СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ МУЛЬТИСПЕЦИФИЧЕСКОГО СВЯЗЫВАЮЩЕГО АГЕНТА
METHOD FOR MULTISPECIFIC BINDING AGENT DETECTION

В настоящем изобретении предложен способ обнаружения мультиспецифического связывающего агента в образце, в котором мультиспецифический связывающий агент выявляют, используя антиидиотипические антитела к различным связывающим специфичностям мультиспецифического связывающего агента.
Предпосылки создания изобретения
Стандартные твердофазные иммуноанализы с использованием антител включают создание комплекса между антителом, адсорбированным/иммобилизованном на твердой фазе («захватывающее» антитело), антигеном и антителом к другому эпитопу антигена, которое конъюгировано с ферментом или выявляемой меткой (меченое антитело). При осуществлении анализа образуется сэндвич: твердая фаза/»захватывающее» антитело/антиген/меченое антитело. Среди прочего, в реакции, катализируемой сэндвичем, активность конъюгированного с антителом фермента является пропорциональной концентрации антигена в среде для инкубации. Анализы с применением антиидиотипических антител упомянуты, например, в US 5219730; WO 87/002778; ЕР 0139389 и ЕР 0170302. У Wadhwa М. и др. (J. Immunol. Methods 278, 2003, сс. 1-17), описаны стратегии обнаружения, измерения и характеризации нежелательных антител, индуцированных терапевтическими биологическими агентами. Метод получения антиидиотипических антител описан в ЕР 1917854.
В WO 2008/119353 описаны биспецифические антитела и методы их получения. Методы определения двухвалентности терапевтических агентов на основе белка и антитела описаны в WO 2006/096697. В WO 2008/134046 описаны эффективные стабильные не обладающие иммуносупрессорным действием антитела к CD4. У Muller K.M. с соавторами отмечено, что в качестве домена гетеродимеризации для биспецифических миниантител можно применять первый константный домен (СН1 и CL) антитела.
Краткое изложение сущности изобретения
Установлено, что путем применения двух антиидиотипических антител в качестве «захватывающего» и меченого антитела в сэндвич-иммуноанализе для определения количества мультиспецифического антитела в образце, если при этом каждое из антиидиотипических антител связывается с различными связывающими специфичностями мультиспецифического антитела, можно минимизировать влияния, связанные с матриксом образца (таким, например, как сыворотка или человеческая плазма, антигены и т.д.). Кроме того, можно применять процедуру анализа, которая является более чувствительной, меньше подвержена воздействиям матрикса образца, которую можно осуществлять более быстро, при осуществлении которой требуется минимальное удаление/разведение матрикса образца и которая является более гибкой касательно мечения/дериватизации/иммобилизации «захватывающего» и/или меченого антитела соответственно. Для этой цели применяют два антиидиотипических антитела, одно, направленное против первой связывающей специфичности биспецифического антитела, и одно, направленное против второй связывающей специфичности биспецифического антитела.
Таким образом, в настоящем описании представлен способ (иммунологического) определения количества мультиспецифического связывающего агента в образце, заключающийся в том, что осуществляют стадии, на которых:
- определяют количество комплекса, образованного между
I) антиидиотипическим антителом, которое специфически связывается с первой связывающей специфичностью мультиспецифического связывающего агента, и
II) мультиспецифическим связывающим агентом
посредством инкубации комплекса с антиидиотипическим антителом, которое специфически связывается со второй связывающей специфичностью мультиспецифического связывающего агента, которая отличается от первой связывающей специфичности мультиспецифического антитела, и тем самым определяют количество мультиспецифического связывающего агента в образце.
В одном из вариантов осуществления изобретения антиидиотипическое антитело, которое специфически связывается с первой связывающей специфичностью мультиспецифического связывающего агента, конъюгируют с твердой фазой.
В одном из вариантов осуществления изобретения антиидиотипическое антитело, которое специфически связывается со второй связывающей специфичностью мультиспецифического связывающего агента, конъюгируют с выявляемой меткой.
В одном из вариантов осуществления изобретения образец содержит (человеческую) сыворотку или (человеческую) плазму и/или представляет собой клеточный лизат, и/или сдержит один или несколько антигенов мультиспецифического связывающего агента. В одном из вариантов осуществления изобретения образец представляет собой (человеческую) сыворотку или (человеческую) плазму.
В одном из вариантов осуществления изобретения мультиспецифический связывающий агент выбирают из антитела, слитого полипептида, который содержит антитело или фрагмент антитела и не представляющий собой антитело полипептид, слитого полипептида, который содержит антитело или фрагмент антитела и растворимый рецептор, или слитого полипептида, который содержит антитело или фрагмент антитела и пептидную связывающую молекулу.
В одном из вариантов осуществления изобретения мультиспецифический связывающий агент представляет собой антитело. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело представляет собой биспецифическое антитело, или триспецифическое антитело, или тетраспецифическое антитело, или пентаспецифическое антитело, или гексаспецифическое антитело. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело представляет собой биспецифическое антитело.
В одном из вариантов осуществления изобретения связывающая специфичность представляет собой связывающий сайт или пару, состоящую из вариабельного домена тяжелой цепи антитела и вариабельного домена легкой цепи антитела.
В одном из вариантов осуществления изобретения антиидиотипическое антитело, которое специфически связывается с первой связывающей специфичностью мультиспецифического связывающего агента, является биотинилированным, а твердая фаза сенсибилизирована стрептавидином. В одном из вариантов осуществления изобретения твердая фаза представляет собой сенсибилизированную стрептавидином парамагнитную гранулу или сенсибилизированную стрептавидином сефарозную гранулу.
В одном из вариантов осуществления изобретения антиидиотипическое антитело, которое специфически связывается со второй связывающей специфичностью мультиспецифического связывающего агента, является дигоксигенилированным.
В одном из вариантов осуществления изобретения способ заключается в том, что осуществляют стадии, на которых
- определяют количество комплекса, образованного между
I) антиидиотипическим антителом, которое специфически связывается с первой связывающей специфичностью мультиспецифического связывающего агента,
II) мультиспецифическим связывающим агентом и
III) антиидиотипическим антителом, которое специфически связывается со второй связывающей специфичностью мультиспецифического связывающего агента и содержит выявляемую метку,
путем определения выявляемой метки в образовавшемся комплексе.
В одном из вариантов осуществления изобретения конъюгацию антиидиотипического антитела с его партнером по конъюгации осуществляют путем химического связывания через N-концевые и/или ε-аминогруппы (лизин), ε-аминогруппы различных лизинов, карбоксильные, сульфгидрильные, гидроксильные и/или фенольные функциональные группы аминокислотного каркаса, представляющего собой лекарственное средство антитела и/или группы сахарного спирта углеводной структуры, представляющего собой лекарственное средство антитела.
В одном из вариантов осуществления изобретения антиидиотипическое антитело представляет собой смесь, содержащую антиидиотипическое антитело, конъюгированное с твердой фазой по меньшей мере через две различные аминогруппы. Указанное сочетание через различные аминогруппы можно осуществлять путем ацилирования части ε-аминогрупп с помощью химических защитных агентов, например, на первой стадии путем цитраконилирования. На второй стадии конъюгацию осуществляют через оставшиеся аминогруппы. Затем цитраконовые группы удаляют и антитело конъюгируют с твердой фазой через оставшиеся свободные аминогруппы, т.е. полученное антитело конъюгировано с твердой фазой через аминогруппы, которые не были защищены путем цитраконилирования. Приемлемые химические защитные агенты образуют связи на незащищенных боковых цепях аминов и являются менее стабильными и отличаются от связей на N-конце. Известно много указанных химических защитных агентов (см., например, ЕР 0651761). В одном из вариантов осуществления изобретения химические защитные агенты включают циклические ангидриды дикарбоновых кислот типа ангидрида малеиновой или цитраконовой кислоты.
В одном из вариантов осуществления изобретения антиидиотипическое антитело конъюгируют с твердой фазой путем пассивной адсорбции. Пассивная адсорбция описана, например, у Butler J.E. в: «Solid Phases in Immunoassay», 1996, сс. 205-225 и в «Immunoassays», под ред. Diamandis Е.Р. и Christopoulos T.K., изд-во Academic Press, San Diego, 1996.
В одном из вариантов осуществления изобретения антиидиотипическое антитело конъюгируют (иммобилизуют) через специфическую связывающуюся пару. Указанную связывающуюся пару (первый компонент/второй компонент) в одном из вариантов осуществления изобретения выбирают из стрептавидина или авидина /биотина, антитела/антигена (см., например, Hermanson G.T. и др. Bioconjugate Techniques, изд-во Academic Press, 1996), лектина/полисахарида, стероида/связывающего стероид белка, гормона/рецептора гормона, фермента/субстрата, IgG/белка А и/или G и т.д. В одном из вариантов осуществления изобретения антиидиотипическое антитело конъюгируют с биотином и иммобилизацию осуществляют через иммобилизованный авидин или стрептавидин.
