СПОСОБ ГИБРИДИЗАЦИИ НК
NA HYBRIDISATION PROCEDURE

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к биофизике и молекулярной биологии и, в частности, касается способа гибридизации нитей молекул двунитевых НК, сложных смесей однонитевых НК, способных к самоассоциации, или даже однонитевых НК, образующих сложные внутримолекулярные структуры с зондами, иммобилизованными на твердой фазе посредством перемещения раствора с НК между зонами тепловой денатурации, охлаждения и гибридизации. Настоящее изобретение может быть использовано в приложениях секвенирования, идентификации последовательностей, обнаружения мутаций, минорного полиморфизма, изучения термодинамики и в иных приложениях, где требуется проведение гибридизации с зондами, иммобилизованными на твердой фазе (биочипами, микрочипами, микроматрицами), исключая стадию предварительной наработки однонитевой ДНК из двунитевой. Данный способ полностью совместим со стандартной технологией анализа ДНК и РНК, основанной на применении биочипов. Он может применяться без каких-либо ограничений и изменения в технологии изготовления биочипов.
Предшествующий уровень техники
Технология гибридизационного анализа с зондами, иммобилизованными на твердой фазе, и, в частности, микроматрицы, включая микрочипы, биочипы и чипы (далее эти термины используются взаимозаменяемо), является эффективным средством многопараметрического анализа экспрессии генов и генетических вариаций. В настоящее время она широко используется в различных генетических, биомедицинских и экологических приложениях. Известны способы: [1-5], способы заключаются в проведении гибридизации однонитевой НК-мишени при фиксированной температуре на твердой фазе, содержащей двумерные микроматрицы (микрочипы) с различной длинной и количеством иммобилизованных однонитевых НК-зондов. Эти способы являются самыми распространенными, однако, несмотря на это, всем им присущ существенный недостаток, связанный с тем, что однонитевая НК склонна к самоассоциации и образованию как внутри-, так и межмолекулярных структур, которые, своим образованием не дают возможность гибридизоваться НК с зондами, иммобилизованными на твердой фазе, комплементарными к этим проблемным участкам. Это снижает чувствительность анализа и мешает интерпретировать результаты [6]. Времена протекания этой самоассоциации как при образовании внутри- так и при образовании межмолекулярных комплексов, как правило, гораздо меньше [7], чем общее время гибридизации, необходимое для того, чтобы получить значимые величины гибридизационных сигналов для проведения дальнейшего анализа [8]. Более того, у этого подхода есть еще один недостаток.
Обычно для того, чтобы подготовить к гибридизационному анализу образцы ДНК, выделенной из клеток, сначала проводят амплификацию, в результате которой получают специфические фрагменты двунитевой ДНК. В дальнейшем необходимо использовать еще одну дополнительную стадию для наработки однонитевой ДНК в количестве, достаточном для гибридизации с однонитевыми зондами на твердой фазе. Для получения однонитевой ДНК наиболее часто используют несколько способов: [9] - использующий асимметричную ПЦР, [10, 11] - использующие экзонуклеазную реакцию гидролиза одной из цепей, [12, 13] - использующие химически модифицированные праймеры, [14] - использующий аффинную очистку. Способы заключаются в проведении дополнительной ферментативной стадии либо синтеза одной из цепей [9], либо гидролиза одной из цепей [10, 11], либо заключаются в непосредственном физическом разделении цепей при использовании фракционирования или афинной хроматографии, если фрагменты сделаны различными по какому-либо физико-химическому свойству или одна из цепей предварительно была помечена афинной меткой или [12-14]. Однако способы [1-5] обычно всегда предполагают в качестве предварительной стадии наработку однонитевых продуктов способами [9-14], что требует проведения дополнительной стадии, а значит дополнительного времени и реагентов для осуществления наработки или разделения однонитевых фрагментов из двунитевых.
В мире была предпринята попытка преодолеть эти недостатки, используя анализ по связыванию двунитевой ДНК без ее денатурации. Известен способ [15], который заключается в проведении связывания, при котором происходит образование комплексов из двунитевой ДНК с однонитевыми зондами на твердой фазе (микрочипе, биочипе). Иначе эти комплексы называются триплексами. Однако этот способ не обладает достаточной специфичностью и чувствительностью и как способ анализа не может конкурировать с гибридизацией однонитевой ДНК.
Эффективность гибридизации также зависит от вторичной структуры анализируемой однонитевой ДНК. Образующиеся внутримолекулярные структуры затрудняют гибридизацию исследуемых фрагментов однонитевой ДНК с олигонуклеотидными зондами при стандартном способе гибридизации, изложенном в [1-5]. Для преодоления этого недостатка был предложен еще один подход. Известен способ [16, 17], который заключается в использовании блокирующих олигонуклеотидов при стандартном способе гибридизации [1-5]. Эти нуклеотиды добавляются в раствор, содержащий гибридизуемую НК, которую гибридизуют с зондами, иммобилизованными на твердой фазе (микрочипе). Они комплементарны к тем участкам НК, которые подвержены образованию внутримолекулярных структур, чтобы конкурировать за их раскрытие, а следовательно, за смещение равновесия в пользу гибридизации с иммобилизованными зондами комплементарных к закрывающим блокирующими фрагментами последовательностей. Эта конкуренция происходит в момент однократного нагрева до температуры денатурации, обеспечивающий раскрытие шпилек, и последующего охлаждения перед гибридизацией. После этого смесь гибридизуют обычным образом при постоянной температуре, как в [1-5], получая уже ненулевые сигналы от зондов, комплементарных к проблеммным участкам. Однако этот способ требует знания последовательности анализируемой ДНК, чтобы знать, какие последовательности должны быть у блокирующих олигонуклеотидов. Также он требует расчета вторичной структуры НК, что не всегда является приемлемым. Скорость схлопывания внутримолекулярных структур [18] всегда быстрее, чем межмолекулярных [7]. Поэтому блокирующим олигонуклеотидам трудно конкурировать, и сигналы редко достигают значимых величин.
Для повышения эффективности гибридизации однонитевой ДНК и подавления влияния самоассоциации и образования внутримолекулярных структур было также предложено использовать еще один способ, использующий микрофлюидные устройства. Известен способ [19], который заключается в использовании денатурации нагреванием и высоких градиентов скоростей при перемещении раствора с НК в узком капилляре из зоны денатурации через зону охлаждения в зону гибридизации. Это делается с целью поддержания денатурированных внутримолекулярных структур в ДНК в открытом состоянии силами вязкого трения, поскольку, будучи охлаждены, внутримолекулярные структуры мгновенно (менее 1 микросекунды) схлопываются [18]. Далее сохраненная денатурированная структура НК в охлажденном растворе становится открытой для гибридизации с иммобилизованными зондами при дальнейшем движении в охлажденной части узкого канала, где размещались иммобилизованные зонды. При организации возвратно-поступательных циклов происходит создание постоянной концентрации денатурированной ДНК рядом с иммобилизованными на твердой фазе зондами, и происходит гибридизация ранее не доступных для этого участков НК. Однако, несмотря на явные преимущества, этот способ также имеет ряд недостатков, заключающихся в том, что предложенные автором устройства сложны в изготовлении и не совместимы с широко используемым и производимым во всем мире матричным типом микрочипов (биочипов, микрочипов, микроматриц) с большим количеством ячеек, при расположении ячеек в виде двумерного регулярного массива на плоскости, которые не представляют из себя узкий капилляр. Кроме того, эти способы пригодны не для всех последовательностей однонитевой ДНК. Время образования внутримолекулярной «шпильки», например, длиной 10 пар оснований и с длинной последовательности «головки» 4 пары - меньше микросекунды [18], а характерное время охлаждения растворов в работе авторов - порядка секунды. Поэтому эти способы могут быть использованы только для однонитевых ДНК, где участки, способные ассоциироваться, находятся достаточно далеко друг от друга в цепи однонитевой ДНК. Например, способ может быть использован в случае, если ДНК находится в состоянии «клубка» из-за неспецифической ассоциации. Этот способ также может быть использован в случае, если ДНК, имеющая шпильку, имеет достаточно длинные последовательности с 3'- и 5'-концов этой шпильки, чтобы вышеописанные гидродинамические силы были бы способны с помощью сил вязкого трения растянуть сформировавшуюся шпильку за эти концы. Гидродинамические силы, вытягивающие молекулу вдоль канала, могут противостоять термодинамике ассоциации комплементарных участков однонитевой ДНК в случае, если длина ДНК не менее 1400 оснований. С другой стороны, гидродинамические силы не должны быть слишком сильными, чтобы не смыть потоком из-за сил вязкого трения молекулы ДНК, связавшиеся с зондами, иммобилизованными на чипе. Эти условия существенно ограничивают длину области самокомплементарности (длину возможных «шпилек» с короткими последовательностями в «головках») в анализируемой однонитевой ДНК, которая, очевидно, не может быть больше, чем длина дуплексов, образующихся на чипе.
В уровне техники известен и другой подход, направленный на уменьшение влияния внутримолекулярных структур в НК. Известен способ [20, 21], который заключается в проведении фрагментации, перед гибридизацией по способу [1-5], которая приводит к разрывам в петлях внутримолекулярных структур. Однако этот способ лишь частично может улучшить анализ последовательностей НК, переводя внутримолекулярные комплексы в межмолекулярные. Такой перевод не способен решить проблему ассоциации фрагментов между собой как таковую, что, в свою очередь, снова приводит к задаче анализа двунитевой ДНК.
Указанные недостатки уровня техники могут быть успешно преодолены с помощью способа гибридизации нитей НК на твердой фазе посредством перемещения раствора с НК между зонами тепловой денатурации, охлаждения и гибридизации, который может быть использован как перспективный способ в практике гибридизационного анализа НК. Предлагаемый способ преодолевает недостатки способов [1-5], посредством одновременной комбинации двух способов: фрагментации, изложенной в [20,21], и модифицированной циклической денатурации-гибридизации [19], без использования узкого канала. Применение первого переводит внутримолекулярные комплексы НК в межмолекулярные, а второе разрушает межмолекулярные. Последнее происходит посредством перемещения раствора с НК между зонами денатурации охлаждения и гибридизации, за время, меньшее, чем ренатурация двунитевых НК. Это, в результате, приводит к полному освобождению НК как от внутри-, так и от межмолекулярных структур, мешающих НК гибридизоваться с зондами, иммобилизованными на твердой фазе. Организация замкнутого цикла циркуляции при перемещении НК приводит, так же, как и в [19], к созданию постоянной концентрации однонитевых НК над твердой фазой с иммобилизованными зондами в течениие всего времени гибридизации. Как следствие, это приводит к накоплению значимых сигналов гибридизации с величинами того же порядка, что и в способах [1-5], примененных к однонитевыми НК, не склонными к образованию каких-либо структур в растворе. Также этот способ преодолевает недостатки способов [9-14], которые используются совместно с [1-5] в качестве необходимой предварительной стадии. Эти недостатки преодолеваются посредством использования для проведения гибридизации сразу двунитевых НК, минуя стадию наработки однонитевых продуктов. Также этот способ преодолевает недостатки способа [15], используя универсальный гибридизационный подход на базе образования дуплексов между однонитевыми НК, который более универсален и свободен от неспецифичного связывания. Также этот способ преодолевает недостатки способов [16, 17] по избавлению от внутри- и межмолекулярных структур, используя более универсальные вышеописанные приемы по преодолению недостатков способов [1-5], которые не требуют синтеза блокирующих олигонуклеотидов. Также этот способ преодолевает недостатки способа [19-21], комбинируя вместе два способа, а именно: (а) фрагментацию, используемую в способах [20, 21], которая не освобождает раствор от межмолекулярных структур в НК, но в нашем случае, произведенную особым образом, и (б) денатурацию нагреванием с циклическим перемещением НК [19], которая не освобождает от внутримолекулярных структур с короткими последовательностями в «головках» шпилек, но, в нашем случае, не используя узкий канал. Поскольку внутримолекулярные структуры, способные к мгновенной ренатурации, разрушаются фрагментацией, а межмолекулярные структуры ренатурируют (восстанавливаются) гораздо медленнее [7, 22], а именно за времена, которые подбором концентрации НК можно достичь в механических устройствах при охлаждении раствора от температур денатурации до температур гибридизации, то надобность использования сложного и неуниверсального узкоканального чипа для поддержания внутримолекулярных структур открытыми (несформировавшимися) отпадает. Таким образом, открывается совместимость предлагаемого способа с широко известной технологией матричных микрочипов, расположенных на двумерных твердых фазах (двумерных плоскостях), которые в настоящее время являются основным, если не единственным типом чипов, используемых в практических приложениях.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение предусматривает способ гибридизациии НК посредством перемещения раствора с НК между зонами денатурации, охлаждения и гибридизации. Предложенный способ включает стадии:
(а) нагревание гибридизационного раствора, содержащего НК, до температуры, при которой происходит денатурация НК,
(б) охлаждение нагретого гибридизационного раствора до температуры, при которой происходит гибридизация НК с зондами, иммобилизованными на твердой фазе,
(в) гибридизация НК, содержащихся в охлажденном гибридизационном растворе, с зондами, иммобилизованными на твердой фазе, которая находится при температуре гибридизации,
при этом гибридизуемые нуклеиновые кислоты перемещаются между зонами денатурации, охлаждения и гибридизации.
