Клеточные технологии в лечении терминальной стадии хронической ишемии нижних конечностей

Обзоры

Клеточные технологии в лечении терминальной стадии хронической ишемии нижних конечностей

А.Б. Смолянинов1, Е.В. Пыхтин1, Д.В. Булгин1, М. Томонага 2

1 Центр клеточной и генной терапии, Покровский банк стволовых клеток, Санкт-Петербург, Россия 2Департамент молекулярной медицины и гематологии, Медицинский факультет Университета Нагасаки, Япония

Cell technologies in the treatmemt of critical lower limbs ischemia

A.B. Smolyaninov1, E.V. Pykhtin1, D.V. Bulgin1, M. Tomonaga 3

1 Center of Cell and Gene Therapy, Stem cell Bank «POKROVSKI», St.-Petersburg, Russia

3Department of Molecular Medicine and Hematology, Nagasaki University Graduate School of Biomedical Sciences, Nagasaki, Japan

В статье представлен обзор вариантов применения клеточных технологий в лечении терминальной стадии хронической ишемии нижних конечностей. Основным методом лечения сосудистых заболеваний нижних конечностей остается хирургическое вмешательство. Высокая эффективность применения хирургического метода, достигается при поражении магистральных артерий, в то же время, при поражении дистальных сегментов периферических артерий [облитерирующий эндартериит и тромбангиит - болезнь Бюргера) оперативное лечение мало эффективно вследствие повторного образования тромбов и последующего стенозирования. Основные усилия хирургов при лечении таких заболеваний направлены на обеспечение адекватного притока крови к дистальным отделам конечности и поддержания эффективной перфузии тканей. Этого можно достичь путем непрямой реваскуляризации. Помимо традиционных методов лечения, таких как остеотрепанация и поясничная симпатэктомия, в последнее время активно изучается возможность применения клеточных технологий для создания новых путей коллатерального кровообращения в конечности. Трансплантация больному его собственных стволовых клеток стимулирует ангиогенез в ишемизированных тканях. Проведенные экспериментальные и клинические исследования в этой области подтверждают высокую эффективность и безопасность трансплантации стволовых клеток больным с данной патологией. Однако есть неразрешенные вопросы, касающиеся «качества» и количества клеток, необходимых для образования новых сосудов.

Ключевые слова: терминальная стадия хронической ишемии нижних конечностей, трансплантация стволовых клеток, костный мозг, предшественники эндотелиоцитов.

This article presents reviews application of cell technologies in the treatment of critical limb ischemia. Surgery treatment remains a basic method in the treatment of vascular obliterans limb diseases. In our days surgical methods are known as the most effective treatment of main artery atherosclerosis, but this kind of treatment is not so good for treatment peripheral arterial diseases such as thromboangitis obliterans [Buerger's disease) because of often restenosis and rethrombosis development. Principal purpose efforts of surgeons according on ensuring of adequate blood flow in terminal parts of limb and also on support effective perfusion of tissue. This aim could be obtain due to undirected revascularization. Recently thanks to development of cells technologies on a level with osteothrepanation and lumbal sympathectomy it became possible to create new ways of roundabout blood flow in ischemic limb. Autological stem cells transplantation to patients with critical ischemic limb provides an appearance of new sites revascularization. In last years experimental and clinical studies in this area confirm safety and efficiency of the stem cells transplantation to patients with ischemic limb disease. However, few questions about quality and quantity of stem cells which are necessary for appearance revascularization remain unknown.

Key words: critical iimb ischemia, stem ceiis transplantation, bone morrow, endothelial progenitors.

Клиническая картина хронической ишемии нижних ко нечностей может быть обусловлена как изолированными, так и сочетанными окклюзиями брюшной аорты, ее бифурка ции, подвздошных и бедренных артерий, а также артерий голени и стопы. Основными морфологическими проявлени ями хронической ишемии нижних конечностей являются облитерирующий атеросклероз, эндартериит и тромбангиит (болезнь Бюргера). В терминальной стадии этих заболева ний развивается состояние, известное как «критическая ишемия нижних конечностей» (КИНК) [1]. Согласно опре делению Российского консенсуса по диагностике и лечению пациентов с критической ишемией, European Consensus и Trans Atlantic Inter Society Consensus (TASC), основными клиническими признаками КИНК являются: наличие хрони ческой артериальной недостаточности нижних конечностей, постоянная боль в покое, требующая обезболивания, в те чение 2 недель и более, трофическая язва или гангрена пальцев или стопы (2 4].

КИНК соответствует III Б и IV стадиям ишемии по класси фикации Покровского Фонтейна [4]. Основными факторами риска развития обструктивного поражения периферических

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, № 3, 2007

сосудов являются: курение, сахарный диабет, гиперхолес теринемия, артериальная гипертензия [4 6].

По результатам национального исследования, прове денного Ангиологическим Советом Великобритании (1996 2006), частота КИНК составляет 400 больных на 1 млн населения в год [7]. Если учесть, что 3% населения стра дают перемежающейся хромотой и у 5% из них в течение

5 лет может развиться КИНК, то частота равна 300 случаев на 1 млн населения в год. Около 90% всех ампутаций выпол няется по поводу выраженной ишемии нижних конечностей. 25% пациентов с КИНК проводится ампутация конечности на уровне голени или бедра [6].

Наравне с характерными клиническими проявлениями хронической артериальной недостаточности нижних конеч ностей (боль в покое, «перемежающаяся хромота», бледность и похолодание кожных покровов, трофические нарушения) существуют инструментальные методы диагностики, позво ляющие объективно оценить уровень дефицита артериально го кровотока. Первостепенным и наиболее важным показа телем, объективно оценивающим состояние гемодинамики при КИНК, является лодыжечно плечевой индекс (ЛПИ).

А

Обзоры

Нормальными считаются значения ЛПИ выше 0,9. При КИНК лодыжечное давление < 50 мм рт. ст., пальцевое дав ление < 30 50 мм рт. ст., ЛПИ < 0,4 [7].

Несмотря на простоту в диагностике КИНК, лечение этого состояния зачастую сопровождается определенными труд ностями. Больные с высоким риском сердечно сосудистых заболеваний это, как правило, пожилые и ослабленные люди. У пациентов с сахарным диабетом КИНК наблюдает ся примерно в пять раз чаще, а трофические нарушения развиваются у 10% пациентов [11 ].

