Штамм бактерий Bacillus subtilis subsp. subtilis - антагонист фитопатогенных микромицетов с ростостимулирующими свойствами и микробный препарат на его основе для повышения продуктивности сельскохозяйственных растений и защиты их от грибных болезней
STRAIN OF BACILLUS SUBTILIS SUBSP. SUBTILIS BACTERIA - ANTAGONIST OF PHYTOPATHOGENIC MICROMYCETES WITH GROWTH-STIMULATING PROPERTIES AND MICROBIAL AGENT BASED THEREON FOR INCREASING THE PRODUCTIVITY OF AGRICULTURAL PLANTS AND PROTECTING FROM FUNGAL DISEASES

Группа изобретений относится к сельскохозяйственной микробиологии и биотехнологии, а именно к микробиологическим средствам контроля фитопатогенов и оптимизации минерального питания растений путем обработки семян перед посевом (или перед закладкой на хранение) и (или) растений по вегетации. Группа изобретений позволяет обеспечить биозащиту растений от грибных болезней, стимулировать рост растений и повысить урожайность сельскохозяйственных культур.
Защита сельскохозяйственных культур от грибных и бактериальных заболеваний остается актуальной проблемой растениеводства и земледелия. Широкое применение пестицидов привело к возникновению проблем накопления их остатков в почве, воздухе, воде и растениях. В результате происходит загрязнение продукции растениеводства и других отраслей сельского хозяйства с последующим поступлением вредных веществ в организм человека. Кроме того, сельскохозяйственная практика все чаще сталкивается с факторами снижения эффективности препаратов, вызванное возникновением форм фитопатогенных грибов и бактерий, устойчивых к фунгицидам. Вопрос защиты сельскохозяйственных культур от грибных болезней остается актуальным. В связи с этим возникает необходимость поиска альтернативных систем защиты растений от фитопатогенов.
К таким эффективным системам можно отнести биометод, среди задач которого является поиск новых штаммов-антагонистов, ингибирующих развитие и ограничивающих распространение возбудителей болезней, и создание на их основе биопрепаратов антифунгального и антибактериального действия, способных вывести производство сельскохозяйственных культур на экологически и экономически более целесообразный уровень.
Опыты последних лет свидетельствуют о перспективности использования спорообразующих бактерий рода Bacillus, которые проявляют высокую антагонистическую активность к широкому кругу фитопатогенных грибов и бактерий, не имеют негативного влияния на макроорганизмы и не загрязняют окружающую среду. Бактерии рода Bacillus эффективны и для повышения урожайности сельскохозяйственных культур с одновременным повышением экономии энергоресурсов за счет отказа или снижения доз при применении химических средств защиты растений и минеральных удобрений, улучшением фитосанитарного состояния почвы и получением экологически безопасной продукции растениеводства.
Известен штамм бактерий Bacillus subtilis 26D, депонированный в коллекции ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии под номером 128 (А.с. №1717156, опубл. 07.03.1992), который характеризуется высокой антагонистической активностью в отношении широкого спектра фитопатогенных бактерий и грибов. На основе штамма Bacillus subtilis 26D разработаны сухая и жидкая формы препарата фитоспорин (патент RU №2099947, опубл. 27.12.1997, патент RU №2129375, опубл. 27.04.1999), предназначенного для защиты различных видов растений от болезней.
В приведенных источниках описаны способ получения препарата, его применение и воздействие на возбудителя (поражаемость растений), при этом нет сведений о других полезных свойствах штамма-продуцента, в частности, о его влиянии на продуктивность растений.
Известен ряд штаммов бактерий рода Bacillus, применяемых для биологического контроля фитопатогенов и повышения продуктивности растений (патент RU №2337955, опубл. 10.11.2008 г; патент RU №2495119, опубл. 10.10.2013 г.; патент UA №121062, опубл. 25.03.2020 г.), а также для восстановления микробоценоза почвы (патент РФ №RU 2482174, опубл. 20.05.2013 г.).
