АНТИГЕН ДЛЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ВИРУСА КРАСНУХИ
ANTIGEN FOR RECOMBINANT VACCINE AGAINST RUBELLA VIRUS

Область техники
Настоящее изобретение относится к иммунологии и биотехнологии, в частности к методам получения иммунобиологических препаратов, которые могут быть использованы как основа для профилактической вакцины против вируса краснухи.
Уровень техники
Вирус краснухи вызывает острое респираторное заболевание - краснуху, наиболее ярким проявлением которого является сыпь. Краснуха - заболевание человека, вирус краснухи не имеет резервуаров в природе среди животных (White et al., 2012). У детей краснуха обычно протекает в относительно легкой форме, для взрослых, напротив, характерно достаточно тяжелое течение заболевания, риск возникновения осложнений значительно возрастает в постпубертатном периоде. Наиболее частыми осложнениями являются боли в суставах. Вероятность возникновения артрита или артралгии после краснухи у женщин, перенесших заболевание в постпубертатном периоде, составляет около 50% (Tingle et al., 1986). Реже встречаются такие осложнения как пурпурная сыпь (1/1500 случаев перенесенной краснухи), переходящая тромбоцитопения (1/3500 случаев перенесенной краснухи) и постинфекционная энцефалопатия (1/5000 - 1/10000 случаев перенесенной краснухи). Редким осложнением является гемолитическая анемия. В очень редких случаях синдром Гийена-Барре может быть осложнением после краснухи (Banatvala, Brown, 2004). Однако наиболее опасным последствием краснухи является синдром врожденной краснухи (СВК). Причиной СВК является фетальная инфекция краснухи во время внутриутробного развития. При инфицировании женщин в первом триместре беременности риск трансплацентарной передачи вируса плоду составляет до 90%, что приводит к развитию у детей СВК, наиболее частыми проявлениями которого, являются глухота, порок сердца, катаракта и повреждения нервной системы (WHO, 2007; Banatvala, Brown, 2004). Как и для большинства вирусных заболеваний специфического лечения краснухи не существует. Наиболее эффективным методом борьбы с краснухой является вакцинация. Все используемые в настоящее время вакцины против краснухи являются живыми аттенуированнымми вакцинами, первая такая вакцина была разработана Стенли Плоткиным еще в 1968 году (US Patent №3660565 А, 02.05.1972). Однако, несмотря на свою эффективность, аттенуированные вакцины имеют ряд недостатков: 1) побочные эффекты, наиболее частыми из которых являются артрит и артралгия, вакцинный штамм RA27/3 может индуцировать суставные симптомы (артрит, артралгия) у восприимчивых взрослых женщин после вакцинации с вероятностью до 40-42%. У небольшой части пациенток возможны периодические или постоянные симптомы. Хронический артрит, вызванный вакциной против краснухи, включен в программу компенсации за осложнения от прививок (Vaccine Injury Compensation Program, VICP). Также по данным различных исследований вероятность возникновения других осложнений: тромбоцитопенической пурпуры и энцефалопатии составляет в среднем 1/38000 и 1/29000 соответственно (Banatvala, Brown, 2004; Mantadakis et al., 2010). Помимо прочего аттенуированная вакцина против краснухи противопоказана людям с аллергией к желатину и неомицину, входящим в состав вакцины, вакцинация таких пациентов может привести к анафилактическому шоку (Kelso et al., 1993; Rietschel, Bernier, 1981); 2) аттенуированные вакцины не рекомендованы для вакцинации беременных женщин, более того рекомендуется избегать зачатия в течение месяца после вакцинации (http://www.cdc.gov/vaccines/hcp/vis/vis-statements/mmr.html). Также такие вакцины не рекомендованы для вакцинации людей с иммунодефицитами, так как это может вызвать субклиническую инфекцию, результатом которой может быть длительное персистирование вакцинного вируса в организме привитого (WHO, 2011); 3) аттенуированные вакцины следует хранить при температуре от +2°С до +8°С и не подвергать заморозке на всем протяжении логистической цепочки - от производителя до конечного потребителя (WHO, 2011).
Побочные эффекты и аллергические реакции, отсутствие возможности вакцинации беременных женщин, которые являются основной группой риска, и людей с иммунодефицитами, а также необходимость соблюдения «Холодовой цепи» характерные для аттенуированных вакцин свидетельствуют о том, что задача создания рекомбинантной вакцины против краснухи, не имеющей побочных негативных эффектов, обусловленных использованием живого вируса, является актуальной.
Вирус краснухи является представителем рода Rubivirus, семейство Togaviridae. Геном вируса краснухи представлен одноцепочечной РНК положительной полярности длиной 9756 нуклеотидов (без учета длины поли(А) хвоста). Геномная РНК вируса краснухи содержит две длинные открытые рамки считывания: 5'-проксимальная рамка считывания состоит из 6345 нуклеотидов (с 41 по 6385) и кодирует полипротеин р200, продуктами процессинга которого являются неструктурные белки р150 (N-терминальный продукт) и р90 (RdRp) (С-терминальный продукт); 3'-проксимальная рамка считывания состоит из 3189 нуклеотидов (с 6506 по 9694) и кодирует структурные белки вируса в порядке NH2-CP-E2-E1-COOH, они транслируются с 24S субгеномной РНК в виде полипротеина p110, который затем разрезается с образованием CP-белка (белок оболочки) и гликопротеинов Е1 и Е2 (Oker-Blom, 1984).
