Роль эпигенетических факторов в патогенезе нейрофиброматоза 1-го типа

Роль эпигенетических факторов в патогенезе нейрофиброматоза 1-го типа

CV

И

ш и

Р.Н. Мустафин1, Э.К. Хуснутдинова1, 2 о

ФГБОУВО «Башкирский государственный университет»; Россия, Республика Башкортостан, 450076 Уфа, ул. Заки Валиди, 32; о 2ФГБУНИнститут биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН; 2

Россия, Республика Башкортостан, 450054 Уфа, проспект Октября, 71

si

Контакты: Эльза Камилевна Хуснутдинова elzakh@mail.ru

и ш

В обзорной статье описана роль эпигенетических факторов в туморогенезе нейрофиброматоза 1-го типа (НФ1). Клиническая в картина НФ1 характеризуется выраженным полиморфизмом — от стертых форм с единичными нейрофибромами до тяжелых проявлений с тысячами опухолей и злокачественными осложнениями. Несмотря на выявление более 1400 типов мутаций в гене NF1, большинством исследователей не обнаружено генофенотипических корреляций. Второе генетическое событие в гене NF1, выявляемое в шванноцитах большинства нейрофибром, может быть результатом общих нарушений стабильности генома и регуляции клеточного цикла. Вероятность тканеспецифической инактивации второго аллеля чрезвычайно мала и не может объяснить образование опухолей у большинства больных НФ1. В то же время роль эпигенетических факторов в блокировании онкосу-прессоров доказана и может иметь значение в развитии данного заболевания, в пользу чего говорит закономерное начало образования нейрофибром в пубертатном периоде, утяжеление клиники при наследовании болезни от матери. Представлены исследования роли определенных микроРНК и особенностей метилирования промоторной области NF1 в туморогенезе при НФ1, а также роли мутаций в гене NF1 в развитии спорадических злокачественных новообразований. В связи с возможностью фармакологической коррекции активности микроРНК с использованием антисмысловых последовательностей изучение эпигенетических процессов при НФ1 перспективно для диагностики и лечения не только данной болезни, но и спорадических злокачественных новообразований.

Ключевые слова: нейрофиброматоз 1-го типа, нейрофибромин, туморогенез, импринтинг, микроРНК, метилирование, СрО-островки

DOI: 10.17650/2313-805X-2017-4-3-35-49

The role of epigenetic factors in the pathogenesis of neurofibromatosis type 1

R.N. Mustafin1, E.K. Khusnutdinova1'2

Bashkir State University; 32 Zaki Validi St., Ufa 450076, Republic of Bashkortostan, Russia;

2Institute of Biochemistry and Genetics, Ufa Science Center, Russian Academy of Sciences;

71 Prospekt Oktyabrya, Ufa 450054, Republic of Bashkortostan, Russia

The article describes the role of epigenetic processes in the tumorigenesis of neurofibromatosis type 1. The clinical manifestations of neurofibromatosis type 1 is characterized by a pronounced polymorphism erased from with single neurofibromas to severe forms with thousands of tumors and complications even in patients with the same mutations. More than 1400 mutations in the NF1 gene have been reported, but have not yet identified genotype-phenotype correlations. Detected in the majority of neurofibromas mutation of the second allele of the gene NF1 and loss of heterozygosity may result from common disorders of genome stability and cell cycle regulation. Chance of tissue-specific inactivation of the second allele is extremely low and can not prove the detection of neurofibromas in most patients with neurofibromatosis type 1. At the same time, the role of epigenetic factors for blocking of oncosupressors has been proven and can be applied to the development of malignant tumors and neurofibromas. This assumption is proved by the fact that the majority of neurofibromas are formed in puberty, while inheriting the disease from mother to clinical manifestations more severe. This review presents the research on the role of miRNAs and specific methylation in the promoter region of NF1 tumorogenesis in neurofibromatosis type 1. Mutations in the NF1 gene are of great importance in the development of many malignancies. Due to the possibility of pharmacological correction of activity of microRNAs using antisense sequences, the study of epigenetic processes in neurofibromatosis type 1 promising to diagnose and treat not only the disease but also sporadic malignancies.

Key words: neurofibromatosis type 1, neurofibromin, tumorogenesis, imprinting, microRNA, methylation, CpO-islands

x ш

и

Введение

Нейрофиброматоз 1-го типа (НФ1) — распространенное аутосомно-доминантное заболевание с опухолевым синдромом, встречающееся в мире в среднем с частотой 1:3,0—3,5 тыс. населения [1—4]. Характерной

клинической чертой болезни являются множественные доброкачественные новообразования — нейрофибро-мы, гамартомы радужной оболочки глаза и пигментные пятна на коже цвета «кофе с молоком». Плексиформ-ные нейрофибромы, отличающиеся инфильтративным

ОБЗОРНЫЕ СТАТЬИ

ТОМ 4 / VOL. 4

CV

со

ев

и ш u

ростом и склонностью к озлокачествлению, встречаются у 30 % больных НФ1. Риск развития глиом зрительного нерва составляет до 20 %, злокачественных опухолей из оболочек периферических нервов (malignant peripheral nerve sheath tumor, MPNST) 5—10 % [2, 3, 5]. Все развивающиеся опухоли устойчивы к химиотерапии, хирургическое иссечение опухолей часто провоцирует образование новых нейрофибром [6].

MPNST — наиболее характерные для НФ1 злокачественные опухоли. Другие распространенные опухоли при НФ1 представлены в табл. 1.

Ген NF1 картирован на 17q11.2 и кодирует белок нейрофибромин, содержащий высококонсервативный ГТФаз-активирущий домен, превращающий активные RAS-ГТФ путем отсоединения остатка фосфорной кислоты в RAS-ГДФ, которая неактивна (рис. 1). Потеря экспрессии нейрофибромина приводит к актива-

ции RAS-сигнальных путей и способствует образованию опухолей [8]. Помимо ингибирования RAS, нейрофибромин положительно регулирует аденилат-циклазу, RAS независимо влияет на апоптоз, регулирует адгезию и подвижность клеток [9].

В целях нахождения причин патологии поиск мутаций в гене NF1 у больных НФ1 проводится по всему миру. В России молекулярно-генетическое исследование с описанием клинической картины больных с выявленными мутациями проведено в работах О. В. Дрозд и соавт. [11], Р.Н. Мустафина и соавт. [12]. В базе данных генных мутаций человека (The Human Gene Mutation Database, 2015) зарегистрировано более 1400 различных мутаций в гене NF1, расположенных практически во всех экзонах [13]. У 5 % больных НФ1 с идентифицированными мутациями выявляются микроделеции NF1, затрагивающие соседние гены [3, 14]. Несмотря

Таблица 1. Сравнение частоты развития злокачественных опухолей при нейрофиброматозе 1-го типа и в общей популяции

Ж ш

и

Вид опухоли

Частота развития при нейрофиброматозе 1-го типа, %

Частота развития в популяции, %

Злокачественные опухоли из оболочек периферических нервов 5,0-10,0 0,001

Гастроинтестинальные стромальные опухоли 3,9-25,0 0,0001

Рак молочной железы 18,5 9

Рабдомиосаркома 1,4-6,0 0,000003

Лейкоз 2,0 0,01

Карциноидные опухоли 1,0 0,00003

Феохромоцитома 0,1-5,7 0,00008

38

Akt

Продолжительность жизни клеток

GEF

О

'II

Рецептор фактора у роста

RAS-

Т т

-Rho- «ERK

I 4

Изменение Экспрессия гена цитоскелета ^ Рост и пролиферация клеток

> Апоптоз

ч

V

Л

\

i

\ \

\

Рис. 1. Схема онкосупрессиеного действия нейрофибромина

на огромный генетический банк данных, исследователями не обнаружено генофенотипических корреляций [13], что дает возможность использования полученных данных лишь для ранней пренатальной диагностики. Однако это не является решением проблемы и вызывает множество спорных биоэтических вопросов (в связи с необходимостью прерывания беременности), поэтому оправдан поиск новых путей патогенеза болезни для возможной коррекции опухолевого синдрома.

