КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ГАСТРОЭЗОФАГЕАЛЬНОЙ РЕФЛЮКСНОЙ БОЛЕЗНИ (ГЭРБ)
COMPOSITIONS FOR TREATMENT OF GASTROESOPHAGEAL REFLUX DISEASE (GERD)

Настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, нутрацевтикам, диетическим пищевым продуктам и композициям для медицинских устройств для орального введения на основе полисахаридов из кладодия Opuntia Ficus Indica, которые предназначены для предупреждения или лечения ГЭРБ (гастроэзофагеальной рефлюксной болезни), гастроэзофагита и родственных заболеваний, включающих диспепсию, эзофагит, опухоль пищевода, желудочно-кишечные нарушения, хронический фарингит, пищевод Баррета, аденокарциному пищевода, ГЭРБ-ассоциированные поражения легких, предпочтительно в комбинации с разными активными веществами, используемыми для лечения тех же заболеваний. Указанные композиции, которые, как было установлено, оказывают синергическое воздействие, позволяют использовать более низкую эффективную дозу активных веществ, улучшая их терапевтический индекс.
Уровень техники
Эзофагеальный рефлюкс является физиологическим состоянием, возникающим, в частности, у новорожденных, но, когда он преодолевает защитный механизм слизистой оболочки пищевода, могут возникнуть такие заболевания, как ГЭРБ.
ГЭРБ является часто встречающимся желудочным заболеванием, возникающим вследствие желудочного или энтерального рефлюкса в пищевод, вызывающего рефлюксный эзофагит, очень распространенное заболевание с типичным воспалением и поражениями (эрозиями и небольшими язвами) слизистой оболочки пищевода вследствие рефлюкса желудочного или энтерального сока в пищевод.
В случае ГЭРБ рефлюкс вызывает симптомы, подобные эзофагиту, но при отсутствии поражений.
Градиент давления между пищеводом и желудком обычно препятствует обратному току содержимого желудка в пищевод.
Анатомической структурой, обеспечивающей сохранение градиента давления, является нижний пищеводный сфинктер (LES), мышечное кольцо, расположенное в месте соединения пищевода с желудком, которое расслабляется во время глотания.
В физиологических условиях, когда находящиеся в желудке вещества (кислота) поднимаются в пищевод, перистальтика пищевода (сокращения мышц пищевода) толкает их обратно в желудок, при этом остатки кислоты нейтрализуются заглатываемой слюной.
ГЭРБ характеризуется одинаковым давлением в пищеводе и желудке. Такое состояние возникает вследствие:
- более низкого тонуса или отсутствия тонуса LES;
- расслабления LES при отсутствии глотания;
- недостаточной нейтрализации кислоты, вызванной вследствие анормальной перистальтикой пищевода;
- анормальной функции кардии, клапана между желудком и пищеводом, который подавляет рефлюкс содержимого желудка в пищевод в физиологических условиях.
Неполное замыкание кардии может происходить по разным причинам, таким как ожирение, курение, многочисленные беременности, тяжелые физические усилия, фармакологическое лечение или грыжа пищеводного отверстия.
Рефлюксный эзофагит в тяжелой степени может привести к сужению пищевода (стенозу) после лечения эзофагита или к предраковым поражениям (”пищевод Баррета”, аденокарцинома пищевода), вызывающим метаплазию слизистой оболочки пищевода, которая становится похожей на слизистую оболочку желудка или двенадцатиперстной кишки. У некоторых субъектов данное заболевание может быть вызвано другими факторами, такими как пониженное слюноотделение, повышенная кислотность, замедленное освобождение желудка, соли желчных кислот или рефлюкс ферментов поджелудочной железы.
Такие заболевания характеризуются изжогой (сильным загрудинным жжением), отрыжкой и срыгиванием пищи или кислоты в рот. Указанные симптомы могут быть ассоциированы с нарушениями, характерными для дыхательной системы (хронический кашель, астма, хрипота, хронический ларингит), зубов (утрата зубной эмали) или ушей (оталгия).
2
ГЭРБ и рефлюксный эзофагит, в случае рефлюкса кислоты, в настоящее время лечат 1) ингибиторами протонного насоса (PPI, например, омепразол, ланзопразол), антагонистами рецепторов Н (например, циметидин и ранитидин), которые уменьшают секрецию кислоты в желудке и, следовательно, рефлюкс; 2) прокинетическими средствами (например, метоклопрамид, домперидон, левосульпирид), которые повышают тонус клапана кардии и улучшают освобождение желудка; 3) антацидными средствами (например, бикарбонат, гидроксид магния и алюминия) и цитозащитными средствами (например, сукралфат), которые понижают кислотность желудка и защищают слизистую оболочку пищевода.
Лишь немногие лекарственные средства могут быть использованы в случае некислотной (энтеральной) регургитации.
Фармакологическое лечение подкрепляется правилами питания, положения тела и поведения, которые помогают уменьшить или предотвратить возникновение вышеуказанных симптомов. Например, рекомендуется отказаться от спиртных напитков, обильной пищи или жирной, пряной или раздражающей пищи (мята, шоколад, кофе, чай) и спать на подушке, поднятой на несколько сантиметров.
Фармакологическое лечение не воздействует на причину заболевания (неправильное функционирование кардии) и должно проводиться в течение длительных периодов времени (даже на протяжении всей жизни), так как почти у всех субъектов возникает рецидив болезни в случае прерывания лечения.
