Изучение содержания рецептора индукции апоптоза CD-95 [Fas/APO-1] на нейтрофилах секретов репродуктивного тракта у женщин с хламидийной инфекцией

Содержание неспецифической эстеразы, как в абсолютных, так и в относительных значениях достоверно повысилось по сравнению с аналогичными показателями до начала терапии с использованием НИЛИ. Усиление под воздействием НИЛИ воспали-тельно-репаративного процесса связано с активацией нейтрофи-лов, с усилением секреции этими клетками лизосомальных ферментов и кислородных радикалов, детерминирующих вторичное повреждение ткани со стимуляцией макрофагов и фибробластов.

Выводы. У больных с генитальной хламидийной инфекцией наблюдается дисфункция нейтрофилов цервикального секрета, которая выражается в снижении активности и интенсивности фагоцитоза, уровня неспецифической эстеразы в нейтрофилах цервикальной слизи, лизосомальной активности. Применение НИЛИ снижает выраженность лейкоцитарной реакции, однако усиливает лизосомальную и НСТ-редуцирующую активность цервикальных нейтрофилов, способствует более быстрой нормализации фагоцитарной активности и функционального резерва в НСТ-реакции. Использование схем лечения с включением методов НИЛИ позволяет нормализовать показатели функциональной активности нейтрофилов цервикального секрета.

Литература

1. Анкирская А. С. // Акуш-во и гинекология.- 1999.- № 3.— С. 8—10.

2. Бартенёва Н.С. / В кн. Хламидийные инфекции / Под ред. А. А. Шаткина.— М. 1986.—.С.14—20.

3. Бурова А.А. и др. // Ж. микробиол., эпидемиол. и иммуно-биол.— 1999.— № 4.— С. 107.

4. Буйлин В.А. Москвин С.В. Низкоинтенсивные лазеры в терапии различных заболеваний.— М.,2001.

5. Гомберг М.А. и др. // Заболевания, передаваемые половым путем.— 1997.— № 4.— С. 34—36.

6. Коэн К.Р., Бранэм Р.К. // Инфекции, передаваемые половым путем.— № 6.— 1999.— С. 5—12.

7. Курносенко И.В. Клинико-иммунологические аспекты цервицитов хлаимидийной этиологии. Автореф...к..м.н.— Челябинск, 2001.

8. Ларюшин А.И. , Илларионов В.Е. Низкоинтенсивные лазеры в медико-биологической практике.— Казань, 1997.

9. Прикладная лазерная медицина: Рук-во для врачей / Под ред.Х.-П. Бермена Г.Й Мюллера: Пер с нем.— М., 1997.

УДК 616.137.73; 616.5-004.1111-008:61.849.19

ИЗУЧЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ РЕЦЕПТОРА ИНДУКЦИИ АПОПТОЗА -ОБ-95 [Раз/АРО-1] НА НЕЙТРОФИЛАХ СЕКРЕТОВ РЕПРОДУКТИВНОГО ТРАКТА У ЖЕНЩИН С ХЛАМИДИЙНОЙ ИНФЕКЦИЕЙ.

И.И. ДОЛГУШИН, О.А. ГИЗИНГЕР, К.Г. ИШПАХТИНА*

Поддержание гомеостаза, в т.ч. и клеточного, является одним из основных свойств живых организмов. Оно осуществляется при уравновешивании процессов клеточной пролиферации и клеточной гибели. Последнее десятилетие отмечено постоянным нарастанием интереса к открытому около сорока лет явлению, названному «программированная клеточная смерть» или апоптоз [1,3,7,8]. Так как апоптоз вовлечён в большинство основных механизмов регулирования иммунной системы, то клеточная смерть, является важным компонентом в биологическом процессе [1,4, 8]. Около 10 лет назад на цитоплазматической мембране клеток открыт первый специализированный рецептор для индукции апоптоза - ОБ-95 [Рав/АРО-1] [5]. Связывание с рецептором моноклональных антител или специфического лиганда ОБ-95Ь/РавЬ индуцирует в чувствительных клетках апоптоз. ОБ-95-рецептор принадлежит к суперсемейству фактора некроза опухолей. Накоплена информация об экспрессии ОБ-95+ лимфоцитами, моноцитами, эозинофилами периферической крови, но часто эти данные противоречивы. Одни исследователи не обнаруживают антиген на покоящихся лимфоцитах, другие его выявляют. Покоящиеся Т-клетки не экспрессируют ОБ-95 антиген, однако выявляют антиген на покоящихся Т-клетках, моноцитах, лимфоцитах, нейтрофилах периферической крови [5,6]. У здоровых взрослых ОБ-95 экспрессирован на лимфоцитах в 23,8 % [9].

