Способ определения жизнеспособности клеток в биомедицинских клеточных продуктах в процессе регенерации
METHOD FOR DETERMINING THE VIABILITY OF CELLS IN BIOMEDICAL CELL PRODUCTS IN THE PROCESS OF REGENERATION

Предполагаемое изобретение относится к биомедицине, медицине, биотехнологии, регенеративной медицине, в частности к способам определения жизнеспособности стволовых клеток в биомедицинских клеточных продуктах в процессе регенерации раневого дефекта и может быть использовано в экспериментальных исследованиях.
Развитие регенеративной медицины неразрывно связано с созданием клеточных биомедицинских клеточных продуктов (БМКП) - представленных матрицей / скаффолдом-носителем содержащим клетки. Наиболее распространённым типом клеток, вводимых в состав БМКП, являются мезенхимальные стволовые клетки (МСК). Эти клетки привлекают все большее внимание из-за их модулирующих свойств и паракринной активности, которые могут быть использованы в регенеративной медицине. Многочисленные исследования последних лет сосредоточены на создании БМКП (тканеинженерных продуктов), предназначенных для закрытия различных раневых дефектов кожи (S. Roux, G. Bodivit, W. Bartis, A. Lebouvier, N. Chevallier, A. Fialaire-Legendre, P. Bierling, H. Rouard. In vitro characterization of patches of human mesenchymal stromal cells // Tissue Eng Part A 2015; 21(3-4): 417-25. doi: 10.1089/ten.TEA.2013.0615), восстановления или замены поврежденных участков кости (A. Kurzyk,  https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/?term=D%C4%99bski+T&cauthor_id=30686126 W.  Z. Pojda. Comparison of adipose stem cells sources from various locations of rat body for their application for seeding on polymer scaffolds // J Biomater Sci Polym Ed. 2019; 30(5): 376-397. doi: 10.1080/09205063.2019.1570433), оболочек легких, вызванных воспалением и/или фиброзом (C.T. Stabler, S. Lecht, P. Lazarovici, P.I. Lelkes. Mesenchymal stem cells for therapeutic applications in pulmonary medicine // Br Med Bull 2015; 115(1): 45-56. doi: 10.1093/bmb/ldv026), регенерации пульпы и поврежденных периферических нервов (I. Lambrichts, R.B Driesen, Y. Dillen, P. Gervois, J. Ratajczak, T. Vangansewinkel, E. Wolfs, A. Bronckaers, P. Hilkens. Dental Pulp Stem Cells: Their Potential in Reinnervation and Angiogenesis by Using Scaffolds // J Endod. 2017; 43(9S): S12-S16. doi: 10.1016/j.joen.2017.06.001), восстановления поврежденной почечной ткани (M. Morigi, C. Rota, G. Remuzzi. Mesenchymal Stem Cells in Kidney Repair // Methods Mol Biol 2016; 1416: 89-107. doi: 10.1007/978-1-4939-3584-0_5) и др. В основе этих регенеративных процессов как подчеркивают авторы, лежат механизмы связанные с паракринной активностью МСК, вводимых в составе БМКП. Так, описана способность МСК секретировать пул факторов роста и цитокинов с противовоспалительным, митогенным и иммуномодулирующим эффектами (M. Wang, Q. Yuan, L.X. Mesenchymal Stem Cell-Based Immunomodulation: Properties and Clinical Application // Stem Cells Int. 2018; 2018: 3057624. doi: 10.1155/2018/3057624). Преобладающим механизмом, посредством которого МСК участвуют в восстановлении тканей, является паракринная активность (D. Kyurkchiev, I. Bochev, E. Ivanova-Todorova, M. Mourdjeva, T. Oreshkova, K. Belemezova, S. Kyurkchiev Secretion of immunoregulatory cytokines by mesenchymal stem cells // World J Stem Cells. 2014 Nov 26; 6(5):552-70. doi: 10.4252/wjsc.v6.i5.552). Благодаря производству множества трофических факторов с различными свойствами МСК могут уменьшить повреждение тканей, защитить ткани от дальнейшей деградации и усилить их восстановление (M. Maumus, C. Jorgensen, D.  Mesenchymal stem cells in regenerative medicine applied to rheumatic diseases: role of secretome and exosomes // Biochimie. 2013; 95(12): 2229-34. doi: 10.1016/j.biochi.2013.04.017).
