ВОДОРАСТВОРИМЫЕ ТЕТРАЗОЛИЕВЫЕ СОЛИ
WATER-SOLUBLE TETRAZOLIUM SALTS

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к анализу биологических проб с медицинскими целями.
Уровень техники
При анализе биологических проб часто используются такие методы, в которых образующийся цвет пропорционален количеству анализируемого вещества в пробе. Например, для окисления интересующего анализируемого вещества могут использоваться ферменты, и степень реакции отображается изменением цвета индикаторного соединения. В этой связи особый интерес представляет семейство тетразолиевых солей, используемых в качестве индикаторов. Эти соли восстанавливаются восстановителями до формазановых красителей. Для измерения анализируемого вещества фермент (например, фермент NAD-зависимая дегидрогеназа) окисляет анализируемое вещество с образованием восстановленной формы (например, NADH), реагирующей с тетразолиевой солью с образованием окрашенного формазона. Для содействия протеканию реакции может потребоваться медиатор. Поскольку количество образующегося в ходе реакции с анализируемым веществом NADH пропорционально количеству получаемого формазана, количество анализируемого вещества может косвенно определяться по получаемому цвету.
Тетразолиевые соли используются в различных областях. В частности, они применяются в медицине для измерения анализируемых веществ в различных биологических жидкостях, таких как кровь, моча, плазма и сыворотка. Эти индикаторы часто используются с системами реагентов, расположенными на тестовых полосках, которые при контакте с пробой жидкости реагируют с анализируемым веществом с образованием цвета, указывающего на количество присутствующего анализируемого вещества. Хотя в некоторых случаях изменение цвета можно определить визуально по цветовой шкале, более точные результаты можно получить спектрофотометрическим путем с применением предназначенных для этой цели приборов. Как правило, для определения изменения цвета полоски на нее направляют свет и производят измерения отраженного света.
Тетразолиевые соли должны образовывать формазаны, поглощающие свет на таких длинах волн, которые бы исключали помехи со стороны других веществ в пробе, таких как гемоглобин в цельной крови. С этой целью было получено семейство тиазолилтетразолиевых солей, образующих формазаны, которые поглощают свет с длиной волны свыше прибл. 640 нм. Эти длины волн характерны для используемых в качестве источников света светодиодов. Светодиоды создают свет в узком диапазоне, так что длины волн различаются лишь примерно на ±5 нм. Такие тиазолилтетразолиевые соли раскрыты в нескольких патентах США, таких как патенты США №№5126275, 5322680, 5300637 и 5290536.
Большинство биологических проб являются водными по своей природе, поэтому желательным является то, чтобы индикаторы были растворимыми в пробе. Однако многие тетразолиевые соли обладают малой растворимостью. Одним из поставщиков тетразолиевых солей является Dojindo Laboratories. Компания предлагает ряд индикаторов, которые удалось сделать более растворимыми благодаря добавлению сульфокислотных групп к молекуле индикатора. См. патент США №6063587 и опубликованные патентные заявки Японии JP 58113181 А2 и JP 58113182 А2. Их серия WST индикаторов-тетразолиевых солей часто упоминается в патентах, раскрывающих аналитические способы. Один из примеров можно найти в патенте США №6586199. Указанная в отчете растворимость тетразолиевых солей серии WST превышает прибл. 10 мг/мл воды. Растворимость также может быть повышена при использовании некоторых сульфонатных и фосфонатных противоионов тетразолиевых солей, как описано в патенте США №5250695.
Среди других патентов, в которых рассматриваются тетразолиевые соли, следует отметить ЕР 0476455 B1; US 2004/0132004 A1; WO 98/37157; патент США №6183878 В1; патент США №6207292 В1; патент США №6277307 B1; DE 2147466; патент США №5185450; патент США №5196314.
Авторы настоящего изобретения стремились повысить растворимость тиазолилтетразолиевых солей, при этом сохраняя способность их формазанов обеспечивать относительно ровный спектральный отклик в диапазоне 600-640 нм на падающий на них свет от светодиодов. Как видно из приведенного ниже описания, им удалось предложить тиазолилтетразолиевые соли, обладающие большей растворимостью при сохранении требуемого спектрального отклика.
Раскрытие изобретения
Настоящее изобретение относится к новым тиазолилтетразолиевым солям. Было обнаружено, что некоторые из них обладают лучшей растворимостью в воде, чем соответствующие запатентованные тиазолилтетразолиевые соли. Улучшение растворимости облегчает их использование в тестовых полосках, применяемых для измерения количества анализируемых веществ в биологических пробах (например, глюкозы в пробе крови). Тетразолиевые соли характеризуются наличием алкиламмонийалкокси заместителя, повышающего растворимость. В соответствии с одним вариантом осуществления изобретения тетразолиевые соли определяются следующей формулой.
где
А=противоион,
X=1-6С алкил или гетероалкил,
а=1-3,
b=0-3,
1
R=1-6С алкил,
2
3
b
1
3-b
2
3
один из R и R является алкилом, а другой представляет собой XN+H(R), или R и R образуют метилендиокси группу,
4
5
один из R или R является галогеном, а другой представляет собой замещенный галогеном 1-6С алкил,
4
5
b
1
3-b
один или оба из R и R являются XN+H(R), или
4
5
R и R связаны с образованием ароматического или гетероароматического кольца или
замещенного ароматического или замещенного гетероароматического кольца.
4
5
4
5
Приведенная выше формула представляет новые тиазолилтетразолиевые соли, которые содержат тиазольное кольцо, присоединенное к тетразолиевому кольцу в позиции азота - 2. Кроме того, каждое из этих соединений имеет фенильные кольца, одно из которых присоединено к тетразольному кольцу в позиции азота - 3, а другое - в позиции - 5. Повышение растворимости по сравнению с запатентованной тиазоилтетразолиевой солью (обозначенной здесь как НТС-045) достигается за счет присоединения одной или нескольких алкиламмонийалкокси-групп к тиазоилтетразолиевой соли. Алкиламмонийалкокси-группы могут присоединяться к тиазолильному кольцу в виде R и/или R или замещаться на ароматическом или гетероароматическом кольце, образованном R и R. В предпочтительных вариантах осуществления алкиламмонийалкокси-группы являются заместителями на фенильных кольцах, присоединенных к тетразолиевому кольцу. В более предпочтительных вариантах осуществления алкиламмонийалкокси-группа представляет собой триалкиламмонийпропокси-группу. Бензотиазолилтетразолиевые соли являются предпочтительными соединениями, обладающими повышенной растворимостью.
В другом аспекте изобретения тиазолилтетразолиевые соли используются в качестве хромогенных индикаторов для определения присутствия восстанавливающих веществ (например, NADH) при анализе биологических проб с применением ферментов для окисления анализируемых веществ, например, как при определении содержания глюкозы в крови.
Краткое описание чертежей
На фиг.1 приведена схема первого способа получения соединений, используемого в примерах.
На фиг.2 приведена схема второго способа получения соединений, используемого в примерах.
На фиг.3 показаны рассматриваемые в примерах соединения для сравнения.
На фиг.4а-b показаны полученные в примерах соединения согласно настоящему изобретению.
На фиг.5а и 5b приведены спектры поглощения тетразолиевых солей.
Описание предпочтительных вариантов осуществления изобретения
Определения
Приведенные ниже определения касаются заместителей тиазолилтетразолиевых солей согласно изобретению.
