СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СРЕДСТВА, ОБЛАДАЮЩЕГО АНТИОКСИДАНТНЫМ, ЖЕЛЧЕГОННЫМ, ГЕПАТО-, РАДИО- И НЕФРОПРОТЕКТОРНЫМ, АНТИРАДИКАЛЬНЫМ, РАНОЗАЖИВЛЯЮЩИМ ДЕЙСТВИЕМ
METHOD OF OBTAINING MEDICATION, POSSESSING ANTIOXIDANT, CHOLAGOGIC, HEPATO RADIO- AND NEPHROPROTECTIVE, ANTIRADICAL, WOUND-HEALING ACTIVITY

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к производству лечебно-профилактических средств из пищевого растительного сырья.
Технический результат изобретения заключается в разработке способа получения средства, обладающего одновременно антиоксидантным, желчегонным, гепато-, радио- и нефропротекторным, антирадикальным, ранозаживляющим действием.
Известен способ получения из шелухи какао-бобов, какаовеллы средства, обладающего гепатозащитным, желчегонным, антиоксидантным и противолучевым действием, который заключается в следующем: 50 кг какаовеллы экстрагируют 250 кг горячей воды (80-90°С), водное извлечение сгушают, сушат, измельчают и получают 11,2 кг светло-коричневого аморфного порошка с выходом 22,4% [1].
Существенным недостатком известного способа являются значительные энергетические затраты на стадии сгущения экстракта, поскольку общий объем отгоняемой воды составляет до 750 кг на каждые 33,6 кг целевого продукта.
Целью изобретения является расширение спектра фармакологического действия целевого продукта, обладающего одновременно антиоксидантным, желчегонным, гепато-, радио- и нефропротекторным, антирадикальным, ранозаживляющим действием, а также повышение выхода целевого продукта, снижение энергетических и материальных затрат на стадии сгущения водных извлечений из какаовеллы.
Поставленная цель достигается тем, что процесс экстрагирования какаовеллы проводят в батарее из четырех перколяторов водой методом ремацерации с обязательным настаиванием с холодной водой, он иллюстрируется следующим примером конкретного исполнения.
В батарею из четырех экстракторов, снабженных паровой рубашкой и мешалкой, загружают по 10 кг какаовеллы и по 70 кг воды (20°С), перемешивают и оставляют на 2 часа для набухания. Затем в первый экстрактор добавляют 100 кг горячей (90°С) воды, нагревают всю массу до 90°С и при перемешивании поддерживают температуру от 80 до 90°С в течение трех часов. Водное извлечение из первого экстрактора сливают и переносят во второй экстрактор с набухшим сырьем, нагревают до 90°С и при перемешивании выдерживают три часа при 80-90°С. В первый экстрактор заливают 100 кг горячей (90°С) воды и при перемешивании поддерживают температуру от 80 до 90°С. Аналогичные операции проводят во всех четырех экстракторах. Из четвертого экстрактора получают максимально насыщенное извлечение. Использование пятого экстрактора не приводит к существенному увеличению содержания экстрактивных веществ (табл.1).
Таблица 1
Номер экстрактора
Содержание экстрактивных веществ в извлечениях из разных экстракторов, кг/%
1
2
3
4
5
1
2,144/21,44
2
1,163/11,16
2,723/27,23
3
0,306/3,06
3,635/36,35
4
0,264/2,64
4,482/44,82
5
0,132/1,32
4,486/44,86
Извлечение из четвертого экстрактора сгущают досуха и получают целевой продукт с выходом 4,482 кг (44,82%). Первый экстрактор становится четвертым. Процесс извлечения продолжают далее как описано выше до получения необходимого количества целевого продукта.
Предлагаемый способ получения целевого продукта в отличие от известного позволяет расширить спектр фармакологического действия целевого продукта, увеличить его выход в 2 раза и значительно (в 5-6 раз) сократить количество сгущаемого извлечения (вместо 500-600 кг -всего 100 кг), что существенно снизит энергетические и материальные затраты.
Исследование желчегонной активности проводили путем определения количества выделившейся желчи. Животным контрольной группы вводили воду. В качестве препарата сравнения использовали официнальное желчегонное средство «Фламин». Для выявления гепатозащитной активности определяли гепатозащитный индекс при введении крысам четыреххлористого углерода в токсической дозе.
