Пробиотик на основе штамма бактерий Bacillus subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 и способ применения пробиотика для профилактики желудочно- кишечных заболеваний у сельскохозяйственных животных и птиц
PROBIOTIC BASED ON BACTERIAL STRAIN BACILLUS SUBTILIS MG-8 VKPM V-12476 AND METHOD OF APPLICATION PROBIOTIC FOR PREVENTION OF GASTROINTESTINAL DISEASES IN AGRICULTURAL ANIMALS AND POULTRY

Предлагаемое изобретение относится к области удовлетворения жизненных потребностей человека, а именно - к микробиологии и биотехнологиям применительно к животноводству. Может быть использовано в биотехнологиях промышленного производства средств профилактики желудочно-кишечных инфекций и растройств у сельскохозяйственных животных и птиц.
Пробиотики и пребиотики - определение, общая характеристика.
Согласно ВОЗ, пробиотики - это непатогенные для человека и животных микроорганизмы, способные восстанавливать нормальную микрофлору органов, а также губительно воздействовать на патогенные и условно-патогенные бактерии. Иными словами, пробиотиками называют микробы, которые в норме составляют микрофлору различных органов человека и животных. Пребиотиками, согласно определению ВОЗ, называют вещества, которые не всасываются в тонкой кишке, но создают благоприятные условия и стимулируют рост нормальной микрофлоры толстого кишечника [http://www.tiensmed.ru/news/probiotik-prebiotik-ab1.html].
Препараты-пробиотики на основе спорообразующих бактерий применяют в ветеринарии в качестве кормовой добавки для сельскохозяйственных животных и птиц. Инфекционные заболевания людей и сельскохозяйственных животных лечат антибиотиками. Проблемы применения антибиотиков заключаются в возникновении устойчивости у энтеропатогенных микроорганизмов к данным антибиотикам, а также в возникновении дисбактериоза и расстройств желудочно-кишечного тракта (далее - ЖКТ). Также известно, что микромицеты родов Fusarium и Alternaria, являющиеся распространенными фитопатогенами сельскохозяйственных культур, способны синтезировать широкий спектр микотоксинов (выделяемых грибами ядовитых веществ). Растительные корма, зараженные спорами грибов родов Fusarium и Alternaria способны вызывать отравления и стать причиной микотоксикозов сельскохозяйтвенных животных. Во избежание ведущего к существенным убыткам у фермеров микотоксикозов и дисбактериоза, актуальным является совместное применение пробиотиков на основе бактерий-антагонистов фитопатогенных грибов и бактерий кишечной группы. Эти пробиотики используют и при лечении животных, птиц с применением антибиотиков - в качестве средства антибиотикотерапии.
Из исследованного уровня техники известно изобретение по патенту РФ №2509149 штамм Bacillus subtilis subsp. subtilis BKM в-2711D, обладающий выраженным антагонизмом по отношению к Escherichia coli, Salmonella typhi, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes и резистентностью к стрептомицину и тетрациклину, сущностью является «Штамм Bacillus subtilis BKM В-2711D обладающий выраженным антагонизмом по отношению к Escherichia coli, Salmonella typhi, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes и резистентностью к стрептомицину и тетрациклину». Штамм может быть использован в микробиологической промышленности для получения пробиотического препарата, применяемого в ветеринарии при лечении и профилактике желудочно-кишечных заболеваний сельскохозяйственных животных и птиц.
Недостатком известного технического решения по патенту РФ №2509149 является отсутствие бактерицидной (антибактериальной) активности в отношении распространенных условно-патогенных штаммов бактерий, например - Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium, Proteus mirabilis, т.к. известное техническое решение не предназначено для подавления активности указанных микроорганизмов, что ограничивает область применения известного технического решения.
Из исследованного уровня техники известно изобретение по патенту РФ №2130316 «Лечебно-профилактический биопрепарат "Бактиспорин», сущностью является биопрепарат, включающий биомассу штамма Bacillus subtilis 3Н (ГИСК №248), отличающийся тем, что он дополнительно содержит наполнитель при следующем соотношении компонентов, масс. %:
9
1) Биомасса штамма Bacillus subtilis 3Н (ГИСК N 248) - живых микробных клеток (1…5)⋅10 в 1 мл растворителя - 92…95;
2) наполнитель - 5…8.
Штамм Bacillus subtilis 3Н характеризуется антагонистической активностью в отношении широкого спектра патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, а именно - Staphylococcus aureus, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Escherichia coli, Candida albicans, устойчивостью к ряду антибиотиков, а именно - полимиксину, рифампицину, пенициллину, линкомицину, стрептомицину. В препарате наполнитель содержит 5% лактозы или 8% сахарозожелатиновой смеси.
В качестве основы биопрепарата бактиспорин используют штамм Bacillus subtilis 3Н по патенту РФ №2067616 «Штамм бактерий Bacillus subtilis, несущий свойство антибиотикорезистентности, используемый для получения препарата Бактиспорин» депонированный в коллекции ФГБУ "Государственный НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов имени Л.А. Тарасевича" Минздрава РФ под №248.
