Сравнение эффективности методов получения функционально активных кардиомиоцитов человека

46

Оригинальные исследования

Сравнение эффективности методов

получения функционально активных кардиомиоцитов

человека

А. А Худяков, Д. И Курапеев, А. А Костарева, А. Б Малашичева

Федеральный Центр сердца, крови и эндокринологии им. В.А. Алмазова МЗ РФ,

Санкт-Петербург

Comparison of different methods for generation of functional human cardiomyocytes

A.A. Khudiakov, D.I. Kurapeev, A.A. Kostareva, A.B. Malashicheva Federal Almazov heart blood and endocrinology centre, Saint-Petersburg

Задача получения кардиомиоцитов человека in vitro важна как с точки зрения фундаментальной науки, так и для «регенеративной медицины». Опубликовано множество протоколов получения культуры кардиомиоцитов той или иной степени эффективности, однако на практике каждый исследователь сталкивается с тем, что опубликованные методики приходится адаптировать в конкретной лаборатории для конкретных задач. Целью настоящей работы было сравнить три метода получения кардиомиоцитов в культуре: 1) из образца миокарда путём получения клеток-предшественниц и их последующей дифференцировки в кардиомиоцитарном направлении; 2) из мультипотентных мезенхимных стромальных клеток жировой ткани; 3) из фибробластов кожи человека путём их репрограммирования и последующей дифференци-ровки в кардиомиоциты c использованием опубликованного ранее протокола [18] c авторскими модификациями.

Показана невысокая эффективность получения кардиомиоцитов в культуре из клеток-предшественниц миокарда взрослого человека и из мультипотентных мезенхимных стромальных клеток; эффективность получения кардиомиоцитов с применением репрограммированных клеток оказалась значительно выше. Обсуждены преимущества и недостатки каждого метода и перспективы их использования.

Ключевые слова: репрограммирование, кардиомиоциты, дифференцировка.

Заболевания сердечно-сосудистой системы являются основной причиной смертности в развитых странах. Поскольку способность миокарда к регенерации низка, текущие терапевтические подходы ограничены. В связи с этим актуальным является получение культуры кардиомиоцитов человека in vitro. Такие культуры могут стать источником кардиомиоцитов для замещения рубцовой ткани в очаге повреждения и также важны в качестве модели для изучения нормального и патологического состояний сердца на клеточном и молекулярном уровне.

Техника изолирования зрелых кардиомиоцитов крыс была впервые описана в 1977 г. [1]. Изучение изолированных кардиомиоцитов ограничено, поскольку эти клетки не способны пролиферировать в культуре и могут поддерживаться в течение сравнительно короткого периода времени [2]. Данная модель позволяет изучать электрофизиологические характеристики, но не развитие кардиомиоцитов. Большинство долговременных исследований на

Generation of human cardiomyocytes in vitro is important for basic science and for regenerative medicine. There are a lot of published protocols describing the cardiomyocytes obtaining with different efficacy. However in practice, a researcher is faced with the fact that published methods have to be adapted to a particular laboratory for specific tasks. The aim of this study was to compare three methods for generation of human cardiomyocytes in vitro: 1) from human adult heart sample by purifying myocardial progenitor cells and their subsequent differentiation into cardiomyocyte direction; 2) from human adipose tissue multipotent mesenchimal stromal cells (AT-MSC); 3) from human dermal fibroblasts using reprogramming technology and subsequent differentiation to cardiomyocytes.

We have shown relatively low efficiency of cardiac progenitor cells and AT-MSC capacity to give rise to cardiomyocyte lineage. The effectiveness of cardiomyocytes differentiation from dermal fibroblasts by reprogramming technology was significantly higher. The advantages, disadvantages and perspectives of each method are discussed.

Key words: reprogramming, cardiomyocytes, differentiation.

культуре кардиомиоцитов проводится с использованием эмбриональных и неонатальных кардиомиоцитов, что исключает возможность проведения подобных исследований на человеке.

