Изучение жизнеспособности кератиноцитов линии HaCaT на композитных пленках из фиброина и желатина

поверхности адипоцитов оказалось меньше активных центров способных к взаимодействию с молекулами галактозы, что не позволило ей хорошо закрепиться на мембране клеток, либо они полностью отсутствуют, но опять же, это лишь предположение, для подтверждения или опровержения данного утверждения необходимо провести ряд молекулярных исследований. Другое предположение, что D-галактоза не имеет активных концов, которые бы могли как-то закрепиться на мембране адипоцита. Так как после инкубации в среде D-галактозы образец промывается раствором PBS, то вполне возможет ее смыв с поверхности клеток. В итоге имеем точно такой же образец как в случае простого нагрева. Это лишний раз подтверждает достоверность полученных результатов.

Заключение. Таким образом, лектин, фукоза и лектин, заблокированный L-фукозой или D-галактозой, оказывает активирующее действие на скорость гибели адипоцитов патогенной жировой ткани. Следовательно, данные концентрации растворов могут использоваться для ингибирования роста адипоцитов и регулирования числа жировых клеток в целом. Однако для окончательного вердикта необходимо провести эксперименты in vivo, которые снимут ряд возможных возражений в отношении количества подкожных инъекций, их интенсивность, продолжительность, а также общего самочувствия пациентов, имеющих патогенные физиологические процессы, такие например, как метаболический синдром или сахарный диабет.

Литература

1. Григорьев К. И., Князев Ю. А. Ожирение - теория и практика. Тактика медицинского работника // Медицинская сестра, 2006. № 8. С. 2-7.

2. Инюшкина Е. М. Лептин - анорексигенный регуляторный полипептид с респираторной активностью // Вестник СамГУ - Естественнонаучная серия, 2006. № 2 (42). С. 168-177.

3. Кучер А. Г., Смирнов А. В., Каюков И. Г., Добронравов В. А., Яковенко А. А. Лептин - новый гормон жировой ткани: значение в развитии ожирения, патологии сердечнососудистой системы и почек // Нефрология, 2005. Т. 9. № 1. С. 9-19.

4. Фильченков А. А., Залесский В. Н. Лептин, адипоциты и ожирение организма // Российский биотерапевтический журнал, 2007. Т. 6. № 3. С. 30-37.

5. Sarmiento U., Benson B., Kaufman S. et al. Morphologic and molecular changes induced by recombinant human leptin in the white and brown adipose tissues of C57BL/6 mice // Lab. Invest, 1997. Vol. 77. P. 243-256.

6. Черкасова О. А. Воздействие биологически активных веществ и повышенной температуры на здоровые адипоциты // Путь науки, 2016. № 2 (24). С. 29-32.

7. Черкасова О. А., Пономарева Е. Г., Симоненко Г. В., Тучин В. В., Никитина В. Е. Воздействие бактериального лектина и повышенной температуры на адипоциты // Известия Самарского научного центра Российской академии наук, 2012 Т. 14. № 1. С. 283-287.

8. Черкасова О. А., Тучин В. В., Пономарёва Е. Г., Никитина В. Е. Влияние бактериального лектина и роль его углеводсвязывающего центра при воздействии на адипоциты при повышенной температуре // Биофизика, 2007. Т. 52. Вып. 4. С. 687-692.

9. Cherkasova O. A., Simonenko G. V., Tuchin V. V. Study of a fatty tissue at temperature action // Problems of Optical Physics, 2003. P. 32-38.

Изучение жизнеспособности кератиноцитов линии HaCaT на композитных пленках из фиброина и желатина Орлова А. А.

Орлова Алина Александровна / Orlova Alina Aleksandrovna — аспирант, кафедра биоинженерии, биологический факультет, Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова, г. Москва

Аннотация: были изготовлены композитные пленки из фиброина шелка и желатина. Было продемонстрировано, что при культивировании на композитных пленках кератиноциты HaCaT сохраняют высокую жизнеспособность. Полученные пленки могут быть использованы при создании биоискуственных аналогов кожи.

Ключевые слова: фиброин, желатин, жизнеспособность, композитные пленки.

Введение

Обширные повреждения кожного покрова, как правило, вызываемые ожогами, могут привести к развитию инфекции и стать причиной летального исхода. Основным методом лечения таких повреждений является аутологичная трансплантация кожи, однако часто количество кожи, которое можно использовать для трансплантации, ограничено. В связи с этим активно разрабатываются методы получения искусственных эквивалентов кожи [1].