Основная идея механизма туморогенеза при НФ1 объясняется двухударной моделью, согласно которой опухоли образуются в результате 2-го генетического события гена опухолевой супрессии [15]. Обоснованием данной идеи являются факты обнаружения би-аллельной инактиванции гена NF1 в нейрофибромах при НФ1 [16], причем только в шванноцитах, не выявляемые в других клетках микроокружения [17, 18]. Также в экспериментальных работах при трансплантации мышам химерных NF1—/— клеток у мышей развивались опухоли, напоминающие нейрофибромы у людей [19]. У мышей со специфической инактивацией гена NF1 в центральной нервной системе формировались глиомы зрительных нервов как результат пролиферации глиальных клеток-предшественников. У эмбрионов мышей с NF1—/— спинальным гребнем формировалось повышенное количество клеток-предшественников олигодендроцитов [20].

Помимо мутаций, на экспрессию нейрофиброми-на могут воздействовать и другие механизмы (табл. 2): процессинг, стабилизация и транспорт матричной РНК (мРНК) гена NF1. Имеет значение неравноценная экспрессия гена NF1, обнаруженная в фибробла-стах, лимфоцитах, кератиноцитах и меланоцитах [8]. Соответственно, для данных клеток неравноценная экспрессия может вызвать эффект, подобный потере гетерозиготности (loss of heterozygosity, LOH), по следующему механизму: у больных НФ1 один из аллелей инактивирован в результате мутации, выработка нейрофибромина поддерживается за счет оставшегося второго аллеля. Однако при подавлении экспрессии данного аллеля гена эпигенетическими механизмами выработка нейрофибромина полностью прекращается — LOH-подобный эффект (полностью прекращается выработка продукта гена). В результате эпигенетической инактивации второго аллеля гена NF1, являющегося геном опухолевой супрессии, потеря его

экспрессии приводит к гиперпролиферации клеток и туморогенезу.

Высококонсервативная среди разных видов 3'-не-транслируемая область N¥1 связывается с опухолевым антигеном НиЯ и содержит 4 потенциальных белоксвя-зывающих домена, которые могут представлять дополнительные механизмы контролирования мРНК стабильности, внутриклеточной локализации и эффективности трансляции [8].

Транскрипционный контроль гена N¥1 осуществляется посредством эпидермального фактора роста (БОБ), тромбоцитарного фактора роста (РБОБ) и основного фактора роста фибробластов (ЬБОБ) [21]. Большое значение в подавлении функции N¥1 имеют микроРНК: путем репрессии трансляции, воздействия на расщепление и деградацию мРНК [22].

Особенности функционирования гена

Для определения возможных причин отсутствия корреляции клинических проявлений с типом мутаций в гене N¥1 необходим поиск новых молекулярно-ге-нетических механизмов формирования болезни. Ген N¥1 размером 280 кб картирован в прицентромерной области длинного плеча хромосомы 17 и состоит из 57 экзонов. Известны 4 нормальные внутрирамоч-ные изоформы альтернативного сплайсинга продукта гена N¥1, экспрессирующиеся во всех тканях в разных концентрациях: экзон 9Ьг (добавочные 30 пар нукле-отидов (п.н.) между экзонами 9 и 10а), экзон 10а-2 (45 п.н. между экзонами 10а и 10Ь), экзон 23а (63 п.н. между экзонами 23 и 24), экзон 48а (54 п.н. в направлении 3'-конца гена). Выявлены несколько дополнительных вариантов сплайсинга, экспрессирующихся в низких концентрациях — альтернативные транскрипты ех29-, ех30-, ех29/30-, К-изоформы, отличающиеся различной степенью активности в тканях [23]. Включение экзона 23а происходит под влиянием белков Т1А-1 /Т1АК, а под действием Ни-белка угнетается [24].

В геноме человека содержатся 11 последовательностей, родственных N¥1, 9 из которых расположены в центромерных областях 7 различных хромосом. Псевдогены N¥1 расположены на хромосомах 2, 12, 14, 15, 18, 21 и 22 [10].

Темп мутирования гена N¥1 на 2 порядка выше, чем в других локусах — до 1 на 10 тыс. гамет [4, 25]. Однако с учетом частоты встречаемости болезни 1:3,0—

CV

ев

и ш u

ж ш

и

Таблица 2. Механизмы изменения экспрессии нейрофибромина

Мишень воздействия Причина инактивации

Экзоны №1 Мутации гена N¥1

Промоторная область гена N¥1 Метилирование

Процессируемая матричная РНК гена N¥1 Расширение рамки считывания экзона N¥1 при процессинге, образование стоп-кодона

3'-нетранслируемая область матричной РНК микроРНК

CV

со

ев

и ш u

х ш

и

3,5 тыс. населения, а также, в среднем, половины спорадических случаев НФ1, темп мутирования гена должен быть не менее 1 на 6—7 тыс. гамет. До 50 % точковых мутаций обнаруживаются в сайтах сплайсинга, в то время как существуют 4 нормальные сплайсин-говые изоформы [26], а также, как упомянуто выше, выявляются дополнительные варианты сплайсинга, экспрессирующиеся в низких концентрациях [23]. Ген ЫЕ1 регулирует пролиферацию клеток, при этом сп-лайсинговые изоформы обладают разной активностью и преимущественно экспрессируются в определенных тканях. Например в нервных клетках преимущественная экспрессия сплайсинговых изоформ нейрофибро-мина, обладающих низкой активностью, может поддерживать низкий пролиферативный потенциал. Поскольку ген ЫЕ1 является онкосупрессором, опосредованно (влиянием на ИЛБ-систему) регулируя пролиферацию клеток, экспрессия сплайсин-говых изоформ в различных тканях может влиять на возрастзависимую тканеспецифическую дифферен-цировку клеток в связи с различной активностью данных изоформ, преимущественная экспрессия специфических изоформ в различных тканях в разные периоды онтогенеза — на скорость клеточных делений. Высокая частота сплайсинговых мутаций иногда связана со сложными взаимодействиями гена ЫЕ1 и продуктов его экспрессии с другими факторами, которые могут влиять на темп мутирования в сайтах сплайсинга, 11 родственных ^^-последовательностей могут влиять на данные процессы совместно.

