Влияние гипоксена и нестероидных противовоспалительных средств на структурно-функциональное состояние подколенных лимфатических узлов при остром воспалении

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

УДК 615.015.21:615.276

ВЛИЯНИЕ ГИПОКСЕНА И НЕСТЕРОИДНЫХ ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ СРЕДСТВ НА СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ ПОДКОЛЕННЫХ ЛИМФАТИЧЕСКИХ УЗЛОВ ПРИ ОСТРОМ ВОСПАЛЕНИИ © Илюхин С.А., Платонов И.А., Новиков В.Е.

Смоленская государственная медицинская академия, Россия, 214019, Смоленск, ул. Крупской, 28

Резюме: Представлены результаты исследования объема конечности и особенностей морфофункциональных изменений левого подколенного лимфатического узла крыс на 1, 7, 14 и 30 сутки при каррагенин-индуцированном воспалении и его фармакологической коррекции антигипоксантом гипоксеном с нестероидными противовоспалительными средствами -ацетилсалициловой кислотой и диклофенаком. Установлено, что гипоксен в комбинации с диклофенаком или ацетилсалициловой кислотой наиболее эффективно, по сравнению с моновведением препаратов, уменьшали величину объема конечности, продолжительность воспаления и выраженность структурно-функциональных изменений подколенных лимфатических узлов.

Ключевые слова: гипоксен, нестероидные противовоспалительные средства, морфометрия, подколенные лимфатические узлы, острое воспаление

IMPACT OF HYPOXENS AND NSAIDS ON STRUCTURAL AND FUNCTIONAL STATE OF THE POPLITEAL LYMPH NODES IN ACUTE INFLAMMATION Ilyukhin S.A., Platonov I.A. , Novikov V.E.

Smolensk State Medical Academy, 214019, Krupskaya St., 28, Smolensk, Russia

Summary: Results of the study of the limbs and features of morphological and functional changes in the left popliteal lymph node in rats at 1, 7, 14 and 30 days in carrageenan-induced inflammation and pharmacological correction of antihypoxant hypoxen and anti-inflammatory drugs - acetylsalicylic acid and diclofenac have been presented in the study. It has been found out that hypoxen in combination with aspirin or diclofenac provides the most effective results reducing the size of a limb, course and severity of inflammation as well as structural and functional changes in the popliteal lymph node.

Key words: hypoxen, non-steroidal anti-inflammatory drugs, morphometry, popliteal lymph nodes, acute inflammation

Введение

Важная роль в защитных реакциях организма при эндотоксических состояниях, например, при воспалительном процессе, принадлежит лимфатическим узлам [2]. При воспалении происходят структурно-функциональные изменения в лимфатических узлах, по выраженности которых можно оценивать тяжесть воспалительного процесса. Препаратами выбора при фармакотерапии воспалительных процессов являются нестероидные противовоспалительные средства [3]. В литературе отсутствуют данные по изучению совместного действия нестероидных противовоспалительных средств (НПВС) и антигипоксантов на лимфатические узлы в зоне воспаления.

Целью работы явилось изучение влияния гипоксена, НПВС и их комбинаций на динамику изменений в лимфатических узлах при каррагенин-индуцированном воспалении с 1-х по 30 сут.

Методика

Опыты проведены на 175 крысах-самцах линии Wistar массой 160-220 г. Моделирование каррагенин-индуцированного воспаления лапы крыс воспроизводили путем субплантарного введения 0,1 мл 1% водного раствора каррагенина в левую заднюю лапу опытным группам крыс [4]. Контрольной группе животных вводили равный объем растворителя. Препараты вводили внутрижелудочно в эффективных противовоспалительных дозах: гипоксен - 50 мг/кг, кислоту

ацетилсалициловую - 100 мг/кг (АСК), диклофенак - 8 мг/кг. Исследуемые препараты вводили животным за час до индукции воспаления и далее однократно ежедневно в течение 1, 7, 14 и 30 сут. в виде водного раствора. При комбинированном применении вещества вводили с интервалом 1 ч. В динамике измеряли объем левой конечности животных спустя 1, 7, 14 и 30 сут. методом плетизмометрии [6]. После этого животных декапитировали для извлечения подколенных лимфатических узлов (ПЛУ). Материал (ПЛУ) фиксировали в 10% нейтральном формалине. Заливали парафиновые блоки с добавлением 5-6% чистого воска. Срезы с блоков делали через середину лимфатических узлов, вдоль их продольной оси. Толщина срезов составляла 5-7 мкм. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином [5]. Окрашенные препараты заключали в пихтовый бальзам и накрывали покровным стеклом. После этого проводили измерение площади структур лимфатического узла окулярной сеткой (100 точек) Г.Г. Автандилова в 10 полях зрения [1]. При наложении сетки считали точки, выпадающие на профили структур лимфатического узла при увеличении х400. Проводили измерение площади следующих структурно-функциональных элементов ПЛУ: корковое и мозговое вещество, краевой и мозговой синусы, мозговые тяжи.

