СТАБИЛЬНОЕ ПОЛУЧЕНИЕ ЛЕНТИВИРУСНЫХ ВЕКТОРОВ

1. Способ получения стабильной линии пакующих лентивирусы клеток, включающий в себя:
i) получение гибридного вектора (A), содержащего бакуловирусный остов, содержащий кассету интеграции, фланкированную ITR AAV, включающую в себя две кассеты экспрессии, при этом первая кассета экспрессии кодирует лентивирусные гены gag и pol, а вторая кассета экспрессии кодирует лентивирусный rev и селектируемый маркер; и
ii) получение экспрессирующей плазмиды (B), содержащей открытую рамку считывания rep AAV под контролем промотора;
iii) трансфекцию клеток экспрессирующей плазмидой B и затем инфекцию клеток гибридным вектором A;
iv) культивирование клеток в присутствии антибиотика для селекции;
v) получение клеток, стабильно экспрессирующих белки gag, pol и rev;
vi) интеграцию гена env в клетки;
vii) культивирование клеток для получения клеточной линии, стабильно экспрессирующей белки gag, pol rev и env.
2. Способ получения стабильной линии пакующих лентивирусы клеток, включающий в себя:
i) получение гибридного вектора (A), содержащего бакуловирусный остов, содержащий кассету интеграции, фланкированную инвертированными концевыми повторами (ITR) аденоассоциированного вируса (AAV), содержащую две кассеты экспрессии, при этом первая кассета экспрессии кодирует лентивирусные гены gag и pol, а вторая кассета экспрессии кодирует лентивирусный rev и селектируемый маркер; и
ii) получение экспрессирующей плазмиды (B), содержащей ORF rep AAV под контролем промотора;
iii) трансфекцию клеток экспрессирующей плазмидой B и затем инфекцию клеток гибридным вектором A;
iv) культивирование клеток в присутствии антибиотика для селекции;
v) получение клеток, стабильно экспрессирующих белки gag, pol и rev;
vi) интеграцию лентивирусного гена tat в такие клетки;
vii) культивирование клеток для получения клеточной линии, стабильно экспрессирующей белки gag, pol, rev и tat.
viii) интеграцию гена env в такие клетки;
ix) культивирование клеток для получения клеточной линии, стабильно экспрессирующей белки gag, pol, rev, tat и env.
3. Способ по п. 1 или 2, в котором две кассеты экспрессии гибридного вектора находятся в ориентации хвост-к-хвосту, и каждая кассета экспрессии управляется конститутивным промотором и поли-A.
4. Способ по п. 3, в котором промотор выбран из CMV, CMV IE, PGK, SV40, eF1α, SFFV и SV.
5. Способ по п. 4, в котором промотором является промотор CMV IE.
6. Способ по любому из пп. 1, 2, 4 или 5, в котором селектируемый маркер выбран из генов резистентности к гигромицину, канамицину, неомицину или зеомицину.
7. Способ по п. 6, в котором селектируемым маркером является ген резистентности к гигромицину.
8. Способ по п. 1 или 7, в котором селектируемый маркер клонируют ниже IRES.
9. Способ по любому из пп. 1, 2, 4, 5 или 7, в котором белком rep AAV является Rep78.
10. Способ по любому из пп. 1, 2, 4, 5 или 7, в котором ген env выбран из env MLV 4070, env RD114, химерного белка оболочки RD114-TR, химерного белка оболочки RD114-pro, бакуловирусного env GP64 или env GALV или их производных.
11. Способ по п. 10 в котором геном env является ген, кодирующий химерный белок оболочки RD114-TR.
12. Способ по п. 11, в котором RD114-TR интегрируют, используя лентивирусный SIN-вектор, содержащий кассету экспрессии, которая содержит от 5'- к 3'-концу промотор CMV, интрон β-глобина, содержащий элемент RRE в своей последовательности, и ORF RD114-TR.