245
285
EP1
EP2
EP3
193
269
214
240
214
233
219
233
208
239
213
239
258
277
273
284
273
275
278
285
250
252
260
263
Все структурные белки вируса являются антигенами, каждый из которых несет определенные эпитопы. Было показано, что Т- и В-клеточные эпитопы присутствуют в составе белка оболочки и гликопротеина Е2 (Ou et al., 1992a,b,c), а специфические к Е2 антитела способны нейтрализовать вирусную инфекцию in vitro (Green, Dorsett 1986). Однако основным антигеном вируса краснухи является гликопротеин Е1, так как большинство нейтрализующих вирус антител направлено именно против него (Waxham, Wolinsky, 1985). Гликопротеин E1 несет основные антигенные детерминанты вируса краснухи и является доминантным антигеном во всех случаях заболевания, кроме случаев синдрома врожденной краснухи (Katow, Sugiura, 1985). Молекулярная масса гликопротеина Е1 составляет 58 кДа (Oker-Blom et al., 1983). E1 содержит по меньшей мере шесть эпитопов, два из которых обладают нейтрализующей активностью, два гемагглютинирующей, а еще два являются одновременно нейтрализующими и гемагглютинирующими. Аминокислотная последовательность Е1-Е1 содержит три эпитопа: E1, E1 и E1. Эпитопы ЕР1 и ЕР обладают нейтрализующей и гемагглютинирующей активностями, ЕР3 только нейтрализующей (Но-Теггу et al., 1986; Terry et al., 1988). Эпитоп EP1 на самом деле состоит из двух эпитопов: первый отвечает трипептиду EVW, а второй октапептиду PVIGSQAR. Важнейшая часть ЕР2 эпитопа это трипептид PER, а основной частью эпитопа ЕР3 является тетрапептид ADDP (Lozzi et al., 1990). Аминокислотная последовательность E1-E1 также содержит гемагглютинирующие и нейтрализующие эпитопы. Гемагглютинирующий эпитоп находится в районе E1-E1, а два нейтрализующих эпитопа в области E1-Е1 и E1-E1 (Chaye et al., 1992). Участок E1-E1 (эпитоп А) является консервативным для для ряда штаммов вируса краснухи: Therien, М33, Judith и HPV77 (Petrova et al., 2016), индуцирует выработку поливалетнтных антител, препятствующих проникновению вируса в клетку и задерживающих выход вирусных частиц из клетки, и играет ключевую роль в защитных механизмах гуморального иммунного ответа (Corboba et al., 2000). Важнейший нейтрализующий эпитоп находится внутри этого участка в районе 223-239 аминокислотных остатков (DuBios et al., 2012). Участки гликопротеина E1-E1, E1-E1 и E1-E1 способны индуцировать пролиферацию лимфоцитов, содержат перекрывающиеся В- и Т-клеточные антигенные детерминанты, и обладают нейтрализующей активностью (Mitchell et al., 1993; Ou et al., 1994).
Убедительно было продемонстрировано, что белок оболочки вируса краснухи инициирует сборку поверхностных гликопротеинов вируса краснухи в вирусоподобные частицы вируса краснухи (Hobman et al., 1994; Qiu et al., 1994; Garbutt et al., 1999). Показано что экспрессия трех структурных белков (CP, E1 и Е2) в трансфицированных клеточных линиях СНО (Chinese Hamster Ovary) или ВНK (Baby Hamster Kidney) приводит к появлению неинфекционных ВПЧ вируса краснухи (Hobman et al., 1994; Qiu et al., 1994), которые могут взаимодействовать с 10-ю типами моноклональных антител к вирусу краснухи и проявляют иммуногенность в опытах на мышах. Предполагается, что ВПЧ вируса краснухи могут быть использованы в иммунодиагностике, а также служить кандидатом для создания безопасной вакцины (Qiu et al., 1994).
Другим подходом к разработке вакцин против краснухи на основе структурных вирусных белков является использование кДНК клонов генов этих белков. Как правило, в случае ДНК вакцин предусматривается наличие в вакцине кДНК, кодирующей все три структурных белка вируса краснухи: С, Е1 и Е2 (US Patent №5663065 А, 02.09.1997; Патент РФ №2167938 С1, 27.05.2001; US Patent №20030130498 А1, 25.10.2005). Тем не менее в экспериментах на лабораторных мышах показано, что после введения вакцины наибольшее количество антител вырабатывается к поверхностному гликопротеину Е1 (Pougatcheva et al., 1999). Однако существует ряд вопросов связанных с безопасностью и эффективностью ДНК-вакцин. Такие вакцины имеют потенциальную опасность интеграции в геном, также не исключена вероятность образования антител непосредственно к ДНК. Остается открытым вопрос о том, не будет ли постоянно персистирующий в организме в небольших количествах антиген вызывать иммунологическую толерантность. Или не будут ли содержащие вектор клетки попросту элиминированы Т-лимфоцитами (Kofta, Wedrychowicz, 2001). Для эффективной стимуляции выработки антител необходимо, чтобы антиген был секретируемым (Drew et al., 2000). Кроме того, антивирусный ответ, индуцированный ДНК-вакциной, может зависеть от мышцы, в которую была введена вакцина (Yokoyama et al., 1997). Таким образом, этот подход еще нуждается в совершенствовании (Kofta, Wedrychowicz, 2001).
Ввиду того, что основным антигеном вируса краснухи на который вырабатываются антитела является гликопротеин Е1, существует множество разработок вакцины против вируса краснухи на основе только одного белка вируса краснухи - E1 (Katow, Sugiura, 1985). E1 является трансмембранным белком, для его выхода из эндоплазматического ретикулума необходимо связывание с белком Е2 (Yang et al., 1998). Это затрудняет выделение белка Е1 из клеточных культур, однако современный уровень техники позволяет решить эту проблему: присоединение к рекомбинантному белку E1 (rE1) гликозилфосфатидилинозитолфосфатного якоря (E1GPI) позволяет преодолеть его задержку в аппарате Гольджи и получить rE1, который будет эффективно транспортироваться к клеточной мембране. При совместной экспрессии в культуре клеток E1GPI и фосфолипазы D можно получить секреторный rE1, обладающий свойствами нативного вирусного E1 (Bernasconi et al., 1996). Perrenoud с коллегами (2004) показали, что иммунизация мышей рекомбинантным белком rE1, полученным путем экспрессии в клеточной линии СНО, вызывает у них выработку нейтрализующий антител к вирусу краснухи, которые способны нейтрализовать вирус in vitro (Perrenoud et al., 2004). Описана возможность получения рекомбинантного белка Е1 и в других экспрессионнах системах, например, в бактериальных клетках E. coli (Londesborough et al., 1992; Terry et al., 1989; European Patent № EP 0299673A1, published 18.01.1989), и в клетках насекомых при помощи трансфекции бакуловирусным вектором  et al., 1991). В Патент РФ №2390563 С1 (27.05.2010) запатентован экспрессионный вирусный вектор, содержащий фрагмент нуклеотидной последовательности поверхностного гликопротеина Е1, кодирующий полипептиды Е1 и Е12, содержащие в своем составе фрагмент белка Е1 вируса краснухи с 154 по 239 аминокислоту и содержит участок (199-239 а.о.), отвечающий за выработку вирус-нейтрализующих антител. После агроинфильтрации этого вектора в растения Nicotiana benthamiana были получены целевые рекомбинантные белки (Котляров, 2010). Однако небольшое количество рекомбинантного белка, получаемого из растений, и высокая стоимость очистки являются недостатками данного подхода.
