Маркеры множественной лекарственной резистентности солидных опухолей человека: методические, фундаментальные и клинические аспекты

1 1

82 ДИАГНОСТИКА

к УДК 615.277.3.038:616-006-02 T. A. Bogush, G. B. Smirnova, E. A. Bogush, A. Yu. Baryshnikov MULTIDRUG RESISTANCE MARKERS OF HUMAN SOLID TUMORS: METHODICAL, FUNDAMENTAL AND CLINICAL ASPECTS N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center RAMS, Moscow ABSTRACT The review contains the description of the literature and original data obtained by the new method developed by authors for estimation of ABC-transporters’ functional activity marker of multidrug resistance (MDRABC) in intact solid tumor specimens. The transporters’ activity study is based on assay of the transporter inhibitor influence on model drug doxorubicin intracellular accumulation. The new point firstly allowing the intravital investigation of the intact tumors is that the index is determined as a decrease of the antracycline fluorescence in incubation medium (but not as the drug quantity in the tissue) during the time of incubation of one and the same specimen with the drug before and after an inhibitor action.Analyses of the results obtained let authors discuss the following conclusions. 1. Functional activity of various ABC-transporters and their combinations (Pgp, MRP and ABC-transporters different from Pgp and MRP) determine MDRABC phenotype of human solid tumors. 2. “Severity” of MDRABC phenotype can be determined not so much by the grade of different transporters’ expression as mostly the number of ABC-transporters expressed. 3. An accurate MDRABC marker of solid tumors is the total activity of all the transporters’ functioning determined by using non-specific inhibitor of ABC-transporters’ function, sodium azide. 4. Clinical attempts to overcome MDRABC using specific inhibitor of only one ABC-transporter (mainly P-gp) are not well founded and thereby - often ended in failure. 5. Taxol and taxoter are the specific inhibitors of ABC-transporter function and the effect can explain taxanes’ efficacy in combination with doxorubicin in tumors with resistance to the anthracycline. Key words: multidrug resistance markers, functional activity, human solid tumors, Pgp, MRP, taxanes. Т. А. Богуш, Г. Б. Смирнова, Е. А. Богуш, А. Ю. Барышников МАРКЕРЫ МНОЖЕСТВЕННОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ СОЛИДНЫХ ОПУХОЛЕЙ ЧЕЛОВЕКА: МЕТОДИЧЕСКИЕ, ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ И КЛИНИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ГУ РОНЦ им. НН Блохина РАМН, Москва РЕЗЮМЕ В обзоре излагается новый метод, разработанный авторами, который впервые позволил оценить функциональную активность АВС-транспортеров, маркеров множественной лекарственной резистентности (MDR) в ин-тактных образцах солидных опухолей. Авторы формулируют и обсуждают следующие положения: 1. Спектр сочетаний экспрессии активности разных АВС-транспортеров, определяющих фенотип MDR солидных опухолей человека, широк и не является постоянной характеристикой определенного вида опухоли или типа резистентности - врожденной и индуцированной. 2. Тяжесть (“злокачественность”) фенотипа MDR может определяться не только выраженностью экспрессии отдельных транспортеров, но в значительной степени - числом экспрессированных АВС-транспортеров. 3. Адекватным маркером MDR является суммарная активность функционирования всех транспортеров, выявляемая с помощью панели специфических ингибиторов, и обязательно - при воздействии неспецифического ингибитора азида натрия, позволяющего заключить, насколько полно выявлен спектр экспрессированных в опухоли АВС-транспортеров. 4. Клинические попытки преодолеть MDR с помощью специфических ингибиторов АВС-транспортеров (главным образом, Pgp) следует признать малообоснованными и объяснимо неудачными. В перспективе следует думать о воздействии на некую общую точку, которой, в частности, является энергетическая зависимость функционирования транспортеров. ч

