Мультипараметрическая тест-система для одновременного определения антигенов вирусов SARS-CoV-2, гриппа типа А и В методом иммунохроматографии

Полезная модель относится к определению нуклеокапсидных антигенов вирусов SARS-CoV-2, гриппа типа А и В в клиническом образце за короткое время методом иммунохроматографического анализа.
Инфекции COVID-19 и грипп, вызванные данными вирусами, – это острые респираторные заболевания со схожей симптоматикой и типами передачи. Для легкого течения инфекций типичны лихорадка, миалгия, головная боль, воспаление горла, кашель или насморк (ВОЗ. Коронавирусная инфекция (COVID-19): COVID-19 и грипп. 2021). Однако возможны осложнения вплоть до летального исхода. Например, острый респираторный дистресс‑синдром (ОРДС) с развитием дыхательной недостаточности (Pormohammad, A., et al., 2021; Щелканов, М., et al.,2015). Риск возникновения осложнений зависит от своевременного начала этиотропной терапии. Таким образом необходим инструмент для точной дифференциальной диагностики данных инфекций (Cuadrado-Payán, E., et al., 2020).  Быстрое обнаружение патогена позволит выбрать верную стратегию лечения, минимизировать последствия болезни, а также вовремя актуализировать информацию по эпидемиологической обстановке.
Современная лабораторная диагностика COVID-19 и гриппа включает в себя метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) (Яцышина, С., et al., 2016; Кузнецова, Н.А., et al., 2020; Жданов, К., et al., 2020; Tsang, N.N.Y., et al., 2021) и различные варианты иммунохимического анализа (Di Domenico, M., A. De Rosa, and M. Boccellino, 2021; Steininger, C., et al., 2020). ПЦР-диагностика и большинство иммунохимических методов сочетают низкий предел обнаружения и высокую воспроизводимость результатов. Однако для их применения необходимо дорогостоящее оборудование и квалифицированный персонал, а само определение занимает длительное время.
Альтернативным методом, который лишен таких недостатков, является иммунохроматографический анализ. Оценить результат исследования можно визуально через 15 минут, что соответствует современному тренду медицинской диагностики – проведение анализа «на месте оказания медицинской помощи» ("Point-of-care testing").
Таким образом, благодаря использованию иммунохроматографических тест-систем появляется возможность выявить заболевание и прервать цепочки передачи инфекции на ранней стадии посредством адресных мер изоляции и взятия под наблюдение большинства зараженных и близко контактировавших с ними лиц. Одновременное определение антигенов SARS-CoV-2 и вирусов гриппа типов А и В позволяет минимизировать количество отбора проб, сократить время анализа и его стоимость, сделать тест удобным инструментом для отделений неотложной или выездной помощи.
Однако разработка таких систем является сложным и наукоемким процессом. Созданию стабильной и чувствительной иммунохроматографической тест-системы предшествует тщательный подбор и индивидуальная оптимизация целого ряда параметров. Одним из ключевых элементов тест-полоски является мембрана под конъюгат. Здесь происходит образование первых иммуноспецифических комплексов с окрашенным маркером. Задача мембраны – поддерживать стабильность конъюгата в высушенном виде, способствовать эффективному его вымыванию на рабочую область контролировать скорость движения жидкости и реагентов.
Частой проблемой при разработке мультипараметрического теста является нарушение кинетики движения фронта жидкости при переходе с мембраны под конъюгат на рабочую мембрану ввиду больших количеств разнородных и склонных агрегировать конъюгатов окрашенного маркера и антител. Дополнительная предобработка (Millipore E. M. D. Rapid lateral flow test strips: considerations for product development, 2013) мембраны предложенным буферным раствором исключает данные сложности. Таким образом обеспечивается равномерное распределение конъюгата по рабочей мембране без фантомных полос и пятен, затрудняющие детекцию результата.
Компоненты буферного раствора для предобработки мембраны включают органические полимеры полиэтиленгликоль (PEG) 1%, поливинилпирролидон (PVP) 0.25% и полоксамер Pluronic f68 0.5%. Они минимизирует неспецифическое связывание, способствуют равномерному и более медленному движению пробы тем самым повышая время специфического взаимодействия и сдвигая предел детекции в область более низких концентраций. Такой вариант является наиболее простым в реализации теста и не требует внедрения новых систем усиления сигнала.С учетом специфики заявленной полезной модели ниже рассмотрены публикации по разработке мультипараметрических тест-систем, где проводится предобработка мембраны под конъюгат.
