СПОСОБ СТИМУЛЯЦИИ МИЕЛОПОЭЗА
METHOD FOR STIMULATING MYELOGENESIS

Изобретение относится к медицине, конкретно к фармакологии и гематологии.
Высокая частота встречаемости заболеваний системы крови, резистентных к современной медикаментозной терапии [1, 2], является основанием для разработки новых способов стимуляции гемопоэза.
Известно большое количество способов стимуляции гемопоэза.
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату прототипом является способ стимуляции миелопоэза с помощью препарата иммобилизированной гиалуронидазы [3].
Недостатком данного способа является его недостаточная эффективность.
Задачей, решаемой данным изобретением, является повышение эффективности способа.
Поставленная задача достигается техническим решением, заключающемся в одновременном введении перорально пегилированной гиалуронидазы в дозе 50 ЕД/кг 1 раз в сутки в течение 2 дней и однократно внутривенно D-глюкуроновой кислоты в дозе 2 мг/кг.
Новым в предлагаемом изобретении является дополнительное однократное введение внутривенно D-глюкуроновой кислоты в дозе 2 мг/кг.
На сегодняшний день показана возможность стимуляции эритроидного и грануломоноцитарного ростков кроветворения с помощью пегилированной гиалуронидазы (пэгГД) [3]. При этом механизмом действия препарата является стимуляция процессов пролиферации и дифференцировки кроветворных клеток под влиянием образующихся под действием фермента низко- и среднемолекулярных форм гиалуроновой кислоты (ГК) межклеточного матрикса гемопоэтической ткани [4].
Известны гемостимулирующие эффекты D-глюкуроновой кислоты, но лишь при ее курсовом введении в высоких дозах (50 мг/кг) [5]. При этом широкое клиническое использование данного препарата в качестве гемостимулятора в указанных дозах, учитывая его кислотность, частоту и тяжесть возникновения местнораздражающих реакций, представляется маловероятным.
Вместе с тем, известно, что введение препаратов гиалуронидазы способно сопровождаться разобщением процессов пролиферации и дифференцировки кроветворных предшественников [4, 6], и как следствие - ограничением выраженности гемостимулирующих эффектов, потенциал которых может быть значительно выше. Кроме того, показано снижение способности прогениторных элементов, подвергшихся воздействию гиалуронидазы, к энграфтингу при их трансплантации [7], а также возможность предупреждения формирования данного феномена путем инкубации трансплантата в растворе, содержащем D-глюкуроновую кислоту, представляющую собой структурную единицу мономера ГК [8].
Тем не менее, возможность усиления гемостимулирующего эффекта пэгГД с помощью дополнительного введения D-глюкуроновой кислоты, причем в дозах, значительно ниже терапевтически эффективных доз, остается не известна.
Факт совместного применения пэгГД и D-глюкуроновой кислоты с достижением нового технического результата: создание эффективного способа стимуляции миелопоэза за счет потенцирования специфических гематотропных эффектов каждого из используемых веществ, для специалиста является не очевидным. Эксперимент показал непредсказуемый результат.
Заявляемые существенные признаки проявили в совокупности новые свойства, не вытекающие явным образом из уровня техники в данной области. Предлагаемое изобретение может быть использовано в экспериментальной медицине с выходом в практическое здравоохранение. Идентичной совокупности признаков при исследовании уровня техники по патентной и научно-медицинской литературе не обнаружено.
Исходя из вышеизложенного, следует считать заявляемое техническое решение соответствующим критериям: «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».
Способ осуществляют следующим образом:
Лабораторному животному (мыши) одновременно вводят перорально препарат пегилированной гиалуронидазы в дозе 50 ЕД/кг 1 раз в сутки, в течение 2-х дней, и однократно внутривенно D-глюкуроновую кислоту в дозе 2 мг/кг.
Заявляемая доза и режим введения пэгГД и D-глюкуроновой кислоты подобраны опытным путем и являются оптимальными для получения заявленного технического результата.
