СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СРЕДСТВА ДЛЯ ЗАЩИТЫ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ КУЛЬТУР
METHOD OF PRODUCING AGENT FOR PROTECTING AGRICULTURAL CROPS

Изобретение относится к сельскому хозяйству и может быть использовано в борьбе с болезнями растений.
Потери урожая при бактериальных патогенезах, вызываемых различными видами Erwinia, Xanthomonas, Clavibacter и другими фитопатогенами, могут достигать 20-50%. Не меньший урон овощеводству, особенно открытого грунта, наносят фитоплазменные заболевания, возбудители которых относятся к семействам Acholeplasmatacea и Spirosplasmatacea. Возбудители фитоплазменных болезней заселяют клетки проводящей системы растений. Продукты жизнедеятельности патогена приводят к дегенеративным изменениям растения хозяина, нарушается система его питания, приводя к карликовости, хлорозу, редукции цветка, цветки часто оказываются стерильными, наступает преждевременная гибель растений.
Особенно подвержены фитоплазменным заболеваниям томаты. Заболевание томатов, известное под названием столбур, широко распространено в южных областях нашей страны: Волгоградской, Астраханской областях, Краснодарском крае и др. Кроме томатов от фитоплазменных заболеваний страдают перцы, баклажаны, картофель.
Для защиты растений от заболеваний, вызываемых фитопатогенными бактериями, описан ряд препаратов микробиологического синтеза, представляющих собой либо живые культуры, либо высушенные культуральные жидкости, содержащие биологически активные вещества. Известны патенты, в которых описываются культуры микроорганизмов, способы их культивирования, способы получения препаративных форм препаратов и способы их применения (например, RU 2313941; RU 2322060).
Известен микробиологический препарат, образуемый культурой Streptomyces griseus, получивший название фитолавин (патенты RU 2144291; RU 2324351). Препарат, получаемый на основе Streptomyees griseus, обладает высокой антибактериальной эффективностью в отношении таких фитопатогенных заболеваний, как Erwinia earotovora (черная ножка), Erwinia earotovora subsp. atroseptiea, Clavibaeter miehiganensis (кольцевая гниль), Ralstonia solanaeearum (бурая гниль), Agrobaeterium tumefaeiens (рак плодовых культур), Xanlhomonas eampestris (черная гниль томатов) и многих других. Фитолавин нашел широкое применение для защиты овощных культур открытого и закрытого грунта, картофеля, злаковых культур, ягодных кустарников, цветов и ряда других сельскохозяйственных культур от различных болезней бактериального и грибного происхождения. Однако препарат на основе Streptomyees griseus не обладает эффективностью в отношении фитоплазменных заболеваний.
Целью и задачей настоящего изобретения является создание препарата, обеспечивающего защиту растений от бактериальных и фитоплазменных инфекций.
Продуцент препарата - штамм Streptomyees fradiae ВНИИСХМ-53 (патент RU 2057180, 1996) получен в результате обработки суспензии спор музейной культуры Str. fradiae тормозным короткоимпульсным облучением с последующим торможением репаративных процессов и ступенчатым отбором активных вариантов. Штамм Streptomyees fradiae ВНИИСХМ-53 характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиологическими признаками.
Микроморфологические признаки. Культура имеет неспиральные спороносцы, расположенные монодиально.
Макроморфологические и культуральные признаки штамма
Минеральный агар 1 (Гаузе-1) (28ºС; pH 7,2-7,4; возраст 21 день). Образует плоские колонии с ровными краями белого цвета. Обратная сторона кремовая. Спороношение умеренное. Пигмент в среде не обнаружен.
Овсяная среда (28ºС; pH 7,2; возраст 21 день). Образует плоские колонии белого цвета с неровными краями. Обратная сторона желтого цвета. Спороношение умеренное. Пигмент не выделяется.
Органическая среда - 2 (Гаузе-2) (28ºС; pH 7,0-7,2; возраст 21 день). Образует плоские колонии белого цвета с неровными краями. Обратная сторона желтого цвета. Спороношение умеренное. Пигмент в среде не обнаружен.
Глицерин-аспарагиновая среда (28ºС; pH 7,0-7,4; возраст 21 день). Колоний не обнаружено.
Физиолого-биохимические признаки. Аэроб. Температура роста 28±1ºС.
