ПОРОШКООБРАЗНЫЙ ПРЕПАРАТ ЛИПАЗЫ, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ
POWDERED LIPASE PREPARATION, PRODUCTION METHOD AND USE THEREOF

Область техники
Настоящее изобретение относится к порошкообразному препарату липазы, который предпочтительно может применяться в различных реакциях этерификации или трансэтерификации, и к порошкообразному препарату липазы, который содержит сложные эфиры жирных кислот и/или жирные кислоты; к способу получения порошкообразного препарата липазы; и к способу трансэтерификации с применением указанных порошкообразных препаратов липазы.
Уровень техники
Липазы широко используются в этерификации различных карбоновых кислот, таких как жирные кислоты, со спиртами, такими как одноатомные спирты и многоатомные спирты, в трансэтерификации сложных эфиров и некоторых карбоновых кислот, и в подобных реакциях. Среди них реакция трансэтерификации представляет собой важный способ, не только как способ модификации животных и растительных жиров и масел, но также как способ получения сложных эфиров различных жирных кислот, таких как сложные эфиры сахаров и стерина. Когда в вышеописанных реакциях в качестве катализатора используется липаза, которая представляет собой фермент, гидролизующий жиры и масла, то реакция трансэтерификации может проводиться при мягких условиях, т.е. в интервале от комнатной температуры примерно до 70°С. Таким образом, реакции, с использованием липазы, могут лучше ингибировать побочные реакции и уменьшать энергетические затраты по сравнению со стандартными химическими реакциями. В дополнение к этому следует объяснить, что поскольку липаза, используемая в качестве катализатора, представляет собой натуральный продукт, то это в высокой степени безвредно. Кроме того, определенные соединения могут быть эффективно получены с использованием липазы благодаря ее субстратной и позиционной специфичности. Однако даже если порошкообразная липаза используется в реакции трансэтерификации без изменения, ее активность не выражается в полной мере. Кроме того, представляется трудным равномерно диспергировать в сущности водорастворимую липазу в исходном материале, представляющем собой масло, и представляется трудным собрать такую липазу.
Таким образом, как правило, обычно липазу иммобилизуют на некоторые носители, такие как анион-обменная смола (патентная литература 1), смола абсорбции фенола (патентная литература 2), гидрофобный носитель (патентная литература 3), катион-обменная смола (патентная литература 4) и хелатная смола (патентная литература 5) и используют ее в реакциях, таких как этерификация и трансэтерификация. Кроме того, предлагается способ получения иммобилизованных липазных частиц, который включает стадии получения эмульсии, где водная фаза, растворяющая липазу и вещество, которое функционирует в качестве носителя липазы, диспергируется в гидрофобной фазе; и удаление воды из эмульсии для превращения ее водной фазы в твердые частицы, покрытые липазой (патентная литература 6).
Как упомянуто выше, липазу иммобилизуют стандартным способом и используют в реакции трансэтерификации. Однако иммобилизованная липаза теряет исходную липазную активность в процессе иммобилизации. В дополнение к этому, когда используют пористый носитель, то исходный материал или продукт застревает в узких порах и в результате скорость трансэтерификации уменьшается. Кроме того, в реакции трансэтерификации, где используют стандартно иммобилизованную липазу, вода, которую сохраняет носитель, попадает в реакционную систему и, таким образом, становится трудно предотвратить побочные реакции, такие как получение диглицеридов и моноглицеридов в реакции трансэтерификации жиров и масел.
В свете вышеописанных обстоятельств, были разработаны различные способы, использующие порошкообразную липазу. Например, предлагается способ реакции трансэтерификации, который включает стадии диспергирования порошкообразной липазы в исходном материале в присутствии или в отсутствие неактивного органического растворителя(ей), причем исходный материал включает сложный эфир(ы), так чтобы 90% или более диспергированных частиц порошкообразной липазы сохраняли во время реакции диаметр частиц, составляющий 1-100мкм; и стадию трансэтерификации указанной смеси (патентная литература 7). Кроме того, также предлагается использование ферментативного порошка, причем указанный порошок, который получают путем сушки раствора фермента, включает фосфолипиды и жирорастворимые витамины (патентная литература 8).
Однако желательной является порошкообразная липаза, с дополнительно улучшенной активностью.
С другой стороны, предлагается способ получения препарата в виде иммобилизованного фермента, причем способ включает стадии добавления гранулированного порошка или гранулированного порошка и сахаров к раствору, включающему фермент(ы), и сушку раствора, включающего фермент(ы) (патентная литература 9). В литературе описано, что примеры применяемых ферментов включают липазу, целлюлазу, протеазу, амилазу и пектиназу, и что препарат в виде иммобилизованного фермента, полученный с помощью вышеописанного способа получения, может ингибировать деактивацию фермента в присутствии вещества, уменьшающего ферментативную активность. Однако в литературе отсутствует описание улучшения ферментативной активности. Кроме того, фактически имеющиеся примеры в литературе представляют собой только те, в которых в качестве целлюлазы или протеазы применяют обезжиренный соевый порошок, имеющий пониженное содержание жира, и отсутствует определенное описание примера, где бы использовалась липаза.
