БИОРЕАКТОР ДЛЯ ПРОМЫШЛЕННОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК РАСТЕНИЙ В ГЛУБИННОЙ СУСПЕНЗИИ

Настоящая полезная модель относится к биотехнологии, а точнее, к промышленной биотехнологии клеток высших растений, продуцирующих ценные вещества растительной природы, трудно получаемые из интактных растений, или не синтезируемые в них.
Эта молодая отрасль биотехнологии открывает новые перспективы фармацевтической, парфюмерно-косметической и химической промышленности. Однако для коммерческого производства растительных клеточных продуктов необходимо успешное решение двух основных проблем: биологической - иметь высокопродуктивный штамм клеток и технологической - уметь масштабировать процесс. Клеточная культура, суперпродуктивная в лаборатории (шейкерные колбы), может не расти и/или не продуцировать целевой продукт в биореакторах большего масштаба.
Известны лишь отдельные примеры удачного промышленного масштабирования процесса культивирования клеток растений, приведенные в последних обзорах [Dornenburg Н., Knorr D. // Enzym. Microbiol. Technol. - 1995. - V.17. - P.p.674-684; Kieran P.M. et al. // J. Biotech. - 1997. - V.59. - P.p.39-52; Collin H.A. // Plant Growth Regulation. - 2001. - V.34. - P.p.119-134; Bourgand F. et al. // Plant Science. - 2001. - V.161. - P.p.839-851].
Из двух основных типов биореактров - культиваторов для клеток микроорганизмов (с механическим или пневматическим перемешиванием, соответственно), для крупномасштабного культивирования клеток растений чаще всего используют аппараты первого типа, обычно называемые баковыми реакторами с мешалкой и относимые к стандартным биореакторам.
Аппараты с пневматическим перемешиванием в зависимости от способа ввода газа в полость аппарата делятся на два подтипа: барботажные и эрлифтные. Последние имеют внутренний или внешний контур циркуляции культуральной суспензии под действием подаваемого газа. По форме пневматически перемешиваемые аппараты обычно выполняются в виде колонн с большим отношением их высоты к диаметру (до 2-3).
Механически перемешиваемые биореакторы по сравнению с пневматически перемешиваемыми, как отмечено [Dornenburg Н., Knorr D. // Enzym. Microbiol. Technol. - 1995. - V.17. - P.p.674-684], обеспечивают лучшее перемешивание культуры и массопередачу кислорода. Освоенные в серийном производстве, они доступнее и дешевле [Verpoorte R. et al. // Pure Appl. Chem. - 1994. - V.66. - N 10/11. - P.p.2307-2310].
2
3
Однако при этом они более энергоемки [ShugelK. // Bioreactor Design, Operation and Control. P.p.99-118]. Из-за наличия движущихся частей в аппарате высок риск контаминации и, главное, гибели клеток от сдвигового стресса [Dornenburg Н., Knorr D. // Enzym. Microbiol. Technol. - 1995. - V.17. - P.p.674-684]. Поэтому механически перемешиваемые реакторы трудно масштабируются. В обзорах [Verpoorte R. et al. // Pure Appl. Chem. - 1994. - V.66. - N 10/11. - P.p.2307-2310; Kieran P.M. et al. // J. Biotech. - 1997. - V.59. - P.p.39-52] отмечается, что в большинстве случаев масштабирование сопровождается снижением продуктивности, что связано с проблемами перемешивания и массопередачи. В частности, отмечено [Vogelman H. // 6-th Int. Ferment Symp. - London. - 1980. - P.p.839-851], что из-за больших напряжений сдвига, которые достигают 7000 дин·см, в аппарате вместимостью 20 м биомасса клеток табака, считающихся достаточно толерантными к сдвиговому стрессу, в 2-3 раза ниже, чем во встряхиваемых колбах.
Клетки растений весьма чувствительны к воздействию механических сил (удары лопастями мешалок, об стенки аппаратов) и срезывающих усилий, или напряжений турбулентных потоков слоев жидкостей. Эта чувствительность связана с большими размерами растительных клеток, относительной хрупкостью их целлюлозно-пектиновых оболочек, а также вакуолизацией [Липский А.Х. и др. // Культура клеток растений. «Наука», М., 1981. - С.51-68; Hooker B.S. et al. // Biotech. Bioeng. - 1990. - V.35. - P.p.296-304]. Подвергаясь воздействию определенного уровня стресса, клетки могут разрушаться или деформироваться, что вызывает их гибель или, по меньшей, но нежелательной мере, нарушение биосинтеза целевых продуктов. Исследователи пришли к заключению, что для успешного культивирования клеток растений в биореакторе необходимо иметь определенный компромисс таких эффектов, как перемешивание, массопередача кислорода, напряжение или скорость сдвига [Moo-Yong М., Chisti Y. // 8-th Int. Biotechn. Symp. - Paris. - V.1. - P.p.454-466].