Описание чертежей
На чертежах показано:
на фиг. 1 - схематическое изображение принципа фармакокинетического анализа ELISA, предназначенного для определения концентраций биспецифических антител в образцах сыворотки и клеток (ELISA на основе антиидиотипических антител);
на фиг. 2 - схема основанного на применении антигенов сэндвич-ELISA, предназначенного для выявления антитела к VEGF/ANG2. Рекомбинантным человеческим ангиопоэтином 2 непосредственно сенсибилизировали титрационный микропланшет. Параллельно осуществляли предварительную инкубацию образцов, содержащих антитела к VEGF/ANG2, с меченным дигоксигенином рекомбинантным VEGF. После сенсибилизации планшет отмывали и инкубировали с предварительно инкубированной смесью. Комплексы антитела к VEGF/ANG2 и меченного дигоксигенином VEGF связывались с ANG2 на поверхности титрационного микропланшета. Связанный меченный дигоксигенином VEGF выявляли с помощью конъюгата антитело к дигоксигенину-HRP и ABTS;
на фиг. 3 - результаты сравнения калибровочных кривых, полученных с помощью основанного на применении антигенов ELISA (А, целевой анализ) и основанного на применении антиидиотипических антител ELISA (Б, анти-ID-анализ) для обнаружения биспецифического антитела к VEGF/ANG2;
на фиг. 4 - результаты сравнения калибровочных кривых, полученных с помощью основанного на применении антиидиотипических антител ELISA и основанного на применении антигенов ELISA в присутствии 5%, 10% и 20% человеческой сыворотки.
Подробное описание изобретения
В настоящем изобретении предложен способ in vitro определения количества мультиспецифического связывающего агента, такого как биспецифические антитела/лекарственные средства, в образцах, полученных в доклинических и клинических исследованиях.
Было установлено, что мультиспецифический связывающий агент в образце можно выявлять с помощью двух антиидиотипических антител, которые связываются с различными связывающими специфичностями мультиспецифического связывающего агента, для того, чтобы минимизировать влияния матрикса образца и обеспечивать большую степень гибкости схемы и процесса осуществления иммунологического определения количества мультиспецифического связывающего агента в образце.
В представленном ниже в настоящем описании способе, приведенном в качестве примера, в качестве варианта мультиспецифического связывающего агента применяют мультиспецифическое антитело.
Понятие «антитело» в контексте настоящего описания применяют в его наиболее широком смысле, и оно относится к антителам различной структуры, включая (но, не ограничиваясь только ими) моноклональные антитела, поликлональные антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела) и фрагменты антител, если они сохраняют требуемую активность в отношении связывания с антигеном.
В некоторых вариантах осуществления изобретения мультиспецифический связывающий агент представляет собой мультиспецифическое антитело, например биспецифическое антитело. Мультиспецифические антитела представляют собой моноклональные антитела, которые имеют специфичности, связывающиеся по меньшей мере с двумя различными сайтами. В некоторых вариантах осуществления изобретения одна из специфичностей связывается с первым антигеном, в другая со вторым отличным от него антигеном. В некоторых вариантах осуществления изобретения биспецфические антитела могут связываться с двумя различными эпитопами одного и того же антигена. Биспецифические антитела можно получать в виде полноразмерных антител или фрагментов антител. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело представляет собой биспецифическое антитело, которое специфически связывается с первым и вторым антигеном. В одном из вариантов осуществления изобретения биспецифическое антитело имеет I) первую связывающую специфичность, которая специфически связывается с первым антигеном или первым эпитопом антигена, и II) вторую связывающую специфичность, которая специфически связывается со вторым антигеном или вторым эпитопом этого же антигена. В одном из вариантов осуществления изобретения второй эпитоп этого же антигена представляет собой неперекрывающийся эпитоп.
Мультиспецифические антитела описаны в WO 2009/080251, WO 2009/080252, WO 2009/080253, WO 2009/080254, WO 2010/112193, WO 2010/115589, WO 2010/136172, WO 2010/145792 или WO 2010/145793.
2
Понятие «фрагмент антитела» относится к молекуле, отличной от интактного антитела, которая содержит часть интактного антитела, связывающуюся с антигеном, с которым связывается интактное антитело. Примеры фрагментов антитела включают (но, не ограничиваясь только ими) Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab'); димерные антитела (диабоди); линейные антитела; молекулы одноцепочечных антител (например, scFv) и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител.
Понятие «класс» антитела относится к типу константного домена или константной области, который/которая входит в его тяжелую цепь. Известно пять основных классов антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM и некоторые из них можно подразделять дополнительно на подклассы (изотипы), например IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2. Константные домены тяжелой цепи, которые соответствуют различным классам иммуноглобулина, обозначают как α, δ, ε, γ и μ соответственно.
Понятие «свободный антиген» означает антиген, который может быть специфически связан связывающей специфичностью антитела, но который в рассматриваемый момент времени не связан с указанной связывающей специфичностью. В одном из вариантов осуществления изобретения свободный антиген представляет собой несвязанный антителом антиген или не образующий комплекс с антителом антиген.
Понятие «Fc-область» в контексте настоящего описания относится к С-концевой области тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит по меньшей мере часть константной области. Понятие включает нативную последовательность Fc-областей и вариант Fc-областей. В одном из вариантов осуществления изобретения Fc-область тяжелой цепи человеческого IgG простирается с Cys226 или с Pro230 до карбоксильного конца тяжелой цепи. Однако С-концевой лизин (Lys447) Fc-области может присутствовать или отсутствовать. Если специально не указано иное, то нумерация аминокислотных остатков в Fc-области или константной области соответствует системе нумерации EU, которую обозначают также как EU-индекс, описанной у Kabat Е.А. и др. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-ое изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991, NIH публикация 91-3242.
Понятие «каркасный участок» или «FR» означает аминокислотные остатки вариабельного домена, отличные от остатков гипервариабельного участка (HVR). FR вариабельного домена, как правило, состоит из четырех FR-доменов: FR1, FR2, FR3 и FR4. Таким образом, последовательности HVR и FR, как правило, расположены в VH (или VL) в следующем порядке: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-Н3(L3)-FR4.
«Человеческое антитело» представляет собой антитело, которое имеет аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности антитела, продуцируемого человеком или человеческой клеткой, или выведенную из источника, отличного от человека, с использованием спектра человеческих антител или других кодирующих человеческое антитело последовательностей. Указанное определение человеческого антитела специально исключает гуманизированное антитело, содержащее нечеловеческие антигенсвязывающие остатки.
Понятие «гуманизированное» антитело относится к химерному антителу, которое содержит аминокислотные остатки из нечеловеческих HVR и аминокислотные остатки из человеческих FR. В некоторых вариантах осуществления изобретения гуманизированное антитело может содержать практически все из по меньшей мере одного и, как правило, двух вариабельных доменов, в которых все или практически все HVR (например, CDR) соответствуют участкам нечеловеческого антитела, а все или практически все FR соответствуют участкам человеческого антитела. Гуманизированное антитело необязательно может содержать по меньшей мере часть константной области антитела, выведенной из человеческого антитела. Понятие «гуманизированная форма» антитела, например нечеловеческого антитела, относится к антителу, которое подвергнуто гуманизации.
Понятие «гипервариабельный участок» или «HVR» в контексте настоящего описания относится к каждому из участков вариабельного домена антитела, последовательности которых являются гипервариабельными и/или образуют петли определенной структуры («гипервариабельные петли»). Как правило, нативные четырехцепочечные антитела содержат шесть HVR; три в VH (H1, Н2, Н3) и три в VL (L1, L2, L3). HVR, как правило, содержат аминокислотные остатки из гипервариабельных петель и/или из «определяющих комплементарность участков» (CDR), последние обладают наибольшей вариабельностью последовательности и/или или участвуют в распознавании антигена. Приведенные в качестве примера гипервариабельные петли включают аминокислотные остатки 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (Н2) и 96-101 (Н3) (Chothia С. и Lesk A.M., J. Mol. Biol. 196, 1987, сс. 901-917). Приведенные в качестве примера CDR (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3) включают аминокислотные остатки 24-34 в случае L1, 50-56 в случае L2, 89-97 в случае L3, 31-35 В в случае H1, 50-65 в случае Н2 и 95-102 в случае Н3 (Kabat Е.А. и др. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-oe изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD,1991, публикация NIH 91-3242). За исключением CDR1 в VH, CDR, как правило, содержат аминокислотные остатки, которые образуют гипервариабельные петли. CDR содержат также «определяющие специфичность остатки» или «SDR», которые представляют собой остатки, контактирующие с антигеном. SDR входят в области CDR, которые обозначают как «сокращенные»-CDRs или a-CDR. Приведенные в качестве примера a-CDR (a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2 и a-CDR-H3) включают аминокислотные остатки 31-34 в случае L1, 50-55 в случае L2, 89-96 в случае L3, 31-35 В в случае H1, 50-58 в случае Н2 и 95-102 в случае Н3 (Almagro J.С. и Fransson J., Front. Biosci. 13, 2008, сс. 1619-1633). Если не указано иное, то HVR-остатки и другие остатки в вариабельном домене (например, FR-остатки) в контексте настоящего описания нумеруют по Кэботу с соавторами (см. выше).