Патентная литература 1: JP-A 60-98984
Патентная литература 2: JP-A 61-202688
Патентная литература 3: JP-A 2-138986
Патентная литература 4: JP-A 3-61485
Патентная литература 5: JP-A 1-262795
Патентная литература 6: JP-B 3403202
Патентная литература 7: JP-B 2668187
Патентная литература 8: JP-A 2000-106873
Патентная литература 9: JP-A 11-246893
Описание изобретения
Целью настоящего изобретения является предложение порошкообразного препарата липазы с улучшенной активностью липазы.
Дополнительной целью настоящего изобретения является предложение способа получения порошкообразного препарата липазы.
Следующей дополнительной целью настоящего изобретения является предложение способа трансэтерификации или способа этерификации, в которых применяют порошкообразный препарат липазы.
Настоящее изобретение было выполнено на основе того открытия, что при гранулировании липазы определенного происхождения в порошок вместе с соевым порошком, имеющим высокое содержание жира, и при использовании полученного порошкообразного препарата липазы в реакции этерификации и/или в реакции трансэтерификации, активность липазы в препарате существенно улучшается.
То есть в настоящем изобретении предлагается порошкообразный препарат липазы, который представляет собой гранулированный материал, включающий липазу, выделенную из Rhizopus oryzae, и/или липазу, выделенную из Rhizopus delemar, и соевый порошок, имеющий содержание жира, составляющее 5 масс.% или более.
В настоящем изобретении также предлагается способ получения порошкообразного препарата липазы, который включает стадию сушки водного раствора, где липаза, выделенная из Rhizopus oryzae, и/или липаза, выделенная из Rhizopus delemar, и соевый порошок, имеющий содержание жира, составляющее 5 масс.% или более, являются растворенными или диспергированными.
В настоящем изобретении дополнительно предлагается способ получения продукта трансэтерификации или продукта этерификации, причем способ включает стадию трансэтерификации или этерификации одного или более классов соединений, выбранных из сложных эфиров жирных кислот, жирных кислот и спиртов с применением вышеописанного порошкообразного препарата липазы.
Согласно настоящему изобретению, является возможным предложение порошкообразного препарата липазы, обладающего существенно улучшенной ферментативной активностью, с помощью которой могут эффективно проводиться реакция трансэтерификации или реакция этерификации, причем указанный порошкообразный препарат липазы может повторно использоваться, будучи собранным после реакции.
Кроме того, согласно настоящему изобретению также возможно получение порошкообразного препарата липазы, который может безвредно и экономично использоваться в производстве пищи или пищевых добавок, предназначенных для тех, кто не может употреблять белки или жиры, выделенные из животных, по религиозным соображениям или по состоянию здоровья.
Краткое описание чертежей
На фиг.1 показаны изменения с течением времени скорости реакции трансэтерификации при использовании порошкообразного препарата липазы, полученного с помощью примера 2 (изобретение 1), и при использовании стандартного порошкообразного препарата липазы.
Лучший способ осуществления изобретения
Rhizopus delemar и Rhizopus oryzae вида Rhizopus могут использоваться в качестве липазы, применяемой по настоящему изобретению. Липаза по настоящему изобретению предпочтительно представляет собой 1,3-специфичную липазу.
Примеры липазы включают Picantase R8000 (продукт компании Robin) и липазу F-AP15 (продукт компании Amano Enzyme Inc.). Наиболее предпочтительной липазой является липаза DF “Amano” 15-K (также обозначаемая как липаза D), выделенная из Rhizopus oryzae, продукт компании Amano Enzyme Inc. Этот продукт представляет собой порошкообразную липазу. При этом липаза DF “Amano” 15-K исходно обозначалась как липаза, выделенная из Rhizopus delemar.
Липаза, применяемая по настоящему изобретению, может представлять собой липазу, полученную с помощью сушки водного раствора, содержащего липазу, такого как водный раствор, содержащий промежуточный компонент липазы.
Соевый порошок, имеющий содержание жира, составляющее 5 масс.% или более, который используется по настоящему изобретению, предпочтительно имеет содержание жира, составляющее 10 масс.% или более, и более предпочтительно, имеет содержание жира, составляющее 15 масс.% или более, и, с другой стороны, предпочтительно, имеет содержание жира, составляющее 25 масс.% или менее. Особенно предпочтительным является соевый порошок, имеющий содержание жира, составляющее 18-23 масс.%. Примеры жиров включают триглицериды жирных кислот и их аналоги. Содержание жира в сое может быть легко измерено с помощью метода, такого как экстракция сокслета и ему подобными.
В настоящем изобретении в качестве соевого порошка может использоваться соевый порошок, содержащий цельный жир. Также возможно использование соевого молока в качестве исходного материала соевого порошка. Соевый порошок может быть получен путем давления сои согласно обычному методу, и диаметр полученных частиц предпочтительно составляет около 0,1-600 мкм.
Использование количества соевого порошка на количество липазы предпочтительно составляет 0,1-200-кратное превышение по стандарту массы, более предпочтительно, 0,1-20-кратное превышение, и наиболее предпочтительно, 0,1-10-кратное превышение.
