БИОМАТЕРИАЛЫ НА ОСНОВЕ ФОСФАТА КАЛЬЦИЯ
CALCIUM PHOSPHATE BIOMATERIALS

Настоящее изобретение относится к новому биоматериалу на основе фосфата кальция, предпочтительно на основе гидроксиапатита, или на основе материала, содержащего гидроксиапатит, такого как двухфазные фосфаты кальция и кальцийфосфатные цементы, к способу его получения и его применению для получения имплантата или для установки протеза с целью обеспечения регенерации костной ткани.
Восстановление костного вещества, утраченного, главным образом, вследствие травм и, в более редких случаях, при опухолях, представляет собой одну из наибольших трудностей, с которыми сталкиваются хирурги-ортопеды. Дефекты малого размера, от "резко выраженного" ложного сустава (дефект консолидации перелома, где вероятна потеря вещества) до потери кости длиной 5-6 см, наиболее часто представляют собой объекты аутологичной трансплантации губчатой или кортикально-губчатой костной ткани, отобранной из подвздошного гребня (золотой стандарт). Дефекты большого размера (≥ 6 см) требуют существенно более серьезных хирургических операций типа переноса васкуляризированной костной ткани или процедуры Маскле. При этом доступное количество аутологичной костной ткани ограничено, консолидация костей носит случайный характер, а такие методики разного типа часто являются причиной послеоперационных осложнений по месту отбора трансплантата.
Различные биоматериалы, доступные в клинической практике, теоретически позволяют обходить недостатки аутологичного трансплантата. К сожалению, ни один из них не сравним с костным трансплантатом по результатам и не обеспечивает восстановление вещества, утраченного в большом количестве.
Большинство изученных в настоящее время материалов связано с биоматериалами штаммов мезенхимных клеток, полученных, исходя из костного мозга после нескольких недель селекции и культивирования клеток in vitro. Такой подход является трудоемким и дорогостоящим, что ограничивает клинические результаты.
Известно, что коагулированная кровь благоприятствует восстановлению кости. L. Okazaki et al., Clin. Oral Impl. Res., 16, 2005, 236-243, описаны имплантаты на основе порошка деминерализованной кости или коагулированной крови. В WO 02/068010 описан композиционный материал на основе костного мозга, причем данный материал содержит имплантируемую, биологически совместимую и пористую матрицу и коагулированный материал, такой как коагулят костного мозга, крови, плазмы.
Такие материалы, представляющие собой результат сочетания подложки и необязательно коагулированной крови, до настоящего времени использовали в челюстно-лицевой хирургии, где проблемы консолидации костей являются менее значительными, и мало использовали или не использовали совсем при восстановлении диафизарных костей.
В способах получения таких имплантатов требуется отбирать кровь у донора, чаще всего представляющего собой реципиента имплантата, и затем осуществлять стадии манипулирования с подложкой (деминерализованной костью, синтетическим полимером или керамикой), в частности стадии смешивания с кровью, что представляет собой источники контаминации биоматериала. Кроме того, такими способами трудно получить однородный биоматериал.
Таким образом, существует потребность в способе получения имплантируемого биоматериала, исходя из синтетической подложки, который может быть легко получен и обладает стабильными и однородными свойствами, причем такой способ должен обеспечивать получение превосходных свойств в отношении биологической совместимости и быстрое восстановление качественной костной ткани без необходимости прибегать к стадиям культивирования или отбора.
Настоящее изобретение позволяет устранить недостатки предшествующего уровня техники и обеспечивает получение костной ткани превосходного качества в отношении твердости и васкуляризации. Кроме того, способ получения такого биоматериала является простым, легким в осуществлении, не требует многократного хирургического вмешательства в организм пациента и является малозатратным по сравнению со способами предшествующего уровня техники.
Гидроксиапатит входит в состав многих материалов для восстановления костей. При таком применении гидроксиапатит может быть использован индивидуально или в смеси с другими компонентами, как, например, в случае двухфазного фосфата кальция или кальцийфосфатных цементов.
10
4
6
2
3
4
2
Двухфазный фосфат кальция, BCP, используют во многих случаях врачебной и стоматологической практики. Двухфазный фосфат кальция в качестве материала для восстановления костей впервые был описан Nery et al., J. Periodontol. 1992, Sept., 63(9):729-35. BCP представляет собой смесь гидроксиапатита (HA) Ca(PO)(OH) и бета-формы трикальцийфосфата Ca(PO) (β-TCP). Его биологическая активность и биорезорбируемость могут регулироваться изменением содержания гидроксиапатита и β-TCP, входящих в его состав.
В US 2005/0226939 описан способ получения наночастиц гидроксиапатита, причем в данном способе применяют смешанную композицию на основе ионов кальция и фосфат-ионов и обработку микроволновым нагреванием. Условия, описанные в данном документе, не предусматривают образования гидроксиапатита или BCP, пропитанного раствором хлорида кальция.
Биоматериалы на основе BCP обладают тем преимуществом, что по сравнению с другими синтетическими биоматериалами они благоприятствуют остеогенезу.
