СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНСОДЕРЖАЩИХ ЛИПОСОМ
ANTIGEN-CONTAINING LIPOSOME PREPARATION PROCESS

Изобретение относится к медицине, а более конкретно к проблеме создания носителя, содержащего антигенный материал.
Проблема специфической профилактики мелиоидоза с помощью химических вакцин, создающих напряженный иммунитет и лишенных побочных эффектов, еще далека от успешного решения. В работах последних лет показано, что отдельные фракции поверхностных мелиоидозных антигенов обладают протективной способностью при небольших заражающих дозах возбудителя мелиоидоза (Пивень Н.Н. Антигенный состав возбудителей мелиоидоза и сапа в аспектах идентификации, диагностики и патогенности: Дисс… докт. мед. наук. - Волгоград, 1997. - 296 с.); Викторов Д.В. Белковый и антигенный состав штаммов В. pseudomallei различной вирулентности: Дисс… канд. биол. наук. - Волгоград, 1997. - 110 с). Ряд авторов показали возможность повышения протективности антигенов различных возбудителей иммобилизованных в липосомы (синегнойной инфекции, чумы, бруцеллеза) (Минухин Б.В., Бородина Н.С., Цыганенко А.Я. с соавт. Иммуногенные свойства липосомальной формы анатоксина синегнойной палочки // Вестн. АМН СССР. - 1990. - №8. - С.44-47; Бямбаа А., Ефременко В.И., Таран Т.В., Таран В.И., Оверченко В.В. Изучение протективных свойств антигенсодержащих липосом при чуме // Диагностика, лечение и профилактика опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология. Ветеринария: Материалы Юбил. Научн. - практ. конференции, посвященной 70-летию НИИ Микробиологии МО РФ, 30 ноября - 1 декабря 1998. - Киров, 1998. - С.62-63; Куликов В.Н., Кашкин К.П., Драновская Е.А. Включение протективного антигена В. abortus в липосомы и иммуногенные свойства антигенсодержащих липосом // ЖМЭИ. - 1985. - №12 - С.69-72).
Перспективность липосом основывается на двух их основных свойствах: сходстве с природными мембранами и универсальности. Универсальность состоит в том, что благодаря полусинтетической природе липосом можно широко изменять их по размерам, поверхностным характеристикам, составу. Липосомы не токсичны и легко биодеградируемы. Возможность использования в меньших дозах, снижение частоты аллергических и иммунологических реакций, внутриклеточная направленность везикул и увеличение времени элиминации - вот основные преимущества использования липосом. Вместе с тем проблема экстренной иммунопрофилактики мелиоидоза разработана недостаточно.
Приготовление моноламеллярных липосом, содержащих антигены путем впрыскивания этанольного раствора фосфолипидов в водную фазу:
50 мг смеси липидов (фосфатидилхолин, холестерин, дицетилфосфат в соотношении 7:2:1) растворяют в 1 мл 96° этанола. Этанольный раствор липидов набирают в шприц с иглой и быстро вводят в 15 мл раствора включаемого 100 мкг антигенного материала в 0,01 М фосфатном буфере рН 7,5. Невключившийся материал удаляют центрифугированием. Образующиеся липосомы включают во внутренний объем в среднем 2,5% материала. Данный метод позволяет включать лабильные биологические макромолекулы без потери специфической активности. Недостатком метода является ограничение в количестве липидов - 3,5 мг, которое можно внести в 1,0 мл водной фазы, что требует в ряде случаев последующего концентрирования препарата липосом (Kremer J.М.Н., Esker М.W.J., Pathmamanoharan С., Wiersema Р.Н. Vesicles of variable diameter prepared by a modified injection method. - Biochemistry, 1977, vol.16, p.3933-3935).
