Влияние парциального давления кислорода на эффективность колониеобразования и дифференцировки мезенхимальных стромальных клеток человека, полученных из различных источников

ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Влияние парциального давления кислорода на эффективность колониеобразования и дифференцировки мезенхимальных стромальных клеток человека, полученных из различных источников

Н.С. Бурнаевский 1, Х.С. Вишнякова 1, А.В. Сафенина 1, Д.В. Рыбалко 2, К.В. Попов1, Е.Е. Егоров1

1 Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной биологии им. В А. Энгельгардта РАН

2 Московский физико-технический институт, Москва

Effects of oxygen partial pressure on the efficacy of colony formation and differentiation of human mesenchymal stromal cells derived from different sources

NS. Burnaevsky1. Kh.S. Vishnyakova 1,A.V. Safenlna 1. D.V. Rybalko 3, K.V. Popov1. E.E. Egorov 1

1 V.A. Engelhardt Institute of Molecular Biology RAS, Moscow

2 Moscow Institute of Physics and Technology. Moscow

Изучали колониеобразование и дифференцировку культур мезенхимальных стромальных клеток, полученных из материала надкостницы (п=10), из губчатой кости (п=8) и из периодонтальной связки (п=3) человека в зависимости от парциального давления кислорода. Показано, что во всех случаях колониеобразование в условиях сниженного парциального давления кислорода (3°/о) идет более эффективно, чем в условиях атмосферного кислорода (21%). Из трех вариантов мезенхимальных стромальных клеток, колонии наибольшего размера давали клетки надкостницы. Остеогенная дифференцировка клеток, напротив, шла более интенсивно в условиях атмосферного кислорода. Интенсивность остеогенной дифференцировки наблюдали в монослое на пластике и в трехмерной культуре на коллагеновых каплях.

Показано, что эффект снижения парциального давления кислорода на колониеобразование частично обусловлен изменением редокс-потенциала среды культивирования.

В условиях сниженного количества кислорода редокс-потенциал среды снижается примерно на 20 мВ и его искусственная коррекция позволяет увеличить эффективность колониеобразования в условиях атмосферного кислорода.

Ключевые слова: культура клеток, кислород, колониеобразование, редокс-регуляция, мезенхимальные стромальные клетки, дифференцировка, надкостница.

Ability of human mesenchimal stromal cells obtained from periost (n=10), from trabecular bone (n = 8), and from periodontal ligaments (n = 3) to form colonies and to differentiate were investigated in the presence of various oxygen concentrations. In all cases the colony forming assay showed increased capacity of cells to proliferate in the presence of decreased (3%) oxygen. From the three kinds of mesenchimal stromal cell periost cells demonstrate the highest ability to form colonies. Osteogenic differentiation in contrast was more intensive in the conditions of atmospheric oxygen. It was suitable to use collagen drops to observe differentiation. It was shown that low oxygen action partially is due to alterations of redox potential of culture media. Low oxygen decreases redox potential of media approximately by 20 mV and its artificial correction lead to increasing of colony forming ability.

Keywords: cells culture, oxygen, colony-formation, redoksregulation, mesenchymal stromal cells, differentiation, periosteum.

В настоящее время во всем мире ведется много работ, направленных на изучение возможности использования клеточных технологий в медицине. В клиниках уже проводятся операции по лечению кожных повреждений при помощи культур аутологичных фиб-робластов и мезенхимальных стволовых клеток [1—3].

Многие исследователи предполагают, что с помощью культур стволовых клеток можно будет лечить заболевания самого различного происхождения, связанные с деградацией или повреждением той или иной ткани, — инфаркт миокарда, остеохондроз, нейроде-генеративные заболевания, ишемические состояния [4—7].

К сожалению, получение клеточных культур из первичного материала и ведение их in vitro сопряжено с различными трудностями, связанными не только с подбором питательных сред и субстратов. Содержание кислорода в атмосфере (21%) много больше, чем его содержание в тканях организма. Уровень кислорода в артериальной крови составляет примерно 15%, в венозной крови — 5%, в ткани хряща может составлять около 1% [8, 9].