"1-6С" - это радикал, содержащий 1-6 атомов углерода
n
2n+1
"алкил" - это неразветвленные или разветвленные углеводородные радикалы общей формулы CH
"гетероалкил" - это неразветвленные или разветвленные углеводородные радикалы, содержащие гетероатомы, присоединенные к соседним атомам углерода
"алкокси" - это радикал -OR, где R является алкилом
2
"метилендиокси" - это двухвалентный радикал формулы -О-СН-О-
"галоген" означает фтор, хлор, йод и бром
n
2n-1
2
"замещенный галогеном 1-6С алкил" - это неразветвленный или разветвленный радикал общей формулы CHY, где Y является галогеном
"ароматическое кольцо" означает бензольное или нафталиновое кольцо
"гетероароматическое кольцо" означает пиридиновое или хинолиновое кольцо
"противоион" - это ионный радикал реагентов, используемых для получения тетразолиевых солей (например, нитрит, фосфат, гидрофосфат, дигидрофосфат, гидросульфат, сульфат, гидрокарбонат, карбонат, метансульфонат, фторборат, бромид, хлорид, йодид или их сочетания)
"тет-соль" - это сокращенное наименование тетразолиевой соли
Тиазолилтетразолиевые соли
+
Как раскрыто в патенте США №5126275, формазаны тиазолилтетразолиевых солей характеризуются спектром отражения, имеющим протяженный ровный участок в области длин волн более 600-650 нм. Это их качество может использоваться в оборудовании, в котором в качестве источника света применяются светодиоды. Проба контактирует с реакционной системой, обеспечивающей появление цвета, указывающего на количество анализируемого вещества в пробе. Отраженный от области тестирования свет принимается и коррелируется с содержанием анализируемого вещества. В качестве одного из важных примеров следует назвать то, что глюкозодегидрогеназа в присутствии NADкатализирует окисление глюкозы в пробах крови. Восстановленный NADH повторно окисляется ферментным медиатором, таким как диафораза, который катализирует восстановление тетразолиевой соли до формазана. Наблюдаемое изменение цвета пропорционально количеству NADH, образующегося при окислении глюкозы, и косвенно пропорционально количеству глюкозы в образце. Изменение цвета в результате превращения тиазолилтетразолиевых солей в обладающий цветом формазан можно измерить, направив на него свет от источника. Отраженный от окрашенной области тестирования свет принимается и преобразуется в соответствии с подходящим алгоритмом в количество анализируемого вещества в пробе. Хотя тетразолиевые соли согласно изобретению были описаны в связи с NAD-NADH, на самом деле они имеют более широкое применение, в т.ч. и с дегидрогеназными ферментами, имеющими другие кофакторы, такие как PQQ и FAD.
Поскольку тиазолилтетразолиевые соли и их соответствующие формазаны должны растворяться в реакционной смеси, наносимой на тестовые полоски для определения анализируемых веществ, цель авторов изобретения состояла в повышении растворимости тиазолтетразолиевых солей, сохраняя при этом их способность образовывать формазаны с относительно ровным спектром отражения в диапазоне 600-640 нм. Авторы изобретения открыли семейство новых тиазолилтетразолиевых солей, включающее соединения, соответствующие поставленной цели. Эти соли представлены следующей общей формулой:
где
А=противоион,
X=1-6С алкил или гетероалкил,
а=1-3,
b=0-3,
1
R=1-6С алкил,
2
3
b
1
3-b
2
3
один из R и R является алкилом, а другой представляет собой XN+H(R), или R и R образуют метилендиокси группу,
4
5
один из R или R является галогеном, а другой представляет собой замещенный галогеном 1-6С алкил,
4
5
b
1
3-b
один или оба из R и R являются XN+H(R), или
4
5
R и R связаны с образованием ароматического или гетероароматического кольца или замещенного ароматического или замещенного гетероароматического кольца.
Тетразолиевые соли согласно изобретению также можно разделить на замещенные тиазоилтетразолиевые соли и замещенные бензотиазолилтетразолиевые соли, как показано в следующих, представляющих особый интерес формулах:
где
А=противоион,
X=1-6С алкил,
а=1-3,
b=0-3,
1
R=1-3С алкил,
2
3
b
1
3-b
2
3
4
2
5
один из R и R является 1-4С алкилом, а другой представляет собой XN+H(R), или R и R соединены с образованием метилендиокси группы, R=CHF, R = галоген.
А = противоион,
X = 1-6С алкил,
а=1-3,
b=0-3,
1
R=1-3С алкил,
2
3
b
1
3-b
2
3
один из R и R является 1-4С алкилом, а другой представляет собой XN+H(R), или R и R соединены с образованием метилендиокси группы,
4
5
4
5
R и R являются Н, или R и R связаны с образованием ароматического кольца
6
R=1-4С алкокси, водород или галоген.
Растворимость этих соединений (I и II) будет показана в приведенных ниже примерах. Повышение растворимости тиазолилтетразолиевых солей должно сократить время, необходимое для получение результатов теста, а также обеспечить большую линейность характеристики при высоких уровнях анализируемого вещества. Кроме того, повышенная растворимость в воде облегчает формирование однореагентной смеси, которую проще и дешевле производить.
Способы получения тетразолиевых солей согласно изобретению
В патенте США №5126275 описаны способы получения тиазолилтетразолиевых солей. Способы включают проведение реакции гидразона с диазотированным анилином с образованием формазана, который затем окисляют до тетразолиевой соли. Описанные ниже новые способы получения соединений согласно изобретению предусматривают введение одной (схема 1) или двух (схема 2) полярных групп в предпочтительные тетразолиевые соли соединений I и II. На фиг.1 и 2 проиллюстрированы эти два способа. Приведенные ниже примеры более подробно иллюстрируют изобретение.
Схема 1 используется для получения тетразолиевых солей, в которых фенильный заместитель в 5 позиции тетразолиевого кольца имеет метилендиокси-заместитель. На схеме 1 триметиламмонийпропокси группа замещена по фенильному заместителю в 3 позиции тетразолиевого кольца. На схеме 1 О-нитрофенол реагирует с 3-бромпропилтриметиламмонийбромидом с образованием 3-(2-нитрофенокси) пропилтриметиламмонийбромида, а затем гидрируется до соответствующего анилина. Реакция этого соединения с гидразоном, содержащим замещенное тиазолильное кольцо и фенильное кольцо с метилендиокси заместителем, дает формазан. Затем формазан окисляют до тетразолиевой соли. Гидразон получают путем реакции замещенного бензальдегида с замещенным гидразином, содержащим требуемые для тетразолиевой соли заместители.
Схема 2 используется для получения тетразолиевых солей, в которых фенильный заместитель в 5 позиции тетразолиевого кольца имеет триметиламмонийпропокси-группы, замещенные в 3 и/или 4 позиции. Как и на схеме 1, триметиламмонийпропокси-группа замещена по фенильному заместителю в 3 позиции тетразолиевого кольца. На схеме 2 4-гидрокси-3 метоксибензальдегид реагирует с 3-бромпропилтриметиламмонийбромидом для добавления триметиламмонийпропокси-группы в бензальдегид. Продукт реагирует с замещенным гидразином с образованием гидразона. Гидразон реагирует с 3-(2-аминофенокси)пропилтриметиламмонийбромидом, полученным на первом этапе схемы 1, с образованием формазана, который затем превращают в тетразолиевую соль.
Из приведенных ниже результатов видно, что на растворимость, похоже, влияют противоионы, связанные с тетразолиевыми солями. Противоионы поступают из реагентов, используемых в способе, и их можно менять для получения требуемых противоионов. В альтернативном варианте противоионы могут быть заменены, например, с помощью ионообменных способов.
В следующих неограничивающих примерах продукты на каждом этапе идентифицировали с использованием спектрофотометрических методов, а результаты представляли для каждого продукта.
Пример 1
Получение 5-бензо[1,3диоксол-5-ил]-3-[2-(3-триметиламмоний)пропокси-фенил]-2-(5-хлор-4-шфторметил-тиазол-2-ил)-2Н-тетразолийбромнитритной соли
EtOAc
13
1
2+
6
6
Как показано на схеме 1, о-нитрофенол реагирует с 3-бромпропилтриметиламмонийбромидом с образованием 3-(2-нитрофенокси)пропилтриметиламмонийбромида, а затем гидрируется до соответствующего анилина. Анилин реагирует с гидразоном, содержащим замещенное тиазолильное кольцо и фенильное кольцо с метилендиокси заместителем, с образованием формазана. Затем формазан окисляют до тетразолиевой соли. Способ полностью описан в следующем примере: к желтому раствору о-нитрофенола (Aldrich, 6,3 г, 45 ммоль) в DMF (150 мл) в сухой 250 мл одногорлой круглодонной колбе под азотом добавляли карбонат калия (6,6 г, 48 ммоль). Смесь приобретала оранжевый цвет. После 10 мин перемешивания добавляли 3-бромпропилтриметиламмонийбромид (Aldrich, 12,9 г, 45 ммоль). Полученную смесь нагревали при 125°С в течение 3 ч. После охлаждения реакционной смеси до комнатной температуры остаток фильтровали, а осадок промывали DMF (2×20 мл). Фильтрат медленно добавляли в EtOAc (750 мл), в результате чего образовался осадок. Полученную смесь перемешивали в течение 30 минут. Осадок фильтровали и промывали раствором EtOAc:DMF, 5:1 (3×100 мл), затем EtOAc (100 мл) и гексаном (100 мл). После высушивания на воздухе желтого твердого вещества в течение 5 минут продукт добавляли к раствору EtOAc:DMF, 10:1 (550 мл) и перемешивали в течение 1 ч. Твердое вещество фильтровали, промывали (100 мл) и гексаном (100 мл). Полученное твердое вещество фильтровали с получением светло-бежевого продукта (14,54 г, >100%), т. пл. (178-181°С), который идентифицировали по следующим свойствам. С ЯМР (400 МГц, DMSO d): δ 151, 139,45, 134,71, 125,14, 121, 115,39, 66,59, 62,84, 52,39, 22,48 Н ЯМР (400 МГц, DMSO-d): δ 7,90 (dd, J=8,1 Гц, J=1,7 Гц, 1Н), 7,58 (dt, J=8,2 Гц, J=1,7 Гц, 1Н), 7,39 (d, J=8,2 Гц, 1H), 7,15 (d, J=1,7 Гц, 1H), 4,25 (t, J=6 Гц, 2H), 3,45 (m, 2H), 3,11 (s, 9H), 2,23 (m, 2H). ESI-MS: m/z 239 (100%, M).
