ПОТЕНЦИОМЕТРИЧЕСКИЙ СЕНСОР ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ

Заявленное техническое решение относится к области аналитической химии, медицины, иммунологии и ветеринарии, а именно к устройствам для определения антител к ДНК, и может быть использовано для обнаружения в сыворотке крови больных аутоиммунными заболеваниями антител, специфичных к нативной ДНК больного.
Аутоиммунные антитела образуются и накапливаются в организме человека или животного как ответная реакция на выброс в кровяное русло внеклеточной ДНК в результате массового апоптоза клеток. Обнаружение антител, относящихся к иммуноглобулинам классов IgG и IgM, является диагностическим критерием аллергических и аутоиммунных заболеваний, а также дисфункций ряда внутренних органов, патологий беременности и натального периода развития. В то же время, в крови здоровых людей антитела к нативной ДНК не встречаются или встречаются в незначительных количествах. Присутствие антител является одним из основных критериев диагностики системной красной волчанки, а также вспомогательным признаком при диагностике аутоиммунного тиреоидита, ревматоидного артрита и других органоспецифичных и системных заболеваний для установления их аутоиммунного характера. Необходимость диагностики аутоиммунных антител связана с неопределенностью проявления симптомов на ранней стадии заболевания и связанной с этим значительной неточностью первичного диагноза аутоиммунных заболеваний.
Для определения аутоантител к нативной ДНК используют устройства, отличающиеся по чувствительности, требующие больших затрат времени и средств и не поддающиеся автоматизации. Известно устройство для иммуноферментного анализа, состоящее из полистирольного планшета для иммуноанализа, на поверхность которого нанесен препарат антигена (нативной или денатурированной ДНК). Для определения антител на поверхность устройства наносят сыворотку крови больного и далее - препарат коньюгата специфического антитела и индикаторного фермента (пероксидазы), после чего в реакционную смесь вносят субстрат фермента, дающий в реакции с ферментом окрашенные продукты. Положительным результатом (наличие антител к ДНК в сыворотке крови) служит появление окраски, интенсивность которой зависит от концентрации антител в крови больного. Устройство позволяет проводить определение антител с высокой чувствительностью (определение антител в сыворотках с оптимальных рабочим разведением 1:100), но имеет следующие недостатки: (1) длительность стадий инкубирования (общая продолжительность анализа более двух часов); (2) многостадийность определения (три стадии с промежуточными отмывками), (3) необходимость применения коньюгата индикаторного фермента со специфичными антителами (патент РФ №2059245, G01N 33/53, 1996 г., Егоров A.M. Осипов А.П. и др. Теория и практика иммуноферментного анализа. Москва: Высшая школа, 1991.- 288 с.)
Известны устройства седиментационного радиоиммуноанализа (система FARR производства Amersham, R.Smeenk, G. van der Lelij, T.Swaak, J.Groenwold, and L.Aarden, Arthritis Rheum. 25 (1982) 631), флюоресцентного иммуноанализа с двунитевыми плазмидными ДНК (EliA™ производства Pharmacia, M.Hemando, С.Gonzalez, A.Sanchez, Р.Guevara, J.A.Navajo, W.Papisch, and J.M.Gonzalez-Buitrago, Clin. Chem. Lab. Med. 40 (2002) 1056) и Crithidia luciliae в качестве субстрата (CLIFT производства Vitro-Immun, L.A.Aarden, Е.R.de Groot, and Т.Е. Feltkamp, Ann. N.Y.Acad.Sci. 254 (1975) 505). К недостаткам данных устройств относятся достаточно большая продолжительность измерения - более 4 часов, применение дорогостоящих и токсичных реагентов.
Известно устройство для определения антител в сыворотке крови. Устройство состоит из серебряного электрода, покрытого пленкой электроосажденной ртути и
нитратцеллюлозной мембраны, содержащей фермент. Для определения антител данное устройство погружали в раствор, полученный при смешивании сыворотки крови с коньюгатом хлорофоса с денатурированной ДНК и специфическим субстратом фермента бутирилхолинэстеразы - бутирилтиохолин иодидом. Концентрацию антител к ДНК измеряли по высоте пика тока на осцилловольтамперограмме раствора при -0.55±0.05 В, высота которого растет пропорционально концентрации антител в сыворотке крови. Применение данного устройства сокращает продолжительность измерения до 20-30 мин. (а.с. СССР №1832198, G01N 33/53, 1993 г.). К недостаткам устройства относятся (1) необходимость синтеза коньюгата ДНК и хлорофоса; (2) использование дополнительных токсичных реагентов (ртуть, хлорофос), а также (3) денатурированной ДНК, сродство которой к антителам отличается от сродства нативной ДНК.
Наиболее близким аналогом, выбранным в качестве прототипа по наибольшему количеству совпадающих признаков и достигаемому техническому результату, является ДНК-сенсор на основе полианилина и нативной ДНК, иммобилизованных посредством кросс-сшивки глутаровым альдегидом на поверхности стеклоуглеродного электрода (А.В.Порфирьева, Г.А.Евтюгин, Е.Ю.Подшивалина, Л.И.Анчикова, Г.К.Будников Журн.анал.химии, принято к печати 19 декабря 2006 г.). Полианилин получали в потенциодинамическом режиме путем многократного сканирования потенциала в интервале от -0.3 В до 0.8 В при скорости смещения потенциала 100 мВ/с. Сигналом сенсора на присутствие антител к нативной ДНК в сыворотке крови является смещение потенциала сенсора при изменении рН раствора от 7.5 (область устойчивости комплекса ДНК-антитело) к 3.0 (область электропроводности полианилина). Сенсор позволяет определять присутствие антител в сыворотке крови больных системной красной волчанкой и аутоиммунным тиреоидитом в интервале разбавлений сыворотки 1:10-1:50. К недостаткам устройства относится немонотонное изменение его потенциала при изменении кислотности среды (прохождение через минимум), что усложняет измерение сигнала и приводит к значительной погрешности оценки сигнала при больших разбавлениях сыворотки. Кроме того, устройство на основе полианилина не позволяет проводить измерения в нейтральной и щелочной средах. Кроме того, полимеризация анилина требует использования высокоочищенного препарата, получаемого в процессе перегонки под аргоном непосредственно перед проведением полимеризации, что требует дополнительных затрат.
