Оптимизация выращивания суспензионных культур клеток Dioscorea deltoidea Wall и Polyscias filicifolia Bailey в полупроточном режиме в биореактрах различного объема

ОПТИМИЗАЦИЯ ВЫРАЩИВАНИЯ СУСПЕНЗИОННЫХ КУЛЬТУР КЛЕТОК

DIOSCOREA DELTOIDEA WALL И POLYSCIAS FILICIFOLIA BAILEY В ПОЛУПРОТОЧНОМ РЕЖИМЕ В БИОРЕАКТРАХ РАЗЛИЧНОГО ОБЪЕМА

М.В. ТИТОВА; НА. ШУМИЛО; И.Е. КУЛИЧЕНКО;

А.В. ОРЕШНИКОВ, кандидат биологических наук Учреждение Российской академии наук Институт физиологии растений им. К.А.

Тимирязева РАН, Москва, Россия А.М. НОСОВ, доктор биологических наук Биологический факультет Московского государственного университета им. М.В.

Ломоносова, Москва, Россия

Введение

В настоящее время культура клеток высших растений является альтернативным способом получения сырья для косметической, фармацевтической и пищевой промышленности [2, 6]. По сравнению с использованием интактных растений, применение технологий растительных клеток in vitro имеет ряд преимуществ, в частности:

- возможность получения необходимых количеств качественного продукта с воспроизводимыми характеристиками в стерильных контролируемых условиях;

- независимость от климатических и политических факторов;

- возможность использования биотрансформации для получения новых метаболитов;

- удобство производства и очистки продукта [6].

Однако следует отметить и ряд проблем, связанных с промышленным использованием культур клеток высших растений:

- трудности получения и сохранения высокопродуктивного штамма- продуцента;

- возможное снижение уровня содержания вторичных метаболитов в шамме-продуценте при длительном культивировании, опасность его генетической нестабильности;

- низкая скорость роста растительных клеток (относительно микробных культур);

- высокие требования к используемому оборудованию и, как следствие, высокая стоимость получаемой биомассы;

- технические трудности осуществления крупномасштабного выращивания клеток растений в промышленных биореакторах [3, 4].

Таким образом, для создания эффективной технологии получения биомассы культур клеток необходим целый комплекс научных и технологических исследований. Не считая получения штамма-продуцента с высокими ростовыми и биосинтетическими характеристиками, что является основой создаваемой технологии, требуется оптимизировать выращивание культур клеток в биореакторах. Для этого необходимы эксперименты по выбору оптимального типа биореактора и определения наиболее выгодных режимов выращивания культур. Кроме того, требуются специальные исследования по масштабированию процесса выращивания до биореакторов полупромышленного и промышленного объемов [3, 7].

Известно, что для промышленного производства биомассы можно использовать три варианта культивирования: периодический, проточный и полупроточный.

С точки зрения создания стабильного масштабного производства, проточный и периодический методы выращивания имеют ряд недостатков. В частности, при периодическом режиме требуется значительное время для подготовки и стерилизации биореактора, каждый новый цикл культивирования требует нового посевного материала, что может приводить к нестабильности биосинтеза и роста культуры. Проточное культивирование более стабильно, однако требует введения в схему биореактора дополнительных устройств (перистальтических насосов, разделительных мембран и пр.),

что для биореакторов промышленного объема представляет определенные конструктивные проблемы и значительно повышает стоимость процесса получения биомассы. Для проточного режима показано также изменение морфофизиологических характеристик и состава клеточных популяций (за счет отбора интенсивно делящихся клеток с пониженным синтезом). Наиболее перспективным представляется полупроточный или "отливно-доливной" метод культивирования, который занимает промежуточное положение между проточным и периодическим режимами выращивания. При использовании данного метода суспензия клеток разбавляется свежей питательной средой в фазу максимального накопления сухой массы в единице объема суспензии, что позволяет поддерживать клеточную популяцию в активно растущем состоянии и значительно уменьшает время культивирования [5].

Целью данной работы явилось оптимизирование режимов культивирования растительных клеток в биореакторах разной конструкции и объема для рентабельного производства биомассы. Для реализации поставленной задачи была исследована возможность длительного аппаратурного выращивания суспензионных культур клеток с использованием полупроточного метода.