Во всех случаях основной целью лечения КИНК является реваскуляризация тканей. Она может быть достигнута пу тем формирования шунта «в обход» места окклюзии сосуда, либо ангиопластикой (тромбэндартерэктомия, стентирование и баллонная дилатация просвета сосуда, лазерная абляция атеросклеротических бляшек и др.) [3, 8 11 ]. Анализ данных, полученных после шунтирующих операций и чрескожной транслюминальной ангиопластики, не выявил значимых различий в летальности [12].

Летальность после реконструктивных операций со ставляет 2 13%, а частота ампутаций до 10%. В сроки до 10 лет проходимость сосудистых протезов сохраняется в аорто подвздошном сегменте у 80 90% пациентов. Резуль таты внеполостных операций хуже: через 3 года проходимы

60 70% бедренно бедренных шунтов и 64% подмышечно бедренных шунтов [13]. Поданным Согласительного документа Российского общества сердечно сосудистых хирургов, при КИНК через 1 год после бедренно подколенного шунтиро вания аутологичной веной сохраняется проходимость 75% шунтов, протезом - 65%. После бедренно тибиального шун тирования аутологичной веной сохраняется проходимость 70% шунтов и 40% протезов. Результаты ангиопластики по казывают, что через 2 года проходимы 85% подвздошных артерий и лишь 50% бедренных и подколенных артерий.

Ситуация осложняется еще и тем, что КИНК в большин стве случаев обусловлена тяжелым и диффузным пораже нием периферических артерий конечности, часто сочетаю щимся с выраженным дефицитом кровотока на уровне микроциркуляторного русла. В условиях поражения дисталь ного сегмента конечности и микроангиопатии, а также при неэффективности ранее проведенной реваскуляризации, медикаментозное лечение остается единственным доступ ным вариантом лечения до ампутации. У пациентов с КИНК при отсутствии условий для «прямой» реваскуляризации стандартная консервативная терапия малоэффективна. В ближайшие сроки от начала лечения положительный ре зультат отмечается лишь у половины пациентов, а 1/3 па циентов являются кандидатами на ампутацию.

Однолетняя выживаемость больных, перенесших ампу тацию на уровне голени, составляет около 30%. Смертность остается главной проблемой в этой группе пациентов, 30 40% из них живут менее 5 лет, а при КИНК, сочетающейся с язвами или гангреной, процент летальности еще выше [9]. По данным ТАБС, среди пациентов с КИНК от 10 до 30% живут не более 6 месяцев, а 25 30% пациентов может по требоваться «массивная» ампутация [3]. Прогноз после ам путации также неутешителен: ранняя послеоперационная летальность составляет около 5 10% после ампутации на уровне голени, и 15 20% после ампутации на уровне бедра. Из пациентов, перенесших операцию, около 30% умирают в ближайшие 2 года. Повторная ампутация требуется 1/3 больных. Полная реабилитация может быть достигнута ме нее, чем у половины из них [2, 14].

Большое внимание в настоящее время уделяется опреде лению места непрямых методов реваскуляризации в лечении КИНК. Наиболее часто используемыми операциями являются поясничная симпатэктомия (ПСЭ) и реваскуляризирующая

остеотрепанация. В качестве самостоятельных методов лече ния они используются только при невозможности выполне ния прямых реконструктивных вмешательств. В ближайший послеоперационный период ПСЭ эффективная у 45% пациентов, а спустя 4 года она позволяет сохранить конеч ность лишь у 35% пациентов. Положительный эффект при проведении остеотрепанации наблюдается в 28% случаев, у 50% из которых сохранность конечностей наблюдается спустя 4 года. Несколько лучшие результаты наблюдаются при сочетании обеих методик: спустя 4 года удается сохра нить конечность более чем у 60% пациентов [15]. Сочетание методов непрямой реваскуляризации с реконструктивными операциями (особенно в случае повторного их выполнения) также дает хороший терапевтический эффект [16]. Продол жается поиск альтернативных путей реваскуляризации ишемизированных тканей. Одним из путей стимуляции нео ангиогенеза может быть применение клеточных и генных технологий [16].

Биологические и патофизиологические основы

клеточной терапии критической ишемии

нижних конечностей

В последнее время были проведены исследования, ко торые показали, что образование кровеносных сосудов в постнатальном периоде обусловлено наличием клеток предшественников эндотелиальных клеток (ЭК) в стенках сосудов [7]. Есть все основания полагать, что эти клетки предшественники могут сохраняться на протяжении всей жизни организма и принимать участие в обновлении сосу дов [17 19].

Формирование новых сосудов - неоангиогенез, во взрослом организме рассматривается как результат про лиферации, миграции и ремоделирования уже имеющихся зрелых ЭК [20]. В неоваскуляризации участвуют предше ственники эндотелиоцитов (ПЭ) С034^ фракции стволовых клеток периферической крови взрослых после их мобили зации из костного мозга (КМ) [7, 19, 21, 22] (рис. 1).

В этом контексте, терапевтический неоангиогенез пред ставляется важной стратегией спасения тканей при КИНК [23 26].

Быстрая реваскуляризация в поврежденных (ишемизиро ванных) и в регенерирующих органах чрезвычайно важна для восстановления функций. Сосудистая травма или ишемия тканей активирует каскад молекулярно генетических реак ций, главным результатом которых является мобилизация из КМ и других источников предшественников эндотелиальных клеток, обеспечивающих реваскуляризацию за счет образо вания новых сосудистых формаций [25 31].

Проведенные исследования показали, что клетки КМ участвуют в неоангиогенезе при заживлении ран [31 41] и ишемии нижних конечностей [31, 32], эндотелизации со судистых протезов [42 45], при атеросклерозе [7, 46], васкуляризации в период постнатального роста [47] и при опухолевом росте [33, 48 52].

Эти исследования свидетельствуют, что во время по вреждения сосудов или регенерации органа, происходит высвобождение цитокинов, которые опосредуют миграцию ПЭ и циркулирующих эндотелиальных клеток (ЦЭК) в зону неоангиогенеза. Например, тканевая ишемия приводит к включению сосудистых факторов, таких как сосудистый эн дотелиальный фактор роста (УЕвЕ), который, связываясь с рецепторами (УЕСЕР2 и УЕвЕРИ) клеток, участвующих в неоангиогенезе, обеспечивает миграцию последних в зону повреждения. Быстрое внедрение клеток в зону неоангио генеза ускоряет восстановление сосудов, позволяет избе жать потенциальных сосудистых осложнений: вторичного тромбоза и гипоксии.

