СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ РАКА ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ НА ОСНОВЕ АНАЛИЗА МИКРОРНК ПЛАЗМЫ КРОВИ
METHOD FOR PROSTATE CANCER DIFFERENTIAL DIAGNOSIS BASED ON PLASMA MICRORNAS ANALYSIS

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии и молекулярной биологии, и может быть использовано для дифференциальной диагностики рака предстательной железы. В плазме крови пациентов методом микрочипового анализа определяется представленность микроРНК hsa-miR-619-5p и hsa-miR-1184. При величинах экспрессии микроРНК hsa-miR-619-5p в log2-шкале более 1,25 и микроРНК hsa-miR-1184 в log2-шкале более 3,5 диагностируют рак предстательной железы. При величинах экспрессии микроРНК hsa-miR-619-5p в log2-шкале менее 1,25 и микроРНК hsa-miR-1184 в log2-шкале менее 3,5 диагностируют доброкачественную гиперплазию предстательной железы. Изобретение позволяет эффективно осуществлять дифференциальную диагностику рака предстательной железы от доброкачественной гиперплазии предстательной железы, что дает возможность начать своевременную и адекватную терапию.
Уровень техники
Ранняя диагностика рака предстательной железы (РПЖ) и дифференциальная диагностика данного состояния с доброкачественной гиперплазией предстательной железы (ДГПЖ) позволяет улучшить клинические исходы и повысить выживаемость среди больных РПЖ. ДГПЖ является распространенным заболеванием, проявляющимся в увеличении размера предстательной железы, что может оказывать значительное влияние на здоровье больного и требовать хирургического лечения. ДГПЖ может развиваться в молодом возрасте, однако заболевание чаще всего диагностируется в возрасте примерно 50 лет, когда частота развития ДГПЖ достигает 50% [М Т Lokant and R К Naz, "Presence of PSA Auto-Antibodies in Men with Prostate Abnormalities (prostate Cancer/benign Prostatic Hyperplasia/prostatitis)," Andrologia, March 2014].
Скрининг для раннего выявления РПЖ включает в себя ректальное пальцевое исследование (РПИ) и/или определение уровня простатического специфического антигена (ПСА). Однако РПИ у пациентов с уровнем ПСА менее 2 нг/мл имеет положительную прогностическую ценность всего около 5-30% [G F Carvalhal et al., "Digital Rectal Examination for Detecting Prostate Cancer at Prostate Specific Antigen Levels of 4 Ng./ml. or Less.," The Journal of Urology 161, no. 3 (1999): 835-39]. В свою очередь, ПСА является маркером, специфичным для органа, но не для конкретного заболевания, поэтому данный маркер может быть повышен как при РПЖ, так и при ДГПЖ, простатите и других состояниях. Кроме того, РПЖ у многих мужчин обнаруживается при низких значениях ПСА [Ian М Thompson et al., "Prevalence of Prostate Cancer among Men with a Prostate-Specific Antigen Level < or =4.0 Ng per Milliliter.," The New England Journal of Medicine 350, no. 22 (2004): 2239-46, doi: 10.1056/NEJMoa031918]. Таким образом, малоинвазивная диагностика РПЖ в настоящее время не является достаточно эффективной, что делает актуальным поиск новых клинико-лабораторных показателей для диагностики РПЖ и дифференциальной диагностики с ДГПЖ.
Было обнаружено, что в качестве биологических показателей наличия РПЖ могут выступать циркулирующие молекулы микроРНК. МикроРНК - это короткие некодирующие одноцепочечные молекулы РНК длиной около 22 нуклеотидов, играющие роль посттранскрипционных регуляторов экспрессии определенных генов-мишеней [David Р Bartel, "MicroRNAs: Genomics, Biogenesis, Mechanism, and Function.," Cell 116, no. 2 (January 2004): 281-97]. Молекулы микроРНК вовлечены во многие процессы, включая развитие, пролиферацию и апоптоз, кроме того, микроРНК связаны со многими патологическими процессами, например злокачественными опухолями [Francesco Russo et al., "A Knowledge Base for the Discovery of Function, Diagnostic Potential and Drug Effects on Cellular and Extracellular miRNAs.," BMC Genomics 15 Suppl 3 (January 2014): S4]. При различных видах рака определение экспрессионных профилей микроРНК может выступать в роли метода для классификации, диагностирования и прогнозирования течения заболевания [Tanja Kunej et al., "Epigenetic Regulation of microRNAs in Cancer: An Integrated Review of Literature.," Mutation Research 717, no. 1-2 (December 2011): 77-84]. МикроРНК обнаруживаются в различных биологических жидкостях и обладают заметной стабильностью, что подчеркивает их возможную роль в качестве перспективных малоинвазивных маркеров рака [Jessica A Weber et al., "The microRNA Spectrum in 12 Body Fluids." Clinical Chemistry 56, no. 11 (November 2010): 1733-41, doi: 10.1373/clinchem. 2010. 147405]. Потенциальная польза микроРНК была показана также в диагностике рака предстательной железы [Qinfeng Yang, Yushan Zheng, and Dequan Zhu, "Diagnostic Performance of microRNAs Expression in Prostate Cancer.," Tumour Biology: The Journal of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine, July 2014].
