Иммунорегуляция

Медицинская иммунология 2000, Т. 2, №2 © 2000, СПб РО РААКИ

ИММУНОРЕГУЛЯЦИЯ

Гистон как фактор полиспецифичности нормальных иммуноглобулинов

Абакушин Д.Н.

Медицинский радиологический научный центр РАМН, Обнинск, Россия

Введение. В последние годы уделяется значительное внимание природным антителам. Характерной чертой таких антител является их полиспецифичность и способность взаимодействовать с различными заряженными клеточными структурами. Известно, что интерфазная клеточная гибель сопровождается высвобождением ядерных компонентов: хроматина, нук-леосом, гистонов, элиминация которых, по-видимому, осуществляется природными антителами. Показано, что в препаратах нормальных иммуноглобулинов и сыворотках крови здоровых индивидуумов содержатся природные антитела, способные реагировать с гистонами. Изучение свойств природных антител, реагирующих с гистонами, представляет несомненный интерес.

Цель и задачи работы состояли в изучении механизма полиспецифичности природных антител и выяснении роли гистона в формировании комплексов иммуноглобулинов с различными веществами и клеточными структурами.

Материалы и методы. В работе использовали препараты человеческого иммуноглобулина для внутривенного введения (“Sandoz”, “Octagam”, Швейцария; “Biochemie”, Австрия); тотальный гистон (“Calbiochem”, США). IgG, образующие комплекс, выявляли с помощью твердофазного ИФА. Выделение и фракционирование комплексов гистонов с иммуноглобулинами проводили с помощью гель-фильтрации на Сефакрил S-200 (“Pharmacia”). Для идио-типирования Ig и их фракций, связавшихся с гисто-ном, использовали моноклональные антитела к иди-отипам 3I и 8.12 (США). Электрофоретическое разделение белков проводили по методу Laemmli (градиент акриламида 7-12%). Вестерн-блот анализ основанный на методе непрямого ИФА на нитроцел-люлозной мембране, содержащей все белки ВИЧ-1, проводили на коммерческом наборе New LAV Blot I (“Sanofi Diagnostics Pasteur”, Франция). Связывание Ig с крысиными тимоцитами определяли с помощью проточного цитофлуориметра FACS Vantage (“Becton Dickinson”).

Основные результаты. Было обнаружено, что в фармакопейных препаратах Ig для внутривенного введения присутствует фракция способная связывать ги-стон. Были определены 3I и 8.12 идиотипы у всех трех исходных препаратов Ig. Однако фракция Ig, связывающая гистон, имела только 3I идиотип. Это свидетельствует в пользу того, что с гистонами взаимодействует определенная субпопуляция Ig и, косвенно, в пользу того, что гистон взаимодействует с Fab фрагментами Ig. Было показано, что гистон образует устойчивый комплекс с Ig, который может быть выделен с помощью гель-фильтрации. Наличие гистона во всех элюированных с Сефакрил S-200 фракциях Ig было определено с помощью электрофореза. Гистон не просто способен образовывать комплекс с Ig, а изменяет их антигенсвязывающие свойства. Таким образом было показано, что комплексы нормальных Ig с гистоном взаимодействовали с нативной и денатурированной ДНК, кардиолипином, фосфатидилсерином, фосфати-дилинозитолом, фосфатидилхолином, липополисаха-ридом E. coli, антигенами Treponema pallidum, инсулином. Распределение активности по фракциям ко всем анионным фосфолипидам приблизительно одинаково и отличается от таковой к цвиттерионному фосфолипиду - фосфатидилхолину. Причем точно такое же распределение активности как для фосфатидилхо-лина наблюдали в тест-системах ИФА для определения IgG антител к ВИЧ. С помощью вестерн-блота было установлено, что Ig, преинкубированные с гис-тоном, приобретали способность взаимодействовать в различной степени с такими антигенами ВИЧ-1 как gp160, gp110/120, p55, gp41, p34, p18. С помощью проточной цитофлуориметрии было установлено, что преинкубированные с гистоном Ig приобретали способность связываться с крысиными тимоцитами. Присутствие нормальных Ig в инкубационной среде уменьшали цитотоксичность гистонов. Рассмотрено значение природных антител в патогенезе радиационных нарушений.

Заключение. Связываясь с нормальными иммуноглобулинами, гистоны выступают в роли кофактора и придают им способность реагировать с ДНК, анионными и цвиттерионными фосфолипидами, бактериальными липополисахаридами, инсулином, некоторыми антигенами ВИЧ-1 и тимоцитами. Таким образом, полиспецифичность некоторых природных антител может быть обусловлена комплексообразо-ванием между молекулами иммуноглобулина и гис-тона.

Ингибиторы хлорных каналов плазматических мембран усиливают экспрессию белков теплового шока на поверхности клеток тимомы EL-4

Баев Д.В., Гусарова Г.А., Сапожников А.М.

Институт Биоорганической Химии

им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН,

Москва, Россия

В настоящее время известно, что хлорные каналы плазматических мембран и белки теплового шока (БТШ) участвуют в процессах активации и программированной гибели лимфоцитов. Однако в литературе практически отсутствуют данные о взаимосвязи трансмембранных потоков хлора и экспрессии БТШ. Ранее нами было показано, что культивируемые в стандартных условиях in vitro клетки мышиной тимомы EL-4 характеризуются спонтанным апоптозом и экспрессией на клеточной поверхности БТШ25, БТШ60, БТШ70, БТШ90. Ингибиторы хлорных каналов (ИХК) плазматических мембран DIDS (4,4’-diisothiocyanostilbene-2,2’-disulphonic acid) и SITS (4-acetamido-4’-isothiocyanatostilbene-2,2’-disulfonic acid) снижали интенсивность программированной клеточной гибели в этой модели. Механизм предотвращающего апоптоз эффекта ИХК может быть обусловлен их специфическим действием - блокированием хлорных каналов, препятствующим дегидратации цитоплазмы, -одному из самых ранних этапов программированной клеточной гибели. В то же время, снижение интенсивности процесса апоптоза клеток EL-4 в присутствии ИХК может быть связано с усилением экспрессии протективных БТШ под действием этого стимула.

Целью данной работы был анализ влияния ИХК SITS и DIDS на уровень экспрессии БТШ на поверхности пулов живых и апоптозных клеток EL-4.

Регистрацию экспрессии БТШ на поверхности живых клеток и клеток, находящихся на ранней и поздней стадиях апоптоза проводили с помощью метода проточной цитофлуориметрии на приборе EPICS ELITE (Coulter Corporation, США).

В результате было установлено, что инкубация клеток EL-4 в течение 4-6 ч с предотвращающими апоптоз дозами DIDS и SITS (50 - 100 мкМ) приводит к достоверному увеличению уровня экспрессии БТШ25, БТШ60, БТШ70 и БТШ90 на клеточной поверхности. Наиболее выраженное усиление экспрессии БТШ наблюдалось у клеток, находящихся на ранней стадии апоптоза. Относительное повышение содержания анализируемых протеинов на клеточной поверхности данного пула клеток составляло в среднем 250 %, 210 %, 110 % и 85 %, соответственно указанной выше последовательности подклассов БТШ. Для живых клеток этот эффект был снижен и был равен для приведенного ряда БТШ примерно 120 %, 95 %, 75 % и 40 %. У пула клеток, находящихся на поздних стадиях апоптоза, изменения экспрессии БТШ на клеточной поверхности были менее значимыми.

Таким образом, ИХК индуцируют повышенную экспрессию протективных БТШ в культуре клеток лим-фомы EL-4, что свидетельствует о существенной роли этих протеинов в механизме предотвращения программированной гибели лимфоидных клеток блокаторами хлорных каналов плазматических мембран.

Фагоцитоз и продукция активных форм кислорода гемоцитами моллюсков

Баскаков А.В., Полевщиков А.В.

Санкт-Петербургский государственный университет, Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН, Санкт-Петербург, Россия

Введение. Клеточные защитные реакции моллюсков осуществляются подвижными клетками гемолимфы - гемоцитами, присутствующими в их циркуляторных системах. Важнейшими свойствами этих клеток являются способность к адгезии, фагоцитозу, генерации активных форм кислорода, внутриклеточному перевариванию поглощенных частиц, а также секреторной дегрануляции и внутриклеточному накоплению микробицидных факторов. Важными показателями функциональной активности гемоцитов моллюсков служат активность фагоцитоза и генерации активных форм кислорода, которые являются основными механизмами элиминации инородных клеток.

Целью работы было изучение активности фагоцитоза и продукции активных форм кислорода гемоцитами некоторых видов брюхоногих и двустворчатых моллюсков.

Материал и методика. В качестве объектов исследования были выбраны представители брюхоногих легочных моллюсков Lymnaea stagnalis (LS), Planorbius corneus (PC), Achatina fulica (AF) и представитель двустворчатых моллюсков - Anodonta cygnea (AC). Оценку фагоцитарной активности гемоцитов осуществляли в мазках. Продукцию активных форм кислорода оценивали in vitro в мазковой и спектрофотометрической модификациях НСТ-теста. В качестве стимуляторов фагоцитоза и НСТ использовали 0,5% cуспензию зимоза-на. Контролем в НСТ-тесте служило внесение ЗФР.

Результаты. На светооптическом уровне в гемолимфе PC и AC выявлено две популяции гемоцитов, различающихся по способности к фагоцитозу частиц зи-мозана: а) среди макрофагоподобных клеток (МФК) PC и AC 39,4% и 58,3% ^ответственно поглощают зимо-зановые частицы; б) среди лимфоцитоподобных клеток (ЛФК) такой активностью обладают соответственно 21,1% и 14,6%. В гемолимфе LS и AF выявлены только МФК, cреди которых фагоцитарной активностью в отношении частиц зимозана обладают 48,3% (LS) и 45% (AF) гемоцитов. Гемоциты PC отвечают 3-кратным достоверным усилением продукции супероксиданиона в ответ на стимуляцию зимозаном через 5 минут

(р<0,001); в гемоцитах ЬБ в течение 10 минут уровень продукции супероксиданиона возрос в 4,5 раза (р<0,001) по сравнению с контролем. Фагоцитоз сопровождался усилением продукции активных форм кислорода в гемоцитах АГ и АС. Достоверный 5-кратный прирост продукции активных форм кислорода гемоци-тами АГ отмечен спустя 10 минут после начала НСТ-теста (р<0,05), а гемоцитами АС - через 15 минут после стимуляции клеток; при этом уровень супероксиданиона в 4,9 раза превысил контрольный показатель (р<0,001) (см.табл.). Микроскопические исследования показали, что способностью к продукции активных

форм кислорода обладают исключительно МФК. Кроме того, гемоциты исследованных видов моллюсков не только отвечают продукцией супероксиданиона в ответ на стимуляцию зимозаном в течение 5-15 минут, но и секретируют гранулы, содержащие антибактериальный ферментативный каскад, обеспечивающий продукцию 02- , а также гранулы диформазана НСТ во внеклеточное пространство через 20-45 минут инкубации, обеспечивая, по-видимому, условия для внутриклеточной и внеклеточной элиминации объекта фагоцитоза.

Работа поддержана Российским Фондом Фундаментальных Исследований, грант № 98-04-49877.

Таблица. ДИНАМИКА ПРОДУКЦИИ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА ГЕМОЦИТАМИ МОЛЛЮСКОВ;

Время 5 мин 10 мин 15 мин 20 мин 45 мин

P,C 1 0,355 ± 0,030 0,330 ± 0,022 0,357 ± 0,062 0,206 ± 0,002 0,217 ± 0,007

2 0,113 ± 0,095 0,144 ± 0,009 0,112 ± 0,005 0,117 ± 0,009 0,123 ± 0,006

L,S 1 0,235 ± 0,023 0,482 ± 0,045 0,330 ± 0,024 0,184 ± 0,012 0,142 ± 0,005

2 0,106 ± 0,002 0,115 ± 0,045 0,139 ± 0,011 0,140 ± 0,004 0,129 ± 0,006

A,F 1 0,236 ± 0,032 0,475 ± 0,079 0,412 ± 0,017 0,251 ± 0,012 0,217 ± 0,004

2 0,083 ± 0,005 0,132 ± 0,017 0,121 ± 0,085 0,167 ± 0,009 0,205 ± 0,012

A,C 1 0,313 ± 0,034 0,430 ± 0,047 0,475 ± 0,047 0,324 ± 0,034 0,258 ± 0,008

2 0,096 ± 0,002 0,152 ± 0,010 0,103 ± 0,002 0,110 ± 0,006 0,160 ± 0,009

ед.0П, (спектрофотометрия при длине волны 620 нм).

1 - клетки, стимулированные зимозаном; 2 - клетки без зимозана

Лигандная специфичность лектинов гемолимфы брюхоногих и двустворчатых моллюсков

Баскаков А.В., Полевщиков А.В., Харазова А.Д.

Санкт-Петербургский государственный университет, Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН, Санкт-Петербург, Россия

Введение. В защитные реакции беспозвоночных вместе с клетками гемолимфы или целомической жидкости вовлечен широкий спектр гуморальных факторов. Среди них видное место занимают лектины S -типа, которые в защитных реакциях беспозвоночных выступают в роли агглютининов и лизинов, способных к более или менее специфическому распознаванию углеводных компонентов чужеродных молекул и клеток. Как правило, среди лигандов лектинов встречаются все терминальные углеводы клеточных стенок потенциальных патогенов и паразитов, однако их спектр у моллюсков остается малоизученным.

Целью работы была оценка лигандной специфичности агглютинирующих и литических факторов гемолимфы некоторых видов моллюсков.

Материал и методика. В качестве объектов исследования были выбраны представители брюхоногих легочных моллюсков (Ьутпаеа stagnalis, LS; Р1апогЫш согпеш, РС и А^айпа /иНса, AF) и представитель дву-

створчатых моллюсков Anodonta cygnea (AC). Оценку лигандной специфичности лектинов гемолимфы исследуемых видов моллюсков осуществляли путем ингибирования реакций гемагглютинации (РГА) и лизиса (реакция гемолиза) эритроцитов барана, использованных в качестве антигена, внесением растворов свободных лигандов. Для ингибиторного анализа использовали N-аце-тил^-глюкозамин (N-Ac-D-Glc), №ацетил^-галактоза-мин (N-Ac-D-Gal), D-галактозу (D-Gal), D-маннозу (D-Man), лактозу (Lac), гепарин, фосфорилхолин (ФХ), ли-пополисахарид клеточной стенки E. coli (ЛПС), глюкозу (Glc) и a-метилглюкопиранозид (а-метглк).

Результаты. Полученные результаты приведены в таблице.

Лектины исследованных видов брюхоногих моллюсков характеризуются разным спектром лигандной специфичности. Данный факт является косвенным сви-

Таблица. ЛИГАНДНАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬ ЛЕКТИНОВ ГЕМОЛИМФЫ МОЛЛЮСКОВ

Вид Лектин Ряды аффинитета

PC ГА Lac>N-Ac-D-Gal>Glc>D-Gal>N-Ac-D-Glc>D-Man

ГЛ Гeпарин>D-Gal>N-Ac-D-Gal>N-Ac-D-Glc>Glc>a-мeтглк>ЛПС

LS ГА D-Gal>D-Man>N-Ac-D-Glc>Lac> ФХ^Іс

ГЛ N-Ac-D-Glc>Glc>D-Man>гeпарин>N-Ac-D-Gal

AF ГА N-Ac-D-GlC>N-Ac-D-Gal

ГЛ D-Man>N-Ac-D-GlC>ЛПС>GlC>N-Ac-D-Gal>D-Gal

AC ГА N-Ac-D-Glc>ЛПС>N-Ac-D-Gal>ФХ>a-мeтглк>D-Gal=D-Man

ГЛ N-Ac-D-Gal>N-Ac-D-Glc>a-мeтглк>D-Gal>ЛПС>D-Man>ФХ

детельством неидентичности молекул ГА и ГЛ. Напротив, анализ спектра лигандных специфичностей ГА и ГЛ гемолимфы двустворчатого моллюска АС может свидетельствовать об идентичности молекул, так как круг распознаваемых ими лигандов одинаков.

Среди лигандов лектинов брюхоногих и двустворчатых моллюсков присутствуют как терминальные углеводы поверхностного аппарата клеток эукариот (Ы-Ас^^1с, Ы-Ас^^аГ) и моносахариды (0^а1, D-Man, Glc), которые в качестве концевых молекул входят в состав гликокаликса различных клеток, так и компоненты клеточных стенок фирмикутных бактерий, инфицирующих внутреннюю среду моллюсков - липопо-лисахариды и фосфорилхолин. Среди лигандов ГЛ обнаружен гепарин - полисахарид и полианион, входящий в состав экстраклеточного матрикса соединительных тканей моллюсков.

Спектр лигандных специфичностей ГА и ГЛ гемолимфы моллюсков указывает, с одной стороны, на низкоспецифический характер организации их защитных систем, а с другой, - на круг их потенциальных патогенов и паразитов.

Работа поддержана Российским Фондом Фундаментальных Исследований, грант № 98-04-49877.

Компоненты тканеспецифических пептидных комплексов тканей: биологическая роль при норме и патологии

Блищенко Е.Ю., Карелин А.А., Филиппова М.М., Калинина О.А., Сазонова О.В., Яцкин О.Н., Хайдуков С.В., Пивник А.В.* и Иванов В.Т.

