Пептид, обладающий антибактериальной активностью в отношении микроорганизмов с множественной лекарственной устойчивостью
PEPTIDE WITH ANTIBACTERIAL ACTIVITY AGAINST MICROORGANISMS WITH MULTIDRUG RESISTANCE

Изобретение относится к области биохимии и может быть использовано в медицине и ветеринарии.
В настоящее время в мире наблюдается широкое распространение патогенных микроорганизмов, обладающих устойчивостью к лекарственным препаратам, в том числе одновременно к нескольким лекарственным препаратам различной химической природы и различного механизма действия. Такое явление получило название «множественная устойчивость к лекарственным препаратам» (multi-drug resistance). Растущее использование антибиотиков в медицине, ветеринарии, а также добавление антибиотиков в корма сельскохозяйственных животных, птиц и рыб на фермах способствует появлению и распространению в природе подобных микроорганизмов.
Исследования геномов микроорганизмов, обладающих множественной устойчивостью к лекарственным препаратам, показывают, что они содержат следующие детерминанты: потерю поринов внешней мембраны вследствие мутаций в соответствующих хромосомных генах, активацию выкачивающих мембранных насосных систем, вызванную теми же причинами и приобретение новых ферментов, разрушающих лекарственные препараты и кодируемых мобильными генетическими элементами, в первую очередь трансмиссибельными плазмидами [Nikado Н. Multidrug Resistance in Bacteria. Annu Rev Biochem. 2009; 78:119-146]. Лечение бактериальных инфекций, вызванных данными микроорганизмами, представляет трудную задачу для клинической медицины [Gootz T.D. The Global Problem of Antibiotic Resistance. Critical Reviews in Immunology, 2010, 30 (1): 79-93].
Ярким примером является штамм Klebsiella pneumoniae, вызвавший в 2016 г. в США смерть больной от сепсиса и оказавшийся устойчивым ко всем 26 лекарственным средствам, предписанным государственным контролирующим органом (USA Food and Drug Administration) для лечения данной инфекции [Chen L., Todd R., Kiehlbauch J., Walters M., Kallen A. Notes from the Field: Pan-Resistant New Delhi Metallo-Beta-Lactamase-Producing Klebsiella pneumoniae. CDC Morbidity and Mortality Weekly Report, 2017, 66(1): 33. doi: 10.15585/mmwr.mm6601a7].
Проблема распространения штаммов патогенных микроорганизмов с множественной лекарственной устойчивостью в России не отличается от ситуации в других странах [Эргешов А., Андреевская С.Н., Ларионова Е.Е., отражает трансмиссивность мутантных клонов. Молекулярная биология, 2017. Т. 51 №4 С. 595-602].
Таким образом, медицинская Смирнова Т.Г., Черноусова Л.Н. Спектр мутаций в генах, ассоциированных с устойчивостью к рифампицину, изониазиду и фторхинолонам, у клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis наука проигрывает борьбу с патогенными микроорганизмами, не успевая открывать и внедрять в практику здравоохранения новые лекарственные препараты, устойчивость бактерий к которым пока неизвестна.
Актуальной задачей является поиск способов лечения инфекций, вызванных микроорганизмами с множественной лекарственной устойчивостью.
Антимикробные пептиды, вырабатываемые защитными клетками высших эукариот, являются частью врожденной иммунной системы и могут служить основой для разработки новых антибиотиков. Также было предложено использование антимикробных пептидов совместно с известными антибиотиками для подавления роста бактерий с множественной лекарственной устойчивостью.
Например, предложены синтетические пептиды длиной от 10 до 14 аминокислотных остатков, с высоким содержанием аргинина [RU 2590706]. Раскрытый в данном патенте пептид RRRFRFFFRFRRR, показавший наилучшие результаты в сравнении с остальными предложенными пептидами, между тем обладал высокими минимальными ингибирующими рост грамположительных и грамотрицательных бактерий концентрациями в диапазоне от 7,8 до 62,5 мг/мл, что выше, чем минимальные ингибирующие концентрации (MIC) пептида по настоящему изобретению, исчисляемые в диапазоне 1-32 мкг/мл (0,5-32 мкМ).
