Способ хирургического лечения дефектов роговицы различного генеза
METHOD FOR SURGICAL TREATMENT OF CORNEAL DEFECTS OF VARIOUS ORIGINS

Предлагаемое изобретение относится к офтальмологии и предназначено для лечения дефектов роговицы различной этиологии.
Согласно данным ВОЗ на долю заболеваний роговицы приходится около четверти всех глазных болезней, а слепота, вызванная повреждениями роговицы, составляет от 4 до 5% во всем мире. В Российской Федерации проблема стоит еще более остро. Причиной роговичной слепоты выступают язвенные поражения роговицы, которые относятся к числу тяжелой патологии, трудно поддающейся лечению.
Для лечения персистирующих дефектов роговицы в качестве консервативного лечения применяется интенсивная терапия с использованием антибиотиков, противовирусных, противовоспалительных, десенсебилизирующих препаратов, ингибиторов протеаз, средств улучшающих трофику и регенерацию, а также слезозаменителей [Ченцова Е.В. Система патогенетически обоснованного лечения ожоговой травмы глаз: Экспериментально-клиническое исследование / Моск. НИИ глазных болезней. - Москва, 1996. - 40 с. Майчук Д.Ю. Рецидивирующие эрозии роговицы: особенности возникновения и лечения // Новое в офтальмологии. 2014. №3. С. 72.]. Однако при использовании консервативной терапии часто не удается достигнуть восстановления ткани роговицы.
Основным способом лечения дефектов роговицы. остается хирургическое вмешательство на роговице.
Известен способ лечения эпителиальных дефектов роговицы путем фиксации амниотической мембраной аутологичного тромбофибринового сгустка [Alio J.L., Arnalich-Montiel F, Rodriguez AE. The role of "eye platelet rich plasma" (E-PRP) for wound healing in ophthalmology. // Curr Pharm Biotechnol. 2012 Jun; 13(7): 1257-65]. Для получения сгустка у пациента производят забор 40-60 мл венозной крови непосредственно перед операцией, после одноступенчатого центрифугирования отбирали плазму, ближайшую к эритроцитам, избегая слоя лимфоцитов. Концентрация тромбоцитов в БоТП в 2-3 раза выше, чем в цельной крови. Один миллилитр полученной БоТП помещали в каждую лунку 4-луночного планшета с плоским дном и добавляли 50 мкл 10% хлорида кальция для активации, затем инкубировали при t 37°C в течение 30 минут. Через 30 минут формировался сгусток БоТП, готовый к наложению на дефект поверхности роговицы с фиксацией его под амниотической мембраной.
Применение этого способа не всегда приводит к эпителизации роговицы. Вероятно, это вызвано особенностями сгустка БоТП, во время изготовления которого используется активатор свертывания в виде хлорида кальция, и 30 минутная инкубация при t 37°C, что может повышать риск контаминации патогенной микрофлорой. Также у способа есть ряд недостатков: возможная дислокация сгустка, сгусток препятствует благотворному воздействию амниотической мембраны на поврежденную поверхность роговицы, невозможность стандартизировать величину сгустка и количеству функционирующих тромбоцитов, что может приводить к недостаточной отдаче факторов роста.
Известен способ того же назначения, включающий применение амниотической мембраны для лечения язв роговицы, при котором покрывают язву роговицы амниотической мембраной и фиксируют с помощью непрерывного П-образного шва, устанавливают мягкую контактную линзу на роговицу и проводят латеральную блефарорафию (патент RU 2607163 С1, 23.12.2016). В способе применяют консервированный силиковысушенный амнион. Однако такой способ консервации, при хорошей сохранности структуры и клеточного состава амниона, характеризуется нежизнеспособностью клеток и уменьшением их количества, что снижает концентрацию факторов роста - важнейшей составляющей успешного заживления дефектов эпителия. Данный способ принят за ближайший аналог.
