ФЕРМЕНТАТИВНАЯ МОДИФИКАЦИЯ ТРИГЛИЦЕРИДНЫХ ЖИРОВ
FERMENTATIVE MODIFICATION OF TRIGLYCERIDE FATS

Область техники
Настоящее изобретение относится к способу переэтерификации жиров с высоким содержанием триглицеридов (далее по тексту - триглицеридных жиров). Более конкретно способ относится к способу ферментативной переэтерификации, который называется также способом ферментативной перегруппировки.
Предшествующий уровень техники
Химическая переэтерификация триглицеридного жира направлена на обмен жирнокислотными остатками среди части глицеридов жира. По окончании переэтерификации во вновь образовавшихся триглицеридах жирнокислотные остатки заменены другими остатками. Жирнокислотные остатки могут быть из молекул одного и того же или разных триглицеридов либо из свободных жирных кислот, присутствующих в реакционной смеси.
Обмен жирнокислотными остатками приводит в конечном итоге к статистически произвольному распределению жирнокислотных остатков по концевым и средним положениям глицеридной молекулы. Считается, что полученный жир претерпевает полную рандомизацию.
Способ химической переэтерификации требует присутствия катализатора, в качестве которого обычно используется гидроксид щелочного металла или алканолат щелочного металла, например метанолат натрия.
Однако потребители все в большей степени отдают предпочтение пищевым продуктам и пищевым ингредиентам, которые не подвергались химической обработке в процессе своего производства. Поэтому возникла повсеместная необходимость в способах нехимической модификации триглицеридных жиров. Переэтерификация может осуществляться также путем ферментативной перегруппировки. Такой ферментативный способ не влияет на натуральность жира.
В противоположность химической переэтерификации, которая происходит мгновенно, ферментативная перегруппировка происходит постепенно и, следовательно, требует больше времени.
Для ферментативной перегруппировки (ER) в качестве катализатора используется фермент липаза. Липазы, используемые для ER, включают микробную липазу, продуцируемую Mucor miehei, липазы, продуцируемые Thermomyces lanuginosa и Rhizopus oryzae (прежнее название Rhizopus delemar).
В большинстве случаев липазы, используемые в ER способе, являются специфичными по отношению к sn-1- и sn-3-положениям, что означает, что они действуют только на концевые жирнокислотные остатки.
В ходе ферментативной реакции может происходить некоторая рандомизация и по среднему положению. Однако если это случается, то только вследствие ацил-миграции (см. Torres et al., JAOCS vol.79, no.8 (2002) p.775-781; Torres et al., JAOCS vol.79, no.7 (2002) p.665-661, и Zhang et al., JAOCS vol.78. no.1 (2001) p.57-64), которая является химической побочной реакцией, происходящей при длительном времени реакции. Ацил-миграция является следствием присутствия диацилглицеридов, которые в большом количестве образуются при длительном времени реакции и в присутствии воды.
Указанное различие в рандомизации приводит к триглицеридным продуктам с триглицеридным составом и свойствами, сильно отличающимися от таких же показателей претерпевшего полную рандомизацию триглицеридного жира, полученного способом химической переэтерификации. К сожалению, обширные знания и опыт, накопленные в результате использования претерпевших полную рандомизацию химически переэтерифицированных жиров в производстве пищевых продуктов, невозможно применить к ферментативно переэтерифицированным жирам (Zhang et al., JAOCS vol.78, no.1 (2001) р.57-64).
Кроме того, среднее положение в натуральном нефракционированном жире обычно занимает ненасыщенная жирная кислота, зачастую олеиновая кислота. Триглицериды типа пальмитин-олеин-пальмитин могут стать причиной появления зернистости в жировой смеси. Поскольку среднее положение триглицеридов почти не подвергается воздействию в ходе реакции ферментативной перегруппировки, триглицериды с насыщенной жирной кислотой по среднему положению едва ли присутствуют в ферментативно перегруппированных жирах, если они уже не имелись в наличии в исходном материале. Это типичное распределение природных жирных кислот по триацилглицеридам имеет некоторые последствия. Во-первых, присутствие ненасыщенной жирной кислоты по среднему положению полезно с питательной точки зрения, поскольку липазная активность в пищеварительной системе человека приводит к образованию 2-моноацилглицерида и 2 свободных жирных кислот из концевых положений триацилглицеридов. Этот результат пищеварения подтверждается Nielsen (Oils and Fats International (vol.18, no.4 (2002)). Он установил, что действие иммобилизованного Lipozyme TL IM ограничивается 1 и 3 положениями в триглицериде, оставляя среднее положение без изменений. Однако указанная конфигурация жирных кислот на глицериновом каркасе триацилглицеридов имеет также и отрицательную сторону. С точки зрения такой функциональности, как структурирование пищевых продуктов, указанные триацилглицериды с ненасыщенным средним положением являются менее функциональными. Это объясняется их более низкой температурой плавления по сравнению с полностью насыщенными триацилглицеридами и их сложным поведением при кристаллизации.
Как объяснялось выше, перегруппировка по среднему положению может происходить в процессе ферментативной перегруппировки, однако для достижения приемлемой степени ферментативная перегруппировка должна происходить в условиях равновесия (100% конверсия sn-1- и sn-3-положений) или вблизи них. Химическая перегруппировка происходит мгновенно, что означает, что мгновенно достигается полная рандомизация. Такова природа ферментативной реакции, что в начале реакции конверсия sn-1- и sn-3-положений происходит быстро, а затем в направлении равновесия скорость конверсии все больше замедляется (см. фиг.1). Вследствие этого для достижения 100% конверсии необходимо, чтобы время контакта с ферментом было продолжительным.
Способ ферментативной перегруппировки, т.е., строго говоря, специфичной по отношению к sn-1- и sn-3-положениям, обычно сопровождается некоторым изменением распределения жирных кислот по sn-2-положению. Причиной этого является неизбежный химический процесс ацил-миграции, который происходит в частично замещенных глицеридах жирных кислот. Xu et al. (Enzymatic production of structured lipides: process reactions and acyi migration, inform 11 (2000) p.1121-1131) сообщает, что ацил-миграцию можно объяснить, в первую очередь, более продолжительным временем пребывания. Однако относительно низкий поток через реактор с уплотненным катализаторным слоем делает способ дорогостоящим для применения в промышленном масштабе. (Xu et al. JAOCS, vol.79, no.6 (2002) pp.561-565). В подтверждение этого Torres et al. рекомендует кратковременную продолжительность реакции для снижения рандомизации жирнокислотных остатков (JAOCS, vol.79, no.8 (2002) pp.775-781).