В контексте настоящего описании понятие «моноклональное антитело» относится к антителу, полученному из популяции практически гомогенных антител, т.е. входящие в популяцию индивидуальные антитела являются идентичными и/или связываются с одним и тем же эпитопом за исключением возможных вариантов, которые могут возникать при получении моноклонального антитела, такие варианты, как правило, присутствуют в небольших количествах. В отличие от препаратов поликлональных антител, которые включают различные антитела к различным детерминантам (эпитопам), мишенью каждого моноклонального антитела является одна детерминанта антигена. Таким образом, прилагательное «моноклональный» указывает на тот отличительный признак, что антитело получено из практически гомогенной популяции антител, и оно не подразумевает требования, что антитело должно быть получено каким-либо конкретным методом. Например, моноклональные антитела, предназначенные для применения согласно настоящему изобретению, можно создавать с помощью различных методов, включая (но, не ограничиваясь только ими) метод гибридом, методы рекомбинантной ДНК, методы фагового дисплея и методы, основанные на применении трансгенных животных, которые содержат все локусы человеческих иммуноглобулинов или их часть, указанные методы и другие приведенные в качестве примеров методы получения моноклональных антител представлены ниже в настоящем описании.
Понятие «вариабельная область» или «вариабельный домен» относится к домену тяжелой или легкой цепи антитела, который принимает участие в связывании антитела с антигеном. Вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи (VH и VL соответственно) нативного антитела, как правило, имеют сходные структуры, при этом каждый домен содержит четыре консервативных каркасных участка (FR) и три гипервариабельных участка (HVR) (см., например, Kindt T.J. и др. Kuby Immunology, 6-ое изд., изд-во W.H. Freeman и Co., N.Y. 2007, с. 91). Индивидуального VH- или VL-домена может быть достаточно для обеспечения специфического связывания с антигеном. Кроме того, антитела, которые связываются с конкретным антигеном, можно выделять, используя VH-или VL-домен из антитела, которое связывается с антигеном, для скрининга библиотеки комплементарных VL- или VH-доменов соответственно (см., например, Portolano S. и др., J. Immunol. 150, 1993, сс. 880-887; Clackson Т. и др. Nature 352, 1991, сс. 624-628).
Понятие «антиидиотипическое антитело» относится к антителу, которое специфически связывается со связывающей специфичностью, такой как связывающий сайт родительского антитела, т.е. которое направлено, например, против антигенсвязывающего сайта родительского антитела. В одном из вариантов осуществления изобретения антиидиотипическое антитело специфически связывается с одним или несколькими CDR родительского антитела. В одном из вариантов осуществления изобретения родительское антитело представляет собой терапевтическое антитело. В одном из вариантов осуществления изобретения родительское антитело представляет собой мультиспецифическое антитело. В одном из вариантов осуществления изобретения родительское антитело представляет собой биспецифическое антитело.
5
Два эпитопа являются перекрывающимися, если обнаружено снижение сигнала на 50% или более, в одном из вариантов осуществления изобретения на 75% или более, с помощью анализа поверхностного плазмонного резонанса (SPR), в котором используют иммобилизованное антитело и растворимый антиген или наоборот, при использовании изучаемого эпитопа в концентрации 20-50 нМ, а антитело, которое связывается с перекрывающимися эпитопами, может быть обнаружено в концентрации 100 нМ. В альтернативном варианте можно применять метод, в котором перекрывание эпитопов двух антител, связывающихся с одним и тем же антигеном, определяют с помощью конкурирующей тест-системы. Например, для этой цели с помощью иммуноферментного клеточного анализа (ELISA), в котором применяют клетки, экспрессирующие эпитопы рекомбинантного антигена, определяют, может ли антитело, для которого требуется обнаружить перекрывание эпитопов, конкурировать с другим антителом за связывание с иммобилизованным антигеном. Для этой цели иммобилизованный антиген инкубируют с антителом в меченой форме и определяют избыток антитела, для которого требуется обнаружить перекрытие эпитопов. Путем оценки связанной метки можно легко обнаруживать перекрывание эпитопов. Если снижение сигнала составляет более 70%, в одном из вариантов осуществления изобретения - более 80%, при одной или той же концентрации, или вытеснение составляет более 80%, в одном из вариантов осуществления изобретения - более 90%, при более высоких концентрациях, в одном из случаев при 10-кратном избытке антитела, для которого требуется обнаружить перекрывание эпитопов, относительно известного антитела, то считается, что присутствуют идентичные эпитопы или перекрывающиеся эпитопы, и оба антитела связываются с одним и тем же или с перекрывающимся эпитопом на одном и том же антигене.
Принципы различных иммуноанализов описаны, например, у Hage D.S. Anal. Chem. 71, 1999, сс. 294-304). У Lu В. и др. Analyst 121, 1996, сс. 29-32 описана ориентированная иммобилизация антител, предназначенных для применения в иммуноанализах. Опосредуемые авидином-биотином иммуноанализы описаны, например, у Wilchek М. и Bayer Е.А., Methods Enzymol. 184, 1990, сс. 467-469.
В белках моноклональных антител и их константных доменов содержится ряд реакционно-способных боковых цепей, пригодных для сочетания с партнером по связыванию, таким как поверхность, белок, полимер (например, ПЭГ, целлюлоза или полистирол), фермент или компонент связывающейся пары. Химическими реакционно-способными группами антител являются, например, аминогруппы (лизины, альфа-аминогруппы), тиольные группы (цистины, цистеины и метионины), группы карбоновых кислот (аспарагиновые кислоты, глутаминовые кислоты) и группы сахарных спиртов. Указанные методы описаны, например, у Aslam М. и Dent А. в «Bioconjugation», изд-во MacMillan Ref. Ltd., 1999, сс. 50-100.
a
Одной из наиболее часто встречающихся реакционно-способных групп белков является алифатический ε-амин аминокислоты лизина. В целом, практически все антитела содержат лизин в большом количестве. Амины лизина представляют собой достаточно хорошие нуклеофилы при значении pH выше 8,0 (pK=9,18) и поэтому легко и полностью вступают во взаимодействие с различными реагентами с образованием стабильных связей.
Реакционно-способные в отношении аминов реагенты сначала вступают во взаимодействие с лизинами и α-аминогруппами белков. Реакционно-способные сложные эфиры, прежде всего сложные N-гидроксисукцинимидные (NHS) эфиры, относятся к одним из наиболее широко применяемых реагентов для модификации аминных групп. Оптимальное значение pH реакции в водной среде составляет от 8,0 до 9,0. Изотиоцианаты представляют собой модифицирующие амин реагенты и образуют тиомочевинные связи с белками. Они взаимодействуют с аминами белков в водном растворе (оптимально при pH 9,0-9,5). Альдегиды взаимодействуют в мягких водных условиях с алифатическими и ароматическими аминами, гидразинами и гидразидами с образованием иминного промежуточного продукта (основание Шиффа). Основание Шиффа можно избирательно восстанавливать с помощью слабых или сильных восстановителей (таких, как борогидрид натрия или цианборогидрид натрия) с получением стабильной алкиламинной связи. Другие реагенты, которые применяли для модификации аминов, представляют собой ангидриды карбоновых кислот. Например, ангидрид диэтилентриаминопентауксусной кислоты (DTPА) представляет собой бифункциональный хелатирующий агент, который содержит две обладающие реакционной способностью в отношении аминов ангидридные группы. Он может взаимодействовать с N-концевыми и ε-аминогруппами с образованием амидных связей. Ангидридные кольца размыкаются с образованием многовалентных металлхелатирующих плеч, которые могут прочно связываться с металлами с образованием координационного комплекса.
Другой широко распространенной реакционно-способной группой в антителах является тиольный остаток серосодержащей аминокислоты цистина и ее восстановленного продукта цистеина (или половины цистина). Цистеин содержит свободную тиольную группу, которая является более нуклеофильной, чем амины, и, как правило, является наиболее реакционно-способной функциональной группой в белке. Тиолы, как правило, являются реакционно-способными при нейтральном значении pH и поэтому их можно избирательно сшивать с другими молекулами в присутствии аминов. Поскольку свободные сульфгидрильные группы являются относительно реакционно-способными, в белках с такими группами они часто присутствуют в окисленной форме в виде дисульфидных групп или дисульфидных связей. В таких белках восстановление дисульфидных связей с помощью реагента, такого как дитиотреитол (DTT), требуется для создания реакционно-способного свободного тиола. Реакционно-способные в отношении тиола реагенты представляют собой соединения, которые могут связываться с тиольными группами на белках, образуя сшитые с помощью простого тиоэфира продукты. Эти реагенты быстро взаимодействуют при значении pH от слабокислого до нейтрального и поэтому могут вступать в реакцию избирательно в присутствии аминных групп. Из литературы известно применение несколько тиолирующих перекрестносшивающих реагентов, таких как реагент Траута (2-иминотиолан), сукцинимидил(ацетилтио)ацетат (SATА) и сульфосукцинимидил-6-[3-(2-пиридилдитио)пропионамидо]гексаноат (сульфо-LC-SPDP), для обеспечения эффективных путей интродукции нескольких сульфгидрильных групп через реакционно-способные аминогруппы. Галоацетильные производные, например йодацетамиды, образуют тиоэфирные связи и также представляют собой реагенты для модификации тиолов. Другими пригодными реагентами являются малеимиды. Реакция малеимидов с обладающими реакционной способностью в отношении тиола реагентами практически такая же, как и в случае йодацетамидов. Малеимиды быстро вступают в реакцию при значении рН от слабокислого до нейтрального.