Оптимальное значение pH равняется 6,5-6,8. Максимальное накопление антибиотика наблюдается через 168-220 часов. Желатину разжижает слабо. Крахмал и казеин гидролизует. Отношение к источникам углерода: усваивает глюкозу, фруктозу, маннит, сахарозу, мальтозу, арабинозу. Рамнозу усваивает слабо.
Характерной особенностью штамма является образование комплекса макролидных антибиотиков, основной из которых - тилозин. Макролидный комплекс обладает высокой антибактериальной активностью, подавляет рост ряда фитопатогенных бактерий Erwinia tracheiphilla - возбудитель бактериального увядания огурцов, Erwinia earotovora - возбудитель прикорневой бактериальной гнили, Pseudomonas syringae - возбудитель угловатой пятнистости огурца, Clavibacter michiganensis - возбудитель бактериального увядания томата, Pseudomonas syringae, вызывающей бактериальную крапчатость томата в открытом грунте, Xantomonas vesicatoria - возбудитель черной бактериальной пятнистости томата.
Макролидный комплекс проявляет также эффективность в отношении фитоплазменного заболевания картофеля - круглолистность картофеля и в отношении заболевания томатов - столбура.
Для получения препаративной формы подготовленный посевной материал культуры выращивают на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные компоненты. Полученную культуральную жидкость высушивали и высушенную биомассу экстрагировали этиловым спиртом для извлечения биологически активного комплекса макролидных соединений. Спиртовой экстракт концентрируют так, чтобы содержание макролидного комплекса составило 350-450 г/л. Препаративная форма предлагаемого изобретения содержит следующие компоненты, мас.%:
Макролидный комплекс
17,0-23,5
Растворители и вспомогательные вещества
до 100
Соотношение компонентов подобрано экспериментально. Использование макролидного комплекса ниже указанной величины снижает антибактериальную активность. Увеличение содержания - экономически нецелесообразно.
Средство представляет собой жидкость, смешивающуюся с водой, равномерно покрывающую рабочим раствором листовую поверхность и стебли обрабатываемых растений, эффективную против бактериальных и фитоплазменных инфекций.
Ниже приводятся примеры осуществления предлагаемого изобретения.
4
2
4
4
3
Пример 1. Споры штамма Streptomyces fradiae ВНИИСХМ-53 выращивают в течение 10 суток при температуре 28ºС на агаризированной среде следующего состава, %: мука соевая 0,5; кукурузный экстракт 1; меласса 1,5; крахмал 1,5; (NH)SO 0,15; NaCl 0,1; MgSO 0,05; CaCO 0,3 агар 2.
Кусочек агаризованной среды со спорами внесли в качалочные колбы емкостью 750 мл, содержащие 50 мл посевной среды следующего состава,%: мука соевая 2,5; глюкоза 2,5; кукурузный экстракт 1; NaCl 0,2; мел 0,5; масло соевое 0,2. Значение pH до стерилизации -7,2. Стерилизовали при 0,8 атм 40 мин.
4
4
2
4
Колбы поставили на качалку с числом оборотов 220 в минуту и выращивали инокулят при температуре 28ºС в течение 72 час. Затем инокулят в количестве 5% перенесли в колбы с ферментационной средой следующего состава, мас.%: рыбная мука 2; меласса 2; крахмал кукурузный 1,5; NaCl 0,2; MgSO 0,2; (NH)HPO 0,02; мел 0,5; масло соевое 3,0. Стерилизация при 1 атм 1 час.
3
4
4
2
4
Колбы поставили на качалку с числом оборотов 220 в минуту и выращивали инокулят при температуре 28ºС в течение 72 час. Затем инокулят в количестве 5% перенесли в колбы с ферментационной средой состава, мас.%: рыбная мука 2; меласса 2-4; крахмал картофельный 2,5; CaCO 0,5; MgSO 0,2; NaCl 0,2; (NH)HPO 0,04; масло соевое 3,0; вода водопроводная. pH до стерилизации 6,8-7,2, стерилизация при 0,8 атм 40 мин.
Ферментацию вели в течение 168-220 час при температуре 28ºС. Количество макролидного комплекса в культуральной жидкости определили спектрофотометрическим методом после экстракции фильтрата культуральной жидкости хлороформом.
