СПОСОБЫ АМПЛИФИКАЦИИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ ВИРУСА ГЕПАТИТА С

1. Способ амплификации нуклеиновой кислоты вируса гепатита С (HCV) из HCV-инфицированного образца, предусматривающий амплификацию сегмента ДНК-матрицы, комплементарного РНК-геному HCV из указанного образца, путем двухстадийной полимеразной цепной реакции (ПЦР), в которой на первой стадии ПЦР используется первый внешний праймер и второй внешний праймер, а на второй стадии ПЦР используется первый внутренний праймер и второй внутренний праймер, где
i) нуклеотидная последовательность первого внешнего праймера содержит SEQ ID NO:2:
5'-GAGTAGTGTTGGGTCG-3' (SEQ ID NO:2),
ii) нуклеотидная последовательность второго внешнего праймера содержит SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:4:
5'-CACGCTGTGATAAATG-3' (SEQ ID NO:3) или
5'-CAVGCTGTGATATATG-3' (SEQ ID NO:4),
где V представляет собой А, С или G;
iii) нуклеотидная последовательность первого внутреннего праймера содержит SEQ ID NO:5:
5'-GGTGCTTGCGAGTGCC-3' (SEQ ID NO:5), и
iv) нуклеотидная последовательность второго внутреннего праймера содержит SEQ ID NO:6 или SEQ ID NO:7:
5'-TAGCCAGCCGTGAACC-3' (SEQ ID NO:6) или
5'-TARCCAGCRACGAACC-3' (SEQ ID NO:7),
где R представляет собой А или G.
2. Способ по п.1, в котором каждый из внутреннего и внешнего праймеров независимо является 15-50-членным.
3. Способ по п.1 или 2, в котором
a) нуклеотидная последовательность первого внешнего праймера содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:9, где необязательно один, два или три нуклеотида в положениях от 1 до 14, считая от 5'-конца SEQ ID NO:9, независимо являются нуклеотидами, отличными от тех, которые представлены в SEQ ID NO:9:
5'-CAAGACTGCTAGCCGAGTAGTGTTGGGTCG-3' (SEQ ID NO:9); и
b) нуклеотидная последовательность второго внешнего праймера содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:10 или SEQ ID NO:11, где необязательно один, два или три нуклеотида в положениях от 1 до 12, считая от 5'-конца SEQ ID NO:10 и SEQ ID NO:11, независимо являются нуклеотидами, отличными от тех, которые представлены в SEQ ID NO:10 и SEQ ID NO:11:
5'-CCGGGCAYGAGACACGCTGTGATAAATG-3' (SEQ ID NO:10), или
5'-TCGGGCACGAGACAVGCTGTGATATATG-3' (SEQ ID NO:11),
где Y представляет собой С, Т или U; и V представляет собой А, С или G.
4. Способ по п.1 или 2, в котором
а) нуклеотидная последовательность первого внутреннего праймера содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:12, где необязательно один, два или три нуклеотида в положениях от 1 до 14, считая от 5'-конца SEQ ID NO:12, независимо являются нуклеотидами, отличными от тех, которые представлены в SEQ ID NO:12:
5'-GTACTGCCTGATAGGGTGCTTGCGAGTGCC-3' (SEQ ID NO:12); и
b) нуклеотидная последовательность второго внутреннего праймера содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:13 или SEQ ID NO:14, где необязательно один, два или три нуклеотида в положениях от 1 до 12, считая от 5'-конца SEQ ID NO:13 и SEQ ID NO:14, независимо являются нуклеотидами, отличными от тех, которые представлены в SEQ ID NO:13 и SEQ ID NO:14:
5'-TCTCCCCCGCTGTAGCCAGCCGTGAACC-3' (SEQ ID NO:13) или
5'-TCTCCCCCGCTGTARCCAGCRACGAACC-3' (SEQ ID NO:14),
где R представляет собой А или G.
5. Способ по п.4, в котором
a) нуклеотидная последовательность первого внутреннего праймера содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:15, где необязательно один, два или три нуклеотида в положениях от 1 до 16, считая от 5'-конца SEQ ID NO:15, независимо являются нуклеотидами, отличными от тех, которые представлены в SEQ ID NO:15:
5'-AAGTACTGCCTGATAGGGTGCTTGCGAGTGCC-3' (SEQ ID NO:15); и
b) нуклеотидная последовательность второго внутреннего праймера содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:16 или SEQ ID NO:17, где необязательно один, два или три нуклеотида в положениях от 1 до 13, считая от 5'-конца SEQ ID NO:16 и SEQ ID NO:17, независимо являются нуклеотидами, отличными от тех, которые представлены в SEQ ID NO:16 или SEQ ID NO:17:
5'-ATCTCCCCCGCTGTAGCCAGCCGTGAACC-3' (SEQ ID NO:16) или
5'-ATCTCCCCCGCTGTARCCAGCRACGAACC-3' (SEQ ID NO:17),
где R представляет собой А или G.