Порошкообразный препарат липазы по настоящему изобретению предпочтительно имеет содержание воды, составляющее 10 масс.% или менее, и особенно предпочтительно, 1-8 масс.%.
Диаметр частиц порошкообразного препарата липазы по настоящему изобретению может быть выбран произвольно, и 90 масс.% или более порошкообразного препарата липазы имеет диаметр частиц, составляющий 1-100 мкм. Их средний диаметр частиц предпочтительно составляет 10-80 мкм. Кроме того, форма частиц порошкообразного препарата липазы предпочтительно является сферической.
Диаметр частиц порошкообразного препарата липазы может быть измерен, например, с помощью использования анализатора распределения размера частиц (LA-500) компании HORIBA, Ltd.
Порошкообразный препарат липазы по настоящему изобретению может быть получен с помощью метода, включающего стадию сушки водного раствора, где липаза и соевый порошок растворены или диспергированы, и указанная сушка представляет собой один из типовых методов, выбранных из распылительной сушки, лиофилизации и осаждения/сушки растворителя.
Водный раствор, где липаза и соевый порошок растворены или диспергированы, может быть получен путем растворения или диспергирования порошкообразной липазы и соевого порошка в воде; путем смешивания порошкообразной липазы в водном растворе, где соевый порошок растворен или диспергирован; или, как упоминается ниже, путем смешивания соевого порошка в водном растворе, содержащем липазу.
В процессе сушки водного раствора, где липаза и соевый порошок растворены или диспергированы, частицы липазы и/или частицы соевого порошка агглютинируют с образованием гранулированного материала, включающего липазу и соевый порошок. Этот гранулированный материал может включать промежуточный компонент липазы.
Таким образом, полученный порошкообразный препарат может использоваться в трансэтерификации или в этерификации без изменения.
Масса воды в водном растворе, где липаза и соевый порошок растворены или диспергированы, регулируется в соответствии с общей массой липазы и соевого порошка. Более определенно, масса воды на общую массу липазы и соевого порошка предпочтительно составляет 0,5-1000-кратное превышение, более предпочтительно, 1,0-500-кратное превышение, и наиболее предпочтительно 3,0-100-кратное превышение.
В особенности, при получении порошкообразного препарата липазы с помощью распылительной сушки, масса воды на общую массу липазы и соевого порошка предпочтительно составляет 2,0-1000-кратное превышение, более предпочтительно, 2,0-500-кратное превышение, и наиболее предпочтительно, 3,0-100-кратное превышение благодаря характеристикам распылительной сушки. При этом, когда в качестве исходного материала используют водный раствор, содержащий липазу, и содержание липазы в указанном водном растворе не определено, то содержание липазы получают с помощью образования порошка из водного раствора, содержащего липазу, с помощью лиофилизации или с помощью других методов сушки при пониженном давлении, и масса липазы может быть рассчитана на основе полученного содержания липазы.
Примеры водного раствора, содержащего липазу, включают липазную культуру, из которой удалено тело гриба, очищенную культуру, водный раствор, где липаза, полученная из указанной культуры, растворяется или диспергируется снова, водный раствор, где коммерческая порошкообразная липаза растворяется или диспергируется снова, и коммерческую жидкую липазу. Кроме того, в целях дополнительного улучшения активности липазы более предпочтительными являются водные растворы, из которых удаляют низкомолекулярный компонент, такой как соли. Кроме того, в целях дополнительного улучшения свойств порошка более предпочтительными являются водные растворы, из которых удаляют низкомолекулярный компонент, такой как сахара.
2
4
4
2
4
4
2
2
4
4
2
4
4
2
Примеры липазной культуры включают водные растворы, содержащие соевую муку, пептон, кукурузный экстракт, KHPO, (NH)SO, MgSO·7HO, или ему подобные. Их концентрации представляют собой указанные далее: соевой муки 0,1-20 масс.% и, предпочтительно, 1,0-10 масс.%; пептона 0,1-30 масс.% и, предпочтительно, 0,5-10 масс.%; кукурузного экстракта 0,1-30 масс.% и, предпочтительно, 0,5-10 масс.%; KHPO 0,01-20 масс.% и, предпочтительно, 0,1-5 масс.%; (NH)SO 0,01-20 масс.% и, предпочтительно, 0,05-5 масс.%; и MgSO·7HO 0,01-20 масс.% и, предпочтительно, 0,05-5 масс.%. Условия их культивирования могут регулироваться, как указано далее: температура культивирования 10-40°С и, предпочтительно, 20-35°С; объем расхода воздуха 0,1-2,0 VVM и, предпочтительно, 0,1-1,5 VVM; скорость вращения для перемешивания 100-800 об/мин и, предпочтительно, 200-400 об/мин; pH 3,0-10,0 и, предпочтительно, 4,0-9,5.
Отделение тела гриба предпочтительно проводят с помощью центрифугирования, мембранной фильтрации или им подобных. Удаление низкомолекулярных компонентов, таких как соли и сахара, может проводиться с помощью обработки ультрафильтрационными мембранами. Более определенно, после обработки с помощью ультрафильтрационных мембран, водный раствор, содержащий липазу, концентрируют так, чтобы получить 1/2 его объема; и затем добавляют туда такое же количество фосфатного буфера, как и количество концентрированного раствора. С помощью повторения этих процедур 1-5 раз возможно получение водного раствора, содержащего липазу, из которой был удален низкомолекулярный компонент.
