ШТАММ БАКТЕРИИ Geobacillus stearothermophilus - ПРОДУЦЕНТ БИОЭТАНОЛА
STRAIN OF BACTERIA Geobacillus stearothermophilus - PRODUCER OF BIOETHANOL

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии и может быть использовано для промышленного производства этанола, используемого в качестве топлива, а также в различных отраслях, например, в медицине и пищевой промышленности.
К настоящему времени известны различные микроорганизмы, используемые для получения спирта. Наиболее распространенным продуцентом биоэтанола являются дрожжи - Saccharomyces cerevisiae. Эти микроорганизмы способны выдерживать высокие концентрации спирта и сахара, растут при высокой концентрациях клеток, что позволяет им достигать значительной скорости наработки этанола. Однако все представители этого вида не способны к сбраживанию пентасахаров, что делает невыгодным их использование для переработки лигноцеллюлозной биомассы.
3
Известен штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae B-3855 - продуцент этилового спирта. Штамм является термотолерантным, способен эффективного сбраживать мелассную питательную среду с использованием геотермальной воды нефенольного класса с концентрацией углеводов 21.0 г/100 см при температурах 30-32°C (патент RU 2492229 C1, оп. 10.09.2013). Однако этот микроорганизм имеет ряд существенных недостатков: низкая скорость роста и требовательность к субстрату.
Другим распространенным продуцентом этилового спирта является бактерия Zymomonas mobilis. Данные бактерии способны продуцировать этиловый спирт в высоких концентрациях (заявка WO 1986004357 A1, оп. 31.07.1986). Недостатком является их неспособность к сбраживанию пентасахаров.
Кроме ранее перечисленных продуцентов были предприняты попытки использования других видов дрожжей, способных к сбраживанию ксилозы до этанола. Наиболее изучены в этом направлении три вида дрожжей: Pichia stipites (заявка WO 2009004273 A1, оп. 08.01.2009); Pachysolen tannophilus (заявка WO 1982003874 A1, оп. 11.11.1982) и Candida lusitaniae (заявка WO 2010072093 A1, оп. 01.07.2010). Главным недостатком этих микроорганизмов является их чувствительность к воздействию ингибирующих агентов, образующихся в результате гидролиза лигноцеллюлозной биомассы.
Актуальной задачей на сегодняшний день является поиск новых штаммов бактерий, способных эффективно усваивать пентасахара, которые могут составлять до 40% от всех сахаров, содержащихся в растительной биомассе быстрорастущих травянистых растений. Такие растения являются наиболее перспективными источниками биомассы, которая может быть использована в качестве возобновляемого источника энергии и вещества целлюлозосодержащего сырья.
Важным аспектом получения биоэтанола является необходимость его отгонки из культуральной среды, а также, по возможности, использование в качестве субстрата питательных элементов, полученных при гидролизе растительной биомассы. И тот, и другой процесс требуют использования повышенных температур, а, соответственно, наличие стадии с понижением температуры будет приводить к повышению затрат энергии, связанной с перепадом температур. Другой момент использования высоких температур при культивировании, который приводит к снижению энергетических затрат, - это возможность организации более простой системы отвода тепла и возможность его использования. Кроме этого, использование при культивировании температур, близких к 70°C или выше, дает возможность проводить отгонку этилового спирта непосредственно из емкости, в которой проводится культивирование.
Известны термофильные микроорганизмы - потенциальные продуценты этилового спирта, обладающие высоким температурным оптимумом роста.
Например, известен штамм Clostridium thermocellum (заявка WO 2012109578 A2, оп. 16.08.2012), способный продуцировать этиловый спирт. Данный штамм несет мутантный генотип с делецией в гене фермента формиат пируват лиазы, что приводит к прекращению наработки формиата, соответственно к снижению выхода побочных продуктов.
Бактерии рода Geobacillus отличаются устойчивостью к высоким температурам и способностью к переработке большого количества соединений, что делает их перспективным объектом для метаболической инженерии с целью производства биоэтанола (Taylor М.P., et al. Trends Biotechnol. 2009. 27(7). P.398-405). Большинство видов рода Geobacillus способны перерабатывать такие сахара, как D-глюкоза, D-ксилоза и L-арабиноза в диапазоне температур 55°C-70°C до смеси продуктов, содержащей лактат, формиат, ацетат и этанол. Некоторые штаммы могут также перерабатывать ксилан (Wu S., Liu В., Zhang X. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2006. 72(6). P.1210-1216), а также отличаются высокой толерантностью к этанолу (Fong J.С. et al. Extremophiles. 2006. 10(5). P.363-372).
