Изучение диагностических возможностей моноклональных антител, специфичных к мембранному белку возбудителя холеры, в иммуноферментном анализе

МИКРОБИОЛОГИЯ

Пробл. особо опасных инф. 2017; 3:45-48. DOI: 10.21055/0370-1069-2017-3-45-48

УДК 616.932

В.В.Евдокимова, л.П.Алексеева, В.П.Зюзина, о.ф.кретенчук, м.Э.Яговкин

изучение диагностических возможностей моноклондльных антител, специфичных к мембранному белку возбудителя холеры, в иммуноферментном анализе

ФКУЗ «Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт», Ростов-на-Дону,

Российская Федерация

цель - разработка пероксидазного конъюгата на основе МКА H2F6 и изучение возможности его использования для выявления tcp+ штаммов холерных вибрионов 01/0139 серогрупп в прямых методах ИФА. материалы и методы. В работе использовали гибридный клон H2F6, синтезирующий в культуральную среду моноклональные антитела, специфичные к белку наружной мембраны холерного вибриона. результаты и выводы. На основе МКА сконструирован пероксидазный конъюгат, позволяющий выявлять tcp+ штаммы V. cholerae 01 и 0139 в прямом ТИФА и дот-ИФА. Испытания препарата на наборе штаммов холерных вибрионов и гетерологичных микроорганизмов показали его специфичность в отношении V. cholerae 01 и 0139. Моноклональный пероксидазный конъюгат H2F6 может быть использован для детекции в иммуноферментных методах эпидемически значимых штаммов холерных вибрионов 01/0139 серогрупп.

Ключевые слова: холерный вибрион, моноклональные антитела, иммуноблоттинг, твердофазный иммунофер-ментный анализ, дот-иммуноанализ, пероксидазный конъюгат.

Корреспондирующий автор: Евдокимова Вероника Вячеславовна, e-mail: nika-evd@yandex.ru.

V.V.Evdokimova, L.P.Alekseeva, V.P.Zyuzina, O.F.Kretenchuk, M.E.Yagovkin

The Study of Diagnostic Potential of Monoclonal Antibodies Specific to the Membrane Protein of Cholera Agent in Enzyme-Linked Immunoassay

Rostov-on-Don Research Anti-Plague Institute, Rostov-on-Don, Russian Federation

Objective of the study was to develop peroxidase conjugate on the base of monoclonal antibodies (MCA) H2F6 and to study the possibility of its application for the detection of tcp+ Vibrio cholerae O1/O139 strains using direct ELISA methods. Materials and methods. Utilized for the investigation was the hybrid H2F6 clone, which synthesized monoclonal antibodies specific to the outer membrane protein of cholera vibrio into culture medium. Results and conclusions. Peroxidase conjugate was designed on the base of MCA which allows for the detection of tcp+ V. cholerae O1 and O139 strains in direct solid-phase enzyme-linked immunosorbent assay and dot-ELISA. The preparation was tested on a group of strains of V. cholerae and heterologous microorganisms and showed specificity in relation to V. cholerae O1 and O139. Monoclonal peroxidase conjugate H2F6 can be used for the detection of epidemically significant V. cholerae O1/O139 strains by means of immune-enzyme methods.

Key words: cholera vibrio; monoclonal antibodies; immunoblotting; solid-phase enzyme-linked immunosorbent assay; dot-immu-noassay; peroxidase conjugate.

Conflict of interest: The authors declare no conflict of interest. Corresponding author: Veronika V. Evdokimova, e-mail: nika-evd@yandex.ru.

