Способ дифференцированного лечения эрозий и язв роговицы
METHOD FOR DIFFERENTIATED TREATMENT OF CORNEAL EROSIONS AND ULCERS

Предлагаемое изобретение относится к офтальмологии и предназначено для дифференцированного лечения эрозий и язв роговицы различной этиологии в зависимости от глубины дефекта. По данным ВОЗ, причиной слепоты у 5% населения мира являются заболевания роговицы. Роговица постоянно подвержена влиянию различных агрессивных факторов внешней среды из-за своих топографических особенностей. Эрозии и язвы роговицы являются чаще всего хроническим процессом, пусковым механизмом развития которых являются: инфекционный процесс, ожоги, механическая травма роговицы, хирургическое вмешательство.
Уровень техники
Традиционная консервативная терапия пациентов с повреждениями роговицы предполагает применение противовоспалительных, антибактериальных препаратов, стимуляторов регенерации роговицы (Декспантенол, Солкосерил), сульфатированных гликозаминогликанов для ускорения репаративных процессов в роговице. Хирургическое лечение представляет собой чаще всего поверхностную кератэктомию, с последующим покрытием роговицы амниотической мембраной [Макаров П.В., Кугушева А.Э., Слепова О.С., Ченцова Е.В., Хазамова А.И. // Российский офтальмологический журнал - N2, 2015. С. 41-44]. Также применяют в качестве хирургического лечения фототерапевтическую кератэктомию. Однако такое лечение не всегда сопровождается полным и долгосрочным восстановлением ткани роговицы. Кроме того, использование антибактериальных и противовирусных препаратов оказывает угнетающее действие на репаративные функции ткани, учитывая механизм их действия, подразумевающий нарушение процессов синтеза ДНК, нередко приводит к необходимости хирургического лечения, включая пересадку роговицы.
Альтернативным методом лечения является применение различных продуктов аутологичных тромбоконцентратов. Наиболее частым и перспективным является применение богатой тромбоцитами плазмы (БоТП или platelet rich plasma - PRP). На протяжении многих лет она успешно используется для купирования воспаления и ускорения регенерации различных тканей [Foster Т.Е., Puskas B.L., Mandelbaum B.R., Gerhardt М.В., Rodeo S.A. Platelet-rich plasma: from basic science to clinical applications. Am J Sports Med. 2009, vol. 37, №11, pp. 2259-2272].
Лечение с помощью препаратов аутологичной богатой тромбоцитами плазмы основано на том факте, что факторы роста тромбоцитов поддерживают три фазы каскада заживления ран - воспаление, пролиферация, моделирование. Основное научное обоснование данной терапии заключается в том, что инъекция концентрированных тромбоцитов в места повреждения может инициировать восстановление тканей за счет высвобождения биологически активных факторов (факторов роста, цитокинов, лизосом) и белков адгезии, которые ответственны за запуск гемостатического каскада, синтез новой соединительной ткани и реваскуляризацию. Кроме того, белки плазмы, такие как: фибриноген, протромбин и фибронектин, присутствуют во фракции плазмы с низким содержанием тромбоцитов. Тромбоконцентраты могут стимулировать супрафизиологическое высвобождение факторов роста, чтобы ускорить заживление хронических травм и ускорить процесс заживления острых повреждений [Everts Р.А.М., Кnаре J.T.A., Weibrich G.,  J.P., Hoffmann J., Overdevest Е.Р., Box H.A.M., Van Zundert A. Platelet-Rich Plasma and Platelet Gel: A Review. J. Extra Corpor. Technol. 2006; 38:174-187]. На всех этапах процесса восстановления ткани широкий спектр факторов роста, цитокинов вносит вклад в большинство основных функций клеток через эндокринные, паракринные, аутокринные механизмы. Основными преимуществами БоТП являются его безопасность и оригинальные методы приготовления биологического препарата, который может быть использован в широком спектре патологий [Andia I., Maffulli N. A contemporary view of platelet-rich plasma therapies: Moving toward refined clinical protocols and precise indications. Regen. Med. 2018; 13:717-728. doi: 10.2217/rme-2018-0042]. Однако алгоритм применения продуктов БоТП при повреждениях роговицы не разработан по настоящее время. Применение препаратов аутологичных тромбоцитов в офтальмологии не имеет стандартизированных методик и носит весьма ориентировочный характер.