* НИИ иммунологии Челябинской ГМА

Постоянная экспрессия CD-95 антигена ограничена ней-трофилами, поскольку только нейтрофилы чувствительны к Fas опосредованному апоптозу. Повышенное содержание нейтрофи-лов в биологических жидкостях является важным индикатором воспалительного процесса репродуктивного тракта [2,8]. Представляет интерес изучение апоптоза нейтрофилов у больных с заболеваниями урогенитального тракта, вызванного инфекциями, передаваемыми половым путём, как одного из возможных механизмов дальнейшего их прогрессирования и усложнения клинической ситуации. Контроль клеточной гибели хламидиями является одним из ведущих механизмов ухода от защитных факторов макроорганизма. При инфекционной патологии апоптоз - это протективная реакция организма, направленная на предотвращение развития инфекции. Подавление апоптоза ведет к диссемина-ции возбудителя в ткани и органы, распространению инфекции, выживанию патогена и его персистенции.

Подавление апоптоза связано с внутриклеточным типом паразитирования. Такое взаимодействие реализуется в результате действия отдельных структурных компонентов бактериальной клетки либо секретируемых молекул с внутриклеточным типом паразитирования. Такое взаимодействие реализуется в результате действия компонентов бактериальной клетки или секретируемых молекул с конкретными звеньями сигнального пути, ведущего к апоптозу. Факторы, активирующие апоптоз, могут служить привлекательными мишенями для физико-химических воздействий. Такого типа воздействия, активирующие апоптоз на фоне инфекции, обусловленной внутриклеточными паразитами, - единственный на данный момент подход для элиминации персистирующих форм возбудителя и борьбы с хроническими инфекционными заболеваниями урогенитального тракта [4-7].

Хламидии являются теми патогенами, для которых достаточно чётко показано участие в контроле апоптоза клеток хозяина, для них характерна про- и антиапоптозная активность. Индукция или подавление апоптоза на уровне макроорганизма определяет характер развития инфекции: продуктивная инфекция или персистентная. Такое комплексное влияние объясняется рядом обстоятельств: во-первых, хламидии могут колонизировать многие клетки и ткани, а механизм ответа на интернализацию патогена специфичен для разных клеток. Во-вторых, для разных штаммов хламидий показано преобладание той или иной активности. В-третьих, на разных этапах жизненного цикла хламидий целесообразна та или иная тактика, подавление на первых этапах внутриклеточного размножения и активация апоптоза на этапе выхода инфекционных элементарных частиц и образование внут-риклеточно выживающих персистирующих форм, также сопряженное с поддержанием жизни клетки [6,8].

Цель работы - изучение содержания CD-95+ на нейтрофи-лах цервикального и вагинального секретов здоровых женщин и женщин с хламидийной инфекцией.

Материалы и методы. Под наблюдением находились 52 женщин с хламидийной инфекцией. Набор в группы производился из числа обратившихся за медицинской помощью в Областной кожвендиспансер №2 г. Челябинска в 2006-2007 гг. Группу сравнения составили 30 женщин без хламидийной инфекции и гинекологической патологии. Диагноз генитального хламидиоза ставился при выявлении возбудителя в цервикальном канале методами прямой иммунофлюоресценции («НПФ Лабдиагностика», Москва) и полимеразой цепной реакции («Литех», Москва).

Таблица 1

Цитограмма цервикального секрета

Показатели Здоровые п=30 Хламидии п=52 Достоверность различий, р <0,005

группа 1 группа 2

Абс. кол-во нейтрофилов, 109/л, абс 0,06±0,68 7,3±0,71 р [1-2]

Нейтрофилы, % 95,72±1,68 98,34±2,25 р [1-2]

Абс. кол-во мононуклеары, 109/л, абс 1,72±0,45 1,03±0,25 р[1-2]

Мононуклеары, % 1,94±1,06 1,52±0,42 рл-ч

Примечание: здесь и далее приведены лишь достоверные различия между сравниваемыми группами. С учетом поправки Бонферони критический уровень р составил 0,005. и - критерий Манна - Уитни

Возраст обследованных - 25-35 лет (28,5±0,5) и существенно не отличался от возраста здоровых из группы сравнения. Большинство было репродуктивного возраста. Курс лечения хламидиоза включал: азитромицин 1 г 1 раз в сутки на 1 , 7, 14

день лечения перорально, циклоферон 2 мл № 10 внутримышечно. На протяжении всего курса применения антибиотиков больные обеих групп получали антимикотики, ферменты, витамины, бифидумбактерин по 5 доз 3 раза в сутки в течение 20 дней.

