СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КАЛЛУСНОЙ ТКАНИ VACCINIUM MYRTILLUS L.
METHOD OF CULTURING CALLUS TISSUE VACCINIUM MYRTILLUS L.

Предлагаемое изобретение относится к биохимии, к культивированию клеточных культур лекарственных растений, богатых биологически активными веществами, в частности, касается способа культивирования каллусной ткани Vaccinium myrtillus L. - продуцента фенольных соединений, который может быть использован в медицине для получения сырья, богатого фенольными соединениями и флавоноидами, вне зависимости от сезона, при культивировании каллусных тканей других медленно растущих растений, для клеточной селекции, генетической трансформации, фундаментальных физиолого-биохимических исследований.
Черника обыкновенная (Vaccinium myrtillus L.) - многолетнее растение семейства Вересковые (Ericaceae Juss.), встречающееся в умеренных и холодных областях Евразии и Северной Америки. В лекарственных целях заготавливают плоды и побеги V. myrtillus, характеризующиеся высоким содержанием биологически активных веществ фенольной природы (Брилкина А.А., Агеева М.Н., Березина Е.В., Павлова Е.Е., Мишукова И.В. Особенности накопления фенольных соединений в листьях и ягодах некоторых представителей рода Vaccinium из коллекции НИИ Ботанический сад Нижегородского государственного университета // Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского. Н.Новгород: Изд-во ННГУ им. Н.И. Лобачевского, 2014. №3, ч. 3. С. 30-34). Растущая заинтересованность в получении фенольных соединений растительного происхождения объясняется положительным воздействием этих соединений на здоровье человека и, в отличие от синтетических препаратов, отсутствием побочных эффектов. Фенольные соединения, в т.ч. флавоноиды, обладают антиоксидантной, Р-витаминной, адаптогенной, противоопухолевой активностью.
Растения V. myrtillus являются медленнорастущими и труднокультивируемыми, в связи с чем получение растительного сырья с высокими биосинтетическими и ростовыми характеристиками является актуальной задачей. Стабильное получение такого сырья в течение круглого года вне зависимости от природно-климатических условий возможно с использованием каллусных культур (каллусов).
Культивирование каллусов проводят на питательных средах, содержащих углеводы, минеральные соли, витамины, аминокислоты. Приготовление питательных сред включает нагревание (для полного растворения желирующего агента), доведение рН и стерилизацию (автоклавирование). Известна питательная среда Woody Plant Medium (далее - WPM), созданная для культивирования древесных растений, в т.ч. для представителей семейства Вересковые (Калинин Ф.Л., Кушнир Г.П., Сарнацкая В.В. Технология микроклонального размножения растений. Киев: Наук, думка, 1992. 232 с.). Ее состав представлен в таблице 1. Для стабильного получения и культивирования каллусов недостатком ее состава является отсутствие необходимых для этого гормонов.
Известны способы культивирования каллусов в отношении растений, богатых алкалоидами: болиголова (Conium maculatum L.) и борца (Aconitum barbatum Patr. ex Pers.), а также богатых терпенами: василька (Centaurea scabiosa L.) и живучки (Ajuga turkestanica (Rgl.) Briq.).
Способ получения каллусной культуры С. maculatum (RU 2590586 С1, кл. C12N 5/04; A01H 5/10, опубл. 10.07.2016 г.) включает стерилизацию растительного материала в спирте и сулеме, помещение кусочков стебля на питательную среду Мурасиге-Скуга для контроля стерильности, помещение проростков на питательной среду Мурасиге-Скуга с гормонами 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-D) и 6-бензиламинопурин (БАП) для получения каллусов, помещение каллусов на питательную среду Мурасиге-Скуга с гормонами α-нафтилуксусная кислота (НУК) и БАП для дальнейшего культивирования каллусов. Недостатком такого способа является смена гормонального состава питательной среды для культивирования каллусов, что делает культивирование более трудоемким.