Согласно изобретению нуклеиновые кислоты включают синтетические и/или природные олигонуклеотиды и/или НК в однонитевой и/или двунитевой форме, НК, выделенные и/или наработанные из биологического образца и/или ПЦР продукты симметричной или асимметричной ПЦР.
Согласно изобретению НК, содержащиеся в гибридизационном растворе, маркируют радиоактивными метками, флуоресцентными метками или масс-метками. Согласно изобретению флуоресцентные метки включают красители CY-7, CY-5.5, CY-5, CY-3.5, CY-3, BodiPy, TexasRed, FITC, TMR, BlackHoleQuencherl, BlackHoleQuencher2 и/или BlackHoleQuencher3.
Согласно изобретению НК не фрагментируют.
Согласно изобретению НК фрагментируют перед гибридизацией или во время гибридизации.
Согласно изобретению НК фрагментируют не зависящим от последовательности способом, случайным способом или случайным и не зависимым от последовательности способом.
Согласно изобретению НК фрагментируют так, чтобы средняя длина фрагментов была примерно равна длинам иммобилизованных зондов.
Согласно изобретению НК фрагментируют ферментативно, с помощью урацил-гликозилазы, с помощью ДНКазы и/или с помощью ультразвука.
Согласно изобретению стадии (а), (б) и (в) осуществляют за один цикл, многократно, путем рециркуляции в замкнутом цикле, возвратно-поступательно или прерывисто.
Согласно изобретению нагревание гибридизационного раствора на стадии (а) производят до температур выше, чем температуры денатурации гибридизуемых НК.
Согласно изобретению время нахождения НК в нагретом состоянии на стадии (а) при температурах выше, чем температура денатурации НК, больше, чем общее время денатурации в сумме с диффузионным временем расхождения НК.
Согласно изобретению время охлаждения НК на стадии (б) меньше, чем время ренатурации НК.
Согласно изобретению общее время нахождения НК в охлажденном состоянии на стадии (б) при температурах ниже температур денатурации в сумме со временем контактирования НК с твердой фазой на стадии (в) должно быть не больше, чем время ренатурации НК.
Согласно изобретению стадия охлаждения совмещена со стадией гибридизации.
Согласно изобретению температура охлаждения на стадии (б) отличается от температуры гибридизации.
Согласно изобретению температура гибридизации на стадии (в) ниже, чем температура нагревания на стадии (а).
Согласно изобретению температура гибридизации на стадии (в) равна или ниже, чем температура ренатурации НК.
Согласно изобретению температура гибридизации находится в диапазоне температур плавления дуплексов между гибридизуемыми НК и зондами или ниже, чем диапазон температур плавления дуплексов между гибридизуемыми НК и зондами.
Согласно изобретению зонды, иммобилизованные на твердой фазе, экспонированы в жидкой фазе гибридизационного раствора.
Согласно изобретению скорость перемещения при потоке гибридизационного раствора с НК в местах иммобилизации зондов на твердой фазе отлична от нуля.
Согласно изобретению время прохождения НК от попадания в зону охлаждения до непосредственного момента гибридизации меньше времени ренатурации.
Согласно изобретению стадию (в) гибридизации проводят в камере, через которую осуществляют перемещение гибридизационного раствора с НК. Камера представляет собой герметичный сосуд, предназначенный для организации потока гибридизационного раствора, содержащий внутри твердую фазу с иммобилизованными зондами, через которую осуществляют перемещение гибридизационного раствора с НК. Камера имеет вход и выход для организации перемещения гибридизационного раствора.
Согласно изобретению стадии (а), (б) и (в) проводят в одной камере.
Согласно изобретению камера имеет охлаждаемую и нагреваемую зоны для организации потока гибридизационного раствора с помощью конвекции.
Согласно изобретению камера имеет охлаждаемую и нагреваемую поверхность, а организацию перемещения гибридизационного раствора осуществляют с помощью внутреннего или внешнего насоса. Насос включает ультразвуковой и/или лепестковый насос.
Согласно изобретению поверхность твердой фазы в местах прикрепления зондов является гидрофильной.
Согласно изобретению твердая фаза включает стекло, пористое стекло, кремний, пористый кремний, металл, керамику, полимерный материал, пористый полимерный материал, целлюлозу или нитроцеллюлозу.
Согласно изобретению на поверхности твердой фазы сформирован дополнительный слой пористого сорбента или гидрогеля. Пористый сорбент или гидрогель включает акриламид, полиметаакрилат, агарозу, гиалуроновую кислоту, альгиновую кислоту и/или декстран. Слой пористого сорбента или гидрогеля сформирован в виде ячеек, которые отделены друг от друга промежутками или располагаются вплотную друг к другу и образуют регулярный одномерный или двумерный массив. Гидрогелевые ячейки включают акриламид, полиметаакрилат, агарозу, целлюлозу, гиалуроновую кислоту, альгиновую кислоту, декстран.
Согласно изобретению время диффузии НК гибридизационного раствора через пористые структуры твердой фазы к иммобилизованным зондам в сумме с временем прохождения зоны охлаждения и гибридизации меньше, чем время ренатурации НК.
Согласно изобретению твердая фаза включает биочип, микрочип или микроматрицу.
Согласно изобретению твердая фаза дополнительно включает температурные маркеры для определения температуры, содержащие однонитевую НК с внутримолекулярной структурой-шпилькой, которая раскрывается при заданной температуре, а на ее концах располагаются флуоресцентная метка и тушитель флуоресценции. Флуоресцентная метка включает красители: CY-7, CY-5.5, CY-5, CY-3,5, CY-3, BodiPy, TexasRed, FITC, TMR. Тушитель флуоресценции включает красители BlackHoleQuencherl, BlackHoleQuencher2, BlackHoleQuencher3, CY-7, CY5.5, CY-5, CY-3,5, CY-3, BodiPy, TexasRed, FITC, TMR.
Согласно изобретению зонды, иммобилизованные на твердой фазе, включают фрагменты НК или пептидно-нуклеиновых кислот, синтетические олигонуклеотиды, фрагменты к-ДНК и/или все переборы олигонуклеотидов заданной длинны.
Согласно изобретению зонды маркируют.
Согласно изобретению зонды маркируют флуоресцентными метками для определения количества иммобилизованных зондов на твердой фазе методом измерения сигнала от маркированных зондов.
Согласно изобретению зонды маркированы температурными маркерами, позволяющими определять температуру в месте их расположения. Температурные маркеры включают однонитевую НК с внутримолекулярной структурой-шпилькой, которая раскрывается при заданной температуре, а на ее концах располагаются флуоресцентная метка и тушитель флуоресценции. Флуоресцентная метка включает красители CY-7,CY-5, CY-3,5, CY-3, BodiPy, TexasRed, FITC, TMR. Тушитель флуоресценции включает красители BlackHoleQuencherl, BlackHoleQuencher2, BlackHoleQuencher3, CY-7, CY-5.5, CY-5, CY-3,5, CY-3, BodiPy, TexasRed, FITC, TMR.
Согласно изобретению перемещение осуществляют при помощи организации потока жидкости гибридизационного раствора с помощью прокачивания, диффузией, конвекцией или с помощью насоса.
Согласно изобретению насос включает перистальтический насос, ультразвуковой насос, мембранный насос, поршневой насос.
Согласно изобретению скорость потока гибридизационного раствора с НК обеспечивает нагревание гибридизационного раствора на стадии (а) до температур выше, чем температура денатурации НК раствора.
Согласно изобретению скорость потока гибридизационного раствора с НК обеспечивает общее время нагревания на стадии (а), большее, чем время денатурации в сумме с диффузионным временем расхождения НК.
Согласно изобретению скорость потока гибридизационного раствора с НК обеспечивает охлаждение гибридизационного раствора на стадиях (б) и (в) до температуры гибридизации.
Согласно изобретению скорость потока гибридизационного раствора с НК обеспечивает общее время охлаждения на стадиях (б) и (в), меньшее, чем время ренатурации НК.
Согласно изобретению скорость потока гибридизационного раствора с НК обеспечивает нагревание гибридизационного раствора на стадии (а) до температур выше, чем температура денатурации при общем времени нагрева, большем, чем время денатурации в сумме с диффузионным временем расхождения НК, и охлаждение на стадиях (б) и (в) до температуры гибридизации, при общем времени охлаждения на стадиях (б) и (в), меньшем, чем время ренатурации НК.
Согласно изобретению стадии (а), (б) и (в) проводят фиксированное время, до достижения величины гибридизационных сигналов стационарного уровня, который обеспечивает установление термодинамического равновесия в образовании дуплексов НК с зондами твердой фазы. Достижение величин обеспечивается с точностью до погрешности. Погрешность определяется стандартным отклонением математического ожидания суммарного сигнала со всех одинаковых зондов.
Согласно изобретению стадии (а), (б) и (в) проводят до достижения такой величины гибридизационных сигналов, при которой интегральные сигналы, полученные со всех одинаковых зондов, соответствующие количеству образовавшихся при гибридизации дуплексов зондов с НК, отличаются друг от друга на величины, большие чем стандартное отклонение математического ожидания при усреднении этого сигнала по одинаковым зондам или площади, где расположены одинаковые зонды.
Согласно изобретению величины сигналов определяют с помощью аналитического способа, который включает радиоактивный способ с применением радиоактивных меток для маркирования НК; флуоресцентный способ с применением флуоресцентных меток для маркирования НК; способ плазмонного резонанса, не требующий меток, и способ регистрации, основанный на измерении электромагнитных полей и электрических токов, включающий размещение чувствительных элементов под зондами, которые включают гальванический или изолированный электрод и/или полевой транзистор.
Краткое описание чертежей
Для более ясного понимания сущности заявленного изобретения, а также для демонстрации его характерных особенностей и преимуществ далее приводится подробное описание изобретения со ссылками на чертежи, на которых изображено следующее.
Фиг.1. Схема устройства для анализа двунитевых нуклеиновых кислот, основанного на накоплении продуктов гибридизации при циркуляции между камерами денатурации и гибридизации.
Фиг.2. Структура чипа, разработанного для анализа устойчивости М. tuberculosis к рифампицину (Пример 1).
(А) Схема расположения олигонуклеотидов в ячейках микрочипа, разработанного для анализа устойчивости М. tuberculosis к рифампицину. Обозначения в ячейках отвечают мутациям в гене rpoB.
(Б) Таблица, в которой приведены последовательности олигонуклеотидов с указанием последовательности, мутации, расположения в геноме и места расположения на чипе.
Фиг.3. Флуоресцентное изображение чипа для анализа устойчивости Mycobacterium tuberculosis к рифампицину (Пример 1).
Нормализованное флуоресцентное изображение микрочипа после проведения анализа двунитевой ДНК, соответствующего участку гена rpoB М. tuberculosis длиной 126 п.н., на предлагаемом устройстве. Гибридизовали ДНК дикого типа (мутации отсутствуют). Получено после проведения процесса гибридизации при анализе двунитевой ДНК М. Tuberculosis - дикий тип (с отсутствием мутаций) после симметричной ПЦР с помощью предлагаемого устройства. Процесс проводили до полного насыщения сигнала в течение 8 часов при температуре чипа 37°С, скорости потока 0.5 см/сек (соответствует времени охлаждения 18 сек) и температуре нагревателя 100°С.
