ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ ИЛИ ЛЕЧЕНИЯ СЕРДЕЧНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ
PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR PREVENTION OR TREATMENT OF HEART FAILURE

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для профилактики или лечения сердечной недостаточности. В частности, настоящее изобретение относится к генной конструкции, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок SERCA2a или его фрагмент, и нуклеотидную последовательность, кодирующую белок CCN5 или его фрагмент, а также к фармацевтической композиции для профилактики или лечения сердечной недостаточности, которая содержит генную конструкцию в качестве активного ингредиента.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Сердечная недостаточность (HF) представляет собой заболевание, при котором возникают сложные симптомы вследствие структурных и функциональных нарушений функции желудочкового насоса, который набирает или выбрасывает кровь. Сердечная недостаточность представляет собой заболевание с более высоким уровнем смертности, чем рак, причем уровень ее смертности в течение 5 лет после постановки диагноза составляет 50% или выше. Число пациентов с сердечной недостаточностью во всем мире составляет 38 миллионов человек, причем распространенность данного заболевания также увеличивается с возрастом. Тем не менее, фундаментальное лекарство от сердечной недостаточности отсутствует, а современные методы лечения могут только замедлить развитие заболевания. Поэтому медицинское обслуживание при данном заболевании сопряжено с большими расходами на лечение, что является тяжелым бременем для пациентов (Braunwald E. Lancet, 2015; 385: 812-824).
Сердечную недостаточность может вызывать широкий спектр сердечных заболеваний, которые возникают в результате сердечных нарушений, генетических дефектов и системных заболеваний. Заболевания, связанные с началом сердечной недостаточности, обычно включают ишемические заболевания, гипертонические заболевания и порок клапана сердца, кроме того, они включают первичную кардиомиопатию, вторичную кардиомиопатию, включая амилоидоз, врожденные пороки сердца, перикардиальные заболевания и тому подобное, которые развиваются вследствие генетических или приобретенных причин (Maron BJ. Et al., Circulation., 2006; 113: 1807-1816). Сердечная недостаточность, которая развивается вследствие разных сердечных заболеваний, приводит к патологическому ремоделированию сердца, которое вызывает структурные изменения и дисфункцию сердца. В частности, что касается ремоделирования: существует ремоделирование на клеточном уровне, вызванное изменениями размера, формы и функции кардиомиоцитов, и ремоделирование на тканевом уровне, вызванное фиброзом сердечной ткани в результате чрезмерного накопления внеклеточного матрикса (ECM). Такое патологическое ремоделирование сердца включает связанные с заболеванием изменения транскрипционной, сигнальной, структурной, электрофизиологической и функциональной природы в кардиомиоцитах.
et al., Circ Res.
Внеклеточный матрикс миокарда (ECM) представляет собой сложную структуру, которая поддерживает механическую функцию, обеспечивая эффективное сокращение и расслабление кардиомиоцитов, и играет роль в обеспечении адекватной передачи усилия, передачи электрического сигнала, межклеточной коммуникации, обмена метаболитов и т.п. в микросреде сердечной мышцы. Повышенный стресс, повреждение и заболевание стенки сердца приводят к развитию фиброза во внеклеточном матриксе, вызывая тем самым нарушение двигательной функции, такой как сокращение и расслабление, кардиомиоцитов и миофибрилл (Li AH. , 2014; 114(5): 916-27).
et al., Nat. rev. Cardiol.
Кроме того, патологическое ремоделирование приводит к нарушению функции сокращения и расслабления сердечной мышцы и исчезновению кардиомиоцитов. Гипертрофия и гибель кардиомиоцитов на клеточном уровне влияют на связь возбуждения-сокращения миокарда и также приводят к патологическим изменениям в молекулярном механизме, который регулирует сокращение кардиомиоцитов, выживание клеток, функцию митохондрий, связанную с энергетическим обменом, и окислительный стресс (Koitabashi N., , 2012; 9:147-157).
et al., Circulation.
Сердечные ткани подвергаются патологическим структурным изменениям, таким как обеспечение образования и фиброза миофибробластов, усиление гладкой мускулатуры сосудов, дисфункция эндотелиальных клеток сосудов и воспалительное действие иммунных клеток. Такое прогрессирование заболевания на клеточном уровне приводит к ремоделированию на тканевом уровне через интегрированные процессы, такие как гипертрофия и смерть кардиомиоцитов, потеря кровеносных сосудов, фиброз, воспаление, метаболическая дисфункция и электрофизиологическое ремоделирование, вызывая тем самым сердечную недостаточность (Burchfield JS  2013; 128: 388-400).
Нейрогормональные блокаторы используют в течение последних 40 лет для лечения пациентов с сердечной недостаточностью. Однако, несмотря на эффективность лечения сердечной недостаточности, заключающегося в облегчении симптомов и уменьшении стрессовой нагрузки на сердце, прогноз у пациентов с сердечной недостаточностью очень плохой, их смертность достигает 50% через 5 лет после начала заболевания и 90% через 10 лет после начала заболевания. Кроме того, если сердечная недостаточность сильно прогрессирует, не существует другого метода лечения, кроме установления устройства для оказания помощи сердцу и трансплантации сердца. Следовательно, существует острая необходимость в разработке фундаментального лекарства от сердечной недостаточности и новых способов лечения, обеспечивающих восстановление сердца.
Lancet,
et al., Nat. Rev. Cardiol.
Что касается новых методов лечения, активно развиваются направления, включающие лекарственные средства, клеточную терапию, микроРНК и генную терапию, которые регулируют сигнальные системы, связанные с заболеванием. Описано, что среди вышеперечисленных методов лечения некоторые лекарственные средства обладают эффективностью, показанной на моделях заболеваний, связанных с сердечной недостаточностью у животных, или в небольших клинических испытаниях фазы II (Braunwald E.  2015; 385: 812-824, VonLueder TG. , 2015; 12: 730-740).
В частности, разные доклинические испытания для лечения сердечных заболеваний у животных были проведены благодаря пониманию на уровне генов механизма заболевания сердечных заболеваний, открытию терапевтических генов, методам конструирования и упаковки генных носителей, быстрой разработке методов доставки и т.п. (Gorski PA, et al. Cell Metabol. 2015; 21: 183-194).
et al., Cardiovas. Res.,
В последние годы многочисленные исследования показали, что доставка гена SERCA2a животным моделям с сердечной недостаточностью приводит к увеличению выживаемости, а также к увеличению сократимости сердца. Однако в фазе IIb клинических испытаний с рекомбинантным аденоассоциированным вирусом, экспрессирующим SERCA2a, AAV-SERCA2a, в которых участвует большое число клинических пациентов, вплоть до 250, генная терапия не показала действительных клинических преимуществ для лечения сердечной недостаточности в отличие от экспериментальных результатов, полученных на свиньях, овцах, собаках и даже приматах (Rincon M Y.  2015; 108: 4-20).
et al., Nat. Rev. Cardiol.,
При разработке лекарственных средств для лечения сердечной недостаточности зарегистрированы случаи, когда новые лекарственные средства, демонстрирующие терапевтический эффект в клинических испытаниях фазы II, обладали меньшей, чем ожидалось, эффективностью, или ек обладали эффективностью в клинических испытаниях фазы III (Vaduganathan M,  2013; 10: 85-97).
Современные методы лечения сердечной недостаточности направлены на облегчение симптомов и уменьшение перегрузочного стресса в сердце. Однако, несмотря на эффективность лечения, прогноз для пациентов с сердечной недостаточностью очень пессимистичен: их смертность достигает 50% через 5 лет от начала заболевания и 90% после 10 лет от начала заболевания. Было обнаружено, что среди механизмов развития заболевания, которые были недавно раскрыты в рамках разработки методов лечения сердечной недостаточности, ремоделирование сердца, включающее фиброз, который непосредственно влияет на функцию сердечного насоса, и повреждение кардиомиоцитов взаимодействуют друг с другом, они тесно связаны друг с другом, влияя на развитие, прогрессирование и прогноз заболевания, и образуют замкнутый круг.
Следовательно, поскольку лечение, направленное на одну лекарственную мишень, или на один механизм заболевания, может привести к недостаточным результатам в лечении сердечной недостаточности, существует потребность в разработке нового комплексного лечения, позволяющего достичь функционального восстановления на клеточном уровне, и обеспечивающего лечение гистологического ремоделирования сердца.
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
ТЕХНИЧЕСКАЯ ПРОБЛЕМА
Авторы настоящего изобретения провели исследование с целью разработки эффективного способа лечения сердечной недостаточности и в результате обнаружили, что генная конструкция, вектор экспрессии и рекомбинантный вирус, каждый из которых содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок SERCA2a или его фрагмент, и нуклеотидную последовательность, кодирующую белок CCN5 или его фрагмент, оказывают синергический терапевтический эффект на дисфункцию, вызванную сердечной недостаточностью, у мышиной модели сердечной недостаточности, вызванной множественной этиологией, тем самым завершив настоящее изобретение.
РЕШЕНИЕ ПРОБЛЕМЫ
В одном аспекте настоящее изобретение предлагает генную конструкцию, содержащую (i) нуклеотидную последовательность, кодирующую белок SERCA2a или его фрагмент; и (ii) нуклеотидную последовательность, кодирующую белок CCN5 или его фрагмент.
В другом аспекте настоящее изобретение предлагает рекомбинантный вектор экспрессии, нагруженный генной конструкцией.
В следующем аспекте настоящее изобретение предлагает рекомбинантный вирус, содержащий генную конструкцию.
В следующем аспекте настоящее изобретение предлагает фармацевтическую композицию для профилактики или лечения сердечной недостаточности, содержащую, в качестве активного ингредиента, генную конструкцию, рекомбинантный вектор экспрессии или рекомбинантный вирус.
В следующем аспекте настоящее изобретение предлагает способ профилактики или лечения сердечной недостаточности, включающий стадию введения фармацевтической композиции индивидууму.
В следующем аспекте настоящее изобретение предлагает фармацевтическую композицию для профилактики или лечения сердечной недостаточности, содержащую вектор экспрессии, нагруженный нуклеотидной последовательностью, кодирующей белок SERCA2a или его фрагмент; и вектор экспрессии, нагруженный нуклеотидной последовательностью, кодирующей белок CCN5 или его фрагмент.
В следующем аспекте настоящее изобретение предлагает фармацевтическую композицию для профилактики или лечения сердечной недостаточности, содержащую рекомбинантный вирус, который содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок SERCA2a или его фрагмент; и рекомбинантный вирус, который содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок CCN5 или его фрагмент.
В следующем аспекте настоящее изобретение предлагает способ профилактики или лечения сердечной недостаточности, включающий стадию введения индивидууму (i) вектора экспрессии, нагруженного нуклеотидной последовательностью, кодирующей белок SERCA2a или его фрагмент; и (ii) вектора экспрессии, нагруженного нуклеотидной последовательностью, кодирующей белок CCN5 или его фрагмент.
В следующем аспекте настоящее изобретение предлагает способ профилактики или лечения сердечной недостаточности, включающий стадию введения индивидууму (i) рекомбинантного вируса, который содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок SERCA2a или его фрагмент; и (ii) рекомбинантного вируса, который содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок CCN5 или его фрагмент.
ПОЛЕЗНЫЕ ЭФФЕКТЫ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Общим признаком сердечной недостаточности является исчезновение кардиомиоцитов и развитие фиброза сердечной ткани, причем такое структурное ремоделирование сердца вызывает дисфункцию сердечного насоса. Однако исчезновение кардиомиоцитов и фиброз ткани сердца могут варьировать в зависимости от стадии развития заболевания и могут взаимодействовать друг с другом, образуя замкнутый круг. Следовательно, одновременное лечение исчезновения кардиомиоцитов и фиброза сердечной ткани может быть наиболее эффективным.
Фармацевтическая композиция настоящего изобретения для профилактики и лечения сердечной недостаточности обеспечивает одновременную экспрессию белка SERCA2a и белка CCN5. Фармацевтическая композиция может оказывать синергический терапевтический эффект путем предотвращения исчезновения кардиомиоцитов и повышения их активности под действием белка SERCA2a, а также путем предотвращения фиброза клеток и тканей сердца под действием белка CCN5, и, следовательно, указанную композицию можно эффективно использовать для профилактики или лечения сердечной недостаточности, сложного заболевания, вызываемого разными причинами.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На фиг. 1a показана структура вектора pTR-CMV-SERCA2a.
