В полевочьих природных очагах чумы на Кавказе циркулируют три генетически различные линии штаммов Yersinia pestis subsp. Microtus bv. Caucasica (0. PE2)

ing in EZH2-induced proliferation, migration, and angiogenesis. On-cotarget. 2010; 1(8): 710—20.

70. Xiaoping L., Zhibin Y., Wenjuan L., Zeyou W., Gang X., Zhaohui L. et al. CPEB1, a histone-modified hypometylated gene, is regulated by miR-101 and involved in cell senescence in glioma. Cell Death Dis. 2013; 4: e675.

71. Boustani M.R., Mehrabi F., Yahaghi E., Khoshnood R.J., Shah-mohammadi M., Darian E.K., Goudarzi P.K. Somatic CPEB4 and CPEB1 mutations spectrum on the prognostic predictive accuracy in patients with high-grade glioma and their clinical significance. J. Neurol. Sci. 2016; 363: 80—3.

72. Kim Y.Z. Altered histone modifications in gliomas. Brain Tumor Res. Treat. 2014; 2(1): 7—21.

73. Liu B.L., Cheng J.X., Zhang X., Wang R., Zhang W., Lin H. et al. Global histone modification patterns as prognostic markers to classify glioma patients. Hotspot mutations in H3F3A and IDH1 define distinct epigenetic and biological subgroups of glioblastoma. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 2010; 19(11): 2888—96.

74. Louis D.N., Perry A., Reifenberger G., von Deimling A., Figarella-Branger D., Cavenee W.K. et al. The 2016 World Health Organization Classification of Tumors of the Central Nervous System: a summary. ActaNeuropathol. 2016; 131(6): 803—20.

75. Verhaak R.G.W., Hoadley K.A., Purdom E., Wang V., Qi Y., Wilker-son M.D. et al. An integrated genomic analysis identifies clinically relevant subtypes of glioblastoma characterized by abnormalities in PDGFRA, IDH1, EGFR and NF1. Cancer Cell. 2010; 17(1): 98.

76. Sturm D., Witt H., Hovestadt V., Khuong-Quang D.A., Jones D.T., Konermann C. et al. Hotspot mutations in H3F3A and IDH1 define distinct epigenetic and biological subgroups of glioblastoma. Cancer Cell. 2012; 22(4): 425—37.

77. Shai R.M., Reichardt J.K., Chen T.C. Pharmacogenomics of brain cancer and personalized medicine in malignant gliomas. Future Oncol. 2008; 4(4): 525—34.

78. Anjum K., Shagufta B.I., Abbas S.Q., Patel S., Khan I., Shah S.A.A. et al. Current status and future therapeutic perspectives of glioblas-toma multiforme (GBM) therapy: A review. Biomed. Pharmacother. 2017; 92: 681—9.

79. Mrugala M.M. Advances and challenges in the treatment of glioblastoma: a clinician's perspective. Discov. Med. 2013; 15(83): 221—30.

Kit O.I., Vodolazhsky D.I., Rostorguev E.E., Frantsiyants EM., Panina S.B.

MOLECULAR GENETIC MARKERS OF GLIOMAS

Rostov Research Institute of Oncology, 344037 Rostov-on-Don, Russia, e-mail: tailana703@gmail.com

Gliomas are invasive recurrent brain tumors with high lethality. Gliomas have been morphologically divided into astrocytomas, oligodendrogliomas and mixed oligoastrocytomas. The gliomas are graded according to World Health Organization (WHO) criteria as grade I (pilocytic astrocytomas), grade II (low-grade gliomas), grade III (high-grade gliomas), grade IV (glioblastoma). The mutations of IDH1, TP53 genes, MGMT methylation have been described as the prognostic markers of glioma. The aim of the present review is to analyze research and experimental results (Scopus, Web of Science, Pubmed) concerning somatic mutations, aberrant regulation of gene expression of signal pathways, diagnostic and prognostic markers of glioma progression, characterizing various morphological types and grades of glioma. Particularly, the specificities of medulloblastomas and ependimomas have been considered in the present review.

Keywords: gliomas, molecular markers, oncogenic mutations, epigenetic alterations, review.

For citation: Kit O.I., Vodolazhsky D.I., Rostorguev E.E., Frantsiyants E.M., Panina S.B. Molecular Genetic Markers of Gliomas. Molekulyarnaya Genetika, Mikrobiologiya i Virusologiya (Molecular Genetics, Microbiology and Virology) 2017; 35(4): 132-140 (Russian). DOI 10.18821/0208-0613-2017-35-4-132-140.

