СПОСОБ РАННЕГО ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РИСКА РАЗВИТИЯ ДИАБЕТИЧЕСКОЙ НЕФРОПАТИИ У ПАЦИЕНТОВ С САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ 1 ТИПА
METHOD FOR EARLY PREDICTION OF THE RISK OF DEVELOPMENT OF DIABETIC NEPHROPATHY IN PATIENTS WITH TYPE 1 DIABETES MELLITUS

Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно к эндокринологии, генетике, нефрологии, генной инженерии, биохимии, и может быть использовано с целью прогнозирования тяжелого течения диабетической нефропатии у лиц с сахарным диабетом 1 типа.
Сахарный диабет 1 типа (СД 1) - это полигенное многофакторное заболевание, в основе которого лежит иммуноопосредованная или идиопатическая деструкция |3-клеток поджелудочной железы, приводящая к абсолютной инсулиновой недостаточности (Клинические рекомендации по лечению Сахарного диабета 1 типа, 2021 год). В основе заболеваний, относящихся к мультифакториальным, лежит генетическая предрасположенность и средовые факторы. Мультифакториальные заболевания (МФЗ) являются самой многочисленной и разнообразной группой болезней, составляющую более 90% от всей соматопатологии человека и характеризующиеся наиболее высокими темпами роста заболеваемости, смертности и инвалидизации трудоспособного населения в современных популяциях [Бочков Н.П. и др., 2011]. К наиболее часто встречающимся МФЗ относятся: ревматоидный артрит, ишемическая болезнь сердца, гипертоническая и язвенная болезни, цирроз печени, сахарный диабет и др., которые сопровождаются различными осложнениями. Особую роль в прогнозе течения болезни и качестве жизни пациента играет такое грозное осложнение СД 1, как диабетическая нефропатия (ДНП), приводящая в своем исходе к Хронической болезни почек. ДНП формируется в результате гемодинамических и метаболических факторов и возникает приблизительно у 20-40% больных СД 1 типа (Дедов ИИ, Шестакова MB., 2016). При этом смертность у лиц с СД 1 типа и ДНП в 2 раза выше, чем у пациентов без ДНП (Древаль А.В., Мисникова И.В., 2010). Выявление предикторов, которые, помимо уже известных повреждающих факторов (гипергликемия, артериальная гипертензия, дислипидемия, иммунное воспаление, окислительный стресс), способны оказывать влияние на тяжесть и быстроту прогрессирования нефропатии, прежде всего, за счет избыточного образования мембрано- и цитотоксических продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ), является важной проблемой для углубления знаний о механизмах развития и течения ДНП. В связи с активным развитием генетических технологий и повышением знаний в области молекулярно-генетических исследований широкое распространение приобретает изучение взаимосвязи между отдельными аллельными генами и патологическими процессами (Кузьмина Л.П, Безругавнигова Л.М., 2006). Значительное число имеющихся данных свидетельствует о вовлеченности различных полиморфных генов в формирование предрасположенности к мультифакторной патологии, как по всему спектру, так и к отдельным нозологическим формам [Risch N.J., 2000; Hirschhorn J.N. et al., 2002; Lohmueller K.E. et al., 2003; Баранов B.C., 2009]. В условиях современной техногенной цивилизации считается, что наиболее существенный вклад в формирование предрасположенности к социально значимым болезням человека могут вносить гены ферментов защитных и адаптационных систем организма - это, прежде всего, гены компонентов системы иммунного надзора, антиоксидантной защиты (АОЗ) и ферментов биотрансформации ксенобиотиков (ФБК) [Полоников А.В. с соавт., 2008.]. Обнаружение полиморфных аллелей генов биотрансформации ксенобиотиков, которые, с одной стороны, обезвреживают опасные для организма вещества, а с другой стороны, продуцируют активные формы кислорода в процессе функционирования (АФК), которые обладают высокой реакционной способностью и являются потенциальными факторами интенсификации процессов свободно-радикального окисления (СРО) и ПОЛ, позволит прогнозировать и заранее включать в комплексную терапию СД препараты антиоксидантного и нефропротективного действия. Все вышесказанное определяет актуальность изучения роли полиморфных вариантов генов системы биотрансформации ксенобиотиков в развитии патобиохимических нарушений у больных с ДНП и позволит определить дополнительные эффективные методы мониторинга проводимой терапии на молекулярно-генетическом уровне.
