СПОСОБ НЕМЕДИКАМЕНТОЗНОГО СНИЖЕНИЯ ГИПЕРХОЛЕСТЕРИНЕМИИ
METHOD OF NONMEDICAMENTOUS REDUCTION OF HYPERCHOLESTEROLEMIA

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается использования медицинских ксилотрофных грибов класса Basidiomycetes, а именно использования биомассы грибов отдельных родов и определенных видов из этих родов, полученной глубинным культивированием, в составе пищевого рациона для снижения уровня общего холестерина и триглицеридов в сыворотке крови и общего холестерина в печени при гиперхолестеринемии.
Известны способы снижения гиперхолестеринемии путем использования базидиальных макромицетов разных видов из рода Pleurotus, Nina Gunde-Cimerman. Medicinal Value of the Genus Pleurotus (Fr.) P.Karst (Agaricales s.1., Basidiomycetes) // International Journal of Medicinal Mushrooms: 1999. Vol.1 / pp.69-71; US №6372964, 435/171, 424/195.15, 435/254.1, 435/256.8, 2002.04.16.
Известны способы снижения гиперхолестеринемии путем использования базидиальных макромицетов вида Lentinus edodes, вида Volvariella volvacea, вида Agrocybe aegerita, вида Tremella fuciformis, Solomon P.Wasser and Alexander L.Weis. Medicinal Properties of Substances Occurring in Higher Basidiomycetes Mushrooms: Current Perspectives (Review) // International Journal of Medicinal Mushrooms: 1999. Vol.1 / pp.34-35.
В известных способах для снижения гиперхолестеринемии используют базидиальные макромицеты разных видов из рода Pleurotus, базидиальные макромицеты вида Lentinus edodes, вида Vohariella volvacea, вида Agrocybe aegerita, вида Tremella fuciformis.
Известно использование культур грибов из рода Trametes в качестве продуцентов биомассы и фермента лакказы, E.S.Gorshina, Prospects of submerged Cultivation of Fungi of Trametes Fr. Genus in Industry. // XV Congress of European Mycologists (XV ТЕМ). Abstracts. SPb, 2007.
Известны способы получения глубинного мицелия гриба рода Trametes (син.Coriolus), SU №718018 A3, C12K 1/00, C12D 13/04, 1980.02.25; SU №1090261 A3, C12N 1/00, C12R 1/645, 1984.04.30; SU №1403990 A3, C08B 37/00, 1988.06.15.
Известна противоопухолевая и гипогликемическая композиция на основе активных ингредиентов из Basidiomycotina, обнаруженных в том числе в культуре грибов Trametes (син.Coriolus) versicotor, RU №2274465 C2, A61K 36/07, A61K 36/25, 2006.04.20.
Известен способ снижения холестерина, заключающийся в использовании грибов класса Basidiomycetes рода Trametes, Solomon P.Wasser and Alexander L.Weis. Medicinal Properties of Substances Occurring in Higher Basidiomycetes Mushrooms: Current Perspectives (Review) // International Journal of Medicinal Mushrooms: 1999. Vol.1/P.50.
Известно использование Trametes hirsuta (Wulfen: Fr.) Pilát в Восточно-азиатских странах в качестве народного средства для снижения жара и испарины, а также успокоения кашля при легочных заболеваниях, для ускорения регенерации мышечной ткани, для ингибирования роста опухолей, Ch. Hobbs. Medicinal mushrooms. Third edition, 1996, Interweave Press, Inc., P.198; Н.П.Денисова. Лечебные свойства грибов. 1998, Изд-во СПбГМУ, Санкт-Петербург, с.15.
В известных грибах видов Trametes hirsuta и Trametes ochracea свойств снижения гиперхолестеринемии не обнаружено.
Известна возможность использования с медицинской целью базидиальных грибов рода Panus, снижающих агрегацию тромбоцитов, Lorenzen К., Anke Т. et al., 1994 - Two inhibitors of platelet aggregation from a Panus species (Basidiomycetes). // Zeitschrift fur Naturforschung 49C: 132-138.
Известен способ получения белковой биомассы гриба путем использования грибов класса Basidiomycetes рода Panus, RU №2186851 С2, C12P 21/00, C12N 1/14, 2002.08.10.
Известны способы получения кормового продукта путем использования штаммов грибов Panus tigrinus, SU №1622388 A1, C12N 1/14, 1991.01.23; RU №2196438 C1, C12N 1/14, 2003.01.20.
В известных грибах вида Panus conchatus снижающего гиперхолестеринемию эффекта не обнаружено.
Известно, что при использовании биомассы грибов вида Cerrena unicolor (Bull.) Murrill (per os) снижается уровень глюкозы в сыворотке крови животных с индуцированным диабетом, М. Yamac, M. Zeytinoglu, G. Kanbak, G. Bayramoglu, H. Senturk, Antidiabetic activities of crude exopolysaccharides produced by three mushroom isolates in streptozotocin (STZ) - induced diabetic rats // XV Congress of European Mycologists (XV ТЕМ). Abstracts. SPb, 2007.
