СПОСОБ ИССЛЕДОВАНИЯ СОСТОЯНИЯ КОЖИ МЕТОДОМ ОПТИЧЕСКОЙ КОГЕРЕНТНОЙ ТОМОГРАФИИ
METHOD OF EXAMINING STATE OF SKIN BY MEANS OF OPTIC COHERENT TOMOGRAPHY

Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно к лучевой диагностике, и может быть использовано для исследования состояния кожи методом оптической когерентной томографии (ОКТ).
До последнего времени единственно эффективным методом исследования морфологии кожи было принято считать традиционную эксцизионную биопсию (1). Решающим преимуществом гистологического метода является возможность исследования структурных изменений кожи на клеточном уровне, а главными недостатками - инвазивность и трудоемкость.
Тенденции современной медицины, отдающие предпочтение органосохраняющим методам исследования, а также появившиеся возможности использования принципиально новых технических решений послужили стимулом для развития неинвазивных методов исследования состояния биотканей, в том числе кожи.
В последнее десятилетие для исследования сруктуры кожи используется метод оптической когерентной томографии (ОКТ). Метод ОКТ наиболее информативен в отношении покровных тканей, имеющих многослойную, вертикально организованную структуру, каковой является и кожа. К настоящему времени установлено, что послойная структура кожи находит свое отображение на ОКТ-изображениях (2, 3). Результаты исследований здоровой и патологически измененной кожи свидетельствуют о перспективности использования ОКТ в диагностике кожных заболеваний (4). Однако интерпретация результатов, связанная с идентификацией полученных изображений, осуществляется различными исследовательскими группами неоднозначно.
От других покровных тканей кожу отличают процессы кератинизации, с которыми связано сильное рассеяние зондирующего излучения от поверхности и потому более слабый оптический контраст между структурными компонентами кожи по сравнению со слизистыми оболочками. Этот факт в совокупности с многослойной организацией кожного покрова делает кожу достаточно сложным органом для ОКТ-исследований (5). Многократное рассеяние зондирующего оптического излучения в коже, обусловленное ее оптической неоднородностью, значительно ограничивает контрастирование отдельных структур и глубину зондирования ОКТ (6).
Одним из перспективных путей решения проблемы повышения эффективности исследования состояния кожи методом ОКТ является изменение оптических характеристик биологической ткани с помощью различных биосовместимых химических веществ. Данный способ, улучшающий проникновение света в глубину биоткани, был впервые предложен В.В.Тучиным (7, 8). На сегодняшний день в целом ряде in vivo экспериментов показана эффективность иммерсионных жидкостей, например глицерола, пропиленгликоля, концентрированных растворов глюкозы, для оптического просветления биотканей (9-14).
Механизм оптического просветления биоткани при местном использовании глицерина и пропиленгликоля связан со способностью этих веществ связывать воду, входящую в состав межклеточной и внутриклеточной жидкости исследуемой ткани. Процесс удаления воды сопровождается большей плотностью упаковки рассеивающих центров и выравниванием показателей преломления рассеивающих центров и окружающей среды объема биоткани, что сопровождается уменьшением рассеяния зондирующего света и увеличением глубины его проникновения.
Кроме того, последующее проникновение глицерина и пропиленгликоля во внутренние слои кожи, в силу близости показателей преломления этих веществ и рассеивающих структур кожи, сопровождается выравниванием показателей преломления рассеивателей и окружающей их среды, что также способствует увеличению оптической проницаемости кожи.
Однако одновременное повышение контраста ОКТ изображений не укладывается в рамки данного объяснения и даже противоречит ему. Была предложена гипотеза, что причиной повышения контраста изображений является так называемая внутренняя иммерсия в результате проникновения глицерина и пропиленгликоля вглубь исследуемой ткани, сопровождающаяся местной дегидратацией ее микроструктур, представляющих собой рассеивающие центры, их уплотнением и увеличением разности показателей преломления относительно окружающей ткани (15).
