КОМПЛЕКС, ПРЕПАРАТ И ПРИМЕНЕНИЕ БОТУЛОТОКСИНА ТИПА А CLOSTRIDIUM BOTULINUM
COMPLEX, AGENT AND APPLICATION OF TYPE A BOTULINUM TOXIN CLOSTRIDIUM BOTULINUM

Область техники, к которой относится изобретение
Данное изобретение относится к белковому лекарственному средству в области эстетической медицины или фармацевтики. Также оно относится к композиции на основе токсина Clostridium botulinum.
Уровень техники
Один из наиболее заметных признаков старения - это морщины, причиной которых являются биохимические, гистологические и физиологические изменения, накапливающиеся из-за воздействия факторов окружающей среды на кожу. Существуют и другие, вторичные факторы, вызывающие характерные складки и углубление лицевых морщин (Stegman et al., The Skin of the Aging Face Cosmetic Dermatological Surgery, 2nd ed., St. Louis, Mo.: Mosby Year Book: 5-15 (1990)). Эти вторичные факторы включают постоянное воздействие силы тяжести, частое и постоянное позиционное сдавление кожи (например, во сне) и повторяющиеся движения с сокращением лицевых мышц (Stegman et al., The Skin of the Aging Face Cosmetic Dermatological Surgery, 2nd ed., St. Louis, Mo.: Mosby Year Book: 5-15 (1990)).
Для того, чтобы нивелировать некоторые признаки старения, используются различные подходы и методы. Эти подходы и методы весьма разнообразны: от применения увлажняющих средств для лица, содержащих α-гидроксикислоты и ретинол, до хирургического вмешательства и инъекций нейротоксинов. Например, в 1986 г. супруги врач-окулист Джин и дерматолог Алистер Каррутерс разработали метод лечения межбровных мимических морщин с использованием ботулинического токсина типа А (Schantz and Scott, In Lewis G. E. (Ed) Biomedical Aspects of Botulinum, New York: Academic Press, 143-150 (1981)). Новаторский метод лечения морщин Каррутерсов был опубликован в 1992 г. (Schantz and Scott, in Lewis G. E. (Ed) Biomedical Aspects of Botulinum, New York: Academic Press, 143-150 (1981)). К 1994 г. эти же исследователи доложили об опыте применения своего метода в случае других мимических лицевых морщин. (Scott, Opthalmol, 87:1044-1049 (1980)). Открытие и разработка применения ботулотоксина типа А послужили началом новой эры в эстетической медицине.
Известно, что ботулинический токсин типа А является смертельно опасным для человека природным ядом - одним из самых сильных известных на сегодняшний день. Споры бактерии Clostridium botulinum присутствуют в почве; они способны прорастать в недостаточно чистых и плохо закрытых емкостях для пищевых продуктов. Проглатывание этих бактерий приводит к отравлению ботулотоксином - ботулизму, что может привести к смерти. Ботулотоксин нарушает передачу нервных импульсов, подавляя высвобождение нейромедиатора ацетилхолина в нервно-мышечных синапсах; считается, что ботулотоксин воздействует на организм человека и другими путями. Блокирование передачи сигналов от нервов к мышцам, что необходимо для мышечных сокращений, приводит к параличу. В последнее десятилетие паралитическое действие ботулинического токсина на мышечное сокращение было поставлено на службу терапевтическим целям. Контролируемое введение ботулотоксина, вызывающее паралич мышц, позволяет лечить ряд патологических состояний, например, нервно-мышечные расстройства с гиперактивностью скелетных мышц. К числу состояний, при которых помогало лечение ботулотоксином, относятся односторонний спазм лицевых мышц, спастическая кривошея взрослых, трещина заднего прохода, блефароспазм, церебральный паралич, дистония мышц шеи, мигрень, косоглазие, дисфункция височно-нижнечелюстного сустава и различные мышечные судороги и спазмы. Последнее время парализующий мышцы эффект ботулинического токсина применяется в терапевтических и косметологических целях, например, для лечения межбровных и лобных складок и морщин, а также других последствий спастических и иных сокращений мышц лица.
У грамположительных бактерий Clostridium botulinum образуется ботулотоксин не только типа А, но еще семи других различных серологических типов. Из этих восьми серологически различных типов ботулотоксина те семь, которые вызывают паралич, обозначают как серотипы A, B, C, D, E, F и G. Каждый из них нейтрализуется определенными, типоспецифичными антителами. Молекулярная масса у всех форм ботулотоксина составляет около 150 кДa. Молекулярные размеры и структура ботулотоксина таковы, что он не способен проникать через роговой слой эпидермиса и подлежащие слои кожи. У животных разных видов эффект, степень тяжести и продолжительность паралича, вызываемого разными серотипами ботулотоксина, различны. Например, у крыс по степени тяжести паралича ботулотоксин типа А действует в 500 раз сильнее ботулотоксина типа В. Кроме того, установлено, что ботулотокисин типа В в дозе 480 Ед на 1 кг массы тела не токсичен для приматов.
Бактерии Clostridium botulinum выделяют ботулотоксин в составе белкового комплекса, в который помимо собственно белка ботулотоксина с молекулярной массой 150 кДа входят другие, ассоциированные с ним нетоксичные белки. Считается, что эти эндогенные нетоксичные белки относятся к семейству гемагглютининовых белков, а также к не гемагглютининовым белкам. Сообщалось, что нетоксичные белки из комплекса с ботулотоксином стабилизируют его и защищают от денатурации под действием кислот в пищеварительном тракте проглотившего комплекс субъекта. Таким образом, нетоксичные белки ботулотоксинового комплекса защищают токсическую активность ботулотоксина и тем самым усиливают его системное воздействие при попадании в организм через пищеварительный тракт. Также предположено, что некоторые из нетоксичных белков ботулотоксинового комплекса стабилизируют молекулы ботулотоксина в крови.
Как было отмечено ранее, из-за наличия в ботулотоксиновом комплексе нетоксичных белков, молекулярная масса всего комплекса обычно гораздо больше, чем 150 кДа, которые приходятся на собственно ботулотоксин. Например, у Clostridium botulinum могут образовываться комплексы ботулотоксина типа А, имеющие молекулярную массу около 900 кДа, 500 кДа или 300 кДа. Ботулотоксин типов В и С продуцируется в составе комплексов с молекулярной массой около 700 кДа или около 500 кДа. Ботулотоксин типа D продуцируется в составе комплексов с молекулярной массой около 300 кДа или около 500 кДа. Ботулотоксин типов E и F продуцируется в составе комплексов с молекулярной массой около 300 кДа.

Для дополнительной стабилизации ботулотоксина его комплексы в процессе изготовления препарата обычно объединяют с альбумином. Например, продукт BOTOX (Allergan, Inc., Ирвин, шт. Калифорния, США) представляет собой препарат, содержащий ботулотоксин типа А в количестве 100 Ед с сопутствующими белками, 0,5 мг человеческого альбумина и 0,9 мг хлорида натрия. Альбумин нужен для связывания и стабилизации ботулотоксиновых комплексов в изменяющихся условиях, включая условия изготовления препарата, транспортировки, хранения и введения субъекту.
Однако на сегодняшний день число доступных композиций на основе ботулотоксина типа А ограничено. Поэтому в данной области техники существует необходимость в получении новых композиций и препаратов, содержащих указанное вещество.
Раскрытие изобретения

Поскольку в данной области техники нужно больше различных комплексов ботулотоксина типа А, авторы данного изобретения предлагают новый комплекс ботулотоксина типа А Clostridium botulinum. По сравнению с существующими на сегодняшний день продуктами (например, Botox) комплекс токсина типа А Clostridium botulinum по данному изобретению имеет меньшую молекулярную массу и, соответственно, его производство обходится дешевле, а также он более стабилен и безопасен.
В одном из аспектов данного изобретения предлагается комплекс токсина типа А Clostridium botulinum, содержащий компоненты HA70, HA17, HA33, NTNH и BoNT/A1, причем комплекс имеет молекулярную массу 740-790 кДa.
В одном из воплощений данного изобретения комплекс токсина типа А Clostridium botulinum состоит из компонентов HA70, HA17, HA33, NTNH и BoNT/A1 и имеет молекулярную массу около 760 kDa.
В одном из воплощений данного изобретения компонент HA70 содержит любую из следующих последовательностей:
(1) аминокислотную последовательность SEQ ID NO. 1; или
(2) аминокислотную последовательность, полученную в результате добавления, делеции, замены или вставки одного или более аминокислотных остатков в последовательности SEQ ID NO. 1 с сохранением функции компонента HA70.
В одном из воплощений данного изобретения компонент HA17 содержит любую из следующих последовательностей:
(1) аминокислотную последовательность SEQ ID NO. 2; или
(2) аминокислотную последовательность, полученную в результате добавления, делеции, замены или вставки одного или более аминокислотных остатков в последовательности SEQ ID NO. 2 с сохранением функции компонента HA17.
В одном из воплощений данного изобретения компонент HA33 содержит любую из следующих последовательностей:
(1) аминокислотную последовательность SEQ ID NO. 3; или
(2) аминокислотную последовательность, полученную в результате добавления, делеции, замены или вставки одного или более аминокислотных остатков в последовательности SEQ ID NO. 3 с сохранением функции компонента HA33.
В одном из воплощений данного изобретения компонент NTNH содержит любую из следующих последовательностей:
(1) аминокислотную последовательность SEQ ID NO. 4; или
(2) аминокислотную последовательность, полученную в результате добавления, делеции, замены или вставки одного или более аминокислотных остатков в последовательности SEQ ID NO. 4 с сохранением функции компонента NTNH.
В одном из воплощений данного изобретения компонент BoNT/A1 содержит любую из следующих последовательностей:
(1) аминокислотную последовательность SEQ ID NO. 5; или
(2) аминокислотную последовательность, полученную в результате добавления, делеции, замены или вставки одного или более аминокислотных остатков в последовательности SEQ ID NO. 5 с сохранением функции компонента BoNT/A1.
В другом аспекте данного изобретения предлагается нуклеиновая кислота, кодирующая комплекс токсина типа А Clostridium botulinum по данному изобретению.
В другом аспекте настоящего изобретения предлагается фармацевтическая композиция, содержащая комплекс токсина типа А Clostridium botulinum по данному изобретению и фармацевтически или дерматологически приемлемый носитель.
В еще одном аспекте данного изобретения предлагается жидкий препарат, содержащий комплекс токсина типа А Clostridium botulinum по любому из пунктов 1-6, а также человеческий сывороточный альбумин, метионин, аргинин, хлорид натрия, Tween 80, цитратный буфер и/или фосфатный буфер.
В еще одном аспекте данного изобретения предлагается способ эстетической медицины, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества комплекса токсина типа А Clostridium botulinum, фармацевтической композиции или жидкого препарата по данному изобретению.
В одном из воплощений данного изобретения предлагаемый способ эстетической медицины включает снижение выраженности мелких тонких и/или более глубоких морщин, в частности на лице, или увеличение разреза глаз, поднятие уголков губ, или сглаживание кисетных морщин над верхней губой, или общее снижение мышечного тонуса.
В еще одном аспекте данного изобретения предлагается способ лечения или предотвращения заболевания, обусловленного синаптической передачей или высвобождением ацетилхолина, у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение субъекту эффективного количества комплекса токсина типа А Clostridium botulinum, фармацевтической композиции или жидкого препарата по данному изобретению.
В одном из воплощений данного изобретения заболевание, подлежащее лечению предлагаемым способом, выбрано из группы, состоящей из нервно-мышечных расстройств, отличающихся гиперактивностью скелетных мышц, нейропатической болью, мигренью, гиперактивностью мочевого пузыря, ринитом, синуситом, угревой сыпью, дистонией, спастическими мышечными сокращениями, гипергидрозом, гиперсекрецией одной или более желез, регулируемых холинергической системой нейронов, односторонним спазмом лицевых мышц, спастической кривошеей взрослых, трещиной заднего прохода, блефароспазмом, церебральным параличом, дистонией мышц шеи, косоглазием, дисфункцией височно-нижнечелюстного сустава и различными мышечными судорогами и спазмами.
В еще одном аспекте данного изобретения предлагается применение комплекса токсина типа А Clostridium botulinum, фармацевтической композиции или жидкого препарата по данному изобретению для изготовлении продукта для эстетической медицины, используемого для снижения выраженности мелких тонких и/или более глубоких морщин, в частности на лице, или увеличения разреза глаз, поднятия уголков губ, или сглаживания кисетных морщин над верхней губой, или общего снижения мышечного тонуса, или лекарственного средства, используемого для лечения или предотвращения заболевания, обусловленного синаптической передачей или высвобождением ацетилхолина.
В одном из воплощений данного изобретения указанное заболевание, выбрано из группы, состоящей из нервно-мышечных расстройств, отличающихся гиперактивностью скелетных мышц, нейропатической болью, мигренью, гиперактивностью мочевого пузыря, ринитом, синуситом, угревой сыпью, дистонией, спастическими мышечными сокращениями, гипергидрозом, гиперсекрецией одной или более желез, регулируемых холинергической системой нейронов, односторонним спазмом лицевых мышц, спастической кривошеей взрослых, трещиной заднего прохода, блефароспазмом, церебральным параличом, дистонией мышц шеи, косоглазием, дисфункцией височно-нижнечелюстного сустава и различными мышечными судорогами и спазмами.
В еще одном аспекте данного изобретения предлагается комплекс токсина типа А Clostridium botulinum, фармацевтическая композиция или жидкий препарат для использования при снижении выраженности мелких тонких и/или более глубоких морщин, в частности на лице, или увеличения разреза глаз и поднятия уголков губ, или сглаживания кисетных морщин над верхней губой, или общего снижения мышечного тонуса, причем указанное лекарственное средство применяется для лечения или предотвращения заболевания, обусловленного передачей нервных сигналов или высвобождением ацетилхолина.
В одном из воплощений данного изобретения указанное заболевание, выбрано из группы, состоящей из нервно-мышечных расстройств, отличающихся гиперактивностью скелетных мышц, нейропатической болью, мигренью, гиперактивностью мочевого пузыря, ринитом, синуситом, угревой сыпью, дистонией, спастическими мышечными сокращениями, гипергидрозом, гиперсекрецией одной или более желез, регулируемых холинергической системой нейронов, односторонним спазмом лицевых мышц, спастической кривошеей взрослых, трещиной заднего прохода, блефароспазмом, церебральным параличом, дистонией мышц шеи, косоглазием, дисфункцией височно-нижнечелюстного сустава и различными мышечными судорогами и спазмами.

