Наноимпринт – формирование нано- и микро- элементов фотоники контактным копированием

Отформатировано

ВИЗУАЛИЗАЦИЯ МИКРО- И НАНОСТРУКТУРЫ КЛЕТОК В НАТИВНОМ СОСТОЯНИИ С ИЗМЕРЕНИЕМ ЖЕСТКОСТИ " И ЭЛЕКТРИЧЕСКОЙ ПРОВОДИМОСТИ КЛЕТОЧНЫХ МЕМБРАН

С.Ю. Керпелева, М.В. Клоков, Г.С. Французов______________*

Научный руководитель - д.ф.-м.н., ст.н.с. А.О. Голубок

| Целью работы было создание нового метода клеточной диагностики с нанометровым уровнем простран-» ственного разрешения на основе объединения метода измерения проводимости ионных каналов клеточных мембран с использованием микропипеток («patch с1атр»метод) с методом сканирующей зондовой микроскопии (СЗМ-метод), обеспечивающим визуализацию микро- и наноструктур на поверхности клеточной мембраны и измерение ее механической жесткости.

| Введение *

Одним из приоритетных направлений развития науки и техники признаны работы в области «живых систем». Очевидно, что для успешного проведения работ в этом направлении необходимо создание современных методов и приборов, обеспечивающих манипуляцию, модификацию и диагностику на уровне отдельных клеток и клеточных структур с высоким пространственным разрешением^ Применение микропипеток, присасывающихся к клеточным мембранам (так называемый «patch clamp» метод) позволило локализовать ионные каналы в клеточных мембранах и измерить их электрическую проводимость. Результаты, полученные с использованием этого метода, дали исключительно важную информацию о функционировании клеток, а сам метод был отмечен Нобелевской премией по биологии в 1991 г.

В работе проведены исследования, направленные на объединение «patch с1атр»и СЗМ-методов исследования биологических клеток. Додход позволит визуализировать отдельные клетки и исследовать поверхность клеточной мембраны с высоким пространственным разрешением, измерять ее механические и электрические характеристики. _,В основе решения данной задачи лежит проблема создания универсального датчика, обеспечивающего измерения как в ¿«patch clamp», так и в СЗМ-режиме, т.е. проблема совмещения нанопипетки («patch clamp».) с датчиком силового взаимодействия. Обычно силовое взаимодействие в СЗМ измеряют с помощью кремниевого кантилевера и оптической схемы, регистрирующей его отклонения под действием силы.

Удалено: УДК 539.24Ц 1

1. Сканирующая зондовая микроскопия »

Метод сканирующей зондовой микроскопии (СЗМ), удостоенный в 1986 Нобелевской премии по физике, стал в настоящее время одним из базовых методов нанотех-нологии и нанобиотехнологии. Исключительно важным является тот факт, что СЗМ, в отличие от электронной микроскопии, обеспечивает высокое пространственное разрешение даже в том случае, когда биологические объекты находятся в жидкости, в том числе в функционально активном состоянии.

В основе сканирующей зондовой микроскопии лежит детектирование локального взаимодействия, возникающего между твердотельным нанозондом и поверхностью исследуемого образца при их взаимном сближении. В зависимости от природы взаимодействия «зонд-образец» различают сканирующий туннельный микроскоп (СТМ, детектируется туннельный ток), сканирующий силовой микроскоп (ССМ, детектируется силовое взаимодействие) и т.п. Отметим, что сканирующая силовая микроскопия, в свою очередь, подразделяется на атомно-силовую микроскопию, микроскопию магнитных сил, микроскопию электростатических сил, фрикционную микроскопию и т.п.

Традиционным датчиком силового взаимодействия является кремниевая микробалка (кантилевер) с оптической схемой регистрации величины прогиба балки, возни-

Удалено:1

Отформатировано:

Отступ: Первая строка: 0 мм

Удалено:1

Удалено: зав. кафедры НТМ

Отформатировано:

Отступ: Первая строка: 0 мм

Удалено: данной

Удалено: ("

Удалено:"

Удалено:

Отформатировано:

Отступ: Первая строка: 0 мм

Удалено:Ц

Удалено: "

Удалено:

Удалено: оду

Удалено: "

Удалено: "

Удалено:

Удалено: Данный п

Удалено:Ц

Удалено: "patch clamp"

Удалено:

Удалено:

Удалено: "patch clamp")

Удалено:

Отформатировано:

Отступ: Первая строка: 0 мм

Удалено: году

Удалено: -

Удалено::

Удалено: ,

Удалено:Ц

Отформатировано:

Отступ: Первая строка: 6,3 мм, Справа: 6,3 мм

кающего вследствие силового взаимодействия между образцом и зондом, расположенным на краю балки. Различают контактный, бесконтактный и полуконтактный способы измерения силового взаимодействия. В контактном режиме зонд упирается в образец и отталкивается от него. Возникающий при этом прогиб кантилевера измеряется оптическим способом. В бесконтактном режиме зонд удален от поверхности и находится в области действия притягивающих сил. Силы притяжения и их градиенты слабее отталкивающих сил, поэтому для их детектирования обычно используется модуляционная методика. Для этого с помощью пьезовибратора кантилевер раскачивается на резонансной частоте. Вдали от поверхности амплитуда колебаний кантилевера имеет максимальную величину. По мере приближения к поверхности амплитуда колебаний, вследствие действия сил притяжения, уменьшается, при этом изменяется частота и фаза колебаний. В полуконтактной моде также применяется модуляционная методика измерения силового взаимодействия. В этом режиме зонд постукивает по поверхности, находясь как в области притяжения, так и в области отталкивания. В контактном режиме происходит разрушение поверхности образца и зонда. В бесконтактном режиме разрушение отсутствует, однако малы измеряемые сигналы. Поэтому наиболее часто при силовой визуализации поверхности используется полуконтактный режим детектирования взаимодействия. При этом вследствие кратковременности контакта воздействие зонда на поверхность минимально, а измеряемые сигналы достаточны для их надежного детектирования.

Существуют и другие, более простые способы детектирования силового взаимодействия, когда происходит прямое преобразование силового взаимодействия в электрический сигнал. Один из таких способов основан на использовании прямого пьезо-эффекта, когда прогиб пьезоматериала под действием силового взаимодействия приводит к появлению электрического напряжения [1].

Сканирующий фондовый .микроскоп,. - это прибор, дающийвозможность исследования свойств поверхностей материалов от микронного до атомарного уровня с помощью твердотельных зондовых сенсоров. С помощью такого микроскопа появилась возможность получать карты распределения целого ряда физических и физико-химических характеристик поверхности, таких как топография, распределение приповерхностных электростатических, магнитных, электродинамических сил, адгезионных сил, сил трения, тепловых полей, теплопроводности, электропроводности с высоким пространственным разрешением вплоть до атомного. Это стало возможным, с одной стороны, благодаря развитию аппаратных средств и программного обеспечения, а с другой - благодаря созданию зондов специальных типов.

Принцип работы СЗМ заключается в следующем. С помощью системы грубого позиционирования измерительный зонд подводится к поверхности исследуемого образца. При сближении образца и зонда на расстояние менее сотен нанометров зонд начинает взаимодействовать с поверхностными структурами анализируемого объекта. Перемещение зонда вдоль поверхности образца осуществляется с помощью сканирующего устройства, которое обеспечивает сканирование поверхности иглой зонда. Обычно оно представляет собой трубку из пьезокерамики, на поверхность которой нанесены три пары разделенных электродов [1].

Датчик положения зонда непрерывно отслеживает позицию зонда относительно образца и через систему обратной связи передает данные о ней в компьютерную систему, управляющую движением сканера. Компьютерная система служит, кроме управления сканером, также для обработки данных от зонда, анализа и отображения результатов исследования поверхности.

Исследования проводились на сканирующем зондовом микроскопе КапоЕ^са1ог (рис. 1). СЗМ ЫапоЕёисаЮг работает как. в атомно-силовом режиме, так. и А туннельном_ режимах.

Удалено: .

Удалено: Поэтому

Удалено: ,

Удалено: ,

Удалено: ,

Удалено: .

Удалено: Зондовый

Удалено: Микрос

Удалено:

Удалено: приближении

Удалено: .

Удалено:Ц

1.1. Устройство СЗМ ««ЧапоЕииса1ог»^

Удалено: .

Удалено:Ц

Отформатировано:

Отступ: Первая строка: мм, Справа: 6,3 мм

6,3

Рис. 1. Внешний вид измерительной головки СЗМ ЫапоЕСиса1ог. 1 - основание, 2 - держатель образца, 3 - датчик взаимодействия, 4 - винт фиксации датчика, 5 - винт ручного подвода, 6 - винты перемещения сканера с образцом, / ' 7 - защитная крышка с видеокамерой

)

I Ч f

' '' I

I Ч

i h 11 I ''/''/

Рис. 2. Конструкция измерительной головки,.

1 - основание, 2 механизмподвода, 3 винт ручного подвода,________I

4 - датчик взаимодействия, 5 - винт фиксации датчика, 6 - зонд,. 7 - предметный столик, 8 - сканер,. 9, 10 - винты перемещения сканера с образцом

На рис. 2 представлена конструкция измерительной головки КапоЕ^са1ог. На столик 7 помещается исследуемый образец. Далее с помощью винта 3 подводится датчик взаимодействия 4, закрепленный винтом 5. Система грубого подвода производит сближение датчика с образцом, после чего переключается на систему точного сближения. После захвата взаимодействия производится сканирование образца.

