СПОСОБ УЛУЧШЕНИЯ СТАБИЛЬНОСТИ АНТИТЕЛ

1. Способ отбора антитела, стабильного к деградации, включающий стадии, при которых
α
а) у каждого остатка Asn и Asp в Fv домене антитела определяют конформационную подвижность С-атома с использованием ансамбля моделей, основанных на гомологии,
б) у каждого остатка Asn и Asp в Fv домене антитела определяют размер аминокислотного остатка, прилегающего к остатку Asn или Asp со стороны С-конца,
α
в) выбирают антитело, у которого С-атом является конформационно неподвижным и у которого со стороны С-конца к Asn или Asp прилегает аминокислотный остаток большого размера.
2. Способ выявления антитела, подверженного деградации аспарагина (Asn), включающий стадии, при которых
α
а) у каждого остатка Asn в Fv домене антитела определяют конформационную подвижность С-атома с использованием ансамбля моделей, основанных на гомологии,
б) у каждого остатка Asn в Fv домене антитела, к которому со стороны С-конца прилегает аминокислотный остаток малого размера, определяют торсионный (двугранный) угол фи остова,
в) у каждого остатка Asn в Fv домене антитела, к которому со стороны С-конца прилегает аминокислотный остаток малого размера и у которого торсионный угол фи остова превышает -75,2 градусов, определяют доступность для растворителя и наличие изменения вторичной структуры в направлении N-конца от остатка Asn, а также расстояние между указанным изменением и остатком Asn, выраженное в аминокислотных остатках, и
г) выявляют антитело, подверженное деградации аспарагина (Asn), если
α
i) остаток Asn находится в петле CDR 1, его С-атом обладает конформационной подвижностью и прилегающий со стороны С-конца аминокислотный остаток представляет собой Asp, Pro, Thr или Asn,
α
ii) С-атом остатка Asn обладает конформационной подвижностью, имеет торсионный угол фи остова менее -75,2 градусов, и аминокислотный остаток, прилегающий к остатку Asn со стороны С-конца, имеет малый размер, или
α
iii) С-атом остатка Asn обладает конформационной подвижностью, имеет торсионный угол фи остова более -75,2 градусов, имеет высокую доступность для растворителя, а изменение вторичной структуры происходит на расстоянии более 3 аминокислотных остатков от остатка Asn в направлении амино-конца.
3. Способ отбора одного или нескольких антител с улучшенной стабильностью аспарагина (Asn), включающий стадии, при которых
а) берут два или более антител,
α
б) у каждого остатка Asn в Fv домене каждого антитела определяют конформационную подвижность С-атома с использованием ансамбля моделей, основанных на гомологии,
в) у каждого остатка Asn в Fv домене каждого антитела, к которому со стороны С-конца прилегает аминокислотный остаток малого размера, определяют торсионный угол фи остова,
г) у каждого остатка Asn в Fv домене каждого антитела, к которому со стороны С-конца прилегает аминокислотный остаток малого размера и у которого торсионный угол фи остова составляет более -75,2 градусов, определяют доступность для растворителя и наличие изменения вторичной структуры, расположенной в направлении N-конца от остатка Asn, а также расстояние между указанным изменением и остатком Asn, выраженное в аминокислотных остатках, и
д) исключают из двух или более антител те антитела, которые имеют по меньшей мере одно из следующего:
α
i) остаток Asn, находящийся в петле CDR 1, у которого С-атом обладает конформационной подвижностью и прилегающий со стороны С-конца аминокислотный остаток представляет собой Asp, Pro, Thr или Asn,
α
ii) остаток Asn, у которого С-атом является конформационно подвижным, торсионный угол фи остова составляет менее -75,2 градусов, а примыкающий со стороны С-конца аминокислотный остаток имеет малый размер, или
α
iii) остаток Asn, который имеет конформационно подвижный С-атом, торсионный угол фи остова более -75,2 градусов, который имеет высокую доступность для растворителя, а изменение вторичной структуры происходит на расстоянии более 3 аминокислотных остатков от остатка Asn в направлении амино-конца,
и таким образом отбирают одно или несколько антител с улучшенной стабильностью аспарагина (Asn).
