Морфологический анализ эффективности внутрибрюшинной трансплантации различных видов фетальных гепатоцитов при лечении печеночной недостаточности у крыс

Экспериментальные исследования

УДК: 612.359: 612.351.6:618.393:616.08

МОРФОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ЭФФЕКТИВНОСТИ ВНУТРИБРЮШИННОЙ ТРАНСПЛАНТАЦИИ РАЗЛИЧНЫХ ВИДОВ ФЕТАЛЬНЫХ ГЕПАТОЦИТОВ ПРИ ЛЕЧЕНИИ ПЕЧЕНОЧНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ У КРЫС

А.А.МАДАМИНОВ, З.С.ЗАЛЯЛОВА, Р.К.АХМЕДОВА, А.Г.МИРЗАКУЛОВ, М.Д.УРАЗМЕТОВА, Ч.М.АБДУВАЛИЕВА

MORPHOLOGIC ANALYSIS OF EFFICIENCY OF INTRAPERITONEAL TRANS-PLANTATION OF VARIOUS FORMS FETAL HEPATOCYTES IN THERAPY OF LIVER FAILURE AT RATS

A.A.MADAMINOV, Z.S.ZALYALOVA, R.K.AHMEDOVA, A.G.MIRZAKULOV, M.D.URAZMETOVA, CH.M.ABDUVALIEVA

Республиканской научный центр экстренной медицинской помощи, Ташкентский институт усовершенствования врачей

Белым беспородным крысам с ОПН, воспроизведенной путем перорального введения разведенного в масле гепато-тропного токсина СС14 в дозе 10 мл/кг (объемное соотношение 1:1) внутрибрюшинно трансплантировали фетальные гепатоциты человека (ФГЧ). Морфологическое исследование показало, что в паренхиме печени крыс с моделью ОПН после введения ФГК и ФГЧ внутрибрюшинно, на 14-21-е сутки возникали одинаково выраженные репаративно-восста-новительные процессы, выражающиеся, главным образом, в гипертрофии и гиперплазии гепатоцитов. Соединительнотканные тяжи между печеночными дольками к концу эксперимента полностью не исчезали, что свидетельствовало о частичном восстановлении структуры печени животных. Основным фактором в восстановлении паренхимы являлась полиплоидия печеночных клеток, выражающаяся в увеличении размеров ядер гепатоцитов, и гипертрофия самих клеток, что является косвенным подтверждением приживления ФГЧ в печени крыс с моделью ОПН. Ключевые слова: морфология, фетальные гепатоциты человека, фетальные гепатоциты крысят, острая печеночная недостаточность, четыреххлористый углерод, внутрибрюшинная трансплантация гепатоцитов.

To white not purebred rats with ALF, reproduced by per oral introductions dissolved in oil hepatotrophic toxin СС14 in a dose of 10 ml/kg (a volume parity 1:1) have intraperitoneal transplanted Human's Fetal Hepatocytes (HFH) and Rat's Fetal Hepatocytes (RFH). Morpholog-ical researches have shown, that in a parenchyma of a liver of rats after introduction RFH and HFH in a pulp of a lien to rats with model ALF in a liver parenchyma for 14-21 days there were the equally expressed reparativ-regenerative processes expressed mainly in a hypertrophy and a hyperplasia of hepatocytes. Connective tissue taenia between hepatic lobes to the experiment extremity disappeared not completely, that testified partial restoration of structure of a liver of animals. And a major factor in parenchyma restoration the polyploidy of hepatic cells expressed in augmentation of the sizes of kernels of hepatocytes and a hypertrophy of cells that is indirect acknowledgement of engraftment HFH in a liver of rats with model ALF was appreciable.

Keywords: Morphology, Human's Fetal Hepatocytes, Rat's Fetal Hepatocytes, Acute Liver Failure, Carbon Tetrachloride Poisoning, Intraperitoneal Transplantation Hepatocytes.

По данным ВОЗ, смертность от хронической печеночной недостаточности занимает пятое место, а от острой печеночной недостаточности (ОПН) достигает 70-90% [4, 6, 8, 11]. Печеночная недостаточность может осложнять течение не только заболеваний гепато-пан-креатодуоденальной зоны, но и других органов и систем организма. Описаны случаи молниеносной печеночной недостаточности при милиарном туберкулезе, раке легкого, болезни Альцгеймера и другой патологии [7].

