Исследование влияния различных концентраций солей тяжелых металлов на рост культуры ацидофильных хемолитотрофных микроорганизмов

© A.C. Хомченкова, 2016

УДК 550.72

А.С. Хомченкова

ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ РАЗЛИЧНЫХ КОНЦЕНТРАЦИЙ СОЛЕЙ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ НА РОСТ КУЛЬТУРЫ АЦИДОФИЛЬНЫХ ХЕМОЛИТОТРОФНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

Получены экспериментальные данные о влиянии различных концентраций солей тяжелых металлов (Ni, Co, Cu, Mg, As) в составе питательной среды на численность клеток в культуре ацидофильных хемо-литотрофов (Acidithiobacillus thiooxidans, Acidithiobacillus ferrooxidans, Sulfobacillus sp., Ferroplasma sp.). Выявлена устойчивость микроорганизмов культуры к концентрациям солей в диапазоне 0,5 % — 1,5 %. Ключевые слова: никель, кобальт, медь, магний, мышьяк, тяжелые металлы, устойчивость, хемолитотрофные микроорганизмы.

Изучение процессов взаимодействия между аборигенными микроорганизмами рудных месторождений и тяжелыми металлами является необходимым компонентом построения технологии добычи ценных металлов из руды посредством геомикробиологии и гидрометаллургии (например, биовыщелачивание).

В ходе эволюции бактерии, в том числе хемолитотрофы, адаптировались к повышенному содержанию ионов металлов в местах залежей руд, в гидротермальных источниках и местах обитания вблизи действующих вулканов. Устойчивость бактерий к металлам может быть обусловлена несколькими факторами: типом и количеством путей транспорта ионов металла в клетку, локализацией генов устойчивости на хромосоме, плаз-миде или транспозоне, ролью ионов металлов в метаболизме клетки. Один штамм может одновременно обладать разными механизмами защиты: внеклеточный барьер; активный транспорт ионов металлов из клетки (эффлюкс); внеклеточная секвестрация; внутриклеточная секвестрация; восстановление ионов металлов [1, 4].

Однако даже в случае работы в бактериальной клетке нескольких механизмов защиты, остаётся справедливым утверждение: нет вредных веществ, есть вредные концентрации.

Подавляющие концентрации способны привести к резкому снижению биопотенциала сообщества микроорганизмов [2].

Материалы и методы

Культура микроорганизмов. Для проведения эксперимента была получена бактериальная культура, накопленная в биореакторе, где осуществлялась аэрация, перемешивание (90 об./мин) и поддержание постоянной температуры (30°С) смеси питательной среды Сильвермана-Ёундгрена (9К) и руды. По данным ПЦР-диагностики (лаборатория НИГТЦ ДВО РАН), в состав накопленной культуры входили: АасШЫоЪасШиз 1Ыоох1с!апз, Ас1СИЬюЪасШиз ¡еттоохСапз, БиИоЪасШиз вр., Гегтор1азта вр.

Образец сульфидной кобальт-медно-никелевой руды. Как источник аборигенной микрофлоры, в работе использована проба сульфидной кобальт-медно-никелевой руды ТП-38 месторождения Шануч (Камчатка). Содержание рудных минералов в образце от 60 до 90 %, содержание N1 - 8,36 % (лаборатория ООО «Камчатгеология», атомно-абсорбционный анализ).

Культивирование при различных концентрациях солей тяжелых металлов. Полученную культуру высевали в пробирки, где находилась жидкая питательная среда 9К и различные концентрации солей (0,10; 0,25; 0,50; 0,75; 1,00; 1,25; 1,50 %), контроль (К) - питательная среда без модификации солями. Культивировали в течение 20-22 суток при температуре 30°С в термостате. В посевном материале присутствовало 5,8-107/мл микробных клеток (прямой подсчёт под микроскопом). В эксперименте использовали соли тяжелых металлов следующего состава: N1804, СоС12, Си804, МдЭ04, №3Дэ04.

Количественный учёт роста бактериальных клеток. Учёт количества клеток проводился методом прямого подсчёта под микроскопом.

