Синтез и исследование сорбционных свойств полимеров с молекулярными отпечатками кверцетина

УДК 543.544

СИНТЕЗ И ИССЛЕДОВАНИЕ СОРБЦИОННЫХ СВОЙСТВ ПОЛИМЕРОВ С МОЛЕКУЛЯРНЫМИ ОТПЕЧАТКАМИ КВЕРЦЕТИНА

В.А. Кудринская, С.Г. Дмитриенко, Ю.А. Золотое

С использованием акриламида и 2-(диметиламино)-этилметакрилата в качестве функциональных мономеров синтезированы полимеры с молекулярными отпечатками кверцетина и соответствующие полимеры сравнения. Показано, что на сорбционные свойства полимеров с молекулярными отпечатками кверцетина влияют природа функционального мономера, соотношение функциональный мономер:темплат в предполимеризационной смеси, количество сшивающего агента, варьируемые на стадии синтеза. Оптимизированы условия синтеза полимеров путем варьирования состава предполимеризационной смеси. Изучены сорбци-онные свойства полученных материалов. На примере структурно родственных соединений проведена оценка селективности сорбента с отпечатками кверцетина. Показано, что полимер на основе акриламида способен к селективной сорбции кверцетина, причем центры связывания кверцетина имеют преимущественно гидрофобный характер.

Ключевые слова: полимеры с молекулярными отпечатками, акриламид, кверцетин, флавоноиды, сорбция.

Кверцетин - широко известный и распространенный природный антиоксидант, представитель большой группы биофлавоноидов. Он содержится во многих растениях, например, в чае, винограде, луке, оливках, цитрусовых [1]. Кверцетин оказывает многостороннее воздействие на организм человека. Он обладает противовоспалительным, антигистаминным, антиокси-дантным, противоотечным и противораковым действием, стабилизирует клеточные мембраны, тормозит процесс старения клеток кожи, роговицы, миокарда, положительно влияет на функцию сердечно-сосудистой системы [2, 3]. Поэтому кверцетин вводят в состав многих биологически активных добавок и некоторых лекарственных препаратов [1]. В связи с этим возникает необходимость концентрирования и селективного выделения кверцетина из растительного сырья (лекарственные травы, кора красильного дуба, листва гинкго [4]). Кроме того, предварительное концентрирование является необходимой стадией определения кверцетина в таких сложных по составу многокомпонентных пищевых продуктах, как, например, пиво, соки, вина [5-8], а также в биологических объектах [9, 10].

Для выделения и концентрирования кверцетина обычно используют сорбенты различной природы, среди которых наибольшее распространение получили силикагели, модифицированные гидрофобными алкиль-ными группами [5, 6]. Эти сорбенты обладают высо-

кой эффективностью, но они неселективны. Полимеры с молекулярными отпечатками (ПМО) обладают способностью селективно связывать органические молекулы, что объясняется наличием в их составе высокоспецифических центров связывания [11-13]. Поэтому их использование представляется перспективным.

В настоящей работе был осуществлен синтез новых полимеров на основе акриламида и 2-(диметил-амино)-этилметакрилата с молекулярными отпечатками кверцетина и проведено сравнительное изучение сорбционных свойств этих полимеров. Основная цель работы состояла в получении полимеров, селективно сорбирующих кверцетин, а также в оптимизации условий синтеза этих полимеров.

Экспериментальная часть

Объекты исследования, реагенты и аппаратура. В качестве темплата (Т) - молекулы, с которой предполагалось получить отпечатки, - использовали дигидрат кверцетина ("Sigma", 98%). В качестве функциональных мономеров (ФМ) при синтезе ПМО и полимеров сравнения (ПС) применяли акриламид ("ч.д.а.") и 2-(диметиламино)-этилме-такрилат ("Acros", 99%, stabilized). Сшивающим агентом (СА) служил этиленгликольдиметакрилат ("Acros", 99%, stabilized). Инициатором реакции полимеризации служил 2,2'-азобисизобутиронитрил ("ч.д.а.").