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, № 3, 2007

Обзоры

Ишемический орган

Синусоидальные сосуды

Рис. 1. Межклеточные взаимоотношения и молекулярные механизмы мобилизации эндотелиальных, лимфатических, стволовых гематопоэтических и прогениторных клеток. Повреждение стенки сосуда приводит к повышению уровня сосудистых факторов роста, включая VEGF-A и PLGF, которые активируют ММР-9. ММР-9 усиливает биодоступность цитокинов, активных в отношении стволовых клеток, sKit-лиганда, активирует циркуляцию и пролиферацию VEGF-R1 'c-Kit' гематопоэтических клеток, VEGF-R3' лимфоцитов и VEGF-R2'c-Kit' клеток-предшественников эндотелиоцитов. Увеличение количества циркулирующих стволовых клеток приводит к появлению клеток-предшественников в зонах ангиогенеза. Содружественная мобилизация проангиогенных VEGF-R1' стволовых гематопоэтических клеток-предшественников может усиливать функциональное внедрение VEGF-R2' клеток-предшественников эндотелиоцитов в зоны ангиогенеза. Syk' and SLP-76' гематопоэтические клетки участвуют процессах регуляции образования кровеносных и лимфатических сосудов

В настоящее время активно разрабатываются техно логии получения сосудистых факторов, которые способны ускорять процессы реваскуляризации тканей [52 59]. Пато логические изменения в сосудах и в тканях в большинстве случаев обусловлены недостаточным количеством в зоне по вреждения резервных ЭК, которые в норме способны само стоятельно восстанавливать васкуляризацию (см. рис. 1). Таким образом, появилась потребность в дополнительных факторах, способных восстановить васкуляризацию. На роль одного из таких факторов могут претендовать ПЭ.

Исследования последних лет доказали, что в КМ нахо дятся сосудистые прогениторные клетки, которые могут поступать в зону ишемии и принимать участие в процессах реваскуляризации [5].

Участие клеток костного мозга в атеросклерозе

и артериосклерозе

Патологическая пролиферация гладкомышечных клеток (ГМК) приводит к изменениям интимы, существующей до фор мирования атероматозной бляшки, рестеноза после ангиопла стики, а трансплантация приводит к зависимой васкулопатии.

Опыты на животных доказали, что гемопоэтические клетки фенотипа Seal ~cKitrUn дифференцируются в ГМК и участвуют в рестенозе после ангиопластики, васкулопатии протеза и

атеросклерозе [85]. Механическое повреждение бедренной артерии также приводит к мобилизации клеток костного мозга, отвечающих за пролиферацию ГМК. Получены дока зательства участия клеток КМ в образовании атероматозных бляшек в сосудах человека [86].

Рекрутинг ЭК и ГМК из костного мозга либо из донорского трансплантата зависит от основной имеющейся патологии. На моделях атеросклеротического поражения сосудистого протеза большинство ЭК и ГМК были выделены из сосудов хозяина с минимальным участием прогениторов КМ [88]. Од нако степень участия клеток КМ может варьировать в зави симости от тяжести сосудистой травмы [93]. Механическая травма сосуда приводит к глубокому проникновению клеток КМ в поврежденную интиму. Каждый инсульт приводит к высво бождению специфических факторов, которые способствуют гиперплазии интимы. Это возможно при тяжелой сосудистой травме и в случае иммуно опосредованной трансплантаци онной васкулопатии [87], приводящей к высвобождению ци токинов, которые индуцируют мобилизацию клеток КМ. Были изучены возможности клеток линии Эса1*сКйгип дифферен цироваться в разные ткани, включая ЭК и ГМК [89, 94, 95]. Однако, для подтверждения участия клеток КМ в образовании функционально полноценных артерий необходимо проведе ние дополнительных исследований.

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, № 3, 2007

Обзоры

Роль предшественников зндотелиоцитов в васкуляризации тканей

Обновление сосудов происходит посредством мобили зации ПЭ и ЦПЭ. Исследованиями, выполненными моле кулярно генетическими методами, доказали возможность поступления ПЭ КМ в ишемизированные конечности мышей [19, 39, 66]. Другие исследования показали, что трансплан тация зрелых зндотелиоцитов, полученных при культивирова нии in vitro мультипотентных предшественников стволовых клеток взрослого организма, выделенных из костного мозга, значительно ускоряет процессы реваскуляризации тканях [22, 67]. Заслуживает внимание экспериментальная работа по замещению у взрослой собаки грудного отдела аорты дакроновым протезом. Перед протезированием собаке выпол нялась пересадка аллогенного костного мозга. Через 3 меся ца в протезе определялся рост эндотелиальных клеток [43,66].

Уменьшение содержания ЦЭК в кровотоке коррелирует с высоким уровнем сердечно сосудистых осложнений [87]. J. Hill et al. (2003) предположили, что снижение уровня ЦЭК ухудшает восстановление поврежденных сосудов [85]. Однако патофизиологическая роль ЦЭК КМ до сих пор не определена.

Трансплантация клеток костного мозга в лечении критической ишемии нижних конечностей

В экспериментальных моделях КИНК для неоангиогенеза были использованы различные типы клеток. Исследования показали, что в ангиогенезе могут участвовать мононуклеар ные клетки (МНК) КМ [58, 63], гемопоэтические стволовые клетки (ГОК) [72 74], мобилизованные эндотелиальные про гениторные клетки [19,39,77], клетки стромы костного мозга [75], стволовые клетки, выделенные из жировой ткани [76].

В доклинических исследованиях введение предшествен ников зндотелиоцитов ускоряло формирование коллатераль ных сосудов, минимизируя при этом зону ишемического повреждения [58, 60, 63]. Механизмы участия ПЭ в васку ляризации тканей человека окончательно не изучены. Ос новная причина - трудности в выделении и распознавании ПЭ и ЦЭК вследствие отсутствия специфических эндотели альных маркеров и невозможности отличить эти клетки от зрелых зндотелиоцитов сосудистой стенки. Более того, подгруппа миело моноцитарных клеток может быть не правильно интерпретирована как ПЭ или ЦЭК, поскольку они тоже экспрессируют эндотелий специфические антигены [90, 91].

