НАБОР ДЛЯ СКРИНИНГА НА РАК ПРЯМОЙ И ОБОДОЧНОЙ КИШКИ И ПРОГРЕССИРУЮЩЕЙ АДЕНОМЫ И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ

1. Набор для обнаружения наличия или отсутствия рака прямой и ободочной кишки (РПОК) или прогрессирующей аденомы (ПА) у пациента, нуждающегося в этом, где указанный набор содержит:
(а) первую пару праймеров и первый зонд для детектирования состояния или уровня метилирования по меньшей мере одного динуклеотида CpG гена BMP3 в биологическом образце, взятом у пациента, где каждый из первой пары праймеров и первого зонда включает непрерывную последовательность по меньшей мере из 16 нуклеотидов, которая идентична и комплементарна последовательности SEQ ID NO. 1 или гибридизуется с этой последовательностью в жестких условиях гибридизации;
(b) вторую пару праймеров и второй зонд для детектирования состояния или уровня метилирования по меньшей мере одного динуклеотида CpG гена NDRG4 в биологическом образце, взятом у пациента, где каждый из второй пары праймеров и второго зонда включает непрерывную последовательность по меньшей мере из 16 нуклеотидов, которая идентична и комплементарна последовательности SEQ ID NO. 2 или гибридизуется с этой последовательностью в жестких условиях гибридизации.
2. Набор по п. 1, где первая пара праймеров и первый зонд выбраны из группы, состоящей из:
i) прямого праймера, содержащего SEQ ID NO: 3, обратного праймера, содержащего SEQ ID NO: 4, и зонда, содержащего SEQ ID NO: 5;
ii) прямого праймера, содержащего SEQ ID NO: 9, обратного праймера, содержащего SEQ ID NO: 10, и зонда, содержащего SEQ ID NO: 11; и
iii) прямого праймера, содержащего SEQ ID NO: 15, обратного праймера, содержащего SEQ ID NO: 16, и зонда, содержащего SEQ ID NO: 17; и
где вторая пара праймеров и второй зонд выбраны из группы, состоящей из:
iv) прямого праймера, содержащего SEQ ID NO: 6, обратного праймера, содержащего SEQ ID NO: 7, и зонда, содержащего SEQ ID NO: 8;
v) прямого праймера, содержащего SEQ ID NO: 12, обратного праймера, содержащего SEQ ID NO: 13, и зонда, содержащего SEQ ID NO: 14; и
vi) прямого праймера, содержащего SEQ ID NO: 18, обратного праймера, содержащего SEQ ID NO: 19, и зонда, содержащего SEQ ID NO: 20.
3. Набор по п. 1, где указанный набор включает:
i) прямой праймер, содержащий SEQ ID NO: 3, обратный праймер, содержащий SEQ ID NO: 4, и зонд, содержащий SEQ ID NO: 5, для детектирования состояния или уровня метилирования по меньшей мере одного динуклеотида CpG гена BMP3 в биологическом образце, взятом у пациента, и
ii) прямой праймер, содержащий SEQ ID NO: 6, обратный праймер, содержащий SEQ ID NO: 7, и зонд, содержащий SEQ ID NO: 8, для детектирования состояния или уровня метилирования по меньшей мере одного динуклеотида CpG гена NDRG4 в биологическом образце, взятом у пациента.
4. Набор по п. 1, где указанный набор включает:
i) прямой праймер, содержащий SEQ ID NO: 9, обратный праймер, содержащий SEQ ID NO: 10, и зонд, содержащий SEQ ID NO: 11, для детектирования состояния или уровня метилирования по меньшей мере одного динуклеотида CpG гена BMP3 в биологическом образце, взятом у пациента, и
ii) прямой праймер, содержащий SEQ ID NO: 12, обратный праймер, содержащий SEQ ID NO: 13, и зонд, содержащий SEQ ID NO: 14, для детектирования состояния или уровня метилирования по меньшей мере одного динуклеотида CpG гена NDRG4 в биологическом образце, взятом у пациента.
