ВАРИАНТ O-АЦЕТИЛГОМОСЕРИН-СУЛЬФГИДРИЛАЗЫ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-МЕТИОНИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЭТОГО ВАРИАНТА
EMBODIMENT OF O-ACETYL-HOMOSERINE-SULFHYDRYLASE AND METHOD OF PRODUCING L-METHIONINE USING THIS EMBODIMENT

Область техники
Настоящее изобретение относится к новому варианту O-ацетилгомосерин-сульфгидрилазы, к полинуклеотиду, кодирующему его, к вектору, содержащему этот полинуклеотид, к штамму, способному экспрессировать этот вариант и к способу получения L-метионина с использованием этого варианта.
Предшествующий уровень техники
L-метионин, незаменимую аминокислоту в живом организме, используют в качестве корма, инфузии, лекарственного сырья, такого как синтетическое сырье для фармацевтических препаратов, и пищевых добавок. Метионин является важной аминокислотой, участвующей в трансметилировании in vivo, и играет роль в обеспечении серой.
Для химического синтеза метионина в основном используют способ гидролиза 5-(β-метилмеркаптоэтил)-гидантоина с получением метионина в виде смеси L-типа и D-типа. Однако химический синтез приводит к получению метионина в виде смеси L-типа и D-типа. Между тем, L-метионин можно селективно продуцировать, используя биологический способ, в котором L-метионин получают посредством прямой ферментации с использованием микроорганизма или посредством двухстадийного способа (международная патентная публикация WO 2008/013432). В частности, двухстадийный способ состоит из способа получения предшественника L-метионина посредством ферментации и способа превращения предшественника L-метионина в L-метионин с помощью фермента. Посредством двухстадийного способа можно селективно получать только L-метионин и дополнительно одновременно получать органические кислоты, более конкретно янтарную кислоту или уксусную кислоту в качестве побочных продуктов той же реакции.
Предшественник L-метионина может включать О-ацетилгомосерин и О-сукцинилгомосерин, и ферменты, используемые в процессе превращения, могут включать О-сукцинилгомосерин-сульфгидрилазу и О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазу. Чтобы максимизировать продуцирование L-метионина посредством двухстадийного способа, необходимо обеспечить максимальное количество ферментированного О-ацилгомосерина, который является предшественником L-метионина. Одновременно, ферменты, используемые для ферментативного превращения с получением L-метионина, должны иметь высокую активность превращения, демонстрировать избыточную экспрессию в микроорганизмах и поддерживать высокую скорость реакции при высоких концентрациях О-ацилгомосерина. Кроме того, ферменты должны иметь низкое ингибирование активности в момент времени, когда конечный продукт (то есть L-метионин и органическая кислота) накапливается в высокой концентрации, и должны иметь термическую стабильность, чтобы не терять свою активность во время взаимодействий. В связи с этим в KR патенте 10-1250651 раскрыта О-ацетилгомосерин-сульфгидрилаза, происходящая из Rhodobacter sphaeroides, которая имеет более высокую термическую стабильность, чем O-ацетилгомосерин-сульфгидрилазы, происходящие из микроорганизмов, отличных от Rhodobacter sphaeroides и которая, таким образом, стала недавно доступной для использования в двухстадийном способе. Однако все еще существует потребность в разработке фермента, который обладает высокой активностью превращения для использования в двухстадийном способе и т.п., а также низким ингибированием активности в момент накопления конечных продуктов.
ая
Описание изобретения Техническая проблема Авторы настоящего изобретения предприняли усилия по разработке О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазы в качестве фермента с улучшенным превращением. В результате они подтвердили, что модифицированные полипептиды, в которых 196 аминокислота происходящей из Rhodobacter sphaeroides О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазы модифицирована аминокислотой, не являющейся валином, имеют более высокую активность превращения и стабильность по сравнению с О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазой дикого типа, тем самым осуществляя настоящее изобретение.
Техническое решение
Цель настоящего изобретения заключается в предложении варианта O-ацетилгомосерин-сульфгидрилазы.
Другая цель настоящего изобретения заключается в предложении полинуклеотида, кодирующего этот вариант.
Еще одной целью настоящего изобретения является предложение вектора, включающего полинуклеотид.
Еще одной целью настоящего изобретения является предложение микроорганизма, продуцирующего вариант О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазы.
Еще одной целью настоящего изобретения является предложение способа получения метионина с использованием варианта О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазы.
