СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 5-, 6-АМИНОФЛУОРЕСЦЕИНОВ
METHOD OF PRODUCING 5-, 6-AMINO-FLUORESCEINS

Изобретение относится к области органической химии и медицины, а именно к нитропроизводным флуоресцеина, которые могут быть использованы в синтезе различных флуоресцентных соединений, таких как 5-изотиоцианат флуоресцеина (ФИТЦ), флуоресцеин лизикол (CFL), 5-[4,6-дихлортриазинил] аминофлуоресцеина (5-DATF), применяемых в медицине для диагностики и лечения заболеваний,
Известно, что производные флуоресцеина активно используются в медицине для диагностики и лечения заболеваний. Например, флуоресцеин лизикол используется в исследованиях фармакокинетики и в диагностике цирроза печени, гепатита, вирусных заболеваний, неалкогольного стеатогепатита у человека и неалкогольной жировой болезни печени [Mills С.О. et al. Cholyl-lysylfluorescein: synthesis, biliary excretion in vivo and during single-pass perfusion of isolated perfused rat liver // Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects. - 1991. - V. 1115. - №2. - P. 151-156.], для лечения атеросклероза [US 2007116754, A61K 49/00, , 2007]. Флуоресцеин-5-изотиоцианат имеет широкий спектр биологических применений, включая использование в качестве флуоресцентного маркирующего агента для белков, в качестве флуоресцентного реагента для отслеживания белка и в качестве реагента в технике флуоресцентных антител для быстрой идентификации патогенов [US 0220787, C07D 493/10, .2012]. Например, известно применение ФИТЦ для диагностики in vivo рака предстательной железы [RU 2450832, A61K 49/14, 2012]. 5-[4,6-Дихлортриазинил] аминофлуоресцеина (DATF) обладает высокой реакционной способностью в отношении белков. В отличие от других реакционноспособных флуоресцеинов, 5-DTAF не только реагирует с аминогруппами, но также реагирует с тиольными группами и даже непосредственно реагирует с гидроксигруппами, такими как полисахариды и другие спирты в водном растворе при рН выше 9. Из-за его высокой реакционной способности, 5-DTAF также используется для маркировки углеводов, а также биологически значимых молекул in vivo [GB 2081257, C07D 405/04, 1982].
Производные флуоресцеина, в частности 5-изотиоцианат флуоресцеин (ФИТЦ), флуоресцеин лизикол, могут быть получены из 5-аминофлуоресцеина, синтезированного известным методом из 5-нитрофлуоресцеина. Последний, в свою очередь, получают по нижеописанной схеме реакцией 4-нитрофталевой кислоты с резорцином, катализируемой ортофосфорной кислотой [Coons А.Н., Kaplan М.Н. Localization of antigen in tissue cells: II. Improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody // Journal of Experimental Medicine. - 1950. - T. 91. - №. 1. - C. 1-13.; Глушко В.H., Блохина Л.И., Садовская Н.Ю. Исследования по получению флуоресцеин-5-изотиоцианата-флуоресцентного наномаркера для создания биосенсоров // Российский химический журнал. - 2014. - Т. 58. - №. 1. - С. 40-45.], или метансульфоновой кислотой [US 0220787 А1, C07D 493/10, 2012].
В результате получается смесь изомеров 5- и 6-нитрофлуоресцеина, которую разделяют с помощью уксусного ангидрида,
Получение 5-аминофлуоресцеина осуществляют либо сначала омылением полученных ацетатов 5-нитрофлуоресцеина спиртовой щелочью с последующим восстановлением полученного 5-нитрофлуоресцеина в растворе спиртовой щелочи гидразин-гидратом на никелевом катализаторе до получения 5-аминофлуоресцеина [Coons А.Н., Kaplan М.Н. Localization of antigen in tissue cells: II. Improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody // Journal of Experimental Medicine. - 1950. - T. 91. - №. 1. - C. 1-13.], либо кипячением в водном растворе сульфида натрия [Глушко В.Н., Блохина Л.И., Садовская Н.Ю. Исследования по получению флуоресцеин-5-изотиоцианата-флуоресцентного наномаркера для создания биосенсоров // Российский химический журнал. - 2014. - Т. 58. - №. 1. - С. 40-45.]. Восстановление нитрогруппы и омыление ацетатов во втором случае происходит в одну стадию. Ниже приводится схема реакций, характеризующая протекание данного процесса синтеза 5-аминофлуоресцеина:
Основным недостатком рассмотренных выше способов синтеза 5-аминофлуоресцеина является использование в них на стадии разделения смеси изомеров 5-и 6-нитрофлуоресцеинов уксусного ангидрида, который является прекурсором в производстве героина и других наркотиков опиоидной группы. В связи с этим уксусный ангидрид введен в утвержденные в ряде государств, в том числе и в Российской Федерации, перечни наркотических средств, психотропных веществ и их прекурсоров, подлежащих контролю [В России он внесен в Постановление Правительства РФ от 30 июня 1998 г. N 681 "Об утверждении перечня наркотических средств, психотропных веществ и их прекурсоров, подлежащих контролю в Российской Федерации" (с изменениями и дополнениями)].
