СПОСОБ И УСТРОЙСТВО ДЛЯ ПРОТОЧНОЙ ЦИТОМЕТРИИ БЕЗ ОБЖИМАЮЩЕЙ ТЕКУЧЕЙ СРЕДЫ
METHOD AND DEVICE FOR FLOW CYTOMETRY WITHOUT PRESSING FLUID MEDIUM

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к области автоматических устройств для подсчета и определения характеристик взвешенных частиц в жидкой среде и, в частности, к области гематологических приборов для подсчета и определения характеристик клеток различных типов, содержащихся в пробе крови.
Настоящее изобретение относится, в частности, но без ограничения, к способу подсчета и классификации лейкоцитов.
Настоящее изобретение относится также к устройству, использующему упомянутый способ.
Известный уровень техники
Нормальные лейкоциты делят на пять типов: моноциты, лимфоциты, нейтрофилы, эозинофилы и базофилы. Общее число лейкоцитов и их относительное распределение по упомянутым пяти субпопуляциям дает практическому врачу возможность установить патологию или наводит на нее.
Таким образом, существующий уровень техники и предлагаемое изобретение относятся к устройствам для подсчета числа лейкоцитов, содержащихся в пробе крови, и для определения их относительного распределения по пяти субпопуляциям.
В известном патентном документе США 2,656,508 авторов W.H. Coulter и др. описан способ абсолютного подсчета частиц в суспензии путем измерения импеданса. В соответствии с данным способом число частиц в единице объема определяют методом измерения импеданса, который состоит из изменения импеданса проходного микроотверстия, когда клетка крови проходит через него. Данный метод, который прост и устойчив к ошибкам, не нуждается в сложных струйных устройствах и является свободно используемым, так как патент США 2,656,508, который защищает данный метод, датирован 1953 годом. Поэтому упомянутый метод регулярно применяется всеми производителями автоматических устройств (компаниями Beckman Coulter, Abbott, Bayer, C2 Diagnostics, Sysmex, ABX и т.п.) для абсолютного подсчета числа лейкоцитов.
Как известно, в данном методе измерения импеданса, форма импульса, генерируемого при проходе клетки, зависит от геометрии проходного микроотверстия и от траектории клетки в последнем. Известна, например, статья фон Беренса с соавторами (Von Behrens, J. Histochemistry and Cytochemistry, 1976, Том, 24, № 1, стр. 247), в которой описана геометрия линий электрического поля, создаваемого в проходном отверстии прямоугольного или круглого сечения, и форма импульсов сопротивления в зависимости от траектории клетки или частицы в упомянутом проходном отверстии. Большинство устройств известного уровня техники основаны на стремлении минимизировать упомянутую зависимость формы импульса сопротивления от траектории посредством оптимизации либо геометрии проходного отверстия, как описано, например, в документе США 2008/0093216 авторов T. Zhao и др., или схемы расположения и конструкции электродов, как описано, например, в документах США 4,420,720 авторов Newton и др. и США 2001/0052763 авторов North и др., соответственно.
Однако метод измерения импеданса, сам по себе, не обеспечивает надежной дифференциации пяти субпопуляций лейкоцитов. Данная дифференциация лейкоцитов по их пяти субпопуляциям эффективно выполняется путем сочетания измерения импеданса с методами оптической проточной цитометрии. В известном документе США 5,812,419 авторов V.L. Chupps и др. описан способ автоматического анализа клеток крови, который также сочетает измерение импеданса, оптических измерений поглощения, спектрофотометрию, дифракцию под разными углами и флуоресценцию. В соответствии с данным способом измерения посредством измерения импеданса и оптической проточной цитометрии выполняют в разных аналитических ячейках и алгоритмы объединения данных позволяют производить подсчет и определение характеристик целевых клеток. Способ, описанный авторами Chupps и др., демонстрирует очевидное преимущество совместного применения измерения импеданса и оптической проточной цитометрии, однако использование разных аналитических ячеек очень усложняет систему. Кроме того, возможная неоднородность клеток крови, анализируемых разными способами, является заметным источником неопределенности измерений.
В патентном документе США 6,228,652 авторов C.M. Rodriguez и др. описана ячейка для цитометрии, предназначенная для одновременного выполнения измерений импеданса и оптических измерений в одних и тех же ячейках, что обеспечивает упрощение устройства и уменьшение проблем измерений для установления связи между несколькими измерительными преобразователями. Следовательно, устройство в соответствии с патентом США 6,228,652 дает возможность, для каждой клетки, измерять ее объем, который зависит от удельного сопротивления клетки при постоянном напряжении, ее непрозрачность для радиочастот, которая зависит от проводимости клетки на частоте электрического тока при измерении, и ее оптические характеристики дифракции и флуоресценции.
Упрощение устройств является важной промышленной задачей при разработке автоматических устройств для гематологии, так как простота открывает обширные рынки небольших медицинских учреждений и развивающихся стран. Например, в документе FR 2653885 авторов D. Lefevre и др. описано устройство для оптической и электрической цитометрии, в котором электроды для измерения удельного сопротивления являются составными частями устройства для перемещения потока клеток.
Оптическая проточная цитометрия налагает важные ограничения на относительное расположение потока, содержащего клетки, и средства освещения. Фактически, для качества оптических измерений важно, чтобы клетки пересекали пучок в зоне, называемой оптической измерительной зоной, при этом освещение можно считать достаточно однородным по интенсивности. Клетка, пересекающая пучок в зоне, в которой освещение является неправильным, может вызывать неточное измерение и ошибку определения типа клетки. Поэтому сложность состоит в принуждении потока, транспортирующего клетки, циркулировать таким образом, чтобы поток целиком находился в оптической измерительной зоне равномерной интенсивности.
