АНТИТЕЛО ПРОТИВ БЕТА-АМИЛОИДА, ЕГО АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩИЙ ФРАГМЕНТ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
ANTIBODY AGAINST BETA-AMYLOID, ANTIGEN-BINDING FRAGMENT OF SAID ANTIBODY, AND APPLICATION THEREOF

Область изобретения
Настоящее раскрытие принадлежит к области биотехнологии. Более конкретно, настоящее раскрытие относится к антителам против β-амилоида и их применениям.
Предшествующий уровень техники
Согласно описаниям в данном документе предложена лишь справочная информация о настоящем изобретении, и они не обязательно составляют предшествующий уровень техники.
β-Амилоид (Амилоид-бета, бета-амилоид, Абета, Аβ) представляет собой полипептид, содержащий 39-43 аминокислот, образованный из белка-предшественника амилоида (АРР - от англ. amyloid precursor protein) в результате протеолиза β- и γ-секретазами. Он может продуцироваться множеством клеток и циркулирует в крови, спинномозговой жидкости и мозговой интерстициальной жидкости. Большая часть β-амилоида связывается с молекулами шаперонов, и небольшое количество существует в свободном состоянии. Аβ является нейротоксическим. Он не может метаболизироваться клетками при возрастании его содержания. Напротив, он будет накапливаться в больших количествах в клетках с образованием Аβ сенильных бляшек и вследствие этого стимулировать повреждение и гибель нейронов. Наиболее распространенными подтипами Аβ в организме человека являются Аβ1-40 и Аβ1-42, из которых Аβ1-42 является более токсичным и легче агрегирует с образованием коры Аβ бляшки и вызывает нейротоксическое действие («Medical Review», 2009, 15 (23): 3575-3577).
Болезнь Альцгеймера (AD - от англ. Alzheimer disease) была впервые открыта в 1906 году немецким психиатром и неврологом, Алоисом Альцгеймером, и была названа в его честь. Она также известна как сенильная деменция, и представляет собой хроническое нейродегенеративное заболевание. Основные клинические проявления AD включают постепенную потерю памяти, когнитивное расстройство, аномальное поведение и нарушение социального поведения. В исследованиях обнаружили, что пациенты с AD главным образом имеют следующие патологические признаки: сенильные бляшки, образованные в результате агрегации β-амилоида в коре головного мозга и гиппокампе, нейрофибриллярные клубки, образованные в результате патологической агрегации тау-белка, и пониженный уровень нервных клеток в горе головного мозга и гиппокампе. Отложение Аβ не только связано с дегенеративными изменениями нейронов, а также способно к активации целого ряда патологических событий, включая активацию астроцитов и микроглиальных клеток, разрушение гематоэнцефалического барьера и изменения в микроциркуляции и т.п. Это является основной причиной дегенерации нейронов вокруг сенильных бляшек в головном мозге и гибели у пациентов с AD (Oh, E.S., Troncoso, J.С.& Fangmark Tucker, S.M. Neuromol Med (2008) 10: 195).
Отложение Аβ обнаружено не только в сенильных бляшках при болезни Альцгеймера, но также обнаружено в большом количестве при других амилоидозах головного мозга, таких как церебральная амилоидная ангиопатия (САА - от англ. cerebral amyloid angiopathy, также называемая конгофильной амилоидной ангиопатией). Отложение Аβ, обнаруженное при САА, главным образом состоит из более короткой формы Аβ (Аβ1-40), и оно также включает маленькое количество Аβ1-42 (Wilcock et al., Journal of  Neuroinflammation 1 (24):1-11 (2004)).
Исходя из важной роли Аβ в патогенезе AD и того, что токсичность Аβ зависит от его количества, степени агрегации и скорости клиренса, исследователи в течение длительного времени разрабатывали разные способы воспрепятствования заболеваниям, связанным с Аβ, пытаясь задержать или блокировать прогрессирование AD посредством уменьшения продукции Аβ, предотвращения накопления и отложения Аβ и воспрепятствования токсичности Аβ. Множество антител против Аβ опубликовано, включая Адуканумаб (Biogen), Бапинейзумаб (Janssen, Elan, Pfizer), Соланезумаб (Eli Lilly), Гантенерумаб (Hoffman-LaRoche) и антитела против Аβ, раскрытые в патентной заявке №№ WO 1994017197 A1, WO 1998044955 A1, WO 2003016466 A3, WO 2003070760 A3, WO 2004071408 A3, WO 2006081171 A1, WO 2007108756 A1, WO 2008011348 А3, WO 2008081008 А1, WO 2012051498 A3 и т.д. Однако, большинство антител оказывались неудачными, включая Бапинейзумаб и Соланезумаб, которые подавали большие надежды, но оказались неудачными на Фазе III клинического испытания. В настоящее время только Адуканумаб все еще находится на Фазе III клинического испытания, и считается, что он является единственным новым антителом против Аβ, являющимся перспективным в отношении того, чтобы быть одобренным для лечения AD, однако все еще нужны дополнительные результаты клинических испытаний для подтверждения того, является ли он пригодным для продажи.
Таким образом, все еще существует острая необходимость в разработке антител против Абета с новой структурой для лечения заболеваний или расстройств, вызванных β-амилоидом (таких как AD).
Краткое изложение сущности изобретения
Авторы изобретения разработали антитела против Абета и их антигенсвязывающий фрагмент с полностью новой структурой после всесторонних экспериментальных исследований. Данные антитела против Абета и их антигенсвязывающий фрагмент способны специфично связываться с человеческим Абета с высокой аффинностью и демонстрируют прекрасную эффективность. Они, как ожидается, являются полезными для лечения или предупреждения заболеваний или расстройств, вызываемых Абета (например, болезни Альцгеймера).
В некоторых воплощениях согласно настоящему раскрытию предложено антитело против Абета или его антигенсвязывающий фрагмент, специфично связывающееся с человеческим Абета, причем указанное антитело содержит по меньшей мере одну область CDR (от англ. complementary determining region-область, определяющая комплементарность), выбранную из следующих аминокислотных последовательностей или обладающих по меньшей мере 85%-ной идентичностью последовательностей с ними:
(1) аминокислотная последовательность определяющей комплементарность области тяжелой цепи (англ. HCDR) HCDR1, как показано в SEQ ID NO: 11,17 или 23;
(2) аминокислотная последовательность области HCDR2 тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 12, 18, 24 или 52;
(3) аминокислотная последовательность области HCDR3 тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 13, 19, 25 или 27;
(4) аминокислотная последовательность определяющей комплементарность области легкой цепи (англ. LCDR) LCDR1, как показано в SEQ ID NO: 14 или 20;
(5) аминокислотная последовательность области LCDR2 легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 15 или 21; и
(6) аминокислотная последовательность области LCDR3 легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 16, 22, 26 или 53.
В случае аминокислотной последовательности, обладающей по меньшей 85%-ной идентичностью последовательностей, как указано выше, она предпочтительно обладает по меньшей мере 86%-ной, 87%-ной, 88%-ной, 89%-ной, 90%-ной, 91%-ной, 92%-ной, 93%-ной, 94%-ной, 95%-ной, 96%-ной, 97%-ной, 98%-ной или 99%-ной идентичностью последовательностей; более предпочтительно, она обладает более чем 90%-ной, более чем 95%-ной или более чем 99%-ной идентичностью последовательностей, наиболее предпочтительно она обладает по меньшей мере 95%-ной идентичностью последовательностей. Упомянутая выше аминокислотная последовательность, обладающая по меньшей мере 85%-ной идентичностью последовательностей, может быть получена посредством делеции, вставки или замены одной или более аминокислот.
-7
-8
-9
-10
В некоторых воплощениях, указанное антитело против Абета связывается с фибриллами Аβ1-42 и/или мономером Аβ1-42 человека с константой равновесия диссоциации (KD) примерно 10М или даже меньше; предпочтительно связывается с человеческим Абета с константой равновесия диссоциации (KD) меньше чем примерно 10 М, 10 М или 10 М или даже меньше. Значение KD может определяться посредством технологии поверхностного плазмонного резонанса (SPR - от англ. surface plasmon resonance) на приборе Biacore Т200. Предпочтительно, указанный человеческий Абета представляет собой фибриллы Аβ1-42 и мономер Аβ1-42.
В некоторых предпочтительных воплощениях указанное антитело против Абета или его антигенсвязывающий фрагмент содержит области HCDR1-3 или области LCDR1-3, как указано в любом из нижеследующего:
(i) области HCDR1, HCDR2 и HCDR3 тяжелой цепи антитела, как показано в аминокислотных последовательностях SEQ ID NO: 11, 12 и 13, соответственно;
(ii) области HCDR1, HCDR2 и HCDR3 тяжелой цепи антитела, как показано в аминокислотных последовательностях SEQ ID NO: 17, 18 и 19, соответственно;
(iii) области HCDR1, HCDR2 и HCDR3 тяжелой цепи антитела, как показано в аминокислотных последовательностях SEQ ID NO: 23, 24 и 25, соответственно;
(iv) области HCDR1, HCDR2 и HCDR3 тяжелой цепи антитела, как показано в аминокислотных последовательностях SEQ ID NO: 17, 18 и 27, соответственно;
(v) области HCDR1, HCDR2 и HCDR3 тяжелой цепи антитела, как показано в аминокислотных последовательностях SEQ ID NO: 17, 52 и 19, соответственно;
(vi) области HCDR1, HCDR2 и HCDR3 тяжелой цепи антитела, как показано в аминокислотных последовательностях SEQ ID NO: 17, 52 и 27, соответственно;
и/или
(vii) области LCDR1, LCDR2 и LCDR3 легкой цепи антитела, как показано в аминокислотных последовательностях SEQ ID NO: 14, 15 и 16, соответственно;
(viii) области LCDR1, LCDR2 и LCDR3 легкой цепи антитела, как показано в аминокислотных последовательностях SEQ ID NO: 20, 21 и 22, соответственно;
(iх) области LCDR1, LCDR2 и LCDR3 легкой цепи антитела, как показано в аминокислотных последовательностях SEQ ID NO: 20, 21 и 26, соответственно; или
(х) области LCDR1, LCDR2 и LCDR3 легкой цепи антитела, как показано в аминокислотных последовательностях SEQ ID NO: 20, 21 и 53, соответственно.
В некоторых воплощениях антитело против Абета или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему раскрытию представляет собой любое антитело против Абета или его антигенсвязывающий фрагмент, выбранное из следующих А - D:
A) антитело против Абета или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющее область HCDR1 тяжелой цепи, как показано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO 11, область HCDR2 тяжелой цепи, как показано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO 12, и область HCDR3 тяжелой цепи, как показано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO 13, и область LCDR1 легкой цепи, как показано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO 14, область LCDR2 легкой цепи, как показано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO 15, и область LCDR3 легкой цепи, как показано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO 16;
B) антитело против Абета или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющее область HCDR1 тяжелой цепи, как показано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO 17, область HCDR2 тяжелой цепи, как показано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 18 или 52, и область HCDR3 тяжелой цепи, как показано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO 19, и область LCDR1 легкой цепи, как показано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO 20, область LCDR2 легкой цепи, как показано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO 21, и область LCDR3 легкой цепи, как показано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO 22;
C) антитело против Абета или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющее область HCDR1 тяжелой цепи, как показано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO 23, область HCDR2 тяжелой цепи, как показано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO 24, и область HCDR3 тяжелой цепи, как показано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO 25, и область LCDR1 легкой цепи, как показано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO 20, область LCDR2 легкой цепи, как показано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO 21, и область LCDR3 легкой цепи, как показано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 26 или 53; и
D) антитело против Абета или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющее область HCDR1 тяжелой цепи, как показано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO 17, область HCDR2 тяжелой цепи, как показано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 18 или 52, и область HCDR3 тяжелой цепи, как показано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO 27, и область LCDR1 легкой цепи, как показано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO 20, область LCDR2 легкой цепи, как показано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO 21, и область LCDR3 легкой цепи, как показано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO 22.
В некоторых воплощениях указанное антитело против Абета или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой мышиное, химерное, гуманизированное или полностью человеческое антитело.
В некоторых воплощениях указанное антитело против Абета или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой мышиное антитело, и аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела показана в SEQ ID NO: 3, 5, 7 или 9 или обладающей по меньшей мере 85%-ной идентичностью последовательностей с ними; и/или
аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела показана в SEQ ID NO: 4, 6, 8 или 10 или обладающей по меньшей мере 85%-ной идентичностью последовательностей с ними.
-7
-8
-9
-10
В случае аминокислотной последовательности, обладающей по меньшей мере 85%-ной идентичностью последовательностей, как указано выше, она предпочтительно обладает по меньшей мере 86%-ной, 87%-ной, 88%-ной, 89%-ной, 90%-ной, 91%-ной, 92%-ной, 93%-ной, 94%-ной, 95%-ной, 96%-ной, 97%-ной, 98%-ной или 99%-ной идентичностью последовательностей; более предпочтительно она обладает более чем 90%-ной, более чем 95%-ной или более чем 99%-ной идентичностью последовательностей, наиболее предпочтительно, она обладает по меньшей мере 95%-ной идентичностью последовательностей. Упомянутая выше аминокислотная последовательность, обладающая по меньшей мере 85%-ной идентичностью последовательностей, может быть получена посредством делеции, вставки или замены одной или более аминокислот. Предпочтительно, указанное антитело связывается с человеческим Абета с константой равновесия диссоциации (KD) примерно 10 М или даже меньше. В некоторых воплощениях указанное антитело связывается с человеческим Абета с константой равновесия диссоциации (KD) меньше чем примерно 10 М, 10 М или 10 М или даже меньше, и значение KD может быть определено посредством технологии поверхностного плазмонного резонанса (SPR, от англ. Surface Plasma Resonance) на приборе Biacore Т200. Предпочтительно, указанный человеческий Абета представляет собой фибриллы Аβ1-42 и мономер Аβ1-42.
В некоторых воплощениях указанное антитело против Абета или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой любое антитело против Абета или его антигенсвязывающий фрагмент, выбранное из следующих Е - Н:
E) антитело против Абета или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, как показано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO 3, и вариабельную область легкой цепи, как показано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO 4;
F) антитело против Абета или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, как показано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO 5, и вариабельную область легкой цепи, как показано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO 6;
G) антитело против Абета или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, как показано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO 7, и вариабельную область легкой цепи, как показано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO 8; и
H) антитело против Абета или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, как показано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO 9, и вариабельную область легкой цепи, как показано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO 10.
В некоторых воплощения упомянутого выше антитела против Абета или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему раскрытию, указанное антитело представляет собой гуманизированное антитело. Предпочтительно, последовательность FR (от англ. framework region - каркасная область) области антитела происходит из последовательности FR области антитела зародышевой линии человека или ее варианта. Предпочтительно, при необходимости, данный вариант включает одну или более делеций, вставок или замен аминокислот; Более предпочтительно, вариант области FR имеет вплоть до 10 аминокислотных обратных мутаций в каркасной области легкой цепи и/или каркасной области тяжелой цепи человеческого антитела, соответственно.
В некоторых воплощениях, аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела против Абета или его антигенсвязывающего фрагмента показана в SEQ ID NO: 44, 46, 48 или 50, или обладающей по меньшей мере 85%-ной идентичностью последовательностей с ними; и/или
аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела против Абета или его антигенсвязывающего фрагмента показана в SEQ ID NO: 45, 47, 49 или 51, или обладающей по меньшей мере 85%-ной идентичностью последовательностей с ними.
-7
-8
-9
-10
В случае аминокислотной последовательности, обладающей по меньшей мере 85%-ной идентичностью последовательностей, как указано выше, она предпочтительно обладает по меньшей мере 86%-ной, 87%-ной, 88%-ной, 89%-ной, 90%-ной, 91%-ной, 92%-ной, 93%-ной, 94%-ной, 95%-ной, 96%-ной, 97%-ной, 98%-ной или 99%-ной идентичностью последовательностей; более предпочтительно, она обладает более чем 90%-ной, более чем 95%-ной или более чем 99%-ной идентичностью последовательностей, наиболее предпочтительно, она обладает по меньшей мере 95%-ной идентичностью последовательностей. Упомянутая выше аминокислотная последовательность, обладающая по меньшей мере 85%-ной идентичностью последовательностей, может быть получена посредством делеции, вставки или замены одной или более аминокислот. Предпочтительно, указанное антитело связывается с человеческим Абета с константой равновесия диссоциации (KD) примерно 10 М или даже меньше. В некоторых воплощениях указанное антитело связывается с человеческим Абета с константой равновесия диссоциации (KD) меньше чем примерно 10 М, 10 М или 10 М или даже меньше, и значение KD может быть определено посредством технологии поверхностного плазмонного резонанса (SPR) на приборе Biacore Т200. Предпочтительно, указанный человеческий Абета представляет собой фибриллы Аβ1-42 и мономер Аβ1-42.
В некоторых воплощениях указанное антитело представляет собой гуманизированное антитело, выбранное из любого антитела против Абета или его антигенсвязывающего фрагмента следующих а) - d):
a) антитело против Абета или его антигенсвязывающий фрагмент, причем вариабельная область тяжелой цепи антитела обладает по меньшей мере 90%-ной идентичностью последовательностей с последовательностью, как показано в SEQ ID NO 44, и вариабельная область легкой цепи антитела обладает по меньшей мере 90%-ной идентичностью последовательностей с последовательностью, как показано в SEQ ID NO 45;
b) антитело против Абета или его антигенсвязывающий фрагмент, причем вариабельная область тяжелой цепи антитела обладает по меньшей мере 90%-ной идентичностью последовательностей с последовательностью, как показано в SEQ ID NO 46, и вариабельная область легкой цепи антитела обладает по меньшей мере 90%-ной идентичностью последовательностей с последовательностью, как показано в SEQ ID NO 47;
c) антитело против Абета или его антигенсвязывающий фрагмент, причем вариабельная область тяжелой цепи антитела обладает по меньшей мере 90%-ной идентичностью последовательностей с последовательностью, как показано в SEQ ID NO 48, и вариабельная область легкой цепи антитела обладает по меньшей мере 90%-ной идентичностью последовательностей с последовательностью, как показано в SEQ ID NO 49; и
d) антитело против Абета или его антигенсвязывающий фрагмент, причем вариабельная область тяжелой цепи антитела обладает по меньшей мере 90%-ной идентичностью последовательностей с последовательностью, как показано в SEQ ID NO 50, и вариабельная область легкой цепи антитела обладает по меньшей мере 90%-ной идентичностью последовательностей с последовательностью, как показано в SEQ ID NO 51, где упомянутая выше по меньшей мере 90%-ная идентичность последовательностей включает по меньшей мере 90%-ную, 91%-ную, 92%-ную, 93%-ную, 94%-ную, 95%-ную, 96%-ную, 97%-ную, 98%-ную, 99%-ную или 100%-ную идентичность последовательностей.
В некоторых воплощениях указанное антитело представляет собой гуманизированное антитело, содержащее вариабельные области, как показано в любом из нижеследующего:
a) вариабельная область тяжелой цепи антитела, содержащая HCDR1, HCDR2 и HCDR3, как показано в SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 12 и SEQ ID NO 13, соответственно, и область(и) FR, содержащую(ие) одну или более аминокислотных обратных мутаций, выбранных из группы, состоящей из 1Е, 71А и 94R; и вариабельная область легкой цепи антитела, содержащая LCDR1, LCDR2 и LCDR3, как показано в SEQ ID NO 14, SEQ ID NO 15 и SEQ ID NO 16, соответственно;
b) вариабельная область тяжелой цепи антитела, содержащая HCDR1 и HCDR3, как показано в SEQ ID NO 17 и SEQ ID NO 19, соответственно, и HCDR2, как показано в SEQ ID NO: 18 или 52, и область(и) FR, содержащую(ие) одну или более аминокислотных обратных мутаций, выбранных из группы, состоящей из 28А и 82В Т; вариабельная область легкой цепи антитела, содержащая LCDR1, LCDR2 и LCDR3, как показано в SEQ ID NO 20, SEQ ID NO 21 и SEQ ID NO 22, соответственно;
c) вариабельная область тяжелой цепи антитела, содержащая HCDR1, HCDR2 и HCDR3, как показано в SEQ ID NO 23, SEQ ID NO 24 и SEQ ID NO 25, соответственно; и вариабельная область легкой цепи антитела, содержащая LCDR1 и LCDR2, как показано в SEQ ID NO 20 и SEQ ID NO 21, соответственно, и LCDR3, как показано в SEQ ID NO: 26 или 53, и область(и) FR, содержащую(ие) одну или более аминокислотных обратных мутаций, выбранных из группы, состоящей из 2V и 45К; и
d) вариабельная область тяжелой цепи антитела, содержащая HCDR1 и HCDR3, как показано в SEQ ID NO 17 и SEQ ID NO 27, соответственно, и HCDR2, как показано в SEQ ID NO: 18 или 52; и вариабельная область легкой цепи антитела, содержащая LCDR1, LCDR2 и LCDR3, как показано в SEQ ID NO 20, SEQ ID NO 21 и SEQ ID NO 22, соответственно, и FR область(и), содержащую(ие) аминокислотную обратную мутацию 2V.