Результаты исследования

При индукции воспаления каррагенином (3табл. 1) установлено, что объем конечности увеличивался в течение 3 ч. до 2,38±0,06 см (р<0,05), достигая максимума, и сохранялась в течение 30 сут. (2,38±0,06 см3 (р<0,05)). При использовании АСК объем конечности увеличился до 1,79±0,03 см3 (р<0,05), при этом достоверное уменьшение до уровня контрольных животных наблюдалось спустя 14 сут. На фоне введения диклофенака объем конечности изменялся незначительно (1,48±0,01 см3) и статистически достоверно не отличался от значений контрольной группы. В опытной группе, где применялся гипоксен, объем конечности составил 2,11±0,08 см3 (р<0,05) и статистически достоверно не достигал исходного уровня спустя 30 сут. (1,68±0,05 см3 (р<0,05)). На фоне регулярного введения комбинации гипоксена и АСК величина отека конечности составила 1,58±0,04 см3 и к 7 сут. достоверно не отличался от значений контрольной группы. Диклофенак в комбинации с гипоксеном проявлял противовоспалительный эффект в первые сутки после индукции воспаления, который выражался в минимальном увеличении объема конечности (1,43±0,02 см3).

Таким образом, наиболее быстрое восстановление объема конечности наблюдалось при действии диклофенака и диклофенака в комбинации с гипоксеном.

Таблица 1. Влияние гипоксена и НПВС на динамику каррагенин-индуцированного воспаления

Группы животных

Доза Исходное Сутки

мг/кг состояние 1 7 14 30

Контрольная группа 1,33 ±0,04 1,35 ±0,05# 1,34 ±0,06# 1,33 ±0,03# 1,33 ±0,05#

Каррагенин 1,32 ±0,04 2,38 ±0,06* 2,34 ±0,03* 2,31 ±0,04* 2,17 ±0,03*

АСК 100 1,31 ±0,03 1,79 ±0,03*# 1,69 ±0,03*# 1,47 ±0,03# 1,32 ±0,03#

Диклофенак 8 1,32 ±0,02 1,48 ±0,01# 1,32 ±0,01# 1,32 ±0,01# 1,32 ±0,02#

Гипоксен 50 1,31 2,11 1,95 1,85 1,68

±0,05 ±0,08*# ±0,04*# ±0,06*# ±0,05*#

Гипоксен 50 1,31 1,58 1,38 1,33 1,32

+АСК 100 ±0,05 ±0,04*# ±0,04# ±0,06# ±0,03#

Гипоксен 50 1,32 1,43 1,32 1,32 1,32

+Диклофенак 8 ±0,02 ±0,02# ±0,02# ±0,02# ±0,02#

Примечание: * - различие с контролем статистически значимо

При морфологическом исследовании ПЛУ наблюдались следующие изменения: лимфатический узел крыс в контрольной группе имеет округлую бобовидную форму, розовато-серый цвет. Размером 1-1,5 мм. При извлечении легко отделяется, не спаян с окружающими тканями. На срезе

четко проявляется паренхиматозное строение органа. В узле можно выделить корковое и мозговое вещество, капсулу, трабекулы, краевой и мозговой синусы, мозговые тяжи.

Таблица 2. Изменения площади структурно-функциональных элементов лимфатических узлов при каррагенин-индуцированном воспалении и его коррекции

Период после индукции Группы Экспериментальная модель каррагенинового воспаления

животных, (п=7) Корковое вещество Мозговое вещество Краевой синус Мозговой синус Мозговой тяж

воспаления Контрольная 0,480 0,369 0,005 0,182 0,247

группа ±0,0060# ±0,006# ±0,00085# ±0,0046# ±0,0052#

Каррагенин 0,632 0,312 0,015 0,230 0,316

±0,0060* ±0,0055* ±0,0014* ±0,0050* ±0,0055*

АСК 0,543 0,351 0,015 0,192 0,248

я и ±0,0060*# ±0,0057*# ±0,0015* ±0,0047# ±0,0052#

о Диклофенак 0,520 ±0,0060*# 0,379 ±0,0058# 0,011 ±0,0013* 0,180 ±0,0046# 0,249 ±0,0052#