Согласно исследованиям К. ^шшег и соавт. ген ЫЕ1 содержит «горячие точки» для инсерции Ы-элементов. Выявлены 3 специфических интеграционных сайта для независимых событий транспозиции в гене N¥1, каждый из которых используется дважды: с. 1642-1_1642 в интроне 14, с. 2835_2836 в экзоне 21, с. 4319_4320 в экзоне 33. Поскольку по данным недавних исследований в онтогенезе происходит перемещение ретроэлементов, а ген N¥1 является предпочтительным сайтом их интеграции, данный процесс может иметь значение в инактивации второго аллеля гена в патогенезе формирования нейрофибром при НФ1 [26]. Существование «горячих точек» мутагенеза в гене N¥1 может в некоторой степени объяснить наличие большого количества псевдогенов и повышенной мутабельности гена. Наличие Ы-элементов в гене приводит к усилению мутагенеза и образованию псевдогенов в связи с тем, что ретроэлемент транспозиру-ет в новый локус, оставляя исходную последовательность на прежнем месте. В результате возможны структурные преобразования генома, в том числе формирование псевдогенов [27]. Псеводогены — неактивные копии исходных генов, измененных мутациями; некоторые из их разновидностей представлены про-цессированными псевдогенами, в которых отсутствуют интроны гена-предшественника (образованные путем встраивания комплементарной ДНК с помощью

генов автономных ретротранспозонов). Многие псевдогены эукариот высоко консервативны и активно транскрибируются, а часть может быть активирована мутациями [28].

С учетом того, что в общебиологическом плане феномен метилирования является элементом системы распознавания, выполняя защитную функцию, направленную на предохранение организма от чужеродной ДНК и избытка эндогенных повторов [29], логично предположить следующий механизм инактивации одного из аллелей NF1 в определенных тканях с возрастом. Известно, что в онтогенезе могут активироваться определенные ретроэлементы, влияя на диф-ференцировку клеток с возрастом. Ген NF1 регулирует цитологическую дифференцировку. Поскольку в гене имеются «горячие точки» инсерции для Ll-транспо-зонов, характер метилирования гена может играть защитную роль, препятствуя тем самым внедрению транспозонов.

Промотор гена расположен в CpG-богатой области [30]. Согласно данным литературы промоторная область NF1 вблизи стартового сайта транскрипции полностью деметилирована в клетках многих нормальных тканей [31]. Данная особенность может свидетельствовать в пользу возможного влияния метилирования на патогенез опухолевого синдрома.

Около 50 % случаев НФ1 обусловлены мутациями de novo, при этом 90 % из них определяются в отцовских хромосомах [25]. Возможные причины данного феномена — влияние микроРНК и геномный импринтинг в связи с тем, что при наличии мутаций de novo материнского происхождения эпигенетическое подавление экспрессии аллеля гена NF1 отцовского происхождения может быть несовместимым с жизнью (инактивация обоих аллелей на ранних этапах эмбрионального развития приводит к летальным порокам развития). В случае семейных форм при наследовании от матери наблюдается утяжеление клиники, однако нелетальное благодаря эпигенетическим механизмам перестройки генома в яйцеклетках.

В интроне 27b расположены 3 небольших гена, транскрибирующиеся в обратной ориентации к NF1: OMGP, EVI2A, EVI2B. Функция данных генов направлена на регуляцию пролиферации клеток, при этом интрон расположен между экзонами, кодирующими функционально активный SecMp-домен [10].

Продукт экспрессии гена NF1 содержит несколько функционально-активных домена, 3 из которых наиболее важны для его функции (рис. 2). ГТФаз-активирующий домен взаимодействует со всеми 3 изоформами RAS-белков. Цистеин-серин-богатый домен (CSRD) взаимодействует с циклической аденозинмонофосфатзависимой протеинкиназой А, регулирует взаимодействие с микро-тубулами. SecMp-домен регулирует расположение нейро-фибромина на эндомембранах, облегчает взаимодействие с глицерофосфолипидами для селективной регуляции RAS [10]. Идентифицирован также плекстрингомологич-

9br

1 2 3 4а 4b 4c 5 6 7 8 9 П10а 10b 10c 11 12a 12b 13 14 15 1Í

II

23a

CSRD

cv

ев

17 18 19a 19b 20 21 22 23-1 23-2 / 24 25 26 27a 27b 28

29

30 31 32 33

48a

OMGPEV12B EV12A 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 Í7 49

и

Ш

u

Рис. 2. Схема гена NF1 с основными доменами

ный (PH) домен, совместно с SecM-доменом модулирующий актиновый цитоскелет [13].

На сегодняшний день известны не менее 7 доменов нейрофибромина, посредством которых он взаимодействует с большим количеством белков, участвуя в разнообразных внутриклеточных процессах (рис. 3) [13]. Он реагирует с белком SPRED1, также влияющим на RAS-систему. Нейрофибромин является основным GAP-белком для RAS в дендритах нейронов, где посредством лейцинбогатого домена он взаимодействует с молекуляр-

Сайт связывания неизвестен

ным проводником (шапероном) - валозинсодержащим белком (VCP). При взаимодействии с убиквитинлигаза-ми продукт экспрессии NF1 подвергается деградации путем убиквитинирования, что повышает активность RAS. Так, убиквитинлигаза SAG посредством подобных взаимодействий стимулирует развитие сосудов, а убик-витинлигаза куллин 3 в клетках спорадических глиобла-стом разрушает нормальный нейрофибромин. Таким образом, изменения активности белков, взаимодействующих с продуктом экспрессии NF1, могут приводить

Нейрофибромин

4 Ремоделирование ' Клеточная адгезия ' " Клеточные Внутриклеточный

актинового цитоскелета "' "' "' сигнальные пути ' обмен

Мембранная локализация Дифференцировка нейронов

Убиквитинирование

Рис. 3. Схема взаимодействия нейрофибомина с биомолекулами. Домены белка: CSRD — цистеин-серин-богатый домен, TBD — тубулинсвязыва-ющий домен, GRD — связанный с ГТФаз-активирующим белком домен

Ж ш

и

N

C

CV

со

es

и ш u

X ш

и

к его инактивации и являться одной из причин инициирования туморогенеза [13].

Патогенез опухолевого синдрома при нейрофиброматозе 1-го типа

В настоящее время механизмом туморогенеза при НФ1 принято считать двухударную модель 2-го генетического события онкосупрессорного гена. Действительно, в злокачественных опухолях и нейрофибро-мах часто выявляется биаллельная инактивация NF1, в том числе LOH. Предполагается, что один из механизмов инактивации второго аллеля NF1 происходит во время репарации ДНК, особенно при гомологичной рекомбинации [32]. Механизмы, ведущие к биаллельной инактивации включают потерю хромосомы с редупликацией, митотическую рекомбинацию, хромосомные микроделеции, а также соматические внутригенные мутации [21]. Однако мутации во втором аллеле, по данным многочисленных исследований, не совпадают с первичной мутацией гена, вызвавшей заболевание [15, 33]. Среди соматических мутаций второго аллеля наиболее распространенными оказались мутации со сдвигом рамки считывания, из них наиболее часто встречающиеся — делеция не менее 4 п.н. Частота выявления LOH составляет 20 % [21]. В исследованиях D.R. Stewart и соавт. при изучении клеточной линии, выделенной из гломусных опухолей при НФ1, обнаружена митоти-ческая рекомбинация в 22 % клеток. Однако исследование проводили в клеточных линиях опухолей, редко (лишь у 5 %) встречающихся при НФ1, выделенных лишь из 4 образцов опухолей, что дает статистически малодостоверный результат [34]. Более того, даже при применении полученных данных в качестве объяснения туморогенеза при НФ1 рекомбинация лишь в 22 % случаев не может объяснить образование опухолей у всех больных НФ1.