Повышенное количество кислорода в условиях in vitro может весьма разнообразно сказываться на поведении клеток. Это действие может проявляться

e-mail:Yegorov58@mail.ru

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, 1У< 4, 2010

в избыточном повреждении клеток активными формами кислорода, в изменении работы ряда генов, которые зависят от концентрации растворенного кислорода, изменении конформации и, следовательно, активности ряда белков, изменении энергетического обмена и т. д. Особо стоит отметить роль окислительно-восстановительного (редокс) потенциала культуральной среды, который активно изменяется самими клетками и на который влияет концентрация растворенного кислорода.

В представленной работе показано, что снижение концентрации кислорода в газовой среде с 21 % (уровня кислорода в воздухе) до 3% усиливает колониеобразование, но тормозит остеогенную дифференци-ровку всех изученных (п=21) культур мезенхимальных стромальных клеток, полученных из тканей ротовой полости человека. Обсуждается возможная роль изменения редокс-потенциала среды культивирования, как одного из механизмов реализации действия низких концентраций кислорода.

Материал и методы

Клетки. Первичные культуры мезенхимальных стромальных клеток (МСК) человека, полученные по стандартной методике с применением коллагеназы

[10], были любезно предоставлены А.А. Докторовым (НИЦБМТ ВИЛАР). Культуры были получены из фрагментов кости (КО) (п = 8) (стенка альвеол верхней или нижней челюсти), надкостницы (НК) (п = 10) и из периодонтальной связки (ПС) (п = 3) человека. Исходным материалом послужили фрагменты тканей, удаляемых в ходе стоматологических операций, не связанных с инфекционно-воспалительными процессами. Клетки культивировали в среде DMEM (ПанЗко, Россия), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) (HyClone) и 40 ед/мл гентамицина при 37°С, в атмосфере, содержащей 5% С02 и различные концентрации кислорода (3% или 21%). Для изменения концентрации кислорода клетки культивировали в специализированном термостате (Thermo Forma, model 3131, США). По достижении клетками монослоя их рассеивали в два раза с помощью растворов трипсина и Версена (ПанЗко, Россия).

Фибробласты 1608hTERT были получены ранее

[11] и представляют собой результат введения гена каталитического компонента теломеразы (hTERT) в штамм диплоидных фибробластов 1608, полученных из кожи взрослого донора. Эти клетки бессмертны, обладают теломеразной активностью и имеют удлиненные теломеры. Культивировали их в тех же условиях, что и МСК.

Колониеобразование. Осуществляли, как описано Егоровым и соавт. в [12]. Работали с клетками от четвертого до шестого пассажа. В пластиковые 10 см чашки Петри (Costar, США) высевали по 150 клеток (подсчет производили в камере Горяева) и культивировали в среде DMEM («ПанЗко»), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки («Hyclone») и 40 ед./мл гентамицина, при 37°С, в атмосфере, содержащей 5% С02, 3 или 21% кислорода. Через 7 дней клетки фиксировали и окрашивали (70% этанол, 0,1% метиленовый синий).

Производили подсчет колоний и количества клеток в колониях. Под термином «колония» мы понимаем любое количество клеток, идентичных одной исходной предшественнице, в том числе и всего одну клетку, которая в общепринятой номенклатуре является

лишь колониеобразующей единицей. Каждую чашку закрепляли на листе бумаги с нарисованной сеткой. Изображения анализировали с помощью стереомикроскопа МБС-9 (СССР). На листе бумаги с увеличенным изображением сетки отмечали положение колоний и количество клеток в них. Количество клеток считали округленно по разрядам двоичной системы. Например, если группа клеток состояла из трех или четырех клеток, то записывали 4, если в группе было от 5 до 8 клеток — 8, если от 128 до 256, то записывали 256. Из полученных таким образом данных вычисляли суммарное количество клеток, выросших в одной чашке. На одну экспериментальную кривую распределения колоний по размерам подсчитывали от трех до шести чашек, после чего данные усредняли.

Индукция остеогенной дифференцировки. Для индукции дифференцировки к монослою клеток добавляли ростовую среду, содержащую: дексаметазон (0,1 мкМ), бета-глицерофосфат (10 мМ) и фосфат L-аскорбиновой кислоты (100 мкМ). Среду меняли каждые три дня. Через 2 или 3 недели клетки фиксировали раствором 4% формальдегида в фосфатном солевом буфере 10 мин при комнатной температуре.

