Способ клонального микроразмножения in vitro сортового хмеля
METHOD FOR IN VITRO CLONAL MICROPROPAGATION OF VARIETAL HOP

Изобретение относится к области сельскохозяйственной биотехнологии, в частности, к способам размножения и может быть использовано для получения качественного посадочного материала.
Возделываемый в производстве хмель относится к виду хмель обыкновенный (Humulus lupulus L.) - многолетнее растение, ботанически родственное конопле, из семейства Cannabineae (Коноплевые), порядка Urticaceae (Крапивоцветньгх). Это многолетняя двудомная вьющаяся лиана с однолетними (монокарпическими) побегами. Многолетняя (функционирующая в течение 20 лет и более) у хмеля только подземная часть растения. Надземные органы (вегетативные и генеративные) ежегодно весной отрастают из почек возобновления, за вегетацию проходят весь цикл, а на зиму отмирают [1].
Ценность хмеля, как сырья для пивоварения обусловлена наличием специфических горьких веществ (общих смол), полифенольных соединений и эфирных масел, которые придают пиву характерный хмелевой аромат, особый горький вкус, усиливают брожение, повышают стойкость готового пива против прокисания, способствуют пеностойкости и прозрачности [2, 3]. В каждую из этих групп веществ входит большое число компонентов, сложных по своей химической природе. Все попытки ученых найти замену хмелю в пивоварении не принесли результатов.
Интенсификация хмелеводства и увеличение объемов выращивания саженцев высокопродуктивных сортов требуют выбора оптимального способа производства посадочного материала. В производстве хмель размножают традиционным способом -вегетативно через укоренение разных частей материнского растения: зелеными, стеблевыми черенками - отрезками подземной части стебля, корневищными черенками - отрезками подземной части бокового корневища с одной или более парами глазков с почками [4].
Недостатками данного способа являются значительные затраты ручного труда, низкий коэффициент размножения, короткий период и сезонность заготовки черенков и как следствие низкий выход полноценных саженцев в год [5, 6].
Альтернативой традиционному способу размножения является клональное микроразмножение in vitro, которое позволяет получать большое количество саженцев от одного растения [7, 8]. Основное преимущество заключается в возможности использования методов культуры клеток и тканей для оздоровления посадочного материала от вирусов и вироидов [9], поскольку вегетативное размножение и длительное производственное использование монокультуры на одном участке (10-15 лет) приводит к повреждению и поражению разнообразными видами фитофагов и фитопатогенов, численность которых с годами повышается [10].
Наиболее близким предлагаемому изобретению является способ размножения в культуре in vitro сортов хмеля, который включает культивирование эксплантов (двухпочковые черенки) на питательной среде по прописи Мурасиге-Скуга, дополненной 6-БА в концентрации 0,5 мг/л и гибберелловой кислотой 1,0 мг/л, что, в свою очередь, обеспечивает высокий коэффициент размножения (до 8) и длину побегов (до 2,5 см) у отдельных генотипов при отсутствии витрификации [11]. Стоит отметить, что длительность культивирования не превышает 3-4 пассажей. При более длительном субкультивировании коэффициент размножения снижается либо регенерация вовсе отсутствует. Недостатком данного способа является низкий коэффициент размножения в отдельном пассаже и ограниченное количество пассажей.
Задача, на решение которой направлено изобретение - разработка способа размножения в культуре in vitro сортового хмеля, включающего стерилизацию эксплантов с последующим культивированием на питательной среде, элонгацию, укоренение, адаптацию растений к условиям ex vitro.
Техническим результатом является повышение коэффициента размножения в отдельном пассаже, увеличение длительности культивирования (числа пассажей) с высоким коэффициентом размножения, улучшение качества и жизнеспособности растений-регенерантов при длительном субкультивировании.