Другой широко распространенной реакционно-способной группой в антителах является карбоновая кислота. Белки содержат группы карбоновых кислот на С-конце и в боковых цепях аспарагиновой кислоты и глутаминовой кислоты. Относительно низкая реакционная способность карбоновых кислот в воде, как правило, затрудняет применение этих группы для избирательной модификации белков и других биомолекул. Когда это осуществляют, то группу карбоновой кислоты, как правило, превращают в реакционно-способный эфир с помощью водорастворимого карбодиимида и подвергают взаимодействию с нуклеофильным реагентом, таким как амин, гидразид или гидразин. Содержащий амин реагент должен быть слабоосновным для того, чтобы избирательно взаимодействовать с активированной карбоновой кислотой в присутствии более высокоосновных ε-аминов лизина с образованием стабильной амидной связи. Перекрестное сшивание белков может происходить при значении pH, превышающем 8,0.
Периодат натрия можно применять для окисления спиртовой части сахара в углеводном фрагменте, присоединенном к антителу, до альдегида. Каждая альдегидная группа может взаимодействовать с амином, гидразидом или гидразином, как описано для карбоновых кислот. Поскольку углеводный фрагмент главным образом встречается в области кристаллизуемого фрагмента (Fc) антитела, то для достижения конъюгации можно применять сайтнаправленную модификацию углевода вне антигенсвязывающего сайта. Образуется промежуточный продукт, представляющий собой основание Шиффа, который можно восстанавливать до алкиламина путем восстановления промежуточного продукта водорастворимым восстановителем, таким как цианборогидрид натрия (мягкий и избирательный реагент) или борогидрид натрия (сильный реагент).
Понятие «образец» относится (но, не ограничиваясь только ими) к любому количеству субстанции из живого организма или бывшего ранее живым организма. Указанные живые организмы включают (но, не ограничиваясь только ими) человека, мышей, обезьян, крыс, кроликов и других животных. В одном из вариантов осуществления изобретения образец получают из обезьян, прежде всего обезьян циномолгус, или кроликов, или мышей, или крыс. В одном из вариантов осуществления изобретения указанные субстанции включают (но, не ограничиваясь только ими) цельную кровь, сыворотку или плазму из организма индивидуумов, которые являются наиболее широко распространенными источниками образцов в клинической практике.
Понятие «твердая фаза» означает нетекучую субстанцию и включает частицы (в том числе, микрочастицы и гранулы), изготовленные из такого материала, как полимер, металл (парамагнитные, ферромагнитные частицы), стекло и керамика; гелеобразные субстанции, такие как кремнезем, глинозем и полимерные гели; капилляры, изготовленные из полимера, металла, стекла и/или керамики; цеолиты и другие пористые субстанции; электроды; титрационные микропланшеты; твердые полоски и кюветы, пробирки или другие контейнеры для образов, применяемые в спектрометрии. Твердофазный компонент отличается от инертных твердых поверхностей тем, что «твердая фаза» содержит на своей поверхности по меньшей мере один фрагмент, который предназначен для взаимодействия с субстанцией, присутствующей в образце. Твердая фаза может представлять собой стационарный компонент, такой как пробирка, полоска, кювета или титрационный микропланшет, или может представлять собой нестационарные компоненты, такие как гранулы и микрочастицы. Можно применять широкое разнообразие микрочастиц, которые позволяют осуществлять либо нековалентное, либо ковалентное связывание с белками и другими субстанциями. Указанные частицы включают полимерные частицы, такие как частицы из полистирола и поли(метилметакрилата); золотые частицы, такие как золотые наночастицы и золотые коллоиды; и керамические частицы, такие как частицы из кремнезема, стекла и оксидов металлов (см., например, Martin C.R. и др. Analytical Chemistry-News & Features, 70, 1998, сс. 322А-327А, или Butler J.E., Methods 22, 2000, сс. 4-23).
3
2+
В одном из вариантов осуществления изобретения выявляемую метку выбирают из хромогенов (флуоресцентные или люминесцентные группы и красители), ферментов, ЯМР-активных групп, частиц металлов или гаптенов, таких как дигоксигенин. Выявляемая метка может представлять собой также фотоактивируемую перекрестносшивающую группу, например азидогруппу или азириновую группу. В одном из вариантов осуществления изобретения хелаты металлов, которые можно выявлять путем электрохемилюминисценции, также представляют собой испускающие сигналы группы, при этом наиболее предпочтительными являются хелаты рутения, например хелат (биспиридил)рутения. Приемлемые применяемые для мечения включающие рутений группы описаны, например, в ЕР 0580979, WO 90/05301, WO 90/11511 и WO 92/14138.
Понятие «терапевтический мультиспецифический связывающий агент» относится к мультиспецифическому связывающему агенту, который предназначен для применения на человеке. В одном из вариантов осуществления изобретения мультиспецифический связывающий агент представляет собой мультиспецифическое антитело. В одном из вариантов осуществления изобретения мультиспецифический связывающий агент представляет собой биспецифическое антитело. В одном из вариантов осуществления изобретения мультиспецифическое или биспецифическое антитело представляет собой моноклональное антитело. В одном из вариантов осуществления изобретения мультиспецифическое антитело или биспецифическое антитело представляет собой человеческое или гуманизированное моноклональное антитело.
Понятие «подопытное животное» означает любое млекопитающее, включая домашних и сельскохозяйственных животных, а также высших приматов, исключая однако человека. В одном из вариантов осуществления изобретения способ, представленный в настоящем описании, осуществляют с использованием образца, полученного из организма подопытного животного, которое выбирают из группы, включающей мышей, крыс, кроликов, коз, овец, собак, кошек и приматов типа лемуров, мартышек, мармозеток и высших обезьян. Если подопытное животное представляет собой гиббона, наиболее близкородственного человеку, то исключаются крупные обезьяны, прежде всего из группы, включающей шимпанзе, бабуинов, горилл и орангутангов.
Понятие «полный терапевтический мультиспецифический связывающий агент» означает любой терапевтический мультиспецифический связывающий агент, присутствующий в образце, полученном из организма подопытного животного, вне зависимости от того, является ли терапевтический мультиспецифический связывающий агент активным (т.е. все еще сохраняет реакционно-способность в отношении одного или нескольких его партнеров по связыванию), неактивным и/или образует комплекс с партнером по связыванию.
Понятие «активный терапевтический мультиспецифический связывающий агент» означает терапевтический мультиспецифический связывающий агент, присутствующий в образце, полученном из организма подопытного животного, который все еще сохраняет способность связываться с одним или несколькими его партнерами по связыванию.
Понятие «образующий комплекс с партнером по связыванию терапевтический мультиспецифический связывающий агент» означает терапевтический мультиспецифический связывающий агент, присутствующий в образце, полученном из организма подопытного животного, в котором по меньшей мере одна связывающая специфичность связана с его партнером по связыванию.
В настоящем описании представлен способ иммунологического определения, предназначенный для оценки количества мультиспецифического связывающего агента в образце.
Иммунологическое определение осуществляют в виде анализа связывания с использованием «захватывающей» молекулы, молекулы-метки и идентифицирующей молекулы.
В одном из вариантов осуществления изобретения «захватывающая» молекула связана с твердой фазой. «Захватывающая» молекула может представлять собой любого партнера по связыванию мультиспецифического связывающего агента (например, один из антигенов биспецифического антитела), обычный агент, образующий комплекс с мультиспецифическим связывающим агентом (например, Fc-рецептор в случае полноразмерного антитела или антитело к Fc-области в случае полноразмерного антитела), или первого партнера из связывающейся пары, если мультиспецифический связывающий агент дериватизирован с помощью второго партнера из связывающейся пары, или антиидиотипическое антитело, которое специфически связывается со связывающей специфичностью мультиспецифического связывающего агента.
Меченая молекула может представлять собой любого партнера по связыванию мультиспецифического связывающего агента (например, один из антигенов биспецифического антитела, но если один антиген применяют в качестве «захватывающей» молекулы, то в качестве меченой молекулы следует применять другой антиген), обычный агент, образующий комплекс с мультиспецифическим связывающим агентом (например, Fc-рецептор в случае полноразмерного антитела при условии, что эту молекулу не использовали уже в качестве «захватывающей» молекулы, или антитело к Fc-области в случае полноразмерного антитела при условии, что это антитело связывается с другим эпитопом, если такой же тип антитела уже использовали в качестве «захватывающей» молекулы), или первый партнер связывающейся пары, если мультиспецифический связывающий агент дериватизируют с помощью второго партнера из связывающейся пары (при условии, что применяют связывающуюся пару, отличную от применяемой для иммобилизованной «захватывающей» молекулы), или антиидиотипическое антитело, которое специфически связывается со связывающей специфичностью мультиспецифического связывающего агента (при условии, что оно связывается со связывающей специфичностью, отличной от той, с которой связывается антиидиотипическое антитело, применяемое в качестве «захватывающей» молекулы).
При создании изобретения было установлено, что для определения количества мультиспецифического связывающего агента в образце целесообразно применять антиидиотипическое антитело в качестве «захватывающей» молекулы и в качестве меченой молекулы, где антиидиотипические антитела связываются с различными связывающими специфичностями мультиспецифического связывающего агента.
