СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОЙ ДОБАВКИ
METHOD FOR BIOLOGICAL ACTIVE ADDITIVE PRODUCTION

Изобретение относится к биотехнологии, может быть использовано при производстве биологически активной добавки пищевого и кормового назначения.
Известны способы автолиза дрожжевой биомассы с получением автолизированных клеток дрожжей, белково-аминокислотных добавок, биологически активных добавок на основе деструкции внутриклеточных полимеров под действием эндоферментов дрожжевой клетки /1, 2/.
Недостатком данных способов является невысокая степень гидролиза белка протоплазмы дрожжевых клеток, полисахаридов клеточных стенок, низкий выход биологически активных веществ, необходимость дополнительного использования активаторов автолиза, а также длительный процесс гидролиза в результате невысокой активности внутриклеточных ферментов дрожжей. При этом результат автолиза и состав автолизатов полностью зависит от физиологического состояния клетки, от активности внутриклеточных ферментов, что обуславливает нестабильность качественных показателей получаемых препаратов.
Известен способ получения ферментолизата дрожжевой биомассы, предусматривающий обработку биомассы клеток дрожжей гидролитическими ферментами, продуцируемыми микромицетом Aspergillus oryzae F-683 /3/.
Однако биологическая активность ферментолизата дрожжей, получаемого данным способом, недостаточно высокая, так как в качестве источника ферментов используется микромицет Aspergillus oryzae F-683, синтезирующий гидролитические ферменты с низким уровнем активности /4/.
Известен способ получения ферментолизата биомассы гриба Aspergillus oryzae для получения биологически активных веществ /5/.
Однако в известном способе не описаны условия обработки мицелиальной биомассы гидролитическими ферментами, температура и продолжительность гидролиза, не указаны дозировки ферментов, входящих в комплекс, что не позволяет воспроизвести этот известный способ в части осуществления процесса ферментолиза или автолиза мицелиальной биомассы для получения биологически активной добавки. Кроме того, в работе используется штамм Aspergillus oryzae РОМ-156 (ВКПМ F-931) - продуцент экзопротеаз, синтезирующий сопутствующие ферменты: α-амилазу, ксиланазу, не участвующие в конверсии полимеров микробной биомассы /6, 7/.
Из известных способов наиболее близким аналогом предлагаемого способа является способ получения биологически активной добавки /8/, предусматривающий предварительную термическую обработку дрожжевой биомассы с целью инактивации внутриклеточных ферментов для устранения процессов брожения, вызывающих резкое вспенивание и увеличение объема дрожжевой суспензии, и проведение дальнейшего гидролиза полимеров биомассы дрожжей комплексом экзогенных гидролитических ферментов.
При этом в известном способе в качестве субстрата используется дрожжевая биомасса, обработанная ферментной композицией, содержащей комплекс экзогенных β-глюканаз, маннаназы, хитиназы, а также используется культуральная жидкость мицелиального гриба Aspergillus oryzae F-931 - продуцента экзопротеаз, β-глюканазы, α-амилазы, ксиланазы 161 и практически не используются нуклеазы, необходимые для гидролиза нуклеиновых кислот. Недостатком этого способа является высокий расход ферментов из-за низкой активности внутриклеточных (эндогенных) ферментов дрожжей и отсутствия ферментов нуклеазного действия, катализирующих гидролиз нуклеиновых кислот, наличия в культуральной жидкости мицелиального гриба ферментов α-амилазы и ксиланазы, не нужных для гидролиза полимеров микробной биомассы ввиду отсутствия в ней крахмала и ксиланов, а также ограниченный аминокислотный состав белков и низкое содержание хитино-глюканового комплекса в дрожжевой биомассе, что не обеспечивает создание биологически активной белково-аминокислотной добавки с широким спектром функциональных свойств.