Другой подход получения культуры кардиомиоцитов заключается в индукции направленной диф-ференцировки клеток различных типов в кардио-миоцитарном направлении. Было показано, что ряд тканеспецифичных стволовых клеток и кле-ток-предшественниц, таких как мультипотентные мезенхимные стромальные клетки (ММСК) [3] и эндотелиальные прогенеторные клетки [4], обладают способностью дифференцироваться в кардиомиоциты. Опубликовано несколько методов получения культур клеток-предшественниц кардиомиоцитов (КПКМ) из миокарда взрослого организма (человека или животных) путём диссоциации ткани, получения резидентных стволовых клеток сердца и последующей индукции их дифференцировки в кардиомиоци-тарном направлении [5—7].

e-mail: malashicheva abalmazovcentre.ru

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 2, 2013

Оригинальные исследования

47

Возможным источником кардиомиоцитов могут являться ММСК, получаемые из костного мозга или жировой ткани. Существуют протоколы, обеспечивающие дифференцировку ММСК в кардиомиоцитар-ном направлении [8—10]. В основном эти методы сводятся к активации клеток 5-азацитидином и последующей спонтанной дифференцировке в кардио-миоцитно-мышечном направлении.

На сегодняшний день наиболее разработанной стратегией получения культуры кардиомиоцитов и клеток, подобных кардиомиоцитам, является использование эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) [11, 12]. ЭСК обладают способностью к дифференцировке во многие клеточные типы — плюри-потентностью, что даёт широкие возможности для изучения процессов раннего развития [13]. Однако трансляция результатов исследований, связанных с ЭСК, в клиническую практику в настоящее время затруднена в виду различного рода ограничений, касающихся использования эмбрионального материала — источника ЭСК.

С открытием индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (иПСК) [14], которые аналогичны по свойствам ЭСК, получение кардиомиоцитов стало возможным еще и из этого типа клеток. Разработано множество комбинаций репрограммирующих факторов, чаще всего представляющих собой различные комбинации 6 генов (Oct4, Sox2, Klf4, cMyc, Nanog и Lin28), в некоторых случаях требующие добавок в виде ферментов или малых молекул [15, 16].

Задачей данной работы было сравнить эффективность разных методов получения кардиомиоцитов с точки зрения возможности и перспективности их применения в исследованиях по изучению патогенеза врождённых и наследственных заболеваний сердца. Мы выбрали три метода — первый, опубликованный ранее метод получения кардиомиоцитов из клеток-предшественниц, которые присутствуют в миокарде взрослого человека [5]. Также данный протокол не требует внесения генетических конструкций, что значительно снижает сложность и стоимость его осуществления. Вторым был выбран метод получения кардиомиоцитов из ММСК жировой ткани [9], благодаря доступности эксплантации тканевого источника. Третий способ — получение кардиомиоцитов при помощи технологии репрограммирования клеток — был выбран, так как его применение предполагает возможность исследовать клетки от конкретного пациента, а также в связи с его высокой эффективностью (согласно данным литературы). Недостатки и преимущества каждого из методов рассмотрены и обсуждаются в работе.

Материал и методы

Исследование проводилось в соответствии со стандартами Хельсинкской Декларации (1989), всеми пациентами, у которых получали биологический материал, было подписано информированное согласие.

Получение КПКМ из ткани миокарда

и их дифференцировка в кардиомиоциты

Получение КПКМ из миокарда и индукцию их дифференцировки в кардиомиоцитарном направлении проводили, как это было описано ранее [6]. Полученный в ходе операции на сердце фрагмент ткани миокарда (auricula cordis) отмывали от остаточной крови, измельчали и подвергали ферментативной

обработке коллагеназой А (0,7 мг/мл) в течение 2 ч при 37°С. Затем ткань пропускали через нейлоновый фильтр с диаметром пор 40 мкм. Суспензию клеток высевали в клональной плотности на 6-лу-ночные платы в среде, содержащей 22,5% EGM-2, (Lonza, США), 67,5% M199, 10% FBS, 1х раствор аминокислот MEM (Invitrogen, США), 1x гентамицин, (Invitrogen, США). Через 3—4 нед. клетки пересевали в плотности 104 кл/см2, через сутки среду заменяли на дифференцировочную (47% IMDM, 47% Ham's F12, 2% лошадиной сыворотки, 1х раствор аминокислот MEM, 1x инсулин-трансферрин-селен, 1х гентамицин (Invitrogen, США). Через 6—8 ч среду заменяли на дифференцировочную, содержащую 5yUM 5-азацитидина (Sigma-Aldrich, США). В течение следующих трёх суток в среду добавляли 5-аза-цитидин. На шестой день с момента начала индукции дифференцировки к среде добавляли 10-4 M аскорбиновой кислоты (Sigma-aldrich, США) и 1 нг/мл TGF-P1 (Peprotech, США). Начиная с этого момента, добавляли аскорбиновую кислоту раз в двое суток и TGF-P1 дважды в неделю. Замену среды проводили каждые 2—3 сут. Продолжительность дифференци-ровки составляла 24 сут.

