ПРИМЕНЕНИЕ ПРОИЗВОДНЫХ 1-ФЕНИЛ-2-ПИРИДИНИЛАЛКИЛОВОГО СПИРТА ПРИ ЛЕЧЕНИИ МУКОВИСЦИДОЗА
USE OF 1-PHENYL-2-PYRIDINYLALKYL ALCOHOL DERIVATIVES IN TREATMENT OF MUCOVISCIDOSIS

Введение
Область изобретения
Настоящее изобретение относится к применению некоторых производных 1-фенил-2-пиридинилалкилового спирта при лечении муковисцидоза.
Предпосылки изобретения
Муковисцидоз (CF) является распространенным летальным генетическим заболеванием, вызываемым мутациями гена, кодирующего трансмембранный регулятор муковисцидоза (CFTR), хлорный канал. Заболевание является мультисистемным заболеванием, характеризующимся недостаточностью поджелудочной железы и хроническими инфекциями дыхательных путей, снижением функции легких, повторными обострениями легких и дыхательной недостаточностью. Заболевание является аутосомно-рецессивным и вызвано снижением уровней и/или недостаточной активностью канала CFTR, ABC-переносчика анионов, который обычно присутствует на апикальной поверхности в эпителиальной мембране многих клеток, включая клетки дыхательных путей (Leier et al., 2012, Cell Physiol. Biochem., vol. 29, p. 775-790; Wainwright et al., 2015, N. Engl. J. Med., vol. 373, p. 220-231; Lambert et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 2014, vol. 50, p. 549-558). Нарушение транспорта соли и воды на поверхности эпителиальных клеток, вызванное мутацией CFTR, приводит, в частности, к повышенной секреции слизи, а также к инфекции или воспалению в пораженных органах. На сегодняшний день не существует полностью удовлетворительного лечения муковисцидоза.
CFTR
CFTR
CFTR
Хотя в качестве вызывающих муковисцидоз у людей были описаны многие мутации в белке CFTR, мутация, вызывающая делецию фенилаланина 508 (Phe508del; F508del; ΔF508) является самой распространенной мутацией в гене CFTR; около 90% пациентов с муковисцидозом являются гетерозиготными по соответствующей мутации, и почти половина пациентов являются гомозиготными по этой мутации (Kuk et al., 2015, Ther. Adv. Resp. Dis., vol. 9, p. 313-326). Мутация ΔF508 нарушает сворачивание/запускает неправильное сворачивание белка CFTR, приводя к преждевременной деградации транслируемого белка, и, таким образом, является причиной дефекта, который значительно снижает уровни белка в эпителиальной мембране (Blanchard et al., 2014, FASEB J., vol. 28, p. 791-801); кроме того, мутация ΔF508 ухудшает стабильность белка CFTR и воротный механизм ионных каналов (гейтинг): несколько каналов, присутствующих на поверхности клетки, имеют ограниченную активность по транспорту ионов хлора/бикарбоната и, таким образом, имеют функциональные нарушения (Leier et al., выше; Wainwright et al., выше). В то же время были описаны другие мутанты , где белок CFTR должным образом присутствует на поверхности эпителиальных клеток, но характеризуется дефицитом в его хлорид/бикарбонатном гейтинге/проводимости, например, мутант CFTR G551D (Kuk et al., выше). «Cystic Fibrosis Mutation Database», доступная в интернете по адресу http://www.genet.sickkids.on.ca/app является всеобъемлющей базой данных, предоставляющей обзор известных мутаций CFTR, причастных к муковисцидозу. Согласно указанной базе данных в настоящее время известно более 2000 мутаций CFTR, сгруппированных как миссенс-мутации, фреймшифт мутации, сплайсинговые мутации, нонсенс-мутации, вставка/делеция внутри рамки считывания (in/dels), большие in/dels, мутации промотора, вариации последовательности и мутации еще неизвестного молекулярного действия. Известные мутации обнаружены распределенными по всей открытой рамке считывания гена  (включая 27 экзонов и 26 интронов), а также по промотору и 3’ нетранслируемой области (3’ UTR) гена . «Вариация последовательности» относится ко всем тем генетическим мутациям, которые известны как таковые, но которые, как было показано, не вызывают заболевания; однако, когда вариация последовательности обнаруживается у одного отдельного человека, невозможно определить, является ли она «не вызывающей заболевание». Вариант последовательности у человека, которая, как было показано, не вызывает заболевания и которая присутствует с частотой аллелей 1%, также называют «полиморфизмом», см. http://www.genet.sickkids.on.ca/app.
Выработка слизи, воспаление и уровень цАМФ при муковисцидозе
Муковисцидоз, как правило, также характеризуется избыточной выработкой слизи, то есть вязкоупругого биологического материала, который представляет собой композицию компонентов, секретируемых апикально (люминально) эпителиальными и железистыми клетками, и покрывает и защищает апикальные поверхности дыхательных, желудочно-кишечных и репродуктивных эпителиальных путей. Избыточная выработка гликопротеинов слизи («муцинов») и закупорка слизью обычно наиболее губительны в дыхательных путях у пациентов с муковисцидозом. Однако избыточная выработка слизи в настоящее время не понимается как прямая причина дефектного белка CFTR, а скорее как последующее проявление; было показано, что в легких экспрессия генов муцина запускается воспалением, вызванным хронической инфекцией (Kreda et al., Cold Spring Harb. Perspect. Med., 2012, a009589). Воспаление, в свою очередь, вызывается снижением уровня циклического аденозинмонофосфата (цАМФ). Как известно, цАМФ представляет собой молекулу «второго мессенджера», которая генерируется ферментом аденилциклазой и участвует в регуляции различных клеточных процессов, включая расслабление гладких мышц дыхательных путей и высвобождение медиатора воспаления. В организме цАМФ гидролизуется специфическими ферментами семейства фосфодиэстераз (PDE), и, таким образом, активация аденилциклазы и/или ингибирование специфических ферментов PDE представляет собой потенциальный механизм, посредством которого функционируют клетки, включая расслабление гладких мышц дыхательных путей и высвобождение медиаторов воспаления. Были идентифицированы одиннадцать генов семейства PDE (PDE1-11). Из них PDE4, который гидролизует цАМФ, является хорошо изученным ферментом, экспрессируемым во многих воспалительных и иммуномодулирующих клетках. Семейство генов PDE4 состоит из четырех генов (PDE4A, B, C, D), каждый из которых имеет несколько вариантов сплайсинга, и экспрессия PDE4 имеет широкое распределение по тканям, включая мозг, желудочно-кишечный тракт, селезенку, легкое, сердце, яичко, почку и почти все типы воспалительных клеток (Abbott-Banner et al., 2014, Basic Clin. Pharmacol. Toxicol., vol. 114, p. 365-376). В легких цАМФ участвует в регуляции многих функций, связанных с воспалительными клетками, мукоцилиарным клиренсом и ремоделированием фиброзных и легочных сосудов. В частности, высокие уровни цАМФ блокируют активность иммунных и воспалительных клеток, таких как нейтрофилы, Т-лимфоциты и макрофаги (Soto et al., Curr. Opin. Pulm. Med., 2005, vol. 11, p. 129-134).
Таким образом, было предположено, что агент, повышающий уровень цАМФ, такой как ингибитор PDE4, мог бы быть полезным при лечении респираторных заболеваний, связанных с избыточной выработкой слизи, таких как ХОБЛ и бронхит (Page et al., Curr. Opin. Pharmacol., 2012, vol. 12, p. 275-286), и, возможно, муковисцидоз. Действительно, было показано, что некоторые ингибиторы PDE4 ингибируют высвобождение воспалительных цитокинов и медиаторов из воспалительных клеток, ингибируют миграционную активность этих клеток и могут даже способствовать их апоптозу (Kawamatawong, J. Thorac. Dis., 2017, vol. 9, p. 1144-1154). Рофлумиласт (3-цикло-пропилметокси-4-дифторметокси-N-[3,5-дихлорпирид-4-ил]-бензамид; Hatzelmann et al., 2001, Pharmacol. Exp. Ther. Vol. 297, p. 267-279) является ингибитором PDE4, который был клинически одобрен для применения у пациентов с ХОБЛ с хроническим бронхитом (например, Beghè et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med., 2013, vol. 188, p. 271-278). Альтернативные ингибиторы PDE4, предлагаемые для лечения заболеваний дыхательных путей, характеризующихся обструкцией дыхательных путей, включают 1-фенил-2-пиридинилалкиленовые спирты и их производные (WO 2008/006509 A1, WO 2009/018909 A2 и WO 2010/089107 A1).
цАМФ-стимулируемая протеинкиназа (PKA) и PKA в свою очередь, активирует белок CFTR (Blanchard et al., 2014, FASEB J., vol. 28, p. 791-801). Таким образом, было высказано предположение, что повышение уровня цАМФ за счет активации аденилциклазы и/или путем ингибирования фосфодиэстеразы может восстановить CFTR-зависимый транспорт ионов в клетках, экспрессирующих эндогенный ΔF508-CFTR; однако такие попытки были в целом неудачными (Schultz et al., 1999, J. Membr. Biol., vol. 170, p. 51-66; Grubb et al., 1993, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., vol. 8, p. 454-460, рассмотрено Blanchard et al., выше).
CFTR-модуляторы
CFTR-зависимый транспорт ионов зависит от количества (правильно свернутого) белка CFTR на клеточной мембране, а также от активности указанного белка CFTR. Ранее были исследованы различные агенты, влияющие на белок CFTR, положительные и отрицательные. Основываясь на этом исследовании фармацевтические активные ингредиенты, которые были протестированы или предложены для воздействия на белок CFTR, можно разделить на отдельные категории: (1) CFTR-корректоры, то есть агенты, которые способствуют коррекции уровней (мутантного) белка CFTR на поверхности клеток, (2) CFTR-потенциаторы, то есть агенты, которые увеличивают функциональность (мутантного) белка CFTR на поверхности клеток, и (3) усилители CFTR, то есть агенты, которые увеличивают уровни CFTR во всех классах мутаций (Miller et al., 2016, Am. J. Respir. Crit. Care Med., vol. 193, A 5574), в одной теоретической модели путем стабилизации мРНК CFTR (Molinski et al., 2017, EMBO Molecular Medicine, vol. 9, p. 1224-1243), хотя термин «усилитель CFTR», как используется в настоящем документе, не ограничивается указанной теоретической моделью. Вместе CFTR-потенциаторы, CFTR-корректоры и усилители CFTR называются «модуляторами CFTR» (Kuk et al., 2015, Ther. Adv. Resp. Dis., vol. 9, p. 313-326; Molinski et al., 2017, EMBO Molecular Medicine, vol. 9, p. 1224-1243). Также были предложены комбинированные терапевтические средства, состоящие из потенциатора и/или корректора и/или усилителя. Недавний прогресс в этой области показал, что надлежащий выбор потенциатора и корректора зависит, среди прочего, от генотипа пациента с муковисцидозом, подлежащего лечению.
В целом, CFTR-потенциаторы представляют собой агенты, которые влияют на активность белка CFTR; для функционирования этих молекул необходимо, чтобы CFTR как таковой присутствовал на поверхности эпителиальных клеток. Фармацевтический агент ивакафтор (VX 770) является таким потенциатором каналов CFTR с нарушенными хлорид/бикарбонатным гейтингом или проводимостью, но присутствующих на поверхности эпителиальных клеток, таких как мутанта CFTR G551D (гейтирующий мутант) и R117H (мутант проводимости); это увеличивает вероятность открытия таких каналов. Однако ивакафтор является лишь одобренным для фармацевтического использования при лечении нескольких таких специфических мутаций белка CFTR, что представляет небольшую подгруппу пациентов с муковисцидозом (Kuk et al., 2015, Ther. Adv. Resp. Dis., vol. 9, p. 313-326).
Обычно CFTR-корректоры являются агентами, которые могут вызывать увеличение количества молекул CFTR на поверхности эпителиальных клеток; считается, что они действуют как шапероны в процессе сворачивания и/или внутриклеточного транспорта CFTR. Лумакафтор (VX809) является таким CFTR-корректором; однако, сам по себе он до сих пор не был одобрен для фармацевтического использования. В общем, известные CFTR-корректоры не являются цАМФ-зависимыми. Не желая быть связанными с конкретной теорией, в настоящее время предполагается, что некоторые ингибиторы PDE4, такие как рофлумиласт и CFTR-потенциатор ивакафтор (VX-770), вызывают общий стимулирующий нисходящий эффект на активацию CFTR. Согласно настоящему пониманию в данной области техники ингибиторы PDE4, такие как рофлумиласт, однако, как правило, не классифицируются как CFTR-потенциаторы.
Также были предприняты попытки объединить использование различных агентов при лечении муковисцидоза или для поиска агентов, которые оказывают более одного желаемого эффекта в ослаблении симптомов или борьбе с причинами муковисцидоза; такие попытки до сих пор сдерживались возникновением побочных эффектов или ограничивались очень маленькими подгруппами пациентов. Некоторые примеры описаны ниже.
CFTR
В WO 2015/175773 A1 упоминается использование ингибитора PDE4 в комбинации с одним или несколькими CFTR-потенциаторами, такими как ивакафтор, и/или одним или несколькими CFTR-корректорами, такими как лумакафтор, но не приводятся экспериментальные доказательства какого-либо потенциального преимущества, связано с таким комбинированным применением. Специально для лечения подгруппы пациентов с муковисцидозом, а именно тех, кто гомозиготен по ΔF508 - хотя CFTR-потенциатор ивакафтор (VX 770) был признан терапевтически недостаточным (Kuk et al., 2015, Ther. Adv. Resp. Dis., vol. 9, p. 313-326) - совместное введение ивакафтора (VX 770) с CFTR-корректором лумакафтора (VX809) было признано удовлетворительным (Wainwright et al., 2015, N. Engl. J. Med., vol. 373, p. 220-231). До настоящего времени не было идентифицировано ни одного агента, подходящего для лечения пациентов с муковисцидозом, характеризующихся меньшей величиной мутации в гене , которая является причиной неправильного процессинга и/или сворачивания белка CFTR, не говоря уже о клиническом развитии.
Несмотря на все еще неполное знание механизмов заболевания муковисцидозом широко распространено мнение, что патология органов при муковисцидозе может быть облегчена путем коррекции дефектов сворачивания и/или дефектов процессинга мутантного CFTR, таким образом восстанавливая функциональную экспрессию мутантного CFTR (такого как ΔF508 CFTR; Lukacs et al., 2012, Trends Mol. Med., vol. 18, p. 81-91).
in vitro
Таким образом, все еще существует потребность в разработке эффективных методов лечения муковисцидоза, как на уровне процессинга CFTR, так и сворачивания и стабильности, так и на уровне активности CFTR (гейтинга/проводимости). В частности, существует потребность в удовлетворительном лечении тех субъектов, которые подвержены или подвержены сниженным процессингу и/или сворачиванию CFTR. Было высказано предположение, что идеальной терапией для муковисцидоза был бы единственный агент, который нормализует сворачивание, процессинг и функционирование мутантного CFTR, чтобы они напоминал таковые у CFTR дикого типа (Rowe et al., Cold Spring Harb. Perspect. Med., 2013, vol. 3, a009761), однако такой агент еще не описан. Например, в WO 2015/175773 A1 упоминается, что CFTR-потенциаторы и/или CFTR-корректоры могут быть использованы в комбинации с некоторыми другими соединениями с  ингибирующей активностью в отношении PDE4, но экспериментальные данные для предложенного комбинированного применения не предоставлены, а однократное использование не является терапевтически эффективным. Поэтому поиск подходящих агентов продолжается.
Решаемая задача
Таким образом, цель настоящего изобретения включает устранение недостатков, имеющихся согласно предшествующему уровню техники. Конкретные цели включают обеспечение надежного лечения муковисцидоза, которое удобно применять и которое не связано с неоправданными нежелательными эффектами, включая лечение подгрупп пациентов с муковисцидозом, для которых на сегодняшний день не существует полностью удовлетворительного лечения. Различные недостатки предшествующего уровня техники определяют дальнейшие цели для улучшения, к которым обращаются изобретатели настоящего изобретения, и эти цели достигаются благодаря достижению, описанному и заявленному в настоящем документе.
Сущность изобретения
CFTR
Настоящее изобретение относится к лечению муковисцидоза. В частности, настоящее изобретение может быть использовано для лечения или профилактики муковисцидоза у субъектов, характеризующихся по меньшей мере одной мутацией в гене , которая является причиной неправильного сворачивания и/или процессинга белка CFTR.
CFTR
В частности, настоящее изобретение относится к соединению для применения при профилактике и/или лечении муковисцидоза у субъекта, где субъект характеризуется по меньшей мере одной мутацией в гене , которая является причиной неправильного сворачивания и/или процессинга белка CFTR, и где соединение представляет собой соединение общей формулы (I)
(I)
где:
n обозначает 0 или 1;
R1 и R2 могут быть одинаковыми или разными, и выбраны из группы, включающей:
1
6
- линейный или разветвленный C-C алкил, необязательно замещенный одним или несколькими атомами галогена;
1
6
3
7
- OR3, где R3 представляет собой линейный или разветвленный C-C алкил, необязательно замещенный одним или несколькими атомами галогена или C-C циклоалкильными группами; и
2
1
4
- HNSOR4, где R4 представляет собой линейный или разветвленный C-C алкил, необязательно замещенный одним или несколькими атомами галогена,
2
- где по меньшей мере один из R1 и R2 представляет собой HNSOR4,
его фармацевтически приемлемые неорганические или органические соли, гидраты, сольваты или аддитивные комплексы,
и где соединение является (-) энантиомером.
2
Предпочтительно, в соединении общей формулы (I) для применения в соответствии с настоящим изобретением, R1 представляет собой HNSOR4; R4 соответствует метилу. Предпочтительно, в соединении общей формулы (I) для применения в соответствии с настоящим изобретением, R2 представляет собой OR3; R3 соответствует циклопропилметилу. Предпочтительно, в соединении общей формулы (I) для применения в соответствии с настоящим изобретением, n обозначает 1.
2
В одном варианте осуществления изобретения соединение формулы (I) является соединением, в котором R1 представляет собой HNSOR4, где R4 представляет собой метил, R2 представляет собой OR3, где R3 представляет собой циклопропилметил, и n обозначает 0.
2
В одном варианте осуществления изобретения соединение формулы (I) является соединением, в котором R1 представляет собой OR3, R2 представляет собой HNSOR4, где R4 представляет собой метил, и n обозначает 1.
2
В одном варианте осуществления изобретения соединение формулы (I) является соединением, в котором R1 представляет собой метил, R2 представляет собой HNSOR4, где R4 представляет собой метил, и n обозначает 1.
2
В одном варианте осуществления изобретения соединение формулы (I) является соединением, в котором оба R1 и R2 представляют собой HNSOR4, где R4 представляет собой метил, и n обозначает 0.
2
В одном варианте осуществления изобретения соединение формулы (I) является соединением, в котором оба R1 и R2 представляют собой HNSOR4, где R4 представляет собой метил, и n обозначает 1.
Субъектом, у которого можно предотвратить или лечить муковисцидоз согласно настоящему изобретению, является млекопитающее, предпочтительно, человек.
CFTR
В настоящем изобретении соединение формулы (I) вводят субъекту. В частности, все аспекты и варианты осуществлений по настоящему изобретению предусматривают, что соединение формулы (I) вводят субъекту, нуждающемуся в этом. Субъектом, нуждающимся в этом, является субъект, для которого характерно наличие по меньшей мере одной мутации в гене , которая является причиной неправильного сворачивания и/или процессинга белка CFTR, как подробно описано в данном описании.
CFTR
CFTR
CFTR
В первом конкретном варианте осуществления изобретения указанный субъект характеризуется по меньшей мере одной мутацией в гене , которая является причиной неправильного сворачивания белка CFTR. Любые мутации такого рода также упоминаются в настоящем документе как «мутация с нарушением сворачивания», термин, который применим как к уровню белка, так и к уровню нуклеиновой кислоты, которая его кодирует. Этот вариант осуществления включает мутацию ΔF508 по меньшей мере на одном аллеле. Таким образом, предпочтительно, у испытуемого человека, характеризующегося по меньшей мере одной мутацией гена , по меньшей мере одной мутацией является мутация ΔF508, кодируемая геном . Более предпочтительно, указанный испытуемый человек, или, точнее, геном испытуемого человека, гомозиготен по мутации ΔF508.