6. Способ по п.1 или 2, в котором
a) нуклеотидная последовательность первого внешнего праймера содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:9, где необязательно один, два или три нуклеотида в положениях от 1 до 14, считая от 5'-конца SEQ ID NO:9, независимо являются нуклеотидами, отличными от тех, которые представлены в SEQ ID NO:9:
5'-CAAGACTGCTAGCCGAGTAGTGTTGGGTCG-3' (SEQ ID NO:9);
b) нуклеотидная последовательность второго внешнего праймера содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:10 или SEQ ID NO:11, где необязательно один, два или три нуклеотида в положениях от 1 до 12, считая от 5'-конца SEQ ID NO:10 и SEQ ID NO:11, независимо являются нуклеотидами, отличными от тех, которые представлены в SEQ ID NO:10 и SEQ ID NO:11:
5'-CCGGGCAYGAGACACGCTGTGATAAATG-3' (SEQ ID NO:10), или
5'-TCGGGCACGAGACAVGCTGTGATATATG-3' (SEQ ID NO:11),
где Y представляет собой С, Т или U; и V представляет собой А, С или G;
c) нуклеотидная последовательность первого внутреннего праймера содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:12, где необязательно один, два или три нуклеотида в положениях от 1 до 14, считая от 5'-конца SEQ ID NO:12, независимо являются нуклеотидами, отличными от тех, которые представлены в SEQ ID NO:12:
5'-GTACTGCCTGATAGGGTGCTTGCGAGTGCC-3' (SEQ ID NO:12); и
d) нуклеотидная последовательность второго внутреннего праймера содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:13 или SEQ ID NO:14, где необязательно один, два или три нуклеотида в положениях от 1 до 12, считая от 5'-конца SEQ ID NO:13 и SEQ ID NO:14, независимо являются нуклеотидами, отличными от тех, которые представлены в SEQ ID NO:13 и SEQ ID NO:14:
5'-TCTCCCCCGCTGTAGCCAGCCGTGAACC-3' (SEQ ID NO:13) или
5'-TCTCCCCCGCTGTARCCAGCRACGAACC-3' (SEQ ID NO:14),
где R представляет собой А или G.
7. Способ по п.1 или 2, в котором
a) нуклеотидная последовательность первого внешнего праймера содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:9, где необязательно один, два или три нуклеотида в положениях от 1 до 14, считая от 5'-конца SEQ ID NO:9, независимо являются нуклеотидами, отличными от тех, которые представлены в SEQ ID NO:9:
5'-CAAGACTGCTAGCCGAGTAGTGTTGGGTCG-3' (SEQ ID NO:9);
b) нуклеотидная последовательность второго внешнего праймера содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:10 или SEQ ID NO:11, где необязательно один, два или три нуклеотида в положениях от 1 до 12, считая от 5'-конца SEQ ID NO:10 и SEQ ID NO:11, независимо являются нуклеотидами, отличными от тех, которые представлены в SEQ ID NO:10 и SEQ ID NO:11:
5'-CCGGGCAYGAGACACGCTGTGATAAATG-3' (SEQ ID NO:10), или
5'-TCGGGCACGAGACAVGCTGTGATATATG-3' (SEQ ID NO:11),
где Y представляет собой С, Т или U; и V представляет собой А, С или G;
c) нуклеотидная последовательность первого внутреннего праймера содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:15, где необязательно один, два или три нуклеотида в положениях от 1 до 16, считая от 5'-конца SEQ ID NO:15, независимо являются нуклеотидами, отличными от тех, которые представлены в SEQ ID NO:15:
5'-AAGTACTGCCTGATAGGGTGCTTGCGAGTGCC-3' (SEQ ID NO:15); и
d) нуклеотидная последовательность второго внутреннего праймера содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:16 или SEQ ID NO:17, где необязательно один, два или три нуклеотида в положениях от 1 до 13, считая от 5'-конца SEQ ID NO:16 и SEQ ID NO:17, независимо являются нуклеотидами, отличными от тех, которые представлены в SEQ ID NO:16 и SEQ ID NO:17:
5'-ATCTCCCCCGCTGTAGCCAGCCGTGAACC-3' (SEQ ID NO:16) или
5'-ATCTCCCCCGCTGTARCCAGCRACGAACC-3' (SEQ ID NO:17),
где R представляет собой А или G.
8. Способ по п.1 или 2, в котором нуклеиновая кислота HCV относится к генотипу 1а или 1b.
9. Способ по п.8, в котором нуклеиновая кислота HCV относится к генотипу 1а.
10. Способ по п.9, в котором
а) нуклеотидная последовательность первого внешнего праймера содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:9, где необязательно один, два или три нуклеотида в положениях от 1 до 14, считая от 5'-конца SEQ ID NO:9, независимо являются нуклеотидами, отличными от тех, которые представлены в SEQ ID NO:9;
b) нуклеотидная последовательность второго внешнего праймера содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:10, где необязательно один, два или три нуклеотида в положениях от 1 до 12, считая от 5'-конца SEQ ID NO:10, независимо являются нуклеотидами, отличными от тех, которые представлены в SEQ ID NO:10;
c) нуклеотидная последовательность первого внутреннего праймера содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:12, где необязательно один, два или три нуклеотида в положениях от 1 до 14, считая от 5'-конца SEQ ID NO:12, независимо являются нуклеотидами, отличными от тех, которые представлены в SEQ ID NO:12; и
d) нуклеотидная последовательность второго внутреннего праймера содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:13, где необязательно один, два или три нуклеотида в положениях от 1 до 12, считая от 5'-конца SEQ ID NO:13, независимо являются нуклеотидами, отличными от тех, которые представлены в SEQ ID NO:13.
11. Способ по п.9, в котором
а) нуклеотидная последовательность первого внешнего праймера содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:9, где необязательно один, два или три нуклеотида в положениях от 1 до 14, считая от 5'-конца SEQ ID NO:9, независимо являются нуклеотидами, отличными от тех, которые представлены в SEQ ID NO:9;
b) нуклеотидная последовательность второго внешнего праймера содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:10, где необязательно один, два или три нуклеотида в положениях от 1 до 12, считая от 5'-конца SEQ ID NO:10, независимо являются нуклеотидами, отличными от тех, которые представлены в SEQ ID NO:10;
c) нуклеотидная последовательность первого внутреннего праймера содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:15, где необязательно один, два или три нуклеотида в положениях от 1 до 16, считая от 5'-конца SEQ ID NO:15, независимо являются нуклеотидами, отличными от тех, которые представлены в SEQ ID NO:15; и
d) нуклеотидная последовательность второго внутреннего праймера содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:16, где необязательно один, два или три нуклеотида в положениях от 1 до 13, считая от 5'-конца SEQ ID NO:16, независимо являются нуклеотидами, отличными от тех, которые представлены в SEQ ID NO:16.
