Способ получения каллусной культуры змееголовника дланевидного (Dracocephalum palmatum Steph.) в условиях in vitro
METHOD FOR MAKING CALLUS CULTURE OF DRACOCEPHALUM PALMATUM STEPH. IN VITRO CONDITIONS

Изобретение относится к области биотехнологии растений и может быть использовано в фармацевтической промышленности для получения сырья, содержащего ценные биологически активные соединения (флавоноиды, фенольные соединения), а также при введении в культуру in vitro других представителей лекарственных растений, получение которых затруднено из-за высокого содержания в своем составе летучих эфирных соединений.
Змееголовник дланевидный Dracocephalum palmatum Steph.– растение семейства Lamiaceae, многолетнее вечнозеленое растение с ползучими побегами, образует очень плотную дернину. Листья и побеги опушены. Цветоносы приподнимаются над дерниной на 10-15 см. Цветки фиолетовые в мутовках. Семена созревают в июле. Зимует с зелеными листьями. Встречается в северо-восточных районах Якутии. Растет на сухих каменисто-щебнистых склонах, скалах, в каменистых тундрах, гонных степях (см. Данилова Н.С., Борисова С.З., Иванова Н.С. Декоративные растения Якутии: Атлас-определитель. – М.: ЗАО «Фитон+», 2012. – 248 с).
Известно, что на основе химических и спектральных работ из частей змееголовника дланевидного было выделено 23 соединения (фенилпропаноиды, кумарины, флавоноиды и тритерпены), среди которых впервые в роду Dracocephalum было обнаружено восемь соединений: сальвианоловая кислота B, кафтаровая кислота, цихоровая кислота, умбеллиферон, эскулетин, апигенин-7-O-β-D-глюкуронопиранозид, изорхоифолин и лютеолин-4'-O-β-D-глюкопиранозид (см. Olennikov DN, Chirikova NK, Okhlopkova ZM, Zulfugarov IS. Chemical composition and antioxidant activity of Tánara Ótó (Dracocephalum palmatum Stephan), a medicinal plant used by the North-Yakutian nomads. Molecules.2013 Nov 14;18(11):14105-21.).
Змееголовник дланевидный используют в тибетской медицине, якутской народной медицине, настой из надземной части и цветков применяют при язвенной болезни желудка, а в Средней Азии - при сердечной недостаточности, астении, болезнях желудка и как потогонное средство.
Известен способ получения каллусной культуры представителя семейства Lamiaceaе шлемника андрахновидного (Scutellaria andrachnoides) (см. ЕА №020503, кл. C12N 5/04, A01H 4/00, опубл. 28.11.2014), включающий получение штамма культуры корня растения шлемника андрахновидного (Scutellaria andrachnoides), интенсивно растущего в условиях in vitro на безгормональных питательных средах, сохраняющего способность к синтезу фенольных соединений, характерных для корней целого растения, и обладающего генетической и биохимической стабильностью.
Авторами в открытых источниках технические решения по получению каллусной культуры клеток змееголовника дланевидного не выявлено.
Задачей настоящего изобретения является получение каллусной культуры клеток змееголовника дланевидного (Dracocephalum palmatum Steph.) в условиях in vitro.
4
3
3
2
2
4
2
2
4
3
3
4
2
4
2
2
4
2
4
2
2
2
4
2
4
3
3
2
2
4
2
2
4
3
3
4
2
4
2
2
4
2
4
2
2
2
4
2
Для решения поставленной задачи способ получения каллусной культуры клеток дикорастущего растения змееголовника дланевидного (Dracocephalum palmatum Steph.) в условиях in vitro включает стерилизацию семян змееголовника раствором перекиси водорода (3% раствор) в течение 5 минут, этиловым спиртом (80% раствор) в течение 1 мин, трехкратное ополаскивание в стерильной дистиллированной воде, помещение стерильных семян на твердую питательную среду без гормонов следующего состава, в мг/л: NHNO- 33000, KNO- 38000, CaCl×2HO - 8800, MgSO×7HO - 7400, KHPO - 3400, KI - 166, НВО - 1240, MnSO×4HO - 4460, ZnSO×7HO - 1720, NaMoO×2HO - 50, CuSO×5HO - 5, CoCl×6HO - 5, FeSO×7HO - 5560, Na-ЭДТА - 7460, мезоинозит - 100, никотиновая кислота - 100, пиридоксин - 100, тиамин - 100, сахароза - 2500, вода - 1000 мл, агар - 7000. Далее, полученные из проростков листовые экспланты помещают в питательную среду следующего состава, в мг/л: NHNO - 33000, KNO - 38000, CaCl×2HO - 8800, MgSO×7HO - 7400, KHPO - 3400, KI - 166, НВО - 1240, MnSO×4HO - 4460, ZnSO×7HO - 1720, NaMoO×2HO - 50, CuSO×5HO - 5, CoCl×6HO - 5, FeSO×7HO - 5560, Na-ЭДТА - 7460, мезоинозит - 100, никотиновая кислота - 100, пиридоксин - 100, тиамин - 100, сахароза - 3000, гидролизат казеина - 500, кинетин - 1, 2,4-Дихлорфеноксиуксусная кислота - 1, вода - 1000 мл, агар - 12000. При этом культивирование растений проводят в темноте, при температуре 26±1°С, влажности помещения 70±5%, цикл субкультивирования составляет 4 недели.
Анализ признаков заявленного решения свидетельствует о соответствии заявленного решения критерию «новизна», каллусная культура змееголовника дланевидного (Dracocephalum palmatum Steph.) впервые получена в условиях in vitro.
Совокупность существенных признаков обеспечивает решение заявленной технической задачи, а именно, получение каллусной культуры змееголовника дланевидного(Dracocephalum palmatum Steph.).