Среднее содержание макролидного комплекса составило 22 г в 1 л культуральной жидкости при размахе изменчивости по данному признаку 19,0-24 г/1 л.
После окончания ферментации 10 литров культуральной жидкости высушили на распылительной сушилке. Полученную сухую биомассу экстрагировали 10 л этилового спирта для извлечения макролидного комплекса. Экстракт, отделенный от биомассы, концентрировали в роторном испарителе до объема 1-1,5 л.
Получили концентрат с содержанием макролидного комплекса 400 г/л. Для получения предлагаемого средства брали 0,5 л полученного концентрата, к которому добавляли 0,3 л триэтиленгликоля, 50 г алкилбензолсульфоната кальция, 10 г триметилсилоксана и доводили вес раствора до 1 кг водой.
Пример 2. Проверку эффективности предлагаемого средства в отношении фитопатогенных бактерий и установления минимальной подавляющей концентрации проводили in vitro методом серийных разведений. Сущность метода заключалась в следующем: в разогретую стерильную питательную среду, содержащую триптоновый агар - 3%; дрожжевой экстракт - 0,5%; глицерин - 0,3% и глюкозу - 0,3%, вносили различные количества приготовленного средства так, чтобы конечная концентрация средства составляла 0,4; 0,2; 0,1 и 0,05%. Среды тщательно перемешивали и разливали в чашки Петри. После застывания среды на агаровую поверхность наносили суспензии тест-культур. Результаты тестирования представлены в таблице 1.
Таблица 1
Установление минимальной подавляющей концентрации средства
Название тест-культуры
Содержание средства, %
0,8
0,4
0,2
0,1
0,05
Xantomonas sp.
-
-
+
++
+++
Clavibacter michiganensis
-
-
+
++
+++
- Отсутствие роста тест-культуры.
- + Рост отдельных колоний.
+++ Сплошной рост культуры.
Установленная минимальная подавляющая - 0,3% была использована при оценке эффективности средства в защите растений.
Обработку растений при бактериозах проводили в условиях стационарных овощеводческих теплиц, а также в полевых условиях путем опрыскивания растений.
Учет развития болезней проводили через 7, 14 и 21 день после обработки растений по общепринятой методике (Чумаков А.Г., Захарова Т.И. «Вредоносность болезней с/х культур». М., В.О. «Агропромиздат», 1990). Контролем служили растения без обработки.
Пример 3. Применение средства при бактериальном увядании огурца
Возбудителем заболевания является высокопатогенная бактерия Erwinia tracheiphilla. Бактериальное увядание огурца в России наносит большой ущерб урожайности и качеству продукции тепличного огурца. Заболевание проявляется в зависимости от интенсивности поражений в виде увядания отдельных листьев верхушек или даже целых растений, ускоренного пожелтения нижних листьев, появления массового количества нестандартной продукции, выделения бактериальных эксудатов.
Опыты по обработке растений предлагаемым средством проводили в очагах развития бактериоза. Зараженность растений на контрольном участке составила в первую неделю опыта 18%. Наблюдения за дальнейшим развитием болезни показали, что через 14 дней количество больных растений увеличилось и составило 27%, а через 21 день - 44%. Опрыскивание растений 0,3% рабочим раствором предлагаемого средства значительно стабилизировало развитие болезни. Уже в первую неделю после обработки биологическая эффективность составила 39%, а через две недели 55%. В дальнейшем эффективность обработки осталась на том же уровне (см. табл.2, пример 2).
Пример 4. Влияние предлагаемого средства на бактериальное увядание огурца светокультуры изучали в производственном опыте в тепличных условиях в начале второй половины вегетации. Бактериальное увядание имело вначале очаговое, а затем сплошное проявление. На начало опыта пораженность растений достигала двух-трех баллов, а развитие болезни на контрольном участке составила 18%. Через 7 дней после опрыскивания растений рабочим раствором средства снижение развития болезни не наблюдалось, но через 14 дней оно снизилось до 6 % (в контроле - 35%) и биологическая эффективность обработки составила 86% (табл.2, пример 3). Защитное действие обработок растений рабочим раствором средства сохранялось не менее 4-х недель.
