СПОСОБ КОРРЕКЦИИ НАРУШЕНИЙ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ТРОМБОЦИТОВ
METHOD FOR CORRECTION OF DISTURBED FUNCTIONAL ACTIVITY OF PLATELETS

Изобретение относится к области медицины, в частности к фармакологии, и может быть использовано для профилактики тромбогеморрагических нарушений в системе гемостаза.
Одним из ключевых механизмов гемостаза является сбалансированная функциональная активность тромбоцитов, где повышение их агрегационной способности может спровоцировать усиление тромбообразования, а снижение - развитие геморрагического синдрома в органах (Баркаган З.С., Момонт А.П. Диагностика и контролируемая терапия нарушений гемостаза. Издание 2-е дополненное. М.: Ньюдиамед, 2001, 296 с.). Многочисленными экспериментальными и клиническими работами доказано, что повышенная способность тромбоцитов к агрегации сопровождает течение ряда тяжелых патологических состояний: инфаркт миокарда, нарушения мозгового кровообращения, сахарный диабет, гипертоническая болезнь и др. Известно, что при прогрессировании вышеуказанных заболеваний нарастает гиперкоагуляция крови и депрессия фибринолиза. В терапии и профилактике заболеваний и состояний, сопровождающихся гиперагрегацией тромбоцитов, в настоящее время широко используют антиагреганты: пентоксифиллин (трентал); тиклопедин (тиклид), ацетилсалициловая кислота и др., недостатком которых являются геморрагические осложнения, тромбопения, лейкопения, агранулоцитоз, выраженные аллергические реакции, а также невозможность использования этих препаратов из-за их противопоказаний при выраженном склерозе коронарных сосудов и сосудов мозга, при обострении язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, заболеваниях печени, беременности и кормлении грудью (Белоусов Ю.Б., Леонова М.В., Белоусов Д.Ю. и др. Основы клинической фармакологии и рациональной фармакотерапии / Рук-во для практикующих врачей // Под редакцией Белоусова Ю.Б., Леоновой М.В. - М.: Бионика, 2002. - 368 с.). При их длительном применении возможно развитие также толерантности к препаратам с активацией процессов тромбообразования (Chen W., Lee P., Ng W. et al. Aspirin resistance is associated with a high incidence ofmyonecrosis after non-urgent percutaneous coronary intervention despite clopidogrel pretreatment // J. Am. Coll. Cardiol. - 2004. - Vol.43. - P.1122-1126) (Dalen J.E. Aspirin Resistance: Is it Real? Is it Clinically Significant? // Am. J. Med. - 2007. - Vol.120. - №1. - Р.1-4).
Пониженная агрегационная способность тромбоцитов, формирующаяся нередко на фоне применения препаратов с антиагрегационной активностью, является причиной геморрагических осложнений. В практической медицине существуют способы их устранения, которые опосредованно оказывают гемостатическое действие. Так, например, использование тромбоконцентрата направлено на восполнение тромбоцитов в кровяном русле, а такие препараты, как адроксон и дицинон, обладают антигиалуронидазной активностью и способствуют стимуляции образования тромбопластина (И.Б.Михайлов. Настольная книга врача по клинической фармакологии. - Руководство для врачей. - СПб.: Издательство «Фолиант», 2001. - 736 с.). Однако применение этих способов оправдано при наличии клинической симптоматики геморрагического синдрома, а не для профилактики его возникновения.
Принимая во внимание вышесказанное, становится очевидным, что многие лекарственные препараты, влияющие на функциональную активность тромбоцитов, имеют однонаправленное действие. В связи с чем данное изобретение направлено на расширение арсенала препаратов, обладающих способностью регулировать агрегационные свойства тромбоцитов в зависимости от направленности нарушений в системе гемостаза, что и является задачей предлагаемого способа.
Указанный технический результат достигается тем, что мелаксен применяют в качестве корректора дезагрегационного и гиперагрегационного состояния тромбоцитов, который вводят перорально белым нелинейным половозрелым крысам в дозе 1 мг/кг один раз в сутки курсом 7 дней.
