Способ прогнозирования риска развития гипертонической болезни на основании молекулярно-генетических данных
METHOD FOR PREDICTING THE RISK OF DEVELOPING HYPERTENSIVE DISORDER BASED ON MOLECULAR AND GENETIC DATA

Изобретение относится к области медицинской диагностики, может быть использовано для прогнозирования риска развития гипертонической болезни (далее ГБ).
Гипертоническая болезнь (ГБ) представляет собой сложное гетерогенное заболевание, которое является результатом сложных взаимодействий между генетическими факторами, факторами окружающей среды и образом жизни [Рекомендации по диагностике и лечению артериальной гипертензии [Текст] / И.Е. Чазова, Е.В. Ощепкова, Ю.В. Жернакова // Кардиологический вестник. – 2015. – № 1. – C. 3-30]. Гипертоническая болезнь регистрируется более чем у  50% людей старшей возрастной группы и является основным фактором риска развития ишемической болезни сердца, сердечной недостаточности, цереброваскулярных заболеваний, фибрилляции предсердий, хронических заболеваний почек [2013 ESH/ESC guidelines for the management of arterial hypertension [Text] / G. Mancia, R. Fagard, K. Narkiewicz [et al.] //J. Hypertens. – 2013. – Vol. 31. – № 7. – P. 1281-1357].
Данные семейных и близнецовых исследований свидетельствуют о наследуемости показателей артериального давления и гипертонии (от 30 до 80%, в зависимости от популяции), однако большинство предрасполагающих генов остаются не установленными [Генетический взгляд на феномен сочетанной патологии у человека [Текст]/ В. П. Пузырев // Медицинская генетика. – 2008. – Т. 7. – № 9. – С. 3-9]. Широкая распространенность гипертонической болезни, высокий риск возникновения осложнений определяют актуальность разработки подходов и выявления критериев индивидуального прогнозирования риска развития гипертонической болезни на основании изучения полиморфных вариантов генов-кандидатов с целью выявления индивидуумов, предрасположенных к данному заболеванию.
Этиология и патогенез ГБ остаются не до конца понятными, при этом одним из перспективных направлений исследований является изучение вовлеченности в формирование данного заболевания неспецифического воспаления и его медиаторов – цитокинов [Анализ межгенных взаимодействий полиморфных локусов генов цитокинов у больных эссенциальной гипертензией [Текст] / Я.Р. Тимашева, Т.Р. Насибуллин, И.А. Туктарова  [и др.] // Артериальная гипертензия. –2012. – №5. – С. 431-437]. Цитокины представляют собой обширную группу пептидов, которые участвуют в регуляции воспаления, ангиогенезе, неспецифических защитных реакциях организма, а также модулируют процессы регенерации, роста и дифференцировки клеток и тканей [Маркеры внутрисосудистого воспаления и профиль цитокинов при артериальной гипертензии [Текст] /  Г. П. Адаменко, Е.С. Головко, Е.И. Скребло // Проблемы здоровья и экологии. – 2014. – №2. – С. 40-44]. С точки зрения вовлеченности в патогенез гипертонической болезни, особая роль среди цитокинов отводится факторам роста.
Трансформирующий фактор роста бета (TGFβ-1) – гетеродимерный белок с молекулярной массой 25-50 кДа [Association of 77 Polymorphisms in 52 Candidate Genes with Blood Pressure Progression and Incident Hypertension: The Women’s Genome Health Study [Text] / D. Conen, S. Cheng, L.L. [et al.] // Steiner Journal of hypertension. – 2009. – Vol. 27, №3. – Р. 476-483]. Трансформирующий фактор роста бета принадлежит семейству TGF, кодирующий его ген расположен на длинном плече 19 хромосомы (19q13.1-19q13.3) [TGF-β1 functional polymorphisms: a review [Text] / C.G. Martelossi, T.K. Paiva, G.S. Badaró [et al.] // Eur Cytokine Netw. – 2016. – Vol. 27(4) – Р. 81-89]. Наиболее изученным полиморфизмом гена  TGFβ-1 является таговый SNР rs1800469 TGFβ-1. Согласно данным литературы, данный молекулярно-генетический маркер способен регулировать транскрипционную активность генов и вовлечен в формирование ряда заболеваний, в том числе, ишемической болезни сердца, аневризмы аорты [The TGF-B1 and IL-10 gene polymorphisms are associated with risk of developing silent myocardial ischemia in the diabetic patients [Text] / M. Cruz, J.M. Fragoso, E. Alvarez-León [et al.] Immunol Lett. – 2013. – Vol. 156, №12. – Р. 18-22].