Высокий темп (до 1 на 10 тыс. гамет) мутирования гена NF1 [4] также не может объяснить образование нейрофибром у 95 % пораженных. Характерна также взаимосвязь образования опухолей и возраста — в большинстве случаев нейрофибромы начинают формироваться в пубертате — в период, когда в организме происходят серьезные физиологические сдвиги под действием эпигенетических процессов. В связи с вышеизложенным становится понятным, что выявленные мутации второго аллеля гена NF1 являются, скорее, не инициирующими, а результатом общих нарушений стабильности генома и регуляции клеточного цикла. Промотор гена расположен в CpG-богатой области [30], в связи с чем обоснованно проведение сравнительного анализа паттернов метилирования CpG-ди-нуклеотидов промоторной области гена NF1 у больных НФ1, а также общего гипометилирования генома. При отличии метилирования геномной ДНК из тканей опухолей по сравнению с ДНК лейкоцитов крови можно утверждать, что мутации во втором аллеле гена NF1 могут быть следствием общих дестабилизирующих

изменений в геноме или (под действием микроРНК) в области геномной нестабильности [22]. В подтверждение можно привести пример обнаружения мутаций N¥1 более чем в 10 % образцов рака легких, появляющихся на поздних стадиях туморогенеза, тогда как при НФ1 нет выраженной предрасположенности к данному виду рака, сравнимой с другими злокачественными новообразованиями [13].

Уровни экспрессии продукта гена N¥1 отличаются в различных тканях и на разных этапах онтогенетического развития [10], что указывает на роль эпигенетических факторов в регуляции гена. Нарушение регуляции с помощью микроРНК или изменения метилирования у здорового человека компенсируется функцией второго аллеля, в то время как при НФ1 данные нарушения ведут к потере функции нейрофибромина и образованию опухолей.

В патогенезе опухолевого синдрома большое значение имеют иммунологические нарушения. В крови больных НФ1 обнаружено повышенное количество активированных моноцитов крупных размеров с СБ16-экспрессией, а также высокие уровни цито-кинов 1Ь-1р и 1Ь-6 [23]. Выявлена корреляция уровней иммуноглобулина Е в сыворотке больных НФ1 с количеством нейрофибром, а также с размерами плек-сиформных нейрофибром [35], что подтверждается эффективностью длительного применения кетоти-фена в лечении болезни. Нейрофибромы густо инфильтрированы мастоцитами, которые принимают активное участие в инициации и прогрессировании опухолевого процесса за счет дегрануляции и высвобождения медиаторов, повреждающих внеклеточный матрикс, усиливая пролиферацию фибробластов и синтез коллагена. Мастоциты выделяют также белок, ре-моделирующий клеточные ассоциации и инициирующий неоангиогенез, а также факторы роста нервных и эндотелиальных клеток. В то же время NF1-мутантные шванноциты секретируют Кй-лиганд, стимулирующий миграцию мастоцитов [36]. Таким образом, формируется своеобразный замкнутый патофизиологический процесс (рис. 4), который подвергается влиянию других факторов (в противном случае происходила бы тотальная безостановочная генерализация, приводящая, в конце концов, к летальному исходу). В действительности характер туморогенеза при НФ1 в каждом случае индивидуален, часто встречается стертая клиника с единичными опухолями, при генерализованных формах туморогенез в определенные моменты значительно стихает, достигая своего максимума в пубертатном периоде. Наиболее вероятной причиной являются особенности онтогенетического регулирования эпигенетическими факторами в разном возрасте [37]. Одновременно данные обстоятельства говорят о выраженной дисфункции иммунной системы, с патологической гиперактивацией и пролиферацией мастоцитов. В связи с этим важно проводить эпигенетические

Кровеносный сосуд

CV

ев

и ш u

Рис. 4. Схема механизма прогрессирования нейрофибромы

исследования не только опухолей, но и клеток периферической крови больных НФ1.

Дегрануляция мастоцитов в тканях опухоли вызывает выброс медиаторов, способствующих пролиферации шванноцитов и фибробластов. Пролифери-рующие фибробласты продуцируют повышенное количество коллагена, что приводит к образованию стромы опухоли. Пролиферирующие шванноциты вырабатывают Kit-лиганд, способствующий миграции мастоцитов (которые далее активно дегранули-руют и приводят к прогрессированию опухолевого процесса).

Роль гена М1 в спорадическом канцерогенезе

Комплексное исследование с анализом соматических мутаций в моделях более 1500 связанных с раком генов в крупной панели опухолей легких, молочной железы, яичников, поджелудочной железы и предстательной железы выявило, что ЫЕ1 — один из 10 наиболее часто мутирующих генов при данных типах опухолей (частота мутаций >5 %) [13]. Частота обнаружения мутаций в гене ЫЕ1 у больных с ювенильной миело-моноцитарной лейкемией достигает 30 %. В то же время лишь 10—14 % детей с данным типом лейкоза страдают НФ1. Данное обстоятельство говорит о роли мутаций ЫЕ1 в генезе спорадических форм миело-лейкоза [25].

В различных исследованиях выявляются соматические мутации NF1 при раке, не ассоциированном с НФ1: глиобластомы, аденокарциномы легких, рак молочной железы, лейкозы, серозные карциномы яичников, нейробластомы. Некоторые изменения в гене NF1 в данных опухолях определяются относительно часто и могут быть использованы в качестве специфических прогностических и диагностических маркеров. Например, NF1 инактивирован в 23 % случаев спорадических глиобластом, что позволяет выделить данный мезенхимальный молекулярный подкласс. В 22 % серозных карцином яичников определяются мутации NF1, из них в 70 % случаев инактивация NF1 биаллель-на [6].

При меланомах 3-го класса (ассоциированных с возрастом) в 30 % случаев обнаруживают делецион-ные мутации NF1. Мутации NF1 при кожных меланомах встречаются в 14 %, при раке легкого — в 12 %, при колоректальной карциноме — в 5 %, при раке молочной железы — в 3 % случаев; при остром миелолей-козе взрослых полная потеря экспрессии NF1 выявлена у 7 % больных. Встречаемость мутаций при других видах рака представлена в табл. 3. Предполагается, что инактивация NF1 при некоторых видах опухолей является причиной резистентности к терапии и неблагоприятных исходов [9]. Так, в работе M.H. Nissan и соавт. при исследовании клеточной линии меланомы

х ш

и

Таблица 3. Частота обнаружения мутаций в гене N¥1 при спорадическом раке

CV

со

es

и ш u

X ш

и

Вид злокачественной опухоли Частота обнаружения мутаций NF1, %

Эмбриональная рабдомиосаркома 35

Спорадические феохромоцитомы 26-41

Глиобластомы 23

Серозные карциномы яичников 22

Кожные меланомы 14

Рак легкого 12

Миксофибросаркома 10

Плеоморфная липосаркома 8

Острый миелолейкоз взрослых 7

Нейробластомы 6

Колоректальная карцинома 5

по мутации в гене BRAF(V600E) показано, что потеря NF1 дает клеткам селективные преимущества и устойчивость к RAF-ингибиторам [38]. В исследованиях M. Holzel и соавт. доказано, что NF1 контролирует ответ на ретиноевую кислоту через RAS-MEK-сигнальный каскад путем ингибирования экспрессии RAR/RXR коактиватора ZNF423. Клеточные линии нейробластомы с NF1-нокдауном проявляли устойчивость к ретиноевой кислоте. При этом мутации NF1 выявляются в 6 % спорадических нейробластом [39].