Объектами исследования сорбции служили квер-цетин, нарингенин ("Acros", 97%), гидрат морина ("Acros"), хризин ("Acros", 99%), рутин ("Acros", 97%) и нарингин ("Acros", 97%), структурные формулы которых приведены на рис. 1. Исходные образцы (0,01-0,001 М) этих соединений готовили растворением их точных навесок в ацетоне (кверце-тин, нарингенин, хризин) или этаноле (морин, рутин, нарингин). Рабочие растворы готовили разбавлением исходных непосредственно перед использованием. Кроме того, использовали гидроксид натрия ("ч.д.а."), соляную кислоту ("ч.д.а.") и этанол ("х.ч."). Все вещества, использованные в работе, применяли без дополнительной очистки.

Спектры поглощения и оптические плотности растворов регистрировали на спектрофотометре "СФ-103" ("Аквилон", Россия), значения рН контролировали на иономере "Эксперт 001" (Россия).

Синтез полимеров с молекулярными отпечатками. Полимеры с отпечатками кверцетина синтезировали методом нековалентного импринтинга по механизму радикальной блочной полимеризации [4, 10, 14, 15]. К раствору кверцетина

Рис. 1. Структурные формулы кверцетина, нарингенина, морина, нарингина, хризина и рутина

и 0,12 ммоль (0,02 г) 2,2'-азобисизобутиронитрила (АИБН). Синтез осуществляли в инертной атмосфере аргона (реакционную смесь продували аргоном в течение 15 мин), чтобы исключить мешающее воздействие кислорода. Полимеризацию проводили в течение 24 ч в термостате "МЬЖ и2с" при температуре 60°С. Полимер сравнения получали аналогичным способом, но в отсутствие кверце-тина. Полученные полимеры растирали в агатовой ступке, просеивали на лабораторных ситах и отбирали фракцию с размером частиц 250-400 мкм. Измельченные сорбенты промывали ацетоном до полного отсутствия кверцетина в промывной жидкости, контроль осуществляли спектрофотометри-чески. Затем полимеры высушивали на воздухе. В табл. 1 перечислены синтезированные полимеры и компоненты, использованные для их синтеза.

Методика сорбционного эксперимента. Сорбцию соединений проводили в статическом режиме. В пробирку с притертой пробкой, где находился исследуемый раствор, помещали навеску сорбента (0,02 г) и встряхивали в течение 1 ч до установления сорбцион-ного равновесия.

Равновесные концентрации соединений определяли спектрофотометрически. Значения степеней извлече-

ния (Л, %) и коэффициентов распределения (О) рассчитывали по следующим уравнениям:

Л,% = С0-С 100,

с 0

Л,%

О =

V

(100 - Л,%) т '

где с0 - концентрация определяемого соединения в исходном растворе до сорбции, с - концентрация в растворе после сорбции, V - объем анализируемого раствора (мл), т - масса сорбента (г).

Результаты и их обсуждение

Поскольку важными ожидаемыми свойствами ПМО являются эффективность извлечения и способность распознавать молекулу-темплат, в первую очередь на синтезированных полимерах была исследована сорбция кверцетина - соединения, в присутствии которого они были получены. При оценке сорбцион-ных свойств сравнивали не только степени извлечения и коэффициенты распределения, но и значения импринтинг-факторов (1Р), которые рассчитывали как отношение коэффициента распределения сорбируемого соединения при использовании полимера с отпе-

Т а б л и ц а 1

Компоненты, использованные для синтеза полимеров с молекулярными отпечатками и полимеров

сравнения

Полимер Кверцетин

ПМО! ПС! 1 ДМАЭМА ДМАЭМА 10 10

ПМО2 ПС2 1 АА АА 10 10

ПМО3 ПС3 1 АА АА 20 20

ПМО4 ПС4 0,5 АА АА 10 10

ПМО5 ПС5 0,25 АА АА 10 10

ПМО6 ПСб 0,125 АА АА 10 10

Т а б л и ц а 2

Степени извлечения (Я, %), коэффициенты распределения (Б) кверцетина на полимерах с молекулярными отпечатками этого соединения и полимерах сравнения и значения импринтинг-факторов (№). Ск = 2-10-5 М растворитель - ацетон:вода = 1:4 (об.), V = 5 мл, т = 0,020 ± 0,001г, t = 60 мин,