Citation: Evdokimova V.V., Alekseeva L.P., Zyuzina V.P., Kretenchuk O.F., Yagovkin M.E. The Study of Diagnostic Potential of Monoclonal Antibodies Specific to the Membrane Protein of Cholera Agent in Enzyme-Linked Immunoassay. Problemy Osobo Opasnykh Infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2017; 3:45-48. (In Russ.). DOI: 10.21055/0370-1069-2017-3-45-48

Возбудитель холеры продолжает представлять угрозу для общественного здравоохранения, что диктует необходимость разработки новых методов и средств диагностики. Создание современных иммунодиагностических препаратов невозможно без высокоактивных специфических антител. Уникальными преимуществами обладают моноклональные антитела (МКА) - они направлены к строго определенной антигенной детерминанте, имеют один изотип, обладают одинаковыми физико-химическими характеристиками и сродством к антигену, при наличии гибридом-продуцентов их можно получать по мере необходимости в неограниченном количестве. На сегодняшний день известно много зарубежных и отечественных публикаций, касающихся получения моноклональных антител к различным

поверхностным структурам холерного вибриона и его факторам патогенности. На основе МКА сконструированы высокоэффективные тест-системы: иммуноферментные [1, 2, 4, 16, 20], иммунохрома-тографические [11, 17, 18] и иммуносенсорные [12]. Нами на базе Ростовского-на-Дону противочумного института получен гибридный клон H2F6, продуцирующий в культуральную среду МКА, специфичные к мембранному белку Отри и/или ОтрТ холерных вибрионов 01, 0139 [5]. При оценке в иммунофер-ментном анализе диагностической значимости МКА H2F6 на наборе штаммов холерных вибрионов 01/ 0139 серогрупп, а также гетерологичных и близкородственных микроорганизмов, установлено, что антитела взаимодействуют только с ^ср+ штаммами V. сЫ1егае 01 и 0139. По данным Референс-центра

по мониторингу за холерой, за период с 2007 по 2015 год в субьектах Российской Федерации из воды поверхностных водоемов изолированы 33 штамма V. cholerae 01 ctxA- tcpA+ в Ростовской области (2007 и 2015 гг.), Республике Калмыкия (2007, 20112015 гг.), Aлтайском (2011 г.) и Хабаровском (2013 г.) краях. Такие штаммы холерных вибрионов не обладают эпидемическим потенциалом, но могут вызывать спорадические случаи и локальные вспышки [9] за счет продукции TCP, кодируемых кластером генов в составе острова патогенности VPI, и других факторов патогенности, детерминанты которых обнаружены в их геномах в различных сочетаниях [8]. Ежегодное выделение атоксигенных холерных вибрионов указывает на необходимость выявления потенциальных и реальных рисков контаминации холерными вибрионами 01/0139 серогрупп водных объектов и их устранения [10]. Цель данной работы - получение пероксидазного конъюгата на основе MKA H2F6 и изучение возможности его использования для выявления tcp+ штаммов холерных вибрионов 01/0139 серогрупп в прямых методах ИФA.

Материалы и методы

В работе использовали штаммы, полученные из коллекции Музея живых культур института: 32 штамма V. cholerae 01, 12 штаммов V. cholerae 0139, 4 -V. cholerae не 01/не 0139, 2 - E. coli, 2 - Salmonella spp., 4 - Aeromonas. Взвеси холерных вибрионов и гетерологичных микроорганизмов готовили в 0,9 % растворе хлорида натрия (рн 7,2±0,1) по стандартным образцам мутности ГИСК им. ЛА.Тарасевича 10 единиц (0С0 42-28-85П), соответствующего года выпуска, эквивалентных концентрации 1109 м.к./мл. Взвеси культур инактивировали на водяной бане в течение 30 мин.

Источником MKA служили культуральные жидкости, накопленные при многократном пассировании in vitro гибридомы-продуцента H2F6. Выделение иммуноглобулиновой фракции из культуральных жидкостей осуществляли преципитацией сульфатом аммония [6] с последующим диализом.

электрофорез образцов проводили по методике U.K.Laemmli [14] в пластинах 12,5 % полиакри-ламидного геля размером 70*100*0,7 мм в денатурирующих условиях (SDS-PAGE) при постоянном напряжении на приборе Mini-Protean Tetra System (Bio-Rad Laboratories, inc., COA). Полусухой перенос образцов из геля на нитроцеллюлозную мембрану (НЦМ) с диаметром пор 0,45 мкм проводили на приборе Trans-Blot Turbo Transfer System (Bio-Rad Laboratories inc., COA). Для окрашивания белковых фракций на мембране использовали краситель Ponceau S (Reanal, Budapest). Постановку иммуно-блоттинга осуществляли как описано H.Towbin et al. [19]; мембрану обрабатывали MKA, а затем инкубировали в рабочем растворе антимышиного конъюга-та (Goat Anti-mouse IgG H+L, HRP-conjugated, MP

Biomedicals), специфические полосы проявляли диа-минобензидином (Aldrich).

