Выбор раковых мутаций для создания персонализированной противораковой вакцины

1. Способ выбора опухолевых неоантигенов для применения в персонализированной вакцине, предусматривающий стадии:
(a) определения неоантигенов в образце раковых клеток, взятом у индивидуума, где каждый неоантиген
- содержится в кодирующей последовательности,
- содержит по меньшей мере одну мутацию в кодирующей последовательности, приводящую к изменению кодируемой аминокислотной последовательности, которое не присутствует в образце нераковых клеток указанного индивидуума, и
- состоит из от 9 до 40, предпочтительно от 19 до 31, более предпочтительно от 23 до 25, наиболее предпочтительно 25 смежных аминокислот кодирующей последовательности в образце раковых клеток,
(b) определения для каждого неоантигена частоты мутантных аллелей каждой из указанных мутаций согласно стадии (а) в кодирующей последовательности,
(c) определения уровня экспрессии каждой кодирующей последовательности, содержащей по меньшей мере одну из указанных мутаций,
(i) в указанном образце раковых клеток или
(ii) на основании базы данных экспрессии рака того же типа, что и образец раковых клеток,
(d) предсказания аффинности связывания неоантигенов с МНС класса I, где
(I) аллели HLA класса I определяют в образце нераковых клеток указанного индивидуума,
(II) для каждого аллеля HLA класса I, определенного на стадии (I), предсказывают аффинность связывания с МНС класса I для каждого фрагмента, состоящего из от 8 до 15, предпочтительно от 9 до 10, более предпочтительно 9, смежных аминокислот неоантигена, где каждый фрагмент содержит по меньшей мере одно аминокислотное изменение, вызванное мутацией согласно стадии (а), и
(III) фрагмент с наивысшей аффинностью связывания с МНС класса I определяет аффинность связывания неоантигена с МНС класса I,
(e) ранжирования неоантигенов в соответствии с значениями, определенными на стадиях (b) - (d), для каждого неоантигена, от самого большого до самого маленького значения, с обеспечением первого, второго и третьего перечня рангов,
(f) вычисления ранговой суммы на основании первого, второго и третьего перечня рангов и распределения неоантигенов по увеличению ранговой суммы с получением ранжированного перечня неоантигенов,
(g) выбора 30-240, предпочтительно 40-80, более предпочтительно 60, неоантигенов из ранжированного перечня неоантигенов, полученного на стадии (f), начиная с самого низкого ранга.
2. Способ по п. 1, в котором стадии (а) и (d)(I) проводят с применением массивно-параллельного секвенирования ДНК образцов, и где число прочтений, содержащих мутацию в хромосомном положении идентифицированной мутации, составляет:
- в образце раковых клеток по меньшей мере 2, предпочтительно по меньшей мере 3,
- в образце нераковых клеток составляет 2 или менее, предпочтительно 0.
3. Способ по любому из предшествующих пунктов, где способ предусматривает стадию (d') в дополнение к стадии (d) или в качестве альтернативы ей, где стадия (d') содержит:
определение аллелей HLA класса II в образце нераковых клеток указанного индивидуума,
предсказание аффинности связывания неоантигена с МНС класса II, где
- для каждого определенного аллеля HLA класса II предсказывают аффинность связывания с МНС класса II для каждого фрагмента из от 11 до 30, предпочтительно 15, смежных аминокислот неоантигена, где каждый фрагмент содержит по меньшей мере одну мутантную аминокислоту, полученную посредством мутации согласно стадии (а), и
- фрагмент с самой высокой аффинностью связывания с МНС класса II определяет аффинность связывания неоантигена с МНС класса II,
где аффинность связывания с МНС класса II ранжируют от самой высокой до самой низкой аффинности связывания с МНС класса II, с получением четвертого перечня рангов, который включают в ранговую сумму на стадии (f).
4. Способ по любому из пп. 1-3, где по меньшей мере одна мутация согласно стадии (а) представляет собой однонуклеотидный вариант (SNV) или инсерционную/делеционную мутацию, приводящую к пептиду со сдвигом рамки считывания (FSP).
5. Способ по п. 4, где мутацией является SNV, и неоантиген имеет общий размер, определенный на стадии (а), и состоит из аминокислоты, вызванной мутацией, фланкированной с каждой стороны рядом соседних смежных аминокислот, причем число на каждой стороне не отличается более чем на одну, кроме тех случаев, когда кодирующая последовательность не содержит достаточного количества аминокислот на каждой стороне, где неоантиген имеет общий размер, определенный на стадии (а).
6. Способ по п. 4, где мутация приводит к FSP, и каждое одно аминокислотное изменение, вызванное мутацией, приводит к неоантигену, который имеет общий размер, определенный на стадии (а), и состоит из:
(i) указанного одного аминокислотного изменения, вызванного мутацией, и от 7 до 14, предпочтительно 8, N-концевых соседних смежных аминокислот, и
(ii) числа смежных аминокислот, примыкающих к фрагменту согласно стадии (i) с каждой стороны, причем число аминокислот с каждой стороны отличается не более чем на одну, кроме тех случаев, когда кодирующая последовательность не содержит достаточного количества аминокислот на каждой стороне,
где аффинность связывания с МНС класса I на стадии (d) и/или аффинность связывания с МНС класса II на стадии (d') предсказывают для фрагмента согласно стадии (i).