На фиг. 1b показана структура вектора pTR-CMV-CCN5.
На фиг. 1c показана структура вектора pTR-CMV-SERCA2a-P2A-CCN5.
На фиг. 1d показана структура вектора pTR-CMV-CCN5-P2A-SERCA2a.
На фиг. 2a показаны результаты внутриклеточной экспрессии и внеклеточной экспрессии pTR-CMV-SERCA2a, pTR-CMV-CCN5 и pTR-CMV-SERCA2a-P2A-CCN5.
2+
На фиг. 2b показаны результаты сравнения связанной с поглощением Ca активности белка SERCA2a, экспрессированного в клетках, трансформированных pTR-CMV-SERCA2a-P2A-CCN5 или pTR-CMV-CCN5-P2A-SERCA2a (n=5, ** < 0,01).
На фиг. 2c показаны результаты измерения уровней экспрессии белка SERCA2a и белка CCN5 в клетках, трансформированных pTR-CMV-SERCA2a-P2A-CCN5 или pTR-CMV-CCN5-P2A-SERCA2a.
На фиг. 3 показана концептуальная диаграмма результатов экспериментов на животных, а именно, на мышах с сердечной недостаточностью, индуцированной ишемически-реперфузионным повреждением.
На фиг. 4a показаны результаты идентификации экспрессии белка SERCA2a и белка CCN5 в тканях сердца, достигнутой путем введения мышам с сердечной недостаточностью, индуцированной ишемически-реперфузионным повреждением, рекомбинантных вирусов AAV9-Control, AAV9-SERCA2a, AAV9-CCN5, AAV9-SERCA2a+AAV9-CCN5.
На фиг. 4b показаны результаты сравнения уровней экспрессии белка SERCA2a в тканях сердца (n=5, * <0,05, ** <0,01), достигнутой путем введения мышам с сердечной недостаточностью, индуцированной ишемически-реперфузионным повреждением, рекомбинантных вирусов AAV9-Control, AAV9-SERCA2a, AAV9-CCN5, AAV9-SERCA2a+AAV9-CCN5.
На фиг. 4c показаны результаты сравнения уровней экспрессии белка CCN5 в тканях сердца (n=5, ** <0,01), достигнутой путем введения мышам с сердечной недостаточностью, индуцированной ишемически-реперфузионным повреждением, рекомбинантных вирусов AAV9-Control, AAV9-SERCA2a, AAV9-CCN5, AAV9-SERCA2a+AAV9-CCN5.
На фиг. 5 показаны фотографии сердец мышей после введения мышам с сердечной недостаточностью, индуцированной ишемически-реперфузионным повреждением, рекомбинантных вирусов AAV9-Control, AAV9-SERCA2a, AAV9-CCN5, AAV9-SERCA2a+AAV9-CCN5: красной линией отмечена область инфаркта ткани сердца.
На фиг. 6 показаны фотографии сердец мышей после введения мышам с сердечной недостаточностью, индуцированной ишемически-реперфузионным повреждением, рекомбинантных вирусов AAV9-Control, AAV9-SERCA2a, AAV9-CCN5, AAV9-SERCA2a+AAV9-CCN5, и результаты окрашивания поперечного среза ткани сердца с использованием пикросириуса красного: красной линией отмечена область трансмурального инфаркта ткани сердца.
На фиг. 7 показаны результаты количественного определения доли пораженной инфарктом области извлеченных сердец (n=5, * <0,05, ** <0,01) после введения мышам с сердечной недостаточностью, индуцированной ишемически-реперфузионным повреждением, рекомбинантных вирусов AAV9-Control, AAV9-SERCA2a, AAV9-CCN5, AAV9-SERCA2a+AAV9-CCN5.
На фиг. 8 показаны результаты, демонстрирующие фракцию сокращения (n=5, * <0,05, ** <0,01, *** <0,001) после введения мышам с сердечной недостаточностью, индуцированной ишемически-реперфузионным повреждением, рекомбинантных вирусов AAV9-Control, AAV9-SERCA2a, AAV9-CCN5, AAV9-SERCA2a+AAV9-CCN5, с последующим проведением эхокардиографии.
На фиг. 9a показаны результаты, демонстрирующие конечно-систолическое отношение объема и давления (ESPVR) (n=5, * <0,05, ** <0,01, *** <0,001) после введения мышам с сердечной недостаточностью, индуцированной ишемически-реперфузионным повреждением, рекомбинантных вирусов AAV9-Control, AAV9-SERCA2a, AAV9-CCN5, AAV9-SERCA2a+AAV9-CCN5, с последующим измерением гемодинамических параметров.
На фиг. 9b показаны результаты, демонстрирующие конечно-диастолическое отношение объема и давления (EDPVR) (n=5, * <0,05, ** <0,01) после введения мышам с сердечной недостаточностью, индуцированной ишемически-реперфузионным повреждением, рекомбинантных вирусов AAV9-Control, AAV9-SERCA2a, AAV9-CCN5, AAV9-SERCA2a+AAV9-CCN5, с последующим измерением гемодинамических параметров.
На фиг. 10 показана концептуальная диаграмма результатов экспериментов на животных, а именно, на мышах с сердечной недостаточностью, индуцированной поперечным сокращением аорты.
На фиг. 11a показаны результаты идентификации экспрессии белка SERCA2a и белка CCN5 в тканях сердца после введения мышам с сердечной недостаточностью, индуцированной поперечным сокращением аорты, рекомбинантных вирусов AAV9-Control, AAV9-SERCA2a, AAV9-CCN5, AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5.
На фиг. 11b показаны результаты сравнения уровней экспрессии белка SERCA2a в тканях сердца (n=5, * <0,05, ** <0,01) после введения мышам с сердечной недостаточностью, индуцированной поперечным сокращением аорты, рекомбинантных вирусов AAV9-Control, AAV9-SERCA2a, AAV9-CCN5, AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5.
На фиг. 11c показаны результаты сравнения уровней экспрессии белка CCN5 в тканях сердца (n=5, ** <0,01) после введения мышам с сердечной недостаточностью, индуцированной поперечным сокращением аорты, рекомбинантных вирусов AAV9-Control, AAV9-SERCA2a, AAV9-CCN5, AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5.
На фиг. 12 показаны фотографии сердец мышей после введения мышам с сердечной недостаточностью, индуцированной поперечным сокращением аорты, рекомбинантных вирусов AAV9-Control, AAV9-SERCA2a, AAV9-CCN5, AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5, и результаты окрашивания поперечного среза ткани сердца с использованием трихрома по Массону.
На фиг. 13 показаны результаты, демонстрирующие фракцию сокращения (n=5, * <0,05, ** <0,01) после введения мышам с сердечной недостаточностью, индуцированной поперечным сокращением аорты, рекомбинантных вирусов AAV9-Control, AAV9-SERCA2a, AAV9-CCN5, AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5, с последующим проведением эхокардиографии.
На фиг. 14a показаны результаты, демонстрирующие конечно-систолическое отношение объема и давления (ESPVR) (n=5, * <0,05, ** <0,01) после введения мышам с сердечной недостаточностью, индуцированной поперечным сокращением аорты, рекомбинантных вирусов AAV9-Control, AAV9-SERCA2a, AAV9-CCN5, AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5, с последующим измерением гемодинамических параметров.
На фиг. 14b показаны результаты, демонстрирующие конечно-диастолическое отношение давления и объема (EDPVR) (n=5, * <0,05, ** <0,01) после введения мышам с сердечной недостаточностью, индуцированной поперечным сокращением аорты, рекомбинантных вирусов AAV9-контроль, AAV9-SERCA2a, AAV9-CCN5, AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5, с последующим измерением гемодинамических параметров.
На фиг. 15 показана концептуальная диаграмма результатов экспериментов на животных, а именно, на мышах с сердечной недостаточностью, индуцированной путем инфузии ангиотензина II (AngII).
На фиг. 16a показаны результаты идентификации экспрессии белка SERCA2a и белка CCN5 в тканях сердца после введения мышам с сердечной недостаточностью, индуцированной путем инфузии ангиотензина II, рекомбинантных вирусов AAV9-Control, AAV9-SERCA2a, AAV9-CCN5, AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5.
На фиг. 16b показаны результаты сравнения уровней экспрессии белка SERCA2a в тканях сердца (n=5, ** <0,01) после введения мышам с сердечной недостаточностью, индуцированной путем инфузии ангиотензина II, рекомбинантных вирусов AAV9-Control, AAV9-SERCA2a, AAV9-CCN5, AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5.
На фиг. 16c показаны результаты сравнения уровней экспрессии белка CCN5 в тканях сердца (n=5, * <0,05, ** <0,01) после введения мышам с сердечной недостаточностью, индуцированной путем инфузии ангиотензина II, рекомбинантных вирусов AAV9-Control, AAV9-SERCA2a, AAV9-CCN5, AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5.
На фиг. 17 показаны фотографии сердец мышей после введения мышам с сердечной недостаточностью, индуцированной путем инфузии ангиотензина II, рекомбинантных вирусов AAV9-Control, AAV9-SERCA2a, AAV9-CCN5, AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5, и результаты окрашивания поперечного среза ткани сердца с использованием трихрома по Массону.
На фиг. 18 показаны результаты, демонстрирующие утолщение стенки левого желудочка (n=5, * <0,05, ** <0,01), после введения мышам с сердечной недостаточностью, индуцированной путем инфузии ангиотензина II, рекомбинантных вирусов AAV9-Control, AAV9-SERCA2a, AAV9-CCN5, AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5, с последующим проведением эхокардиографии.
На фиг. 19 показаны результаты, демонстрирующие фракцию сокращения (n=5, * <0,05, ** <0,01), после введения мышам с сердечной недостаточностью, индуцированной путем инфузии ангиотензина II, рекомбинантных вирусов AAV9-Control, AAV9-SERCA2a, AAV9-CCN5, AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5, с последующим проведением эхокардиографии.
НАИЛУЧШИЙ СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В одном аспекте настоящее изобретение предлагает генную конструкцию, содержащую (i) нуклеотидную последовательность, кодирующую белок SERCA2a или его фрагмент; и (ii) нуклеотидную последовательность, кодирующую белок CCN5 или его фрагмент. В соответствии с данным документом, нуклеотидная последовательность может находиться в виде мРНК.
2+
В данном описании термин "белок SERCA2a", который является сокращенным названием саркоплазматической Ca-АТФазы 2a, относится к белку, который обеспечивает поступление кальция в саркоплазматический ретикулум с использованием энергии АТФ. Белок SERCA2a может иметь аминокислотную последовательность, описанную в SEQ ID NO: 1. А нуклеотидная последовательность, кодирующая белок SERCA2a, может представлять собой последовательность, описанную в SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 13.
Фрагмент белка SERCA2a может быть получен путем отсечения N-концевого и/или C-концевого участка SERCA2a дикого типа при условии, что фрагмент сохраняет активность белка SERCA2a. А именно, фрагмент белка SERCA2a может быть получен путем отсечения 1-100, 1-50, 1-20 или 1-10 аминокислот с N-конца или C-конца.
В данном описании термин "белок CCN5" относится к белку внеклеточного матрикса, принадлежащему к семейству CCN, которое играет разные роли в регуляции клеточных функций, например, оно может участвовать в индукции сосудистых болезней, ангиогенезе, онкогенезе, индукции фиброзных заболеваний, клеточной дифференциации и выживании. Белок CCN5, в отличие от других белков семейства CCN, не имеет C-концевого домена и также может называться WISP-2, HICP, Cop1, CTGF-L и т.п. Кроме того, белок CCN5 состоит из одной полипептидной цепи, содержащей 250 аминокислот. Благодаря секреторной лидерной последовательности, состоящей из 22-аминокислот и расположенной на N-конце, белок CCN5 секретируется из клетки и функционирует как сигнальный белок.
Белок CCN5 может иметь аминокислотную последовательность, описанную в SEQ ID NO: 3. А нуклеотидная последовательность, кодирующая белок CCN5, может представлять собой последовательность, описанную в SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 14.
