Способ диагностики полиморфизма генов AGRN, ISG15 и HES4, обуславливающего летальный генетический дефект множественного артрогрипоза крупного рогатого скота мясных пород
DIAGNOSTIC TECHNIQUE FOR POLYMORPHISM OF GENES AGRN, ISG15 AND HES4 CAUSING LETHAL GENETIC DEFECT OF MULTIPLE ARTHROGRYPOSIS OF CATTLE MEAT BREEDS

Изобретение относится к молекулярной генетике, а именно к способам определения полиморфизма генов AGRN, ISG15 и HES4, обуславливающего летальный рецессивный генетический дефект крупного рогатого скота мясных пород множественный артрогрипоз (AM), и может быть использовано в селекции крупного рогатого скота.
Одной из задач Государственной программы развития сельского хозяйства на 2013-2020 годы является развитие мясного скотоводства. Важнейшую роль в процессе ускоренного развития этой отрасли играет практически заново сформированная племенная база за счет использования лучших племенных ресурсов [Государственная программа развития сельского хозяйства и регулирования рынков сельскохозяйственной продукции, сырья и продовольствия на 2013-2020 годы. Утверждена Постановлением Правительства Российской Федерации от 14 июля 2012 г. №717, с. 66.], что, отчасти, достигается импортом племенного материала крупного рогатого скота мясного направления продуктивности из-за рубежа.
Однако, практически у всех мясных пород зарубежной селекции были выявлены генетические дефекты, проявление которых вместо ожидаемой пользы может нанести серьезный экономический ущерб [Gholap P.N., Kale D.S. and Sirothia A.R. Genetic Diseases in Cattle: A Review. Research Journal of Animal, Veterinary and Fishery Sciences. 2014; 2(2): 24-33].
Одним из летальных генетических дефектов крупного рогатого скота является множественный артрогрипоз (Arthrogriposis multiplex, AM). Летальный гаплотип был картирован на хромосоме 16 [OMIA, Online Mendelian Inheritance in Animals // URL: http://omia.angis.org.au/home (дата обращения 25.01.2017)].
Причиной AM является обширная деления (23347 п.о.), охватывающая три гена (полностью удаляется ген убиквитино-подобного модификатора (ISG15), 5' регуляторный регион гена волос и усилителя расщепления (HES4) и/или два первых экзона гена агрина (AGRN)) (OMIA 002135-9913) [Beever J.E. Likely presence of lethal genetic defect in a specific line of Angus cattle.2008. http://www.angus.org/pub/am/aaa_notice.pdf].
Телята, гомозиготные по мутантному аллелю, характеризуются нарушением нервно-мышечного взаимодействия, вследствие чего развиваются такие клинические признаки как аномальный изгиб спины (сколиоз или кифоз), мышечная гипоплазия, умеренная гидроцефалия. Больные телята рождаются мертвыми или умирают вскоре после рождения [Beever, Jon. 2008. An Update on Arthrogryposis Multiplex in Cattle. Website of the American Angus Association. (http://www.angus.org/NAAB_release.pdf accessed 11-22-2009)].
Анализ коров и быков, зарегистрированных в Американской ассоциации абердин-ангусской породы, проведенный по данным 2008-2017 гг., показал, что за рубежом среди быков дефект множественного артрогрипоза практически полностью искоренен, а среди коров носительство данной аномалии остается на стабильно высоком уровне (12,0%) [Konovalova E.N., Gladyr" Е.А., Kostiunina O.V., Zinovieva N.A. Congenital defects of beef cattle breeds and general principles of their prevention. Journal of Agriculture and Environment, 2017, p. 3].
Известен способ диагностики полиморфизма в генах AGRN, ISG15 и HES4, ассоциированного с AM, и взятый в качестве прототипа, заключающийся в том, что выделенная из биоматериала животных (кожа, кровь, сперма, молоко и пр.) ДНК исследуется методом аллель-специфичной ПЦР с использованием трех олигонуклеотидных праймеров: одного прямого и двух обратных, имеющих длину 22 нуклеотида, температуру плавления 64-68°С и содержание гуанина-цитозина 45,5-54,5%. При этом у животных-носителей порока выявляется два фрагмента ДНК: 576 п. о., соответствующий здоровому аллелю, и 507 п.о., соответствующий мутантному аллелю [WO 2011/075144, C12Q 7/68 (2006.07].