Фиг.4. Графики зависимости интенсивностей сигналов в ячейках чипа для анализа устойчивости Mycobacterium tuberculosis к рифампицину от времени при гибридизации двуцепочечной ДНК в примере 1, демонстрирующие работу устройства в разных режимах.
Графики получены в результате анализа двунитевой ДНК на чипе, разработанном для анализа устойчивости М. tuberculosis к рифампицину, при различных режимах работы нагревателя и насоса. ДНК дикого типа, sequence of rpoB gene (Genbank асc. No. L27989), была получена с использованием маркирования праймера в симметричной ПЦР. Температура охладителя и чипа = 37°С. Над графиком помечены 5 разных случаев изменения режимов. 1. Температура нагревателя (20°С) при времени охлаждения 3 сек. 2. Температура нагревателя (60, затем 80°С) при том же времени охлаждения. 3. Температура нагревателя (100°С) при временах охлаждения 3, 6, 9, 18 сек. 4. Время охлаждения раствора увеличили до 90 сек при той же температуре нагревателя. 5. Время охлаждения раствора уменьшили до 18 сек. Температура нагревателя (110°С).
Квадратики () соответствуют флуоресцентному сигналу ячейки чипа с индексом 2В, в которой иммобилизован зонд 5'-GTT-GTT-CTG-GTC-CAT-GAA-TTG-GC-NH-3'-gel образующий совершенный дуплекс со значащей цепью двунитевой ДНК раствора.
Кружочки (•) - флуоресцентному сигналу другой ячейки чипа с индексом 2А, в которой иммобилизован другой зонд 5'-GCT-GTC-TGG-TGC-CGA-AGA-NH-3'-gel, образующий другой совершенный дуплекс с другим участком значащей цепи двунитевой ДНК раствора.
Ромбики (♦) - флуоресцентному сигналу ячейки чипа с индексом 3В 5'-GTT-GTT-CTG-GTC-TAT-GAA-TTG-GC-NH-3'-gel, в которой иммобилизован зонд, образующий несовершенный дуплекс,
Крестики (Χ) - флуоресцентному сигналу ячейки чипа с индексом 2F, содержащей пустой гель.
Фиг.5. Графики зависимости интенсивностей сигналов в ячейках чипа для анализа устойчивости Mycobacterium tuberculosis к рифампицину от времени при гибридизации двунитевой ДНК в оптимальных условиях в примере 1.
Температура нагревателя 100°С, время охлаждения 18 сек.
Квадратики () соответствуют флуоресцентному сигналу ячейки чипа с индексом 2 В, в которой иммобилизован зонд 5'-GTT-GTT-CTG-GTC-CAT-GAA-TTG-GC-NH-3'-gel, образующий совершенный дуплекс со значащей цепью двунитевой ДНК раствора.
Кружочки (•) - флуоресцентному сигналу другой ячейки чипа с индексом 2А, в которой иммобилизован другой зонд 5'-GCT-GTC-TGG-TGC-CGA-AGA-NH-3'-gel, образующий другой совершенный дуплекс с другим участком значащей цепи двунитевой ДНК раствора.
Ромбики (♦) - флуоресцентному сигналу ячейки чипа с индексом 3В 5'-GTT-GTT-CTG-GTC-TAT-GAA-TTG-GC-NH-3'-gel, в которой иммобилизован зонд, образующий несовершенный дуплекс, Крестики - флуоресцентному сигналу ячейки чипа с индексом 2F, содержащей пустой гель.
Фиг.6. Графики зависимости интенсивностей флуоресцентных сигналов в ячейках чипа от времени при сравнительном анализе двунитевой (семейства кривых а и b) и однонитевой (семейство с) ДНК в ходе трех разных процессов гибридизации, демонстрирующие работу устройства на примере микрочипа для анализа устойчивости М. tuberculosis к рифампицину в примере 1.
Использовались 2 образца амплифицированной ДНК, полученные из одного штамма дикого типа, sequence of rpoB gene (Genbank асе. No. L27989). Образцы получали в симметричной и асимметричной ПЦР с использованием маркирования праймером значимой цепи. Температура охладителя и чипа = 37°С. Время охлаждения раствора в охладителе при циркуляции = 18 сек, (скорость потока = 0.5 см/сек). Общее время гибридизации=8 часов. На графике помечены 3 разных семейства кривых: а, Гибридизовали dsDNA, температура нагревателя = 20°С, b, Гибридизовали dsDNA,температура нагревателя = 100°С. с, гибридизовали ssDNA для сравнения, температура нагревателя=100°С.
Кружочки (•) соответствуют флуоресцентному сигналу ячейки чипа с индексом 2В, в которой иммобилизован зонд 5'-GTT-GTT-CTG-GTC-CAT-GAA-TTG-GC-NH-3'-gel.
Квадратики () - 2D - 5'-Т САА ССС CGA CAG CG-NH-3'-gel.
Ромбики (♦) - 9А - 5'-ТС CAT GAA TTG GCT CAG СТ-NH-3'-gel.
Фиг.7. График корреляции гибридизационных сигналов способа гибридизации двунитевой ДНК и стандартного способа гибридизации на чипе для анализа устойчивости Mycobacterium tuberculosis в примере 1. Производили сравнения гибридизационных сигналов всех ячеек чипа после проведения гибридизации одно- и двунитевой ДНК при одинаковых условиях гибридизации. Гибридизацию проводили 8 часов при одинаковых условиях. Использовались 2 образца амплифицированной ДНК, полученные из одного штамма дикого типа, sequence of rpoB gene (Genbank асc. No. L27989). Образцы получали в симметричной (двунитевая ДНК) и асимметричной (однонитевая ДНК) ПЦР с использованием маркирования праймером значимой цепи. Температура охладителя и чипа = 37°С. Время охлаждения раствора в охладителе при циркуляции = 18 сек, (скорость потока = 0.5 см/сек). После гибридизации фиксировали сигналы и откладывали на графике. Каждый из экспериментов повторяли 8 раз. Стандартное отклонение отложено в виде крестиков соответствующего размера. Использовалась последовательность фрагмента ДНК М. Tuberculosis - дикий тип (последовательность в ген банке L27989). Значимая цепь была маркирована при проведении ПЦР, используя флуоресцентно-меченый праймер, окрашенный красителем CY5.
Ось X: данные сигналов всех ячеек чипа после гибридизации однонитевой ДНК, полученной несимметричной ПЦР.
Ось У: данные сигналов всех ячеек чипа после гибридизации двунитевой ДНК, полученных симметричной ПЦР.
Фиг.8. Дискриминационные соотношения, полученные после гибридизационного анализа одно- и двунитевой ДНК между совершенными и средней суммой соответствующих несовершенных дуплексов в примере 1.
Гибридизацию проводили 8 часов при одинаковых условиях. Использовались 2 образца амплифицированной ДНК, полученные из одного штамма дикого типа, sequence of гроВ gene (Genbank асc. No. L27989). Образцы получали в симметричной (двунитевая ДНК) и асимметричной (однонитевая ДНК) ПЦР с использованием маркирования праймером значимой цепи. Температура охладителя и чипа = 37°С. Время охлаждения раствора в охладителе при циркуляции = 18 сек, (скорость потока = 0.5 см/сек). После гибридизации фиксировали сигналы и получали дискриминационные отношения. Каждый из экспериментов повторяли 8 раз. Стандартное отклонение отложено в виде вертикальных линий соответствующего размера. Черные бары обозначают дискриминационные соотношения, полученные после гибридизации однонитевой ДНК. Светлые бары обозначают дискриминационные соотношения, полученные после анализа двунитевой ДНК. Индексы под осью X означают координаты совершенных дуплексов на схеме чипа. Вдоль оси Y отложены обратные значения величины дискриминации. Вертикальные крестики обозначают стандартное отклонение.
Фиг.9. Графики зависимости интенсивностей сигналов в ячейках универсального чипа от времени при гибридизации короткого двунитевого фрагмента, демонстрирующие работу устройства в примере 2 в разных режимах.
(А): Графики получены в результате процесса гибридизации при анализе короткого участка двунитевой ДНК (дуплекса) 5'-Cy3-NH-GGT-CTC-TCC-3'/5'-GGA-GAG-ACC-NH-Су3-3' на универсальном чипе при различных режимах работы нагревателя и постоянной скорости прокачки (время охлаждения во всех случаях = 3 сек). Температура охладителя и чипа = -5°С. Сверху над графиком указаны 4 разных случая изменения режимов. 1: Нагреватель отключен. Его температура (20°С) ниже температуры плавления дуплекса (40°С). 2: Температура нагревателя (60°С) выше температуры плавления дуплекса. 3: Нагреватель выключили (20°С). 4: Нагреватель снова включили (60°С).
Кружочки (•) соответствуют флуоресцентному сигналу ячейки чипа, в которой иммобилизован зонд gel-5'-NH-N-TCT-CTC-N-3', образующий совершенный дуплекс с одной из двух нитей анализируемого дуплекса в растворе.
Квадратики () - флуоресцентному сигналу ячейки чипа, в которой иммобилизован зонд gel-5'-NH-N-GAG-AGA-N-3', комплементарный предыдущему, который образует совершенный дуплекс с другой нитью анализируемого дуплекса в растворе.
Крестики (X) соответствуют флуоресцентному сигналу от той же ячейки чипа, как в случае отображенной кружочками, но при анализе нерасщепленной шпильки 5'-Cy3-NH-GGTCTCTCC-TTTT-GGAGAGACC-3' при проведении отдельного проверочного эксперимента.
Ромбики (♦)- флуоресцентному сигналу отдельной ячейки чипа, в которой иммобилизован зонд gel-5'-NH-N-TGATCG-N-3', комплементарный контрольному однонитевому праймеру р1272 5'-Cy3-NH-CGCCG-CGATC-AAGGA-GTTCT-3', добавленному в раствор в той же концентрации, что дуплекс или шпилька в ходе основного и проверочного экспериментов.
(Б) Пояснение к эксперименту 2: структура и последовательность анализируемого в эксперименте 2 короткого участка двунитевой ДНК (дуплекса) и схема его получения из шпильки, используемой в отдельном проверочном эксперименте. Рамками выделены последовательности зондов 2 ячеек чипа, от которых получали сигналы, показанные на графике (А).
Фиг 10. Сравнительный гибридизационный анализ неразрезанной шпильки, дуплекса, полученной при разрезании этой шпильки и однонитевых цепей разрезанной шпильки по отдельности, в примере 2 с помощью предлагаемого устройства.
(А) Графики зависимости интенсивностей флуоресцентных сигналов в ячейках универсального чипа от времени. При проведении анализа температура охладителя и чипа = -5°С. Время охлаждения=3 сек (скорость потока = 3 см/сек). На графике помечены 4 разных семейства кривых, соответствующих 4 разным экспериментам: а - семейство кривых при проведении анализа неразрезанной внутримолекулярной шпильки 5'-Cy3-NH-GGTCTCTCC-TTTT-GGAGAGACC-3' при температуре нагревателя 60°С (отсутствие сигнала), b - проведение анализа разрезанной шпильки (дуплекса) 5'-Cy3-NH-GGT-CTC-TCC-3V5'-GGA-GAG-ACC-NH-Cy3-3' при температуре нагревателя 20°С (слабые сигналы), с - проведение анализа этого же дуплекса при температуре нагревателя 60°С (сильные сигналы), d - проведение контрольного анализа частей разрезанной шпильки по отдельности при температуре нагревателя 60°С.
ЛЕГЕНДА
Кружочки (•) соответствуют флуоресцентному сигналу ячейки чипа Pad 1, в которой иммобилизован зонд gel-5'-NH-N-TCT-CTC-N-3'.
Квадратики () - флуоресцентному сигналу ячейки чипа Pad 2, в которой иммобилизован зонд gel-5'-NH-N-GAG-AGA-N-3', комплементарный предыдущему.