Полезные эффекты изобретения
Модифицированные полипептиды по настоящему изобретению, обладающие О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазной активностью, представляют собой модифицированные полипептиды, которые обеспечены всеми необходимыми требованиями, такими как высокая активность для применения в качестве фермента для промышленного превращения, высокая степень превращения, возможность сверхэкспрессии в Е. coli, низкое ингибирование активности в момент накопления конечного продукта, поддержание термической стабильности и т.д. Соответственно, модифицированные полипептиды по настоящему изобретению полезны тем, что их можно использовать для быстрого и высокоэффективного получения L-метионина наряду с уксусной кислотой в качестве побочного продукта.
Краткое описание графических материалов
На Фиг. 1 показано изображение, иллюстрирующее результаты SDS-PAGE-электрофореза (электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия) образцов, полученных на каждой стадии после очистки О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазы, происходящей из Rhodobacter sphaeroides.
Лучший вариант осуществления
ая
ая
ая
Для достижения вышеуказанных целей в одном аспекте настоящего изобретения может быть предложен новый модифицированный полипептид, имеющий О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазную активность. Этот модифицированный полипептид может представлять собой модифицированный полипептид, имеющий О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазную активность, в которой 196 аминокислота от N-конца аминокислотной последовательности О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазы, происходящей из Rhodobacter sphaeroides и, более конкретно, 196 аминокислота от N-конца полипептида, охарактеризованного аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, заменена аминокислотой, не являющейся валином. Более конкретно, модифицированный полипептид может представлять собой вариант, в котором 196 аминокислота от N-конца (то есть валин) заменена треонином. В частности, модифицированный полипептид, имеющий О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазную активность, может представлять собой модифицированный полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, но модифицированный полипептид не ограничен этой последовательностью.
Модифицированный полипептид как таковой обладает повышенной О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазной активностью по сравнению с полипептидом SEQ ID NO: 1, имеющим О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазную активность.
ой
При использовании здесь термин "модификация" или "вариант" относится к продукту культивирования или к отдельному субъекту, который генетически или не генетически демонстрирует стабильное фенотипическое изменение, и, в частности, относится к варианту, в котором аминокислота О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазы, происходящей из Rhodobacter sphaeroides, модифицирована и, таким образом, способна эффективно увеличивать свою активность по сравнению с активностью дикого типа. Последовательность такого варианта может включать полипептид, имеющий гомологию по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% с вышеуказанным модифицированным полипептидом. В частности, модифицированный полипептид по настоящему изобретению, обладающий О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазной активностью, может включать полипептид SEQ ID NO: 3 и полипептид, который имеет гомологию с последовательностью SEQ ID NO: 3, составляющую по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%. Кроме того, очевидно, что любой вариант фермента, имеющий аминокислотную последовательность с делецией, модификацией, заменой или добавлением в части последовательности при сохранении модификации 196 аминокислоты (то есть конкретного положения) аминокислотой, не являющейся валином, также может быть включен в объем настоящего изобретения, если аминокислотная эта последовательность имеет вышеописанную гомологию и оказывает эффект, соответствующий эффекту фермента. Кроме того, любой полипептид, кодируемый зондом, который может быть получен из известных последовательностей генов (например полинуклеотид, который может быть гибридизован в жестких условиях с комплементарными последовательностями для всей или части нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид) и имеет О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазную активность, также может быть без ограничения включен в объем настоящего изобретения.
При использовании здесь термин "жесткие условия" означает условия, которые обеспечивают возможность специфической гибридизации между полинуклеотидами. Такие условия зависят от длины и степени комплементарности полинуклеотидов и соответствующие параметры хорошо известны в данной области и конкретно описаны в ссылках (например J. Sambrook et al., выше). Например, условия могут включать осуществление гибридизации генов с высокой гомологией, например с гомологией 80% или выше, в частности 90% или выше, более конкретно 95% или выше, еще более конкретно 97% или выше, и точнее 99% или выше, и в то же время не осуществление гибридизации генов, имеющих гомологию ниже вышеуказанных гомологий; или для осуществления гибридизации один раз, или, например, два или три раза в обычных условиях отмывки для Саузерн-гибридизации 60°C, 1×SSC (раствор хлорида и цитрата натрия) и 0,1% SDS, в частности с концентрацией соли и температурой, соответствующей 60°C, 0,1×SSC и 0,1% SDS, и более конкретно при 68°C, 0,1×SSC и 0,1% SDS.
