Ферментативное определение содержания этанола в плодово-ягодных винах и соках

раженной гетероспермии P.major тем не менее не может быть отнесен к гетеродиа-споричным видам. Подобное проявление гетероспермии характеризует самый низкий уровень адаптивной специализации ге-терокарпного вида.

Библиографический список

1. Nicotra L. Eterocarpia ed eterosper-mia/ L.Nicotra // Bull.Soc.Bot.ital., 1898.- T.12.-P.213 - 216

2. Huth E. Ueber geocarpe, amphicarpe und heterocarpePflanzen/ E.Huth// Samml. Naturwis.- Vortr.,1890.- Bd.3.- № 10. S.1 - 32

3. Delpino F. Eterocarpia ed eteromeri-carpia nelle Angiospermae/ F.Delpino// Mem. R. Accad. Sci. Instituto Bologna., 1894.- T.4.-Ser.5.- P.27 - 68

4. Войтенко В.Ф. Гетерокарпия (гете-родиаспория) у покрытосеменных растений: анализ понятия, классификация, терминология/ В.Ф.Войтенко// Ботанический журнал.- М., 1989.- Е.74.- №3.- С.281 - 297

5. Левина Р.Е., Войтенко В.Ф. Гетерокарпия или разноплодие/ Р.Е.Левина// Природа.- М., 1975.- №5.- С.87 - 95

6. Muller-Schneider P., Lhotska M. Zur Terminologie der Verbeitungbiologie der Blutenpflanzen/ P. Muller-Schneider// Folia Geobot et Phytotaxon., 1971.- Vol.6.- № 4.- P. 407 - 417

7. Меликян А.П. Некоторые современные аспекты исследования семян цветковых растений/ А.П.Меликян// Теоретическая и прикладная карпология. Кишинев, 1989. С.24 - 27

УДК 633.256

ФЕРМЕНТАТИВНОЕ OПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРжАНИя эТАНОЛА

в плодово-ягодных винах и соках

Владимир Андреевич Сибирный, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник

ФГОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия» e-mail: vladimir_sibirnyi@yahoo.com

Гончар Михаил Васильевич, доктор биологических наук, профессор, Институт биологии клетки НАН Украины,

79005, Львов, ул. Драгоманова, 14/16 Телефон: (0322) 72-8508; e-mail: myg52@yahoo.com

Ключевые слова: алкоголь, ферментативное определение, алкогольоксидаза, плодово-ягодные вина, соки

Работа посвящена использованию ферментного набора «Алкотест» для определения содержания этанола в плодово-ягодных винах и соках. Такой метод значительно дешевле по сравнению с другими ферментативными методами благодаря низкой стоимости препарата алкогольоксидазы (АО), полученной из мутантного штамма метилотрофных дрожжей HansenulapolymorphaC-105 (gcr1 catX) с нарушенной катаболитной репрессией синтеза АО. Компоненты исследованных напитков не оказывают негативного влияния на результаты определения, что подтверждено методом газовой хроматографии.

Введение ние его содержания играют важную роль в

Тесты на наличие этанола и определе- контроле процессов брожения и сертифи-

кации различных алкогольных и безалкогольных напитков. Имеется ряд различных химических и физико-химических методов для определения спиртов [1]. Простейший тест заключается в перегонке спирта и ден-симетрическом или рефрактометрическим анализом дистиллята. Недостатки таких методов - их продолжительность, низкая точность и сложность выполнения серийных определений.

Особенно эффективна газо-жидкост-ная хроматография, которая обеспечивает возможность одновременной идентификации и количественного определения различных веществ[2], однако из-за высокой стоимости оборудования и необходимости квалифицированного персонала этот метод не получил широкого распространения. Аналогичные ограничения имеют экспресс-методы определения этанола с использованием ядерно-магнитного резонанса (ЯМР).

