Гидролизуемая кислотой композиция, включающая частицы микрогеля, для доставки лекарств в живые организмы и способ ее получения
HYDROLYSABLE ACID COMPOSITION INCLUDING MICROGEL PARTICLES FOR DRUG DELIVERY TO LIVING ORGANISMS AND METHOD FOR ITS PRODUCTION

Настоящее изобретение относится к получению гидролизуемой кислотой композиции, включающей диспергированные в растворе частицы микрогеля, пригодной для использования в качестве терапевтических агентов, способных доставлять биологически активные материалы в клетку. Получение гидролизуемой кислотой композиции, включающей диспергированные в растворе частицы микрогеля, основано на использовании сшивающей молекулы, содержащей пептидные связи. Кроме того, кислотная протеаза, имеющая максимальную активность и стабильность в слабокислых условиях и способность к инактивации при рН выше 7,0, также является неотъемлемой частью химической структуры разрабатываемой гидролизуемой кислотой композиции, включающей диспергированные в растворе частицы микрогеля. Этот новый тип материалов стабилен при нейтральном рН, но способен разлагаться в слабокислой среде, выпуская полезную нагрузку внутрь клетки, что обычно присуще эндосомным или лизосомальным компартментам клеток. Эти материалы также могут быть использованы для доставки терапевтических средств к кислотным регионам опухолей и участкам воспаления.
Водные полимерные микрогели представляют собой слегка сшитые частицы гидрогеля, которые могут поглощать большое количество воды. Среди различных специализированных частиц для доставки лекарственных средств рост интереса к микрогелям в значительной мере стимулировало то, что они проявляют различные многообещающие свойства, такие как высокая пористость, превосходная коллоидная стабильность, транспортные свойства, присущие жидкостям, полностью водная среда и точный контроль размеров частиц [Klinger, D.; Landfester, K. Polymer 2012, 53, 5209-5231]. Способность некоторых микрогелей изменять их объем в ответ на изменение условий окружающей среды (при помощи таких факторов как рН, ионная сила, температура, наличие специфических ионов и других соединений, окислительно-восстановительные условия, или внешние поля) позволяет им захватывать и выпускать захваченные молекулы адаптивным образом [Pelton, R. Adv. Colloid Interface Sci. 2000; 85, 1-33]. Авторы данной статьи столкнулись с огромными трудностями, так как не многим из ученых удалось достичь оптимальной внутренней доступности лекарств внутри клеток из-за отсутствия у таких веществ способности к химическому или биологическому разложению.
В научной литературе встречаются описание структуры и свойств биоразлагаемых микрогелей, содержащих химические связи, расщепляющиеся в физиологических условиях. Примеры такого рода включают в себя химические связи сложных эфиров [Sawhney, A.S.; Pathak, СР.; Hubbell, J.A. Macromolecules, 1993, 26, 581-587], амидов [Jin, S.; Wan, J.; Meng, L.; Huang, X.; Guo, J.; Liu, L.; Wang, C. ACS Appl. Mater. Interfaces 2015, 7, 19843-19852], дисульфидов [Groll, J.; Singh, S.; Albrecht, K.; Moeller, M.J. Polym. Sci., PartA: Polym. Chem. 2009, 47, 5543-5549; Wang, Y.; Nie, J.; Chang, В.; Sun, Y.; Yang, W. Biomacromolecules 2013, 14, 3034-3046].
Основной задачей в области транспортировки лекарственных средств в организме является разработка материалов, способных выпускать содержимое в ответ на патологические раздражители, позволяя задавать адресную доставку лекарств к больным тканям и клеткам. Особенно важным патологическим раздражителем является слабокислая рН. Например, опухоли существуют при кислом рН между 6.4 и 6.8, а фаголизосомы фагоцитарных клеток при рН от 4.5 до 5.0. Кислотная природа этих частей стимулировала необходимость разработок микрогелей, способных разлагаться и избирательно выпускать содержимое при умеренно кислых условиях.
В качестве наиболее близкого аналога известны микрогелевые частицы для доставки биоактивных материалов (Патент WO 2003082316 A1). В данном патенте описано получение микрогелей при помощи ацеталь сшивающего агента, в котором ацеталь связи имеют период полураспада 24 ч при рН 7,4 и только 5 мин при рН 5,0. Тем не менее, биосовместимость соединений, используемых в таком случае, и продуктов разложения до сих пор проверяется.
Заявляемая гидролизуемая кислотой композиция, включающая диспергированные в растворе частицы микрогеля, является универсальной, к тому же биосовместимость и биоразлагаемость компонентов этого материала и продуктов разложения позволяет его использовать для доставки лекарств в живые организмы.
