Влияние структуры на взаимодействиe липополисахарида с порином наружной мембраны Yersinia pseudotuberculosis

Влияние структуры на взаимодействие липополисахарида с порином наружной мембраны Yersinia pseudotuberculosis

Вакорина Т.И.

(1)Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН, Владивосток, (2) Институт физиологии Коми НЦ, УрО РАН, Сыктывкар

Липополисахарид (ЛПС) и порообразующие тримерные белки (порины) являются основными компонентами наружной мембраны (НМ) грамотрицательных бактерий [1]. ЛПС - специфический амфифильный биополимер, молекула которого состоит из трех фрагментов: олигосахарида кора, липида А и О-специфических полисахаридных цепей (S-ЛПС). Молекула ЛПС, не содержащая полисахаридных цепей, определяется как R-ЛПС. Порины обеспечивают важную для микробной клетки функцию, образуя в нативной мембране гидрофильные поры, через которые диффундируют низкомолекулярные вещества, нутриенты и метаболиты жизнедеятельности клетки.

Специфическое взаимодействие ЛПС и поринов, существующее в нативной мембране, определяет свойства НМ и имеет решающее значение для жизнедеятельности бактериальной клетки. [1-3]. Так, ЛПС-белковые комплексы (ЛПБК), содержащие в своем составе ЛПС и порины, являются рецепторами фагов, колицинов, участвуют в процессе конъюгации клеток. Кроме того, ЛПБК играют важную роль в сборке мембраны: только взаимодействие с ЛПС обеспечивает олигомеризацию порина, реконструкцию "зрелого" белка в НМ. Существуют экспериментальные доказательства того, что структура ЛПС и конформационное состояние порина во многом определяют как свойства изолированного комплекса, так и молекулярную организацию и стабильность НМ в целом [4]. Тем не менее, данные о стехиометрии ЛПБК и влиянии структуры ЛПС на характер и эффективность комплексообразования встречаются лишь в единичных работах [5-7]. Нуждается также в определении и уточнении механизм образования комплексов и количественные характеристики этого процесса.

Выяснение механизмов взаимодействия биологически активных макромолекул, являющихся компонентами живых биологических систем, остается одним из основных направлений современных исследований. С разработкой новых поколений вычислительной техники и новых вычислительных технологий для решения задач такого рода все более эффективными становятся методы математического моделирования

структуры и динамических свойств различных биомолекул. Однако развитие представлений о пространственной организации и механизмах функционирования таких сложных мультифункциональных макромолекул, как мембранные белки и ЛПС бактерий, невозможно без корреляции результатов, полученных с помощью теоретических моделей, с экспериментальными данными о физико-химических свойствах молекул. В связи с этим, не теряют своей актуальности подходы, позволяющие проанализировать изменения биологичекой активности или характера взаимодействия биомолекул с изменением их структуры.

Настоящая работа является частью систематического исследования [8-10] взаимодействия различных молекулярных форм (тримерной и мономерной) порообразующего белка НМ Yersinia pseudotuberculosis с эндогенным ЛПС и его структурными фрагментами. Работа, посвящена изучению взаимодействия тримера порина с эндогенными ЛПС методом тушения собственной флуоресценции белка. Ее целью явилось изучение влияния структуры ЛПС, а именно длины О-специфических полисахаридных цепей и степени ацилирования липида А (остатков 3-гидрокситетрадекановой кислоты) на характер, эффективность и количественные параметры комплексообразования.

Экспериментальная часть

Выделение и очистка порина Иерсинин в олигомерной форме получали, как описано ранее [11] с последующей гель-хроматографией на TSK-геле (Toysoda, Япония) [12]. Степень очистки порина от сопутствующих белков определяли с помощью SDS, ПААГ-электрофореза по Лэммли [13]. Белки, разделенные в геле, окрашивали раствором Кумасси ярко-голубого G-250 в 3,5%-ной хлорной кислоте [14]. Содержание белка определяли по модифицированному методу Лоури в присутствии 2%-ного додецилсульфата натрия (SDS) [15], моносахариды - стандартным методом [16]. Полученный препарат иерсинина содержит 75-80% белка и не более 5% моносахаридов.

Для очистки от ЛПС образец белка выдерживали 16 часов при 37°С в буфере, содержащем 1мМ ЭДТА, 20мМ Tris-HCl, pH 7,5 (буфер А) и 0,5% дезоксихолата натрия (ДОХ), затем фракционировали на колонке с сефадексом G-200 в буфере А, содержащем 0,25% ДОХ. Содержание ЛПС во фракциях контролировали с помощью теста с тиобарбитуровой кислотой [17] и SDS, ПААГ-электрофореза, проявляя гели ионами серебра [18].