Фрагмент белка CCN5 может быть получен путем отсечения N-концевого и/или C-концевого участка CCN5 дикого типа при условии, что фрагмент сохраняет активность белка CCN5. А именно, фрагмент белка CCN5 может быть получен путем отсечения 1-30, 1-20, 1-10 или 1-5 аминокислот с N-конца или C-конца.
Генная конструкция может дополнительно содержать самоотщепляющуюся последовательность, расположенную между нуклеотидной последовательностью (i) и нуклеотидной последовательностью (ii). Самоотщепляющаяся последовательность может представлять собой пептидную последовательность 2A, полученную из РНК-вирусов с положительной цепью, таких как Picornaviridae, Iflaviruses, Tetraviridae и Discistroviridae, или пептидную последовательность 2A, полученную из двухцепочечных РНК-вирусов, таких как Rotaviruses, Cypoviruses и Totiviridae (Garry A Luke, et al Journal of General Virology, 2008; 89: 1036-1042).
Нуклеотидная последовательность, кодирующая пептид 2A, полученная из свиного тешовируса-1, вируса Thosea asigna, вируса конского ринита A или вируса ящура, которая обычно широко используется в исследованиях, может присутствовать между нуклеотидной последовательностью, кодирующей белок SERCA2a или его фрагмент, и нуклеотидной последовательностью, кодирующей белок CCN5 или его фрагмент. А именно, самоотщепляющаяся последовательность может представлять собой, без ограничения, нуклеотидную последовательность, кодирующую пептид 2A, полученную из свиного тешовируса-1. Кроме того, самоотщепляющаяся последовательность может представлять собой нуклеотидную последовательность, описанную в SEQ ID NO: 6.
Нуклеотидная последовательность, кодирующая пептид 2A, полученная из свиного тешовируса-1, может представлять собой нуклеотидную последовательность кодирующую аминокислотную последовательность, описанную в SEQ ID NO: 5. Кроме того, нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность, описанную в SEQ ID NO: 5, может представлять собой нуклеотидную последовательность, описанную в SEQ ID NO: 6.
Нуклеотидная последовательность, кодирующая пептид 2A, полученная из вируса Thosea asigna, может представлять собой нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, описанную в SEQ ID NO: 7. Кроме того, нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность, описанную в SEQ ID NO: 7, может представлять собой нуклеотидную последовательность, описанную в SEQ ID NO: 8.
Нуклеотидная последовательность, кодирующая пептид 2A, полученная из вируса конского ринита A, может представлять собой нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, описанную в SEQ ID NO: 9. Кроме того, нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность, описанную в SEQ ID NO: 9, может представлять собой нуклеотидную последовательность, описанную в SEQ ID NO: 10.
Нуклеотидная последовательность, кодирующая пептид 2A, полученная из вируса ящура, может представлять собой нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, описанную в SEQ ID NO: 11. Кроме того, нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность, описанную в SEQ ID NO: 11, может представлять собой нуклеотидную последовательность, описанную в SEQ ID NO: 12.
Помимо пептидной последовательности 2A, которая является примером самоотщепляющейся последовательности, существуют другие самоотщепляющиеся последовательности, включающие пикорнавирусные последовательности 2A (например, полученные из вируса энцефаломиокардита, вируса энцефаломиелита мышей Тейлера, вируса, подобного вирусу Тейлера, вируса Саффолда, вируса конского ринита B, бычьего риновируса, вируса Ljungan, вируса сенека-валли, вируса гепатита уток), присутствующие у млекопитающих, и ифлавирусные последовательности 2A (например, полученные из инфекционного вируса флашерии, пикорна-подобного вируса Ectropisobliqua, пикорна-подобного вируса Perina nuda), Tetraviruses (например, из вируса Euprosterna elaeasa, вируса Providence) или Dicistroviridae (например, из вируса паралича сверчка, вируса дрозофилы C, вируса острого паралича пчел, кашмирского вируса пчел, израильского вируса острого паралича пчел), присутствующие у насекомых, среди РНК-вирусов с положительной цепью. Кроме того, примеры таких последовательностей, полученных из двухцепочечных РНК-вирусов, могут включать ротавирусные последовательности 2A (например, полученные из свиного ротавируса A, бычьего ротавируса C, человеческого ротавируса C, вируса диареи взрослых), присутствующие у млекопитающих, циповирусные последовательности 2A (например, полученные из вируса цитоплазматического полиэдроза гусениц тутового шелкопряда, циповируса шелкопряда непарного, циповируса Dendrolimus punctatus, циповируса пяденицы), присутствующие у насекомых, и тотивирусные последовательности 2A (например, полученные из вируса инфекционного мионекроза), присутствующие у Penaeid Shrimp. Как таковые, могут существовать разные последовательности 2A, которые не ограничиваются вышеперечисленными.
Кроме того, генная конструкция может содержать нуклеотидные последовательности (i) и (ii), которые в направлении от 5'-конца к 3'-концу располагаются в порядке (i)-(ii). Если SERCA2a-P2A-CCN5, вариант осуществления генной конструкции, экспрессируется в клетке, белок SERCA2a может быть вставлен в мембрану саркоплазматического ретикулума, а белок CCN5 может секретироваться из клетки.
Кроме того, генная конструкция (i) или (ii) может содержать функционально связанную с ней промоторную последовательность.
В данном описании термин "функционально связанный" относится к функциональной связи нуклеотидной регуляторной последовательности (такой как промотор, сигнальная последовательность или совокупность участков связывания факторов транскрипции) с другими нуклеотидными последовательностями. Регуляторная последовательность регулирует транскрипцию и/или трансляцию других нуклеотидных последовательностей.
C5-12
А именно, промотор, связанный с нуклеотидной последовательностью, кодирующей белок SERCA2a, или белок CCN5, может функционировать в клетках животных, предпочтительно в клетках млекопитающих, регулируя транскрипцию гена SERCA2a или гена CCN5. Промотор может включать промоторы, полученные из вирусов млекопитающих, и промоторы, полученные из геномов клеток млекопитающих. Кроме того, промотор включает синтетический промотор (синтетический мышечно- и сердечно-рестриктированный промотор, SP), полученный путем сочетания геномных последовательностей клеток млекопитающих и предназначенный для повышения специфической экспрессии в мышцах и сердце. Промотор может функционировать специфически в клетках сердца и может также функционировать в любых клетках.
В одном варианте осуществления промотор может быть вставлен в одном из следующих порядков: i) промотор-SERCA2a-P2A-промотор-CCN5, ii) промотор-CCN5-P2A-SERCA2a, iii) промотор-SERCA2a-P2A-CCN5, или iv) промотор-CCN5-P2A-SERCA2a.
C5-12
Промотор может быть выбран из группы, состоящей из промотора цитомегаловируса (CMV), позднего промотора аденовируса, промотора вируса коровьей оспы 7.5K, промотора SV40, промотора HSV tk, промотора RSV, промотора EF1 альфа, промотора металлотионеина, промотора бета-актина, промотора человеческого гена IL-2, промотора человеческого гена IFN, промотора человеческого гена IL-4, промотора человеческого гена лимфотоксина и промотора человеческого гена GM-CSF, а также синтетический мышечно- и сердечно-рестриктированный промотор (SP). Однако промотор не ограничивается приведенными примерами. Конкретно промотор может представлять собой промотор CMV.
Кроме того, генные конструкции настоящего изобретения можно доставлять в клетку с использованием липосом. Липосомы образуются спонтанно из фосфолипидов, диспергированных в водной среде, а липосомы, содержащие ген SERCA2a и ген CCN5, могут взаимодействовать с клетками посредством такого механизма, как эндоцитоз, адсорбция на клеточной поверхности или слияние с плазматической мембраной, доставляя таким образом ген SERCA2a и ген CCN5 в клетку.
В настоящем изобретении, если фармацевтическую композицию настоящего изобретения получают на основе вирусного вектора, содержащего генную конструкцию, способ введения фармацевтической композиции может включать в себя известные в данной области методы инфицирования вирусами. Кроме того, в настоящем изобретении, если генная конструкция содержится в оголенной рекомбинантной молекуле ДНК или плазмиде, для введения гена в клетки можно использовать метод микроинъекции, опосредованный липосомами метод трансфекции, метод обработки DEAE-декстраном и метод бомбардировки генами.
В другом аспекте настоящее изобретение предлагает рекомбинантный вектор экспрессии, нагруженный генной конструкцией.
В данном описании термин "вектор экспрессии" относится к рекомбинантному вектору, способному обеспечить экспрессию целевого белка в клетке-мишени хозяина, причем рекомбинантный вектор представляет собой генную конструкцию, которая содержит необходимые регуляторные элементы, функционально связанные с генной вставкой и обеспечивающие ее экспрессию.
Кроме того, вектор экспрессии может содержать сигнальную последовательность, обеспечивающую секрецию белка. Для эффективной трансляции вставленной нуклеотидной последовательности могут также потребоваться специфические сигналы инициации. Такие сигналы содержат старт-кодон ATG и примыкающие последовательности. Эффективность экспрессии можно увеличить путем введения соответствующего энхансера транскрипции или трансляции.
Вектор экспрессии может представлять собой вектор, выбранный из группы, состоящей из плазмидных векторов и космидных векторов.
Плазмидный вектор может включать в себя, без ограничения, коммерчески доступные плазмиды, такие как pUC18, pBAD и pIDTSAMRT-AMP.
В следующем аспекте настоящее изобретение предлагает рекомбинантный вирус, содержащий генную конструкцию.
Вирус может представлять собой любой вирус, выбранный из группы, состоящей из аденовируса, аденоассоциированного вируса (AAV), ретровируса, лентивируса, вируса простого герпеса, вируса коровьей оспы и т.п. Конкретно вирус может представлять собой, без ограничения, аденоассоциированный вирус.
Аденовирус широко используют в качестве вектора для переноса генов вследствие среднего размера его генома, простоты манипулирования, высокого титра, широкого диапазона клеток-мишеней и превосходной инфекционности. Его геном может фланкироваться 100-200 п.о. инвертированного концевого повтора (ITR), который является необъодимым цис-элементом для репликации и упаковки ДНК. Аденовирус может дополнительно содержать участки генома E1 (E1A и E1B), которые кодируют белки, участвующие в репликации вирусной ДНК.
Среди аденовирусных векторов можно использовать аденовирусы, неспособные к репликации, в которых отсутствуют участки E1. С другой стороны, участок E3 удаляют из обычных аденовирусных векторов, чтобы обеспечить сайт для вставки чужеродного гена.
Таким образом, генную конструкцию настоящего изобретения, содержащую ген SERCA2a и ген CCN5, можно вставить в участки, из которых удалены участки E1 (участок E1A и/или участок E1B, предпочтительно участок E1B) или участок E3. В одном варианте осуществления генную конструкцию, содержащую ген SERCA2a и ген CCN5, можно вставить в участок E3.
Кроме того, поскольку примерно до 105% генома дикого типа может быть упаковано в аденовирус, примерно 2 т.п.о. можно дополнительно упаковать в аденовирус. Таким образом, чужеродная последовательность, подлежащая вставке в аденовирус, может быть дополнительно связана с аденовирусным геномом.
Аденовирус включает 42 разных серотипа и подгруппы от А до F. В одном варианте осуществления аденовирусный вектор настоящего изобретения может быть получен из аденовируса типа 5, принадлежащего к подгруппе С. Биохимическая и генетическая информация о аденовирусе типа 5 хорошо известна.
Чужеродные гены, доставляемые аденовирусом, реплицируются как эписомы, и, следовательно, имеют очень низкую генотоксичность для клеток-хозяев.
Ретровирус широко используют в качестве вектора для переноса генов, поскольку ретровирус способен вставлять свой ген в геном хозяина и доставлять большое количество чужеродного генетического материала, и, кроме того, он может инфицировать широкий спектр клеток.
Чтобы сконструировать ретровирусный вектор, генную конструкцию, содержащую ген SERCA2a и ген CCN5, можно вставить в геном ретровируса вместо ретровирусной последовательности, с получением вируса, не способного к репликации. Чтобы получить вирионы, можно сконструировать и использовать упаковочную клеточную линию, которая экспрессирует гены gag, pol и env и не экспрессирует длинный концевой повтор (LTR) и последовательность Ψ.