Одной из проблем аналогичных изобретений является то, что частицы микрогелей способны инкапсулировать только гидрофильные препараты, но не способны связываться с гидрофобными или нерастворимыми в воде веществами (Патент US 20050079222 A1, патент US 5078994 А). Если даже удается создать частицы микрогелей, способные к загрузке гидрофобных соединений, то они все равно будут обладать плохой растворимостью в воде из-за низкого гидрофильного содержания. И, к тому же, они склонны образовывать большие мультимолекулярные агрегаты, в результате чего лекарственный препарат не инкапсулируется, а адсорбируется на поверхности агрегатов, что ведет к быстрому высвобождению лекарств.
В заявляемом изобретении упомянутая выше проблема решена путем формирования гидрофобных нанокарманов внутри диспергированных в растворе частиц микрогелей, содержащихся в гидролизуемой кислотой композиции. Причем растворимость в воде полностью сохраняется.
Задачей настоящего изобретения является получение гидролизуемой кислотой композиции, включающей диспергированные в растворе частицы микрогеля, и способной инкапсулировать и высвобождать активные вещества, такие как лекарственные средства и водорастворимые препараты, в ответ на изменение рН.
Техническим результатом изобретения является адресная доставка медицинских лекарств в живые организмы, с использованием гидролизуемой кислотой композиции, включающей диспергированные в растворе частицы микрогеля. В данном изобретении предлагается использование частиц адаптивных микрогелей в качестве наноносителей лекарственных средств и водорастворимых препаратов. Главными преимуществами данного изобретения являются биосовместимость и биоразлагаемость компонентов гидролизуемой кислотой композиции, включающей диспергированные в растворе частицы микрогеля. Так же разработанный способ получения такой гидролизуемой кислотой композиции предоставит возможность для осуществления однородной и эффективной загрузки гидрофобных лекарственных препаратов, что является существенной проблемой для большинства аналогичных технических решений. Немаловажным преимуществом разработанного способа является возможность ограничения размеров частиц микрогеля, содержащихся в композиции, от 200 до 500 нм, в частных случаях реализации изобретения, что является оптимальным для иммунного фагоцитоза. Предлагаемый способ довольно прост и экономичен. Более того, используемые материалы гарантируют хорошую химическую стабильность гидролизуемой кислотой композиции, включающей диспергированные в растворе частицы микрогеля, в широком диапазоне рН.
Технический результат достигается тем, что заявляемая гидролизуемая кислотой композиция, включающая диспергированные в растворе частицы микрогеля, имеющие размер в диапазоне от 0,1 до 10 мкм, для доставки лекарств в живые организмы содержит основную цепь полимера, связанную сшивающим агентом, содержащим олигопептидный фрагмент; кислотную протеазу, инактивированную при нейтральном рН и активированную при умеренно кислых рН, и водорастворимый препарат или лекарственное средство, не расщепляющиеся при катализе кислотной протеазы. При этом в предпочтительных случаях реализации композиция характеризуется также следующим: в растворе, в котором диспергированы частицы микрогеля, растворено лекарственное средство; водорастворимый препарат инкапсулирован в диспергированных в воде частицах микрогеля; основной полимерной цепью является поли(этиленгликоль); основной полимерной цепью является полисахарид; в качестве реакции сшивания используется реакция Майкла; в качестве кислотной протеазы используется пепсин; частицы микрогеля имеют размер в диапазоне от 200 до 500 нм.
Технический результат достигается также тем, что предлагаемый способ получения гидролизуемой кислотой композиции, включающей диспергированные в растворе частицы микрогеля, содержит следующие этапы: приготовление смеси алифатической фазы с клинообразными амфифильными соединениями на основе сульфоновой кислоты и водной фазы, содержащей лекарственное средство или водорастворимый препарат, функциональный полимер с несколькими функциональными группами, сшивающий агент и кислотную протеазу; обработку ультразвуком смеси в течение 5-20 мин для достижения инверсии эмульсии и ограничения размера частиц диапазоном от 0,1 до 10 мкм; сшивку олигомера со сшивающим агентом в присутствии лекарственного средства или водорастворимого препарата и кислотной протеазы; выделение полученной гидролизуемой кислотой композиции, включающей диспергированные в растворе частицы микрогеля, содержащей лекарственное средство или водорастворимый препарат и протеазу, связанные внутри. При этом в предпочтительных вариантах исполнения способ характеризуется также тем, что в качестве функциональных групп функционального полимера используют три акриловые группы; в качестве функциональных групп функционального полимера используют три акриловые группы и азобензольную группу; смесь обрабатывают ультразвуком в течение 15-20 минут для ограничения размера частиц диапазоном от 200 до 500 нм.