Известны искусственные синтетические пептиды лексицин-1, последовательность которого IGVLKKYFKIGALIKAIIK [RU 2715854] и пептид GRFKRFRKKLKRLWHKVGPFVGPILHY [RU 2702661], обладающие антимикробным действием, однако их активность в отношении бактерий с множественной лекарственной устойчивостью не показана.
В [WO 9840401] раскрывается использование пептида индолицидина и его аналогов, полученных путем частичных замен, делеций и вставок отдельных аминокислот, замен отдельных аминокислот на их D-аналоги, химической модификации N- и С-концов молекулы, для подавления роста бактерий и преодоления устойчивости бактерий к антибиотикам. Также в данном патенте заявлено применение для указанной цели совместно с антибиотиками (ципрофлоксациллином, ванкомицином, пиперациклином, гентамицином, тобрамицином) пептида индолицидина и его аналогов, и ряда известных видов антимикробных пептидов, включая некоторые бактенецины.
Известно, что бактенецины - высококатионные пептиды гранул нейтрофилов - обладают высокой бактерицидной активностью [Gennaro R, Skerlavaj В, Romeo D. Purification, composition, and activity of two bactenecins, antibacterial peptides of bovine neutrophils. Infect Immun. 1989; 57(10): 3142-3146. doi: 10.1128/IAI.57.10.3142-3146.1989] и отличаются высоким (от 20% до 50%) содержанием пролина.
Считается, что антимикробное действие богатых пролином пептидов является результатом блокирования ими аминоацилирующего сайта бактериальных рибосом, нарушения фолдирования белков, а также, при более высоких концентрациях - разрушения бактериальных мембран. [Scocchi М., Tossi A., Gennaro R. Proline-rich antimicrobial peptides: converging to a non-lytic mechanism of action. Cell. Mol. Life Sci. 2011. 68: P. 2317-2330 doi: 10.1007/s00018-011-0721-7; 37; Mardirossian M., Grzela R., Giglione C., Meinnel Т., Gennaro R., Mergaert P., et al. The host antimicrobial peptide Bac 71-35 binds to bacterial ribosomal proteins and inhibits protein synthesis. Chem. Biol. 2014.21: 1639-1647. doi: 10.1016/j.chembiol.2014.10.009].
Между тем, ни один из предложенных природных или синтетических пептидов с антибактериальным действием до сих пор не используется в практике здравоохранения.
Цель изобретения заключается в расширении спектра пептидов, обладающих противобактериальным действием, в том числе против бактерий с множественной лекарственной устойчивостью, при низком уровне цитотоксического и гемолитического действия.
Для достижения цели настоящего изобретения была произведена модификация природного богатого пролином пептида бактенецина ChBac 3.4, обнаруженного в лейкоцитах домашней козы Capra hircus, который отличается широким спектром антимикробного действия как против грамположительных, так и грамотрицательных бактерий [Shamova О., Orlov D., Stegemann С., Czihal P., Hoffmann R., Brogden K., et al. ChBac3.4: A novel proline-rich antimicrobial peptide from goat leukocytes. Int. J. Pept. Res. Therap.2009. 15:1, P. 31-42. doi: 10.1007/s10989-009-9170-7].
Последовательность аминокислотных остатков природного пептида бактенецина ChBac 3.4, амидированного с С-конца, представлена на фиг. 1.
Для достижения цели изобретения были спроектированы, синтезированы и подвергнуты сравнительным исследованиям аналоги ChBac 3.4, отличающиеся заменами некоторых аминокислот, карбоксилированным С-концом, делециями и вставками отдельных аминокислот, а также укороченные варианты - N- и С-концевые фрагменты молекулы.
2
Последовательность аминокислот пептида RFR-ChBac3.4(1-14)-NHприведена на фиг. 2.
2
Результаты испытаний показали, что вариант синтетического пептида, названный RFR-ChBac 3.4(1-14)-NH, обладает антимикробной активностью против грамположительных и грамотрицательных бактерий, в том числе патогенных бактерий - активен как против планктонных (свободно плавающих) бактерий, так и подавляет развитие биопленок патогенными бактериями, устойчивыми к нескольким лекарственным препаратам. При этом полученный пептид не обладает выраженной токсичностью к клеткам человека.