Лечение печеночной недостаточности с помощью трансплантации зрелых соматических и фетальных гепатоцитов является новым этапом развития практической гепатологии [1-3,10,12]. Трансплантация ге-патоцитов направлена на восстановление утраченных функций печени пациента и активацию регенерации неповрежденной паренхимы печени. Такой подход объясняется тем, что даже в очень сильно поврежденной печени часть паренхиматозных клеток, окружающих зоны некроза, являются жизнеспособными и при определённых условиях могут регенерировать [9].

Цель. Оценка морфологических изменений в печени при экспериментальной ОПН и лечении различными видами изолированных гепатоцитов (крысят и плодов человека).

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

В качестве донорского материала использовали печень из плодов человека (ФГЧ) и фетальные гепатоциты от новорожденных 1-2-дневных крысят (ФГК). ФГЧ (1822 нед. внутриутробного развития) получали в результате легальных абортов, произведенных в поздние сроки по медицинским показаниям в отделениях патологии беременности городских больниц г. Ташкента. Для получения гепатоцитов из печени плода использовали методику выделения клеток, включающие четыре этапа: 1) нерециркуляторная перфузия печени ЭДТА-со-держащим раствором, 2) рециркуляторная перфузия печени раствором, содержащим 0,025% коллагеназы, 3) диспергирование печени, 4) отмывка гепатоцитов центрифугированием [5]. При микроскопировании клеточного состава полученных ФГЧ определялись гепатоциты и их предшественники - гепатобласты до 60%, гемопоэ-тические клетки (в том числе макрофаги) - до 30%, непаренхиматозные клетки - до 10%. Выход клеток из 1 г ткани печени составил 12,6±0,28 (х108), жизнеспособность в первые 2 часа после получения - 96,2±3,4%. Жизнеспособность клеток оценивали следующим способом: 300 мкл раствора трипанового синего добавляли к 100 мкл суспензии клеток (конечная концентрация трипанового

синего 0,45%).

Модель ОПН воспроизводилась путем однократного внутрибрюшинного введения неразведенного гепато-тропного токсина СС14 половозрелым беспородным крысам самцам в дозе 1 мл/кг. Животные были разделены на две группы. Всего в эксперименте использовали 140 половозрелых беспородных крыс-самцов массой 170-220 г. 1-ю (контрольную) группу составили крысы с моделью ОПН. Во 2-ю (сравнительную) группу включены животные, которых лечили с помощью ФГЧ без дополнительного введения иммуносупрессоров. Для этого внутрибрю-шинно им трансплантировали свежевыделенные ФГЧ на вторые сутки после индуцирования ОПН в дозе 15-20 млн клеток в объеме 0,15-0,20 мл в питательном растворе RPMI 1640 путем безопасной инъекции в брюшную полость из нижней параумбиликальной точки 1 мл туберкулиновым шприцем в течение 0,5 минут.

Животных содержали в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных целей (Страсбург, 1986), и с одобрения Национального этического комитета. За экспериментальными животными наблюдали в течение 21 суток. Забой осуществляли под эфирным наркозом.

Для морфологических исследований ткань печени фиксировали в течение 48 ч в 10% растворе нейтрального формалина. После фиксации материал проводили по общепринятой гистологической методике с изготовлением парафиновых срезов толщиной 4-6 мкм, которые окрашивали гематоксилином и эозином. Гистологически оценивалось полнокровие центральных и воротных вен, выраженность жировой дистрофии гепатоцитов, очаги некроза гепатоцитов, состояние портальных трактов и перипортальных зон (разрастание соединительной ткани, формирование междольковых септ, инфильтрация) и желчных капилляров (изменения эндотелия, холестаз), воспалительно-клеточная инфильтрация паренхимы, наличие делящихся клеток. Для сравнения изучали нормальную ткань печени здоровых крыс (рис. А).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

После введения четыреххлористого углерода наблюдалось токсическое поражение печени с картиной ОПН. Выраженная патология отмечена при макроскопическом исследовании погибших на 5-6-е сутки крыс при лапаротомии - плотная поверхность печени красноватой окраски, зернистость и закругленность краев. При микроскопическом исследовании выявлялись повреждения гепатоцитов с очагами некрозов и лейкоцитарной инфильтрацией, участки дискомплексации балочных структур. Наиболее выраженные изменения были обнаружены на светооптическом уровне в зоне портальных трактов. Просветы синусоид сужены, просветы центральных вен пусты или с единичными эритроцитами (рис. Б).