13
1
2+
6
6
Суспензию 3-(2-нитрофенокси)пропилтриметиламмонийбромида (7 г, 21,94 ммоль), 10% Pd/C (725 мг), МеОН (70 мл) и воду (70 мл) гидрировали при 35 фунт/кв. дюйм в течение 2,5 ч в аппарате Parr Hydrogenation. Через 30 минут давление упало до 22 фунт/кв. дюйм. Полученную смесь фильтровали через слой 521 Celite. Слой черного катализатора/Celite промывали МеОН (2×10 мл). Фильтрат концентрировали на роторном испарителе при пониженном давлении при 40-45°С. Когда дистиллят прекращал образовываться, светло-розовый раствор переносили в другую колбу и концентрировали там путем лиофилизации в течение 2 дней с образованием светло-бежевого анилинового производного (5,92 г, 93%), которое идентифицировали по следующим спектральным характеристикам: С ЯМР (400 МГц, DMSO-d): δ 145,19, 137,76, 121,39, 116,15, 114,09, 111,86, 64,79, 63,27, 52,36, 22,78 Н ЯМР (400 МГц, DMSO-d): δ 6,78 (d, J=4 Гц, 1Н), 6,66 (m, 2H), 6,53 (d, J=6 Гц, 1H), 4,82 (br s, 2H), 3,99 (t, J=6 Гц, 2H), 3,54 (m, 2H), 3,11 (s, 9H), 2,17 (m, 2H). ESI-MS: m/z 209 (100%, M).
EtOAc
EtOAc
EtOAc
19
13
1
2+
6
6
6
HF
К раствору указанного выше анилинового производного (7,7 г, 26,64 ммоль) в воде (80 мл) на водно-ледяной бане по каплям добавляли конц. HCl (7,2 мл). После перемешивания раствора в течение 5 мин по каплям добавляли раствор нитрита (2,2 г, 32 ммоль) в воде (16 мл). Цвет раствора изменился со светло-коричневого до золотисто-желтого. Полученный раствор перемешивали в течение 30 минут. Раствор гидразона (Bayer, 9,8 г, 27,98 ммоль) в пиридине (400 мл) перемешивали в 3-горлой 2-литровой колбе, оснащенной механической мешалкой и воронкой для добавления веществ с рубашкой, на солевой/ледяной/водной бане (-15 - -20°С). Только что полученный диазораствор добавляли по каплям к раствору гидразона через воронку для добавления с рубашкой, заполненной льдом/водой. После нескольких первых капель цвет реакции изменился с желтого на темно-синий. После 1/3 добавления темно-синяя реакционная смесь стала очень вязкой. По завершении добавления смесь перемешивали в течение 30 минут. Затем реакционную смесь нагревали до 3-5°С посредством ледяной/водной бани. Реакционную смесь перемешивали в течение 1 часа. Смесь переносили в 2-литровую круглодонную колбу с МеОН (500 мл). Смесь концентрировали на роторном испарителе при пониженном давлении при 45°С до прекращения образования дистиллята. Вновь добавляли МеОН (500 мл), и смесь концентрировали. Процесс повторяли. Полученное твердое вещество высушивали под вакуумом в течение ночи. Затем колбу промывали МеОН (100 мл) и разбавляли (500 мл). Суспензию перемешивали на ледяной/водной бане в течение 30 минут. Продукт фильтровали и промывали (100 мл), холодным МеОН (50 мл), (150 мл) и гексаном (150 мл). Полученный темно-синий продукт переносили в бутылочку из желтого стекла и сушили под вакуумом с образованием требуемого формазана (13, 11,3 г, 67%), который идентифицировали по следующим спектральным свойствам: F ЯМР: (376 МГц, DMSO d): δ -177,77 (d, J=59,2 Гц), С ЯМР (400 МГц, DMSO-d): δ 169,57, 153,6, 148,1, 147,8, 144,81, 141,9, 137,1, 132,74, 128,82, 121,53, 121,5, 121,1, 115,89, 113,96, 108,8, 108,22, 106,68, 101,33, 66,21, 63,03, 51,99, 22,35 Н ЯМР (400 МГц, DMSO-d): δ 11,78 (br s, 1Н), 8,05 (dd, J=8,1 Гц, J=1,5 Гц, 1Н), 7,55 (dd, J=8,2 Гц, J=1,6 Гц, 1H), 7,48 (dd, J=8,2 Гц, J=1,7 Гц, 1H), 7,43 (d, J=1,7 Гц, 1H), 7,32 (dd, J=8 Гц, J=<1 Гц, 1H), 7,16 (t, J=7,9 Гц, 1H), 7,15 (t, J=59,2, 1H), 7,04 (d, J=8,2 Гц, 1H), 6,11 (s, 2H), 4,32 (t, J=6 Гц, 2H), 3,49 (m, 2H), 3,05 (с, 9H), 2,38 (m, 2H). ESI-MS: m/z 611 (100%, M-Ms), 258 (26%, M).
19
13
1
2+
+
2+
6
6
6
HF
К смеси указанного выше формазана (2,16 г, 3,4 ммоль), воды (1,4 мл) и THF (40 мл) добавляли метансульфокислоту (0,68 мл, 10,24 ммоль). Смесь перемешивали в течение 5 минут. Затем добавляли одной порцией нитрит натрия (720 мг, 10,24 ммоль). Смесь перемешивали в течение 3 дней. Цвет суспензии изменился с темно-синего на оранжевый. Оранжевый осадок фильтровали и промывали THF (2×10 мл). Продукт сушили под вакуумом на протяжении ночи. Затем твердое вещество суспендировали МеОН (80 мл), фильтровали, а остаток промывали МеОН (2×5 мл). Фильтрат концентрировали на роторном испарителе при пониженном давлении при 40°С. Полученный продукт сушили 2 дня под вакуумом с образованием оранжевой тет-соли (2,86 г >100%), которую идентифицировали по следующим спектральным свойствам: F ЯМР: (376 МГц, DMSO-d): δ - 181,13 (d, J=52,1 Гц), С ЯМР (400 МГц, DMSO-d): δ 165,1, 152,52, 152,27, 148,85, 146,68, 142,72, 142,45, 137,07, 135,95, 128,44, 123,87, 121,87, 121,86, 121,39, 115,57, 114,68, 110,80, 109,84, 108,43, 107,14, 106,06, 102,78, 100,49, 66,92, 62,23, 52,21, 22,08 Н ЯМР (400 МГц, DMSO-d): δ 7,98 (dd, J=8,0 Гц, J=1,5 Гц, 1Н), 7,91 (m, 2H), 7,82 (d, J=1,8 Гц, 1H), 7,53 (d, J=8,2 Гц, 1H), 7,37 (m, 1H), 7,31 (d, J=8,2 Гц, 1H), 7,25 (t, J=59,2, 1H), 6,27 (s, 2H), 4,17 (t, J=6 Гц, 2H), 3,49 (m, 2H), 2,93 (2, 9H), 2,02 (m, 2H). ESI-MS: m/z 663 (22%, M+ TFA), 645 (17%, M), 275 (100%, M).
Пример 2
Получение 5-бензо[1,3диоксол-5-ил]-3-[2-(3-триметиламмоний)пропокси-фенил]-2-(5-хлор-4-дифторметил-тиазол-2-ил)-2Н-тетразолийбромтетрафторборатной соли
13
19
1
+
6
6
6
HF
Соль получали согласно примеру 1, за исключением того, что использовали 48% тетрагидрофторборную кислоту с тем же формазаном для получения требуемой оранжевой тетразолиевой соли. С ЯМР (400 МГц, DMSO d): δ 137, 128, 124, 121, 114, 111, 110, 108, 107, 106, 103, 68, 63, 53, 28 F ЯМР: (376 МГц, DMSO-d): δ - 181,13 (d, J=59,2 Гц), Н ЯМР (400 МГц, DMSO-d): δ 7,92 (m, 3Н), 7,82 (d, J=1,8 Гц, 1Н), 7,52 (bd, J=8,2 Гц, 1H), 7,37 (m, 1H), 7,31 (d, J=8,2 Гц, 1H), 7,25 (t, J=59,2, 1H), 6,27 (s, 2H), 4,17 (t, J=6 Гц, 2H), 3,35 (m, 2H), 2,93 (2,9H), 2,02 (m, 2H). ESI-MS: m/z 637 (100%, M-Br).