12. Способ по п.8, в котором нуклеиновая кислота HCV относится к генотипу 1b.
13. Способ по п.12, в котором
а) нуклеотидная последовательность первого внешнего праймера содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:9, где необязательно один, два или три нуклеотида в положениях от 1 до 14, считая от 5'-конца SEQ ID NO:9, независимо являются нуклеотидами, отличными от тех, которые представлены в SEQ ID NO:9;
b) нуклеотидная последовательность второго внешнего праймера содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:11, где необязательно один, два или три нуклеотида в положениях от 1 до 12, считая от 5'-конца SEQ ID NO:11 независимо являются нуклеотидами, отличными от тех, которые представлены в SEQ ID NO:11;
c) нуклеотидная последовательность первого внутреннего праймера содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:12, где необязательно один, два или три нуклеотида в положениях от 1 до 14, считая от 5'-конца SEQ ID NO:12, независимо являются нуклеотидами, отличными от тех, которые представлены в SEQ ID NO:12; и
d) нуклеотидная последовательность второго внутреннего праймера содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:14, где необязательно один, два или три нуклеотида в положениях от 1 до 12, считая от 5'-конца SEQ ID NO:14, независимо являются нуклеотидами, отличными от тех, которые представлены в SEQ ID NO:14.
14. Способ по п.12, в котором
а) нуклеотидная последовательность первого внешнего праймера содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:9, где необязательно один, два или три нуклеотида в положениях от 1 до 14, считая от 5'-конца SEQ ID NO:9, независимо являются нуклеотидами, отличными от тех, которые представлены в SEQ ID NO:9;
b) нуклеотидная последовательность второго внешнего праймера содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:11, где необязательно один, два или три нуклеотида в положениях от 1 до 12, считая от 5'-конца SEQ ID NO:11 независимо являются нуклеотидами, отличными от тех, которые представлены в SEQ ID NO:11;
c) нуклеотидная последовательность первого внутреннего праймера содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:15, где необязательно один, два или три нуклеотида в положениях от 1 до 16, считая от 5'-конца SEQ ID NO:15, независимо являются нуклеотидами, отличными от тех, которые представлены в SEQ ID NO:15; и
d) нуклеотидная последовательность второго внутреннего праймера содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:17, где необязательно один, два или три нуклеотида в положениях от 1 до 13, считая от 5'-конца SEQ ID NO:17, независимо являются нуклеотидами, отличными от тех, которые представлены в SEQ ID NO:17.
15. Способ по п.1 или 2, в котором амплифицированная нуклеиновая кислота HCV содержит гены, которые кодируют белки С, E1, E2, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A и NS5B.
16. Способ по п.1 или 2, дополнительно предусматривающий стадию формирования ДНК-матрицы, которая комплементарна РНК-геному HCV из указанного образца путем обратной транскрипции (ОТ) с использованием ОТ-праймера, где нуклеотидная последовательность ОТ-праймера содержит на своем 3'-конце SEQ ID NO:1:
n
5'-(А)-АААА-3' (SEQ ID NO:1),
где n является целым числом от 1 до 26.
17. Способ по п.16, в котором n для ОТ-праймера является целым числом от 10 до 20.
18. Способ по п.16, в котором ОТ-праймер на своем 3'-конце содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:8:
5'-FFFFFFFFFFFFFFFFFAFF-3' (SEQ ID NO:8).
19. Способ по п.16, в котором стадия формирования ДНК-матрицы предусматривает выделение перед стадией амплификации РНК HCV из HCV-инфицированного образца с использованием РНК-носителя, выбранного из группы, состоящей из поли-А РНК и бактериальной тРНК.
20. Способ по п.1 или 2, в котором за первой стадией ПЦР следует вторая стадия ПЦР, и в процессе проведения каждой из первой и второй стадий ПЦР каждую реакционную смесь ПЦР независимо инкубируют
a) при температуре Т1 в течение временнуго периода R1 и
b) в дальнейшем проводят множество циклов "touchdown" ПЦР, при этом каждый цикл "touchdown" включает инкубацию реакционной смеси ПЦР
i) при температуре Т2 в течение временного периода R2,
го
ii) затем при температуре [Т3-(V°C×m)] для m цикла в течение временного периода R3 и
iii) затем при температуре Т4 в течение временного периода R4, где
Т1 и Т2 независимо находятся в интервале от 90°С до 100°С;
Т3 и Т4 независимо находятся в интервале от 65°С до 70°С;
R1 находится в интервале от 1 мин до 5 мин;
R2 находится в интервале от 5 с до 45 с;
R3 находится в интервале от 10 с до 40 с;
R4 находится в интервале от 5 мин до 20 мин; и
V находится в интервале от 0,2°С до 0,8°С.
21. Способ по п.20, в котором
R1 находится в интервале от 1 мин до 3 мин;
R2 находится в интервале от 10 с до 20 с;
R3 находится в интервале от 15 с до 25 с;
R4 находится в интервале от 8 мин до 15 мин; и
число циклов "touchdown" ПЦР находится в интервале от 20 до 50.