Формирование гелевых капель. Раствор коллагена (из хвостов крыс) в уксусной кислоте был любезно предоставлен З.Б. Дашинимаевым (ИБР РАН). Полимеризацию геля вели парами NH40H. Капли геля по 10^20 мкл наносили в 6-луночные планшеты (Costar, США). После этого планшеты помещали на 100^120 мин в эксикатор емкостью 4 л с парами аммиака. Для этого 5 мл 25% NH40H наливали на бумажную салфетку, которую клали в эксикатор. Контроль полимеризации геля проводили визуально. Гель не должен перетекать при наклонах планшета. После полимеризации в лунки планшетов добавляли по

2 мл среды DMEM и инкубировали в течение 24 ч при температуре 37°С. После еще одной смены среды лунки были готовы для посева клеток.

Измерение редокс-потенциала. Измерения проводили с помощью редокс электрода модели 96-78 (Orion Research Inc., США), подключенного к цифровому мультиметру OP-211/1 (Radelkis, Венгрия). Электрод в специальном держателе постоянно находился внутри термостата. Его опускали на несколько миллиметров в культуральную среду в чашке Петри (Costar, США), расположенную в термостате. Редокс-потенциал фиксировали через 15 мин, чтобы исключить изменения, вносимые процедурой открывания дверцы термостата. Для искусственного изменения редокс-потенциала среды использовали дитиотреи-тол (Sigma, США).

Гистологическая окраска. Для выявления минерализованного матрикса клетки окрашивали при комнатной температуре в течение 10 мин 2% раствором Ализаринового красного pH 4,1—4,3. Клетки фотографировали в «мокром» состоянии сразу после окрашивания с помощью инвертированного фазовоконтрастного микроскопа Diaphot (Nikon, Япония) и цифровой камеры Nikon D70.

Результаты

Колониеобразование. Как видно из рис.1, во всех исследованных случаях (п = 21) снижение содержания кислорода в атмосфере до 3% усиливает колониеобразование. Во всех случаях мода распределения сдвигается вправо на одно-три удвоения, при снижении концентрации кислорода уменьшается доля

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, № 4, 2010

І І І І І

ш

неделящихся клеток. Практически всегда (в 20 случаях из 21) увеличивается максимальный размер колоний (рис. 1). Эффект проявляется в равной степени для всех трех типов клеток — мезенхимальных стромальных клеток (МСК) из надкостницы, кости и периодонтальной связки.

В среднем МСК из надкостницы обладали наибольшей способностью к колониеобразованию, по

сравнению с МСК из кости и периодонтальной связки (рис. 2). Клетки, полученные из разных тканей одного пациента, различались достаточно сильно. Например, НК-10 давали колонии с количеством клеток почти в два раза большим, чем К0-10, которые, в свою очередь, правосходили ПС-1 Он и ПС-10в (рис. 2). При этом клетки пациента 7 (ПС-7 и НК-7) давали колонии сходного размера.

1 2 4 8 16 64 256 1024 1 2 4 8 16 64 256 1024 1 2 4 8 16 64 256 1024

32 128 512 32 128 512 32 128 512

Размер колоний в клетках

Рис. 1. Влияние кислорода на распределение колоний различных МСК по размерам.

Кривые с кружками соответствуют атмосферному содержанию кислорода [21 %}, кривые с квадратами - 3% кислорода. Номера обозначают различных пациентов, индексы «в» и «н» - верхнюю и нижнюю челюсть соответственно

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, № 4, 2010

МСК из периодонтальной связки МСК из кости МСК из надкостницы

10 ^ 20 2S 30

Суммарное количество клеток в чашке

Рис, 2, Результаты опытов по колониеобразованию различных МСК в условиях 3% кислорода, выраженные в суммарном количестве клеток, вырастающих в чашках. Цифрами обозначены различные пациенты, индексами «в» и «н» - верхняя и нижняя челюсть соответственно

Остеогенная дифференцировка. Опыты показали, что все исследованные культуры МСК обладают способностью к остеогенной дифференцировке. Обнаруженные различия в интенсивности дифференцировки не позволили выявить закономерную разницу в зависимости от источника ткани. Хорошо выраженные костные узелки, видимые невооруженным глазом и

массовое накопление минерализованного матрикса наблюдали начиная со второй недели (рис. ЗВ). Костная дифференцировка в условиях 3% кислорода во всех исследованных случаях (п = 21) происходила медленнее, чем в условиях атмосферного кислорода и к контрольному сроку достигала меньшей интенсивности (рис. ЗА, Б).