Техническим результатом, достигаемым настоящим изобретением, является повышение эффективности процесса гидролиза полимеров микробной биомассы, сокращение продолжительности процесса, исключение или существенное снижение расхода экзогенных ферментов в результате действия внутриклеточных ферментов используемого гриба Aspergillus oryzae 12-84 (RCAM 01134), а также повышение качества и биологической ценности целевого продукта за счет обогащения гидролизата дрожжевой биомассы низкомолекулярными биологически активными продуктами глубокого ферментативного гидролиза внутриклеточных белковых и углеводных полимеров грибной биомассы.
Указанный технический результат достигается за счет того, что в заявляемом способе в качестве субстрата используется объединенная микробная биомасса, представляющая собой смесь дрожжевой и грибной биомассы в соотношении 1:0,5, при этом грибная биомасса является источником биологически полноценных белков с высоким содержанием незаменимых аминокислот, ценных полиаминосахаридов, а также ферментов, синтезируемых высокопродуктивным штаммом Aspergillus oryzae RCAM 01134 - продуцентом комплекса протеиназ и пептидаз, нуклеаз, β-глюканазы, маннаназы, хитиназы, уровень активности которых превышает активность штамма Aspergillus oryzae F-931, используемого в известном способе: по нуклеазам в 24,0 раза, по хитиназе - в 3,0 раза, по β-глюканазе - в 1,7 раза, по маннаназе - в 1,4 (табл. 1), что позволяет повысить интенсивность и глубину гидролиза полимеров объединенной микробной биомассы.
Кроме того, используемая в заявляемом способе грибная биомасса содержит более высокое количество полисахаридов (38,6%), хитина (18,5%), а также незаменимых аминокислот в составе белка - триптофана (20,7%) и метионина (9,6%), что в 1,4; 9,3; 12,2 и 3,7 раза соответственно превосходит аналогичные показатели дрожжевой биомассы, используемой в известном способе (табл. 2). В то же время в заявляемом способе аминокислотный состав грибных белков балансируется более высоким содержанием в дрожжевом белке лейцина (в 1,6 раза), фенилаланина с тирозином (в 1,4 раза) и валина (в 1,6 раза). Различия в аминокислотном составе белков дрожжевой и грибной биомассы позволяют получить биологически активную белково-аминокислотную добавку, обогащенную ценными полисахаридами и незаменимыми аминокислотами, что расширяет спектр функциональных свойств получаемых на их основе биопрепаратов.
3
6
1
4
Питательная ценность объединенной микробной биомассы определяется и ее богатым витаминным комплексом. В грибной биомассе, как и в дрожжевой, достаточно высокое содержание витаминов группы В, играющих важную роль в обменных процессах. При этом в дрожжевой биомассе отмечено более высокое содержание ниацина (В) и пиридоксина (В), а в грибной - тиамина (B) и холина (В), что также способствует получению белково-аминокислотной добавки со сбалансированным составом витаминов.
Повышенное содержание ценных полисахаридов в грибной биомассе, включающих β-глюканы, маннаны, хитин, сказывается на функциональных свойствах, получаемых по заявленному способу биологически активных добавок: на увеличении их иммуномодулирующей, противоопухолевой, сорбционной и антимикробной способности.
3
Наличие высокого количества триптофана в ферментолизатах микробной биомассы позволяет использовать их для создания натуральных продуктов - антидепрессантов, способствующих стабилизации настроения, снятию усталости, беспокойства и напряжения, нормализации сна. Триптофан, являясь предшественником ниацина (витамина В), способствует сдерживанию первичного образования компонентов жира, что снижает риск ожирения, а также способствует стимуляции синтеза гормона роста. Присутствие в грибной биомассе большого количества метионина придает ферментолизатам антиоксидантные и антитоксические свойства, способствует образованию иммунных клеток и улучшению функционирования нервной системы организма.
Кроме того, предлагаемый способ позволяет использовать остаточную биомассу микромицета как отход ферментного производства, а остаточную дрожжевую биомассу как отход бродильных производств, что обеспечит снижение финансовых затрат на производство биологически активных белково-аминокислотных добавок за счет низкой стоимости субстрата, будет способствовать ресурсосбережению, снижению техногенного воздействия биотехнологических производств в результате переработки отходов.
