ОСОБЕННОСТИ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОВ ММР-1, ММР-3, TNFα У БЕРЕМЕННЫХ С ПРЕЖДЕВРЕМЕННЫМ ИЗЛИТИЕМ ОКОЛОПЛОДНЫХ ВОД ПРИ ДОНОШЕННОМ СРОКЕ

© В. М. Болотских, Т. Э. Иващенко ОСОБЕННОСТИ ПОЛИМОРФИзМА ГЕНОВ

ММР-1, ММР-3, TNFa

НИИ акушерства и гинекологии у БЕРЕМЕННЫХ С ПРЕЖДЕВРЕМЕННЫМ

им. Д. О. Отта СЗ0 РАМН ИЗЛИТИЕМ ОКОЛОПЛОДНЫХ ВОД

ПРИ ДОНОШЕННОМ СРОКЕ

УДК: 618.514.8-07:575

Целью настоящей работы явилось изучение особенностей частот аллельного полиморфизма генов ММР1, ММР3, TNFa у беременных с преждевременным из-литием околоплодных вод (ПИОВ) при доношенном сроке. Основную группу составили 84 беременных с ПИОВ при доношенном сроке. В контрольную группу вошли 72 пациентки со своевременным излитием околоплодных вод при доношенном сроке. В исследуемые группы

не включались беременные с тяжелыми хроническими соматическими заболеваниями и выраженной акушерской патологией. Достоверных различий в частотах аллелей по генам ММР-1 и ММР-3 в анализируемых группах выявлено не было. При исследовании полиморфизма гена ТОТа выявлены достоверные различия в частотах аллелей -308А и -308G между анализируемыми группами. Так же достоверно отличалось распределение частот генотипов по гену ТОТа между исследуемыми группами. Можно утверждать о необходимости изучения других полиморфизмов генов ММР1, ММР3, а также генов других металлопротеиназ. Продолжение исследований в данном направлении, вероятно, позволит разработку балльной шкалы прогнозирования ПИОВ.

Ключевые слова: преждевременное излитие околоплодных вод; доношенный срок беременности; гены ММР1, ММР3, ТОТа; полиморфизм генов.

Роды, осложненные преждевременным излитием околоплодных вод (ПИОВ) при доношенной беременности, варьируют от 11 до 20 % и не имеют тенденции к снижению. Данная патология способствует росту осложнений в родах и в послеродовом периоде со стороны матери, плода и новорожденного [2, 13]. Следует отметить, что ПИОВ имеет тенденцию к повторному развитию в последующих родах с частотой до 20-32 % [15]. Не существует единой точки зрения относительно причины преждевременного разрыва плодных оболочек. Многие исследователи считают, что причина ПИОВ — по-лиэтиологична [17, 3]. Тем не менее, ряд авторов выделяют несколько основных факторов, влияющих на частоту ПИОВ. В частности, по данным Malak T. et al., Bell S. C. et al., предел прочности соединительной ткани обусловлен содержанием и биохимическими свойствами коллагена [14, 7]. Причиной низкого содержания коллагена при ПИОВ является разрушение его коллагеназами, ферментами матричной металлопро-теазы (ФММП). Проведенные исследования Fortunato S. еt al. показали, что в родах всегда повышается ферментативная активность матриксных металлопротеиназ (ММР): ММР-2, ММР-8, ММР-9 в амниотической жидкости и ФММП-1 в материнской сыворотке крови [11].

Матриксные металлопротеиназы — протеолитические ферменты (эндопептидазы), участвующие в деструкции и ремоделировании соединительной ткани [8, 21] Активность MMP регулируется специфическими ингибиторами метал-лопротеиназ. Механизмы регуляции процессов синтеза и активации ММР имеют большое значение для поддержания гомеостаза экстрацеллюлярного матрикса (ЭЦМ). MMP принадлежит регулирующая роль в поддержании гомеостаза ЭЦМ при физиологических состояниях (заживление ран) [21] и при патологических процессах (воспаление, разрушение хряща и др.) [8].