У всех крыс с ОПН, погибших на 7-е сутки, при исследовании структуры печени наблюдались изменения, аналогичные наблюдаемым у погибших на 5-е сутки. Морфологические изменения в печени крыс, погибших на 8-9-е сутки, были представлены мелкоочаговыми некрозами, поврежденными гепатоцитами, в зонах некроза гепатоцитов наблюдались скопления нейтрофилов. На 10-е сутки у погибших крыс имела место инфильтрация пери-

портальных зон лимфоцитами. Сами гепатоциты были полиморфными. Как правило, клетки были увеличены в размерах. В цитоплазме их наблюдались признаки ги-дропической и вакуольной дистрофии, преимущественно в области центральных вен. Балочное строение печени было нарушено. Имелись двуядерные гепатоциты. В ряде случаев наблюдались очаговые некрозы клеток печени. Просветы синусоидных капилляров неравномерно кро-венаполнены. Клетки Купфера увеличены в объеме. Морфологические изменения в печени крыс, погибших на 1314-е сутки, были представлены жировой инфильтрацией паренхимы печени и характеризовались постепенным снижением интенсивности поражения печеночных долек от портопортальной зоны к центру. Таким образом, наблюдалось нарушение общей архитектоники печени, ми-кроциркуляторные нарушения, клеточный полиморфизм; дискомплексация гепатоцитов, жировая, гидропическая и балонная дистрофии гепатоцитов, очаговые гепатонекро-зы, гиперхромия и полихромия; лимфоплазмоцитарная инфильтрация (рис. В, Г).

Результаты морфологического исследования печени крыс опытной группы после внутрибрюшинного введения им ФГК и ФГЧ в начальные сроки (7 дней) показали, что степень некроза печеночных клеток и воспалительно-клеточной инфильтрации паренхимы, фиброза, дистрофии гепатоцитов, степень пролиферации эпителия желчных протоков были выражены почти в той же степени, что и при изменениях печени крыс контрольной группы с ОПН. Другая картина наблюдалась при введении ФГЧ: толстые соединительнотканные тяжи пронизывали паренхиму печени. Довольно большие участки в паренхиме занимали воспалительные инфильтраты, состоящие из лимфоцитов, макрофагов и фибробластов. Выявлялись отек, очаговые кровоизлияния в печени, резкое расширение синусоидов, портальных сосудов и центральных вен, выраженный стаз в них элементов крови.

На 14-е сутки введения ФГК очаговая дистрофия и некрозы гепатоцитов сохранялись. Выражены застойные явления в синусоидах и центральных венах. Гепатоциты в паренхиме печени располагались беспорядочно. В большинстве гепатоцитов появились начальные репа-ративные процессы на фоне набухания клеток. Выражена активность фибробластов и мононуклеарных клеток. Отчетливо видны ядра различных размеров и ядрышки. Выявлялось большое количество гипертрофированных гепатоцитов с большими ядрами. Количество двуядер-ных гепатоцитов несколько увеличивалось. Определялись признаки активации купферовских клеток, особенно вблизи соединительнотканных прослоек.

В последующие сроки (21-е сут.) пересадка ФГК способствовала восстановлению и сохранности балочной структуры с преобладанием неповрежденных гепато-цитов за счет протективной функции пересаженных клеток. Отмечалось частичное восстановление балочной структуры, хотя структура и размеры гепатоцитов сильно варьировали. Основную массу паренхимы составляли гипертрофированные гепатоциты с ядрами различных размеров. Восстанавливалась цитоплазма некоторых печеночных клеток, при окраске гематоксилином и эозином они окрашивались в розовый цвет. Аналогичная картина наблюдалась при трансплантации ФГЧ: в непосредственной близости от портальных трактов они были

Морфологический анализ эффективности внутрибрюшинной трансплантации различных видов фетальных гепатоцитов при...