1) тест-система для одновременного выявления вирусов мозаики тростникового сахара, описанная в публикации Thangavelu R. M. и соавторов «Ultrasensitive nano-gold labelled, duplex lateral flow immunochromatographic assay for early detection of sugarcane mosaic viruses» («Сверхчувствительный дуплексный иммунохроматографический анализ на коллоидном золоте для ранней детекции вирусов мозаики сахарного тростника»): Scientific reports, 2022, v.12. p. 1-14. DOI: 10.1038/s41598-022-07950-6.
2) тест-система для одновременной детекции пестицидов атразина и ацетохлора, описанная в публикации Ruan X. и соавторов «Nanomaterial-enhanced 3D-printed sensor platform for simultaneous detection of atrazine and acetochlor» («Напечатанная на 3D-принтере усиленная наноматериалами сенсорная платформа для одновременного определения атразина и ацетохлора»): Biosensors and Bioelectronics, 2021, v.184. p. 113238. DOI: 10.1016/j.bios.2021.113238.
Описанная в публикации Thangavelu R. M. и соавторов тест-система представляет собой мембранный композит, в состав которого входит:
1) мембрана под образец;
2) мембрана под конъюгат, предобработанная натрий-фосфатным буфером рН 7,4 с добавлением 2% БСА, 2% ПВП, 1% сахарозы и 0,25% Tween-20;
3) нитроцеллюлозная мембрана с иммобилизованными мАТ против вирусов мозаики и полосатой мозаики сахарного тростника в соответствующих тестовых зонах и кроличьими антивидовыми антителами в контрольной зоне;
4) конечная адсорбирующая мембрана для впитывания компонентов пробы после прохождения реакции.
Для детекции вирусных антигенов используются конъюгаты соответствующих вирусу мАТ и НЧКЗ, покрытых цистеамином. Конъюгаты каждого типа мАТ наносятся на отдельную мембрану и высушиваются. При сборке тест-полоски обе мембраны помещаются внахлест.
По окончании анализа применяют «золотое» усиление, заключающееся в восстановлении солей золота. Это приводит к формированию крупных частиц и, следовательно, большей интенсивности окрашивания на мембране.
Анализ проводят следующим образом:
1) Растительный экстракт наносится на тест-полоску, происходит инкубация.
2) Результат анализа фиксируют визуально.
Результат анализа интерпретируют следующим образом:
1) Если на рабочей мембране проявляется одна окрашенная линия в контрольной зоне, результат признается отрицательным. В пробе отсутствуют антигены вирусов мозаики и полосатой мозаики сахарного тростника;
2) Если на рабочей мембране окрашиваются две или три линии, одна из которых контрольная, результат признается положительным.  В пробе отсутствуют антигены вирусов мозаики и полосатой мозаики сахарного тростника.
Технический результат полезной модели заключается в улучшении условий протекания иммунохимических реакций на мембране тест-системы с достижением минимального предела детекции нуклеокапсидных антигенов вирусов SARS-CoV-2, гриппа типа А и В.
Указанный технический результат достигается тем, что перед нанесением конъюгатов мАТ против вирусов SARS-CoV-2, гриппа типа А и В с окрашенным маркером мембрана предобрабатывается буферным раствором с добавлением композиции органических полимеров полиэтиленгликоля (PEG) 1%, поливинилпирролидона (PVP) 0.25% и полоксамера Pluronic f68 0.5%.
Буферный раствор с добавлением композиции органических полимеров полиэтиленгликоля (PEG) 1%, поливинилпирролидона (PVP) 0.25% и полоксамера Pluronic f68 0.5% растворяется в наносимом конъюгате, смешивается с ним и высушивается. При проведении анализа, после внесение образца он способствует равномерному вымыванию окрашенного реагента с мембраны. Равномерное распределение конъюгатов по мембране минимизирует неспецифическое связывание и обеспечивает их ресолюбилизацию без потери реакционной способности. Таким образом, благодаря предобработке мембраны под конъюгат буферным раствором с добавлением композиции органических полимеров полиэтиленгликоля (PEG) 1%, поливинилпирролидона (PVP) 0.25% и полоксамера Pluronic f68 0.5% достигаются высокие значения аналитических параметров тест-системы.
