СПОСОБ ПОДГОТОВКИ КУЛЬТУР СУЛЬФИДОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ДНК
METHOD OF PREPARATION OF CULTURES OF SULPHIDE-BEARING BACTERIA FOR DNA EXTRACTION

Изобретение относится к биологии, а именно для проведения  подготовки накопительных и чистых культур сульфидогенных бактерий,  растущих на жидкой среде, для молекулярно-биологического анализа путем очистки клеточной массы от осадка сульфидов.
Методы молекулярно-биологического анализа на основе ПЦР широко применяют для поиска функциональных генов, кодирующих ферменты микроорганизмов, для оценки биоразнообразия и определения доминирующих групп прокариот в различных экосистемах. Методы молекулярной детекции применяются и для изучения культивируемых микроорганизмов для скрининга накопительных культур и для определения филогенетической принадлежности микроорганизмов, выделенных в чистые культуры.
Накопительные и чистые культуры сульфидогенных бактерий образуют сульфиды железа и микроэлементов, входящих в состав питательной среды для культивирования, а также металлов, вносимых в среду в экспериментальных целях. Сульфиды металлов представляют собой осадок черного цвета. Сульфиды металлов затрудняют выделение ДНК и могут препятствовать эффективному проведению полимеразной цепной реакции. Для эффективного выделения ДНК из небольших объемов культуральной жидкости (15 мл) с целью проведения молекулярно-биологического анализа необходимо максимально очистить клеточную массу от осадка сульфидов.
Известен способ выделения ДНК из сульфатредуцирующих бактерий (СРБ). Процедура включает получение сырой массы клеток массой 3 г, ресуспендирование клеток в буфере для лизиса, с добавлением додецилсульфата натрия, инкубации при повышенной температуре, экстракции с хлороформ-изоамиловым спиртом, осаждением ДНК ацетат-2-пропанолом, и промывку этанолом (T. Hai, D. Lange, R. Rabus, A.Steinbuchel. Polyhydroxyalkanoate (PHA) Accumulation in Sulfate-Reducing Bacteria and Identification of a Class III PHA Synthase (PhaEC) in Desulfococcus multivorans // Applied and environmental microbiology. Aug. 2004, Vol. 70, No. 8, p. 4440-4448).
Наиболее близким по существу является способ выделения ДНК психротолерантных, ацидофильных железоокисляющих бактерий. Для выделения ДНК культуру клеток из культуральной жидкости объемом не менее 100 мл осаждают центрифугированием при 10000 об/мин в течение 10 минут. Полученный осадок используют для выделения ДНК: двукратно промывают 10мМ Tris (pH 8,0) и ресуспендируют осадок с 0,5 мл 10мМ Tris, 1мМ буфером EDTA, содержащим 20 мг/мл лизоцима, и инкубируют при 37 °С в течение 30 минут, далее выделяют ДНК с использованием набора Wizard DNA Clean Up System (Promega) (D. Kupka, O.I. Rzhepishevska, M. Dopson, E. B. Lindstrom, O.V. Karnachuk, O.H. Tuovinen. Bacterial oxidation of ferrous iron at low temperatures // Biotechnology and Bioengineering, 2007, Aug 15; 97(6):1470-8).
Недостатком вышеперечисленных способов является необходимость использования больших объемов культуральной жидкости для получения ДНК и проведения молекулярно-биологического анализа (3 г сырой массы, как в прототипе 1, может быть получено только более, чем из 1 л культуры; во втором прототипе использовано 100 мл культуры). Сульфидогенные бактерии демонстрируют низкую урожайность (биомасса обычно не выше 1 г белка на 1 л) и их культивирование в больших объемах связано с техническими трудностями. При выделении ДНК из небольшого объема (15 мл) вышеперечисленными способами количество ДНК низкое и не превышает 2 нг/мкл. Оставшиеся сульфиды металлов могут препятствовать эффективному проведению полимеразной цепной реакции, что осложняется низкой концентрацей ДНК. Кроме того, при применении вышеперечисленных способов для небольших объемов культуральной жидкости (15 мл) сульфидогенных бактерий невозможно полностью очистить клеточную массу от сульфидов металлов, которые мешают проведению молекулярно-биологического анализа.
Задачей настоящего изобретения является разработка способа получения очищенной клеточной массы сульфидогенных бактерий для выделения ДНК из небольшого объема культуральной жидкости (15 мл), что обеспечивает высокую эффективность и точность результатов последующего молекулярно-биологического анализа.
Техническим результатом при осуществлении заявленного способа также является возможность быстрого и точного определения филогенетической принадлежности прокариот по последовательности гена 16S рРНК и поиска функциональных генов в чистых и накопительных культурах сульфидогенных бактерий.