Недостатками известных штаммов является недостаточно высокая фунгицидная активность, технологичность, узкий спектр полезных для растений свойств, что ограничивает их применение в агроценозах сельскохозяйственных культур. Важно отметить, что для известных штаммов нет или не раскрыты особенности совместного применения с клубеньковыми бактериями бобовых растений, которые, в свою очередь, чувствительны к фунгицидам, но их интродукция в почву (ризосферу) является необходимым элементом технологии выращивания нута, сои, гороха и других.
В основу изобретения поставлена задача получения более конкурентоспособного и эффективного штамма, имеющего антагонистическую активность к широкому спектру фитопатогенных грибов и широкий комплекс полезных для растений и почвы свойств, совместимого с ризобиями, а также разработки на его основе микробного препарата, оказывающего стимулирующее действие на рост и развитие растений, способствующего повышению их продуктивности и защите от грибных болезней.
Поставленная задача решена путем выделения штамма Bacillus subtilis subsp. subtilis 12501 НК, антагониста фитопатогенных микромицетов с ростостимулирующими свойствами и создания на его основе препарата для повышения продуктивности сельскохозяйственных растений и защиты их от грибных болезней.
Заявляемый штамм выделен из ризосферы разнотравья целины, которая располагается вблизи села Клепинино Красногвардейского района Республики Крым. Штамм выделен модифицированным методом накопительных культур (Берестецкий О.Α., Шерстобоев Н.К., Шерстобоева Е.В., Патыка В.Ф. Модифицированный метод накопительных культур для выделения симбиотрофных азотфиксирующих микроорганизмов // Микробиологический журнал. К. 1985. С.5-6). Первичная идентификация проведена по морфологическим, культуральным и биохимическим признакам штамма по Красильникову Н.А. (Красильников Н.А. Определитель бактерий и актиномицетов. - Изд. АН СССР, 1949. - 830 с.) и уточнена по определителю Берджи (Определитель бактерий Берджи. В 2-х т. Т.1: Пер. с англ. / Под ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита, Дж. Стейли С. Уилльямса. - М.: Мир, 1997. - 432 с.).
Генетическая идентификация выделенного штамма проведена секвенированием части гена 16S рРНК в ФГБНУ ВНИИСХМ в 2019 г. На основании проведенного анализа штамм идентифицирован как Bacillus subtilis subsp. subtilis 12501 НК и депонирован в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения ФГБНУ ВНИИСХМ под регистрационным номером RCAM05209.
Заявляемый штамм Bacillus subtilis subsp. subtilis 12501 НК интенсивно растет на мясопептонном агаре (ΜΠΑ). Клетки односуточной культуры штамма Bacillus subtilis subsp. subtilis 12501 НК имеют палочкообразную форму размером 0,6-0,7×2-5 мкм, подвижные, грамположительные. Эндогенная спора эллиптической формы центрально-терминального расположения, без заметного утолщения клетки. При росте на ΜΠΑ штамм образует колонии, размером от 2 до 4 мм (средняя), округлые с крупнозубчатым или лопастным краем, складчатой поверхностью, матовые, розового цвета, бугристые.
Рост биомассы бактерий при посеве штрихом на гороховом агаре интенсивный, штрих с розовым оттенком матовый с выделением капель блестящей жидкости, со средой не срастается. Споры образуются на 2-3 сутки.
Штамм Bacillus subtilis subsp. subtilis 12501 НК по отношению к кислороду определен как аэробный; положительная реакция на молоке с лакмусом; среду с глюкозой подкисляет, но газ не образует. Хорошо развивается на средах с солями аммония. На безазотистых средах рост слабый, споры не образует. Штамм Bacillus subtilis subsp. subtilis 12501 НК растет в температурных пределах от 10 до 35°С, оптимум роста 22-28°С. Рост культуры бактерий наблюдается в средах с диапазоном рН 6,0-8,5; оптимум рН - 7,0-7,2.
Коллекционную культуру хранят на среде ΜΠΑ или гороховом агаре с пересевом 1 раз в год.
