СПОСОБ НЕПРЕРЫВНОЙ МНОГОСТАДИЙНОЙ ОЧИСТКИ АНТИТЕЛ

1. Способ очистки белка из раствора, включающий:
(a) первую хроматографическую стадию, включающую:
пропускание указанного раствора через первую хроматографическую матрицу;
элюирование неочищенного белкового элюента с первой хроматографической матрицы при использовании первого элюирующего буфера;
(b) вторую хроматографическую стадию, включающую:
пропускание неочищенного белкового элюента, полученного в конце стадии (a), через вторую хроматографическую матрицу;
элюирование белкового элюата со второй хроматографической матрицы при использовании второго элюирующего буфера; и
(c) третью хроматографическую стадию, включающую:
пропускание белкового элюата, полученного в конце стадии (b), через третью хроматографическую матрицу в режиме пропускания непрерывного потока;
выделение очищенного белка из элюата с третьей хроматографической матрицы;
где каждый из буферов включает бис-трис.
2. Способ по п. 1, где неочищенный белковый элюент, полученный в конце стадии (a), непосредственно пропускают через вторую хроматографическую матрицу без проведения обработки, такой как регулирование pH, замена или разбавление буфера.
3. Способ по п. 1 или 2, где белковый элюат, полученный в конце стадии (b), непосредственно пропускают через третью хроматографическую матрицу без проведения обработки, такой как регулирование pH, замена или разбавление буфера.
4. Способ по любому из пп. 1-3, где способ осуществляют в закрытой системе от первой до последней стадии.
5. Способ по любому из пп. 1-4, где каждая из двух первых хроматографических стадий включает:
пропускание уравновешивающего буфера через хроматографическую матрицу;
пропускание раствора или неочищенного белкового элюента через хроматографическую матрицу;
пропускание уравновешивающего буфера через хроматографическую матрицу;
необязательно, пропускание промывочного буфера через хроматографическую матрицу;
необязательно, пропускание уравновешивающего буфера через хроматографическую матрицу;
элюирование неочищенного белкового элюента или белкового элюата с хроматографической матрицы при использовании элюирующего буфера,
где каждый из буферов включает бис-трис.
6. Способ по любому из пп. 1-5, где каждый из буферов состоит из бис-триса, уксусной кислоты, NaCl, воды и, необязательно, NH4Cl.
7. Способ по любому из пп. 1-6, где указанный способ включает следующие стадии:
(a) первую хроматографическую стадию, включающую:
(i) пропускание уравновешивающего буфера через первую хроматографическую матрицу;
(ii) пропускание раствора через первую хроматографическую матрицу;
(iii) пропускание уравновешивающего буфера через первую хроматографическую матрицу;
(iv) пропускание промывочного буфера через первую хроматографическую матрицу;
(v) пропускание уравновешивающего буфера через первую хроматографическую матрицу; и
(vi) элюирование неочищенного белкового элюента с первой хроматографической матрицы при использовании первого элюирующего буфера;
(b) вторую хроматографическую стадию, включающую:
(i) пропускание уравновешивающего буфера через вторую хроматографическую матрицу;
(ii) пропускание неочищенного белкового элюента из стадии (a) через вторую хроматографическую матрицу;
(iii) пропускание уравновешивающего буфера через вторую хроматографическую матрицу; и
(iv) элюирование белкового элюата со второй хроматографической матрицы при использовании второго элюирующего буфера;
и
(c) третью хроматографическую стадию, включающую:
(i) пропускание уравновешивающего буфера через третью хроматографическую матрицу;
(ii) пропускание белкового элюата из стадии (b) через третью хроматографическую матрицу в режиме пропускания непрерывного потока;
(iii) необязательно, пропускание промывочного буфера через третью хроматографическую матрицу; и
(iv) выделение очищенного белка из элюата с третьей хроматографической матрицы.
8. Способ по любому из пп. 1-7, где первая, вторая и третья хроматографические матрицы являются хроматографическими колонками.
9. Способ по любому из пп. 1-7, где первая, вторая и третья хроматографические матрицы являются хроматографическими мембранными адсорберами.
10. Способ по любому из пп. 1-9, где первая хроматографическая матрица является аффинной хроматографической матрицей.
11. Способ по п. 10, где указанная аффинная хроматографическая матрица является матрицей с белком A.
12. Способ по любому из пп. 1-11, где вторая хроматографическая матрица является хроматографической матрицей с мультимодальной смолой или катионообменной хроматографической матрицей.
13. Способ по любому из пп. 1-12, где третья хроматографическая матрица является анионообменной хроматографической матрицей.
14. Способ по любому из пп. 1-13, где белком является моноклональное антитело.
15. Способ по п. 14, где указанное моноклональное антитело выбрано из группы, состоящей из антитела, которое специфично связывается с протофибриллярной формой человеческого β-амилоидного белка, антитела, которое специфично связывается с поверхностным бактериальным полисахаридом поли-N-ацетилглюкозамином (PNAG), антитела, которое специфично связывается с раково-эмбриональный антиген связанной молекулой клеточной адгезии 5 (CEACAM5), и антитела, которое специфично связывается с трансмембранным гликопротеином CD38.