Комплекс токсина типа А Clostridium botulinum (обозначаемый в настоящем описании также «OBI-858») обладает следующими преимуществами по сравнению с имеющимся в продаже продуктом Botox:
50
50

(1) его терапевтический эффект (эффективная доза ED) сравним с таковым продукта Botox в экспериментах на мышах, но его летальная доза (LD) выше, чем у Botox, в экспериментах на мышах, и его коэффициент безопасности (MOS) также выше, чем у Botox, в экспериментах на мышах и это указывает на то, что препарат на основе ботулотоксина Clostridium botulinum, согласно настоящему изобретению, более безопасен, чем имеющийся в продаже продукт Botox;

(2) комплекс токсина типа А Clostridium botulinum по данному изобретению имеет суммарную молекулярную массу белка 760 кДa в отличие от Botox, молекулярная масса которого 900 кДa, и поэтому представляет собой новый комплекс ботулотоксина типа А Clostridium botulinum;
(3) препарат комплекса токсина типа А Clostridium botulinum по данному изобретению обладает улучшенной стабильностью.
Краткое описание фигур
Фиг. 1 - определение чистоты продукта методом жидкостной хроматографии высокого разрешения с исключением по размеру (SEC-HPLC).
Фиг. 2 - определение молекулярной массы методом многоуглового светорассеяния (MALS).
Фиг. 3 - определение суммарной молекулярной массы белка в продукте методом электронной микроскопии. (a) OBI-858; стрелка указывает на частицы токсина. (b) Референсное исследование L-PTC/A с молекулярной массой 760 кДа; стрелкой указаны четыре разных ориентации.
Фиг. 4 - оценка в тесте разведения пальцев (DAS).
Осуществление изобретения
Данное изобретение относится к комплексу токсина типа А Clostridium botulinum и его жидкому препарату. Как описывается в настоящей заявке, композиция по данному изобретению может применяться для введения субъекту ботулотоксина путем инъекций в различных лечебных и/или эстетических целях. По сравнению с существующими на сегодняшний день продуктами на основе комплекса токсина типа А Clostridium botulinum, комплекс токсина типа А Clostridium botulinum по данному изобретению более безопасен и обладает большей или сравнимой эффективностью. Комплекс токсина типа А Clostridium botulinum по данному изобретению предлагается в жидкой лекарственной форме, в составе которой он чрезвычайно стабилен.
Термин «комплекс токсина типа А Clostridium botulinum» в настоящем описании относится к белковой молекуле токсина типа А Clostridium botulinum, имеющей молекулярную массу 150 кДа, и ассоциированным с этим белком эндогенным нетоксичным белкам, то есть к комплексу, сформированному гемагглютинином (HA) и нетоксичным не гемагглютинином (NTNH). Белок гемагглютинин состоит из субкомпонентов с молекулярной массой 70, 33 и 17 кДa, обозначаемых HA70, HA33 и HA17. Для получения комплекса токсина типа А Clostridium botulinum собственно природный токсин, происходящий непосредственно из Clostridium botulinum, не является обязательным. Например, токсин Clostridium botulinum или модифицированный ботулотоксин может быть получен рекомбинантным путем, а затем объединен с нетоксичными белками. Кроме того, рекомбинантный токсин Clostridium botulinum имеется в продаже, и он тоже может быть объединен с нетоксичными белками.
Комплекс токсина типа А Clostridium botulinum, раскрытый в настоящей заявке, содержит также HA70, HA33, HA17, NTNH или BoNT/A1, описанные здесь, или их варианты. Такой вариант имеет аминокислотную последовательность, являющуюся результатом добавления, делеции, замены или вставки одного или более аминокислотных остатков в соответствующую последовательность, раскрытую в настоящем описании (например, в любую из последовательностей SEQ ID No. 1-5).
Выражение «один или более» относится к количеству изменений аминокислотной последовательности, не нарушающих значительно активность белка. Например, «один или более» относится к 1-100, предпочтительно 1-80, более предпочтительно 1-50, еще более предпочтительно 1-40 и особенно предпочтительно 1-30, 1-20, 1-10 или 1-5 (например, 1, 2, 3, 4 или 5) изменениям.
Ниже приводятся аминокислотные последовательности каждого из компонентов комплекса токсина типа А Clostridium botulinum, указанных в разделе «Примеры».
HA70 (SEQ ID NO. 1)
MNSSIKKIYNDIQEKVINYSDTIDLADGNYVVRRGDGWILSRQNQILGGSVISNGSTGIVGDLRVNDNAIPYYYPTPSFNEEYIKNNIQTVFTNFTEANQIPIGFEFSKTAPSNKNLYMYLQYTYIRYEIIKVLQHEIIERAVLYVPSLGYVKSIEFNPGEKINKDFYFLTNDKCILNEQFLYKKILETTKNIPTNNIFNSKVSSTQRVLPYSNGLYVINKGDGYIRTNDKDLIGTLLIEAGSSGSIIQPRLRNTTRPLFTTSNDTKFSQQYTEERLKDAFNVQLFNTSTSLFKFVEEAPSDKNICIKAYNTYEKYELIDYQNGSIVNKAEYYLPSLGYCEVTNAPSPESEVVKMQVAEDGFIQNGPEEEIVVGVIDPSENIQEINTAISDNYTYNIPGIVNNNPFYILFTVNTTGIYKINAQNNLPSLKIYEAIGSGNRNFQSGNLCDDDIKAINYITGFDSPNAKSYLVVLLNKDKNYYIRVPQTSSNIENQIQFKREEGDLRNLMNSSVNIIDNLNSTGAHYYTRQSPDVHDYISYEFTIPGNFNNKDTSNIRLYTSYNQGIGTLFRVTETIDGYNLINIQQNLHLLNNTNSIRLLNGAIYILKVEVTELNNYNIRLHIDITN
HA17 (SEQ ID NO.2)
MSVERTFLPNGNYNIKSIFSGSLYLNPVSKSLTFSNESSANNQKWNVEYMAENRCFKISNVAEPNKYLSYDNFGFISLDSLSNRCYWFPIKIAVNTYIMLSLNKVNELDYAWDIYDTNENILSQPLLLLPNFDIYNSNQMFKLEKI
HA33 (SEQ ID NO. 3)
MEHYSVIQNSLNDKIVTISCKADTNLFFYQVAGNVSLFQQTRNYLERWRLIYDSNKAAYKIKSMDIHNTNLVLTWNAPTHNISTQQDSNADNQYWLLLKDIGNNSFIIASYKNPNLVLYADTVARNLKLSTLNNSNYIKFIIEDYIISDLNNFTCKISPILDLNKVVQQVDVTNLNVNLYTWDYGRNQKWTIRYNEEKAAYQFFNTILSNGVLTWIFSNGNTVRVSSSNDQNNDAQYWLINPVSDTDETYTITNLRDTTKALDLYGGQTANGTAIQVFNYHGDDNQKWNIRNP
NTNH (SEQ ID NO. 4)
MNINDNLSINSPVDNKNVVVVRARKTDTVFKAFKVAPNIWVAPERYYGESLSIDEEYKVDGGIYDSNFLSQDSEKDKFLQAIITLLKRINSTNAGEKLLSLISTAIPFPYGYIGGGYYAPNMITFGSAPKSNKKLNSLISSTIPFPYAGYRETNYLSSEDNKSFYASNIVIFGPGANIVENNTVFYKKEDAENGMGTMTEIWFQPFLTYKYDEFYIDPAIELIKCLIKSLYFLYGIKPSDDLVIPYRLRSELENIEYSQLNIVDLLVSGGIDPKFINTDPYWFTDNYFSNAKKVFEDHRNIYETEIEGNNAIGNDIKLRLKQKFRININDIWELNLNYFSKEFSIMMPDRFNNALKHFYRKQYYKIDYPENYSINGFVNGQINAQLSLSDRNQDIINKPEEIINLLNGNNVSLMRSNIYGDGLKSTVDDFYSNYKIPYNRAYEYHFNNSNDSSLDNVNIGVIDNIPEIIDVNPYKENCDKFSPVQKITSTREINTNIPWPINYLQAQNTNNEKFSLSSDFVEVVSSKDKSLVYSFLSNVMFYLDSIKDNSPIDTDKKYYLWLREIFRNYSFDITATQEINTNCGINKVVTWFGKALNILNTSDSFVEEFQNLGAISLINKKENLSMPIIESYEIPNDMLGLPLNDLNEKLFNIYSKNTAYFKKIYYNFLDQWWTQYYSQYFDLICMAKRSVLAQETLIKRIIQKKLSYLIGNSNISSDNLALMNLTTTNTLRDISNESQIAMNNVDSFLNNAAICVFESNIYPKFISFMEQCINNINIKTKEFIQKCTNINEDEKLQLINQNVFNSLDFEFLNIQNMKSLFSSETALLIKEETWPYELVLYAFKEPGNNVIGDASGKNTSIEYSKDIGLVYGINSDALYLNGSNQSISFSNDFFENGLTNSFSIYFWLRNLGKDTIKSKLIGSKEDNCGWEIYFQDTGLVFNMIDSNGNEKNIYLSDVSNNSWHYITISVDRLKEQLLIFIDDNLVANESIKEILNIYSSNIISLLSENNPSYIEGLTILNKPTTSQEVLSNYFEVLNNSYIRDSNEERLEYNKTYQLYNYVFSDKPICEVKQNNNIYLTINNTNNLNLQASKFKLLSINPNKQYVQKLDEVIISVLDNMEKYIDISEDNRLQLIDNKNNAKKMIISNDIFISNCLTLSYNGKYICLSMKDENHNWMICNNDMSKYLYLWSFK
BoNT/A1 (SEQ ID NO. 5)
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKNAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNSISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTQEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNNSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNNIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVMTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPL
Данное изобретение также относится к способу достижения биологического эффекта в результате введения эффективного количества композиции по данному изобретению нуждающемуся в этом субъекту или пациенту путем инъекций. Биологический эффект включает, например, купирование мышечного паралича, снижение избыточного потоотделения или иной секреции, лечение нейропатической боли или мигрени, облегчение ринита или синусита, ослабление гиперактивности мочевого пузыря, купирование мышечных спазмов, предотвращение или лечение угревой сыпи, ослабление или усиление иммунного ответа, уменьшение выраженности морщин или предотвращение или лечение различных других заболеваний.
Композиция по данному изобретению имеет лекарственную форму, пригодную для введения путем инъекций в кожу или эпителий пациента (человека или иного млекопитающего, нуждающегося в таком специфическом лечении). Определение «нуждающийся» в настоящем описании означает потребность субъекта, связанную с его состоянием здоровья или лекарственными средствами (например, для лечения состояний, обусловленных нежелательными спазмами мышц лица), а также с эстетическими и субъективными соображениями (например, изменение или усовершенствование внешности, затрагивающее ткани лица). В своем самом простом варианте композиция по данному изобретению содержит водный фармацевтически приемлемый разбавитель, например, забуференный солевой раствор (например, физиологический раствор, забуференный фосфатом, PBS). Но композиция по данному изобретению может содержать и другие ингредиенты, обычно присутствующие в фармацевтических или косметологических композициях, вводимых путем инъекций, в том числе дерматологически или фармацевтически приемлемый носитель, совместимый с тканями, в которые вводится композиция. В настоящем описании определение «дерматологически или фармацевтически приемлемый» означает, что композиция или ее компоненты, описанные в настоящей заявке, пригодны для контактирования с тканями организма и у большинства субъектов их применение не вызывает токсических эффектов, аллергических реакций, проявлений несовместимости или нестабильности и других нежелательных явлений. При необходимости композиция по данному изобретению содержит любые компоненты, обычно используемые в данной области техники, в частности в дерматологии и косметологии.
Комплекс токсина Clostridium botulinum по данному изобретению вводится в подкожный мышечный слой путем инъекций (обычно с помощью шприца) или вблизи железистых структур в коже в количестве, эффективном для обеспечения паралича, или расслабления мышц, или ослабления мышечных сокращений, или для предотвращения либо уменьшения мышечной спастичности, сокращения секреции желез или для других нужных эффектов. Такое местное применение ботулотоксина позволяет снизить его дозу, токсичность и более точно подобрать оптимальную дозировку соответственно инъецируемому или имплантируемому препарату для достижения желаемого эффекта.
Комплекс токсина Clostridium botulinum по данному изобретению вводится субъекту так, чтобы обеспечить эффективное количество ботулотоксина. Термин «эффективное количество» в настоящем описании относится к такому количеству, которое достаточно для достижения желаемой степени мышечного паралича или другого биологического или эстетического эффекта, но это количество непременно безопасно, то есть не настолько велико, чтобы вызвать серьезные побочные эффекты. Желаемый эффект включает расслабление определенных мышц, например, снижение выраженности мелких тонких и/или более заметных морщин, в частности на лице, или иное желательное для субъекта изменение внешности, например, увеличение разреза глаз, поднятие уголков губ или снижение мышечного тонуса. Снижение мышечного тонуса возможно на лице или в других частях тела. Комплекс токсина Clostridium botulinum по данному изобретению вводится индивиду путем инъекций для лечения, например, морщин, нежелательных мышечных спазмов на лице или в иных частях тела, гипергидроза, угревой сыпи или других заболеваний, при которых требуется купирование мышечной боли или спазмов. Комплекс токсина Clostridium botulinum по данному изобретению вводится в мышцы или другие связанные с кожей или иными тканями структуры путем инъекций. Например, комплекс токсина Clostridium botulinum по данному изобретению может быть введен в нижние конечности, плечевой пояс, спину (включая поясницу), подмышечные впадины, ладони, подошву стопы, шею, лицо, паховую область, тыльную сторону кисти или стопы, локоть, плечевую часть руки, колено, бедро, ягодицы, корпус, тазовую область или в любую другую часть тела, где есть в том необходимость.