Наиболее близким аналогом разработанного способа по решаемой задаче и совокупности сходных существенных признаков является способ исследования состояния кожи методом ОКТ при поверхностном воздействии иммерсионных средств - глицерина и пропиленгликоля. При этом несколько капель химического агента наносили на исследуемый участок кожи и проводили поиск оптимального времени контакта этих средств с кожей для получения максимальной глубины и наилучшего контраста ОКТ-изображений. С этой целью ОКТ-исследование проводили до нанесения, непосредственно после и через 20, 40, 60 и 80 мин после нанесения иммерсионного средства. При исследовании здоровой и патологически измененной кожи оптимальная экспозиция иммерсионного средства составила при использовании пропиленгликоля 40-60 мин, а при использовании глицерина 60-80 мин. В эти сроки достигалась максимальная глубина и контраст изображений. Улучшение контраста ОКТ-изображений выражалось в усилении контрастности слоев кожи, усилении четкости границ между ними, более четкой визуализации сосудов, выводных протоков потовых желез и сально-волосяных комплексов (9).
Тем не менее повышение информативности ОКТ-изображений после применения указанных жидкостей достигалось главным образом за счет эффекта просветления, то есть за счет увеличения пропускания света верхними тканевыми слоями благодаря иммерсии. Эффект просветления уменьшает интенсивность ОКТ-сигнала от верхних тканевых слоев. Контраст ОКТ-изображений, который определяется различиями показателей преломления соседних слоев или структур и окружающей их среды объема биоткани, был достаточно слабым.
Задача, на решение которой направлено изобретение, заключается в создании способа исследования состояния кожи методом ОКТ, обеспечивающего визуализацию слоев кожи и отдельных структур с достижением высокого контраста ОКТ-изображений.
Поставленная задача достигается тем, что предварительно перед сеансом ОКТ на поверхность кожи однократно наносят коллоидный раствор наночастиц, имеющих максимум экстинкции, связанный с плазмонным резонансом, в области работы прибора ОКТ, проникающих в глубину тканей; исследование кожи методом ОКТ проводят через 0,5-24 часа после аппликации наночастиц, при этом идентификацию слоев кожи проводят по наличию на ОКТ-изображении контрастных светлых и темных горизонтальных зон, соответствующих разной интенсивности ОКТ-сигнала, связанной с наличием или отсутствием наночастиц, а идентификацию и дифференциацию внутренних структур кожи проводят по меньшей мере в сравнении с окружающими тканями интенсивности сигнала, а так же по форме, размерам и глубине расположения.
Предлагаемый способ отличается тем, что в качестве контрастирующего средства используется коллоидный раствор наночастиц. Если указанные частицы обладают свойством плазмонного резонанса, это значительно улучшает их контрастирующие свойства. При этом длина волны плазмонного резонанса и связанный с ним максимум экстинкции должны совпадать с длиной волны зондирующего излучения ОКТ. Необходимым условием реализации способа является способность наночастиц проникать в кожу при поверхностном нанесении и инертность в отношении биологической ткани.
В предлагаемом способе поверхностное нанесение плазмонно-резонансных наночастиц приводит к контрастированию слоев кожи и кожных придатков за счет повышения контраста тканевых слоев и структур, в которых содержатся наночастицы, с областями без наночастиц. Наличие наночастиц в коже, а именно в отдельных структурах и слоях, усиливает ОКТ-сигнал от данных образований. Высокий контраст достигается за счет разницы интенсивности ОКТ-сигнала благодаря увеличению обратного рассеяния от областей, содержащих наночастицы. Наличие наночастиц в коже, а именно вокруг конрастируемых структур и в отдельных слоях, подтверждено нами методом электронной микроскопии.
Предлагаемый способ отличается по продолжительности действия контрастирующего агента. Высокий контраст ОКТ-изображений после нанесения наночастиц сохраняется в течение 4 часов, а в отдельных случаях до 24 часов наблюдения. В то время как продолжительность действия пропиленгликоля и глицерина не превышает 80 мин.
Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.
При подготовке к исследованию непосредственно перед началом работы в случае необходимости производится депиляция выбранного участка кожи. При этом следует избегать использования средств, которые могли бы изменить оптические свойства биологической ткани (крем, мыло и пр.). Затем на участок чистой сухой кожи без волосяного покрова наносится капля коллоидного раствора наночастиц. На соседний участок кожи наносится капля воды в качестве контроля. ОКТ-изображения получают через 0.5-24 ч после аппликации наночастиц.
Для осуществления способа используют оптический когерентный томограф. Сканирование осуществляют путем прижима сканирующего конца зонда под визуальным контролем к поверхности кожи. Изображения, полученные в процессе исследования, выводятся на монитор компьютера. На ОКТ-изображений светлые оттенки соответствуют высокой интенсивности ОКТ-сигнала, темные оттенки - низкой.