Неправильно функционирующий клапан кардии можно скорректировать при помощи хирургического лечения, которое обеспечивает полное выздоровление, но при недостаточно хорошем выполнении операции, могут возникнуть новые симптомы. Кроме того, хирургическое лечение рекомендовано молодым субъектам с хорошим состоянием здоровья и субъектам, нуждающимся в постоянном приеме больших доз лекарственных средств. Недавно д-р Гига предложил новый хирургический метод, позволяющий уменьшить ГЭРБ, но данный метод не получил широкого распространения (http://www.medwatchtoday.com/1113.htm).
Не существует четких показаний для выбора одного конкретного метода фармакологического лечения ГЭРБ или рефлюксного эзофагита: лечащие врачи обычно руководствуются личным опытом. Таким образом, выбор лечения зависит от лечащего врача и не является объективным, поэтому лечащий врач может испробовать несколько методов фармакологического лечения, прежде чем им будет выбрано лечение, лучше всего соответствующее физиологии субъекта.
2
2
Субъектам со слабыми или периодически возникающими симптомами рекомендованы антацидные средства, прокинетические средства, альгинаты и в наиболее тяжелых случаях антагонисты Н (анти-Н средства) и ингибиторы протонного насоса (PPI).
В клинической практике используют повышающие методы лечения - когда менее эффективные лекарственные средства постепенно объединяют или заменяют более эффективными лекарственными средствами с учетом симптоматики - и понижающие методы лечения - когда лечение начинают высокоэффективными лекарственными средствами, такими как ингибиторы протонного насоса, и продолжают менее эффективными лекарственными средствами (Bytzer P., Goals of therapy and guidelines for treatment success in symptomatic gastroesophageal reflux disease patients, Am. J. Gastroenterol. 2003, 98(3) Suppl: S31-S39).
PPI являются очень эффективными лекарственными средствами, но их продолжительное применение (необходимое в случае лечения рефлюксного эзофагита) вызывает серьезные побочные эффекты, связанные с длительным лечением лекарственными средствами данного класса, такие как повышенный риск перелома костей тазобедренного сустава из-за мигрирующей абсорбции кальция в результате возникновения гипохлоргидрии (Yang et al., Long term proton pomp inhibitor therapy and risk of hip fracture, JAMA 2006, 296(94):2947-2953), мышечных заболеваний, а также полимиозита и рабдомиолиза (Clark et al., Myopathy including polymyositis: a likely class adverse effect of proton pump inhibitors?, Eur. J. Clin. Pharmacol., 2006, Jun, 62(6):473-479).
Информация о разных побочных эффектах PPI была получена на основании данных контрольного исследования лекарственных средств, проведенного в Испании с 1 января по 31 декабря 2004 г., которые были представлены в публикации Salquiero et al., Safety profile of proton pump inhibitors according to the spontaneous reports of suspected adverse reactions, Int. J. Clin. Pharmacol. Ther., 2006 Nov., 44(11):548-556.
3
-
Альгинаты, обладающие физическим механизмом воздействия (гелеобразование и пенообразование при кислотном значении рН в желудке в присутствии НСО ), являются более безопасными, чем PPI, но не пригодны для лечения некислотного эзофагеального рефлюкса (Zentlin et al., An evaluation of the antireflux properties of sodium alginate by means of combined multichannel intraluminal impedance and pH-metry, Aliment Pharmacol. Ther. 2005, 21:29-34).
С учетом вышеизложенного и того, что указанные заболевания, такие как ГЭРБ, рефлюксный эзофагит и родственные заболевания (диспепсия, эзофагит, опухоль пищевода, желудочно-кишечные нарушения, хронический фарингит, пищевод Баррета, аденокарцинома пищевода, ГЭРБ-ассоциированные поражения легких), получают все более широкое распространение, весьма желательно найти безопасный и эффективный способ предупреждения и лечения таких заболеваний, позволяющий избежать одновременного прохождения субъектом разных курсов лечения для достижения эффективных результатов лечения.
Описание изобретения
Настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, нутрацевтикам, диетическим пищевым продуктам и композициям для медицинских устройств для орального введения, способным синергически взаимодействовать с активными веществами, используемыми для предупреждения и лечения кислотных и некислотных эзофагеальных рефлюксных болезней и вызываемых ими клинических осложнений. Указанные композиции содержат полисахаридный экстракт из кладодия Opuntia Ficus Indica.
Opuntia Ficus Indica (Nopal) является растением, принадлежащим к семейству Cactaceae, которое произрастает в Мексике и на юго-западе США, но широко распространено даже среди размножающейся самосевом растительности Средиземноморья.
Плоды и молодой кладодий (более нежный) с древних времен используются для питания (кладодий используется свежим, соленым, маринованным, засахаренным, в виде джема и даже в качестве фуража) или для приготовления алкогольных напитков.
В народной медицины данное растение используется разными способами: плоды, обладающие вяжущими свойствами, моряки использовали для предотвращения цинги благодаря высокому содержанию витамина С; молодой кладодий используется в качестве катаплазмы (нагретым в печи) и в качестве смягчающих веществ; нанесение измельченной массы кладодия на раны и язвы кожи является великолепным противовоспалительным, эпителизирующим и заживляющим средством. Указанное растение до сих пор является традиционным сицилийским средством, применяемым в сельской местности; отвар цветов обладает мочегонными свойствами.