Институт Биоорганической Химии

им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН,

Москва, Россия,*Гематологический научный центр РАМН, Москва, Россия

Анализ экстрактов различных тканей экстрактов млекопитающих, супернатанта и лизата эритроцитов человека показазал, что все эти источники содержат в значимых количествах (до нМ на грамм ткани) пептиды, являющиеся результатом эндогенного протео-лиза узкой группы белков с известной функцией, гемоглобина, актина, основного белка миелина, некоторых клеточных ферментов. В результате исследований установлено более 500 аминокислотных последовательностей таких белков. Состав и содержание этих пептидов отличается высокой стабитьностью в нормальных условиях и является тканеспецифической характеристикой. Несмотря на высокую консервативность в норме, индивидуальные компоненты пептидных наборов (или тканеспецифических комплексов тканей), воспроизводимо изменяются при патологиях связаных с дегенерацией тканей (болезнь Аль-цхеймера, ишемия мозга), нарушениях пролиферации

(лимфогрануломатоз) и онкологических заболеваниях (рак легкого, лимфосаркома). Исследование биологической активности более 100 пептидов показало, что более 70% веществ обладают способностью стимулировать или ингибировать пролиферацию как трансформированных так и нормальных клеток in vitro. Исследование нескольких групп фрагментов гемоглобина, содержание которых увеличивается при лимфогрануломатозе, лимфосаркоме и раке легкого показало, что эти вещества обладают способностью стимулировать пролиферацию трансформированных клеток, что дает основание предполагать наличие связи между их содержанием в организме и развитием нарушений пролиферации и онкологических заболеваний. Исследование этих пептидов в культурах нормальных клеток позволили идентифицировать две функционально различные группы веществ. Пептиды, образующиеся из а-цепи гемоглобина и соответсву-ющие сегменту (1-32), восстанавливают пролиферацию клеток красного костного мозга после обработки цитостатиком эпирубицином. Неокиоторфин (фрагмент а-глобина (137-141)) стимулирует пролиферацию нормальных клеток и поддерживает их жизнеспособность в отсутствии факторов роста. Полученные результаты позволяют предполагать, что роль пролиферативных пептидов в организме связана с восстановлением клеточных популяций после повреждающих внешних воздействий и при заболеваниях, являющихся следствием клеточной гибели, вызванной нарушениями гомеостаза тканей. Исследование пептидов, обладающих способностью уменьшать количество трансформированных клеток, показало, что механизм их действия связан с обратимой задержкой пролиферации, а также, в случае наиболее активных веществ, с индукцией клеточной гибели. Исследованные группы пептидов, например, геморфины (фрагменты 0-цепи гемоглобина, соответсвующие участку (32-41)) обладают высокой (до 80-90%) активностью в линиях трансформированных клеток различного происхождения при наличии в несколко раз меньшего аналогичного эффекта в нормальных клетках. Ге-морфины, а также пептиды аналогичной направленности действия, обладают противоопухолевой активностью in vivo, а, следовательно, могут вносить непосредственный вклад в подавление роста опухоли непосредственно на уровне ткани. С другой стороны, вещества, способные обратимо ингибировать пролиферацию нормальных клеток и не обладающие выраженной токсичностью, способны стимулировать клеточную дифференцировку и защишать быстро делящиеся клетки при использовании цитостатических препаратов.

На основании полученных результатов и летератур-ных данных сделано предположение о роли компонентов тканеспецифических пептидных комплексов в поддержании гомеостаза тканей -стабильного уровня функциональных клеток.

Выраженность экспрессии маркеров мембран иммунокомпетентных клеток слизистой оболочки толстой кишки и периферической крови в норме

Боровская Т.Ф., Ганьчева Е.А., Макаревич А.М., Фролова Е.Г.

Хабаровский филиал Дальневосточного научного центра физиологии и патологии дыхания СО РАМН - Научно-исследовательский институт охраны материнства и детства, Хабаровск, Россия

Введение. Исследование механизмов иммунного надзора в организме возможно только при определении выраженности рецепции Т- и В-клеток и/или их эпитопов и, как следствие, межклеточных взаимодействий.

Целью настоящей работы было определение кластеров дифференцировки на мембране лимфоцитов периферической крови (ПК) и слизистой оболочки толстой кишки (СОТК) у здоровых лиц.

Материалы и методы. Мембранные маркеры различных клонов иммунокомпетентных клеток ПК и СОТК идентифицировали у 17 практически здоровых человек иммунофлюоресцентным методом с помощью моноклональных антител отечественного производства серии ИКО (ВОНЦ РАМН) (Барышников А.Ю., 1990; 1993) на проточном цитометре FACScan (“Becton Dickinson”). Выделение лимфоцитов СОТК проводили по методу С.Л. Нестерчук с соавт. (1994).

Основные результаты. Популяция клеток лимфоидного ряда разнородна и состоит из множества групп, подгрупп и клонов клеток с различными функциональными свойствами, специфичностью рецепторов, распознающих антигены. Как показано в таблице, содержание Т-лимфоцитов в ПК в 2,5 раза выше, чем в СОТК, а В-лимфоцитов - в 1,25 раза. Индекс соотношения Тл/Вл в ПК равнялся 2,76 , а в СОТК - 1,41. При этом уровни В-лимфоцитов и клеток, несущих на мембране рецепторы к молекулам IgG (тяжелые у-цепи) и IgM (тяжелые ц-цепи), в ПК и СОТК не имели достоверных отличий.

Общеизвестно, что одной из основных функций иммунной системы является распознавание, нейтрализация и своевременное выведение из организма генетически чужеродных субстанций. Презентированный антиген воспринимается как чужеродный прежде всего Т-клетками индукторно-хелперного ряда, которые стимулируют цитотоксические, супрессорные Т-, а также В-лимфоциты. По-видимому, достоверно высокий уровень Т-лимфоцитов (CD3+), Т- и В-лимфоцитов (CD5+), Т-хелперов (CD4+) и Т-супрессоров (CD8+) в ПК, свидетельствует о более высокой антигенной нагрузке на лимфоциты ПК по сравнению со СОТК (табл.).

Иммунный ответ на антиген, опосредуемый Т-лим-фоцитами, является каскадным процессом, протекающим с участием большого количества регулирующих

агентов. В результате действия различных медиаторов происходит активация иммунокомпетентных клеток, их дифференцировка и пролиферация. Уровень активированных лимфоцитов, секретирующих интерлейкин-2 (CD25+), пролиферирующих лимфоцитов, несущих на мембране рецепторы к трансферрину (CD71+), клеток, опосредующих апоптоз (CD95+) в ПК достоверно выше, чем в группе сравнения, что, возможно, указывает на компенсаторно-приспособительный механизм, посредством которого создается невосприимчивость к эндо-и экзогенным веществам, агентам инфекционной и неинфекционной природы. В то же время соотношение CD71+/CD95+ в ПК составило 0,94 , а в СОТК - 1,32. По-видимому, лимфоциты, интенсивно циркулируя в организме, сохраняют баланс между пролиферацией и убылью.

Заключение. Постоянный обмен между клетками ПК и С0ТК обуславливает генерализацию иммунных реакций организма. Феномен рециркуляции лимфоцитов имеет большое значение в процессах резорбции антигенов в кишечнике, обеспечении локальных факторов защиты и сохранении структурного гомеостаза.

Таблица. СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ

В НОРМЕ

Показатели ПК СОТК Р

Лимфоциты 1,22+1,22 2,16+0,88 > 0,05

CD3+ (Т-клетки) 84,50+3,83 34,33+6,33 < 0,001

CD4+ (Т-хелперы) 50,22+3,74 27,81+7,33 < 0,05

CD5+ (Т-, В- клетки) 55,83+4,41 35,41+5,76 < 0,05

CD7+

(Т-, 1Ж- клетки) 62,21+7,53 31,63+6,34 < 0,01

CD8+

(Т-супрессоры) 39,94+5,70 19,88+2,67 < 0,01

CD16+

(натур. киллеры) 17,61+6,77 15,59+3,62 > 0,05

CD22+ (В-клетки) 30,63+3,75 24,41+4,52 > 0,05

CD25+ (акт.Т, В) 36,33+5,05 23,02+4,19 < 0,05

Н1А^

(акт.Т-, все В-кл.) 30,52+2,49 20,71+4,87 > 0,05

CD38+

(акт.Т-, В-кл.) 35,80+5,31 26,1+4,88 > 0,05

CD71 +

(пролиф. клетки) 37,52+4,31 24,14+4,81 < 0,05

Т11у-1

(ранние тимоциты) 36,80+4,14 31,78+4,28 > 0,05

Н1А-1

(Т-лимфоциты) 60,62+6,70 46,48+6,25 < 0,001

CD95+

(кл., опоср. апоптоз 39,42+7,63 18,28+2,34 < 0,05

ДО (тяжелые

гамма-цепи) 38,19+4,14 30,12+5,33 > 0,05

1дМ (тяжелые

мю-цепи) 38,88+5,62 25,13+5,98 > 0,05

Влияние фармакологической модификации

на противовоспалительную активность эмбриональных фибробластов in vitro

Бурда Ю.Е., Нестеренко С.Н., Шевченко С.М., Леонова ИЮ., Гапонов А.М., Чирвин А.Б.

Областная клиническая больница, г. Курск, Россия

В предыдущих наших исследованиях было установлено ингибирующее влияние эмбриональных фиб-робластов человека (ЭФ) на продукцию TNF-a имму-нокомпетентными клетками in vitro. Учитывая широкое клиническое применение клеточной трансплантации ЭФ в лечении ожоговых и других ран, а также возможные перспективы использования ЭФ при других нозологиях, представлялось интересным изучить возможность модификации противовоспалительной активности ЭФ с помощью фармакологических препаратов. В качестве препаратов-индукторов были выбраны: перекись водорода и гипохлорит натрия как мощные окислители, эуфиллин и простагландин Е2 как индукторы цАМФ в клетках, дексаметазон как препарат с доказанной противовоспалительной активностью, тактивин и синтетический тимомиметик имуно-фан, которые применялись в широком диапазоне концентраций.

В первой серии опытов монослой ЭФ в лунках 24-луночных планшетов (Flow) подвергался обработке препаратами в течение 1 и 24 часов, после чего ЭФ отмывались и в течение суток культивировались без препаратов во влажной атмосфере с 5% СО2 при 37°С. Затем мононуклеарные клетки периферической крови здоровых доноров (МПК) в концентрации 1 млн/ лунку 24-луночного планшета подвергались воздействию полученного супернатанта ЭФ. В части опытов к МПК дополнительно вносили ЛПС S.typhi в концентрации 10 мкг/мл. Клетки инкубировались в течение суток в тех же условиях, после чего их супернатант тестировался на активность TNF-a биологическим методом на чувствительной линии мышиных опухолевых фибробластов L-929. Установлено, что супернатант ЭФ, обработанных всеми указанными, кроме дексаметазона, препаратами, не оказывал влияния на продукцию TNF-a МПК во всем диапазоне исследуемых концентраций препаратов и временного интервала воздействия. Супернатант обработанных декса-метазоном в концентрациях 10-4, 10-5, 10-6 моль/л ЭФ подавлял спонтанную продукцию TNF-a МПК по сравнению с супернатантом интактных ЭФ на 69,19±7,52% (p<0,001), 57,17±9,39% (p<0,05) и 34,95±7,92% (p<0,05) соответственно, а ЛПС-стиму-лированную продукцию данного цитокина - на 42,35±16,01%, 32,37±8,97% и 23,51±4,49% (везде p<0,05) соответственно. Действие супернатанта от ЭФ, обработанных дексаметазоном в течение 1 часа и

24 часов достоверно не различалось. Концентрации дексаметазона 10-7, 10-8, 10-9 какого-либо влияния не оказывали.

Во второй серии опытов МПК инкубированы совместно с обработанными дексаметазоном и отмытыми ЭФ и интактными ЭФ в течение суток. Получены следующие результаты: дексаметазон в концентрации 10-4 моль/л усиливал ингибирующую активность ЭФ по отношению к необработанным ЭФ на 62,04±10,36% (p<0,001) для спонтанной продукции TNF-a и на 43,52±7,51% (p<0,001) для ЛПС-стимулированной. Аналогичные показатели для концентраций 10-5 и 10-6 моль/л составили соответственно 56,93±10,63% (p<0,001) и 62,25±8,85% (p<0,001) для спонтанной продукции TNF-a и 23,49±3,64% (p<0,001) и 13,69±8,29% (p>0,05) для ЛПС-стимулированной. Кроме того, при сравнении выраженности противовоспалительного действия обработанных дексаметазоном ЭФ и самого декса-метазона в тех же концентрациях (10-6, 10-5, 10-4 моль/л) на продукцию TNF-a МПК установлено, что продукция данного цитокина под влиянием декса-метазона и супернатанта ЭФ, обработанных декса-метазоном в соответствующих концентрациях, достоверно не отличается. ЛПС-стимулированная продукция TNF-a МПК при совместной инкубации с ЭФ, предварительно обработанными дексаметазо-ном, была достоверно (p<0,05) ниже, чем в условиях воздействия самого препарата в тех же концентрациях, а при спонтанной продукции наблюдалась та же тенденция, но достоверности различий не наблюдалось.

Таким образом, установлено, что: 1) обработка ЭФ дексаметазоном в концентрациях 10-6, 10-5, 10-4 моль/л дозозависимо усиливает ингибирующее влияние ЭФ как на спонтанную, так и на ЛПС-стимулированную продукцию TNF-a МПК здоровых доноров in vitro; 2) контактное воздействие предварительно обработанных дексаметазоном ЭФ на МПК здоровых доноров сильнее подавляет продукцию TNF-a последними по сравнению с воздействием супернатанта фармакологически модифицированных ЭФ.

Подавление эмбриональными фибробластами продукции фактора некроза опухолей мононуклеарными клетками периферической крови in vitro

Бурда Ю.Е., Нестеренко С.Н., Шевченко С.М., Леонова И.Ю., Гапонов А.М., Чирвин А.Б.

Курская областная клиническая больница, Россия

В последние два десятилетия в связи с развитием клеточной трансплантации, созданием специального оборудования и реактивов, разработкой новых био-

технологий вновь получила развитие проблема теоретического обоснования и практического применения эмбриональных и фетальных тканей (ЭФТ) человека (Сухих Г.Т. и соавт.) и животных (Н.Н.Ска-лецкий и соавт.). Давно замечена многоплановая биологическая активность ЭФТ, что можно объяснить высокой продукцией широкого спектра ростовых факторов, а также особенностями антигенного фенотипа клеток на данном этапе развития. Однако до настоящего времени количество работ, в которых детально исследовались тонкие механизмы взаимодействия ЭФТ с разнообразными клетками-участни-цами воспалительной реакции, минимально. Поэтому для нас представляло интерес изучить влияние ЭФТ на продукцию одного из основных провоспа-лительных цитокинов - TNF-a - иммунокомпетент-ными клетками.

В качестве объекта исследования служили человеческие эмбриональные (10-12 недель гестации) фиб-робласты (ЭФ), получаемые путем механического измельчения и ферментативной деградации эмбриона с последующим выращиванием выделенной культуры клеток. В качестве иммунокомпетентных клеток были использованы мононуклеары периферической крови здоровых доноров (МПК). На первом этапе в лунки 24-луночного планшета (Flow) с монослоем ЭФ вносились МПК доноров по 1 млн/лунку в среде RPMI-1640 с 5% эмбриональной телячьей сыворотки. В первой серии экспериментов изучалась спонтанная продукция TNF-a МПК, во второй - ЛПС-стимулирован-ная. После суточной инкубации при 37°С во влажной атмосфере с 5% СО2 собирался супернатант. Определение выраженности продукции TNF-a проводили биологическим методом на чувствительной линии мышиных опухолевых фибробластов L-929. В качестве контроля служил супернатант МПК, не контактировавших с ЭФ. В результате выявлено достоверное снижение спонтанной продукции TNF-a МПК доноров в присутствии ЭФ в среднем на 29,9±2,91% (p<0,001), а ЛПС-стимулированной - на 11,01±0,63% (p<0,001). На следующем этапе исследований была изучена продукция TNF-a МПК под влиянием продуцируемых ЭФ растворимых медиаторов. Для этого суточный супернатант монослойной культуры ЭФ вносили в лунки 24-луночных планшетов с МПК доноров (1 млн/лунку) в конечной концентрации 25%. Дальнейшие условия эксперимента те же, что и на первом этапе. Выявлено, что супернатант ЭФ подавляет спонтанную продукцию TNF-a МПК в среднем на 23,83±5,53% (p<0,05), а стимулированную ЛПС -на 21,38±2,89% (p<0,001).

Таким образом, можно сделать вывод, что эмбриональные фибробласты in vitro обладают противовоспалительным эффектом в отношении продукции иммунокомпетентными клетками TNF-a. Данное влияние ЭФ опосредуется растворимыми медиаторами.

Демаскирование поверхностных антигенов клеток меланомы BRO под действием N-ацетилглюкоз-аминил-(р-1-4)^-ацетилмурамоил-аланил-6-изоглутамина и фактора некроза опухолей

Валякина Т.И., Петрова Е.Э.,

Комалева Р.Л., Ревазова Е.С.,

Несмеянов В.А.

Институт биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова Российской Академии Наук,

Москва, Россия

Показано, что ^ацетилглюкозаминил-(Р-1-4)^-ацетилмурамоил-аланил^-изоглутамин (ГМДП) модифицирует фенотип опухолевых клеток, изменяя спектр поверхностных антигенов, участвующих в развитии иммунной реакции. Характер изменений в существенной степени определялся типом клеток. Целью данной работы явился сравнительный анализ спектров поверхностных антигенов клеток низко и высокометастази-рующих сублиний меланомы BRO, а также изучение влияния на фенотип этих клеток ГМДП и ФНОa.