Идентификацию ОКТ-изображений производят следующим образом. Тканевые слои на ОКТ-изображении идентифицируются как темные или светлые горизонтально-ориентированные контрастные зоны, имеющие ровные или волнистые границы с соседними зонами и отличающиеся от последних интенсивностью ОКТ-сигнала. Кожные придатки (волосы и железы) и сосуды идентифицируются как включения в пределах одного или нескольких ОКТ-слоев. При этом волосяные фолликулы на ОКТ-изображении выглядят как округлые или продолговатые (как правило, диагонально-ориентированные) области с более или менее четкими границами и низким уровнем ОКТ-сигнала. Железы идентифицируются как образования неправильной формы меньшего размера, чем волосяные фолликулы, с низким уровнем ОКТ-сигнала. Сосуды на ОКТ-изображении имеют вид небольших округлых или щелевидных темных образований с очень низким уровнем ОКТ-сигнала, хорошо выраженными границами.
Под термином «наночастицы» следует понимать частицы любой структуры (наностержни, нанооболочки, сферические наночастицы и пр.), имеющие размер от 1 до 1000 нм.
Под термином «золотые нанооболочки» следует понимать наночастицы, состоящие из сферического диэлектрического ядра и оболочки из наноразмерного золота.
Приводим описание чертежей, иллюстрирующих предлагаемый способ.
На фиг 1 (А, Б, В, Г, Д, Е) приведены результаты исследования состояния кожи разными методами:
фиг.1А - методом световой микроскопии. Окраска препарата гематоксилином и эозином. Увеличение х20;
фиг.1Б - методом ОКТ после нанесения воды в качестве контроля на кожу бедра;
фиг.1В - методом ОКТ через 3 ч после нанесения золотых нанооболочек с размерами ядро/оболочка 150/25 нм на кожу бедра;
фиг.1Г - методом ОКТ после нанесения воды в качестве контроля на кожу уха;
фиг.1Д - методом ОКТ через 1 ч 30 мин после нанесения золотых нанооболочек с размерами ядро/оболочка 150/25 нм на кожу уха;
фиг.1E - методом трансмиссионной электронной микроскопии. Увеличение × 11000. Наночастицы в эпителии показаны стрелками.
На фиг.2 (А, Б, В) приведены ОКТ-изображения кожи:
фиг.2А - 3 ч после нанесения воды в качестве контроля;
фиг.2Б - 3 ч после нанесения золотых нанооболочек с размерами ядро/оболочка 75/15 нм;
фиг.2В - 3 ч после нанесения золотых наночастиц размером 20 нм.
На фиг.3 (А, Б, В) приведены результаты электронной микрофотографии кожи:
фиг.3А - после нанесения воды в качестве контроля. Увеличение ×5600. Эпителий;
фиг.3Б - после нанесения золотых нанооболочек с размерами ядро/оболочка 75/15 нм. Увеличение 36000. Наночастицы в дерме показаны стрелкой;
фиг.3В - после нанесения золотых наночастиц размером 20 нм. Увеличение ×44000. Наночастица в эпидермисе показана стрелкой.
На фиг.4 (А, Б, В) приведены ОКТ-изображения кожи:
фиг.4А - после нанесения воды в качестве контроля;
фиг.4Б - 1 ч после нанесения пропиленгликоля;
фиг.4В - 24 ч после нанесения золотых нанооболочек с размерами ядро/оболочка 150/25 нм.
На фиг.5 приведены графики спадания по глубине ОКТ-сигналов, усредненных по поперечному направлению.
На фиг.6 приведены ОКТ-изображения кожи в результате многократного нанесения золотых нанооболочек с размерами ядро/оболочка 150/25 нм:
фиг.6А - контроль без наночастиц;
фиг.6Б - 30 мин после первого нанесения;
фиг.6В - 30 мин после второго нанесения;
фиг.6Г - 30 мин после третьего нанесения;
фиг.6Д - 30 мин после четвертого нанесения;
фиг.6Е - 30 мин после пятого нанесения.
На фиг.1-6 цифрами обозначено: 1 - поверхностная дерма, 2 - глубокая дерма, 3-волосяные луковицы, 4 - железы, 5 - сосуды.
