СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РАСТЕНИЙ-РЕГЕНЕРАНТОВ ЗЕМЛЯНИКИ (IN VITRO)
METHOD OF PRODUCTION OF PLANTS-REGENERANTS OF STRAWBERRIES (IN VITRO)

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии и может быть использовано для массового получения качественного посадочного материала ценных сортов и гибридов земляники в питомниководстве и селекционных работах.
5
Известен способ получения растений-регенерантов земляники (патент СССР №1658929 А1, МПК А01Н 4/00, Бюл. №24 - М., 1991), согласно которому эксплантами являлись верхушечные и латеральные почки. Растения подвергают суховоздушной терапии, а затем освобождают от патогенной микрофлоры путем обработки побегов горячей водой.
Недостатком данного способа (аналога) является сложность проведения стерилизации растительного материала. Земляника является почвопокровным растением, поэтому получение стерильного и жизнеспособного материала при введении в культуру in vitro почек вегетативного побега представляет большую трудность. Согласно данному способу гибель эксплантов после обработки составляет 23,5%.
Наиболее близким к предлагаемому является способ получения растений-регенерантов земляники методом дифференциации почек в ткани экспланта, где в качестве эксплантов используют листовые диски, полученные от растений, размножаемых in vitro (Sorvari S., Ulvinen S., Hietaranta Т., Hiirsalmi Н. Preculture medium promotes direct choot regeneration from mikropropagatied strawberry leaf disks// Hort Science, 1993, V.28, N.1, P.55-57). Данный способ позволяет исключить этап стерилизации эксплантов, так как исходные растения размножаются микроклонально. Для увеличения выхода регенерантов у земляники проводят предкультивирование на питательной среде, содержащей 6-бензиламинопурин (БАП) 0,5 мг/л, 3-индолилмасляную кислоту (ИМК) 0,5 мг/л. Это ускоряет морфогенез на листовых дисках и увеличивает количество сформировавшихся побегов от 1,5 до 9,9 на один эксплант.
Недостатками данного способа (прототипа) является низкий процент эксплантов (56,3-75%), регенерировавших побеги. При этом способе необходимо иметь введенные в культуру in vitro исходные растения.
Заявляемый способ получения растений-регенерантов земляники in vitro, за счет ускорения получения регенерантов, методом дифференциации почек в ткани экспланта, где в качестве эксплантов используются фрагменты цветоложа и цветоножки;
- упрощает этап стерилизации и увеличивает процент жизнеспособности эксплантов;
- увеличивает эффективность процесса, тиражируемость, высокая приживаемость, низкая инфицируемость эксплантов;
- увеличивает коэффициент размножения, что позволяет применять в промышленном размножении.
Сущность изобретения заключается в том, что в способе получения растений-регенерантов земляники in vitro используют в качестве эксплантов фрагменты цветоложа и цветоножки, взятых из цветов земляники, в фазе бутонизации, промывают 15-25 минут, стерилизуют 0,1% раствором сулемы 10 минут, затем трижды промывают стерильной дистиллированной водой, цветоложе освобождают от чашелистиков и лепестков, разрезают на фрагменты 5×5 мм, цветоножку отделяют от цветка, отрезают фрагмент длиной 5 мм, затем фрагменты помещают срезом на питательную среду.
Способ реализуют следующим образом:
Цветки земляники берут в фазе бутонизации. Перед стерилизацией промывают под проточной водой в течение 15-25 минут. Стерилизацию проводят в условиях ламинар-бокса 0,1% раствором сулемы 10 минут. Затем трижды промывают стерильной дистиллированной водой. Этот способ стерилизации позволяет получить 95% эксплантов «стерильными» и жизнеспособными. Цветоложе освобождают от чашелистиков и лепестков, разрезают на фрагменты 5×5 мм и помещают срезом на питательную среду. Цветоножку отделяют от цветка, отрезают фрагмент длиной 5 мм и также помещают на питательную среду. Питательные среды готовят по прописи Мурасиге-Скуга, содержащей 20 мкМ БАП и 1 мкМ ИМК. Через 20-30 суток на месте среза у эксплантов цветоножки появляются побеги (Фиг.1, Геммогенез у эксплантов цветоножки земляники). Побеги фрагментов регенерируют из завязей и тканей цветоложа (Фиг.2, Геммогенез у эксплантов цветоложа земляники). Образовавшийся конгломерат легко делится на одиночные побеги, которые пересаживают на среды размножения, содержащие 0,5-1 мкМ БАП. Укореняют побеги на безгормональной среде Мурасиге-Скуга. Число побегов на один эксплант составляет от 10 до 15 штук.
В результате использования данного способа получения растений-регенерантов земляники от одного экспланта за 3 месяца культивирования получают около 200 штук растений-регенерантов, морфологически идентичных материнским экземплярам.
Состав питательной среды на основе MS, мкМ
Тип экспланта
цветоложе
цветоножка
чашелистики
лепестки
10,0 БАП
нет
нет
нет
нет
15,0 БАП
сл. регенерация
сл. регенерация
нет
нет
17,0 БАП
каллус
каллус
каллус
каллус
20,0 БАП+1ИМК
активная регенерация
активная регенерация
слабая регенерация
нет
Регенерационная способность различных типов эксплантов фрагментов цветка земляники сорта Лидия Норвежская в зависимости от состава питательных сред