22. Способ по п.21, в котором Т1 составляет 94°С, Т2 составляет 94°С, Т3 составляет 68°С, Т4 составляет 68°С, и V составляет 0,5°С, и при этом число циклов "touchdown" ПЦР составляет 30.
23. Способ по п.20, в котором каждая реакционная смесь ПЦР первой и второй стадий ПЦР независимо содержит ДНК-полимеразу Klentaq и ДНК-полимеразу Pfu в соотношении ДНК-полимераза Klentaq: ДНК-полимераза Pfu, составляющем от 1:1 до 3:1.
24. Способ по п.23, в котором реакционная смесь ПЦР первой стадии ПЦР содержит от 2 до 3 единиц ДНК-полимеразы Klentaq и от 1 до 1,5 единиц ДНК-полимеразы Pfu.
25. Способ по п.23, в котором реакционная смесь ПЦР второй стадии ПЦР содержит от 2,5 единиц до 3,5 единиц ДНК-полимеразы Klentaq и от 1 единицы до 2 единиц ДНК-полимеразы Pfu.
26. Способ по п.23, в котором реакционная смесь ПЦР каждой из указанных первой и второй стадий ПЦР независимо содержит бетаин в количестве, составляющем от 0,75 М до 2 М.
27. Способ амплификации нуклеиновой кислоты вируса гепатита С (HCV) из HCV-инфицированного образца, предусматривающий амплификацию сегмента ДНК-матрицы, комплементарного РНК-геному HCV из указанного образца, путем двухстадийной полимеразной цепной реакции (ПЦР), в которой на первой стадии ПЦР используется первый внешний праймер и второй внешний праймер, а на второй стадии ПЦР используется первый внутренний праймер и второй внутренний праймер, где
i) нуклеотидная последовательность первого внешнего праймера на своем 3'-конце содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:9, где необязательно один, два или три его нуклеотида независимо являются нуклеотидами, отличными от тех, которые представлены в SEQ ID NO:9:
5'-CAAGACTGCTAGCCGAGTAGTGTTGGGTCG-3' (SEQ ID NO:9);
ii) нуклеотидная последовательность второго внешнего праймера на своем 3'-конце содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:10 или SEQ ID NO:11, где необязательно один, два или три его нуклеотида независимо являются нуклеотидами, отличными от тех, которые представлены в SEQ ID NO:10 и SEQ ID NO:11:
5'-CCGGGCAYGAGACACGCTGTGATAAATG-3' (SEQ ID NO:10), или
5'-TCGGGCACGAGACAVGCTGTGATATATG-3' (SEQ ID NO:11), где Y представляет собой С, Т или U; и V представляет собой А, С или G;
iii) нуклеотидная последовательность первого внутреннего праймера на своем 3'-конце содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:12, где необязательно один, два или три его нуклеотида независимо являются нуклеотидами, отличными от тех, которые представлены в SEQ ID NO:12:
5'-GTACTGCCTGATAGGGTGCTTGCGAGTGCC-3' (SEQ ID NO:12); и
iv) нуклеотидная последовательность второго внутреннего праймера на своем 3'-конце содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:13 или SEQ ID NO:14, где необязательно один, два или три его нуклеотида независимо являются нуклеотидами, отличными от тех, которые представлены в SEQ ID NO:13 и SEQ ID NO:14:
5'-TCTCCCCCGCTGTAGCCAGCCGTGAACC-3' (SEQ ID NO:13) или
5'-TCTCCCCCGCTGTARCCAGCRACGAACC-3' (SEQ ID NO:14),
где R представляет собой А или G.
28. Способ по п.27, в котором каждый из внутренних и внешних праймеров независимо является 15-50-членным.
29. Способ по п.27 или 28, в котором нуклеиновая кислота HCV относится к генотипу 1а или 1b.
30. Способ по п.29, в котором нуклеиновая кислота HCV относится к генотипу 1а.
31. Способ по п.30, в котором
а) нуклеотидная последовательность первого внешнего праймера на своем 3'-конце содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:9, где необязательно один, два или три его нуклеотида независимо являются нуклеотидами, отличными от тех, которые представлены в SEQ ID NO:9;
b) нуклеотидная последовательность второго внешнего праймера на своем 3'-конце содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:10, где необязательно один, два или три его нуклеотида независимо являются нуклеотидами, отличными от тех, которые представлены в SEQ ID NO:10;
c) нуклеотидная последовательность первого внутреннего праймера на своем 3'-конце содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:12, где необязательно один, два или три его нуклеотида независимо являются нуклеотидами, отличными от тех, которые представлены в SEQ ID NO:12, и
d) нуклеотидная последовательность второго внутреннего праймера на своем 3'-конце содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:13, где необязательно один, два или три его нуклеотида независимо являются нуклеотидами, отличными от тех, которые представлены в SEQ ID NO:13.
32. Способ по п.30, в котором
a) нуклеотидная последовательность первого внешнего праймера на своем 3'-конце содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:9, где необязательно один, два или три его нуклеотида независимо являются нуклеотидами, отличными от тех, которые представлены в SEQ ID NO:9;
b) нуклеотидная последовательность второго внешнего праймера на своем 3'-конце содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:10, где необязательно один, два или три его нуклеотида независимо являются нуклеотидами, отличными от тех, которые представлены в SEQ ID NO:10;
c) нуклеотидная последовательность первого внутреннего праймера на своем 3'-конце содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:15, где необязательно один, два или три его нуклеотида независимо являются нуклеотидами, отличными от тех, которые представлены в SEQ ID NO:15; и
d) нуклеотидная последовательность второго внутреннего праймера на своем 3'-конце содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:16, где необязательно один, два или три его нуклеотида независимо являются нуклеотидами, отличными от тех, которые представлены в SEQ ID NO:16.