Одним из наиболее вероятных механизмов появления РПЖ-специфических циркулирующих микроРНК в периферической крови представляется их поступление непосредственно из раковых клеток или клеточного окружения опухоли, включая эндотелий, иммунные клетки и другие источники. Было обнаружено, что повышение уровня экспрессии микроРНК может быть связано с гиперэкспрессией гена-хозяина, в интроне которого закодирована соответствующая микроРНК [S. Ambs et al., "Genomic Profiling of MicroRNA and Messenger RNA Reveals Deregulated MicroRNA Expression in Prostate Cancer," Cancer Research 68, no. 15 (August 2008): 6162-70, doi: 10.1158/0008-5472. CAN-08-0144]. Таким образом, можно предположить, что анализ циркулирующих микроРНК в периферической крови помимо ранней дифференциальной диагностики позволяет оценивать генетические изменения в клетках РПЖ.
Первично было обнаружено, что miR-141 может определять наличие распространенного, метастатического РПЖ при сравнении со здоровым контролем с чувствительностью 60% и специфичностью 100% [Patrick S Mitchell et al., "Circulating microRNAs as Stable Blood-Based Markers for Cancer Detection.," Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 105, no. 30 (July 29, 2008): 10513-18, doi: 10.1073/pnas. 0804549105]. При сравнении локализованного РПЖ с метастатической формой специфичность определения miR-141 оказалась ниже 100%, параллельно были выявлены две микроРНК, отличавшие раннюю стадию болезни от здорового контроля [Fulya Yaman Agaoglu et al., "Investigation of miR-21, miR-141, and miR-221 in Blood Circulation of Patients with Prostate Cancer.," Tumour Biology: The Journal of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine 32, no. 3 (June 2011): 583-88]. Еще одно исследование обнаружило в результате микрочипового анализа 15 микроРНК, повышенных при РПЖ, но данные молекулы не позволяли достоверно отличить РПЖ от других типов рака [Michael J Lodes et al., "Detection of Cancer with Serum miRNAs on an Oligonucleotide Microarray.," PloS One 4, no. 7 (January 2009): e6229, doi: 10.1371/journal. pone. 0006229]. Было показано, что в крови мужчин при РПЖ изменена концентрация 12 определенных микроРНК, 11 из которых значительно повышены при наличии метастазов в сравнении с локализованной формой РПЖ, особенно микроРНК miR-141 и miR-375 [R J Bryant et al., "Changes in Circulating microRNA Levels Associated with Prostate Cancer.," British Journal of Cancer 106, no. 4 (February 14, 2012): 768-74, doi: 10.1038/bjc. 2011. 595].