В некоторых воплощениях, указанное антитело представляет собой гуманизированное антитело, содержащее вариабельные области, как показано в любом из нижеследующего:
a) вариабельная область тяжелой цепи антитела, как показано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO 66, или ее вариант FR области; и вариабельная область легкой цепи антитела, как показано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO 67, или ее вариант FR области;
b) вариабельная область тяжелой цепи антитела, как показано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO 68, или ее вариант FR области; и вариабельная область легкой цепи антитела, как показано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO 69, или ее вариант FR области;
c) вариабельная область тяжелой цепи антитела, как показано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO 70, или ее вариант FR области; и вариабельная область легкой цепи антитела, как показано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO 71, или ее вариант FR области; и
d) вариабельная область тяжелой цепи антитела, как показано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO 72, или ее вариант FR области; и вариабельная область легкой цепи антитела, как показано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO 73, или ее вариант FR области; где вариант FR области имеет вплоть до 10 аминокислотных обратных мутаций отдельно в каркасной области легкой цепи и/или каркасной области тяжелой цепи.
В некоторых воплощениях упомянутое выше антитело против Абета или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему раскрытию представляет собой любое антитело против Абета или его антигенсвязывающий фрагмент, выбранное из следующих М - Р:
М) антитело против Абета или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, как показано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO 44, и вариабельную область легкой цепи, как показано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO 45;
N) антитело против Абета или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, как показано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO 46, и вариабельную область легкой цепи, как показано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO 47;
О) антитело против Абета или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, как показано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO 48, и вариабельную область легкой цепи, как показано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO 49;
Р) антитело против Абета или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, как показано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO 50, и вариабельную область легкой цепи, как показано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO 51.
В некоторых воплощениях указанное антитело против Абета или его антигенсвязывающий фрагмент дополнительно содержит константную область.
В некоторых воплощениях константная область тяжелой цепи антитела представляет собой константную область человеческого IgG1, предпочтительно, аминокислотная последовательность константной области тяжелой цепи антитела представляет собой такую, как показано в SEQ ID NO 42, или обладающую по меньшей мере 85%-ной идентичностью последовательностей с ней; и константная область легкой цепи антитела выбрана из константной области каппа человека, и наиболее предпочтительно аминокислотная последовательность константной области легкой цепи антитела представляет собой такую, как определено в SEQ ID NO 43, или обладающую по меньшей мере 85%-ной идентичностью последовательностей с ней.
В случае аминокислотной последовательности, обладающей по меньшей мере 85%-ной идентичностью последовательностей, как указано выше, она предпочтительно обладает по меньшей мере 86%-ной, 87%-ной, 88%-ной, 89%-ной, 90%-ной, 91%-ной, 92%-ной, 93%-ной, 94%-ной, 95%-ной, 96%-ной, 97%-ной, 98%-ной или 99%-ной идентичностью последовательностей; более предпочтительно, она обладает более чем 90%-ной, более чем 95%-ной или более чем 99%-ной идентичностью последовательностей, наиболее предпочтительно, она обладает по меньшей мере 95%-ной идентичностью последовательностей. Упомянутая выше аминокислотная последовательность, обладающая по меньшей мере 85%-ной идентичностью последовательностей, может быть получена посредством делеции, вставки или замены одной или более аминокислот.
В некоторых воплощениях аминокислотная последовательность тяжелой цепи антитела против Абета представляет собой такую, как показано в SEQ ID NO: 30, 34, 38 или 40, или обладающую по меньшей мере 85%-ной идентичностью последовательностей с ними, и/или
аминокислотная последовательность легкой цепи антитела против Абета показана в SEQ ID NO: 31, 35, 39 или 41, или обладающей по меньшей мере 85%-ной идентичностью последовательностей с ними.
-7
-8
-9
-10
В случае аминокислотной последовательности, обладающей по меньшей мере 85%-ной идентичностью последовательностей, как указано выше, она предпочтительно обладает по меньшей мере 86%-ной, 87%-ной, 88%-ной, 89%-ной, 90%-ной, 91%-ной, 92%-ной, 93%-ной, 94%-ной, 95%-ной, 96%-ной, 97%-ной, 98%-ной или 99%-ной идентичностью последовательностей; более предпочтительно, она обладает более чем 90%-ной, более чем 95%-ной или более чем 99%-ной идентичностью последовательностей, наиболее предпочтительно, она обладает по меньшей мере 95%-ной идентичностью последовательностей. Упомянутая выше аминокислотная последовательность, обладающая по меньшей мере 85%-ной идентичностью последовательностей, может быть получена посредством делеции, вставки или замены одной или более аминокислот. Предпочтительно, указанное антитело связывается с человеческим Абета с константой равновесия диссоциации (KD) примерно 10 М или даже меньше. В некоторых воплощениях указанное антитело связывается с человеческим Абета с константой равновесия диссоциации (KD) меньше чем примерно 10 М, 10 М или 10 М или даже меньше, и значение KD может быть определено посредством технологии поверхностного плазмонного резонанса (SPR) на приборе Biacore Т200. Предпочтительно, указанный человеческий Абета представляет собой фибриллы Аβ1-42 и мономер Аβ1-42.
В некоторых воплощениях указанное антитело против Абета или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой любое антитело против Абета или его антигенсвязывающий фрагмент, выбранное из следующих Q - Т:
Q) антитело против Абета или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее тяжелую цепь, как показано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO 30, и легкую цепь, как показано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO 31;
R) антитело против Абета или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее тяжелую цепь, как показано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO 34, и легкую цепь, как показано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO 35;
S) антитело против Абета или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее тяжелую цепь, как показано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO 38, и легкую цепь, как показано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO 39; и
Т) антитело против Абета или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее тяжелую цепь, как показано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO 40, и легкую цепь, как показано в аминокислотной последовательности SEQ ID NO 41.
2
В некоторых воплощениях антигенсвязывающий фрагмент по настоящему раскрытию выбран из группы, состоящей из Fab (от англ. antigen-binding fragment -антигенсвязывающий фрагмент), Fab', F(ab'), scFv (от англ. single-chain variable fragment - одноцепочечный вариабельный фрагмент), диатела, dsFv и антигенсвязывающего фрагмента пептида, содержащего CDR.
В некоторых воплощениях предложено антитело против Абета, конкурирующее с упомянутым выше антителом или его антигенсвязывающим фрагментом за связывание с человеческим Абета, или конкурирующее с упомянутым выше антителом или его антигенсвязывающим фрагментом за связывание с одним и тем же эпитопом антигена Абета.
В некоторых воплощениях согласно настоящему раскрытию также предложена молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая любое антитело против Абета или его антигенсвязывающий фрагмент, как описано выше.
В некоторых воплощениях молекула нуклеиновой кислоты представляет собой любую молекулу нуклеиновой кислоты, выбранную из следующих U - Z:
U) молекула нуклеиновой кислоты, которая содержит нуклеотидную последовательность, как показано в SEQ ID NO 52, или нуклеотидную последовательность, обладающую по меньшей мере 85%-ной идентичностью последовательностей с ней, и/или содержит нуклеотидную последовательность, как показано в SEQ ID NO 53, или нуклеотидную последовательность, обладающую по меньшей мере 85%-ной идентичностью последовательностей с ней;
V) молекула нуклеиновой кислоты, которая содержит нуклеотидную последовательность, как показано в SEQ ID NO 54, или нуклеотидную последовательность, обладающую по меньшей мере 85%-ной идентичностью последовательностей с ней, и/или содержит нуклеотидную последовательность, как показано в SEQ ID NO 55, или нуклеотидную последовательность, обладающую по меньшей мере 85%-ной идентичностью последовательностей с ней;
W) молекула нуклеиновой кислоты, которая содержит нуклеотидную последовательность, как показано в SEQ ID NO 56, или нуклеотидную последовательность, обладающую по меньшей мере 85%-ной идентичностью последовательностей с ней, и/или содержит нуклеотидную последовательность, как показано в SEQ ID NO 57, или нуклеотидную последовательность, обладающую по меньшей мере 85%-ной идентичностью последовательностей с ней; и
Z) молекула нуклеиновой кислоты, которая содержит нуклеотидную последовательность, как показано в SEQ ID NO 58, или нуклеотидную последовательность, обладающую по меньшей мере 85%-ной идентичностью последовательностей с ней, и/или содержит нуклеотидную последовательность, как показано в SEQ ID NO 59, или нуклеотидную последовательность, обладающую по меньшей мере 85%-ной идентичностью последовательностей с ней.
В одном аспекте согласно настоящему раскрытию также предложен рекомбинантный вектор, который содержит упомянутую выше молекулу нуклеиновой кислоты.
В одном аспекте согласно настоящему раскрытию также предложена клетка-хозяин, полученная посредством трансформации упомянутым выше рекомбинантным вектором; клетка-хозяин выбрана из группы, состоящей из прокариотических клеток и эукариотических клеток, предпочтительно эукариотических клеток, более предпочтительно клеток млекопитающего, включая СНО (от англ. Chinese Hamster ovary cell line - линия клеток яичника китайского хомяка) и клетки NS0.
В еще одном аспекте согласно настоящему раскрытию предложен способ получения упомянутого выше антитела против Абета или его антигенсвязывающего фрагмента, включая стадии культивирования упомянутой выше клетки-хозяина в культуральной среде и затем очистки и выделения данного антитела.
В еще одном аспекте согласно настоящему раскрытию также предложена фармацевтическая композиция, содержащая упомянутое выше антитело против Абета или его антигенсвязывающий фрагмент и один или более фармацевтически приемлемых носителей, вспомогательных веществ или разбавителей.
В еще одном аспекте согласно настоящему раскрытию также предложено применение упомянутого выше антитела против Абета или его антигенсвязывающего фрагмента или упомянутой выше фармацевтической композиции в получении лекарственного средства для лечения или предупреждения заболевания или расстройства, вызванного Абета.
В еще одном аспекте согласно настоящему раскрытию также предложен способ лечения или предупреждения заболевания или расстройства, вызываемого Абета, включающий введение терапевтически эффективного количества упомянутого выше антитела против Абета или его антигенсвязывающего фрагмента или упомянутой выше фармацевтической композиции пациенту, имеющему данное заболевание или расстройство.
В еще одном аспекте согласно настоящему раскрытию также предложено упомянутое выше антитело против Абета или его антигенсвязывающий фрагмент или упомянутая выше фармацевтическая композиция для применения в качестве лекарственного средства для лечения заболеваний или расстройств, опосредованных Абета.
В некоторых воплощениях упомянутое выше заболевание или расстройство представляет собой нейродегенеративное заболевание, выбранное из группы, состоящей из болезни Альцгеймера, легкого когнитивного расстройства, фронтотемпоральной деменции, деменции с тельцами Леви, болезни Паркинсона, болезни Пика, болезни Бевака, конгофильной амилоидной ангиопатии, церебральной амилоидной ангиопатии, синдрома Дауна, мультиинфарктной деменции, болезни Гентингтона, болезни Крейтцфельдта - Якоба, синдрома деменции при СПИДе, депрессии, тревожного невроза, фобии, паралича Белла, эпилепсии, энцефалита, множественного склероза, нервно-мышечного расстройства, нейроонкологического заболевания, опухоли головного мозга, нейроваскулярного расстройства вследствие инсульта, нейроиммунологического заболевания, нейропатического отологического заболевания, травматического повреждения нервной системы вследствие повреждения спинного мозга, боли из-за нейропатической боли, детского нейро- и нейропсихиатрического расстройства, нарушения сна, синдрома Туретта, легкого когнитивного расстройства, сосудистой деменции, мультиинфарктной деменции, кистозного фиброза, болезни Гоше и другой дискинезии и заболеваний центральной нервной системы. В некоторых воплощениях заболевание представляет собой болезнь Альцгеймера.
В некоторых воплощениях согласно настоящему раскрытию также предложен способ лечения или предупреждения болезни Альцгеймера, включающий введение пациенту терапевтически эффективного количества упомянутого выше антитела против Абета или его антигенсвязывающего фрагмента или упомянутой выше фармацевтической композиции.
-8
-10
-7
-8
Антитела против Абета или их антигенсвязывающие фрагменты по настоящему раскрытию демонстрируют хорошую эффективность, как в биохимических тестах, так и фармакодинамических анализах in vivo. Например, в анализе выявления аффинности антитела против Абета по настоящему раскрытию (НАВ-2401, НАВ-5101, НАВ-3601 и НАВ-9001) демонстрируют аффинность в отношении фибрилл Aβ1-42 меньше чем 10 М, даже меньше чем 10 М, и аффинность в отношении мономера Aβ1-42 меньше чем 10 М - 10 М. В особенности, антитело НАВ-9001 демонстрирует аффинность почти в 100 раз сильнее, чем Адуканумаб, известный в настоящее время как наиболее превосходное антитело против Абета.
Кроме того, в анализе влияния антител на блокирование агрегации мономеров Aβ1-42 в фибриллы Aβ1-42, результаты показывают, что антитела НАВ-2401, НАВ-5101 и НАВ-9001 по настоящему раскрытию могут эффективно ингибировать агрегацию мономера Aβ1 -42 в фибриллы Aβ1-42, тогда как Адуканумаб не может.
В биохимическом анализе результаты показывают, что антитела против Абета НАВ-2401 и НАВ-3601 по настоящему раскрытию оказывают влияние на защиту первичных нейронов крысы и могут стимулировать фагоцитоз фибрилл Аβ первичными клетками микроглии.
Кроме того, результаты фармакодинамического анализа на животных показывают, что антитела НАВ-2401, НАВ-5101 и НАВ-9001 по настоящему раскрытию могут значимо улучшать пространственную память и когнитивную способность мышей 5*FAD с болезнью Альцгеймера. Кроме того, антитела по настоящему раскрытию оказывают более слабое влияние на высвобождение цитокинов (таких как, ФНОα (фактор некроза опухоли альфа), IFN-γ (от англ. interferon gamma - интерферон гамма), IL1р (от англ. Interleukin - интерлейкин), IL2, IL6, IL12p70, IL4, IL10, МСР-1 (от англ. Monocyte Chemotactic Protein 1 - Моноцитарный хемотаксический белок 1) и КС) в ткани головного мозга, по сравнению с положительным контролем - антителом Адуканумаб, что указывает на то, что антитела по настоящему раскрытию являются контролируемыми с точки зрения угроз безопасности. Ожидается, что антитела против Абета по настоящему раскрытию будут полезными в будущем для лечения или предупреждения заболеваний или расстройств, вызываемых Абета (таких как болезнь Альцгеймера).
Описание графических материалов
На Фиг. 1 изображен анализ флуоресценции тиофлавина (ThT - от англ. thioflavin Т), показывающий результаты экспериментов по блокирующему действию антител против Абета на агрегацию мономеров Аβ1-42 в фибриллы Аβ1-42;
На Фиг. 2 изображен анализ защиты на первичных нейронах коры головного мозга, показывающий результаты экспериментов по защитному действию антител против Абета на первичные нейроны крысы;
На Фиг. 3 изображен анализ фагоцитоза BV2, показывающий результаты экспериментов по антителам против Абета, которые стимулируют фагоцитоз фибрилл Аβ клетками BV2;
На Фиг. 4 показаны результаты экспериментов по воздействию антител против Абета на фагоцитоз фибрилл Аβ первичными микроглиальными клетками крысы;
Фиг. 5 представляет собой репрезентативную картину балльной оценки способности мышей строить гнездо;
На Фиг. 6 показан эксперимент по гнездованию, причем на столбчатой диаграмме показано действие антител против Абета на улучшение социального поведения трансгенных мышей 5×FAD;
На Фиг. 7 показан эксперимент по гнездованию, причем на диаграмме рассеяния показано воздействие антител против Абета на улучшение социального поведения трансгенных мышей 5×FAD;
На Фиг. 8 показано схематичное изображение водного лабиринта. Закрашенный кружок и пунктирный кружок представляют расположение платформы и зоны платформы, соответственно.
На Фиг. 9 изображены кривые обучения для эксперимента с водным лабиринтом; показаны результаты кривых по тренировке и обучению со спрятанной платформой. Двухфакторный дисперсионный анализ относится к двухфакторному дисперсионному анализу; Результаты анализа выглядят следующим образом:
Двухфакторный дисперсионный анализ: WT (от англ. wild type - дикий тип) в сравнении с Носителем: # р меньше 0,05; ###: р меньше 0,001;
Amab в сравнении с Носителем:  меньше 0,05;  р меньше 0,01;  р меньше 0,001;
HAB-5101-Ch в сравнении с Носителем: ^: р меньше 0,05;
НАВ-2401-Ch в сравнении с Носителем:  р меньше 0,05;  р меньше 0,01;
НАВ-9001-Ch в сравнении с Носителем: *: р меньше 0,05; **: р меньше 0,01; ***: Р меньше 0,001.
На Фиг. 10A-10G изображены результаты эксперимента - водного лабиринта: на горизонтальной оси показаны группы введения лекарственного средства; На Фиг. 10А показаны результаты по времени задержки в достижении платформы, на Фиг. 10В показаны результаты по времени задержки в достижении зоны платформы, на Фиг. 10С показаны результаты подсчета пересечений платформы, на Фиг. 10D показаны результаты подсчета пересечения зоны платформы, на Фиг. 10Е показаны результаты по продолжительности пребывания на платформе, на Фиг. 10F показаны результаты по продолжительности пребывания в зоне платформы, и на Фиг. 10G показаны результаты по индексу пересечения платформы (индекс пересечения равен количеству пересечений целевой области - (сумма количеств пересечений соответствующих областей в других трех секторах)/3), легенды Фиг. 10B-10G являются такими же, как легенды Фиг. 10А (для получения более подробной информации см. легенду в Фиг. 10А). Однофакторный дисперсионный анализ относится к однофакторному дисперсионному анализу (то же в случае фиг. 12 и 13), в сравнении с носителем, *р меньше 0,05, **р меньше 0,01, ***р меньше 0,001; значимые различия между группами не были выявлены;
На Фиг. 11A-11D изображены результаты твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА, или ELISA - от англ. enzyme-linked immunosorbent assay) отложения Аβ. На Фиг. 11А показано содержание нерастворимого Аβ1-40, присутствующего в гиппокампе, на фиг. 11В показано содержание нерастворимого Аβ1-42, присутствующего в гиппокампе (легенда Фиг. 11В является такой же, как легенда Фиг. 11 А, для получения более подробной информации см. Фиг 11 А), на Фиг. 11С показано содержание нерастворимого Аβ1-40, находящееся в коре головного мозга, и на Фиг. 11D показано содержание нерастворимого Аβ1-42, находящееся в коре головного мозга (легенда Фиг. 11D является такой же, как легенда Фиг. 11С, для получения более подробной информации см. Фиг. 11С);
Фиг. 12 представляет собой график, показывающий Аβ в гиппокампе, показывающий результаты иммуногистохимии (ИГХ) - обнаружение отложения Аβ (кора головного мозга). Однофакторный дисперсионный анализ, в сравнении с носителем ***р меньше 0,001;
На Фиг. 13 показан Аβ в коре головного мозга, показывая результаты ИГХ-обнаружение отложения Аβ (гиппокамп);
На Фиг. 14А показано воздействие антител против Абета на высвобождение цитокина, ФНОα в ткани головного мозга;
На Фиг. 14В показано воздействие антител против Абета на высвобождение цитокина IFN-γ в ткани головного мозга;
На Фиг. 14С показано воздействие антител против Абета на высвобождение МСР-1 в ткани головного мозга;
На Фиг. 14D показано воздействие антител против Абета на высвобождение КС в ткани головного мозга;
На Фиг. 15А показано воздействие антител против Абета на высвобождение цитокина IL1γ в ткани головного мозга;
На Фиг. 15В показано воздействие антител против Абета на высвобождение цитокина IL2 в ткани головного мозга;
На Фиг. 15С показано воздействие антител против Абета на высвобождение цитокина IL6 в ткани головного мозга;
На Фиг. 15D показано воздействие антител против Абета на высвобождение цитокина IL12р70 в ткани головного мозга;
На Фиг. 15Е показано воздействие антител против Абета на высвобождение цитокина IL4 в ткани головного мозга;
На Фиг. 15F показано воздействие антител против Абета на высвобождение цитокина IL10 в ткани головного мозга.
Терминология
Для более легкого понимания настоящего раскрытия определенные технические и научные термины конкретно определены ниже. Если в данном документе в явном виде не определено иное, все другие технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют значение, обычно подразумеваемое специалистами в области, к которой принадлежит данное раскрытие.
Трехбуквенные коды и однобуквенные коды для аминокислот, используемые в настоящем раскрытии, представляют собой такие, как описано в J. Biol. Chem, 243, р3558 (1968).
В настоящем раскрытии термин «XXX» относится к одному или более веществам; например, под термином «антитело против Абета» следует понимать одно или более антител, специфично связывающихся с Абета. Таким образом, термины «один», «один или более» и «по меньшей мере один» могут использоваться взаимозаменяемо в данном документе.
Термины «амилоид β», «β-амилоид», «Ар» и «Абета» могут использоваться взаимозаменяемо в данном документе и относятся к сегменту, образованному посредством расщепления белка-предшественника амилоида (АРР) с использованием р-секретазы 1 (ВАСЕ1), или его любой модификации или любому функциональному эквиваленту, включая Аβ1-40 и Аβ1-42, но, не ограничиваясь ими. Известно, что Аβ находится в форме мономеров, которые объединены с образованием олигомеров и протофибриллярной структуры. Структура и последовательности таких пептидов Аβ хорошо известны специалистам в данной области, и способы получения данных пептидов или выделения данных пептидов из головного мозга и других тканей также хорошо известны (например, Glenner and Wong, Biochem Biophys Res. Comm. 129:885 -890 (1984)). Кроме того, пептиды Аβ также имеются в продаже. В качестве примеров аминокислотной последовательности человеческого Аβ SEQ ID NO 1 представляет аминокислотную последовательность Аβ1-40 и SEQ ID NO 2 представляет аминокислотную последовательность Аβ1-42.
