Роль сфингомиелина и церамида в регуляции процессов пролиферации и апоптоза клеток гепатоцеллюлярной карциномы

РОЛЬ СФИНГОМИЕЛИНА И ЦЕРАМИДА В РЕГУЛЯЦИИ ПРОЦЕССОВ ПРОЛИФЕРАЦИИ И АПОПТОЗА КЛЕТОК ГЕПАТОЦЕЛЛЮЛЯРНОЙ КАРЦИНОМЫ

В.А. Заварзин1, Р.З. Зайнагетдинов2, Г.В. Какурина1, И.Л. Пурлик2, В.Ю.Серебров2, И.В. Кондакова1

ГУ «НИИ онкологии Томского научного центра СО РАМН»1 ГОУВПО «Сибирский государственный медицинский университет», г. Томск2

Исследовано влияние внутривенного курсового введения липосом, содержащих сфингомиелин или церамид, на процессы пролиферации и апоптоза в динамике развития гепатоцеллюлярного рака у крыс, вызванного введением нитроздиэтила-мина. Показано, что выраженным эффектом на изучаемые показатели обладают липосомы, содержащие сфингомиелин, на ранних этапах гепатоканцерогенеза, липосомы, содержащие церамид, оказывают аналогичное влияние на поздних стадиях опухолевого процесса.

THE ROLE OF SPHINGOMYELINE AND CERAMDE ON A PROLIFERATION AND APOPTOSIS PROCESS OF HEPATOCELLULAR CARCINOMA CANCER CELLS

VA. Zavarzin1, R.Z. Zainagetdinov2, G.V Kakurina1, I.L. Purlik2,

VYu. Serebrov2, I.V Kondakova1 Cancer Research Institute, Tomsk Scientific Center of the SB RAMS1,

Siberian State Medical University, Tomsk2

It was investigated the influence of intravenous injects of liposomes loaded by sphingomyeline and ceramide on a process of proliferation and apoptosis during the hepatocelular carcinoma development, caused by diethylnitrosamine. It was shown, the most expressed effects on tested index was occurred by liposomes loaded by sphingomyeline at the early stadies of hepatocarcinogenesis, the action of liposomes loaded by ceramide was analogous at the late period of cancer development.

Сфинголипиды являются обязательным компонентом всех эукариотических клеток, различаются между собой химическим строением и биологическими функциями, но объединены общей основой - сфингоидным основанием. Установлено, что они являются предшественниками активных метаболитов, играющих существенную роль в развитии ткани, онкогенезе, росте и дифференциации клеток. Критическая роль в регуляции клеточных процессов через сигнальный сфингомиелиновый путь принадлежит церамиду, который, являясь вторичным мессенджером, ингибирует протеинкиназу С и обладает антипролиферативным действием, модулирует фосфорилирование белков, активность фосфолипазы А2 и является потенциальным индуктором апоптоза [1, 3, 4, 8].

Показано, что изменения в составе и локализации сфинголипидов на различных этапах гепатоканцерогенеза приводят к дисбалансу

процессов пролиферации и апоптоза. Такие изменения, в свою очередь, приводят к нарушению межклеточных взаимодействий и неконтролируемой пролиферации опухолевых клеток [5]. Кроме очевидной фундаментальной значимости изучения сфингомиелинового цикла в ходе нарушения соотношения процессов апоптоза и пролиферации при гепатоканцерогенезе, данное направление исследований имеет существенное практическое значение, так как рак печени различного генеза в настоящее время имеет широкую распространенность и является острейшей медико-социальной проблемой. В Европе злокачественные опухоли гепатобили-арной зоны встречаются в 1-3 случаях на 100 тыс. населения, тогда как в различных регионах Африки и Юго-Восточной Азии - в 10-15 случаях на 100 тыс. [7]. Учитывая важную роль сфингомиелина и его производных в патогенезе новообразований, является актуальным

изучение регуляции пролиферации и апоптоза компонентами сфингомиелинового цикла, а также возможности коррекции нарушения этих процессов при гепатоканцерогенезе.

Целью работы явилось изучение влияния компонентов сфингомиелинового цикла (сфин-гомиелина и церамида) на уровень пролиферации и индукции апоптоза клеток гепатоцеллю-лярной карциномы.

