Изолированная перфузия печени в эксперименте

ИЗОЛИРОВАННАЯ ПЕРФУЗИЯ ПЕЧЕНИ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

Беляев А.М.1, Котив Б.Н.2, Соловьёв И.А.2, Гафтон Г.И.1, Сенчик К.Ю.1,

Васильченко М.В.2, Суров Д.А.2, Лихачев ЕА2, Хомчук И.А.2, УДК: 616.36-089.819.6-092.4

Алексеев В.В.2, Киреева Г.С.1

1 ФГБУ «НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова» Минздрава России, Санкт-Петербург

2 Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова, Санкт-Петербург

Резюме

У пациентов с нерезектабельными метастазами колоректального рака в печень перспективным выглядит выполнение локорегиональной химиотерапии, позволяющей создавать высокие концентрации противоопухолевых препаратов в опухолевых клетках при минимальном повреждении здоровых тканей. Целью проводимого исследования являлось оценить в условиях эксперимента на лабораторных животных возможность и безопасность проведения изолированной перфузии печени, выбрать оптимальные режимы и технику выполнения этой процедуры. Исследование выполнено на 5 свиньях массой 25-55 кг. Была создана оригинальная техническая установка для осуществления перфузии печени. Разработана методика и поэтапная техника выполнения процедуры изолированной перфузии печени, при которой приток и отток перфузата осуществляется через воротную вену и нижнюю полую вену (участок выше отхождения печёночных вен) соответственно, а венозный возврат обеспечивается формированием дополнительного вено-венозного контура (bypass). Результаты интраоперационного мониторинга показателей витальных функций животных не выявили существенных нарушений, что говорит о хорошей переносимости процедуры. Все животные успешно перенесли операцию. Гистологическое исследование образцов печени, взятых во время и после перфузии, показало полную сохранность и жизнеспособность клеток печени. Изолированная перфузия печени является технически выполнимой, воспроизводимой и относительно безопасной процедурой.

Ключевые слова: метастазы печени, изолированная перфузия, ло-корегионарная химиотерапия.

ISOLATED HEPATIC PERFUSION IN TEST

Belaev A.M., Kotiv B.N., Solovjev I.A., Gafton G.I., Senchin K.Yu., Vasilchenko M.V., Surov D.A., Lihachev E.A., Homchuk I.A., Alekseev V.V, Kireeva G.S.

In patients with unresectable colorectal cancer metastasis to the liver locoregional chemotherapy, allowing to keep high concentration of antineoplastic drugs in tumor cells with minimal damage to healthy tissue, seems promising. The aim of the study was to evaluate in experimental conditions in laboratory animals, opportunities and safety of the isolated hepatic perfusion, to choose the optimal modes and techniques perform this procedure. The study was performed in 5 pigs with weight 25-55 kg. The original installation for the technical implementation of the hepatic perfusion was created. The method and the technique of stepwise procedure isolated hepatic perfusion in which the inflow and outflow of the perfusate is carried out through the portal vein and the inferior vena cava (the portion above the discharge of hepatic veins), respectively, and venous return is provided by the formation of additional veno-venous circuit was developed. The results of intraoperative monitoring indicators of vital functions of animals did not reveal significant abnormalities, suggesting good portability of the procedures. All the animals had surgery successful. Histological examination of liver samples taken during and after perfusion showed complete safety and vitality of the liver cells. The isolated hepatic perfusion is technically feasible, reproducible and relatively safe procedure.

Keywords: liver metastasis, isolated perfusion, locoregional chemioth-

erapy.

За последние 20 лет рак толстой кишки в структуре онкологической заболеваемости населения Российской Федерации значительно приблизился к лидирующим позициям. В 2014 году в России зарегистрировано 37384 новых случаев рака толстой кишки и 22010 смертей от него, а прирост стандартизованного показателя заболеваемости за 10 лет составил 23,8%. Ввиду мало-симптомного течения заболевания и зачастую поздней диагностики, у большинства пациентов с колорек-тальным раком всё чаще развивается метастатическое поражение печени [1, 3]. Наилучших результатов выживаемости пациентов с метастатическим поражением печени позволяет достичь хирургическая резекция. Так, пяти- и десятилетняя выживаемость пациентов с коло-ректальным раком после резекции печени составляет около 30 и 20% соответственно [12]. Однако, примерно в 80% случаев метастазы колоректального рака в печени являются нерезектабельными. Причинами, как правило, являются наличие распространенного опухолевого процесса, недостаточный объем печени с ненарушенным сосудистым притоком/оттоком или наличие сопутствующих заболеваний [13]. В этом случае используются агрессивные режимы системной химиотерапии, уровень ответа на которые составляет от 50 до 70%. Тем не менее, после первичного положительного ответа на