Введение комплекса токсина Clostridium botulinum по данному изобретению может применяться также для лечения других состояний, включая любое состояние, при котором полезно предотвращать передачу нервных импульсов или высвобождение ацетилхолина в синапсах. Например, состояния, которые можно лечить с помощью комплекса по данному изобретению, включают, не ограничиваясь перечисленным здесь, нейропатическую боль, мигрень или иную головную боль, гиперактивность мочевого пузыря, ринит, синусит, угревую сыпь, дистонию, спастические мышечные сокращения, гипергидроз, гиперсекрецию одной или более желез, регулируемых холинергической системой нейронов, нервно-мышечные расстройства, характеризующиеся гиперактивностью скелетных мышц. Состояния, подлежащие лечению ботулотоксином, включают односторонний спазм лицевых мышц, спастическую кривошею взрослых, трещину заднего прохода, блефароспазм, церебральный паралич, дистонию мышц шеи, косоглазие, дисфункцию височно-нижнечелюстного сустава и различные мышечные судороги и спазмы. Комплекс по данному изобретению можно использовать также для ослабления или усиления иммунного ответа или для лечения других состояний, применительно к которым предлагались или делались инъекции комплекса токсина Clostridium botulinum. Комплекс токсина Clostridium botulinum по данному изобретению можно получать в твердой форме, например, в виде лиофилизата - порошка, таблеток и др. и для инъекций такой препарат разводят (восстанавливают) водной средой.
Применение комплекса токсина Clostridium botulinum, композиции или препарата по данному изобретению индивиду осуществляется врачом или другим профессиональным медицинским работником либо под их руководством. Использование указанных средств может быть однократным или же многократным на протяжении некоторого периода времени. В одном из предпочтительных воплощений данного изобретения инъекция комплекса токсина Clostridium botulinum, композиции или препарата делается в одно или более мест тела, где требуется эффект, обусловленный токсином Clostridium botulinum. С учетом природы комплекса токсина Clostridium botulinum, ботулотоксин используют предпочтительно в таком режиме дозирования (количество, скорость и частота введения), чтобы достичь желаемого результата без каких-либо побочных или нежелательных последствий.
Препарат, раскрытый в настоящей заявке, содержит человеческий сывороточный альбумин, метионин, аргинин, хлорид натрия, Твин 80, цитратный и/или фосфатный буфер. Предпочтительно указанный препарат содержит человеческий сывороточный альбумин, хлорид натрия и Твин 80, растворенные в цитратном буфере с концентрацией 50 мМ. В указанном препарате концентрация человеческого сывороточного альбумина составляет 0,1-1 мг/мл, например, 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8 или 0,9 мг/мл. Концентрация хлорида натрия составляет 5-20 мг/мл, например, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 или19 мг/мл, более предпочтительно 11,25 мг/мл. Концентрация Tween 80, растворенного в цитратном буфере с концентрацией 50 мM, может составлять 0,1-0,3 мг/мл, например, 0,2 мг/мл, более предпочтительно 0,188 мг/мл. Препарат по данному изобретению имеет определенный рН, например, 4-8, предпочтительно рН 5,6.
Далее в настоящей заявке концепция данного изобретения описывается подробнее в приведенных ниже примерах. Однако эти примеры служат только для иллюстрации и не ограничивают объем изобретения.
Примеры
Пример 1. Получение OBI-858
(1) Получение лекарственного вещества (лекарственной субстанции) (DS) OBI-858
Замороженные бактериальные клетки OBI-858, взятые из банка клеток, восстанавливали в соответствующей среде и культивировали. Затем бактерии переносили в ферментер. По завершении культивирования клетки и их фрагменты удаляли путем фильтрации. Процесс очистки включал осаждение в два этапа, замену буфера и колоночную хроматографию. Прошедший через хроматографическую колонку раствор лекарственного вещества пропускали через фильтр с порами диаметром 0,22 мкм, после чего непосредственно помещали в изолятор и лиофилизировали.
(2) Приготовление лекарственного средства (DP) OBI-858
Порошковый лиофилизат OBI-858 DS восстанавливали в буфере для препарата. Полученный раствор в асептических условиях пропускали через фильтр с порами диаметром 0,22 мкм, после чего непосредственно помещали в стерильный пакет, находящийся в изоляторе. Затем этот раствор лиофилизовали, получая в результате OBI-858 DP.
Пример 2. Идентификация OBI-858
(1) Выравнивание нуклеотидных последовательностей геномов
Штамм OBI-858 для производственных целей получали независимо и в результате геномного секвенирования было показано, что геном OBI-858 на 98,28% идентичен геному штамма Clostridium botulinum A ATCC 3502 и на 89,69% - геному штамма Clostridium botulinum A Hall (таблица 1). Таким образом, штамм OBI-85 генетически отличается от аналогичных продуктов, существующих на рынке.
Таблица 1. Выравнивание нуклеотидных последовательностей геномов штаммов Clostridium botulinum
Штамм
Степень идентичности геномов (%)
Clostridium botulinum A ATCC 3502
98,28
Clostridium botulinum A ATCC 19397
90,29
Clostridium botulinum A Hall
89,69
Clostridium botulinum H04402 065(A5)
68,98
Clostridium botulinum A2 Kyoto
68,39
Clostridium botulinum A3 Loch Maree
48,84
(2) Анализ белкового состава
Материалы и методы
Чтобы достичь наибольшего покрытия последовательности, белковый образец OBI-858 расщепляли различными ферментами, после чего проводили анализ методом жидкостной хроматографии и тандемной масс-спектрометрии (LC-MS/MS) Вначале белок OBI-858 денатурировали мочевиной (6 M), восстанавливали дитиотреитолом (DTT; 10 мМ) при температуре 37°C в течение 1 часа, затем обрабатывали алкилирующим агентом йодацетамидом (IAM; 50 мМ) в темноте при комнатной температуре в течение 30 минут. Затем проводили расщепление ферментами в растворе бикарбоната аммония (50 мM) в следующих условиях:
(a) трипсин - 37°C, 18 ч;
(b) эндопротеиназа Glu-C - 37°C, 18 ч;
(c) трипсин (37°C, 18 ч) + эндопротеиназа Glu-C (37°C, 18 ч);
(d) эндопротеиназа Lys-C - 37°C,18 ч;
(e) хемотрипсин - 37°C,18 ч;
(f) термолизин - 37°C,18 ч.
После ферментативного расщепления белковый образец разбавляли и подкисляли 0,1%-ной муравьиной кислотой (FA) для масс-спектрометрического анализа.
Анализ проводили на масс-спектрометре Q Exactive (Thermo Scientific), соединенном с системой высокоэффективной жидкостной хроматографии быстрого разрешения Ultimate 3000 RSLC (Dionex). Для хроматографии использовали колонки C18 (Acclaim PepMap RSLC, 75 мкм x 150 мм, 2 мкм, 100 Å) с приведенными ниже градиентами:
Таблица 2. Параметры жидкостной хроматографии для анализа LC-MS/MS
Время(мин)
Подвижная фаза A(%)
Подвижная фаза B(%)
Скорость потока(мкл/мин)
0
99
1
0,25
5,5
99
1
0,25
45
75
25
0,25
48
40
60
0,25
50
20
80
0,25
60
20
80
0,25
65
99
1
0,25
70
99
1
0,25
Подвижная фаза A: 0,1% муравьиная кислота
Подвижная фаза B: 95% ацетонитрил/0,1% муравьиная кислота
Полные MS-сканы получали при соотношении масс/заряд (m/z) 300-2000 и для десяти ионов с наибольшей интенсивностью пиков проводили фрагментацию для тандемной масс-спектрометрии (MS/MS). Необработанные данные анализировали и идентифицировали с помощью программы Proteome Discoverer 1.4 и поиска по базам данных в программной системе Mascot.
Экспериментальные результаты
Анализ аминокислотной последовательности токсина типа А Clostridium botulinum OBI-858 методом LC-MS/MS показал, что этот белок состоит из пяти субъединиц разного размера, а именно с молекулярной массой 71 кДа, 17 кДа, 34 кДа, 138 кДа и 149 кДа (см. таблицу 3). Были установлены аминокислотные последовательности этих субъединиц (SEQ ID NO. 1-5) посредством белкового секвенирования.
Таблица 3. Теоретические значения молекулярной массы, рассчитанные на основе белкового секвенирования
Аминокислотная последова-тельность (ID)
Теоретическая молекулярная масса (Да)
Обозначение белка
Количество аминокислотных остатков
Брутто-формула
A5HZZ4
71391,01
HA-70
626
C<sub>3200</sub>H<sub>4953</sub>N<sub>837</sub>O<sub>999</sub>S<sub>8</sub>
A5HZZ5
17034,31
HA-17
146
C<sub>775</sub>H<sub>1169</sub>N<sub>191</sub>O<sub>230</sub>S<sub>6</sub>
A5HZZ6
33872,73
HA-33
293
C<sub>1515</sub>H<sub>2313</sub>N<sub>409</sub>O<sub>468</sub>S<sub>4</sub>
A5HZZ8
138092,85
NTNH
1193
C<sub>6240</sub>H<sub>9555</sub>N<sub>1569</sub>O<sub>1905</sub>S<sub>33</sub>
A5HZZ9
149425,84
BoNT/A1
1296
C<sub>6763</sub>H<sub>10452</sub>N<sub>1744</sub>O<sub>2011</sub>S<sub>33</sub>
(3) Определение чистоты продукта методом хроматографии с исключением по размеру (SEC-HPLC) и определение молекулярной массы методом многоуглового светорассеяния (MALS).
Материалы и методы
3
Анализ методом SEC-MALS - это сочетание жидкостной хроматографии высокого разрешения с исключением по размеру и статического светорассеяния, который осуществляется с помощью системы Agilent 1260 HPLC, многоуглового детектора статического рассеяния света WYATT_DAWN HELEOS и колонки SRT SEC-300 (5 мкм; 7,8×300 мм). Управление системой Agilent 1260 HPLC осуществлялось с помощью программного обеспечения ChemStation (Agilent Technologies). Для детектора светорассеяния использовали программное обеспечение ASTRA V (Wyatt Technology). Элюирование было изократическим со скоростью 0,5 мл/мин; подвижная фаза - фосфатный буферный раствор (150 мМ PBS)/NaCl (0,1 М) и NaN (200 ppm), pH6.0. В ходе регистрации светорассеяния концентрацию комплекса OBI-858 отслеживали по поглощению ультрафиолетового излучения при длине волны 280 нм. Молекулярную массу комплекса OBI-858 рассчитывали по данным детекции светорассеяния, используя удельный инкремент показателя преломления (dn/dc) 0,185 мл/г и коэффициент экстинкции UV 1,49 мл/(мг*см).
Экспериментальные результаты
На фиг. 1 представлены результаты определения чистоты продукта методом хроматографии с исключением по размеру (SEC-HPLC); чистота полученного продукта составила 99,36%. На фиг. 2 представлены результаты определения молекулярной массы методом многоуглового светорассеяния (MALS); молекулярная масса по белку составила около 760 кДа.
(4) Электронно-микроскопическое исследование
Материалы и методы
Препарат образца негативно окрашивали, после чего действовали стандартным образом. Вкратце, раствор образца (капля объемом 4 мкл) наносили на медную сеточку с углеродной пленкой-подложкой, обработанной в тлеющем разряде, промывали одной каплей деионизованной воды, обрабатывали 2%-ным уранилацетатом и высушивали на воздухе. Изображения образца получали на просвечивающем электронном микроскопе (TEM) JEM-2100F с автоэмиссионной электронной пушкой при ускоряющем напряжении 200 кВ. Изображения регистрировались с помощью камеры DE12.
Экспериментальные результаты
На фиг. 3 представлены результаты определения молекулярной массы суммарного белка с помощью электронного микроскопа. На фиг. 3 (а) показан комплекс OBI-858, стрелками отмечены частицы токсина. На фиг. 3 (b) показано референсное исследование L-PTC/A с молекулярной массой 760 кДа, стрелками отмечены четыре разные ориентации. Таким образом, продукт по данному изобретению отличается от имеющегося в продаже токсина типа А Clostridium botulinum с молекулярной массой 900 кДа.
Пример 3. Изучение эффективности OBI-858
50
50
50
Цель этого исследования - оценить высокий эффект однократной дозы тестируемого продукта (изделия) (OBI-858) при внутримышечном (IM) введении на самках мышей линии ICR. Эффект оценивался в баллах по шкале для теста разведения пальцев (DAS), на основании чего рассчитывали среднюю действующую (полуэффективную) дозу (ED) для внутримышечного введения. Коэффициент безопасности при внутримышечном введении определяли, как отношение LD за 72 часа к EDза 48 часов.
Материалы и методы
Тестируемый продукт, референсный продукт, несущая среда и контроль
Тестируемый продукт:
Название - OBI-858
Поставщик - OBI Pharma, Inc.
Номер партии - 14004-25, 14004-30, 14004-35, 14004-45
Условия хранения - при температуре от -15°C до -25°C
Другие характеристики - одна емкость стерилизованного порошка, содержащая 1 350 440 Ед.
Референсный продукт:

Название - BOTOX
Поставщик - Allergan Inc.
Номер партии - C3461 C2
Условия хранения - при температуре от -15°C до -25°C
Другие характеристики - в одной емкости 50 Ед токсина типа А Clostridium botulinum.
Несущая среда и контроль:
В качестве несущей среды для изготовления препарата и отрицательного контроля при дозировании использовали буфер для разведения [физиологический раствор, забуференный фосфатом (30 мM); желатин (0,2% масса/объем); pH 6,8].
Получение и распределение дозы препаратов
Все препараты готовили в день использования соответственно схеме дозирования по дням.
Восстановление препарата (изделия) и дозирование препарата
Все процедуры по изготовлению препаратов осуществляли в боксе биологической безопасности класса II, расположенном в испытательной лаборатории. Препарат дозировали в день исследования перед процедурой введения.
50
Тестируемый препарат в виде лиофилизованного материала был расфасован (упакован) в стерильные запаянные емкости. Для восстановления в емкость с лиофилизатом вводили с помощью шприца 1 мл буфера для разведения. Емкость хорошенько встряхивали, чтобы добиться полного растворения материала, до тех пор, пока не оставалось видимых невооруженным глазом частиц. Если через по меньшей мере 3 минуты энергичного встряхивания еще видны были частицы, авторы обращались в компанию-изготовитель (OBI) для замены емкости с тестируемым препаратом. Восстановленный исходный тестируемый препарат имел концентрацию 1 350 440 единиц LD (U) в 1 мл. Из этого исходного раствора готовили серийные разведения (см. таблицу 4).
Для приготовления каждого серийного разведения нужный объем буфера для разведения (см. выше схему серийных разведений) отбирали микропипеткой и вносили в чистую стеклянную емкость с крышкой. Затем также микропипеткой отбирали нужный объем исходного раствора препарата, подлежащего разведению, и вносили его в емкость, содержащую буфер для разведения. Перемешивание достигалось осторожным повторным пипетированием и аккуратным переворачиванием емкости, плотно закрытой крышкой (и то, и другое по нескольку раз). После каждого переноса использованную микропипетку заменяли на чистую. Полученные растворы 5-15 использовали в качестве тестируемого дозируемого препарата.
50
Восстановление референсного препарата (изделия) и дозирование препарата Референсный препарат в виде лиофилизованного материала был расфасован (упакован) в стерильные запаянные емкости. Для восстановления в емкость с лиофилизатом вводили с помощью шприца 0,2 мл буфера для разведения. Емкость хорошенько встряхивали, чтобы добиться полного растворения материала, до тех пор, пока не оставалось видимых невооруженным глазом частиц. Восстановленный исходный тестируемый препарат имел концентрацию 250 единиц LD (U) в 1 мл. Из этого исходного препарата готовили серийные разведения (см. таблицу 5).
Таблица 5. Схема разведения исходного раствора референсного препарата для приготовления дозированного продукта
Номер раствора (ID)
0(RТA)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
Группа
N/A
12
11
10
9
8
7
6
5
4
3
2
Объем буферного раствора для разведения (мкл)
1600
360
281
253
229
187
366
327
305
391
373
360
Номер раствора (ID)
N/A
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Добавляемый объем исходного раствора (мкл)
0
1440
1400
1280
1130
950
720
670
600
500
480
450
Общий объем (мкл)
1600
1800
1681
1533
1359
1137
1086
997
905
891
853
810
Вводимый объем (мкл)))
0
400
401
403
409
417
416
397
405
411
403
810
Коэффициент разведения
1
1,25
1,501
1,798
2,162
2,587
3,903
5,807
8,759
15,609
27,739
49,930
Кратность разведения
1
1,25
1,201
1,198
1,203
1,197
1,508
1,488
1,508
1,782
1,777
1,8
Концентрация вводимого препарата (Ед./мл)
250
200
166,568
139,078
115,642
96,623
64,059
43,049
28,541
16,016
9,013
5,007
RТA - исходный раствор референсного изделия; N/A - не применимо
Для приготовления каждого серийного разведения нужный объем буфера для разведения (см. выше схему серийных разведений) отбирали микропипеткой и вносили в чистую стеклянную емкость с крышкой. Затем также микропипеткой отбирали нужный объем исходного раствора препарата, подлежащего разведению, и вносили его в емкость, содержащую буфер для разведения. Перемешивание достигалось осторожным повторным пипетированием и аккуратным переворачиванием емкости, плотно закрытой крышкой (и то, и другое по нескольку раз). После каждого переноса использованную микропипетку заменяли на чистую. Полученные растворы 1-11 использовали в качестве дозированного референсного препарата.
Экспериментальные животные
Описание экспериментальных животных:
Вид, линия - мыши линии ICR.
Источник - BioLASCO Taiwan Co., Ltd (Тайбэй, Тайвань).
Количество особей для отбора в группы - 4 партии по 236 самок. Количество резервных особей - по 14 самок в партии; 4 партии.
Масса тела в день введения препарата - 18-22 г (масса тела подопытных животных варьировала в пределах ±10% от среднего значения).
Идентификация особей - ушная маркировка выщипом; маркировка краской на хвосте или туловище; этикетки на клетках.
Обоснование для отбора - для установленных процедур оценки эффективности и токсичности лекарственных препаратов того класса, к которым относятся испытываемый препарат и референсный препарат, в данном исследовании в качестве тест-системы использовали мышей. Самки мышей использовались при разработке этих процедур, а также в предыдущих исследованиях было показано, что они более восприимчивы к фармакологическому действию и токсичности лекарственных препаратов того класса, к которым относятся тестируемый препарат и референсный препарат. Исходя из установленных процедур и результатов предыдущих исследований, для данного исследования в качестве экспериментальной модели были взяты самки мышей.
Условия окружающей среды
Подопытные животные содержались в следующих условиях.