Пневматически перемешиваемые биореакторы, особенно эрлифты, характеризуются более низким сдвигом по сравнению с механически перемешиваемыми и легко масштабируются, но хуже перемешиваются (особенно барботажные), из-за чего имеются мертвые зоны, происходит оседание клеток и более низка интенсивность массопередачи кислорода (особенно в эрлифте) [Dornenburg Н., Knorr D. // Enzym. Microbiol. Technol. - 1995. - V.17. - P.p.674-684].
Из проанализированного материала следует, что по большинству показателей (особенно по такому важному, как сдвиговый стресс) эрлифт предпочтительнее как механически перемешиваемых, так и барботажных биореакторов. Но в эрлифте менее интенсивна массопередача кислорода, что может не соответствовать потребностям культур с высокой дыхательной активностью при максимизации выхода биомассы и целевых продуктов.
Поэтому технической задачей настоящей полезной модели является создание конструкции эрлифта для промышленного культивирования клеток растений с условиями перемешивания, обеспечивающими необходимую интенсивность процесса массопередачи кислорода, отсутствие застойных зон и травмирования клеток.
Простейшей конструкцией эрлифта с внутренним контуром циркуляции может служить вертикальная цилиндрическая металлическая емкость с крышкой. Внутри емкость разделяется на две зоны примерно одинаковой площади с помощью трубы или вертикальной перегородки, расположенных обычно по центру емкости на некотором расстоянии от дна и крышки аппарата. Под одну из зон подают воздух (или, если необходимо, смесь газов), и в этой зоне газожидкостная смесь с биомассой поднимается вверх, а по другой зоне она, содержащая меньше газа, опускается вниз. Так происходит перемешивание культуральной суспензии, которое характеризуется параметром - временем полного перемешивания.
По существующим рекомендациям устройства эрлифтов, которые обычно представляют собой колонные аппараты с большим отношением высоты к диаметру, трубы (перегородки) также имеют большую высоту, равную по величине примерно двум - трем диаметрам аппарата [Moo-Yong М., Chisti J. // 8-th Int. Biotechn. Symp.- Paris. - V.1. - P.p.454-466]. Однако, как показали многочисленные исследования авторов для адекватного перемешивания в биореакторах для промышленного культивирования клеток растений в глубинной суспензии достаточно иметь высоту зон циркуляции в эрлифте примерно равной диаметру биореактора. Для этого в биореакторе для промышленного культивирования клеток растений в глубинной суспензии с пневматическим перемешиванием эрлифтного типа, внутри которого установлен вертикальный элемент, обеспечивающий создание внутреннего контура циркуляции культуральной суспензии с равной площадью зон входящего и нисходящего потоков, высота вертикального элемента составляет от 0,8 до 1,2 диаметра биореактора. При этом вертикальный элемент представляет собой сплошную перегородку по центру аппарата или коаксиально установленную трубу.
На представленных чертежах на фиг.1 показан биореактор для промышленного культивирования клеток растений в глубинной суспензии с внутренним вертикальным элементом в виде перегородки, а на фиг.2 - в виде коаксиально установленной трубы.
⌀
Биореактор на фиг.1 содержит обечайку 1 с отношением высоты к диаметру биореактора Н≈2D, внутреннюю перегородку 2 с отношением высоты к высоте биореактора h≈0,5 H и воздушный барботер 3 с диаметром <D/2. Биореактор заполнен культуральной суспензией 4.
⌀
Биореактор на фиг.2 содержит обечайку 1 с отношением высоты к диаметру биореактора Н≈2D, коаксиально установленную трубу 2 с отношением высоты к высоте биореактора h≈0,5 Н и отношением диаметра к диаметру биореактора  и воздушный барботер 3 с диаметром <D/2. Биореактор заполнен культуральной суспензией 4.