Исследование циркулирующих микроРНК при РПЖ подтвердило изменение уровней miR-141 и miR-375 в крови больных РПЖ, а также выявило панель из пяти микроРНК (miR-562/miR-210/miR-501-3p/miR-375/miR-551b), способных определить 84% больных РПЖ, панель из 4 микроРНК (let-7a*/miR-210/miR-562/miR-616), достоверно отличающих РПЖ от ДГПЖ в 80% случаев, а также панель из 4 микроРНК (miR-375/miR-708/miR-1203/miR-200a), отличающих диссеминированную форму РПЖ от локализованной [Christa Haldrup et al, "Profiling of Circulating microRNAs for Prostate Cancer Biomarker Discovery.," Drug Delivery and Translational Research 4, no. 1 (February 2014): 19-30]. Уровень miR-21 оказался повышен в сыворотке при сравнении кастрационно-резистентного РПЖ и ДГПЖ, однако с локализованным и андрогензависимым РПЖ достоверной разницы не наблюдалось [Hai-Liang Zhang et al., "Serum miRNA-21: Elevated Levels in Patients with Metastatic Hormone-Refractory Prostate Cancer and Potential Predictive Factor for the Efficacy of Docetaxel-Based Chemotherapy.," The Prostate 71, no. 3 (February 2011): 326-31]. Еще одно исследование показало, что микроРНК let-7e, let-7с, miR-25 и miR-30с понижены в плазме при РПЖ в сравнении с ДГПЖ, a miR-346, miR-622, miR-940 и miR-1285 повышены. При этом авторы выявили, что панель из пяти микроРНК с наибольшей точностью отличает РПЖ от ДГПЖ, при этом три микроРНК данной панели понижены при РПЖ (let-7e, let-7c и miR-30с), а две - повышены (miR-622 и miR-1285) [Zhang-Hui Chen et al., "A Panel of Five Circulating microRNAs as Potential Biomarkers for Prostate Cancer.," The Prostate 72, no. 13 (September 2012): 1443-52]. Набор из 4 микроРНК (miR-26a, miR-32, miR-195, miR-let7i) позволял отличать РПЖ от ДГПЖ с чувствительностью 78,4% и специфичностью 66,7%, при этом уровень miR-16, miR-195 и miR-26a был связан с повышенной частотой положительными хирургическими краями, а уровень miR-195 и miR-let7i - с оценкой по шкале Глисона [Robert Mahn et al., "Circulating microRNAs (miRNA) in Serum of Patients with Prostate Cancer.," Urology 77, no. 5 (May 2011): 1265.е9-16]. Комбинация микроРНК let-7c, miR-30с, miR-141 и miR-375 позволяла провести дифференциальную диагностику ДГПЖ и РПЖ с чувствительностью 86,8% и специфичностью 81,8% и площадью под ROC-кривой (AUC) 0,877 [Darina Kachakova et al., "Combinations of Serum Prostate-Specific Antigen and Plasma Expression Levels of Let-7c, miR-30с, miR-141, and miR-375 as Potential Better Diagnostic Biomarkers for Prostate Cancer.," DNA and Cell Biology 34, no. 3 (March 2015): 189-200, doi: 10.1089/dna. 2014. 2663].
В ходе патентного поиска запатентованных способов определения риска развития, диагностики, стадирования, прогнозирования течения и результатов лечения РПЖ было обнаружено ограниченное количество патентов, часть из которых не обладает специфичностью по отношению только к РПЖ, кроме того, определение биологических маркеров происходит чаще всего в ткани опухоли, что ассоциировано с большой инвазивностью процедуры и снижает ценность метода в аспекте скрининга опухоли. Все вышесказанное определяет целесообразность разработки и патентования такого метода. Общая тенденция развития изобретений в данной области предполагает использование малоинвазивных способов получения образца, в частности определение биомаркеров в крови и ее производных.
Один из аспектов создания тест-систем для диагностики и дифференциальной диагностики РПЖ - это анализ и выбор конкретных генов и молекул для последующего включения в тест-систему. В данном случае наблюдается тенденция к изучению транскриптома различных биологических объектов с помощью полногеномного транскриптомного анализа с использованием микрочиповых технологий для установления закономерностей и определения целевых генов, наиболее соответствующих поставленным целям (AU 2014202735).
Изобретение ЕР 2505669 (А2) относится к методам диагностики солидных опухолей путем определения измененного уровня экспрессии определенных микроРНК. Диагностируется наличие или повышенный риск развития солидных опухолей, среди которых рак толстой кишки, поджелудочной железы, желудка и РПЖ. Определение уровня микроРНК производится путем проведения обратной транскрипции выделенной из образца РНК и гибридизации на микрочипе. Кроме того, используются другие методы определения микроРНК, включая нозерн-блоттинг, ПЦР-РВ, гибридизацию in situ. В качестве образца могут выступать свежая ткань предстательной железы или клетки крови, выделенные из цельной крови, например лейкоциты. Как видно из описания, изобретение не обладает специфичностью для РПЖ и использует менее эффективную методику определения микроРНК.