Технической задачей создания данной полезной модели является повышение надежности, точности и простоты работы устройства для определения антител в сыворотке крови. Заявленное техническое решение устраняет недостатки, присущие наиболее близкому аналогу, и обеспечивает реализацию поставленной задачи. Технический результат заключается в снижении продолжительности анализа, в повышении точности и надежности определения антител, а также в возможности работы в широком диапазоне рН.
Потенциометрический сенсор для определения антител в сыворотке крови, состоящий из стеклоуглеродного электрода, выполненного из тефлонового корпуса и стеклоуглеродного стержня внутри корпуса, контактирующего с медным токосъемником. Рабочая поверхность стеклоуглеродного стержня покрыта полимерной пленкой, содержащей нативную ДНК. В качестве полимерной пленки используется полимерная форма метиленового зеленого. Полимерная пленка получается путем электрополимеризации метиленового зеленого в нейтральной или слабощелочной среде.
Такое выполнение потенциометрического сенсора обеспечивает технический результат - простоту измерения сигнала в широком диапазоне рН, надежность работы и высокую точность определения антител - за счет использования в составе сенсора покрытия на основе полимерной формы метиленового зеленого. Данное покрытие сохраняет электропроводность и обратимость окислительно-восстановительных свойств в нейтральной и слабощелочной среде. Это приводит к монотонному изменению сигнала
сенсора при изменении рН раствора и концентрации антител в сыворотке крови, что упрощает количественную оценку сигнала и его зависимости от разбавления сыворотки крови.
Конструкция потенциометрического сенсора представлена на фиг.1. Потенциометрический сенсор состоит из стеклоуглеродного электрода, состоящего из токосъемника 1, изолирующего корпуса из политетрафторэтилена 2 и стеклоуглеродного стержня 3, а также из полимерной пленки метиленового зеленого 4 и слоя ДНК, закрепленного кросс-сшивкой глутаровым альдегидом 5. Полимерная пленка должна быть выполнена путем электроосаждения из раствора метиленового зеленого в фосфатном буферном растворе на стеклоуглеродный электрод в потенциодинамическом режиме в интервале от -400 до 750 мВ при скорости сканирования 50-100 мВ/с. Слой ДНК должен быть выполнен путем нанесения поверх полимерной пленки 10 мкл смеси, содержащей ДНК из эритроцитов цыпленка и глутарового альдегида в 0.001 М фосфатном буферном растворе.
Устройство функционирует следующим образом. Для измерения сигнала ДНК-сенсора помещают его и хлоридсеребряный электрод сравнения в фосфатный буферный раствор и измеряют э.д.с. ячейки в течение 20 мин. После этого на рабочую поверхность сенсора поверх слоя ДНК наносят 5 мкл разбавленной сыворотки крови, содержащей антитела к ДНК. Через 10 мин. сенсор промывают в фосфатном буферном растворе и повторяют измерение потенциала сенсора. Разность значений потенциала до и после контакта электрода с разбавленной сывороткой крови рассчитывают как сигнал ДНК-сенсора. Полученные значения в серии измерений по одному параметру усредняют по трем измерениям, воспроизводимость измерений определяют как среднее относительное стандартное отклонение. Воспроизводимость сигнала составляет ±2 мВ (10-15%).
Примеры определения антител к ДНК в сыворотках крови приведены ниже.
Пример 1. Сыворотка крови здорового донора, не содержащая аутоиммунных антител к ДНК. На зависимости сигнала ДНК-сенсора Е от разбавления сыворотки крови наблюдается слабое нерегулярное изменение сигнала, по величине близкое к удвоенному значению погрешности измерения (±4 мВ) (фиг.2).
Пример 2. Сыворотка крови больного системной красной волчанкой с высоким уровнем антител к ДНК по результатам иммуноферментного анализа. На зависимости сигнала Е от разбавления сыворотки наблюдается выраженный максимум при разбавлении сыворотки 1:20-1:50 (фиг.3). Максимальное смещение потенциала составляет 12-25 мВ.
Пример 3. Сыворотка крови больного системным аутоиммунным тиреоидитом (присутствие антител к ДНК подтверждено результатами иммуноферментного анализа). На зависимости сигнала Е от разбавления сыворотки наблюдается максимум при разбавлении 1:20-1:50 (фиг.4). Максимальное смещение потенциала составляет 15-35 мВ.
Таким образом, по сравнению с прототипом предлагаемое устройство имеет следующие преимущества:
1) отсутствует необходимость в строгом контроле кислотности среды;
2) изменение потенциала ДНК-сенсора во времени имеет монотонный характер с выходом на стационарное значение, что позволяет вместо регистрации полной кривой временной зависимости проводить однократное измерение потенциала через 20 мин. после внесения сенсора в анализируемый раствор, в результате существенно упрощается процедура определения антител;
3) снижение погрешности оценки сигнала при больших разбавлениях сыворотки.