Пример 3
Получение 5-бензо[1,3диоксол-5-ил]-3-[2-(3-диметилгидроаммоний)пропокси-фенил]-2-(5-хлор-4-дифторметил-тиазол-2-ил)-2Н-тетразолийбромнитритной соли
EtOAc
EtOAc
EtOAc
EtOAc
1
6
К желтому раствору о-нитрофенола (Aldrich, 2,1 г, 45 ммоль) в DMF (50 мл) в сухой 100мл одногорлой круглодонной колбе под азотом добавляли карбонат калия (4,4 г, 32 ммоль). Смесь приобретала оранжевый цвет. После 10 мин перемешивания добавляли 3-хлорпропилдиметиламмонийхлорид (Aldrich, 2,4 г, 16,5 ммоль). Полученную смесь нагревали при 125°С в течение одного дня. После охлаждения реакционной смеси до комнатной температуры остаток фильтровали, а осадок промывали МеОН (2×10 мл). Фильтрат концентрировали под вакуумом при 40°С до 5 мл. Затем добавляли (100 мл). Образовался осадок, который отфильтровали. К фильтрату добавляли воду (100 мл) и (150 мл), слои перемешивали и разделяли. Водный слой экстрагировали (3×25 мл). Объединенные экстракты промывали насыщенным водным хлоридом натрия (25 мл), высушивали над сульфатом магния (5 г), фильтровали и концентрировали с образованием желтого масла (2,55 г, 81%). Н ЯМР (400 МГц, DMSO-d): δ 7,80 (dd, J=8,1 Гц, J=1,7 Гц, 1Н), 7,58 (dt, J=8,2 Гц, J=1,7 Гц, 1Н), 7,05 (d, J=8,2 Гц, 1H), 6,65 (d, J=1,7 Гц, 1H), 4,25 (t, J=6 Гц, 2H), 2,45 (m, 2H), 2,15 (s, 9H), 1,9 (m, 2H). ESI-MS: m/z 225 (100%, M+1).
13
19
1
2+
6
6
6
HF
Алкилированный нитрофенол обрабатывали таким же образом, как описано в примере 1, с получением требуемой тет-соли. С ЯМР (400 МГц, DMSO d): δ 127, 124, 121, 115, 110, 109, 108, 107, 104, 102, 64, 48, 36, 28 F ЯМР: (376 МГц, DMSO-d) (d, J=59,2 Гц): δ - 119,13, Н ЯМР (400 МГц, DMSO-d): δ 7,95 (m, 3Н), 7,80 (d, J=1,8 Гц, 1H), 7,50 (d, J=8,2 Гц, 1H), 7,35 (t, J=8,2 Гц, 1H), 7,31 (d, J=8,2 Гц, 1H), 7,25 (t, J=59,2, 1H), 6,27 (s, 2H), 4,20 (t, J=6 Гц, 2H), 3,45 (m, 2H), 2,65 (d, j=1,8 Гц, 6H), 1,98 (m, 2H). ESI-MS: m/z 535 (100%, M).
Пример 4
Получение 5-бензо[1,3диоксол-5-ил]-3-[2-(3-триметиламмоний)пропокси-фенил]-2(бензотиазол-2-ил)-2Н-тетразолийбромнитритной соли
Провели реакцию пиперонал-бензотиазол-2-илгидразона с 3-(2-аминофенокси)пропилтриметиламмонийбромидом, как описано в примере 1, с образованием формазана, который затем превратили в соответствующую тетразолиевую соль.
1
+
6
Провели реакцию пиперонал-бензотиазол-2-илгидразона (Bayer, 2,5 г, 10,5 ммоль) с анилиновым производным из примера 1 (2,85 г, 9,6 ммоль) при условиях, аналогичных получению формазана в примере 1, с образованием темно-пурпурного твердого вещества (4,7 г, 82%), которое идентифицировали по следующим спектральным свойствам: Н ЯМР (400 МГц, DMSO-d): δ 11,78 (br s, 1Н), 7,98 (dd, 2H), 7,73 (m, 1H), 7,60 (m, 2H), 7,50 (m, 1H), 7,41 (m, 2H), 7,29 (m, 1H), 7,05 (d, 1H), 6,14 (s, 2H), 4,39 (t, 2H), 3,55 (m, 2H), 3,05 (s, 9H), 2,48 (m, 2H). ESI-MS: m/z 517 (100%, M).
13
1
+
6
6
Указанный выше формазан (600 мг, 1,01 ммоль) превращали в тетразолиевую соль (870 мг, >100%) при тех же условиях, что и в примере 1. Тетразолиевую соль идентифицировали по следующим спектральным свойствам: С ЯМР (100 МГц, DMSO-d): δ 164,98, 152,59, 152,26, 148,91, 136,64, 132,74, 135,08, 129,27, 128,88, 128,24, 124,77, 123,97, 123,7, 122,6, 121,97, 115,81, 114,56, 109,86, 107,12, 102,82, 66,88, 62,26, 52,2, 22,02. Н ЯМР (400 МГц, DMSO-d): δ 8,42 (dd, J=8,2 Гц, J=0,8 Гц, 1Н), 8,03 (dd, J=7,7 Гц, J=1,6 Гц, 1H), 8,02 (dd, J=8,1 Гц, J=0,9 Гц, 1H), 7,97 (dd, J=8,2 Гц, J=1,8 Гц, 1H), 7,93 (m, 1H), 7,86 (d, J=1,7 Гц, 1H), 7,76 (m, 1H), 7,73 (m, 1H), 7,55 (dd, J=8,6 Гц, J=0,9 Гц, 1H), 7,39 (m, 1H), 7,32 (d, J=8,1 Гц, 1H), 6,28 (s, 2H), 4,12 (t, J=6 Гц, 2H), 3,16 (m, 2H), 2,91 (s, 9H). ESI-MS: m/z 561,2 (100%, М).
Пример 5
Получение 5-бензо[1,3диоксол-5-ил]-3-[2-(3-триметиламмоний)пропокси-фенил]-2-(6-метоксинафтилтиазол-2-ил)2Н-тетразолийбромнитритной соли
13
1
+
6
6
Для получения требуемого гидразона в примере 4 вместо 6-гидразино-бензотиазола использовали 6-метокси-2-гидразино-нафтилтиазол. Гидразон затем обрабатывали в тех же условиях для получения требуемого формазана (44% всего). С ЯМР (400 МГц, DMSO-d): δ 135, 130, 125, 122, 121, 120, 115, 114, 113, 110, 65, 64, 55, 52, 38, 22 Н ЯМР (400 МГц, DMSO-d): δ 8,61 (d, J=8,1 Гц, 1Н), 8,29 (d, J=8,2 Гц, 1Н), 8,05 (dd, J=8,1 Гц, J=l,8 Гц, 1H), 7,82 (dt, J=8,2 Гц, J=1,7 Гц, 1H), 7,68 (m, 2H), 7,61 (dd, J=8,1 Гц, J=1,6 Гц, 1H), 7,55 (d, J=1,8 Гц), 7,37 (dd, J=8,2 Гц, J=l,8 Гц, 1H), 7,31(dd, J=8,2 Гц, J=1,8 Гц, 1H), 7,27 (dt, J=8,1 Гц, J=1,7 Гц, 1H), 7,08 (d, J=8,1 Гц, 1H), 6,12 (s, 2H), 4,45 (t, J=6 Гц, 2H), 4,10 (s, 3H), 3,60 (m, 2H), 2,95 (s, 9H), 2,65 (m, 2H). ESI-MS: m/z 597 (100%, M).