Гипоксен 0,548 0,339 0,015 0,232 0,272

±0,0060*# ±0,0056*# ±0,0014* ±0,0050* ±0,0053 *#

Гипоксен 0,515 0,376 0,009 0,174 0,244

+АСК ±0,0060*# ±0,0058# ±0,0011*# ±0,0045# ±0,0051#

Гипоксен 0,500 0,370 0,011 0,169 0,240

+Диклофенак ±0,0060*# ±0,0058# ±0,0013* ±0,0045 *# ±0,0051#

Каррагенин 0,680 0,213 0,030 0,271 0,362

±0,0060* ±0,0049* ±0,0020* ±0,0053* ±0,0057*

АСК 0,609 0,319 0,021 0,191 0,270

я ±0,0060*# ±0,0056*# ±0,0017*# ±0,0047# ±0,0053 *#

и н с Диклофенак 0,578 ±0,0060*# 0,339 ±0,0056*# 0,015 ±0,0014*# 0,174 ±0,0045# 0,230 ±0,0050*#

Гипоксен 0,689 0,275 0,020 0,227 0,316

±0,0055* ±0,0053*# ±0,0017*# ±0,0050*# ±0,0055 *#

Гипоксен 0,572 0,350 0,015 0,189 0,241

+АСК ±0,0060*# ±0,0057*# ±0,0014*# ±0,0047# ±0,0051#

Гипоксен 0,531 0,369 0,014 0,177 0,242

+Диклофенак ±0,0060*# ±0,0058# ±0,0014*# ±0,0046# ±0,0051#

Каррагенин 0,629 0,278 0,025 0,253 0,312

±0,0058* ±0,0053* ±0,0019* ±0,0052* ±0,0055*

АСК 0,538 0,310 0,014 0,198 0,270

я ±0,0059*# ±0,0055*# ±0,0014*# ±0,0048*# ±0,0053 *#

и н с Диклофенак 0,520 ±0,0060*# 0,377 ±0,0058# 0,012 ±0,0013*# 0,172 ±0,0045 *# 0,250 ±0,0052#

Гипоксен 0,620 0,302 0,015 0,210 0,249

±0,0058* ±0,0055*# ±0,0014*# ±0,0049*# ±0,0052#

Гипоксен 0,519 0,341 0,012 0,168 0,240

+АСК ±0,0060*# ±0,0057*# ±0,0013*# ±0,0045 *# ±0,0051#

Гипоксен 0,500 0,359 0,010 0,170 0,240

+Диклофенак ±0,0060*# ±0,0057# ±0,0012*# ±0,0045 *# ±0,0051#

Каррагенин 0,629 ±0,0058* 0,278 ±0,0053* 0,021 ±0,0017* 0,200 ±0,0048* 0,281 ±0,0054*

АСК 0,538 0,310 0,009 0,172 0,246

±0,0059*# ±0,0055*# ±0,0011*# ±0,0045# ±0,0051#

к Диклофенак 0,520 0,377 0,009 0,164 0,239

о ±0,0060*# ±0,0058# ±0,0011*# ±0,0044*# ±0,0051#

Гипоксен 0,620 0,302 0,010 0,187 0,253

О") ±0,0058* ±0,0055*# ±0,0012*# ±0,0046# ±0,0052#

Гипоксен 0,519 0,341 0,013 0,189 0,250

+АСК ±0,0060*# ±0,0057*# ±0,0014*# ±0,0047 ±0,0052#

Гипоксен 0,500 0,359 0,008 0,166 0,240

+Диклофенак ±0,0060*# ±0,0057# ±0,0010*# ±0,0044*# ±0,0051#

Примечание: * - различие с контролем статистически значимо

Лимфатические узлы опытных животных увеличены, особенно с левой стороны (со стороны введения каррагенина). При макроскопии заметно напряжение капсулы ПЛУ. Снаружи

5

лимфатические узлы имели кирпичную окраску и бугристую поверхность. На разрезе все ПЛУ сочные, поверхность несколько выбухает над капсулой. Заметно некоторое увеличение коркового вещества, расширение краевого синуса, увеличение мозговых тяжей.

