СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕТЕРОГЕННОГО БИОКАТАЛИЗАТОРА НА ОСНОВЕ ПАПАИНА, ИММОБИЛИЗОВАННОГО НА ИОНООБМЕННЫХ СМОЛАХ
METHOD OF PRODUCING HETEROGENEOUS BIOCATALYST BASED ON PAPAIN IMMOBILIZED ON ION-EXCHANGE RESINS

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в пищевой промышленности для тендеризации мяса и улучшения плавкости сыров.
Папаин (КФ 3.4.22.2) - это протеолитический фермент, обладающий высокой каталитической активностью. Папаин получают из кожуры незрелой папайи Carica papaya. Он специфически расщепляет пептидную связь вблизи положительно заряженных остатков лизина и аргинина, а также фенилаланина. Энзим имеет молекулярную массу 23 кДа, стабилен при высоких температурах, активен в диапазоне рН 3-9.
Папаин широко используется в различных отраслях промышленности, таких как пищевая, фармацевтическая, в производстве кожи, моющих средств, для тендеризации рыбных и мясных продуктов. Он применяется для гидролиза мясного белка, особенно белка миофибрилл и соединительной ткани, используется в качестве осветляющего агента в пивоварении. Папаин может улучшить плавкость и растяжимость сыра Набулси, используемого в различных кондитерских изделиях [Study on industrial applications of papain: A succinct review / H.A. Shouket [et al.] // 1st International Conference on Energetics, Civil and Agricultural Engineering. - 2020. - V. 614. - P.7].
Ферменты - это высокоэффективные катализаторы, но применение их в свободной форме (в растворе) в промышленных масштабах является сложной задачей. Чтобы улучшить свойства энзимов такие как стабильность, специфичность, каталитическую активность и сродство к субстрату, используется их иммобилизация. К другим преимуществам иммобилизации относят возможность удаления фермента из системы в любой момент реакции, повторное использование биокатализаторов. Благодаря иммобилизации ферментов на нерастворимых носителях расширяются возможности их применения в различных отраслях, включая сельское хозяйство, пищевую, целлюлозно-бумажную, текстильную и фармацевтическую промышленность [Review on surface modification of nanocarriers to overcome diffusion limitations: An enzyme immobilization aspect / C.G. Malar [et al.] // Biochemical Engineering Journal. - 2020. - V. 158. - P. 8].
Существует большое разнообразие полимерных матриц для иммобилизации энзимов. К одним из перспективных носителей относят ионообменные смолы. Ионообменные смолы - это нерастворимые полимеры, которые могут осуществлять ионный обмен. Иониты подразделяются на катионообменники (с анионными функциональными группами и положительно заряженными подвижными ионами) и анионообменники (с катионными функциональными группами и отрицательно заряженными подвижными ионами). Большинство ионообменных смол синтезированы из сшитых сополимеров полистирола и дивинилбензола, несущих ионообменные функциональные группы. Ионообменные смолы используются для очистки воды, извлечения металлов, замещения ионов, кислотно-основного катализа, в качестве сенсоров, или в виде твердых электролитов, в химической, пищевой промышленности, в производстве напитков, а также в энергетической, ядерной, полупроводниковой и фармацевтической промышленности [Biswas K., Ghosh S., Basu В. Ion-exchange Resins and Polypeptide Supported Catalysts: A Critical Review // Current Green Chemistry. - 2020. - V. 7. - P. 40-52].
В качестве прототипа служил способ получения гетерогенного препарата на основе папаина, обладающего регенерационными свойствами [Патент RU 2677873 С2, МПК A61K 38/48, A61K 47/30, А61Р 17/02, опубл. 22.01.2019, Бюл. №3], включающий обработку матрицы ионообменных волокон ВИОН АН-1 или ВИОН КН-1 раствором папаина, инкубирование, отличающийся тем, что для иммобилизации на ВИОН КН-1 используют 0.2 М ацетатный буфер (рН 4.5-5.5) или 0.05 М боратный буфер с добавлением KCl (рН 9.0-9.5), а для иммобилизации на ВИОН АН-1 - 0.05 М трис-глициновый (рН 9.0) или 0.05 М глициновый (рН 10.0) буфер в расчете 20 мл раствора фермента в концентрации 5 мг/мл на 1 г волокон, инкубирование проводится в течение 24 ч при комнатной температуре, образовавшийся осадок промывают использованным при иммобилизации буфером до отсутствия в промывных водах белка.