13. Стабильная линия пакующих лентивирусы клеток, содержащих стабильно интегрированный в их геном:
i) по меньшей мере, одну копию кассеты интеграции, фланкированную ITR AAV, содержащую две кассеты экспрессии, при этом первая кассета экспрессии кодирует лентивирусные гены gag и pol, а вторая кассета экспрессии кодирует лентивирусный rev и селектируемый маркер;
ii) по меньшей мере, одну копию гена env.
14. Стабильная линия пакующих лентивирусы клеток по п. 13, в которой клетка дополнительно содержит ген tat ВИЧ-1, стабильно интегрированный в ее геном.
15. Стабильная линия пакующих лентивирусы клеток по п. 13 или 14, в которой клеткой является линия клеток человека, выбранная из HEK293, HEK293-T, HEK293-SF, TE671, HT1080 или HeLa.
16. Стабильная линия пакующих лентивирусы клеток по п. 13 или 14, в которой две кассеты экспрессии в кассете интеграции находятся в ориентации хвост-к-хвосту, и каждая кассета экспрессии управляется конститутивным промотором и поли-A.
17. Стабильная линия пакующих лентивирусы клеток по п. 16, в которой промотор выбран из CMV, CMV IE, PGK, SV40, eF1α, SFFV и RSV.
18. Стабильная линия пакующих лентивирусы клеток по любому из пп. 13, 14 или 17, в которой селектируемый маркер выбран из генов резистентности к гигромицину, канамицину, неомицину или зеомицину.
19. Стабильная линия пакующих лентивирусы клеток по любому из пп. 13, 14 или 17, в которой ген env выбран из env MLV 4070, env D114, химерного белка оболочки RD114-TR, химерного белка оболочки RD114-pro, бакуловирусного env GP64 или env GALV или их производных.
20. Стабильная линия пакующих лентивирусы клеток по любому из пп. 13, 14 или 17, в которой геном env является ген, кодирующий химерный белок оболочки RD114-TR.
21. Способ получения лентивирусных векторов, включающий в себя:
i) культивирование стабильной линии пакующих лентивирусы клеток по любому из пп. 13-20;
ii) встраивание в стабильную линию пакующих клеток вектора переноса.
22. Линия клеток-продуцентов, содержащих стабильно интегрированные в их геном:
i) по меньшей мере, одну копию кассеты интеграции, фланкированную ITR AAV, содержащую две кассеты экспрессии, при этом первая кассета экспрессии кодирует лентивирусные гены gag и pol, а вторая кассета экспрессии кодирует лентивирусный rev и селектируемый маркер;
ii) по меньшей мере, одну копию env;
iii) вектор переноса.
23. Линия клеток-продуцентов по п. 22, в которой клетка дополнительно содержит, по меньшей мере, одну копию лентивирусного гена tat, стабильно интегрированную в ее геном.
24. Линия клеток-продуцентов по п. 22 или 23, в которой клеткой является линия клеток человека, выбранная из HEK293, HEK293-T, HEK293-SF, TE671, HT1080 или HeLa.
25. Линия клеток-продуцентов по п. 22 или 23, в которой две кассеты экспрессии в гибридном векторе находятся в ориентации хвост-к-хвосту, и каждая кассета экспрессии управляется конститутивным промотором и поли-A.
26. Линия клеток-продуцентов по п. 25, в которой промотор выбран из CMV, CMV IE, PGK, SV40, eF1α, SFFV и RSV.
27. Линия клеток-продуцентов по любому из пп. 22, 23 или 26, в которой селектируемый маркер выбран из гена резистентности к гигромицину, канамицину, неомицину или зеомицину.
28. Линия клеток-продуцентов по любому из пп. 22, 23 или 26, в которой ген env выбран из env MLV 4070, env RD114, химерного белка оболочки RD114-TR, химерного белка оболочки RD114-pro, бакуловирусного env GP64 или env GALV или их производных.
29. Линия клеток-продуцентов по любому из пп. 22, 23 или 26, в которой геном env является ген, кодирующий химерный белок оболочки RD114-TR.
30. Способ получения лентивирусных векторов, включающий в себя:
i) культивирование линии клеток-продуцентов по любому из пп. 22-30.