Недостатком известного технического решения по патенту РФ №2067616 является отсутствие у штамма бактерицидной (антибактериальной) активности в отношении широко распространенных и вредоносных условно-патогенных штаммов Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium, т.к. известное техническое решение не предназначено для подавления активности указанных микроорганизмов, что ограничивает область применения известного технического решения по патенту РФ №2067616.
Наиболее близким по наибольшему количеству совпадающих признаков с заявленным техническим решением, выбранным в качестве прототипа, является изобретение по патенту РФ №2169767 «Штамм бактерий Bacillus subtilis, обладающий широким спектром антагонистической активности и устойчивостью к антибиотикам», задепонированный в ФБГУ ВГНКИ (Всероссийский государственный научно исследовательский институт контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов).
Прототип изготовлен на основе штамма бактерий Bacillus subtilis 12В-ДЕП (далее по тексту S. subtilis 12В-ДЕП), обладает антагонистической активностью по отношению к 21 видам болезнетворных бактерий, а именно - Shigella sonne 2586, Shigella HK 65, Proteus mirabilis 40, Proteus mirabilis 36, Proteus mirabilis 35, Proteus vulgaris 12, Proteus vulgaris 48, Proteus vulgaris 41, Pseudomonas aeruginosa 126, Pseudomonas aeruginosa 8, Escherihia coli 154, Escherihia coli 140, Streptococcus 321, Streptococcus 325, Streptococcus 191, Staphylococcus aureus 66, Staphylococcus aureus 67, Staphylococcus aureus 80, Paratyhv 269, Paratyhv 15, Hexaere II 1230 и антибиотикоустойчивостью к 6 видам антибиотиков, а именно - полимиксин, оксациллин, ампицилин, тобрамицин, бензилпенициллин, стрептомицин.
Недостатком прототипа по патенту РФ №2169767 является весьма ограниченная устойчивость к современным антибиотикам, полное отсутствие антагонистической активности штамма В. subtilis 12 В-ДЕП к микромицетам (грибам и грибообразным организмам микроскопических размеров) - возбудителям микотоксикозов сельскохозяйственных животных и птиц. Таким образом, прототип не способен защитить животных и птиц, в том числе - применяемых в сельскохозяйственной деятельности, от вызываемых микромицетами микотоксикозов (отравлений), т.к. штамм В. subtilis 12 В-ДЕП не продуцирует вещества с антигрибковой активностью, то есть имеет ограниченную область применения. Кроме того в описании прототипа отсутствуют способы применения пробиотика на основе штамма B. subtilis 12 В-ДЕП. В описании прототипа присутствует лишь упоминание о том, что штамм «…создает возможность конструирования на его основе препаратов-пробиотиков для сочетанного использования с антибиотиками», причем отсутствуют какие-либо из технических и технологических показателей, необходимых для конструирования и применения этих возможных препаратов-пробиотиков.
Недостаток существенно ограничивает применение прототипа по патенту РФ №2169767 в животноводстве.
Целью предполагаемого изобретения является пробиотик на основе штамма бактерии рода Bacillus вида Bacillus subtilis MG-8 ВКПМ В-12476, устойчивый к антибиотикам, обладающий широким спектром антагонистического воздействия в отношении патогенных и условно-патогенных бактерий, микромицетов и способ применения этого пробиотика для профилактики кишечных инфекций, микотоксикозов и кишечных расстройств у сельскохозяйственных животных и птиц.
Заявленные цели достигают тем, что применяют пробиотик на основе бактерии рода Bacillus вида Bacillus subtilis штамма MG-8 ВКПМ В-12476, депонированного во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ В-12476, устойчивого к антибиотикам и обладающего широким спектром антагонистического воздействия в отношении патогенных и условно-патогенных бактерий, микромицетов. Способ применения пробиотика на основе бактерии рода Bacillus вида Bacillus subtilis штамма MG-8 ВКПМ В-12476 для профилактики кишечных инфекций, микотоксикозов и кишечных расстройств у сельскохозяйственных животных заключается в получении биомассы, содержащей бактерии рода Bacillus вида Bacillus subtilis штамма MG-8 ВКПМ В-12476 и продукты метаболизма бактерий, смешивании биомассы с полнорационным комбикормом в соотношении (1,0±0,3) литра культуральной жидкости на 100 килограммов комбикорма, скармливании этого комбикорма в количестве (0,1…1,0) % от живой массы животного в течение 1…10 суток с последующим перерывом в 15…25 суток и ежемесячным повторением этого курса профилактики в течение всего периода содержания животных. Способ применения пробиотика на основе бактерии рода Bacillus вида Bacillus subtilis штамма MG-8 ВКПМ В-12476 для профилактики кишечных инфекций, микотоксикозов и кишечных расстройств у сельскохозяйственных птиц заключается в получении биомассы, содержащей бактерии рода Bacillus вида Bacillus subtilis штамма MG-8 ВКПМ В-12476 и продукты метаболизма бактерий, смешивании биомассы с полнорационным комбикормом в соотношении (1,0±0,5) литра культуральной жидкости на 100 килограммов комбикорма, скармливании этого комбикорма в количестве (1,0…2,0) % от живой массы птицы в течение всего периода содержания птицы.