Метку MKA ферментом проводили по методу P.K.Nakane et al. [15] в соотношении 2:1, используя пероксидазу хрена (ПХ) с RZ (Reinheitszahl - показатель чистоты) не менее 3,0 (активность >250 ед/ мг, хроматографически чистая, обессоленная, для иммунологии, «ДИА-М»). Очистку конъюгатов от несвязавшейся пероксидазы проводили путем диализа против 0,01 М фосфатного буфера. Рабочее разведение ПХ-конъюгатов определяли методом шахматного титрования в двухкомпонентной реакции: контрольный антиген (АГ) АГ+МКА, меченные ферментом.

Постановку прямого твердофазного иммуно-ферментного анализа (ТИФА) в полистироловых планшетах осуществляли по общепринятой методике [7]. В качестве хромогена использовали 3,3'-5,5'-тетраметилбензидин (AppliChem, Германия). оптическую плотность измеряли на спектрофотометре BioTek EL*800 (BioTek Instruments, США) при длине волны 450 нм (референс-волна 630 нм).

Для постановки дот-ИФА по стандартной методике [7] использовали НЦМ с диаметром пор 0,45 мкм (Bio-Rad). После проведения реакции специфические пятна проявляли хромогеном диа-минобензидином (Aldrich), активированным 0,1 мл 3,5 % H2O2.

все исследования проводили не менее чем в трех повторностях. При анализе и обобщении результатов планшетного ИФА использованы методы, описанные И.П.Ашмариным [3].

Результаты и обсуждение

На первом этапе работы для приготовления препаративных количеств МКА клетки гибридомы H2F6, стабильно продуцирующей специфические иммуноглобулины, тиражировали in vitro в чашках Петри и культуральных матрасах. Оценку интенсивности антителопродукции проводили с помощью тестирования в ТИФА образцов среды из лунок с гибридомой. После накопления культуральной жидкости (КЖ) гибридомы H2F6 проводили выделение МКА с помощью метода сульфатного осаждения (при 50 % насыщения). В полученных препаратах определили содержание белка равное 5-8 мг/мл и методом непрямого ТИФА установили специфическую активность, которая составляла 1:4000-1:8000.

Эпитопную направленность МКА определяли в иммуноблоттинге, используя лизаты клеток холерных вибрионов (рис. 1). В результате обработки мембраны МКА H2F6 специфические белковые полосы обнаружены на уровне маркерных белков 3842 кДа у штаммов V. cholerae cholerae, V. cholerae El Tor (tcp+) и V. cholerae О139 (tcp+), что соответствует мембранным белкам OmpU и/или OmpT холерного вибриона.

Затем очищенные специфические моноклональ-

МИКРОБИОЛОГИЯ

Рис. 1. Иммуноблоттинг клеточных лизатов холерных вибрионов с МКА H2F6:

1—3 - штаммы Vibrio cholerae cholerae: 1401, 10353, 13571; 4-6- штаммы Vibrio cholerae El Tor (tcp+): 13020, 18895, 18780; 7-9 - штаммы Vibrio cholerae 0139 (tcp+): 16064, 16485, 17916

ные иммуноглобулины H2F6 конъюгировали с перок-сидазой хрена, в результате чего получено две серии препаратов. Для каждой серии конъюгатов проверяли способность связываться со специфическим антигеном и возможность неспецифической сорбции. Методом прямого ТИФА определили максимальное разведение конъюгатов, при котором наблюдалось положительное взаимодействие клеток холерного вибриона с МКА, а именно, препараты титровались до разведения 1:64-1:128. Для дальнейших экспериментов использовали их в рабочем титре 1:32 при отсутствии неспецифической сорбции.