Зонды, используемые в гибридизации, могут являться частью комплементарных последовательностей нуклеотидных последовательностей. Эти зонды могут быть получены с помощью ПНР с использованием олигонуклеотидов, полученных на основе известных последовательностей в качестве праймеров и фрагментов генов, содержащих нуклеотидные последовательности в качестве матрицы. Кроме того, специалист в данной области может по мере необходимости регулировать температуру и концентрацию соли промывочных растворов в зависимости от таких факторов, как длина зондов.
При использовании здесь термин "гомология" относится к проценту идентичности двух полинуклеотидных или полипептидных группировок. Гомология последовательностей одной группировки по сравнению с другой может быть определена известными в данной области способами. Например, гомология может быть определена путем непосредственного выравнивания информации о последовательностях, такой как параметры, включающие вес парного выравнивания, идентичность, подобие и т.д., (например BLAST 2.0) двух полинуклеотидных молекул или двух полипептидных молекул с использованием легкодоступной компьютерной программы, которая способна выравнивать информацию о последовательности. Кроме того, гомологию между полинуклеотидами можно определить путем гибридизации полинуклеотидов в условиях, в которых полинуклеотиды могут образовывать стабильную двойную цепь в гомологичных участках, с последующим их разрушением с использованием специфической одноцепочечной нуклеазы для определения размера расщепленных фрагментов.
Полипептид, охарактеризованный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, может быть полипептидом дикого типа, имеющим О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазную активность, происходящим из Rhodobacter sphaeroides. Полипептид SEQ ID NO: 1, имеющий О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазную активность, обладает более высокой термической стабильностью по сравнению с пептидами, происходящими из других микроорганизмов (например Hyphomonas neptunium и т.д.). Поэтому очевидно, что преимуществом модифицированного полипептида по настоящему изобретению, где введена аминокислотная замена в полипептид SEQ ID NO: 1, имеющий О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазную активность, также будет его высокая термостабильность.
При использовании здесь термин "О-ацетилгомосерин" относится к первому конкретному промежуточному соединению в биосинтезе метионина, который можно наблюдать в микроорганизмах и который может быть получен посредством катализа с использованием гомосеринацетилтрансферазы из L-гомосерина и ацетил-СоА в сочетании с биосинтезом треонина.
При использовании здесь термин "предшественник" относится к метаболиту, который является частью метионин-специфического метаболического пути, продуцируемого штаммами-продуцентами предшественника L-метионина или производными его метаболита. В настоящем описании изобретения примеры предшественника L-метионина могут представлять собой О-сукцинилгомосерин или О-ацетилгомосерин, без ограничения ими.
При использовании здесь термин "штамм, продуцирующий предшественник L-метионина" относится к штамму прокариотического или эукариотического микроорганизма, который, будучи способным продуцировать предшественник L-метионина in vivo, способен накапливать предшественник L-метионина. Например, штамм, продуцирующий предшественник L-метионина, может включать штаммы микроорганизмов, которые относятся к роду Escherichia, роду Erwinia, роду Serratia, роду Providencia, роду Corynebacterium, роду Pseudomonas, роду Leptospira, роду Salmonella, роду Brevibacterium, роду Hyphomononas, роду Chromobacterium, роду Nocardia или к таким микроорганизмам, которые относятся к грибам или дрожжам. В частности, штамм может представлять собой микроорганизм рода Escherichia, рода Corynebacterium или рода Leptospira и более конкретно, микроорганизм рода Escherichia (например Escherichia coli), без ограничения этими штаммами.
В другом аспекте настоящего изобретения предложен полинуклеотид, кодирующий модифицированный полипептид.
ая
Этот полинуклеотид может представлять собой полинуклеотид, который кодирует модифицированный полипептид, имеющий О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазную активность, в котором 196 аминокислота от N-конца полипептида, представленного аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, (то есть валин) заменена другой аминокислотой. Например, полинуклеотид может представлять собой полинуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 4, без ограничения этой нуклеотидной последовательностью. Кроме того, полинуклеотид может представлять собой полинуклеотид, имеющий гомологию по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 97% или по меньшей мере 99% с последовательностью SEQ ID NO: 4. Кроме того, на основании вырожденности генетического кода очевидно, что любая нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептиды, которая может гибридизоваться в жестких условиях с нуклеиновыми кислотами (которые состоят из нуклеотидных последовательностей, комплементарных полинуклеотидам, которые могут быть транслированы в модифицированный полипептид, а также в нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 4), и имеют О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазную активность, также может быть включена в объем настоящего изобретения.
