Изучение антагонистической активности гемолитических E. coli, выделенных от больных с заболеваниями желудочно-кишечного тракта

УДК 579 ББК 52.64 Х 53

Н.С. Хиштова

Изучение антагонистической активности гемолитических Е.еоН, выделенных от больных с заболеваниями желудочно-кишечного тракта

Аннотация:

Изучена антагонистическая активность гемолитических эшерихий (Е. соН Н1у+), выделенных при заболеваниях ЖКТ в отношении близкородственных и неродственных микроорганизмов и её связь с наличием ферментативной активности. Выявлено низкое антагонистическое действие бактериоцинов изучаемых штаммов по отношению к БТП «Коли-бактерин» и к типичным Е.соН, и высокое - к условно-патогенным и патогенным энтеробактериям, лактобактериям, золотистому стафилококку. Из трех групп Е.соН Н1у+ наибольшую антагонистическую активность на изученные индикаторные группы, проявляют штаммы со слабовыраженной ферментативной активностью, наименьшую - лактозонегативные.

Ключевые слова:

Антагонистическая активность, гемолитические, типичные эшерихии, пробиотики, лактобактерии, энтеробактерии.

Введение

При исследовании кишечной микрофлоры больных, страдающих хроническими кишечными заболеваниями, такими как гастрит, холецистит, панкреатит, язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки, был выявлен дисбактериоз, выражающийся в резком повышении содержания бактерий рода протей, наличии гемолитических стафилококков и их ассоциаций, гемолитических кишечных палочек, увеличение числа споровых анаэробных бактерий [5, 6]. Дисбактериоз кишечника может стать причиной, поддерживающей воспалительный процесс при сопутствующих заболеваниях. Отмечено обнаружение гемолитических эшерихий - до 43,6 [9] при полипозах толстой кишки и до 3,4% у больных ЯБЖ и ЯБДК из биоптатов [3]. Существует корреляция между факторами вирулентности и продукцией бактериоцинов [4].

В нашей работе мы изучили наличие антагонистической активности гемолитических эшерихий (Н1у+), выделенных при заболеваниях ЖКТ в отношении близкородственных и не-

родственных микроорганизмов и проследили её связь с наличием ферментативной активности.

Материалы и методы. Изучение микробного биоценоза на основании изучения про-светной микрофлоры, согласно методике бактериологического исследования испражнений, предусматривало выделение, количественную и качественную характеристику основных представителей облигатных и факультативноанаэробных бактерий толстой кишки. Оценку полученных результатов проводили в соответствии с методическими рекомендациями по бактериологической диагностике дисбактериоза [7]. Антагонистическую активность гемолитических Е.соН определяли методом отстроченного антагонизма [1,8]. На плотную питательную среду (1,5% питательный агар) засевали суточную бульонную культуру штамма -продуцента факторов ингибирования (гемолитические Е.соН) в виде прямой полосы в центре чашки Петри. После выращивания в течение 24 часов при 37°С и 24 часов при комнатной температуре 24°С, штрихами, перпендикулярно штамму - продуценту проводили высев 4-х часовых бульонных (при использовании лакто-

бактерий - суточных агаровых) культур индикаторных штаммов. Через 24-4В часов культивирования при оптимальной для испытуемых культур температуре и условий (микроаэро-фильных для лактобактерий) культивирования учитывали расстояние задержки роста индикаторных штаммов. Для контрольного посева вместо индикаторного штамма использовалась изучаемая культура гемолитической E.coli. Таким образом создавались оптимальные условия раздельно для роста штамма- продуцента, биосинтеза факторов антагонизма и роста индикаторной культуры, которые могут существенно различаться [2]. Результат оценивался по торможению роста индикаторных штаммов, чувствительных к антагонистическому действию: до 2мм - +, от 2 до 5 мм - ++, 5-10 мм - +++, более 10 мм - ++++.

В качестве индикаторных штаммов использовались культуры патогенных энтеробактерий: E.coli О-151, Salmonella enteritidis, Shigella flex-neri 2a; культуры условно-патогенных бактерий: Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Stahpylococcus aureus, типичные E.coli и лактобактерии, выделенные от больных дисбактериозом; культуры пробиотиков: E.coli М-17 из биотерапевтического препарата (БПТ) «Колибактерин». Выделенные микроорганизмы подвергали идентификации по морфологическим, культуральным, биохимическим свойствам. К лактобациллам относили грамположи-тельные, неподвижные, неспоровые, не обладающие каталазой микроаэрофильные бактерии.