Известно наличие ферментов фибринолитического и тромболитического действия в культуре Cerrena unicolor, Nina P.Denisova, Vladimir N. Mikhailov, and Nickolay N. Petrishchev, Thrombolytic Activity of Proteineses from Coprinus domesticus, C. cinereus, and Cerrena unicolor. // Int. Journal of Medicinal Mushrooms, 1999, Vol.1, pp.187-190; SU №1459232 A, C12R 1/645, 1989.
В известном виде Cerrena unicolor эффекта снижения гиперхолестеринемии не обнаружено.
Известно использование в народной медицине гриба Flammulina velutipes (Fr.) P.Karst. при заболеваниях печени, язвах кишечно-желудочного тракта, С.Hobbs. Medicinal mushrooms. Third edition, 1996, Interweave Press, Inc., P.177; Н.П.Денисова. Лечебные свойства грибов. 1998, Изд-во СПбГМУ, Санкт-Петербург, с.15-16.
Известна противоопухолевая активность гриба Flammulina velutipes, T. Ikekava. Beneficial effect of edible and medicinal mushrooms on health care. Int. Journal of Medicinal Mushrooms, 2001, Vol.3, pp.291-298.
Известны гиполипидемические свойства гриба Flammulina velutipes, O.V.Remesova, N.P.Denisova. The action of higher basidiomycetes mushrooms mycelia on plasma lipids and lipoproteins of hyperlipidemic rats and Guinea pigs. Int. Journal of Medicinal Mushrooms, 1999, Vol.1, pp.331-336.
Известны антиаллергенные свойства гриба Flammulina velutipes, M. Sano, К. Yoshino, Т. Matsuzava, T. Ikekava. Inhybitory effect of edible higher basidiomycetes mushroom extracts on mouse type IV allergy. Int. Journal of Medicinal Mushrooms, 2002, Vol.4, pp.37-41.
Известны антиоксидантные свойства гриба Flammulina velutipes (S.M.Badalyan. Antioxidant activity of culinary-medicinal mushroom Flammulina velutipes, W. Curt.: Fr) P. Karst. (Agaricomycetideae). Int. Journal of Medicinal Mushrooms, 2003, Vol.5, pp.277-286.
Известны фибринолитические и тромболитические свойства культур базидиальных грибов, в том числе вида Flammulina velutipes, Н.П.Денисова, И.А.Алехина, Фибринолитическая активность культур базидиальных грибов //Микология и фитопатология, 1987, т.21, с.471-477; Н.П.Денисова, Протеолитические ферменты базидиальных грибов, таксономические и экологические аспекты их изучения. Автореферат дисс.…д.б.н., Ленинград, 1991, 31 с.
Известные гиполипидемические свойства известного гриба Flammulina velutipes подтверждены конкретными примерами, но выполнение которых является малоэкономичными.
Известны медицинские грибы Ganoderma lucidum (W.Curt.: Fr.) P.Karst, считающиеся в народной медицине Востока панацеей от разнообразных недугов, Terry Willard, Kenneth Jones, Reishi Mushroom, Herb of Spiritual Potency and Medical Wonder, Sylvan Press, 1990, 167 р.; Ch. Hobbs. Medicinal mushrooms. Third edition, 1996, Interweave Press, Inc., pp.96-107; Н.П. Денисова. Лечебные свойства грибов. 1998, Изд-во СПбГМУ, Санкт-Петербург, с.10-12, 16, 23-24, 34-35.
Известно использование медицинского гриба Ganoderma lucidum, обладающего гипотензивным действием при лечении сердечно-сосудистых заболеваний, Terry Willard, Kenneth Jones, Reishi Mushroom, Herb of Spiritual Potency and Medical Wonder, Sylvan Press, 1990, p.55, 57, 85; Yibuai Gao, Guoliang Chen et al., A Phase I/II Study of Ling Zhi Mushroom Ganoderma lucidum (W.Curt.: Fr.) Lloyd (Aphyllophoromycetideae) Exstract in Patient with Coronary Heart Gisease.// Int. Journal of Medicinal Mushrooms, 2004, Vol.6, pp.327-334; Solomon P.Wasser, I.V. Zmitrovich et al., in: Morphological Traits of Ganoderma lucidum Complex Highlighting G. tsugae var. jannieae: The Current Generalization, Ruggel, 2006, pp.149-150.