CFTR
Во втором конкретном варианте осуществления изобретения указанный субъект характеризуется по меньшей мере одной мутацией в гене , которая является причиной неправильного процессинга белка CFTR. Любая мутация такого рода также упоминается в настоящем документе как «мутация процессинга», термин, который применим как к уровню белка, так и к уровню нуклеиновой кислоты, которая его кодирует. Первый и второй конкретные варианты осуществления не обязательно являются взаимоисключающими.
CFTR
CFTR
Предпочтительно, по меньшей мере одна мутация представляет собой геномную мутацию гена . Предпочтительно, по меньшей мере одна мутация представляет собой мутацию гена , присутствующую в клетках дыхательных путей указанного субъекта.
CFTR
В некоторых вариантах осуществления изобретения соединение, соответствующее общей формуле (I), для применения по настоящему изобретению также обладает ингибирующей активностью в отношении PDE4. Не желая связываться с какой-либо конкретной теорией, однако предусматривается, что ингибирование PDE4 не является необходимым и/или недостаточным для объяснения механизма влияния соединения общей формулы (I) на белок CFTR, кодируемый геном , имеющим меньшей мере одну мутацию, в соответствии с настоящим изобретением.
В некоторых вариантах осуществления изобретения указанный субъект страдает от симптомов муковисцидоза в дыхательных путях. В некоторых вариантах указанный субъект страдает от симптомов муковисцидоза в желудочно-кишечном тракте. В некоторых вариантах указанный субъект страдает от симптомов муковисцидоза в дыхательных путях, а также в желудочно-кишечном тракте.
В одном варианте осуществления изобретения соединение общей формулы (I) вводят путем ингаляции.
В одном варианте осуществления изобретения соединение общей формулы (I) вводится с помощью устройства, выбранного из одно- или многодозового ингалятора сухого порошка, ингалятора отмеренных доз и ингалятора мягкого тумана.
В некоторых вариантах осуществления изобретения соединение общей формулы (I) используют или вводят в комбинации по меньшей мере с одним вторым фармацевтически активным компонентом. По меньшей мере один второй фармацевтически активный компонент, предпочтительно, не является соединением общей формулы (I). В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения по меньшей мере одно второе фармацевтически активное соединение представляет собой CFTR-корректор, такой как, например, лумакафтор. Во втором предпочтительном варианте осуществления изобретения второе фармацевтически активное соединение представляет собой CFTR-потенциатор, такой как, например, ивакафтор. В третьем предпочтительном варианте осуществления изобретения по меньшей мере одно второе фармацевтически активное соединение представляет собой комбинацию CFTR-корректора и CFTR-потенциатора; другими словами, как CFTR-корректор, таки и CFTR-потенциатор могут быть введены вместе с соединением по изобретению.
Подробное описание изобретения
В следующем далее подробном описании представлены конкретные и/или предпочтительные варианты отдельных признаков изобретения. В настоящее изобретение также рассматриваются в качестве особенно предпочтительных вариантов осуществления такие варианты осуществления изобретения, которые создаются путем объединения двух или более конкретных и/или предпочтительных вариантов, описанных для двух или более признаков настоящего изобретения.
Специалисту в данной области понятно, что изобретению, описанному в настоящем документе, могут быть присущи изменения и модификации, отличные от описанных конкретно. Таким образом, специалисту в данной области техники будет очевидно, что настоящее описание включает все такие вариации и модификации. Описание также включает все объекты, соединения, признаки, стадии, способы или композиции, упомянутые или указанные в настоящем описании, отдельно или вместе, и любые и все комбинации или любые два или более указанных объектов, соединений, признаков, стадий, способов или композиций. Таким образом, если в настоящем документе не указано иное, или контекст не требует иного, ссылка на отдельный объект, соединение, признак, стадию, способ или композицию должна быть принята как охватывающая один и множество (то есть более одного, например, два или более, три или более или все) этих объектов, соединений, признаков, стадий, способов или композиций.
Настоящее изобретение не ограничивается конкретными вариантами осуществления, описанными в данном документе, которые предоставлены в данном документе в целях иллюстрации и пояснения. Функционально или иным образом эквивалентные объекты, соединения, признаки, стадии, способы или композиции входят в объем настоящего изобретения.
Если специально не указано иное или из контекста не требуется иного, каждый вариант осуществления, аспект и пример, описанные в данном документе, должны рассматриваться как применимые и комбинируемые с любым другим вариантом осуществления, аспектом или примером, описанным в настоящем документе.
Каждый документ, цитируемый в настоящем документе (включая все патенты, патентные заявки, научные публикации, спецификации производителя, инструкции, презентации и т. д.), независимо от того, указаны ли они выше или ниже, настоящим полностью включены в качестве ссылки. Ничто в настоящем документе не должно быть истолковано как признание того, что настоящее изобретение не вправе предшествовать конкретной рекомендации.
Если специально не указано иное, все используемые в настоящем документе технические и научные термины имеют то же значение, которое обычно понятно специалистам в данной области (например, в области генетики, молекулярной биологии, экспрессии генов, клеточной биологии, клеточной культуры, медицины, анатомии, гистологии, иммунологии, иммуногистохимии, неорганической и органической химии, химии белка и биохимии). В опубликованных учебниках и обзорных статьях, например, на английском языке, обычно определено значение, общепринятое для специалиста в данной области.
Выражение «и/или», например «X и/или Y», следует понимать как означающее «X и Y» или «X или Y», и должны быть приняты для предоставления ясного описания «и», «или» и обоих значений («и» или «или»).
Как используется в настоящем документе, если не указано иное, термины «около», «прибл.» и «по существу», все они означают приблизительно или почти, и в контексте изложенного в настоящем документе числового значения или диапазона, предпочтительно, обозначают +/-10%, более предпочтительно, +/-5%, вокруг числового значения или диапазона, указанного или заявленного.
Во всех случаях, когда дается ссылка на агент, такой как молекула, тогда фармацевтически приемлемые неорганические или органические соли, гидраты, сольваты или их аддитивные комплексы входят в объем настоящего изобретения и полностью охватываются данным описанием, а также самим соответствующим агентом. Таким образом, в изобретение также включены фармацевтические композиции, которые включают агент, описанный в настоящем документе, и фармацевтически приемлемые носители или разбавители, а также способы доставки указанных агентов или композиций пациентам путем введения пациентам таких агентов или композиций.
Если явно не указано иное, слово «содержит» или варианты, такие как «включает» или «содержащий», используется в контексте настоящего документа чтобы указать, что в дополнение к членам списка, представленного как «содержащие», могут необязательно присутствовать дополнительные члены. Однако в качестве конкретного варианта осуществления настоящего изобретения предполагается, что термин «содержащий» включает в себя возможность отсутствия дополнительных элементов, то есть для цели этого варианта осуществления «содержащий» следует понимать как имеющий значение «состоящий из».
Если прямо не указано иное, все указания относительных количеств в отношении настоящего изобретения даются на основе мас./мас. Указания на относительные количества компонента, характеризуемого общим термином, предназначены для обозначения общего количества всех конкретных вариантов или элементов, охватываемых указанным общим термином. Если некоторый компонент, определенный родовым термином, определен как присутствующий в некотором относительном количестве, и если этот компонент, кроме того, охарактеризован как конкретный вариант или элемент, охватываемый общим термином, это означает, что никакие другие варианты или элементы, не охватываемые общим термином, дополнительно не присутствуют, так что общее относительное количество компонентов, охватываемых общим термином, превышает указанное относительное количество; более предпочтительно, никакие другие варианты или члены, охватываемые общим термином, вообще не присутствуют.
Термин «агент», как используется в настоящем документе, если не указано иное, обычно относится к соединению или композиции, предпочтительно, к соединению. Агент способен оказывать воздействие на живой организм и/или на клетку живого организма или полученную из живого организма, например, воздействуя на клетку и/или на ткани организма, или в окружающей среде. Физическое состояние агента особо не ограничивается и, если не указано иное, он может находиться в воздухе, воде и/или быть в твердом состоянии. Тип агента конкретно не ограничен, если не указано иное, и, таким образом, агент может представлять собой химическое вещество и/или биомолекулу, такую как белок или нуклеиновая кислота. Конкретные агенты, определенные в настоящем документе, могут быть использованы в настоящем изобретении.
«Неблагоприятный эффект», как используется в данном документе, представляет собой нежелательное вредное воздействие, возникающее в результате введения агента (лекарственного средства) субъекту. Неблагоприятные эффекты включают, без ограничения, заболеваемость, смертность, изменение массы тела, уровни ферментов, потерю функции или любые патологические изменения, обнаруживаемые на микроскопическом, макроскопическом или физиологическом уровне. Неблагоприятные эффекты могут вызвать обратимые или необратимые изменения, в том числе увеличение или уменьшение восприимчивости человека к другим химическим веществам, пище или процедурам, таким как лекарственные взаимодействия.
Термин «аллель» относится к вариантной форме данного гена (или локуса), например, у субъекта, подлежащего лечению согласно настоящему изобретению. Термин применим к субъектам с двумя наборами хромосом, то есть диплоидным субъектам; соответствующие наборы хромосом упоминаются как гомологичные хромосомы. Если оба аллеля в гене (или локусе) на гомологичных хромосомах одинаковы, то аллели и организм являются «гомозиготными» по отношению к этому гену (или локусу). Если аллели разные, то аллели и организм являются «гетерозиготными» по отношению к этому гену.
«Аллельный вариант» относится к изменению нормальной последовательности гена. Полное секвенирование генов часто идентифицирует многочисленные аллельные варианты для данного гена.
«Частота аллелей», как используется в настоящем документе, относится к проценту конкретного аллеля в данной популяции. Для частоты аллелей человека, если не указано иное, данная популяция представляет собой общую популяцию людей на дату вступления в силу настоящего описания, независимо от возраста, расы, этнического или географического происхождения.
Термин «муковисцидоз», используемый в данном документе, имеет общее значение, используемое в данной области техники, в его самом широком смысле; несмотря на вышесказанное, конкретные аспекты настоящего изобретения направлены на подгруппу субъектов, пораженных «муковисцидозом». Обычно муковисцидоз представляет собой состояние, вызванное наличием у субъекта мутаций гена белка трансмембранного регулятора проводимости муковисцидоза (CFTR), в настоящем понимании обоих генов (аллелей) белка CFTR у субъекта, хотя настоящее изобретение не обязательно ограничено таким пониманием. «Муковисцидоз» обычно диагностируется с помощью потовой пробы и/или генетического тестирования (O’Sullivan et al., 2009, Lancet, vol. 373, p. 1891-1904), например, путем скрининга новорожденных и/или путем тестирования отдельных субъектов, например в случае подозрения со стороны врача (O’Sullivan et al., выше). Термин «муковисцидоз», как используется в настоящем документе, не ограничен конкретным типом или методом диагностики.
CFTR
Термин «CFTR», как используется в настоящем документе, обозначает трансмембранный регулятор проводимости муковисцидоза и может обозначать его форму дикого типа, а также любой его мутант, в частности, мутанты с потерей функции, если контекст не требует иного. «» в настоящем документе также используется для обозначения гена, кодирующего белок CFTR, дикого типа или мутанта.
CFTR
Термин «модулятор CFTR», как используется в настоящем документе, является общим термином, который относится к агенту, который при контакте с клеткой, экспрессирующей CFTR, или с субъектом, может влиять на сворачивания и/или процессинг и/или гейтинг и/или проводимость белка CFTR. Как правило, модулятор CFTR представляет собой агент, нацеленный на дефект, вызванный одной или несколькими мутациями в гене . Примерами модуляторов CFTR являются CFTR-корректоры, CFTR-потенциаторы и усилители CFTR.
Термин «CFTR-корректор», как используется в настоящем документе, относится к агенту, который при контакте с CFTR-экспрессирующей клеткой или с субъектом оказывает влияние на частичное или полное преодоление дефектного процессинга белка, что обычно приводит к уменьшению присутствия CFTR и/или уменьшенному отображению CFTR. Термин не ограничен каким-либо конкретным способом действия или механистическим объяснением.
Термин «CFTR-потенциатор», как используется в данном документе, относится к агенту, который при контакте с CFTR-экспрессирующей клеткой или с субъектом оказывает влияние на частичное или полное преодоление сниженной активности CFTR, такой как пониженная проводимость и/или пониженное гейтирование CFTR. Термин не ограничен каким-либо конкретным способом действия или механистическим объяснением.
Термины «кодировать», «кодирующий» и тому подобное относятся к свойству, присущему специфическим последовательностям нуклеотидов в полинуклеотиде, таким как ген, кДНК или мРНК, которые служат в качестве матриц для синтеза других полимеров и макромолекул в биологических процессах, имеющих определенную последовательность нуклеотидов (то есть, рРНК, тРНК и мРНК) или определенную последовательность аминокислот и следующие из этого их биологические свойства. Таким образом, ген кодирует белок, если транскрипция и трансляция мРНК, соответствующие этому гену, продуцируют белок в клетке или другой биологической системе. Как кодирующая цепь, нуклеотидная последовательность которой идентична последовательности мРНК, так и некодирующая цепь, используемая в качестве матрицы для транскрипции гена или кДНК, могут указывать на то, что они «кодируют» белок или другой продукт этого гена или кДНК.
CFTR
CFTR
Термины «экспрессировать», «экспрессированный», «экспрессия», «экспрессия гена» и тому подобное, как используется в настоящем документе, относятся к использованию информации от гена при синтезе функционального продукта гена. Экспрессия гена включает по меньшей мере транскрипцию и, необязательно, включает одну из дополнительных функций, необязательно выбранных из открытого списка, включающего редактирование РНК, трансляцию и посттрансляционную модификацию. При определении экспрессии гена определяется наличие продукта экспрессии, такого как нередактированная или отредактированная РНК или даже кодированный белок. Вышеуказанные термины, используемые в связи с конкретным геном или локусом, предназначены для определения экспрессии генетической информации из этого гена или локуса; например, когда указано, что экспрессируется , подразумевается, что экспрессируется ген .
Как используется в настоящем документе, термин «проточная цитометрия» относится к лазерной или биофизической технологии на основе импеданса, подходящей для подсчета клеток, сортировки клеток, анализа свойств клеток и обнаружения биомаркеров (такого как, в частности, обнаружение молекул клеточной поверхности, таких как кластер дифференцировки (CD) молекул). Для проточной цитометрии требуется наличие клеток в суспензии; чтобы проанализировать прилипшие клетки, их необходимо отделить от субстрата, например, культурального сосуда, к которому они прикрепляются, например, путем ферментативной обработки, такой как трипсинизация, посредством которой они становятся клетками в суспензии. Клетки в суспензии, то есть клетки в потоке жидкости, пропускаются через электронный детектор (проточная цитометрия). Устройство проточной цитометрии анализирует клетку, например, основываясь на определенном рассеянии света каждой клетки. Для проточной цитометрии можно использовать коммерческий проточный цитометр как проточный цитометр FACSAria III (BD Biosciences). Данные, полученные на проточных цитометрах, могут быть построены на графике в одном измерении, чтобы произвести гистограмму, или в двухмерных точечных участках или даже в трех измерениях. Графики могут быть сделаны с использованием шкал выбора, таких как линейный или логарифмический масштаб. Области на этих графиках могут быть последовательно разделены, основываясь на интенсивности флуоресценции, путем создания серии поднаборов, называемых «воротами».
«Активируемая флуоресценцией сортировка клеток» или, взаимозаменяемо, «FACS», как используется в настоящем документе, является специализированным типом проточной цитометрии. FACS является методом сортировки гетерогенной смеси биологических клеток на две или более популяции, основанным на специфических характеристиках рассеяния света и/или флуоресценции каждой клетки. Тип флуорофора, используемого в качестве метки для FACS, конкретно не ограничен; в некоторых вариантах осуществления флуорофоры присоединяются к антителу, которое распознает признак-мишень, такой как белок клеточной поверхности (такой как, в частности, обнаружение молекул клеточной поверхности, таких как молекулы кластерной дифференцировки (CD)). В качестве альтернативы флуорофор может быть присоединен к химическому объекту со сродством к клеточной мембране или другой клеточной структуре. Каждый флуорофор имеет характерный пик возбуждения и длину волны излучения, которые определяются устройством, подходящим для FACS. Может быть использовано коммерческое устройство.
Термин «гетерологичный», как используется в настоящем документе описывает нечто, состоящее из множества различных элементов.
CFTR
CFTR
Термин «потеря функции» относится к генетической мутации (то есть изменению, присутствующему в мутантном гене и его продукте), то есть мутации в гене (или локусе), которая является причиной того, что продукт такого гена (обычно белок, кодируемый таким геном) не функционирует так же эффективно, как белок соответствующего дикого типа, или что мутация в гене или локусе вызывает экспрессию продукта гена или локуса на разных уровнях, с разным временем жизни, или другую отличительную особенность, которая влияет на функцию или продукцию или время жизни продукта такого гена (или локуса). Важно отметить, что термин «потеря функции» не подразумевает и не требует, чтобы функция была полностью потеряна в отношении белка дикого типа: скорее, этот термин является относительным термином, который указывает на то, что функция мутанта с потерей функции составляет менее 100% (например, менее 90%, менее 80%, менее 70%, менее 60%, менее 50%), чем функция белок дикого типа. Обычно термин «потеря функции» относится к мутации в соответствующем гаплотипе, и его можно использовать независимо от того, кодируется ли вторая копия, которая может дополнять потерю функции, соответствующей другой хромосомой рассматриваемого субъекта. Однако, например, для рецессивных мутаций с потерей функции этот термин может использоваться для конкретного обозначения того, что субъект характеризуется двумя копиями с потерей функции соответствующего гена (или локуса) и, следовательно, не обладает нормальной функциональностью генного продукта. Мутация с потерей функции гена  может быть мутацией, которая влияет на гейтинг и/или проводимость (мутация гейтинга/проводимости) и/или мутацией, которая влияет на сворачивания и/или процессинг (мутация с нарушением сворачивания/процессинга). Примером мутации потери функции гена  является мутация, вызывающая мутацию ΔF508 на уровне белка. Не желая привязываться к какой-либо конкретной теории, ΔF508 мутация белка CFTR обычно считается рецессивной мутацией с потерей функции.
Термины «мульти» и «многочисленный», как используется в настоящем документе означает множество, то есть любое число из двух или более.
»
Термин «мутация, как используется в настоящем документе, относится к изменению нуклеотидной последовательности генома организма, вируса или внехромосомной ДНК или других генетических элементов. Термин также распространяется на мутации аминокислотной последовательности, в частности, аминокислотной последовательности гена, который несет по меньшей мере одну (не молчащую) мутацию. Если не указано иное, мутация нуклеотидной последовательности является постоянным изменением. Мутации, присутствующие в зародышевой линии, обычно наследуются. Обычно мутация нуклеотидной последовательности может приводить к множеству различных типов изменений в последовательностях: мутации в генах могут либо не оказывать влияния, либо изменять продукт гена, либо мешать гену функционировать должным образом или полностью. Мутации также могут присутствовать в не генных областях. Если не указано иное, последовательность дикого типа используется в качестве эталонной последовательности для описания мутации. Таким образом, например, когда говорят, что данный мутант характеризуется мутацией положения 508 полипептидной последовательности, это указывает на то, что в положении 508 мутант не имеет той же аминокислоты, что и полипептид дикого типа. Конкретные типы мутаций нуклеотидной последовательности и/или аминокислотной последовательности включают такие изменения, как делеции, замены, добавления, вставки и варианты сплайсинга. Термин «делеция» в отношении нуклеотидной последовательности относится к отсутствию одного или нескольких нуклеотидов в нуклеотидной последовательности. «Делеция» в отношении аминокислотной последовательности относится к отсутствию одного или нескольких аминокислотных остатков в полипептиде. «Добавление» в отношении нуклеотидной последовательности относится к наличию одного или нескольких дополнительных нуклеотидов в нуклеотидной последовательности. «Добавление» в отношении аминокислотной последовательности относится к наличию одного или нескольких дополнительных аминокислотных остатков в соответствующем полипептиде. «Замена» в отношении нуклеотидной последовательности относится к замене одного или нескольких нуклеотидов на другой нуклеотид(ы) в нуклеотидной последовательности. «Замена» в отношении аминокислотной последовательности относится к замене одного или нескольких аминокислотных остатков на другие (и) другие аминокислотные остатки в полипептиде. Добавления, делеции и замены в нуклеотидной последовательности, например в открытой рамке считывания, могут быть 5’-концом, 3’-концом и/или внутренними. Добавления, делеции и замены в полипептиде могут быть у амино-конца, карбокси-конца и/или внутри. «Вставка» в отношении нуклеотидной последовательности и/или полипептидной последовательности представляет собой добавление одного или нескольких нуклеотидов или одного или нескольких аминокислотных остатков, соответственно, конкретно во внутреннем положении соответствующей последовательности. Термин «вариант сплайсинга» используется для описания того, что РНК, кодирующая полипептидную последовательность, сплайсируется иначе, чем соответствующая РНК дикого типа, обычно в результате мутации на уровне нуклеиновой кислоты, что обычно приводит к продукту трансляции полипептида, который отличается от полипептида дикого типа. Термин «вариант сплайсинга» можно использовать не только в отношении соответствующей РНК, но также в отношении соответствующей последовательности ДНК-матрицы (обычно геномной ДНК) и в отношении последовательности полипептида, кодируемого такой РНК.