В том виде, в котором он используется в данном документе, термин «антитело» относится к иммуноглобулину, структуре четырех пептидных цепей, соединенных вместе посредством дисульфидной связи между двумя идентичными тяжелыми цепями и двумя идентичными легкими цепями. Разные константные области тяжелой цепи иммуноглобулина демонстрируют разные аминокислотные составы и расположение, следовательно, представляют разную антигенность. Соответственно, иммуноглобулины могут быть подразделены на пять типов или так называемых изотипов иммуноглобулинов, а именно IgM, IgD, IgG, IgA и IgE, в соответствии с тяжелой цепью μ, δ, γ, α и ε, соответственно. В соответствии с его аминокислотным составом шарнирной области и числом и локализацией дисульфидных связей тяжелой цепи, один и тот же тип lg может быть дополнительно подразделен на разные подтипы, например, IgG может быть подразделен на IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Легкая цепь может быть подразделена на цепь κ или λ, с учетом разной(ых) константной(ых) области(ей). Каждый из пяти типов lg может иметь цепь κ или λ.
В настоящем раскрытии легкая цепь антитела может дополнительно содержать константную область легкой цепи, которая содержит цепь κ, λ человека или мыши или ее вариант; тяжелая цепь антитела может дополнительно содержать константную область тяжелой цепи, которая содержит IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 человека или мыши, или ее вариант.
Последовательности из примерно 110 аминокислот, прилегающие к N-концу тяжелой и легкой цепей антитела, являются высоко вариабельными, известны как вариабельная область (область Fv), включая вариабельную область легкой цепи (VL) и вариабельную область тяжелой цепи (VH); остальные аминокислотные последовательности рядом с С-концом являются относительно стабильными, известны как константная область. Вариабельная область включает три гипервариабельные области (HVR - от англ. hypervariable region) и четыре относительно консервативные каркасные области (FR). Данные три гипервариабельные области, которые определяют специфичность антитела, также известны как области, определяющие комплементарность (CDR). Каждая вариабельная область легкой цепи (VL) и каждая вариабельная область тяжелой цепи (VH) состоит из трех областей CDR и четырех областей FR, причем последовательный порядок от N-конца до С-конца является следующим: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. Три области CDR легкой цепи относятся к LCDR1, LCDR2 и LCDR3; и три области CDR тяжелой цепи относятся к HCDR1, HCDR2 и HCDR3. Число и положение аминокислотных остатков CDR антитела или антигенсвязывающего фрагмента, описанного в данном документе, соответствуют известным критериям нумерации Kabat и/или критериям нумерации Chothia ((1983) U.S.Dept.of Health and Human Services,"Sequence of Proteins of Immunological Interest.).
Антитела по настоящему раскрытию включают мышиные антитела, химерные антитела, гуманизированные антитела, предпочтительно гуманизированные антитела.
Термин «мышиное антитело», описанный в настоящем раскрытии, относится к моноклональному антителу, связывающему Абета человека, полученному в соответствии со знанием и умениями в данной области. Во время получения подопытному может быть инъецирован антиген Абета, и затем выделяют гибридому, экспрессирующую антитело, которое имеет желаемую последовательность или функциональные характеристики. В одном воплощении настоящего раскрытия мышиное антитело против Абета или его антигенсвязывающий фрагмент дополнительно сдержит константную область легкой цепи мышиной цепи κ, λ или ее вариант, и/или дополнительно содержит константную область тяжелой цепи мышиного IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4, или ее вариант.
Термин «химерное антитело», как описано в данном документе, представляет собой антитело, которое образовано слиянием вариабельной области мышиного антитела вместе с константной областью человеческого антитела, и данное химерное антитело может облегчать иммунный ответ, вызываемый мышиным антителом. Для конструирования химерного антитела, сначала, создают гибридому, секретирующую специфичное мышиное моноклональное антитело, и затем ген вариабельной области клонируют из мышиной гибридомы. Затем ген константной области клонируют из человеческого антитела в соответствии с необходимостью. Ген вариабельной области мыши соединяют с геном константной области человека с образованием химерного гена, который впоследствии может быть вставлен в экспрессионный вектор. Наконец, молекула химерного антитела будет экспрессироваться в эукариотической или прокариотической системе. В одном воплощении настоящего раскрытия легкая цепь химерного антитела дополнительно содержит константную область легкой цепи, происходящую из цепи к, Я, человека, или ее вариант. Тяжелая цепь химерного антитела дополнительно содержит константную область тяжелой цепи, происходящую из человеческого IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, или ее вариант, предпочтительно содержит константную область тяжелой цепи, происходящую из человеческого IgG1, IgG2 или IgG4, или варианта IgG1, IgG2 или IgG4 с аминокислотной(ыми) мутацией (ям и), такой(ими) как мутация(и) YTE или обратная(ые) мутация(и).
«Гуманизированное антитело», в том виде, в котором оно используется в данном документе, также известное как антитело с привитыми CDR, относится к антителу, созданному посредством прививания мышиных последовательностей CDR в каркасные области вариабельной области антитела человека, а именно антителу, полученному из разных типов последовательностей каркасных областей антитела зародышевой линии человека. Гуманизированное антитело может преодолевать гетерологичные ответы, вызываемые химерным антителом, которое несет большое количество мышиных белковых компонентов. Такие последовательности каркасных областей могут быть получены из общедоступной базы данных по ДНК, охватывающей последовательности генов антител зародышевой линии, или из опубликованных референсных последовательностей. Например, ДНК-последовательности зародышевой линии генов вариабельной области тяжелой и легкой цепи человека могут быть найдены в базе данных последовательностей зародышевой линии человека «VBase» (www.mrccpe.com.ac.uk/vbase), а также в Kabat, ЕА, et al, 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Для того, чтобы избежать снижения активности, вызываемого сниженной иммуногенностью, последовательности каркасных областей в вариабельной области антитела человека могут подвергаться минимальным обратным мутациям или обратной(ым) мутации(ям) для сохранения активности. Гуманизированное антитело по настоящему раскрытию также включает гуманизированное антитело, на котором осуществляется созревание аффинности CDR посредством фагового дисплея. В одном воплощении настоящего раскрытия последовательность CDR гуманизированного антитела против Абета выбрана из SEQ ID NO: 11-27. В случае каркасной области вариабельной области антитела человека, после конструирования и селекции, последовательность FR области тяжелой цепи антитела выбрана из FR1, FR2, FR3 и JH6 областей зародышевой линии человека IGHV1-24*01 и hjh6.3, IGHV3-30*01 и hjh6.3 или IGHV2-70D*04 и hjh6.1, или их мутантной последовательности; последовательность FR области легкой цепи выбрана из FR1, FR2, FR3 и JK4, JK2 областей зародышевой линии человека IGKV1-27*01 и hjk4.1, IGKV1-39*01 и hjk4.1, IGKV2-40*01 и hjk4.1, IGKV2-40*01 и hjk2.1 или их мутантной последовательности.
Прививание CDR может приводить к снижению аффинности полученного антитела против Абета или его антигенсвязывающего фрагмента в отношении антигена за счет остатков каркасной области, контактирующих с антигеном. Такие взаимодействия могут быть результатом высоко соматических мутаций. Таким образом, все еще может быть необходимым прививать донорские аминокислоты каркасных областей к каркасным областям гуманизированного антитела. Аминокислотные остатки, участвующие в связывании антигена, происходящие из антитела против Абета, не являющегося человеческим, или его антигенсвязывающего фрагмента, могут быть идентифицированы посредством проверки последовательности и структуры вариабельной области мышиного моноклонального антитела. Аминокислотные остатки, которые отличаются у каркасных областей донорских CDR и зародышевых линий, могут считаться родственными. Если невозможно определить наиболее близкородственную зародышевую линию, последовательность можно сравнивать с общей последовательностью, являющейся общей у подтипов, или мышиной последовательностью с высоким процентом сходства. Считается, что редкие остатки каркасных областей являются результатом высокого уровня мутаций в соматических клетках и играют важную роль в связывании.
2
В том виде, в котором он используется в данном документе, термин «антигенсвязывающий фрагмент» или «функциональный фрагмент» относится к одному или более фрагментам антитела, сохраняющим способность связываться с антигеном. Показано, что фрагменты полноразмерного антитела могут быть использованы для достижения функции связывания с конкретным антигеном. Примеры связывающих фрагментов, охватываемые термином «антигенсвязывающий фрагмент», включают: (i) Fab-фрагмент, одновалентный фрагмент, состоящий из домена VL, VH, CL и СН1; (ii) Р(аb')-фрагмент, двухвалентный фрагмент, содержащий два Fab-фрагмента, связанных дисульфидной связью в шарнирной области; (iii) Fd-фрагмент, состоящий из доменов VH и СН1; (iv) Fv-фрагмент, состоящий из доменов VH и VL одного плеча; (v) один домен или фрагмент dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), состоящий из домена VH; и (vi) отдельную область, определяющую комплементарность (CDR), или (vii) комбинацию двух или более отдельных CDR, возможно связанных синтетическим линкером. Кроме того, домен VL и домен VH Fv-фрагмента кодируются двумя отдельными генами, однако, они могут быть связаны синтетическим линкером посредством использования способов генной инженерии с образованием одной белковой цепи, где одновалентная молекула образуется посредством объединения в пары домена VL и VH (называемая одноцепочечным Fv (scFv - от англ. single-chain variable fragment); см., например, Bird et al. (1988): 423-426; Science 242 и Huston et al (1988) Proc. Natl. Acad. Sci USA 85:5879-5883). Такие одноцепочечные антитела также предназначены для включения в термин «антигенсвязывающий фрагмент». Такие антитела получают с использованием общепринятых методик, известных в данной области, и подвергают скринингу в отношении функциональных фрагментов посредством использования того же способа, как и способ в случае интактного антитела. Антигенсвязывающие части могут быть получены способом генной инженерии или посредством ферментативного или химического повреждения интактного иммуноглобулина. Антитела могут находиться в виде разных изотипов, например, антитела IgG (например, подтип IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4), IgA1, lgA2, IgD, IgE или IgM.
В том виде, в котором он используется в данном документе, Fab представляет собой фрагмент антитела, полученный посредством обработки молекулы антитела IgG папаином (который отщепляет аминокислотный остаток в положении 224 цепи Н). Fab-фрагмент имеет молекулярную массу примерно 50000 и обладает антигенсвязывающей активностью, где примерно половина N-концевой стороны цепи Н и вся цепь L связаны вместе посредством дисульфидной связи. Fab по настоящему раскрытию может быть получен посредством обработки моноклонального антитела по настоящему изобретению (которое специфично распознает человеческий Абета и связывается с внеклеточной областью или ее трехмерной структурой) папаином. Кроме того, Fab может быть получен в результате включения ДНК, кодирующей Fab антитела, в прокариотический экспрессионный вектор или эукариотический экспрессионный вектор, и введения вектора в прокариота или эукариота для экспрессии Fab.
2
2
2
В том виде, в котором он используется в данном документе, F(ab')представляет собой фрагмент антитела, имеющий молекулярную массу примерно 100000 и обладающий антигенсвязывающей активностью и содержащий две Fab области, которые связаны в положении шарнира, он может быть получен в результате расщепления пепсином двух дисульфидных связей нижней части в шарнирной области IgG. F(ab') по настоящему раскрытию может быть получен посредством обработки пепсином моноклонального антитела по настоящему изобретению, (которое специфично распознает человеческий Абета и связывается с внеклеточной областью или ее трехмерной структурой). Кроме того, F(ab') можно получать посредством связывания Fab', описанного ниже, тиоэфирной связью или дисульфидной связью.
2
2
В том виде, в котором он используется в данном документе, Fab' представляет собой фрагмент антитела, имеющий молекулярную массу примерно 50000 и обладающий антигенсвязывающей активностью. Fab' получают в результате расщепления дисульфидной связи в шарнирной области упомянутого выше F(ab'). Fab' по настоящему раскрытию можно получать посредством обработки F(ab') по настоящему раскрытию, (который специфично распознает Абета и связывается с внеклеточной областью или ее трехмерной структурой), восстанавливающим агентом, таким как дитиотреитол. Кроме того, Fab' может быть получен посредством включения ДНК, кодирующей Fab' антитела, в прокариотический экспрессионный вектор или эукариотический экспрессионный вектор, и введения вектора в прокариота или эукариота для экспрессии Fab'.
2
2
В том виде, в котором он используется в данном документе, термин «одноцепочечное антитело», «одноцепочечный Fv» или «scFv» относится к молекуле, содержащей вариабельный домен тяжелой цепи антитела (или область; VH), соединенный с вариабельным доменом легкой цепи антитела (или область; VL) линкером. Такие молекулы scFv имеют общую структуру: NH-VL-линкер-VH-COOH или NH-VH-линкер-VL-COOH. Подходящий линкер в предшествующем уровне техники состоит из повторяющейся аминокислотной последовательности GGGGS или ее варианта, например, варианта с 1 - 4 повторами (Holligeret al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448). Другие линкеры, которые можно использовать в настоящем раскрытии, описаны Alfthan et al. (1995), Protein Eng. 8:725-731, Choi et al.(2001), Eur. J. Immunol. 31:94-106, Hu et al. (1996), Cancer Res. 56:3055-3061, Kipriyanov et al. (1999), J. Mol. Biol. 293:41-56 и Roovers et al. (2001), Cancer Immunol. scFv по настоящему раскрытию может быть получен посредством следующих стадий: получение кДНК, кодирующей VH и VL моноклонального антитела по настоящему раскрытию, которое специфично распознает человеческий Абета и связывается с внеклеточной областью или ее трехмерной структурой, конструирование ДНК, кодирующей scFv; включение ДНК в прокариотический экспрессионный вектор или эукариотический экспрессионный вектор, и затем введение экспрессионного вектора в прокариота или эукариота для экспрессии указанного scFv.
В том виде, в котором оно используется в данном документе, диатело представляет собой фрагмент антитела, где scFv димеризован, и оно представляет собой фрагмент антитела, обладающий двухвалентной антигенсвязывающей активностью. При двухвалентной антигенсвязывающей активности два антигена могут быть одинаковыми или разными. Диатело по настоящему раскрытию может быть получено посредством следующих стадий: получение кДНК, кодирующих VH и VL моноклонального антитела по настоящему раскрытию, которое специфично распознает человеческий Абета и связывается с внеклеточной областью или ее трехмерной структурой; конструирование ДНК, кодирующей scFv, таким образом, чтобы длина линкерного пептида составляла 8 аминокислотных остатков или меньше, включение ДНК в прокариотический экспрессионный вектор или эукариотический экспрессионный вектор, и затем введение данного экспрессионного вектора в прокариота или эукариота для экспрессии диатела.
В том виде, в котором он используется в данном документе, dsFv получают посредством замены одного аминокислотного остатка в каждой из VH и VL на остаток цистеина, и затем связывания замещенных полипептидов посредством дисульфидной связи между данными двумя остатками цистеина. Аминокислотные остатки, подлежащие замене остатком цистеина, могут быть выбраны на основе предсказания трехмерной структуры антитела в соответствии с известными способами (Protein Engineering, 7, 697 (1994)). dsFv по настоящему раскрытию можно получать посредством следующих стадий: получение кДНК, кодирующих VH и VL моноклонального антитела по настоящему раскрытию, которое специфично распознает человеческий Абета и связывается с внеклеточной областью или ее трехмерной структурой; конструирование ДНК, кодирующей dsFv, включение данной ДНК в прокариотический экспрессионный вектор или эукариотический экспрессионный вектор, и затем введение данного экспрессионного вектора в прокариота или эукариота для экспрессии dsFv.
В том виде, в котором он используется в данном документе, CDR-содержащий пептид конструируют из одной или более областей CDR, VH или VL. Пептиды, содержащие несколько CDR, могут быть связаны непосредственно или через подходящий пептидный линкер. CDR-содержащий пептид по настоящему раскрытию может быть получен посредством следующих стадий: конструирование ДНК, кодирующей VH и VL моноклонального антитела по настоящему раскрытию, которое специфично распознает человеческий Абета и связывается с внеклеточной областью или ее трехмерной структурой, включение данной ДНК в прокариотический экспрессионный вектор или эукариотический экспрессионный вектор, и затем введение данного экспрессионного вектора в прокариота или эукариота для экспрессии пептида. CDR-содержащий пептид может быть также получен способом химического синтеза, таким как способ на основе Fmoc (от англ. 9-fluorenylmethoxycarbonyl - 9-флуоренилметилоксикарбонил) или способ на основе tBoc (от англ. tert-Butoxycarbonyl - трет-бутоксикарбонил).
В том виде, в котором он используется в данном документе, термин «CDR» относится к одной из шести гипервариабельных областей, находящихся в вариабельном домене антитела, которые главным образом содействуют связыванию антигена. Одно из наиболее широко используемых определений данных 6 CDR предложено Kabat Е.А. et al, ((1991) Sequences of proteins of immunological interest. NIH Publication 91-3242). В том виде, в котором оно используется в данном документе, определение CDR по Kabat применяется KCDR1, CDR2 и CDR3 вариабельного домена легкой цепи (CDR L1, CDR L2, CDR L3 или L1, L2, L3), а также к CDR2 и CDR3 вариабельного домена тяжелой цепи (CDR Н2, CDR Н3 или Н2, Н3).
В том виде, в котором он используется в данном документе, термин «каркасная область антитела» относится к части вариабельного домена, или VL или VH, которая служит скелетом для антигенсвязывающих петель (CDR) данного вариабельного домена. По существу он является вариабельным доменом без CDR.
В том виде, в котором он используется в данном документе, термин «эпитоп» или «антигенная детерминанта» или «эпитоп антигена» относится к сайту на антигене, с которым специфично связывается иммуноглобулин или антитело (например, конкретный сайт на молекуле Абета). Эпитопы обычно включают по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 последовательных или непоследовательных аминокислот в единственной третичной конформации. (См., Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, ed. G. E. Morris (1996)).
-7
-8
-9
-10
В том виде, в котором он используется в данном документе, термин «специфично связываются с», «селективно связываются с», «селективно связывается с» или «специфично связывается с» относится к связыванию антитела с заданным эпитопом на антигене. Обычно антитело связывается с аффинностью (KD) меньше чем примерно 10 М, например, меньше чем примерно 10 М, 10 М или 10 М или даже меньше.
-7
-8
-9
-10
В том виде, в котором он используется в данном документе, термин «KD» или «Kd» относится к константе равновесия диссоциации для конкретного взаимодействия антитело-антиген. Обычно антитело по настоящему раскрытию связывается с человеческим Абета с константой равновесия диссоциации (KD) меньше чем примерно 10 М, например, меньше чем примерно 10М, 10М или 10 М или даже меньше, например, как определено посредством технологии поверхностного плазмонного резонанса (SPR) на приборе Biacore Т200.
В том виде, в котором он используется в данном документе, термин «конкурентное связывание» и «конкурентно связывается с» относится к антителу, распознающему и связывающемуся с тем же эпитопом (также называемым антигенной детерминантой) или частью того же эпитопа на человеческом Абета, что и моноклональные антитела по настоящему раскрытию. Антитело, связывающееся с тем же эпитопом, что и моноклональные антитела по настоящему раскрытию, относится к антителу, которое распознает и связывается с аминокислотной последовательностью человеческого Абета, которую распознают моноклональные антитела по настоящему раскрытию.