Выделение и очистка ЛПС. В экспериментах использовали штаммы Y. pseudotubercuiosis IB серовара, выращенные при 8° и 37°С на жидкой питательной среде [19]. ЛПС получали последовательной экстракцией бактерий смесью фенол-хлороформ-

петролейный эфир (2:5:8) [20] и горячим водным фенолом по методу Вестфаля и сотр. [21]. Определение общего содержания углеводов, белка и нуклеиновых кислот проводили, как описано ранее [19]. Количественный анализ моносахаридов в виде ацетатов полиолов проводили методом ГЖХ, используя ксилозу в качестве внутреннего стандарта [19]. Степень полимеризации (n) ЛПС рассчитывали, определяя мольное отношение маннозы (моносахарида О-специфического полисахарида IB серовара [22]) и гептозы (моносахарида кора [23]) в гидролизатах ЛПС (1М трифторуксусная кислота, 100°С, 2 часа). Жирные кислоты получали гидролизом ЛПС 4М NaOH (100°С, 4 часа) и анализировали в виде метиловых эфиров (обработка диазометаном) с помощью ГЖХ и ГЖХ-МС, используя тетрадекановую кислоту в качестве стандарта [24]. Степень ацилирования 3-гидрокситетрадекановой кислоты определяли как отношение додекановой и 3-гидрокситетрадекановой (100%) кислот [25].

Флуоресценция. Спектры флуоресценции белка измеряли на спектрофлуориметре Hitachi 850 (Япония) при 25оС в кварцевой кювете с толщиной слоя 1 см. Возбуждение флуоресценции проводили при 280 нм. Спектры флуоресценции, скорректированные по родамину В (Wako Pure Chemical Industries, Япония), регистрировали, вычитая рамановскую полосу буфера. Ширина щели на монохроматорах возбуждения и излучения составляла 5 нм.

Эксперимент проводили следующим образом: при 24° С к 1мл раствора порина (с = 5,4-10"7М) при интенсивном перемешивании добавляли равные порции (20 мкл) соответствующего ЛПС (с = 4,2-10"4М) и через 20-30 минут (достижение равновесия) измеряли спектры флуоресценции белка. При образовании ЛПБК происходило уменьшение интенсивности флуоресценции порина до предельной величины, которую контролировали .при ^max, равной 327 нм. Значение интенсивности флуоресценции белка, при котором не происходило уменьшения при добавлении лиганда, принимали за F«,. Степень насыщения мест связывания на молекуле порина (9) определяли по изменению интенсивности флуоресценции белка: ' 9 = (Fo - F)/(Fo - F^) = AF/AFmax,

где Fq и F - исходная интенсивность флуоресценции белка при 327 нм и интенсивность флуоресценции раствора белка при этой же длине волны после добавления ЛПС, AFmax -максимальное падение флуоресценции. Все значения интенсивности флуоресценции (F) были скорректированы с учетом разбавления раствора порина при добавлении ЛПС и внутреннего фильтра [26].

По данным проведенного эксперимента строили графики в координатах Скэтчарда: 9/[ЛПС]общ.. от 9, где 9 - степень насыщения, [ЛПС]общ. - общая концентрация

добавленного липополисахарида в пересчете на реакционный обьем. Расчет констант ассоциации порина и ЛПС проводили, как описано в [10], используя компьютерную программу Кукарских А.В, разработанную на основе аналитических методов, предложенных в работах [ 27, 28]. Степень кооперативности (коэффициент Хилла) определяли, как тангенс угла наклона прямой, построенной в координатах lg[9/(1-9)] от 1В[ЛПС]о6Щ. [29].

Результаты и их обсуждение Выделение и очистка ЛПС и порина. Липополисахариды Y. pseudotuberculosis представляют собой гетерогенную популяцию молекул различного молекулярного веса и степени гидрофобности. Синтез ЛПС в клетках псевдотуберкулезного микроба регулируется температурой роста бактерий. Так, при пониженной температуре (8-10°С) преобладающим типом являются ЛПС c высокой степенью гидрофобности (50%), полисахаридная цепь которых содержит до 5 моносахаридных звеньев [19]. Гидрофобность ЛПС определяется наличием в его составе липида А, который состоит из двух в-1,6-связанных остатков глюкозамина, замещенных остатками фосфорной, 3-гидрокситетрадекановой (30H14:0) и 3-додеканоилгидрокситетрадекановой кислот [3032]. Липид А бактерий псевдотуберкулеза, выращенных на холоду, характеризуется высоким содержанием 3-гидроксиалкановых кислот со сложноэфирным и амидным типом связи [19]. Характерной особенностью псевдотуберкулезного микроба является также способность продуцировать ЛПС S-формы двух типов, которые имеют близкие значения степени полимеризации О-специфического полисахарида, но различаются по степени ацилирования 3ОН14:0 [19]. При температуре 37°С в клетках псевдотуберкулеза увеличивается доля молекул с короткой О-полисахаридной цепью вплоть до ее отсутствия (R-ЛПС) и низким содержанием 3-гидроксиалкановых кислот [19] .