3
Штамм продуцирует экзополисахариды (ЭПС) в количестве 33-35 мкг/см среды, что было установлено фенольно-серным методом (Захарова И.М, Косенко, Л.В. Методы изучения микробных полисахаридов. 1982. 67 с.) Экзополисахариды повышают адаптационный потенциал бактерий к негативным факторам окружающей среды, а также увеличивают их адгезию на семенах, корнях, листьях и т.д.
Bacillus subtilis subsp. subtilis 12501 НК растет на среде Гетчинсона с целлюлозой (фильтр, солома) в качестве единственного источника углерода. Это позволяет использовать штамм для разложения растительных остатков.
Штамм обладает антагонистической активностью к фитопатогенным микромицетам родов Fusarium, Bipolaris, Trichotecium. Антагонистические свойства штамма по отношению к фитопатогенным микромицетам исследовали методом перпендикулярных штрихов и методом агаровых блочков (Егоров Н.С. Основы учения об антибиотиках. - М.: Изд-во МГУ; Наука, 2004. - 528 с.). Эффект подавления грибов составляет 5-47 мм (таблица 1).
Штамм Bacillus subtilis subsp. subtilis 12501 НК продуцирует физиологически активные вещества - стимуляторы роста растений: ауксин подобные вещества (таблица 2) и гиббереллины (таблица 3). Способность штамма синтезировать экзогенные стимуляторы роста растений устанавливали фитотестом с использованием колеоптелей озимой пшеницы сорта Альбатрос Одесский (ауксины) и гипокотиля огурца сорта Лялюк (гиббереллины). В качестве контролей использовали дистиллированную воду и соответствующие аутентичные вещества.
В серии вегетационных опытов установлено, что предлагаемый штамм стимулирует рост и развитие растений, что выражается в прибавке сухой массы озимой пшеницы (таблица 4).
В условиях полевого опыта с пшеницей яровой сорта Харьковская 46 инокулирование штаммом Bacillus subtilis subsp. subtilis 12501 НК обеспечило прибавку урожая зерна 10,5% (таблица 5).
Предлагаемый штамм является биоагентом микробного препарата, который представляет собой жидкую производственную культуру с содержанием клеток не менее 1 млрд в 1 мл, метаболиты. Биопрепарат изготавливают в два этапа с получением маточной и рабочей культур.
Маточную культуру получают путем смыва со скошенного горохового агара биомассы клеток штамма в жидкую питательную среду следующего состава (г/л):
Гороховый отвар
- 10,0;
Сахар пищевой
- 20,0;
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
- 1,0;
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>
- 0,5;
K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>
- 0,5;
MgSO<sub>4</sub>⋅7H<sub>2</sub>O
- 0,3;
СаСО<sub>3</sub>
- 1,0
Штамм выращивают трое суток в колбах объемом 0,75 л или бутылях объемом 3 л с заполнением 30% объема на качалке при оборотах 200-220 в минуту и температуре 27-30°С и достижения титра 1,0-4,0 млрд. клеток в 1 мл.
Для получения рабочей культуры (препарата) оптимизированы компоненты среды и условия культивирования, позволившие повысить титр штамма на 16%.
Состав среды (г/л):
Меласса
- 25
Кукурузный экстракт
- 25
MgSO<sub>4</sub>⋅7H<sub>2</sub>O
- 0,3
CaCO<sub>3</sub>
- 1,0
Получают рабочую культуру в бутылях или ферментере путем инокуляции маточной культурой штамма Bacillus subtilis subsp. subtilis 12501 НК в количестве 5-7% от общего объема питательной среды и культивирования ее в течение трех суток при температуре 27-30°С и 200-220 оборотах в минуту до общего титра 1,3-2,0 млрд. клеток в 1 мл и титра спор - 1-1,6-1,2-1,8 млрд. (80-90%), обеспечивающего высокое качество и эффективность биопрепарата.
Хранят биопрепарат при температуре 10-15°С - до трех месяцев, при 4-8°С (без замораживания) - до шести месяцев и более.
Способ применения - приготовить суспензию и нанести на семена. Норма расхода препарата - 0,1 л, рабочего раствора - 1,8-3,0% от массы семян.