ПЭ, выделенные из костного мозга, ЦЭК и зрелые эндоте лиоциты, выделенные из сосудистой стенки, экспрессируют схожие эндотелий специфичные маркеры, включая VEGFR2, Tie 2, сосудистый эндотелиальный кадгерин (VE cadgerin), CD34^, CD146^ и Е селектин [19, 39, 41, 91, 92]. Различие между ПЭ, ЦЭК и ЭК также осложняется тем, что ГОК эксп рессируют маркеры, сходные с теми, которые экспресси руют ЭК, включая CD34^, РЕСАМ (CD31 ), Tie 2, фактор Виллибранда и VEGFR1.

Проведенные клинические исследования определили высокий потенциал клеток КМ в восстановлении васкуля ризации ишемизированных тканей (рис. 2, рис. 3) [33, 59,

61 63, 81].

Успех этой стратегии зависит от определения механизмов, посредством которых стволовые и прогениторные клетки проходят молекулярные перестройки, необходимые для их направленной пролиферации, мобилизации и дифференци ровки, и тем самым определяется их функциональное пове дение в тканях взрослого организма.

До имплантации

24 недели после

Рис. 2. Ангиограммы больного с поражением дистальных сосудов нижней конечности до и после [через 24 недели) имплантации мононуклеарных клеток, выделенных из костного мозга.

Введение мононуклеарных клеток стимулирует ангиогенез в тканях нижней конечности

До имплантации

8 недель после

Г . -

Рис. 3. Пример заживления длительно существующих трофических язв после проведения клеточной трансплантации аутологичными мононуклеарными клетками, выделенными из костного мозга больного с критической ишемией нижних конечностей

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, № 3, 2007

Обзоры

Первое клиническое исследование по применению ство ловых клеток в лечении КИНК опубликовано в 2002 г. Е. Tateishi Yuyarna et al., которые исследовали эффектив ность и безопасность имплантации аутологичных МНК из КМ больным с КИНК [67]. Под общей анестезией они аспи рировали 500,0 мл КМ из гребня подвздошной кости. Че рез 3 часа после аспирации фракция изолированных МНК была введена в икроножные мышцы посредством 40 инъ екций по 0,75 мл. Количество введенных клеток составило 0,7 2,8x10s. Пациентов разделили на 2 группы. Первой группе вводили МНК, выделенные из КМ, второй группе вво дили МНК, выделенные из КМ, в мышцы одной конечности, а в мышцы другой конечности вводили ГСК после стимуля ции G CSF. Результатом лечения через 4 недели было появ ление коллатералей, повышение чрезкожного напряжения кислорода, уменьшение болей и увеличение времени ходь бы до появления болей. Во второй группе значительное улуч шение перечисленных параметров было в области введения МНК КМ. Осложнений, связанных с проведенным лечени ем, отмечено не было. Исследование показало, что транс плантация аутологичных МНК КМ является безопасной и эф фективной процедурой для проведения терапевтического ангиогенеза.

В двух других исследованиях пациентам с КИНК произ водилась трансплантация предшественников ЭК в сочетании с введением сосудистых факторов роста. Получен стойкий эффект спустя 6 месяцев с момента трансплантации. Ав торы также указывают на безопасность и эффективность данной методики [68, 69]. Аналогичное по методике иссле дование проведено группой под руководством К. Esato (2002). Ими проведена трансплантация МНК, выделенных из костного мозга 8 больных с хроническими обструктив ными заболеваниями артерий нижних конечностей, ослож ненных образованием трофических язв [76]. В сроки до

6 месяцев от начала терапии наравне с клиническим улуч шением и исчезновением большинства симптомов отмечено заживление язв.

P. Huang et al. (2004) предложили другой подход к ауто логичной трансплантации МНК, мобилизованных в перифе рическую кровь посредством G CSF [77]. В исследовании приняли участие 5 человек, страдающих облитерирующим атеросклерозом нижних конечностей III и IV степени. Все па циенты имели трофические нарушения в виде язв или ганг рены. Этим пациентам в течение 5 дней подкожно вводили G CSF в дозе 600 м/сут [78]. Для снижения потенциально го риска артериального тромбоза на фоне введения G CSF пациентам вводили гепарин в дозе 10000 ЕД/сут. Стиму ляция G CSF позволила увеличить содержание CD34^ клеток в периферической крови в 100 раз. После стимуляции из периферической крови пациентов была получена суспен зия 300 мл, содержащая фракцию МНК, обогащенную CD34^. Методика введения МНК аналогична описанной ра нее. Через 3 месяца наблюдений основные клинические симптомы значительно улучшились более чем у половины больных. При ангиографии отмечалось существенное улуч шение коллатерального кровотока.

N. Van Royen et al. (2003) было проведено пилотное ис следование, которое заключалось в проведении монотера пии G CSF у пациентов с облитерирующими заболеваниями артерий нижних конечностей. Были получены хорошие резуль таты, дающие место данному методу лечения среди других методов непрямой реваскуляризации [79].

Все исследования, изучающие влияние трансплантации прогениторных сосудистых клеток на неоангиогенез при КИНК, так или иначе базируются на введении МНК КМ боль шей или меньшей степени «чистоты». Способы доставки в ос новном представлены внутримышечным и внутрисосудистым

введением. Разработка способов идентификации ПЭ и ЦЭК позволила ряду исследователей провести трансплантацию тканеспецифичных клеток [33, 35, 63].

Большинство исследований указывают на стойкий по ложительный эффект после аутологичной трансплантации СК больным с КИНК в сроки до 6 8 месяцев. В 2006 году учеными из Японии закончено пилотное исследование по оценке отдаленных результатов трансплантации МНК больным с облитерирующим тромбангиитом [80]. Из 8 па циентов, вошедших в исследование, трое отмечали не прекращающиеся боли в конечности, кроме того, у всех пациентов имело место язвенное поражение конечности. Через 4 недели отмечено улучшение клинического стату са у всех пациентов. Полное заживление язв произошло у

7 из 8 пациентов. Восстановление кровоснабжения в ишемизированных тканях нижних конечностей зависит от баланса между образованием кровеносных и лимфати ческих сосудов. Дисфункция лимфатической системы приводит к отеку, который является причиной длительно незаживающих язв. Введение VEGF С ускоряет восста новление функции ишемизированной нижней конечности посредством увеличения скорости образования лимфа тических и кровеносных микрососудов и уменьшением отека [81 83].

