать терапевтическое средство для ALS. Таким образом, существует значительная нереализованная потребность медицины в разработке эффективных против ALS терапевтических средств. Целью настоящего изобретения является предоставление терапевтического средства для ALS, для которого не существует эффективного лекарственного средства, где терапевтическое средство способно подавлять патологическое прогрессирование ALS и эффективно лечить это заболевание.
Решение проблемы
[0015] Авторы настоящего изобретения провели тщательные исследования с терапевтическими средствами, пригодными против ALS, для которого не существует полностью (или достаточно) эффективного лекарственного средства, в частности лекарственными средствами, способными более эффективно лечить ALS по сравнению с только одним существующим лекарственным средством рилузол. В результате авторы настоящего изобретения выполнили настоящее изобретение путем открытия того, что агонисты GHS-R оказывают более эффективное защитное для мотонейронов действие, чем защитное действие существующего лекарственного средства. В частности, настоящее изобретение относится к следующим ниже аспектам:
[0016] (1) Терапевтическое средство для бокового амиотрофического склероза, содержащее агонист рецептора стимулятора секреции гормона роста или его фармацевтически приемлемую соль в качестве активного ингредиента, для введения индивидууму, страдающему боковым амиотрофическим склерозом без тяжелой дисфагии.
[0017] (2) Терапевтическое средство по п. (1), где индивидуум также является невосприимчивым или недостаточно восприимчивым к существующему терапевтическому средству для бокового амиотрофического склероза.
(3) Терапевтическое средство по п. (1) или (2), где терапевтическое средство используют в комбинации с существующим терапевтическим средством для бокового амиотрофического склероза.
(4) Терапевтическое средство по п. (2) или (3), где существующее терапевтическое средство для бокового амиотрофического склероза представляет собой рилузол
[0018] (5) Терапевтическое средство по любому из пп. (1)-(4), где терапевтическое средство для бокового амиотрофического склероза, содержащее агонист рецептора стимулятора секреции гормона роста или его фармацевтически приемлемую соль в качестве активного ингредиента, вводят посредством подкожной инъекцией.
[0019] (6) Терапевтическое средство по любому из пп. (1)-(5), где агонист рецептора стимулятора секреции гормона роста представляет собой грелин, пралморелин, GHRP-6, гексарелин, ипаморелин, ибутаморена мезилат, улиморелин, анаморелин, мациморелин, капроморелин или SM-130686.
[0020] (7) Терапевтическое средство по п. (6), где грелин представляет собой пептидное соединение, содержащее аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, в которой 3-й аминокислотный остаток от N-конца представляет собой аминокислотный остаток, модифицированный жирной кислотой, вводимой в боковую цепь аминокислотного остатка, или пептидное соединение, содержащее аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 с делецией, заменой и/или добавлением одного или нескольких аминокислотных остатков в положении 5-28 от N-конца SEQ ID NO: 1, в которой 3-й аминокислотный остаток от N-конца представляет собой аминокислотный остаток, модифицированный жирной кислотой, введенной в боковую цепь аминокислотного остатка, и обладающее активностью повышения внутриклеточной концентрации ионов кальция посредством связывания с рецептором стимулятора секреции гормона роста.
[0021] (8) Терапевтическое средство по п. (7), где грелин представляет собой пептидное соединение, содержащее аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, в которой 3-й аминокислотный остаток от N-конца представляет собой аминокислотный остаток, модифицированный жирной кислотой, вводимой при гидроксигруппе в боковую цепь аминокислотного остатка.
[0022] (9) Терапевтическое средство по п. (8), где грелин представляет собой пептидное соединение, содержащее аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, в которой гидроксигруппа в боковой цепи 3-го аминокислотного остатка от N-конца является ацетилированной н-октаноиловой группой.
(10) Способ лечения бокового амиотрофического склероза, включающий введение терапевтического средства для бокового амиотрофического склероза, содержащего агонист рецептора стимулятора секреции гормона роста или его фармацевтически приемлемую соль в качестве активного ингредиента, индивидууму, страдающему боковым амиотрофическим склерозом без тяжелой дисфагии.
(11) Способ лечения по п. (10), где индивидуум также является невосприимчивым или недостаточно восприимчивым к существующему терапевтическому средству для бокового амиотрофического склероза.
(12) Способ лечения по п. (10) или (11), где терапевтическое средство вводят в комбинации с существующим терапевтическим средством для бокового амиотрофического склероза.
(13) Способ лечения по п. (11) или (12), где существующее терапевтическое средство для бокового амиотрофического склероза представляет собой рилузол.
(14) Способ лечения по любому из пп. (10)-(13), где терапевтическое средство для бокового амиотрофического склероза, содержащее агонист рецептора стимулятора секреции гормона роста или его фармацевтически приемлемую соль в качестве активного ингредиента, вводят посредством подкожной инъекции.
(15) Способ лечения по любому из пп. (10)-(14), где агонист рецептора стимулятора секреции гормона роста представляет собой грелин, пралморелин, GHRP-6, гексарелин, ипаморелин, ибутаморена мезилат, улиморелин, анаморелин, мациморелин, капроморелин или SM-130686.
(16) Способ лечения по п. (15), где грелин представляет собой пептидное соединение, содержащее аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, в которой 3-й аминокислотный остаток от N-конца представляет собой аминокислотный остаток, модифицированный жирной кислотой, вводимой в боковую цепь аминокислотного остатка, или пептидное соединение, содержащее аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 с делецией, заменой и/или добавлением одного или нескольких аминокислотных остатков в положении 5-28 от N-конца SEQ ID NO: 1, в которой 3-й аминокислотный остаток от N-конца представляет собой аминокислотный остаток, модифицированный жирной кислотой, вводимой в боковую цепь аминокислотного остатка, и обладающее активностью повышения внутриклеточной концентрации ионов кальция посредством связывания с рецептором стимулятора секреции гормона роста.
(17) Способ лечения по п. (16), где грелин представляет собой пептидное соединение, содержащее аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, в которой 3-й аминокислотный остаток от N-конца представляет собой аминокислотный остаток, модифицированный жирной кислотой, вводимой при гидроксигруппе в боковую цепь аминокислотного остатка.
(18) Способ лечения по п. (17), где грелин представляет собой пептидное соединение, содержащее аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, в которой гидроксигруппа в боковой цепи 3-го аминокислотного остатка от N-конца является ацетилированной н-октаноиловой группой.
(19) Агонист рецептора стимулятора секреции гормона роста или его фармацевтически приемлемая соль для лечения бокового амиотрофического склероза путем введения индивидууму, страдающему боковым амиотрофическим склерозом без тяжелой дисфагии.
(20) Агонист рецептора стимулятора секреции гормона роста или его фармацевтически приемлемая соль по п. (19), где индивидуум также является невосприимчивым или недостаточно восприимчивым к существующему терапевтическому средству для бокового амиотрофического склероза.
(21) Агонист рецептора стимулятора секреции гормона роста или его фармацевтически приемлемая соль по п. (19) или (20), где при лечении агонист рецептора стимулятора секреции гормона роста или его фармацевтически приемлемую соль используют в комбинации с существующим терапевтическим средством для бокового амиотрофического склероза.
(22) Агонист рецептора стимулятора секреции гормона роста или его фармацевтически приемлемая соль по п. (20) или (21), где существующее терапевтическое средство для бокового амиотрофического склероза представляет собой рилузол.
(23) Агонист рецептора стимулятора секреции гормона роста или его фармацевтически приемлемая соль по любому из пп. (19)-(22), где введение агониста рецептора стимулятора секреции гормона роста или его фармацевтически приемлемой соль индивидууму представляет собой введение в форме подкожной инъекции.
(24) Агонист рецептора стимулятора секреции гормона роста или его фармацевтически приемлемая соль по любому из пп. (19)-(23), где агонист рецептора стимулятора секреции гормона роста представляет собой грелин, пралморелин, GHRP-6, гексарелин, ипаморелин, ибутаморена мезилат, улиморелин, анаморелин, мациморелин, капроморелин или SM-130686.
(25) Агонист рецептора стимулятора секреции гормона роста или его фармацевтически приемлемая соль по п. (24), где грелин представляет собой пептидное соединение, содержащее аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, в которой 3-й аминокислотный остаток от N-конца представляет собой аминокислотный остаток, модифицированный жирной кислотой, вводимой в боковую цепь аминокислотного остатка, или пептид соединение, содержащее аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 с делецией, заменой и/или добавлением одного или нескольких аминокислотных остатков в положении 5-28 от N-конца SEQ ID NO: 1, в которой 3-й аминокислотный остаток от N-конца представляет собой аминокислотный остаток, модифицированный жирной кислотой, вводимой в боковую цепь аминокислотного остатка, и обладающее активностью повышения внутриклеточной концентрации ионов кальция посредством связывания с рецептором стимулятора секреции гормона роста.
(26) Агонист рецептора стимулятора секреции гормона роста или его фармацевтически приемлемая соль по п. (25), где грелин представляет собой пептидное соединение, содержащее аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, в которой 3-й аминокислотный остаток от N-конца представляет собой аминокислотный остаток, модифицированный жирной кислотой, вводимой при гидроксигруппе в боковую цепь аминокислотного остатка.
(27) Агонист рецептора стимулятора секреции гормона роста или его фармацевтически приемлемая соль по п. (26), где грелин представляет собой пептидное соединение, содержащее аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, в которой гидроксигруппа в боковой цепи 3-го аминокислотного остатка от N-конца является ацетилированной н-октаноиловой группой.