For correspondence: Panina Svetlana B. Dr Rostov Research Institute of Oncology, 344037 Rostov-on-Don, Russia, e-mail: taila-na703@gmail.com

Acknowledgments. The study had no sponsorship. Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.

Received 06.03.17 Accepted 02.11.17

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2017 УДК 579.842.23:579.253

Кисличкина А.А.1, Соломенцев В.И.1, Благодатских С.А.1, Кадникова Л.А.1, Платонов М.Е.1, Майская Н.В.1, Дубянский В.М.2, Богун А.Г.1, Куличенко А.Н.2, Анисимов А.П.1

В ПОЛЕВОЧЬИХ ПРИРОДНЫХ ОЧАГАХ ЧУМЫ НА КАВКАЗЕ ЦИРКУЛИРУЮТ ТРИ ГЕНЕТИЧЕСКИ РАЗЛИЧНЫЕ ЛИНИИ ШТАММОВ YERSINIA PESTIS SUBSP. MICROTuS

BV. CAUCASICA

1 Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии Роспотребнадзора, 142279, Московская обл.,

Серпуховский р-н, п. Оболенск 2 Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора, 355035, Ставрополь

Грамотрицательные бактерии У. pestis subsp. pestis SNP-типов 0.АПТ-4.АПТ, 1.0И и 2.MED — причина многочисленных эпидемических вспышек, эпидемий и трех пандемий чумы, унесших сотни миллионов человеческих жизней. В то же время, циркулирующие в популяциях различных видов полевок (МкШш spp.) штаммы подвида microtus, относящиеся к SNP-типам 0.РЕ, способны вызывать у людей лишь крайне редкие не передающиеся от человека к человеку заболевания чумой. Высказано предположение, что клиническая форма инфекции может развиться лишь у лиц с нарушениями иммунного статуса. Штаммы У. pestis bv. caucasica (0.РЕ2), одной из наиболее древних филогенетических групп subsp. microtus, выделяют на территории при-

родных очагов: Закавказского высокогорного (включающего ме-зоочаги Ленинаканский горный (04), Присеванский горный (05) и Зангезуро-Карабахский горный (06)) и Восточно-Кавказского высокогорного (39). Кроме перечисленных районов, аналогичные штаммы У. pestis выделяют на территориях Приараксинско-го низкогорного очага песчаночьего типа (07), граничащих с Закавказским высокогорным. Ранее, мы показали, что паспортные данные о фенотипических отличиях штаммов биовара caucasica, выделенных из разных очагов, соответствовали их МЬУА25-, СИБРИ и DFR-генотипам.

В настоящей работе на 21 штамме У. pestis subsp. microtus Ыг. caucasica (0.РЕ2) проведен сравнительный анализ кластеризующей способности методов МЪУА25- и СИБРИгипирования с «золотым стандартом» филогенетических исследований — SNP-типированием. Анализ полученных результатов подтверждает существование трех клональных кластеров штаммов, соответ-

Для корреспонденции: Кисличкина Ангелина Александровна, e-mail: angelinakislichkina@yandex.ru, kislichkina@obolensk.org

ствующих природным очагам чумы — 39, 04 и группе очагов 05—07. Только метод SNP-типирования позволил выделить из группы штаммов, выделенных в очагах 05—07 отдельную ветвь изолятов из 05 очага. Кроме этого этот метод позволил выявить большую генетическую гетерогенность штаммов из 39 очага в отличие от штаммов 04—07 очагов. При анализе геномов штаммов Y. pestis, выделенных на территории 39 очага, в регионе CRISPR локуса Ypb обнаружили делецию (=20 т.п.н.). Отсутствие этого локуса может служить маркером для определения данной популяции штаммов Y. pestis.

Ключевые слова: Yersinia pestis, полногеномный сиквенс, генотипирование, MLVA, CRISPR, SNP

Для цитирования: Кисличкина А.А., Соломенцев В.И., Благо-датских С.А., Кадникова Л.А., Платонов М.Е., Майская Н.В., Дубянский В.М., Богун А.Г., Куличенко А.Н., Анисимов А.П. В полевочьих природных очагах чумы на Кавказе циркулируют три генетически различные линии штаммов Yersinia pestis subsp. microtus bv. caucasica (0.PE2). Молекулярная генетика, микробиология и вирусология 2017; 35(4): 140-144. DOI 10.18821/02080613-2017-35-4-140-144.