Предлагаемый способ клонального микроразмножения in vitro сортового хмеля, включает стерилизацию, культивирование in vitro микрочеренков или адвентивных побегов оздоровленных растений сортового хмеля на питательной среде, содержащей макро-, микроэлементы, Fe-хелат по прописи Мурасиге-Скуга, дополненной тиамин хлоридом, пиридоксин хлоридом, никотиновой кислотой по 0,5 мг/л, мезоинозитом, глицином в концентрациях 100 и 2 мг/л, соответственно, глюкозой - 2%, агаг-агаром - 0,53%, получение растений-регенерантов, их адаптацию, при этом в питательную среду в процессе 6-ти последовательных субкультивирований дополнительно вносят 0,5 мг/л тидиазурона - 1, 3, 5-й пассажи и 4 мг/л янтарной кислоты - 2, 4, 6-й пассажи.
Задача, на решение которой направлено изобретение, решается оптимизацией питательной среды на этапе собственно микроразмножения, включающей культивирование in vitro микрочеренков или адвентивных побегов оздоровленных растений сортового хмеля на питательной среде, содержащей макро-, микроэлементы, Fe-хелат по прописи Мурасиге-Скуга, дополненной витаминами, мезоинозитом и глицином, янтарной кислотой, гормонами группы цитокининов - 6-Бензиламинопурин или тидиазурон и гиббереллинов - гибберелловая кислота (Табл. 1.)
В процессе исследований разработана методика клонального микроразмножения хмеля обыкновенного (Humulus lupulus L.). В качестве объектов были использованы сорта Bor, Marynka, Sladek, Shpalter Select.
Стерилизация эксплантов включала три этапа: предстерилизацию - механическая очистка эксплантов, промывание в мыльной воде на магнитной мешалке в течение 20 минут, 10-15 минутное промывание в проточной воде; ступенчатую стерилизацию - обработка 70% этанолом - 1 минута и 30% пероксидом водорода - 5 минут, постстерилизацию - 4 кратное промывание стерильной дистиллированной водой не менее 5 минут каждое.
1
Инициацию первичной асептической культуры сортов хмеля обыкновенного - после 0 пассажа - проводили путем переноса эксплантов на питательную среду MS, включающую 2 мг/л БАП, 1 мг/л ГК, 20 мл/л глюкозы, 7 г/л агара.
0
Для оптимизации этапа микроразмножения - 1 пассаж - провели тестирование различных концентрации 2 типов регуляторов роста цитокининового ряда - 6-Бензиламинопурина (БАП) и тидиазурона (ТДЗ) (9 вариантов) в диапазоне 0,5-2,0 и 0,1-0,5 мг/л, соответственно. Регуляторы роста добавляли в питательные среду MS, дополненную 1 мг/л гибберелловой кислотой, 20 мл/л глюкозы, 5,3 г/л агара. Контролем служила безгормональная среда MS (Табл. 1).
Использование БАП и ТДЗ в качестве стимуляторов роста на этапе размножения в различных концентрациях позволило достичь коэффициентов размножения на уровне 1,6-3,9 и 3,5-4,8, соответственно (Табл. 2). Тидиазурон в составе питательной среды в концентрации 0,5 мг/л обеспечил максимальный коэффициент размножения для большинства сортов хмеля обыкновенного (Фиг. 1). Увеличение концентрации ТДЗ выше 0,5 мг/л приводило к витрификации побегов.
2
3
Высота побегов изученных сортов хмеля, сформированных на питательной среде MS с добавлением 0,5 мг/л ТДЗ, не превышала 10 мм, что обусловило необходимость их элонгации при последующим пассировании на MS, содержащей 4 мг/л янтарной кислоты. Янтарную кислоту успешно использовали в качестве стимулятора роста для микропобегов сливы [13]. Увеличение числа пассажей эксплантов сортового хмеля в процессе этапа собственно микроразмножение приводит к значительному снижению коэффициента размножения [12], витрификации побегов и хлорозу листьев (Фиг. 2а, 2б).
2
3
Полученные нами данные показали что, последовательная смена стимуляторов роста в питательной среде - MS ↔ MS - в процессе субкультивирования в течение 1-6 пассажей повысила эффективность размножения эксплантов с сохранением качества регенерантов (Табл. 3).
Примеры осуществления способа.
0
Пример 1. Использовали безгормональную питательную среду - MS. Длительность субкультивирования не превышала 3 пассажей, при этом средний коэффициент размножения сортов в отдельном пассаже варьировал от 0,3 до 1,1.