Матриксная металлопротеиназа-1 (ММР-1) — коллаге-наза-1 (интерстициальная коллагеназа), синтезируется фибро-бластами и моноцитами [20]. Полиморфизм в гене ММР1 — инсерция гуанина (G) в положении 1607 — определяет наличие двух аллелей гена: 1G (содержащий в своем составе один остаток гуанин в положении 1607) и 2G (содержащий последовательность из 2 остатков гуанина). Результатом мутации в гене ММР1 становится повышенное образование соответствующего фермента. Наличие данной мутации в гомо-(2G/2G) или гетерозиготном (1G/2G) состоянии гена ММР1 ассоциируется в ряде работ с повышенным риском преждевременного разрыва плодного пузыря [16, 18].

Известно, что цитокины участвуют в механизмах передачи межклеточных сигналов как в норме, так и при патологии. Они обеспечивают сеть коммуникативных сигналов

ЖУРНАЛЪ АКУШЕРСТВА и ЖЕНСКИХЪ БОЛЪЗНЕЙ

ТОМ LX ВЫПУСК 4/2011

ISSN 1684-0461

между клетками иммунной системы и клетками других органов и тканей [3]. В отличие от гормонов, поддерживающих гомеостати-ческий баланс, цитокины определяют ответную реакцию на внедрение чужеродных тел, иммунное повреждение, а также воспаление. К цитокинам относятся интерлейкины, фактор некроза опухоли, интерфероны, эйкозаноиды, калликреины-кинины, серотонин, гистамин и другие вещества.

Фактор некроза опухоли (TNF) — клеточный медиатор, продуцируемый макрофагами и лимфоцитами, обладает значительной биологической активностью. Фактор некроза опухоли альфа (кахектин) — продукт гена TNFa, играет важную роль в регуляции процессов дифферен-цировки, роста и метаболизма клеток. Кроме того, он выполняет роль медиатора патологических воспалительных процессов при различных заболеваниях [4, 3]. Рядом авторов высказывается предположение о важной роли воспалительных процессов в патогенезе ПИОВ [19, 14, 7].

Цель работы

Изучение особенностей частот аллельного полиморфизма генов ММР1, ММР3, TNFa у беременных с преждевременным излитием околоплодных вод при доношенном сроке.

Материалы и методы характеристика исследуемых групп

Для определения особенности полиморфизма генов у беременных с преждевременным излитием околоплодных вод при доношенном сроке были исследованы две группы женщин. Основную группу составили беременные с ПИОВ при доношенном сроке. В контрольную группу вошли пациентки со своевременным излитием околоплодных вод при доношенном сроке. В исследуемые группы не включались беременные с тяжелыми хроническими соматическими заболеваниями (бронхиальная астма, сахарный диабет, коллагенозы и т. д.), выраженной акушерской патологией (тяжелые формы гестоза, декомпенси-рованная плацентарная недостаточность и т. д.).

Методы

Методом ПЦР-ПДРФ анализа исследованы частоты полиморфных вариантов генов ММР1 (1G/2G полиморфизм) и ММР3 (5G/6G полиморфизм) и TNFa (-308G/A полиморфизм) у 84 женщин с преждевременным излитием околоплодных вод при доношенном сроке и у 72 женщин с нормальным течением беременности и родов.

Выделение ДНК из лимфоцитов периферической крови проводили в соответствии

с методикой приведенной в руководстве Сэмбрука (Sambrook et al., 1989), с некоторыми модификациями.

Для амплификации фрагментов промотор-ных областей генов ММР1 и ММР3, а также гена TNFA использовали следующие праймеры:

1. MMP1 F TGACTTTTAAAACATAGTCTATGT-TCA

2. MMP1 R TCTTGGATTGATTTGAGATAAGT-CATAGC

3. MMP3 F 5'-GGTTCTCCATTCCTTTGATGG-GGGGAAAgA-3'

4. MMP3 R 5 '- CTTCCTGGAATTCACATCA-CTGCCACCACT-3

5. TNFA1: 5' < ATC TGG AGG AAG CGG TAG TG > 3'

6. TNFM1: 5' < AAT AGG TTT TGA GGG CCA TG > 3'

Смесь для амплификации обьемом 25 мкл включала 15 нМ каждого праймера, 67 мМ трис-HCl, рН 8,8, 16,6 мМ сульфата аммония, 6,7 мМ MgCl2, 6,7 мкМ ЭДТА, 10 мМ меркап-тоэтанола, 170 мкг BSA, 1,0 мМ каждого dNTP и 1U Taq-ДНК-полимеразы (производства «Бион», Москва).

