СПОСОБ УКОРЕНЕНИЯ ВИНОГРАДА EX VITRO
GRAPES ROOTING METHOD EX VITRO

Изобретение относится к области биотехнологии растений, представляет собой способ повышения эффективности укоренения микропобегов винограда в условиях ех vitro и может быть применено для получения посадочного материала винограда, в том числе и безвирусного.
Виноград является одной из наиболее ценных сельскохозяйственных культур в мире. Ягоды винограда наряду с высокими вкусовыми достоинствами имеют большое питательное и лечебное значение. Они содержат от 16 до 35% сахара, главным образом глюкозы и фруктозы, а также от 0,5 до 1,4% различных органических кислот, витамины, макро- и микроэлементы, красящие и ароматические вещества, и др. Ягоды винограда используются как в свежем виде, так и на переработку - в основном для получения различных вин. В последние годы в России резко возрос интерес к виноделию, что требует закладки новых виноградников и соответственно, выращивания посадочного материала. Виноград размножают вегетативно и одним из наиболее перспективных методов является клональное микроразмножение, которое позволяет в короткие сроки получить большое количество однородного посадочного материала. Кроме того, только с помощью клонального микроразмножения возможно получить растения винограда, свободные от вирусов.
Известен способ клонального микроразмножения винограда (Mhatre М., Salunkhe С.K., Rao P.S. Micropropagation of Vitis vinifera L.: Towards an improved protocol. Scientia Horticulturae, 2000, 84:357-363). Недостатком такого способа является высокая себестоимость посадочного материала, что связано с высокой трудоемкостью этого процесса и гибелью растений при их переносе из условий in vitro в нестерильные условия (ex vitro). Для снижения себестоимости клонального микроразмножения используют прием укоренения ex vitro, при котором одновременно проходят процессы укоренения и акклиматизации к нестерильным условиям.
Наиболее близким аналогом является способ укоренения ex vitro, в котором микропобеги после мультипликации in vitro обрабатывают регуляторами роста, после чего высаживают в нестерильные условия (Ranaweera K.K., Gunasekara М.Т.K., Eeswara J.P. Ex vitro rooting: A low cost micropropagation technique for tea (Camellia sinensis (L.) O. Kuntz hybrids. Scientia Horticulturae, 2013, 155, 8-14). Однако этот способ оказался непригодным для винограда из-за особенностей его морфологии: виноград является быстрорастущей лианой и в культуре in vitro формирует длинные, тонкие и «нежные» побеги и при попытке использовать такие побеги для укоренения ex vitro они быстро погибают, не успевая образовать корни.
Целью предлагаемого изобретения является укоренение винограда ex vitro. Поставленная цель достигается благодаря решению следующих задач: 1) изменению состояния микропобегов винограда на стадии укоренения ex vitro с помощью изменения состава питательной среды для укоренения in vitro; 2) использованию для укоренения верхушек микропобегов определенного размера, находящихся на стадии адаптации строго определенное время; 3) использованию для укоренения ex vitro субстрата строго определенного состава; 4) добавления в субстрат биопрепарата для предотвращения развития грибных заболеваний и гибели микропобегов; 5) использованию на стадии укоренения ex vitro освещения определенной интенсивности.
Вышеперечисленные задачи решаются следующим образом: 1) добавление в питательную среду активированного угля в концентрации 100 мг/л приводит к укорачиванию, утолщению и «огрублению» микропобегов винограда, что улучшает их адаптацию к нестерильным условиям; 2) нахождение на стадии адаптации в течение 2-3 недель является оптимальным для получения материала для укоренения ex vitro: ранее этого срока растения недостаточно адаптированы к нестерильным условиям, что приводит к их гибели, тогда как позднее этого срока снижается их ювенильность, что приводит к ухудшению укоренения; 3) использование в качестве субстрата смесь торфа и перлита в соотношении 3:1 и определенной фракции (торф 0-5 мм, перлит 1-5 мм) обеспечивает оптимальный влажностный режим и контакт с растениями; 4) добавление в субстрат порошка глиокладина в соотношении 50 мг / 1 л субстрата подавляет развитие грибных заболеваний, что повышает выживание микропобегов винограда, причем добавление глиокладина должно проводиться не менее, чем за 5 дней до посадки растений; 5) использование на стадии укоренения ex vitro освещенности 5-10 тыс.люкс как оптимального для растений винограда и температуры 20-25°С как оптимального для растений винограда и жизнедеятельности биопрепарата глиокладина.