5. Набор по п. 1, где указанный набор включает:
i) прямой праймер, содержащий SEQ ID NO: 15, обратный праймер, содержащий SEQ ID NO: 16, и зонд, содержащий SEQ ID NO: 17, для детектирования состояния или уровня метилирования по меньшей мере одного динуклеотида CpG гена BMP3 в биологическом образце, взятом у пациента, и
ii) прямой праймер, содержащий SEQ ID NO: 18, обратный праймер, содержащий SEQ ID NO: 19, и зонд, содержащий SEQ ID NO: 20, для детектирования состояния или уровня метилирования по меньшей мере одного динуклеотида CpG гена NDRG4 в биологическом образце, взятом у пациента.
6. Набор по любому из пп. 1-5, где первый зонд и второй зонд содержат флуоресцентный донор и акцепторный флуорофор.
7. Набор по п. 6, где первый зонд и второй зонд представляют собой зонды TAQMAN.
8. Набор по любому из пп. 1-7, где набор дополнительно включает:
(1) средство для детектирования присутствия или отсутствия по меньшей мере одной мутации в гене KRAS у пациента; и
(2) средство для детектирования наличия или отсутствия гемоглобина в биологическом образце, взятом у пациента.
9. Набор по п. 8, где средство для детектирования присутствия или отсутствия по меньшей мере одной мутации в гене KRAS у пациента включает по меньшей мере одну пару праймеров, способных амплифицировать область экзона 12 и/или экзона 13 гена KRAS в полимеразной цепной реакции (ПЦР).
10. Набор по п. 8, где средство для детектирования присутствия или отсутствия гемоглобина в биологическом образце включает антитело против гемоглобина.
11. Набор по п.9, где праймеры способны амплифицировать область гена KRAS, содержащую по меньшей мере одну мутацию KRAS, выбранную из группы, состоящей из G12D, G12V, G12C, G13D, G12A, G12R, G12S и G13C.
12. Набор по п. 10, в котором антитело представляет собой антитело, конъюгированное с коллоидным золотом.
13. Набор по любому из пп. 1-12, где набор дополнительно включает средство для амплификации контрольного гена для количественной оценки.
14. Набор по любому из пп. 1-12, где набор дополнительно содержит инструкции по применению и/или интерпретации результата теста, полученного с использованием набора.
15. Набор по п. 10, где набор дополнительно включает средство для детектирования комплекса, образованного антителом и гемоглобином в биологическом образце.
16. Набор по любому из пп. 1-15, в котором биологический образец, взятый у пациента, представляет собой пробу кала.
17. Набор по любому из пп. 1-16, где набор дополнительно включает бисульфитный реагент и контейнер, подходящий для смешивания бисульфитного реагента и биологического образца пациента или полинуклеотидов, полученных из биологического образца.
18. Набор по любому из пп. 1-17, где набор дополнительно включает рестриктирующий фермент-реагент, чувствительный к метилированию.
19. Набор по любому из пп. 1-18, где набор дополнительно включает:
(1) позитивный стандарт и негативный стандарт для детектирования метилирования BMP3 в биологическом образце, и
(2) позитивный стандарт и негативный стандарт для детектирования метилирования NDRG4 в биологическом образце.
20. Набор по п.19, в котором:
позитивный стандарт для обнаружения метилирования BMP3 включает полинуклеотидную последовательность
GTTAGTTTGGTCGGGTGTTTTTAAAAATAAAGCGAGGAGGGAAGGTATAGATAGATTTTGAAAATATTCGGGTTATATACGTCGCGATTTATAGTTTTTTTTTAGCGTTGGAGTGGAGACGGCGTTCGTAGCGTTTTGCGCGGGTGAGGTTCGCGTAGTTGTTGGGGAAGAGTTTATTTGTTAGGTTGCGTTGGGTTAGCGTAGTAAGTGGGGTTGGTCGTTATTTCGTTGTATTCGGTCGCGTTTCGGGTTTCGTGCGTTTTCGTTTTAG (SEQ ID NO: 67);
негативный стандарт для детектирования метилирования BMP3 включает полинуклеотидную последовательность
GTTAGTTTGGTTGGGTGTTTTTAAAAATAAAGTGAGGAGGGAAGGTATAGATAGATTTTGAAAATATTTGGGTTATATATGTTGTGATTTATAGTTTTTTTTTAGTGTTGGAGTGGAGATGGTGTTTGTAGTGTTTTGTGTGGGTGAGGTTTGTGTAGTTGTTGGGGAAGAGTTTATTTGTTAGGTTGTGTTGGGTTAGTGTAGTAAGTGGGGTTGGTTGTTATTTTGTTGTATTTGGTTGTGTTTTGGGTTTTGTGTGTTTTTGTTTTAG (SEQ ID NO: 68);