Предлагаемый способ был изучен в экспериментах на мышах линии CBA/CaLac в количестве 244 штук, массой 18-20 г. Мыши 1 категории (конвенциональные линейные мыши) получены из питомника отдела экспериментального биомедицинского моделирования НИИ фармакологии СО РАМН (сертификат имеется).
Эффективность стимуляции миелопоэза определялась на модели цитостатической миелосупрессии в соответствии с методическими указаниями по изучению гемостимулирующей активности фармакологических веществ [9] с помощью стандартных и культуральных гематологических методов на 3, 5 и 8-е сутки после введения цитостатика [10].
Пример 1.
Моделирование цитостатической миелосупрессии осуществляли путем однократного внутрибрюшинного введения циклофосфана в максимально переносимой дозе (250 мг/кг) в 0,3 мл физиологического раствора. Опытным животным на фоне моделирования миелосупрессии вводили перорально препарат пэгГД (ООО «Саентифик фьючер менеждмент», г.Новосибирск) 1 раз в сутки в течение 2-х дней в дозе 50 ЕД/кг (способ-прототип) и препарат пэгГД в аналогичном режиме совместно с однократным внутривенным введением D-глюкуроновой кислоты в дозе 2 мг/кг («Sigma», США).
Контролями служили группы животных, которым вводили либо однократно внутривенно D-глюкуроновую кислоту в дозе 2 мг/кг, либо 1 раз в сутки в течение 2-х дней физиологический раствор.
Введение препарата пэгГД на фоне моделирования цитостатической миелосупрессии сопровождалось стимуляцией процессов регенерации эритроидного и гранулоцитарного ростков кроветворения. Отмечалось увеличение содержания кроветворных прекурсоров (КОЕ-Э, КОЕ-ГМ) и морфологически распознаваемых клеточных элементов эритроидного и грануломоноцитарного ростков кроветворения в гемопоэтической ткани (табл.1, 2), а также количества зрелых клеток эритроидного и гранулоцитарного ряда в периферической крови (табл.3).
В отличие от этого введение D-глюкуроновой кислоты в дозе 2 мг/кг не оказывало статистически значимого влияния на показатели системы крови (табл.1-3).
В то же время применение D-глюкуроновой кислоты на фоне введения пэгГД сопровождалось значительной стимуляцией процессов кроветворения. Причем темп и выраженность регенерации кроветворной ткани в данном случае существенно превосходили таковые при использовании только пэгГД. Так, количество КОЕ-Э и КОЕ-ГМ в костном мозге на 5-е сутки было в 2,3 и 1,8 раз соответственно выше аналогичных параметров у животных, получавших терапию по способу-прототипу.
Указанные изменения состояния пула родоначальных элементов сопровождались закономерно более ранним восстановлением морфологически распознаваемых показателей костного мозга (в первую очередь, незрелых и зрелых нейтрофильных гранулоцитов, эритроидных клеток) (табл.2) и периферической крови (ретикулоцитов, палочко- и сегментоядерных нейтрофилов и тромбоцитов) (табл.3).
Таким образом, дополнительное введение низких доз D-глюкуроновой кислоты на фоне проведения терапии с помощью пегилированной гиалуронидазы приводило к значительному ускорению регенеративных процессов гемопоэтической ткани. При этом механизмом потенцирования гемостимулирующих эффектов пэгГД, по-видимому, являлось регуляторное влияние D-глюкуроновой кислоты на метаболизм гиалуроновой кислоты гликокаликса кроветворных прекурсоров.
Литература
1. Glaspy J.A. Hematopoietic management in oncology practice. Part 1. // Myeloid growth factors Oncology (Huntingt). - 2003. - Vol.17. - №11. - P.1593-1603.
2. Волкова М.А. Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор граноцит и его клиническое применение // Тер. архив. - 1998. - №4. - С.80-84.