Таблица 2

Цитограмма вагинального секрета

Показатели Здоровые п=30 Хламидии п=З2 Достоверность различий, р <0ДО

группа 1 группа 2

Абс. кол-во нєйтрофилов,109іл, aбс 2,42±2,44 9^4±0,81 р[1-2]

Абс. кол-во мононуклеаров, 1091л , абс 0,87±0,12 0,87±0,1 р[1-2]

Нейтрофилы, % 96,2±4,37 97^±2,96 р[1-2]

Мононуклеары, % 1,29±0,91 2,99±0,87 р[1-2]

Таблица 3

CD-95+ нейтрофилов цервикального секрета

Показатели Здоровые п=30 Хламидии до лечения п=З2 Хламидии после лечения. п=З2 Достовер- ность различий, р <0ДО

группа 1 группа 2 группа 3

CD-95+, % 7±2,З 3±1¿ 10±1,2 р[1-2],[1-3]

Таблица 4

CD-95+ нейтрофилов вагинального секрета

Показатели Здоровые [п=30] Хламидии до лечения [п=З2] Хламидии после лечения [п=З2] Достоверность различий, р <0ДО

группа 1 группа 2 группа 3

CD-95+, % 4,2±1,3 2^±0,9 6,1±1,1 р[1-2],[1-3]

Для исследования выбраны цервикальный и вагинальный секреты, поскольку, по данным большинства исследователей, занимающийся проблемой урогенитального хламидиоза, именно шейка матки и влагалище являются местом наибольшей иммунологической активности репродуктивного тракта и местом наиболее частой локализации хламидийной инфекции. Забор цервикальной и вагинальной слизи вели с помощью специальной градуированной пипетки. Слизь помещали в 1,0 мл физиологического раствора или среды 199, тщательно суспендировали. Для выявления поверхностного маркера (антигена) CD-95 клеток нами были использованы моноклональные антитела, имеющие соответствующую направленность и специфичность, конъюгирующие с меткой, например, с люминесцирующим красителем. Исследование велось по методике иммунофенотипирования в модификации С.В.Сибиряк и соавт. (1997) с использованием моноклональных антител серии ИКО (НПЦ «МедБиоСпектр», Москва):

1. Нейтрофилы в разведении 2х106 в объеме 50,0 мкл вносили в центрифужные пробирки. К клеткам добавляли 5,0 мкл соответствующего моноклонального антитела [мышиного] и инкубировали 30-45 мин. При t +4°С в темноте.

2. Добавляли 150,0 мкл раствора Хенкса и центрифугировали 5 мин. При 2000 об/мин. Супернатант удаляли, затем клетки ресуспендировали в 150,0 мкл раствора Хенкса и центрифугировали 5 мин при 2000 об/мин.

3. Супернатант удаляли, осадок отмытых клеток ресуспен-дировали в 50,0 мкл F[ab] 2-фрагментов овечьих антител к Ig мыши, меченных ФИТЦ и разведенных 1:100. Для разведения использовали физиологический раствор, забуференный фосфатами, содержащий 0,5% желатины и 0,1% азида натрия. Клетки ресуспендировали и инкубировали 30 мин. при t +4°С в темноте.

4. Клетки 2 раза отмывали, как указано в п. 3.

5. Подсчет окрашенных клеток производили с помощью люминесцентного микроскопа «ЛЮМАМ» [объектив х 90, окуляр х 1,7]. Перед этим клетки ресуспендировали. Полученную суспензию наносили на предметное стекло, накрывали покровным стеклом. Препарат просматривали под иммерсией (нефлюоресцирующее иммерсионное масло) в затемненном помещении. Если результаты учитывались лишь через несколько часов, то после заключительного центрифугирования и удаления супернатанта клетки фиксировались. Для этого к осадку клеток добавляли 50,0 мкл раствора формалина, разведенного 1:40 на физиологическом растворе, забуференном фосфатами, содержащем 0,5% желатины и 0,1% азида натрия.