Одновременно определяли снижение в процентах фермента аланинаминотрансферазы (АлАт). В качестве препарата сравнения использовали официнальное гепатозащитное средство «Силибор» (табл.2).
Антиоксидантная активность определялась в соответствии с методикой Референс по снижению малонового дильдегида (МДА). Препаратом сравнения служил витамин Е (табл.2).
Таблица 2
Лекарственное средство
Кол-во крыс
Желчегонная активность, % увеличения
Кол-во крыс
Гепатозащитная активность, % снижения АлАт
Кол-во крыс
Антиоксидантная активность, % снижения МДА
Целевой подукт (Кавехол)
10
94,7
10
23,3
1-0
43,5
Прототип
10
95,5
10
23,8
10
44,4
Фламин
10
53,8
Силибор
10
51,0
10
29,5
В табл.3 приведены результаты исследований ранозаживляющей способности после лучевого повреждения кожи.
Таблица 3
Лекарственное средство
Кол-во крыс
Сокращение сроков эпителизации, дни /%
Сроки начала отрастания шерсти
Сроки окончания отрастания шерсти
Контроль (физ. р-р)
20
41,0±1,5/100
50,3±2,0
59,4±2,5
Прототип
20
22,5±1,5/54,88
28,4±2,0
34,2±2,5
Целевой продукт
20
21,8±1,5/53,17
28,5±2,0
34,0±2,5
Этоний
20
24,8±1,5/60,49
31,0±2,5
40,3±2,5
Приведенные в табл.2 и 3 результаты исследований показывают, что целевой продукт (кавехол), полученный по предлагаемому способу, в сравнении с прототипом практически не приводит к снижению желчегонной, гепатозащитной, антиоксидантной и ранозаживляющей (при лучевом повреждении кожи) активности.
Гепато- и нефропротекторную деятельность целевого продукта исследовали на модели хронического эндотоксикоза (ХЭТ) у крыс, вызванного тетрахлорметаном (по 5 мл/кг 5 раз в неделю), а на шестой день дополнительно вводили внутрибрюшинно бактериальный липополисахарид (Sal. typhimurium, Sigma, USA в дозе 0,2 мл/кг) [2]. Летальность животных к 30 сут составила 10%, к 90 сут - 40-50%. В группе сравнения (норма) использовались интактные животные. Опытные группы животных на 7 сут получали дополнительно кавехол в дозе 25 мг/кг перорально. В качестве препарата сравнения использовали эссенциале, который вводили внутрибрюшинно в виде раствора 0,1 мл/кг однократно в сутки на фоне моделирования ХЭТ.
3
В печени при гистоморфометрии рассчитывали объемные доли (ОД, мкм), занимаемые соединительной тканью, гепатоцитами (%) и ОД липидов, некрозы гепатоцитов (%).
В табл.4 приведены результаты морфологических исследований ткани печени. Установлено, что развитие ХЭТ сопровождается прогрессирующей дистрофией и некрозом гепатоцитов с реакцией микроциркуляции, макрофагов и лимфоцитов на них. Изменения перисинусоидальных клеток и сосудистая перестройка способствовали поддержанию в печени умеренно выраженного внутритканевого цитолиза, а к 30-м суткам выявлялись признаки гепатофиброза. Морфометрия опытной группы животных, получавших целевой продукт (кавехол), показала значительное ограничение всех морфометрических появлений вторичного повреждения печени при ХЭТ (табл.4). Курсовое введение эссенциале приводило к частичному ограничению снижения ОД гепатоцитов и увеличению доли некротизированных гепатоцитов, характерных для хронического ЭТ. В то же время увеличение ОД соединительной ткани также было замедлено по сравнению с контролем (табл.4). Целевой продукт (кавехол) вызывал аналогичные эффекты, сопоставимые с эссенциале на сроках 7 и 14 суток. На 30-е сутки его эффект в отношении сохранения пула гепатоцитов превышал таковой для эссенциале, а в отношении замедления прироста соединительной ткани - несколько ниже, но сопоставим с эссенциале.