Примеры, подтверждающие существенность отличительных признаков
Пример 1.
2
Исследование эффективности применения золотых нанооболочек в качестве средства контрастирования ОКТ-изображений. Для осуществления способа используют золотые нанооболочки, состоящие из диэлектрического ядра SiO диаметром 150 нм и золотой оболочки толщиной 25 нм. Благодаря строению типа ядро/оболочка такие частицы обладают уникальными оптическими свойствами, генерируя плазменные резонансы в ближней ИК-области спектра. Нанооболочки с указанными размерами имеют максимум экстинкции в ближней ИК-области (850-950 нм). Исследование выполнено in vivo на коже кроликов. Для получения ОКТ-изображений использован оптический когерентный томограф, имеющий следующие технические характеристики: длина волны излучения 900 нм, мощность источника излучения 2 мВт, пространственное разрешение 15-20 мкм, глубина сканирования до 1,5 мм, время получения двумерного изображения размером 200×200 точек - 1,5-2 с. ОКТ-изображения представлены в желто-коричневой палитре, где оттенки желтого соответствуют большей интенсивности, а оттенки коричневого меньшей интенсивности отраженного света. На ОКТ-изображении интактной кожи морфологически отличающиеся области дермы - слои и кожные придатки - слабо различимы. Установлено, что однократное накожное нанесение раствора наночастиц вызывает возрастание интенсивности сигнала в верхней части ОКТ-изображения (эпидермис, поверхностные слои дермы) через 30 мин после нанесения частиц, увеличение глубины проникновения сигнала. Характерно, что ОКТ-изображение кожи в целом становится более информативным вследствие контрастирования в ней придатков кожи (волосяных фолликулов и желез). Граница между поверхностным и глубоким слоями дермы становится более четкой, непрерывной, хорошо различимой, что позволяет точно дифференцировать эти слои (фиг.1).
Пример 2.
Сравнение ОКТ-эффектов золотых нанооболочек, описанных в примере 1, с другими наночастицами: золотыми нанооболочками с размерами ядро/оболочка 75/15 нм, а также золотыми наночастицами размером 20 нм (фиг.2), выполнено на коже бедра кроликов in vivo. Установлено, что нанесение указанных агентов не вызывает значимых оптических эффектов и не приводит к контрастированию кожных слоев и структур, несмотря на проникновение наночастиц в эпидермис и дерму, подтвержденное электронной микроскопией (фиг.3).
Пример 3.
Сравнение эффектов золотых панооболочек со стандартным просветляющим биосовместимым агентом - пропиленгликолем (фиг.4). ОКТ-изображения, полученные нами после нанесения пропиленгликоля, подтвердили результаты других авторов (9, 11). Однократное нанесение пропиленгликоля на кожу бедра кролика in vivo привело к повышению интенсивности сигнала через 5 мин после нанесения с достижением максимального уровня через 1 ч, увеличению глубины визуализации на ОКТ-изображении, а также к контрастированию границы поверхностной и глубокой дермы, которая, однако, слабее выражена, по сравнению со случаем нанесения раствора золотых нанооболочек. Контрастирования придатков кожи в данном случае не наблюдалось. Численно оценить наблюдаемые эффекты можно по графикам усредненных ОКТ-сигналов, представленных на фиг.5. На фиг.5 пунктирной линией обозначен график спадания по глубине ОКТ-сигнала, усредненного по некоторой области ОКТ-изображения кожи после нанесения воды в качестве контроля (фиг.4А), сплошной синей линией - то же после нанесения пропиленгликоля (фиг.4Б), сплошной красной линией - то же после нанесения золотых нанооболочек (фиг.4В). Эффект контрастирования границы поверхностного и глубокого слоев дермы в результате нанесения золотых нанооболочек виден как перепад ОКТ-сигнала порядка 20 дБ на глубине 250 мкм на последнем графике. В то время как в контроле имеет место монотонное спадание ОКТ-сигнала по глубине, нанесение на кожу пропиленгликоля привело к увеличению пропускания зондирующего излучения верхними слоями и повышению за счет этого глубины проникновения ОКТ-сигнала на 100 мкм, а также увеличению интенсивности ОКТ-сигнала в верхних слоях кожи.
Пример 4.