Указанный технический результат достигается тем, что способ получения биологически активной добавки заключается в использовании в качестве субстрата объединенной микробной биомассы, представляющей собой смесь дрожжевой и грибной биомассы в соотношении 1:0,5, в осуществлении двухстадийного гидролиза высокомолекулярных полимеров дрожжевой и грибной биомассы под действием внутриклеточных ферментов гриба Aspergillus oryzae RCAM 01134, катализирующих глубокий гидролиз глюканов, маннанов и хитина клеточных стенок, а также внутриклеточных белковых веществ и нуклеиновых кислот, с получением целевого продукта в виде ферментолизата микробной биомассы (объединенной дрожжевой и грибной биомассы).
Способ согласно изобретению предусматривает приготовление водной суспензии дрожжей Saccharomyces cerevisiae (дрожжевой биомассы), инактивирование внутриклеточных ферментов дрожжей путем их термической обработки при температуре 85-95°С в течение 15-20 мин, охлаждение до температуры 55-56°С и смешивание в соотношении 1:0,5 с грибной биомассой Aspergillus oryzae RCAM 01134, содержащей активные внутриклеточные ферменты. Далее осуществляют двухстадийный гидролиз высокомолекулярных полимеров объединенной микробной (дрожжевой и грибной) биомассы. При этом на 1-й стадии температура гидролиза поддерживается на уровне 48-50°С в течение 1 ч 45 мин - 2 ч 15 мин для осуществления деструкции белково-полисахаридных структур клеточных стенок. На 2-й стадии температуру снижают до 38-40°С во избежание инактивации эндогенных ферментов протеолитического действия и процесс продолжают в течение 3 ч 45 мин - 4 ч. 15 мин для гидролиза внутриклеточных белковых полимеров и нуклеиновых кислот.
В заявляемом способе исключается дополнительное введение экзогенных ферментов маннано-, хитинолитического, β-глюканазного и нуклеазного действия, так как используемый гриб Aspergillus oryzae RCAM 01134 обладает указанными активностями в необходимом количестве, и при этом достигается существенное снижение продолжительности процесса гидролиза (до 6 часов) по сравнению с известным способом, где продолжительность гидролиза составляет 12-18 часов.
Способом согласно изобретению рекомендуется проведение при определенных режимных параметрах 2-стадийного ферментативного гидролиза объединенной в соотношении 1:0,5 биомассы дрожжей Saccharomyces cerevisiae и гриба Aspergillus oryzae RCAM 01134 внутриклеточными ферментами гриба протеолитического, β-глюканазного, маннанолитического, хитинолитического и нуклеазного действия, что позволяет повысить качество и биологическую ценность гидролизатов за счет более глубокого ферментативного гидролиза основных субклеточных полимеров микробной биомассы с образованием биологически активных легкоусвояемых продуктов гидролиза с высоким содержанием свободных незаменимых аминокислот, редуцирующих углеводов, низкомолекулярных пептидов и нуклеотидов в результате действия собственной ферментативной системы грибной биомассы, что позволяет расширить спектр функциональных свойств биологически активных добавок, получаемых по заявляемому способу.
Для сравнения качества биологически активной добавки, получаемой в результате реализации способа согласно изобретению, с качеством продукта, получаемого в результате осуществления процесса по наиболее близкому аналогу, приводим таблицы 3 и 4.
Получаемый по заявленному способу препарат содержит биологически активные продукты глубокого ферментативного гидролиза полимеров дрожжевой и грибной биомассы: биологически активные пептиды, незаменимые и заменимые аминокислоты, биологически активные продукты гидролиза полисахаридов клеточных стенок и нуклеиновых кислот. Препарат рекомендуется к использованию как биологически активная добавка.