Поставленная задача решается тем, что способ получения очищенной клеточной массы сульфидогенных бактерий из небольших объемов культуральной жидкости (15 мл) для молекулярно-биологического анализа включает отделение клеток от питательной среды посредством центрифугирования культуральной жидкости при 10000 об/мин в течение 10 минут с последующей трехкратной отмывкой собранных клеток однократным фосфатно-солевым буфером (1xPBS). Каждая отмывка представляет собой добавление к осадку 1хPBS  в соотношении 10:1, перемешивание на приборе Vortex в течение 10 секунд и центрифугирование при 10000 об/мин в течение 10 минут. Отмывка фосфатно-солевым буфером обеспечивает достаточную очистку клеточной массы от сульфидов металлов даже при небольших объемах культуральной жидкости, что очень важно при работе с сульфидогенными бактериями. Полученная клеточная масса бактерий используется для выделения ДНК и последующего молекулярно-биологического анализа.
Предложенный способ можно применять для выделения ДНК из накопительных и чистых культур сульфидогенных бактерий, в том числе промышленных штаммов, использующихся в биотехнологиях осаждения металлов, с последующим молекулярно-биологическим анализом на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Пример осуществления изобретения приведен ниже.
Пример 1.
Для анализа использовали жидкую чистую культуру ацидотолерантных грамположительных сульфидогенных бактерий объемом 15 мл. Предполагалось определение филогенетической принадлежности выделенного микроорганизма путем секвенирования последовательности ПЦР-амплифицированного гена 16S рРНК. Были проведены работы по оценке эффективности выделения ДНК из клеток бактерий, выращенных на стандартной среде Видделя (Widdel, Bak, 1992) без отмывки фосфатно-солевым буфером и с проведением отмывки. Отделение клеток сульфидогенных бактерий от питательной среды проводили посредством центрифугирования культуральной жидкости при 10000 об/мин в течение 10 минут с последующей трехкратной отмывкой собранных клеток однократным фосфатно-солевым буфером (1xPBS). Для отмывки использовали готовый фосфатно-солевой буфер (Invitrogen), pH 7.4. Каждая отмывка представляет собой добавление к осадку 1хPBS  в соотношении 10:1, перемешивание на приборе Vortex в течение 10 секунд и центрифугирование при 10000 об/мин в течение 10 минут.  ДНК после отмывки клеток выделяли с помощью набора Power Soil DNA isolation kit (MoBio).
Из данных, представленных в таблице 1 (эффективность выделения ДНК из чистой культуры сульфидогенных бактерий и последующей ПЦР без отмывки и с отмывкой фосфатно-солевым буфером (1хPBS)), следует, что без отмывки препарата фосфатно-солевым буфером получение препарата тотальной ДНК из небольшого объема культуры (15 мл) и последующее получение из препарата продуктов ПЦР гена 16S рРНК  невозможно. Наилучший результат получен при 3-кратной отмывке препарата фосфатно-солевым буфером.
Пример 2.
2
4
2
4
Для анализа использовали жидкую накопительную культуру сульфидогенных бактерий из подземной термальной воды объемом 15 мл. Предполагалось определение филогенетической принадлежности доминирующих бактерий в культуре путем секвенирования последовательностей фрагментов гена 16S рРНК, ПЦР-амплифицированных и разделенных в химическом градиенте (ПЦР-ДГГЭ). Провели оценку эффективности выделения ДНК из клеток бактерий, выращенных на стандартной среде Видделя (Widdel, Bak, 1992), без отмывки фосфатно-солевым буфером и с проведением отмывки. Отделение клеток накопительной культуры сульфидогенных бактерий из подземной термальной воды от питательной среды проводили посредством центрифугирования культуральной жидкости при 10000 об/мин в течение 10 минут с последующей трехкратной отмывкой собранных клеток однократным фосфатно-солевым буфером (1xPBS). Каждая отмывка представляет собой добавление к осадку 1хPBS  в соотношении 10:1, перемешивание на приборе Vortex в течение 10 секунд и центрифугирование при 10000 об/мин в течение 10 минут.  Для отмывки клеток от сульфидов использовали фосфатно-солевой буфер, содержащий 137 мM NaCl, 2.7 мM KCl, 10 мM NaHPO и 1.8 мM KHPO,  pH 7.4. Геномную ДНК после отмывки клеток выделяли стандартным методом (Wilson, 2004).
Из данных, представленных в таблице 2 (эффективность выделения ДНК из накопительной культуры сульфидогенных бактерий и последующей ПЦР без отмывки и с отмывкой фосфатно-солевым буфером (1хPBS)), следует, что без отмывки клеток фосфатно-солевым буфером получение препарата тотальной ДНК из 15 мл культуральной жидкости и получение из препарата продуктов ПЦР гена 16S рРНК  невозможно.