Благодаря применению антиидиотипического антитела в качестве «захватывающей» молекулы и в качестве меченой молекулы для иммунологического определения мультиспецифического антитела в образце способ I) является более надежным /подвергается меньшему воздействию субстанций в матриксе образца, II) для него требуется меньшее разведение образца, III) его можно осуществлять быстрее, IV) является более гибким в отношении мечения/дериватизации/иммобилизации «захватывающего» антитела и/или меченого антитела по сравнению со способом, в котором используют антигены мультиспецифического связывающего агента в качестве «захватывающей» молекулы и меченой молекулы.
Установлено, что на иммунологическое определение количества мультиспецифического связывающего агента в образце, прежде всего в образце, содержащем сыворотку или человеческую плазму, полученном из организма подопытного животного, оказывает сильное влияние матрикс образца, если антигены мультиспецифического связывающего агента применяют в качестве «захватывающей» молекулы и меченой молекулы.
Если образец получают из организма подопытного животного, которое, например, используют для фармакокинетического исследования, то образец может содержать, помимо мультиспецифического связывающего агента, также другие близко родственные компоненты, полученные из организма подопытного животного. Например, если образец представляет собой сыворотку, полученную из крови экспериментального животного, то она будет содержать также один или несколько партнеров по связыванию (например, растворимые лиганды рецептора или отделившиеся рецепторные молекулы) мультиспецифического связывающего агента (например, антигены мультиспецифического антитела), иммуноглобулины других классов в количестве, более высоком или более низком по сравнению с количеством мультиспецифического связывающего агента, неспецифические комплексообразующие молекулы и т.д. Все эти молекулы могут оказывать влияние на способ иммунологического определения.
Например, в случае биспецифического антитела образец содержит, помимо биспецифического антитела, также один или оба антигена биспецифического антитела. Это приводит к присутствию смеси, содержащей свободное биспецифическое антитело, биспецифическое антитело в комплексе с одним антигеном, биспецифическое антитело в комплексе с двумя антигенами и каждую из вышеуказанных молекул, образующую неспецифический комплекс с другими компонентами сыворотки или человеческой плазмы. Свободное биспецифическое антитело можно обнаруживать с помощью любой возможной указанной выше комбинации «захватывающей» молекулы и меченой молекулы. Образующее комплекс с антигеном антитело, в принципе, можно обнаруживать также с помощью любой из вышеперечисленных комбинаций, но чувствительность метода может снижаться, поскольку часть биспецифического антитела изымается из общего количества антитела, присутствующего в образце, поскольку образующее комплекс с антигеном антитело находится в равновесии с необразующей комплекс формой. Количество антитела, образующего комплекс с антигеном, сильно варьируется и поэтому также оказывает сильно варьирующие воздействия. Этому можно по меньшей мере частично противодействовать путем пролонгированного времени инкубации, что, с другой стороны, замедляет осуществление анализа.
Было установлено, что чувствительность способа иммунологического определения количества биспецифического антитела в образце сыворотки или плазмы, полученном из организма подопытного животного, можно повышать путем использования в качестве «захватывающей» и меченой молекулы антиидиотипического антитела, которое специфически связывается с CDR различных связывающих специфичностей биспецифического антитела. Можно снижать также время, требуемое для осуществления определения, при этом среди прочего не требуется пролонгированное время инкубации для сдвига равновесия связывания. Кроме того, можно уменьшать требуемое количество «захватывающей» молекулы/плотности «захватывающих» молекул на твердой поверхности, поскольку биспецифическое антитело можно «захватывать» вне зависимости от образования комплекса с антигеном и поэтому требуется меньшее количество «захватывающих» молекул.
Одним из объектов изобретения является способ определения количества или концентрации терапевтического мультиспецифического связывающего агента, в одном из вариантов осуществления изобретения мультиспецифического антитела, прежде всего биспецифического антитела, в образце, полученном из организма подопытного животного, заключающийся в том, что осуществляют стадии, на которых:
а) инкубируют образец с первым антиидиотипическим антителом, которое специфически связывается с первой связывающей специфичностью мультиспецифического связывающего агента,
б) инкубируют образец со вторым антиидиотипическим антителом, которое специфически связывается со второй связывающей специфичностью мультиспецифического связывающего агента, где вторая связывающая специфичность отличается от первой связывающей специфичности, и
в) устанавливают корреляцию между комплексом, полученным на стадии б), с количеством или концентрацией терапевтического мультиспецифического связывающего агента.
В одном из вариантов осуществления изобретения мультиспецифический связывающий агент представляет собой мультиспецифическое антитело.
В одном из вариантов осуществления изобретения мультиспецифический связывающий агент представляет собой биспецифическое антитело.
В одном из вариантов осуществления изобретения связывающая специфичность представляет собой пару, состоящую из вариабельного домена тяжелой цепи антитела и вариабельного домена легкой цепи когнатного антитела.
В одном из вариантов осуществления изобретения партнер по связыванию одной или нескольких связывающих специфичностей мультиспецифического связывающего агента представляет собой антиген. В одном из вариантов осуществления изобретения антиген независимо друг от друга выбирают для каждой связывающей специфичности из растворимых антигенов и связанных с мембраной антигенов. В одном из вариантов осуществления изобретения антиген независимо друг от друга выбирают для каждой связывающей специфичности из лигандов рецепторов и рецепторов клеточной поверхности.
В одном из вариантов осуществления изобретения способ представляет собой иммуноанализ. В одном из вариантов осуществления изобретения иммуноанализ представляет собой сэндвич-иммуноанализ.
В одном из вариантов осуществления изобретения конъюгацию мультиспецифического связывающего агента с партнером по конъюгации осуществляют путем химического связывания через N-концевые и/или ε-аминогруппы (лизин), ε-аминогруппы различных лизинов, карбоксильные, гидроксильные и/или фенольные функциональные группы аминокислотного каркаса антитела и/или группы сахарных спиртов углеводной структуры.
В одном из вариантов осуществления изобретения «захватывающее» антиидиотипическое антитело иммобилизуют через специфическую связывающую пару. В одном из вариантов осуществления изобретения «захватывающее» антиидиотипическое антитело конъюгируют с биотином и иммобилизацию осуществляют через иммобилизованный авидин или стрептавидин.
В одном из вариантов осуществления изобретения меченое антиидиотипическое антитело конъюгируют с выявляемой меткой через специфическую связывающуюся пару. В одном из вариантов осуществления изобретения меченое антиидиотипическое антитело конъюгируют с дигоксигенином и сшивание с выявляемой меткой осуществляют через антитело к дигоксигенину.
В одном из вариантов осуществления изобретения подопытное животное выбирают из группы, включающей представителей семейств мармозеток и тамаринов, низших узконосых обезьян, карликовых и мышиных лемуров, гиббонов и гиббоновых обезьян, истинных лемуров, а также из животных, полученных в результаты их скрещивания.
В одном из вариантов осуществления изобретения терапевтическое антитело представляет собой человеческое или гуманизированное антитело. В одном из вариантов осуществления изобретения человеческое или гуманизированное антитело представляет собой моноклональное антитело. В одном из вариантов осуществления изобретения осуществляют обнаружение полного терапевтического антитела, в другом варианте осуществления изобретения осуществляют обнаружение активного терапевтического антитела, а еще в одном из вариантов осуществления изобретения осуществляют обнаружение антитела, которое связано с его антигеном.
В одном из вариантов осуществления изобретения антиидиотипическое антитело конъюгируют с парамагнитной гранулой.
В одном из вариантов осуществления изобретения антиидиотипическое антитело конъюгируют с твердой фазой.
Различные аспекты, связанные с применением терапевтического мультиспецифического связывающего агента для подопытного животного, можно оценивать в процессе доклинических исследований. В некоторых ситуациях может оказаться целесообразным анализировать общее количество терапевтического мультиспецифического связывающего агента, присутствующего в образце, или может оказаться важным анализировать определенные фрагменты терапевтического мультиспецифического связывающего агента в образце, определенные модификации терапевтического мультиспецифического связывающего агента в образце, концентрацию в образце терапевтического мультиспецифического связывающего агента, связанного с его одним или несколькими партнерами по связыванию, или фракцию в образце терапевтического мультиспецифического связывающего агента, которая все еще обладает способностью связываться с одним или несколькими его партнерами по связыванию. В одном из вариантов осуществления изобретения указанный в настоящем описании способ предназначен для обнаружения полного терапевтического мультиспецифического связывающего агента, или активного терапевтического мультиспецифического связывающего агента, или образующего комплекс с партнером по связыванию терапевтического мультиспецифического связывающего агента соответственно.
С помощью способа, представленного в настоящем описании, можно непосредственно выявлять полный, активный или образующий комплекс с партнером по связыванию терапевтический мультиспецифический связывающий агент.
Кроме того, «неактивный» терапевтический мультиспецифический связывающий агент можно оценивать косвенным путем. Указанный неактивный терапевтический мультиспецифический связывающий агент может представлять собой, например, терапевтическое биспецифическое антитело, связанное с одним или обоими его антигенами, или терапевтическое биспецифическое антитело, связанное с близкородственным (перекрестно-реагирующим) антигеном, или терапевтическое биспецифическое антитело, блокированное аутоантителом к терапевтическому биспецифическому антителу. В том случае, когда общие количества мультиспецифического связывающего агента превышают сумму активного мультиспецифического связывающего агента и образующего комплекс с партнером по связыванию мультиспецифического связывающего агента, то может присутствовать дополнительная фракция мультиспецифического связывающего агента, содержащая неактивный мультиспецифический связывающий агент, не сшитый с его соответствующим партнером по связыванию.
