Научно обоснованное культивирование микроводорослей

НАУЧНО ОБОСНОВАННОЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ МИКРОВОДОРОСЛЕЙ В.А. Лукьянов, А.И. Стифеев, С.Ю. Горбунова

Аннотация. Выполнен обзор современных источников литературы по проблемам массового интенсивного культивирования микроводорослей. Проанализированы основные проблемы, сдерживающие развитие отрасли биотехнологии в стране и определены современные подходы.

Ключевые слова: микроводоросли, культивирование, инокулят, питательная среда, ассимиляция, экология.

В настоящее время проблема интенсивного культивирования микроводорослей широко изучается не только в странах бывшего СНГ, но и в США, Японии, Франции, Италии, Чехословакии, Болгарии, России и других странах [3,6,17,26,30,32]. Это обусловлено широким спектром применимости микроводорослей: использование выращенного урожая микроводорослей, использование биомассы как сырья для получения каких-либо ценных веществ, а также применение ассимиляционных свойств микроводорослей для мелиорации водной среды. Эффективность развития этих направлений определяется оптимизацией процессов управляемого культивирования клеток водорослей и, соответственно, обеспечением их потенциально высоких продукционных свойств.

В связи с этим микроводоросли являются перспективными объектами для проведения разноплановых научных исследований в области физиологии, биохимии, биофизики, генетики, космической биологии и т.д. Их используют для повышения продуктивности водоемов и плодородия почв, получения биологически активных веществ, различных пищевых и кормовых добавок, в качестве индикаторных организмов при изучении текущего состояния почв и водоемов [1,7,10,14,18,28].

К сожалению, в настоящее время в плане передовых научных разработок в области альгологии (науки о водорослях) мы отстаем от зарубежных исследователей, что объясняется недостаточной материальной базой, а также с нехваткой научно-методической литературы, отражающей современные тенденции развития альгологии. Особенно остро ощущается недостаток работ, обобщающих опыт ведущих зарубежных и отечественных исследователей в области интенсивного культивирования водорослей.

На сегодняшний день известно большое количество способов культивирования микроводорослей, но только единичные варианты из них обеспечивают низкую себестоимость получаемой продукции и высокий питательный состав [2,4,8].

Существует два основных способа культивирования клеток: накопительный и непрерывный. В случае накопительного способа выращивания в освещаемый культиватор, заполненный питательной средой, вносится небольшое количество клеток микроводорослей (инокулят). Их рост приводит со временем к увеличению концентрации клеток (плотность, млн. кл/мл) до некоторой максимальной плотности культуры, которая ограничена либо элементами питания, либо интенсивностью света, или же другими физико-химическими условиями среды. Графически такой рост изображается 8-образной кривой, форма которой зависит от условий, в которых выращиваются клетки и кинетических характеристик культуры [9,11,13,18].

Возраст культуры

Рисунок 1 - Рост микроводорослей: 1 - лаг-фаза, 2 - экспоненциальная (логарифмическая) фаза, 3 - фаза линейного роста, 4 - фаза замедления роста, 5 - стационарная фаза, 6 - фаза отмирания.

Совсем иная картина будет наблюдаться при вмешательстве экспериментатора в процессе роста в любой фазе развития периодической культуры, например при разбавлении питательной средой. График роста будет зависеть от величины этого разбавления и используемой питательной среды. При определенных условиях (неизменность биохимического состава, возрастной структуры популяции клеток, концентрации метаболитов и др.) динамика роста после разбавления будет повторять прежнюю [12,18,26,35]. Процедуру разбавления можно проводить неоднократно, в результате чего в культиваторе будет наблюдаться непрерывный рост культуры. Подбирая относительные объемы и моменты разбавления можно управлять процессами роста микроводорослей. Причем это управление может осуществляться только по плотности культуры и времени, что следует из определения основных кинетических характеристик роста (скорость роста, удельная скорость роста, удельная скорость дыхания, КПД фотобиосинтеза и др.).

Как известно основным компонентом производства микроводорослей является вода. От качественного состава воды напрямую зависит рост и продуктивность клеток той или иной микроводоросли. Самые первые исследователи использовали ключевую воду, потому что талая и водопроводная вода были сильно загрязнены металлами. Для экспериментов принято использовать дистиллированную воду, так как в ней содержится минимальное количество металлов [15]. Качество воды в большинстве случаев не удовлетворяет требованиям, предъявляемым для использования концентрированных питательных сред. Поэтому, в полупромышленных и промышленных условиях необходимо делать общий анализ качества воды, чтобы затем рассчитать поправку на питательную среду с учетом присутствующих в воде химических элементов.