п = 3, Р = 0,95

Сорбент я, % Г>-10-2 № - -Опмо^ПС

ПМО1 89 ± 1 20,2 ± 0,3

1,1

ПС! 88 ± 1 18,3 ± 0,3

ПМО2 80 ± 5 10,0 ± 0,7

6,0

ПС2 40 ± 5 1,7 ± 0,3

ПМО3 30 ± 1 1,10 ± 0,04

1,4

ПС3 23 ± 2 0,75 ± 0,07

ПМО4 73 ± 4 6,8 ± 0,4

4,1

ПС4 40 ± 5 1,7 ± 0,3

ПМО5 71 ± 1 6,10 ± 0,09

3,7

ПС5 40 ± 5 1,7 ± 0,3

ПМО6 61 ± 1 3,90 ± 0,07

2,3

ПСб 40 ± 5 1,7 ± 0,3

чатками (ОПМО) к коэффициенту распределения этого соединения в случае полимера сравнения (ОПС):

^ = АшЛС .

Установлено, что селективность и эффективность ПМО зависят от природы ФМ, соотношения ФМ:Т, количества сшивающего агента в предполимеризаци-онной смеси, природы и концентрации сорбата, рН раствора.

Влияние природы ФМ. Схема синтеза ПМО методом нековалентного импринтинга включает образование устойчивого ассоциата между мономером и темплатом в определенном растворителе и сополиме-ризацию в присутствии инициатора и больших количеств сшивающего агента. В ряде работ отмечено, что основной вклад в образование предполимеризаци-онного комплекса мономер-темплат вносит межмолекулярная водородная связь [14, 16, 17-20]. Наличие в молекуле кверцетина гидроксильных групп обусловило выбор функциональных мономеров - акрилами-да (АА) и 2-(диметиламино)-этилметакрилата (ДМАЭМА). Эти функциональные мономеры могут образовывать ассоциаты с кверцетином за счет водородных связей. Как видно из данных, приведенных в табл. 2 и на рис. 2 (а), ПМО1 на основе 2-(диме-тиламино)-этилметакрилата более эффективно извле-

кает кверцетин, чем ПМО2 на основе акриламида, но обладает меньшей способностью к молекулярному распознаванию этого соединения. Это, по-видимому, связано с большей устойчивостью ассоциатов квер-цетина с 2-(диметиламино)-этилметакрилатом, чем с акриламидом, поэтому на полимерах на основе ДМАЭМА доля неспецифической сорбции кверцетина больше, чем на полимерах на основе АА. Таким образом, полимеры на основе АА лучше подходят для селективного извлечения кверцетина. Поэтому в дальнейшем исследовали полимеры на основе акри-ламида.

Влияние количества сшивающего агента. Для

выяснения связи между количеством сшивающего агента и способностью ПМО к повторному связыванию темплата синтезированы две пары полимеров на основе акриламида с использованием этиленгликоль-диметакрилата (ЭГДМА) в качестве сшивающего агента со степенями сшивки 92 и 96% (вес.). Степень сшивки полимеров определяли по содержанию сшивающего агента в предполимеризационной смеси. Экспериментальные результаты указывают на то, что увеличение степени сшивки полимеров с 92 до 96% (это соответствует увеличению абсолютного количества сшивающего агента в предполимеризационной смеси в 2 раза) приводит к снижению эффективности

Рис. 2. Коэффициенты распределения кверцетина на полимерах с отпечатками этого соединения и полимерах сравнения: а - влияние природы функционального мономера (АА - акриламид, ДМАЭМА - 2-(диметиламино)-этилметакрилат); б - влияние степени сшивки полимера; в - влияние соотношения функциональный мономер:темплат (АА:кверцетин);

С = 2-10 М, V = 5 мл, т = 0,020 ± 0,001 г, г = 60 мин

кверц

сорбентов и к уменьшению способности к молекулярному распознаванию кверцетина (рис. 2, б и табл. 2). Значения коэффициентов распределения на ПМО3 со степенью сшивки 96% мало отличаются от значений, полученных на соответствующем полимере сравнения ПС3 (рис. 2, б и табл. 2). Это означает, что ПМО3 не способен к эффективному молекулярному распознаванию кверцетина (= 1,4). Такое различие в сорбционном поведении полимеров с разной степенью сшивки по отношению к молекулам темплата связано, по-видимому, с тем, что сайты селективного связывания кверцетина расположены преимущественно в трехмерной сетке полимера, а не на поверхности. При увеличении степени сшивки полимеров доступ к этим сайтам затрудняется и

наблюдается преимущественно неспецифическая сорбция кверцетина.

