ПРОБИОТИЧЕСКИЕ ГРАМПОЛОЖИТЕЛЬНЫЕ БАКТЕРИИ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ, ПОДАВЛЕНИЯ ИЛИ УСТРАНЕНИЯ АЛЛЕРГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ У ЧЕЛОВЕКА
PROBIOTIC GRAM-POSITIVE BACTERIA FOR HUMAN ALLERGY PREVENTION, INHIBITION OR ELIMINATION

Изобретение относится к фармацевтическому препарату для профилактики, подавления или устранения аллергических реакций у людей.
Аллергические реакции на вещества, такие как пыльца (сенная лихорадка) или другие компоненты растений, кошачью шерсть и шерсть других животных, пыль, содержащую выделения клещей домашней пыли, яд насекомых, пищевые продукты, такие как молоко или орехи, или духи и другие компоненты косметики, хорошо известны и являются растущей проблемой для все время увеличивающегося числа людей.
Причина состоит в том, что собственная иммунная система тела реагирует на такие вещества, как если бы они фактически были вредными захватчиками, такими как паразиты. Кроме того, степень реакции чрезмерна.
н
н
н
н
В этом аутоиммунном ответе белые частицы крови, лимфоциты, играют значительную роль. Одна форма лимфоцитов - Т лимфоциты, или хелперные клетки (ТН клетки), которые выделяют различные медиаторы, цитокины, для управления иммунными ответами. Существуют, во-первых, цитокины, которые уменьшают или предотвращают аллергические реакции, и, во-вторых, другие цитокины, которые вызывают воспалительные, то есть аллергические, реакции при наличии стимулирующего эффекта в качестве медиаторов на действующих клетках, таких как тучные клетки. Согласно этому эффекту, все ТН клетки подразделяются на две группы, а именно Т1 и Т2 клетки. Т1 клетки включают антиаллергические цитокины, такие как γ-интерферон (IFN-γ) или интерлейкин 2 (IL-2). Т2 клетки включают медиаторы, которые вызывают аллергические реакции, такие как интерлейкины IL-3, IL-4, IL-5 и IL-10. Интерлейкин-4 стимулирует тучные клетки, чтобы сформировать антитело иммуноглобулина типа Е (IgE), которое присутствует в очень больших количествах при аллергиях.
н
н
Отношение между числом Т1 клеток и Т2 клеток является критическим для иммунного ответа тела на захваченные болезнетворные микроорганизмы, оно значительно ниже в пациентах с аллергической реакцией, чем в здоровых людях. Известно, что новорожденные или преждевременно рожденные младенцы также имеют очень низкую величину этого отношения, чтобы организм матери по ошибке не атаковал клетки младенца.
н
н
Поэтому баланс Т1-Т2 - важная характеристика каждого человека и также становится все более широко известной.
В целом предполагается, что изменения в кишечной флоре и/или нехватка бактериальной стимуляции в очень раннем детстве в результате чрезмерной гигиены и уменьшения инфекционных заболеваний создают предрасположение для расхождения величины баланса и поэтому дают начало аллергической сверхчувствительности.
Поэтому даже в младенчестве вторжение аллергенов может вызвать воспалительные реакции, такие как насморк и опухшая слизистая оболочка и даже повышенная температура тела.
Известны многочисленные фармацевтические препараты, которые борются или подавляют имеющие место симптомы. Их недостаток состоит в том, что часто они очень дороги, вызывают множество нежелательных побочных эффектов и должны приниматься пациентом непрерывно.
На этом фоне объект изобретения - идентифицировать активное вещество, которое уже известно, может быть получено в промышленных масштабах и поэтому является легкодоступным и перерабатываемым, которое обеспечивает низкие цены, которое уже встречается в незначительных количествах даже в окружении здоровых людей и поэтому совместимо с человеческим организмом в определенных пределах и которое не атакует аллергические реакции на уровне симптомов, но на стадии запуска медиаторами.
Для достижения этой цели изобретение предлагает фармацевтический препарат, в котором пробиотические, грамположительные бактерии, такие как Lactobacillus и Bifidobacterium присутствуют как существенный активный компонент, а именно как жизнеспособные бактерии и/или инактивированные бактерии и/или их геномная ДНК.
Признак "пробиотический" объясняется в Brockhaus как сосуществование двух организмов в пользу одного партнера без повреждения другого. В случае этого изобретения, второй организм, а именно бактерия, полезен для организма человека.
Сама бактерия не повреждается и поэтому остается жизнеспособной. Это заключается в том, что при оральном приеме насколько возможно много бактерий проходят невредимыми через желудок с его кислотами, ферментами и другими пищеварительными агентами.
Термин "пробиотический" также подразумевает, что неблагоприятные эффекты на человека являются незначительными или, по крайней мере, очень маленькими и что преобладают эффекты, которые классифицируются как полезные. Термин "пробиотики" означает препараты микроорганизмов, которые имеют оздоровительный эффект на организм хозяина, когда употребляются в достаточных количествах. Пробиотические молочнокислые бактерии (Lactobacillus) использовались в течение длительного времени. Пробиотики могут вводиться как специально приготовленные пищевые продукты или в форме фармацевтических препаратов.
Оздоровительные эффекты пробиотиков являются штамм-специфичными в каждом случае. Из медицины известно, что пробиотические бактериальные штаммы несомненно повышают усвоение лактозы, подавляют патогенные микроорганизмы в кишечнике и ограничивают или подавляют диарею.
Другие бактериальные штаммы увеличивают защиту против инфекции, понижают уровень холестерина и сокращают риск рака ободочной кишки. Эти эффекты успешно продемонстрированы in vitro перед их широким применением. Поэтому правомерно подтвердить оздоровительный эффект этого изобретения рядом лабораторных экспериментов.
Посредством экспериментов, описанных ниже, было оценено, какие цитокины из фракции клеток крови человека (РВМС - периферийные мононуклеарные клетки крови) освобождаются при специфических условиях. Для одного ряда экспериментов, эти клетки крови были выделены из крови здоровых людей и для второго ряда экспериментов - из крови аллергических пациентов, которые имели аллергию на домашнюю пыль.
Для стимуляции тип А стафилококкового энтеротоксина (SEA) и в дальнейших сериях Дерматофагоид (Dpt) добавлялись, потому что страдающие от аллергии на домашнюю пыль обычно также имеют аллергию на них. Таким образом моделировалось вторжение аллергенного вещества.
н
н
γ-Интерферон был оценен как заместитель для Т1 реакции. Т2 образец был зарегистрирован посредством выделенных интерлейкинов 4 и 5 (IL-4 и IL-5).