Термин «мутант» обычно предназначен для обозначения последовательности нуклеиновой кислоты или аминокислотной последовательности, которая отличается от последовательности дикого типа. В тех случаях, когда существуют полиморфизмы в последовательности нуклеиновой кислоты, которые, однако, не отражены на уровне соответствующего кодируемого полипептида (молчащие мутации, вырождение генетического кода), термин «мутант» на уровне нуклеиновой кислоты конкретно относится только к тем вариантам нуклеиновых кислот, которые кодируют мутантный полипептид. Мутанты могут содержать разные комбинации мутаций, по отдельности или в комбинации, включая более одной мутации, и разные типы мутаций.
Термин «пептид» согласно изобретению включает олиго- и полипептиды и относится к веществам, содержащим два или более, предпочтительно, 3 или более, предпочтительно, 4 или более, предпочтительно, 6 или более, предпочтительно, 8 или более, предпочтительно, 10 или более, предпочтительно, 13 или более, предпочтительно, более 16, предпочтительно, 21 или более и, предпочтительно, до 8, 10, 20, 30, 40 или 50, в частности, 100 аминокислот, ковалентно связанных с цепью пептидными связями.
Термин «белок», предпочтительно, относится к крупным пептидам, предпочтительно, к пептидам с более чем 100 аминокислотными остатками, но обычно термины «пептид», «полипептид» и «белок» являются синонимами и используются в настоящем документе взаимозаменяемо, если только контекст не предписывает иное.
Термином «фармацевтически приемлемый» обычно описывается, что определенное вещество может быть введено субъекту, необязательно и предпочтительно в комбинации с агентом, без агента, вызывающего невыносимые неблагоприятные эффекты, в используемой дозировке.
Термин «фармацевтически приемлемый носитель» используется для обозначения любого одного или нескольких из растворителей, дисперсионных сред, покрытий, антибактериальных и противогрибковых агентов, изотонических и задерживающих абсорбцию агентов и тому подобное, которые являются физиологически совместимыми и подходят для введения субъекту для методов, описанных в настоящем документе. Примеры таких фармацевтически приемлемых носителей включают, без ограничения, один или несколько, выбранных из воды, солевого раствора, солевого раствора с фосфатным буфером, декстрозы, глицерина, этанола и тому подобного, а также их комбинации. В частности, в случае жидких фармацевтических композиций может быть предпочтительным включение в композицию изотонических агентов, например сахаров, многоатомных спиртов, таких как маннит, сорбит, или хлорида натрия. Фармацевтически приемлемые носители могут дополнительно содержать вспомогательные вещества, такие как смачивающие или эмульгирующие агенты, консерванты или буферы, которые увеличивают срок годности или эффективность агента. Обычно в композиции по настоящему изобретению содержится фармацевтически приемлемый носитель.
Термин «фармацевтически активный агент» относится к агенту, который можно использовать при лечении субъекта, где агент будет полезен, например, для облегчения симптомов заболевания или расстройства. Кроме того, «фармацевтически активный агент» может оказывать положительное или успешное влияние на состояние или болезненное состояние субъекта при введении субъекту в терапевтически эффективном количестве. Предпочтительно, фармацевтически активный агент обладает лечебными свойствами и может вводиться для улучшения, ослабления, облегчения, регресса, задержки начала или уменьшения тяжести одного или нескольких симптомов заболевания или расстройства. Фармацевтически активный агент может обладать профилактическими свойствами и может использоваться для отсрочки начала заболевания или для уменьшения тяжести такого заболевания или патологического состояния. Например, агент по изобретению рассматривается в настоящем документе как фармацевтически активный ингредиент для лечения муковисцидоза, как заявлено. В другом примере фармацевтически активный белок может быть использован для лечения клетки или индивидуума, когда обычно белок экспрессируется не нормально или не на желаемых уровнях, или когда неправильно экспрессируется белок, например, фармацевтически активный белок может компенсировать мутацию или отсутствие достаточно высокой экспрессии путем подачи желаемого белка. Термин «фармацевтически активный пептид или белок» включает в себя целые белки или полипептиды и может также относиться к их фармацевтически активным фрагментам. Он также может включать фармацевтически активные аналоги пептида или белка.
«Открытая рамка считывания» или «ORF» представляет собой непрерывную полосу кодонов, начинающуюся со стартового кодона и заканчивающуюся стоп-кодоном.
Когда в настоящем документе указывается, что белок «присутствует», например, в клетке, это подразумевает указание на то, что в клетке существует белок на уровнях, определяемых способами согласно уровню техники. Такой белок, например, белок CFTR, как правило, является продуктом экспрессии гена этой клетки. Таким образом, определение присутствия белка является косвенным способом определения экспрессии соответствующего гена.
Когда в настоящем документе указывается, что белок «отображается», например, на клетке, это подразумевает указание на то, что белок существует на поверхности клетки на уровнях, определяемых способами согласно уровню техники. Таким образом, определение отображения конкретного белка на поверхности клетки представляет собой конкретный способ определения присутствия указанного белка.
В соответствии с настоящим изобретением, РНК может кодировать пептид или белок. Соответственно, РНК может содержать кодирующую область (открытую рамку считывания (ORF)), кодирующую пептид или белок. Например, РНК может кодировать и экспрессировать антиген или фармацевтически активный пептид или белок. Если не указано иное, термин РНК может использоваться в настоящем документе как для первичных транскриптов РНК, так и для сплайсированной РНК, включая любые варианты сплайсинга, как описано в данном документе.
В соответствии с настоящим изобретением, термин «дыхательные пути» обычно относится к части анатомии дыхательной системы, связанной с процессом дыхания. Таким образом, дыхательные пути включают без ограничения нос, рот, носовую полость, глотку, гортань, надгортанник, трахею, легкие, первичные (главные) бронхи, вторичные (долевые) бронхи, третичные (сегментарные) бронхи, небольшие дыхательные пути (также называемые бронхиолами) и альвеолы (тонкие специализированные структуры, которые функционируют при газообмене).
Термин «желудочно-кишечный тракт», как используется в настоящем документе, как правило, относится к набору анатомических структур или серии соединенных органов тела, которые принимают пищу, переваривают ее для извлечения и поглощения энергии и питательных веществ и удаляют оставшиеся отходы в виде фекалий. Желудочно-кишечный тракт млекопитающего включает без ограничения рот, пищевод, желудок и кишечник.
H
G
H
G
H
G
Термин «подгруппа» (символ ), как используется в настоящем документе, относится к собственной подгруппе группы . То есть подгруппа  является собственным подмножеством  (то есть ≠). Обычно это обозначается как H<G, читается как «H является собственной подгруппой группы G». Если H является подгруппой в G, то G называется надгруппой H. «Подгруппа пациентов» представляет собой подгруппу пациентов, страдающих от состояния. Например, подгруппа пациентов с муковисцидозом является подгруппой всех пациентов с муковисцидозом.
Термины «субъект» и «пациент», как используется в настоящем документе, относятся к млекопитающему. Например, млекопитающими в контексте настоящего изобретения являются люди, приматы, не являющиеся человеком, домашние животные, включая, но не ограничиваясь ими, собак, кошек, овец, крупный рогатый скот, коз, свиней, лошадей и т.д., лабораторные животные, включая, но не ограничиваясь этим, мышей, крыс, кроликов и т.д., а также животные в неволе, такие как животные в зоопарках. Термины «субъект» и «пациент», как используется в настоящем документе, в частности, включают людей. Субъект (человек или животное) имеет два набора хромосом; то есть субъект является диплоидным. Термин «пациент» относится к субъекту, который страдает от состояния, подвергается риску страдания от состояния, страдал от состояния или, по прогнозам, будет страдать от состояния, и который может подвергаться терапии, например, путем введения агента. Состояние пациента может быть хроническим и/или острым. Таким образом, «пациент» также может быть описан как субъект, подвергаемый терапии и/или нуждающийся в терапии.
Термин «терапия» следует понимать в широком смысле, и он относится к лечению субъекта с целью предотвращения или лечения состояния у субъекта. В предпочтительных вариантах осуществления терапия, в частности, включает введение агента субъекту.
В контексте настоящего изобретения термин «транскрипция» относится к процессу, в котором генетический код в последовательности ДНК транскрибируется в РНК.
Термин «трансляция» в соответствии с изобретением относится к процессу, с помощью которого РНК-мессенджер направляет сборку последовательности аминокислот на рибосомах клетки для получения пептида или белка.
CFTR
Термин «дикий тип» используется в настоящем документе для обозначения аллеля, например, гена , который не связан с муковисцидозом, то есть аллеля, который, как считается, способствует типичному фенотипическому признаку, наблюдаемому в «диких» популяциях субъектов. Аллель, который не является «диким типом», упоминается в настоящем документе как «мутант» или «мутированный» или тому подобное.
Настоящее изобретение основано на нескольких выводах, которые взаимосвязаны и, таким образом, вместе подтолкнули изобретателей прийти к различным аспектам изобретения, которые все индивидуально описаны далее. Все аспекты настоящего изобретения основаны, среди прочего, на обнаружении того, что соединение формулы (I) может быть использовано для лечения и профилактики муковисцидоза в конкретной подгруппе пациентов.
Новое лечение на конкретной подгруппе пациентов
В настоящем изобретении предложен новый способ профилактики или лечения конкретной подгруппы пациентов с муковисцидозом. В соответствии с настоящим изобретением предлагается применение соединения, соответствующего общей формуле (I), по настоящему изобретению для лечения муковисцидоза у субъектов, связанных с одной или несколькими мутациями потери функции гена CFTR. Новое применение такого соединения основано на конкретных данных, представленных в настоящем документе.
CFTR
CFTR
Настоящее изобретение также относится к способу лечения пациента, страдающего муковисцидозом, где пациент характеризуется по меньшей мере одной мутацией в гене , которая является причиной неправильного сворачивания и/или процессинга CFTR, где способ включает введение пациенту эффективного количества соединения общей формулы (I). Термины «пациент» и «субъект» используются в настоящем документе взаимозаменяемо, в частности, применительно к пациенту/субъекту, характеризующемуся по меньшей мере одной мутацией в гене , которая является причиной неправильного сворачивания и/или процессинга CFTR.
На фиг. 8 и SEQ ID NO: 1 представлена аминокислотная последовательность белка человека CFTR дикого типа (1480 аминокислот). Учетный номер P13569, версия P13569.3, источник данных UniProtKB: локус CFTR_HUMAN. Не желая быть связанными с какой-либо конкретной теорией, следует понимать, что субъектами, у которых особенно успешными будут профилактика или лечение в соответствии с настоящим изобретением, являются такие субъекты, которые характеризуются по меньшей мере одной мутацией по меньшей мере в одном аллеле белка человека CFTR.
CFTR
В качестве вступительного комментария, ввиду недостаточности структурной информации о полноразмерном диком типе и мутантном CFTR, а также сложности дефектов, вызванных некоторыми генетическими мутациями гена  (например, мутация, вызывающая ΔF508), обнаружение лекарственного средства при муковисцидозе в значительной степени основано на фенотипических анализах, основанных на функции канала CFTR. Ценными являются некоторые специфические галоид-чувствительные мутанты флуоресцентного белка, а именно: мутанты желтого флуоресцентного белка (YFP), флуоресценция которых сильно гасится (снижается) йодидом (Jayaraman et al., 2000, J. Biol. Chem., vol. 275, p. 6047-6050), потому что йодид является галогенидом, который эффективно транспортируется CFTR (Rowe et al., Cold Spring Harb. Perspect. Med., 2013 vol. 3, a009761). В дополнение к этому информативными являются иммунофенотипические подходы, которые обнаруживают полное присутствие (мутантного) белка CFTR (например, вестерн-блот) и/или отображение белка CFTR на поверхности клетки (например, иммуноокрашивание, необязательно в сочетании с FACS и/или микроскопией).
in vitro
В отличие от традиционных методов лечения муковисцидоза, таких как антибиотиками, муколитиками, противовоспалительными средствами и, например, небулизированным гипертоническим раствором, которыми лечат проявления заболевания CF, соединение по настоящему изобретению непосредственно устраняет основной дефект анионного канала CFTR. Данные, представленные в примере 2, как обсуждено в настоящем документе, подтверждают тот факт, что, что соединение, соответствующее общей формуле (I), имеет функцию CFTR-корректора. Эти результаты совершенно удивительны: хотя согласно недавно опубликованным литературным данным предполагается, что ингибитор PDE4 рофлумиласт действует как потенциатор белка CFTR, то есть за счет усиления активности мутантного белка CFTR, для которого характерны специфические мутации, обнаруженные у пациентов с муковисцидозом в эпителии дыхательных путей (Blanchard et al., 2014, FASEB J., vol. 28, p. 791-801; Lambert et al. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 2014 vol. 50, p. 549-58), не было описано, что известные ингибиторы PDE4 способны корректировать присутствие белка CFTR в клетках пациентов с муковисцидозом или в моделях , не говоря уже о том, чтобы оказывать причинное действие (для сравнения с настоящим изобретением см. также, например, WO 2015/175773 A1). В данной области техники, как, например, в WO 2015/175773 А1 и в работе Blanchard et al., 2014, выше, не показано никаких доказательств действия предлагаемых ингибиторов PDE4 на уровни белка CFTR, не говоря уже о его коррекции в качестве причинного эффекта, не говоря уже о таких предположениях. Принимая во внимание уровень техники, обнаружение авторами настоящего изобретения, то есть того, что соединения по настоящему изобретению обладают способностью действовать в качестве CFTR-корректоров у субъектов, связанных со специфическими мутациями CFTR, было неожиданным.
В дополнение к этому, пример 1 настоящего описания дает основания для предположения о функции потенциатора соединения общей формулы (I). Кроме того, в примере 1 подтверждается, что известный ингибитор PDE4 рофлумиласт обладает эффектом как CFTR-потенциатор. Согласно литературным данным этот эффект ингибиторов PDE4, таких как рофлумиласт, на муковисцидоз, строго связан с их способностью приводить посредством ингибирования фосфодиэстеразы 4 к увеличению концентрации цАМФ в специфических клеточных компартментах. Эффект рофлумиласта (эталонного ингибитора PDE4) подтверждается в примере 1 в настоящем документе.
Как подтверждено в примере 1, не только рофлумиласт, но и соединение, соответствующее общей формуле (I), частично восстанавливали активность мутированного CFTR в эпителии дыхательных путей, сходную с потенциатором ивакафтором (ссылка) и известным ингибитором PDE4 рофлумиластом, что свидетельствует о том, что соединение работает как потенциатор.
Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением соединение общей формулы (I) предназначено для терапии человека или животного, страдающего муковисцидозом или склонного к муковисцидозу. Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением у этого человека или животного муковисцидоз можно предотвратить или лечить.
В приведенных в настоящем документе примерах сообщается, что соединение общей формулы (I) может восстанавливать CFTR-зависимый ионный транспорт в клетках, экспрессирующих эндогенный ΔF508-CFTR; и, таким образом, предоставляются доказательства того, что соединение общей формулы (I) оказывает различное и благоприятное действие на ΔF508-CFTR, отличное от ингибиторов PDE4, ранее испытанных в данной области (Schultz et al., 1999, J. Membr. Biol., vol. 170, p. 51-66; Grubb et al., 1993, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., vol. 8, p. 454-460, рассмотрено Blanchard et al., выше).
Коррекция CFTR и ее экспериментальное обнаружение
CFTR
Предпочтительно, соединение в соответствии с настоящим изобретением обладает активностью CFTR-корректора. В частности, предпочтительно, соединение обладает активностью CFTR-корректора в клетке или у субъекта, характеризующегося по меньшей мере одной мутацией в гене , которая является причиной неправильного сворачивания и/или процессинга белка CFTR. В конкретном варианте осуществления изобретения соединение в соответствии с настоящим изобретением является причиной увеличения присутствия и/или поверхностного отображения белка CFTR в клетке такого субъекта.
CFTR
В контексте настоящего изобретения присутствие и поверхностное отображение белка CFTR являются важными. Белок CFTR является членом суперсемейства мембранных белков переносчика АТФ-связывающей кассеты (ABC). Белок CFTR дикого типа имеет 1480 аминокислотных остатков (168,142 кДа). Аминокислотная последовательность белка CFTR дикого типа представлена локусом UniProtKB CFTR_HUMAN и показана на фиг. 14. При правильном введении в клеточную мембрану белок CFTR функционирует как хлоридный канал и контролирует регуляцию других транспортных путей. Мутации в этом гене связаны, в частности, с аутосомно-рецессивным расстройством муковисцидозом. Альтернативно сплайсированные варианты транскрипта были описаны, многие из которых являются результатом мутаций в гене .
CFTR
В настоящем изобретении присутствие белка CFTR в клетке, особенно на клеточной поверхности, может быть скорректировано. Это связано с недавно выявленной и неожиданной функцией соединения общей формулы (I). Действительно, является предпочтительным, а также продемонстрировано экспериментальными примерами в настоящем документе то, что достижение коррекции CFTR является неотъемлемой частью изобретения, заявленного в настоящем документе. Действительно, достижение заявленного терапевтического эффекта является функционально-техническим признаком настоящего изобретения. Приведенные в настоящем документе примеры подтверждают, что указанная функциональная техническая особенность достижима как прямой результат введения соединения общей формулы (I). Другими словами, авторы настоящего изобретения определили, что соединение общей формулы (I) является причиной для достижения коррекции CFTR в клетке или у субъекта, характеризующегося по меньшей мере одной мутацией в гене , которая является причиной неправильного сворачивания и/или процессинга белка CFTR.
Для этой цели в контексте настоящего изобретения может быть определено присутствие белка, такого как белок CFTR. Более предпочтительно, присутствие белка на поверхности клетки, то есть отображение поверхности. Другими словами, определяется, отображается ли белок, такой как белок CFTR, на поверхности клетки.
Клетки, отображающие конкретный белок на клеточной поверхности, могут быть проанализированы, например, с помощью иммунологически активных молекул, таких как специфические антитела и другие иммунореактивные молекулы. Термин «клеточная поверхность» используется в настоящем документе в соответствии с его обычным значением в данной области техники и, таким образом, конкретно включает внешнюю сторону клетки, которая доступна для связывания белками и другими молекулами. Белок отображается на поверхности клетки, если он, по меньшей мере, частично расположен на поверхности указанной клетки и доступен для связывания антигенсвязывающими молекулами, такими как антигенспецифические антитела, добавленные в клетку. В одном варианте осуществления изобретения белок, отображаемый на поверхности клетки, представляет собой цельный мембранный белок, имеющий внеклеточную часть, которая может распознаваться антителом. Термин «внеклеточная часть» или «экзодомен» в контексте настоящего изобретения означает часть молекулы, в частности, белка, которая обращена к внеклеточному пространству клетки и, предпочтительно, доступна снаружи указанной клетки, например, посредством связывающих молекул, таких как антитела, расположенные вне клетки. Предпочтительно, термин относится к одной или нескольким внеклеточным петлям или доменам или их фрагменту. Термин «часть» используется в настоящем документе и относится к непрерывному или прерывному элементу структуры, такой как аминокислотная последовательность. Элемент или часть последовательности белка, предпочтительно, включают по меньшей мере 5, в частности, по меньшей мере 8, по меньшей мере 12, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 30 или по меньшей мере 100 последовательных и/или непоследовательных аминокислот аминокислотной последовательности, составляющей белок.