В решениях, обычно используемых в устройствах известного уровня техники, применяют, по меньшей мере, один поток обжимающей текучей среды, называемый также струей обжимающей текучей среды, который циркулирует концентрично с центральной струей, переносящей клетки. Упомянутые потоки обжимающей текучей среды вытягивают центральную струю и, тем самым, точно ограничивает частицы, которые содержит данная струя. Следовательно, в патентном документе Франции FR 2653885, например, используют метод двойного обжима, в соответствии с которым центральная струя ограничена двумя концентрическими потоками обжимающей текучей среды. Формирование потока обжимающей текучей среды и центральной струи, переносящей клетки крови, требует нескольких струйных впускных элементов, а также микросопел. Данное решение приводит к очень плотным компоновкам струйных компонентов около измерительной зоны, что осложняет и удорожает сборку датчиков. Кроме того, чтобы эффективно ограничивать частицы потоком обжимающей текучей среды, скорость течения потока обжимающей текучей среды должна быть намного больше, чем скорость течения потока, содержащего пробу. Это означает, что значительный объем используемого реагента, обычно разбавителя, служит не химическим реагентом, а используется только для направления потока пробы, подлежащей измерению. Последствия с точки зрения расхода реагентов и образования отходов являются очевидными.
Кроме того, степень разбавления, применяемая в решениях приведенного типа, несовместима со степенью разбавления, необходимой для измерения гемоглобина, который обычно измеряют с разбавлением лейкоцитов, и поэтому требует дополнительного разбавления, а также дополнительных дорогих струйных элементов.
Целью настоящего изобретения является создание способа проточной цитометрии, содержащего измерения импеданса и оптические измерения и не нуждающегося в потоке обжимающей текучей среды, что позволяет значительно упростить измерительную ячейку и соответствующие струйные элементы.
Другой целью настоящего изобретения является создание устройства, использующего упомянутый способ, которое проще и дешевле как в изготовлении, так и в эксплуатации, чем устройства известного уровня техники, чтобы оборудованные таким образом автоматические устройства можно было использовать в небольших лабораториях, при обеспечении эквивалентного качества измерений.
Сущность изобретения
Приведенная цель достигается с помощью способа проточной цитометрии для определения характеристик частиц, содержащего этапы, на которых:
- перемещают текучую среду, содержащую частицы, через апертурную проточную ячейку, причем упомянутая апертурная проточная ячейка является, по меньшей мере, частично, по существу, прозрачной для, по меньшей мере, одной представляющей интерес длины волны и, по меньшей мере, частично, по существу, электроизоляционной,
- измеряют изменение электрического импеданса, создаваемое прохождением упомянутых частиц, содержащихся в текучей среде, через апертурную проточную ячейку,
- измеряют, по меньшей мере, одну оптическую характеристику упомянутых частиц, которые взаимодействуют с, по меньшей мере, одним световым пучком, пересекающим апертурную проточную ячейку,
- определяют характеристики упомянутых частиц с использованием упомянутых измерений изменения электрического импеданса и оптических характеристик,
причем упомянутый способ отличается тем, что дополнительно содержит этапы, на которых:
- выводят информацию о траектории частиц (4) в апертурной проточной ячейке (2), по меньшей мере, на основании анализа упомянутого измерения изменения электрического импеданса,
- используют упомянутую информацию о траектории для ограничения определения характеристик частиц заданными условиями.
В соответствии с особо предпочтительными характеристиками:
- способ в соответствии с изобретением является способом проточной цитометрии, который не нуждается в использовании обжимающей текучей среды или потока обжимающей текучей среды, как в способах в соответствии с известным уровнем техники. Принцип физического ограничения частиц обжимающими текучими средами заменен возможностью выполнения селективной обработки данных, полученных из измерений частиц, при этом упомянутая обработка ограничена заданными условиями или задана информацией, относящейся к их траектории;
- через апертурную проточную ячейку пропускается только текучая среда, содержащая частицы;
- апертурная проточная ячейка может быть значительно упрощенной по сравнению с устройствами в соответствии с известным уровнем техники. Апертурная проточная ячейка может быть упрощена до простой апертуры или проходного отверстия в стенке ячейки, через которую перемещают текучую среду, содержащую частицы, и в которой выполняют измерения.