Рис. 3. Остеогенная дифференцировка МСК: А - остеодифференцировка ПС-10н при 21% кислорода; Б - тоже при 3% кислорода. Длительность дифференцировки - 3 нед.;

В - костный узелок, образовавшийся в культуре НК-10 через 3 нед. при дифференцировке в условиях 21% кислорода. Темнопольное освещение, бар =100 мкм;

Г - дифференцировка на гелевых каплях, длительность 2 нед.

Окраска ализариновым красным

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, № 4, 2010

Была предпринята попытка ускорить процесс выявления дифференцировки. Для этого клетки высевали на предварительно сформированные капли коллагенового геля. В этом случае, уже через две недели можно было наблюдать выраженное накопление минерализованного внеклеточного матрикса, свидетельствующего о дифференцировке (рис. ЗП. Как и при дифференцировке на пластике, дифферен-цировка на гелевых каплях шла более интенсивно в условиях атмосферного кислорода (рис. ЗП. Сравнение верхнего и нижнего ряда лунок на рис. ЗГ ясно показывает, что дифференцировка на гелевых каплях идет существенно быстрее.

Редокс-потенциал и колониеобразование. Одним из механизмов влияния кислорода на поведение клеток могут служить опосредованные кислородом изменения редокс-потециала среды. Прямое измерение редокс-потенциала среды показало его снижение примерно на 20 мВ в условиях 3% кислорода по сравнению с атмосферными условиями. Было решено снизить редокс-потенциал в условиях атмосферного кислорода с помощью восстанавливающего агента дитиотреитола (ДТТ) и провести опыты по колоние-образованию.

Из рис. 4 видно, что добавление ДТТ в концентрации 10 мкг/мл сдвигает редокс-потенциал более чем на 25 мВ. Однако уже через 24 ч после добавления ДТТ редокс-потенциал восстанавливается почти до исходного уровня. В связи с этим, мы решили провести опыты по колониеобразованию с повышенной до 30 мкг/мл концентрацией ДТТ, что сдвигает редокс-потенциал до 100 мВ.

160

m

5 140

г 120

о 100

О

3

Q.

80

О

о о

. зк-

о

О 10 20 30 40 S0

Концентрация ДТТ

Рис. 4, Зависимость редокс-потенциала культуральной среды от концентрации дитиотреитола [ДТТ].

Измерения проводили через 1 ч после добавления ДТТ

На рис. 5 представлены результаты этого эксперимента. ДТТ очень сильно стимулировал колониеобразование клеток 1608НТЕ№Т. Максимальный размер колоний увеличился в 8 раз (с 128 до 1024), доля одиночных клеток упала с 42% до 16%, суммарное количество клеток возросло примерно в 19 раз (с 453 до 8576). Более того, возросло общее количество колоний: в контроле оно составило 106±14, в присутствии ДТТ 147±11 (достоверность различия

1,64ст или 90%).

Размер колоний в клетках

Рис. 5. Оценка эффективности колониеобразования в виде определения доли колоний с различным числом клеток. Квадратами обозначена линия, соответствующая распределению колоний по числу клеток при добавлении ДДТ в концентрации 30 мкг/мл, кружками - контроль

Обсуждение

Традиционные методы культивирования клеток не учитывают того, что в организме кислорода значительно меньше, чем в окружающем воздухе, который содержит около 21% кислорода. В альвеолах концентрация кислорода падает до 15%, в венозной крови его концентрация составляет примерно 5%, а в тканях и того меньше — всего несколько процентов. Известно, что в костном мозге концентрация кислорода варьирует от 1 до 7% [13]. Культивирование в условиях газовой смеси, содержащей 3% кислорода было выбрано нами как модель, соответствующая некоторому среднетканевому уровню кислорода.

Полученные результаты по усилению колониеобразования соответствуют данным литературы и нашим собственным. Ранее нами было показано усиление колониеобразования различных клеток в условиях 3^ 5% кислорода [13—18].