Отличительной особенностью предлагаемого способа является то, что авторы впервые для коррекции дезагрегационного и гиперагрегационного состояния тромбоцитов, возникающих в условиях «аспириновой» модели гипоагрегации, а также усиления хлористым кальцием их функциональной деятельности (модель гиперагрегации), используют мелаксен в соответствующих пределах дозировки, определив степень эффективности каждой из доз в эксперименте.
Предлагаемый способ позволяет исключить полную блокаду процесса агрегации тромбоцитов, который является физиологическим в организме и необходимым для сохранения баланса во всех звеньях гемостаза. Кроме того, принимая во внимание особенности выбранной модели - «аспириновая» гипоагрегация, можно прогнозировать успех профилактики геморрагических осложнений на фоне применения ацетилсалициловой кислоты.
Способ осуществляли следующим образом: для исследования использовали белых нелинейных крыс обоих полов в возрасте 5-7 месяцев. В каждой серии животных разбивали на следующие группы (n=8): 1-я группа получала в качестве «плацебо» эквивалентный объем 0,9% раствора натрия хлорида (контроль 1); 2-я группа представлена животными с моделью «аспириновой» гипоагрегации, индуцированной пероральным введением ацетилсалициловой кислоты в дозе 20 мг/кг (контроль 2); 3-я и 4-я группы - животные получали мелаксен в дозах 1 мг/кг и 10 мг/кг соответственно (контроль 3 и 4); 5-я - сформирована из животных с моделью гиперагрегации, индуцированной внутрибрюшинным введением 0,1 мл 10% раствора кальция хлорида на 1 мл 0,9% раствора натрия хлорида (контроль 5); 6-я и 7-я - животные получали в условиях «аспириновой» гипоагрегации мелаксен в дозах 1 мг/кг и 10 мг/кг соответственно (опыт).
Функциональную активность тромбоцитов оценивали на основании агрегационной активности одного тромбоцита (ААТ) в максимальной (-2) и минимальной (-6) дозе гемолизата как индуктора АДФ-агрегации тромбоцитов и индекса активации тромбоцитов (ИАТ), полученных в процессе проведения гемолизат-агрегационного теста (ГАТ) по методу Л.З.Баркагана и соавт. (Баркаган Л.З., Архипова Б.Ф., Куческого В.М. Медицинские лабораторные технологии и диагностика: Справочник. Медицинские лабораторные технологии / Под редакцией А.И.Карпищенко. - Санкт-Петербург: Интермедика, 1999. - С.273-275).
Исследования во всех сериях проводили в осенне-зимний период, все животные содержались в стандартных условиях вивария при чередовании естественного и искусственного освещения для блокирования синтеза эндогенного мелатонина и влияния его на гемостаз и синхронизированы по питанию при свободном доступе к воде. По завершении экспериментов животных забивали декапитацией под хлороформным наркозом.
Все манипуляции с животными проводили согласно Международным правилам GLP. Все полученные данные обработаны статистически с применением t-критерия Стьюдента с поправкой Бонферрони для множественных сравнений. Предлагаемый способ апробирован на животных на кафедре фармакогнозии, фармацевтической технологии и биотехнологии ГБОУ ВПО «Астраханская государственная медицинская академия». Ниже приводятся результаты апробации
Пример 1
Исследовали способность мелаксена в дозе 1 мг/кг сохранять агрегационные свойства тромбоцитов в условиях приема ацетилсалициловой кислоты, которая способна необратимо блокировать циклооксигеназный путь синтеза тромбоксана, тем самым вызывая стойкую дезагрегацию тромбоцитов.
Эксперимент проводили по описанной ранее схеме. Животные опытной группы на фоне приема ацетилсалициловой кислоты перорально получали в течение 7 суток мелаксен 1 раз в сутки в дозе 1 мг/кг. Полученные результаты отражены в таблице 1.
