Скрининг и идентификация патогенных агентов байкальских губок с помощью клеточной культуры примморф

Бюллетень Оренбургского научного центра УрО РАН (электронный журнал), 2018, № 3 © Коллектив авторов, 2018 УДК 579.262

Л.И. Черногор1, С.И. Феранчук12 Е.С. Клименко1, И.В. Ханаев1, С.И. Беликов1

СКРИНИНГ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ ПАТОГЕННЫХ АГЕНТОВ БАЙКАЛЬСКИХ ГУБОК С ПОМОЩЬЮ КЛЕТОЧНОЙ КУЛЬТУРЫ ПРИММОРФ

1 Лимнологический институт СО РАН, Иркутск, Россия

2 Иркутский национальный исследовательский технический университет, Иркутск, Россия

Цель работы. Идентификация патогенных агентов на клеточной культуре прим-морф с последующим определением их микробиомов в пораженных губках и экспериментально инфицированных клеточных культурах примморф.

Материалы и методы. Работа проведена с помощью морфологических методов и ме-тагеномного секвенирования ампликонов 16$ rRNA генов с биоинфомационным анализом.

Результаты. Отмечалось снижение и гибель зеленых микроводорослей до полного их исчезновения и увеличение количества Bacteroidetes и Proteobacteria.

Заключение. В данной работе проведен поиск патогенного агента в больных губках с применением комплекса современных и классических методов, что позволит расширить представления о симбиотических взаимоотношениях в пресноводных губках.

Ключевые слова: клеточная культура примморф, симбионты, больные губки, мик-робиом, оппортунистические патогены, аннотация и ассемблирование данных.

L.I. Chernogor1, S.I. Feranchuk12 E.C. Klimenko1, I.V. Khanaev1, S.I. Belikov1

PATHOGENIC AGENTS SCREENING AND IDENTIFICATION IN THE BAIKAL SPONGES USING THE CELL CULTURE OF PRIMMORPHS

1 Limnological Institute of the SB of RAS, Irkutsk, Russia

2 National Research Technical University, Irkutsk, Russia

Aim. Identification of pathogenic agents on the cell culture of primmorphs followed by the determination of their microbiomes in affected sponges and experimentally infected cell cultures of primmorphs.

Materials and methods. The work was carried out using morphological methods and met-agenomics sequencing of amplicons of 16S rRNA genes with bioinfomation analysis.

Results. There was a decrease and death of green microalgae before their complete disappearance and an increase in the number of Bacteroidetes and Proteobacteriaphyla.

Conclusion. In this work, a search for a pathogenic agent in sponges with the use of a complex of modern and classical methods has been carried out, which will allow to expand our understanding of symbiotic relationships in freshwater sponges.

Key words: cell culture of primmorphs, symbionts, diseased sponges, microbiomes, opportunistic pathogens, annotation and assembling of data.

Введение

Работа посвящена проблеме массового поражения и гибели эндемичных байкальских губок, которая в дальнейшем может иметь катастрофические последствия для всего уникального биоразнообразия экосистемы озера

Бюллетень Оренбургского научного центра УрО РАН (электронный журнал), 2018, № 3 Байкал. Известно, что Байкал является эмблемой России и признан ЮНЕСКО объектом Всемирного наследия, назвавшей озеро «самым выдающимся примером пресноводной экосистемы».

Губки (тип Porifera) являются самыми древними фильтрующими многоклеточными животными, жившими более 635 млн. лет назад и существующими по настоящее время [1]. Известно, что симбионты губок могут составлять более 40-60% их объема и вносить значительный вклад в метаболизм хозяина [2]. Кроме того, губки занимают ключевое положение в глобальном функционировании водных экосистем и участвуют в фильтрации воды, рециклинге частиц, молекул, ионов и являются хорошим биоиндикатором состояния окружающей среды [3, 4].

Однако в последние годы во всем мире обсуждается актуальная проблема гибели морских губок и кораллов, которая наблюдается в Средиземном, Адриатическом, Карибском и других морях и океанах [3-6]. Существует не менее актуальная проблема массового заболевания и гибели байкальских пресноводных губок, которая возникла в 2011 г. с появлением в озере Байкал розовых губок. В настоящее время во многих районах озера выявлены больные губки Lubomirskia baicalensis и массовая гибель других видов эндемичных губок [7, 8]. Кроме того, отмечено крупномасштабное нарушение пространственного распределения и структуры фитоценозов прибрежной зоны озера Байкал [9]. Причины возникновения этих феноменов до сих пор не известны.