Оценка эффективности имеющейся концентрации золотых нанооболочек путем выполнения многократных аппликаций раствора золотых нанооболочек на поверхность кожи кролика in vivo (фиг.6). Золотые нанооболочки наносили в виде капли 5 раз с интервалом 30 минут. ОКТ-изображения фиксировали до и непосредственно после каждого нанесения. Установлено, что многократное нанесение не приводит к дополнительному повышению контраста ОКТ-изображений. После второго и третьего нанесений имело место уменьшение глубины изображения с сохранением высокой интенсивности ОКТ-сигнала в поверхностной дерме. Результатом последующих аппликаций стало еще большее снижение уровня полезного сигнала и появление темных вертикальных полос на ОКТ-изображениях. По-видимому, многократное нанесение привело к скоплению золотых наночастиц в неровностях на поверхности кожи, что вызвало экранирование ОКТ сигнала от более глубоких слоев ткани.
Конкретные примеры реализации способа
Выписка из протокола эксперимента №1.
17 ноября 2006 г. Кролик породы Белый великан, самец. Масса 3,5 кг. Правый бок, включая область бедра, побрили с помощью электрической машинки для бритья животных. Участки, подготовленные для нанесения химических агентов, без загрязнения и видимых повреждений, очертили цветными метками. На один участок кожи бедра с помощью дозатора нанесли каплю (объем порядка 25 мкл) коллоидного раствора золотых нанооболочек. Концентрация золота в растворе 22 мкг/мл, рН 5.0-6.0. На соседний участок нанесли каплю воды. ОКТ-изображения фиксировали сразу после нанесения агентов, через 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 270, 300 мин.
18 ноября 2006 г. С участков нанесения агентов зафиксированы ОКТ-изображения (24 ч после нанесения). Сделана местная анестезия лидокаином. Выполнена биопсия кожи для последующей световой и электронной микроскопии.
В ходе ОКТ-наблюдения через 30 мин после нанесения золотых наночастиц отмечено повышение интенсивности ОКТ-сигнала в верхней части изображений, появление контрастных структур, четкая дифференцировка слоев кожи (фиг.1Б, 1В). Идентифицируется поверхностная дерма как светлый слой с высоким уровнем ОКТ-сигнала, контрастной волнистой границей с нижележащей областью глубокой дермы. На ОКТ-изображениях становятся хорошо различимы волосяные луковицы в виде диагонально-ориентированных продолговатых областей с низким уровнем ОКТ-сигнала, а также железы в виде небольших включений округлой или неправильной формы в пределах слоя, соответствующего поверхностной дерме. Повышается глубина ОКТ-изображения. Видимых изменений состояния кожи типа раздражения, отечности, гиперемии и т.д. в результате нанесения золотых нанооболочек не отмечено. Через 24 ч наблюдаемые изменения на ОКТ-изображениях сохранялись.
Выписка из протокола эксперимента №2.
25 февраля 2007. Кролик породы Белый великан, самец. Масса 3,8 кг. Исследование выполнено на коже уха. Участки кожи с внутренней сторны уха перед нанесением агентов очертили цветными метками. На один участок с помощью дозатора нанесли коллоидный раствор золотых нанооболочек в виде капли (25 мкл). Концентрация золота в растворе 22 мкг/мл, рН 5.0-6.0. На соседний участок кожи нанесли каплю воды в качестве контроля. ОКТ-изображения фиксировали сразу после нанесения агентов, через 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 270, 300 мин. Выполнили биопсию кожи под местной анестезией для световой и электронной микроскопии.
В результате нанесения золотых нанооболочек через 30 мин на ОКТ-изображениях отмечается повышение интенсивности сигнала, контрастирование слоев кожи и кожных придатков (фиг.1Г, 1Д). На изображениях идентифицируются слои поверхностной и глубокой дермы с ровной контрастной границей между ними. В поверхностной дерме видны волосяные фолликулы в виде достаточно крупных округлых областей с низким уровнем ОКТ-сигнала и железы в виде небольших образований неправильной формы с низким уровнем ОКТ-сигнала. В течение 5 ч наблюдаемые изменения на ОКТ-изображениях сохраняются.
26 февраля 2007. Через 24 ч после нанесения наночастиц провели повторное ОКТ-наблюдение. Указанные эффекты контрастирования сохраняются, однако выражены слабее, чем в первые часы наблюдения.
На основании анализа 90 ОКТ-изображений чувствительность способа составила 86%, а специфичность 65%.