В работе A.M. Altman et al. показано, что жизнеспособные МСК в составе БМКП с ацеллюлярной дермальной матрицей-носителем имплантированные в дефект мягких тканей сформированный у мышей, значительно улучшали заживление ран, усиливали регенерацию мягких тканей и способствовали развитию неоваскулярной сети (A.M. Altman, N. Matthias, Y. Yan, Y.-H. Song, X. Bai, E.S. Chiu, D.P. Slakey, E.U. Dermal matrix as a carrier for in vivo delivery of human adipose-derived stem cells // Alt Biomaterials, 2008; 29(10): 1431-42. doi: 10.1016/j.biomaterials. 2007.11.026). В работе T. Yoshikawa et al. рассматриваются клинические случаи применения МСК с использованием в качестве скаффолда-носителя, обеспечивающего поддержание жизнеспособности МСК, коллагеновой губки. МСК на носителе применялись у пациентов с тяжелыми ожогами или трудноизлечимыми дерматопатиями, которые не реагировали на стандартную терапию в течение 3 и более месяцев. У всех пациентов была показана терапевтическая эффективность трансплантации жизнеспособных мезенхимальных клеток, наблюдалась регенерация подкожной клетчатки, формирование эпидермиса и васкуляризация при заживлении ран (T. Yoshikawa, H. Mitsuno, I. Nonaka, Y. Sen, K. Kawanishi, Y. Inada, Y. Takakura, K. Okuchi, A. Nonomura. Wound therapy by marrow mesenchymal cell transplantation // Plast Reconstr Surg, 2008; 121(3): 860-77 doi: 10.1097/01.prs.0000299922.96006.24). Таким образом, необходимым условием для успешного протекания регенеративного процесса при применении БМКП является сохранение жизнеспособности клеток в процессе регенерации. Это позволяет клеткам осуществлять свою паракринную функцию и поддерживать регенеративный процесс, на протяжении длительного времени пролонгировано синтезируя и высвобождая биологически активные вещества.
Оценка жизнеспособности стволовых клеток в БМКП в процессе регенерации раневого дефекта является одним из важнейших показателей, который может служить критерием качества БМКП, так как только живые клетки могут обеспечить пролонгированный паракринный эффект, обеспечивая восстановление поврежденной ткани.
Существует несколько способов оценки жизнеспособности клеток культивируемых в трехмерных носителях в составе БМКП in vitro. Колориметрические и флуориметрические методы широко используются в различных приложениях тканевой инженерии. Анализ метаболического красителя на основе 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолийбромида (МТТ) является одним из самых известных анализов такого рода, в котором растворимая соль тетразолия превращается в нерастворимые синие кристаллы формазана, за счет восстановительных реакций в клетках. МТТ-анализ использовался для оценки жизнеспособности клеток в трехмерных тканевых конструкциях. Однако сообщалось, что МТТ может изменять форму клеток и, следовательно, физиологию ткани. Он может повредить клетки, “прокалывая” их мембрану во время экзоцитоза. Крайне важно, что данные методы исследования не применимы для оценки жизнеспособности клеток в процессе регенерации. Осуществить их можно только in vitro до имплантации БМКП, они не позволяют оценить жизнеспособность клеток после имплантации БМКП на живой модели.