В предпочтительном варианте:
- измерение изменения электрического импеданса может содержать измерение удельного сопротивления, выполняемое при постоянном токе;
- измерение изменения электрического импеданса может также содержать, по меньшей мере, одно измерение импеданса в комплексной форме, выполняемое на, по меньшей мере, одной ненулевой частоте;
- по меньшей мере, одна измеренная оптическая характеристика может быть одной из следующих оптических характеристик: коэффициентом поглощения, упругим рассеянием под, по меньшей мере, одним углом, неупругим рассеянием под, по меньшей мере, одним углом, упругим обратным рассеянием, неупругим обратным рассеянием, автофлуоресценцией, флуоресценцией на, по меньшей мере, одной длине волны, вызываемой, по меньшей мере, одним маркером, присоединенным к частицам, флуоресценцией на, по меньшей мере, одной длине волны, вызываемой, по меньшей мере, одним маркером, присоединенным к, по меньшей мере, одному элементу, содержащемуся в частицах, поляризацией света;
- определение характеристик частиц может содержать классификацию частиц;
- определение характеристик частиц может также содержать подсчет частиц;
- анализ изменения электрического импеданса может содержать сравнение измеренного изменения электрического импеданса с, по меньшей мере, одним элементом сравнения из, по меньшей мере, одной модели изменения электрического импеданса и, по меньшей мере, одним предварительно заданным численным значением, при этом результат упомянутого сравнения устанавливает, пересекла ли траектория частиц предварительно заданную зону апертурной проточной ячейки;
- данные, относящиеся к частицам, траектория которых не пересекла предварительно заданную зону апертурной проточной ячейки, могут удаляться из данных, используемых для классификации упомянутых частиц. Следовательно, согласно способу в соответствии с изобретением, можно сортировать частицы по их траекториям, например, таким образом, чтобы сохранять данные только тех частиц, которые удовлетворяют некоторым условиям;
- измеренную оптическую характеристику частиц можно сравнивать с, по меньшей мере, одним элементом сравнения из, по меньшей мере, одной модели оптической характеристики и, по меньшей мере, одним предварительно заданным численным значением. При этом, если результаты сравнений изменения электрического импеданса и оптической характеристики с их моделями или соответствующими предварительно заданными численными не удовлетворяют, по меньшей мере, одному предварительно заданному критерию, то данные, относящиеся к частицам, могут удаляться из данных, используемых для классификации упомянутых частиц;
- операция классификации частиц может содержать этап присвоения частицам набора значений или координат, полученных на основании анализа данных измерений, выполненных во время прохождения частиц через апертурную проточную ячейку, при этом упомянутые координаты задают положение частиц в предварительно заданном характеристическом пространстве, и этап сегментации упомянутого характеристического пространства на отдельные области, причем упомянутые области группируют частицы с по существу одинаковыми характеристиками;
- частицы могут содержать клетки крови. Упомянутые клетки крови могут быть лейкоцитами.
В соответствии с другим аспектом изобретения предлагается устройство для проточной цитометрии для определения характеристик частиц, при этом упомянутое устройство содержит:
- апертурную проточную ячейку, по меньшей мере, частично, по существу, прозрачную для, по меньшей мере, одной представляющей интерес длины волны и, по меньшей мере, частично, по существу, электроизоляционную,
- средство для перемещения текучей среды, содержащей частицы, через упомянутую апертурную проточную ячейку,
- средство для измерения изменения электрического импеданса, создаваемого прохождением упомянутых частиц, содержащихся в текучей среде, через апертурную проточную ячейку,
- средство для измерения, по меньшей мере, одной оптической характеристики частиц, причем упомянутые частицы взаимодействуют с, по меньшей мере, одним световым пучком, пересекающим апертурную проточную ячейку,
- средство для анализа упомянутых измерений изменения электрического импеданса и оптических характеристик,
причем упомянутое устройство отличается тем, что дополнительно содержит:
- средство для вывода информации о траектории частиц в апертурной проточной ячейке, по меньшей мере, на основании анализа упомянутого измерения изменения электрического импеданса, и
- средство для использования упомянутой информации о траектории для ограничения определения характеристик частиц заданными условиями.
Устройство в соответствии с изобретением может дополнительно содержать средство подготовки представляющих интерес частиц перед их перемещением через апертурную проточную ячейку. Представляющие интерес частицы - это частицы, которые предполагается анализировать и классифицировать, и которые, возможно, необходимо отделять от других частиц, присутствующих в пробе, в частности, способами лизиса или разбавления в случае клеток крови.
В предпочтительном варианте,
- геометрия апертурной проточной ячейки может быть адаптирована таким образом, что измеряемое изменение электрического импеданса во время прохождения частиц зависит, по существу, от их траектории в упомянутой апертурной проточной ячейке. Данный результат может быть получен, например, в апертурной проточной ячейке, по существу, прямоугольного сечения, продольные края которой заканчиваются в углах с небольшим радиусом кривизны. Следует отметить, что, в данном случае, рассчитывают на результат, противоположный установившейся методике в устройствах в соответствии с известным уровнем техники, в которых, предпочтительно, рассчитывают минимизировать упомянутую зависимость от траектории частиц;
- апертурная проточная ячейка может иметь внутреннее поперечное сечение, по существу, одной из следующих форм: круглой, прямоугольной;
- апертурная проточная ячейка может состоять из, по меньшей мере, одного из следующих материалов: сапфира, рубина, стекла, пластика;
- средство для измерения изменения электрического импеданса, создаваемого прохождением частиц, может содержать, по меньшей мере, два электрода, расположенных, соответственно, с каждой стороны проходного отверстия апертурной проточной ячейки, при этом упомянутые электроды находятся в электрическом контакте с текучей средой, содержащей частицы;
- средство для измерения изменения электрического импеданса, создаваемого прохождением частиц, может также содержать, по меньшей мере, один электрод, расположенный в проходном отверстии апертурной проточной ячейки, при этом упомянутый электрод находится в электрическом контакте с текучей средой, содержащей частицы. Следовательно, устройство в соответствии с изобретением может содержать, например, электроды, распределенные вдоль стенки апертурной проточной ячейки. По меньшей мере, один из электродов может быть также составляющим элементом средства для перемещения текучей среды, содержащей частицы;
- средство для измерения оптической характеристики частиц может содержать, по меньшей мере, один источник света и, по меньшей мере, одно оптоэлектронное средство обнаружения;
- средство для измерения оптической характеристики частиц может также содержать, по меньшей мере, одно оптическое средство фокусировки света, излучаемого источником света, в апертурной проточной ячейке;
- средство для измерения оптической характеристики частиц может также содержать, по меньшей мере, одно оптическое средство сбора света, исходящего из апертурной проточной ячейки;
- средство для измерения оптической характеристики частиц может дополнительно содержать, по меньшей мере, одно средство для спектральной фильтрации света, исходящего от частиц, характеристики которых подлежат определению;
- по меньшей мере, одно из упомянутых оптических средств для измерения оптической характеристики частиц может быть интегрировано в апертурную проточную ячейку. Упомянутое интегрирование возможно, например, при применении апертурной проточной ячейки, отформованной из пластика, внутренние стенки которой будут составлять линзы для фокусировки и, по желанию, для сбора света. Оптические элементы, например оптоэлектронный элемент обнаружения, может быть также приклеенным непосредственно на апертурную проточную ячейку.