Белок, определяемый антителом или другой иммунореактивной молекулой, также может называться антигеном. В некоторых вариантах осуществления клетка по изобретению может характеризоваться отображением - или не отображением - одного или нескольких специфических антигенов. В контексте настоящего изобретения антиген белка CFTR, предпочтительно, отображается на поверхности клетки.
В соответствии с общими принципами клеточной биологии, когда антиген специфически определяется антителом или другой иммунореактивной молекулой, например на поверхности (интактной) клетки (например, с помощью иммуноокрашивания) или в лизате клетки (например, с помощью вестерн-блоттинга), клетка экспрессирует ген, кодирующий антиген (полипептид). Следовательно, обнаружение антигена (полипептида), который отображается на поверхности клетки, является косвенным средством для демонстрации экспрессии гена, кодирующего полипептид. Другим косвенным методом показать, что ген, кодирующий белок, экспрессируется и, таким образом, присутствует в клетке, является вестерн-блот (см., например, пример 2).
Согласно изобретению антиген отображается на клетке, если уровень экспрессии выше предела обнаружения и/или если уровень экспрессии достаточно высок, чтобы допустить связывание антигенспецифическими антителами, добавленными в клетку. Согласно изобретению полагают, что антиген не экспрессируется в клетке, если уровень экспрессии ниже предела обнаружения и/или если уровень экспрессии слишком низок, чтобы допустить связывание посредством антигенспецифического антитела, добавленного в клетку. Предпочтительно, антиген, экспрессируемый в клетке, экспрессируется или экспонируется, то есть присутствует на поверхности указанной клетки и, таким образом, доступен для связывания антигенспецифическими молекулами, такими как антитела или другие иммунореактивные молекулы, добавленные в клетку. В некоторых случаях также добавляют вторичную молекулу, которая помогает в обнаружении, такую как, например, необязательно меченное вторичное антитело.
Антитело или другая иммунореактивная молекула может распознавать эпитоп на клетке. Термин «эпитоп» относится к антигенной детерминанте в молекуле, такой как антиген, то есть к части или фрагменту молекулы, которая распознается, то есть связана иммунной системой, например, которая распознается антителом или другой иммунореактивной молекулой. Обнаружение эпитопа, специфичного для какого-либо конкретного антигена, обычно позволяет сделать вывод, что этот конкретный антиген присутствует в анализируемой клетке.
В одном варианте осуществления изобретения клетка или образец от субъекта могут характеризоваться иммунофенотипированием. «Иммунофенотипирование» обычно означает, что клетка или образец могут быть охарактеризованы антигенспецифическими молекулами, такими как антитела или другие иммунореактивные молекулы, которые добавляются в клетку для определения наличия антигена. Иммунофенотипирование включает сортировку клеток с использованием различных методов, включая проточную цитометрию, а также аналитические методы для лизированных клеток и лизированных образцов, такие как вестерн-блоттинг. Одним из методов иммунофенотипирования является проточная цитометрия, в частности, FACS: аналит, в частности, белок клеточной поверхности, распознается, как правило, антителом или другой иммунореактивной молекулой. Антитело или другая иммунореактивная молекула либо сами помечены флуорофором, либо распознаются вторичным антителом, помеченным флуорофором, или другой иммунореактивной молекулой, которая добавляется для этой цели.
Характеристика подгруппы пациентов
CFTR
CFTR
Настоящее изобретение особенно подходит для подгруппы субъектов, страдающих муковисцидозом, где указанная подгруппа характеризуется конкретным генотипом и конкретным фенотипом. Что касается специфичности генотипа, субъект характеризуется по меньшей мере одной мутацией по меньшей мере в одном аллеле гена . Что касается специфичности фенотипа, мутация является причиной неправильного сворачивания и/или процессинга белка CFTR. Таким образом, генетическая мутация является мутацией с потерей функции. Было идентифицировано около 2000 мутаций в гене , которые вызывают фенотип потери функции за счет нарушения транскрипции и/или трансляции, клеточного сворачивания и/или процессинга, и/или гейтинга хлоридных каналов. В общем мутации потери функции гена CFTR были описаны, среди прочего, Rowe et al. (Cold Spring Harb. Perspect. Med., 2013, vol. 3, a009761) и в http://www.genet.sickkids.on.ca/app.
CFTR
В частности, настоящее изобретение относится к соединению общей формулы (I) для применения при профилактике и/или лечении муковисцидоза у субъекта, где субъект характеризуется по меньшей мере одной мутацией в гене , которая является причиной неправильного сворачивания и/или процессинга белка CFTR.
CFTR
Таким образом, указанная по меньшей мере одна мутация в гене  не является молчащей мутацией: это мутация с потерей функции, которая является причиной мутации аминокислотной последовательности кодируемого белка CFTR.
CFTR
Хотя было отмечено, что некоторые мутации в гене  являются более частыми у субъектов с североевропейским происхождением или родословной и реже встречаются у субъектов с африканским и азиатским происхождением или родословной (O’Sullivan, et al., 2009, Lancet, vol. 373, p. 1891-1904), настоящее изобретение применимо независимо от возраста, расы, этнического или географического происхождения субъекта, если контекст явно не предписывает иное.
Настоящее изобретение частично основано на удивительном обнаружении того, что соединение общей формулы (I), определенное в настоящем документе, такое как CHF6001, неожиданно увеличивает присутствие мутированного белка CFTR на уровне клеточной плазматической мембраны. Это показано в примере 2.
В одном варианте осуществления изобретения субъект характеризуется двумя аллелями мутированного CFTR, как описано в настоящем документе. Два мутированных аллеля могут быть одинаковыми или разными. В предпочтительном варианте осуществления два мутантных аллеля имеют по меньшей мере одну мутацию, которая является причиной неправильного сворачивания и/или процессинга белка CFTR.
Субъектом, у которого муковисцидоз может быть предотвращен или излечен в соответствии с настоящим изобретением, предпочтительно, является млекопитающее, более предпочтительно, человек. Примерами животных являются предназначенные на убой животные и другие животные, выращиваемые на ферме, такие как крупный рогатый скот, свиньи, овцы или домашняя птица.
У животных, не являющихся людьми, настоящее изобретение применимо к субъектам подгрупп, имеющих видовые гомологи белков CFTR человека, описанные в настоящем документе. В общем, «видовой гомолог» представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты или аминокислоты или ее мутацию с происхождением, отличным от вида данной последовательности нуклеиновой кислоты или аминокислоты или ее мутации. Таким образом, видовой гомолог белка человека CFTR представляет собой белок CFTR нечеловеческого вида, а видовой гомолог человеческой мутации ΔF508 у животного, не являющегося человеком, относится к делеции участка белка CFTR животного, не являющегося человеком, которое по гомологии последовательностей соответствует человеческой мутации ΔF508.
Тот факт, что соединение по настоящему изобретению способно специфически увеличивать присутствие мутированного белка CFTR (пример 2), предполагает, не желая быть связанным какой-либо конкретной теорией, что молекулярный механизм, отличный от, или, по крайней мере, в дополнение к ингибированию PDE4, отвечает за коррекцию дефекта клеточного процессинга канала CFTR, наблюдаемого при воздействии CHF6001 в примере 2, то есть то, что корректирующая активность CHF6001 в мутированном белке CFTR может быть обусловлена другим механизмом действия. Такой механизм действия еще не полностью выяснен на молекулярном уровне, но это подтверждается научными открытиями, о которых сообщается в настоящем документе.
CFTR
Следовательно, настоящее изобретение может быть использовано для лечения или профилактики муковисцидоза у субъектов, характеризующихся по меньшей мере одной мутацией в гене , которая является причиной неправильного сворачивания и/или процессинга белка CFTR. В некоторых вариантах осуществления изобретения такие субъекты могут страдать от муковисцидоза в дыхательных путях и/или в желудочно-кишечном тракте. Субъекты, которые получают пользу от лечения или профилактики согласно настоящему изобретению, представляют собой подгруппу пациентов с муковисцидозом. Эта подгруппа, которая определяется как генотипически, так и фенотипически, является узкой и специфической по сравнению с не определенным общим количеством пациентов с муковисцидозом, как указано, например, в WO 2010/089107 A1. В одном варианте осуществления изобретения соединение в соответствии с настоящим изобретением может быть использовано, в частности, для лечения субъектов, страдающих муковисцидозом в дыхательных путях. Пример 2 свидетельствует о том, что соединение по настоящему изобретению особенно подходит для лечения клеток дыхательных путей. Действительно, согласно общеизвестным знаниям, общепризнанно, что разработка лекарств в области муковисцидоза дыхательных путей может в значительной степени основываться на фенотипических анализах, основанных на функции канала CFTR (Rowe et al., Cold Spring Harb. Perspect. Med., 2013 vol. 3, a009761). В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект связан с состоянием, выбранным из воспаления легких. Не желая привязываться к конкретной теории, обычно понимают, что мутация ΔF508 del является мутацией сворачивания.
CFTR
CFTR
CFTR
CFTR
CFTR
CFTR
CFTR
CFTR
Субъект характеризуется по меньшей мере одной мутацией, которая характеризуется постоянным изменением нуклеотидной последовательности субъекта, предпочтительно, геномной нуклеотидной последовательности субъекта. Таким образом, предпочтительно, чтобы по меньшей мере одна мутация представляла собой геномную мутацию гена . Предпочтительно, такая мутация представляет собой мутацию с потерей функции. Более предпочтительно, субъект, которого лечат, характеризуется мутацией потери функции гена  на каждом из аллелей гена CFTR. Другими словами, по меньшей мере, один аллель гена  субъекта не кодирует белок CFTR дикого типа, предпочтительно, оба аллеля гена  субъекта не кодируют белок CFTR дикого типа. Предпочтительно, по меньшей мере один аллель гена  субъекта кодирует белок CFTR, характеризующийся измененными сворачиванием, процессингом, проводимостью или гейтингом по сравнению с белком CFTR дикого типа. Как используется в настоящем документе, белок CFTR, характеризующийся измененными сворачиванием, процессингом, проводимостью или гейтингом по сравнению с белком CFTR дикого типа, может характеризоваться мутацией с потерей функции. Более предпочтительно, оба аллеля гена  субъекта кодируют белок CFTR, характеризующийся измененными сворачиванием, процессингом, проводимостью или гейтингом по сравнению с белком CFTR дикого типа. Два аллеля субъекта, которые кодируют белок CFTR не дикого типа, предпочтительно, белок CFTR, характеризующиеся измененными сворачиванием, процессингом, проводимостью или гейтингом по сравнению с белком CFTR дикого типа, могут быть одинаковыми или разными. В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения два аллеля субъекта, которые кодируют белок CFTR не дикого типа, кодируют один и тот же мутант белка CFTR и, необязательно, имеют одну и ту же нуклеотидную последовательность. Таким образом, в некоторых предпочтительных вариантах субъект является гомозиготным по мутации в гене . Пример 1 и пример 2 показывают, что соединение, соответствующее общей формуле (I), подходит для клеток, гомозиготных по мутации в гене .
CFTR
CFTR
По меньшей мере одна мутация в гене  выбрана из миссенс мутации (включая вставку или удаление не в кадре), мутации сдвига рамки, мутации сплайсинга, мутации нонсенса, вставки или удаления в рамке (in/del) одной или нескольких аминокислот, мутации промотора, мутации, которая влияет на гликозилирование белка CFTR, или любой другой мутации гена , которая влияет на белок CFTR. Предпочтительно, мутация представляет собой вставку или делецию в рамке (in/del) одной или нескольких аминокислот. Примером этого является делеция аминокислотного остатка фенилаланина 508 (Phe508, F508), вызванная делецией из 3 нуклеотидов (то есть в рамке). Эта специфическая делеция (ΔF508) вызывает дефект сворачивания белка. Если этот дефект преодолен, как предусмотрено в настоящем изобретении, тогда белок может образовывать функциональный канал CFTR.
CFTR
CFTR
CFTR
CFTR
CFTR
По меньшей мере одна мутация гена  может представлять собой мутацию в экзоне 1, или экзоне 2, или экзоне 3, или экзоне 4, или экзоне 5, или экзоне 6, или экзоне 7, или экзоне 8, или экзоне 9, или экзоне 10, или экзоне 11, или экзоне 12, или экзоне 13, или экзоне 14, или экзоне 15, или экзоне 16, или экзоне 17, или экзоне 18, или экзоне 19, или экзоне 20, или экзоне 21, или экзоне 22, или экзоне 23, или экзоне 24, или экзоне 25, или экзоне 26, или экзоне 27 гена . Альтернативно или дополнительно по меньшей мере одна мутация гена  может представлять собой мутацию внутри интрона 1, или интрона 2, или интрона 3, или интрона 4, или интрона 5, или интрона 6, или интрона 7, или интрона 8, или интрона 9, или интрона 10, или интрона 11, или интрона 12, или интрона 13, или интрона 14, или интрона 15, или интрона 16, или интрона 17, или интрона 18, или интрона 19, или интрона 20, или интрона 21, или интрона 22, или интрона 23, или интрона 24, или интрона 25, или интрона 26 гена , и/или мутацию, которая перекрывает несколько экзонов и/или интронов. В предпочтительных вариантах осуществления по меньшей мере одна мутация обнаружена в экзоне 11 гена , то есть в экзоне, кодирующем фенилаланин 508 в CFTR дикого типа (http://www.genet.sickkids.on.ca/CftrDomainPage.html?domainName=NBD1).
CFTR
Предпочтительно, по меньшей мере одна мутация гена  представляет собой нуклеотидную мутацию, которая вызывает мутацию на уровне аминокислотной последовательности в пределах нуклеотидсвязывающего домена (NBD) белка CFTR. NBD содержат ряд высоко консервативных мотивов, которые, по прогнозам, связывают и гидролизуют АТФ. Сайт-направленный мутагенез по этим мотивам показал, что АТФ связывается с обоими NBD, чтобы контролировать гейтинг канала. В предпочтительных вариантах осуществления по меньшей мере одна мутация является причиной мутации на уровне аминокислот в первом (более N-концевом) нуклеотидсвязывающем домене (NBD) белка CFTR. Фенилаланин 508 в CFTR дикого типа обнаружен в первом нуклеотидсвязывающем домене (NBD1; см., http://www.genet.sickkids.on.ca/CftrDomainPage.html?domainName=NBD1).
В одном варианте осуществления изобретения субъект, подлежащий лечению в соответствии с настоящим изобретением, характеризуется по меньшей мере одной мутацией в белке CFTR, которая является не только мутацией гейтинга или мутацией проводимости. Во избежание сомнений, хотя фенилаланин 508 в белке CFTR дикого типа находится в NBD1, делеция фенилаланина 508 не только вызывает дефект гейтинга и проводимости, но также и сворачивания белка CFTR, как описано ниже.
CFTR
В предпочтительных вариантах осуществления изобретения субъект характеризуется отсутствием фенилаланина 508 со ссылкой на последовательность CFTR дикого типа. Фенилаланин 508 может отсутствовать из-за множества различных альтернативных генетических мутаций, и все такие альтернативы включены в настоящее изобретение, если контекст явно не диктует иное. В частности, по меньшей мере одна мутация в гене , вызывающая отсутствие фенилаланина 508, выбрана из ошибочной мутации (включая вставку или удаление не в рамке), обычно в положении в нуклеотидной последовательности, которая кодирует фенилаланин 508 или выше от этого положения; мутация со сдвигом рамки, обычно в положении в нуклеотидной последовательности, которая кодирует фенилаланин 508 или выше этого положения; мутация сплайсинга, обычно затрагивающая, по меньшей мере, один из экзонов 1-11 и/или интронов 1-10, нонсенс-мутация, обычно в положении в нуклеотидной последовательности, которая кодирует фенилаланин 508 или выше этого положения; вставка или удаление в рамке (in/del) одной или нескольких аминокислот, как правило, в положении в нуклеотидной последовательности, которая кодирует фенилаланин 508 или выше этого положения. Термин «выше» в контексте настоящего изобретения имеет обычное значение в области молекулярной биологии и, когда используется со ссылкой на последовательность нуклеиновых кислот, предназначен для указания положения ближе к 5’ концу этой последовательности нуклеиновых кислот.
В первом конкретном варианте осуществления изобретения указанный субъект характеризуется по меньшей мере одной мутацией в гене CFTR, которая является причиной неправильного сворачивания белка CFTR. Любая мутация такого типа также упоминается в настоящем документе как «мутация с нарушением сворачивания», термин, который применим как к уровню белка, так и к уровню нуклеиновой кислоты, которая его кодирует.
Если только не исправлено, например, путем введения подходящего CFTR-корректора, мутация с нарушением сворачивания обычно является причиной пониженного присутствия белка CFTR в клетке, в частности, уменьшенного отображения белка CFTR на поверхности клетки. Присутствие белка можно обнаружить, например, с помощью гель-электрофореза и вестерн-блоттинга. Отображение белка на поверхности клетки может быть обнаружено, например, с помощью иммуноокрашивания.
CFTR
Предпочтительно, когда по меньшей мере один аллель (первый аллель) у субъекта, подлежащего лечению в соответствии с настоящим изобретением, характеризуется мутацией сворачивания, тогда второй аллель не является аллелем, который способен транс-дополнять дефект сворачивания, вызванный мутацией сворачивания на первом аллеле (Cormet-Boyaka et al., 2004, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 101, p. 8221-8226). Предпочтительно, в этом варианте осуществления у субъекта, подлежащего лечению в соответствии с настоящим изобретением, кодирован белок CFTR с мутацией сворачивания (одинаковой или разной) на каждом из двух аллелей гена . Когда мутация с нарушением сворачивания идентична на обоих аллелях, что является предпочтительным, тогда субъект гомозиготен по указанной мутации сворачивания.
В контексте настоящего изобретения «мутация с нарушением сворачивания» относится к мутации полипептидной последовательности CFTR (и, следовательно, также к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей ее), где мутация полипептидной последовательности CFTR является причиной неэффективного сворачивания полипептида CFTR. Не желая связываться с какой-либо конкретной теорией, в настоящее время понятно, что сворачивание CFTR происходит в эндоплазматическом ретикулуме, ко- и/или посттрансляционно; мутация с нарушением сворачивания представляет собой мутацию, в которой мутантный белок CFTR не сворачивается так же эффективно, как белок CFTR дикого типа, например, из-за одного или нескольких из следующих дефектов: неэффективное образование нативной конформации в эндоплазматической сети (ER), неэффективный выход из ER и/или неэффективное гликозилирование в компартменте Гольджи (Lukacs et al., 2012, Trends Mol. Med., vol. 18, p. 81-91). «Не сворачивается так же эффективно, как белок CFTR дикого типа» означает, что менее 100% отдельных полипептидов CFTR сворачиваются так же эффективно, как белок CFTR дикого типа, даже если определенный процент отдельных полипептидов CFTR действительно должен быть свернут правильно. Не желая привязываться к какой-либо конкретной теории, предполагается, что частично свернутые каналы удаляются посредством ER-ассоциированной деградации (ERAD) через систему убиквитин-протеасома (UPS; Lukacs et al., выше), которая объясняет, почему присутствие и/или поверхностное отображение складывающегося мутанта CFTR обычно составляет менее 100% по сравнению с уровнями присутствия и/или поверхностного отображения белка CFTR дикого типа в соответствующем типе клеток. Хотя первопричина неэффективного сворачивания мутантного CFTR не была окончательно выяснена и не является критической для практики настоящего изобретения, было предположено, что неэффективному сворачиванию способствуют энергетическая нестабильность отдельных доменов белка CFTR, медленная сборка доменов и относительно быстрая кинетика ERAD (Lukacs et al., выше).