позитивный стандарт для детектирования метилирования NDRG4 включает полинуклеотидную последовательность
TGAGAAGTCGGCGGGGGCGCGGATCGATCGGGGTGTTTTTTAGGTTTCGCGTCGCGGTTTTCGTTCGTTTTTTCGTTCGTTTATCGGGTATTTTAGTCGCGTAGAAGGCGGAAGTTACGCGCGAGGGATCGCGGTTCGTTCGGGATTAGTTTTAGGTTCGGTATCGTTTCGCGGGTCGAGCGTTTATATTCGTTAAATTTACGCGGGTACGTTTTCGCGGCGTATCGTTTTTAGTT (SEQ ID NO.: 69); и
негативный стандарт для детектирования метилирования NDRG4 включает полинуклеотидную последовательность
TGAGAAGTTGGTGGGGGTGTGGATTGATTGGGGTGTTTTTTAGGTTTTGTGTTGTGGTTTTTGTTTGTTTTTTTGTTTGTTTATTGGGTATTTTAGTTGTGTAGAAGGTGGAAGTTATGTGTGAGGGATTGTGGTTTGTTTGGGATTAGTTTTAGGTTTGGTATTGTTTTGTGGGTTGAGTGTTTATATTTGTTAAATTTATGTGGGTATGTTTTTGTGGTGTATTGTTTTTAGTT (SEQ ID NO.: 70).
21. Набор по п. 13, где средство для амплификации гена внутреннего контроля содержит праймеры для амплификации гена позитивного контроля и/или гена негативного контроля.
22. Способ определения наличия или отсутствия рака прямой и ободочной кишки (РПОК) или прогрессирующей аденомы (ПА) у пациента, нуждающегося в этом, где указанный способ включает:
а) получение геномной ДНК из биологического образца пациента;
b) обработку геномной ДНК (а) или ее фрагмента одним или несколькими реагентами для превращения цитозиновых оснований, которые не являются метилированными, в урацил или другое основание, которое заметно отличается от цитозина с точки зрения свойств гибридизации;
c) контактирование обработанной геномной ДНК или ее обработанного фрагмента с первой парой праймеров для детектирования присутствия или отсутствия сайтов метилирования гена, кодирующего белок морфогенеза кости 3 (BMP3) у пациента, и со второй парой праймеров для детектирования у пациента присутствия или отсутствия сайтов метилирования гена, кодирующего белок члена 4 семейства NDRG (NDRG4), где первая пара праймеров включает непрерывную последовательность по меньшей мере из 9 нуклеотидов, которая идентична, комплементарна SEQ ID NO: 1 или гибридизуется с ней в жестких условиях гибридизации, и где вторая пара праймеров содержит непрерывную последовательность по меньшей мере из 9 нуклеотидов, которая комплементарна SEQ ID NO: 2 или гибридизуется с ней в жестких условиях гибридизации, где обработанная геномная ДНК или ее фрагмент были либо амплифицированы для получения по меньшей мере одного амплификата с использованием первой пары праймеров или второй пары праймеров, либо не были амплифицированы; и
d) определение наличия или отсутствия РПОК или ПА у пациента исходя из присутствия или отсутствия указанного амплификата, состояния или уровня метилирования по меньшей мере одного динуклеотида CpG гена BMP3 и гена NDRG4 у пациента.
23. Способ по п. 22, в котором первая пара праймеров и первый зонд выбраны из группы, состоящей из:
i) прямого праймера, содержащего SEQ ID NO: 3, обратного праймера, содержащего SEQ ID NO: 4, и зонда, содержащего SEQ ID NO: 5;
ii) прямого праймера, содержащего SEQ ID NO: 9, обратного праймера, содержащего SEQ ID NO: 10, и зонда, содержащего SEQ ID NO: 11;
iii) прямого праймера, содержащего SEQ ID NO: 15, обратного праймера, содержащего SEQ ID NO: 16, и зонда, содержащего SEQ ID NO: 17; и
где вторая пара праймеров и второй зонд выбраны из группы, состоящей из:
iv) прямого праймера, содержащего SEQ ID NO: 6, обратного праймера, содержащего SEQ ID NO: 7, и зонда, содержащего SEQ ID NO: 8;
v) прямого праймера, содержащего SEQ ID NO: 12, обратного праймера, содержащего SEQ ID NO: 13, и зонда, содержащего SEQ ID NO: 14; и
vi) прямого праймера, содержащего SEQ ID NO: 18, обратного праймера, содержащего SEQ ID NO: 19, и зонда, содержащего SEQ ID NO: 20.