16. Способ по любому из пп. 1-15, дополнительно включающий стадия нанофильтрации после стадии (c).
17. Способ по п. 16, дополнительно включающий стадию ультрафильтрации и диафильтрации после стадии нанофильтрации.
18. Способ по любому из пп. 1-17, где первый элюирующий буфер включает 15-25 мМ бис-триса и 15-25 мМ NaCl, доведенные до pH 3-4 уксусной кислотой.
19. Способ по любому из пп. 1-8 или 10-18, где второй элюирующий буфер включает 15-25 мМ бис-триса, 40-50 мМ NaCl и 20-30 мМ NH4Cl, доведенные до pH 7-8 уксусной кислотой.
20. Способ по любому из пп. 1-7 или 9-18, где второй элюирующий буфер включает 15-25 мМ бис-триса, 50-150 мМ NaCl и 20-30 мМ NH4Cl, доведенные до pH 6-7 уксусной кислотой.
21. Способ по любому из пп. 5-20, где уравновешивающий буфер включает 15-25 мМ бис-триса и 15-25 мМ NaCl, доведенные до pH 7-8 уксусной кислотой.
22. Способ по любому из пп. 5-21, где промывочный буфер включает 15-25 мМ бис-триса и 0,9-1,1 М NaCl, доведенные до pH 7-8 уксусной кислотой.
23. Способ по любому из пп. 1-22, где очищенный белок выделен с выходом по меньшей мере 95%.
24. Способ по любому из пп. 1-23, где выделенный очищенный белок демонстрирует чистоту по меньшей мере 99%.
25. Способ по любому из пп. 1-24, дополнительно включающий стадию включения выделенного очищенного белка в фармацевтическую композицию.
26. Способ очистки белка из раствора в непрерывном режиме, включающий:
(a) первую хроматографическую стадию, включающую:
(i) пропускание уравновешивающего буфера через колонку с белком A;
(ii) пропускание раствора через колонку с белком A;
(iii) пропускание уравновешивающего буфера через колонку с белком A;
(iv) пропускание промывочного буфера через колонку с белком A;
(v) пропускание уравновешивающего буфера через колонку с белком A; и
(vi) элюирование неочищенного белкового элюента из колонки с белком A при использовании первого элюирующего буфера;
(b) вторую хроматографическую стадию, включающую:
(i) пропускание уравновешивающего буфера через хроматографическую колонку с мультимодальной смолой;
(ii) пропускание неочищенного белкового элюента из стадии (a) через хроматографическую колонку с мультимодальной смолой;
(iii) пропускание уравновешивающего буфера через хроматографическую колонку с мультимодальной смолой; и
(iv) элюирование белкового элюата из хроматографической колонки с мультимодальной смолой при использовании второго элюирующего буфера;
(c) третью хроматографическую стадию, включающую:
(i) пропускание уравновешивающего буфера через анионообменную хроматографическую колонку;
(ii) пропускание белкового элюата из стадии (b) через анионообменную хроматографическую колонку в режиме пропускания непрерывного потока; и
(iii) выделение очищенного белка из элюата с анионообменной хроматографической колонки,
где каждый из буферов состоит из бис-триса, уксусной кислоты, NaCl, воды и, необязательно, NH4Cl.
27. Способ очистки белка из раствора в непрерывном режиме, включающий:
(a) первую хроматографическую стадию, включающую:
(i) пропускание уравновешивающего буфера через колонку с белком A;
(ii) пропускание части раствора через колонку с белком A;
(iii) пропускание уравновешивающего буфера через колонку с белком A;
(iv) пропускание промывочного буфера через колонку с белком A;
(v) пропускание уравновешивающего буфера через колонку с белком A; и
(vi) элюирование неочищенного белкового элюента из колонки с белком A при использовании первого элюирующего буфера;
(b) вторую хроматографическую стадию, включающую:
(i) пропускание уравновешивающего буфера через хроматографическую колонку с мультимодальной смолой;
(ii) пропускание неочищенного белкового элюента из стадии (a) через хроматографическую колонку с мультимодальной смолой;
(iii) пропускание уравновешивающего буфера через хроматографическую колонку с мультимодальной смолой; и
(iv) элюирование белкового элюата из хроматографической колонки с мультимодальной смолой при использовании второго элюирующего буфера;
(c) третью хроматографическую стадию, включающую:
(i) пропускание уравновешивающего буфера через анионообменную хроматографическую колонку;
(ii) пропускание белкового элюата из стадии (b) через анионообменную хроматографическую колонку в режиме пропускания непрерывного потока; и
(iii) выделение очищенного белка из элюата с анионообменной хроматографической колонки,
(d) последовательный повтор стадий a), b) и c) с использованием другой части раствора до полного использования всего раствора, и
(e) сбор очищенных белков, выделенных в конце каждой третьей хроматографической стадии;
где каждый из буферов состоит из бис-триса, уксусной кислоты, NaCl, воды и, необязательно, NH4Cl.