Две сублинии меланомы Mel-7 с высокой и низкой способностью к метастазированию, полученные нами из меланомы BRO, трансплантировали в иммунодефи-цитных мышей nude и beige-nude. Опухоль гомогенизировали и методом проточной цитофлюориметрии изучали экспрессию различных групп молекул, участвующих в иммунологическом распознавании опухолевых клеток, а именно антигенов главного комплекса гистосовместимости II класса HLA-DR, молекул адгезии ICAM-1 и ICAM-3, опухолеассоциированных антигенов MCA-1, Muc-18, а также ФНОa, IL-1 р, LAMP-2 и Sia-Lex. На обоих сублиниях присутствовали опухолеассоциированные антигены MCA-1, Muc-18, а также ICAM-3. Различие состояло в том, что на клетках с низким метастатическим потенциалом не экспрессировались ФНОa, LAMP-2 и Sia-Lex, а на клетках с высоким метастатическим потенциалом не обнаруживались ICAM-1, HLA-DR и IL-1 р. Экспрессия опухолеассоциированных антигенов MCA-1 и Muc-18 возрастала под действием ГМДП в равной степени на обеих сублиниях. В то же время ГМДП (после однократной обработки) не индуцировал появление ни одного из антигенов, исходно отсутствующих на клеточной поверхности. Двукратная обработка ГМДП приводила к обнаружению на опухолевых клетках высокометастазирующей сублинии антигенов ICAM-1 и IL-1p. Их появление также могло быть индуцировано кратковременной (1 мин) обработкой сериновой протеазой (трипсином) или обработкой рекомбинантным ФНОa (1 ч), причем появление этих антигенов сопровождалось исчезновением высокогликозилированного протеина LAMP-2. По-ви-

димому, антигены ICAM-1 и IL-1 в на поверхности клеток высокометастазирующей сублинии маскировались гликопротеином LAMP-2. Механизм демаскирования антигенов под действием рекомбинантного ФНОa или ГМДП, очевидно, включал активацию эндогенной се-риновой протеазы, поскольку демаскирование не наблюдалось в присутствии ингибиторов сериновых протеаз.

Влияние ультрафиолета С и липополисахаридов на апоптоз

нейтрофилов человека

Винокуров М.Г., Долгачева Н.Н., Юринская М.М., Анисимов Р.Л., Прохоренко И.Р., Сахно И.В., Гражданкин Е.Б., Печатников В.А.

Институт биофизики клетки РАН,

Институт фундаментальных проблем биологии РАН, Пущино Московской области.

Нейтрофилы играют центральную роль в защите организма при грамотрицательной бактериальной инфекции (ГБИ). Время жизни нейтрофила в кровяном русле и его функциональное состояние зависит от влияния различных факторов, в частности от действия ли-пополисахаридов (ЛПС), освобождающихся из клеточной стенки погибших бактерий. Известно, что ЛПС ингибирует апоптоз нейтрофилов, увеличивая их время жизни. Ультрафиолетовое облучение диапазона С (УФС) давно используется в качестве эффективного метода лечения при ГБИ и других заболеваниях. В данной работе исследовано действие УФС и ЛПС из E.coli на апоптоз нейтрофилов, которые культивировали in vitro в среде RPMI-1640 с 10% ЭТС. Долю апоптозных клеток определяли методом проточной цитометрии и световой микроскопии. На 6 час культивирования УФС (80 Дж/м2) ускоряет апоптоз (50±3%) по сравнению с контролем (18±2%). ЛПС (1 мкг/мл) после УФ облучения (1 мин - 3 час.) несколько ингибирует УФ-индуци-руемый апоптоз (36±2%). Действие УФ после культивирования нейтрофилов с ЛПС (1 - 60 мин.) вызывает ускорение апоптоза (30±2%); увеличение времени инкубирования с ЛПС до 3 часов полностью ингибирует действие УФС (8±0,5%), что соответствует уровню апоптоза при культивировании клеток с ЛПС без облучения. Предполагается, что действие УФС на апоптоз нейтрофилов реализуется через Fas- и тирозинкиназо-зависимые пути регуляции. Полученные данные свидетельствуют о том, что активация апоптоза по Fas-зависимому пути происходит значительно быстрее, чем ингибирование апоптоза ЛПС, который ингибирует ти-розинкиназозависимый путь регуляции апоптоза ней-трофилов.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ, грант № 98-04-48303.

Культивирование in vitro клеток тимомы EL-4 приводит к появлению в межклеточном пространстве протективных белков теплового шока 70

Гусарова Г.А., Пономарёв Е.Д., Сапожников А.М.

Институт Биоорганической Химии

им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН,

Москва, Россия

Сравнительно недавно было обнаружено, что программированная гибель Т-лимфоцитов сопровождается появлением на внешней поверхности их плазматических мембран стресс-индуцируемых протеинов (белков теплового шока, БТШ). Феномен включения этих внутриклеточных протеинов в состав плазматической мембраны, зарегистрированный не только у погибающих, но и у живых трансформированных и вирус-инфицирован-ных клеток, пока не получил достоверного объяснения. Ранее нами было показано, что клетки мышиной лим-фомы EL-4, культивируемые in vitro в стандартных условиях, подвержены спонтанному апоптозу и экспрессируют на своей поверхности широкий спектр БТШ. Причем, количество этих протеинов, ассоциированных с плазматической мембраной, возрастало после вступления клеток на путь апоптоза с последующим снижением плотности поверхностных БТШ на завершающей стадии клеточной гибели. Указанное падение числа молекул БТШ на клеточной поверхности, зарегистрированное на последнем этапе программированной гибели клеток EL-4, может быть связано со слущиванием этих протеинов в межклеточное пространство.

Для проверки данного предположения мы провели анализ присутствия БТШ70 в кондиционированном супернатанте культуры клеток EL-4.

Образцы кондиционированного супернатанта получали из культур клеток EL-4 после их 24-ч инкубации в полной питательной среде с последующим 24-ч культивированием в среде RPMI, не содержащей фетальной сыворотки (FCS). Анализ опытных и контрольных (среда RPMI, дополненная 1% FCS) образцов на содержание БТШ70 проводили с помощью стандартного метода иммуноблоттинга.

Результаты проведенных экспериментов достоверно свидетельствуют о присутствии молекул БТШ70 во всех проанализированных образцах кондиционированного супернатанта, полученного из культур клеток EL-4. В отличие от этого, контрольные образцы были негативны по отношению к проявляемым протеинам. Существенно, что цитофлуориметрический анализ клеточных культур, из которых были получены образцы супернатанта, продемонстрировал практическое отсутствие в этих культурах клеток, погибших по механизму некроза, но выявил в них высокое процентное содержание апоптозных клеток (примерно от 20 до 50 %).

Зарегистрированное присутствие растворимой формы БТШ70 в кондиционированном супернатанте культуры клеток лимфомы EL-4 свидетельствует в пользу

нашего предположения о слущивании этих протеинов с поверхности апоптозных клеток на последних стадиях их гибели. Возможность продукции стрессированным клеточным сообществом протективных БТШ в межклеточное пространство согласуется с современной концепцией социального контроля клеточного выживания.

Взаимосвязи в системе иммунитета

Добродеева Л.К., Щёголева Л.С.,

Сенькова Л.Е.

Институт физиологии природных адаптаций,

УрО РАН, Архангельск, Россия

Значительное количество внутрисистемных корреляционных взаимосвязей, усложнение их структуры и появление дополнительных связей на межсистемном уровне, выявляется в организме при развитии каскада иммунных реакций, воспалительных процессов и в других стрессовых ситуациях.

Цель работы: представляло интерес изучить указанные закономерности. Определяли содержание в крови ИКК с помощью моноклональных сывороток в непрямой иммуно-пероксидазной реакции: CD3, CD4, CD5, CD8, CD10, CD16, CD22, CD25, CD71, CD95, TNFa, HLA-DR.

Материалы и методы: обследовано750 человек мужского и женского пола в возрасте от 18 до 50 лет 1-2 группы здоровья. Проведены вычисления среднего арифметического, ошибки среднего, коэффициентов корреляции относительно популяций и субпопуляций ИКК.

В оценке внутрисистемных корреляций всегда регистрируется устойчивая взаимосвязь между содержанием CD 22 с уровнем ИКК CD4, CD71, CD25, CD5, CD16, HLA-DR (r=0,6-0,7; p<0,005).

Концентрации СD5 коррелятивно связаны с содержанием CD16, CD25, HLA-DR и CD22, CD3, CD10 (r=0,6-0,7; p<0,005),

Уровни содержания лимфоцитов CD4 взаимосвязаны с концентрациями CD10, CD25, CD71 (r=0,6-0,7; p<0,005), в меньшей степени с количеством CD3, CD5 (r=0,4-0,6;p<0,005).

Концентрации ИКК СD8 коррелируют с уровнем содержания CD5, CD71 и в меньшей степени с содержанием CD3, CD16.

Следовательно, сила и направленность корреляционных взаимосвязей между концентрациями отдельных фенотипов лимфоидных популяций отражают процессы активации, пролиферации, созревания и формирования ИКК.

Дальнейшие исследования позволили выявить наличие корреляционных взаимосвязей между уровнем содержания клеток с рецепторами CD25, CD95, TNFa и ИЛ-2. При этом направленность связей определялась как положительная , так и отрицательная, в зависимос-

ти от степени развития иммунного ответа. Кроме того направленность этих коррелятивных взаимоотношений в разных ситуациях (иммунные, воспалительные процессы) могла меняться. Если в начале развития иммунных реакций как правило подобные соотношения являются прямыми, то по окончании иммунного ответа и реконвалесценции они характеризуются обратными взаимосвязями. Особенно резко подобные взаимоотношения проявляются при анализе содержания отдельных фенотипов ИКК и соответствующих лимфокинов. Наиболее достоверными по силе корреляциями обладают соотношения между содержанием CD95 и концентрациями TNFa, CD25 и ИЛ-2, IgE и CD23.

Таким образом, корреляционные взаимосвязи отражают характер иммунного ответа, а молекулы диффе-ренцировки участвуют в его регуляции.

Апоптоз нейтрофилов периферической крови модулируется гамма-излучением

Долгачева Н.Н., Винокуров М.Г., Печатников В.А.

Институт биофизики клетки РАН,

Пущино Московской области.

Нарушение функций иммунной системы является одним из наиболее значимых последствий действия ионизирующих излучений на организм. Нейтрофилы являются высокочувствительным элементом иммунной системы, обеспечивающим неспецифическую резистентность организма. Механизм апоптоза обеспечивает поддержание фукционально полноценной популяции нейтрофилов. Известно, что у-излучение даже в малых дозах вызывает структурные и функциональные изменения гранулоцитов, поэтому представляет интерес изучение влияния у-излучения на апоптоз нейтрофилов. Нейтрофилы выделяли из периферической крови здоровых доноров. у-облучение 137Cs производили на установке ГУПОС при мощности дозы 1,87 Гр/мин. После облучения клетки культивировали в среде RPMI-1640 с 10% ЭТС. Долю апоптозных клеток определяли методом проточной цитометрии и световой микроскопии. Облучение в дозе 2 Гр вызывало увеличение доли апоптозных клеток на 9,4 ± 1,3% на 6-ой час культивирования, при дальнейшей инкубации (9 ч, 12 ч) это различие сохранялось. При более кратковременной инкубации (1,5 ч, 3 ч, 4,5 ч) доля апоптозных клеток в облученных образцах не превышала данный показатель в контроле. При дозах облучения 10 Гр и 20 Гр наблюдали снижение доли апоптозных клеток на 10,6±1,2% и 11±1,3% соответственно. Возможно, такое неоднозначное действие у-излучения на нейтрофилы связано с образованием активных форм кислорода, которые, как следует из данных о модулирующем действии у-излу-чения на функции нейтрофилов, приводят либо к увеличению активности НАДФН-оксидазы (при дозах 2-5 Гр), либо к снижению активности этого фермента в

результате цитотоксического действия (при дозах больше 5 Гр).Таким образом, увеличение процента апоптоза при дозе 2 Гр и его снижение при дозах 10-20 Гр, вероятно, связано с генерацией активных форм кислорода и с регулированием активности НАДФН-оксида-зы.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ, грант № 98-04-48303.

Сравнительное изучение взаимодействий a-2-макроглобулина и С-реактивного белка со стрептолизином О

Дорофейков В.В., Назаров П.Г., Фрейдлин Т.С., Бутюгов А.А., Берестовая Л.К.

Кафедра биохимии Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. акад. И.П. Павлова, отдел иммунологии НИИ экспериментальной медицины РАМН, Санкт-Петербург

При большинстве острых инфекционных и других воспалительных заболеваниях в плазме крови возрастает концентрация белково-пептидных молекул, получивших название “реактанты острой фазы”. Одним из основных в группе этих молекул является С-реактивный белок. Мы попытались изучить возможность взаимодействия a-2-макроглобулина (МГ) и С-реактивного белка с белковым экзотоксином, продуцируемым патогенными стрептококками -стрептолизином О, в модельной системе. Для изучения гемолитической активности стрептолизина О (коммерческий препарат НИИ вакцин и сывороток, С.-Петербург) было проведено определение его гемолитического титра.

Было показано, что С-реактивный белок дозозависимо угнетает токсин-зависимый гемолиз. 50%-ное угнетение лизиса соответствовало конечной концентрации С-реактивного белка 2,3 мкг/мл (Ki 1,5х10-8 М). Сходное дозозависимое угнетение гемолиза, вызываемого стрептолизином О, было получено и в экспериментах с препаратом нативного МГ. 50%-подавление гемолиза соответствовало конечной концентрации МГ 16 мкг/мл. Сопоставляя результаты этих экспериментов, можно сделать вывод, что оба протеина обладают антитоксическим, антигемолитическим действием. По-видимому, главную роль в предотвращении гемолиза в сосудистом русле играет макроглобулин, так как его концентрация в плазме крови на несколько порядков выше, чем в наших модельных опытах. Концентрация же С-реактивного белка в плазме крови в норме не превышает 2-10 мкг/мл и значительно возрастает только при острых воспалительных заболеваниях или травмах.

В экспериментах с препаратом МГ, обработанным метиламином (с последующим диализом), торможение

гемолитического действия стрептолизина О наблюдалось при значительно более высоких концентрациях МГ (50% угнетение гемолиза соответствовало концентрации ингибитора 500 мкг/мл). Можно предположить, что механизм антитоксического действия С-реактивно-го белка и МГ сводится к гидрофобно-электростатическим взаимодействиям этих белков с олигомерами

О-стрептолизина, в результате чего блокируется фиксация токсина на эритроцитах и/или прерывается образование кольцевых структур, формирующих поры в эритроцитарной мембране. Схожесть механизмов действия МГ и С-реактивного белка на стрептолизин-за-висимый гемолиз подтверждается и близкими молярными концентрациями протеинов, которые замедляют скорость лизиса.

Исследование поддержано грантом РФФИ №2 98-0449695.

Содержание иммунокомпетентных клеток в коже у практически здоровых людей

Кашутин С.Л.*, Добродеева Л.К.**

Институт физиологии природных адаптаций УрО РАН*, Архангельская государственная медицинская академия **, Архангельск, Россия.

Кожные покровы выполняют роль химического, биологического и механического барьеров, осуществляют выделительную функцию, участвуют в эндокринной регуляции, терморегуляции, являются огромным рецепторным полем, имеющим рефлекторные связи с центральной нервной системой и внутренними органами. Кожа чаще других органов и в большем объеме подвергается воздействию факторов внешней среды, защита от которых реализуется не только в проявлении физико-химической функции ее, но и в наличии эволюционно сформировавшегося мощного арсенала иммунокомпетентных клеток. С этих позиций представляло интерес изучение содержания иммуно-компетентных клеток непосредственно в кожных покровах.

Методы: проведено клинико-иммунологическое обследование 34 практически здоровых человек в возрасте от 20 до 60 лет. Содержание иммунокомпетентных клеток определяли в экссудате “кожного окна”, в том числе с применением фенотипирования клеток методом непрямой иммунопероксидазной реакции с моноклональными антителами.

Преобладающими клетками в экссудате “кожного окна” являются сегментоядерные нейтрофилы, относительное содержание которых практически не зависит от пола обследуемых. Тканевые сегментоядерные нейтрофилы довольно резко отличаются от клеток периферической крови по количеству фрагментов ядра. Так если в периферической крови практически здоровых людей среднее содержание фрагментов составля-

ет 2,54±0,26, то в коже их уровень значительно выше 4,03±0,31 (р<0,01). Указанные процессы, по всей вероятности, есть отражение деградации данных клеток по мере выполнения ими функций. Второе ранговое место по значимости содержания клеток в экссудате занимают лимфоидные клетки. Их количество не зависит от пола 18,01±3,18% у женщин и 21,01±2,83% у мужчин (р>0,05). Большую часть указанных клеток представлены лимфоидными элементами с малой площадью цитоплазмы. Лимфоциты составляют не более 56% в экссудате “кожного окна” и представлены малыми (0,71±0,05%), средними (3,13±0,51%) и большими (2,01±0,38%). Довольно высокий удельный вес в экссудате здоровых людей занимают моноциты 12 - 16%. Структура моноцитограммы такова: промоноциты -1,47±0,25%, собственно моноциты - 2,95±0,49%, полиморфноядерные моноциты - 10,13±1,01%, то есть большую часть клеток составляют полиморфноядерные варианты, что может свидетельствовать об активиро-ванности моноцитов.

Фенотипирование клеток, входящих в состав экссудата “кожного окна”, позволило выявить, что в дерме представлены практически все иммунокомпетент-ные клетки. Так содержание CD5+ составляет 19,38±1,87%; удельный вес CD3+ выше содержания клеток с рецепторами CD5+(48Д6±5Д3%). Клетки, характеризующие варианты лимфопролиферации (CD25+, CD71+, HLA-DR+) представлены в коже и соответственно составляют 26,05±2,37%, 19,93±1,99%, 25,16±2,25%. Маркеры CD4 присутствуют на уровне 33,21±3,03%. Содержание клеток СD8+ у практически здоровых людей сравнительно незначительно (15,08±1,14%). Концентрация фенотипов клеток CD16+ в среднем составляет 21,63±2,01%. Клетки, фе-нотипируемые как CD22+, также представлены в коже (18,11±1,69%). Таким образом, среди клеток кожного экссудата у практически здоровых людей выявляется достаточно широкий круг маркеров дифференциации, что свидетельствует об активности указанных процессов в коже.

Функциональная активность макрофагов в динамике роста перевиваемой опухоли у мышей

Киселева Е.П.

Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН, Санкт-Петербург, Россия

В последние годы принято считать, что макрофаги играют двойственную роль в противоопухолевом иммунитете. Активированные макрофаги могут проявлять как цитотоксические, так и ангиогенные свойства, однако их фенотипические признаки и различия до сих пор не охарактеризованы. Целью настоящей работы послужило изучение функциональных параметров пери-

тонеальных макрофагов в динамике роста сингенной перевиваемой слабоиммуногенной опухоли гепатомы 22а. Мышам подкожно инокулировали 105 живых клеток гепатомы и исследовали еженедельно продукцию нитроксид (NO2) и супероксид (НСТ-тест) анионов, пи-ноцитоз нейтрального красного и активность мембранного фермента 5’нуклеотидазы. Исследованные параметры сопоставляли с гистологической картиной опухоли на срезах.

Ни на одном из сроков исследования с 1 по 42 сут после инокуляции опухолевых клеток признаков подавления функциональной активности перитонеальных макрофагов не обнаружено. Активация макрофагов носила волнообразный характер. Ранняя фаза активации (1 сут) проявлялась в усилении пиноцитоза, спонтанного и стимулированного НСТ-теста, усиления продукции NO2 при инкубации в течении 24 и 48 ч и снижения активности 5’нуклеотидазы, что соответствует фенотипу “классически” активированного макрофага и, по-видимому, является неспецифической реакцией интактного организма на введение опухолевых клеток. На 7 сут фенотип активаированных мкрофагов несколько изменялся. С этого времени активность 5’нуклеотидазы становилась повышенной и появился ряд отличий в продукции NO2 в ответ на разные стимулы in vitro. Конец первой недели - время появления пальпируемой опухоли, которое характеризуется максимальной лимфо-макрофагальной инфильтрацией вокруг опухолевого узла и новообразованием сосудов. Начиная с этого времени, быстро растущая опухоль нуждается в постоянном прорастании сосудов и развитии стромы. Третий пик усиления активности макрофагов наблюдали на 28 сут после инокуляции опухолевых клеток. Функциональные характеристики макрофагов были подобны тем, которые наблюдали на 7 сут. Однако активация макрофагов проходила в организме на фоне выраженных изменений в опухоли и иммунной системе. Опухоль достигала к этому времени значительных размеров, продолжала активно пролиферировать (количество митозов на этом сроке было максимальным), но более 40% опухолевой ткани было подвергнуто некрозу. В некротизированной части опухоли обнаруживались макрофаги с большим количеством жировых включений, напоминающие “ксантомные” клетки. Все три волны активации макрофагов не коррелировали с уровнем провоспалительных цитокинов ФНО-a и ИЛ-6 в сыворотке крови животных. Мы предполагаем, что активация макрофагов может быть связана с ангиогенными факторами, продуци-ремыми опухолевыми клетками в результате недостаточного кровоснабжения и гипоксии, а функциональные характеристики макрофагов на 7 и 28 сут после инокуляции опухолевых клеток соответствуют фенотипу “ангиогенных” макрофагов.

Работа поддержана грантом РФФИ № 00-04-49430.

Новые аспекты проблемы антител

Климович В.Б.

Центральный научно-исследовательский рентгено-радиологический институт М3 РФ, Санкт-Петербург, Россия

Центральным пунктом проблемы антител (Edelman, Gall, 1969) в течение полутора десятилетий оставался вопрос об источниках разнообразия антиген-связыва-ющих областей иммуноглобулинов (Ig). Открытие явления реаранжировки генов Ig и рекомбинационных механизмов, обеспечивающих этот процесс, позволило найти объяснение практически бесконечному разнообразию специфичности антител. Это создало иллюзию исчерпанности проблемы, несмотря на то, что многие явления и закономерности оставались недостаточно исследованными. Начиная с середины 80-х годов стали появляться новые аспекты, которые расширили границы проблемы антител и придали ей более широкое биологическое и эволюционное звучание.

Первый из новых аспектов - окончательное установление факта существования антител, обладающих свойствами полиреактивности и аутореактивности. Ранее обнаружение антител с указанными свойствами объясняли техническими погрешностями и несовершенством методов детекции. Техника создания гибридом и молекулярное клонирование позволили установить, что клетки-продуценты полиспецифических и аутореактивных антител реально существуют и представлены в популяции лимфоцитов в неожиданно большой пропорции. В организме млекопитающих они появляются на ранних стадиях эмбрионального развития и продолжают функционировать на протяжении всей жизни. Полиреактивность присуща также антителам, синтезируемым в организме низших позвоночных животных.

Второй аспект связан с раскрытием механизма “созревания”, под которым подразумевают постепенное увеличение аффинности антител в ходе иммунного ответа. При длительной антигенной стимуляции в некоторых экспериментальных системах аффинитет антител может возрастать на 6-7 порядков. Установлено, что этот феномен обусловлен появлением точковых мутаций в генах вариабельных областей Ig и последующим отбором клонов-продуцентов антител наивысшего аффинитета. Таким образом, в иммунной системе в процессе дифференцировки нормальных соматических клеток используется два неизвестных ранее физиологических механизма. Первый индуирует точковые мутации в перестроенных генах Ig, второй обеспечивает отбор клеток, синтезирующих антитела с наиболее эффективно модифицированной структурой связывающих центров. К настоящему времени установлено, что процессы созревания антител происходят в зародышевых центрах лимфоидных органов. Природа стимулов, индуцирующих мутации и управляющих процессами отбора, неизвестна.

Третий актуальный аспект проблемы - открытие каталитических свойств антител. Обращает на себя внимание то, что в ряде случаев ферментативная активность антител (протеолитическая, нуклеазная), продуцируемых в организме спонтанно, проявляется в отношении аутоантигенов, таких как пептид, регулирующий тонус сосудов кишечника, тиреоглобулин, ДНК.

Физиологическая роль аутоантител, полиреактив-ных и каталитических антител, их функции в здоровом организме и участие в развитии патологических процессов до сих пор остаются неясными.

Четвертый аспект - антитела являются членами суперсемейства ^, которое определяют как совокупность структурно и эволюционно родственных молекул, обладающих гомологией первичной структуры, сходной доменной организацией и общностью выполняемых функций. Молекулы суперсемейства ^, как правило, выступают в качестве рецепторов или лигандов, участвующих в актах распознавания при взаимодействиях клеток между собой, с межклеточным матриксом и с гуморальными факторами. Наряду с иммунологическими реакциями, они обеспечивают процессы миграции, дифференцировки, кооперации клеток, морфогенеза и регенерации тканей. Молекулы суперсемейства ^ обнаружены у представителей всех таксонов, от простейших до млекопитающих. В эволюционном ряду прослеживается увеличение разнообразия структуры молекул суперсемейства и многообразия выполняемых ими функций: от простых адгезионных взаимодействий до контроля экспрессии антигенов гистосовместимости, презентации пептидных фрагментов антигена и распознавания чужеродных антигенов Т-лимфоцита-ми и антителами.

Изучение влияния углеводов на цитолитическую активность NK-клеток человека с использованием липофильных гликоконъюгатов

Коваленко Е.И., Хирова Е.В., Овчинникова Т.В., Хайдуков С.В., Бовин Н.В.

Институт биоорганической химии

им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН,

Москва, Россия

Олигосахариды поверхности клеток-мишеней могут взаимодействовать с КК-клетками, усиливая или ослабляя их эффекторную функцию. Для изучения роли углеводов в КК-клеточной цитотоксичности нами разработана экспериментальная модель, которая включает модификацию клеток-мишеней с помощью неогликолипидов, содержащих различные углеводные лиганды.

В работе были использованы синтетические полимерные гликоконъюгаты типа Glyc-PAA-PE и Glyc-РДА^1и)-РЕ (где Glyc - остаток сахарида, РАА - поли-

мер, PE - фосфатидилэтаноламин, Flu - флуоресцеин). Встраивание проводили в клетки эритролейкемической линии К562 и клетки лимфобластной линии Raji, различные по чувствительности к действию естественных киллеров. Факт встраивания гликоконъюгата в мембрану доказывали цитофлуориметрически; пространственную доступность остатков Glyc на клетках-мишенях оценивали с помощью флуоресцентно-меченых моноклональных антител. Цитотоксическую активность эффекторов оценивали двумя независимыми методами: по выходу лактат-дегидрогеназы из клеток-мишеней и проточной цитометрией с использованием пропидий иоди-да и DiOC18. В качестве эффекторных клеток использовали мононуклеары, выделенные из периферической крови здоровых доноров по стандартной методике. Моноциты удаляли прилипанием к пластику, В-клетки -пэннингом.

Изучена временная зависимость элиминации гликоконъюгата с клеточной поверхности, подобраны оптимальная структура и условия для встраивания неогликоконъюгатов в клетки. Описаны характеристики встраивания в клетки ганглиозида GM3, который является мономерным природным гликоконъюгатом. Синтезированы гликоконъюгаты, содержащие в качестве углеводного компонента сахариды различной структуры, включая ксеноантигены, опухолеассоциированные, дифференцировочные и группоспецифические антигены. С помощью разработанной модели произведена оценка влияния ряда сахаридов на цитотоксичность NK-клеток человека. Выявлены углеводы, оказываю-шие позитивное действие, в то же время другие либо частично ингибировали цитотоксичность, либо не оказали на нее никакого влияния. Для олигосахаридов, оказавших позитивное влияние на эффекторную функцию NK-клеток человека был выявлен общий структурный мотив - трисахарид LewisX. Полученные данные свидетельствуют в пользу того, что углеводный эпитоп LewisX принимает участие во взаимодействии с NK-клетками.

NK-клетки человека резистентны к низким дозам иономицина

Коваленко Е.И., Хирона Е.В.,

Поклонский Д.Л., Хайдуков С.В.,

Литвинов И.С.

Институт Биоорганической Химии

им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН,

Москва, Россия

Естественный иммунитет человека в значительной мере определяется натуральными киллерами (NK-клетками). При постановке цитотоксического теста в качестве клеток-эффекторов чаще всего используют моно-нуклеары периферической крови, в составе которых доля NK-клеток обычно не превышает 20%. Нами предложен удобный метод обогащения популяции мононук-

леаров NK-клетками, основанный на различиях в кальциевом гомеостазе NK-клеток и субпопуляций Т-лим-фоцитов.

Мононуклеары выделяли из периферической крови здоровых доноров по стандартной методике на градиенте плотности фиколл-верографин. Моноциты удаляли прилипанием к пластику, В-клетки - пэн-нингом. Оставшиеся клетки обрабатывали иономи-цином (3 тМ при 370С в течение 10 мин). От мертвых клеток избавлялись центрифугированием на градиенте плотности фиколл-верографин. Жизнеспособность клеток контролировали по отсутствию включения трипанового синего. Цитотоксическую активность эффекторов оценивали двумя независимыми методами: по выходу лактат-дегидрогеназы из клеток-мишеней и проточной цитометрией с использованием пропидий иодида и DiOC18. В качестве мишеней использовали клетки линии К562. Состав популяции мононуклеаров до и после обработки ионо-мицином контролировали методом проточной цитометрии с использованием моноклональных антител к CD16, CD56, CD3, CD8, CD4, CD19, CD25 и HLA-DR.

Обработка клеток иономицином приводила к изменению в составе популяции. Параллельно наблюдалось уменьшение доли CD3+ клеток (от 75% до 20%) и увеличение доли CD16+/CD56+ NK-клеток (от 17% до 60%). Снижение доли CD3+ клеток обусловленно чувствительностью к иономицину наивных Т-лимфоцитов. Оставшиеся иономицин-резистентные клетки (NK-клетки и Т-клетки памяти) сохраняли литическую активность в обоих использованных цитотоксических тестах. Удельная цитотоксичность популяции эффекторов возрастала пропорционально увеличению доли NK-клеток.

Представленные данные свидетельствуют о резистентности NK-клеток к действию низких доз иономи-цина. Таким образом, обработка низкими дозами ионо-мицина мононуклеаров периферической крови может быть использована для обогащения популяции NK-клетками.

Разнонаправленные эффекты дефенсина и лактоферрина на функциональную активность эндотелиальных клеток in vitro

Крылов А.В., Киселева Е.П.,

Алешина Г.М., Шамова О.В.,

Кокряков В.Н.

Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН, Санкт-Петербург, Россия

Несмотря на противоречивые данные о возможной роли нейтрофилов в процессах ангиогенеза

(Moore J.W. et al, 1985), в последние годы были получены новые сведения, подтверждающие несомненное участие этих клеток при ранозаживлении и новообразовании сосудов. Было показано, что человеческие нейтрофилы синтезируют и секретируют такие ангиогенные факторы, как VEGF, IL-8, TNF-a, TGF-в, а также протеолитические ферменты, влияющие на различные этапы роста сосудов. Роль катионных белков в этих процессах не изучалась. Целью настоящего исследования послужило изучение эффекта четырех антимикробных препаратов белковопептидной природы из нейтрофилов на пролиферативную активность и адгезию эндотелиальных клеток к матриксу. Дефенсины были выделены из лейкоцитов кролика или человека; лактоферрины получали из лейкоцитов свиней или человеческого молока. Функциональнуя активность эндотелиальных клеток человека линии ECV-304 изучали в бессыворо-точной среде. Специфичность полученных эффектов проверяли на линии мышиных фибробластов L-929. Пролиферацию клеток оценивали с помощью МТТ-теста; адгезию клеток к пластику, покрытому желатином, определяли спетрофотометрически после окрашивания метиленовым синим. Полученные результаты выявили разнонаправленные эффекты де-фенсинов и лактоферринов. Оба дефенсина стимулировали пролиферативную активность и адгезию эндотелия в концентрации 1-10 мкг/мл. Этот эффект не был специфичен только для эндотелиальных клеток и воспроизводился также на фибробластах, что согласуется с данными Murphy C.J. и соавт., 1993, которые описали наличие митогенного эффекта де-фенсина для фибробластов. Напротив, оба лактофер-рина оказывали ингибирующий эффект на адгезию и пролиферацию эндотелия в концентрации 0,1-10 мкг/мл. При этом лактоферрины не флияли на пролиферативную активность фибробластов. Указанные концентрации не являются токсичными для клеток и могут быть обнаружены в сыворотке крови больных (Алешина Г.М. и др., 1998). Исследование влияния дефенсина и лактоферрина на функции эндотелиальных клеток in vitro проводилось впервые. Полученные результаты по ангиогенному действию де-фенсинов согласуются с данными, описанными ранее об ускоренном заживлении асептических ран после внутримышечного введения дефенсина крысам (Кудряшов Б.А. и др., 1990). В литературе также имеются сведения о специфическом связывании де-фенсина с эндотелиальными клетками, причем половина максимального связывания находится в концентрации 10 мкг/мл (Higazi A.A. et al., 1996). Полученные нами данные по антиангиогенному действию лактоферрина in vitro являются новыми характеристиками, дополняющими спектр противовоспалительной и антипролиферативной активности этого многофункционального гликопротеина. Дальнейшие исследования позволят обосновать перспектив-

ность клинического применения антибактериальных белков нейтрофилов, обладающих одновременно про-, либо антиангиогенными свойствами.

Работа поддержана грантами РФФИ № 00-04-49430 и 99-04-49508.

Регуляция активности нейтрофилов хорионическим гонадотропином. Роль циклооксигеназы

Куклина Е.М., Ширшев С.В.

Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь, Россия

Нейтрофилы являются основными клеточными эффекторами воспаления и ранних защитных реакций организма. Беременность сопровождается существенным изменением функций этих клеток - угнетением хемотаксиса, адгезии, снижением цитотоксической активности. Для анализа механизмов, ответственных за регуляцию нейтрофилов в этот период, мы исследовали влияние основного гормона беременности хорионического гонадотропина (ХГ) на фагоцитоз и дыхательный взрыв клеток. Было показано, что в высокой физиологической дозе (100 МЕ/мл) ХГ статистически значимо угнетает фагоцитарную активность нейт-рофилов. Дыхательный взрыв, оценивавшийся по интенсивности люминол-зависимой хемилюминесцен-ции (ЛЗХЛ) клеточной культуры, также ингибировался ХГ независимо от дозы как на пике стимуляции (оп-сонизированный зимозан, 5 мг/мл), так и при дальнейшем культивировании. Учитывая, что некоторые иммуномодулирующие эффекты гормона реализуются только в присутствии фагоцитов и зависят от активности циклооксигеназы в этих клетках, мы исследовали роль данного фермента в ХГ-зависимой регуляции функций нейтрофилов. Для этого использовали ингибитор циклооксигеназы вольтарен, который вносили в культуру одновременно с ХГ. В результате было показано, что супрессивное действие ХГ на фагоцитарную активность нейтрофилов отменяется вольтареном. При оценке ЛЗХЛ стимулированных нейтрофилов и ХГ (10 МЕ/мл), и вольтарен обладали самостоятельным супрессивным действием, однако их комбинация была неэффективна, демонстрируя показатели, близкие к контролю. Таким образом, ХГ эффективно угнетает фагоцитоз и дыхательный взрыв нейтрофилов и является, по-видимому, одним из ключевых факторов, ответственных за регуляцию функций этих клеток во время беременности. Супрессивные эффекты гормона полностью или частично отменяются вольтареном, свидетельствуя об опосредовании его эффектов простагландинами, которые могут действовать как паракринные или аутокринные факторы.

Показатели НСТ-теста и чувствительность к адреналину фагоцитирующих клеток in vitro при экспериментальном тиреотоксикозе

Ланин Д.В., Шилов Ю.И., Ширшев С.В.

Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь, Россия

Известно, что тиреоидные гормоны модулируют экспрессию адренорецепторов на клетках-мишенях различных органов и оказывают пермиссивный эффект по отношению к катехоламинам. Цель работы - исследовать изменения показателей кислородозависимых механизмов бактерицидности фагоцитирующих клеток и влияние на них адреналина in vitro при экспериментальном тиреотоксикозе разной тяжести, вызванном введением L-тироксина.