Аденоассоциированный вирус (AAV) можно использовать в качестве системы доставки генов настоящего изобретения, поскольку он способен инфицировать неделящиеся клетки и обладает способностью инфицировать разные типы клеток. Детали конструирования и использования векторов AAV раскрыты в патентах США №№ 5139941 и 4797368. Как правило, AAV, содержащий генную конструкцию, которая содержит ген SERCA2a и ген CCN5, можно получить путем совместной трансформации плазмиды, содержащей генную конструкцию, которая содержит ген SERCA2a и ген CCN5, фланкированные двумя концевыми повторами AAV, и плазмиды экспрессии, содержащей кодирующую последовательность AVV дикого типа, в которой отсутствуют концевые повторы.
Векторы, полученные из вируса коровьей оспы, лентивируса или вируса простого герпеса, также можно использовать для доставки в клетку гена CCN5 и целевой нуклеотидной последовательности, подлежащей доставке.
В следующем аспекте настоящее изобретение предлагает фармацевтическую композицию для профилактики или лечения сердечной недостаточности, содержащую, в качестве активного ингредиента, генную конструкцию, рекомбинантный вектор экспрессии, или рекомбинантный вирус настоящего изобретения.
Если фармацевтическую композицию настоящего изобретения получают в виде препаратов, она может содержать фармацевтически приемлемые носители, включающие, без ограничения, лактозу, декстрозу, сахарозу, сорбит, маннит, крахмал, аравийскую камедь, фосфат кальция, альгинат, желатин, силикат кальция, микрокристаллическую целлюлозу, поливинилпирролидон, целлюлозу, воду, сироп, метилцеллюлозу, метилгидроксибензоат, пропилгидроксибензоат, тальк, стеарат магния и минеральное масло.
Лекарственная форма фармацевтической композиции может варьировать в зависимости от способа применения, и может находиться в виде препаратов для инъекций.
3
20
3
20
8
16
12
15
3
14
Дозу фармацевтической композиции настоящего изобретения предпочтительно определяют с учетом возраста, пола, состояния пациента, степени абсорбции активных ингредиентов в организме, скорости инактивации и лекарственных средств, используемых в сочетании; и если фармацевтическая композиция представляет собой вирус, фармацевтическую композицию можно вводить взрослому индивидууму в количестве от 1,0×10 до 1,0×10 вирусных геномов в день. Конкретно фармацевтическую композицию настоящего изобретения можно вводить взрослому индивидууму в количестве от 1,0×10 до 1,0×10, 1,0×10 до 1,0×10, 1,0×10 до 1,0×10, или 1,0×101 до 1,0×10вирусных геномов в день.
Если фармацевтическая композиция представляет собой плазмидный вектор, фармацевтическую композицию можно вводить взрослому индивидууму в концентрации от 0,1 мкг/1 мкл до 1 мг/1 мкл в день. Кроме того, если фармацевтическая композиция представляет собой плазмидный вектор, доза может составлять 0,1 мл, 1 мл, 2 мл, 3 мл, 4 мл, 5 мл, 6 мл, 7 мл, 8 мл, 9 мл, 10 мл или выше, и может включать все значения и диапазоны между ними.
В следующем аспекте настоящее изобретение предлагает фармацевтическую композицию для профилактики или лечения сердечной недостаточности, содержащую, в качестве активного ингредиента, белок SERCA2a и белок CCN5.
Фармацевтическую композицию настоящего изобретения вводят парентерально, причем парентеральное введение включает внутривенное введение, подкожное введение, внутримышечное введение, внутрибрюшинное введение, чрезкожное введение, непосредственное введение в ткань и т.п.
th
В данном описании термин "приемлемый носитель" относится к некоторым или всем из нижеприведенных веществ и включает вещества, подходящие для конкретной формы: растворители, разбавители, жидкие среды, диспергирующие средства, средства, способствующие суспендированию, поверхностно-активные вещества, средства, обеспечивающие изотоничность, загустители, эмульгаторы, консерванты, твердые связующие, смазывающие вещества и т.п. Alfanso R. Gennaro, Remington's Pharmaceutical Sciences, 19 edition, 1995, Macna Publishing Co. Easton, PA описывают разные носители для применения в фармацевтических композициях с использованием известных методов и составов. Примеры фармацевтически приемлемых носителей для фармацевтической композиции включают, без ограничения, перечисленные ниже средства. В состав фармацевтической композиции могут входить глюкоза, сахароза, крахмал, такой как кукурузный крахмал и картофельный крахмал, целлюлоза и ее производные, такие как натрийкарбоксиметилцеллюлоза, этилцеллюлоза и ацетат целлюлозы; трагакант в виде порошка; солод; желатин; тальк; вспомогательные вещества, такие как масло какао, воск для суппозиториев, арахисовое масло, хлопковое масло, сафлоровое масло, кунжутное масло, оливковое масло и соевое масло; гликоли, такие как пропиленгликоль; сложные эфиры, такие как этилолеат и этиллаурат; агар; буферы, такие как гидроксид магния и гидроксид алюминия; альгиновая кислота; апирогенная дистиллированная вода; изотонический солевой раствор; раствор Рингера; вода на основе этилового спирта и фосфата, лаурилсульфат натрия и стеарат магния, красители, высвобождающие средства, покрывающие средства, подсластители, вкусовые добавки и ароматизаторы, антиоксиданты и т.п., по усмотрению производителя.
В следующем аспекте настоящее изобретение предлагает способ профилактики или лечения сердечной недостаточности, включающий стадию введения фармацевтической композиции индивидууму.
В данном документе индивидуум может представлять собой млекопитающее, предпочтительно человека. А именно, индивидуум может представлять собой человека, или отличное от человека млекопитающее, где индивидуум может страдать от сердечной недостаточности, или иметь риск сердечной недостаточности.
В следующем аспекте настоящее изобретение предлагает фармацевтическую композицию для профилактики или лечения сердечной недостаточности, содержащую вектор экспрессии, нагруженный генной конструкцией, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок SERCA2a или его фрагмент; и вектор экспрессии, нагруженный генной конструкцией, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок CCN5 или его фрагмент.
Используют белок SERCA2a или его фрагмент, описанный выше для генной конструкции. Используют белок CCN5 или его фрагмент, описанный выше для генной конструкции.
Кроме того, генная конструкция может содержать функционально связанную промоторную последовательность.
А именно, промотор, связанный с нуклеотидной последовательностью, кодирующей белок CCN5 или его фрагмент, может функционировать, предпочтительно в клетках животных, более предпочтительно, в клетках млекопитающих, регулируя транскрипцию гена CCN5. Промотор включает промоторы, полученные из вирусов млекопитающих, и промоторы, полученные из геномов клеток млекопитающих. Промотор может специфически функционировать в клетках сердца, или он может функционировать в любых клетках.
Промотор представляет собой описанный выше промотор, а именно, он может представлять собой промотор CMV.
В следующем аспекте настоящее изобретение предлагает фармацевтическую композицию для профилактики или лечения сердечной недостаточности, содержащую рекомбинантный вирус, включающий генную конструкцию, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок SERCA2a или его фрагмент; и рекомбинантный вирус, включающий генную конструкцию, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок CCN5 или его фрагмент.
Генная конструкция, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок SERCA2a или его фрагмент, и генная конструкция, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок CCN5 или его фрагмент, описаны для "фармацевтической композиции для профилактики или лечения сердечной недостаточности, содержащей вектор экспрессии, нагруженный генной конструкцией, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок SERCA2a или его фрагмент; и вектор экспрессии, нагруженный генной конструкцией, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок CCN5 или его фрагмент".
В следующем аспекте настоящее изобретение предлагает способ профилактики или лечения сердечной недостаточности, включающий (i) стадию введения индивидууму вектора экспрессии, нагруженного нуклеотидной последовательностью, кодирующей белок SERCA2a или его фрагмент; и (ii) стадию введения индивидууму вектора экспрессии, нагруженного нуклеотидной последовательностью, кодирующей белок CCN5 или его фрагмент.
В данном документе индивидуум может представлять собой млекопитающее, предпочтительно человека. А именно, индивидуум может представлять собой человека, или отличное от человека млекопитающее, где индивидуум может страдать от сердечной недостаточности, или иметь риск сердечной недостаточности.
Стадии введения (i) и (ii) можно проводить одновременно. Или, после проведения стадии (i) или (ii), другую стадию введения можно проводить через некоторый интервал времени.
В следующем аспекте настоящее изобретение предлагает способ профилактики или лечения сердечной недостаточности, включающий (i) стадию введения рекомбинантного вируса, который содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок SERCA2a; и (ii) стадию введения рекомбинантного вируса, который содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок CCN5.
В данном документе индивидуум может представлять собой млекопитающее, предпочтительно человека. А именно, индивидуум может представлять собой человека, или отличное от человека млекопитающее, где индивидуум может страдать от сердечной недостаточности, или иметь риск сердечной недостаточности.
Стадии введения (i) и (ii) можно проводить одновременно. Или, после проведения стадии (i) или (ii), другую стадию введения можно проводить через некоторый интервал времени.
В следующем аспекте настоящее изобретение предлагает применение генной конструкции настоящего изобретения для профилактики или лечения сердечной недостаточности.
В следующем аспекте настоящее изобретение предлагает применение рекомбинантного вектора экспрессии настоящего изобретения для профилактики или лечения сердечной недостаточности.
В следующем аспекте настоящее изобретение предлагает применение рекомбинантного вируса настоящего изобретения для профилактики или лечения сердечной недостаточности.
В следующем аспекте настоящее изобретение предлагает применение генной конструкции настоящего изобретения для получения фармацевтической композиции для профилактики или лечения сердечной недостаточности.
В следующем аспекте настоящее изобретение предлагает применение рекомбинантного вектора экспрессии настоящего изобретения для получения фармацевтической композиции для профилактики или лечения сердечной недостаточности.
В следующем аспекте настоящее изобретение предлагает применение рекомбинантного вируса настоящего изобретения для получения фармацевтической композиции для профилактики или лечения сердечной недостаточности.
СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Далее настоящее изобретение будет подробно описано с помощью экспериментальных примеров и примеров. Однако нижеследующие экспериментальные примеры и примеры предназначены только для иллюстрации настоящего изобретения, и настоящее изобретение не ограничивается нижеследующими примерами и примерами способов получения.
Пример способа получения 1. Конструирование генных конструкций и AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5
Конструируют генные конструкции PTR-CMV-SERCA2a, pTR-CMV-CCN5, pTR-CMV-SERC2a-P2A-CCN5 и pTR-CMV-CCN5-P2A-SERC2a, обеспечивающие экспрессию белка CCN5 и белка SERCA2a по отдельности или одновременно (фиг. 1a-1d).
Фрагмент SERCA2a состоит из полноразмерной последовательности кДНК человеческого белка SERCA2a. Следующий связанный фрагмент P2A представляет собой самоотщепляющийся участок, полученный из свиного тешовируса-1 и состоящий из нуклеотидной последовательности, кодирующей 22 аминокислоты. И, наконец, фрагмент CCN5 состоит из полноразмерной последовательности кДНК человеческого белка CCN5.
ой
ой
Рекомбинантную плазмиду pTR-CMV-SERCA2a-P2A-CCN5 получают путем удаления фрагмента люциферазы из вектора pTR-CMV-люцифераза и вставки вместо него генной конструкции SERCA2a-P2A-CCN5. Белок, продуцируемый рекомбинантной плазмидой, разделяется на белок SERCA2a и белок CCN5 в результате саморасщепления между 21 аминокислотой, глицином, и 22 аминокислотой, пролином, в участке P2A. Белок SERCA2a может оставаться в мембране эндоплазматического ретикулума и выполнять присущую ему функцию. Белок CCN5 может мигрировать в эндоплазматический ретикулум и затем секретироваться из клетки в форме, которую отщепляет сигнальный пептид, тем самым выполняя присущую ему функцию. Рекомбинантную плазмиду pTR-CMV-CCN5-P2A-SERCA2a также конструируют путем удаления фрагмента люциферазы из вектора pTR-CMV-люцифераза и вставки вместо него генной конструкции CCN5-P2A-SERCA2a. Опять же, полученный в результате белок разделяется на белок SERCA2a и белок CCN5 благодаря такой же функции последовательности P2A.