13
1
2+
+
6
6
К раствору уксусной кислоты (5 мл) и тетрагидрофурана (5 мл) на ледяной/соляной/водяной бане добавляли нитрит натрия (143 мг, 2,08 ммоль). После перемешивания в течение 10 минут добавляли указанный выше формазан (340 мг, 0,051 ммоль). Через 1 час реакции дали нагреться до комнатной температуры и перемешивали в течение ночи. Темно-красно-коричневую смесь фильтровали, и твердое вещество промывали уксусной кислотой (3×5 мл), этилацетатом (2×10 мл) и гексаном (10 мл). Фильтрат концентрировали на роторном испарителе при 30°С, а затем сушили под вакуумом на протяжении ночи. Остаток суспендировали этилацетатом (15 мл), дали отстояться и сцеживали. Процесс повторяли. Затем добавляли гексан (10 мл). Продукт фильтровали и сушили на протяжении ночи с получением требуемой красно-коричневой тет-соли (260 мг, 75%). С ЯМР (400 МГц, DMSO-d): δ 129, 128, 126, 123, 121, 119, 115, 114, 112, 108, 105, 101, 98, 66, 63, 57, 51, 22 Н ЯМР (400 МГц, DMSO-d): δ 8,32 (m, 1Н), 8,02 (m, 4Н), 7,87 (d, J=1,8 Гц, 1 Гц), 7,78 (m, 3Н), 7,66 (d, 8,2 Гц, 1Н), 7,47 (t, J=8,2 Гц, 1Н), 7,33 (d, J=8,2 Гц, 1H), 6,28 (s, 2H), 4,13 (s, 3H), 3,15 (m, 2H), 2,85 (s, 9H), 1,87 (m, 2H). ESI-MS: m/z 298 (100%, M), 709 (20%, M+ TFA).
Пример 6
Получение 5-[4-(3-триметиламмоний)пропокси-3-метокси-фенил]-3- [2-(3-триметиламмоний)пропокси-фенил]-2-(5-хлор-4-дифторметил-тиазол-2-ил)-2Н-тетразолийдибромнитритной соли
13
1
+
6
6
Проводили реакцию 4-гидрокси-3-метоксибензальдегада с 3-бромпропилтриметиламмонийбромидом для введения еще одного триметиламмонийпропокси заместителя. Продукт вводили в реакцию с 5-хлор-4-дифторметил-2-гидразино-тиазолом с образованием гидразона. Этот гидразон вводили в реакцию с 3-(2-аминофенокси)пропилтриметиламмонийбромидом, как описано в примере 1, с образованием формазана, который затем превращали в соответствующую тетразолиевую соль. 4-Гидрокси 3 метокси-бензальдегид (Vanillin, Aldrich, 4,56 г, 30 ммоль) алкилировали 3-бромпропилтриметиламмонийбромидом (8,8 г, 34 ммоль) при условиях примера 1 с получением беловатого продукта (9,73 г, 97%), который идентифицировали по следующим спектральным свойствам: С ЯМР (400 МГц, DMSO-d): δ 192,5, 155, 150, 130, 125,75, 112,6, 110, 66,5, 63,4, 56, 25,5. Н ЯМР (400 МГц, DMSO-d): δ 9,88 (s, 1Н), 7,58 (dd, J=8,2 Гц, J=1,9 Гц, 1H), 7,41 (d, J=1,9 Гц, 1H), 7,22 (d, J=8,2 Гц, 1H), 4,35 (t, J=6,4 Гц, 2H), 3,49 (m, 2H), 3,14 (s, 9H), 2,30 (m, 2H). ESI-MS: m/z 252,2 (100%, M).
EtOAc
EtOAc
19
13
1
+
6
6
6
HF
К суспензии указанного выше алкилированного бензальдегида (6,8 г, 20,5 ммоль) и 5-хлор-4-дифторметил-2-гидразино-тиазола (Bayer, 3,72 г, 18,6 ммоль) в МеОН (60 мл) добавляли уксусную кислоту (0,55 мл). Суспензия почти полностью растворилась в течение 5 минут. Полученную смесь нагревали при 80°С в течение ночи. После охлаждения реакционной смеси до комнатной температуры раствор медленно добавляли в (650 мл). Образовался светло-серый осадок. Смесь перемешивали в течение 30 минут. Твердое вещество фильтровали и промывали и гексаном. Светло-серый продукт переносили в бутылочку желтого цвета и сушили под вакуумом в течение ночи с образованием требуемого гидразона (8,7 г, 87%), который идентифицировали по следующим свойствам: F ЯМР: (376 МГц, DMSO-d): δ 111,08 (d, J=47 Гц), С ЯМР (400 МГц, DMSO-d): δ 143, 121, 114, 109, 108,5, 66, 63, 55, 53, 39, 22. Н ЯМР (400 МГц, DMSO-d): 12,37 (s, 1Н), 7,29 (d, J=1,9 Гц, 1H), 7,19 (dd, J=10 Гц, J=1,8 Гц, 1H), 7,06 (t J=7,7 Гц, 1H), 7,18 (mm, 1H), 6,95 (t, J=47, 1H), 4,09 (t, J=6,1 Гц, 2H), 3,83 (s, 3H), 3,47 (m, 2H), 3,47 (m, 2H), 3,29 (s, 9H), 2,50 (m, 2), 2,20 (m, 2H). ESI-MS: m/z 433,1 (100%, M).
19
13
1
+
+
6
6
6
HF
Указанный выше гидразон (7,08 г, 13,86 ммоль) вводили в реакцию с анилиновым производным из примера 1 (6 г, 20,76 ммоль) при условиях, аналогичных примеру 1, с образованием темно-синего формазана (8,56 г, 76%), который идентифицировали по следующим спектральным свойствам: F ЯМР: (376 МГц, DMSO-d): δ 177,77 (d, J=59,2 Гц), С ЯМР (400 МГц, DMSO-d): δ 153, 148,98, 148,63, 144,5,136,5, 132,73, 132,74, 127, 121,59, 119,53, 115,54, 113,96, 113,58, 110,98, 108,92, 66,10, 65,79, 62,77, 55,54, 52,15, 22,45, 22,25. Н ЯМР (400 МГц, DMSO-d): δ 11,78 (br s, 1Н), 8,03 (dd, J=8,1b Гц, J=1,5 Гц, 1H), 7,56 (m, 1H), 7,52 (dt, J=8,5 Гц, J=2 Гц, 1H), 7,50 (d, J=2 Гц, 1H), 7,35 (dd, J=8,5 Гц, J=1 Гц, 1H), 7,30 (d, J=7,9 Гц, 1H), 7,18 (mm, 1H), 7,17 (t, J=59,2, 1H), 4,35 (t, J=5,8 Гц, 2H), 4,13 (t, J=6,1 Гц, 2H), 3,88 (s, 3H), 3,55 (m, 2H), 3,50 (m, 2H), 3,14 (s, 9H), 3,07 (s, 9H), 2,50 (m, 2H), 2,30 (m, 2H). ESI MS: m/z 652,2 (45%, M), 326,8 (100%, M).
13
1
+
4+
2+
6
6
Указанный выше формазан (2,44 г, 3 ммоль) превращали в тетразолиевую соль при аналогичных примеру 1 условиях, за исключением того, что реакционную смесь нагревали при 40°С в течение 15 часов. Продукт идентифицировали по следующим спектральным свойствам: С ЯМР (100 МГц, DMSO-d): δ 136,7, 128,5, 121,9, 121,8, 114,5, 113,5, 110,2, 108,1, 105,7, 66,7, 66,1, 62,5, 62,1, 56,1, 52,1, 51,8, 21,8, 21,2. Н ЯМР (400 МГц, DMSO-d): δ 8,06 (dd, J=8,1 Гц, J=1,5 Гц, 1Н), 7,93 (m, 8H), 7,77 (d, J=2 Гц, 1H), 7,53 (d, J=8,6 Гц, 1H), 7,38 (t, J=8,5 Гц, 2H), 7,26 (d, J=52,2 Гц, 1H), 4,23 (t, J=6H, 2H), 4,17 (t, J=6,1 Гц, 2H), 3,94 (s, 3H), 3,53 (m, 2H), 3,32 (m, 2H), 3,14 (s, 9H), 3,01 (s, 9H), 2,26 (m, 2H), 2,03 (m, 2H), ESI MS: m/z 652,2 (45%, M), 326,8 (100%, M), 326,8 (100%, M).
Пример 7
Получение 5-[4-(3-триметиламмоний)пропокси-3-метокси-фенил]-3-[2-(3-триметиламмоний)пропокси-фенил]-2-(6-этокси-бензотиазол-2-ил)-2Н-тетразолийдибромнитритной соли
6-Этокси-2-гидразино-бензотиазол вводили в реакцию с алкилированным бензальдегидом, полученным в примере 6, с получением гидразона, который затем реагировал с замещенным анилином, полученным в примере 1, с получением формазана. Формазан превращали в соответствующую тетразолиевую соль.