Способы оценки жизнеспособности клеток, основанные на использовании резазурина (например, Alamar Blue™ и Presto Blue™), так же используются в лабораторной практике для контроля и оптимизации процесса культивирования тканей и БМКП. Так была продемонстрирована возможность использования методов на основе резазурина для мониторинга жизнеспособности клеток в рецеллюляризованных матрицах-носителях легких. Ацеллюлярные каркасы легких рецеллюляризировали, а затем в течение 5 дней контролировали жизнеспособность клеток (S.H. Mahfouzi, G. Amoabediny, A. Doryab, S.H. Safiabadi-Tali, M. Ghanei. Noninvasive Real-Time Assessment of Cell Viability in a Three-Dimensional Tissue // Tissue Eng Part C Methods. 2018; 24(4): 197-204. doi: 10.1089/ten.TEC.2017.0371). Метод с использованием резазурина был применен к БМКП с культурой почек и тканеинженерной костной ткани (M. Caralt, J.S. Uzarski, S. Iacob, K.P. Obergfell, N. Berg, B.M. Bijonowski. Optimization and critical evaluation of decellularization strategies to develop renal extracellular matrix scaffolds as biological templates for organ engineering and transplantation // Am J Transplant 2015; 15(1): 64-75. doi: 10.1111/ajt.12999; R. Owen, C. Sherborne, T. Paterson, N.H. Green, G.C. Reilly, F. Claeyssens. Emulsion templated scaffolds with tunable mechanical properties for bone tissue engineering // J Mech Behav Biomed Mater 2016; 54: 159-72. doi: 10.1016/j.jmbbm.2015.09.019). Тем не менее, известно, что красители на основе резазурина проявляют цитотоксическое действие при длительном воздействии на клетки. Так же не встречается исследований по применению методов с использованием резазурина для оценки жизнеспособности клеток в БМКП в процессе регенерации после имплантации в ткани.
Методы исследования in vitro широко применимы и очень популярны, они позволяют проводить видоспецифичный, простой, удобный и подробный анализ, однако показатели жизнеспособности клеток, полученные вне организма данными методами, не всегда соответствуют реальной картине внутри живой системы, так как в условиях in vitro клетки могут функционировать иначе, чем в ткани. При имплантации резко меняются условия, в которые попадает БМКП. Может наблюдаться воспалительный процесс, затрагивающий мягкие и твердые ткани, окружающие БМКП. При воспалительном процессе в тканях повышается уровень эндотоксинов, индукторов воспалительной реакции, активируются клетки-мишени (макрофаги и нейтрофилы). Высвобождающиеся свободные цитокины активируют клетки различных тканей и органов, индуцируя метаболические, гормональные и нейроэндокринные изменения в организме. Все это может оказывать непосредственное влияние на жизнеспособность клеток имплантированного БМКП. Таким образом, жизнеспособности клеточного компонента БМКП, оцененная в условиях in vitro, не может быть экстраполирована на условия in vivo. Поэтому разработка методов, позволяющих провести оценку жизнеспособности клеток в БМКП после имплантации в процессе регенерации тканей, является актуальной задачей.
В качестве прототипа выбран способ, применяемый для определения жизнеспособности клеток в процессе регенерации в БМКП представленном гидрогелем с инкапсулированными МСК имплантируемом в ткани экспериментального животного (X. Ding, G. Yang, W. Zhang, G. Li, S. Lin, D.L Kaplan, X. Jiang. Increased stem cells delivered using a silk gel/scaffold complex for enhanced bone regeneration. // Sci Rep. 2017. 7(1): 2175. doi: 10.1038/s41598-017-02053-z2017) включающий окрашивание специфическим трассирующим флуоресцентным красителем (например, CellTrackerTM CM-Dil, Invitrogen, USA)МСК до формирования БМКП, инкапсуляцию окрашенных клеток в скаффолд-носитель, культивирование сформированного БМКП in vitro с последующей имплантацией в дефекты тканей лабораторных животных (крыс), эвтаназию экспериментальных животных в контрольные сроки, выделение области дефекта (вырезание), куда был имплантирован БМКП, фиксацию полученных образцов в 10%-ном буферном растворе формальдегида, их дегидратацию в градиенте от 75% до абсолютного этанола и заключаются в блок полиметилметакрилата (ПММА), затем образцы разрезаются на секции толщиной 150 мкм с помощью микротома Leica SP1600 (Leica, Германия) и отполировываются до конечной толщины 40 мкм, в полученных срезах с помощью флуоресцентного стереомикроскопа (например, Leica, Wetzlar, Германия) визуализируются клетки, окрашенные трассирующим флуоресцентным красителем.