2
Центробежную силу центрифугирования предпочтительно регулируют до значений 200-20000×g. Подобным образом, давление мембранной фильтрации предпочтительно регулируют до значений 3,0 кг/м или менее в микрофильтрационных мембранах, в фильтре-прессе и им подобных. В случае ферментов в теле гриба, предпочтительно разрушают его клетки с помощью гомогенизатора, гомогенизатора Уоринга, с помощью ультразвукового разрушения, Французского пресса, гранулятора или им подобных, и затем удаляют остатки клеток с помощью центрифугирования, мембранной фильтрации или им подобных методов. Скорость вращения для перемешивания гомогенизатора составляет 500-30000 об/мин и, предпочтительно, 1000-15000 об/мин. Скорость вращения гомогенизатора Уоринга составляет 500-10000 об/мин и, предпочтительно, 1000-5000 об/мин. Время перемешивания составляет 0,5-10 минут и, предпочтительно, 1-5 минут. Ультразвуковое разрушение проводят при условиях 1-50 кГц и, предпочтительно, при 10-20 кГц. Является предпочтительным, чтобы гранулятор содержал стеклянные шарики, имеющие диаметр 0,1-0,5 мм.
В некоторой стадии перед процессом сушки возможно концентрирование водного раствора, содержащего липазу. Метод концентрирования особо не ограничивается, и его примеры включают использование испарителя, испарителя мгновенного вскипания, концентрирования с помощью ультрафильтрации, концентрирования с помощью микрофильтрации, высаливания с помощью неорганических солей, осаждения с помощью растворителей, абсорбции с помощью ионо-обменных целлюлоз и им подобных, и поглощения воды с помощью водо-поглощающих гелей. Среди них предпочтительными методами концентрирования являются ультрафильтрация и концентрирование с помощью испарителя. Процедура концентрирования с помощью ультрафильтрации представлена далее: плоская мембрана или половолоконная мембрана, каждая из которых имеет фракционированную молекулярную массу, составляющую 3000-100000 и, более предпочтительно, 6000-50000; и их материал предпочтительно представляет собой полиакрилонитрил, полисульфон или им подобный.
Далее здесь описаны методы распылительной сушки, лиофилизации и осаждения растворителем/сушки, каждый из которых представляет собой метод сушки водного раствора, где липаза и соевый порошок растворены или диспергированы.
Распылительную сушку предпочтительно проводят с использованием распылительных сушилок, таких как сушилка с противотоком, содержащая насадку(и), сушилка с противотоком, содержащая диск, сушилка с противотоком, содержащая насадку(и), и сушилка с противотоком, содержащая диск. Сушилка с противотоком, содержащая диск, является более предпочтительной, и является предпочтительным регулировать условия, представленные далее для распылительной сушки: скорость вращения пульверизатора 4000-20000 об/мин; и нагревание 100-200°С для температуры на входе и 40-100°С для температуры на выходе. В особенности, предпочтительно регулировать температуру в водном растворе, содержащем липазу и соевый порошок, до значений 20-40°С, и затем сушить раствор с помощью распыления в сухой атмосфере при 70-130°С. Также предпочтительно перед сушкой регулировать pH водного раствора до значений 7,5-8,5.
Лиофилизацию предпочтительно проводят с использованием настольного лиофилизатора для малых количеств образца, с использованием лиофилизатора пластинчатого типа и им подобных. Кроме того, также возможна сушка раствора при пониженном давлении.
Осаждение растворителем/сушку проводят с помощью метода, включающего стадии фракционного добавления водного раствора, где липаза и соевый порошок растворены или диспергированы, к растворителю для генерирования осаждения, центрифугирования полученного осадка с помощью центрифуги для его сбора, и затем сушка собранного осадка при пониженном давлении. Последовательность операций предпочтительно проводят при низкотемпературных условиях комнатной температуры или ниже, в целях предотвращения утраты природных свойств и/или разложения порошкообразного препарата липазы.
Примеры растворителя, используемого в осаждении растворителем, включают водорастворимые или гидрофильные растворители, такие как этанол, ацетон, метанол, изопропиловый спирт и гексан, а также используют смешанные растворители на их основе. Среди них предпочтительно используют этанол или ацетон в целях дополнительного усиления активности порошкообразного препарата липазы.
Хотя количество используемого растворителя особо не ограничено, предпочтительно использовать 1-100-кратное превышение по объему растворителя на объем водного раствора, где липаза и соевый порошок растворены или диспергированы, и более предпочтительно использовать 2-10-кратное превышение по объему растворителя.
После осаждения растворителем осадок может быть получен с помощью фильтрации после выстаивания, и также он может быть получен с помощью умеренного центрифугирования со скоростью около 1000-3000×g. Сушку полученного осадка можно проводить, например, при пониженном давлении.