н
н
н
н
н
Факторы, которые могут быть вовлечены в увеличенное распространение аллергического заболевания, как полагают, включают модификацию кишечной флоры или нехватки бактериальной стимуляции в детстве. Т2 цитокины увеличивают выработку IgE и стимулируют тучные клетки. С другой стороны, γ-интерферон (IFN-γ), Тн1цитокин вносит свой вклад в подавление синтеза IgE. Таким образом, нарушение равновесия выражения "Т1 к Т2" может внести свой вклад в запуск и поддержание аллергических заболеваний. Бактерии Lactobacillus, которые являются частью естественной микрофлоры кишечника, как полагают, сокращают частоту и серьезность аллергических проявлений и модулируют Т1 / Т2 ответ. Функциональный механизм еще не объяснен.
н
н
н
н
Задача: Наша экспериментальная задача состояла в том, чтобы определить влияние пробиотических бактерий на производство таких цитокинов Т1 и Т2 типа здоровых людей и пациентов с аллергиями на клещей домашней пыли и объяснить молекулярные основы эффектов бактериальной геномной ДНК на Т1/Т2 ответ на энтеротоксин А стафилококка (SEA) и Dermatophagoides pteronyssinus (Dpt) и сравнить их с эффектами живых бактерий.
н
н
Способы: РВМС от пациентов с аллергиями на клещей домашней пыли в сравнении с теми же от здоровых доноров были инкубированы в течение 24 и 48 часов с или без Dpt и SEA аллергенов. Эффект предынкубации с живыми пробиотическими бактериями, а также влияние их геномной ДНК, которая была одновременно добавлена к культивированным и инкубированным в течение 24 часов, были оценены путем измерения выработки Т1/Т2 цитокинов.
Результаты
н
Тестированные, жизнеспособные, грамположительные, пробиотические бактерии и их геномная ДНК показали, что они подавляли SEA и Dpt-стимулируемую секрецию Т2 цитокинов (EL4 и EL5) и увеличивали стимуляцию IFN-γ. Этот эффект зависел и от дозировки, и от выбранного бактериального штамма. Не было вызвано существенное ингибирование контрольными грамотрицательными Escherichia coli TG1. Пробиотические бактерии сокращали выработку цитокинов IL-4 из аллергических РВМС особенно после повторной стимуляции SEA и Dpt даже более эффективно, чем в здоровых людях. С другой стороны, ингибирование IL-5 в здоровых субъектах более ясно заявлено. Бактериальная ДНК также подавила освобождение IL-4 и IL-5, но только до несколько более низкой степени. Ингибирование EL4 было более явно в случае РВМС от аллергических субъектов, чем для здоровых субъектов, хотя это имело место для EL5.
Заключение
н
н
н
Т1/ Т2 ответ на аллергены, модулированный тестированными пробиотическими бактериями, а также их геномной ДНК, показал анти Т2 активность. Следовательно, различные штаммы пробиотических бактерий и их геномной ДНК могут быть полезными в предотвращении аллергических заболеваний.
1. Введение
н
н
н
н
н
Теория причин аллергических заболеваний остается неясной, хотя экспериментальные исследования на человеке показывают, что генетические состояния вносят свой вклад в иммунный ответ слизистой оболочки кишечника, а кишечные бактерии вносят свой вклад в патогенез аллергических заболеваний. Некоторые исследования предполагают, что Т2 цитокины, особенно IL-4, IL-5, 1L-9 и IL-13, играют существенную роль в патогенезе, регулируя выработку IgE и стимулируя тучные клетки. Производство IL-4, IL-5, 1L-9 или IL-13 Т2 лимфоцитами на высоком уровне может играть решающую роль в развитии и прогрессе аллергических ответов; напротив, IFN-γ, так называемый Т1 цитокин, имеет способность подавлять IgE синтез. Дефектные IFN-γ экспрессии часто связаны с IgE-опосредованными аллергиями. Разрегуляция в балансе Т1/Т2 цитокинов может в большой степени быть ответственной за запуск и поддержание аллергических воспалительных процессов в заболеваниях, таких как бронхиальная астма или атопический дерматит.
н
н
н
н
н
н
н
Предложено, что, в частности, профиль Т2 цитокина новорожденных младенцев; старение, которое обычно снижает Т1/Т2 баланс; предписания современной гигиены; интенсивная стерилизация пищи и/или изменения в кишечной флоре новорожденных младенцев, вызванные кормлением искусственными препаратами, играют главные роли в изменениях Т1/Т2 баланса. Приобретенные знания в этой области подготовили основание для ряда новых терапевтических подходов. Один подход состоит в том, чтобы просто использовать пробиотические бактерии для воспроизведения тех цитокинов, которые не были сформированы в достаточных количествах, или уменьшения тех цитокинов, которые были сформированы в слишком большом масштабе благодаря тому, что пробиотические бактерии модулировали Т1/Т2 баланс.
Пробиотические бактерии вообще классифицируются как безопасные и употреблялись людьми или животными. Бактерии Lactobacillus и Bifiobacterium - микроорганизмы, наиболее широко распространенные в желудочно-кишечном тракте человека. Интерес состоит в росте иммуностимулирующего эффекта пробиотических бактерий, в особенности их антиаллергенного эффекта. Важная роль бактерий в аллергических заболеваниях увеличивает возможность предотвращения или лечения этих отклонений путем изменения кишечной микрофлоры пробиотической обработкой. Пробиотические бактерии могут действовать прямо или косвенно за счет изменения эндогенной флоры или иммунной системы. Было предложено использовать новое выражение "иммунобиотики" для бактерий, которые улучшают здоровье через иммунную систему слизистой оболочки, в отличие от тех же, только с местным эффектом. Сообщалось о различных иммунных ответах на пробиотики, таких как секреция продвигающих воспаление цитокинов, воспроизводство лимфоцитов и формирование окисей азота. Кроме того, показано, что все клетки, некоторые растворимые компоненты, которые вырабатывались LGG или ДНК из LGG, компоненты стенок клеток, такие как пептидогликановая или липотейхионовая кислоты Lactobacilli, вызывают воспалительные иммунные ответы и иммунобиотическую активность. Продемонстрировано, что не только живые бактерии, которые введены в кишечный тракт, но также и изолированная пробиотическая ДНК активна, даже если она введена подкожно.
Сообщалось, что неденатурированные CpG мотивы в бактериальной ДНК являются митогенетическими для В-клеток мышей и вызывают производство воспалительных цитокинов макрофагами и древовидными клетками (DC). И CpG олигодеоксинуклеотиды (ODN) и бактериальная ДНК вызывают производство интерлейкина 6 (IL-6), интерлейкина 12 (IL-12) и интерферона-γ (IFN-γ) В-лимфоцитами и естественными клетками-киллерами мышей. Кроме того, CpG ДНК вызывает распространение В-клеток и разделение не находящихся под влиянием и активированных Т-клеток в Т-хелперных клетках 1 и 2. Специфичные CpG ODN (D-тип) особенно эффективны при активировании NK клеток и производстве α-интерферона (IFN-α) плазмацитоидными древовидными клетками, в то время как другие ODN (тип К) - особенно эффективные активаторы В-клеток. Недавно установлено, что колоколоподобный рецептор 9 (TLR9) играет критическую роль в запуске клеточной активации с помощью CpG ДНК.