Для получения самокомплементарного аденоассоциированного вируса (AAV, серотип 9) человеческий ген CCN5 и ген SERCA2a клонируют в векторе pds-AAV2-EGFP. Чтобы улучшить упаковку вируса и эффективность доставки вируса, последовательность eGFP удаляют во время конструирования вектора AAV. Рекомбинантный AAV конструируют с использованием клеток 293T. Частицы AAV в клеточной культуре собирают и осаждают сульфатом аммония. Полученный продукт очищают ультрацентрифугированием с использованием градиента иодиксанола. Частицы AAV обогащены путем нескольких процессов разбавления и обогащения таким образом, чтобы иодиксанол обменивался с лактат-содержащим раствором Рингера с использованием центрифугирования. Концентрацию AAV определяют методами количественной ОТ-ПЦР и SDS-PAGE.
Экспериментальный метод 1. Анализ поглощения кальция
2
3
Клеточную линию 293T, содержащую экспрессируемый ген, гомогенизируют в растворе pH 7,0, содержащем 40 мМ имидазол, 10 мМ NaF, 1 мМ EDTA, 300 мМ сахарозу и 0,5 мМ DTT, после чего 500 мкг лизата добавляют к буферу для измерения поглощения pH 7,0, содержащему 100 мМ KCl, 5 мМ MgCl, 5 мМ NaN, 0,5 M EGTA и 40 мМ имидазол. Поглощение измеряют с использованием pCa 6 (0,0185 мкмоль) кальций-содержащих радиоизотопов. Обрабатывают 1 мкМ рутением красным (Sigma Aldrich) и оставляют стоять при температуре 37°С в течение 3 минут. Затем реакционную смесь оставляют стоять до проведения обработки 5 мМ оксалатом K и Mg-ATP (Sigma Aldrich). 500 мкл продукта реакции фильтруют через фильтр 0,45 мкм (Millipore) до 4 минут с интервалами в 1 минуту и измеряют число импульсов в минуту (cpm) с помощью сцинтилляционного счетчика (Beckman).
Экспериментальный метод 2. Вестерн-блоттинг
st
Клетки или ткани сердца гомогенизируют в минимальном объеме 50 мМ раствора трис-HCl, рН 7,4, в который добавляют смесь ингибиторов протеаз широкого спектра действия (Calbiochem). Белки разделяют методом SDS-PAGE и переносят на поливинилиденфторидную мембрану (Schleicher & Schuell). После блокирования 5% (масс./объем) обезжиренным молоком в течение 1 часа и промывания на TBST мембране дают взаимодействовать с антителом против SERCA2a (21 Century Biochemical), антителом против CCN5 (Sigma Aldrich) и антителом против GAPDH (Sigma-Aldrich)). Затем мембрану подвергают взаимодействию с вторичным антителом, конъюгированным с пероксидазой хрена (Jackson ImmunoResearch, WestGrove, PA, USA), и окрашивают с использованием хемилюминесцентного субстрата (Dogen). Полученный результат фотографируют и количественно оценивают с использованием программного обеспечения LAS.
Экспериментальный метод 3. Окрашивание ткани
Ткани сердца берут у животных моделей и затем фиксируют 10% (масс./объем) формалином при комнатной температуре в течение 5 дней. Затем промывают PBS. Каждый образец погружают в парафин и блок ткани разрезают, получая срезы толщиной 7 мкм. Чтобы проверить степень фиброза и инфаркта миокарда, полученный результат окрашивают пикросириусом красным (Sigma Aldrich) и трихромом по Массону (Sigma Aldrich). Затем наблюдают с помощью оптического микроскопа.
Экспериментальный метод 4. Измерение функции миокарда методом эхокардиографии
Мышей анестезируют путем внутрибрюшинной инъекции кетамина (95 мг/кг) и ксилазина (5 мг/кг) и проводят эхокардиографию. Регистрацию осуществляют с использованием 2-мерной визуализации и функции слежения в М-режиме, были определяют фракцию сокращения и соотношение размеров желудочков (GE Vivid Vision).
Экспериментальный метод 5. Измерение функции миокарда с использованием гемодинамических параметров
Измерение гемодинамики in vivo проводят с использованием катетера для измерения давления-объема 1.2Fr (Scisense Inc., Ontario, Canada). Мышей анестезируют путем внутрибрюшинной инъекции кетамина (95 мг/кг) и ксилазина (5 мг/кг), интубируют с помощью трахеостомии и проводят вентиляцию, регулируя механический воздушный поток до дыхательного объема 7 мкл/г и 120 вдохов в минуту. Катетер для измерения давления-объема (PV) помещают в левый желудочек, результаты измерения объема-давления анализируют с использованием программного обеспечения IOX2 (emka TECHNOLOGIES).
Пример 1. Идентификация экспрессии белка
Чтобы наблюдать экспрессию белка SERCA2a и белка CCN5 рекомбинантной плазмидой, pTR-CMV-SERA2a, pTR-CMV-CCN5 или pTR-CMV-SERCA2a-P2A-CCN5, полученные в экспериментальном примере 1, доставляют в культивированные клетки с использованием липофектамина. Полученные клетки и культуры подвергают вестерн-блоттингу по способу, описанному в экспериментальном методе 2, чтобы подтвердить экспрессию белков SERCA2a, CCN5 и GAPDH.
В результате установлено, что в случае экспрессии под управлением одного промотора белок SERCA2a сохраняется в цитоплазме, а белок CCN5 секретируется из клетки (Fig. 2a).
Кроме того, для сравнения уровня экспрессии и активности белков, pTR-CMV-SERC2a-P2A-CCN5 и pTR-CMV-CCN5-P2A-SERC2a, полученные в экспериментальном примере 1, доставляют в культивированные клетки с использованием липофектамина. Полученные клетки и культуры подвергают анализу на поглощение кальция по способу, описанному в экспериментальном способе 1.
В результате не наблюдают значительных различий в уровнях экспрессии белка SERCA2a и белка CCN5, а клетки, экспрессирующие pTR-CMV-CCN5-P2A-SERC2a, характеризуются низким уровнем поглощения кальция (фиг. 2b и 2c).
Это связано с тем, что белок CCN5 является секретируемым белком, что позволяет предположить, что когда белок SERCA2a и белок CCN5 экспрессируются в порядке SERCA2a-CCN5, оба белка экспрессируются в своей нормальной структуре, а если белок SERCA2a и белок CCN5 экспрессируются в порядке CCN5-SERCA2a, белок SERCA2a, который транслируется вслед за белком CCN5, может быть получен в виде аномального белка с топологией, противоположной его исходной топологии.
I. Идентификация терапевтического эффекта в отношении сердечной недостаточности
Чтобы идентифицировать терапевтический эффект в отношении сердечной недостаточности, рекомбинантный вирус настоящего изобретения, содержащий генную конструкцию, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок SERCA2a, и нуклеотидную последовательность, кодирующую белок CCN5, вводят мышам с сердечной недостаточностью, индуцированной множественной этиологией.
Мыши с индуцированной сердечной недостаточностью включают модель сердечной недостаточности, индуцированной ишемически-реперфузионным повреждением, модель сердечной недостаточности, индуцированной поперечным сокращением аорты, и модель сердечной недостаточности, индуцированной ангиотензином II. Мышей с индуцированной сердечной недостаточностью подразделяют на группу AAV9-контроль, группу, получающую AAV9-SERCA2a, группу, получающую AAV9-CCN5, и группу, получающую AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5, после чего сравнивают терапевтические эффекты в отношении сердечной недостаточности в разных группах.
Экспериментальный пример 1. Идентификация терапевтического эффекта в отношении сердечной недостаточности у мышей с сердечной недостаточностью, индуцированной ишемически-реперфузионным повреждением.
Экспериментальный пример 1.1. Получение мышей с сердечной недостаточностью, индуцированной ишемически-реперфузионным повреждением, и введение рекомбинантного вируса
11
Мышей B6C3F1 возрастом 8-10-недель анестезируют путем внутрибрюшинной инъекции кетамина (95 мг/кг) и ксилазина (5 мг/кг) и подвергают хирургическому вмешательству. Чтобы индуцировать ишемию, трубку из полиэтилена 10 (РЕ10) диаметром 1 мм помещают на левую переднюю нисходящую коронарную артерию и привязывают. Через 30 минут индуцируют реперфузию путем отсоединения и удаления трубки PE10. Одновременно с индукцией реперфузии каждой мыши вводят через хвостовую вену 1×10 вирусных геномов (vg) AAV9-контроль, AAV9-CCN5, AAV9-SERCA2a или AAV9-SERCA2a+AAV9-CCN5. Через 4 недели проводят измерение функции миокарда и гистологический анализ (рис. 3).
Экспериментальный пример 1.2. Идентификация экспрессии белка CCN5 и/или белка SERCA2a
Вначале, чтобы определить, произошла ли эффективная доставка вирусного генома, проверяют экспрессию белка SERCA2a и белка CCN5 с помощью вестерн-блоттинга по способу, описанному в экспериментальном методе 2.
В результате установлено, что по сравнению с группой, получающей AAV9-контроль, экспрессия белка CCN5 значительно повышена в группе, получающей AAV9-CCN5, а экспрессия белка SERCA2a в значительной степени нормализована в группе, получающей AAV9-SERCA2a. Кроме того, установлено, что в группе, получающей совместное введение AAV9-CCN5 и AAV9-SERCA2a, экспрессия белка CCN5 и белка SERCA2a значительно повышены (фиг. 4a-4c).
Экспериментальный пример 1.3. Идентификация эффекта уменьшения области инфаркта сердца
Сердца извлекают из мышей, у которых сердечная недостаточность была индуцирована ишемически-реперфузионным повреждением, и фотографируют. Окрашивание тканей проводят по способу, описанному в экспериментальном методе 3.
Результаты демонстрируют, что в группе, получающей AAV9-CCN5, в группе, получающей AAV9-SERCA2a, и в группе, получающей сочетание AAV9-CCN5 и AAV9-SERCA2a, наблюдается значительно меньший размер области инфаркта по сравнению с областью инфаркта в группе, получающей AAV9-контроль. В частности, в группе, получающей сочетание AAV9-CCN5 и AAV9-SERCA2a, наблюдается значительно меньший размер области инфаркта (фиг. 5 и 6). Кроме того, из графика, полученного путем количественного определения доли площади инфаркта от общей площади сердца, видно, что в группе, получающей сочетание AAV9-CCN5 и AAV9-SERCA2a, наблюдается значительное уменьшение доли области инфаркта (фиг. 7).
Экспериментальный пример 1.4. Идентификация эффекта увеличения сердечной сократимости
Проводят эхокардиографию и определяют гемодинамические параметры, чтобы определить, могут ли морфологические изменения в ткани сердца влиять на сердечную сократимость.
Чтобы измерить фракцию сокращения (FS), параметр сердечной сократимости, эхокардиографию проводят по способу, описанному в экспериментальном методе 4. Полученные результаты показывают, что фракция сокращения, которая была уменьшена вследствие ишемически-реперфузионного повреждения, в значительной степени восстанавливается в группе, получающей AAV9-CCN5, в группе, получающей AAV9-SERCA2a, и в группе, получающей сочетание AAV9-CCN5 и AAV9-SERCA2a. В частности, в группе, получающей сочетание AAV9-CCN5 и AAV9-SERCA2a заметно увеличение фракции сокращения (рис. 8).
Кроме того, измерение гемодинамики проводят по способу, описанному в экспериментальном методе 5, для точного анализа сердечной сократимости. В результате отношение конечного систолического давления к объему (ESPVR), параметр систолической силы миокарда, уменьшается вследствие ишемически-реперфузионного повреждения. В группе, получающей AAV9-SERCA2a, наблюдается гораздо более высокий ESPVR, а в группе, получающей AAV9-CCN5, существенное увеличение ESPVR отсутствует. Такое же явление наблюдается в исследовании CCN5, подтверждая тот факт, что CCN5 не влияет на сердечную недостаточность. Кроме того, в группе, получающей сочетание AAV9-CCN5 и AAV9-SERCA2a, наблюдается синергетически повышенное ESPVR (рис. 9а).