В настоящем изобретении сложные эфиры жирных кислот и/или жирные кислоты могут быть дополнительно добавлены в процессе получения порошкообразного препарата липазы. Более определенно, порошкообразный препарат липазы можно получить с помощью метода, включающего стадии контактирования сложных эфиров жирных кислот и/или жирных кислот с водным раствором, где липаза и соевый порошок растворены или диспергированы, и сушки смеси. Активность липазы и стабильность порошкообразного препарата липазы может быть дополнительно улучшена с помощью контактирования сложных эфиров жирных кислот и/или жирных кислот, как упомянуто выше.
Примеры сложных эфиров жирных кислот включают сложные эфиры одноатомных или многоатомных спиртов и жирных кислот. Сложные эфиры жирных кислот многоатомных спиртов могут представлять собой неполные или полные эфиры.
Примеры одноатомных спиртов включают алкиловые одноатомные спирты и стерины, такие как фитостерины. Алкильная составляющая алкиловых одноатомных спиртов предпочтительно представляет собой алкил со средним размером цепи, содержащий 6-12 атомов углерода или длинноцепочечный алкил, содержащий 13-22 атомов углерода, причем каждый из алкилов представляет собой насыщенный или ненасыщенный и линейный или разветвленный. Фитостерины предпочтительно представляют собой ситостерин, стигмастерин, кампестерин, фукостерин, спинастерин, брассикастерин и им подобные. Примеры многоатомных спиртов включают глицериновые конденсаты, такие как глицерин, диглицерин и декаглицерин, гликоли, такие как пропиленгликоль и сорбит.
Хотя составляющие жирных кислот, используемых в сложных эфирах жирных кислот и используемых жирных кислот особо не ограничены, предпочтительными являются жирные кислоты, выделенные из жиров и масел. Их примеры включают жирные кислоты с цепью среднего размера, содержащие 6-12 атомов углерода, например гексановую кислоту, октановую кислоту, деакновую кислоту и ундекановую кислоту; и длинноцепочечные ненасыщенные жирные кислоты, содержащие 13-22 атомов углерода, например олеиновую кислоту, линолевую кислоту, рицинолевую кислоту и эруковую кислоту. Примеры также включают длинноцепочечные насыщенные жирные кислоты, например тетрадекановую кислоту, гексадекановую кислоту, октадекановую кислоту, эйкозановую кислоту и докозановую кислоту.
Используемые сложные эфиры жирных кислот предпочтительно представляют собой один или более классов соединений, выбранных из группы, состоящей из диглицеридов и моноглицеридов, каждый из которых включает в качестве составляющих жиры и масла или жирные кислоты, выделенные из жиров и масел. Кроме того, также возможно использование смеси жирных кислот и неполных сложных эфиров, полученных с помощью гидролиза части сложных эфиров и жирных кислот.
При этом предпочтительно выбирать такие же сложные эфиры жирных кислот и жирные кислоты, используемые в порошкообразном препарате липазы, как и в исходных материалах, используемых в трансэтерификации или в этерификации с использованием порошкообразного препарата липазы.
Жиры и масла, используемые в качестве сложных эфиров жирных кислот, особо не ограничены, и при получении порошкообразного препарата липазы с помощью проведения гидролиза и этерификации предпочтительно использовать жидкие жиры и масла при температуре реакции.
Примеры жиров и масел включают один или более классов соединений, выбранных из группы, состоящей из растительных жиров и масел, таких как масло канолы, подсолнечное масло, оливковое масло, кукурузное масло, пальмовое масло, кунжутное масло, сафлоровое масло, соевое масло и высокомасличные жиры и масла, хлопковое масло, рисовое масло, льняное масло, пальмовое масло, фракционированное пальмовое масло, кокосовое масло, масло камелии, какао-масло, масло ши, масло сал и масло ореха бассия; триглицериды (синтетические жиры и масла), такие как триолеин (глицерин триолеат), трикаприлин (глтцерин триоктаноат), триацетин (глицерин триацетат) и трибутирин (глицерин трибутаноат); и животные жиры и масла, такие как рыбий жир, мясной жир и свиной жир. Среди них предпочтительными являются растительные жиры и масла.
При использовании в качестве исходных материалов сложных эфиров жирных кислот или сложных эфиров жирных кислот и жирных кислот, порошкообразный препарат липазы может быть получен с помощью способа, включающего стадии добавления и контактирования сложных эфиров жирных кислот или сложных эфиров жирных кислот и жирных кислот с водным раствором, где липаза и соевый порошок растворены или диспергированы, равномерное перемешивание смеси с помощью мешалки, трех- или одномоторной, или с помощью подобных, и/или эмульгирование или диспергирование полученной смеси, и затем сушка смеси с помощью одного из типов методов, выбранных из распылительной сушки, лиофилизации и осаждения растворителем/сушки.
Также возможна сушка смеси с помощью дегидратации, сопровождающей реакцию этерификации. То есть порошкообразный препарат липазы может быть получен способом, включающим стадии гидролиза и/или эмульгирования и диспергирования смеси, затем проведения реакции этерификации со смесью с ее дегидратацией и, если необходимо, фильтрации его масляной части, такой как не вступившие в реакцию вещества.