Для проведения ПЦР использовали следующие условия: после денатурации (94 °С, 7 мин) проводили 30 циклов амплификации в режиме: 94 °С — 40 с; 58 °С — 40 с; 72 °С — 1 мин. После амплификации продукты реакции анализировали в 7,5 % полиакриламидном геле с последующей окраской этидиумбромидом и визуализацией в УФ-свете.

Для идентификации полиморфных аллелей гена ММР1 продукты амплификации расщепляли эндонуклеазой Alu1

Для идентификации аллельных вариантов TNFa гена ПЦР продукты гидролизовали при 37 °C в течение 16 часов эндонуклеазой Bsp19I для детекции полиморфизма G-308A

Полноту гидролиза оценивали по результатам электрофореза в 7, 5 % полиакриламидном геле.

Оценка достоверности различий распределения частот генотипов (df = 2) между группой пациентов с заболеванием и контрольной выборкой осуществлялась с использованием критерия хи-квадрат с поправкой Йетса. Определение достоверности различий частот аллелей и генотипов производили с помощью с помощью критерия хи-квардрат (%2) по стан-

ЖУРНАЛЪ АКУШЕРСТВА и ЖЕНСКИХЪ БОЛЪЗНЕЙ ТО M LX В Ы ПУ С К 4/2 011 ISSN 1684-0461

Таблица 1

Частота генотипов и аллелей гена ММР1 в основной группе и в группе сравнения

Генотипы Группы

Основная Контрольная

п % п %

10/10 18 21 19 26

10/20 43 51 36 50

20/20 23 27 17 24

Всего 84 100 72 100

Аллели

10 79 47 74 51

20 89 53 70 49

Всего 168 100 144 100

Таблица 3

Частота генотипов и аллелей гена Т^а в основной группе и в группе сравнения

Генотипы Группы р

Основная Контрольная

п % п %

-308А/-308А 0 0 1 1 р > 0,05

-308А/-3080 29 34 37 52 р=0,034

-3080/-3080 55 66 34 47 р = 0,022

Всего 84 100 72 100

Аллели

-308А 29 17 39 27 р = 0,036

-3080 139 83 105 73

Всего 168 100 144 100

дартной формуле с учетом поправки Йетса для парных сравнений и поправки Бонферрони для множественных сравнений с контрольной группой [1].

Результаты

Распределения частот генотипов и аллелей по генам ММР1 и ММР3 в основной группе и группе сравнения представлены в таблицах 1 и 2.

Достоверных различий в частотах аллелей по генам ММР1 и ММР3 в анализируемых группах выявлено не было. Однако можно отметить некоторое увеличение частоты аллеля 2G (ММР1 ген) в основной группе по сравнению с контролем (53 % и 49 % соответственно) (табл. 1). Достоверных различий в частотах генотипов по генам ММР1 и ММР3 при сравнении обеих групп также выявлено не было. Но в основной группе несколько чаще встречался генотип 5А/6А (ММР3 ген) по сравнению с контрольной группой (58 % и 51 % соответственно) (табл. 2).

Таблица 2

Частота генотипов и аллелей гена ММР3 в основной

группе и в группе сравнения

Генотипы Группы

Основная Контрольная

п % п %

5А/5А 11 13 13 18

5А/6А 49 58 37 51

6А/6А 24 29 22 31

Всего 84 100 72 100

Аллели

5А 71 42 63 44

6А 97 58 81 56

Всего 168 100 144 100

При исследовании полиморфизма гена TNFa выявлены достоверные различия в частотах аллелей -308А и -308G между анализируемыми группами (р = 0, 036) (табл 3) .

Распределения частот генотипов и аллелей по гену TNFa в основной группе и группе сравнения представлены в таблице 3.