Чума, особо опасная зоонозная инфекция, природные очаги которой разбросаны в Евразии, Африке и Америке. Штаммы возбудителя чумы, Yersinia pestis, подразделяют на два подвида, отличающиеся по эпидемической значимости: штаммы высоковирулентные для широкого круга млекопитающих (включая морскую свинку и человека), Y. pestis subsp. pestis, и штаммы, как правило, слабовирулентные или даже авирулентные для морских свинок, являющиеся причиной редких неконтагиозных заболеваний людей [1—3], Y. pestis subsp. microtus [4, 5]. Такие штаммы возбудителя чумы с очень низким эпидемическим потенциалом циркулируют в популяциях различных видов полевок (Microtus arvalis, M. socialis, M. majori, M. nivalis, Arvicola terrestris и др.) в нескольких древних очагах Евразии [1—2, 4, 6—7]. Этот полевочий подвид включает и штаммы биовара caucasica (SNP-тип 0.PE2) [3—4] из природных очагов — Закавказского высокогорного (включающего мезоочаги Ленинаканский горный (04), Присеван-ский горный (05) и Зангезуро-Карабахский горный (06)) и Восточно-Кавказского высокогорного (39) [2, 6]. Кроме перечисленных районов, аналогичные штаммы Y. pestis выделяют на территориях Приараксинского низкогорного очага песчаночьего типа (07), граничащих с Закавказским высокогорным [6]. До описания двух штаммов Y. pestis SNP-типа 0.PE7 [3] считали, что полевочьи штаммы, выделяемые на территории Кавказа, являются наиболее древними из ныне сохранившихся ветвей Y. pestis [8]. При изучении штаммов Y. pestis биовара caucasica из разных очагов было показано, что между ними существуют определенные отличия [6], но до последнего времени исследованию этих штаммов уделяли гораздо меньше внимания, нежели штаммам основного подвида. Однако их всестороннее изучение может оказаться полезным не только для лучшего понимания микроэволюции Y. pestis и совершенствования внутривидовой классификации возбудителя чумы, но и для выявления факторов пато-генности, определяющих универсальную вирулентность штаммов основного подвида.

Для изучения природного разнообразия штаммов и филогенеза Y. pestis используют различные молекулярно-биологические методы: секвенирование, мультилокус-ный анализ вариабельного числа тандемных повторов, анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов и много других [4]. Возможности для мультилокус-ного анализа при изучении популяционной генетики возбудителя чумы и филогенетических отношений разных групп штаммов значительно расширились с накоплением результатов полногеномного секвенирования большого числа штаммов Y. pestis, что позволяет срав-

нивать огромные массивы информации [9] и на основе полученных данных дифференцировать внутривидовые популяционные группы и строить филогенетические деревья, отражающие эволюционные процессы.

В нашей работе представлена сравнительная оценка трех методов молекулярного типирования (MLVA25-, CRISPR- и SNP-) по их способности дифференцировать филогенетически близкие группы Y. pestis subsp. microtus.

Материалы и методы

Полногеномные последовательности штаммов. В работе использовали полногеномные последовательности 21 штамма Y. pestis bv. caucasica (19 из них определены нами), относящихся к SNP-типу 0.PE2 (табл. 1).

Данные MLVA25- и CRISPR-типирования получены нами ранее [8]. Номенклатуру спейсеров определяли по базе данных, созданной под руководством М. Скур-ника для комплекса Yersinia pseudotuberculosis [10].

SNP-типирование. Для анализа полногеномных нуклеотидных последовательностей штаммов Y. pestis использовали программу Wombac 2.0 (Bacterial core Genome SNPs for Phylogenomic Trees from NGS Reads and/ or draft genomes; http://www.mybiosoftware.com/wombac-1-1-bacterial-core-genome-snps-phylogenomic-trees-ngs-reads-andor-draft-genomes.html).

Анализ данных. Полученные результаты внесли в базу данных программы Bionumerics 5.1 (Applied Math NV, Бельгия). Для построения дендрограмм использовали метод Neighbor-Joining с категорическим коэффициентом.

