Способ количественного определения альдегидных групп в окисленном декстране
METHOD OF QUANTITATIVE IDENTIFICATION OF ALDEHYDE GROUPS IN OXIDIZED DEXTRAN

Изобретение относится к аналитической химии и может быть использовано для количественного определения альдегидных групп в водорастворимых окисленных полисахаридах, в частности окисленном декстране, применяемом в качестве биосовместимого и биодеградируемого носителя для лекарственных препаратов.
Альдегидные группы в окисленном декстране способны реагировать с нуклеофильными группами различных лекарственных препаратов, в частности с первичными аминогруппами, с которыми образуются устойчивые ковалентные азометиновые связи. В организме конъюгат окисленного декстрана с лекарственным препаратом захватывается клетками ретикуло-эндотелиальной системы, в которых происходит ферментативный гидролиз декстрановой матрицы с высвобождением лекарственного средства. Таким образом, происходит адресная доставка лекарственного препарата в клетки ретикуло-эндотелиальной системы, которые являются основным эндогенным очагом развития многих внутриклеточных инфекций, в частности туберкулеза и системных микозов. Чем больше альдегидных групп в окисленном декстране, тем больше к нему можно присоединить фармакологически активного компонента, содержащего первичные аминогруппы. В связи с этим, важное значение имеет количественное определение альдегидных групп в окисленном декстране.
В аналитической химии существует достаточно большое число методов количественного определения альдегидных групп.
В частности, известен метод, основанный на реакции альдегидных групп с солями гидроксиламина. Как правило, для реакции используют гидрохлорид гидроксиламина, который вступает в реакцию с альдегидными соединениями с образованием оксимов, а по количеству образующейся соляной кислоты, определяемой титриметрическими методами, находят количественное содержание альдегидных групп. Недостатком этого метода является неводное титрование с использованием таких органических растворителей, как безводный этанол, метанол, диметиламиноэтанол и др., которые осаждают как окисленные, так и неокисленные полисахариды, включая декстраны (1).
Известен способ определения альдегидных групп по реакции присоединения бисульфита. Как и при использовании гидроксиламина гидрохлорида, данный способ не отличается высокой чувствительностью. Дополнительным недостатком способа является использование серной кислоты, которая может привести к частичному гидролизу окисленного декстрана, особенно при нагревании (2).
Близким к вышеуказанным способам определения альдегидных групп является способ, основанный на образовании гидразонов. Этот способ имеет те же недостатки. Кроме того, он неприемлем для анализа окисленного декстрана, так как образующиеся гидразоны, за счет высокой гидрофильности декстрана, растворимы в воде и не могут быть отфильтрованы и количественно определены гравиметрически, как, например, алифатические или ароматические гидразоны (3).
Для количественного определения альдегидных групп в окисленном декстране также неприемлемы методы с использование гипоиодита, так как это соединение является достаточно сильным окислителем и может дополнительно вызывать окисление глюкозных остатков в окисленном декстране, что приведет к получению завышенных результатов. (4).
Существуют комбинированные способы определения альдегидных групп, основанные на предколоночной дериватизации альдегидов с образованием оксимов и гидразонов, с последующим использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии. Способы отличаются сложностью исполнения и неприемлемы для окисленного декстрана, так как окисленный декстран нерастворим в ацетонитриле, который используется для обращено-фазовой хроматографии (5).
Наиболее близким аналогом к заявляемому изобретению является способ количественного определения альдегидных групп в окисленном декстране, включающий добавление к окисленному декстрану раствора 2,4-динитрофенилгидразина в качестве аналитического реагента, спиртового раствора щелочи, инкубацию анализируемого раствора, регистрацию оптической плотности раствора на спектрофотометре при длине волны 480 нм относительно контроля; определение содержания альдегидных групп в мМ/л раствора окисленного декстрана по калибровочному графику, построенному по неокисленному декстрану соответствующей молекулярной массы (6). Недостатком известного способа является то, что при использовании 2,4-динитрофенилгидразина и спиртового раствора щелочи наблюдается осаждение декстрана, что приводит к появлению мутности и вследствие этого плохой воспроизводимости результатов. Снижение концентрации спирта приводит к тому, что окрашенный продукт взаимодействия окисленного декстрана, 2,4-динитрофенилгидразина и спиртового раствора щелочи становится нестабильным и окраска быстро в течение нескольких минут исчезает, что также приводит к плохой воспроизводимости результатов.