В заявке на патент WO 2014057279 (А1) описаны маркерные микроРНК, применяемые в диагностике и/или прогнозировании РПЖ, а также для мониторинга и/или лечения РПЖ. Составлен список из 35 микроРНК, в различных комбинациях предсказывающих наличие или прогрессирование РПЖ, а также позволяющих отличать вялотекущий РПЖ от агрессивного. Таким образом, определение наличия или отсутствия данных микроРНК и/или изменения их уровня с течением времени может быть использовано для обнаружения у человека РПЖ или потенциала развития его агрессивной формы, а также для дифференциальной диагностики РПЖ и простатита или ДГПЖ. В типичном случае в качестве образца используется свежая ткань предстательной железы, сыворотка, плазма или моча, однако определение возможно в таких биологических образцах, как заключенная в парафин ткань предстательной железы, цельная кровь, слюна, жидкость вокруг предстательной железы, секрет предстательной железы, лимфатическая жидкость, раневой секрет, фекалии, слизь, пот, слезы и ликвор. Предпочтительным методом определения микроРНК является ПЦР-РВ, однако приемлемыми в изобретении указываются методы на основе микрочипов, других вариантов ПЦР, гибридизации in situ, нозерн-блоттинга, секвенирования и методов, основанных на флуоресценции.
Другая наиболее близкая тест-система описана в патенте AU 2014202735 (А1), который относится к области молекулярной биологии, конкретно к средствам и методам диагностики, прогнозирования и лечения РПЖ. Сущность способа заключается в определении ряда микроРНК в свежей ткани предстательной железы и сравнение с уровнем в контроле. Первичный поиск маркеров производился с помощью микрочиповых технологий для анализа как мРНК в целом, так и отдельно микроРНК. Подтвержденные микроРНК определялись методом ПЦР-РВ. Среди методов оценки уровня микроРНК в патентной заявке упоминаются также микрочиповые технологии, нозерн-блоттинг и гибридизация in situ. Постулируется, что для РПЖ характерно повышение хотя бы одной микроРНК из списка, включающего 21 микроРНК (miR-32, miR-182, miR-31, miR-26a-1/2, miR-200c, miR-375, miR-196a-112, miR-370, miR-425, miR-194-112, miR-181a-112, miR-34b, let-7i, miR-188, miR-25, miR-106b, miR-449, miR-99b, miR-93, miR-92-112, miR-125a), и/или понижение хотя бы одной из другого списка из 21 микроРНК (miR-520h, miR-494, miR-490, miR-133a-1, miR-1-2, miR-218-2, miR-220, miR-128a, miR-221, miR-499, miR-329, miR-340, miR-345, miR-410, miR-126, miR-205, miR-7-1/2, miR-145, miR-34a, miR-487, let-7b). При анализе в опухолевых и неопухолевых образцах набора из 23 микроРНК (37 зондов) в отношении диагностики РПЖ была обнаружена чувствительность 80% (верно определились 48 из 60 опухолевых образцов) и специфичность 100% (16 из 16 неопухолевых образцов). Недостатками метода является необходимость получения ткани предстательной железы, что связано с привлечением высококвалифицированных специалистов, дополнительными возможными осложнениями инвазивной процедуры и увеличением времени пробоподготовки.
Прототипом изобретения авторами выбран патент RU 2521389 С2, адаптированный к измерению величины экспрессии микроРНК hsa-miR-619-5p и hsa-miR-1184 в плазме периферической крови человека методом микрочипового анализа.
Недостатками данного метода с нашей точки зрения являлись его относительная низкая специфичность и чувствительность.
Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа дифференциальной диагностики ДГПЖ и рака предстательной железы, обладающего высокой специфичностью, экономически выгодного и простого в применении.
Анализ патентной документации свидетельствует о том, что поиск эффективных решений, направленных на дифференциальную диагностику ДГПЖ и РПЖ, является крайне актуальной задачей.
Раскрытие изобретения
Задачей предлагаемого технического решения является разработка новых диагностических маркеров ДГПЖ и РПЖ, позволяющих осуществлять дифференциальную диагностику ДГПЖ от РПЖ, а также разработка на их основе простого, чувствительного, надежного, применимого в условиях клинических или поликлинических медицинских учреждений способа дифференциальной диагностики ДГПЖ от РПЖ.
Заявляемое изобретение расширяет арсенал диагностических тестов посредством получения новых диагностических маркеров ДГПЖ и РПЖ, позволяющих при сопоставимой достоверности и специфичности осуществлять дифференциальную диагностику ДГПЖ от РПЖ.