Биореактор работает следующим образом. В подготовленный биореактор загружают питательную среду, стерилизуют ее водяным паром требуемого давления в течение необходимого времени, после охлаждения среды до температуры культивирования вводят в нее клеточный инокулят, устанавливают постоянный температурный режим культивирования путем подачи в теплообменное устройство биореактор термостатируемой воды, (на чертеже не показано) Для перемешивания питательной среды с клетками, а также для подачи в нее кислорода и отвода других газов через барботер 3 подают стерильный воздух с постоянным увеличением его расхода по установленному графику по мере роста биомассы клеток, сопровождаемого повышением концентрации клеток и потребности их в кислороде (на общую массу). Насыщенная воздухом из барботера 3 культуральная суспензия поднимается в восходящей зоне (образуемой перегородкой 2) вверх, откуда, освобождаясь от воздуха, по нисходящей зоне опускается в низ биореактра. Таким образом происходит вертикальная циркуляция культуральной суспензии в биореакторе, ее перемешивание и массообмен с воздухом, кислородом и другими газами.
Кроме обеспечения требуемого перемешивания и массопередачи кислорода при высоте разделительных перегородок 2 указанного размера представляется возможным использовать в качестве конструктивной основы эрлифта с внутренним контуром циркуляции стандартные биореакторы бакового типа в их оснащении, у которых отношение общей высоты к диаметру составляет около 1,5-2. В этом случае вместо мешалки внутри биореактора размещается труба 2 с высотой, не превышающей его диаметр, (оптимально, как показано на фиг.2). Внизу одной из зон, образованных трубой 2, должен быть расположен воздушный барботер 3, устроенный согласно любой из приемлемых конструкций. Над верхним краем трубы 2 в ходе культивирования должен поддерживаться минимальный уровень жидкости, обеспечивающий перелив из восходящей в нисходящую зоны.
Авторы проводили опыты по культивирования клеток растений в биореакторах различных конструкций. В них культивировали, в частности, клетки стефании гладкой Stephania glabra (Roxb) Miers, представляющие коммерческий интерес в связи с возможным использованием их вторичнонго метаболита - алкалоида стефарина для производства медицинского препарата антихолинэстеразного действия - стефаглабрина сульфата.
-1
Клетки довольно успешно культивировали ранее в лабораторных биореакторах с перемешиванием механическим [Савина Т.А. и др. // II Междунар. конф. «Биология культивируемых клеток растений и биотехнология» - Алматы. - 1993. - С.193] и барботажным [Решетняк О.В. и др. // IX Междунар. конф. «Биология клеток растений in vitro и биотехнология». - Звенигород. - 2008. - С.322]. Емкость аппаратов - 14 и 20 л, соответственно. При этом было установлено, что для получения высоких выходов стефарина, как в шейкерных колбах, необходимо производить культивирование при довольно высоком значении коэффициента массопередачи кислорода, равном 17 ч и создаваемом в биореакторе с механическим перемешиванием. В барботажном биореакторе клетки в большей массе оседали у дна биореактора, что, возможно, разрушало их структуру и ухудшало массопередачу кислорода и питательных веществ между клетками и культуральной жидкостью. Удельный объемный выход биомассы был в 1,3 раза ниже, а содержание в ней стефарина в 1,6 раза меньше, чем в шейкерных колбах.
В связи с вышеизложенным исследовали культивирование клеток стефании гладкой в опытных биореакторах емкостью 100-250 л с перемешиванием механической мешалкой и пневматическим способом, как предлагается в настоящей полезной модели.
Результаты этих опытов изложены ниже.
Пример 1
Проводили культивирование в биореакторе БИОР-0,1 бакового типа емкостью 100 л отечественного производства (изготовитель - ОКБ ТБМ, г.Кириши, Ленинградская область) с механической мешалкой. Аппарат представляет собой вертикальную цилиндрическую емкость с внутренним диаметром 0,4 м, высотой - 0,81 м, снабженную теплообменной рубашкой, турбинной мешалкой с магнитной муфтой с регулируемым числом оборотов, штуцерами для ввода и вывода материальных потоков и установки КИП и А. Ранее такой аппарат был успешно использован для культивирования в заводских условиях (НПО «Восток», Кировская область) клеток женьшеня Panax ginseng С.А.Меу [Шамков Н.В. и др. // Биотехнология. - 1991. - №1. - С.32-34].
-
3
В стерильный аппарат БИОР-0,1 заливали 55 л питательной среды рекомендуемого состава [Савина Т.А. и др. // II Междунар. конф. «Биология культивируемых клеток растений и биотехнология» - Алматы. - 1993. - С.193], стерилизовали ее паром, устанавливали температуру (26±1)°С, засевали клеточной культурой, выращенной в шейкерных колбах, из расчета 30 г сырой биомассы на 1 л свежей питательной среды в аппарате. Включали минимальное перемешивание (150 об/мин) и подачу стерильного воздуха от 60 л/ч и, возможно, выше при наличии роста клеток (требуемое максимальное значение коэффициента массопередачи кислорода 17 ч1 достигается в данном аппарате при подаче воздуха 2 м/ч). Культивирование проводили с периодическим отбором проб на анализ концентрации клеток, их жизнеспособности и содержания стефарина.