Описанная Ruan X. И соавторами тест-система представляет собой бифункциональный мембранный композит, в состав которого входит:
1) расширенная мембрана под образец треугольной формы;
2) две мембраны под конъюгат, одна из которых предобработана раствором 2% БСА + 2% сахароза, другая – раствором 2% БСА + 2% сахароза + 0,3% Tween-20;
3) две нитроцеллюлозные рабочие мембраны: на одной из них в тестовой зоне нанесен комплекс атразин-БСА, на другой – комплекс ацетохлор-БСА. В контрольной зоне сорбированы козьи антивидовые антитела;
4) две конечные адсорбирующие мембраны для впитывания компонентов пробы после прохождения реакции.
Для детекции пестицидов используются конъюгаты антител с наночастицами платины-палладия (Pd@Pt NPs).
Определение пестицидов происходит методом конкурентного анализа.
Анализ проводят следующим образом:
1) 200 мкл анализируемой пробы наносится на мембрану под образец, происходит инкубация в течение 10 минут.
2) Прореагировавшие участки рабочей мембраны вырезаются ножом холдера и опускаются в реакционные ячейки, заполненные тионинацетатом и перекисью водорода. Наночастицы платины-палладия в составе иммунного комплекса катализируют окислительно-восстановительную реакцию (ОВР) между данными реагентами. Процесс ОВР контролируется вольтамперометрически с помощью потенциостата.
Содержание пестицидов в пробе оценивается количественно.
Для достижения высоких аналитических параметров тест-систем авторами публикаций представлен целый комплекс решений, направленных на усиление сигнала. Основной подход заключается в использовании неклассического варианта маркера и/или приборной регистрации результата. Однако такой способ детекции требует использования высокотехнологичного оборудования и дополнительную работу с реагентами, что делает невозможным проведение анализа point-of-care и не подходит для самотестирования. Подобные системы также сложны в полномасштабном производстве: трудоемкость сборки систем лимитирует возможности автоматизации процесса, а внедрение систем усиления сигнала увеличит затраты материалов и затем отразится на стоимости анализа.
Необходимо отметить, что в данных тест-системах мембраны под конъюгат хоть и подвергаются специальной обработке, но при этом конъюгаты разных мАт наносятся на отдельные мембраны. Таким образом предобработка мембраны раствором не является единым комплексным решением проблемы размещения конъюгатов на одну мембрану, эффективного вымывания маркера на рабочую область тест-полоски, а также усиления чувствительности системы — это всего лишь один из элементов целого ряда оптимизаций.
Более того, входящий в состав раствора для предобработки БСА не способствует равномерному вымыванию компонентов, а при высыхании потенциально может снизить химическую стабильность системы, окисляться, дезаминироваться, проявлять конформационную нестабильность и способствовать агрегации (Horn, J., Mahler, H.-C. and Friess, W. (2020). Drying for Stabilization of Protein Formulations. In Drying Technologies for Biotechnology and Pharmaceutical Applications (eds S. Ohtake, K.-i. Izutsu and D. Lechuga-Ballesteros). https://doi.org/10.1002/9783527802104.ch4).
Технической задачей заявленной полезной модели является улучшение условий протекания иммунохимических реакций на мембране тест-системы для достижения минимального предела детекции нуклеокапсидных антигенов вирусов SARS-CoV-2, гриппа типа А и В. Технический результат полезной модели заключается в использовании специального состава для предобработки мембраны под конъюгат. При нанесении состав растворяется в наносимом конъюгате, смешивается с ним и способствует равномерному вымыванию окрашенного реагента при проведении анализа. Как результат, подобранный состав поддерживает равномерное распределения конъюгатов по мембране, минимизируя неспецифическое связывание и ресолюбилизацию без потери реакционной способности. Таким образом, найденный оптимум обеспечивает высокие значения аналитических параметров тест-системы.
Указанный технический результат достигается тем, что:
на мембрану для конъюгата нанесены конъюгаты мАТ против вируса SARS-CoV-2, вирусов гриппа типа А и В с окрашенным маркером;
перед нанесением конъюгатов на мембрану производится её предобработка специальным раствором состава PEG 1%, PVP 0.25% и Pluronic f68 0.5%.
Для проведения анализа, как показано на рис.1:
1) готовятся тест-полоски, на которые нанесены все необходимые иммунореагенты;
2) респираторные образцы (мазки из носоглотки и ротоглотки человека) разбавляются рабочим натрий-фосфатным буфером в объеме 0,7 мл;
3) 3 капли (90 мкл) полученного раствора вносят на впитывающую мембрану тест-полоски и инкубируют в течение 10 минут;
4) По образованию окрашенных линий проводится интерпретация результата.