Таким образом, сущностью заявленного технического решения является пробиотик на основе бактерии рода Bacillus вида Bacillus subtilis штамма MG-8 ВКПМ В-12476, обладающий широким спектром антагонистической активности по отношению к микромицетам, например - Alternaha alternate ТП 712, Alternaria solani 12РKЛ15, Alternaria tenuissima, Colletotrichum coccodes 14raKK6, Doratomyces sp. 14 raKKLD, Fusarium spp., Fusarium avenaceum, Fusarium oxysporum, Fusarium redolens, Fusarium solani и по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам, например - Salmonella typhimurium, Klebsiella oxytoca, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Proteus mirabilis. Кроме того, пробиотик по сравнению с прототипом обладает более высокой устойчивостью к антибиотикам: карбеницилин, рифампицин, неомицин, канамицин, левомицетин. Кроме того, заявленное техническое решение от прототипа отличается антагонистической активностью по отношению к микромицетам (у прототипа полностью отсутствует антагонистическая активность по отношению к микромицетам), что существенно увеличивает его конкурентоспособность на рынке как России, так и зарубежных стран.
Заявленное техническое решение иллюстрируется Таблицами 1, 2, 3, представленными на Фиг. 1, 2, 3 соответственно:
На Фиг. 1 приведена антагонистическая активность штамма B.subtilis MG-8 В-12476 в отношении микромицетов Alternaria alternate ТП 712, Alternaria solani 12РKЛ15, Alternaria tenuissima, Colletotrichum coccodes 14raKK6, Doratomyces sp. 14 raKKLD, Fusarium spp., Fusarium avenaceum, Fusarium oxysporum, Fusarium redolens, Fusarium solani - возбудителей микотоксикозов.
На Фиг. 2 приведена бактерицидная (антибактериальная) активность штамма B.subtilis MG-8 В-12476 в отношении патогенных и условно-патогенных Salmonella typhimurium, Klebsiella oxytoca, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Proteus mirabilis.
На Фиг. 3 приведена антибиотикочувствительность штамма B.subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 в отношении следующих антибиотиков: ампицилин, карбеницилин, полимиксин, стрептомицин, рифампицин, гентамицин, левомицетин, тетрациклин, неомицин, канамицин, эритромицин.
На Фиг. 4 приведена справка о депонировании штамма B.subtilis MG-8 ВКПМ В-12476.
Для получения пробиотика на первом этапе получают биомассу штамма бактерий 6. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 путем посева штамма в бульоне LB, далее выращивают эту биомассу в течение (72±24) час при температуре плюс 30±6°C с постоянным перемешиванием (200±20) об/мин) на инкубаторе-качалке (для аэрации). Продолжительность культивирования зависит от температуры и интенсивности перемешивания, при этом отклонение от оптимального значения температуры (+30°С) и интенсивности аэрации путем перемешивания (200 об/мин) увеличивает продолжительность времени культивирования. Далее культуральную жидкость, содержащую биомассу вегетативных клеток и спор S. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476, продукты метаболизма бактерии, остатки питательной среды смешивают с полнорационным комбикормом из расчета (1,0±0,3) литра культуральной жидкости на 100 килограммов комбикорма.
Техническим результатом заявленного технического решения является пробиотик на основе бактерии рода Bacillus вида Bacillus subtilis штамма MG-8 ВКПМ В-12476, устойчивый к антибиотикам и обладающий широким спектром действия в отношении патогенных и условно-патогенных бактерий, например: Salmonella typhimurium, Klebsiella oxytoca, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Proteus mirabilis, микромицетов, например: Fusarium spp., Fusarium avenaceum, Fusarium oxysporum, Fusarium redolens, Fusarium solani, Alternaria alternate ТП 712, Alternaria solani 12РKЛ15, Alternaria tenuissima, Colletotrichum coccodes 14raKK6, Doratomyces sp. 14 raKKLD и способ применения этого пробиотика для профилактики кишечных инфекций, микотоксикозов и кишечных расстройств, возникающих у сельскохозяйственных животных и птиц вследствие действия микотоксинов из-за наличия в корме микромицетов.
Технический результат достигают применением пробиотика на основе штамма бактерий Bacillus subtilis MG-8 ВКПМ В-12476, обладающего высокой антибиотикоустойчивостью, а также бактерицидной (антибактериальной), антагонистической активностью против микромицетов, патогенных и условно-патогенных (клинических) микроорганизмов, выделенных из животных с нарушениями деятельности желудочно-кишечного тракта.
Штамм бактерии рода Bacillus вида Bacillus subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 выделен из почв Республики Татарстан (Россия) и депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) ФБГУ «ГосНИИгенетика» Минобрнауки России под номером ВКПМ В-12476 [Справка №12476 о национальном патентном депонировании].
Идентификация штамма осуществлена на основании гомологии гена 16 S рРНК и гена субъединицы В (бета)- гиразы, одного из самых консервативных генов бактерий.