Кроме того, установлено, что конечно-диастолическое отношение объема и давления (EDPVR), параметр диастолической силы миокарда, увеличивается при ишемически-реперфузионном повреждении. В группе, получающей AAV9-CCN5, наблюдается значительное снижение EDPVR, а в группе, получающей AAV9-SERCA2a, отсутствует значительное снижение EDPVR. Данный результат, как и в предыдущих исследованиях, подтверждает тот факт, что белок SERCA2a не влияет на диастолическую сердечную недостаточность. Кроме того, в группе, получающей сочетание AAV9-CCN5 и AAV9-SERCA2a, наблюдается значительное снижение EDPVR (фиг. 9b).
На основании полученных данных установлено, что сочетание введения AAV9-CCN5 и AAV9-SERCA2a позволяет достичь синергического терапевтического эффекта.
Экспериментальный пример 2. Идентификация терапевтического эффекта в отношении сердечной недостаточности у мышей с сердечной недостаточностью, индуцированной поперечным сокращением аорты
Экспериментальный пример 2.1. Получение мышей с сердечной недостаточностью, индуцированной поперечным сокращением аорты, и введение рекомбинантного вируса
11
Мышей B6C3F1 в возрасте от 8 до 10 недель анестезируют путем внутрибрюшинной инъекции кетамина (95 мг/кг) и ксилазина (5 мг/кг) и подвергают хирургическому вмешательству. Для обеспечения поля зрения дуги аорты продольно рассекают от 2 до 3 мм проксимальной части грудины. После этого с помощью иглы 27-го калибра устанавливают соединение между безымянной артерией и сонной артерией. Затем проводят завязывание и иглу удаляют, что вызывает сужение поперечной аорты. Через 8 недель после индукции сердечной недостаточности путем сужения каждой мыши вводят через хвостовую вену 1×10 мкг AAV9-контроль, AAV9-CCN5, AAV9-SERCA2a или AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5. Через 8 недель проводят измерения функции миокарда и гистологический анализ (рис. 10).
Экспериментальный пример 2.2. Идентификация экспрессии белка CCN5 и/или белка SERCA2a
Вначале, чтобы определить, была ли осуществлена эффективная доставка вирусного генома, проверяют экспрессию белка SERCA2a и белка CCN5 методом вестерн-блоттинга по способу, описанному в экспериментальном методе 2. Результаты показывают, что по сравнению с группой, получающей AAV9-контроль, экспрессия белка CCN5 значительно увеличена в группе, получающей AAV9-CCN5, а экспрессия белка SERCA2a значительно увеличена в группе, получающей AAV9-SERCA2a. Кроме того, установлено, что и в группе, получающей AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5, экспрессия белка CCN5 и экспрессия белка SERCA2a значительно повышены (фиг. 11a-11c).
Экспериментальный пример 2.3. Идентификация эффекта уменьшения внутренних размеров сердца
Сердца извлекают у мышей с сердечной недостаточностью, индуцированной ишемически-реперфузионным повреждением, ткани сердца окрашивают трихромом по Массону по способу, описанному в экспериментальном методе 3. Результаты показывают, что в группе, получающей AAV9-контроль, наблюдается увеличение внутренних размеров сердца; а в группе, получающей AAV9-CCN5, в группе, получающей AAV9-SERCA2a, и в группе, получающей AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5, наблюдается уменьшение внутренних размеров сердца. В частности, установлено, что в группе, получающей AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5, наблюдается значительное уменьшение внутренних размеров. Кроме того, установлено, что в группе, получающей AAV9-CCN5, в группе, получающей AAV9-SERCA2a, и в группе, получающей AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5, наблюдается снижение степени фиброза сердца, вызванного сердечной недостаточностью (фиг. 12).
Экспериментальный пример 2.4. Идентификация эффекта повышения сердечной сократимости
Проводят эхокардиографию и определяют гемодинамические параметры, чтобы определить, могут ли морфологические изменения в ткани сердца влиять на сердечную сократимость.
Чтобы измерить фракцию сокращения (FS), параметр сердечной сократимости, эхокардиографию проводят по способу, описанному в экспериментальном методе 4. Полученные результаты показывают, что фракция сокращения, которая была уменьшена вследствие сокращения аорты, в значительной степени восстанавливается в группе, получающей AAV9-CCN5, в группе, получающей AAV9-SERCA2a, и в группе, получающей сочетание AAV9-CCN5 и AAV9-SERCA2a. В частности, в группе, получающей AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5, заметно увеличение фракции сокращения (фиг. 13).
Кроме того, измерение гемодинамики проводят по способу, описанному в экспериментальном методе 5, для точного анализа сердечной сократимости. В результате отношение конечного систолического давления к объему (ESPVR), параметр систолической силы миокарда, уменьшается вследствие сокращения аорты. В группе, получающей AAV9-SERCA2a, наблюдается значительное восстановление ESPVR, а в группе, получающей AAV9-CCN5, существенное восстановление ESPVR отсутствует. Кроме того, в группе, получающей AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5, наблюдается значительное повышение ESPVR (фиг. 14a).
Кроме того, установлено, что конечно-диастолическое отношение объема и давления (EDPVR), параметр диастолической силы миокарда, увеличивается при ишемически-реперфузионном повреждении. В группе, получающей AAV9-CCN5, наблюдается значительное снижение EDPVR, а в группе, получающей AAV9-SERCA2a, отсутствует значительное снижение EDPVR. Кроме того, в группе, получающей AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5 наблюдается значительное снижение EDPVR (фиг. 14b).
На основании полученных данных установлено, что введение AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5 позволяет достичь синергического терапевтического эффекта.
Экспериментальный пример 3. Идентификация терапевтического эффекта в отношении сердечной недостаточности у мышей с сердечной недостаточностью, индуцированной введением ангиотензина II (Ang II)
Экспериментальный пример 3.1. Получение мышей с сердечной недостаточностью, индуцированной введением ангиотензина II, и введение рекомбинантного вируса
11
Мышей B6C3F1 в возрасте от 8 до 10 недель анестезируют путем внутрибрюшинной инъекции кетамина (95 мг/кг) и ксилазина (5 мг/кг) и индуцируют сердечную недостаточность путем подкожной инфузии ангиотензина II (Ang II). Ангиотензин II вводят подкожно в течение 2 недель в концентрации 3 мг/кг в день с использованием небольшого осмотического насоса (Alzet 1002, Alzet). Через 2 недели после индукции сердечной недостаточности Ang II каждой мыши через хвостовую вену вводят 1×10 вирусных геномов (vgs) AAV9-контроль, AAV9-CCN5, AAV9-SERCA2a или AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5. Через 4 недели проводят измерение функции миокарда и гистологический анализ (фиг. 15).
Экспериментальный пример 3.2. Идентификация экспрессии белка CCN5 и/или белка SERCA2a
Вначале, чтобы определить, была ли осуществлена эффективная доставка вирусного генома, проверяют экспрессию белка SERCA2a и белка CCN5 методом вестерн-блоттинга по способу, описанному в экспериментальном методе 2.
Результаты показывают, что по сравнению с группой, получающей AAV9-контроль, экспрессия белка CCN5 значительно увеличена в группе, получающей AAV9-CCN5, а экспрессия белка SERCA2a значительно увеличена в группе, получающей AAV9-SERCA2a. Кроме того, установлено, что и в группе, получающей AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5, экспрессия белка CCN5 и экспрессия белка SERCA2a значительно повышены (фиг. 16a-16c).
Экспериментальный пример 3.3. Идентификация эффекта уменьшения внутренних размеров сердца и изменения толщины внутренней стенки сердца
Сердца извлекают у мышей с сердечной недостаточностью, индуцированной введением ангиотензина II, ткани сердца окрашивают трихромом по Массону по способу, описанному в экспериментальном методе 3.
Результаты показывают, что в группе, получающей AAV9-контроль, наблюдается увеличение внутренних размеров сердца; а в группе, получающей AAV9-CCN5, в группе, получающей AAV9-SERCA2a, и в группе, получающей AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5, наблюдается уменьшение внутренних размеров сердца. В частности, установлено, что в группе, получающей AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5, наблюдается значительное уменьшение размеров просвета (фиг. 17).
Кроме того, проводят эхокардиографию по способу, описанному в примере 6, чтобы измерить толщину внутренней стенки сердца. Изменение толщины внутренней стенки сердца определяют количественно и графически.
Полученные результаты показывают, что толщина внутренней стенки сердца уменьшается после инфузии ангиотензина II, а в группе, получающей AAV9-CCN5, в группе, получающей AAV9-SERCA2a, и в группе, получающей AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5, наблюдается значительно восстановление толщины внутренней стенки сердца (фиг. 18).
Экспериментальный пример 3.4. Идентификация эффекта повышения сердечной сократимости
Проводят эхокардиографию и определяют гемодинамические параметры, чтобы определить, могут ли морфологические изменения в ткани сердца влиять на сердечную сократимость.
Чтобы измерить фракцию сокращения (FS), параметр сердечной сократимости, эхокардиографию проводят по способу, описанному в экспериментальном методе 4. Полученные результаты показывают, что фракция сокращения, которая была уменьшена вследствие сокращения аорты, в значительной степени восстанавливается в группе, получающей AAV9-CCN5, в группе, получающей AAV9-SERCA2a, и в группе, получающей сочетание AAV9-CCN5 и AAV9-SERCA2a. В частности, в группе, получающей AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5, заметно восстанавливается фракция сокращения (фиг. 19). На основании полученных данных установлено, что введение AAV9-SERCA2a-P2A-CCN5 позволяет достичь синергического терапевтического эффекта.
<110>    BethphaGen Inc.