Фактор роста эндотелия сосудов (VEGFА) – гепарин-связывающий гликопротеин с молекулярной массой 34-42 кДа [Contribution of VEGF polymorphisms to variation in VEGF serum levels in a healthy population [Text] / H.H. Al-Habboubi, M.S. Sater, A.W. Almawi [et al.] // Eur Cytokine Netw. – 2011. – Vol. 22, №3. – Р. 154-158]. Ген, кодирующий VEGFА, расположен на шестой хромосоме (6p21.3) и состоит из восьми экзонов и семи интронов [Genetic association study of coronary collateral circulation in patients with coronary artery disease using 22 single nucleotide polymorphisms corresponding to 10 genes involved in postischemic neovascularization [Text] / J. Duran, P.S. Olavarría, M. Mola [et al.] // BMC Cardiovasc Disord. – 2015. – Vol. 12, №15. – Р. 37]. Наиболее интересен SNР rs833061 VEGFА, представляющий собой замену C на Т в позиции -958. Данный локус ассоциирован с развитием гипертонической болезни и ее осложнений у населения Германии [Fibroblasten-basierter VEGF-Transfer unter Nutzung eines Hypoxie-induzierten Vektors zur Modulation der Neoangiogenese im Bereich ischämischer Regionen myo-cutaner Transplantate [Text] / C. Eggers // Jena, Diss. – 2015. – Р. 211].
Отечественные исследования, посвященные изучению вовлеченности генов факторов роста в формирование предрасположенности к гипертонической болезни и ее осложнений единичны и фрагментарны, а данные о роли генетических вариантов rs1800469 TGFβ-1 и rs833061 VEGFА в развитии данного заболевания у индивидуумов русской национальности, уроженцев Центрального Черноземья отсутствуют.
В изученной научно-медицинской и доступной патентной литературе авторами не было обнаружено способа прогнозирования риска развития гипертонической болезни у индивидуумов русской национальности, уроженцев Центрального Черноземья на основании молекулярно-генетических данных о полиморфизмах генов цитокинов rs1800469 TGFβ-1 и rs833061 VEGFА.
Из области техники известен «Способ прогнозирования возникновения гипертонической болезни» по патенту РФ № 2257139 от 27.07.2005 г. Заявляемый способ позволяет прогнозировать гипертоническую болезнь, основываясь на оценке показателей гемодинамики в ответ на нагрузочную пробу, в качестве которой используется задержка пациентом дыхания после глубокого вдоха.
Недостаток указанного способа заключается в том, что не рассматриваются сочетания полиморфных маркеров генов-кандидатов с риском развития гипертонической болезни.
За прототип выбран патент № 2624480 (Опубликовано: 04.07.2017) на изобретение «Способ прогнозирования риска развития эссенциальной гипертензии на основе комбинаций генов матриксных металлопротеиназ». Данный способ включает выделение ДНК из периферической венозной крови индивидуумов русской национальности, уроженцев Центрального Черноземья, анализ полиморфизмов генов матриксных металлопротеиназ и  прогнозирование высокого риска развития эссенциальной гипертензии при выявлении сочетания генотипа АА rs1320632 MMР-8 и аллеля С rs11225395 MMР-8.
Задачей предполагаемого изобретения является расширение арсенала способов прогнозирования развития гипертонической болезни.