Объекты и методы исследования

В качестве объектов исследования были использованы суспензионные культуры клеток диоскореи дельтовидной и полисциаса папортниколистного. Культуры депонированны в ВККК ВР ИФ РАН под соответствующими номерами: Dioscorea deltoidea Wall, мутантный штамм-сверхпродуцент фуростаноловых гликозидов ИФР ДМ-0.5 (№ 6); Polyscias filicifolia Bailey, коллекционный штамм BFT-001-95 (№ 58).

Культуры выращивали на модифицированных средах Мурасиге и Скуга с добавлением сахарозы и регуляторов роста. Для всех штаммов начальная плотность культур находилась в пределах 2,0-2,5 г/л по сухому весу при жизнеспособности культур 87-93%.

Культивирование проводили в колбах и в биореакторах.

Для выращивания суспензионных культур клеток в колбах на круговой качалке использовали колбы объемом 0,5-2,0 л. Культивирование проводили в темноте при температуре 26-27°С, влажности 70-75% и частоте оборотов качалки 80-100 об/мин.

Для аппаратурного выращивания использовали биореакторы 3-х типов:

1) барботажный соплоконусный ферментер (разработка Отдела биологии клетки и биотехнологии РАН), общий объем 20 л, рабочий объем 15 л.

2) аппарат с барботажем и механическим перемешиванием (фирма «Electrolux», Швеция); общий объем 75 л, рабочий объем 50 л, тип перемешивающего устройства «морской винт», скорость вращения мешалки при культивировании 30-65 об/мин.

3) барботажный аппарат (1Т, ОКБА, Йошкар-Ола), общий объем 630 л; рабочий объем 550 л.

В зависимости от типа биореактора и фазы ростового цикла расход воздуха на барботаж составлял 0,1-1,0 л/л/мин. Концентрацию растворенного кислорода рО2 поддерживали на уровне 10-40% от насыщения при отсутствии интенсивного пенообразования. Для уменьшения отрицательного воздействия перемешивающих устройств в биореакторах с механическим перемешиванием на начальных фазах роста устанавливали минимальную скорость перемешивания по отсутствию седиментации клеток. В период экспоненциального роста скорость вращения мешалки увеличивали до максимально возможной, не приводящей к разрушению клеток (степень повреждения определяли микроскопически). Температуру суспензии поддерживали на уровне 26+0,5°С.

Для характеристики роста и физиологического состояния культур использовали сухую и сырую массы, а также жизнеспособность и концентрацию клеток. По

первичным результатам, характеризующим рост культуры, рассчитывали следующие параметры:

индекс роста: 1=Хтах/Хо;

удельную скорость роста в экспоненте: ц= (Д1пХ/Хо)/ Д^ [сут-1]

время удвоения: Т=1п2 / ц, [сут], где

Хтах - максимальное значение параметра (сухая масса М,^, сырая масса М^) в цикле роста;

Хо - начальное значение параметра в цикле роста;

Дt - значение времени длительности экспоненциальной фазы роста, [сут].

При выращивании суспензионной культуры клеток Б. ёеЫвгёеа конце каждого цикла субкультивирования отбирали образцы биомассы и проводили количественное определение фуростаноловых гликозидов. Анализ гликозидов осуществлялся спектрофотометрическим методом с использованием реактива Эрлиха [1].

Результаты и обсуждение

Для проведения экспериментов по оптимизации и масштабированию выращивания была использована стратегия, типичная для микробных культур: предварительные эксперименты в лабораторных биореакторах (объем 2-15 л) по оптимизации роста культуры, затем выращивание в пилотных установках (объемом до 50 л) и проверка выбранных режимов, и наконец - масштабирование выращивания до полупромышленных и коммерческих биореакторов (объемом более 500 л) [5]. Для реализации этой схемы был использован ряд биореакторов с рабочим объемом от 15 до 550 л и различной системой перемешивания, причем аппараты меньшего объема использовались как инокуляторы для аппаратов большего объема.