(Б) Нормализованные флуоресцентные изображения ячеек универсального чипа
Изображения получены после проведения гибридизации, как в пункте (А):
а - после проведения анализа неразрезанной внутримолекулярной шпильки при температуре нагревателя 60°С (отсутствие сигнала),
b - после проведения анализа разрезанной шпильки при температуре нагревателя 20°С (слабые сигналы),
с - после проведения анализа разрезанной шпильки при температуре нагревателя 60°С (сильные сигналы),
d - после проведения контрольного анализа частей разрезанной шпильки по отдельности при температуре нагревателя 60°С.
Раскрытие изобретения
Способ гибридизации комплементарных однонитевых участков НК в дуплексы, который лежит в основе предлагаемого изобретения, основан на фундаментальном свойстве узнавания комплементарных друг другу однонитевых последовательностей ДНК/РНК (далее по тексту - НК) [5]. Если в дуплексе какая-то пара оснований не соответствует друг другу, связывание нитей в дуплексе становится слабым. Б-форма двойной спирали нарушается. Такая НК легко денатурирует. Такой дуплекс называется несовершенным [23]. Такой эффект дискриминации между совершенными и несовершенными дуплексами предложено использовать в различных биомедицинских приложениях, прикрепляя для удобства и одновременности проведения экспериментов по множественному параллельному связыванию множество различных однонитевых зондов на твердую фазу, именуемую также чипом [1-4]. Однако НК в растворе не всегда может существовать в однонитевой форме. Однонитевая цепь в солевых условиях гибридизационного буфера очень гибкая. Она может без труда повернуться на 180° уже за 3-4 основания и способна образовывать как внутри- так и межмолекулярные структуры, закрывая потенциальные однонитевые участки от связывания с зондами, нарушая тем самым ожидаемое соответствие. Эти проблемы подробно описаны в [6].
Задача для разработки зондов чипа для конкретного приложения (например [5], для детекции известных мутаций у вызывающей заболевание туберкулезом бактерии Mycobacterium tuberculosis, приводящих к устойчивости по отношению к антибиотику рифампицину в клинической практике), на котором гибридизуют однонитевую НК, в принципе, решаема и заключается в экспериментальном подборе длин и последовательностей зондов так, чтобы их энергия связывания с анализируемой НК была заведомо больше, чем энергия внутри- и межмолекулярных взаимодействий при температурах дискриминации. Для таких чипов обычно используют отдельную стадию несимметричной ПЦР, чтобы наработать однонитевой продукт.
Более трудоемкой задачей является гибридизация однонитевой НК на подложке универсального чипа. Этот чип называется так потому, что на нем иммобилизованы все переборы олигонуклеотидов определенной длины (например, 4096 гексамеров) и его можно использовать в любых приложениях без изменения технологии. Это уменьшает трудозатраты на разработку чипов под каждую новую задачу. Такие чипы применяют для секвенирования больших участков НК, например, как в [24], или для определения заранее неизвестных мутаций [25]. Но поскольку длина зондов такого чипа фиксирована, то преодолеть влияние внутри- и межмолекулярных структур в анализируемой НК способом удлинения зондов нельзя.
Еще более трудоемкой задачей является непосредственная гибридизация на подложке какой-либо нити двунитевой НК. Именно такая НК чаще всего встречается в биологических объектах и ее легче всего нарабатывать в двунитевом виде. Если взять такую НК, денатурировать нагреванием и, быстро охладив, поместить на гибридизационную подложку, то могут быть получены только очень слабые сигналы, свидетельствующие о том, что почти вся НК успела ренатурировать, прежде чем успела бы продиффундировать к ячейкам и связаться с зондами чипа.
На данный момент в мире нет эффективных универсальных способов анализа двунитевых фрагментов НК на основе гибридизации ее нитей с образованием дуплексов, принимающих на своем входе гибридизуемый продукт, а на выходе выдающих набор образовавшихся дуплексов в соответствующих ячейках на гибридизационной подложке, где гибридизуемая НК оказалась связанной в соответствии со степенью комплементарности последовательности ее нитей с последовательностями иммобилизованных на подложке зондов. Предложенное изобретение решает эти проблемы как в случае однонитевой, так и в случае двунитевой НК.
Задача настоящего изобретения состоит в создании простого способа для анализа последовательностей двунитевой НК, непосредственно подаваемой на вход такого устройства в целях использования в различных приложениях молекулярно биологического и диагностического назначения.
В заявленном способе предложено использовать процесс циклической циркуляции раствора с гибридизуемой НК, в ходе которого происходит денатурация (нагревание), быстрое охлаждение и гибридизация не успевших ренатурировать цепей гибридизуемой двунитевой НК при циркуляции раствора через гибридизационную подложку (чип), содержащую элементы (ячейки), в каждом из которых иммобилизован уникальный НК зонд. Зонды могут представлять собой как короткие олигонуклеотиды, так и длинные фрагменты, например последовательности к-ДНК.
h
Предлагаемый способ основан на том, что двунитевую НК превращают в однонитевую форму (денатурируют) способом плавления при нагревании. Согласно Франк-Каменецкому [23], при температурах выше, чем температура денатурации, двунитевые НК расплетаются и диффундируют друг от друга достаточно быстро. Чтобы расхождение было необратимым, нити НК должны разойтись на расстояние, которое много больше, чем длина НК. Исходя из этого, необходимое минимальное время для полной денатурации двунитевых НК (t) можно оценить по формуле
где:
diff
t - время диффузионного расхождения,
diff
DNA
2
t=L/4D,
L - расстояние между молекулами в растворе, которое необходимо для необратимого расхождения. Оно должно быть много больше длины НК.
DNA
D - коэффициент диффузии для НК в растворе,
tw
-6
t - время распада связей между нитями НК; для температур выше температуры плавления его можно оценить для НК любой длины примерно как 10 с.
h
DNA
diff
2
-6
2
-4
-5
Время, которое раствор с двунитевой НК должен находиться в устройстве денатурации, должно быть больше, чем время t, чтобы вся НК успела денатурировать. Например, для ДНК, как приведено в примере 1, длина молекулы ДНК из 125 п.н. равна 45 нм. Исходя из этого, расстояние необратимости можно принять как L~10 нм. Коэффициент диффузии для этого случая равен D~10 см/с, следовательно, получаем t~10-10 с. Как видно, эти времена достаточно малы и не являются ограничивающими в цикле циркуляции для предлагаемого способа. Процессы теплообмена в гидромеханических системах идут гораздо медленнее. Например, теплообмен в микронагревателе, описанном в примере 1, исчисляется секундами.
4
5
-1
-1
После стадии денатурации следует быстрое охлаждение. При охлаждении до температуры гибридизации анализируемые НК могут находиться в свободном от межмолекулярных взаимодействий состоянии короткое время. Как показано в [7], это время определяется константой скорости ассоциации, которая зависит от длины НК и в случае длин около 24 н. равна ~10-10М с. При этом скорости ассоциации существенно зависят от вторичной структуры однонитевой ДНК [22] и уменьшаются при наличии шпилек. Примерное время ассоциации может быть оценено по формуле:
где
ass
k - скорость ассоциации,
с - концентрация НК в растворе.
2
3
-7
Согласно этой формуле время жизни однонитевых фрагментов расплавленных комплементарных дуплексов в однонитевом состоянии после того, как раствор резко охладили до температуры их ренатурации, обратно пропорционально их концентрации. То есть, чем выше концентрация, тем меньше время жизни. Например, в условиях примера 1 оценка этого времени составляет примерно ~10-10 с. Реальное, полученное в эксперименте время равнялось около 90 с. Для коротких НК длиной 10 н. время ренатурации составляло порядка 10 с. Поскольку на охлаждение жидкости конкретному аппаратному устройству теплообменника охладителя требуется некоторое время, определяемое скоростью теплообмена, то это время устанавливает ограничение на величину допустимой верхней границы концентрации дуплексов, циркулирующих в системе. Если концентрацию увеличить сверх порогового значения, то ренатурация пройдет быстрее, чем раствор успеет пройти охладитель, и на гибридизационную подложку однонитевые НК не попадут. Резюмируя вышесказанное, в случае концентрации дуплексов в растворе порядка 10 М для коротких дуплексов время ренатурации составляет порядка десяти секунд. Для дуплексов длиной 100 пар оснований - порядка сотни секунд. Времена охлаждения, ниже этих значений, вполне достижимы при конструкции гидродинамических устройств в микрофлюидном варианте.
T
T
r
T
T
T
2
-3
2
В случае устройства, описанного в примере 1 и 2, время пребывания раствора в камерах нагревания/охлаждения должно превышать характерные времена теплообмена. Считая лимитирующей стадией теплообмена выравнивание температур для фторопластовой оболочки микротрубочек, согласно [26], получаем характерное время t≅Δr/D, где Δ - толщина оболочки микротрубочки, a D - коэффициент тепловой диффузии. При Δr≈0.3 мм и D~10 см/с время теплообмена составляет t~1 с. Как видно из вышеприведенных оценок, в нашем случае условие на теплообмен выполняется.
Рассмотрим случай чипа, предназначенного для конкретного приложения. Например, таким чипом может быть чип, предназначенный для диагностики известных мутаций у Mycobacterium tuberculosis к рифампицину [5]. При проектировании такого чипа в целях проведения гибридизации однонитевой НК без использования предлагаемого способа зонды гибридизационной подложки могут быть выбраны разной длины. В этом случае, варьируя длину зондов, достигают условия, когда зонды будут иметь значения энергий связывания с гибридизуемой НК больше, чем значения энергии меж- и внутримолекулярных структур в ней. Это условие также справедливо и для зондов. Кроме того, вышеописанные вариации длин производят для уравнивания температур плавления дуплексов в разных ячейках, чтобы проводить анализ и сравнение всех ячеек чипа одновременно, при одной температуре. Проводя гибридизацию при температуре плавления дуплексов с такими зондами, достигается условие открывания всех внутримолекулярных структур (шпилек), энергия образования которых будет в данном случае слабее. В дополнение к вышеописанному, для устранения неспецифических ассоциаций в НК, таких как сворачивание НК в клубки (третичные структуры), используют дестабилизирующие агенты в буферных растворах (например: формамид, гуанидин-хлорид). Их также можно использовать для уравнивания температур плавления дуплексов одной длины, но разного АТ-ГС состава (AT пары - менее стабильны, ГС - более стабильны). Однако такие агенты способствуют уменьшению дискриминации. В итоге, для получения достоверной картины гибридизации по стандартному протоколу, когда не производят циркуляцию, необходимо, чтобы фрагменты, иммобилизованные в ячейках чипа (зонды), были выбраны согласно вышеприведенным условиям. При соблюдении этих условий при температуре дискриминации, при которой проводят анализ, будут образовываться только дуплексы гибридизуемой однонитевой НК с иммобилизованными зондами чипа. Подробнее про подбор нуклеотидных последовательностей зондов для чипа можно узнать в [5]. Гибридизуемые НК могут быть получены, используя стандартную ПЦР и маркированы флуоресцентными или иными метками. Подробнее об этом см. [27]. Специфичность праймеров может быть проверена с помощью программного обеспечения, использующего поиск в базах нуклеотидных последовательностей по алгоритму BLAST (например, www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST).