24. Способ по п.22, который включает применение:
i) прямого праймера, содержащего SEQ ID NO: 3, обратного праймера, содержащего SEQ ID NO: 4, и зонда, содержащего SEQ ID NO: 5, для детектирования состояния или уровня метилирования по меньшей мере одного динуклеотида CpG гена BMP3 в биологическом образце, взятом у пациента, и
ii) прямого праймера, содержащего SEQ ID NO: 6, обратного праймера, содержащего SEQ ID NO: 7, и зонда, содержащего SEQ ID NO: 8, для детектирования состояния или уровня метилирования по меньшей мере одного динуклеотида CpG гена NDRG4 в биологическом образце, взятом у пациента.
25. Способ по п.22, который включает применение:
i) прямого праймера, содержащего SEQ ID NO: 9, обратного праймера, содержащего SEQ ID NO: 10, и зонда, содержащего SEQ ID NO: 11, для детектирования состояния или уровня метилирования по меньшей мере одного динуклеотида CpG гена BMP3 в биологическом образце, взятом у пациента, и
ii) прямого праймера, содержащего SEQ ID NO: 12, обратного праймера, содержащего SEQ ID NO: 13, и зонда, содержащего SEQ ID NO: 14, для детектирования состояния или уровня метилирования по меньшей мере одного динуклеотида CpG гена NDRG4 в биологическом образце, взятом у пациента.
26. Способ по п. 22, который включает применение:
i) прямого праймера, содержащего SEQ ID NO: 15, обратного праймера, содержащего SEQ ID NO: 16, и зонда, содержащего SEQ ID NO: 17, для детектирования состояния или уровня метилирования по меньшей мере одного динуклеотида CpG гена BMP3 в биологическом образце, взятом у пациента, и
ii) прямого праймера, содержащего SEQ ID NO: 18, обратного праймера, содержащего SEQ ID NO: 19, и зонда, содержащего SEQ ID NO: 20, для детектирования состояния или уровня метилирования по меньшей мере одного динуклеотида CpG гена NDRG4 в биологическом образце, взятом у пациента.
27. Способ по любому из пп. 22-26, в котором первый зонд и второй зонд содержат флуоресцентный донор и акцепторный флуорофор.
28. Способ по любому из пп. 22-26, в котором первый зонд и второй зонд представляют собой зонды TAQMAN.
29. Способ по любому из пп. 22-28, где указанный способ дополнительно включает стадию детектирования присутствия или отсутствия по меньшей мере одной мутации в гене KRAS в биологическом образце, взятом у пациента, и стадию детектирования присутствия или отсутствия гемоглобина в биологическом образце, взятом у пациента.
30. Способ по п. 29, где стадия детектирования присутствия или отсутствия по меньшей мере одной мутации в гене KRAS у пациента включает применение по меньшей мере одной пары праймеров, способных амплифицировать область экзона 12 и/или экзона 13 гена KRAS в полимеразной цепной реакции (ПЦР).
31. Способ по п. 29, где стадия детектирования присутствия или отсутствия гемоглобина в биологическом образце включает использование антитела против гемоглобина.
32. Способ по п. 30, где праймеры способны амплифицировать область гена KRAS, содержащую по меньшей мере одну мутацию KRAS, выбранную из группы, состоящей из G12D, G12V, G12C, G13D, G12A, G12R, G12S и G13C.
33. Способ по п. 31, где антитело представляет собой антитело, конъюгированное с коллоидным золотом.
34. Способ по любому из пп. 22-33, где амплификацию гена BMP3 осуществляют с помощью количественной ПЦР (кол.ПЦР), и этот способ дополнительно включает амплификацию первого контрольного гена для определения значения Ct амплификации BMP3 как ∆Ct1.
35. Способ по любому из пп. 22-33, где амплификацию гена NDRG4 осуществляют с помощью количественной ПЦР (кол.ПЦР), и этот способ дополнительно включает амплификацию второго контрольного гена для определения значения Ct амплификации NDRG4 как ∆Ct2.