Как показано в таблице 1, введение ацетилсалициловой кислоты не сопровождалось достоверным снижением количества тромбоцитов в контрольной группе 2, но при этом их агрегационная активность была полностью «заблокирована», что проявлялось снижением показателей, отражающих агрегационную активность одного тромбоцита (ААТ) в максимальной (-2) и минимальной (-6) дозе гемолизата как индуктора АДФ-агрегации тромбоцитов, а также индекса активации тромбоцитов. В контрольной группе 3 происходило достоверное снижение количества тромбоцитов относительно контроля 1, однако уровень активных тромбоцитов (ИАТ) не изменялся. В опытной группе количество тромбоцитов достоверно увеличилось только относительно третьей и второй групп. Под влиянием мелаксена в дозе 1 мг/кг дезагрегационное действие ацетилсалициловой кислоты достоверно нивелировалось, так как агрегация тромбоцитов происходила под влиянием как высоких, так и низких доз АДФ, а также уровень активных тромбоцитов достоверно увеличивался относительно всех контрольных групп.
Пример 2
Исследовали способность мелаксена в дозе 10 мг/кг сохранять агрегационные свойства тромбоцитов в условиях приема ацетилсалициловой кислоты, которая способна необратимо блокировать циклооксигеназный путь синтеза тромбоксана, тем самым вызывая стойкую дезагрегацию тромбоцитов.
Эксперимент проводили по описанной ранее схеме. Животные опытной группы на фоне приема ацетилсалициловой кислоты перорально получали в течение 7 суток мелаксен 1 раз в сутки в дозе 10 мг/кг. Полученные результаты отражены в таблице 2.
Как показано в таблице 2, применение мелаксена в дозе 10 мг/кг не сопровождалось значимыми изменениями количества тромбоцитов, но при этом их агрегационная способность под влиянием ацетилсалициловой кислоты сохранялась. Это следует из того, что показатели функциональной активности в опытной группе достоверно приближались к контрольным значениям первой и четвертой групп и уровень активных тромбоцитов возрастал практически в 1,5 раза.
Пример 3
Исследовали способность мелаксена в дозе 1 мг/кг подавлять функциональную активность тромбоцитов в условиях гиперагрегации тромбоцитов под влиянием кальция хлорида.
Эксперимент проводили по описанной ранее схеме. Животные опытной группы на фоне внутрибрюшинного введения 0,1 мл 10% раствора кальция хлорида на 1 мл 0,9% раствора натрия хлорида перорально получали в течение 7 суток мелаксен 1 раз в сутки в дозе 1 мг/кг. Полученные результаты отражены в таблице 3.
Как показано в таблице 3, под влиянием кальция хлорида достоверно увеличивалась агрегационная активность тромбоцитов (ААТ) независимо от дозы индуктора, что, вероятно, обусловлено увеличением притока ионов Са++ в тромбоциты, при этом количество их активных форм не изменялось (ИАТ). У животных опытной группы под влиянием мелаксена на фоне достоверного повышения количества тромбоцитов и увеличения активных форм их агрегационная способность достоверно снижалась до контрольных значений первой группы под влиянием высоких доз АДФ.
Пример 4
Исследовали способность мелаксена в дозе 10 мг/кг подавлять функциональную активность тромбоцитов в условиях гиперагрегации под влиянием кальция хлорида.
Эксперимент проводили по описанной ранее схеме. Животные опытной группы на фоне внутрибрюшинного введения 0,1 мл 10% раствора хлорида кальция на 1 мл 0,9% раствора натрия хлорида получали в течение 7 суток мелаксен 1 раз в сутки в дозе 10 мг/кг. Полученные результаты отражены в таблице 4.
Как показано в таблице 4, количество тромбоцитов в опытной группе не изменялось, но при этом их агрегационная активность под влиянием минимальных доз АДФ относительно контроля 1 и 5 (р<0,05), а под влиянием максимальных только в сравнении с контролем 1 (р<0,01) достоверно увеличивалась. Индекс активации тромбоцитов во всех группах не изменялся.