Приготовление липосом методом «ручного» встряхивания:
100 мг смеси липидов (фосфатидилхолин, холестерин, дицетилфосфат в соотношении 7:2:1) растворяют в 50 мл хлороформа в 200 мл круглодонной колбе для роторного испарителя и при пониженном давлении проводили выпаривание органического растворителя. Время окончания выпаривания определяли по исчезновению запаха хлороформа в колбе, при этом на ее стенках образовывалась тонкая пленка липидов. Снятую с роторного испарителя колбу продували газообразным азотом для предотвращения окисления липидов и затем вносили 5 мл, содержащих 100 мкг антигенного материала в 0,01 М фосфатном буфере рН 7,2. После 2-часовой инкубации при комнатной температуре смеси для образования гомогенной суспензии липосом в колбу помещали несколько стеклянных бусинок и энергично встряхивали в течение 5 минут. Невключившийся антигенный материал удаляли центрифугированием. Мягкие условия приготовления и большие размеры липосом позволяют использовать этот метод для включения крупных биологических макромолекул, без значительной потери активности. Недостатком метода является низкий процент включения материала (1-3%) (Acuto O., Pugliese O., Muler М., Tosi R. Preparation of liposomes incorporating membrane components from human lymphoid cells // Tissue Antigenes. - 1979. - V.14, №5. - P.385-397).
3
Наиболее близким аналогом является метод получения липосом предложенный Szoka F., Papahandjopoulos D. Procedure for preparation of liposomes with large internal space and high capture by reverse-phase evaporation // Proc. Nat. Sci. USA. - 1978. - V.75, N 9. - P.4194-4198. Согласно методу 30 мг липидов (фосфатидилхолин, холестерин, дицетилфосфат в соотношении 7:2:1) растворяют в 3 мл смеси эфира с хлороформом 2:1 и вносят в круглодонную колбу роторного испарителя объемом 100 см 1 мл раствора включаемого материала в 0,01 М фосфатном буфере рН 7,5, добавляют к раствору липидов в органической фазе и обработкой ультразвуком 20 кГц, мощностью 200 Вт в течение 5 минут достигают образования эмульсии типа «вода в масле». Колбу с эмульсией присоединяют к роторному испарителю и постепенно понижая давление так, чтобы не происходило кипение и полностью удаляют органический растворитель. Об окончании выпаривания судят по образованию геля в колбе и исчезновения запаха органического растворителя. В процессе выпаривания поддерживают температуру смеси выше температуры фазового перехода фосфолипидов (20-25°С). Колбу снимают с испарителя, к образовавшемуся гелю добавляют 5 мл 0,01 М фосфатного буфера рН 7,5 и встряхивают до образования гомогенной суспензии липосом. Липосомы, полученные данным методом, характеризуются высокой эффективностью включения - до 50-60% и большими размерами - до 1,0-1,2 мкм. Невключившийся материал удаляют центрифугированием. Недостатками является малая устойчивость эмульсии и геля типа «вода в масле», вследствие чего в каждом конкретном случае требуется подбор состава липидной смеси, техники выпаривания и навыка в работе, использование смеси растворителей с разной температурой кипения, что приводит к неоднородному образованию фосфолипидных везикул (температура кипения эфира + 34,5°С, температура кипения хлороформа + 61,2°С), а также токсическое воздействие ионов титана на антигенный материал и фосфолипиды (Г.Грегориадис., А.Аллисон. Липосомы в биологических системах. - М.: Медицина. - 1983. - С.28-29).
Целью изобретения является разработка способа получения антигенсодержащих липосом с высоким количеством иммобилизации фракций (Н, D) антигена возбудителя мелиоидоза.
Поставленная цель достигается тем, что вследствие увеличения липидной нагрузки, повышается стабильность мембраны липосом, их количество и возрастает процент инкапсуляции антигенных мелиоидозных фракций (Н, D). Универсальность носителя обеспечивается нейтральным зарядом мембраны липосом. Получение эмульсии на роторном миксере позволяет исключить токсическое влияние ионов титана (титановый зонд ультразвукового дезинтегратора) на антигенные фракции. Для этого 56, 7 мг смеси липидов (фосфатидилхолин, холестерин в соотношении 7:3) растворяли в 3,8 мл хлороформа. Включаемый материал, растворенный в 0,01 М фосфатном буфере рН 7,2, в объеме 1,5 мл добавляли к раствору липидов в органической фазе, и обработкой на роторном миксере мощностью 500 Вт при 15000 об/мин в течение 1 мин достигали образования эмульсии. При пониженном давлении в роторном испарителе полностью удаляли органический растворитель. К образовавшемуся гелю добавляли 5 мл 0,01 М фосфатного буфера рН 7,2 и тщательно перемешивали в колбе на роторном испарителе. Удаление невключившегося антигенного материала осуществляли диализом. В качестве диализующего раствора использовали буфер, взятый для приготовления липосом (0,01 М фосфатный буфер рН 7,2). Диализ проводили при + 4°С, постоянно перемешивая на магнитной мешалке диализующий раствор в течение 2 ч, после чего производили смену буфера. Для полного удаления невключившегося в липосомы антигенного материала достаточно 4-х смен буфера.