Таблица 4
Влияние исследуемых препаратов на показатели морфометрии печени при ХЭТ у крыс
Экспериментальные группы
Сроки эксперимента
7 сут
21 сут
30 сут
ОД соединительные ткани, % (норма -1,8±0,5)
Контроль
6,4±0,5
9,3±0,7
10,2±0,8
Целевой продукт (кавехол)
3,0±0,3*
5,4±0,6*
6,4±0,6*
Эссенциале
3,1±0,4*
5,2±0,7*
6,2±0,8*
ОД гепатоцитов, % (норма - 63,5±2,9)
Контроль
58,0±3,4
51,4±3,0
48,0±2,9
Целевой продукт (кавехол)
63,1±3,7
59,2±3,7*
58,0±3,3*
Эссенциале
61,5±2,9
58,0±3,1*
51.4±3,0*
Некрозы гепатоцитов, % (норма - 4,5±0,5)
Контроль
18,2±1,4
22,4±1,7
20,6±1,6
Целевой продукт (кавехол)
14,0±1,1
12,5±0,8*
13,8±0,9*
Эссенциале
12,5±1,1
10,3±1,0*
17,1±1,4*
ОД липидов, % (норма -3,8±0,4)
Контроль
9,2±1,4
15,0±1,9
11,4±1,2
Целевой продукт (кавехол)
6,0±0,7*
8,4±1,1*
9,0±1,0
Эссенциале
6,6±0,7*
12,2±1,5*
10,5±1,1
* Достоверные различия с контролем, р≤0,05
При назначении животным эссенциале проявления дисметаболической нефропатии, характерной для хронического эндотоксикоза, несколько сглаживались. Формирование нефросклероза не сопровождалось нарушениями внутрипочечной уродинамики, явления дистрофии и некроза эпителия канальцев не были столь яркими (табл.5).
При назначении целевого продукта, в отличие от эссенциале, происходило замедление прироста ОД соединительной ткани и процента склерозированных клубочков, а также сокращение мочевого пространства в клубочках. Сохранение размеров ядер эпителия канальцев, в противовес их уменьшению при ХЭТ, было в равной мере характерно для эссенциале и кавехола.
Таблица 5
Влияние кафехола и эссенциале на показатели морфометрии почек при ХЭТ у крыс
Экспериментальные группы
Сроки эксперимента
7 сут
21 сут
30 сут
ОД соединительной ткани, % (норма - 7,3±0,7)
Контроль
12,7±0,7
13,7±0,8
15,5±1,1
Целевой продукт (кавехол)
8,9±0,6*
9,1±0,8*
8,4±0,7*
Эссенциале
12,0±0,7
12,2±1,0
15,0±0,8*
Мочевое пространство клубочков (норма - 1,8±0,2)
Контроль
1,4±0,2
1,1±0,4
0,9±0,2
Целевой продукт (кавехол)
1,9±0,2
1,7±0,2*
1,6±0,3*
Эссенциале
1,8±0,2
1,1±0,2*
1,0±0,3*
СО эпителия канальцев, мкм<sup>3</sup> (норма - 102,9±4,9)
Контроль
104,0±9,8
85,9±7,0
82,8±6,1
Целевой продукт (кавехол)
110,4±10,1
102,3±9,7
98,9±7,8
Эссенциале
101,4±9,2
100,2±9,5
96,4±7,7
Склерозированные клубочки, % (в норме - нет)
Контроль
0
1,0±0,3
8,0±0,8
Целевой продукт (кавехол)
0
0
4,4±0,4*
Эссенциале
0
0
3,9±0,3*
* Достоверные различия с контролем, р≤0,05
Таким образом, при использовании кавехола удается частично ограничить цитотоксические, сосудистые и фибропластические механизмы повреждения ткани печени и почек, свойственные ХЭТ. Его протективные эффекты в отношении печени сопоставимы с препаратом сравнения, а в отношении почек - превосходят действие эссенциале.
Антирадикальную активность (АРА) целевого продукта определяли по степени гашения хемилюминесценции в системе, генерирующей свободные радикалы, с помощью хемилюминометра ХЛМ 1Ц-01 [3]. При добавлении в систему, генерирующую свободные радикалы, раствора целевого продукта в объеме (V) от 1 до 30 мкл можно определить степень гашения хемилюминесценции. Исходная концентрация вещества 1 мг/мл, в качестве растворителя использовали воду. Величину гашения хемилюминесценции в процентах от контроля X рассчитывают по формуле X=100%-(А·100%)/К, где А - значение гашения хемилюминесценции раствора вещества, К - гашение хемилюминесценции растворителя.
