ОБОГАЩЕНИЕ АКТИВИРУЕМОЙ ФЛУОРЕСЦЕНЦИЕЙ СОРТИРОВКИ КЛЕТОК (FACS) ДЛЯ СОЗДАНИЯ РАСТЕНИЙ

1. Способ получения растения из популяции растительных клеток, включающий выделение протопласта растения, содержащего представляющий интерес полинуклеотид, при этом способ включает:
обеспечение популяции растительных протопластов, содержащей по меньшей мере один протопласт, который содержит представляющий интерес полинуклеотид и флуоресцирующий маркер, при этом популяция по существу не содержит растительных протопластов, содержащих флуоресцентный маркер и не содержащих представляющий интерес полинуклеотид; при этом растительный протопласт инкапсулируют в альгинат натрия;
отделение по меньшей мере одного протопласта, содержащего представляющий интерес полинуклеотид и флуоресцирующий маркер, от остальных растительных протопластов в популяции и, таким образом, выделение растительного протопласта, содержащего представляющий интерес полинуклеотид;
регенерацию растения из указанного выделенного растительного протопласта; и
культивирование указанного растения.
2. Способ по п. 1, в котором отделение по меньшей мере одного протопласта включает применение проточной цитометрии.
3. Способ по п. 1, в котором отделение по меньшей мере одного протопласта включает применение активируемой флуоресценцией сортировки клеток (FACS).
4. Способ по п. 1, в котором флуоресцирующим маркером является флуоресцирующий полипептид, который экспрессируется с полинуклеотида в протопласте растения.
5. Способ по п. 1, в котором представляющий интерес полинуклеотид кодирует представляющий интерес полипептид.
6. Способ по п. 5, в котором представляющим интерес полипептидом является нуклеаза с цинковым пальцем.
7. Способ по п. 1, в котором популяция растительных протопластов получена из ткани растения.
8. Способ по п. 1, включающий разделение множества протопластов, содержащих представляющий интерес полинуклеотид и флуоресцирующий маркер.
9. Способ по п. 1, в котором растение является однодольным или двудольным растением.
10. Растение, регенерированное посредством выделения растительного протопласта, содержащего представляющий интерес полинуклеотид, интегрированный в геном растительного протопласта, при этом способ включает:
обеспечение популяции растительных протопластов, содержащей по меньшей мере один протопласт, который содержит представляющий интерес полинуклеотид и флуоресцирующий маркер; при этом растительный протопласт инкапсулируют в альгинат натрия;
извлечение микрокаллусов из популяции протопластов, содержащих представляющий интерес полинуклеотид и флуоресцирующий маркер, при этом по меньшей мере один протопласт, который содержит представляющий интерес полинуклеотид и флуоресцирующий маркер, был трансформирован представляющим интерес полинуклеотидом и полинуклеотидом, кодирующим флуоресцирующий маркер;
регенерацию растения из указанных микрокаллусов; и
культивирование указанного растения.
11. Способ по п. 9, в котором представляющий интерес полинуклеотид и полинуклеотид, кодирующий флуоресцирующий маркер, присутствуют в молекуле нуклеиновой кислоты, используемой для трансформации по меньшей мере одного протопласта, содержащего представляющий интерес полинуклеотид и флуоресцирующий маркер.
12. Способ по п. 9, в котором представляющий интерес полинуклеотид и полинуклеотид, кодирующий флуоресцирующий маркер, интегрирован в геном по меньшей мере одного протопласта, содержащего представляющий интерес полинуклеотид и флуоресцирующий маркер.
13. Способ по п. 12, в котором представляющий интерес полинуклеотид и полинуклеотид, кодирующий флуоресцирующий маркер, интегрированы сайт-специфичным образом в геном по меньшей мере одного протопласта.
14. Способ по п. 13, в котором представляющий интерес полинуклеотид и полинуклеотид, кодирующий флуоресцирующий
маркер, интегрированы сайт-специфичным образом при использовании нуклеазы с цинковым пальцем.
15. Способ получения трансгенного растения, при этом способ включает:
обеспечение популяции растительных протопластов, содержащей по меньшей мере один протопласт, который содержит представляющий интерес полинуклеотид и флуоресцирующий маркер, при этом по меньшей мере один протопласт содержит сайт-специфичную нуклеазу, так что представляющий интерес полинуклеотид способен подвергаться интеграции в геном по меньшей мере одного растительного протопласта за счет гомологичной рекомбинации в сайте распознавания сайт-специфичной нуклеазой, и при этом растительный протопласт инкапсулируют в альгинат натрия;
отделение по меньшей мере одного протопласта, содержащего представляющий интерес полинуклеотид и флуоресцирующий маркер, от остальных растительных протопластов в популяции;
регенерацию трансгенного растения по меньшей мере из одного протопласта; и
культивирование указанного трансгенного растения.
16. Растение, полученное способом по п. 15, в котором растение продуцирует представляющий интерес полипептид, который кодируется представляющим интерес полинуклеотидом.
17. Растение, полученное способом по п. 15, в котором растение обладает признаком, повышающим его ценность, придаваемым растению представляющим интерес полинуклеотидом.
18. Способ получения семени, включающий FACS-сортировку, культивирование/оптимизацию и регенерацию, культивирование растения, извлечение семени.