Способ получения каллусной культуры A. barbatum (RU 2631927 С1, кл. C12N 5/04, опубл. 28.09.2017 г.) включает стерилизацию семян в спирте и сулеме, помещение их на питательную среду Мурасиге-Скуга для образования этиолированных проростков, помещение проростков на питательную среду Мурасиге-Скуга с гормонами 2,4-D и БАП для получения и дальнейшего культивирования каллусов. Недостатком этого способа, как и предыдущего, является использование довольно токсичного агента - сулемы.
Способ культивирования каллусов С. scabiosa (RU 2458121 С1, кл. C12N 5/04, опубл. 10.08.2012 г.) включает получение каллусной культуры из интактных растений на питательной среде Мурасиге-Скуга с гормонами НУК и БАП и выращивание каллусов в пластиковых чашках Петри на синем свету. Недостатком такого способа является выращивание в пластиковых чашках Петри на синем свету, что требует дополнительного оборудования и расходных материалов.
Способ получения каллусной культуры A. turkestanica (RU 2639566, кл. C12N 5/04, A61K 36/18, опубл. 21.12.2017 г.) включает стерилизацию растительного материала в спирте и диациде, помещение на питательную среду Гамборга на одну неделю, затем - на питательную среду Гамборга с гормонами 2,4-D и кинетином на одну неделю, затем на эту же питательную среду с измененной концентрацией 2,4-D на две недели (два цикла субкультивирования), дальнейшее культивирование на питательной среде Гамборга с гормонами НУК и БАП. Недостатком этого способа является частая смена гормонального состава питательной среды для культивирования каллусов, что делает такое культивирование трудоемким.
Общим недостатком известных способов является то, что они нацелены на культивирование объектов, накапливающих алкалоиды и терпены, и не обеспечивают высокое накопление фенольных соединений, в т.ч. флавоноидов.
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому техническому результату является способ культивирования каллусов V. myrtillus (Madhavi D.L., Bomser J., Smith M.A.L., Singletary K. Isolation of bioactive constituents from Vaccinium myrtillus (bilberry) fruits and cell cultures // Plant Sci. 1998. V. 131, iss. 1. P. 95-103). Способ включает использование гипокотилей стерильных растений V. myrtillus для получения каллусной культуры путем помещения их на модифицированную питательную среду Гамборга с кокосовым молочком, гормонами НУК, 2,4-D и кинетином, последующим четырехкратным субкультивированием (по три недели) и дальнейшим переносом на питательную среду Гамборга того же гормонального состава со сниженным содержанием нитратов и увеличенным содержанием сахарозы для усиления продукции фенольных соединений. Через 10 дней в каллусах V. myrtillus содержание таких фенольных соединений, как антоцианы, составило 0.08 мг/г сухой массы, полимерные проантоцианидины - 436 мг/г сухой массы, олигомерные проантоцианидины - 178 мг/г сухой массы, причем содержание антоцианов в каллусах меньше, чем в ягодах, в 341 раз, полимерных проантоцианидинов - в 3.7 раза, содержание олигомерных проантоцианидинов почти не изменилось. Ростовые характеристики полученных каллусов V. myrtillus не приведены. Недостатком этого способа является использование кокосового молочка и трех видов гормонов в составе питательной среды, смена состава питательной среды для культивирования каллусов, что делает данный способ трудоемким и финансово затратным. Кроме того, выход некоторых групп фенольных соединений невысокий.
Следовательно, будет полезен способ, позволяющий снизить трудоемкость культивирования каллусов посредством использования одного варианта питательной среды, а также позволяющий получить фенольные соединения на уровне ягод.
В задачу изобретения положено упрощенное получение каллусной культуры V. myrtillus in vitro, богатой биологически активными веществами фенольной природы.
Техническим результатом от использования предлагаемого изобретения является повышение накопления биомассы и фенольных соединений, в т.ч. флавоноидов, в каллусной ткани V. myrtillus.
