ПОЛИМЕРНЫЙ КОМПЛЕКС ДЛЯ МОЛЕКУЛЯРНО-ПРИЦЕЛЬНОЙ ТЕРАПИИ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ
POLYMERIC COMPLEX FOR MOLECULAR TARGETING THERAPY AND METHOD FOR ITS OBTAINING

Возможности химиотерапии злокачественных новообразований сильно ограничивает низкая избирательность действия подавляющего большинства противоопухолевых препаратов, а также развитие устойчивости опухолевых клеток к действию лекарств. В настоящее время для преодоления указанных проблем разрабатываются препараты, способные связываться со специфическими детерминантами на поверхности клеток-мишеней благодаря введению в их состав адресных (векторных) молекул. Использование адресного компонента обеспечивает селективность системы доставки по отношению к опухолевым клеткам. Такие векторные лекарственные препараты получили название таргетных препаратов, или систем направленного транспорта (СНТ). Несколько десятков таких препаратов в настоящее время проходят клинические испытания, значительное количество разнообразных конструкций находятся в стадии доклинических испытаний. Избирательность доставки СНТ обеспечивается за счет связывания препарата с векторными молекулами, которые должны обладать специфическим сродством к поверхности опухолевых клеток. В качестве векторных молекул могут быть использованы антитела, лиганды рецепторов, специфических для опухолевых клеток, аптамеры. При использовании в качестве векторных молекул лигандов рецепторов, уровень экспрессии которых повышен на клетках опухолей, препарат проникает внутрь клетки посредством рецептор-опосредованного эндоцитоза, избегая действия трансмембранных ABC-транспортеров. Таким образом, данный подход является не только методом повышения селективности действия препарата, но и одним из способов преодоления множественной лекарственной устойчивости.

Несколько препаратов, относящихся к СНТ, зарегистрированы в настоящее время для лечения злокачественных заболеваний: Милотарг (Mylotarg, Ozogamicin), Адсетрис (Adcetris, Brentuximab vedotin; SGN35), Кадсила (Kadcyla, Ado-trastuzumab emtansine; T-DM1) (Lambert J.M., Morris C.Q. Antibody-Drug Conjugates (ADCs) for Personalized Treatment of Solid Tumors: A Review // Adv. Ther. 2017. - V. 34 (5). - P. 1015-1035). Все они представляют собой конъюгаты гуманизированных или химерных антител с цитотоксическими соединениями.
Недостатком конъюгатов антител с цитотоксическими веществами в качестве терапевтических препаратов, препятствующим их внедрению в клиническую практику, является малое количество молекул цитотоксических соединений, которое можно присоединить к пептиду без нарушения его способности связываться со своим рецептором с высокой аффинностью. Для решения этой проблемы разрабатываются новые подходы, в которых цитотоксический препарат включается в состав мицелл или полимерных биодеградируемых наночастиц, снабженных векторными молекулами. Использование препаратов в составе наноразмерных частиц в виде липосом, мицелл и полимерных наночастиц, даже без векторных молекул является одним из подходов для улучшения биодоступности и оптимизации фармакокинетики лекарств, так как позволяет оптимизировать доставку препаратов в опухоль (Zhang H., Wang G., Yang Н. Drug delivery systems for differential release in combination therapy // Expert Opin. Drug Deliv. 2011. - V. 8 (2). - P. 171-190).
Дальнейший прогресс в создании полимерных форм противоопухолевых лекарств связан с разработкой усовершенствованных многофункциональных носителей, несущих на своей поверхности векторные лиганды, обеспечивающие избирательное связывание наночастиц с опухолевыми клетками или эндотелиальными клетками кровеносных сосудов, снабжающих опухоль питательными веществами и кислородом, и даже лиганды, обеспечивающие проникновение таких контейнеров в раковую клетку-мишень (Ramzy L., Nasr М., Metwally А.А., Awad G.A.S. Cancer nanotheranostics: A review of the role of conjugated ligands for overexpressed receptors // Eur. J. Pharm. Sci. 2017. - V. 104. - P. 273-292). Использование векторных полимерных наноразмерных (субмикронных) носителей при создании таргетных препаратов должно также обеспечивать защиту лекарственных препаратов от деградации и оптимизировать их фармакокинетику, благодаря улучшению накопления в опухоли. Таким образом, разработка новых противоопухолевых препаратов избирательного действия на основе полимерных комплексов для молекулярно-прицельной терапии (ПКМПТ) является актуальной задачей и перспективным направлением создания высокоэффективных и относительно безопасных лекарственных препаратов.