Предлагаемое решение состоит в том, что за основу взяты стерильные свежие проростки, культивируемые в контролируемых условиях климатической камеры из семян интактного растения, фитомасса которого собрана во время стационарно-маршрутных работ на территории Оймяконского нагорья в Республике Саха (Якутия), известного как «Полюс холода – Оймякон», в фенофазах «конец цветения, начало плодоношения».
При этом отобранные семена стерилизовали раствором 3 % перекиси водорода в течение 5 минут, после чего, вторично 80 % спиртом в течение 1 мин. После стерилизации материал трехкратно ополаскивали стерильной дистиллированной водой. Стерилизованные семена помещали на твердую питательную среду без гормонов. Культивирование проростков проводили до третьего-пятого настоящих листьев в течение трех недель.
Питательная среда Мурасиге-Скуга для культивирования свежих проростков растения содержит компоненты в количественном соотношении, представленном в таблице 1.
Из полученного проростка получали листовые экспланты, которые помещали в питательную среду с дополнительным добавлением гидролизата казеина, кинетина, 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты. При этом выявлено, что наиболее интенсивное каллусообразование получается при концентрации фитогормонов кинетин 1 мг/л, 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты 1 мг/л.
После образования каллусной ткани проводили его отделение и рассадку в культуральные сосуды (чашки Петри, конически колбы на 100 и 250 мл) со свежей питательной средой, того же состава.
Питательная среда Мурасиге-Скуга для получения каллусной ткани содержит компоненты в количественном соотношении, представленном в таблице 2.
Культивирование проводили в темноте, при 26±1°С, влажности помещения 70±5%, в чашках Петри с диаметром 90 мм. При этом цикл субкультивирования составлял 4 недели. При пересеве использовали ¼ каллусной культуры.
Пересадку проводили каждые 30 дней, таким образом, сохраняя полученную каллусную культуру. В процессе культивирования определяли морфологические, цитологические характеристики, также отбирали для молекулярных исследований и химических анализов.
Описание способа получения каллусной культуры Dracocephalum palmatum Steph. в настоящее время нигде не зарегистрировано.
Полученная каллусная культура характеризуется следующими признаками.
Культуральные признаки: каллусные культуры рыхлые и зернистые, имеют желтовато-серую окраску.
Индекс роста (кратность прироста биомассы за одно субкультивирование) определяют по сырому и сухому весу биомассы. Для определения веса сырой биомассы каллусных культур отделяют от среды культивирования на бумажных фильтрах и взвешивают. Сухую биомассу каллусных культур получают после лиофильной сушки.
При анализе представленных кривых роста следует отметить замедление роста на 20 сутки культивирования, что позволяет использовать 4-недельный цикл выращивания. Ростовые параметры (кроме индекса роста) рассчитывали по сырому весу биомассы. Результаты представлены в таблице 3 и свидетельствуют о наличии стабильных ростовых характеристик.
Таким образом, выявлен способ получения каллусных культур змееголовника дланевидного (Dracocephalum palmatum Steph.) из эксплантов проростков, полученных в лабораторных условиях.
Таблица 1
Состав питательной среды Мурасиге-Скуга для культивирования проростков к получению стерильных эксплантов, в мг/л
Компоненты
Содержание
NH<sub>4</sub>NO<sub>3</sub>
33000
KNO<sub>3</sub>
38000
CaCl<sub>2</sub>x2H<sub>2</sub>O
8800
MgSO<sub>4</sub>x7H<sub>2</sub>O
7400
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>
3400
KI
166
H<sub>3</sub>BO<sub>3 </sub>
1240
MnSO<sub>4</sub>x4H<sub>2</sub>O
4460
ZnSO<sub>4</sub>x7H<sub>2</sub>O
1720
Na<sub>2</sub>MoO<sub>4</sub>x2H<sub>2</sub>O
50
CuSO<sub>4</sub>x5H<sub>2</sub>O
5
CoCl<sub>2</sub>x6H<sub>2</sub>O
5
FeSO<sub>4</sub>x7H<sub>2</sub>O
5560
Na-ЭДТА
7460
Мезоинозит
100
Тиамин
100
Пиридоксин
100
Никотиновая кислота
100
Сахароза
2500
Вода
1000 мл
Агар
7000
Таблица 2
Состав питательной среды Мурасиге-Скуга для получения каллусной культуры клеток
Компоненты
Содержание, в мг/л
NH<sub>4</sub>NO<sub>3</sub>
33000
KNO<sub>3</sub>
38000
CaCl<sub>2</sub>x2H<sub>2</sub>O
8800
MgSO<sub>4</sub>x7H<sub>2</sub>O
7400
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>
3400
KI
166
H<sub>3</sub>BO<sub>3 </sub>
1240
MnSO<sub>4</sub>x4H<sub>2</sub>O
4460
ZnSO<sub>4</sub>x7H<sub>2</sub>O
1720
Na<sub>2</sub>MoO<sub>4</sub>x2H<sub>2</sub>O
50
CuSO<sub>4</sub>x5H<sub>2</sub>O
5
CoCl<sub>2</sub>x6H<sub>2</sub>O
5
FeSO<sub>4</sub>x7H<sub>2</sub>O
5560
Na-ЭДТА
7460
Мезоинозит
100
Гидролизат казеина
500
Тиамин
100
Пиридоксин
100
Никотиновая кислота
100
Сахароза
30000
Кинетин
1
2,4-Д
1
Вода
1000 мл
Агар
12000
Таблица 3
Ростовые параметры каллусных культур змееголовника дланевидного
Показатели
Значения, г
Индексы роста по: весу сырой биомассы
0,0867
Удельный рост по весу сырой биомассы, сут -1
0,0043