лечение опухолевый процесс в печени, как правило, продолжает прогрессировать, и тогда медиана продолжительности жизни (МПЖ) пациентов колеблется от 11 до 20 месяцев [14]. При отсутствии лечения МПЖ сокращается до 6-12 месяцев [15]. Соответственно, для улучшения результатов лечения стали разрабатываться способы, позволяющие контролировать течение не-резектабельного вторичного опухолевого поражения печени. Печень является органом, строение которого позволяет выполнить полную сосудистую изоляцию с целью направленной доставки химиопрепарата. Метастазы в печени снабжаются кровью преимущественно из печеночной артерии, тогда как основной источник крови для здоровых гепатоцитов - это воротная вена. Такое разобщение в кровоснабжении позволяет создавать высокую концентрацию химиопрепаратов в опухоли при ограниченной токсичности по отношению к нормальной паренхиме печени [16]. К основным вариантам локорегионарной химиотерапии опухолевого поражения печени относят локальную абляцию, печеночную артериальную инфузию, трансартериальную химиоэм-болизацию, и изолированную перфузию печени. Метод изолированной химиоперфузии успешно применяется в лечении местно-распространенных опухолей малого таза, конечностей, метастатического поражения легких

[2, 3, 5, 6]. В ряде клинических исследований была подтверждена эффективность процедуры изолированной перфузии печени у пациентов с нерезектабельными метастазами в печени [6, 9, 10]. Одновременно с этим сообщается, что смертность пациентов после данной процедуры может достигать 37,5% [17, 18]. Отсутствие универсальной методики проведения изолированной перфузии печени, несовершенство аппаратно-техниче-ского обеспечения и отсутствие обоснованных эффективных и безопасных режимов процедуры не позволяют говорить о рутинном выполнении перфузии печени в клинической практике.

Целью данного исследования являлось оценить в условиях эксперимента на лабораторных животных возможность и безопасность проведения изолированной перфузии печени, выбрать оптимальные режимы и технику выполнения этой процедуры.

Материалы и методы

Исследования выполнены на 5 свиньях породы вьетнамская вислобрюхая массой 25-55 кг. Перфузии выполнялись в условиях операционной вивария ФГБУ «НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова Минздрава России». Методика проведения исследования получила одобрение этического комитета Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова.

Изолированную перфузию печени выполняли у животных под внутривенным наркозом. Для премедикации использовался кетамин внутримышечно в дозировке 30 мг/кг. Перед интубацией трахеи было внутривенно введено 4 мг/кг тиопентала натрия, 0,04 мг/кг атропина и 0,5 мг/кг панкурония. Анестезия и мышечная релаксация поддерживалась в/в введением 8-10 мг/кг/ч пропофола, 0,15 мг/кг/ч фентанила, 0,6 мг/кг/ч панкурония. Частота дыхания составила 15 вдохов в минуту.

Для выполнения экспериментов была создана оригинальная система для изолированной перфузии печени. Основной контур перфузии (непосредственно для перфузии печени) состоял из следующих элементов (рис. 1): водяная термостатирующая баня с теплообменником (ЗАО «Лабораторное оборудование и приборы», Россия), роликовый насос для перфузии и роликовый насос оксигенатора (оба - Центральный научно-исследовательский и опытно-конструкторский институт робототехники и технической кибернетики, СПб, Россия), мембранный оксигенатор (Nipro Europe, Италия), воздушный фильтр (MAQUET, Германия), магистрали с соответствующими канюлями (MAQUET, Германия), датчики для определения температуры, давления. Дополнительный контур перфузии (для осуществления вено-венозного возврата во время перфузии) состоял из следующих элементов: роликовый насос (Центральный научно-исследовательский и опытно-конструкторский институт робототехники и технической кибернетики, СПб, Россия), магистрали и канюли соответствующего диаметра (MAQUET, Германия), датчик контроля давления.