При разработке ПКМПТ наиболее важным аспектом является подбор оптимального состава, а именно выбор действующего вещества, векторной молекулы, полимерного носителя. При использовании полимерных наноразмерных (субмикронных) носителей в виде полимерных частиц, действующее вещество нековалентно сорбируется в объеме частицы и на ее поверхности, и в условиях организма постепенно высвобождается из состава частицы за счет диффузии и деградации полимера. Векторные молекулы, ковалентно или нековалентно связанные с полимерным носителем, обеспечивают механизм активного транспорта частицы в клетку-мишень. Наиболее важным требованием, предъявляемым к полимерам для создания ПКМПТ, является отсутствие токсичности используемого полимера и его биодеградируемость. Этим требованиям отвечает ряд полимеров, но наибольшее распространение получили полимеры на основе молочной, гликолевой кислот и их сополимеров (PLGA, ПЛГА) (Branco М.С., Schneider J.P. Self-assembling materials for therapeutic delivery // Acta Biomater. 2009. - V. 5 (3). - P. 817-831).
Вторым важным параметром при разработке ПКМПТ является размер частиц. В здоровом организме внутривенно введенные частицы могут покинуть сосудистую систему только в тех участках, где встречаются фенестрированные или синусоидные капилляры, например, в печени или селезенке. Однако проницаемость капилляров может повышаться в случаях патологии, например, в зоне роста опухоли или при воспалительном процессе. Размер пор в капиллярах, питающих эти опухоли, составляет от 200 нм до 1.2 мкм. Этот феномен создает предпосылки для эффективного лечения этих заболеваний с помощью наносомальных препаратов (Ruoslahti Е., Bhatia S.N., Sailor M.J. Targeting of drugs and nanoparticles to tumors // J. Cell Biol. 2010. V. 188 (6). - P. 759-768). Типичное для неопластических тканей нарушение оттока лимфы способствует удерживанию частиц. В мировой литературе это явление, впервые описанное для макромолекулярных пролекарств, получило название эффекта «повышенной проницаемости и удерживания» Enhanced Permeation and Retention (EPR) Effect (Maeda H., Matsumura Y. Tumoritropic and lymphotropic principles of macromolecular drugs // Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 1989. - V. 6 (3). - P. 193-210; Maeda H., Matsumura Y. EPR effect based drug design and clinical outlook for enhanced cancer chemotherapy // Adv. Drug Deliv. Rev. 2011. - V. 63 (3). - P. 129-130).
Третьим важным аспектом разработки ПКМПТ является технологичность производственного процесса его получения. Для связывания полимерных частиц с векторными молекулами используются различные стратегии. Связывание молекулы-вектора с полимером можно производить как на предварительных стадиях до получения частиц, так и в процессе получения частиц.
Использование в качестве векторных молекул в составе ПКМПТ белковых молекул (например, гуманизированных антител, рекомбинантных белков) сопряжено с рядом проблем. Получение химически связанных с реакционными группами на поверхности полимерных частиц белковых молекул, являющихся достаточно лабильными, - это весьма сложный, многостадийный и достаточно затратный процесс с низкими показателями выхода конечного продукта. В результате, использование в качестве векторных молекул белков многократно повышает стоимость готового продукта и делает производство таких препаратов экономически не выгодным.
Таким образом, важнейшей задачей является разработка эффективного и экономически целесообразного лекарственного препарата, сочетающего в себе высокую специфичность за счет использования векторного компонента, его стабильность, ценовую доступность и высокую технологичность производственного процесса получения. Этим критериям соответствует хорошо известный витамин В9 - фолиевая кислота (ФК), которая может быть использована в свободной форме, так и в виде конъюгатов (Mainardes R.M., Silva L.P., Drug Delivery Systems: Past, Present, and Future // Current Drug Target. 2004. - V. 5 (5). - P. 449-455) В результате может быть получена эффективная транспортная система для доставки противоопухолевых препаратов внутрь клеток. В силу сходства особенностей строения капиллярной сети в зоне опухоли и очаге воспаления, похожая транспортная система может оказаться интересной с точки зрения доставки противовоспалительных препаратов в очаг воспаления, что уже было показано на конъюгатах ФК с противовоспалительными препаратами.