Мышей размещали по одной в поликарбонатных клетках с подстилкой в сертифицированном отделении Международной ассоциации оценки и аккредитации лабораторных исследований на животных (AAALAC International). Температура 20,7 - 23,1°C; относительная влажность 51,2 - 67,1%; режим освещенности 12 ч/12 ч; питание - готовый стерилизованный корм Autoclaved Rodent Diet 5010 (PMI Nutrition International; Inc., шт. Миссури, США) без ограничений, вода без ограничений. Корм и воду регулярно проверяли; результаты этих анализов имеются в архиве сертифицированного отделения. Ни в корме, ни в воде не должно было содержаться каких-либо примесей, которые могли бы повлиять на результаты данного исследования.
Схема эксперимента
Акклиматизация и отбор животных
Перед введением препарата животных выдерживали на карантине в испытательной лаборатории в течение 2 суток, затем давали привыкнуть к обстановке в течение 3-4 суток. По меньшей мере за сутки до введения препарата животных случайным образом разбивали на группы (группы 1-12, в каждой группе две подгруппы - А и В) согласно предполагаемой схеме эксперимента. Каждой особи, взятой для эксперимента, присваивали четырехзначный номер. Что касается массы тела подопытных особей, то ни между группами, ни между подгруппами не было статистически значимой разницы в средней массе тела (p < 0,05), что показано путем однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) или с использованием рангового критерия Краскела-Уоллиса. Те мыши, которых не взяли в опыт, служили резервными. Животных, предназначенных для эксперимента, в том случае, если бы в День 0 или ранее у них обнаружились какие-либо отклонения в состоянии здоровья [в том числе превышение предельно приемлемой массы тела (24 г)] и/или возникли бы подозрения на ошибку в дозировании, заменяли бы резервными особями. После завершения периода акклиматизации сбор данных по резервным особям не проводился. После Дня 1 резервные особи не включались в эксперимент.
Схема эксперимента
В приведенной ниже таблице 6 указаны группы особей, номинальные дозовые концентрации, объем доз, номинальные дозовые уровни и количество животных в каждой группе, получавшей препараты.
Таблица 6. Схема эксперимента
Группы
Номинальная дозовая концентрация(Ед./мл)<sup>а</sup>
Объем вводимой дозы(мл/особь)
Номинальный дозовый уровень (Ед./особь)<sup>b</sup>
Количество животных(F- самки)
OBI-858
BOTOX<sup></sup>
1
0c
0,02
0
10F
Подгруппа A
Подгруппа B
2
5
0,02
0,1
10F
10F
3
9
0,02
0,18
10F
10F
4
16
0,02
0,32
10F
10F
5
28,5
0,02
0,57
10F
10F
6
43
0,02
0,86
10F
10F
7
64
0,02
1,28
10F
10F
8
96,5
0,02
1,93
10F
10F
9
115,5
0,02
2,31
10F
10F
10
139
0,02
2,78
10F
10F
11
166,5
0,02
3,33
10F
10F
12
200
0,02
4
10F
10F
13
844,025
0,1
84,402,5
3F+ 3F<sup>d</sup>
0
a - См. расчет дозовой концентрации в разделе 4.3.4.
b - За исключением группы 13 реальный дозовый уровень получается умножением концентрации на объем.
c - В группе 1 (контрольной) животным вводили буфер для разведения.
d - Группа 13 служила для проверки целостности испытываемого изделия. Мышей в группу 13 отбирали из резервных особей в день введения препарата.
Проверка целостности испытываемого препарата
В каждой группе мышей в день введения препарата (День 0) из резервных животных случайным образом отбирали 3 особи. Брали одну емкость с тестируемым препаратом и восстанавливали содержимое (исходный раствор 0); часть этого исходного раствора 0 разводили в 1,6 раза. Отобранным резервным мышам вводили в хвостовую вену 0,1 мл восстановленного и разведенного тестируемого препарата. Особям основной группы вводили препарат после того, как целостность тестируемого препарата подтверждалась тем, что по меньшей мере две мыши из тех, которым внутривенно ввели указанный раствор в указанном количестве умирали не позже чем через 1 час после введения. Если же по меньшей мере две особи из получивших указанную инъекцию за 1 час не умирали, то данную емкость с исходным раствором 0 тестируемого препарата отбрасывали. В таком случае брали вторую емкость с тестируемым препаратом, готовили из ее содержимого новый исходный раствор 0 и повторяли процедуру проверки. Если и вторая емкость не проходила проверку, введение препарата из партии, к которой принадлежали эти две емкости, не проводили из-за неприемлемого качества тестируемого препарата в данной партии. В описываемом эксперименте все тестируемые емкости с препаратами успешно прошли проверку и поэтому описанных выше повторных процедур не потребовалось.
Применение тестируемого препарата - внутримышечная инъекция в икроножную мышцу правой задней конечности.
Обоснование выбора дозировки и пути введения
50
50
Номинальный дозовый уровень был выбран компанией-изготовителем (OBI) таким образом, чтобы при внутримышечном введении ожидаемые полуэффективная доза (IM ED) и полулетальная доза (IM LD) различались на порядок.
Частота введения - однократно.
Введение отрицательного контроля
В качестве отрицательного контроля мышам группы 1 вводили внутримышечно в икроножную мышцу правой задней конечности 20 мкл буфера для разведения. Процедура контрольной инъекции была такой же, как инъекции тестируемого препарата.
Наблюдение и осмотр животных
50
В день 0 после введения препарата животных осматривали по меньшей мере каждые 6 часов, чтобы выявить умерших особей. Затем такой осмотр делали ежедневно на протяжении всего периода исследования параллельно с проведением теста разведения пальцев (вплоть до дня 3). Регистрировали каждый случай смерти как по отдельности, так и суммарно в каждой группе, чтобы рассчитать LD.
Тест разведения пальцев (DAS)
В каждой группе подопытных животных осматривали на предмет признаков мышечной слабости через 24-26, 48-50 и 72-74 часов после введения препарата первой особи данной группы в день 0. Мышечную слабость оценивали по результатам теста разведения пальцев. У каждой особи регистрацию мышечной слабости проводили два сотрудника независимо друг от друга. Из этих независимых оценок для анализа брали среднее значение. Тест разведения пальцев проводили следующим образом (приводится выдержка из опубликованной заявки на патент США № US 2010/0168023A1). Мышечный паралич оценивали по результатам теста разведения пальцев (DAS), как сообщалось в работе Aoki, K. R. in “A comparison of the safety margins of botulinum neurotoxin serotypes A, B, and F in mice”, Toxicon 2001; 39(12):1815-1820. Мышь на короткое время подвешивали за хвост, что вызывает характерную реакцию испуга, при которой животное вытягивает задние конечности и растопыривает на них пальцы. Степень выраженности такой реакции оценивается по пятибалльной шкале (от 0 до 4): оценка «0» отражает нормальную реакцию, оценка «4» - максимальное ослабление разведения пальцев и вытягивания задних конечностей. Шкала оценки разведения пальцев приведена в таблице 7.
Таблица 7. Шкала оценки в тесте разведения пальцев (DAS)
Оценка в баллах
4
Стопа изогнута, 5 пальцев сомкнуты
Смерть
3
Стопа плоская, 5 пальцев сомкнуты
Стопа изогнута, 4 пальца сомкнуты
2
Стопа плоская, расходятся только кончики всех пальцев
Стопа плоская, 3 пальца касаются друг друга.
1
Стопа плоская, расстояние между пальцами отличается от такового в контрлатеральной конечности (в которую препарат не вводили)
Стопа плоская, 2 пальца сомкнуты, остальные полностью растопырены
0
Без отклонений от нормальной реакции
Мыши, умершие в период проведения теста DAS, получали оценку “4” для полноты результатов теста.
Масса тела
Массу тела мышей измеряли по меньшей мере один раз для разделения на группы и в День 0 перед введением препарата.
Статистический анализ
50
50
50
50

2
При построении и анализе кривых доза-ответ (количество единиц токсина - оценка в тесте DAS) и расчете IM ED, а также IM LD использовали пробит-модель и логистическую сигмоидную функцию для зависимости «количество единиц токсина-реакция DAS». Статистический анализ осуществляли с помощью программного обеспечения Minitab. Коэффициент безопасности партий препарата рассчитывали исходя из значений IM ED (DAS) через 48 часов после введения препарата и IM LD через 72 часа после введения. Критерием приемлемости для регрессионного анализа считали R>0,9.
Информационно-вычислительная компьютерная система

Для сбора и анализа данных по массе тела использовали лабораторную информационную онлайновую систему Pristima (версия 6.3.2; Xybion Medical Systems Corporation) в испытательной лаборатории.
Результаты и обсуждение
Проверка целостности препарата OBI-858 RDS в различных партиях
Сводка результатов тестирования целостности OBI-858 приведена в таблице 8:
Таблица 8. Проверка целостности препарата OBI-858
Партия
Номер партии-емкости
Среднее время выживания после введения препарата (мин)
1
14004-25
34,0 ± 2,6
2
14004-30
33,3 ± 1,5
3
14004-35
34,7 ± 3,1
4
14004-45
31,7 ± 2,3
Все емкости с тестируемым препаратом прошли проверку целостности препарата, при которой определяли среднюю выживаемость животных в течение не более 1 часа после введения препарата.
Масса тела
В опытах с каждой партией препарата масса тела мышей в пределах группы особей, получавших ту или иную дозу препарата, варьировала в пределах +/- 10% от среднего для данной группы значения.
50
Тест разведения пальцев и расчет ED
OBI-858
50
50
2
Признаки изменений в разведении пальцев появлялись у мышей уже через 24 часа после введения препарата. Степень выраженности паралича коррелировала с увеличением дозы OBI-858 RDS и при дальнейшем увеличении дозы выходила на плато по достижении максимальной выраженности (включая смерть). Результаты определения IM EDза период 48 часов после введения препарата для всех партий, кроме партии 1, удовлетворяли критериям приемлемости для регрессионного анализа (R>0,9). Для партий 2, 3 и 4 ED за период 48 часов после введения препарата составила 0,33; 0,32 и 0,36 Ед/особь соответственно.
Таблица 9. Результаты определения ED<sub>50 </sub>(Ед/особь) за 48 ч после введения тестируемого препарата OBI-858
Партия
ED<sub>50</sub>
L 95%
H 95%
R<sup>2</sup>
1
0,21
0,13
0,35
0,89
2
0,33
0,27
0,41
0,97
3
0,32
0,23
0,46
0,92
4
0,36
0,27
0,47
0,95
L 95% - нижняя граница 95%-ного доверительного интервала
H 95% - верхняя граница 95%-ного доверительного интервала

BOTOX
50
50
50
2

Признаки изменений в тесте разведения пальцев появлялись у мышей уже через 24 часа после введения препарата. Степень выраженности паралича коррелировала с увеличением дозы OBI-858 RDS и при дальнейшем увеличении дозы выходила на плато по достижении максимальной выраженности (включая смерть) при меньшей дозе, чем в случае OBI-858 RDS. Результаты определения IM EDза период 48 часов после введения препарата для всех партий, кроме партии 1, удовлетворяли критериям приемлемости при регрессионном анализе (R>0,9). Для партий 2, 3 и 4 ED за период 48 часов после введения препарата составила 0,22; 0,24 и 0,23 Ед./особь соответственно. В целом IM ED за период 48 часов после введения BOTOX меньше, чем в случае OBI-858.
Таблица 10. Результаты определения ED<sub>50 </sub>(Ед/особь) за 48 ч после введения BOTOX<sup></sup>
Партия
ED<sub>50</sub>
L 95%
H 95%
R<sup>2</sup>
1
0,36
0,21
0,60
0,82
2
0,22
0,19
0,25
0,99
3
0,24
0,22
0,26
1,00
4
0,23
0,19
0,29
0,98
L 95% - нижняя граница 95%-ного доверительного интервала
H 95% - верхняя граница 95%-ного доверительного интервала
50
Смертность и расчет LD
OBI-858
50
В большинстве случаев гибели животных смерть наступала через 72 часа после введения препарата, хотя в группах 11 и 12 после введения препарата из некоторых партий мыши умирали и раньше, даже через 48 часов после введения. Для четырех партий препарата (1, 2, 3, 4) через 72 часа после введения LD составила 3,00; 3,42; 3.33 и 3,35 Ед/особь соответственно. Однако для этого периода времени только для партий 2, 3 и 4 было достаточно разных по дозе групп животных для регрессионного анализа в пределах линейной корреляции доза-ответ, в которых смертность варьировала от 0% до 100% (для такого анализа требуется по меньшей мере три разные по дозе группы особей). Из указанных трех партий только в случае партий 2 и 3 данные удовлетворяли критериям приемлемости для регрессионного анализа.
Таблица 11. LD<sub>50 </sub>(Ед/особь) через 72 ч после введения тестируемого препарата OBI-858
Партия
LD<sub>50</sub>
L 95%
H 95%
R<sup>2</sup>
1
3,00
2
3,42
2,70
4,32
0,99
3
3,33
3,31
3,36
1,00
4
3,35
1,66
6,75
0,86
L 95% - нижняя граница 95%-ного доверительного интервала
H 95% - верхняя граница 95%-ного доверительного интервала

BOTOX

2
50
50
Среди мышей, которым вводили BOTOX, смерть наступала раньше (уже через 24 часа после введения препарата) и при более низких дозах, чем среди животных, получавших OBI-858 RDS (в группах 6-12 через 72 ч после введения препарата). Через 72 ч после введения препарата рассчитанная LD для четырех партий препарата (1, 2, 3, 4) составила 2,21; 1,63; 2.14 и 1.57 Ед/особь соответственно. Однако ни для одной из этих партий данные по смертности не удовлетворяли критериям приемлемости для регрессионного анализа. В случае партий 2, 3 и 4 не было разных по дозе групп в пределах линейной корреляции доза-ответ через 72 ч после введения препарата. Поэтому нельзя было провести регрессионный анализ рассчитанных LD для этих партий. Для партии 1 R получилось 0,74, что ниже критериев приемлемости.
Taблица 12. LD<sub>50 </sub>(Ед/особь) через 72 ч после введения BOTOX<sup></sup>
Партия
LD<sub>50</sub>
L 95%
H 95%
R<sup>2</sup>
1
2,21
0,80
6,11
0,74
2
1,63
3
2,14
4
1,57
L 95% - нижняя граница 95%-ного доверительного интервала
H 95% - верхняя граница 95%-ного доверительного интервала
50
Определение влияния вариаций массы тела на результаты расчета ED

50
50
50
50
Ни для OBI-858 RDS, ни для BOTOX не было обнаружено разницы в результатах расчета ED для мышей с массой тела в пределах установленного диапазона (18-22 г) и для мышей с большей массой тела (более 22 г) на момент введения препарата. Исключение данных, полученных для животных с излишней массой тела, из расчета ED не влияло на получаемые значения ED в сравнении с общей для всех особей величиной ED (см. таблицу 13).
Таблица 13. Сравнение рассчитанных значений ED<sub>50</sub> (Ед/особь) за период 48 часов после внутримышечного введения препарата для животных с разной массой тела
Партия
OBI-858
BOTOX<sup></sup>
IM ED<sub>50</sub>48 ч
IM ED<sub>50</sub>48 ч(Масса тела18-22 г)
IM ED<sub>50</sub>48 ч(Масса тела> 22 г)
IM ED<sub>50</sub>48 ч
IM ED<sub>50</sub>48 ч(Масса тела18-22 г)
IM ED<sub>50</sub>48 ч(Масса тела> 22 г)
1
0,21
0,19
0,23
0,36
0,36
0,41
2
0,33
0,33
0,40
0,22
0,21
0,22
3
0,32
0,37
0,32
0,24
0,25
0,25
4
0,36
0,38
0,36
0,23
0,24
0,25

У одной особи на момент введения препарата масса тела была меньше нижней границы установленного диапазона (18 г), а именно 17,7 г. У этой мыши [ID 0193; группа 9, подгруппа B (Botox); партия 2] во всех сериях теста разведения пальцев наблюдались в основном такие же оценки, как и у других особей из той же группы. Иными словами, отклонение массы тела не влияло на результаты экспериментов.
Определение коэффициента безопасности (MOS)
50
50
Коэффициент безопасности рассчитывали, как отношение LD за период 72 часа после внутримышечного введения препарата к ED за период 48 часов после внутримышечного введения препарата.