Для получения заявляемой гидролизуемой кислотой композиции, включающей диспергированные в растворе частицы микрогеля, используется инверсная эмульсия типа «масло-в-воде», включая мини-имульсии, состоящие из частиц, как правило, от 0,1 до 10 мкм в диаметре в набухшем состоянии. В сжатом состоянии размеры частиц варьируются от 1 до 500 нм. Стоит отметить, что размеры от 200 до 500 нм являются оптимальными для фагоцитоза иммунными клетками. Понятно, что дисперсия размеров частиц микрогеля будет содержать различные диапазоны сжатых и набухших состояний, но, несмотря на это, такие размеры позволяют им проникать в клетки в обоих случаях. Гидролизуемая кислотой композиция, включающая диспергированные в растворе частицы микрогеля, в соответствии с настоящим изобретением выпускает содержимое в ответ на слабокислые условия, свойственные лизосомам, опухолям, воспалительным тканям и фаголизосомам антиген-презентирующих клеток. Они химически стабильны при рН 7,4 и разлагаются на водорастворимые фрагменты, для высвобождения инкапсулированного содержимого в предпочтительном интервале рН от 4,5 до 6,5. Преимущественно, они будут полностью деградированы в течение 24 ч при рН 5.
Данное изобретение описывает способ получения гидролизуемой кислотой композиции, включающей диспергированные в растворе частицы микрогеля, для доставки лекарственных средств и водорастворимых препаратов в клетку, состоящий из 4 стадий. На первой стадии изготавливаются смеси алифатической фазы с поверхностно-активными веществами и водной фазы, содержащей лекарственное средство, функциональный полимер, сшивающий агент и кислотную протеазу. Далее при помощи ультразвука смесь обрабатывается для достижения инверсии эмульсии. Затем осуществляется сшивка олигомера со сшивающим агентом в присутствии лекарственного средства и кислотной протеазы. На последней стадии методом центрифугирования выделяется полученная гидролизуемая в кислоте композиция, включающая диспергированные в растворе частицы микрогеля, также содержащая лекарственное средство или водорастворимый препарат и протеазу.
Функциональный полимер представляет собой полимер, который содержит по меньшей мере две функциональные группы для дальнейших реакций. Поэтому желательно использовать водные биологически совместимые полимеры, например, включающие такие соединения, как поли(этиленгликоль), статистические сополимеры и блочные поли(этилен-гликоль)-со-поли(пропилен-гликоль), полисахариды и др. Полимерные цепи могут быть линейными, разветвленными, звездообразными и т.д. В качестве функциональных групп используются группы, способные реагировать с аминогруппами, такие как акриловый полимер, винилсульфон, трет-бутил карбонат активированной карбоновой кислотой и т.д. Желательно, чтобы полимер имел молекулярную массу менее чем 100000 дальтон для легкого вывода из организма.
Сшивающий агент представляет собой олигопептид или соединение, содержащее олигопептидный фрагмент. Он содержит по крайней мере две функциональные группы, которые могут реагировать с функциональными группами функционального полимера.
Два типа кислотных протеаз широко используются в пищевой промышленности: на основе Aspergillus, напоминающий пепсин; и на основе Mucor, напоминающий ренин. Например, очищенный от кислотной протеазы Aspergillus oryzae неактивен при рН 6, но проявляет значительную активность при рН 5 [Yin, L.-J.; Chou, Y.-H.; Jiang, S.-T. J. Mar. Sci. Technol. 2013, 21, 105-110]. Некоторые из них могут быть выделены из органов животных. Такими примерами являются cathepsin С и D из бычьей селезенки, пепсин из желудка свиньи и т.д. Протеазы, как правило, действуют преимущественно на месте расщепления. Они расщепляют пептиды либо постепенно от конца цепи (экзо-расщепление), или они расщепляют в определенных точках в середине пептидной цепи (эндо-расщепление). В случае экзо-расщепления указан расщепляемый конец. Таким образом, протеазы, используемые в этом случае, должны соответствовать олигопептидам, используемым для реакции сшивания. Например, пепсин расщепляет предпочтительно пептидные связи с гидрофобными остатками.
В принципе любые водорастворимые препараты или лекарственные средства, не расщепляющиеся при катализе кислотной протеазы, могут быть инкапсулированы. Примерами являются декстран, различные вакцины, противоопухолевые препараты, такие как антрациклин, доксорубицин и т.д., или препараты, инкапсулированные в наноносителях, как липосомы.