н
н
н
н
1
Эксперименты, которые осуществляются на мышах, которые были сенсибилизированы к яичному альбумину, показали, что после введения молочно-кислых бактерий в желудок, специфичные IgE и Т2 профильзависимые воспалительные ответы были подавлены. Кроме того, последние сообщения предполагают, что lactobacillus Rhamnosus GG могут уменьшить симптомы аллергических заболеваний в человеке, подобно тому как их могут вызвать врожденные иммунные ответы путем активизации транскрипционных факторов, которые интегрированы в сигнальную функцию цитокинов. Введение этого бактериального штамма грудным матерям и новорожденным младенцам приводило к подавлению риска атопической экземы у младенцев. In vitro эксперименты показали, что возбуждение РВМС или моноцитов здоровых доноров разнообразными молочно- кислыми бактериями вызывает секрецию IL-12, который является существенным про-Т1 цитокином и вовлечен в управление развитием аллергических заболеваний. Функциональные механизмы, посредством которых LAB влияет на производство Т2 цитокинов, которые являются ответственными за инициацию развития аллергических заболеваний, остаются идентифицируемыми. Принимая во внимание присутствие неденатурированных ДНК последовательностей (CpG мотивы) в хромосомах ДНК из Bifidobacterium и Lactobacillus, мы решили в этой работе исследовать эффект четырех штаммов бактерий Lactobacillus и Bifidobacterium, а также их хромосомной ДНК на производство IL-4, IL-5 и IFN-γ SEA- и Dpt-стимулированными РВМС здоровых и аллергических тестируемых субъектов. Исследованные бактерии Lactobacillus и Bifiobacterium проявили анти-Т2 активность и про-Тн цитокин, IFN-γ.
2. Методы и Материал
2.1. Бактериальная культура
В этом исследовании использовались следующие бактериальные штаммы:
Lactobacillus rhamnosus GG (92164), Lactobacillus gasseri (PA 16/8), Bifidobacterium bifidum (MG 20/5), Bifidobacterium longum (SP 07/3) и LgsB.bB.I (смесь Lactobacillus gasseri, Bifidobacterium bifidum и Bifidobacterium longum).
-1
10
7
1
-1
Штаммы Bifidobacterium и Lactobacillus использовались (0,02% прививочный материал штаммов, который анаэробно сохранен при минус 80°С в 30%-ном глицерине) (анаэробная система, MACS-VА500 Workstation с воздушным шлюзом и воздушный шлюз, Don Whitley Scientific Limited UK в MRS среде (MRS; Merck, Дармштадт, Германия), дополненные 0,05% L-цистеином при 37°С в течение 16 часов. Перед сбором и промыванием в PBS последовательные растворы свежеприготовленных культур были нанесены на пластины, содержащие MRS - агаровую среду и культивированы для подсчета. Подсчет формирующих колонию единиц (CFU мл) пробиотических групп бактерий был получен с применением повторных 10-кратных растворений на пластины. Пластины анаэробно инкубированы при 37°С в течение 24-48 часов. Бактерии затем промыты три раза PBS и доведены до окончательных концентраций 10, 10 и 10 CFU мл. Бактериальная суспензия хранилась при -80°С в MRS растворе, содержащем 30%-ный глицерин. Для всех бактериальных штаммов нормальные кривые роста были получены путем записи подсчета OD600 vs агаровых пластин свежеприготовленных неоднократно растворенных культур. Чтобы вычислить подсчет жизнеспособных бактерий в свежеприготовленных культурах, кривые оснащены логарифмическими распечатками, которые получили все значения более чем 98,5% (данные не показаны). Грамотрицательный Е. coli TG1 (продукт номер BU-00035) был закуплен у Maxim Biothec Inc и выращен в LB-среде в течение 18 часов при 37°С и собран, как приведено выше.
2.2. Получение геномной ДНК из бактерий
2
260
260/280
260/230
260/280
250/230
Геномные ДНК из чистых культур пробиотических бактерий очищены путем экстракции с применением фенол/хлороформ/изоамилового спирта (25:24:1). Чтобы получить полное разрушение клетки, способ был немного модифицирован продлением ферментативного лизиса с 2 до 7 часов. Впоследствии ДНК была осаждена, стерилизована холодным (-20°С) 95%-ным этанолом и растворена в дважды дистиллированной воде (ddH0). Концентрация и чистота всех приготовлений ДНК были получены измерением OD поглощения или ОD и OD отношений. Использовались только ДНК с отношением OD>1,8 и OD>2.
-1
ДНК были очищены от эндотоксина с применением TritonX-114D и также исследованы на содержание липополисахаридов (LPS) с использованием limulus amaebocytes теста (QCL-1000, CAMBREX, Германия). Содержание LPS было меньше чем 0,01 U эндотоксинов мгк.
-1
Для определения биологической активности LPS или других бактериальных загрязнений в ДНК препаратах ДНК деградировала дезоксирибонуклеазой I (Sigma). Не было очевидного подавления цитокинов клетками РВМС ниже основного уровня, когда была добавлена деградированная ДНК с концентрацией 75 мкг мл (измерено перед обработкой DANN разрушения).