Известна противоопухолевая активность гриба Ganoderma lucidum при онкозаболеваниях различной локализации, Yibuai Gao, Wenbo Tank et al., Chemopreventive and Tumoricidal Properties of Ling Zhi Mushroom Ganoderma lucidum (W.Curt.: Fr.) Lloyd (Aphyllophoromycetideae). Part I. Preclinical and Clinical Studies.// Int. Journal of Medicinal Mushrooms, 2004, Vol.6, pp.95-106; Solomon P.Wasser, I.V. Zmitrovich et al., in: Morphological Traits of Ganoderma lucidum Complex Highlighting G. tsugae var. jannieae: The Current Generalization, Ruggel, 2006, pp.132-147; Alice W.Chen and John Seleen, Potential Benefits of Ling Zhi or Reishi Mushroom Ganoderma lucidum (W.Curt.: Fr.) Lloyd (Aphyllophoromycetideae) to Breast Cancer Patients, Int. Journal of Medicinal Mushrooms, 2007, Vol.9, pp.29-38; RU №2082755 C1, C12N 1/14, C12P 1/02, C12P 21/00, C12R 1/645, 1997.06.27.
Известен сочетанный гипотензивно-гиполипидемический эффект гриба Ganoderma lucidum при спонтанной гипертензии, Y. Kabir, S. Kimura, Т. Tamura. Dietary effect of Ganoderma lucidum mushroom on blood pressure and lipid levels in spontaneously hypertensive rats (SHR), J. Nutr. Sci. Vitaminol, 1988, Vol 34, pp.433-438.
Известен гипохолестерольный эффект питательной смеси соевых бобов с мицелием Ganoderma lucidum, Terry Willard, Kenneth Jones, In: Reishi Mushroom, Herb of Spiritual Potency and Medical Wonder, Sylvan Press, 1990, p.56; Solomon P.Wasser, I.V.Zmitrovich et al., In: Morphological Traits of Ganoderma lucidum Complex Highlighting G. tsugae var. jannieae: The Current Generalization, Ruggel, 2006, p.149.
Обнаруженный гипохолестерольный эффект известного гриба Ganoderma lucidum подтвержден индивидуальными вариантами использования мицелия Ganoderma lucidum в питательных смесях.
Известно медицинское использование ксилотрофных грибов класса Basidiomycetes, S.P.Wasser, A.L. Weis. Medicinal properties of substances occurring in higher basidiomycetes mushrooms: current perspectives (review)// Int. Journal of Medicinal Mushrooms, 1999, Vol.1, pp.31-62).
Известный медицинский гриб Ganoderma lucidum обладает антифунгальной, антибактериальной, противовоспалительной, антивирусной, гипотензивной, иммуномодулирующей, гепатопротекторной активностью, известный медицинский гриб Flammulina velutipes, кроме выше перечисленного, обладает противоопухолевой активностью, гриб Trametes versicolor также обладает противоопухолевой активностью.
Известно использование биомассы медицинского ксилотрофного гриба Ganoderma lucidum для снижения гиперхолестеринемии, Материалы конгресса «Успехи Медицинской Микологии», Москва 20-21 февраля 2003, т.1, с.234-235.
Данное техническое решение принято в качестве «ближайшего аналога» настоящего изобретения.
В «ближайшем аналоге» возможность снижения уровня гиперхолестеринемии при использовании в эксперименте в составе пищевого рациона биомассы медицинского ксилотрофного гриба Ganoderma lucidum косвенно подтверждена на интактной группе животных (на фоне нормального уровня холестерина), прямых данных об абсолютных изменениях уровня холестерина в сыворотке крови и ткани печени у этих животных в «ближайшем аналоге» не приведены, данные о количестве внесения биомассы в состав пищевого рациона в нем отсутствуют.
В основу настоящего изобретения положено решение задачи, позволяющей выявить из медицинских ксилотрофных грибов штаммы, снижающие уровень гиперхолестеринемии, и расширить возможность осуществления способа.
Технический результат настоящего изобретения заключается в использовании биомассы при минимальном количестве 2% от пищевого рациона, как продукта глубинного культивирования медицинских ксилотрофных грибов Trametes hirsuta ТИ-14 или Trametes ochracea ТИ-15, или Panus conchatus ТИ-16, или Cerrena unicolor ТИ-9, или Flammulina velutipes ТИ-3, или Ganoderma lucidum ТИ-7.
Согласно изобретению эта задача решается за счет того, что способ немедикаментозного снижения гиперхолестеринемии предусматривает использование продуктов глубинного культивирования медицинского ксилотрофного гриба Ganoderma lucidum в виде биомассы, вводимой в состав пищевого рациона.
Используют продукты глубинного культивирования медицинских ксилотрофных грибов Trametes hirsuta ТИ-14 или Trametes ochracea ТИ-15, или Panus conchatus ТИ-16, или Cerrena unicolor ТИ-9, или Flammulina velutipes ТИ-3. Из вида Ganoderma lucidum используют штамм Ganoderma lucidum ТИ-7. Из продуктов глубинного культивирования этих медицинских ксилотрофных грибов используют биомассы при минимальном количестве 2% от пищевого рациона. Штаммы Flammulina velutipes ТИ-3, Ganoderma lucidum ТИ-7, Cerrena unicolor ТИ-9, Trametes hirsuta ТИ-14, Trametes ochracea ТИ-15, Panus conchatus ТИ-16 взяты из Коллекции культур высших базидиомицетов кафедры технологии микробиологического синтеза Санкт-Петербургского государственного технического университета.