2
2
2
BCP был объектом многочисленных исследований: Lerouxel et al., Biomaterials, 2006, Sept., 27(26):4566-72, 18, 287-294; Malard O. et al., J. Biomed. Mater. Res., 46(1), 1999, 103; Mankani M.H. et al., Biotechnology and Bioengineering, 72(1), 2001, 96-107. Различными авторами осуществлены исследования, касающиеся влияния размера частиц BCP. По Mankani M.H. et al. способ включает смешивание частиц HA/TCP с клетками и затем с фибриногеном и тромбином, восстановленным в растворе CaCl. Но раствор CaCl является более концентрированным, чем раствор, применяемый по настоящему изобретению, а молярно-массовое соотношение CaCl/BCP превышает соотношение, используемое в биоматериалах по настоящему изобретению.
Trojani C. et al., Biomaterials, 27, 2006, 3256-3264, показали, что хорошая остеоиндукция могла быть достигнута имплантацией композиционного материала "BCP/гидрогель Si-гидроксипропилметилцеллюлозы", к которому были прибавлены клетки костного мозга, в случае частиц BCP, отсортированных в интервале от 40 до 80 мкм. Однако такие способы требуют осуществления стадии отбора клеток костного мозга, а также их культивирования.
2
В WO 2006/015275 описан способ, способствующий регенерации костной ткани, причем данный способ включает получение композиции, состоящей из материала подложки на основе фосфата кальция, плазмы, с повышенным содержанием тромбоцитов, кальция и активатора рецептора PAR, отличного от тромбина. Но концентрация CaCl в таких композициях является такой высокой, что он будет действовать как антикоагулянт, если его использовать в условиях настоящего изобретения.
Оба компонента BCP, т.е. HA и β-TCP, представляют собой два главных типа фосфата кальция, используемых в остеохирургии и стоматологии. Они обладают замечательной биологической совместимостью, при этом считается, что их сочетание проявляет более хорошую биологическую активность и, таким образом, более значительную эффективность, чем HA или β-TCP, используемые по отдельности. На практике оба компонента (HA и β-TCP) проявляют в BCP синергическое действие.
Гидроксиапатит, после его имплантации in vivo, благодаря своей химической структуре может содействовать образованию на своей поверхности полизамещенного с нестехиометрическим соотношением кальцийфосфатного апатита (так называемый "биологический апатит") вследствие эпитаксиального роста. Такой слой биологического апатита, являющийся очень близким к кристаллам костной матрицы, мог бы способствовать клеточной адгезии и активности.
β-TCP, обладающий существенно большей растворимостью, чем HA, поддерживает пересыщение по кальцию и фосфатам в биологических жидкостях, окружающих имплантат из BCP. Данная особенность позволяет поддерживать феномен осаждения биологического апатита на фазе HA. Кроме того, данная фаза является существенно более резорбируемой, чем HA, что дает возможность регулировать резорбируемость имплантата, варьируя соотношение HA/β-TCP.
Данные химические явления были показаны in vitro (J.M. Bouler, G. Daculsi, Key Engineering Materials, 2001, 192-195:119-122; Yamada S. et al., Biomaterials 1997, 18:1037-41; S. Yamada et al., J. Biomed. Mater. Res., 1997, 37:346-52) и in vivo (Daculsi G. et al., J. Biomed. Mater. Res. 1989, 23:883-94; G. Daculsi et al., Int. Rev. Cytol. 1997, 129-191). Данные механизмы, видимо, обуславливают лучшую клиническую эффективность BCP по сравнению с однофазными материалами из HA или TCP (Nery E.B. et al., J. Periodontol. 1992, 63:729-35; Ellinger R.F. et al., Int. J. Periodontics Restorative Dent. 1986, 6:22-33; Passuti N. et al., Clin. Orthop. Relat. Res. 1989, (248):169-76; Gouin F. et al., Rev. Chir. Orthop. Reparatrice Appar. Mot. 1995, 81:59-65; Ransford A.O. et al., J. Bone Joint Surg. Br. 1998, 80:13-8; R. Cavagna et al., J. Long-Term effect of Med. Impl. 1999, 9:403-412).
Настоящее изобретение основывается на констатации того, что некоторые фосфаты кальция, в частности кальцийфосфатные апатиты, такие как гидроксиапатит, ингибируют спонтанную коагуляцию цельной крови в том случае, когда они находятся в контакте. Действительно, было установлено, что HA, а также и BCP, содержащий HA, ингибирует спонтанную коагуляцию цельной крови в том случае, когда они находятся в контакте. Также было установлено, что при предварительной пропитке гидроксиапатита или BCP физиологическим раствором (представляющим собой водный раствор NaCl) соответственно указаниям инструкции по применению данных биоматериалов кровь, приведенная затем в контакт с ними, не коагулирует.
Экспериментальные условия, позволившие установить антикоагулянтные свойства материала подложки, подробно изложены в экспериментальной части.