В соответствии с частным вариантом осуществления оптоэлектронное средство обнаружения может располагаться таким образом, чтобы измерять световой пучок, приходящий от частиц, характеристики которых подлежат определению, который имеет угловую ориентацию, отличающуюся от угловой ориентации оси пучка, исходящего из источника света. Данная конфигурация дает возможность, например, выполнять измерения рассеяния под ненулевыми углами.
В соответствии с другим частным вариантом осуществления средство для измерения оптической характеристики частиц может содержать источник света, обладающий известным состоянием поляризации, и оптоэлектронное средство обнаружения содержит средство для анализа поляризации света.
В соответствии с еще одним аспектом изобретения предлагается прибор для анализа крови, содержащий, по меньшей мере, одно устройство в соответствии с изобретением, при этом частицы, подлежащие анализу, являются клетками крови и, в частности, лейкоцитами.
Описание чертежей и вариантов осуществления
Другие преимущества и признаки изобретения будут ясны из подробного описания применений и вариантов осуществления, которые никаким образом не являются ограничивающими, и нижеследующих прилагаемых чертежей:
- Фигура 1 - схематическое изображение устройства в соответствии с изобретением;
- Фигура 2 - пояснение влияния положения частиц в световом пучке в проточной цитометрии. Фигура 2a отражает ситуацию, когда поток частиц движется не по центру пучка, а фигура 2b отражает ситуацию, когда поток частиц движется по центру пучка. Эффект представлен для случая измерений коэффициентов поглощения, который никаким образом не является ограничивающим;
- Фигуры 3a и 3b - пояснение отклонения светового пучка поверхностью цилиндрического проходного отверстия и получаемого, в результате, установления границы зон надежных оптических измерений;
- Фигура 4a - пример формы эквипотенциальных линий, возникающих в микроскопическом отверстии, выполненном в изоляционном материале, когда через упомянутое отверстие прикладывают напряжение. На фигуре 4b представлена форма импульсов сопротивления, получаемых, когда частицы проходят через отверстие по различным траекториям. Приведенные иллюстрации взяты из работы V. Kachei, Flow cytometry and Sorting, Wiley-Liss Inc., 1990, упомянутой также в заявке США 2008/0093216;
Фигура 5a - изображение, поясняющее примерные траектории частиц внутри апертурной проточной ячейки цилиндрической формы, а также установление границы зоны надежных оптических измерений, охарактеризованной на фигуре 3. На фигуре 5b представлена форма импульсов сопротивления, которые будут получены для частиц, движущихся вдоль траекторий, показанных на фигуре 5a;
Фигура 6 - блок-схема последовательности операций получения и обработки данных в соответствии с предпочтительным вариантом осуществления способа согласно изобретению;
Фигура 7 - временная диаграмма получения и обработки данных в соответствии с блок-схемой последовательности операций способа, представленной на фигуре 6;
Фигура 8 - примеры измеренных сигналов, соответствующих импульсам сопротивления и оптическим импульсам, получаемым при измерениях коэффициента поглощения. Упомянутые сигналы являются репрезентативными, соответственно, для траекторий T1 и T4, изображенных на фигуре 5;
Фигура 9 - примеры диаграмм классификации частиц в случае лейкоцитов, полученные с помощью устройства в соответствии с изобретением. На фигуре 9a представлен случай, когда представлены все обнаруженные частицы. На фигуре 9b показаны только частицы, отсортированные в соответствии со способом согласно изобретению;
Фигура 10 - изображение устройства в соответствии с вариантом осуществления изобретения, который является предпочтительным, но никак не ограничивающим;
Фигура 11 - схематическое изображение устройства в соответствии с известным уровнем техники, в котором использовано ограничение частиц в оптической измерительной зоне с помощью обжимающих текучих сред.
Ниже, со ссылками на чертежи, приведено описание устройства в соответствии с вариантом осуществления, который является предпочтительным, но ни в коем случае не ограничивающим, с использованием способа в соответствии с изобретением в инструменте для подсчета и определения характеристик клеток различных типов, содержащихся в пробе крови, и, в частности лейкоцитов. Данный инструмент можно применять, например, для определения полного числа лейкоцитов и их относительного распределения по пяти субпопуляциям: моноцитов, лимфоцитов, нейрофилов, эозинофилов и базофилов.
В дальнейшем описании принято, что частицами являются белые клетки крови или лейкоциты, но это не означает никакого ограничения.
Как показано на фигуре 1, устройство, использующее способ в соответствии с изобретением, содержит апертурную проточную ячейку 2, через которую протекает текучая среда 3, содержащая частицы 4. Данная апертурная проточная ячейка содержит проходное отверстие 1, в котором, главным образом, происходят взаимодействия между частицами и средством измерения. Перемещение текучей среды 3 через апертурную проточную ячейку 2 можно осуществить с помощью различных методов, которые остаются при этом в пределах объема настоящего изобретения и из которых можно упомянуть, в частности, подачу самотеком, аспирацию и нагнетание под давлением.