Рисунок. Печень крысы в норме и при патологии. Световая микроскопия. Окраска гематоксилином и эозином, x200. А - печень норма. 3-я зона (перицентральная). Четко просматривается просвет центральной вены, балочная структура гепатоцитов сохранена. Б - выражены некротические и некробиотические изменения во 2-3 зонах ацинуса с деструкцией гепатоцитов с неравномерным расширением просвета синусоид. В - дистрофические изменения в ткани печени: набухание и вакуольная дистрофия гепатоцитов, анизоцитоз. Сохраняются очаговые некрозы. Г - 1-я зона ацинуса. Просветы портальной вены и печеночной артерии. Круглоклеточная инфильтрация триады. Дистрофическое набухание гепатоцитов. Просветы синусоидов сужены. Д - период репаративных процессов. Полнокровие центральной вены. Гиперхромия ядер. Двуядерные и многоядерные гепатоциты. Восстановлены просветы синусоидов и балочная структура гепатоцитов. Е - репарация. 1-я зона ацинуса. Образование портопортальных и портоцентральных септ на месте погибших гепатоцитов с сохранившейся клеточной воспалительной реакцией. Восстановление балочной структуры. Гипертрофия гепатоцитов.

Явления на-

мелкие, с плотной зернистой цитоплазмой, часто двуядерные. Ближе к перипортальным зонам структура печеночных балок не определялась, клетки были крупнее, с большими ядрами. В некоторых участках продолжали определяться участки с жировой дистрофией гепатоцитов. Соединительнотканные прослойки между печеночными дольками становились немного тоньше, чем в предыдущие сроки, иногда исчезали совсем. Отмечались

ярко выраженные процессы регенерации. рушений кровообращения в печеночных дольках уменьшались (рис. Д, Е).

Таким образом, развитие токсического гепатита, вызванного однократным введением четыреххлористого углерода, сопровождается жировой инфильтрацией паренхимы печени и характеризуется постепенным снижением интенсивности поражения печеночных долек

от перипортальной зоны к центру. Морфологические исследования печени крыс с трансплантацией ФГК и ФГЧ в брюшную полость показывают, что при обоих видах транплантационного материала в паренхиме печени на 14-21-е сутки возникают репаративно-восстанови-тельные процессы, выражающиеся, главным образом, в гипертрофии и гиперплазии гепатоцитов. Соединительнотканные тяжи между печеночными дольками к концу эксперимента полностью не исчезают, что свидетельствует о частичном восстановлении структуры печени животных. При внутрибрюшинном введении фетальных гепатоцитов при СС14-ОПН основным фактором регенерации является полиплоидия печеночных клеток, выражающаяся в увеличении размеров ядер гепатоцитов и гипертрофия самих клеток, восстановлении микротопографических взаимоотношений в дольке и создании условий для пролиферации гепатоцитов. Эти данные являются косвенным подтверждением приживления ксеногенного клеточного материала в виде ФГЧ в печени крыс с моделированной ОПН.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Положительное воздействие ксенотрансплантации фетальных гепатоцитов на поврежденную печень выражается в более раннем возникновении репаративных, регенеративных процессов в печеночной ткани, что обосновывает целесообразность трансплантации выделенных фетальных изолированных гепатоцитов и создает предпосылки для использования их в клинических условиях с СС14-ОПН. Сравнительный анализ влияния трансплантации различных видов изолированных гепатоцитов (ксено-генных и аллогенных) не выявил выраженных различий по морфологической картине в печени крыс с СС14-ОПН.

ЛИТЕРАТУРА

1. Грищенко В. И., Лобынцева Г. С., Вотякова И. А., Ше-решков С. И. Гемопоэтические клетки эмбриональной печени. Киев Наук думка 1988;192.

2. Суббота Н. П., Пашинский П. П., Розанова З. Д., Биологические свойства криоэкстрактов эмбриональных

тканей. Пробл криобиол 1998; 3: 35-42.

3. Хаджибаев А.М., Уразметова М.Д., Мадаминов А.А., и др. Сравнительная оценка влияния аллогенных и ксе-ногенных изолированных гепатоцитов на иммунный статус крыс с острой печеночной недостаточностью. Вестн экстр медицины 2011;2:48-51.