Таким образом, полимеры на основе АА со степенью сшивки 92% больше подходят для селективного извлечения кверцетина. Поэтому в дальнейшем исследовали полимеры на основе акриламида со степенью сшивки 92%.

Влияние соотношения функциональный моно-мер:темплат в предполимеризационной смеси. Важным фактором, влияющим на сорбционные свойства ПМО, является соотношение функциональный мономер:темплат в предполимеризационной смеси [14, 21, 22]. В настоящей работе влияние этого соотношения на сорбционные свойства ПМО изучено на примере четырех пар полимеров на основе акрилами-

да с отпечатками кверцетина (ПМО2, ПМО4 -ПМО6 и ПС2, ПС4 - ПС6). В предполимеризацион-ной смеси варьировали только количество кверцетина, содержание остальных компонентов поддерживали постоянным (табл. 1). Следует подчеркнуть, что в каждой из изученных систем соотношения компонентов и условия синтеза ПС не отличались. Из сравнения экспериментальных данных видно, что значения степеней извлечения и импринтинг-факгоров (рис. 2, в и табл. 2) кверцетина на ПМО возрастают при уменьшении соотношения ФМ:Т от 1:0,0625 до 1:0,5. Это связано с тем, что при увеличении абсолютного количества кверцетина в предполимеризационной смеси при неизменном количестве ФМ увеличивается количество сайтов селективного связывания кверце-тина. Дальнейшее увеличение количества кверцетина в предполимеризационной смеси не представлялось возможным вследствие малой растворимости кверце-тина в ацетоне.

Таким образом, для изученных систем лучшей распознавательной способностью обладает ПМО2 (соотношение ФМ:Т = 1:0,5). На примере этого полимера (и соответствующего полимера сравнения) изучено влияние рН и концентрации кверцетина на сорб-ционные свойства полимеров с молекулярными отпечатками этого соединения и проведена оценка селективности сорбции.

Влияние рН и концентрации кверцетина. На примере пары полимеров ПМО2 и ПС2 исследовали зависимость степени извлечения кверцетина от рН. Для создания необходимой кислотности среды к исходным водно-ацетоновым растворам кверцетина добавляли необходимое количество соляной кислоты или гидроксида натрия. Характер рН-зависимости (рис. 3) свидетельствует о том, что кверцетин извлекается в молекулярной форме как ПМО, так и ПС. Максимальная степень извлечения наблюдается в области рН < 5, с увеличением рН сорбция уменьшается симбатно уменьшению количества недиссоци-ированных молекул кверцетина в растворе.

Различие в сорбционном поведении ПМО2 и соответствующего полимера сравнения проявляется в достаточно широком интервале концентраций кверцетина (5-10-6 до 1-10-4 М). Изотермы сорбции (рис. 4) хорошо аппроксимируются изотермами Лэнгмюра. Рассчитанные значения предельной сорбции (ат) и констант сорбции (К) приведены в табл. 3. Из таблицы видно, что полимер с молекулярными отпечатками отличается от полимера сравнения не только более высокой константой сорбции, но и большим значени-

Рис. 3. Зависимость степени извлечения кверцетина от рН на полимере с отпечатками этого соединения ПМО2 (1) и полимере сравнения ПС2 (2); С ц = 510-5 М, V = 5 мл, т = 0,040 ± 0,001 г, Г = 60 мин

ем предельной сорбции, что можно объяснить появлением в ПМО дополнительных сайтов связывания кверцетина, причем эти сайты обладают более сильным сродством к кверцетину, чем сайты неспецифической сорбции кверцетина на ПС.