Дифференцировка ММСК жировой ткани

в кардиомиоцитарном направлении

ММСК получали из биоптата жировой ткани здоровых доноров по описанной ранее методике [17]. Культуры вели в среде а-МЕМ (Панэко, Россия) с добавлением 10% фетальной сыворотки Hyclone, 50 МЕ/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина (Invitrogen, США). Для подтверждения принадлежности полученных культур к ММСК проводили им-мунофенотипирование с использованием антител к CD19, CD34, CD45, CD73, CD90, CD105, CD146, CD166 по стандартной методике на цитофлюори-метре Millipore Guava easyCytе. Дифференцировку в кардиомиоцитарном направлении индуцировали при помощи 5-азацитидина, как это было описано ранее [9].

Получение и культивирование

репрограммированных клеток

Репрограммирование осуществлялось при помощи трансдукции клеток лентивирусными векторами, несущими полицистронную кассету STEMCCA, содержащую кодирующие последовательности генов OCT4, SOX2, KLF4 и c-MYC [18]. Набор плазмид для сборки лентивирусных частиц был любезно предоставлен Dr. Kaomei Guan (Медицинский университет, Гёттинген, Германия).

Для репрограммирования использовали культуру фибробластов кожи человека на 5 пассаже. Культура фибробластов кожи была любезно предоставлена Натальей Юдинцевой (Институт Цитологии РАН) [19]. Фибробласты кожи культивировали в среде DMEM (Invitrogen, США), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Invitrogen, США). 2,4х103 фибробластов трансдуцировали супернатантом клеток, содержащим лентивирусные частицы. Через 6 сут. после трансдукции клетки пересевали в соотношении 1:4 на фидерный слой мышиных эмбриональных фибробластов, инактивированных 0,01 мг/мл митомицина С (Serva, Германия). Дальнейшее культивирование осуществлялось в среде для ЭСК, включающей DMEM/F12 (Invitrogen, США),

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 2, 2013

48

Оригинальные исследования

20% заменителя сыворотки KOSR (Invitrogen, США), раствор заменимых аминокислот (Invitrogen, США), b-меркаптоэтанол (Sigma-aldrich, США), 10 нг/мл bFGF (Peprotech, США).

Спустя 3 нед. индивидуальные колонии репро-граммированных клеток изолировали механически и культивировали в течение 10 пассажей. Колонии пассировали в соотношении 1:4 при помощи раствора коллагеназы IV (Worthington Biochemical, США) в концентрации 200 ед./мл в среде DMEM.

Дифференцировка репрограммированных клеток

в кардиомиоциты

Индукцию дифференцировки проводили методом формирования эмбриоидных тел. Колонии ре-программированных клеток снимали с чашек при помощи коллагеназы и переносили в чашки Петри (диаметр 6 см) с гидрофобной поверхностью. На следующий день среду меняли на дифференциро-вочную: IMDM (Invitrogen, США) с 20% эмбриональной телячьей сыворотки (Invitrogen, США), добавляли ингибитор p38 MAPK киназы SB 203580 (конечная концентрация 10 мкМ, Calbiochem, Германия). На 8 сут. эмбриоидные тела пересаживали в лунки 6-луночного планшета, покрытые 0,1% раствором желатина на PBS. Среду меняли каждые 4 сут. Дифференцировку осуществляли в течение 35 сут. Эффективность дифференцировки оценивали процентным отношением количества спонтанно сокращающихся эмбриоидных тел к общему числу на 35 сут.

Анализ экспрессии маркеров методом ПЦР

с обратной транскрипцией

РНК из клеток выделяли при помощи TRIzolReagent (Invitrogen, США) согласно рекомендациям производителя. 1 мкг выделенной РНК использовали в реакции обратной транскрипции, используя RevertAid™ First Strand cDNA Synthesis Kit,

Fermentas в соответствии с рекомендациями производителя. Далее проводили ПЦР по следующей схеме: 95°С — 30 с, затем 35 циклов (95°С — 30 с, Tm — 30 мин, 72°С — 45 с) и 72°С — 7 мин. Использовавшиеся праймеры указаны в таблице. Температуру отжига праймеров (Tm) определяли при помощи онлайн-сервиса Oligo Analizer (Integrated DNA technologies, http://eu.idtdna.com/analyzer/ applications/oligoanalyzer/).