Кавехол в концентрации 0,24 мкг/мл приводит к гашению хемилюминесценции на 42.5%.
В качестве препарата сравнения использовали известный антиоксидант - дибунол (4-гидрокси-3,5-ди-трет-бутил-1-метилбензол), для которого описана и антирадикальная активность [4]. Исследования АРА дибунола, проведенные в тех же условиях, не показали гашения свободных радикалов даже в концентрации 1 мг/мл.
Таким образом, по величине ингибирования хемилюминесценции целевой продукт значительно превышает активность дибунола.
Ранозаживляющая активность целевого продукта при ожогах установлена на 12 лабораторных крысах обоего пола в возрасте 80 суток. Для оценки результатов эксперимента был использован комплексный критерий определения эффективности заживления ожогов у экспериментальных животных.
В качестве первого критерия проводили гистологическое исследование ожоговых поверхностей. Срезы кожи, полученные на 3, 7 и 14 сутки эксперимента. Образцы кожи помещали в 10% раствор формалина с последующей проводкой по стандартной методике и окраской гематоксилином и эозином. Данное исследование позволяет определить влияние терапии на процессы репарации.
Следующий критерий - данные бактериологического исследования, позволяющий объективно оценивать динамику заживления ран посредством определения наличия микрофлоры в составе раневого отделяемого и проведения ее качественной оценки. Материалом для бактериологических исследований послужили 56 смывов с ожоговой поверхности кожи крыс. В качестве контроля использовали 8 смывов с ожоговых поверхностей, не подвергавшихся лечению.
Количественный и видовой состав микрофлоры ожоговой поверхности изучали бактериологическим методом путем посева смывов с поверхности ожога на дифференциально-диагностические среды с целью определения количества тех или иных микроорганизмов после применения целевого продукта и препарата сравнения «Левомиколь».
При исследовании микробиоценоза ожоговой поверхности учитывали: 1) общее количество микроорганизмов; 2) микробы семейства Enterobacteriaceae; 3) стафилококки; 4) грибы рода Candida. Оценивали частоту встречаемости отдельных видов микроорганизмов в зависимости от биотопа и применяемых средств для лечения ожогов, плотность бактериальной обсемененности в динамике на 7 и 14 сутки лечения ожоговой поверхности с учетом индекса доминирования, определяемой по формуле Одума Ю. [5].
Заключительным критерием явилась оценка динамики уменьшения площади кожного дефекта: площадь раны в процентах, из расчета на начало лечения - 100% ожоговой поверхности (табл.6).
Таблица 6
Площадь кожной раны (% от площади ожога)
Исследуемые препараты
3 сут
7 сут
14 сут
Целевой продукт (кавехол)
85,3
55,6
26,6
Левомеколь (преп. сравнения)
94,5
62,1
30,8
Контроль (без лечения)
90,0*
45,8
36,9
* В ранние сроки у животных, не получивших лечения площадь поверхности раны уменьшается на 10-15%
Микробиоценоз ожоговой поверхности рассматривали с позиции доминантности каждого вида, в качестве показателя используя частоту встречаемости [6]. При этом выделяли постоянные виды (встречаемость более 50%), дополнительные - (25-30%) и случайные - (менее 25%).
Анализ микрофлоры, позволяющий разделить ее на постоянную и дополнительную, представлен в табл.7.
Таблица 7
Частота встречаемости экологических групп микроорганизмов в микробиоценозе ожоговых поверхностей крыс
№ биотопа
Экологические группы, %
Staphilococcus
Streptococcus
Enterobacteriaceae
Грибы рода Candida
Целевой продукт (каввехол)
62,5
25,0
75,0
25,0
Левомеколь
87,5
25,0
62,5
37,5
Контроль
100,0
37,5
87,5
75,0
Основными представителями, высеваемыми с поверхностного слоя ожоговой поверхности, являются стафилококки. Таким образом, стафилококки являются абсолютно доминирующими представителями ожоговой поверхности, при этом наибольший удельный вес среди стафилококков принадлежит S.saprophyticus, S.epidermidis, S.aureus (табл.8).