2.3. Изоляция РВМС и культура
2.3.1. Предынкубация РВМС пробиотическими бактериями и дальнейшая стимуляция с помощью SEA и Dpt
-1
-1
-1
6
-1
6
4
5
6
6
7
7
7
-1
-1
-1
2
Восемь аллергических пациентов и восемь здоровых доноров были взяты на исследование. Все испытуемые субъекты перед регистрацией представили устное и письменное согласие для этого исследования, как требуется этической комиссией Университета Киля по использованию в исследовании человеческих испытуемых субъектов. Венозная кровь была направлена от доноров в гепаринизированных Vacutainers и растворена в пропорции 1:1 0,9% NaCl. Затем мононуклеарные клетки свежей периферийной крови (РВМС) были изолированы от гепаринизированной растворенной крови центрифугированием согласно увеличивающейся плотности (1,077 г мл) (Lymphoprep, AXIS-SHIELD PoC AS, Осло, Норвегия). Клетки были превращены в эмульсию в среде культуры RPMI-1640 (Sigma, Мюнхен, Германия), дополнены 10% (об./об.) активизированной высокой температурой (56°С, 1 ч) эмбриональной бычьей сывороткой, Гентамицин (50 мкг мл) (Sigma), стрептомицин пенициллина (1%) и раствором пирувата натрия (0,23 ммоль л) (Sigma) (заказанный как полная среда). Все компоненты были куплены проверенными на эндотоксины, как требуется LAL. Клетки культивированы в полной среде в концентрации 2*10 клеток мл в емкости с 24 лунками. В то же время для стимуляции к культурам добавлены четыре штамма живых пробиотических бактерий и грамотрицательные бактерии (Е.coli TG1). Как требуется для бактериального подсчета, пробиотическое и другие бактерии были жизнеспособны во время дополнения к культурам. Клетки, которые культивированы только со средой, служили в качестве нестимулируемого контроля. Тесты на зависимость от дозировки, выполненные для IL-4 и IL-5 как культур с окончательным объемом 200 мкл/лунка, получены в плоскодонных 96-луночных микротитровальных пластинах (Nune, Роскилле, Дания) с 2×10 мононуклеарными клетками и 5×10, 5×10, 2×10, 5×10, 2×10 и 5×10 бактерий/мл, соответствующими 0,025, 0,25, 1, 2, 5, 10 и 25 бактерий на мононуклеарную клетку. Они показали, что максимальная супрессия наблюдалась с 2×10 CFU бактерий/мл, соответствующая отношению 10:1 (бактерии к РВМС). Эта концентрация использовалась в других экспериментах. Окончательное отношение между РВМС и бактериями (отношение бактерий к РМВС) было 10:1 для здоровых доноров и для аллергиков. Для контрольной обработки только среда культуры была добавлена к раствору РВМС. Затем и после инкубации в течение трех часов при 37°С, РВМС далее стимулировались с SEA (2 мкг мл) или Dpt (2000SQ-E мл эквивалент до 2 мкг дозы мл) и в 5%-ном увлаженном CO инкубаторе при 37°С в течение 48 часов. Все эксперименты выполнены в двойном экземпляре. После инкубации в течение 48 часов среда культуры центрифугирована при 4°С в течение 20 минут при 1,000×г. Не содержащая клетки надосадочная жидкость стерилизована пропусканием через фильтр с размером поры 0,2 мкм (Millipore, Германия) и хранится при -80°С до использования. Жизнеспособность клеток определена до и после инкубации с бактериями путем исключения с трипановым синим.
2.3.2. Возбуждение с SEA, LPS и геномной ДНК
-1
-1
-1
6
-1
6
-1
-1
-1
-1)
-1
-1
2
Свежие РВМС из гепаринизированной периферийной крови от четырех здоровых доноров выделены центрифугированием в соответствии с увеличивающейся плотностью (1,077 г мл) (Lymphoprep, AXIS-SHIELD PoC AS, Осло, Норвегия). Клетки были превращены в эмульсию в среде RPMI 1640 культуры (Sigma, Мюнхен, Германия), дополнены 10% (об./об.) активизированной высокой температурой (56°С, 1 ч) эмбриональной бычьей сывороткой, Гентамицин (50 мкг мл) (Sigma), стрептомицин пенициллином (1%) и раствором пирувата натрия (0,23 ммоль л) (Sigma) (полная среда). Все компоненты были куплены проверенными на эндотоксин. Все тесты на зависимость от дозировки, выполненные для IL-4 и IL-5 как культур с окончательным объемом 200 мкл/лунка, были получены в плоскодонных 96 - луночных микротитровальных пластинах (Nune, Roskilde, Дания) с 2×10 мононуклеарными клетками и 5, 10, 25, 50, 75 и 100 мкг геномных ДНК на мл. Они показали, что максимальная супрессия могла наблюдаться с 75 мкг ДНК мл. Эта концентрация использовалась в дальнейшем эксперименте. Клетки культивированы в полной среде в концентрации 2*10 клеток мл в 24-луночной пластине (Nune, Roskilde, Дания). В то же самое время геномная ДНК (75 мкг мл) пробиотических бактерий, геномная ДНК из теленка (75 мкг мл Sigma, Мюнхен, Германия) SEA (2 мкг мл и LPS из Е. coli (20 мкг мл, Sigma, Мюнхен, Германия) добавлены к культуре и инкубированы при 37°С, 5% СО-увлажнением в течение 24 часов. Все эксперименты выполнены в трех экземплярах. После 24-часовой инкубации, надосадочные жидкости без клеток собраны и центрифугированы при 1000g в течение 20 минут при 4°С, стерилизованы пропусканием через фильтр с 0,2 мкм порами (Millipore, Германия) и сохранены при -80°С в определенных количествах до проведения анализа. Жизнеспособность клеток определена до и после инкубации с геномной ДНК путем исключения трипановым синим. Во всех экспериментах 95-98% РВМС были жизнеспособны. Эксперименты по зависимости от дозировки, которые выполнены для всех цитокинов, показали, что максимальная супрессия наблюдалась при концентрации 75 мкг мл. Эта концентрация использовалась в дальнейших экспериментах.
2.4. Исследование цитокинов посредством энзимсвязанного иммуносорбентного анализа (ELISA)
-1
-1
-1
Концентрация IL-4, IL-5 и IFN-γ определена количественно в надосадочных жидкостях без клеток посредством специального ELISA (BD OptEiA™ набора IL-4, 5 и IFN-γ человека, Гейдельберг, Германия). Пределы чувствительности исследования были 0,5 мкг мл для IL-4, 0,5 мкг мл для IL-5 и 1 мкг мл для IFN-γ. Значения оптической плотности образцов были считаны при 450 и 570 нм на анодном электрическом реакторе ELISA. Эксперименты повторены, по крайней мере, дважды и выполнены в трех экземплярах.
2.5. Статистический анализ
Экспериментальные данные теста были произведены посредством ±S.E.M и был выполнен непараметризованный статистический анализ с t-тестом. Значения Р меньше чем 0,05 рассматривались как статистически существенные.
Результаты
Lactobacillus и Bifidobacterium подавляют IL-4 и IL-5 и запускают производство IFN-γ посредством SEA или Dpt-стимулированными РВМС от здоровых доноров. Показано, что стрептококковые суперантигены вызывают высокую концентрацию IL-4 и IL-5 из РВМС от здоровых доноров, а убитые высокой температурой молочнокислые бактерии были способны к подавлению выработки профиля цитокина типа-2. Кроме того, исследование показало, что аллергические пациенты имели повышенное содержание IL-4 и IL-5. Dermatophagoides pteronyssinus, Dpt (в 83,8%) и Dermatophagoides farinae, Df (при 78,4%) - самые широко распространенные причинные аллергены в пациентах с аллергическим ринитом. Теперь мы подтвердили эти наблюдения с другим суперантигеном - стафилококковым энтеротоксином A (SEA) и Dpt.
