ПРОДУЦИРОВАНИЕ AAV В КЛЕТКАХ НАСЕКОМЫХ, СПОСОБЫ И КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ЭТОГО
PRODUCTION OF AAV IN INSECT CELLS, METHODS AND COMPOSITIONS FOR THIS PURPOSE

Ссылка на Предыдущие Заявки
Данная заявка заявляет преимущество и приоритет по предварительной заявке США 62/325,817, поданной 21 апреля 2016 года. Заявка 62/325,817 включена в данное описание посредством ссылки в полном объеме.
Включение посредством ссылки списка последовательностей
Список последовательностей, который является частью данного описания, включает в себя машиночитаемую форму и письменный список последовательностей, содержащий нуклеотидные и/или аминокислотные последовательности. Информация списка последовательностей, записанная в машиночитаемой форме идентична письменной форме списка последовательностей. Содержание списка последовательностей включено в данный документ посредством ссылки в полном объеме.
Введение
После одобрения первого препарата для опосредованной аденоассоциированным вирусом (AAV) генной терапии, потребность в крупномасштабной технологии производства векторов AAV постоянно растет (Yla-Herttuala, S., Mol. Ther. 20, 1831-1832, 2012). В настоящее время существует несколько технологий для производства AAV. Традиционный способ использует трансфекцию клеток HEK293 или других клеточных линий млекопитающих тройными или двойными плазмидами. Этот способ имеет низкий выход AAV и его трудно масштабировать из-за его потребности в адгезивных клетках (Xiao, X., Li, J. & Samulski, R J, J. Virol. 72, 2224-2232, 1998). Другой способ получения AAV включает использование вируса простого герпеса (HSV) для инфицирования клеток млекопитающих. Этому способу препятствуют трудности в создании достаточных запасов посевного материала HSV, а также низкая продуктивность AAV (Booth, M.J, et al., Gene Ther. 11, 829-837,2004).
Способы, основанные на бакуловирусах для производства AAV-векторов в клетках насекомых значительно увеличили выход продукции AAV по сравнению с другими системами (Urabe, М, et al., Human Gene Therapy 13, 1935-1943, 2001; Chen, H., Mol. Ther. 16, 924-930, 2008; Chen, H., Molecular Therapy-Nucleic Acids 1, e57, 2012; патент США 8,945,918, Chen). Однако рекомбинантный бакуловирус может быть нестабильным в течение множественных пассирований, что приводит к снижению производства AAV. Таким образом, существует неудовлетворенная потребность в системе производства AAV, которая может поддерживать производство векторов AAV с высоким выходом даже после множественных пассирований.
В геноме бакуловируса множественного ядерного полиэдроза Autographa californica (AcMNPV) содержится 5 «гомологичных областей» (hr), обозначенных как hrl-hr5 (Cochran, MA и Faulkner P., J. Virol. 45, 961-970, 1983; Guarino, L.A. and Summers, M.D., J. Virol. 60, 214-223, 1986). Эти 5 областей могут функционировать как энхансеры (Guarino, LA, et al., J. Virol. 60, 224-229, 1986). Сообщалось о последовательностях hrl-hr5 (Guarino, LA и Summers, MD, J. Virol. 60, 214-223, 1986; Guarino, L.A., et al., J. Virol. 60, 224-229, 1986), которые изложены в данном документе, hr может быть длиной от около 400 пар оснований до около 1000 пар оснований. Примеры последовательностей hr AcMNPV следующие.
Последовательности hr1-hr4 согласно Guarino, L.A., et al., J. Virol. 60, 224-229, 1986. Последовательность hr5 - согласно Guarino, L.A. and Summers, M.D., J. Virol. 60, 214-223, 1986. Другие последовательности hr2 представлены в Aslanidi, G., et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 106, 5059-5064, 2009, и Ayres, M.D., et al., Virology 202, 586-605, 1994.
Кроме того, сообщалось о разнообразии последовательностей среди hr в вирусах насекомых. Последовательности с идентичностью всего 64% с AcMNPV hr были распознаны как последовательности hr из вируса полиэдроза Bombyx mori (Majima, K., et al., J. Virol. 67, 7513-7521, 1993).
Сообщалось, что бакуловирусные hr могут действовать через цис-действующий Rep-Связывающий Элемент (RBE) AAV2 для усиления продуцирования AAV в линии клеток насекомых, в которой содержатся гены AAV Rep и Cap (Aslanidi, G., et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 106, 5059-5064, 2009). В этом исследовании анализировали экспрессию генов rep AAV в исследовании временной трансфекции и сообщалось о повышенной транскрипции при трансфекции конструкцией, несущей hr2 и RBE против хода транскрипции относительно rep. Исследователи предложили петлю прямой обратной связи, в которой транскрипция генов AAV rep и cap индуцируется транс-активным предранним трансрегулятором 1 (IE-1) бакуловирусного вектора экспрессии. В их модели один из продуктов (белок Rep) взаимодействует с RBE, чтобы индуцировать высвобождение/амплификацию и опосредовать большую транскрипцию.
Сообщалось также, что последовательности hr бакуловируса стабилизируют рекомбинантные бакуловирусы в непрерывно-каскадных биореакторах с клетками насекомых (Pijlman, GP, et al., Biotechnol. Bioeng. 87, 743-753, 2004). Тем не менее, не было сообщений о последовательности hr, повышающей производительность вируса AAV в бакуловирусной системе.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Данный изобретатель разработал композиции и способы для усиления продукции аденоассоциированного вируса (AAV) в бакуловирусных системах в клетках насекомых in vitro. Композиции и способы задействуют векторы, которые не имеют AAV Rep-связывающего элемента (RBE), но содержат гомологичную область (hr) бакуловируса. В различных конфигурациях стабильность клеточной линии насекомых, содержащей бакуловирусный геном, который содержит в себе AAV-геном, может поддерживаться при множественных пассажах.
В различных конфигурациях производство AAV в клетках насекомых, содержащих вектор согласно данному изобретению, может быть увеличено по сравнению с векторами, которые не содержат hr. Кроме того, линии клеток насекомых, содержащие вектор согласно данному изобретению, могут стабильно поддерживать высокие титры продуцирования AAV даже после повторных пассажей.