Для четырех партий (1, 2, 3 и 4) OBI-858 значения MOS составили 14,07; 10,32; 10,33 и 9,29 соответственно. Для четырех партий (1, 2, 3 и 4) BOTOX значения MOS составили 6,20; 7,58; 8,98 и 6,73 соответственно. Коэффициент безопасности (MOS) OBI-858 RDS неизменно получался больше, чем у BOTOX(таблица 16).
Выводы
50.
50
50
50
50
50

В этом исследовании все исследуемые емкости с OBI-858 прошли проверку на целостность препарата. Излишняя масса тела (22-24 г) на момент введения препарата у некоторых подопытных мышей существенно не влияла на результаты расчета ED Для приемлемых партий препарата OBI-858 значения LD за период 72 ч после внутримышечного введения и ED за период 48 ч после внутримышечного введения в случае партии 2 составили 3,42 Ед/особь и 0,33 Ед/особь соответственно, в случае партии 3 - 3,33 Ед/особь и 0,32 Ед/особь соответственно. Значения MOS для партий 2 и 3 составили 10,32 и 10,33 соответственно. Для препарата BOTOX значения LD за период 72 ч после внутримышечного введения и ED за период 48 ч после внутримышечного введения в случае партии 2 составили 1,63 Ед/особь и 0,22 Ед./особь соответственно, в случае партии 3 - 2,14 Ед./особь и 0,24 Ед/особь соответственно. Значения MOS для партий 2 и 3 составили 7,58 и 8,98 соответственно. Короче говоря, препарат OBI-858 обладает более сильным действием, чем BOTOX. У OBI-858 выше LD за период 72 ч после внутримышечного введения и более высокий коэффициент безопасности, чем у BOTOX.
Таблица 16. Коэффициент безопасности партий OBI-858 и BOTOX<sup></sup>
Партия
OBI-858
BOTOX<sup></sup>
1
14,07
6,20
2
10,32
7,58
3
10,33
8,98
4
9,29
6,73
Пример 4. Проверка стабильности OBI-858
Материалы и методы
(1) Состав LF08:
0,5 мг/мл человеческий сывороточный альбумин (HSA); 11,25 мг/мл хлорид натрия; 0,188 мг/мл Tween 80, растворенные в фосфатном буфере (50 мМ; pH 6,3).
(2) Состав LF09:
0,5 мг/мл человеческий сывороточный альбумин (HSA); 11,25 мг/мл хлорид натрия; 0,188 мг/мл Tween 80, растворенные в цитратном буфере (50 мМ лимонная кислота/цитрат натрия; pH 5,6).
(3) Состав LF10:
0,5 мг/мл метионин; 11,25 мг/мл хлорид натрия; 0,188 мг/мл Tween 80;150 мМ аргинин, растворенные в цитратном буфере (50 мМ лимонная кислота/цитрат натрия; pH 6,0).
(4) Состав LF11:
11,25 мг/мл хлорид натрия; 0,188 мг/мл Tween, растворенные в цитратном буфере (50 мМ лимонная кислота/цитрат натрия; pH 6,3).
(5) Экспериментальные животные
50
Восемь самок мышей линии ICR с массой тела 18-22 г. Отобранным особям вводили в хвостовую вену 0,1 мл OBI-858 для определения летальной дозы (LD/мл).
Результаты
(1) Определение стабильности препаратов разного состава
50
Восстанавливали порошковый лиофилизат OBI-858 DS четырех разных составов. Полученные препараты выдерживали при температуре 45°C в течение 14 суток, а затем при 4°C в течение 24 часов. После этого препараты согревали в течение 1 часа до комнатной температуры и вводили подопытным мышам в хвостовую вену. В таблице 17 приведены значения летальной дозы (LD/мл) для этих четырех составов. Полученные данные свидетельствуют, что наилучшей стабильностью обладал препарат с составом LF09.
Таблица 17. Проверка стабильности препаратов разного состава
Состав
LF08
LF09
LF10
LF11
Летальная доза до исследования(LD<sub>50</sub>/мл)
6,15E+05
8,12E+05
6,75E+05
1,63E+05
Температура
45°C
Продолжительность
14 суток
Летальная доза после исследования (LD<sub>50</sub>/мл)
0
2,58E+05
0
0
(2) Исследование стабильности препарата OBI-858 с составом LF09 в условиях ускоренной деградации (4-60°C)
50
Восстанавливали порошковый лиофилизат OBI-858 DS состава LF09. Полученные препараты выдерживали при четырех разных температурах (4°C, 25°C, 45°C и 60°C) в течение 7 суток, после чего еще 24 часа при температуре 4°C. Затем препараты согревали в течение 1 часа до комнатной температуры и вводили подопытным мышам в хвостовую вену. В таблице 18 приведены значения летальной дозы (LD/мл) для препарата с составом LF09. Эти данные показывают, что после хранения при температуре 45°C данный препарат все еще стабилен.
Таблица 18. Стабильность препарата OBI-858 с составом LF09 в условиях ускоренной деградации
Температура хранения
4°C
25°C
45°C
60°C
Летальная доза до исследования (LD<sub>50</sub>/мл)
5,07E+05
5,07E+05
5,07E+05
5,07E+05
Время хранения
7 суток
Летальная доза после исследования (LD<sub>50</sub>/мл)
5,07E+05
5,07E+05
4,06E+05
0
Следует принять во внимание, что приведенные в настоящей заявке примеры воплощений данного изобретения носят описательный характер и не ограничивают объем изобретения. Как правило, раскрытие признаков или вариантов в том или ином воплощении изобретения, приведенном в качестве примера, могут быть применимы к другим сходным признакам или вариантам в иных воплощениях изобретения. Хотя одно или более воплощений данного изобретения, приведенных в качестве примера, проиллюстрированы с помощью прилагающихся фигур, специалисту в данной области техники должно быть очевидно, что эти воплощения могут быть осуществлены с различными изменениями по форме и деталям без отступления от сущности и объема настоящего изобретения согласно соответствующей формуле изобретения.
Список последовательностей
<110>  ОБИ ФАРМА, ИНК.
<120>  КОМПОЗИЦИЯ, ПРЕПАРАТ И ПРИМЕНЕНИЕ БОТУЛОТОКСИНА ТИПА А CLOSTRIDIUM BOTULINUM
<130>  F20W6191
<160>  5
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  626
<212>  PRT
<213> Clostridium botulinum
<400>  1
Met Asn Ser Ser Ile Lys Lys Ile Tyr Asn Asp Ile Gln Glu Lys Val
1               5                   10                  15
Ile Asn Tyr Ser Asp Thr Ile Asp Leu Ala Asp Gly Asn Tyr Val Val
20                  25                  30
Arg Arg Gly Asp Gly Trp Ile Leu Ser Arg Gln Asn Gln Ile Leu Gly
35                  40                  45
Gly Ser Val Ile Ser Asn Gly Ser Thr Gly Ile Val Gly Asp Leu Arg
50                  55                  60
Val Asn Asp Asn Ala Ile Pro Tyr Tyr Tyr Pro Thr Pro Ser Phe Asn
65                  70                  75                  80
Glu Glu Tyr Ile Lys Asn Asn Ile Gln Thr Val Phe Thr Asn Phe Thr
85                  90                  95
Glu Ala Asn Gln Ile Pro Ile Gly Phe Glu Phe Ser Lys Thr Ala Pro
100                 105                 110
Ser Asn Lys Asn Leu Tyr Met Tyr Leu Gln Tyr Thr Tyr Ile Arg Tyr
115                 120                 125
Glu Ile Ile Lys Val Leu Gln His Glu Ile Ile Glu Arg Ala Val Leu
130                 135                 140
Tyr Val Pro Ser Leu Gly Tyr Val Lys Ser Ile Glu Phe Asn Pro Gly
145                 150                 155                 160
Glu Lys Ile Asn Lys Asp Phe Tyr Phe Leu Thr Asn Asp Lys Cys Ile
165                 170                 175
Leu Asn Glu Gln Phe Leu Tyr Lys Lys Ile Leu Glu Thr Thr Lys Asn
180                 185                 190
Ile Pro Thr Asn Asn Ile Phe Asn Ser Lys Val Ser Ser Thr Gln Arg
195                 200                 205
Val Leu Pro Tyr Ser Asn Gly Leu Tyr Val Ile Asn Lys Gly Asp Gly
210                 215                 220
Tyr Ile Arg Thr Asn Asp Lys Asp Leu Ile Gly Thr Leu Leu Ile Glu
225                 230                 235                 240
Ala Gly Ser Ser Gly Ser Ile Ile Gln Pro Arg Leu Arg Asn Thr Thr
245                 250                 255
Arg Pro Leu Phe Thr Thr Ser Asn Asp Thr Lys Phe Ser Gln Gln Tyr
260                 265                 270
Thr Glu Glu Arg Leu Lys Asp Ala Phe Asn Val Gln Leu Phe Asn Thr
275                 280                 285
Ser Thr Ser Leu Phe Lys Phe Val Glu Glu Ala Pro Ser Asp Lys Asn
290                 295                 300
Ile Cys Ile Lys Ala Tyr Asn Thr Tyr Glu Lys Tyr Glu Leu Ile Asp
305                 310                 315                 320
Tyr Gln Asn Gly Ser Ile Val Asn Lys Ala Glu Tyr Tyr Leu Pro Ser
325                 330                 335
Leu Gly Tyr Cys Glu Val Thr Asn Ala Pro Ser Pro Glu Ser Glu Val
340                 345                 350
Val Lys Met Gln Val Ala Glu Asp Gly Phe Ile Gln Asn Gly Pro Glu
355                 360                 365
Glu Glu Ile Val Val Gly Val Ile Asp Pro Ser Glu Asn Ile Gln Glu
370                 375                 380
Ile Asn Thr Ala Ile Ser Asp Asn Tyr Thr Tyr Asn Ile Pro Gly Ile
385                 390                 395                 400
Val Asn Asn Asn Pro Phe Tyr Ile Leu Phe Thr Val Asn Thr Thr Gly
405                 410                 415
Ile Tyr Lys Ile Asn Ala Gln Asn Asn Leu Pro Ser Leu Lys Ile Tyr
420                 425                 430
Glu Ala Ile Gly Ser Gly Asn Arg Asn Phe Gln Ser Gly Asn Leu Cys
435                 440                 445
Asp Asp Asp Ile Lys Ala Ile Asn Tyr Ile Thr Gly Phe Asp Ser Pro
450                 455                 460
Asn Ala Lys Ser Tyr Leu Val Val Leu Leu Asn Lys Asp Lys Asn Tyr
465                 470                 475                 480
Tyr Ile Arg Val Pro Gln Thr Ser Ser Asn Ile Glu Asn Gln Ile Gln
485                 490                 495
Phe Lys Arg Glu Glu Gly Asp Leu Arg Asn Leu Met Asn Ser Ser Val
500                 505                 510
Asn Ile Ile Asp Asn Leu Asn Ser Thr Gly Ala His Tyr Tyr Thr Arg
515                 520                 525
Gln Ser Pro Asp Val His Asp Tyr Ile Ser Tyr Glu Phe Thr Ile Pro
530                 535                 540
Gly Asn Phe Asn Asn Lys Asp Thr Ser Asn Ile Arg Leu Tyr Thr Ser
545                 550                 555                 560
Tyr Asn Gln Gly Ile Gly Thr Leu Phe Arg Val Thr Glu Thr Ile Asp
565                 570                 575
Gly Tyr Asn Leu Ile Asn Ile Gln Gln Asn Leu His Leu Leu Asn Asn
580                 585                 590
Thr Asn Ser Ile Arg Leu Leu Asn Gly Ala Ile Tyr Ile Leu Lys Val
595                 600                 605
Glu Val Thr Glu Leu Asn Asn Tyr Asn Ile Arg Leu His Ile Asp Ile
610                 615                 620
Thr Asn
625
<210>  2
<211>  146
<212>  PRT
<213>  Clostridium botulinum
<400>  2
Met Ser Val Glu Arg Thr Phe Leu Pro Asn Gly Asn Tyr Asn Ile Lys
1               5                   10                  15
Ser Ile Phe Ser Gly Ser Leu Tyr Leu Asn Pro Val Ser Lys Ser Leu
20                  25                  30
Thr Phe Ser Asn Glu Ser Ser Ala Asn Asn Gln Lys Trp Asn Val Glu
35                  40                  45
Tyr Met Ala Glu Asn Arg Cys Phe Lys Ile Ser Asn Val Ala Glu Pro
50                  55                  60
Asn Lys Tyr Leu Ser Tyr Asp Asn Phe Gly Phe Ile Ser Leu Asp Ser
