Исследование бактерио- и фунгистатических свойств липидной фракции и доклинические испытания сенсибилизирующей активности экстракта из дальневосточных видов голотурий

УДК 577.115+593.96:687.5

исследование бактерио- и фунгистатических свойств липидной фракции

и доклинические испытания сенсибилизирующей активности экстракта

из дальневосточных видов голотурий

Л.С. Долматова1, Н.Ф. Тимченко2

1 Тихоокеанский океанологический институт им. В.И. Ильичева ДВО РАН (690041 г. Владивосток, ул. Балтийская, 43),

2 Институт эпидемиологии и микробиологии СО РАМН

Ключевые слова: экстракт из голотурий, липиды, бактериостатическое действие, фунгистатическая активность.

В эксперименте на крысах исследован вклад липидной фракции комплекса биологически активных веществ экстракта из дальневосточных голотурий Eupentacta fraudatrix и Cucumaria japonica в его бактериостатическое и фунгистати-ческое действие, проведены доклинические испытания сенсибилизирующих свойств экстракта. Показано, что фракция общих липидов комплекса в концентрации 5-20 мкг/мл полностью тормозила рост Yersnia pseudotuberculosis в течение 2 суток инкубации in vitro, а полное ингибирование роста Candida albicans происходило при концентрации липидов 14-56 мкг/мл уже через сутки. Установлено отсутствие сенсибилизирующей активности экстракта в дозе 6 мг/кг и незначительная сенсибилизирующая активность препарата в дозе 60 мг/кг. Не отмечено также кожно-раздражающего действия препарата. В целом проведенные исследования свидетельствуют о важной роли липидной фракции экстракта из голотурий в его дерматологических эффектах, что может иметь значение для дальнейшей разработки препаратов из этих гидробионтов.

Липиды играют большую роль в устойчивости кожи к различным заболеваниям, в том числе акне, аллергической патологии, бактериальным инфекцям [9]. В частности, лечебную эффективность многих косметических средств обеспечивают входящие в их состав холестерин и жирные кислоты. Однако наиболее перспективными здесь являются фосфолипиды. В регенерирующей косметике используются сфин-голипиды (сфингофосфолипиды), в основе которых лежит длинноцепочечный аминоспирт сфингозин, а также их метаболиты церамиды (жирнокислотные эфиры сфингозина), получаемые преимущественно из растений. Заполняя пространство между ороговевшими клетками, церамиды повышают устойчивость эпидермиса. Они способны накапливать и передавать влагу, предупреждая сухость, шелушение, дряблость кожи [9].

Метаболиты сфинголипидов (церамиды, сфин-гозин, сфингозин-1-фосфат, сфингозинфосфонат) рассматриваются в настоящее время как новый класс вторичных липидных посредников, способных регулировать пролиферацию и размножение клеток [14]. Перспективным источником сфинголипидов могут быть морские беспозвоночные [13]. Оригинальными методами экстракции из тканей дальневосточных

Долматова Людмила Степановна - канд. биол. наук, вед. н. с. лаборатории биофизики ТОИ ДВО РАН; тел.: 8 (4232) 31-25-80, e-mail: dolmatova@poi.dvo.ru

голотурий Eupentacta fraudatrix, Cucumaria japonica, Apostichopus japonicus получен комплекс биологически активных веществ (БАВ), эффективно ингибирую-щий рост грибов и бактерий [3]. Экстракт отличается относительно небольшим содержанием липидов (до 8 %), при этом доля нейтральных жиров в их общем количестве составляет до 88 % [4]. Доля фосфолипи-дов составляет 12-18 % (в зависимости от вида голотурий). На основе экстракта была разработана серия лечебно-профилактических косметических средств «Пентакан».

Представляется вероятным, что экстракт из голотурий может оказывать выраженное защитное действие на кожу за счет присутствия в нем целого ряда веществ липидной природы. Вместе с тем необходимо учитывать, что многие комплексы биологически активных веществ из морских животных обладают значительным сенсибилизирующим эффектом.

Целью данного исследования явился анализ вклада липидной фракции комплекса БАВ из голотурий в его бактериостатическое и фунгистатическое действие, а также доклинические испытания сенсибилизирующих свойств экстракта.