Существуют различные системы анализа, предназначенные для анализа, например, полного, активного или образующего комплекс с партнером по связыванию терапевтического мультиспецифического связывающего агента.
Полный мультиспецифический связывающий агент, например, можно выявлять с помощью так называемой системы иммуноанализа в условиях конкуренции или системы анализа так называемого сэндвич-типа.
Указанный анализ можно осуществлять без стадии промывок (гомогенный иммуноанализ) или с применением стадий промывок (гетерогенный иммуноанализ).
В одном из вариантов осуществления изобретения количество полного терапевтического мультиспецифического связывающего агента определяют с помощью иммуноанализа сэндвич-типа, в котором используют антиидиотипические антитела с обеих сторон в указанном сэндвиче при проведении анализа, при этом два антиидиотипических антитела специфически связываются с различными связывающими специфичностями мультиспецифического связывающего агента. Антиидиотипическое антитело, применяемое на одной стороне указанного сэндвича, связано или обладает способностью связываться с твердой фазой (часто его обозначают как «захватывающее» антиидиотипическое антитело), в то время как антиидиотипическое антитело на другой стороне указанного сэндвича метят таким образом, чтобы облегчать прямое или косвенное обнаружение (так называемое меченое антиидиотипическое антитело). Количество связанного меченого антиидиотипического антитела в такой процедуре сэндвич-анализа прямо коррелирует с количеством терапевтического мультиспецифического связывающего агент в исследуемом образце.
В данной области известны (например, описаны в US 2003/0068664) системы анализа, которые позволяют осуществлять обнаружение активных терапевтических антител. При применении указанной системы требуется связывание антигена с твердой фазой, связывание терапевтического антитела с указанным сшитым антигеном и обнаружение терапевтического антитела, связанного через антиген с твердой фазой.
Обнаружение активного мультиспецифического связывающего агента в образце можно осуществлять с помощью приемлемых процедур, известных в данной области. Однако обнаружение полного терапевтического мультиспецифического связывающего агента или фракции терапевтического мультиспецифического связывающего агента, образующего комплекс с его партнером по связыванию, является довольно сложным и для него требуются совершенно различные схемы анализов и прежде всего требуются специально приготовленные реагенты для каждого из различных анализов. С помощью способа, представленного в настоящем описании, можно оценивать фракцию активного терапевтического мультиспецифического связывающего агента, полный терапевтический мультиспецифический связывающий агент или образующий комплекс с партнером по связыванию терапевтический мультиспецифический связывающий агент в тест-системах, которые аналогичны друг другу. Благодаря присущим ему особенностям этот тип сравнительного анализа полного, активного или образующего комплекс с партнером по связыванию терапевтического мультиспецифического связывающего агента может обладать преимуществами, состоящими в том, что можно осуществлять количественные сравнения между различными фракциями терапевтического мультиспецифического связывающего агента.
В одном из вариантов осуществления изобретения формат анализа сэндвич-типа создают для обнаружения активного терапевтического мультиспецифического связывающего агента. В одном из вариантов осуществления изобретения антиидиотипическое антитело, которое связывается с одной связывающей специфичностью терапевтического мультиспецифического связывающего агента, используют в качестве «захватывающего» антиидиотипического антитела, и в этом анализе предназначенную для идентификации сторону указанного сэндвича либо создают путем использования антигена, который специфически связывается с соответствующей другой связывающей специфичностью мультиспецифического связывающего агента, в меченой форме, или в альтернативном варианте после связывания антигена, который специфически связан с соответствующей другой связывающей специфичностью мультиспецифического связывающего агента, либо создают путем использования второго антитела, которое не связывается с эпитопом или не конкурирует за связывание с эпитопом, распознаваемым терапевтическим мультиспецифическим связывающим агентом, при этом второе антитело поддается специфическому выявлению и/или его метят так, чтобы облегчать его прямое или косвенное обнаружение.
В одном из вариантов осуществления изобретения образующий комплекс с партнером по связыванию терапевтический мультиспецифический связывающий агент выявляют с помощью формата анализа сэндвич-типа, используя антиидиотипическое антитело, которое специфически связывается с одной связывающей специфичностью мультиспецифического связывающего агента, в качестве «захватывающего» антиидиотипического антитела. Для обнаружения используют второе антитело, связывающееся с партнером по связыванию, специфически связанное с другой связывающей специфичностью мультиспецифического связывающего агента, на эпитопе, который не конкурирует с эпитопом терапевтического мультиспецифического связывающего агента. В одном из вариантов осуществления изобретения второе антитело метят таким образом, чтобы облегчать его прямое или косвенное обнаружение.
3
2+
Для прямого обнаружения предназначенную для мечения группу можно выбирать из любых известных выявляемых маркерных групп, таких как красители, люминесцентные группы-метки, такие как хемилюминесцентные группы, например сложные эфиры или диоксетаны акридиния, или флуоресцентные красители, например флуоресцеин, кумарин, родамин, оксазин, резоруфин, цианин и их производные. Другими примерами групп-меток являются люминесцентные комплексы с металлами, такие как комплексы с рутением или европием, ферменты, например, применяемые для ELISA или CEDIA (иммуноанализ с клонированным донором фермента (Cloned Enzyme Donor Immunoassay)), и радиоизотопы. В одном из вариантов осуществления изобретения в качестве испускающих сигналы групп, применяемых в качестве выявляемых меток, используют хелаты металлов, которые можно выявлять с помощью электрохемилюминисценции, при этом наиболее предпочтительными являются хелаты рутения. В одном из вариантов осуществления изобретения группа-метка представляет собой хелат (биспиридил) рутения.
Системы косвенного обнаружения содержат, например, предназначенный для обнаружения реагент, например антиидиотипическое антитело-метку, меченное первым партнером из биоаффиной связывающейся пары. Примерами приемлемых связывающихся пар являются гаптен или антиген/антитело, биотин или аналоги биотина, такие как аминобиотин, иминобиотин или дестиобиотин/авидин или стрептавидин, сахар/лектин, нуклеиновая кислота или аналог нуклеиновой кислоты/комплементарная нуклеиновая кислота и рецептор/лиганд, например рецептор стероидного гормона/стероидный гормон. В одном из вариантов осуществления изобретения компоненты первой связывающейся пары представляют собой гаптен, антиген и гормон. В одном из вариантов осуществления изобретения гаптены выбирают из группы, включающей дигоксигенин, теофиллин, карборан и биотин, а также их аналогов. Второй партнер из указанной связывающейся пары, например антитело, стрептавидин и т.д., как правило, метят, что позволяет осуществлять прямое обнаружение, например, с помощью указанных выше меток.
Иммуноанализы хорошо известны специалисту в данной области. Методы осуществления указанных анализов, а также их практические применения и процедуры обобщены в соответствующих руководствах. Примерами соответствующих руководств являются: Tijssen P., Preparation of enzyme-antibody or other enzyme-macromolecule conjugates в: «Practice and theory of enzyme immunoassays)), под ред. R.H. Burdon и v. P.H. Knippenberg, изд-во Elsevier, Amsterdam, 1990, cc. 221-278) и различные тома «Methods in Enzymology», под ред. S.P. Colowick, N.O. Caplan и S.P., изд-во Academic Press), в которых описаны методы иммунологического обнаружения, прежде всего т.т. 70, 73, 74, 84, 92 и 121.
Во всех указанных выше методах иммунологического обнаружения выбирают реакционные условия, которые позволяют осуществлять связывание применяемых реагентов, например связывание антитела с соответствующим ему антигеном. Специалист в данной области рассматривает результаты такого случая связывания в понятиях образования комплекса. Согласно способу, предлагаемому в настоящем изобретении, с помощью процедур, известных в данной области, определяют корреляцию комплекса, образованного при осуществлении анализа, с соответствующей концентрацией терапевтического мультиспецифического связывающего агента в образце. В зависимости от применяемого идентифицирующего реагента на этой стадии оценки корреляции определяют концентрацию полного, активного или образующего комплекс с партнером по связыванию терапевтического мультиспецифического связывающего агента.
Благодаря применению одного и того же реагента, антиидиотипического антитела, можно легко осуществлять сравнение друг с другом результатов, полученных в различных анализах, и даже оценивать их соотношения. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения определяют соотношение между активным и полным терапевтическим мультиспецифическим связывающим агентом. Это соотношение может служить важным показателем эффективности терапевтического мультиспецифического связывающего агента.
Одним из объектов настоящего изобретения является способ иммунологического определения количества мультиспецифического связывающего агента в образце, заключающийся в том, что осуществляют стадии, на которых:
- определяют количество комплекса, образовавшегося между
I) первым антиидиотипическим антителом, которое специфически связывается с первой связывающей специфичностью мультиспецифического связывающего агента, и
II) мультиспецифическим связывающим агентом,
путем инкубации комплекса со вторым антиидиотипическим антителом, которое специфически связывается со второй связывающей специфичностью мультиспецифического связывающего агента, отличной от первой связывающей специфичности мультиспецифического антитела, и
тем самым определяют количество мультиспецифического связывающего агента в образце.