Технический результат использования изобретения – получение критериев оценки риска развития гипертонической болезни у индивидуумов русской национальности, уроженцев Центрального Черноземья на основе данных о сочетаниях генетических вариантов локусов rs1800469 TGFβ-1 и rs833061 VEGFА, включающий:
- выделение ДНК из периферической венозной крови;
- анализ полиморфизмов генов цитокинов rs1800469 TGFβ-1 и rs833061 VEGFА;
- прогнозирование высокого риска развития гипертонической болезни при выявлении сочетания генотипа СС rs1800469 TGFβ-1 с генотипом ТТ rs833061 VEGFА.
Новизна и изобретательский уровень заключаются в том, что из уровня техники не известна возможность прогноза риска развития гипертонической болезни у индивидуумов русской национальности, уроженцев Центрального Черноземья по наличию сочетания генетических вариантов полиморфных маркеров цитокинов rs1800469 TGFβ-1 и rs833061 VEGFА.
Выделение геномной ДНК из периферической крови осуществляют методом фенольно-хлороформной экстракции (Mathew, 1984) в два этапа. На первом этапе к 4 мл крови с ЭДТА добавляют 25 мл лизирующего буфера, содержащего 320мМ сахарозы, 1% тритон Х-100, 5мМ MgCl2, 10мМ трис-HCl (pH=7,6). Полученную смесь перемешивают и центрифугируют при 4ºС, 4000 об./мин. в течение 20 минут. После центрифугирования надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 4 мл раствора, содержащего 25 мМ ЭДТА (рН=8,0) и 75 мМ NaCl, ресуспензируют. Затем прибавляют 0,4 мл 10% SDS, 35 мкл протеиназы К (10мг/мл) и инкубируют образец при 37ºС в течение 16 часов.
На втором этапе из полученного лизата последовательно проводят экстракцию ДНК равными объемами фенола, фенол-хлороформа (1:1) и хлороформа с центрифугированием при 4000 об/мин. в течение 10 минут. После каждого центрифугирования производят отбор водной фазы. ДНК осаждают из раствора двумя объемами охлажденного 96% этанола. После лиофилизации полученную ДНК растворяют в бидистиллированной, деионизованной воде и хранят при -200С. Выделенную ДНК используют для проведения полимеразной цепной реакции синтеза ДНК.
Анализ полиморфизма гена rs1800469 TGFβ-1 проводят методом ПЦР синтеза ДНК на амплификаторе СFX96 (Bio-Rad) с использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров и зондов с последующим анализом полиморфизма методом дискриминации аллелей. Реакционная смесь объемом 25 мкл включает: 67 мМ трис-HCl (pH=8,8), 2,5мМ MgCl2, 0,1 мкг геномной ДНК, по 10 пМ каждого праймера, по 5 пкмоль каждого зонда, по 200 мкМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP и 1 единицу активной Taq-полимеразы. После денатурации (5 мин при 95°С) выполняют 40 циклов амплификации по схеме: отжиг праймеров – 1 мин. при t=54°С; денатурация – 15 сек при t=95°С. При проведении ПЦР в амплификаторе (CFX96) с флюоресцентной детекцией генотипирование осуществляют методом Tag Man зондов по данным величин ОЕФ (относительные единицы флуоресценции). Для rs1800469 TGFβ-1 зонд с флуоресцентным красителем ROX соответствует аллелю Т, зонд с красителем FAM – аллелю С (фиг.1).
Для исследования полиморфизма rs833061 VEGFА используют наборы 2,5х реакционной смеси для проведения ПЦР-РВ в объеме 25 мкл на 1 образец, включающие 2,5х реакционную смесь (2,5х ПЦР буфер: (KСl, ТрисHСl (рH 8,8), 6,25 мМ MgСl2), SynTаq ДНК-полимеразу, дезоксинуклеозидтрифосфаты, глицерол, Twееn 20) в объеме 10мкл, 25мМ MgСl2 в объеме 1,5 мкл, ddH2О  (деионизированная вода), по 10 пкмоль каждого праймера и по 5 пкмоль каждого зонда. При проведении ПЦР в амплификаторе с флюоресцентной детекцией (на амплификаторе CFX96) генотипирование осуществляют методом Tag Man зондов по данным величин ОЕФ (относительные единицы флуоресценции). Для rs833061 VEGFА зонд с флуоресцентным красителем ROX соответствует аллелю Т, зонд с красителем FAM – аллелю С (фиг.2).