Исследование метилирования промоторной области гена NF1 при нейрофиброматозе 1-го типа

Важнейшая эпигенетическая модификация, статус которой в организме достоверно меняется с течением жизни — метилирование ДНК [40] — механизм геномного импринтинга и регуляции всей программы развития. У эукариот метилирование видо- и тканеспе-цифично, контролируется гормонами, изменяется с возрастом и является одним из механизмов клеточной и половой дифференцировки. Профиль метилирования изменяется при канцерогенезе, служит надежным диагностическим признаком разных форм рака [41].

В норме в организме человека метилировано до 70 % CpG-динуклеотидов, или 3—6 % всех цитози-нов [40]. Распространенным механизмом инактивации генов-онкосупрессоров при туморогенезе является гиперметилирование промотора — данная «эпимута-ция» считается функциональным эквивалентом LOH [42]. Локальное гиперметилирование при этом распространяется на относительно небольшую часть (20 %) динуклеотидов CpG, образующих соответствющие островки [29]. Подавление продукции нейрофиброми-на в результате метилирования NF1 наблюдается

в раковых клетках [13]. Логично предположить, что и при НФ1 инициирующим для образования опухолевых клеток может служить физиологическое гиперметилирование одного из аллелей. Физиологическое — значит, что для генома человека описаны возрастные характеристики процесса метилирования ДНК, имеющие ткане- и возрастспецифический характер. Различна также роль ДНК метилтрансфераз в клетках на различной стадии дифференцировки [29]. В пубертате происходят серьезные физиологические перестройки в организме под действием гормонов, в том числе для регуляции функций определенных тканей необходимо регулирование функции генов. В данном возрасте характерно образование большинства нейро-фибром при НФ1. Основной причиной этого может служить гиперметилирование промоторной области NF1 — гена, регулирующего пролиферативную активность клеток — соответственно, инактивация одного из его аллелей для резких физиологических переходов оправданна.

Перерождение плексиформных нейрофибром в MPNST при НФ1 — распространенный процесс. Особенности метилирования могут быть вовлечены в развитие различных типов нейрофибром и злокачественную трансформацию. В работе A. Harder и соавт. при исследовании паттерна метилирования промотора NF1 би-сульфитным геномным секвенированием НФ1-ассоции-рованных 9 кожных и 7 плексиформных нейрофибром, 5 MPNST и 20 контрольных образцов ДНК из лейкоцитов периферической крови было выявлено специфическое метилирование сайтов связывания транскрипционных факторов для SP1, CRE (-10), AP-2; гиперметилирование промотора в НФ1-ассоциирован-ных опухолях не обнаружено [43]. Однако M.P. Horan и соавт. при исследовании нейрофибром и лимфоцитов периферической крови больных НФ1 и в группе контроля обнаружили опухолеспецифическое метилирование в 6 отдельных CpG-сайтах в позициях -609, -429, -406, -383, -331, -315 по отношению к сайту начала транскрипции [42]. В работе L. Fishbein и соавт. проведен анализ метилирования промотора NF1 в нормальных шванно-цитах и образцах плексиформных нейрофибром от больных НФ1, в которых соматические мутации второго аллеля не были выявлены. Однако в позиции -451 по отношению к сайту начала транскрипции определено специфическое метилирование в 12 из 18 анализируемых опухолей [31].

D.H. Gutmann и соавт. при сравнительном исследовании паттерна метилирования NF1 низкодиффе-ренцированных глиом обнаружили значительные различия с данными по спорадическим опухолям, что дало основание считать метилирование NF1 в качестве возможной причины биаллельной инактивации гена [44].

У животных, как и у человека, существует тканевая (клеточная), субклеточная и возрастная разнокачест-венность (специфичность) метилирования ДНК.

CG CNG

CNN _|_

dsRNA

J

cv

Метилирование de novo

Инвертированные повторы ДНК

'^RDR2)

ев

И <Ш>ч

CG CNG CNN

'metA/1)rm@'''ag04 }

Рис. 5. Подавление экспрессии генов малыми интерферирующими РНК

И

ш u

Общебиологическое явление программированного метилирования определяется гормональным контролем. При этом глобальные перестройки происходят в период полового созревания [41]. С учетом инициирования опухолевого процесса при НФ1 главным образом в пубертатный период роль метилирования в данном отношении наиболее очевидна. Перспективы исследования характера метилирования промотора N¥1 при НФ1 и его роли в патогенезе заболевания связаны с возможностью специфического деметилирования и, таким образом, ингибирования опухолевой трансформации. Метилирование ДНК может существенно модулироваться различными биологическими (вирусами, бактериями, грибами, паразитическими растениями) и абиотическими (стрессами) факторами. Так, ингибитор метилирования ДНК 5-азацитидин уже используется для лечения рака кожи [41]. Поэтому программа по возможному нахождению терапевтических моделей регуляции метилирования вполне осуществима. Однако перспективно использование молекул, максимально специфично взаимодействующих с промотор-ной областью конкретного гена, так как описаны случаи, когда химиотерапия с применением гипоме-тилирующих агентов (азацитидина и децитабина) приводила к развитию тяжелого миокардита [40].

У животных и растений существует связь между метилированием ДНК и деацетилированием гистонов. Например, ген гистоновой деацетилазы необходим для метилирования ДНК, индуцированной малыми РНК (ёБЯКЛ). Большой интерес привлекает изучение

механизмов и биологической роли метилирования ДНК, направляемой малыми РНК, которые осуществляют специфическое выключение генов (сайленсинг). Сайтспецифичные ДНК-метилтрансферазы в присутствии малых сигнальных РНК осуществляют de novo метилирование ДНК по CNG и другим сайтам нукле-отидной последовательности ДНК, узнаваемой малой РНК (рис. 5). Метилирование ДНК играет решающую роль в подавлении экспрессии генов малыми РНК [41].

Исследование микроРНК в патогенезе нейрофиброматоза 1-го типа

МикроРНК имеют важное значение в регуляции канцерогенеза. Различные типы образований и опухоли на разных стадиях показывают уникальные профили микроРНК [22]. Одним из первых сообщений об ассоциации микроРНК с канцерогенезом человека стала публикация G.A. Calin и соавт. (2002) о hsa-miR-15a и hsa-miR-16-1, делетированных в 70 % опухолевых клеток у больных с В-клеточным хроническим лимфо-лейкозом. Трансгенная экспрессия hsa-miR-15a и hsa-miR-16-1 приводила к снижению уровней белка В-кле-точного лейкоза и индукции апоптоза в лейкемических клеточных линиях [22, 45]. С момента открытия микроРНК около 24 лет назад обнаружена их важная роль в развитии рака, в том числе НФ1-ассоциированных опухолей. C момента открытия микроРНК, им посвящено более 60 000 научных публикаций, около половины которых о роли микроРНК в онкогенезе. У человека открыто около 2000 уникальных микроРНК,