Существенным недостатком способа, представленного в прототипе, является длительность и трудоемкость. Осуществление данного способа требует больших затрат временного ресурса, он включает следующие этапы пробоподготовки образцов выделенных из области имплантации БМКП: фиксацию образцов в формальдегиде, которая может занимать от 6 до 24 часов; обезвоживание образцов в градиенте от 75% до абсолютного этанола, которое может длиться от 24 до 36 часов; изготовление блока, когда кусок материала помещается в форму с расплавленным ПММА и охлаждается, данный этап выполняется вручную длится 12 часов, и его сложно ускорить и; затем материал выдерживают при комнатной температуре в течение 24 часов и, наконец, изготавливают срезы с использованием специального инструмента - микротома. Таким образом, данная процедура даже по самым оптимистичным прогнозам требует 3-4 дня для получения среза. К существенным недостаткам метода можно отнести то, что для получения достаточно тонких (10-30 нм) срезов изучаемых объектов, требуются высокие специальные навыки и умения персонала, осуществляющего данный процесс, наличие специализированного дорогостоящего оборудования (например, микротом Leica SP1600 (Leica, Германия)), с помощью которого получают срезы и отполировывают их до необходимой толщины. Неправильная пробоподготовка может повлечь невозможность получения данных или высокую степень погрешности. Так, например, при большой толщине среза изображение одних структур может как бы «накладываться» на изображение других и их исследование представленным методом становится невозможным.
Необходимо отметить, что используемый для реализации способа прототипа трассирующий флуоресцентный краситель (CellTrackerTM CM-Dil, Invitrogen, USA) является цитоплазматическим и согласно спецификации производителя предназначен для отслеживания клеток в течение 72 часов после окрашивания. В тоже время, исследования, связанные с реализацией регенеративного потенциала БМКП, требуют значительно больше времени. Так, в описанном прототипе на культивирование БМКП после окрашивания отводилось 7 суток и 8 недель непосредственно на экспериментальное исследование с животными. Таким образом, с момента окрашивания клеток до момента визуализации клеток прошло 9 недель. Этот срок значительно превышает 72 часа, что может повлечь большие погрешности при оценке результатов, связанных с выцветанием с течением времени флуоресцентного красителя, перераспределением его при делении клеток (чем дольше период времени, тем больше циклов деления может пройти клетка, и тем меньшее количество красителя будет содержаться в дочерних клетках, соответственно, при длительном эксперименте количество красителя может быть настолько мало, что он не будет детектироваться).
Задача предполагаемого изобретения - усовершенствование способа.
Технический результат - уменьшение трудоемкости, затрат времени при оценке жизнеспособности клеток БМПК в процессе регенерации; повышение точности анализа.
Технический результат достигается за счет того, что в способе, включающем окрашивание трассирующим флуоресцентным красителем мезенхимальные стволовые клетки до формирования биомедицинских клеточных продуктов (БМКП), включение клеток в состав БМКП, культивирование in vitro сформированного БМКП, имплантацию БМКП в ткани экспериментального животного, эвтаназию животного в контрольные сроки, выделение тканей из места имплантации БМКП, визуализацию клеток, окрашенных трассирующим флуоресцентным красителем, окрашивание мезенхимальных стволовых клеток до формирования БМКП осуществляют мембранным трассирующим флуоресцентным красителем, выделенные из места имплантации БМКП ткани распределяют по дну пластиковой чашки Петри, содержащей 1 мл культуральной среды, ex-tempore, без проведения дополнительной пробоподготовки перед визуализацией, проводят исследование не менее чем в 10 полях зрения с использованием широкопольной флуоресцентной микроскопии с прижизненной визуализацией и фотофиксацией жизнеспособных клеток, окрашенных мембранным трассирующим флуоресцентным красителем и обладающих характерным флуоресцентным свечением и морфологическими характеристиками, соответствующими мезенхимальным стволовым клеткам.
Способ определения жизнеспособности клеток в биомедицинских клеточных продуктах в процессе регенерации осуществляют следующим образом:
1. Проводят окрашивание мезенхимальных стволовых клеток (МСК) мембранным трассирующим красителем (например, Lipophilic Tracers-DiO DiOC14(3) Hydroxyethanesulfonate), для этого:
a) Готовят исходный раствор мембранного трассирующего красителя в растворе диметилсульфоксида (ДМСО) и этанола в соотношении 7:3 в соответствии с протоколом производителя. Используют стоковые растворы красителя 1:10000. Для приготовления 10 мл рабочего окрашивающего раствора на 10 мл полной питательной среды для МСК (например, ДМЕМ/F12 или α-МЕМ) добавляют 2 мкл стокового раствора мембранного трассирующего красителя.