Специфичность полученных конъюгатов оценивали на наборе штаммов холерных вибрионов, а также близкородственных и гетерологичных микроорганизмов. Подобраны культуры V. cholerae 01 и 0139 с генотипами tcp+ и tcp-. В таблице приведены результаты прямого ТИФА, которые подтверждают установленную в предыдущих опытах [5] специфичность МКА H2F6 в отношении tcp+ штаммов V. cholerae 01, 0139. Кроме того, исследуемые антитела взаимодействуют как с клетками El Tor штаммов, так и классических холерных вибрионов, что указывает на сходство у этих биоваров антигенной структуры мембранного порина, к которому направлены МКА H2F6.

Взаимодействие холерных вибрионов 01/0139 серогрупп с пероксидазным конъюгатом H2F6 в прямом ТифА

Бактериальные штаммы (обеззараженные кипячением) Количество исследуемых штаммов Количество штаммов, положительно взаимодействующих в ТИФА с ПХ-МКА H2F6

V. cholerae cholerae tcp+ 8 8

V. cholerae El Tor tcp+ 16 16

V. cholerae El Tor tcp- 8 0

V. cholerae 0139 tcp+ 6 6

V. cholerae 0139 tcp- 6 0

E. coli 2 0

V. cholerae не 01/не O139 4 0

Aeromonas spp. 4 0

Salmonella spp. 2 0

1 г 3 ч Г 6 г У (0 и (S

14 IS (ь & И ¿0 2i 22 ZI ¿4 г> U

г? П ю 31 32 Я ZI SS" зь 3>1 33 iS

ЧО ч\ 4¿ 43

—i

Рис. 2. Дот-ИФА исследуемых культур с ПХ-МКА H2F6:

Штаммы микроорганизмов: 1—13 - V. cholerae El Tor tcp+, 14-21 - V. cholerae El Tor tcp-, 22-26 - V. cholerae cholerae tcp+, 27-29 - V. cholerae не Ol/не O139, 30 - E. coli, 31-34 -Aeromonas spp, 35-40- V cholerae 0139 tcp+, 41-43 - V. cholerae 0139 tcp-

Конъюгаты ПХ-МКА H2F6 также исследовали в прямом дот-иммуноферментном анализе (рис. 2). Результаты дот-ИФА показали, что препараты взаимодействуют только с холерными вибрионами 01 и 0139 серогрупп, имеющими ген tcp. Положительная реакция на нитроцеллюлозной мембране проявляется в виде четко окрашенных коричневых пятен-дотов. 0трицательная реакция (отсутствие окрашенных пятен или еле заметные пятна) зарегистрирована в отношении tcp-штаммов V. cholerae 01, 0139, близкородственных и гетерологичных микроорганизмов.

Результаты проведенной работы показывают, что из культуральной жидкости гибридомы H2F6, накопленной при пассировании in vitro, возможно выделить специфические моноклональные иммуноглобулины, на основе которых могут быть приготовлены пероксидазные конъюгаты с титром 1:64 для постановки прямого ТИФА и дот-ИФА. Экспериментальные серии препаратов разливали на аликвоты и хранили при -20 °С. Часть препаратов стабилизировали путем лиофильного высушивания, в качестве криопротектора добавляли 1 % БСА (Albumin bovine, Amresco). Результаты испытаний препаратов после хранения их в лиофилизирован-ном состоянии в течение 12 месяцев показали, что они сохраняют специфическую активность на исходном уровне.

Таким образом, полученные моноклональные пероксидазные конъюгаты на основе МКА H2F6 имеют диагностическую значимость, т.к. способны выявлять в прямых методах ИФА tcp+ штаммы V. cholerae 01, 0139, в том числе и нетоксигенные. Как известно, наличие пилей адгезии у нетокси-генных штаммов холерных вибрионов создает потенциальную возможность адсорбции на них фага СТХф, в результате чего может произойти формирование нового клона. Адгезируясь на клетках тонкого кишечника с помощью tcp-пилей, холерные вибрионы образуют микроколонии с филаментоз-ным матриксом, который окружает бактериальные клетки и защищает их от антибактериальных компонентов [13]. В связи с этим штаммы ctx- tcp+ могут обладать определенным патогенетическим

потенциалом и возможностью выжить в условиях кишечника хозяина.