В различных вариантах реализации данное изобретение включает векторы. В различных конфигурациях вектор может быть бакуловирусом или плазмидой, такой как, например, но не ограничиваясь ими, бакмидный челночный вектор (Luckow, V., et al., J. Virol. 67, 4566-4579, 1993). В различных конфигурациях вектор может содержать кассету экспрессии AAV Сар, кассету экспрессии AAV Rep и гомологичную область (hr) бакуловируса. В различных конфигурациях hr может быть расположен на расстоянии до около 4 тыс п.о. от стартового кодона кассеты экспрессии AAV. В различных конфигурациях hr может представлять собой вставку. В различных конфигурациях hr может быть расположен до около 0,5 kb, до около 1 тыс п.о, до около 1,5 тыс п.о, до около 2 тыс п.о, до около 2,5 тыс п.о, до около 3 тыс п.о, до около 3,5 тыс п.о, до около 4 тыс п.о или до около 4,5 тыс п.о от стартового кодона кассеты экспрессии AAV. В различных конфигурациях вставленная область hr может быть расположена до около 4 тыс.п.о. от стартового кодона кассеты экспрессии Rep.В различных конфигурациях вставленная область hr может быть расположена до около 4 тыс.п.о. от стартового кодона кассеты экспрессии Сар. В различных конфигурациях вектор может включать в себя последовательности из вируса, такие как бакуловирус, такой как, но не ограничиваясь этим, вирус множественного ядерного полиэдроза Autographa californica (AcMNPV). В некоторых конфигурациях вектором может представлять собой вектор, описанный ранее (Chen, Н., Mol. Ther. 16, 924-930, 2008; Chen, Н., Molecular Therapy-Nucleic Acids 1, e57, 2012; US Patent 8,945,918 to Chen), модифицированный с включением hr.
В различных конфигурациях кассета экспрессии AAV Сар и кассета экспрессии AAV Rep могут представлять собой такие, как описано ранее (Chen, Н., Mol. Ther. 16, 924-930, 2008; Chen, Н., Molecular Therapy-Nucleic Acids 1, e57, 2012; US Patent 8,945,918 to Chen), a hr может представлять собой hr1, hr2, hr3, hr4 или hr5 из бакуловируса, такого как AcMNPV. В некоторых конфигурациях hr может представлять собой hr2 AcMNPV. В некоторых конфигурациях hr может представлять собой hr, имеющую идентичность последовательности с hr AcMNPV и может представлять собой, например, но не ограничиваясь этим, hr из AcMNPV, hr из другого вируса насекомого или искусственную последовательность hr, имеющую не менее 64% идентичности последовательности, по меньшей мере 65% идентичности последовательности, по меньшей мере 70% идентичности последовательности, по меньшей мере 75% идентичности последовательности, по меньшей мере 80% идентичности последовательности, по меньшей мере 85% идентичности последовательности, по меньшей мере 90% идентичности последовательности, по меньшей мере 95% идентичности последовательности или большую идентичность последовательности с hr AcMNPV, такую как hr2.
В различных конфигурациях вектор согласно данному изобретению может исключать связывающий Rep элемент (RBE), a AAV может быть получен в клетках насекомых при использовании векторов, которые содержат hr, но не содержат RBE.
В различных конфигурациях вектор согласно данному изобретению может содержать, в направлении 5'-3', кассету экспрессии Сар, кассету экспрессии Rep и гомологичную область бакуловируса.
В различных конфигурациях вектор согласно данному изобретению может содержать, в направлении 5'-3', кассету экспрессии Rep, кассету экспрессии Сар и гомологичную область бакуловируса.
В различных конфигурациях вектор согласно данному изобретению может содержать, в направлении 5'-3', кассету экспрессии Сар, гомологичную область бакуловируса и кассету экспрессии Rep.
В различных конфигурациях вектор согласно данному изобретению может содержать, в направлении 5'-3', кассету экспрессии Rep, гомологичную область бакуловируса и кассету экспрессии Сар.
В различных конфигурациях вектор согласно данному изобретению может содержать, в направлении 5'-3', гомологичную область бакуловируса, кассету экспрессии Сар и кассету экспрессии Rep.
В различных конфигурациях вектор согласно данному изобретению может содержать, в направлении 5'-3', гомологичную область бакуловируса, кассету экспрессии Rep и кассету экспрессии Сар.
В различных конфигурациях область hr может быть расположена между кассетой экспрессии Rep и кассетной экспрессией Сар. В различных конфигурациях кассета экспрессии Rep и кассета с экспрессией Сар могут находиться в ориентации голова-к-голове (5'-5'), ориентации хвост-к-хвосту (3'-3') или в ориентации голова-к-хвосту (5'-3').
В различных конфигурациях данное изобретение включает линии клеток насекомых, такие как, например, но не ограничиваясь этим, клетки Sf9, клетки Tni Pro или клетки Е4а, которые содержат вектор, описанный в данном документе. В различных конфигурациях данное изобретение включает линии клеток насекомых, такие как, но не ограничиваясь этим, клетки Sf9.
В некоторых вариантах реализации данное изобретение включает способы выращивания бакуловируса in vitro. В различных конфигурациях эти способы включают в себя получение культуры клеток насекомых, инфицирование или трансфекцию клеток насекомых вектором, содержащим кассету экспрессии AAV Сар, кассету экспрессии AAV Rep и гомологичную область (hr) бакуловируса и инкубацию клеток. В различных конфигурациях hr может находится на расстоянии до около 4 тыс.п.о. от кассеты экспрессии AAV. В различных конфигурациях hr может находится на расстоянии до около 4 тыс.п.о. от кассеты экспрессии Rep. В различных конфигурациях hr может находится на расстоянии до около 4 тыс.п.о. от кассеты экспрессии Сар. В различных аспектах полученные в результате клеточные линии могут многократно пассироваться.