Первым объектом настоящего изобретения является способ получения имплантируемого биоматериала, содержащего подложку на основе по меньшей мере фосфата кальция, такого как гидроксиапатит или смесь гидроксиапатита и по меньшей мере одного другого материала, причем данный способ включает по меньшей мере одну стадию пропитки подложки по меньшей мере одним коагулянтом.
Под подложкой на основе фосфатов кальция понимают материал, содержащий по меньшей мере один компонент типа кальцийфосфатного апатита, выбранный из гидроксиапатита, фторапатита, полизамещенных с нестехиометрическим соотношением апатитов (ANSPS), а также их смесей с другими кальцийфосфатными биоматериалами. Такие подложки могут состоять из гидроксиапатита, BCP, ANSPS и апатитовых кальцийфосфатных цементов.
Пропитанную таким образом подложку затем имплантируют по месту, в котором должен быть восполнен дефект костной ткани. При этом имплантация подложки вызывает коагуляцию крови, которая входит в контакт с биоматериалом или проникает в биоматериал in situ. В испытаниях, осуществленных с BCP, было установлено, что BCP, сочетаемый с коагулированной кровью, обеспечивает хороший остеогенез и ведет к образованию костной ткани весьма приемлемого качества очень простым способом по сравнению со способами предшествующего уровня техники. Без пропитки BCP раствором коагулянта остеогенез не происходит.
В одном из вариантов настоящего изобретения подложку на основе фосфата кальция, предпочтительно на основе гидроксиапатита или смеси гидроксиапатита и другого материала, имплантируют по месту, в котором должен быть восполнен дефект костной ткани, а затем пропитывают ее по месту имплантации раствором коагулянта.
3
4
2
4
2
4
4
2
2
4
2
8
2
4
6
Подложка, используемая по настоящему изобретению, предпочтительно представляет собой подложку на основе гидроксиапатита, фторапатита, полизамещенных с нестехиометрическим соотношением апатитов (ANSPS) или смеси таких соединений по меньшей мере с одним другим биоматериалом, таким как трикальцийфосфат в α- и β-форме (Ca(PO)), дигидрат дикальцийфосфата (CaHPO·2HO), безводный дикальцийфосфат (CaHPO), моногидрат монокальцийфосфата (Са(HPO)·HO), тетракальцийфосфат (Са(PO)O) и октскальцийфосфат (CaH(PO)). Подложка преимущественно представляет собой подложку на основе гидроксиапатита или ВСР, предпочтительно она представляет собой подложку на основе ВСР.
Подложка и, в частности, апатит или ВСР, которые могут быть использованы по настоящему изобретению, могут находиться в любой форме: как в виде монолитного тела, так и в виде необязательно отсортированных гранул.
ВСР, который может быть использован по настоящему изобретению, представляет собой высокотемпературную фритту. В случае, когда ВСР представляет собой гранулы, его дробят и сортируют, например, просеиванием в зависимости от выбранного диаметра. ВСР, который может быть использован по настоящему изобретению, преимущественно содержит гидроксиапатит и β-трикальцийфосфат с массовым соотношением "HA/β-TCP" в интервале от 5/95 до 95/5, предпочтительно от 30/70 до 80/20 и преимущественно от 40/60 до 60/40.
Предпочтительно речь идет о пористой подложке, в частности ВСР, с размерами пор в интервале от 50 нм до 1000 мкм, предпочтительно от 500 нм до 100 мкм и более предпочтительно от 1 до 50 мкм.
Если подложка, в частности ВСР, используемая в настоящем изобретении, представляет собой гранулы, то ее гранулометрический состав предпочтительно находится в интервале от 40 до 500 мкм, предпочтительно от 40 до 400 мкм, более предпочтительно от 40 до 300 мкм и преимущественно от 80 до 200 мкм.
Гранулы или порошок ВСР могут быть получены способами, описанными Bouler et al., J. Biomed. Mater. Res., 1996, 32, 603-609; Bouler et al., J. Biomed. Mater. Res., 2000, 51, 680-684; Obadia et al., J. Biomed. Mater. Res., 2006, 80 (В), 32-42.
ВСР может быть приобретен у компании GRAFTYS SARL (Экс-ан-Прованс).
Гидроксиапатит, который может быть применен по настоящему изобретению, предпочтительно представляет собой гранулы. Он может быть приобретен у компании GRAFTYS SARL.
Более предпочтительно настоящее изобретение относится к биоматериалу, содержащему подложку на основе фосфата кальция, пропитанную раствором по меньшей мере одного коагулянта, представляющего собой производное кальция, причем подложка выбрана из гидроксиапатита и ВСР, а коагулянт находится в виде водного раствора с концентрацией в интервале от 1 до 50 ммоль/л, причем соотношение между раствором коагулянта и НА или ВСР составляет от 0,5 до 5 об./об. раствора коагулянта по отношению к объему НА или ВСР.
Настоящее изобретение предпочтительно относится к биоматериалу, содержащему подложку на основе фосфата кальция, пропитанную раствором по меньшей мере одного коагулянта, представляющего собой производное кальция, причем подложка выбрана из гидроксиапатита и ВСР, а коагулянт, представляющий собой производное кальция, содержится с соотношением в интервале от 2,5 до 60 мкмоль кальция на грамм НА или ВСР и предпочтительно от 5 до 40 мкмоль кальция на грамм НА или ВСР.