125
Когда термин «конкуренция» используется в контексте антигенсвязывающих белков (например, нейтрализующих антигенсвязывающих белков или нейтрализующих антител), которые конкурируют за один и тот же эпитоп, он означает, что конкуренция имеет место между антигенсвязывающими белками, которая определяется анализами, в которых антигенсвязывающий белок, подлежащий тестированию (например, антитело или его иммунологически функциональный фрагмент), предотвращает или ингибирует (например, уменьшает) специфичное связывание референсного антигенсвязывающего белка (например, лиганда или референсного антитела) с общим антигеном (например, антигеном PD-L1 или его фрагментом). Множество типов анализов конкурентного связывания доступно для определения того, конкурирует ли один антигенсвязывающий белок с другим. Данные анализы представляют собой, например, твердофазный прямой или непрямой радиоиммунологический анализ (RIA - от англ. radioimmunoassay), твердофазный прямой или непрямой иммуноферментный анализ (EIA - от англ. enzyme immunoassay), конкурентный «сэндвич»-анализ (см., например, Stahli et al, 1983, Methods in Enzymology 9: 242-253); твердофазный прямой EIA с биотином-авидином (см., например, Kirkland et al, 1986, J. Immunol. 137: 3614-3619), твердофазный прямой анализ на основе мечения, твердофазный прямой «сэндвич»-анализ на основе мечения (см., например, Harlow and Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press); твердофазный прямой RIA на основе мечения меткой I (см., например, Morel et al, 1988, Molec. Immunol. 25: 7-15); твердофазный прямой EIA с биотином-авидином (см., например, Cheung, et al, 1990, Virology 176: 546-552); и прямой RIA на основе мечения (Moldenhauer et al, 1990, Scand. J. Immunol. 32: 77-82). Обычно анализ включает применение очищенного антигена, способного связываться с твердой поверхностью или клеткой, загруженной как немеченым тестируемым антигенсвязывающим белком, так и меченым референсным антигенсвязывающим белком. Конкурентное ингибирование определяется измерением количества метки, связанной с твердой поверхностью или с клеткой, в присутствии тестируемого антигенсвязывающего белка. Обычно, тестируемый антигенсвязывающий белок находится в избытке. Антигенсвязывающие белки, идентифицируемые посредством конкурентного анализа (конкурирование с антигенсвязывающим белком) включает: антигенсвязывающие белки, которые связываются с тем же эпитопом, что и референсный антигенсвязывающий белок; и антигенсвязывающие белки, которые связываются с эпитопом, который достаточно близок к эпитопу, с которым связывается референсный антигенсвязывающий белок, где данные два эпитопа пространственно мешают друг другу, препятствуя связыванию. Дополнительные подробности относительно способов определения конкурентного связывания предложены в данном документе в разделе Примеры. Обычно, когда конкурирующий антигенсвязывающий белок находится в избытке, он будет ингибировать (например, уменьшать) по меньшей мере на 40-45%, 45-50%, 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70-75% или 75% или даже больше специфичное связывание референсного антигенсвязывающего белка с общим антигеном. В некоторых случаях связывание ингибируется по меньшей мере на 80-85%, 85-90%, 90-95%, 95-97% или 97%, или даже больше.
Термин «молекула нуклеиновой кислоты», в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к молекулам ДНК и молекулам РНК. Молекула нуклеиновой кислоты может быть одноцепочечной или двухцепочечной, но предпочтительно является двухцепочечной ДНК. Нуклеиновая кислота является «функционально связанной», когда она находится в функциональной взаимосвязи с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, промотор или энхансер функционально связан с кодирующей последовательностью, если он влияет на транскрипцию данной последовательности.
Термин «вектор», в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой она связана. В одном воплощении вектор представляет собой «плазмиду», которая относится к петле кольцевой двухцепочечной ДНК, в которую могут быть лигированы дополнительные сегменты ДНК. В еще одном воплощении вектор представляет собой вирусный вектор, в котором дополнительные сегменты ДНК могут быть лигированы в вирусный геном. Векторы, раскрытые в данном документе, способны к саморепликации в клетке-хозяине, в которую их вводят (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальный репликатор, и эписомальные векторы млекопитающего), или могут быть интегрированы в геном клетки-хозяина при введении в клетку-хозяина и, таким образом, реплицируются вместе с геномом хозяина (например, векторы млекопитающего, не являющиеся эписомальными).
Термин «клетка-хозяин», в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к клетке, в которую был введен экспрессионный вектор. Клетки-хозяева могут включать бактериальные, микробные, растительные или животные клетки. Бактерии, которые чувствительны к трансформации, включают члены Enterobacteriaceae, такие как штаммы Escherichia coli или Salmonella; Bacillaceae, как например Bacillus subtilis; Pneumococcus; Streptococcus и Haemophilus influenzae. Подходящие микроорганизмы включают Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris. Подходящие линии животных клеток-хозяев включают СНО (линия клеток яичника китайского хомяка) и клетки NS0.
Способы получения и очистки антител и антигенсвязывающих фрагментов хорошо известны в данной области, например, в A Laboratory Manual for Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, chapters 5-8 and 15. Например, мыши могут быть иммунизированы человеческим Абета или его фрагментами, и полученные антитела могут быть затем ренатурированы, очищены и секвенированы в отношении аминокислотных последовательностей посредством использования традиционных способов, хорошо известных в данной области. Антигенсвязывающие фрагменты также могут быть получены традиционными способами. Антитела или антигенсвязывающие фрагменты по настоящему раскрытию конструируют для того, чтобы они содержали одну или более каркасных областей и CDR, происходящих из антитела, не являющегося человеческим. Последовательности FR зародышевой линии человека могут быть получены из ImMunoGeneTics (IMGT) через их веб-сайт http://imgt.cines.fr или из The Immunoglobulin Facts Book, 2001, ISBN 012441351, посредством выравнивания против последовательностей из базы данных генов вариабельных областей антител зародышевой линии человека и использования программного обеспечения МОЕ.
Сконструированные антитела или антигенсвязывающие фрагменты по настоящему раскрытию могут быть получены и очищены, используя известные способы. Например, последовательности кДНК, кодирующие тяжелую цепь и легкую цепь, можно клонировать и конструировать в экспрессионный вектор GS. Векторами, экспрессирующими рекомбинантный иммуноглобулин, можно затем стабильно трансфицировать клетки СНО. В качестве более рекомендованного способа, хорошо известного в данной области, экспрессионные системы млекопитающих будут приводить к гликозилированию, обычно на высоко консервативных N-концевых сайтах в области Fc. Получали стабильные клоны, экспрессирующие антитело, специфично связывающееся с человеческим TIM-3. Позитивные клоны могут быть размножены в культуральной среде, не содержащей сыворотку, в биореакторах для получения антител. Культуральную среду, в которую было секретировано антитело, можно очищать традиционными методиками. Например, очистку можно проводить на колонке на основе сефарозы FF с белком А или G, которую модифицировали буфером. Компоненты неспецифичного связывания вымывают. Связанное антитело элюируют с помощью градиента рН, и фрагменты антитела выявляют посредством SDS-PAGE (от англ. sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis - электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия) и затем объединяют. Антитела можно фильтровать и концентрировать, используя обычные методики. Растворимые агрегаты и мультимеры можно эффективно удалять обычными методиками, такими как гель-фильтрация или ионный обмен. Полученный продукт затем сразу же замораживают, например, при -70°С, или он может быть лиофилизирован.
В том виде, в котором он используется в данном документе, термин «мутация» включает «обратную мутацию», «консервативную модификацию» или «консервативную замену», но не ограничивается ими. В том виде, в котором он используется в данном документе, термин «консервативная модификация» или «консервативная замена» относится к заменам аминокислот в белке другими аминокислотами, обладающими похожими характеристиками (например, заряд, размер боковых цепей, гидрофобность/гидрофильность, конформация и жесткость остова и т.д.), таким образом, что данные изменения могу часто происходить без изменения биологической активности белка. Специалисты в данной области признают, что в общем одна аминокислотная замена в заменимых областях полипептида существенно не изменяет биологическую активность (см., например, Watson et al. (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p.224 (4th Ed.)). Кроме того, замены структурно или функционально похожих аминокислот менее вероятно нарушат биологическую активность.
Термин «мутантная последовательность», упомянутый в настоящем раскрытии, относится к нуклеотидной последовательности и аминокислотной последовательности, обладающей отличной идентичностью последовательностей, выраженной в процентах, с последовательностями по настоящему раскрытию после модификации нуклеотидной последовательности и аминокислотной последовательности по настоящему раскрытию посредством соответствующей замены, вставки или делеции. Идентичность последовательностей, описанная в настоящем раскрытии, может составлять по меньшей мере 85%, 90% или 95%, предпочтительно по меньшей мере 95%. Неограничивающие примеры включают 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%. Сравнение последовательностей и определение выраженной в процентах идентичности между двумя последовательностями можно проводить, используя алгоритм BLASTN/BLASTP с установками по умолчанию, доступный на веб-сайте Национального центра биотехнологического института.
Термин «гомология» или «идентичность» или «соответствие», в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к сходству последовательностей между двумя полинуклеотидными последовательностями или между двумя полипептидными последовательностями. Когда положение в обеих из данных двух последовательностей, подлежащих сравнению, занято одной и той же мономерной субъединицей - основанием или аминокислотой - например, если положение в каждой из двух молекул ДНК занято аденином, тогда данные молекулы являются гомологичными в данном положении. Процент гомологии двух последовательностей является функцией числа совпадающих или гомологичных положений, являющихся общими у данных двух последовательностей, деленного на число сравниваемых положений и затем умноженного на 100. Например, при оптимальном выравнивании последовательностей, если 6 из 10 положений в двух последовательностях совпадают или являются гомологичными, тогда данные две последовательности обладают 60%-ной гомологией. Если 95 из 100 положений в двух последовательностях совпадают или являются гомологичными, тогда данные две последовательности обладают 95%-ной гомологией. В общем, сравнение проводят, когда две последовательности выравнивают с получением максимального процента гомологии.
Термин «экзогенный», упомянутый в настоящем раскрытии, относится к веществам, образующимся вне организмов, клеток или организма человека, в соответствии с обстоятельствами. Термин «эндогенный» относится к веществам, продуцируемым в клетках, организмах или организме человека, в соответствии с обстоятельствами.
В том виде, в котором они используются в данном документе, термины «клетка», «клеточная линия» и «клеточная культура» используются взаимозаменяемо, и все такие обозначения включают их потомство. Таким образом, слова «трансформант» и «трансформированная клетка» включают первичные исследуемые клетки и полученные из них культуры без учета числа переносов. Также следует понимать, что все потомство не может быть с точностью идентичным по содержанию ДНК вследствие целенаправленных или случайных мутаций. Включено потомство с мутациями, которое имеет такую же функцию или обладает такой же биологической активностью, как функция или биологическая активность в исходно трансформированных клетках. Когда предполагаются отличные обозначения, это будет очевидно понятно из контекста.
В том виде, в которой она используется в данном документе, фраза «полимеразная цепная реакция» или «ПЦР» относится к способу или методике, в которой малые количества конкретного фрагмента нуклеиновой кислоты, РНК и/или ДНК, амплифицируют, как описано, например, в патенте США №4683195. Обычно существует необходимость в наличии информации о последовательности на концах или за пределами исследуемой области, таким образом, чтобы можно было сконструировать олигонуклеотидные праймеры; данные праймеры будут идентичными или похожими по последовательности с обратными цепями матрицы, подлежащей амплификации. 5'-Концевые нуклеотиды данных двух праймеров могут совпадать с концами амплифицируемого материала. ПЦР можно использовать для амплификации конкретных последовательностей РНК, конкретных последовательностей ДНК из тотальной геномной ДНК и кДНК, транскрибируемой с тотальной РНК клетки, последовательностей бактериофагов или плазмид и т.д. Обычно см. Mullis et al. (1987) Cold Spring Harbor Symp.Ouant.Biol. 51:263; Erlich, ed., (1989) PCR TECHNOLOGY (Stockton Press, N.Y.). ПЦР анализ, используемый в настоящем раскрытии, считается одним, но не единственным примером способа амплификации тестируемого образца нуклеиновой кислоты на основе полимеразной реакции. Способ включает применение известных последовательностей нуклеиновой кислоты в качестве праймеров и полимеразы нуклеиновой кислоты для амплификации или образования конкретного фрагмента нуклеиновой кислоты.
Термин «фармацевтическая композиция», в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к смеси, содержащей одно или более соединений согласно настоящему раскрытию или его(их) физиологически/фармацевтически приемлемую соль или пролекарство и другие химические компоненты, такие как физиологически/фармацевтически приемлемые носители и вспомогательные вещества. Целью фармацевтической композиции является содействие введению в организм, облегчение поглощения активного вещества и, таким образом, оказание биологического действия.
Термин «лечить», в том виде, в котором он используется в данном документе, означает вводить внутрь или наружно терапевтическое средство, такое как композиция, содержащая любое из связывающих соединений по настоящему раскрытию, пациенту, имеющему одно или более симптомов заболевания, в отношении которого данное средство обладает известной терапевтической активностью. Типично средство вводят в количестве, эффективном для облегчения одного или более симптомов заболевания у пациента или популяции, подлежащих лечению, или вызывая регрессию или ингибируя прогрессирование такого(их) симптома(ов) до какой-либо клинически измеряемой степени. Количество терапевтического средства, которое является эффективным для облегчения какого-либо определенного симптома заболевания (также называемое «терапевтически эффективным количеством»), может варьировать в зависимости от разных факторов, таких как течение заболевания, возраст и масса пациента, и способности лекарственного средства вызывать желаемый ответ у пациента. Был ли облегчен симптом заболевания можно оценить посредством любого клинического измерения, обычно используемого лечащими врачами или другими квалифицированными медицинскими работниками, для оценки тяжести или статуса прогрессирования того симптома. В то время как воплощение настоящего изобретения (например, способ лечения или продукт изготовления) может не быть эффективным в облегчении целевого(ых) симптома(ов) заболевания у каждого пациента, оно должно облегчать целевой(ые) симптом(ы) заболевания у статистически значимого числа пациентов, как определено любым статистическим критерием, известным в данной области, таким как t-критерий Стьюдента, критерий хи-квадрат, U-критерий Манна и Уитни, критерий Краскела - Уоллиса (Н-критерий), критерий Джонкхира-Терпстры и критерий Уилкоксона.
Термин «эффективное количество», в том виде, в котором он используется в данном документе, охватывает количество, достаточное для смягчения или предупреждения симптома или признака медицинского состояния. Эффективное количество также означает количество, достаточное для обеспечения возможности или облегчения диагностирования. Эффективное количество для конкретного пациента или субъекта ветеринарии может варьировать в зависимости от факторов, таких как состояние, подлежащее лечению, общее состояние здоровья пациента, путь и доза введения, и тяжесть побочных эффектов. Эффективное количество может представлять собой максимальную дозу или протокол дозирования, которая позволяет избежать значимых побочных эффектов или токсичных эффектов.
Термин «введение» или «обработка», в том виде, в котором он используется в данном документе, при его применении к животному, человеку, экспериментальному субъекту, клетке, ткани, органу или биологической жидкости, относится к приведению экзогенного фармацевтического, терапевтического, диагностического средства или композиции в контакт с животным, человеком, субъектом, клеткой, тканью, органом или биологической жидкостью. Термин «введение» или «обработка» может относиться, например, к терапевтическим, фармакокинетическим, диагностическим, исследовательским и экспериментальным способам. Обработка клетки охватывает приведение реагента в контакт с клеткой, а также приведение реагента в контакт с жидкостью, где данная жидкость находится в контакте с клеткой. Термин «введение» или «обработка» также означает обработки in vitro или ex vivo, например клетки, реагентом, диагностическим средством, связывающей композицией или другой клеткой. Термин «лечение», при применении к субъекту-человеку, субъекту ветеринарии или субъекту исследования, относится к терапевтическому лечению, профилактическим или превентивным мерам, исследовательским и диагностическим применениям.
В том виде, в котором он используется в данном документе, термин «заболевание или расстройство, вызываемое Абета» относится к заболеванию или расстройству, вызываемому или ассоциированному с β-амилоидом, включая, но, не ограничиваясь заболеваниями и расстройствами, вызываемыми наличием или активностью β-амилоида, состоящего из мономеров Абета, или протофибрилл или полимеров или любой их комбинации, например, нейродегенеративным заболеванием (например: болезнью Альцгеймера, легким когнитивным расстройством, фронтотемпоральной деменцией, деменцией с тельцами Леви, болезнью Паркинсона, болезнью Пика, болезнью Бевака и т.д.), разными заболеваниями глаза, вызываемыми отложением β-амилоида (например, макулярной дегенерацией, оптической нейропатией, ассоциированной с друзами, глаукомой, катарактой и т.д.).
В том виде, в котором они используются в данном документе, «нейродегенеративные заболевания» включают следующие: болезнь Альцгеймера, легкое когнитивное расстройство, фронтотемпоральная деменция, деменция с тельцами Леви, болезнь Паркинсона, болезнь Пика, болезнь Бевака, конгофильная амилоидная ангиопатия, церебральная амилоидная ангиопатия, синдром Дауна, мультиинфарктная деменция, болезнь Гентингтона, болезнь Крейтцфельдта -Якоба, синдром деменции при СПИДе, депрессия, тревожный невроз, фобия, паралич Белла, эпилепсия, энцефалит, множественный склероз, нервно-мышечное расстройство, нейроонкологическое заболевание, опухоль головного мозга, нейроваскулярное расстройство вследствие инсульта, нейроиммунологического заболевания, нейропатическое отологическое заболевание, травматическое повреждение нервной системы, включающее повреждение спинного мозга, боль, включающая нейропатическую боль, детское нейро- и нейропсихиатрическое расстройство, нарушение сна, синдром Туретта, легкое когнитивное расстройство, сосудистая деменция, мультиинфарктная деменция, кистозный фиброз, болезнь Гоше и другая дискинезия и заболевания центральной нервной системы, но не ограничиваются ими.
Подробное описание изобретения
Следующие примеры предложены для дополнительного описания настоящего раскрытия, но не предназначены для ограничения объема раскрытия. Экспериментальные способы, для которых не указаны конкретные условия в примерах настоящего раскрытия, обычно проводят в соответствии с традиционными условиями, такими как у Sambrook et al., Antibodies, Molecular Cloning, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory; или в соответствии с условиями, рекомендуемыми производителем. Реагенты, для которых конкретным образом не указаны источники, представляют собой имеющиеся в продаже реагенты.
Пример 1. Получение антигена Абета
Антигены Абета, используемые в примерах и примерах анализов настоящего раскрытия синтезировали с помощью GL Biochem, GenScript или Sigma, и затем получали in vitro (для получения более подробной информации см. Таблицу 1). Антигены Абета для применения в иммунизации представляли собой протофибриллы Аβ 1-42 и Аβ 1-40 KLH (от англ. Keyhole Limpet Hemocyanin - гемоцианин лимфы улитки); Антигены Абета для применения в осуществлении скрининга представляли собой фибриллы Aβ1-40-BSA (от англ. bovine serum albumin - бычий сывороточный альбумин), суспензию Аβ1-40 DMSO (от англ. Dimethyl sulfoxide - Диметилсульфоксид), суспензию Аβ1-42-биотин DMSO, протофибриллы Аβ1-42 и фибриллы Аβ1-42; антигены Абета для применения в выявлении представляли собой мономер Аβ1-42 и фибриллы Аβ1-42.
Аминокислотная последовательность Аβ 1-40 показана в (SEQ ID NO 1): DАЕFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV;
Аминокислотная последовательность Аβ 1-42 показана в (SEQ ID NO 2): DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA.
Aβ1-40 KLH и Aβ1-40-BSA относятся к синтезированному полипептиду Aβ1-40, соединенному с KLH (гемоцианин лимфы улитки) и BSA (бычий сывороточный альбумин), соответственно, где используемый Aβ1 -40 включали с аминокислотой Cys на N-конце для удобства связывания и выявления;
Протофибриллы Aβ1-42 относятся к полипептиду Aβ1-42, полученному в виде протофибрилл in vitro.
Фибриллы Aβ1-40-BSA относятся к полипептиду Aβ1-42, соединенному с BSA, полученному в виде фибрилл in vitro.
Суспензия Aβ1-40 DMSO относится к прозрачному раствору, приготовленному посредством непосредственного растворения полипептида Aβ1-42 в DMSO (диметилсульфоксид).
Суспензия Aβ1-42-биотин DMSO относится к прозрачному раствору, приготовленному посредством непосредственного растворения полипептида Aβ1-42, меченного биотином, в DMSO (диметилсульфоксид).
Фибриллы Aβ1-42 относятся к полипептиду Aβ1-42, полученному в виде фибрилл in vitro.
Мономер Aβ1-42 относится к мономеру Aβ1-42.
Пример 2. Получение моноклонального антитела гибридомы против человеческого Абета
1. Иммунизация
Моноклональные антитела против человеческого Абета получали посредством иммунизации мышей. Для эксперимента использовали белых мышей SJL, самок, 6-8-недельного возраста (Beijing Weitong Lihua Experimental Animal Technology Co., Ltd., номер лицензии на производство животных: SCXK (Пекин) 2012-0001). Среда кормления: уровень SPF (от англ. specific pathogen free -свободный от специфической патогенной микрофлоры). После приобретения мышей, их держали в лабораторных условиях в течение 1 недели, с 12/12-часовым циклом свет/темнота, при температуре 20-25°С; влажности 40-60%. Затем мышей иммунизировали в соответствии со следующими схемами. Антигены для иммунизации представляли собой Aβ1-40-KLH и протофибриллы Aβ1-42.
Схема иммунизации 1: Адъювант, используемый для иммунизации, представлял собой QuickAntib ody-Mouse3W (Beijing Kangbiquan Biotechnology Co., Ltd. Кат. №KX0210042). Соотношение антигена и адъюванта (QuickAntibody-Mouse3W) составляло 1:1, 10 мкг/мышь/период времени. Антиген и адъювант смешивали тщательно и использовали для инокуляции в сутки 0, 7, 14, 21, 28, 35 и 42. В сутки 0 мышам внутримышечно (в.м.) инъецировали в заднюю лапу 10 мкг/мышь смешанного антигена. Первую иммунизацию повторяли в сутки 7, 14, 21, 28, 35 и 42, и мышам аналогично внутримышечно (в.м.) инъецировали в заднюю лапу 10 мкг/мышь смешанного антигена. Образцы крови собирали в сутки 19, 40 и 55, и титр антитела в мышиной сыворотке определяли посредством метода ИФА. После седьмой-восьмой иммунизации мышей с высоким титром антител в сыворотке, имеющим тенденцию к выходу на плато, отбирали для слияния спленоцитов. За трое суток до слияния спленоцитов раствор антигена, приготовленный с помощью физиологического раствора, инъецировали внутрибрюшинно (в.б.), 20 мкг/мышь, для повторной иммунизации.