Недавно было обнаружено, что: 1) плоды Opuntia Ficus Indica обладают выраженными антиоксидантными свойствами (Tesoriere et al., Supplementation with cactus pear (Opuntia Ficus-indica) fruit decreases oxidative stress in healthy humans: a comparative study with vitamin C, Am. J. Clin. Nutr. 2004 Aug; 80(2); 391-395); 2) экстракт Opuntia Ficus Indica является эффективным средством лечения похмелья (Wiese J. et al., Effect of Opuntia Ficus Indica on symptoms of the alcohol hangover, Arch Intern. Med. 2004 Jun 28; 164(12):1334-1340); 3) благодаря высокому содержанию полисахаридов, образованных главным образом полимером галактозы, арабинозы и других сахаров, кладодий Opuntia обладает способностью связывать съеденный жир и сахара (предотвращая их абсорбцию), улучшая гликолипидный обмен и устраняя нарушения обмена веществ; 4) слизь и пектины кладодия Opuntia Ficus Indica защищают желудок в экспериментальных животных моделях (Vazquez-Ramirez R. et al., Reversing gastric mucosal alterations during ethanol-induced chronic gastritis in rats by oral administration of Opuntia Ficus Indica mucilage, World J. Gastroenterol. 2006 Jul 21; 12(27):4318-4324). Тромбетта и др. (Trombetta D. and al., Effects of polysaccharides from Opuntia Ficus Indica (L.) cladodes on the healing of dermal wounds in the rat, Phytomedicine, 13 (2006) 352-358) установили, что полисахариды, экстрагированные из кладодия Opuntia Ficus Indica, оказывают заживляющее воздействие на кожу на уровне клеточного матрикса.
В настоящее время весьма неожиданно было обнаружено, что полисахариды, экстрагированные из кладодия Opuntia Ficus Indica, обладают синергическим действием с веществами, используемыми для предупреждения и лечения ГЭРБ и осложнений, вызываемых данным заболеванием.
2
Таким образом, настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, нутрацевтикам, диетическим пищевым продуктам и композициям для медицинских устройств, предназначенным для перорального введения, на основе полисахаридов, экстрагированных из кладодия Opuntia Ficus Indica, которые предпочтительно в комбинации с активными веществами пригодны для предупреждения или лечения заболеваний верхнего отдела желудочно-кишечного тракта и, в частности, ГЭРБ, рефлюксного эзофагита и родственных заболеваний (диспепсия, эзофагит, опухоль пищевода, желудочно-кишечные нарушения, хронический фарингит, пищевод Баррета, аденокарцинома пищевода, ГЭРБ-ассоциированные поражения легких). Активные вещества, используемые в комбинации с полисахаридами, экстрагированными из кладодия Opuntia Ficus Indica, включают, не ограничиваясь ими, антацидные средства, ингибиторы протонного насоса, антагонисты Н, прокинетические средства, бикарбонат натрия, альгиновую кислоту или альгинаты, хитозаны, гидроксид алюминия, карбонат кальция или магния, антиоксидантные и противовоспалительные флавоноиды, экстрагированные из растений и листьев маслины или почек Capparis Spinosa, антоцианозиды из красных апельсинов, черного риса или других природных источников, и их комбинации.
Указанные композиции позволяют уменьшить дозу фармакологически активных веществ и являются терапевтически безопасными, что особенно важно при лечении детей, беременных женщин и пожилых людей или в случае продолжительного совместного лечения нестероидными противовоспалительными лекарственными средствами (NSAID).
Указанные средства позволяют проводить эффективное и безопасное местное лечение заболеваний желудочно-кишечного тракта, таких как диспепсия, эзофагит, опухоль пищевода, пищевод Баррета, аденокарцинома пищевода, ГЭРБ-ассоциированные поражения легких, в комбинации с другими методами лечения таких заболеваний.
Поэтому первым объектом настоящего изобретения являются фармацевтические композиции, нутрацевтики, диетические пищевые продукты и композиции для медицинских устройств, предназначенные для перорального введения, которые включают полисахариды из кладодия Opuntia Ficus Indica, предпочтительно в комбинации с активными веществами, используемыми для предупреждения или лечения заболеваний верхнего отдела желудочно-кишечного тракта, которые представлены в прилагаемой формуле изобретения.
В соответствии с настоящим изобретением термин ”комбинация” означает физическую или функциональную ассоциацию экстрактов и активных веществ. В первом случае (физическая ассоциация) активные ингредиенты получают в одной композиции с носителями, наполнителями или другими ингредиентами, пригодными для данной цели использования. Во втором случае (функциональная ассоциация) активные ингредиенты можно вводить в разных композициях или разными способами для достижения комбинированного терапевтического действия.
2
Вторым объектом настоящего изобретения является применение указанных композиций для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения ГЭРБ, диспепсии, эзофагита, опухоли пищевода, желудочно-кишечных нарушений, хронического фарингита, пищевода Баррета, аденокарциномы пищевода, ГЭРБ-ассоциированных поражений легких, в комбинации с активными веществами, которые, как известно, предотвращают и лечат такие же заболевания, при этом эффективность указанных активных веществ повышается благодаря синергической активности полисахаридов кладодия Opuntia Ficus Indica, и такие активные вещества предпочтительно выбирают из антацидных средств, ингибиторов протонного насоса, антагонистов Н, прокинетических средств, бикарбоната натрия, альгиновой кислоты или альгинатов, хитозанов, гидроксида алюминия или магния, карбоната кальция или магния, антиоксидантных и противовоспалительных флавоноидов, экстрагированных из растений и листьев маслины или почек Capparis Spinosa, антоцианозидов из красных апельсинов, черного риса или других природных источников, и их комбинаций.