Не останавливаясь на теории, авторы настоящей заявки утверждают, что процесс ацилмиграции не зависит от применяемого фермента, однако это объясняется относительно медленной скоростью процесса. Заметное воздействие на среднее положение происходит только при очень высоких степенях конверсии, зачастую 100%, которые соответствуют очень длительному времени контакта. Это показано на фиг.3.
Способы, описанные в предшествующем уровне техники, обычно относятся к комбинациям времени и концентраций фермента, которые обеспечивают 100% конверсию по sn-1- и sn-3-положениям (равновесие), и избыток времени зачастую необходим для достижения 100% конверсии по концевым положениям. Как логическое следствие этих реакций достигается также и определенная степень рандомизации среднего положения. Однако указанные способы не являются экономически привлекательными, поскольку требуют длительного времени контакта для достижения приемлемой степени рандомизации sn-2-положения.
Например, Berben et al. в Society of Chemical Industry (online 16, February 2001) описывает способ ферментативной перегруппировки, в котором реакция проводится до достижения равновесия и получения рандомизации по среднему положению 18%.
WO 96/14756 описывает ER жировых смесей с использованием в качестве липазы-катализатора SP392, специфичной по отношению к sn-1- и sn-3-положениям. Способ отличается тем, что перегруппировка не обеспечивает степени конверсии sn-1- и sn-3-положений выше 90% (а составляет, по меньшей мере, 20%), что приводит к сокращению времени реакции. Однако в sn-2-положении никакой рандомизации не наблюдается.
Некоторые редко встречающиеся липазы, включая липазы от Candida cylindracae и Arthrobacter, не обладают специфичностью. ER-способ, использующий такие липазы, дает жир с перегруппировкой по всем положениям глицеридов. Однако, как установлено, указанные липазы или не пригодны для применения в промышленном масштабе, и/или не разрешены к использованию в пищевом производстве.
Способ, описанный в ЕР 652289, использует традиционную липазу, специфичную по отношению к sn-1- и sn-3-положениям. Перегруппировка требует присутствия значительного количества (по меньшей мере, 4 мас.%) диацилглицеридов (называемых также диглицеридами) в реакционной смеси. Жир претерпевает перегруппировку по всем трем положениям, но в конце он содержит много диглицеридов и других побочных продуктов, все из которых требуется удалить путем последующего процесса очистки. Существует необходимость в эффективном с точки зрения стоимости ER-способе, который приводил бы к значительной перегруппировке и по среднему положению. Такой способ позволил бы сделать новый ассортимент модифицированных естественным путем триглицеридных жиров экономически привлекательным.
Таким образом, целью настоящего изобретения является обеспечение способа ферментативной перегруппировки, в котором достигается значительная степень перегруппировки по среднему положению. Следующей целью изобретения является способ с сокращенным временем реакции. Еще одной целью изобретения является обеспечение способа ферментативной перегруппировки без намеренного использования диацилглицеридов.
Одна или более из вышеуказанных целей достигается путем применения катализатора с активностью, превышающей 250 IUN (22 г/(г·ч), измеренной в начале способа.
Описание фигур
Фиг.1: график зависимости степени конверсии Re от времени.
Фиг.2: график зависимости рандомизации по 2-положению (Ra) от времени контакта.
Фиг.3: график зависимости рандомизации по 2-положению (Ra) от времени.
Re>1 указывает на то, что время реакции превысило время, необходимое для достижения равновесия по отношению к рандомизации sn-1- и sn-3-положений.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к способу перегруппировки, в котором жирнокислотные остатки части глицеридов произвольно перегруппировываются по концевым и средним положениям, в котором способ осуществляется до степени конверсии по концевым положениям (Re), варьирующей от 0,3 до 0,95, в котором степень конверсии по среднему положению (Ra) колеблется от 0,06 до 0,75 и в котором Ra больше (0,32Re - 0,08), при этом способ включает воздействие на триглицеридный жир катализатора, содержащего липазу, и отличается тем, что липаза является липазой, продуцируемой Thermomyces lanuginosa, которая имеет активность, по меньшей мере, 250 IUN, что соответствует 22 г/(г·ч), в начале способа.
IUN является мерой активности фермента и определяется согласно методике, описанной ниже в экспериментальной части.
Активность фермента может измеряться также другим, более удобным методом. Метод измеряет количество масла с определенной степенью конверсии на количество катализатора за 1 час (г/(г·ч)). Активность 250 IUN соответствует 22 г/(г·ч). Метод описывается в экспериментальной части.
Предлагаемый способ имеет преимущества перед способами ферментативной перегруппировки предшествующего уровня техники, заключающиеся в том, что он обеспечивает значительную степень перегруппировки по среднему положению триглицеридов, не требует избытка диацилглицеридов и поэтому не нуждается в связанной с определенными трудностями стадии очистки в конце. В дополнение к этому способ изобретения предусматривает более короткое время контакта.
Степень конверсии Re является истинной конверсией в sn-1- и sn-3-положениях. Это степень конверсии за определенное время, деленная на состояние равновесия (100% конверсия sn-1- и sn-3-положений). Степень конверсии Ra является истинной конверсией только в sn-2-положении. Это конверсия sn-2-положения за определенное время, деленная на состояние равновесия в sn-2-положении, которая идентична распределению жирных кислот по sn-2-положению в химически переэтерифицированной смеси. Определение степеней конверсии Re и Ra в образце перегруппированного жира основано либо на изменении его профиля углеродного числа, либо на изменении молярных фракций специфических видов триглицеридов. Измерения поясняются в экспериментальной части.
Способ настоящего изобретения является таким, что еще до установления равновесия по отношению к sn-1- и sn-3-рандомизации (Re=1) уже достигается значительная рандомизация среднего положения (Ra), варьирующая от 0,06 до 0,75. Поэтому способ настоящего изобретения не продолжается далее степени конверсии Re 0,95. Это обеспечивает сокращенное время пребывания, такое, которое указывается в WO 96/14756.
Способы предшествующего уровня техники продолжаются не только до достижения равновесия, но и еще дольше, см., например, Berben et al. в Society of Chemical Industry (online 16, February 2001); Torres et al., JAOCS, vol.79, no.8 (2002), p.775-781; Torres et al., JOACS, vol.79, no.7 (2002), p.655-661, и Zhang et al., JAOCS, vol.78, no.1 (2001), p.57-64.