Штамм бактерии Bacillus subtilis MG-8 ВКПМ В-12476, используемый в качестве основы пробиотика, обладает нижеследующими основными свойствами:
Морфологические признаки: клетки палочковидные, в основном одиночные, реже соединены в короткие цепочки, грамположительные, образуют овальные споры, не превышающие диаметра клеток. Свободные споры появляются на 24…36 час роста (не более 5…7%), далее их (спор) количество нарастает и достигает максимального значения (до 70%) на 60-й час культивирования. Величина клеток односуточной культуры на бульоне Лурия-Бертони (далее по тексту - LB), следующего состава: (г/л): триптон - 10,0; дрожжевой экстракт - 5,0; NaCl - 5,0; размер клеток (1,1…2,2)×(0,5…0,6) мкм.
Культуральные признаки: при росте на агаризованной среде Лурия-Бертони (далее по тексту - LA), следующего состава: (г/л): триптон - 10,0; дрожжевой экстракт - 5,0; NaCl - 5,0; агар (2%) - 200; (через 24 часа роста при плюс 30°С) колонии имеют круглую форму, белую окраску, гладкую блестящую поверхность и слегка волнистые края; пигмент не образуют. Консистенция вязкая слизистая. На агаризованной среде LA (через 24 ч, +30°С) образует белые гладкие, блестящие колонии с неправильными круглыми краями, слизистой консистенции. Колонии дают обильный рост. При росте на LB-бульоне (24 ч, +30°С) в процессе роста среда мутнеет, появляется осадок. На поверхности образуется серовато-белая пленка.
1. Экспериментально установлено, что штамм S. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 обладает антагонистической активностью против микромицетов, продуцирующих микотоксины. Антагонистическая активность штамма 6. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 была исследована в отношении следующих микромицетов: Alternaria alternate ТП 712, Alternaria solani 12РKЛ15, Alternaria tenuissima, Colletotrichum coccodes 14raKK6, Doratomyces sp. 14 raKKLD, Fusarium spp., Fusarium avenaceum, Fusarium oxysporum, Fusarium redolens, Fusarium solani.
3
3
4
2
4
4
Исследование осуществляют известным методом блоков [Егоров, Н.С. Основы учения об антибиотиках [Текст] / Егоров, Н.С. // М: Наука, 2004. - 528 с. - ISBN: 5-211-04669-2]. Для этого на поверхность среды Чапека следующего состава: (г/л) глюкоза - 14,0; СаСО - 0,70; KNO - 0,70; MgSO - 0,35; NaCl - 0,35; KHPO - 0,35; FeSO - следы; агар - 20,00 шпателем засевают микромицеты. Чашки помещают в термостат при температуре плюс 30°C на 120…168 час (5…7 суток). Продолжительность культивирования штамма на чашке Петри зависит от температуры в диапазоне плюс (20…40)±2°C, причем чем ниже температура, тем продолжительнее культивирование. Оптимальная для культивирования температура плюс 30°С.
Кроме того, для выявления свойств штамм В. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 засевают газоном на поверхность среды LA. Посевы инкубируют в течение 24 час при температуре +30°С. Стерильным пробочным сверлом вырезают блоки микромицетов и помещают их в центр чашки Петри на среду Чапека. На расстоянии 20…25 мм от блока с микромицетом размещают 2 (два) блока с бактериями-антагонистами. В качестве контроля инкубируют чашки с микромицетами при отсутствии штамма В. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476. Культуры инкубируют при +30°C в течение 120…240 час (5…10 суток). Полученные результаты исследования Ингибирующей Способности (ИС) представлены в Таблице 1 (Фиг. 1). ИС штамма определяют величиной усредненного, например - по результатам 6-ти разнонаправленных измерений, диаметра зоны задержки роста в миллиметрах (мм) на поверхности питательной среды в чашке Петри.
Как видно из Фиг. 1 (Таблицы 1), существенным свойством заявленного штамма бактерий В. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 является высокая антагонистическая активность в отношении микромицетов - возбудителей микотоксикозов сельскохозяйственных животных и птиц, причем - при полном отсутствии антагонистической активности в отношении микромицетов у прототипа - штамма бактерий В. subtilis 12 В-ДЕП. Так, заявленный штамм бактерий В. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 проявляет высокую антагонистическую активность, например - в отношении возбудителей микотоксикозов - микромицетов Fusarium spp., Fusarium avenaceum, Fusarium oxysporum, Fusarium redolens, Fusarium solani, Alternaria alternate ТП 712, Alternaria solani 12РKЛ15, Alternaha tenuissima, Colletotrichum coccodes 14raKK6, Doratomyces sp. 14 raKKLD, тогда как у прототипа такая антагонистическая активность полностью отсутствует.
Антагонистическая активность заявленного штамма не ограничивается приведенными примерами микромицетов, ибо авторы и заявитель ограничились перечнем наиболее распространенных вредоносных микромицетов региона Среднего Поволжья России. Принимая во внимание общеизвестность отсутствия существенных отличий микромицетов региона Среднего Поволжья России от аналогичных микромицетов любых других регионов представляется возможным использование заявляемого технического решения в любых регионах с природными условиями, подобными условиям Среднего Поволжья России.
2. Культура штамма B. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 характеризуется антагонистической активностью в отношении широкого спектра патогенных и условно-патогенных микроорганизмов.
