СПОСОБ ОБУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОЙ НЕЙРОННОЙ СЕТИ КУЛЬТУРЫ, ВЫРАЩЕННОЙ НА МУЛЬТИЭЛЕКТРОДНОЙ МАТРИЦЕ
TRAINING METHOD OF BIOLOGICAL NEURON NETWORK OF CULTURE GROWN ON MULTIPLE-ELECTRODE MATRIX

Изобретение относится к области проведения электрофизиологических манипуляций с живой тканью, а именно к обучению нейронной сети in vitro. Обучение понимается как формирование воспроизводимого условного ответа на электрический стимул. Способ может быть использован для проведения электрофизиологических экспериментов, связанных с изучением явлений обучения и памяти, влияния различных химических, физических и биологических факторов на указанные явления, и для создания нейрон-компьютерных устройств, способных к обучению.
Электродинамические свойства любой нейронной сети не постоянны во времени, вариабельны и носят вероятностный характер, кроме того, они могут сильно различаться со свойствами других таких же нейронных сетей. Поэтому при обучении нейронной сети возникает задача индивидуального подбора ряда параметров, а именно: параметров стимуляции (частота, амплитуда), оптимального для процесса обучения временного интервала рассмотрения ответа, критериев ответа, критериев обучения.
Известен способ обучения биологической нейронной сети, выращенной на мультиэлектродной матрице, на основе стимуляции с обратной связью, предложенный в 2001 году группой ученых под руководством Ш. Марома (Израильский технологический институт «Технион»). Способ включает цикл, состоящий из стимуляции, регистрации ответа сети и изменения стимуляции на некоторое время, если ответ удовлетворяет заданным критериям. Цикл повторяют до тех пор, пока сеть не натренируется давать определенный «желаемый ответ». Уменьшение времени достижения «желаемого ответа» от одной серии стимуляции к другой является свидетельством обучения биологической нейронной сети. Методика отражена в патенте US 7499894, а также в журнальной публикации: Goded Shahaf and Shimon Marom, Learning in Networks of Cortical Neurons // The Journal of Neuroscience, 2001, 21 (22): 8782-8788.
Одним из основных недостатков данного способа является отсутствие алгоритма определения оптимальных для индивидуальной нейронной сети параметров, используемых в протоколе обучения. В связи с этим предложенный протокол трудно воспроизводится в других лабораториях мира. С 2001 года положительные результаты с повторением данного способа были получены лишь несколькими научными коллективами. Кроме того, протокол был успешен лишь в части экспериментов. Критерий ответа устанавливался одинаковый для всех нейронных сетей: в необученной сети ответ на выбранном электроде должен быть равен 1 за 10 стимулирующих импульсов (отношение количества ответов к количеству стимулирующих импульсов равно 0,1), критерий обучения (пороговый желаемый ответ) равен 0,2. В связи с такой установкой критериев возникают существенные ограничения на выбор подходящего для обучения электрода, что сильно ограничивает и может даже исключить возможность применения протокола ко многим нейронным сетям. Второй недостаток метода заключается в том, что не разработан способ проверки сохранения достигнутого эффекта обучения. Та часть ответа на стимулирующий импульс, которая рассматривается в протоколе обучения у Ш. Марома, определяется фиксированным интервалом времени после стимулирующего импульса, составляющим 50±10 мс. Но профиль ответа сильно отличается между разными нейронными сетями и даже между разными участками одной сети. Поэтому необходим алгоритм выбора оптимального для рассмотрения времени ответа.