Байкальские губки (Demospongiae, Lubomirskiidae) - симбиотические животные, которые являются сложными консорциумами множества видов эукариот и прокариот [10]. Эти массовые, эндемичные животные очень важны для экосистемы озера Байкал и представляют собой хлорофилл-содержащие организмы, благодаря симбиозу с микроводорослями [11, 12]. Демоспонгии имеют различных симбионтов и доминируют в освещенной зоне, заселяя всю каменистую литораль озера, где образуют заросли на глубинах 5-30 метров. Ранее нами было показано, что внутриклеточные фото-синтезирующие зеленые водоросли Mychonastes sp., Choricystis sp. (Chlorophyta) занимают доминирующее положение в здоровых клеточных культурах губок L. baicalensis (Pallas, 1776) [10]. Кроме того, была получена длительно культивируемая in vitro клеточная культура губок - примморф [13].

Разработка модели передачи патогенных агентов в инфицированных губках требует детального изучения взаимодействий патоген-хозяин в окружающей среде. Однако в естественных условиях озера Байкал проведение таких экспериментов сложно, а порой и невозможно. Поэтому в данной работе мы применили клеточную культуру байкальской губки L. baicalensis для получения сравнительных данных о составе микробиомов больных и здоровых губок и экспериментального заражения клеточной культуры примморф.

Таким образом, целью данного исследования являлась идентификация микробиомов больных губок с помощью клеточной культуры примморф с последующим определением их составов на основе метагеномных и биоинформационных исследований.

Этот подход позволил нам осуществить выделение и идентификацию полученных изолятов с доказательством их патогенности для клеточной культуры губок. Полученные результаты расширят наши представления о симбиотических взаимоотношениях в эндемичных байкальских губках. В дальнейшем будет возможно предпринимать конкретные меры по защите экосистемы озера Байкал и сохранению этих гидробионтов.

Материалы и методы

Объектом наших исследований были пресноводные эндемичные байкальские губки L. baicalensis (рис. 1А и Б). Эта губка является хорошим модельным объектом для прикладных исследований, так как является фактически единственным видом байкальских губок, идентификация которых не вызывает сомнения (рис. 1А). Образцы внешне здоровых губок были собраны в районе Ольхонских ворот с глубины 10 м с помощью водолазного снаряжения.

Рис. 1. L. baicalensis: А - здоровая губка и В - клеточная культура губок (примморф), полученная из этой губки.

Бюллетень Оренбургского научного центра УрО РАН (электронный журнал), 2018, № 3 Примморфы (рис. 1Б), размером 3-4 мм в диаметре получали путем механической диссоциацией клеток и с помощью модифицированного нами метода длительного культивирования [13].

Кроме того, были собраны образцы больных губок (рис. 2) с целью получения 10% клеточной суспензии для экспериментального заражения клеточной культуры здоровых примморф.

Рис. 2. Больная губка L. baicalensis, которая использовалась для получения клеточной суспензии при экспериментальном заражении здоровых примморф.

Клеточную культуру примморф размером 3-4 мм культивировали в 24-луночных планшетах (Nunc Multidish Nunclon Delta, TPP Nalge Nunc International, Rochester, NY) при температуре 3-6°C в условиях, максимально приближенных к природным (температура, вода, свет). В качестве среды применялась натуральная байкальская вода (НБВ), отобранная с глубины 500 м, пропущенная через стерилизующие фильтры и обработанная ультрафиолетом (патент РФ № 2045478). Примморфы заражали по 20 мкл клеточной суспензии от больных губок в 2 мл НБВ и культивировали при температуре 3 -6°C. Наблюдения за ходом инфицирования велись in vivo в течение одного месяца с помощью световой и флуоресцентной (синий фильтр HBO 100, возбуждение 358/493 нм, излучение 463/520 нм) микроскопии с применением Axio Imager Z 2 microscope (Zeiss, Germany), а также с дальнейшим отбором проб для фиксаций и выделения ДНК и последующей идентификацией их микробиомов. Окрашивание зараженных образцов клеточных культур проводили с помощью красителя NucBlue Live ReadyProbes (Invitrogen, USA).

