Полиморфизм микросателлитного локуса CAMS-336 у сортов перца и близкородственных видов

СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2011, № 5

УДК 635.649:577.29:57.2.08

ПОЛИМОРФИЗМ МИКРОСАТЕЛЛИТНОГО ЛОКУСА CAMS-336 У СОРТОВ ПЕРЦА И БЛИЗКОРОДСТВЕННЫХ ВИДОВ*

Е.А. СНИГИРЬ1' 2, О.Н. ПЫШНАЯ2, Е.З. КОЧИЕВА1' 3, Н.Н. РЫЖОВА1

Полиморфизм микросателлитного локуса CAMS-336 исследовали у 45 сортов, гибридов и линий перца Capsicum annuum L. отечественной и зарубежной селекции, а также у образцов близкородственных культурных видов C. frutescens, C. chinense, C. baccatum. Было обнаружено 6 аллельных вариантов локуса, различающихся по длине, определены частоты встречаемости аллелей. Выявлены уникальные аллели для ряда сортов и видов, вычислены величины PIC (polymorphism information content) для полного набора образцов. Аллельная вариабельность подтверждена прямым секвенированием, что позволило установить точный нуклеотидный состав и размеры обнаруженных аллельных вариантов микросателлитного локуса CAMS-336. Кроме того, секвенирование этого локуса дало возможность определить механизм возникновения новых аллельных вариантов B и D, что связано с точечной заменой Т на А. Полученные данные свидетельствуют о возможности применения микросателлитного локуса CAMS-336 для паспортизации отечественных сортов C. annuum.

Ключевые слова: SSR-анализ, Capsicum annuum, паспортизация сортов.

Keywords: SSR analysis, Capsicum annuum, cultivar fingerprinting.

Идентификация и паспортизация сортов — один из основных способов защиты интеллектуальной собственности в селекции и семеноводстве. В настоящее время для этой цели широко используются методы молекулярного маркирования геномов, прежде всего SSR-анализ (simple sequence repeats) микросателлитных локусов — коротких (длиной менее 6 нуклеотидов) тандемно повторяющихся ДНК-последовательностей. Подобные повторы часто встречаются в геномах растений как в гетеро-, так и в эухроматиновых областях, включая экзонные, интронные и межгенные последовательности, и, как правило, равномерно распределены по геному (1). Число повторов внутри микросателлитного локуса и его длина могут значительно варьировать даже у близкородственных генотипов, в то время как фланкирующие микросателлит последовательности у генотипов одного и того же вида остаются неизменными (2, 3). Вариабельность числа повторов микросателлита — результат проскальзывания ДНК (DNA slippage) при репликации или неравного кроссинговера (4). Анализ аллельного полиморфизма микросателлитных локусов характеризуется высокой дискриминирующей способностью, поэтому широко используется для генотипи-рования сортов культурных растений, при сортовой и интрогрессивной гибридизации (3, 5-12).

Эффективность SSR-маркеров для оценки внутрисортового и межсортового полиморфизма, а также генотипирования сортов и линий сельскохозяйственных культур подтверждалась неоднократно (3, 13-22). При этом существенное значение имеет определение набора наиболее информативных микросателлитных праймеров и локусов, так как исходный генетический материал для создания современных сортов в разных странах значительно различается. Достаточно часто SSR-маркеры, рекомендуемые для генотипирования одного набора сортов, не столь эффективны при идентификации других образцов (13, 16).

Работы по использованию микросателлитных локусов генома у перца немногочисленны (20-22). Наиболее информативные данные представлены в статье, посвященной получению генетической карты Capsicum an-

* Работа выполнена при частичной финансовой поддержке гранта РФФИ 08-04-00300-а и гранта Министерства образования и науки ГК 16.М04.11.0004.

nuum на основе SSR-маркеров (22). Для микросателлитного локуса CAMS-336 на выборке из 7 сортов японской и американской селекции показан ал-лельный полиморфизм, характеризующийся высокими значениями PIC (polymorphism information content) (22).

Целью настоящей работы стала характеристика микросателлитного локуса CAMS-336, определение его вариабельности у сортов перца Capsicum annuum L. и образцов близкородственных культурных видов, а также оценка возможности применения этого локуса для паспортизации отечественных сортов C. annuum L.