Иммуноцитохимический анализ

Использовали следующие антитела: к Oct4

(Santa Cruz, США), к Nanog, SSEA-1, Tra-1-81, Tra-1-60 (Milllipore, США), к десмину, клону D33 (Dako, Дания), к тропомиозину (Santa Cruz, США), к а-актинину (Santa Cruz, США), к тропонину Т (Thermo Scientific, США). Для иммуноцитохимической реакции колонии репрограммированных клеток выращивали на покровных стёклах. Сокращающиеся спонтанно кластеры кардиомиоцитов механически изолировали и культивировали в течение 3 сут. на среде IMDM, содержащей 5% эмбриональной телячьей сыворотки и раствор заменимых аминокислот, на чашках Петри с гидрофобной поверхностью. Для получения суспензии клетки инкубировали в растворе коллагеназы II (300 ед./мл) и коллагеназы IV (200 ед./мл) (Worthington Biochemical, США) в среде DMEM в течение 30 мин, регулярно перемешивая. Полученную суспензию центрифугировали в течение 3 мин при 1200 g, супернатант удаляли, ресуспендировали в среде IMDM, содержащей 3% эмбриональной телячьей сыворотки и раствор заменимых аминокислот, и высевали на покровные стёкла, предварительно покрытые желатином.

Препараты анализировали при помощи флуоресцентного микроскопа Axio Observer (Carl Zeiss, Германия). Обработку изображения производили в программе Axiovision Rel.4.7 (Carl Zeiss, Германия).

Последовательности праймеров, использовавшихся для амплификации маркеров

Маркер Прямой праймер

Oct 3/4 GACAGGGGGAGGGGAGGAGCTAGG CTTCCCTCCAACCAGTTGCCCCAAAC

Nanog CAGCCCTGATTCTTCCACCAGTCCC TGGAAGGTT CCCAGT CGGGTT CACC

cMyc GCGTCCTGGGAAGGGAGAT CCGGAGC TTGAGGGGCATCGTCGCGGGAGGCTG

Sox2 GGGAAATGGGAGGGGTGCAAAAGAGG TTGCGTGAGTGTGGATGGGATTGGTG

Nkx 2.5 GGCCTCAATCCCTACGGTTA CACGAGAGTCAGGGAGCTGT

Миозин, тяжёлая цепь GTCATTGCT GAAACCGAGAAT G GCAAAGTACTGGATGACACGCT

Миозин, лёгкая цепь GGCGAGTGAACGTGAAAA AT CAGCATTTCCCGAACGTA AT

GATA-4 GACGGGTCACTATCTGTGCAAC AGACAT CGCACT GACT GAGAAC

MEF 2C GAACAATCCCGGTGTGTCAGGA CACCCAGTGGCAGCCTTTTACA

Тропонин Т GGCAGCGGAAGAGGATGCTGAA GAGGCACCAAGTTGGGCATGAACGA

GAPDH CAAGGTCATCCATGACAACTTTG GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 2, 2013

Оригинальные исследования

49

Результаты

Получение кардиомиоцитов из КПКМ На начальном этапе работы мы следовали опубликованному протоколу получения кардиомиоцитов из резидентных стволовых клеток миокарда [6]. Из фрагмента послеоперационного миокарда человека была получена культура так называемых КПКМ. Далее эти клетки были индуцированы к дифферен-цировке, как это описано ранее [6]. Через 24 сут. клетки изменяли морфологию, однако спонтанных сокращений мы не наблюдали. Для подтверждения

дифференцировки в кардиомиоцитарном направлении мы проверили экспрессию маркеров, специфичных для кардиомиоцитов. В дифференцированных клетках детектировались саркомерные белки: а-актинин и тропонин I (рис. 1), мРНК, специфичных для кардиомиоцитов маркеров тропонина Т и MEF 2C и несколько повышалась экспрессия маркера карди-омиоцитарной линии Nkx 2.5, который на высоком уровне уже присутствовал в клетках-предшествен-ницах, что свидетельствовало о кардиомиоцитарной природе полученных из миокарда клеток (рис. 2).

