Частота генетических маркеров фолатного цикла у новорожденных с задержкой внутриутробного развития

Частота генетических маркеров фолатного цикла у новорожденных с задержкой внутриутробного развития

А.Н. Ни, Т.Ю. Фадеева, Т.Г. Васильева, С.Н. Шишацкая

ГБОУ ВПО «Тихоокеанский государственный медицинский университет»; ГАУЗ «Краевой клинический центр специализированных видов медицинской помощи», Владивосток

The frequency of genetic markers of the folate cycle in newborns with intrauterine growth retardation

A.N. Ni, T.Yu. Fadeeva, T.G. Vasilyeva, S.N. Shishatskaya

Pacific State Medical University, Vladivostok; Regional Clinical Center of Specialized Medical Care, Vladivostok

Представлены результаты исследования частоты генетических маркеров фолатного цикла у 24 новорожденных с гипотро-фическим, гипопластическим типами задержки внутриутробного развития. Изучены полиморфные системы гена метилен-тетрагидрофолатредуктазы MTHFR С677С, С677Т, Т677Т гена метионинсинтазы MTR А2756А, A2756G, G2756G; гена метионинсинтазы-редуктазы MTRR G66G, G66A, А66А. В результате проведенного анализа была установлена ассоциация возникновения задержки внутриутробного развития у новорожденных с полиморфизмом Т677Т гена MTHFR, G2756G гена MTR и A66A гена MTRR, особенно это актуально при гипотрофическом варианте задержки развития плода и у мальчиков. Выявление групп риска, проведение генетического анализа обмена фолиевой кислоты позволяют подобрать эффективный комплекс профилактики задержки внутриутробного развития.

Ключевые слова: плод, новорожденный, задержка внутриутробного развития, гены MTHFR, MTR, MTRR, фолатный цикл.

The article presents the results of an investigation of the frequency of genetic markers of the folate cycle in 24 neonates with the hypotrophic or hypoplastic types of intrauterine growth retardation (IUGR). The investigators examined the polymorphisms of the methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) gene, such as S677S, C677T, and T677T, the methionine synthase (MTR) gene, such as A2756A, A2756G, and G2756G, and the methionine synthase reductase (MTRR) gene, such as G66G, G66A, and A66A. The analysis established an association of the occurrence of IUGR in neonates with MTHFR T677T, MTR G2756G, and MTRR A66A polymorphisms; this is especially relevant in the hypotrophic type of IUGR and in boys. Identification of risk groups and genetic analysis of folic acid metabolism allow the choice of an effective package of measures to prevent IUGR.

Key words: fetus, newborn, intrauterine growth retardation, MTHFR, MTR, MTRR genes, folate cycle.

Задержка внутриутробного развития плода является объективным критерием неблагоприятного течения беременности, процесса созревания различных органов и систем, функциональных, адаптационных возможностей детского организма в раннем неонатальном периоде, в процессе роста и развития ребенка в последующие годы. Задержка внутриутробного развития плода формируется под воздействием многочисленных факторов: материнских, плацентарных, социально-биологических, генетических [1]. Несмотря на активизацию исследований в данной области, внедрение современных методов пренатальной диагностики, частота задержки внутриутробного развития плода остается высокой. Особенно актуальна эта проблема в Дальневосточном федеральном округе, где ее частота превышает средние показатели по стране в 1,5—2 раза [2, 3]. Доказана важ-

© Коллектив авторов, 2015

Ros Vestn Perinatol Pediat 2015; 3:63-66

Адрес для корреспонденции: Ни Антонина Николаевна — д.м.н., проф. кафедры педиатрии, иммунологии и аллергологии Тихоокеанского государственного медицинского университета Фадеева Татьяна Юрьевна — асп. той же кафедры Шишацкая Светлана Николаевна — к.м.н., доц. той же кафедры Васильева Татьяна Геннадьевна — д.м.н., зав. Краевой детской консультативной поликлиникой Краевого клинического центра специализированных видов медицинской помощи 690002 Владивосток, пр. Острякова, д. 2

ная роль в формировании плода нугритивного статуса, уровня обеспеченности отдельными микро- и макроэлементами [4, 5]. При этом подчеркивается особая роль фолиевой кислоты, которая участвует в качестве кофактора в большом количестве клеточных реакций, в их делении, в синтезе нуклеиновых кислот, ДНК. Дефицит фолиевой кислоты ассоциирован с невынашиванием беременности, формированием врожденных пороков развития нервной системы у плода, макроцитарной анемии, гипотрофии у детей, задержки их психомоторного развития [6—8]. Биохимические, клеточные эффекты фолиевой кислоты осуществляются через каскад генетически детерминированных ферментативных реакций, роль которых в формировании задержки внутриутробного развития плода изучена недостаточно [9].