Целью методов очистки является получение жизнеспособной культуры одного вида, свободной от других видов («загрязнителей» - эукариот, прокариот и вирусов). Идея чистых культур берет свое начало со времен Коха и Пастера относительно бактерий. Маточная культура микроводорослей (инокулят) должна быть альгологически чистой, что означает присутствие культуры водорослей одного вида и не имеет загрязнителей. От инокулята зависит качество произведенной продукции и его экологическая чистота [15,19,35]. Для этого применяют способы пересева и очистки микроводорослей от других видов.

Для выращивания микроводорослей могут использоваться различные типы установок из самого различных материалов: кирпича, бетона, стекла, орг.стекла, железа, дерева, пластмассы и др. Известны следующие основные типы установок: закрытая циркулирующая (полиэтиленовые трубы, замыкающиеся в кольцо); закрытая глубинная (бетонные танки, ферментаторы); глубинная открытая (аквариумы, ванны, бассейны); открытые не глубинные (латки, каскады, плоскопараллельные). Самые распространенные типы - это лоточный и плоскопараллельный, так как они обеспечивают более равномерное распределение света и обеспечивают получение высокого урожая. Лоточный способ самый экономичный, ввиду простоты его конструкции, который считается основным промышленным способом получения биомассы микроводорослей в больших объемах, однако плоскопараллельные культиваторы обеспечивают большую продуктивность и скорость роста микроводорослей [11,19,21].

Рассмотрим культивирование микроводорослей, направленное на максимальное получение продуктивности (АСВ, г/л). Одно из основных требований при таком культивировании - это освещаемый слой культиватора [19,21,22]. Оптимальный освещаемый слой, обеспечивающий наиболее высокую продуктивность микроводорослей, составляет 3 -5 см при использовании люминисцентных ламп и 10-15 см при использовании ламп ДРЛ, ДРИ, ДРВ, ЛДГ, ДНАТ и др. Особое внимание стоит уделять спектральному составу каждой из ламп. Для наиболее известных микроводорослей (Chlo-rella vulgaris, Scenedesmus bijugatus, Spirulina platensis и др.), спектр излучаемого света должен быть максимально приближен к спектру солнечного света.

Актуальной задачей остается использование естественного (в летний период) и светодиодного (в зимний период) освещения, в целях снижения себестоимости продукции.

Синтез хлорофилла

Фотосинтез

- / Фотолюрфогенез s\

" \ \ S' /1 \и \\ !

\ \ У \/  \

400 445 500 600 660 700 нм

Рисунок 2 - Оптимальный спектр поглощения для микроводорослей и растений

Одной из основных проблем, с которой сталкиваются многие производители, это подбор оптимальной питательной среды для конкретного вида микроводорослей. Многие ученые [5,6,24,28] рекомендуют использовать разбавленные питательные среды, заменяя химически чистые соли сельскохозяйственными удобрениями. Но не стоит забывать тот факт, что продуктивность микроводорослей при этом резко снижается. Если происходит лимитирование хотя бы одного из элементов питания, то согласно принципу Либиха [31], фотобиосинтез замедляет свою скорость, вплоть до полной остановки процесса культивирования. И даже если пытаться изменить или дополнить другие из усло-

вий культивирования (свет, температура), рост по-прежнему будет отсутствовать. Химические реактивы, необходимые для приготовления питательных сред, должны быть самого высокого качества. Качество определяется изготовителем, и каждая фирма использует свою собственную маркировку для его обозначения. Для определения качества реактивов можно использовать каталоги компаний и информацию, размещенную на интернет-сайтах. В последнее время установлено, что большинство солей и реагентов содержат следовые количества металлов и других загрязнителей, что может замедлять рост некоторых видов микроводорослей [16,22,24].

Таким образом, использование различных питательных сред, как показали H. A. Spоher, H. W. Milner (1956), существенно изменяет химический состав клеток. Поэтому, для получения большего количества белка, рекомендуется использовать концентрированные питательные среды (Ben-Amotz, Тамия, Артари, Заррук и др.) [17,29,34,37], к которым клетки отдельных микроводорослей необходимо адаптировать. Потенциал использования элементов минерального питания настолько высок, что их выращивание на разбавленных растворах солей не только не рентабельно, но и обезвоживает сами клетки.

Известны случаи использования микроводорослей в виде суспензии, когда клетки микроводорослей находятся совместно с рабочей питательной средой и выделяемыми в процессе фотобиосинтеза метаболитами. Насколько известно [20,35], ряды авторов отмечают отрицательное воздействие культуральной среды на организм животного, так как в процессе своей жизнедеятельности клетки могут выделять нитриты, нитраты, соли и продукты метаболизма. Результат, получаемый от такого продукта, будет ниже, нежели от отделенной от культуральной среды биомассы конкретной микроводоросли. Биомасса любого вида микровододорослей должна быть промыта водопроводной (питьевой) водой определенным объемом.