В некоторых вариантах реализации данное изобретение включает способы выращивания AAV in vitro. В этих способах бакуловирус, содержащий кассету AAV Сар, кассету AAV Rep и hr, может быть использован для инфицирования или трансфекции (или совместного инфицирования или совместной трансфекции) клетки насекомого, такой как, например, но не ограничиваясь этим, клетки Sf9, клетки Tni Pro или клетки Е4а. Затем инфицированную (или трансфицированную) клетку можно выращивать in vitro и тем самым формировать клеточную линию, которая продуцирует бакуловирус и AAV. Такие клеточные линии могут повторно пассироваться для множественных пассажей с незначительной потерей или без потерь продукции AAV, например, по меньшей мере 3 пассажа, по меньшей мере 4 пассажа, по меньшей мере 5 пассажей, по меньшей мере 6 при пассажей, по меньшей мере 7 пассажей, по меньшей мере 8 пассажей, по меньшей мере 9 пассажей или по меньшей мере 10 пассажей. В различных конфигурациях продукция AAV из линии клеток насекомых, содержащих вектор, содержащий кассету экспрессии AAV Сар, кассету экспрессии AAV Rep и hr согласно данному изобретению может быть, например, после 7 пассажей, по меньшей мере в 2 раза большей, по меньшей мере в 3 раза большей или по меньшей мере в 4 раза большей чем у линии клеток насекомых, содержащей вектор, содержащий кассету экспрессии AAV Сар и кассету экспрессии AAV Rep, но не содержащий hr, после 7 пассажей. В различных конфигурациях продукция AAV из линии клеток насекомых, содержащих вектор, содержащий кассету экспрессии AAV Сар, кассету экспрессии AAV Rep и hr согласно данному изобретению может представлять собой, например, после 8 пассажей, по меньшей мере в 2 раза большую, по меньшей мере в 3 раза большую или по меньшей мере в 4 раза большую чем у линии клеток насекомых, содержащей вектор, содержащий кассету экспрессии AAV Сар и кассету экспрессии AAV Rep, но не содержащий hr, после 8 пассажей. В различных конфигурациях продукция AAV из линии клеток насекомых, содержащих вектор, содержащий кассету экспрессии AAV Сар, кассету экспрессии AAV Rep и hr согласно данному изобретению может представлять собой, например, после 9 пассажей, по меньшей мере в 2 раза большую, по меньшей мере в 3 раза большую или по меньшей мере в 4 раза большую чем у линии клеток насекомых, содержащей вектор, содержащий кассету экспрессии AAV Сар и кассету экспрессии AAV Rep, но не содержащий hr, после 9 пассажей. В различных конфигурациях продукция AAV из линии клеток насекомых, содержащих вектор, содержащий кассету экспрессии AAV Сар, кассету экспрессии AAV Rep и hr согласно данному изобретению может быть, например, после 10 пассажей, по меньшей мере в 2 раза больше, по меньшей мере в 3 раза больше или по меньшей мере в 4 раза больше чем у линии клеток насекомых, содержащей вектор, содержащий кассету экспрессии AAV Сар и кассету экспрессии AAV Rep, но не содержащий hr, после 10 пассажей.
В некоторых вариантах реализации данное изобретение включает способы выращивания бакуловируса in vitro. В этих способах бакуловирусные векторы, содержащие кассеты AAV Сар и AAV Rep, могут быть использованы для инфицирования или трансфекции (или совместной инфекции или совместной трансфекции) клетки насекомого in vitro, такой как, например, но не ограничиваясь этим, клетка Sf9 из Spodoptera frugiperda, или клетка in vitro от другого насекомого, такого как, например, но не ограничиваясь этим, клетки Tni Pro от Trichoplusia ni или клетки Е4а от Estima acrea. В различных конфигурациях клетка может быть совместно заражена трансгеном между инвертированными терминальными повторами (ITR) AAV, такими как, но не ограничиваясь этим, ITR AAV5. В некоторых конфигурациях трансген может представлять собой репортерный ген, такой как, например, но не ограничиваясь этим, ген, кодирующий зеленый флуоресцентный белок или красный флуоресцентный белок. Инфицированную (или трансфицированную) клетку можно выращивать in vitro и тем самым формировать клеточную линию, которая продуцирует бакуловирус. Такие клеточные линии могут многократно пассироваться. В различных конфигурациях титр бакуловируса, содержащего ген AAV, такой как ген Сар или ген Rep, может составлять по меньшей мере 20% титра общего бакуловируса в пассаже Р7, когда вектор содержит hr. В различных конфигурациях титр бакуловируса, содержащего ген AAV, такой как ген Сар или ген Rep, может составлять по меньшей мере 30% титра общего бакуловируса в пассаже Р7, когда вектор содержит hr. В различных конфигурациях титр бакуловируса, содержащего ген AAV, такой как ген Сар или ген Rep, может составлять по меньшей мере 40% титра общего бакуловируса в пассаже Р7, когда вектор содержит hr. В различных конфигурациях титр бакуловируса, содержащего ген AAV, такой как ген Сар или ген Rep, может составлять по меньшей мере 50% титра общего бакуловируса в пассаже Р7, когда вектор содержит hr. В различных конфигурациях титр бакуловируса, содержащего ген AAV, такой как ген Сар или ген Rep, может составлять по меньшей мере 60% титра общего бакуловируса в пассаже Р7, когда вектор содержит hr. В различных конфигурациях титр бакуловируса, содержащего ген AAV, такой как ген Сар или ген Rep, может составлять по меньшей мере 70% титра общего бакуловируса в пассаже Р7, когда вектор содержит hr. В различных конфигурациях титр бакуловируса, содержащего ген AAV, такой как ген Сар или ген Rep, может составлять по меньшей мере 80% титра общего бакуловируса в пассаже Р7, когда вектор содержит hr. В различных конфигурациях титр бакуловируса, содержащего ген AAV, такой как ген Сар или ген Rep, может составлять по меньшей мере 90% титра общего бакуловируса в пассаже Р7, когда вектор содержит hr. В различных конфигурациях титр бакуловируса, содержащего ген AAV, такой как ген Сар или ген Rep, может составлять по меньшей мере 100% титра общего бакуловируса в пассаже Р7, когда вектор содержит hr. В различных конфигурациях титр бакуловируса, содержащего ген AAV, такой как ген Сар или ген Rep, может составлять по меньшей мере 20% титра общего бакуловируса в пассаже Р10, когда вектор содержит hr. В различных конфигурациях титр бакуловируса, содержащего ген AAV, такой как ген Сар или ген Rep, может составлять более 5% титра общего бакуловируса в пассаже Р10, когда вектор содержит hr.