Выделенную ДНК подвергают полимеразной цепной реакции с использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров [Ray D.W. et.al., 2004; McKnight A., 2007].
Изобретение характеризуется фигурами.
Фиг. 1. Дискриминации аллелей методом детекции TaqMan зондов по данным величин ОЕФ (относительные единицы флуоресценции) каждого зонда на амплификаторе CFX96 c детектирующей системой в режиме реального времени полиморфизма TGFβ-1 (rs1800469):    - СС,     - ТТ,   - ТС,  - отрицательный контроль.
Фиг. 2. Дискриминации аллелей методом детекции TaqMan зондов по данным величин ОЕФ (относительные единицы флуоресценции) каждого зонда на амплификаторе CFX96 c детектирующей системой в режиме реального времени полиморфизма VEGF-A (rs833061):    - СС,     - ТТ,   - СТ,  - отрицательный контроль.
Фиг. 3. Диаграмма взаимодействий локусов rs1800469 TGFβ-1 и rs833061 VEGFA в двухфакторной модели при формировании гипертонической болезни, полученная методом GMDR с коррекцией на коварианты, где столбики слева соответствуют группе больных, столбики справа соответствуют контрольной группе.
Генотипирование полиморфизмов rs1800469 TGFβ-1 и rs833061 VEGFA осуществляют методом детекции TagMan зондов по данным величин ОЕФ (относительные единицы флуоресценции) каждого зонда на амплификаторе CFX96 c детектирующей системой в режиме реального времени.
Анализ ассоциаций сочетаний генетических вариантов и статуса курения с гипертонической болезнью проводят с помощью методов MDR (Multifactor Dimensionality Reduction) и его модификации GMDR (Generalized Multifactor Dimensionality Reduction) с использованием соответствующего программного обеспечения (MDR версии 3.0.2, http://www.epistasis.org/ mdr.html, и GMDR версии 0.9, http://www.ssg.uab.edu/gmdr/) (фиг. 3). В основе использованных методов лежит общий принцип выявления переменной, содержащей информацию о нескольких локусах, и формирование кластеров, содержащих комбинации генотипов высокого и низкого риска развития изучаемой патологии.
Возможность использования предложенного способа для оценки риска возникновения и развития гипертонической болезни подтверждает анализ результатов наблюдений 939 пациентов с ГБ и 466 индивидуумов контрольной группы. Общий объем исследуемой выборки составил 1405 человек. В группе больных насчитывается 564 мужчины (средний возраст составил 57,60 лет) и 375 женщин (средний возраст составил 58,80 лет). В контрольной группе 257 мужчин (средний возраст составил 57,54 лет) и 209 женщин (средний возраст составил 58,17 лет). В исследуемые выборки включались индивидуумы русской национальности, являющиеся уроженцами Центрального Черноземья России и не имеющие родства между собой. Таким образом, группа больных с ГБ и контрольная группа сопоставимы по полу, возрасту, месту рождения и национальности.
Все клинические и клинико-лабораторные исследования проводили на базе неврологического и кардиологического отделений Белгородской областной клинической больницы Святителя Иоасафа, с информированного согласия пациентов на использование материалов лечебно-диагностических мероприятий, проводимых за период госпитализации и после нее для научно-исследовательских целей. В работе использовалась анкета-опросник, включающая антропометрические, социально-демографические показатели, а также сведения о наличии у респондентов средовых факторов риска эссенциальной гипертензии, таких как курение, злоупотребление алкоголем, низкий уровень физической активности, особенности питания, стрессовые ситуации [Промоторный полиморфизм -1293G>C гена CУР2E1 увеличивает риcк развития гипертоничеcкой болезни у мужчин, злоупотребляющих алкоголем [Текcт] / А.В. Полоников, В.П. Иванов, М.А. Cолодилова // Бюллетень экcпериментальной биологии и медицины. – 2013. – Т. 155, № 6. – C. 695-698]. Полученные материалы протоколировали по стандартам этического комитета Российской Федерации.