Материал и методы. Экстракцию БАВ из тканей голотурий E. fraudatrix и C. japonica проводили по собственной методике [3]. Общие липиды выделяли посредством метаноловодно-хлороформ-ной экстракции [10]. Для испытаний противо-микробной активности использовали несущий плазмиду вирулентности штамм бактерии Yersinia pseudotuberculosis 512 pYV+, выделенный от больного человека. Противогрибковую активность испытывали по отношению к Candida albicans. Микроорганизмы из исходного разведения, а также через 1, 2 и 3 суток инкубирования с образцами липидов при 37 °С высевали на плотную диагностическую среду 67 [7]. Антимикробную активность оценивали по числу колониеобразующих единиц (КОЕ) [8]. Сенсибилизирующее действие экстракта изучали по ГОСТ Р ИСО 10993.10-99 [2].

При исследовании сенсибилизирующей активности экстракта использовали крыс-самок линии Вистар массой 230±20 г. Животные были разделены на три группы по 5 особей: 1) контрольная группа,

Оригинальные исследования

49

Таблица 1

Влияние фракций общих липидов комплекса БАВ из голотурий на размножение Y. pseudotuberculosis

lgKOE, M±m

Сутки контроль липидная фракция

20 мкг/мл 5 мкг/мл

0 1,75±0,13 1,36±0,16 2,20±0,21

1 1,10±0,05 0 2,32±0,08

2 2,15±0,24 0 0

2) группа, получавшая экстракт в дозе, близкой к лечебной (6 мг/кг), 3) группа, получавшая десятикратную дозу (60 мг/кг). Крысам опытных групп для предварительной сенсибилизации внутрикожно вводили 0,02 мл водного раствора экстракта (в контроле - дистиллированной воды). Результаты наблюдения за состоянием кожи с целью исключения раздражения фиксировали через 15 мин, 1, 24, 48 и 72 часа. Через 10 суток проводили пять аппликаций по 0,5 мл растворов комплекса БАВ на выстриженные заранее участки кожи размером 1x1 см (в контроле -0,5 мл воды). Ежедневно отмечали наличие или отсутствие видимой реакции и оценивали ее выраженность в соответствии с существующими рекомендациями [2]. Через 1 сутки после последней аппликации выполняли провокационную пробу. Для этого 0,02 мл раствора экстракта вводили внутрикожно в противоположный аппликациям бок каждого животного. Реакцию на пробу отмечали через 15 мин, 24 и 48 часов.

Через 48 часов после внутрикожной пробы животных забивали декапитацией и отбирали кровь для специфических иммунологических реакций [5]: дегрануляции тучных клеток, пассивной гемагглю-тинации, специфической агглютинации лейкоцитов. При постановке реакции пассивной гемагглютина-ции использовали эритроциты барана, фиксированные формалином, а затем таннизированные и сенсибилизированные к комплексу БАВ голотурий в концентрациях 0,01 или 0,02 %. Постановку реакции специфической агглютинации лейкоцитов проводили по микрометоду Kissmeyer-Nielsen, van Rood

[11], выделение тучных клеток - по методу Kruger

[12], постановку реакции дегрануляции тучных клеток - по методу О.Г. Алексеевой и Л.А. Дуевой [1]. Показатель дегрануляции тучных клеток (ПДТК) рассчитывали по формуле:

ПДТК = (1а+2б+3в+3г):100,

где а, б, в, г - количество (среднее из трех повторений) дегранулированных клеток соответственно степени дегрануляции (слабо, умеренно, резко и полностью дегранулированные клетки).

Кроме этого, выполняли взвешивание тимуса и селезенки, определяли индексы их массы (в мг на 100 г массы животного). Степень аллергенной активности препарата устанавливали по комплексу критериев, с учетом величины сенсибилизирующей дозы. Данные обрабатывали методами вариационной статистики.

Результаты исследования и обсуждение полученных данных. Липиды комплекса БАВ голотурий ин-гибировали рост Y. pseudotuberculosis в течение первых двух суток. При этом при концентрации 20 мкг/ мл полное торможение роста регистрировалось уже через 1 сутки (табл. 1).