н
н
Когда живые штаммы бактерий Lactobacillus и Bifidobacterium предынкубированы с РВМС, полученное производство IL-4a с помощью SEA и Dpt очень уменьшилось по сравнению с тем, которое было вызвано положительным контролем (без предынкубации с Lactobacillus и Bifidobacterium). Интересно, что не наблюдалось существенного подавления, когда РВМС предынкубированы с грамотрицательным контрольным штаммом TG1 (фигура 1). Хотя ни четыре штамма Lactobacillus и Bifidobacterium, ни TG1 не вызвали основное производство IL-4, все четыре штамма вызвали производство IFN-γ. Когда РВМС с SEA и Dpt стимулировались, концентрация IFN-γ выхода, кроме того, очень увеличилась. Синергетический эффект наблюдался не только с Lactobacillus и Bifidobacterium бактериями, но также и с TG1. Следовательно Lactobacillus и Bifidobacterium, по-видимому, способны влиять на секрецию как Т1, так и Т2 цитокинов в противоположных направлениях.
Производство цитокинов зависит от времени и дозировки.
н
н
7
-1
Другие эксперименты, выполненные с четырьмя штаммами Lactobacillus и Bifidobacterium показали, что подавление Т2 цитокинов зависит от времени и дозировки. Когда РВМС стимулировались пробиотическими бактериями перед дополнением SEA, ингибирующее рост влияние на производство Т2 цитокина увеличивалось с отношением бактерий к РВМС. Максимальное ингибирование роста наблюдалось при 2×10 CFU бактерий мл, соответствуя отношению 10:1 (бактерии к ВМС) (фигура 2, А и В).
н
Этот эффект также наблюдался для производства IL-4 и IL-5. Например, для штамма L. gasseri процент от ингибирования роста производства IL-4 поднялся с 40,19%±3% (отношение 1:1) до 54, 22% ± (отношение 10:1) в ответ на SEA. Процент от подавления производства IL-5 вырос от 43,77%±8% (отношение 1:1) до 73,17%±5% (отношение 10:1). Кроме того, процент от ингибирования производства IL-4 в ответ на Dpt в РВМС от здоровых доноров увеличился с 34,61%±4% (отношение 1:1) до 47,33%±5% (отношение) 10:1. Процент ингибирования роста производства IL-5 вырос от 45,72%±4% до 77,59%±6%. В отличие от Т2 цитокина, наши проверенные штаммы вызвали основное производство IFN-γ, которое, по-видимому, зависит от отношения бактерии/клетки. Замечательно, что возможно было показать, что пробиотические бактерии в значительной степени влияют на производство IFN-γ как ответ на стимуляцию SEA (фигуры 1 и 2, С).
Зависимый от времени ингибирующий рост эффект живых пробиотических бактерий на производство IL-4а и IL-5
6
-1
РВМС от здоровых доноров (n=4 в 2×10 мл) стимулированы с SEA (2 мкг/мл). Мононуклеарные клетки или предынкубированы в течение 1, 3 и 5 часов штаммами L.GG (отношение 10:1) перед инкубацией до стимуляции SEA, или они одновременно стимулированы штаммами L.GG, и суперантиген или L.GG был добавлен спустя 1, 3 и 5 часов после SEA стимуляции, и клеточные культуры предынкубированы в течение 24, 48 и 72 часов. При вышеуказанных значениях времени надосадочные жидкости без клеток собраны и после центрифугирования и стерилизации сохранены при -20°С. Измеренная концентрация IL-4 и IL-5 показала, что максимальное подавление роста наблюдалось для 3-часовой предынкубации РВМС живыми бактериями перед возбуждением SEA. Аналогично максимальное ингибирование роста наблюдалось для 48-часовой инкубации (данные не показаны). Этот промежуток использовался в дальнейших экспериментах.
н
Lactobacillus и Bifidobacterium подавляют производство Т2 цитокинов из аллерген-стимулированных РВМС от аллергических пациентов.
н
н
Способность Lactobacillus и Bifidobacterium корректировать разбаланс между Т1 и Т2 цитокинами затем оценена в еще более релевантной модели возбуждения аллергенами. Когда РВМС от пациентов (аллергических к D. pteronyssinus) предынкубированы с различными жизнеспособными штаммами Lactobacillus и Bifidobacterium, производство IL-4 и IL-5, запущенное после специфического стимулирования D. pteronyssinus аллергенами, значительно сокращено, особенно в зависимости от отношения бактерии/клетки. Этот эффект на IL-5 не зависит от типа штамма исследованных пробиотических бактерий. Подавление IL-5 соответствовало, например, в случае В.b. - 57.31%±4,52% и в случае B.I. - 63,77%±5% (фигура 1).
н
н
Кроме того, подобные эффекты наблюдались, когда РВМС от аллергических пациентов стимулировались SEA. В этом случае, хотя производство IL-4 и IL-5 очень высоко по сравнению с производством, которое наблюдалось с D. pteronyssinus (фигура 1), тестированные пробиотические бактерии уменьшали секрецию IL-5 до 71,29%±4,10% для L.GG и до 77,3%±3,52% для L.gasseri (фигура 1). Совместная инкубация с Lactobacillus и Bifidobacterium очень увеличила производство IFN-γ (фигура 1). Таким образом, сокращением производства Т2 цитокинов и интенсификацией производства IFN-γ за счет РВМС от аллергических пациентов Lactobacillus и Bifidobacterium, по-видимому, проявляют анти-Т2 активность. В этом контексте интересно отметить, что эффект ингибирующей рост Lactobacillus и Bifidobacterium на производство IL-4 за счет РВМС от аллергических тестируемых субъектов больше, чем для здоровых тестируемых субъектов. Напротив, ингибирующий рост эффект этих бактерий на производство IL-5 за счет РВМС от здоровых доноров больше, чем для аллергических тестируемых субъектов (фигура 1). В отличие от этого ингибирующий рост эффект B.I и LgsBbBI на производство IL-4 за счет Dpt-стимулированных РВМС от аллергических тестируемых субъектов больше, чем он же от здоровых тестируемых субъектов (р<0,05), и ингибирующий эффект L.GG, В.b. и B.I на производство IL-4 SEA-стимулированными РВМС от аллергических тестируемых субъектов был больше, чем для здоровых тестируемых субъектов (р<0,01). В отличие от этого ингибирующий рост эффект L. gasseri, В.b и В.1 на производство IL-5 Dpt-стимулированными РВМС от здоровых тестируемых субъектов был больше, чем для аллергических тестируемых субъектов (р<0,05), и эффект подавления LgsBbBI на производство IL-5 из SEA-стимулированных РВМС от здоровых тестируемых субъектов был больше, чем для аллергических пациентов (р<0,01, фигура 1).
Геномная ДНК из пробиотических бактерий ингибирует производство IL-4 и IL-5 SEA-стимулированными РВМС здоровых тестируемых субъектов в зависимости от времени и дозировки.