Настоящее изобретение в своем первом аспекте относится к способу дифференциальной диагностики ДГПЖ от РПЖ у человека, включающему:
- получение образца периферической крови пациента;
- выделение плазмы крови из образца;
- выделение РНК из плазмы крови;
- проведение микрочипового анализа экспрессии микроРНК hsa-miR-619-5p и hsa-miR-1184 с получением для каждого из перечисленных маркеров их количественных оценок представленности Q(g) и дифференциальной диагностикой ДГПЖ от РПЖ путем сравнения оценок представленности Q(g) с предустановленными порогами:
при получении значений Q(hsa-miR-619-5p) больше 1,25 и Q(hsa-miR-1184) более 3,5 делают вывод о раке предстательной железы, при Q(hsa-miR-619-5p) менее 1,25 и Q(hsa-miR-1184) менее 3,5 делают вывод и низком риске возникновения рецидива, при получении значений Q(hsa-miR-619-5p) более или равном 1,25 и Q(hsa-miR-1184) менее 3,5 или Q(hsa-miR-619-5p) менее 1,25 и Q(hsa-miR-1184) более или равном 3,5 считают риск неопределенным.
Предпочтительно для выделения плазмы крови из образца использовать два этапа центрифугирования по 10 минут каждый при температуре 22±2°С: первый - при 2000g с последующим переносом верхней фазы в новую пробирку, второй - при 4000g.
Предпочтительно выделение РНК из плазмы крови осуществлять с помощью набора реагентов miRNeasy Serum/Plasma Kit (Qiagen, ФРГ).
Предпочтительно для проведения микрочипового анализа использовать чипы GeneChip miRNA 4.0 Array (Affymetrix, США).
Предпочтительно осуществлять предобработку результата микрочипового анализа совместно со стандартным нормирующим набором GSE60715 [Sonia A. Melo et al., "Cancer Exosomes Perform Cell-Independent MicroRNA Biogenesis and Promote Tumorigenesis," Cancer Cell 26, no. 5 (October 10, 2014): 707-21, doi: 10.1016/j.ccell. 2014.09.005].
Осуществление изобретения
В изобретении представлены новые молекулярно-генетические маркеры для дифференциальной диагностики доброкачественной гиперплазии предстательной железы от рака предстательной железы, основанной на определении количественных оценок представленности двух микроРНК: hsa-miR-619-5p и hsa-miR-1184. Это простой, надежный и малоинвазивный способ дифференциальной диагностики доброкачественной гиперплазии предстательной железы от рака предстательной железы.
В качестве образца для проведения анализа используется плазма периферической крови.
Способы получения плазмы крови хорошо известны специалистам [М.Ю. Шкурников et al., "Профиль микроРНК плазмы крови здоровых доноров," Бюллетень экспериментальной биологии и медицины 160, no. 11 (2015): 577-79] и, как правило, включают следующие стадии: забор периферической крови пациента в пробирки с антикоагулянтом (например, вакуумно-аспирационные пробирки S-Monovette EDTA-KE 8 мл (Sarstedt, ФРГ)); отделение плазмы крови от клеточных компонентов с помощью центрифуги (например, 5810 R (Eppendorf, ФРГ)) в два этапа по 10 минут каждый при комнатной температуре: первый - при 2000g, с последующим переносом верхней фазы в новую пробирку, второй этап проводился при 4000g.
Быстрое и качественное выделение РНК из плазмы крови проводят с использованием ряда коммерчески доступных наборов (miRNeasy Serum/Plasma Kit (Qiagen, ФРГ); NucleoSpin miRNA Plasma Kit (MACHEREY-NAGEL, ФРГ); Direct-zol RNA MiniPrep Kit (Zymo Research, США) и т.д.).
Проведение микрочипового анализа экспрессии микроРНК осуществляется по стандартным методикам для микрочипов GeneChip miRNA 4.0 (Affymetrix, США). Результат микрочипового исследования образца предобрабатывается совместно со стандартным нормирующим набором GSE60715 [Melo et al., "Cancer Exosomes Perform Cell-Independent MicroRNA Biogenesis and Promote Tumorigenesis"]. Использование стандартного нормирующего набора необходимо для приведения результатов разных микрочипов в единую шкалу. Предобработка и оценка экспрессии осуществляется с использованием метода RMA [Irizarry R.A. и др. Exploration, normalization, and summaries of high density oligonucleotide array probe level data // Biostatistics. 2003. T. 4 C. 249-264].
После предобработки в качестве оценок количественной представленности транскриптов Q(hsa-miR-619-5p) и Q(hsa-miR-1184) берут полученные в результате предобработки значения, ассоциированные с соответствующими микроРНК-маркерам наборами проб микрочипа. Значения берутся в логарифмической шкале с основанием два.
