СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДОБРОКАЧЕСТВЕННЫХ И ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЙ ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ЧЕЛОВЕКА
METHOD FOR DETECTING BENIGN AND MALIGNANT NEW GROWTHS OF HUMAN THYROID

Изобретение относится к области молекулярной биологии и медицины, в частности к онкологии, и предназначено для быстрого определения типа новообразования (злокачественное или доброкачественное) щитовидной железы (ЩЖ) человека.
Новообразования ЩЖ проявляются как структурные (узловые) патологии ЩЖ. Узловой зоб (собирательное клиническое понятие, объединяющее все обособленные образования в ЩЖ, отличающиеся морфологическими характеристиками от остальной ткани) встречается почти у 40-50% населения. Злокачественные образования составляют до 10% всех случаев узлового зоба. К неопухолевым заболеваниям, или опухолеподобным поражениям (ОПП) ЩЖ, проявляющимся в форме диффузной и узловатой гиперплазии и напоминающим новообразования, относятся узловой зоб, аутоиммунный тиреоидит.
Рак щитовидной железы (РЩЖ) - наиболее часто встречающаяся злокачественная опухоль эндокринных органов, занимающая высокие позиции по числу смертельных исходов среди злокачественных эндокринных опухолей [1]. Эпидемиологические исследования последних десятилетий показывают отчетливую тенденцию к росту количества больных РЩЖ во многих регионах мира. В РФ в последние годы прирост заболеваемости РЩЖ составляет в среднем 3.5% в год [2].
Подавляющее большинство случаев РЩЖ (80-85% всех случаев) составляет папиллярный рак (или папиллярная аденокарцинома), который может встречаться в любом возрасте. На долю фолликулярного рака (фолликулярной аденокарциномы) приходится 5-15% случаев. Эти два типа рака относят к дифференцированному РЩЖ, отличающемуся медленным течением и благоприятным прогнозом. К умеренно дифференцированному раку относят медуллярную карциному (5% случаев) и плоскоклеточный рак (0.2-0.7%). Недифференцированный или анапластический рак составляет 0.1-1% всех карцином. Папиллярный рак является самым вариабельным по степени поражения долей железы и окружающих тканей, причем для этого типа рака характерно метастазирование в региональные лимфатические узлы шеи (60-70%). Особенность развития РЩЖ заключается в том, что узел на шее безболезнен, развивается медленно и может не беспокоить до 10 лет, а затем быстро начать прогрессировать.
В настоящее время диагноз пациенту ставится на основании цитологического исследования биоптата опухоли, однако практика цитологической дифференциальной диагностики опухолей ЩЖ демонстрирует ее недостаточную надежность из-за сложности и разнообразия морфологических форм РЩЖ, когда даже внутри одного и того же гистологического типа новообразования наблюдается вариабельность клинического течения. В целом дооперационная и послеоперационная диагностика с помощью цитологического исследования новообразований ЩЖ не позволяет избежать высокого, до 20%, уровня ошибок.
В этой связи чрезвычайно актуальна проблема создания современных высокоэффективных методов определения опухолевых образований ЩЖ, содержащих объективные и надежные количественные методы оценки состояния клетки в норме и при патологическом состоянии.
Известен стандартный способ дифференциальной диагностики опухолей ЩЖ, включающий забор материала опухоли пациента путем аспирационной биопсии или вырезания фрагментов ткани опухоли, удаленной во время операции, приготовление препаратов для морфологического анализа - стандартных гистологических срезов толщиной 5-6 мкм, их стандартную окраску для гистологического исследования и цитологическое исследование аномальных клеток опухоли ЩЖ [3].
Способ неточный, неколичественный, достаточно субъективный и зависит от практического опыта врачей при визуальной оценке структур опухоли и раковых клеток.
На настоящий момент на стыке медицины и молекулярной биологии разрабатываются способы диагностики различных заболеваний и различных типов рака, в том числе рака ЩЖ, с использованием в качестве биомаркеров микроРНК [4].