Поставленная задача достигается тем, что способ культивирования каллусной ткани V. myrtillus включает приготовление питательной среды WPM при нагревании, в которую дополнительно добавляют гормоны: α-нафтилуксусную кислоту (НУК) - 0.5 мг/л и 6-бензиламинопурин (БАП) - 0.5 мг/л, затем доводят рН питательной среды до 4.9-5.1 и полученную питательную среду разливают по культуральным сосудам, закрывают и автоклавируют, для инициации каллусов надсекают листья стерильных (полученных in vitro) растений V. myrtillus скальпелем, помещают листовые экспланты в культуральные сосуды с застывшей питательной средой, стерильно закрывают и хранят на стеллажах с подсветкой, полученные каллусные ткани отделяют от питательной среды, разрезают на части и переносят на свежую питательную среду того же состава, субкультивирование каллусов проводят каждые 4-6 недель при 16-часовом фотопериоде.
На фиг. 1 представлены кривые, отражающие характер накопления биомассы каллусов V. myrtillus в течение одного пассажа, где а - накопление сырой биомассы, б - накопление сухой биомассы.
На фиг. 2 представлена диаграмма содержания фенольных соединений и флавоноидов в каллусах V. myrtillus после 0, 5 и 7 пассажей.
Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.
Сначала готовят питательную среду WPM при нагревании, состав которой отражен в таблице 2. При этом витамины, аминокислоты и гормоны (НУК и БАП) кладут в последнюю очередь.
Доводят рН питательной среды до 4.9-5.1. Кислое значение рН предпочтительнее для растений семейства Вересковые (в т.ч. V. myrtillus), однако при изменении рН ниже указанного диапазона питательная среда не застынет и будет непригодна для посадки каллусных культур. Приготовленную питательную среду разливают по культуральным сосудам, закрывают фольгой и автоклавируют 30-40 мин. при 115-120°С. Указанный режим автоклавирования достаточен для стерилизации питательной среды и не препятствует последующему ее застыванию. При получении каллусов в стерильных условиях листья стерильных растений надсекают скальпелем, помещают листовые экспланты в культуральные сосуды с питательной средой WPM, культуральные сосуды стерильно закрывают и хранят на стеллажах с подсветкой не более 2 месяцев (во избежание истощения питательной среды и отравления культур продуктами метаболизма). Полученные каллусные ткани отделяют от питательной среды, разрезают на части и переносят на свежую питательную среду того же состава. Субкультивирование каллусов проводят каждые 4-6 недель при 16-часовом фотопериоде и температуре 23-27°С. Указанные условия субкультивирования являются оптимальными для большинства растительных культур (особенно растений умеренных широт).
Ниже представлены примеры конкретного осуществления изобретения.
Пример 1.
Питательную среду WPM готовят при нагревании. Дополнительно в питательную среду вводят гормоны: НУК - 0.5 мг/л и БАП - 0.5 мг/л. При этом гормоны (НУК и БАП) добавляют в последнюю очередь. Затем доводят рН питательной среды до 4.9-5.1. Питательную среду разливают по культуральным сосудам, закрывают фольгой и автоклавируют 30 минут при 118°С в стерилизаторе паровом ВК-75-01 (ТЗМОИ, Россия). При получении каллусов в стерильных условиях листья стерильных растений надсекают скальпелем, помещают листовые экспланты в культуральные сосуды с застывшей питательной средой, культуральные сосуды с эксплантами стерильно закрывают и хранят на стеллажах с подсветкой не более 2 месяцев. Полученные каллусные ткани отделяют от питательной среды, разрезают на части и переносят на свежую питательную среду того же состава. Субкультивирование каллусов проводят каждые 4 недели при 16-часовом фотопериоде и температуре 23°С; 16-часовой фотопериод обеспечивают за счет освещения лампами дневного света Philips TL-D 36W, 2000-5000 люкс (преимущественно 3000 люкс).
Пример 2.