7
Для исследования бактерицидной (антибактериальной) активности используют известный диско-диффузионный метод [Егоров, Н.С. Основы учения об антибиотиках [Текст] / Егоров, Н.С. // М: Наука, 2004. - 528 с. - ISBN: 5-211-04669-2]. В качестве патогенных и условно-патогенных микроорганизмов тест-культур используют распространенные в природе микроорганизмы кишечной группы: Salmonella typhimurium, Klebsiella oxytoca, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Proteus mirabilis. На поверхность LA среды на чашке Петри наносят 0,1 мл бактериальной суспензии тестируемого патогенного и условно-патогенного микроорганизма в концентрации 1×10 колониеобразующих единиц на миллилитр (далее по тексту КОЕ/мл) среды и засевают шпателем Дригальского. Бактерии Bacillus (далее по тексту - В.) subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 культивируют на среде LB в течение 72 час при +30°С на качалке с постоянным перемешиванием при 200 оборотов в минуту (далее по тексту об/мин). Супернатант получают центрифугированием культуральной жидкости В. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 при 13000 об/мин в течение 5 мин при +4°С. Стерильные бумажные диски диаметром 6 мм пропитывают супернатантом В. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476. Пропитанные диски помещают на поверхность LA среды, засеянной тестируемыми патогенными и условно-патогенными микроорганизмами: Salmonella typhimurium, Klebsiella oxytoca, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Proteus mirabilis. Диффузия супернатанта В. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 в агар приводит к формированию зоны подавления роста исследуемых патогенных и условно-патогенных микроорганизмов: Salmonella typhimurium, Klebsiella oxytoca, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Proteus mirabilis вокруг дисков. Антагонистическую активность В. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 оценивают по величине зоны задержки роста исследуемых патогенных и условно-патогенных микроорганизмов вокруг диска, пропитанной супернатантом B. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476.
Ингибирующую Способность (ИС) штамма определяют величиной усредненного, например - по результатам 6-ти разнонаправленных измерений, диаметра зоны задержки роста в миллиметрах (мм) на поверхности питательной среды в чашке Петри. Оценку ИС заявленного штамма Bacillus subtilis MG-8 В-12476 выполняют по формуле (1)
Полученные результаты исследования представлены в Таблице №2 (Фиг. 2). Анализ указанной Таблицы 2 позволяет сделать вывод о том, что штамм В. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 проявляет высокую антагонистическую активность в отношении бактерий Escherichia coli (зона задержки роста = 14…16 мм), Pseudomonas aeruginosa (16…18 мм), в сравнении с антагонистической активностью штамма-прототипа В. subtilis 12 В-ДЕП, активного в отношении Escherichia coli 154 (зона задержки роста = 10…12 мм), Pseudomonas aeruginosa 8 (12…15 мм).
Таким образом, заявляемый штамм В. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 проявляет полностью отсутствующую у прототипа антагонистическую активность по отношению к бактериям Salmonella typhimurium (14…16 мм), Klebsiella oxytoca (12…14 мм) и более высокую, по сравнению с прототипом, антагонистическую активность в отношении бактерий Escherichia coli 154 (10…12 мм), Pseudomonas aeruginosa 8 (12…15 мм).
Антагонистическая активность заявленного штамма не ограничивается приведенными примерами условно-патогенных бактерий, ибо авторы и заявитель в примерах ограничились перечнем наиболее распространенных возбудителей кишечных расстройств животных и птиц в Российской Федерации.
3. Определение устойчивости штамма В. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 к антибиотикам изучают известным диско-диффузионным методом [Егоров, Н.С. Основы учения об антибиотиках [Текст] / Егоров, Н.С. // М: Наука, 2004. - 528 с. - ISBN: 5-211-04669-2], используя стандартные диски, пропитанные антибиотиками. С помощью шпателя Дригальского штамм В. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 засевают газоном на LA среду на чашку Петри. На поверхность LA среды, засеянной культурой В. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 раскладывают коммерческие диски с ветеринарными антибиотиками: ампицилин, карбеницилин, полимиксин, стрептомицин, рифампицин, гентамицин, левомицетин, тетрациклин, неомицин, канамицин, эритромицин. Посевы штамма бактерий 6. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 инкубируют при плюс (26…34)°С в течение 24 ч. Оптимальная температура культивирования штамма плюс 30°С. Устойчивость культуры к антибиотикам выражают в [мм] диаметра зон задержки роста. Устойчивыми к антибиотикам считают штаммы, диаметр зоны задержки роста которых составляет (0…10) мм; менее устойчивыми - (10…20) мм, неустойчивыми - (20…30) мм (Таблица 3, Фиг. 3). Из данных Таблицы 3 следует, что штамм бактерий В. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 обладает отсутствующей у прототипа абсолютной устойчивостью к антибиотику: рифампицин, и более устойчива, чем прототип, к антибиотикам карбеницилин, левомицетин, неомицин, канамицин.
3. Культура штамма проверена на безвредность (вирулентность, токсичность и токсигенность).
В, subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 является безопасным для животных, птиц и не обладает вирулентностью, токсигенностью и токсичностью по отношению к ним.