Распределение частот генотипов по гену TNFa так же достоверно отличалось (р = 0, 049, df2). В основной группе чаще встречался генотип -308G/-308G (66 %) по сравнению с контрольной (47 %) (р = 0, 022 (5,12)), а генотип -308A/-308G чаще отмечен в контрольной группе (52 %) по сравнению с основной (34 %) (р = 0,034 (4,5)) (табл. 3).

Обсуждение полученных результатов

Согласно современным научным исследованиям матриксная металлопротеиназа-1 или коллагеназа-1 (ММР1) является одним из ферментов, осуществляющих первый этап катаболизма интерстициального коллагена I, II и III типов [20]. После протеолитической активации в ЭЦМ ММР1 расщепляет в определенном участке тройную спираль коллагенового волокна, нарушая, таким образом, его стабильность.

Инсерционный полиморфизм в промотор-ной области гена ММР1 определяет повышение экспрессии и, следовательно, уровня соответствующего белка Результатом мутации в гене ММР1 становится повышенное образование соответствующего фермента. Наличие инсерции в гомо- (2G/2G) или гетерозиготном (1G/2G) состоянии ассоциируется в ряде работ с повышенным риском ПИОВ [16, 18].

По полученным нами данным, распределения частот генотипов и аллелей по гену ММР1 не показали достоверных отличий между исследуемыми группами. Хотя можно отметить

ЖУРНАЛЪ АКУШЕРСТВА и ЖЕНСКИХЪ БОЛЪЗНЕЙ

ТОМ LX ВЫПУСК 4/2011

КЫ 1684-0461

небольшое повышение частоты аллеля 2G в основной группе по сравнению с контролем. При гистохимическом исследовании плодных оболочек нами обнаружено достоверное повышения уровня MMP1, что подтверждает необходимость дальнейшего исследования других функционально значимых полиморфных вариантов гена ММР1.

В настоящее время семейство ММР включает, по меньшей мере, 25 протеолитических энзимов. На основании специфичности ММР к субстратам, различиях в аминокислотной последовательности в структуре белка, а также на особенностях организации активного центра, все ММР подразделяются на 6 больших групп: коллагеназы, желатиназы, стромели-зины, матрилизины, ММР мембранного типа, другие ММР (7 ферментов, не относящихся ни к одной из указанных групп) [10, 21, 20].

Ряд авторов в своих работах выявили приоритетную роль определенных ММР в развитии ПИОВ. В частности Fortunato S. J., Menon R. (2000) отметили 10-кратное повышение экспрессии генаMMP2 при ПИОВ. Это повышение совпадало с повышением экспрессии проапоп-тозных генов p53 и bax и падением экспрессии антиапоптозного гена bcl-2 [12].

В нашей работе при анализе функционально значимого полиморфизма ММР3 также не выявлено достоверных различий в частотах аллелей и генотипов. Тем не менее, отмечено некоторое повышение частоты функционально ослабленного аллеля в основной группе.

Таким образом, полученные данные позволяют предположить, что исследованные нами полиморфизмы генов ММР1 и ММР3, а также варианты их генотипов не играют основной роли в развитии ПИОВ. Не исключено, что эти-опатогенез ПИОВ определяется более сложным механизмом взаимодействия разных матрикс-ных металлопротеиназ с участием других эндогенных и экзогенных факторов.

Известно, что многофункциональный ци-токин TNFa играет важную роль в генезе воспалительных реакций. С одной стороны, он участвует в регуляции нормальной диффе-ренцировки, роста и метаболизма клеток, а с другой — выступает в качестве медиатора патологических воспалительных процессов при различных заболеваниях человека [4, 3].

В ряде работ высказано предположении об участии TNFa в апоптозе клеток плодных оболочек [6, 5]. Нами установлено достоверное увеличение частоты аллеля -308G и генотипа -308G/-308G по гену TNFa у беременных с ПИОВ.