Методика. Для анализа были взяты растения 45 сортов, гибридов и линий перца С. annuum L. отечественной и зарубежной селекции из коллекции Всероссийского НИИ селекции и семеноводства овощных культур, а также образцы близкородственных культурных видов — C. frutescens, C. chinense, C. baccatum.

Тотальную растительную ДНК выделяли из 8-10-суточных проростков перца по методике, предложенной К. Edwards с соавт. (23), с дополнительной депротеинизацией смесью фенол:хлороформ (1:1). Эта методика позволяет проводить быстрое выделение тотальной ДНК высокого качества (ОП260/280 1,6-1,9) в количестве более 5 мкг.

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) осуществляли с использованием соответствующих наборов реактивов («Диалат», Россия). Амплификацию микросателлитных локусов проводили в реакционной смеси объемом 15 мкл, содержащей 1* буфер из набора, 0,16 мМ каждого dNTP, 0,3 мкМ праймера, 0,3 ед. Taq-полимеразы, 100 нг геномной ДНК. Была подобрана оптимальная концентрация MgCl2. Реакцию амплификации проводили в термоциклере GeneAmp PCR System 2700 («Applied Biosystems», США) в следующем режиме: денатурация — 30 с при 94 °С, отжиг праймера — 45 с при 50 °С; синтез ДНК — 1 мин при 72 °С с предварительной денатурацией 5 мин при 94 °С (35 циклов); заключительная элонгация ПЦР-фрагментов — 10 мин при 72 °С. Температуру плавления праймеров определяли по формуле: Tra. = 69,3 + 0,41(GC) - 650/L, где L — число нуклеоти-дов в праймерной последовательности, GC — содержание GC-оснований в праймере, % (26). Исходную температуру отжига рассчитывали по формуле: Тотж. = Тдл. - 3 °С. Продукты реакции разделяли электрофорезом в 1,7 % агарозном геле в 1*ТВЕ-буфере, окрашивали бромистым этидием и фотодокументировали. Маркер молекулярных масс — GeneRuler™ 100 bp Plus DNA Ladder («Fermentas», Литва).

Для выявления аллельного полиморфизма микросателлитных локу-сов продукты амплификации разделяли в 6 % денатурирующем полиакри-ламидном геле (ПААГ) и визуализировали окрашиванием нитратом серебра с использованием набора SILVER SEQUENCE™ DNA («Promega», США) согласно рекомендациям производителя. Аллельный полиморфизм SSR-локуса оценивали с использованием коэффициента PIC: PIC = 1 - Ypt2, где Pi — частота встречаемости i-го аллеля в выборке (24).

Первичные последовательности определяли на ABI 310 capillary DNA Analyzer (США). Нуклеотидные последовательности анализировали в программе Mega 3.0 (25).

Результаты. Ранее на выборке из 5 образцов ДНК были выявлены оптимальные условия амплификации локуса CAMS-336 с праймерами ŒF и ŒR: температура отжига праймеров — 56 °С, концентрация MgCl2 — 1,1 мМ при прочих стандартных параметрах (22). В подобранных нами условиях у всех исследованных образцов также были получены фрагменты ожидаемой длины (150-200 п.н.) (рис. 1). В 1,7 % агарозном геле выявлял-

ся только один мажорный фрагмент. По результатам электрофореза удалось идентифицировать 4 аллеля микросателлита у сортов перца С. аппиит, а также 2 аллельных варианта локуса у образцов С. сЫпвтв и С. ЬассаШт.

При разделении полученных ПЦР-фрагментов в денатурирующем полиакриламидном геле у локуса СЛМБ-ЗЗб идентифицировали 6 аллелей (А, В, С, Б, Е и Б) (рис. 2).