2
3
2
2
4
Коагулянт представляет собой коагулянт на основе кальция, такой как биологически совместимая соль кальция, такая как, например, CaCl, Ca(NO), Ca(AcOEt), CaSO.
2
2
Коагулянт предпочтительно представляет собой коагулянт на основе кальция и выбран из биологически совместимых солей кальция и предпочтительно из CaCl. С целью обеспечения пропитки подложки, в частности HA или BCP, коагулянтом, последний используют в виде водного раствора, предпочтительно в виде водного раствора с концентрацией в интервале от 1 до 50 ммоль/л, предпочтительно от 3 до 40 ммоль/л и преимущественно от 5 до 20 ммоль/л. Данные значения особенно предпочтительны в случае, когда коагулянт представляет собой соль кальция и предпочтительно CaCl.
Соотношение между раствором коагулянта и HA или BCP, используемое в способе по настоящему изобретению, составляет от 0,5 до 5 об./об. раствора коагулянта по отношению к единице массы HA или BCP и предпочтительно от 1 до 3 и преимущественно равно приблизительно 2.
По одному из других вариантов настоящего изобретения биоматериал получают непосредственно перед применением пропиткой подложки на основе фосфата кальция непосредственно перед его имплантацией.
Также может быть предусмотрено получение биоматериала по настоящему изобретению соответственно следующей процедуре: пропитать подложку на основе фосфатов кальция раствором коагулянта, затем высушить или лиофилизовать, далее расфасовать в стерильных условиях и хранить подложку до ее имплантации.
Предпочтительно длительность пропитки составляет от 1 минуты до 1 часа, предпочтительно от 1 до 30 минут и преимущественно от 5 до 15 минут.
По другому  варианту настоящего изобретения биоматериал по настоящему изобретению можно получать, пропитывая подложку на основе фосфата кальция раствором коагулянта, затем данный биоматериал расфасовывают в стерильных условиях и хранят его в таком виде до его имплантации.
В одном из вариантов настоящего изобретения можно предусмотреть, что биоматериал-подложку (на основе фосфата кальция) комбинируют с коагулянтом в виде порошка. В частности, можно смешивать биоматериал, такой как BCP или HA в виде порошка или гранул, с солью кальция в виде порошка твердого тела. Таким образом, данный биоматериал можно хранить до его применения и пропитки экстемпорально водным раствором, таким как, например, физиологический раствор, непосредственно перед его имплантацией во время его применения. Биоматериал может быть имплантирован также в сухом виде, без пропитки.
По настоящему изобретению может быть предусмотрено введение в подложку, в частности в BCP, одной или нескольких возможных добавок, таких как полимеры, керамические частицы, соединения фармацевтического назначения, биологически активные вещества, причем условиями применения таких материалов являются их биологическая совместимость и отсутствие отрицательного действия на реакцию коагуляции крови. Если одна из таких добавок оказывает неблагоприятное действие на коагуляцию крови, то данное обстоятельство должно быть принято в расчет при определении применяемого количества коагулянта. Например, такие добавки или активные вещества могут быть использованы при сшивании подложки, BCP или иного материала, при смешивании или пропитке или при нанесении покрытия. Такие добавки хорошо известны специалистам в данной области техники и предназначены для изменения реологических свойств биоматериала, его поведения in vivo (твердость, резорбция, остеогенез) или действия в отношении инфекций или воспалительных явлений (антибиотики, противоинфекционные, противовоспалительные средства).
Также может быть предусмотрено введение в биоматериал по настоящему изобретению одного или нескольких соединений терапевтического назначения в качестве соединений, предназначенных для профилактики или лечения патологий, выбранных, например, из рака, остеопороза.
Также может быть предусмотрено введение в биоматериал по настоящему изобретению жировой ткани или любого другого препарата из тканей или клеток, отобранных у пациента, которому предназначается биоматериал, причем такую жировую ткань или такой препарат предварительно суспендируют в крови, плазме или физиологическом растворе.
В биоматериал по настоящему изобретению также можно вводить природные или синтетические факторы роста. Также может быть предусмотрено присутствие биомаркеров или контрастных веществ, благоприятствующих визуализации резорбции биоматериала и его изменения в организме посредством медицинской техники получения изображений.
Согласно способу по настоящему изобретению подложку, в частности HA или BCP, помещают в полость закрытого и стерильного контейнера. Если подложка представляет собой гранулы, то ее можно, например, помещать во внутреннюю полость шприца. Соответствующее количество коагулянта вводят в данный контейнер, например посредством набора в шприц, в случае использования такого устройства.
В случае, когда подложка, в частности HA или BCP, представляет собой монолитное тело, то ее помещают в контейнер соответствующих форм и размеров.
Во всех случаях объем контейнера предусматривают таким, чтобы обеспечить введение требуемого количества раствора коагулянта.