Данный факт позволяет сделать предположение, что молекулярно-генетический анализ полиморфизма -308G/A гена TNFa может быть использован в качестве прогностического теста ПИОВ, позволяющего своевременно менять тактику ведения беременности и корректировать методы подготовки к родам. Однако, для создания полноценной бальной шкалы прогноза ПИОВ необходим дальнейший поиск генов, ассоциированных с ПИОВ и анализ их полиморфизма.

заключение

Полученные данные об отсутствии достоверных различий между исследуемыми группами по частоте аллелей и генотипов генов ММР1 и ММР3 дают основание утверждать необходимость изучения других полиморфизмов изучаемых генов, а также генов других металлопротеиназ.

Достоверная разница между изучаемыми группами по частоте аллелей и генотипов гена TNFa предполагает разработку балльной шкалы прогнозирования ПИОВ, с целью снижения перинатальной заболеваемости и смертности, связанной с изучаемой патологией.

Литература

1. ГланцС. Медико-биологическая статистика. — М.: Практика, 1999. — 459 с.

2. Громова A. M. Прогнозирование и профилактика преждевременного излития околоплодных вод при доношенной беременности: дис. ... д-ра мед. наук. — М., 1992. — 370 с.

3. Симбирцев А. С. Цитокины — новая система регуляции защитных функций организма // Цитокины и воспаление. —

2002. — Т. 1, № 1. — С. 9.

4. Симбирцев А. С., Рыдловская А. В. Функциональный полиморфизм гена TNFA и патология // Цитокины и воспаление. — 2005.— Т. 4, № 3. — С. 4-10.

5. Сухих Г. Т., Ванько Л. В. Иммунология беременности. — М.,

2003. — 331 с.

6. Association of type II apoptosis and 92-kDa type IV collagenase expression in human amniochorion in prematurely ruptured membranes with tumor necrosis factor receptor-1 expression / Arechavaleta-Velasco F. [et al.] // J. Soc. Gynecol. Investig. — 2002. — Vol. 9, N 2. — P. 60-67.

7. Bell S. C., Malak T. M. Structural and cellular biology of the fetal membranes // Preterm Labor / eds. Elder M., Romero R., Lam-ont F. — New-York, 1997. — P. 401-428

8. Birkedal-HansenH. Proteolytic remodeling of exstracellular matrix // Current Opinion in Cell Biology. — 1995.— Vol. 7.— P. 728-735.

9. Bryant-Greenwood G, Yamamoto S. Control of peripartal collag-enolysis in human chorion and deciduas // Am. J. Obstet. Gynecol. — 1995. — Vol. 172. — P. 63.

ЖУРНАЛЪ АКУШЕРСТВАи ЖЕНСКИХЪ БОЛЪЗНЕЙ ТО М LX В Ы ПУ С К 4/2 011 I55N 1684-0461

10. Curry T. E., Osteen K. G. The matrix metalloproteinase system: changes, regulation, and impact throughout the ovarian and uterine reproductive cycle // Endocrine Reviews. — 2003.— Vol. 24, № 4.— P. 428-465.

11. FortunatoS., MenonR, LombardiS. Induction of MMP-9 and normal presence of MMP-2, TIMP-I and 2 in human fetal membranes // Am. J. Obstet. Gynecol. — 1997. — Vol. 176. — P. 14. —

12. FortunatoS. J., MenonR. Programmed cell death (apoptosis) as a possible pathway to metalloproteinase activation and fetal membrane degradation in premature rupture of membranes // Am. J. Obstet. Gynecol. — 2000. — Vol. 182, N 6. — P. 1468-1476.

13. Ladfors L. Prelabor rupture of the membranes at or near term. Clinical and epidemiological studies / Sahlgrenska University Hospital. — Goteborg, 1999. — 78 p.

14. Malak T., Bell S. Structural characteristics of term human fetal membranes: a novel zone of extreme morphological alteration within the rupture site // Br. J. Obstet. Gynaecol. — 1994. — Vol. 101. — P. 375.

15. Naeye R. E. Factors that predispose to premature rupture of the fetal membranes // Obstet. Gynecol. — 1982. — Vol. 60. — P. 93.

16. Parry S, Strauss J. F. Premature rupture of the fetal membranes // The New England J. Medicine.— 1998.— Vol. 338, № 10.— P. 663-670.