Сравнение аминокислотных последовательностей показало отличие полученного пептида от известных пептидов с антибактериальными свойствами. Созданный пептид может быть использован для подавления роста бактерий с множественной лекарственной устойчивостью, в том числе формирующих биопленки.
2
Молекулярный дизайн синтетического пептида RFR-ChBac3.4(1-14)-NH
2
2
2
В пептиде RFR-ChBac 3.4(1-14)-NH представлен фрагмент ChBac 3.4, содержащий аминокислотные остатки с 1 по 14, а N-концевая последовательность из трех аминокислот (RFR) удвоена. С-конец пептида амидирован. Последовательность аминокислот синтетического пептида RFR-ChBac 3.4(1-14)-NH представлена в Seq ID No 1 и на фиг. 2. сравнение аминокислотных последовательностей пептидов ChBac 3.4 (верхняя последовательность) и RFR-ChBac3.4(1-14)-NH (нижняя последовательность) представлены на фиг. 3.
Молекулярная масса полученного пептида составляет 2319.8 Да, пептид имеет высокое содержание основных аминокислот, в его состав входит 7 остатков (41,18%) аргинина.
Химический синтез пептидов
2
Пептиды ChBac3.4 и ChBac3.4(1-14)-NH были получены путем твердофазного синтеза из Fmoc-аминокислот с помощью автоматического синтезатора пептидов Symphony X (Protein Technologies, США). После завершения синтеза и снятия со смолы пептид был очищен методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии ОФ-ВЭЖХ на хроматографе Beckman Gold System, колонка - Vydac С18 column, 10×250 mm, 5 μm. Чистота пептидов, по данным аналитической хроматографии составляла 96-98%. Молекулярная масса подтверждена данными масс-спектрометрического анализа MALDI TOF.
2
Свойства полученного синтетического пептида, отличающие его от исходного природного пептида - бактенецина ChBac 3.4, иллюстрируется примерами 1-5, показывающими, что пептид RFR-ChBac3.4(1-14)-NH, характеризующийся аминокислотной последовательностью Seq ID No 1, может быть использован для подавления роста бактерий, в том числе бактерий с множественной лекарственной устойчивостью.
2
Пример 1. Изучение подавления роста грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов пептидами ChBac3.4 и RFR-ChBac3.4(1-14)-NH
6
Гр(-)
Гр(+)
общ
Минимальные ингибирующие концентрации (minimal inhibiting concentrations - MIC) пептидов изучались с помощью метода серийных разведений в жидкой питательной среде (бульон Мюллера-Хинтона). Микрокамеры Терасаки для культивирования микроорганизмов предварительно обрабатывались 0,1% раствором бычьего сывороточного альбумина (БСА) для предотвращения сорбции пептидов на стенки планшета. Использовали серийные (с шагом 1:2) разведения пептидов в стерильном 10 мМ Na-фосфатном буферном растворе, рН 7,4, содержавшем 0,1% БСА, в каждую ячейку микрокамеры вносили равные объемы раствора пептида и культуры бактерий, находившихся в середине логарифмической фазе роста и содержавшей 1×10 КОЕ/мл. Конечный объем пробы составлял 10 мкл и все пробы повторялись трижды. Через 20 часов культивирования при 37°С MIC для каждого штамма бактерий определяли, как наименьшую концентрацию пептида, подавляющую рост бактерий, вычисляя ее по результатам 3-5 экспериментов. Также вычисляли среднее геометрическое значение MIC отдельно для грамотрицательных и грамположительных бактерий, обозначенные, как GMIC и GMIC и среднюю геометрическую GMIC для всех исследованных бактерий.
Использованные для испытаний штаммы бактерий представлены в таблице 1.
Результаты испытаний представлены в таблице 2.
2
общ.
Результаты, представленные в таблице 2, показывают, что в подавлении роста грамотрицательных бактерий оба пептида обладают сходной активностью, в то время как в подавлении роста грамположительных бактерий пептид RFR-ChBac3.4(1-14)-NH более активен. Показатель GMIC для синтетического пептида снижен по сравнению с показателем природного пептида.