65                  70                  75                  80
Leu Ser Asn Arg Cys Tyr Trp Phe Pro Ile Lys Ile Ala Val Asn Thr
85                  90                  95
Tyr Ile Met Leu Ser Leu Asn Lys Val Asn Glu Leu Asp Tyr Ala Trp
100                 105                 110
Asp Ile Tyr Asp Thr Asn Glu Asn Ile Leu Ser Gln Pro Leu Leu Leu
115                 120                 125
Leu Pro Asn Phe Asp Ile Tyr Asn Ser Asn Gln Met Phe Lys Leu Glu
130                 135                 140
Lys Ile
145
<210>  3
<211>  293
<212>  PRT
<213>  Clostridium botulinum
<400>  3
Met Glu His Tyr Ser Val Ile Gln Asn Ser Leu Asn Asp Lys Ile Val
1               5                   10                  15
Thr Ile Ser Cys Lys Ala Asp Thr Asn Leu Phe Phe Tyr Gln Val Ala
20                  25                  30
Gly Asn Val Ser Leu Phe Gln Gln Thr Arg Asn Tyr Leu Glu Arg Trp
35                  40                  45
Arg Leu Ile Tyr Asp Ser Asn Lys Ala Ala Tyr Lys Ile Lys Ser Met
50                  55                  60
Asp Ile His Asn Thr Asn Leu Val Leu Thr Trp Asn Ala Pro Thr His
65                  70                  75                  80
Asn Ile Ser Thr Gln Gln Asp Ser Asn Ala Asp Asn Gln Tyr Trp Leu
85                  90                  95
Leu Leu Lys Asp Ile Gly Asn Asn Ser Phe Ile Ile Ala Ser Tyr Lys
100                 105                 110
Asn Pro Asn Leu Val Leu Tyr Ala Asp Thr Val Ala Arg Asn Leu Lys
115                 120                 125
Leu Ser Thr Leu Asn Asn Ser Asn Tyr Ile Lys Phe Ile Ile Glu Asp
130                 135                 140
Tyr Ile Ile Ser Asp Leu Asn Asn Phe Thr Cys Lys Ile Ser Pro Ile
145                 150                 155                 160
Leu Asp Leu Asn Lys Val Val Gln Gln Val Asp Val Thr Asn Leu Asn
165                 170                 175
Val Asn Leu Tyr Thr Trp Asp Tyr Gly Arg Asn Gln Lys Trp Thr Ile
180                 185                 190
Arg Tyr Asn Glu Glu Lys Ala Ala Tyr Gln Phe Phe Asn Thr Ile Leu
195                 200                 205
Ser Asn Gly Val Leu Thr Trp Ile Phe Ser Asn Gly Asn Thr Val Arg
210                 215                 220
Val Ser Ser Ser Asn Asp Gln Asn Asn Asp Ala Gln Tyr Trp Leu Ile
225                 230                 235                 240
Asn Pro Val Ser Asp Thr Asp Glu Thr Tyr Thr Ile Thr Asn Leu Arg
245                 250                 255
Asp Thr Thr Lys Ala Leu Asp Leu Tyr Gly Gly Gln Thr Ala Asn Gly
260                 265                 270
Thr Ala Ile Gln Val Phe Asn Tyr His Gly Asp Asp Asn Gln Lys Trp
275                 280                 285
Asn Ile Arg Asn Pro
290
<210>  4
<211>  1193
<212>  PRT
<213>  Clostridium botulinum
<400>  4
Met Asn Ile Asn Asp Asn Leu Ser Ile Asn Ser Pro Val Asp Asn Lys
1               5                   10                  15
Asn Val Val Val Val Arg Ala Arg Lys Thr Asp Thr Val Phe Lys Ala
20                  25                  30
Phe Lys Val Ala Pro Asn Ile Trp Val Ala Pro Glu Arg Tyr Tyr Gly
35                  40                  45
Glu Ser Leu Ser Ile Asp Glu Glu Tyr Lys Val Asp Gly Gly Ile Tyr
50                  55                  60
Asp Ser Asn Phe Leu Ser Gln Asp Ser Glu Lys Asp Lys Phe Leu Gln
65                  70                  75                  80
Ala Ile Ile Thr Leu Leu Lys Arg Ile Asn Ser Thr Asn Ala Gly Glu
85                  90                  95
Lys Leu Leu Ser Leu Ile Ser Thr Ala Ile Pro Phe Pro Tyr Gly Tyr
100                 105                 110
Ile Gly Gly Gly Tyr Tyr Ala Pro Asn Met Ile Thr Phe Gly Ser Ala
115                 120                 125
Pro Lys Ser Asn Lys Lys Leu Asn Ser Leu Ile Ser Ser Thr Ile Pro
130                 135                 140
Phe Pro Tyr Ala Gly Tyr Arg Glu Thr Asn Tyr Leu Ser Ser Glu Asp
145                 150                 155                 160
Asn Lys Ser Phe Tyr Ala Ser Asn Ile Val Ile Phe Gly Pro Gly Ala
165                 170                 175
Asn Ile Val Glu Asn Asn Thr Val Phe Tyr Lys Lys Glu Asp Ala Glu
180                 185                 190
Asn Gly Met Gly Thr Met Thr Glu Ile Trp Phe Gln Pro Phe Leu Thr
195                 200                 205
Tyr Lys Tyr Asp Glu Phe Tyr Ile Asp Pro Ala Ile Glu Leu Ile Lys
210                 215                 220
Cys Leu Ile Lys Ser Leu Tyr Phe Leu Tyr Gly Ile Lys Pro Ser Asp
225                 230                 235                 240
Asp Leu Val Ile Pro Tyr Arg Leu Arg Ser Glu Leu Glu Asn Ile Glu
245                 250                 255
Tyr Ser Gln Leu Asn Ile Val Asp Leu Leu Val Ser Gly Gly Ile Asp
260                 265                 270
Pro Lys Phe Ile Asn Thr Asp Pro Tyr Trp Phe Thr Asp Asn Tyr Phe
275                 280                 285
Ser Asn Ala Lys Lys Val Phe Glu Asp His Arg Asn Ile Tyr Glu Thr
290                 295                 300
Glu Ile Glu Gly Asn Asn Ala Ile Gly Asn Asp Ile Lys Leu Arg Leu
305                 310                 315                 320
Lys Gln Lys Phe Arg Ile Asn Ile Asn Asp Ile Trp Glu Leu Asn Leu
325                 330                 335
Asn Tyr Phe Ser Lys Glu Phe Ser Ile Met Met Pro Asp Arg Phe Asn
340                 345                 350
Asn Ala Leu Lys His Phe Tyr Arg Lys Gln Tyr Tyr Lys Ile Asp Tyr
355                 360                 365
Pro Glu Asn Tyr Ser Ile Asn Gly Phe Val Asn Gly Gln Ile Asn Ala
370                 375                 380
Gln Leu Ser Leu Ser Asp Arg Asn Gln Asp Ile Ile Asn Lys Pro Glu
385                 390                 395                 400
Glu Ile Ile Asn Leu Leu Asn Gly Asn Asn Val Ser Leu Met Arg Ser
405                 410                 415
Asn Ile Tyr Gly Asp Gly Leu Lys Ser Thr Val Asp Asp Phe Tyr Ser
420                 425                 430
Asn Tyr Lys Ile Pro Tyr Asn Arg Ala Tyr Glu Tyr His Phe Asn Asn
435                 440                 445
Ser Asn Asp Ser Ser Leu Asp Asn Val Asn Ile Gly Val Ile Asp Asn
450                 455                 460
Ile Pro Glu Ile Ile Asp Val Asn Pro Tyr Lys Glu Asn Cys Asp Lys
465                 470                 475                 480
Phe Ser Pro Val Gln Lys Ile Thr Ser Thr Arg Glu Ile Asn Thr Asn
485                 490                 495
Ile Pro Trp Pro Ile Asn Tyr Leu Gln Ala Gln Asn Thr Asn Asn Glu
500                 505                 510
Lys Phe Ser Leu Ser Ser Asp Phe Val Glu Val Val Ser Ser Lys Asp
515                 520                 525
Lys Ser Leu Val Tyr Ser Phe Leu Ser Asn Val Met Phe Tyr Leu Asp
530                 535                 540
Ser Ile Lys Asp Asn Ser Pro Ile Asp Thr Asp Lys Lys Tyr Tyr Leu
545                 550                 555                 560
Trp Leu Arg Glu Ile Phe Arg Asn Tyr Ser Phe Asp Ile Thr Ala Thr
565                 570                 575
Gln Glu Ile Asn Thr Asn Cys Gly Ile Asn Lys Val Val Thr Trp Phe
580                 585                 590
Gly Lys Ala Leu Asn Ile Leu Asn Thr Ser Asp Ser Phe Val Glu Glu
595                 600                 605
Phe Gln Asn Leu Gly Ala Ile Ser Leu Ile Asn Lys Lys Glu Asn Leu
610                 615                 620
Ser Met Pro Ile Ile Glu Ser Tyr Glu Ile Pro Asn Asp Met Leu Gly
625                 630                 635                 640
Leu Pro Leu Asn Asp Leu Asn Glu Lys Leu Phe Asn Ile Tyr Ser Lys
645                 650                 655
Asn Thr Ala Tyr Phe Lys Lys Ile Tyr Tyr Asn Phe Leu Asp Gln Trp
660                 665                 670
Trp Thr Gln Tyr Tyr Ser Gln Tyr Phe Asp Leu Ile Cys Met Ala Lys
675                 680                 685
Arg Ser Val Leu Ala Gln Glu Thr Leu Ile Lys Arg Ile Ile Gln Lys
690                 695                 700
Lys Leu Ser Tyr Leu Ile Gly Asn Ser Asn Ile Ser Ser Asp Asn Leu
705                 710                 715                 720
Ala Leu Met Asn Leu Thr Thr Thr Asn Thr Leu Arg Asp Ile Ser Asn
725                 730                 735
Glu Ser Gln Ile Ala Met Asn Asn Val Asp Ser Phe Leu Asn Asn Ala
740                 745                 750
Ala Ile Cys Val Phe Glu Ser Asn Ile Tyr Pro Lys Phe Ile Ser Phe
755                 760                 765
Met Glu Gln Cys Ile Asn Asn Ile Asn Ile Lys Thr Lys Glu Phe Ile
770                 775                 780
Gln Lys Cys Thr Asn Ile Asn Glu Asp Glu Lys Leu Gln Leu Ile Asn
785                 790                 795                 800
Gln Asn Val Phe Asn Ser Leu Asp Phe Glu Phe Leu Asn Ile Gln Asn
805                 810                 815
Met Lys Ser Leu Phe Ser Ser Glu Thr Ala Leu Leu Ile Lys Glu Glu
820                 825                 830
Thr Trp Pro Tyr Glu Leu Val Leu Tyr Ala Phe Lys Glu Pro Gly Asn
835                 840                 845
Asn Val Ile Gly Asp Ala Ser Gly Lys Asn Thr Ser Ile Glu Tyr Ser
850                 855                 860
Lys Asp Ile Gly Leu Val Tyr Gly Ile Asn Ser Asp Ala Leu Tyr Leu
865                 870                 875                 880
Asn Gly Ser Asn Gln Ser Ile Ser Phe Ser Asn Asp Phe Phe Glu Asn
885                 890                 895
Gly Leu Thr Asn Ser Phe Ser Ile Tyr Phe Trp Leu Arg Asn Leu Gly
900                 905                 910
Lys Asp Thr Ile Lys Ser Lys Leu Ile Gly Ser Lys Glu Asp Asn Cys
915                 920                 925
Gly Trp Glu Ile Tyr Phe Gln Asp Thr Gly Leu Val Phe Asn Met Ile
930                 935                 940
Asp Ser Asn Gly Asn Glu Lys Asn Ile Tyr Leu Ser Asp Val Ser Asn
945                 950                 955                 960
Asn Ser Trp His Tyr Ile Thr Ile Ser Val Asp Arg Leu Lys Glu Gln
965                 970                 975
Leu Leu Ile Phe Ile Asp Asp Asn Leu Val Ala Asn Glu Ser Ile Lys
980                 985                 990
Glu Ile Leu Asn Ile Tyr Ser Ser  Asn Ile Ile Ser Leu  Leu Ser Glu
995                 1000                 1005
Asn Asn  Pro Ser Tyr Ile Glu  Gly Leu Thr Ile Leu  Asn Lys Pro
1010                 1015                 1020
Thr Thr  Ser Gln Glu Val Leu  Ser Asn Tyr Phe Glu  Val Leu Asn
1025                 1030                 1035
Asn Ser  Tyr Ile Arg Asp Ser  Asn Glu Glu Arg Leu  Glu Tyr Asn
1040                 1045                 1050
Lys Thr  Tyr Gln Leu Tyr Asn  Tyr Val Phe Ser Asp  Lys Pro Ile
1055                 1060                 1065
Cys Glu  Val Lys Gln Asn Asn  Asn Ile Tyr Leu Thr  Ile Asn Asn
1070                 1075                 1080
Thr Asn  Asn Leu Asn Leu Gln  Ala Ser Lys Phe Lys  Leu Leu Ser