В некоторых вариантах реализации данное изобретение включает способы выращивания AAV in vitro. В этих способах клетки насекомых, содержащие вектор согласно данному изобретению, содержащий hr, можно выращивать и повторно пассировать in vitro. В некоторых конфигурациях относительный выход AAV в пассаже 7 (Р7) из линии клеток насекомых, несущей контрольный вектор без hr, может составлять менее 60% выхода AAV из линии клеток насекомых, несущей вектор, который имеет hr. В некоторых конфигурациях относительный выход AAV в пассаже 7 (Р7) из линии клеток насекомых, несущей контрольный вектор без hr, может составлять менее 50% выхода AAV из линии клеток насекомых, несущей вектор, который имеет hr. В некоторых конфигурациях относительный выход AAV в пассаже 7 (Р7) из линии клеток насекомых, несущей контрольный вектор без hr, может составлять менее 40% выхода AAV из линии клеток насекомых, несущей вектор, который имеет hr. В некоторых конфигурациях относительный выход AAV в пассаже 7 (Р7) из линии клеток насекомых, несущей контрольный вектор без hr, может составлять менее 30% выхода AAV из линии клеток насекомых, несущей вектор, который имеет hr. В некоторых конфигурациях относительный выход AAV в пассаже 7 (Р7) из линии клеток насекомых, несущей контрольный вектор без hr, может составлять менее 20% выхода AAV из линии клеток насекомых, несущей вектор, который имеет hr. В некоторых конфигурациях относительный выход AAV в пассаже 10 (Р10) из линии клеток насекомых, несущей контрольный вектор без hr, может составлять менее 20% выхода AAV из линии клеток насекомых, несущей вектор, который имеет hr.
Данное изобретение включает, без ограничения, следующие аспекты.
1. Бакуловирусный вектор, содержащий:
кассету экспрессии AAV Сар; кассету экспрессии AAV Rep; и гомологичную область (hr) бакуловируса, расположенную примерно на расстоянии до около 4 тыс.п.о. от стартового кодона кассеты экспрессии AAV.
2. Вектор в соответствии с аспектом 1, содержащий в направлении 5'-3' кассету экспрессии Сар, кассету экспрессии Rep и гомологичную область (hr) бакуловируса.
3. Вектор в соответствии с аспектом 1, содержащий в направлении 5'-3' кассету экспрессии Rep, кассету экспрессии Сар и гомологичную область (hr) бакуловируса.
4. Вектор в соответствии с аспектом 1, содержащий в направлении 5'-3' кассету экспрессии Сар, гомологичную область (hr) бакуловируса и кассету экспрессии Rep.
5. Вектор в соответствии с аспектом 1, содержащий в направлении 5'-3' кассету экспрессии Rep, гомологичную область (hr) бакуловируса и кассету экспрессии Сар.
6. Вектор в соответствии с аспектом 1, содержащий в направлении 5'-3' гомологичную область (hr) бакуловируса, кассету экспрессии Сар и кассету экспрессии Rep.
7. Вектор в соответствии с аспектом 1, содержащий в направлении 5'-3' гомологичную область (hr) бакуловируса, кассету экспрессии Rep и кассету экспрессии Сар.
8. Вектор в соответствии с аспектом 1, в котором область hr находится между кассетой экспрессии Rep и кассетой экспрессии Сар, и в котором кассета экспрессии Rep и кассета экспрессии Сар находятся в ориентации голова-к-голове (5'-5').
9. Вектор в соответствии с любым из аспектов 1-8, отличающийся тем, что гомологичная область бакуловируса представляет собой последовательность hr2.
10. Вектор в соответствии с любым из аспектов 1-9, отличающийся тем, что вектор не содержит Rep-связывающий элемент (RBE).
11. Линия клеток насекомых, содержащая клетки, содержащие вектор в соответствии с любым из аспектов 1-10.
12. Линия клеток насекомых в соответствии с аспектом 11, в которой клетки дополнительно содержат второй вектор, причем указанный второй вектор содержит трансген, фланкированный AAV ITR.
13. Способ выращивания бакуловируса in vitro, включающий: получение культуры клеток насекомых в соответствии с аспектом 11 или аспектом 12 и инкубацию клеток.
14. Способ в соответствии с аспектом 13, в котором инкубация клеток включает в себя пассирование клеток, причем выход продукции AAV в пассаже 7 по меньшей мере в 2 раза больший по сравнению с контрольной линией клеток насекомых, содержащей бакуловирусный вектор, содержащий кассету экспрессии AAV Сар и кассету экспрессии AAV Rep, но не содержащий hr бакуловируса.
15. Способ в соответствии с аспектом 13, в котором в пассаже 7 титр бакуловируса, содержащего кассету экспрессии AAV Сар, превышает 21,5% от титра общего бакуловируса (при измерении с помощью qPCR gp64 для общего BV и Сар для AAV).
16. Способ выращивания AAV in vitro, включающий: получение культуры клеток насекомых, заражение или трансфекцию клеток насекомых бакуловирусным вектором в соответствии с любым из аспектов 1-10 и инкубацию клеток.
17. Способ в соответствии с аспектом 16, в котором в Р7 выход AAV из клеток насекомых по меньшей мере на 50% превышает выход AAV из клеток насекомых в Р7, содержащих бакуловирусный вектор без hr.
18. Способ в соответствии с аспектом 16, в котором в Р7 выход AAV из клеток, содержащих hr бакуловируса, по меньшей мере на 20% превышает выход AAV из клеток, содержащих бакуловирусный вектор без hr.
19. Способ в соответствии с аспектом 16, в котором бакуловирусный вектор не содержит Rep-связывающий элемент (RBE).
20. Способ продуцирования AAV in vitro, включающий выращивание культуры клеток насекомых, содержащей вектор по любому из аспектов 1-10, и вектор, содержащий трансген, фланкированный AAV ITR.
21. Бакуловирусный вектор без Rep-связывающего элемента (RBE) для продуцирования AAV в клетках насекомых in vitro, содержащий: кассету экспрессии AAV Сар, кассету экспрессии AAV Rep, и гомологичную область (hr) бакуловируса, расположенную примерно на расстоянии до около 4 тыс.п.о. от стартового кодона кассеты экспрессии AAV.