4. Bernal W., Auzinger G., Dhawan A., Wendon J. Acute liver failure. Lancet 2010; 376(9736):190-201.

5. Berry M.N., Friend D.S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study. J Cell Biol 1969; 43: 506-520.

6. El-Karaksy H.M., El-Shabrawi M.M., Mohsen N.A. et al.. Study of predictive value of pediatric risk of mortality (PRISM) score in children with end stage liver disease and fulminant hepatic failure. Ind J Pediatr 2011;78(3):301-306.

7. Laleman W, Verbeke L, Meersseman P. et al. Acute-on-chronic liver failure: current concepts on definition, pathogenesis, clinical manifestations and potential therapeutic interventions. Exp Rev Gastroenterol Hepatol 2011;5(4):523-537.

8. Nguyen N.T., Vierling J.M. Acute liver failure. Curr Opin Organ Transplant 2011;16(3):289-296.

9. Teng Y., Wang Y., Li S. et al. Treatment of acute hepatic failure in mice by transplantation of mixed microencapsulation of rat hepatocytes and transgenic human fetal liver stromal cells. Tissue Engl Part C Methods 2010;16(5):1125-1134.

10. Touboul T, Vallier L, Weber A. Robust differentiation of fetal hepatocytes from human embryonic stem cells and iPS. Med Sci (Paris). 2010;26(12):1061-1066.

11. Zhang L, Han F, Wu D. et al. Analysis of the clinical features of and responsive factors on the prognosis in patients with fulminant hepatic failure. Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi 2010;18(8):614-617.

12. Zhou P., Lessa N., Estrada D.C. et al. Decellularized liver matrix as a carrier for the transplantation of human fetal and primary hepatocytes in mice.Liver Transpl 2011;17(4):418-427.

КАЛАМУШЛАРДА ЖИГАР ЕТИШМОВЧИЛИГИНИ ДАВОЛАШДА ТУРЛИ ХИЛ ФЕТАЛ ГЕПАТОЦИТЛАРНИ КОРИН ПАРДАСИ ИЧИГА ТРАНСПЛАНТАЦИЯ КДЛИШ САМАРАДОРЛИГИНИНГ МОРФОЛОГИК ТАХЛИЛИ

А.А.Мадаминов, З.С.Залялова, Р.К.Ахмедова, А.Г.Мирзакулов, М.Д.Уразметова, Ч.М.Абдувалиева Республика шошилинч тиббий ёрдам илмий маркази Ёвда эритилган гепатотроп токсин СС14ни 10 мл/кг (хажмли нисбати 1:1) дозада огиз ор;али бериш йули билан ча;ирилган уткир жигар етишмовчилиги (УЖЕ) булган о; наслсиз каламушларга одамнинг (ОФГ) ва каламушнинг (КФГ) фетал гепатоцитлари ;орин пардаси ичига трансплантация ;илинган. Мор-фологик тад;и;отлар УЖЕ булган каламушларга ;орин пардаси ичига ОФГ ва КФГни киритгандан сунг 14-21-кунлари каламушларнинг жиган паренхимасида тахминан ухшаш репаратив-тикланувчи жараён-лар, айни;са гепатоцитларнинг гипертрофияси ва гиперплазияси юзага келишини курсатди. Тажрибанинг охирига келиб жигар булакчалари орасидаги бириктирувчи ту;имали туси;чалар батамом йу;олиб, бу жониворлар жигарининг структураси ;исман тикланганлигига далолат беради. Жигар хужайраларининг полиплоидияси хамда гепатоцитлар ядросининг улчамлари катталашуви ва хужайралар узининг хам гипертрофияси паренхима тикланганлигининг асосий белгиси булиб, бу холат УЖЕ модели булган каламуш-ларда ОФГнинг илдиз отиб кетганлигини тасди;лайди.

Контакт: Уразметова Маиса Дмитриевна, доктор медицинский наук, профессор. 100115, Ташкент, ул. Фархадская, 2. Тел.: +99871-1504384 (р), +99890-9562723 (м). E-mail: urazmetovr@gmail.com.