Способ настоящего изобретения избегает длительного времени контакта и длительного времени реакции, которые характерны для способов предшествующего уровня техники.
В дополнение к этому даже при коротком времени контакта, т.е. низкой степени конверсии Re, уже происходит минимальная рандомизация в sn-2-положении. При Re от 0,3 до 0,95 перегруппировка по среднему положению (Ra) составляет более (0,32Re - 0,08). Предпочтительно Ra составляет, по меньшей мере, (0,32Re - 0,06), более предпочтительно Ra составляет, по меньшей мере, (0,32Re - 0,04).
Предпочтительно степень конверсии Re составляет менее 0,9, более предпочтительно - менее 0,85.
Степень конверсии Re предпочтительно составляет, по меньшей мере, 0,35, более предпочтительно, по меньшей мере, 0,4.
Фирма-поставщик Lipozyme TL IM рекомендует величину потока 1500 кг масла в час из расчета на 400 кг катализатора в реакторе с уплотненным катализаторным слоем. Это приводит к времени пребывания 32 минуты. Общее описание этого процесса можно также найти у Nielsen в Oils and Fat International, vol.18, no.4 (2002).
В противоположность этому настоящее изобретение, в котором фермент имеет активность, по меньшей мере, 250 IUN, что соответствует 22 г/(г·ч), позволяет обрабатывать 4400 кг масла в час при использовании такого же количества фермента, что обусловливает время пребывания только 11 минут. Однако при этом еще происходит значительная степень рандомизации по среднему положению.
Так, в течение первого часа пропускания масла через реактор с уплотненным катализаторным слоем время пребывания масла в катализаторном слое с Lipozyme TL IM настоящего изобретения предпочтительно составляет менее 25 мин, более предпочтительно менее 20 мин и наиболее предпочтительно менее 15 мин. Указанное время пребывания - это время пребывания в самом начале процесса перегруппировки, когда присутствует свежий катализатор. В ходе процесса катализатор постепенно теряет свою активность, вследствие чего требуется более длительное время пребывания для поддержания степени конверсии Re. Более длительное время пребывания может привести к снижению потока масла через реактор с катализаторным слоем. В настоящем изобретении даже если активность катализатора в ходе реакции снижается и поток регулируется, рандомизация sn-2-положения все еще происходит на приемлемом уровне (см. фиг.2).
Настоящее изобретение может также использоваться в периодическом режиме. Однако взамен краткого времени пребывания или высокого расхода масла могут применяться низкие концентрации катализатора. По сравнению со способами предшествующего уровня техники, в которых концентрация катализатора составляет 10 мас.%, концентрация катализатора настоящего изобретения в периодическом процессе может колебаться от 0,05 до 9 мас.%, более предпочтительно - от 0,05 до 5 мас.% и наиболее предпочтительно - от 0,05 до 3 мас.% в пересчете на реакционную смесь.
Настоящий способ предпочтительно использует липазу от Thermomyces lanuginosa, содержащую ER-катализатор Lipozyme TL IM, который поставляется на рынок фирмой NOVOZYMES, Дания, в виде комбинации фермента с диоксидом кремния. Активность катализатора в IUN определяется методом измерения, предложенным NOVOZYMES и описанным в экспериментальной части. Альтернативно активность может измеряться другим, более удобным методом измерения активности, который также описывается в экспериментальной части.
Сообщается, что в рамках ферментативной перегруппировки присутствие диоксида кремния катализирует рандомизацию среднего положения. Не останавливаясь на теории, авторы настоящей заявки выдвигают предположение, что диоксид кремния удерживает воду и что вода гидролизует триглицериды до диацилглицеридов, которые катализируют перегруппировку по sn-2-положению. Так, в способах предшествующего уровня техники повышенное количество диоксида кремния влечет за собой повышенное количество диацилглицеридов, что, в свою очередь, ведет к более высокой степени sn-2-рандомизации. Однако в случае применения высокоактивной липазы согласно настоящему изобретению было установлено, что меньшее количество диоксида кремния приводит к росту рандомизации по среднему положению. Экономически выгодным преимуществом настоящего способа является то, что он не требует трудно осуществимой конечной очистки от диглицеридов, которая является необходимой в способе ЕР 652289.
В предшествующем уровне техники катализатор Lipozyme TL IM разводится водой, а затем добавляется в реакционную смесь. Однако настоящий способ предпочтительно осуществляется при относительно низком содержании воды. Предпочтительно количество воды колеблется от 0,001 до 0,1 мас.%, более предпочтительно от 0,001 до 0,05 мас.%.
Измерение содержания воды проводится методом стандартного титрования по Карлу Фишеру, но не ранее чем через 30 минут после контакта катализатора с исходным раствором в реакторе периодического действия. При обработке в реакторе с уплотненным катализаторным слоем измерение количества воды проводится в образце масла, отбираемого на выходе из реактора, но не ранее чем через 30 минут после начала пропускания потока масла через катализаторный слой с целью получения надежных результатов измерений.
Соответственно температура реакционной смеси составляет от 40 до 85°С, предпочтительно от 45 до 80°С, более предпочтительно от 50 до 75°С.
Способ изобретения может применяться к множеству смесей триглицеридных жиров, но наиболее подходящими являются смеси триглицеридных жиров, в которых существует различие между распределением жирных кислот в sn-1-, sn-3- и sn-2-положениях глицеридной молекулы.
Способ настоящего изобретения особенно пригоден для исходного продукта, включающего:
- любую смесь, содержащую жидкое масло и гидрогенизированное масло, предпочтительно гидрогенизированное масло является полностью гидрогенизированным, так как это ведет к отсутствию транс-жирных кислот, или
- любой триглицеридный жир, который не подвергался гидрогенизации, или
- смесь пальмового жира или фракции пальмового жира с жиром с высоким содержанием лауриновой кислоты или фракцией жира с высоким содержанием лауриновой кислоты.
Смесь пальмового жира или фракции пальмового жира с жиром с высоким содержанием лауриновой кислоты или фракцией жира с высоким содержанием лауриновой кислоты является предпочтительной.