Рис. 1. Электрофоретические спектры продуктов ПЦР-амплификации локуса CAMS-336 у 45 сортов, гибридов и линий перца Capsicum annuum L., а также образцов близкородственных культурных видов Capsicum, полученные в 1,7 % агарозном геле (слева направо): Калифорнийское Чудо, Мадонна, Spady, Рубин, Salad Festival, Marconi pepper, Chimes, Fj Раиса, Fj Пурпурная красавица, Мазурка, Оранжевое Чудо, Pirati, Memphis, RS 87001, Гибрид 167, Болеро, Шарм, Шрегеда, Бенда, Медаль, Fj Екатерина, Белоснежка, Мария, Желтый букет, Ёжик, Маяк, Каскад, Золотой Дождь, Fj Хризолит, Fj Очарование, Карлик, Fj Сибиряк, Малыш, Fj Руза, Fj Ария, Fj Изабелла, Златозар, Линия 7j Сирень, Агаповский, Здоровье, Мавр, Родник, Нежность, Сиреневый туман, C. frutescens, C. chínense, C. baccatum; крайний справа — маркер молекулярный масс GeneRuler™ !00 bp Plus DNA Ladder.

CBBCABBAC AB+B+CB BBCABAACAADCAABCABCAB С A A BB+AA С A A A

E F

Рис. 2. Электрофоретические спектры продуктов ПЦР-амплификации локуса CAMS-336 у 45 сортов, гибридов и линий перца Capsicum annuum L., а также образцов близкородственных культурных видов C. frutescens, C. chinense и C. baccatum, полученные в 6 % денатурирующем полиакриламидном геле: А, В, С, D, Е и F — аллели локуса (плюсом отмечено предполагаемое гетерозиготное состояние); крайний справа — маркер молекулярный масс GeneRuler™ Ю0 bp Plus DNA Ladder.

Аллель А содержали сорта Salad Festival, Мазурка, Шрегада, Медаль, Екатерина, Мария, Желтый букет, Каскад, Золотой дождь, Карлик, Златозар, Здоровье, Мавр, Нежность, Сиреневый туман, Fj Раиса, Fj Руза, Линия 7j а также вид С. frutescens; аллель В — сорта Мадонна, Spady, Marconi pepper, Chimes, Оранжевое чудо, Pirati, RS 8700!, Болеро, Ария, Сирень, Агаповский, Fj Хризолит, Fj Сибиряк, Гибрид ^7; аллель С — сорта Калифорнийское чудо, Рубин, Memphis, Шарм, Белоснежка, Маяк, Малыш, Изабелла, Родник, Fj Пурпурная красавица, Fj Очарование. Сорт Ёжик характеризовался присутствием сортоспецифичного аллеля D. В образцах C. chínense и C. baccatum обнаружили специфичные аллельные варианты — соответственно E и F, значительно отличающиеся по длине от аллелей, детектированных для представителей C. annuum. Интересно, что у растений сортов Оранжевое чудо, Агаповский, Pirati локус CAMS-336 был представлен двумя фрагментами, различающимися по длине, что предполагает его гетерозиготное состояние (В+).

Частота встречаемости каждого аллеля микросателлитного локуса CAMS-336 определялась как отношение числа сортов, имеющих этот аллель, к общему числу анализируемых сортов. Так, для аллеля А она составила 40, для аллеля В — 3^ аллеля С — 23, аллелей D, E и F — 2 %. То есть наиболее распространенными были аллельные варианты А, В и С, с помощью которых

описывалась аллельная вариабельность у 94 % сортов.

Величина PIC для полного набора образцов равнялась 0,69, для образцов C. annuum — 0,67, для сортов отечественной селекции — 0,62, для сортов европейской селекции — 0,57. В работе Y. Minamiyama с соавт. (22) для анализа бышо взято 14 образцов перца, в том числе 7 образцов видов С. frutescens, C. chínense, C. baccatum, С. chacoense и C. pubescens, а также 7 сортов C. annuum из различныгх селекционныгх центров. Для всего набора образцов идентифицировано 6 аллелей, а коэффициент PIC составил 0,82. Для 7 образцов C. annumm идентифицировано 4 аллеля и величина PIC равнялась 0,61. Следовательно, значения PIC для сортов перца в целом в обоих исследованиях сопоставимы. Несколько большее значение PIC для видов можно объяснить тем, что японские исследователи брали для анализа представителей С. chacoense и C. pubescens, которые отсутствовали в нашей работе.

Чтобы интерпретировать данные о микросателлитных аллелях и использовать микросателлитный локус CAMS-336 для паспортизации сортов, результаты анализа фрагментов в ПААГ необходимо подтвердить определением первичных последовательностей выявленных аллельных вариантов. С этой целью все 6 типов аллелей были секвенированы с помощью прямого и обратного праймеров.