I </

л '<//'

-Jt

2. Метод локальной фиксации потенциала

Метод локальной фиксации потенциала, patch-clamp (англ. patch - заплатка, clamp здесь - захват, фиксация) - электрофизиологическая методика для изучения свойств ионных каналов, состоящая в том, что фрагмент клеточной мембраны изолируется с | помощью специальной пипетки. Эта методика дает возможность экспериментатору контролировать разность потенциалов между сторонами мембраны, а также помещать I ее в среду с определенным химическим составом. В этих хорошо контролируемых условиях измеряют ионные токи, проходящие через мембрану, что, в конечном итоге, позволяет делать выводы о том, как ионные каналы реагируют на электрическое и хими-I ческое воздействие. Метод настолько чувствителен, что позволяет наблюдать поведение и химические превращения единичных молекул, взаимодействующих с мембраной.

¥ 1VV

ш

VV

»Л1 %

I

V

Отформатировано: По

центру, Отступ: Первая строка: 0 мм

Отформатировано:

русский

Отформатировано:

Шрифт: 11 пт

Отформатировано:

Шрифт: 11 пт

Удалено: СЗМ №поЕёисаЬг работает как в атомно-силовом режиме, так и в туннельном режимах.^

На рис. 2 представлена конструкция измерительной головки NanoEducator.^

Отформатировано: По

центру, Отступ: Первая

строка: 0 мм

Отформатировано ( . . ш

Отформатировано ( . . Г21

Отформатировано [ . . Г31

Удалено:.

Удалено:-

Удалено: -

Отформатировано ( . . Г41

Удалено:

Удалено: -

Отформатировано ( . . Г51

Отформатировано f . . Г61

Отформатировано ( . . Г71

Удалено: -

Отформатировано [. . Г81

Отформатировано ( . . Г91

Отформатировано i ... Г101

Удалено: -

Отформатировано ( ... Г111

Удалено: -

Отформатировано [... Г121

Удалено:

Отформатировано [... Г131

Отформатировано [ ... Г141

Отформатировано f ... Г151

Удалено: -

Отформатировано [ ... Г161

Удалено:

Отформатировано ... Г171

Удалено: -

Отформатировано ... Г181

Удалено:Ц

Отформатировано ... Г191

I 220,

Разработаны экспериментальные протоколы, позволяющие измерять характеристики ионных каналов оптимальным образом [2].

Живые клетки покрыты мембраной, структурную основу которой составляет двойной слой липидов, слабо проницаемый для воды и практически непроницаемый для ионов. Каждая клетка должна обмениваться с внешней средой различными вещест-| вами, в частности, ионами. Перенос ионов через мембрану играет важную роль в процессах возбуждения клетки и передачи сигналов. Ионы проникают в клетку и выходят из нее через встроенные в мембрану белковые структуры - каналы и_транспор'Щры.

Транспор^рыт- это_мембранные белки,, .соединяющиеся _Р_пер_еносимы¥_ веществом по одну сторону мембраны, переносят это вещество через мембрану и затем его | освобождают. Каналы — это белки, которые выполняют функцию мембранных пор, так как формируют отверстия, сквозь которые могут проходить ионы. Мембранные каналы селективны. Селективность обусловлена радиусом пор и распределением заряженных функциональных групп в них. Существуют каналы, селективно пропускающие ионы натрия (натриевые каналы) и ионы калия (калиевые каналы), а также хлоридные каналы. Для каждого вида ионов существует не один, а довольно много видов каналов. Сквозь один канал за секунду может проходить ионов. _

Несмотря на фундаментальные различия в механизме транспорта через каналы и транспортеры, они могут быть образованы высокогомологичными белками.

При переходе ионов через мембранные каналы переносится заряд, а значит, через мембрану течет электрический ток. Проводимость одиночного канала в открытом состоянии варьирует рт _ 1-2 до _3_^_50_ пикосименсов в_ зависимости от вида_ канала. Это значит, что при разности потенциалов, равной 100 мВ, через канал потечет ток в несколько пикоампер [3, 4].

3. Результаты исследований

3.1. Вытяжка нанопипеток из стеклянных или кварцевых капилляров

Нанопипетки изготавливают методом механической вытяжки из стеклянных капилляров при тепловом нагреве. В качестве теплового источника можно использовать газовую горелку или лазерное излучение.

3.2. Изготовление датчиков^Конструкция универсального датчика

Датчик представляет собой пьезокерамическую трубку длиной ]_= 5-.0 мм, диаметром 1.0-1.5 мм и толщиной _стенкиь_= 0.20^.30 мм, жестко.за_крепленну_ю с_о_д_-

ного конца. На внутреннюю поверхность трубки нанесен проводящий электрод. На внешнюю поверхность трубки нанесены два электрически изолированных полуцилиндрических электрода. К свободному концу трубки прикреплена вольфрамовая проволока диаметром 100 мкм (рис. 3).

Рис. 3. Конструкция универсального датчика туннельного тока и силового взаимодействия

* '

* 1 / I '/ 1 '< / 1!' и 'о /

-'?"/ Л/,/ .