При фармакологической коррекции изучаемыми НПВС происходит уменьшение размеров ПЛУ, снижение напряжения капсулы, ПЛУ имеют розовато-серый цвет по сравнению с опытной группой, которой вводили каррагенин. Данные изменения незначительно выражены при введении комбинации гипоксена с АСК и гипоксена с диклофенаком. При микроскопическом изучении ПЛУ на фоне введения каррагенина происходят структурные изменения (табл. 2), а именно: увеличение площади коркового вещества (0,632±0,0060 (р<0,05)), уменьшение площади мозгового вещества (0,312±0,0055 (р<0,05)), увеличение краевых (0,015±0,0014 (р<0,05)) и мозговых (0,230±0,0050 (р<0,05)) синусов, мозговых тяжей (0,316±0,0055 (р<0,05)). Данные изменения характерны для всего периода наблюдения. На фоне действия препаратов к 30 сут. все структурно-функциональные элементы ПЛУ оставались увеличенными. Установлено, что спустя 1 сут. происходила нормализация показателя площади мозгового вещества на фоне комбинации диклофенака с гипоксеном (0,359±0,0057). На фоне действия всех препаратов значение площади мозгового тяжа возвращались к исходным значениям на 30 сут.

Полученные данные не позволяют однозначно судить об изменениях в ПЛУ при действии препаратов. В связи с этим были введены следующие коэффициенты для - К1л (отношение площади коркового и мозгового вещества), К2л (краевой синус / мозговой синус), К3л (мозговые тяжи / мозговое вещество). В контрольной группе получены следующие значения показателя К1л, К2л, Кэл - 1,303±0,0271, 0,026±0,0042, 0,671±0,0148, соответственно (табл. 3). На фоне каррагенина происходило достоверное увеличение К1л, К2л и К3л, которое достигало максимума спустя 7 сут. (3,200±0,0151, и 1,902±0,0060 и 1,702±0,0095 (р<0,05)). Спустя 30 сут. значения данных коэффициентов на фоне каррагенина уменьшились до 1,728±0,0079, 1,318±0,0032 и 0,850±0,0032 (р<0,05). На фоне АСК наблюдалось достоверное снижение исследуемых коэффициентов, но спустя 30 сут. после индукции воспаления нормализация не отмечалась. На фоне диклофенака выявлено волнообразное течение воспаления. Гипоксен проявлял слабое действие, исследуемые коэффициенты изменялись незначительно, имея тенденцию к уменьшению. При введении гипоксена совместно с АСК в площади структурно-функциональных элементов ПЛУ отмечаются изменения, подобные таковым на фоне АСК, при этом величина ни одного показателя из исследуемых коэффициентов не возвращалась к исходным значениям. При введении гипоксена и диклофенака отмечены минимальные изменения величины исследуемых коэффициентов - к 30 сут. происходит нормализация К1л и К3л.

Обсуждение результатов исследования

При анализе данных динамики изменений объема конечности установлено, что гипоксен оказывает незначительное противовоспалительное действие, а в комбинации с АСК и диклофенаком потенцируют их противовоспалительный эффект. Введение каррагенина вызывает структурно-функциональные изменения в ПЛУ. При анализе данных, полученных при морфометрии, установлено, что в течение всего периода наблюдения отсутствует восстановление значений площади краевых и мозговых синусов, причем изменения краевых синусов были наиболее значительными. Данные изменения в синусах указывают на повышение количества лимфы внутри лимфатического узла, что создает условия для освобождения лимфы. Предположительно увеличение площади коркового вещества, особенно мозговых тяжей может свидетельствовать о нарастании В-клеточного иммунитета при экспериментальном воспалении и его фармакологической коррекции, причем, исходя из полученных данных коэффициент отношения площади мозгового вещества к площади мозгового тяжа увеличивается за счет изменений площади мозгового тяжа. Таким образом, как показал проведенный анализ наиболее эффективной противовоспалительной комбинацией оказались диклофенак и гипоксен в комбинации с диклофенаком. Их влияние на величину объема конечности и структурно-функциональные изменения элементов ПЛУ, возможно связано с подавлением синтеза простагландинов со стороны диклофенака и снижением процессов свободнорадикального окисления со стороны гипоксена, что вызывает синергический эффект. В связи с этим при введении исследуемых веществ происходит динамическая нормализация структуры ПЛУ.

Таблица 3. Изменения коэффициентов отношения площадей структурно-функциональных элементов лимфатических узлов при каррагенин-индуцированном воспалении и его коррекции