Медико-биологические исследования биологически активной добавки (БАД), получаемой по заявленному способу, показали, что испытанная добавка обладает антиоксидантными, иммуномодулирующими и антиканцерогенными свойствами. Клинические исследования эффективности ферментолизатов дрожжевой биомассы в процессе реабилитации больных с черепно-мозговой травмой (ЧМТ) показали, что испытанные препараты влияли на коррекцию здоровья, улучшая функциональное состояние организма у больных, перенесших ЧМТ. Кроме того, биологически активная добавка, получаемая по заявленному способу, обладает антимикробной способностью, антитоксическими свойствами, способствует улучшению функций нервной системы, а также стимулирует синтез ростовых факторов. Выявленные эффекты указывают на возможность создания на основе ферментолизата дрожжевой и грибной биомассы эффективных функциональных продуктов питания.
Ниже приведены примеры, иллюстрирующие изобретение.
3
Пример 1. Готовят водную суспензию из 100 г сухих пекарных дрожжей и 200 см воды. Смесь тщательно перемешивают. Для инактивации эндогенных ферментов дрожжевых клеток приготовленную суспензию нагревают до температуры 85-95°С и выдерживают при этой температуре в течение 15-20 мин, после чего смесь охлаждают до температуры 55-56°С. Далее готовят объединенную микробную биомассу.
2
4
3
3
-3
3
3
3
Для этого к охлажденной дрожжевой суспензии, содержащей 100 г сухих дрожжей, добавляют в соотношении 1:0,5 грибную биомассу в количестве 50 г сухих веществ, полученной при культивировании штамма Aspergillus oryzae RCAM 01134 на питательной среде следующего состава, %: ячменная мука - 3,0; пшеничные отруби - 3,0; KHPO - 1,5; остальное - водопроводная вода, рН - естественный. Штамм культивирован в аэробных условиях при температуре 32°С в течение 42 ч. Уровень активности ферментов, синтезируемых штаммом Aspergillus oryzae RCAM 01134, составил: по протеазе - 30,7 ед. ПС/см, по β-глюканазе - 6,8 ед. β-ГкС/см, по нуклеазам - 4,8⋅10 ед. НС/см, по хитиназе - 0,21 ед. ХС/см, по маннаназе - 0,82 ед. МС/см. По окончании ферментации биомассу гриба, содержащую активные внутриклеточные ферменты, используют для получения ферментолизата объединенной микробной биомассы.
Ферментативный гидролиз полученной объединенной микробной биомассы дрожжей Saccharomyces cerevisiae и биомассы гриба Aspergillus oryzae RCAM 01134 осуществляют в две стадии при постоянном перемешивании.
На 1-й стадии проводят гидролиз полимеров микробных клеток под действием внутриклеточных ферментов грибной биомассы при температуре 50°С в течение 1 ч 45 мин и постоянном перемешивании. При этом на 1-й стадии в результате ферментативного гидролиза высокомолекулярных белковых и полисахаридных полимеров клеточных стенок под действием внутриклеточных ферментов микромицета происходит образование пептидов, олигосахаридов и аминосахаров, а также освободившихся β-глюкана, маннана и хитина. Деструкция полимеров клеточных стенок дрожжей и микромицета обеспечивает повышение степени доступности внутриклеточных белковых веществ протоплазмы и нуклеиновых кислот для дальнейшего действия ферментов на 2-й стадии гидролиза.
На 2-й стадии процесса ферментативного гидролиза частично разрушенную объединенную микробную биомассу, полученную на 1-й стадии, охлаждают до температуры 40°С для исключения термоинактивации ферментов и процесс продолжают в течение 3 ч 45 мин при постоянном перемешивании. Об окончании второй стадии ферментолиза судят по нарастанию концентрации растворимых редуцирующих углеводов, содержанию свободных аминокислот, низкомолекулярных пептидов и нуклеотидов, образующихся в результате гидролиза полисахаридов (хитина, глюканов и маннанов), белковых веществ и нуклеиновых кислот объединенной микробной биомассы.