Полезные эффекты изобретения
[0023] Агонист GHS-R по настоящему изобретению обладает эффектом увеличения периодов выживаемости в результате подавления патологического прогрессирования ALS и по существу является очень пригодным для лечения ALS, для которого не существует эффективного лекарственного средства. Кроме того, агонист GHS-R по настоящему изобретению является дополнительно пригодным, т.к. он обладает эффектом подавления мышечной слабости путем ингибирования снижения числа мотонейронов, характерного для патологического начала и прогрессирования ALS, и, таким образом, заметно подавляет гибель клеток. Агонист GHS-R по настоящему изобретению превосходит по этим эффектам рилузол, существующее терапевтическое средство для ALS, и удовлетворяет давнюю нереализованную потребность медицины, т.к. агонист GHS-R может увеличивать периоды выживания, даже при введении с момента времени, когда рилузол не является больше эффективным. Кроме того, агонист GHS-R по настоящему изобретению обладает защитным для мотонейронов эффектом и подавляет мышечную слабость, что приводит не только к увеличенным периодам выживания, но и к улучшенному качеству жизни во время периодов выживания. Кроме того, вследствие этого защитного для мотонейронов эффекта агонист GHS-R является пригодным против болезней или нарушений мотонейронов, отличных от ALS, например, спинальной мышечной атрофии.
Описание вариантов осуществления
[0024] В качестве агониста GHS-R по настоящему изобретению можно использовать известное в данной области пептидное или непептидное соединение. Примеры пептидного соединения включают эндогенный лиганд грелин, а также пралморелин (GHRP-2), GHRP-6, гексарелин и ипаморелин. Примеры непептидного соединения включают ибутаморена мезилат (MK-0677), улиморелин (TZP-101), анаморелин (RC-1291), мациморелин (AEZS-130), капроморелин (CP-424391),и SM-130686. Среди этих пептидных соединений грелин является особенно желательным. Среди этих непептидных соединений, анаморелин является особенно желательным.
[0025] Примеры грелина могут включать получаемый от человека грелин и грелин, получаемый от любого другого животного, такого как крысы, мыши, свиньи и крупный рогатый скот, и их производные (см. например, международную публикацию № WO01/07475). В случае, когда индивидуум-реципиент представляет собой человека, желательно использовать получаемый от человека грелин. Получаемый от человека грелин представляет собой пептидное соединение, состоящее из 28 аминокислот (SEQ ID NO: 1), в которых гидроксигруппа в боковой цепи 3-го аминокислотного остатка (серин) при подсчете от N-конца является ацетилированной жирной кислотой (н-октаноиловой группой).
in vivo
Эндогенный лиганд грелин представляет собой гормон, существующий , и может служить, в частности, в качестве в высшей степени безопасного терапевтического средства для ALS, т.к. его безопасность при введении людям уже была подтверждена.
[0026] В качестве производного грелина можно использовать пептид, содержащий аминокислотную последовательность, получаемую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 1, путем делеции, замены и/или добавления одной или нескольких аминокислот, выбранных из с 5 по 28 аминокислотных остатков при подсчете от N-конца, в которой 3-ий аминокислотный остаток (серин) при подсчете от N-конца представляет собой аминокислотный остаток, модифицированный жирной кислотой, вводимой в боковую цепь (гидроксигруппу) аминокислотного остатка, и обладающий активностью повышения внутриклеточной концентрации ионов кальция посредством связывания с GHS-R (см. международную публикацию № WO01/07475).
В этом контексте используемый в настоящем описании термин "несколько" означает от 1 до 8, от 1 до 7, от 1 до 6, от 1 до 5, от 1 до 4, от 1 до 3 или 1, или 2.
Желательно аминокислотная последовательность производного грелина обладает 70%, предпочтительно 80%, более предпочтительно 90%, особенно предпочтительно 95%, наиболее предпочтительно 97% гомологией с природной аминокислотной последовательностью. Это справедливо для варианта сплайсинга (SEQ ID NO: 2) получаемого от человека грелина, состоящего из 27 аминокислот.
in vivo
[0027] Касательно активности производного герлина в качестве показателя можно использовать агонистическую активность в отношении GHS-R или биологическую активность, описанную в указанной выше публикации. На основании этого показателя можно выбирать представляющее интерес производное грелина. Например, можно анализировать агонистическую активность по отношению к GHS-R с использованием внутриклеточной концентрацию ионов кальция в качестве показателя. Этот показатель можно измерять известным в данной области способом и, например, можно использовать FLIPR (Fluorometric Imaging Plate Reader, Molecular Devices, LLC), основанного на изменении интенсивности флуоресценции Fluo-4AM (Molecular Probes) в результате изменения концентрации ионов кальция. Кроме того, орексигенную активность  пептидного или непептидного соединения, обладающего повышающим концентрацию кальций действием, можно подтверждать известным в данной области способом. Например, для подтверждения его орексигенного эффекта на здоровых мышах пептидное или непептидное соединение, обладающее повышающим концентрацию кальция действием, вводят подкожно или интраперитонеально животным и через 1 час после введения можно сравнивать их потребление пищи с группой, которой вводят носитель.
[0028] В качестве пралморелина (GHRP-2) можно использовать D-аланил-D-(2-нафтил)аланил-L-аланил-L-триптофил-D-фенилаланил-L-лизинамид (патент США № 5663146).
[0029] В качестве GHRP-6 можно использовать L-гистидил-D-триптофил-L-аланил-L-триптофил-D-фенилаланил-L-лизинамид (Endocrinology (1984), vol. 114 (No. 5), p. 1537-1545).
[0030] В качестве гексарелина можно использовать L-гистидил-2-метил-D-триптофил-L-аланил-L-триптофил-D-фенилаланил-L-лизинамид (патент США № 5646301).
[0031] В качестве ипаморелина можно использовать α-метилаланил-L-гистидил-D-b-(2-нафтил)-L-аланил-D-фенилаланил-L-лизинамид (Journal of Medicinal Chemistry (1998), vol. 41, p. 3699-704).
[0032] В качестве ибутаморена мезилата (MK-0677) можно использовать мезилат 2-амино-2-метил-N-[(1R)-2-(1-метансульфонилспиро[индолин-3,4'-пиперидин]-1'-ил)-2-оксо-1-(фенилметоксиметил)этил]пропанамида (патент США № 5536716).
[0033] В качестве улиморелина (TZP-101) можно использовать 5(S)-циклопропил-11(R)-(4-фторбензил)-2(R),7,8(R)-триметил-2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,13,14,15,16-тетрадекагидро-1,4,7,10,13-бензоксатетраазациклооктадецин-6,9,12-трион (патент США № 7476653).
[0034] В качестве анаморелина можно использовать 2-амино-N-{(1R)-2-[3-бензил-3-(N,N',N'-триметилгидразинокарбонил)пиперидин-1-ил]-1-((1H-индол-3-ил)-2-оксоэтил)-2-метилпропионамид} (патент США № 6576648).
[0035] В качестве мациморелина (AEZS-130) можно использовать 2-метилаланил-N-[1(R)-формамидо-2-(1H-индол-3-ил)этил]-D-триптофанамид (патент США № 6861409).
[0036] В качестве капроморелина (CP-424391) можно использовать 2-амино-N-[2-[3a(R)-бензил-2-метил-3-оксо-3,3a,4,5,6,7-гексагидро-2H-пиразоло[4,3-c]пиридин-5-ил]-1(R)-(бензилоксиметил)-2-оксоэтил]изобутирамид (патент EP № 0869968).
[0037] В качестве можно использовать SM-130686 гидрохлорид (+)-3(S)-(2-хлорфенил)-1-[2-(диэтиламино)этил]-3-гидрокси-2-оксо-4-(трифторметил)-2,3-дегидро-1H-индол-6-карбоксиамида (патент США № 6576656).
[0038] Соль агониста GHR-S, которую можно использовать в настоящем изобретении, предпочтительно представляет собой фармацевтически приемлемую соль. Ее примеры включают соли с неорганическими основаниями, соли с органическими основаниями, соли с неорганическими кислотами, соли с органическими кислотами и соли с основными или кислыми аминокислотами.
[0039] Предпочтительные примеры солей с неорганическими основаниями включают: соли щелочных металлов, такие как натриевая соль и калиевая соль; соли щелочноземельных металлов, такие как кальциевая соль и магниевая соль, и соль алюминия и аммонийную соль.
[0040] Предпочтительные примеры солей с органическими основаниями включают триметиламин, триэтиламин, пиридин, пиколин, этаноламин, диэтаноламин, триэтаноламин, дициклогексиламин и N,N'-дибензилэтилендиамин.
[0041] Предпочтительные примеры солей с неорганическими кислотами включают соли с соляной кислотой, бромистоводородной кислотой, азотной кислотой, серной кислотой и фосфорной кислотой.
пара
[0042] Предпочтительные примеры солей с органическими кислотами включают соли с муравьиной кислотой, уксусной кислотой, трифторуксусной кислотой, фумаровой кислотой, щавелевой кислотой, винной кислотой, малеиновой кислотой, лимонной кислотой, янтарной кислотой, яблочной кислотой, метансульфоновой кислотой, бензолсульфоновой кислотой и -толуолсульфоновой кислотой.
[0043] Предпочтительные примеры солей с основными аминокислотами включают соли с аргинином, лизином и орнитином. Предпочтительные примеры солей с кислыми аминокислотами включают соли с аспарагиновой кислотой и глутаминовой кислотой.
Среди этих солей предпочтительной является натриевая соль или калиевая соль.
[0044] Агонист GHS-R по настоящему изобретению можно получать общепринятым способом. Например, агонист GHS-R по настоящему изобретению можно выделять из природного сырья или можно получать технологией рекомбинантной ДНК и/или способом химического синтеза.
E. coli
Bacillus subtilis
[0045] В случае получения пептидного соединения по настоящему изобретению с использованием технологии рекомбинантной ДНК, примеры векторов для введения в представляющий интерес ген, кодирующий пептидное соединение по настоящему изобретению, включают векторы на основе  (pBR322, pUC18, pUC19 и т.д.), векторы на основе  (pUB110, pTP5, pC194 и т.д.), дрожжевые векторы (типов YEp, YRp и YIp) и векторы на основе животной клетки (ретровируса, вируса оспавакцины и т.д.). Можно использовать другой вектор при условии, что вектор может обеспечивать то, что клетки-хозяева стабильно несут представляющий интерес ген. Векторы переносят в соответствующие клетки-хозяева. В качестве способа введения представляющего интерес гена в плазмиды можно использовать способ, описанный, например, в Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), или способ переноса плазмид в клетки-хозяева.