Все исследованные концентрации липидной фракции комплекса БАВ вызывали и 100 % подавление роста C. albicans. Фунгистатическое действие проявлялось в том же диапазоне концентраций, что и противомикробное (табл. 2). Это подтверждает роль липидной фракции в дерматологических эффектах экстракта из голотурий и может иметь значение для дальнейшей разработки форм препарата.

Было установлено, что предварительная внутри-кожная сенсибилизация экстрактом при концентрации 6 мг/кг не оказывала раздражающего действия на кожу, а при концентрации 60 мг/кг регистрировалось слабое раздражение. При многократной аппликации и при проведении провокационной пробы ни у одного животного не было выявлено эритемы или отека. При постановке реакции пассивной гемагглю-тинации положительный результат (агглютинация) не обнаружен ни при одном разведении экспериментальных антисывороток. В реакции агрегации лейкоцитов отмечено, что если в контроле агрегаты

Таблица 2

Показатели жизнеспособности C. albicans при воздействии липидов комплекса БАВ из голотурий

56 мкг/мл 28 мкг/мл 14 мкг/мл

Контроль Опыт Контроль Опыт Контроль Опыт

ки т & КОЕ в 1 мл, 106 lg»OE, M±m КОЕ в 1 мл, 106 ^КОЕ, M±m КОЕ в 1 мл, 106 ^КОЕ, M±m КОЕ в 1 мл, 106 ^КОЕ, M±m КОЕ в 1 мл, 106 ^КОЕ, M±m КОЕ в 1 мл, 106 ^КОЕ, M±m

1 5 6,60±0,01 0 0 1,1 6,01±0,01 0 0 12 7,09±0,13 0 0

2 18 7,25±0,30 0 0 10,0 7,60±0,20 0 0 126 8,10±0,50 0 0

3 100 8,20±0,02 0 0 - - - - - - - -

4 1520 9,18±0,04 0 0 - - - - - - - -

Таблица 3

Влияние экстракта из голотурий на массу иммунокомпетентных органов

Индекс массы, мг/100 г

Орган контроль опыт

6 мг/кг 60 мг/кг

Тимус 147,0±9,7 146,0±15,3 101,8±3,3*

Селезенка 267,0±41,9 319,0±27,4 348,4±12,9*

* Разница с контролем статистически значима.

отсутствовали или присутствовали в незначительном количестве (до 4,2±0,11 %), то при дозе экстракта 6 мг/ кг 6,3±0,17 % клеток образовывали мелкие агглютина-ты. При дозе 60 мг/кг отмечены более крупные агрегаты (до 28,0±0,11 % клеток). Таким образом, некоторый рост концентрации агглютинирующих антител зарегистрирован только в сыворотках животных, получавших экстракт в дозе 60 мг/кг.

При постановке реакции дегрануляции тучных клеток были получены следующие значения показателя дегрануляции: в контроле - 0,074±0,012 %, при дозе экстракта 6 мг/кг - 0,105±0,050 %, при дозе экстракта 60 мг/кг - 0,053±0,008 % (т.е., достоверного роста выраженности дегрануляции по сравнению с контролем не выявлено).

Комплекс БАВ из голотурий в концентрации 6 мг/ кг не оказывал влияния на массу тимуса и селезенки (по сравнению с контролем). Однако индекс массы тимуса достоверно снижался при использовании экстракта в дозе 60 мг/кг, а индекс массы селезенки при этом увеличивался (табл. 3). Формирование гуморального иммунного ответа, в частности, продукция специфических иммуноглобулинов связано главным образом с селезенкой [6]. Поэтому такое изменение массы иммунокомпетентных органов может свидетельствовать о некоторой сенсибилизации, вызванной очень высокой дозой препарата.

В целом проведенные исследования свидетельствуют о важной роли липидной фракции комплекса БАВ из голотурий в его дерматологических эффектах, что может иметь значение для дальнейшей разработки лекарственной формы препарата из этих гидроби-онтов.

Работа выполнена при частичной поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проект № 08-04-99141).

Литература

1. Алексеева О.Г., Дуева Л.А. Аллергия к промышленным химическим соединениям. М.: Медицина, 1978. 271 с.