Аналог кожи может быть сформирован путем культивирования клеток кожи, фибробластов и кератиноцитов, на искусственном каркасе - матриксе, в качестве которого может выступать двумерная полимерная пленка [2].

Важную роль при создании таких конструкций играет выбор материала. Для этой цели может быть использован фиброин - основной структурный компонент шелка тутового шелкопряда Bombyx mori. Фиброин нетоксичен, он обладает высокой механической прочностью, биосовместимостью и способностью к биодеградации [3].

Для улучшения взаимодействия с клетками изделия из фиброина могут быть модифицированы другими полимерами, например, компонентами внеклеточного матрикса или их производными. На трехмерных пористых матриксах было показано, что использование при их приготовлении материала из фиброина и желатина приводит к увеличению эффективности адгезии клеток к их поверхности по сравнению с фиброиновыми матриксами [4].

В данной работе была изучена жизнеспособность кератиноцитов линии HaCaT в ходе культивирования на композитных пленках из фиброина и желатина.

Очистка шелка от минорных компонентов

Очистку шелка проводили следующим образом: шелк из коконов тутового шелкопряда кипятили в

0.02 M №НС03 в течение 40 минут, затем промывали дистиллированной водой. Шелк высушивали при комнатной температуре в течение суток.

Изготовление пленок

Для изготовления пленок использовали метод кастинга. Фиброин растворяли в 9,3 M водном растворе LiBr, далее диализовали в течение трех часов против дистиллированной воды, меняя воду во внешнем резервуаре каждые 30 минут. Далее раствор центрифугировали при 10000 g и определяли концентрацию фиброина. Раствор доводили до концентрации 70 мг/мл дистиллированной водой. Далее вносили в раствор желатина навеску желатина для достижения концентрации 30 мг/мл. Полученный водный раствор, содержащий 70 % фиброина и 30 % желатина, наносили на тефлон. Пленки высушивали в течение суток, затем обрабатывали спиртом для перехода фиброина в нерастворимую форму.

Сканирующая электронная микроскопия

Для изучения структуры поверхности пленок применяли метод СЭM. Подготовку образцов осуществляли следующим образом: препараты обезвоживали 96 % спиртом и ацетоном, после чего высушивали их методом перехода критической точки на приборе HCP-2 criticalpointdryer (HitachiLtd., Япония). Препараты покрывали слоем золота толщиной 20 нм в атмосфере аргона при ионном токе 6 мА и давлении 0,1 мм рт. ст. с использованием прибора IonCoaterIB-3 (EikoEngineering, Mnro, Япония). Исследования проводили на электронном микроскопе Camscan S2 (CambridgeInstruments, Кембридж, Великобритания) в режиме SEI. Разрешение микроскопа 10 нм, рабочее напряжение 20 кВ. Изображения были получены с использованием программного обеспечения MicroCapture (SMA, РФ).

Изучение жизнеспособности кератиноцитов линии HaCaT на композитных пленках

Пленки стерилизовали 70 % спиртом в течение 40 минут, затем дважды отмывали от спирта, инкубируя пленки в среде ,3MEM по 30 минут. После этого переносили пленки в лунки 24-луночного планшета. На пленки наносили по 1 мл ^MEM, содержащему 8 тысяч клеток HaCaT. Добавляли в лунки 10 % фетальной бычьей сыворотки. Образцы инкубировали при 37°С в присутствии 5 % CO2. На

1, 3 и 7 день культивирования исследовали жизнеспособность клеток на поверхности пленок.

Для определения жизнеспособности клеток использовали методику двойного окрашивания на живые и мертвые клетки флуоресцеин диацетатом (ФДА) и пропидием иодидом (ПИ). Образцы пленок помещали в чашки со стеклянным дном в буферный раствор HEPES, нагретый до 37°С. Вносили по 1 мкл стоковых растворов ФДА и ПИ на 1 мл буферного раствора. Образцы изучали на конфокальном микроскопе микроскопе Eclipse Ti-E с конфокальным модулем А1 (Nikon Corporation, Япония). Для изучения образцов использовали объектив Plan Fluor 10x/0.3. Настройки лазеров и анализирующих фильтров производили согласно рекомендациям производителей. Подсчет количества клеток производили в программе Nis- Elements v.4.13.

Результаты и обсуждения

Одно из направлений современной экспериментальной биологии - это создание биоискусственных аналогов тканей и органов для восстановления поврежденных. Такие конструкции включают в себя клеточные компоненты и матриксы - носители из биосовместимых материалов. Такие материалы не

должны оказывать токсического эффекта или вызывать воспаление. Также они должны поддерживать адгезию и пролиферацию клеток и подвергаться биодеградации по мере восстановления ткани [5].