МикроРНК - это недавно открытые малые, не кодирующие белок, регуляторные РНК, которые контролируют экспрессию генов на посттранскрипционном уровне. МикроРНК участвуют практически во всех базовых процессах от момента возникновения организма: эмбриональном развитии, пролиферации, дифференцировке, старении, иммунном и стрессорном ответах, геномном импринтинге, в ключевых процессах метаболизма, а также при разных патологиях, включая рак. Кроме того, микроРНК сами могут выступать в роли онкогенов и супрессоров опухолевого роста. Дерегуляция микроРНК ведет к изменению их экспрессии в опухолевых клетках в сравнении с нормальными тканями.
Известен способ определения новообразований ЩЖ на основе комбинации методов ПЦР в реальном времени (qRT-PCR) и микрочипа по классификации фолликулярной неоплазии ЩЖ [5]. Способ заключается в измерении экспрессии 4-х групп микроРНК для улучшения дооперационной диагностики узелковых образований ЩЖ. Первая комбинация, состоящая из 14 и 2 микроРНК, позволяет, согласно двухстороннему классификатору с вероятностью от 0 до 1, получить ответ на один из поставленных вопросов: а) фолликулярная неоплазия (аденома или карцинома) или норма; б) фолликулярная аденома или норма и в) фолликулярная карцинома или норма. Вторая комбинация, состоящая из 2 и нескольких дополнительных из 4-й группы в 59 микроРНК, позволяет различить сильно агрессивную фолликулярную карциному, склонную к образованию метастазов, и минимально агрессивную фолликулярную карциному ЩЖ.
Недостатками известного способа являются сложность, громоздкость, дороговизна, ограниченные функциональные возможности, поскольку классификатор служит для распознавания в основном злокачественного и доброкачественного подтипов фолликулярного РЩЖ. Кроме того, использование микрочипов (технология microarray) дает практически на порядок менее точные результаты, чем метод ПНР в реальном времени.
Наиболее близким к заявляемому способу - прототипом является способ определения новообразований ЩЖ путем оценки экспрессии микроРНК [6], заключающийся в следующем. Образцы опухолевой ткани ЩЖ получали из фиксированных формалином и залитых парафином блоков (слайдов), хранимых более 10 лет. Из образцов опухолевой ткани ЩЖ выделяли микроРНК. Для получения кДНК проводили обратную транскрипцию не менее чем 500 нг РНК с использованием TaqMan микроРНК Kit (Applied Biosystems). После чего проводили измерение экспрессии микроРНК методом количественной ПНР в реальном времени с использованием специфических праймеров и зондов TaqMan для человеческих микроРНК.
При этом измеряли уровень экспрессии хотя бы по одной микроРНК из каждой группы (46 специфических микроРНК - 1-я группа и 13 микроРНК - 2-я группа) у отдельного пациента и далее проводили сравнение с известным уровнем экспрессии микроРНК, установленным для случаев отсутствия неоплазии ЩЖ (контроль). Аналогично проводили сравнение уровней экспрессии по 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 или 40 микроРНК из первой группы и 13 микроРНК из второй группы и также проводили сравнение уровней экспрессии микроРНК в обеих группах. На основании анализа индивидуальных уровней экспрессии измеряемых микроРНК устанавливали диагноз или делали прогноз вероятности возникновения злокачественного новообразования и предлагали соответствующее лечение. В анализ входил поиск тех специфических микроРНК, которые экспрессировались только в опухолях определенного типа, а именно для фолликулярного рака - это 5, для фолликулярной аденомы - 3, для папиллярного рака - 8 и для незлокачественных неоплазии - это 5 индивидуальных и различных микроРНК. Строили диаграмму Венна, представляющую собой частично перекрывающиеся овалы, символизирующие для конкретного типа опухоли экспрессируемые микроРНК с уровнем значимости p<0.01. Неперекрывающиеся между различными типами опухолей участки и соответствовали количеству специфических для данного типа диагностических микроРНК.
Недостатками известного способа являются большая сложность и длительность, громоздкость и дороговизна для массового применения в клинической онкологии. Известный способ неприемлем для быстрого анализа биопсийного или операционного материала и быстрой постановки диагноза больному до или во время операции.
Задачей, на решение которой направлено настоящее изобретение, является упрощение и сокращение длительности способа определения новообразований ЩЖ.
Технический результат: упрощение и сокращение длительности способа.
Поставленная задача достигается предлагаемым способом, заключающимся в следующем.