конфликт интересов. Авторы подтверждают отсутствие конфликта финансовых/нефинансовых интересов, связанных с написанием статьи.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Алексеева Л.П., Козлова Г.А., Маркина О.В., Кретенчук О.Ф., Яговкин М.Э., Бурша О.С. Использование моноклональ-ных пероксидазных конъюгатов для идентификации холерных вибрионов О1, О139 в реакции дот-иммуноанализа. Клин. лаб. диагн. 2013; 3:26-9.

2. Алексеева Л.П., Телесманич Н.Р., Ломов Ю.М., Храмов М.В., Кругликов В.Д., Агафонова В.В., Фатеева О.Ф., Чеботарев Д.А., Керманов А.В. Сравнительная оценка методов дот-иммуноанализа и иммунохроматографии при выявлении холерных вибрионов О1 серогруппы. Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2010; 6:88-93.

3. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л.: Медгиз; 1962. 180 с.

4. Евдокимова В.В., Алексеева Л.П., Кретенчук О.Ф., Кругликов В.Д., Архангельская И.В., Бурша О.С. Иммунофер-ментные методы анализа в диагностике холеры. Клин. лаб. диагн. 2016; 5:303-7. DOI: 10.18821/0869-2084-2016-61-5-303-307.

5. Евдокимова В.В., Алексеева Л.П., Кретенчук О.Ф., Кругликов В.Д., Архангельская И.В. Моноклональные антитела к термостабильным поверхностным антигенам холерных вибрионов О1- и О139-серогруппы. Эпидемиол. и инф. бол. 2015; 3:51-7.

6. Кэтти Д., редактор. Антитела. Методы. Т. 1. М.: Мир; 1991. 384 с.

7. Кэтти Д., редактор. Антитела. Методы. Т. 2. М.: Мир; 1991. 382 с.

8. Монахова Е.В. Стратегия вирулентности холерных вибрионов и пути ее реализации. Пробл. особо опасных инф. 2013; 4:60-8.

9. Онищенко Г.Г., Ломов Ю.М., Москвитина Э.А., Подосинникова Л.С., Водяницкая С.Ю., Прометной В.И., Монахова Е.В., Водопьянов С.О., Телесманич Н.Р., Дудина Н.А. Холера, обусловленная Vibrio cholerae O1 ctxAB- tcpA+. Журн. микробиол., эпидемол. и иммунобиол. 2007; 1:23-9.

10. Титова С.В., Москвитина Э.А., Кругликов В.Д., Самородова А.В., Тюленева Е.Г., Монахова Е.В., Писанов Р.В., Водопьянов А.С., Архангельская И.В., Иванова С.М., Ковалева Т.В., Водопьянов С.О. Холера: оценка эпидемиологической обстановки в мире и России в 2006-2015 гг. Прогноз на 2016 г. Пробл. особо опасных инф. 2016; 1:20-7. DOI: 10.21055/03701069-2016-1-20-27.

11. Chen W., Lu J.Zh.G., Yuan Z., Wu Q., Li J., Xu G., He A., Zheng Ji., Zhang Ju. Development of an immunochromatographic lateral flow device for rapid diagnosis of Vibrio cholerae O1 serotype Ogawa. Clinical Biochemistry. 2014; 47(6):448-54. DOI: 10.1016/j. clinbiochem.2013.12.022.

12. Jyoung J.Y., Hong S., Lee W., Choi J.W. Immunosensor for the detection of Vibrio cholerae O1 using surface plasmon resonance. Siosens. Bioelectron. 2006; 21(12):2315-9. DOl: 10.1016/j. bios.2005.10.015.

13. Krebs S.J., Taylor R.K. Protection and attachment of Vibrio cholerae mediated by the toxin-coregulated pilus in the infant mouse model. J. Bacteriol. 2011; 193(19):5260-70. DOI: 10.1128/ JB.00378-11.

14. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during assembly of the head ofbacteriophage T4. Nature. 1970; 227(5259): 680-5.

