СПОСОБ СОЗДАНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ МОДЕЛИ АДЕНОМИОЗА НА КРЫСАХ ЛИНИИ WISTAR
METHOD FOR CREATING AN EXPERIMENTAL MODEL OF ADENOMIOSIS IN WISTAR RATS

Изобретение относится к области медицины, а именно к гинекологии, и может быть использовано для создания экспериментальной модели аденомиоза на крысах линии Wistar.
Известен способ создания экспериментальной модели аденомиоза, в котором новорожденным самкам мышей линии CD 1 в возрасте от 1 до 5 дней вводили перорально тамоксифен (1 мг /кг) (n=27) или эстрадиол (0,1 мг/кг) (n=24). Матки мышей были получены на 2, 5, 10, 15 и 42 дни после рождения. Далее исследовали срезы гистологическим и иммуногистохимическим методами: после воздействия тамоксифена во всех матках отмечались признаки аденомиоза уже на 10-й день - внутренний миометрий был с истончением, отсутствием непрерывности и дезорганизацией. В группе животных, получавших эстрадиол, аденомиоз не наблюдался - все слои матки были развиты нормально, но гипертрофированы, а внутренний миометрий сохранил круговое строение [Mehasseb М.K., Bell S.C., Habiba M.A. The effects of tamoxifen and estradiol on myometrial differentiation and organization during early uterine development in the CD1 mouse // Reproduction (Cambridge, England). 2009. Vol.138. №2. P. 341-350].
Известно исследование Parrott E. и соавт., в котором мышам вводили эстрадиол, тамоксифен, цитрат торемифена или гидрохлорид ралоксифенасо 2 по 5 день после рождения и исследовали гистологические срезы матки на 6, 42 и 90 день. Данные исследования показали, что краткосрочное введение новорожденным мышам тамоксифена и торемифена приводит к созданию модели аденомиоза у значительной части животных к 3-месячному возрасту (на 90 день). Авторы отметили, что уже через 6 дней от рождения матки мышей, получавших тамоксифен и торемифен, но не ралоксифен и эстрадиол, были лишены нормальной дифференцировки слоев гладкой мускулатуры [Parrott Е., Butterworth М., Green A., White I. N., Greaves P. Adenomyosis-a result of disordered stromal differentiation // The American journal of pathology. 2001. Vol. 159. №2. P. 623-630].
Известно исследование Green A.R. и соавт., в котором для создания модели аденомиоза перорально вводили мышам со 2 по 5 день после рождения тамоксифен и ралоксифен, а затем исследовали экспрессию фактора роста нервов (NGF) и родственных ему рецепторов в клетках матки 6-дневных животных. Известно, что во время терминальной миогенной дифференцировки происходит подавление NGF. Результаты исследования продемонстрировали повышение экспрессии фактора роста нервов в 18 раз в просветном эпителии и 25-кратное его повышение во всей матке после введения тамоксифена, что не наблюдалось при введении ралоксифена. Исследование показывает, что за счет подавления NGF регулируется дифференцировка мезенхимальных клеток в миоциты и что раннее нарушение этого процесса играет ключевую роль в развитии аденомиоза [Green A.R., Edwards R.E., Greaves P., White I.N.H. Comparison of the effect of oestradiol, tamoxifen and raloxifene on nerve growth factor-alpha expression in specific neonatal mouse uterine cell types using laser capture microdissection // Journal of molecular endocrinology. 2003. Vol. 30. №LP. 1-12].
Недостатком описанных способов является сложность выполнения эксперимента на новорожденных мышах, отсутствие сведений о точных и экономичных схемах создания экспериментальной модели, характеризующейся высокой воспроизводимостью, об оптимальных сроках выведения животных из эксперимента, связанных с экономическими затратами.
Российских исследований по созданию экспериментальной модели аденомиоза в литературных источниках не обнаружено.
Техническим результатом изобретения является создание высоковоспроизводимой экспериментальной модели аденомиоза на крысах линии Wistar впервые, повышение воспроизводимости способа, более простое и удобное его исполнение по сравнению с мышами, сокращение материальных затрат на проведение эксперимента и длительное содержание животных, разработка точной схемы введения тамоксифена для индукции аденомиоза и определение оптимальных сроков выведения крыс из эксперимента.
Указанный технический результат достигается в способе создания экспериментальной модели аденомиоза на крысах линии Wistar, характеризующемся тем, что новорожденным самкам вводят блокатор рецепторов эстрогенов тамоксифен в дозе 1 мг препарата / 1 кг веса животного перорально однократно со 2 по 5 день неонатального периода и выводят из эксперимента на 30 день после рождения.
Для проведения эксперимента были использованы новорожденные самки крыс линии Wistar. Исследований по созданию экспериментальной модели аденомиозана крысах линии Wistar в литературных источниках не обнаружено.