Перспективным направлением разработки безопасных и эффективных вакцин является создание эпитопных вакцин, что подразумевает использование не полноразмерных вирусных белков, а их отдельных частей - Т- и В-клеточных эпитопов вирусных антигенов. Такие синтетические вакцины должны быть более эффективными по сравнению с субъединичными вакцинами, так как содержат именно те фрагменты патогена, на которые направлено действие иммунной системы. Создавая такие иммуногены можно целенаправленно регулировать активацию гуморального и клеточного иммунного ответа, индуцируемого вакцинацией. Была запатентована линейка синтетических пептидов, которые представляют собой короткие участи структурных белков вируса краснухи, ответственных за активацию В- и Т- клеточного иммунного ответа, а также липидные модификации таких пептидов (липопептиды) (US Patent №6037448 А, 14.03.2000). Однако индивидуальные пептиды имеют маленький размер, из-за чего являются низкоиммуногенными. Так же зачастую короткие синтетические пептиды оказываются нестабильными в сыворотке крови.
Одним из путей решения этой проблемы может быть создание вакцины, состоящей из биогенного носителя и целевого белка (антигена). Такие структуры безопасны для человека. Роль носителя могут играть как биологические структуры, так и искусственные. Например, вирусоподобные частицы вируса гепатита В, образованные коровым белком (НВс-антиген), в работе Котлярова (2010) были получены рекомбинантные НВс-частицы, несущие на своей поверхности эпитопы полипептида Е12. Иммунизация животных полученными структурами привела к появлению у них специфического иммунного ответа против гликопротеина Е1 вируса краснухи (Котляров, 2010). Skrastina с коллегами (2013) также сконструировали вирусоподобные частицы на основе НВс-антигена вируса гепатита В и трех различных нейтрализующих последовательностей гликопротеина Е1 (с 214 по 285, с 214 по 240 и с 245 по 285 аминокислотные остатки). Однако только вирусоподобная частица, несущая вставку с 245 по 285 аминокислотные остатки гликопротеина Е1 имела правильную пространственную структуру (Skrastina et al., 2013).
Использование вирусов растений, их вирусоподобных и структурно-модифицированных частиц для усиления иммуногенности и стабильности рекомбинантных антигенов является перспективным подходом для создания современных безопасных и эффективных рекомбинантных вакцин (Steinmetz et al., 2009; Denis et al., 2007; Acosta-Ramirez et al., 2007; Nikitin et al., 2018a,b). Была описана и запатентована кандидатная вакцина на основе рекомбинантного белка тетраэпитопа А, представляющего собой четырехкратный повтор участка гликопротеина Е1 (208-239 а.о.) в качестве антигена, и сферических частиц, полученных при термической обработке вируса табачной мозаики, в качестве носителя и адъюванта (Karpova et al., 2012; Trifonova et al., 2017; Патент РФ №2660563 C2, 06.07.2018). Безопасность для человека, высокая стабильность, биодеградируемость, простота изготовления, высокая скорость производства и отсутствие необходимости добавления какого-либо адъюванта делает этот подход крайне перспективным для создания вакцин.
Прототипом данного изобретения является белок тетраэпитоп А, который является рекомбинантный антиген вируса краснухи, содержащий четырехкратный повтор эпитопа А (208-239 а.о.) гликопротеина Е1 вируса краснухи. Ранее этот белок был создан и охарактеризован как компонент кандидатной вакцины против краснухи на основе структурно-модифицированного вируса растения (Патент РФ №2660563 С2, 06.07.2018). Данный белок тетраэпитоп А содержит в своем составе только последовательность эпитопа А, но не эпитопа В гликопротеина Е1 вируса краснухи. При этом следует отметить, что эпитоп В играет важную роль в формировании иммунного ответа против вируса краснухи.
Раскрытие сущности изобретения
Задачей изобретения является создание высокоэффективного антигена для рекомбинантной вакцины против краснухи посредством синтеза белка, содержащего в своем составе все основные эпитопы главного антигена вируса краснухи - гликопротеина Е1.
Поставленная задача решается за счет создания генетической конструкции для экспрессии в культуре клеток E. coli рекомбинантного белка 2xАВ с последовательностью аминокислот Seq ID 02, включающей в себя двукратный повтор эпитопов А и В гликопротеина Е1 вируса краснухи и специфические последовательности, служащие для стимуляции иммунного ответа, накопления 2xАВ в бактериальных клетках, его выделения и очистки. Степень чистоты выделенного препарата подтверждается методом электрофоретического анализа в денатурирующих условиях, молекулярная масса белка составляет 23 кДа. Наличие у выделенного и очищенного белка антигенной специфичности вируса краснухи, подтверждается иммуноблот анализом с поликлональной антисывороткой к вирусу краснухи.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является создание антигена для рекомбинантной вакцины для профилактики краснухи, обеспечивающей эффективную стимуляцию гуморального и клеточного иммунного ответа и выработку широкого спектра нейтрализующих и гемагглютинирующих антител к вирусу краснухи.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 представляет собой нуклеотидную последовательность белка 2xАВ в контексте плазмидного вектора pQE-BT-2AB. Стартовый кодон ATG и терминирующий кодон ТАА выделены жирным шрифтом и подчеркнуты. Последовательность, кодирующая шесть гистидинов (His6) выделена жирным шрифтом. Сайты разрезания эндонуклеазами рестрикции обозначены цифрами, выделены курсивом и подчеркнуты. Таким же образом выделена последовательность, возникшая в результате лигирования друг на друга ДНК фрагментов порезанных рестриктазами XhoI и SalI. 1 - EcoRI; 2 - BamHI; 3 - BglII; 4 - SalI; 5 - KpnI; 6 - XhoI; 7 - HindIII.
Фиг. 2 представляет собой поэтапную схему получения генетической конструкции для продукции белка 2xАВ в бактериальных клетках E. coli. Представлены схематичные изображения: А - вектора pQE-BT; Б - вектора pQE-BT-1А; В - вектора pQE-BT-1АВ; Г - вектора pQE-BT-2AB; Д - последовательности, содержащей эпитоп А; Е - последовательности содержащей эпитоп В. Инактивированный сайт рестрикции XhoI располагающийся перед последовательностью Т5-промотера, зачеркнут. ПАМП - патоген-ассоциированные молекулярные паттерны. His6 - последовательность, кодирующая шесть гистидинов.
Фиг. 3 представляет схему расположение эпитопов А и B в составе гликлпротеина Е1 вируса краснухи (А) и аминокислотную последовательность рекомбинантного белка 2xАВ. Большими буквами показаны последовательности эпитопов А и В. Последовательность эпитопа А выделена жирным шрифтом, последовательность эпитопа В выделена курсивом. Серым выделены последовательности соответствующие паттернам активации иммунного ответа (ПАМП). Шесть гистидинов (His6) выделены жирным шрифтом. Стартовый метеонин подчеркнут.