Анализ результатов, отраженных в приведенных примерах, показывает, что мелаксен в дозе 1 мг/кг массы тела обладает корригирующей способностью в отношении функциональной активности тромбоцитов в зависимости от направленности изменения. Так, при введении данного препарата в условиях «аспириновой» гипоагрегации дезагрегационный эффект ацетилсалициловой кислоты нивелируется практически до фоновых показателей, при этом в условиях гиперагрегации мелаксен снижает агрегационную активность тромбоцитов также до контрольных значений.
Предлагаемым способом достигается коррекционная эффективность функциональных нарушений агрегационной способности тромбоцитов, возникающих на фоне развития дезагрегации, вызванной применением ацетилсалициловой кислоты, и гиперагрегации под влиянием кальция хлорида.
Высокая эффективность предлагаемого способа заключается в том, что мелаксен применяют в качестве корректора дезагрегационного и гиперагрегационного состояния тромбоцитов и при его введении в дозе 1 мг/кг одновременно с веществом, способным вызвать резкое снижение агрегационной активности тромбоцитов как причины развития геморрагических кровотечений, он сохраняет физиологический потенциал тромбоцитов к процессам агрегации, тогда как в условиях гиперагрегации -снижает их функциональную активность.
Таблица 1
Влияние мелаксена в дозе 1 мг/кг на функциональную активность тромбоцитов в условиях «аспириновой» гипоагрегации
Показатели ГАТ группы животных
Количество тромбоцитов (M±m, x 10<sup>12</sup>/л)
ААТ(-2) (M±m, %)
ААТ(-6) (M±m, %)
ИАТ (M±m)
Контроль 1: физ.раствор (n=8)
852,0±53,1
150,6±18,2
308,0±22,7
2,6±0,31
Контроль 2: Ацетилсалицилов. кислота (20 мг/кг) (n=8)
766,0±49,5
0***
0***
0***
Контроль 3: Мелаксен (1 мг/кг) (n=8)
720±21,8*
171,0±28,1
294,5±30,5
2,3±0,31
Опыт: ацетилсалициловая  кислота (20 мг/кг) +Мелаксен (1 мг/кг) (n=8)
1007,2±7,1<sup>◇◇◇#</sup>
72,0±12,0<sup>###</sup>
275,9±36,7<sup>###</sup>
4,6×0,6<sup>**###◇◇</sup>
Примечание:
* - р<0,05 в сравнении с контролем 1;
** - р<0,01;
*** - р<0,001;
# - р<0,05 в сравнении с контролем 2;
## - р<0,01;
### - р<0,001;
◇ - р<0,05 в сравнении с контролем 3;
◇◇ - р<0,01;
◇◇◇ - р<0,001;
ГАТ - гемолизат-агрегационный тест;
ААТ(-2) - агрегационная активность тромбоцита под максимальной дозой АДФ;
ААТ(-6) - агрегационная активность тромбоцита под минимальной дозой АДФ;
ИАТ - индекс активации тромбоцитов.
Таблица 2
Влияние мелаксена в дозе 10 мг/кг на функциональную активность тромбоцитов в условиях «аспириновой» гипоагрегации
Показатели ГАТ группы животных
Количество тромбоцитов (M±m, x 10<sup>12</sup>/л)
AAT(-2) (M±m, %)
AAT(-6) (M±m, %)
ИАТ (M±m)
Контроль 1: физ.раствор (n=8)
852,0±53,1
150,6±18,2
308,0±22,7
2,6±0,31
Контроль 2: Ацетилсалицилов. кислота (20 мг/кг) (n=8)
766,0±49,5
0***
0***
0***
Контроль 4: Мелаксен (10 мг/кг) (n=8)
810,0±45,6
179,4±26,4
298,2±24,9
2,5±0,27
Опыт: Ацетилсалициловая кислота (20 мг/кг) +Мелаксен (10 мг/кг) (n=8)
978,6±61,6
159,5±19,2<sup>###</sup>
351,0±24,1<sup>###</sup>
4,0±0,16<sup>**###◇◇</sup>
Примечание:
* - р<0,05 в сравнении с контролем 1;
** - р<0,01;
*** - р<0,001;
# - р<0,05 в сравнении с контролем 2;
## - р<0,01;
М# - р<0,001 ;
◇ - р<0,05 в сравнении с контролем 3;
◇◇ - р<0,01;
◇◇◇ - p<0,001;
ГАТ - гемолизат-агрегационный тест;
ААТ(-2) - агрегационная активность тромбоцита под максимальной дозой АДФ;
AAT (-6) - агрегационная активность тромбоцита под минимальной дозой АДФ;
ИАТ - индекс активации тромбоцитов.