При использовании этой схемы в течение 5 лет проводились многократные эксперименты по длительному полупроточному выращиванию суспензионных культур клеток Р. /Иш/вИа и Б. ёе1Шёеа. Для всех типов биореакторов процесс «отлива-долива» проводили при достижении плотности суспензии, соответствующей началу фазы замедления роста. Разбавление средой в каждом цикле проводили до концентрации биомассы, исключающей появление лаг-фазы (2,0-2,5 г/л среды по сухому весу). При снижении плотности инокулюма ниже 2,0 г/л отмечали падение жизнеспособности клеток, уменьшение удельной скорости роста и конечной концентрации сухой биомассы, а в некоторых случаях - полную остановку роста и гибель популяции.

Полученные типичные кривые роста, а также соответствующие им основные ростовые характеристики представлены на рис. 1, 2, 3, 4 и в табл. Как следует из полученных результатов, для барботажных биореакторов удельная скорость роста культур варьировала в пределах 0,12-0,28 сут-1 для Р. /Иш/вМа и 0,12-0,18 сут-1 для Б. ёеЬвгёеа; максимальное накопление биомассы происходило на 9-14 сутки и достигало 15,0-17,0 г/л по сухому весу для культуры клеток полисциаса и 11,0-14,0 г/л для диоскореи. Жизнеспособность клеток сохранялась на уровне 90-85% для Р. /ШЫ/вМа и 90-80% для Б. ёеквгёеа. Для пилотного биореактора с механическим перемешиванием наблюдали общее снижение всех ростовых характеристик: удельная скорость роста составляла 0,13-0,11 сут-1 для культуры клеток полисциаса и 0,12-0,10 сут-1 для диоскореи. Максимальное накопление биомассы не превышало 12,0 г/л по сухому весу для Р. /Пш/вИа и 8,0 г/л для Б. ёеЫв1ёеа; жизнеспособность варьировала в пределах 8077 и 73-66% соответственно. Такой характер изменения ростовых параметров обусловлен, по-видимому, повреждающим действием механического перемешивания на клетки суспензии.

Рис. 1. Динамика роста суспензионных культур клеток Р. /Ше/оНа и Б. йеЫо1йеа при

периодическом выращивании в колбах

Рис. 2. Динамика роста суспензионных культур клеток Р. /Лш/оКа и Б. йеЫо1йеа при полупроточном выращивании в 20Ь барботажном биореакторе

Рис. 3. Динамика роста суспензионных культур клеток Р. /Ше/оИа и Б. йеЫо1йеа при полупроточном выращивании в 75Ь биореакторе с механическим перемешиванием

Содержание фуростаноловых гликозидов при полупроточном культивировании сохранялось на уровне 4,5-9,5%, что не ниже, чем при стандартном периодическом выращивании культуры в колбах на качалке.

Рис. 4. Динамика роста суспензионных культур клеток Р. /Иш/оКа и Б. йеко1йеа при полупроточном выращивании в 630Ь барботажном биореакторе

Таблица

Основные характеристики роста суспензионных культур клеток Р. /Яш/оНа и Б. йеЫо1йеа при полупроточном выращивании в различных системах

культивирования

Параметр Объект 20L биореактор 75L биореактор «Electrolux» 630L биореактор Колбы

Mmax dry weight, г/л P. filicifolia 15,02 11,82 16,54 12,8

D. deltoidea 13,53 8,30 11,16 10,27

Удельная скорость роста, Мм, сут-1 P. filicifolia 0,28-0,17 0,13-0,11 0,19-0,12 0,22-0,15

D. deltoidea 0,14-0,12 0,12-0,10 0,18-0,15 0,20-0,15

Продуктивность, Pdry weighs г/л*сут P. filicifolia 0,98-0,71 0,63-0,55 0,81-0,59 0,96-0,75

D. deltoidea 0,75-0,48 0,58-0,36 0,75-0,63 0,63-0,46

Индекс роста, 1м P. filicifolia 7,55-5,89 5,85-3,75 7,65-3,84 7,20-5,53

D. deltoidea 5,82-3,32 4,21-3,63 5,41-3,47 6,84-5,15

Жизнеспособность, % P. filicifolia 89,0-86,0 80,0-77,0 89,0-85,0 98,0-96,

D. deltoidea 83,0-79,0 73,0-66,0 89,0-77.0 98,0-95,0

Содержание фуростанол. гликозидов, % D. deltoidea 4,6-6,8 3,0-4,5 6,2-9,5 4,5-7.6

Сходные данные были получены и для других циклов полупроточного культивирования клеток Р. /Нш/оЫа и Б. ёвкогёва.