Материал и методы

Исследования проводились в осенне-зимний период на 230 беспородных крысах обоего пола массой 100-150 г. Животные содержались в стандартных условиях вивария. Моделирование гепатоцеллюлярного рака на крысах осуществлялось путем введения 0,02 % раствора N-нитроздиэтиламина («Sigma Aldrich») c питьевой водой, которую крысы потребляли ad libitum [2].

Экспериментальные животные разделены на следующие группы наблюдений: I группа - фон (интактные животные), II группа -экспериментальные животные с индукцией гепато-целлюлярной карциномы, III группа - введение липосом, содержащих сфингомиелин, на фоне индукции гепатоцеллюлярной карциномы, IV группа - введение липосом, содержащих цера-мид, на фоне индукции гепатоцеллюлярной карциномы, V группа - крысы, которым на фоне развития гепатоцеллюлярного рака вводили «пустые» липосомы, не содержащие сфинго-миелин или церамид. Первоначально каждая группа состояла из 45 животных, смертность в ходе эксперимента составляла 7-9 %.

Введение липосом в дозе 0,25 мл на 100 г массы тела животного осуществляли в хвостовую вену в течение 2 нед с интервалом в один день (7 инъекций), первая инъекция проводилась на 14-е сут от начала индукции гепатоцеллюлярной карциномы. Липосомы получали методом механической дезинтеграции фосфатидилхолиновой пленки в физиологическом растворе, содержащем 0,2 мг/мл церамида или сфингомиелина. В липосомы включалось до 65 % церамида или сфингомиелина. Не включенные в липосомы препараты удаляли с помощью многократного ультрацентрифугирования и удаления надоса-дочной жидкости.

Для исследований использовали трансформированные клетки, выделенные путем перфузии печени in situ через портальную вену перфузионной средой, подогретой до 37° С на 14, 28, 35, 60, 90-е сут, следующие за первой инъекцией липосом, что соответствовало стадиям созревания клеток гепатоцеллюлярной карциномы [2]. Сбор крови осуществляли через кавальную вену. Перфузировали орган 0,1 % раствором коллагеназы в течение 20 мин. По окончании перфузии в гомогенной взвеси клеток печени оценивали жизнеспособность и использовали материал для дальнейшего исследования [10].

Уровень синтеза ДНК в опухолевых клетках при введении липосом измеряли по включению в клетки меченного радионуклидами предшественника синтеза нуклеиновых кислот [3Н]-тимидина («Изотоп», Россия). Подсчет количества включенной радиоактивной метки проводили на MicroBeta TriLux (Perkin Elmer) в сцинтилляторе Lumaх (Lumac systems те.,С-ША) [6]. Индукцию апоптоза в опухолевых клетках регистрировали методом С.Н. Орлова по анализу фрагментации ДНК [14].

Для морфологического исследования фрагменты ткани фиксировали в 12 % нейтральном растворе формалина, обезвоживали и заливали в парафин. Срезы толщиной 5-6 мкн окрашивали гематоксилином-эозином, пирфуксином по Ван Гизону [9]. Морфометрическое исследование осуществлялось методами световой микроскопии (световой микроскоп Карл Цейс Йена, цифровой фотоаппарат Сanon-400).

Статистическую обработку результатов проводили с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни.

Результаты и обсуждение

Исследование уровня индукции апоптоза показало, что развитие гепатоканцерогенеза сопровождается значительным ингибированием процесса программируемой клеточной гибели по сравнению с интактной печенью (табл. 1), что согласуется с данными литературы о резистентности опухолевых клеток к апоптотическим воздействиям [8]. После курсового введения липосом, содержащих сфингомиелин, наблюдалось значительное повышение уровня

Таблица 1

Активность процесса апоптоза клеток гепатоцеллюлярной карциномы на фоне курсового введения липосом, содержащих

сфингомиелин и церамид

Группа экспериментальных животных Сроки наблюдения

14 n=6 28 n=6 35 n=6 60 n=6 90 n=6

Фон (интактные животные) 5,3 ± 0,4 4,7 ± 0,3 5,6± 0,2 3,42 ± 0,1 4,6 ± 0,2

Гепатоцеллюлярная карцинома 1,3 ± 0,08* 1,47 ± 0,02* 1,73 ± 0,05* 1,02 ± 0,06* 0,97 ± 0,02*