3. Дыгай A.M., Артамонов А.В., Бекарев А.А. и др. Гемостимулирующие эффекты иммобилизированной гиалуронидазы и механизмы их развития при цитостатической миелосупрессии // Бюл. эксперим. биол. и медицины. - 2010. - №5. - С.528-531.
4. Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В. и др. Регуляция функций прогениторных клеток с помощью гиалуронидазы // Вестник РАМН. - 2009. - №11. - С.7-10.
5. Гурьянцева Л.А., Удут Е.В., Симанина Е.В. и др. Механизмы регуляции системы крови под влиянием гемостимуляторов на фоне цитостатической миелосупрессии // Сибирский онкологический журнал. - 2005. - №3. - С.39-43.
6. Зюзьков Г.Н., Жданов В.В., Дыгай A.M., Гольдберг Е.Д. Роль гиалуронидазы в регуляции гемопоэза // Бюл. эксперим. биол. и медицины. - 2007. - №12. - С.690-695.
7. Hui Zhu, Noboru Mitsuhashi, Andrew Klein e.a. The Role of the Hyaluronan Receptor CD44 in Mesenchymal Stem Cell Migration in the Extracellular Matrix // Stem Cells. 2006 - Vol.24. - N.4. - P.928-935.
8. Патент (RU) на изобретение №2392947 «Способ получения клеточного материала для трансплантации при миелосупрессии», 2010. Авторы: Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В. и др.
9. Дыгай A.M., Жданов В.В., Гольдберг В.Е. и др. Методические указания по изучению гемостимулирующей активности фармакологических веществ // Ведомости научного центра экспертизы и государственного контроля лекарственных средств. - 2002. - №1(9). - С.29-32.
10. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Шахов В.П. Методы культуры ткани в гематологии. - Томск: Изд-во ТГУ, 1992. - С.130-145.
Таблица 1
Динамика содержания КОЕ-Э и КОЕ-ГМ в костном мозге мышей линии CBA\CaLac (на 10<sup>5</sup> неприлипающих миелокариоцитов) после введения дистиллированной воды (1), 2 мг/кг D-глюкуроновой кислоты (2) и 50 ЕД/кг пегилированиой гиалуронидазы (пэгГД) (3) и совместно D-глюкуроновую кислоту с пэгГД (4) на фоне моделирования цитостатической миелосупрессии, (Х±m)
Сроки исследования, сутки
КОЕ-Э
КОЕ-ГМ
Фон
6,75±0,73
4,50±0,38
3-е
1
8,40±0,30*
8,35±0,44*
2
8,58±0,23*
8,70±0,96*
3
14,1±1,7*#
12,38±0,82*#
4
18,3±0,23*#$
17,00±0,53#$
5-е
1
7,56±0,48
6,63±0,78*
2
7,59±0,51
7,75±0,76*
3
10.73±0,65*#
15,89±0,45*#
4
24,8±1,3*#$
28,5±0,5#$
10-е
1
5,8±0,8
4,25±0,53
2
5,75±0,7
4,4±0,29
3
7,7±0,3#
6,1±0,80*
4
8,10±0,42*#
8,2±0,7*#
* - различия достоверны по отношению к фону при р<0,05;
# - различия достоверны по отношению к группе, получавшей дистиллированную воду на фоне введения циклофосфана при р<0,05;
$ - различия достоверны с группой животных, получавших только пэгГД при р<0,05.