[0046] В плазмидах промотор является функционально связанным выше гена для экспрессии представляющего интерес гена пептида.
Escherichia
Bacillus
Используемый в настоящем изобретении промотор может представлять собой любой промотор, подходящий для клеток-хозяев для применения для экспрессии представляющего интерес гена. В случае, когда клетки-хозяева необходимо трансформировать, например, бактериальными клетками рода , можно использовать промотор lac, промотор trp, промотор lpp, промотор λPL, промотор recA или т.п. Для клеток-хозяев рода  можно использовать промотор SPO1, промотор SPO2 или т.п. Для дрожжевых клеток можно использовать промотор GAP, промотор PHO5, промотор ADH или т.п. Для животных клеток можно использовать получаемый из SV40 промотор, получаемый из ретровирусов промотор или т.п.
Escherichia
Bacillus
Saccharomyces
Pichia
Candida
[0047] Получаемые таким образом векторы, содержащие представляющий интерес ген используют для трансформации клеток-хозяев. В качестве клеток-хозяев можно использовать бактериальные клетки (например, рода  и ), дрожжевые клетки (например, рода ,  и ), животные клетки (например, клетки CHO и клетки COS) или т.п. В качестве среды для культивирования подходящей является жидкая среда. Особенно предпочтительно среда содержит источник углерода, источник азота и т.п., необходимый для роста трансформированных клеток, которые необходимо культивировать. При желании в среду можно дополнительно добавлять витамины, стимулятор роста, сыворотку и т.п.
[0048] После культивирования пептидное соединение по настоящему изобретению выделяют и очищают от культур общепринятым способом. Например, для экстракции представляющего интерес вещества из культивируемых клеток микроорганизмов или животных клеток эти клетки, культивируемые таким образом, собирают, затем суспендируют в буферном растворе, содержащем денатурирующее белок средство (гидрохлорид гуанидина и т.д.) и разрушают с использованием ультразвука, например, с последующим центрифугированием. Затем представляющее интерес вещество можно очищать от супернатанта подходящей комбинацией способов отделения и очистки, таких как гель-фильтрация, ультрафильтрация, диализ, SDS-PAGE и различные хроматографические способы, учитывая молекулярную масса, растворимость, заряд (изоэлектрическую точку), аффинность и т.д. представляющего интерес вещества.
[0049] В случае получения пептидного соединения по настоящему изобретению способом химического синтеза, например, аминокислоты с защитными группами подвергают конденсации жидкофазным способом и/или твердофазным способом для удлинения пептидной цепи. Все защитные группы удаляют кислотой. Получаемый неочищенный продукт очищают известным в данной области способом очистки с получением пептидного соединения по настоящему изобретению.
[0050] Грелин и его производное по настоящему изобретению также можно получать общепринятыми способами. Например, грелин и его производное по настоящему изобретению можно выделять или очищать из природного сырья или можно получать технологией рекомбинантной ДНК и/или способом химического синтеза.
[0051] Вследствие того, что грелин содержит модифицированный (ацетилированный) аминокислотный остаток в своей боковой цепи, аминокислотный остаток можно модифицировать (ацетилировать) реакцией модификации в соответствии с известным в данной области подходом. Например, в способе получения с использованием технологии рекомбинантной ДНК культивируют клетки-хозяева, трансформированные экспрессирующими векторами, содержащими ДНК, кодирующую грелин или его производное, и представляющий интерес пептид можно собирать из культур с получением грелина или его производного по настоящему изобретению. Для получением модифицированного (ацетилированного) соединения представляющего интерес пептид в клетках клетки-хозяева можно подвергать скринингу. Например, для непосредственного получения модифицированного жирной кислотой (ацетилированного) пептидного соединения желательно использовать клетки, обладающие процессирующей протеазной активностью, способной расщеплять полипептид-предшественник пептида в подходящем положении и обладающие активностью ацетилирования остатка серина в пептиде. Такие клетки-хозяева, обладающие процессирующей протеазной активностью и активностью ацетилирования и серина можно отбирать путем трансформации клеток-хозяев экспрессирующими векторами, содержащими кДНК, кодирующую полипептид-предшественник, и подтверждения, что трансформированные клетки продуцируют модифицированное жирной кислотой пептидное соединение, обладающее повышающей концентрацию кальция активностью или активностью стимуляторной секреции гормона роста.
[0052] В способе получения способом химического синтеза, например, аминокислоты с защитными группами подвергают конденсации жидкофазным способом и/или твердофазным способом для удлинения пептидной цепи. Все защитные группы удаляют кислотой. Получаемый неочищенный продукт можно очищать указанным выше способом очистки с получением грелина или его производного по настоящему изобретению. Боковую цепь аминокислоты, расползающуюся в представляющем интерес положении, можно избирательно ацетилировать с использованием ацетилирующего фермента или ацилтрансферазы.
[0053] Альтернативно, в способе получения можно использовать в комбинации технологию рекомбинантной ДНК и способ химического синтеза. Такой способ получения может включать получение фрагмента, содержащего модифицированный аминокислотный остаток химическим синтезом, наряду с этим получение других фрагментов, не содержащих модифицированный аминокислотный остаток, технологией рекомбинантной ДНК, а затем слияние этих фрагментов (см. международную публикацию № WO01/07475 и WO03/084983).
[0054] Другие соединения, которые можно использовать в настоящем изобретении, т.е. пралморелин (GHRP-2), GHRP-6, гексарелин, ипаморелин, ибутаморена мезилат (MK-0677), улиморелин, анаморелин, мациморелин, капроморелин и SM-130686, также можно получать известными в данной области способами, включая указанные выше способы.
G93A
[0055] Модели ALS на животных (мыши SOD1) выращивали в условиях ограниченного кормления и вводили животным агонист GHS-R, таким образом, что агонист GHS-R не проявлял орексигенного эффекта. В этом случае не наблюдали ни подавляющее мышечную слабость действие, ни подавляющее действие в отношении гибели мотонейронов, хотя ингибировали уменьшение массы скелетных мышц. Таким образом, агонист GHS-R проявляет подавляющее мышечную слабость действие и/или увеличивающий период выживания эффект у индивидуумов, у которых агонист GHS-R проявляет свой орексигенный эффект. Таким образом, реципиент по настоящему изобретению из числа страдающих ALS индивидуумов представляет собой индивидуума, потребление пищи которого можно увеличивать путем введения агониста GHS-R, кратко "индивидуума без тяжелой дисфагии", который способен перорально принимать внутрь столько пищи, сколько является желательным для индивидуума. Вследствие того, что агонист GHS-R может проявлять свой терапевтический эффект при введении даже с того момента, когда рилузол не является больше эффективным, индивидуум также может являться "невосприимчивым или недостаточно восприимчивым к рилузолу".
[0056] (1) Индивидуум без тяжелой дисфагии
Термин "индивидуум без тяжелой дисфагии" относится к индивидууму, способному перорально принимать внутрь пищу при желаемом уровне потребления. Такой индивидуум может принимать пищу в таком количестве, в котором индивидуум желает. Другими словами, индивидуум может получать содержимое рациона, предоставленное в легкой для потребления форме (обработанная пища в форме пасты и т.д.), использовать устройства для приема пищи для предоставления пищи в легкой для потребления форме и получать помощь для облегчения приема пища индивидуума (например, содействие в использовании устройства для приема пищи) при условии, что у индивидуума сохраняется функция проглатывания.
[0057] "Нетяжелую дисфагию" можно определять в соответствии с модифицированной функциональной оценочной шкалой ALS (далее в настоящем описании обозначаемой как ALSFRS-R, Journal of the Neurological Sciences (1999), vol. 169 (№ 1-2), p. 13-21), признанный во всем мире клинический оценочный показатель. Нетяжелая дисфагия соответствует баллу 2 (изменения консистенции рациона) или выше, предпочтительно баллу 3 (ранние проблемы с потреблением пища - случайное поперхивание) или выше, более предпочтительно баллу 4 (нормальный прием пищи) при измерении проглатывания по функциональной оценочной шкале.
G93A
[0058] В случае использования грелина в качестве агониста GHS-R грелин проявляет подавляющее мышечную слабость действие и/или увеличивающий период выживания эффект, как подробно описано в примерах, даже в условиях, когда мышам SOD1 оказывают содействие в приеме пищи путем разбрасывания корма на полу в возрасте 18 недель или старше, когда мыши испытывают трудности с взятием корма из кормушки. В частности, грелин может подавлять мышечную слабость на моделях ALS на животных и увеличивать периоды их выживания при введении в условиях, когда можно достигать его орексигенного эффекта.
[0059] (2) Индивидуум, невосприимчивый или недостаточно восприимчивый к существующему терапевтическому средству для бокового амиотрофического склероза
Термин "невосприимчивый" в отношении существующего терапевтического средства для бокового амиотрофического склероза (терапевтического средства для ALS) относится к состоянию, когда терапевтический эффект существующего терапевтического средства для ALS, используемого ранее или в настоящее время, невозможно наблюдать, или к состоянию, когда эффект не сохраняется, т.е. к состоянию, когда патологическое прогрессирование не подавляется введением существующего терапевтического средства для ALS. Невосприимчивость к лечению существующим терапевтическим средством для ALS оценивают анализом одного или более клинических оценочных показателей по указанной выше ALSFRS-R. Таким образом, клиницист в данной области может определять невосприимчивость к существующему терапевтическому средству для ALS при лечении ALS. Например, клиницист оценивает статус индивидуума в соответствии с ALSFRS-R при медицинском осмотре каждые 3 месяца. Когда скорость изменения (сниженный балл/период) по оценочной шкале предопределенного периода (например, 3 месяцев) после начала лечения существующим терапевтическим средством для ALS является равной или больше, чем скорость изменения по оценочной шкале для предопределенного периода (например, 6 месяцев) до начала лечения существующим терапевтическим средством для ALS, существующее терапевтическое средство для ALS не является эффективным для индивидуума. Таким образом, подтверждают, что индивидуум является невосприимчивым к существующему терапевтическому средству для ALS.