Таблица 1

Полногеномные последовательности использованных в работе штаммов Y. pestis bv. caucasica

№

Штамм

Код очага

Дата выделения

Код доступа

1 C-537

2 C-370

3 C-535

4 C-678

5 C-700

6 C-712

7 C-739

8 C-746

9 C-824

10 Pestoides G

11 C-590

12 C-290

13 C-346

14 C-666

15 C-359

16 C-265

17 C-197

18 C-267

39 13.06.1984 LIYP00000000

39 12.06.1978 MIDX00000000

39 28.08.1984 MIDY00000000

39 31.07.1988 MIDZ00000000

39 31.07.1995 MIEA00000000

39 10.06.1996 MTZW00000000

39 08.06.1998 MTZX00000000

39 12.06.1997 MTZY00000000

39 25.06.2010 MTZZ00000000

4* НД** NZ_CP010247.1

4 22.10.1983 LIYQ00000000

4 15.06.1971 LIYU00000000

4 25.101976 LIZE00000000

5 24.08.1988 LIZF00000000

5 09.11.1978 LIZB00000000

5 16.06.1969 MIEB00000000

6 08.12.1967 LIYX00000000

6 03.07.1969 LIYZ00000000

19 Pestoides F 6-7* НД ПС_009381

20 С-235 7 12.09.1968 ПУУ00000000

21 С-291 7 19.08.1971 ЬЕОЮ000000

Примечание. * — очаговая принадлежность указана в соответствии с генотипами штаммов. ** — нет данных.

Результаты

CRISPR-типирование

Исследованные штаммы представлены пятью различными СИБРИ-типами, два из которых включали единичные изоляты. На дендрограмме (рис. 1, а) выделяются две группы А и В. Группа А сформирована штаммами Y. pestis, выделенными на территории 39 очага. Эти штаммы имеют одинаковый СИБРИ профиль Ура 402-403-404-431, Урс 507-508-509, УрЬ локус определить не удалось. При анализе контигов геномов, полученных при полногеномном секвенировании, обнаружена большая делеция (~20 т.п.н.) в регионе УрЬ локу-са у всех исследованных в этой работе штаммов Y. pestis, выделенных на территории 39 очага.

Группа В образована двумя ветвями. Первая ветвь представлена тремя штаммами из 4 очага и штаммом Pestoides G с СМБРЯ профилем Ура 402-403-404-405-406-431-432, УрЬ 473-495-474-477-501-502, Урс 507-508-509-514-515. Вторая ветвь состоит из семи штаммов Y. pestis, выделенных на территории 5, 6 и 7 очагов и штамма Pestoides Е Два штамма С-197 (Ура 402-403-404-405-406-431-2967, УрЬ 473-495-474-477-501-502, Урс 507-508-509-514-515) и С-265 (Ура 402-403-404-405-406-431-432, УрЬ 473-495474-477-502, Урс 507-508-509-514-515) имеют уникальные профили, у штаммов С-666, С-359, С-267, С-235, С-291 и Pestoides F - идентичные (Ура 402-403-404-405-406-431, УрЬ 473-495-474-477-501-502, Урс 507-508-509-514-515).

MLVA25-типирование

На дендрограмме (рис. 1, Ь), построенной на основе результатов МЬУА25-типирования штаммов У. pestis Ы^. caucasica, четко выделяются те же две группы штаммов — группа А (39 очаг) и группа В (4, 5—7 очаги). Группа В состоит из двух подрупп — В1 (4 очаг) и В2 (5—7 очаги).

SNP-типирование.

Полногеномные нуклеотидные последовательности штаммов анализировали в программе Wombac 2.0. Выявили 2262 сайта коровых SNP, на основе которых построили филогенетическое древо, демонстрирующее сходную с другими видами типирования картину, сформированную группами штаммов — А и В (рис. 1, с). Группа А включает штаммы У. pestis из 39 очага. Эта группа отличается большей генетической гетерогенностью. Группа В образована двумя ветвями — В1 и В2. Первая ветвь включает четыре штамма: С-590, С-290, С-346 и Pestoides й Во второй ветви можно выделить два кластера — с5 и с6-7. В кластер с5 входят три штамма: С-666, С-359, С-265, выделенные на территории 5 очага, а кластер с6-7 состоит из пяти штаммов У. pestis, выделенных на территории 6 и 7 очагов и штамма Pestoides Е

Обсуждение

Особенности биохимических и культуральных свойств, отсутствие плазмиды рР1а, а также избирательная вирулентность объединяют полевочьи штаммы У. pestis, вы-