2
2
b) Удалив кондиционную среду из флакона с растущими в виде субконфлюэнтного монослоя МСК, проводят окрашивание клеток. Для этого во флакон с МСК добавляют окрашивающую среду с мембранным трассирующим красителем (например, Lipophilic Tracers-DiO DiOC14(3) Hydroxyethanesulfonate). Флакон помещают в СО-инкубатор и выдерживают 30-40 минут при 37°С, 5% СОи абсолютной влажности. Затем окрашенные клетки открепляют от пластика с использованием специальных растворов (например, трипсина и Версена), переводя их в суспензию, которую используют для формирования БМКП.
1. Формируют БМКП (например, гидрогелевый биополимерный скаффолд-носитель) с инкапсулированными МСК, окрашенными по п. 1.
2. Проводят имплантацию БМКП в дефект ткани экспериментального животного.
3. В контрольные сроки животное подвергают эвтаназии. Затем осуществляют забор тканей из области имплантации БМКП.
4. Образец тканей, выделенный из области имплантации БМКП, распределяют по дну предварительно подготовленной пластиковой чашки Петри, содержащей 1 мл культуральной среды для МСК (например, ДМЕМ/F12 или α-МЕМ), с целью предотвращения его пересыхания.
5. Проводят визуализацию и фотофиксацию жизнеспособных клеток, окрашенных мембранным специфическим трассирующим флуоресцентным красителем (например, Lipophilic Tracers-DiO DiOC14(3) Hydroxyethanesulfonate). Для этого ex-tempore, в течение 1 часа после выделения образцов, чашку с образцом тканей переносят на оборудование, позволяющее проводить широкопольную флуоресцентную микроскопию (например, имиджер Cytationᵀᴹ 5), используя канал для регистрации соответствующий рекомендациям спецификации мембранного трассирующего красителя, которым окрашивали МСК по п. 1. Например, GFP канал для регистрации «зеленого» сигнала (длина волны возбуждения - 477 нμ, длина волны эмиссии - 525 нμ). Не менее чем в 10 произвольно выбранных полях зрения проводят визуализацию клеток окрашенных мембранным специфическим трассирующим флуоресцентным красителем. Для этого в поле зрения, меняя фокусное расстояние на фиксированную глубину до 500 μm от дна чашки Петри, «проходят» вдоль оси Z в толщу образца ткани визуализируя объекты с характерным флуоресцентным свечением. Для визуализации и фотофиксации используют объективы с 10-кратным или 20-кратным увеличением. При выявлении объектов с характерным флуоресцентным свечением их фотофиксируют. При характеристике выявленных объектов учитывают их морфологию и ее соответствие морфологическим характеристикам МСК. Объекты, имеющие характерное флуоресцентное свечение и морфологические характеристики, соответствующие МСК (звезчатую или веретеновидную форму, отростки, ядро овальной или круглой формы) оценивают как жизнеспособные МСК.
Способ определения жизнеспособности клеток в биомедицинских клеточных продуктах в процессе регенерации поясняется фигурами, приложенными к данному описанию.
На Фиг. 1 представлен пример микрофотоснимка полученного при реализации описанного способа. На снимке хорошо визуализируются МСК (отмечены стрелочкой) с характерным флуоресцентным свечением и морфологическими признаками - множественными отростками и ядром овальной формы. Изображение получено на 7 сутки развития регенеративного процесса после имплантации БМКП в ткани с использованием объектива с 20-кратным увеличением.
На Фиг. 2 представлен пример микрофотоснимка полученного при реализации описанного способа. На снимке визуализируются МСК с характерным флуоресцентным свечением и морфологическими признаками - веретеновидная или звездчатая форма клеток, наличие отростков, ядро овальной формы (объекты А). Визуализируются объекты с характерным флуоресцентным свечением, но не имеющие характерных морфологических признаков МСК (объекты В). Изображение получено на 14 сутки развития регенеративного процесса после имплантации БМКП в ткани с использованием объектива с 10-кратным увеличением.