Для получения образцов ЛПС, различающихся длиной полисахаридных цепей и степенью ацилирования липида А, использовали бактерии, выращенные при температуре 8 и 37°С. Аналитические данные для полученных образцов ЛПС представлены в таблице 1.

Таблица 1. Аналитические данные ЛПС из Y. pseudotuberculosis

Тип ЛПС о t Мол. вес, кДа n а, %

ЛПС-1 (R) 37 3,6 0,0 12,4

ЛПС-2 (S) 37 4,7 1,3 20,1

ЛПС-3 (S) 8 6,8 4,0 15,3

ЛПС-4 (S) 8 7,0 3,8 66,0

t - температура, при которой выращены штаммы Y. pseudotuberculosis n - степень полимеризации О-полисахаридных цепей. a - степень ацилирования 3- гидрокситетрадекановой кислоты.

Согласно аминокислотной последовательности [33], порин из Y. pseudotuberculosis, названный нами иерсинином [ 34], содержит 3 остатка триптофана и 25 остатков тирозина (в расчете на мономерную форму). Методами кругового дихроизма и флуоресценции показано, что иерсинин является типичным в-структурированным порообразующим белком с динамичной третичной структурой [35]. Конформация порина зависит от условий получения белка и природы используемого для солюбилизации детергента, что свидетельствует о пластичности конформации изолированного порина в растворах

Иерсинин был выделен в олигомерной форме при расщеплении лизоцимом комплекса пептидогликан-белок [11]. Очищенный образец порина содержит до 5% прочносвязанного ЛПС. Как известно [36], свободный от ЛПС белок можно получить обработкой порина 30%-ым раствором SDS. Однако, как было показано нами ранее [35], воздействие на порин высокой концентрации этого ионного детергента вызывает изменение конформации порина на уровне вторичной и третичной структур белка [35]. В настоящей работе для очистки порина от ЛПС использовали более мягкий неионный детергент -ДОХ и гель-хроматографию на Сефадексе G-200 [37]. С помощью кругового дихроизма и флуоресценции показано, что при обработке порина в ДОХ сохраняется вторичная и третичная структура белка [37]. Полученный образец порина дает отрицательную реакцию на ЛПС в тесте с тиобарбитуровой кислотой. При анализе белка с помощью SDS-ПААГ-электрофореза окрашивание соответствующей полипептидной зоны ионами серебра также не выявило присутствия ЛПС.

Изучение комплексообразования между ЛПС и порином проводили методом тушения собственной белковой флуоресценции по уменьшению интенсивности излучения белка при добавлении ЛПС. Как показали предварительные исследования, спектр суммарной флуоресценции раствора иерсинина в ДОХ (A,ex. = 280 нм) имеет максимум при 327 нм. Возбуждение на 296 нм, при котором происходит эмиссия только остатков триптофана, приводит к сдвигу максимума спектра в длиноволновую область всего на 3 нм. Квантовые выходы в обоих случаях сравнимы. На этом основании можно утверждать, что при возбуждении порина в ДОХ при 280 нм наблюдается преимущественно эмиссия

остатков триптофана, несмотря на присутствие в белке большого количества остатков тирозина [38].

Связывание порина с ЛПС приводит к уменьшению интенсивности излучения белка, длина волны максимума спектра сохраняется. Это свидетельствует о том, что микроокружение остатков триптофана в молекуле белка не изменяется, а тушение их эмиссии обусловлено внутри- и межмолекулярными взаимодействиями. На рис. 1 приведен пример тушения собственной белковой флуоресценции порина при титровании его ЛПС-1. Нелинейное уменьшение интенсивности флуоресценции белка в процессе комплексообразования предполагает сложный характер взаимодействия порина и ЛПС.

-1-1-1-1-1-1-1-1—

320 340 360 х

Рис. 1. Спектры флуоресценции порина в отсутствии (верхний) и в присутствии ЛПС-1 (все остальные), ^возб. = 280 нм.