13
1
+
+
+2
6
6
6-Этокси-2-гидразино-бензотиазол (Acros, 4,62 г, 22 ммоль) вводили в реакцию с 4-(3-триметиламмонийпропокси)-3-метокси-бензальдегидом при условиях, аналогичных примеру 6, с образованием светло-серого продукта (10,23 г, 95%), который идентифицировали по следующим свойствам: С ЯМР (400 МГц, DMSO-d): δ 165,58, 153,82, 153,74, 149,24, 148,96, 142,42, 128,01, 120,16, 118,24, 113,62, 113,54, 108,66, 106,49, 101,33, 65,83, 63,51, 62,86, 55,32, 52,16, 22,51, 14,6. Н ЯМР (400 МГц, DMSO-d): δ 11,98 (br s, 1Н), 8,03 (s, 1H), 7,38 (d, J=2,2 Гц, 1H), 7,34 (d, J=8,7 Гц 1H), 7,32 (d, J=1,8 Гц, 1Н), 7,20 (dd, J=8,4 Гц, J=1,8 Гц, 1H), 7,07 (d, J=8,4 Гц, 1H), 6,89 (dd, J=8,7 Гц, J=2,5 Гц, 1H), 4,09 (t, J=6,1 Гц, 2H), 4,03 (t, J=7 Гц, 2H), 3,84 (m, 3H), 3,49 (m, 2H), 3,12 (s, 9H), 2,22 (m, 2H), 1,33 (t, J=7 Гц). ESI-MS: m/z 561,2 (100%, M). ESI-MS: m/z 443,1 (78%, M), 222,1 (100%, M).
13
1
+′+
+
+2
6
6
Полученный выше гидразон (3,6 г, 6,93 ммоль) вводили в реакцию с анилином из примера 1 (3 г, 10,38 ммоль) при условиях, аналогичных примеру 1, с образованием формазана, за исключением того, что использовалась смесь 3:1 пиридина и DMF в качестве растворителя. Был получен темно-синий продукт (3,8 г, 66%), который идентифицировали по следующим спектральным свойствам: С ЯМР (400 МГц, DMSO-d): δ 130,5, 123,2, 121,8, 118,8, 116, 115,3, 114,1, 113,8, 109,8, 106,3, 67,1, 66,5, 63,6, 52,5, 22,6, 22,5, 14,2. Н ЯМР (400 МГц, DMSO-d): δ 11,78 (br s, 1Н), 8,01 (br d, J=8 Гц, 1H), 7,81 (br s, 1H=8,8 Гц, 1H), 7,62 (m, 3H), 7,48 (t, J=8 Гц, 1H), 7,33 (d, J=8,3 Гц, 1H), 7,16 (m, 1H), 7,10 (dd, J=8,8 Гц, J=2,4 Гц, 1H), 4,38 (t, J=5,8 Гц, 2H), 4,13 (m, 2H), 3,91 (s, 3H), 3,55 (m, 2H), 3,50 (m, 2H), 3,13 (s, 9H), 3,08 (s, 9H), 2,54 (m, 2H), 2,25 (m, 2H), 1,38 (t, J=7 Гц, 3H). ESI MS: m/z 776 (12%, MTFA) 662,2 (45%, M), 331,8 (100%, M).
13
1
+3
6
6
Указанный выше формазан (1,24 мг, 1,5 ммоль) превращали в тетразолиевую соль (2 г, >100%) при аналогичных примеру 1 условиях. Продукт идентифицировали по следующим спектральным свойствам: С ЯМР (400 МГц, DMSO-d): δ 136,8, 128,1, 125,4, 121,5, 121,4, 114, 113,5, 109,8, 106,8, 66,6, 66,2, 64,5, 62,5, 62,2, 56,1, 52,2, 52,1, 22,1, 21,5, 13,5. Н ЯМР (400 МГц, DMSO-d): δ 8,04 (dd, J=8 Гц, J=1,5 Гц, 1Н), 7,95 (m, 4H), 7,78 (d, J=2 Гц, 3Н), 7,54 (d, J=8,5 Гц, 1H), 7,40 (t, J=7,8 Гц, 1H), 7,38 (d, J=8,6 Гц, 1H), 4,23 (t, J=6,1 Гц, 2H), 4,1 (q, J=8 Гц, 2H), 4,12 (m, 2H), 3,96 (s, 3H), 3,53 (m, 2H), 3,50 (m, 2H), 3,18 (m, 2H), 3,15 (s, 9H), 2,92 (2, 9H), 2,30 (m, 2H), 1,89 (m, 2H), 1,40 (t, J=7 Гц, 2H). ESI MS: m/z 220,8 (100%, M).
Пример 8
Получение 5-[4-(3-триметиламмоний)пропокси-3-метокси-фенил]-3-[2-(3-триметиламмоний)пропокси-фенил]-2-(6-бром-бензотиазол-2-ил)-2Н-тетразолийдибромнитритной соли
1
2+
6
Для получения требуемого гидразона в примере 8 вместо 6-этокси-2-гидразино-бензотиазола использовали 6-бром-2-гидразино-бензотиазол. Гидразон затем обрабатывали в тех же условиях для получения требуемого формазана (44% всего). Н ЯМР (400 МГц, DMSO-d), δ 7,90 (dd, J=8,1 Гц, J=1,7 Гц, 1 Н), 7,58 (dt, J=8,2 Гц, J=1,7 Гц, 1Н), 7,39 (d, J=8,2 Гц, 1H), 7,15 (d, J=1,7 Гц, 1H), 4,25 (t, J=6 Гц, 2H), 3,45 (m, 2H), 3,11 (s, 9H), 2,48 (m, 2H), 2,25 (m, 2H). ESI-MS: m/z 249 (100%, M).
13
1
3+
6
6
Формазан (322 мг, 0,375 ммоль) обрабатывали при тех же условиях, что и в примере 8, с образованием тетразолиевой соли, за исключением того, что реакционную смесь нагревали при 40°С в течение ночи с образованием требуемой тетразолиевой соли (478 мг, >100%), С ЯМР (100 МГц, DMSO d): δ 151, 139,45, 134,71, 125,14, 121, 115,39, 66,59, 62,84, 52,39, 22,48: δ 7,90 Н ЯМР (400 МГц, DMSO-d), 8,74 (d, J=2,1 Гц, 1Н), 7,95 (m, 5Н), 7,78 (d, J=2,1 Гц, 1H), 7,51 (d, J=7,8 Гц, 1H), 7,39 (m, 2H), 4,2 (m, 2H), 4,08 (m, 2H), 3,96 (s, 3H), 3,53 (m, 2H), 3,19 (m, 2H), 3,11 (s, 9H), 2,91 (s, 9H), 2,24 (m, 2H), 1,87 (m, 2H). ESI-MS: m/z 233 (100%, M).
Пример 9
Получение 5 -[4-(3-триметиламмоний)пропокси-3-метокси-фенил]-3-[2-(3-триметиламмоний)пропокси-фенил]-2-(6-этокси-бензотиазол-2-ил)-2Н-тетразолийтрибромидной соли
13
1
3+
6
6
К суспензии формазана (из примера 7, 1,18 г, 1,43 ммоль) в ацетонитриле (15 мл) добавляли n-бромсукцинимид (300 мг, 1,69 ммоль) при комнатной температуре. Через 1 час все растворилось. Через 3 часа образовался оранжевый осадок. Реакцию перемешивали на протяжении ночи. Осадок фильтровали и промывали ацетонитрилом (3x5 мл). Полученный оранжевый продукт сушили под вакуумом на протяжении ночи. (1,07 г, 83%) С ЯМР (100 МГц, DMSO d): δ 151, 139,45, 134,71, 125,14, 121, 115,39, 66,59, 62,84, 52,39, 22,48 Н ЯМР (400 МГц, DMSO-d): δ 8,08 (d, J=8,2 Гц, 1Н), 8,04 (d, J=l,7 Гц, 1Н), 7,94 (m, 3Н), 7,79 (bs, 1H), 7,55 (d, J=8,2 Гц, 1H), 7,40 (d, J=8,2 Гц, 1H), 7,30 (dd, J=8,2 Гц, J=l,7 Гц, 1H), 4,23 (t, J=6 Гц, 2H), 4,15 (q, J=8,2 Гц, 2H), 4,10 (m, 2H), 3,95 (s, 3H), 3,57 (m, 2H), 3,22 (m, 2H), 3,15 (s, 9H), 2,95 (s, 9H), 2,30 (m, 2H), 1,90 (m, 2H), 1,4 (t, J=8,2 Гц). ESI-MS: m/z 221 (100%, M).
Растворимость тетразолиевых солей, полученных в примерах 1-9, определяли путем добавления 0,2М фосфатного буфера, рН ~ 7,5 при комнатной температуре к известным количествам каждого соединения до растворения соединения. Результаты приведены в таблице, где проведено их сравнение с WST-4 - тиазолилтетразолиевой солью Dojindo Laboratories, НТС-045 - тиазолилтетразолиевой солью Bayer Corp. и модифицированной НТС-045, в которой метокси-группа заменена на 3-сульфонатпропокси-группу (см. фиг.3).