При лечении повреждения роговицы главной задачей является купирование воспалительной реакции, усиление и ускорение репарации, чего можно добиться посредством применения биологически активных пептидов, содержащихся в гранулах тромбоцитов человека. Известно, что альфа-гранулы тромбоцитов содержат более 30 цитокинов и факторов роста, которые способствуют улучшению репаративных процессов в тканях. Факторы роста, высвобождаемые из активированных тромбоцитов, инициируют и модулируют заживление ран [Nurden А.Т., Nurden P., Sanchez M., Andia I., et al. Platelets and wound healing. // Front. Biosci., 2008, 13, 3532-3548].
Известен способ лечения герпетических эрозий роговицы с помощью БоТП (патент RU 2653260, 05.07.18). Лечение проводят в два этапа. На первом этапе в течение трех недель проводят противовирусную, антибактериальную, репаративную терапию. На втором этапе добавляют инстилляции богатой тромбоцитами плазмы 6 раз в день в сочетании с субконъюнктивальной инъекцией богатой тромбоцитами плазмы 1 раз в неделю. Длительность лечения составляет от 3 до 5 недель. При такой форме применения БоТП отсутствие клинического эффекта в ряде случаев может быть связано с недостаточной концентрацией цитокинов в месте повреждения роговицы за счет смывания или разбавления БоТП слезной жидкостью.
Известен способ лечения эрозивных и других повреждений роговицы с помощью аутологичного тромбофибринового сгустка, который фиксируют амниотической мембраной (Alio J.L., Amalich-Montiel F, Rodriguez AE. The role of "eye platelet rich plasma" (E-PRP) for wound healing in ophthalmology. // Curr Pharm BiotechnoL 2012 Jun; 13(7):1257-65]. Для получения сгустка у пациента производят забор 40-60 мл венозной крови непосредственно перед операцией, после одноступенчатого центрифугирования отбирают плазму, ближайшую к эритроцитам, избегая слоя лимфоцитов. Концентрация тромбоцитов в БоТП в 2-3 раза выше, чем в цельной крови. Один миллилитр полученной БоТП помещали в каждую лунку 4-луночного планшета с плоским дном и добавляли 50 мкл 10% хлорида кальция для активации, затем инкубировали при t37°C в течение 30 минут. Через 30 минут формировался сгусток БоТП, готовый к наложению на дефект поверхности роговицы с фиксацией его под амниотической мембраной.
Данные способы актуальны, но не отражают дальнейшего алгоритма лечения, в зависимости от площади или глубины поражения, а описаны при отдельных патологиях. Кроме того, еще одним недостатком данных способов является отсутствие методик стандартизации плазмы по количеству функционально полноценных тромбоцитов, в связи с этим получаемый эффект может быть неоднозначным. Данный способ принят за ближайший аналог.
Задачей изобретения является разработка алгоритма лечения эрозий и язв роговицы с помощью продуктов аутологичной богатой тромбоцитами плазмы, в зависимости от объема поражения.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является повышение эффективности лечения в зависимости от характера и глубины повреждения роговицы с ускорением заживления поврежденной поверхности роговицы, формированием помутнения меньшей интенсивности при глубоких повреждениях, снижением частоты рецидивов.
Технический результат достигается за счет использования трех форм введения препаратов богатой тромбоцитами плазмы в зависимости от характера и глубины повреждения роговицы - лизата в инстилляциях и инъекциях и покрытия тромбофибриновым сгустком, фиксированным амниотической мембраной, в сочетании с лимбальными инъекциями сыворотки, полученных из аутоплазмы.
Важным аспектом является наличие трех форм препарата, которые позволяют обеспечить целевую концентрацию цитокинов в течение определенного времени. При эрозиях роговицы достаточно наименее инвазивного способа введения - инстилляций лизата БоТП. При язвах глубиной 100 мкм и менее необходимо более длительное воздействие ростстимулирующих факторов, что обусловливает применение субконъюнктивальных инъекций лизата. При глубоких язвах (более 100 мкм глубиной) необходимо использование БоТП в виде покрытия тромбофибриновым сгустком, фиксированным амниотической мембраной, в комбинации с субконъюнктивальным введением сыворотки, с целью «тампонирования» дефекта, а также медленного выхода из клеток ростстимулирующих и противовоспалительных цитокинов. Таким образом, можно получить более длительное, постепенное терапевтическое воздействие непосредственно в зоне повреждения роговицы пациента.