Аддитивное количество сложных эфиров жирных кислот и/или жирных кислот, используемых в получении порошкообразного препарата липазы, предпочтительно составляет 0,1-500-кратное превышение по массе на общую массу липазы и соевого порошка, более предпочтительно, 0,2-100-кратное превышение по массе, и наиболее предпочтительно, 0,3-50-кратное превышение по массе.
При этом при получении порошкообразного препарата липазы с помощью распылительной сушки, аддитивное количество используемых сложных эфиров жирных кислот и/или жирных кислот на общую массу липазы и соевого порошка предпочтительно составляет 0,1-10-кратное превышение по массе, более предпочтительно 2,0-10-кратное превышение по массе и наиболее предпочтительно 3,0-10-кратное превышение по массе. Это из-за того, что в случае использования распылительной сушки, когда аддитивное количество сложных эфиров жирных кислот и/или жирных кислот становится больше, начинаются проблемы, связанные с тем, что вода недостаточно эффективно испаряется, или с тем, что становится трудно собрать полученный порошкообразный препарат липазы из-за избытка сложных эфиров жирных кислот и/или жирных кислот.
Хотя верхний предел аддитивного количества используемых сложных эфиров жирных кислот и/или жирных кислот может представлять собой более высокое значение в соответствии с модификацией устройства для распылительной сушки или изменений форм сбора, в случае содержания сложных эфиров жирных кислот и/или жирных кислот свыше необходимого уровня, требуется процесс фильтрации.
При получении порошкообразного препарата липазы, включающего сложные эфиры жирных кислот и/или жирные кислоты с помощью осаждения растворителем, предпочтительно использовать растворитель в количестве 1-100-кратное превышение по объему растворителя на общую массу сложных эфиров жирных кислот и/или жирных кислот и водного раствора, где липаза и соевый порошок растворены или диспергированы, и более предпочтительно, использовать 2-10-кратное превышение по объему растворителя.
При добавлении следующего вспомогательного фильтрующего материала перед проведением осаждения растворителем массу вспомогательного фильтрующего материала дополнительно включают в вышеописанную общую массу, и растворитель используют на основе указанной общей массы.
В настоящем изобретении процесс добавлении вспомогательного фильтрующего материала может быть дополнительно включен в изобретение.
При проведении сушки с помощью дегидратации, сопровождающей реакцию этерификации возможно добавлять вспомогательный фильтрующий материал перед, во время или после реакции этерификации. Предпочтительно добавлять вспомогательный фильтрующий материал, так как фильтрация может проводиться без проблем после реакции этерификации.
При добавлении вспомогательного фильтрующего материала перед или во время реакции этерификации возможно одновременное дополнительное добавление жиров и масел. Так как вязкость раствора увеличивается при добавлении вспомогательного фильтрующего материала, то в случае возникновения проблем при перемешивании, текучесть раствора реакции улучшают с помощью добавления жиров и масел, как упомянуто выше.
Примеры используемых вспомогательных фильтрующих материалов включают силикагель, селлаит, целлюлозу, крахмал, декстрин, активированный уголь, активированную глину, каолин, бентонит, тальк и песок. Среди них силикагель, селлаит и целлюлоза являются предпочтительными. Диаметр частицы вспомогательного фильтрующего материала может быть выбран произвольно, предпочтительным является размер, составляющий 1-100 мкм, и особенно предпочтительным является размер, составляющий 5-50 мкм.
Вспомогательный фильтрующий материал, используемый перед, во время или после реакции этерификации, предпочтительно добавлять в количестве 1-500 масс.% на общую массу липазы и соевого порошка, и более предпочтительно, в количестве 10-200 масс.%. При использовании вспомогательного фильтрующего материала в количестве, которое находится в вышеуказанном интервале, нагрузка при фильтрации станет меньше и не потребуется использование устройства для крупномасштабной фильтрации.
Кроме того, также возможно включение вспомогательного фильтрующего материала в порошкообразный препарат липазы по настоящему изобретению, который получают с помощью метода сушки, отличного от дегидратации, сопровождающей реакцию этерификации. При получении порошкообразного препарата липазы с помощью распылительной сушки или с помощью лиофилизации, вспомогательный фильтрующий материал может быть добавлен перед или после сушки.
При проведении сушки после осаждения растворителем предпочтительно добавлять вспомогательный фильтрующий материал к порошкообразному препарату липазы, полученному с помощью сушки.
Количество вспомогательного фильтрующего материала, включенного в порошкообразный препарат липазы, может составлять 1-500 масс.% на основе общей массы липазы и соевого порошка, и предпочтительно, составляет 10-200 масс.%.
Далее здесь описывается способ получения трансэтерифицированного продукта или этерифицированного продукта, каждый из которых получают путем проведения трансэтерификации или этерификации с применением порошкообразного препарата липазы по настоящему изобретению.
Реакция трансэтерификации, проводимая с применением порошкообразного препарата липазы по настоящему изобретению, представляет собой реакцию трансэтерификации сложных эфиров жирных кислот с одним или более классов соединений, выбранных из сложных эфиров жирных кислот, жирных кислот и спиртов. Их примеры включают трансэтерификацию. Между жирами и маслами согласно стандартному методу, трансэтерификацию жиров и масел со сложными эфирами жирных кислот и трансэтерификацию алкоголиза или ацидолиза.