Материалы и методы. Работа проводилась на крысах-самцах популяции Wistar. Для моделирования состояния тиреотоксикоза разной степени тяжести использовали экспериментальную систему с экзогенным введением L-тироксина, обоснованную в работах Б.А. Бахметьева с соавт. [1984; 1986; 1992; 1994, и др.]. Животные первой группы получали L-тироксин в течение 14 дней ежедневно подкожно по 0,04 мг/кг/сут, а второй группы - по 40 мг/кг/сут. Функции фагоцитирующих клеток периферической крови оценивали в комплексе микротестов, включающих спектрофотометрический вариант НСТ-теста, оценку фагоцитарной активности лейкоцитов, нагрузочные тесты с агонистами и антагонистами адренергических рецепторов и модуляторами сиг-

нальных путей. Периферическую кровь получали из сосудов хвоста до начала введения гормона (показатели исходного фона, использовавшиеся в качестве контроля), а также на 5-е, 10-е и 15-е сутки эксперимента.

Основные результаты. Установлено, что на фоне развития тиреотоксикоза изменения показателей НСТ-теста были минимальными. Выявлено лишь статистически значимое снижение показателей НСТ-теста в пробах с добавлением опсонизированного зимозана (стимулированный вариант теста) на 5-е сутки у животных с более легкой формой тиреотоксикоза (1-я группа) в сравнении с показателями объединенного исходного фона. При исследовании изменений показателей НСТ-теста после преинкуба-ции клеток крови с адреналином в концентрации 1 мкг/мл в течение 1 часа установлено, что до введения тироксина адреналин существенно не влиял на показатели НСТ-теста. Однако, как видно из таблицы, у животных обеих групп с тиреотоксикозом адреналин статистически значимо увеличивал продукцию активных форм кислорода на 15-е сутки эксперимента в спонтанном варианте теста в сравнении с контрольными пробами (преинкубация в течение 1 часа со средой). Учитывая полученные ранее данные об ингибирующем эффекте стимуляции Р-адреноре-цепторов на продукцию активных форм кислорода [Ю.И. Шилов, Е.Г. Орлова, 1997], можно полагать, что этот эффект адреналина у животных стиреоток-сикозом реализуется через изменения экспрессии а-адренорецепторов.

Заключение. Таким образом, при экспериментальном тиреотоксикозе увеличивается чувствительность фагоцитирующих клеток к адреналину.

Таблица. ПОКАЗАТЕЛИ СПОНТАННОГО И СТИМУЛИРОВАННОГО ВАРИАНТОВ НСТ-ТЕСТА НА 15 СУТКИ ЭКСПЕРИМЕНТА В ПРОБАХ С ПРЕИНКУБАЦИЕЙ В СРЕДЕ И С АДРЕНАЛИНОМ

Показатель Тироксин 0,04 мг/кг/сутки Тироксин 40 мг/кг/сутки

пробы с пре-инкубацией в среде пробы с адреналином пробы с пре-инкубацией в среде пробы с адреналином

Абсолютные значения НСТ теста (спонтанный) Относительные значения НСТ теста (спонтанный) Абсолютные значения НСТ теста (стимулированный) Относительные значения НСТ теста (стимулированный) 0,2438±0,0627 92,75±34,37 0,3411±0,0816 114,93±32,89 0,4078±0,0769|п™ 164,43±53,73|пТ 0,4857±0,1206 192,27±66,51 0,2563±0,0411 110,42±23,25 0,4132±0,0703 166,47±27,36 0,6692±0,1452|п™ 247,90±34,46*™ 0,5161±0,1109 216,97±46,15

*п - р<0,05 в сравнении с контролем (пробы с преинкубацией в среде) по парному ^-критерию Стьюдента; т -то же по парному знаковому Т-критерию Вилкоксона; - то же по W-критерию суммы рангов Вилкоксона; число животных (п) во всех выборках 10-11.

Эндогенный фактор некроза опухолей демаскирует центры связывания N -ацетилглюкозаминил-(р-1-4)-М-ацетилмурамоил-аланил^-изоглутамина

Петрова E3., Baлякинa T.И., Hесмеянов B.A.

Институт биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова Российской Академии Наук,

Москва, Россия

Ранее нами было показано, что N-ацетилглюкоза-минил-(Р-1-4)-№ацетилмурамоил-аланил^-изоглута-мин (ГМДП) влияет на различные виды опухолевых клеток человека, изменяя экспрессию опухолеассоциированных антигенов, ICAM-1 и некоторых других антигенов. Число отвечающих опухолевых клеток и уровень экспрессии антигена на отдельновзятой клетке значительно увеличивается при двукратном воздействии ГМДП. В настоящей работе исследован механизм праймирования клеток меланомы BRO к повторному действию ГМДП. Показано, что при первичном действии ГМДП клетки меланомы продуцируют ФHOa, который делает ранее неотвечающие на ГМДП клетки способными к ответу на повторное введение этого му-рамилпептида. Рекомбинантный ФHOa (р-ФHOa) также переводит субпопуляцию ранее не отвечающих на ГМДП клетки в состояние готовности отвечать на стимуляцию ГМДП изменением экспрессии поверхностных антигенов.

Методом проточной цитофлюориметрии с использованием ФИTЦ-меченного ГМДП и радиолигандным анализом с использованием 125!-меченного ГМДП-ли-зина показано, что увеличение числа отвечающих на ГМДП клеток коррелирует с ростом числа клеток, несущих на поверхности центры связывания ГМДП. Эти центры, по-видимому, обнажаются в результате демаскирования, происходящего вследствие активации ГМДП или ФHOa эндогенной протеазы. Аргументом в пользу такого предположения является тот факт, что в присутствии ингибиторов сериновых протеаз увеличения числа центров связывания не происходит. Кроме того, появление рецепторов ГМДП может быть индуцировано кратковременной (1 мин) обработкой се-риновой протеазой (трипсином). Константы диссоциации для участков специфического связывания ГМДП на поверхности интактных клеток и клеток, обработанных р-ФHOa в течении 1 часа или обработанных ГМДП в течении 24 часов, оказались близкими и составляли около 15 нМ. Центры связывания ГМДП со сходными константами диссоциации (20 нМ) ранее были обнаружены внутри клеток мышиной миеломоноцитарной линии WEHI-3 и перитониальных макрофагов мыши (Sumaroka М. et al. Muramyl peptide-binding sites are located inside target cells. FEBS Letters. 1991; 295: 4850).

Влияние ^-6 и продуктов деградации фибринового сгустка на дифференцировку клеток РС12

Петрова Ю.И., Калашник Е.Н., Скок М.В.

Институт биохимии им А.В.Палладина НАН Украины, Киев, Украина

Регенерация нервов после ранения или хирургического вмешательства требует присутствия как различных цитокинов, так и фибринового матрикса. Известно, что Ш-6 способен ускорять регенерацию периферических нервов, а также способствует росту дендри-тов в клетках феохромоцитомы РС12. Влияние фибринового сгустка и продуктов его деградации на нервные клетки является менее изученным.

Целью данной работы было изучить влияние Ш-6 и продуктов деградации фибринового сгустка на диффе-ренцировку, пролиферацию и адгезию клеток РС12 и сравнить его с действием ростового фактора нервов (NGF). Клетки РС12 несут на своей поверхности никотиновый ацетилхолиновый рецептор (АХР), причем нейрональная дифференцировка сопровождается усилением его экспрессии.

Экспрессию АХР исследовали методом иммунофер-ментного анализа на живых клетках и иммуноцитохи-мического окрашивания фиксированных клеток с помощью моноклональных антител к различным субъединицам АХР, полученных в нашей группе. Пролиферацию и адгезию оценивали по количеству живых клеток, определяемому с помощью МТТ.

Согласно данным иммуноцитохимического окрашивания и клеточного иммуноферментного анализа, как NGF, так и Ш-6 усиливали экспрессию а-субъединиц АХР. Ш-6 влиял преимущественно на а3 -субъединицу, в то время как экспрессия а5-субъединицы возрастала преимущественно под действием NGF. В присутствии фибринового сгустка увеличивалась экспрессия как а5-, так и а3-субъеди-ницы АХР, причем эффект был опосредован низкомолекулярными продуктами деградации сгустка (26 кДа и ниже).

Как NGF, так и Ш-6 замедляли скорость пролиферации клеток РС12, что также свидетельствовало об их нейрональной дифференцировке. Фибриновый сгусток и продукты его деградации тоже влияли на пролиферацию клеток РС12: в малых дозах стимулировали пролиферацию, а в больших - подавляли. В дальнейшем было выяснено, что подавляющий эффект опосредован DD-, D- и Е-фрагментами, в то время как стимулирующее действие оказывали низкомолекулярные фрагменты.

NGF влиял на адгезию клеток РС12 к пластику, фибриногену и фибронектину, причем при кратковременном воздействии адгезия усиливалась, а при хроническом - ослаблялась. В отличие от NGF, Ш-6 никак не влиял на адгезию клеток РС12. Клетки РС12 не прилипали к поверхности фибринового сгустка, но прилипали к DD-, D- и Е-фрагментам, сорбированным на пластике. Адгезия РС12 к пластику в присутствии сгустка

или растворимых низкомолекулярных продуктов его деградации усиливалась, а в присутствии растворимых D- и Е-фрагментов фибрина - снижалась. При помощи FITC-меченого D-фрагмента фибрина было определено количество специфических сайтов связывания D-фрагмента на поверхности клетки и константа сродства такого связывания.

Заключение: Ш-6 способствует нейрональной дифферен-цировке РС12, усиливая экспрессию АХР и снижая скорость пролиферации клеток, подобно NGF, но не влияет на адгезию клеток. Продукты деградации фибринового сгустка также способствуют нейрональной дифференцировке РС12 и модулируют их пролиферацию и адгезию, причем разные фрагменты оказывают противоположное действие.

Динамика уровней лектинов гемолимфы моллюсков в ответ на иммунизацию

Полевщиков А.В., Баскаков А.В.

Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН, Санкт-Петербургский государственный университет, Санкт-Петербург, Россия

Введение. Установлена важная роль белок-углевод-ных взаимодействий в различных клеточных и гуморальных защитных реакциях беспозвоночных. Антиген-рас-познающие клеточные рецепторы беспозвоночных обычно имеют лектиновую природу (С-лектины). Обнаружены также растворимые лектины в гемолимфе беспозвоночных, к которым относятся гемагглютинины (ГА) и гемолизины (ГЛ) ^-лектины). Вопрос о клетках-про-дуцентах ГА и ГЛ у гастропод и двустворчатых моллюсков остается открытым; противоречивы также данные о характере и сроках изменения концентраций этих факторов в ответ на введение антигенов.

Целью работы было сравнение динамики уровней ГА и ГЛ в гемолимфе 3 видов брюхоногих и 1 вида двустворчатых моллюсков в ответ на введение эритроцитов барана (ЭБ).

Материал и методика. В качестве объектов исследования были выбраны брюхоногие легочные моллюски (Ьутпаеа stagnalis (LS), Р1апогЫш сотеш (РС), Achatina /иИса (AF)) и двустворчатый моллюск -Anodonta cygnea (АС) Моллюсков иммунизировали, вводя 0,05-0,5 мл 0,5% суспензии ЭБ, контрольная группа получала равный объем ЗФР. Уровни ГА и ГЛ оценивали до иммунизации и через 3, 5, 10 и 15 сут после введения ЭБ. Титр ГА оценивали в реакции ге-магглютинации, титр ГЛ - спектрофотометрически по высвобождению гемоглобина из ЭБ (реакция гемолиза).

Результаты. Система ГА исследованных видов брюхоногих моллюсков (РС и AF) функционирует по конституциональному механизму, обеспечивая ранний ответ на попадание антигена во внутреннюю среду животного (первые 3 - 5 суток); об этом свидетельствует заметное падение концентрации ГА на этих сроках (-

72-88%) В свою очередь, литическая система этих моллюсков работает по индуцибельному механизму, что выражается в стремительном накоплении ГЛ в гемолимфе в первые 5 суток после иммунизации (+60-65%) и постепенном расходовании этих литических факторов по мере развития защитной реакции (5-15 сутки). Динамика концентраций ГА и ГЛ у LS в ответ на иммунизацию ЭБ имеет выраженный конституциональный характер: агглютинины и лизины вовлекаются в процесс элиминации антигена на ранних этапах ответной реакции (первые 3-5 суток) и восстанавливаются до исходных концентраций к 15-м суткам после иммунизации. Кроме того, для этого моллюска установлена высокая положительная корреляция между динамикой исследуемых лектинов (г=+0,841; р<0,01); это позволяет предполагать, что ГА и ГЛ LS могут быть одними и теми же лектинами гемолимфы. В отличие от гастро-под, агглютининовая и литическая системы двустворчатого моллюска АС функционируют по индуцибель-ному механизму, обеспечивая 2-кратный подъем общей концентрации ГА и ГЛ на ранних этапах гуморальной реакции и последующее их вовлечение в процесс окончательной элиминации антигена. Для АС также установлена достоверная высокая корреляция между динамикой ГА и ГЛ (г=+0,875; р<0,01). Таким образом, гуморальный ответ РС и АГ складывается из двух механизмов: агглютинирующего и литического. На ранних этапах защитной реакции (в течение пяти суток после иммунизации) антиген связывается агглютинирующими факторами гемолимфы. Среди лигандов ГА этих моллюсков - ^ацетилированные сахара и моносахариды, которые в качестве концевых молекул входят в состав гликокаликса инородных клеток. Этим, по-видимому, обеспечивается элиминация большей части введенного антигена. Общая концентрация ГА в гемолимфе в это время снижается. Агглютинины, таким образом, составляют первый рубеж обороны организма. У позвоночных аналогичную роль в ходе иммунного ответа играют молекулы ^М, обладающие низкими специфичностью и аффинитетом связывания с антигеном. На следующем этапе в реакцию вступают лити-ческие факторы гемолимфы, функционирующие в течение 10 и более суток. ГЛ лизируют антиген и завершают гуморальную реакцию. В отличие от ГА, лизины высоко специфичны к лигандам и в силу своего многообразия способны распознавать большее число антигенов, среди которых не только №ацетилированные сахара и моносахариды, но и компоненты клеточных стенок бактерий и экстраклеточного матрикса соединительных тканей моллюсков. Аналогом этого звена защитных реакций у позвоночных являются поздние стадии гуморального иммунного ответа, связанные с продукцией высокоспецифичных молекул IgG, которые активируют белки комплемента, запуская этот литичес-кий каскад в ходе иммунного ответа.

Работа поддержана Российским Фондом Фундаментальных Исследований, грант № 98-04-49877.

Белки теплового шока 70 на поверхности клеток-мишеней распознаются NK-клетками мыши

Пономарёв E-Д., Taрaсенко T.H., Caпожников A.M.

Институт биоорганической химии

им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН,

Москва, Россия

Экспрессия белков теплового шока (БTШ) на клеточной поверхности, зарегистрированная у ряда линий опухолевых и вирус-инфицированных клеток, относится к числу малоизученных явлений, однако в настоящее время установлено, что эти протеины могут являться маркерами клеток, подлежащих элиминации эффекторами иммунной системы. Tакие данные получены, в частности, в экспериментах с NK-клетками человека, взаимодействующими in vitro с мишенями, несущими на своей поверхности БХШ70. Однако в литературе отсутствуют сведения о распознавании БTШ на поверхности клеток-мишеней NK-клетками мыши. Мы разработали простую модель, позволяющую оценить реакцию естественных киллеров мыши на сингенные и аллогенные клетки-мишени, экспрессирующие на своей поверхности БTШ. Эта модель основана на обнаруженном нами ранее явлении спонтанной экспрессии опухолевыми клетками мыши (тимомы EL-4) широкого спектра БTШ, ассоциированных с плазматической мембраной.

Цель данной работы заключалась в исследовании роли БХШ70, локализованных на поверхности клеток EL-4, в распознавании этих мишеней NK-клетками мыши.

Источником естественных киллеров являлись спле-ноциты мышей линий C57Bl/6 (H-2b), CBA (H-2k) и Balb/c (H-2d). В качестве клеток-мишеней использовалась лимфома EL-4 (H-2b), культивируемая in vitro в стандартных условиях. Эффект цитотоксичности оценивался методом М^-анализа жизнеспособности опухолевых клеток и с помощью стандартного теста, основанного на измерении активности лактатде-гидрогеназы, высвобождаемой из поврежденных эффекторами клеток-мишеней.

Проведенные эксперименты свидетельствуют о том, что клетки EL-4 подвергаются активной цитоток-сической атаке естественных киллеров как в синген-ной, так и в аллогенной ситуации. Экранирование БTШ70 на поверхности клеток-мишеней с помощью моноклональных антител уменьшало эффект цитотоксичности NK-клеток в этой модели примерно в 2-3 раза (без существенных различий для сингенного и аллогенного взаимодействия). Важно отметить, что в отличие от этого, экранирование моноклональными антителами молекул ГКГС I класса и антигенов Thy1 на поверхности клеток EL-4 приводило к увеличению регистрируемого эффекта цитотоксичности естественных киллеров.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что NK-клетки мыши могут распознавать и элиминировать клетки-мишени, экспрессирующие на своей поверхности БТШ70. Эти данные подтверждают существующую концепцию о важной роли БТШ в системе иммунологического надзора.

Изучение влияния новой биологически активной добавки к пище “Олексин” на иммунную систему мышей, подвергшихся иммобилизационному стрессу

Сафонова Г.М., Перевозчиков А.Б.,

Шилов Ю.И.

Научно-производственное объединение “Биомед”, Институтэкологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь, Россия

Препараты растительного происхождения находят все большее применение в качестве лекарственных средств, обладающихмягким иммуномодулирующим действием. В НПО “Биомед” из листьев персикао-быкновенного получен препарат, содержащий природные полифенольные соединения. На его основе создана биологически активная добавка к пище “Олексин”. Исследования на животных показали, что “Олексин” обладает выраженной антиоксидантной активностью, иммуномодулирующим, адаптогенным и профилактическим противоопухолевым действиями. Цель данного исследования - изучить влияние “Олексина” на иммунную систему животных, подвергнутых стрессу.