Удалено: Метод локальной фиксации потенциала, patch-clamp - электрофизиологическая методика для изуч| [20]

Удалено: и

Удалено:

Удалено:ё

Удалено: f

Удалено: ё

Удалено:

Удалено: f

Отформатировано

[21]

Удалено:

Удалено:

Удалено:

Отформатировано [ . [22]

Удалено: ё

Удалено: в зависимос

[23]

Удалено:

Отформатировано ( _ [24]

Удалено:

Отформатировано [ _ [25]

Код поля изменен

Удалено: ё

Удалено:

Отформатировано (  [26]

Отформатировано

[27]

Отформатировано ( _ [28]

Удалено: 1

Удалено:

Отформатировано

Отформатировано

Отформатировано

Отформатировано

Удалено:

Отформатировано

Отформатировано

Удалено:

Отформатировано

Отформатировано

Отформатировано

Отформатировано

Отформатировано

Отформатировано

Отформатировано [ _ [41]

1291

[30]

Х3Ц

132]

133]

Ш

Ж

136]

[37]

ХМ

139!

[40]

Удалено:f

Отформатировано ( _ [42]

I .

221

Свободный конец проволоки, использующийся в качестве нанозонда, заточен электрохимически, радиус закругления имеет величину 0,2-0,05 _мкм. В силу конструктивных особенностей вольфрамовая проволока имеет электрический контакт с внутренним электродом трубки, соединенным с заземленным корпусом прибора. При измерении туннельного тока пьезотрубка играет роль жесткой пассивной балки, при этом электрическое смещение прикладывается к образцу относительно заземленного зонда. Силовые измерения проводятся по модуляционной методике, когда зонд постукивает по поверхности, находясь как в области притяжения, так и в области отталкивания [5].

Нанопипетка приклеивается на конце пьезоэлектрической трубы (рис. 4). Для удобного приклеивания при изготовлении нанопипетки нужно подобрать режим, чтобы полученные пипетки имели удлинение 7^0 _мм._ _

пьезотрубка

НП

Рис. 4. Схематическое изображение нанопипетки, приклеенной к датчику

3.3. Измерения

3.3.1. Блок-схема экспериментальной установки^ Состав аппаратной части представлен на рис^5.____________________________________________________»

Регистры ввода-вывода Г < *

Процессорная 1 1 1 1

Удалено:

камера NE

Контроллер

Шаговых

двигателей

Источники питания +5,+12,+-15,+300 В,

, ЦАП ЦАП ЦАП

1 X,Y 1 Z Bias voltage

Удалено:.

Удалено: Схема датчика с нанопипеткой[

Удалено: .

Удалено: ,

Удалено: ,

Удалено: мм

Удалено:

Удалено: <sp>1

1 1

Отформатировано: По

центру, Отступ: Первая строка: 0 мм

Отформатировано:

Шрифт: 11 пт

Отформатировано:

Отступ: Первая строка: 0 мм

Отформатировано: По

ширине, Отступ: Первая строка: 9,5 мм

Удалено:

Удалено:f

Удалено: рисунке

АЦП

Рис. 5. Структурная схема аппаратных средств NanoEducator

Отформатировано:

Шрифт: 11 пт

Физический узел (головка NE) состоит из пьезокерамического трехкоординатного позиционера (сканера), расположенного на подвижной платформе, шагового двигателя для сближения зонда с образцом, предварительного усилителя сигналов, сменных зондов различного типа, а также цифрового видеомикроскопа. Для исследования клеток применяется специальный зонд с микропипеткой.

Электронный блок подключается к головке посредством кабелей._ В его состав _ „, - ^Удалено: 1 входят следующие функциональные узлы:

- цифровой контроллер, состоящий из платы MEC, которая реализует функции обработки цифровой информации и осуществляет связь с персональным компьютером через контроллер шины USB и платы ADEPT, которая содержит аналого-цифровые и

Отформатировано:

Отступ: Первая строка: 0 мм

Удалено: 1

Отформатировано:

Отступ: Первая строка: 6,3 мм, Справа: 6,3 мм

222г_

цифроаналоговые преобразователи (АЦП и ЦАП) и связана с платой MEC по внутреннему интерфейсу^

- аналоговые платы - контур обратной связи, синхродетектор с встроенным генератором, высоковольтные усилители (ВВУ), контроллер шаговых двигателей и источники питания.

Работа прибора происходит следующим образом. Для исследования клеток используется режим силового микроскопа. Исследуемый образец, прикрепленный к подложке, устанавливается на предметный столик трехкоординатного сканера. Зонд с микропипеткой устанавливается в держатель, и производится автоматический поиск его резонансной частоты при помощи генератора переменной частоты и синхродетектора. Кончик микропипетки колеблется на резонансной частоте с амплитудой в несколько десятков нанометров. Затем включают двигатель, который осуществляет сближение зонда с поверхностью клетки. При необходимости взаимное расположение зонда и образца корректируется микровинтами вручную и контролируется на мониторе цифрового микроскопа.