Нетромбогенные сосудистые протезы

Недавно в хирургическом лечении атеросклероза ко ронарных артерий были применены аутологичные сосуди стые протезы. Как альтернатива этому, биодеградирующая матрица обеспечила адекватную замену для сосудов большого калибра. Однако осложняющим фактором явля ется образование тромбов на поверхности матрицы из за контакта с кровью. Один из способов использования эн дотелиальных прогениторных клеток - это образование нетромбогенных сосудистых клеток, которые бы покрыва ли поверхность сосудистого протеза. В одном из исследо ваний клетки КМ были внедрены в синтетический протез перед пересадкой его внутрь аорты собаки, что привело к формированию нетромбогенной эндотелизированной по верхности [95].

Аутологичные ЦЭК также дифференцировались in vitro до зрелых зндотелиоцитов и последовательно «заселяли» протезы в сонных артериях. Это привело к образованию не тромбогенных функционально полноценных сосудов, которые оставались интактными на протяжении 120 дней, в проти воположность тому, что в сосудистых протезах без эндоте лиальной выстилки формировались тромбы. Сократимость и кислород зависимая релаксация, измеряемые через 120 дней in vivo, были сходными с таковыми в нормальных артериях. Эти данные свидетельствуют о том, что предва рительная выстилка сосудистых протезов эндотелием из выделенных ПЭ и ЦЭК облегчает ремоделирование in vivo, способствует формированию нетромбогенных эндотелизи рованных поверхностей.

Клинические осложнения, связанные

с лечением стволовыми клетками

Внутривенное введение проангиогенных ПЭ и ЦЭК и ГСК может иметь неблагоприятные эффекты. Ряд исследований показали, что у мышей с гиперхолестеринемией, VEGF А и иммунокомпетентные клетки могут ускорять образование атероматозных бляшек посредством мобилизации ПЭ и мо ноцитов [96, 97]. Избежать этих потенциальных осложнений можно путем введения ПЭ, ЦЭК, ГСК и гематопоэтических прогениторных клеток непосредственно в места повреж дения ткани, избегая нежелательного заселения клетками других мест.

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, № 3, 2007

Обзоры

Что является более предпочтительным внутрисосудистое или внутримышечное введение стволовых клеток?

Путь введения СК оказывает важное влияние на васку ляризацию тканей. Экспрессия молекул матрикса и адгезия к поврежденными тканями обеспечивают захват рецепто рами мобилизованных ЦЭК, ГСК и гемопоэтических проге ниторных клеток при их внутрисосудистом введении.

В настоящее время установлено, что после поврежде ния сосудистой стенки ПЭ спонтанно поступают в кровоток [98 100]. Возникает вопрос, почему мобилизация этих кле ток автоматически не восстанавливает реваскуляризацию тканей и почему необходимо введение этих клеток инъек ционным методом? Это объясняется тем, что ПЭ не дости гают той степени дифференцировки, которая обеспечивает их внедрение в ишемизированную ткань. Альтернативным объяснением является то, что недостаточность кровотока в ишемизированной ткани мешает этим клеткам распознать поврежденные сосуды. Непосредственное введение ПЭ в зону повреждения позволяет обойти эти препятствия.

Генетическая модификация используемых факторов улучшает выживаемость и прикрепление сосудистых кле ток. Выживаемость сосудистых клеток во время движения их к зоне повреждения является важным для внедрения кле ток в ткань мишень. Например, введение теломеразы гена обратной транскриптазы может увеличивать репликативный и восстановительный потенциал ПЭ [101].

Результаты исследования стволовых клеток могут ока зывать существенное влияние на жизнь миллионов людей во всем мире. Осознание того, что стволовые клетки откры вают новые подходы к терапии многих заболеваний, требу ет от нас более детального изучения потенциала стволовых клеток. Данные о биологии стволовых клеток стимулируют биомедицинское сообщество применять эти находки для кли нического применения. Стволовые клетки можно использовать для прямой трансплантации или для тканевой инженерии в комбинации с биоматериалами. Рассматривается возмож ность применения стволовых клеток для генной терапии в качестве средств доставки генов или генетических продук тов к поврежденным тканям.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Савельев B.C., Кошкин В.М. Критическая ишемия нижних конечно стей. М.: Медицина; 1997.

2. Second European Consensus Document on chronic critical leg ischemia. Circ. 1999; 84[IV): 1 26.

3. Dormandly J.A., Rotherford R.B. Management of peripheral arterial dis ease. TASC Group. Trans Atlantic Inter Society Consensus. J. Vase. Surg. 2000; 31: 1 296.

4. Смолянинов А.Б. Современные биотехнологические центры клеточ ных и генных технологий и банки стволовых клеток. Технология чистоты 2006; 1:45.

5. Смолянинов А.Б., Жарова Е.В., Козлова К.Л., Кириллова Д.А. Осно вы клеточной и генной терапии сердечно сосудистых заболеваний. М.; 2005.

6. Baumgartner I., Schainfeld R., Graziani L. Management of peripheral vascular disease. An. Rev. Med. 2005; 56: 249 72.

7. Vascular Society of Great Britain and Ireland. B. J. Surg. 2007; 94: issue 2:1 13.

8. Emmerich J. Current state and perspective on medical treatment of critical leg ischemia: Gene and cell therapy. Int. J. of Lower Extremity Wounds 2005; 4: 234 41.

9. Dorros G., Jaff M.R., Dorros A.M. et al. Tibioperoneal [outflow lesion) angioplasty can be used as primary treatment in 235 patients with critical limb is chemia: five year follow up. Circ. 2001; 104: 2057 62.

10. Kudo T., Chandra F.A., Ahn S.S. The effectiveness of percutaneous transluminal angioplasty for the treatment of critical limb ischemia: a 10 year ex perience. J. Vase. Surg. 2005; 41: 423 35.