Изобретение относится также к применению комбинации из липазы, продуцируемой Thermomyces lanuginosa, и диоксида кремния в качестве катализатора для частичной перегруппировки жирнокислотных остатков триглицеридного жира до степени конверсии концевых положений Re от 0,3 до 0,95, включая перегруппировку по среднему положению до степени конверсии Ra от 0,06 до 0,75, в котором комбинация липаза/диоксид кремния имеет активность, по меньшей мере, 250 IUN (22 г/(г·ч)), предпочтительно, по меньшей мере, 300 IUN (25,5 г/(г·ч)), более предпочтительно, по меньшей мере, 350 IUN (29 г/(г·ч)).
Изобретение включает также триглицеридный жир, получаемый ферментативной перегруппировкой до степени конверсии концевых положений Re от 0,3 до 0,95 и до степени конверсии среднего положения триглицерида Ra от 0,6 до 0,75, при этом Ra составляет более (0,32Re - 0,08), предпочтительно - более (0,32Re - 0,06), более предпочтительно - более (0,32Re - 0,04).
Способ ферментативной перегруппировки настоящего изобретения отличается от часто используемой химической переэтерификации и способа ферментативной конверсии, проводимого до 100% конверсии sn-1- и sn-3-положений, поэтому свойства жиров, полученных способом ферментативной перегруппировки настоящего изобретения, отличаются от свойств жиров, полученных традиционной химической переэтерификацией и способом ферментативной конверсии, проводимой до 100% конверсии sn-1- и sn-3-положений (см. Berben et al. в Society of Chemical Industry (online 16 february 2001); Nielsen в Oils and Fat International, vol.18, no.4 (2002); Torres et al., JAOCS, vol.79, no.8 (2002), p.775-781; Torres et al., JOACS, vol.79, no.7 (2002), p.655-661, и Zhang et al., JAOCS, vol.78, no.1 (2001), p.57-64.
Предпочтительно триглицеридный жир получается путем ферментативной перегруппировки, в процессе которой степень конверсии концевых положений Re составляет менее 0,9, более предпочтительно менее 0,85. Предпочтительно степень конверсии Re составляет, по меньшей мере, 0,35, более предпочтительно, по меньшей мере, 0,4.
Жиры согласно изобретению пригодны для приготовления пищевых композиций, в частности для приготовления составной жировой фазы, которая включает жидкое масло и структурирующий жир. Такие жировые фазы широко применяются для приготовления эмульсий с непрерывной жировой фазой, используемых в производстве, например, спредов.
Поскольку способ ферментативной перегруппировки квалифицируется как естественный, указанные жиры также могут квалифицироваться как натуральные.
Способ согласно изобретению обеспечивает производство жиров, обогащенных триглицеридами, которые имеют насыщенный жирнокислотный остаток по среднему положению. Такие жиры используются в тех областях пищевой промышленности, где кристаллизуемость липидной фазы является критической для качества готового продукта. Указанные триацилглицериды оказывают сильное влияние и на стабильность конечных продуктов в неблагоприятных температурных условиях, и на параметры связанного с кристаллизацией процесса, основу которых составляет истинная способность жира к кристаллизации.
Таким образом, способ согласно изобретению обеспечивает производство жиров, аналогичных жирам в ЕР 831711 с низкой зернистостью, несмотря на высокое содержание в них пальмитиновой кислоты. Хотя обрабатываемый исходный жир является смесью с пальмовым маслом или фракцией пальмового масла, перегруппированная жировая фаза не вызывает зернистости в приготовленных с такой жировой фазой эмульсионных спредах с непрерывной жировой фазой или, по меньшей мере, существенно снижает зернистость.
Изобретение включает также пищевые продукты, в которые вводится жир, полученный способом настоящего изобретения.
Настоящее изобретение имеет полезное преимущество перед способами ферментативной перегруппировки предшествующего уровня техники, состоящее в намного более коротком времени реакции, что делает способ экономически осуществимым. Кроме того, способ изобретения делает возможной значительную степень рандомизации по sn-2-положению, сохраняя в то же время натуральность жира. В дополнение к этому способ перегруппировки может быть приостановлен в разное время, что позволяет получить жиры с самыми различными свойствами, поскольку значительная степень рандомизации среднего положения достигается при более коротком времени реакции и низкой степени конверсии по sn-1- и sn-3-положениям. Можно выбирать любую степень конверсии - Re и Ra, остановив реакцию в определенное время и тонко регулируя, тем самым, свойства получаемого жира.
Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения
Определение времени пребывания
Время пребывания определяется путем отбора объема масла, включающего катализаторный слой, вычитания объема катализатора и деления разности на объем масла, прошедшего через слой за один час.
Установление IUN-активности липазы-катализатора
1. Принцип
Метод предложен фирмой-поставщиком катализатора и основан на переэтерификации триглицеридов иммобилизованной липазой. Для количественной оценки активности катализатора используется конверсия тристеарина в субстрате, состоящем из 27 мас./мас.% полностью гидрогенизированного соевого масла и 73 мас./мас.% рафинированного отбеленного и дезодорированного соевого масла, при 70°С и перемешивании при 200 об/мин. Концентрация тристеарина определяется с помощью аналитического метода, основанного на HPLC (жидкостная хроматография высокого разрешения).
2. Специфичность и чувствительность
Компоненты, характеризующиеся таким же временем удерживания в применяемом хроматографическом методе, что и тристеарин, могут стать причиной завышенной концентрации тристеарина.
3. Определение единиц
Активность переэтерификации определяется как начальная скорость конверсии тристеарина в стандартных условиях. 1 IUN соответствует скорости конверсии 0,01 г тристерина/1 минута/грамм катализатора.
4. Оборудование
Аналитические весы
Встряхивающее устройство с водяной баней
Пипетки:
Объемная пипетка для отбора образцов масла (из-за
высокой вязкости жидкости).
Стандартные пипетки (например, Finn-pipette) для
других стадий анализа.
HPLC-система, включающая следующие модули: HPLC насос, система инъецирования и подогреватель колонки.
Детектор рассеяния света, например, Sedex 55.
HPLC-колонка RP 18e (5 мкм) LiChroCart 250-4.
Сбор данных: данные могут регистрироваться и обрабатываться с помощью программного пакета Хроматография.