Заявляемое изобретение предназначено для расширения числа носителей, используемых для получения иммобилизованного папаина. Применение с этой целью ионообменных смол КУ-2, КУ-2-8 чС, IMAC-HP111, АВ-Д6-ГС, АВ-17-2П, PUROLITE А100, ЭДЭ-10П позволит получить биокатализатор с более высокой активностью и упростить процесс сорбции. Способ прост в исполнении, не требует предварительной активации носителя, а иммобилизованный папаин имеет высокую стабильность. В отличие от прототипа в заявляемом изобретении используются ионообменные смолы, а время сорбции сокращается с 24 до 2 часов, т.е. в 12 раз.
Технический результат заявленного изобретения заключается в разработке простого в исполнении, не требующего предварительной активации носителя способа получения гетерогенного биокатализатора на основе папаина, иммобилизованного на ионообменных смолах, позволяющего сократить время сорбционной иммобилизации до 2 часов, а также проводить ферментативные реакции с высокими скоростями и в условиях среды, отличающихся от физиологических, в том числе в так называемых «агрессивных» условиях.
В своей работе мы оптимизировали параметры для иммобилизации папаина адсорбционным методом на матрицах ионообменных смол с использованием различных буферов. Благодаря адсорбционной иммобилизации фермент приобретает свойства гетерогенного биокатализатора, становится более стабильным при изменении рН среды и температуры.
Технический результат достигается тем что, в способе получения гетерогенного биокатализатора на основе папаина, иммобилизованного на ионообменных смолах, включающем адсорбционную иммобилизацию папаина в буферном растворе на матрицу ионообменной смолы в соотношении 20 мл раствора папаина в концентрации 5 мг/мл на 1 г носителя, инкубацию при комнатной температуре с периодическим перемешиванием, промывку образовавшегося осадка буфером до отсутствия в промывных водах белка, согласно изобретению, иммобилизацию проводят на матрицу воздушно-сухой ионообменной смолы АВ-16-ГС, в качестве буферного раствора для иммобилизации используют 0.05 М фосфатный буфер, рН 11.0, инкубацию осуществляют в течение 2 часов, промывку образовавшегося осадка проводят 0.05 М трис-HCl буфером, рН 7.5.
Фиг. 1. Содержание белка (мг/г носителя) в препаратах папаина, иммобилизованного адсорбционным методом на ионообменных смолах с использованием следующих буферов: 1 - 0.05 М фосфатный с рН 6.5; 2 - 0.05 М глициновый с рН 9.0; 3 - 0.05 М фосфатный с рН 11.0; 4 - 0.05 М NaOH-KCL с рН 12.0.
Фиг. 2. Протеазная активность (ед/мл раствора) в препаратах папаина, иммобилизованного адсорбционным методом на ионообменных смолах с использованием следующих буферов: 1 - 0.05 М фосфатный с рН 6.5; 2 - 0.05 М глициновый с рН 9.0; 3 - 0.05 М фосфатный с рН 11.0; 4 - 0.05 М NaOH-KCL с рН 12.0.
Фиг. 3. Удельная протеазная активность (ед/мг белка) в препаратах папаина, иммобилизованного адсорбционным методом на ионообменных смолах с использованием следующих буферов: 1 - 0.05 М фосфатный с рН 6.5; 2 - 0.05 М глициновый с рН 9.0; 3 - 0.05 М фосфатный с рН 11.0; 4 - 0.05 М NaOH-KCL с рН 12.0.
Фиг. 4. Эстеразная активность (ед/мл раствора) в препаратах папаина, иммобилизованного адсорбционным методом на ионообменных смолах с использованием следующих буферов: 1 - 0.05 М фосфатный с рН 6.5; 2 - 0.05 М глициновый с рН 9.0; 3 - 0.05 М фосфатный с рН 11.0; 4 - 0.05 М NaOH-KCL с рН 12.0.
Фиг. 5. Удельная эстеразная активность (ед/мг белка) в препаратах папаина, иммобилизованного адсорбционным методом на ионообменных смолах с использованием следующих буферов: 1 - 0.05 М фосфатный с рН 6.5; 2 - 0.05 М глициновый с рН 9.0; 3 -0.05 М фосфатный с рН 11.0; 4 - 0.05 М NaOH-KCL с рН 12.0.
Пример реализации способа.
В качестве объекта исследования был выбран папаин (Sigma, США), субстратами для гидролиза служили азоказеин и N-α-бензоил-DL-аргинин-n-нитроанилид (BAPNA) (Sigma, США), носителями для иммобилизации - ионообменные смолы КУ-2, КУ-2-8 чС, IMAC-HP111, АВ-16-ГС, АВ-17-2П, PUROLITE А100, ЭДЭ-10П (Уральская химическая компания, Россия).