Микроводоросли требуют особого внимания при хранении, так как от него зависит питательная ценность конечного продукта. Так, например, протококковые микроводоросли Chlorella vulgaris, Scenedesmus bijugatus и др. рекомендуется хранить при t= +2...+50C, возможно также замораживание, где срок хранения значительно увеличивается. Другой вид микроводоросли - Spirulina platensis, рекомендуют свежеполученную пасту замораживать, при этом срок хранения составляет 12-18 месяцев. Несоблюдение таких температурных диапазонов в различной степени снижает качество продукции.

Таким образом, приведенный краткий анализ состояния вопроса культивирования различных видов микроводорослей различных систематических групп и эффективности их использования в промышленной биотехнологии, подтверждает научную необходимость и обоснованность его дальнейшего изучения. При этом, необходимо придерживаться всех аспектов культивирования, которые апробированы в лабораторных и промышленных условиях.

Кроме того, следует отметить быстрый темп роста ежегодного спроса на продукцию альгобиотехнологии, в частности производства микроводорослей для медицины, пищевой промышленности, сельского хозяйства, где актуальной проблемой остается научная обоснованность их интенсивного культивирования.

Список использованных источников

1 Водоросли: Справочник / С.П.Вассер, Н.В. Кондратьева, Н.П.Масюк и др. - Киев: Наук.думка, 1989. - 608 с.

2 Геворгиз Р.Г., Шахматов А.П. Установка для культивирования морских микроводорослей // Экология моря. -2005. - № 67. - С. 44 - 47.

3 Горбунова С.Ю., Жондарева Я.Д. Об эффективности использования микроводорослей в промышленной биотехнологии с целью мелиорации водной среды и получения кормов для различных отраслей сельского хозяйства // Современные рыбохозяйственные и экологические проблемы АзовоЧерноморского региона. - Керчь: ЮгНИРО, 2012. - Т. 2. -114-119 с.

4 Гуревич Ю.Л. Устойчивость и регуляция размножения в микробных популяциях. - Новосибирск, 1984. - 161 с.

5 Дробецкая И.В., Минюк Г.С. Использование мочевины при выращивании цианобактерии Spimlma (Arthrospira) platensis методом непропорционально проточной культуры // Экология моря. - Севастополь: Изд-во ИнБЮМ, 2004. - №. 65. - С. 28-34.

6 Зарипов Э. Физиологические особенности и культивирование сине-зелёной водоросли Spirulina platensis Geitl. в связи с возможностью её практического использования а Узбекистане: Автореф. дис. канд. биол. наук. - Л., 1982. - 16 с.

7 Каталог культур микроводорослей в коллекциях СССР / отв. ред. В. Е.Семененко. - М.: ИФР, 1991. - 231 с.

8 Кокова В.Е., Лисовский Г.М Непропорциональнопроточная культура простейших. - Новосибирск: Наука, 1976.

- 76 с.

9 Курс низших растений. - М.: Высшая школа, 1981. -520 с.

10 Ладыгина Л. В. Микроводоросли как кормовые объекты личинок мидий и устриц: автореф. дис. на соиск. ст. канд. биол. наук. - Севастополь, 2007. - 25 с.

11 Лелеков А.С., Тренкеншу Р.П. Простейшие модели роста микроводорослей. 4. Экспоненциальная и линейная фазы роста // Экология моря. - 2007. - № 74. - С. 47 - 49.

12 Масюк Н. П. Морфология, систематика, экология, географическое распространение рода DunalieUa Teod. - К: Наук. думка, 1973. - 487 с.

13 Мурадян Е. А. Влияние экстремально высокой концентрации СО2 на функциональное состояние фотосинтетиче-ского аппарата и обмен липидов Бипа1іе11а 8а1іпа : автореф. дис. на соиск. ст. канд. биол. наук. - М., 2003. - 26 с.

14 Одноклеточные водоросли как возобновляемый биологический ресурс: обзор / Г. С. Минюк, И. В. Дробецкая, И. Н. Чубчикова, Н.В. Терентьева // МЭЖ. - 2008. - № 2. - С. 5 -23.

15 Перт С. Д. Основы культивирования микроорганизмов. - М.: Мир, 1978. - 331 с.

16 Ризниченко Г. Ю. Лекции по математическим моделям в биологии. - М.: Изд-во РХД, 2002. - 236 с.

17 Саут Р., А. Уиттик. Основы альгологии: пер. с англ. К.Л. Тарасов. - М.: Мир, 1990. - 597 с.