Рис. 1. Культура клеток-предшественниц кардиомиоцитов:

А, В - недифференцированные клетки; Б, В - клетки, дифференцированные в кардиомиоцитарном направлении. Иммуноцитохимическая реакция: А, Б - с антителами к а-актинину; В, Г - с антителами к тропонину I. Визуализация ядер DAPI. Масштабный отрезок - 200 мкм

М

Д

К

Рис. 2. Экспрессия кардиомиоцитарных маркеров:

М - клетки миокарда человека;

К - недифференцированные клетки-предшественницы; Д -клетки-предшественницы, дифференцированные в кардиомиоцитарном направлении.

Электрофорез продуктов ПЦР с обратной транскрипцией в агарозном геле

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 2, 2013

50

Оригинальные исследования

Однако маркер мышечной дифференцировки MHC (тяжёлая цепь миозина), а также специфические для кардиомиоцитов маркеры (десмин и сердечный актин) ни в предшественниках, ни в дифференцированных клетках выявить не удалось.

Таким образом, из фрагмента миокарда взрослого человека была получена культура клеток-пред-шественниц, способных к дифференцировке в кар-диомиоцитарном направлении с экспрессией ряда специфичных для кардиомиоцитов маркеров.

Получение кардиомиоцитов из ММСК

жировой ткани

ММСК жировой ткани были получены по описанной ранее методике и проанализированы на экспрессию стандартной для ММСК панели маркеров [17]. По данным иммунофенотипирования донорские клетки 3 пассажа имели следующий фенотип: CD73+/CD90+/CD105 + ; эндотелиальные и гемопоэтические маркеры (CD19, CD 34, CD45) определялись на минимальном уровне.

Была индуцирована дифференцировка ММСК в кардиомиоцитарном направлении с помощью 5-аза-цитидина, как это было описано ранее [9]. Полученные в результате клетки были проанализированы таким же образом, как это описано выше для предшественников кардиомиоцитов. По нашим оценкам (согласно визуальному подсчёту клеток) 0,1% клеток экспрессировал а-актинин и тропонин I. Таким образом, воздействие 5-азацитидина не приводило к эффективной дифференцировке ММСК в кардиомиоцитарном направлении.

Репрограммирование фибробластов кожи

человека

Репрограммированные клетки получали из фибробластов кожи путём их трансдукции лентивиру-сом, содержащим набор кодирующих последовательностей: Oct 3/4, Klf4, Sox2, cMyc, необходимых для экспрессии 4 функциональных транскрипционных факторов. В ходе исследования были получены и проанализированы несколько линий репрограмми-рованных клеток, как это общепринято.

Характеристика репрограммированных клеток включала анализ ряда маркеров плюрипотентности, экспрессирующихся в иПСК и ЭСК. Методом ПЦР с обратной транскрипцией c использованием праймеров, комплементарных 5'-некодирующему участку

мРНК, была показана эндогенная экспрессия транскрипционных факторов: Oct 3/4, Nanog, Sox2, cMyc, что свидетельствует о состоянии плюрипотентности репрограммированных клеток (рис. 3). С помощью иммуноцитохимического исследования была выявлена экспрессия поверхностных антигенов: Tra-1-60, Tra-1-81, SSEA-3 и транскрипционных факторов: Oct 3/4, Nanog (рис. 4). Экспрессия маркеров плюрипотентности между линиями практически не различалась.

Дифференцировка репрограммированных клеток

в кардиомиоциты

Индукцию дифференцировки линий репрограм-мированных клеток в кардиомиоциты осуществляли по ранее опубликованному методу [18] с авторскими модификациями. Преимуществом такого протокола является возможность его применения для эффективной дифференцировки репрограммированных клеток, полученных из различных типов исходных клеток. Это позволяет использовать большой спектр тканей в качестве источника первичной культуры клеток для репрограммирования.

Ключевой стадией дифференцировки является состояние эмбриоидных тел — клеточных агрегатов, формирующихся при помещении колоний репрограммированных клеток на неадгезивную поверхность. Модификацией опубликованного метода являлось применение ингибитора p38 MAPK киназы SB 203580 [20].

На 7-е сут. дифференцировки наблюдали спонтанные ритмические сокращения отдельных эмбрио-идных тел. Сокращение эмбриоидных тел учащалось в присутствии адреналина и угнеталось верапами-лом с проявлением характерной для кардиомиоцитов фармакокинетики. На 35-е сут. дифференцировки в кардиомиоцитах выявляли специфические транскрипционные факторы и белки саркомера. Была выявлена мРНК транскрипционных факторов GATA 4 и MEF 2C и белки саркомера: тяжёлая и лёгкая цепи миозина, сердечная изоформа тропонина Т, десмин, тропомиозин, а-актинин (рис. 5). Наблюдалась поперечная исчерченность клеток, характерная для зрелых кардиомиоцитов.