По окончании процесса гидролиза полученный ферментолизат нагревают до температуры 85°С и выдерживают при этой температуре в течение 15 мин для инактивации всех ферментов.
Полученный ферментолизат микробной биомассы содержит биологически активные продукты глубокого ферментативного гидролиза внутриклеточных полимеров объединенной дрожжевой и грибной биомассы: биологически активные пептиды с молекулярной массой от 500 до 700 Да - 14%, до 500 Да - 82%; свободные аминокислоты и низкомолекулярные пептиды до 300 Да - 72,4%, незаменимые аминокислоты в свободной форме - 39,2% от исходного количества белка, а также биологически активные продукты гидролиза полимеров клеточных стенок (β-глюкана, маннанов, хитина) - 29,7% РВ (редуцирующих веществ) и низкомолекулярные нуклеотиды - 67,2% от исходного содержания нуклеиновых кислот. Ферментолизат микробной биомассы рекомендуется к использованию как биологически активная добавка.
Полученный ферментолизат по сравнению с известным аналогом характеризуется более высоким содержанием аминокислот в свободной форме, активных низкомолекулярных пептидов и легко усваиваемых биологически активных продуктов гидролиза (β-глюкана, маннанов, хитина и нуклеиновых кислот).
Пример 2. Целевой продукт получают по методике примера 1 с соблюдением перечисленных далее режимных параметров. На первой стадии гидролиз мицелиальной биомассы под действием внутриклеточных ферментов проводят при температуре 48°С в течение 2 ч 15 мин. Гидролиз на второй стадии осуществляют при температуре 38°С в течение 4 ч 15 мин при постоянном перемешивании. Препарат содержит биологически активные продукты глубокого ферментативного гидролиза клеточных полимеров микромицета: биологически активные пептиды с молекулярной массой от 500 до 700 Да - 13,8%, до 500 Да - 82,2%, свободные аминокислоты и низкомолекулярные пептиды до 300 Да - 72,2%, незаменимые аминокислоты в свободной форме - 39,3% от исходного количества белка, а также биологически активные продукты гидролиза полимеров клеточных стенок (β-глюкана, маннанов, хитина) - 29,8% РВ (редуцирующих веществ) и низкомолекулярные нуклеотиды - 67,0% от исходного содержания нуклеиновых кислот. Ферментолизат мицелиальной биомассы рекомендуется к использованию как биологически активная добавка.
Полученный ферментолизат характеризуется высоким содержанием аминокислот в свободной форме, активных низкомолекулярных пептидов и легко усваиваемых биологически активных продуктов гидролиза β-глюкана, маннанов, хитина и нуклеиновых кислот.
Таким образом, способ согласно изобретению позволяет получать высококачественную пищевую добавку.
Литература
1. Патент РФ №2065275, кл. A23J 1/18, опубл. 20.08.1996.
2. Патент РФ №2084171, кл. A23J 1/18, опубл. 20.07.1997.
3. Патент РФ №2104300, кл. C12N 1/06, A23L 1/28, опубл. 10.02.1998 г.
4. Патент РФ №2070921, кл. C12N 1/14, опубл. 27.12.1996 г.
5. Римарева Л.В. Использование биомассы гриба Aspergillus oryzae в качестве источника биологически активных веществ / Л.В. Римарева, Е.М. Серба, Оверченко М.Б., К.В. Рачков, И.М. Абрамова // Хранение и переработка сельхоз сырья. - 2012. - №9. - С. 46-49.
6. Патент РФ 2315096, кл. C12N 1/30, опубл. 2008 г.
7. Серба Е.М. Синтез и секреция гидролаз микромицетом Aspergillus oryzae - продуцентом ферментов, необходимых для биокатализа полимеров зернового сырья / Е.М. Серба, М.Б. Оверченко, Л.В. Римарева // Производство спирта и ликероводочных изделий. - 2011. - №2. - С. 18-20.
8. Патент РФ 2374901, кл. A23L 1/00, опубл. 10.12.2009 г.