Этим требованиям удовлетворяет фиброин шелка тутового шелкопряда. Механические свойства фиброина позволяют производить из него одновременно гибкие и прочные конструкции [6].

Желатин, продукт денатурации коллагена, также является биосовместимым материалом. В структуре желатина содержится сигнальная последовательность RGD (аргинин-глицин-аспарагиновая кислота), которая способствует адгезии клеток и стимулирует их пролиферацию. Однако желатин является хрупким материалом и характеризуется неконтролируемой скоростью биодеградации, поэтому наиболее эффективно создание композитных материалов из желатина и более прочных полимеров, в частности фиброина [7].

В ходе работы были получены композитные пленки из фиброина, содержащие 30 % желатина Поверхность пленок имеет слабовыраженный микрорельеф (рис. 1).

I

3 мкм

Рис. 1. Поверхность пленки. Изображение получено методом СЭМ

Была изучена жизнеспособность кератиноцитов линии HaCaT при культивировании клеток на пленках из фиброина и желатина (рис. 3). Для этого было использован метод двойного окрашивания ФДА и ПИ, основанный на определении целостности мембран. Проникая в клетку, ФДА гидролизуется до флуоресцеина, который, являясь полярным соединением, плохо проходит через мембраны и, как следствие, накапливается в цитоплазме живых клеток. В то же время ПИ способен окрашивать ядра только мертвых клеток, имеющих поврежденные мембраны [8].

На рисунке 2 приведены изображения клеток на пленках.

Рис. 2. Кератиноциты линии HaCaT на пленках из фиброина и желатина на А, Б — первый день культивирования, В, Г — третий день культивирования, Д, Е — седьмой день культивирования.

Слева — живые клетки, окрашенные ФДА, справа — ядра мертвых клеток, окрашенные ПИ

На первый день культивирования жизнеспособны были около 90 % клеток. Гибель клеток может быть связана с повреждениями, вызванными ферментативной обработкой клеток [1]. На третий день соотношение живых и мертвых клеток значительно повышается за счет активной пролиферации клеток (рис. 2В, 2Г). К 7 дню был достигнут монослой (рис. 2Д, 2Е), при этом более 95 % клеток сохранили жизнеспособность.

Рис. 3. Жизнеспособность HaCaT в течение культивирования на пленках из фиброина и желатина

Клетки, культивирующиеся на пленках из фиброина и желатина, характеризуются высокой жизнеспособностью и способностью к пролиферации. Данный результат свидетельствует о том, что субстрат, формируемый на поверхности пленок, не оказывает токсического или угнетающего действия на клетки, что является необходимым критерием для создания биоискуственных конструкций для применения в медицине и проведения исследований in vitro [9].

Заключение

Были исследованы пленки на основе фиброина, содержащие 30 % желатина. Поверхность пленок характеризуется наличием микрорельефа. При культивировании кератиноцитов линии HaCaT на композитных пленках клетки сохраняли высокую жизнеспособность в продолжении 7 дней. При достижении монослоя доля жизнеспособных клеток составляла более 95 %. Полученные пленки могут служить подложкой для культивирования кератиноцитов при создании прототипа искусственной кожи, также полученные пленки могут использоваться для проведения исследований in vitro.

Работа выполнена при поддержке федерального государственного бюджетного учреждения «Фонд содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере» по договору № 6826ГУ2/2015 от 15.07.2015.

Литература

1. Atiyeh B. S., Hayek S. N., Gunn S. W. New technologies for burn wound closure and healing — review of the literature // Bums. 2005. Т. 31. №. 8. С. 944-956.

2. Luangbudnark W. Viyoch J., Laupattarakasem W., Surakunprapha P., and Laupattarakasem P. Properties and biocompatibility of chitosan and silk fibroin blend films for application in skin tissue engineering // The Scientific World Journal. 2012. Article ID 697201, 10 с. [Электронный ресурс]: сайт издательства Hindawi Publishing Corporation. URL: http://www.hindawi.com/journals/tswj/2012/697201/citations/ (дата обращения: 24.06.2016).

3. Liu T., Miao J., Sheng W., and Xie Y. Cytocompatibility of regenerated silk fibroin film: a medical biomaterial applicable to wound healing // Journal of Zhejiang University SCIENCE B. 2010. Т. 11. №. 1. С. 10-16.