X ш

и

or

Таблица 4. МикроРНК, ингибирующие экспрессию гена NFl

CV

со

es

Источник

МикроРНК

Объект исследования

[47] miR-21, miR-29c, miR-34a, miR-204 Злокачественные опухоли из оболочек периферических нервов

[8, 21, 47] miR-10b Злокачественные опухоли из оболочек периферических нервов, нейрофибромы

[48] miR-370 Лейкоциты при остром миелолейкозе

[9] miR-193b Плоскоклеточный рак головы и шеи

[50] miR-514a Меланома

[49] miR-128, miR-137 Клетки головного мозга здорового человека

[49] miR-103 Любые клетки здорового человека

и ш u

X ш

и

и число их растет. Изменение уровней специфических микроРНК выявлено почти во всех типах злокачественных новообразований, включая рак легкого, толстой кишки, поджелудочной и молочной железы и лейкоз [46]. Сейчас очевидно, что микроРНК регулируют экспрессию не менее 30 % всех белоккодирующих генов в геномах млекопитающих. Потенциальная роль ми-кроРНК в патологии изучена не только при определении их однонуклеотидных полиморфизмов (SNP), но и по вариациям числа их копий (CNV). МикроРНК играют ключевую роль в развитии рака влиянием на ге-ны-онкосупрессоры. Более 50 % микроРНК локализуются в ассоциированных с раком областях или ломких участках хромосом [47].

Специфические микроРНК могут служить альтернативой LOH гена NF1 в регуляции туморогенеза при НФ1 [8]. Несколько исследовательских групп изучили роль микроРНК в возникновении НФ1 -ассоциированных злокачественных заболеваний. Из них напрямую вовлечены в туморогенез злокачественного перерождения при НФ1: miR-10b, miR-21, miR-29c, miR-34a, miR-204 [47]. В исследованиях G. Chai были определены профили микроРНК для NF1 в опухолевых тканях и клеточных линиях. Выявлена усиленная регуляция miR-10b в шванноцитах MPNST, а также нейрофибром при НФ1 [8, 21].

Функциональный анализ показал, что ген NF1 является непосредственной мишенью miR-370, гиперэкспрессия которого дает аналогичные с NFl-инактивацией эффекты, усиливая пролиферацию и образование колонии клеток острого миелолейкоза [48]. На уровень экспрессии нейрофибромина оказывают влияние miR-103, miR-128 и miR-137 путем специфического связывания с 3'-концом белка. При этом miR-103 экспресси-руется во всех тканях организма, тогда как miR-128 и miR-137 — только в головном мозге. Экспрессия данных трех микроРНК на самом высоком уровне регистрируется в нейронах, на самом низком — в шванноцитах. Избыточная экспрессия этих микроРНК значительно снижает уровень эндогенного нейрофибромина, тогда

как антисмысловое ингибирование данных микроРНК усиливает его трансляцию [49].

Обнаружено подавление NF1 посредством miR-193b, гиперэкспрессия которого наблюдается при спорадическом плоскоклеточном раке головы и шеи, приводящее к активизации ERK и прогрессии опухоли [9]. В исследованиях M.S. Stark и соавт. подтверждено, что NF1 является непосредственной мишенью miR-514a. Гиперэкспрессия miR-514a в клеточной линии меланомы ингибирует экспрессию NF1 [50].

Изучение влияния микроРНК на ген NF1 в туморо-генезе при НФ1, а также при спорадических злокачественных опухолях имеет большое значение. Так, в исследованиях G. Chai и соавт. показана возможность использования антисмыслового ингибирования miR-10b для восстановления экспрессии нейрофибромина клеточной линии саркомы SK-ES-1 и подавления зависимой от нейрофибромина RAS-активности в клетках MPNST при НФ1 [8]. В апреле 2013 г. начаты клинические испытания противоопухолевой терапии микроРНК-препара-та MRX34 — липосомсвязанной мимичной miR-34 для лечения больных гепатоцеллюлярной карциномой [51].

В табл. 4 представлены накопленные данные об ин-гибирующем влиянии микроРНК на экспрессию NF1. Эти микроРНК могут служить альтернативой LOH для гена NF1 в регуляции туморогенеза при НФ1.

Сегодня возлагаются большие надежды на использование специфических микроРНК в терапии рака и других болезней. Это преимущественно связывают с направленным ингибированием активности генов, отвечающих за раковую трансформацию клеток и метастазирование [41]. Поскольку NF1 играет значительную роль в опухолевой трансформации как при НФ1 -ассоциированных, так и при спорадических злокачественных новообразованиях, исследование роли микроРНК в патогенезе данных процессов является перспективной и социально значимой задачей.

Кроме того, выявлена значительная роль длинных некодирующих РНК (long non-coding RNA, 1псРНК) для активации критических регуляторов в развитии

опухолей при НФ1. В качестве гена-модификатора N¥1 может служить ген 1псРНК ANRIL, оказывающий существенное влияние на формирование плексиформных нейрофибром при НФ1. В работе Е. РаБшаП и соавт. обнаружена статистически значимая ассоциация одно-нуклеотидного полиморфизма ге2151280, расположенного в ANRIL, с количеством плексиформных нейро-фибром у больных НФ1 [52]. Однако в исследовании Т. МиЬойег и соавт. у больных НФ1 с микроделециями N¥1 не выявлено ассоциации плексиформных нейро-фибром с ^2151280. ЬпсРНК ANRIL напрямую связывается с белком Би/12, важным участником многокомпонентного репрессивного комплекса-2, и необходим для использования Би/12 генами-онкосупрессорами CDKN2A/CDKN2B, а также для их эпигенетического подавления. Т-аллель ^2151280, коррелирующий с редуцированной экспрессией ANRIL, ассоциирован с большим количеством плексиформных нейрофибром [53]. ЬпсРНК ANRIL идентифицирована в качестве онкогена, вовлеченного в развитие ряда опухолей, таких как рак желудка, легкого, гепатоцеллюлярная карцинома и плоскоклеточный рак пищевода. Ингибирование ANRIL подавляет пролиферацию, миграцию и инвазию раковых клеток [54]. Предполагается, что исследование роли 1псРНК имеет важное значение в фармакокоррек-ции опухолевого синдрома при НФ1, в частности путем модуляции экспрессии ANRIL [50]. Кроме того, ANRIL может выступать в качестве диагностического и прогностического биомаркера некоторых опухолей [52] и быть использован для прогнозирования течения опухолевого синдрома при НФ1.

