Антибиотикорезистентность штаммов энтерококков, циркулирующих в Оренбургской области

лучают на территории умеренного климатического пояса средней и южной тайги. В основном к ним относятся Сибирский, Уральский, Приволжский, Центральный и Северо-Западный федеральные округа, наиболее эндемичные в развитии клещевых инфекций. Сформированная благоприятная совокупность природных предпосылок, а также расширяющиеся антропургические очаги приводят к расширению очага распространения инфекции. Территория Пермского края, входящая в состав Приволжского федерального округа, является одной из наиболее заклещёванных, что увеличивает риски заражения энцефалитом и боррелиозом. Для того чтобы снизить вероятность заражения, необходимо проводить систему профилактических мероприятий, в которую входит акарицидная и дератизационная обработка местности, а также массовая вакцинация населения против энцефалита и соблюдение мер профилактики.

Литература

1. Афанасьева Н.Б. Клещевой энцефалит в Приморском крае (клинико-эпидемиологические аспекты современного периода): автореф. дисс. ... канд. мед. наук. Владивосток, 2004. 25 с.

2. Байгеланов К.Ж. Клинико-иммунологическая характеристика менингеальных форм иксодовых клещевых боррелиозов и клещевого энцефалита: автореф. дисс. ... канд. мед. наук. СПб., 2009. 28 с.

3. Конев В.П. Клещевой энцефалит: патоморфология и молекулярная патология // Дальневосточный журнал инфекционной патологии. 2007. № 11. С. 87—90.

4. Андаев Е.И. Клещевой энцефалит в Читинской области и этиология очаговых форм с летальным исходом / Е.И. Андаев, А.Г. Трухина, Л.С. Карань, В.В. Погодина, Е.Г. Гамова, Н.Г. Бочкова, Т.И. Борисова, О.А. Нагибина, Е.А. Верешинин, Е.А. Сидорова // Бюллетень Сибирского отделения Российской академии медицинских наук. 2007. Т. 27. № 4. С. 60-65.

5. Болотин Е.И., Ананьев В.Ю., Бурухина Е.Г. Некоторые особенности экологии клещевых инфекций в Приморском крае // Здоровье. Медицинская экология. Наука. 2009. Т. 38. № 3. С. 63-65.

6. Захарычева Т.А. Клещевой энцефалит в Хабаровском крае: вчера, сегодня, завтра / Т.А. Захарычева, Т.В. Мжельская, Т.В. Корита, Т.Н. Каравянская, О.Е. Троценко // Дальневосточный журнал инфекционной патологии. 2012. № 20. С. 5-12.

7. О состоянии санитарно-эпидемиологического благополучия населения в Пермском крае в 2014 году: государственный доклад. Пермь: Управление Роспотребнадзора по Пермскому краю, ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Пермском крае», 2015. 257 с.

8. Число зарегистрированных случаев инфекционных заболеваний (человек). Единая межведомственная информационно-статистическая система. [Электронный ресурс].URL: http:// fedstat.ru/indicator/data.do?id=38208 (дата обращения: 05.10.2015).

Антибиотикорезистентность штаммов энтерококков, циркулирующих в Оренбургской области

М.В. Сычёва, к.б.н, ФГБОУ ВО Оренбургский ГАУ

Бактерии рода Е^егососсыз представляют особый научный и практический интерес, так как, с одной стороны, рассматриваются в качестве представителей нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта млекопитающих и благодаря наличию целого ряда полезных свойств для макроорганизма активно применяются в медицине в качестве пробиотиков. С другой стороны, ЕМегососсыз зрр. являются условно-патогенными микроорганизмами и могут выступать в роли этиологического агента экзогенных и эндогенных инфекционных процессов [1].

Энтерококки выработали устойчивость практически ко всем группам антимикробных препаратов, применяемых в клинической практике, используя для этого разнообразные генетические стратегии. Мультирезистентные энтерококки прекрасно адаптированы к выживанию в желудочно-кишечном тракте и могут становиться доминирующей флорой на фоне назначения антибиотиков, представляя серьёзную опасность в качестве возбудителей эндогенных инфекций [2].