В случае применения предлагаемого способа циклической гибридизации межмолекулярные комплексы устраняются, что упрощает условия подбора зондов чипа. В случае, когда перед или во время гибридизации по предлагаемому способу применяется случайная, не зависящая от последовательности фрагментация гибридизуемых НК, при которой средняя длина фрагментов равна средней длине зондов, условия на выбор зондов дополнительно упрощаются. В данном случае не требуется дополнительно удлинять зонды, чтобы зонды чипа могли конкурировать за связывание с внутримолекулярными структурами (шпильками) в гибридизуемой НК. Следует указать, что время образования шпилек составляет микросекунды [18], и предлагаемый способ без фрагментации не справляется с ними, но предлагаемая фрагментация переведет их в межмолекулярные структуры, а предлагаемый способ циркуляции с денатурацией устранит влияние образовавшихся межмолекулярных структур. В дополнение к этому, появившаяся возможность использовать более короткие зонды повысит дискриминацию. В этом случае также можно отказаться от применения дестабилизирующих агентов, что также повысит дискриминацию. Этот способ, даже без применения фрагментации, позволяет гибридизовать обе нити двунитевой ДНК на гибридизационной подложке, поэтому стадию несимметричной ПЦР можно не проводить, что облегчает пробоподготовку. Возможная тандемная гибридизация цепи, комплементарной к значимой, которая может гибридизоваться в ячейках к уже связавшейся с зондом значимой цепи, не вносит существенных искажений в термодинамические параметры образовавшегося дуплекса. Если она не маркирована, как, например, в случае маркирования ПЦР продуктов посредством праймера значимой цепи, где незначимая - не маркируется, то существенного искажения в гибридизационньгх сигналах не происходит. Более того, поместив на гибридизационную подложку пары ячеек с комплементарными зондами, можно одновременно анализировать обе последовательности двунитевой НК, что позволило бы проводить анализ с большей надежностью, а также анализировать двунитевую НК с мисматчами на любой из цепей и определять их местоположение. В дополнение к вышесказанному, в контуре тока жидкости можно устроить нагреватели, настроенные на температуры проведения стадий ПЦР, проводить ПЦР прямо в контуре жидкости и/или прямо на ячейках микрочипа, анализируя получающиеся продукты с помощью чипа по мере их наработки в реальном масштабе времени. Это совместит стадию ПЦР и стадию гибридизации вместе, что ускорит время проведения анализа и открывает путь для разработки компактных микрофлюидных устройств для быстрой диагностики НК, на вход которых помещают образец НК, а на выходе получают результат анализа.
N
В отличие от пользовательских чипов, на универсальном чипе длина иммобилизованных зондов в ячейках фиксирована. Она не может быть столь большой, как в пользовательских чипах, иначе потребовалось бы слишком большое количество ячеек (4, где N - длина зонда), чтобы перебрать на чипе все возможные комбинации зондов такой длины. Исходя из этого энергии возможных внутримолекулярных структур (шпилек) в гибридизуемой НК могут оказаться больше, чем энергии дуплексов, которые должны образоваться на чипе. В этом случае происходит блокирование гибридизации на чипе участков гибридизуемой НК, которые содержатся в этих шпильках. Увеличить энергии связывания зондов их удлинением невозможно. Иначе чип потерял бы свою универсальность. Для разрешения такой проблемы предлагается проводить фрагментацию, как было описано выше. А именно, нужно фрагментировать гибридизуемые НК случайным, не зависящим от последовательности образом так, чтобы средняя длина получаемых фрагментов была равна длине зондов на чипе, и каждый фрагмент был бы маркирован флуоресцентной или иной меткой. В этом случае длина возможной «шпильки» в гибридизуемых фрагментах будет меньше, чем половина длины иммобилизованного зонда в силу ограниченности длины фрагментов. Известно, что энергия образования шпильки длинной меньше половины длины дуплекса - меньше энергии образования самого такого дуплекса. Поэтому такая фрагментация приведет к тому, что из-за малой длины фрагментов гибридизуемой НК [7] эти фрагменты будут иметь энергию образования возможных шпилек меньше, чем энергия образования дуплексов между этими фрагментами и зондами чипа. Гибридизацию НК обычно проводят при температурах, близких к температурам плавления дуплексов, образующихся на чипе. Поэтому внутримолекулярные структуры (шпильки) в гибридизуемых коротких фрагментах не могут эффективно образовываться при таких температурах. Более того, короткие «свисающие» концы от связавшихся с зондами фрагментов, которые могут образоваться из-за разброса в длинах при случайной фрагментации гибридизуемой НК, не свяжутся с другими фрагментами из комплементарной цепи этой НК по тем же причинам. Если этот эффект был бы не устранен, то могли бы быть получены искажения общих интегральных сигналов в ячейках чипа. В предлагаемом случае с универсальными чипами пробоподготовка состоит из проведения ПЦР маркирования и фрагментации.
Вышеприведенный способ в применении к универсальным чипам пригоден как для анализа двунитевых фрагментов НК, так и для уменьшения неоднозначностей при анализе GC богатых однонитевых фрагментов, изобилующих шпильками и самокомплементарными участками. После проведения гибридизации, свободной от влияния вышеописанных эффектов, и получения гибридизационных сигналов проводят поиск мутаций или чтение последовательности, используя математическую реконструкцию [24].
Устройство для проведения анализа нитей двунитевой НК в одной из своих реализаций может состоять (см. фиг.1) из резервуара, насоса, нагревателя, охладителя и герметичной камеры с гибридизационной подложкой (чипом). Раствор с гибридизуемой НК циркулирует в контуре с такой скоростью, чтобы он успевал нагреваться в зоне денатурации (теплообменнике нагревателя) до температуры выше, чем температура плавления гибридизуемых НК. После нагревания раствор должен быстро охладиться в зоне охлаждения (в теплообменнике охладителя) до температуры, которая поддерживается на твердой фазе в зоне гибридизации. Этот процесс должен проходить за время, меньшее, чем время ренатурации комплементарных частей анализируемых фрагментов. Далее, анализируемый раствор подается в зону гибридизации, содержащую твердую фазу. На ней однонитевые фрагменты НК гибридизуются с иммобилизованными в ячейках зондами. Из зоны гибридизации раствор с остатками пробы вновь поступает в резервуар. Цикл может быть проведен как однократно, так и многократно повторен. Во время работы устройства происходит рост количества дуплексов и, соответственно, рост сигналов на зондах. Резервуар может не использоваться. Перемещение раствора с НК может быть как однонаправленным, как и возвратно-поступательным, и может быть организовано в любом другом виде, но при соблюдении ограничений для всех характерных времен нагрева, охлаждения и пребывания в зоне гибридизации. Перемещение раствора может осуществляться как насосом, так и любым другим устройством. Например, в других воплощениях это может быть достигнуто с помощью изменения угла наклона чипа при использовании сил гравитации для перемещения раствора, или при тепловой конвекции раствора, или изменением давления с торцов разомкнутой схемы цикла при возвратно-поступательном движении.
Перед проведением гибридизации с помощью вышеописанного устройства, реализующем предлагаемый способ, проводится пробоподготовка, которая заключается в том, что если ДНК имеется в недостаточном количестве, то ее нарабатывают, например, способом симметричной или несимметричной ПЦР и маркируют при необходимости тем или иным способом. Например, в [5, 28, 29] использовали маркирование как посредством флуоресцентно-меченного праймера значащей цепи, введенного в ПЦР, так и посредством добавления к ПЦР флуоресцентно меченых трифосфатов. Маркирование также может производиться масс-метками [30] при масс-спектральном анализе. Обнаружение ДНК может быть произведено и без меток, используя полевой транзистой [31], плазмонный резонанс [32] или гальванический электрод [33]
Для улучшения результатов, особенно при использовании в качестве гибридизационной подложки универсальных чипов, необходимо проводить фрагментацию. Фрагментацию можно осуществлять различными способами. Наиболее эффективные способы - это ферментативные. Например, в [34] описываются неспецифичные ферменты - эндонуклеазы. При этом, по сравнению с радикальными способами структура фрагментов НК не деградирует. Еще более неспецифичный к последовательности способ фрагментации - это способ фрагментации с помощью ультразвука [35]. Если используется фрагментация, то маркирование желательно осуществить по одному из концов каждого фрагмента. Это необходимо для того, чтобы метки не влияли на термодинамические свойства образующихся дуплексов, а каждый фрагмент был маркирован строго одной меткой. Например, такое маркирование можно осуществить, используя флуоресцентно меченые трифосфаты и фермент - терминальную трансферазу, которая ковалентно прикрепляет к одному из концов фрагмента НК маркер. Выход такой реакции высок и может достигать 80% [27].
Продукты, полученные на стадии пробоподготовки, гибридизуют с помощью предлагаемого способа. Гибридизацию проводят в растворе, содержащем буферный компонент для поддержания рН, соли для создания ионной силы и, при необходимости, хаотропный (дестабилизирующий водородные связи) агент. Температура гибридизационной подложки и охладителя устанавливается в диапазоне ожидаемых температур плавления дуплексов анализируемой НК с зондами чипа. Например, для этих целей может быть использован термостолик, на котором находится гибридизационная подложка и охладитель, а температура может быть выбрана равной средней температуре плавления всех дуплексов, которые образуются с зондами чипа. Температуру чипа можно непосредственно измерять с помощью специально иммобилизованных термомаркеров, сконструированных на основе однонитевой ДНК, образующей внутримолекулярную шпильку, раскрывающуюся при определенной температуре, на концах которой находится флуоресцентная метка и гаситель флуоресценции [36, 37]. В данном случае, при раскрытии шпильки флуоресценция такой конструкции будет резко возрастать, начиная с определенных температур. Будучи иммобилизованной на твердой фазе, такая конструкция может служить термомаркером, позволяя точно контролировать температуру поверхности твердой фазы (чипа). Температура нагревателя должна быть установлена больше, чем температура плавления двунитевой анализируемой ДНК, настолько, чтобы все двунитевые НК с гарантией денатурировали. Например, это можно сделать, установив температуру нагревателя на 10-20°С выше, чем температура плавления гибридизуемой НК. Скорость потока раствора выбирается такой, чтобы раствор успевал нагреваться и охлаждаться до заданных температур, с точностью до нескольких градусов, а однонитевые фрагменты анализируемой ДНК, полученные после прохождения жидкости через нагреватель, не успевали бы ренатурировать, проходя охладитель и чип. Возможность организации как быстрого потока раствора, так и быстрого обмена целиком определяется разветвленностью каналов теплообменников нагревателя и охладителя и их материалами. Например, их можно сделать из бруска обладающего высокой теплопроводностью алюминия с тонкими отверстиями в качестве разветвленной сети каналов. Их температуру можно контролировать термоэлементами и термодатчиками с помощью внешней управляющей электроники. В качестве насоса можно использовать как пьезоакустические, перистальтические, пузырьковые, так и любые другие насосы, включая использование наклона плоскости чипа в гравитационном поле Земли. Все возможные элементы конструкций микрофлюидных систем подробно систематизированы и изложены в [38]. В качестве дестабилизирующего водородные связи агента могут быть использованы, например, гуанидин тиоцианат, мочевина или формамид. Выбор оптимальной температуры гибридизации проводят с учетом критериев решаемой задачи. Например, если требуется провести дискриминацию, то обычно используют среднюю температуру плавления всех дуплексов, образующихся с зондами чипа. В другом случае температуру делают гораздо ниже (на 10-20°С), чем средняя температура плавления дуплексов чипа, а потом проводят процесс отмывки, промывая чип тем же буфером, но без НК, и регистрируют кривые отмывки, постепенно повышая температуру.
сов
несов
сов
несов
Например, при использовании пользовательских чипов гибридизуемые фрагменты НК образуют совершенные дуплексы только с соответствующими зондами чипа. С остальными зондами они дают несовершенные дуплексы. В случае флуоресцентного маркирования гибридизуемой НК дискриминацию совершенных и несовершенных дуплексов выполняют путем сравнения интенсивностей флуоресценции ячеек, в которых образовались дуплексы. Интенсивность сигнала в ячейке, в которой образовался совершенный дуплекс (I) выше, чем интенсивность в ячейке с несовершенным дуплексом (I). Как показано в [5], проведение гибридизации при оптимальных условиях (температура, рН, концентрация хаотропного агента и ионная сила гибридизационного буфера) позволяет добиться соотношения I/I≥2 между двумя ячейками, содержащими зонды, принадлежащие одной группе, и различающиеся на один нуклеотид. Известно, что как количества иммобилизованных зондов в ячейках чипа, так и размер ячеек может отличаться из-за разбросов при изготовлении. Но, иммобилизуя такие зонды вместе с ковалентно пришитым красителем (другого флуоресцентного диапазона, чем при гибридизации), можно производить точную нормировку на количество и вычислять дискриминационные соотношения пробы еще точнее [39]. Получить независимость от количества иммобилизованных зондов можно и по-другому. Например, сравнивая полученные сигналы от ячеек с зондами универсального либо пользовательского чипа при анализе НК, выделенной из дикой и мутантной формы микроорганизма, гибридизуя сразу смесь из дикой и мутантной НК, маркированных разными красками, и, используя регистрацию на 2-х флуоресцентных диапазонах одновременно, определяют местоположение и тип мутации. Такой способ описан в [25]. Например, как в [40] при использовании универсального чипа, описанного выше, процесс анализа может состоять из гибридизации при температурах ниже, чем температуры плавления, и дискриминации, которую возможно проводить с помощью регистрации кривых отмывки с последующей математической обработкой. Стоит напомнить, что во всех этих случаях предлагаемый способ позволяет гибридизовать сразу двунитевую НК, не проводя вторую, несимметричную стадию ПЦР, и избавляться от неоднозначностей, связанных с образованием внутри- и межмолекулярных структур в гибридизуемой НК.