Кривые насыщения, построенные в координатах: 9 = f ([ЛПС]общ.) (рис.2), имеют сигмоидноподобный характер для всех исследуемых лигандов, что свидетельствует о сложности и специфичности взаимодействия порина с ЛПС, а также о наличии на макромолекуле белка нескольких неидентичных мест связывания, взаимозависимых друг от друга [39].

Экспериментальные данные по связыванию порина с исследуемыми образцами ЛПС, представленные в виде графиков Скэтчарда (рис. 3), свидетельствуют о различиях в характере взаимодействия белка с лигандами, которые, скорее всего, определяются особенностями строения молекулы ЛПС

п I I I I I I I I I I I I

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

[ЛПСЬбщхЮ5, М

Рис.2. Зависимость степени насыщения мест связывания на молекуле порина (6) от концентрации ЛПС.

Рис.3. Графики Скэтчарда для взаимодействия порина с R-ЛПС (1) и S-ЛПС (2-4) Параметры связывания порина с исследованными образцами ЛПС, различающимися длиной О-специфических полисахаридных цепей и степенью ацилирования липида А, представлены в таблице 2.

Таблица 2. Параметры комплексообразования порина с ЛПС.

ЛПС Константа ассоциации, М-1 Коэфф. Хилла

К1 К2 Кз

ЛПС-1 1,0104 1,8-104 - 1,8

ЛПС-2 3,3-105 1,1-106 2,0-104 2,8

ЛПС-3 1,3105 4,4-105 2,7-104 2,6

ЛПС-4 4,2-104 9,0-103 - 0,75

Для ЛПС-1, который является Я-ЛПС с небольшой степенью ацилирования (12,4%), график Скэтчарда имеет вид выпуклой линии (рис. 3, кривая 1). Такая форма кривой Скэтчарда предполагает кооперативное взаимодействие рецептора и лиганда [39], однако величины констант ассоциации отличаются незначительно (табл. 2). Исходя из строения ЛПС-1, можно предположить, что связывание его с порином идет по двум типам сайтов: по олигосахариду кора и по липиду А. Следует отметить, что подобный вид кривой графика Скэтчарда (выпуклая линия) может быть обусловлен гетерогенностью лиганда [40]. Поскольку в эксперименте были использованы достаточно узкие фракции ЛПС, полученные избирательной экстракцией, то результаты, скорее всего, свидетельствуют о существовании на молекуле порина двух типов мест связывания, различающихся по аффинности.

Усложнение молекулы ЛПС-2 за счет присоединения одного О-специфического полисахаридного звена (табл. 1) приводит к колоколообразному виду кривой Скэтчарда с переходом в вогнутую линию при высокой степени насыщения мест связывания на молекуле порина лигандом (рис. 3, кривая 2). График Скэтчарда для ЛПС-3 (рис.3, кривая 3), который имеет в своем составе четыре О-специфических звена, подобен графику, полученному для ЛПС-2. Однако в этом случае насыщение мест связывания на молекуле белка происходит при более низких концентрациях лиганда, чем для ЛПС-2. Возможно, это объясняется увеличением гидрофильности молекулы ЛПС-3 за счет наличия более длинных О-полисахаридных цепей (табл. 1) и, как следствие, лучшей растворимостью данного образца [41].

В качестве лиганда с высокой степенью ацилирования (66%) использовали ЛПС-4, длина полисахаридной цепи которого была такой же, как и для ЛПС-3. Как видно из рис. 3 (кривая 4), увеличение степени гидрофобности липида А приводит к кардинальному изменению характера связывания ЛПС с порином. Об этом свидетельствует вогнутая кривая Скэтчарда, на которой можно выделить два участка связывания. Такой вид графика означает связывание лиганда с двумя типами независимых сайтов или указывает на антикооперативный процесс взаимодействия рецептора и лиганда, когда присоединение лиганда идет в первую очередь по более аффинным сайтам. Как известно [39], дискриминация этих двух моделей рецепторного связывания представляет собой сложную задачу даже для простейших молекул. Для ЛПС-4, учитывая сложность взаимодействующих молекул, представляется возможным ограничиться только рассмотрением величин констант связывания К1 и К2. Сравнение их говорит в пользу антикооперативного характера связывания этого образца ЛПС с порином (табл. 2).