2
Пример 2. Исследование совместного действия пептида RFR-ChBac3.4(1-14)-NH и антибиотиков, для подавления роста патогенных бактерий с множественной лекарственной устойчивостью
Данное исследование проводили в условиях, описанных в примере 2, следующим образом:
Пептид, раститрованный с шагом разведения 1:2, вносили в каждый ряд планшета-микрокамеры для культивирования бактериальных клеток, а раститрованный таким же образом антибиотик вносили в каждую колонку. Таким образом получали разнообразные сочетания концентраций пептида и антибиотика.
В первый ряд вносили только разведения пептида и в последнюю колонку - только разведения антибиотика для установления MIC каждого компонента в отдельности. После инкубации с бактериями в течение ночи по результатам учета роста бактерий в ячейках микрокамеры вычисляли фракционные концентрационные индексы подавления (fraction inhibitory concentration index - FICI) роста бактерий по формуле:
,
где [А] и [В] - концентрации А и В в комбинациях, эффективно подавляющих рост бактерий, a [MICA] и [MICB] - минимальные ингибирующие концентрации А и В при их индивидуальном использовании.
Комбинированный эффект оценивался следующим образом:
Минимальный FICI ≤ 0,5 - синергизм пептида и антибиотика (совместное действие пептида и антибиотика выше простой суммы их индивидуальных действий).
0,5 < Минимальный FICI ≤ 1,0 - аддитивность (действия пептида и антибиотика складываются)
1,0 < Минимальный FICI < 2,0 - независимое действие (один компонент действует, как если бы второй отсутствовал).
2 < Минимальный FICI - антагонизм.
[Orhan G, Bayram A, Zer Y, Balci I. Synergy tests by E test and checkerboard methods of antimicrobial combinations against Brucella melitensis. J Clin Microbiol. 2005 Jan; 43(1): 140-3. doi: 10.1128/JCM.43.1.140-143.2005.].
Исследовали действие ряда антибиотиков, краткая характеристика которых приведена в табл. 3.
Результаты представлены в таблице 4.
Результаты, изложенные в таблице 4 показывают, что для обоих пептидов в большинстве случаев характерен синергизм либо аддитивность их действия с исследованными антибиотиками.
Для обоих пептидов характерно независимое действие с оксациллином для всех исследованных штаммов бактерий и с меропенемом для E.coli ESBL 521/17. Также независимое действие пептида ChBac3.4 с меропенемом показано для K. pneumoniae ESBL 344/17.
2
2
Однако из таблицы 4 видно, что синтетический пептид RFR-ChBac-3.4(1-14)-NH обладает преимуществом по сравнению с природным пептидом ChBac3.4. Так, при совместном применении с эритромицином против A. baumannii, с меропенемом против P. aeruginosa, с офлокацином против K. pneumoniae и P. aeruginosa синтетический пептид RFR-ChBac-3.4(1-14)-NH показал синергизм действия с антибиотиками, а природный пептид ChBac3.4 - показал только аддитивность.
Пример 3. Подавление пептидом образования биопленки патогенными микроорганизмами с множественной лекарственной устойчивостью
Микробные клетки обладают способностью размножаться на различных поверхностях, образуя так называемые биопленки. Биопленки содержат плотный матрикс, защищающий находящиеся в них клетки от лекарственных веществ и эффекторов иммунной системы. Кроме того, биопленки содержат метаболически неактивные бактериальные клетки, устойчивые к действию антибиотиков.
Большинство инфекционных заболеваний человека, например, пневмония, раневые инфекции, муковисцидоз, зубной кариес и другие, вызываются пленкообразующими бактериями [Shahrour Н, Ferrer-Espada R, Dandache I,   Chokr A, Martinez-de-Tejada G. AMPsasAnti-biofilm Agents for Human Therapy and Prophylaxis. Adv Exp Med Biol. 2019; 1117:257-279. doi: 10.1007/978-981-13-3588-4_14].
Для изучения влияния пептидов на образование биопленок в ячейки культурального 96-луночного планшета вносили по 50 мкл пептида, серийно раститрованного в питательной среде. Далее в ячейки вносили равный объем ночной культуры Pseudomonas aeruginosa MDR522/17 (штамм №4 в табл. 1), либо Acinetobacter baumanii 7226/16 (штамм №2 в табл. 1), разведенной в 50 раз.