Использование терапевтически значимого уровня биологически активных факторов в зоне повреждения в виде тромбофибринового сгустка (БоТП), характеризующегося содержанием функционально полноценных тромбоцитов (с гранулами) в определенной концентрации, что обеспечивает наиболее полноценный эффект в зоне повреждения роговицы.
Субконъюнктивальное введение по лимбу в 4-х квадрантах аутологичной сыворотки оказывает стимулирующее влияние на клетки лимбальной зоны, а вместе с тем усиление процессов регенерации роговицы. Сочетание эффекта от присутствующего на поверхности роговицы тромбофибринового сгустка и введенной аутологичной сыворотки обеспечивает усиление лечебного эффекта.
Тарзорафия и амниотическая мембрана действуют как дополнительная биологическая повязка, препятствующая смещению сгустка и защищающая переднюю поверхность глаза от внешних воздействий, что также вносит свой вклад в получение наиболее адекватного клинического эффекта.
Способ осуществляют следующим образом.
9
У пациента с поражением роговицы применяют для лечения продукт богатой тромбоцитами аутоплазмы (БоТП). При этом используют при эрозии и язве роговицы глубиной 100 мкм и менее лизат БоТП, полученный из богатой тромбоцитами плазмы, содержащей количество тромбоцитов не менее 1000*10 кл/л и с долей функционально полноценных тромбоцитов не менее 38%. При эрозии проводят инстилляций лизата БоТП по 1 капле 3 раза в день до полного заживления. При язве глубиной 100 мкм и менее - субконъюнктивальные инъекции 1 раз в день через день по 0.5 мл всего 3 инъекции. При язве роговицы глубиной более 100 мкм - покрытие роговицы тромбофибриновым сгустком, фиксированным амниотической мембраной, в сочетании с субконъюнктивальным введением по лимбу в 4-х квадрантах аутологичной сыворотки в общем объеме 1 мл. Выполняют тарзорафию.
9
Для получения лизата богатой тромбоцитами плазмы у пациентов забирали 20 мл венозной крови в пробирки с антикоагулянтом ЭДТА. С сохранением стерильности кровь подвергали двухэтапному центрифугированию, выделяя тромбоциты. Затем определяли концентрацию тромбоцитов в суспензиии и проводили морфофункциональный анализ. Конечные концентрации тромбоцитов составляли >1000*10, тромбоцитов с гранулами 38% и более. После этого производили лизирование клеток путем замораживания до -40°C с последующим дефростированием при температуре +4°С в течение 10-12 ч. После чего пробирку центрифугировали с ускорением 3000g с целью осаждения разрушенных клеток Надосадочную плазму отбирали и разделяли на несколько доз. Хранение лизата осуществляли при температуре +4°С.
9
Для получения тромбофибринового сгустка у пациента проводили забор венозной крови по тому же принципу. Кровь подвергали двухэтапному центрифугированию, после чего, с сохранением стерильности, отбирали ближайшую к эритроцитам плазму с тромбоцитами. Из 20 мл крови получали 3 мл БоТП с концентрацией тромбоцитов не менее 1000×10 кл/л. Для получения сгустка один миллилитр полученной БоТП помещали в пробирку с круглым дном и добавляли 50 мкл 10% хлорида кальция для активации тромбоцитов. После чего, плазму инкубировали при t 37°С в термостате до формирования геля. В результате констрикции гель разделялся на сгусток и сыворотку.
Всем пациентам перед началом лечения проводили базовое офтальмологическое исследование, оптическую когерентную томографию. На полученных результатах лечения большой группы пациентов с различной степенью повреждения роговицы был разработан определенный алгоритм дифференцированного лечения в зависимости от степени повреждения роговицы.
Клинический пример 1.