В одном из вариантов осуществления изобретения количество мультиспецифического связывающего агента определяют с помощью иммуноанализа на основе мостикового конъюгирования. В одном из вариантов осуществления изобретения иммуноанализ включает «захватывающее» антитело и меченое антитело, при этом «захватывающее» антитело конъюгируют с твердой фазой, а меченое антитело конъюгируют с выявляемой меткой. В одном из вариантов осуществления изобретения «захватывающее» антитело и меченое антитело оба представляют собой антиидиотипические антитела, которые связываются с различными специфичностями мультиспецифического связывающего агента.
В одном из вариантов осуществления изобретения «захватывающее» антитело конъюгируют с твердой фазой.
В одном из вариантов осуществления изобретения меченое антитело содержит выявляемую метку.
Антиидиотипическое «захватывающее» антитело, которое применяют в способе, указанном в настоящем описании, может быть конъюгировано с твердой фазой. В одном из вариантов осуществления изобретения конъюгацию осуществляют путем химического связывания через N-концевые и/или ε-аминогруппы (лизин), ε-аминогруппы различных лизинов, карбоксильные, гидроксильные и/или фенольные функциональные группы аминокислотного каркаса антитела и/или группы сахарных спиртов углеводной структуры. В одном из вариантов осуществления изобретения антиидиотипическое «захватывающее» антитело представляет собой смесь, состоящую по меньшей мере из двух антител, конъюгированных с твердой фазой, при этом по меньшей мере два антитела, конъюгированные с твердой фазой, отличаются по месту их конъюгации с твердой фазой. Например, смесь, состоящая по меньшей мере из двух антител, конъюгированных с твердой фазой, может содержать антитело, конъюгированное с твердой фазой через аминокислоту аминокислотного каркаса антитела, и антитело, конъюгированное с твердой фазой через группу сахарного спирта углеводной структуры антитела. Кроме того, смесь, состоящая по меньшей мере из двух антител, конъюгированных с твердой фазой, может содержать антитела, конъюгированные с твердой фазой через различные аминокислотные остатки их аминокислотного каркаса. Понятие «другой (отличный) аминокислотный остаток» относится либо к остаткам двух различных типов аминокислот, например лизин и аспарагиновая кислота или тирозин и глутаминовая кислота, или к двум аминокислотным остаткам аминокислотного каркаса, которые отличаются их положением в аминокислотной последовательности антитела. В последнем случае аминокислоты могут относиться к такому же типу или к другому типу. Понятие «другой сайт в антителе» означает, что имеет место либо другой тип сайта, например аминокислота или группа сахарного спирта, или, например, разное количество аминокислот аминокислотного каркаса, через которые антитело конъюгируют с твердой фазой. И, наоборот, это же относится к меченому антителу, которое применяют в способе, указанном в настоящем описании.
В одном из вариантов осуществления изобретения в способе иммуноанализа применяют «захватывающее» антитело, меченое антитело и идентифицирующее антитело, при этом «захватывающее антитело представляет собой биотинилированное антиидиотипическое антитело, которое специфически связывается с первой связывающей специфичностью мультиспецифического связывающего агента, конъюгированное с твердой фазой через стрептавидин, меченое антитело представляет собой антиидиотипическое антитело, которое специфически связывается со второй специфичностью мультиспецифического связывающего агента, отличной от первой связывающей специфичности, конъюгированное с дигоксигенином, а идентифицирующее антитело представляет собой антитело к дигоксигенину, конъюгированное с пероксидазой из хрена.
В одном из вариантов осуществления изобретения способ заключается в том, что осуществляют следующие стадии, на которых:
- инкубируют образец, содержащий мультиспецифический связывающий агент, с первым антиидиотипическим антителом, которое специфически связывается с первой связывающей специфичностью мультиспецифического связывающего агента, при этом образуется комплекс между первым антиидиотипическим антителом и мультиспецифическим связывающим агентом,
- инкубируют комплекс, образовавшийся между антиидиотипическим «захватывающим» антителом и мультиспецифическим связывающим агентом, со вторым антиидиотипическим антителом, специфически связывающимся со второй связывающей специфичностью мультиспецифического связывающего агента, которая не идентична, т.е. которая отлична от связывающей специфичности, с которой связывается первое антиидиотипическое антитело, при этом образуется комплекс между первым антиидиотипическим антителом, мультиспецифическим связывающим агентом и вторым антиидиотипическим антителом, и
- определяют количество комплекса, образовавшегося на предыдущей стадии.
В одном из вариантов осуществления изобретения количество мультиспецифического связывающего агента определяют с помощью калибровочной кривой.
В одном из вариантов осуществления изобретения второе антиидиотипическое антитело конъюгируют с выявляемой меткой.
В одном из вариантов осуществления изобретения количество мультиспецифического связывающего агента определяют по количеству иммобилизованной выявляемой метки.
В одном из вариантов осуществления изобретения мультиспецифический связывающий агент представляет собой биспецифический связывающий агент. В одном из вариантов осуществления изобретения биспецифический связывающий агент представляет собой биспецифическое антитело.
Приведенные ниже примеры и чертежи даны с целью лучшего понимания настоящего изобретения, истинный объем которого представлен в прилагаемой формуле изобретения. Должно быть очевидно, что в представленные процедуры можно вносить модификации без отклонения от сущности изобретения.
Примеры
Пример 1
Общий способ определения количества биспецифического антитела в образце
Концентрации мультиспецифического связывающего агента/биспецифического антитела определяли с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA)
Для количественного определения биспецифических антител в образцах мышиной сыворотки или плазмы и лизатах глаз осуществляли твердофазный серийный сэндвич-анализ с использованием биотинилированных и дигоксигенированных моноклональных антиидиотипических антител против различных связывающих специфичностей биспецифического антитела в качестве «захватывающих» и идентифицирующих антител для подтверждения целостности биспецифичности биспецифического антитела. При такой схеме анализа биспецифического антитела к VEGF/ANG2 биотинилированное антиидиотипическое «захватывающее» антитело специфически связывается с VEGF-связывающим сайтом, а дигоксигенированное антиидиотипическое идентифицирующее антитело специфически связывается с ANG2-связывающим сайтом. Связанный иммунный комплекс, содержащий «захватывающее» антитело, биспецифическое антитело и идентифицирующее антитело, на твердой фазе сенсибилизированного стрептавидином титрационного микропланшета (SA-MTP) выявляли с помощью сшитого с пероксидазой из хрена антитела к дигоксигенину. После отмывки несвязанного материала от SA-MTP и добавления в качестве субстрата ABTS полученный сигнал был пропорционален количеству биспецифического антитела, связанного с твердой фазой SA-MTP. Количественное определение осуществляли, превращая измеренные сигналы, полученные от образцов, в концентрации относительно калибраторов, которые анализировали параллельно.
Процедура обнаружения биспецифического антитела к VEGF/ANG2
На первой стадии SA-MTP сенсибилизировали, используя по 100 мкл/лунку раствора биотинилированного антиидиотипического «захватывающего» антитела (антитело к анти-VEGF антителу M-2.45.51-Bi) в концентрации 1 мкг/мл в течение 1 ч при 500 об/мин на шейкере для титрационных микропланшетов (МТР-шейкер). Параллельно приготавливали калибраторы, образцы для контроля качества (QC-образцы) и тестируемые образцы. Калибраторы и QC-образцы разводили до 2%, используя в качестве матрицы сыворотку. Образцы разводили до тех пор, пока сигналы находились в линейной области калибраторов.
После сенсибилизации SA-MTP антиидиотипическим «захватывающим» антителом планшет отмывали трижды, используя 300 мкл/лунку буфера для отмывки. Затем добавляли с помощью пипетки из расчета по 100 мкл/лунку SA-MTP калибраторы, QC-образцы и тестируемые образцы и инкубировали в течение 1 ч при 500 об/мин.
В результате биспецифическое антитело к VEGF/ANG2 оказывалось связанным с помощью его VEGF-связывающего сайта через антиидиотипическое «захватывающее» антитело к VEGF с твердой фазой SA-MTP. После инкубации несвязанную анализируемую субстанцию удаляли путем отмывки планшета. Затем в лунки SA-MTP добавляли из расчета по 100 мкл/лунку антиидиотипическое идентифицирующее антитело (антитело к анти-ANG2 антителу M-2.6.81-Dig) в концентрации 250 нг/мл. Затем планшет инкубировали в течение 1 ч при 500 об/мин на шейкере. После отмывки в лунки SA-MTP добавляли из расчета по 100 мкл/лунку второе идентифицирующее антитело (конъюгат Fab-фрагмента поликлонального антитела к дигоксигенину-POD) в концентрации 50 мед. (миллиединиц)/мл и планшет инкубировали в течение 1 ч при 500 об/мин. После конечной стадии отмывки для удаления избытка второго идентифицирующего антитела добавляли 100 мкл/лунку субстрата (ABTS). Конъюгат антитело-POD катализировал цветную реакцию субстрата ABTS. Затем сигнал измеряли с помощью ридера для ELISA при длине волны 405 нм (длина референс-волны 490 нм ([405/490] нм)).