Следует отметить, что отбор транскриптов, используемых непосредственно для формирования прогноза, осуществлялся на основе анализа собственных данных о профиле микроРНК плазмы крови 256 пациентов с РПЖ, 65 пациентов с ДГПЖ и 61 здорового пациента, полученных на базе МНИОИ им. П.А. Герцена - филиал ФГБУ «НМИРЦ» Минздрава России. В основе отбора лежало построение бинарного (двухклассового) классификатора, различающего пациентов, у которых был диагностирован рак предстательной железы, и пациентов, у которых была диагностирована гиперплазия предстательной железы.
При фиксированном наборе транскриптов для построения классификатора, использующего в точности этот набор транскриптов, применялся однофакторный непарный дисперсионный анализ с поправкой Бенджамини-Хохберга на множественность сравнений.
Валидация итогового набора микроРНК-маркеров осуществлялась на валидационной выборке, образцы которой не использовались ни при отборе транскриптов.
Примеры конкретного выполнения
Изобретение поясняется следующими примерами осуществления.
Пример 1. Получение плазмы крови
Забор крови производился с использованием вакуумно-аспирационных пробирок S-Monovette EDTA-KE 8 мл (Sarstedt, ФРГ). Выделение плазмы производилось с помощью центрифуги 5810 R (Eppendorf, ФРГ). Центрифугирование проводилось при комнатной температуре в два этапа: на первом этапе центрифугирование производилось при ускорении 2000g в течение 10 минут со средней скоростью разгона и торможения. Затем верхняя фаза жидкости переносилась в новую пробирку и производился второй этап центрифугирования при ускорении 4000g. После второго этапа аккуратно отбиралась вся полученная плазма кроме 10% объема у дна пробирки.
Пример 2. Выделение РНК
8
1. Смешать в отдельной пробирке 1,2 мл TRIzol LS Reagent (Life Techologies, США) и 3 мкл miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control (10 копий/мкл).
2. Перенести 400 мкл образца плазмы крови в чистую пробирку 2 мл.
3. Добавить в пробирку с плазмой 1,2 мл TRIzol LS Reagent с miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control.
4. Тщательно перемешать на вортексе.
5. Поставить пробирку в штатив и инкубировать 10 минут при комнатной температуре.
6. Добавить в пробирку 1 мкл GlycoBlue Coprecipitant (15 мг/мл), перемешать на вортексе.
7. Добавить 320 мкл хлороформа и тщательно перемешать на вортексе 15 сек.
8. Поставить пробирку в штатив и инкубировать при комнатной температуре 2-3 мин.
9. Поставить пробирку в центрифугу, предварительно охлажденную до 4°С, и центрифугировать в течение 15 мин при ускорении 12000g при 4°С.
10. Перенести водную фазу в чистую пробирку на 2 мл, измерить объем водной фазы и добавить 1,5 объема 100% этанола. Хорошо перемешать с помощью пипетки. Не центрифугировать.
11. Перенести 700 мкл образца, включая осадок, если он выпал, на колонку RNeasy Mini Spin. Центрифугировать 15 сек при 12000g.
12. Удалить раствор, прошедший через колонку, перенести на нее оставшуюся часть образца и повторить центрифугирование. Снова удалить раствор, прошедший через колонку.
13. Нанести на колонку RNeasy Mini Spin 700 мкл RWT-буфера, центрифугировать 15 сек при 12000g. Удалить раствор, прошедший через колонку.
14. Нанести на колонку RNeasy Mini Spin 500 мкл буфера RPE, центрифугировать 15 сек при 12000g. Удалить раствор, прошедший через колонку.
15. Добавить на колонку RNeasy Mini Spin 500 мкл буфера RPE, центрифугировать 2 мин при 12000g, чтобы высушить мембрану колонки.
16. Перенести колонку RNeasy Mini Spin в чистую пробирку на 2 мл и центрифугировать 5 мин при открытой крышке, чтобы полностью удалить остатки жидкости.
17. Перенести колонку RNeasy Mini Spin в чистую пробирку на 1,5 мл для элюции образца. Аккуратно нанести 30 мкл воды, свободной от РНКаз, непосредственно на мембрану колонки. Центрифугировать 1 мин при максимальном ускорении.