Кроме того, этерификация, проводимая с применением порошкообразного препарата липазы по настоящему изобретению, представляет собой реакцию этерификации неполных сложных эфиров жирных кислот с жирными кислотами или реакцию этерификации одноатомных или многоатомных спиртов с жирными кислотами. Их примеры включают реакцию этерификации глицерина с жирными кислотами.
Более определенно, в качестве реакции трансэтерификации между жирами и маслами возможно провести трансэтерификацию масла канолы, которое представляет собой триглицерид длинноцепочечной жирной кислоты, и глицерин триоктаноата, который представляет собой триглицерид жирной кислоты с цепью среднего размера, выделенный из овощных культур, с получением триглицерида, который включает длинноцепочечную жирную кислоту и жирную кислоту с цепью среднего размера.
Кроме того, в качестве реакции трансэтерификации жиров и масел и жирных кислот с использованием ацидолиза возможно получать структурированные жиры и масла, где в значительной степени используется 1,3-специфичная липаза. Это метод, при котором определенная жирная кислота остается во втором положении остова глицерина, а жирные кислоты в первом и третьем положениях заменяются на определенные жирные кислоты. Полученные жиры и масла могут использоваться в шоколаде и в качестве жиров и масел в имеющих определенное действие питательных веществах.
Условие реакции трансэтерификации или реакции этерификации с использованием порошкообразного препарата липазы особо не ограничены, и каждая реакция может проводиться с помощью стандартного метода.
Как правило, реакция проводится при стандартном или пониженном давлении с предотвращением загрязнения водой, которая вызывает гидролиз. Хотя температура реакции зависит от используемого исходного материала и точки замерзания смеси, с которой объединяется исходный материал, предпочтительной является температура 20-80°С, и если нет ограничений точкой замерзания, то предпочтительной является температура 40-60°С.
Аддитивное количество порошкообразного препарата липазы в исходном материале реакции предпочтительно составляет 0,05-10 масс.%, и, более предпочтительно, 0,05-5 масс.%. Наиболее подходящее количество определяется согласно температуре реакции, времени проведения реакции, активности полученного порошкообразного препарата липазы и тому подобного. После завершения реакции порошкообразный препарат липазы удаляют с помощью фильтрации и центрифугирования, и он может быть повторно использован (оценка стабильности), пока его активность не уменьшится до такой степени, что продуктивность порошкообразного препарата липазы окажется неосуществимой.
Соответственно, предпочтительно, чтобы липаза, которая обычно является дорогостоящей, одновременно имела высокую активность и высокую стабильность в его наименьшем возможном количестве в порошкообразном препарате липазы.
Хотя полученный таким образом трансэтерифицированный или этерифицированный материал особо не ограничен, предпочтительно он представляет собой трансэтерифицированные или этерифицированные жиры и масла, используемые в области питания, и, более предпочтительно, трансэтерифицированные или этерифицированные жиры и масла, выделенные из растительных масел, которые могут использоваться в производстве пищи или пищевых добавок, предназначенных для тех, кто не может потреблять белки или жиры и масла, имеющие животное происхождение, по религиозным соображениям или по состоянию здоровья.
Далее примеры получения и примеры дополнительно иллюстрируют настоящее изобретение.
Пример 1
Трехкратное количество соевого молока (дисперсная система соевого порошка, имеющего содержание жира 20 масс.%: Meiraku Co., Ltd.) добавляли с перемешиванием к раствору фермента (150000 Ед/мл) липазы DF “Amano” 15-K (также обозначаемой как липаза D), продукт компании Amano Enzyme Inc. Затем pH смеси регулировали до значения 7,8 с помощью раствора NaOH 0,5 н. (температура раствора:комнатная температура), и смесь распыляли при температуре входа, составляющей 130°С, для проведения распылительной сушки (с использованием SD-1000, Tokyo Rikakikai Co., Ltd). 95 масс.% полученного порошкообразного препарата липазы имело диаметр частиц, составляющий 1-100 мкм.
Сравнительный пример 1
Порошкообразный препарат липазы получали с помощью того же метода, как описано в примере 1, за исключением того, что соевое молоко не добавлялось.
Активность каждого порошкообразного препарата липазы, полученного в примере 1 и в сравнительном примере 1, измеряли согласно следующему методу.
Метод измерения активности липазы
Каждый порошкообразный препарат липазы добавляли к маслу, в котором смешивали 1:1 (масс.) 1,2,3-триолеоил глицерин и 1,2,3-триоктаноил глицерин, и давали вступить в реакцию при 60°С. С течением времени брали из раствора 10 мкл в качестве образца, разводили с помощью 1,5 мл гексана, и раствор, где порошкообразный препарат липазы был отфильтрован, брали в качестве образца для газовой хроматографии (GC). Раствор анализировали с помощью GC (колонка: DB-1ht) и рассчитывали скорость реакции исходя из следующей формулы. Условия GC: температура колонки: 150°С, рост температуры: 15°С/мин и конечная температура 370°С.