Анализ ассоциаций сочетаний генетических вариантов цитокинов с гипертонической болезнью проводили с помощью методов MDR (Multifactor Dimensionality Reduction) и его модификации GMDR (Generalized Multifactor Dimensionality Reduction) с использованием соответствующего программного обеспечения (MDR версии 3.0.2, http://www.epistasis.org/ mdr.html, и GMDR версии 0.9, http://www.ssg.uab.edu/gmdr/), с коррекцией на индекс массы тела, уровни холестерина, триглицеридов, липопротеидов низкой плотности, липопротеидов высокой плотности, курение, низкую физическую активность, предпочтение к жирной пище, редкое употребление овощей и фруктов. Для валидации полученных результатов проводили пермутационный тест – выполнено 1000 пермутаций при 10 кросс-валидациях, что обеспечивает рperm<0,001
Установлены особенности «конституции» больных с гипертонической болезнью на основе комбинаций генов цитокинов. Выявлена модель ген-генных взаимодействий полиморфизмов rs1800469 TGFβ-1 и rs833061 VEGFA, ассоциированная с высоким риском развития гипертонической болезни с поправкой на такие ковариаты как индекс массы тела, уровни холестерина, триглицеридов, липопротеидов низкой плотности, липопротеидов высокой плотности, курение, низкую физическую активность, предпочтение к жирной пище, редкое употребление овощей и фруктов, для исключения их влияния. Воспроизводимость модели (CVC) составила 100%, точность предсказания модели (Test.Bal.Acc.) равна 51,89%, OR=1,47, 95% CI 0,93-2,32, р=0,01 (рреrm<0,001).
Таким образом, в рамках данной модели выявлена комбинация, являющаяся фактором риска развития гипертонической болезни: сочетание генотипа СС rs1800469 TGFβ-1 с генотипом ТТ rs833061 VEGFА наблюдается у 10,12% больных с ГБ и у 6,22% индивидуумов контрольной группы (Х2=4,36, р=0,03). Следовательно, наличие данного сочетания является фактором риска развития гипертонической болезни (ОR=1,23, 95% СI 0,82-1,86) независимо от влияния средовых факторов риска.
В качестве примеров конкретного применения разработанного способа приведено генетическое обследование по локусам rs1800469 TGFβ-1 и rs833061 VEGFA добровольцев русской национальности, являющихся жителями Центрального Черноземья и не являющихся родственниками между собой.
Пример 1.
У пациента И. была взята венозная кровь, при генотипировании ДНК-маркеров было выявлено, что генотип индивидуума по локусу rs1800469 TGFβ-1 – СС, генотип по локусу rs833061 VEGFA – ТТ. Сочетание генотипа СС (rs1800469 TGFβ-1) с генотипом ТТ (rs833061 VEGFА) позволило отнести пациента И. в группу больных с высоким риском развития гипертонической болезни. Дальнейшее наблюдение подтвердило диагноз гипертонической болезни у пациента.
Пример 2.
У пациентки Д. произведен забор венозной крови, при генотипировании ДНК-маркеров выявлено, что ее генотип по локусу rs1800469 TGFβ-1 – ТТ, генотип по локусу rs833061 VEGFA – СС. По данным генотипирования пациентка Д. не включается в группу больных с высоким риском развития гипертонической болезни. В дальнейшем было установлено, что артериальное давление пациентки соответствует норме.
Пример 3.
У пациента В. после забора венозной крови из локтевой вены и последующего генотипирования выявлен генотип СС по локусу rs1800469 TGFβ-1 и генотип СС по локусу rs833061 VEGFA. По данным генотипирования пациент В. не включается в группу больных с высоким риском развития гипертонической болезни. В дальнейшем было установлено, что артериальное давление пациента В. соответствует нормальным значениям.
Применение данного способа позволит на доклиническом этапе формировать среди индивидуумов группы риска и своевременно реализовывать в этих группах необходимые лечебно-профилактические мероприятия по предупреждению развития гипертонической болезни.