36. Способ по любому из пп. 30-33, где амплификацию мутантного гена KRAS осуществляют с помощью количественной ПЦР (кол.ПЦР), и этот способ дополнительно включает амплификацию третьего контрольного гена для определения значения Ct амплификации мутантного KRAS как ∆Ct3.
37. Способ по п. 34 или 35, где первый и второй контрольные гены являются одинаковыми.
38. Способ по п. 37, где тот же самый контрольный ген является геном B2M.
39. Способ по п. 36, где мутантный ген KRAS содержит мутацию, выбранную из группы, состоящей из G12D, G13D, G12V, G12C, G12S, G12A и G13R.
40. Способ по п. 39, где мутантный ген KRAS амплифицируют с использованием одной или более пар праймеров, выбранных из группы, состоящей из:
(1) прямого праймера G12D-F, содержащего SEQ ID NO: 35, и обратного праймера Kras-R, содержащего SEQ ID NO: 42;
(2) прямого праймера G13D-F, содержащего SEQ ID NO: 36, и обратного праймера Kras-R, содержащего SEQ ID NO: 42;
(3) прямого праймера G12V-F, содержащего SEQ ID NO: 37, и обратного праймера Kras-R, содержащего SEQ ID NO: 42;
(4) прямого праймера G12C-F, содержащего SEQ ID NO: 38, и обратного праймера Kras-R, содержащего SEQ ID NO: 42;
(5) прямого праймера G12S-F, содержащего SEQ ID NO: 39, и обратного праймера Kras-R, содержащего SEQ ID NO: 42;
(6) прямого праймера G12A-F, содержащего SEQ ID NO. : 40, и обратного праймера Kras-R, содержащего SEQ ID NO: 42; и
(7) прямого праймера G12R-F, содержащего SEQ ID NO: 41, и обратного праймера Kras-R, содержащего SEQ ID NO: 42,
и где зонд KRAS для кол.ПЦР содержит SEQ ID NO: 46.
41. Способ по п. 36, где третий контрольный ген представляет собой ген ACTB.
42. Способ по п. 41, где праймеры для кол.ПЦР для амплификации гена ACTB содержат SEQ ID NO: 43 и 44, а зонд содержит SEQ ID NO: 46.
43. Способ по пп. 22-42, где указанный способ включает применение:
(1) позитивного стандарта и негативного стандарта для детектирования метилирования BMP3 в образце, и
(2) позитивного стандарта и негативного стандарта для детектирования метилирования NDRG4 в образце.
44. Способ по п. 43, где
позитивный стандарт для детектирования метилирования BMP3 включает полинуклеотидную последовательность
GTTAGTTTGGTCGGGTGTTTTTAAAAATAAAGCGAGGAGGGAAGGTATAGATAGATTTTGAAAATATTCGGGTTATATACGTCGCGATTTATAGTTTTTTTTTAGCGTTGGAGTGGAGACGGCGTTCGTAGCGTTTTGCGCGGGTGAGGTTCGCGTAGTTGTTGGGGAAGAGTTTATTTGTTAGGTTGCGTTGGGTTAGCGTAGTAAGTGGGGTTGGTCGTTATTTCGTTGTATTCGGTCGCGTTTCGGGTTTCGTGCGTTTTCGTTTTAG (SEQ ID NO: 67);
негативный стандарт для детектирования метилирования BMP3 включает полинуклеотидную последовательность
GTTAGTTTGGTTGGGTGTTTTTAAAAATAAAGTGAGGAGGGAAGGTATAGATAGATTTTGAAAATATTTGGGTTATATATGTTGTGATTTATAGTTTTTTTTTAGTGTTGGAGTGGAGATGGTGTTTGTAGTGTTTTGTGTGGGTGAGGTTTGTGTAGTTGTTGGGGAAGAGTTTATTTGTTAGGTTGTGTTGGGTTAGTGTAGTAAGTGGGGTTGGTTGTTATTTTGTTGTATTTGGTTGTGTTTTGGGTTTTGTGTGTTTTTGTTTTAG (SEQ ID NO: 68);
позитивный стандарт для детектирования метилирования NDRG4 включает полинуклеотидную последовательность
TGAGAAGTCGGCGGGGGCGCGGATCGATCGGGGTGTTTTTTAGGTTTCGCGTCGCGGTTTTCGTTCGTTTTTTCGTTCGTTTATCGGGTATTTTAGTCGCGTAGAAGGCGGAAGTTACGCGCGAGGGATCGCGGTTCGTTCGGGATTAGTTTTAGGTTCGGTATCGTTTCGCGGGTCGAGCGTTTATATTCGTTAAATTTACGCGGGTACGTTTTCGCGGCGTATCGTTTTTAGTT (SEQ ID NO.: 69); и
негативный стандарт для детектирования метилирования NDRG4 включает полинуклеотидную последовательность
TGAGAAGTTGGTGGGGGTGTGGATTGATTGGGGTGTTTTTTAGGTTTTGTGTTGTGGTTTTTGTTTGTTTTTTTGTTTGTTTATTGGGTATTTTAGTTGTGTAGAAGGTGGAAGTTATGTGTGAGGGATTGTGGTTTGTTTGGGATTAGTTTTAGGTTTGGTATTGTTTTGTGGGTTGAGTGTTTATATTTGTTAAATTTATGTGGGTATGTTTTTGTGGTGTATTGTTTTTAGTT (SEQ ID NO.: 70).