18. Вынуть из пробирки колонку, перемешать элюированный раствор, осадить и определить объем раствора тотальной РНК с помощью пипетки. Хранить на льду до продолжения эксперимента или заморозить при минус 20°С для непродолжительного хранения либо при минус 80°С для длительного хранения.
Пример 3. Проведение микрочипового анализа экспрессии
Для анализа брали 150 нг тотальной РНК. На первой стадии проводили реакцию неспецифического синтеза поли-А олигонуклеотидов на 3'-конце молекул РНК с помощью поли-А-полимеразы. Для этого к 1000 нг РНК в 8 мкл воды (категории Nuclease-free) добавляли 2 мкл RNA Spike Control Oligos и 5 мкл Poly A Tailing Master Mix (Таблица 1), аккуратно перемешивали, инкубировали 15 минут при 37°С.
Далее проводили стадию лигирования для мечения каждой молекулы РНК специальной Biotin-labeled3DNA меткой, содержащей биотином. Для этого после наращивания поли-А-концов к реакционной смеси добавляли 4 мкл 5х FlashTag Biotin HSR Ligation Mix, 2 мкл T4 DNA Ligase, аккуратно перемешивали и инкубировали 30 мин при 25°С, после чего останавливали реакцию, добавлением 2,5 мкл HSR Stop Solution. Затем из 23,5 мкл реакционной смеси отбирали по 2 мкл для анализа ELOSA QC Assay, оставшиеся 21,5 мкл использовали для гибридизации на микрочипе.
Анализ ELOSA QC Assay (Enzyme Linked Oligosorbent Assay) проводится для оценки качества проведенных реакций, поэтому этот анализ проводится до стадии гибридизации. ELOSA QC Assay проводили с тремя контролями: положительный контроль, содержащий ELOSA Positive Control (олигонуклеотиды, меченые биотином и проверенные на качество производителем), отрицательный контроль, содержащий все реагенты для мечения РНК, кроме RNA Spike Control Oligos, отрицательный контроль, содержащий все реагенты для мечения РНК, кроме RNA Spike Control Oligos и тотальной РНК. Для проведения анализа сначала разводили ELOSA Spotting Oligos в растворе 1x PBS: например, для трех образцов 4,5 мкл ELOSA Spotting Oligos растворяли в 220,5 мкл 1x PBS. Разведенные ELOSA Spotting Oligos добавляли по 75 мкл в каждую лунку на плашке для ELOSA. После этого плашку с ELOSA Spotting Oligos оставляли на ночь в холодильнике при 2-8°С. Затем плашку промывали дважды раствором 0,02% Tween-20 в 1x PBS, добавляли 150 мкл 5% BSA в 1x PBS в каждую лунку, после этого инкубировали плашку 1 час при комнатной температуре. Раствор удаляли из плашки.
На следующем этапе готовили Hybridization Master Mix (Таблица 2) и заполняли 50,5 мкл этого раствора каждую лунку. Далее добавляли либо 2 мкл воды (для отрицательного контроля), либо 2 мкл ELOSA Positive Control (для положительного контроля), либо 2 мкл меченого образца. Плашку хорошо заклеивали и инкубировали 1 час при комнатной температуре.
Далее проводили связывание с SA-HRP. Лунки промывали 3 раза 0,02%-ным раствором Tween в 1x PBS, потом в каждую добавляли 75 мкл SA-HRP, разведенного в соотношении 1:4000 раствором 5%-ного BSA в 1x PBS. Плашку заклеивали и инкубировали 1 час при комнатной температуре. После этого лунки промывали 3 раза раствором 0,02% Tween в 1x PBS, добавляли 100 мкл ТМВ Substrate в каждую лунку, заклеивали плашку, заворачивали в фольгу и оставляли так в темноте на 7 минут. Синий цвет раствора в лунке означает положительный результат: лунки с положительным контролем оказывались синими, а лунки с неокрашенным раствором - содержали отрицательные контроли. Если раствор в лунках с образцами оказывался синим, то считали, что стадия мечения прошла успешно, и образцы использовали дальше для гибридизации на микрочип.
Для гибридизации готовили Hybridization Master Mix (Таблица 3), при этом 20х Eukaryotic Hybridization Controls перед добавлением в реакционную смесь инкубировали 5 мин при 65°С. Готовый раствор Hybridization Master Mix добавляли по 110,5 мкл к 21,5 мкл меченого образца для составления Hybridization Cocktail. Полученный раствор инкубировали 5 мин при 99°С, а затем 5 мин при 45°С. Затем 130 мкл Hybridization Cocktail переносили в микрочип GeneChip miRNA 4.0. Чипы помещали в разогретую до 48°С гибридизационную печь Affymetrix Hybridization Oven 645 и оставляли в ней на 16 часов при скорости вращения 60 rpm.