Для определения этанола давно предложен ферментативный метод, с использованием фермента алкогольдегидрогеназы (АдГ) в присутствии кофермента (НАД). Этот метод достаточно чувствителен и селективен, но из-за высокой стоимости фермента и кофактора слишком дорог. Альтернативой может быть фермент алкогольоксидаза (АО) метилотрофных дрожжей. В отличие от АдГ АО содержит крепко связанный коэнзим ФАД (флавинадениндинуклеотид) и не требует добавления экзогенного кофактора и, кроме того, оксидазная реакция необратима [3]. Фермент АО катализирует окисление этанола кислородом воздуха с образованием уксусного альдегида и перекиси водорода:

АО

сн3сн2он + о2 ^ сн3а-ю + н2о2

Перекись водорода окисляет в перок-сидазной реакции специфичное химическое соединение (хромоген) до окрашенного продукта, количество которого можно определять фотометрически:

Пероксидаза

Н202 + SH2----------> S + 2Н20

Хромоген Краситель

На этой реакции основано использование АО в аналитическом наборе «Алкотест»,

разработанный в Институте биологии клетки НАН Украины [4]. Этот вариант анализа имеет ряд преимуществ: 7-кратное увеличение чувствительности, точность определения [5] и снижение его стоимости в связи с дешевизной полученного препарата АО из мутанта H. polymorphaа-105 ^г1 catX), способного к синтезу фермента на минеральной среде с глюкозой.

Целью работы было использование ферментного набора «Алкотест» для определения содержания этанола в плодовоягодных винах и соках.

Материалы и методы. В исследованиях использовали фруктовые напитки и соки различных фирм, плодово-ягодные вина «Особое», «Цезарь», «Канелли», «Валь-двейн», «Бабушкина наливка», а также виноподобные напитки «Клубничная бочка», «Медовая липа», «Медовуха» и безалкогольное пиво TESCО.

Определение этанола в пробах проводили с использованием аналитического набора «Алкотест» по методике[3]. В набор входят: Хромоген (сухая смесь 3,3',5,5'-те-траметилбензидина (ТМБ)); Ферменты (суспензия АО и пероксидазы хрена (ПО) в сульфате аммония); Стандарт (образцовый раствор этанола концентрацией 10 г/л);0,8 МНС1 - реактив для остановки реакции.

Для получения АО - компонента набора «Алкотест» использовали безкаталазный мутантный штамм метилотрофных дрожжей с нарушенной глюкозной катаболитной репрессией H.polymorphaа-105 ^г1 catX).

Разведения анализированных проб вин (250х, 500х, 750х, 1000х, 1250х или 1500х) выполняли в зависимости от содержания этанола. Реакцию проводили во временном режиме. К 100 мкл каждого разведения пробы добавляли 3,5 мл смеси хромогена с ферментами с интервалом 15 сек. Реакцию останавливали добавлением 0,5 мл 0,8 МНС1 в той же последовательности и временном интервале. В каждой серии выполняли также «слепые» пробы (добавление воды вместо пробы исследуемого материала) и образцовые пробы (добавление стандартного раствора этанола вместо исследуемого материала). Оптическую плот-

ность определяли при длине волны 450 нм против «слепой» пробы.

Кроме обычного определения содержания этанола в пробах методом АОП с использованием набора «Алкотест» применяли также ее модификацию «Метод стандартных добавок» (МСД). Методика эта заключалась в добавлении к определенной аликвоте (100 мкл) исследуемого вина в разведении 500х различных количеств стандарта этанола (для внутренней калибровки на фоне исследуемой пробы) и последующим определении этанола.

Для сравнения результатов, полученных по методу АОП в модификации МСД, использовали методику газовой хроматографии (ГХ): хроматограф LCM-80, колонка 200x0,3 см, детектор - катарометр. К пенициллиновому флакону с 0,5 мл 50 % трих-лоруксусной кислоты (ТХУ) добавляли 0,5 мл исследуемой пробы, флакон закрывали и встряхивали. Затем шприцом добавляли 0,3 мл 30 % нитрита натрия и после перемешивания 2 мл газовой фазы вводили в хроматограф. В качестве внутреннего стандарта использовали пропанол. 2 мл 4 %% (г/л) пропанола смешивали с 2 мл исследуемои пробы и 1 мл смеси добавляли во флакон с

0,5 мл 50 % ТХУ, закрывали и шприцом добавляли 0,3 мл 30 % №N0^ После 1 мин перемешивания 2 мл газовой фазы вводили в хроматограф. Для калибровочной кривой использовали 1, 2, 3, 4 i 6 % водный раствор этанола, концентрацию которого определяли по высоте пиков азотистого этила.

Результаты и обсуждение. Использование метода АОП для анализа содержания этанола не требует дистилляции алкоголя, которая могла бы элиминировать компоненты вина или сока, отрицательно влияющие на ход энзиматической реакции. К таким компонентам вин принадлежат, например, фенолы, нарушающие действие ферментов, восстанавливающие вещества, а также пигменты, наличие которых может приводить к неправильным результатам.