Введение ненагруженных (пустых) липосом 0,6 ± 0,017* 1,32 ± 0,04* 1,46 ± 0,07* 1,54 ± 0,05* 1,02 ± 0,03*

Введение липосом, нагруженных сфингомиелином 2,83 ± 0,23* ** 3,21 ± 0,17* ** 3,82 ± 0,43* ** 1,93 ± 0,03* 1,72 ± 0,37*

Введение липосом, нагруженных церамидом 1,54 ± 0,02* 2,04 ± 0,05* 1,93 ± 0,11* 2,34 ± 0,14* ** 3,02 ± 0,27* **

Примечание: * - достоверное различие при сравнении с группой «фон», р<0,05, ** - достоверное различие при сравнении с группой «гепатоцеллюлярная карцинома», р<0,05.

Таблица 2

Значения уровня пролиферации гепатоцеллюлярного рака на фоне курсового введения липосом, содержащих сфингомиелин

и церамид

Группа экспериментальных животных Сроки наблюдения

14 n=6 28 n=6 35 n=6 60 n=6 90 n=6

Фон (интактные животные) 100 100 100 100 100

Гепатоцеллюлярная карцинома 157,3 ± 1,3* 163,5 ± 1,4* 170,2 ± 1,5* 198,7 ± 1,6* 208,1 ± 2,0*

Введение ненагруженных (пустых ) липосом 151,8 ± 1,3* 148,3 ± 1,1* 181,6 ± 1,6* 204 ± 1,8* 213,5 ± 2,0*

Введение липосом, нагруженных сфингомиелином 119,3 ± 1,11* ** 120,7 ± 1,1* ** 128,8 ± 1,2* ** 183,1 ± 1,7* 195,2 ± 1,8*

Введение липосом, нагруженных церамидом 153,2 ± 1,2* 144,8 ± 1,1* 125,3 ± 1,1* ** 160,1 ± 1,4* ** 172,4 ± 1,5*

Примечание: * - достоверное различие при сравнении с группой «фон», р<0,05, ** - достоверное различие при сравнении с группой «гепатоцеллюлярная карцинома», р<0,05.

апоптотической гибели трансформированных клеток печени на 14, 28 и 35-е сут гепатокан-церогенеза по сравнению с контролем. При введении липосом, содержащих церамид, достоверное увеличение изучаемого показателя наблюдалось на 60-е и 90-е сут по сравнению с группой контроля (табл. 1).

В группе животных, которым вводили липосомы, содержащие сфингомиелин, максимальное подавление уровня пролиферации отмечено на ранних стадиях опухолевого роста (до 35 сут), в то время как в группе животных, которым вводили липосомы, содержащие цера-

мид, аналогичное снижение данного показателя наблюдалось лишь на поздних стадиях гепато-канцерогенеза - 60 сут (табл. 2).

При исследовании морфологической картины в группе животных при введении липосом, содержащих сфингомиелин, на протяжении всего периода наблюдений процессов некроза и гидропической дистрофии не наблюдалось. Формирование цирроза начиналось на 60-е сут, а к концу третьего месяца наблюдался выраженный цирроз, наряду с опухолевым процессом (рис. 1). Формирования цирроза, при введении липосом, содержащих церамид, не наблюдалось,

Рис. 1. Печень крысы на 60-е сут опухолевого процесса. Гепатоцеллюлярный рак в сочетании с циррозом на фоне введения липосом, содержащих сфингомиелин. Окраска гематоксилин и эозин, ув. 400

Рис. 2. Печень крысы на 60-е сут опухолевого процесса. Отсутствие гепатоцеллюлярного рака, фибротические изменения на фоне введения липосом, содержащих церамид. Окраска гематоксилин и эозин, ув. 400

отмечалось развитие фиброзного поражения печени с 28-х сут эксперимента, однако выраженного характера оно не имело (рис. 2).