Краткое Описание Графических Материалов
На ФИГ. 1 изображена бакуловирусная челночная плазмида согласно данному изобретению, содержащая последовательность hr2 между геном капсида AAV8 и геном rep AAV2.
На ФИГ. 2 изображена бакуловирусная челночная плазмида согласно данному изобретению, содержащая ген AAV8 Сар и последовательность hr2 между геном rep AAV2 и геном резистентности к гентамицину (GmR).
На ФИГ. 3 изображена бакуловирусная челночная плазмида согласно данному изобретению, содержащая ген AAV9 Сар и последовательность hr2 между геном rep AAV2 и геном резистентности к гентамицину (GmR).
На ФИГ. 4 изображена бакуловирусная челночная плазмида согласно данному изобретению, содержащая ген AAV6 Сар и последовательность hr2 между геном rep AAV2 и геном резистентности к гентамицину (GmR).
На ФИГ. 5 изображена бакуловирусная челночная плазмида согласно данному изобретению, содержащая ген AAV1 Сар и последовательность hr2 между геном rep AAV2 и геном резистентности к гентамицину (GmR).
На ФИГ. 6 изображена бакуловирусная челночная плазмида согласно данному изобретению, содержащая ген AAV5 Сар и последовательность hr2 между геном rep AAV2 и геном резистентности к гентамицину (GmR).
На ФИГ. 7 изображена кассета экспрессии GFP, фланкированная двумя ITR в бакуловирусной челночной плазмиде V372-pFB-CMV-GFP-SV40pA-full ITR.
На ФИГ. 8 изображены сравнительные результаты выходов AAV, полученных с помощью рекомбинантных бакуловирусов (rBV) с последовательностью hr2 или без нее.
На ФИГ. 9А-Н изображены сравнительные титры рекомбинантного бакуловируса (rBV) с или без последовательности hr2 от пассажа 3 до пассажа 10.
На ФИГ. 10А-Е изображены сравнительные результаты выходов AAV в сравнении между рекомбинантными бакуловирусами (rBV) с или без последовательности hr2 от пассажа 3 до пассажа 10 или в пассаже 10 между штаммами AAV.
На ФИГ. 11А-В изображена экспрессия с помощью вестерн-блоттинга капсидных белков AAV в клетках, инфицированных рекомбинантными бакуловирусами с последовательностями hr2 и без них.
На ФИГ. 12А-В изображена экспрессия с помощью вестерн-блоттинга белков rep AAV в клетках, инфицированных рекомбинантными бакуловирусами с последовательностями hr2 и без них.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Способы и композиции, описанные в данном документе, основываются на применении лабораторных способов, хорошо известных специалистам в данной области техники, и их можно найти в лабораторных руководствах, таких как Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001; Spector, D. L. et al., Cells: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1998; Nagy, A., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual (Third Edition), Cold Spring Harbor, NY, 2003 and Harlow, E., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1999. В контексте данного документа и любого пункта прилагаемой формулы изобретения, единственные формы существительных имен также включают в себя множественные формы, если контекст не указывает иначе.
Следующие материалы и способы также используются в различных аспектах данного изобретения.
Культура клеток насекомых
6
Клетки Sf9 Spodoptera frugiperda, клетки Trichoplusia ni и клетки Estima acrea культивировали в бутылках для хранения Corning при 28°С в среде ESF921 (системы экспрессии), дополненной 100 единицами/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (Mediatech). Для поддержания клетки разделяли 1:4, как только плотность клеток достигала 8×10 клеток/мл.
Конструирование плазмид и генерация рекомбинантного бакуловируса
Последовательность hr2 была амплифицирована с помощью ПЦР из генома бакуловируса и клонирована в плазмиду V053-pFBD-inRepOpt-inCap8 для создания V059-pFBD-inRepOpt-hr2-inCap8. Чтобы включить последовательность Козака, плазмида V059 была подвергнута рестрикции с помощью BstZ17I и AgeI для удаления фрагмента BstZ17I-AgeI и была проведена замена фрагментом BstZ 17I-AgeI с последовательностью Козака перед стартовым кодоном VP1 из V150-pFB-inCap8-inRep-kozak до создания V277-pFB-inCap8-hr2-inRep-kozak, в которой hr2 находится между кассетами экспрессии Rep и Сар. Чтобы вставить последовательность hr2 в другое место после последовательности полиА кассеты экспрессии Rep, последовательность hr2 была амплифицирована с помощью ПЦР с праймерами 3205F (5'-GCTTTACGAGTAGAATTCTACGTGT-3' SEQ ID NO: 7) и 3206R (5'-GGCCTACGTAGTTTTACACGTAGAATTCTACTCGT-3' SEQ ID NO: 8) из V277. Последовательность промотора pc была амплифицирована с помощью праймеров 3065F (5'-ATTTGACTTGGTCAGGGCCG-3' SEQ ID NO: 9) и 3204R (5'-GAATTCTACTCGTAAAGCCCAGTTGACATAAGCCTGTTCG-3' SEQ ID NO: 10) из V150. Эти фрагменты ПЦР промотора hr2 и рс были объединены во второй реакции ПЦР с праймерами 3065F и 3206R. Объединенный фрагмент ПЦР расщепляли с помощью BsrGI и SnaBI и лигировали в сайтах BsrGI и SnaBI V150, V212, V195, V188 и V146 для создания V288-pFB-inCap8-inRep-hr2, V289-pFB-inCap9-inRep-hr2, V290-pFB-inCap6-inRep-hr2, V291-pFB-inCap1-inRep-hr2 и V295-pFB-inCap5-inRep-hr2 соответственно. Примеры плазмид с вставками последовательности hr изображены на ФИГ. 1-6.
Плазмиду pFB-CMV-GFP конструировали путем ПЦР-амплификации фрагмента GFP, который затем клонировали в сайты множественного клонирования V032-pFB-CMV-SV40pA (ФИГ. 7)
Плазмиды использовали для получения бакмид в соответствии с протоколом производителя (Invitrogen). Кратко, плазмиды разбавляли до концентрации 2 нг/мкл и использовали 2 мкл плазмидной ДНК для трансформации компетентных клеток DH10Bac. После 2-х дней инкубации отбирали белые колонии и получали бакмидную ДНК в масштабе минипреп. Бакмидную минипреп-ДНК использовали для трансфекции клеток Sf9 для получения рекомбинантных бакуловирусов.