Фиг. 4 представляет электрофоретический анализ белка 2xАВ после диализа против Milli-Q. 1. 2xАВ - 1 мкг, 2. Маркеры. Градиент 8-20% ДСН-ПААГ. Гель окрашен Кумасси G-250. Справа указаны молекулярные массы белковых маркеров в килодальтонах.
Фиг. 5 представляет иммуноблот анализ эффективности взаимодействия белка 2xАВ с поликлональной антисывороткой к вирусу краснухи (А). 1. 2xАВ - 1 мкг. 2. БО ВТМ (отрицательный контроль). 3. 2xАВ - 0,5 мкг. 4. Белковые маркеры. Белки разделяли методом электрофореза в градиентном ДСН-ПААГ (8-20%), после чего переносили на мембрану Hybond-P (GE Healthcare Life Sciences). Положение на мембране рекомбинантных белков определяли с помощью поликлональных антител к вирусу краснухи (А) и вторичных противомышиных антител, коньюгированных с пероксидазой хрена (Promega). Визуализировали с помощью ECL системы (GE Healthcare Life Sciences). Контрольный эксперимент - электрофоретический анализ (гель, окрашенный кумасси G-250) (Б).
Осуществление изобретения
В соответствии с настоящим изобретением антиген для профилактической вакцины против краснухи представляет собой рекомбинантный белок (2xАВ), состоящий из дважды повторенной последовательности эпитопов А (208-239 а.о.) и В (246-285 а.о.) гликопротеина Е1 вируса краснухи (Фиг. 3А). Выбор соответствующих эпитопов определялся тем, что по литературным данным поверхностный гликопротеин Е1 является основным антигеном вируса краснухи на который вырабатываются антитела. Большинство нейтрализующих и гемагглютинирующих эпитопов сосредоточенны именно в составе выбранных последовательностей белка Е1 - с 208 по 239 а.о. (Эпитоп А) и с 246 по 285 а.о. (Эпитоп В). Обе последовательности были описаны многими исследователями как основные эпитоп-содержащие регионы вируса краснухи (Chaye et al., 1992; Wolinsky et al., 1993; Meitsch et al., 1997; Corboba et al., 2000; DuBios et al., 2012; Li et al., 2014; Ho-Terry et al., 1986; Terry et al., 1988; Lozzi et al., 1990; Londesboroug et al., 1994) и являются консервативными для различных штаммов (Petrova et. al., 2016; Londesboroug et al., 1995). Эпитоп А, известный в литературе как SP15, содержит как минимум один геаагглютинирующий и два нейтрализующих эпитопа (Chaye et al., 1992), а также индуцирует выработку поликлональных антител, которые способны in vitro нейтрализовать вирус (Wolinsky et al., 1993) и блокировать выход вирионов из клетки (Corboba et al., 2000). Участок с 246 по 285 а.о. (эпитоп В) содержит четыре эпитопа, один из которых является нейтрализующим, а три других обладают как нейтрализующей так и гемагглютинирующей активностями (Но-Теrry et al., 1986). Таким образом, описанные последовательности являются перспективными антигенными детерминантами для создания кандидатных вакцин против краснухи. Для дополнительной стимуляции иммунного ответа в последовательность предлагаемого антигена помимо непосредственно эпитопов А и В гликопротеина Е1 вируса краснухи были добавлены короткие последовательности (QYIKANSKFTGITE и SQDGNNHQFT на N'- и С' концах белка соответственно), которые фланкируют последовательности эпитопов вируса краснухи и являются патоген-ассоциированными молекулярными паттернами (ПАМП), служащими для более эффективной активации механизмов гуморального и клеточного иммунного ответа.
Приведенные примеры конкретного осуществления изобретения приведены для предоставления специалистам в данной области техники полного описания проведения и применения анализа по изобретению, и подразумевают, что приведенные примеры не ограничивают предполагаемый авторами изобретения объем изобретения.
Изобретение осуществляется следующим способом.
Плазмида pQE-BT-2AB синтезируется путем последовательного клонирования нуклеотидных последовательностей, кодирующих эпитоп А и эпитоп В гликопротеина Е1 вируса краснухи в вектор pQE-BT. Рекомбинантный белок 2xАВ с молекулярной массой 23 кДа, включающий в себя двукратный повтор эпитопов А и В гликопротеина Е1 вируса краснухи и специфические последовательности, служащие для стимуляции иммунного ответа, имеет последовательность аминокислот Seq ID 02 и синтезируется в бактериальной системе клеток E. coli штамма SG[pRep4], путем трансформации этих клеток плазмидой pQE-BT-2AB, содержащей нуклеотдную последовательность Seq ID 01, кодирующую белок 2xАВ. Экспрессированный белок выделяется из лизата бактериальных клеток методом металл-хелатной хроматографии и затем переводится в водный раствор методом диализа. Анализ полученного белка, а также его специфических свойств осуществляют с использованием следующих методик: электрофорез в денатурирующих условиях в полиакриламидном геле и иммуноблот анализ.
Сущность изобретения поясняют следующие примеры, не ограничивая его.
Пример 1.
Получение генетической конструкции для продукции рекомбинантной антигена 2xАВ в бактериальных клетках.