Рецептор фолиевой кислоты присутствует на мембранах клеток широкого спектра опухолей (Salazar M.D., Ratnam М. The folate receptor: what does it promise in tissue-targeted therapeutics? // Cancer Metastasis Rev. 2007. - V. 26 (1). - P. 141-152). Поэтому фолиевая кислота - привлекательный объект для использования в качестве вектора для доставки противоопухолевых препаратов. Молекула ФК имеет высокое сродство к своему рецептору. Использование ее в качестве адресной метки удобно ввиду высокой химической стабильности в широком диапазоне температур и значений рН и прочности связывания с рецептором (Chen K, Xie J, Xu Н, et al. Triblock copolymer coated iron oxide nanoparticle conjugate for tumour integrin targeting. // Biomaterials. 2009. - V. 30. - P. 6912-6919; Zhan C., Gu В., Xie C, et al. Cyclic RGD conjugated poly(ethylene glycol)-copoly(lactic acid) micelle enhances paclitaxel anti-glioblastoma effect // J. Control. Release. 2010. - V. 143. - P. 136-142).
Низкая стоимость фолиевой кислоты и обширная библиотека доступных реакций конъюгации делают ее одним из наиболее используемых лигандов для доставки лекарств, нацеленных на опухоль (Low P.S., Henne W.A., Doorneweerd D.D. Discovery and development of folic-acidbased receptor targeting for imaging and therapy of cancer and inflammatory diseases // Acc. Chem. Res. 2008. - V. 41 (1). - P. 120-129).
Фолиевую кислоту используют для доставки в клетки-мишени антител, антисмысловых олигонуклеотидов, нуклеиновых кислот, белков и пептидов, радиоактивных и контрастных агентов для магнитно-резонансной томографии (Zhao X., Li H., Lee R.J. Targeted drug delivery via folate receptors. // Expert Opin. Drug Deliv. 2008. - V. 5 (3). - P. 309-319). После связывания с рецептором такой комплекс проникает в клетку посредством рецептор-опосредованного эндоцитоза. Известно также, что активированные макрофаги экспрессируют на своей поверхности рецептор к фолиевой кислоте FRB и путем рецептор-зависимого эндоцитоза также захватывают фолиевую кислоту в повышенных количествах. В связи с этим, в ряде исследовательских работ ФК используют для доставки противовоспалительных агентов.
Ниже приводятся примеры использования фолиевой кислоты или ее производных в целях создания препаратов для избирательной доставки в опухолевые клетки. Варианты включения ФК в состав систем доставки можно разделить на две группы подходов: первая группа - ковалентное связывание фолиевой кислоты с частицами, вторая группа - получение производных фолиевой кислоты и их встраивание в состав частиц.
В работе Esmaeili F. et al, 2008 (Esmaeili F., Ghahremani M.H., Ostad S.N., et al. Folate-receptor-targeted delivery of docetaxel nanoparticles prepared by PLGA-PEG-folate conjugate. // J. Drug Target. 2008. - V. 16 (5). - P. 415-423) получали конъюгат ди-блок-сополимера PLGA-PEG с активированной фолиевой кислотой, а затем, используя этот продукт, получали наночастицы с включением доцетаксела. Частицы имели средний размер 200 нм, при этом фолатный фрагмент был расположен на поверхности полимерной мицеллы. Было показано, значительно большее внутриклеточное поглощение частиц, содержащих остаток фолиевой кислоты, в опухолевые клетки (SKOV3) по сравнению с аналогичными частицами без вектора, что указывает на то, что механизм рецептор-опосредованного эндоцитоза играет важную роль в клеточном поглощении препарата.
50
В работе Wang Y. et al, 2015 (Wang Y., Li P., Chen L., Gao W., Zeng F, Kong L.X. Targeted delivery of 5-fluorouracil to HT-29 cells using high efficient folic acid-conjugated nanoparticles // Drug Delivery. 2015. - V. 22 (2). - P. 191-198) приводятся результаты исследований по получению полимерных частиц, содержащих 5-фторурацил, и снабженных фолатным вектором. В этом исследовании 1,3-диаминопропан использовался в качестве сшивающего агента для связывания PLGA и фолиевой кислоты. Полимерные частицы, нагруженные 5-фторурацилом, были получены с помощью метода эмульгирования и отгонки растворителя. На первом этапе проводили эмульгирование ультразвуком водной фазы, содержащей 5-фторурацил и органической фазы, содержащей модифицированный полимер с получением первичной эмульсии, которую далее эмульгировали ультразвуком с водным раствором ПАВ и получением вторичной эмульсии. Конъюгированные с ФК полимерные частицы имели средний размер частиц 224 нм. В экспериментах in vitro на раковых клетках НТ-29 было показано, что такие частицы обладают большей цитотоксичностью, чем свободный 5-фторурацил, и чем частицы, полученные без фолиевой кислоты (IC=5,69, 22,9 и 14,17 мкг/мл, соответственно).