Пример 5. Средство применяли при заболевании растений огурца прикорневой гнилью. Возбудитель заболевания - бактерия Erwinia carotovora. Развитие заболевания происходит обычно при отклонении условий выращивания от оптимальных, а также при стрессовых воздействиях на растения: температура в теплице ниже или значительно выше технологического уровня выращивания, суточные скачки температур, изменение режима освещенности в связи с весенним увеличением числа солнечных дней и др.
Первичные симптомы заболевания проявляются в надземной прикорневой зоне растений. В начальном этапе заболевания корневая шейка приобретает желтоватую окраску, через несколько дней краснеет, приобретая янтарную полупрозрачность, затем темнеет, становится коричневой, потом - почти черной.
Нередко на стебле наблюдается образование капель беловатого экссудата Erwinia carotovora, особенно в местах поражения аскохитозом, причем независимо от того, на какой высоте располагается поражение. При заболевании замедляется рост стебля в длину и толщину. В солнечные дни отмечается снижение тургора в тканях, начинается увядание. Итогом бактериального патогенеза данного типа является гибель растений от увядания.
Бактериоз огурца, вызываемый Erwinia carotovora наносит значительный ущерб в стационарных теплицах в период с февраля по май, с августа по октябрь, а также в пленочных теплицах в летнее время. Его эпифитотийное развитие может вызвать гибель до 80% растений, приводя в концу апреля опустошение в стационарных теплицах, уменьшая время оборота огурца на 2-3 месяца.
Работу проводили в тепличных условиях при очаговом распространении болезни. Через неделю после обработки 0,3% рабочим раствором предлагаемого средства отмечалось полуторократное снижение количества пораженных растений: у большинства растений в стебле и листьях верхушки восстановился нормальный тургор, произошло их выздоровление. Через две недели после обработки в вариантах с обработкой количество растений с симптомами заболеваний сохранялось на таком же уровне, тогда как в контроле в это время продолжалось развитие болезни. В опытном варианте нарастание болезни возобновилось только через 4 недели после обработки (табл.2, пример 4).
Биологическая эффективность предлагаемого средства против прикорневой бактериальной гнили через неделю после обработки оказалась на уровне 25%, через две недели - 50%, через три - 40%, а через четыре - 33%.
Было отмечено также значимое влияние обработок на морфологические признаки обработанных растений огурца. Обработка растений огурца предлагаемым средством стимулировала увеличение количества образующихся боковых побегов, необходимых для формирования урожая огурца: четыре недели после обработки количество побегов на обработанных растениях увеличилось в 10 раз по сравнению с контрольными растениями.
Пример 6. Применение предлагаемого средства при бактериальном увядании томата (опрыскивание)
Бактериальное увядание растений томата (бактериальный рак томата), вызываемое фитопатогенной бактерией Clavibacter michiganensis, проявляется в виде увядания растений, пятнистости плодов («птичий глаз»). Первые признаки заболевания обнаруживаются в виде увядания средней части растения, затем увядание распространяется вверх и вниз по стеблю, вызывая гибель всего растения. На стеблях черешках плодоножек нередко появляются коричневые язвочки, а при сильном развитии болезни на черешках и стеблях образуются коричневые полосы и язвы. При интенсивном развитии болезни срок активной жизни производственных посадок томата может сократиться на 1-2 месяца, а урожай плодов может снизиться на 20-45%.
Оценка влияния обработок раствором предлагаемого средства на распространение данной болезни была проведена на фоне нескольких очагов заболевания. Опрыскивание растений 0,3% раствором средства привело к уменьшению количества погибающих растений уже через неделю после обработки. Гибель наступила лишь сильно увядших растений. Через две недели после обработки очагов заболевания не было вовсе. Через три недели после обработки отмечались увядание и гибель незначительной части обработанных растений. В сравнении с необработанным контролем биологическая эффективность средства составила 78%. Через 4 недели после обработки число погибших растений увеличилось, но было значительно меньше, чем в контроле (табл.2, пример 5).
Пример 7. Применение предлагаемого средства для защиты растений томата от бактериального увядания (подлив под корень)
Обработку растений проводили путем подлива под корень 0,3% рабочего раствора предлагаемого средства. Расход жидкости составил 0,5 л на одно растение. Эффективность средства при подливе оказалась несколько выше, чем при опрыскивании растений, хотя она проявилась с некоторым опозданием. Через 4 недели после обработки биологический эффект составил 86% (табл.2, пример).