За время культивирования в аппарате не обнаружено роста клеток, а доля жизнеспособных снизилась с 85% до 30%.
Аналогичным образом проводили культивирование клеток стефании гладкой в биореакторе БИОР-0,25 бакового типа (высота 1 м, диметр 0,6 м) емкостью 250 л с мешалкой при минимальной скорости 100 об/мин. В аппарат загружено 150 л свежей питательной среды и в общем подготовка культивирования проведена, как описано выше. Получены по существу аналогичные результаты. Сырая биомасса - 18 г/л (засеяно 30 г/л), сухая - 2 г/л, содержание стефарина - 0,14% по сухой биомассе, доля жизнеспособных клеток - 54%.
Таким образом, условия культивирования в испытанных стандартных биореакторах бакового типа при скорости вращения мешалки в диапазоне 100-150 об/мин оказались неприемлемыми для выращивания клеток стефании гладкой.
Пример 2
3
На базе стандартного биореактора БИОР-0,1 бакового типа вместимостью 100 л сконструирован эрлифтный аппарат с внутренним циркуляционным контуром. Для этого в полости аппарата вместо мешалки коаксиально смонтировали металлическую трубу внутреннего диаметра 0,25 м на высоте 0,31 ми на расстоянии 0,09 м от днища аппарата. Под трубой горизонтально расположили кольцевой воздушный барботер диаметром 0,15 м, имеющий вверху отверстия для выхода воздуха диаметром по 1,5 мм на расстоянии 20 мм друг от друга. В этом модернизированном аппарате максимально требуемое значение коэффициента массопередачи кислорода для культивирования клеток стефании гладкой достигается при подаче воздуха до 4 м/ч.
3
В созданном эрлифтном аппарате, подготовленном технологически и засеянном исходной культурой из шейкерных колб аналогично изложенному выше (пример 1), провели культивирование клеток стефании гладкой вышеописанным способом, но с перемешиванием только сжатым воздухом (без мешалки), подаваемым через кольцевой барботер в коаксиальную трубу. Подача воздуха на аэрацию составляла от 0,06 м/ч и выше в зависимости от текущей концентрации биомассы. Культивирование осуществляли периодическим способом циклами до 2-х недель каждый до достижения максимальной концентрации клеток.
Таким образом, проведено более 10 циклов культивирования с получением концентрации клеток по сырой биомассе от 200 до 300 г/л, по сухой - от 13 до 18 г/л при доле жизнеспособных клеток 80-90%. Содержание стефарина в сухой биомассе, определенное экстракционно фотоколориметрическим методом [Бидниченко Ю.И. // Дис. канд. фарм. наук. - Львов. - 1990], составляло в среднем 0,2%. Эти показатели статистически не отличаются от тех, которые наблюдались в параллельных опытах культивирования клеток в шейкерных колбах: сырая биомассы - 200-400 г/л, сухая биомасса - 15-21 г/л, жизнеспособность клеток 80-90%, содержание стефарина в среднем 0,2%.
Пример 3
Аналогично вышеописанному провели культивирование клеток стефании гладкой в эрлифтном аппарате вместимостью 250 л, созданном на базе стандартного биореактора бакового типа с мешалкой БИОР-0,25. На месте мешалки установили коаксиальную трубу диаметром 0,4 м высотой 0,5 м от днища аппарата. Под ней разместили воздушный барботер диаметром 0,24 м с отверстиями диаметром 1,5 мм на расстоянии по 20 мм.
В эрлифтном биореакторе на базе БИОР-0,25, содержащем 150 л культуральной суспензии, проведено культивирование клеток стефании гладкой со следующим результатом: сырая биомасса - 200 г/л, сухая биомасса - 13 г/л, доля живых клеток - 80%, содержание стефарина в сухой биомассе - 0,2%. Эти показатели практически не отличаются от полученных в эрлифте емкостью 100 л, а также в шейкерных колбах.
Таким образом, в аппаратах емкостью 100 и 250 л, обустроенных согласно настоящему предложению, практически проведено масштабирование процесса культивирования клеток растений от лабораторного уровня (шейкерные колбы).
Таким образом, авторами создана конструкции эрлифтного биореактора для промышленного культивирования клеток растений с условиями перемешивания, обеспечивающими необходимую интенсивность процесса массопередачи кислорода, отсутствием застойных зон и травмированием клеток.