В предпочтительном варианте апертурная проточная ячейка 2 и проходное отверстие 1 имеют, по существу, круглое поперечное сечение, и проходное отверстие 1 имеет диаметр порядка 80 мкм. Данные характеристики, естественно, никоим образом не являются ограничивающими, и устройство в соответствии с изобретением может, с таким же результатом, содержать апертурную проточную ячейку 2, по существу, прямоугольного или многоугольного поперечного сечения и иметь отличающийся размер.
Для обеспечения измерений импеданса и оптических измерений апертурная проточная ячейка 2 должна состоять, по меньшей мере, частично, из, по меньшей мере, одного материала, который является, по существу, электроизоляционным, и, по меньшей мере, частично, из, по меньшей мере, одного материала, который является, по существу, прозрачным для представляющих интерес оптических длин волн. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления упомянутая ячейка выполнена из сапфира. Разумеется, можно, без выхода за пределы настоящего изобретения, использовать апертурную проточную ячейку 2, выполненную из какого-то другого материала, например рубина, стекла, полимера или пластика, или даже выполненную с использованием комбинации нескольких материалов.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления электроды 5 расположены с каждой стороны апертурной проточной ячейки 2. Упомянутые электроды находятся в электрическом контакте с текучей средой, чтобы создавать возможность формирования продольного электрического поля в апертурной проточной ячейке и, в частности, через проходное отверстие 1. Упомянутые электроды 5 соединены с устройством 6, которое измеряет изменения импеданса во время прохождения частиц 4 через проходное отверстие 1 апертурной проточной ячейки 2, т.е. временную форму и амплитуду импульса, обусловленные прохождением упомянутых частиц. Измерение импеданса, используемое в устройстве в соответствии с изобретением, является в предпочтительном, но не ограничивающем варианте измерением удельного сопротивления, выполняемым при постоянном токе.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления устройство в соответствии с изобретением содержит, по меньшей мере, одно устройство для оптических измерений, в основу которого положен принцип измерения результата взаимодействия между частицей, например лейкоцитом, и световым пучком. Упомянутое измерение называется также измерением оптических свойств частицы.
Как показано на фигуре 1, данное устройство для оптического измерения может содержать, в частности, источник 8 света и, по меньшей мере, одно средство 13 обнаружения. Упомянутое устройство может также содержать, по меньшей мере, одно оптическое средство 9 для фокусировки пучка 7 в апертурной проточной ячейке 2 и, по меньшей мере, одно оптическое средство 11 для сбора света из апертурной проточной ячейки 2.
Источник 8 света может, например, быть лазером, лазерным диодом или светоизлучающим диодом.
Оптические средства 9 и 11, соответственно, для фокусировки и для сбора света могут содержать, в частности, сферические, асферические или цилиндрические линзы или оптические элементы произвольной формы с градиентными показателями преломления и/или отражательными поверхностями (зеркалами). Данные оптические средства могут также содержать, по меньшей мере, один световод, который, например, направляет пучки, исходящие из измерительной зоны, к чувствительной поверхности средства 13 обнаружения.
Средство 13 обнаружения может содержать, по меньшей мере, один фотоприемник, например фотодиод, лавинный фотодиод или фотоумножитель.
В предпочтительном варианте, по меньшей мере, одно из оптических средств 9 и 11, соответственно, для фокусировки и для сбора света может быть, по меньшей мере, частично объединено с апертурной проточной ячейкой 2, например, приклеиванием или выполнением упомянутой ячейки с такой внешней формой, чтобы образовывать поверхность линзы. Кроме того, средство 13 обнаружения можно закреплять непосредственно на апертурной проточной ячейке 2, по желанию, без использования собирающего средства 11.
В устройстве в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения, который является предпочтительным, но без какого-либо ограничения, используют измерение коэффициента поглощения, при котором измеряют изменение интенсивности света на детекторе 13, когда лейкоцит пересекает световой пучок 7. Поэтому именно измерение данной оптической характеристики поясняется в остальной части описания. Однако специалисту можно будет легко применить способ в соответствии с настоящим изобретением в устройствах, использующих измерение других оптических характеристик частицы, без выхода за пределы объема изобретения.
В предпочтительном исполнении настоящего варианта осуществления:
- источник 8 света может быть светоизлучающим диодом голубого свечения;
- оптическое устройство 9 для фокусировки может состоять из регулируемой плоско-параллельной пластины, позволяющей направлять пучок 7 по центру апертурной проточной ячейки 2, и двухлинзового ахромата и цилиндрической линзы для фокусировки пучка 7 в апертурной проточной ячейке 2, которая, в предпочтительном варианте, является, по существу, цилиндрической;
- оптическое устройство 11 для сбора света может состоять из двух плосковыпуклых линз, формирующих изображение зоны взаимодействия света с частицами 4 на средстве 13 обнаружения, содержащем, например, фотодиод.
Для получения надежных результатов необходимо, чтобы оптическая измерительная зона, в которой происходят взаимодействия между частицами и светом, имела ограниченные размеры, например, порядка 100 мкм × 30 мкм, и чтобы распределение интенсивности падающего света в упомянутой зоне было, по существу, равномерным. Сложность заключается в ограничении циркуляции потока, переносящего частицы, таким образом, чтобы весь данный поток проходил внутри упомянутой оптической измерительной зоны. Упомянутая проблема отражена на фигуре 2 для неограничивающего случая измерений коэффициента поглощения на частицах, имеющих, по существу, идентичный коэффициент поглощения. Когда весь поток 3 частиц 4 пересекает оптическую измерительную зону 7, то все пики 20 коэффициентов поглощения имеют, по существу, одинаковую амплитуду, между 21b и 22b. Если поток 3, переносящий частицы, приближается к границе оптической измерительной зоны 7 или даже выходит за нее, как показано на фигуре 2a, то частицы 4 больше не получают равное количество света, и оптическое измерение дает погрешность. Погрешность характеризуется значительной изменчивостью, от 21a до 22a, амплитуды пиков 20, что, в свою очередь, отражается в увеличении неопределенности классификации частиц.