Генетическое разнообразие в здоровых и зараженных клеточных культурах примморф, а также в больных и здоровых губках оценивали с помо-

щью массового параллельного секвенирования нового поколения (NGS) на платформе 454/Roche по протоколу GS Titanium. Геномную ДНК в трех повторах экстрагировали от 10 до 30 мг ткани губки или по 3 примморф, используя TRIzol LS реагент (Invitrogen, Ambion, США) в соответствии с инструкциями производителя. В каждый эксперимент брали по три примморфы в трех повторностях, полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили с набором Encyclo Plus PCR kit («Евроген», Россия). Реакцию осуществляли в автоматическом амплификаторе Бис М-111 (ООО «БИС-Н», Россия). Универсальные бактериальные праймеры 518F и 1064R [14] использовали для амплификации с помощью ПЦР гипервариабельной V4-V6 области бактериального гена 16S rRNA по программе: 3 мин. при 96°С; 30 циклов из 94° С в течение 20 сек., 55°С в течение 20 сек. и 72°С в течение 1 мин. с конечной 10-минутной инкубацией при 55°С. Метагеномное секвенирование ампликонов выполнено с ДНК из трех повторных ПЦР-реакций.

Результаты и обсуждение

Для сравнения в качестве здоровых контрольных образцов брались губки 2010, 2011, 2015 гг. и примморфы, которые были получены из этой же губки 2015 г. В последующем эти примморфы являлись экспериментальными образцами для заражения суспензией клеток от больной губки. Так, в здоровой, не зараженной клеточной культуре примморф был отмечен активный

Бюллетень Оренбургского научного центра УрО РАН (электронный журнал), 2018, № 3 рост симбиотических водорослей, при микроскопии выявлена ярко-красная активная автофлуоресценция хлорофилла, клеток микроводорослей, при возбуждении синим светом (рис. 3 А и Б). При экспериментальном заражении клеточных культур суспензиями клеток больной губки выявлено, что прим-морфы теряли свой прежний ярко-зелёный цвет на 3-4 день во всех образцах, в дальнейшем отмечалось их обесцвечивание, что связано с гибелью зеленых внутриклеточных симбионтов - водорослей. Кроме того, в культуре отмечался грязный налет, зловонный запах и образование бактериальных пленок. При дальнейшем культивировании в течение месяца во всех экспериментальных образцах отмечалась гибель зеленых внутриклеточных симбионтов с потерей хлорофилла, наблюдалось интенсивное нарастание биомассы бактерий с последующим расплавлением тканей и клеток губки, и резким увеличением биомассы различных бактерий (рис. 3 В и Г).

1г

VI • I

♦ е

\

V • » . V I

' а»,- ДН

Рис. 3. А - световая микроскопия здоровой, не зараженной клеточной культуры примморф, культивированная в течении 1 месяца, Б - эта культура в ультрафиолете; красным цветом отмечена ярко-красная автофлуоресценция зеленых симбионтов. В, Г - культура примморф, зараженная суспензией клеток от больной губки через 14 дней. Красным цветом отмечены единичные зеленые симбионты, синим цветом - биомасса бактерий. Размер 10 мкм.

Бюллетень Оренбургского научного центра УрО РАН (электронный журнал), 2018, № 3

Для более детального анализа был оценен состав микробиомов микроорганизмов и фотосинтетических водорослей (эукариот и прокариот) в здоровых и больных губках и клеточных культурах примморф (здоровых и зараженных) с последующим биоинформационным анализом данных. На гистограмме показано обилие филы СуапоЪас1вг1а1С Ыогор1ав1 и бактериальных фил, наблюдаемых в исследованных образцах, (рис. 4).

Характеристика микробиомов губок и примморф

Рис. 4. Микробиомы больных и здоровых губок и клеточной культуры примморф.