Цель исследования — обосновать патогенетические подходы к диагностике задержки внутриутробного развития плода на основе изучения отдельных аспектов нарушения фолатного обмена у детей.

Характеристика детей и методы исследования

Обследованы 24 новорожденных с задержкой внутриутробного развития (основная группа исследования). Диагноз задержки внутриутробного развития поставлен на основании сопоставления клинико-анамнестических данных с показателями биофизи-

ческого профиля плода в динамике прогрессирова-ния беременности [10, 11]. При этом использовались данные ультразвукового исследования: фетометрии, плацентографии, определения физиологических параметров, включающего в себя регистрацию дыхательных движений, двигательной активности, тонуса плода, определение количества околоплодных вод (ультразвуковой аппарат Aloca 1700 с конвексным абдоминальным трансдьюсером 3,5 МГц, оснащенный акушерской программой). У новорожденных форму задержки внутриутробного развития диагностировали (дополнительно) по данным соматометрии в сравнении с долженствующими параметрами для гестаци-онного возраста с использованием соответствующих центильных таблиц. Гипопластический вариант (равномерное отставание плода в длине и массе тела с первых недель гестации) был выявлен у 8 детей. Ги-потрофический (снижение массы при нормальной длине тела) — у 16 новорожденных.

У всех пациентов исследовали генотип фолатного цикла. Геномную ДНК выделяли из лимфоцитов пу-повинной крови стандартным методом при помощи протеиназы К с последующей фенольной экстракцией и осаждением этанолом. Анализ полиморфных вариантов специфических участков генома проводился с использованием методов полимеразной цепной реакции и анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов [12, 13]. Полученные данные сравнивали с аналогичными показателями здоровых новорожденных (контрольная группа), прошедших обследование в ГУ «НИИ медицинской генетики» ТНЦСО РАМН Томска [14]. Были изучены полиморфные системы гена MTHFR (метилентетрагидрофолатредуктаза): С677С, С677Т, Т677Т; гена MTR (метионинсинтаза): А2756А, A2756G, G2756G; гена MTRR (метионинсин-таза-редуктаза): G66G, G66A, А66А.

Оценку полученных результатов и комплексный анализ данных проводили методом вариационной статистики с вычислением средней арифметической (M), ее ошибки (m), доверительного коэффи-

циента Стьюдента (t) при заданном уровне значимости (p) и степени достоверности. Сравнительный анализ изучаемых показателей в разных группах проводился с использованием непараметрического метода Фишера. Статистическую обработку материала выполняли с помощью специализированных пакетов прикладных программ для исследований Excel 2003 и Statstica 6.0 for Windows [15]. Различия для всех видов анализа считали статистически значимыми при p<0,05.

Результаты и обсуждение

При проведении генетического исследования была установлена вариабельность частоты генов фолатного цикла у новорожденных с задержкой внутриутробного развития (см. таблицу). В структуре полиморфизмов гена MTHFR превалировал с гетерозиготный генотип изученного полиморфизма С677Т - 62,5%. Сочетание С677С и Т677Т составило соответственно 25 и 12,5%. При сравнительном анализе с показателями контрольной группы выявлено, что при задержке внутриутробного развития чаще, чем у здоровых новорожденных, регистрировались генотипы СТ (p<0,001), ТТ (p<0,05), но реже - СС (p<0,001). Частота аллелей гена MTHFR различалась в группах пациентов. Новорожденные с задержкой физического развития в 1,3 раза реже имели аллель 677С, чем пациенты контрольной группы (56,25 и 72,3% соответственно; p<0,01), но при задержке внутриутробного развития в 1,6 раза чаще выявляли мутацию 677Т (43,7 и 27,7% соответственно; p<0,01).

Частота генотипов MTR у новорожденных основной группы распределилась следующим образом. А2756А - 54,2%, A2756G - 37,5%, G2756G - 8,3% в контроле - соответственно 58,3% (p>0,05), 38% (p>0,05), 3,7% (p<0,05). Распространенность аллелей MTR была практически одинаковой во всех группах исследования. При задержке внутриутробного развития аллель 2756А составил 72,9% (у здоровых детей -77,3%), 2756G - 27,05% (у здоровых - 22,7%).