Недостатки аналога частично преодолены в протоколе обучения биологической нейронной сети, выращенной на мультиэлектродной матрице, на основе стимуляции с обратной связью группы Дж. ле Фебера (Университет Твенте, Энсхеде, Нидерланды), который выбран в качестве прототипа. Часть ответа на стимулирующий импульс, рассматриваемый в протоколе обучения, выбирают индивидуально для различных культур. Размер временного «окна» составляет от 20 до 50 мс, начиная с 10 мс после стимулирующего импульса и позднее. Кроме того, Дж. ле Фебером предложено применять протокол стимуляции с обратной связью в течение 5±1 часов. Это позволяет более адекватно оценить динамику обучения и наблюдать сохранение обучения порядка 1-2 часов. Протоколы стимуляции описаны в журнальной публикации: le Feber J, Stegenga J, Rutten WLC (2010) The Effect of Slow Electrical Stimuli to Achieve Learning in Cultured Networks of Rat Cortical Neurons. PLoS ONE 5(1): e8871.
Основным недостатком прототипа является необходимость тщательного выбора обучаемого электрода, связанная с фиксированным критерием ответа, а именно отношением количества ответных импульсов к количеству стимулирующих импульсов, равным 0,1. Настройка индивидуальных для каждой нейронной сети параметров ответа и параметров стимуляции не имеет четкого алгоритма. Сохранение эффекта обучения наблюдают лишь на небольших временных интервалах.
Задачей, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, является создание универсального протокола обучения биологической нейронной сети культуры, выращенной на мультиэлектродной матрице, на основе стимуляции с обратной связью, включающего алгоритм определения оптимальных для индивидуальной биологической нейронной сети параметров, используемых в протоколе обучения, адаптированных к физиологическим особенностям биологической нейронной сети выращенной культуры в данном конкретном эксперименте, который бы подлежал воспроизведению в других аналогичных экспериментах по обучению биологической нейронной сети и обеспечивал достоверное подтверждение сохранения эффекта обучения.
Указанный результат достигается благодаря тому, что осуществляют способ обучения биологической нейронной сети культуры, выращенной на мультиэлектродной матрице, на основе стимуляции с обратной связью, включающий применение по крайней мере одного цикла, в рамках которого стимулируют биологическую нейронную сеть, регистрируют ответ, отключают стимуляцию на некоторое время, если ответ удовлетворяет заданному критерию, или продолжают стимуляцию некоторое время, а потом отключают, если ответ не удовлетворяет заданному критерию, а также выбор временного интервала рассмотрения ответа и выбор стимулирующего и регистрирующего электродов, используемых в процессе обучения.
Новым в изобретении является то, что до начала процесса обучения производят предварительную стимуляцию без обратной связи, на основании которой выбирают наиболее эффективный стимулирующий электрод, который будут использовать в процессе обучения, и подбирают параметры стимуляции, причем для выбранного стимулирующего электрода частоту стимуляции подбирают наибольшую от 0,04 до 0,1 Гц таким образом, чтобы при минимальной амплитуде стимуляции, не превышающей 800 мВ, не уменьшалось число ответных импульсов на каждый стимулирующий импульс и ответ биологической нейронной сети имел место более чем в 50% случаев предварительной стимуляции, и производят контрольную стимуляцию без обратной связи на выбранном стимулирующем электроде, на основании которой выбирают наиболее эффективный регистрирующий электрод, который будут использовать в процессе обучения, подбирают критерий ответа и критерий обучения, адаптируя перечисленные параметры и критерии к физиологическим особенностям биологической нейронной сети выращенной культуры в данном конкретном эксперименте, а после окончания процесса обучения проверяют сохранение эффекта обучения.
В частном случае реализации способа по п.2 в качестве критерия ответа выбирают отношение R/S: суммарное число ответных импульсов за последние 10 стимулирующих импульсов (R), деленное на 10 (S) на выбранном для обучения регистрирующем электроде в выбранном временном интервале рассмотрения ответа в контрольной стимуляции.
В частном случае реализации способа по п.3 в качестве критерия обучения выбирают границу 20% наибольших значений R/S, которые наблюдались на выбранном для обучения регистрирующем электроде в выбранном временном интервале рассмотрения ответа в контрольной стимуляции.
В частном случае реализации способа по п.4 в качестве критерия ответа выбирают число ответных импульсов после одиночного стимулирующего импульса на выбранном для обучения регистрирующем электроде в выбранном временном интервале рассмотрения ответа в контрольной стимуляции.