9
Пациентка К. поступила в отделение с жалобами на снижение зрения, дискомфорт в левом глазу. В анамнезе - химический ожог неизвестной жидкостью 9 лет назад; многократные реконструктивные операции на веках. Две недели назад произошло обострение кератоконъюнктивита, по месту жительства выявили эрозию роговицы (Фиг. 1а - Дефект роговицы на момент начала лечения), проводили консервативное лечение - безуспешно. Нами начато лечение с помощью инстилляций лизата богатой тромбоцитами плазмы, содержащей количество тромбоцитов не менее 1000*10 кл/л и с долей функционально полноценных тромбоцитов не менее 38%, при этом провели инстилляций лизата БоТП по 1 капле 3 раза в день до полного заживления.
При осмотре на 7 сутки лечения лизатом отмечается уменьшение интенсивности помутнения за счет снижения отека, роговица не окрашивается флюоресцеином (Фиг. 1б - Роговица на 7-е сутки лечения). При наблюдении в динамике в течение 3-х месяцев рецидива не было.
Клинический пример 2.
9
Пациентка Н. поступила в отделение с жалобами на боли, снижение зрения на левом глазу. В анамнезе операция на веках (блефаропластика), после которой появились дискомфорт и сухость в глазах. В течение 3-х последних месяцев отмечает светобоязнь, боль, слезотечение, был поставлен диагноз OS трофическая рецидивирующая язва роговицы с глубиной поражения 20 мкм (Фиг. 2а - На момент начала применения лизата, 2б - Данные ОСТ, глубина дефекта 20 мкм). Начато лечение с помощью субконъюнктивальных инъекций лизата БоТП, содержащего количество тромбоцитов не менее 1000*10 кл/л и с долей функционально полноценных тромбоцитов не менее 38%, 1 раз в день через день по 0.5 мл, всего 3 инъекции.
Через одну неделю после начала лечения отмечали уменьшение глубины дефекта, снижение интенсивности окрашивания.
При осмотре на 14 сутки дефект полностью эпителизировался, отмечалось уменьшение отека роговицы (с 667 мкм до 645 мкм) (Фиг. 2в - На 14-е сутки от начала применения лизата, 2г - Данные ОСТ на 14 сутки).
Клинический пример 3.
Пациент В., поступил в стационар: постожоговая язва роговицы с субтотальной конъюнктивизацией, лимбально-клеточная недостаточность правого глаза. Из анамнеза: со слов ожог произошел в быту (кипятком). Находился на стационарном лечении по месту жительства, где проводили длительную консервативную терапию. Спустя 3 месяца после травмы пациент обратился в НМИЦ с жалобами на отсутствие предметного зрения, ощущение инородного тела, слизистое отделяемое из глаза.
При поступлении Vis OD pr.l.certae OS 1.0. При осмотре глазная щель сужена. В центре роговицы язва диаметром 5,5×5,0 мм, с неоднородной рыхлой поверхностью глубиной 110 мкм (фиг. 3а - Дефект роговицы на момент обращения).
Учитывая, что пациенту проводилась длительная репаративная терапия с использованием кератопротекторов без видимого эффекта, принято решение о применении тромбофибринового сгустка.
Полученный сгусток уложили на поверхность роговицы, затем сверху покрыли амниотической мембраной (Фиг. 3б - Сгусток уложен на поверхность роговицы, фиксирован амниотической мембраной). Мембрану фиксировали к эписклере по границе лимба циркулярным швом, по лимбу в 4-х квадрантах произвели инъекции аутологичной сыворотки. После этого была выполнена блефарорафия.
На 5 сутки произвели расшивание век. Амниотическая мембрана и остатки тромбофибринового сгустка были удалены для оценки эпителизации. При осмотре выявлено равномерное окрашивание флюоресцеином. Площадь эрозии сократилась до 4,0×4,0 мм, обрела более четкие границы (Фиг. 3в - Клиническая картина на 5-е сутки, после снятия конструкции).
Учитывая положительную динамику, но не полное закрытие дефекта, процедуру повторили. Пациент был выписан под амбулаторное наблюдение с необходимостью осмотра через 2 недели. При повторном осмотре, после снятия швов с век и удаления остатков амниотической мембраны с роговицы, наблюдали уменьшение инъекции глазного яблока, роговица полностью эпителизировалась, не окрашивалась флюоресцеином. Vis OD счет пальцев у лица эксцентрично (Фиг. 3г - Клиническая картина на 14-е сутки, роговица не окрашивается флюоресцеином).
Таким образом, предложенный способ дифференцированного лечения эрозий и язв роговицы позволяет добиться адекватных лечебных результатов.