Наиболее близким к заявляемому штамму - прототипом является термофильный штамм Thermoanaerobacter italicus (патент EP 2516621 A1, оп. 31.10.2012), который способен продуцировать этанол, молочную и уксусную кислоты из лигноцеллюлозы.
Недостатком известного штамма является его отношение к кислороду - строгий анаэробиоз, что затрудняет работу с ним в условиях производства.
Задачей изобретения является получение термостабильного бактериального штамма, являющегося продуцентом этанола и способного к конверсии целлюлозосодержащего сырья в биоэтанол и устойчивого к токсичным составляющим лигноцеллюлозого гидролизата.
Поставленная задача достигается получением термофильного штамма Geobacillus stearothermophilus, обладающего способностью продуцировать этанол. Предлагаемый штамм выделен из природного материала донного осадка термального источника Северного Прибайкалья в результате целенаправленного поиска.
Технический результат: упрощение условий культивирования штамма и расширение ассортимента штаммов-продуцентов для получения биоэтанола.
Полученный штамм Geobacillus stearothermophilus депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов (ГосНИИгенетика) под регистрационным номером ВКПМ В-11691.
Штамм Geobacillus stearothermophilus ВКПМ В-11691 характеризуется следующими признаками.
Культурально-морфологические признаки: грамположительные палочки растут на средах LB-бульон, LB-arap, среда Пфеннига с глюкозой, среда Пфеннига с ксилозой. При росте на агаризованной среде LB образует округлые колонии кремового цвета. Края колоний волнистые или слегка волнистые. Профиль колоний слегка выпуклый, размеры варьируют от 3 до 5 мм. Рост в жидких средах (LB, среда Пфеннига с глюкозой или ксилозой) характеризуется ровным помутнением, осадок легко седиментирует.
Физиолого-биохимические признаки: аэроб, термофил. Оптимальная температура роста 60-65°C. Хорошо растет в пределах рН среды от 6,5 до 7,5. Штамм характеризуется способностью использовать в качестве субстратов пептон, дрожжевой экстракт, эскулин. Продуцирует кислоту из D-глюкозы. Не утилизирует цитрат, маннитол, малонат, инозитол, адонитол, сорбитол, дульцит, пируват, сахара (целлобиозу, сахарозу, трегалозу, рамнозу, мелибиозу, раффинозу) и аминокислоты (лизин, орнитин, аргинин, триптофан, фенилаланин). Способен к гидролизу мочевины и лактозы.
Штамм не обладает инфекционным и общетоксическим действием.
Штамм является непатогенным и не включен в списки, приведенные в санитарных правилах СП 1.3.2322-08; штамм не несет опасных генетических конструкций; способность штамма выживать в окружающей среде ограничена в связи с термофильностью.
Штамм идентифицирован на основе секвенирования фрагмента гена 16S рибосомальной РНК.
Хранение штамма осуществляют на среде Luria Bertani (LB) с глицерином при температуре - 70°C.
Для культивирования штамма применяют среды следующего состава:
Среда LB (г/л): хлорид натрия - 5,0; триптон - 10,0; дрожжевой экстракт - 5,0.
2
4
4
4
2
2
2
3
Среда Пфеннига (г/л): KHPO-0,5; NHCl-0,5; MgSO×7HO-0,5; KCl-0,5; NaCl-0,5; CaCl×2HO-0,05; NaHCO-1,5, содержание глюкозы и/или ксилозы - 10,0-30,0.
Предлагаемый штамм термофильных бактерий рода Geobacillus в качестве продуцентов биоэтанола имеет ряд преимуществ, заключающихся в следующем.
1. Бактерии рода Geobacillus имеют часть ферментов целлюлозолитического комплекса и, следовательно, продуцент этанола на основе Geobacillus spp. может стать хорошей основой для последующих работ, направленных на создание штамма, способного к прямой конверсии лигноцеллюлозной биомассы в биоэтанол.
2. Снижается вероятность контаминации в ходе технологического процесса ввиду того, что микрофлора мезофильных мест обитания плохо приспособлена к жизни в условиях повышенных температур.