В работу были взяты 105 штаммов гемолитической E.coli, выделенных от больных ЖКБ, панкреатитом, холециститом, колитом, ЯБЖ и ЯБДК. Из них 48 штаммов проявляли хорошую, 45 штаммов были со слабовыраженной и 12 штаммов не обладали ферментативной активностью по отношению к лактозе.

Результаты. Все индикаторные штаммы были подразделены на группы [таб. 1]:

1. Группа патогенных и условно-патогенных энтеробактерий, куда вошли E.coli О-151,

S. enteritidis, S. flexneri 2a, K. pneumoniae. С этой группой было проведено 408 ииследова-ний, в 21б случаях индикаторные штаммы проявляли чувствительность к антагонистическому действию дисбактериозной E.coli Hly+ - 59,9 ±

2,5% (M±m), подавление роста в этой группе составило 8,4±0,8 мм.

2. Вторая группа представлена БТП E.coli М-17, из 105 проведенных исследований, антагонистическая активность проявилась в 9 случаях - 8,6±2,8%, подавление роста составило

0,9±0,5 мм.

3. С третьей группой - P. aeruginosa, проведено 105 исследований, в 51 случае 48,6±4,9% штаммов гемолитической E.coli проявили антагонистическую активность с зоной подавления 3,7±0,9 мм.

4. Четвертая группа была представленная кокковыми микроорганизмами- Stahpylococcus aureus. Из 105 штаммов гемолитической E.coli , 81 штамм обладал бактериоцинной активностью- 77,1±4,1%, с зонной задержки роста 7,6±0,9%.

5. Из 1680 исследований - в 636 случаях типичные E.coli (пятая группа) были чувствительными к антагонистическому действию E.coli Hly+, что составило 37,8±1,2%, зона задержки роста составила 10,8±0,5мм.

6.Группа, представленная бактериями рода Lactobacillus. Из 1482 исследований в 853 случаях E. coli Hly+проявляли антагонистическое действие, что составило 57,5±1,9% с зоной задержки роста 17,7±0,8мм.

Для изучения влияния лактозного признака на антагонистическую активность штамма-продуцента все E.coli Hly+ были разбиты на 3 группы [таб. 3]. Было обнаружено, что наибольшей активностью обладают штаммы со слабовыраженной ферментативной активностью. Так, E.coli О-151 была чувствительна к таким штаммам в 80,0±6,0%; S. enteritidis в 66,7±7,0%; S. flexneri 2a в 26,7±6,6%; K. pneumoniae - в 100%, лактобактерии в 68,8±1,8%, типичные E.coli - в 48,9±3,3% случаев. Наибольшая антагонистическая активность гемолитических E.coli со слабовыраженной ферментативной активностью проявилась в отношении K. pneumoniae. Штаммы E.coli О-151 оказались более чувствительными к бактериоцинному действию слабоферментирующих E.coli Hly+, чем S. enteritidis в 1,2 раза (р>0,1). Лактобактерии оказались в 1,4 раза более чувствительными, чем типичные кишечные палочки (n>30, p<0,001).

Активность гемолитической E.coli с выраженной ферментативной активностью была не-

сколько ниже. Так, в 93,8±3,4% случаев E.coli Hly+ проявляли активность в отношении K. pneumoniae, в бВ,В±б,7% к E.coli О-151, в 5б,2±7,2% к S. enteritidis, в 39,б±3,2% к типичным E.coli, в 28,3±2,0% к лактобактериям и только в б,2±3,4% к S. flexneri. Прослеживается достоверная разница антагонистического действия по отношению к S. flexneri группы E.coli Hly+ с ферментативной активностью и группы E.coli Hly+ со слабовыраженной ферментативной активностью в пользу последних (р<0,01). В 75,0±12,5% случаев штаммы лактозонегативных E.coli Hly+ проявляют антагонистическую активность к K. pneumoniae и в 82,0±2,2% случаев к лактобактериям. К E.coli О-151 и S. enteritidis: такая активность была в 50,0±14,4%, к типичным E.coli в 25,0±5,б%, а к S. flexneri - ни одного случая.