Известен способ прогнозирования развития хронической болезни почек (ХБП) у пациентов с сахарным диабетом (СД) (2021115852, 02.06.2021 МПК А61 В 5/00 (2006.01) G01N 33/50 (2006.01)), включающий определение типа сахарного диабета и комплекса диагностически значимых показателей: пол (х пол), возраст на момент постановки диагноза (х возраст), наличие инфаркта миокарда в анамнезе (х инфаркт), наличие диабетической комы в анамнезе (х кома), наличие диабетической ретинопатии (х ретинопатия), значение индекса массы тела (ИМТ) (х ИМТ), на основании полученных данных и при наличии СД 1 типа вычисляют вероятность развития ХБП через 5 лет у пациентов с СД 1 типа (р) по формуле:
где
Известен способ диагностики риска развития у субъекта атеросклероза или диабетической ретинопатии (заявка 2001130755/14, C12Q 1/68, БИПМ №24, 27.08.2003 г.), включающий определение у пациента с сахарным диабетом 2 типа наличия полиморфизма на участке сигнального пептида препро- NPY человека. Полиморфизм заключается в замене лейцина на пролин в 7-ом положении на участке сигнального пептида препро- NPY человека и является индикатором повышенного риска развития диабетической ретинопатии и атеросклероза. Но, к сожалению, в данном исследовании не участвовали пациенты с СД 1 типа и гликемический контроль у всех исследуемых был разный. Что не позволяет судить об отсутствии влияния других внешних факторов на формирование ретинопатии.
Ближайшим аналогом является способ прогнозирования риска развития диабетической ретинопатии при сахарном диабете типа 2 у якутов (Заявка: 2011137055/15, 07.09.2011 G01N 33/50 (2006.01) C12Q 1/68 (2006.01)), включающий выделение ДНК из лимфоцитов венозной крови, генотипирование гена интерлейкина методом полимеразной цепной реакции с последующим рестрикционным анализом, отличающийся тем, что проводят генотипирование интерлейкина - 6 и при выявлении аллеля *G полиморфного варианта -572 G/C гена интерлейкина-6 - IL-6 прогнозируют риск развития диабетической ретинопатии.
Заявителями не обнаружено аналогов по способам комплексного генетического прогнозирования степени тяжести ДНП у пациентов с СД1 типа. А именно нефропатия является одной из основных причин смерти пациентов с сахарным диабетом. Кроме того, в вышеуказанном ближайшем аналоге пациенты были с разным уровнем гликированного гемоглобина, соответственно с разной степенью компенсации углеводного обмена, что не позволяет достоверно судить о вкладе в прогнозирование ретинопатии только изучаемого полиморфизма. С практической точки зрения, пациенты должны быть максимально схожи между собой по возрасту, длительности диабета, степени компенсации гликемии и принимаемой (или не принимаемой) терапии. Это позволит в большей степени исключить влияние смежные факторов на развитие диабетических осложнений.
Задача: определение наиболее достоверных и информативных молекулярно-генетических и биохимических маркеров, на ранних стадиях, приводящих к прогрессирующему течению ДНП у лиц с СД 1 типа.
Сущностью данного изобретения является выявление гетерозиготного полиморфизма G681A гена CYP2C19, превышение активности ферментов системы АОЗ и показателей процессов свободно-радикального окисления от референтных значений - показателей контрольной группы здоровых доноров, при наличии этих изменений, определяют высокую степень риска развития ДНП.
Технический результат: в связи с выделением гетерозиготного полиморфизма G681A гена CYP2C19 и определением активности ферментов системы АОЗ и показателей процессов свободно-радикального окисления (каталазы (КАТ), супероксиддисмутазы (СОД), глутатион-S-трансферазы (Г-S-T)) и уровня малонового диальдегида (МДА), как основного маркера процессов СРО и ПОЛ, а также биохимических маркеров, таких как уровень креатинина в сыворотке крови, расчетом скорости клубочковой фильтрации (СКФ) и определением уровня белка в моче, может позволить на ранней стадии достоверно и информативно спрогнозировать риск развития быстропрогрессирующей нефропатии, своевременно осуществить мероприятия по коррекции данного состояния и предупредить раннее развитие таких тяжелых осложнений ДНП, как анемия, артериальная гипертензия, патология фосфорно-кальциевого обмена, дислипидемия, протеинурия и др.