15. Nakane P.K., Kawaoi A. Peroxidase-labeled antibody a new method of conjugation. J. Histochem Cytochem. 1974; 22:1084-91.

16. Pengsuk C., Longyant S., Rukpratanporn S., Chaivisuthangkura P., Sridulyakul P., Sithigorngul P. Differentiation among the Vibrio cholerae serotypes O1, O139, O141 and non-O1, non-0139, non-0141 using specific monoclonal antibodies with dot blotting. J. Microbiol Methods. 2011; 87(2):224-33. DOI: 10.1016/j. mimet.2011.07.022.

17. Pengsuk Ch., Chaivisuthangkura P., Longyant S., Sithi-gorngul P. Development and evaluation of a highly sensitive immu-nochromatographic strip test using gold nanoparticle for direct detection of Vibrio cholerae O139 in seafood samples. Biosen. Bioelectron. 2013; 42:229-35. DOI: 10.1016/j.bios.2012.10.011.

18. Thattiyaphong A., Okada K., Khangrang S., Nispa W., Sawanpanyalert P., Honda T. Development of a 5-minute rapid test for detecting Vibrio cholerae O139. Southeast Asian J. Trop. Med. Public Health. 2013; 44(3):448-55.

19. Towbin H., Gordon J. Immunoblotting and dot immu-

nobinding - Current status and outlook. J. Immunol. Methods. 1984; 72:313-40.

20. Tuteja U., Kumar S., Shukla J., Kingston J., Batra H.V. Simultaneous direct detection of toxigenic and non-toxigenic Vibrio cholerae from rectal swabs and environmental samples by sandwich ELISA. J. Med. Microbiol. 2007; 56(Pt 10):1340-5. DOI: 10.1099/ jmm.0.47166-0.

References

1. Alekseeva L.P., Kozlova G.A., Markina O.V., Kretenchuk O.F., Yagovkin M.E., Bursha O.S. [Usage of monoclonal peroxidase conjugates for identification of cholera vibrios O1, O139 in dot-immunoassay]. Klin. Lab. Diagnost. 2013; 3: 26-9.

2. Alekseeva L.P., Telesmanich N. R., Lomov Yu.M., Khramov M.V., Kruglikov V.D., Agafonova V.V., Fateeva O.F., Chebotarev D.A., Kermanov A.V. [Comparative evaluation of dot-immunoassay and immune-chromato-graphic methods in case of cholera vibrio O1 detection]. Zh. Mikrobiol. Epidemiol. Immunobiol. 2010; 6: 88-93.

3. Ashmarin I.P., Vorob'ev A.A. [Statistical Methods in Microbiological Investigations]. Leningrad.: "Medgiz"; 1962; 180 p.

4. Evdokimova V.V., Alekseeva L.P., Kretenchuk O.F., Kruglikov V.D., Arkhangel'skaya I.V., Bursha O.S. [Immune-enzyme analysis in cholera diagnostics]. Klin. Lab. Diagnost. 2016; 5:303-7. DOI: 10.18821/0869-20842016-61-5-303-307.

5. Evdokimova V.V., Alekseeva L.P., Kretenchuk O.F., Kruglikov V.D., Arkhangel'skaya I.V. [Monoclonal antibodies to thermo-resistant surface antigens of cholera vibrio O1 and O139]. Epidemiol. Infek. Bol. 2015; 3:51-7.

6. Ketty D., editor. [Antibodies. Methods]. Vol. 1. M.: "Mir"; 1991.

384 p.

7. Ketty D., editor. [Antibodies. Methods]. Vol. 2. M.: "Mir"; 1991.

382 p.

8. Monakhova E.V. [Cholera vibrio virulence strategy and ways of its realization (Scientific review)]. Probl. Osobo Opasn. Infek. 2013; 4:60-8.

9. Onishchenko G.G., Lomov Yu.M., Moskvitina E.A., Podosinnikova L.S., Vodyanitskaya S.Yu., Prometnoy V.I., Monakhova E.V., Vodop'yanov S.O., Telesmanich N.R., Dudina N.A. [Cholera caused by Vibrio cholerae O1 ctxAB" tcpA+]. Zh. Mikrobiol. Epidemiol. Immunobiol. 2007; 1:23-9.