Заключение

НФ1 — одно из самых распространенных наследственных заболеваний с частотой встречаемости 1:3,0— 3,5 тыс. населения в мире [1—4]. Причиной возникновения НФ1 являются мутации в онкосупрессорном гене N¥1, отличающиеся чрезвычайно высокой мутабельно-стью — доля спорадических случаев составляет 50 %, в связи с чем с учетом сохраненной способности к деторождению больных, распространенность НФ1 в мире

неуклонно возрастает. В настоящее время не существует эффективных способов лечения опухолевого синдрома при НФ1, нередко иссечение опухолей провоцирует диссеминацию опухолевого процесса и развитие рецидивов. Возникающие злокачественные новообразования при НФ1 проявляют высокую стойкость к химиотерапии [6]. Кроме того, мутации в гене N¥1 играют важную патогенетическую роль в спорадическом канцерогенезе [6, 9, 38, 39]. Предполагается, что в инактивации второго аллеля гена N¥1 в опухолях при НФ1 и в инактивации обоих аллелей N¥1 в спорадических неоплазмах большое значение имеют эпигенетические факторы. На роль эпигенетических факторов в патогенезе НФ1 указывает отсутствие в большинстве опубликованных исследований гено-фенотипических корреляций даже у членов одной семьи с идентичной мутацией [13], а также особенности гена N¥1 (большие размеры гена — 280 кб, 57 экзонов; наличие нескольких функционирующих альтернативных сплайсинговых транскриптов [23]; наличие 11 псевдогенов N¥1 [10], высокий темп мутирования гена N¥1 [4, 25]; наличие в гене N¥1 «горячих точек» для инсерции Ь1-элементов [26]; развитие большинства нейрофибром в пубертатном периоде, расположение промотора гена в СрО-богатой области [30], разные уровни экспрессии N¥1 в различных тканях и на различных этапах и в разном возрасте [10]). Исследование роли эпигенетических факторов в патогенезе НФ1 позволило выявить специфическое изменение характера метилирования промоторной области гена N¥1 в НФ 1 -ассоциированных опухолях [31, 42—44], а также обнаружить вовлечение в канцерогенез злокачественных новообразований микроРНК тЯ- 10Ь, тЯ-21, тЯ-29с, тЯ-34а, тЯ204 [8, 21, 47], ш1Я-370 [48] при НФ1 и в спорадических случаях ш1Я-193Ь [9], шiR-514a [50]. Перспективы изучения роли эпигенетических факторов в патогенезе НФ1 позволяют надеяться на возможности таргетной терапии опухолевого синдрома при данном заболевании, а также при спорадических злокачественных новообразованиях. В эксперименте успешно применено антисмысловое ингибирование шiR-10Ь в клеточных линиях злокачественных опухолей при НФ 1 [8].

CV

CS

и ш U

X ш

и

ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES

1. Duong T., Sbidian E., Valeyrie-Allanore L. et al. Mortality associated with neurofibromatosis 1: a cohort study of 1895 patients in 1980-2006 in France. Orphanet

J Rare Dis 2011;6:18-26.

2. Gregorian C., Nakashima J., Dry S. et al. PTEN dosage is essential for neurofibroma development and malignant transformation. PNAS 2009;106(46):19479-84.

3. Melean G., Hernandez A.M., Valero M.C. et al. Monozygotic twins with neurofibro-matosis type 1, concordant phenotype and synchronous development of MPNST and metastasis. BMC Cancer 2010;10:407-12.

4. Ponti G., Losi L., Martotana D. et al. Clinico-pathological and biomolecular findings in Italian patients with multiple cutaneous neurofibromas. Hered Cancer in Clin Pract 2011;9:6-15.

5. Brinkman J., Bron J., Wuisman P. et al. The correlation between clinical, nuclear and histologic findings in a patient with Von Recklinghausen's disease.

World J Surg Oncol 2007;5:130-7.

6. Laycock-van Spyk S., Thomas N., Cooper D., Upadhyaya M. Neurofibromatosis type 1-associated tumours: their somatic mutational spectrum and patho-

genesis. Hum Genomics 2011;5(6): 623-90.

7. Patil S., Chamberlain R.S. Neoplasms associated with germline and somatic NF1 gene mutations. Oncologist 2012;17(1):101-16.

8. Chai G., Liu N., Ma J. et al. MicroRNA-10b regulated tumorigenesis in neurofibromatosis type 1. Cancer Sci 2010;101(9):1997-2004.

9. Yap Y.S., McPherson J.R., Ong C. et al. The NF1 gene revisited — from bench to bedside. Oncotarget 2014;5(15); 5873-92.

I*" 10. Vandenbrucke I. Identification and chare acterization of neurofibromatosis type 1 PJ splice variants. 2004.

11. Дрозд О .В., Бабенко О.В., СемячкинаАН. со и др. Разработка подходов к ДНК-

диагностике нейрофиброматоза 1-го ДД типа в России. Медицинская генетика

-J 2005;4(7):322-6. [Drozd O.V., Babenko O.V.,

ts Semyachkina A.N. et al. Development

of approaches to DNA diagnostics Og of type 1 neurofibromatosis in Russia.

2 Meditsinskaya genetika = Medical

=Э Genetics 2005;4(7):322-6. (In Russ.)].

ш 12. Мустафин Р.Н., Бермишева М.А., О Хуснутдинова Э.К. Особенности

нейрофиброматоза 1-го типа 25 в Республике Башкортостан.

С/9 Медицинская генетика 2015;14(6):

29-35. [Mustafin R.N., Bermisheva M.A., 25 Khusnutdinova E.K. Features of type 1

^ neurofibromatosis in the Republic

eg of Bashkortostan. Meditsinskaya genetika =

Medical Genetics 2015;14(6):29-35. 3- (In Russ.)].

ЯВ 13. Ratner N., Miller S.J. A RASopathy gene commonly mutated in cancer: the neurofi-О bromatosis type 1 tumour suppressor.

== Nat RevCancer 2015;15(5):290-301.

в 14. Sabbagh A., Pasmant E., Laurendeau I.

et al. Unravelling the genetic basis of variable clinical expression in neurofibromato-^ sis 1. Hum Mol Gen 2009;18(18):

g 2768-78.

3E 15. Eisenbarth I., Beyer K., Krone W, Assum G.

ш

^ Toward a survey of somatic mutation

of the NF1 gene in benigh neurofibromas

of patients with neurofibromatoss type 1. X Am J Hum Genet 2000;66(2):393-401.

¡Й 16. Stevenson D.A., Zhou H., Ashrafi S. et al. g Double inactivation of NF1 in tibial

pseudarthrosis. Am J Hum Genet 2006;79(1):143-8.

17. Boyd K.P., Korf B.R., Theos A. Neurofi-bromatosis type 1. J Am Acad Dermatol 2009;61(1):1-16.

18. MсGillicuddy L.T., Fromm JA, Hollstein P.E. Proteasomal and genetic inactivation

of the NF1 tumor suppressor in glioma-genesis. Cancer Cell 2009;16(1):44-54.

19. Gutmann D.H., Giovannini M. Mouse models of neurofibromatosis 1 and 2. Neoplasia 2002;4(4):279-90.

20. Hawes J.J., Tuskan R.G., Reilly K.M. Nf1 expression is dependent on strain background: implications for tumor suppressor haploinsufficiency studies. Neurogenetics 2007;8(2):121-30.

21. Jouhilahti E.M., Peltonen S., Heape A.M., Peltonen J. The pathoetiology of neurofi-bromatosis 1. Am J Pathol 2011;178(5):1932-9.

22. Huppi K., Volfovsky N., Mackiewicz M. et al. MicroRNAs and genomic instability. Semin Cancer Biol 2007;17(1):65-73.

23. Bottillo I., Luca A., Schirinzi A. et al. Functional analysis of splicing mutations in exon 7 of NF1 gene. BMC Med Genet 2007;8:4-13.

24. Zhou H., Hinman M., Barron V. et al. Hu proteins regulate alternative splicing by inducing localized histone hyperacety-lation in an RNA-dependent manner. PNAS 2007;108(36):627-35.