Клонирование с помощью метода бляшкообразования и пассирование рекомбинантного бакуловируса
-2
-3
-4
-5
-6
-7
Сгенерированные рекомбинантные бакуловирусы клонировали с помощью метода бляшкообразования для получения гомогенных клонов. Кратко, клетки Sf9 высевали на 6-луночные планшеты с плотностью клеток 1,5е+6 клеток/лунку в 2 мл среды ESF921 и инкубировали при температуре 28'С в течение 30 минут. Бакуловирусы каждый разводили до 10, 10, 10, 10, 10 и 10 в 1 мл объема. По окончании инкубации среду удаляли из лунок и добавляли 250 мкл каждого разведения для инфицирования клеток Sf9 при температуре 28'С в течение 1 часа. По окончании инкубации в лунки добавляли 3 мл 1% агарозного наслоения (охлажденного до 42'С). Когда агароза затвердевала, в каждую лунку добавляли 2 мл среды ESF921 и планшеты инкубировали при температуре 28'С в течение 5-7 дней. Хорошо сформированные бляшки отбирали и использовали для заражения клеток насекомых для пассирования.
Для пассирования рекомбинантных бакуловирусов, клонированных с помощью метода бляшкообразования, клетки насекомых инфицировали при множественности заражения (moi) вирусов, составляющем около 1, в течение 3 дней при температуре 28'С и отбирали супернатант. Отобранные вирусы были использованы для нового заражения свежих клеток насекомых и так далее до пассажа 10.
Количественная ПЦР (Qpcr) в режиме реального времени рекомбинантных бакуловирусов и векторов AAV
Для определения титров рекомбинантных бакуловирусов и AAV применяли метод ПЦР в режиме реального времени. Было эмпирически определено, что одна бляшкообразующая единица (pfu) содержит около 20 копий генома вируса. Кратко, отобранные вирусы разводили в буфере для разведения ПЦР в режиме реального времени и нагревали до температуры 95°С в течение 30 минут для разрушения вирусных частиц. Образцы обработанных вирусов затем анализировали в системе CHROM04™ (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA) вместе с известным стандартом. Величины Ct были преобразованы в pfu и использованы для проведения бакуловирусного пассирования и продуцирования AAV.
Продуцирование и количественная оценка вектора AAV
2
Рекомбинантные бакуловирусы использовали для инфицирования клеток насекомых для получения векторов AAV. Кратко, рекомбинантный бакуловирус с множественностью заражения 10, содержащий гены Rep и Сар с или без последовательности hr2, был совместно инфицирован с рекомбинантным бакуловирусом с множественностью заражения 5, содержащим маркерный ген GFP, фланкированный AAV ITR в течение 3 дней при температуре 28°С. Клетки осаждали центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 мин. Клеточные осадки лизировали в буфере для лизиса SF9 (50 мМ Трис-HCl, рН 7,8, 50 мМ NaCl, 2 мМ MgCl, 1% Sarkosyl, 1% Triton Х-100 и 140 единиц/мл Benzonase) путем обработки ультразвуком. Клеточный дебрис удаляли центрифугированием при 8000 об/мин в течение 20 мин. Очищенные лизаты использовали для количественной оценки продуктивности AAV следующим образом: лизаты разбавляли буфером для разбавления ПЦР в режиме реального времени, а загрязняющую ДНК разрушали путем инкубации с ферментом ДНКаза I при температуре 37°С в течение 1 часа. Фермент ДНКазу I инактивировали путем нагревания при температуре 95°С в течение 30 мин. в присутствии 100 мМ ЭДТА. Обработанные образцы AAV дополнительно разбавляли и анализировали на приборе для проведения ПЦР в режиме реального времени Chromo4. Значения Ct были преобразованы в значения копий генома вектора AAV.
Анализ с помощью Вестерн-блоттинга
6
Рекомбинантные бакуловирусы, содержащие гены rep и cap, использовали для инфицирования клеток Sf9 в течение трех дней и клетки осаждали центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 мин. Клеточные осадки, содержащие примерно 2×10 клеток, сначала ресуспендировали в 300 мкл буфера PBS и затем перемешивали с 100 мкл буфера для образцов 4×LDS для лизиса клеток. Лизаты нагревали при температуре 95°С в течение 5 мин и затем обрабатывали ультразвуком в течение 20 секунд для фрагментирования геномной ДНК. После кратковременного центрифугирования лизаты затем помещали в 10%-ный SDS-гель для разделения белков. Затем белки переносили из геля на нитроцеллюлозные мембраны. После блокирования с помощью 5% обезжиренного молока мембраны тестировали специфическими антителами против белков rep или cap.Соединенное с пероксидазой хрена (HRP) второе антитело против первого антитела использовали для определения белков rep или cap с помощью цветной реакции матрикса.
ПРИМЕРЫ
Данные описания, включая описания, приведенные в Примерах, не должны рассматриваться как ограничивающие объем любых пунктов формулы изобретения или аспектов. Если пример конкретно не представлен в прошедшем времени, пример может быть профетическим или фактическим примером. Следующие неограничивающие примеры приведены для дальнейшего описания данного изобретения. Специалистам в данной области техники в свете данного описания будет понятно, что многие изменения могут быть сделаны в раскрытых конкретных вариантах реализации изобретения и при этом приводить к похожему или подобному результату, не отступая от сущности и объема данного изобретения.
Пример 1.
Этот пример демонстрирует челночный вектор согласно данному изобретению.
В этой плазмиде (ФИГ. 1) последовательность hr2 расположена между кассетой гена капсида AAV8 и кассетой гена rep AAV2. Вектор содержит гены Сар и Rep в ориентации голова-к-голове. Данную челночную плазмиду использовали для получения рекомбинантного бакуловируса (rBV), который, в свою очередь, использовался для продуцирования AAV8 в клетках насекомых.
Пример 2.
Этот пример демонстрирует челночный вектор согласно данному изобретению.