Механизм влияния сниженного содержания кислорода на клетки остается не совсем ясным. С одной стороны существует известный кислородо-зависимый регулятор активности многих генов — HIF-1 [19, 20]. Авторы по большей части приписывают обнаруженные явления изменению транскрипции многих генов, имеющих в своем составе специфическую последовательность HRE (HIF-response element). Однако диапазон концентраций кислорода, в котором активируется HIF-1, лежит значительно ниже использованных в работе. Максимальную активность HIF-1 приобретает при концентрации кислорода около 0,5% [21].

По самому названию HIF-1 (фактор, индуцируемый гипоксией) активируется при гипоксии, т.е. когда концентрация кислорода резко падает до уровней ниже 1 %. Мы же проводили работу в условиях среднетканевого содержания кислорода, в нормальных, с точки зрения физиологии, условиях, а не изучали гипоксический ответ.

Одним из возможных объяснений улучшения роста клеток при сниженной концентрации кислорода может считаться уменьшение окислительного повреждения

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, № 4, 2010

клеток. Давно известно, что повышение концентрации кислорода (гипероксия) приводит к развитию окислительного стресса, увеличению количества разрывов в ДНК, в том числе и особенно в теломерной ДНК [22]. Аналогично можно предположить, что снижение концентрации кислорода должно уменьшать окислительное повреждение. Известно, что некоторые линии клеток, в том числе известный штамм фибробластов человека \А/1-38, способны к иммортализации только в условиях сниженного кислорода [23]. В условиях 3—5% кислорода экспрессия теломеразы приводит к иммортализации этих клеток, в то время как в условиях атмосферного кислорода экспрессия теломеразы лишь незначительно увеличивает их пролиферативный потенциал. Аналогичные данные были получены нами при иммортализации мезенхимальных стромаль-ных клеток человека, выделенных из материала ли-посакции [16]. Клетки становились иммортальными только в условиях сниженного содержания кислорода.

Однако прямое измерение продукции активных форм кислорода в клетках указывает, что при снижении концентрации кислорода в клетках увеличивается продукция супероксид-аниона и перекиси водорода. Вопрос крайне запутан и нуждается в дальнейших исследованиях [24, 25], которые должны показать, каким образом повышенная продукция различных окислителей (активных форм кислорода, азота, радикалов) может сочетаться с уменьшением повреждения клеток. Одним из объяснений, базирующихся на последних данных является то, что количество активных форм кислорода при снижении уровня кислорода является отражением усиления общего уровня клеточного сигналинга, сопряженного с продукцией супероксид-аниона НАДФН-оксидазами и поэтому не является достаточным признаком окислительного стресса [26, 27]. Косвенно на такую возможность указывает работа, показавшая, что снижение уровня кислорода не изменяет скорость укорачивания тело-мер. Клетки при этом вступают в репликативное старение имея более короткие теломеры. Возможно этот эффект связан с усилением положительного для пролиферации сигналинга [28].

Одним из факторов, которые в подавляющем большинстве случаев не принимаются во внимание, является окислительно-восстановительный потенциал (редокс-потенциал) среды культивирования. Этот потенциал отражает доступность (недоступность) электронов в среде для разнообразных, в том числе полностью обратимых окислительно-восстановительных реакций. В данном случае особый интерес представляют реакции с участием цистеина и метионина. Окисление-восстановление цистеина в большинстве случаев проявляется как образование-разрушение дисуль-фидных связей. Цистеиновые остатки входят в состав активных центров многих ферментов, они обеспечивают связывание различных белковых субъединиц друг с другом. В общем виде возникновение-разрушение дисульфидных связей меняет конформации белков, что неизбежно ведет к изменению их функций [29].

Логично предположить, что для прохождения определенных клеточных процессов (пролиферация, дифференцировка, апоптоз) требуются вполне определенные окислительно-восстановительные условия [30], способствующие или препятствующие взаимодействию чувствительных цитокинов с рецепторами.