4. Орлова А. А., Котлярова М. С., Лавренов В. С., Волкова С. В., Архипова А. Ю. Влияние концентрации желатина в составе композитных матриксов на основе фиброина шелка на адгезию и пролиферацию клеток линии мышиных эмбриональных фибробластов // Бюллетень Экспериментальной Биологии и Медицины, 2014. т. 158. № 7. С. 98-102.

5. Севастьянов В. И. Технологии тканевой инженерии и регенеративной медицины // Вестник трансплантологии и искусственных органов, 2014. Т. 16. № 3. С. 93-108.

6. Агапов И. И., Мойсенович М. М, Васильева Т. В., Пустовалова О. Л., Коньков А. С., Архипова А. Ю., Соколова О. С., Богуш В. Г., Севастьянов В. И., Дебабов В. Г. 2010, Биодеградируемые матриксы из регенерированного шелка Bombix mori // ДАН. 2010. Т. 433. № 5. С. 699-702.

7. Yang L., Yaseen M., Zhao X., Coffey P., Pan F., Wang Y., Xu H. Gelatin modified ultrathin silk fibroin films for enhanced proliferation of cells // Biomedical Materials. 2015. Т. 10. №. 2. [Электронный ресурс]: IOPscience, сервис научных статей издательства IOP Publishing. URL: http://iopscience.iop.org/1748-605X/10/2/025003/ (дата обращения: 25.06.2016).

8. Jones K. H., Senft J. A. An improved method to determine cell viability by simultaneous staining with fluorescein diacetate-propidium iodide // Journal of Histochemistry & Cytochemistry, 1985. Т. 33. №. 1. С. 77-79.

9. Mao J., Zhao L., De Yao K., Shang Q., Yang G., Cao Y. Study of novel chitosan gelatin artificial skin in vitro // Journal of Biomedical Materials Research Part A, 2003. Т. 64. №. 2. С. 301-308.

Составление экологического паспорта микрорайона школы Хуснетдинова Э. З.

Хуснетдинова Эльвира Зиляфкарьевна /Khusnetdinova Elvira Zilyafkarevna - магистр, Башкирский государственный университет, Бирский филиал, г. Бирск

Аннотация: в статье описано влияние на состояние здоровья детей факторов окружающей среды, экологическое исследование школы, составлен экологический паспорт, проведена оценка экологической комфортности школьного здания для проведения учебных занятий, а также были проведены некоторые лабораторные исследования школьниками.

Ключевые слова: экологический паспорт школы, санитарно-гигиеническое состояние помещений, качество питьевой воды, загрязнённость воздуха.

Здоровье - одна из несомненных ценностей человека. Оно формируется под влиянием сложного комплекса внутренних факторов и внешних воздействий.

Рабочая среда - составная часть жизненной среды человека. В школах миллионы детей и подростков проводят значительную часть своего времени, и их развитие происходит при непрерывном воздействии факторов этой среды.

От качества среды в учебных помещениях во многом зависит их самочувствие, работоспособность, состояние здоровья.

Санитарно-гигиеническое состояние помещений характеризует ряд важных показателей: размеры помещения, внутренняя отделка и оформление помещения, освещенность, которые оказывают значительное влияние на зрительный анализатор, определяет состояние экологической комфортности учащихся; микроклимат закрытого помещения; воздушная среда помещения оказывает постоянное воздействие на организм человека; вентиляционный режим учебного помещения позволяет относительно стабилизировать в течение дня уровень химического и бактериального загрязнения, что обеспечивает благоприятное протекание физиологических процессов у учащихся.

Экологически чистая полноценная внешняя среда наряду с другими факторами является важной предпосылкой сохранения и укрепления здоровья и развития людей.

Таким образом, составление экологического паспорта микрорайона школы является актуальной.

Для решения вопроса мною были применены несколько методик. По ходу своей работы привлекла школьников в исследовательской деятельности. Учащиеся школы определили запылённость воздуха по листьям деревьев [1, с. 327], а также качество питьевой воды в школьной лаборатории [2, с. 71]. Приняв участие в конкурсе исследовательских работ на школьном этапе, работа прошла на городской конкурс «Открытие мира» в г. Нижневартовск.

В результате получилось следующее: из всех взятых проб листьев наиболее запылёнными оказались листья, взятые с деревьев ближе к центральной дороге в нижней части кроны. Причём, с высотой запылённость уменьшалась. Наименее запылёнными были листья, взятые с деревьев в саду, с южной стороны школы.

Такую разницу в показателях можно объяснить большим значением подстилающей поверхности.

Так же были проведены анализы питьевой воды в школьной лаборатории. Анализы воды отображены в таблице 1.