Данный способ является высокоспецифичным и позволяет выявлять животных-носителей множественного артрогрипоза независимо от пола и возраста.
Однако, он имеет следующие недостатки: 1) наличие различий между праймерами в температуре плавления и содержании гуанина-цитозина делает затруднительным оптимизацию температурно-временных условий ПЦР; 2) дизайн метода предполагает амплификацию в ходе ПЦР фрагментов ДНК длиной свыше 500 п.о., что возможно лишь при использовании ДНК высокой степени очистки; 3) разница между длиной здорового аллеля и дефектного, составляющая 69 п.о., затрудняет визуализацию фрагментов ДНК в агарозном геле при электрофорезе, что может приводить к получению ложноотрицательного результата.
При создании настоящего изобретения задача состояла в разработке способа обнаружения дефектного аллеля генов AGRN, ISG15 и HES4, ассоциированного с гаплотипом АМС, с целью идентификации скрытых носителей AM и разработки программ их использования в селекции без риска получения нежизнеспособных телят.
Задача нашего изобретения - создание простого, не требующего использования дорогостоящего оборудования, специфичного способа идентификации полиморфизма в генах AGRN, ISG15 и HES4, ассоциированного с гаплотипом АМС, для использования в селекции крупного рогатого скота.
Технический результат изобретения достигается тем, что предложен способ диагностики полиморфизма генов AGRN, ISG15 и HES4, обуславливающего летальный генетический дефект множественного артрогрипоза крупного рогатого скота мясных пород, включающий анализ выделенной из биоматериала животных (кожа, кровь, сперма, молоко и пр.) ДНК методом аллель-специфичной ПЦР с использованием трех праймеров: одного прямого и двух обратных с последующим электрофорезом в агарозном геле, отличающийся тем, что для амплификации искомых фрагментов ДНК используют олигонуклеотидные праймеры длиной 20 пар нуклеотидов с температурой плавления 58-60°С и содержанием гуанина-цитозина 45-50%, и амплифицированные фрагменты ДНК длиной 357 п.о. для здорового аллеля и 242 п.о. - для мутантного.
Данный подход имеет следующие преимущества: 1) минимальные различия между праймерами в температуре плавления и содержании гуанина-цитозина позволяют легче оптимизировать температурно-временные условия ПЦР; 2) меньшая длина олигонуклеотидных праймеров несколько снижает их стоимость; 3) образование в ходе ПЦР фрагментов ДНК до 500 п.о. дает возможность использовать данный способ при работе с ДНК не высокого качества; 4) разница в длине между здоровым и мутантным аллелем в 115 п.о. лучше визуализируется на электрофореграмме, что сводит к минимуму возможность ошибочной интерпретации результатов.
Принцип действия разрабатываемого способа основан на использовании двух обратных праймеров, специфичных для здорового и дефектного аллеля и одного общего прямого праймера. При этом мутантному аллелю, ассоциированному с АМС, соответствует фрагмент длиной 242 п.о., а нормальному (не мутантному аллелю) - фрагмент длиной 357 п.о., что позволяет дифференцировать мутантные и немутантные аллели генов AGRN, ISG15 и HES4 методом электрофореза в агарозном геле.
Разрабатываемый способ базируется на определении делеции, охватывающей три гена (полностью удаляется ген убиквитино-подобного модификатора (ISG15), 5' регуляторный регион гена волос и усилителя расщепления (HES4) и/или два первых экзона гена агрина (AGRN)) размером 23347 п.о. С этой целью был выбран участок генов AGRN, ISG15 и HES4 крупного рогатого скота внутри делеции и за ее пределами.
Для создания серии референтных образцов с известными генотипами по AGRN, ISG15 и HES4 (n=60) были использованы образцы ткани (ушной выщип) быков и коров абердин-ангусской породы. ДНК выделяли при помощи набора реагентов «ДНК-Экстран-1» (ЗАО «Синтол», Россия) согласно инструкции. Создание серии референтных генотипов проводили посредством использования способа-прототипа. С этой целью проводили амплификацию фрагментов длиной 576 п. о., характерного для мутантного аллеля и 507 п.о., характерного для здорового аллеля.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 - теоретическая модель тест-системы определения гаплотипа АМС на основе метода ПЦР (А) и результаты генотипирования образцов (Б).