Генетическая конструкция для синтеза рекомбинантного белка 2xАВ в бактериальных клетках E. coli была получена на основе вектора pQE-BT, который представляет собой вектор pQE-30 со следующими модификациями: 1) сайт рестрикции XhoI, располагающийся перед последовательностью Т5-промотера инактивирован; 2) по сайтам рестрикции BamHI и HindIII в вектор встроены две последовательности, кодирующие патоген-ассоциированные молекулярные паттерны, служащие для более эффективной активации механизмов гуморального и клеточного иммунного ответа (ПАМП); 3) полилинкер, располагающийся между встроенными последовательностями видоизменен и состоит из последовательно расположенных сайтов рестрикции BglII, NcoI, KpnI и XhoI. Схема строения вектора pQE-BT представлена на Фиг. 2А. На первом этапе в вектор pQE-ВТ по сайтам рестрикции BglII и KpnI была клонирована последовательность, кодирующая эпитоп А гликопротеина Е1 и содержащая дополнительный сайт рестрикции SalI перед последовательностью эпитопа А (Фиг. 2Д). В результате был получен вектор pQE-BT-1А, схема которого представлена на Фиг. 2Б. На следующем этапе в вектор pQE-ВТ-1А по сайтам рестрикции KpnI и XhoI была клонирована последовательность, кодирующая эпитоп В гликопротеина Е1 (Фиг. 2Е), в результате чего был получен вектор pQE-BT-1АВ, схема которого представлена на Фиг. 2 В. Из данного вектора по сайтам SalI и XhoI был вырезан фрагмент ДНК, содержащий последовательность эпитопов А и В. Также вектор pQE-BT-1АВ был лианеризован по сайту рестрикции XhoI. Поскольку сайты рестрикции SalI и XhoI представляют собой последовательности 5'-G↓TCGAC-3' и 5'-CTCGA↓G-3' соответственно, фрагменты, получившиеся при обработке одной из этих рестриктаз имеют липкие концы, позволяющие произвести лигирование с фрагментом обработанным другой рестриктазой с образование в этом месте последовательности 5'-CTCGAC-3', не являющейся сайтом рестрикции (Фиг. 1). Поэтому лианеризованный по сайту XhoI вектор pQE-BT-1АВ был лигирован с ранее вырезанным по сайтам SalI и XhoI фрагментом, содержащим последовательности эпитопов А и В, по сайтам SalI/XhoI и XhoI, в результате чего был получен вектор pQE-BT-2AB (Фиг. 2Г), который был использован для продукции рекомбинантного белка 2xАВ. Нуклеотидная последовательность гена белка 2xАВ (Seq ID 01) в контексте вектора pQE-BT-2AB с указанием последовательностей, кодирующих эпитопы А и В, гистидины, ПАМПы, а также с указанием сайтов рестрикции представлена на Фиг. 1.
Во всех случаях молекулярное клонирование фрагментов ДНК осуществлялось следующим образом:
1) Нужные фрагменты ДНК вырезались путем обработки соответствующими рестриктазами. Рестрикцию проводили в объеме 40 мкл, содержащем 1-кратный буфер Fast Digest («Thermo Fisher Scientific», США), по 20 единиц эндонуклеаз рестрикции («Thermo Fisher Scientific», США) и примерно 100 нг каждого из разрезаемых фрагментов ДНК. Смесь инкубировали в течение 20 минут при температуре 37°С.
2) Из рестрикционной смеси выделялись нужные фрагменты ДНК, для чего проводился электрофорез рестрикционной смеси в 1% агарозе, поле чего необходимые фрагменты вырезались из геля. Выделение ДНК из геля проводилось при помощи набора «Набор для экстракции ДНК из геля» «Thermo Fisher Scientific» (США) согласно протоколу.
3) Лигирование фрагментов ДНК, имеющих соответствующие липкие концы. Лигирование проводили в объеме 35 мкл, содержащем 1-кратный буфер для Т4-ДНК лигазы, 0,2 мМ АТФ, 1 единицу Т4-ДНК лигазы («Fermentas»), и примерно 0,5 мкг смеси лигируемых фрагментов ДНК. Смесь инкубировали в течение 1 часа при температуре 16°С.
4) Трансформация бактериальных клеток лигазной смесью. Для этого к 200 мл суспензии бактериальных клеток Escherichia coli (штамм XL1-Blue) добавляли 10 мкл лигазной смеси и инкубировали во льду в течение 20 минут. После этого выдерживали 90 секунд при 42°С и снова во льду 5 минут. Затем добавляли 800 мкл среды 2xYT (1,6% триптон, 1% дрожжевой экстракта, 0,5% NaCl) и инкубировали при 37°С в течение 50 минут. Высевали суспензию клеток на чашку со средой YT с агаром, содержащей селективный антибиотик ампициллин в концентрации 100 мкг/мл и инкубировали 16 часов при 37°С.
5) Выделение соответствующей плазмидной ДНК из клеток E. coli XL1-Blue. Для этого трансформированные колонии выращивали в течение ночи в небольшом объеме (3 мл) культуральной среды 2xYT, содержащей 100 мкг/мл ампициллина при 37°С. Затем из ночной культуры выделяли плазмидную ДНК. Для выделения плазмидной ДНК использовали «Набор для выделения плазмидной ДНК» фирмы «Евроген» (Россия) согласно протоколу.
Пример 2.
Продукция рекомбинантного белка 2xАВ, содержащего эпитопы гликопротеина Е1 вируса краснухи в бактериальных клетках
λ=600
2
4
На Фиг. 3Б представлена аминокислотная последовательность белка 2xАВ (Seq ID 02), с указанием последовательности эпитопов А и В гликопротенина Е1 вируса краснухи (Фиг. 3А), гистидинов и последовательностей ПАМП. Для продукции белка 2xАВ были использованы клетки E. coli штамма SG, содержащие плазмиду pRep4, наличие которой обеспечивает больший выход белка по сравнению с клетками штамма XL1-Blue. Бактериальные клетки E. coli штамма SG трансформировали плазмидой, содержащей последовательность, кодирующую белок 2xАВ. Для этого к 200 мл суспензии бактериальных клеток добавляли 100 нг плазмиды, далее проводили трансформацию по аналогии с клетками XL1-Blue, за исключением того, что в качестве селективного антибиотика, помимо ампициллина (100 мкг/мл), добавляли канамицин до конечной концентрации 50 мкг/мл. Эти клетки были высеяны в небольшой объем (3 мл) культуральной среды 2xYT (1,6% триптон, 1% дрожжевого экстракт, 0,5% NaCl), содержащей селективные антибиотики - ампициллина и канамицин в концентрациях 100 мг/мл и 50 мг/мл соответственно, после чего выращивались в течение ночи при +37°С. Затем для получения белка в большом объеме ночная культура была перенесена в 200 мл свежей 2xYT, содержащей 100 мг/мл ампициллина и 50 мг/мл канамицина и выращивалась при +37°С до OD равной 0,7-0,9. Далее была проведена индукция экспрессии клонированных генов с помощью изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида (ИПТГ), путем добавления его до конечной концентрации 2 мМ. ИПТГ является аналогом аллолактозы, и поэтому индуцирует транскрипцию lac-оперона, в который встроен ген целевого белка. После этого клеточная культура выращивалась еще в течение 4 часов при +37°С. Затем клетки были отделены от культуральной среды с помощью низкоскоростного центрифугирования при 5000 об/мин, (10 минут, ротор JA-14, центрифуга «Beckman») при +4°С. Отделенные центрифугированием от культуральной среды клетки были лизированы в 5 мл буфера А (6 М гуанидин-HCl, 0,1 М NaHPO, 1М Трис-HCl; рН 8,0) в течение двух часов на качалке Biosan PSU-10i (Латвия) (160-170 оборотов в минуту). Далее для очистки от крупных компонентов бактериальных клеток лизат был центрифугирован при 9000 об/мин (15 минут, ротор JA-14, центрифуга «Beckman») при +4°С. После этого белок 2xАВ содержался в осветленном супернатанте.