После инкубации при 37°С в течение 24 часов планшет осторожно промывали от неприкрепившихся бактерий погружением в сосуд с дистиллированной водой, после чего прикрепленные к стенкам планшета клетки и компоненты матрикса биопленки окрашивали 0,1% раствором красителя кристаллический фиолетовый в течение 10 минут, после чего планшет снова промывали, высушивали, связавшийся краситель растворяли в 30% растворе уксусной кислоты и его количество определяли спектрофотометрически.
Каждую концентрацию пептида исследовали в четырех параллельных пробах. Результаты, представленные в таблице 5, вычислены на основании трех независимых экспериментов.
2
Таким образом, синтетический пептид RFR-ChBac3.4(1-14)-NH обладает способностью к подавлению образования биопленок патогенными бактериями с множественной лекарственной устойчивостью.
2
Пример 4. Гемолитическая активность пептидов ChBac3.4 и RFR-ChBac3.4(1-14)-NH
Образцы периферической крови здоровых доноров, собранные в стандартные ЭДТА-вакутейнеры, подвергали центрифугированию при 300-х g и +4°С в течение 10 минут, после чего осадок клеток ресуспендировали в забуференном физиологическом растворе (ЗФР). Указанную процедуру повторяли еще два раза для удаления компонентов плазмы крови и следов антикоагулянта.
Конечный осадок ресуспендировали в 10 мл физраствора и 27 мкл данной суспензии вносили в каждую пробу. К пробам добавляли по 3 мкл раститрованного раствора пептида. Смеси инкубировали 30 минут при +37°С, после чего центрифугировали при 10000 g в течение 3 минут. Выход гемоглобина в супернатант измеряли спектрофотометрически при длине волны 540 нм.
Использовали два контроля: 100% лизиса эритроцитов определяли в пробах с добавлением 3 мкл 1% раствора Тритона-Х-100, 0% лизиса определяли в пробах с добавлением 3 мкл ЗФР вместо раствора пептида.
В качестве положительного контроля использовали другой вариант синтетического ChBac3.4, отличающийся двумя вставками триптофана в позициях 10 и 22 и отсутствием амидной группы на С-конце. На каждую экспериментальную точку ставили три параллельных пробы и все эксперименты проводили трижды. Процент гемолиза вычисляли по формуле
Гемолиз (%)=(А образца - А0% лизиса) / (А100% лизиса - А0% лизиса) × 100%,
где А - оптическая плотность раствора при дли длине волны 540 нм (А540 нм)
2
2
В результате было показано, что оба пептида - ChBac3.4 и RFR-ChBac3.4(1-14)-NH - в концентрациях от 0 до 64 мкМ не вызывают лизиса эритроцитов, превышающего фоновое значение, в то время как другой вариант синтетического ChBac3.4 (положительный контроль) показал 19% лизиса при концентрации 32 мкМ и 25% при концентрации 64 мкМ. Таким образом, синтетический пептид RFR-ChBac3.4(1-14)-NH не обладает гемолитической активностью.
2
Пример 5. Исследование цитотоксичности пептидов ChBac3.4 и RFR-ChBac3.4(1-14)-NH в отношении культивируемых клеток человека
4
Мононуклеарные клетки периферической крови человека, выделенные из крови здоровых доноров стандартным методом центрифугирования в градиенте фиколла и ресуспендированные в среде RPMI-1640, вносили в ячейки культурального планшета по 2×10 клеток в ячейку. Также в ячейки добавляли серийные разведения раствора пептида.
Для получения положительного контроля (100% живых клеток) в ячейку вместо пептида добавляли среду культивирования, в отрицательном контроле (0% живых клеток) среду культивирования добавляли вместо клеток.
2
Планшеты инкубировали при 37°С и 5% CO в течение ночи, после чего в ячейки добавляли раствор 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромида (МТТ) из расчета 5 мг/мл.
540
690
После 4-х часов культивирования добавляли изопропанол, закисленный при помощи 0,04 М HCl, и определяли светопоглощение при длине волны 540 нм (А). Также определяли значения А для каждой пробы, которые вычитали для выравнивания фона. Содержание выживших клеток в образцах вычисляли по формуле
обр
0%жив кл
100%жив кл
0% жив кл
Выживаемость (%)=(А - А)/(А - А) × 100%
о6р
540
690 нм
где: А - A - A образца;
100% жив клеток
540
690 нм
А - А - А положительного контроля (100% живых клеток);
0% жив кл
540
690 нм
А - А - А отрицательного контроля (0% живых клеток)
Все опыты производили трижды, используя по 3 параллельных пробы на каждую экспериментальную точку.