1
Пример 2. Использовали питательную среду - MS. Средний коэффициент размножения в процессе субкультвирования составил 0,9-3,2 в зависимости от сорта. Количество пассажей, на которых происходила регенерация растений, зависело от генотипа и составляло 2-3.
2
3
1
2
Пример 3. Использовали чередование питательных сред, содержащих ТДЗ-MS либо янтарную кислоту - MS в процессе 6-ти последовательных культивирований обеспечило высокий коэффициент размножения. ТДЗ индуцировал увеличение числа побегов на экспланте - 1, 3, 5-й пассажи. Янтарная кислота стимулировала рост регенерантов, предотвращала хлороз листьев и витрификацию побегов в сравнении с культивированием на средах MS и MS - 2, 4, 6-й пассажи (Фиг. 3).
После 6 пассажа побеги переносили для укоренения на питательную среду MS, содержащую 0,5 мг/л ИМК (индолил-3-масляная кислота), 20 г/л глюкозы и 7,3 г/л агар-агара. Мериклоны формировали хорошо развитую корневую систему (Фиг. 4) и надземную часть растений, сохраняли 100% жизнеспособность при адаптации к условиям ex vitro, что позволило получить посадочный материал сортового хмеля высокого качества.
Список литературы
1. Иванов А.Л., Савин И.Ю., Егоров А.В. Методология оценки ресурсного потенциала земель России для сельскохозяйственного производства (на примере хмеля) // Бюллетень Почвенного института им. В.В. Докучаева, 2014. - Вып.73. - С. 19-53.
2. Гаврилова С.Е. Эффективность применения биопрепаратов при выращивании посадочного материала хмеля // Актуальные вопросы развития аграрной науки в современных экономических условиях: материалы IV-й Междунар. научно-практич. конф., Волгоград, 22-23 мая 2015 г. - Волгоград, 2015. - С. 82-85.
3. Милоста Г.М., Лапа В.В. Агробиологические основы выращивания хмеля в Республике Беларусь. - Гродно: ГГАУ, 2010. - 286 с.
4. Христюк А.В., Касьянов Г.И. Хмель в пивоварении // Пиво и напитки, 2007. - №1. - С. 10-12.
5. Whittock S., Tedone L., Staskova L., Bird M., Yan D., Price A., Koutoulis A., Shellie R. Hop flavoromics for distinctive beer// Acta Horticulturae, 2019. - Vol. 1236. - P. 113-120.
6. Технология возделывания хмеля: Метод. Рекомендации / под общей ред к.с.-х. н. А.А. Фадеева. П. Опытный: ФГБНУ Чувашский НИИСХ, 2016. - 39 с.
7. Кухарчик Н.В. Получение посадочного материала плодовых и ягодных растений in vitro // Наука и инновации, 2019. - №6 (196). - С.17-21.
8. Roy А.Т., Leggett G., Koutoulis A. Development of a shoot multiplication system for hop Hamulus lupulus L. // In vitro Cell. Dev. Biol. - Plant, 2001. - Vol. 37(1). - P. 79-83.
9. Adams A.N. Elimination of viruses from the hop (Humulus lupulus) by heat and meristem culture // J. Hort. Sci., 1975. - Vol.50. - P. 151-160.
10. Перспективная ресурсосберегающая технология производства хмеля: метод. рекомендации / сост. А.С. Якимов, А.Н. Смирнов, С.С. Данилов и др. М.: Росинформагротех, 2008. - 52 с.
11. Кастрицкая М.С., Кухарчик Н.В., Гашенко О.А. Микроразмножение сортов хмеля in vitro II Вес.Нац. акад. навук Беларусь Сер. аграр. навук. - 2014. - №2. - С. 75-80.
12. Гашенко О.А., Кастрицкая М.С., Кухарчик Н.В. Микроразмножение сортов хмеля в культуре in vitro // Субтропическое и декоративное садоводство, 2019. - №68. -С. 111-118.
13. Бунцевич Л.Л., Беседина Е.Н., Костюк М.А. Изучение препарата-1, янтарной кислоты и ее солей в качестве стимуляторов роста эксплантов растений in vitro // ТППП АПК, 2015. - №4 (8). - С. 64-69.