Схема иммунизации 2: Адъювант, используемый для иммунизации, представлял собой QuickAntib ody-Mouse5W (Beijing Kangbiquan Biotechnology Co., Ltd. Кат. № KX021004). Соотношение антигена и адъюванта (QuickAntibody-MouseSW) составляло 1:1, 25 мкг/мышь/период времени (для первой иммунизации) и 25 мкг/мышь/период времени (для повторной иммунизации). Антиген и адъювант смешивали тщательно и использовали для инокуляции в сутки 0, 14, 28, 42 и 56. В сутки 0 мышам внутримышечно (в.м.) инъецировали в заднюю лапу 25 мкг/мышь смешанного антигена. Первую иммунизацию повторяли в сутки 14, 28, 42 и 56, и мышам аналогично внутримышечно (в.м.) инъецировали в заднюю лапу 25 мкг/мышь смешанного антигена. Образцы крови отбирали в сутки 20 и 49, и титр антител в сыворотке мыши определяли способом ИФА. После пятой иммунизации мышей с высоким титром антител в сыворотке, имеющим тенденцию к выходу на плато, отбирали для слияния спленоцитов. За трое суток до слияния спленоцитов раствор антигена, приготовленный с помощью физиологического раствора, инъецировали внутрибрюшинно (в.б.), 50 мкг/мышь, для повторной иммунизации.
2. Слияние спленоцитов
6
2
2
Клетки гибридомы получали посредством слияния лимфоцитов селезенки с клетками миеломы Sp2/0 (АТСС CRL-8287™) посредством использования оптимизированного способа слияния, опосредованного ПЭГ (полиэтиленгликоль). Слитые клетки гибридомы ресуспендировали в полной среде (среде DM ЕМ (от англ. Dulbecco modified Eagle's medium - среда Иглу, модифицированная по Дульбекко), содержащей 20% FBS (от англ. Fetal Bovine Serum - фетальная телячья сыворотка), 1*НАТ (от англ. hypoxanthine-aminopterinethymidine - гипоксантин аминоптеринтимидин), 1×ОРI) с плотностью 0,5-1*10/мл, засевали в 96-луночный планшет в количестве 100 мкл/лунка, инкубировали при 37°С и 5% СOв течение 3-4 суток, добавляли 100 мкл/лунка полной среды HAT и культивировали в течение 3-4 суток до образования иглоподобных клонов. Супернатант удаляли, добавляли 200 мкл/лунка полной среды НТ (среда RPMI-1640, содержащая 20% FBS, 1*НАТ и 1*ОР1), инкубировали при 37°С, 5% СO в течение 3 суток и затем подвергали выявлению ИФА.
3. Скрининг клеток гибридомы
Через 10-11 суток после слияния в соответствии с плотностью растущих клеток анализ связывания ИФА (также известный как твердофазный иммуноферментный анализ) проводили на супертанатанте клоновой культуры с разными формами полипептида Аβ для предварительного скрининга для классификации подтипов полученных клонов гибридомы. Фибриллы Aβ1-40-BSA, суспензию Аβ1-42-биотин DMSO и суспензию Аβ 1-40 DMSO использовали для осуществления скрининга клеток гибридомы CA01-40-KLH в качестве иммуногена; и протофибриллы Аβ1-42, фибриллы Аβ1-42 и суспензию Аβ1-42-биотин DMSO использовали для осуществления скрининга клеток гибридомы с протофибриллами Aβ1-42 в качестве иммуногена. В случае позитивных лунок среду меняли и помещали в 24-луночный планшет в соответствии с плотностью клеток. Линии клеток, переносимые в 24-луночный планшет, снова тестировали и затем впервые субклонировали. Некоторое количество позитивных клеток, подвергавшихся скринингу в первом субклонировании, консервировали и использовали для второго субклонирования. Некоторое количество позитивных клеток, подвергавшихся скринингу во втором субклонировании, консервировали и использовали для экспрессии белка. Клетки гибридомы, способные специфично связываться с полипептидом Аβ, получали в результате множества слияний. После анализа флуоресценции тиофлавина (также называемого ThT), анализа защиты нейронов и анализа фагоцитоза макрофагами получали клон гибридомы mAb-2401, mAb-3601, mAb-5101 и mAb-9001 и использовали для получения антител с клеточной культурой, не содержащей сыворотку. Полученные антитела очищали в соответствии с примером очистки, и очищенные антитела использовали в примерах анализа.
4. Очистка антител гибридомы и рекомбинантных антител
Образцы супернатанта, экспрессируемые клетками, центрифугировали с высокой скоростью для удаления примесей, и супернатант, экспрессируемый гибридомой, очищали посредством колонки с Белком G, и супернатант, состоящий из рекомбинантньк антител, очищали посредством колонки с белком А. Колонку промывали PBS (рН 7,4) до тех пор, пока измеренное значение А280 не упадет до исходного уровня. Целевые белки элюировали 100 мМ уксусной кислотой, рН 3,0, и нейтрализовали 1 М Tris-HCl, рН 8,0. Элюированные образцы должным образом концентрировали и затем дополнительно очищали посредством колонки для гель-хроматографии Superdex200 (GE), предварительно уравновешенной PBS, с удалением агрегатов. Пики мономеров собирали и аликвотировали для применения.
5. Секвенирование позитивных клонов гибридомы
Способы клонирования последовательностей из позитивной гибридомы выглядели следующим образом. Клетки гибридомы собирали в логарифмическую фазу роста. РНК выделяли Тризолом (Invitrogen, кат. №. 15596-013) в соответствии с инструкциями к набору, и проводили обратную транскрипцию с набором для обратной транскрипции PrirneScript™ (Takara, кат. №2680А). Полученные кДНК амплифицировали посредством ПЦР с использованием набора праймеров к мышиному lg (Novagen, ТВ326 Rev. В 0503) и секвенировали в компании. Аминокислотные последовательности вариабельной области тяжелой цепи мышиного антитела (VH) и вариабельной области легкой цепи (VL) клонов гибридомы mAb-2401, mAb-3601, mAb-5101 и mAb-9001 были определены следующим образом:
Примечание: аминокислотные последовательности вариабельных областей приведенных выше антител представлены как FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. Буквы, выделенные курсивом, показывают последовательности FR, и подчеркнутые буквы показывают последовательности CDR.
Аминокислотные последовательности областей CDR антител mAb-2401, mAb-3601, mAb-5101 и mAb-9001 показаны в Таблице 2.
Пример 3. Гуманизация моноклональных антител гибридомы против человеческого Абета
Каноническую структуру определяли в соответствии с последовательностью вариабельной области легкой цепи и последовательностью вариабельной области тяжелой цепи мышиного антитела. Среди последовательностей зародышевой линии человека с одной и той же структурой последовательности, наиболее похожие на мышиные области, не являющиеся CDR (каркасные области), отбирали в качестве матриц для гуманизации. Затем, области CDR мышиного антитела прививали на выбранные матрицы для гуманизации с замещением человеческих областей CDR. Обратные мутации или точеные мутации делали на некоторых последовательностях FR областей, при необходимости. Вариабельные области затем объединяли с человеческой(ими) константной(ыми) областью(ями) (как например, константной областью IgG1 человека) с получением гуманизированных антител против Абета.
1. Гуманизация mAb-2401
Матрицы для гуманизации тяжелой цепи антитела mAb-2401 представляли собой IGHV1-24*01 и hjh6.3. А именно, отбирали FR1, FR2 и FR3 области из тяжелой цепи зародышевой линии человека IGHV1-24, и область JH6 hjh6.3 отбирали в качестве FR4 области. Матрицы для легкой цепи представляли собой IGKV1-27*01 и hjk4.1. А именно, отбирали FR1, FR2 и FR3 из легкой цепи зародышевой линии человека IGKV1-27, и область JK4 hjk4.1 отбирали в качестве FR4 области.
Аминокислотная последовательность матрицы тяжелой цепи зародышевой линии человека (IGHV1-24*01) показана в (SEQ ID NO 28):
Аминокислотная последовательность матрицы легкой цепи зародышевой линии человека (IGKV 1-27*01) показана в (SEQ ID NO 29):
Гуманизированные вариабельные области тяжелой и легкой цепей выглядели следующим образом:
НАВ-2401 с привитой VH (SEQ ID NO 66):
НАВ-2401 с привитой VL (SEQ ID NO 67):
Области CDR мышиного антитела прививали на отобранную матрицу гуманизации с заменой человеческих областей CDR матрицы, и обратные мутации вводили на тяжелой цепи в положении 1, 72 и 98 (нумерация природных последовательностей, соответствующая положению 1, 71 и 94, соответственно, в соответствии с нумерацией Kabat) (Q1E, Е72А и T98R; Q1E, Е71А, T94R в соответствии с нумерацией Kabat), и затем объединяли с константной областью человеческого IgG 1 с получением гуманизированного антитела НАВ-2401.
Аминокислотная последовательность тяжелой цепи НАВ-2401 показана в (SEQ ID NO 30):
Аминокислотная последовательность легкой цепи НАВ-2401 показана в (SEQ ID NO 31):
Примечание: В приведенных выше аминокислотных последовательностях легкой и тяжелой цепей НАВ-2401 буквы, выделенные курсивом, показывают последовательность FR, подчеркнутые буквы показывают последовательность CDR, буквы с двойным подчеркиванием показывают последовательность константой области.
2. Гуманизация mAb-3601
Матрицы для гуманизации тяжелой цепи антитела mAb-3601 представляли собой IGHV3-30*01 и hjh6.3. А именно, выбирали области FR1, FR2 и FR3 из тяжелой цепи зародышевой линии человека IGHV3-30, и область JH6 hjh6.3 выбирали в качестве области FR4. Матрицы для легкой цепи представляли собой IGKV1-39*01/hjk4.1. А именно, отбирали FR1, FR2 и FR3 из легкой цепи зародышевой линии человека IGKV1-39, и область JK4 hjk4.1 отбирали в качестве области FR4.
Аминокислотная последовательность матрицы тяжелой цепи зародышевой линии человека (IGHV3-30*01) показана в (SEQ ID NO 32):
Аминокислотная последовательность матрицы легкой цепи зародышевой линии человека (IGKV1-39*01) показана в (SEQ ID NO 33):
Гуманизированные вариабельные области тяжелой и легкой цепей выглядели следующим образом:
НАВ-3601 с прививкой VH (SEQ ID NO 68):
НАВ-3601 с прививкой VL (SEQ ID NO 69):
Области CDR мышиного антитела прививали на отобранную матрицу для гуманизации с заменой человеческих областей CDR из матрицы, обратные мутации вводили на тяжелой цепи в положении 28 и 86 (нумерация природной последовательности, соответствующая положению 28 и 82 В, соответственно, согласно нумерации Kabat) (Т28А и S86T; Т28А и S82B Т согласно нумерации Kabat), точечную мутацию вводили на тяжелой цепи в положении 58 (нумерация природной последовательности) (D58N) для устранения возможной изомеризации аспарагиновой кислоты и затем объединяли с константной областью человеческого IgG1 с получением гуманизированного антитела НАВ-3601.
Аминокислотная последовательность тяжелой цепи НАВ-3601 показана в (SEQ ID NO 34):
Аминокислотная последовательность легкой цепи НАВ-3601 показана в (SEQ ID NO 35):
Примечание: в приведенных выше аминокислотных последовательностях легкой и тяжелой цепей НАВ-3601 буквы, выделенные курсивом, показывают последовательность FR, подчеркнутые буквы показывают последовательность CDR и буквы с двойным подчеркиванием показывают последовательность константной области.
3. Гуманизация mAb-5101
Матрицы для гуманизации тяжелой цепи антитела mAb-5101 представляли собой IGHV2-70D*04 и hjh6.1. А именно, отбирали FR1, FR2 и FR3 из тяжелой цепи зародышевой линии человека lgHV2-70D, и область JH6 hjh6.1 отбирали в качестве области FR4. Матрицы для легкой цепи представляли собой IGKV2-40*01 и hjk4.1. А именно, отбирали области FR1, FR2 и FR3 из легкой цепи зародышевой линии человека IGKV2-40, и область JK4 hjk4.1 отбирали в качестве области FR4.
Аминокислотная последовательность матрицы тяжелой цепи зародышевой линии человека (IGHV2-70D*04) показана в (SEQ ID NO 36):
Аминокислотная последовательность матрицы легкой цепи зародышевой линии человека (IGKV2-40*01) показана в (SEQ ID NO 37):
Гуманизированные вариабельные области выглядели следующим образом: НАВ-5101 с прививкой VH (SEQ ID NO 70):
НАВ-5101 с прививкой VL (SEQ ID NO 71):
Области CDR мышиного антитела прививали на отобранную матрицу гуманизации с заменой человеческих областей CDR из матрицы, обратные мутации были сделаны на легкой цепи в положении 2 и 50 (нумерация природной последовательности, соответствующая положению 2 и 45, соответственно, в соответствии с нумерацией Kabat) (I2V и Q50K; I2V и Q45K согласно нумерации Kabat), точечную мутацию вводили на легкой цепи в положении 94 (нумерация природной последовательности) (C94S) для исключения возможной ошибки спаривания с участием дисульфидной связи и затем объединяли с константной областью человеческого IgG1 с получением гуманизированного антитела НАВ-5101.
Аминокислотная последовательность тяжелой цепи НАВ-5101 показана в (SEQ ID NO 38):
Аминокислотная последовательность легкой цепи НАВ-5101 показана в (SEQ ID NO 39):
Примечание: в приведенных выше аминокислотных последовательностях легкой и тяжелой цепей НАВ-5101 буквы, выделенные курсивом, показывают последовательность FR, подчеркнутые буквы показывают последовательность CDR и буквы с двойным подчеркиванием показывают последовательность константной области.
4. Гуманизация mAb-9001
Матрицы для гуманизации тяжелой цепи антитела mAb-9001 представляли собой IGHV2-70D*04 и hjh6.1. А именно, отбирали FR1, FR2 и FR3 из тяжелой цепи зародышевой линии человека IGHV2-70, и область JH6 hjh6.1 отбирали в качестве области FR4. Матрицы для легкой цепи представляли собой IGKV2-40*01 и hjk2.1. А именно, отбирали FR1, FR2 и FR3 из легкой цепи зародышевой линии человека IGKV2-40, и область JK2 hjk2.1 отбирали в качестве области FR4.
Аминокислотная последовательность матрицы тяжелой цепи зародышевой линии человека (IGHV2-70D*04) показана в (SEQ ID NO 36):
Аминокислотная последовательность матрицы легкой цепи зародышевой линии человека (IGKV2-4CT01) показана в (SEQ ID NO 37):
Гуманизированные вариабельные области выглядели следующим образом: НАВ-9001 с прививкой VH (SEQ ID NO 72):
НАВ-9001 с прививкой VL (SEQ ID NO 73):
Области CDR мышиного антитела прививали на отобранную матрицу для гуманизации с заменой человеческих областей CDR из матрицы, обратную мутацию вводили на легкой цепи в положении 2 (нумерация природных последовательностей, соответствующая положению 2 в соответствии с нумерацией Kabat) (I2V), точечную мутацию вводили на тяжелой цепи в положении 58 (нумерация природных последовательностей) (D58N) для исключения возможной изомеризации аспарагиновой кислоты, и затем объединяли с константной областью человеческого IgG1 с получением гуманизированного антитела НАВ-9001.
Аминокислотная последовательность тяжелой цепи НАВ-9001 показана в (SEQ ID NO 40):
Аминокислотная последовательность легкой цепи НАВ-9001 показана в (SEQ ID NO 41):
Примечание: в приведенных выше аминокислотных последовательностях легкой и тяжелой цепей НАВ-9001 буквы, выделенные курсивом, показывают последовательность FR, подчеркнутые буквы показывают последовательность CDR и буквы с двойным подчеркиванием показывают последовательность константной области.
Кроме того, в отношении последовательностей константной области антитела НАВ-2401, НАВ-3601, НАВ-5101 и НАВ-9001, аминокислотная последовательность константной области тяжелой цепи показана в SEQ ID NO 42, аминокислотная последовательность константной области легкой цепи показана в SEQ ID NO 43, аминокислотные последовательности вариабельной области и полноразмерные аминокислотные последовательности показаны в следующей таблице:
Пример 4. Получение гуманизированных антител 1. Молекулярное клонирование гуманизированных антител Оптимизацию кодонов проводили в сопоставлении с последовательностями сконструированных гуманизированных антител с получением человеческих кодон-предпочтительных кодирующих последовательностей генов. Фрагмент гена VH/VK каждого антитела конструировали со сконструированными праймерами для ПЦР и затем вводили в экспрессионный вектор рНr (несущий сигнальный пептид и фрагмент гена константной области (CH1-FC/CL)) посредством гомологичной рекомбинации для конструирования плазмиды, экспрессирующей полноразмерное гуманизированное антитело VH-CH1-FC-pHr/VK-CL-pHr. Правильность клонов проверяли посредством секвенирования, где, в случае НАВ-2401, нуклеотидная последовательность, кодирующая тяжелую цепь, показана в SEQ ID NO 54, нуклеотидная последовательность, кодирующая легкую цепь, показана в SEQ ID NO 55; в случае НАВ-3601, нуклеотидная последовательность, кодирующая тяжелую цепь, показана в SEQ ID NO 56, нуклеотидная последовательность, кодирующая легкую цепь, показана в SEQ ID NO 57; в случае НАВ-5101, нуклеотидная последовательность, кодирующая тяжелую цепь, показана в SEQ ID NO 58, нуклеотидная последовательность, кодирующая легкую цепь, показана в SEQ ID NO 59; и в случае НАВ-9001, нуклеотидная последовательность, кодирующая тяжелую цепь, показана в SEQ ID NO 60, нуклеотидная последовательность, кодирующая легкую цепь, показана в SEQ ID NO 61.
2. Экспрессия и очистка гуманизированных антител
Клетки НЕК293Е трансфицировали плазмидами, экспрессирующими тяжелую и легкую цепи антитела, соответственно, в соотношении 1:1,5. Спустя 6 суток после трансфекции, экспрессионный супернатант собирали, центрифугировали с высокой скоростью для удаления примесей и очищали посредством колонки с белком А. Колонку промывали PBS до тех пор, пока значение А280 не падало до исходного уровня. Целевые белки элюировали 100 мМ уксусной кислотой, рН 3,0, и нейтрализовали 1 М Tris-HCl, рН 8,0. Элюированные образцы должным образом концентрировали и затем дополнительно очищали посредством колонки для гель-хроматографии Superdex200 (GE), предварительно уравновешенной PBS, с удалением агрегатов. Пики мономеров собирали и ал и квотировал и для применения.
Эффективность и действие настоящего раскрытия проверяли с помощью следующих биохимических анализов или фармакологического анализа in vivo:
Пример анализа 1. Аффинность антител против Абета, выявляемая посредством анализа BIAcore
Аффинность антитела к фибриллам Aβ1 выявляли способом связывания аминогрупп. Фибриллы Аβ1-42 связывали с биосенсорным чипом СМ5 (200 RU), и затем обеспечивали прохождение молекул антител через поверхность данного чипа. Сигналы от взаимодействия выявляли в реальном времени с использованием прибора Biacore Т200 с получением кривой связывания и диссоциации. В конце каждого экспериментального цикла после завершения диссоциации биосенсорный чип промывали и регенерировали 10 мМ Глицином-HCI (рН 1,5). Антитело -положительный контроль, Адуканумаб, получали в соответствии с информацией о последовательности Адуканумаба, выпускаемого ВОЗ (Всемирная организация здравоохранения) (см. WHO Drug Information, Vol.28, No. 3, 2014), и способ получения описан в Примере 4 настоящего раскрытия.
Аффинность антитела к мономеру Aβ1-42 выявляли посредством захватывающего антитела на чипе. IgG захватывался благодаря аффинности на биосенсорном чипе с Белком А, и затем обеспечивалось пропускание антигена -мономера Aβ1-42 через поверхность чипа. Сигналы взаимодействия выявляли в реальном времени с использованием прибора Biacore Т200 с получением кривой связывания и диссоциации. В конце каждого экспериментального цикла после завершения диссоциации биосенсорный чип промывали и регенерировали 10 мМ Глицином-HCI (рН 1,5).
-8
-10
-7
-8
Результаты экспериментов показаны в Таблице 4. НАВ-2401, НАВ-5101, НАВ-3601 и НАВ-9001 обладают аффинностью в отношении фибрилл Aβ1-42, находящейся в интервале от 10 до 10 М, из которых НАВ-9001 обладает наиболее сильной аффинностью, которая на 2 порядка величины сильнее, чем аффинность Адуканумаба. НАВ-2401, НАВ-5101, НАВ-3601 и НАВ-9001 обладают аффинностью в отношении мономера Aβ1-42, находящейся в интервале от 10 до 10М, из которых НАВ-9001 обладает наиболее сильной аффинностью, которая на 2 порядка величины сильнее, чем аффинность Адуканумаба. Все из четырех анализируемых антител обладают аффинностью, более сильной, чем аффинность антитела в качестве положительного контроля - Адуканумаба.