2. ГОСТ Р ИСО 10993.10-99: Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 10. Исследование раздражающего и сенсибилизирующего действия. М.: Издательство стандартов. 2000. 31 с.

3. Долматова Л. С., Долматов И. Ю. Композиция для лечения и профилактики кожных заболеваний и ран у человека и животных. Патент Еи№ 2183962.27.06.2002 // Бюл. № 18. 2002.

4. Долматова Л.С., Тимченко Н.Ф., Фоменко С.Е. и др. Исследование состава и бактерицидного действия липидной фракции комплекса биологически активных веществ косметического средства «пентакан» // Фитофарм 2006: материалы X Международного съезда 27-30 июня 2006 г. СПб., 2006. С. 67-71.

5. Иммунологические методы / под ред. Г. Фримеля. М.: Медицина, 1987. 472 с.

6. Петров Р.В. Иммунология. М.: Медицина, 1987. 416 с.

7. Серов Г.Д., Вишняков А.К., Знаменский В.А. Методика выделения псевдотуберкулезного микроба // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1968. № 6. С. 146-149.

8. Фурзикова Т.М., Сергейчук М.Г., Сорокулова И.Б., Смирнов В.В. Влияние условий культивирования на некоторые свойства бацилл, составляющих основу пробиотиков // Микробиологический журнал. 1999. Т. 61, № 5. С. 19-27.

9. Эрнандес Е.И., Марголина А.А., Петрухина А.О. Липидный барьер кожи и косметические средства. М.: Фирма «Кла-вель», 2003. 340 с.

10. Folch J., Less M., Sloane-Stanley G.H. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues // J. Biol. Chem. 1957. Vol. 226, No. 1. P. 497-509.

11. Kissmeyer-Nielsen J., van Rood J.J. Micro-agglutination test // Manual of tissue typing techniques. Bethesda: National Institute of Health, 1972. P. 1-2.

12. Kruger P.G. The histamine release process and concomitant structural changes in rat peritoneal mast cells // Int. Archs. Allergy appl. Immunol. 1976. Vol. 51. P. 608-626.

13. Mukhamedova K.S., Glushenkova, A.I. Natural phosphonolipids // Chem. Nat. Compounds. 2000. Vol. 36. P. 329-341.

14. Van Brocklyn J.R., Lee M.-J., Menzeleev R. et al. Dual actions of sphingosine-1-phosphate: extracellular through the Gi-coupled receptor Edg-1 and intracellular to regulate proliferation and survival // J. Cell. Biol. 1998. Vol. 142, No. 1. Р. 229-240.

Поступила в редакцию 04.02.2009.

studying bacteriostatic and fungostatic properties of lipid fraction and pre-clinical trials of sensitizing power of the far eastern holothurian extracts

L.S. Dolmatova1, N.F. Timchenko2

1 V.I. Il'ichov Pacific Oceanological Institute of the Far Eastern Branch of Russian Academy of Sciences (43 Baltiyskaya St. Vladivostok 690041 Russia), 2 Institute of Epidemiology and Microbiology of the Siberian Branch of Russian Academy of Medical Sciences (1 Selskaya St. Vladivostok 690027 Russia) Summary - The paper discusses experimentally investigated role of lipid fraction of a number of biologically active substances derived from the Far Eastern holothurians Eupentacta fraudatrix and Cucumaria japonica in activating bacteriostatic and fungostatic properties, and provides pre-clinical trials of its sensitizing properties. As indicated, the total lipid fraction with the concentration of 5 to 20 mkg/mL is capable of entirely inhibiting the growth of Yersinia pseudotuberculosis during two days of the in vitro incubation. The lipids with the concentration of 14 to 56 mkg/mL are capable of completely inhibiting the growth of Candida albicans during one day. The authors point out there is no sensitizing powers of the extract at the dose of 6 mg/kg, minor sensitizing activity at the dose of 60 mg/kg and absent skin irritant effects. As a whole, the studies highlight an important role of the lipid fraction derived from the holothurians in producing dermatological effects that appear to be of significance for further practical investigations of the hydrobi-ont-derived substances.

Key words: holothurian extracts, lipids, bacteriostatic effects, fungostatic properties.

Pacific Medical Journal, 2011, No. 1, p. 48-50.