ВАКЦИННЫЙ ПРЕПАРАТ
VACCINE PREPARATION

Изобретение относится к области молекулярной биологии, иммунологии, вирусологии и касается вакцинного препарата, который может быть использован для борьбы с вирусными и другими заболеваниями инфекционной природы.
Известен вакцинный препарат, состоящий из вирусных частиц, несущих на поверхности эпитопы (антигенные детерминанты) различных вирусов животных (M.Bendahmane, М.Коо, E.Karrer, R.N.Beachy, Display of epitopes on the surface of tobacco mosaic virus: impact of charge and isoelectric point of the epitope on virus-host interactions, J. Mol. Biol., 1999, 290, 9-20).
Известен вакцинный препарат, состоящий из палочковидных вирусных частиц с ковалентно связанным биотином для конъюгирования таких модифицированных вирусных частиц с антигенными полипептидами, содержащими ковалентно связанный авидин (M.M.McCormick, T.A.Corbo, S.Wykoif-Clary, L.V.Nguyen, M.L.Smith, K.E.Palmer, G.P.Pogue, TMV-peptide fusion vaccines induce cell-mediated immune responses and tumor protection in two murine models, Vaccine, 2006, 24, 6414-6423).
Наиболее близким к заявляемому является известный вакцинный препарат, представляющий собой комплекс палочковидной вирусной частицы - вируса табачной мозаики (ВТМ) и антигенных полипептидов по крайней мере одного типа, относящихся, например, к вирусу иммунодефицита человека, вирусу гриппа и т.д. (ЕР 1135162А2, 2001, А61К 47/00) - прототип.
Недостатком известного вакцинного препарата является пониженная иммуногенная активность.
Технической задачей изобретения является повышение иммуногенной активности препарата.
Указанный технический результат достигается за счет того, что в вакцинном препарате, представляющем собой комплекс палочковидной вирусной частицы и антигенных полипептидов по крайней мере одного типа, в качестве антигенного полипептида используют продукт взаимодействия эквимольных количеств катионного олигомера и антигенной детерминанты при следующем составе комплекса (мольные части):палочковидная вирусная частица- 1; антигенный полипептид - (10-100).
В предлагаемом техническом решении в качестве палочковидной вирусной частицы могут быть использованы различные вирусные частицы, например, относящиеся к вирусам рода Tobamovirus, Tobravirus, Pomovirus и т.д.
В предлагаемом изобретении в качестве антигенных полипептидов используют продукты взаимодействия эквимольных количеств катионного олигомера и антигенной детерминанты, синтезируемые в клетках бактерий как единое целое. В качестве катионного олигомера можно использовать различные олигомеры, например, такой, как гексааргининовый пептид, октамерный сополимер аргинина и лизина, лизиновый октапептид и т.д. Следует отметить, что используемые олигомеры обязательно должны быть катионными, т.е. быть положительно заряженными в водном растворе, для прочного взаимодействия с отрицательно заряженной поверхностью вирусной частицы. Если в качестве олигомеров использовать нейтральный или анионный олигомер, то техническая задача изобретения не решается.
В качестве антигенной детерминанты можно использовать различные рекомбинантные белки, например, такие, как белок вируса гриппа, белок вируса гепатита С, белок вируса иммунодефицита человека, и т.д.
Антигенный полипептид может быть получен различными методами, например, путем биосинтеза в клетках бактерий или путем ковалентной модификации (конъюгации). Данный продукт может быть очищен и выделен в виде индивидуального препарата.
Если в качестве антигенного полипептида использовать продукт взаимодействия неэквимольных количеств катионного олигомера и антигенной детерминанты, то техническая задача изобретения не выполняется, что обусловлено потерей и/или изменением антигенных свойств полипептида.
В предлагаемом вакцинном препарате на одну мольную часть вирусной палочковидной частицы приходится от 10 до 100 мольных частей антигенного полипептида. Данное оптимальное соотношение в препарате было установлено экспериментальным путем. При других соотношениях компонентов в препарате техническая задача изобретения не решается за счет значительного снижения антигенной активности препарата.
Иммуностимулирующие свойства вакцинного препарата были показаны с помощью традиционных иммунологических исследований на лабораторных животных.
Преимущества предлагаемого способа поясняют следующие примеры.
Пример 1.
Из 100 г растений табака, зараженных ВТМ, выделяют препарат палочковидных вирусных частиц методом центрифугирования в градиенте концентрации сахарозы. Готовят 10 мл суспензии палочковидных вирусных частиц в дистиллированной воде, содержащей 100 мг вирусных частиц.
Из 100 г клеток E.coli на Ni-содержащей агарозе выделяют генноинженерный антигенный полипептид, содержащий эквимольные количества антигенной детерминанты - фрагмента гемагглютинина вируса гриппа и катионного олигомера - октааргининовой последовательности. Готовят 2 мл суспензии антигенного полипептида в дистиллированной воде, содержащей 8 мг антигенного полипептида.
Комплекс палочковидной вирусной частицы и антигенного полипептида получают путем смешения 1 мл суспензии палочковидных вирусных частиц и 0,01 мл раствора антигенного полипептида, т.е. при соотношении вирусная частица - 1 мол. ч., антигенный полипептид - 20 мол. ч. Смесь инкубируют в течение 1 час при 4°С. Комплекс выделяют центрифугированием полученной смеси в течение 30 мин при 60000g и 4°С. Осажденный комплекс ресуспендируют в физиологическом растворе. Методом электрофореза в денатурирующем полиакриламидном геле определяют состав комплекса: вирусная частица - 1 мол. ч., антигенный полипептид - 20 мол. ч.