4
В соответствии с настоящим изобретением полисахариды кладодия Opuntia Ficus Indica, которые необязательно содержат мальтодекстрины (до 50%), могут быть получены в виде слизи, которая может быть выделена в результате отжима кладодия или обработки водой при комнатной температуре. Альтернативно кладодий отжимают под прессом, полученный таким образом сок центрифугируют и жидкий супернатант подвергают ультрафильтрации, получая таким образом водный раствор с высоким содержанием полисахаридов (молекулярная масса более 10 Да). Затем водный раствор центрифугируют и сушат. Содержание полисахаридов в экстракте кладодия Opuntia Ficus Indica обычно составляет от 1 до 70 мас.%. Химическая структура и состав полисахарида кладодия Opuntia Ficus Indica были исследованы и описаны в следующих публикациях (D. McGarvie, H. Parolis, Methylation analysis of the mucilage of Opuntia ficus indic. Carbohydrate Research, (1981) 88:305-314; M. S. Karawya et al. Mucilages and Pectines of Opuntia, Tamarindus and Cydonia. Planta Medica (1980) Supplement:68-75; M. E. Malainine et al. Structure and morphology of cladodes and spines of Opuntia ficus indica. Cellulose extraction and characterisation. Carbohydrate polymers (2003) 51:77-83).
Слизь состоит из остатков 1,4-α-D-галактопиранозилуроновой кислоты и 1,2-β-L-рамнопиранозидов, которые присоединены к коротким цепям 1,6-β-D-галактопиранозы в положении 4 всех остатков рамнопиранозы. Большинство остатков галактозида имеют цепи в положении О-3 или О-4, которые в основном состоят из остатков арабинофуранозида, арабинофуранозида-ксилопиранозида (D. McGarbie, H. Parolis, Methylation analysis of the mucilage of Opuntia ficus indic. Carbohydrate Research, (1981) 88:305-314). Слизь, содержащуюся в кладодии Opuntia Ficus Indica, обычно выделяют путем отжима (D. Trombetta et al., Effect of polysaccharides from Opuntia ficus-indica (L.) cladodes on the healing of dermal wounds in the rat. Phytomedicine (2006) 13:352-358) или обработки водой (R. Vazquez-Ramirez et al., Reversing gastric mucosal alterations during ethanol-induced chronic gastritis in rats by oral administration of Opuntia Ficus Indica mucilage. World J. Gastroenterol (2006) 12(27):4318-4324).
Композиции по настоящему изобретению могут быть жидкими или твердыми, пригодными для перорального введения, предпочтительно в виде пероральных растворов, пероральных суспензий, пероральных эмульсий, таблеток, порошков и таблеток для приготовления по индивидуальному рецепту. В использованном здесь значении термин ”медицинское устройство” означает ”активное медицинское устройство” (класса I) в соответствии с классификацией, определяемой директивой 93/42/ЕЕС, приложение IX.
Композиции по настоящему изобретению могут включать консерванты, ионные и неионные буферы и добавки, обычно используемые для получения композиций для перорального введения.
Для жидких композиций для перорального введения, таких как растворы, суспензии или эмульсии, в качестве растворителя предпочтительно используют воду или многокомпонентный водный раствор, пригодный для перорального введения.
2
Активные вещества, пригодные для лечения или профилактики заболеваний верхнего отдела желудочно-кишечного тракта, которые могут быть использованы в комбинации с экстрактом кладодия Opuntia Ficus Indica по настоящему изобретению, включают: 1) вещества, используемые для лечения тех же заболеваний, такие как ингибиторы протонного насоса, антагонисты Н, прокинетические средства, антацидные средства, бикарбонат натрия, альгиновая кислота или альгинаты, хитозаны, бикарбонат натрия и их комбинации; 2) природные вещества, такие как антиоксидантные и противовоспалительные флавоноиды, выделенные из растений, например, из почек Capparis Spinosa, антоцианозиды из красных апельсинов, черного риса или других природных источников и предпочтительно экстракты листьев маслины; 3) комбинации веществ, указанных в пунктах 1) и 2).
Epub ahead of print
Anal Bioanal Chem
J Agric Food Chem
J Agric Food Chem
J Chromatogr A
Листья Olea europeae могут быть экстрагированы водными или гидроспиртовыми растворителями (10-80% этанола) при комнатной температуре или при нагревании до 60-70°С, при обработке в микроволновой печи, ультразвуком или при помощи жидкостной экстракции с перегревом (Lee O.H. et al. Assessment of phenolics-enriched extract and fractions of olive leaves their antioxidant activities Bioresour Technol (2009) ; Mylonaki S. et al. Optimisation of the extraction of olive (olea europaea) leaf phenolics using water/ethanol-based solvent systems and response surface methodology. . (2008) 392(5):977-85; Japтn-Lujan R, Luque de Castro MD. Small branches of olive tree: a source of biophenols complementary to olive leaves. . (2007) 30; 55(11):4584-8; Vassiliki T Papoti, Maria Z. Tsimidou. Impact of sampling parameters on the radical scavening potential of olive (Olea europeae L.) leaves. . 2009, 57, 3470-3477; Japтn-Lujбn R, Luque de Castro MD. Superheated liquid extraction of oleuropein and related biophenols from olive leaves. . (2006) 1136(2):185-91). Водно-спиртовая экстракция может быть повторена несколько раз для получения высокого содержания бифенолов. После окончания экстракции водный или водно-спиртовой растворитель удаляют в вакууме при 40°С. Для дальнейшего обогащения бифенолами, сухой экстракт может быть введен в полистиролы и подвергнут элюированию раствором этанола и воды с соотношением 50:50.