<120>    ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ ИЛИ ЛЕЧЕНИЯ СЕРДЕЧНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ
<130>    PCB807071BPG
<150>    KR 2017/127442
<151>    2017-09-29
<160>    14
<170>    KoPatentIn 3.0
<210>    1
<211>    997
<212>    Белок
<213>    Homo sapiens
<400>    1
Met Glu Asn Ala His Thr Lys Thr Val Glu Glu Val Leu Gly His Phe
1               5                  10                  15
Gly Val Asn Glu Ser Thr Gly Leu Ser Leu Glu Gln Val Lys Lys Leu
20                  25                  30
Lys Glu Arg Trp Gly Ser Asn Glu Leu Pro Ala Glu Glu Gly Lys Thr
35                  40                  45
Leu Leu Glu Leu Val Ile Glu Gln Phe Glu Asp Leu Leu Val Arg Ile
50                  55                  60
Leu Leu Leu Ala Ala Cys Ile Ser Phe Val Leu Ala Trp Phe Glu Glu
65                  70                  75                  80
Gly Glu Glu Thr Ile Thr Ala Phe Val Glu Pro Phe Val Ile Leu Leu
85                  90                  95
Ile Leu Val Ala Asn Ala Ile Val Gly Val Trp Gln Glu Arg Asn Ala
100                 105                 110
Glu Asn Ala Ile Glu Ala Leu Lys Glu Tyr Glu Pro Glu Met Gly Lys
115                 120                 125
Val Tyr Arg Gln Asp Arg Lys Ser Val Gln Arg Ile Lys Ala Lys Asp
130                 135                 140
Ile Val Pro Gly Asp Ile Val Glu Ile Ala Val Gly Asp Lys Val Pro
145                 150                 155                 160
Ala Asp Ile Arg Leu Thr Ser Ile Lys Ser Thr Thr Leu Arg Val Asp
165                 170                 175
Gln Ser Ile Leu Thr Gly Glu Ser Val Ser Val Ile Lys His Thr Asp
180                 185                 190
Pro Val Pro Asp Pro Arg Ala Val Asn Gln Asp Lys Lys Asn Met Leu
195                 200                 205
Phe Ser Gly Thr Asn Ile Ala Ala Gly Lys Ala Met Gly Val Val Val
210                 215                 220
Ala Thr Gly Val Asn Thr Glu Ile Gly Lys Ile Arg Asp Glu Met Val
225                 230                 235                 240
Ala Thr Glu Gln Glu Arg Thr Pro Leu Gln Gln Lys Leu Asp Glu Phe
245                 250                 255
Gly Glu Gln Leu Ser Lys Val Ile Ser Leu Ile Cys Ile Ala Val Trp
260                 265                 270
Ile Ile Asn Ile Gly His Phe Asn Asp Pro Val His Gly Gly Ser Trp
275                 280                 285
Ile Arg Gly Ala Ile Tyr Tyr Phe Lys Ile Ala Val Ala Leu Ala Val
290                 295                 300
Ala Ala Ile Pro Glu Gly Leu Pro Ala Val Ile Thr Thr Cys Leu Ala
305                 310                 315                 320
Leu Gly Thr Arg Arg Met Ala Lys Lys Asn Ala Ile Val Arg Ser Leu
325                 330                 335
Pro Ser Val Glu Thr Leu Gly Cys Thr Ser Val Ile Cys Ser Asp Lys
340                 345                 350
Thr Gly Thr Leu Thr Thr Asn Gln Met Ser Val Cys Arg Met Phe Ile
355                 360                 365
Leu Asp Arg Val Glu Gly Asp Thr Cys Ser Leu Asn Glu Phe Thr Ile
370                 375                 380
Thr Gly Ser Thr Tyr Ala Pro Ile Gly Glu Val His Lys Asp Asp Lys
385                 390                 395                 400
Pro Val Asn Cys His Gln Tyr Asp Gly Leu Val Glu Leu Ala Thr Ile
405                 410                 415
Cys Ala Leu Cys Asn Asp Ser Ala Leu Asp Tyr Asn Glu Ala Lys Gly
420                 425                 430
Val Tyr Glu Lys Val Gly Glu Ala Thr Glu Thr Ala Leu Thr Cys Leu
435                 440                 445
Val Glu Lys Met Asn Val Phe Asp Thr Glu Leu Lys Gly Leu Ser Lys
450                 455                 460
Ile Glu Arg Ala Asn Ala Cys Asn Ser Val Ile Lys Gln Leu Met Lys
465                 470                 475                 480
Lys Glu Phe Thr Leu Glu Phe Ser Arg Asp Arg Lys Ser Met Ser Val
485                 490                 495
Tyr Cys Thr Pro Asn Lys Pro Ser Arg Thr Ser Met Ser Lys Met Phe
500                 505                 510
Val Lys Gly Ala Pro Glu Gly Val Ile Asp Arg Cys Thr His Ile Arg
515                 520                 525
Val Gly Ser Thr Lys Val Pro Met Thr Ser Gly Val Lys Gln Lys Ile
530                 535                 540
Met Ser Val Ile Arg Glu Trp Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Arg Cys
545                 550                 555                 560
Leu Ala Leu Ala Thr His Asp Asn Pro Leu Arg Arg Glu Glu Met His
565                 570                 575
Leu Glu Asp Ser Ala Asn Phe Ile Lys Tyr Glu Thr Asn Leu Thr Phe
580                 585                 590
Val Gly Cys Val Gly Met Leu Asp Pro Pro Arg Ile Glu Val Ala Ser
595                 600                 605
Ser Val Lys Leu Cys Arg Gln Ala Gly Ile Arg Val Ile Met Ile Thr
610                 615                 620
Gly Asp Asn Lys Gly Thr Ala Val Ala Ile Cys Arg Arg Ile Gly Ile
625                 630                 635                 640
Phe Gly Gln Asp Glu Asp Val Thr Ser Lys Ala Phe Thr Gly Arg Glu
645                 650                 655
Phe Asp Glu Leu Asn Pro Ser Ala Gln Arg Asp Ala Cys Leu Asn Ala
660                 665                 670
Arg Cys Phe Ala Arg Val Glu Pro Ser His Lys Ser Lys Ile Val Glu
675                 680                 685
Phe Leu Gln Ser Phe Asp Glu Ile Thr Ala Met Thr Gly Asp Gly Val
690                 695                 700
Asn Asp Ala Pro Ala Leu Lys Lys Ala Glu Ile Gly Ile Ala Met Gly
705                 710                 715                 720
Ser Gly Thr Ala Val Ala Lys Thr Ala Ser Glu Met Val Leu Ala Asp
725                 730                 735
Asp Asn Phe Ser Thr Ile Val Ala Ala Val Glu Glu Gly Arg Ala Ile
740                 745                 750
Tyr Asn Asn Met Lys Gln Phe Ile Arg Tyr Leu Ile Ser Ser Asn Val
755                 760                 765
Gly Glu Val Val Cys Ile Phe Leu Thr Ala Ala Leu Gly Phe Pro Glu
770                 775                 780
Ala Leu Ile Pro Val Gln Leu Leu Trp Val Asn Leu Val Thr Asp Gly
785                 790                 795                 800
Leu Pro Ala Thr Ala Leu Gly Phe Asn Pro Pro Asp Leu Asp Ile Met
805                 810                 815
Asn Lys Pro Pro Arg Asn Pro Lys Glu Pro Leu Ile Ser Gly Trp Leu
820                 825                 830
Phe Phe Arg Tyr Leu Ala Ile Gly Cys Tyr Val Gly Ala Ala Thr Val
835                 840                 845
Gly Ala Ala Ala Trp Trp Phe Ile Ala Ala Asp Gly Gly Pro Arg Val
850                 855                 860
Ser Phe Tyr Gln Leu Ser His Phe Leu Gln Cys Lys Glu Asp Asn Pro
865                 870                 875                 880
Asp Phe Glu Gly Val Asp Cys Ala Ile Phe Glu Ser Pro Tyr Pro Met
885                 890                 895
Thr Met Ala Leu Ser Val Leu Val Thr Ile Glu Met Cys Asn Ala Leu
900                 905                 910
Asn Ser Leu Ser Glu Asn Gln Ser Leu Leu Arg Met Pro Pro Trp Glu
915                 920                 925
Asn Ile Trp Leu Val Gly Ser Ile Cys Leu Ser Met Ser Leu His Phe
930                 935                 940
Leu Ile Leu Tyr Val Glu Pro Leu Pro Leu Ile Phe Gln Ile Thr Pro
945                 950                 955                 960
Leu Asn Val Thr Gln Trp Leu Met Val Leu Lys Ile Ser Leu Pro Val
965                 970                 975
Ile Leu Met Asp Glu Thr Leu Lys Phe Val Ala Arg Asn Tyr Leu Glu
980                 985                 990
Pro Ala Ile Leu Glu
995
<210>    2
<211>    2991
<212>    ДНК
<213>    Homo sapiens
<400>    2
atggagaacg cgcacaccaa gacggtggag gaggtgctgg gccacttcgg cgtcaacgag         60
agtacggggc tgagcctgga acaggtcaag aagcttaagg agagatgggg ctccaacgag        120
ttaccggctg aagaaggaaa aaccttgctg gaacttgtga ttgagcagtt tgaagacttg        180
ctagttagga ttttattact ggcagcatgt atatcttttg ttttggcttg gtttgaagaa        240
ggtgaagaaa caattacagc ctttgtagaa ccttttgtaa ttttactcat attagtagcc        300
aatgcaattg tgggtgtatg gcaggaaaga aatgctgaaa atgccatcga agcccttaag        360
gaatatgagc ctgaaatggg caaagtgtat cgacaggaca gaaagagtgt gcagcggatt        420
aaagctaaag acatagttcc tggtgatatt gtagaaattg ctgttggtga caaagttcct        480
gctgatataa ggttaacttc catcaaatct accacactaa gagttgacca gtcaattctc        540
acaggtgaat ctgtctctgt catcaagcac actgatcccg tccctgaccc acgagctgtc        600
aaccaagata aaaagaacat gctgttttct ggtacaaaca ttgctgctgg gaaagctatg        660
ggagtggtgg tagcaactgg agttaacacc gaaattggca agatccggga tgaaatggtg        720
gcaacagaac aggagagaac accccttcag caaaaactag atgaatttgg ggaacagctt        780
tccaaagtca tctcccttat ttgcattgca gtctggatca taaatattgg gcacttcaat        840
gacccggttc atggagggtc ctggatcaga ggtgctattt actactttaa aattgcagtg        900
gccctggctg tagcagccat tcctgaaggt ctgcctgcag tcatcaccac ctgcctggct        960
cttggaactc gcagaatggc aaagaaaaat gccattgttc gaagcctccc gtctgtggaa       1020
acccttggtt gtacttctgt tatctgctca gacaagactg gtacacttac aacaaaccag       1080
atgtcagtct gcaggatgtt cattctggac agagtggaag gtgatacttg ttcccttaat       1140
gagtttacca taactggatc aacttatgca cctattggag aagtgcataa agatgataaa       1200
ccagtgaatt gtcaccagta tgatggtctg gtagaattag caacaatttg tgctctttgt       1260
aatgactctg ctttggatta caatgaggca aagggtgtgt atgaaaaagt tggagaagct       1320
acagagactg ctctcacttg cctagtagag aagatgaatg tatttgatac cgaattgaag       1380
ggtctttcta aaatagaacg tgcaaatgcc tgcaactcag tcattaaaca gctgatgaaa       1440
aaggaattca ctctagagtt ttcacgtgac agaaagtcaa tgtcggttta ctgtacacca       1500
aataaaccaa gcaggacatc aatgagcaag atgtttgtga agggtgctcc tgaaggtgtc       1560
attgacaggt gcacccacat tcgagttgga agtactaagg ttcctatgac ctctggagtc       1620
aaacagaaga tcatgtctgt cattcgagag tggggtagtg gcagcgacac actgcgatgc       1680
ctggccctgg ccactcatga caacccactg agaagagaag aaatgcacct tgaggactct       1740
gccaacttta ttaaatatga gaccaatctg accttcgttg gctgcgtggg catgctggat       1800
cctccgagaa tcgaggtggc ctcctccgtg aagctgtgcc ggcaagcagg catccgggtc       1860
atcatgatca ctggggacaa caagggcact gctgtggcca tctgtcgccg catcggcatc       1920
ttcgggcagg atgaggacgt gacgtcaaaa gctttcacag gccgggagtt tgatgaactc       1980
aacccctccg cccagcgaga cgcctgcctg aacgcccgct gttttgctcg agttgaaccc       2040
tcccacaagt ctaaaatcgt agaatttctt cagtcttttg atgagattac agctatgact       2100
ggcgatggcg tgaacgatgc tcctgctctg aagaaagccg agattggcat tgctatgggc       2160
tctggcactg cggtggctaa aaccgcctct gagatggtcc tggcggatga caacttctcc       2220
accattgtgg ctgccgttga ggaggggcgg gcaatctaca acaacatgaa acagttcatc       2280
cgctacctca tctcgtccaa cgtcggggaa gttgtctgta ttttcctgac agcagccctt       2340
ggatttcccg aggctttgat tcctgttcag ctgctctggg tcaatctggt gacagatggc       2400
ctgcctgcca ctgcactggg gttcaaccct cctgatctgg acatcatgaa taaacctccc       2460
cggaacccaa aggaaccatt gatcagcggg tggctctttt tccgttactt ggctattggc       2520
tgttacgtcg gcgctgctac cgtgggtgct gctgcatggt ggttcattgc tgctgacggt       2580
ggtccaagag tgtccttcta ccagctgagt catttcctac agtgtaaaga ggacaacccg       2640
gactttgaag gcgtggattg tgcaatcttt gaatccccat acccgatgac aatggcgctc       2700
tctgttctag taactataga aatgtgtaac gccctcaaca gcttgtccga aaaccagtcc       2760