Проверку иммуногенной активности вакцинного препарата проводят следующим образом. Лабораторных животных иммунизируют путем подкожной инъекции, вводя по 50 мкг препарата в присутствии адъюванта Фрейнда в мышь три раза с интервалом 7 дней. В конце цикла иммунизации проводят отбор крови из хвостовой вены мыши и выделяют тотальный препарат иммуноглобулинов, осаждая их сульфатом аммония. Иммуногенная активность вакцинного препарата, определенная методом иммуноферментного анализа, изображена на Фиг.1 (кривая 1). На этой фигуре на оси абсцисс представлены разведения тотального препарата иммуноглобулинов, а на оси ординат - оптическая плотность раствора после завершения ферментативной реакции, которая прямо пропорциональна иммуногенной активности вакцинного препарата.
Полученный результат сравнивают с иммуногенной активностью контрольных препаратов: антигенного полипептида в отсутствие вирусных частиц (Фиг.1, кривая 2) и сыворотки неиммунизированных животных (Фиг.1, кривая 3).
Пример 2 (контрольный, по прототипу).
Опыт проводят аналогично примеру 1, однако в качестве вакцинного препарата используют комплекс палочковидной вирусной частицы и антигенного полипептида (фрагмента гемагглютинина вируса гриппа), дополнительно обработанных глутаровым альдегидом. Полученный результат сравнивают с иммуногенной активностью контрольных препаратов: антигенного полипептида в отсутствие вирусных частиц (Фиг.2, кривая 2) и сыворотки неиммунизированных животных (Фиг.2, кривая 3). Обозначения осей на Фиг.2 совпадают с представленными на Фиг.1.
Из сравнения результатов, представленных на Фиг.1 и Фиг.2, видно, что оптическая плотность растворов после завершения ферментативной реакции с использованием иммуноглобулинов к предлагаемому вакцинному препарату в 1,5 раза выше, чем к известному вакцинному препарату, выбранному в качестве прототипа, и выше, чем оптическая плотность контрольных образцов.
Пример 3.
Опыт проводят аналогично примеру 1, однако в качестве антигенного полипептида используют продукт взаимодействия эквимольных количеств катионного олигомера (октомерного сополимера аргинина и лизина) и антигенной детерминанты, представляющей собой структурный белок вируса гепатита С. При этом в качестве вакцинного препарата используют комплекс, содержащий 1 мольную часть палочковидной вирусной частицы (вирус погремковости табака, род Tobravirus) и 10 мольных частей вышеуказанного антигенного полипептида.
Проверку иммуногенной активности вакцинного препарата проводят аналогично примеру 1. Полученный результат сравнивают с иммуногенной активностью контрольных препаратов: антигенного полипептида в отсутствие вирусных частиц, сыворотки неиммунизированных животных, а также вакцинного препарата, полученного по прототипу с использованием палочковидной вирусной частицы вируса погремковости табака и антигенного полипептида (структурного белка вируса гепатита С), дополнительно обработанных глутаровым альдегидом. Иммуногенная активность предлагаемого препарата существенно превышает иммуногенную активность антигенного полипептида в отсутствие вирусных частиц и сыворотки неиммунизированных животных, а также в 1,5 раза превышает иммуногенную активность известного вакцинного препарата, выбранного в качестве прототипа.
Пример 4.
Опыт проводят аналогично примеру 1, однако в качестве антигенного полипептида используют продукт взаимодействия эквимольных количеств катионного олигомера (лизинового октапептида) и антигенной детерминанты, представляющей собой структурный белок вируса иммунодефицита человека. При этом в качестве вакцинного препарата используют комплекс, содержащий 1 мольную часть палочковидной вирусной частицы (potato mop-top virus, род Pomovirus) и 100 мольных частей вышеуказанного антигенного полипептида.
Проверку иммуногенной активности вакцинного препарата проводят аналогично примеру 1. Полученный результат сравнивают с иммуногенной активностью контрольных препаратов: антигенного полипептида в отсутствие вирусных частиц, сыворотки неиммунизированных животных, а также вакцинного препарата, полученного по прототипу с использованием палочковидной вирусной частицы вируса potato mop-top virus и антигенного полипептида (структурного белка вируса иммунодефицита человека), дополнительно обработанных глутаровым альдегидом. Иммуногенная активность предлагаемого препарата существенно превышает иммуногенную активность антигенного полипептида в отсутствие вирусных частиц и сыворотки неиммунизированных животных, а также в 2 раза превышает иммуногенную активность известного вакцинного препарата, выбранного в качестве прототипа.
Пример 5 (с использованием антигенных полипептидов двух типов).
Опыт проводят аналогично примеру 1, однако в качестве вакцинного препарата используют комплекс, содержащий 1 мольную часть палочковидной вирусной частицы ВТМ, 10 мольных частей антигенного полипептида на основе эквимольных количеств фрагмента гемагглютинина вируса гриппа и катионного олигомера - октааргининовой последовательности, а также 10 мольных частей антигенного полипептида на основе эквимольных количеств катионного олигомера (октомерного сополимера аргинина и лизина) и антигенной детерминанты, представляющей собой структурный белок вируса гепатита С.
Иммуногенная активность полученного вакцинного препарата к обоим вирусам (вирус гриппа и вирус гепатита С) в 1,6 раза превышает иммуногенную активность соответствующего вакцинного препарата, полученного по методике, описанной в прототипе.
Таким образом, из приведенных примеров видно, что иммуногенная активность предлагаемого вакцинного препарата действительно существенно превышает иммуногенную активность антигенного полипептида в отсутствие вирусных частиц и сыворотки неиммунизированных животных, а также в 1,5-2 раза превышает иммуногенную активность известного вакцинного препарата, выбранного в качестве прототипа.