Экстракт листьев Olea europeae содержит фенолы (тирозол, гидрокситирозол и их производные), коричные кислоты, флавоноиды (апигенин, лютеолин и их глюкозидные производные, рутин, кверцетин), лигнаны, секоиридоиды (олеурозид, олеуропеин и их производные, эленоловую кислоту) и имеет следующий полифенольный профиль: 2-40% флавоноидов (апигенин, лютеолин и их производные), 0,5-10% олеуропеина, 1-30% гидрокситирозола и их производных.
В данной области известны методы получения фармацевтических или пищевых композиций. Содержание полисахаридов, экстрагированных из Opuntia Ficus Indica, предпочтительно составляет от 0,5 до 50% мас./мас. в расчете на общую массу композиций; другие активные вещества могут составлять 1-30%.
Полисахариды Opuntia Ficus Indica, которые в настоящее время используются в пище, являются безопасными для определенных категорий субъектов, таких как пожилые люди, дети или беременные женщины.
Настоящее изобретение далее относится к применению указанных композиций для лечения и предупреждения заболеваний верхнего отдела желудочно-кишечного тракта путем введения нуждающемуся субъекту терапевтически эффективного количества полисахаридов Opuntia, предпочтительно в комбинации с активными веществами, используемыми для лечения или профилактики тех же заболеваний.
Патологические состояния, которые можно успешно лечить композициями по настоящему изобретению, включают: гастроэзофагеальный рефлюкс, ГЭРБ, диспепсию, эзофагит, опухоль пищевода, желудочно-кишечные нарушения, хронический фарингит, пищевод Баррета, аденокарциному пищевода, ГЭРБ-ассоциированные поражения легких.
Краткое описание чертежей
Другие особенности и преимущества настоящего изобретения будут более очевидны из нижеследующего описания изобретения и неограничивающих примеров со ссылкой на прилагаемые чертежи, где:
- Фиг.1А: фотография кладодия и плодов Opuntia Ficus Indica;
- Фиг.2: модель мукоадгезии in vitro;
- Фиг.3: сравнение синергического действия полисахаридов, экстрагированных из кладодия Opuntia Ficus Indica, с альгинатом натрия в отношении отдельных компонентов в модели in vitro с использованием эпителиальных клеток слизистой оболочки щеки;
- Фиг.4: мукоадгезия (процентное значение ингибирования связывания лектина после воздействия) каждого испытанного вещества, подвергнутого сравнению на фиг.3.
- Фиг.5: воздействие на язву желудка разных веществ или комбинации веществ, испытанных в разных экспериментальных моделях язвы желудка у крыс, вызванной химическим методом. Данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение для 6 животных; в скобках указано процентное значение ингибирования по сравнению с контрольной группой.
- Фиг.6: воздействие на язву пищевода разных веществ или комбинации веществ, испытанных в модели гастроэзофагеального рефлюкса, вызванного хирургическим методом. Данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение для 6 животных; в скобках указано процентное значение ингибирования по сравнению с контрольной группой.
В нижеследующих таблицах приведены неограничивающие примеры композиций по настоящему изобретению.
<b>Таблица 1</b>Суспензия 1 для перорального введения
<b>Компоненты</b>
<b>%</b>
Полисахариды из кладодия Opuntia Ficus Indica
2 г (1-20 г)
Вода
до 100 мл
<b>Таблица 2</b>Суспензия 2 для перорального введения
<b>Компоненты</b>
<b>%</b>
Альгинат натрия
5 г
Бикарбонат натрия
2,67 г
Полисахариды из кладодия Opuntia Ficus Indica
2,0 г (1-20 г)
Вода
до 100 мл
<b>Таблица 3</b>Порошок (пакетики) 1 для перорального введения
<b>Компоненты</b>
<b>%</b>
Альгинат натрия
10-20 г
Бикарбонат натрия
5-10 г
Полисахариды из кладодия Opuntia Ficus Indica
1-20 г
<b>Таблица 4</b>Порошок (пакетики) 2 для перорального введения
<b>Компоненты</b>
<b>%</b>
Альгинат натрия
10-20 г
Бикарбонат натрия
5-10 г
Экстракт из листьев маслины
5-20 г
Полисахариды из кладодия Opuntia Ficus Indica
1-20 г
<b>Таблица 5</b>Капсула 1
<b>Компоненты</b>
<b>мг/капсулу</b>
Циметидин
200 мг
Полисахариды из кладодия Opuntia Ficus Indica
100-200 мг
Экстракт из листьев маслины
100-200 мг
Лактоза
до заполнения капсулы
<b>Таблица 6</b>Капсула 2
<b>Компоненты</b>
<b>мг/капсулу</b>
Гидрохлорид ранитидина
84 мг
Альгиновая кислота
500,0 мг
Полисахариды из кладодия Opuntia Ficus Indica
200 мг
Экстракт из листьев маслины
200 мг
Бикарбонат натрия
165,25 мг
Стеарат магния
0,75 мг
Наполнитель
350 мг
Определение in vitro мукоадгезии полисахаридов из кладодия Opuntia Ficus Indica, используемых отдельно и в комбинации с альгиновой кислотой, на эпителиальных клетках слизистой оболочки щеки
Для оценки мукоадгезивной способности полисахаридов из кладодия Opuntia Ficus Indica был выполнен анализ мукоадгезии in vitro, описанный в публикации Патела (Patel D. and al., An in vitro mucosal model predictive of bioadhesive agents in the oral cavity. J. Control Release, 1999, 61(1-2):175-183), с использованием взвешенных эпителиальных клеток из слизистой оболочки щеки. При выполнении данного анализа мукоадгезию (адгезивную способность испытанных веществ в отношении клеток слизистой оболочки) определяют в виде ингибирования связывания лектина с гликопротеином мембраны, индуцированного путем маскировки поверхности клетки мукоадгезивным веществом.