Так, например, в способе, выбранном нами в качестве прототипа [Глушко В.Н., Блохина Л.И., Садовская Н.Ю. Исследования по получению флуоресцеин-5-изотиоцианата-флуоресцентного наномаркера для создания биосенсоров // Российский химический журнал. - 2014. - Т. 58. - №. 1. - С. 40-45.], 5-аминофлуоресцеин реакцией 4-нитрофталевой кислоты с резорцином взятых в мольном соотношении 1:2, протекающей в среде ортофосфорной кислоты, взятой в соотношении к массе 4-нитрофталевой кислоты как 1:2,5 (концентрация ортофосфорной кислоты - 70%, что соответствует уд. весу 1,52) при температуре 135°С до образования смеси изомеров 5- и 6-нитрофлуоресцеинов и ее выделением. Для разделения смеси 5- и 6-нитрофлуоресцеин диацетатов, используют уксусный ангидрид. 5-нитрофлуоресцеин диацетат восстанавливают, подвергая кипячению в водном растворе сульфида натрия, взятого в мольном соотношении 1:3,3 к 5-нитрофлуоресцеин диацетату и выделяют 5-аминофлуоресцеин.
Целью предлагаемого изобретения является получение 5-аминофлуоресцеина и 6-аминофлуоресцеина доступным способом, который обеспечивал бы получение продукта, который по своему качеству отвечал бы всем требованиям, предъявляемым к реактивам для медицины.
Предлагаемый способ получения состоит в следующем: 5- и 6-аминофлуоресцеины получают реакцией 4-нитрофталевой кислоты с резорцином взятых в мольном соотношении 1:2, протекающей в среде ортофосфорной кислоты, взятой в соотношении к массе 4-нитрофталевой кислоты как 1:2,5 (уд. вес ортофосфорной кислоты - 1,75 г/мл) при температуре 135°С до образования смеси изомеров 5- и 6-нитрофлуоресцеинов и ее выделением и разделением через образование 5- и 6-нитрофлуоресцеин дипропионатов, с последующим восстановлением каждого из них до образования соответствующих аминопроизводных отличающийся тем, что для разделения смеси изомеров нитрофлуоресцеина (5- и 6-) используют пропионовый ангидрид в количестве 1:8, который смешивают со смесью изомеров, кипятят полученную смесь в течение 2,5 часов, охлаждают, фильтруют и выпавший осадок 5-нитрофлуоресцеин дипропионата промывают этиловым спиртом, высушивают и подвергают кипячению в водном растворе сульфида натрия, взятого в мольном соотношении 1:3,3 к 5-нитрофлуоресцеин дипропионату и выделяют 5-аминофлуоресцеин, а отделенный после фильтрации маточный раствор содержащий 6-нитрофлуоресцеин дипропионат, обрабатывают дистиллированной водой до получения маслянистого осадка, его закристаллизовывают растиранием, кристаллический осадок отделяют фильтрованием и промывают этанолом, сушат и перекристаллизовывают из бензола после чего полученный 6-нитрофлуоресцеин дипропионат также подвергают кипячению в водном растворе сульфида натрия, взятого в мольном соотношении 1:3,3 к 6-нитрофлуоресцеин дипропионату и выделяют 6-аминофлуоресцеин
Предлагаемый способ получения 5-нитрофлуоресцеина (предшественника 5-аминофлуоресцеина) реакцией 4-нитрофталевой кислоты с резорцином отличается тем, что для получения смеси 5-, 6-нитрофлуоресцеинов используют более концентрированную ортофосфорную кислоту, а для разделения смеси изомеров нитрофлуоресцеина (5- и 6-) используют пропионовый ангидрид.
Пропионовый ангидрид - гомолог уксусного ангидрида, не является прекурсором в производстве героина и других наркотиков опиоидной группы, является сырьем, доступным для массового производства.