н
Чтобы оценить эффект ингибирующей рост бактериальной ДНК по сравнению с ДНК животных и LPS, РВМС от четырех здоровых тестируемых субъектов инкубированы с геномной ДНК из четырех штаммов пробиотических бактерий, L. GG, L. gasseri, В.b., В.1 и LgsBbBI (смесь из L-gasseri, В.b. и B.I), LPS и ДНК животных (ДНК тимуса теленка). Подавление Т2 цитокинов наблюдалось с применением тестовых наборов BDoptEIA, чтобы продемонстрировать и определить количественно производство цитокинов. Как показано на фигуре 4, ДНК из пробиотических бактерий обычно препятствует РВМС производить IL-4 и IL-5 как ответ на стимуляцию за счет SEA или Dpt. Напротив, LPS не уменьшали производство IL-4 и IL-5; аналогично ДНК, свободные от LPS тимуса теленка, не уменьшали производство IL-4 и IL-5 (данные не показаны).
Зависимый от временем эффект ингибирующей рост бактериальной ДНК на производство IL-4 и IL-5 за счет SEA-стимулированных РВМС от здоровых тестируемых субъектов
6
-1
-1
-1
o
Несколько экспериментов выполнено, чтобы определить временной профиль ответа на геномную ДНК. РВМС от здоровых доноров (n=4, в 2×10 мл) стимулированы SEA (2 мкг мл) и либо предынкубированы в течение одного, трех и шести часов с геномной ДНК из L.GG или В.b. (30 мкг мл) перед SEA стимулом, либо стимулированы одновременно с геномными ДНК. Суперантиген или геномные ДНК добавлены спустя 1, 3 и 6 часов после SEA стимула, и клеточные культуры инкубированы за периоды 24, 48 и 72 часов. Геномная ДНК из L.GG и В.b. отобраны как представитель для двух штаммов Lactobacillus и Bifidobacterium. При вышеуказанных периодах времени надосадочные жидкости без клеток собраны и после центрифугирования и стерилизации сохранены при -80°С. Измеренные концентрации IL-4 и IL-5 показали, что максимальное подавление роста наблюдалось при t часах инкубации РВМС с геномными ДНК и SEA (данные не показаны), аналогично максимальное подавление было достигнуто после инкубации в течение 24 часов. Это время использовалось для дальнейших экспериментов. Геномная ДНК из В.b. была подтверждена как более эффективный ингибитор IL-4, чем геномная ДНК из L.GG. Напротив, подтверждено, что геномная ДНК из L.GG - более эффективный ингибитор IL-5, чем геномная ДНК из В.b.
Зависимый от дозировки эффект ингибирующей рост бактериальной ДНК на производство IL-4 и IL-5 из SEA-стимулированных РВМС от здоровых тестируемых субъектов
-1
-l
-1
-1
-1
-1
Чтобы исследовать эффект ингибирующей рост бактериальной ДНК на ингибирование IL-4 и IL-5 SEA-стимулированными РВМС из здоровых тестируемых субъектов, геномная ДНК из каждого штамма введена в РВМС культуру в различных концентрациях, а именно в диапазоне от 5 до 105 мкг мл, чтобы определить, какая дозировка имеет самый большой эффект ингибирования на производство IL-4 и IL-5 (фигура 4). Этот диапазон дозировки был выбран на основе результатов тестов, описанных выше, который показал, что производство цитокинов иммунными клетками может демонстрироваться после дополнения, по крайней мере, 3 мкг мл E.coli. ДНК и оптимальной стимуляции, требуемой бактериальной ДНК в концентрации>50 мкг мл. Как показано на фигуре 4, максимальное ингибирование IL-4 и IL-5 наблюдалось, когда геномная ДНК использовалась в концентрации 75 мкг мл. Три других образца ответов цитокина могли быть ясно дифференцированы. Геномная ДНК: Все штаммы подавили производство IL-4 и IL-5 при концентрации 75 мкг мл за исключением В.b.-ДНК и L.GG-DANN, которые подавили производство IL-4 и IL-5 при концентрации 65 мкг мл.
-1
-1
-1
Все геномные ДНК подавили производство IL-4 и IL-5 до более низких установившихся уровней при добавлении в диапазоне концентрации от 5 до 45 мкг мл. В отличие от этого все геномные ДНК показали зависимую от дозировки интенсификацию производства IL-4 и IL-5, когда они использовались в диапазоне концентрации от 85 до 105 мкг мл. По сравнению с другими геномными ДНК, В.b и L.GG ДНК очевидно более эффективные ингибиторы производства IL-4 и IL-5 в ответ на SEA-стимулирование. Кроме того, геномная ДНК из В.b. показала самое низкое ингибирующее влияние на производство IL-5 при концентрации 105 мкг мл.
Ингибирующий рост эффект геномной ДНК из пробиотических бактерий на производство IL-4 и IL-5 SEA-стимулированными РВМС из аллергических тестируемых субъектов
6
-1
-1
Чтобы исследовать ингибирующий рост эффект геномной ДНК из пробиотических бактерий, РВМС (2×10 мл) при 75 мкг мл, из L.GG ДНК, Bi ДНК и LgsBbBI, ДНК инкубирована в течение 24 часов. Три других образца ингибирования производства IL-4 как ответ на SEA-стимуляцию могли быть ясно отличимы: геномные ДНК из L.GG и LgsBbBI показали самый сильный эффект ингибирования, а именно 37,4%±4% и 39,56%±5,1%, соответственно. L.gasseri ДНК показал самый низкий эффект ингибирования (19,14%±2%) и B.b.B.I. показал подобный образец (24,47%±3,28%). Наоборот L. gasseri ДНК показывает самый большой ингибирующий рост эффект на производство IL-5 как ответ на SEA-стимуляцию (61,41%±3,74%), ДНК LgsBbBI показал самое низкое подавление (46,31%±4%) и геномная ДНК из L. GG, В.b. и В.i показали идентичный образец подавления (данные не показаны). Кроме того, мы сравнили ингибирующий эффект геномных ДНК с живыми бактериями, так же как эффект подавления геномной ДНК на производство IL-4 и IL-5 как ответ на SEA стимуляцию между здоровыми и аллергическими тестируемыми субъектами. Ингибирующий рост эффект живых бактерий на производство IL-4 здоровыми и аллергическими тестируемыми субъектами выше, чем влияние их геномной ДНК. В отличие от этого, ингибирующий рост эффект геномной ДНК в аллергических тестируемых субъектах больше, чем в здоровых тестируемых субъектах (за исключением L. gasseri). Следовательно, геномные ДНК более эффективны в сокращении производства IL-4 как ответ на SEA возбуждение в аллергических тестируемых субъектах.