В еще одном аспекте настоящего изобретения предложен вектор, который включает полинуклеотид, кодирующий модифицированный полипептид. Вектор может находиться в форме, функционально связанной с полинуклеотидом.
При использовании здесь термин "функционально связанный" относится к функциональной связи между последовательностью контроля экспрессии нуклеотида и нуклеотидной последовательностью, кодирующей целевой белок, для выполнения его основных функций и это может влиять на экспрессию кодируемой нуклеотидной последовательности. Функциональная связь с вектором может быть получена с использованием известного в данной области метода генетической рекомбинации, и сайт-специфическое расщепление и лигирование ДНК может быть осуществлено с использованием рестрикционного фермента, лигазы и т.д., известного в данной области.
При использовании здесь термин "вектор" относится к любому медиатору для клонирования и/или переноса нуклеотидов в клетку-хозяина. Вектор может представлять собой репликон, позволяющий реплицировать фрагмент ДНК, связанный другим с фрагментом ДНК. Термин "репликон" относится к любой генетической единице, действующей как самореплицирующаяся единица, для репликации ДНК in vivo, то есть реплицируемой посредством саморегуляции (например плазмидам, фагам, космидам, хромосомам, вирусам и т.д.). Термин "вектор" может включать вирусные и невирусные медиаторы для введения нуклеотидов в клетку-хозяина in vitro, ex vivo или in vivo, а также может включать мини-сферическую ДНК. Например, вектор может представлять собой плазмиду без какой-либо бактериальной ДНК-последовательности. Термин "вектор" может включать транспозон, такой как "Спящая Красавица" (Sleeping Beauty) (Izsvak et ah, J. Mol. Biol. 302: 93 to 102 (2000)), или искусственную хромосому. Примеры обычного вектора могут включать природные или рекомбинантные плазмиды, космиды, вирусы и бактериофаги. Например, в качестве фагового вектора или космидного вектора могут быть использованы pWE15, М13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, Charon21A и т.д.; и в качестве плазмидного вектора могут быть использованы векторы на основе pBR, pUC, pBluescriptII, pGEM, pTZ, pCL, pET, и т.д. Вектор, который можно использовать в настоящей заявке, конкретно не ограничен, и может быть использован любой известный экспрессионный вектор.
Кроме того, вектором может представлять собой рекомбинантный вектор, который дополнительно включает различные гены устойчивости к антибиотикам.
При использовании здесь термин "ген устойчивости к антибиотикам" относится к генам, обладающим устойчивостью к антибиотикам, и клетки, содержащие эти гены, могут выживать даже в среде, обработанной соответствующим антибиотиком. Следовательно, ген устойчивости к антибиотикам можно эффективно использовать в качестве селективного маркера для крупномасштабного производства плазмид в E. coli. В настоящем изобретении изобретения ген устойчивости к антибиотику не является фактором, который существенно влияет на эффективность экспрессии в соответствии с оптимальной комбинацией векторов, что является базовой технологией настоящего изобретения, и, таким образом, любой общий ген устойчивости к антибиотику можно использовать в качестве селективного маркера без ограничения. Например, можно использовать гены устойчивости к ампициллину, тетрациклину, канамицину, хлорамфениколу, стрептомицину и неомицину и т.д.
ая
В еще одном аспекте настоящего изобретения предложен микроорганизм, продуцирующий О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазу, который может экспрессировать модифицированный полипептид, имеющий О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазную активность, или включает вектор, включающий полинуклеотид, кодирующий модифицированный полипептид, и, конкретно, микроорганизм рода Escherichia, продуцирующий О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазу, в которой 196 аминокислота от N-конца полипептида, представленного аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, т.е. валин, может быть заменена на треонин; или может быть включен вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий модифицированный полипептид.
В настоящем изобретении введение может быть осуществлено путем трансформации, и термин "трансформация" относится к введению гена в клетку-хозяина для экспрессии этого гена, но не ограничен этим. Например, трансформация может быть выполнена с использованием способа введения вектора, включающего полинуклеотид, кодирующий модифицированный полипептид, в клетку-хозяина, и способ трансформации вектора может включать любой способ, с помощью которого можно вводить нуклеотиды в клетки и может быть выполнен путем выбора подходящего стандартного метода, известного в данной области техники. Можно использовать такие способы, как электропорация, соосаждение фосфатом кальция, ретровирусное инфицирование, микроинъекция, DEAE-декстран (диэтиламиноэтил-декстран), катионные липосомы и т.д., без ограничения этими способами.