3. Термофильные организмы обладают большей скоростью роста и скоростью катаболических процессов по сравнению с мезофильными микроорганизмами, следовательно, скорость конверсии источника углерода в биоэтанол будет выше у термофильных организмов.
4. Культивирование при высоких температурах делает возможным разработку технологии отгонки спирта в процессе культивирования, что позволит сократить объем отработанных жидкостей.
5. Упрощение условий культивирования, поскольку штамм является аэробом.
Поскольку предлагаемый штамм получен впервые и он характеризуется уникальным свойством продуцировать этанол, можно сделать вывод о соответствии предлагаемого штамма критериям изобретения «новизна» и «изобретательский уровень».
Изобретение иллюстрируется примерами конкретного выполнения.
Пример 1. Выращивание штамма Geobacillus stearothermophilus и определение содержания этанола в культуральной жидкости.
Для получения биомассы и определения содержания биоэтанола в культуральной жидкости культуру штамма-продуцентов рассевали штрихом на чашках с агаризованной средой LB таким образом, чтобы были получены отдельные колонии. Засеянные чашки культивировали в суховоздушном термостате в течение 16 часов при температуре 65°C. Затем 20 мл среды LB инокулировали одной колонией нарабатываемого штамма. Культивировали при 65°C в течение 12 часов на орбитальном шейкере при скорости перемешивания 200 оборотов в минуту. После этого к 200 мл среды LB в литровой конической колбе добавляли 4 мл ночной культуры нарабатываемого штамма. Культивирование проводили при 60°C на орбитальном шейкере при скорости перемешивания 250 оборотов в минуту до достижения оптической плотности OD600~0.90 -0.95. В полученной таким образом культуральной жидкости определяли содержание этанола.
Содержание этанола в культуральной жидкости определяли методом газовой хроматографии с масс-спектрометрическим детектором на хроматографе Agilent Technologies 6890N с квадрупольным масс-спектрометром Agilent Technologies 5973N и кварцевой колонной DB-1. Газ-носитель - гелий с постоянным потоком 1 мл/мин. Режим программирования температуры колонки: начальная температура термостата колонки 50°C, выдержка при начальной температуре 5 мин, далее нагрев до температуры 250°C со скоростью 25°C/мин, выдержка при конечной температуре 7 мин. Ввод пробы осуществляли с помощью микрошприца, объем вводимой пробы 1 мкл, температура инжектора 250°C. Ионизация электронным ударом (70 эВ). Через 15 часов культивирования отбирали 350 мкл культуральной жидкости в пробирку (1,7 мл) и добавляли 1050 мкл 0,5 М ТОА (триоктиламин) в ТБФ (трибутилфосфат). Экстракцию проводили при помощи перемешивания на шейкере (15 минут). Затем отбирали 1 мл органического растворителя с экстрактом в стеклянный бокс для хроматографа. Концентрацию этилового спирта определяли сравнением площадей пиков экспериментальных образцов с калибровочными растворами. Выход этанола - не менее 20 г/л.
Пример 2. Наработка биоэтанола штаммом Geobacillus stearothermophilus.
Для определения количества биоэтанола, нарабатываемого штаммом Geobacillus stearothermophilus, было проведено культивирование штамма в вихревом биореакторе ′′Vortex-5′′ с программируемым блоком управления («Центр вихревых технологий», Россия) следующим образом.
Предварительно исследуемую культуру выращивали на питательной среде LB (дрожжевой экстракт - 5 г/л, триптон - 10 г/л, NaCl - 10 г/л, рН 7,0) при температуре 60°C в 1/10 объема от предполагаемого объема культуральной жидкости в биореакторе. Через 12 часов переносили инокулят в биореактор, заполненный 3-мя литрами среды Пфеннига, содержащей 2% глюкозы. В ходе культивирования поддерживали температуру 60°C и рН 7.0. Начальный этап культивирования проводили в аэробных условиях. Перемешивание осуществляли вихревым образом при помощи воздушной мешалки (2600 об/мин). Через 5 часов в среду добавляли 3% глюкозы и продолжали культивирование в течение 7 часов.
В полученной культуральной жидкости определяли содержание этанола аналогично примеру 1.
Использование предлагаемого штамма позволит упростить процесс культивирования последнего и расширить ассортимент штаммов-продуцентов для получения биоэтанола.