11. Faglia E., Dalla Paola L, Clerici G. et al. Peripheral angioplasty as the first choice revascularization procedure in diabetic patients with critical limb is chemia prospective study of 993 consecutive patients hospitalized and followed between 1999 and 2003. Eur. J. Vase. Endovasc. Surg. 2005; 29: 620 7.

1 2. Leng G.C., Davis М., Baker D. Bypass surgery for chronic lower limb ischemia. Cochrane Database Syst. Rev. 2000; CD 0020000.

1 3. Бураковский В.И., Бокерия Л.А. Сердечно сосудистая хирургия. М.: Медицина; 1989.

14. Schainfeld R.M., Isner J.M. Critical limb ischemia: nothing to give at the office? An. Intern. Med. 1999; 130: 442 4.

1 5. Казьмин З.В. Комплексное хирургическое и консервативное лече ние хронической критической ишемии при отсутствии условий прямой рева скуляризации нижних конечностей. Автореф. дисс.... канд. мед. наук. М., 2006.

16. Gavrilenko A.V. Current possibilities of the reconstructive vascular surgery and the outlooks for using genetic engineering in critical ischemia of the lower extremities. Vestn. Ross. Akad. Med. Nauk 2003; [12): 74 7.

1 7. Nishikawa S.I., Nishikawa S., Hirashima M. et al. Progressive lineage analysis by cell sorting and culture identifies FLKi-VE cadherini- cells at a diverg ing point of endothelial and hemopoietic lineages. Dev. 1998; 125: 1747 57.

1 8. Gehling U.M., Ergun S., Schumacher (J. et al. In vitro differentiation of endothelial cells from AC133 positive progenitor cells. Blood 2000; 95: 3106 12.

19. Asahara T., Murohara T., Sullivan A. et al. Isolation of putative progeni tor endothelial cells for angiogenesis. Science 1997; 275: 964 7.

20. Folkman J. Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other dis ease. Nat. Med. 1995; 1: 27 31.

21. Asahara T., Masuda H., Takahashi T. et al. Bone marrow origin of endo thelial progenitor cells responsible for postnatal vasculogenesis in physiological and pathological neovascularization. Circ. Res. 1999; 85: 221 8.

22. Reyes М., Dudek A., Jahagirdar B. et al. Origin of endothelial progeni tors in human postnatal bone marrow. J. Clin. Invest. 2002; 109: 337 46.

23. Isner J.M., Pieczek A., Schainfeld R. et al. Clinical evidence of angio genesis after arterial gene transfer of phVEGFI 65 in patient with ischaemic limb. Lancet 1996; 348: 3704.

24. Pearlman J.D., Flibberd M.G., Chuang M.L et al. Magnetic resonance map ping demonstrates benefits of VEGF induced myocardial angiogenesis. Nat. Med. 1995; 1: 1085 9.

25. Baumgartner I., Pieczek A., Manor 0. et al. Constitutive expression of phVEGF165 after intramuscular gene transfer promotes collateral vessel de velopment in patients with critical limb ischemia. Circ. 1998; 97: 1114 23.

26. Folkman J. Therapeutic angiogenesis in ischemic limbs. Circ. 1998; 97: 1108 10.

27. Flanahan D., Folkman J. Patterns and emerging mechanisms of the an giogenic switch during tumorogenesis. Cell 1996; 86: 353 64.

28. Risau W. Mechanisms of angiogenesis. Nature 1997; 386: 671 4.

29. Yancopoulos G.D., Davis S., Gale N.W. et al. Vascular specific growth factors and blood vessel formation. Nature 2000; 407: 242 8.

30. Carmeliet P., Jain R.K. Angiogenesis in cancer and other diseases. Na ture 2000; 407: 249 57.

31. Pepper M.S. Manipulating angiogenesis. From basic science to the bed side. Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 1997; 17: 605 19.

32. Majka S.M., Jackson K.A, Kienstra K.A et al. Distinct progenitor popu lations in skeletal muscle are bone marrow derived and exhibit different cell fates during vascular regeneration. J. Clin. Invest. 2000; 111:71 9.

33. Asahara T., Masuda H., Takahashi T. et al. Bone marrow origin of endo thelial progenitor cells responsible for postnatal vasculogenesis in physiological and pathological neovascularization. Circ. Res. 1999; 85: 221 8.

34. Asahara T., Takahashi T., Masuda H. et al. VEGF contributes to postna tal neovascularization by mobilizing bone marrow derived endothelial progenitor cells. EMBO J. 1999; 18: 3964 72.

35. Iwaguro H., Yamaguchi J., Kalka C. et al. Endothelial progenitor cell vascular endothelial growth factor gene transfer for vascular regeneration. Circ. 2002; 105: 732 8.

36. Kalka C., Masuda H., Takahashi T. et al. Transplantation of ex vivo ex panded endothelial progenitor cells for therapeutic neovascularization. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2002; 97: 3422 7.

37. Schatteman G.C., Flanlon H.D., Jiao, C. et al. Blood derived angioblasts accelerate blood flow restoration in diabetic mice. J. Clin. Invest. 2000; 106: 571 8.

38. Crosby J.R., Kaminski W.E., Schatteman G. et al. Endothelial cells of hematopoietic origin make a significant contribution to adult blood vessel forma tion. Circ. Res. 2000; 87: 728 30.

39. Takahashi T., Kalka C., Masuda H. et al. Ischemia and cytokine induced mo bilization of bone marrow derived endothelial progenitor cells for neovascularization. Nat. Med. 1 999; 5: 434 8.

40. Luttun A., Carmeliet G., Carmeliet, P. Vascular progenitors: from biol ogy to treatment. Trends Cardiovasc. Med. 2002; 12: 88 96.

41. Rafii S. Circulating endothelial precursors: mystery, reality, and promise. J. Clin. Invest. 2000; 105: 17 9.

42. Shi Q., Rafii S., Wu M.FI. et al. Evidence for circulating bone marrow derived endothelial cells. Blood 1998; 92: 362 7.

43. Bhattacharya V., McSweeney P.A., Shi Q. et al. Enhanced endotheliali zation and microvessel formation in polyester grafts seeded with CD34-!- bone marrow cells. Blood 2000; 95: 581 5.

44. Kaushal S., Amiel G.E., Guleserian K.J. et al. Functional small diameter neovessels created using endothelial progenitr cells expanded ex vivo. Nat. Med. 2001; 7: 1035 40.