Поскольку кислород является окислителем, то снижение его уровня, безусловно, должно сдвигать

редокс-потенциал среды в сторону восстановления. Прямое измерение показало, что редокс-потенциал среды снижается примерно на 20мВ. Мы решили химически (с помощью восстановителя) понизить ре-докс-потенциал среды культивирования и изучить, как это влияет на колониеобразование. Снижение редокс-потенциала на 20 мВ обеспечивается добавлением в среду ДТТ в концентрации около 10 мкг/мл. Однако при инкубации этой восстановленной среды в течение суток (без клеток) мы наблюдали медленное окисление среды (данные не приведены). Поэтому для опыта, длящегося неделю, была выбрана повышенная концентрация ДТТ (30 мкг/мл). Ранее нами было показано, что ключевыми при колониеобразовании являются условия первых дней. Колонии, достигая определенного размера (примерно 16 клеток), имеют тенденцию в дальнейшем к устойчивому росту [18]. Таким образом, концентрация в 30 мкг/мл ДТТ обеспечивает восстановление среды культивирования в первые критические дни опыта.

В результате проведенных экспериментов мы убедились, что колониеобразование при добавлении ДТТ усилилось даже в большей степени, чем при действии пониженной концентрации кислорода. Помимо усиления колониеобразования мы зафиксировали повышенную выживаемость клеток (Р=90%). Это соответствует положению о том, что окисление среды повышает вероятность апоптоза [30, 31].

Подбор редокс-потенциала среды особенно важен именно при клонировании клеток. Клетки способны эффективно регулировать редокс-потенциал среды, поглощая и секретируя цистеин или цистин [32]. При очень редком посеве мощности биосинтетических процессов не хватает для подобной модификации среды, которая остается непермиссивной для пролиферации, несмотря на формальное наличие в ней разнообразных факторов роста.

Таким образом, одним из механизмов влияния сниженного содержания кислорода на клетки, является снижение редокс-потенциала среды. Ранее исследователи часто вводили в состав культуральной среды цистеин, р-меркаптоэтанол или ДТТ и наблюдали улучшение колониеобразования [33].

С современных позиций подобные эффекты объясняются изменением редокс-регуляции. Подобные эффекты могут играть ключевую роль в чувствительности клеток к уже имеющимся факторам роста, которые, находясь в неправильной конформации, неспособны к индукции сигналинга. Полагают, что регуляция пролиферации различных иммунных клеток в организме опосредуется локальными, индуцированными клетками-регуляторами, изменениями редокс-потенциала среды [34, 35]. Для ознакомления с основами ре-докс-регуляции можно рекомендовать следующие обзоры [29, 36—38].

Влияние кислорода на дифференцировку также, возможно, опосредовано редокс-регуляцией, однако у нас нет данных это подтверждающих. Из общих соображений ясно, что остеогенная дифференцировка, поскольку является одним из компонентов чрезвычайной реакции организма на перелом кости, должна происходить в местах с богатым кровоснабжением, с относительно высоким уровнем кислорода. Эти же соображения позволяют объяснить факт того, что клетки, полученные из надкостницы, обладают самой высокой способностью к колониеобразованию (см. рис. 2). Известно, что клетки надкостницы вносят

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, № 4, 2010

существенный вклад в заживление переломов [39]. Этими доводами можно объяснить наши результаты показавшие, что остеогенная дифференцировка тормозится при низком содержании кислорода.

Полученные данные вполне коррелируют с литературными. Было показано, что условия трех процентов кислорода тормозят остеогенную дифференцировку мезенхимальных стволовых клеток человека [13, 40— 42]. Известно, что даже кратковременная глубокая гипоксия способна на длительный срок снижать экспрессию остеогенных факторов в таких клетках [43].

Таким образом, культивирование разнообразных клеток при сниженном уровне кислорода (3%) ускоряет их пролиферацию. Другими словами, в таких условиях можно получить во много раз больше клеток из одинакового начального количества, но главное

можно получить значительное количество более молодых, способных к пролиферации клеток, которые безусловно способны оказать более значительный терапевтический эффект при введении в организм. Вторым практическим выводом из данной работы может быть использование химических соединений для восстановления редокс-потенциала среды культивирования. Особую важность этот вопрос имеет в случаях клонирования клеток.

Работа поддержана грантом Российского фонда фундаментальных исследований 09-04-01071 а и государственным контрактом П1293 Федерального Агентства по Образованию. Авторы выражают благодарность A.A. Докторову за предоставление культур клеток и Э.Б. Дашинимаеву за предоставление коллагенового геля.