Результаты и обсуждение

Рост бактерий наблюдался во всех вариантах концентраций солей тяжелых металлов в питательной среде на протяжении всего периода культивирования, следовательно, добавление этих солей в указанных концентрациях не оказало летального действия на аборигенную бактериальную культуру (табл. 1).

Таблица 1

Результаты количественного учёта клеток микроорганизмов в процессе культивирования под воздействием различных концентраций солей тяжелых металлов

Концентрация, % Сутки Количество клеток в 1 мл

№8О4 СоС12 Си8О4 МдБО4

К 0-11 3,0 6,8 56,8 9 15,0

12-18 12,0 11,3 23,4 12,8 16,6

19-22 15,9 21,9 18,9 18,1 25,7

0,10 0-11 1,5 18,9 8,3 10,6 15,9

12-18 11,3 7,6 11,3 21,9 10,6

19-22 18,9 27,2 24,2 25,7 20,4

0,25 0-11 5,0 17,4 25,7 22,7 41,6

12-18 12,8 11,3 15,9 16,6 6,8

19-22 21,2 16,6 31,0 18,1 20,4

0,50 0-11 19,7 47,7 38,6 16,6 18,0

12-18 12,0 10,6 18,9 15,1 12,8

19-22 19,7 21,8 21,2 25,0 16,6

0,75 0-11 13,6 29,5 38,6 15,9 43,9

12-18 9,8 12,8 25,7 19,7 7,5

19-22 16,5 18,1 27,2 25,7 15,1

1,00 0-11 16,6 34,1 59,8 15,6 28,0

12-18 6,0 15,9 21,2 20,4 8,3

19-22 13,6 20,4 23,4 27,2 20,4

1,25 0-11 13,6 18,1 32,5 11,3 10,6

12-18 12,8 18,1 21,2 25,0 8,3

19-22 21,2 20,4 24,2 25,0 15,1

1,50 0-11 13,6 56,8 31,8 27,2 12,0

12-18 13,6 1 2, 8 18,1 9,8 8,3

19-22 15,9 31,8 21,2 31,8 15,1

По результатам, представленным в табл. 1, видно: увеличение концентрации в ростовой среде соли никеля до 1,01,25 %; кобальта до 1,0-1,50 %; меди до 0,75-1,50 %; магния до 1,50 %; мышьяка до 0,25-1,50 % в 12-18 сутки культивирования оказывает ингибирующее действие на рост культуры, после чего численность бактерий (на 19-22 сутки) восстанавливается и становится близкой к началу эксперимента. Такое волнообразное изменение численности культуры, вероятно, связано с гибелью неустойчивых клеток, и ростом клеток, обладающих механизмами защиты.

Таблица 2

Результаты ПЦР-диагностики культур, выращенных под воздействием различных концентраций солей тяжелых металлов

Микроорганизм Наличие (+) / отсутствие (-) роста в среде с

N1804 СоС1г Си804 Мд804 ^3А04

ЛС^ШоЬасШш thiooxidans + + - - -

Л^ПЫоЬасШш ferrooxidans + + - - -

БиМоЬасШт sp. - - + + +

Регюрата sp. + + + - -

Результаты ПЦР-диагностики культур, подвергшихся воздействию различных концентраций указанных солей тяжелых металлов, представлены в табл. 2.

Бактериальная культура, использованная в эксперименте -аборигенная микрофлора руд кобальт-медно-никелевого месторождения, и обладает природными механизмами устойчивости к повышенным концентрациям этих металлов, что и подтвердил результат ПЦР-анализа. Три вида микроорганизмов из четырёх от первоначальной культуры (Л. thiooxidans, A. ferrooxidans, Гепор^та sp.) проявили резистентность к высоким содержаниям солей никеля и кобальта в питательной среде. Наибольший ингибирующий эффект на исследуемую культуру бактерий оказали соли магния и мышьяка, при условиях повышенных концентраций этих солей отмечается рост только БиИоЬасШт sp.

Заключение

Полученные результаты показали: бактерии, входящие в состав одного аборигенного сообщества, имеют различную резистентность к тяжелым металлам. Необходимо проводить предварительную селекцию видов и штаммов перед промышленным применением в процессах извлечения ценных металлов.