Ранее [10], в процессе изучения связывания радиоактивно-меченых Б- и Я- ЛПС с иммобилизованным на сефарозе тримером порина, были определены основные черты взаимодействия ЛПС и белка. Показано, что на молекуле порина существуют различные типы сайтов, специфичных к структурным фрагментам молекулы ЛПС. Структура лиганда определяет характер взаимодействия с белком, доминирующую роль в этом взаимодействии играет липид А. Участки, специфичные к липиду А и олигосахариду кора, представляют собой два типа независимых сайтов взаимодействия с порином [10, 42], появление в структуре ЛПС О-специфических цепей приводит к кооперативному процессу связывания [10]. Наиболее подходящим объяснением наблюдаемой кооперативности признано создание относительно высокой локальной концентрации ЛПС на соседних сайтах молекулы белка, что, в свою очередь, обеспечивает возможность стабилизации комплекса за счет углевод-углеводных взаимодействий, описанных для агрегатов ЛПС [43].

Полученные нами результаты не противоречат вышеприведенным особенностям ЛПС-белкового взаимодействия. Однако анализ полученных данных, с учетом условий проведения эксперимента, и сравнение их с выводами предыдущих исследований позволяют сделать некоторые уточнения к предполагаемому механизму взаимодействия порина и ЛПС.

Выбранный нами подход - мониторинг изменения собственной белковой флуоресценции порина - позволяет регистрировать суммарный эффект, наблюдающийся в результате изменения конформации белка в процессе связывания с ЛПС. Ранее мы показали [35], что локальная третичная структура порина из псевдотуберкулезного микроба чувствительна к природе детергента, используемого для солюбилизации белка. Как известно [44], пространственная структура интегральных белков в растворах неионных детергентов максимально приближена к таковой в нативной мембране. В отличие от ионных детергентов (например, БОБ), образующих в растворах смешанные с белком мицеллы сферической или эллипсоидной формы и полностью покрывающих поверхность белковой глобулы от воды, для неионных детергентов характерно образование так называемых мицеллоподобных структур. В этом случае молекулы детергента закрывают только гидрофобную поверхность белка, а гидрофильные участки остаются доступными воде. Возможно, именно эти особенности конформационного состояния белка в присутствии ДОХ определяют "равновероятное" взаимодействие с ЛПС по гидрофобным и гидрофильным сайтам. В пользу такого предположения свидетельствует и тот факт, что К1 и К2 при взаимодействии с Я-ЛПС, как в случае иммобилизованного белка в растворе БББ [10], так и солюбилизированного в БОХ

порина, близки по значению. Иными словами, при взаимодействии порина с Я-ЛПС сайты, специфичные для липида А и кора, близки по аффинитету. Однако в зависимости от условий эксперимента (использование БББ или ДОХ) сайты могут быть "независимыми" или "взаимодействующими", что и будет определять характер связывания. Так, кривая, описывающая процесс взаимодействия иммобилизованного порина с Я-ЛПС в присутствии БББ [10] типична для связывания по независимым сайтам различного типа. Напротив, для солюбилизированного в ДОХ белка, сохраняющего способность "свободного" изменения конформации в процессе связывания, мы наблюдали слабокооперативное взаимодействие этих же участков связывания, о чем свидетельствует коэффициент Хилла, равный 1,8.

Согласно пространственной модели порина [45], неупорядоченные и а-спиральные участки полипептидной цепи белка располагаются в области так называемых петель, соединяющих в-тяжи. Исходя из этого, можно предположить, что в отличие от участков, специфичных к липиду А и расположенных, скорее всего, на белковой поверхности, погруженной в мембрану[45], сайты связывания белка с олигосахаридом кора находятся на участке полипептидной цепи, экспонированном на поверхность мембраны. Скорее всего, это область петель, содержащая наибольшее количество гидрофильных аминокислотных остатков в структуре порина и способная в силу своей природы взаимодействовать с ионными группами олигосахарида кора [45].

В случае Б-ЛПС (ЛПС-2 и ЛПС-3) взаимодействие с белком описывают колоколообразные кривые, заканчивающиеся вогнутыми линиями (рис.3). Такой вид кривой графика Скэтчарда наблюдается уже для ЛПС-2, молекула которого отличается от молекулы Я-ЛПС добавлением только одной О-специфической полисахаридной цепи. Вид кривой сохраняется при взаимодействии белка с ЛПС-3, который содержит четыре полисахаридных звена. Анализ кривых связывания порина с Б-ЛПС, выполненный путем аппроксимации их к различным моделям взаимодействия, показал, что наиболее подходящей является модель связывания по трем типам сайтов. Возможно, это свидетельствует о наличии на молекуле белка трех участков, различающихся по специфичности и соответствующих трем фрагментам молекулы Б-ЛПС. Поскольку в литературе имеются данные о том, что каждый из фрагментов молекулы Б-ЛПС ингибирует реакцию взаимодействия с порином примерно в одинаковой степени [10], можно предположить, что О-полисахаридные цепи непосредственно участвуют во взаимодействии с порином. Однако делать однозначные заключения о числе мест связывания и их взаимодействии в случае самоассоциирующих лигандов, к которым относится ЛПС, следует с осторожностью [46].

