СПОСОБ ОЦЕНКИ ЛОКАЛЬНОГО ИММУННОГО ОТВЕТА ПОСЛЕ ВАКЦИНАЦИИ ПРОТИВ ЭЙМЕРИОЗА КУР
METHOD FOR EVALUATING A LOCAL IMMUNE RESPONSE AFTER CHICKEN EIMERIOSIS VACCINATION

Заявленное изобретение относится к области ветеринарной паразитологии в сфере птицеводства, а именно к способу оценки локального иммунного ответа после вакцинации против эймериоза кур путем оценки уровня секреции секреторного иммуноглобулина класса A (sIgA) в слизистой оболочке кишечника с помощью иммуногистохимического исследования (ИГХИ) срезов замороженного материала.
Для оценки иммунитета против эймериоза применяют методы, ориентированные на локальный иммунитет в кишечнике. Существуют следующие методы оценки локального иммунитета в кишечнике кур: сэндвич-вариант иммуноферментного анализа (ИФА) для определения количества цитокинов в слизистой кишечника кур [3]; полимеразно-цепная реакция (ПЦР) для оценки экспрессии различных цитокинов [1]; методпроточной цитометрии для количественной характеристики субпопуляции лимфоцитов [2]; ИФА для определения концентрации секреторного иммуноглобулина A(sIgA) [2]; иммуногистохимическое исследование (ИГХИ) для оценки секреции sIgA [4-6].
4
3
При ИГХИ кишечника кур зарубежные авторы опираются на разработанный в 2006 году способ, который описал Yurong Y. с соавторами [6]. Суть их способа заключается в следующем: в процессе вскрытия исследователи отобрали образцы двенадцатиперстной, тощей кишки и слепых отростков, которые затем переносили в 10% забуференный нейтральный формалин, ткань фиксировали не менее 24 часов. После чего  образцы кишечника выдерживали в 5 сменах этилового спирта и приступали к заливке в парафин. После изготовления парафиновых блоков, нарезали на микротоме срезы толщиной 5 микрон. Полученные срезы наклеивали на стекла, покрытые поли-L-лизином. Стекла со срезами выдерживали при температуре 37°С в течение не менее 12 часов. Затем депарафинировали стекла со срезами в 3 порциях раствора ксилола и 5 порциях этилового спирта в возрастающих концентрациях. Для удаления эндогенной пероксидазы на срезы наносили 0,3% раствор пероксидметанола и оставляли на 30 минут при комнатной температуре. Дальнейшие этапы проводились с использованием влажной камеры. Перед каждым новым этапом стекла промывали в 3 сменах фосфатно-солевого буфера (PBS, рН 7,4). В качестве блокирующего раствора использовали 20% козью сыворотку на 30 минут при температуре 37°С. Затем наносили первичные мышиные антикуриные моноклональные антитела (Southern Biotechnology, USA), разведенные в фосфатно-солевом буфере (PBS, рН 7,4) в соотношении 1:200. Полученный раствор оставляли на стеклах на 16 часов при температуре 4°С.После этого на срезы наносили вторичные антитела - антимышиные, конъюгированные пероксидазой хрена, разведенные PBS (рН 7,4) в соотношении 1:200 и инкубировали при температуре 37°С в течение 2 часов. Наносили свежий раствор 3,3'-диаминобензидин тетрахлоридаи выдерживали при комнатной температуре в течение 10 минут. Реакцию останавливали промыванием в дистиллированной воде. Срезы окрашивали гематоксилином Майера, после чего промывали в растворе (10 г MgS и 2 г NaHCO в 1 литре ультрачистой воды). Затем стекла полоскали в дистиллированной воде, дегидрировали, покрывали покровным стеклом при помощи монтирующей среды.
В России, для оценки локального иммунного ответа после вакцинации против эймериоза кур применяют полимеразную цепную реакцию ПЦР, иммуноферментный анализ.
Известна также другаяметодика, основанная на получении срезов с помощью замораживающего микротома и проведения ИГХИ, предложенная Mohammed А. в 2005 году [4] для исследования слизистой оболочки трахеи кур. Данная методика служила прототипом нашего изобретения. Ее суть заключается в следующем: замороженные при -34°С образцы трахеи были нарезаны на замораживающем криотоме толщиной 5 микрон. Срезы помещали на стекла с поли-L-лизиновым покрытием. На стекла наносили охлажденный ацетон на 10 минут, затем инкубировали при температуре -20°С до начала ИГХИ. Блокировку эндогенной пероксидазы проводили с помощью 0,03% раствора перекиси водорода в течение 2 минут. После этого наносили авидин-биотиновый блокирующий раствор (SP-2001) с 3% мышиной сывороткой. На стекла наносили антимышиные антитела (Southern Biotechnology, США) конъюгированные с биотином и разведенные 1:100 фосфатно-солевым буфером (PBS, рН 7,4). Инкубировали во влажной камере при температуре +37°С в течение 45-60 минут. После чего промывали стекла в PBS и затем наносили авидин-биотиновыйкомплекс (ABC-HRT) на 45 минут. Затем наносили хромоген пероксидазы диаминобензидин (ДАБ), промывали дистиллированной водой, дегидрировали, окрашивали гематоксилином и закрывали стекла при помощи монтирующей среды. Результат учитывали путем подсчета количества окрашенных клеток на сантиметр квадратный.