Известен способ лечения эрозий роговицы с помощью инсталляций лизата БоТП на фоне стандартной антибактериальной, противовоспалительной, репаративной терапии, показавший большую эффективность в сравнении со стандартной схемой лечения. Однако при инсталляции лизат БоТП быстро вымывается из конъюнктивальных сводов слезой, сокращая время воздействия ростовых факторов на поврежденную роговицу (Н.В. Боровкова, И.А. Филатова, Е.В. Ченцова, Е.В. Федосеева, Ю.А. Павленко, С.А. Шеметов, А.О. Петрова, И.Н. Пономарев. Эффективность применения лизата богатой тромбоцитами плазмы БоТП у пациентов с эрозией роговицы или посттравматическим рубцеванием тканей век. Российский офтальмологический журнал, 2020; 13(3):8-14).
Задачей изобретения является создание комбинированного способа лечения дефектов роговицы с помощью биоконструкции.
Техническим результатом предлагаемого способа является полноценная эпителизация дефектов роговицы с сокращением сроков реабилитации и сохранением прозрачности роговицы.
Технический результат достигается за счет совместного синергического действия амниотической мембраны и аутологичного лизата БоТП.
Амниотическая мембрана выступает как биологическая повязка, имеет низкую иммуногенность и отсутствие реакций отторжения, ускоряет эпителизацию, угнетает ангиогенез, воспаление, фиброз, обладает анальгезирующим и антимикробным эффектом против ряда микроорганизмов. Хотя силиковысушенная амниотическая мембрана имеет преимущества перед другими методами консервации в простоте изготовления, удобстве хранения и в хорошей сохранности структуры, но отличается нежизнеспособностью клеток и уменьшением их количества. Аутологичный лизат БоТП насыщает амниотическую мембрану широким набором цитокинов и факторов роста, которые постепенно выходят из амниотической мембраны по мере ее деградации и под воздействием слезы, что еще больше усиливает анаболические и регенеративные процессы в роговице, при этом амниотическая мембрана и контактная линза удерживают лизат БоТП от вымывания.
Нами было проведено исследование по оценке биосовместимости и рост-стимулирующего эффекта биоконструкции на основе амниона, обогащенного аутолизатом БоТП in vitro. В работе использовали культуру буккального эпителия человека 5 пассажа. Образцы амниотической мембраны площадью 0,5 мм помещали на дно опытных лунок до посева клеток. В контрольные и опытные лунки вносили по 10 тыс. клеток буккального эпителия. В опытах с лизатом БоТП объем используемого лизата определяли, исходя из оптимального содержания тромбоцитарного фактора роста в исходной БоТП. Объем лизата составил 25 мкл. Общее время культивирования составляло 3 суток. По завершении эксперимента производили подсчет клеток в тысячах. Результаты показали биосовместимость и взаимное потенцирование рост-стимулирующего эффекта биоконструкции на основе амниона и лизата БоТП по сравнению с контрольными группами.
2
Были проведены дополнительные эксперименты по определению необходимой длительности обработки амниона лизатом БоТП для полного пропитывания амниона. Для этого были взяты кусочки амниотической мембраны 5×10 мм на бумажном носителе, и произведено их взвешивание. Далее кусочки помещали в чашку Петри с лизатом БоТП. Через 1, 3, 5, 10, 15 и 20 минут их вынимали из лизата и взвешивали повторно. Также в эксперименте использовали амнион, отделенный от подложки для подсчета того, сколько лизата БоТП на единицу площади будет доставлено на роговицу после наложения. Дельта межу весом до пропитывания и после свидетельствует о количестве лизата БоТП в амнионе. Результаты показали, что оптимальная длительность пропитывания силиковысушенной амниотической мембраны составляет 5 минут.
БоТП изготавливается по патенту RU 2681753 С1, 23.03.2020 из стабилизированной венозной крови пациента. Процесс получения состоит из взятия 20 мл венозной крови, взятой из кубитальной вены, центрифугирования ее в течение пяти мнут при 300g. Богатая тромбоцитами плазма забирается из верхней части пробирки так, чтобы над клеточным осадком осталось не меньше 1 мм плазмы. Далее проводят центрифугирование в течение 17 минут при 700g. Повторно отбирают верхнюю часть плазмы так, чтобы ее над осадком осталось 3,1 мл. Далее проводят количественный анализ функциональных тромбоцитов путем витального окрашивания флуорохромными красителями трипафлавином и акридиновым оранжевым с помощью флуоресцентного микроскопа. Для получения лизата пробирку с БоТП замораживают до температур - 80°С, с последующей разморозкой при температуре 2-6°С и центрифугированием 20 минут при 3000g. Вся надосадочная часть - это лизат БоТП, который отбирается и помещается в пробирку. Из 20 мл крови получается около 2 мл лизата БоТП. На дно стерильного контейнера для сбора биоматериала (100 мл) выливают 2 мл лизата БоТП, туда же пинцетом помещают фрагмент силиковысушенной амниотической мембраны эпителием вниз. 2 мл - это объем, достаточный для полного погружения амниотической мембраны и гарантированно достаточный для полного пропитывания мембраны любого требуемого для нас размера.