Пример 2
Применение анализа, описанного в примере 1, для фармакокинетической характеризапии биспецифического антитела в трансгенных по FcRn мышах, несущих человеческий FcRn
Прижизненная фаза
Опыт проводили на самках мышей C57BL/6J (фон), которые представляли собой мышей с дефицитом мышиного FcRn и гемизиготных трансгенных по человеческому FcRn (huFcRn, линия 276 -/tg).
Часть 1
Всем мышам инъецировали однократно интравитреально в правый глаз соответствующий раствор из расчета по 2 мкл/животное (т.е. по 21 мкг соединения/животное (антитело к VEGF/ANG2 без мутаций I253А, Н310А и Н435А (нумерация в соответствии с EU-индексом Кэбота), см. в ЕР 12176299.1 дополнительные детали, касающиеся применяемых антител и аминокислотных последовательностей) или по 23,6 мкг соединения/животное (антитело к VEGF/ANG2, содержащее мутации I253А, Н310А и Н435А (нумерация в соответствии с EU-индексом Кэбота)).
Мышей разделяли на 2 группы по 6 животных в каждой. Образцы крови в группе 1 получали через 2, 24 и 96 ч, а в группе 2 через 7, 48 и 168 ч после введения соответствующего биспецифического антитела.
Инъекцию в стекловидное тело правого глаза мышей осуществляли с помощью системы NanoFil с использованием микрошприца для нанолитровых инъекций фирмы World Precision Instruments, Inc., Берлин, Германия. Мышей анестезировали с помощью 2,5% изофлурана и для визуализации глаза мышей использовали микроскоп Leica MZFL 3 с 40-кратным увеличением и источником кольцевого света Leica KL 2500 LCD. Затем инъецировали 2 мкл соединения с помощью иглы 35-размера.
Кровь собирали из ретробульбарного венозного сплетения контралатерального глаза каждого животного для определения уровней соединения в сыворотке.
Образцы сыворотки объемом по меньшей мере 50 мкл получали из крови после выдерживания в течение 1 ч при КТ путем центрифугирования (9300×g) при 4°C в течение 3 мин. Образцы сыворотки замораживали непосредственно после центрифугирования и хранили в замороженном состоянии при -80°C до анализа.
Обработанные глаза животных из группы 1 выделяли через 96 ч после обработки, а обработанные глаза животных из группы 2 выделяли через 168 ч после обработки. Образцы хранили в замороженном состоянии при -80°C до анализа.
Часть 2
Всем мышам инъецировали однократно внутривенно через хвостовую вену соответствующий раствор из расчета по 200 мкл/животное (т.е. по 21 мкг соединения/животное (антитело к VEGF/ANG2 без мутаций I253А, Н310А и Н435А (нумерация в соответствии с EU-индексом Кэбота)) или по 23,6 мкг соединения/животное (антитело к VEGF/ANG2, содержащее мутации I253А, Н310А и Н435А (нумерация в соответствии с EU-индексом Кэбота)).
Мышей разделяли на 2 группы по 5 животных в каждой. Получали образцы крови у животных группы 1 через 1, 24 и 96 ч, а у животных группы 2 через 7, 48 и 168 ч после введения соответствующего биспецифического антитела.
Кровь собирали из ретробульбарного венозного сплетения каждого животного для определения уровней соединения в сыворотке.
Образцы сыворотки объемом по меньшей мере 50 мкл получали из крови после выдерживания в течение 1 ч при КТ путем центрифугирования (9300×g) при 4°C в течение 3 мин. Образцы сыворотки замораживали непосредственно после центрифугирования и хранили в замороженном состоянии при -80°C до анализа.
Получение лизатов всего глаза (мышей)
Лизаты глаз получали путем физико-химического расщепления всего глаза лабораторных животных. Для механического разрушения каждый глаз переносили в микропробирку с коническим дном объемом 1,5 мл. После замораживания-оттаивания глаза промывали однократно промывочным буфером (фирма Bio-Rad, набор для лизиса клеток Bio-Plex, каталожный №171-304011). На следующей стадии добавляли 500 мкл свежеприготовленного буфера для лизиса клеток и глаза измельчали с помощью 1,5-миллилитрового пестика для измельчения тканей (фирма Kimble Chase, 1,5-миллилитровый пестик, артикул №749521-1500). Затем смесь 5 раз подвергали замораживанию и оттаиванию и вновь измельчали. Для отделения лизата от оставшейся ткани образцы центрифугировали в течение 4 мин при 4500×g. После центрифугирования супернатант собирали и хранили при -20°C для дополнительного анализа с помощью количественного ELISA.
Анализ
Определение количества биспецифического антитела в образце осуществляли согласно методу, описанному в примере 1.
Оценка фармакокинетики
Фармакокинетические параметры рассчитывали с помощью некомпартментального анализа, используя программу для оценки фармакокинетических параметров WinNonlin™ (фирма Pharsight), версия 5.2.1.
Результаты:
А) Концентрации в сыворотке
Результаты определения концентраций в сыворотке представлены в таблицах 1 и 2.
Б) Концентрации в глазных лизатах левых и правых глаз
Результаты определения концентраций в глазных лизатах представлены в таблицах 3-4.
Пример 3
Анализ для определения фармакокинетических характеристик биспецифических антител
Анализировали тот же набор образцов, содержащих антитело к VEGF/ANG2 в 10% человеческой плазмы/ЭДТК, с помощью ELISA, основанного на применении антигенов (А), и ELISA, основанного на применении антиидиотипических антител (Б).
ELISA, основанный на применении антигенов, для обнаружения антитела к VEGF/ANG2
На первой стадии рекомбинантным человеческим ангиопоэтином 2 (ANG2) сенсибилизировали непосредственно титрационный микропланшет Maxisorb в течение 1 ч. Параллельно меченный дигоксигенином рекомбинантный человеческий VEGF предварительно инкубировали с образцами, содержащими неизвестные количества антитела VEGF/ANG2 или референс-стандарты соответственно. Образцы 10-кратно разводили до предварительной инкубации с меченным дигоксигенином VEGF. После сенсибилизации и отмывки титрационного микропланшета предварительно инкубированный раствор антитела к VEGF/ANG2 и меченного дигоксигенином VEGF добавляли с помощью пипетки в титрационный микропланшет и инкубировали в течение еще 1 ч. Антитела к VEGF/ANG2, связанные с меченным дигоксигенином VEGF, из предварительно инкубированного раствора связывались с иммобилизованным ANG2. После другой стадии отмывки в планшет добавляли поликлональное меченное HRP (меченное пероксидазой из хрена) антитело к дигоксигенину и инкубировали в течение еще 1 ч. Затем планшет отмывали и добавляли раствор ABTS-субстрата для инициации цветной реакции (см. фиг. 2).
ELISA, основанный на применении антиидиотипических антител, для обнаружения антитела к VEGF/ANG2
На первой стадии SA-MTP (сенсибилизированный стрептавидином титрационный микропланшет) сенсибилизировали раствором биотинилированного антиидиотипического «захватывающего» антитела (антитело к анти-VEGF антителу (M-2.45.51-BI)). Параллельно приготавливали калибраторы, контрольные образцы (QC-образцы) и тестируемые образцы. Калибраторы и QC-образцы разводили до 10%, используя в качестве матрицы плазму обезьян циномолгус. Образцы разводили до тех пор, пока сигналы находились в линейной области калибраторов.
После сенсибилизации SA-MTP антиидиотипическим «захватывающим» антителом планшет отмывали трижды. Затем QC-образцы и тестируемые образцы наносили пипеткой на SA-MTP и инкубировали в течение 1 ч при 500 об/мин.
Биспецифическое антитело к VEGF/ANG2 оказывалось связанным с помощью его VEGF-связывающего сайта через антиидиотипическое «захватывающее» антитело к VEGF с твердой фазой SA-MTP. После инкубации анализируемую субстанцию удаляли путем отмывки планшета. Затем в лунки SA-MTP добавляли антиидиотипическое идентифицирующее антитело (антитело к aHTH-ANG2 антителу M-2.6.81-Dig, 0,5 мкг/мл). Затем планшет инкубировали в течение 1 ч при 500 об/мин на шейкере. После отмывки в лунки SA-MTP добавляли второе идентифицирующее антитело (конъюгат Fab-фрагмента поликлонального антитела к дигоксигенину-POD (POD обозначает пероксидазу) и планшет инкубировали в течение 1 ч при 500 об/мин. После конечной стадии отмывки для удаления избытка второго идентифицирующего антитела добавляли субстрат (ABTS). Конъюгат антитело-POD катализировал цветную реакцию субстрата ABTS. Затем сигнал измеряли с помощью ридера для ELISA при длине волны 405 нм (длина референс-волны: 490 нм ([405/490] нм)). ОП-сигналы калибровочных стандартов, применяемых в концентрациях от 0,1 до 30 нг/мл в 10% человеческой плазмы, измеряли при 405 нм.
Калибровочные кривые, полученные при осуществлении различных анализов (А) и (Б), представлены на фиг. 3.
С помощью данных, представленных на фиг. 4, можно продемонстрировать, что анализ на основе антиидиотипических антител позволял получать сопоставимые результаты в присутствии 5%, 10% и 20% человеческой сыворотки, в то время как при использовании анализа на основе антигенов обнаружены значительные отклонения.