60
60
30
15
15
Установлено, что обработка семян препаратом перед посевом повышает зерновую продуктивность на 6,1-8,7% при выращивании озимой пшеницы по интенсивной технологии и на 7,3-13,0%) - по биологической (таблица 6). Под интенсивной технологией подразумевается внесение минеральных удобрений под основную вспашку NP, ранневесенняя подкормка минеральным азотом N. Применение гербицидов и Би-58 для защиты посевов от сорной растительности, фитопатогенов и фитофагов. Биологическая технология выращивания предусматривает обработку препаратом NP. Почва - чернозем южный, тяжелосуглинистый. Сравнение проводили с химическим фунгицидом Витавакс 200 ФФ.
Штамм Bacillus subtilis subsp. subtilis 12501 НК и препарат на его основе эффективны как сами, так и в сочетании с азотфиксирующими клубеньковыми бактериями, агробактериями. Предлагаемый штамм способствует увеличению численности полезной микробиоты в ризосфере, учтенной в фазу цветения растений пшеницы: микроорганизмов, ассимилирующих азот минеральных и органических соединений в 1,5 и 1,7 раз соответственно. Повышается потенциальная азотфиксирующая активность в 1,5 раза и содержание подвижного фосфора в 1,3 раза в сравнении с контролем. Следовательно, предлагаемый штамм способствует оптимизации минерального питания растений пшеницы.
Обработка заявляемым микробным препаратом перед хранением способствует увеличению численности бактерий и уменьшению микромицетов в эпифитном микробоценозе семян нута (таблица 7). Семена сорта Александрит обрабатывали суспензией препарата и сравнивали с химическим фунгицидом Витавакс 200 ФФ, а также известным препаратом Фитоспорин. Абсолютным контролем являлась дистиллированная вода. Через сутки численность бактерий на поверхности семян нута увеличилась в 4 и 6,3 раза в сравнении с контролем и химическим протравителем соответственно, а также превосходила известный препарат. Через шесть месяцев хранения численность бактерий на семенах нута в 5,5 и 6,8 раз превышала абсолютный и химический контроли соответственно. Численность микромицетов снижалась: через сутки в 3,9 и 2,7 раз в сравнении с абсолютными и химическими контролями соответственно; через шесть месяцев в 2,2 и 1,7 раз соответственно, а также была ниже в сравнении с известным препаратом.
Заблаговременная обработка семян нута не снижала их посевные качества (таблица 8). Энергия прорастания увеличивалась на 33,3%, всхожесть на 9,7% в сравнении с контролем.
Bacillus subtilis subsp. subtilis 12501 НК не проявляет антагонизм к клубеньковым бактериям, что было установлено в лабораторных условиях методом перпендикулярных культур и методом лунок (Егоров Н.С. Основы учения об антибиотиках. - М.: Изд-во МГУ; Наука, 2004. - 528 с. - С.155-159). В вегетационных опытах установлено, что обработка семян нута препаратом на основе Bacillus subtilis subsp. subtilis 12501 НК как заблаговременная (шесть месяцев), так и предпосевная совместно с ризобиями повышает симбиотический потенциал растений (таблица 9). Контролем является обработка семян нута препаратом на основе клубеньковых бактерий Mesohrizobium ciceri L. в блоке.
Предлагаемый препарат на основе штамма Bacillus subtilis subsp. subtilis 12501 НК способствует повышению продуктивности растений. За три года полевых испытаний прибавка урожая зерна составляла 9,1% к контролю, как при совместном применении с ризобиями, так и при заблаговременной обработке препаратом. Препарат рекомендуют для обработки семян зерновых культур перед посевом, и обработки семян зернобобовых культур, в частности нута, при закладке на хранение.
Таким образом, предлагаемый штамм Bacillus subtilis subsp. subtilis 12501 НК имеет комплекс полезных для растений и почвы свойств, способен продуцировать физиологически активные вещества - стимуляторы роста растений и характеризуется антагонистической активностью в отношении широкого спектра фитопатогенных грибов. Разработанный на его основе микробный препарат может быть использован для повышения урожайности сельскохозяйственных культур и защиты их от грибных болезней.