Что касается трансформированного гена, то включена как форма, где ген введен в хромосому клетки-хозяина, так и форма, где ген находится вне хромосомы, при условии что этот ген может экспрессироваться в клетке-хозяине. Кроме того, ген включает ДНК и РНК в качестве полинуклеотида, кодирующего полипептид, и любой ген, который можно вводить и экспрессировать в клетке-хозяине, может быть использован без ограничения. Например, ген можно вводить в клетку-хозяина в форме экспрессионной кассеты, которая является полинуклеотидной конструкцией, включающей все существенные элементы, необходимые для самоэкспрессии. Экспрессионная кассета может, как правило, включать промотор, функционально связанный с геном, сигнал окончания транскрипции, домен связывания с рибосомой и сигнал окончания трансляции. Экспрессионная кассета может находиться в форме экспрессионного вектора, способного самореплицироваться. Кроме того, ген может быть введен в клетку-хозяина сам по себе или в форме полинуклеотидной конструкции и функционально связан с последовательностями, необходимыми для экспрессии в клетке-хозяине.
При использовании здесь термин "(трансформированная) клетка-хозяин, содержащая вектор" относится к клетке, трансформированной вектором, который включает ген, кодирующий по меньшей мере один целевой белок. В настоящем изобретении может быть использован любой из прокариотических и эукариотических микроорганизмов, если этот микроорганизм может продуцировать О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазу путем включения вектора. Например, можно использовать штаммы микроорганизмов, принадлежащих к роду Escherichia, роду Erwinia, роду Serratia, роду Providencia, роду Corynebacteria и роду Brevibacteria, и Е. coli в качестве примера рода Escherichia, без ограничения этими штаммами микроорганизмов.
Микроорганизм рода Escherichia, продуцирующий О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазу, который может экспрессировать модифицированный полипептид, имеющий О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазную активность, может включать все микроорганизмы, которые могут экспрессировать модифицированный полипептид посредством различных известных в данной области способов, в дополнение к описанному выше способу введения вектора.
В еще одном аспекте настоящего изобретения предложен способ получения метионина с использованием модифицированного полипептида, имеющего О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазную активность, или микроорганизма, продуцирующего модифицированный полипептид или продукт его культивирования. В частности, способ может представлять собой способ получения метионина, который включает реакцию модифицированного полипептида или микроорганизма, продуцирующего модифицированный полипептид или продукт его культивирования, с О-ацетилгомосерином и метилмеркаптаном. Метионин может представлять собой L-метионин.
Продукт культивирования микроорганизма, продуцирующего О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазу, может быть получен путем культивирования в среде микроорганизма, продуцирующего О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазу, который может экспрессировать модифицированный полипептид, обладающий -ацетилгомосерин-сульфгидрилазной активностью, или включать вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий модифицированный полипептид.
При использовании здесь термин "культивирование" относится к выращиванию микроорганизма в надлежащим образом адаптированной среде. В настоящем изобретении культивирование может быть выполнено в подходящей среде и в условиях культивирования, хорошо известных в данной области. Культивирование можно легко использовать после адаптации в соответствии со штаммом микроорганизма, выбранным обычным специалистом в данной области техники. Выращивание микроорганизма можно осуществлять непрерывно в периодическом процессе, непрерывном процессе, в периодическом процессе с подпиткой и т.д., известных в данной области, без ограничения этими способами культивирования. В частности, в отношении условий культивирования, рН культуры может быть доведен до подходящего рН (например рН 5-9, в частности рН 6-8, более конкретно рН 6,8) посредством использования подходящего основного соединения (например гидроксида натрия, гидроксида калия или аммиака) или кислотного соединения (например фосфорной кислоты или серной кислоты). Кроме того, во время культивирования для предотвращения образования пены можно использовать пеногаситель, такой как полигликолевый эфир жирной кислоты. Кроме того, аэробные условия культивирования можно поддерживать путем введения в культуру кислородной или кислородсодержащей газовой смеси, а анаэробное и микроаэробное состояние культуры можно поддерживать путем введения азота, водорода или углекислого газа в культуру без закачивания газа. Температуру культивирования можно поддерживать в диапазоне от 20 до 45°С и, в частности, от 25°С до 40°С, без ограничения этой температурой культивирования. Кроме того, культивирование можно продолжать вплоть до получения полезного вещества и, в частности, в течение от 10 до 160 часов, без ограничения этими условиями культивирования.