Условные обозначения: Sp. 2010 - здоровые губки 2010 года; Sp. 2011 - здоровые губки 2011 года; Sp. 2015 - здоровые губки 2015 года; Pr. 1d - здоровые приммор-фы 1 день культивирования; Pr. 14d - здоровые примморфы 14 день культивирования; Sp.sick - больная губка 2015 года; Pr. + sick sp. - примморфы экспериментально зараженные суспензией клеток больной губкой 2015 года; Pr. sick - больные примморфы. Показана относительная численность доминирующих бактериальных фил в исследуемых образцах в процентах. Обилие фил нанесено на ось Y. Филы, показывающие <0,1% относительной численности, не рассматриваются.

Так, в здоровых образцах губок, выделенных в 2010, 2011, 2015 гг., и не инфицированных клеточных культурах примморф по результатам анализа 16S rRNA отмечалось доминирование хлоропласта (до 85%) и незначительное количество Cyanobacteria (до 5%). Основным симбионтом губки являлась зеленая микроводоросль Choricystis sp., которая детектируется по после-

довательности гена 16S rRNA хлоропласта и попадает в кластер Cyanobacteria. Известно, что в здоровых байкальских губках и культурах примморф присутствуют зеленые микроводоросли, содержащие один хлоропласт на клетку, которые относятся к эукариотическим симбионтам губки. Кроме того, ранее нами было показано, что и в здоровых губках, и приммор-фах доминирующими зелеными симбионтами являются фотосинтетические водоросли Mychonastes sp. и Choricystis sp. (Chlorophyta) [10]. Было показано, что одноклеточные эукариоты, входящие в сложные симбиотические сообщества байкальских губок, продуцируют значительную долю хлорофилла, жирных кислот и других вторичных метаболитов [11, 12], тогда как содержание бактериальных симбионтов составляет: Proteobacteria 9.5%, Bacteroidetes 6.7%, Actinobacteria 2.1%, Planctomycetes 0.9%, Saccharibacteria 0.8% и Ver-rucomicrobia 0.9%.

Совершенно другая картина отмечается в больных губках и инфицированных примморфах, суспензиями клеток от этих губок. В образцах отмечается резкое снижение содержания хлоропластной ДНК и существенно увеличивается количество бактерий фил Bacteroidetes (42.6-61%) и Proteobacteria (22.5-15.8%). Среди фил Bacteroidedes и Proteobacteria доминируют роды Flavobacterim до 59% и Betaproteobacteria до 27%, соответственно. Среди Betaproteobacteria отмечаются группы порядка Burkholderiales, семейства Comamonadaceae и Oxalobacteracea, которые в клеточных культурах экспериментально зараженных примморф увеличились до 10,2 и 7,4%, что соответствует микробиомам больных губок. Кроме того, отмечалось увеличение Undibacterium, Rhizobacter, Polaromonas, Albidiferax до 5,0 и 10,0%, соответственно, которые не были идентифицированы в здоровых губках и приммор-фах. Среди Gammaproteobacteria отмечается рост (до 25,4%) бактерий семейства Moraxellaceae в инфицированных культурах примморф, тогда как филы Planctomycetes и Actinobacteria представлены в качестве минорных компонентов. Кроме того, не было обнаружено Verrucomicrobia (LD 19) в здоровых и больных губках 2015 г. и в культурах примморф, которые отмечались ранее в образцах губок в 2010, 2011 г.

Все оценки биоразнообразия были выражены с использованием показателей Шеннона, Симпсона и Джини, и отражают разницу между здоровыми и больными образцами. Индекс Шеннона для здоровых образцов варьирует в пределах 1,5-2,5, а для больных образцов от 3,5 до 5 (p-значение <0,005) из-за

Бюллетень Оренбургского научного центра УрО РАН (электронный журнал), 2018, № 3 высокого содержания хлоропластов в здоровых образцах. Индекс Фишера использовался, как оценка разнесения (Р = 0,03 на уровне семейств).