Вследствие увеличения липидной нагрузки достигнута высокая устойчивость эмульсии и геля типа «вода в масле». Универсальность носителя обеспечивается нетральным зарядом мембраны липосом. Используемый метод позволяет применять один органический растворитель с определенной температурой кипения. Получение эмульсии на роторном миксере позволяет исключить токсическое влияние ионов титана (титановый зонд ультразвукового дезинтегратора) и сократить время обработки. Данный способ позволяет инкапсулировать внутрь липосом 89-93% Н и D фракций мелиоидозного антигена.
Примеры конкретного выполнения.
Пример 1. Иммобилизация внутрь липосом Н-фракции антигена возбудителя мелиоидоза.
Для этого 56, 7 мг смеси липидов (фосфатидилхолин, холестерин в соотношении 7:3) растворяли в 3,8 мл хлороформа. 100 мкг фракции Н-антигена возбудителя мелиоидоза, в 0,01 М фосфатном буфере рН 7,2, в объеме 1,5 мл добавляли к раствору липидов в органической фазе и обрабатывали на роторном миксере мощностью 500 Вт при 15000 об/мин в течение 1 мин до образования эмульсии. При пониженном давлении в роторном испарителе полностью удаляли органический растворитель. К образовавшемуся гелю добавляли 5 мл 0,01 М фосфатного буфера рН 7,2 и тщательно перемешивали в колбе на роторном испарителе. Удаление невключившегося материала (фракции Н-антигена) осуществляли диализом. В качестве диализующего раствора использовали буфер, взятый для приготовления липосом (0,01 М фосфатный буфер рН 7,2). Диализ проводили при + 4°С, постоянно перемешивая на магнитной мешалке диализующий раствор в течение 2 ч, после чего производили смену буфера. Для полного удаления невключившегося в липосомы антигенного материала проводили 4 смены буфера. Процент иммобилизации Н-фракции определяли хемилюминесценцией и радиоизотопным методом. Он составлял 89%. При этом сорбции Н-фракции антигена на поверхности мембраны липосом не отмечалось. Размеры липосомального препарата при электронно-микроскопическом исследовании составляли 600-800 нм (фиг.1). Степень окисления лиипдов мембраны липосом составляла 0,8±0,02 (перекисный индекс Клейна) (Klein R.A. The detection of oxidation in liposome preparations // Biochim. Biophys. Acta. - 1970. - N 21. - P.486-489).
Пример 2. Получение инкапсулированной в липосомы D-фракции антигена возбудителя мелиоидоза
При получении липосом с D-фракцией антигена возбудителя мелиоидоза методика приготовления препарата идентична указанной в примере №1. Процент иммобилизации D-фракции составлял 93%. При этом сорбции D-фракции антигена на поверхности мембраны липосом не отмечалось. Размеры липосомального препарата при электронно-микроскопическом исследовании составляли 600-700 нм (фиг.2). Степень окисления липидов мембраны липосом составляла 0,8±0,02.
Таким образом, вследствие увеличения нагрузки липидов в исходных навесках достигнута высокая стабильность и пластичность мембраны липосом и возросло их количество. Получение эмульсии на роторном миксере позволило исключить токсическое влияние на антигенный материал ионов титана (титановый зонд ультразвукового дезинтегратора) и сократить время обработки. Универсальность носителя обеспечивается нейтральным зарядом мембраны липосом. Данный способ позволяет получать стабильные липосомы, содержащие 89-93% Н- и D-фракций антигенов возбудителей мелиоидоза.