Таким образом, использование данного метода привёло к получению функционально активных кардиомиоцитов.

К 1 2

Oct 3/4 Nanog

cMyc Sox 2 GAPDH

Рис. 3. Экспрессия маркеров плюрипотентности репрограммированными клетками:

К - контроль, тотальная РНК фибробластов кожи человека; 1,2 - линии репрограммированных клеток.

Электрофорез продуктов ПЦР с обратной транскрипцией в агарозном геле

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 2, 2013

Оригинальные исследования

51

И

К

1 _ 1'-|_r

Рис. 4. Культуры кардиомиоцитов, полученных из репрограммированных клеток.

Экспрессия: А, Б - Oct 3/4; В, Г - Nanog; Д, Е - Tra-1-60; З, Ж -Tra-1-81; И, К - SSEA-3. А, В, Д, Ж, И - кардиомиоциты, полученные из репрограммированных клеток линии 1; Б, Г, Е, З, К - кардиомиоциты, полученные из репрограммированных клеток линии 2. Иммуноцитохимическая реакция, визуализация ядер DAPI. Масштабный отрезок - 300 мкм

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 2, 2013

52

Оригинальные исследования

Рис. 5.

Кардиомиоциты, полученные из репрограммированных клеток.

Экспрессия: А, Б - тропомиозина;

В, Г - сердечной изоформы тропонина-Т;

Д, Е - а-актинина;

Ж, З - десмина.

А, В, Д, Ж - репрограммированные клетки линии 1;

Б, Г, Е, З - репрограммированные клетки линии 2. Иммуноцитохимическая реакция, визуализация ядер DAPI.

Масштабный отрезок - 30 мкм

Обсуждение

Нами проведено сравнение трех методов получения кардиомиоцитов человека in vitro: из КПКМ, из ММСК жировой ткани и из репрограммированных клеток. Метод получения кардиомиоцитов из ММСК являлся весьма привлекательным из-за доступности биологического материала, а также из-за технической простоты и относительно низкой стоимости. Однако, согласно нашим данным, индукция диф-ференцировки ММСК при помощи 5-азацитидина приводила к появлению крайне низкого количества кардиомиоцит-подобных клеток, и, по-видимому, можно говорить об относительной неэффективности этого метода. В литературе не существует единого мнения на эту тему. Так, сообщалось об успешном получении кардиомиоцитов этим способом [9], в то же время, опубликованы данные и о неэффективности метода [21]. Недавно было показано, что среди популяции ММСК жировой ткани существует небольшая субпопуляция клеток, экспрессирующих ранние маркеры кардиомиоцитов — GATA4 и Nkx2.5, — и высказано предположение, что именно такие клетки могут служить предшественниками кардиомиоцитов в популяции ММСК [22]. Кроме того, опубликованы работы, показывающие возможность дифференци-

ровки ММСК в кардиомиоциты и мышечные клетки при помощи ко-культивирования с первичными мышечными клетками, что также указывает на существование мышечного и кардиогенного потенциала в популяции ММСК [23—25], однако эффективные методы индукции дифференцировки этих клеток в мышечном и кардиомиоцитарном направлении остаются предметом дальнейших исследований.

Дифференцировка выделенных из миокарда кле-ток-предшественниц в направлении кардиомиоцитов [6] приводила к видимым изменениям во всей дифференцирующейся популяции, однако из функциональных белков кардиомиоцитов мы смогли детектировать экспрессию лишь а-актинина и тропонина I, в то время как другие белки, характерные для функциональных кардиомиоцитов — десмин и тропонин Т — выявить не удалось. Таким образом, можно говорить скорее о получении этим способом популяции клеток, подобных кардиомиоцитам. Это подтверждают опубликованные данные о том, что дифференцировочная способность клеток-предшественников кардиомиоцитов недостаточна для регенерации миокарда при его повреждении [22]. Несмотря на всё это, данный метод имеет дальнейшие перспективы, в частности, при

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 2, 2013

Оригинальные исследования

53

изучении популяции резидентных стволовых клеток миокарда. Существуют данные о том, что в миокарде разных желудочков и разных предсердий содержатся популяции резидентных стволовых клеток разной потентности [5, 26]. Приведённый метод получения клеток-предшественниц кардиомиоцитов смог бы пролить свет на этот вопрос при исследовании постоперационного и донорского миокарда.