Период Группы животных, Экспериментальная модель каррагенинового воспаления

после индукции (n=7) К1л К2л К3л

воспаления Контрольная группа 1,303±0,0271# 0,026±0,0042# 0,671±0,0148#

Каррагенин 2,038±0,0586* 0,065±0,0030* 1,017±0,0257*

АСК 1,547±0,0093*# 0,080±0,002*# 0,706±0,0059*#

Диклофенак 1,372±0,0029*# 0,062±0,0050* 0,656±0,0052#

и н Гипоксен 1,618±0,0206*# 0,064±0,0030* 0,805±0,0146*#

0J Гипоксен +АСК 1,369±0,0030*# 0,053±0,0040*# 0,650±0,0034#

Гипоксен +Диклофенак 1,352±0,0051# 0,067±0,0037* 0,647±0,0038#

Каррагенин 3,200±0,0151* 0,112±0,0041 * 1,702±0,0095*

АСК 1,907±0,0084*# 0,111±0,0036* 0,845±0,0059*#

s Диклофенак 1,704±0,0049*# 0,0846±0,0021*# 0,679±0,0041#

H Гипоксен 2,515±0,0586*# 0,089±0,0031*# 1,155±0,0350*#

Гипоксен +АСК 1,633±0,0075*# 0,079±0,0051*# 0,687±0,0046#

Гипоксен +Диклофенак 1,436±0,0034*# 0,076±0,0029*# 0,655±0,0041#

Каррагенин 2,263±0,0126* 0,100±0,0015* 1,122±00,0047*

АСК 1,737±0,0071*# 0,072±0,0026*# 0,872±0,0032*#

s и Диклофенак 1,380±0,0064*# 0,070±0,0063*# 0,663±0,0034#

о Гипоксен 2,055±0,0062*# 0,071±0,0026*# 0,825±0,0046*#

Гипоксен +АСК 1,523±0,0034*# 0,069±0,0025*# 0,704±0,0042*#

Гипоксен +Диклофенак 1,395±0,0070*# 0,058±0,0043*# 0,670±0,0022#

Каррагенин 1,728+0,0079* 0,106±0,0055* 0,850±0,0032*

АСК 1,484±0,0166*# 0,052±0,0038*# 0,704±0,0041 *#

s и H Диклофенак 1,328±0,0083# 0,056±0,0027*# 0,636±0,0109#

о Гипоксен 1,654±0,0211 *# 0,057±0,0057*# 0,767±0,0131*#

о Гипоксен +АСК 1,642±0,0174*# 0,070±0,0078*# 0,747±0,0129*#

Гипоксен +Диклофенак 1,317±0,0145# 0,047±0,0019*# 0,638±0,0066*#

Примечание: К^ - отношение площади коркового вещества к площади мозгового вещества; К^ отношение площади краевого синуса к площади мозгового синуса; К3л отношение площади мозгового тяжа к площади мозгового вещества. * - различие с контролем статистически значимо

Выводы

1. При введении каррагенина возникают структурно-функциональные изменения левого подколенного лимфатического узла: увеличение площади коркового вещества, уменьшение площади мозгового вещества, увеличение краевых и мозговых синусов, мозговых тяжей.

2. На фоне действия диклофенака и комбинации гипоксена с диклофенаком происходит нормализация объема конечности и структурно-функциональных элементов подколенных лимфатических узлов.

3. Наиболее активное участие в процессе воспаления и противовоспалительном действии препаратов принимают синусы и корковое вещество подколенного лимфатического узла.

Литература

1. Автандилов Г.Г. Медицинская морфометрия. Руководство. - М.: Медицина, 1990. - 384 с.

2. Бородин Ю.И. Лимфатический узел как маркер средового прессинга на биосистему // Бюлл. СО РАМН. -1993. - №2. - C. 5-11.

3. Насонов Е.Л., Сигидин Я.А. Базисная терапия ревматоидного артрита в ранней стадии // Тер. архив. -1996. - №5. - С. 5-8.

4. Рейхарт Д.В., Фисенко В.П., Хабриев Р.У. и др. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. - М., 2000. - С. 234-241.

5. Ромейс Б. Микроскопическая техника. Пер. с нем. - М.: Иностранная литература, 1954. - 718 с.

6. Buttle G.A.H., D'Arcy P.F., Howard E.M. Plethysmometric measurement of swelling in the feet of small laboratory animals // Nature. - 1957. - 179. - P. 4560-4569.

Информация об авторах

Илюхин Сергей Алексеевич - аспирант кафедры фармакологии с курсом фармации факультета повышения квалификации и переподготовки специалистов ГБОУ ВПО «Смоленская государственная медицинская академия» Минздрава России. E-mail: chemtester@mail.ru

Платонов Игорь Александрович - доктор медицинских наук, профессор кафедры фармакологии с курсом фармации факультета повышения квалификации и переподготовки специалистов ГБОУ ВПО «Смоленская государственная медицинская академия» Минздрава России. E-mail: mtsasd-pia@yandex.ru

Новиков Василий Егорович - доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой фармакологии с курсом фармации факультета повышения квалификации и переподготовки специалистов ГБОУ ВПО «Смоленская государственная медицинская академия» Минздрава России. E-mail: novicov.farm@yandex.ru