В результате проведенного генотипирования была создана серия референтных образцов (n=60), в том числе 5 образцов с генотипом АМС (носитель AM) и 55 образцов с генотипом AMF (не носитель).
Определение полиморфизма HES4, ISG15 и AGRN предложенным способом выполняли следующим образом:
1. Исходя из локализации делеции были подобраны два обратных праймера, специфичных для здорового и дефектного аллеля (AMV2, AMV3), и одного общего прямого праймера (AMV1):
AMV1 - 5'-CGAAAGCCTTCTTTCCACTG
AMV2 - 5'-TTCTGCAGGCAAGAACACTG
AMV3 - 5'-GAATGCCACTTCCTCCTCTG
Продукт амплификации праймеров AMV1 и AMV3 характерен для «здорового» аллеля и имеет длину 357 п.о., продукт амплификации праймеров AMV1 и AMV2 характерен для «мутантного» аллеля и имеет длину 242 п.о. Участок делеции помечен звездочками. Фиг. 1А иллюстрирует описанный выше вариант настоящего изобретения.
4
2
4
2
2. Выполняли 37 циклов ПЦР в 10 мкл реакционной смеси следующего состава: 1хПЦР буфер (16.6 мМ (NH)SO, 67.7 мМ Трис-HCl, рН=8.8, 0.1% (v/v) Tween 20, 1.5 мМ MgCl), 0,2 мМ дНТФ, 10 пмол каждого из праймеров, 1 Ед Taq-полимеразы и 1 мкл ДНК при следующем температурно-временном режиме: начальная денатурация при 95°С - 3 мин, 35 циклов последовательно - 95°С - 0,75 мин, 65,5°С - 0,5 мин, 72°С - 0,5 мин, заключительная элонгация при 72°С - 7 мин;
3. Определение аллелей АМС и AMF генов HES4, ISG15 и AGRN осуществляли методом гель-электрофореза, нанося по 5 мкл амплификата в 2% агарозный гель, электрофоретически разделяли в 1х ТАЕ буфере 25 мин при 110 В и детектировали под ультрафиолетовым светом (УФ). При этом генотипу AMF (не носителю AM) соответствует фрагмента длиной 357 п.о., генотипу АМС (носителю AM) - два фрагмента длиной 357 и 242 п.о. и генотипу AMI (летальный, может быть выявлен только среди плодов или новорожденных телят) - фрагмент длиной 242 п.о. (Фиг. 1В). Длины фрагментов сравнивали в сопоставлении с М - маркером длины 100 п.о. (500×2), Биосан, Россия;
4. Результативность разработанной тест-системы оценивали посредством сравнения результатов генотипирования референтных образцов.
Пример. Контрольное использование предложенного способа определения полиморфизма генов HES4, ISG15 и AGRN было апробировано на выборке племенного поголовья крупного рогатого скота абердин-ангусской (n=857 голов, шесть популяций) и герефордской (n=124, одна популяция) пород. Исследование выявило наличие 7 животных с генотипом АМС (носители AM). Таким образом, разработанный способ может быть использован для выявления животных, являющихся скрытыми носителями делеции в генах HES4, ISG15 и AGRN, ассоциированной с гаплотипом АМС.
Положительный результат изобретения заключается в том, что с применением технически простых методов, не требующих использования дорогостоящих реактивов, оборудования, больших затрат сил и времени, возможно выявление мутантного аллеля АМС генов AGRN, ISG15 и HES4, что позволит применить данный метод в селекции животных.
Предложенный способ применим в генетике сельскохозяйственных животных для выявления полиморфизма в генах HES4, ISG15 и AGRN крупного рогатого скота, ассоциированного с гаплотипом АМС, с целью последующего использования полученных результатов в разведении и селекции крупного рогатого скота в племенных и товарных хозяйствах отрасли мясного скотоводства.