Условия проведения анализа
Температура колонки:
40°С
Поток:
1,5 мл/мин
Подвижная фаза:
Подвижная фаза состоит из
ацетонитрила HPLC-качества и 50%
об./об. дихлорметана HPLC-качества
50 об./об.%
Инъецируемый объем:
20 мкл
Время процесса:
По меньшей мере, 11 минут
Температура колонки:
40±2°С
Детектор:
40±2°С, давление азота 2,3 бар
Чувствительность детектора:
Усиление 6
5. Реагенты и субстраты
Химические реагенты
Тристеарин, качество SIGMA, примерно 99%
Растворы
Субстрат (20 граммов):
27 мас./мас.% полностью гидрогенизированного соевого масла (поставщик - фирма ADM, шт. Иллинойс, США)
73 мас./мас.% рафинированного, отбеленного и дезодорированного соевого масла (поставщик - фирма ADM, шт. Иллинойс, США)
w
Катализатор (2 грамма): образцы кондиционируются при a=0,3 в течение, по меньшей мере, 24 часов.
6. Образцы и стандарты
Стандарты
Стандартная кривая тристеарина строится в диапазоне концентраций от 0,25 до 2,0 мг/мл.
Контроль уровня
Контрольный образец: используется Lipozyme TL IM, соответствующий стандарту PPW6503-3, фракция с размером частиц от 425 до 500 мкм (одно определение).
7. Методика
В качестве субстрата используется смесь из 27 мас./мас.% полностью гидрогенизированного соевого масла (FH SBO) и 73 мас./мас.% рафинированного, отбеленного и дезодорированного соевого масла (RBD SBO). Смесь масел нагревается до 80°С на водяной бане и хорошо перемешивается.
Смесь масел отвешивается в конические склянки на 100 мл с завинчивающейся крышкой, по 20 граммов в каждую. Точная навеска определяется с точностью до одной сотой (2 знака после запятой). Склянки (партии) помещаются на водяную баню встряхивающего устройства при 70°С и 200 об/мин.
Далее взвешивается количество катализатора (около 2 граммов), соответствующее примерно 10% от количества масла. Точная навеска катализатора определяется с точностью до одной сотой.
Если смесь масел является гомогенной, то образец отбирается спустя время 0. С помощью объемной пипетки (Gilson microman) отбирается 100 мкл масла. Кончик пипетки протирается Kleenex для удаления снаружи остатков смеси масел, и образец переносится в HPLC-склянку (типа BROWN 12×32 мм, заполненную силиконом/PTFE Septa).
Взвешенное количество катализатора добавляется в склянки, содержащие смесь масел; отбор образцов производится спустя 15, 30, 45 и 60 минут. Все образцы составляют по 100 мкл. Образцы хранятся в холодильнике до HPLC-анализа.
Образцы в HPLC-склянках разбавляются 900 мкл дихлорметана. Полученный раствор перемешивается на вихревой мешалке перед проведением последующего разбавления 100 мкл до 900 мкл дихлорметаном (общее разбавление 100х). После последующего перемешивания указанный образец подвергается HPLC-анализу.
Анализ разбавленных образцов проводится методом HPLC-ELSD.
Зависимость реакции от концентрации стандартов тристеарина соответствует экспоненциальной (показательной) модели.
8. Расчеты
Концентрация тристеарина в образцах рассчитывается с помощью стандартной кривой.
Динамика (снижение) концентрации тристеарина во времени соответствует экспоненциальной модели с оценкой нелинейных параметров. Модель имеет вид:
tristearin
0, est
est
C(t)=С·exp (-k·t),
где:
tristearin
C(t) - концентрация тристеарина в реакционной смеси при времени t;
0, est
С - начальная концентрация тристеарина (расчетный параметр);
est
k - константа скорости (расчетный параметр);
t - время реакции.
est
На основе рассчитанной константы скорости (k) можно рассчитать активность при стандартных условиях (IUN активность) по следующей формуле:
где:
0, std
C - начальная концентрация тристеарина при стандартных условиях;
std
W - масса катализатора при стандартных условиях (2 г);
W - фактическая масса катализатора;
oil
М - фактическая масса масла;
oil, std
М - масса масла при стандартных условиях (20 г).
Определение активности в г/(г·ч)
Расчет активности
Субстраты:
50 г выделенной методом сухого фракционирования стеариновой фракции пальмового масла рафинированного, отбеленного и дезодорированного качества mp 53,
50 г пальмоядрового масла рафинированного, отбеленного и дезодорированного качества,
такое количество иммобилизованного ферментного катализатора, которое обеспечивает степень конверсии (Re) от 0,2 до 0,4 примерно за один час. Нескольких экспериментов с различными количествами фермента обычно достаточно для определения правильного количества фермента. При использовании фермента с активностью 455 IUN/38 г/(г·ч) степень конверсии Re от 0,2 до 0,4 достигается примерно за 1 час при количестве фермента 1 мас.%.
Методика:
Два указанных вида масел тщательно смешиваются вместе в закрытом реакторе на 100 мл, и смесь доводится до 70°С при перемешивании. Ферментный катализатор добавляется к масляному субстрату, и общая смесь перемешивается при 70°С. Спустя 1 час, что гарантирует отсутствие ферментного катализатора, отбирается первый образец масла, а затем образцы отбираются каждый час до тех пор, пока реакция не станет равновесной.
Строится график зависимости степени конверсии Re от времени, как показано на фиг.1.
Затем определяется активность по следующему уравнению:
где:
х - степень конверсии Re (определяется, как описано) и является точкой спустя примерно 1 час, в которой Re составляет от 0,2 до 0,4.
Однако Re никогда не должно превышать 0,4.
t - время;
количества масла и катализатора в граммах являются известными параметрами.
Следует внимательно следить за тем, чтобы точка х лежала на линейной части кривой и не слишком близко к исходной точке.
Определение Re и Ra
Определение степени конверсии Re образца перегруппированного жира основано либо на изменении его профиля углеродного числа, либо на изменении в молярных фракциях специфических видов триглицеридов. Определение проводится следующим образом.
Образец перегруппированного жира подвергается анализу на определение его общего жирнокислотного состава, состава жирных кислот по среднему положению и триглицеридного состава. Используются общие аналитические методы, включая FAME-анализ (пламенная абсорбционная спектроскопия), метод GLC (газожидкостная хроматография)/определения углеродного числа и метод HPLC с серебряной фазой, как они описываются, например, в ЕР 78568, ЕР 652289, JAOCS, (1991), 68 (5). р.289-293, и Hammond E.W.J., Chromatography, 203, 397,1981.
sn1,3
Молярная фракция (pA) специфического жирнокислотного остатка (А) в концевом положении (либо в sn-1-, либо в sn-3-положениях, которые предположительно являются идентичными) рассчитывается по следующей формуле:
sn1,3
total
sn2
pA=(3·pA-1·pA)/2,
где:
total
sn2
sn1,3
pA обозначает общую встречаемость конкретного жирнокислотного остатка А в жировой смеси, a pA - встречаемость жирнокислотного остатка А во 2-положении. Показатель pA устанавливается для всех встречаемых жирнокислотных остатков, имеющих молярную фракцию более 0,002. Распределение этих молярных фракций должно быть нормализовано до 1,0.