Предлагаемый способ реализуется следующим образом.
Побеги винограда с стадии мультипликации высаживают на среду для укоренения, содержащую 100 мг/л активированного угля и через 4 недели укорененные побеги высаживают на адаптацию в нестерильные условия. С растений, находящихся на стадии адаптации от 2 до 3 недель, срезают верхушки побегов длиной не менее 30 мм, которые высаживают на укоренение ex vitro в субстрат следующего состава: торф фракции 0-5 мм и перлит фракции 1-5 мм в соотношении 3:1, к которому добавлен порошок глиокладина в соотношении 50 мг/1 л субстрата, причем глиокладин следует добавляет не менее, чем за 5 дней до посадки растений. Культивирование растений осуществляют при температуре 20-25°С, влажности 90-100% и освещенности 5-10 тыс.люкс при длительности светового дня 16 ч. Сравнение предлагаемого способа с укоренением ex vitro микропобегов винограда со стадии мультипликации приведено в таблице 1.
Примеры в детальном описании приводятся для винограда сорта Московский Белый.
Пример 1. Сравнение состава питательных сред на стадии укоренения винограда in vitro.
Побеги винограда со стадии мультипликации высаживают на среду для укоренения, содержащую минеральные соли MS (Murashige Т., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Plant Physiology, 1962, 15, 473-497) в половинной концентрации, 0.1 мг/л ИУК, 0.1 мг/л ИМК, 30 г/л сахарозы, 7 г/л агара, с добавлением активированного угля в 4-х вариантах: 0, 50, 100 и 200 мг/л. Через 4 недели укорененные побеги высаживают на адаптацию и записывают количество выживших растений через 6 недель (таблица 2).
Пример 2. Сравнение длительности нахождения на стадии адаптации микрорастений винограда - источника растительного материала для укоренения ex vitro.
Укорененные растения винограда высаживают на адаптацию в теплицу и через 1, 2, 3 или 4 недели с них срезают верхушки побегов для посадки на укоренение ex vitro. Количество выживших растений записывают через 6 недель после посадки на укоренение (таблица 3).
Пример 3. Сравнение состава субстрата.
Верхушки побегов винограда высаживают в субстраты, состоящие из торфа и перлита в соотношении 2:1, 3:1 и 4:1 и количество выживших растений записывают через 6 недель после посадки на укоренение (таблица 4).
Пример 4. Сравнение фракций комплектующих субстрата.
Верхушки побегов винограда высаживают в субстрат, состоящие из торфа (фракции 0-5 или 0-25 мм) и перлита (фракции 1-5 или 0.16-1.25 мм) в соотношении 3:1 (всего 4 варианта). Количество выживших растений записывают через 6 недель после посадки на укоренение (таблица 5).
Пример 5. Влияние размера верхушек на укоренение винограда ex vitro.
Верхушки побегов винограда размером 20-30 и более 30 мм высаживают в субстрат и количество выживших растений записывают через 6 недель после посадки на укоренение (таблица 6).
Пример 6. Влияние глиокладина на укоренение винограда ex vitro.
Верхушки побегов винограда высаживают в субстрат с добавлением порошка глиокладина в соотношении 0, 25, 50 или 100 мг/1 л субстрата. Количество выживших растений записывают через 6 недель после посадки на укоренение (таблица 7). В соответствии с инструкциями производителя глиокладин следует добавлять в субстрат не менее, чем за 5 дней до посадки микрорастений.
Пример 7. Влияние интенсивности освещения на укоренение винограда ex vitro.
Верхушки побегов винограда высаживают в субстрат и помещают в условия освещенности с интенсивностью 3-5, 5-10 или 10-20 тыс.люкс с продолжительностью светового дня 16 ч и температурой 20-25°С. Количество выживших растений записывают через 6 недель после посадки на укоренение (таблица 8).
Техническим результатом предлагаемого способа является достижение высокой эффективности получения посадочного материала винограда (до 80%) при использовании неукоренных микропобегов. Изобретение может быть использовано для быстрого получения качественного и здорового посадочного материала винограда со сниженной себестоимостью.