Пример анализа 2. Действие антител против Абета на блокирование агрегации мономера Аβ1-42 в фибриллы Аβ1-42
2
Действие антител против Абета на ингибирование агрегации мономера Аβ1-42 в фибриллы Аβ1-42 выявляли посредством анализа на основе ThT. ThT (Тиофлавин Т, тиофлавин) представляет собой тип флуоресцентного красителя и обычно используется для идентификации in vitro фибрилл Аβ, поскольку сигналы флуоресценции при длине волны возбуждения 450 нм и длине волны излучения 482 нм будут значительно усиливаться при его объединении с белком, богатым β-листами (как например, отложение амилоида Ар). Конкретные экспериментальные процедуры анализа на основе ThT были указаны следующим образом. 0,5 мг человеческого Аβ1-42 (GenScript, кат. №RP10017) добавляли в 250 мкл 10 мМ NaOH, полностью растворяли и затем добавляли в равный объем предварительно охлажденного 2xPBS для нейтрализации. Раствор мономера Аβ1-42 с концентрацией 1 мг/мл готовили и разбавляли ddHO до 0,25 мг/мл. Мономер Аβ1-42 (10 мкл/лунка, 0,25 мг/мл) смешивали с 20 мкМ ThT (sigma, кат. №Т3516) и добавляли в черный 384-луночный планшет (Corning, кат. №4514), и лунка без добавления мономера Аβ 1-42 служила в качестве отрицательного контроля. Затем, градиентно разведенные антитела (начиная с 1 мг/мл, 2-кратное градиентное разведение, 10 мкл/лунка) добавляли в указанную выше смесь, инкубировали при 37°С в течение 24 ч. Сигналы флуоресценции считывали при длине волны возбуждения 440 нм и длине волны излучения 485 нм посредством использования микропланшет-ридера FlexStation3 (Молекулярные устройства).
Результаты экспериментов показаны на Фиг. 1. Все из НАВ-2401, НАВ-5101 и НАВ-9001 могут эффективно ингибировать агрегацию мономеров Аβ1-42 в фибриллы Аβ1-42. Тогда как НАВ-3601 и Адуканумаб не выполняют такой функции.
Пример анализа 3. Защита, осуществляемая антителами против Абета, на первичных нейронах крысы
4
2
Кору головного мозга отсекали у плодных крыс SD с гестационного возраста 16-18 суток, расщепляли трипсином (Gibco, кат. №25200-072), дозировали пипеткой и фильтровали в суспензию отдельных клеток, центрифугировали и осуществляли подсчет. Клетки разводили DM ЕМ (Gibco, кат. №10564-029), содержащей 10% FBS (Gibco, кат. №10099-141), до 1Е4 на лунку (1×10/лунка) и высевали в 96-луночный планшет (Corning, кат. №3903), покрытый PDL (от англ. Poly-D-lysine - поли-D-лизин, полилизин) (Sigma, кат. №Р0899). После инкубирования в течение ночи в инкубаторе (37°С, 5% СO), среду заменяли средой Neurobasal (Gibco, кат. №21103049)+2% В27 (Gibco, кат. №17504044), и половину среды заменяли каждые 3-4 суток. В сутки 8 добавляли 10 мкМ фибриллы Аβ1-42 (GL biochem, кат. №53819) и разные концентрации анализируемых антител. После инкубирования в течение 3 суток добавляли 30 мкл/лунка Cell Titer-Glo (Promega, кат. №G7571), и с планшета снимали показания с помощью микропланшет-ридера (PerkinElmer, Vector3) хемилюминесцентным способом.
Результаты экспериментов показаны на Фиг. 2. НАВ-2401, НАВ-5101, НАВ-3601, НАВ-9001 и антитело в качестве положительного контроля Адуканумаб могут защищать первичные нейроны от токсичности фибрилл Аβ, и дозозависимый эффект наблюдали в диапазоне концентраций 10-100 мкг/мл.
Пример анализа 4. Антитела против Абета стимулируют фагоцитоз фибрилл Аβ клетками BV2
5
2
2
Клетки BV2 в логарифмическую фазу роста (FuDan IBS Cell Center, FH0366) брали и расщепляли трипсином, центрифугировали при 800 об/мин в течение 5 мин. Плотность клеток в 24-луночном планшете регулировали с помощью RPMI 1640 (содержащей 10% FBS) до 1,2×10 клеток/лунка/500 мкл, тщательно встряхивали до образования одного слоя клеток и помещали в инкубатор при 37°С, 5% СO на ночь. Спустя 16 часов, 100 мкл градиентно разведенного антитела против Абета или отрицательного контроля (антитело к тромбину против нерелевантной мишени использовали в качестве отрицательного контроля, и антитело к тромбину получали в соответствии со способом получения для Н1601-008, как описано в WO 2017133673 A1) тщательно смешивали с 10 мкМ фибриллами Абета, меченными флуоресцентной меткой (разведенными 100 мкл основной среды F-12K), инкубировали при 37°С в течение одного часа, добавляли в 24-луночный планшет при удалении 500 мкл среды, и инкубировали при 37°С, 5% СO в течение 1 часа. Супернатант удаляли, и клетки три раза аккуратно промывали PBS, предварительно охлажденным при 4°С. И затем добавляли предварительно охлажденный 0,25% раствор Трипсина-ЭДТА (Этилендиаминтетрауксусная кислота) (1 х) в количестве 200 мкл/лунка и помещали при 4°С на 20 минут. Трипсин нейтрализовали средой F-12К, содержащей 10% FBS, и центрифугировали, и затем клетки три раза промывали предварительно охлажденным PBS, 100 мкл клеток собирали и наносили на проточный цитометр для считывания интенсивности флуоресценции FITC (от англ. Fluorescein isothiocyanate - Флуоресцеина изотиоцианат).
Результаты эксперимента показаны на Фиг. 3. Как НАВ-2401, так и НАВ-3601 могут стимулировать фагоцитоз фибрилл Аβ клетками BV2, как и антитело в качестве положительного контроля Адуканумаб. Дозозависимый эффект наблюдали в диапазоне концентраций от 0,03 до 0,3 мкг/мл.
Пример анализа 5. Действие антител против Абета на фагоцитоз фибрилл Аβ первичными клетками микроглии крысы
2
4
Кору головного мозга отсекали у новорожденной крысы SD, измельчали и фильтровали с получением клеточной суспензии. Клетки ресуспендировали в DMEM, содержащей 20% FBS (Gibco, кат. №10099-141), переносили в колбу для культуры Т75 (Corning, кат. №3473), предварительно охлажденную PDL (Sigma, кат. №Р0899) и помещали в инкубатор (37°С, 5% СO). Среду меняли каждые 3 суток. В сутки 8, колбу для культуры помещали на шейкер и встряхивали при 200 об/мин в течение 1 часа. Супернатант охлаждали, центрифугировали, считали, разводили до 5Е4/лунка (5 ×10/лунка) средой DMEM/F12 (GE, кат. №SH30023.01), содержащей 10% FBS, и помещали в 24-луночный планшет. Спустя 6 часов, среду заменяли на бессывороточную среду DMEM/F12 и инкубировали в течение ночи. В сутки 9 разные концентрации антител или отрицательный контроль (антитело к тромбину против нерелевантной мишени использовали в качестве отрицательного контроля, и антитело к тромбину получали в соответствии со способом получения для Н1601-008, как описано в WO 2017133673 A1) смешивали с 10 мкМ FITC-меченого (Thermo, кат. №А30006) Абета 1-42 (GL biochem, кат. №53819), соответственно, инкубировали при 37°С в течение 30 минут и центрифугировали для того, чтобы смыть избыток антител. Смесь антитела и Абета добавляли к клеткам и инкубировали при 37°С в течение 30 минут. Клетки дважды промывали PBS (Hyclone, кат. №SH30256.01) и добавляли к ним трипсин (Gibco, кат. №25200-072), помещали в холодильник на 4°С на 10 минут для расщепления клеток. И затем добавляли сыворотку для окончания реакции, клетки собирали после удаления супернатанта посредством центрифугирования, добавляли предварительно охлажденный PBS, и супернатант удаляли посредством центрифугирования, и клетки дважды промывали PBS. Интенсивность флуоресценции FITC считывали посредством проточного цитометра (BD, Verse).
Результаты эксперимента показаны на Фиг. 4. В эксперименте по фагоцитозу первичными клетками микроглии крысы НАВ-2401 и НАВ-3601 могут стимулировать фагоцитоз фибрилл Аβ первичными клетками микроглии, как и антитело -положительный контроль Адуканумаб. Дозозависимый эффект наблюдали в диапазоне концентраций от 0,03 до 0,3 мкг/мл.
Пример анализа 6. In vivo фармакологический анализ антител против Аβ Мышиную модель болезни Альцгеймера 5* FAD (пять мутаций при Наследственной Болезни Альцгеймера (от англ. Familial Alzheimer Disease)) использовали для оценки эффективности in vivo антител против Аβ. Пять наследственных мутаций генов АРР и PS1, включая три мутации в гене АРР (а именно, шведская мутация (K670N, M671L), флоридская мутация (I716V) и лондонская мутация (V717I)) и две мутации в гене PS1 (а именно, M146L и L286V), были сверхэкспрессированы в мышах 5×FAD. Таким образом, по сравнению с мышами дикого типа (WT), мыши 5*FAD демонстрировали явные нарушения когнитивной функции и памяти и имели значительное отложение Аβ бляшек в ткани головного мозга. Данный пример анализа был предназначен для оценки эффективности анализируемых антител в улучшении когнитивной способности мыши и уменьшении отложения Аβ бляшек посредством анализа улучшения поведения мыши, включая способность к гнездостроению, и пространственной памяти (пространственная память в водном лабиринте Морриса), а также посредством анализа изменений в содержании Аβ бляшек в ткани головного мозга.
Мыши 5×FAD были предоставлены Shanghai ChemPartner Co., Ltd. Мышей в возрасте трех месяцев отбирали и держали при комнатной температуре 23 плюс/минус 2°С, с 12/12-часовым циклом свет/темнота, и при неограниченном потреблении пищи и воды. Все анализируемые антитела находились в химерной форме человек-мышь, а именно, константную(ые) область(и) тяжелой и легкой цепей заменяли мышиной(ыми) константной(ыми) областью(ями) для того, чтобы избежать ADA (антитело к лекарственному средству), вызываемых длительным введением антител. В эксперимент включали шесть групп (п равен 15 в каждой группе), 4 группы антител, подлежащих анализу, одна группа Адуканумаба в качестве положительного контроля и одна группа PBS в качестве отрицательного контроля. НАВ-2401 и НАВ-3601 находились в химерной форме mIgG1, тогда как НАВ-5101, НАВ-9001 и Адуканумаб находились в химерной форме mIgG2a, и они назывались HAB-2401-Ch, HAB-3601-Ch, HAB-5101-Ch, HAB-9001-Ch и Адуканумаб-Ch, соответственно. НАВ-2401-Ch и НАВ-3601-Ch получали посредством слияния вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи НАВ-2401 и НАВ-3601 с константной областью тяжелой цепи mIgG1 (аминокислота константной области тяжелой цепи mIgG1 показана в SEQ ID NO 62) и константной областью легкой цепи mIgG1 (аминокислотная последовательность константной области легкой цепи mIgG1 показана в SEQ ID NO 63), соответственно; НАВ-5101-Ch, НАВ-9001-Ch и Aducanumab-Ch получали посредством слияния вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи НАВ-5101, НАВ-9001 и Адуканумаба с константной областью тяжелой цепи mIgG2a (аминокислотная последовательность константной области тяжелой цепи mIgG2a показана в SEQ ID NO 64) и константной областью легкой цепи mIgG2a (аминокислотная последовательность константной области легкой цепи mIgG2a показана в SEQ ID NO 65), соответственно. Способ получения антитела описан в Примере 4 данного раскрытия. Антитело вводили в.б. в количестве 15 мг/кг (миллиграмм на килограмм массы тела) один раз в неделю, и введение проводили в 13:00 - 16:00, на протяжении в общей сложности 12 недель.
Всем мышам 5×FAD давали дополнительную инъекцию соответствующего антитела после поведенческого теста (Пример анализа 8). Мышей подразделяли на три партии, по 5 мышей в каждой группе. Образцы отбирали, спустя 24 ч, 72 ч и 7 суток после дополнительной дозы, для количественного выявления содержания антител, проникающих через ВВВ (от англ. blood-brain barrier гематоэнцефалический барьер) в разные моменты времени после обработки антителами. Одновременно в отношении выявления отложения Аβ (Пример Анализа 9) и цитокинов (Пример анализа 10), для групп одного и того же антитела все образцы, отобранные в разные моменты времени после дополнительной дозы, объединяли вместе для обработки данных.
Пример анализа 7. Анализ способности мыши к гнездостроению
Гнездостроение является мышиным инстинктом, и оно обычно используется в качестве экспериментального способа измерения социального поведения мыши. Сообщалось, что трансгенные мыши, сверхэкспрессирующие АРР, как например, Tg2576, APPswe/PS1, 3 × Tg-AD, 5 × FAD (Transl Psychiatry. 2015 May 5;5:e562), демонстрировали нарушение способности гнездостроения в разной степени. Данный пример анализа предполагает оценку действия анализируемых антител на улучшение социального поведения трансгенных мышей 5* FAD посредством оценивания в баллах способности к гнездостроению мышей с множеством параметров.
Конкретные процедуры гнездостроения, осуществляемого мышью, описаны ниже. Примерно в 16:00 в первые сутки эксперимента в каждую клетку помещали кусочек уплотненной ваты, и каждую мышь держали в отдельной клетке. Уплотненную вату взвешивали перед помещением в клетку (масса 1), и окружающая среда скрещивания оставалась неизменной. В 10 часов следующего утра мышей вынимали и возвращали в исходные клетки. Форма гнезда и положение кусочков ваты оставались неизменными. Прежде, цифровую камеру использовали для того, чтобы сделать фотографии гнезд, сделанных мышами (вид спереди и вид сбоку для отражения истинной формы и высоты гнезда). Вату, которая не была разорвана на кусочки, собирали и взвешивали (масса 2). Рассчитывали процент оставшейся ваты. На основе фотографий, в соответствии с формой, высотой гнезда и степенью, до которой вата была разорвана, для каждого животного получали средний балл из трех независимых баллов, предоставленных параллельно, в соответствии с критериями подсчета баллов, баллы можно соответствующим образом корректировать в зависимости от конкретной ситуации. Критерии подсчета баллов показаны в Таблице 5:
Фотографии каждого животного анализировали посредством использования инструмента Lasso в пакете программного обеспечения Photoshop CS4 для расчета относительной площади гнезда (процент площади гнезда к общей площади разбросанных кусочков ваты). Совокупный балл трех параметров (кубический балл) рассчитывали в соответствии с приведенной ниже формулой:
Совокупный балл трех параметров = Процент оставшейся ваты * Процент площади гнезда × средний балл
Результаты анализа показаны на Фиг. 6 и Фиг. 7. Существовало некоторое различие между носителем (растворитель в качестве холостого контроля) и WT (дикий тип), которое отражает экспериментальное окно данного анализа. В то время как группы Адуканумаба-Ch, НАВ-2401-Ch и НАВ-9001-Ch демонстрировали некоторую тенденцию к улучшению, по сравнению с группой носителя.
Пример анализа 8. Поведенческий тест «водный лабиринт» (водный лабиринт Морриса)
Эксперимент - водный лабиринт представляет собой поведенческий тест, обычно используемый в области нейробиологии для оценки пространственного обучения и способности памяти грызунов. В таком эксперименте пространственные ориентиры вокруг бассейна использовали, чтобы ориентировать грызунов для нахождения и запоминания спасательной платформы, спрятанной под водой в бассейне, посредством тренировок.
Водный лабиринт Морриса состоял из белого, нетоксичного и непахнущего пластмассового круглого бассейна с диаметром 120 см и высотой 50 см и прозрачной платформы из органического стекла. Платформа имела высоту 31 см, и верхняя поверхность платформы имела диаметр 8,5 см. Бассейн наполняли водой до тех пор, пока уровень поверхности воды не составит 1 см выше платформы. Бассейн равным образом делили на четыре сектора, NE, SE, SW и NW, и N, NE, Е, SE, S, SW, W и NW отмечали в восьми точках, равным образом делили внешнюю окружность круглого бассейна. Платформу помещали в центр сектора SW, с расстоянием 30 см до центра окружности и расстоянием 30 см до стенки бассейна (схематичное изображение водного бассейна показано на Фиг. 8). Установленное съемочное устройство соединяли с компьютером и монитором. Круглый бассейн помещали в хорошо освещенную лабораторию. Явными визуальными ориентирами оформляли маркеры NE, SE, SW и NW. Перед экспериментом воду усеивали соответствующим количеством белых пластмассовых частиц, достигая равномерного покрытия водной поверхности, и температуру воды поддерживали на уровне 23,0 плюс/минус 2,0°С. Воду меняли каждые 5 суток.
В эксперимент с водным лабиринтом включали следующие модули: тренировка с флажком, спрятанная платформа и тест с использованием зонда.
8.1. Тренировка с флажком
Флажок помещали над водой на платформе для ориентирования животных. Каждое экспериментальное животное помещали в воду (мордой к стене бассейна) в точке N, и в то же время начинали видеослежение и видеозапись, в течение 60 секунд. Если у животного не получалось подняться на платформу за 60 с, его вручную направляли к платформе и позволяли оставаться на протяжении 20 с перед удалением из лабиринта; если животное находило платформу за 60 с, но оставалось на платформе на протяжении меньше чем 20 с, после окончания тренировки продолжительностью 60 с, его принуждали оставаться на платформе на протяжении 20 с перед удалением из лабиринта; если животное находило платформу за 60 с и оставалось на платформе на протяжении 20 с, его удаляли из лабиринта. После тренировки каждое животное сушили полотенцем и возвращали в клетку. После того, как все животные проходили тренировку, повторно начинали новый раунд той же тренировки. Таким путем, каждое животное тренировали 4 раза за одни сутки.
8.2. Спрятанная платформа
Платформу прятали примерно на 1 см ниже поверхности воды. Животных тренировали 4 раза в сутки на протяжении в общей сложности 12 суток. Место, в котором мышей помещали в воду, показано на Фиг. 8. Во время каждой тренировки, животных помещали мордой к стене бассейна, и в то же время начинали видеослежение и видеозапись. Каждая тренировка длилась в течение 60 с. Если у животного не получалось найти платформу за 60 с, его вручную направляли к платформе и позволяли остаться на протяжении 15 с перед выведением из лабиринта; если животное находило платформу за 60 с, но оставалось на платформе на протяжении меньше чем 15 с, после окончания тренировки продолжительностью 60 с, его принуждали оставаться на платформе на протяжении 15 с перед выведением из лабиринта; если животное находило платформу за 60 с и оставалось на платформе в течение 15 с, его выводили из лабиринта. После тренировки каждое животное сушили полотенцем и возвращали в клетку. После того, как все животные проходили тренировку, новый раунд тренировки повторно начинали с другого места, в котором животное помещали в воду.
8.3 Тест с использованием зонда
Спустя 24 часа после последней тренировки в сутки 12, платформу под водой удаляли для теста с использованием зонда. Животное помещали в воду (мордой к стенке бассейна) в точке NE, в то же время начинали видеослежение и видеозапись. Спустя 60 с, слежение заканчивали. Животное удаляли из бассейна, сушили полотенцем и возвращали в клетку. Траекторию животного анализировали посредством программного обеспечения Noldus Ethovision. 8.4. Результаты эксперимента с водным лабиринтом
Кривая обучения тренировки со спрятанной платформой показана на Фиг. 9. Результаты показали, что между группой носителя Тg мыши 5*FAD (растворитель в качестве холостого контроля) и группой WT наблюдали значимое различие в сутки 6, и очень значимые различия наблюдали в сутки 10 и сутки 11 тренировки со спрятанной платформой, и такое различие оказывалось, как правило, стабильным, указывая на то, что существует различие в способности пространственной памяти между трансгенными мышами 5*FAD и мышами дикого типа в поведенческом тесте. Такое различие является основой тестирования тестируемых лекарственных средств; с суток 1 группа лекарственного средства Адуканумаб-Ch в качестве положительного контроля всегда демонстрировала более короткий период задержки в достижении платформы, чем группа носителя, в сутки 11, наблюдали значимое различие, что указывало на то, что Адуканумаб-Ch демонстрировал превосходную эффективность в данном эксперименте; Аналогично группе Адуканумаба-Ch, НАВ-2401-Ch, HAB-5101-Ch и HAB-9001-Ch демонстрировали значимое различие в сутки 11 и 12, что указывало на то, что подобно Адуканумабу-Ch, данные три лекарственных средства могут значимо улучшать пространственную память и когнитивную способность мышей.
В тесте с использованием зонда авторы изобретения оценивали несколько экспериментальных параметров, включая задержку в достижении платформы, задержку в достижении зоны платформы, подсчет пересечений платформы или зоны платформы, продолжительность пребывания на платформе и продолжительность пребывания в зоне платформы, и индекс ACI.
Результаты по задержке в достижении платформы показаны на Фиг. 10А. Существовало определенное различие между WT и группой носителя, которое представляет собой экспериментальное окно. (В случае группы WT, задержка в достижении платформы в тесте с использованием зонда была дольше, чем задержка в тренировке с флажком, что могло быть вызвано экспериментальной вариацией, поскольку только один тест проводили в тесте с использованием зонда, тогда как в тренировке с флажком было проведено четыре теста). Результаты по НАВ-2401-Ch, HAB-5101-Ch и НАВ-9001-ch были сопоставимы с результатами по группе Адуканумаба-Ch, и демонстрировали более короткую продолжительность, чем группа носителя.