В частном случае реализации способа по п.5 в качестве критерия обучения выбирают границу 20% наибольших значений числа ответных импульсов, которые наблюдались на выбранном для обучения регистрирующем электроде в выбранном временном интервале рассмотрения ответа в контрольной стимуляции.
В частном случае реализации способа по п.6 проверку сохранения эффекта обучения производят через 1-6 часов после окончания процесса обучения, применяя по крайней мере один раз стимуляцию с обратной связью длительностью порядка 1-1,5 часов или 5-10 циклов стимуляции с обратной связью.
Способ поясняется следующими чертежами.
На Фиг.1 приведено схематическое изображение установки, на которой реализуется способ обучения биологической нейронной сети.
На Фиг.2 приведен пример распределения значений R/S в контрольной стимуляции для выбранного регистрирующего электрода. Вертикальная линия показывает пороговое значение R/S, выбранное в качестве критерия обучения.
На Фиг.3 приведена диаграмма распределения среднего количества электродов в процентах с разными значениями R/S. Черным отмечено количество электродов, которое может быть использовано для обучения в протоколе прототипа. Черным и серым отмечено количество электродов, которое может быть использовано для обучения с применением протокола, предложенного авторами.
В устройство, на котором реализуется способ обучения биологической нейронной сети, входят (см. Фиг.1): мультиэлектродная матрица 1 (MED64 probe), которая представляет из себя стеклянную чашку, содержащую растущую культуру нейронов в специальной среде (в нашем случае использовалась культура гиппокампа), на дне которой расположены 64 электрода, регистрирующих наведенные электрические сигналы от активности нервных клеток; с каждого электрода мультиэлектродной матрицы 1 сигнал подается на выделенный вход усилителя 2 (MED64 Amplifier) для преобразования и усиления принимаемых сигналов независимо по всем каналам. Вместе мультиэлектродная матрица 1 и усилитель 2 образуют подсистему элекрофизиологического мониторинга, которая позволяет неинвазивно регистрировать электрическую активность культивированной биологической нейронной сети в виде сигналов с нейронов, пространственно локализованных в окрестности каждого из электродов. Система записывает эволюцию наведенного внеклеточного потенциала с 64-х электродов параллельно с высоким временным разрешением (частота дискретизации на каждый канал составляет 20 кГц). В устройство входит также соединенный с усилителем 2 компьютер 3 (MED64), оснащенный программным обеспечением MED64 Conductor для визуализации наведенных электрических сигналов от активности нервных клеток и записи данных в файл в специализированном формате для последующего анализа. Усилитель 2 соединен также с блоком АЦП/ЦАП 4, работающим в режиме реального времени, который подключен к управляющему компьютеру 5, оснащенному специально разработанным программным обеспечением NLearn, предназначенному для анализа и управления цифровыми сигналами и позволяющему проводить компьютерную обработку и автоматическое управление стимуляцией на основе анализа вызванной активности. Управляющий компьютер 5 через блок АЦП/ЦАП 4 соединен со стимулятором 6 (Multichannel systems STG 4004), с которого информация поступает на усилитель 2 и обратно на мультиэлектродную матрицу 1.
Способ обучения биологической нейронной сети осуществляют следующим образом.
Для стимуляции клеток выбирают один из активных электродов из 64 возможных. В стимулятор 6, подключенный к управляющему компьютеру 5, загружают с помощью программы, поставляемой в комплекте, параметры генерируемых стимулятором импульсов. Программа NLearn с управляющего компьютера 5 запускает генерацию коротких импульсов на выходе блока АЦП/ЦАП 4, инициирующих генерацию желаемых биполярных импульсов на стимуляторе 6, подающихся через усилитель 2 для стимуляции мультиэлектродной матрицы 1. Последовательности биполярных импульсов прикладывают к выбранному электроду с межимпульсным интервалом, соизмеримым с интервалом следования спонтанных пачек (5÷10 с). Снимаемые данные через усилитель 2 в аналоговом виде поступают на компьютер 3 для визуализации и анализа, а также с усилителя 2 через блок АЦП/ЦАП 4 в цифровом виде на управляющий компьютер 5, где они также регистрируются и анализируются и где программа NLearn на основе проведенного анализа и вводимых экспериментатором параметров инициирует необходимые последующие действия.