Индивидуум, не восприимчивый к лечению существующим терапевтическим средством для ALS, также может включать индивидуума, на которого существующее терапевтическое средство ранее оказывало свой терапевтический эффект в ответ на лечение, но больше не оказывает аналогичного эффекта в результате лечения на данный момент.
[0060] Термин "недостаточно восприимчивый" к существующему терапевтическому средству для ALS относится к состоянию, когда патологическое прогрессирование не подавляется достаточно в результате лечения существующим терапевтическим средством для ALS вследствие неподходящего терапевтического эффекта существующего терапевтического средства для ALS. Недостаточная восприимчивость к лечению существующим терапевтическим средством для ALS оценивают путем анализа одного или более клинических оценочных показателей по ALSFRS-R, как указано выше. Таким образом, клиницист в данной области может определять недостаточную восприимчивость к существующему терапевтическому средству для ALS при лечении ALS. Например, клиницист оценивает статус индивидуума в соответствии с ALSFRS-R при медицинском осмотре каждые 3 месяца. Когда скорость изменения (сниженный балл/период) по оценочной шкале для предопределенного периода (например, 3 месяца) после начала лечения существующим терапевтическим средством для ALS составляет менее 30% снижения по сравнению со скоростью изменения по оценочной шкале для предопределенного периода (например, 6 месяцев) до начала лечения существующим терапевтическим средством для ALS, существующее терапевтическое средство для ALS является недостаточно эффективным для индивидуума. Таким образом, подтверждают, что индивидуум является "недостаточно восприимчивым" к существующему терапевтическому средству для ALS.
[0061] Используемый в настоящем описании термин "лечение" относится к регуляции, снижению или предотвращению патологического прогрессирования ALS. Лечение включает регуляцию, снижение или предотвращение патологического прогрессирования прогрессирующей дегенерации мотонейронов, денервации мышечных волокон, мышечной атрофии, мышечной слабости, контрактуры или паралича и увеличение периодов выживания.
[0062] Описываемый в настоящем описании "терапевтический эффект" можно определять известным в данной области способом. Терапевтический эффект можно определять оценкой, например, функционального статуса на основе ALSFRS-R, дыхательных функций на основе форсированной жизненной емкости (FVC) или мышечной силы на основе шкалы Комитета медицинских исследований (MRC).
Можно использовать любой другой способ при условии, что способом можно определять тяжесть симптомов ALS. Терапевтический эффект можно определять на основании, например, силы захвата, мышечной силы спины, способности или неспособности независимо передвигаться, наличия или отсутствия кормления через зонд, периода времени до кормления через зонд (дату начала периода времени можно устанавливать относительно, и она может представлять собой, например, сутки, на которые начинают введение терапевтического средства для ALS по настоящему изобретению или существующего терапевтического средство для ALS, или сутки, когда впервые наблюдают симптомы ALS, такие как мышечная слабость), наличия или отсутствия трахеотомии, наличия или отсутствия размещения респиратора, периода времени до интубации для размещения респиратора или трахеотомии (дату начала периода времени можно устанавливать относительно, и она может представлять собой, например, сутки, на которые начинают введение терапевтического средства для ALS по настоящему изобретению или существующего терапевтического средства для ALS, или сутки, когда впервые наблюдают симптомы ALS, такие как мышечная слабость), или периода выживания (дату начала периода времени можно устанавливать относительно, и она может представлять собой, например, сутки, на которые начинают введение терапевтического средства для ALS по настоящему изобретению или существующего терапевтического средства для ALS, или сутки, когда впервые наблюдают симптомы ALS, такие как мышечная слабость).
"Терапевтический эффект" лекарственного средства можно определять любым из этих способов после завершения периода дозирования терапевтического средства для ALS по настоящему изобретению или существующего терапевтического средства для ALS или во время период его дозирования.
[0063] Терапевтическое средство для ALS, содержащее агонист GHS-R по настоящему изобретению в качестве активного ингредиента, можно вводить отдельно индивидууму-реципиенту или можно вводить в комбинации с дополнительным лекарственным средством индивидууму-реципиенту.
Используемый в настоящем описании термин "(вводимый) в комбинации" или "используемый в комбинации" относится к введению двух или более типов лекарственных средств одному индивидууму. Эти лекарственные средства можно вводить одномоментно или почти одномоментно (например, в течение 1 часа) или можно вводить разнесенным во времени образом с интервалами в несколько часов. Например, первое лекарственное средство вводят каждые сутки непосредственно после введения второго лекарственного средства. Как правило, первое и второе лекарственные средства вводят в моменты времени, подходящие для того, чтобы эти лекарственные средства проявляли свои эффекты. В случае использования, например, терапевтического средства для ALS, содержащего агонист GHS-R грелин в качестве активного ингредиента, в комбинации с существующим терапевтическим средством для ALS, существующее терапевтическое средство для ALS вводят перед приемом пищи каждое утро и каждый вечер непосредственно после введения (например, подкожного введения) терапевтического средства для ALS, содержащего грелин в качестве активного ингредиента, или наоборот. Таким образом, эти лекарственные средства можно использовать в комбинации.
[0064] Вследствие того, что грелин проявляет подавляющее мышечную слабость действие и/или увеличивающий период выживания эффект в условиях, когда существующее терапевтическое средство для ALS является неэффективным, это лекарственное средство является эффективным для страдающего ALS индивидуума, невосприимчивого или недостаточно восприимчивого к существующему терапевтическому средству для ALS, и также ожидают, что оно обладает эффективностью для страдающего ALS индивидуума, недостаточно восприимчивого к существующему терапевтическому средству для ALS, при использовании в комбинации с существующим терапевтическим средством для ALS. Примеры существующего терапевтического средства для ALS могут включать рилузол.
[0065] Агонист GHS-R или его фармакологически приемлемая соль, которую можно использовать в настоящем изобретении, можно вводить перорально или парентерально в форме твердого препарата (таблеток, капсул, гранул, мелкозернистых гранул, порошков и т.д.) или жидкого препарата (сиропов, инъекций и т.д.) с добавлением фармацевтически приемлемых носителей.
[0066] В качестве фармацевтически приемлемых носителей используют различные органические или неорганические вещества-носители, общепринято используемые в качестве фармацевтических веществ. В твердый препарат добавляют эксципиент, смазочное средство, связывающее средство, дезинтегрант и т.п. В жидкий препарат добавляют растворитель, солюбилизатор, суспендирующее средство, средство придания тоничности, регулятор pH, буферное средство, успокаивающее средство и т.п. При необходимости в этих препаратах можно дополнительно использовать фармацевтические добавки, такие как антисептик, антиоксидант, краситель и подсластитель.
[0067] Предпочтительные примеры эксципиента включают лактозу, сахарозу, D-маннит, крахмал, кристаллическую целлюлозу и легкую безводную кремниевую кислоту. Предпочтительные примеры смазочного средства включают стеарат магния, стеарат кальция, тальк и коллоидный диоксид кремния.
[0068] Предпочтительные примеры связывающего средства включают кристаллическую целлюлозу, сахарозу, D-маннит, декстрин, гидроксипропилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу и поливинилпирролидон.
[0069] Предпочтительные примеры дезинтегранта включают крахмал, карбоксиметилцеллюлозу, карбоксиметилцеллюлозу кальция, кроскармеллозу натрия и карбоксиметилкрахмал натрия.
[0070] Предпочтительные примеры растворителя включают воду для инъекций, спирты, пропиленгликоль, макрогол, сезамовое масло и кукурузное масло.
[0071] Предпочтительные примеры солюбилизатора включают полиэтиленгликоль, пропиленгликоль, D-маннит, бензил бензоат, этанол, трисаминометан, холестерин, триэтаноламин, карбонат натрия и цитрат натрия.
[0072] Предпочтительные примеры суспендирующего средства включают поверхностно-активные вещества, такие как стеарилтриэтаноламин, лаурилсульфат натрия, лауриламинопропионовую кислоту, лецитин, хлорид бензалкония, хлорид бензетония и моностеарат глицерина, и гидрофильные полимеры, такие как поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, карбоксиметилцеллюлоза натрия, метилцеллюлоза, гидроксиметилцеллюлоза, гидроксиэтилцеллюлоза и гидроксипропилцеллюлоза.
[0073] Предпочтительные примеры средства придания тоничности включают хлорид натрия, глицерин и D-маннит.
[0074] Предпочтительные примеры буферного средства включают растворы фосфатного, ацетатного, карбонатного и цитратного буфера.
[0075] Предпочтительные примеры успокаивающего средства включают бензиловый спирт.
пара
Предпочтительные примеры антисептика включают сложные эфиры, -гидроксибензоата, хлорбутанол, бензиловый спирт, фенэтиловый спирт, дегидроуксусную кислоту и сорбиновую кислоту.
[0076] Предпочтительные примеры антиоксиданта включают сульфит и аскорбиновую кислоту.
[0077] Примеры лекарственных форм, подходящих для парентерального введения могут включать инъекции, капли, суппозитории, всасывающиеся через кожу составы, всасывающиеся через слизистую оболочку составы и лекарственные формы для ингаляции для внутривенного введения, внутрикожного введения, подкожного введение или внутримышечного введения. Примеры лекарственных форм, подходящих для перорального введения могут включать капсулы, таблетки и сиропы. Когда активный ингредиент в терапевтическом средстве по настоящему изобретению представляет собой пептидное соединение, его лекарственная форма представляет собой предпочтительно лекарственную форму, подходящую для парентерального введения, например, инъекцию, капли или лекарственную форму для ингаляции. Специалистам в данной области известны различные такие лекарственные формы. Специалисты в данной области могут соответствующим образом выбирать лекарственную форму, подходящую для желательного способа введения и могут получать препарат в форме фармацевтической композиции с использованием при необходимости одного или двух, или более фармацевтических добавок, которые можно использовать в данной области. Например, терапевтическое средство в форме инъекции или каплей можно получать растворением активного ингредиента агониста GHS-R совместно с одним или двумя, или более фармацевтическими добавками, такими как средство придания тоничности, регулятор pH, успокаивающее средство и антисептик, в дистиллированной воде для инъекций, и стерилизацией раствора. Альтернативно, терапевтическое средство в форме инъекции или каплей можно предоставлять в виде лиофилизированного терапевтического средства. Такой препарат можно растворять добавлением дистиллированной воды или физиологического раствора для инъекций перед использованием и использовать в качестве инъекции или каплей.