Способ применили у 10 пациентов с язвами различной этиологии: ожоговой, трофической, вирусной. Результаты применения показали положительную динамику во всех случаях. В 2-х случаях было достаточно одного применения. В 7-ми потребовалось повторное покрытие амниотической мембраной, пропитанной аутологичным лизатом БоТП. В одном случае с тяжелым ожогом для полной эпителизации потребовалось 3 покрытия амниотической мембраной, пропитанной лизатом БоТП.
Способ осуществляют следующим образом
Насыщают силиковысушенную амниотическую мембрану лизатом аутологичной богатой тромбоцитами плазмы (БоТП) в объеме 2 мл в течение 5 минут. Осуществляют покрытие деэпителизированной поверхности роговицы амниотической мембраной, пропитанной лизатом БоТП. Дополнительно фиксируют мягкой контактной линзой. Проводят временную латеральную блефарорафию. Через 5-7 дней швы снимают, амниотическую мембрану удаляют. При отсутствии полной эпителизации процедуру повторяют.
Клинический пример 1.
Пациент Р., 32 Года. Диагноз: Химический (щелочной) ожог роговицы и конъюнктивы 2-3 ст. правого глаза
Со слов пациента два месяца назад в правый глаз попал растворитель из краскопульта, появилась боль, зрение резко снизилось, глаз покраснел. В тот же день по скорой помощи был доставлен в больницу по месту жительства, где был выставлен диагноз: Химический ожог роговицы и конъюнктивы правого глаза. Было назначено консервативное лечение: Окомистин, Левомицетин, Флоксал мазь, Ибупрофен в таблетках. Почувствовал некоторое улучшение зрения и уменьшение боли через 3 недели и самостоятельно прекратил лечение. Через неделю обратился в кабинет неотложной помощи НМИЦ имени Гельмгольца, откуда был госпитализирована по неотложным показаниям с диагнозом язва роговицы, ожоговая болезнь правого глаза.
При поступлении предъявлял жалобы на резкое снижение зрения, боли в глазу, светобоязнь, выраженный блефароспазм. Острота зрения правого глаза - 0,1. Конъюнктива гиперемирована, роговица отечная, в верхненаружном квадранте язва с подрытыми краями, 3.0×4.0 мм. Было проведено покрытие силиковысушенной амниотической мембраной, обогащенной лизатом БоТП (в течение 5 минут в объеме 2 мл), фиксированного к лимбальной зоне непрерывным кисетным швом 10-0, надета мягкая контактная линза и проведена временная латеральная блефарорафия. Через 7 дней после снятия швов с века и удаления МКЛ роговица была прозрачная, не окрашивалась флуоресцеином. Острота зрения правого глаза 0,4, блефароспазм уменьшился. В связи с успешным заживлением язвы больной выписан под наблюдение офтальмолога по месту жительства. Таким образом удалось добиться эпителизации дефекта роговицы в кратчайшие сроки.
Клинический пример 2.
Пациент Б. 55 лет. Диагноз травматическая язва роговицы левого глаза.
Со слов пациента 13 дней назад в левый глаз попала металическая стружка. Обратился в поликлинику по месту жительства, где после удаления инородного тела проходил консервативное амбулаторное лечение безрезультатно. Был направлен в НМИЦ имени Гельмгольца для госпитализации в стационар.
При поступлении жалобы на боль, светобоязнь и снижение зрение левого глаза. Острота зрения 0,1 н.к.