После закрытия контейнера содержащаяся в нем подложка, в частности HA или BCP, и коагулянт могут быть перемешаны с целью обеспечения равномерной пропитки биоматериала. Но также может быть предусмотрена пассивная пропитка подложки коагулянтом.
После данной стадии биоматериал представляет собой:
- однородную жидкую пасту, если подложка была использована в виде гранул;
- монолитное тело, полости которого заполнены жидкостью, если подложка была использована в виде монолитного тела.
В одном из вариантов настоящего изобретения может быть предусмотрена имплантация в заполняемое пространство непосредственно материала подложки при необходимости в смеси с коагулянтом в виде порошка с последующей пропиткой in situ как раствором коагулянта, так и - в случае, когда подложка уже смешана с коагулянтом - соответствующим водным раствором, таким как физиологический раствор. Также может быть предусмотрена имплантация без пропитки - в случае, когда подложка представляет собой сухую смесь с коагулянтом, которая затем пропитывается кровью из окружающих тканей.
Другим объектом настоящего изобретения является биоматериал, содержащий подложку на основе фосфата кальция, такого как гидроксиапатит или BCP, пропитанную раствором по меньшей мере одного описанного ранее коагулянта.
Исходя из физической формы подложки, HA или BCP, и типа устройства, использованного для получения биоматериала по настоящему изобретению, биоматериал может быть затем внесен посредством устройств, более приспособленных для перемещения в место, в котором должен быть восполнен дефект костной ткани, например, посредством инструмента, такого как шпатель, или посредством шприца, имеющего на торце отверстие, адаптированное к реологическим свойствам и размеру частиц биоматериала по настоящему изобретению. Биоматериал также может быть имплантирован непосредственно в виде монолитного тела. В данном случае биоматериал должен быть спроектирован или выполнен так, чтобы его форма и размеры соответствовали заполняемому пространству.
Настоящее изобретение относится также к способу восполнения дефекта костной ткани, причем данный способ включает перечисленные ранее стадии и, кроме того, стадию помещения биоматериала в место, в котором имеется дефект костной ткани. Кроме того, данный способ может включать стадии рассечения ткани и наложения шва.
Исходя из размеров и конфигурации дефекта кости, восполнение биоматериалом по настоящему изобретению может сочетаться с временным остеосинтезом, позволяющим придать пораженной ткани механическую прочность, необходимую в течение времени восстановления кости по месту имплантации биоматериала по настоящему изобретению.
Заявителями было установлено, что имплантация биоматериала по настоящему изобретению позволила облегчить образование костной ткани в короткие сроки (несколько недель), причем данная костная ткань имела очень хорошую васкуляризацию.
2
Другим объектом настоящего изобретения является набор для осуществления способа по настоящему изобретению, причем данный набор включает комбинацию подложки на основе фосфата кальция, такого как гидроксиапатит или смесь гидроксиапатита и по меньшей мере одного другого материала, такого как, например, микропористый BCP, с коагулянтом, представляющим собой производное кальция. Коагулянт предпочтительно представляет собой биологически совместимую соль кальция, такую как CaCl.
Количество коагулянта рассчитывают для компенсации антикоагулянтного эффекта фосфата кальция, в частности гидроксиапатита, и облегчения коагуляции крови в окружающих тканях.
Такая комбинация может представлять собой набор, в который входят:
(a) стерильное устройство, имеющее внутреннюю стерильную полость, в которой размещена подложка, такая как, например, BCP или HA;
(b) стерильная емкость, содержащая коагулянт.
Емкость (b) может представлять собой часть устройства (a) или отдельное изделие, такое как пробирка или флакон, из которых может быть отобран коагулянт для перемещения во внутреннюю полость устройства (a), или шприц, позволяющий вводить коагулянт в полость, в которую помещена подложка.
Внутренняя полость устройства (a) имеет размеры, позволяющие вводить в нее коагулянт в количестве, необходимом для получения биоматериала по настоящему изобретению, а также другие компоненты смеси, такие как, например, активные вещества.
Устройство (a) преимущественно содержит также средства, обеспечивающие нанесение биоматериала в зоне, имеющей дефект костной ткани.
Такое устройство может представлять собой шприц.
Также может быть предусмотрено применение устройства, такого как устройство, описанное в WO 02/068010, которое включает пробирку, внутри которой хранится подложка, в частности BCP, в которое вводят коагулянт и которое может быть снабжено поршнем для вытеснения биоматериала после его образования.
Биоматериал по настоящему изобретению может быть использован для получения костного имплантата в случае заполнения места перелома, восполнения потери вещества вследствие травмы или поражения опухолью, дефекта, являющегося результатом хирургической операции, или для содействия установке протеза.
Биоматериал посредством хирургической операции может быть введен в зону, в которой должен быть восполнен дефект костной ткани. После рассечения биоматериал имплантируют, а рану закрывают.
Биоматериал по настоящему изобретению может сочетаться с остеосинтезом с целью обеспечения временной консолидации до достижения стабилизации зоны, имеющей дефект костной ткани.
Покрытие протеза биоматериалом по настоящему изобретению благоприятствует внедрению живой костной ткани в протез или вокруг него.