При сравнении антагонистического действия 3 групп E.coli Hly+ на представителей семейства энтеробактерий в показателях задержки роста (в мм) [таб.2], обнаружено, что наибольшая зона задержки роста прослеживается у K. pneumoniae. К слабоферментирующим штаммам E.coli Hly+ подавление роста клебси-елл составляет 20,3±1,1 мм, к штаммам с выраженной ферментативной активностью -1В,б±1,4 мм, и наименьшая - к лактозонегативным E.coli Hly+ - 10,5±2,4 мм. Наименьшая задержка роста проявляется у S. flexneri в этой же последовательности: 1,5±0,5; 0,б±0,2; 0, мм соответственно. Показатель ингибиции роста типичных E.coli [таб.4] выше при действии сла-боферментирующих E.coli Hly+ и с нормальной ферментативной активностью в 2,2 (р<0,001) и в 1,9 раза (р<0,001) соответственно, чем при действии лактозонегативных. Наибольшая задержка роста патогенной Е. coli обнаружена к действию лактозонегативной E.coli Hly+, S. enteritidis к действию E.coli Hly+ с выраженной ферментативной активностью, а S. flexneri, K. pneumoniae, типичных E.coli к действию сла-боферментирующих E.coli Hly+ - 1,5±0,5; 20,3±1,1; 5.1±0,5 мм (M±m) соответственно. Связь наличия или отсутствия лактозного признака (в нашем случае - слабовыраженная ферментативная активность) с антагонистической активностью и величиной зоны подавления роста E. coli Hly+ прослеживается по отношению к S. flexneri, K. pneumoniae, типичным E.coli. Наибольшие показатели ингибиции рос-

та лактобактерий проявляли лактонегативные E.coli Hly+: 21,4±0,7 мм, что в 1,4 раза больше, чем действие гемолитических эшерихий с выраженной и слабовыраженной ферментативной активностью (n>30, p<0,001).

Обсуждение

Наибольшую чувствительность к антагонистическому действию гемолитических E.coli проявили лактобактерии, S. aureus, патогенные и условно патогенные энтеробактерии - более 50% штаммов - продуцентов оказали ингиби-рущее действие. Менее 50% исследованных штаммов E.coli Hly+ проявили активность к синегнойной палочке и к типичным E.coli -4В,б±4.9; 37,8±1,2% соответственно. Наименьшую чувствительность проявил штамм E.coli М-17 - В,б±2,В, что в 8,9 раз меньше, чем в группе S. aureus , в б,9 раз - в группе энтеробактерий, в 5,б раз в группе P. aeruginosa и в 4,3 раза в группе типичных E.coli и в б,б раз в группе лактобактерий. Таким образом, наиболее устойчивы к антагонистическому действию гемолитических E.coli штамм E.coli М-17 и типичные E.coli.

При сравнении антагонистической активности 3-х групп E.coli Hly+ на индикаторные штаммы энтеробактерий, обнаружено, что все они проявляют наибольшую активность к K. pneumoniae. Штаммы E. coli O-151, S. enteritidis были чувствительны к действию бактерио-цинов более, чем в 50% случаев, но отмечается наибольшее действие E.coli Hly+ с низкой ферментативной активностью. Самая низкая чувствительность к факторам антагонизма прослеживается у S. flexneri: лактозонегативные гемолитические E.coli не активны по отношению к ней, E.coli Hly+с выраженной ферментативной активностью проявляют антагонизм в б,2±3,0% случаев, а со слабовыраженной ферментативной активностью - в 2б,7±б,б% (р<0,01), т. е. в 4 раза больше. При сравнении антагонистической активности 3-х групп E.coli Hly+ на представителей патогенных и типичных кишечных палочек, обнаружено, что все 3 группы проявляют высокую активность к патогенным культурам кишечных палочек. Так культура E.coli O-151 в 1,7 раз случаев больше была чувствительна к действию бактериоцинов E.coli Hly+ с выраженной ферментативной активностью (р<0,001), в 1,б раз случаев к действию E.coli Hly+ со слабовыраженной ферментативной ак-

тивностью (р<0,001) и в 2 раза к действию лактозонегативных E.coli Hly+ (р>0,01), чем типичные кишечные палочки. При изучении антагонистического действия E.coli Hly+ на представителей нормальной микрофлоры кишечника, обнаружено, что лактобактерии более чувствительны - у 57,5±1,9% штаммов лактобактерий отмечается подавление роста, тогда как типичные эшерихии подавляли свой рост в 37,В±1.2% случаев, т.е. в 1.5 раза меньше. Так же выявлено неравнозначное действие антагонистической активности 3-х групп гемолитических эшерихий представителей биоценоза кишечника. Наиболее чувствительны лактобактерии были к действию лактозонегативных -82,0±2,2% и со слабовыраженной ферментативной активность бВ,В±1,В% E.coli Hly+, что в 2,9 и 2,4 раза больше, чем действие гемолитических эшерихий с выраженной ферментативной активностью - 28,3±2,0%.(n>30,p<0,001). Типичные эшерихии были наиболее чувствительны к действию гемолитических эшерихии со слабовыраженной - 48,9±3,3% и выраженной - 39,б±3,2% ферментативной активностью. Антагонистическое действие на лактобактерии лактозонегативных E.coli Hly+ в 3,3 раза; со сниженной ферментативной активностью - в 1,4 раза достоверно больше, чем на типичные E.coli (n>30, p<0,001) и, наоборот, гемолитические эшерихии с выраженной ферментативной активностью наибольший антагонистический эффект оказывали на типичные E.coli 40,0±3,2 против 2В,3±2,0% лактобактерий, т.е. в 1,4 раза больше (n>30, p<0,001).