Триацилглицеридный профиль триглицеридного жира - продукта полной рандомизации - рассчитывается путем простой статистики, известной квалифицированному в данной области специалисту. Мольная фракция р (ABB) триацилглицерида ABB, например, рассчитывается по формуле:
sn1,3
sn2
sn1,3
р(АВВ)=2·pA·pB·pB.
В большинстве случаев углеродное число молекулы специфического триглицерида означает общее число атомов углерода в его трех жирнокислотных остатках. Профиль углеродного числа конкретной жировой смеси состоит из процента встречаемости всех углеродных чисел этой жировой смеси.
Профиль углеродного числа жировой смеси является производным его триацилглицеридного состава (совокупность мольных фракций всех триацилглицеридов).
Из триацилглицеридного профиля жировой смеси можно легко вывести профиль углеродного числа.
Путем анализа устанавливается профиль углеродного числа исходной жировой смеси и специфического произвольно частично перегруппированного образца, отобранного из реакционной смеси. Профиль углеродного числа теоретически полностью рандомизированной в sn-1- и sn-3-положениях жировой смеси определяется путем статистического расчета профиля триглицеридов, как описывается выше.
Степень конверсии образца частично перегруппированного жира рассчитывается следующим образом.
Для каждого углеродного числа в диапазоне от 30 до 60 рассчитывается разность между мольной фракцией в начале реакции и мольной фракцией при полной sn-1 и sn-3 рандомизации (равновесие). Сумма (абсолютных) значений этих разностей (100% абсолютное изменение углеродных чисел) определяет 100% перегруппировку жировой смеси.
Таким же образом для отобранного из реакционной смеси специфического образца по каждому углеродному числу в диапазоне от 30 до 60 рассчитывается разность между мольной фракцией в начале реакции и фактической мольной фракцией при отборе образца продукта реакции. И также берутся абсолютные значения этой разности. Сумма их является фактическим абсолютным изменением углеродных чисел до момента отбора образца.
В каждом конкретном образце степень конверсии Re = (фактическое абсолютное изменение углеродных чисел) / (100% абсолютное изменение углеродных чисел).
Это уравнение применимо к триглицеридным продуктам, в которых вышеуказанное 100% абсолютное изменение углеродных чисел составляет, по меньшей мере, 0,15. Если нет, то тогда степень конверсии Re должна определяться альтернативным путем.
Для каждого триацилглицерида типа Н3, Н20 и H2L (где Н обозначает остатки пальмитиновой или стеариновой кислоты, О - остаток олеиновой кислоты, a L - остаток линолевой кислоты) мольная фракция устанавливается путем анализа. Для каждого из этих триглицеридов рассчитывается абсолютное изменение между молярными фракциями в начале реакции и при полной sn-1 и sn-3 рандомизации. Сумма абсолютных значений этих изменений относится к состоянию 100% конверсии.
В случае специфического образца, отобранного в ходе реакции, разность между мольными фракциями в начале реакции и при фактическом состоянии продукта реакции рассчитывается для тех же выбранных триглицеридов. Абсолютные значения этой разности в мольной фракции суммируются. Полученная сумма определяет 100% перегруппировку жировой смеси.
Степень конверсии Re специфического образца вытекает из уравнения:
Re = (фактическое изменение триацилглицеридов) / (100% абсолютное изменение триацилглицеридов).
Определение Ra, т.е. степени перегруппировки по среднему положению, проводится следующим образом.
Для исходного жира и для образца, отобранного из реакционной смеси, сначала устанавливается общая частота встречаемости жирнокислотных остатков и частота встречаемости жирнокислотных остатков в 2-положении триацилглицерида с помощью метода GLC-FAME и анализа 2-положения. Ссылки на эти методы см. выше.
Для каждой жирной кислоты, встречающейся в триацилглицеридном жире на молярном уровне, по меньшей мере, 0,002, рассчитывается абсолютная разность между его sn-2 молярной фракцией в начале реакции и его молярной фракцией в реакционной смеси, в которой последняя смесь является равнозначной химически произвольно перегруппированному жиру. Сумма абсолютных значений этих изменений (Fa-Sn2-100%) для всех выбранных жирных кислот определяет состояние 100% степени sn-2 рандомизации.
Для образца, отобранного в ходе реакции, точно так же рассчитывается по каждой из выбранных жирных кислот абсолютное изменение между sn-2 молярными фракциями в начале реакции и при фактическом состоянии продукта реакции. Сумма абсолютных значений этих изменений (Fa-Sn2-фактическое) и есть фактическое абсолютное изменение жирных кислот в sn-2-положении.
Для конкретного образца значение Ra определяется по следующему уравнению:
Ra=(Ра-Sn2-фактическое)/(Fa-Sn2-100%).
Пример 1
60 г пальмового масла и 40 г пальмоядрового масла смешивали вместе в реакционном сосуде на 100 мл и нагревали до 70°С. К смеси добавляли 1 мас.% Lipozyme TL IM (активностью 455 IUN, 38 г/(г·ч)) и общую смесь перемешивали при 70°С. Образцы отбирали с определенными интервалами, степень конверсии Re и степень конверсии Ra определяли методами, описанными в настоящем описании, путем установления изменений в распределении углеродного числа и изменений в составе жирных кислот по среднему положению. При степенях конверсии Re 0,85 и 0,5 установлены следующие степени перегруппировки в среднем положении.
Таблица 1
Степень конверсии Re
Степень конверсии Ra
0,85
0,28
0,5
0,1
Пример 2
Пример 1 повторяли, но использовали липазу-катализатор Lipozyme TL IM с низкой активностью и в концентрации катализатора 10%, как и в способах предшествующего уровня техники.
Пример 3
Пример 1 повторяли с применением катализатора Lipozyme TL IM с высокой активностью, но в такой же высокой концентрации катализатора, что и в сравнительном примере 2, что позволило намного сократить время контакта по сравнению с примерами 1 и 2.