Таблица 8
Степень доминантности видов стафилококков в структуре сообщества ожоговой поверхности
№ биотопа
Вид стафилококков, в %
S. saprophyticus
S. epidermidis
S. aureus
Целевой подукт (кавехол)
41,8
42,5
15,7
Левомеколь
23,6
31,3
45,1
Контроль
3,4
41,8
54,8
Анализ доминантности состава стафилококков показал, что при использовании целевого продукта превалировал сапрофитический стафилококк - представитель резидентной флоры. В противовес этому на ожоговой поверхности группы сравнения абсолютно доминировал золотистый стафилококк (54,8%) и эпидермальный стафилококк с гемолитическими свойствами. На биотопах, обрабатываемых препаратом сравнения левомеколем, доминировал золотистый стафилококк (45,1%), наличие которого осложняет течение раневого и ожогового процесса и обусловливает гнойные осложнения.
2
2
При изучении общей бактериальной обсемененности в динамике установлено, что данный показатель достоверно снижался к 14 суткам эксперимента при использовании целевого продукта, а именно от 131,5±17,1 КОЕ/см - на 7 сут эксперимента, до 100,9±12,3 КОЕ/см - на 14 сут (р<0,05). Обработка ожоговых поверхностей препаратом сравнения левомеколь не привела к достоверному уменьшению общей бактериальной обсемененности. Снижение плотности микробных ассоциаций на 14 сутки эксперимента зафиксировано и на ожоговых поверхностях, не обрабатываемых лекарственными средствами. На 3 сутки все ожоговые поверхности были покрыты плотным струпом, а некоторые из них на 7 сутки перешли в третью фазу заживления - эпителизации, образования и реорганизации рубца.
Данные гистологического исследования показывают, что заживление ожоговой поверхности произошло при применении обоих препаратов, а также в контрольном образце, не обрабатываемом лекарственными средствами. Однако скорость эпителизации была различной. На 3 сутки эксперимента появляются признаки краевой эпителизации, о чем свидетельствует базофильное окрашивание микропрепарата под струпом. Наличие клеточно-лейкоцитарной инфильтрации активно влияет на сроки заживления и, соответственно, скорость эпителизации. Так, клеточная инфильтрация незначительно проявлялась при использовании целевого продукта и увеличивалась при использовании левомеколя (препарата сравнения), удлиняя сроки эпителизации. На 7 сутки отмечаются булавовидные базофильные разрастания, направленные на заживление ожоговой поверхности, наиболее выраженные под действием целевого продукта. Под эпителиальным слоем появляется незрелая грануляционная ткань, с богатой васкуляризацией, а также разрастание мышечных волокон под базальной мембраной. Следует отметить, что при использовании препарата левомеколь эпителизация происходит с элементами патологической регенерации, проявляющейся в виде роста эпителия вокруг волосяного фолликула.
На 14 сутки зарегистрированы пикообразные разрастания эпителия при практически полном смыкании ожогового дефекта. Под эпителизированными участками наблюдаются разрастания соединительной ткани. Особенностью ожоговой поверхности при применении целевого продукта является длительное сохранение струпа (вплоть до полной эпителизации), что обусловливает асептическое ведение раны и объясняет низкую микробную обсемененность.
Таким образом, оценивая степень заживления ожоговых ран, можно придти к выводу, что наиболее ранняя эпителизация и закрытие ожогового дефекта происходят при использовании целевого продукта (кавехола), при этом площадь ожога и скорость эпителизации была выше и сопровождалось отсутствием гнойных осложнений.
Таким образом, заявляемый способ позволяет получить целевой продукт, обладающий одновременно антиоксидантным, желчегонным, гепато-, радио- и нефропротекторным. антирадикальным, ранозаживляющим действием, а также повысить выход целевого продукта, снизить энергетические и материальные затраты на стадии сгущения водных извлечений из какаовеллы.
Литература
1. Патент РФ №2033176, кл. А61К 35/78.
2. Новочадов В.Н. Актуальные проблемы морфологии. - Тр. Сибирского мед. ун-та, Томск, 2002, с.105-106.
3. Пашков А.Н. Клиническая лабораторная диагностика. М.: Медицина. 5-6, 1992, с.62-63.
4. Машковский М.Д. Лекарственные средства. М., Изд. 14-е. ООО «Новая Волна», 2004.
5. Одум Ю. Экология: Пер. с англ. - М.: Мир, 1986. - 376 с.
6. Сытник С.И. Экологическая характеристика сообщества // ЖМЭИ. - 1990. - №9. - С.27-31.