По зоне подавления роста энтеробактерий, E.coli М-17 так же оказались наиболее устойчивыми - 0,9±0,5 мм, а типичные кишечные палочки, наоборот, самыми чувствительными-10,8±0,5 мм. Штаммы S. aureus и энтеропато-генные бактерии одинаково подавляли рост -7,б±0,9 и 8,4±0,8 мм. По сравнению с типичной E.coli как представителя нормальной флоры кишечника человека, все индикаторные штаммы кроме E.coli М-17, проявляли более высокую чувствительность к антагонистическому действию E.coli Hly+. Так, S. aureus в 2 раза (р=0,001, n>30), энтеробактерии в 1,б раз (р<0,01, n>30), Р.aeruginosa - в 1,3 раза (р<0,001, n>30). E.coli М-17 были усточивее к антагонистическому действию гемолитической E.coli в 4,4 раза (р<0,001, n>30), чем типичные

кишечные палочки. По зоне подавления роста лактобактерии также оказались менее устойчивыми, чем типичные E.coli к действию всех трех групп гемолитических эшерихий: от 15,4±0,9 до 21,4±0,7 мм. (M+m). Наибольшее подавление роста отмечено к действию лактозонегативных гемолитических E.coli -21,4±0,7 мм., тогда как типичные эшерихии наиболее подавляли свой рост при действии E.coli Hly+ с выраженной и слабовыраженной ферментативной активностью. Так подавление роста лактобактерий было достоверно больше, чем у представителей типичных E.coli (n>30, p<0,001) при действии лактозонегативных E.coli Hly+ в 9,3 раза, слабоферментирующих E.coli Hly+ в 3,2 раза и с нормальной ферментативной активностью в 3,5 раз.

Выводы. Штаммы гемолитической E. coli обладают антагонистическим, в т. ч. бактерио-цинпродуцирующим действием со способностью ингибировать рост как близкородственных патогенных и условно патогенных энтеробактерий, в т. ч. типичную кишечную палочку, так и неродственных микроорганизмов - стафилококков, псевдомонад, лактобактерий. Антагонистическое действие бактериоцинов изучаемых штаммов низкое по отношению к БТП «Колибактерин» - E.coli М-17 и по чувствительности и по подавлению зоны роста. В отношении патогенных и условно патогенных энтеробактерий, антагонистическая активность выше к K. pneumoniae, ниже к S. flexneri. Средняя бактерицидная активность обнаружена к представителю диареегенных кишечных палочек - E.coli O-151 и к S. enteritidis и невысокая к типичным представителям E.coli. Обнаружена антагонистическая активность к неродственным микроорганизмам, особенно к лактобактериям и золотистому стафилококку. Среди представителей нормофлоры толстого кишечника, лактобактерии в несколько раз оказались наиболее чувствительными к действию гемолитических эшерихий, чем типичные E.coli и по процентному содержанию и по зоне подавления роста.

Из трех групп E.coli Hly+ наибольшую антагонистическую активность на изученные индикаторные группы, кроме лактобактерий, проявляют штаммы со слабовыраженной ферментативной активностью, наименьшую - лактозонегативные. E.coli Hly+ оказывают выражен-

ный антагонистический эффект на патогенные (кроме Б. йехпей), непатогенные представители энтеробактерий, не являющихся нормофлорой кишечника и лактобактерии. Их активность их ниже при действии на типичные эшерихии. Антагонистическая активность Е.соН Н1у+ на лактобактерии более выражена у штаммов с отсутствием или слабовыраженным лактозным признаком.

Из проделанного фрагмента работы вытекает два аспекта для последующего изучения:

1. Формирование персистенции патогенных, условно патогенных энтеробактерийбак-терий и неродственных микроорганизмов за счет устойчивости к бактериоцинам.