45. Noishiki Y, Tomizawa Y., Yamane Y, Matsumoto A. Autocrine angiogenic vascular prosthesis with bone marrow transplantation. Nat. Med. 1996; 2: 90 3.

46. Sata M., Saiura A., Kunisato A. et al. Hematopoietic stem cells differen tiate into vascular cells that participate in the pathogenesis of atherosclerosis. Nat. Med. 2002; 8: 403 9.

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, № 3, 2007

Обзоры

47. Young P.P., Hofling A.A., Sands M.S. VEGF increases engraftment of bone marrow derived endothelial progenitor cells [EPCs) into vasculature of new born murine recipients. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2002; 99: 11951 6.

48. Lyden D., Flattori K., Dias S. et al. Impaired recruitment of bone marrow derived endothelial and hematopoietic precursor cells blocks tumor angio genesis and growth. Nat. Med. 2001; 7: 1194 201.

49. Moore M.A. Putting the neo into neoangiogenesis. J. Clin. Invest. 2002; 109: 313 5.

50. Gehling U.M., Ergun S., Schumacher U. et al. In vitro differentiation of endothelial cells from AC133 positive progenitor cells. Blood 2000; 95: 3106 12.

51. Marchetti S., Gimond C., Iljin K. et al. Endothelial cells genetically se lected from differentiating mouse embryonic stem cells incorporate at sites of ne ovascularization in vivo. J. Cell. Sci. 2002; 115: 2075 85.

52. Davidoff A.M., Ng C.Y., Brown P. et al. Bone marrow derived cells contribute to tumor neovasculature and, when modified to express an angiogenesis inhibitor, can restrict tumor growth in mice. Clin. Cancer Res. 2001; 7: 2870 9.

53. Isner J.M. Myocardial gene therapy. Nature 2002; 415: 234 9.

54. Khurana R., Simons M. Insights from angiogenesis trials using fibroblast growth factor for advanced arteriosclerotic disease. Trends Cardiovasc. Med. 2003; 13: 116 22.

55. Cao R., Brakenhielm E., Pawliuk R. et al. Angiogenic synergism, vascu lar stability and improvement of hind limb ischemia by a combination of PDGF BB and FGF 2. Nat. Med. 2003; 9: 604 13.

56. Carmeliet P. VEGF gene therapy: stimulating angiogenesis or angioma genesis? Nat. Med. 2000; 6: 1102 3.

57. Kim S., Flan FI., Chae G. et al. Successful stem cell therapy using um bilical cord blood derived multipatent stem cells for Buerger's disease and ische mic limb disease animal model. Stem Cells 2006; 9[4): 1128 34.

58. Shintani S., Murohara T., Ikeda FI. et al. Augmentation of postnatal ne ovascularization with autologous bone marrow transplantation. Circ. 2001; 103: 897 908.

59. Finney M.R., Greco N.J., Flaynesworth S.E. et al. Direct comparison of umbilical cord blood versus bone marrow derived endothelial precursor cells in mediating neovascularization in response to vascular ischemia. Biol. Blood Mar row Transpl. 2006; 12[5): 585 93.

60. Kim D., Kim M., Joh J. Angiogenesis facilitated by autolo gous whole bone marrow stem cell transplantation for Buerger's disease. Stem Cells 2006; 24[5):

11 94 200.

61. Schatteman G.C., Dunnwald M, Jiao C. et al. Biology of bone marrow derived endothelial cell precursors. Am. J. Physiol. Fleart Circ. Physiol. 2007; 292:1 18.

62. Kinnaird T., Stabile E., Burnett M.S., Epstein S.E. Bone marrow derived cells for enhancing collateral development: Mechanisms, animal data, and initial clinical experiences. Circ. Res. 2004; 95: 354 62.

63. Miyamoto K., Kondo T., Suzuki S. et al. Molecular evaluation of endo thelial progenitor patients with ischemic limbs. Ather. Thromb. and Vase. Biology 2004; 24: 192 202.

64. Schatteman G.C., Dunnwald M., Jiao C. Biology of bone marrow derived endothelial cell precursors. Am. J. Physiol. Fleart. Circ. Physiol. 2007; 292[1): 1 18.

65. Shi Q., Bhattacharya V., Flong De Wu M., Sauvage, L.R. Utilizing granulocyte colonystimulating factor to enhance vascular graft endothelialization from circulating blood cells. Ann. Vase. Surg. 2002; 16: 314 20.

66. Jiang Y., Jahagirdar B.N., Reinhardt R.L et al. Pluripotency of mesen chymal stem cells derived from adult marrow. Nature 2002; 418: 41 9.

67. Tateishi Yuyama E, Matsubara FI, Murohara T. et al. Therapeutic an giogenesis for patients with limb ischemia by autologous transplantation of bone marrow cells: a pilot study and randomized controlled trial. Lancet 2002; 360:427 35.

68. Higashi Y., Kimura M, Flara K. Autologous bone marrow mononuclear cell implantation improves endothelium dependent vasodilatation in patients with limb ischemia. Circ. 2004; 109: 1215 18.

69. Saigawa T., Kato K, Ozawa T. et al. Clinical application of bone marrow implantation in patients with arteriosclerosis obliterans, and the associa tion between efficacy and the number of implanted bone marrow cells. Circ. J. 2004; 68: 1189 93.

70. Iba 0., Matsubara FI, Nozawa Y. et al. Angiogenesis is by implantation of peripheral blood mononuclear cells and platelets into ischemic limbs. Circ. 2002; 106: 2019 25.

71. Dzau V.J, Braun Dullaeus R.C, Sedding D.G. Vascular proliferation and atherosclerosis: New perspectives and therapeutic strategies. Nat. Med. 2002; 8: 1249 56.

72. Ribatti D, Vacca A, Roncali L, Dammacco, F. Flematopoiesis and an giogenesis: a link between two apparently independent processes. J. Flematother. Stem Cell Res. 2000; 9:13 9.

73. Flattori K, Dias S, Fleissig B. et al. Vascular endothelial growth factor and an giopoietin 1 stimulate postnatal hematopoiesis by recruitment of vasculogenic and hematopoietic stem cells. J. Exp. Med. 2001; 93: 1005 14.