Материалы и методы
В результате обработки клеток слизистой оболочки биотинилированным лектином и стрептавидинпероксидазой образец приобретает желтый цвет; предварительная обработка клеток слизистой оболочки мукоадгезивным веществом (30°С, в течение 15 минут до обработки лектином) позволяет замаскировать сайт связывания лектина, в результате чего уменьшается интенсивность желтой окраски.
Лектин является белком, содержащимся в некоторых растениях Leguminosae (Canavalia ensiformis), который обладает способностью связываться с гликозидными и маннозидными остатками гликопротеинов мембраны; биотин (витамин Н) связывается с лектином при помощи стрептавидинпероксидазы, которую добавляют к взвеси клеток для создания комплекса белок-глюкоза-лектин-биотин-стрептавидинпероксидаза.
При добавлении к взвеси клеток дигидрохлорида о-фенилендиамина (o-pd) и пероксида водорода дигидрохлорид о-фенилендиамина окисляется комплексом белок-глюкоза-лектин-биотин-стрептавидинпероксидаза с образованием 2,3-диаминофеназина, при этом образец становится желтым (фиг.2).
2
4
Взаимодействие блокируют через 1 минуту, добавляя 1 М раствор HSO. Интенсивность цвета, которую определяют спектрофлуориметром, пропорциональна связыванию лектина с гликозидными остатками на клеточной мембране.
4
Клетки слизистой оболочки щеки были получены у здоровых добровольцев мужского и женского пола путем осторожного соскабливания с внутренней стороны щеки деревянным шпателем. Затем клетки собирали и суспендировали в 10 мл 0,05 М (TBS) изотонического раствора трис-буфера, рН 7,6 (Patel D. et al., An in vitro mucosal model predictive of bio-adhesive agents in the oral cavity. J. Control Release, 1999, 61(1-2):175-183). Затем добавляли образец взвеси (0,1 мл трипанового синего, 0,5% (мас./об.)) и при помощи гемоцитометра определяли общее число клеток: каждый образец содержал 48×10 клеток слизистой оболочки щеки. Полисахариды из кладодия Opuntia Ficus Indica и альгинат натрия растворяли в 0,9% изотоническом растворе NaCl до концентрации 0,5% мас./об., и затем использовали для предварительной обработки клеток слизистой оболочки щеки. Результаты выражены в виде процентного значения связывания испытанного вещества с клетками слизистой оболочки, которое обратно пропорционально процентному значению уменьшения цвета образца по сравнению с контрольным образцом.
Весь эксперимент повторяли 5 раз для контрольного образца и для каждого испытанного вещества.
Статистический анализ результатов выполняли при помощи одномерного анализа ANOVA в соответствии с hoc-критерием Бонферрони.
Результаты
Как показано на фиг.3 и 4, в результате выполнения данного анализа было установлено, что 55,81% полисахаридов Opuntia Ficus Indica сцепляются с взвешенными клетками слизистой оболочки щеки, что значительно больше по сравнению с альгинатом натрия (мукоадгезия 5,36%; р<0,05). Кроме того, было установлено, что при добавлении альгината натрия к полисахаридам кладодия Opuntia Ficus Indica мукоадгезия достигает 74,83%.
Заключение
Результаты, полученные при выполнении анализа мукоадгезии in vitro, показали, что полисахариды кладодия Opuntia Ficus Indica характеризуются более высокой мукоадгезией по сравнению с альгинатом натрия. Кроме того, было неожиданно обнаружено, что комбинация указанных веществ оказывает синергическое действие, которое гарантирует более сильную мукоадгезивную активность.
Оценка in vivo противоязвенной активности композиции, содержащей альгинат натрия/антацид/полисахариды из кладодия Opuntia Ficus Indica/экстракт из листьев Olea Europeae
Целью данного исследования была оценка противоязвенной активности комбинации альгината натрия/антацида, полисахаридов из кладодия Opuntia Ficus Indica и экстракта из листьев Olea Europeae в животной модели язвы (у крыс), вызванной этанолом и индометацином.