Частота генотипов и аллелей генов фолатного цикла у новорожденных

Новорожденные, n= 300

MTHFR MTR MTRR

Генотипы CC CT TT AA AG GG GG GA AA

52,0 40,7 7,3 58,3 38,0 3,7 30,0 52,3 17,73

Частота аллеля (гена) С= Т= =72,3 =27,7 А=77,3 G=22,7 G=56,2 А=43,8

Новорожденные с задержкой внутриутробного развития плода, n= =24

MTHFR MTR MTRR

Генотипы CC CT TT AA AG GG GG GA AA

25,0 62,5 12,5 54,2 37,5 8,3 17,4 47,8 34,8

Частота аллеля (гена) С= Т= 56,25 43,75 А=72,95 G=27,05 G=41,3 А=58,7

Ни А.Н. и соавт. Частота генетических маркеров фолатного цикла у новорожденных с задержкой внутриутробного развития

Были получены достоверные различия в частоте генотипов гена MTRR в группах сравнения. Так, G66G выявлялись у 17,4% детей с признаками задержки внутриутробного развития (в контроле — 30,0%; p<0,05), G66A — у 47,8% новорожденных основной группы (против 52,3%; p>0,05), A66A -34,8% (против 17,7%; p<0,001). При этом отмечено увеличение частоты му-тантного аллеля 66А у новорожденных с синдромом задержки внутриутробного развития по сравнению с контролем (p<0,05).

При оценке влияния полиморфизма генов фолат-ного обмена на развитие вариантов задержки внутриутробного развития плода отмечена более высокая частота встречаемости полиморфизма С677Т гена MTHFR (52,4%), A2756G гена MTR (28,6%), А66А гена MTRR (30%) у новорожденных с гипотрофи-ческим вариантом задержки развития. Кроме того, полиморфный вариант С677Т гена MTHFR(42,6%), A2756G гена MTR (23,8%), А66А гена MTRR (35%) чаще диагностировался у новорожденных мужского пола. Корреляционный анализ установил влияние изучаемых полиморфизмов на частоту формирования задержки внутриутробного развития и степень ее тяжести. При этом были выявлены соответствующие корреляции относительно полиморфизма 677Т гена MTHFR (r=+0,62; r=+0,54; p<0,05 соответственно); А66Агена MTRR (r=+0,34; r=+0,36;p<0,05).

В результате проведенного анализа была установлена ассоциация возникновения задержки внутриутробного развития у новорожденных с полиморфизмом Т677Т гена MTHFR, G2756G гена MTR и A66A гена MTRR, особенно это актуально при гипотрофи-ческом варианте задержки внутриутробного развития и у мальчиков. По данным проведенных ранее исследований, было выявлено, что полиморфизм 677Т гена MTHFR связан с дефектами развития плода [6,14]. Наличие гомозиготной формы 677Т/Т приводит к почти десятикратному повышению риска высокого

уровня в крови гомоцистеина, дающего фетотоксиче-ский, тератогенный эффект. Аллель 2757G гена MTR ассоциирован с риском фетопланцентарной недостаточности, нарушения белкового обмена у плода, формированием хромосомных аномалий. Патологический полиморфизм гена MTRR приводит к нарушению процесса метилирования ДНК и синтеза нуклеиновых кислот [16]. Особенно негативный эффект всех указанных изменений генотипов проявляется у детей при наличии дефицита витамина В12, при ассоциации изученных полиморфизмов [17].

Выводы

При задержке внутриутробного развития у новорожденных отмечается более высокая частота полиморфизмов С677Т (62,5%), Т677Т (12,5%) гена MTHFR, G2756G (8,3%) гена MTR, А66А (34,8%) гена MTRR относительно здоровых детей.

Установлено наиболее выраженное влияние на формирование задержки внутриутробного развития биохимических механизмов, контролируемых генами MTHFR и MTRR. При этом установлены корреляции средней (677Т гена MTHFR) и умеренной силы (А66А гена MTRR) между распространенностью полиморфизма и частотой формирования задержки внутриутробного развития, степенью ее тяжести.

Определение полиморфизмов С677Т гена MTHFR, A2756G гена MTR, А66А гена MTRR может являться дополнительным критерием диагностики задержки внутриутробного развития плода, ее клинического типа, обоснования патогенетических подходов в проведении превентивных и лечебных мероприятий.