45. Способ по любому из пп. 22-44, где способ включает амплификацию стандарта контроля качества.
46. Способ обнаружения наличия или отсутствия рака прямой и ободочной кишки (РПОК) или прогрессирующей аденомы (ПА) у пациента, нуждающегося в этом, где указанный способ включает использование набора по любому из пп. 1-21.
47. Способ обнаружения наличия или отсутствия рака прямой и ободочной кишки (РПОК) или прогрессирующей аденомы (AA) у пациента, нуждающегося в этом, где указанный способ включает:
а) получение необработанной геномной ДНК из пробы кала пациента;
b) обработку геномной ДНК (а) или ее фрагмента одним или более реагентами для превращения цитозиновых оснований, которые являются неметилированнными, в урацил или другое основание, которое заметно отличается от цитозина с точки зрения свойств гибридизации;
c) проведение количественной ПЦР (кол.ПЦР) с использованием обработанной геномной ДНК (b) в качестве матрицы и определение значения Ct гена BMP3 у пациента как ∆Ct1;
d) проведение кол.ПЦР с использованием обработанной геномной ДНК (b) в качестве матрицы и определение значения Ct гена NDRG4 у пациента как ∆Ct2;
e) проведение кол.ПЦР с использованием необработанной геномной ДНК в качестве матрицы и определение значения мутантного гена KRAS у пациента как ∆Ct3;
f) проведение иммунохимического анализа кала на белок гемоглобин в пробе кала и оценку результата как FIT;
g) определение значения K, где K=a*ΔCt1+b*ΔCt2+c*ΔCt3+d*FIT+X, где a, b, c, d, X представляют собой клинические константы; и
K
K
h) определение значения общего индекса P, где Р=e/(1+e), где e представляет собой натуральную константу, при этом, если P равно или больше заданного порога, то у пациента диагностируют РПОК и/или ПА, а если P меньше этого порога, то пациент считается здоровым.
48. Способ по п. 47, где кол.ПЦР для амплификации гена BMP3 включает первую пару праймеров и первый зонд, где первая пара праймеров и первый зонд выбраны из группы, состоящей из:
i) прямого праймера, содержащего SEQ ID NO: 3, обратного праймера, содержащего SEQ ID NO: 4, и зонда, содержащего SEQ ID NO: 5;
ii) прямого праймера, содержащего SEQ ID NO: 9, обратного праймера, содержащего SEQ ID NO: 10, и зонда, содержащего SEQ ID NO: 11; и
iii) прямого праймера, содержащего SEQ ID NO: 15, обратного праймера, содержащего SEQ ID NO: 16, и зонда, содержащего SEQ ID NO: 17; и
где кол.ПЦР для амплификации гена NDRG4 включает вторую пару праймеров и второй зонд, где вторая пара праймеров и второй зонд выбраны из группы, состоящей из:
iv) прямого праймера, содержащего SEQ ID NO: 6, обратного праймера, содержащего SEQ ID NO: 7, и зонда, содержащего SEQ ID NO: 8;
v) прямого праймера, содержащего SEQ ID NO: 12, обратного праймера, содержащего SEQ ID NO: 13, и зонда, содержащего SEQ ID NO: 14; и
vi) прямого праймера, содержащего SEQ ID NO: 18, обратного праймера, содержащего SEQ ID NO: 19, и зонда, содержащего SEQ ID NO: 20.