50
pbmc 50%
Показатель токсичности по отношению к мононуклеарным клеткам крови человека - 50% ингибирующую концентрацию (inhibitory concentration ). Значения токсичности в IC вычисляли нелинейным регрессионным анализом с использованием программы Sigma Plot 11 (Systat Software Inc., США).
pbmc
oбщ
общ
h/b
Результат деления IC 50% на GMIC (величина GМIС взята из таблицы 2) представляет собой индекс селективности (selectivity index - SI), показывающий соотношение средней концентрации пептида, разрушающей 50% мононуклеарных клеток крови человека, к среднему геометрическому значению MIC для всех испытанных микробных клеток. Результаты представлены в таблице 6.
2
2
Результаты, представленные в таблице 6, указывают на многократное превосходство пептида RFR-ChBac3.4(1-14)-NH перед пептидом ChBac3.4 по индексу селективности. При высокой и, в ряде случаев, более высокой, чем у ChBac3.4 способности к подавлению роста бактерий, пептид RFR-ChBac3.4(1-14)-NH обладает более чем в 4,3 раза сниженным цитотоксическим действием по отношению к мононуклеарным клеткам крови человека, чем пептид ChBac3.4.
Заключение.
2
Таким образом, синтетический пептид RFR-ChBac3.4(1-14)-NH, являющийся продуктом модификации природного пептида ChBac3.4 обладает явными преимуществами по сравнению с природным пептидом:
- В меньших минимальных ингибирующих концентрациях подавляет рост патогенных штаммов грамположительных бактерий: Staphylococcus aureus 1399/17, устойчивого к ампициллину, оксациллину, гентамицину, амикацину, офлоксацину, и Staphylococcus aureus MRSA (АТСС 33591), устойчивого к метициллину;
- В меньшей минимальной ингибирующей концентрации подавляет рост патогенного грамотрицательного штамма Escherichia coli 521/17, устойчивого к ампициллину, амоксициллину/клавулоновой кислоте, цефотаксиму, цефтазидиму, цефиксиму, азтреонаму, нетилмицину, ципрофлоксацину, триметоприму/сульфаметоксазолу;
- Обладает синергизмом подавления роста штаммов бактерий, устойчивых к антибиотикам при совместном применении с антибиотиками: с эритромицином против Acinetobacter baumannii 7226/16 (устойчив к имипенему, гентамицину, тобрамицину, ципрофлоксацину, триметоприму/сульфаметоксазолу), с меропенемом и офлокацином против Pseudomonas aeruginosa MDR 522/17 (устойчив к меропенему, цефтазидиму, цефиксиму, амикацину, гентамицину, нетилмицину, ципрофлоксацину, колистину), с офлокацином против Klebsiella pneumoniae ESBL 344/17 (устойчив к ампициллину и другим пенициллинам), в отличие от природного пептида ChBac3.4, который показал только аддитивность с данными антибиотиками.
2
- Цитотоксическое действие пептида RFR-ChBac3.4(1-14)-NH на мононуклеарные клетки крови человека снижено более чем в 4,3 раза по сравнению с исходным пептидом ChBac3.4.
2
Также пептид RFR-ChBac3.4(1-14)-NH способен подавлять образование биопленок патогенными микроорганизмами с множественной лекарственной устойчивостью и не обладает гемолитической активностью.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>   ФГБНУ “ИЭМ” (FSBSI “IEM”
<120>    Пептид, обладающий антибактериальной активностью в отношении
микроорганизмов с множественной лекарственной устойчивостью
<140>
<141>
<150>
<151>
<160>   1
<170>
<210>   SEQ ID No: 1
<211>    17
<212>   Аминокислотная последовательность
<213>   Искусственная последовательность
<220>
2
<223>   Аминокислотная последовательность пептида RFR-ChBac3.4(1-14)-NH
<400> 1
Arg Phe Arg Arg Phe Arg Leu Pro Phe Arg Arg Pro Pro Ile Arg Ile His-NH2
1                5                  10                  15
<---