Когда кончик микропипетки начинает касаться поверхности клетки, амплитуда механических колебаний зонда уменьшается, что немедленно регистрируется датчиком силового взаимодействия, и через предварительный усилитель этот сигнал поступает на контур обратной связи (ОС) и измерительный АЦП. Шаговый двигатель останавливается, сближение прекращается. Сигнал обратной связи поступает на высоковольтный усилитель (ВВУ2), который управляет пьезокерамическим сканером по оси Z таким образом, что неконтролируемое изменение зазора между зондом и клеткой (вследствие вибраций и других причин) компенсируется передвижением предметного столика с клеткой вверх или вниз.

Таким образом, амплитуда колебаний зонда поддерживается постоянной при помощи петли обратной связи. Силовое механическое воздействие на поверхность клетки пропорционально амплитуде колебаний, следовательно, среднее значение силы давления микропипетки на клетку поддерживается постоянным. Эта сила составляет приблизительно 10^8_Н и не разрушает клетку.

В приборе имеется возможность двигать образец относительно зонда в горизонтальной плоскости при помощи пьезоэлементов трехкоординатного сканера на расстояние до 100 мкм. Осуществляя построчную развертку при помощи высоковольтных усилителей X,Y, подложка с клеткой может двигаться относительно кончика микропипетки, при этом контур обратной связи поддерживает постоянной амплитуду колебаний. Регистрируя напряжение, которое управляет перемещением образца по вертикали, при помощи АЦП в каждой точке на плоскости можно построить топографическую карту высот клетки, иными словами, ее трехмерное изображение. Цифровой контроллер обеспечивает развертку по координатам X,Y при помощи ЦАП и передачу информации в ПК.

В приборе имеется .возможность прикладывать разность потенциалов и регистрировать ток, протекающий через микропипетку и исследуемую клетку, таким образом можно получать распределение локальных электрических свойств клетки. Для измерения локальной механической жесткости клеточной мембраны сканирование в точке измерения останавливается, разрывается петля обратной связи, и образец приближается или удаляется от кончика зонда (микропипетки) с помощью пьезосканера, перемещающего его вдоль координаты Z. При этом измеряется зависимость амплитуды колебаний пьезотрубки от расстояния между зондом и образцом. .Угол наклона этой кривой пропорционален локальной жесткости объекта.

3.3.2. Визуализация тест-объектов нанопипеткой._ Перед началом измерения локальной жесткости и ионных токов необходимо убедиться в том, что нанопипетка может работать как зонд СЗМ. Для этого было выполнено предварительное сканирова-

Удалено::

Отформатировано:

надстрочные

Удалено: Прибор

Удалено:

: развертки

Удалено: обеспечивает Удалено: Прибор имеет

Удалено: ,

Удалено:Ц

Отформатировано: По

ширине

Удалено:f

Удалено: ,

Удалено:Ц

Отформатировано:

Отступ: Первая строка: 6,3 мм, Справа: 6,3 мм

ние нанопипеткой различных тестовых образцов. На рис. 6 представлено трехмерное изображение торца нанопипетки. Это изображение получено при сканировании тест-объекта в виде регулярно расположенных острий с радиусом закругления, значительно меньшим, чем поперечный размер торца нанопипетки.

Рис. 6. Исследование нанопипетки с помощью_______________*

тест-объекта - дифракционной решетки ТСТ1

На рис. 7. представлены СЗМ - изображения эритроцитов человека, полученных при сканировании нанопипеткой (а) и обычным вольфрамовым зондом (б). На рис. 8, 9. представлено СЗМ-изображение поверхности СБ диска, полученное с помощью нанопипетки. На рис. 10 представлено типичное СЗМ-изображение подложки с нанесенной на нее колонией бактерий (сенная палочка) полученное с помощью зонда в виде нанопипетки. Анализ полученных изображений позволяет сделать вывод о том, что пьезоре-зонансный датчик силового взаимодействия с нанопипеткой в качестве зонда дает адекватные СЗМ-изображения.

Отформатировано:

Шрифт: 11 пт

Отформатировано:

Отступ: Первая строка: 0 мм

Отформатировано:

Шрифт: 11 пт

Удалено:

Отформатировано:

Шрифт: 11 пт

Удалено:Ц

91 ь

20000 ^^^^ 15000 ^^^

10000 5000

^----* 20000

\ —15000 о 10000

5000

о

а) б)

д_______________________________

Рис. 7. СЗМ-изображения клеток крови - эритроцитов, полученных а) нанопипеткой,

б) вольфрамовым зондом_______________________

Рис. 8. Скан поверхность СО-диска

Отформатировано:

Шрифт: 6 пт

Отформатировано:

Шрифт: 11 пт

Отформатировано:

Отступ: Первая строка: 0 мм

Отформатировано:

Шрифт: 11 пт

Отформатировано:

Шрифт: 5 пт

Удалено: На рис. 8, 9. представлено СЗМ-изображение поверхности СБ диска, полученное с помощью нанопипет-ки.Ц

Отформатировано:

Шрифт: 11 пт

Удалено:Ц

Отформатировано:

Отступ: Первая строка: 6,3 мм, Справа: 6,3 мм

224г_

Рис. 9. Профиль СО-диска

Рис. 10. СЗМ-изображение бактерии сенной палочки, _________

полученное с помощью нанопипетки

3.3.3. Измерение жесткости клеточной мембраны.,С помощью атомно-силового микроскопа можно изучать особенности локального силового взаимодействия зонда с поверхностью и на основании результатов данных исследований судить о свойствах поверхности различных образцов. С этой целью снимаются так называемые кривые подвода зонда к поверхности и кривые отвода. Фактически это зависимости величины изгиба кантилевера (а, следовательно, и силы взаимодействия зонда с поверхностью) от координаты 2 при сближении датчика и образца. Аналогичные измерения проводятся при удалении зонда от поверхности. При приближении к поверхности образца зонд попадает в область действия сил притяжения. Это вызывает изгиб кантилевера в направлении к поверхности. При этом может наблюдаться скачок зонда к поверхности, обусловленный наличием большого градиента сил притяжения вблизи поверхности образца. При дальнейшем сближении датчика и образца зонд начинает испытывать отталкивание со стороны поверхности, а кантилевер изгибается в другую сторону. Наклон кривой Д2 на этом участке определяется упругими свойствами образца и кантилевера.

На рис. 11 представлено СЗМ-изображение бактерий на поверхности покровного стекла. Точка 1 лежит на поверхности стекла, точка 2 - на поверхности клетки. На рис 12 изображены кривые подвода зонда в точках 1 и 2._ На рис 11 изображены кривые подвода зонда в точках 1 и 2.

Как видно из результатов измерений, кривая подвода к поверхности стекла имеет более крутой наклон, чем кривая подвода к поверхности бактерии, что свидетельствует о меньшей жесткости клеточной мембраны по сравнению с покровным стеклом и указывает на возможность применения пьезорезонансного силового датчика с зондом в виде нанопипетки для измерения локальной жесткости.

I

№

ч 'Ч ч Ч

- V 1

Отформатировано:

Шрифт: 11 пт

Удалено:

Отформатировано:

Шрифт: 6 пт

Отформатировано:

Отступ: Первая строка: 0 мм

Отформатировано:

Шрифт: 11 пт

Удалено: На рис. 10 представлено типичное СЗМ-изображение подложки с нанесенной на нее колонией бактерий (сенная палочка) полученное с помощью зонда в виде нанопипетки. Анализ полученных изображений, позволяет сделать вывод о том, пьезоре-зонансный датчик силового взаимодействия с нанопипеткой в качестве зонда дает адекватные СЗМ-изображения.^

Отформатировано:

Шрифт: 11 пт

Отформатировано:

Отступ: Первая строка: 0 мм

Отформатировано:

Шрифт: 11 пт

Отформатировано:

Шрифт: 11 пт

Отформатировано:

Шрифт: 11 пт

Отформатировано:

Шрифт: 11 пт

Отформатировано:

Шрифт: 11 пт

Отформатировано:

Шрифт: 11 пт

Отформатировано:

Шрифт: 11 пт

Отформатировано: По

левому краю

Отформатировано: По

ширине

Удалено:f

Отформатировано:

Шрифт: курсив

Отформатировано:

Шрифт: курсив

Удалено:Ц

Отформатировано:

Отступ: Первая строка: 6,3 мм, Справа: 6,3 мм

Рис. 11. СЗМ-изображение бактерий на поверхности покровного стекла

к

I F*- ?"

xt" I f I

п*«^»«^.^ : M-MnjcAfq

а) б)

A__________________________________

Рис. 12. Кривые подвода зонда а) к поверхности стекла, б) к поверхности бактерии

Живая клетка, как правило, функционирует в жидкой среде. Поэтому было необходимо проверить работу датчика в жидкости. Например, можно было ожидать уменьшения добротности колебательной системы под действием вязкого трения в жидкости, проявления капиллярных сил или влияния воздушных пузырьков, растворенных в жидкости. Однако измерения, проведенные в водной среде, не выявили заметных различий при работе датчика в газе или жидкости.

На рис. 13 представлены СЗМ-изображения поверхности CD-диска (рис. 12, а) и поверхности трековой мембраны из лавсана (рис. 12, б), полученные в воде.