о ю

ю ю

л (О

о со

о

ю о <35

Strain bv F Ypa Ypb Ypc

С-265 cau 5 402-403-404-405-406-431 -432 473-495-474-477-502 507-508-509-514-515 ~

С-197 cau 6 402-403-404-405-406-431-2967 507-508-509-514-515 473-495-474-477-501-502

С-359 cau 5 402-403-404-405-406-431 473-495-474-477-501 -502 507-508-509-514-515

С-666 cau 5 402-403-404-405-406-431 473-495-474-477-501 -502 507-508-509-514-515

Pestoides F cau 6-7* 402-403-404-405-406-431 473-495-474-477-501 -502 507-508-509-514-515

С-267 cau 6 402-403-404-405-406-431 473-495-474-477-501 -502 507-508-509-514-515

С-235 cau 5 402-403-404-405-406-431 473-495-474-477-501 -502 507-508-509-514-515

С-291 cau 7 402-403-404-405-406-431 473-495-474-477-501 -502 507-508-509-514-515

С-346 cau 4 402-403-404-405-406-431 -432 473-495-474-477-501 -502 507-508-509-514-515 -

С-590 cau 4 402-403-404-405-406-431 -432 473-495-474-477-501 -502 507-508-509-514-515

С-290 cau 4 402-403-404-405-406-431 -432 473-495-474-477-501 -502 507-508-509-514-515

Pestoides G cau 4* 402-403-404-405-406-431 -432 473-495-474-477-501 -502 507-508-509-514-515 _

С-370 cau 39 402-403-404-431 0 507-508-509

С-535 cau 39 402-403-404-431 0 507-508-509

С-537 cau 39 402-403-404-431 0 507-508-509

С-678 cau 39 402-403-404-431 0 507-508-509

С-712 cau 39 402-403-404-431 0 507-508-509

С-746 cau 39 402-403-404-431 0 507-508-509

С-700 cau 39 402-403-404-431 0 507-508-509

С-739 cau 39 402-403-404-431 0 507-508-509

С-824 cau 39 402-403-404-431 0 507-508-509

-В2

-В1

а

Г

НЕг £

Strain bv F

C-666 cau 5

C-265 cau 5

C-359 cau 5

Pestoides F cau 6-7'

C-235 cau 7

C-267 cau 6

C-291 cau 7

C-197 cau 6

Pestoides G cau 4* '

C-346 cau 4

C-590 cau 4

C-290 cau 4

C-746 cau 39 '

C-370 cau 39

C-712 cau 39

C-678 cau 39

C-739 cau 39

C-537 cau 39

C-824 cau 39

C-535 cau 39

C-700 cau 39

-В2 с

-В1

t~

t

4

Strain bv F

C-666 cau 5 -

C-265 cau 5

C-359 cau 5

C-267 cau 6 ~~

C-197 cau 6

Pestoide s F cau 6-7*

C-235 cau 7

C-291 cau 7 _

PestoidE s G cau 4*

C-290 cau 4

C-590 cau 4

C-346 cau 4

C-739 cau 39

C-537 cau 39

C-700 cau 39

C-712 cau 39

C-746 cau 39

C-535 cau 39

C-824 cau 39

C-678 cau 39

C-370 cau 39

-С5

С6-7

-В2

-B1

Рис. 1. Дендрограммы штаммов Yersiniapestis subsp. microtus bv. caucasica (0.PE2), построенные на основе результатов: а — CRISPR-типирования, b — МТУА25-типирования, с — SNP-типирования коровых геномов. Strain — название штамма; F — номер природного очага; bv — биовар (cau — caucasica); YPa, YPb, YPc — названия (профили спейсеров) локусов CRISPR.

b

деленные на территории 4—7 и 39 природных очагов чумы в биовар caucasica [4]. Однако даже на первых этапах изучения этих очагов было показано, что штаммы имеют ряд отличий. Так, штаммы из Зангезуро-Карабахского горного очага (06) зависимы от фенилаланина в отличие от штаммов из Присеванского горного (05), а штаммы из Ленинаканского горного очага (04) имеют более высокую вирулентность для морских свинок [2].

Методы MLVA25-, CRISPR-, и SNP-типирования позволяют выделить две генетические группы штаммов — группа A (39 очаг) и группа B (4—7 очаги). Все методы позволили в равной степени разделить группу В на две ветви — штаммы 4 очага и штаммы 5—7 очагов.