49. Способ по п. 47, где способ включает применение:
i) прямого праймера, содержащего SEQ ID NO: 3, обратного праймера, содержащего SEQ ID NO: 4, и зонда, содержащего SEQ ID NO: 5, для детектирования состояния или уровня метилирования по меньшей мере одного динуклеотида CpG гена BMP3 в образце, и
ii) прямого праймера, содержащего SEQ ID NO: 6, обратного праймера, содержащего SEQ ID NO: 7, и зонда, содержащего SEQ ID NO: 8, для детектирования состояния или уровня метилирования по меньшей мере одного динуклеотида CpG гена NDRG4 в образце.
50. Способ по п. 47, где способ включает применение:
i) прямого праймера, содержащего SEQ ID NO: 9, обратного праймера, содержащего SEQ ID NO: 10, и зонда, содержащего SEQ ID NO: 11, для детектирования состояния или уровня метилирования по меньшей мере одного динуклеотида CpG гена BMP3 в образце, и
ii) прямого праймера, содержащего SEQ ID NO: 12, обратного праймера, содержащего SEQ ID NO: 13, и зонда, содержащего SEQ ID NO: 14, для детектирования состояния или уровня метилирования по меньшей мере одного динуклеотида CpG гена NDRG4 в образце.
51. Способ по п. 47, где указанный способ включает применение:
i) прямого праймера, содержащего SEQ ID NO: 15, обратного праймера, содержащего SEQ ID NO: 16, и зонда, содержащего SEQ ID NO: 17, для детектирования состояния или уровня метилирования по меньшей мере одного динуклеотида CpG гена BMP3 в образце, и
ii) прямого праймера, содержащего SEQ ID NO: 18, обратного праймера, содержащего SEQ ID NO: 19, и зонда, содержащего SEQ ID NO: 20, для определения состояния или уровня метилирования по меньшей мере одного динуклеотида CpG гена NDRG4 в образце.
52. Способ по любому из пп. 47-51, где первый зонд и второй зонд содержат флуоресцентный донор и акцепторный флуорофор.
53. Способ по любому из пп. 47-52, где первый зонд и второй зонд представляют собой зонды TAQMAN.
54. Способ по любому из пп. 47-53, где мутантный ген KRAS содержит по меньшей мере одну мутацию KRAS, выбранную из группы, состоящей из G12D, G12V, G12C, G13D, G12A, G12R, G12S и G13C.
55. Способ по любому из пп. 47-54, в котором иммунохимический анализ кала включает антитело, конъюгированное с коллоидным золотом.
56. Способ по любому из пп. 47-55, в котором стадия с) и стадия d) включают использование гена B2M в качестве контрольного гена.
57. Способ по п. 54, где мутантный ген KRAS амплифицируют с использованием одной или более пар праймеров, выбранных из группы, состоящей из:
(1) прямого праймера G12D-F, содержащего SEQ ID NO: 35, и обратного праймера Kras-R, содержащего SEQ ID NO: 42;
(2) прямого праймера G13D-F, содержащего SEQ ID NO: 36, и обратного праймера Kras-R, содержащего SEQ ID NO: 42;
(3) прямого праймера G12V-F, содержащего SEQ ID NO: 37, и обратного праймера Kras-R, содержащего SEQ ID NO: 42;
(4) прямого праймера G12C-F, содержащего SEQ ID NO: 38, и обратного праймера Kras-R, содержащего SEQ ID NO: 42;
(5) прямого праймера G12S-F, содержащего SEQ ID NO: 39, и обратного праймера Kras-R, содержащего SEQ ID NO: 42;
(6) прямого праймера G12A-F, содержащего SEQ ID NO: 40, и обратного праймера Kras-R, содержащего SEQ ID NO: 42; и
(7) прямого праймера G12R-F, содержащего SEQ ID NO: 41, и обратного праймера Kras-R, содержащего SEQ ID NO: 42,
и где зонд KRAS для кол.ПЦР содержит SEQ ID NO: 46.
58. Способ по п. 57, где ген ACTB используют в качестве контрольного гена в кол.ПЦР для амплификации мутантного гена KRAS.