Красные виноградные вина содержат высокие концентрации фенолов, которые могут окисляться перекисью водорода, возникающей в реакции АО с этанолом в присут-

ствии пероксидазы. В этом случае реакция окисления хромогена ТМБ пероксидазой может конкурировать с реакцией окисления фенолов вина и приводить к ошибочным выводам. Для подтверждения возможного отрицательного влияния специфического химического состава различных напитков на результаты определения этанола, были проведены специальные исследования.

Проведено определение содержания алкоголя в изучаемых винах со стандартным использованием аналитического ферментативного набора «Алкотест». Как видно из данных, представленных на рис. 1 и 2, не выявлено существенного отрицательного влияния химического состава вина на рассчитанное содержание алкоголя, так как в случае меньшего разведения, когда можно было ожидать наибольшего отрицательного влияния компонентов напитков на ход ферментативного определения, эти концентрации почти не уменьшаются. Наоборот, наблюдается уменьшение рассчитанного количества этанола по мере разведения.

—Вино земляничное «Особое»

# Вино вишневое «Особое»

А Вино вишневое «Цезарь»

И Вино земляничное «Вальдвейн»

Разведение

Рис. 1. Определяемая концентрация этанола в красных плодово-ягодных винах в зависимости от разведения проб.

В дальнейшем проведено сравнение результатов определения содержания алкоголя в красных и белых плодово-ягодных ви-

-Вино «Бабушкинаналивка»

- Вино персиковое «Канелли»

- Калибровочная кривая

- Кривая: стандартная конц. этанола + 100 мкл еевляничного вина «Особое»

РаЗЕ5(СДенИС!

Рис. 2. Определяемая концентрация этанола в белых плодово-ягодных винах в зависимости от разведения проб.

Калибровочная кривая

Кривая: стандартная конц. этанола + 100 мкл персикового вина «Канелли»

ЕсдиаЫоп у= а +1й<

Аф. Ри^иаге 0,99871

Уаіие 51аггіаг<1Еггог

А ІгНегсері 0,288 -

В 5Ьре 1,67911 0,03246

0,2 0,4 0,6 0,8

Содержание этанола, г/л

Рис. 3. Определение этанола в белом персиковом вине „Канелли" методом МСД

Определение этанола в плодово - ягодных АОП, МСД, ГХ

Содержание этанола, г/л

Рис. 4. Определение этанола в красном земляничном вине „Особое" методом МСД

нах, полученные при помощи классической методики АОП и ее модификации МСД

Линейность для двух использованных методик была весьма высока (коэффициенты линейной регрессии составляли, соответственно, 0,9976 при р<0,0001 для красных и 0,9974 при р<0,0001 для белых плодовоягодных вин).

Калибровочные кривые для классической методики и ее модификации МСД имели подобные значения наклона: 1,679 и 1,845 - для плодово-ягодных красных вин и 1,678 и 1,845 - для белых вин.

Различия в калибровочных коэффициентах для классической методики и методики МСД не превышали 9,0 %. Концентрации этанола, полученные в случае применения обеих методик подобны (табл. 1). Эти данные свидетельствуют о том, что наличие ингибирующих веществ в плодово-ягодных красных и белых винах оказывают незначительное действие на ход реакции окисления ТМБ пероксидазой.

Таблица 1

винах различными методами: стандартным

Метод Вино Содержание этанола, % Разница, %

АОП мсд ГХ АОП- ГХ МСД-ГХ

Вино персиковое „Канелли" 9,80 8,63 9,02 +8,0 -4,5

Вино земляничное „Особое" 9,22 9,94 8,52 +7,6 +14,0

В дальнейшем был проведен анализ содержания алкоголя в изучаемых пробах при помощи ГХ, которая показала незначительные различия данных о концентрации этанола. Содержание этанола, определенное техникой ГХ, в пробах красного и белого вина составляло, соответственно, 8,52 % и9,02 %, тогда как в модификации МСД для красного вина составляло 9,94 %, а для белого 8,63%. В табл. 1 сопоставлены все методы, которые применялись для определения концентрации алкоголя в красных и белых плодово-ягодных винах. Сравнение различий результатов, полученных классической методикой АОП и ее модификацией МСД по отношению к ГХ показало, что МСД не характеризуется лучшей корреляцией результатов по сравнению с классической АОП. В связи с изложенным, можно утверждать, что для серийных определений алкоголя в плодово-ягодных винах (белых и красных) оправданно использование менее трудоемкого классического варианта анализа, который не требует внутренней калибровки.