Заявителями не выявлены источники, содержащие информацию о технических решениях, идентичных настоящему изобретению, что позволяет сделать вывод о его соответствии критерию «новизна».
За счет реализации отличительных признаков изобретения (в совокупности с признаками, указанными в ограничительной части формулы) достигаются важные новые свойства объекта.
Выявлены штаммы медицинских ксилотрофных грибов из коллекции культур высших базидиомицетов кафедры технологии микробиологического синтеза Санкт-Петербургского государственного технического университета, снижающие уровень гиперхолестеринемии:
- Flammulina velutipes ТИ-3,
- Ganoderma lucidum ТИ-7,
- Cerrena unicolor ТИ-9,
- Trametes hirsuta ТИ-14,
- Trametes ochracea ТИ-15,
- Panus conchatus ТИ-16.
Использование биомассы, при минимальном количестве 2% от пищевого рациона, предложенных штаммов медицинских ксилотрофных грибов существенно снижает уровень гиперхолестеринемии.
Внесение биомассы штамма Ganoderma lucidum ТИ-7 («ближайшего аналога») при минимальном количестве 2% от пищевого рациона дополняет возможность осуществления способа.
Использование биомассы штаммов Flammulina velutipes ТИ-3 или Ganoderma lucidum ТИ-7, или Cerrena unicolor ТИ-9, или Trametes hirsuta ТИ-14, или Trametes ochracea ТИ-15, или Panus conchatus ТИ-16 расширяет возможность осуществления способа.
Заявителям не известны какие-либо публикации, которые содержали бы сведения о влиянии отличительных признаков изобретения на достигаемый технический результат. В связи с этим, по мнению заявителей, можно сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию «изобретательский уровень».
Способ осуществляют следующим образом.
Для немедикаментозного снижения гиперхолестеринемии используют штаммы Flammulina velutipes ТИ-3, Ganoderma lucidum ТИ-7, Cerrena unicolor ТИ-9, Trametes hirsuta ТИ-14, Trametes ochracea ТИ-15, Panus conchatus ТИ-16 из коллекции культур высших базидиомицетов кафедры технологии микробиологического синтеза Санкт-Петербургского государственного технического университета.
Биомассу одного из перечисленных штаммов медицинских ксилотрофных грибов вносят в состав пищевого рациона при минимальном количестве 2% от пищевого рациона.
Базидиальные грибы рода Trametes являются дереворазрушающими грибами, в природе обитают на древесине различных пород деревьев, активно разрушая ее. Грибы этой трофической группы (ксилотрофы, лигнотрофы) быстрее адаптируются к искусственным условиям культивирования, чем другие сапротрофные группы (подстилочные, напочвенные и др.). Они могут активно развиваться на питательных средах с использованием более широкого спектра источников азота и углерода на фоне минеральных солей.
Культура Trametes hirsuta выделена из плодовых тел дереворазрушающего гриба Trametes hirsuta (Pers.) Gilb. et Rivarden., собранного в северовосточной пригородной лесной зоне Санкт-Петербурга. Плодовые тела (син. базидиомы) собраны, охарактеризованы и индуцированы в чистую культуру авторами.
Культура Trametes ochracea выделена из плодовых тел дереворазрушающего гриба Trametes ochracea (Pers.) Gilb. et Rivarden., собранного в северо-восточной пригородной лесной зоне Санкт-Петербурга. Плодовые тела собраны, охарактеризованы и индуцированы в чистую культуру авторами.
Базидиальные грибы рода Panus являются сапротрофами, обитающими на древесине лиственных и хвойных пород, в природе вызывают так называемую белую гниль древесины. В Ленинградской области грибов из рода Panus насчитывается всего четыре вида (И.В.Змитрович, В.Ф.Малышева, Е.Ф.Малышева, В.А.Спирин. Плевротоидные грибы Ленинградской области. 2004, 123 с.).
Культура Panus conchatus выделена из плодовых тел дереворазрушающего гриба Panus conchatus (Bull.: Fr.) Fr. (Панус раковинообразный), собранных в северо-восточной пригородной лесной зоне Санкт-Петербурга. Плодовые тела Panus conchatus съедобны. Они собраны, охарактеризованы и индуцированы в чистую культуру авторами.
Базидиальные грибы рода Cerrena также являются дереворазрушающими базидиомицетами, как и указанные выше виды из родов Trametes и Panus и также широко распространены в лесных массивах различных географических районов.
Культура Cerrena unicolor выделена из плодовых тел ксилотрофного гриба Cerrena unicolor (Fr.) Murr., собранных в Пискаревском лесопарке г.С.-Петербурга. Грибы этого вида обитают на валеже лиственных пород, являются активными биодеструктарами, вызывая белую гниль древесины, выделены в чистую культуру авторами.