Судя по форме кривых Скэтчарда и величинам констант, в процессе образования комплекса порина с ЛПС-2 и ЛПС-3 характер связывания меняется: на первом этапе он является кооперативным с высокой степенью кооперативности (табл. 2), а затем при концентрации ЛПС, близкой к насыщению мест связывания на молекуле белка, проходит по независимым участкам связывания. Следует отметить, что даже небольшие различия в длине О -полисахаридных звеньев ЛПС-2 и ЛПС-3 приводят к существенным различиям в величине К2. Это, на первый взгляд, опосредованное влияние присутствия О-специфических цепей кажется нам достаточно важным. Скорее всего, оно свидетельствует в пользу того, что главным условием высокоаффинного, т.е. специфического, взаимодействия ЛПС и порина является наличие полной структуры ЛПС. Для объяснения такого результата, вероятно, необходимо учитывать, что биологическая система, в нашем случае, ЛПБК, фрагмент наружной бактериальной мембраны, принадлежит к системам с так называемой "осмысленной упорядоченностью" [47]. Это означает, что при образовании такой системы, помимо непременного выполнения термодинамических требований, определяющим становится "качество" информации, получаемой отдельными компонентами системы, иными словами, "узнавание" структуры.

В литературе известны подобные примеры. Так, при исследовании молекулярного механизма действия бактериальных эндотоксинов установлено [48], что особенности структуры липида А определяют взаимодействие ЛПС с белковыми рецепторами. Различные значения термодинамических параметров связывания, полученные для ряда модельных аминокислотных последовательностей, предполагаемых в качестве сайтов взаимодействия, свидетельствуют в пользу специфического узнавания молекулярной структуры липида А рецепторами на белке.

В отношении влияния О-специфических цепей на процесс взаимодействия порина с ЛПС было показано более высокое сродство Б-ЛПС к белку по сравнению с Я-ЛПС [6, 49]. Более того, даже в присутствии Я-ЛПС наблюдается предпочтительное взаимодействие порина из Е.еоМ с Б-ЛПС [5]. Полученные нами значения К1 и К2 для ЛПС-2 и ЛПС-3 имеют более высокие значения по сравнению с величинами соответствующих констант для ЛПС-1, что согласуется с литературными данными.

В ходе нашего эксперимента мы обнаружили резкое изменение характера связывания в случае высокоацилированного Б -ЛПС. Согласно литературным данным [49, 50], липид А играет доминантную роль во взаимодействии ЛПС с целым рядом ЛПС-связывающих белков. К подобному выводу привели и результаты по наибольшей активности липида А при ингибировании взаимодействия ЛПС с порином [9]. Это является косвенным доказательством определяющего влияния взаимодействия именно по этим, специфичным

к липиду А, сайтам на результирующий характер связывания ЛПС с порином. Однако эти сайты, обладающие наибольшим аффинитетом для ЛПС-1 - ЛПС-3, в случае аномально гидрофобного S-ЛПС (ЛПС-4) (а = 65%) обнаруживают значительно меньшее сродство к белку, на что указывает значение К2 (табл. 2). Очевидно, цепи алифатических жирных кислот, связанные с липидом А, создают столь существенные стерические затруднения, что изменяют характер взаимодействия порина с S-ЛПС. В отличие от S-ЛПС с невысокой степенью ацилирования (ЛПС-2 и ЛПС-3) оно становится антикооперативным.

Недавно появившиеся сообщения об определяющем значении локальной структуры липида А для проявления эндотоксической активности свидетельствуют в пользу такого объяснения [48, 51, 52]. При этом обнаружено, что именно ацильная часть липида А, т.е. число и длина ацильных остатков в-гидроксикарбоновых кислот, играет важную роль в регулировании конформации гидрофильного остова молекулы [48]. Наблюдается прямая корреляция между количеством и распределением ацильных остатков в дисахариде глюкозамина и конформацией молекулы липида А [51]. Для гекса- и пентаацилированных производных дисахарида глюкозамина, несущего два остатка фосфорной кислоты, характерна коническая форма молекулы липида А, когда поперечное сечение гидрофобной части молекулы превосходит по величине сечение гидрофильного остова [51]. Гидрофобное взаимодействие между ацильными цепями может удерживать дисахаридный остов в этой особой конформации, узнаваемой рецепторами. Изменение степени ацилирования и распределения ацильных остатков приводит к изменению конформации липида А, что, в свою очередь, и определяет характер взаимодействия молекулы ЛПС с мембраной клеток "хозяина" [51].