В работе Санжаков и др., 2016 (Санжаков М.А., Игнатов Д.В., Кострюкова Л.В. и др. Изучение свойств лекарственных композиций доксорубицина в составе коллоидных наночастиц с адресным фрагментом в экспериментах in vivo // Биомед. химия, 2016. - Т. 62, вып. 2, - С. 150-153) был предложен способ конструирования системы адресной доставки доксорубицина в составе растительных фосфолипидных частиц. В качестве адресного фрагмента были использованы конъюгаты фолиевая кислота-додециламин и биотин-додециламин. Средний размер частиц лекарственных композиций доксорубицина в составе коллоидных частиц на основе фосфатидилхолина с этими адресными конъюгатами не превышал 20 нм. Плотность поверхностного заряда (дзета-потенциала) частиц была положительна и составляла 20,9 и 14,3 мВ, соответственно. Накопление доксорубицина в ткани опухоли Льюис у мышей повышалось при введении его в составе коллоидных наночастиц с адресными коньюгатами: содержание в опухоли доксорубицина, введенного внутривенно в составе наночастиц с адресным фрагментом фолиевая кислота-додециламин было почти в 2 раза выше в сравнении со свободным доксорубицином и в 1,4 раза выше в сравнении с доксорубицином, введенным в составе наночастиц с адресным фрагментом биотин-додециламин.
В работе Varshosaz J. et al. 2012 (Varshosaz J., Hassanzadeh F., Sadeghi H. Shaker M. Folate Targeted Solid Lipid Nanoparticles of Simvastatin for Enhanced Cytotoxic Effects of Doxorubicin in Chronic Myeloid Leukemia // Current Nanosci. 2012. - V. 8 (2). - P. 249-258) описано получение конъюгата фолиевой кислоты с октадециламином и включение его в состав твердых липидных наночастиц (SLN) с симвастатином. При получении частиц использовали глицерил моностеарат. Показано, что фолиевая кислота в составе таких частиц может значительно повысить цитотоксический эффект симвастатина на клеточной линии К562.
Одним из наиболее эффективных современных противоопухолевых препаратов является доцетаксел (ДТ). Однако клиническое применение доцетаксела ограничивает высокий уровень проявления побочной токсичности, в связи с чем ведется поиск путей создания новых лекарственных форм доцетаксела и схем его применения. Включение ДТ в состав ПКМПТ является перспективным подходом для повышения избирательности действия препарата и снижения его неспецифической токсичности.
По фармакологическому действию доцетаксел относится к противоопухолевым препаратам цитостатического действия. Действие доцетаксела связано с повреждением микротубулярной сети в клетках на стадии митоза и в интерфазе. Доцетаксел связывается со свободным тубулином, стимулирует сбор тубулина в стабильные микротрубочки и препятствует их распаду. В результате образуются связки микротрубочек, они стабилизируются, теряют способность к нормальному функционированию, что приводит к ингибированию митоза в клетках. Лекарственный препарат доцетаксел выпускается в парентеральной форме. Доцетаксел широко применяют в схемах адъювантной и монотерапии при лечении злокачественных новообразований желудка, бронхов, легкого, молочной железы, яичника, предстательной железы, рака головы, лица и шеи (Доцетаксел. Регистр лекарственных средств России, www.rlsnet.ru). Доцетаксел вызывает многочисленные побочные эффекты, основные из которых: со стороны сердечнососудистой системы и крови (кроветворение, гемостаз) - нейтропения, тромбоцитопения, анемия; нарушение сердечного ритма, сердечная недостаточность, понижение или повышение АД; Со стороны органов ЖКТ - тошнота, рвота, диарея/запор, анорексия, стоматит, эзофагит, повышение сывороточных уровней ACT, АЛТ, ЩФ, гипербилирубинемия; случаи желудочно-кишечного кровотечения; со стороны кожных покровов: алопеция; кожная сыпь, зуд; аллергические реакции: реакции гиперчувствительности легкой или умеренной степени выраженности и тяжелые реакции (сопровождающиеся артериальной гипотензией и/или бронхоспазмом или генерализованной сыпью/эритемой); периферическая нейропатия (парестезия, дизестезия или боль, слабость), периферические отеки (первоначально обычно появляются на нижних конечностях), асцит, астения, артралгия и миалгия, реакции в месте введения (гиперпигментация, воспаление, покраснение или сухость кожи, флебит, кровоизлияние или отек вены).