2+
2+
2
4
Для выделения и очистки 2xАВ из клеточного лизата проводили хромотографию на Ni-нитрилотриацетатной агарозе (Ni-HTA) согласно протоколу «The QIAexpressionist» фирмы QIAGEN с некоторыми изменениями. Супернатант, получившийся после центрифугирования клеточного лизата, был нанесен на предварительно уравновешенную буфером А колонку с Ni-NTA агарозой (1,6×1,8 см, V=17 мл). Проводили сорбцию белка в течение часа. Далее колонка промывалась последовательно буфером А (20 мл), затем буфером В (8 М мочевина; 0,1 М NaHPO; 0,01 М трис-HCl; рН 8,0) (15 мл), буфером С (аналогичного состава, рН 6,3) (30 мл), буфером D (аналогичного состава, рН 5,9) (2 мл), затем колонка инкубировалась с элюирующим буфером Е (аналогичного состава, рН 4,5) (5 мл) в течения 30 минут, затем собирлись фракции по 1 мл. Наиболее прочно связанные с сорбентом молекулы белка были элюированы буфером F (8 М мочевина, 0,2 М уксусная кислота) (6 мл).
Очищенный белок 2xАВ переводили в водный раствор с помощью диализа. Диализ проводили в диализных мешках (Serva, Германия) в течение 4 часов, меняя воду каждый час. Соотношение раствор белка/вода 1:1000. Для диализа использовали воду качества Milli-Q, полученную с помощью системы Simplicity UV (Millipore, США). 2xАВ после диализа был проанализирован с помощью электрофореза с добавлением додецилсульфатнатрия (ДСН) в градиентном 8-20% полиакриламидном геле (ПААГ). Исходя из Фиг. 4 видно, что в условиях диализа не произошла деградация белка 2xАВ, то есть он был успешно переведен в водный раствор. На электофореграмме отчетливо выявляется полоса, соответствующая белку 2xАВ с молекулярной массой 23 кДа (Фиг. 4, дорожка 1), что совпадает с расчетной молекулярной массой этого белка, полученной с использованием программы ProtParam (http://www.expasy.org).
Пример 3.
Вестерн-блот анализ антигенной активности тетраэпитопа А вируса краснухи
При помощи метода вестерн-блот анализа была исследована способность 2xАВ взаимодействовать с поликлональной антисывороткой к вирусу краснухи. Был проведен анализ белка 2xАВ в количестве 1 мкг и 0,5 мкг (Фиг. 5А). Белки фракционировали в градиентном 8-20% ПААГ. В качестве отрицательного контроля был использован белок оболочки вируса табачной мозаики (ВТМ). В качестве стандартов молекулярной массы был использован набор окрашенных маркерных белков фирмы «Thermo scientific» (10-250 кДа). Контрольный эксперимент (гель, окрашенный кумасси G-250) представлен на Фиг. 5Б. Белки из геля были перенесены на мембрану Hybond-P из ПВДФ («Amersham», Великобритания) предварительно активированную этанолом, методом электро-переноса (прибор Pierce Power Blotter фирмы «Thermo scientific», буфер для переноса - фирмы «Thermo scientific»), время переноса - 10 минут. После переноса мембрана была проинкубирована в 5% растворе сухого молока в буфере tTBS (1 М трис-HCl рН=7,4; 3 М NaCl; 0,05% твин-20) в течение часа. Далее проводилась инкубация с мышиными поликлональными антителами к вирусу краснухи в разведении 1:5000 в 5% растворе сухого молока в буфере tTBS в течение 1 часа. Отмывка мембраны от первичных антител проводилась 3 раза по 15 минут в буфере tTBS, каждый раз меняя буфер. Затем мембрана была проинкубирована со вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена («Promega», разведение 1:10000) в 5% растворе сухого молока в буфере tTBS 1 час при комнатной температуре. Отмывка мембраны от вторичных антител проводилась 2 раза по 15 минут в буфере tTBS, каждый раз меняя буфер. Еще одна отмывка была проведена в течение 20 минут в TBS (1 М трис-HCl рН=7,4; 3 М NaCl) без добавления твина-20. Мембрана была проявлена с помощью ECL системы («Amersham», Великобритания). Хемилюминесцентный сигнал детектировали с помощью гельдокументирующей системы Chemi Doc XRS+ с программным обеспечением Image Lab Software (Bio Rad, США). Из Фиг. 3 видно, что 2xАВ как в количестве 1 мкг (Фиг. 5А, дорожка 1), так и в количестве 0,5 мкг (Фиг. 5А, дорожка 3) эффективно с поликлональной антисывороткой к вирусу краснухи. Следует отметить, что полосы соответствующие белкам более низкой молекулярной массы в пробах с антигеном также эффективно узнаются антителами к вирусу краснухи, а значит, вероятно являются продуктами незначительной деградации белка 2xАВ, сохраняющими свою антигенную специфичность, и, следовательно, не могут считаться препятствием для использования белка 2xАВ в качестве антигена. Отрицательный контроль БО ВТМ (Фиг. 5Б, дорожка 2) маркеры молекулярной массы (Фиг. 5Б, дорожка 4) с поликлональной антисывороткой к вирусу краснухи не взаимодействуют (Фиг. 5А, дорожки 2 и 4 соответственно). Способность взаимодействия поликлональной антисыворотки к вирусу краснухи с тетраэпитопом А свидетельствует о доступности для взаимодействия с антителами эпитопов вируса краснухи в составе полученного рекомбинантного белка.
Литература
Ссылки на патенты:
1. Атабеков И.Г., Карпова О.В., Кирпичников М.П., Кондакова О.А., Никитин Н.А., Петрова Е.К., Путляев Е.В., Трифонова Е.А. Вакцина против краснухи на основе структурно-модифицированного вируса растений и способ ее получения // Патент РФ № 2660563 С2, 06.07.2018.
2. Котляров Р.Ю., Марданова Е.С., Равин Н.В., Свешников П.Г., Скрябин К.Г. Рекомбинантный вирусный вектор для продукции в растениях белка Е1 вируса краснухи (варианты) и система экспрессии белка Е1 вируса краснухи в растениях (варианты) // Патент РФ № 2390563 С1, 27.05.2010.
3. Прилипов А.Г., Алексеев С.Б., Красильников И.В., Колбенев С.Г., Зайцев И.З. Плазмида, несущая вектор, содержащий кДНК (24S РНК) вируса краснухи // Патент РФ № 2167938 С1, 27.05.2001.