[0078] Вследствие того, что грелин человека проявляет подавляющее мышечную слабость действие и/или увеличивающий период выживания эффект на моделях ALS на животных при подкожном введении, грелин или его производное, или фармакологически приемлемую соль грелина или производного, или пептидный или непептидный агонист GHS-R можно вводить в форме инъекции, так как подкожная инъекция.
[0079] В случае, когда активный ингредиент представляет собой пептидное соединение, это соединение можно вводить перорально в форме препарата, неподдающегося перевариванию в желудочно-кишечном тракте, например, в форме микрокапсулы, содержащей активный ингредиент пептид, заключенный в липосому. Другой возможный способ введения включает всасывание через слизистую мембрану, отличную от желудочно-кишечной слизистой оболочки, такой как слизистая оболочка прямой кишки, слизистая оболочка носа или подъязычная слизистая оболочка. В этом случае соединение можно вводить индивидууму в форме суппозитория, назального спрея, лекарственной формы для ингаляций или сублингвальной таблетки. Альтернативно, в настоящем изобретении также можно использовать препарат, улучшенный в отношении удерживания пептида в крови, путем применения, например, препарата с контролируемым высвобождением или препарата с длительным высвобождением, содержащего полисахарид, такой как декстран или биоразрушаемый полимер, типичным представителем которого является полиамин или PEG, в качестве носителя.
[0080] Если непептидное соединение используют в качестве активного ингредиента при пероральным введением, соединение можно таблетировать, вводить в твердые капсулы в форме порошков или гранул, или получать в форме пастилки совместно с твердыми носителями, такими как эксципиент, смазочное средство, связывающее средство и дезинтегрант. Количество твердых носителей может изменяться в широких пределах и, как правило, составляет приблизительно от 25 мг приблизительно до 1 г. В случае использования жидких носителей препарат, содержащий активный ингредиент и жидкие носители, можно вводить в форме сиропа, эмульсии, мягкой капсулы или водной или неводной жидкой суспензии или раствора.
[0081] Доза агониста GHS-R, которую можно использовать в качестве активного ингредиента в терапевтическом средстве для ALS по настоящему изобретению, можно соответствующим образом выбирать в зависимости от возраста, массы тела, тяжести симптомов и способа введения индивидууму (пациенту). Верхняя граница его суточной дозы для взрослого человека, такого как страдающего ALS индивидуума, как правило, составляет, например, приблизительно 100 мг/кг или менее, предпочтительно приблизительно 10 мг/кг или мене, более предпочтительно 1 мг/кг или мене, в отношении верхней границы масса вещества. Нижняя граница его суточной дозы составляет, например, приблизительно 0,1 мкг/кг или более, предпочтительно 1 мкг/кг или более, более предпочтительно 10 мкг/кг или более. Вследствие того, что вещество, которое можно использовать в качестве активного ингредиента в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, подавляет патологическое прогрессирование ALS в условиях, когда получают его орексигенный эффект, период его введения заканчивается, когда страдающий ALS индивидуум проявляет выраженную дисфагию, которая не является больше нетяжелой, и для него требуется подход непроизвольного перорального приема внутрь, такой как кормление через зонд. Вещество можно вводить повторно или постоянно приблизительно один раз или два раза в сутки в течение от нескольких месяцев до нескольких лет до этой стадии. Для повторного введения вещества вещество желательно вводить перед приемом пища каждое утро и/или каждый вечер.
Примеры
[0082] Далее в настоящем описании настоящее изобретение конкретно описано со ссылкой на примеры. Однако эти примеры приведены только с целью иллюстрации одного из вариантов осуществления настоящего изобретения и не предназначены для ограничения настоящего изобретения.
G93A
G93A
G93A
G93A
[0083] В примерах ниже используемые модели ALS на животных представляли собой мышей SOD1. Сначала мышей B6SJL-Tg(SOD1-G93A)1Gur/J (мыши SOD1) и мышей дикого типа той же линии приобретали от The Jackson Laboratory (ME, USA) и спаривали друг с другом с получением потомства. Получаемых мышей SOD1 дополнительно скрещивали с однопометными животными дикого типа (мыши WT). В экспериментах использовали новорожденных мышей SOD1. В некоторых экспериментах также использовали мышей WT.
G93A
G93A
Мышам SOD1 и мышам WT обеспечивали свободный доступ к водопроводной воде и стандартному гранулированному корму для грызунов (CRF-1, 13,6% всех калорий получают из жира, 3570 ккал/кг, Oriental Yeast Co., Ltd.) во время их индукции. Мышам SOD1 способствовали в потреблении пищи путем разбрасывания корма на полу в возрасте 18 недель или позже, когда мыши испытывали трудности с забором корма из кормушки вследствие ухудшения функций нижних конечностей.
G93A
[0084] <Пример 1> Сравнение массы тела и мышечной силы передних конечностей у мышей SOD1 и мышей WT в возрасте 10 недель
G93A
G93A
Мыши SOD1 характеризуются избирательной гибелью мотонейронов на стадии созревания и проявляют атрофию скелетных мышц или потерю мышечной силы, в конечном итоге, приводящую к гибели, как у ALS человека. Таким образом, масса тела и мышечная сила передних конечностей мышей SOD1 в возрасте 10 недель сначала сравнивали с мышечной силой передних конечностей мышей WT для подтверждения начала ALS в этом возрасте.
[0085] 1. Вещества и способы
G93A
В этом примере использовали мышей WT и SOD1 в возрасте 10 недель и измеряли их массы тела и мышечную силу передних конечностей. Мышечную силу передних конечностей измеряли с использованием простого динамометра для крысы/мыши, шкала 200 г (O'HARA & CO., LTD.).
[0086] 2. Результаты
Масса тела и мышечная сила передних конечностей каждой группы приведены в таблице 1.
G93A
G93A
Для мышей SOD1 демонстрировали такие низкие значения средней массы тела, как приблизительно на 1 г меньше, а также значительно меньшую мышечную силу передних конечностей приблизительно на 0,1Н меньше среднего значений мышечной силы мышей WT. Это демонстрировало, что мыши SOD1 уже потеряли свою мышечную силу, и ALS развивался в возрасте 10 недель.
[0087] <b>[Таблица 1]</b>
Мышь WT
Мышь SOD1<sup>G93A</sup>
Масса тела (г)
25,2±0,7 (18)
24,1±0,7 (10)
Мышечная сила передних конечностей (Н)
1,04±0,04 (18)
0,91±0,04 (10)<sup>*</sup>
Численные величины указаны в виде среднего значения ± SE (число случаев).
<sup>*</sup>:P <0,05 в сравнении с мышами WT (t-критерий Стьюдента).
G93A
[0088] <Пример 2> Эффект рилузола на мышей SOD1
1. Вещества и способы
G93A
G93A
Опубликовано, что рилузол, существующее терапевтическое средство для ALS, проявляет увеличивающий продолжительность жизни эффект при введении мышам SOD1 с возраста 4 недели или 7 недель и в обоих случаях до начала ALS (Amyotrophic Lateral Sclerosis (2009), vol. 10, p. 85-94; и Annals of Neurology (1996), vol. 39, p. 147-157). В примере 1 подтверждали, что мыши SOD1 проявляют мышечную слабость как симптом ALS в возрасте 10 недель.
G93A
В этом примере мышей SOD1 в возрасте 10 недель разделяли на 2 группы: группу носителя (физиологический раствор) и группу рилузола. Физиологический раствор или рилузол (Sigma-Aldrich Corp, 16 мг/кг) вводили интраперитонеально один раз в сутки до гибели и анализировали период выживания каждого индивидуума. Дозу рилузола устанавливали в соответствии с предшествующим сообщением (Amyotrophic Lateral Sclerosis (2009), vol. 10, p. 85-94).
[0089] 2. Результаты
Средний период выживания каждой группы приведен в таблице 2.
В группе носителя и группе рилузола наблюдали равные средние периоды выживания. Таким образом, не подтверждали, что рилузол обладает увеличивающим продолжительность жизни эффектом в условиях введения с возраста 10 недель.
<b>[0090] [Таблица 2]</b>
Группа носителя
Группа рилузола
Период выживания (сутки)
137±3 (7)
134±3 (6)
Численные величины указаны в виде среднего значения ± SE (число случаев).
G93A
[0091] <Пример 3> Эффект получаемого от человека грелина (далее в настоящем описании обозначаемого как грелин человека) на мышей SOD1 - (1): Эффекты на массу скелетных мышц, мышечную силу и период выживания при непрерывном подкожном введении
G93A
G93A
В примере 2 подтверждали, что рилузол не проявляет увеличивающего период выживания эффекта при введении мышам SOD1 с возраста 10 недель. Эффект грелина человека (SEQ ID NO: 1) анализировали в таких условиях, когда мыши SOD1 уже проявляли мышечную слабость как симптом ALS, и рилузол не являлся эффективным для увеличения периодов их выживания.
[0092] 1. Вещества и способы
G93A
В эксперименте использовали мышей SOD1 в возрасте 10 недель, которых разделяли на 2 группы: группу носителя и группу грелина человека. Для получения дозирующего раствора в носителе (физиологическом растворе) растворяли грелин человека (50 мкг/сутки, приблизительно 2 мг/кг/сутки). Осмотический насос (ALZET(R) MINI-OSMOTIC PUMP MODEL 1004, DURECT Corporation), наполненный дозирующим раствором или физиологическим раствором, имплантировали под кожу на спине каждой мыши для непрерывного подкожного введения. Введение начинали с возраста 10 недель и продолжали на живых индивидуумах с заменой осмотического насоса на свежий насос каждые 4 недели.