Подробный биоинформационный анализ позволяет определить конкретные роды и семейства бактерий до операционной таксономической единицы (ОТи), которые были идентифицированы для больных губок. Однако гетерогенность распределения этих бактерий в инфицированных образцах примморф, а также наличие небольших количеств таксономически сходных бактерий в образцах здоровой губки в 2010 г. не позволили нам идентифицировать только один тип бактерий, который является причиной заболевания губки. В результате анализа микробиомов больных губок и инфицированных примморф было выявлено множество патогенных агентов. Известно, что в облигатных симбиотических системах, в частности в губках, члены микробного сообщества очень специализированы и тесно взаимосвязаны [20, 21], поэтому утрата даже одного из видов, часто не позволяет компенсировать потерю и замену функционально эквивалентными видами [22]. Появление разлагающихся тканей является весьма характерным признаком заболевания, что свидетельствует о паразитическом способе питания представителей многих бактериальных семейств. Значительное уменьшение в больных губках по сравнению со здоровыми, представителей фил ЛсИпоЪа^впа (0.3 и 11.4%), а также филотипа М&НуШвпвга (<0.01 и 1.0%, соответственно), очевидно, может служить примером нарушения метаболических связей между симбионтами губки. Известно, что микроорганизмы, как полезные, так и вредные, в процессе эволюции развили важную роль в губках [23]. Таким образом, наблюдаемый дисбаланс в исследуемых микробных сообществах больных губок и инфицированных культурах примморф может быть вызван несколькими различными оппортунистическими патогенами, что, в итоге, приводит к полной гибели зеленых эукариотических, фотосинтетических микроводорослей (CЫoшphyta). Природа связи между зелеными микроводорослями и бактериальными патогенами пока не выяснена и требует проведения дополнительных исследований.

Заключение

Нами разработана удобная экспериментальная клеточная культура примморф для исследования передачи патогенных агентов от больных губок для изучения взаимодействий патоген-хозяин в окружающей среде. В больных губках и зараженных культурах примморф показаны сложные симбио-

Бюллетень Оренбургского научного центра УрО РАН (электронный журнал), 2018, № 3 тические изменения, связанные с массовой гибелью зеленых эукариотиче-ских симбионтов, а также резкое увеличение представителей различных бактериальных групп, которые проявляют себя как коинфекции с несколькими различными оппортунистическими патогенами, повышающими эффективность заболевания. Описанная модельная система примморф, применимая для изучения основных механизмов развития болезни губки, будет полезна в будущих исследованиях. В данной работе проведен поиск патогенного агента в больных губках с применением комплекса современных и классических методов, что позволит расширить представления о симбиотических взаимоотношениях в пресноводных губках, а также позволит внедрить научные рекомендации по сохранению уникальных пресноводных губок озера Байкала.

(Исследование финансировалось по бюджетному проекту ФАНО России № 0345-20160002 и грантам РФФИ, № 16-04-00065, 16-54-150007, 18-04-00224). Авторы благодарны за помощь в работе ЦКП Национального научного центра морской биологии ДВО РАН (Институт морской биологии им. А.В. Жирмунского).

ЛИТЕРАТУРА

1. Love G.D., Grosjean E., Stalvies C. et al. Fossil steroids record the appearance of Demospongiae during the Cryogenian period. Nature. 2009. 457 (7230): 718-721.

2. Bayer K., Schmitt S., Hentschel U. Microbial nitrification in Mediterranean sponges: possible involvement of ammonium-oxidizing Betaproteobacteria. In: Muricy G (ed) Porifera Research: biodiversity, innovation, sustainability. Série Livros. Museu Nacional, Rio de Janeiro, 2007: 165-171.

3. Wulff J.L. Disease prevalence and population density over time in three common Caribbean coral reef sponge species. J Mar Biol Assoc. 2007. 87: 1715-1720.

4. Webster N.S. Sponge disease: a global threat? Environ Microbiol. 2007. 9 (6): 1363-1375.

5. Olson J.B., Gochfeld D.J., Slattery M. Aplysina red band syndrome: a new threat to Caribbean sponges. Dis Aquat Organ. 2006. 71(2):163-168.

6. Stabili L., Cardone F., Alifano P. et al. Epidemic mortality of the sponge Ircinia variabilis (Schmidt, 1862) associated to proliferation of a Vibrio bacterium. Microb Ecol. 2012. 64 (3): 802-813.

7. Kravtsova L.S., Izhboldina L.A., Khanaev I.V. et al. Nearshore benthic blooms of filamentous green algae in Lake Baikal. J Great Lakes Res. 2014. 40 (1): 441-48.