В ходе эксперимента не были выявлены минимальные подавляющие концентрации для исследуемого бактериального сообщества, что предполагает повтор эксперимента с ещё более высокими концентрациями солей тяжелых металлов.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Янeвa O.Ä. Механизмы устойчивости бактерий к ионам тяжёлых металлов // Микробиологический журнал. 2QQ9. Т. 71, №б, С. 54-б5.

2. Cmзенцов A.H., Hyгaмaнoвa Э.M., Пешков C.A. Влияние тяжёлых металлов на рост пробиотических штаммов E. Coli M-17, E. faecium, L. acidophillus, L. bulgaricusLB-51 и бактерии рода Bacillusв условиях invitro // Вестник O^. 2Q11. №12(131), С. 358-36Q

3. Лхметов П.И., Быков A.r., Baйнштeйн M.Á., Ecмкoвa T.3., Филонов A.E., Крылош Ë.H., Mopтaзaвм C. Токсичность никеля для тионовых бактерий // Известия Тульского государственного университета. Естественные науки. 2Q1Q. №1, С. 1б7-174

4. Xoмчeнкoвa A.C., Mycмxмн B.O., ÊMope^y A.B., Позолотиш Ë.A. Omrr выделения аборигенных хемолитотрофных микроорганизмов из окисленных сульфидных медно-никелевых руд месторождения Шануч (Камчатка) // Горный информационно-аналитический бюллетень. 2Q15. Специальный выпуск б3, С. 366-37Q

5. Xoмчeнкoвa A.C. Микробиологические аспекты бактериально-химического выщелачивания сульфидных руд // Горный информационно-аналитический бюллетень. 2Q15. Специальный выпуск б3, С. 371-377

6. Ёевенец O.O., Xaйнacoвa T.C., Бельков A.A., Пoзoлoтмнa Ë.A. Биовыщелачивание сульфидной кобальт-медно-никелевой руды с вариациями питательной среды для хемолитотрофных микроорганизмов // Горный информационно-аналитический бюллетень. 2Q15. Специальный выпуск б3, С. 291-29б

7. Xaйнacoвa T.C., Poranx C.B., Kys^^a T.È., Кopнмлoвa T.È. OHM^ ленная руда как источник выделения ацидофильных хемолитотрофных микроорганизмов для биовыщелачивания сульфидных медно-никелевых руд // Горный информационно-аналитический бюллетень. 2Q13. № 1Q, С. 135-138

8. ÊMope^y A.B., MycèXMB B.O., Xoмчeнкoвa A.C. Исследование процессов проточного бактериально-химического выщелачивания сульфидных медно-никелевых руд месторождения Шануч (Камчатка) // Горный информационно-аналитический бюллетень № 11. 2Q16. Специальный выпуск 31, С. 272-279.

9. Gadd G.M. Heavy metal accumulation by bacteria and other microorganisms // Experientia 4б, P. 834-84Q, 199Q.

1Q. Rathnayake I.V.N., MegharajMallavarapu, Krishnamurti G.S.R., Bolan Nanthi S., Naidu Ravi Heavy metal toxicity to bacteria - Are the existing growth media accurate enough to determine heavy metal toxicity? // Chemosphere 9Q, P. 1195-12QQ, 2Q13.

КОРОТКО ОБ АВТОРЕ -

Xoмчeнкoвa A.C. - младший научный сотрудник, nigtc@kscnet.ru, Научно-исследовательский геотехнологический центр Дальневосточного отделения Российской академии наук.

UDC 550.72

STUDY OF EFFECT OF VARIOUS CONCENTRATION SALTS OF HEAVY METALS ON GROWTH ACIDOPHILIC CHEMOLITHOTROPHIC MICROORGANISMS CROP

Khomchenkova AS., junior scientist, nigtc@kscnet.ru, Research Geotechnological Center, Far Eastern Branch of Russian academy of Science, Russia.