G ТТСАСССТСТСТСТСТСТСТСТСТСТСТСТСТСТСТСТСТСТСТСТСАСТСТСAGTATTAG

D ттслссстстстстстстстстстстстстстстстстстстстс- -ЛСТСТСAGTATTAG

С ГТСАСССТСТСТСТСТСТСТСТСТСТСТСТСТСТСТСТСТС----- -------AGTATTAG

А ТТСАСССТСТСТСТСТСТСТСТСТСТСТСТСТСТСТСТС AGTATTAG

Е ГТСАСССТСТСТСТСТСТСТСТСТСТСТС----------------- -AGTATTAG

Г ТТСАСССТСТСТСТСТСТСТСТС AGTATTAG

Рис. 3. Нуклеотидные последовательности аллелей А, В, С, D, Е и F локуса CAMS-336, идентифицированных у 45 сортов, гибридов и линий перца Capsicum annuum L., а также образцов близкородственных культурных видов C. frutescens, C. chinense и C. baccatum в программе Mega 3.0.

Характеристика аллелей локуса CAMS-336 у 45 сортов, гибридов и линий перца Capsicum annuum L., а также образцов близкородственных культурных видов C. frutescens, C. chinense и C. baccatum

Аллель | Размер аллеля | Нуклеотидный состав аллеля

A 157 п.н. (ТС)16

B 171 п.н. (ТС)20АС(ТС)2

C 159 п.н. (ТС)17

D 169 п.н. (ТС^зА^ТС^

Е 147 п.н. (ТС)и

F 141 п.н. (ТС)8

Каждый из полученных фрагментов содержал последовательность анализируемого микросателлитного локуса ^C)n (рис. 3), длина которого у образцов варьировала и определялась числом повторяющихся единиц микросателлитной последовательности. Анализ секвенированных последовательностей для CAMS-336 подтвердил данные электрофореза в ПААГ и позволил выявить 6 аллелей размером от 141 до 171 п.н., различающихся по числу повторов микросателлитной единицы (табл.). Аллели В и D характеризовались наличием трансверсии Т ^ А в одной из единиц микросателлитного повтора, что привело к возникновению нового типа микросателлита вместо основного: (ТС)П ^ (ТС^А^ТС)^

Таким образом, анализ полиморфизма микросателлитного локуса CAMS-336 у 45 сортов, гибридов и линий перца Capsicum annuum L. отечественной и зарубежной селекции, а также у образцов близкородственных культурных видов позволил выявить 6 аллельных вариантов. Наиболее частыми аллелями в исследованной выборке были А, В и С. Аллельную ва-

риабельность подтвердило прямое секвенирование, что позволило определить точный нуклеотидный состав и размеры обнаруженных аллельных вариантов CAMS-336, а также механизм возникновения новых аллельных вариантов B и D. Показана возможность применения микросателлитного ло-куса CAMS-336 для паспортизации отечественных сортов C. annuum L.

Л И Т Е Р А Т У Р А

L K a t t i M.V., R a n j e k a r P.K., G u p t a V.S. Differential distribution of simple sequence repeats in eukaryotic genome sequences. Mol. Biol. Evol., 2001, 18(7): 1161-1167.

2. T o t h G., G a s p a r i Z., J u r k a J. Microsatellites in different eukaryotic genomes: survey and analysis. Genome Res., 2000, 10: 967-981.

3. V a r s h n e y R.K., G r a n e r A., S o r r e l l s M.E. Genetic microsatellite markers in plants: features and applications. Trends Biotechnol., 2005, 23: 48-55.

4. S c h l o t t e r e r C., T a u z D. Slippage synthesis of simple sequence DNA. Nucl. Acids Res., 1992, 20: 211-215.

5. К о ч и е в а Е.З. Использование методов на основе полимеразной цепной реакции для маркирования генома растений. С.-х. биол., 1999, 1: 1-19.

6. К о ч и е в а Е.З., Р ы ж о в а Н.Н. Использование PCR-амплификации на основе са-теллитнытх последовательностей для маркирования генома различный видов перца. С.-х. биол., 2001, 1: 94-97.