ttgctgagga tgcccccctg ggagaacatc tggctcgtgg gctccatctg cctgtccatg       2820
tcactccact tcctgatcct ctatgtcgaa cccttgccac tcatcttcca gatcacaccg       2880
ctgaacgtga cccagtggct gatggtgctg aaaatctcct tgcccgtgat tctcatggat       2940
gagacgctca agtttgtggc ccgcaactac ctggaacctg caatactgga g                2991
<210>    3
<211>    250
<212>    Белок
<213>    Homo sapiens
<400>    3
Met Arg Gly Thr Pro Lys Thr His Leu Leu Ala Phe Ser Leu Leu Cys
1               5                  10                  15
Leu Leu Ser Lys Val Arg Thr Gln Leu Cys Pro Thr Pro Cys Thr Cys
20                  25                  30
Pro Trp Pro Pro Pro Arg Cys Pro Leu Gly Val Pro Leu Val Leu Asp
35                  40                  45
Gly Cys Gly Cys Cys Arg Val Cys Ala Arg Arg Leu Gly Glu Pro Cys
50                  55                  60
Asp Gln Leu His Val Cys Asp Ala Ser Gln Gly Leu Val Cys Gln Pro
65                  70                  75                  80
Gly Ala Gly Pro Gly Gly Arg Gly Ala Leu Cys Leu Leu Ala Glu Asp
85                  90                  95
Asp Ser Ser Cys Glu Val Asn Gly Arg Leu Tyr Arg Glu Gly Glu Thr
100                 105                 110
Phe Gln Pro His Cys Ser Ile Arg Cys Arg Cys Glu Asp Gly Gly Phe
115                 120                 125
Thr Cys Val Pro Leu Cys Ser Glu Asp Val Arg Leu Pro Ser Trp Asp
130                 135                 140
Cys Pro His Pro Arg Arg Val Glu Val Leu Gly Lys Cys Cys Pro Glu
145                 150                 155                 160
Trp Val Cys Gly Gln Gly Gly Gly Leu Gly Thr Gln Pro Leu Pro Ala
165                 170                 175
Gln Gly Pro Gln Phe Ser Gly Leu Val Ser Ser Leu Pro Pro Gly Val
180                 185                 190
Pro Cys Pro Glu Trp Ser Thr Ala Trp Gly Pro Cys Ser Thr Thr Cys
195                 200                 205
Gly Leu Gly Met Ala Thr Arg Val Ser Asn Gln Asn Arg Phe Cys Arg
210                 215                 220
Leu Glu Thr Gln Arg Arg Leu Cys Leu Ser Arg Pro Cys Pro Pro Ser
225                 230                 235                 240
Arg Gly Arg Ser Pro Gln Asn Ser Ala Phe
245                 250
<210>    4
<211>    750
<212>    ДНК
<213>    Homo sapiens
<400>    4
atgagaggca caccgaagac ccacctcctg gccttctccc tcctctgcct cctctcaaag         60
gtgcgtaccc agctgtgccc gacaccatgt acctgcccct ggccacctcc ccgatgcccg        120
ctgggagtac ccctggtgct ggatggctgt ggctgctgcc gggtatgtgc acggcggctg        180
ggggagccct gcgaccaact ccacgtctgc gacgccagcc agggcctggt ctgccagccc        240
ggggcaggac ccggtggccg gggggccctg tgcctcttgg cagaggacga cagcagctgt        300
gaggtgaacg gccgcctgta tcgggaaggg gagaccttcc agccccactg cagcatccgc        360
tgccgctgcg aggacggcgg cttcacctgc gtgccgctgt gcagcgagga tgtgcggctg        420
cccagctggg actgccccca ccccaggagg gtcgaggtcc tgggcaagtg ctgccctgag        480
tgggtgtgcg gccaaggagg gggactgggg acccagcccc ttccagccca aggaccccag        540
ttttctggcc ttgtctcttc cctgccccct ggtgtcccct gcccagaatg gagcacggcc        600
tggggaccct gctcgaccac ctgtgggctg ggcatggcca cccgggtgtc caaccagaac        660
cgcttctgcc gactggagac ccagcgccgc ctgtgcctgt ccaggccctg cccaccctcc        720
aggggtcgca gtccacaaaa cagtgccttc                                         750
<210>    5
<211>    22
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    самоотщепляющаяся последовательность, полученная из свиного тешовируса-1
<400>    5
Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
1               5                  10                  15
Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210>    6
<211>    66
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    самоотщепляющаяся последовательность, полученная из свиного тешовируса-1
<400>    6
ggaagcggag ctactaactt cagcctgctg aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct         60
ggacct                                                                    66
<210>    7
<211>    21
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    самоотщепляющаяся последовательность, полученная из вируса Thoseaasigna
<400>    7
Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu
1               5                  10                  15
Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210>    8
<211>    63
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    самоотщепляющаяся последовательность, полученная из вируса Thoseaasigna
<400>    8
ggaagcggag agggcagagg aagtctgcta acatgcggtg acgtcgagga gaatcctgga         60
cct                                                                       63
<210>    9
<211>    23
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    самоотщепляющаяся последовательность, полученная из вируса конского ринита A
(ERAV)
<400>    9
Gly Ser Gly Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp
1               5                  10                  15
Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210>    10
<211>    69
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    самоотщепляющаяся последовательность, полученная из вируса конского ринита A
(ERAV)
<400>    10
ggaagcggac agtgtactaa ttatgctctc ttgaaattgg ctggagatgt tgagagcaac         60
cctggacct                                                                 69
<210>    11
<211>    25
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    самоотщепляющаяся последовательность, полученная из FMDV 2A
<400>    11
Gly Ser Gly Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala
1               5                  10                  15
Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20                  25
<210>    12
<211>    75
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    самоотщепляющаяся последовательность, полученная из FMDV 2A
<400>    12
ggaagcggag tgaaacagac tttgaatttt gaccttctca agttggcggg agacgtggag         60
tccaaccctg gacct                                                          75
<210>    13
<211>    2994
<212>    ДНК
<213>    Homo sapiens
<400>    13
atggagaacg cgcacaccaa gacggtggag gaggtgctgg gccacttcgg cgtcaacgag         60
agtacggggc tgagcctgga acaggtcaag aagcttaagg agagatgggg ctccaacgag        120
ttaccggctg aagaaggaaa aaccttgctg gaacttgtga ttgagcagtt tgaagacttg        180
ctagttagga ttttattact ggcagcatgt atatcttttg ttttggcttg gtttgaagaa        240
ggtgaagaaa caattacagc ctttgtagaa ccttttgtaa ttttactcat attagtagcc        300
aatgcaattg tgggtgtatg gcaggaaaga aatgctgaaa atgccatcga agcccttaag        360
gaatatgagc ctgaaatggg caaagtgtat cgacaggaca gaaagagtgt gcagcggatt        420
aaagctaaag acatagttcc tggtgatatt gtagaaattg ctgttggtga caaagttcct        480
gctgatataa ggttaacttc catcaaatct accacactaa gagttgacca gtcaattctc        540
acaggtgaat ctgtctctgt catcaagcac actgatcccg tccctgaccc acgagctgtc        600
aaccaagata aaaagaacat gctgttttct ggtacaaaca ttgctgctgg gaaagctatg        660
ggagtggtgg tagcaactgg agttaacacc gaaattggca agatccggga tgaaatggtg        720
gcaacagaac aggagagaac accccttcag caaaaactag atgaatttgg ggaacagctt        780
tccaaagtca tctcccttat ttgcattgca gtctggatca taaatattgg gcacttcaat        840
gacccggttc atggagggtc ctggatcaga ggtgctattt actactttaa aattgcagtg        900
gccctggctg tagcagccat tcctgaaggt ctgcctgcag tcatcaccac ctgcctggct        960
cttggaactc gcagaatggc aaagaaaaat gccattgttc gaagcctccc gtctgtggaa       1020
acccttggtt gtacttctgt tatctgctca gacaagactg gtacacttac aacaaaccag       1080
atgtcagtct gcaggatgtt cattctggac agagtggaag gtgatacttg ttcccttaat       1140
gagtttacca taactggatc aacttatgca cctattggag aagtgcataa agatgataaa       1200
ccagtgaatt gtcaccagta tgatggtctg gtagaattag caacaatttg tgctctttgt       1260
aatgactctg ctttggatta caatgaggca aagggtgtgt atgaaaaagt tggagaagct       1320
acagagactg ctctcacttg cctagtagag aagatgaatg tatttgatac cgaattgaag       1380
ggtctttcta aaatagaacg tgcaaatgcc tgcaactcag tcattaaaca gctgatgaaa       1440
aaggaattca ctctagagtt ttcacgtgac agaaagtcaa tgtcggttta ctgtacacca       1500
aataaaccaa gcaggacatc aatgagcaag atgtttgtga agggtgctcc tgaaggtgtc       1560
attgacaggt gcacccacat tcgagttgga agtactaagg ttcctatgac ctctggagtc       1620
aaacagaaga tcatgtctgt cattcgagag tggggtagtg gcagcgacac actgcgatgc       1680
ctggccctgg ccactcatga caacccactg agaagagaag aaatgcacct tgaggactct       1740
gccaacttta ttaaatatga gaccaatctg accttcgttg gctgcgtggg catgctggat       1800
cctccgagaa tcgaggtggc ctcctccgtg aagctgtgcc ggcaagcagg catccgggtc       1860
atcatgatca ctggggacaa caagggcact gctgtggcca tctgtcgccg catcggcatc       1920
ttcgggcagg atgaggacgt gacgtcaaaa gctttcacag gccgggagtt tgatgaactc       1980
aacccctccg cccagcgaga cgcctgcctg aacgcccgct gttttgctcg agttgaaccc       2040
tcccacaagt ctaaaatcgt agaatttctt cagtcttttg atgagattac agctatgact       2100
ggcgatggcg tgaacgatgc tcctgctctg aagaaagccg agattggcat tgctatgggc       2160
tctggcactg cggtggctaa aaccgcctct gagatggtcc tggcggatga caacttctcc       2220
accattgtgg ctgccgttga ggaggggcgg gcaatctaca acaacatgaa acagttcatc       2280
cgctacctca tctcgtccaa cgtcggggaa gttgtctgta ttttcctgac agcagccctt       2340
ggatttcccg aggctttgat tcctgttcag ctgctctggg tcaatctggt gacagatggc       2400
ctgcctgcca ctgcactggg gttcaaccct cctgatctgg acatcatgaa taaacctccc       2460
cggaacccaa aggaaccatt gatcagcggg tggctctttt tccgttactt ggctattggc       2520
tgttacgtcg gcgctgctac cgtgggtgct gctgcatggt ggttcattgc tgctgacggt       2580
ggtccaagag tgtccttcta ccagctgagt catttcctac agtgtaaaga ggacaacccg       2640
gactttgaag gcgtggattg tgcaatcttt gaatccccat acccgatgac aatggcgctc       2700
tctgttctag taactataga aatgtgtaac gccctcaaca gcttgtccga aaaccagtcc       2760
ttgctgagga tgcccccctg ggagaacatc tggctcgtgg gctccatctg cctgtccatg       2820
tcactccact tcctgatcct ctatgtcgaa cccttgccac tcatcttcca gatcacaccg       2880
ctgaacgtga cccagtggct gatggtgctg aaaatctcct tgcccgtgat tctcatggat       2940
gagacgctca agtttgtggc ccgcaactac ctggaacctg caatactgga gtag             2994
<210>    14
<211>    753
<212>    ДНК
<213>    Homo sapiens
<400>    14
atgagaggca caccgaagac ccacctcctg gccttctccc tcctctgcct cctctcaaag         60
gtgcgtaccc agctgtgccc gacaccatgt acctgcccct ggccacctcc ccgatgcccg        120
ctgggagtac ccctggtgct ggatggctgt ggctgctgcc gggtatgtgc acggcggctg        180
ggggagccct gcgaccaact ccacgtctgc gacgccagcc agggcctggt ctgccagccc        240
ggggcaggac ccggtggccg gggggccctg tgcctcttgg cagaggacga cagcagctgt        300
gaggtgaacg gccgcctgta tcgggaaggg gagaccttcc agccccactg cagcatccgc        360
tgccgctgcg aggacggcgg cttcacctgc gtgccgctgt gcagcgagga tgtgcggctg        420
cccagctggg actgccccca ccccaggagg gtcgaggtcc tgggcaagtg ctgccctgag        480
tgggtgtgcg gccaaggagg gggactgggg acccagcccc ttccagccca aggaccccag        540
ttttctggcc ttgtctcttc cctgccccct ggtgtcccct gcccagaatg gagcacggcc        600
tggggaccct gctcgaccac ctgtgggctg ggcatggcca cccgggtgtc caaccagaac        660
cgcttctgcc gactggagac ccagcgccgc ctgtgcctgt ccaggccctg cccaccctcc        720
aggggtcgca gtccacaaaa cagtgccttc tag                                     753