+
-
Перед проведением иммобилизации исследуемые образцы ионообменных смол помещали в насыщенный раствор NaCl на 3-4 ч для предотвращения растрескивания гранул, далее сорбент переносили в колонку и промывали дистиллированной водой. Для удаления минеральных примесей ионит сначала обрабатывали растворами HCl в количестве 5 объемов на 1 объем смолы в нарастающей концентрации (0.5-3.0 М) до отсутствия ионов железа в промывных водах, а затем обработку соляной кислотой повторяли при соответствующем уменьшении концентрации кислоты и отмывали смолу дистиллированной водой до нейтральной реакции. Следующей стадией подготовки ионитов-носителей была обработка растворами гидроксида натрия в нарастающей концентрации 0.1-0.25 М, после которой смолы отмывали дистиллированной водой. Для более полного удаления примесей кислотно-щелочную обработку проводили троекратно. После очистки ионит переводили в требуемую ионную форму в той же колонке: для перевода катионита в Н- форму использовали раствор 0.5 М HCl, для перевода анионита в ОН - форму - раствор 0.1 М NaOH в количестве 5 объемов раствора на 1 объем смолы [Горбунов Н.В. О кондиционировании катионитов / Н.В. Горбунов, Н.Г. Полянский. // Журнал физической химии. - 1978. - Т. 52, №5. - С. 1259-1262; Полянский Н.Г. Методы исследования ионитов / Н.Г. Полянский, Н.В. Горбунов, Н.Л. Полянская. - М.: Химия, 1976. - 208 с.]. Подготовленный таким образом носитель высушивали при комнатной температуре и хранили в емкости с плотно притертой крышкой [Создание гетерогенного ферментного препарата на основе иммобилизованной инулиназы из Helianthus tuberosus. Холявка М.Г. [и др.] // Биотехнология. - 2012. - №6. - С. 31-42].
Иммобилизацию папаина на матрице ионообменной смолы осуществляли адсорбционным методом. К 1 г воздушно-сухой ионообменной смолы добавляли 20 мл раствора фермента в концентрации 5 мг/мл, инкубировали в течение 2 часов. После окончания инкубации образовавшийся осадок промывали 0.05 М трис-HCl буфером, рН 7.5 до отсутствия в промывных водах белка (контроль осуществляли на спектрофотометре СФ-2000 при λ=280 нм).
Содержание белка в иммобилизованных препаратах папаина определяли методом Лоури [Lowry О.Н., Rosebrough N.J., Faar A.L., Randall R.J. Protein measurement with folin-phenol reagent // J. Biol. Chem. - 1951. - V. 193. - P. 265-275].
Измерение протеазной активности папаина проводили на субстрате азоказеине (Sigma, США) [Sabirova A.R., Rudakova N.L., Balaban N.P., Ilyinskaya O.N., Demidyuk I.V., Kostrov S.V., Rudenskaya G.N., Sharipova M.R. A novel secreted metzincin metalloproteinase from Bacillus intermedins // FEBS Lett. - 2010 - V. 584 (21), P. 4419-4425]. К 50 мг иммобилизованного образца добавляли 200 мкл 0.05 М трис-HCl буфера с рН 7.5, 800 мкл азоказеина (0.5% в 0.05 М трис-HCl буфере, рН 7.5) и инкубировали 2 часа при 37°С. Далее добавляли 800 мкл трихлоруксусной кислоты (ТХУ) (5%), инкубировали 10 минут при 4°С, затем центрифугировали в течение 3 мин при 13 тыс об/мин для удаления негидролизованного азоказеина. К 1200 мкл супернатанта добавляли 240 мкл 3% NaOH для нейтрализации кислоты, после чего измеряли оптическую плотность опытной пробы при 410 нм в 10 мм кювете. Контрольная проба содержала 800 мкл азоказеина, 800 мкл ТХУ, 50 мг образца и 200 мкл буфера (иммобилизованный фермент в контрольную пробу вносили последним, остальные операции для нее делали аналогично опытным пробам).
Единицей протеазной активности служило количество папаина, которое в условиях эксперимента гидролизует 1 мкМ азоказеина за 1 мин. Удельную протеазную активность рассчитывали по формуле:
ПА=D*1000/120/200/С,
где ПА - протеазная активность препарата, мкМ/мин на 1 мг белка,
D - оптическая плотность раствора при 410 нм,
С - концентрация белка в пробе, мг/мл, измеренная по методу Лоури,
120 - время инкубации в минутах,
200 - объем пробы, мкл,
1000 - коэффициент для пересчета в мкМ.