ЛИТЕРАТУРА

1. Расулов М.Ф., Васильченков А.В., Онищенко Н.А. и др. Первый опыт применения мезенхимальных стволовых клеток костного мозга для лечения больной с глубокими ожоговыми ранами кожи. Клеточные технологии в биологии и медицине 2005; 1: 42—5.

2. Shi С., Zhu Y., Su Y., Cheng T. Stem cells and their applications in skin-cell therapy. Trends in Biotechnology 2DD6; 24: 48—52.

3. Зорин В.Л., Зорина А.И., Черкасов В.P. Анализ зарубежного рынка регенеративной медицины. Клет. трансплантология и тканевая инженерия 2DD9; 4[3): 68—78.

4. Higashi Y., Kimura М., Нага К. et al. Autologous bone-marrow mononuclear cell implantation improves endothelium-dependent vasodilation in patients with limb ischemia. Circ. 2DD4; 109: 1215—8.

5. Dimmeler S., Burchfield J., Zeiher A.M. Cell-based therapy of myocardial infarction. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology 2008; 28: 208.

6. Astradsson A, Cooper 0, Vinuela A, Isacson 0. Recent advances in cell-based therapy for Parkinson disease. Neurosurg Focus. 2008; 24(3-41: E6.

7. Kabelitz D., Geissler E.K., Soria B., Schroeder I. S., Fflndrich F., Chatenoud L. Toward cell-based therapy of type I diabetes. Trends in Immunology 2008;29t2]: 68-74.

8. Grant J.L., Smith B. Bone marrow gas tensions, bone marrow blood flow, and erythropoiesis in man. Annals of Internal Med. 1963; 58(51: 802-9.

9. Lin Q., Kim Y., Alarcon R. M. et al. Oxygen and Cell Fate Decisions. Gene Regulation and Systems Biology 2008; 2: 43—519.

10. Zuk P.A., Zhu М., Ashjian P. et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Mol. Biol. Cell. 2002; 13: 4279—95.

11. Егоров E.E., Молдавер М.В., Вишнякова Х.С. и др. Усиление контроля пролиферации в теломеризованных клетках. Онтогенез 2007; 38: 105-19.

12. Егоров Е.Е., Молдавер М.В., Терехов С.М. и др. Теломеризация не увеличивает способность фибробластов человека к колониеобразованию. Биол. Мембраны. 2004; 21: 298—305.

13. D’lppolito G., Diabira S., Howard G.A. et al. Low oxygen tension inhibits osteogenic differentiation and enhances sternness of human MIAMI cells. Bone 2006; 39: 513—22.

14. Егоров E.E., Молдавер М.В., Вишнякова Х.С. и др. Действие кислорода на культуры фибробластов человека. Биол. Мембраны. 2005; 22: 43-51.

15. Егоров Е.Е., Молдавер М.В., Вишнякова Х.С. и др. Свидетельства в пользу дифференцировки иммортальных фибробластов человека in vitro при редком посеве. Биол. Мембраны. 2005; 22: 458—65.

16. Молдавер М.В., Дашинимаев З.Б., Вишнякова Х.С. и др. Влияние кислорода на теломеризованные клетки разного типа, полученные от одного донора. Биол. Мембраны. 2007; 24: 402—12.

17. Панюхин Н.В., Вишнякова Х.С., Егоров Е.Е. Влияние парциального давления кислорода на выживаемость, пролиферацию и дифференцировку мезенхимальных стволовых клеток из костного мозга мыши. Биол. Мембраны. 2008; 25: 260—7.

18. Moldaver M.V., Yegorov Y.E. Sparse plating increases the heterogeneity of proliferative potential of fibroblasts. Mech. Ageing Dev. 2009; 130: 337-42.

19. Simon M.C. Mitochondrial reactive oxygen species are required for hypoxic HIF alpha stabilization. Adv. Exp. Biol. 2006; 588: 165-70.

20. Wenger R.H., Stiehl D.P, Camenisch G. Integration of oxygen signaling at the consensus HRE. Sci. STKE 2005; re12.

21. Guzy R.D., Schumacker P.T. Oxygen sensing by mitochondria at complex III: the paradox of increased reactive oxygen species during hypoxia. Exp. Physiol. 2006; 91: 807—19.