Забор образца опухолевой ткани ЩЖ и образца прилежащей неизмененной ткани железы в качестве контроля осуществляют при операции или с помощью тонкоигольной аспирационной пункционной биопсии (ТАПБ), выделяют микроРНК из образцов любым из известных способов. Для получения копии кДНК проводят реакцию обратной транскрипции с соответствующими праймерами (амплификация), полученную кДНК сразу используют в качестве матрицы для проведения ПЦР.
Далее проводят измерение уровня экспрессии пяти микроРНК, а именно микроРНК-21, -221, -222, -155, -205 в опухолевых клетках в сравнении с нормальными тканями методом ПНР в реальном времени (qRT-PCR платформа) стандартным способом [7]. В качестве внутреннего контроля используют малую РНК U6, которая характеризуется стабильной экспрессией.
Сочетание времени и температуры на каждом этапе протокола реакции подбирают специально для эффективной реакции с используемыми олигонуклеотидами. Использованные праймеры и зонды приведены в таблице 1.
Оценку изменения уровня экспрессии диагностических микроРНК в опытном образце по отношению к контрольному (т.е. опухолевой и нормальной ткани ЩЖ) вычисляют по стандартной формуле [7]:
<img file="00000001.tif" he="56" wi="51" img-content="undefined" img-format="tif" />
где E - эффективность реакции амплификации микроРНК (E<sub>miR</sub>) или внутреннего контроля U6 (E<sub>U6</sub>); Ct - пороговый цикл реакции. Все значения Ct определяют как для опухоли (оп), так и для нормы (норм).
В том случае, если изменение уровня экспрессии диагностических микроРНК-21, -221, -222, -155, -205 не превышает 4-кратного значения как в сторону повышения, так и в сторону понижения экспрессии, т.е. находится в диапазоне [-4; +4], делают заключение о доброкачественном новообразовании, а если уровни экспрессии вышеназванных микроРНК в опухоли при сравнении с нормальной тканью органа отличаются более чем в 4 раза, то делают заключение о злокачественном новообразовании.
Предлагаемый способ позволяет просто, быстро и точно идентифицировать и различать доброкачественные (опухолеподобные поражения - коллоидный зоб, аутоиммунный тиреоидит и фолликулярная аденома) и злокачественные (папиллярный рак) новообразования ЩЖ человека.
Определяющим отличием заявляемого способа, по сравнению с прототипом, является то, что измеряют уровни экспрессии специально подобранных пяти микроРНК (микроРНК-21, -221, -222, -155, -205) в опухолевых образцах в сравнении с нормальными тканями ЩЖ, что позволяет упростить способ, вследствие подбора минимально значимого количества диагностируемых микроРНК сократить его длительность (5-6 часов или один рабочий день, вместо как минимум трех рабочих дней по прототипу). Выбранные для анализа онкогенные и онкосупрессорные микроРНК являются оптимальными и достаточными, поскольку первые три микроРНК относятся к онкогенным, повышенная экспрессия которых в раковых клетках нарушает работу генов-супрессоров опухоли, стимулируя развитие раковых клеток; микроРНК-155 тесно связана с иммунной системой, состояние которой важно учитывать при онкологическом заболевании, а микроРНК-205 является онкосупрессорной микроРНК в норме, т.е. сдерживает возникновение и рост опухоли, ее дерегуляция и снижение экспрессии свидетельствуют об активации онкогенов и росте опухоли.
Предварительно, для определения и обоснования диагностических значений микроРНК был проведен сравнительный анализ уровней экспрессии пяти человеческих микроРНК: микроРНК-21, микроРНК-221, микроРНК-222, микроРНК-155 и микроРНК-205 в 67 образцах трех групп новообразований ЩЖ: ОПП - 15, фолликулярная аденома - 26 и папиллярный рак - 26 образцов. Материал сопровождался официальным заключением гистологического анализа.
При проведении сравнительного анализа уровней экспрессии 5 онкогенных и онкосупрессорных микроРНК в разных типах опухолей ЩЖ человека - опухолеподобных поражениях (ОПП), доброкачественных и злокачественных новообразованиях, выявлены характерные для каждого вида новообразования уровни экспрессии микроРНК. Определение вариации уровня экспрессии каждой микроРНК в нормальных клетках ЩЖ выявило, что уровень медианных значений колебался в пределах не более 4 единиц как в сторону повышения, так и понижения экспрессии.