Для исследования вирулентности штамма В. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476, культуру выращивают в среде LB в течение 18 час при температуре +30°С при 200 об/мин перемешивающего питательную среду шейкера. Выросшую биомассу штамма центрифугируют при 13000 об/мин в течении 20 мин и суспензируют 0,9%-ным раствором натрия хлорида. Готовят бактериальные суспензии штамма В. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 с концентрацией клеток от 1,0 млн до 1,0 млрд в мл. Полученные суспензии вводят беспородистым белым мышам (в количестве 6 шт) массой (16±1) г для каждой концентрации клеток, двумя способами: однократно внутрибрюшинно и перорально. Контрольным вариантом служит физиологический раствор, не содержащий клеток бактерий В. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476.
Для исследования токсичности штамма В. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 культуру выращивают в бульоне LB в течение 18 ч при температуре +30°С, центрифугируют при 13000 об/мин в течении 20 мин и суспензируют 0,9%-ным раствором хлорида натрия, готовят суспензию, содержащую от 1,0 млн до 1,0 млрд клеток в 1 мл, которые затем инактивируют прогреванием в течение 90 мин при +75°С. Суспензию вводят однократно внутрибрюшинно и перорально. Контрольным вариантом служит физраствор, не содержащий клеток бактерий.
Для изучения токсигенности штамма B. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 культуру выращивают в течение 168 час (7 суток) в бульоне LB при температуре +30°C с постоянным перемешиванием (200 об/мин) на инкубаторе-качалке. Затем культуральную жидкость освобождают от бактериальных клеток центрифугированием при 13000 об/мин в течение 20 мин. Для введения мышам используют надосадочную жидкость. Контрольным вариантом служила группа мышей, получивших стерильный LB бульон.
Наблюдения за всеми группами животных проводят на протяжении 30 суток после инъекций или перорального введения. В этот период все животные оставались активными, хорошо поедали пищевые рационы, прибавляли в весе, физиологические отправления и поведенческие реакции у них не изменялись. Полученные данные свидетельствуют как о высокой эффективности, так и высокой безопасности заявленного технического решения.
Далее приведен способ получения биомассы штамма бактерий 6. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 и примеры его использования в кормлении животных и птиц.
Пример 1. Получение биомассы штамма бактерий В. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 в лаборатории.
9
Для получения биомассы с концентрацией 1×10 KOE/мл питательной среды, полученный из хранилища ВКПМ штамм бактерий В. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 выращивают в течение 72 ч (3 суток) в бульоне LB при температуре плюс 30°C с постоянным перемешиванием (200 об/мин) на инкубаторе-качалке. Полученную культуральную жидкость, содержащую биомассу вегетативных клеток и спор B. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476, а также остатки питательной среды по потребности смешивают с полнорационным комбикормом из расчета 1 литр культуральной жидкости на 100 килограммов комбикорма.
Пример 2. Получение пробиотика на основе биомассы штамма бактерий B. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 для промышленного применения.
Пробиотик на основе бактерии рода Bacillus вида Bacillus subtilis штамма MG-8 ВКПМ В-12476 для применения получают, например, следующим путем. Из хранилища Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) берут задепонированный штамм бактерий рода Bacillus вида Bacillus subtilis MG-8 ВКПМ В-12476, например в питательной среде, объемом 0,5 литров. Берут биореактор с регулятором температуры, например - производства фирмы ИТП "ПРОМБИОФИТ" (Россия, г. Москва, Клары Цеткин ул., д. 4), емкостью 10 литров. Готовят известную питательную среду Лурия-Бертани (далее по тексту - LB) состава (г/л): триптон - 10,0; дрожжевой экстракт - 5,0; NaCl - 5,0; pH 8,5. Питательную среду LB заливают в реактор, терморегулирующую автоматику биореактора регулируют на поддержание оптимальной температуры питательной среды в биореакторе, например - на рекомендованные паспортом штамма плюс 37°C, запускают биореактор и прогревают питательную среду. При этом с использованием мешалки биореактора питательную среду (в биореакторе) перемешивают, через каждые три минуты замеряя температуру питательной среды. После достижения температуры питательной среды в биореакторе +37°C при работающей мешалке, например с частотой 1 оборот в минуту, производят постепенный посев (выливают) ранее полученный штамм в питательной среде на питательную среду в биореакторе. Перемешивание содержимого биореактора после завершения посева штамма продолжают, например, в течение 30 мин. Затем мешалку работающего биореактора останавливают, включая ее через каждые 4 часа и перемешивая содержимое биореактора. Работу биореактора в этом режиме, при температуре +37°C культуральной среды в биореакторе, продолжают, например - в течение 72 час (3 суток) и получают готовую к применению биомассу (готовый к применению продукт), содержащую бактерии В. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 и продукты метаболизма бактерии. Готовую к использованию биомассу сливают в стерильные емкости, например - в пластиковые бутыли емкостью 1 л, хранят в темном прохладном помещении, например - при температуре не выше +10°C, и применяют по потребности. Срок хранения готовой к применению биомассы - не более 30 суток. Перед применением емкость с готовой биомассой (продуктом) встряхивают, например - в течение 30 сек.
Пример 3. Применение пробиотика на основе штамма бактерий 6. subtilis MG-8 В-12476 для кормления крупного рогатого скота (КРС), например - дойных коров, в личном подсобном хозяйстве.
По Примеру 2 готовят биомассы штамма бактерий В. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476. Полученную биомассу смешивают с полнорационным комбикормом из расчета 1 литр культуральной жидкости на 100 килограммов комбикорма.