22. von Zglinicki T., Saretzki G., Ducke W. et al. Mild hyperoxia shortens telomeres and inhibits proliferation of fibroblasts: a model for senescence? Exp. Cell Res. 1995; 220: 186—93.

23. Wright W.E., Shay J.W. Historical claims and current interpretations of replicative aging. Nat. Biotechnol. 2002; 20: 8—14.

24. Bell E.L., Klimova T.A., Eisenbart J. et al. Mitochondrial reactive oxygen species trigger hypoxia-inducible factor-dependent extension of the replicative life span during hypoxia. Mol. Cell. Biol. 2007; 27: 5737^15.

25. Butler A.J., Eagleton M.J., Wang D. et al. Induction of the proliferative phenotype in differentiated myogenic cells by hypoxia. J. Biol. Chem. 1991; 266: 18250-8.

26. Chandel N.S., Maltepe E., Mathieu M. et al. Mitochondrial reactive species trigger hypoxia-induced transcription. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001; 95: 11715-20.

27. Chandel N.S., Budinger G.R.S. The cellular basis for diverse responses to oxygen. Free Radical Biol. Med. 2007; 42: 165—74.

28. Betts D.H., Perrault S.D., King W.A. Low oxygen delays fibroblast senescence despite shorter telomeres. Biogerontol. 2008; 9: 19—31.

29. Jones D. P. Radical-free biology of oxidative stress. Amer. J. Physiol. Cell Physiol. 2008; 295: C849-68.

30. Jones D. P. Extracellular redox state: refining the definition of oxidative stress in aging. Rejuvenation Res. 2006; 9: 169—81.

31. Banjac A., Perisic T., Sato H. et al. The cystine/cysteine cycle: a redox cycle regulating susceptibility versus resistance to cell death. Oncogene 2008; 27: 1618-28.

32. Gmunder H., Eck H.-P., Benninghoff B. et al. Macrophages regulate intracellular glutathione levels of lymphocytes. Evidence for an immunoregulatory role of cysteine. Cell. Immunol. 1990; 129: 32—46.

33. Epstein A.L., Kaplan H.S. Feeder layer and nutritional requirements for the establishment and cloning of human malignant lymphoma cell lines. Cancer Res. 1979; 39: 1748—59.

34. Yan Z., Garg S.K., Kipnis J. et al. Extracellular redox modulation by regulatory T cells. Nat. Chem. Biol. 2009; 5: 721—3.

35. Rubartelli A., Sitia R. Chemo-metabolic regulation of immune responses by Tregs. Nat. Chem. Biol. 2009; 5: 709—10.

36. Go Y.-M., Jones D. P. Redox compartmentalization in eukaryotic cells. Biochim. Biophys. Acta 2008; 1780: 1273—90.

37. Droge W. Free radicals in the physiological control of cell function. Physiol. Rev. 2002; 82: 47-95.

38. Valko M., Leibfritz D., Moncol J. et al. Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease. Internat. J. Biochem. Cell Biol. 2007; 39: 44—84.

39. Redlich A., Perka C., Schultz 0. et al. Bone engineering on the basis of periosteal cells cultured in polymer fleeces. J. Mater. Sci.: Materials Med. 1999; 10: 767—72.

40. Fehrer С., Brunauer R., Laschober G. et al. Reduced oxygen tension attenuates differentiation capacity of human mesenchymal stem cells and prolongs their lifespan. Aging Cell 2007; 6: 745—57.

41. Жамбалова А.Л., Гершович (О.Г., Буравкова Л.Б., и др. Влияние пониженного содержания кислорода на дифференцировку мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга человека in vitro. КлетТранспл. 2009; IVC3): 47—51.

42 Буравкова Л.Б., Капланский А.С., Андреева Е.Р. и др. Особенности формирования костной мозоли у крыс после введения в область перелома мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток, культивированных при различном содержании кислорода. КлетТранспл. 2009; IVC3): 52—57.

43. Potier Е., Ferreira E., Andriamanalijaona R. et al. Hypoxia affects mesenchymal stromal cell osteogenic differentiation and angiogenic factor expression. Bone 2007; 40: 1078—87.

Поступила 18.032010

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, hl< 4, 2010