Описанный анализ включает следующие процессы:
При наличии в анализируемой пробе нуклеокапсидных антигенов вирусов SARS-CoV-2 и/или гриппа типа А и/или гриппа типа В, они вступают в реакцию со соответствующими специфическими мАТ, мечеными окрашенным маркером. Образуются иммунные комплексы «антиген-мАТ-окрашенный маркер», которые продолжают движение с током жидкости. В соответствующей аналитической зоне тест-полоски происходит взаимодействие с иммобилизованными специфическими мАТ против SARS-CoV-2 и/или вируса гриппа типа А и/или В с образованием окрашенных иммунных комплексов «иммобилизованные мАт–антиген образца–мАт–окрашенный маркер». Увеличение количества таких иммунных комплексов приводит к образованию видимой окрашенной линии в соответствующей антигену аналитической зоне тест-полоски. В контрольной зоне тест-полоски специфический окрашенный иммунный комплекс антивидовых антител и мАт в составе конъюгата образуется независимо от наличия антигена в пробе.
Интерпретация результатов анализа производится в соответствии со схемой, представленной на рис. 1: при появлении одной окрашенной линии в контрольной зоне (7) делается вывод об отсутствии нуклеокапсидных антигенов вирусов SARS-CoV-2, гриппа типа А и В в испытуемом образце. При появлении двух и более окрашенных линий, одна из которых контрольная (7), делается вывод о присутствии нуклеокапсидных антигенов вирусов SARS-CoV-2 и/или гриппа типа А и/или гриппа типа В в испытуемом образце.
Эффективность данного подхода подтверждается следующими представленным ниже примером:
С использованием заявляемого устройства проводят анализ модельных образцов с содержанием нуклеокапсидных антигенов вирусов SARS-CoV-2, гриппа типа А и В в диапазоне концентрации 0 – 0,6 нг/мл. Образцы получены путем последовательных разведений рекомбинантных антигенов вирусов в натрий-фосфатном буфере.
На поверхность мембраны под образец вносят 3 капли (90 мкл) полученного раствора. Через 10 минут проводят документирование результатов анализа и их последующую цифровую обработку.
На рисунке 2 представлен график полученной зависимости интенсивности окрашивания аналитической зоны (результат цифровой обработки изображений тест-полосок) от концентрации нуклеокапсидных антигенов вирусов SARS-CoV-2, гриппа типа А и В в пробе. Из полученных данных видно, что созданный тест способен проводить идентификацию данных антигенов с пределом обнаружения 0,01 нг/мл, 0,06 нг/мл, 0,15 нг/мл соответственно (начало роста интенсивности окрашивания, т.е. появления линии в аналитической зоне), что превышает показатели тест-ссистемы собранной без использования предлагаемоего состава.
Краткое описание чертежей
На рис. 1 изображена схема тест-полоски: 1 – впитывающая мембрана, 2 – рабочий натрий-фосфатный буфер для разведения образца, 3 – предобработанная мембрана под конъюгат, 4 – аналитическая зона рабочей мембраны с сорбированными мАт против гриппа типа В, 5 – аналитическая зона рабочей мембраны с сорбированными мАт против гриппа типа А, 6 – аналитическая зона рабочей мембраны  с сорбированными мАт против SARS-CoV-2, 7 – контрольная зона рабочей мембраны  с сорбированными антивидовыми антителами, 8 – адсорбирующая мембрана.
На рис. 2 изображена калибровочные кривые иммунохроматографического определения нуклеокапсидных антигенов вирусов SARS-CoV-2, гриппа типа А и В в модельных образцах в диапазоне концентраций 0 – 0,6 нг/мл: 9 – определение антигенов вируса SARS-CoV-2 в системе с предобработкой мембраны под конъюгат, 10 - определение антигенов вируса SARS-CoV-2 в системе без предобработки мембраны под конъюгат, 11 -  определение антигенов вируса гриппа типа А в системе с предобработкой мембраны под конъюгат, 12 - определение антигенов вируса гриппа типа А в системе без предобработки мембраны под конъюгат, 13 -  определение антигенов вируса гриппа типа В в системе с предобработкой мембраны под конъюгат, 14 -  определение антигенов вируса гриппа типа В в системе без предобработки мембраны под конъюгат.