Работа выполнена в рамках Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007—2012 гг.» при поддержке гранта по Госконтракту № 16.512.11.2072.

ЛИТЕРАТУРА

1. Шабалов Н.П. Основы перинатологии. М: МЕДпресс-информ 2002; 312.

2. Сенькевич О.А. Микроэлементный дисбаланс в формировании патологии маловесных новорожденных на Дальнем востоке: Автореф. дисс. ... д-ра мед. наук. Хабаровск 2009; 28.

3. Артемьева Е.К., Сетко Н.П., Сапрыкин В.Б., Веккер И.Р. Концентрация микроэлементов в системе «мать-плацента—плод» на территорях с различным уровнем антропогенной нагрузки. Микроэлементозы в медицине. М: КМК 2004; 5: 4: 1—3. (Artemyev E.K., Setko N.P., Saprykin V.B., \fekker I.R. The concentration of trace elements in the «mother-placenta-fetus» in the territory with different levels of anthropogenic load. Microelementoses in medicine. Moscow: KMK 2004; 5: 4: 1—3).

4. Громова О.А. Критерии выбора витаминных и минеральных препаратов. Здравоохранение Урала 2003; 6: 24: 49—53.

5. Kugelman A., Reichman B. Postdischarge infant mortality among very low birth weight infants: a population — based study. Pediatrics 2007; 120: 4: 788—794.

6. Вахарловский В.Г., Воронин Д.В., Соколов К.А. и др. Применение фолиевой кислоты для профилактики дефектов заращения нервной трубки у плода. Журн акуш и жен бол 2008; 2: 4—11.

7. Поляков А.В., Тверская С.М., Бескоровайная Т.С., Гудзен-ко С.В. Ассоциация полиморфных аллелей генов фо-латного обмена с привычным невынашиванием беременности. Пробл репрод 2006; 1: 53—60. (Polyakov A.V.,

Tverskaya S.M., Beskorovainaya T.S., Gudzenko S.V. Association of polymorphic alleles of genes of folate metabolism with habitual miscarriage. Probl reprod 2006; 1: 53—60.)

8. Доброхотова Ю.Э., Сухих Г.Т., Файзуллин Л.З. и др. Роль гипергомоцистеинемии в генезе неразвивающейся беременности и начавшегося выкидыша. Рус мед журн 2005; 13: 17: 1110-1112.

9. Деревянчук Е.Г., Машкина Е.В., Коваленко К.А. и др. Биохимические и генетические критерии фолатного метаболизма и нарушение эмбриогенеза человека. Современные проблемы науки и образования 2011; 4: www.science-education.ru/98-4738.

10. Кулаков В.И., Серов В.Н., Демидов В.Н. и др. Алгоритм пренатального мониторинга. Акуш и гин 2000; 5: 56-59.

11. Бескоровайная Т.С. Влияние некоторых генетических факторов на нарушение репродукции у человека: Авто-реф. дисс. ... канд. мед. наук. М 2005; 89.

12. Lissak A., Sharon A., Fruchter O. et al. Polymorphism for mutation of cytosine to thymine at location 677 in the methy-lenetetrahydrofolate reductase gene is associated with recurrent early fetal loss. Am J Obstet Gynecol 1999; 181: 126-130.

13. Shi M. Genotype frequencies and linkage disequilibrium in he CEPH human diversity panel for variants in folate pathway genes MTHFR, MTHFD, MTRR, RFC1, and GCP2. Birth Defects Res A Clin Mol Teratol 2003; 67: 8: 545-549.)

14. Назаренко М.С., Пузырев В.П., Лебедев И.Н. Частота полиморфизмов С677Т и А1298С гена метилентетрагидро-фолатредуктазы

15. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA. М: МедиаСфера 2006; 312.

16. Шуматова Т.А., Приходченко Н.Г., Оденбах Л.А., Ефремова И.В. Роль метилирования ДНК и состояния фолатно-го обмена в развитии патологических процессов в организме человека. Тихоокеанский мед журн 2013; 4: 39-43.

17. Фетисова И.Н., Добролюбов А.С., Липин М.А., Поляков А.В. Полиморфизм генов фолатного обмена и болезни человека. Вестник новых медицинских технологий 2007; 1: 23-28. (Fetisova I.N., Dobrolubov A.S., Lipin M.A., Polyakov A.V. Polymorphism of genes of folate metabolism and human disease. Vestnik novykh meditsinskikh tekhnologiy 2007; 1: 23-28.).

Поступила 03.03.15