Кроме того, в качестве источников углерода, используемых в культуральной среде, можно использовать отдельно или в комбинации сахара и углеводы (например глюкозу, сахарозу, лактозу, фруктозу, мальтозу, мелассу, крахмал и целлюлозу); масла и жиры (например соевое масло, подсолнечное масло, арахисовое масло и кокосовое масло); жирные кислоты (например пальмитиновую кислоту, стеариновую кислоту и линолевую кислоту); спирты (например глицерин и этанол); и органические кислоты (например уксусную кислоту), без ограничения ими. В качестве источников азота для использования в культуральной среде можно использовать отдельно или в комбинации азотсодержащие органические соединения (например пептон, дрожжевой экстракт, мясной сок, солодовый экстракт, жидкий кукурузный экстракт, соевую муку и мочевину) или неорганические соединения (например сульфат аммония, хлорид аммония, фосфат аммония, карбонат аммония и нитрат аммония) и т.д., без ограничения ими. В качестве источников фосфора для использования в культуральной среде можно использовать отдельно или в комбинации дигидрофосфат калия, дикалия гидрофосфат, соответствующие натрийсодержащие соли и т.д., без ограничения ими. Кроме того в культуральной среде могут содержаться соли металлов (например сульфат магния или сульфат железа), аминокислоты, витамины и т.д., которые являются важными веществами, способствующими росту.
3
3
О-ацетилгомосерин может находиться в очищенной форме О-ацетилгомосерина или в культуральной жидкости, содержащей О-ацетилгомосерин. Кроме того, метилмеркаптан может относиться к сжиженной форме метилмеркаптана натрия (CHS-Na) и к газообразной или сжиженной форме метилмеркаптана (CHSH), а также к метилмеркаптану, содержащему диметилсульфид (DMS) (раскрытый в международной патентной публикации WO 2010/098629).
Способ получения метионина может быть легко определен в оптимизированных условиях культивирования, известных в данной области техники специалистом в данной области, и способ крупномасштабного производства метионина с использованием модифицированного полипептида и/или микроорганизма, продуцирующего модифицированный полипептид или продукт его культивирования, можно легко определить в оптимизированных условиях активации ферментов, известных специалистам в данной области техники.
Способ получения метионина может дополнительно включать извлечение метионина, полученного с помощью вышеуказанной реакции. Способ извлечения может быть выполнен с использованием подходящего способа, известного в данной области техники. Например, можно использовать такие способы, как центрифугирование, фильтрация, ионообменная хроматография, кристаллизация, ВЭЖХ и т.д., без ограничения этими способами.
Кроме того, способ извлечения может включать стадию очистки, которая может быть выполнена с использованием подходящего способа, известного в данной области техники.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Далее настоящее изобретение будет подробно описано с помощью типичных воплощений. Однако эти типичные воплощения представлены только для иллюстрации и не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения.
Пример 1: Получение варианта V196T О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазы и оценка его активности
Пример 1-1: Экспрессия О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазы, происходящей из микроорганизма рода Rhodobacter
CJ1
Вектор pCL-P:metZ-rsp (корейский патент 10-1250651), в котором О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазу, происходящую из известного представителя микроорганизма рода Rhodobacter sphaeroides, трансформировали в клетки Escherichia coli K12 W3110 (АТСС 27325) при помощи теплового шока. Затем трансформанты культивировали в среде LB (лизогенная среда), содержащей хлорамфеникол (25 мкг/мл). Выделенные колонии инокулировали в среду LB (3 мл) и культивировали при 200 об/мин при 33°С в течение 6 часов. Полученную культуру в количестве 250 мкл собирали и повторно инокулировали в свежую среду LB (25 мл в колбе 250 мл), содержащую хлорамфеникол (25 мкг/мл), и культивировали при 200 об/мин при 33°С в течение 15 часов, при этом экспрессировалась О-ацетилгомосерин-сульфгидрилаза дикого типа.
Пример 1-2: Получение варианта V196T (новый вариант О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазы)
ая
В качестве положения для модификации с целью повышения активности О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазы дикого типа была выбрана 196 аминокислота (то есть валин).