Сшивание осуществляется с помощью реакции между функциональными группами сшивающего пептида и функционального полимера. Такими реакциями могут быть реакция Майкла, амидирование, радикальная полимеризация и т.д.
Далее изобретение будет пояснено посредством примеров 1-4, не будучи, однако, ограничено ими, а также фиг. 1, на которой представлена рН-зависимая кривая высвобождения декстрана гидролизуемой кислотой композиции, включающей диспергированные в растворе частицы микрогеля, синтез приготовления которой описан в примере 2.
n
Поли(этиленгликоль) диакрилат (ПЭГ-диакрилат) со средней молекулярной массой M 700, пепсин из слизистой оболочки желудка свиньи, Span 80, Tween 80, н-гексан, флуоресцеина изотиоцианат-декстран со средней молекулярной массой 10000 были приобретены у Sigma-Aldrich, фосфатный буфер с рН 7,4 и ацетатный буфер с рН 5,12 использовались непосредственно после получения. Тетрапептид, Lys-Phe-Gly-Lys, был синтезирован на твердофазном синтезаторе пептидов (Focus ХС Solid Phase Peptide Synthesizer, AAPPTec).
Размер частиц микрогеля, содержащихся в гидролизуемой кислотой композиции, был измерен методами динамического светорассеяния (DLS) и крио-сканирующей электронной микроскопии (крио-FESEM). DLS измерения проводились на Malvern Zetasizer Nano Series под углом рассеяния 147° при 25°С. Исследование крио-FESEM проводили при помощи Hitachi S4800 с высоким разрешением автоэлектронной эмиссии сканирующего электронного микроскопа с ускоряющим напряжением 1,5 кВ, оснащенного ячейкой для приготовления образца и переноса с системой охлаждения на жидком азоте.
Пример 1
Миниэмульсия типа «вода-в-масле» готовилась путем смешивания водной фазы с ПЭГ-диакрилатом и пепсином в фосфатном буфере (рН 7,4) и органической фазы, состоящей из Span 80 и Tween 80, имеющих суммарный гидрофильно-липофильный баланс равный 5,6 в н-гексане. Смесь обрабатывалась ультразвуком при помощи ультразвукового дезинтегратора Branson W450 в течение 1 мин при охлаждении льдом. Затем добавлялся в реакционную систему Lys-Phe-Gly-Lys, растворенный в фосфатном буфере, и продолжалась обработка ультразвуком в течение еще одной минуты. После этого эмульсия перемешивалась до завершения реакции при комнатной температуре. Гидролизуемая кислотой композиция, включающая диспергированные в растворе частицы микрогеля, отделялась при помощи метода центрифугирования. Размеры частиц микрогеля, диспергированных в растворе, полученной гидролизуемой кислотой композиции составили 200-500 нм.
Пример 2
Путь синтезирования, аналогичный синтезу, описанному в примере 1, только был добавлен к водной фазе флуоресцеин изотиоцианат-декстран со средней молекулярной массой 10000. Размер частиц микрогеля, диспергированных в растворе, полученной гидролизуемой кислотой композиции лежал в диапазоне от 300 до 600 нм.
Пример 3
Гидролизуемую кислотой композицию, включающую диспергированные в растворе частицы микрогеля, получали так же, как описано для примера 1, диспергировали в фосфатном буфере с рН 7,4, а затем в ацетатном буфере с рН 5,12 при 37°С. После 48 часов, с помощью измерений DLS, не наблюдалось никаких изменений размера частиц микрогеля в случае при рН равном 7,4. В то время как ни методом DLS, ни методом крио-FESEM частицы не были обнаружены для гидролизуемой кислотой композиции в буфере с рН равным 5,12.
Пример 4
Для экспериментов с высвобождением, лекарственные средства, загруженные в гидролизуемую кислотой композицию, аналогичную примеру 2, были диспергированы в буфере определенного рН. Полученный раствор, заключенный в диализной мембране, был помещен в тот же буфер. Систему выдерживали при температуре 37°С. Через определенные интервалы времени отбирали аликвоту от внешнего раствора и при помощи спектроскопии в ультрафиолетовой и видимой области спектра (Genesys IOS от Thermo Fischer Scientific США) определяли количество выпущенного препарата.
На фиг. 1 приведена кривая высвобождения лекарств в зависимости от времени при различных значениях рН для гидролизуемой кислотой композиции. Видно, что при рН 5.12 гидролизуемая кислотой композиция способна выпустить 80% декстрана в течение 6 часов, однако при рН 7,4 менее 20% декстрана было выпущено в течение такого же периода времени.