8. Khanaev I.V., Kravtsova L.S., Maikova O.O., et al. Current state of the sponge fauna (Porifera: Lubomirskiidae) of Lake Baikal: sponge disease and the problem of conservation of diversity. J Great Lakes Res. 2018. 44 (1): 77-85.

9. Timoshkin O.A., Samsonov D.P., Yamamuro M. et al. Rapid ecological change in the coastal zone of Lake Baikal (East Siberia): Is the site of the world's greatest freshwater biodiversity in danger? J Great Lakes Res. 2016. 42 (3): 487-97.

10. Chernogor L., Denikina N., Kondratov I. et al. Isolation and identification of microalgal symbiont from the primmorphs of endemic freshwater sponge Lubomirskia baicalensis (Pallas, 1773) (Lubomiskiidae: Haplosclerida: Demospongiae: Porifera). European Journal of Phycology. 2013. 48 (4): 497-508.

11. Latyshev N.A., Zhukova N.V., Efremova S.M. Effect of habitat on participation of symbi-onts in formation of the fatty acid pool of freshwater sponges of Lake Baikal. Comp Bio-chem Physiol. 1992. 102B: 961-965.

12. Bil K., Titlyanov E., Berner T. et al. Some aspects of the physiology and biochemistry of

Lubomirska baicalensis, a sponge from Lake Baikal containing symbiotic algae. Symbiosis. 26: 179-191.

13. Chernogor L.I., Denikina N.N., Belikov S.I. Long-term cultivation of primmorphs from freshwater Baikal sponges Lubomirskia baicalensis. Mar Biotechnol. 2011. 13 (4): 782-92.

14. Klindworth A., Pruesse E., Schweer T. et al. Evaluation of general 16S ribosomal RNA gene PCR primers for classical and next-generation sequencing-based diversity studies. Nucleic Acids. 2013. 7: 41(1):e1. https://doi: 10.1093/nar/gks808.

15. Caporaso J.G., Kuczynski J., Stombaugh J. et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nat Methods. 2010. 7 (5): 335-336.

16. Kopylova E., Navas-Molina J.A., Mercier C., et al. Open-source sequence clustering methods improve the state of the art. mSystems. 2016. 9;1(1). pii: e00003-15 https://doi: 10.1128/mSystems.00003-15

17. Feranchuk S., Belkova N., Potapova U. et al. Evaluating the use of diversity indices to distinguish between microbial communities with different traits. Res Microbiol. 2018. 169 (45): 254-261.

18. He Y., Caporaso J.G., Jiang X.T. et al. Stability of operational taxonomic units: an important but neglected property for analyzing microbial diversity. Microbiome. 2015. 3: 20. DOI: 10.1186/s40168-015-0081-x.

19. Edgar R.C. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics. 2010. 26 (19): 2460-2461.

20. Thomas T., Rusch D., Demaere M.Z. et al. Functional genomic signatures of sponge bacteria reveal unique and shared features of symbiosis. ISME J. 2010. 49 (12): 1557-1567.

21. Fan L., Reynolds D., Liu M. et al. Functional equivalence and evolutionary convergence in complex communities of microbial sponge symbionts. Proc Natl Acad Sci USA. 2012. 109 (27): E1878-87.

22. Mao-Jones J., Ritchie K.B., Jones L.E. et al. How microbial community composition regulates coral disease development. PLoS Biol. 2010. 8: e1000345.

23. Taylor M.W., Radax R., Steger D. et al. Sponge-associated microorganisms: evolution, ecology, and biotechnological potential. Microbiol Mol Biol Rev. 2007. 71 (2): 295-347.

Получена 07.09.2018

Образец ссылки на статью:

Черногор Л.И., Феранчук С.И., Клименко Е.С., Ханаев И.В., Беликов С.И. Скрининг и идентификация патогенных агентов байкальских губок с помощью клеточной культуры примморф. Бюллетень Оренбургского научного центра УрО РАН. 2018. 3: 11 c. [Электр. ресурс] (URL: http://elmag.uran.ru:9673/magazine/Numbers/2018-3/Articles/LIC-2018-3.pdf). DOI: 10.24411/2304-9081-2018-13001.