Способ оценки состояния мононуклеаров периферической крови у больных туберкулезом легких
METHOD FOR EVALUATING THE CONDITION OF PERIPHERAL BLOOD MONONUCLEAR CELLS IN PULMONARY TUBERCULOSIS PATIENTS

Способ оценки состояния мононуклеаров периферической крови у больных туберкулезом легких относится к медицине, а именно к фтизиатрии и может быть использован для раннего выявления функциональных нарушений в иммунной системе и определения показания к корригирующей терапии.
Физиологическое состояние любой клетки организма в том числе и иммуноцитов во многом определяется билипидным слоем их мембран играющих ключевую роль в структурной и функциональной организации этих клеток (Есимова И. Е. Микровязкость и липидный спектр мембраны мононуклеарных лейкоцитов крови у больных туберкулезом легких / И.Е. Есимова, В.В Новицкий, О.И. Уразова и др. // Сибирский медицинский журнал. - 2006. – Т. 66, №8. – С. 15-18).
Мононуклеары и фагоциты играют важную роль в системе противотуберкулезного иммунитета. Нарушения состава и как следствие свойств мембранных структур мононуклеаров отражается на состоянии процессов клеточного метаболизма, времени жизни клеток и эффективности выполнения ими своих функций. Соотношение липидных фракций входящих в состав мембран мононуклеаров определяет её физическое состояние (вязкость, текучесть, проницаемость) и функциональное состояние клетки (Есимова И.Е. Структурные особенности мембран и интенсивность процессов перекисного окисления липидов в мононуклеарах крови при диссеминированном туберкулезе легких / И.Е. Есимова, В.В. Новицкий, А.К. Стрелис и др //Фундаментальные исследования – 2006. - №2. – С. 75 – 76).
Определение основных фосфолипидных фракций мононуклеаров и расчет коэффициента, характеризующего соотношение этих фракций между собой, позволяет оценить состояние мононуклеаров у больных туберкулезом легких.
Из уровня техники известен способ диагностики состояния фагоцитарной защиты (RU 2131609, опубл. 10.06.1999), который позволяет рассчитать индекс активности фагоцитов и определить недостаточность фагоцитарной защиты или её активацию. Также известен способ оценки функциональной активности мононуклеарных фагоцитов у больных туберкулезом легких (SU 1725127, опубл. 07.04.1992), который позволяет определить повышенную и пониженную функциональность моноцитов, где в качестве антигена используют БЦЖ, а регистрацию осуществляют с помощью радиоактивного тимидина.
Недостатками известных способов является то, что определяется активность дифференцированных макрофагов периферической крови, которая не всегда отражает состояние иммуноцитов в зоне казеозного воспаления у больных туберкулезом легких. Оценить можно только фагоцитарную активность макрофагов, что не дает достаточного представления о состоянии мононуклеаров периферической крови. Данные способы не отражают перестройку метаболических процессов в иммуноцитах (активация фосфолипаз, накопление токсических фосфолипидов), происходящую под воздействием противотуберкулезной химиотерапии.
2
Наиболее близким по технической сущности к заявленному решению является способ диагностики хронический заболеваний печени (RU 2167424, опубл. 20.05.2001), позволяющий провести диагностику хронических заболеваний печени, путем анализа липидного спектра крови и расчета коэффициента, определяемого по формуле ФХ/СМ*ЛФХ, где ФХ – относительное содержание фосфатидилхолина, СМ – относительное содержание сфингомиелина, ЛФХ – относительное содержание лизофосфатидилхолина. Недостатком данного способа является определение липидных фракций сыворотки крови, а не клеточных мембран. Такой способ не дает возможность оценить состояние мононуклеаров периферической крови. Другим недостатком является определение только лизофосфатидилхолина, а не суммарных лизофосфолипидов, обладающих мембранодеструктивным эффектом. Кроме того, исследование проводилось у больных с хроническими заболеваниями печени. Способ не позволяет проводить исследование у больных туберкулезом легких, для оценки состояния мононуклеаров.
Задача, на решение которой направлено данное изобретение заключается в разработке способа, который позволил бы врачу точно оценить состояние мононуклеаров у больных туберкулезом легких и принять решение о проведении корригирующей терапии при первых признаках снижения функциональной активности мононуклеаров, тем самым повысить эффективность противотуберкулезной терапии.
2
Данная задача достигается за счет того, что в способе оценки состояния мононуклеаров периферической крови оценку проводят путем определения относительного содержания фракций суммарных лизофосфолипидов, сфингомиелина и фосфатидилхолина фосфолипидного спектра мембран мононуклеаров периферической крови и расчета коэффициента КР, определяемого по формуле КР=ФХ/СМ*ЛФЛ, где ФХ – относительное содержание фосфатидилхолина, СМ – относительное содержание сфингомиелина, ЛФЛ – относительное содержание суммарных лизофосфолипидов; и при значениях КР≤6,7 диагностируют снижение функциональной активности мононуклеаров, требующее проведения корригирующей терапии.
Технический результат заключается в точном и раннем определении состояния мононуклеаров периферической крови у больных туберкулезом легких, позволяющем назначать корригирующую терапию при выявлении снижения их функциональной активности.
Новыми, ранее неизвестными признаками заявленного способа оценки состояния мононуклеаров периферической крови у больных туберкулезом легких являются:
2
1. Расчет коэффициента КР=ФХ/СМ*ЛФЛ для мононуклеаров периферической крови больных туберкулезом легких.