По истечении 16 часов чипы вынимали из гибридизационной печи, удаляли из них гибридизационную смесь (при необходимости смесь можно сохранить и нанести на новый чип), заполняли чип буфером Array Holding Buffer и далее, следуя протоколу «GeneChip Expression Wash, Stain and Scan User Manual», промывали и прокрашивали с помощью GeneChipFluidics Station 450.
После промывки и прокрашивания чипы сканировали с помощью сканнера GeneChipScanner 3000 7G. В результате сканирование получали файл с расширением «.CEL», в котором хранится информация об интенсивности свечения каждой точки на микрочипе.
Пример 4. Предобработка данных микрочипового анализа и получение количественных оценок представленности hsa-miR-619-5p и hsa-miR-1184
Полученные данные микрочипового исследования (файл с расширением «.CEL») были совместно предобработаны со стандартным нормирующим набором GSE60715. Предобработка и оценка экспрессии проводились с использованием реализации метода RMA [Rafael A Irizarry et al., "Exploration, Normalization, and Summaries of High Density Oligonucleotide Array Probe Level Data.," Biostatistics (Oxford, England) 4, no. 2 (April 2003): 249-64, doi: 10.1093/biostatistics/4.2.249] в программном обеспечении Affymetrix Expression Console. Предобработка включала в себя коррекцию фона с использованием глобальной модели распределения интенсивностей проб [R.A. Irizarry, "From CEL Files to Annotated Lists of Interesting Genes - Bioinformatics and Computational Biology Solutions Using R and Bioconductor.: Springer. P. 431-442", ed. W. Huber R. Gentlemen, V. Carey, S. Dudoit, R. Irizarry (New York: Springer, 2005), 431-42] и квантильную нормализацию уровней проб [В М Bolstad et al., "A Comparison of Normalization Methods for High Density Oligonucleotide Array Data Based on Variance and Bias.", Bioinformatics (Oxford, England) 19, no. 2 (January 2003): 185-93]. Оценка экспрессии наборов проб по интенсивностям отдельных проб осуществлялась с использованием устойчивого построения линейной модели методом медианной подгонки [John W. Tukey, Exploratory Data Analysis, Biometrics, vol. 33 (Addison-Wesley, 1977), doi: 10.2307/2529486].
В качестве количественной оценки представленности Q(hsa-miR-619-5p) использовали оценку экспрессии кластера транскрипта №20504364 (Transcript Cluster ID), а для Q(hsa-miR-1184) - кластера транскрипта №20506716.
Пример 5.
Пациент М-ов, 66 лет.
В феврале 2013 г. проходил обследование в поликлинике МНИОИ им. П.А. Герцена - филиал ФГБУ «НМИРЦ» Минздрава России с предварительным диагнозом гиперплазия предстательной железы. Жалобы на учащенное мочеиспускание.
Общий анализ мочи - норма. Лабораторная диагностика: ПСА=1,8 нг/мл.
Результаты
Пациенту было проведено исследование согласно заявляемому способу.
Q(hsa-miR-619-5p)=2,13.
Q(hsa-miR-1184)=5,90.
Так как Q(hsa-miR-619-5p)>1,25 и Q(hsa-miR-1184)>3,5 было сделано заключение о наличии РПЖ.
В результате биопсии предстательной железы был поставлен диагноз - рак предстательной железы (T2cN0M0).
Пример 6.
Пациент К-ов, 75 лет.
В марте 2013 г. проходил обследование в поликлинике МНИОИ им. П.А. Герцена - филиал ФГБУ «НМИРЦ» Минздрава России с предварительным диагнозом гиперплазия предстательной железы. Жалобы на учащенное мочеиспускание.
Общий анализ мочи - норма. Лабораторная диагностика: ПСА=17,1 нг/мл.
Результаты
Пациенту было проведено исследование согласно заявляемому способу.
Q(hsa-miR-619-5p)=1,18.
Q(hsa-miR-1184)=2,47.
Так как Q(hsa-miR-619-5p)≤1,25 и Q(hsa-miR-1184)≤3,5 было сделано заключение о наличии ДГПЖ.
В результате биопсии предстательной железы был поставлен диагноз - доброкачественная гиперплазия предстательной железы.