2. Направленный подбор при дисбактериозе биотерапевтических препаратов с более выраженными антагонистическими свойствами для воздействия на персистирущие патогенные и условно патогенные бактерии.

Таблица 1

Чувствительность индикаторных штаммов к антагонистическому действию гемолитических Е.соИ

№ п/п Группы индикаторных штаммов Число проведенных исследований Чувствительность, % М ± m Чувствительность в количественном выражении (в мм подавления роста) М ± m

1. Патогенные и условно патогенные энтеробактерии (ЭПЭП и УПЭБ) 408 216 8,4±0,8

59,9±25,0

2. E.coli М-17 105 9 0,9±0,5

8,6±2,8

3. Р. aeruginosa 105 51 3,7±0,9

48,6±4,9

4. S. aureus 105 81 7,6±0,9

77,1±4,1

5. Типичные E.coli 1680 636 10,8±0,5

37,8±1,2

6. Лактобактерии 1482 853 17,7±0,8

57,5±1,9

Таблица 2

Количественные характеристики антагонистического действия гемолитичских Е.соИ 3-х групп на бактерии семейства Еп1егоЬас1епасеае

№ п/п Штаммы индикаторных энтеробактерий E.coli с нормальной ферментативной активностью E.coli со сниженной ферментативной активностью Лактозонега- тивные E.coli

M ± m

1. E. coli O- 151 7,8±1,1 7,3±0,7 8,5±2,5

2. S. enteritidis 7,3±1,4 5,6±0,7 4,2±1,5

3. S. flexneri 0,6±0,2 1,5±0,5 0

4. K. pneumoniae 18,6±1,4 20,3±1,1 10,5±2,4

5. Типичные E. coli 4,4±0,4 5,1±0,5 2,3±0,4

6. Лактобактерии 15,4±0,9 16,3±0,5 21,4±0,7

Таблица 3

Чувствительность патогенных энтеробактерий к 3-м группам дисбактериозных гемолитических Е.соИ

№ п/п Штаммы индикаторных энтеробактерий Е.соИ с нормальной ферментативной активностью Е.соИ со сниженной ферментативной активностью Лактозонегативные E.coli

48 штаммов 45 штаммов 12 штаммов

1 E. coli O-151 33 36 6

68,8±6.7 80,0±6,0 50,0±14,4

2 S. enteritidis 27 30 6

56,2±7,2 66,7±7,0 50,0±14,4

3 S. flexneri 3 12 0

6,2±3,4 26,7±6,6

4 K. pneumoniae 45 45 9

93,8±3,4 100,0 75,0±12,5

5 Типичные E. coli 19 22 3

39,6±3,2 48,9±3,3 25,0±5,6

6 Лактобактерии 28 38 16

28,3±2,0

68,8±1,8 82,0±2,2

Таблица 4

Антагонистическая активность 3 групп гемолитических Е. соИ в отношении типичных Е.соИ и лактобактерий

№ п/п гемолитические Е. соН Число n М±m (мм) типичные E.coli Число n М±m (мм) лактобактерии

1 с нормальной ферментативной активностью 240 4,4±0,4 513 15,4+0,9

2 со сниженной ферментативной активностью 225 5,1±0,5 657 16,3+0,5

3 лактозонегативные 180 2,3±0,4 312 21,4+0,7

Примечания:

1. Блинкова Л Л. Бактериоцины: критерии, классификация, свойства, методы выявления. Журн. микробиол., 2003, № 3, с. 109-113.

2. Блинкова Л Л. Получение томицида - нового бактерийного препарата и изучение его биологической активности. Дис. д-ра биол. наук. М., 1986.

3. . ., . ., . .

Роль персистирующих условно- патогенных бактерий в патогенезе язвенной болезни желудка и 12-перстной кишки. Журн. микробиол., 2003, № 4, с. 11-17.

4. . . -

рий. М. Медицина,1999г.с.365.

5. Красноголовец ВЛ. Дисбактериоз кишечника. М. Медицина, 1989г. с.208.

6. . ., . . кишечника у детей в норме и патологии. Рос. мед. вести. - 1996. - №1. с.34-43.

7. Методические рекомендации «Бактериологическая диагностика дисбактериоза кишечника», М.: 1977. - 25с.

8. . ., . ., . ., -

фарская ЛЛ. Поиск перспективных штаммов бифидобактерий и лактобацилл для разработки новых биопрепаратов. Журн. микробиол., 2004, №2, с. 64-69.

9. . . -

зом толстой кишки. Журн. микробиол., 2001, №5, .65-68.