Питательную среду WPM готовят при нагревании. Дополнительно в питательную среду вводят гормоны: НУК - 0.5 мг/л и БАП - 0.5 мг/л. При этом гормоны (НУК и БАП) добавляют в последнюю очередь. Затем доводят рН питательной среды до 4.9-5.1. Питательную среду разливают по культуральным сосудам, закрывают фольгой и автоклавируют 40 минут при 115°С в стерилизаторе паровом ВК-75-01 (ТЗМОИ, Россия). При получении каллусов в стерильных условиях листья стерильных растений надсекают скальпелем, помещают листовые экспланты в культуральные сосуды с застывшей питательной средой, культуральные сосуды с эксплантами стерильно закрывают и хранят на стеллажах с подсветкой не более 2 месяцев. Полученные каллусные ткани отделяют от питательной среды, разрезают на части и переносят на свежую питательную среду того же состава. Субкультивирование каллусов проводят каждые 6 недель при 16-часовом фотопериоде и температуре 27°С; 16-часовой фотопериод обеспечивают за счет освещения фитолампами Osram fluora L36W/77, 2000-5000 люкс (преимущественно 3000 люкс).
Полученные каллусные культуры V. myrtillus характеризуются следующими культуральными признаками: каллусы плотные желтовато-коричневатые, с группами красных клеток. Длительность лаг-фазы составляет одну неделю; начало экспоненциальной фазы роста - со второй недели; замедление роста происходит после седьмой недели. Повышенное накопление биомассы выражается в том, что индекс роста каллусной ткани V. myrtillus на 4 неделе пассажа составляет около 2 по сырой и сухой биомассе (т.е. 3-кратное увеличение биомассы; согласно Примеру 1), а на 6 неделе пассажа он составляет около 4 по сырой и сухой биомассе (т.е. 5-кратное увеличение биомассы, согласно Примеру 2). Для определения массы каллусов их тщательно отделяют от питательной среды и взвешивают. Для получения сухой биомассы каллусы высушивают при +60°С до постоянной массы. Характер накопления каллусной биомассы в ходе пассажа представлен на фиг. 1. В таблице 3 приведены индексы роста каллусов V. myrtillus, выращенных на питательных средах разного гормонального состава.
Повышенное содержание в каллусах биологически активных веществ выражается в том, что культуры накапливают фенольные соединения на уровне ягод, а флавоноиды - в 2-9 раз больше, чем ягоды, т.е. содержание фенольных соединений составляет 11-17 мг/г сырой массы, а флавоноидов - 9-19 мг/г сырой массы.
2
3
2
3
Для определения содержания фенольных соединений и флавоноидов навеску каллусов фиксируют кипящим 80% этанолом (81°С) в течение 10 мин, гомогенизируют и центрифугируют при 6010 g 15 мин. (20°С). Определение содержания фенольных соединений в экстрактах проводят с использованием реактива Фолина-Денис и 7% NaCO. Окрашенные растворы фотометрируют при 725 нм. Определение содержания флавоноидов в экстрактах проводят с использованием 5% NaNO, 10% AlCl, 1 М NaOH. Окрашенные растворы фотометрируют при 510 нм. Содержание фенольных соединений и флавоноидов определяют с использованием градуировочных зависимостей, построенных по раствору рутина. Содержание фенольных соединений и флавоноидов в каллусах V. myrtillus по окончании трех пассажей представлено на фиг. 2.
Таким образом, предлагаемое изобретение обеспечивает повышение накопления биомассы и фенольных соединений, в т.ч. флавоноидов, в каллусной ткани V. myrtillus. Удобство изобретения состоит в относительной простоте состава питательной среды для каллусов, повышенном уровне накопления биомассы и фенольных соединений каллусами (в сравнении с ягодами); удобство такого получения фенольных соединений состоит в отсутствии сезонной зависимости и возможного негативного влияния факторов окружающей среды (как в случае сбора ягод).