2
2. Определение пределов значения коэффициента КР=ФХ/СМ*ЛФЛ для мононуклеаров периферической крови больных туберкулезом легких получающих противотуберкулезную химиотерапию, не получающих противотуберкулезную химиотерапию и здоровых лиц.
2
3. Определение значения коэффициента КР=ФХ/СМ*ЛФЛ ниже которого диагностируют снижение функциональной активности мононуклеаров.
Способ разработан на основе анализа фосфолипидного спектра мононуклеаров периферической крови 184 больных туберкулезом легких до лечения и после окончания интенсивной фазы основного курса противотуберкулезной химиотерапии (60 доз комбинации противотуберкулезной химиотерапии), а также 36 здоровых добровольцев без выявленной соматической, инфекционной или психической патологии. Полученные данные фосфолипидного спектра мононуклеаров периферической крови позволяют рассчитать коэффициент КР. Данный коэффициент является результатом произведения, то есть, результатом интегрального объединения двух показателей: СМ/ФХ  и ФХ/ЛФЛ, то есть, объединяет 2 направления биохимических процессов уменьшение липидной «жидкостности» мембран и изменение активности фосфолипаз с накоплением деструктивных лизофосфолипидов (RU 2167424, опубл. 20.05.2001). Изменение состава фосфолипидов на мембранах мононуклеаров начинается намного раньше изменения фагоцитарной активности мононуклеарных фагоцитов. Опытным путем было установлено, что при значениях данного коэффициента ниже или равными 6,7 диагностируют снижение функциональной активности мононуклеаров, что требует введения корригирующей терапии.
Предлагаемый способ оценки состояния мононуклеаров периферической крови у больных туберкулезом легких осуществляется в следующей последовательности.
Кровь для исследования забирают из вены утром до завтрака. В вакуумную пробирку без наполнителя забирают 10мл крови, после чего в неё добавляется цитрат натрия – 1мл. Пробирку отстаивают при температуре 15°С до разделения цельной крови на 2 слоя. Лейкоплазму разделяют на градиенте плотности 1,083 г/см3 центрифугированием на 7000 об/мин в течении 5 мин. Полученные мононуклеары отмыват и проводят экстракцию липидов смесью хлороформ-метанол (1:2 по объему). Полученный экстракт выпаривают при температуре 15°С в вакууме или токе азота. Полученный экстракт подвергают хроматографическому разделению (используется непрерывная тонкослойная хроматография в горизонтальных камерах). В качестве элюента используют систему растворителей, состоящую из хлороформа, метанола и аммиака в соотношении 13,4:4,6:1.  Полученные хроматограммы проявляют в парах серной кислоты при температуре 180°С в течении 20 минут. Далее хроматограммы денситометрируют в отраженном свете. Содержание фракций фосфолипидов рассчитываться по площади соответствующих пиков денситометрической кривой. Для определения процентного содержания конкретной фракции сумма площади всех пиков делится на площадь пика соответствующего фракции.
Оценка состояния мононуклеаров периферической крови было проведено у 184 пациентов с туберкулезом легких и 36 здоровых лиц без диагностированной инфекционной, соматической или психической патологии. Опытным путем установлено, что у здоровых лиц значения коэффициента КР колебалось в пределах от 12,1 до 16,0. У пациентов с туберкулезом легких снижение коэффициента ниже 12 свидетельствовало о снижении функциональной активности мононуклеаров. Снижение противотуберкулезной резистивности подтверждалось снижением фагоцитарной активности по фагоцитарному числу и фагоцитарному индексу.
Пример 1. Больной Б. История 2231. Диагноз: Инфильтративный тубекулез легких, БК+. Подтверждён бактериологически. Получал основной курс противотуберкулезной химиотерапии по 1 стандартному режиму. Значение индекса  КР до начала химиотерапии 14,2, после окончания интенсивной фазы химиотерапии 6,1. Оценка состояния мононуклеаров периферической крови выявила снижение их функциональной активности. Назначена корригирующая терапия.
Пример 2. Больной В. История 2462. Диагноз: Инфильтративный тубекулез легких, БК+. Подтверждён бактериологически. Получал основной курс противотуберкулезной химиотерапии по 1 стандартному режиму. Значение индекса  КР до начала химиотерапии 13,9, после окончания интенсивной фазы химиотерапии 5,0. Оценка состояния мононуклеаров периферической крови выявила снижение их функциональной активности. Назначена корригирующая терапия.
2
Пример 3. Больная Н. История 2574. Диагноз: Инфильтративный тубекулез легких, БК+. Подтверждён бактериологически. Получала основной курс противотуберкулезной химиотерапии по 1 стандартному режиму. Значение индекса  ФХ/СМ*ЛФЛ до начала химиотерапии 15,9, после окончания интенсивной фазы химиотерапии 11,3. Оценка состояния мононуклеаров периферической крови не выявила снижение их функциональной активности. Корригирующая терапия не требовалась.
Таким образом, предлагаемый нами способ оценки состояния мононуклеаров периферической крови у больных туберкулезом легких позволяет выявить снижение функциональной активности мононуклеаров периферической крови при снижении значения коэффициента КР ниже или равным 6,7.
Изобретение может быть использовано в диагностических целях для раннего выявления функциональных нарушений в иммунной системе и определения показания к корригирующей терапии.