[0093] До начала введения и через 8 недель введения измеряли их массу тела и массу корма для расчета величины изменения массы тела и потребления корма. Через 8 недель введения измеряли массу скелетных мышц нижней части тела с использованием рентгеновской компьютерной томографии (Latheta LCT-200, Hitachi Aloka Medical, Ltd.). Концентрации общего холестерина в плазме измеряли с использованием Cholesterol E-Test Wako (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), с использованием плазмы, отделенной от крови, собираемой из хвостовой вены через 8 недель введения. Мышечную силу передних конечностей измеряли с использованием простого динамометра для крысы/мыши, шкала 200 г (O'HARA & CO., LTD.) в возрасте 16 недель. Также анализировали период выживания каждого индивидуума.
[0094] 2. Результаты
Величина изменения средней массы тела, потребления корма и масса скелетных мышц нижней части тела каждой группы чрез 8 недель введения представлена в таблице 3.
Величина изменения средней массы тела, потребления корма и массы скелетных мышц нижней части тела через 8 недель введения значительно увеличивалась в группе грелина человека по сравнению с группой носителя.
<b>[0095] [Таблица 3]</b>
Группа носителя
Группа грелина человека
Величина изменения массы тела (г)
0,4±0,4 (15)
2,6±0,4 (15)<sup>**</sup>
Потребление корма (г)
177,0±2,9 (15)
188,2±3,6 (15)<sup>*</sup>
Масса скелетных мышц нижней части тела (г)
4,8±0,3 (15)
5,7±0,3 (15)<sup>*</sup>
Численные величины указаны в виде среднего значения ± SE (число случаев).*, **: P<0,05, 0,01 в сравнении с группой носителя (t-критерий Стьюдента).
[0096] Концентрация общего холестерина в плазме каждой группы через 8 недель введения представлена в таблице 4.
Не наблюдали различий между группой носителя и группой грелина человека.
[0097] [Таблица 4]
Группа носителя
Группа грелин человека
Концентрация общего холестерина в плазме (мг/дл)
86,5±5,6 (15)
85,8±4,0 (15)
Численные величины указаны в виде среднего значения ± SE (число случаев).
[0098] Средняя мышечная сила передних конечностей каждой группы через 6 недель введения представлена в таблице 5.
Группа грелина человека характеризовалась существенно большей мышечной силой передних конечностей по сравнению с мышечной силой группы носителя, что демонстрирует, что грелин человека подавлял потерю мышечной силы.
<b>[0099] [Таблица 5]</b>
Группа носителя
Группа грелина человека
Мышечная сила передних конечностей (Н)
0,74±0,05 (15)
0,96±0,05 (15)<sup>**</sup>
Численные величины указаны в виде среднего значения ± SE (число случаев).
<sup>**</sup>: P<0,01 в сравнении с группой носителя (t-критерий Стьюдента).
[0100] Далее в таблице 6 представлен средний период выживания каждой группы.
Период выживания группы грелина человека являлся значительно увеличенным по сравнению с группой носителя и являлся в среднем на 13,8% больше чем сутки выживания группы носителя.
<b>[0101] [Таблица 6]</b>
Группа носителя
Группа грелина человека
Период выживания (сутки)
152±5 (15)
173±4 (15)<sup>**</sup>
Численные величины указаны в виде среднего значения ± SE (число случаев).
<sup>**</sup>: P<0,01 в сравнении с группой носителя (логранговый критерий).
G93A
[0102] Эти результаты демонстрировали, что грелин человека, непрерывно вводимый подкожно с возраста 10 недель, когда мыши SOD1 уже проявляли мышечную слабость, и рилузол являлся неэффективным для увеличения периодов их выживания, увеличивал их массу тела и потребление корма, подавлял потерю мышечной силы передних конечностей и увеличивал периоды выживания по сравнению с группа носителя, несмотря на то, что не оказывал влияния на концентрации общего холестерина в плазме. Таким образом, было выявлено, что грелин человека подавляет прогрессирование симптомов ALS даже в условиях, когда рилузол, существующее терапевтическое средство для ALS, не являлся эффективным.
G93A
[0103] <Пример 4> Эффект грелина человека на мышей SOD1 - (2): защитный эффект по отношению к мотонейронам при непрерывном подкожном введении
G93A
В примере 3 подтверждали, что грелин человека, вводимый мышам SOD1 с возраста 10 недель, подавлял потерю мышечной силы передних конечностей и увеличивал периоды их выживания. ALS представляет собой заболевание, включающее мышечную атрофию, вызываемую гибелью мотонейронов, в конечном итоге приводящее к гибели. В связи с этим грелин человека анализировали на его защитный эффект в отношении мотонейронов.
[0104] 1. Вещества и способы
G93A
G93A
В эксперименте использовали мышей SOD1 и WT (дикого типа) в возрасте 10 недель. Мышей SOD1 разделяли на 2 группы: группу носителя и группу грелина человека. В качестве контрольной группы использовали мышей WT, которым вводили носитель. Для получения дозирующего раствора грелин человека (50 мкг/сутки, приблизительно 2 мг/кг/сутки) растворяли в носителе (физиологический раствор). Осмотический насос (ALZET(R) MINI-OSMOTIC PUMP 1004, DURECT Corporation), наполненный дозирующим раствором или физиологическим раствором, имплантировали под кожу на спине каждой мыши для непрерывного подкожного введения. Введение начинали с возраста 10 недель и продолжали после замены осмотического насоса свежим насосом через 4 недели. Через семь недель после начала введения мышей анатомировали и выделяли области T9 их спинного мозга. Получали окрашенные по Нисслю срезы и гистологически определяли число мотонейронов. Для измерения числа мотонейронов, находящихся в переднем роге, использовали три несмежных среза на индивидуума. Измеряемую величину каждой группы рассчитывали в виде относительной величины, где среднее число мотонейронов в контрольной группе определяли как 100%.
[0105] 2. Результаты
Относительное число мотонейронов в каждой группе по сравнению с контрольной группой представлено в таблице 7.
Число мотонейронов в группе носителя являлось значительно меньше приблизительно в 1/2 раза по сравнению с числом мотонейронов контрольной группы. С другой стороны, число мотонейронов в группе грелина человека являлось значительно больше, чем число мотонейронов группы носителя.
<b>[0106] [Таблица 7]</b>
Контрольная группа
Группа носителя
Группа грелина человека
Генотип мыши
WT
SOD1<sup>G93A</sup>
SOD1<sup>G93A</sup>
Тестируемое вещество
Носитель
Носитель
Грелин человека
Число мотонейронов (%)
100±4 (9)
51±3 (8)<sup>**</sup>
84±7 (7)<sup>*,##</sup>
Численные величины указаны в виде среднего значения ± SE (число случаев).
<sup>*</sup>, <sup>**</sup>: P<0,05, 0,01 в сравнении с контрольной группой (критерий множественного сравнения Даннета).
<sup>##</sup>: P<0,01 в сравнении с группой носителя (t-критерий Стьюдента).
G93A
[0107] Эти результаты демонстрируют, что введение грелина человека мышам SOD1 ингибирует уменьшение числа мотонейронов, т.е. защищает мотонейроны.
G93A
[0108] <Пример 5> Эффект грелина человека на мышей SOD1 - (3): Эффект на мышечную силу и периоды выживания при повторном подкожном введении
G93A
В примерах 3 и 4 подтверждали, что грелин человека, непрерывно вводимый подкожно мышам SOD1 с возраста 10 недель, подавляет потерю мышечной силы передних конечностей, увеличивает периоды их выживания и защищает мотонейроны.
G93A
В этом примере исследовали грелин человека на его эффекты в отношении мышечной силы передних конечностей и периодов выживания при повторном подкожном введении мышам SOD1 в возрасте 10 недель.
[0109] 1. Вещества и способы
G93A
В эксперименте использовали мышей SOD1 в возрасте 10 недель, которых разделяли на 2 группы: группу носителя и группу грелина человека. Грелин человека (1 мг/кг) или носитель (5% раствор маннита) подкожно вводили дважды в сутки с возраста 10 недель до гибели. До начала введения и через 8 недель введения измеряли их массу тела и массу корма для расчета величины изменения массы тела и потребления корма. Мышечную силу передних конечностей измеряли с использованием простого динамометра для крысы/мыши, шкала 200 г (O'HARA & CO., LTD.) до начала введения и через 8 недель введения. Также анализировали период выживания каждого индивидуума.
[0110] 2. Результаты
Величина изменения средней массы тела и потребления пищи каждой группы через 8 недель введения представлена в таблице 8.
Величина изменения массы тела и потребления пищи через 8 недель введения значительно увеличивалась в группе грелина человека по сравнению с группой носителя.
<b>[0111] [Таблица 8]</b>
Группа носителя
Группа грелина человека
Величина изменения массы тела (г)
0,1±0,7 (12)
2,1±0,4 (13)<sup>**</sup>
Потребление корма (г)
160,8±3,9 (12)
176,2±3,5 (13)<sup>**</sup>
Численные величины указаны в виде среднего значения ± SE (число случаев).
<sup>**</sup>: P<0,01 в сравнении с группой носителя (t-критерий Стьюдента).
[0112] Средняя величина мышечной силы передних конечностей каждой группы с возраста 10 недель до периода через 8 недель введения представлена в таблице 9. Потеря мышечной силы передних конечностей значительно подавлялась в группе грелина человека по сравнению с группой носителя.
<b>[0113] [Таблица 9]</b>
Группа носителя
Группа грелина человека
Изменение мышечной силы передних конечностей (Н)
-0,34±0,05 (12)
-0,08±0,07 (13)<sup>**</sup>
Численные величины указаны в виде среднего значения ± SE (число случаев).
<sup>**</sup>: P<0,01 в сравнении с группой носителя (t-критерий Стьюдента).
[0114] Ниже в таблице 10 представлен средний период выживания для каждой группы.
Период выживания группы грелина человека значительно увеличивался по сравнению с группой носителя и являлся в среднем на 21,8% больше, чем сутки выживания группы носителя.