Оценка селективности сорбции. Для оценки селективности полимера с отпечатками кверцетина, обладающего лучшей распознавательной способностью (ПМО2), на нем и на соответствующем полимере сравнения (ПС2) в статическом режиме была изучена сорбция кверцетина, а также структурно родственных ему соединений: нарингенина, морина, хри-зина, рутина и нарингина. Изученные органические соединения различаются числом и расположением гидроксильных групп (рис. 1), гидрофобностью (значениями параметра Ханша - коэффициента распределения в системе октанол-вода) и кислотно-основными

Т а б л и ц а 3

Значения предельной сорбции

Сорбент ат, мкмоль/г К, л/моль

ПМО2 14 10,2-104

ПС2 8 3,3-104

свойствами. Сопоставление коэффициентов распределения и логарифмов параметров гидрофобности (^ Р) исследованных веществ показывает, что гидрофоб-ность веществ оказывает существенное влияние на их сорбцию на полимере сравнения: коэффициенты распределения изученных веществ на полимерах сравнения в целом возрастают с увеличением их гидрофобности (табл. 4). Напротив, полимер с отпечатками кверцетина лучше всего сорбирует именно это соединение, а также более гидрофобные хризин и нарингенин. Более гидрофильные, чем кверцетин, соединения (морин, рутин, нарингин), содержащие в своей структуре объемные дисахаридные заместители, сорбируются на этом полимере практически так же, как и на соответствующем полимере сравнения (табл. 4). Это говорит о том, что синтезированный ПМО содержит в своей структуре центры селективного связывания кверцетина, которые имеют преимущественно гидрофобный характер. Ниже приведен ряд селективности сорбции структурно родственных флавоноидов на этом полимере (ПМО2), построенный в соответствии с уменьшением значений импринтинг-факторов (указаны в скобках): кверцетин (6,0) > хризин (3,3) > рутин (2,1) > нарингенин (2,0) > нарингин (1,3) > морин (1,2).

Таким образом, полученные результаты указывают на то, что, варьируя различные факторы на стадии синтеза полимеров, можно получать сорбенты с различной сорбционной способностью. Для изученных

Рис. 4. Изотермы сорбции кверцетина на полимере с отпечатками этого соединения ПМО2 (1) и полимере сравнения ПС2 (2); V = 5 мл, т = 0,020 ± 0,001 г, г = 60 мин

систем лучшей распознавательной способностью обладает полимер с молекулярными отпечатками кверцетина со степенью сшивки 92%, при синтезе которого в качестве функционального мономера использовали акриламид (соотношение ФМ:Т составляло 1:0,5). Показано, что этот полимер (ПМО2) способен к селективной сорбции кверцетина, причем центры связывания кверцетина имеют преимущественно гидрофобный характер.

Т а б л и ц а 4

Параметры гидрофобности Р), коэффициенты распределения (Б) и значения импринтинг-сторов (1Ё) флавоноидов на полимерах на основе акриламида (ПМ02, ПС^). С = 2-10-5 М, растворитель - ацетон:вода = 1:4 (об.), V = 5 мл, т = 0,020 ± 0,001г, £ = 60 мин, п = 3, Р = 0,95

Вещество 1% Р £Ч0-2 Ш

ПМО2 ПС2

Кверцетин 2,07 ± 0,72 10,0 ± 0,7 1,7 ± 0,3 6,0

Нарингенин 3,19 ± 0,38 10,0 ± 0,7 5,1 ± 0,4 2,0

Морин 1,61 ± 0,70 1,5 ± 0,3 0,80 ± 0,07 1,2

Хризин 2,88 ± 0,53 13,1 ± 0,7 2,5 ± 0,3 3,3

Рутин 1,95 ± 1,01 0,34 ± 0,03 0,16 ± 0,01 2,1

Нарингин 2,73 ± 0,71 0,55 ± 0,04 0,44 ± 0,03 1,3

Авторы выражают благодарность РФФИ за финансовую поддержку.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Беликов В. Г. Фармацевтическая химия: В 2 ч. Ч. 2. Специальная фармацевтическая химия. Пятигорск, 2003. С. 457.

2. Manach C., Regerat F., Texier O., Agullo G., Demigne C., Remesy C. // Nutr. Res. 1996. 16. P. 517.

3. Wei B. L., Lu C. M, Tsao L. T, Wang J. P., Lin C. N. // Planta Med. A. 2001. 67. P. 745.

4.Xie J., Zhu L., Luo H., Zhou L., Li C., XuX. // J. Chromatogr. A.

2001. 934. P. 1.