18 Тренкеншу Р.П., Гейнрих И.А. Морские микроводоросли - источник резиноидов // Экология моря. - 2000. - №. 50. - С. 75 - 77.

19 Тренкеншу Р.П. Одноклеточные водоросли: массовое культивирование и практическое использование // Прикладная альгология. - 1999. - Т. 1. - С. 7 - 10.

20 Тренкеншу Р. П. Простейшие модели роста микроводорослей. 1. Периодическая культура // Экология моря. -2005. - № 67. - С. 89 - 97.

21 Тренкеншу Р.П., Лелеков А.С. Простейшие модели роста микроводорослей. Потребность микроводорослей в

элементах минерального питания // Экология моря. - 2005. -№ 70. - С. 53 - 61.

22 Тренкеншу Р.П. Ростовые и фотоэнергетические характеристики морских микроводорослей в плотной культуре: автор. дисс. канд. биол. наук. - Красноярск, 1984. - 37 с.

23 Уильямсон М. Анализ биологических популяций. -М.: Мир, 1975. - 271 с.

24 An investigation of effect of replacing nitrate by urea in the growth and production of chlorophyll by Spirulina platensis / E.G. Danesi, C.M. Rangel-Yagui, C.M. Carvalho, S. Sato // Biomass & Bioenergy. - 2002. - Vol. 23, № 4. - p. 261-269.

25 Blackman F. F. Optima and limiting factors / F.F. Blackman // Ann. Bot. Lond.1905. - Vol. 19. - P. 281 - 295.

26 Borowitzka M.A., Borowitzka L. J. Vitamins and fine chemicals from micro-algae // Micro-algal biotechnology, - 1988.

- Р. 153-196.

27 Cojocari A. Particularita^ile fiziologo-biochimice si biotehnologice ale tulpinii Nostoc linckia (Roth) Born et Flah CNM-CB-03 - sursa de substance bioactive: Autoreferat al tezei de doctor in biologie. - Chisinau, 2006. - 26 p.

28 Dobrojan S. Modificarile morfofiziologice §i biochimice ale algei Spirulina platensis (Nordst.) Geitl. cultivate pe ape reziduale §i utilizarea ei: Autoreferatul tezei de doctor in biologie: 03.00.05 / S. Dobrojan: Academia de §tiin^e a Moldovei Gradina Botanica (INSTITUT). - Chisinau, 2011. - 29 p.

29 Fabregas J. Reneval rate of semicontinuous culture of the microalga Porphyridium cruentum modifies phycoerythrin, exopolysaccharoide and fatty acid productivity / J. Fabregas, D. Garcia, E. Morales // J. Ferment. Bioengin. - 1998. - Vol. 86, №. 5. - P. 463 - 467.

30 Muller-Feuga A. The role of microalgae in aquaculture: situation and trends // J. Appl. Phycol. - 2000. - 12. - P. 527-534.

31 Liebig J. Chemistry in its Application to Agriculture and Physiology / J. Liebig.Lond., 1847. - 320 p.

32 Monod J. The growth of bacterial cultures / J. Monod // Ann. Rev. Microbiol. -1949. Vol. 3. - P. 371 - 394.

33 Novick A. Description of the chemostat / A. Novick, L. Szilard // Scien. - 1950.Vol. 112. - P. 715 - 718.

34 Shaish A., Avron M., Ben-Amotz A. Effect of ingibitors on the formation of stereoisomers in the biosynthesis of P-carotene in Dunaliella bardawil // Plant.Cell. Physiol. - 1990. - 31, No. 5. -P. 689 - 696.

35 Ukeles R. Cultivation of plants / R. Ukeles // Marine Ecology. - 1976. - Vol. 3.P. 367 - 420.

36 Vonshak A. Laboratory techniques for the cultivation of microalgae / A. Vonshak. Handbook of micro-algal mass culture, 1986. - P. 117 - 145.

37 Zarrouk C. Contribution a l’etude d’une cyanophycee. Influence de divers facteurs physiques et chimiques sur la crossance et la photosynthese de Spirulina maxima / C. Zarrouk // Ph.D. thesis. - Paris, 1966. - 138p.

Информация об авторах

Лукьянов Вячеслав Анатольевич, аспирант ФГБОУ ВПО «Курская ГСХА», e-mail: lukyanov27@mail.ru

Стифеев Анатолий Иванович, доктор сельскохозяйственных наук, профессор, заведующий кафедрой экологии и охраны природы ФГБОУ ВПО «Курская ГСХА», тел. 8-910-276-29-77.

Горбунова Светлана Юрьевна, кандидат биологических наук, младший научный сотрудник Института биологии южных морей, Национальная Академия Наук Украины.