CFTR
CFTR
Настоящее изобретение применимо к любому мутанту сворачивания CFTR, если контекст явно не диктует иное. В частности, настоящее изобретение применимо к делеции фенилаланина 508 в отношении человеческого CFTR дикого типа. Эта мутация может упоминаться как ΔF508, ΔPhe508, F508del или Phe508del, или тому подобное. Мутация ΔF508 является наиболее хорошо изученной мутацией с нарушением сворачивания белка CFTR человека. У человека, которого предполагается лечить в соответствии с настоящим изобретением, мутация ΔF508 присутствует по меньшей мере в одном аллеле. Таким образом, предпочтительно, у человека, характеризующегося по меньшей мере одной мутацией гена , по меньшей мере одна мутация представляет собой ΔPhe508 в гене . Предпочтительно, когда по меньшей мере один аллель (первый аллель) у субъекта, подлежащего лечению в соответствии с настоящим изобретением, характеризуется мутацией сворачивания ΔPhe508, тогда второй аллель не является аллелем, который способен транс-дополнять дефект сворачивания, вызванный мутацией сворачивания ΔPhe508. В соответствии с вышеизложенным настоящее изобретение, таким образом, относится к применению соединения, соответствующего общей формуле (I), у человека, где геном указанного субъекта человека по меньшей мере кодирует мутацию ΔF508 в белке CFTR.
Более предпочтительно, указанный человек является гомозиготным по мутации ΔPhe508. В этом отношении настоящее изобретение относится к применению соединения, соответствующего общей формуле (I), у человека, где геном указанного субъекта человека кодирует мутацию ΔF508 в обоих геномных аллелях гена, кодирующего белок CFTR. Другими словами, настоящее изобретение относится к применению соединения, соответствующего общей формуле (I), у человека, где указанный субъект человек гомозиготен по ΔF508.
Настоящее изобретение в равной степени применимо к другим мутантам сворачивания CFTR. Такие другие мутанты сворачивания могут характеризоваться или нет мутацией фенилаланина 508. Субъекты, у которых один аллель (первый аллель) кодирует мутант CFTR, характеризующийся мутацией фенилаланина 508 белка CFTR, а другой аллель, кодирующий второй мутант CFTR, отличается от мутанта, кодируемого первым аллелем, но, предпочтительно, также характеризуется неправильным сворачиванием второго мутанта CFTR, явно включены в подгруппу пациентов в соответствии с предпочтительными вариантами осуществления настоящего изобретения.
Во втором конкретном варианте осуществления указанный субъект характеризуется по меньшей мере одной мутацией в гене CFTR, которая является причиной неправильного процессинга белка CFTR. Любая мутация такого типа также упоминается в настоящем документе как «мутация процессинга», термин, который применим как к уровню белка, так и к уровню нуклеиновой кислоты, которая его кодирует. Предпочтительно, в этом втором варианте осуществления у субъекта, подлежащего лечению в соответствии с настоящим изобретением, кодирован белок CFTR с мутацией сворачивания (одинаковой или разной) на каждом из двух аллелей гена CFTR. Когда мутация с нарушением сворачивания идентична на обоих аллелях, что является предпочтительным, тогда субъект гомозиготен по указанной мутации сворачивания.
Первый и второй конкретные варианты осуществления не обязательно являются взаимоисключающими. Другими словами, субъект, которого можно лечить в соответствии с настоящим изобретением, может характеризоваться либо мутацией сворачивания, либо мутацией, которая является одновременно мутацией сворачивания и мутацией процессинга (являющейся причиной как для неправильного процессинга, так и для неправильного сворачивания), на одном и том же аллеле или на разных аллелях.
Хотя CFTR мутация ΔF508 классифицируется в настоящем документе как «мутант сворачивания», настоящее изобретение не следует понимать как ограничиваемое такой категоризацией, поскольку нельзя исключать, что в научной среде будет предложена повторная категоризация; например, некоторые авторы также предложили классифицировать CFTR мутацию ΔF508 как «мутацию процессинга», см., например, Cormet-Boyaka et al., 2004, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 101, p. 8221-8226.
Предпочтительно, настоящее изобретение в равной степени применимо к другим мутантам процессинга CFTR. Такие другие мутанты с нарушенным сворачиванием могут или нет характеризоваться мутацией фенилаланина 508. Субъекты, у которых один аллель (первый аллель) кодирует мутант CFTR, характеризующийся мутацией фенилаланина 508 белка CFTR, а другой аллель, кодирующий второй мутант CFTR, отличается от мутанта, кодируемого первым аллелем, но, предпочтительно, характеризуется неправильным процессингом второго мутанта CFTR, явно включен в подгруппу пациента в соответствии с предпочтительными вариантами осуществления настоящего изобретения.
Если только не исправлено, например, путем введения подходящего CFTR-корректора, мутация процессинга может быть причиной пониженного присутствия белка CFTR в клетке, в частности, уменьшенного отображения белка CFTR на поверхности клетки и/или изменения молекулярной массы белка CFTR по сравнению с белком CFTR дикого типа. Отображение белка на поверхности клетки может быть обнаружено, например, с помощью иммуноокрашивания. Присутствие белка и измененную молекулярную массу можно обнаружить, например, с помощью гель-электрофореза и вестерн-блоттинга.
Обычно CFTR-мутанты процессинга не могут покинуть эндоплазматический ретикулум и быстро деградируют. Один пример человеческого CFTR мутанта процессинга характеризуется заменой аминокислотного остатка гистидина 1085 остатком аргинина (H1085R, Cormet-Boyaka et al., 2004, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 101, p. 8221-8226). Другие мутанты процессинга могут быть идентифицированы и/или они описаны в литературе, и настоящее изобретение также может быть применимо к ним.
CFTR
CFTR
Предпочтительно, по меньшей мере, одна мутация представляет собой мутацию гена , присутствующего в клетках дыхательных путей указанного субъекта. Не желая быть связанными с какой-либо конкретной теорией, в настоящее время понятно, что любая неспонтанная мутация, присутствующая в зародышевой линии субъекта, обычно также присутствует в дыхательных путях указанного субъекта. Наличие мутации в дыхательных путях может быть проверено, например, путем взятия образца из дыхательных путей и анализом генной последовательности, например, гена .
Staphylococcus aureus
Haemophilus influenzae
Pseudomonas aeruginosa
В некоторых вариантах осуществления изобретения указанный субъект страдает от симптомов муковисцидоза в дыхательных путях. Симптомы муковисцидоза в дыхательных путях могут включать, без ограничения, одно или несколько из следующих: закупорка дыхательных путей из-за скопления слизи, уменьшение мукоцилиарного клиренса и, как следствие, воспаление, и затруднение дыхания. Не желая привязываться к какой-либо конкретной теории, воспаление и инфекция вызывают травмы и структурные изменения в легких, что приводит к различным симптомам. Другие симптомы муковисцидоза в дыхательных путях могут также включать в себя непрерывный кашель, обильное образование мокроты и снижение способности к физической нагрузке. Не желая привязываться к какой-либо конкретной теории, многие из этих симптомов возникают, когда бактерии, которые обычно населяют густую слизь, выходят из-под контроля и вызывают пневмонию. Другие симптомы муковисцидоза в дыхательных путях могут также включать изменения в архитектуре легких, такие как патология магистральных дыхательных путей (бронхоэктазия), серьезные затруднения дыхания, кашель с кровью (кровохарканье), высокое кровяное давление в легких (легочная гипертензия), сердечная недостаточность, трудности с поступлением достаточного количества кислорода в организм (гипоксия) и дыхательная недостаточность, требующая поддержки с помощью дыхательных масок. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект, страдающий симптомами муковисцидоза в дыхательных путях, инфицирован одним или несколькими из следующих факторов: ,  и ; не исключено совместное заражение другими организмами.
В некоторых вариантах осуществления изобретения указанный субъект страдает от симптомов муковисцидоза в желудочно-кишечном тракте. Симптомы муковисцидоза в желудочно-кишечном тракте включают, без ограничения, густые выделения из поджелудочной железы, частичную или полную блокировку экзокринного движения выделений поджелудочной железы в двенадцатиперстную кишку и повреждение поджелудочной железы, часто с болезненным воспалением (панкреатитом) и атрофией экзокринные железы. Термин «муковисцидоз» относится к характерному фиброзу и кистам, которые образуются в поджелудочной железе (Andersen, 1938, Am. J. Dis. Child, vol. 56, p. 344-399), но обычно не ограничиваются симптомами в желудочно-кишечном тракте. Действительно, в некоторых вариантах осуществления указанный субъект страдает от симптомов муковисцидоза в дыхательных путях, а также в желудочно-кишечном тракте.
В некоторых вариантах субъект, подлежащий лечению в соответствии с настоящим изобретением, страдает муковисцидозом в малых дыхательных путях. Малые дыхательные пути обычно определяются как не хрящевые дыхательные пути с внутренним диаметром <2 мм (Burgel et al., 2009, Eur. Respir. Rev., vol. 18, p. 80-95). Не желая быть связанными с какой-либо конкретной теорией, малые дыхательные пути часто особенно уязвимы, потому что там могут откладываться многие частицы и инфекционные агенты, и потому что их узкий просвет делает их более восприимчивыми к полной обструкции, чем более крупные дыхательные пути. Как правило, заболевание поражает эпителий субъектов, страдающих муковисцидозом в малых дыхательных путях, и у соответствующих субъектов успех может быть достигнут при лечении путем профилактики или терапии, описанных в настоящем документе. Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением можно предотвратить или лечить симптомы муковисцидоза в эпителии малых дыхательных путей. Таким образом, в предпочтительных вариантах субъект страдает муковисцидозом в эпителии малых дыхательных путей.
В примерах, представленных в настоящем документе, в качестве модели муковисцидоза была использована клеточная линия CFBE41 человека (см., примеры). Как описано ранее, клеточная линия CFBE41 представляет собой клеточную линию человека, которая была получена путем трансформации трахеобронхиальных клеток муковисцидоза (CF) с помощью SV40 и, как сообщалось, является гомозиготной по мутации ΔF508 (Ehrhard et al., 2006, Cell Tissue Res., vol. 323, p. 405-415). Клеточная линия CFBE41 гомозиготна по ΔF508-CFTR по нескольким пассажам в культуре и экспрессирует ряд белков, важных для абсорбции лекарственных средств в легких (например, P-gp, LRP и кавеолин-1). Эта клеточная линия сохраняет, по меньшей мере, некоторые аспекты эпителиальных клеток бронхиального CF человека, такие как способность образовывать электрически плотные клеточные слои с функциональными межклеточными контактами при выращивании в условиях погруженной (но не с воздушной поверхностью) культуры. Следовательно, клеточная линия CFBE41 считается полезной для исследований муковисцидоза, например, путем обработки низкомолекулярными агентами (кандидатами лекарственных средств) и для сбора дополнительной информации о заболевании на клеточном уровне без необходимости первичной культуры (Ehrhard et al., выше).
Описание соединения для применения в соответствии с настоящим изобретением
Настоящее изобретение относится к лечению муковисцидоза у субъекта, принадлежащего к конкретной подгруппе пациентов, описанных в настоящем документе, с помощью соединения общей формулы (I)
(I)
где:
n обозначает 0 или 1;
R1 и R2 могут быть одинаковыми или разными, и выбраны из группы, включающей:
1
6
- линейный или разветвленный C-C алкил, необязательно замещенный одним или несколькими атомами галогена;
1
6
3
7
- OR3, где R3 представляет собой линейный или разветвленный C-C алкил, необязательно замещенный одним или несколькими атомами галогена или C-C циклоалкильными группами; и
2
1
4
- HNSOR4, где R4 представляет собой линейный или разветвленный C-C алкил, необязательно замещенный одним или несколькими атомами галогена,
2
- где по меньшей мере один из R1 и R2 представляет собой HNSOR4,
его фармацевтически приемлемыми неорганическими или органическими солями, гидратами, сольватами или аддитивными комплексами.
Термин «атомы галогена», как используется в настоящем документе включает фтор, хлор, бром и йод, предпочтительно, хлор.
Как используется в настоящем документе, выражение «линейный или разветвленный C1-Cx алкил», где x обозначает целое число больше чем 1, относится к алкильным группам с прямой и разветвленной цепью, где число атомов углерода находится в диапазоне от 1 до х. Конкретными алкильными группами являются метил, этил, н-пропил, изопропил и трет-бутил. Необязательно, в указанных группах один или несколько атомов водорода могут быть заменены атомами галогена, предпочтительно, хлора или фтора.
Как используется в настоящем документе, выражение «C3-Cx циклоалкил», где х представляет собой целое число больше 3, относится к циклическим неароматическим углеводородным группам, содержащим от 3 до х кольцевых атомов углерода. Примеры включают циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил и циклогептил. Необязательно, в указанных группах один или несколько атомов водорода могут быть заменены атомами галогена, предпочтительно, хлора или фтора.
Специалистам в данной области техники будет очевидно, что соединения общей формулы (I) содержат один асимметричный центр в положении -CHO- и поэтому существуют в виде оптических стереоизомеров.
Хотя настоящее изобретение может включать использование рацемата или (-) или (+) энантиомеров, предпочтительно в практически чистой форме, предпочтительными соединениями формулы (I) являются (-)энантиомеры. В примере 2 показано, что (-)энантиомер соединения, соответствующего общей формуле (I), действует как CFTR-корректор. Таким образом, соединение, соответствующее общей формуле (I), представляет собой по существу чистый (-)энантиомер производного 1-фенил-2-пиридинилалкилового спирта.
Предпочтительными группами соединений общей формулы (I) являются такие, где:
2
- R1 представляет собой HNSOR4, R2 представляет собой OR3, и n обозначает 0;
2
- R1 представляет собой HNSOR4, R2 представляет собой OR3, и n обозначает 1;
2
- R1 представляет собой HNSOR4, где R4 представляет собой метил, R2 представляет собой OR3, где R3 представляет собой циклопропилметил, и n обозначает 0;
2
- R1 представляет собой HNSOR4, где R4 представляет собой метил, R2 представляет собой OR3, где R3 представляет собой циклопропилметил, и n обозначает 1;
1
6
2
- R1 представляет собой линейный или разветвленный C-C алкил, R2 представляет собой HNSOR4, и n обозначает 0;
2
- R1 представляет собой метил, R2 представляет собой HNSOR4, где R4 представляет собой метил, и n обозначает 0;
1
6
2
- R1 представляет собой линейный или разветвленный C-C алкил, R2 представляет собой HNSOR4, и n обозначает 1;
2
- R1 представляет собой метил, R2 представляет собой HNSOR4, где R4 представляет собой метил, и n обозначает 1;
1
6
2
- R2 представляет собой линейный или разветвленный C-C алкил, R1 представляет собой HNSOR4, и n обозначает 0;
2
- R2 представляет собой метил, R1 представляет собой HNSOR4, где R4 представляет собой метил, и n обозначает 0;
1
6
2
- R2 представляет собой линейный или разветвленный C-C алкил, R1 представляет собой HNSOR4, и n обозначает 1;
2
- R2 представляет собой метил, R1 представляет собой HNSOR4, где R4 представляет собой метил, и n обозначает 1;
2
- R1 представляет собой OR3, R2 представляет собой HNSOR4, и n обозначает 0;
2
- R1 представляет собой OR3, R2 представляет собой HNSOR4, и n обозначает 1;
2
- R1 представляет собой OR3, где R3 представляет собой циклопропилметил, R2 представляет собой HNSOR4 и R4 представляет собой метил, и n обозначает 1;
2
- R1 представляет собой OR3, R2 представляет собой HNSOR4, и n обозначает 1;
2
- оба R1 и R2 представляют собой HNSOR4, и n обозначает 0;
2
- оба R1 и R2 представляют собой HNSOR4, где R4 представляет собой метил, и n обозначает 0;
2
- оба R1 и R2 представляют собой HNSOR4, и n обозначает 1;
2
- оба R1 и R2 представляют собой HNSOR4, где R4 представляет собой метил, и n обозначает 1.
2
Предпочтительно, в соединении общей формулы (I) R1 представляет собой HNSOR4; R4 соответствует метилу. Предпочтительно, в соединении общей формулы (I) R2 представляет собой OR3; R3 соответствует циклопропилметилу. Предпочтительно, в соединении общей формулы (I) n обозначает 1.
2
В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения соединение формулы (I) является соединением, в котором R1 представляет собой HNSOR4, где R4 представляет собой метил, R2 представляет собой OR3, где R3 представляет собой циклопропилметил, и n обозначает 0.
2
В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения соединение формулы (I) является соединением, в котором R1 представляет собой OR3, R2 представляет собой HNSOR4, где R4 представляет собой метил, и n обозначает 1 - см. соединение C2 в таблице 1 ниже.
2
В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения соединение формулы (I) является соединением, в котором R1 представляет собой метил, R2 представляет собой HNSOR4, где R4 представляет собой метил, и n обозначает 1.
2
В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения соединение формулы (I) является соединением, в котором оба R1 и R2 представляют собой HNSOR4, где R4 представляет собой метил, и n обозначает 0.
2
В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения соединение формулы (I) является соединением, в котором оба R1 и R2 представляют собой HNSOR4, где R4 представляет собой метил, и n обозначает 1.
Таким образом, в соответствии с этими предпочтительными вариантами осуществления настоящее изобретение относится к применению соединений, представленных в таблице 1 ниже:
<b>Соединение</b>
<b>Химическое название</b>
<b>C1</b>
1-(3-Циклопропилметокси-4-дифторметоксифенил)-2-(3,5-дихлорпиридин-4-ил)этиловый эфир 3-циклопропилметокси-4-метансульфониламинобензойной кислоты
<b>C2</b>
1-(3-Циклопропилметокси-4-дифторметоксифенил)-2-(3,5-дихлор-1-оксипиридин-4-ил)этиловый эфир 3-циклопропилметокси-4-метансульфониламинобензойной кислоты (CHF6001)
<b>C3</b>
1-(3-Циклопропилметокси-4-дифторметоксифенил)-2-(3,5-дихлор-1-оксипиридин-4-ил)этиловый эфир 4-циклопропилметокси-3-метансульфониламинобензойной кислоты
<b>C4</b>
1-(3-Циклопропил-метокси-4-дифторметоксифенил)-2-(3,5-дихлор-1-оксипиридин-4-ил)этиловый эфир 3,4-бис-метансульфониламинобензойной кислоты
<b>C5</b>
1-(3-Циклопропил-метокси-4-дифторметоксифенил)-2-(3,5-дихлор-1-оксипиридин-4-ил)этиловый эфир 3-метансульфониламино-4-метил-бензойной кислоты
<b>C6</b>
1-(3-Циклопропилметокси-4-дифторметоксифенил)-2-(3,5-дихлор-1-оксипиридин-4-ил)этиловый эфир 4-метансульфониламино-3-метил-бензойной кислоты
В некоторых вариантах осуществления изобретения соединение C2 (CHF6001) является наиболее предпочтительным. CHF6001 также использовали в экспериментальных примерах, показанных в настоящем документе. В литературе соединение С2 также упоминается под названием «[(S)-3,5-дихлор-4-(2-(3-(циклопропилметокси)-4-(дифторметокси)фенил)-2-(3-(циклопропилметокси)-4-(метилсульфонамидо)бензоилокси)этил)-пиридин-1-оксид] (CHF6001)» (Moretti et al. 2015, выше).
Таким образом, в соответствии с вышеизложенным, подгруппа пациентов, подвергаемых специфическому лечению соединением в соответствии с общей формулой (I) согласно настоящему изобретению, представлена подгруппой всех субъектов, пораженных муковисцидозом.
Общеизвестно, что белок CFTR активируется цАМФ. Хотя основываясь на этих общих знаниях ранее было высказано предположение, что некоторые ингибиторы PDE4 могут способствовать активации белка CFTR и, следовательно, CFTR-зависимой секреции хлорида при некоторых респираторных заболеваниях (Lambert et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 2014, vol. 50, p. 549-558; Liu et al, J. Pharmacol Exp Ther., 2005, vol. 314, p. 846-854), никогда нельзя было показать, что ингибиторы PDE4 в целом могут способствовать активации белка CFTR. Более того, исходя из результатов предшествующего уровня техники, обычно нельзя было ожидать, что ингибирование одних только ингибиторов PDE вылечит муковисцидоз, в частности, скорректирует присутствие белка CFTR или его отображения на поверхности клетки (Blanchard et al., 2014, FASEB J., vol. 28, p. 791-801).