Базидиальные грибы рода Ganoderma являются в настоящее время наиболее активно изучаемой группой дереворазрушающих грибов, не только в плане биотехнологического использования, но и в плане ревизии их номенклатурного статуса. Особенно это касается вида Ganoderma lucidum, который по современным представлениям является сложным видовым комплексом. На территории России встречается реже, чем другие виды этого рода.
Базидиальные грибы рода Flammulina по экологической принадлежности также относятся к активным разрушителям древесины в природе, как и все указанные выше виды ксилотрофных макромицетов. По морфологическим характеристикам они принадлежат к агариковым пластинчатым грибам и при этом являются малоизвестными съедобными грибами. Широко распространены по всей территории России, растут на древесине различных лиственных пород, особенно часто на осине, тополе и ивовых. Появляются поздней осенью, ближе к зиме.
Культура Flammulina velutipes изолирована из шляпки пластинчатого съедобного гриба Flammulina velutipes (Fr.) P.Karst. (Фламмулина бархатистоножковая), собранного в Токсовском лесопарке г.Санкт-Петербурга. Характерной особенностью этого вида является морозоустойчивость, его плодовые тела выдерживают морозы до -18°С, за что в народе разных стран имеет название «зимний гриб» или «зимний опенок». Вид Flammulina velutipes является продуктом коммерческого грибоводства с торговой маркой «яп. Enoki-take». Плодовые тела зимнего опенка собраны и индуцированы в чистую культуру авторами.
Культура Ganoderma lucidum (ближайшего аналога) получена из плодовых тел гриба Ganoderma lucidum (Leyss.:Fr.) P.Karst., трутовика лакированного или блестящего. Этот трутовик обитает преимущественно у основания живых лиственных пород деревьев, особенно кленов, а также на пнях. Является предметом коммерческого грибоводства в странах Восточного региона, продается в супермаркетах стран Европы и Америки. Плодовые тела пользуется большой популярностью в качестве лечебно-профилактического средства. Культура из плодовых тел Ganoderma lucidum выделена авторами.
Для осуществления способа используют культуры указанных видов грибов из коллекции культур высших базидиомицетов кафедры технологии микробиологического синтеза Санкт-Петербургского государственного технологического института (технического университета) - Trametes hirsuta ТИ-14, Trametes ochracea ТИ-15, Panus conchatus ТИ-16, Cerrena unicolor ТИ- 9, Flammulina velutipes ТИ-3, Ganoderma lucidum (ближайшего аналога) ТИ-7.
Примечание
Для осуществления способа могут быть использованы и другие исследованные штаммы этих видов из указанной коллекции.
В коллекции штаммы Flammulina velutipes ТИ-3, Ganoderma lucidum ТИ-7, Cerrena unicolor ТИ-9, Trametes hirsuta ТИ-14, Trametes ochracea ТИ-15, Panus conchatus ТИ-16 поддерживают на косяках сусло-агара (пивное сусло 4° по Баллингу, агар 20%) и хранят в рефрижераторе при +4°±2°С.
Получают биомассу при глубинном культивировании каждого из штаммов Flammulina velutipes ТИ-3, Ganoderma lucidum ТИ-7, Cerrena unicolor ТИ-9, Trametes hirsuta ТИ-14, Trametes ochracea ТИ-15, Panus conchatus ТИ-16.
2
4
2
4
4
4
2
4
2
4
2
5
Предварительно готовят посевной материал, выращивая каждый штамм в стационарных условиях на жидкой питательной среде следующего состава (г/л): глюкоза - 20; пептон - 4; KHPO - 0.6; КHPO - 0.4; MgSO - 0,5; ZnSO·7HO - 0,001; FeSO·7HO - 0,005; MnSO - 0,003; CaCl - 0,05; кукурузный экстракт - 1,0 (по сухому весу); рН среды до стерилизации 5,8-6,0. Стерилизацию среды проводят при 0.5*10 Па в течение 30 минут.
Посевной материал каждого штамма выращивают в течение 7-10 дней при 25-28°С, диспергируют и используют в качестве инокулюма для получения биомассы.
Глубинное культивирование каждого из штаммов проводят в колбах Эрленмейера объемом 750 мл, содержащих 100 мл глюкозо-пептонной среды указанного состава и суспензию посевного материала в количестве 10% от объема среды. Культивирование проводят на роторной качалке при 120-160 об/мин в течение 7 суток при 25-28°С. Указанный температурный интервал является оптимальным для активного роста используемых культуры.
Выросшую при глубинном культивировании биомассу каждого из штаммов отделяют от нативного раствора, сушат при температуре 40-50°С и измельчают в порошок.
Примечание
1. Глубинное культивирование штаммов аналогичным способом можно проводить и на натуральной среде, в состав которой входят пивное сусло (4° по Баллингу) и соевая мука (1%), рН среды 5.8-6.0.
2. Для глубинного культивирования могут быть использованы и другие известные питательные среды.
Достоверное снижение уровня гиперхолестеринемии подтверждено в эксперименте.