Материалы и методы
При выполнении данного эксперимента была произведена оценка 5 испытуемых композиций, которые сравнивали с наполнителем: комбинация альгината/антацида (А), полисахариды из кладодия Opuntia Ficus Indica (В), экстракт из листьев Olea Europeae (C), комбинация альгината/антацида/полисахаридов из кладодия Opuntia Ficus Indica (D), комбинация альгината/антацида/полисахаридов из кладодия Opuntia Ficus Indica/экстракта из листьев Olea Europeae (Е) и суспензия карбопола 919 0,3% мас./об. в воде в качестве наполнителя (F).
Каждый образец, полученный в виде водной суспензии (концентрации указаны в таблице 7), вводили при помощи насоса для перорального введения (1 мл на 100 г массы тела).
<b>Таблица 7</b>Испытуемые композиции
<b>Композиции (% мас./об.)</b>
<b>Компоненты</b>
<b>А</b>
<b>В</b>
<b>С</b>
<b>D</b>
<b>E</b>
<b>F</b>
Альгинат натрия
5
-
-
5
5
-
Бикарбонат натрия
2,67
-
-
2,67
2,67
-
Полисахариды из кладодия Opuntia Ficus Indica
-
2
-
2
2
-
Экстракт из листьев Olea Europeae
-
-
1
-
1
-
Карбопол 919
0,3
Данный эксперимент выполняли с использованием взрослых самцов крыс Wistar (Rattus norvegicus) с массой тела от 180 до 200 г. Животные находились в условиях естественного освещения (цикл чередования света и темноты 12:12 часов), контролируемой температуры (24±1°С) и влажности (60±4%), получали стандартный корм (корм для крыс GLP Morini Mill) и воду по потребности в течение одной недели. Затем животных лишали корма в течение 24 часов и воды за 2 часа до начала эксперимента (F. Vitali, Antiulcer potential of a standardized extract of red orange juice in the rat, Int. J. Food Properties, 10, 331-344, 2007).
Экспериментальная модель язвы, вызванной этанолом
Животных произвольно распределяли в 6 групп (1-6) по 6 животных в каждой группе. Группу 1 использовали в качестве контрольной группы, которой вводили наполнитель (образец F, раствор 0,3% мас./об. карбопола 919 и 1% мас./об. карбоната кальция в дистиллированной воде, нейтрализованной NaOH, 1 мл/100 г массы тела) и через 1 час ульцерогенное вещество: абсолютный этанол в количестве 1 мл/крысу; животным в группах 2-6 перорально вводили образцы А (767 мг/кг массы тела, группа 2), В (200 мг/кг массы тела, группа 3), С (100 мг/кг массы тела, группа 4), D (967 мг/кг массы тела, группа 5) и Е (1067 мг/кг массы тела, группа 6). Через 1 час после введения образцов А-Е животным в группах 2-6 вводили 1 мл абсолютного этанола, чтобы вызвать язву. Через 1 час после введения этанола всех животных анестезировали диэтиловым эфиром и умерщвляли. У всех животных удаляли желудки, которые разрезали на уровне большой кривой и осторожно промывали 0,9% раствором NaCl, не удаляя при этом поверхностную слизистую оболочку.
Экспериментальная модель язвы, вызванной индометацином
Животных произвольно распределяли в 6 групп (1-6) по 6 животных в каждой группе. Животным в группе 1 (контрольная группа) перорально вводили наполнитель (образец F, раствор 0,3% мас./об. карбопола 919 и 1% мас./об. карбоната кальция в дистиллированной воде, нейтрализованной NaOH, 1 мл/100 г массы тела) и через 1 час подкожно вводили ульцерогенное вещество индометацин (суспензия в дистиллированной воде, содержащая 1% карбоксиметилцеллюлозы) в количестве 0,03 г/кг массы тела (1 мл/кг массы тела). Животным в группах 2-4 вводили образцы А-Е так же, как в вышеописанной экспериментальной модели язвы, вызванной этанолом, и через 1 час вводили суспензию индометацина. Через 5 часов после введения индометацина животных анестезировали диэтиловым эфиром и умерщвляли. У всех животных удаляли желудки, которые анализировали так же, как в эксперименте с использованием этанола.
Оценка эффективности испытанных композиций
Визуально анализировали поверхность слизистой оболочки желудка. Длину (мм) каждого поражения на слизистой оболочке определяли на основании произвольной шкалы (таблица 8).
контрольная
образец
контрольная
В обеих экспериментальных моделях для каждого желудка вычисляли индекс изъязвления (U.I.), добавляя оценки, присвоенные язве, и процентное значение ингибирования изъязвления (P.I.U.) [(U.I. - U.I.)/U.I.]*100. Данные выражены в виде арифметического среднего ± стандартная ошибка среднего для каждой группы; значимость данных анализировали на основании критерия Крускала-Валлиса и затем критерия Данна. Значение р<0,05 было признано значимым.
Оценки язвы для 2 моделей приведены в таблице 8.
Результаты
Результаты указанных экспериментов показаны на фиг.5. В обеих экспериментальных моделях процентное значение ингибирования изъязвления (Р.I.U.), полученное для группы D (животные, которым вводили комбинацию альгината натрия/антацида/полисахаридов из кладодия Opuntia Ficus Indica), было выше по сравнению с аналогичным значением, полученным при отдельном использовании компонентов той же комбинации, и выше, чем сумма P.I.U, что свидетельствует о синергическом действии комбинации отдельных веществ. Добавление экстракта из листьев Olea Europeae (группа Е) повышает P.I.U. на величину, превышающую сумму P.I.U. при отдельном использовании экстракта из листьев Olea Europeae и комбинации альгината натрия/антацида/полисахаридов из кладодия Opuntia Ficus Indica, что указывает на наличие синергического действия.