Задачей, на решение которой направлено изобретение, является повышение воспроизводимости способа. Техническим результатом является предотвращение осаждения окисленного декстрана из реакционной среды при реализации способа.
Решение поставленной задачи достигается тем, что к окисленному декстрану в качестве аналитического реагента добавляют 3-(4,5-диметил-2-тиазолил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолия бромида и водный раствор щелочи; оптическую плотность раствора регистрируют при длине волны 540 нм.
Раскрытие изобретения
Способ количественного определения альдегидных групп в окисленном декстране включает добавление в опытной пробе к водному раствору окисленного декстрана с молекулярной массой 40 или 70 кДа 3-(4,5-диметил-2-тиазолил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолия бромида в качестве аналитического реагента и водного раствора щелочи. В качестве контрольной пробы используют смесь водных растворов 3-(4,5-диметил-2-тиазолил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолия бромида и щелочи в тех же концентрациях и объемах, что в опытной пробе. Затем проводят инкубацию полученных растворов; регистрируют их оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 540 нм. По разности оптической плотности опытного и контрольного растворов определяют содержание альдегидных групп в мМ/л раствора окисленного декстрана с помощью калибровочного графика, построенного по неокисленному декстрану аналогичной молекулярной массы.
Для реализации способа в качестве щелочи может быть использована гидроокись калия. Окисленный декстран молекулярной массы 40 или 70 кДа может быть получен согласно (7).
Для реализации способа используют растворы в следующих концентрациях: водный раствор гидроокиси калия - не выше 0,2%; водный раствор 3-(4,5-диметил-2-тиазолил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолия бромида - не выше 0,05%; окисленный декстран - не выше 0,1%.
Полученные смеси растворов инкубируют при температуре не менее 30°С (30±0,2°С) не менее 15 мин.
Для инкубации растворов используют водяной термостат с точностью 0,2°С, например Ultraterm BWTU. Регистрацию оптической плотности осуществляют на спектрофотометре, например СФ-2000.
Примеры калибровочных графиков для неокисленного декстрана молекулярной массы 40 или 70 кДа приведены на фиг. 1, 2.
Условия реакции альдегидных групп окисленного декстрана с 3-(4,5-диметил-2-тиазолил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолия бромидом установлены экспериментально. Изменение концентрации реактивов и условий проведения реакции снижает чувствительность способа и воспроизводимость результатов анализа. Например, при увеличении в реакционной смеси количества раствора 3-(4,5-диметил-2-тиазолил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолия бромида или увеличения его концентрации свыше 0,05% контрольные пробы приобретают значительную фоновую окраску, которая мешает определению оптических плотностей в пробах. Аналогичный эффект наблюдается при увеличении количества или концентрации раствора гидроокиси калия. Температура и время реакции также подобраны экспериментально, и при снижении температуры ниже 30°С и снижении времени реакции менее 15 минут наблюдается снижение оптических плотностей растворов, а при увеличении - оптические плотности не изменяются, так как количество окрашенного продукта реакции лимитируется количеством альдегидных групп в окисленном декстране.
Перечень фигур и иных материалов
Фиг. 1. Калибровочный график для неокисленного декстрана с молекулярной массой 40 кДа.
Фиг. 2. Калибровочный график для неокисленного декстрана с молекулярной массой 70 кДа.
Осуществление изобретения
В опытную пробу вносят 1,5 мл 0,1% водного раствора окисленного декстрана молекулярной массы 40 или 70 кДа, 1,5 мл 0,05% водного раствора 3-(4,5-диметил-2-тиазолил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолия бромида и 0,4 мл 0,2% водного раствора гидроокиси калия. В контрольную пробу вносят то же без окисленного декстрана. Пробирки встряхивают и помещают в термостат при температуре (30±0,2)°С на 15 минут.
По окончании инкубации измеряют оптическую плотность растворов в опытной и контрольной пробах на спектрофотометре при длине волны 540 нм в стандартной кювете с толщиной поглощающего свет слоя 10 мм. Определяют разность полученных значений, по которой определяют содержание альдегидных групп (С) в мМ/л раствора окисленного декстрана с использованием калибровочного графика, построенного по неокисленному декстрану той же молекулярной массы.
Примеры конкретного выполнения.
Заявленное изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.
Пример 1.
Перед осуществлением заявленного способа получают окисленный декстран с молекулярной массой 40 кДа согласно (7), добавляя в качестве окислителя 2 мл 2% раствора перманганата калия на 99 мл 5% раствора неокисленного декстрана с молекулярной массой 40 кДа.