Наиболее эффективным оказался способ получения кардиомиоцитов путём дифференцировки ре-программированных клеток. Репрограммирование осуществлялось факторами Oct 3/4, Klf4, Sox2, cMyc. Был проведён анализ экспрессии получен-

ными клетками общепринятой панели маркеров (рис. 3, 4). Эффективность дифференцировки в кардиомиоциты составила около 10%, что соответствует опубликованным другими группами исследователей данным [18]. На функциональную зрелость кардиомиоцитов указывали несколько факторов: экспрессия специфических белков; способность к спонтанным сокращениям, специфическая реакция на добавление фармакологических препаратов. Необходимо отметить, что наблюдаются различия в экспрессии кардиоспецифичных маркеров между кардиомиоцитами, полученными из различных линий репрограммированных клеток (рис. 5, 6).

М К1 К2 Д1 Д2

Тропонин Т NKX 2.5 MEF 2C MHC MLC 2V GAPDH

Рис. 6. Экспрессия специфических маркеров кардиомиоцитами, полученными из репрограммированных клеток:

М - клетки миокарда человека;

К1, К2 - репрограммированные клетки линий 1 и 2, соответственно; Д1, Д2 - кардиомиоциты, полученные из репрограммированных клеток линий 1 и 2, соответственно.

Электрофорез продуктов ПЦР с обратной транскрипцией в агарозном геле

К неоспоримому преимуществу этого метода можно отнести то, что его использование даёт возможность получить клетки от конкретного пациента из доступного малоинвазивным способом биоматериала (например, биоптата кожи или жировой ткани). В настоящее время общепринято, что репро-граммированные клетки являются перспективным источником для разработок в рамках регенеративной медицины, а также мощным исследовательским инструментом при изучении патогенеза заболеваний. Тем не менее, необходимо отметить ряд существенных ограничений, с которыми встретится исследователь при использовании этого подхода. Процесс получения репрограмированных клеток занимает около 3 мес. В каждом конкретном случае необходимо получить и охарактеризовать несколько линий репрограммированных клеток, а затем наиболее эффективно репрограммированные линии индуцировать к дифференцировке. В настоящее время нет единого мнения о том, какой именно протокол получения кардиомиоцитов из иПСК и ЭСК наиболее эффективен [27, 28]. Существует несколько основных разновид-

ЛИТЕРАТУРА:

1. Jacobson S.L. Culture of spontaneously contracting myocardial cells from adult rats. Cell Structure and Function 1977; 2: 1—9.

2. Mitcheson, J.S., Hancox, J.C., Levi, A.J. Cultured adult cardiac myocytes: future applications, culture methods, morphological and electrophysiological properties. Cardiovascular Research 1998; 39(2): 280-300.

3. Makino S., Fukuda K., Miyoshi S. et al. Cardiomyocytes can be generated from marrow stromal cells in vitro. J. Clinic. Investig. 1999; 103(5): 697-705.

4. Badorff C., Brandes R.P., Popp R. et al. Transdifferentiation of blood-derived human adult endothelial progenitor cells into functionally active cardiomyocytes. Circulation 2003; 107(7): 1024-32.

5. Bearzi C., Rota M., Hosoda T. et al. Human cardiac stem cells. PNAS USA 2007; 104(35): 14068-73.

ностей методов с большим количеством модификаций, которые непрерывно совершенствуются. Кроме того, известно, что результаты индукции дифферен-цировки могут зависеть не только от протокола, но и от конкретных сред, сывороток и культуральных компонентов: даже в пределах продукции одного производителя разные партии расходных материалов могут предопределять существенную разницу в уровне дифференцировки клеток.

Успешное получение репрограммированных клеток человека из фибробластов кожи и их диффе-ренцировка в кардиомиоциты позволяет говорить о создании модели кардиомиогенеза и получении культуры кардиомиоцитов in vitro. Полученная модель будет использована нами для исследований механизмов развития сердечных патологий.

Благодарности

Работа выполнена при поддержке грантов Министерства образования и науки Российской Федерации, соглашения: 14.740.11.06, К-32-НИР/111-3, 8786, 8105.