Дойных коров кормят штатным кормом с добавлением комбикорма, обработанного культуральной жидкостью из расчета 1 литр культуральной жидкости на 100 килограммов комбикорма. К массе основного корма обработанный культуральной жидкостью комбикорм добавляют из расчета 1 кг на 100 кг живой массы (в количестве 1% от массы) животного в сутки. Кормление комбикормом, обработанным суспензией клеток В. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 проводили ежедневно в течение 10 дней подряд, делали перерыв и далее курс профилактики повторяли ежемесячно. Испытания заявленного технического решения проводились в условиях действующего личного подсобного хозяйства течение 1,5 лет.
При апробации заявляемого способа применения штамма бактерий 6. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 наблюдалось полное отсутствие случаев расстройств желудочно-кишечного тракта дойных коров.
При этом, расчетная норма в (1,0±0,3) л на 100 кг комбикорма является оптимальным соотношением для наиболее эффективной профилактики от патогенных и условно патогенных бактерий и микромицетов, при этом превышения указанной нормы может привести к негативным последствиям в силу возможности угнетения собственной микрофлоры дойных коров, а значительное снижение расчетной нормы может привести к уменьшению эффективности при использовании заявленного технического решения по назначению.
Пример 4. Применение пробиотика на основе штамма бактерий B. subtilis MG-8 В-12476 для кормления молодняка крупного рогатого скота (КРС), например - телят в возрасте от 1-го до 6 месяцев.
По Примеру 2 готовят биомассы штамма бактерий B. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476. Полученную биомассу смешивают с полнорационным комбикормом из расчета 1 литр культуральной жидкости на 100 килограммов комбикорма для молодняка. Телят кормят штатным кормом с добавлением комбикорма, обработанного культуральной жидкостью из расчета 1 литр культуральной жидкости на 100 килограммов комбикорма. К массе основного корма обработанный культуральной жидкостью комбикорм добавляют из расчета 1 кг на 100 кг живой массы (в количестве 1% от массы) животного в сутки. Кормление комбикормом, обработанным суспензией клеток В. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 проводили ежедневно в течение 10 дней подряд, делали перерыв и далее курс профилактики повторяли ежемесячно. В течение 1,5 лет апробации заявляемого способа применения штамма бактерий В. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 полностью отсутствуют случаи расстройств желудочно-кишечного тракта животных. Испытания заявленного технического решения проводились в условиях действующего личного подсобного хозяйства.
При этом, расчетная норма в (1,0±0,2) л на 100 кг комбикорма является оптимальным соотношением для наиболее эффективной профилактики от патогенных и условно патогенных бактерий и микромицетов, при этом превышения указанной нормы может привести к негативным последствиям в силу возможности угнетения собственной микрофлоры телят, а значительное снижение расчетной нормы может привести к уменьшению эффективности при использовании заявленного технического решения по назначению.
Пример 5. Применение пробиотика на основе штамма бактерий вида В. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 для кормления овец.
По Примеру 2 готовят биомассу штамма бактерий В. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476. Полученную биомассу смешивают с полнорационным комбикормом из расчета 1 литр культуральной жидкости на 100 килограммов комбикорма. Овец кормят штатным кормом с добавлением комбикорма, обработанным культуральной жидкостью В. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 из расчета: молодняку возрастом 10-14 дней суточная доза комбикорма составляет 0,1-0,3% от живой массы; 14-30 дней - 0,3-0,5% от живой массы, возрастом 1-4 месяца - 0,5-1,0% от живой массы. От 4 месяцев кормление овец корбикормом, обработанным суспензией клеток бактерии В. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 проводили ежедневно в концентрации 1,0% от живой массы в сутки в течение 10 дней подряд, делали перерыв и далее курс профилактики повторяли ежемесячно. В течение 1,5 лет апробации заявляемого способа применения штамма бактерии В. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 полностью отсутствуют случаи расстройств желудочно-кишечного тракта животных - овец. Испытания заявленного технического решения проводились в условиях действующего личного подсобного хозяйства.
При этом, расчетная норма в (1,0±0,2) л на 100 кг комбикорма является оптимальным соотношением для наиболее эффективной профилактики от патогенных и условно патогенных бактерий и микромицетов, при этом превышения указанной нормы может привести к негативным последствиям в силу возможности угнетения собственной микрофлоры животного, а значительное снижение расчетной нормы может привести к уменьшению эффективности при использовании заявленного технического решения по назначению.
Пример 6. Применение пробиотика на основе штамма бактерий вида В. subtilis MG-8 В-12476 для кормления цыплят-бройлеров.
По Примеру 2 готовят биомассы штамма бактерий В. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476.
Способ кормления цыплят-бройлеров включает вскармливание цыплят начиная с суточного возраста до убоя полнорационным комбикормом с добавлением В. subtilis MG-8 В-12476.
Птиц - цыплят-бройлеров кормили полнорационным комбикормом, с добавлением суспензии клеток В. subtilis MG-8 В-12476 из расчета в количестве 2,0% от живой массы птиц, поедающих этот корм в сутки. В течение 1 года апробации заявляемого способа применения штамма бактерий В. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 полностью отсутствуют случаи расстройств желудочно-кишечного тракта цыплят-бройлеров. Испытания заявленного технического решения проводилось в птицефабрике «Йошкар-Олинская» течение 1,5 лет.