Для осуществления заявленного способа в опытную пробирку вносят 1,5 мл 0,05% водного раствора 3-(4,5-диметил-2-тиазолил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолия бромида, 0,4 мл 0,2% водного раствора гидроокиси калия и 1,5 мл 0,1% водного раствора окисленного декстрана с м.М 40 кДа. В контрольную пробирку вносят 1,5 мл 0,05% водного раствора 3-(4,5-диметил-2-тиазолил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолия бромида, 0,4 мл 0,2% водного раствора. Пробирки встряхивают и помещают в водяной термостат Ultraterm BWTU при температуре (30±0,2)°С на 15 минут. По окончании инкубации измеряют оптическую плотность опытного и контрольного растворов на спектрофотометре СФ-2000 при длине волны 540 нм в стандартной кювете с толщиной поглощающего свет слоя 10 мм, определяют их разность. По величине последней определяют содержание альдегидных групп (С) в мМ/л раствора окисленного декстрана по калибровочному графику, построенному по неокисленному декстрану молекулярной массы 40 кДа. В результате анализа получено содержание альдегидных групп в окисленном декстране 0,21 мМ/г.
Пример 2.
Перед осуществлением заявленного способа получают окисленный декстран с м.М. 40 кДа согласно (7), добавляя в качестве окислителя 4 мл 2% раствора перманганата калия на 99 мл 5% раствора неокисленного декстрана с м.М. 40 кДа. Заявленный способ осуществляют, как описано в примере 1. В результате анализа получено содержание альдегидных групп в окисленном декстране 0,43 мМ/г.
Пример 3.
Перед осуществлением заявленного способа получают окисленный декстран с м.М. 70 кДа согласно (7), добавляя в качестве окислителя 2 мл 2% раствора перманганата калия на 99 мл 5% раствора неокисленного декстрана с м.М. 70 кДа. Заявленный способ осуществляют, как описано в примере 1, используя окисленный декстран с м.М. 70 кДа вместо окисленного декстрана с м.М. 40 кДа. Содержание альдегидных групп (С) в мМ/л раствора окисленного декстрана находят по калибровочному графику, построенному по не окисленному декстрану молекулярной массы 70 кДа. В результате анализа получено содержание альдегидных групп в окисленном декстране 0,11 мМ/г.
Пример 4.
Перед осуществлением заявленного способа получают окисленный декстран с м.М. 70 кДа согласно (7), добавляя в качестве окислителя 4 мл 2% раствора перманганата калия на 99 мл 5% раствора неокисленного декстрана с м.М. 70 кДа. Заявленный способ осуществляют, как описано в примере 3. В результате анализа получено содержание альдегидных групп в окисленном декстране 0,19 мМ/г.
Пример 5.
Перед осуществлением заявленного способа получают окисленный декстран с м.М. 70 кДа согласно (7), добавляя в качестве окислителя 6 мл 2% раствора перманганата калия на 99 мл 5% раствора неокисленного декстрана с м.М. 70 кДа. Заявленный способ осуществляют, как описано в примере 3. В результате анализа получают содержание альдегидных групп в окисленном декстране 0,29 мМ/г.
Во всех приведенных выше примерах визуально наблюдали отсутствие помутнения, опалесценции или выпадения осадка в области рабочих концентраций растворов исследуемых образцов, что подтверждает предотвращение осаждения окисленного декстрана из реакционной среды при реализации способа. При повторном воспроизведение способа в примерах 1-5, получали отклонение от первоначального результата количественного определения альдегидных групп в окисленном декстране не более 5%, что свидетельствует о высокой воспроизводимости заявленного способа.
Список использованных источников
1. С. Сиггиа, Дж. Г. Ханна. Количественный органический анализ по функциональным группам. Москва. Изд-во Химия, 1983, с. 80-84.
2. Там же, с. 85-89.
3. Там же, с. 89-95.
4. Там же, с. 112.
5. М. Czaplicka, K. Jaworek, A. Wochnic Determination of aldehydes in wet deposition // Archives of environmental protection, 2014. Vol. 40. N 2. P. 21-31.
6. С. Сиггиа, Дж. Г. Ханна. Количественный органический анализ по функциональным группам. Москва, Изд-во Химия, 1983, с. 122-125.
7. Евразийский патент на изобретение №011718 «Способ получения диальдегиддекстрана», опубл. 28.04.2009, МПК С08В 37/02.