В этой плазмиде (ФИГ. 2) последовательность hr2 расположена между кассетой гена rep AAV2 и геном стойкости к гентамицину (GmR). Вектор также содержит кассету гена капсида AAV8. Гены Сар и Rep находятся в ориентации голова-к-хвосту. Данную плазмиду использовали для получения рекомбинантного бакуловируса (rBV), который, в свою очередь, использовался для продуцирования AAV8 в клетках насекомых.
Пример 3.
Этот пример демонстрирует челночный вектор согласно данному изобретению.
В этой плазмиде (ФИГ. 3) последовательность hr2 расположена между кассетой гена rep AAV2 и геном стойкости к гентамицину (GmR). Вектор также содержит кассету гена капсида AAV9. Гены Сар и Rep находятся в ориентации голова-к-хвосту. Данную плазмиду использовали для получения рекомбинантного бакуловируса (rBV), который, в свою очередь, использовался для продуцирования AAV9 в клетках насекомых.
Пример 4.
Этот пример демонстрирует челночный вектор согласно данному изобретению.
В этой плазмиде (ФИГ. 4) последовательность hr2 расположена между кассетой гена rep AAV2 и геном стойкости к гентамицину (GmR). Вектор также содержит кассету гена капсида AAV6. Гены Сар и Rep находятся в ориентации голова-к-хвосту. Данную плазмиду использовали для получения рекомбинантного бакуловируса (rBV), который, в свою очередь, использовался для продуцирования AAV6 в клетках насекомых.
Пример 5.
Этот пример демонстрирует челночный вектор согласно данному изобретению.
В этой плазмиде (ФИГ. 5) последовательность hr2 расположена между кассетой гена rep AAV2 и геном стойкости к гентамицину (GmR). Вектор также содержит кассету гена капсида AAV1. Гены Сар и Rep находятся в ориентации голова-к-хвосту. Данную плазмиду использовали для получения рекомбинантного бакуловируса (rBV), который, в свою очередь, использовался для продуцирования AAV1 в клетках насекомых.
Пример 6.
Этот пример демонстрирует челночный вектор согласно данному изобретению.
В этой плазмиде (ФИГ. 6) последовательность hr2 расположена между кассетой гена rep AAV2 и геном стойкости к гентамицину (GmR). Вектор также содержит кассету гена капсида AAV5. Гены Сар и Rep находятся в ориентации голова-к-хвосту. Данную плазмиду использовали для получения рекомбинантного бакуловируса (rBV), который, в свою очередь, использовался для продуцирования AAV5 в клетках насекомых.
Пример 7.
Этот пример демонстрирует, что последовательность hr увеличивает выход продукции AAV.
В этих экспериментах последовательность hr2 была клонирована либо между кассетами экспрессии Rep и Сар в плазмиде V277 (ФИГ. 1), либо после последовательности поли-А кассеты экспрессии Rep в плазмидах V289 (ФИГ. 3) и V295 (ФИГ. 6), и были получены рекомбинантные бакуловирусы. Эти рекомбинантные бакуловирусы использовали для совместного инфицирования клеток Sf9 рекомбинантным бакуловирусом, несущим ген GFP для производства AAV. Результаты изображены на ФИГ. 8. Данные показывают, что последовательность hr2 повышает продуктивность AAV независимо от местоположения последовательности hr2 и серотипов AAV. Увеличение продуктивности AAV варьировалось от 2- до 4-х раз по сравнению с контролем, в котором отсутствует hr.
Пример 8.
Этот пример демонстрирует, что последовательность hr повышает стабильность рекомбинантных бакуловирусов, содержащих гены rep и cap AAV.
В этих экспериментах для дальнейшего анализа стабильности рекомбинантных бакуловирусов с или без последовательности hr2 применяли клонирование с помощью метода бляшкообразования и многократное пассирование рекомбинантных бакуловирусов. Пару праймеров для ПЦР в режиме реального времени - gp64F (5'-CCCTCTGTGTACTTGGCTCTAACG-3' SEQ ID NO: 11) и gp64R (5'-CGGTGAAACGCAAAGTCGAGCACCG-3' SEQ ID NO: 12) - соответствующую гену gp64 (присутствующему во всех рекомбинантных бакуловирусах согласно данному изобретению) использовали для определения общего титра бакуловируса. Для бакуловирусов, содержащих кассеты экспрессии Rep и Сар, пару праймеров для ПЦР в режиме реального времени - Rep2F (5'-ATTCATGCTCCACCTCAACC-3' SEQ ID NO: 13) и Rep2R (5'-GCCGTCTGGATCATGACTTT-3' SEQ ID NO: 14) - соответствующую последовательности Rep, использовали для определения титра данных бакуловирусов. Для этих экспериментов были выбраны рекомбинантные бакуловирусы, несущие Cap1-Rep (ФИГ. 5), Сар6-Rep (ФИГ. 4), Cap9-Rep (ФИГ. 3) и Cap8-Rep (ФИГ. 2). Для каждого пассажа общий показатель БОЕ (pfu) бакуловируса определяли с помощью праймеров gp64 и рассматривали его как 100%. Специфический бакуловирус для каждого пассажа определяли с использованием праймеров Rep, и оценивали в процентах от титра общего бакуловируса. Результаты изображены на ФИГ. 9А-Н для титров рекомбинантного бакуловируса (rBV) с или без последовательности hr2. На ФИГ. 9А изображены титры rBV, определенные с помощью праймеров для ПЦР в режиме реального времени gp64 и rep2 в клетках, несущих rBV-inCap1-inRep (Cap1 V188), экспрессирующую гены капсида AAV1 и rep AAV2 без последовательности hr2. На ФИГ. 9В изображены титры rBV, определенные с помощью праймеров для ПЦР в режиме реального времени gp64 и rep2 в клетках, несущих rBV-inCap1-inRep-hr2 (Cap1 V291, экспрессирующую гены капсида AAV1 и rep AAV2 с последовательностью hr2). На ФИГ. 