Результаты по задержке в достижении зоны платформы показаны на Фиг. 10В. Группа WT демонстрировала примерно в три раза более значимое различие при сравнении с группой носителя. Группа Адуканумаба-Ch показывала значимое различие при сравнении с группой носителя, в то время как результат группы Адуканумаба-Ch был близок к результату группы WT, что указывало на то, что молекулы положительного контроля могут значимо улучшать память мышей 5* FAD. Все из четырех анализируемых антител демонстрировали значимые различия при сравнении с группой носителя, среди которых НАВ-9001-Ch демонстрировало даже более лучшую эффективность, чем Адуканумаб-Ch.
Результаты эксперимента по подсчету пересечений платформы или зоны платформы показаны на Фиг. 10С и Фиг. 10D, результаты эксперимента по продолжительности пребывания на платформе и продолжительности пребывания в зоне платформы показаны на Фиг. 10Е и Фиг. 10F, и результаты эксперимента по индексу ACI показаны на Фиг. 10G. В тесте с использованием зонда платформу удаляли, и память мышей о платформе теоретически положительно коррелирует с данными параметрами. Что касается данных пяти параметров, существовало определенное различие между группой WT и группой носителя, указывая на экспериментальное окно результатов экспериментов. По сравнению с группой носителя, Адуканумаб-Ch демонстрировал тенденцию к улучшению. По сравнению с группой носителя, НАВ-2401-Ch, HAB-5101-Ch и НАВ-9001-Ch все демонстрировали разные степени улучшения, и НАВ-9001-Ch демонстрировало наилучшую эффективность.
Подводя итог, в тесте с использованием зонда по сравнению с группой носителя НАВ-2401-Ch, HAB-5101-Ch и НАВ-9001-Ch демонстрировали разные степени улучшения в задержке в достижении платформы, задержке в достижении зоны платформы, продолжительности пребывания на платформе, продолжительности пребывания в зоне платформы, подсчете пересечений платформы, подсчете пересечений зоны платформы и индексе ACI, что указывает на то, что данные три анализируемых антитела могут значимо улучшать пространственную память и когнитивную способность мышиной модели болезни Альцгеймера 5* FAD.
Пример анализа 9. Выявление отложения Аβ
Все образцы отбирали у мышей, используемых для поведенческого теста (Пример анализа 8). Каждую мышь опрыскивали PBS (рН 7,4), и собирали головной мозг. Левое полушарие сразу же погружали в 4% ПФА (параформальдегид) и фиксировали в течение 72 часов, и правое полушарие рассекали на льду для сбора лобной доли коры и гиппокампа, взвешивали по отдельности, затем быстро замораживали в жидком азоте и хранили в холодильнике при -80°С для последующей обработки образцов.
Конкретные процедуры гомогенизации правого полушария выглядели следующим образом: анализируемую ткань взвешивали и переносили в пробирку для гомогенизации и в нее добавляли 10-кратный объем лизата диэтиламина (50 мМ NaCl, 0,2% DEA (от англ. diethanol amine - диэтаноламин), содержащий ингибиторы протеаз). А именно, 10 мг ткани добавляли к 100 мкл лизирующего раствора, гомогенизировали посредством гомогенизатора и обрабатывали ультразвуком на ледяной бане в течение 15-20 секунд. Гомогенат переносили в центрифужную пробирку, центрифугировали при 100000 * g при 4°С в течение 30 мин. Полученный супернатант, содержащий растворимый Аβ, собирали и хранили при -80°С.10-кратный объем лизирующего раствора гуанидин гидрохлорида (5 М GuHCl в PBS) добавляли в центрифужную пробирку, осадок ресуспендировали и обрабатывали ультразвуком в ледяной воде в течение 15-20 секунд. Образец центрифугировали при 100000 × g при 4°С в течение 30 мин. Полученный супернатант, содержащий нерастворимый Аβ, собирали и хранили при -80°С.
Отложение Аβ в гомогенате ткани головного мозга выявляли посредством метода ИФА (набор для ИФА человеческого бета-амилоида (а.к. 1-40) Quantikine: R&D systems, DAB140B; набор для ИФА человеческого бета-амилоида (а.к.1-42) Quantikine: R&D systems, DAB142). Сначала, нерастворимые компоненты в гомогенате головного мозга (а именно, образец, подлежащий анализу) и стандарт разводили разбавителем; предварительно охлажденный планшет промывали промывочным буфером; добавляли разведенный стандарт и образцы; планшет герметично закрывали и инкубировали при 4°С в течение 2 часов; планшет промывали промывочным буфером 3-4 раза; добавляли предварительно охлажденное вторичное антитело; планшет герметично закрывали и инкубировали при 4°С в течение 2 часов; планшет промывали 3-4 раза промывочным буфером; раствор хромогенного субстрата добавляли и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут; добавляли останавливающий раствор, и значение OD450 считывали на микропланшет-ридере.
Результаты анализа ИФА показаны на Фиг. 11A-11D, группа носителя (растворитель в качестве холостого контроля) демонстрировала значимое отложение Аβ1-40 и Аβ1-42, по сравнению с группой WT, указывая на то, что отложение Аβ сверхэкспрессировалось в ткани головного мозга мыши 5 х FAD. По сравнению с группой носителя, в группе Адуканумаба-Ch наблюдалась тенденция к пониженному уровню Аβ1-40 и Аβ1-42. Среди четырех анализируемых антител, НАВ-3601-Ch обладало наилучшей эффективностью и имело тенденцию к пониженному уровню нерастворимого Аβ1-40 (нерастворимый Аβ1-40 гиппокампа) и нерастворимого Аβ1-42 (нерастворимый Аβ1-42 гиппокампа), по сравнению с носителем.
2
2
Процедуры иммуногистохимического окрашивания ткани левого полушария выглядели следующим образом. Дегидратация выделенного головного мозга: головной мозг фиксировали 4% ПФА в течение 72 часов, затем помещали в 30%-ный раствор сахарозы для дегидратации, помещали в холодильник на 4°С на ночь и процедуру дегидратации повторяли один раз; ткани заливали: изопентан помещали в сухой лед на несколько минут для получения жидкости в изопентане до достижения -70°С; ткань головного мозга сушили посредством промокательной бумаги и помещали в изопентан для замораживания на несколько секунд после удаления лишней порции, и затем ткань головного мозга вынимали из изопентана, сушили и заливали в заливочную камеру с ОТС (заливочное средство), и затем заливочную камеру помещали на сухой лед с получением отвержденного ОТС. Залитую ткань головного мозга хранили в холодильнике при -80°С; Приготовление срезов: ткань головного мозга нарезали на сагиттальные срезы в криостате, 20 мкм на срез; инактивация эндогенной пероксидазы: срез головного мозга промывали 3 раза в PBS, по 5 минут каждый, инкубировали с 0,3% НO (полученным с помощью PBS) в течение 10 минут; пермеабилизация: срез головного мозга промывали 3 раза в PBS, по 5 минут каждый, инкубировали с TBST (TBS, содержащий 0,25% Triton X -100) 3 раза, по 5 мин каждый; блокирование: инкубировали с 0,3% Triton Х-100 и 5% BSA в PBS в течение 1 ч; инкубация с первичным антителом: первичное антитело 3D6 разводили 2% BSA в TBST до рабочей концентрации 10 мкг/мл, и срез головного мозга помещали в рабочий раствор первичного антитела и инкубировали в течение ночи при 4°С; инкубация с вторичным антителом: срез головного мозга промывали в TBST три раза, по 5 минут каждый, вторичное антитело разводили TBST, содержащим 2% BSA, с получением рабочей концентрации 5 мкг/мл, срез головного мозга инкубировали в рабочем растворе вторичного антитела в течение 1 ч; развивалась окраска: срез головного мозга 3 раза промывали в TBST, по 5 минут каждый, и помещали в раствор для развития окраски в темноте в течение 5 минут, и затем дважды погружали в чистую воду для остановки реакции развития окраски; заливка в среду: срез головного мозга помещали в и из PBS, сушили, погружали в чистую воду для удаления соли, сушили и фиксировали с градиентом концентраций этанола (75%, 95%, абсолютный этанол), заливали смолой и сушили; сканирование и количественный анализ: срез сканировали посредством цифрового сканера для срезов (Hamamatsu Nanozoomer S210) с получением отсканированных изображений среза. В случае каждой фотографии среза головного мозга, области коры головного мозга и гиппокампа сначала показаны в соответствии с координатой головного мозга мыши, и затем Аβ-позитивные сигнальные площади показаны посредством программного обеспечения системы анализа BIOTOPIX™. Наконец, долю позитивных сигналов рассчитывали для коры головного мозга и гиппокампа, соответственно. А именно, доля Аβ-позитивных сигналов в коре головного мозга = площадь Аβ-позитивных сигналов в коре головного мозга/общая площадь коры головного мозга; доля Аβ-позитивных сигналов в гиппокампе=площадь Ар-позитивных сигналов в гиппокампе/общая площадь гиппокампа.
Результаты экспериментов по ИГХ-выявлению показаны на Фиг. 12 и Фиг. 13. По сравнению с группой WT, группа носителя демонстрировала явное отложение Аβ1-40 и Аβ1-42, что согласуется с анализом ИФА. В сравнении с группой носителя, НАВ-3601-Ch, НАВ-9001-Ch и Адуканумаб-Ch могут значимо уменьшать отложение Аβ, что указывает на то, что НАВ-3601-Ch и НАВ-9001-Ch могут значимо уменьшать отложение Аβ, как и Адуканумаб-Ch.
Пример анализа 10. Действие антител на высвобождение цитокинов в ткани головного мозга
Образцы, используемые в данном примере анализа, представляли собой растворимый компонент из гомогената головного мозга в Примере анализа 9, и способ выявления, подлежащий использованию, представлял собой высокочувствительный анализатор электрохемилюминесценции MSD (Meso Scale Discovery). Конкретные экспериментальные процедуры описаны в руководстве по продукту (набор для мультиплексного анализа U-PLEX Biomarker Group (мышь): MSD, N05235A-1). Кратко, биотинилированное захватывающее антитело для каждого цитокина связывалось с каждым линкером U-PLEX, участвовало в реакции при комнатной температуре в течение 30 минут, и затем реакцию заканчивали; полученные растворы U-PLEX-связанных антител смешивали и наносили на планшет U-PLEX, инкубировали при комнатной температуре при встряхивании в течение одного часа или 4°С в течение ночи; стандарт и анализируемые образцы (а именно, растворимые компоненты в гомогенате ткани головного мозга) разводили в соответствии с руководством; покрытый планшет 3 раза промывали PBST или 1×MSD промывочным буфером (промывочный реагент 1×MSD), добавляли 25 мкл разбавителя образцов и 25 мкл разведенного стандарта и образцов, подлежащих анализу, и планшет герметично закрывали и инкубировали при комнатной температуре при встряхивании в течение 1 часа. Покрытый планшет 3 раза промывали PBST или 1×MSD промывочным буфером, добавляли 50 мкл смеси разведенных выявляющих антител, и планшет плотно закрывали и инкубировали при встряхивании при комнатной температуре в течение 1 часа. Покрытый планшет 3 раза промывали PBST или 1×MSD промывочным буфером, и затем добавляли 2* буферный реагент считывания. Наконец, с планшета считывали значения на приборе MSD.
Результаты экспериментов показаны на Фиг. 14А-Фиг. 14D и Фиг. 15А-Фиг. 15F. Уровни всех цитокинов, таких как ФНОα, IFN-γ, IL1 β, IL2, IL6, IL12p70, IL4, IL10, МСР-1 и КС, были очень низкими и почти достигали нижнего предела обнаружения способа выявления. Имели место явные различия между отдельными мышами, таким образом, отсутствовало значимое различие между группами. Подводя итог вышесказанному, четыре группы анализируемых антител не демонстрировали более высокого уровня цитокинов, по сравнению с положительным контролем - Адуканумабом, указывая на то, что анализируемые антитела являются безопасными.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  JIANGSU HENGRUI MEDICINE CO., LTD.; SHANGHAI HENGRUI PHARMACEUTICAL CO.,
LTD.
<120>  АНТИТЕЛО ПРОТИВ БЕТА-АМИЛОИДА, ЕГО АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩИЙ ФРАГМЕНТ И ИХ
ПРИМЕНЕНИЕ
<130>  719048CPCT
<140>  PCT/CN2019/096159
<141>  16.07.2019
<150>  CN201810782196.2
<151>  17.07.2018
<160>  73
<170>  SIPOSequenceListing 1.0
<210>  1
<211>  40
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  домен
<223>  1-40 аминокислотная последовательность Абета
<400>  1
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys
1               5                   10                  15
Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile
20                  25                  30
Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val
35                  40
<210>  2
<211>  42
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  домен
<223>  1-42 аминокислотная последовательность Абета
<400>  2
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys
1               5                   10                  15
Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile
20                  25                  30
Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala
35                  40
<210>  3
<211>  120
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  домен
<223>  аминокислотная последовательность вариабельной области тяжёлой цепи
mAb-2401
<400>  3
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Val Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asn Thr
20                  25                  30
Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Arg Ile Asp Pro Thr Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ala Pro Lys Phe
50                  55                  60
Lys Asp Lys Ala Thr Ile Ile Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Gly Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Arg Val Tyr Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  4
<211>  113
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  домен
<223>  аминокислотная последовательность вариабельной области лёгкой цепи
mAb-2401
<400>  4
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly
1               5                   10                  15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20                  25                  30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35                  40                  45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50                  55                  60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65                  70                  75                  80
Ile Ser Asn Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85                  90                  95
Asp Tyr Asn Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
100                 105                 110
Lys
<210>  5
<211>  121
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  домен
<223>  аминокислотная последовательность вариабельной области тяжёлой цепи
mAb-3601
<400>  5
Gln Ala Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Ser Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Phe
20                  25                  30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
35                  40                  45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ala
50                  55                  60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65                  70                  75                  80
Phe Leu Lys Ile Ala Asn Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85                  90                  95
Cys Ala Arg Arg Pro Leu Gly Ser Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
100                 105                 110
Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  6
<211>  112
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  домен
<223>  аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи
mAb-3601
<400>  6
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35                  40                  45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85                  90                  95
Ser Arg Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100                 105                 110
<210>  7
<211>  122
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  домен
<223>  аминокислотная последовательность вариабельной области тяжёлой цепи
mAb-5101
<400>  7
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Ser Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Ser
20                  25                  30
Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
35                  40                  45
Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Val Ser Leu Tyr Asn Pro Ser
50                  55                  60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Ala Ser Arg Asn Gln Val
65                  70                  75                  80
Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr
85                  90                  95
Cys Val Arg Arg Arg Ile Ile Thr Val Val Asp Ala Met Asp Tyr Trp
100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  8
<211>  112
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  домен
<223>  аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи
mAb-5101
<400>  8
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Ser Gly Gln Ser
35                  40                  45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Cys Gln Gly
85                  90                  95
Ser Arg Val Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105                 110
<210>  9
<211>  124
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  домен
<223>  аминокислотная последовательность вариабельной области тяжёлой цепи
mAb-9001
<400>  9
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Phe
20                  25                  30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
35                  40                  45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ala
50                  55                  60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65                  70                  75                  80
Phe Leu Lys Ile Ala Ile Val Asp Thr Ala Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr
85                  90                  95
Cys Val Arg Arg Gly Phe His Leu Gly Ser Arg Gly Asp Tyr Phe Asp
100                 105                 110
His Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  10
<211>  112
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  домен
<223>  аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи
mAb-9001
<400>  10
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35                  40                  45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85                  90                  95
Ser Arg Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100                 105                 110
<210>  11
<211>  5
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  домен
<223>  аминокислотная последовательность определяющей комплементарность
области тяжелой цепи (HCDR1) HAB-2401, mAb-2401
<400>  11
Asn Thr Tyr Met His
1               5
<210>  12
<211>  17
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  домен
<223>  аминокислотная последовательность HCDR2 HAB-2401, mAb-2401
<400>  12
Arg Ile Asp Pro Thr Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ala Pro Lys Phe Lys
1               5                   10                  15
Asp
<210>  13
<211>  11
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  домен
<223>  HCDR3 HAB-2401, mAb-2401
<400>  13
Arg Val Tyr Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Asn Tyr
1               5                   10
<210>  14
<211>  17
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  домен
<223>  аминокислотная последовательность определяющей комплементарность
области легкой цепи (LCDR1) HAB-2401, mAb-2401
<400>  14
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu
1               5                   10                  15
Thr
<210>  15
<211>  7
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  домен
<223>  аминокислотная последовательность LCDR2 HAB-2401, mAb-2401
<400>  15
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1               5
<210>  16
<211>  9
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  домен
<223>  аминокислотная последовательность LCDR3 HAB-2401, mAb-2401
<400>  16
Gln Asn Asp Tyr Asn Tyr Pro Leu Thr
1               5
<210>  17
<211>  7
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  домен
<223>  аминокислотная последовательность HCDR1 HAB-9001, mAb-3601, mAb-9001,
HAB-3601,
<400>  17
Thr Phe Gly Met Gly Val Gly
1               5
<210>  18
<211>  16
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  домен
<223>  аминокислотная последовательность HCDR2 mAb-9001, mAb-3601
<400>  18
His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ala Leu Lys Ser
1               5                   10                  15
<210>  19
<211>  11
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  домен
<223>  аминокислотная последовательность HCDR3 HAB-3601, mAb-3601
<400>  19
Arg Pro Leu Gly Ser Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr
1               5                   10
<210>  20
<211>  16
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  домен
<223>  аминокислотная последовательность LCDR1 HAB-9001, mAb-3601, mAb-5101,
mAb-9001, HAB-3601, HAB-5101
<400>  20
Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu
1               5                   10                  15
<210>  21
<211>  7
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  домен
<223>  аминокислотная последовательность LCDR2 HAB-9001, mAb-3601, mAb-5101,
mAb-9001, HAB-3601, HAB-5101
<400>  21
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1               5
<210>  22
<211>  9
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  домен
<223>  аминокислотная последовательность LCDR3 HAB-9001, mAb-3601, mAb-9001,
HAB-3601
<400>  22
Phe Gln Gly Ser Arg Val Pro Leu Thr
1               5
<210>  23
<211>  7
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  домен
<223>  аминокислотная последовательность HCDR1 HAB-5101, mAb-5101
<400>  23
Thr Ser Gly Met Gly Val Ser
1               5
<210>  24
<211>  16
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  домен
<223>  аминокислотная последовательность HCDR2 HAB-5101, mAb-5101
<400>  24
His Ile Tyr Trp Asp Asp Val Ser Leu Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1               5                   10                  15
<210>  25
<211>  12
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  домен
<223>  аминокислотная последовательность HCDR3 HAB-5101, mAb-5101
<400>  25
Arg Arg Ile Ile Thr Val Val Asp Ala Met Asp Tyr
1               5                   10
<210>  26
<211>  9
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  домен
<223>  аминокислотная последовательность LCDR3 mAb-5101
<400>  26
Cys Gln Gly Ser Arg Val Pro Pro Thr
1               5
<210>  27
<211>  14
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  домен
<223>  аминокислотная последовательность HCDR3 HAB-9001, mAb-9001
<400>  27
Arg Gly Phe His Leu Gly Ser Arg Gly Asp Tyr Phe Asp His
1               5                   10
<210>  28
<211>  98
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  домен
<223>  аминокислотная последовательность матрицы тяжелой цепи зародышевой
линии человека (IGHV1-24*01)
<400>  28
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Leu
20                  25                  30
Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Thr
<210>  29
<211>  95
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  домен
<223>  аминокислотная последовательность матрицы легкой цепи зародышевой
линии человека (IGKV1-27*01)
<400>  29
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Lys Tyr Asn Ser Ala Pro
85                  90                  95
<210>  30
<211>  450
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  домен
<223>  аминокислотная последовательность тяжелой цепи HAB-2401
<400>  30
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Asn Thr
20                  25                  30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Arg Ile Asp Pro Thr Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ala Pro Lys Phe
50                  55                  60
Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Arg Val Tyr Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Asn Tyr Trp Gly Lys
100                 105                 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115                 120                 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130                 135                 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145                 150                 155                 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165                 170                 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180                 185                 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195                 200                 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210                 215                 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225                 230                 235                 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245                 250                 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260                 265                 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275                 280                 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290                 295                 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305                 310                 315                 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325                 330                 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340                 345                 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355                 360                 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370                 375                 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385                 390                 395                 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405                 410                 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420                 425                 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435                 440                 445
Gly Lys
450
<210>  31
<211>  220
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  домен
<223>  аминокислотная последовательность легкой цепи HAB-2401
<400>  31
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20                  25                  30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35                  40                  45
Val Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50                  55                  60
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65                  70                  75                  80
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn
85                  90                  95
Asp Tyr Asn Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
100                 105                 110
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
115                 120                 125
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
130                 135                 140
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
145                 150                 155                 160
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
165                 170                 175
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
180                 185                 190
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
195                 200                 205
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210                 215                 220
<210>  32
<211>  98
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  домен
<223>  аминокислотная последовательность матрицы тяжелой цепи зародышевой
линии человека (IGHV3-30*01)
<400>  32
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg
<210>  33
<211>  95
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  домен
<223>  аминокислотная последовательность матрицы легкой цепи зародышевой
линии человек (IGKV1-39*01)
<400>  33
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro
85                  90                  95
<210>  34
<211>  451
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  домен
<223>  аминокислотная последовательность тяжелой цепи HAB-3601
<400>  34
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Thr Phe
20                  25                  30
Gly Met Gly Val Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35                  40                  45
Trp Val Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asn Lys Tyr Tyr Asn Pro Ala
50                  55                  60
Leu Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu
65                  70                  75                  80
Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85                  90                  95
Cys Ala Arg Arg Pro Leu Gly Ser Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
100                 105                 110
Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115                 120                 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130                 135                 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145                 150                 155                 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165                 170                 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180                 185                 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195                 200                 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210                 215                 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225                 230                 235                 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245                 250                 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260                 265                 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275                 280                 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290                 295                 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305                 310                 315                 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325                 330                 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340                 345                 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355                 360                 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370                 375                 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385                 390                 395                 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405                 410                 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420                 425                 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435                 440                 445
Pro Gly Lys
450
<210>  35
<211>  219
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  домен
<223>  аминокислотная последовательность легкой цепи HAB-3601
<400>  35
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
35                  40                  45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65                  70                  75                  80
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85                  90                  95
Ser Arg Val Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105                 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115                 120                 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130                 135                 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145                 150                 155                 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165                 170                 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180                 185                 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195                 200                 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210                 215
<210>  36
<211>  100
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  домен
<223>  аминокислотная последовательность матрицы тяжелой цепи зародышевой
линии человека (IGHV2-70D*04)
<400>  36
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20                  25                  30
Gly Met Arg Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35                  40                  45
Trp Leu Ala Arg Ile Asp Trp Asp Asp Asp Lys Phe Tyr Ser Thr Ser
50                  55                  60
Leu Lys Thr Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65                  70                  75                  80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85                  90                  95
Cys Ala Arg Ile
100
<210>  37
<211>  101
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  домен
<223>  аминокислотная последовательность матрицы легкой цепи зародышевой
линии человека (IGKV2-40*01)
<400>  37
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20                  25                  30
Asp Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln
35                  40                  45
Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser Tyr Arg Ala Ser Gly Val
50                  55                  60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys
65                  70                  75                  80
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln
85                  90                  95
Arg Ile Glu Phe Pro
100
<210>  38
<211>  452
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  домен
<223>  аминокислотная последовательность тяжелой цепи HAB-5101
<400>  38
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20                  25                  30
Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35                  40                  45
Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Val Ser Leu Tyr Asn Pro Ser
50                  55                  60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65                  70                  75                  80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85                  90                  95
Cys Ala Arg Arg Arg Ile Ile Thr Val Val Asp Ala Met Asp Tyr Trp
100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115                 120                 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130                 135                 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145                 150                 155                 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165                 170                 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180                 185                 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
195                 200                 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
210                 215                 220
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
225                 230                 235                 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245                 250                 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260                 265                 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275                 280                 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
290                 295                 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305                 310                 315                 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
325                 330                 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340                 345                 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
355                 360                 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370                 375                 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385                 390                 395                 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