оп
норм
оп
норм
оп
норм
На фиг.1 представлены уровни экспрессии микроРНК-21, -221, -222, -155, -205 в трех исследуемых выборках. Для удобства визуального восприятия материала в виде графиков рассчитанные по формуле данные 0<С/С<1 представлены в виде 1:С/С со знаком «минус». А данные С/С>1 представлены на графиках со знаком «плюс».
Из фиг.1 видно, что все три группы - ОПП, фолликулярная аденома и папиллярный рак, имеют различающиеся уровни экспрессии. ОПП и фолликулярная аденома по всем микроРНК имеют пониженные медианные значения, незначительные интерквартильные размахи, характеризуются небольшой вариацией уровня экспрессии микроРНК, что совпадает со значениями для нормальных клеток. Злокачественное новообразование ЩЖ - папиллярная карцинома, характеризуется повышением и более значительным интерквартильным размахом по трем онкогенным микроРНК: -21, -221 и -222, тогда как изменения микроРНК-155 и микроРНК-205 менее выражены, но отличаются по своим медианам от ОПП и фолликулярных аденом. Статистический анализ с помощью U-критерия Манна-Уитни подтвердил наличие достоверных отличий (p<0.05) группы образцов с карциномами от случаев с опухолеподобными образованиями и аденомами.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения способа.
Пример 1.
У пациента №101 во время операции были взяты образцы ткани опухоли щитовидной железы и прилежащей неизмененной ткани железы для контроля. Выделение микроРНК из образцов ткани проводили с помощью набора «РеалБест экстракция 100» (ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск) в соответствии с инструкцией производителя. Реакцию обратной транскрипции для получения копии к ДНК проводили в объеме 50 мкл. Использовали готовые реакционные смеси «РеалБест Мастер микс ОТ» (ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск) с добавлением 0.5 мкМ соответствующего праймера для обратной транскрипции. Реакцию проводили в течение 30 мин при 42°С, после чего реакционную смесь инкубировали 2 мин при 95°С для инактивации обратной транскриптазы. Полученную реакционную смесь, содержащую кДНК, в объеме 3 мкл сразу использовали в качестве матрицы для проведения ПЦР.
Измерение уровней экспрессии микроРНК-21, -221, -222, -155, -205 проводили методом ПЦР в реальном времени на амплификаторе CFX96 (Bio-Rad Laboratories, США). В качестве контроля использовали малую РНК U6. Использовали праймеры и зонды, приведенные в таблице 1. Реакцию проводили в объеме 50 мкл с использованием готовых реакционных смесей «РеалБест Мастер микс» (ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск) с добавлением по 0.5 мкМ раствора прямого и обратного праймеров и 0.25 мкМ раствора зонда. Протокол реакции ПЦР: предварительный прогрев при 94°C - 2 мин, 50 основных циклов: денатурация при 94°C - 10 сек, отжиг праймеров и элонгация: 60°С - 20 сек.
Изменение уровней экспрессии микроРНК в опытном образце (fold change), по отношению к контрольному (во сколько раз), вычисляли по стандартной формуле:
U6
где Е - эффективность реакции амплификации микроРНК (EmiR) или внутреннего контроля U6 (E); Ct - пороговый цикл реакции. Все значения Ct определяли как для опухоли (оп), так и для нормы (норм).
Результаты, полученные по пациенту №101, представлены на фиг.2. Дооперационный диагноз пациента №101 по ТАПБ - ОПП (диффузный токсический зоб правой доли ЩЖ). Диагноз подтвержден гистологически на операционном материале. Измерения пяти микроРНК показали, что изменения уровней экспрессии микроРНК варьируют в пределах [-2; +2], что соответствует незлокачественному образованию.
Пример 2.
У пациента №80 во время операции были взяты образцы ткани опухоли щитовидной железы и прилежащей неизмененной ткани железы для контроля. Способ определения новообразований ЩЖ осуществляли аналогично примеру 1. Результаты, полученные по пациенту №80, представлены на фиг.3.