Все штаммы из очагов 04 и 39 вошли только в состав соответствующих групп, что может свидетельствовать о стабилизации природных очагов и отсутствии заноса на эти территории штаммов Y. pestis из других очагов, вследствие их географической изоляции. Методы MLVA25- и CRISPR-типирования не позволили разделить штаммы из очагов 5—7 на отдельные группы. Только метод SNP-типирования выделил в отдельную группу штаммы из 5 очага. Полученные результаты свидетельствуют, что 05 очаг, скорее всего, недавно отделился от 6—7 очагов. Если в будущем не будет обмена штаммами между 5 и 6—7 очагами, то изолированные популяции Y. pestis будут накапливать уникальные признаки, что, со временем, приведет к формированию двух отдельных эволюционных групп.

Исследованные штаммы из 6 (С-267, С-197) и 7 очагов (С-235, С-291) относятся к одной генетической группе. Изолированность 7 очага является относительной [6]. Вероятно, отсутствие географических преград между этими очагами позволяет экологическим нишам теплокровных носителей и переносчиков чумы перекрываться.

Для определения очаговой принадлежности штамма подходят все три метода. Говоря о возможностях метода MLVA25, необходимо отметить, что благодаря своей высокой дискриминирующей способности он существенно расширяет возможности решения задач эпидемиологической направленности, в том числе при определении источника инфекции в природном очаге чумы. Возможности SNP-типирования еще более широкие — одно-нуклеотидный полиморфизм широко используют для построения филограмм на основе дивергенции гомологичных участков ДНК в филогенезе [11]. На основании прямой зависимости между степенью полиморфизма и филогенетическим расстоянием между организмами строится кладограмма, отражающая родственные отношения между группами микроорганизмов.

При анализе геномов обнаружена делеция (~20 т.п.н.) в регионе Ypb локуса у штаммов Y. pestis, выделенных на территории 39 очага. Отсутствие этого локуса может служить маркером для определения данной популяции штаммов.

Успешное типирование штаммов Y. pestis зависит от нескольких факторов, связанных с особенностями этого микроорганизма — общее низкое генетическое разнообразие, эволюционная молодость вида и кло-нальный способ распространения. Некоторые методы типирования позволяют успешно идентифицировать только видовую принадлежность или принадлежность к большим популяциям изучаемых штаммов Y. pestis. Гораздо меньшее количество методов можно использовать для дифференциации субпопуляций возбудителя чумы. Качество типирования зависит от ключевых факторов — особенности мишеней в применяемых методах, частоты мутаций в этих мишенях и вероят-

ности конвергентной эволюции. Быстро мутирующие VNTR локусы способны дифференцировать генетически тесно связанные штаммы Y. pestis, что важно при эпидемиологических исследованиях. Однако следует учитывать и вероятность конвергентной эволюции, приводящей к гомоплазии. Конвергенция может быть связана с отбором, но также может быть и результатом нейтрального события (например, делеции и вставки в VNTR локусах). В методах, в которых используется небольшое количество мишеней в определенных местах хромосомы, эффект конвергентной эволюции может существенно изменить результат филогенетических исследований [12]. Определение SNP в полном геноме нивелирует эти влияния и позволяет более точно определять филогенетические отношения и пути глобального распространения Y. pestis.

Метод SNP-типирования позволил выявить большую генетическую гетерогенность штаммов из Восточно-Кавказского высокогорного очага (39) в отличие от штаммов 4—7 очагов. Штаммам из 39 очага свойственна «пестрота» проявления вирулентности, отмечается значительное количество (заметно большее, чем среди штаммов, выделенных в Закавказском высокогорном очаге) слабовирулентных для белых мышей штаммов, нет четкой корреляции между факторами патогенности и вирулентностью для лабораторных животных [6]. Относительная малоизученность очага не позволяет сделать однозначные выводы о причинах «пестроты» вирулентности. Однако для Закавказского высокогорного очага характерна относительная моно-гостальность — роль основного носителя принадлежит обыкновенной полевке (M arvalis), другие виды малочисленны, дополнительных носителей нет. На территории же 39 очага обыкновенная полевка не такой многочисленный вид, в качестве второстепенного носителя выступает кустарниковая полевка (M majori), серому хомячку (Cricetulus migratorius) отводится роль дополнительного носителя [6]. Однако из 9 исследованных штаммов Y. pestis 39 очага семь связаны с полевкой обыкновенной, а объект выделения остальных двух — блохи, забор которых произведен из неустановленного источника. Можно предположить два фактора, которые повлияли на становление большей генетической разнородности полевочьих штаммов из 39 очага нежели из 4—7 очагов: циркуляция штаммов возбудителя чумы в 39 очаге в более разнородной популяции грызунов [6] или более длинное эволюционное время (наиболее древняя линия 0.PE2) [8].