Таким образом, полученные нами данные о характере взаимодействия ЛПС и порина, двух основных компонентов наружной бактериальной мембраны, свидетельствуют об определяющем влиянии на процесс их связывания молекулярной и/пространственной структуры обоих компонентов. Наиболее значимыми являются изменения в конформации ЛПС, вызванные увеличением гидрофобной части молекулы. Конфомационное состояние порина определяется условиями солюбилизации белка конкретного эксперимента.

Литература

1. Hitchcock P.J., Morrison D.C. -Handbook of endotoxin:Chemistry of endotoxin (Rietschel E.T., ed). -1984. -Elsevier Inc., New York. -V. 1. -P. 339-375.

2. Lugtenberg B., van Alphen L.- Biochim. Biophis. Acta. -1983. -V. 737. -P.51-115

3. Sen K., Nikaido H. -J. Bacteriol. -1991. -V. 173. -P. 926-928.

4. Соловьева Т.Ф., Оводов Ю.С.-Биорган. химия. -1983. -Т. 9. -С.725-733.

5. Diedrich D.L., Stein M.A.,Schnaitman C. -J. Bacteriol. -1990. -V. 172. -P. 5307-5311.

6. Bornelit P., Bleschmidt D., Kleber H.-P. -Electrophoresis. -1990. -V. 10. -P.848-852.

7. Roque W.J., Coughlin R.T., McGroarty E.J. -J. Bacteriol. -1987. -V. 169. -P.4003-4010.

8. Федореева Л.И., Горбач В.И. -Биоорган. химия. -1993. -Т. 19. -С. 933-940.

9. Федореева Л.И., Соловьева Т.Ф. -Биорган. химия. -1995. -Т. 21. -С.17-23.

10. Набережных Г.А., Хоменко В.А., Красикова И.Н., Ким Н.Ю., Соловьева Т.Ф. -Биоорган. химия. -1996 -Т. 22. -С. 671-677.

11. Nurminen M., Lounatmaa K., Sarvas M., Makela P.H., and Nakae T. -J. Bacteriol. -1976. -V. 127. -P. 941-995.

12. Новикова О.Д., Федореева Л.И., Хоменко В.А., Портнягина О.Ю., Ермак И.М., Лихацкая Г.Н., Мороз С.В., Соловьева Т.Ф., Оводов Ю.С., Биоорган. химия. -1993 -Т. 19. -С. 536-547.

13. Laemmli U.K. -Nature. -1970. -V. 2. -P.-680-685.

14. Гааль Э., Медьеши Г., Верецкеи Л. -Электрофорез в разделении биологических макромолекул. М: Мир, 1982. С. 157.

15. Kashyar M.L., Hynd B.A., Robinson K.J. -J. Lipid Res. -1980. -V. 21. -P. 481-484.

16. Dubois M., Gelles K.A., Hamilton J.K., Rebers P.A., and Smith F. -Anal.Chem. -1956. -V. 28. -P. 350-356.

17. Burtseva T.I., Glebko L.I., Ovodov Yu.S. -Anal. Biochem. -1975. -V. 64. -P. 1-4.

18. Hitchcock P.I., Brown T.M. -J. Bacteriol. -1983. -V. 154. -P. 269-277.

19. Соловьева Т.Ф., Ермак И.М., Мороз С.В. и др. -Биол. Мембраны. -1988. -Т. 5. -С. 492-588.

20. Galanos С., Luderitz O., Westphal O. -Eur. J. Biochem. -1969. -V. 9. -P. 245-249.

21. Westphal O., Jann K. Meth. Carbohydr.Chem. 1965. V.5. P. 83-91.

22. Tomshich S.V., Gorshkova R.P., El'kin Yu.N., Ovodov Yu.S. -Eur. J. Biochem. -1976. -V. 65.-P. 193-199.

23. Томшич С.В., Горшкова Р.П., Елькин Ю.Н., Оводов Ю.С. -Химия природн. соедин. -1985. Т.-6. -С. 751-755.

24. Krasikova I.N., Khotimchenko S.V., Solov"eva T.F., Ovodov Yu.S. -Biochim. Biophys. Acta. -1985. -V. 1257. -P. 118-124.