Для получения аденомиоза крысам вводили блокатор рецепторов эстрогенов (тамоксифен 20 мг) из расчета 1 мг препарата /1 кг веса животного 1 раз в день. По причине лучшей переносимости использовали пероральное, а не подкожное введение препарата [Mehasseb М.K., Bell S.C., Habiba М.А. The effects of tamoxifen and estradiol on myometrial differentiation and organization during early uterine development in the CD1 mouse // Reproduction (Cambridge, England). 2009. Vol. 138. №2. P. 341-350].
Новорожденные крысы были разделены на 4 основные группы для определения наиболее оптимальной схемы введения тамоксифена:
1-я основная группа (n=6) получала препарат со 2 по 5 день постэмбрионального развития (Р2-Р5) один раз в день.
Во 2 основной группе крыс (n=8) препарат применялся с 3 по 8 день жизни (Р3-Р8) один раз в день.
3 основная группа животных (n=7) получала курс тамоксифена дважды: с 3 по 8 день (Р3-Р8) и с 25 по 29 день жизни (Р25-Р29).
4 группа - контрольная, состояла из 5 крыс, которые получали воду без препарата.
Выведение животных из эксперимента проводилось на Р16, Р30 или Р90. Для микроскопического исследования материал (влагалище, матка и яичники) фиксировали в 10% формалине, осуществляли проводку биологического материала и окрашивали гематоксилином и эозином.
По результатам гистологического исследования, в 1 группе аденомиоз наблюдался у всех крыс (n=6): у двух крыс на Р16, у четырех - на Р30. Во 2 группеаденомиоз также был диагностирован у всех животных (n=8): у 6 животных на Р30 и у двух крыс на Р90. В 3 группе аденомиоз был подтвержден у 6 из 7 животных (85,7%), при этом 4 крысы были выведены из эксперимента на Р30 и 3 - на Р90. Аденомиоз не был выявлен у одной крысы, выведенной из эксперимента на Р30, что возможно, связано с техническими трудностями, возникшими при проведении эксперимента.
Таким образом, у 95,2% (20 из 21) крыс из основных групп был гистологически верифицирован аденомиоз, что не отличается от ожидаемого результата, который составляет 100% (р>0,05). В контрольной группе животных (n=5), которых вывели из эксперимента через 90 дней, аденомиоз не наблюдался. Таким образом, на Р90 у животных, принимавших тамоксифен (n=5), аденомиоз развивался, в отличие от контроля, в 100% случаев (р=0,0079). У крыс, вошедших в основную группу, аденомиоз гистологически характеризовался наличием желез эндометрия в миометрий, в отдельных случаях с небольшим количеством стромы эндометрия. Другой особенностью было нарушение концентрических и продольных полос гладких мышц миометрия: вместо регулярных концентрических слоев гладкомышечных клеток у крыс основной группы были обнаружены переплетенные утолщенные полосы гладкомышечных клеток, перемежающиеся со слоями коллагена. Во многих из этих измененных зон наблюдалось наличие полиморфно-ядерных лейкоцитов и эозинофилов, которые отсутствовали у животных контрольной группы.
В связи с тем, что в основной группе на Р30 процент животных с развившимся аленомиозом (92,85%) статистически значимо не отличался от процента животных с аденомиозом, выведенных из эксперимента на Р90 (100%), целесообразно проводить исследование с выводом животных из эксперимента на Р30 (р>0,05). Несмотря на то, что статистически значимых отличий в проценте животных с развившимся аденомиозом на Р16 и Р30 выявлено не было (р>0,05), небольшая выборка исследований, проведенных на Р16 не позволяет рекомендовать выведение животных из эксперимента на этот день.
Способ иллюстрируется фиг. 1-4, где:
на фиг. 1 - макропрепарат матки с влагалищем и яичниками крысы контрольной группы, выведенной из эксперимента на 90 день. Вес препарата 3 г;
на фиг. 2 - макропрепарат матки с влагалищем и яичниками крысы основной группы, получавшей тамоксифен со 2 по 5 день, выведенной из эксперимента на 90 день. Матка увеличена, стенки синюшного цвета. Вес препарата 4,5 г;
на фиг. 3 - гистологический препарат матки крысы контрольной группы (х200), выведенной из эксперимента на 30 сутки, окраска гематоксилином и эозином. Регулярные концентрические слои гладкомышечных клеток, отсутствие желез и стромы эндометрия в миометрий;
на фиг. 4 - гистологический препарат матки крысы основной 1-ой группы (х200), выведенной из эксперимента на 30 сутки, окраска гематоксилином и эозином. В миометрий визуализируются железы эндометрия, миометрий представлен переплетенными утолщенными полосами гладкомышечных клеток, перемежающимися со слоями коллагена.
Заявляемый способ обеспечивает создание высоковоспроизводимой модели аденомиоза на крысах линии Wistar, более простой и удобной по сравнению с мышами; требует меньших материальных затрат благодаря возможности выведения животных из эксперимента на 30 день постэмбрионального развития, когда выраженность заболевания достаточна и подтверждается при морфологическом исследовании, а также позволяет экономить время и средства благодаря однократному введению тамоксифена по сравнению с нецелесообразным двукратным.