Таким образом, в полевочьих природных очагах чумы на Кавказе циркулируют три генетически различные линии штаммов Y. pestis subsp. microtus bv. caucasica (0.PE2). Подтвержден статус Восточно-Кавказского высокогорного (39) очага чумы. SNP-типирование полностью подтвердило правильность сделанного нами ранее на основе MLVA25-, CRISPR- и LcrV-сиквенс-типирования предложения рассматривать в настоящее время мезоочаги 05, 06 и прилегающую к ним часть очага 07 как единый природный очаг чумы — Закавказский высокогорный (не исключая в отдаленной перспективе их автономизации), а Ле-нинаканскому горному очагу необходимо предоставить статус автономного [8]. В связи с полученными данными имеет смысл провести комплексный сравнительный анализ экологии сочленов паразитарных систем (носителей и переносчиков Y. pestis) вышеназванных очагов для возможного пересмотра их границ.

Финансирование. Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант 1415-00599).

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

ЛИТЕРАТУРА

1. Никифоров К.А. Внутривидовая дифференциация штаммов Yersinia pestis: дисс. ... канд. мед. наук. Саратов; 2016.

4. Платонов М.Е., Евсеева В.В., Дентовская С.В., Анисимов А.П. Молекулярное типирование Yersinia pestis. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2013; 2: 3—12.

6. Онищенко Г.Г., Кутырев В.В. ред. Природные очаги чумы Кавказа, Прикаспия, Средней Азии и Сибири. М.: Медицина; 2004.

8. Платонов М.Е., Евсеева В.В., Светоч Т.Э., Ефременко Д.В., Кузнецова И.В., Дентовская С.В., Куличенко А.Н., Анисимов А.П. Филогеография полевочьих штаммов Yersinia pestis из природных очагов Кавказа и Закавказья. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2012; 3: 18—21.

REFERENCES

1. Nikiforov K.A. Vnutrividovaya differentsiatsiya shtammov Yersinia pestis. Diss. Saratov; 2016.

2. Anisimov A.P., Lindler L.E., Pier G.B. Intraspecific diversity of Yersinia pestis. Clin. Microbiol. Rev. 2004; 17(2): 434—64.

3. Cui Y., Yu C., Yan Y., Li D., Li Y., Jombart T. et al. Historical variations in mutation rate in an epidemic pathogen. Yersinia pestis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2013; 110(2): 577—82. doi: 10.1073/ pnas.1205750110.

4. Platonov M.E., Evseeva V.V., Dentovskaya S.V., Anisimov A.P. Molecular typing of Yersinia pestis. Mol. Genet. Microbiol. Virol. 2013; 28

5. Qi Z., Cui Y., Zhang Q., Yang R. Taxonomy of Yersinia pestis Adv. Exp. Med. Biol. 2016; 918: 35—78.

6. Onishchenko G.G., Kutyrev V.V. eds. Natural foci of the plague of the Caucasus, the Caspian Sea, Central Asia and Siberia

7. Zhou D., Tong Z., Song Y., Han Y., Pei D., Pang X. et al. Genetics of metabolic variations between Yersinia pestis biovars and the proposal of a new biovar, microtus. J. Bacteriol. 2004; 186(15): 5147—52.

8. Platonov M.E., Evseeva V.V., Svetoch T.E., Dentovskaya S.V., Anisimov A.P., Efremenko D.V., Kuznetsova I.V., Kulichenko A.N. Phy-logeography of Yersinia pestis vole strains isolated from natural foci of the Caucasus and South Caucasus. Mol. Genet. Microbiol. Virol. 2012; 27

9. Yang R., Motin V.L. Yersinia pestis in the age of big data. Adv. Exp. Med. Biol. 2016; 918: 257—72.

10. Koskela K.A., Mattinen L., Kalin-Mänttäri L., Vergnaud G., Gorgé O., Nikkari S., Skurnik M. Generation of a CRISPR database for Yersinia pseudotuberculosis complex and role of CRISPR-based immunity in conjugation. Environ. Microbiol. 2015; 17(11): 4306—21. doi: 10.1111/1462-2920.12816.