Рис. 1. Основной контур для изолированной перфузии печени: А - мембранный оксигенатор, Б - водяная термостатирующая баня с теплообменником внутри, В - роликовый насос, Г - роликовый насос оксигенатора

Результаты

Нами была разработана и апробирована методика изолированной перфузии печени, которая состояла из следующих этапов:

1. Выделение магистральных сосудов. По срединной линии живота выполняли срединную верхне-нижнюю лапаротомию. Выделяли нижнюю полую вену в месте отхождения печёночных вен вплоть до диафрагмы (рис. 2), так же участок нижней полой вены выше и ниже печёночных вен, отрезок воротной вены в области ворот печени (рис. 3). Выделение наружной ярёмной вены на шее (рис. 4). На все выделенные сосуды накладывали турникеты.

2. Формирование вено-венозного возврата (bypass): сосудистый зажим Блелока накладывали на супраре-нальный сегмент нижней полой вены. Кисетные швы накладывали на наружную ярёмную вену и сегмент нижней полой вены ниже отхождения почечных вен, через которые, после рассечения сосудистой стенки, вводили канюли 6 и 3 Fr, соответственно. После введения канюль выполнялась системная гепаринизация в дозе 80 ЕД/кг. Перфузионный контур для осуществления вено-венозного возврата заполнялся 0,9% раствором натрия хлорида в объеме 500 мл, после чего он подключался к закрепленным канюлям. Скорость циркуляции перфузата в данном контуре составляла

Рис. 2. Поддиафрагмальный участок нижней полой вены

Рис. 3. Воротная вена

800 мл/мин., давление в контуре - 10 мм Таким образом, была обеспечена непрерывная циркуляция крови из системы нижней полой вены в верхнюю.

3. Сосудистая изоляция печени. Последовательно на сосуды накладывались зажимы:

- поддиафрагмальный сегмент нижней полой вены - выше отхождения печёночных вен; печёночная артерия - у входа в печень; участок портальной вены - у печени. Кисетные швы накладывались на нижнюю полую вену и воротную вену, через которые, после рассечения сосудистой стенки, вводились канюли 10 и 10 Fr, соответственно (рис. 5). Перфузионный контур для осуществления изолированной перфузии печени заполнялся 0,9% раствором натрия хлорида объемом 1000 мл с добавлением раствора гепарина натрия в количестве 5000 ЕД, после чего контур подключался к соответствующим канюлям. Приток и отток осуществляется через канюлированные воротную вену и нижнюю полую вену (участок, выше отхождения почечных вен) соответственно. Скорость циркуляции перфузата в основном контуре составляла 500 мл/мин., давление в контуре - 5 мм

4. Изолированная сосудистая перфузия печени в условиях нормотермии. После включения роликового насоса основного контура перфузии раствор из нижней полой вены поступает теплообменник, где поддерживается температура 38,0° С, далее - в мембранный оксигенатор с подключённым источником кислорода, после - в бассейн воротной вены. Общее время перфузии печени составило 45 минут.

Произведён забор крови из нижней полой и воротной вен на 15 минуте процедуры для определения газового состава.

До перфузии, на 15 мин., на 30 мин., после перфузии взята биопсия краевых отделов печени.

5. Завершающий этап. С печёночной артерии снимали сосудистый зажим. Извлекали канюли из нижней полой вены

Рис. 4. Ярёмная вена

Рис. 5. Изолированная перфузия печени: А - канюля в воротной вене, Б - канюля в нижней полой вене, В - зажим на печёночной артерии у входа в печень

61

и воротной вены, дефекты стенки ушиты. Снимали оставшиеся сосудистые зажимы для полного восстановления кровотока. Извлекали канюли из нижней полой вены (участок, ниже отхождения почечных вен) и наружной ярёмной вены. Дефекты стенок ушивали. Производилась нейтрализация гепарина внутривенным введением 1% раствора протамина-сульфата из расчёта 1,5 мг - на 100 ЕД гепарина. На протяжении всех перечисленных этапов перфузии выполнялся мониторинг функционального состояния животных с учетом следующих показателей: частота сердечных сокращений (ЧСС), артериальное давление (АД), частота дыхания (ЧД). Для этой цели был использован универсальный кибернетический комплекс регистрации и анализа параметров витальных функций «Телец» (Центральный научно-исследовательский и опытно-конструкторский институт робототехники и технической кибернетики, СПб, Россия). 6. Послойное ушивание ран.