7. T o m m a s i n i L., B a t l e y J., A r n o l d G.M., C o o k e R.J., D o n i n i P., L e e D., L a w J.R., L o w e C., M o u l e C., T r i c k M., E d w a r d s K.J. The development of multiplex simple sequence repeat (SSR) markers to complement distinctness, uniformity and stability testing of rape (Brassíca napus L.) varieties. Theor. Appl. Genet., 2003, 106: 1091-1101.

8. S p o o n e r D.M., N u n e z J., T r u j i l l o G., H e r r e r a M.R., G u z m a n F., G h i s l a i n M. Extensive simple sequence repeat genotyping of potato landraces supports a major reevaluation of their gene pool structure and classification. PNAS USA, 2007, 104(49): 19398-19403.

9. K o o p m a n W.J.M., L i Y., C o a r t E., V a n d e W e g E., V o s m a n B., R o l d a n - R u i z I., S m u l d e r s M.J.M. Linked vs. unlinked markers: multilocus microsatellite haplotype-sharing as a tool to estimate gene flow and introgression. Mol. Ecol., 2007, 16: 243-256.

10. H e C., P o y s a V., Y u K. Development and characterization of simple sequence repeat (SSR) markers and their use in determining relationships among Lycopersícon esculentum culti-vars. Theor. Appl. Genet., 2003, 106: 363-373.

11. M a c a u l a y e t M., R a m s a y L., P o w e l l W., W a u g h R. A representative, highly informative «genetyping set» of barley SSRs. Theor. Appl. Genet., 2001, 102: 801-809.

12. G h i s l a i n M., S p o o n e r D.M., R o d r i g u e z F., V i l l a m ó n F., N ú ñ e z J., V á s q u e z C., W a u g h R., B o n i e r b a l e M. Selection of highly informative and user-friendly microsatellites (SSRs) for genotyping of cultivated potato. Theor. Appl. Genet., 2004, 108: 881-890.

13. B a r a n d a l l a L., d e G a l a r r e t a R.J.I., R i o s D., R i t t e r E. Molecular analysis of local potato cultivars from Tenerife Island using microsatellite markers. Euphytica, 2006, 152: 283-291.

14. M o i s a n - T h i e r y M., M a r h a d o u r S., K e r l a n M.C., D e s s e n n e N., P e r r a -M a n t M., G o k e l a e r e T., H i n g r a t Y.L. Potato cultivar identification using simple sequence repeats markers (SSR). Potato Res., 2005, 48: 191-200.

15. G i a r r o c c o L.E., M a r a s s i M.A., S a l e r n o G.L. Assessment of the genetic diversity in Argentine rice cultivars with SSR markers. Crop Sci., 2007, 47: 853-858.

16. D e G a l a r r e t a R.J.I., B a r a n d a l l a L., L o r e n z o R., G o n z a l e z J., R i-o s D.J., R i t t e r E. Microsatellite variation in potato landraces from the island of La Palma. Spanish J. Agric. Res., 2007, 5(2): 186-192.

17. M a n i f e s t o M.M., S c h l a t t e r A.R., H o p p H.E., S u á r e z E.Y., D u b c o vs k y J. Quantitative evaluation of genetic diversity in wheat germplasm using molecular markers. Crop Sci., 2001, 41: 682-690.

18. B r a c c i T., S e b a s t i a n i L., B u s c o n i M., F o g h e r C., B e l a j A., T r u-j i l l o I. SSR markers reveal the uniqueness of olive cultivars from the Italian region of Liguria. Scientia Horticulturae, 2009, 122(2): 209-215.

19. W a n g L., G u a n R., Z h a n g x i o n g L., C h a n g R., Q i u L. Genetic diversity of Chinese cultivated soybean revealed by SSR markers. Crop Sci., 2006, 46: 1032-1038.

20. P r i n c e J.P., L a c k n e y V.K., A n g e l e s C., B l a u t h J.R., K y l e M.M. A survey of DNA polymorphism within the genus Capsícum and the fingerprinting of pepper cultivar. Genome, 1995, 36: 404-417.

21. N a g y I., P o l l e y A., G a n a l M. Development and characterization of microsatellte

markers in pepper. Proc. Xth Meeting on genetics and breeding of Capsicum and eggplant (Avignon, France, 7-11 September, 1998). Paris, INRA, 1998: 235-237.