Гибридизация не всегда можете служить только для целей анализа или диагностики, а может использоваться, например, и для других целей. Например, можно проводить массивный скрининг связывания ДНК связывающих белков на универсальных чипах с однонитевыми олигонуклеотидами [41]. Если же в такой работе перед экспериментом с белками гибридизовать смесь всех возможных синтетических олигонуклеотидов к такому чипу, что можно сделать только с помощью предлагаемого способа, то также открывается возможность изучать взаимодействия белков со всеми двунитевыми НК (дуплексами) определенной длинны.
Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения
Приведенные ниже примеры иллюстрируют сущность предлагаемого изобретения, но не должны рассматриваться как ограничивающие область применения.
Пример 1. Применение устройства для пользовательского (специализированного) чипа, предназначенного для анализа устойчивости Mycobacterium tuberculosis к рифампицину.
1. Твердая фаза с иммобилизованными зондами (биочип).
В качестве гибридизационной подложки с однонитевыми зондами для комплементарного связывания с гибридизуемой НК был взят биочип для анализа устойчивости Mycobacterium tuberculosis к рифампицину [5]. Чип изготавливали на стеклянной подложке стандартного микроскопного слайда размером 25 на 75 мм. Стекло предварительно было активировано с целью ковалентной пришивки ячеек к поверхности стекла. Для нанесения ячеек использовали специализированный механический робот. Робот раскапывал приготовленный раствор смеси специального мономера геля и олигонуклеотидных зондов, состав которых указан в таблице на фиг.2Б. Нанесение на чип происходило в соответствии со схемой, приведенной на фиг.2А. Гелевые элементы содержали специальный флуоресцентный маркер Су3, предварительно соллюбилизированный сульфо-группами в целях предотвращения агрегации олигонуклеотидов. Краситель был ковалентно присоединен к иммобилизованным олигонуклеотидам возле места прикрепления. Этот краситель не используется для гибридизации, и поэтому не мешает флуоресцентному анализу, поскольку находится в другом флуоресцентном диапазоне по сравнению с Су5. Его использовали в качестве точного определения объема ячейки и количества иммобилизованных зондов в целях нормировки после изготовления чипа. После нанесения гель в ячейках чипа подвергали полимеризации в специальной камере. Это делали с целью того, чтобы объемные ячейки представляли бы из себя пористую «губку» из сшитого в разветвленную структуру мономера с ковалентно присоединенными зондами, надежно закрепленную на поверхности. В итоге, произведенный биочип содержит 9X6 полусферических ячеек из пористого геля диаметром 100 мкм, отстоящих друг от друга на расстояние 300 мкм. Размер зоны с ячейками 1.6 на 2.5 мм. Гель использовали для того, чтобы увеличить чувствительность, расположив зонды в объеме, а не на плоскости. Также гель способствует тому, что термодинамика связывания в нем полностью идентична термодинамике в растворе, поскольку расстояние между зондами больше, чем размер зондов, а концы фиксированы не жестко. Фактически, каждая ячейка чипа превращается в полноценную микропробирку. Более подробно см. [42]. Чип, используемый в этом примере, также имел три маркерные точки с красителем Су5 для правильного позиционирования (захвата изображения), выполняемого компьютерной программой, и резервные ячейки пустого геля. Расположение иммобилизованных на микрочипе олигонуклеотидных зондов показано на фиг.2А сверху. Серым цветом на фиг.2А обозначены гелевые ячейки, содержащие зонды, способные образовать совершенный дуплекс с ДНК, не имеющей мутаций (т.е. с ДНК дикого типа (WT)). Белым цветом на фиг.2А обозначены гелевые ячейки, содержащие олигонуклеотидные зонды, которые образуют несовершенные дуплексы с ДНК дикого типа и совершенные дуплексы с ДНК, предназначенные для обнаружения соответствующих мутаций.
2. Пробоподготовка.
Тотальная ДНК выделялась из клеток так же, как описано в [5]. Клетки разрушали специальным ферментом, а полученную ДНК очищали от обломков клеток методом переосаждения. Далее проводили первый раунд ПЦР [27], как в [5], предназначенный, чтобы наработать необходимое количество ДНК. Второй раунд ПЦР проводили с некоторыми отличиями от [5]. В первом случае точно следовали протоколу, изложенному в [5], и использовали праймеры для ПЦР: прямой F1272 и обратный R1398 с разными концентрациями, чтобы получить однонитевую ДНК, как в [9]. При этом концентрация прямого праймера была в 10 раз больше, чем обратного. Во втором случае использовали праймеры с равными концентрациями, чтобы получить двунитевую ДНК. В обоих случаях длина получаемой однинитевой и двунитевой ДНК одинакова. Это было сделано для корректного сравнения предлагаемого способа с [5]. В обоих случаях пробу маркировали добавлением в реакционную массу ПЦР флуоресцентно меченого праймера значащей цепи.
3. Конструкция устройства.
Конструкции устройства представлена на фиг.1. Для демонстрации предлагаемого способа в качестве твердой фазы с иммобилизованными зондами был взят чип, предназначенный для анализа устойчивости Mycobacterium tuberculosis к рифампицину [5]. Верхняя крышка камеры микрочипа была изготовлена из препаративного стекла фирмы Corning (Corning, NY, USA), размером 75X25 мм и толщиной 1 мм. Крышка имела два отверстия диаметром 1 мм. Спейсер был вырезан из нескольких слоев двустороннего гидрофобного скотча фирмы EuroCell SICAD (Uboldo (VA) Italia) суммарной толщиной 200 мкм. Герметичный «сэндвич» из верхней крышки, спейсера и микрочипа закрепляли прижимным механизмом на алюминиевом держателе с высокой теплопроводностью для обеспечения надежного теплового контакта. Фторопластовые (Polytetrafluoroethylene, PTFE) микротрубочки фирмы Cole-Parmer Ins. Со (East Bunker Court, Vernon Hills, Illinois, USA) P/N 06417-11 имели внешний диаметр 0.8 мм, а внутренний - 0.3 мм, и герметично вставлялись через силиконовые уплотнения в отверстия верхней крышки, обеспечивая герметичность соединений. Объем камеры для универсального чипа в примере 2 составлял 200 мкл, а для чипа для идентификации М. Tuberculosis в примере 1 - 50 мкл. Для циркуляции анализируемого раствора использовали перистальтический насос фирмы Gilson Minipuls-2 (Middleton, WI, USA) с внутренним диаметром силиконового шланга 1.6 мм. Наборы силиконовых шлангов для подбора оптимальных режимов циркуляции были взяты у Cole-Parmer Ins. Со (East Bunker Court, Vernon Hills, Illinois, USA). Нагреватель был выполнен из бруска алюминия 10×10×20 мм, в теле которого, в один ряд, параллельно друг другу было просверлено 10 отверстий диаметром 0.8 мм. Через эти отверстия змееобразно была протянута фторопластовая микротрубочка. Суммарная длинна теплового контакта трубочки и алюминиевого бруска составила 20 см. Как было показано выше, этой длины достаточно для осуществления теплообмена. Для нагрева и контроля температуры в брусок был вмонтирован нагревательный керамический резистор мощностью 10 Вт и медно-никелевая термопара. Нагреватель контролировали термоконтроллером Alpha Omega Instrument Corp.(Cumberland, RI, USA), а пельтье-термостолик чипа, входящий в аппаратный комплекс микроскопа, мощностью 20 Вт - контроллером LFI-3751 фирмы Wavelength Electronics (Bozeman, МТ, USA), как описано в [43].
Охладитель был сделан по тому же принципу, что и нагреватель - в алюминиевом держателе микрочипа, который находился на салазках термостолика так, что между ними устанавливался хороший тепловой контакт. Длина вставленной в охладитель трубки равнялась 10 см. Экспериментально было проверено, что жидкость охлаждалась до температуры чипа с точностью до градуса при разнице температур нагревателя и чипа, равной 60°С, при всех режимах прокачки. В качестве резервуара использовали пробирку типа Эппендорф емкостью 2 мл. Перед проведением эксперимента шкалу насоса привели в соответствие со временем прохождения жидкости через охладитель (прокалибровали), используя секундомер и подкрашенную жидкость. Скорость потока в примере 1 составляла ~1 см/с, в примере 2 ~3 см/с.
Это устройство, как пример, обеспечивает одну из возможных реализаций циркуляции раствора по схеме нагреватель - охладитель - гибридизационная подложка, заявленную в этом способе.
4 Регистрация сигналов с ячеек микрочипа.
2
Все измерения на микрочипах производили в реальном масштабе времени на автоматическом исследовательском микроскопе [8]. С полем зрения 10×10 мм, ксеноновой лампой в качестве источника возбуждения и набором автоматически переключаемых фильтров, включая фильтры для красителя Су5 (excitation wavelength 630 nm, emission wavelength 690 nm) and Cy3 (excitation wavelength 580 mn, emission wavelength 535 nm). Микроскоп был оборудован ПЗС камерой (SenSys KAF3200E, Roper Scientific, Tucson, AZ, USA), и столиком пельтье с контроллером температуры LFI-3751 (Wavelength Electronics, Bozeman, МТ, USA) и сканирующей системой, состоящей из двухкоординатного позиционера и контроллера перемещений (Newport, Irvine, СА, USA). Экспозиция ПЗС камеры была 10 секунд. Микроскоп был оборудован компьютером и программным обеспечением Imagel Research [41, 42], для записи флуоресцентных сигналов и изображений универсального и любого другого микрочипа в любой временной или температурной точке. Запись изображения целиком в каждой точке позволяет перерасчитывать кинетические кривые целиком, если понадобится.
Флуоресцентные сигналы от каждой ячейки получали с помощью программы ImaGel. Флуоресцентное изображение каждой ячейки было окружено внутренней и внешней круглыми рамками: внутренняя рамка включала саму ячейку чипа, в то время как внешняя рамка включала интенсивность фона вокруг него, создаваемое флуоресценцией ДНК, находящейся в растворе. Поскольку ДНК в растворе находится в избытке, а температура на чипе не изменялась, то интенсивность флуоресценции фона можно принять за константу. Пренебрегая малостью высоты ячейки (25 мкм) по сравнению с толщиной слоя раствора (200 мкм), интенсивность флуоресценции в ячейке J можно аппроксимировать уравнением J=(In-Out)/Out, где In - флуоресценция, усредненная по внутренней рамке, соответствующая флуоресценции ячейки и столба жидкости с флуоресцентно-меченной ДНК над ней, Out - усредненная флуоресценция по внешней рамке, соответствующая только флуоресценции раствора. Полное поглощение (absorbance) возбуждающего света микроскопа на всем оптическом пути (столб жидкости флуоресцентного раствора + высота ячейки) меньше чем 0.1 при используемых концентрациях флуоресцентной ДНК в растворе в полностью гибридизованном виде в ячейке. Поэтому линейная форма уравнения для J справедлива. Флуоресценция других объектов на оптическом пути (стекла слайдов, линзы микроскопа, и т.д.) и темновой ток ПЗС камеры были малы, и ими пренебрегали. Нормализацию сигналов путем деления на Out в приведенном уравнении проводили для устранения эффекта неоднородности засветки чипа и влияния нестабильности света дуги ксеноновой лампы на модуляцию интенсивности сигналов J от ячеек чипа в ходе эксперимента. Поскольку величина флуоресценции раствора с маркированной ДНК во внешней рамке (Out) имела на порядок большую отличную, чем флуктуации темнового тока, деление на величины, близкие к нулю, в формуле для J не происходит, и нормировка корректна. Более подробно см [8, 43].