405                 410                 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420                 425                 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435                 440                 445
Ser Pro Gly Lys
450
<210>  39
<211>  219
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  домен
<223>  аминокислотная последовательность легкой цепи HAB-5101
<400>  39
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35                  40                  45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Gly
85                  90                  95
Ser Arg Val Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105                 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115                 120                 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130                 135                 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145                 150                 155                 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165                 170                 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180                 185                 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195                 200                 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210                 215
<210>  40
<211>  454
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  домен
<223>  аминокислотная последовательность тяжелой цепи HAB-9001
<400>  40
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Phe
20                  25                  30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35                  40                  45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asn Lys Tyr Tyr Asn Pro Ala
50                  55                  60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65                  70                  75                  80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85                  90                  95
Cys Ala Arg Arg Gly Phe His Leu Gly Ser Arg Gly Asp Tyr Phe Asp
100                 105                 110
His Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115                 120                 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
130                 135                 140
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145                 150                 155                 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165                 170                 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180                 185                 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
195                 200                 205
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro
210                 215                 220
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
225                 230                 235                 240
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
245                 250                 255
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260                 265                 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
275                 280                 285
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
290                 295                 300
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
305                 310                 315                 320
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
325                 330                 335
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
340                 345                 350
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
355                 360                 365
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
370                 375                 380
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
385                 390                 395                 400
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
405                 410                 415
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
420                 425                 430
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
435                 440                 445
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450
<210>  41
<211>  219
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  домен
<223>  аминокислотная последовательность легкой цепи HAB-9001
<400>  41
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85                  90                  95
Ser Arg Val Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105                 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115                 120                 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130                 135                 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145                 150                 155                 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165                 170                 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180                 185                 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195                 200                 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210                 215
<210>  42
<211>  330
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  домен
<223>  аминокислотная последовательность константной области тяжёлой цепи
HAB-2401, HAB-3601, HAB-5101, HAB-9001
<400>  42
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85                  90                  95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100                 105                 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115                 120                 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130                 135                 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145                 150                 155                 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165                 170                 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180                 185                 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195                 200                 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210                 215                 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225                 230                 235                 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245                 250                 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260                 265                 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275                 280                 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290                 295                 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305                 310                 315                 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325                 330
<210>  43
<211>  107
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  домен
<223>  аминокислотная последовательность константной области легкой цепи
HAB-2401, HAB-3601, HAB-5101, HAB-9001
<400>  43
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1               5                   10                  15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20                  25                  30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35                  40                  45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50                  55                  60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65                  70                  75                  80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85                  90                  95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100                 105
<210>  44
<211>  120
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  домен
<223>  аминокислотная последовательность вариабельной области тяжёлой цепи
HAB-2401
<400>  44
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Asn Thr
20                  25                  30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Arg Ile Asp Pro Thr Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ala Pro Lys Phe
50                  55                  60
Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Arg Val Tyr Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Asn Tyr Trp Gly Lys
100                 105                 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  45
<211>  113
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  домен
<223>  аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи
HAB-2401
<400>  45
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20                  25                  30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35                  40                  45
Val Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50                  55                  60
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65                  70                  75                  80
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn
85                  90                  95
Asp Tyr Asn Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
100                 105                 110
Lys
<210>  46
<211>  121
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  домен
<223>  аминокислотная последовательность вариабельной области тяжёлой цепи
HAB-3601
<400>  46
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Thr Phe
20                  25                  30
Gly Met Gly Val Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35                  40                  45
Trp Val Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asn Lys Tyr Tyr Asn Pro Ala
50                  55                  60
Leu Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu
65                  70                  75                  80
Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85                  90                  95
Cys Ala Arg Arg Pro Leu Gly Ser Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
100                 105                 110
Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  47
<211>  112
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  домен
<223>  аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи
HAB-3601
<400>  47
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
35                  40                  45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65                  70                  75                  80
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85                  90                  95
Ser Arg Val Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105                 110
<210>  48
<211>  122
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  домен
<223>  аминокислотная последовательность вариабельной области тяжёлой цепи
HAB-5101
<400>  48
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20                  25                  30
Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35                  40                  45
Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Val Ser Leu Tyr Asn Pro Ser
50                  55                  60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65                  70                  75                  80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85                  90                  95
Cys Ala Arg Arg Arg Ile Ile Thr Val Val Asp Ala Met Asp Tyr Trp
100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  49
<211>  112
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  домен
<223>  аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи
HAB-5101
<400>  49
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35                  40                  45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Gly
85                  90                  95
Ser Arg Val Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105                 110
<210>  50
<211>  124
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  домен
<223>  аминокислотная последовательность вариабельной области тяжёлой цепи
HAB-9001
<400>  50
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Phe
20                  25                  30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35                  40                  45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asn Lys Tyr Tyr Asn Pro Ala
50                  55                  60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65                  70                  75                  80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85                  90                  95
Cys Ala Arg Arg Gly Phe His Leu Gly Ser Arg Gly Asp Tyr Phe Asp
100                 105                 110
His Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  51
<211>  112
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  домен
<223>  аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи
HAB-9001
<400>  51
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85                  90                  95
Ser Arg Val Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105                 110
<210>  52
<211>  16
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  домен
<223>  аминокислотная последовательность HAB-3601, HAB-9001 HCDR2
<400>  52
His Ile Trp Trp Asp Asp Asn Lys Tyr Tyr Asn Pro Ala Leu Lys Ser
1               5                   10                  15
<210>  53
<211>  9
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  домен
<223>  аминокислотная последовательность HAB-5101 LCDR3
<400>  53
Ser Gln Gly Ser Arg Val Pro Pro Thr
1               5
<210>  54
<211>  1350
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  Ген
<223>  нуклеотидная последовательность тяжелой цепи HAB-2401
<400>  54
gaggtgcagc tggtgcagag cggtgccgag gtgaagaagc cgggagcgag cgtgaaagtg        60
agctgcaagg tgagcggcta caccctgacc aacacctaca tgcactgggt gaggcaggcc       120
cctgggaagg gcctggagtg gatgggcagg atcgacccca ccaacggcaa caccaagtac       180
gcccccaagt tcaaggacag ggtgaccatg accgccgaca ccagcaccga cactgcgtac       240
atggagctga gcagcctgag aagcgaggac accgccgtgt actactgcgc caggagggtc       300
tactactacg acagcaccta taactactgg ggtaagggca ccactgtaac cgtgagctct       360
gcttcgacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg       420
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg       480
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca       540
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc       600
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc       660
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga       720
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct       780
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg       840
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac       900
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag       960
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc      1020
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag      1080
ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc      1140
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg      1200
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg      1260
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg      1320
cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa                                       1350
<210>  55
<211>  660
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  Ген
<223>  нуклеотидная последовательность легкой цепи HAB-2401
<400>  55
gacatccaga tgacccaaag ccccagctcc ctgagcgcca gcgtggggga cagggtgact        60
atcacctgca agagcagcca gagcctgctg aactcaggca accagaagaa ctacctgacc       120
tggtatcagc agaagcccgg caaggtgccc aagcttctga tctactgggc cagcaccagg       180
gagagcggcg tgcccagcag gttcagtggc agcggtagcg gaaccgactt cacccttaca       240
atctcaagcc tgcagcccga ggacgttgcc acctactact gccagaacga ctacaactac       300
cccctcacct tcggcggagg gactaaggtg gagatcaagc gtacggtggc tgcaccatct       360
gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc       420
ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc       480
caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc       540
ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc       600
gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt       660
<210>  56
<211>  1353
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  Ген
<223>  нуклеотидная последовательность тяжелой цепи HAB-3601
<400>  56
caggtgcagc tggtggagag cggcggtggc gtggtgcaac ccggcaggag cctgaggctg        60
agctgcgctg ccagcggctt cgccttcagc accttcggca tgggcgtggg ctgggtgagg       120
caggcacccg gaaagggcct ggagtgggtg gcccatatct ggtgggacga caacaagtac       180
tacaatccag ccctgaagag caggttcacc atcagcaggg acaacagcaa aaacaccctg       240
tacctgcaga tgaataccct gagggccgag gataccgccg tgtactactg cgccaggagg       300
cccctgggct cctacgatta cttcgactac tggggcaagg gaaccaccgt gaccgtgagc       360
agcgcttcga ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct       420
gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg       480
tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc       540
tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag       600
acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag       660
cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg       720
ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc       780
cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac       840
tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac       900
aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc       960
aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc      1020
tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat      1080
gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac      1140
atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc      1200
gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg      1260
tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac      1320
acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaa                                   1353
<210>  57
<211>  657
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  Ген
<223>  нуклеотидная последовательность легкой цепи HAB-3601
<400>  57
gacatccaga tgacccagag ccccagcagt ctgagcgcca gcgtgggcga cagggtcacc        60
atcacctgta ggagcagcca gagcatcgtg cacagcaacg gcaacaccta cctggagtgg       120
tatcagcaaa agcccggcaa ggcccccaag cttctgatat acaaggtgag caacaggttc       180
tcaggcgttc ccagtaggtt cagcggaagc ggcagcggga ccgacttcac cctgaccatc       240
agctccctgc agcccgagga cttcgccacc tactactgct tccagggcag ccgggtgcct       300
ctgacctttg gtgggggcac caaggtggag attaagcgta cggtggctgc accatctgtc       360
ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg       420
ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa       480
tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc       540
agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa       600
gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgt          657
<210>  58
<211>  1356
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  Ген
<223>  нуклеотидная последовательность тяжелой цепи HAB-5101
<400>  58
caggtgaccc tgaaagaaag cggccctgct ctggtgaagc ccacccagac cctcaccctg        60
acctgcacct tcagcggctt cagcttgagc accagcggca tgggcgtgag ctggatcagg       120
cagcctcccg gcaaggccct ggagtggctg gcccacatct actgggacga cgtgagcctg       180
tacaacccta gcctgaagag ccgcctgaca atcagcaagg acaccagcaa gaaccaggtg       240
gtgctgacca tgaccaacat ggaccccgtg gacaccgcca cctactactg cgccaggagg       300
aggatcatca ccgtggtgga cgccatggac tattggggcc agggcaccac tgtgaccgtg       360
agcagcgctt cgaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc       420
tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg       480
gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag       540
tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc       600
cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagaaagtt       660
gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg       720
gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg       780
acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc       840
aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag       900
tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat       960
ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc      1020
atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg      1080
gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc      1140
gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct      1200
cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc      1260
aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac      1320
tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaa                                1356
<210>  59
<211>  657
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  Ген
<223>  нуклеотидная последовательность легкой цепи HAB-5101
<400>  59
gacgtcgtga tgacccagac ccccctgagc ctgcccgtga cccctggcga gcccgccagc        60
atcagctgca ggagcagcca gagcatcgtg cacagcaacg gcaacaccta cctggagtgg       120
tacctgcaga agcccggtca gagccccaag ctgctgatat acaaggtgag caacaggttc       180
agcggcgtgc ccgacaggtt ttccggcagc ggaagcggca ccgacttcac cctgaagatc       240
agccgcgtgg aggccgagga cgtgggcgtg tactactgca gtcagggaag ccgagtgccc       300
cccacctttg gaggcggaac taaggtggag atcaagcgta cggtggctgc accatctgtc       360
ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg       420
ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa       480
tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc       540
agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa       600
gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgt          657
<210>  60
<211>  1362
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  Ген
<223>  нуклеотидная последовательность тяжелой цепи HAB-9001
<400>  60
caggtgaccc tcaaggaatc tggccctgca ctggtgaagc ccacccagac cctgacgctg        60
acctgcacct ttagcggctt cagcttgagc accttcggca tgggcgtggg ctggatcagg       120
cagcctcccg gaaaggccct ggagtggctg gcccacatct ggtgggacga caacaagtac       180
tacaaccccg ctctgaagag ccgcctgaca atcagcaagg acaccagcaa gaaccaggtg       240
gtgctgacca tgaccaacat ggaccccgtg gacaccgcca cctactactg cgccaggagg       300
ggcttccacc ttggcagcag gggcgactac ttcgaccact ggggccaagg caccactgtg       360
accgtgagca gcgcttcgac caagggccca tcggtcttcc ccctggcacc ctcctccaag       420
agcacctctg ggggcacagc ggccctgggc tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg       480
gtgacggtgt cgtggaactc aggcgccctg accagcggcg tgcacacctt cccggctgtc       540
ctacagtcct caggactcta ctccctcagc agcgtggtga ccgtgccctc cagcagcttg       600
ggcacccaga cctacatctg caacgtgaat cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag       660
aaagttgagc ccaaatcttg tgacaaaact cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa       720
ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc       780
tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc       840
aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag       900
gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg       960
ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag      1020
aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca      1080
tcccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat      1140
cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc      1200
acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct acagcaagct caccgtggac      1260
aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac      1320
aaccactaca cgcagaagag cctctccctg tctccgggta aa                         1362
<210>  61
<211>  657
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  Ген
<223>  нуклеотидная последовательность легкой цепи HAB-9001
<400>  61
gacgtcgtga tgacccagac ccccctgagc ctgcccgtga ccccaggaga acccgccagc        60
atcagctgca ggagcagcca gagcatcgtg cacagcaacg gcaacaccta cctggagtgg       120
tacctgcaga agcctggcca aagcccccag ctgctgatat acaaggtgag caacaggttc       180
agcggcgtgc ccgataggtt ctctggcagt ggcagcggga ccgacttcac cctgaagatt       240
agcagagtgg aggccgagga cgtgggcgtg tactactgct tccaaggcag ccgcgtgccc       300
ctgaccttcg gccagggcac taagctggag atcaagcgta cggtggctgc accatctgtc       360
ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg       420
ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa       480
tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc       540
agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa       600
gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgt          657
<210>  62
<211>  324
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  домен
<223>  аминокислотная последовательность константной области тяжёлой цепи
mIgG1
<400>  62
Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala
1               5                   10                  15
Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr
20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser
35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Glu Ser Asp Leu Tyr Thr Leu
50                  55                  60
Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Pro Arg Pro Ser Glu Thr Val
65                  70                  75                  80
Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys
85                  90                  95
Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro
100                 105                 110
Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu
115                 120                 125
Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser
130                 135                 140
Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu
145                 150                 155                 160
Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
165                 170                 175
Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn
180                 185                 190
Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro
195                 200                 205
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln
210                 215                 220
Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val
225                 230                 235                 240
Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val
245                 250                 255
Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln
260                 265                 270
Pro Ile Met Asn Thr Asn Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn
275                 280                 285
Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val
290                 295                 300
Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His
305                 310                 315                 320
Ser Pro Gly Lys
<210>  63
<211>  107
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  домен
<223>  аминокислотная последовательность константной области легкой цепи
mIgG1
<400>  63
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
1               5                   10                  15
Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe
20                  25                  30
Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg
35                  40                  45
Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50                  55                  60
Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu
65                  70                  75                  80
Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser
85                  90                  95
Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
100                 105
<210>  64
<211>  330
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  домен
<223>  аминокислотная последовательность константной области тяжелой цепи
mIgG2a
<400>  64
Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly
1               5                   10                  15
Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr
20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser
35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu
50                  55                  60
Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile
65                  70                  75                  80
Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys
85                  90                  95
Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys
100                 105                 110
Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
115                 120                 125
Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys
130                 135                 140
Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp
145                 150                 155                 160
Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg
165                 170                 175
Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln
180                 185                 190
His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn
195                 200                 205
Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly
210                 215                 220
Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu
225                 230                 235                 240
Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met
245                 250                 255
Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu
260                 265                 270
Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe
275                 280                 285
Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn
290                 295                 300
Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr
305                 310                 315                 320
Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys
325                 330
<210>  65
<211>  107
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  домен
<223>  аминокислотная последовательность константной области легкой цепи
mIgG2a
<400>  65
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
1               5                   10                  15
Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe
20                  25                  30
Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg
35                  40                  45
Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50                  55                  60
Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu
65                  70                  75                  80
Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser
85                  90                  95
Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
100                 105
<210>  66
<211>  120
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  домен
<223>  HAB-2401 с привитой вариабельной областью тяжёлой цепи
<400>  66
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Asn Thr
20                  25                  30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Arg Ile Asp Pro Thr Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ala Pro Lys Phe
50                  55                  60
Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Thr Arg Val Tyr Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Asn Tyr Trp Gly Lys
100                 105                 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210> 67
<211>  113
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  домен
<223>  HAB-2401 с привитой вариабельной областью легкой цепи
<400> 67
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20                  25                  30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35                  40                  45
Val Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50                  55                  60
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65                  70                  75                  80
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn
85                  90                  95
Asp Tyr Asn Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
100                 105                 110
Lys
<210> 68
<211>  121
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  домен
<223>  HAB-3601 с привитой вариабельной областью тяжёлой цепи
<400>  68
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Phe
20                  25                  30
Gly Met Gly Val Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35                  40                  45
Trp Val Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ala
50                  55                  60
Leu Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu
65                  70                  75                  80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85                  90                  95
Cys Ala Arg Arg Pro Leu Gly Ser Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
100                 105                 110
Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  69
<211>  112
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  домен
<223>  HAB-3601 с привитой вариабельной областью легкой цепи
<400> 69
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
35                  40                  45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65                  70                  75                  80
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85                  90                  95
Ser Arg Val Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105                 110
<210>  70
<211>  122
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  домен
<223>  HAB-5101 с привитой вариабельной областью тяжёлой цепи
<400>  70
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20                  25                  30
Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35                  40                  45
Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Val Ser Leu Tyr Asn Pro Ser
50                  55                  60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65                  70                  75                  80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85                  90                  95
Cys Ala Arg Arg Arg Ile Ile Thr Val Val Asp Ala Met Asp Tyr Trp
100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  71
<211>  112
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  домен
<223>  HAB-5101 с привитой вариабельной областью легкой цепи
<400>  71
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Cys Gln Gly
85                  90                  95
Ser Arg Val Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105                 110
<210>  72
<211>  124
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  домен
<223>  HAB-9001 с привитой вариабельной областью тяжёлой цепи
<400>  72
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Phe
20                  25                  30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35                  40                  45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ala
50                  55                  60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65                  70                  75                  80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85                  90                  95
Cys Ala Arg Arg Gly Phe His Leu Gly Ser Arg Gly Asp Tyr Phe Asp
100                 105                 110
His Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  73
<211>  112
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  домен
<223>  HAB-9001 с привитой вариабельной областью легкой цепи
<400>  73
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85                  90                  95
Ser Arg Val Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105                 110
<---