ая
196 аминокислота, валин (Val, V) О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазы, происходящей из Rhodobacter sphaeroides, была заменена на треонин (Thr, Т) с помощью набора для сайт-направленного мутагенеза Quikchange site-directed mutagenesis kit (Agilent Technologies). Конкретно, рекомбинантный вектор, в который был введен ген, кодирующий вариант О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазы, был получен с помощью реакции ПЦР с использованием в качестве матрицы вместе с праймерами SEQ ID NO: 5 и 6 (Таблица 1).
Затем введение модифицированной О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазы было подтверждено секвенированием и модифицированная О-ацетилгомосерин-сульфгидрилаза была введена в Е. coli K12 W3110 посредством теплового шока. Трансформированный штамм был назван СА05-4012 и депонирован в Корейский центр культур микроорганизмов (КССМ), международный орган по депонированию согласно Будапештскому договору, 27 ноября 2014 года, под регистрационным номером KCCM11611P.
Трансформированные Escherichia coli K12 W3110 инокулировали в среду LB, содержащую хлорамфеникол (25 мкг/мл), и культивировали при 33°С в течение 6 часов, и часть культуры собирали и переносили в среду LB, содержащую хлорамфеникол (25 мкг/мл), и культивировали при 33°С в течение 15 часов, чтобы индуцировать экспрессию варианта фермента.
Пример 1-3: Оценка активности культурального раствора варианта V196T
2% (об/об) п-ксилола добавляли к культуре варианта фермента и к культуре фермента дикого типа соответственно и обрабатывали при 1150 об/мин при 33°С в течение 1 часа. Затем часть каждой из культур собирали и добавляли к буферу (содержащему 50 мМ фосфата калия (рН 7,4, рН 6.4), 15 г/л О-ацетилгомосерина, 0,05 мМ PLP (пиридоксаль-5'-фосфат) и 30 мМ метилмеркаптана натрия), и подвергали реакции при 1150 об/мин при 33°С в течение 5 минут и реагенты подвергали анализу ВЭЖХ для определения количества полученного L-метионина. Количество полученного L-метионина рассматривали, как активность превращения метионина ферментами и, как таковые, активность О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазы дикого типа, происходящей из Rhodobacter sphaeroides, и активность ее варианта V196T показаны в Таблице 2 ниже.
В результате, как показано в таблице 2 выше, было подтверждено, что культуральный раствор варианта фермента продемонстрировал 1,86-кратное увеличение активности в условиях рН 7,4 по сравнению с культуральным раствором самого фермента дикого типа и примерно 2,60-кратное увеличение активности при рН 6,4 по сравнению с активностью самого фермента дикого типа.
Пример 2: Очистка О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазы и оценка активности О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазы
Пример 2-1: Очистка O-ацетилгомосерин-сульфгидрилаз 25 мл каждого из культурального раствора О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазы дикого типа, происходящей из Rhodobacter sphaeroides, и его варианта V196T, полученного в примере 1, центрифугировали, и клетки соответственно собирали. Для получения каждого бесклеточного экстракта, содержащего
О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазу, клетки суспендировали в 15 мл 50 мМ фосфата калия (рН 7,8), содержащего 150 мМ NaCl и 5% глицерина, и лизировали с использованием ультразвукового аппарата, поддерживая температуру клеточной суспензии ниже 10°С соответственно. Затем каждую клеточную суспензию центрифугировали при 15000g в течение 25 минут для удаления клеточного дебриса. Аликвоту (15 мл) каждого из бесклеточных экстрактов наносили на 10 мл колонку GE Healthcare MonoQ, которую предварительно уравновешивали 50 мМ фосфата калия (рН 7,8) и промывали/элюировали 50 мМ фосфата калия (рН 7,8), содержащего 800 мМ NaCl путем применения к колонке градиента из 10 объемов колонки. О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазу элюировали при электропроводности от 15 мСм/см до 20 мСм/см. Каждый элюент концентрировали до объема 2 мл - 3 мл, используя центробежный сепаратор Millipore/Amicon Centricon (MWCO (отсечение по молекулярной массе): 3 кДа). Каждый концентрат наносили на колонку Superdex (HiLoad 16/600 Superdex 75 pg, GE Healthcare), которую предварительно уравновешивали 50 мМ фосфатом калия (рН 7,8), содержащим 150 мМ NaCl и 5% глицерина, и разделяли в соответствии с молекулярной массой.