Эксперимент проведен на белых беспородных крысах-самцах массой 140-160 г, полученных из питомника «Рапполово РАМ» г.Санкт-Петербурга.
Модель гиперхолестеринемии белых беспородных крыс-самцов выбрана на основании опыта Института Экспериментальной Медицины РАМН (г.С.-Петербург) и зарубежных работ (Климов А.Н., Рыженков В.Е. Экспериментальное изучение гиполипидемических и антиатеросклеротических средств. Методические рекомендации. М., 1988, 18 с.; Staprans I., Rapp J.H., Pan X-M. et al., Oxidized lipids in the diet accelerate the development of fatty streaks in cholesterol-fed rabbits, Arterioscl.Thromb.Vasc.BioL, 1996, v. 16, N 4, 533-538).
Экспериментально индуцированную гиперхолестеринемию создавали у белых беспородных крыс-самцов (животных) путем использования в качестве их ежедневного пищевого рациона специального гиперлипидемического корма в течение трех недель (21 день).
Гиперлипидемический корм в качестве основы включал овсяные хлопья, в качестве атерогенных компонентов - сухой кристаллический холестерин - 5%, свиной жир - 25%, подсолнечное масло - 18%, витамин D (эргокальциферол) - 200 тыс. МЕ/сутки.
Животные были разделены на несколько групп.
Интактная группа (12 животных) получала стандартный сухой корм и водопроводную воду ad libitum.
Контрольная группа (7 животных) получала гиперлипидемический корм и воду.
Животные опытных групп (по 7 животных в каждой) наряду с гиперлипидемическим кормом получали добавку в виде сухой биомассы предложенных грибов.
Пример 1
Животные опытной группы №1 получали гиперлипидемический корм плюс добавка в виде сухой биомассы штамма Trametes hirsuta ТИ-14 в количестве 2% от пищевого рациона в течение 21 дня.
Внесение сухой биомассы штамма Trametes hirsuta ТИ-14 при минимальном количестве 2% от пищевого рациона является оптимальным.
Пример 2
Животные опытной группы №2 получали гиперлипидемический корм плюс добавка в виде сухой биомассы штамма Trametes ochracea ТИ-15 в количестве 2% от пищевого рациона в течение 21 дня.
Внесение сухой биомассы штамма Trametes ochracea ТИ-15 при минимальном количестве 2% от пищевого рациона является оптимальным.
Пример 3
Животные опытной группы №3 получали гиперлипидемический корм плюс добавка в виде сухой биомассы штамма Panus conchatus ТИ-16 в количестве 2% от пищевого рациона в течение 21 дня.
Внесение сухой биомассы штамма Panus conchatus ТИ-16 при минимальном количестве 2% от пищевого рациона является оптимальным.
Пример 4
Животные опытной группы №4 получали гиперлипидемический корм плюс добавка в виде сухой биомассы штамма Cerrena unicolor ТИ-9 в количестве 2% от пищевого рациона в течение 21 дня.
Внесение сухой биомассы штамма Cerrena unicolor ТИ-9 при минимальном количестве 2% от пищевого рациона является оптимальным.
Пример 5
Животные опытной группы №5 получали гиперлипидемический корм плюс добавка в виде сухой биомассы штамма Flammulina velutipes ТИ-3 в количестве 2% от пищевого рациона в течение 21 дня.
Внесение сухой биомассы штамма Flammulina velutipes ТИ-3 при минимальном количестве 2% от пищевого рациона является оптимальным.
Пример 6
Животные опытной группы №6 получали гиперлипидемический корм плюс добавка в виде сухой биомассы штамма Ganoderma lucidum ТИ-7 («ближайшего аналога») в количестве 2% от пищевого рациона в течение 21 дня.
Внесение сухой биомассы штамма Ganoderma lucidum ТИ-7 («ближайшего аналога») при минимальном количестве 2% от пищевого рациона является оптимальным.
Для осуществления способа, согласно примерам 1, 2, 3, 4, 5 и 6, у животных определяли общий холестерин и триглицериды в сыворотке крови и общий холестерин в печени.
По истечении 21 дня у животных, предварительно наркотизированных уретаном, проводили забор крови и ткани печени.
Содержание общего холестерина определяли с помощью набора «Ольвекс диагностикум» (Санкт-Петербург, Россия).
Метод основан на сочетании ферментативной реакции с реакцией окисления. Образующаяся в результате этих реакций перекись водорода взаимодействует под действием пероксидазы с 4-аминофеназоном и фенолом с образованием окрашенного продукта - хинонимина.
Определение триглицеридов проводили в сыворотке крови с применением энзиматического колориметрирического метода с использованием набора реагентов для определения триглицеридов в сыворотке или цельной крови человека «ВИТАЛ ДИАГНОСТИКС» (Санкт-Петербург, Россия).
Содержание общего холестерина и триглицеридов в сыворотке крови и общего холестерина в печени у животных интактной группы, контрольной группы и опытных групп №1, №2 и №3 представлены в таблице 1.