Для определения содержания алкоголя в соках и безалкогольных напитках с целью увеличения чувствительности метода проводили анализ с 5-кратно увеличенным содержанием ферментов. При использовании классического варианта метода АОП, линейность калибровочной кривой сохранялась до концентрации аналита 0,9 г/л (рис. 5). При 5-кратном увеличении содержания ферментов (АО и ПО) в реакционной смеси отмечалось также 5-кратное увеличение наклона калибровочной кривой (8,02 по

А

Содержание этанола, г/л

В

Содержакие этанола, г/л

Рис. 5. Калибровочная кривая для определения этанола методом АОП. А -стандартные условия; В - вариант с использованием 5-кратной концентрации ферментов.

Таблица 2

Содержание этанола в соках и безалкогольных напитках, определенное стандартным методом АОП и с использованием 5-кратной концентрации энзимов

Содержание этанола (%) Соки и безалкогольные напитки

Клубничный напиток „Каппи" Яблочный сок „Фортуна" Малиновый сок „Карми" Пиво безалкогольное ,^СО"

Стандартный метод АОП 0,035 0,024 0,009 0,005

5-кратная концентрация энзимов 0,068 0,043 0,022 0,049

сравнению с 1,61). При использовании такого варианта метода в исследуемых соках и безалкогольных напитках обнаруживались следовые количества алкоголя, что невозможно при использовании стандартной методики. Таким образом, этот вариант метода несмотря на использование большего количества ферментов является в 5 раз более чувствительным (табл.2).

Преимуществами ферментативного метода АОП с использованием набора «Алкотест» являются хорошие аналитические свойства, высокая стабильность и воспроизведение результатов, что позволяет использовать этот набор для контроля содержания алкоголя в плодово-ягодных красных и белых винах, а также, в соках и безалкогольных напитках.

Заключение

Проведенные исследования показали, что ферментативный метод АОП с использованием набора «Алкотест» позволяет с высокой точностью определять содержание этанола в красных и белых плодово-ягодных винах, соках и безалкогольных напитках. Методу свойственна высокая чувствительность и хорошая линейность в широком диапазоне концентраций аналита. Применение метода значительно облегчает определение содержания этанола, а анализ требует меньших затрат времени и труда. Использованный метод значительно дешевле по сравнению с другими ферментативными методами благодаря низкой стоимости препарата АО, полученной из мутантного штамма метило-трофных дрожжей H. polymorpha С-105 (gcr1 catX) с нарушенной катаболитной репрессией синтеза АО и блоком каталазы.

Сравнение классической методики АОП и ее модификации МСД показало отсутствие существенного влияния ингибирующих компонентов, наличие которых могло

отрицательно сказываться на результатах определения этанола. Сравнение методики МСД с методом ГХ показало незначительные отличия в содержании этанола в исследуемых продуктах. 5-кратное увеличение содержания ферментов по сравнению с классической АОП-методикой позволяет обнаруживать следовые количества этанола в фруктово-ягодных соках, напитках и безалкогольном пиве.

Представленные результаты свидетельствуют о возможности использования метода АОП для анализа этанола в алкогольных и безалкогольных напитках, соках и вине. Использование этого метода облегчает анализ этанола по сравнению с традиционными методами -рефрактометрическим и ареометрическим.

Библиографический список

1. Методы технохимического и микробиологического контроля в виноделии // Под ред. Г.Г. Валуйко. М: Пищевая промышленность, 1980. - 145 с.

2. JainN.C., Cravey R.H. Analysis of alcohol. II. A review of gas chromatographic methods // J. Chromatogr. Sci. - 1972. - V. 10. - P. 263-267.

3. Gonchar M., Maidan M., Pavlishko H., Sibirny A. A new oxidase-peroxidase kit for ethanol assays in alcoholic beverages // Food Technol. Biotechnol. - 2001. - V. 39. - P. 37-42.

4. Гончар М.В., Майдан М.М., Сибірний А.А. Способ кількісного визначення перекису водню та субстратів оксидаз у біологічних об"єктах // Патент України 10752.

- 1996. - Бюлл. № 4.

5. Гончар М.В., Сибирный А.А. Способ определения пероксидазной активности биологических объектов// Авторское свидетельство СССР 1636773. Бюлл. Изобретений

- 1991. - Т. 11.