Животных наблюдали в течение 6 часов после процедуры, после чего выводили из эксперимента путём введения летальных доз препарата для наркоза Золетил 100 мг/кг внутримышечно.

Показатели ЧСС, АД, ЧД животных во время перфузии (на 5 мин., 15 мин., 30 мин., 45 мин.) представлены в таблице 1. Во время изолированной перфузии колебания показателей были незначительны и не выходили за пределы нормы.

Газовый состав крови в нижней полой вене и воротной вене представлен в таблице 2. Кровь взята на 15 мин. перфузии из контура перфузии печени, а именно из воротной вены (приток крови к печени) и нижней полой вены (отток крови от печени). В эксперименте не выявлено широкого разброса значений показателей.

Во время выполнения изолированной перфузии не замечено изменения размеров печени и её цвета.

Гистологическое исследование печени: до перфузии (рис. 6), через 30 мин. (рис. 7), после перфузии (рис. 8).

По результатам гистологического исследования подтверждено отсутствие участков некроза в ткани печени; во взятых образцах не выявлено отёка клеток и сохранена ацинарная структура; центральные вены не расширены.

Заключение

Для лечения метастатического поражения печени изолированная химиоперфузия может успешно применяться наряду с наиболее распространёнными методами лечения, что подтверждается зарубежными авторами. Ввиду малого опыта применения данного метода в России, при его достаточной эффективности, необходимы дальнейшие исследования в этом направлении. В эксперименте подтверждено, что показатели функционального состояния организма животных были стабильны и существенно не изменялись во время всей процедуры. На всём протяжении эксперимента печень

Табл. 1. Изменение ЧСС, АД, ЧД в эксперименте

Показатель Значение

5 мин 15 мин 30 мин 45 мин

ЧСС, уд/мин 76-88 72-80 66-74 84-92

Систолическое АД, мм рт.ст. 104-116 108-122 110-118 124-130

ЧД, в мин 15 15 15 15

Табл. 2. Газовый состав крови

Показатель Приток крови к печени Отток крови от печени

РаО2, мм рт.ст. 87-93 36-45

РаСО2, мм рт.ст. 38-44 43-48

Рис. 6. Ткань печени до перфузии

Рис. 7. Ткань печени через 30 минут перфузии

Рис. 8. Ткань печени после перфузии

не меняла цвета, размеров. Сохранила свою клеточную структуру, обширного повреждения клеток не выявлено, что подтверждено гистологически. В связи с чем, можно заключить, что изолированная перфузия печени является

технически выполнимой и относительно безопасной, но требуются дальнейшие исследования в этом направлении. Необходима разработка и поиск оптимальных режимов перфузии (давления, скорости перфузии, степени оксиге-нации и пр.), определение показаний для данной процедуры (выбор одного или комбинации противоопухолевых препаратов, их дозы, временной интервал воздействия) с целью увеличения эффективности и снижения риска развития осложнений, развитие аппаратного обеспечения. В дальнейшем возможно внедрение данного метода для лечения метастазов печени.

Литература

1. Каприн А.Д. Злокачественные новообразования в России в 2014 году (заболеваемость и смертность) / В.В. Старинский, Г.В. Петрова // -М.: МНИОИ им. П.А.Герцена-Филиал ФГБУ«НМИРЦ» Минздрава России, - 2016. - С. 50-57.

2. Noter SL. Isolated hepatic perfusion with high-dose melphalan for the treatment of uveal melanoma metastases confined to the liver. / Rothbarth J, Pijl ME, et al. // Melanoma Res. - 2004. - No14. - P. 67-80.

3. Rizell M. Isolated hepatic perfusion for liver metastases of malignant melanoma. /Mattson J, Cahlin C, et al./ Melanoma Res. - 2008. - Vol. 8. - P. 120-26.

4. Yan L.N. Modified techniques for adult-to-adult living donor liver transplantation . Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International. - 2006. - N.5(2). - P. 173-9.