Конъюнктива гиперемирована, роговица отечная с язвой 2×3 мм в центральной зоне, глубжележащие структуры соответствуют норме. Нами было проведено покрытие амниотической мембраной, обогащенной лизатом БоТП, согласно нашему методу. Спустя 6 дней были сняты швы, мягкая контактная линза и амниотическая мембрана. На роговице осталась эрозия эпителия роговицы 2×2 мм, роговичный синдром купировался, острота зрения 0,3. Через 4 дня консервативного лечения эпителизация была завершена. Острота зрения составляла 0,6. За 2 месяца наблюдения динамика была положительная, рецидивов не было, острота зрения повысилась до 0,8. Таким образом, удалось избежать осложнений и повысить остроту зрения, а также добиться быстрого заживления роговичного дефекта.
Клинический пример 3.
Пациентка М., 43 года. Диагноз: ожог роговицы и конъюнктивы известью 2-3 ст. правого глаза.
Со слов пациентки две недели назад в правый глаз попала известь. Больная в течение 2-х недель проходила стационарное терапевтическое лечение по месту жительства, которое имело слабоположительную динамику. Лечащим врачом было принято решение направить пациентку в НМИЦ имени Гельмгольца.
При поступлении предъявляла жалобы на боли в глазу, светобоязнь, слезотечение - выраженный роговичный синдром, блефароспазм. Острота зрения - движение руки у лица. Конъюнктива гиперемирована, участки ишемии по конъюнктивальным сводам, роговица полупрозрачная (матовое стекло), отечная, шероховатая, субтотальная эрозия роговицы на 18-й день после травмы. Проведено покрытие силиковысушенной амниотической мембраной, обогащенной лизатом БоТП, фиксированного к лимбальной зоне непрерывным кисетным швом 10-0, надета мягкая контактная линза и проведена временная латеральная блефарорафия. Через 5 дней проведено снятие швов с века и удаление МКЛ. На роговице осталась только эрозия 3×3 мм, роговичный синдром купировался, острота зрения 0,02. В связи с сохранившемся дефектом было принято решение о повторном наложении амниотической мембраны, обогащенной лизатом БоТП. Через 7 дней было произведено снятие швов и удаление МКЛ, под которой была полностью эпителизорованная роговица, а острота зрения составляла 0,2. Таким образом, удалось избежать осложнений и повысить остроту зрения, а также добиться быстрого заживления роговичного дефекта.
Клинический пример 4.
Пациента Ю., 41 год. Диагноз: Язва послойного кератотрансплантата правого глаза.
Со слов пациента травмировал роговицу правого глаза веткой. По м/ж проходил стационарное консервативное лечение язвы роговицы в течение 2-х недель безрезультатно. Был направлен в НМИЦ им. Гельмгольца, где проходил стационарное лечение в отделе вирусных и инфекционных заболеваний. Из-за отсутствия эффекта от консервативного лечения и образования десцеметоцеле было принято решение о проведении субтотальной неавтоматизированной передней послойной кератопластики с наложением обычной амниотической мембраны. Спустя 3 месяца пациент поступил с жалобами на низкое зрение, боль, дискомфорт в правом глазу. Острота зрения - движение руки у лица. Глаз гиперемирован, центральная язва 6×5 мм полупрозрачного отечного послойного кератотрансплантата, швы чистые, провисшие, передняя камера средней глубины, влага прозрачная, радужка структурная, зрачок круглый, в центре, глубжележащие структуры не просматривались из-за помутнения роговицы.
Проведено удаление провисших роговичных швов и покрытие силиковысушенной амниотической мембраной, обогащенной лизатом БоТП, фиксированной к лимбальной зоне непрерывным кисетным швом 10-0, надета мягкая контактная линза и проведена временная латеральная блефарорафия. Через 6 дней удалили швы и мембрану, сохранялась язва 1×2 мм с каймой эпителиопатии. В связи с сохранившемся дефектом было принято решение о повторном наложении амниотической мембраны, обогащенной лизатом БоТП. Через неделю язвы не наблюдалось, была полная эпителизация, сохранилось легкое помутнение в оптической зоне, а острота зрения составляла 0,1. При наблюдении в течение 70 дней рецидива язвы не было, сохранялась полная эпителизация.