Однако данный метод имеет следующие недостатки: прямой метод ИГХ является менее чувствительным и точным, по сравнению с непрямым методом; система учета результатов не подходит для оценки нарастания общего пула sIgA в слизистой оболочке кишечника.
Заявленный способ отличается от вышеописанного тем, что проводят оценку локального иммунного ответа тонкого и толстого отделов кишечника, а не трахеи. Кроме того, в заявленном способе ИГХИ проводили непрямым методом. Дополнительно разработали подробную бальную систему для
оценки локального иммунного ответа в кишечнике кур после вакцинации против эймериоза кур, в которой учитывают уровень секреции sIgA в энтероцитах и sIgA секретирующих клеток в собственной пластинке слизистой оболочки кишечника.
Предложенный способ предусматривает проведение
иммуногистохимического анализа непрямым методом для оценки уровня секреции sIgA в энтероцитах и подсчета sIgA секретирующих клеток в собственной пластинке слизистой оболочки кишечника кур с использованием моноклональных антител, меченных пероксидазой хрена, к IgA кур.
Предложенный способ позволяет проводить оценку локального иммунного ответа в кишечнике кур после проведения вакцинации против эймериоза кур. Метод является достаточно точным и выполняется специалистом в течение одного рабочего дня.
Предложенный способ апробирован нами в 2017-2018 гг, в ФГБОУ ВО МГАВМиБ - МВА им. К.И.Скрябина и в секторе патоморфологии ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН.
Предложенный способ состоит из следующих шагов: во время вскрытия отбирали образцы тонкого и толстого отделов кишечника кур (двенадцатиперстная, тощая, подвздошная кишки, слепые отростки, прямая кишка) размером 0,5 см, сразу охлаждали и хранили до исследования при -20°С. После этого охлаждали ткань до -34°С и, с помощью криотома, изготавливали срезы толщиной в 5 микрон. Срезы помещали на стекла с поли-L-лизиновым покрытием. Затем переносили в раствор изопропилового спирта и физиологического раствора в соотношении 1:1 и выдерживали при температуре +4°С в течение 1 часа. После каждого этапа промывали стекла в 3 сменах фосфатно-солевого буфера (PBS, рН 7,4). Для блокировки эндогенной пероксидазы использовали 3% раствор перекиси водорода, который наносили на стекла и инкубировали в течение 10 минут при
4
3
комнатной температуре. После чего наносили 5% раствор нормальной бычьей сыворотки на 30 минут. Затем инкубировали с первичными антителами (мышиные антикуриные моноклональные антитела к IgA Southern Biotechnology, США), при температуре +37°С во влажной камере в течение 2 часов. Антитела разводили фосфатно-солевым буфером в соотношении 1:150. Наносили на стекла вторичные антимышиные антитела, меченные пероксидазой хрена (Сорбент, Россия) и инкубировали в течение 1 часа. Вторичные антитела разводили фосфатно-солевым буфером в соотношении 1:200. Для выявления продукта реакции использовали свежий раствор аминоэтилкарбазола (АЭК). Реакцию останавливали промыванием в дистиллированной воде. Срезы окрашивали гематоксилином Майера, после чего промывали в растворе (10 г MgS и 2 г NaHCO в 1 литре ультрачистой воды). Затем стекла закрывали покровным стеклом при помощи монтирующей среды.
При этом обнаружение продукта реакции осуществляется в виде мембрано-цитоплазматической или диффузного цитоплазматического специфического окрашивания энтероцитов и sIgA секретирующих клеток в красно-коричневый цвет, который хорошо заметен при контрастном окрашивании препаратов гематоксилином Майера (рис. 1-5)
Для учета результата нами разработана бальная система по оценке уровня секреции sIgA в слизистой оболочке кишечника кур. При этом подсчитывали количество энтероцитов с диффузным цитоплазматическим или мембрано-цитоплазматическим окрашиванием красно-коричневого цвета, оценивали интенсивность окраски клеток и объем окрашенной цитоплазмы, а также подсчитывали количество окрашенных sIgA секретирующих клеток (плазмоцитов) в собственной пластинке слизистой оболочки кишечника кур. Увеличение микроскопа должно быть в 200 раз. На основе вышеперечисленного образцам присваивали баллы - от 0 до 3. Где 0 баллов соответствуют отсутствию нарастания общего пула sIgA в ответ на
вакцинные эймерии и выражались в менее 20% окрашенных энтероцитов, цитоплазма которых окрашена менее чем на 10%, а интенсивность окраски слабая (рисунок 1). 1 балл соответствует наличию низкого уровня секреции sIgA в слизистой оболочке кишечника и выражается в наличии 20-40% окрашенных энтероцитов, объем цитоплазмы которых окрашен на 50-70%, а интенсивность окраски является умеренной (рисунок 2). 2 балла соответствуют среднему уровню секреции sIgA и выражаются в наличии 40-70% окрашенных энтероцитов, объем цитоплазмы которых окрашен на 50-70%, а интенсивность окраски является средней (рисунок 3). 3 балла соответствуют выраженной степени секреции sIgA и выражаются в наличии 70-100% окрашенных энтероцитов, объем цитоплазмы которых окрашен на 70-100%, а интенсивность окраски является выраженной (рисунок 4).