4. Chong P., Gillam S., Ou D., Tingle A. Synthetic peptides for a rubella vaccine // US Patent № 6037448 A, 14.03.2000.
5. Frey Т.K., Dominguez G., Wang C.Y. DNA encoding infectious Rubella virus // US Patent № 5663065 A, 02.09.1997.
6. Frey Т.K., Pugachev K., Abernathy E., Tzeng W.P. Highly infectious rubella virus DNA constructs and methods of production // US Patent № 20030130498 A1, 25.10.2005.
7. Ho-Terry L., Terry G., Kenneth R. Rubella E1 glycoprotein antigens // European Patent № ЕР 0299673 A1, published 18.01.1989.
8. Plotlin S.A. Rubella vaccine and method // US Patent № 3660565 A, 02.05.1972.
Непатентная литература:
1. Котляров Р.Ю. Вирусоподобные наноразмерные частицы - носители антигенов вирусов гриппа и краснухи: диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. // Москва, 2010. 112 с.
2.  Majeau N., Pastelin-Palacios R., Gil-Cruz С,  Santos-Argumedo L., Flores-Romo L., Becker I., Isibasi A., Leclerc D.,  Translating innate response into long-lasting antibody response by the intrinsic antigen-adjuvant properties of papaya mosaic virus // Immunology. 2008. V. 124. № 2. P. 186-197.
3. Banatvala J.E., Brown D.W.J. Rubella // The Lancet. 2004. V. 363. № 9415. P. 1127-1137.
4. Bernasconi E., Fasel N., Wittek R. Cell surface expression of a functional rubella virus E1 glycoprotein by addition of a GPI anchor // Journal of cell science. 1996. V. 109. № 6. P. 1195-1201.
5. Chaye H., Chong P., Tripet В., Brush В., Gillam S. Localization of the neutralizing and hemagglutinin epitopes of E1 glycoprotein of rubella virus // Virology. 1992. V. 189. № 2. P. 483-492.
6. Corboba P., Grutadauria S., Cuffini C., Zapata M. Neutralizing monoclonal antibody to the E1 glycoprotein epitope of rubella virus mediates virus arrest in VERO cells // Viral Immunology. 2000. V. 13. №1. P. 83-92.
7. Denis J., Majeau N., Acosta-Ramirez E., Savard C., Bedard M.C., Simard S., Lecours K., Bolduc M., Pare C., Willems В., Shoukry N., Tessier P., Lacasse P., Lamarre A., Lapointe R., Lopez C., L.C. Leclerc D. Immunogenicity of papaya mosaic virus-like particles fused to a hepatitis С virus epitope: evidence for the critical function of multimerization // Virology. 2007. V. 363. №1. P. 59-68.
8. Drew D.R., Lightowlers M., Strugnell R.A. Humoral Immune responses to DNA vaccines expressing secreted, membrane bound and non-secreted forms of the Taenia ovis 45 W antigen // Vaccine. 2000. V. 18. № 23. P. 2522-2532.
9. DuBois R.M., Vaney M.C., Tortorici A., Kurdi R.A., Barba-Spaeth G., Krey Т., Rey F.A. Functional and evolutionary insight from the crystal structure of rubella virus protein E1 // Nature. 2013. V. 493. № 7433. P. 552-556.
10. Garbutt M., Chan H., Hobman T.C. Secretion of rubella virions and virus-like particles in cultured epithelial cells // Virology. 1999. V. 261 № 2. P. 340-346.
11. Green K.Y, Dorsett P.H. Rubella virus antigens: localization of epitopes involved in hemagglutination and neutralization by using monoclonal antibodies // Journal of Virology. 1986. V. 57. № 3. P. 893-898.
12. Hobman T.C, Lundstrom M.L., Mauracher C.A., Woodward L., Gillam S., Farquhar M.G. Assembly of rubella virus structural proteins into virus-like particles in transfected cells // Virology. 1994. V. 202. № 2. P. 574-585.
13. Ho-Terry L., Terry G.M., Cohen A., Londersborough P. Immunological characterisation of the rubella E1 glycoprotein // Archives of Virology. 1986. V. 90. № 1-2. P. 145-152.
14. Karpova O.V., Nikitin N.A., Chirkov S.N., Trifonova E.A., Sheveleva A.A., Lazareva E.A., Atabekov J.G. Immunogenic compositions assembled from tobacco mosaic virus-generated spherical particle platforms and foreign antigens // Journal of General Virology. 2012. V. 93. № 2. P. 400-407.
15. Katow S., Sugiura A. Antibody response to individual rubella virus proteins in congenital and other rubella virus infections // Journal of Clinical Microbiology. 1985. V. 21. № 3. P. 449-451.
16. Kelso J.M., Jones R.T., Yunginger J.W. Anaphylaxis to measles, mumps, and rubella vaccine mediated by IgE to gelatin // Journal of allergy and clinical immunology. 1993. V. 91. № 4. P. 867-872.
17. Kofta W., Wedrychowicz H. c-DNA vaccination against parasitic infections: advantages and disadvantages // Veterinary parasitology. 2001. V. 100. № 1. P. 3-12.
18. Li Z.M., Chu F.L., Wen H.L., Sun Z.H., Li G.H., Xie W.Y., Wang Z.Y. R237 and H238 Are Key Amino Acids in the Rubella Virus E1 Neutralization Epitope // Viral immunology. 2014. V. 27 № 9. P. 422-429.
19. Londesborough P., Ho-Terry L., Terry G. Sequence variation and biological activity of rubella virus isolates // Archives of virology. 1995. V. 140. № 3. P. 563-570.
20. Londesborough P., Terry G., Ho-Terry L. Reactivity of a recombinant rubella E1 antigen expressed in E. coli //Archives of virology. 1992. V. 122. № 3-4. P. 391-397.
21. Lozzi L., Rustici M., Corti M., Cusi M., Valensin P.E., Bracci L., Santucci A., Soldani P., Spreafico A., Neri P. Structure of rubella E1 glycoprotein epitopes established by multiple peptide synthesis // Archives of Virology. 1990. V. 110. № 3-4. P. 271-276.
22. Mantadakis E., Farmaki E., Buchanan G.R. Thrombocytopenic purpura after measles-mumps-rubella vaccination: a systematic review of the literature and guidance for management // The Journal of pediatrics. 2010. V. 156. №4. P. 623-628.
23. Mitchell L.A.,  Tingle A.J., Zrein M., Lacroix M. Identification of immunoreactive regions of rubella virus E1 and E2 envelope proteins by using synthetic peptides // Virus research. 1993. V. 29 № 1. P. 33-57.