Таблица 2
Динамика показателей костномозгового кроветворения у мышей линии CBACaLac (×106 бедро) после введения дистиллированной воды (1), 2 мг/кг D-глюкуроновой кислоты (2) и 50 ЕД/кг пегилированной гиалуронидазы (пэгГД) и совместно D-глюкуроновую кислоту с пэгГД (4) на фоне моделирования цитостатической миелосупрессии, (Х±m)
Сроки исследования, сутки
Незрелые нейтрофильные гранулоциты
Зрелые нейтрофильные гранулоциты
Эозинофильные гранулоциты
Моноциты
Эритроидные клетки
фон
1,0±0,05
3,22±0,19
0,57±0,05
0,34±0,08
1,85±0,32
3-е
1
0,03±0,01
0,10±0,04
0
0,25±0,05
0,17±0,04
2
0,03±0,02
0,15±0,02
0
0,20±0,14
0,14±0,05
3
0,14±0,02#
0,14±0,04
0
0,42±0,07
0,36±0,03#
4
0,15±0,02#
0,17±0,03
0
0,51±0,03
0,44±0,02#$
5-е
1
1,5±0,21*
2,8±0,24*
0,20±0,08
0,96±0,1*
1,22±0,1
2
1,6±0,06*
2,6±0,29*
0,09±0,05*
0,98±0,08*
1,28±0,26
3
2,31±0,02*#
3,4±0,10*#
0,22±0,05
1,34±0,15*
1,99±0,32#
4
3,49±0,05*#$
5,7±0,37#$
0,2±0,20
2,55±0,25*#$
2,78±0,2#$
10-е
1
1,6±0,08*
4,5±0,3*
0,56±0,25
0,40±0,09
1,4±0,04
2
0,80±0,41
4,7±0,5*
0,58±0,10
0,61±0,17
1,39±0,03
3
3,6±0,08*#
6,41±0,4*#
0,53±0,7
0,99±0,31
2,36±0,1*#
4
4,3±0,03*#$
7,32±0,08#$
0,57±0,14
1,07±0,06*#
3,4±0,07*#$
 - различия достоверны по отношению к фону при р<0,05;
различия достоверны по отношению к группе, получавшей дистиллированную воду на фоне введения циклофосфана при р<0,05;
$ - различия достоверны с группой животных, получавших только пэгГД при р<0,05.
Таблица 3
Показатели периферической крови у мышей линии CBA\CaLac после введения дистиллированной воды (1), 2 мг/кг D-глюкуроновой кислоты (2) и 50 ЕД/кг пегилированной гиалуронидазы (пэгГД) (3) и совместно D-глюкуроновую кислоту с пэгГД (4) на фоне моделирования цитостатической миелосупрессии, (Х±m)
Сроки исследования, сутки
Ретикулоциты, в промиллях
Палочкоядерные нейтрофилы, Г/л
Сегментоядерные нейтрофилы, Г/л
Тромбоциты, Т/л
Фон
9,3±0,2
0,30±0,02
2,34±0,07
654,7±23,4
3-е
1
10,4±0,14*
0,01±0,01*
0,11±0,02*
544,60±31,1*
2
10,89±0,33*
0,01±0,01*
0,14±0,01*
584,6±36,7
3
14,7±0,5*#
0,01±0,01*
0,19±0,02*
507,9±14,7*
4
16,8±0,59*#$
0,01±0,01
0,16±0,02
577,1±23,0
3-е
1
23,7±1,1
0,06±0,04
1,5±0,43
477,8±6,4
2
22,6±1,3
0,08±0,03
1,62±0,29
493,0±37,9
3
35,7±0,9#
0,33±0,04#
2,8±0,26#
487,3±17,8
4
42,4±2,08#$
0,94±0,21*#$
3,71±0,11#$
794,5±21,8*#$
10-е
1
16,2±1,0
1,5±0,2
4,23±0,53
708,4±17,1
2
15,7±0,7
1,72±0,1
4,37±0,7
869,6±94,3
3
17,4±0,7
1,6±0,3
6,3±0,12#
1084,7±42,8#
4
20,1±0,9#$
1,97±0,1*
7,43±0,45*#$
1256,7±21,8#$
* - различия достоверны по отношению к фону при р<0,05;
# - различия достоверны по отношению к группе, получавшей дистиллированную воду на фоне введения циклофосфана при р<0,05;
$ - различия достоверны с группой животных, получавших только пэгГД при р<0,05.