О lui] ac:i ИВ "с /

а) б) ///,

Рис. 13. СЗМ-изображения, полученные с помощью нанопипетки в воде,_____«f/'/

а) поверхность CD-диска, б) поверхность трековой мембраны из лавсана

3.3.3. Измерение ионного тока.. Для измерения ионных токов в пипетку был помещен электрод (вольфрамовая проволока диаметром 50 мкм или 25 мкм), который соединен с заземлением датчика. ..Исследовался модельный объект в виде микроканальной полупроводниковой пластины, закрепленной на проводящей подложке, к которой прикладывался электрический потенциал, относительно нулевого электрода, расположенного внутри пипетки. Образец погружался в проводящий раствор и сканировался нано-

Отформатировано:

Шрифт: 5 пт

Отформатировано:

Шрифт: 11 пт

Отформатировано:

Отступ: Первая строка: 0 мм

Отформатировано:

Шрифт: 4 пт

Отформатировано:

Отступ: Первая строка: 0 мм

Отформатировано:

Шрифт: 11 пт

Удалено: Как видно из результатов измерений, кривая подвода к поверхности стекла имеет более крутой наклон, чем кривая подвода к поверхности бактерии, что свидетельствует о меньшей жесткости клеточной мембраны по сравнению с покровным стеклом и указывает на возможность применения пьезорезонансного силового датчика с зондом в виде нано-пипетки для измерения локальной жесткости. ^

Удалено: ,

Отформатировано:

Шрифт: 5 пт

Отформатировано:

Шрифт: 11 пт

Отформатировано:

Отступ: Первая строка: 0 мм

Отформатировано:

Шрифт: 11 пт

Отформатировано:

Шрифт: 11 пт

Отформатировано:

Шрифт: 11 пт

Отформатировано:

Шрифт: 11 пт

Отформатировано:

Шрифт: 11 пт

Удалено:f Удалено:Ц Удалено: Ц

Отформатировано:

Отступ: Первая строка: 6,3 мм, Справа: 6,3 мм

пипеткой. При этом на экран компьютера выводились как силовое, так и токовое изо- Удалено: выводилось

бражения. Отметим, что для того, чтобы водный раствор заполнял внутренний канал нанопипетки и контактировал с внутренним W электродом, стеклянная поверхность нанопипетки обезжиривалась с помощью раствора хромпика.

Рис. 14. СЗМ-изображение микроканальной пластины, полученное в полуконтактном

/,/ < i,i > i,i I i,i ; V '

силовом режиме

На рис. 15 представлено силовое изображение одиночного канала микроканальной пластины, а на рис. 16 -_ диаграмма ионного тока этого канала, полученная одновременно с силовым изображением. Величина ионного тока составила 1,1 нА.

I / I !

Рис. 15. СЗМ-топография одного_канала_, Рис. 16. Диаграмма ионного тока

X____________________________________________________________________

На рис. 17 представлены силовые изображения двух каналов, на рис. 18 -_диа-грамма ионных токов для этих каналов, полученная одновременно с силовым изображением Величина ионного тока составила 2,3 нА.

<м< I »! ' I

V ' I ! >1 < ti'i ' I 'I ' I'll l'H

I 'I' ;

I i/i / №l I I, I 'll !

I "' '/ I II' I, I II' 11 I fcV /, /

' !"< ' I ' I, ' -

V '' ' / iff/, //' ;

Рис. 17. СЗМ-топография,двух каналов___Рис. 18. Диаграммаионньж токов,

Удалено:•

Отформатировано:

Шрифт: 11 пт

Отформатировано:

Отступ: Первая строка: 0 мм

Удалено: Отметим, что для того, чтобы водный раствор заполнял внутренний канал нанопипетки и контачил с внутренним W электродом, стеклянная поверхность нанопипетки обезжиривалась с помощью раствора хромпика. Ц

Удалено: -

Удалено:Ц

Удалено:

Отформатировано:

Шрифт: 11 пт

Отформатировано: По

центру

Отформатировано:

Шрифт: 11 пт, русский

Отформатировано:

Шрифт: 11 пт

Отформатировано:

Шрифт: 11 пт, русский

Удалено: канала

Отформатировано:

Шрифт: 11 пт

Удалено: Величина ионного тока составила 1,1 нА.^

Удалено: -

Удалено:

Отформатировано:

Шрифт: 11 пт

Отформатировано: По

центру

Удалено:

Отформатировано:

Шрифт: 11 пт, русский

Отформатировано

Отформатировано

Отформатировано

Удалено: Рис. 18. Д^

Отформатировано

Отформатировано

Отформатировано

Отформатировано

Отформатировано

I43L

I44L

I45L

146L

I4ZL

I48L

I49L

I50L

I51L

Удалено:Ц

Отформатировано

J52L

Заключение

Таким образом, исследования разработанного нами пьезорезонансного датчика с зондом в виде стеклянной нанопипетки показали, что датчик данного типа позволяет получать адекватные СЗМ изображения биологических клеток, находящихся в жидкой среде, измерять локальную механическую жесткость и электрическую проводимость нанообъектов. Применение подобного датчика позволяет объединить СЗМ и «patch clamp» метод в одном приборе при условии, что будет решена проблема закрепления исследуемых клеток на твердой подложке в жидкой среде.