Выводы

Таким образом, было продемонстрировано, что при переходе к длительному полупроточному культивированию в биореакторах разных типов суспензионные культуры клеток Б. ёвЫогёва и Р. /ШЫ/оМа сохраняют удовлетворительные ростовые и биосинтетические характеристики и предложенная схема масштабирования вполне может быть использована для производственного выращивания. Кроме того, для штамма ИФР ДМ-0,5 культуры клеток диоскореи дельтовидной остается стабильной также способность к синтезу фуростаноловых гликозидов, что весьма существенно

при разработке промышленного производства биомассы.

В целом при использовании полупроточного режима выращивания общая продуктивность процесса повышается в среднем на 15 -20% за счет отсутствия лаг-фазы и времени, необходимого на подготовку периодического культивирования.

Список литературы

1. Определение олигофуростанозидов в культуре клеток Dioscorea deltoidea Wall спектрофотометрическим методом / Васильева И.С., Воробьев А.С., Горская Н.В., Липский А.Х., Гуриелидзе К.Г., Пасешниченко В.А. // Прикладная биохимия и микробиология. - 1987. - № 5. - С. 692.

2. Production of plant secondary metabolites: a historical perspective / Bourgaud F., Gravot A., Milesi S., Gontier E. // Plant Science. - 2001. - 161. - Р. 839-851.

3. Collin H.A. Secondary product formation in plant tissue cultures // Plant Growth Regulation. - 2001. - № 34. - Р. 119-134.

4. DiCosmo F., Misawa M. Plant cell and tissue culture: alternative for metabolite production // Biotechnology Advances. - 1995. - № 3. - Р. 425-453.

5. Kieran P.M., MacLoughlin P.F., Malone D.M. Plant cell suspension cultures: some engineering considerations // Journal of Biotechnology. - 1997. - 59. - Р. 39-52

6. Ramachandra Rao S., Ravishankar G.A. Plant cell cultures: chemical factories of secondary metabolites // Biotechnology Advances. - 2002. - V. 20. - Р. 101-153.

7. Verpoorte R., Contin A., Memelink J. Biotechnology for the production of plant secondary metabolites // Phytochemistry Reviews. - 2002. - № 1. - Р. 13-25.

РАЗМНОЖЕНИЕ БОРЕЦА СЕВЕРНОГО В КАЛЛУСНОЙ КУЛЬТУРЕ IN VITRO НА ОСНОВЕ ФЕНОМЕНА ЭМБРИОИДОГЕНИИ

Н.Н. КРУГЛОВА, доктор биологических наук; А.Е. КРУГЛОВА Учреждение РАН Институт биологии Уфимского НЦ РАН, Уфа, Россия

Введение

Длительный процесс адаптивной эволюции привел к возникновению у цветковых растений разнообразных репродуктивных структур, обеспечивающих семенное (гетерофазная репродукция) и вегетативное (гомофазная репродукция) размножение [1]. Особый интерес вызывают случаи формирования эмбриоида (синонимы: соматический зародыш, зародышеподобная структура, адвентивный зародыш) - зачатка растения, образующегося из соматических (неполовых) клеток. Системный эмбриологический подход позволил установить новую категорию вегетативного (бесполого) размножения цветковых растений - эмбриоидогению; показано, что растения, образующиеся из эмбриоидов, представляют собой клоны -особи, генетически идентичные между собой и исходным растением [2].

В течение ряда лет явление эмбриоидогении в каллусной культуре in vitro изучается нами на примере бореца северного Aconitum lycoctonum L. (синоним: аконит высокий Aconitum septentrionale Koelle), многолетнего растения из семейства Лютиковые (рис. 1).

Помимо теоретического значения, связанного с выявлением разнообразия способов размножения и систем репродукции цветковых растений, полученные данные имеют и прикладное значение для разработки способа стабильного получения растений-клонов этого ценного лекарственного растения.