Сказать кратко, ингибирующий рост эффект живых бактерий на производство IL-5 как ответ на SEA возбуждение в РВМС от здоровых и аллергических пациентов тот же самый, что и эффект на производство IL-4 (например, ингибирующий эффект живых бактерий был выше, чем их геномной ДНК и в здоровых, и в аллергических тестируемых субъектах). Но ингибирующий рост эффект геномных ДНК на производство IL-5 в здоровых донорах был больше, чем для аллергических тестируемых субъектов. Следовательно, геномные ДНК более эффективные ингибиторы для IL-5 в здоровых донорах. Относительно возбуждения Dpt, ингибирующий эффект геномной ДНК из L. GG и LgsBbBI на производство IL-4 Dpt-стимулированными РВМС из аллергических тестируемых субъектов был больше, чем в случае здоровых тестируемых субъектов (р>0,05). Подобный образец был получен для геномной ДНК из L. gasseri B.b. и B.I. Кроме того, эффект ингибирования геномной ДНК из L. gasseri, В.b. В.1 и LgsBbBI на производство IL-5 из Dpt-стимулированных РВМС от здоровых тестируемых субъектов был больше, чем в случае аллергических тестируемых субъектов. Но ингибирующий рост эффект L.GG ДНК на производство IL-5 в здоровых тестируемых субъектах был тем же самым, что для аллергических тестируемых субъектов. Следовательно, геномная ДНК из L.GG может модулировать производство IL-5 Dpt-стимулированных РВМС от здоровых и аллергических тестируемых субъектов тем же способом.
Обсуждение
н
н
н
н
н
н
н
н
н
н
н
н
н
Аллергии - сверхчувствительные реакции иммунной системой на специфические вещества, названные аллергенами (такие как пыльца, яды насекомых, фармацевтические препараты или пища). Некоторые экспериментальные исследования показывают, что аллергические болезни могут быть связаны с нарушением баланса Т1/Т2 цитокинов с относительным превосходством Т2 цитокинов и нехваткой Т1 цитокинов. Фактически, IL-4, IL-5, IL-3 и IL-9 вовлечены в запуск и поддержание аллергических реакций. Предполагается, что Т2 цитокины, предпочтительно, вовлечены в аллергические болезни, потому что сдвиг иммунного ответа Т2 к Т1 в значительной степени очевиден в большинстве типов аллергических заболеваний. Обнадеживающие результаты, полученные при лечении аллергических пациентов пробиотическими бактериями, побудили нас объяснить взаимодействие между Т1/Т2 цитокинами и аллергиями. Следовательно, одна стратегия в терапии аллергий состоит в том, чтобы изменить Т1/Т2 баланс назначением пробиотических бактерий для восстановления Т1/Т2 баланса. Особенно интересны результаты относительно способности живых или убитых пробиотических бактерий значительно уменьшать количество IL-4 и увеличивать количества SFN-γ цитокинов.
н
н
н
н
н
Кроме того, настоящее исследование доказало, что защитный эффект пробиотических бактерий мог быть связан с освобождением растворимых факторов, которые изменяют проходимость эпителия и защищают против патогенных бактериальных вторжений. Эти данные поднимают вопрос, мог ли этот растворимый фактор или другие цитоплазматические бактериальные компоненты, такие как ДНК, быть вовлечен в запуск и модуляцию цитокинов. С этой точки зрения мы исследовали эффект живых бактерий и чистой геномной ДНК из штаммов L.GG L. gasseri, В.b., В.I и LgasBbBI (смесь В L-gasseri. b. и В.1) на освобождение цитокинов IL-4 и IL-5, используя модели человеческой культуры. Результаты показывают, что различные штаммы пробиотичских бактерий, так же как их геномная ДНК, вызывают существенные изменения в профиле цитокинов, которые активно выделяются in vitro из SEA или Dpt-стимулированных РВМС. Кроме того, они могут модулировать Т1/Т2 баланс, уменьшая производство Т2 цитокинов и увеличивая производство Т1 цитокинов. Следовательно, такие пробиотические бактерии могут проявлять полезный эффект при аллергических заболеваниях в результате их эффекта ингибирования на производство Т2 цитокинов.
н
н
н
н
7
-1
Чтобы исследовать этот эффект, мы сначала стимулировали РВМС от здоровых и аллергических тестируемых субъектов с SEA или Dpt (как производящая Т2 цитокин клеточная модель). Многочисленные исследователи сообщали, что РВМС выделяют Т2 цитокины после возбуждения суперантигенами. Когда в этом исследовании SEA или Dpt, стимулированные РВМС, были предынкубированы с живыми пробиотическими бактериями и их геномной ДНК, производство Т2 цитокинов было сокращено, но не в присутствии Е. coli. Кроме того, этот эффект ингибирования зависел от дозы так, что при концентрации 2×10 CFU мл  (соответствие отношению 10:1 бактериальный к РВМС), эффект ингибирования живых бактерий достигал максимума относительно производства IL-4 и IL-5. О таком зависимом от дозировки эффекте также сообщается in vitro для производства IL-10 и IL-12 моноцитами из здоровых тестируемых субъектов после инкубации с некоторыми штаммами грамположительных бактерий. Это исследование также показало, что не только живые пробиотические бактерии, но также и их геномная ДНК может ингибировать производство IL-4 и IL-5 SEA- или Dpt стимулированными РВМС. Самый важный пункт этого исследования то, что, во-первых, оно представляет выгодный эффект геномной ДНК или пробиотических бактерий на клетках аллергических пациентов, которые чувствительны к клещам домашней пыли; то есть микроскопическим организмам, которые найдены в домах. Они - главная причина аллергий от пыли. Все другие сообщения только связаны с выгодными эффектами живых или убитых пробиотических бактерий на аллергические заболевания, вызванные пищевыми аллергиями или аэроаллергенами. Наши данные предполагают, что пробиотические бактерии и их геномная ДНК действуют прямым или косвенным регулированием сигнального пути, который требуется для подавления Т2 цитокинов, потому что эффект ингибирования наблюдался, даже когда пробиотические бактерии и их геномная ДНК добавлялись до или одновременно (для геномной ДНК) с SEA - или Dpt стимулированием. Некоторые экспериментальные исследования указывают, что модуляция производства IL-4 и IL-5 - многофакторный процесс, и некоторые цитокины, такие как IFN-γ описаны как возможные регуляторы производства IL-4. Кроме того, сообщается, что IL-12 - выдающийся цитокин в вызове производства IFN-γ человеческими РВМС. В нашем исследовании пробиотические бактерии и их геномная ДНК способны к увеличению производства IL-12 РВМС (данные не показаны).