5. TarolaA. M., Giannetti V. // Chromatographia. 2007. 65. P. 367.

6. WangS.-P, HuangK.-J. // J. Chromatogr. A. 2004. 1032. P. 273.

7. Molinelli A., Weiss R., Mizaikoff B. // J. Agric. Food. Chem.

2002. 50. P. 1804.

8. Weiss R., Molinelli A., Jakusch M., Mizaikoff B. // Bioseparation. 2002. 10. P. 379.

9. Hsiu S.-L, Tsao C.-W., Tsai Y.-C., HoH.-J, ChaoP.-D. L. // Biol. Pharm. Bull. 2001. 24. P. 967.

10. Xie J., Chen L, Luo H, Li C, Xu X. // J. Chromatogr. B. 2003. 788. P. 233.

11. Alexander C., Andersson H. S., Andersson L. I., AnsellR. J., Kirsch N., Nicholls I. A., O'Mahony J., Whitcombe M. J. // J. Mol. Recognit. 2006. 19. P. 106.

12. Лисичкин Г. В., Крутяков Ю. А. // Усп. хим. 2006. 75. C. 998.

13. Гендриксон О. Д., Жердев А. В., Дзантиев Б. Б. // Усп. биол. хим. 2006. 46. C. 149.

14. O 'Mahony J., Molinelli A., Nolan K., Smyth M. R., Mizaikoff B. // Biosensors and Bioelectronics. 2006. 21. P. 1383.

15. Дмитриенко С. Г., Ирха В. В., Кузнецова А. Ю., Золотое Ю. А. // Журн. аналит. химии. 2004. 59. С. 902.

16. O 'Mahony J., Wei S., Molinelli A., Mizaikoff B. // Anal. Chem. 2006. 78. P. 6187.

17. Deng Y., Fan X., Delgado A., Nolan C., Furton K., Zuo Y., JonesR. D. // J. Chromatogr. A. 1998. 817. P. 145.

18. Zhang T, Liu F., Chen W. // Anal. Chim. Acta. 2001. 450. P. 53.

19. Baggiani C., Giovannoli C., Anfossi L., Tozzi C. // J. Chromatogr. A. 2001. 938. P. 35.

20. Ли П., Ронг Ф, Кси Й, Ху Я., Юан Ч. // Журн. аналит. химии. 2004. 59. С. 1043.

21. Lanza F., Hall A. J., Sellergren B., Bereczki A., Horvai G., Bayoudh S., Cormack P. A. G., Sherrington D. C. // Anal. Chim. Acta. 2001. 435. P. 91.

22. Andersson H. S., Karlsson J. G., Piletsky S. A., Koch-Schmidt A. C, Mosbach K., Nicholls J. A. // J. Chromatogr. A. 1999. 848. P. 39.

Поступила в редакцию 10.09.08

SYNTHESIS AND STUDY OF SORPTION PROPERTIES OF MOLECULARLY IMPRINTED POLYMERS FOR QUERCETIN

V. A. Kudrinskaya, S. G. Dmitrienko, Yu. A. Zolotov

Using acrylamide and 2-(dimethylamino)-ethylmethacrylate as functional monomers molecularly imprinted polymers for quercetin and corresponding non-imprinted blank polymers (control polymers) were synthesized. It was shown that the nature of functional monomer, the functional monomer:template ratio in the pre-polymerization mixture and the amount of cross-linker varying in the stage of synthesis had an influence on the sorption properties of molecularly imprinted polymers for quercetin. Synthesis conditions were optimized by varying the composition of a pre-polymerization mixture. The sorption properties of the obtained materials were studied. By the example of structurally related compounds the estimation of selectivity of a sorbent with the imprints of quercetin was carried out. It was shown that the acrylamide-based polymer was able to selectively sorb quercetin, the polymer's binding sites being mainly of hydrophobic nature.

Key words: Molecularly imprinted polymers, acrylamide, quercetin, flavonoids, sorption.

Сведения об авторах: Кудринская Вера Александровна - аспирантка химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова (vera_d@rambler.ru); Дмитриенко Станислава Григорьевна - профессор кафедры аналитической химии химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова, докт. хим. наук (dmitrienko@analyt.chem.msu.ru); Золотов Юрий Александрович - зав. кафедрой аналитической химии химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова, академик РАН (zolotov@analyt.chem.msu.ru).