Таблица 3
Влияние мелаксена в дозе 1 мг/кг на функциональную активность тромбоцитов при повышенной их агрегационной способности под влиянием хлорида кальция
Показатели ГАТ группы животных
Количество тромбоцитов (M±m, x 10<sup>12</sup>/л)
AAT(-2) (M±m, %)
AAT(-6) (M±m, %)
ИАТ (M±m)
Контроль 1: физ.раствор (n=8)
852,0±53,1
150,6±18,2
308,0±22,7
2,6±0,31
Контроль 5: хлористый кальций (0,1 мл 10% раствора) (n=8)
904,6±67,3
236,3±24,1**
421,6±19,9**
2,3±0,12
Контроль 3: Мелаксен (1 мг/кг) (n=8)
720,0±21,8
171,0±28,1
294,5±30,5
2,3±0,31
Опыт: хлористый кальций (0,1 мл 10% раствора) +мелаксен (1 мг/кг) (n=8)
1091,0±13,6
170,1±19,0<sup>#</sup>
385,7±14,8
3,1±0,17<sup>###</sup>
Примечание:
* - р<0,05 в сравнении с контролем 1;
** - р<0,01;
*** - р<0,001;
# - р<0,05 в сравнении с контролем 2;
## - р<0,01;
М# - р<0,001 ;
◇ - р<0,05 в сравнении с контролем 3;
◇◇ - р<0,01;
◇◇◇ - p<0,001;
ГАТ - гемолизат-агрегационный тест;
ААТ(-2) - агрегационная активность тромбоцита под максимальной дозой АДФ;
AAT (-6) - агрегационная активность тромбоцита под минимальной дозой АДФ;
ИАТ - индекс активации тромбоцитов.
Таблица 4
Влияние мелаксена в дозе 10 мг/кг на функциональную активность тромбоцитов при повышенной их агрегационной способности под влиянием хлорида кальция
Показатели ГАТ группы животных
Количество тромбоцитов (M±m, x 10<sup>12</sup>/л)
AAT(-2) (M±m, %)
AAT(-6) (M±m, %)
ИАТ (M±m)
Контроль 1: физ.раствор (n=8)
852,0±53,1
150,6±18,2
308,0±22,7
2,6±0,31
Контроль 5: Хлористый кальций (0,1 мл 10% раствора) (n=8)
904,6±67,3
236,3±24,1**
421,6±19,9**
2,3±0,12
Контроль 3: Мелаксен (10 мг/кг) (n=8)
810,0±45,6
179,4±26,4
298,2±24,9
2,5±0,27
Опыт: Хлористый кальций (0,1 мл 10% раствора) +мелаксен (10 мг/кг) (n=8)
888,0±55,2
238,1±17,3**
487,3±16,4*<sup>#</sup>
2,1±0,19
Примечание:
* - р<0,05 в сравнении с контролем 1;
** - р<0,01;
*** - р<0,001;
# - р<0,05 в сравнении с контролем 2;
## - р<0,01;
М# - р<0,001;
◇ - р<0,05 в сравнении с контролем 3;
◇◇ - р<0,01;
◇◇◇ - p<0,001;
ГАТ - гемолизат-агрегационный тест;
ААТ(-2) - агрегационная активность тромбоцита под максимальной дозой АДФ;
AAT (-6) - агрегационная активность тромбоцита под минимальной дозой АДФ;
ИАТ - индекс активации тромбоцитов.