Пример №
(Противоион)
Растворимость (мМ)
1
(бромнитрит)
33
2
(бромтетрафторборат)
5
3
(бромнитрит)
9
4
(бромнитрит)
167
5
(бромнитрит)
5
6
(дибромнитрит)
181
7
(дибромнитрит)
169
8
(дибромнитрит)
290
9
(трибромид)
260
WST-4
118
НТС-045
21
Модифицированная НТС-045
8
Хотя улучшенная растворимость тетразолиевых солей была достигнута путем введения триалкиламмонийпропокси заместителей в тиазолилтетразолиевые соли, это усовершенствование не было очевидным, исходя из известного уровня техники. Из известного уровня техники можно было предположить, что добавление 3-сульфонатпропокси-группы в молекулу повысит растворимость вещества в воде. Введение сульфокислотной группы в молекулу было осуществлено Dojindo Laboratories. Однако замена метокси группы 3-сульфонатпропокси-группой в фенильной группе, присоединенной к тетразолиевому кольцу (см. модифицированную НТС-045 на фиг.3) дало меньшую растворимость (8 мМ), чем у НТС-045 (21 мМ). Таким образом, в предложенной нами молекулярной структуре это явление не наблюдается. Нам удалось определить, что растворимость в воде улучшает другая полярная группа. Однако наблюдались другие неожиданные эффекты, которые будут рассмотрены ниже.
Замена метокси группы триметиламмонийпропокси-группой повысила растворимость с 21 мМ (НТС-045) до 33 мМ (пример 1), а добавление второй триметиламмонийпропокси-группы (пример 6) значительно повысило растворимость до 181 мМ. Однако замена нитрата тетрафторборатным противоионом привела к значительному снижению растворимости. (Сравните пример 2 с примером 1.) Растворимость тетразолиевой соли в примере 1 снизилась в примере 3, когда триметиламмонийпропокси-группу изменили на диметиламмонийпропокси-группу.
Значительное повышение растворимости в результате добавления двух триметиламмонийпропокси-групп (пример 6) было также неожиданно обнаружено в примере 4 (167 мМ), где была введена только одна триметиламмонийпропокси-группа, а замещенная тиазоильная группа была заменена на незамещенную бензотиазоильную группу. Однако дальнейшее добавление к тиазоильной группе, проиллюстрированное в примере 5, где использовали замещенную нафтилтиазоильную группу, дало вещество с малой растворимостью (5 мМ). В примере 7 был получен еще один неожиданный результат: добавление двух триметиламмоний-групп и бензотиазоильной группы, обе из которых обеспечивали повышение растворимости, не дало комплементарного эффекта. Вещество примера 7 обладает растворимостью 167 мМ.
Другое значительное повышение растворимости было получено при замене этоксигруппы на бензотиазоильной группе примера 7 на бромогруппу в примере 8. Растворимость повысилась с 169 мМ до 290 мМ, что является наилучшим из приведенных здесь результатов. Аналогичный результат был получен, когда противоион в примере 7 (нитритный ион) был заменен на бромидный ион в примере 9. Растворимость повысилась с 169 мМ до 260 мМ. Похоже, введение брома является эффективным средством для повышения растворимости этого семейства тетразолиевых солей.
Полученные и испытанные на растворимость соединения обладали несколько отличающимися спектральными свойствами. Спектр поглощения каждого формазана, полученного из тетразолиевой соли и испытанного на растворимость (таблица), измеряли спектрофотометром Hewlett-Packard Модель 8453 с диодной матрицей, работающим в области УФ и видимого спектра. Растворы 100 мкМ тетразолиевой соли готовили в буфере 100 мМ фосфата калия. Спектры формазана измеряли после добавления 5-кратного избытка соли аскорбиновой кислоты для превращения тет-солей в соответствующие формазаны. Результаты приведены на фиг.5а и b.
Как отмечалось ранее, формазаны тиазолилтетразолиевых солей должны поглощать свет на длинах волн свыше 640 нм, желательно при ровной характеристике отклика. На фиг.5а и b для сравнения приведены спектры поглощения НТС-045 и WST-4. WST-4 имеет пик поглощения примерно при 560 нм, а НТС-045 демонстрирует относительно постоянное поглощение в диапазоне от примерно 460 нм до 660 нм. Однако растворимость этого вещества меньше, чем у WST-4. Добавление триметиламмонийпропокси-группы привело к изменению кривых спектра. Соединения примеров 1, 2, 3, 4, 6, 7 и 8 обладают меньшим поглощением, чем НТС-045, однако их характеристики относительно ровные в показанном диапазоне. Как можно видеть, тет-соли примера 5, включающие нафтилтиазоильную группу, не только имеют малую растворимость, но и восходящую по мере увеличения длины волны характеристику поглощения, не имеющую ровных участков, как НТС-045 или модифицированные соединения примеров 1, 2, 3, 4, 6, 7 и 8. Соединение примера 9 обладает спектральной характеристикой с относительно ровным участком в диапазоне 400-640 нм, а также высокой растворимостью.
В идеальном случае, тетразолиевая соль должна образовывать формазан, обладающий высоким поглощением в широком диапазоне длин волн, что позволит легко и точно измерять появляющийся при реакции с анализируемым веществом цвет. Таким образом, наиболее желательной является относительно ровная характеристика. Как видно из данных по растворимости формазанов, полученных из протестированных тет-солей, все они (возможно, за исключением лишь соединения примера 5) имеют хорошие перспективы применения в качестве индикаторов. Тетразолиевая соль примера 5 является новым соединением и может использоваться в качестве индикатора, однако она менее предпочтительна, чем соединения с более равномерной спектральной характеристикой и более высокой растворимостью.
Применение тетразолиевых солей
Хотя тетразолиевые соли могут использоваться в качестве индикаторов во многих сферах, они особенно подходят для применения в тестовых полосках для измерения содержания анализируемых веществ в биологических пробах. Одним из важных применений является определение содержания глюкозы в крови.
Тестовые полоски обычно содержат носитель и композицию реагентов. Реагенты (например, глюкозодегидрогеназа) и кофактор (например, NAD или PQQ) реагируют с анализируемым веществом (например, глюкозой) в биологических пробах, а медиатор (например, PMS или фермент диафораза) восстанавливает тиазолилтетразолиевую соль до соответствующего окрашенного формазана. Полученный цвет обычно наиболее точно измеряют с помощью предназначенного для этой цели измерительного прибора. Источник света (например, светодиод) освещает тестовую полоску. Отраженный от тестовой полоски свет принимается датчиком и коррелируется с количеством вступившего в реакцию анализируемого вещества.
Тиазолилтетразолиевые индикаторы согласно изобретению обеспечивают широкий спектр, как и индикаторы, раскрытые в патенте США №5126275 и других упомянутых выше документах. Однако, как показано в примерах, многие из новых тиазолилтетразолиевых индикаторов обладают большей растворимостью по сравнению с НТС-045, обеспечивая, таким образом, более быстрое и точное тестирование.
Изобретение подытожено в следующих альтернативных вариантах осуществления.
Альтернативный вариант осуществления А
Соединение формулы
где
А=противоион,
а=1-3,
b=0-3,
X=1-6С алкил или гетероалкил,
1
R=1-6С алкил,
2
3
b
1
3-b
2
3
один из R и R является алкилом, а другой представляет собой XN+H(R), или R и R образуют метилендиокси группу,
4
5
один из R и R является галогеном, а другой представляет собой замещенный галогеном 1-6С алкил,
4
5
b
1
3-b
4
5
один или оба из R и R являются XN+H(R), или R и R соединены с образованием ароматического или гетероароматического кольца или замещенного ароматического кольца или замещенного гетероароматического кольца.
Альтернативный вариант осуществления В
Соединение согласно альтернативному варианту осуществления А, имеющее формулу
где
А=противоион,
X=1-6С алкил,
а=1-3,
b=0-3,
1
R=1-3С алкил,
2
3
b
1
3-b
2
3
один из R и R является 1-4С алкилом, а другой представляет собой XN+H(R), или R и R образуют метилендиокси-группу,
4
2
R=CHF,
5
R=галоген.
Альтернативный вариант осуществления С
Соединение согласно альтернативному варианту осуществления В, отличающееся тем, что
X является пропилом,
b=0,
1
R является метилом,
2
3
R и R образуют метилендиокси-группу,
4
2
R является CHF,
5
R является Cl.
Альтернативный вариант осуществления D
Соединение согласно альтернативному варианту осуществления В, отличающееся тем, что
X является пропилом,
b=1,
1
R является метилом,
2
3
R и R образуют метилендиокси-группу,
4
2
R является CHF,
5
R является Cl.