25. Горбунова В.Н., Имянитов Е.Н., Леда-щева Т.А. и др. Молекулярная неврология. Часть III. Опухоли головного мозга, онкогены и антионкогены. Под ред. А. А. Скоромца. СПб.: Интермедика, 2004. С. 219-232. [Gorbunova V.N., Imyanitov E.N., Ledashcheva Т.А. et al. Molecular neurology. Part III. Tumors

of the brain, oncogenes and anti-onco-genes. Ed. A.A. Skoromets. Saint Petersburg: Intermedika, 2004. Pp. 219-232. (In Russ.)].

26. Wimmer K., Callens T., Wernstedt A., Messiaen L. The NF1 gene contains hotspots for L1 endonuclease-dependent de novo insertion. PLoS Genet 2011;7(11):e1002371.

27. Ayarpadikannan S., Lee H.E., Han K., Kim H.S. Transposable element-driven transcript diversification and its relevance to genetic disorders. Gene 2015;558(2):187-94.

28. Патрушев Л.И., Минкевич И.Г. Проблема размера геномов эукариот. Успехи биологической химии 2007;47:293-370. [Patrushev L.I., Minkevich I.G. The problem of the size of the genomes of eukaryotes. Uspekhi biologicheskoy khimii = Advances

in Biological Chemistry 2007;47:293-370. (In Russ.)].

29. Козлов В.А. Метилирование ДНК клетки и патология организма. Медицинская иммунология 2008;10(4): 307-18. [Kozlov V.A. Methylation of cell DNA and pathology of the body. Meditsinskaya immunologiya = Medical Immunology 2008;10(4):307-18. (In Russ.)].

30. Jeong S.Y., Park S.J., Kim H.J. The spectrum of NF1 mutations in Korean patients with neurofibromatosis type 1. J Korean Med Sci 2006;21(1):107-12.

31. Fishbein L., Eady B., Sanek N. et al. Analysis of somatic NF1 promoter meth-ylation plexiform neurofibromas and Schwann cells. Cancer Genet Cytogenet 2005;157(2):181-6.

32. Garcia-Linares C., Fernandez-Rodriguez J., Terribas E. et al. Dissecting loss of hetero-zygosity (LOH) in neurofibromatosis type 1-associated neurofibromas: importance of copy neutral LOH. Hum Mutat 2011;32(1):78-90.

33. De Raedt T.D., Maertens O., Chmara M. et al. Somatic loss of wild type NF1 allele in neurofibromas: comparison of NF1 mi-crodeletion and non-microdeletion patients. Genes Chromosomes Cancer 2006;45(10):893-904.

34. Stewart D.R., Pemov A., van Loo P. et al. Mitotic recombination of chromosome arm 17q as a cause of loss of heterozygosity of NF1 in neurofibromatosis type 1-asso-

ciated glomus tumors. Genes Chromosomes Cancer 2012;51(5):429-37.

35. Geller M., Ribeiro M.G., Araüjo A.P. et al. Serum IgE levels in neurofibromatosis 1. Int J Immunogenet 2006;33(2):111-5.

36. Chen S., Burgin S., McDaniel A. et al. NF1-/- schwann cell-conditioned medium modulates mast cell degranulation by c-Kit-mediated hyperactivation of phosphatidylinositol 3-kinase. Am J Pathol 2010;177(6):3125-32.

37. Horvath S. DNA methylation age of human tissues and cell types. Genome 2013;14(10):115.

38. Nissan M.H., Pratilas C.A., Jones A.M. Loss of NF1 in cutaneous melanoma is associated with RAS activation and MEK dependence. Cancer Res 2014;74(8):2340-50.

39. Holzel M., Huang S., Koster J. et al. NF1 is a tumor suppressor in neuroblastoma that determines retinoic acid response and disease outcome. Cell 2010;142(2): 218-29.

40. Рунов АЛ., Вонский М.С., Михельсон В.М. Уровень метилирования ДНК и длина теломер как основа для построения модели биологических часов старения. Цитология 2015;57(3):192-6. [Runov A.L., Vonskiy M.S., Mikhel'son УМ. The level of DNA methylation and the length

of telomeres as a basis for constructing a model of biological aging hours. Tsi-tologiya = Cytology 2015;57(3):192-6. (In Russ.)].

41. Ванюшин Б.Ф. Эпигенетика сегодня

и завтра. Вавиловский журнал генетики и селекции 2013;17(4/2):805-32. [Vanyushin B.F. Epigenetics today and tomorrow. Vavilovskiy zhurnal genetiki i selektsii = Vavilov Journal of Genetics and Breeding 2013;17(4/2):805-32. (In Russ.)].

42. Horan M.P., Cooper D.N., Upadhyaya M. Hypermethylation of the neurofibromato-sis type 1 (NF1) gene promoter is not

a common event in the inactivation of the NF1 gene in NF1-specific tumours. Hum Genet 2000;107(1):33-9.

43. Harder A., Rosche M., Reuss D.E. et al. Methylation analysis of the neurofibroma-tosis type 1 (NF1) promoter in peripheral nerve sheath tumors. Eur J Cancer 2004;40(18):2820-8.

44. Gutmann D.H., McLellan M.D., Hussain I. et al. Somatic neurofibromatosis type 1 (NF1) inactivation characterizes NF1-as-sociated pilocytic astrocytoma. Genome Res 2013;23(3):431-9.

45. Calin G.A., Dumitru C.D., Shimizu M.

et al. Frequent deletions and down-regulation of micro-RNA genes miR15 and miR16 at 13q14 in chronic lymphocytic leukemia. Proc Natl Acad Sci U S A 2002;99(24):15524-9.

46. Gozuacik D., Akkoc Y., Ozturk D.G., Ko-cak M. Autophagy-regulating microRNAs and cancer. Front Oncol 2017;7:65.

47. Sedani A., Cooper D.N., Upadhyaya M. An emerging role for microRNAs in NF1 tu-morigenesis. Human Genomics 2012;6:23-32.

48. Garcia-Orti L., Cristobal I., Cirauqui C. et al. Integration of SNP and mRNA arrays with microRNA profiling reveals that miR-370 is upregulated and targets NF1 in acute myeloid leukemia. PLoS One 2012;7(10):e47717.

49. Paschou M., Doxakis E. Neurofibromin 1 is a miRNA target in neurons. PLoS One 2012;7(10):e46773.

50. Stark M.S., Bonazzi V.F., Boyle G.M.

et al. MiR-514a regulates the tumour suppressor NF1 and modulates BRAFi sensitivity in melanoma. Oncotarget 2015;6(19):17753-63.

51. Ling H., Fabbri M., Calin G.A. MicroRNAs and other non-coding RNAs

as targets for anticancer drug development. Nat Rev Drug Discov 2013;12(11): 847-65.

52. Pasmant E., Sabbagh A., Masliah-Plan-chon J. et al. Role of noncoding RNA

ANRIL in genesis of plexiform neurofibro-mas in neurofibromatosis type 1. J Natl Cancer Inst 2011;103(22):1713-22.

53. Mubotter T., Kluwe L., Hogel J. et al. Non-coding RNA ANRIL and the number of plexiform neurofibromas in patients with NF1 microdeletions. BMC Med Genet 2012;13:98.

54. Li Z., Yu X., Shen J. ANRIL: a pivotal tumor suppressor long non-coding RNA

in human cancers. Tumour Biol 2016;37(5):5657-61.

cv

CS

и ш u

X ш

и