Из приведенной информации видно, что использование ДТ сопряжено с многочисленными и сильными побочными эффектами, представляющими в ряде случаев опасность для жизни пациентов (Ковтун В.А., Гаевой К.В., Севидов В.В. Длительная инфузия доцетаксела (Таксотера) в полихимиотерапии 2-й линии у больных с прогрессирующими солидными опухолями // Онкология. 2006. - Т. 8, №3. - С. 285-286).
Как показывают литературные данные, включение доцетаксела в системы для адресной доставки позволяет успешно решать проблемы связанные с токсичностью, а также с преодолением лекарственной резистентности.
Имеющиеся в литературе данные о разработке ПКМПТ на основе доцетаксела в качестве действующего вещества и фолиевой кислоты в качестве векторной молекулы в составе полимерных комплексов на основе PLGA показывают, что основным подходом является создание таких комплексов через стадию получения блоксополимера (например, PLGA-PEG), химически связанного с фолиевой кислотой, и использование его для получения частиц с включенным доцетакселом.
В работе Hu L. et al, 2015 (Hu L., Pang S., Hu Q., Gu D., Kong D., Xiong X., Su J. Enhanced antitumor efficacy of folate targeted nanoparticles co-loaded with docetaxel and curcumin // Biomed. Pharmacother. 2015. - V. 75. - P. 26-32) приведены результаты исследований по получению полимерных частиц на основе PLGA, содержащих доцетаксел и куркумин, а также векторную молекулу - остаток фолиевой кислоты, ковалентно связанный с диаминополиэтиленгликолем. Полученный фрагмент далее "сшивался" с молекулами PLGA-COOH с получением диблоксополимера PEG-PLGA. На основе синтезированных полимеров были получены наночастицы с включением доцетаксела и куркумина, методом эмульгирования на гомогенизаторе высокого давления и последующего удаления органического растворителя. Размер частиц составил  100 нм, дзета-потенциал -  16-17 мВ. Наночастицы, содержащие ФК в роли векторной молекулы, проявляли более высокий уровень цитотоксичности на культурах клеток рака легких А549, чем наночастицы, не содержащие ФК. Кроме того, частицы с ФК более эффективно подавляли рост опухоли S180 и обладали меньшей токсичностью.
Однако следует отметить, что направление получения ПКМПТ, связанное с использованием блоксополимеров, в настоящее время является дорогостоящим так, как не налажено их производство, а получение осуществляется в лабораторных условиях.
Раскрытие изобретения
Проблемой, решаемой данным изобретением является усовершенствование состава и технологии получения ПКМПТ, сочетающего в себе высокую технологичность процесса получения и его экономичность, а также оптимальные показатели для реализации молекулярно-прицельного механизма действия ПКМПТ,
Техническим результатом изобретения являются субмикронный размер частиц и высокие показатели специфичности полимерного комплекса, что достигается без проведения стадии химической модификации полимерной основы и/или полученных частиц.
Для достижения указанного технического результата предложен полимерный комплекс для молекулярно-прицельной противоопухолевой терапии в виде лиофилизата для приготовления суспензии частиц с размером 50-600 нм, содержащий активный компонент - доцетаксел, полимерный компонент - сополимер молочной и гликолевой кислот с соотношением полимерных звеньев 50:50, векторный компонент - додециламид фолиевой кислоты, поливиниловый спирт, плюроник F-127 и D-маннитол, при следующем соотношении компонентов, % масс.:
доцетаксел 1.0-5.0
сополимер молочной и гликолевой кислот 58.0-65.0
додециламид фолиевой кислоты 0.01-0.50
поливиниловый спирт 0.01-1.0
плюроник F-127 0.1-2.0
D-маннитол 27.0-35.0
Полимерный комплекс отличается тем, что количество частиц с размером 50-600 нм составляет не менее 90% от общего количества частиц в суспензии.
Также предложен способ получения полимерного комплекса, характеризующийся тем, что он включает стадии: растворения сополимера молочной и гликолевой кислоты, доцетаксела и плюроника F-127 в хлористом метилене; растворения додециламида фолиевой кислоты в смеси N,N-диметилформамид-плюроник F-127 в соотношении 80:20 по массе и внесения полученной смеси в 1% водный раствор поливинилового спирта; смешивания указанных растворов в условиях обработки ультразвуком с образованием эмульсии; удаления из полученной эмульсии хлористого метилена путем перемешивания на воздухе или в вакууме до получения суспензии частиц; центрифугирования, с последующим получением восстановленной суспензии; добавления к восстановленной суспензии раствора D-маннитола; замораживания суспензии и последующей ее лиофилизации в течение суток с получением лиофилизата.