<b>[0115] [Таблица 10]</b>
Группа носителя
Группа грелина человека
Период выживания (сутки)
147±5 (13)
179±8 (13)<sup> **</sup>
Численные величины указаны в виде среднего значения ± SE (число случаев).
<sup>**</sup>: P<0,01 в сравнении с группой носителя (логранговый критерий).
G93A
[0116] Эти результаты демонстрируют, что повторное подкожное введение грелина человека подавляло патологическое прогрессирование ALS у мышей SOD1 также как при непрерывном подкожном введении. Это указывает на то, что грелин человека может подавлять патологическое прогрессирование у являющихся человеком пациентов с ALS и проявлять терапевтический эффект после повторного подкожного введения.
G93A
[0117] <Пример 6> Эффект грелина человека на мышей SOD1 - (4): Эффекты на массу тела, массу скелетных мышц, мышечную силу и число мотонейронов при ограниченном кормлении
G93A
G93A
В примерах 3 и 5 продемонстрировано, что грелин человека непрерывно вводимый подкожно или вводимый повторно мышам SOD1 с возраста 10 недель подавляет потерю мышечной силы передних конечностей и увеличивает периоды их выживания. В примере 4 подтверждали, что грелин, непрерывно подкожно вводимый мышам SOD1, защищает мотонейроны.
G93A
G93A
В этом примере мышей SOD1 выращивали в условиях ограниченного кормления, при котором ежесуточное потребление корма мышей SOD1 в условиях неограниченного доступа устанавливали приблизительно на 90%. Грелин человека непрерывно подкожно вводили в условиях, когда мыши были не способны потреблять больше корма, т.е. грелин не проявлял орексигенный эффект. Вводимый грелин анализировали в отношении его эффектов на массу тела, массу скелетных мышц, мышечную силу, число мотонейронов и экспрессию мРНК атрогин-1 и белка Muscle RING-finger-1 (MuRF1), которые участвуют в атрофии скелетных мышц.
[0118] 1. Вещества и способы
G93A
G93A
G93A
В эксперименте использовали мышей SOD1 и WT в возрасте 10 недель. Мышей WT разделяли на 2 группы, одну из которых выращивали в условиях свободного доступа к корму (контрольная группа WT), и другую, которая получала от 2,8 до 2,9 г/сутки, что соответствует приблизительно 90% ежесуточного потребления корма в условиях свободного доступа к корму мышей SOD1 (группа WT с ограниченным кормлением). Мышей SOD1 разделяли на 2 группы: группу носителя и группу грелина человека, которых выращивали в условиях ограниченного кормления от 2,8 до 2,9 г/сутки (G93A-группа носителя и G93A-группа грелина человека).
Для получения дозирующего раствора грелин человека (50 мкг/сутки, приблизительно 2 мг/кг/сутки) растворяли в носителе (физиологический раствор). Осмотический насос (ALZET(R) MINI-OSMOTIC PUMP 1004, DURECT Corporation), наполненный дозирующим раствором или физиологическим раствором, имплантировали под кожу на спине каждой мыши для непрерывного подкожного введения. Введение начинали с возраста 10 недель, и осмотический насос заменяли свежим насосом после 4 недель.
На сутки начала введения и через 6 недель измеряли их массу тела для расчета величины изменения массы тела.
Мышечную силу передних конечностей измеряли с использованием простого динамометра для крысы/мыши, шкала 200 г (O'HARA & CO., LTD.) через 7 недель после начала введения.
[0119] Массу скелетных мышц нижней части тела мышей измеряли с использованием рентгеновской компьютерной томографии (Latheta LCT-200, Hitachi Aloka Medical, Ltd.) до начала введения (в возрасте 10 недель) и через 7 недель для определения величины изменения массы скелетных мышц.
Затем мышей анатомировали и выделяли области T9 их спинного мозга. Получали окрашенные по Нисслю срезы и гистологически определяли число мотонейронов. Для измерения числа мотонейронов, находящихся в переднем роге, использовали три несмежных среза на индивидуума. Измеряемую величину каждой группы рассчитывали в виде относительной величины, где среднее число мотонейронов в контрольной группе WT определяли как 100%.
Выделяли икроножные мышцы и после экстракции мРНК количественной ПЦР измеряли уровни экспрессии мРНК атрогина-1 и MuRF1. Измеряемую величину каждой группы рассчитывали в виде относительной величины, где средний уровень экспрессии мРНК в контрольной группе WT определяли как 100%.
[0120] 2. Результаты
Всех мышей в группах выращивали в условиях ограниченного кормления, при котором они потребляли полную часть корма во время периода тестирования. Таким образом, подтверждали, что потребление корма являлось одинаковым в группе WT с ограниченным кормлением, G93A-группа носителя и G93A-группе грелина человека, выращиваемых в условиях ограниченного кормления.
Величина изменения массы тела через 6 недель после начала введения и массы скелетных мышц нижней части тела через 7 недель после начала введения мышей в каждой группе представлена в таблице 11.
G93A
G93A
G93A
G93A
Масса тела контрольной группы WT, которую выращивали в условиях свободного доступа к корму, увеличивалась тогда, как ограниченное кормление приводило к снижению массы тела у мышей WT и у мышей SOD1 и к особенно заметному снижению массы тела у мышей SOD1. Снижение массы тела являлось достоверно меньше в группе грелина человека (G93A-группа грелина человека), чем у мышей SOD1, которым вводили носитель (G93A-группа носителя). Аналогично, масса скелетных мышц нижней части тела также увеличивалась у мышей WT, которых выращивали в условиях свободного доступа к корму, но снижалась в группе с ограниченным кормлением. Снижение массы скелетных мышц значительно ингибировали в G93A-группе грелина человека по сравнению с G93A-группой носителя. Как представлено ниже, введение грелина даже в условиях ограниченного кормления, в которых грелин не проявляет орексигенный эффект, подавляло снижение массы тела или массы скелетных мышц мыший SOD1.
<b>[0121] [Таблица 11]</b>
Величина изменения массы тела (г)
Величина изменения скелетных мышц нижней части тела (г)
Группа контроля WT (9)
3,5±1,1
0,3±0,2
Группа WT с ограниченным кормлением(8)
-2,5±0,9<sup>**</sup>
-1,3±0,1<sup>**</sup>
G93A-группа носителя (13)
-4,7±0,6<sup>**</sup>
-1,6±0,2<sup>**</sup>
G93A-группа грелина человека (15)
-1,4±0,7<sup>**,##</sup>
-0,9±0,2<sup>**,#</sup>
( ): число случаев, <sup>**</sup>: P<0,01 в сравнении с контрольной группой WT (критерий множественного сравнения Даннета).
<sup>#,##</sup>: P<0,05, 0,01 в сравнении с G93A-группой носителя (t-критерий Стьюдента).
[0122] Уровни экспрессии мРНК атрогина-1 и MuRF1 в скелетных мышцах через 7 недель после начала введения представлены в таблице 12.
G93A
Уровни экспрессии этих генов значительно не изменялись у мышей WT, которых выращивали в условиях ограниченного кормления, и у мышей WT, которых выращивали в условиях свободного доступа к корму, но значительно повышались у мышей SOD1, которым вводили носитель в условиях ограниченного кормления (G93A-группа носителя), по сравнению с мышами WT, которых выращивали в условиях свободного доступа к корму (контрольная группа).
G93A
С другой стороны, уровни экспрессии мРНК антрогина-1 и MuRF1 значительно понижались у мышей SOD1, которым вводили грелин человека в условиях ограниченного кормления (G93A-группа грелина) по сравнению с группой носителя, что подтверждает, что атрофия скелетных мышц подавлялась в группе грелина человека. Эти результаты соответствуют результатам таблицы 11, в которой продемонстрировано, что снижение массы скелетных мышц являлось меньше в группе грелина человека.
<b>[0123] [Таблица 12]</b>
Уровень экспрессии мРНК атрогина 1 (%)
уровень экспрессии мРНК MuRF1 (%)
Контрольная группа WT (9)
100±11
100±8
Группа WT с ограниченным кормлением (8)
113±19
142±24
G93A-группа носителя (13)
528±143<sup>**</sup>
613±196<sup>*</sup>
G93A-группа грелина человека (15)
205±34<sup>##</sup>
207±36<sup>##</sup>
( ): число случаев, <sup>*,**</sup>: P<0,05, 0,01 в сравнении с контрольной группой WT (критерий множественного сравнения Даннета).
<sup>##</sup>: P<0,01 в сравнении с G93A-группой носителя (t-критерий Стьюдента).
G93A
[0124] Как продемонстрировано выше, грелин человека подавляет атрофию скелетных мышц мышей SOD1 даже в условиях ограниченного кормления.
Ниже в таблице 13 приведены мышечная сила передних конечностей и число мотонейронов в спинном мозге каждой группы мышей в этих условиях.
G93A
Для мышей WT, которых выращивали в условиях ограниченного кормления, демонстрировали мышечную силу передних конечностей или число мотонейронов, равные аналогичным показателям контрольной группы WT (неограниченный доступ к корму). Мышечная сила передних конечностей или число мотонейронов значительно снижалось у мышей SOD1, которых выращивали в условиях ограниченного кормления (носитель), по сравнению с контрольной группой WT (неограниченный доступ к корму). Это является верным и в отношении группы, которой вводили грелин человека. Таким образом, грелин человека не подавлял ни гибель мотонейронов ни мышечную силу передних конечностей в условиях ограниченного кормления.
[0125] <b>[Таблица 13]</b>
Число мотонейронов (%)
Мышечная сила передних конечностей (Н)
Контрольная группа WT (9)
100±11
1,02±0,05
Группа ограниченного кормления WT (8)
93±10
0,99±0,07
G93A-группа носителя (13)
63±4<sup>**</sup>
0,74±0,06<sup>**</sup>
G93A-группа грелина человека (15)
66±5<sup>**</sup>
0,77±0,06<sup>**</sup>
( ): число случаев, <sup>**</sup>: P<0,01 в сравнении с контрольной группой WT (критерий множественного сравнения Даннета).