74. Al Khaldi A., Al Sabti FI., Galipeau J., Lachapelle K. Therapeutic angiogene sis using autologous bone marrow stromal cells: improved blood flow in a chronic limb ischemia model // Ann. Thorac. Surg. 2003; 75[1): 204 9.

75. Pesce M, Orlandi A, lachininoto M.G. etal. Myoendothelial Differen tiation of Fluman Umbilical Cord Blood Derived Stem Cells in Ischemic Limb Tis sues. Circ. Res. 2003; 93: e51 62.

76. Nakagami FI, Maeda K, Morishita R. Novel autologous cell Therapy in Ischemic Limb Disease Through Growth Factor Secretion by Cultured Adipose Tissue Derived Stromal Cells. Arterioscler. Thromb. and Vase. Biol. 2005; 25: 2542.

77. Esato K., Flamano K, Li T.S. et al. Neovascularization induced by autologous bone cells implantation in peripheral arterial disease. Cell Transpl. 2002; 11 [8): 747 52.

78. Fluang P.P., Li S.Z, Flan M.Z. et al. Autologous transplantation of pe ripheral blood stem cells as an effective therapeutic approach for severe arterio sclerosis obliterans of lower extremities. Thromb. Flaemost. 2004; 91: 606 9.

79. Van Royen N, Schirmer S.H, Atasever B. etal. START Trial: a pilot study on stimulation of arteriogenesis using subcutaneous application of granule cyte macrophage colony stimulating factor as a new treatment for peripheral vas cular disease. Circ. 2005; 112: 104049.

80. Miyamoto K, Nishigami K, Nagaya N. et al. Unblinded pilot study of autologous transplantation of bone marrow mononuclears in patients with throm boangiitis obliterans. Circ. 2006; 114: 2679 84.

81. Yoon Y.S, Murayama T, Gravereaux E. et al. VEGF C gene therapy augments postnatal lymphangiogenesis and ameliorates secondary lymphedema. J. Clin. Invest. 2003; 111: 717 25.

82. Saaristo A, Karkkainen M.J, Alitalo K. Insights into the molecular pathogenesis and targeted treatment of lymphedema. An. NY Acad. Sci. 2002; 979: 94 110.

83. Szuba A, Skobe M, Karkkainen M.J. et al. Therapeutic lymphangio genesis with human recombinant VEGF. C. FASEB J. 2002; 16: 198587.

84. Sata M, Saiura A, Kunisato A. et al. Flematopoietic stem cells differen tiate into vascular cells that participate in the pathogenesis of atherosclerosis. Nat. Med. 2002; 8: 403 9.

85. Caplice N.M., Bunch T.J, Stalboerger P.G. et al. Smooth muscle cells in human coronary atherosclerosis can originate from cells administered at marrow transplantation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2003; 100: 4754 59.

86. Hill J.M, Zalos G, Halcox J.P. et al. Circulating endothelial progenitor cells, vascular function, and cardiovascular risk. N. Engl. J. Med. 2003; 348: 593 600.

87. Hillebrands J.L, Klatter FA, van Dijk W.D, Rozing J. Bone marrow does not contribute substantially to endothelial cell replacement in transplant arte riosclerosis. Nat. Med. 2002; 8: 194 5.

88. Wagers A.J, Sherwood R.I., Christensen J.L, Weissman I.L. Little evi dence for developmental plasticity of adult hematopoietic stem cells. Science 2002; 297: 2256 59.

89. Rehman J, Li J, Orschell C.M, March K.L Peripheral blood endothe lial progenitor cells are derived from monocyte/macrophages and secrete angio genic growth factors. Circ. 2003; 107: 1164 69.

90. Solovey A.N, Gui L, Chang L. et al. Identification and functional as sessment of endothelial P1H12. J. Lab. Clin. Med. 2001; 138: 322 31.

91. Peichev M, Naiyer A.J, Pereira D. et al. Expression of VEGFR 2 and AC133 by circulating human CD34[i-) cells identifies a population of functional endothelial precursors. Blood 2000; 95: 952 8.

92. Hillebrands J.L, Klatter FA, Rozing J. Origin of vascular smooth mus cle cells and the role of circulating stem cells in transplant arteriosclerosis. Arte rioscler. Thromb. Vase. Biol. 2003; 23: 380 7.

93. Shimizu K, Sugiyama S, Aikawa M.et al. Host bone marrow cells are a source of donor intimal smoothmusclelike cells in murine aortic transplant arte riopathy. Nat. Med. 2001; 7: 738 41.

94. Hu Y. Davison F, Ludewig B. et al. Smooth muscle cells in transplant atherosclerotic lesions are originated from recipients, but not bone marrow pro genitor cells. Circ. 2002; 106: 1834 9.

95. Noishiki Y, Tomizawa Y, Yamane Y, Matsumoto A. Autocrine angio genic vascular prosthesis with bone marrow transplantation. Nat. Med. 1996; 2: 90 3.

96. Celletti F.L, Waugh J.M, Amabile P.G. et al. Vascular endothelial growth factor enhances atherosclerotic plague progression. Nat. Med. 2001; 1:425 9.

97. Van Royen N, Hoefer I, Bottinger M. et al. Local monocyte chemoattractant protein 1 therapy in creases collateral artery formation in apolipoprotein E deficient mice but in duces systemic monocytic CD11 b expression, neointimal formation, and plague progression. Circ. Res. 2003; 92: 218 25.

98. Gill M, Dias S, Hattori K. et al. Vascular trauma induces rapid but tran sient mobilization of VEGFR2[i-) AC133[i) endothelial precursor cells. Circ. Res. 2001; 88: 167 74.

99. Vasa M, Fichtlscherer S, Adler K. et al. Increase in circulating endothe lial progenitor cells by statin therapy in patients with stable coronary artery disease. Circ. 2001; 103: 2885 90.

100. Shintani S, Murohara T, Ikeda H. et al. Mobilization of endothelial progenitor cells in patients with acute myocardial infarction. Circ. 2001; 103: 2776 79.

101. Murasawa S, Llevadot J, Silver M.et al. Constitutive human telom erase reverse transcriptase expression enhances regenerative properties of endothe lial progenitor cells. Circ. 2002; 106: 1133 9.

Поступила 23.04,2007

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, № 3, 2007