17. Plasminogen binding by human amniochorion: a possible factor in premature rupture of membranes / Burgos H. [et al.] // Am. J. Obstet. Gynecol. — 1982. — Vol. 143. — P. 958-963.

18. PrzybylowskaK., Blasiak J. A single nucleotide polimorfism in the matrix metalloproteinase-1 gene promoter in colorectal cancer // Experimental oncology. — 2002. — Vol. 24. — P. 25-27.

19. Risk factors for preterm premature rupture of fetal membranes: a multicenter case-control study / Harger J. H. [et al.] // Am. J. Obstet. Gynecol. — 1990. — Vol. 163. — P. 130.

20. VisseR, NagaseH. Matrix metalloproteinases and tissue in inhibitors of metalloproteinases: structure, function and biochemistry // Circulation research.— 2003.— Vol. 92. — P. 827-839.

21. Woessner J. F. Matrix metalloproteinases and their inhibitors in connective tissue remodeling // The FASEB Journal. — 1991.— Vol. 5. — P. 2145-2154.

Статья представлена Е. В. Мозговой, НИИ акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта СЗО РАМН,

Санкт-Петербург

THE FEATURES OF MATRIX METALLOPROTEINASE-1, MATRIX METALLOPROTEINASE-3, TUMOR NECROSIS FACTOR-a GENES POLYMORPHISMS IN PREGNANT WOMEN WITH PREMATURE RUPTURE OF MEMBRANES AT TERM

Bolotsky V. M., Ivaschenko T. E.

Summary: The aim of our study was to investigate the frequency of matrix metalloproteinase-1 (ММР1), matrix metalloproteinase-3 (ММР3), tumor necrosis factor-a (TNFa) genes allele polymorphisms in pregnant women with premature rupture of membranes (PROM) at term. 84 women with PROM at term included in study group. 72 patients with the rupture of membranes at the end of the fist stage of labor at term comprised in control group. Pregnant women with severe chronic somatic diseases and severe obstetric pathology were excluded from the study. We have not found significant difference between the frequency of ММР-1 and ММР-3 allele polymorphisms in studied groups. The frequency of 308A and 308G polymorphisms of TNFa gene significantly differed between the two groups. We also found significant difference of TNFa genotypes frequency distribution in study and control group. We approve the significance of the investigation of other ММР1 and ММР3 genes allele polymorphisms and other MMP genes. Further studies are supposed to allow the development of point scale for the prognosis of PROM.

Key words: premature rupture of membranes; term pregnancy; matrix metalloproteinase-1; matrix metalloproteinase-3; tumor necrosis factor-a genes; allele polymorphisms.

Адреса авторов для переписки-

Болотских Вячеслав Михайлович — к. м. н.

НИИ акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта СЗО РАМН, II акушерское отд. патологии беременности. 199034, Санкт-Петербург, Менделеевская л., д. 3. E-mail: docgin@yandex.ru.

Иващенко Татьяна Эдуардовна — д. б. н., профессор, вед. науч. сотрудник лаборатории пренатальной диагностики наследственных заболеваний человека.

НИИ акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта СЗО РАМН. 199034, Санкт-Петербург, Менделеевская л., д. 3. E-mail: tiv@hosp.ru.

Bolotsky VyacheslavMihailovich — head branch pregnancy pathologies. D. O. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology, Northwest Branch of the Russian Academy of Medical Sciences. 3 Mendeleyevskaya Line, 199034, St. Petersburg, Russia. E-mail: docgin@yandex.ru.

Ivaschenko Tatyana Eduardovna — doctor of biological sciences, professor, main scientific researcher.

D. O. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology, Northwest Branch of the Russian Academy of Medical Sciences, Laboratory of prenatal diagnostics of human congenital diseases. 3 Mendeleyevskaya Line, 199034, St. Petersburg, Russia. E-mail: tiv@hosp.ru.

ЖУРНАЛЪ АКУШЕРСТВА и ЖЕНСКИХЪ БОЛЪЗНЕЙ

ТОМ LX ВЫПУСК 4/2011

ISSN 1684-0461