Таблица II
ER с применением в качестве катализатора Lipozyme TL IM
Пример 1
Пример 2
Пример 3
Концентрация катализатора (мас.%)
1
10
10
Вода (мас.%)
0,013
0,025
0,024
Время реакции (ч)
5,25
2,75
0,60
Активность (IUN)
455
160
455
Активность г/(г·ч)
38
18
38
Конверсия Re
0,85
0,85
0,85
Рандомизация Ra
0,28
0,08
0,21
Ra>0,32Re - 0,08
да
нет
да
Ra>0,32Re - 0,06
да
нет
равно
Ra>0,32Re - 0,04
да
нет
нет
Катализатор Lipozyme TL IM с высокой активностью (пример 1) обеспечивал при низкой концентрации такую же степень конверсии Re, что и катализатор с низкой активностью предшествующего уровня техники (пример 2), но это сопровождалось высоким уровнем перегруппировки в среднем положении. При увеличении концентрации катализатора до уровня примера 3 достигался такой же эффект, что и в примере 1, при более коротком времени контакта, что дает возможность увеличения производительности.
Примеры 4-6
Примеры 1-3 повторяли при тех же условиях соответственно, но при более кратком времени контакта. Сокращенное время контакта приводило к более низкой степени конверсии Re, но даже при этой более низкой степени конверсии наблюдалась такая же относительно высокая степень перегруппировки по среднему положению.
Таблица III
ER с применением в качестве катализатора Lipozyme TL IM
Пример 4
Пример 5
Пример 6
Концентрация катализатора (мас.%)
1
10
10
Вода (мас.%)
0,013
0,025
0,024
Активность (IUN)
455
160
455
Активность г/(г·ч)
38
18
38
Конверсия Re
0,4
0,4
0,4
Рандомизация Ra
0,08
0,02
0,08
Ra>0,32Re - 0,08
да
нет
да
Ra>0,32Re - 0,06
да
нет
да
Ra>0,32Re - 0,04
нет
нет
нет
Пример 7: Зернистость в спредах
Твердый жир А получали следующим способом:
50 мас.% пальмового масла и 50 мас.% пальмоядрового масла смешивали вместе в реакционном сосуде и к полученной смеси добавляли 0,53 мас.% Lipozyme TL IM (активность 38 г/(г·ч)). Общую смесь перемешивали при 70°С до достижения степени конверсии Re 0,63. Установлено, что степень перегруппировки sn-2-положения составила 0,18.
Жировую смесь готовили из следующего:
- 42 мас.% твердого жира А
- 5 мас.% полученного сухим фракционированием стеарина пальмового масла (62 мас.%), переэтерифицированного с пальмоядровым маслом (38 мас.%)
- 53 мас.% рапсового масла.
Жировую фазу готовили путем смешивания 99,7 частей жировой смеси, 0,2 части лецитина и 0,1 части моноглицерида (Hymono 8903). Водную фазу готовили из 96,3 частей воды, 2,2 частей сухой кислой сыворотки и 1,5 частей соли. рН устанавливали на уровне 4,6 добавлением лимонной кислоты.
Объединяли 80 частей жировой фазы и 20 частей водной фазы и обрабатывали традиционным способом с применением ротатора для получения спреда, который упаковывали в тубы. Спреды изготовляли, используя последовательность установок ААС. Температура после второй А-установки составила 8°С, а после С-установки 16°С. А-установки работали при 600 об/мин, а С-установка - при 230 об/мин. Время пребывания в С-установке составило примерно 90 сек. Продукт хранился при 5°С в течение 5 недель. Для сравнения изготовляли маргарины с применением жировой смеси, в которой:
1) был использован твердый жир В (Re 0,62, Ra 0,10), приготовленный с Lipozyme TL IM активностью 18 г/(г·ч)
2) был использован твердый жир С (Re 0,60, Ra 0,05), приготовленный с липазой D (Rhizopus oryzae на носителе Accurel).
Все остальное без изменений.
Комиссия экспертов оценивала продукты на присутствие предполагаемых зерен.
В маргаринах, приготовленных с твердым жиром А, количество зерен было незначительным и едва заметным.
В маргаринах, приготовленных с твердым жиром В, количество зерен достигало неприемлемого уровня, создавая недопустимый порок продуктов.
В маргаринах, приготовленных с твердым жиром С, количество зерен по всей массе продукта было очень обильным, отсюда четко выраженный недопустимый порок продуктов.
Таблица IV
Фермент-катализатор
Lipozyme TL IM (твердый жир А)
Lipozyme TL IM (твердый жир В)
Липаза D (твердый жир С)
Активностьг/(г·ч)IUN
38455
18160
53-
Концентрация мас.%
0,53
1,03
0,34
Re
0,63
0,62
0,60
Ra
0,18
0,10
0,05
Наличие зерен в готовом продукте
Небольшое количество, приемлемый продукт
Значительное количество, неприемлемый продукт
Очень большое количество, неприемлемый продукт
В продукте, приготовленном с твердым жиром А, полученным способом настоящего изобретения, в котором Ra достигал максимума, предполагаемые зерна либо не обнаруживались вовсе, либо их количество было очень незначительным. В противоположность этому продукты, приготовленные с ферментом с низкой активностью (твердый жир В) или с sn-1- и sn-3-специфичной липазой (твердый жир С), дали неприемлемо высокий уровень гипотетических зерен.
Пример 8: Зернистость
60 мас.% пальмового масла и 40 мас.% пальмоядрового масла смешивали вместе в реакционном сосуде и к полученной смеси добавляли 0,9 мас.% Lipozyme TL IM (активность 455 IUN, 38 г/(г·ч)). Общую смесь перемешивали при 70°С с получением твердого жира А с Re 0,68. Ra, как было определено, составил 0,22. Получен твердый жир В с Re 0,26, Ra 0,08 и 0,6 мас.% Lipozyme TL IM (активность 455 IUN, 38 г/(г·ч)).
Жировую смесь готовили из следующего:
- 42 мас.% твердого жира А
- 5 мас.% стеарина пальмового масла, переэтерифицированного с пальмоядровым маслом
- 53 мас.% рапсового масла.
Жировую фазу готовили путем смешивания 0,9971 частей жировой смеси, 0,0020 частей лецитина и 0,0009 частей моноглицерида. Водную фазу готовили из 0,9630 частей воды, 0,0220 частей сухой кислой сыворотки, 0,0150 частей соли и лимонной кислоты для доведения рН до 3,8.