Определение эстеразной активности папаина проводили на субстрате N-α-бензоил-DL-аргинин-n-нитроанилиде (BAPNA) [Erlanger D.F., Kokowski N., Cohen W. The preparation and properties of two new chromogenic substrates of trypsin // Arch. Biochem. Biophys. - 1961. - V. 95. - P. 271]. К 50 мг образца добавляли 400 мкл BAPNA (1 мг/мл) и 400 мкл 0.2 М фосфатного буфера с рН 7.4, содержащего 0.04 М раствор цистеина. Инкубировали раствор 2 часа при 37°С, останавливали реакцию 800 мкл 1 М HCl. Измеряли оптическую плотность образцов при длине волны 410 нм. Контрольная проба содержала 400 мкл BAPNA, 400 мкл 1 М HCl, 50 мг образца и 400 мкл буфера (иммобилизованный фермент в контрольную пробу вносили последним, остальные операции для нее делали аналогично опытным пробам).
Единицей эстеразной активности служило количество папаина, которое в условиях эксперимента гидролизует 1 мкМ N-α-бензоил-DL-аргинин-n-нитроанилида за 1 минуту. Удельную эстеразную активность рассчитывали по формуле:
ЭА=D*1000/120/400/С,
где ЭА - эстеразная активность препарата, мкМ/мин на 1 мг белка,
D - оптическая плотность раствора при 410 нм,
С - концентрация белка в пробе, мг/мл, измеренная по методу Лоури,
120 - время инкубации в минутах,
400 - объем пробы, мкл,
1000 - коэффициент для пересчета в мкМ.
Все экспериментальные исследования осуществляли минимум в 8-кратной повторности. Статистическая обработка полученных результатов проводилась при уровне значимости 5% с использованием t-критерия Стьюдента.
При иммобилизации папаина на ионообменных материалах необходимо учитывать такие важные показатели, как заряды носителя и фермента. Значение pI папаина составляет 8.75 [Холявка М.Г. Практикум по биотехнологии: иммобилизованные биологические объекты в системе лабораторных работ / М.Г. Холявка, М.А. Наквасина, В.Г. Артюхов - Воронеж: Издательский дом ВГУ, 2017. - 161 с], поэтому в качестве иммобилизационной среды для его адсорбции на катионитах КУ-2, КУ-2-8 чС и IMAC-НР111 мы использовали 0.05 М фосфатный буфер с рН 6.5 и 0.05 М глициновый буфер с рН 9.0, а для иммобилизации на анионитах АВ-17-2П, АВ-16-ГС, ЭДЭ-10П и PUROLITE А100 применяли 0.05 М фосфатный буфер с рН 11.0 и 0.05 М NaOH-KCL буфер с рН 12.0. Результаты отражены на фиг. 1-5.
Наибольшее количество белка в гетерогенных препаратах (в мг на г носителя) наблюдалось при иммобилизации папаина адсорбционным методом на матрице АВ-16-ГС с NaOH-KCl буфером, рН 12.0 в качестве иммобилизационной среды (фиг. 1). Высокие значения общей протеазной активности (в ед на мл раствора) были зарегистрированы при иммобилизации фермента на матрицах АВ-16-ГС с фосфатным буфером, рН 11.0 и NaOH-KCl буфером, рН 12.0 (фиг. 2). Наибольшую удельную протеазную активность (в ед на мг белка) показали препараты папаина, иммобилизованного с помощью адсорбционного метода на матрице АВ-16-ГС с фосфатным буфером, рН 11.0 (фиг. 3).
Наибольшая эстеразная активность препаратов (в ед на мл раствора) проявлялась при использовании носителя АВ-16-ГС с фосфатным буфером, рН 11.0 и NaOH-KCl буфером, рН 12.0 (фиг. 4). Наибольшую удельную эстеразную активность показал папаин, иммобилизованный с помощью адсорбционного метода на матрице АВ-16-ГС с фосфатным буфером, рН 11.0 (фиг. 5).
Мы сравнили полученные результаты по определению содержания белка, протеазной и эстеразной активности для препаратов папаина, иммобилизованных на матрицах ионообменных смол КУ-2, КУ-2-8 чС, IMAC-HP111, АВ-16-ГС, АВ-17-2П, PUROLITE А100, ЭДЭ-10П. Оптимальное соотношение содержания белка (в мг на г носителя), общей протеазной и эстеразной активностей (в ед на мл раствора), удельной протеазной и эстеразной активностей (в ед на мг белка) выявлено при иммобилизации папаина на анионите АВ-16-ГС с фосфатным буфером, рН 11.0.
Из вышеизложенного материала следует, что среди апробированных нами вариантов иммобилизации для создания гетерогенных препаратов на основе папаина и ионообменных смол наиболее перспективным является адсорбция на анионите АВ-16-ГС с фосфатным буфером, рН 11.0.