Эмпирическое применение антибактериальных препаратов для терапии животных с инфекциями энтерококковой этиологии возможно лишь при определённом известном уровне резистентности ЕМегососсыз зрр. к этим средствам в данном регионе

или в данной популяции животных, что позволяет достаточно точно прогнозировать эффект терапии. В связи с этим актуальным является определение состояния региональной антибиотикорезистентно-сти энтерококков для выбора адекватной стартовой антибактериальной терапии, что и предопределило цель настоящего исследования — изучить антибиотикорезистентность штаммов ЕМегососсыз зрр., выделенных от животных в Оренбургской области.

Материал и методы исследования. В работе было изучено 334 штамма бактерий рода ЕМегососсыз. Из них 162 изолята, выделенные из фекалий клинически здоровых сельскохозяйственных животных, сформировали I гр. и 172 штамма ЕМегососсыз зрр., изолированные от продуктивных животных с инфекционно-воспалительными заболеваниями, составили II гр. сравнения. Штаммы энтерококков идентифицировали до вида при помощи мультиплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР) по наличию видоспецифических генов, кодирующих синтез супероксиддисмутазы [3].

Чувствительность микроорганизмов к антибактериальным препаратам (АБП) определяли диско-диффузионным методом [4]. При помощи ПЦР-анализа у изолятов энтерококков определяли гены, кодирующие резистентность к аминоглико-зидам [5], тетрациклинам [6] и гликопептидам [7] (высокий уровень резистентности к гентамицину — аас(6)-1е-арН(2")-1а, резистентность к аминоглико-

зидам (кроме гентамицина) — aph(3')-IIIa, ant(4)-Ia; резистентность к тетрациклину — tetL, резистентность к тетрациклину и миноциклину — tetM; резистентность к ванкомицину и тейкопланину — vanA, резистентность к различным концентрациям ванкомицина — vanB, резистентность к низким концентрациям ванкомицина — vanC-1, vanC-2/3).

Полученные в ходе исследований численные материалы были обработаны статистически [8].

Результаты исследования. В результате идентификации, проведённой с помощью мультиплексной ПЦР, из 162 кишечных изолятов энтерококков 45 штаммов (27,8%) были отнесены к виду E. faecium, 39 культур (24,1%) идентифицированы как E. hirae, 36 изолятов (22,2%) — E. durans, 21 культура (12,9%) — E. faecalis, 15 штаммов (9,3%) — E. flavescens и 6 изолятов (3,7%) — E. casseliflavus. Видовой состав клинических изо-лятов энтерококков был не менее разнообразным, однако доминирующее положение занимали культуры вида E. faecalis (79,1%). 9 культур (5,2%) принадлежали к виду E. faecium, 8 (4,7%) — E. casseliflavus, 7 штаммов (4,1%) — E. flavescens. В единичных случаях высевали E. hirae (1,7%), E. avium (2,3%), E. durans (2,9%).

По данным определения чувствительности энтерококков к антибактериальным препаратам диско-диффузионным методом установлено, что 85,1+2,79% фекальных и 28,0+3,42% клинических изолятов были чувствительны к ванкомицину (Р<0,001). Умеренной резистентностью к изучаемому гликопептиду характеризовались соответственно 13,0+2,64 и 23,2+3,22% культур (Р<0,05). Ванкомицинрезистентные культуры Enterococcus spp. встречались среди клинических изолятов в 25 раз чаще, чем среди штаммов, выделенных из кишечника, — 48,8+3,81 и 1,9+1,07% соответственно (Р<0,001).

В отношении ампициллина фекальные изо-ляты энтерококков сохраняли чувствительность в 87,0+2,64% случаев, клинические — в 100%. У 13,0+2,64% культур Enterococcus spp., выделенных из кишечника здоровых продуктивных животных, зарегистрирована резистентность к ампициллину.