Для доказательства решения задачи проведено выделение ДНК из лимфоцитов венозной крови, генотипирование генов ФБК методом полимеразной цепной реакции с последующим рестрикционным анализом. Выявление у пациента гетерозиготного полиморфизма G681A гена CYP2C19 и, связанное с этим, повышение активности малонового диальдегида (МДА), каталазы (КАТ), глутатион-S-трансферазы (Г-S-T) и супероксиддисмутазы (СОД) над референтными значениями - показателями контрольной группы здоровых доноров, прогнозирует высокий риск развития диабетической нефропатии.
Для проведения лабораторных исследований используют образцы сыворотки крови, полученные при центрифугировании пробирок с цельной венозной кровью со скоростью 3 тыс. об/мин в течение 5 минут при комнатной температуре. Наряду с общеклиническим обследованием у больных оценивают уровни глюкозы натощак и постпрандиальной гликемии, а также общий анализ крови, биохимический анализ крови, общий анализ мочи, определение гликированного гемоглобина. Оценку микроальбуминурии производят в разовой порции мочи после полной стабилизации гликемического профиля (в контрольном общем анализе мочи перед выпиской). С целью оценки оксидативного статуса перед выпиской пациента из стационара, после полной стабилизации гликемии производился забор крови для определения состояния системы про-/антиоксиданты (МДА -показатель процессов СРО и ПОЛ и ферменты АОЗ и ФБК - КАТ, СОД, Г-S-Т).
Способ апробирован на 50 пациентах с СД 1 типа, имеющих сходный уровень гликированного гемоглобина (средний уровень в опытной группе 8,7%), и длительность течения СД 1 типа 7-10 лет. Контрольная группа была сформирована из 20 условно здоровых добровольцев, сопоставимых по возрасту, полу и этнической принадлежности, не являющихся родственниками пациентов основных групп и не имевших в анамнезе сахарный диабет и другие хронические заболевания.
Материалом для молекулярно-генетического исследования послужила цельная венозная кровь, которая забиралась однократно при включении пациента в исследование. Для выделения геномной ДНК применяли сорбентный метод с использованием набора реактивов «ДНК-экспресс кровь» («Литех», Россия), затем методом полимеразной цепной реакции из лейкоцитарной фракции в режиме реального времени (ПЦР-РВ) на анализаторе RotorGene выполняли генотипирование гена CYP2C19 полиморфизм G681A. Для этого применяли соответствующие наборы реагентов («Литех», Россия), Регистрация FAM и HEX позволяла определить три варианта генотипа:
гомозигота по основному аллелю (аллель 1),
гетерозигота,
гомозигота по минорному аллелю (аллель 2) Было проведено сравнение различных вариантов полиморфизма G681A гена CYP2C19 с показателями СКФ, микроальбуминурии, потребностью в инсулине и показателями общего антиоксидантного статуса. Значимые отклонения в вышеуказанных показателях выявлены для гетерозиготного варианта полиморфизма G681A гена CYP2C19.
Исследование показателей системы про-/антиоксиданты проводилось по следующим методикам:
1) МДА: Стальная И.Д., Гаришвили Т.Г., 1977.
2) Суперооксиддисмутаза (СОД): Сирота Т. В., 1999.
3) Глутатион-S-трансфераза (Г-S-T): Карпищенко А.И., 1999.
4) Каталаза (КАТ): Королюк М.А. и соавт., 1988.
За нормальные (референтные) значения активности ферментов системы АОЗ принимались показатели пациентов контрольной группы
Достоверность различий в распределении частот генотипов между группами больных и здоровых лиц оценили по тесту F 2. Количественные показатели в клинических характеристиках пациентов - по критерию Стьюдента. Расчеты выполнены с помощью программы BIOSTAT. Статистически значимыми считали различия при р менее 0,05.