33. Способ по п.29, в котором нуклеиновая кислота HCV относится к генотипу 1b.
34. Способ по п.33, в котором
a) нуклеотидная последовательность первого внешнего праймера на своем 3'-конце содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:9, где необязательно один, два или три его нуклеотида независимо являются нуклеотидами, отличными от тех, которые представлены в SEQ ID NO:9;
b) нуклеотидная последовательность второго внешнего праймера на своем 3'-конце содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:11, где необязательно один, два или три его нуклеотида независимо являются нуклеотидами, отличными от тех, которые представлены в SEQ ID NO:11;
c) нуклеотидная последовательность первого внутреннего праймера на своем 3'-конце содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:12, где необязательно один, два или три его нуклеотида независимо являются нуклеотидами, отличными от тех, которые представлены в SEQ ID NO:12; и
d) нуклеотидная последовательность второго внутреннего праймера на своем 3'-конце содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:14, где необязательно один, два или три его нуклеотида независимо являются нуклеотидами, отличными от тех, которые представлены в SEQ ID NO:14.
35. Способ по п.33, в котором
a) нуклеотидная последовательность первого внешнего праймера на своем 3'-конце содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:9, где необязательно один, два или три его нуклеотида независимо являются нуклеотидами, отличными от тех, которые представлены в SEQ ID NO:9;
b) нуклеотидная последовательность второго внешнего праймера на своем 3'-конце содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:11, где необязательно один, два или три его нуклеотида независимо являются нуклеотидами, отличными от тех, которые представлены в SEQ ID NO:11;
c) нуклеотидная последовательность первого внутреннего праймера на своем 3'-конце содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:15, где необязательно один, два или три его нуклеотида независимо являются нуклеотидами, отличными от тех, которые представлены в SEQ ID NO:15; и
d) нуклеотидная последовательность второго внутреннего праймера на своем 3'-конце содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:17, где необязательно один, два или три его нуклеотида независимо являются нуклеотидами, отличными от тех, которые представлены в SEQ ID NO:17.
36. Способ по п.27 или 28, в котором амплифицированная молекула нуклеиновой кислоты HCV содержит гены, которые кодируют белки С, E1, E2, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A и NS5B.
37. Способ по п.27 или 28, дополнительно предусматривающий стадию формирования ДНК-матрицы, комплементарной РНК-геному HCV из указанного образца, путем обратной транскрипции (ОТ) с помощью ОТ-праймера, где нуклеотидная последовательность ОТ-праймера содержит на своем 3'-конце SEQ ID NO:1:
n
5'-(А)-АААА-3' (SEQ ID NO:1),
где n является целым числом от 1 до 26.
38. Способ по п.37, в котором n для ОТ-праймера является целым числом от 10 до 20.
39. Способ по п.37, в котором ОТ-праймер на своем 3'-конце содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:8:
5'-АААААААААААААААААААА-3' (SEQ ID NO:8).
40. Способ по п.37, в котором стадия формирования ДНК-матрицы включает выделение перед стадией амплификации РНК HCV из HCV-инфицированного образца с использованием РНК-носителя, выбранного из группы, состоящей из поли-А РНК и бактериальной тРНК.
41. Способ по п.40, в котором РНК HCV примирована ОТ-праймером в 3'-нетранслируемой области (3'-UTR) генома HCV.
42. Способ по п.41, в котором первый внутренний и внешний праймеры независимо примированы в 5'-нетранслируемой области (5'-UTR) генома HCV, а второй внутренний и внешний праймеры независимо примированы в области NS5B генома HCV.
43. Способ по п.27 или 28, в котором за первой стадией ПЦР следует вторая стадия ПЦР, и в процессе каждой из первой и второй стадий ПЦР каждую реакционную смесь ПЦР независимо инкубируют
a) при температуре Т1 в течение временнуго периода R1 и
b) в дальнейшем проводят множество циклов "touchdown" ПЦР, при этом каждый цикл "touchdown" включает инкубацию реакционной смеси ПЦР
i) при температуре Т2 в течение временного периода R2,
го
ii) затем при температуре [Т3-(V°C×m)] для m цикла в течение временного периода R3, и
iii) затем при температуре Т4 в течение временного периода R4, где
Т1 и Т2 независимо находятся в интервале от 90°С до 100°С;
Т3 и Т4 независимо находятся в интервале от 65°С и 70°С;
R1 находится в интервале от 1 мин до 5 мин;
R2 находится в интервале от 5 с до 45 с;
R3 находится в интервале от 10 с до 40 с;
R4 находится в интервале от 5 мин до 20 мин; и
V находится в интервале от 0,2°С до 0,8°С.
44. Способ по п.43, в котором
R1 находится в интервале от 1 мин до 3 мин;
R2 находится в интервале от 10 секунд до 20 секунд;
R3 находится в интервале от 15 секунд до 25 секунд;
R4 находится в интервале от 8 минут до 15 минут; и
число циклов "touchdown" ПЦР находится в интервале от 20 до 50.
45. Способ по п.44, в котором 11 составляет 94°С, Т2 составляет 94°С, Т3 составляет 68°С, Т4 составляет 68°С, и V составляет 0,5°С, и при этом число циклов "touchdown" ПЦР составляет 30.
46. Способ по п.45, в котором каждая реакционная смесь ПЦР первой и второй стадий ПЦР независимо содержит ДНК-полимеразу Klentaq и ДНК-полимеразу Pfu в соотношении ДНК-полимераза Klentaq: ДНК-полимераза Pfu, составляющем от 1:1 до 3:1.