Высокий процент резистентных штаммов энтерококков, выделенных из кишечника, отмечен к фторхинолонам: к норфлоксацину нечувствительными оказались 33,3+3,70% изолятов, к ципроф-локсацину — 50,0+3,92 % культур, к энрофлокса-цину — 64,9+3,75% штаммов. Процент фекальных изолятов чувствительных и умеренно резистентных к норфлоксацину был одинаковым и составил 33,3+3,70%. В отношении ципрофлоксацина культуры Enterococcus spp. сохраняли чувствительность в 14,8+2,78% случаев, энрофлоксацина — в 5,5+1,79% случаев. Спектр чувствительности к фторхинолонам клинических изолятов Enterococcus spp. характеризовался следующими особенностями: распространённость резистентности к норфлоксацину,

ципрофлоксацину и энрофлоксацину составила 21,0+3,10, 48,8+3,81 и 62,8+1,85%, соответственно.

Среди фторхинолонов максимальную антимикробную активность в отношении 39,5+3,72% культур энтерококков, выделенных от животных с инфекционно-воспалительными заболеваниями, проявлял норфлоксацин. Чувствительность энтерококков к ципрофлоксацину отмечена в 18,6+2,97%, умеренная резистентность — в 32,6+3,58% случаев (рис. 1).

К тетрациклину были чувствительны 77,8+3,26% фекальных культур энтерококков и 20,9+3,10% клинических изолятов (Р<0,001), резистентны — 13,0+2,64 и 76,7+3,23% соответственно (Р<0,001). Процент культур умеренно резистентных к данному АБП был больше среди энтерококков кишечного биотопа (9,2+2,27 против 2,3+1,15% клинических изолятов (Р<0,01).

Более половины энтерококков, выделенных из фекалий и клинического материала, обладали резистентностью к линезолиду (53,8+3,91 и 79,1+3,10% соответственно (Р<0,001). Только 16,6+2,92% фекальных и 9,3+2,22% клинических изолятов Enterococcus spp. демонстрировали чувствительность к линезолиду (Р<0,05), процент умеренно резистентных культур составил 29,6+3,58 и 11,6+2,44% соответственно (Р<0,001).

Установлено, что большинство штаммов, выделенных из клинического материала, характеризовалось выраженной резистентностью к цефтриаксону (90,7+2,21%). Умеренная резистентность к данному АБП среди клинических изолятов энтерококков определена в 9,3+2,22% случаев. Фекальные культуры энтерококков, резистентные к цефтриаксону, обнаружены в значительно меньшем проценте случаев (26,0+3,44% (Р<0,001), 59,2+3,86% штаммов проявляли умеренную резистентность к данному цефалоспорину и только 14,8+2,78% изолятов демонстрировали чувствительность.

Высокий процент чувствительных штаммов энтерококков фекального происхождения отмечен к аминогликозидам: к стрептомицину чувствительными оказались 94,5+1,79% изолятов, к гентамицину — 96,3+1,48% культур.

Уровень чувствительности клинических изо-лятов энтерококков к аминогликозидам (стрептомицин и гентамицин) варьировал в пределах от 83,7+2,82 до 95,3+1,62%. Устойчивость среди фекальных культур энтерококков к аминогликозидам не обнаружена, в то время как среди штаммов, выделенных из клинического материала, 14,0+2,65% изолятов были резистентны к стрептомицину, 4,7+1,62% — к гентамицину.

В результате исследования антибиотикорези-стентности штаммов энтерококков, выделенных из клинического материала, у 79,1+3,10% культур обнаружена полирезистентность. Процент полирезистентных штаммов среди фекальных изолятов был значительно меньшим — 48,1+3,93% (Р< 0,001).