Так, при заболеваниях посадок томата бактериальным увяданием обработка растений предлагаемым средством позволяет продлить жизнь растений на 3-4 недели.
Пример 8. Применение предлагаемого средства in vitro против культуры возбудителя круглолистности картофеля (КЛК)
В стерильные чашки Петри по горизонтальной поверхности разливают по 15 мл питательной среды, используемой для культивирования микоплазм. За основу берут бульон Эдварда с добавление 10-20% лошадиной сыворотки, 10% дрожжевого экстракта, 0,3% десятипроцентного ацетата таллия, 1,3% агара в количестве от общего объема питательной среды и пенициллина 1000 ед. на 1 мл среды. Чашки подсушивают 20-30 мин при комнатной температуре. Поверхность застывшей среды засевают 1 мл суточной бульонной культурой КЛК. Суспензию распределяют равномерно по поверхности чашек, удаляя избыток путем отсасывания пипеткой. Чашки вновь подсушивают 10-15 мин и в стерильных условиях на поверхность засеянной среды пинцетом раскладывают диски, пропитанные растворами, содержащими следующие концентрации средства: 0,25%; 0,05%; 0,01%; 0,002% и контроль (вода). Чашки помещали в термостат при температуре 28ºС на 2-е суток. На чашках наблюдается зона задержки роста фитоплазмы вокруг дисков, во всех случаях кроме контроля.
Пример 9. Применение предлагаемого средства для обработки растений барвинка, инфицированных культурой фитоплазмы круглолистности картофеля
12 растений барвинка заражают возбудителем круглолистности картофеля путем прививок. В качестве привоя используют больные растения барвинков, на которые заболевание передано с табака и картофеля с помощью повилики.
Через две недели после прививок 10 растений опрыскивают раствором средства 0,25%. Норма расхода - 10 мл жидкости на 1 растение. Контрольные растения 2 не подвергаются обработке. Всего проводят семь обработок через 4-5 дней. В течение периода обработок на опытных растениях не наблюдаются симптомы микоплазмов, в контроле за это время отмечают явления начинающегося хлороза. Таким образом, действие средства проявляется в торможении размножения фитомикоплазмы КЛК. На опытных растениях внешние признаки заболевания появляются лишь через 1-1,5 месяца после прекращения обработок растений.
Пример 10. Применение предлагаемого средства для обработки посадок томата в полевых условиях в одном из хозяйств Краснодарского края. Обработка средством проводилась в сравнении с обработкой растений водой.
2
Для опыта были выделены два участка посадок томата по 100 м: 1-й участок - контрольный, обработка водой; 2-й участок - опытный, обрабатывали 0,3% рабочим раствором предлагаемого средства; расходование жидкости - из расчета 1000 л/га.
Заболевание столбуром проявляется во второй половине лета, в связи с чем первую обработку растений провели 1 июля. Учет распространения болезни провели 5 и 20-го июля и 5 августа. Идентификацию заболевания столбуром проводили визуально по признакам, характерным только для данного заболевания. У больных растений происходит изменение формы цветка, чашелистики увеличиваются в размерах, израстаются или утолщаются. Лепестки - с прозеленью или вообще отсутствуют. Завязь прорастает в мелкую зеленую ягоду. Может происходить пролиферация пестика в вегетативный побег. Плоды на заболевших растениях мелкие и не вкусные.
При первом учете, проведенном 5 июля, у большинства растений, как в контроле, так и в опыте были обнаружены первые признаки заболевания. При втором учете распространение болезни в контроле составило уже 36%, тогда как в опытном варианте - 1%. При учете, проведенном 5 августа, распространение болезни в контроле составило 70%, в опытном варианте - 10%. Продуктивность растений в опытном варианте была в два раза выше чем в контрольном.
Проведенное исследование показывает, что предлагаемое средство, получаемое на основе культуры Streptomyces fradiae ВНИИСХМ-53 и названное нами фитоплазмином, обладает высокой антибактериальной и антифитоплазменной активностью и может быть использовано для защиты овощных культур как закрытого, так и открытого грунта от болезней, вызываемых фитопатогенными бактериями и фитоплазмами.
Штамм Streptomyces fradiae ВНИИСХМ-53 для получения средств защиты растений прежде не использовался.