1085                 1090                 1095
Ile Asn  Pro Asn Lys Gln Tyr  Val Gln Lys Leu Asp  Glu Val Ile
1100                 1105                 1110
Ile Ser  Val Leu Asp Asn Met  Glu Lys Tyr Ile Asp  Ile Ser Glu
1115                 1120                 1125
Asp Asn  Arg Leu Gln Leu Ile  Asp Asn Lys Asn Asn  Ala Lys Lys
1130                 1135                 1140
Met Ile  Ile Ser Asn Asp Ile  Phe Ile Ser Asn Cys  Leu Thr Leu
1145                 1150                 1155
Ser Tyr  Asn Gly Lys Tyr Ile  Cys Leu Ser Met Lys  Asp Glu Asn
1160                 1165                 1170
His Asn  Trp Met Ile Cys Asn  Asn Asp Met Ser Lys  Tyr Leu Tyr
1175                 1180                 1185
Leu Trp  Ser Phe Lys
1190
<210>  5
<211>  1296
<212>  PRT
<213>  Clostridium botulinum
<400>  5
Met Pro Phe Val Asn Lys Gln Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val Asn Gly
1               5                   10                  15
Val Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn Ala Gly Gln Met Gln Pro
20                  25                  30
Val Lys Ala Phe Lys Ile His Asn Lys Ile Trp Val Ile Pro Glu Arg
35                  40                  45
Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro Pro Glu
50                  55                  60
Ala Lys Gln Val Pro Val Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu Ser Thr
65                  70                  75                  80
Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu Phe Glu
85                  90                  95
Arg Ile Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser Ile Val
100                 105                 110
Arg Gly Ile Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr Ile Asp Thr Glu Leu Lys
115                 120                 125
Val Ile Asp Thr Asn Cys Ile Asn Val Ile Gln Pro Asp Gly Ser Tyr
130                 135                 140
Arg Ser Glu Glu Leu Asn Leu Val Ile Ile Gly Pro Ser Ala Asp Ile
145                 150                 155                 160
Ile Gln Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Val Leu Asn Leu Thr
165                 170                 175
Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Tyr Ile Arg Phe Ser Pro Asp Phe
180                 185                 190
Thr Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu Glu Val Asp Thr Asn Pro Leu Leu
195                 200                 205
Gly Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala Val Thr Leu Ala His Glu
210                 215                 220
Leu Ile His Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Asn Pro Asn
225                 230                 235                 240
Arg Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser Gly Leu
245                 250                 255
Glu Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp Ala Lys
260                 265                 270
Phe Ile Asp Ser Leu Gln Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr Tyr Asn
275                 280                 285
Lys Phe Lys Asp Ile Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser Ile Val
290                 295                 300
Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gln Tyr Met Lys Asn Val Phe Lys Glu Lys
305                 310                 315                 320
Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Val Asp Lys Leu
325                 330                 335
Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu Ile Tyr Thr Glu Asp
340                 345                 350
Asn Phe Val Lys Phe Phe Lys Val Leu Asn Arg Lys Thr Tyr Leu Asn
355                 360                 365
Phe Asp Lys Ala Val Phe Lys Ile Asn Ile Val Pro Lys Val Asn Tyr
370                 375                 380
Thr Ile Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala Ala Asn
385                 390                 395                 400
Phe Asn Gly Gln Asn Thr Glu Ile Asn Asn Met Asn Phe Thr Lys Leu
405                 410                 415
Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys Val Arg
420                 425                 430
Gly Ile Ile Thr Ser Lys Thr Lys Ser Leu Asp Lys Gly Tyr Asn Lys
435                 440                 445
Ala Leu Asn Asp Leu Cys Ile Lys Val Asn Asn Trp Asp Leu Phe Phe
450                 455                 460
Ser Pro Ser Glu Asp Asn Phe Thr Asn Asp Leu Asn Lys Gly Glu Glu
465                 470                 475                 480
Ile Thr Ser Asp Thr Asn Ile Glu Ala Ala Glu Glu Asn Ile Ser Leu
485                 490                 495
Asp Leu Ile Gln Gln Tyr Tyr Leu Thr Phe Asn Phe Asp Asn Glu Pro
500                 505                 510
Glu Asn Ile Ser Ile Glu Asn Leu Ser Ser Asp Ile Ile Gly Gln Leu
515                 520                 525
Glu Leu Met Pro Asn Ile Glu Arg Phe Pro Asn Gly Lys Lys Tyr Glu
530                 535                 540
Leu Asp Lys Tyr Thr Met Phe His Tyr Leu Arg Ala Gln Glu Phe Glu
545                 550                 555                 560
His Gly Lys Ser Arg Ile Ala Leu Thr Asn Ser Val Asn Glu Ala Leu
565                 570                 575
Leu Asn Pro Ser Arg Val Tyr Thr Phe Phe Ser Ser Asp Tyr Val Lys
580                 585                 590
Lys Val Asn Lys Ala Thr Glu Ala Ala Met Phe Leu Gly Trp Val Glu
595                 600                 605
Gln Leu Val Tyr Asp Phe Thr Asp Glu Thr Ser Glu Val Ser Thr Thr
610                 615                 620
Asp Lys Ile Ala Asp Ile Thr Ile Ile Ile Pro Tyr Ile Gly Pro Ala
625                 630                 635                 640
Leu Asn Ile Gly Asn Met Leu Tyr Lys Asp Asp Phe Val Gly Ala Leu
645                 650                 655
Ile Phe Ser Gly Ala Val Ile Leu Leu Glu Phe Ile Pro Glu Ile Ala
660                 665                 670
Ile Pro Val Leu Gly Thr Phe Ala Leu Val Ser Tyr Ile Ala Asn Lys
675                 680                 685
Val Leu Thr Val Gln Thr Ile Asp Asn Ala Leu Ser Lys Arg Asn Glu
690                 695                 700
Lys Trp Asp Glu Val Tyr Lys Tyr Ile Val Thr Asn Trp Leu Ala Lys
705                 710                 715                 720
Val Asn Thr Gln Ile Asp Leu Ile Arg Lys Lys Met Lys Glu Ala Leu
725                 730                 735
Glu Asn Gln Ala Glu Ala Thr Lys Ala Ile Ile Asn Tyr Gln Tyr Asn
740                 745                 750
Gln Tyr Thr Glu Glu Glu Lys Asn Asn Ile Asn Phe Asn Ile Asp Asp
755                 760                 765
Leu Ser Ser Lys Leu Asn Glu Ser Ile Asn Lys Ala Met Ile Asn Ile
770                 775                 780
Asn Lys Phe Leu Asn Gln Cys Ser Val Ser Tyr Leu Met Asn Ser Met
785                 790                 795                 800
Ile Pro Tyr Gly Val Lys Arg Leu Glu Asp Phe Asp Ala Ser Leu Lys
805                 810                 815
Asp Ala Leu Leu Lys Tyr Ile Tyr Asp Asn Arg Gly Thr Leu Ile Gly
820                 825                 830
Gln Val Asp Arg Leu Lys Asp Lys Val Asn Asn Thr Leu Ser Thr Asp
835                 840                 845
Ile Pro Phe Gln Leu Ser Lys Tyr Val Asp Asn Gln Arg Leu Leu Ser
850                 855                 860
Thr Phe Thr Glu Tyr Ile Lys Asn Ile Ile Asn Thr Ser Ile Leu Asn
865                 870                 875                 880
Leu Arg Tyr Glu Ser Asn His Leu Ile Asp Leu Ser Arg Tyr Ala Ser
885                 890                 895
Lys Ile Asn Ile Gly Ser Lys Val Asn Phe Asp Pro Ile Asp Lys Asn
900                 905                 910
Gln Ile Gln Leu Phe Asn Leu Glu Ser Ser Lys Ile Glu Val Ile Leu
915                 920                 925
Lys Asn Ala Ile Val Tyr Asn Ser Met Tyr Glu Asn Phe Ser Thr Ser
930                 935                 940
Phe Trp Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Phe Asn Ser Ile Ser Leu Asn Asn
945                 950                 955                 960
Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Glu Asn Asn Ser Gly Trp Lys Val
965                 970                 975
Ser Leu Asn Tyr Gly Glu Ile Ile Trp Thr Leu Gln Asp Thr Gln Glu
980                 985                 990
Ile Lys Gln Arg Val Val Phe Lys  Tyr Ser Gln Met Ile  Asn Ile Ser
995                 1000                 1005
Asp Tyr  Ile Asn Arg Trp Ile  Phe Val Thr Ile Thr  Asn Asn Arg
1010                 1015                 1020
Leu Asn  Asn Ser Lys Ile Tyr  Ile Asn Gly Arg Leu  Ile Asp Gln
1025                 1030                 1035
Lys Pro  Ile Ser Asn Leu Gly  Asn Ile His Ala Ser  Asn Asn Ile
1040                 1045                 1050
Met Phe  Lys Leu Asp Gly Cys  Arg Asp Thr His Arg  Tyr Ile Trp
1055                 1060                 1065
Ile Lys  Tyr Phe Asn Leu Phe  Asp Lys Glu Leu Asn  Glu Lys Glu
1070                 1075                 1080
Ile Lys  Asp Leu Tyr Asp Asn  Gln Ser Asn Ser Gly  Ile Leu Lys
1085                 1090                 1095
Asp Phe  Trp Gly Asp Tyr Leu  Gln Tyr Asp Lys Pro  Tyr Tyr Met
1100                 1105                 1110
Leu Asn  Leu Tyr Asp Pro Asn  Lys Tyr Val Asp Val  Asn Asn Val
1115                 1120                 1125
Gly Ile  Arg Gly Tyr Met Tyr  Leu Lys Gly Pro Arg  Gly Ser Val
1130                 1135                 1140
Met Thr  Thr Asn Ile Tyr Leu  Asn Ser Ser Leu Tyr  Arg Gly Thr
1145                 1150                 1155
Lys Phe  Ile Ile Lys Lys Tyr  Ala Ser Gly Asn Lys  Asp Asn Ile
1160                 1165                 1170
Val Arg  Asn Asn Asp Arg Val  Tyr Ile Asn Val Val  Val Lys Asn
1175                 1180                 1185
Lys Glu  Tyr Arg Leu Ala Thr  Asn Ala Ser Gln Ala  Gly Val Glu
1190                 1195                 1200
Lys Ile  Leu Ser Ala Leu Glu  Ile Pro Asp Val Gly  Asn Leu Ser
1205                 1210                 1215
Gln Val  Val Val Met Lys Ser  Lys Asn Asp Gln Gly  Ile Thr Asn
1220                 1225                 1230
Lys Cys  Lys Met Asn Leu Gln  Asp Asn Asn Gly Asn  Asp Ile Gly
1235                 1240                 1245
Phe Ile  Gly Phe His Gln Phe  Asn Asn Ile Ala Lys  Leu Val Ala
1250                 1255                 1260
Ser Asn  Trp Tyr Asn Arg Gln  Ile Glu Arg Ser Ser  Arg Thr Leu
1265                 1270                 1275
Gly Cys  Ser Trp Glu Phe Ile  Pro Val Asp Asp Gly  Trp Gly Glu
1280                 1285                 1290
Arg Pro  Leu
1295