Дооперационный диагноз пациента №80 по ТАПБ - Аденома Гюртле, диагноз по гистологии операционного материала - атипическая фолликулярная аденома и токсический зоб, размер 2.0 см. Измерения пяти микроРНК показали, что изменения уровней экспрессии по пяти микроРНК находятся в пределах [-2.5; +4], что соответствует доброкачественному образованию.
Пример 3.
У пациента №59 во время операции были взяты образцы ткани опухоли щитовидной железы и прилежащей неизмененной ткани железы для контроля. Все методические процедуры обработки и определения материала проведены аналогично примеру 1. Результаты, полученные по пациенту №59, представлены на фиг.4.
У пациента №59 по ТАПБ выявлен папиллярный рак, диагноз подтвержден гистологически - T1mN0M0. Измерения по пяти микроРНК показали, что изменения уровней экспрессии диагностируемых микроРНК в ткани опухоли в 12-200 раз выше, чем в нормальной ткани, т.о. изменения в диапазоне [+12; +200], что соответствует злокачественному образованию (папиллярный рак).
Пример 4.
Провели сравнение изменений уровней экспрессии пяти микроРНК в разных долях ЩЖ одного пациента при злокачественном опухолевом поражении только одной из долей. Пациент дважды прооперирован с интервалом в 6 мес. (образцы №7 и №117, соответственно). В обоих случаях во время операции были взяты образцы ткани опухоли щитовидной железы и прилежащей неизмененной ткани железы для контроля. Все методические процедуры обработки и измерения уровней экспрессии пяти микроРНК проведены аналогично примеру 1. Полученные результаты показаны на фиг.5, где белые столбики - норма, нет злокачественного образования в правой доле ЩЖ, серые - папиллярный рак в левой доле ЩЖ.
В первом случае (№7) по результатам ТАПБ было вынесено заключение - подозрение на рак, показание - хирургическое удаление левой доли ЩЖ. Гистологическое заключение операционного материала - папиллярный рак, T1mN0M0, размер 1 см. По показаниям проведена повторная операция через 6 месяцев - удаление правой доли железы. Гистологическое заключение - отсутствие новообразований.
При измерении уровней экспрессии пяти микроРНК в левой доле ЩЖ (№7) выявлены изменения в 8-16 раз, что подтверждает злокачественность новообразования. В правой доле (№117) изменение уровней экспрессии микроРНК не превышает двукратного увеличения (диапазон [0; +2]), что указывает на отсутствие злокачественных изменений и соответствует норме. Данный пример показывает, что пациенту проведена неоправданная операция: правая доля железы могла быть сохранена, т.к. гистологическое послеоперационное заключение и анализ экспрессии пяти микроРНК показали, что правая доля железы не была поражена раком. Достаточно было провести дооперационное измерение уровней экспрессии микроРНК, используя ТАПБ правой доли ЩЖ.
Заявляемый способ позволит просто, быстро и точно определять новообразования ЩЖ до операции, используя ткань опухоли, полученную с помощью ТАПБ или сразу после операции, чтобы подтвердить или скорректировать результаты, полученные при гистологическом и цитологическом исследовании, выбрать правильную тактику последующего лечения пациента.
ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ
1. Чиссов В.И., Старинский В.В. Петрова Г.В. Злокачественные новообразования в России в 2003 г. (заболеваемость и смертность). - М., 2005. - 228 с.
2. Румянцев П.О., Ильин А.А., Румянцева У.В., Саенко В.А. Рак щитовидной железы. / М.: ГЕОТАР-Медиа, 2009. - 448 с.
3. Богин Ю.Н. Комплексная экспресс-диагностика заболеваний щитовидной железы / Ю.Н. Богин и др. // Методические рекомендации. - М., 1992. - 175 с.
4. Iorio M.V., Croce СМ. MicroRNA dysregulation in cancer: diagnostics, monitoring and therapeutics. A comprehensive review// EMBO Mol Med - 2012. - №4 - P.143-159.
5. Nielsen F.C., Rossing M., Bennedbaek F.N. Microma classification of thyroid follicular neoplasia. - Patent WO 2011154008 A1, on. 25.12.2011.
6. Soldin O. P., Gusev Y., Marian C. Microma expression profiling of thyroid cancer. - Patent WO 2013066678 A1, on. 10.05.2013.
7. Pfaffl M.W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR //Nucleic Acids Res. - 2001. - V.29. - №9. - С45.