5. Тимофеева Е.С. Изолированная перфузия легкого цитостатиками. / Е.С. Тимофеева, Е.В. Левченко, В.М. Моисеенко// Вопросы онкологии. - 2011.

- Т. 57,- С. 147-154.

6. Beasley G.M. Prospective multicenter phase II trial of systemic ADH-1 in combination with melphalan via isolated limb infusion in patients with advanced extremity melanoma./ J.C. Riboh, C.K. Augustine, J.S. Zager, et al // J. Clin. 0ncol.-2011

- Vol. 29(9). - P. 1210-5.

7. Alexander H.R. Hepatic vascular isolation and perfusion for patients with progressive unresectable liver metastases from colorectal carcinoma refractory to previous systemic and regional chemotherapy. / S.K.Libutti, D.L.Bartlett, J.F.Pingpank, et al // Cancer. Vol.95(4) - P. 730-6.

8. Azoulay D. In situ hypothermic perfusion of the liver versus standard total vascular exclusion for complex liver resection./ R.Eshkenazy, P.Andreani, D.Castaing, et al// Ann. Surg.- ; Vol.241 (2). - P. 277-85.

9. Oldhafer K.J. High-dose mitomycin C in isolated hyperthermic liver perfusion for unresectable liver metastases./ M.K.Frerker, H.Lang, J.Fauler, et al // J. Invest. Surg.

- Vol.11(6). - P. 393-400.

10. Zeh H.J. 3rd. A phase I study of hyperthermic isolated hepatic perfusion with oxal-iplatin in the treatment of unresectable liver metastases from colorectal cancer./ C.K. Brown, M.P. Holtzman, M.J. Egorin, et al// Ann. Surg. Oncol. - 2009 - Vol.16(2).

- P. 385-94.

11. Van lersel L. Management of isolated nonresectable liver metastases in colorectal cancer patients: a case-control study of isolated hepatic perfusion with melphalan versus systemic chemotherapy./ M.Koopman, C. van de Velde, L. Mol,et al// Ann. Oncol. - 2010 - Vol.21. - P. 1662-67.

12. Fong Y. Clinical score for predicting recurrence after hepatic resection for metastatic colorectal cancer./ J. Fortner, R.L. Sun, M.F. Brennan, L.H.Blumgart // Ann. Surg.-1999-230. - P. 309-21.

13. Tzeng C., and Aloia T., Colorectal liver metastases. J. Gastrointest. Surg. - 2013 - Vol.17. P. 195-201.

14. Rothenberg M.C. Superiority of oxaliplatin and fluourouracil-leucovorin compared with either therapy alone in patients with progressive colorectal cancer after irinote-can and fluorouracil-leucovorin: interim results of a phase III trial. /A.M. Oza, R.H. Bigelow, J.D. Berlin, J.L. Marshall, R.K. Ramanathan, L.L. Hart, S. Gupta, C.A. Garay, B.G. Burger, N. Le Bail, D.G. Haller. // J. Clin. Oncol. - 2003 - Vol. 21.P. 2059-69.

15. Bengmark S. and Hafstrom L. The natural history of primary and secondary malignant tumors of the liver. I. The prognosis for patients with hepatic metastases from colonic and rectal carcinoma by laparotomy. Cancer. - 1969 - Vol. 23.P. 198-202.

16. de Brauw L., Pharmacological evaluation of experimental isolated liver perfusion and hepatic artery infusion with 5-fluorouracil./Marinelli A., Van de Velde C., Hermans, J., Tjaden U., Erkelens C. et al.// Cancer Res. - 1991 - Vol. 51. P. 1694-1700.

17. Noter S.L. Isolated hepatic perfusion with high-dose melphalan for the treatment of uveal melanoma metastases confined to the liver./ J. Rothbarth, M.E. Pijl, et al.// Melanoma Res. - 2004 - Vol.14. P. 67-72.

18. Rizell M. Isolated hepatic perfusion for liver metastases of malignant melanoma. / J. Mattson, C. Cahlin, et al.// Melanoma Res. - 2008 - Vol. 18. - P.120-6.

КОНТАКТНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

105203, г. Москва, ул. Нижняя Первомайская, 70 e-mail: nmhc@mail.ru

63