9С изображены титры rBV, определенные с помощью праймеров для ПЦР в режиме реального времени gp64 и rep2 в клетках, несущих rBV, экспрессирующую гены капсида AAV6 и rep AAV2 без последовательности hr2. На ФИГ. 9D изображены титры rBV, определенные с помощью праймеров для ПЦР в режиме реального времени gp64 и rep2 в клетках, несущих rBV-inCap6-inRep (Сар6 V195), экспрессирующую гены капсида AAV6 и rep AAV2 с последовательностью hr2. На ФИГ. 9Е изображены титры rBV, определенные с помощью праймеров для ПЦР в режиме реального времени gp64 и rep2 в клетках, несущих rBV-inCap9-inRep (Сар9 V212), экспрессирующую гены капсида AAV9 и rep AAV2 без последовательности hr2. На ФИГ. 9F изображены титры rBV, определенные с помощью праймеров для ПЦР в режиме реального времени gp64 и rep2 в клетках, несущих rBV-inCap9-inRep-hr2 (Сар9 V289), экспрессирующую гены капсида AAV9 и rep AAV2 с последовательностью hr2. На ФИГ. 9G изображены титры rBV, определенные с помощью праймеров для ПЦР в режиме реального времени gp64 и rep2 в клетках, несущих rBV-Cap8-inRep (Сар8 V150), экспрессирующую гены капсида AAV8 и rep AAV2 без последовательности hr2. На ФИГ. 9Н изображены титры rBV, определенные с помощью праймеров для ПЦР в режиме реального времени gp64 и rep2 в клетках, несущих rBV-inCap8-inRep-hr2 (Сар8 V288), экспрессирующую гены капсида AAV8 и rep AAV2 с последовательностью hr2. rBV получали и пассировали в клетках Sf9 (ФИГ. 9A-D), клетках Tni pro (ФИГ. 9E-F) и клетках Е4а (ФИГ. 9G-H). Данные демонстрируют, что титр специфического бакуловируса уменьшался с увеличением числа пассажей в случае, когда бакуловирус не содержал последовательность hr2 (ФИГ. 9А, ФИГ. 9С, ФИГ. 9Е и ФИГ. 9G), тогда как было отмечено меньшее снижение титра специфического бакуловируса, когда бакуловирус содержал последовательность hr2 вблизи кассеты экспрессии rep (ФИГ. 9В, ФИГ. 9В, ФИГ. 9F и ФИГ. 9Н). Эти изменения сохранялись, независимо от того, были ли клетками-хозяевами SF9 (ФИГ. 9A-9D), Tni Pro (ФИГ. 9E-F) или Е4а (ФИГ. 9G-H). К пассажу Р10 бакуловирус с Cap1 AAV или Сар6 AAV имел титр ниже 10% от общего титра rBV в случае, когда векторы не содержали hr (ФИГ. 9А, ФИГ. 9С, ФИГ. 9Е и ФИГ. 9G), но бакуловирус с Cap1AAV или Сар6 AAV имел титр около 20% от общего титра rBV в случае, когда векторы содержали hr2 (ФИГ. 9В, ФИГ. 9D, ФИГ. 9F, ФИГ. 9Н).
Пример 9.
Этот пример демонстрирует, что последовательность hr повышает продуктивность AAV рекомбинантных бакуловирусов (rBV), содержащих гены rep и cap AAV.
+
-
В этих экспериментах rBV с или без последовательности hr в пассажах от 3 до 10 использовали для совместного инфицирования rBV, содержащим GFP, клеточных линий Sf9, Tni Pro и Е4а для получения векторов AAV. После трех дней совместного инфицирования гранулы клеток отбирали и определяли выход продукции AAV. Как изображено на ФИГ. 10A-D, выход продукции AAV1 в клетках Sf9 (ФИГ. 10А), AAV6 в клетках Sf9 (ФИГ. 10В), AAV9 в клетках Tni pro (ФИГ. 10С) и AAV8 в клетках Е4а (ФИГ. 10D) сохранялся в пассажах 3-10 в случае, когда вектор бакуловируса содержал последовательность hr2. Напротив, выход продукции AAV1, AAV6, AAV9 и AAV8 резко снизился в пассажах 3-10 при отсутствии hr2 в rBV. Чтобы дополнительно подтвердить это наблюдение, клетки Sf9 были совместно инфицированы rBV с hr2 пассажа 10 (V290, V288 и V289) или без последовательности hr2 (V195, V150 и V212) для получения AAV6 (V195 и V290), AAV8 (V150 и V288) и AAV9 (V212 и V289). Результаты демонстрируют значительно более высокий выход продукции AAV из клеток Sf9, инфицированных rBV, содержащим hr2, нежели те, которые инфицированы rBV без последовательности hr2 (ФИГ. 10Е) (сравните hrrBV V290, V288 и V289, с hrrBV V195, V150 и V212).
Пример 10.
Этот пример демонстрирует, что экспрессия rep и cap AAV напрямую коррелирует со стабильностью rBV при множественных пассажах.
В этих экспериментах был проведен вестерн-блоттинг для определения уровня экспрессии белков rep и cap.На ФИГ. 11 А-В изображена экспрессия капсидных белков VP1, VP2 и VP3 AAV6 после инфицирования клеток Sf9 рекомбинантными бакуловирусами rBV-inCap6-inRep (V195) без последовательности hr2 (ФИГ. 11А) и rBV-inCap6-inRep-hr2 (V290) с последовательностью hr2 (ФИГ. 11В) в пассажах от 3 до 10, соответственно. М, маркеры размера белка; дорожки от 1 до 8, клеточные лизаты, полученные из клеток Sf9, инфицированных rBV из пассажей 3-10.
На ФИГ. 12А-В изображена экспрессия белков REP78 и REP52 AAV2 после инфицирования клеток Sf9 рекомбинантными бакуловирусами rBV-inCap8-inRep (V150) без последовательности hr2 (ФИГ. 12А) и rBV-inCap8-inRep-hr2 (V288) с последовательностью hr2 (ФИГ. 12В). М, маркеры размера белка; дорожки 1-5, клеточные лизаты, полученные из клеток Sf9, инфицированных rBV из пассажей 6-10. Результаты на ФИГ. 11 и ФИГ. 12 демонстрируют, что rBV с последовательностью hr экспрессируют более высокие уровни белков rep и cap в течение множественных пассажей, включая более поздние пассажи, по сравнению с rBV, не имеющими последовательности hr.
Все цитируемые ссылки включены посредством ссылки, каждая в полном объеме. Заявитель оставляет за собой право оспорить любые выводы, представленные авторами любой ссылки.