Биоматериал по настоящему изобретению также может быть использован in vitro или ex vivo в качестве подложки для продуцирования костной ткани.
На практике культивирование костных клеток вокруг такого биоматериала позволяет продуцировать костную ткань, которая затем может быть имплантирована.
Другим объектом настоящего изобретения является применение in vitro или ex vivo описанного ранее биоматериала для получения костного имплантата.
Согласно настоящему изобретению можно культивировать костные клетки на биоматериале по настоящему изобретению в форме, соответствующей конфигурации изготовляемого протеза. Культивирование клеток в таких условиях позволяет получать биологически совместимый протез соответствующих форм и размеров.
ФИГУРЫ
Фиг. 1A-1D. - Получение имплантатов и хирургическая процедура
Фиг. 2. - Графическое отображение концентрации кальция в плазме, контактирующей с биоматериалами из фосфата кальция
Фиг. 3A. - Фотография продукта, полученного при прибавлении раствора хлорида кальция к BCP и HA до прибавления крови.
Фиг. 3B. - Фотография продукта, полученного при прибавлении к BCP раствора хлорида кальция с возрастающей концентрацией.
Фиг. 4. - Исследование сканирующей электронной микроскопией имплантатов, полученных с использованием цельной крови, отобранной без антикоагулянта (A, C), и микрочастиц BCP (80-200 мкм), и имплантатов, полученных по традиционной методике (B, D). В имплантатах, полученных без применения кальция, заметно отсутствие образования фибриновой сетки и сгустка крови вокруг гранул (A, C). Стрелка белого цвета на фиг. C указывает на несколько красных кровяных телец, отложившихся на гранулах. Масштаб на фигурах: A и B: 100 мкм; C и D: 10 мкм.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
I - Действие BCP и HA на коагуляцию
1. Принцип
2
Речь идет об экстемпоральной процедуре, осуществляемой в операционном блоке. Процедура представляет собой смешивание в полости шприца из полипропилена частиц BCP и коагулянта CaCl. Имплантация такого биоматериала по месту, в котором имеется дефект костной ткани, благоприятствует коагуляции вокруг биоматериала.
2. Материалы и методики
2.1. Частицы двухфазного фосфата кальция
10
4
6
2
3
4
2
Биоматериал из двухфазного фосфата кальция (BCP) состоит из 60% гидроксиапатита (HA; Ca(PO)(OH)) и 40% трикальцийфосфата (TCP; Ca(PO)). Частицы BCP, отсортированные в интервале от 40 до 200 мкм, были поставлены компанией GRAFTYS SARL (Экс-ан-Прованс, Франция). Частицы были стерилизованы нагреванием при 180°C в течение двух часов.
2.2. Измерение концентрации кальция в мышиной плазме
Концентрацию кальция измеряли в плазме мышей C57BL/6 (Janvier, Ле-Женет-Сент-Иль, Франция). Данную плазму получали, исходя из крови, отобранной с прибавлением гепарина, центрифугированием при 1800 g в течение 15 минут. Гепарин использовали в качестве антикоагулянта, не изменяющего концентрацию кальция в плазме. Анализ осуществляли на автоматически действующем приборе Hitachi (Орлеан, Франция).
2.3. Получение имплантатов и хирургическая процедура
2
2
Как показано на фиг. 1A-1D, используют шприц (1), имеющий цилиндрический полый корпус (2), в котором перемещается поршень (3). С торца корпуса (2), не закрытого поршнем, корпус шприца закрыт фильтрующим колпачком (4). В корпусе (2) шприца между торцом (5) поршня и фильтрующим колпачком (4) находятся гранулы (6) BCP (фиг. 1A). До применения комплект был стерилизован. Торец шприца, снабженный фильтрующим колпачком (4), помещают в контейнер (7), наполненный водным раствором (8) CaCl с концентрацией 1%. Движение поршня (3) назад обеспечивает всасывание раствора (8) внутрь корпуса (2) шприца (1) (фиг. 1B). Комплект оставляют в покое в течение 10 мин, чтобы частицы BCP пропитались раствором, а затем посредством поршня (3) избыток раствора (8) CaCl выдавливают через фильтрующий колпачок (4) (фиг. 1C). Из фильтрующего колпачка (4) удаляют фильтр (9) и давлением на поршень (3) наносят гранулы (6) BCP, пропитанные раствором (8), по месту операции (10) (фиг. 1D). Затем место имплантации закрывают (стадия не показана).
3. Результаты
3.1. Действие гидроксиапатита и TCP на коагуляцию
50 мг порошка HA или порошка TCP помещали в шприц вместимостью 1 мл. В каждый из шприцев, содержавших HA или TCP, прибавляли по 100 мкл крови. Полученную смесь помещали на ротор, позволявший поддерживать порошок в крови в состоянии суспензии в течение времени коагуляции, т.е. в течение 10 минут. В каждом опыте один шприц, содержавший 100 мкл цельной крови и выдержанный, как и другие шприцы, т.е. в течение 10 мин, на роторе, служил позитивным контролем коагуляции. Через 10 минут ротор останавливали, шприцы извлекали, их концы отрезали и смесь "кровь/порошок" выдавливали, толкая поршень шприца. Отмечали наличие или отсутствие коагуляции крови вокруг порошка. Каждый опыт повторяли 3 раза.