G93A
[0126] Как видно из этих результатов грелин подавляет потерю массы тела или атрофию скелетных мышц мышей SOD1 независимым от своего орексигенного эффекта действием даже в условиях ограниченного кормления.
С другой стороны, показано, что, для подавления гибели мотонейронов или потери мышечной силы грелин необходимо вводить таким образом, чтобы достигать его орексигенного эффекта, в кратком изложении, его необходимо вводить индивидууму, потребление пищи которого можно повышать введением грелина. В частности, было выявлено, что грелин улучшает общий энергетический статус посредством своего орексигенного эффекта, таким образом, опосредованно подавляя гибель мотонейронов и подавляя патологическое прогрессирование ALS.
G93A
[0127] <Пример 7> Сравнение массы тела и мышечной силы передних конечностей у мышей и SOD1 и мышей WT в возрасте 16 недель
G93A
В примерах 3, 4 и 5 продемонстрировано, что грелин человека, вводимый мышам SOD1 с возраста 10 недель, когда мыши уже проявляли мышечную слабость передних конечностей, увеличивает их потребление корма или массы тела, подавляет гибель мотонейронов или потерю мышечной силы и увеличивает период выживания.
В клинической практике лечение пациентов с ALS начинали только, когда клиницист проводил точную диагностику заболевания после его начала. Вследствие того, что для точной диагностики ALS требуется от полугода до одного или нескольких лет (Guideline for treatment of ALS, 2002 руководство по лечению японского общества неврологии), прежде чем приступать к лечению, необходимо увидеть симптомы.
G93A
G93A
Таким образом, грелин человека исследовали в отношении его эффекта при введении мышам SOD1 на более поздней стадии патологического прогрессирования ALS. Таким образом, в этом примере сравнивали массу тела и мышечную силу передних конечностей мышей SOD1 в возрасте 16 недель с массой тела и мышечной силой передних конечностей мышей WT.
1. Вещества и способы
[0128]
G93A
В эксперименте использовали мышей WT и SOD1 в возрасте 16 недель и измеряли их массу тела и мышечную силу передних конечностей. Мышечную силу передних конечностей измеряли с использованием простого динамометра для крысы/мыши, шкала 200 г (O'HARA & CO., LTD.).
[0129] 2. Результаты
Масса тела и мышечная сила передних конечностей каждой группы представлены в таблице 14.
G93A
G93A
Для мышей SOD1 выявляли среднюю массу тела по меньшей мере на 2 г меньше и мышечную силу передних конечностей приблизительно на 0,5 Н меньше средней массы тела и мышечной силы передних конечностей мышей WT. Эти различия значений мышей WT являлись более заметными по сравнению с мышами в возрасте 10 недель (таблица 1). Также мышечная сила передних конечностей в возрасте 16 недель мышей SOD1 являлась ниже мышечная сила передних конечностей в возрасте 10 недель (0,91 Н) (таблица 1).
<b>[0130] [Таблица 14]</b>
Мышь WT
Мышь SOD1<sup>G93A</sup>
Масса тела (г)
28,0±0,5 (5)
25,3±0,9 (8)<sup> *</sup>
Мышечная сила передних конечностей
1,21±0,06(5)
0,68±0,06 (8)<sup>**</sup>
Численные величины указаны в виде среднего значения ± SE (число случаев).
<sup>*,**</sup>: P<0,05, P<0,01 в сравнении с мышами WT (t-критерий Стьюдента).
G93A
G93A
[0131] Как продемонстрировано выше, мыши SOD1 в возрасте 16 недель имели более низкую мышечную сила передних конечностей по сравнению с мышами WT того же возраста или мышами SOD1 в возрасте 10 недель (таблица 1), и таким образом подтверждали, что они находятся на более поздней стадии патологического прогрессирования ALS.
G93A
[0132] <Пример 8> Эффект грелина человека на мышей SOD1 - (5): Эффект на период выживания при непрерывном подкожном введении с возраста 16 недель
G93A
В этом примере исследовали эффект грелина человека на патологическое прогрессирование ALS у мышей SOD1 в возрасте 16 недель, которые проявляли выраженную мышечная слабость и находились на более поздней стадии патологического прогрессирование ALS, с периодами их выживания в качестве показателя.
[0133] 1. Вещества и способы
G93A
В эксперименте использовали мышей SOD1 в возрасте 16 недель, которых разделяли на 2 группы: группу носителя и группу грелина человека. Для получения дозирующего раствора грелин человека (50 мкг/сутки, приблизительно 2 мг/кг/сутки) растворяли в носителе (физиологическом растворе). Осмотический насос (ALZET(R) MINI-OSMOTIC PUMP 1004, DURECT Corporation), наполненный дозирующим раствором или физиологическим раствором, имплантировали под кожу на спине каждой мыши для непрерывного подкожного введения. Введение начинали с возраста 16 недель и продолжали на живых индивидуумах с заменой осмотического насоса на свежий насос каждые 4 недели. Анализировали период выживания каждого индивидуума.
[0134] 2. Результаты
Средний период выживания каждой группы представлен в таблице 15.
Период выживания группы грелина человека являлся значительно продленным по сравнению с группой носителя и являлся в среднем на 17,6% больше по сравнению с сутками выживания группы носителя.
<b>[0135] [Таблица 15]</b>
Группа носителя
Группа грелина человека
Период выживания (сутки)
153±7 (9)
180±11 (9)<sup>*</sup>
Численные величины указаны в виде среднего значения ± SE (число случаев).
<sup>*</sup>: P<0,05 в сравнении с группой носителя (логранговый критерий).
G93A
G93A
[0136] Как продемонстрировано выше, грелин человека значительно увеличивал периоды выживания мышей SOD1 по сравнению с группой носителя, даже когда его введение начинали с возраста 16 недель, когда мыши SOD1 проявляли выраженную мышечную слабость и находились на более поздней стадии патологического прогрессирования ALS.
G93A
Как продемонстрировано в примере 2, рилузол, существующее терапевтическое средство для ALS, не увеличивал периоды выживания при введении с возраста 10 недель. Эти результаты демонстрировали, что грелин, вводимый мышам SOD1 даже с возраста 16 недель, оказывает заметный эффект значительно увеличивал периоды их выживания по сравнению с существующим терапевтическим средством для ALS.
Таким образом, было выявлено, что грелин заметно подавляет патологическое прогрессирование ALS и обладает терапевтическим эффектом.
G93A
[0137] <Пример 9> Эффекты агонистов рецептора стимулятора секреции гормона роста GHRP-6 и анаморелина на мышей SOD1: Эффекты на период выживания при повторном подкожном введении
G93A
В примере 5 подтверждали, что грелин человека, повторно вводимый подкожно мышам SOD1 с возраста 10 недель, увеличивал периоды их выживания.
G93A
В этом примере исследовали агонисты рецептора стимулятора секреции гормона роста GHRP-6 и анаморелин в отношении их эффекта на периоды выживания, когда каждый повторно вводили подкожно мышам SOD1 в возрасте 10 недель.
[0138] 1. Вещества и способы
G93A
В эксперименте использовали мышей SOD1 в возрасте 10 недель, которых разделяли на 3 группы: группу носителя, группу GHRP-6 и группу анаморелина. GHRP-6 (1 мг/кг), анаморелин (1 мг/кг) или носитель (5% маннит раствор) подкожно вводили дважды в сутки с возраста 10 недель до гибели. Перед началом введения и через 5 недель введения измеряли их массу тела и массу корма для расчета величины изменения массы тела и потребления корма. Также анализировали период выживания каждого индивидуума.
[0139] 2. Результаты
Величина изменения средней массы тела и потребления корма каждой группы через 5 недель введения представлены в таблице 16.
Величина изменения массы тела и потребления корма через 5 недель введения значительно увеличивалась в группе GHRP-6 по сравнению с группой носителя. Величина изменения массы тела через 5 недель введения значительно увеличивалась в группе анаморелина по сравнению с группой носителя, и в группе анаморелина также выявляли тенденцию увеличения потребления корма.
<b>[0140] [Таблица 16]</b>
Группа носителя
Группа GHRP-6
Группа анаморелина
Величина изменения массы тела (г)
0,0±0,4 (31)
1,9±0,2 (30)<sup>**</sup>
0,9±0,2 (31)<sup>*</sup>
Потребление корма (г)
132,0±2,6 (31)
142,7±2,1 (30)<sup>**</sup>
139,5±2,5 (31)<sup>†</sup>
Численные величины указаны в виде среднего значения±SE (число случаев).
<sup>+</sup>, <sup>*</sup>, <sup>**</sup>: P<0,1, P<0,05, P<0,01 в сравнении с группой носителя (критерий множественного сравнения Даннета).
[0141] Ниже в таблице 17 представлен средний период выживания каждой группы.
Периоды выживания группы GHRP-6 и группы анаморелина значительно увеличивались по сравнению с группой носителя.
<b>[0142] [Таблица 17]</b>
Группа носителя
Группа GHRP-6
Группа анаморелина
Период выживания (сутки)
130±2 (31)
138±2 (30)<sup>*</sup>
136±2 (31)<sup>*</sup>
Численные величины указаны в виде среднего значения ± SE (число случаев).
<sup>*</sup>: P<0,05 в сравнении с группой носителя (критерий Уилкоксона).
G93A
[0143] Эти результаты демонстрировали, что агонисты рецептора стимулятора секреции гормона роста GHRP-6 и анаморелин, повторно вводимые подкожно мышам SOD1, подавляют патологическое прогрессирование ALS,как и грелин человека.
Применимость в промышленности
[0144] Фармацевтическая композиция, содержащая агонист рецептора стимулятора секреции гормона роста или его фармацевтически приемлемую соль, может служить в качестве терапевтического средства для бокового амиотрофического склероза у индивидуума, страдающего боковым амиотрофическим склерозом без тяжелой дисфагии.
Открытый текст для списка последовательностей
[0145] SEQ ID NO: 1 - Аминокислотная последовательность грелина человека
SEQ ID NO: 2 - Аминокислотная последовательность грелина человека (вариант сплайсинга, 27 аминокислот)