7. Способ по любому из предшествующих пунктов, где частота мутантных аллелей неоантигена, определенная на стадии (b) в образце раковых клеток, составляет по меньшей мере 2%, предпочтительно по меньшей мере 5%, более предпочтительно по меньшей мере 10%.
8. Способ по любому из предшествующих пунктов, где на стадии (g) дополнительно удаляют из указанного ранжированного перечня неоантигенов неоантигены со значением энтропии Шеннона для их аминокислотной последовательности ниже 0,1.
9. Способ по любому из предшествующих пунктов, где уровень экспрессии, определенный на стадии (c)(i), использует скорректированное значение транскриптов на миллион тысяч пар нуклеотидов (corrТРМ), вычисленное согласно следующей формуле
где М представляет собой число прочтений, охватывающих положение мутации согласно стадии (а), которые содержат мутацию, и W представляет собой число прочтений, охватывающих положение мутации согласно стадии (а), без мутации, и ТРМ представляет собой значение транскриптов на миллион тысяч пар нуклеотидов гена, содержащего мутацию, и с является константой больше 0, предпочтительно равно 0,1.
10. Способ по любому из предшествующих пунктов, где ранговая сумма на стадии (f) представляет собой взвешенную ранговую сумму, где
- число неоантигенов, определенное на стадии (а), добавляют к значению ранга каждого неоантигена:
в третьем перечне рангов, для которого предсказанная аффинность связывания с МНС класса I согласно стадии (d) привела к значению IC50 выше 1000 нМ и/или
в четвертом перечне рангов, для которого предсказанная аффинность связывания с МНС класса II на стадии (d') привела к значению IC50 выше 1000 нМ;
и/или
- в случае выполнения стадии (с) (i) путем массивно-параллельного секвенирования транскриптома, ранговую сумма на стадии (f) умножают на фактор взвешивания (WF), где WF равен
1, если число картированных прочтений транскриптома для мутации равно >0,
2, если число картированных прочтений транскриптома для мутации равно 0, и число картированных прочтений немутантной последовательности равно 0, и значение транскриптов на миллион (ТРМ) равно по меньшей мере 0,5,
3, если число картированных прочтений транскриптома для мутации равно 0, и число картированных прочтений немутантной последовательности равно >0, и значение транскриптов на миллион (ТРМ) равно по меньшей мере 0,5,
4, если число картированных прочтений транскриптома для мутации равно 0, и число картированных прочтений немутантной последовательности равно 0, и значение транскриптов на миллион (ТРМ) равно <0,5, или
5, если число картированных прочтений транскриптома для мутации равно 0, и число картированных прочтений немутантной последовательности равно >0, и значение транскриптов на миллион (ТРМ) равно <0,5.
11. Способ по любому из предшествующих пунктов, где стадия (g) содержит альтернативный способ выбора, где неоантигены выбирают из ранжированного перечня неоантигенов начиная с самого низкого ранга, до тех пор, пока не будет достигнут установленный максимальный размер в общей полной длине в аминокислотах для всех выбранных неоантигенов, где максимальный размер составляет от 1200 до 1800, предпочтительно 1500 аминокислот для каждого вектора одновалентной или поливалентной вакцины, и необязательно где два или несколько неоантигена сливают в один новый неоантиген, если они содержат перекрывающиеся сегменты аминокислотных последовательностей.
12. Способ конструирования персонализированного вектора, кодирующего комбинацию неоантигенов по любому из пп. 1-11, для применения в виде вакцины, предусматривающий стадии:
(i) распределения перечня неоантигенов в по меньшей мере 10^5-10^8, предпочтительно 10^6 различные комбинации,
(ii) создания всех возможных пар сегментов соединения неоантигенов для каждой комбинации, где каждый сегмент соединения содержит 15 соседних смежных аминокислот с каждой стороны соединения,
(iii) предсказания аффинности связывания с МНС класса I и/или класса II для всех соединенных эпитопов, где тестируют только HLA аллели, которые присутствуют у индивидуума, для которого конструируют вектор, и
(iv) выбора комбинации неоантигенов с наименьшим числом соединенных эпитопов с IC50, равной ≤1500 нМ, и где, если множество комбинаций имеют одно и то же наименьшее число соединенных эпитопов, выбирают первую встречающуюся комбинацию.
13. Вектор, кодирующий перечень неоантигенов по любому из пп. 1-11 или комбинацию неоантигенов по п. 12, необязательно дополнительно содержащий энхансерный элемент Т-клеток, предпочтительно (SEQ ID NO: 173 - 182), более предпочтительно SEQ ID NO: 175, слитый с N-концом первого неоантигена в перечне, и где необязательно вектор содержит две независимые экспрессионные кассеты, где каждая экспрессионная кассета кодирует часть перечня неоантигенов по любому из пп. 1-11 или комбинацию неоантигенов по п. 12, и где части перечня, кодируемые экспрессионными кассетами, имеют приблизительно равный размер по числу аминокислот.
14. Коллекция векторов, каждый из которых кодирует часть перечня неоантигенов по любому из пп. 1-11 или комбинацию неоантигенов по п. 12, где коллекция содержит 2-4, предпочтительно 2 вектора, и где предпочтительно вставки в эти векторы, кодирующие часть перечня, имеют приблизительно равный размер по числу аминокислот.
15. Вектор по п. 13 или коллекция векторов по п. 14 для применения в вакцинации против рака.