Содержание общего холестерина и триглицеридов в сыворотке крови и общего холестерина в печени у животных интактной группы, контрольной группы и опытных групп №4, №5 и №6 представлены в таблице 2.
Из таблицы 1 «Снижение уровня индуцированной гиперхолестеринемии у белых беспородных крыс-самцов под влиянием добавок в виде биомассы штаммов Trametes hirsuta ТИ-14, Trametes ochracea ТИ-15 и Panus conchatus ТИ-16 в пищевой рацион» и из таблицы 2 «Снижение уровня индуцированной гиперхолестеринемии у белых беспородных крыс-самцов под влиянием добавок в виде биомассы штаммов Cerrena unicolor ТИ-9, Flammulina velutipes ТИ-3 и Ganoderma lucidum ТИ-7 («ближайшего аналога») в пищевой рацион» видно следующее.
У животных контрольной группы (гиперлипидемический корм) по сравнению с интактной группой (таблицы 1 и 2):
- концентрация общего холестерина в сыворотке крови увеличилась на 77%;
- содержание триглицеридов в сыворотке крови увеличилось на 130%;
- концентрация общего холестерина в печени повысилась на 33%.
У животных опытной группы №1 (гиперлипидемический корм плюс биомасса штамма Trametes hirsuta ТИ-14) по сравнению с контрольной группой (таблица 1):
- концентрация общего холестерина в сыворотке крови снизилась на 20%;
- содержание триглицеридов в сыворотке крови снизилось на 18%;
- концентрация общего холестерина в печени снизилась на 50%.
У животных опытной группы №2 (гиперлипидемический корм плюс биомасса штамма Trametes ochracea ТИ-15) по сравнению с контрольной группой (таблица 1):
- концентрация общего холестерина в сыворотке крови снизилась на 20%;
- содержание триглицеридов в сыворотке крови снизилось на 53%;
- концентрация общего холестерина в печени снизилась на 58%.
У животных опытной группы №3 (гиперлипидемический корм плюс биомасса штамма Panus conchatus ТИ-16) по сравнению с контрольной группой (таблица 1):
- концентрация общего холестерина в сыворотке крови снизилась на 17%;
- содержание триглицеридов в сыворотке крови снизилось на 20%;
- концентрация общего холестерина в печени снизилась на 45%.
У животных опытной группы №4 (гиперлипидемический корм плюс биомасса штамма Cerrena unicolor ТИ-9) по сравнению с контрольной группой (таблица 2):
- концентрация общего холестерина в сыворотке крови снизилась на 22%;
- содержание триглицеридов в сыворотке крови снизилось на 14%;
- концентрация общего холестерина в печени снизилась на 46%.
У животных опытной группы №5 (гиперлипидемический корм плюс биомасса штамма Flammulina velutipes ТИ-3) по сравнению с контрольной группой (таблица 2):
- концентрация общего холестерина в сыворотке крови снизилась на 16%;
- содержание триглицеридов в сыворотке крови снизилось на 33%;
- концентрация общего холестерина в печени снизилась на 46%.
У животных опытной группы №6 (гиперлипидемический корм плюс биомасса штамма Ganoderma lucidum ТИ-7 («ближайшего аналога») по сравнению с контрольной группой (таблица 2):
- концентрация общего холестерина в сыворотке крови снизилась на 18%;
- содержание триглицеридов в сыворотке крови снизилось на 32%;
- концентрация общего холестерина в печени снизилась на 19%.
Таким образом, снижение общего холестерина в сыворотке крови во всех опытных группах было сходным и в среднем колебалось в пределах 18-20%.
Наибольшее снижение содержания триглицеридов в сыворотке крови (53%) наблюдалось под влиянием добавки биомассы штамма Trametes ochracea ТИ-15 (опытная группа №2), наименьшее (14%) - при добавке биомассы штамма Cerrena unicolor ТИ-9 (опытная группа №4).
Существенное снижение уровня общего холестерина в печени наблюдалось практически во всех опытных группах (№3, №5, №4, №1, №2) - на 45%, 46%, 46%, 50% и 58% соответственно. В опытной группе №6 (гиперлипидемический корм плюс биомасса штамма Ganoderma lucidum ТИ-7 (ближайшего аналога) уровень общего холестерина снизился на 19%.
Таким образом, внесение в гиперлипидемический корм животных в каждой из групп №1, 2, 3, 4 и 5 соответствующих добавок в виде биомассы штаммов Trametes hirsuta ТИ-14, Trametes ochracea ТИ-15, Panus conchatus ТИ-16, Cerrena unicolor ТИ-9 и Flammulina velutipes ТИ-3 снижает уровень общего холестерина и триглицеридов в сыворотке крови и значительно снижает уровень общего холестерина в печени, что доказывает существенное снижение гиперхолестеринемии.