24. Nikitin N.A., Matveeva I.N., Trifonova E.A., Puhova N.M., Samuylenko A.Ya., Gryn S.A., Atabekov J.G., Karpova O.V. Spherical particles derived from TMV virions enhance the protective properties of the rabies vaccine // Data in brief. 2018a. V. 21. P. 742-745.
25. Nikitin N.A., Zenin V.A., Trifonova E.A., Ryabchevskaya E.M., Kondakova O.A., Fedorov A.N., Atabekov J.G., Karpova O.V. Assessment of structurally modified plant virus as a novel adjuvant in toxicity studies // Regulatory Toxicology and Pharmacology. 2018b. V. 97. P. 127-133.
26. Oker-Blom C. The gene order for rubella virus structural proteins is NH2-C-E2-E1-COOH // Journal of Virology. 1984. V. 51. № 2. P. 354-358.
27. Oker-Blom С, Kalkkinen N., Kaariainen L., Pettersson R.F. Rubella virus contains one capsid protein and three envelope glycoproteins, E1, E2a, and E2b // Journal of Virology. 1983. V. 46. № 3. P. 964-973.
28. Ou D., Chong P., Choi Y., McVeigh P., Jefferies W.A., Koloitis G., Tingle A.J., Gillam S. Identification of T-cell epitopes on E2 protein of rubella virus, as recognized by human T-cell lines and clones // Journal of Virology. 1992a. V. 66. № 11. P. 6788-6793.
29. Ou D., Chong P., McVeish P., Jefferies W.A., Gillam S. Characterization of the specificity and genetic restriction of human CD4+ cytotoxic T cell clones reactive to capsid antigen of rubella virus // Virology. 1992b. V. 191. № 2. P. 680-686.
30. Ou D., Chong P., Tripet В., Gillam S. Analysis of T-and B-cell epitopes of capsid protein of rubella virus by using synthetic peptides // Journal of Virology. 1992c. V. 66. № 3. P. 1674-1681.
31. Ou D., Mitchell L.A., Ho M.,  Tingle A.J., Nepom G.T., Lacroix M., Zrein M. Analysis of overlapping T-and B-Cell antigenic sites on rubella virus E1 envelope protein influence of HLA-DR4 polymorphism on T-cell clonal recognition // Human immunology. 1994. V. 39 № 3. P. 177-187.
32. Perrenoud G., Messerli F., Thierry A.C., Beltraminelli N., Cousin P., Fasel N., Valletc V., Demotza S., Duchosalc M.A., Moulona C. A recombinant rubella virus E1 glycoprotein as a rubella vaccine candidate // Vaccine. 2004. V. 23 № 4. P. 480-488.
33. Petrova E.K., Dmitrieva A.A., Trifonova E.A., Nikitin N.A., Karpova O.V. The key role of rubella virus glycoproteins in the formation of immune response, and perspectives on their use in the development of new recombinant vaccines // Vaccine. 2016. V. 34 № 8. P. 1006-1011.
34. Pougatcheva V.O., Abernathy E.S., Vzorov A.N., Compans R.W., Frey Т.K., 1999. Development of a rubella virus DNA vaccine // Vaccine. 1999. V. 17. № 15-16. P. 2104-2112.
35. Qiu Z., Ou D., Hobman T.C, Gillam S. Expression and characterization of virus-like particles containing rubella virus structural proteins // Journal of virology. 1994. V. 68. № 6. P. 4086-4091.
36. Rietschel R.L., Bernier R. Neomycin sensitivity and the MMR vaccine // JAMA. 1981. V. 245. № 6. P. 571-571.
37.  Huhtala M.L., Vaheri A., Summers M.D., Oker-Blom С. Diagnostic potential of baculovirus-expressed rubella virus envelope proteins //Journal of clinical microbiology. 1991. V. 29. № 9. P. 1877-1882.
38. Skrastina D., Petrovskis I., Petraityte R., Sominskaya I., Ose V., Lieknina I., Bogans J., Sasnauskas K., Pumpens P. Chimeric derivatives of hepatitis В core particles carrying major epitopes of the rubella virus E1 glycoprotein // Clinical and Vaccine Immunology. 2013. V. 20. № 11. P. 1719-1728.
39. Steinmetz N.F., Lin Т., Lomonossoff G.P., Johnson J.E. Structure-based engineering of an icosahedral virus for nanomedicine and nanotechnology // Viruses and Nanotechnology. - Springer, Berlin, Heidelberg, 2009. P. 23-58.
40. Terry G.M., Ho-Terry L., Londersborough P. Localization of the rubella E1 epitopes // Archives of Virology. 1988. V. 98. № 3-4. P. 189-197.
41. Terry G.M., Ho-Terry L., Londesborough P., Rees K.R. A bio-engineered rubella E1 antigen // Archives of virology. 1989. V. 104. № 1-2. P. 63-75.
42. Tingle A.J., Allen M., Petty R.E., Kettyls G.D., Chantler J.K. Rubella-associated arthritis. I. Comparative study of joint manifestations associated with natural rubella infection and RA 27/3 rubella immunisation // Annals of the rheumatic diseases. 1986. V. 45. № 2. P. 110-114.
43. Trifonova E.A., Zenin V.A., Nikitin N.A., Yurkova M.S., Ryabchevskaya E.M., Putlyaev E.V., Donchenko E.K., Kondakova O.A., Fedorov A.N., Atabekov J.G., Karpova O.V. Study of rubella candidate vaccine based on a structurally modified plant virus // Antiviral Research. 2017. V. 144. № C. P. 27-33.
44. Waxham M.N., Wolinsky J.S. Detailed immunological analysis of the structural polypeptides of rubella virus using monoclonal antibodies // Virology. 1985. V. 143. № 1. P. 153-165.
45. White S.J., Boldt K.L., Holditch S.J., Poland G.A., Jacobson R.M. Measles, mumps, and rubella // Clinical obstetrics and gynecology. 2012. V. 55. № 2. P. 550.
46. WHO (World Health Organization). Rubella vaccines. Summary of WHO position paper published in WER July 2011.
47. Wolinsky J.S., Sukholutsky E., Moore W.Т., Lovett A., McCarthy M., Adame B. An antibody - and synthetic peptide-defined rubella virus E1 glycoprotein neutralization domain //Journal of Virology. 1993. V. 67. № 2. P. 961-968.
48. Yokoyama M., Hasett D.E., Zhang J., Whitton J.L. DNA immunization can stimulate florid local inflammation and the antiviral immunity induced varies depending on injection site // Vaccine. 1997. V. 15. № 5. P. 553-560.