Технический результат заявленного изобретения заключается в том, что предложен полимерный комплекс, состоящий из полимерного компонента-носителя, активного компонента и векторного компонента в виде субмикронных частиц, обладающий оптимальными характеристиками для реализации молекулярно-прицельного механизма и технологичным способом получения, что позволит широко использовать предложенный комплекс в составе лекарственных средств, предназначенных для молекулярно-прицельной терапии. Преимуществом предложенного способа получения комплекса является способ введения плохо растворимого в органической и водной среде додециламида фолиевой кислоты (векторный компонент) с использованием N,N-диметилформамида и поверхностно-активного вещества (ПАВ) плюроника F-127. Плюроник F-127 образует мицеллы с инкорпорированным додециламидом фолиевой кислоты и способствует его растворению в водном растворе ПАВ, а также обеспечивает последующее включение молекул векторного компонента на поверхность капель эмульсии раствора полимера и активного вещества. Далее, при потере каплями эмульсии летучего растворителя происходит формирование суспензии.
Предложенный способ отличается от известных тем, что осуществляется без проведения стадии химической модификации блоксополимера или поверхности предварительно полученных частиц с последующим трудоемким удалением побочных продуктов химической реакции, которые могут обладать собственной фармакологической активностью. Использование ранее синтезированного и очищенного векторного компонента для введения его в поверхностный слой формируемой частицы значительно упрощает процесс получения готового продукта и исключает использование специализированного оборудования для химического синтеза.
Иммунофлуоресцентный анализ показал, что векторные молекулы располагаются на поверхности частиц полученной суспензии и способны связываться с моноклональными антителами к фолиевой кислоте, что свидетельствует о высоких показателях специфичности полимерного комплекса и способности связываться с фолатными рецепторами на поверхности клеток.
Описанный технический результат достигается по совокупности всех существующих признаков созданного полимерного комплекса для молекулярно-прицельной терапии.
Краткое описание чертежей
На Фиг. 1 представлена схема введения производного фолиевой кислоты в поверхностный слой полимерных частиц с указанием стадий: I - эмульсия, окруженная мицеллами, содержащими производное фолиевой кислоты; II - внедрение мицелл в поверхностный слой эмульсии за счет амфифильных свойств мицеллообразующего вещества (плюроник F-127); III - формирование частицы, содержащей производное фолиевой кислоты на поверхности. Условные обозначения на Фиг. 1: А - активное вещество, включенное в состав полимерных частиц; В - производное фолиевой кислоты, содержащее гидрофобный фрагмент; С - мицелла, образованная плюроником F-127; D - мицелла (С), содержащая производное фолиевой кислоты; Е - полимерная частица.
На Фиг. 2 представлена гистограмма распределения частиц по размерам с указанием планок погрешностей (мин-макс) для каждой фракции. По оси абсцисс - диаметр частиц, нм; по оси ординат - относительное содержание фракций, %. Средний размер частиц: 227.6 нм; стандартное отклонение: ±1.5%
На Фиг. 3 представлены результаты анализа содержания производного фолиевой кислоты на поверхности частиц с помощью непрямого иммунофлуоресцентного окрашивания. По оси абсцисс - образцы частиц: ОО-016 - образец, не содержащий производного фолиевой кислоты, ОФ-020 и ОФ-021 - образцы, содержащие различное количество производного фолиевой кислоты. По оси ординат - интенсивность флуоресценции, отн. ед.
Осуществление и примеры реализации изобретения
Разработка состава и способа получения комплекса для молекулярно-прицельной терапии в виде частиц является необходимым элементом в создании технологического процесса получения. Для достижения указанных целей, необходимо было, оптимизировать состав и разработать методики получения полимерных частиц с включенным доцетакселом и разработать технологически приемлемый способ введения векторного компонента.
Полимерные частицы, описываемые в настоящем изобретении, представляют собой субмикронные частицы, размер которых лежит в диапазоне от 50 до 600 нм. Полимер-носитель, в который включено активное вещество и молекулы векторного компонента, выбирался из сополимеров молочной и гликолевой кислоты с соотношением полимерных звеньев молочной и гликолевой кислоты от 75:25 до 25:75. Использовались коммерчески доступные полимеры ПЛГА. В качестве активного вещества использовали доцетаксел (в виде тригидрата). В качестве векторного компонента использовалось производное фолиевой кислоты - додециламид фолиевой кислоты (Санжаков М.А., Игнатов Д.В., Прозоровский В.Н. и др. Синтез адресного коньюгата для фосфолипидной системы транспорта лекарств // Биомед. химия, 2014. - Т. 60, вып. 6. - С. 713-716). В качестве растворителя полимера и активного вещества использовался метиленхлорид. При растворении додециламида фолиевой кислоты применяли N,N-диметилформамид. В качестве ПАВ применяли поливиниловый спирт (Sigma) и плюроник F-127 (Sigma). Концентрации полимера ПЛГА и активного вещества в неводной фазе подбирались аналогично ранее описанным подходам (Муравьёва А.И., Воронцов Е.А., Гукасова Н.В. и др. Разработка полимерной формы противоопухолевого препарата этопозид // Российские нанотехнологии. 2016. - Т. 11, №3.4. С. 84-91).