Было замечено, что в присутствии 50 мг HA и 100 мкл цельной крови коагуляция была ингибирована. При этом кровь осталась жидкой.
Контрольный опыт: позитивный контроль коагуляции. Отмечают наличие сгустка и экссудата сыворотки.
В присутствии 50 мг TCP+100 мкл крови имела место коагуляция, она была выражена в образовании имплантата, в котором фибриновая сетка поддерживала порошок в состоянии суспензии однородным образом.
Такой же опыт осуществляли, прибавляя хлорид кальция в шприц, содержавший HA, до введения крови: при этом наблюдалась коагуляция и образование имплантата.
3.2. Действие BCP на коагуляцию
2
2
Заявителями было замечено, что кровь (100 мкл), свежеотобранная в отсутствие антикоагулянта и немедленно смешанная с частицами BCP (50 мг), не коагулирует. Данный антикоагулянтный эффект устраняется прибавлением CaCl (20 мкл 1%-го раствора CaCl), что ведет к предположению о захвате BCP плазматического кальция. Данная гипотеза была подтверждена измерением концентрации кальция в плазме до и после контакта с BCP. С этой целью была получена плазма, исходя из крови мышей C57BL/6, отобранной с прибавлением гепарина (антикоагулянт, не изменяющий плазматическую концентрацию кальция). В присутствии BCP заявителями было замечено падение плазматической концентрации кальция с 2,06 ± 0,06 ммоль/л (нормальное значение) до 0,59 ± 0,07 ммоль/л.
II - Действие биоматериалов на основе фосфатов кальция на плазматическую концентрацию кальция
1. Принцип
2
2
2
Аликвоты 50 мг микрочастиц BCP (60/40), аликвоты 50 мг HA или β-TCP были смешаны с 50 мкл HO или с 50 мкл 2,5 мМ раствора CaCl·2HO и высушены в течение ночи при 56°C. Данные биоматериалы вносили в лунки микропланшета на 96 лунок. В каждую из лунок прибавляли по 100 мкл плазмы, полученной, исходя из крови мышей C57BL/6, отобранной с прибавлением гепарина, т.е. антикоагулянта, который не влияет на содержание кальция. После выдержки в течение 15 минут микропланшет центрифугировали в течение 2 минут при 800 g, и надосадочные жидкости отбирали для определения концентрации кальция в плазме. Определение кальция осуществляли, используя набор QuantiChrom Calcium Assay (CENTAUR, Брюссель, Бельгия) соответственно инструкциям изготовителя. С этой целью аликвоты 5 мкл надосадочной жидкости смешивали с 200 мкл раствора фенолсульфонфталеина, представляющего собой краситель, образующий стабильный комплекс синего цвета в присутствии свободных ионов кальция. После выдержки в течение 3 минут развивается окрашивание, интенсивность которого, определенная при 612 нм, прямопропорциональна концентрации кальция в пробе. В каждом микропланшете готовили серию эталонов, исходя из концентраций кальция 0-0,5-1-1,5-2-3-4-5 мМ.
2. Результаты:
Заявителями было установлено (фиг. 2), что BCP в виде микрочастиц, а также порошок HA, приведенные в контакт с плазмой, индуцировали существенное и значимое уменьшение в ней концентрации кальция. Падение концентрации кальция было сравнимым в случае BCP и HA и не было отмечено в случае β-TCP. Исходя из значений, полученных для одной плазмы (1,960±0,044 мМ), для плазмы в присутствии BCP (0,871±0,160 мМ) и для плазмы в присутствии HA (0,840±0,121 мМ) заявителями был оценен захват кальция величиной 0,125 мкмоль кальция на 50 мг BCP или HA.
Заявителями также было установлено, что прибавление 50 мкл 2,5 мМ раствора (или 0,125 мкмоль) к BCP или HA перед прибавлением плазмы позволяет восстанавливать нормальную плазматическую концентрацию кальция (фиг. 2). Такое же количество хлорида кальция, прибавленное к β-TCP, суммируется с исходным количеством кальция в плазме, что подтверждает отсутствие захвата данным биоматериалом в таких условиях.
В то же время заявителями было замечено, что захват кальция был идентичным для трех испытуемых образцов BCP с разной крупностью, то есть для микрочастиц размером 40-80, 80-200 и 200-500 мкм.
Кроме того, заявителями были получены такие же результаты в отношении компенсации прибавлением кальция как в случае экстемпорального прибавления раствора хлорида кальция непосредственно перед прибавлением плазмы, так и в случае предварительного упаривания данного раствора, находившегося в контакте с частицами.