Проводят предварительную стимуляцию, на основании которой происходит выбор параметров стимуляции и выбор стимулирующего электрода, который будет использоваться для обучения биологической нейронной сети. Экспериментатор в программе задает начальные параметры стимуляции (амплитуду и длительность импульсов, частоту и время их подачи) и запускает поиск стимулирующего электрода. Параметры стимуляции выбирают с учетом особенностей биологической нейронной сети. Подают 5-10 двухфазных импульсов 200 мс на фазу с минимальной частотой (0,04 Гц) и максимальной амплитуды (800 мВ) на электрод, который выбирают для стимуляции. С помощью всех остальных электродов принимают ответ - регистрируют электрическую активность в виде наведенных электрических сигналов от активности нейронов, пространственно локализованных в окрестности каждого электрода. Если стимуляция с данными параметрами вызывала ответ сети в менее чем 50% случаев, т.е. сеть отреагировала менее чем на половину всех стимулирующих импульсов, пробуют подавать стимулирующие импульсы через другой электрод. Поиск стимулирующего электрода, который будет использоваться для обучения, производят последовательно, начиная с первого электрода до последнего, с шагом в пять электродов (1, 5, 10, 15 и т.д.). В отличие от прототипа, где поиск производят вручную, пока не найдут электрод, более-менее стабильно вызывающий ответ, в предлагаемом способе поиск осуществляют в автоматическом режиме с помощью программы NLearn по понятным критериям и находят наиболее эффективный для применения в процессе обучения стимулирующий электрод. Для достаточно зрелой нормально функционирующей нейронной сети не составляет проблемы найти электрод, при подаче стимулирующих импульсов на который наблюдается требуемый ответ биологической нейронной сети при данных параметрах стимуляции. Именно его впоследствии используют для стимуляции в процессе обучения биологической нейронной сети.
После того как выбран стимулирующий электрод, экспериментатор запускает серии предварительной стимуляции длительностью 10 минут каждая на выбранном стимулирующем электроде (5-10 стимулирующих импульсов), понижая амплитуду с шагом в 100-50 мВ и повышая частоту с шагом 0,01 Гц. Это нужно для того, чтобы уменьшить вероятность повреждения культуры электрической стимуляцией и в то же время увеличить количество стимулирующих импульсов в стимулирующей серии (10 минут). Чем больше стимулирующих импульсов в стимулирующей серии, тем точнее анализ функциональной активности биологической нейронной сети, на основе которого впоследствии определяется критерий обучения. Подачу стимулирующих импульсов, анализ ответов и визуализацию результатов анализа с помощью программы NLearn производят автоматически. На основании анализа поступающих данных с помощью управляющего компьютера 5 выбирают параметры стимуляции, наиболее подходящие для обучения данной биологической нейронной сети выращенной на мультиэлектродной матрице культуры в данном конкретном эксперименте.
Амплитуду выбирают минимальную, которая с минимальной частотой стабильно вызывает ответ биологической нейронной сети более чем в 50% случаев предварительной стимуляции (т.е. сеть реагирует более чем на половину всех стимулирующих импульсов) и не превышает 800 мВ. Частоту стимуляции выбирают наибольшую от 0,04 до 0,1 Гц, в результате которой не происходит уменьшение вероятности (ответ биологической нейронной сети имеет место более чем в 50% случаев) и силы (число ответных импульсов на каждый стимулирующий импульс не уменьшается) ответа биологической нейронной сети в предварительной стимуляции.
Выбирают также временной интервал рассмотрения ответа после стимулирующего импульса, который составляет 40 мс и ограничивается интервалом от 20 до 500 мс после стимулирующего импульса. В выбираемый временной интервал должно входить не менее 5 и не более 60 процентов ответных импульсов.