Были подобраны условия, позволяющие получать полимерные частицы с содержанием включенного доцетаксела от 1 до 5% масс. Для достижения этого показателя наиболее оптимальным оказался сополимер молочной и гликолевой кислот с соотношением полимерных звеньев молочной и гликолевой кислоты 50:50 (ПЛГА 50/50).
В ходе экспериментальных исследований был предложен способ введения в состав частиц плохо растворимого в органической и водной средах додециламида фолиевой кислоты (векторный компонент) с использованием N,N-диметилформамида и ПАВ - плюроника F-127. Плюроник F-127 образует мицеллы с инкорпорированным додециламидом фолиевой кислоты и способствует его растворению в водном растворе ПАВ, а также обеспечивает последующее включение молекул векторного компонента на поверхность полимерных частиц. Для дополнительной стабилизации эмульсии, а затем и полученной из нее суспензии используется водный раствор ПАВ - поливинилового спирта, в который вводится солюбилизированный в растворе N,N-диметилформамида и плюроника F-127 векторный компонент.
Примененные подходы позволили получить продукт в виде лиофилизата для приготовления суспензии частиц субмикронного размера (диапазон 50-600 нм).
Таким образом, экспериментально были подобраны условия технологического процесса, позволяющие стабильно, воспроизводимо и с высоким выходом получать продукт в виде лиофилизата с указанными выше характеристиками.
Подробное описание получения полимерного комплекса для молекулярно-прицельной терапии, представлено ниже в примере 1.
Размер частиц определяли методом динамического светорассеяния. Полученные частицы имели субмикронные размеры - средний диаметр 90% частиц из диапазона 90-600 нм. Пример изображения распределения частиц по размерам суспензии образца в графическом виде приведен на Фиг. 2.
Для анализа содержания производного фолиевой кислоты на поверхности частиц проводили непрямое иммунофлуоресцентное окрашивание образцов. Иммунофлуоресцентный анализ показал, что молекулы векторного компонента располагаются на поверхности частиц и способны связываться с моноклональными антителами к фолиевой кислоте, что свидетельствует о высоких показателях специфичности полимерного комплекса. Подробное описание эксперимента представлено ниже в примере 2.
Предлагаемое изобретение иллюстрируется нижеследующими примерами.
Пример 1

Навески 190 мг сополимера молочной и гликолевой кислот (PURASORB PDLG 5004, PURAC Biochemicals, Нидерланды) и 10 мг доцетаксела тригидрата растворяли в 5.0 мл хлористого метилена. В полученный раствор вносили 4 мг плюроника F-127 (Pluronic F-127) с последующим его растворением.
Навеску 5 мг додециламида фолиевой кислоты растворяли в 1 мл смеси N,N-диметилформамид-плюроник F-127, взятых в соотношении 80:20 по массе. 200 мкл полученного раствора додециламида фолиевой кислоты (1 мг) вносили в 35 мл 1% водного раствора поливинилового спирта, приготовленного ранее, и тщательно перемешивали.
Раствор сополимера молочной и гликолевой кислот, доцетаксела и плюроника F-127 в метиленхлориде вносили в 1% водный раствор поливинилового спирта, содержащий мицеллы додециламида фолиевой кислоты, и дважды обрабатывали ультразвуком с энергией 35 Дж в течение 1 минуты с перерывом в 1 минуту. В полученную эмульсию вносили якорь магнитной мешалки и оставляли перемешиваться при комнатной температуре на ночь. Сформировавшуюся суспензию переносили в центрифужную пробирку и далее центрифугировали с ускорением не менее 20000 g (20000-30000 g) в течение 15 минут при температуре рабочей камеры центрифуги 4°С.
Супернатант отбирали, добавляли к осадку 20 мл воды (использовали воду для инъекций). С помощью встряхивания осадок ресуспендировали. К восстановленной суспензии добавляли 0.75 мл 10% раствора D-маннитола, затем замораживали и лиофилизировали в течение суток.