<b>Таблица 8</b>Оценка язвы в моделях химически индуцированной язвы
<b>Оценка</b>
<b>Поражение</b>
0
Отсутствие язвы
0,5
Гиперемия
1
Геморрагические пятна
2
1-5 маленьких язв
3
Много маленьких язв
4
1-5 маленьких язв и 1-3 большие язвы
5
Много маленьких и больших язв
6
Желудок заполнен язвами наряду с прободением
Заключение
Данное исследование in vivo позволило выявить неожиданное синергическое потенцирование воздействия альгината натрия/антацида, достигаемое при использовании полисахаридов из кладодия Opuntia Ficus Indica. Указанное синергическое действие еще более усиливает экстракт из листьев Olea Europeae. Язвенным поражениям, имевшимся у животных, которых подвергали стандартному лечению (альгинат натрия и бикарбонат натрия), была присвоена очень высокая оценка по сравнению с животными, которым вводили комбинацию по настоящему изобретению, что свидетельствует о синергическом действии отдельных компонентов.
Оценка in vivo комбинации альгината натрия/антацида/полисахаридов из кладодия Opunta Ficus Indica/экстракта из листьев Olea Europeae в отношении уменьшения гастроэзофагеального рефлюкса, вызванного хирургическим путем (лигирование привратника)
Целью данного исследования была оценка эффективности комбинации альгината натрия/антацида/полисахаридов из кладодия Opuntica Ficus Indica с добавлением экстракта из листьев Olea Europeae в отношении уменьшения гастроэзофагеального рефлюкса, вызванного хирургическим путем в результате лигирования привратника у крыс.
Уменьшение гастроэзофагеального реалюкса измеряли при наличии язв пищевода у животных, которым вводили активные комбинации после хирургической индукции язвы.
Взрослых самцов крыс Wistar (Rattus norvegicus) с массой тела 180-200 граммов произвольно распределяли в 6 групп (1-6) по 6 животных в каждой группе. В соответствии с протоколом эксперимента, описанным в публикации Мина (Min et al.: The effects of apigenin-7-O-β-D-glucurono-pyranoside on reflux oesophagitis and gastritis in rats, Autonomic & autacoid Pharmacology 2005 Jul; 25(3):85-91; Hayakawa T. et al.: Roles of cyclooxygenase 2 and microsomal prostaglandin E synthase 1 in rat acid reflux oesophagitis, Gut 2006, 55:450-456), животных анестезировали пентобарбиталом и вызывали эзофагит вследствие рефлюкса кислоты путем лигирования переходной области между кардиальным отделом желудка и железистой частью и завертывания двенадцатиперстной кишки около привратника. Группа 1 (не подвергаемая никакому воздействию) была положительной контрольной группой. Животным в группах 2-6 интрадуоденально вводили композиции А-Е сразу же после лигирования привратника и ограничивающего выступа в таких же количествах, что и в вышеописанных моделях химически вызванной язвы. Затем в месте соединения желудка с пищеводом выполняли продольную кардиомиотомию длиной около 1 см для усиления рефлюкса из желудка в пищевод. Через 6 часов животных анестезировали диэтиловым эфиром и умерщвляли, пищеводы удаляли и оценивали общую площадь поражений на основании оценок, приведенных в таблице 9.
Конечный индекс изъязвления (U.I.) и P.I.U. для каждой группы вычисляли вышеописанным способом.
<b>Таблица 9</b>Оценка поражений слизистой оболочки пищевода
<b>Оценка</b>
<b>Общая площадь (мм</b><sup>2</sup><b>)</b>
0
Отсутствие видимых поражений
1
Редкие поражения
2
Общая площадь поражений ≤30 мм<sup>2</sup>
3
Общая площадь поражений ≥30 мм<sup>2</sup>
4
Прободение
Результаты
Результаты описанного эксперимента показаны на фиг.6. Данная экспериментальная модель подтвердила более высокое процентное значение ингибирования изъязвления (P.I.U.), полученное в группе D (которой вводили альгинат натрия/антацид/полисахариды из кладодия Opuntia Ficus Indica), по сравнению с аналогичным значением, полученным в экспериментальных группах, которым вводили отдельные компоненты, причем указанное значение было даже выше суммы P.I.U, что свидетельствует о значительном синергическом действии комбинации альгинат натрия/антацид/полисахариды из кладодия Opuntia Ficus Indica в отношении уменьшения гастроэзофагеального рефлюкса. Последующее добавление экстракта из листьев Olea Europeae к указанной комбинации (группа Е) увеличило P.I.U. до уровня, который был выше суммы P.I.U. отдельно используемого экстракта из листьев Olea Europeae и комбинации D, подтверждая результаты, полученные в моделях химически индуцированной язвы желудка.
Заключение
Данное испытание in vivo показывает, что экстракт из кладодия Opuntia Ficus Indica оказывает потенцирующее действие на уменьшение гастроэзофагеального рефлюкса. Указанный эффект далее повышается в результате добавления экстракта из листьев Olea Europeae.