ГИДРОЛИЗ СТЕВИОЛОВЫХ ГЛИКОЗИДОВ С ПОМОЩЬЮ БЕТА-ГЛЮКОЗИДАЗЫ

1. Способ изменения гликозилирования стевиолового гликозида, включающий:
обеспечение рекомбинантных микроба, водоросли или растительной клетки, модифицированных для получения первого субстрата;
разрушение указанных рекомбинантных микроба, водоросли или растительной клетки с высвобождением их клеточного цитозоля, где такой цитозоль содержит указанный первый субстрат;
получение цитозоля из указанных рекомбинантных микроба, водоросли или растительной клетки;
подвергание указанного цитозоля воздействию бета–глюкозидазы, где такая бета–глюкозидаза характеризуется гидролитической активностью в течение периода времени, достаточного для образования второго представляющего интерес субстрата посредством удаления по меньшей мере одной глюкозильной группы из указанного первого субстрата; и
сбор указанного второго представляющего интерес субстрата.
2. Способ по п. 1, где указанный первый субстрат представляет собой стевиоловый гликозид.
3. Способ по п. 2, где указанная гидролитическая активность обеспечивает удаление глюкозильной группы в положении C19 указанного стевиолового гликозида.
4. Способ по п. 2, где указанная гидролитическая активность обеспечивает удаление глюкозильной группы в положении C13 указанного стевиолового гликозида.
5. Способ по п. 2, где указанная гидролитическая активность обеспечивает удаление глюкозильной группы либо в положении C19 указанного стевиолового гликозида, либо в положении C13 указанного стевиолового гликозида.
6. Способ по п. 2, где указанная гидролитическая активность обеспечивает удаление глюкозильной группы как в положении C19 указанного стевиолового гликозида, так и в положении C13 указанного субстрата.
7. Способ по п. 3, где указанная гидролитическая активность обеспечивает удаление глюкозильной группы в положении C19 рубузозида с получением стевиол–13–глюкозида.
8. Способ по п. 3, где указанная гидролитическая активность обеспечивает удаление глюкозильной группы в положении C19 стевиозида с получением стевиолбиозида.
9. Способ по п. 3, где указанная гидролитическая активность обеспечивает удаление глюкозильной группы в положении C19 Reb E с получением стевиолбиозида.
10. Способ по п. 3, где указанная гидролитическая активность обеспечивает удаление глюкозильной группы в положении C19 Reb I с получением Reb A.
11. Способ по п. 3, где указанная гидролитическая активность обеспечивает удаление глюкозильной группы в положении C19 Reb A с получением Reb B.
12. Способ по п. 4, где указанная гидролитическая активность обеспечивает удаление глюкозильной группы в положении C13 стевиол–13–глюкозида с получением стевиола.
13. Способ по п. 4, где указанная гидролитическая активность обеспечивает удаление глюкозильной группы в положении C13 Reb D с получением Reb B или Reb A.
14. Способ по п. 5, где указанная гидролитическая активность обеспечивает удаление глюкозильной группы в положении C19 и в положении C13 Reb G с получением стевиол–13–глюкозида.
15. Способ по п. 1, где указанный второй представляющий интерес субстрат представляет собой Reb M.
16. Способ по п. 1, где указанный второй представляющий интерес субстрат представляет собой Reb B.
17. Способ по п. 1, где указанный второй представляющий интерес субстрат представляет собой Reb A.
18. Способ по любому из пп. 1–17, дополнительно включающий применение ферментов, представляющих собой бета–галактозидазу или пектиназу, для увеличения скорости ферментативного гидролиза.
19. Способ по любому из пп. 1–18, дополнительно включающий:
обеспечение экспрессии стевиолового гликозида в трансформированной клеточной системе;
выращивание клеточной системы в среде и
получение указанного второго представляющего интерес субстрата.
20. Способ по любому из пп. 1–19, где указанный период времени воздействия бета–глюкозидазы на указанный первый субстрат составляет по меньшей мере 6 часов.
21. Способ по любому из пп. 1–19, где указанный период времени воздействия бета–глюкозидазы на указанный первый субстрат составляет по меньшей мере 12 часов.
22. Способ по любому из пп. 1–19, где указанный период времени воздействия бета–глюкозидазы на указанный первый субстрат составляет по меньшей мере 18 часов.
23. Способ по любому из пп. 1–19, где указанный период времени воздействия бета–глюкозидазы на указанный первый субстрат составляет по меньшей мере 24 часа.
24. Способ по п. 1, где указанный второй представляющий интерес субстрат представляет собой стевиоловый гликозид.
25. Способ по любому из пп. 1–24, где бета–глюкозидаза имеет аминокислотную последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 90% идентичностью с SEQ ID NO:1.
26. Способ по любому из пп. 1–24, где бета–глюкозидаза имеет аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 95% идентична SEQ ID NO:3.
27. Способ по любому из пп. 1–26, где рекомбинантные микроб, водоросль или растительная клетка выбраны из группы, состоящей из бактерии, дрожжей, нитчатого гриба, водоросли, представляющей собой цианобактерию, и растительной клетки.
28. Способ по любому из пп. 1–26, где рекомбинантный микроб выбран из группы, состоящей из Escherichia; Salmonella; Bacillus; Acinetobacter; Streptomyces; Corynebacterium; Methylosinus; Methylomonas; Rhodococcus; Pseudomonas; Rhodobacter; Synechocystis; Saccharomyces; Zygosaccharomyces; Kluyveromyces; Candida; Hansenula; Debaryomyces; Mucor; Pichia; Torulopsis; Aspergillus; Arthrobotlys; Brevibacteria; Microbacterium; Arthrobacter; Citrobacter; Escherichia; Yarrowia; Klebsiella; Pantoea; Salmonella Corynebacterium; Clostridium и Clostridium acetobutylicum.
29. Способ по п. 1, где второй представляющий интерес субстрат представляет собой Reb E.
30. Способ по п. 1, где указанный второй субстрат представляет собой смесь Reb E, Reb D4 и Reb M.
31. Способ по п. 1, где второй представляющий интерес субстрат представляет собой Reb D4.
32. Способ по п. 1, где указанный второй представляющий интерес субстрат представляет собой смесь стевиоловых гликозидов, и содержание стевиоловых гликозидов из данной смеси в совокупности выше, чем любых других компонентов полученного из цитозоля концентрата по весу в пересчете на сухое вещество.
33. Способ по любому из пп. 1–32, где второй представляющий интерес субстрат на стадии e) представляет собой неочищенный продукт, и стадия e) дополнительно включает: i) очистку указанного неочищенного продукта и ii) удаление растворителей под вакуумом с получением концентрированного продукта.
34. Способ по п. 33, где указанный неочищенный продукт очищают с помощью колоночной хроматографии.
35. Способ по п. 33, где указанный неочищенный продукт очищают с помощью кислотно–щелочной экстракции.
36. Способ по п. 33, где указанный неочищенный продукт очищают с помощью вакуумной перегонки.
37. Способ по п. 33, дополнительно предусматривающий очистку концентрированного продукта с применением полупрепаративной HPLC.