Внесение сухой биомассы штамма Ganoderma lucidum ТИ-7 («ближайшего аналога», пример №6) при минимальном количестве 2% от пищевого рациона снижает уровень общего холестерина и триглицеридов в сыворотке крови и холестерина в печени.
Предложенный способ немедикаментозного снижения гиперхолестеринемии, относящийся к микробиологической промышленности, включающий использование штаммов Flammulina velutipes ТИ-3, Ganoderma lucidum ТИ-7, Cerrena unicolor ТИ-9, Trametes hirsuta ТИ-14, Trametes ochracea ТИ-15, Panus conchatus ТИ-16 из коллекции культур высших базидиомицетов кафедры технологии микробиологического синтеза Санкт-Петербургского государственного технического университета, и подтверждающий снижение гиперхолестеринемии по результатам экспериментальных исследований, проведенных в Санкт-Петербургском государственном медицинском университете им. акад. И.П. Павлова, обусловливает, по мнению заявителей, соответствие его критерию «промышленная применимость».
Использование предложенного способа позволяет:
- использовать штаммы Flammulina velutipes ТИ-3, Cerrena unicolor ТИ-9, Trametes hirsuta ТИ-14, Trametes ochracea ТИ-15, Panus conchatus ТИ-16 для снижения уровня гиперхолестеринемии,
- вносить биомассу любого штамма Flammulina velutipes ТИ-3, Ganoderma lucidum ТИ-7, Cerrena unicolor ТИ-9, Trametes hirsuta ТИ-14, Trametes ochracea ТИ-15, Panus conchatus ТИ-16 в состав пищевого рациона при минимальном количестве 2% от пищевого рациона для снижения уровня холестерина и триглицеридов в крови и для снижения уровня холестерина в печени,
- расширить возможности осуществления способа за счет использования биомассы штаммов Flammulina velutipes ТИ-3 или Ganoderma lucidum ТИ-7, или Cerrena unicolor ТИ-9, или Trametes hirsuta ТИ-14, или Trametes ochracea ТИ-15, или Panus conchatus ТИ-16.
Таблица 1
Снижение уровня индуцированной гиперхолестеринемии у белых беспородных крыс-самцов под влиянием добавок в виде биомассы штаммов Trametes hirsuta ТИ-14, Trametes ochracea ТИ-15 и Panus conchatus ТИ-16 в пищевой рацион
Интактная группа (стандартный корм)
Контрольная группа (гиперлипидемический корм)
Опытная группа №1 (гипер. корм + биомасса) Trametes hirsuta ТИ-14
Опытная группа №2 (гипер. корм + биомасса) Trametes ochracea ТИ-15
Опытная группа №3 (гипер. корм + биомасса) Panus conchatus ТИ-16
в сыворотке крови
Общий холестерин (ммоль/л)
1.72
3.05
2.45
2.43
2.55
По сравнению с интактной группой
-
+77%
+42%
+41%
+48%
По сравнению с контрольной группой
-
-
-20%
-20%
-17%
Триглицериды (ммоль/л)
0.7
1.61
1.32
0.76
1.29
По сравнению с интактной группой
-
+130%
+88%
+8%
+84%
По сравнению с контрольной группой
-
-
-18%
-53%
-20%
в печени
Общий холестерин (ммоль/л)
0.076
0.101
0.051
0.043
0.056
По сравнению с интактной группой
-
+35%
-32%
-44%
-26%
По сравнению с контрольной группой
-
-
-50%
-58%
-45%
Примечание:
достоверность экспериментальных результатов р<0.05
Таблица 2
Снижение уровня индуцированной гиперхолестеринемии у белых беспородных крыс-самцов под влиянием добавок в виде биомассы штаммов Cerrena unicolor ТИ-9, Flammulina velutipes ТИ-3 и Ganoderma lucidum ТИ-7 («ближайшего аналога») в пищевой рацион.
Интактная группа (стандартный корм)
Контрольн. группа (гиперлипидемический корм)
Опытная группа №4 (гипер. корм + биомасса) Cerrena unicolor ТИ-9
Опытная группа№6 (гипер. корм + биомасса) Ganoderma lucidum ТИ-7
Опытная группа №5 (гипер корм + биомасса) Flammulina velutipes ТИ-3
в сыворотке крови
Общий холестерин (ммоль/л)
1.72
3.05
2.37
2.51
2.57
По сравнению с интактной группой
-
+77%
+38%
+46%
+49%
По сравнению с контрольной группой
-
-
-22%
-18%
-16%
Триглицериды (ммоль/л)
0.7
1.61
1.38
1.1
1.08
По сравнению с интактной группой
-
+130%
+97%
+57%
+54%
По сравнению с контрольной группой
-
-
-14%
-32%
-33%
в печени
Общий холестерин (ммоль/л)
0.076
0.101
0.055
0.082
0.055
По сравнению с интактной группой
-
+35%
-27%
+9%
-27%
По сравнению с контрольной группой
-
-
-46%
-19%
-46%
Примечание:
достоверность экспериментальных результатов р<0.05