Experimental data on the effect of different concentrations of heavy metal salts (Ni, Co, Cu, Mg, As) in the composition of nutrient medium on the number of cells acidophilic chemolithotrophic microorganisms crop (Acidithiobacillus thiooxidans, Acidithiobacillus fer-rooxidans, Sulfobacillus sp., Ferroplasma sp.). Microbial culture revealed resistance to salt concentrations in the range of 0.5-1.5 %.

Key words: nickel, cobalt, copper, magnesium, arsenic, stability, chemolithotrophic microorganisms. REFERENCES

1. Yaneva O.D. Mekhanizmy ustojchivosti bakterij k ionam tyazhyolyh metallov (Mechanisms of bacterial resistance to heavy metal ions) // Mikrobiologicheskij zhurnal.

2009. T. 71, No 6, pp. 54-65.

2. Sizencov A.N., Nugamanova Eh.M., Peshkov S.A. Vliyanie tyazhyolyh metallov na rost probioticheskih shtammov E. coli M-17, E. faecium, L. acidophilus, L. bulgaricus LB-51 i bakterii roda Bacillus v usloviyah in vitro (Impact of heavy metals on the growth of probiotic strains E. Coli M-17, E. faecium, L. acidophillus, L. bulgaricusLB-51 and bacteria of the genus BacillusB vitro) // Vestnik OGU. 2011. No 12 (131), pp. 358-360.

3. Ahmetov L.I., Bykov A.G., Vajnshtejn M.B., Esikova T.Z., Filonov A.E., Krylova L.N., Mortazavi S. Toksichnost nikelya dlya tionovyh bakterij (Toxicity of Nickel to Tihono-vich bacteria) // Izvestiya Tulskogo gosudarstvennogo universiteta. Estestvennye nauki.

2010. No 1, pp. 167-174.

4. Homchenkova A.S., Musihin V.O., Kioresku A.V., Pozolotina L.A. Opyt vydeleniya aborigennyh hemolitotrofnyh mikroorganizmov iz okislennyh sulfidnyh medno-nikelevyh rud mestorozhdeniya Shanuch (Kamchatka) (Experience chemolithotrophic selection of native microorganisms from oxidized copper-Nickel sulfide ores chanoch (Kamchatka)) // Gornyj informacionno-analiticheskij byulleten. 2015. Specialnyj vypusk 63, pp. 366-370.

5. Homchenkova A.S. Mikrobiologicheskie aspekty bakterialno-himicheskogo vyshchelachivaniya sulfidnyh rud (Microbiological aspects of bacterial-chemical leaching of sulfide ores) // Gornyj informacionno-analiticheskij byulleten. 2015. Specialnyj vypusk 63, pp. 371-377.

6. Levenets O.O., Khajnasova T.S., Balykov A.A., Pozolotina L.A. Biovyshchelachivanie sulfidnoj kobalt-medno-nikelevoj rudy s variaciyami pitatelnoj sredy dlya hemolitotrofnyh mikroorganizmov (Bioleaching of sulphide cobalt-copper-Nickel ore with variations of a nutrient medium for microorganisms chemolitotrophic) // Gornyj informacionno-analiticheskij byulleten. 2015. Specialnyj vypusk 63, pp. 291-296.

7. Khajnasova T.S., Rogatyh S.V., Kuzyakina T.I., Kornilova T.I. Okislennaya ruda kak istochnik vydeleniya acidofilnyh hemolitotrofnyh mikroorganizmov dlya biovyshchelachivaniya sulfidnyh medno-nikelevyh rud (The oxide ore as a source of acidophi-lus chemolithotrophic selection of microorganisms for the bioleaching of sulphide copper-Nickel ores) // Gornyj informacionno-analiticheskij byulleten. 2013. No 10, pp. 135-138.

8. Kioresku A.V., Musihin V.O., Homchenkova A.S. Issledovanie processov protochnogo bakterialno-himicheskogo vyshchelachivaniya sulfidnyh medno-nikelevyh rud mestorozhdeniya Shanuch (Kamchatka) (Study of the processes of the flow of bacterial-chemical leaching of sulfide copper-Nickel ore deposits chanoch (Kamchatka)) // Gornyj informacionno-analiticheskij byulleten No 11. 2016. Specialnyj vypusk 31, pp. 272-279.