10. Titova S.V., Moskvitina E.A., Kruglikov V.D., Samorodova A.V., Tyuleneva E.G., Monakhova E.V., Pisanov R.V., Vodop'yanov A.S., Arkhangel'skaya I.V., Ivanova S.M., Kovaleva T.V., Vodop'yanov S.O. [Cholera: analysis of epidemiological situation across the world and in Russia within a period of 2006-2015]. Probl. Osobo Opasn. Infek. 2016; 1:20-7. DOI: 10.21055/0370-1069-2016-1-20-27.

11. Chen W., Lu J.Zh.G., Yuan Z., Wu Q., Li J., Xu G., He A., Zheng Ji., Zhang Ju. Development of an immunochromatographic lateral flow device for rapid diagnosis of Vibrio cholerae O1 serotype Ogawa. Clinical Biochemistry. 2014; 47(6):448-54. DOI: 10.1016/j.clinbiochem.2013.12.022.

12. Jyoung J.Y., Hong S., Lee W., Choi J.W. Immunosensor for the detection of Vibrio cholerae O1 using surface plasmon resonance. Siosens. Bioelectron. 2006; 21(12):2315-9. DOI: 10.1016/j.bios.2005.10.015.

13. Krebs S.J., Taylor R.K. Protection and attachment of Vibrio cholerae mediated by the toxin-coregulated pilus in the infant mouse model. J. Bacteriol. 2011; 193(19):5260-70. DOI: 10.1128/JB.00378-11.

14. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during assembly of the head ofbacteriophage T4. Nature. 1970; 227(5259): 680-5.

15. Nakane P.K., Kawaoi A. Peroxidase-labeled antibody a new method of conjugation. J. Histochem Cytochem. 1974; 22:1084-91.

16. Pengsuk C., Longyant S., Rukpratanporn S., Chaivisuthangkura P., Sridulyakul P., Sithigorngul P. Differentiation among the Vibrio cholerae serotypes O1, O139, O141 and non-O1, non-O139, non-O141 using specific monoclonal antibodies with dot blotting. J. Microbiol Methods. 2011; 87(2):224-33. DOI: 10.1016/j.mimet.2011.07.022.

17. Pengsuk Ch., Chaivisuthangkura P., Longyant S., Sithigorngul P. Development and evaluation of a highly sensitive immunochromatographic strip test using gold nanoparticle for direct detection of Vibrio cholerae O139 in seafood samples. Biosen. Bioelectron. 2013; 42:229-35. DOI: 10.1016/j. bios.2012.10.011.

18. Thattiyaphong A., Okada K., Khangrang S., Nispa W., Sawanpanyalert P., Honda T. Development of a 5-minute rapid test for detecting Vibrio cholerae O139. Southeast Asian J. Trop. Med. Public Health. 2013; 44(3):448-55.

19. Towbin H., Gordon J. Immunoblotting and dot immunobinding -Current status and outlook. J. Immunol. Methods. 1984; 72:313-40.

20. Tuteja U., Kumar S., Shukla J., Kingston J., Batra H.V. Simultaneous direct detection of toxigenic and non-toxigenic Vibrio cholerae from rectal swabs and environmental samples by sandwich ELISA. J. Med. Microbiol. 2007; 56(Pt 10):1340-5. DOI: 10.1099/jmm.0.47166-0.

Authors:

Evdokimova V.V., Alekseeva L.P., Zyuzina V.P., Kretenchuk O.F., Yagovkin M.E. Rostov-on-Don Research Anti-Plague Institute. 117/40, M.Gor'kogo St., Rostov-on-Don, 344002, Russian Federation. E-mail: plague@aaanet.ru.

об авторах:

Евдокимова В.В., Алексеева Л.П., Зюзина В.П., Кретенчук О.Ф., Яговкин М.Э. Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт. Российская Федерация, 344002, Ростов-на-Дону, ул. М.Горького, 117/40. E-mail: plague@aaanet.ru.

Поступила 11.08.17.