Объединяли 80 частей жировой фазы и 20 частей водной фазы и обрабатывали традиционным способом с применением ротатора для получения спреда, который упаковывали в тубы. Спреды изготовляли, используя последовательность установок АСАА. Температура после первой А-установки составила 15°С, после С-установки 18°С и после последней А-установки 10°С. А-установки работали при 600 об/мин, а С-установка - при 200 об/мин. Время пребывания в С-установке составило примерно 90 сек. Продукт хранился при 5°С в течение 5 недель. Образования зерен в продукте не наблюдалось.
Для сравнения изготовляли маргарины с применением жировой смеси, в которой был использован твердый жир В.
Продукты, в которых использовался твердый жир А, не показали образования предполагаемых зерен.
В продуктах, в которых использовались твердые жиры В, гипотетические зерна были идентифицированы спустя 5 недель хранения при 5°С.
Таблица V
Твердый жир
А
В
Активность
IUN
455
455
г/(г·ч)
38
38
Re
0,68
0,26
Ra
0,22
0,08
Предполагаемые зерна
Нет
Да
Пример 9: Зависимость Ra от времени реакции
Выполняли ту же процедуру, что и в примере 1; проводили четыре эксперимента в реакторе периодического действия. В табл.VI приводятся вид фермента, его активность и его концентрация в реакторе.
Таблица VI
Эксперимент
Липаза
Концентрация % (мас./мас.)
Активность г/г/ч
1
Lipozyme TL IM
2,4
38
2
Lipozyme TL IM
10
38
3 (сравнительный)
Lipozyme TL IM
10
18
4 (сравнительный)
Липаза D
10
53
Реакционная смесь вновь состояла из 60 частей пальмового масла и 40 частей пальмоядрового масла. Проводили четыре реакции с регулированием по времени. Отбирали определенное количество образцов и анализировали их. Последний образец отбирали спустя время реакции 10 часов. По данным анализов степень конверсии (Re) и рандомизации sn-2-положения (Ra) определяли, как описывается в тексте. Фиг.3 показывает динамику Re и Ra во времени для различных реакций.
График четко показывает, что при использовании липазы D (эксперимент 4) и Lipozyme TL IM с низкой активностью (эксперимент 3) незначительные изменения в составе sn-2-положения прогрессируют линейно во времени. Это согласуется с утверждением предшествующего уровня техники о влиянии ацил-миграции в частично замещенных глицеридах жирных кислот (см. Torres et al., JAOCS, vol.79, no.8 (2002), p.775-781; Torres et al., JOACS, vol.79, no.7 (2002), p.655-661, и Zhang et al., JAOCS, vol.78, no.1 (2001), p.57-64).
В противоположность этому Lipozyme TL IM с высокой активностью и уровнем концентрации 10% (мас./мас.) (эксперимент 2) дает резкое увеличение рандомизации sn-2-положения при том же времени реакции.
Следует подчеркнуть, что по сравнению с экспериментом 4 (липаза D) эти временные показатели фактически соответствуют практически идентичным степеням конверсии по отношению к рандомизации sn-1- и sn-3-положений (Re). Различные формы кривых также подтверждают это.
Эксперимент 1 с более низкой концентрацией Lipozyme TL IM также показывает более четко выраженное различное поведение, чем сравнительные эксперименты (3 и 4). Сравнивая эксперименты 1 и 2, каждый обнаружит, что при данной степени конверсии (рандомизация sn-1- и sn-3-положений (Re)) эксперимент с использованием низкой концентрации ферментного катализатора фактически дает более высокие степени рандомизации sn-2-положения (Ra). Это увеличение Ra совпадает с присутствием меньшего количества диоксида кремния в реакторе.
Указанный пример четко показывает, что способ, предложенный авторами настоящего изобретения, существенно отличается от способов предшествующего уровня техники.
Пример 10: Зависимость Ra от времени контакта
60 частей пальмового масла хорошо смешивали с 40 частями пальмоядрового масла при 70°С и добавляли в танк-питатель системы реактора с уплотненным катализаторным слоем (PBR), температура в котором также составляла 70°С.
PBR объемом 20 мл заполняли 3 г Lipozyme TL IM (активность 455 IUN, 38 г/(г·ч)) с получением катализаторного слоя объемом 7 мл.
Расходомер, контролирующий поток масла через реактор, устанавливали на 35 г/ч, что соответствует времени пребывания примерно 8 минут, с целью достижения Re около 0,6.
Образцы отбирали с одинаковыми интервалами, а поток регулировали таким образом, чтобы компенсировать дезактивацию фермента и поддержать тем самым Re 0,6.
Таблица VII
Относительная активность (%)
Re
Ra
Поток (г/ч)
Время пребывания (мин.)
100
0,58
0,15
35
8
42
0,63
0,15
13
22
32
0,62
0,14
10
28
9
0,64
0,12
3
105
По такой же схеме проводили и второй эксперимент, причем поток устанавливали на уровне 20 г/ч, что соответствует времени пребывания 14 минут, с целью достижения Re примерно 0,8.
Таблица VIII
Относительная активность (%)
Re
Ra
Поток (г/ч)
Время пребывания (мин)
100
0,84
0,30
20
14
77
0,83
0,29
16
17
47
0,83
0,27
10
28
8
0,84
0,25
2
165
Результаты, приведенные в табл.VII и VIII (см. выше), показывают, что для поддержания постоянной степени конверсии во времени в реакторе с уплотненным катализаторным слоем необходимо регулировать расход жидкости в обратной зависимости к дезактивации фермента-катализатора (снижение активности). Авторами настоящей заявки установлено, что на конечную рандомизацию sn-2-положения указанное резко увеличенное с 14 до 165 минут время пребывания практически не влияет. Если бы установленная рандомизация была результатом часто упоминающейся ацил-миграции в частично замещенных глицеридах жирных кислот, то sn-2 рандомизация (Ra) должна была бы резко возрасти с увеличением времени пребывания. Однако способ согласно изобретению обеспечивает практически постоянную sn-2 рандомизацию (Ra) при увеличении времени пребывания.
Данные показывают также, что sn-2 рандомизация (Ra) не изменяется и в том случае, когда высокая начальная активность фермента-катализатора снижается по мере непрерывного осуществления способа согласно изобретению. Это подтверждает, что высокая начальная активность фермента-катализатора, определение которой дается в тексте, является ключевым элементом установления sn-2 рандомизации (Ra).