47. Способ по п.46, в котором реакционная смесь ПЦР первой стадии ПЦР содержит от 2 единиц до 3 единиц ДНК-полимеразы Klentaq и от 1 единицы до 1,5 единиц ДНК-полимеразы Pfu.
48. Способ по пункту 46, в котором реакционная смесь ПЦР второй стадии ПЦР содержит от 2,5 единиц до 3,5 единиц ДНК-полимеразы Klentaq и от 1 единицы до 2 единиц ДНК-полимеразы Pfu.
49. Способ по п.48, в котором реакционная смесь ПЦР каждой из указанных первой и второй стадий ПЦР независимо содержит бетаин в количестве, составляющем от 0,75 М до 2 М.
50. Способ по п.1 или 2, в котором стадия амплификации ДНК-матрицы включает
i) амплификацию сегмента ДНК-матрицы посредством первой ПЦР с получением первых ампликонов; и
ii) амплификацию по меньшей мере части первых ампликонов посредством второй ПЦР с получением вторых ампликонов, которые включают амплифицированную нуклеиновую кислоту HCV.
51. Способ анализа нуклеиновой кислоты вируса гепатита С (HCV) в HCV-инфицированном образце, предусматривающий
a) амплификацию ДНК-матрицы, комплементарной РНК-геному HCV из указанного образца, путем двухстадийной полимеразной цепной реакции (ПЦР) по любому из пп.1-50 с получением амплифицированной нуклеиновой кислоты HCV; и
b) секвенирование амплифицированной нуклеиновой кислоты HCV.
52. Способ анализа нуклеиновой кислоты вируса гепатита С (HCV) в HCV-инфицированном образце, предусматривающий
a) амплификацию ДНК-матрицы, комплементарной РНК-геному HCV из указанного образца, путем двухстадийной полимеразной цепной реакции (ПЦР) по любому из пп.1-50 с получением ампликона;
b) клонирование ампликона; и
c) секвенирование нуклеиновой кислоты HCV клонированного ампликона.
53. Способ мониторинга профиля резистентности пациента, инфицированного HCV, предусматривающий
a) получение HCV-инфицированного образца у пациента;
b) амплификацию ДНК-матрицы, комплементарной РНК-геному HCV из указанного образца, путем двухстадийной полимеразной цепной реакции (ПЦР) по любому из пп.1-50; и
с) секвенирование амплифицированной нуклеиновой кислоты HCV.
54. Набор для анализа нуклеиновой кислоты вируса гепатита С (HCV) из HCV-инфицированного образца, содержащий пару внешних ПЦР-праймеров, включающих первый внешний праймер и второй внешний праймер, где
i) нуклеотидная последовательность первого внешнего праймера содержит SEQ ID NO:2:
5'-GAGTAGTGTTGGGTCG-3' (SEQ ID NO:2), и
ii) нуклеотидная последовательность второго внешнего праймера содержит SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:4:
5'-CACGCTGTGATAAATG-3' (SEQ ID NO:3) или
5'-CAVGCTGTGATATATG-3' (SEQ ID NO:4),
где V представляет собой А, С или G.
55. Набор по п.54, в котором
i) нуклеотидная последовательность первого внешнего праймера на своем 3'-конце содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:9, где необязательно один, два или три его нуклеотида независимо являются нуклеотидами, отличными от тех, которые представлены в SEQ ID NO:9:
5'-CAAGACTGCTAGCCGAGTAGTGTTGGGTCG-3' (SEQ ID NO:9), и
ii) нуклеотидная последовательность второго внешнего праймера на своем 3'-конце содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:10 или SEQ ID NO:11, где необязательно один, два или три его нуклеотида независимо являются нуклеотидами, отличными от тех, которые представлены в SEQ ID NO:10 и SEQ ID NO:11:
5'-CCGGGCAYGAGACACGCTGTGATAAATG-3' (SEQ ID NO:10), или
5'-TCGGGCACGAGACAVGCTGTGATATATG-3' (SEQ ID NO:11),
где Y представляет собой С, Т или U, и V представляет собой А, С или G.
56. Набор для анализа нуклеиновой кислоты вируса гепатита С (HCV) из HCV-инфицированного образца, содержащий пару внутренних ПЦР-праймеров, включающий первый внутренний праймер и второй внутренний праймер, где
i) нуклеотидная последовательность первого внутреннего праймера содержит SEQ ID NO:5:
5'-GGTGCTTGCGAGTGCC-3' (SEQ ID NO:5), и
ii) нуклеотидная последовательность второго внутреннего праймера содержит SEQ ID NO:6 или SEQ ID NO:7:
5'-TAGCCAGCCGTGAACC-3' (SEQ ID NO:6) или
5'-TARCCAGCRACGAACC-3' (SEQ ID NO:7),
где R представляет собой А или G.
57. Набор по п.56, в котором
i) нуклеотидная последовательность первого внутреннего праймера на своем 3'-конце содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:12, где необязательно один, два или три его нуклеотида независимо являются нуклеотидами, отличными от тех, которые представлены в SEQ ID NO:12:
5'-GTACTGCCTGATAGGGTGCTTGCGAGTGCC-3' (SEQ ID NO:12); и
ii) нуклеотидная последовательность второго внутреннего праймера на своем 3'-конце содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:13 или SEQ ID NO:14, где необязательно один, два или три его нуклеотида независимо являются нуклеотидами, отличными от тех, которые представлены в SEQ ID NO:13 и SEQ ID NO:14:
5'-TCTCCCCCGCTGTAGCCAGCCGTGAACC-3' (SEQ ID NO:13) или
5'-TCTCCCCCGCTGTARCCAGCRACGAACC-3' (SEQ ID NO:14),
где R представляет собой А или G.