59. Способ по п.58, где праймеры для кол.ПЦР для амплификации гена ACTB содержат SEQ ID NO: 43 и 44, а зонд для кол.ПЦР гена ACTB содержит SEQ ID NO: 46.
60. Способ по пп. 47-59, где способ включает применение:
(1) позитивного стандарта и негативного стандарта для детектирования метилирования BMP3 в образце, и
(2) позитивного стандарта и негативного стандарта для детектирования метилирования NDRG4 в образце.
61. Способ по п. 60, где
позитивный стандарт для детектирования метилирования BMP3 включает полинуклеотидную последовательность
GTTAGTTTGGTCGGGTGTTTTTAAAAATAAAGCGAGGAGGGAAGGTATAGATAGATTTTGAAAATATTCGGGTTATATACGTCGCGATTTATAGTTTTTTTTTAGCGTTGGAGTGGAGACGGCGTTCGTAGCGTTTTGCGCGGGTGAGGTTCGCGTAGTTGTTGGGGAAGAGTTTATTTGTTAGGTTGCGTTGGGTTAGCGTAGTAAGTGGGGTTGGTCGTTATTTCGTTGTATTCGGTCGCGTTTCGGGTTTCGTGCGTTTTCGTTTTAG (SEQ ID NO: 67);
негативный стандарт для детектирования метилирования BMP3 включает полинуклеотидную последовательность
GTTAGTTTGGTTGGGTGTTTTTAAAAATAAAGTGAGGAGGGAAGGTATAGATAGATTTTGAAAATATTTGGGTTATATATGTTGTGATTTATAGTTTTTTTTTAGTGTTGGAGTGGAGATGGTGTTTGTAGTGTTTTGTGTGGGTGAGGTTTGTGTAGTTGTTGGGGAAGAGTTTATTTGTTAGGTTGTGTTGGGTTAGTGTAGTAAGTGGGGTTGGTTGTTATTTTGTTGTATTTGGTTGTGTTTTGGGTTTTGTGTGTTTTTGTTTTAG (SEQ ID NO: 68);
позитивный стандарт для детектирования метилирования NDRG4 включает полинуклеотидную последовательность
TGAGAAGTCGGCGGGGGCGCGGATCGATCGGGGTGTTTTTTAGGTTTCGCGTCGCGGTTTTCGTTCGTTTTTTCGTTCGTTTATCGGGTATTTTAGTCGCGTAGAAGGCGGAAGTTACGCGCGAGGGATCGCGGTTCGTTCGGGATTAGTTTTAGGTTCGGTATCGTTTCGCGGGTCGAGCGTTTATATTCGTTAAATTTACGCGGGTACGTTTTCGCGGCGTATCGTTTTTAGTT (SEQ ID NO.: 69); и
негативный стандарт для детектирования метилирования NDRG4 включает полинуклеотидную последовательность
TGAGAAGTTGGTGGGGGTGTGGATTGATTGGGGTGTTTTTTAGGTTTTGTGTTGTGGTTTTTGTTTGTTTTTTTGTTTGTTTATTGGGTATTTTAGTTGTGTAGAAGGTGGAAGTTATGTGTGAGGGATTGTGGTTTGTTTGGGATTAGTTTTAGGTTTGGTATTGTTTTGTGGGTTGAGTGTTTATATTTGTTAAATTTATGTGGGTATGTTTTTGTGGTGTATTGTTTTTAGTT (SEQ ID NO: 70).
62. Способ по любому из пп. 47-61, где способ включает амплификацию стандарта контроля качества в стадии c) и в стадии d).
63. Способ диагностики и лечения рака прямой и ободочной кишки (РПОК) и/или прогрессирующей аденомы (ПА) у пациента, нуждающегося в этом, где указанный способ включает определение наличия или отсутствия РПОК и/или ПА у пациента с использованием набора по любому из пп. 1-21, и лечение пациента в зависимости от наличия или отсутствия у него РПОК и/или ПА.
64. Способ диагностики и лечения рака прямой и ободочной кишки (РПОК) и/или прогрессирующей аденомы (ПА) у пациента, нуждающегося в этом, где указанный способ включает определение наличия или отсутствия РПОК и/или ПА у пациента с применением способа по любому из пп. 22-62, и лечение пациента в зависимости от наличия или отсутствия у него РПОК и/или ПА.