Скорость реакции (%)={C34площадь/(C24площадь+C34площадь)}×100
где, C24 представляет собой 1,2,3-триоктаноил глицерин; C34 представляет собой 1,2,3-триоктаноил глицерин, где одна жирная кислота заменена на олеиновую кислоту; и площадь представляет собой площадь каждого из них. На основе скорости реакции в каждый момент времени, рассчитывали константу скорости k реакции с помощью компьютерного анализа (исходная версия 6.1).
Активность порошкообразного препарата липазы представляли с помощью относительной активности, когда определенное значение k раствора фермента, высушенного с помощью распылительной сушки, которое оставалось без изменения, считали как 100.
В таблице 1 показаны результаты эксперимента.
<b>Таблица 1</b>
Условие (объемное соотношение)
Относительная активность (%)
Сравнительный пример 1
Раствор липазы
100
Пример 1
Раствор липазы:соевое молоко=1:3 (рН 7,8)
504
Из результатов таблицы 1 очевидно, что активность липазы значительно улучшается согласно настоящему изобретению.
Пример 2
Трехкратное количество 10% водного раствора дезодорированного соевого порошка, содержащего цельный жир (содержание жира: 23 масс.%; торговое название: Alphaplus HS-600, производится компанией Nisshin Cosmo Foods, Ltd.), добавляли с перемешиванием к тому же раствору фермента (150000 Ед/мл) липазы DF “Amano” 15-K, как липаза в примере 1. Затем pH смеси регулировали до значения 7,8 с помощью раствора NaOH 0,5 н., и смесь сушили с помощью распылительной сушки (с использованием SD-1000, Tokyo Rikakikai Co., Ltd). (изобретение 1).
Когда сравнили каждый водный раствор дезодорированного соевого порошка, содержащего цельный жир, имеющего концентрацию 10 масс.% (далее обозначается как %), 15% (изобретение 2) и 20% (изобретение 3), то имели возможность получить порошок, трансэтерифицирующая активность которого было наивысшей, с помощью добавления его 10% водного раствора.
Кроме того, когда предварительно проводили стерилизацию автоклавированием (121°С, 15 минут) 10% раствора дезодорированного соевого порошка, содержащего цельный жир, и раствор охлаждали до комнатной температуры и превращали в порошок согласно вышеописанному процессу (изобретение 4), то имели возможность получить ферментативный порошок, имеющий еще более высокую активность.
В таблице 2 показаны результаты эксперимента.
<b>Таблица 2</b>
Условие (объемное соотношение)
Относительная активность (%)
Изобретение 1
Раствор липазы: 10% HS-600=1:3 (pH 7,8)
409
Изобретение 2
Раствор липазы: 15% HS-600=1:3 (pH 7,8)
209
Изобретение 3
Раствор липазы: 20% HS-600=1:3 (pH 7,8)
227
Изобретение 4
Раствор липазы: 10% HS-600=1:3 (pH 7,8)
440
Пример 3
Тип соевого порошка, который добавляли к тому же раствору фермента (150000 Ед/мл) липазы DF “Amano” 15-K, был тем же, который исследовали в примере 1. Концентрация водного раствора соевого порошка представляла собой 10%.
Порошкообразный препарат липазы получали тем же методом, что и в примере 1, за исключением того, что использовали соевую муку U.S. (торговое название: Органическая соевая мука, производимая компанией Arrowhead Mills; после получения ее суспензии с помощью миксера, сцеживания ее с помощью марли или подобного материала, использовали полученный раствор; содержание жира: 7 масс.%) или обезжиренный соевый порошок (торговое название: Соевая Мука FT-N, производимая компанией Nisshin Cosmo Foods, Ltd.; содержание жира: 0,2 масс.%, сравнительный пример 2).
В таблице 3 показана активность липазы каждого полученного порошкообразного препарата липазы.
<b>Таблица 3</b>
Условие (объемное соотношение)
Относительная активность (%)
Пример 3
Раствор липазы: 10% US соевая мука (pH 7,8)
465
Сравнительный пример 2
Раствор липазы: 10% обезжиренный соевый порошок (pH 7,8)
22
Из результатов таблицы 3 очевидно, что активность липазы не может улучшаться при использовании обезжиренного соевого порошка, имеющего меньшее содержание жира.
Пример 4
2 г порошкообразного препарата липазы, полученного в примере 2 (изобретение 1), добавляли к 200 г ши-олеина (торговое название: Lipex205, производимый компанией Aarhuskarlshamn), и перемешивали при 60°С в течение 20 часов для проведения реакции трансэтерификации. 10 мкл полученной смеси брали в качестве образца с течением времени, разводили с помощью 1,5 мл гексана, и раствор, где порошкообразный препарат липазы был отфильтрован, брали в качестве образца для газовой хроматографии (GC). Соотношение дистеароил моноолеоил глицерина (смесь SSO и SOS) в составе триацилглицерида определяли по скорости реакции. Подобным образом, реакцию трансэтерификации проводили с порошкообразным препаратом липазы, полученным в сравнительном примере 1. В результате, как показано на фиг.1, очевидно, что активность фермента, полученного в примере 2, несомненно высокая.