22. M i n a m i y a m a Y., T s u r o M., H i r a i M. An SSR-based linkage map of Capsicum annuum. Mol. Breed., 2006, 18: 157-169.

23. E d w a r d s K., J o h n s t o n e C., T h o m p s o n C. A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis. Nucl. Acid Res., 1991, 19(6): 1349.

24. N e i M. Analyses of gene diversity in subdivided populations. PNAS USA, 1973, 70: 3321-3323.

25. K u m a r S., T a m u r a K., N e i M. MEGA3: Integrated software for molecular evolutionary genetics analysis and sequence alignment. Brief. Bioinform., 2004, 5: 150-163.

1Центр «Биоинженерия» РАН, Поступила в редакцию

117312 г. Москва, просп. 60-летия Октября, 7, корп. 1, JÇ октября 2010 года

e-mail: ekochieva@yandex.ru;

2ГНУ Всероссийский НИИ селекции и семеноводства овощных культур Россельхозакадемии, 143080 Московская обл., Одинцовский р-н, п/о Лесной городок, e-mail: pishnaya_o@mail.ru;

3ФГОУ ВПО Московский государственный университет

им. М.В. Ломоносова,

119899 г. Москва, ГСП-1, Ленинские горы, 1

POLYMORPHISM OF MICROSATELLITE LOCUS CAMS-336 IN PEPPER VARIETIES AND CLOSELY RELATED SPECIES

E.A. Snigir'1, 2, O.N. Pyshnaya2, E.Z. Kochieva1, 3, N.N. Ryzhova1 S u m m a r y

The polymorphism of microsatellite locus CAMS-336 was investigated in 45 pepper varieties of native and foreign selection, and also in variants of closely related cultivated species of the Capsicum frutescens, C. chinense, C. baccatum. The authors revealed 6 alleles of this locus, distinguished in length, and determined the frequency of its occurrence. The unique alleles for some varieties and species were isolated and the PIC quantities for complete set of variants were calculated. The allelic variability was confirmed by sequencing, which permitted to determine the accurate nu-cleotide sequence and the size of revealed alleles of microsatellite locus CAMS-336. In addition, the sequencing of this locus permits to determine the mechanism of appearance of new B and D alleles, notably point substitution of T for A. The obtained data suggests the possibility of the use of microsatellite locus CAMS-336 for issue passports to the native varieties of C. cinnuum L.

Редакция журнала «Сельскохозяйственная биология» выполняет рассылку электронных оттисков опубликованных статей

Для получения электронного оттиска Вам необходимо:

•!• отослать точное описание заказа (авторы и название статьи, год, номер журнала, страницы) по адресу agrobiol@mail.ru, указав Ваши фамилию, имя, отчество (полностью), город, где проживаете, контактные e-mail и телефон;

❖ получить из редакции по своему контактному e-mail подтверждение заказа (с присвоенным ему номером);

❖ оплатить услугу, указав в платежном документе в графе «Назначение платежа» присвоенный заказу номер и Ваши фамилию, имя, отчество.

Оттиски высылаются на Ваш контактный e-mail после зачисления оплаты на счет редакции.

Банковские реквизиты редакции:

Получатель: Банк получателя:

ИНН 7708051012 Редакция журнала «Сельскохозяйственная Сбербанк России ОАО г. Москва, биология», Марьинорощинское ОСБ 7981, г. Москва, БИК 044525225,

р/с 40703810638050100603 к/с 30101810400000000225

В назначении платежа укажите номер заказа, Ваши фамилию, имя, отчество.

Стоимость услуги:

❖ один оттиск — 120 руб.,

❖ не более шести оттисков (абонемент) — 360 руб.,

❖ не более двенадцати оттисков (абонемент) — 700 руб.

Цены приведены с учетом НДС 10 %. Абонементное обслуживание предполагает предоставление указанного числа оттисков за период не более каждого текущего года по предоплате.

E-mail для заказа электронных оттисков — agrobiol@mail.ru

© Электронные оттиски являются интеллектуальной собственностью редакции журнала «Сельскохозяйственная биология». Внесение в них каких бы то ни было изменений и дополнений не допускается. Перепечатка, тиражирование, размещение в средствах информации, в том числе электронных и сети Интернет, а также коммерческое распространение возможны только с разрешения редакции.