и S я фекальные изоляты

х £ клинические изоляты

= = х К фекальные изоляты

и & О s 5 клинические изоляты

i я & и Я х фекальные изоляты

о клинические изоляты

4 5 - О фекальные изоляты

и х К Ч клинические изоляты

я & циклин фекальные изоляты

й £ клинические изоляты

О и S я я фекальные изоляты

IS m й о - клинические изоляты

& я S я я фекальные изоляты

Я £ о - & клинические изоляты

о & к S * я фекальные изоляты

й о - & клинические изоляты

i S я I фекальные изоляты

= 1 - клинические изоляты

я 5 и S

фекальные изоляты

клинические изоляты

0% 20% 40% 60% 80% Доля штаммов, % I Чувствительный  Умер енно-р езистентный  Резистентный

100%

Примечание: * — достоверность различий частоты встречаемости резистентности к АБП в популяции клинических и фекальных изолятов энтерококков (Р<0,05); ** - (Р<0,01); *** - (Р<0,001).

Рис. 1 - Чувствительность энтерококков к антибактериальным препаратам

Таким образом, прослеживается следующая общая закономерность: в популяции фекальных изолятов энтерококков, выделенных от животных, обнаружен более низкий процент резистентных штаммов к различным антимикробным препаратам, чем среди клинических изолятов ЕМегососст зрр. Исключение составили фторхинолоны: на фенотипическом уровне процент чувствительных к норфлоксацину и ципрофлоксацину культур был недостоверно больше среди клинических изолятов.

Поскольку известно, что на фенотипическом уровне не всегда проявляется информация, закодированная в геноме, представлялось интересным изучить распространённость среди культур энтерококков генов, кодирующих антибиотико-резистентность, и сравнить полученные данные с фенотипическим профилем изолятов. При исследовании штаммов энтерококков на наличие генов резистентности к аминогликозидам генетическая детерминанта аас(6)-1е-арк(2")-1а, кодирующая

высокии уровень резистентности к гентамицину, была выявлена у 33,4+3,70% фекальных культур и 55,8+3,78% штаммов, изолированных из клинического материала (Р< 0,001).

Данный ген в популяции фекальных энтерококков был обнаружен у культур E. faecium, E. hi-rae, E. durans и E. faecalis, в то время как среди клинических изолятов ген aac(6')-Ie-aph(2")-Ia содержали только штаммы E. faecalis.

Ген aph(3)-IIIa, обусловливающий резистентность к аминогликозидам (кроме гентамицина), достоверно чаще регистрировался в геноме клинических изолятов E. faecalis, E. avium, E. casseliflavus чем фекальных E. flavescens (37,2+3,68 и 1,8+1,04% соответственно (Р<0,001).

Напротив, генетическая детерминанта ant(4)-Ia, кодирующая резистентность к аминогликозидам (кроме гентамицина), чаще была обнаружена в популяции энтерококков, выделенных из кишечника здоровых животных (31,5+3,64%), чем среди клинических изолятов (7,0+1,95% (Р<0,001) (рис. 2).

% 70 60 50 40 30 20 10 0

Гены резистентности к тетрациклином

Гены резистентности к гликопептидам

Клинические изоляты  Фекальные изоляты

Примечание: ** — достоверность различий частоты встречаемости генов антибиотикорезистентности в популяции клинических и фекальных изолятов энтерококков —

Рис. 2 - Распространённость генетических детерминант резистентности к антибактериальным препаратам в популяции Е^етососсш 5рр., %

Резистентность к тетрациклину и миноцикли-ну (¿еШ) на генетическом уровне обнаружена у 51,2+3,81% клинических изолятов энтерококков и у 35,1+3,74% культур, выделенных из кишечного биотопа здоровых животных (Р<0,01). У фекальных культур ЕМегососы зрр. выявлен только ген ¿е1Ы, тогда как у штаммов энтерококков, изолированных от животных с инфекционно-воспалительными заболеваниями, наряду с данным геном зарегистрирован ген ¿е1Ь в 9,3+2,21% случаев.