Для регистрации постгибридизационных изображений, построения корреляции и дискриминационных соотношений гибридизационный раствор удаляли, и пользовались нормировочным соотношением с учетом темнового тока и распределения освещенности, как в [28].
5. Ход выполнения гибридизации флуоресцентно меченых продуктов ПЦР на биочипе с помощью предлагаемого устройства.
-7
К 25 мкл реакционной смеси, полученной после второй стадии ПЦР и содержащей флуоресцентно меченые фрагменты ДНК, добавляли концентрированный раствор гибридизационного буфера так, чтобы конечная концентрация гуанидина тиоцианата составляла 1 М, HEPES - 50 мМ, рН 7,5, ЭДТА - 5 мМ, а конечный объем 1.5 мл. Конечная концентрация двунитевой ДНК была примерно 10 М.
Такая концентрация ДНК в соответствии с формулой (2) приводит к тому, что время жизни ДНК в однонитевом состоянии при использовании возможностей устройства достаточно для того, чтобы гибридизуемая ДНК успела пройти охладитель и чип не ренатурировав. При большей концентрации доля однонитевых ДНК, дошедших до чипа, резко уменьшается. При меньших концентрациях ДНК сигнал на чипе растет значительно медленнее. Чем больше скорость потока, тем меньше время прохождения жидкости через охладитель и чип и, соответственно тем более концентрированный раствор гибридизуемой ДНК можно использовать в данном устройстве. Время гибридизации, которое можно определить как время, необходимое для того, чтобы большинство комплементарных зондов окажется в дуплексах с гибридизуемой ДНК, уменьшается с ростом концентрации гибридизуемой ДНК в растворе. Чрезмерное увеличение скорости потока не позволяет раствору охладиться до температуры гибридизации. В нашем примере минимальное время, за которое раствор ДНК проходит охладитель и чип, претерпевая необходимый нагрев и охлаждение, составляет 3 сек. При меньшем времени раствор не успевает охладиться, что приводит к разогреву чипа и препятствует росту сигналов в ячейках чипа.
Полученную смесь помещали в резервуар устройства, см. фиг.1, устанавливали на термостолике чипа и охладителе температуру 37°С (температура была выбрана такой же, какая использовалась при гибридизации на этих чипах в [5], и включали насос. Далее регистрировали кинетику нарастания сигналов с ячеек чипа аппаратным комплексом [8]. Далее, через 0,5 часа включали нагреватель и увеличивали его температуру, регистрируя значения сигналов ячеек (в случае как на фиг.4.) Подобрав оптимальные условия, обеспечивающие максимальное нарастание сигнала во всех ячейках, снова регистрировали кинетику нарастания сигналов при постоянных условиях (в случае как на фиг.5.) в течение 8 часов до насыщения. Окончательное изображение флуоресцентных сигналов ячеек чипа представлено на фиг.3. Далее в подобранных условиях проводили детальное сравнение двух методов, производя регистрацию полных кривых кинетики гибридизации, как на фиг.6.
6. Регистрация и интерпретация результатов гибридизации.
Устойчивость М. tuberculosis к рифампицину вызывается набором мутаций. Подробнее это описано в [5]. Около 95% таких мутаций сосредоточено в области гена rpoB длиной 81 основание [44, 45]. Для анализа этих мутаций был разработан специальный олигонуклеотидный микрочип, рассчитанный на гибридизацию с однонитевой ДНК, отвечающей фрагменту гена rpoB длиной 125 оснований [5]. Предлагаемый способ гибридизации с циркуляцией между устройствами денатурации и гибридизации был применен к гибридизации соответствующего двунитевого фрагмента гена rpoB той же длины и на таком же чипе. Во всех экспериментах использовалась ДНК дикого типа (с отсутствием мутаций). Регистрация кривых роста величин сигналов ячеек чипа и флуоресцентного изображения биочипа после достижения насыщения сигналов выполнялась на универсальном аппаратно-программном комплексе [8]. Раствор, содержащий двунитевую ДНК, окрашенную методом добавления флуоресцентно-меченного праймера F1272, помещали в резервуар устройства (Фиг 1), устанавливали на термостолике чипа и охладителе температуру 37°С (температура была выбрана такой же, какая использовалась при гибридизации однонитевой ДНК на этих чипах в [5]) и включали перистальтический насос (случай 1 на фиг 4). Далее регистрировали кинетику нарастания сигналов со всех ячеек чипа, как описано в [8]. Затем через 0.5 часа включали нагреватель (случаи 2-5) и ступенчато увеличивали его температуру, регистрируя значения сигналов ячеек. Фиг.4 демонстрирует эффект прироста гибридизационного сигнала при работе нагревателя в разных режимах. При выключенном нагревателе рост сигналов не наблюдается (случай 1). При температурах выше комнатной (20°С), но ниже, чем температура плавления анализируемой двунитевой ДНК (около 80°С), наблюдается рост сигналов только в отдельных ячейках, что еще не позволяет провести полный анализ ДНК (случай 2). При температуре нагревателя больше, чем температура плавления ДНК, наблюдается существенный рост сигналов (случай 3). Как видно из фиг 4, в случаях 4 и 5 чрезмерное увеличение времени охлаждения до 90 секунд приводит к тому, что денатурированная ДНК полностью ренатурирует обратно, и сигнал обратимо перестает расти. Стоит заметить, что это не связано с уменьшением нарастания сигнала вследствие уменьшения эффекта перемешивания [46], поскольку в эксперименте на однонитевых ДНК не происходит значительного снижения роста сигнала при таком же снижении потока. В промежутки времени, когда нагреватель отключали при работающем насосе, прирост в интенсивностях сигналов на чипе обратимо прекращался (как в случае 1 на фиг.4). Были подобраны оптимальные условия (температура нагревателя = 100°С, время охлаждения = 18 с). Эти условия обеспечивали максимальное нарастание сигнала во всех ячейках и достаточное время для охлаждения раствора без видимой ренатурации. Эксперимент повторяли снова в неизменных условиях и регистрировали кинетику нарастания сигналов до насыщения в течение 8 часов. Момент старта нагревателя и полные кинетические кривые с нескольких ячеек чипа показаны на фиг.5. В конце каждого эксперимента фиксировали конечное флуоресцентное изображение микрочипа (Фиг.3). Затем была проведена гибридизация с использованием однонитевой ДНК. При гибридизации с одноцепочечной ДНК кинетика нарастания сигнала уже не зависела от температуры нагревателя, а нарастание сигнала продолжалось и при выключенном насосе в отсутствие циркуляции. Эти данные согласуются с влиянием эффектов перемешивания при гибридизации однонитевой ДНК, которые описаны в [8]. Данные, полученные при гибридизации однонитевой ДНК, служили для сравнения эффективности гибридизации с использованием двунитевой ДНК. Кинетические кривые для однонитевой и двунитевой ДНК показаны в сравнении на фиг.6. Вышеописанные пары экспериментов повторяли 8 раз, получая идентичные результаты. Сравнение сигналов флуоресценции в одинаковых ячейках микрочипа одной серии после анализа однонитевой и двунитевой ДНК приведено на графике корреляции (фиг.7). Коэффициент корреляции составил 0.954. В данном случае строили двумерный график - сравнительную диаграмму, для всех ячеек чипа: по оси X, абсцисс, откладывали значения сигналов в ячейках чипа, после гибридизации однонитевой ДНК; по оси Y, ординат - значения, соответствующие тем же ячейкам чипа, после идентичного процесса гибридизации нитей двунитевой ДНК. Как следует из фиг.7, имеет место хорошая корреляция между результатами анализа однонитевой и двунитевой ДНК с маркированием праймером. На фиг.3 представлено изображение чипа, на котором была проанализирована двунитевая ДНК. Сравнивая его со схемой расположения иммобилизованных в ячейках чипа зондов, представленной на фиг.2А, можно увидеть, что сигналы от ячеек, содержащие зонды, комплементарные к дикому типу ДНК, дают более сильный сигнал, чем сигналы от ячеек, содержащие зонды, комплементарные к ДНК мутантного типа. Поэтому можно заключить, что на чипе действительно находится ДНК, соответствующая «дикому типу» фрагмента гена rpoB Mycobacterium tuberculosis. Исходя из этого, если имеется хорошее совпадение всех сигналов чипа при использовании предложенного способа в сравнении со старым, как это происходит в нашем случае, то можно утверждать, что дискриминационные соотношения при определении мутаций при использовании предлагаемого способа тоже сохранятся. Небольшое снижение интенсивности сигнала на фиг.6 по сравнению со способом гибридизации однонитевой ДНК можно объяснить тем, что диффузия ДНК в ячейку чипа идет примерно около 2-х минут, что чуть больше чем время ренатурации (90 сек). Поэтому, согласно формуле (2) ДНК ренатурирует раньше, чем продифундирует в самые глубокие слои ячейки и свяжется там с зондами, что объясняет некоторое снижение интегральных сигналов, которое может быть убрано при использовании более пористого геля. Несмотря на это фиг.6 показывает, что сигналы при использовании предложенного способа дают многократный прирост по сравнению с фоновыми сигналами, которые могут быть получены при анализе двунитевой ДНК без применения предложенного способа. На фиг.10, которая демонстрирует аналогичные данные из другого примера, для коротких олигонуклеотидов, такая потеря сигналов вследствие ренатурации во время длительной диффузии в гель не происходит, что объясняется тем, что диффузия коротких олигонуклеотидов в гель существенно выше.
На фиг.8 изображен график, показывающий дискриминационные соотношения для способов гибридизационного анализа одно- и двунитевой ДНК, полученные для 12 совершенных дуплексов чипа и соответствующих ему мисматчей. Из фиг.8. следует, что дискриминация остается практически неизменной, что подтверждает работоспособность способа.
Пример 1 подтверждает преимущества предлагаемого способа гибридизации в цикле циркуляции с денатурацией, показывая, что при применении этого способа появляется сигнал от двунитевой ДНК и чувствительность способа сопоставима (см. фиг.6) с широко используемым способом гибридизации однонитевой ДНК, изложенным в [5].
Пример 2. Применение устройства для универсального чипа с целью гибридизации коротких дуплексов двунитевой ДНК
1. Структура биочипа.
В качестве гибридизационной подложки был взят чип, как в [41], изготовленный по технологии, как в [42]. В ячейках этого чипа были иммобилизованы все возможные гексануклеотиды. Этот чип содержал 4096 гелевых ячеек, размером 100 мкм, где каждая из которых содержит свой уникальный однонитевой гексануклеотидный зонд. Такой чип имел размер поля с ячейками примерно 2 на 2 см и состоял из 4-х кластеров, 2 кластера составляли 972 ячейки, включая 36 ячеек, содержащих иммобилизованные маркеры и 4 пустые гелевые ячейки в каждом поле. Флуоресцентно меченный олигонуклеотид gel-5'-NH-TTTTTTTT-NH-TR-3' был иммобилизован в соответствующие ячейки в оконечной концентрации 6 мМ и использовался как маркер. Два других поля состояли из 1152 гелевых ячеек, включая 36 ячеек в каждом поле, содержащих иммобилизованные маркеры. Подробнее о технологии изготовления чипов с гелевыми ячейками см. [41, 42]
2. Пробоподготовка.
Были синтезированы, хромотографически очищены и охарактеризованы MALDI масс-спектрометрически на гомогенность два флуоресцентно меченных олигонуклеотида, содержащие внутримолекулярную (шпилечную) структуру (см. фиг.9Б). Последовательности синтетического олигонуклеотида, образующего шпильку, и короткий дуплекс были 5'-Су3 -NH-GGTCTCTCC-TTTT-GGAGAGACC-3' и 5'-Cy3-NH-GGTCTCTCC-UUUU-GGAGAGACC-NH-Су3-3' соответственно. Первый олигонуклеотид содержит в «головке шпильки» уридин, а второй - тимидин. Первый олигонуклеотид был обработан урацил-гликозилазой так, что получилось строго одинаковое количество комплементарных друг к другу частей. Результаты полноты расщепления контролировали с помощью MALDI масс-спектрометрии. В качестве контрольного некомплементарного вышеописанным олигонуклеотида был использован маркированный праймер F1272 с последовательностью 5'-Cy3-NH-CGCCG CGATC AAGGA GTTCT-3', полученный как [5]. Последовательность этого праймера не совпадала с последовательностью первого и второго олигонуклеотида с точностью до гексануклеотидов. Последовательности коротких олигонуклеотидов для проведения сравнения были 5'-Cy3-NH-GGTCTCTCC-3' и 5'-Су3- NH-GGAGAGACC-3'.