На фигуре 3 поясняется отклонение светового пучка 7 поверхностью цилиндрического проходного отверстия, например проходного отверстия 1 апертурной проточной ячейки 2. На фигуре 3a показан пучок с диаметром больше, чем диаметр проходного отверстия 1. Из-за угла падения на внутреннюю поверхность проходного отверстия 1 некоторые участки 30 данного пучка 7 отражаются или, по меньшей мере, сильно преломляются и, в результате, периферическая зона 33 проходного отверстия 1 не получает достаточно однородного освещения. На фигуре 3b показан пучок с диаметром меньше, чем диаметр проходного отверстия 1. Аналогично, периферическая зона 33 проходного отверстия 1, расположенная за граничным лучом 31, не получает надлежащего освещения. В обоих случаях, в надлежащих условиях будет осуществляться измерение только тех частиц, которые пересекают так называемую надежную оптическую измерительную зону 32. Те частицы, которые пересекают зону 33, могут давать ошибочные результаты. Разумеется, приведенное рассуждение может быть легко распространено специалистом на другие геометрии проходных отверстий 1 и апертурных проточных ячеек 2, без выхода за пределы объема настоящего изобретения.
Решение, применяемое, обычно, в устройствах известного уровня техники, как показано на фигуре 11, содержит ограничение 72 потока 3, переносящего частицы 4, центром измерительной ячейки 73, с помощью, по меньшей мере, одного концентрического потока 71 обжимающей текучей среды, при этом все уже упомянутые недостатки с точки зрения сложности, стоимости изготовления и стоимости эксплуатации обусловлены, в частности, применением инжекторов 70.
Решение, принятое в способе в соответствии с изобретением, в противоположность, содержит идентификацию частиц, траектории которых в апертурной проточной ячейке не проходят через предварительно заданную зону, например надежную оптическую измерительную зону 32, чтобы упомянутые частицы можно было иначе учитывать, когда анализируют данные. Упомянутую идентификацию можно выполнять, в частности, посредством анализа формы импульсов, получаемых измерением импеданса. Иначе говоря, информацию о траектории частиц 4 в проходном отверстии 1 апертурной проточной ячейки 2, получаемую, в частности, анализом изменений электрического импеданса, используют для воздействия на функцию определения характеристик частиц, т.е. для видоизменения метода, в соответствии с которым используют данные измерений.
Как показано на фигуре 4, когда частица, например лейкоцит, пересекает отверстие, в котором приложено электрическое поле, изменение удельного сопротивления во времени на упомянутом отверстии, которое может быть проходным отверстием 1 апертурной проточной ячейки 2 устройства в соответствии с изобретением, имеет форму импульса 41, форма которого зависит, в основном, от траектории 40 частицы. В частности, в примере на фигуре 4 можно видеть, что упомянутый импульс 41 становится шире и, в конечном случае, имеет плато и, затем, всплеск по мере того, как траектория частицы отодвигается дальше от центра апертурной проточной ячейки 2. Вышеописанный эффект обусловлен формой электрического поля, эквипотенциальные линии 42 которого вокруг отверстия 2 и в данном отверстии показаны на фигуре 4a.
Данный эффект, который считается в устройствах известного уровня техники источником погрешности, которую следует минимизировать, применяется в предпочтительном варианте в соответствии с настоящим изобретением. Данный эффект дает возможность определять характеристики траекторий частиц в апертурной проточной ячейке на основании анализа формы импульсов сопротивления, и упомянутую форму можно считать характеристической кривой для упомянутых траекторий.
Схему расположения и поверхность электродов 5 с каждой стороны ячейки 2, а также геометрию упомянутой ячейки 2 можно даже разработать в предпочтительном варианте таким образом, чтобы форма импульса 41 имела сильную зависимость от траектории частицы, что противоречит принципам, используемым в устройствах существующего уровня техники. Однако проходное отверстие 1 цилиндрической формы, заканчивающееся в углах с малыми радиусами кривизны, как в предпочтительном варианте осуществления, уже демонстрирует требуемые характеристики.
Пример характеристических кривых, представляющих траектории частиц в апертурной проточной ячейке, приведен на фигуре 5. В данном примере оптическая измерительная зона имеет форму цилиндра, который соответствует внутренней области проходного отверстия 1 апертурной проточной ячейки 2, которая также может иметь, приблизительно, цилиндрическую форму. Надежная оптическая измерительная зона 32 представлена в виде обведенного цилиндра в общей оптической измерительной зоне, и характеристической кривой для оптимальных траекторий T1 частиц, пересекающих упомянутую надежную оптическую измерительную зону 32, является, приблизительно, гауссова кривая 51. Данная гауссова характеристическая кривая имеет плато, которое уширяется по мере того, как траектория отодвигается дальше от центра проходного отверстия (траектории T2, Т3, T4). В связи с этим существует возможность установления связи, на границе надежной оптической измерительной зоны 32, между формой импульса и предельной характеристической кривой, и определения, на основе математического критерия, является ли траектория применимой (характеристическая кривая 51) или неприменимой (характеристическая кривая 52). Изменение формы импульсов сопротивления, показанное на фигуре 5, разумеется, является неограничивающим примером, так как характер изменения упомянутых импульсов может отличаться в зависимости от геометрии апертурной проточной ячейки и в зависимости от типа частиц.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления математический критерий, используемый для определения применимости траекторий, следует из сравнения измеренных импульсов с, по меньшей мере, одним предельным значением длительности импульса для, по меньшей мере, одной высоты упомянутого импульса.