В полученном лиофилизате определяли содержание доцетаксела, которое составило 3.0±0.5%.
Определяли средний размер частиц методом динамического светорассеяния, который составил 227.6 нм, стандартное отклонение ±1.5%, индекс полидисперсности - 0,069. Среднее значение дзета-потенциала частиц, в восстановленной из лиофилизата суспензии составило около минус 4.0±0.15 мВ.
Содержание додециламида фолиевой кислоты на поверхности частиц восстановленной из лиофилизата суспензии определяли качественно, с использованием метода непрямого иммунофлуоресцентного окрашивания. Было подтверждено наличие на поверхности частиц фрагментов, содержащих фолиевую кислоту, которые способны связываться со специфическими антителами к фолиевой кислоте. Подробное описание эксперимента, представлено ниже в примере 2.
Пример 2
Для проведения исследования использовали образцы лиофилизатов, содержащие додециламид фолиевой кислоты (серии образцов ОФ-020, ОФ-021) и не содержащие додециламид фолиевой кислоты (контрольный образец серии ОО-016). Содержание додециламида фолиевой кислоты на поверхности частиц восстановленной из лиофилизата суспензии определяли качественно, с использованием метода непрямого иммунофлуоресцентного окрашивания. Для проведения исследования использовали моноклональные антитела к фолиевой кислоте - клоны FA1, FA2, FA3 (ОАО «ВНЦМДЛ», Россия), поликлональные антитела козы против иммуноглобулинов мыши, конъюгированные с Alexa Fluor 488 (Biolegend, США).
Для анализа образцы лиофилизатов (по 1.5 мг для каждого определения) ресуспендировали в деионизованной воде. Для удаления криопротектора (маннита) частицы центрифугировали с помощью настольной микроцентрифуги (5415R, Eppendorf, ФРГ) 10 мин при 10000 об/мин при 4°С. Супернатант удаляли, частицы ресуспендировали в фосфатном буферном растворе, рН 7.2. К суспензии частиц добавляли моноклональные антитела в концентрациях 1 мкг/мл, 5 мкг/мл, 10 мкг/мл и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре при перемешивании. После окончания инкубации частицы трижды промывали фосфатным буферным раствором, осаждая центрифугированием, как указано выше. Отмытые частицы ресуспендировали в фосфатном буферном растворе, добавляли вторичные антитела, конъюгированные с Alexa Fluor 488, в разведении 1:1000 и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре в темноте при перемешивании. Далее частицы трижды отмывали фосфатным буферным раствором, ресуспендировали в 200 мкл фосфатного буферного раствора, переносили в 96-луночный планшет и измеряли интенсивность флуоресценции с помощью планшетного спектрофотометра-флуориметра VICTOR (Perkin Elmer, США).
Результаты анализа способности трех исследованных клонов моноклональных антител к фолиевой кислоте (МоАт к ФК) взаимодействовать с додециламидом фолиевой кислоты на поверхности частиц представлены в таблице. Показаны данные связывания различных клонов МоАт к ФК с частицами, содержащими додециламид фолиевой кислоты (серия образца ОФ-020) и не содержащими додециламид фолиевой кислоты (серия образца ОО-016).
По данным иммунофлуоресцентного анализа был выбран клон МоАт (FA3) к ФК, обладающий не только высокой аффинностью к антигену, но и низкой неспецифической сорбцией на полимере. В отдельном эксперименте проведено исследование образцов, отличающихся по содержанию додециламида фолиевой кислоты - образцы серий ОФ-020 и ОФ-021.
Результаты эксперимента, представленные на Фиг. 3, показали, что интенсивность флуоресценции изменяется пропорционально содержанию додециламида фолиевой кислоты.
Таким образом, иммунофлуоресцентный анализ показал, что молекулы векторного компонента располагаются на поверхности частиц полученной суспензии и способны связываться со моноклональными антителами к фолиевой кислоте, что свидетельствует о высоких показателях специфичности полимерного комплекса и его способности связываться с фолатными рецепторами на поверхности клеток для реализации молекулярно-прицельного механизма.
Таким образом, по совокупности всех полученных результатов испытаний полимерный комплекс, содержащий: активный компонент - доцетаксел, полимерный компонент - сополимер молочной и гликолевой кислот, векторный компонент - додециламид фолиевой кислоты, представляющий собой лиофилизат для приготовления суспензии частиц субмикронного размера, обладает технологичным способом получения и оптимальными характеристиками для реализации молекулярно-прицельного механизма, что позволит широко использовать предложенный комплекс в составе лекарственных средств, предназначенных для молекулярно-прицельной терапии.