6. Smits A.M., van Vliet P., Metz C.H. et al. Human cardiomyocyte progenitor cells differentiate into functional mature cardiomyocytes: an in vitro model for studying human cardiac physiology and pathophysiology. Nature Protocols 2009; 4(2): 232-43.

7. Takamiya M., Haider K.H., Ashraf M. Identification and characterization of a novel multipotent sub-population of Sca-1 cardiac progenitor cells for myocardial regeneration. PLoS One 2011; 6(9): 1-11.

8. Planat-Benard V., Menard C., Andre M. et al. Spontaneous cardiomyocyte differentiation from adipose tissue stroma cells. Circulation Research 2004; 94(2): 223-9.

9. Antonitsis P., loannidou-Papagiannaki E., Kaidoglou A. et al. Cardiomyogenic potential of human adult bone marrow mesenchymal stem cells in vitro. Thorac. Cardiovasc. Surg. 2008; 56(2): 77-82.

10. van Dijk A., Niessen H.W., Zandieh Doulabi B. et al. Differentiation of human adipose-derived stem cells towards

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 2, 2013

54

Оригинальные исследования

cardiomyocytes is facilitated by laminin. Cell Tissue Research 2008; 334(3): 457-67.

11. Kehat I., Kenyagin-Karsenti D., Snir M. et al. Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes. J. Clinic. Investig. 2001; 108(3): 407-14.

12. Xu C., Police S., Rao N. et al. Characterization and enrichment of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells. Circulation Research 2002; 91(6): 501-8.

13. Thomson J.A., Itskovitz-Eldor J., Shapiro S.S. et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science 1998; 282(5391): 1145-7.

14. Takahashi K., Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 2006; 126(4): 663-76.

15. Yu J., Vodyanik M.A., Smuga-Otto K. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science 2007; 318(5858): 1917-20.

16. Haase A., Olmer R., Schwanke K. et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood. Cell Stem Cell 2009; 5(4): 434-41.

17. Zuk P.A., Zhu M., Mizuno H. et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering 2001; 7(2): 211-26.

18. Streckfuss-Bomeke K., Wolf F., Azizian A. Comparative study of human-induced pluripotent stem cells derived from bone marrow cells, hair keratinocytes, and skin fibroblasts. European heart journal 2012; Epub. ahead of print.

19. Юдинцева Н.М., Блинова М.И., Пинаев Г.П. Особенности организации цитоскелета у фибробластов нормальной, рубцовой и эмбриональной кожи человека, распластанных на белках внеклеточного матрикса. Цитология 2008; 50(10): 861-7.

20. Graichen R., Xu X., Braam S.R. et al. Enhanced cardiomyogenesis of human embryonic stem cells by a small molecular inhibitor of p38 MAPK. Differentiation 2008; 76(4): 357-70.

21. Martin-Rendon E., Sweeney D., Lu F. et al. 5-Azacytidine-

treated human mesenchymal stem/progenitor cells derived from umbilical cord, cord blood and bone marrow do not generate

cardiomyocytes in vitro at high frequencies. Vox sanguinis 2008; 95(2): 137-48.

22. Oh H., Bradfute S.B., Gallardo T.D. et al. Cardiac progenitor cells from adult myocardium: homing, differentiation, and fusion after infarction. PNAS USA 2003; 100(21): 12313-8.

23. He X.Q., Chen M.S., Li S.H. et al. Co-culture with cardiomyocytes enhanced the myogenic conversion of mesenchymal stromal cells in a dose-dependent manner. Mol. Cell Biochem. 2010; 339(1-2): 89-98.

24. Wei F., Wang T., Liu J. et al. The subpopulation of

mesenchymal stem cells that differentiate toward cardiomyocytes is cardiac progenitor cells. Exper. Cell Res. 2011; 317(18):

2661-70.

25. Beier J.P., Bitto F.F., Lange C et al. Myogenic differentiation of mesenchymal stem cells co-cultured with primary myoblasts. Cell Biol. Internat. 2011; 35(4): 397-406.

26. Bollini S., Smart N., Riley P.R. Resident cardiac progenitor cells: at the heart of regeneration. J. Mol. Cell Cardiol. 2011; 50(2): 296-303.

27. Zhang J., Wilson G.F., Soerens A.G. et al. Functional

cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells. Circulation Research 2009; 104(4): 30-41.

28. Mummery C.L., Zhang J., Ng E.S. et al. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview. Circulation Research 2012; 111(3): 344-58.

Поступила 0504.2013

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 2, 2013