58. Набор по п.57, в котором
i) нуклеотидная последовательность первого внутреннего праймера содержит SEQ ID NO:15:
5'-AAGTACTGCCTGATAGGGTGCTTGCGAGTGCC-3' (SEQ ID NO:15); и
ii) нуклеотидная последовательность второго внутреннего праймера содержит SEQ ID NO:16 или SEQ ID NO:17:
5'-ATCTCCCCCGCTGTAGCCAGCCGTGAACC-3' (SEQ ID NO:16) или
5'-ATCTCCCCCGCTGTARCCAGCRACGAACC-3' (SEQ ID NO:17),
где R представляет собой А или G.
59. Набор по любому из пп.54-58, дополнительно содержащий ОТ-праймер, где нуклеотидная последовательность ОТ-праймера содержит SEQ ID NO:1:
n
5'-(А)-АААА-3' (SEQ ID NO:1), где n является целым числом от 1 до 26.
60. Набор для анализа нуклеиновой кислоты вируса гепатита С (HCV) из HCV-инфицированного образца, содержащий
а) пару внешних ПЦР-праймеров, включающих первый внешний праймер и второй внешний праймер, где
i) нуклеотидная последовательность первого внешнего праймера на своем 3'-конце содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:9, где необязательно один, два или три его нуклеотида независимо являются нуклеотидами, отличными от тех, которые представлены в SEQ ID NO:9:
5'-CAAGACTGCTAGCCGAGTAGTGTTGGGTCG-3' (SEQ ID NO:9), и
ii) нуклеотидная последовательность второго внешнего праймера на своем 3'-конце содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:10 или SEQ ID NO:11, где необязательно один, два или три его нуклеотида независимо являются нуклеотидами, отличными от тех, которые представлены в SEQ ID NO:10 и SEQ ID NO:11:
5'-CCGGGCAYGAGACACGCTGTGATAAATG-3' (SEQ ID NO:10) или
5'-TCGGGCACGAGACAVGCTGTGATATATG-3' (SEQ ID NO:11),
где Y представляет собой С, Т или U, и V представляет собой А, С или G; и
b) пару внутренних ПЦР-праймеров, включающих первый внутренний праймер и второй внутренний праймер, где
i) нуклеотидная последовательность первого внутреннего праймера на своем 3'-конце содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:12, где необязательно один, два или три его нуклеотида независимо являются нуклеотидами, отличными от тех, которые представлены в SEQ ID NO:12:
5'-GTACTGCCTGATAGGGTGCTTGCGAGTGCC-3' (SEQ ID NO:12); и
ii) нуклеотидная последовательность второго внутреннего праймера на своем 3'-конце содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:13 или SEQ ID NO:14, где необязательно один, два или три его нуклеотида независимо являются нуклеотидами, отличными от тех, которые представлены в SEQ ID NO:13 и SEQ ID NO:14:
5'-TCTCCCCCGCTGTAGCCAGCCGTGAACC-3' (SEQ ID NO:13) или
5'-TCTCCCCCGCTGTARCCAGCRACGAACC-3' (SEQ ID NO:14),
где R представляет собой А или G.
61. Набор по п.60, дополнительно содержащий в себя ОТ-праймер, причем нуклеотидная последовательность ОТ-праймера содержит SEQ ID NO:1:
5'-(A)n-AAAA-3' (SEQ ID NO:1), где n является целым числом от 1 до 26.
62. Набор по п.61, в котором нуклеотидная последовательность ОТ-праймера включает SEQ ID NO:8:
5'-АААААААААААААААААААА-3' (SEQ ID NO:8).
63. Набор для анализа нуклеиновой кислоты вируса гепатита С (HCV) из HCV-инфицированного образца, содержащий
a) ОТ-праймер, причем нуклеотидная последовательность ОТ-праймера включает SEQ ID NO:8:
5'-АААААААААААААААААААА-3' (SEQ ID NO:8);
b) пару внешних ПЦР-праймеров, включаюших первый внешний праймер и второй внешний праймер, где
i) нуклеотидная последовательность первого внешнего праймера включает SEQ ID NO:9:
5'-CAAGACTGCTAGCCGAGTAGTGTTGGGTCG-3' (SEQ ID NO:9), и
ii) нуклеотидная последовательность второго внешнего праймера включает SEQ ID NO:10 или SEQ ID NO:11:
5'-CCGGGCAYGAGACACGCTGTGATAAATG-3' (SEQ ID NO:10), или
5'-TCGGGCACGAGACAVGCTGTGATATATG-3' (SEQ ID NO:11),
где Y представляет собой С, Т или U, и V представляет собой А, С или G; и
с) пару внутренних ПЦР-праймеров, включающих первый внутренний праймер и второй внутренний праймер, где
i) нуклеотидная последовательность первого внутреннего праймера включает SEQ ID NO:15:
5'-AAGTACTGCCTGATAGGGTGCTTGCGAGTGCC-3' (SEQ ID NO:15); и
ii) нуклеотидная последовательность второго внутреннего праймера включает SEQ ID NO:16 или SEQ ID NO:17:
5'-ATCTCCCCCGCTGTAGCCAGCCGTGAACC-3' (SEQ ID NO:16) или
5'-ATCTCCCCCGCTGTARCCAGCRACGAACC-3' (SEQ ID NO:17),
где R представляет собой А или G.