4. Способ выявления антитела, подверженного деградации аспартата (Asp), включающий стадии, при которых:
α
а) у каждого остатка Asp в Fv домене антитела определяют конформационную подвижность С-атома с использованием ансамбля моделей, основанных на гомологии,
б) у каждого остатка Asp в Fv домене антитела определяют размер аминокислотного остатка, прилегающего к остатку Asp со стороны С-конца,
в) у каждого остатка Asp в Fv домене антитела определяют наличие изменения вторичной структуры, расположенной в направлении С-конца от остатка Asp, а также расстояние между указанным изменением и остатком Asp, выраженное в аминокислотных остатках, и
г) выявляют антитело, подверженное деградации аспартата (Asp), если
α
i) С-атом остатка Asp обладает высокой конформационной подвижностью и аминокислотный остаток, прилегающий к остатку Asp со стороны С-конца, имеет малый размер, или
α
ii) С-атом остатка Asp обладает умеренной конформационной подвижностью, аминокислотный остаток, прилегающий со стороны С-конца, имеет малый размер, и изменение вторичной структуры возникает на расстоянии менее 3 аминокислотных остатков от остатка Asp в направлении С-конца, или
α
iii) С-атом остатка Asp обладает умеренной конформационной подвижностью, аминокислотный остаток, прилегающий со стороны С-конца, представляет собой Gly, и изменение вторичной структуры возникает на расстоянии более 3 аминокислотных остатков от остатка Asp в направлении С-конца.
5. Способ отбора одного или нескольких антител с улучшенной стабильностью аспартата (Asp), включающий стадии, при которых:
а) берут два или более антител,
α
б) у каждого остатка Asp в Fv домене каждого антитела определяют конформационную подвижность С-атома с использованием ансамбля моделей, основанных на гомологии,
в) у каждого остатка Asp в Fv домене каждого антитела определяют размер аминокислотного остатка, прилегающего к остатку Asp со стороны С-конца,
г) у каждого остатка Asp в Fv домене каждого антитела определяют наличие изменения вторичной структуры, расположенной в направлении С-конца от остатка Asp, и расстояние между указанным изменением и остатком Asp, выраженное в аминокислотных остатках, и
д) исключают из двух или более антител те антитела, которые имеют по меньшей мере одно из следующего:
α
i) остаток Asp с конформационно подвижным С-атомом, к которому со стороны С-конца прилегает аминокислотный остаток малого размера,
α
ii) остаток Asp, имеющий С-атом, обладающий умеренной конформационной подвижностью, к которому со стороны С-конца прилегает аминокислотный остаток малого размера, и изменение вторичной структуры возникает на расстоянии менее 3 аминокислотных остатков от остатка Asp в направлении карбокси-конца, или
α
iii) остаток Asp, имеющий С-атом, обладающий умеренной конформационной подвижностью, к которому со стороны С-конца прилегает аминокислотный остаток Gly, и изменение вторичной структуры возникает на расстоянии более 3 аминокислотных остатков от остатка Asp в направлении карбокси-конца,
и таким образом отбирают одно или несколько антител с улучшенной стабильностью аспартата (Asp).
6. Способ отбора антитела, стабильного при длительном хранении, включающий стадии, при которых
α
а) у каждого остатка Asn и Asp в Fv домене антитела определяют конформационную подвижность С-атома с использованием ансамбля моделей, основанных на гомологии,
б) у каждого остатка Asn и Asp в Fv домене антитела определяют размер аминокислотного остатка, прилегающего к остатку Asn или Asp со стороны С-конца,
α
в) выбирают антитело, у которого С-атом является конформационно неподвижным и у которого со стороны С-конца к Asn или Asp прилегает аминокислотный остаток большого размера.
7. Способ получения антитела, включающий следующие стадии:
а) культивирование клеток млекопитающих, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, отобранное способом согласно любому из пп. 1, 3, 5 и 6,
б) выделение антитела из клеток или среды культивирования и таким образом, получение антитела.
8. Способ по любому из пп. 1-7, отличающийся тем, что конформационная подвижность представляет собой среднеквадратичное отклонение (RMSD) соответствующих Сα-атомов остатков Asn/Asp в ансамбле моделей, основанных на гомологии.
9. Способ по п. 8, отличающийся тем, что
i) конформационно неподвижным является RMSD в 0,01  или менее,
ii) конформационно подвижным является RMSD более чем 0,01 ,
iii) умеренной конформационной подвижностью является RMSD между 0,145  и 0,485 , и
iv) высокой конформационной подвижностью является RMSD более чем 0,485 .
10. Способ по любому из пп. 1-7, отличающийся тем, что ансамбль моделей, основанных на гомологии, строят для Fv фрагмента антитела.
11. Способ по любому из пп. 1-7, отличающийся тем, что аминокислотный остаток малого размера представляет собой Gly, Ala, Ser, Cys или Asp.
12. Способ по п. 11, отличающийся тем, что аминокислотный остаток малого размера представляет собой Gly, Ala, Ser или Cys.