3. Конструкция устройства.
Устройство было такой же конструкции, как в примере 1, только использовалась камера большего размера для универсального чипа объемом 200 мкл.
4. Гибридизация маркированных олигонуклеотидов на чипе.
-7
В первом эксперименте использовали раствор праймера F1272 и «разрезанной шпильки» с одинаковыми концентрациями 10М в гибридизационном буфере состава: 1М NaCl, TrisHCl - 50 мМ, рН 7,5, ЭДТА - 5 мМ, объемом 1,5 мл. Смесь помещали в резервуар устройства, см. фиг.1. Устанавливали на термостолике чипа и охладителе температуру минус 5°С, а нагреватель оставляли при комнатной температуре, которая была ниже температуры плавления дуплекса разрезанной шпильки (20°С), и включали насос (см. фиг.9А). Далее регистрировали кинетику нарастания сигналов [8] с ячеек чипа аппаратным комплексом, как описано в [41], и подбирали оптимальные условия. Через 0,5 часа на нагревателе задавали температуру (60°С), которая выше температуры плавления дуплексов «разрезанной шпильки» (40°С). Затем на короткое время отключали и снова включали нагреватель. На фиг.9А изображен эффект влияния температуры нагревателя на нарастание гибридизационных сигналов при подборе условий. Во втором эксперименте, в тех же условиях включения и выключения нагревателя по времени и в том же режиме прокачки, анализировали «неразрезанную шпильку», содержащую в «головке» тимидин. Затем, в подобранных оптимальных условиях провели детальное сравнение кинетических кривых для неразрезанной шпильки, дуплекса, и однонитевых частей шпильки по отдельности, фиксируя конечные сигналы со значимых комплементарных друг другу ячеек (см. фиг.10Б)
5. Регистрация и интерпретация результатов анализа.
Кинетику роста сигналов [8] в ячейках чипа регистрировали с помощью программно-аппаратного комплекса, как было описано выше, подробнее см. [41]. Чип сканировали поле за полем примерно каждые 5 минут. Каждое поле снимали с экспозицией в 10 секунд. Весь микрочип (4 поля) сканировали примерно за 70 секунд. Основные результаты, показывающие принцип работы устройства, изображены на фиг.7А. В первой части эксперимента использовали эквимолярный раствор смеси одноцепочечного маркированного праймера p1272f и короткого дуплекса длиной 9 п.н. с последовательностью, как на фиг.9Б, отвечающего «разрезанной шпильке». Смесь помещали в резервуар устройства (Фиг.1). Устанавливали на термостолике чипа и охладителе температуру -5°С. Нагреватель оставляли при комнатной температуре (20°С), которая была ниже температуры плавления дуплекса в растворе (около 40°С). Далее включали насос и регистрировали кинетику нарастания сигналов с ячеек чипа. Через 0.5 часа на нагревателе задавали температуру 60°С, которая была выше температуры плавления дуплексов, отвечающих «разрезанной шпильке». Затем на короткое время отключали и снова включали нагреватель. Поскольку скорость ренатурации уменьшается с ростом длины ДНК, по сравнению с анализом длинной двунитевой ДНК в предыдущем разделе время пребывания смеси коротких расплавленных дуплексов в охладителе и чипе уменьшили до трех секунд, увеличив скорость прокачки раствора насосом. В качестве примера на фиг.9А представлены графики зависимости сигналов от времени для двух ячеек универсального чипа, содержащих зонды, комплементарные частям обеих ветвей дуплекса, обозначенных как pad 1 и pad 2 на фиг.9Б.
Однонитевой праймер, присутствующий в смеси, использовали в качестве внутреннего контроля. Этот флуоресцентно-меченый праймер может связаться со всеми ячейками, в которых иммобилизованы зонды, комплементарные любой из гексамерных подпоследовательностей праймера. Подробнее об этом см. [3, 24].
Во второй части эксперимента, в тех же условиях анализировали только однонитевую ДНК с «неразрезанной шпилькой», содержащей в «головке» тимидин. Эти данные брали от ячейки (pad 1), зонд которой комплементарен одной из ветвей шпильки. Данные наносили на тот же график (Фиг.9А) в качестве контрольного гибридизационного сигнала.
Приведем теперь некоторые комментарии к результатам, показанным на Фиг.9А и иллюстрирующим эффект от работы устройства. Рассмотрим сначала случай 1 (ячейки А и Б), когда температура нагревателя равнялась комнатной температуре (20°С) и была ниже температуры плавления дуплекса, отвечающего разрезанной шпильке (около 40°С). Как известно, кривые плавления в растворе у коротких дуплексов имеют плавный, растянутый характер. Если температура раствора ниже, чем температура плавления дуплекса (как в нашем случае), то однонитевые фрагменты ДНК для разрезанной шпильки будут присутствовать в смеси в небольшой концентрации, которая, тем не менее, достаточна для наблюдаемого роста сигналов в ячейках чипа. Поэтому на графике наблюдается небольшой прирост сигнала. При установке температуры нагревателя большей, чем температура плавления (случай 2), все дуплексы в нагревателе плавятся, и происходит резкое увеличение концентрации однонитевых фрагментов над ячейками чипа. Однонитевые фрагменты быстро охлаждаются и гибридизуются с зондами в ячейках чипа, не успевая ренатурировать. Как следствие, происходит ускорение в нарастании сигнала, которое оказывается сравнимо со скоростью нарастания сигнала от ячейки с зондом, комплементарным к одноцепочечному праймеру. Этот эффект воспроизводим (случаи 3 и 4 на фиг.9А). Практически полное отсутствие сигнала от «неразрезанной шпильки» в ячейках, содержащих комплементарные к ней гексамерные подпоследовательности, подтверждает тот факт, что «шпилька» - это внутримолекулярная структура, время образования которой составляет несколько микросекунд и гораздо меньше, чем время прохождения смеси через охладитель и чип. Столь малые времена охлаждения не могут быть достигнуты в данном устройстве.
Для кинетики контрольной гибридизации с одноцепочечным праймером влияние нагревателя на кинетику гибридизации отсутствует (нет изменения в скорости нарастания при переходе между случаями 1-4 на фиг.9А).
Этот модельный эксперимент подтверждает важность применения фрагментации, показывая, что после фрагментации и применения вышеописанного устройства появляется сигнал от коротких дуплексов, отвечающих шпилькам. В данном конкретном случае последовательности анализируемых комплементарных олигонуклеотидов теперь могли быть без труда прочитаны на универсальном чипе. Наиболее оптимальным представляется применение случайной, не зависящей от последовательности фрагментации со средней длиной фрагментов, примерно равной длине зондов чипа. Использование такой фрагментации может значительно повысить эффективность реконструкции последовательности с помощью универсальных микрочипов. Вторым важным моментом является использование пар взаимно комплементарных зондов на универсальном микрочипе. Это позволяет одновременно анализировать как значимую (sense), так и комплементарную (antisense) ДНК, что служит дополнительным эффективным средством контроля (ср. совпадение кривых для ячеек А и В на фиг.7А).
Далее, в подобранных оптимальных условиях (Температура нагревателя = 60°С, время охлаждения = 3с) провели детальное сравнение кинетических кривых для неразрезанной шпильки, дуплекса, и однонитевых частей шпильки по отдельности, фиксируя конечные сигналы от значимых комплементарных друг другу ячеек (см. фиг.10Б).
В первой части эксперимента (семейство кривых «а» на фиг.10А) анализировали однонитевую ДНК с «неразрезанной шпилькой», содержащей в «головке» тимидин. Кривые демонстрируют отсутствие какого либо нарастания сигнала при применении предложенного метода (температура нагревателя 60°С, скорость прокачки - 3 см/сек). Финальное изображение значимых ячеек чипа см. Фиг 10Б случай «а».
Во второй части эксперимента (семейство кривых «b» на Фиг 10А) анализировали разрезанную урацил-гликозилазой шпильку при выключенном нагревателе. При этом внутримолекулярная шпилька превращается в межмолекулярную структуру - дуплекс. В этой части эксперимента температура раствора, подаваемая на охладитель, определялась комнатной температурой (20°С). Это обусловлено тем, что нагреватель не был оборудован элементом пельтье для охлаждения и вместе с резервуаром не имел теплового контакта с термостоликом микроскопа, охлажденным до -5°С. В этом случае кривые демонстрируют умеренное нарастание гибридизационных сигналов вследствие предплавления анализируемого дуплекса. Финальное изображение ячеек чипа см. Фиг.10Б случай «b». Стоит заметить, что если бы удалось опустить в этом эксперименте температуру нагревателя и всей циркулирующий жидкости до -5°С, как это происходит при обычной гибридизации, то семейство кривых "b" легло бы гораздо ниже.
В третьей части эксперимента (семейство кривых «с» на Фиг.10А) анализировали разрезанную урацил-гликозилазой шпильку при включенном нагревателе (60°С). Кривые демонстрируют увеличение нарастания в кривых по сравнению с предыдущим случаем примерно в 2.5 раза. Дальнейшее увеличение температуры нагревателя и/или скорости потока прироста в нарастании кривых не дает. Финальное изображение ячеек чипа см. Фиг.10Б случай «с».
В четвертой части эксперимента (семейство кривых «с» на Фиг 10А) в двух независимых гибридизационных экспериментах анализировали однонитевые участки разрезанной шпильки по отдельности, используя два флуоресцентно меченные девятимера, которые были синтезированы отдельно. Финальные изображения значимых ячеек чипа см. Фиг.10Б случай «d1» и «d2». Этот эксперимент использовали для сравнения возможностей предлагаемого метода со стандартным, когда гибридизуют только одну цепь.
Как видно из Фиг.10, предложенный способ дает существенный рост сигналов в случае коротких дуплексов, с применением фрагментации, и интенсивности сигналов, достигаемые в ячейках чипа практически такие же, как и в стандартном методе.
Пример 2 подтверждает эффективность способа на коротких двунитевых ДНК, а также подтверждает важность применения фрагментации, показывая, что после фрагментации появляется сигнал от коротких «шпилек» и он достигает своего максимума при применении вышеописанного устройства.
Промышленная применимость
Разработан способ гибридизации путем организации перемещения раствора с НК между зонами денатурации, охлаждения и гибридизации. Предложенный способ полностью совместим с широко распространенной технологией микрочипов (биочипов, матричных микрочипов - микрочипов в виде ячеек на двумерной плоскости твердой фазы) и позволяет проводить гибридизацию обоих нитей двунитевой ДНК без предварительной наработки однонитевой ДНК из двунитевой. В комбинации с фрагментацией, способ также позволяет анализировать однонитевые ДНК со сложной внутримолекулярной структурой. Разработанный способ может быть применен как в медицинской диагностике, так и в практике проведения научных исследований, где требуется получать дуплексы ДНК с зондами, прикрепленными на твердой фазе с помощью гибридизации. Способ может быть применен при гибридизации сложных смесей, как на универсальных, так и на экспрессионных микрочипах. Способ может быть применен также для упрощения конструкции замкнутых (ампулизированых) устройств диагностики, предназначенных для обнаружения опасных патогенов и не позволяющих ампликону опасной инфекции после ПЦР контактировать с внешней средой. С использованием предлагаемого способа, времена проведения анализа могут быть существенно уменьшены, а конструкции таких устройств, построенных на базе микрофлюидных решений, разрабатываемых на базе ПЦР и микрочипов, могут быть существенно упрощены, поскольку способ позволяет не использовать одну из стадий ПЦР и легко совместим с принципом поточной ПЦР при перемещении раствора через участки герметичной сети каналов с разной температурой, соединенных с микрочипом.