64. Набор для анализа нуклеиновой кислоты вируса гепатита С (HCV) из HCV-инфицированного образца, содержащий
a) ОТ-праймер, причем нуклеотидная последовательность указанного ОТ-праймера на своем 3'-конце содержит SEQ ID NO:1:
n
5'-(А)-АААА-3' (SEQ ID NO:1),
где n является целым числом от 1 до 26;
b) пару внешних ПЦР-праймеров, включающих в себя первый внешний праймер и второй внешний праймер, где
i) нуклеотидная последовательность первого внешнего праймера на своем 3'-конце содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO:9, где необязательно один, два или три его нуклеотида независимо являются нуклеотидами, отличными от тех, которые представлены в SEQ ID NO:9:
5'-CAAGACTGCTAGCCGAGTAGTGTTGGGTCG-3' (SEQ ID NO:9), и
ii) нуклеотидная последовательность второго внешнего праймера на своем 3'-конце содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO:10 или SEQ ID NO:11, где необязательно один, два или три его нуклеотида независимо являются нуклеотидами, отличными от тех, которые представлены в SEQ ID NO:10 и SEQ ID NO:11:
5'-CCGGGCAYGAGACACGCTGTGATAAATG-3' (SEQ ID NO:10), или
5'-TCGGGCACGAGACAVGCTGTGATATATG-3' (SEQ ID NO:11),
где Y представляет собой С, Т или U, и V представляет собой А, С или G; и
с) пару внутренних ПЦР-праймеров, включающих первый внутренний праймер и второй внутренний праймер, где
i) нуклеотидная последовательность первого внутреннего праймера на своем 3'-конце содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO:12, где необязательно один, два или три его нуклеотида независимо являются нуклеотидами, отличными от тех, которые представлены в SEQ ID NO:12:
5'-GTACTGCCTGATAGGGTGCTTGCGAGTGCC-3' (SEQ ID NO:12); и
ii) нуклеотидная последовательность второго внутреннего праймера на своем 3'-конце содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO:13 или SEQ ID NO:14, где необязательно один, два или три его нуклеотида независимо являются нуклеотидами, отличными от тех, которые представлены в SEQ ID NO:13 и SEQ ID NO:14:
5'-TCTCCCCCGCTGTAGCCAGCCGTGAACC-3' (SEQ ID NO:13) или
5'-TCTCCCCCGCTGTARCCAGCRACGAACC-3' (SEQ ID NO:14),
где R представляет собой А или G.
65. Набор для анализа нуклеиновой кислоты вируса гепатита С (HCV) из HCV-инфицированного образца, содержащий
a) ОТ-праймер, причем нуклеотидная последовательность указанного ОТ-праймера на своем 3'-конце содержит SEQ ID NO:8:
5'-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3' (SEQ ID NO:8);
b) пару внешних ПЦР-праймеров, включающих первый внешний праймер и второй внешний праймер, где
i) нуклеотидная последовательность первого внешнего праймера содержит SEQ ID NO:9:
5'-CAAGACTGCTAGCCGAGTAGTGTTGGGTCG-3' (SEQ ID NO:9), и
ii) нуклеотидная последовательность второго внешнего праймера содержит SEQ ID NO:10 или SEQ ID NO:11:
5'-CCGGGCAYGAGACACGCTGTGATAAATG-3' (SEQ ID NO:10), или
5'-TCGGGCACGAGACAVGCTGTGATATATG-3' (SEQ ID NO:11),
где Y представляет собой С, Т или U, и V представляет собой А, С или G; и
c) пару внутренних ПЦР-праймеров, включающих первый внутренний праймер и второй внутренний праймер, где
i) нуклеотидная последовательность первого внутреннего праймера содержит SEQ ID NO:12:
5'-GTACTGCCTGATAGGGTGCTTGCGAGTGCC-3'(SEQ ID NO:12); и
ii) нуклеотидная последовательность второго внутреннего праймера содержит SEQ ID NO:13 или SEQ ID NO:14:
5'-TCTCCCCCGCTGTAGCCAGCCGTGAACC-3' (SEQ ID NO:13) или
5'-TCTCCCCCGCTGTARCCAGCRACGAACC-3' (SEQ ID NO:14),
где R представляет собой А или G.
66. Набор для анализа нуклеиновой кислоты вируса гепатита С (HCV) из HCV-инфицированного образца, содержащий
a) ОТ-праймер, причем нуклеотидная последовательность указанного ОТ-праймера содержит SEQ ID NO:8:
5'-АААААААААААААААААААА-3' (SEQ ID NO:8);
b) пару внешних ПЦР-праймеров, включающих первый внешний праймер и второй внешний праймер, где
i) нуклеотидная последовательность первого внешнего праймера содержит SEQ ID NO:9:
5'-CAAGACTGCTAGCCGAGTAGTGTTGGGTCG-3' (SEQ ID NO:9), и
ii) нуклеотидная последовательность второго внешнего праймера содержит SEQ ID NO:10 или SEQ ID NO:11:
5'-CCGGGCAYGAGACACGCTGTGATAAATG-3' (SEQ ID NO:10), или
5'-TCGGGCACGAGACAVGCTGTGATATATG-3' (SEQ ID NO:11),
где Y представляет собой С, Т или U, и V представляет собой А, С или G; и
c) пару внутренних ПЦР-праймеров, включающих первый внутренний праймер и второй внутренний праймер, где
i) нуклеотидная последовательность первого внутреннего праймера содержит SEQ ID NO:15:
5'-AAGTACTGCCTGATAGGGTGCTTGCGAGTGCC-3' (SEQ ID NO:15); и
ii) нуклеотидная последовательность второго внутреннего праймера содержит SEQ ID NO:16 или SEQ ID NO:17:
5'-ATCTCCCCCGCTGTAGCCAGCCGTGAACC-3' (SEQ ID NO:16) или
5'-ATCTCCCCCGCTGTARCCAGCRACGAACC-3' (SEQ ID NO:17),
где R представляет собой А или G.