Выбрав описанным выше образом наилучшие для использования данной биологической нейронной сети параметры стимуляции и подходящий для процесса обучения стимулирующий электрод, обеспечивают максимальную чувствительность биологической нейронной сети к подаваемым стимулирующим импульсам.
Затем, заведя в программу NLearn выбранные параметры стимуляции, проводят контрольную стимуляцию на выбранном стимулирующем электроде - не менее 5 циклов без обратной связи (1-1.5 часов в зависимости от выбранной частоты стимуляции), на основании которой выбирают критерии ответов, критерии обучения и регистрирующий электрод, который будет использоваться при обучении биологической нейронной сети. Цикл стимуляции задается в виде непрерывной генерации биполярных импульсов в течение 10 минут. Между каждым циклом определяется время без стимуляции, равное 5 минутам.
В процессе обучения биологическая нейронная сеть должна формировать желаемую динамическую характеристику выходного сигнала в соответствии с заданным критерием. Критерий ответа выбирают по усмотрению экспериментатора. Можно рассматривать усредненное состояние биологической нейронной сети за относительно небольшой промежуток времени, либо оценивать ее состояние в отдельный конкретный момент времени. Не существует четких обоснований того, что какой-то из этих подходов лучше или хуже.
В вызванной пачке ответных импульсов динамической характеристикой ответа на стимулирующий импульс может быть выбрана, например, одна из следующих:
1. Среднее число ответных импульсов за 10 стимулирующих импульсов. В выбранном временном интервале рассмотрения ответа после стимулирующего импульса подсчитывают число ответных импульсов. Критерий ответа определяется как суммарное число ответных импульсов за последние 10 стимулирующих импульсов (R), деленное на 10 (S) -. отношение R/S. Этот критерий ответа выбран в частном случае реализации способа по п.2.
2. Мгновенный ответ на стимулирующий импульс. Критерий ответа определяется как число ответных импульсов в выбранном временном интервале рассмотрения ответа после одиночного стимулирующего импульса. Этот критерий ответа выбран в частном случае реализации способа по п.4.
Выбранный критерий ответа заводят в программу NLearn.
Регистрирующий (обучаемый) электрод выбирают таким образом, чтобы в течение контрольной стимуляции значение выбранного критерия ответа статистически значимо не изменялось. Для этого сравнивают сетевые ответы в начале и в конце контрольной стимуляции с применением стандартных методов статистического анализа (тест Манна-Уитни и Т-тест). Поиск осуществляют в автоматическом режиме с помощью программы NLearn.
Критерием обучения является пороговое значение критерия ответа, при достижении которого стимуляцию отключают. Пороговое значение выбирают следующим образом: в процессе проведения контрольной стимуляции одновременно регистрируют значения выбранного критерия ответа. После стимуляции вычисляют среднее значение и стандартное отклонение критерия ответа за все время стимуляции. Сумма среднего значения и стандартного отклонения критерия ответа и определяет пороговое значение. Таким образом, критерий обучения адаптируют к выбранному критерию ответа и соответственно к базовой активности участка биологической нейронной сети, который предстоит обучать. Данный подход позволяет применить протокол обучения к большинству электродов на мультиэлектродной матрице, не накладывая строгих требований к базовой вызванной активности.
Если осуществляется частный случай реализации способа по п.2, то пороговое значение выбирается как граница 20% наибольших значений R/S на выбранном регистрирующем электроде, которые наблюдались в контрольной стимуляции (см. Фиг.2). Этот критерий обучения выбран в частном случае реализации способа по п.3.
Если осуществляется частный случай реализации способа по п.4, порогом для протокола обучения служит граница 20% наибольших значений числа ответных импульсов в контрольной стимуляции. Этот критерий обучения выбран в частном случае реализации способа по п.5.