11. Morelli G., Song Y., Mazzoni C.J., Eppinger M., Roumagnac P., Wagner D.M. et al. Yersinia pestis genome sequencing identifies patterns of global phylogenetic diversity. Nat. Genet. 2010; 42(12): 1140—3. doi: 10.1038/ng.705.

12. Vogler A.J., Keim P., Wagner D.M. A review of methods for subtyping Yersinia pestis: From phenotypes to whole genome sequencing. Infect. Genet. Evol. 2016; 37: 21—36.

Kislichkina AA.1, Solomentsev V.I.1, Blagodatskikh SA.1, Kadnikova LA.1, Platonov M.E.1, Maiskaya N.V.1, Dubyanskiy VM.2, Bogun A.G.1, Kulichenko AN.2, Anisimov A.P.1

THREE DISTINCT YERSINIA PESTIS SUBSP. MICROTUS BV. CAUCASICA (0.PE2) LINEAGES ARE CIRCULATING AMONG COMMON VOLES (MICROTUS SPP.) IN THE CAUCASUS NATURAL PLAGUE FOCI

1 State Research Center for Applied Microbiology and Biotechnology, 142279 Obolensk, Russia;

2 Stavropol Research Anti-Plague Institute, 355035 Stavropol, Russia e-mail: angelinakislichkina@yandex.ru

Gram-negative bacteria Y. pestis subsp. pestis of SNP-types 0.ANT-4.ANT, 1.ORI, and 2.MED are the cause of numerous outbreaks, epidemics and three pandemics of plague, which took hundreds of millions of human lives. At the same time, the subspecies microtus strains circulating in populations of different species of voles (Microtus spp.) and belonging to SNP type 0.PE can cause in people, only very rare not transmitted from person-to-person form of plague. It is suggested that the clinical form of the disease can develop only in individuals with impaired immune status. Y. pestis bv. caucasica (0.PE2) strains are one of the oldest phylogenetic groups, subsp. microtus, isolated on the territory of vole type natural foci: the Transcaucasian highland focus (including subfoci Leninakan mountain (#04), Pre-Sevan mountain (#05) and Zanzegur-Karabakh mountain (#06)) and East-Caucasian highmountain focus (#39). In addition to these areas, similar Y. pestis strains were isolated in the territories of Pre-Araks low-mountain plague focus of gerbil type (#07), bordering on the Transcaucasian highland focus. Previously, we showed that passport data concerning the phenotypic differences between strains of biovar caucasica isolated from different foci, were consistent with their MLVA25-, CRISPR- and DFR-genotypes.

In the present work 21 Y. pestis subsp. microtus bv. caucasica (0.PE2) strains were used for analysis of the cluster-grouping ability of MLVA25 and CRISPR-typing in comparison with the «gold standard» of phylogenetic studies, SNP-typing. Analysis of the results confirms the existence of the three clonal clusters of strains corresponding to separate natural plague foci, # 39, #04 and a group of foci #05—07. The method of SNP typing allowed distinguishing from the group of strains isolated in the foci #05—07 separate branch of isolates from natural focus #05. In addition, this method allowed to reveal the great genetic heterogeneity of strains from the #39 focus in contrast to strains from foci #04—07. Analysis of the genomes of Y. pestis strains isolated on the territory of the focus #39, in the region of the CRISPR locus Ypb indicated deletion (=20 kb). The absence of this locus may serve as a marker to determine this population of Y. pestis strains.

For citation: Kislichkina A.A., Solomentsev V.I., Blagodatskikh S.A., Kadnikova L.A., Platonov M.E., Maiskaya N.V., Dubyanskiy V.M., Bogun A.G., Kulichenko A.N., Anisimov A.P. Three Distinct YERSINIA PESTIS subsp. MICROTUS BV. CAUCASICA (0.PE2) Lineages Are Circulating Among Common Voles (MICROTUS SPP.) In The Caucasus Natural Plague Foci. Molekulyarnaya Genetika, Mikrobiologiya i Virusologiya (Molecular Genetics, Microbiology and Virology) 2017; 35(4): 140-144 (Russian). DOI 10.18821/02080613-2017-35-4-140-144.

For correspondence: Kislichkina, Angelina Aleksandrovna — ange-linakislichkina@yandex.ru, kislichkina@obolensk.org Acknowledgments. This work was supported by the Russian Science Foundation (Grant No. 14-15-00599).

Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.

Received 15.11.16 Accepted 05.06.17