Ниже изобретение иллюстрируется следующим примером:
Пример
1. Получение смеси 5-, 6-нитрофлуоресцеинов:
В трехгорлую круглодонную колбу емкостью 1 л, снабженную термометром, механической мешалкой, обратным холодильником загружают 220 г (2 моль) резорцина, 211 г (1 моль) 4-нитрофталевой кислоты и 300 мл ортофосфорной кислоты (90%, уд. вес. 1,75 г/мл). Нагревают до 135°С и выдерживают при этой температуре 3,5 часа. Реакционную массу охлаждают до 100°С и выливают в 1 л дистиллированной воды нагретой до 80°С. Реакционную колбу споласкивают 0,5 л горячей дистиллированной воды и присоединяют к основной массе. Перемешивают 1 час, осадок отфильтровывают, переносят в колбу емкостью 2 л, приливают 1 л дистиллированной воды, кипятят 1 час и отфильтровывают горячим. Сушат при 110°С в вакуумном шкафу до постоянной массы. Получают 312 г смеси 5- и 6-нитрофлуоресцеиновов. Выход 90%.
2. Получение смеси 5-, 6-нитрофлуоресцеин диацетатов и ее разделение на изомеры
422 г (1,12 моль) смеси 5-, 6-нитрофлуоресцеинов и 1162 г (1145 мл, 8,94 моль) пропионового ангидрида помещают в трехгорлую колбу емкостью 2,0 л, нагревают до кипения и кипятят в течение 2,5 часов. Затем реакционную смесь переливают в стакан емкостью 2,0 л, выпавший осадок при охлаждении отфильтровывают, промывают 350 мл этилового спирта. После высушивания получают 137 г (0,28 моль) 5-нитрофлуоресцеин дипропионата. Выход: 25%.
пл.
2
3
Т=215-218°С. ТСХ (тонкослойная хроматография) (Толуол/AcOEt 7:1): Rf - 0.64. 1Н-ЯМР (DMSO d6, σ): 8.70 (d 1Н); 8.62 (dd, 1H); 7.75 (d, 1H); 7.30 (d, 2H), 7.05-6.52 (m, 4H); 2.62 (q, 4H (CH)) 1.29 (t, 6H (CH)).
пл.
2
3
Маточный раствор переливают в 2 л дистиллированной воды. Выпадает маслянистый осадок, который при растирании стеклянной палочкой закристаллизовывается. Осадок отфильтровывают, промывают 100 мл этилового спирта сушат и перекристаллизовывают из 700 мл бензола. После сушки получают 109,5 г 6-нитрофлуоресцеин дипропионата (0,224 моль) Выход: 20%. Т=191°С. ТСХ (тонкослойная хроматография) (Толуол/AcOEt; 7:1) Rf 0.51. 1Н-ЯМР (DMSO, d6): 8.70 (d 1Н); 8.40 (dd, 1H); 7.75 (d, 1H); 7.30 (d, 2H), 7.05-6.52 (m, 4H); 2.62 (q, 4H (CH)) 1.29 (t, 6H (CH)).
3. Восстановление нитрогруппы с одновременным омылением дипроионатов (на примере получения 5-аминофлуоресцеина:
1
В двухгорлую колбу, объемом 1000 мл, снабженную обратным холодильником, капельной воронкой, магнитной мешалкой помещают 50,6 г (0,11 моль) 5-нитрофлуоресцеин дипропината и 500 мл воды. К этому раствору прибавляют небольшими порциями раствор 87,2 г (0,363 моль) 9-водного сульфида натрия в 220 мл воды из капельной воронки. Суспензия 5-нитрофлуоресцеин диацетата полностью растворяется и цвет раствора из желто-коричневого становится темно красным. Кипятят раствор в течение 2-х часов, затем охлаждают до комнатной температуры. Отфильтровывают от выделившейся серы и подкисляют небольшим количеством уксусной кислоты (52 г, 50 мл)). Выпадает мелкий красный осадок. Осадок отфильтровывают, высушивают на фильтре, досушивают в вакуумном шкафу при 90°С до постоянной массы. Получено 26,7 г кирпично-красного осадка 5-аминофлуоресцеина. Выход: 70%. Н ЯМР (DMSO d6, σ) 10.05 (s, 2Н); 7.00 - 6.80 (m, 3Н); 6.65 - 6.50 (m, 6Н); 5.70 (s, 2Н).