III - Эффект прибавления кальция на антикоагулянтные свойства BCP и HA
1. Принцип
2
2
Для доказательства существования причинно-следственной связи между ингибированием коагуляции и падением плазматического содержания кальция, индуцированным BCP и HA, заявителями были осуществлены испытания по коагуляции аликвот 50 мг микрочастиц BCP (60/40) и 50 мг порошка HA после прибавления 50 мкл 150 мМ раствора NaCl или 50 мкл 2,5 мМ раствора CaCl·2HO.
2. Результаты:
После прибавления необработанной антикоагулянтом крови и выдерживания на роторе в течение 15 минут заявителями было установлено (фиг. 3A), что предварительное прибавление кальция к BCP и HA позволяет восстанавливать коагуляцию крови в присутствии обоих данных биоматериалов.
Полученные результаты доказывают, что антикоагулянтный эффект BCP и HA связан с уменьшением плазматической концентрации кальция, вызываемым обоими данными биоматериалами, а прибавление кальция обеспечивает восстановление коагуляции.
2
2
2
2
Заявителями было проанализировано ответное действие дозы кальция на коагуляцию крови, приведенной в контакт с BCP (фиг. 3B). Биоматериал получали, прибавляя 100 мкл цельной крови, не дополненной антикоагулянтом, к 50 мг частиц BCP в присутствии раствора CaCl·2HO, взятого в фиксированном объеме 50 мкл и приготовленного с концентрациями 0,01% (0,68 мМ) - 0,02% (1,36 мМ) - 0,05% (3,4 мМ) - 0,1% (6,8 мМ) - 0,2% (13,6 мМ) - 0,5% (34 мМ) - 1% (68 мМ) - 10% (680 мМ), или такого же объема раствора NaCl с концентрацией 150 мМ. После выдержки в течение 15 минут на роторе биоматериал извлекали. Заявителями было установлено, что при низкой концентрации, соответствовавшей в данном случае 0,01 и 0,02%, прибавленный кальций не обеспечивал восстановление коагуляции. При концентрациях в интервале от 0,05 до 0,5% наблюдалась коагуляция. Неожиданным образом заявителями было установлено, что увеличение концентрации CaCl·2HO до 1% и более снова индуцировало ингибирование коагуляции (фиг. 3B и табл. 1).
Данные испытания позволили определить оптимальные концентрации кальция, обеспечивающие блокирование антикоагулянтного эффекта BCP 60/40, и показали, что существует интервал концентраций, соблюдение которого является очень важным.
IV. Исследование фибриновой сетки, сканирующей электронной микроскопией
Антикоагулянтный эффект BCP, визуально оцениваемый по отсутствию образования желеобразных когезивных имплантатов в ходе описанных ранее испытаний, соответствует на молекулярном уровне ингибированию образования фибриновой сетки, формирующей каркас сгустка. Заявителями было осуществлено исследование на наличие фибриновой сетки посредством сканирующей электронной микроскопии. С этой целью имплантаты получали, смешивая 100 мкл крови, не дополненной антикоагулянтом, с 50 мг BCP или с 50 мг BCP, выдержанных в присутствии кальция и затем высушенных. После выдерживания в течение 15 минут на роторе смеси извлекали и сразу погружали в фиксирующий раствор 1,6%-го раствора глутарового альдегида в буферном фосфатном растворе с концентрацией 0,1 M и pH=7. Затем образцы промывали, обезвоживали в спиртовых растворах с возрастающими концентрациями, погружали на 5 минут в гексаметилдисилазан (Sigma-Aldrich, Л'Иль-д'Або-Шен, Франция) и высушивали при комнатной температуре. После фиксации на алюминиевой подложке и покрытия слоем "золото-палладий" в течение 4 минут (Polaron, A5100, Великобритания) осуществляли исследование посредством сканирующего электронного микроскопа (JEOL 6700F, Япония).
Как можно видеть на фиг. 4, в случае BCP фибриновая сетка (фиг. 4A, 4C) между микрочастицами BCP не наблюдается. Наличие нескольких красных кровяных телец, отложившихся на гранулах, свидетельствует о смеси частиц с кровью. В противоположность этому, в присутствии системы "BCP/кальций" отмечается наличие сгустка, сжимающего частицы, причем сгусток визуализуется ячейками фибриновой сетки и очень большим числом красных кровяных телец (фиг. 4B, 4D).
Таблица 1
Концентрация раствора CaCl<sub>2</sub>·2H<sub>2</sub>O, прибавленного к смеси BCP и крови (в% и молярности)
Число мкмоль кальция, привнесенного 50 мкл раствора CaCl<sub>2</sub>·2H<sub>2</sub>O
Испытание коагуляции смеси "50 мг BCP + 100 мкл крови + 50 мкл раствора CaCl<sub>2</sub>·2H<sub>2</sub>O (в виде жидкости или после высушивания)"
0
-
0,01% (0,68 мМ)
0,034
-
0,02%
0,068
+
0,03%
0,102
+
0,04%
0,136
+
0,05%
0,17
+
0,1%
0,34
+
0,2%
0,68
+
0,5%
1,7
+
0,6%
2,04
+
0,7%
2,38
+
0,8%
2,72
+
0,9%
3,06
+
1% (68 мМ)
3,4
+/-
2%
-
10% (680 мМ)
34
-