25. Wollenweber H.W., Schlecht S., Luderitz O. -Eur. J. Biochem. -1983. -V. 130. -P. 167171.

26. Oberfelder R.W., Lee J.C. -Meth. Enzymol. -1985. -V. 117. -P. 385-388.

27. SchreierA.A., Schimmel P.R. -J. Mol. Biol. -1974. -V. 86. -P. 601-620.

28. Thakur A.K., Jaffe M.L., Roodbard D. -Anal. Biochem. -V. 107. -P. 279-295.

29. Мецлер Д. -Биохимия. -М: Мир, 1980. Т. 1. С.262.

30. Krasikova I.N., Gorbach V.I., Solov"eva T.F., Ovodov Yu.S. -Eur. J. Biochem. -1978. -V. 89. -P. 287-289.

31. Krasikova I.N., Gorbach V.I., Isakov V.V., Solov"eva T.F., Ovodov Yu.S. -Eur. J. Biochem. -1982. -V. 126. -P. 349-351.

32. Krasikova I.N., Luk"yanov P.A., Gorbach V.I., Solov"eva T.F., Ovodov Yu.S. -Experienta. -1984. -V. 40. -P.709-710.

33. Issaeva M.P., Abdurashidov M.A., Akishev A.G., Gonchar D.A., Novikova O.D., Vostrikova O.P., Portnyagina O.Yu., Solov"eva T.F., Rasskazov V.A., Degtyarev S.Kh. -Thesis 8th Intern. Symp. Yersinia. -2002. -Turku, Finland.

34. Новикова О.Д., Зыкова Т.А., Ядыкина Г.М., Глазунов В.П., Соловьева Т.Ф., Оводов Ю.С., -Биол. мембраны. -1985. -Т. 2. -C. 714-723.

35. Новикова О.Д., Ким Н.Ю., Глазунов В.П., Вакорина Т.И., Набережных Г.А., Лихацкая Г.Н., Хоменко В.А., Соловьева Т.Ф. -Биоорган. химия -1999. Т. 25. С. 97-106.

36. Todt J.C., Roque W.J., McGroatry E.J. -Biochemistry. -1992. -V. 31, P 10471-10478.

37. Соловьева Т.Ф., Бахолдина С.И., Ермак И.М., Хоменко В.А., Федореева Л.И., Новикова О.Д., Фролова Г.М., Лихацкая Г.Н., Оводов Ю.С. -Биоорган. химия. -1990. -Т. 16. -С. 1301-1309

38. Лакович Д. -Основы флуоресцентной спектроскопии. -М: Мир, 1986. С.351.

39. Варфоломеев С.Д., Гуревич К.Г. -Биокинетика. -М: Фаир-пресс. -1999. -С. 390399.

40. Mendel C.M., Licko V., Kone J.P. -J. Biol. Chemistry.-1985.- V. 260. -P. 3451-3455

41. Aurell C.A., Wistrom A O. -Biochem. Biophys. Res. Com. -1998. -V. 253. -P. 119-123.

42. Yamada H., Mizushima S. -Eur. J. Biochem. -1980. -V. 103.- P. 209-218.

43. Peterson A.A., Haug A., McGroarty E.J. -J. Bacteriol. -1986. -V. 165. -P. 116-122.

44. Helenius A., Simons L. -Biochim. Biophys. Acta. -1975. -V.415. -P.29-79.

45. Jap B.K., Wilian P.J. -Physical. Rev. -1996. -V. 76. -P. 1073-1088.

46. Ishida T., Horiike K., Tojo H., Nozaki M. -J. Theor. Biol. -1988. -V. 130. -P. 49-66.

47. Блюменфельд Л.А. -Проблемы биологической физики. -М.: Наука.-1977. -с.336.

48. Fukase K., Oikawa M., Suda Y., Lui W.-C., Fukase Y., Shintaku T., Sekljic H., Yjshizaki H., Kusumoto S. -J. Endotoxin Res. -1999. -V. 5.-P. 46-51.

49. Wilkinson S.G. -Progress Lipid Res. -1996. -V. 165. -P. 116-122.

50. Ohno N., Morrison D C. -Biol. Chemistry.-1989.- V. 264. -P. 4434-4441.

51. Fukuoka S., Brundenburg K., Muller M., Linder B., Koch M.H.J., Seydel U. -Biochim. Biophys. Acta. -2001. -V. 1510. -P. 185-197.

52. Frecer V., Ho B., Ding J.L. -Eur. J. Biochem. -2000. -V.267. -P. 837-852.