В качестве экспериментальной модели нами выбрана модель иммобилизационного стресса, предложенная еще Г. Селье, в которой сочетаются эмоциональный и физический стресс. Осуществляли 9-часовую иммобилизацию мышей-самцов массой 18-20 г в пластмассовых клетках в положении на спине. “Олексин” вводили перорально один раз в сутки в течение 3-х дней в дозах 0,00125; 0,005 и 0,02 мл/кг в 0,5 мл дистиллированной воды. Контрольные животные, подвергавшиеся иммобилизации (контроль 2), получали по 0,5 мл дистиллированной воды по той же схеме. Для анализа выраженности стрессорной реакции использовали дополнительный контроль - животные, получавшие в течение 3-х суток дистиллированную воду, но не подвергавшиеся иммобилизации (контроль 1). Оценивали влияние препарата in vivo на клеточность и массу тимуса, селезенки, лимфатических узлов, клеточность костного мозга, показатели гемограммы, а также на фагоцитарную активность нейтрофилов периферической крови, клеток костного мозга, селезенки и лимфатических узлов.

Изучение показателей периферической крови животных, подвергнутых иммобилизации, выявило ха-

рактерные для стресса изменения в структуре лейкоцитарной формулы: развитие лимфопении, эози-нопении и нейтрофильного лейкоцитоза. “Олексин” практически не влиял напоказатели белой крови. У мышей, подвергнутых стрессу (контроль 2), происходило уменьшение массы и клеточности тимуса, селезенки и лимфатическихузлов, увеличение клеточности костного мозга. Применение “Олексина” в наибольшей дозе (0,02 мл/кг) приводило к восстановлению этих показателей. При введении препарата в дозе 0,00125 мл/кг число кариоцитов тимуса увеличивалось. “Олексин” в наибольшей из апробированных доз (0,02 мл/кг) предотвращал снижение фагоцитарной активности нейтрофилов крови у иммобилизированных животных. Как видно из таблицы,

Тонкая специфичность антительного ответа на антиген зависит от типа Т-клеточного иммунного ответа

Cвирщевскaя E.B., Ллексеева Л.Г.*, Лндронова T.M.*

Группа клеточных взаимодействий и *Лаборатория пептидов.

Институт биоорганической химии

им. М.М. Шемякина и Ю.В. Овчинникова, РАН, Москва

Нами ранее было показано, что тип T клеточного иммунного ответа на антиген определяется молекулой ГКГС II класса, представляющей пептиды белка антигена. Tак, Tх2 активируются в случае доминирующего представления пептидов молекулой I-A, тогда как Tх1 активируются при представлении пептидов молекулой I-E. Задачей данного исследования было определить характер и тонкую специфичность антительного ответа на антиген аллергического комплекса грибка Aspergillus fumigatus Asp f2.

В норме ответ на растворимые белки опосредуется Tх2. Для индукции клеточного ответа на Asp f2 мы использовали антитела против I-Ad молекулы ГКГС. Мы-

препарат предотвращал стрессорную активацию фагоцитарной активности клеток костного мозга в абсолютном выражении и активировал фагоцитоз в селезенке. Таким образом, “Олексин” при профилактическом применении в дозе 0,02 мл/кг оказал выраженное антистрессорное действие, препятствуя изменению клеточности органов иммунной системы и восстанавливая показатели фагоцитарной активности нейтрофилов, клеток костного мозга и селезенки. Складывается впечатление, что в целом препарат обладает стресс-лимитирующим действием. Препарат предупреждает развитие не только стрессорной (акцидентальной) инволюции лимфоидных органов, но и стрессорных изменений фагоцитарного звена иммунной системы.

шей BALB/c (H-2d) иммунизировали 30 мкг/мышь рекомбинантного Asp f2 п/к в подушечку правой лапы в НАФ. Мыши одной из групп получили дополнительно 10 инъекций анти I-Ad антител (MK-D6) в течение 5 дней п/к в район дренирующего место иммунизации лимфатического узла (ЛУ). Повторную иммунизацию проводили аналогично через месяц и через 5 дней забирали сыворотку крови, клетки ЛУ и спленоциты иммунных мышей. Наличие I-A и I-E рестриктированного иммунного ответа определяли по продукции ИЛ-2 клетками ЛУ in vitro в ответ на Aspf2. Наличие цитотоксических клеток, специфичных к Asp f2, определяли в цитотоксическом тесте против клеток-мишеней P815 (H-2d), нагруженных антигеном. Для анализа тонкой специфичности антительного ответа были синтезированы 14 пептидов, перекрывающих 66% последовательности белка Asp f2. Антитела к Asp f2 определяли методом ИФА, где в качестве подложки наносили либо пептиды белка (линейные эпитопы), либо полный белок (конформационные эпитопы).

Показали, что использованный режим иммунизации позволяет индуцировать к растворимому белку Asp f2 как Тх1, так и Тх2 типа. При иммунизации мышей только белком иммунный ответ клеток ЛУ in vitro подавля-

Таблица. ВЛИЯНИЕ “ОЛЕКСИНА” НА ФАГОЦИТАРНУЮ АКТИВНОСТЬ КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА И СЕЛЕЗЕНКИ НА ФОНЕ ИММОБИЛИЗАЦИОННОГО СТРЕССА

Группа животных Доза, мл/кг Костный мозг/бедренную кость Селезенка/орган

Абсолютное число фагоцитирующих клеток

Контроль 1 1,7G±G,36** 1,8±G,5** 15,8±3,65 17,9 ±4,3

Контроль 2 (стресс) 4,44±G,87 5,2±G,8 1G,9±1,67 12,7± 1,8

Олексин G,G2 1,25±G,44** 1,3±G,5** 27,7±4,26** 32,G±4,9**

G,GG5 2,45±G,58 2,5±G,5* 21,4±4,29* 26,3±5,4*

G,GG125 2,81±G,79 3,1±1,G 16,2±3,76 19,1 ±4,4

Примечание: *- р < 0,05; **- р < 0,01; ***- р < 0,001 по отношению к контролю 2 (стресс) по непарному ^-критерию Стьюдента; число животных (п) во всех группах равно 10.

ется в присутствии анти-I-A антител. И, наоборот, при иммунизации белком и дополнительном введении анти-

I-A антител in vivo иммунный ответ in vitro рестрикти-руется I-E молекулой ГКГС. Также показали, что в селезенках мышей, получивших анти-I-A антитела, появляются антиген специфичные цитотоксические клетки, что соответствует формированию клеточного иммунитета, опосредуемого Тх1.

Известно, что Тх2 оказывают помощь В клеткам в переключении на синтез IgG1 субкласса антител, тогда как Тх1 - на синтез IgG2a. Полученные данные показали, что при ответе Тх2 формировался репертуар антител IgG1, распознающих доминантно только один линейный эпитоп, соответствующий С-концевому пептиду 296-310. Также были обнаружены антитела IgG2a субкласса, распознающие эпитопы 155-169 и 182-196. Данные получены для индивидуальных сывороток и достоверно воспроизводимы между мышами одной группы. При смене типа иммунного ответа на Тх1 уровень антител класса IgG1, специфичных к линейным эпитопам Asp f2, значительно снижался, а у части мышей исчезал вообще. Спектр эпитопов, распознаваемых IgG2a антителами, изменялся. Кроме эпитопа 155-169 на таком же уровне распознавались эпитопы 20-33, 73-84, 132-148 и 296-310. Таким образом, В клеточный иммунный ответ отражает с одной стороны структуру белка (гидрофильность, третичная структура), что выражается в распознавании двух доминант белка - пептидов 155-169 и 296-310 и ряда конфор-мационных эпитопов, а с другой стороны - тип иммунного ответа являясь моновалентным (преимущественно конформационным) для гуморального ответа и поливалентным (преимущественно направленным на линейные эпитопы) для клеточного ответа.

Особенности экспрессии Fas-антигена и апоптоз лимфоцитов периферической крови у опийных наркоманов

Сибиряк С.В., Рисберг В.Ю., Юлдашев В.Л., Юсупова Р.Ш., Сибиряк Д.С., Набиуллина Е.В.

Всероссийский центр глазной и пластической хирургии, Уфа, Россия; Башкирский Государственный медицинский университет, Уфа, Россия

В последние годы значительно возрос интерес к роли процесса программированной клеточной

гибели (апоптоза) в регуляции иммунных функций и его значимости для развития иммунопатологических синдромов. Сформулирована и находит экспериментальное подтверждение концепция апоптотического иммунодефицита (А.Н. Череде-ев, Л.В. Ковальчук, 1999). Можно полагать, что вторичный иммунодефицит, развивающийся в условиях воздействия ксенотоксикантов (в том числе и наркотоксикантов), также имеет в основе аномальный апоптоз иммуноцитов, связанный как с прямым воздействием ксенобиотика на клетку, так и с опосредованным нарушением иммунного гомеостаза.

В настоящем исследовании было обнаружено, что у лиц, страдающих опийной наркоманией (про-дожительность употребления опиатов от 3 до 5 лет), наряду с отчетливыми изменениями субпопу-ляционной структуры и митогенного ответа лимфоцитов периферической крови (Т-лимфоцитоз, CD72+ В-лимфоцитоз, КК-лимфоцитопения, депрессия митогенного ответа при стимуляции ФГА и митогеном лаконоса) отмечается статистически значимое (более чем на 39%, в сравнении с донорской группой) нарастание содержания лимфоцитов, экспрессирующих Fas-рецептор (МКА 1СО-160). Что особенно важно, изменяется и характер корреляционных связей ^Спирмана) между содержанием CD95+ лимфоцитов и других субпопуляций лимфоцитов.

Кроме того, в периферической крови опийных наркоманов значительно увеличивалось содержание лимфоцитов с признаками терминальной фазы апоп-тоза (окраска Hoechst 33342), которое составило 34,2±11,5% (п=9) против 9,6±4,8% (п=12) у здоровых доноров (Р<0,001). Известно, что Fas-рецептор экспрессирован в норме в основном на примирован-ных Т лимфоцитах (СD3+СD4+ и CD3+СD8+ лимфоцитах), и его экспрессия возрастает при активации клеток. Об этом свидетельствует и наблюдаемый характер корреляционных связей в группе доноров. Можно полагать, что изменение спектра экспрессии CD95, числа Fas+ клеток и содержания апоптирую-щих лимфоцитов при воздействии наркотоксикантов отражает аномальный характер “готовности” соответствующих субпопуляций к негативной селекции и их последующий апоптоз.

Таблица

Значение коэффициента корреляции между содержанием CD95+лимфoцитoв и основных субпопуляций лимфоцитов

CD3+ CD4+ CD8+ CD72+ HLA-DR+ CD25+ CD16+

Доноры +0,36 +0,34 +0,32 +0,28 +0,28 +0,36 -0,24

(п=36) P=0,03 P=0,04 P=0,05 P=0,09 P=0,11 P=0,03 P=0,15

Наркоманы +0,42 +0,36 +0,02 +0,04 +0,26 +0,23 -0,09

(п=23) P=0,04 P=0,09 P=0,93 P=0,83 P=0,22 P=0,28 P=0,68

Толл-белки и цитокины в противоинфекционной защите

Симбирцев А.С.

ГНЦ НИИ особо чистых биопрепаратов, Санкт-Петербург, Россия

Внедрение патогенов в организм приводит к активации механизмов противоинфекционной резистентности и развитию целого комплекса защитных реакций, связанных с местной воспалительной реакцией и затем системным острофазовым ответом на уровне организма. Последовательные этапы формирования воспалительной реакции известны достаточно хорошо, однако, до последнего времени были неизвестны клеточные рецепторы, передающие активационные сигналы после взаимодействия с различными бактериальными патогенами или компонентами их клеточных стенок. Лишь в последние два года выяснилось, что эта функция связана с Toll белками, которые экспрессированы на мембране лейкоцитов и других клеток различных видов животных и человека. Toll-белки являются эво-люционно древними молекулами и впервые были описаны у дрозофилы, где они также выполняют примитивные защитные функции. Среди около десяти известных Toll-белков существуют явные различия в узнавании бактериальных производных. Белок Toll-4 обеспечивает проведение сигнала при встрече лейкоцитов с грамотрицательными бактериями и основным компонентом их клеточных стенок - ЛПС, взаимодействующим также с CD14 и ЛПС-связывающим белком, которые сами не обладают функцией проведения сигнала в клетку. Белок Toll-2 связывает продукты грампо-ложительных микроорганизмов, пептидогликаны, а также производные дрожжевых клеток, например, зи-мозан. Оба белка Toll экспрессируются на мембранах макрофагов и обеспечивают активацию синтеза про-воспалительных цитокинов ИЛ-1, ФНО и других. Таким образом, уже на уровне макрофага может происходить распознавание различных типов микроорганизмов. Однако в обоих случаях вслед за этим запускается одна и та же программа передачи внутриклеточного сигнала активации с участием адаптерного белка MyD88, ассоциированной с рецептором ИЛ-1 киназы и транслокацией ядерного транскрипционного фактора NFkB. Важно, что этот путь полностью повторяется при передаче сигнала от рецептора ИЛ-1, более того, внутриклеточные части трансмембранных Toll-белков имеют гомологию с рецептором ИЛ-1. Это позволяет предположить, что семейство молекул ИЛ-1 использует тот же путь активации клеток, как и при первичном распознавании патогенов Toll-белками, и это нужно для усиления сигнала к развитию защитной воспалительной реакции. ЛПС, пептидогликаны, зимозан и другие компоненты клеточных стенок различных микроорганизмов запускают синтез ИЛ-1 и ряда других провос-палительных цитокинов в макрофагах. В свою очередь ИЛ-1 способен вызвать продукцию тех же провоспа-

лительных цитокинов и самого себя. Анализ строения То11-белков и рецепторного комплекса ИЛ-1 подтверждает, что это не случайно. ИЛ-1 практически повторяет все биологические эффекты ЛПС как на местном, так и на системном уровне. Последние данные по изучению роли То11-белков в развитии защитных реакций позволяют предположить, что ИЛ-1 служит не просто медиатором действия ЛПС в организме, но является ам-плификатором развития защитных реакций, используя гомологичные рецепторы и полностью идентичные внутриклеточные сигнальные системы.

Сравнительная характеристика первичных и перевиваемых человеческих эндотелиальных клеток

Соколов Д.И., Кузнецова С.А.,

Шейкин Ю.А., Фрейдлин И.С.

Институт экспериментальной медицины РАМН, Санкт-Петербург, Россия

Эндотелиальные клетки (ЭК) привлекают внимание в связи с накопившимися в литературе данными об их участии в процессах воспаления, индукции и реализации иммунного ответа, ангиогенеза. Непосредственное участие ЭК в этих процессах обеспечивается регулируемой экспрессией на их поверхности адгезионных молекул. Участие ЭК в межклеточных взаимодействиях, кроме того, опосредовано продукцией и рецепцией цитокинов, среди которых особое место занимают хемокины. Общепринятой модельной системой для изучения ЭК является первичная культура человеческих эндотелиальных клеток вены пупочного канатика (НЦУЕС). Наряду с этим, используется ряд перевиваемых линий ЭК, среди которых наиболее близкой к НЦУЕС является перевиваемая линия ЕСУ304 человеческих эндотелиальных клеток, полученная в результате спонтанной трансформации человеческих эндотелиальных клеток вены пупочного канатика. Целью настоящего исследования было изучение экспрессии на мембране клеток линии ЕСУ304 адгезионных молекул 1САМ-1, секреции этими клетками интерлейкина (ИЛ)-8, экспрессии на мембране клеток линии ЕСУ304 молекул СЭ95, адгезии лейкоцитов к клеткам данной линии, пролиферативной активности клеток линии ЕСУ304 и проведение сравнительного анализа этих характеристик с характеристиками НЦУЕС. Уровни экспрессии 1САМ-1 и CD95 определяли с помощью клеточной модификации им-муноферментного анализа (ИФА); концентрацию ИЛ-8 определяли в надосадочных жидкостях клеток линии ЕСУ304 при помощи ИФА; адгезию лейкоцитов к ЭК оценивали при помощи миелопероксидазного теста; пролиферацию клеток линии ЕСУ304 оценивали при помощи пролиферативного теста, окрашивая монослои витальным красителем МТТ. Сравнение полученных данных с литературными показало, что и первич-

ная, и перевиваемая линии имеют одинаковый уровень спонтанной секреции ИЛ-8. Стандартный индуктор форболмиристатацетат (ФМА) усиливает секрецию ИЛ-8 и у первичной, и у перевиваемой линии ЭК. Фактор некроза опухолей-а (ФНО) или интерферон-у (ИФН) стимулируют секрецию ИЛ-8 клетками обеих линии. Комбинация ФНО и ИФН вызывает менее выраженную секрецию ИЛ-8 перевиваемой линией и, наоборот, у клеток первичной линии вызывает более выраженную секрецию ИЛ-8 по сравнению с действием одного ФНО. ИЛ-10 оказывает на активированные ФНО или ФНО+ИФН клетки этих линий одинаковый ингибирующий секрецию ИЛ-8, эффект. В то же время ИЛ-4 никак не влияет на секрецию ИЛ-8 клетками первичной и перевиваемой линий. По нашим данным, высокие концентрации гранулоцитарно-макрофагаль-ного колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) оказывают угнетающее действие на секрецию ИЛ-8 клетками линии ЕСУ304, что отличается от опубликованных в литературе данных об отсутствии влияния этого фактора на клетки первичной линии. Анализ собственных и литературных данных по адгезионным молекулам показал, что клетки линии ECV304 имеют несколько более высокий уровень спонтанной экспрессии 1САМ-1 по сравнению с первичной линией. ФМА усиливает экспрессию 1САМ-1 и у первичной и у перевиваемой линий ЭК. ФНО усиливает экспрессию 1САМ-1 примерно в три раза, а ИФН - примерно в два раза у обеих клеточных линий. Комбинация этих цитокинов аддитивно усиливает экспрессию 1САМ-1 на клетках анализируемых линий. ИЛ-4 и его комбинации с ИФН или ФНО не влияют на экспрессию 1САМ-1 у этих клеточных линий. В отличие от первичной линии, ГМ-КСФ угнетает индуцированную ФНО или ФНО+ИФН экспрессию 1САМ-1 на поверхности клеток линии ЕСУ304. Предобработка клеток линии ЕСУ304 ИЛ-10 приводит к усилению индуцированной ФНО или ФНО+ИФН экспрессии 1САМ-1, что также отличает эти клетки от первичной линии. Бактериальный липополисахарид (ЛПС) вызывал усиление экспрессии 1САМ-1 на клетках линии ЕСУ304, а также адгезии лейкоцитов крови к указанным клеткам, что соответствует данным об усиливающем действии ЛПС на экспрессию 1САМ-1 на поверхности ИЦУЕС. Конститутивная экспрессия CD95 не выявлена на клетках ни первичной, ни перевиваемой линий ЭК. Экспрессия CD95 на поверхности клеток линии ECV304 не выявлена в присутствии нормальных белков плазмы крови, однако экспрессию этого маркера индуцировали иммунные комплексы, выделенные из крови больных ревматоидным артритом. Как и ЭК первичной линии, клетки линии ЕСУ304 способны адекватно реагировать увеличением или снижением пролиферативной активности на действие индукторов или ингибиторов. Проведенный сравнительный анализ собственных и опубликованных в литературе данных свидетельствует о целесообразности исполь-

зования перевиваемой линии ECV304 для изучения иммуномодулирующих воздействий на ЭК.