О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазу элюировали в виде тетрамера в объеме элюирования 50 мл и затем концентрировали до объема 200 мкл или менее, используя центробежный сепаратор Millipore / Amicon Centricon (MWCO: 3 кДа).
Чистоту очищенных ферментов исследовали с помощью 10% SDS-PAGE анализа (Фиг. 1) и ферменты хранили при -80°С.
Результаты, представленные на Фиг. 1, свидетельствуют о том, что вариант по настоящему изобретению может быть очищен с высокой степенью чистоты, а также может быть сверхэкспрессирован в Е. coli.
Пример 2-2: Оценка активности очищенных О-ацетилгомосерин-сульфгидрилаз дикого типа и V196T
Очищенные О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазы дикого типа и варианта V196T, происходящие из Rhodobacter sphaeroides, каждая в концентрации 1,3 мг/мл, добавляли в равное количество буфера, содержащего 50 мМ фосфата калия (рН 7,4 и рН 6,4), 15 г/л О-ацетилгомосерина, 0,05 мМ PLP (пиридоксаль-5-фосфат) и 30 мМ метилмеркаптана натрия, и проводили реакцию при 1150 об/мин при 33°C в течение 5 минут. Затем реагенты подвергали анализу ВЭЖХ для определения количества продуцируемого L-метионина. Активность О-ацетилгомосерин-сульфгидрилаз дикого типа и варианта V196T показана в Таблице 3 ниже.
В результате, как показано в таблице 3 выше, было подтверждено, что очищенный вариант фермента показал 1,90-кратное увеличение активности при рН 7,4 по сравнению с ферментом дикого типа и увеличение активности примерно в 2,68 раза при рН 6,4 по сравнению с активностью фермента дикого типа.
ая
Пример 3: Оценка вариантов, где 196 аминокислота О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазы заменена другой аминокислотой
Пример 3-1: Получение вариантов V196S, V196L, V196D и V196K
ая
Векторы, содержащие гены, и штаммы Е. coli K12 W3110, трансформированные этими векторами, получали так же, как в Примере 1-2, за исключением того, что варианты О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазы дикого типа, происходящей из Rhodobacter sphaeroides, в которой 196 аминокислота, валин (Val, V), О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазы дикого типа, происходящей из Rhodobacter sphaeroides, была заменена серином (Ser, S), лейцином (Leu, L), аспарагиновой кислотой (Asp, D) и лизином (Lys, K) соответственно, с помощью сайт-направленного мутагенеза, как в Примере 1.
Пример 3-2: Оценка активности культуральных растворов ферментов вариантов V196S, V196L, V196D и V196K
Культуральные растворы вариантов, полученные в Примере 3-1, оценивали так же, как в Примере 1-3, и результаты показаны в Таблице 4 ниже.
(*n.d.; не обнаружено)
ая
В результате, как показано в таблице 4 выше, было подтверждено, что варианты, в которых 196 аминокислота был замещена другой аминокислотой, отличной от треонина, продемонстрировали уменьшение или потерю активности.
Эти результаты свидетельствуют о том, что вариант V196T, новый вариант О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазы по настоящему изобретению, имеет значительно улучшенную ферментативную активность по сравнению с активностью дикого типа и, таким образом, может быть использован для получения L-метионина в избыточном количестве и, кроме того, вариант V196T показывает более высокую активность L-метионинового превращения при низком рН и продуцирует L-метионин в избыточном количестве и, следовательно, имеет низкое ингибирование активности даже в момент накопления уксусной кислоты (то есть конечного продукта) и, таким образом, способен продуцировать L-метионин в избыточном количестве. Кроме того, эти результаты свидетельствуют о том, что L-метионин может быть получен в избыточном количестве, даже когда его очищают в форме бесклеточного экстракта, а также внутриклеточной культуры.
Из вышесказанного специалист в области техники, к которой относится настоящее изобретение, может понять, что настоящее изобретение может быть воплощено в других конкретных формах без изменения технических принципов или основных характеристик настоящего раскрытия. В этом отношении типичные воплощения, раскрытые здесь, предназначены только для иллюстративных целей и не должны истолковываться как ограничивающие объем настоящего изобретения. Напротив, предполагается, что настоящее изобретение охватывает не только типичные воплощения, но также различные альтернативы, модификации, эквиваленты и другие воплощения, которые могут быть включены, в рамках сущности и объем настоящего раскрытия, определенного прилагаемой формулой изобретения.