В этом отношении, бактериальная ДНК была добавлена к SEA стимулированной культуре РВМС и, интересно, что этот эксперимент показал многообразное производство IL-4 и IL-5 цитокинов после возбуждения бактериальной ДНК и SEA обработки. Бактериальная ДНК из пробиотических бактерий уменьшала секрецию IL-5 намного больше, чем из IL-4. Наши данные указывают, что геномная ДНК из пробиотических бактерий может действовать как ингибитор производства IL-4а и IL-5 SEA- и Dpt-стимулированных РВМС из здоровых и аллергических тестируемых субъектов. Кроме того, настоящее исследование сообщает, что убитые высокой температурой пробиотические бактерии уменьшают производство IL-4 и IL-5 SEA стимулированных РВМС. Принимая во внимание, что процесс получения, желудочно-кишечный тракт и высокие температуры (70°С) влияют на жизнеспособность бактерий, результаты этих исследований показывают возможный эффект ингибирования геномной DANN, которая реализуется убитыми высокой температурой бактериями и добавлена к РВМС. Различные статьи описывают ответ различных цитокинов на CPG мотивы, которые присутствуют в бактериальной ДНК, такой как геномная ДНК из L.GG. Было бы интересно узнать, имеет ли определенное для штамма высвобождение цитокинов, которое продемонстрировано в этом исследовании, отношение к геномной последовательности и CPG мотивам каждого штамма.
Насколько мы знаем, это сообщение - первое, которое показывает эффекты иммуномодуляции геномных ДНК пробиотических бактерий из SEA- или Dpt стимулированных РВМС из здоровых и аллергических тестируемых субъектов.
Наблюдаемые различия в скорости и величине ингибирования IL-4 и IL-5 как ответ на бактериальные ДНК и SEA- или Dpt возбуждение - интересная информация о влиянии живых или убитых пробиотических бактерий и/или бактериальных компонентов на иммунный ответ. Растущие знания о пробиотиках являются захватывающими, но в ближайшем будущем должно быть установлено, какая пробиотическая ДНК (индивидуальные штаммы или комбинация) имеет самый сильный эффект на специфические болезни. Далее требуется, чтобы хорошо организованные выборочные клинические испытания определили роль геномной ДНК из пробиотических бактерий в качестве профилактических и терапевтических агентов в будущем.
Дальнейшие детали и признаки изобретения объясняются детально ниже в отношении примеров с результатами ряда экспериментов. Однако они не предназначены для ограничения изобретения, а только для его объяснения. В схематическом виде
Фигура 1
Модуляция цитокина РВМС без (среда) или со стимуляцией SEA и Dpt
Фигура 2
Зависимый от дозировки эффект ингибирования живых пробиотических бактерий на
производство IL-4 (А), IL-5 (В) и (IFN-γ) SEA стимуляцией РВМС здоровых тестируемых субъектов.
Фигура 3
Аннулирована
Фигура 4
Ингибирующий рост эффект геномной ДНК из пробиотических бактерий на производство IL-4, IL-5 и IFN-γ SEA- или Dpt-стимулированными РВМС от здорового (А, n=5) и аллергического (В, n=5) тестируемых субъектов.
Фигура 5
Зависимый от дозировки ингибирующий рост эффект геномной ДНК на производство IL-4 (А), IL-5 (В) и IFN-γ (С) РВМС клетками от здоровых тестируемых субъектов.
Детально фигуры показывают:
Фигура 1
Модуляция цитокина РВМС без (среды) или со стимуляцией SEA и Dpt.
5
-1
-1
РВМС от здорового (А, n=8) и аллергического (В, n=8) тестируемого субъекта были предынкубированы в течение 3 часов (в 2×10 клетки/мл) со средой без (РВМС) или с четырьмя штаммами пробиотических бактерий, LgB.b. В.1 (смесь пробиотических бактерий и грамотрицательных бактерий контроля (E-coli TG1) при отношении бактерии-клетки 10:1 перед стимуляцией с SEA-суперантигеном (2 мкг мл), Dpt (2 мкг мл) или нет.
н
н
IL-4, IL-5 и IFN-γ были определены количественно после часов инкубации в надосадочных жидкостях определенным исследованием ELISA. Звездочки указывают специфическую супрессию или стимуляцию (*р<0,05, **р<0,01) производства Т1 и Т2 цитокинов по сравнению с контролем.
Фигура 2
6
1
4
5
6
7
7
-1
Зависимый от дозировки эффект ингибирования живых пробиотических бактерий на производство IL-4 (А), IL-5 (В) и (IFN-γ) SEA- стимуляцией РВМС здоровых тестируемых субъектов. РВМС из четырех здоровых доноров (2×10 клеток мл-) были культивированы с четырьмя штаммами пробиотических бактерий, L. GG, L. gasseri, B.b., B.I. в концентрациях 5×10, 5×10, 2×106, 5×10, 2×10, 5×10, соответствующих 0,025, 0,25, 1, 2,5, 5, 10 и 25 отношениям бактерии-к-клеткам в течение 3 часов перед стимуляцией с 2 мкг мл SEA. После 48 часовой инкубации IL-4, IL-5 и IFN-γ были измерены определенным ELISA. Строка сообщений об ошибках показывает стандартные ошибки средних значений.
Фигура 3 аннулирована.
Фигура 4
6
-1
-1
-1
-1
-1
-1
Ингибирующий рост эффект геномной ДНК из пробиотических бактерий на производство IL-4, IL-5 и IFN-γ SEA- или Dpt стимулированными РВМС от здоровых (А, n=5) и аллергических (В, n=5) тестируемых субъектов. РВМС от пяти здоровых и пяти аллергических тестируемых субъектов культивированы в течение 48 часов (при 2×10 клетки мл) с геномной ДНК из 4 штаммов пробиотических бактерий, L.GG, L. gasseri, B.b., B.I. и LgBbBI (смесь L. gasseri, B.b и B.I). При концентрации 75 мкг мл перед стимуляцией с SEA (2 мкг мл) или Dpt (2000 SQ -EML соответствующее введению 2 мкг на мл). Среда и LPS (100 нг мл) использовались как контроль. IL-4, IL-5 и IFN-γ были определены количественно после 24 часовой инкубации в надосадочных жидкостях определенным ELISA.
Звездочки указывают выдающееся ингибирование (*р<0,05, **р<0,01) производства цитокина по сравнению с контролем (среда). Данные выражены как среднее значение +/-SEM.
Фигура 5
Зависимый от дозировки ингибирующий рост эффект геномной ДНК на производство IL-4 (A), IL-5 (В) и IFN-γ (C) PBMC от здоровых тестируемых субъектов.
-1
РВМС от 4 здоровых доноров культивированы с различными концентрациями (5-105 мг мл) бактериальной геномной ДНК. Производство IL-4 (А) и IL-5 (В) измерено после 24 часовой инкубации. Данные выражены как среднее значение +/-SEM.