CFTR
Несмотря на вышесказанное, в некоторых вариантах осуществления изобретения соединение, соответствующее общей формуле (I), для применения в соответствии с настоящим изобретением действительно обладает ингибирующей активностью в отношении PDE4. Не желая связываться с какой-либо конкретной теорией, однако предусматривается, что ингибирование PDE4 не является необходимым и/или недостаточным для объяснения механизма действия соединения общей формулы (I) на мутантный белок CFTR в подгруппе пациентов, подлежащих лечению, особенно при коррекции CFTR. В частности, понятно, что ингибирующая активность по отношению к PDE4 не может полностью объяснить наблюдаемую коррекцию присутствия мутантного CFTR, кодируемого геном , имеющим по меньшей мере одну мутацию, согласно настоящему изобретению.
Выводы авторов настоящего изобретения весьма удивительны в свете предшествующего уровня техники: когда ингибиторы PDE4 были предварительно испытаны и оценены на предмет их потенциального воздействия на клетки дикого типа и ΔF508-CFTR, было обнаружено, что только ингибиторы PDE4 вызывают минимальную активацию канала; было обнаружено, что они усиливают эффекты как CFTR-корректоров, так и CFTR-потенциаторов, но ничего не было предложено для коррекции CFTR с помощью ингибиторов PDE4, не говоря уже об экспериментальных показаниях (Blanchard et al., 2014, FASEB J., vol. 28, p. 791-801).
Некоторые ингибиторы PDE4, такие как, в частности, рофлумиласт (Daxas, Takeda Pharmaceuticals, Цюрих, Швейцария), при введении людям ассоциируются с побочными эффектами, в частности с желудочно-кишечными расстройствами, такими как тошнота, диарея, боль в животе, рвота и диспепсия (Moretto et al., 2015, J. Pharmacol. Exper. Ther., 2015, vol. 352, p. 559-567). Хотя было обнаружено, что в процессе разработки настоящего изобретения известный ингибитор PDE4 рофлумиласт может играть роль в модулировании некоторых аспектов ΔF508 белка CFTR, настоящее изобретение, как конкретно заявлено, не сосредоточено на использовании рофлумиласта. В отличие от таких агентов, как рофлумиласт, соединение общей формулы (I) по настоящему изобретению характеризуется минимальными побочными эффектами при введении субъекту. Таким образом, наряду с тем, что муковисцидоз можно лечить или предотвращать у субъекта с помощью соединения по настоящему изобретению, введение такого соединения обычно не вызывает нежелательных побочных эффектов у большинства субъектов. Неблагоприятные эффекты могут возникнуть, например, в начале, при продолжении, увеличении режима приема или при прекращении лечения. Иногда неблагоприятные эффекты могут вызывать осложнения заболевания или процедуры и негативно влиять на его прогноз. Они также могут привести к несоблюдению режима лечения.
В примере 1 продемонстрировано, что некоторые агенты с известной ингибирующей активностью в отношении PDE4, в частности, соединение общей формулы (I) и рофлумиласт, обладают специфическим действием в качестве CFTR-потенциаторов. Из них соединение общей формулы (I) и рофлумиласт ассоциируются с преимущественным профилем неблагоприятного эффекта, например, у людей.
Это явное преимущество перед рофлумиластом, который, как показано в примере 1, также может корректировать уровни CFT-F508, но хорошо известно, что он связан с общими неблагоприятными эффектами у субъектов (например, у 1-10% субъектов), включая диарею, потерю веса, тошноту, головную боль, бессонницу, снижение аппетита, боль в животе, ринит, синусит, инфекцию мочевых путей и психические расстройства, включая депрессию (см., например, Daliresp: EPAR - Product Information, European Medicines Agency, Takeda GmbH, 26 September 2013).
Таким образом, в поисках агента без эффектов вне цели, который нормализует сворачивание, процесссинг и функцию мутантного CFTR, аналогично CFTR дикого типа (Rowe et al., Cold Spring Harb. Perspect. Med., 2013, vol. 3, a009761), предоставление конкретного применения соединения по настоящему изобретению для лечения или профилактики муковисцидоза у конкретных субъектов является важным достижением.
50
50
50
Хорошо установлено, что PDE4 существует в двух различных формах, представляющих различные конформации, которые были обозначены как сайт связывания с высокой аффинностью ролипрама или HPDE4, особенно присутствующей в центральной нервной системе и в париетальных клетках, и сайт связывания с низкой аффинностью ролипрама или LPDE4 (Jacobitz, et al, 1996, Mol. Pharmacol, vol. 50, p. 891-899), обнаруженной в иммунных и воспалительных клетках. Хотя обе формы проявляют каталитическую активность, они различаются по чувствительности к ингибиторам. В частности, соединения с более высокой аффинностью к LPDE4 менее склонны вызывать побочные эффекты, такие как тошнота, рвота и повышенная желудочная секреция. Следовательно, в предпочтительных вариантах осуществления изобретения соединение для применения согласно настоящему изобретению характеризуется высокой селективностью в отношении PDE4, в частности, высокой селективностью в отношении LPDE4. Действительно, в WO 2010/089107 А1 было показано, что соединения, подпадающие под общую формулу (I) настоящего изобретения, имеют превосходную селективность по LPDE4. Преимущественно, соединения по изобретению характеризуются более высокой селективностью по отношению к LPDE4, чем по отношению к HPDE4, полученной путем определения их IC. В соответствии с настоящим изобретением, IC данного агента, обладающего ингибирующей активностью в отношении PDE4, следует определять, как подробно описано в WO 2010/089107 A1. Предпочтительно, соотношение IC HPDE4/LPDE4 для соединения для применения в соответствии с настоящим изобретением составляет более 5, предпочтительно, более 10, более предпочтительно, более 20 и, наиболее предпочтительно, более 100.
Высокая селективность по PDE4 является значительным преимуществом по сравнению с ингибиторами PDE4 первого поколения, такими как ролипрам и пикламиласт, которые ассоциируются с сильными неблагоприятными эффектами, такими как тошнота и рвота и секреция желудочной кислоты, а также улучшением по сравнению с ингибиторами PDE4 второго поколения, такими как как циломиласт и рофлумиласт. Как описано в WO 2010/089107 A1, присутствие сульфонамидных заместителей в бензоатном остатке в соединении общей формулы (I) улучшает активность, и (-)энантиомер соединения общей формулы (I) является фармацевтически успешным по сравнению с соответствующими (+)энантиомерами и рацематами.
in vitro
В некоторых вариантах осуществления изобретения соединение, которое следует использовать согласно настоящему изобретению, представляет собой ингибитор фосфодиэстеразы, который преимущественно не действует в качестве ингибитора цГМФ-зависимой фосфодиэстеразы. В некоторых вариантах осуществления изобретения соединение, используемое в соответствии с настоящим изобретением, специально не ингибирует фосфодиэстеразу 5 (PDE5), то есть не является специфическим ингибитором PDE5. Таким образом, соединение по настоящему изобретению и его способ действия отличаются от известного ингибитора фосфодиэстеразы 5 (PDE5) силденафила, который ранее был изучен в исследовании  на его потенциальную двойную функцию в качестве корректора и потенциатора CFTR (Leier et al., 2012, Cell Physiol. Biochem., vol. 29, p. 77-790); однако необходимые высокие дозы агента для восстановления CFTR приводят авторов к выводу, что силденафил может не подходить в качестве терапевтического агента для лечения муковисцидоза легких. PDE5 является cGMP-зависимым, а не cAMP-зависимым.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к применению соединения, соответствующего общей формуле (I), в качестве CFTR-корректора. В предпочтительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к применению соединения, соответствующего общей формуле (I), в качестве корректора мутанта с нарушенным сворачиванием CFTR и/или мутанта процессинга CFTR.
В наиболее предпочтительном варианте осуществления соединение, которое следует использовать в соответствии с настоящим изобретением, представляет собой 1-(3-циклопропилметокси-4-дифторметоксифенил)-2-(3,5-дихлор-1-оксипиридин-4-ил)этиловый эфир 3-циклопропилметокси-4-метансульфониламинобензойной кислоты. Это соответствует соединению C2 в приведенной выше таблице; соответствующее соединение было описано ранее (Armani et al., 2014, J. Med. Chem., vol. 57, p. 793-816; Moretto et al., 2015, J. Pharmacol. Exper. Ther., 2015, vol. 352, p. 559-567), но его прямое действие на мутантный белок CFTR до сих пор не было предположено, не говоря уже об экспериментальных показаниях.
CHF 6001 в настоящее время разрабатывается для лечения хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ) и астмы. Хорошая безопасность и переносимость CHF 6001 у здоровых добровольцев уже была продемонстрирована при ежедневных дозах до 4800 мкг в течение 14 дней (Lucci et al., Eur. Resp. J., 2016, vol. 48, PA4086).
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к применению CHF6001 в качестве CFTR-корректора. В предпочтительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к применению CHF6001 в качестве корректора мутанта сворачивания CFTR и/или мутанта процессинга CFTR.
Получение соединений, используемых в настоящем изобретении
Соединение представляет собой соединение общей формулы (I), определенное в настоящем изобретении. Такие соединения, используемые в данном изобретении, и родственные соединения могут быть получены специалистом в данной области техники способами, описанными в WO 2010/089107 A1, WO 2009/018909 A2, или любым другим подходящим способом. В частности, получение соединения, соответствующего общей формуле (I), может включать синтез рацемического спирта, который подвергают конденсации с хиральной кислотой, такой как (S)-напроксен или (S)-ацетилминдальная кислота, с получением, соответственно, диастереомерной смеси, которую разделяют на два отдельных диастереоизомера, соответственно, например, с помощью хроматографии, кристаллизации или других хорошо известных способов, дающих после расщепления, соответственно, энантиомерные спирты, которые при взаимодействии с подходящей бензойной кислотой дают соединения общей формулы (I), все как подробно описано, например, в WO 2010/089107 A1. Дополнительные аспекты и примеры также описаны в WO 2010/089107 A1, и все они применимы к настоящему изобретению.
Композиции, содержащие такие соединения, также могут быть получены способами, описанными в WO 2010/089107 А1, WO 2009/018909 А2, или любым другим подходящим способом.
Композиции
В одном варианте осуществления изобретения соединение, соответствующее общей формуле (I), является по существу чистым. «По существу чистый», как используется в настоящем документе означает, что соединение по меньшей мере на более чем около 97% является хирально чистым, предпочтительно, более чем на 99% и наиболее предпочтительно, более чем на 99,9%.
Соединение, соответствующее общей формуле (I), для применения в соответствии с настоящим изобретением может быть составлено в виде фармацевтической композиции. Фармацевтическая композиция содержит соединение, описанное в настоящем документе, как пригодное для использования в настоящем изобретении, и по меньшей мере одну фармацевтически приемлемую соль, буферное вещество, консервант, носитель, разбавитель и/или нейтральное вспомогательное вещество. Термин «фармацевтически приемлемый» описывает что-то нетоксичное и/или то, что по существу не влияет на действие активного ингредиента фармацевтической композиции.
Изобретение также охватывает применение фармацевтически приемлемых гидратов, сольватов, аддитивных комплексов, неорганических или органических солей соединения, соответствующего общей формуле (I), например, соли натрия, калия и лизина.
Фармацевтическая композиция, предпочтительно, является стерильной и, необязательно, содержит один или несколько дополнительных агентов, упомянутых или не упомянутых в настоящем документе.
Возможные составы включают в себя, без ограничения, таблетки, желатиновые капсулы, капсулы, таблетки в виде капсулы, гранулы, пастилки и насыпные порошки; водные и неводные растворы, эмульсии, суспензии, сиропы и эликсиры; кремы, гели, пасты, пены, мази, линименты, лосьоны, эмульсии, суспензии, гели, пасты, порошки, спреи и капли; и трансдермальные пластыри. Ингаляционные препараты включают вдыхаемые порошки, такие как сухие порошки, содержащие пропеллент дозирующие аэрозоли или ингаляционные составы, не содержащие пропеллент. Ингаляционные препараты являются предпочтительными в настоящем изобретении для профилактики или лечения муковисцидоза в легких.
Введение
CFTR
В настоящем изобретении соединение формулы (I) вводят субъекту. В частности, все аспекты и варианты осуществления настоящего изобретения предусматривают, что соединение формулы (I) вводят субъекту, нуждающемуся в этом. Субъектом, нуждающимся в этом, является субъект, характеризующийся по меньшей мере одной мутацией в гене , которая является причиной неправильного сворачивания и/или процессинга белка CFTR, как подробно описано в данном описании.
Введение соединения для применения в соответствии с настоящим изобретением может осуществляться в соответствии с потребностями пациента, например, перорально, назально, парентерально, например, подкожно, внутривенно, внутримышечно, внутрикожно и инфузией, путем ингаляции, ректально, вагинально, местно, локально, трансдермально и путем внутриглазного введения.
Для лечения муковисцидоза дыхательных путей соединение для применения по настоящему изобретению, предпочтительно, вводят путем ингаляции. В одном варианте осуществления соединение общей формулы (I) вводят путем ингаляции. Одним из преимуществ ингаляционного пути по сравнению с системным является возможность доставки агента непосредственно в место воздействия, избегая любых системных побочных эффектов, что приводит к более быстрому клиническому ответу и более высокому терапевтическому индексу. Настоящее изобретение, в частности, относится к агентам и фармацевтическим композициям для применения путем ингаляции.
Действительно, соединения для применения согласно настоящему изобретению, такие как, в частности, CHF6001, являются оптимальными для ингаляционной доставки (Armani et al., 2014, J. Med. Chem., vol. 57, p. 793-816). Использование при вдыхании особенно успешно при лечении состояний дыхательных путей, таких как, в настоящем изобретении, муковисцидоз в дыхательных путях.
Дозировка соединения для применения в соответствии с настоящим изобретением зависит от множества факторов, включая конкретное состояние, которое нужно лечить или предотвращать, тяжесть симптомов, путь введения, частоту интервала дозирования, конкретное используемое соединение, эффективность, токсикологический профиль и фармакокинетический профиль соединения. Когда соединение по настоящему изобретению вводят субъекту путем ингаляции, доза соединения преимущественно составляет от 0,01 до 20 мг/день, предпочтительно, от 0,1 до 10 мг/день, более предпочтительно, от около 0,5 до около 5 мг/день. Хорошая безопасность и переносимость CHF 6001 у здоровых добровольцев уже была продемонстрирована при ежедневных дозах до 4,8 мг в течение 14 дней (Lucci et al., Eur. Resp. J., 2016, vol. 48, PA4086). В одном варианте осуществления изобретения соединение общей формулы (I) вводят один раз в день, но также возможен любой альтернативный режим введения.
В одном варианте осуществления изобретения соединение общей формулы (I) вводится с помощью устройства, выбранного из одно- или многодозового ингалятора сухого порошка, ингалятора отмеренных доз и ингалятора мягкого тумана.
Для введения некоторых ингаляционных препаратов, таких как, например, сухой порошок, могут быть использованы одно- или многодозовые ингаляторы, известные из уровня техники. В этом случае порошок может быть заполнен в желатиновые, пластиковые или другие капсулы, картриджи или блистерные упаковки или в резервуар. Для этой цели к порошкообразным соединениям по изобретению может быть добавлен разбавитель или носитель, обычно нетоксичный и химически инертный по отношению к соединениям по изобретению, например, лактоза или любая другая добавка, подходящая для улучшения вдыхаемой фракции.

Для введения дополнительных некоторых ингаляционных препаратов, таких как, например, ингаляционные аэрозоли, содержащие газ-вытеснитель, такой как гидрофторалканы, соединение для применения согласно настоящему изобретению может содержаться либо в растворе, либо в дисперсной форме. Составы, регулируемые пропеллентом, могут также содержать другие ингредиенты, такие как сорастворители, стабилизаторы и, необязательно, другие наполнители. Ингаляционные составы, не содержащие пропеллент, содержащие соединения по изобретению, могут быть в виде растворов или суспензий в водной, спиртовой или водно-спиртовой среде, и они могут доставляться струйными или ультразвуковыми распылителями, известными из уровня техники, или распылителями с мягким туманом, такими как Respimat.
Комбинации
Соединения по изобретению можно вводить в качестве единственного активного агента или в комбинации с одним или несколькими другими фармацевтически активными ингредиентами.
CFTR
Таким образом, в первом варианте осуществления соединение, соответствующее общей формуле (I), вводят в качестве монотерапии. Монотерапия в данном контексте означает, что дополнительные терапевтические агенты, то есть дополнительные фармацевтически активные компоненты, отличные от соединения, соответствующего общей формуле (I), не являются частью схемы лечения, предусмотренной в соответствии с настоящим изобретением. Действительно, экспериментальные примеры по настоящему изобретению подтверждают тот факт, что, что соединение, соответствующее общей формуле (I), само по себе обладает желаемым терапевтическим эффектом, вызывающим лечение субъекта, который характеризуется по меньшей мере одной мутацией в гене , которая является причиной неправильного сворачивания и/или процессинга белка CFTR. В этом отношении действие соединений, соответствующих общей формуле (I), по настоящему изобретению заметно отличается от описанных соединений, например, в WO 2015/175773 A1 и Blanchard et al., 2014, FASEB J., vol. 28, p. 791-801.
В некоторых вариантах осуществления изобретения соединение общей формулы (I) используют или вводят в комбинации по меньшей мере с одним вторым фармацевтически активным компонентом. По меньшей мере один второй фармацевтически активный компонент, предпочтительно, не является соединением общей формулы (I). Таким образом, настоящее изобретение также относится к комбинированной терапии, по меньшей мере, с двумя агентами, где по меньшей мере один агент представляет собой соединение, соответствующее общей формуле (Ii), и по меньшей мере один агент не является соединением, соответствующим общей формуле (I). По меньшей мере два агента могут быть составлены вместе или по отдельности.
Пример 1 и пример 2 подтверждают, что комбинированное использование соединения, соответствующего общей формуле (I), по меньшей мере с одним дополнительным агентом может обеспечить терапевтический успех.
По меньшей мере один дополнительный агент конкретно не ограничен и включает низкомолекулярные агенты, а также фармацевтически активные пептиды или белки и нуклеиновые кислоты, кодирующие их, хотя некоторые агенты являются предпочтительными, как указано ниже.
В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения по меньшей мере одно второе фармацевтически активное соединение представляет собой CFTR-корректор. Указанный CFTR-корректор конкретно не ограничен и может быть выбран из всех соединений и композиций, которые обладают способностью действовать в качестве CFTR-корректоров, определенных в настоящем документе. При этом указанный CFTR-корректор, предпочтительно, представляет собой агент, который не является соединением, соответствующим общей формуле (I). В предпочтительном варианте осуществления указанный CFTR-корректор выбран из группы, включающей лумакафтор, VX-152 (Vertex Pharmaceuticals), VX-440 (Vertex Pharmaceuticals), VX-445 (Vertex Pharmaceuticals), тезакафтор (VX-661, Vertex Pharmaceuticals, см., также Rowe et al., 2017, N. Engl. J. Med., vol. 377, p. 2024-2035), VX-659 (Vertex Pharmaceuticals), FDL 169 (Flatley Discovery Lab), GLPG2222 (Galapagos), PTI-801 (Proteostasis Therapeutics), и, предпочтительно, представляет собой лумакафтор.
Во втором предпочтительном варианте осуществления изобретения второе фармацевтически активное соединение представляет собой CFTR-потенциатор. Указанный CFTR-потенциатор конкретно не ограничен и может быть выбран из всех соединений и композиций, которые обладают способностью действовать в качестве CFTR-потенциаторов, определенных в настоящем документе. Указанный CFTR-потенциатор, предпочтительно, представляет собой агент, который не является соединением, соответствующим общей формуле (I). В предпочтительном варианте осуществления указанный CFTR-потенциатор выбран из группы, включающей ивакафтор, QWB251 (в разработке компанией Novartis), VX-561 (ранее CTP-656, Vertex Pharmaceuticals), PTI-808 (Proteostasis Therapeutics), генистеин (De Stefano et al., 2014, Autophagy, vol. 10, p. 2053-2074), и, предпочтительно, представляет собой ивакафтор.