При исследовании клинических изолятов энтерококков на наличие генов резистентности к гликопептидам ген уапА обнаружен у 32,6+3,58% культур. Частота встречаемости данного гена у фекальных культур энтерококков составила 29,6+3,58%. Штаммов, содержащих генетическую детерминанту резистентности к различным концентрациям ван-комицина (уапБ), среди энтерококков, выделенных из клинического материала, выявлено не было. Фекальные изоляты ЕПегососсыз зрр. содержали ген уапБ в 1,8+1,04% случаев. Генами резистентности к низким концентрациям ванкомицина — уапС-1 и уапС-2/3 обладали 14,0+2,65 и 7,0+1,95% клинических изолятов и 16,7+2,93 и 22,2+3,26% (Р<0,001) фекальных культур ЕМегососы зрр. соответственно.

Корреляционный анализ антибиотикорези-стентности клинических и фекальных культур энтерококков к тетрациклину на уровне фено- и генотипа выявил достоверную высокую положи -тельную связь между наличием генов резистентности и фенотипическим проявлением признака (Р< 0,001). У исследуемых штаммов энтерококков, изолированных из кишечного биотопа, обнаружена обратная взаимосвязь (г=-0,625; Р< 0,001) между наличием в геноме генетических детерминант резистентности к аминогликозидам и гликопеп-тидам и фенотипическим проявлением признака. Последнее обстоятельство может быть связано с тем, что данные препараты в настоящее время редко используется для лечения инфекционных заболеваний животных, в связи с этим не возникает

селективного давления антибиотика, способствующего фенотипическому проявлению признака.

Выводы. В Оренбургской области для лечения животных с энтерококковыми инфекциями обосновано использование ампициллина, являющегося препаратом выбора. Из других антибиотиков, потенциально эффективных при лечении инфекционно-воспалительных заболеваний, вызванных энтерококками, можно рассматривать гентамицин и стрептомицин. Целесообразность применения фторхинолонов в качестве резервной терапии является сомнительной в связи с относительно высоким уровнем резистентности энтерококков к данной группе антимикробных лекарственных средств.

Учитывая, что распространённость микроорганизмов Enterococcus spp. с повышенной резистентностью к тем или иным антибактериальным препаратам в разных регионах может быть различной и изменяться во времени, целесообразно составление и динамическое пополнение баз данных на региональных уровнях.

Литература

1. Пошвина Д.В., Щепитова Н.Е., Сычёва М.В. и др. Видовая характеристика и факторы персистенции энтерококков, выделенных от животных в норме и при патологии // Ветеринария. 2015. № 6. С. 26-30.

2. Miller W.R., Munita J.M., Arias C.A. Mechanisms of antibiotic resistance in enterococci // Expert. Rev. Anti Infect. Ther. 2014. Vol. 12. No. 10. P. 1221-1236.

3. Jackson C.R., Fedorka-Cray P.J., Barrett J.B. Use of a genus- and species-specific multiplex PCR for identification of enterococci // Journal of Clinical Microbiology. 2004. Vol. 42. No. 8. P. 3558-3565.

4. Методические указания МУК 4.2.1890-04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам»: (утв. гл. гос. санитар. врачом РФ 04.03.2004: введ. 04.03.2004). М.: Минздрав России, 2005. 62 с.

5. Vakulenko S., Donabedian S.M., Voskresenskiy A.M. et al. Multiplex PCR for detection of aminoglycoside resistance genes in enterococci // Antimicrob. Agents and Chemother. 2003. Vol. 47. No. 4. P. 1423-1426.

6. De Leener E., Martel A., Decostere A. et al. Distribution ofthe erm(B) gene, tetracycline resistance genes, and Tn1545-like transposons in macrolide- and lincosamide-resistant enterococci from pigs and humans // Microb. Drug Resist. 2004. No. 10. P. 341-345.

7. Dutka-Malen S., Evers S., Courvalin P. Detection ofglycopeptide resistance genotypes and identification to the species level of clinically relevant enterococci by PCR // J. Clin. Microbiol. 1995. Vol. 33. No. 1. P. 24-27.

8. Ашмарин И.П., Воробьёв А.А. Статистические методы в микробиологии. Л.: Гос. изд. мед. лит., 1962. 177 с.