При этом, расчетная норма в (1,0±0,5) л на 100 кг комбикорма является оптимальным соотношением для наиболее эффективной профилактики от патогенных и условно патогенных бактерий и микромицетов, при этом превышения указанной нормы может привести к негативным последствиям в силу возможности угнетения собственной микрофлоры цыплят-бройлеров, а значительное снижение расчетной нормы может привести к уменьшению эффективности при использовании заявленного технического решения по назначению.
Пример 7. Применение пробиотика на основе штамма бактерий вида В. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 для кормления уток, гусей.
Способ кормления уток и гусей включает вскармливание с первых суток жизни непрерывным циклом на весь период откорма полнорационным комбикормом с добавлением В. subtilis MG-8 В-12476.
Птиц - уток и гусей кормят полнорационным комбикормом, с добавлением пробиотика на основе бактерии В. subtilis MG-8 В-12476 из расчета в количестве (1,2…1,5) % от живой массы птиц, поедающих этот корм в сутки.
В течение 1 года апробации заявляемого способа применения штамма бактерий В. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 полностью отсутствуют случаи расстройств желудочно-кишечного тракта уток и гусей. Испытания заявленного технического решения проводилось в птицефабрике «Йошкар-Олинская» течение 1,5 лет.
При этом, расчетная норма в (1,0±0,3) л на 100 кг комбикорма является оптимальным соотношением для наиболее эффективной профилактики от патогенных и условно патогенных бактерий и микромицетов, при этом превышения указанной нормы может привести к негативным последствиям в силу возможности угнетения собственной микрофлоры уток и гусей, а значительное снижение расчетной нормы может привести к уменьшению эффективности при использовании заявленного технического решения по назначению.
Расчетные нормы в примерах применения пробиотика на основе штамма бактерий В. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 получены опытным путем, с учетом строения желудочно-кишечного тракта и физиологии животных и птиц.
Необходимо отметить полное отсутствие зараженности яиц у получавших заявляемый пробиотик птиц (кур, уток, гусей) опасным для людей сальмонеллезом, что можно интерпретировать как результат проявления антагонистической активности пробиотика к наиболее часто инфицирующим яйца бактериям Salmonella typhimurium.
Приведенные примеры использования предлагаемого технического решения показывают достигнутость заявленных целей, а именно - пробиотик на основе штамма бактерии рода Bacillus вида Bacillus subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 обладает:
- отсутствующей у прототипа абсолютной устойчивостью к антибиотику рифампицин, и более устойчив, чем прототип, к антибиотикам карбеницилин, левомицетин, неомицин, канамицин;
- полностью отсутствующей у прототипа антагонистической активностью по отношению к патогенным и условно патогенным (клиническим) бактериям Salmonella typhimurium, Klebsiella oxytoca и более высокую, по сравнению с прототипом, антагонистическую активность в отношении клиническим бактериям Escherichia coli 154, Pseudomonas aeruginosa 8;
- высокой антагонистической активностью в отношении микромицетов - возбудителей микотоксикозов (активностью, полностью отсутствующей у прототипа);
С использованием характерных особенностей штамма бактерии рода Bacillus вида Bacillus subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 разработан пробиотик и эффективные способы применения этого пробиотика для профилактики кишечных инфекций, микотоксикозов и кишечных расстройств у сельскохозяйственных животных и птиц.
Таким образом, заявленное техническое решение доказывает его полезность для использования в сельскохозяйственной деятельности, ветеринарии в качестве средства профилактики и лечения инфекций и кишечных расстройств у сельскохозяйственных животных и птиц. Штамм В. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 обладает устойчивостью к применяемым в ветеринарии антибиотикам, имеет антагонистическую активность в отношении широкого спектра патогенных и условно-патогенных микроорганизмов и микромицетов -продуцентов микотоксинов, вызывающих заболевания и кишечные расстройства у сельскохозяйственных животных и птиц. То есть, заявленное техническое решение обладает позитивными свойствами, отсутствующими у прототипа.
Предполагаемое изобретение удовлетворяет критерию новизны, так как при определении уровня техники не обнаружено средство, которому присущи признаки, идентичные (то есть совпадающие по исполняемой ими функции и форме выполнения этих признаков) всем признакам штамма бактерий В. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476.
Предполагаемое изобретение удовлетворяет критерию изобретательский уровень, потому что является не очевидным для специалиста в указанной области деятельности, т.к. наряду с проявляемой антибактериальной активностью является эффективным средством профилактики и лечения от микотоксикозов, являющихся весьма серьезной проблемой животноводства и птицеводства, т.к. из-за микотоксикозов наблюдается смертность молодняка животных и птиц.
Таким образом, примеры применения пробиотика на основе бактерий В. subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 доказывают, что пробиотик на основе штамма может быть в воспроизведен в промышленных масштабах с использованием стандартного оборудования и материалов. Пробиотик является полезным для применения в сельскохозяйственной деятельности для профилактики широкого спектра заболеваний.