Пример 1
Для определения жизнеспособности клеток в биомедицинских клеточных продуктах в процессе регенерации было проведено окрашивание мезенхимальных стволовых клеток мембранным трассирующим красителем (Lipophilic Tracers-DiO DiOC14(3) Hydroxyethanesulfonate) согласно представленному способу (п. 1). Далее согласно п. 2-3 способа окрашенные клетки инкапсулировали в БМКП (на основе гидрогелевого биополимерного скаффолда-носителя) и имплантировали в ткани экспериментального животного - крысы. Для этого у крысы формировали дефект ткани - полнослойную скальпированную рану в области спины, в сформированный тканевой дефект имплантировали БМКП. На 7 сутки животное подвергли эвтаназии и осуществили забор образца тканей, выделенный из области имплантации БМКП согласно представленному способу (п. 4-5). Затем проводили визуализацию жизнеспособных клеток, окрашенных мембранным специфическим трассирующим флуоресцентным красителем (Lipophilic Tracers-DiO DiOC14(3) Hydroxyethanesulfonate), используя GFP канал для регистрации «зеленого» сигнала (длина волны возбуждения - 477 нμ, длина волны эмиссии - 525 нμ) согласно пункту 6, представленного способа. В результате, в 10 полях зрения с использованием объектива с 20-кратным увеличением проводили визуализацию объектов с характерным флуоресцентным свечением, перемещаясь вдоль оси Z на фиксированную глубину 500 μm от дна чашки Петри. При выявлении объектов с характерным флуоресцентным свечением их фотофиксировали. Все внешние характеристики выявленных объектов с характерным флуоресцентным свечением клеток соответствовали морфологическим характеристикам МСК (Фиг. 1). Клетки с характерным флуоресцентным свечением были достаточно крупные, имели отростки. В них хорошо просматривалось ядро овальной формы. Клетки, окрашенные трассирующим флуоресцентным мембранным красителем, имеющие зеленое флуоресцентное свечение и характерную морфологию - соответствующий размер от 20 до 300 мкм, отростки, ядро овальной формы, являются живыми. Таким образом, на 7 сутки после имплантации БМКП в процессе регенерации определялись жизнеспособные мезенхимальные стволовые клетки. Это позволяет сделать заключение, что в имплантированном БМКП МСК сохраняют жизнеспособность в течении 7 суток в процессе регенерации.
Пример 2
Для определения жизнеспособности клеток в биомедицинском клеточном продукте в процессе регенерации было проведено окрашивание мезенхимальных стволовых клеток мембранным трассирующим красителем (Lipophilic Tracers-DiO DiOC14(3) Hydroxyethanesulfonate) согласно представленному способу (п. 1), которые инкапсулировали в БМКП (на основе скаффолда-носителя из криопреципитата плазмы крови и коллагена) и имплантировали в ткани экспериментального животного. На 14 сутки животное подвергали эвтаназии и осуществили забор образца тканей, выделенный из области имплантации БМКП согласно представленному способу (п. 4-5). Затем проводили визуализацию жизнеспособных клеток, окрашенных мембранным специфическим трассирующим флуоресцентным красителем (Lipophilic Tracers-DiO DiOC14(3) Hydroxyethanesulfonate), используя GFP канал для регистрации «зеленого» сигнала (длина волны возбуждения - 477 нμ, длина волны эмиссии - 525 нμ) в 10 полях зрения с использованием объектива с 10-кратным увеличением. Для этого в поле зрения, меняя фокусное расстояние на фиксированную глубину до 500 μm от дна чашки Петри, «проходили» вдоль оси Z в толщу образца ткани визуализируя объекты с характерным флуоресцентным свечением согласно пункту 6, представленного способа.
При визуализации был выявлен ряд объектов с характерным флуоресцентным свечением и морфологией характерной для МСК (Фиг. 2, объекты А). Клетки были достаточно крупные, веретенообразной и звездчатой формы, с выраженными отростками и хорошо визуализирующимся ядром. Так же визуализировались объекты имеющие характерное флуоресцентное свечение, но не имеющие характерной для МСК морфологи, а именно объекты округлой или овальной формы, без отростков, у которых ядро не визуализируется (Фиг. 2, объекты В). Таким образом, в процессе регенерации на 14 сутки имплантации БМКП сохранялись жизнеспособные МСК. На данном примере хорошо видно, как минимизируется погрешность оценки жизнеспособности МСК, если при анализе учитывается не только характерное флуоресцентное свечение, но и соответствие объекта морфологическим характеристикам клеток. Последнее позволяет отсечь посторонние объекты, которые могут быть представлены различными артефактами или погибшими ошарившимися и элиминирующимися МСК.