СПОСОБ СНИЖЕНИЯ СТЕПЕНИ ГЛИКОЗИЛИРОВАНИЯ БЕЛКОВ, СПОСОБЫ И БЕЛКИ

1. Способ уменьшения степени гликозилирования белка, представленного формулой I:
X-B-Y-A,
где
Х представляет собой последовательность лидерного пептида, содержащую по меньшей мере одну аминокислоту,
В представляет собой аминокислотную последовательность В-цепи молекулы инсулина, его производного или аналога,
Y представляет собой линкерный пептид, содержащий по меньшей мере одну аминокислоту,
А представляет собой аминокислотную последовательность А-цепи молекулы инсулина, его производного или аналога,
и А- и В-цепи могут быть модифицированы путем замены, делеции и/или добавления аминокислоты;
продуцируемого штаммом метилотрофных дрожжей, модифицированного посредством инактивации по меньшей мере одного или более гена, выбранного из группы, включающей гены РМТ1, РМТ5 и РМТ6, имеющие нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NOs 1, 4 и 5 соответственно, при этом указанные последовательности кодируют протеин-маннозилтранферазу или его функциональную часть.
2. Способ по п.1, в котором указанный штамм метилотрофных дрожжей принадлежит роду Pichia sp.
3. Способ по п.2, в котором указанный штамм метилотрофных дрожжей принадлежит виду Pichia pastoris.
4. Способ по п.1, в котором способ гликозилирования представляет собой О-гликозилирование.
5. Способ по п.1, в котором степень гликозилирования снижается на величину по меньшей мере от 10% до 99%.
6. Способ по п.5, в котором степень гликозилирования снижается на 25%.
7. Способ по п.5, в котором степень гликозилирования снижается на 65%.
8. Вектор, содержащий ген протеин-маннозилтрансферазы или его функциональную часть, выбранный из группы, включающей гены РМТ1, РМТ5 и РМТ6, имеющий нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NOs 1, 4 и 5 соответственно.
9. Вектор по п.8, где указанным вектором трансформируют штамм метилотрофных дрожжей для снижения степени или изменения гликозилирования белка.
10. Вектор по п.8, в котором указанный штамм метилотрофных дрожжей принадлежит роду Pichia sp.
11. Вектор по п.10, в котором указанный штамм метилотрофных дрожжей принадлежит виду Pichia pastoris.
12. Способ получения нокаутированного штамма метилотрофных дрожжей, включающий:
(а) вектор, включающий последовательность нуклеиновой кислоты, способную к гомологичной рекомбинации, содержащую целевую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую по меньшей мере один из генов, выбранных из группы, включающей гены РМТ1, РМТ5 и РМТ6, имеющий нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NOs 1, 4 и 5 соответственно, и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую селективный маркер,
(б) культивирование клеток в условиях, делающих возможной гомологичную рекомбинацию между ДНК, кодирующей целевой ген в векторе, и ДНК, кодирующей целевой ген в клетке-хозяине, что приводит к нарушению целевого гена в клетке-хозяине;
(в) селекцию клеток-хозяев с инактивированным целевым геном для получения нокаутированного штамма метилотрофных дрожжей.
13. Белок, продуцируемый с помощью способа по любому из пп.1-7 или 12.
14. Нокаутированный штамм метилотрофных дрожжей, содержащий по меньшей мере один инактивированный ген, выбранный из группы, включающей РМТ1, РМТ5 и РМТ6, имеющий нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NOs 1, 4 и 5 соответственно.
15. Штамм с нокаутом гена РМТ1, как указано в п.14, с номером доступа МТСС5515.
16. Штамм с нокаутом гена РМТ5, как указано в п.14, с номером доступа МТСС5517.
17. Штамм с нокаутом гена РМТ6, как указано в п.14, с номером доступа МТСС5518.
18. Нокаутированный штамм по п.14, в котором указанный штамм-хозяин продуцирует белок со сниженным уровнем гликозилирования, по сравнению с белковым продуктом, экспрессированным в немодифицированном штамме-хозяине.
19. Нокаутированный штамм по п.14, в котором указанный штамм-хозяин продуцирует белок, в котором степень гликозилирования снижена по меньшей мере на 25%.
20. Нокаутированный штамм по п.14, в котором указанный штамм-хозяин продуцирует белок, в котором степень гликозилирования снижена по меньшей мере на 65%.
21. Белок, продуцируемый нокаутированным штаммом по п.14.
22. Белок, продуцируемый нокаутированным штаммом по п.21, где нокаутированный штамм представляет собой один из штаммов МТСС5515, МТСС5517, МТСС5518 или любой модифицированный штамм на его основе.
23. Способ по п.12, где указанный белок имеет селективный маркер нуклеиновой кислоты, представляющий собой маркер устойчивости к зеоцину.
24. Белок по п.21, где указанный белок имеет селективный маркер нуклеиновой кислоты, представляющий собой маркер устойчивости к зеоцину.
25. Белок по п.21, где указанный белок представляет собой молекулу инсулина/ аналога инсулина/предшественника инсулина.