Введение «пустых» липосом на фоне развития гепатоцеллюлярной карциномы не приводило к значительным отличиям от показателей группы животных, которым не вводили липосомы, содержащие компоненты сфинго-миелинового цикла, на фоне индукции гепато-целлюлярного рака. Такие различия в эффекте двух типов липосом могут быть обусловлены тем, что сфингомиелин является начальным компонентом сфингомиелинового цикла и гидролизуется сфингомиелиназой с образованием эндогенного церамида. Показано, что цера-мид индуцирует дифференцировку, обладает антипролиферативным действием, блокирует клеточный цикл и является потенциальным индуктором апоптоза [11]. В связи с этим увеличение содержания церамида в клетке будет приводить к ингибированию протеинкиназы С и снижению пролиферативной активности. Известно, что сфингозин, образующийся при гидролизе церамида, является также эндогенным ингибитором протеинкиназы С и способен индуцировать как пролиферацию, так и апоптоз [8, 11-13]. Можно предположить, что при введении липосом, содержащих сфингомиелин или цера-мид, изменяется динамический баланс между

уровнем метаболитов сфингомиелинового цикла. Происходит последовательная регуляция различных семейств митоген-активированных киназ, которые являются важными факторами при проведении сигналов клеточной пролиферации и апоптоза, определяя функциональную активность клетки.

Таким образом, на ранних этапах гепа-токанцерогенеза выраженным эффектом на пролиферацию и апоптоз обладают липосомы, содержащие сфингомиелин. На поздних этапах наиболее эффективно использование церамида для ингибирования пролиферации и индукции апоптоза трансформированных клеток печени.

Литература

1. Алесенко А.В. Функции сфингомиелина в клеточной пролиферации и смерти // Биохимия. 1998. Т. 63, № 1. С. 75-82.

2. Антониенко С.Г., БердинскихИ.К., Мишнаевская Е.Г. Роль некоторых компонентов системы циклических нуклеотидов при гепатоканцерогенезе, индуцированном N-нитроздиэтиламином у крыс // Эксп. онкология. 1990. Т. 12, № 5. С. 18-21.

3. Дятловицкая Э.В. Зависимость биоэфекторных свойств сфинголипидов от строения их гидрофобного фрагмента // Биохимия. 1998. Т. 63, № 1. С. 67-74.

4. Дятловицкая Э.В., Безуглов В.В. Липиды как биоэфекторы // Биохимия. 1998. Т. 63, № 1. С. 3-5.

5. Дятловицкая Э.В. Сфинголипиды и злокачественный рост // Биохимия. 1995. Т. 60, № 6. С. 843-849.

6. Кондакова И.В., Загребельная Г.В., Чойнзонов ЕЦ. Влияние NO-генерирующих соединений на опухолетоксическое действие доксорубицина // Бюл. эксп. биологии и мед. 2004. Т. 137, № 6. С. 664-666.

7. Пальцев М.А., Аничков НМ. Патологическая анатомия: В 3 т. М.: Медицина, 2001. . Т.2, ч.1. 736 с.

8. Программированная клеточная гибель / Под ред. В.С. Новикова. СПб.: Наука, 1996. 276 с.

9. Пирс Э. Гистохимия. М.: Наука, 1962. 962 с.

10. Шахов В.П., Хлусов И.А., Дамбаев Г.Ц. и др. Введение в методы культуры клеток, биоинженерии органов и тканей. Томск: STT, 2004. 135 с.

11. Jarvis W.D., Fornari FA., Browning J.L. at al. Attenuation of ceramide - induced apoptosis by diglyceride in human myeloid leuke-

mia cells // J. Biol. Chem. 1994. Vol. 269, № 50. Р. 31 685-31 692.

12. Jarvis W.D., KolesnikR.N., Browning J.L. Induktion of apop-totic DNA damage and cell death by activation of the sphingomyeline pathway // Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 1994. Vol. 91, № 1. P. 73.

13. Liscovith M., Cantley L.C. Lipid second messengers // Cell. 1994. Vol. 77. P. 329-334.

14. Orlov S.N., Dam T. V, Tremblay J. et al. Apoptosis in vascular smooth muscle cells: role of cell shrinkage // Biochem. Biophys. Res. Comm. 1996. Vol. 221. P. 708-715.

Поступила 5.06.06