2
2
При сравнении опытной и контрольной групп по гену СУР2С19 (G681A), не было выявлено значимых различий в процентном соотношении между гомо- и гетерозиготными носителями полиморфных вариантов данного гена. Число гетерозиготных носителей (GA) 15%, гомозиготных носителей по аллели 1 (GG) - 85%. Однако были выявлены значимые различия в уровне СКФ опытной группы. Так носители гетерозиготной мутации гена СУР2С19 имели более низкий уровень СКФ (73,7 мл/мин/1,73 м), более высокую микроальбуминурию (0,21 г/л - стадия A3) по сравнению с гомозиготными носителями (СКФ - 86,2 мл/мин/1,73 м; микроальбуминурия - 0,18 г/л), при этом потребность в инсулине в сутки была выше у лиц с гомозиготным носительством - 54,5 Ед/сут. по сравнению с 46,8 Ед/сут у гетерозиготных носителей. Носители мутантной гомозиготы по аллели 2 обнаружены не были ни в контрольной, ни в опытной группе.
Пример
2
Пациент А., 1994 года рождения, страдает СД 1 типа в течение 8 лет. Получает ИТ (аспарт и гларгин 300) в средней суммарной суточной дозе 48 ед. В домашних условиях старался поддерживать гликемию в диапазоне от 8-13 ммоль/л. В связи с сильным эмоциональным стрессом в последние 2-3 недели измерял гликемию редко, пропускал инъекции инсулина, не считал хлебные единицы, колол инсулин «на глаз». Уровень гликемии на этом фоне повышался до 20-25 ммоль/л, появилась выраженная сухость во рту, жажда, тошнота и однократная рвота. Самостоятельно справиться с декомпенсацией сахарного диабета не мог. Госпитализирован в терапевтическое отделение Больницы Скорой медицинской помощи. Из анамнеза: СД 1 типа 8 лет. Хронические заболевания: хронический тонзиллит, стадия компенсации. Биохимический анализ крови: Калий крови - 3,3 (3,4-5,5 ммоль/л) Креатинин -97 г/л, СКФ -70 мл/мин/1,73 м. Общий анализ крови - без особенностей. Общий анализ мочи при поступлении - глюкоза +++, кетоновые тела +++, белок - 1,0 г/л. Кислотно-щелочное состояние: рН - 7,11, sBE, с - (-8) ммоль/л. Гликированный гемоглобин - 8,4%. Была назначена инфузионная терапия, инсулинотерапия, терапия препаратами альфа-липоевой кислоты. К моменту выписки после стабилизации состояния и достижения нормогликемии повторно был проведен общий анализ мочи. Уровень белка в моче составил 0,6 г/л (600 мг/л) в разовой порции мочи. После стабилизации гликемии был произведен забор крови для оценки системы про- /антиоксиданты и ФБК. Уровень МДА - 28,9 МкМ/л, КАТ - 55,1 нмоль/мг, Г-S-T - 56,6 мкмоль/мин/мг, СОД - 100,1 усл.ед. Что значительно превышает аналогичные показатели в контрольной группе.
Пациент осмотрен офтальмологом. Диагноз - непролиферативная ретинопатия.
Был сформулирован окончательный диагноз: Сахарный диабет 1 типа, декомпенсация с кетоацидозом при поступлении. Непролиферативная ретинопатия, Диабетическая нефропатия с незначительно сниженной СКФ (СКФ = 70 мл/мин/1,73 м2). Диабетическая дистальная полинейропатия нижних конечностей, сенсорный тип. Целевой уровень гликированного гемоглобина - менее 6,5%. Хронический тонзиллит, стадия компенсации.
В процессе исследования гена CYP2E1 был обнаружен гетерозиготный полиморфизм.
В связи с чем пациенту была предложена антиоксидантная терапия: Витамин Е 400 мг ежедневно 1-2 месяца курсами 2 раза в год, препараты альфа-липоевой кислоты 600 мг 1 раз в день 2-3 месяца курсами 2 раза в год. Ежегодное наблюдение эндокринолога с более тщательной оценкой функции почек. А также, в случае появления артериальной гипертензии - использование препаратов ингибиторов ангиотензин-превращающего фермента (иАПФ), либо антагонистов рецепторов ангиотензина II (АРА) с целью нефропротекции.