Альтернативный вариант осуществления Е
Соединение согласно альтернативному варианту осуществления В, отличающееся тем, что
X является пропилом,
b=0,
1
R является метилом,
2
R является триметиламмонийпропилом,
3
R представляет собой метокси,
4
2
R является CHF,
5
R является Cl.
Альтернативный вариант осуществления F
Соединение согласно альтернативному варианту осуществления А, имеющее формулу
где
а=1-3,
А=противоион,
X=1-6С алкил
b=0-3,
1
R=1-3С алкил,
2
3
b
1
3-b
2
3
один из R и R является алкилом, а другой представляет собой XN+H(R), или R и R образуют метилендиокси-группу,
4
5
4
5
один из R и R является галогеном, а другой представляет собой замещенный галогеном 1-6С алкил, или R и R являются галогеном,
6
R=1-4С алкокси, водород или галоген.
Альтернативный вариант осуществления G
Соединение согласно альтернативному варианту осуществления F, отличающееся тем, что
X является пропилом,
b=0,
1
R является метилом,
2
R является триметиламмонийпропилом,
3
R представляет собой метокси,
4
5
6
R, R, и R являются водородом.
Альтернативный вариант осуществления Н
Соединение согласно альтернативному варианту осуществления F, отличающееся тем, что
X является пропилом,
1
R является метилом,
b=0,
2
R является триметиламмонийпропилом,
3
R является метилом,
4
5
R и R образуют ароматическое кольцо,
6
R представляет собой метокси.
Альтернативный вариант осуществления I
Соединение согласно альтернативному варианту осуществления F, отличающееся тем, что
X является пропилом,
b=0,
1
R является метилом,
2
R является триметиламмонийпропилом,
3
R является метилом,
4
5
R и R являются водородом,
6
R является этокси.
Альтернативный вариант осуществления J
Соединение согласно альтернативному варианту осуществления F, отличающееся тем, что
X является пропилом,
b=0,
1
R является метилом,
2
R является триметиламмонийпропилом,
3
R является метилом,
4
5
R и R являются водородом,
6
R является бромом.
Альтернативный вариант осуществления К
Соединение согласно альтернативному варианту осуществления А, отличающееся тем, что, по меньшей мере, один противоион представляет собой нитрит, фосфат, гидрофосфат, дигидрофосфат, гидросульфат, сульфат, гидрокарбонат, карбонат, метансульфонат, фторборат, бромид, хлорид, йодид или их сочетания.
Альтернативный способ L
Способ измерения содержания анализируемого вещества, способного обеспечивать пропорциональное изменение цвета в результате реакции, в биологической жидкости, включающий этапы:
обеспечения наличия в качестве индикатора тетразолиевой соли формулы
где
А=противоион,
а=1-3,
b=0-3,
X=1-6С алкил или гетероалкил,
1
R=1-6С алкил,
2
3
b
1
3-b
2
3
один из R и R является алкилом, а другой представляет собой XN+H(R), или R и R образуют метилендиокси-группу,
4
5
4
5
b
1
3-b
4
5
один из R и R является галогеном, а другой представляет собой замещенный галогеном 1-6С алкил, один или оба из R и R являются XN+H(R), или R и R соединены с образованием ароматического или гетероароматического кольца или замещенного ароматического кольца или замещенного гетероароматического кольца; и
определения концентрации указанного анализируемого вещества в биологической жидкости с помощью указанной тетразолиевой соли, используемой в качестве индикатора.
Альтернативный способ М
Способ согласно альтернативному способу L, отличающийся тем, что указанным анализируемым веществом является глюкоза.
Альтернативный способ N
Способ согласно альтернативному способу М, отличающийся тем, что указанной биологической жидкостью является кровь.
Альтернативный способ О
Способ согласно альтернативному способу М, отличающийся тем, что указанная тетразолиевая соль имеет формулу
где
А=противоион,
X=1-6С алкил,
а=1-3,
b=0-3,
1
R=1-3С алкил,
2
3
b
1
3-b
2
3
один из R и R является 1-4С алкилом, а другой представляет собой XN+H(R), или R и R образуют метилендиокси-группу,
4
2
R=CHF,
5
R=галоген.
Альтернативный способ Р
Способ согласно альтернативному способу О, отличающийся тем, что
X является пропилом,
b=0,
1
R является метилом,
2
3
R и R образуют метилендиокси-группу,
4
2
R является CHF,
5
R является Cl.
Альтернативный способ Q
Способ согласно альтернативному способу О, отличающийся тем, что
X является пропилом,
b=1,
1
R является метилом,
2
3
R и R образуют метилендиокси-группу,
4
2
R является CHF,
5
R является Cl.
Альтернативный способ R
Способ согласно альтернативному способу О, отличающийся тем, что
X является пропилом,
b=0,
1
R является метилом,
2
R является триметиламмонийпропилом,
3
R представляет собой метокси,
4
2
R является CHF,
5
R является Cl.
Альтернативный способ S
Способ согласно альтернативному способу L, имеющий формулу
где
а=1-3,
А=противоион,
X=1-6С алкил,
b=0-3,
1
R=1-3С алкил,
2
3
b
1
3-b
2
3
один из R и R является алкилом, а другой представляет собой XN+H(R), или R и R образуют метилендиокси-группу,
4
5
4
5
один из R и R является галогеном, а другой представляет собой замещенный галогеном 1-6С алкил, или R и R являются водородом,
6
R=1-4С алкокси, водород или галоген.
Альтернативный способ Т
Способ согласно альтернативному способу S, отличающийся тем, что
X является пропилом,
b=0,
1
R является метилом,
2
R является триметиламмонийпропилом,
3
R представляет собой метокси,
4
5
6
R, R, и R являются водородом.
Альтернативный способ U
Способ согласно альтернативному способу S, отличающийся тем, что
X является пропилом,
1
R является метилом,
b=0,
2
R является триметиламмонийпропилом,
3
R является метилом,
4
5
R и R образуют ароматическое кольцо,
6
R представляет собой метокси.
Альтернативный способ V
Способ согласно альтернативному способу S, отличающийся тем, что
X является пропилом,
b=0,
1
R является метилом,
2
R является триметиламмонийпропилом,
3
R является метилом,
4
5
R и R являются водородом,
6
R является этокси.
Альтернативный способ W
Способ согласно альтернативному способу S, отличающийся тем, что
X является пропилом,
b=0,
1
R является метилом,
2
R является триметиламмонийпропилом,
3
R является метилом,
4
5
R и R являются водородом,
6
R является бромом.
Альтернативный способ X
Способ согласно альтернативному способу L, отличающийся тем, что, по меньшей мере, один противоион представляет собой нитрит, фосфат, гидрофосфат, дигидрофосфат, гидросульфат, сульфат, гидрокарбонат, карбонат, метансульфонат, фторборат, бромид, хлорид, йодид или их сочетания.
Альтернативный способ Y
Способ повышения растворимости тиазоилтетразолиевых солей, в которых тиазоильная группа присоединена к третьему атому азота тетразолиевого кольца, включающий введение в тиазоилтетразолиевую соль, по меньшей мере, одной триалкиламмонийалкокси группы в качестве заместителя.
Альтернативный способ Z
Способ согласно альтернативному способу Y, отличающийся тем, что тиазоилтетразолиевая соль имеет фенильные заместители у третьего атома азота и атома углерода тетразолиевого кольца.
Альтернативный способ АА
Способ согласно альтернативному способу Z, отличающийся тем, что, по меньшей мере, одна триалкиламмонийалкокси-группа является триметиламмонийпропокси-группой.
Альтернативный способ ВВ
Способ согласно альтернативному способу Z, отличающийся тем, что, по меньшей мере, одна триалкиламмонийалкокси-группа является заместителем указанной фенильной группы.
Альтернативный способ СС
Способ согласно альтернативному способу Z, отличающийся тем, что, по меньшей мере, одна триалкиламмонийалкокси-группа является заместителем обоих указанных фенильных заместителей.
Альтернативный способ DD
Способ согласно альтернативному способу Z, отличающийся тем, что указанная тиазоильная группа является бензотиазоильной группой.
Альтернативный способ ЕЕ
Способ согласно альтернативному способу Z, отличающийся тем, что указанная тиазоилтетразолиевая соль имеет противоионы нитрита, фосфата, гидрофосфата, дигидрофосфата, гидросульфата, сульфата, гидрокарбоната, карбоната, метансульфоната, фторбората, бромида, хлорида, йодида или их сочетаний.
Альтернативный способ FF
Способ согласно альтернативному способу ЕЕ, отличающийся тем, что указанные противоионы представляют собой бромнитрит, дибромнитрит или трибромид.