Кроме того, подсчитывали окрашенные sIgA секретирующие клетки в собственной пластинке слизистой оболочки кишечника кур, количество которых также оценивали в баллах от 0 до 3 для упрощения восприятия результата. Где 0 баллов соответствуют незначительному количеству окрашенных клеток - от 0 до 4; 1 балл соответствует умеренному количеству - от 5 до 14; 2 балла соответствуют среднему количеству - от 15 до 29 окрашенных клеток, а 3 балла соответствуют большому количеству окрашенных клеток - от 30 до 50.
Учет результатов
Для учета результатов нами предложена бальная система, где на основании количества окрашенных энтероцитов с диффузным цитоплазматическим или мембрано-цитоплазматическим окрашиванием, интенсивности окраски клеток и объема окрашенной цитоплазмы исследуемому образцу присваивается балл - от 0 до 3 (таблица 1, рисунки 1-4).
Для упрощения восприятия и учета результата по количеству окрашенных sIgA секретирующих клеток (плазмоцитов) в собственной пластинке слизистой оболочки кишечника, количество клеток также оценивали в баллах от 0 до 3 (таблица 2, рисунок 5).
Для оценки окрашивания необходимо проанализировать минимум 5 различных полей зрения микроскопа каждого образца при увеличении в 200
раз. Чтобы избежать ошибочной оценки яркости мембрано-цитоплазматического окрашивания энтероцитов, перед анализом необходимо сбалансировать все фотографии по белому цвету.
- 0 баллов означает отсутствие гуморального ответа на вакцинацию против эймерий.
Увеличение баллов от 1 до 3 говорит о нарастании синтеза sIgA в слизистой оболочке кишечника и соответственно об активации локального адаптивного гуморального иммунитета в ответ на вакцинацию против эймерий.
- 3 балла говорят о наивысшей активации синтеза sIgA после вакцинации.
Предлагаемый способ найдет применение в научно-исследовательских институтах, ветеринарных диагностических лабораториях и в учебном процессе специалитета по дисциплинам «Паразитология» и «Иммунология».
Разработанный способ эффективен для оценки локального иммунного ответа в кишечнике кур, обеспечивает специфическое выявление и оценку уровня секреции sIgA, не занимает много времени - в среднем в 4 раза меньше, чем при ИГХИ с использованием парафиновых блоков, прост в исполнении и выполним в гистологической лаборатории.
Источники информации
1. Hong Y., Lillehoj Н., Lee S., Dalloul R., Lillehoj E. Analysis of chicken cytokine and chemokine gene expression following Eimeria acervulina and Eimeria tenella infections. Veterinary Immunology and Immunopathology. 2006, 114; p. 209-223.
2. Jang S., Lillehoj H., Lee S., Lee K., Lillehoj E., Bertrand F., Dupuis L., Deville S. Mucosal immunity against Eimeria acervulina infection in broiler
Parasitology 2011, 129; p. 36-41.
3. Miyamoto Т., Min W., Lillehoj H. Kinetics of interleukin-2 production in chickens infected with Eimeria tenella. Comparative immunology, microbiology & infectious diseases 2002, 25; p. 149-158.
4. Mohammed A., Salvatore F. Jr., Debra R., Katharine C, Martha G., Steven J., Lawrence K. Correlates of Immune Protection in Chickens Vaccinated with Mycoplasma gallisepticum Strain GT5 following Challenge with Pathogenic M. gallisepticum Strain Rlow. Infection and immunity, 2005, Sept.: p. 5410-5419.
5. Tian E, Zhou B. Effect of diclazuril on intestinal morphology and sIgA expression in chicken infected with Eimeria tenella. Parasitol Res. 2014, 13; p. 4057-4064.
6. Yurong Y, Yibao J, Ruiping S, Qingqiang Y, Kaisong P, Huihui B, et al. Effects of chicken intestinal antimicrobial peptides on humoral immunity of chickens and antibody titres after vaccination with infectious bursal disease virus vaccine in chicken. Arch Anim Nutr. 2006, 60; p. 427-35.