В третьем предпочтительном варианте осуществления изобретения второе фармацевтически активное соединение представляет собой усилитель CFTR. Указанный усилитель CFTR конкретно не ограничен и может быть выбран из всех соединений и композиций, которые обладают способностью действовать в качестве усилителей CFTR, как определено в настоящем документе. Указанный усилитель CFTR, предпочтительно, представляет собой агент, который не является соединением, соответствующим общей формуле (I). В предпочтительном варианте осуществления указанный CFTR-потенциатор выбран из группы, включающей PTI-CH (Molinski et al., 2017, EMBO Molecular Medicine, vol. 9, p. 1224-1243), PTI-428 (Proteostasis Therapeutics). Известно, что соединения усилители могут обеспечить дополнительное преимущество для субъектов с мутацией ΔF508 в CFTR, и настоящее изобретение обеспечивает комбинированное использование соединения общей формулы (I) и усилителя CFTR у таких и других субъектов.
В следующем предпочтительном варианте осуществления изобретения второе фармацевтически активное соединение представляет собой соединение, способное корректировать нуклеотидную последовательность мутантного белка CFTR либо на уровне ДНК (генная терапия), либо на уровне РНК. Соединением второго класса является QR-010 (ProQR Therapeutics).
В следующем предпочтительном варианте осуществления изобретения второе фармацевтически активное соединение представляет собой регулятор протеостаза, предпочтительно, выбранный из цистеамина или его фармацевтически приемлемой соли, такой как, предпочтительно, битратрат цистеамина (битартрат меркаптамина, цистагон) и галлат эпигаллокатехина (EGCG) или комбинации двух таких регуляторов протеостаза (Tosco et al., Cell Death Differentiation, 2016, vol., 23, p. 1380-1393).
В дополнительном варианте осуществления второе фармацевтически активное соединение выбрано из агентов, подходящих для лечения проявлений муковисцидоза, предпочтительно выбранных из группы антибиотиков, муколитиков, противовоспалительных агентов и водных солевых растворов, в частности, например, распыленный гипертонический раствор.
В особенно предпочтительном варианте осуществления, по меньшей мере, одно второе фармацевтически активное соединение содержит комбинацию CFTR-корректора (отличного от соединения, соответствующего общей формуле (I)) и CFTR-потенциатора (отличного от соединения, соответствующего общей формуле (I)); другими словами, для комбинированной терапии можно предусмотреть как CFTR-корректор, так и CFTR-потенциатор (отличные от соединения, соответствующего общей формуле (I)). Альтернативно, для такой комбинированной терапии может использоваться усилитель CFTR.
Когда соединение, соответствующее общей формуле (I), составлено вместе по меньшей мере с одним дополнительным агентом, тогда соединение, соответствующее общей формуле (I), и по меньшей мере один дополнительный агент необязательно присутствуют в одной и той же композиции. Таким образом, все композиции, описанные в настоящем документе, могут быть составлены в виде композиций, которые содержат, в дополнение к агенту, соответствующему общей формуле (I), по меньшей мере один дополнительный агент, указанный в настоящем документе. Получение и введение соответствующих композиций входит в объем настоящего изобретения.
Альтернативно, соединение, соответствующее общей формуле (I), и по меньшей мере один дополнительный агент составляют в отдельных композициях. Это может быть уместным, например, когда предусмотрены разные пути введения и/или разные дозы для соединения, соответствующего общей формуле (I), и по меньшей мере одного дополнительного агента, соответственно, и/или когда могут этого потребовать химические свойства и/или стабильность соединения, соответствующего общей формуле (I), и по меньшей мере одного дополнительного агента. Например, в случаях, когда предполагается вводить соединение, соответствующее общей формуле (I), путем ингаляции, но по меньшей мере один дополнительный агент путем, отличным от ингаляции, являются подходящими отдельные составы или композиции. При этом настоящее изобретение явно также относится к набору частей, который включает как соединение, соответствующее общей формуле (I), так и по меньшей мере один дополнительный агент, в отдельных составах, но предусмотренных для комбинированной терапии, в одно и то же или в разных моментах времени.
В некоторых вариантах осуществления, которые явно сочетаются со всеми вышеприведенными вариантами осуществления изобретения, по меньшей мере одно второе фармацевтически активное соединение выбрано из одного или нескольких антибиотиков, которые можно вводить внутривенно, вдыхая или перорально, вместе или нет с соединением, соответствующим общей формуле (I).
Промышленная применимость
Настоящее изобретение представляет ценность для лечения пациентов с муковисцидозом. Это применимо к различным отраслям промышленности, включая химическую промышленность, фармацевтическую промышленность, другие отрасли здравоохранения, такие как, например, больницы. Это также имеет последствия для смежных отраслей, например, поскольку речь идет об упаковке и маркировке лекарств и/или диагностике пациентов (генотипирование, фенотипирование).
Примеры
Следующие примеры и фигуры предназначены для иллюстрации некоторых предпочтительных вариантов осуществления изобретения и не должны интерпретироваться для ограничения объема изобретения, который определяется формулой изобретения.
Материал и методы
Линии клеток
4
2
TM
Линия клеток эпителия бронхов человека CF (CFBE41o-), гомозиготная по мутации ΔF508 белка CFTR (Ehrhard et al., 2006, Cell Tissue Res. Vol. 323, p. 405-415; добрый подарок D. C. Gruenert, California Pacific Medical Center Research Institute, San Francisco, CA, USA) и линия эпителиальных клеток бронхов человека 16HBE14o-, дикого типа (wt) для белка CFTR (любезно предоставленная P. Davis, Case Western Reserve University School of Medicine, Cleveland, OH, USA) поддерживались в EMEM (Lonza) с добавлением 10% FBS и 1% Glutamax (Sigma). Для поляризованных монослоев CFBE41o- клетки высевали при плотности 2×10/см в колбу или в несколько лунок, предварительно покрытых раствором для покрытия фибронектином, состоящим из базальной среды LHC (Gibco, Invitrogen), 10% бычьего сывороточного альбумина (1 мг/мл), 1% бычьего коллагена I (Sigma) и человеческого фибронектина (BD Laboratories) в конечной концентрации 1 мг/мл, перед использованием фильтровали (0,22 мкМ). с помощью реагента диссоциации PET (на дату вступления в силу, имеющегося в продаже у различных коммерческих поставщиков, например, AthenaES), который содержит поливинилпирролидон, EGTA и трипсин в основе HBS.
Вещества
CHF6001, ММ 687,54
Рофлумиласт (CHF5152), ММ 403,21
CHD-051662 (VX809, лумакафтор), ММ 452,41
CHD-051663 (VX770, ивакафтор), ММ 392,49
В случае CHF6001 и рофлумиласта исходные растворы готовили, растворяя соединения в ДМСО при 5 мМ. Исходные растворы инкубировали в ультразвуковой ванне в течение 30 минут и затем выдерживали еще 30 минут при температуре 37яяяС. В случае лумакафтора и ивакафтора исходные растворы готовили, растворяя соединения в ДМСО при 5 мМ. Все исходные растворы выдерживали перед использованием при температуре -30яяяС.
Проточная цитометрия
5
CFBE41o- клетки высевали при 1,5×10 клеток/лунку в чашку с 6-лунками в среде EMEM, дополненный 10% FBS и 1 мМ L-глютамина, и выдерживали в инкубаторе при 37°C в течение ночи. На следующий день клетки обрабатывали различными агентами, как указано далее: VRT809 (5 мкМ), CHF6001 (30 нМ), рофлумиласт (50 нМ) или носитель ДМСО. Через 24 ч клетки собирали.
6
Специально для обнаружения внеклеточного домена CFTR клетки промывали PBS 1x и последовательно окрашивали моноклональным антителом против CFTR CF3 (Abcam), подходящим для обнаружения внеклеточного домена CFTR. После промывки в течение 30 минут на льду добавляли вторичное козье антимышиное антитело (μ-цепь), конъюгированное с Alexa Fluor-488 (Invitrogen, Карлсбад, США), (1 мкг на 10 клеток).
В частности, чтобы распознать C-концевую область CFTR, после обработки промывочным буфером для проницаемости согласно производителю (BioLegend) клетки инкубировали (45 минут при комнатной температуре) с поликлональным первичным кроличьим анти-CFTR антителом (Alomone Labs, Иерусалим, Израиль). Для определения вклада неспецифических взаимодействий антитело-клетка поликлональное первичное антитело кролика предварительно инкубировали с блокирующим пептидом (4 мг), соответствующим аминокислотным остаткам 1468-1480 CFTR, расположенным в C-концевом домене CFTR. В качестве вторичного антитела использовали козье антитело против IgG кролика (1,5 мг на образец), конъюгированное с Alexa Fluor (AF) 488 (Life Technologies, Карлсбад, CA).
Наконец, клетки дважды промывали и затем анализировали в анализаторе MACSQuant (Miltenyi Biotech, Кельн, Германия), а данные анализировали с помощью FlowJo Software (Tree Star, Inc).
Процент событий с фоновым шумом (определяемым с помощью изотипа IgM или пептидного сигнала) вычитали, и результат выражали в виде %-ного значения CFTR-положительных клеток. Были также получены геометрические средние значения сигнала в зеленом канале и вычислено соотношение между сигналами, полученными с антителом, специфичным для внеклеточного домена CF3, и с поликлональным антителом (Alomone), соответственно, относительно базового сигнала (MFI).
Чтобы определить возможную цитотоксическую активность вышеуказанных агентов, те же обработанные агентом клетки также анализировали с использованием двойного окрашивания флуоресцентным аннексином V и йодидом пропидия (PI), в котором аннексин V-позитивные/PI-негативные клетки рассматриваются как некротические клетки. После обработки клетки собирали и инкубировали с 2,5 мкл/мл аннексина V-eFluor 450/связывающего буфера 1× (eBioscience, набор для определения апоптоза аннексина V eFluor 450) и оставляли на 10-15 мин при комнатной температуре. Затем клетки инкубировали с 1 мкл PI/300 мкл связывающего буфера и анализировали проточной цитометрией в течение 30 минут, хранили при 4°C в темноте. Сбор данных проводился с использованием MACSQuant, а данные анализировались с помощью программного обеспечения FlowJo.
HS-YFP анализ
E. coli
Активность CFTR в эпителиальных клетках оценивали с помощью желтого флуоресцентного белка (YFP) по протоколу, модифицированному по методу, опубликованному Averna et al. (PLoS One, 2013, том 8, e66089). В соответствии с Averna et al., YFP был чувствителен к галогенидам, и клетки не трансфицировали нуклеиновой кислотой, но указанный YFP, очищенный из рекомбинантного источника, добавляли к супернатантам для проведения анализа; модификация по Averna et al. конкретно касается рекомбинантного источника указанного YFP (здесь экспрессированная ).
Вестерн-блот
Клетки CFBE41 и 16HBE14, соответственно, лизировали в буфере для лизиса (50 ммоль/л Трис, 150 ммоль/л NaCl, 1 ммоль/л ЭДТА, 1% Тритон Х-100, рН 7,4), содержащем ингибиторы протеаз (Roche, Inc.). Отделяли всего 10 мкг (16HBE14o-/CFBE41o-) общего белка на полосу с использованием 7,5% (об/об) полиакриламидного электрофореза (PAGE) SDS-гелей и переносили на нитроцеллюлозные мембраны, которые исследовали с помощью моноклонального анти-CFTR антитела (Cell Signaling 2269; согласно информации, предоставленной Cell Signaling, полученной путем иммунизации кроликов синтетическим пептидом, соответствующим аминокислотным остаткам вблизи аминоконца человеческого CFTR) в разведении 1:500 в течение ночи при 4°C. Мембраны повторно зондировали моноклональным анти-актином (Sigma-Aldrich) для нормализации нагрузки белка. Относительные уровни CFTR оценивали денситометрией с использованием программы ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/). Количество полосы C (понимается как полностью гликозилированная зрелая форма CFTR)) рассчитывается как доля актина для соответствующей полосы движения и указывается как доля от общего количества (полоса C/актин). Обычно полоса C в вестерн-блоттинге указывает, что CFTR правильно свернут и обработан в аппарате Гольджи. Указанные значения выражены как среднее значение+/-SD (n=3). Наборы данных сравнивались с помощью t-теста с использованием GraphPad Prism.
Анализ трансэпителиального электрического сопротивления (TEER)
Трансэпителиальное электрическое сопротивление (TEER) является широко распространенным количественным методом для измерения целостности динамики плотного соединения в моделях клеточных культур эндотелиального и эпителиального монослоев (Srinivasan et al., 2015, J. Lab. Autom., vol. 20, p. 107-126.) Значения TEER, указанные в Омах, являются хорошими показателями целостности клеточных барьеров, например, до оценки агентов на клеточном барьере. Измерения TEER могут выполняться в режиме реального времени без повреждения клетки. Таким образом, экспериментально определенный TEER клеточного монослоя является количественной мерой целостности барьера, а также мерой его проницаемости для ионов. Установка для измерения TEER, как описано в настоящем документе, состоит из клеточного монослоя, культивируемого на полупроницаемой фильтрующей вставке (Costar Transwell, Corning, США, 12 мм вставка, полиэфирная мембрана 0,4 мкм), которая определяет разделение для апикального и базолатерального компартментов. Поверхности вставки были покрыты раствором для покрытия из фибронектина. Для электрических измерений используются два электрода, один из которых расположен в верхнем отсеке, а другой в нижнем, и электроды разделены клеточным монослоем. Омическое сопротивление рассчитывается по закону Ома как отношение напряжения и тока; подается сигнал напряжения переменного тока (переменного тока) с прямоугольной формой волны. В системе измерения TEER, известной как эпителиальный вольтметр (EVOM; World Precision Instruments, Сарасота, Флорида), использовалась прямоугольная переменная волна с частотой 12,5 Гц. EVOM и его использование показаны на фиг. 7. В системе EVOM имеется диапазон измерения 1-9999 Ω с разрешением 1 Ω и используется пара электродов, известная как пара электродов STX2/«стержень». Каждый стержень пары электродов (шириной 4 мм и толщиной 1 мм) содержит слой серебра/хлорида серебра для измерения напряжения и серебряный электрод для пропускания тока. Процедура измерения включает в себя измерение сопротивления холостого хода (RBLANK) только полупроницаемой мембраны (без клеток) и измерение сопротивления через слой клеток на полупроницаемой мембране (RTOTAL). Удельное сопротивление клетки (RTISSUE) в единицах Ω можно получить в виде:
ТКАНЬ
ВСЕГО
КОНТРОЛЬ
R(Ω)=R-R
2
Значения TEER приводятся в единицах Ω*см и рассчитываются как:
ОПРДЕЛЕННЫЙ
ТКАНЬ
2
TEER= (Ω)*MAREA(см)
Для анализа TEER клетки выращивали за 3-7 дней до экспериментов, и среду меняли два раза в неделю. Некоторые клетки подвергались воздействию агентов следующим образом: либо ингибитор CFTRinh-172 (40 мкМ), либо активаторы CFTR: IBMX (100 мкМ) и форсколин (10 мкМ), VRT 770 (5 мкМ), либо ингибитор ENaC амилорид (200 мкМ) или один из следующих агентов: CHF6001 (30 нМ) или рофлумиласт (50 нМ). Контроли подвергали воздействию ДМСО (1:1000). Агенты добавляли в среду апикально и базально, а TEER измеряли через 10, 30 и 60 минут.
Иммунофлюоресценция
4
Клетки CFBE41o- и 16HBE14o-, соответственно, высевали на предметное стекло и после воздействия агента или носителя дважды промывали PBS 1× и фиксировали параформальдегидом 4% (PFA) в течение 30 минут и хранили в PBS 1× при 4яяяС перед иммуноокрашиванием. Фиксированные клетки дважды промывали PBS 1× и обрабатывали в течение 3 минут 50 нМ NHCl при комнатной температуре, чтобы погасить альдегидную группу. После еще одного этапа промывания клетки пронизывали TRITON X100 0,1% в течение 5 минут и блокировали раствором 1% BSA в течение 30 минут. Антитело против CFTR M3A7, выращенное против эпитопа, соответствующего остаткам 1197-1480 человеческого CFTR (Санта-Крус), добавляли при разведении 1:100 в течение 1 часа, затем клетки окрашивали вторичным антителом против IgG1 488 (1:1000, Санта-Крус) и родамин фаллоидином (1:500) в течение еще одного часа. Наконец, клетки подвергали окрашиванию DAPI (Sigma Aldrich) (1:2000) в течение 1 часа при комнатной температуре, затем предметные стекла анализировали с помощью микроскопа Leica DM6000M с 40-кратным объективом. Изображения были обработаны для яркости и контраста с помощью Adobe Photoshop.
Статистический анализ
Статистический анализ выполняли с помощью программного обеспечения Prism5 (GraphPad Software Inc., La Jolla, США). Односторонний анализ ANOVA использовали для сравнения средних величин между группами. Все парные сравнения были выполнены с использованием специального теста Тьюки. Порог значимости p b 0,05 был установлен для всех статистических анализов.
Пример 1: CFTR потенцирующий активность CHF6001
Потенциальное влияние различных агентов на активность CFTR в клетках CFBE41o анализировали с помощью анализа HS-YFP, комбинируя короткое воздействие (10 минут) с агентами следующим образом: CHF6001, рофлумиласт или VRT 770 (5 мкМ), отдельно или в комбинации с предварительной обработкой CFTR VRT809 (5 мкМ) в течение 24 часов. Для концентрации используемых агентов см. фиг. 1.
Результаты показаны на фиг. 1. Эти результаты демонстрируют значительную способность обоих агентов стимулировать активность CFTR.
Следует отметить, что после коррекции CFTR CFTR-корректором VRT809 CHF6001 восстанавливал активность CFTR в клетках CFBE41 до уровней, сопоставимых с эталонным соединением VRT 770.
С помощью анализа TEER, показанного на фиг. 2, функциональность апикальных каналов, присутствующих в клетках, определяют путем измерения потока ионов через эпителий в разные моменты времени. Сопротивление уменьшается в зависимости от увеличения количества ионов, которые проходят мембрану через каналы в единицу времени. Чтобы проверить способность CHF6001 и рофлумиласта действовать непосредственно на канал CFTR, анализ TEER был проведен с этими агентами на 16HBE14o- бронхиальных эпителиальных клетках (BEC), выращенных на границе раздела жидкость-жидкость.
+
Как показано на фиг. 2А, влияние различных агентов было протестировано на 16HBE14o- клетках, обработанных в течение 10, 30 и 60 минут, соответственно, CFTR-ингибиторами или амилоридом (ингибитор Na канала). Как и ожидалось, было зарегистрировано увеличение эпителиального сопротивления из-за уменьшенного потока ионов через эпителий. Напротив, CFTR-потенциатор ивакафтор (VRT 770) и IBMX плюс форсколин вызывали значительное снижение трансэндотелиального электрического сопротивления, которое, по оценкам, составило 60-70% по сравнению с контролем.
2
Как показано на фигуре 2B, агенты CHF6001 (30 нМ) и рофлумиласт (50 нМ) были протестированы на 16HBE14o- клетках в разные моменты времени. Значения трансэпителиального электрического сопротивления (Ом/см) были нормализованы до значений ДМСО (установлено на 100%). Измерения проводили через 10, 30 и 60 минут после воздействия соответствующего агента(ов). Ивакафтор (VRT 770), CHF6001 (CHF) и рофлумиласт (ROFL) оказались способными снизить электрическое сопротивление во всех испытанных экспериментальных условиях. Эти данные подтверждают данные, полученные с помощью анализа HS-YFP, и подтверждают роль CHF6001, а также рофлумиласта в качестве CFTR-потенциаторов.
Таким образом, этот пример подтверждает, что соединение общей формулы (I) (CHF6001) обладает потенцирующей активностью в отношении ΔF508 CFTR CF50 50F508.