Такой выбор критериев обучения позволяет использовать для обучения биологической нейронной сети значительно большее количество электродов матрицы, чем в прототипе. Авторами установлено, что только около 9% электродов имеют 0<R/S≤0,1 (это как у прототипа) в контрольной стимуляции, количество электродов с 0<R/S≤0,5 (верхнее значение 0,5 взято из эксперимента, это максимальное среднее значение R/S, при котором проводилось обучение биологической нейронной сети в предлагаемом способе) составляет около 30% (см. Фиг.3). Следует отметить, что эти значения являются усредненными для 10 различных культивируемых биологических нейронных сетей (имеются в виду 10 разных образцов культур из клеток гиппокампа, которые использовались в экспериментах). Для отдельных культур количество электродов с 0<R/S≤0,5 может достигать 80%.
После выбора максимально эффективных для обучения электродов и адаптированных к физиологическим особенностям биологической нейронной сети выращенной культуры параметров стимуляции и критериев ответа и обучения, заведя соответствующие данные в программу NLearn, проводят непосредственно процесс обучения, используя стимуляцию с обратной связью. С помощью программы NLearn на стимулирующий электрод непрерывно подают последовательность биполярных импульсов. Обратная связь - это зависимость времени стимуляции от ответа на стимуляцию. Если ответ на стимулирующий импульс удовлетворяет критерию обучения (значение критерия ответа больше порогового значения), то стимуляцию прекращают на 5 минут. Вычисляют время адаптации для проведенного цикла стимуляции. Затем стимуляцию после перерыва включают заново. Если в течение 10 минут стимуляции заданный критерий обучения не достигается, то стимуляцию отключают также на 5 минут. Подобный цикл повторяют в течение 3÷4 часов 5÷10 раз (около 40 циклов) за эксперимент. Время достижения заданного порогового значения критерия ответа с момента начала стимуляции определяется как время адаптации. Статистически достоверное уменьшение времени адаптации при стимуляции от цикла к циклу свидетельствует о появлении эффекта обучения.
Проверка сохранения эффекта обучения является отдельной операцией способа, и сохранение эффекта обучения наблюдают не случайным образом в процессе обучения за счет того, что процесс обучения достаточно длителен, как в прототипе, а делают это специально уже после окончания обучения через некоторый интервал времени, применяя стимуляцию с обратной связью. Серия стимуляции с обратной связью может повторяться несколько раз. Длительность временных интервалов, через которые проводится проверка эффекта обучения, определяется исследователем в зависимости от поставленной задачи. Это позволяет однозначно отследить динамику сохранения эффекта обучения и говорить о конкретных временных интервалах, на которых эффект сохраняется.
В частном случае реализации способа по п.6 проверку сохранения обучения проводят, применяя стимуляцию с обратной связью через несколько часов (1-6 ч) после окончания эксперимента длительностью порядка 1-1,5 часов или 5-10 циклов. Описанная серия стимуляции с обратной связью может повторяться несколько раз.
В наших экспериментах на достижение эффекта обучения нейронной сети требовалось от 11 до 17 стимулирующих циклов (1,5-2 часа). Сохранялся эффект обучения от 1,5 до 13 часов.
Таким образом, предлагаемый способ обучения биологической нейронной сети позволяет применить протокол обучения к большинству активных электродов на мультиэлектродной матрице, поскольку параметры и критерии обучения адаптированы к базовой активности нейронной сети, а значит, обеспечить воспроизводимость протокола обучения в других аналогичных экспериментах, с другими культурами. Ввиду того что сохранение эффекта обучения в предлагаемом способе наблюдают отдельно и периодически, можно говорить о том, что обеспечивается достоверное подтверждение сохранения эффекта обучения. Описанный способ, очевидно, может быть применен для поддержания достигнутого эффекта обучения в течение длительного времени.
Изобретение может применяться для проведения электрофизиологических экспериментов, связанных с изучением явлений обучения и памяти, влияния различных химических (лекарственных препаратов, токсинов и т.п.), физических (в т.ч. электрической стимуляции) и биологических (сокультивирование, генетические мутации и др.) факторов на указанные явления, и для создания нейрон-компьютерных устройств, способных к обучению.