В результате проведения исследований получены следующие результаты.

1. Адаптирована технология изготовления стеклянных (боросиликатное стекло) нано-пипеток для использования нанопипеток в качестве зонда СЗМ.

2. Разработана технология и изготовлен опытный образец универсального СЗМ датчика, обеспечивающий одновременные измерения в режиме полуконтактной силовой моды и измерения ионных токов.

3. Разработаны и испытаны аппаратно-программные средства, обеспечивающие одновременно силовые измерения и измерения ионных токов.

4. Получены СЗМ изображения тест-объектов и биологических клеток с помощью зонда в виде нанопипетки.

5. Проведены измерения локальной жесткости мембраны бактерии сенной палочки.

6. Проведены измерения локальных ионных токов на модельном объекте в виде микроканальной пластины.

7. Показано, что разработанный датчик может быть адаптирован к прибору «NanoEducator», и на его основе реализована новая методика диагностики клеток, находящихся в функционально активной жидкой среде, с нанометровым пространственным разрешением.

работа выполнена в рамках федеральной целевой_программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы»,, научно-исследовательские работы по лоту «Работы по проведению проблемно-ориентированных поисковых исследований и созданию научно-технического задела в области живых систем по критической технологии «Кде- 11 .точные технологии» (мероприятие 1.2 Программы)». Государственный контракт от 11 «25» июня 2007 г. № 02.512.11.2136. «Визуализация микро- и наноструктуры клеток в нативном состоянии с измерением жесткости и электрической проводимости кде.точ-

ных мембран».

Дитература

1. Миронов В ^Основы сканирующей зондовой МИКРОСКОПИИ! —ММ.: Техносфера, 20' -144 с.

2_ M.G. Langer, W. Öffner, H. Wittmann, H. Flösser, and H. Schaar, W. Häberle, A. Pralle J. P. Ruppersberg, J. K. H. Hörber. // A scanning force microscope for simultaneous force and patch-clamp measurements on living cell tissues. Review of Scientific Instruments -June 1997 - Volume 6§._—Issue 6 -Р. 2583,-2590.

3. B. Sakmann, E. Neher. Single-channel recording, 1995.

4. Microelectrode techniques: The Plymouth workshop handbook. —Cambridge, UK: Company of Biologists, 1994.

5. Васильевх А,.А,Т Керпелева С.Ю. Котов В.ВТ Сапожников И.Д. Голубок А.О. Датчик локального силового и туннельного взаимодействий в сканирующем зондовом микроскопе // Научное приборостроение. - 2005. - Т. 15. - № 1.

Удалено:,

Удалено: основные

Отформатировано Г .. [53] 1

'ГС 1 Удалено: -

Отформатировано Q .. [54] )

'Г "1 Удалено: Список л

Отформатировано .. [55] )

Удалено:ы

Отформатировано .. [56] 1

U1 Удалено: Миронов../ .. [57] ]

Отформатировано .. [58] )

Отформатировано .. [59] )

Удалено:

Отформатировано Г .. [60] )

Отформатировано Г .. [61] )

Отформатировано .. [62] ]

Отформатировано .. [63] )

Отформатировано .. [64] ]

1А  Отформатировано .. [65] )

Отформатировано Q .. [66] )

Отформатировано .. [67] ]

А\  Отформатировано .. [68] )

Отформатировано .. [69] )

Отформатировано Q .. [70] ]

Отформатировано .. [71] )

Отформатировано .. [72] )

Отформатировано Q .. [73] )

Отформатировано .. [74] )

Отформатировано .. [75] 1

Отформатировано Q .. [76] )

Отформатировано .. [77] )

Отформатировано Q .. [78] )

Отформатировано .. [79] )

Отформатировано .. [80] )

Отформатировано Q .. [81] )

Отформатировано Q .. [82] )

Отформатировано Q .. [83] 1

Отформатировано Q .. [84] )

Отформатировано .. [85] )

Отформатировано .. [86] 1

Отформатировано .. [87] )

Отформатировано .. [88] )

Отформатировано Q .. [89] 1

Отформатировано .. [90] )

Отформатировано Q .. [91] )

Отформатировано Q .. [92] )

Отформатировано .. [93] )

Отформатировано .. [94] 1

Отформатировано .. [95] )

Отформатировано .. [96] )

Отформатировано .. [97] 1

Отформатировано .. [98] )

Отформатировано .. [99] )

[ Отформатирован^ .. [100] 1

с Отформатировано .. [101] ]

Отформатировано .. [102] )

Отформатировано .. [103] )

Отформатировано .. [104] ]

Отформатировано .. [105] )

Отформатировано .. [106] )

Отформатировано .. [107] )

Отформатировано .. [108] )

Отформатировано .. [109] ]

Отформатировано .. [110] )