В соответствии с предпочтительным, но не ограничивающим вариантом осуществления, использующим измерение удельного сопротивления и измерение оптического поглощения, частицы, пересекающие апертурную проточную ячейку, формируют, тем самым, два импульса или электрических сигнала: импульс сопротивления, исходящий из датчика измерения импеданса, и импульс, исходящий из датчика оптического поглощения.
Оптические импульсы предварительно обрабатываются аналоговыми методами, усиливаются и фильтруются в соответствии с обычными методами для передачи в аналого-цифровой преобразователь.
Импульсы сопротивления получают традиционными методами, но, при этом, особое внимание уделяется применению датчика таким образом, чтобы максимально увеличивать отношение сигнал/шум и получать достаточную информацию для определения характеристик и сортировки, например, выбору ширине полосы частот.
Упомянутые сигналы, получаемые из датчиков измерения импеданса и оптического поглощения, предварительно обрабатываются и передаются в аналого-цифровой преобразователь, который соединен с системой цифровой обработки, которая может содержать, в частности, микропроцессор и/или FPGA (программируемую вентильную матрицу), и/или DSP (цифровой процессор сигналов). Частоту дискретизации оптических импульсов и импульсов сопротивления подбирают соответственно каждому типу сигнала, чтобы получать количество информации, необходимое для цифровой обработки.
Обработка оптических импульсов может быть ограничена выделением информации об амплитуде и длительности.
Дискретизированный сигнал из датчика сопротивления формируется традиционными методами обработки сигналов, основанными на временных и частотных характеристиках сигнала, подлежащего анализу, например цифровой фильтрации с конечной и бесконечной импульсной характеристикой, оптимальной фильтрации, быстрому Фурье-преобразованию и т.п.
Таким образом, можно создать пару, сформированную из импульса сопротивления и соответствующего оптического импульса, и записать в память их характеристики, например амплитуды, длительности импульсов и т.п.
Затем импульсы сопротивления и оптические импульсы, свободные от фонового шума и нормированные, можно обрабатывать с помощью алгоритма сортировки, который классифицирует измерения, по меньшей мере, двум, так называемым, применимой и неприменимой категориям.
В предпочтительном варианте алгоритм сортировки содержит измерение разности между характеристической кривой, соответствующей оптимальной траектории, представленной оптимальной формой импульса сопротивления, и характеристической кривой для эффективных траекторий частиц, т.е. измеренных импульсов сопротивления. Если упомянутая разность слишком велика, то данные, относящиеся к упомянутым частицам, считаются неприменимыми. На фигуре 8 представлен результат измерения применимой и неприменимой пары из импульса (Res) сопротивления и оптического импульса (Opt). Упомянутые импульсы соответствуют измерениям, относящимся к частицам, которые следуют, например, соответственно, по траекториям T1 и T4, показанным на фигуре 5. Временная диаграмма, представленная на фигуре 7, поясняет временную последовательность получения и классификации (Val) данных измерений.
Алгоритм определения характеристик, который выполняет фактический анализ результатов, содержит, в предпочтительном варианте, по меньшей мере, одну операцию классификации частиц по категориям, имеющим, по существу, единообразные характеристики, и, по желанию, по меньшей мере, одну операцию подсчета упомянутых частиц. В соответствии с вариантом осуществления, который является предпочтительным, но никак не ограничивает способ, классификация использует только данные, относящиеся к частицам, чьи импульсы или характеристические кривые классифицированы как применимые, как показано на блок-схеме последовательности операций, представленной на фигуре 6. И, наоборот, подсчет может выполняться по всем измерениям, которые приводили к получению импульса сопротивления, независимо от применимости или неприменимости. Разумеется, предполагается возможность применения любого другого метода использования данных после сортировки частиц, без выхода за пределы объема изобретения.
Классификацию применимых частиц или, в соответствии с предпочтительным вариантом осуществления, лейкоцитов по подкатегориям можно выполнять, в предпочтительном варианте, посредством присвоения упомянутым частицам набора значений или координат, получаемых в результате анализа данных измерений сопротивления и оптических измерений, выполняемых во время пересечения частицами апертурной проточной ячейки 2, при этом упомянутые координаты определяют положение частиц в предварительно заданном характеристическом пространстве. В таком случае сегментация упомянутого характеристического пространства на отдельные области группировки частиц с, по существу, одинаковыми характеристиками дает возможность идентифицировать популяцию каждой из подкатегорий, например, для измерения их относительного размера. На фигуре 9 приведен пример представления частиц, в настоящем случае лейкоцитов, в зависимости от данных, полученных соответственно путем анализа измерений сопротивления (Res) и измерений оптического поглощения (ALL). Каждая точка представляет пару измерений. На фигуре 9a представлены все данные измерений, применимые и неприменимые. На фигуре 9b показаны только применимые данные измерений, что дает возможность выявлять отдельные группы точек, соответствующие разным категориям частиц.