28. Способ очистки белка из раствора в непрерывном режиме, включающий:
(a) первую хроматографическую стадию, включающую:
(i) пропускание уравновешивающего буфера через мембранный адсорбер с белком A;
(ii) пропускание раствора через мембранный адсорбер с белком A;
(iii) пропускание уравновешивающего буфера через мембранный адсорбер с белком A;
(iv) пропускание промывочного буфера через мембранный адсорбер с белком A;
(v) пропускание уравновешивающего буфера через мембранный адсорбер с белком A; и
(vi) элюирование неочищенного белкового элюента из мембранного адсорбера с белком A при использовании первого элюирующего буфера;
(b) вторую хроматографическую стадию, включающую:
(i) пропускание уравновешивающего буфера через катионообменный мембранный адсорбер;
(ii) пропускание неочищенного белкового элюента из стадии (a) через катионообменный мембранный адсорбер;
(iii) пропускание уравновешивающего буфера через катионообменный мембранный адсорбер; и
(iv) элюирование белкового элюата с катионообменного мембранного адсорбера при использовании второго элюирующего буфера;
(c) третью хроматографическую стадию, включающую:
(i) пропускание уравновешивающего буфера через анионообменный мембранный адсорбер;
(ii) пропускание белкового элюата из стадии (b) через анионообменный мембранный адсорбер в режиме пропускания непрерывного потока; и
(iii) выделение очищенного белка из элюата с анионообменного мембранного адсорбера,
где каждый из буферов состоит из бис-триса, уксусной кислоты, NaCl, воды и, необязательно, NH4Cl.
29. Способ очистки белка из раствора в непрерывном режиме, включающий:
(a) первую хроматографическую стадию, включающую:
(i) пропускание уравновешивающего буфера через мембранный адсорбер с белком A;
(ii) пропускание части раствора через мембранный адсорбер с белком A;
(iii) пропускание уравновешивающего буфера через мембранный адсорбер с белком A;
(iv) пропускание промывочного буфера через мембранный адсорбер с белком A;
(v) пропускание уравновешивающего буфера через мембранный адсорбер с белком A; и
(vi) элюирование неочищенного белкового элюента из мембранного адсорбера с белком A при использовании первого элюирующего буфера;
b) вторую хроматографическую стадию, включающую:
(i) пропускание уравновешивающего буфера через катионообменный мембранный адсорбер;
(ii) пропускание неочищенного белкового элюента из стадии (a) через катионообменный мембранный адсорбер;
(iii) пропускание уравновешивающего буфера через катионообменный мембранный адсорбер; и
(iv) элюирование белкового элюата с катионообменного мембранного адсорбера при использовании второго элюирующего буфера;
(c) третью хроматографическую стадию, включающую:
(i) пропускание уравновешивающего буфера через анионообменный мембранный адсорбер;
(ii) пропускание белкового элюата из стадии (b) через анионообменный мембранный адсорбер в режиме пропускания непрерывного потока; и
(iii) выделение очищенного белка из элюата с анионообменного мембранного адсорбера,
(d) последовательный повтор стадий a), b) и c) с использованием другой части раствора до полного использования всего раствора, и
(e) сбор очищенных белков, выделенных в конце каждой третьей хроматографической стадии;
где каждый из буферов состоит из бис-триса, уксусной кислоты, NaCl, воды и, необязательно, NH4Cl.
30. Способ по п. 26 или 27, где:
указанный уравновешивающий буфер включает 15-25 мМ бис-триса и 15-25 мМ NaCl, доведенные до pH 7-8 уксусной кислотой,
указанный промывочный буфер включает 15-25 мМ бис-триса и 0,9-1,1 М NaCl, доведенные до pH 7-8 уксусной кислотой,
указанный первый элюирующий буфер включает 15-25 мМ бис-триса и 15-25 мМ NaCl, доведенные до pH 3-4 уксусной кислотой, и
указанный второй элюирующий буфер включает 15-25 мМ бис-триса, 40-50 мМ NaCl и 20-30 мМ NH4Cl, доведенные до pH 7-8 уксусной кислотой.
31. Способ по п. 28 или 29, где:
указанный уравновешивающий буфер включает 15-25 мМ бис-триса и 15-25 мМ NaCl, доведенные до pH 7-8 уксусной кислотой,
указанный промывочный буфер включает 15-25 мМ бис-триса и 0,9-1,1 М NaCl, доведенные до pH 7-8 уксусной кислотой,
указанный первый элюирующий буфер включает 15-25 мМ бис-триса и 15-25 мМ NaCl, доведенные до pH 3-4 уксусной кислотой, и
указанный второй элюирующий буфер включает 15-25 мМ бис-триса, 50-150 мМ NaCl и 20-30 мМ NH4Cl, доведенные до pH 6-7 уксусной кислотой.
32. Способ по любому из пп. 26-31, где способ осуществляют в закрытой системе от первой до последней стадии.