Работа поддержана грантом РФФИ № 00-04-48064.

Спонтанный апоптоз тимоцитов in vitro сопровождается появлением белков теплового шока 70 на поверхности погибающих клеток

Тарасенко Т.Н., Пономарёв Е.Д.,

Сапожников А.М.

Институт Биоорганической Химии

им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН,

Москва, Россия

Белки теплового шока (БТШ) являются внутриклеточными протеинами, обладающими важными функциями для жизнедеятельности клеток всех типов, в том числе и для клеток лимфоидного ряда. В последние годы было установлено, что у некоторых линий опухолевых клеток и у вирус-инфицированных лимфоцитов локализация этих протеинов наблюдается не только во внутриклеточном пространстве, но и на поверхности плазматической мембраны. Функции БТШ, ассоциированных с плазматической мембраной, практически не изучены. Наши предыдущие работы свидетельствуют о взаимосвязи транслокации БТШ на клеточную поверхность с процессом апоптоза клеток мышиной лимфомы EL-4. В связи с этим мы предположили, что транслокация БТШ на поверхность клеток, погибающих по механизму апоп-тоза, является универсальным явлением, свойственным не только опухолевым, но и нормальным лимфоцитам.

Данная работа посвящена проверке этого предположения на модели программированной гибели тимоцитов мыши.

Исследование проводили на тимоцитах мышей линии С57В1/6. Для индукции апоптоза клетки инкубировали в течение 4 ч в присутствии дексаметазона. Анализ экспрессии БТШ70 на клеточной поверхности проводили с помощью метода проточной цитофлуориметрии на приборе EPICS ELITE (Coulter Corporation, США).

Было обнаружено, что в отличие от клеток тимомы EL-4, на поверхности живого пула нормальных тимо-цитов не наблюдается экспрессии БТШ70. Однако продвижение тимоцитов по пути апоптоза сопровождается появлением на их поверхности этих протеинов. Наиболее выраженная экспрессия БТШ7 0 зарегистрирована на плазматических мембранах тимоцитов, находящихся на поздних стадиях программированной гибели.

Таким образом, программированная гибель тимоци-тов, как и клеток лимфомы EL-4, сопровождается экспрессией БТШ70 на их плазматических мембранах, что позволяет рассматривать явление транслокации БТШ на клеточную поверхность как один из процессов, внутренне присущих апоптозу лимфоидных клеток.

Различная чувствительность субпопуляции Т-клеток человека к низким дозам иономицина

Хайдуков С.В., Тонеев В.В., Поклонский Д.Л., Хирова Е.В., Чудакова Д.Л., Литвинов И.С.

Институт Биоорганической Химии

им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН,

Москва, Россия

Введение. Являясь Са-ионофором иономицин (I) специфически переносит ионы кальция через плазматическую мембрану (ПМ) лимфоцитов. Однако, низкие дозы иономицина повышают Са вследствие активации природных Са-транспортирующих систем ПМ и эндоплазматического ретикуллума.

Цель и задачи. Основной задачей представленной работы являлся анализ чувствительности различных субпопуляций Т-клеток периферической крови человека к низким дозам I. Особенное внимание было направлено на клетки, имеющие фенотип Т-клеток памяти.

Материалы и методы. Лимфоциты периферической крови выделяли на градиенте фиколла. Макрофаги и В-клетки удаляли пеннингом. Для окрашивания клеток был использован метод прямой иммунофлуоресценции с использованием моноклональных антител к маркерам клеточной поверхности: CD3, CD4, CD7, CD8, CD11a, CD19, CD16, CD56, CD45RA, CD45RO. Анализ окрашенных клеток проводили методом проточной цитометрии.

Основные результаты. Низкая доза иономицина (3|хМ и 10 мин инкубации при 37°С) оказывала неодинаковое действие на субпопуляции Т-клеток, однако соотношение CD4+/CD8+ практически не изменялось. (Дальнейший анализ проводился для CD4+ и CD8+ Т-клеток раздельно.) Среди CD4+ Т-клеток обработка I приводила к резкому снижению CD4+CD7+ субпопуляции с 85,2% до 27,3% и CD4+CD45RA+ субпопуляции с 52,9% до 10,2%. Однако та же доза I приводила к возрастанию в популяции доли клеток CD4+CD7- субпопуляции с 14,8% до 72,7% и CD4+CD45RO+ субпопуляции с 55,5% до 85,9%. Следовательно, большинство наивных CD4+ Т-клеток (CD4+CD7+ и CD4+CD45RA+) являются чувствительными к I. Небольшая, но существенная доля CD4+CD7+ (32%) и CD4+CD45RA+ (19%) Т-клеток остается живыми в данных условиях. Напротив, Т-клетки памяти с фенотипом - CD4+CD45RO+ являются резистентными к действию I.

Среди CD8+ Т-клеток обработка I в тех же условиях приводила к более неоднозначным последствиям. Как и в случае с CD4+CD45RA+, доля CD8+CD45RA+ субпопуляции значительно снижается (с 46,0% до 18,5%). Однако та же доза I приводила к снижению доли субпопуляции CD8+CD45RO+ практически до нуля. Следовательно, чувствительными к I являются обе субпопуляции CD8+CD45RO+ и CD8+CD45RA+, однако среди CD8+CD45RA+ присутствует небольшая, но существенная доля CD8+CD45RA+ Т-клеток (19%) остается живы-

ми в используемых условиях. Эта популяция состоит, скорее всего, из CD8+CD11а+ Т-клеток. При инкубации с I в использованных условиях доля CD8+CD11a+ возрастает с 47% до 95%. Следовательно, среди CD8+ Т-клеток только CD8+CD11a+CD45RA+ - цитотоксические CD8+ Т-клет-ки-эффекторы - являются резистентными к иономицину.

Заключение. Резистентными к иономицину являются CD4+ Т-клетки с фенотипом клеток памяти -CD4+CD7-CD45RA-CD45RО+ и CD8+CD11a+CD45RA+ среди CD8+ Т-клеток. Взаимосвязь экспрессии CD45RО+ или CD45RA+ с чувствительностью клеток к иономицину отмечена только для CD4+ Т-клеток. Обнаружено новое свойство Т-клеток памяти человека -резистентность к иономицину.

Фенотипическая характеристика Т-клеток памяти мышей

Хайдуков С.В., Чудакова Д.А.,

Агафонова С.А., Литвинов И.С.

Институт Биоорганической Химии

им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН,

Москва, Россия

Принципиальным отличием фенотипических характеристик Т-клеток мыши от человека является отсутствует позитивного маркера Т-клеток памяти для мышей (аналога человеческой молекулы CD45RO). Поэтому часто фенотипическим критерием Т-клеток памяти мыши являются не качественные их отличия от наивных Т-клеток, а только количественные.

Фенотипическая характеристика Т-клеток памяти получена в сравнении с другими Т-клеточными популяциями методом проточной цитофлуориметрии с мАт к маркерам клеточной поверхности: CD2, CD3, CD4, CD8, CD11a, CD25, CD28, CD44, CD45RB, CD62L. Отсутствие в настоящее время метода селективного выделения наивных Т-клеток не позволяет прямо сравнить по фенотипу наивные и Т-клетки памяти. В данном случае в качестве наивных Т-клеток использовали Т-клетки селезенки молодых (4-6 недель) мышей статуса SPF.

Выделенные Т-клетки памяти скорее всего находятся в состоянии покоя. Об этом свидетельствует отсутствие на их поверхности “классических” маркеров активации Т-клеток - CD25 и CD28. Аналогичные данные получены и для наивных Т-клеток мышей статуса SPF. (Отсутствие активированных Т-клеток характерно для животных статуса SPF). Напротив, в популяции общих Т-клеток мышей, содержащихся в обычных условиях вивария, присутствует популяция (5-7%) активированных Т-клеток. Одновременно, Т-клетки памяти имеют и характерный “активационныйфенотип” -CD11ahighCD44highCD45RBlowCD62low. (По современным данным, подобный фенотип Т-клеток характерен и для активированных Т-клеток, и для Т-клеток памяти). Среди наивных Т-клеток мышей статуса SPF практически отсутствуют (меньше 2%) Т-клетки с данным феноти-

пом, а подавляющее большинство T-клеток имеют и xa-paктepный “наивный фенотип” -

CD11alowCD44lowCD45RBhighCD62high. В популяции T-клеток мышей из вивapия пpиcyтcтвyют и популяция c “активационным фенотипом”, и популяция c “наивным фенотипом”. Haблюдaeмыe фeнотипичecкиe изменения в ypовнe экcпpeccии “молекул активации” -CD11a,CD44,CD45RB и CD62 отpaжaют caм факт yc-пешной активации T-клеток и, crapee вceго, являютcя нeобpaтимыми на оcтaвшиxcя покоящиxcя клонax T-клеток памяти. Oдновpeмeнно, данные изменения отpaжa-ют и пpоцecc пepecтpойки peцeптоpного aппapaтa наи-вньк T-клеток в ^оцетее ж диффepeнциpовки в T-клетки памяти. Cкоpee вceго, CD25 и CD28 появляютcя и на ^^re^ax памяти в каждом cлyчae лишь в момент оте-цифичecкой активации, но, иcчeзaют по окончанию активного иммунного ответа c повepxноcти T-клеток памяти. Подобный мexaнизм, cкоpee вceго пpeдотвpaщaeт нecпeцифичecкyю активацию T-клеток памяти.

Опедовательно, фенотип CD4+ и CD8+ T-клеток памяти, выделенный кальциевым пapaдокcом и по методу Miller R.A. et al, может быть запдоан cлeдyющим обpaзом:

CD2+CD3+CD4+CD11ahighCD25-CD28-CD44high

CD45RBlowCD62Llowи

CD2+CD3+CD8+CD11ahighCD25-CD28-CD44high

CD45RBdimCD62Llow.

Ганглиозиды индуцируют апоптоз клеток цитотоксической линии CTLL-2, но не промиелоцитарной лейкемической линии HL-60

Холоденко P.B., Зеленова H.A.,

Caпожников A.M., Молотковская И.М.

Институт биоорганической химии

им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН,

Москва, Россия

Ганглиозиды, ноpмaльныe гликоcфинголипиды плаз-мaтичecкиx мeмбpaн эyкapиотов, игpaют важную pоль в пpоцeccax ноpмaльной жизнедеятельности клеток иммунной cистeмы. Oднaко пpи paзвигии pядa пaтологичecкиx п^це^ов pоль ганглиозидов чacто окaзывaeтcя пapaдок-caльной, а то и вpeдной для оpгaнизмa. Taк, пpи pa^m™ опyxолeвого пpоцecca ганглиозиды cбpacывaютcя c по-вepxноcти быcтpо дeлящиxcя клеток; cвободныe ганглиозиды пepexвaтывaют IL-2 и IL-4, cyпpeccиpyя таким об-paзом ингepлeйкин-зaвиcимый ответ T-лимфоцитов. По-cколькy ганглиозиды cпоcобны ингибиpовaть ^олифе-paцию IL-2- зaвиcимыx клеток линии CTLL-2 не только конкypeнгным, но и нeконкypeнraым cпоcобом, мы ^о-вepили влияние paзличныx ганглиозидов на индукцию и paзвитиe апоптоза в цитотокcичecкиx клeткax.

Oцeнкa количecтвa клеток, вступивши в апоптоз, пpоводилacь цитофлyоpимeтpичecким cпоcобом двумя методами. Пepвый метод оcновaн на окpaшивaнии ДHК клеток PI, дpyгой оcновaн на ^пользовании FITC-

меченого аннексина V.

Нами было показано, что ганглиозиды способны индуцировать развитие апоптоза в клетках линии СТЕЬ-2, причем наиболее эффективно - моносиалированные ганглиозиды, в частности, опухолевый маркер GM2. Более того, его апоптоз- индуцирующее действие усиливается в присутствии ГЬ-2. Изученные ганглиозиды не способны индуцировать апоптоз в клетках промиелоцитарной лейкеми-ческой линии НЬ-60, что мы связываем с блокировкой прохождения сигнала на апоптоз протоонкогеном Ьс1-2.

Временная зависимость числа апоптотических клеток, образовавшихся под влиянием ганглиозидов, носит сложный характер: мы выявили два пика в этой зависимости. Нами показано, что пептид N-Acetyl-Tyr-Val-Ala-Aspartinal (ингибитор каспаз) уменьшает первый пик (долю апоптотических клеток) на 90%.

Т.о., ганглиозиды могут усиливать иммуносупрессию у онкологических больных путем введения цито-токсических клеток в апоптоз. Избирательность действия ганглиозидов заключается в том, что они не влияют на опухолевые клетки.

Расщепление биологического сигнала в реакциях естественной цитотоксичности

Чекнёв С.Б.

НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи РАМН, Москва, Россия

Вовлечение естественных киллеров (ЕК) в реализацию широкого спектра нецитотоксических регуляторных взаимодействий с клетками лимфоидной и нелимфоидной природы, обеспечиваемых продукцией эффекторами гуморальных факторов регуляции, предполагает возможность и целесообразность ослабления или ограничения в условиях индукции синтетических процессов других форм специализированной клеточной активности, в том числе - собственно цитотоксичности. Одним из наиболее значимых вариантов расщепления биологического сигнала в реакциях естественной цитотоксичности (ЕЦТ) является регистрируемая в эксперименте и в ходе клинико-иммунологических наблюдений диссоциация цитотоксической и интерферон (ИФН)-продуцирующей функций ЕК.

Осуществленные нами исследования позволили установить предпосылки к возникновению диссоциации первичных функций эффекторов ЕЦТ, ее связь с активностью тимуса, формы - при отдельных заболеваниях, физиологический характер. Изучение механизмов обеспечения диссоциации цитотоксичности и выработки ИФН ЕК показывает, что перехват потребляемых в цитолизе активных метаболитов кислорода (рациональное ограничение ЕЦТ) и торможение каскада реакции на стадии программирования лизиса (исключение аутологичной цитотоксичности) снижают цитотоксическую компоненту межклеточного взаимодействия, тем самым облегчая синтетические процессы, но не формируют

диссоциации, при которой усиливается цитолиз, а синтетический потенциал эффектора блокируется.

Поиск механизма, посредством которого в физиологических условиях форсируется цитолиз с одновременным ослаблением синтеза регуляторных цитокинов не-цитотоксического воздействия, обнаруживает указанные свойства у пролин-богатых олигопептидов, продуктов частичного катаболизма антител. Комплексированные с муциноподобными металлосвязывающими протеогли-канами, эти соединения способны регулировать ЕЦТ и ИФН-генез, усиливая цитотоксическую составляющую реакции с полной отменой выработки ИФН ЕК. В этих условиях, с одной стороны, исключается возможность гиперактивации ЕК и, по-видимому, реализации их ци-тотоксического потенциала против собственных неизмененных клеток организма, с другой, - отсутствует хорошо известное протективное действие ИФН в отношении трансформированных мишеней, чем в высокой степени обеспечивается эффективность цитолиза.

Обобщая, можно заключить, что постоянно меняющиеся направленность и динамика примембранных процессов в физиологическом поле межклеточного обмена устанавливают и поддерживают способность эффекторов системы ЕЦТ к диссоциации их первичных функций, суть - расщеплению биологического сигнала. Система эволюционно обретает, поэтому, высокий потенциал мягкой (физиологической) адаптации и внутренней компенсации, функциональную пластичность и формирует чрезвычайно широкий спектр цитотокси-ческих и нецитотоксических регуляторных взаимодействий с клетками различного происхождения.

Роль различных типов адренергических рецепторов в изменениях показателей НСТ-теста в условиях адреналинового стресса

Шилов Ю. И., Гилева Н.А., Таскаев В.П.

Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь, Россия

Адренергические механизмы играют существенную роль в регуляции функций фагоцитирующих клеток при стрессе. Как было показано ранее в системе in vivo, 0-адренергический антагонист пропранолол значительно активировал как фагоцитарную активность лейкоцитов периферической крови, так и продукцию ими активных форм кислорода в условиях острого стресса (6-часовая иммобилизация в сочетании с дозированной кровопо-терей). При этом он значительно усиливал раннюю волну активации фагоцитоза при остром стрессе, что в условиях повышенного выброса катехоламинов и глюко-кортикоидов может быть опосредовано через действие эндогенного адреналина на а-адренорецепторы [Ю.И. Шилов, Е.Г. Орлова, 1998]. В системе in vitro [Ю.И. Ши-

лов с соавт., 1998] адреналин и агонист Р-адренорецеп-торов тербуталина сульфат в близком диапазоне концентраций оказывали прямо противоположное действие на фагоцитарную активность нейтрофилов, эозинофилов и моноцитов периферической крови (стимуляция адреналином и угнетение тербуталином сульфатом).

Целью настоящей работы явился анализ эффектов антагонистов различных типов адренергических рецепторов в условиях адреналинового стресса in vivo на показатели кислородозависимой бактерицидности фагоцитирующих клеток периферической крови в тесте с нитросиним тетразолием (НСТ-тест) у крыс.

Материалы и методы. Исследования проведены на крысах-самцах популяции Wistar средней массой 229,19±3,75 г. Для экспериментального моделирования острого фармакологического стресса использовали введение высокой дозы адреналина (1 мг/кг массы тела подкожно). Эта экспериментальная модель широко использовалась П.Д. Горизонтовым с соавт. [1983], а также Ю.И. Зиминым [1980, 1983, 1985], которые показали, что многие изменения как в системе крови, так и в нейроэндокринной системе (включая увеличение уровня гормонов коры надпочечников) в этой модели сходны с другими формами биологического стресса. Крысам 1 -й группы вводили только адреналин. Животные 2-й, 3-й и 4-й групп были подвергнуты аналогичному воздействию в условиях блокады различных типов адренергических рецепторов специфическими антагонистами, которые вводились за 1 час до иньек-ции адреналина с интервалом 3 часа двукратно. Для блокады Р-адренорецепторов вводили пропранолола гидрохлорид (ISIS PHARMA GmbH, Германия, по 5 мг/кг массы тела на инъекцию подкожно), для блокады а2-адреноре-цепторов йохимбина гидрохлорид (Sigma, США, по 5 мг/ кг подкожно двукратно), а а-адренорецепторов - празози-на гидрохлорид (Norton, Великобритания, по 1 мг/кг подкожно двукратно). Животные 5-й группы служили контролем. Показатели кислородозависимой бактерицидности фагоцитирующих клеток периферической крови оценивали в спектрофотометрическом варианте НСТ-теста с использованием опсонизированного зимозана [С.М. Горди-енко, 1983]. Статистический анализ результатов проведен с использованием непарного t-критерия Стьюдента.

Основные результаты. Установлено, что через 6 ч после введения адреналина наблюдается статистически достоверное падение относительных показателей спонтанного варианта НСТ-теста. Через 1 ч после введения антагонистов адренорецепторов (до иньекции адреналина) отмечены эффекты, прямо зависящие от типа рецептора. Блокада Р-адренорецепторов приводила к статистически значимому увеличению относительных показателей стимулированного варианта НСТ-теста. Напротив, при блокаде а1-адренорецепторов отмечено снижение относительных показателей как стимулированного, так и спонтанного варианта теста. Блокада а2-адренорецепто-ров приводила к депрессии относительных показателей только спонтанного варианта НСТ-теста. Перечисленные эффекты блокады а1- и а2-адренорецепторов сохранялись

и после введения адреналина. При блокаде а1-адреноре-цепторов депрессия показателей стимулированного и спонтанного варианта НСТ-теста сохранялась через 1, 3 и 6 ч после введения адреналина. В условиях блокады Ог-адренорецепторов снижение относительных показателей стимулированного варианта НСТ-теста наблюдалось через 3, 6 и 24 ч после инъекции адреналина, а спонтанного - через 1, 3, 6 и 24 ч. У животных с блокадой Р-адреноре-цепторов первоначальная стимуляция относительных показателей НСТ-теста сменялась развитием их депрессии в стимулированном и спонтанном вариантах через 3 и 6 ч после введения адреналина.

Заключение. Таким образом, специфические антагонисты адренорецепторов оказывают прямо противоположный эффект на бактерицидный потенциал фагоцитирующих клеток, который связан с выпадением действия катехоламинов на соответствующий тип рецепторов.

Влияние пилокарпина и теофиллина на фагоцитарную активность лейкоцитов периферической крови человека

Шилов Ю.И., Зотин А.В., Атнагузина А.Т.

Институт экологии и

генетики микроорганизмов УрО РАН,

Пермский государственный университет,

Пермь, Россия

При изучении влияния холинергических соединений на функции фагоцитирующих соединений были

получены противоречивые результаты, что может быть связано с гидролизом ацетилхолина холинэсте-разой.

Цель настоящей работы - исследование влияния негидролизуемого агониста М-холинорецепторов пилокарпина гидрохлорида на фагоцитарную активность лейкоцитов периферической крови здоровых людей (27 мужчин в возрасте от 16 до 44 лет) in vitro. Учитывая антагонизм сигнальных путей, через которые реализуются эффекты холинергических соединений, и цАМФ-зависимого сигнального пути на внутриклеточном уровне, одной из задач явилась сравнительная оценка эффектов теофиллина - агента, повышающего уровень цАМФ.

Материалы и методы. В опытных пробах 25 мкл крови преинкубировали с 12,5 мкл препаратов на полной питательной среде (ППС, среда 199 с добавлением 2 мМ L-глутамина и 10 мМ HEPES) в течение 1 часа при 370С в пластиковых микропробирках с антиадге-зивным покрытием. В контрольные пробы вместо препаратов вносили 12,5 мкл ППС. Затем во все пробирки вносили по 12,5 мкл формалинизированных эритроцитов барана (ФЭБ; 200 106/мл ППС, объекты фагоцитоза). Пробы инкубировали 20 мин при 370С. На мазках, окрашенных по Романовскому, дифференцированно учитывали показатели нейтрофильного, моноцитарного и эозинофильного фагоцитоза, рассчитывали комплекс описанных ранее показателей [Ю.И. Шилов с соавт., 1997; 1998]. Дополнительным контролем служили пробы без преинкубации.

Основные результаты. Выявлено, что в концентрациях 10-9, 10-11 М пилокарпин активировал нейт-рофильный и моноцитарный фагоцитоз (таблица),

Таблица. ВЛИЯНИЕ ПИЛОКАРПИНА НА ФАГОЦИТАРНУЮ АКТИВНОСТЬ НЕЙТРОФИЛОВ И МОНОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ЗДОРОВЫХ ЛЮДЕЙ

Воздействие Фагоцитарное число Фагоцитарный индекс Процент фагоцитоза Процент активных фагоцитов Абсолютное число фагоцитирующих клеток

I. Нейтрофильный фагоцитоз Без преинкубации Контроль (преинкубация в ППС) Пилокарпин (10-11 М) Пилокарпин (10-9 М) II. Моноцитарный фагоцитоз Без преинкубации Контроль (преинкубация в ППС) Пилокарпин (10-11 М) Пилокарпин (10-9 М) G,96±G,13 G,94±G, 18 1,25±G,2GtT 1,18±G,17T G,88±G,21 G,78±G,18tWT 1,69±G,35 1,46+G,25,wt 1,7G±G,96 1,71±G, 13 1,9G±G,13tT 1,65±G,13 1,63±G, 14 1,55±G,14tT 2,2G±G,28 2,G7±G,17tWT 54,77+4,43 51,18±б,7б 62,46+7,G3t 6G,45+7,99t 48,б5+8,87 4б,98+8,11 72,19+7,74tWT 69,46+9,G2,wt 25,27+4,5G 24,G4+5,51 32,5G+6, 12tT 3G,16+5,G6 22,5б+б,42 19,G2+5,44 42,25+8,66,wt 42,73+9,36,wt 33,G4,23+457,89 3237,G1+651,63 3923,GG+697,77,t 3664,72+582,18t 326,G7+122,82 282,бб+99,33 452,82+134,51t 42G, 13+ 12б, 28tT 5709,25±949,84 5910,63±1432,87 7Щ02±1612,33( 7100,03±1401,45‘' 646,19±289,51 105,64±38,74 1080,69±402,271' 853,14±295,89‘

1 - р < 0,05 в сравнении с контролем по парному 1-критерию Стьюдента; т - то же по парному знаковому Т-критерию Вилкоксона; - то же по W-критерию суммы рангов Вилкоксона; число обследованных (п) во всех выборках равно 9.

причем эффект был более выражен в концентрации 10-11 М. На фагоцитарную активность эозинофилов пилокарпин оказывал разнонаправленный эффект, угнетая активность в концентрации 10-3 М и активируя в концентрациях 10-6-10-9 М. Теофиллин в концентрации 3-10-3 М оказывал резко выраженный супрессивный эффект на популяции гранулоцитов - нейт-рофилов и эозинофилов, практически не влияя на мо-ноцитарный фагоцитоз.

Заключение. Полученные результаты подтверждают участие холинергических соединений и цАМФ-за-висимых путей в регуляции функций фагоцитирующих клеток.

Роль калия

в иммуномодулирующем действии хорионического гонадотропина

Ширшев С.В., Лялина О.Г., Заморина С.А.

Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь, Россия

Хорионический гонадотропин (ХГ), являясь плацентарным гормоном, играет важную роль, как в регуляции процессов репродукции, так и модуляции им-мунокомпетентных клеток. Моноциты, выступающие основными антигенпрезентирующими клетками и ци-токинпродуцентами, считаются главной мишенью для иммуномодулирующих эффектов ХГ. Известно, что функциональная активность макрофагов тесно связана с внутриклеточным содержанием калия ([К+^), который принимает участие в инициации процессов пролиферации и клональной экспансии. В связи с вышесказанным, целью работы была оценка роли калия в моноцит-регулирующем действии ХГ и его связи с фазами менструального цикла.

Работа проводилась на фракционированных моноцитах периферической крови женщин, находящихся в фолликулярной и лютеиновой фазах менструального цикла. Чистота выделения по оценке иммунофлуорес-центным методом с использованием моноклональных антител к CD14 составляла 73-85%. Клетки преинку-бировались с ХГ в физиологических дозах (10, 50 и 100 МЕ/мл) в течение 10, 30 и 60 мин. Фагоцитарная активность моноцитов оценивалась по поглощению фор-малинизированных эритроцитов барана с последующим расчетом процента фагоцитирующих клеток; фагоцитарного числа и фагоцитарного индекса, отражающих поглотительную способность моноцитов. Уровни [К+^ в клетках определяли методом пламенной фотометрии.

ХГ, вне зависимости от дозы и фазы овариального цикла, достоверно снижал уровни [К+^ в моноцитах в динамике культивирования. После часовой инкубации низкие дозы ХГ (10, 50 МЕ/мл) оказывали статисти-

чески значимый депрессивный эффект на поглотительную способность моноцитов женщин, находящихся в фолликулярной фазе цикла, не влияя на уровень [К+]і. В то же время, высокая доза гормона (100 МЕ/мл), напротив, приводила к достоверному повышению [К+]і, не оказывая существенного влияния на фагоцитарную активность клеток. Таким образом, фагоцитарная активность моноцитов фолликулярной фазы не связана с гормональной модуляцией уровня [К+]і. Изучение мо-ноцит-модулирующих эффектов ХГ на клетках, полученных в лютеиновую фазу овариального цикла, показало, что повышение уровня [К+]і под действием ХГ100 МЕ/мл на 60-й минуте инкубации сопровождается достоверным увеличением процента фагоцитирующих моноцитов. При этом поглотительная способность фагоцитов существенно не изменялась. Таким образом, ХГ в дозе, отражающей уровень гормона в Г триместр беременности, повышает количество фагоцитирующих моноцитов женщин, находящихся в лютеи-новой фазе овариального цикла, и это действие связано с изменением уровня [К+]і. Не исключено, что компонентом, который запускает молекулярные механизмы, сопрягающие уровень [К+]і с функциональной активностью моноцитов, является прогестерон, доминирующий в данной фазе менструального цикла.

Изучение влияния секреторных продуктов нейтрофилов больным атопическим дерматитом на морфологические характеристики иммунокомпетентных органов мышей линии СВА

Яровинский Б.Г., Зурочка А.В.,

Гиниятуллин А.В., Биргер О.В., Егоров В.А.

Уральская Государственная Академия Дополнительного Образования, Челябинск, Россия

Введение: Изучали влияние секреторных продуктов нейтрофилов больных атопическим дерматитом (АД) в фазе обострения на изменение клеточного состава иммунокомпетентных органов мышей линии СВА.

Цель: Определение патогенетической значимости секреторных продуктов нейтрофилов, полученных от больных АД в стадии обострения, и оценка их влияния на иммунокомпетентные органы мышей линии СВА.

Задачи: Изучение воздействия супернатантов активированных и неактивированных нейтрофилов больных АД на изменение морфологических характеристик тимуса, селезенки и оценка колониеобразующей активности клеток костного мозга мышей линии СВА.

Материалы и методы: Супернатанты активированных и неактивированных нейтрофилов, полученные от больных АД, вводили трехкратно по 0,02 мл через 48 ч мышам линии СВА. Результаты опыта оценивали на 14 сутки. Контролем служило введение физиологического раствора в том же обьеме, и в те же сроки. Выбор дозировки определен работами Зуроч-ки А.В (1991г.). Для гистологического исследования использовались тимус, селезенка. Органы фиксировались 10% нейтральным формалином с последующей воск-парафиновой проводкой и приготовлением гистологических срезов толщиной 4-6 мкм. Препараты окрашивались гематоксилином и эозином. Для оценки напряженности иммунных реакций в срезах тимуса и селезенки проводили морфометрическое исследование с помощью стереометрической сетки Г.Г.Ав-тондилова (1973). При этом подсчитывали обьемную плотность (%) каждого изучаемого параметра тимуса и селезенки. Оценка роста колоний и кластеров ГМ-ряда кроветворения мышей линии СВА проводилась методом клонирования коммитированных гемопоэти-ческих клеток-предшественников гранулоцитарномо-ноцитарного ряда костного мозга мышей. Костный мозг бедренной кости мышей вымывался из трубчатой костной муфты, просвет которой создавался путем срезания кости в эпифизарных частях, двумя миллилитрами среды 199. Вымытая из кости кроветворная ткань последовательно пропускалась через набор игл с уменьшающим диаметром для получения суспензии костного мозга. Полученная суспензия фильтровалась через капроновый фильтр для удаления клеточных агрегатов и стромальных элементов, после чего трижды отмывалась средой 199. Выделение мо-нонуклеаров проводилось градиентным центрифугированием (фиколл-верографин, плотность 1,077кг/л). Для клонирования коммитированных клеток-предше-ственников использовались микрокамеры конструкции Попова И.Г (рац. предл. ЧМИ от 27.09.85 № 257,258) . После заполнения и герметизации микрокамеры, содержащие мононуклеары костного мозга исследуемых мышей, имплантировались в брюшную полость крыс-реципиентов (линия Вистар). Через семь суток после имплантации под эфирным наркозом крысы-реципиенты забивались путем дислокации шейных позвонков, а микрокамеры извлекались из брюшной полости. Для подсчета образовавшихся колоний и кластеров из содержимого микрокамер приготавливались мазки на предметных стеклах. После фиксации метанолом препарат окрашивался по Гимза-Романовско-му. При просмотре в мазке определялись равномерно расположенные группы клеток гранулоцитарного и макрофагального типов. За кластеры принимались образования, содержащие от 4 до 19 клеток; образова-

ния, содержащие от 20 до 49 клеток классифицировались как малые колонии, более 50 клеток- как большие колонии. Учет колоний проводился также по морфологическому типу. Отдельно учитывались колонии, состоящие преимущественно из гранулоцитов, моноцитов-макрофагов и колонии, содержащие в равной мере гранулоциты и макрофаги.

Основные результаты. Гистологические исследования показали, что в вилочковой железе животных, получавших супернатанты нейтрофилов, активированных латексом (САН), и супернатанты интактных нейтрофи-лов (СНН), полученных от больных АД в стадии обострения, обнаруживалась картина, характерная для второй фазы акцидентальной трансформации. Данная фаза проявлялась очаговой убылью тимоцитов из коркового слоя и “налипанием” их на макрофаги. Корковое вещество оставалось широким и четко отграничивалось от более узкого мозгового слоя. В последнем были видны мелкие эпителиальные островки. Междольковые со-единительноткнанные перегородки - тонкие с полнокровными сосудами. В тимусе мышей контрольной группы определялась первая фаза акцидентальной трансформации. Оценка микроскопической картины селезенки опытных животных выявила, что в этом органе обнаруживались чаще мелкие лимфатические фолликулы без светлых центров. Периартериальные Т- зависимые зоны были хорошо выраженными и представлены лимфоидными клетками различных размеров. В синусах красной пульпы преобладали лимфоциты, эритроциты, нередко отмечалась выраженная макрофагальная реакция с формированием гигантских многоядерных клеток. В селезенке животных контрольной группы обнаруживались чаще крупные лимфатические фолликулы без светлых центров, выраженные периартериаль-ные зоны. В синусах красной пульпы регистрировались, как правило, эритроциты, реже лимфоциты и в небольшом количестве- макрофаги. Количество лимфоцитов под воздействием САН и СНН больных в 2-3 раза ниже, чем в контрольной группе. При исследовании костномозгового кроветворения было отмечено, что донорские супернатанты вызывали стимуляцию кластеро- и колониеобразования клеток костного мозга мышей линии СВА. В то же время, супернатанты больных такими свойствами не обладали.

Заключение: Таким образом, при введении супернатантов активированных нейтрофилов доноров отмечается системная реакция лимфоидных органов и костного мозга мышей линии СВА, направленная на развитие иммуностимулирующих процессов. Супернатанты больных АД не только не стимулировали костномозговое кроветворение, но и, наоборот, вызывали явления деструкции в иммунокомпетентных органах мышей линии СВА.