В соответствии с полезной характерной особенностью изобретения способ и устройство можно легко применить для изготовления особенного простого гематологического прибора. Устройство в соответствии с изобретением можно легко установить на простой емкости 60, содержащей раствор, подлежащий анализу, и соответствующее проходное отверстие 61. Апертурную проточную ячейку 2 можно установить в любом положении относительно емкости. Упомянутую апертурную проточную ячейку можно установить в непрерывном трубопроводе и можно изготавливать из материала любого типа, который является, по существу, прозрачным и является электрическим изолятором. Перекачивание раствора, подлежащего анализу, можно выполнять, например, аспирацией через апертурную проточную ячейку 2. На фигуре 10 показан неограничивающий пример применения, содержащий одно оптическое измерение на оси проходного отверстия. Вокруг оси проходного отверстия можно разместить несколько фотодиодов, чтобы измерения можно было производить под различными углами и на различных длинах волн.
Данный вариант осуществления дает полезную возможность объединения традиционного измерения гемоглобина методом спектрометрии сквозь прозрачную емкость, содержащую раствор, подлежащий анализу.
В соответствии с частными вариантами осуществления устройство согласно изобретению может содержать множество электродов, распределенных по, по меньшей мере, одному слою вдоль апертурной проточной ячейки 2, как описано, например, в документе США 4,420,720. Устройство в соответствии с изобретением может также содержать электроды с регулируемым или нерегулируемым удельным сопротивлением, охватывающими всю или частично внутреннюю поверхность апертурной проточной ячейки 2, как поясняется, например, в документе США 2001/0052763. В случае устройства в соответствии с изобретением, содержащим больше двух электродов, можно применять несколько измерений импеданса между разными парами электродов.
В соответствии с частными вариантами осуществления можно, без выхода за пределы объема изобретения, применять комплексные измерения импеданса на, по меньшей мере, одной дискретной частоте, а также в, по меньшей мере, одной непрерывной полосе частот электрического тока.
В соответствии с частными вариантами осуществления можно, без выхода за пределы объема изобретения, применять, по меньшей мере, одно измерение, по меньшей мере, одной оптической характеристики, например:
- измерение автофлуоресценции, измерение флуоресценции, вызываемой маркером, присоединенным к мембране лейкоцита, или измерение флуоресценции, вызываемой маркером, присоединенным к, по меньшей мере, одному элементу внутриклеточного содержимого лейкоцитов, при этом измеряют силу света на длине волны флуоресценции, по меньшей мере, одним элементом 13 обнаружения, расположенным вокруг апертурной проточной ячейки, причем упомянутый элемент обнаружения, например, изолирован от света с длиной волны 7 возбуждения спектральным фильтром;
- измерение упругого рассеяния под, по меньшей мере, одним углом, неупругого рассеяния под, по меньшей мере, одним углом, обратного рассеяния, при этом, в частности, по меньшей мере, один элемент 13 обнаружения можно располагать вокруг апертурной проточной ячейки, с ориентацией, отличающейся от ориентации оси пучка 7, чтобы измерять свет, рассеянный под разными углами, на которых могут иметь место сдвиги оптической частоты;
- измерение поляризации, при котором средства 13 обнаружения выполняют с возможностью анализа поляризации света, который взаимодействовал с частицей, источник 8 света имеет известную, например линейную, поляризацию.
В соответствии с частными вариантами осуществления можно, в устройстве в соответствии с изобретением, применять измерения нескольких оптических характеристик одновременно, например, посредством расположения нескольких устройств для оптического измерения, как показано на фигуре 1, с разными ориентациями или вдоль разных осей вокруг апертурной проточной ячейки 2 или посредством введения средства для деления пучка 10, исходящего из апертурной проточной ячейки.
В соответствии с частными вариантами осуществления математический критерий, применяемый для определения применимости траектории, может быть результатом:
- по меньшей мере, одного сравнения с амплитудным порогом или минимальной высотой импульса,
- по меньшей мере, одного вычисления расстояния как меры математического различия между измеренным импульсом и, по меньшей мере, одной моделью импульса, при этом упомянутое расстояние вычисляется, например, с помощью нормированной корреляционной функции,
- по меньшей мере, одного анализа, выполняемого с результатом применения, по меньшей мере, одного преобразования, например Фурье-преобразования, измеренных импульсов,
- или любой комбинации приведенных способов или любого другого подходящего математического способа, без выхода за пределы объема изобретения.
В соответствии с частными вариантами осуществления можно также, без выхода за пределы объема изобретения, задать, по меньшей мере, одну модель оптических импульсов для сравнения измеряемых оптических импульсов с упомянутой моделью или моделями и для включения данного сравнения в алгоритм сортировки. Кроме того, можно также задать, по меньшей мере, одну парную модель оптических импульсов и импульсов сопротивления и выполнять операции сравнения и сортировки с использованием упомянутых моделей. Данное решение может предоставлять возможность обработки других случаев погрешностей измерения, обусловленных, например, частицами, которые не принадлежат к ожидаемым категориям, или тем, что несколько частиц измеряются одновременно.
В соответствии с частными вариантами осуществления способ и соответствующее устройство можно использовать в устройстве, выполненном на основе технологий, относящихся к области микросистем (MEM (микроэлектромеханических систем)) или оптических микросистем (MOEM (микрооптоэлектромеханических систем)), например, чтобы интегрировать все струйные, электрические и оптические функции в одном компоненте.
В соответствии с другими частными вариантами осуществления способ и соответствующее устройство можно использовать для измерения частиц, отличающихся от биологических клеток, например керамических частиц в производстве изготовления промышленных порошков или пигментов в лакокрасочном производстве.
Разумеется, настоящее изобретение не ограничено вышеописанными примерами, и в приведенные примеры можно внести многочисленные изменения, не выходящие за пределы объема изобретения.