Пример 2: Активность CFTR-корректора CHF6001
Потенциальную корректирующую активность рофлумиласта и соединения общей формулы (I) (CHF6001) оценивали в сравнении с известным корректором CFTR VRT809 в линии эпителиальных клеток бронхов человека CFBE41o- (гомозиготной по мутации ΔF508 белка CFTR) с помощью анализа HS-YFP (фигура 3). Для концентраций используемых агентов см. фиг. 3. Удивительно, но и рофлумиласт, и CHF6001 индуцировали активность CFTR до уровня, равного или превышающего VRT809. Было проверено, может ли восстановление активности CFTR в линии эпителиальных клеток бронхов человека CFBE41o- (гомозиготной по мутации ΔF508 белка CFTR) помощью рофлумиласта и CHF6001, соответственно, быть связано с восстановлением присутствия CFTR на поверхности клетки. Для сравнения был использован известный CFTR-корректор VRT809. Концентрации используемых агентов см. на фиг. 4. Присутствие CFTR оценивали с помощью проточной цитометрии с использованием двух разных антител, которые нацелены на внеклеточный (CF3) и внутриклеточный (Alomone) эпитопы CFTR. Интересно, что как CHF6001, так и рофлумиласт оказались способными восстанавливать присутствие эпитопов CFTR на клетках CFBE41 после 24 часов лечения. Примечательно, что наблюдаемое восстановление сравнимо с тем, которое наблюдалось с контрольным соединением VX809 (см. фиг. 4).
Общее присутствие белка CFTR также проверяли, подвергая человеческую линию эпителиальных клеток бронхов CFBE41o- (гомозиготную по мутации ΔF508 белка CFTR) воздействию рофлумиласта, VRT809 и CHF6001 (для концентраций: см. фиг. 5), соответственно, а затем клеточному лизису, гель-электрофорезу и вестерн-блоту. Вестерн-блот анализ клеточных лизатов и количественная оценка общей интенсивности сигнала в процентах, подтверждающая повышающую регуляцию белка CFTR, показана на фиг. 5.
+/+
CFTR
Таким образом, этот пример вместе с примером 1 подтверждают, что соединение общей формулы (I) (CHF6001) обладает активностью как потенциатора, так и корректора в клетках, характеризующихся генотипом CFTR F508del (то есть мутация ΔF508 на обоих аллелях гена ).
Краткое описание фигур
Фиг. 1
+/+
CFTR
: Активность CFTR-потенциатора оценивалась в клетках CFBE41o- (характеризуемых генотипом CFTR F508del (то есть мутация ΔF508 на обоих аллелях гена )) и выражалась в виде дельта-флуоресценции между нестимулированными и стимулированными клетками после короткого воздействия (10 минут) к CHF6001, рофлумиласту или VRT770 в разных концентрациях по отдельности или после предварительной инкубации (24 ч) с VRT809.
Значения являются средними значениями±SEM (n=4). **p≤0,02 *p≤0,05 t-тест (ДМСО в сравнении с обработкой).
Фиг. 2
: A: TEER был выполнен после воздействия на 16HBE14 бронхиальные эпителиальные клетки CFTR-ингибитором (CFTR-inh 172, 40 мкМ), форсколином (10 мкМ)+IBMX (100 мкМ), амилоридом (200 мкМ) или VRT 770 (ивакафтор, 5 мкМ).
2
B: CHF6001 (30 нМ), Рофлумиласт (50 нМ) или VRT770 были испытаны на клетках 16HBE14o- в разные моменты времени. Значения трансэпителиального электрического сопротивления (Ом/см) 16HBE14o- были нормализованы до значений ДМСО (установлено на 100%). Измерения проводили через 10, 30 и 60 минут после воздействия агента(ов).
Значения являются средними значениями±SEM (n=3). **p≤0,02 *p≤0,05 t-тест (ДМСО в сравнении с обработкой).
Фиг. 3
. Активность CFTR-корректора оценивали в эпителиальной клеточной линии CFBE41 после 24-часового воздействия CFTR-корректора VRT809 (5 мкМ), CHF6001 и рофлумиласта в указанных дозах.
Значения нормализовали для общего содержания клеток и выражали как среднее значение±SEM (n=4) *p≤0,05 t-тест (в сравнении с ДМСО).
Фиг. 4
. Присутствие CFTR в линиях эпителиальных клеток бронхов человека 16HBE14o- (не CF) и CFBE41o- (ΔF508/ΔF508) оценивали с помощью проточной цитометрии после 24-часового воздействия CFTR-корректора VRT809 (5 мкМ) в сравнении с двумя соединениями CHF6001 (30 нМ) или рофлумиластом (50 нМ). Проточную цитометрию проводили после трипсин-опосредованного отделения клеток от культуральной чашки с использованием двух разных антител, которые нацелены на внеклеточный (CF3) и внутриклеточный (Alomone) эпитопы CFTR. Процент CFTR-положительных клеток уже был вычтен из событий, определяемых изотипным или пептидным сигналом IgM. Значения являются средними значениями±SEM (n=4). **p≤0,02 *p≤0,05 t-тест (ДМСО в сравнении с обработкой/16HBE14o- в качестве эталона без CF). Например, столбик в левой части фиг. 4 показывает, что около 30% клеток оказались позитивными в отношении окрашивания антителами.
Фиг. 5
. Присутствие CFTR оценивали с помощью вестерн-блоттинга в линиях эпителиальных клеток бронхов человека 16HBE14o- (не CF) и CFBE41o- (ΔF508/ΔF508) после 24-часового воздействия CFTR-корректора VRT809 (5 мкМ) в сравнении с двумя соединениями CHF6001 и рофлумиластом.
Вверху: среднее из нескольких экспериментов; относительные уровни CFTR были оценены денситометрией с использованием программы ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/). Нативное количество полосы С рассчитывается как доля актина для соответствующей полосы движения и представляется как доля от общего количества (полоса С/актин). Указанные значения выражены в виде среднего значения+/-SEM (n=3). Наборы данных сравнивались с помощью t-теста с использованием GraphPad Prism. *p≤0,05 t-тест (в сравнении с ДМСО). % присутствия CFTR установлен на 100 в клетках 16HBE14o- (то есть в клетках без CF).
Внизу: вестерн-блот одного показательного эксперимента.
Фиг. 6
: Иммунофлуоресцентное окрашивание, выполненное на клетках CFBE41o-, обработанных в течение 24 часов VX809+VX770, CHF6001 и рофлумиластом при различных концентрациях или в несущей среде (ДМСО). Оба ингибитора PDE4 увеличивают присутствие CFTR (один показательный из n=3 экспериментов).
Фиг. 7
: Вольтметр, используемый в примерах, описанных в настоящем документе.
Фиг. 8
: Аминокислотная последовательность белка CFTR человека (1480 аминокислот). Учетный номер P13569, версия P13569.3, источник данных UniProtKB: локус CFTR_HUMAN
Фенилаланин 508 отмечен выделением.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  Chiesi Famaceutici Spa
<120>  ПРИМЕНЕНИЕ ПРОИЗВОДНЫХ 1-ФЕНИЛ-2-ПИРИДИНИЛАЛКИЛОВОГО СПИРТА ПРИ
ЛЕЧЕНИИ МУКОВИСЦИДОЗА
<130>  1786PCT
<160>  1
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  1480
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  1
Met Gln Arg Ser Pro Leu Glu Lys Ala Ser Val Val Ser Lys Leu Phe
1               5                   10                  15
Phe Ser Trp Thr Arg Pro Ile Leu Arg Lys Gly Tyr Arg Gln Arg Leu
20                  25                  30
Glu Leu Ser Asp Ile Tyr Gln Ile Pro Ser Val Asp Ser Ala Asp Asn
35                  40                  45
Leu Ser Glu Lys Leu Glu Arg Glu Trp Asp Arg Glu Leu Ala Ser Lys
50                  55                  60
Lys Asn Pro Lys Leu Ile Asn Ala Leu Arg Arg Cys Phe Phe Trp Arg
65                  70                  75                  80
Phe Met Phe Tyr Gly Ile Phe Leu Tyr Leu Gly Glu Val Thr Lys Ala
85                  90                  95
Val Gln Pro Leu Leu Leu Gly Arg Ile Ile Ala Ser Tyr Asp Pro Asp
100                 105                 110
Asn Lys Glu Glu Arg Ser Ile Ala Ile Tyr Leu Gly Ile Gly Leu Cys
115                 120                 125
Leu Leu Phe Ile Val Arg Thr Leu Leu Leu His Pro Ala Ile Phe Gly
130                 135                 140
Leu His His Ile Gly Met Gln Met Arg Ile Ala Met Phe Ser Leu Ile
145                 150                 155                 160
Tyr Lys Lys Thr Leu Lys Leu Ser Ser Arg Val Leu Asp Lys Ile Ser
165                 170                 175
Ile Gly Gln Leu Val Ser Leu Leu Ser Asn Asn Leu Asn Lys Phe Asp
180                 185                 190
Glu Gly Leu Ala Leu Ala His Phe Val Trp Ile Ala Pro Leu Gln Val
195                 200                 205
Ala Leu Leu Met Gly Leu Ile Trp Glu Leu Leu Gln Ala Ser Ala Phe
210                 215                 220
Cys Gly Leu Gly Phe Leu Ile Val Leu Ala Leu Phe Gln Ala Gly Leu
225                 230                 235                 240
Gly Arg Met Met Met Lys Tyr Arg Asp Gln Arg Ala Gly Lys Ile Ser
245                 250                 255
Glu Arg Leu Val Ile Thr Ser Glu Met Ile Glu Asn Ile Gln Ser Val
260                 265                 270
Lys Ala Tyr Cys Trp Glu Glu Ala Met Glu Lys Met Ile Glu Asn Leu
275                 280                 285
Arg Gln Thr Glu Leu Lys Leu Thr Arg Lys Ala Ala Tyr Val Arg Tyr
290                 295                 300
Phe Asn Ser Ser Ala Phe Phe Phe Ser Gly Phe Phe Val Val Phe Leu
305                 310                 315                 320
Ser Val Leu Pro Tyr Ala Leu Ile Lys Gly Ile Ile Leu Arg Lys Ile
325                 330                 335
Phe Thr Thr Ile Ser Phe Cys Ile Val Leu Arg Met Ala Val Thr Arg
340                 345                 350
Gln Phe Pro Trp Ala Val Gln Thr Trp Tyr Asp Ser Leu Gly Ala Ile
355                 360                 365
Asn Lys Ile Gln Asp Phe Leu Gln Lys Gln Glu Tyr Lys Thr Leu Glu
370                 375                 380
Tyr Asn Leu Thr Thr Thr Glu Val Val Met Glu Asn Val Thr Ala Phe
385                 390                 395                 400
Trp Glu Glu Gly Phe Gly Glu Leu Phe Glu Lys Ala Lys Gln Asn Asn
405                 410                 415
Asn Asn Arg Lys Thr Ser Asn Gly Asp Asp Ser Leu Phe Phe Ser Asn
420                 425                 430
Phe Ser Leu Leu Gly Thr Pro Val Leu Lys Asp Ile Asn Phe Lys Ile
435                 440                 445
Glu Arg Gly Gln Leu Leu Ala Val Ala Gly Ser Thr Gly Ala Gly Lys
450                 455                 460
Thr Ser Leu Leu Met Val Ile Met Gly Glu Leu Glu Pro Ser Glu Gly
465                 470                 475                 480
Lys Ile Lys His Ser Gly Arg Ile Ser Phe Cys Ser Gln Phe Ser Trp
485                 490                 495
Ile Met Pro Gly Thr Ile Lys Glu Asn Ile Ile Phe Gly Val Ser Tyr
500                 505                 510
Asp Glu Tyr Arg Tyr Arg Ser Val Ile Lys Ala Cys Gln Leu Glu Glu
515                 520                 525
Asp Ile Ser Lys Phe Ala Glu Lys Asp Asn Ile Val Leu Gly Glu Gly
530                 535                 540
Gly Ile Thr Leu Ser Gly Gly Gln Arg Ala Arg Ile Ser Leu Ala Arg
545                 550                 555                 560
Ala Val Tyr Lys Asp Ala Asp Leu Tyr Leu Leu Asp Ser Pro Phe Gly
565                 570                 575
Tyr Leu Asp Val Leu Thr Glu Lys Glu Ile Phe Glu Ser Cys Val Cys
580                 585                 590
Lys Leu Met Ala Asn Lys Thr Arg Ile Leu Val Thr Ser Lys Met Glu
595                 600                 605
His Leu Lys Lys Ala Asp Lys Ile Leu Ile Leu His Glu Gly Ser Ser
610                 615                 620
Tyr Phe Tyr Gly Thr Phe Ser Glu Leu Gln Asn Leu Gln Pro Asp Phe
625                 630                 635                 640
Ser Ser Lys Leu Met Gly Cys Asp Ser Phe Asp Gln Phe Ser Ala Glu
645                 650                 655
Arg Arg Asn Ser Ile Leu Thr Glu Thr Leu His Arg Phe Ser Leu Glu
660                 665                 670
Gly Asp Ala Pro Val Ser Trp Thr Glu Thr Lys Lys Gln Ser Phe Lys
675                 680                 685
Gln Thr Gly Glu Phe Gly Glu Lys Arg Lys Asn Ser Ile Leu Asn Pro
690                 695                 700
Ile Asn Ser Ile Arg Lys Phe Ser Ile Val Gln Lys Thr Pro Leu Gln
705                 710                 715                 720
Met Asn Gly Ile Glu Glu Asp Ser Asp Glu Pro Leu Glu Arg Arg Leu
725                 730                 735
Ser Leu Val Pro Asp Ser Glu Gln Gly Glu Ala Ile Leu Pro Arg Ile
740                 745                 750
Ser Val Ile Ser Thr Gly Pro Thr Leu Gln Ala Arg Arg Arg Gln Ser
755                 760                 765
Val Leu Asn Leu Met Thr His Ser Val Asn Gln Gly Gln Asn Ile His
770                 775                 780
Arg Lys Thr Thr Ala Ser Thr Arg Lys Val Ser Leu Ala Pro Gln Ala
785                 790                 795                 800
Asn Leu Thr Glu Leu Asp Ile Tyr Ser Arg Arg Leu Ser Gln Glu Thr
805                 810                 815
Gly Leu Glu Ile Ser Glu Glu Ile Asn Glu Glu Asp Leu Lys Glu Cys
820                 825                 830
Phe Phe Asp Asp Met Glu Ser Ile Pro Ala Val Thr Thr Trp Asn Thr
835                 840                 845
Tyr Leu Arg Tyr Ile Thr Val His Lys Ser Leu Ile Phe Val Leu Ile
850                 855                 860
Trp Cys Leu Val Ile Phe Leu Ala Glu Val Ala Ala Ser Leu Val Val
865                 870                 875                 880
Leu Trp Leu Leu Gly Asn Thr Pro Leu Gln Asp Lys Gly Asn Ser Thr
885                 890                 895
His Ser Arg Asn Asn Ser Tyr Ala Val Ile Ile Thr Ser Thr Ser Ser
900                 905                 910
Tyr Tyr Val Phe Tyr Ile Tyr Val Gly Val Ala Asp Thr Leu Leu Ala
915                 920                 925
Met Gly Phe Phe Arg Gly Leu Pro Leu Val His Thr Leu Ile Thr Val
930                 935                 940
Ser Lys Ile Leu His His Lys Met Leu His Ser Val Leu Gln Ala Pro
945                 950                 955                 960
Met Ser Thr Leu Asn Thr Leu Lys Ala Gly Gly Ile Leu Asn Arg Phe
965                 970                 975
Ser Lys Asp Ile Ala Ile Leu Asp Asp Leu Leu Pro Leu Thr Ile Phe
980                 985                 990
Asp Phe Ile Gln Leu Leu Leu Ile  Val Ile Gly Ala Ile  Ala Val Val
995                 1000                 1005
Ala Val  Leu Gln Pro Tyr Ile  Phe Val Ala Thr Val  Pro Val Ile
1010                 1015                 1020
Val Ala  Phe Ile Met Leu Arg  Ala Tyr Phe Leu Gln  Thr Ser Gln
1025                 1030                 1035
Gln Leu  Lys Gln Leu Glu Ser  Glu Gly Arg Ser Pro  Ile Phe Thr
1040                 1045                 1050
His Leu  Val Thr Ser Leu Lys  Gly Leu Trp Thr Leu  Arg Ala Phe
1055                 1060                 1065
Gly Arg  Gln Pro Tyr Phe Glu  Thr Leu Phe His Lys  Ala Leu Asn
1070                 1075                 1080
Leu His  Thr Ala Asn Trp Phe  Leu Tyr Leu Ser Thr  Leu Arg Trp
1085                 1090                 1095
Phe Gln  Met Arg Ile Glu Met  Ile Phe Val Ile Phe  Phe Ile Ala
1100                 1105                 1110
Val Thr  Phe Ile Ser Ile Leu  Thr Thr Gly Glu Gly  Glu Gly Arg
1115                 1120                 1125
Val Gly  Ile Ile Leu Thr Leu  Ala Met Asn Ile Met  Ser Thr Leu
1130                 1135                 1140
Gln Trp  Ala Val Asn Ser Ser  Ile Asp Val Asp Ser  Leu Met Arg
1145                 1150                 1155
Ser Val  Ser Arg Val Phe Lys  Phe Ile Asp Met Pro  Thr Glu Gly
1160                 1165                 1170
Lys Pro  Thr Lys Ser Thr Lys  Pro Tyr Lys Asn Gly  Gln Leu Ser
1175                 1180                 1185
Lys Val  Met Ile Ile Glu Asn  Ser His Val Lys Lys  Asp Asp Ile
1190                 1195                 1200
Trp Pro  Ser Gly Gly Gln Met  Thr Val Lys Asp Leu  Thr Ala Lys
1205                 1210                 1215
Tyr Thr  Glu Gly Gly Asn Ala  Ile Leu Glu Asn Ile  Ser Phe Ser
1220                 1225                 1230
Ile Ser  Pro Gly Gln Arg Val  Gly Leu Leu Gly Arg  Thr Gly Ser
1235                 1240                 1245
Gly Lys  Ser Thr Leu Leu Ser  Ala Phe Leu Arg Leu  Leu Asn Thr
1250                 1255                 1260
Glu Gly  Glu Ile Gln Ile Asp  Gly Val Ser Trp Asp  Ser Ile Thr
1265                 1270                 1275
Leu Gln  Gln Trp Arg Lys Ala  Phe Gly Val Ile Pro  Gln Lys Val
1280                 1285                 1290
Phe Ile  Phe Ser Gly Thr Phe  Arg Lys Asn Leu Asp  Pro Tyr Glu
1295                 1300                 1305
Gln Trp  Ser Asp Gln Glu Ile  Trp Lys Val Ala Asp  Glu Val Gly
1310                 1315                 1320
Leu Arg  Ser Val Ile Glu Gln  Phe Pro Gly Lys Leu  Asp Phe Val
1325                 1330                 1335
Leu Val  Asp Gly Gly Cys Val  Leu Ser His Gly His  Lys Gln Leu
1340                 1345                 1350
Met Cys  Leu Ala Arg Ser Val  Leu Ser Lys Ala Lys  Ile Leu Leu
1355                 1360                 1365
Leu Asp  Glu Pro Ser Ala His  Leu Asp Pro Val Thr  Tyr Gln Ile
1370                 1375                 1380
Ile Arg  Arg Thr Leu Lys Gln  Ala Phe Ala Asp Cys  Thr Val Ile
1385                 1390                 1395
Leu Cys  Glu His Arg Ile Glu  Ala Met Leu Glu Cys  Gln Gln Phe
1400                 1405                 1410
Leu Val  Ile Glu Glu Asn Lys  Val Arg Gln Tyr Asp  Ser Ile Gln
1415                 1420                 1425
Lys Leu  Leu Asn Glu Arg Ser  Leu Phe Arg Gln Ala  Ile Ser Pro
1430                 1435                 1440
Ser Asp  Arg Val Lys Leu Phe  Pro His Arg Asn Ser  Ser Lys Cys
1445                 1450                 1455
Lys Ser  Lys Pro Gln Ile Ala  Ala Leu Lys Glu Glu  Thr Glu Glu
1460                 1465                 1470
Glu Val  Gln Asp Thr Arg Leu
1475                 1480
<---