6. Количество антиген-позитивных клеток определяли, как процент флюоресцирующих клеток, наблюдаемых в препарате отрицательного контроля. В качестве отрицательного контроля использовали препараты, приготовленные аналогичным образом,

за исключением того, что вместо моноклональных антител к клеткам добавляли раствор Хенкса.

Полученные результаты исследований были подвергнуты обработке методами вариационной статистики с вычислением средней арифметической и ее стандартной ошибки [М±т]. Для каждого показателя проверялась статистическая гипотеза о нормальности распределения данных по критерию %2 и Колмогорова - Смирнова о равенстве дисперсий. В случае нормального распределения о достоверности различий средних величин судили по t-критерию Стьюдента. Если условия нормальности распределения не выполнялись, мы применяли непараметрический критерий Манна - Уитни. Цифровой материал обрабатывался методом вариационной статистики с помощью пакета прикладных программ «Statistica for Windows» версия basis.

Результаты. При изучении клеточного состава цервикального и вагинального секретов было выявлено увеличение количества нейтрофилов до 98% от общего количества клеток, присутствующих в секретах (табл. 1-2), это позволило провести их CD-типирование. Нами был изучено содержание CD-95+ нейтрофилов учитывая, что именно они чувствительны к Fas опосредованному апоптозу. В табл. 3-4 приведены значения CD-95+ цервикального и вагинального секретов у больных с хламидийной инфекцией. В ходе исследования выявлено снижение числа CD95+ рецепторов для апоптоза нейтрофилов цервикального и вагинального секретов у лиц с хламидиозом по сравнению со здоровыми (табл.2-3). Сниженный уровень готовности к апопто-зу указывает на спад активности иммунорегуляторных клеток.

Нами исследовано содержание CD95+ после проведения противохламидийной терапии: выявлено увеличение CD95 на поверхности нейтрофилов. Хотя до сих пор не известен механизм этого явления, возможно, препараты, входящие в курс противо-хламидийной терапии, инициируют на поверхности клеток экспрессию CD95-лиганда, который затем связывается с CD95-рецептором, локализованным на поверхности этих клеток, что ведет к передаче сигнала смерти. Этот же механизм был ранее обнаружен при исследовании апоптоза в Т-клетках. При помощи данной гипотезы можно объяснить и результаты по индукции апоптоза в процессе химиотерапии в CD-95+ бластах костного мозга [1]. Апоптоз нейтрофилов ведет к активизации макрофагов, связывающих тромбоспондин (белок в зонах воспаления), способствуя прекращению воспалительных явлений [6-8].

Литература

1. Барышников А.Ю. , Шишкин Ю.В. Иммунологические проблемы апоптоза.- М., 2002.- 291с.

2. Бурова А.А. и др // Ж. микробио., эпидемиол. и иммуно-биол.- 1999.- № 4.- С. 107.

3. Владимирская Е.Б. и др. // Гематол. и траннсфузиол.-1997.- Т.42,.№ 5.- С 4-9.

4. Зенков Н.К. и др. // Успехи соврем. биол.- 1999.- Т.119, № 5.- С.440-450.

5. Программированная клеточная гибель / Под ред. В.С. Новикова.- СПб.: Наука.- 1996.- 276 с.

6. Нестерова И.В. // Цитокины и воспаление. - №3.- С. 89.

7. Сидоренко С.П. // Экспер. онкол.- 1990.- Т. 20.- С.15-28.

8.Толыбеков Ф.С. Морфогенез и вопросы патогенеза инфекционных процессов, вызванных хламидиями: Автореф. дис... д-ра мед. наук.- Л., 1979.- 32с.

9.Holzman D. // ASM News.- 1994.- Vol 60, № 12.- Р. 634.

УДК616.24-036.12-008.8-076-078

АНАЛИЗ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ПЕЙЗАЖА МОКРОТЫ И СОДЕРЖАНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКИХ ЮЕ У БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКОЙ ОБСТРУКТИВНОЙ БОЛЕЗНЬЮ ЛЕГКИХ

О.О. МИХАЛЕВА, Д.Р. ВАГАПОВА, Т.И. ВЕРЕВКИНА, В.И. НИКУЛИ-ЧЕВА*

Хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) явля-етсянаиболее часто регистрируемым заболеванием, в связи с этим решение вопросов разработки новых методов диагностики и терапии ХОБЛ является крайне актуальным [5,9]. Одной из основных причин в развитии обострения ХОБЛ являются бактери-

* Башкирский ГМУ, 450000 г. Уфа, ул. Ленина, дом 3