№3/том5/2006 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ

1 1

1 1

ДИАГНОСТИКА 83

>- 5. Эффективность таксанов в отношении опухолей, резистентных к антрациклинам, в том числе при комбинации с последними, может объясняться специфическим ингибирующим воздействием таксанов на активность ABC-транспортеров, выявленную в настоящем исследовании. Ключевые слова: маркеры множественной лекарственной резистентности, функциональная активность, солидные опухоли человека, Pgp, MRP, таксаны. Экспрессия обратного транспорта ксенобиотиков вать их биологическую активность. Наличие же из клеток, приводящего к уменьшению их внутрикле- в клетке транспортного белка или экспрессия гена, его точного содержания и как результат - к снижению эф- кодирующего, еще не означает функциональной ак-фективности - один из основных механизмов защиты тивности транспортера, что является необходимым ус-клеток от воздействия чужеродных соединений. Он ха- ловием выполнения его биологической функции. рактерен не только для клеток млекопитающих, Разработанные методы позволяют оценивать но также для бактерий, грибов и даже простейших. функциональную активность ABC-транспортеров Применительно к противоопухолевым препаратам - в опухолевых клетках, находящихся в суспензии, и по-это механизм реализации наиболее распространенного этому широко используются при изучении разных типа резистентности - так называемой множественной форм лейкозов. При этом именно функциональный лекарственной резистентности (MDR), когда появле- тест позволяет с большой вероятностью прогнозиро-ние устойчивости к одному из цитостатиков сопро- вать эффективность противоопухолевой химиотера-вождается резистентностью к другим лекарствам, от- пии и течение заболевания [20; 30; 51]. личающимся по структуре и механизму действия. Что касается солидных опухолей, которые состав-К ним относятся антрациклины, винкаалкалоиды, по- ляют основную долю онкологических заболеваний, то дофилотоксины, таксаны, актиномицин Д, митоксант- подобная оценка функциональной активности ABC-рон, амсакрин, митрамицин и митомицин C, топотекан транспортеров, строго говоря, была невозможна. и иринотекан [25; 26; 35], т. е. большинство эффектив- Применение даже самых “мягких” методов получения ных и широко применяемых в клинике противоопухо- суспензии клеток из плотной ткани неизбежно приво-левых лекарств (так называемые MDR-препараты). дят к неконтролируемому повреждению клеток, что, B последнее время в эту группу включен антиметабо- в свою очередь, искажает результаты тестирования лит метотрексат [49] и препараты платины [38]. B ли- функциональной активности мембранных транспорте-тературе эта большая группа противоопухолевых ле- ров. По мнению ведущих исследователей, именно от-карств называется MDR-препараты. сутствие методов определения функциональной ак- Процесс обратного транспорта препаратов из кле- тивности ABC-транспортеров в интактных плотных ток осуществляется представителями большой группы тканях препятствовало изучению механизма реализа-энергетически зависимых мембранных транспортных ции множественной лекарственной резистентности белков - так называемое семейство ABC-транспорте- в солидных опухолях и разработке подходов к ее пре-ров (ATP-binding cassette transporters). Из них в насто- одолению. Это полностью совпадает с нашей точкой ящее время идентифицированы P-гликопротеин (Pgp) зрения. Именно поэтому мы сосредоточили усилия [7; 36; 39; 46], белки, ассоциированные с множествен- прежде всего на разработке метода оценки функцио-ной лекарственной резистентностью (MRP) [19], ра- нальной активности ABC-транспортеров в плотных ком молочной железы (BCRP) [34; 44] и некоторые тканях. другие [22; 33]. Этим исследованиям предшествовала разработка Физиологическая роль большинства представите- подходов к изучению функциональной активности марлей ABC-транспортеров еще до конца не понята, и на- керов множественной лекарственной резистентности, иболее изученным и общепризнанным маркером мно- которые были начаты в начале 1990-х гг. и завершились жественной лекарственной резистентности является созданием двух принципиально новых спектрофлюори-Pgp. Экспрессия этого транспортера в ряде случаев метрических методов прижизненной количественной коррелирует с чувствительностью к противоопухоле- оценки кинетики внутриклеточного накопления и свя-вой химиотерапии MDR-препаратами, длительностью зывания с ДНК модельного препарата доксорубицина, безрецидивного течения заболевания и его прогнозом а также его внутриклеточного распределения в суспен-[8; 9; 21; 28; 32; 45]. Однако частое отсутствие такой зии клеток in vitro и ex vivo [1; 2; 17; 41]. Упомянем корреляции, а также данные о высоком внутриклеточ- лишь очень кратко некоторые, на наш взгляд, наиболее ном содержании цитостатиков в клеточных культурах интересные новые данные, которые мы получили бла-с экспрессией транспортных белков или кодирующих годаря использованию этих методов. их генов однозначно указывали на необходимость Показано, что связывание антрациклинов с полиоценки функциональной активности транспортеров. мерными носителями приводит к принципиальному Действительно, только функционально активные изменению механизма их действия: биологические эф-транспортеры способны выбрасывать противоопухо- фекты противоопухолевого препарата могут реализо-левые препараты из клеток и таким образом регулиро- вываться с поверхности клеточных мембран без про- —(

№3/том5/2006 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ

I 1

никновения внутрь клетки. Это приводит к тому, что высокая цитотоксическая активность комплексов с полимерами проявляется не только в чувствительных опухолевых клетках, но и в клетках с индуцированной множественной лекарственной резистентностью [4; 13]. Получено объяснение высокой эффективности в отношении резистентных клеток с экспрессией Pgp идарубицина - производного антрациклинового антибиотика даунорубицина. Внутриклеточное накопление идарубицина, в отличие от даунорубицина, в резистентных и чувствительных опухолевых клетках было практически одинаковым и лишь в незначительной степени связано с функционированием Pgp [10; 11; 12]. В культуре клеток рака яичника человека линии CaOv и в клетках лейкоза мышей P388 ex vivo [6; 16] подтверждено представление о том, что преимущественное накопление доксорубицина в ядрах клеток является характеристикой их чувствительности к антра-циклинам [31].

Логическим продолжением явилась разработка методов оценки внутриклеточного накопления доксо-рубицина и функциональной оценки АВС-транспорте-ров в интактных образцах плотных тканей [3; 14; 15]. В основу нового метода положен общепринятый подход к оценке функциональной активности АВС-транс-портеров по изменению внутриклеточного накопления

субстратов, выброс которых из клеток осуществляется этими мембранными транспортерами при воздействии их специфических ингибиторов. В наших исследованиях в качестве модельного субстрата используется типичный представитель MDR-препаратов - доксору-бицин, в выбросе которого из клетки принимают участие разные АВС-транспортеры. В работе использованы 3 ингибитора АВС-транспортеров: верапамил -специфический ингибитор Pgp, генистеин - специфический ингибитор MRP и азид натрия - ингибитор АТФ-зависимых процессов в клетках, а следовательно, функциональной активности всех АВС-транспортеров в целом. Существенным отличием, впервые позволившим изучение интактных образцов солидных опухолей в реальном времени и значительно упростившим исследование, является то, что внутриклеточное накопление доксорубицина в исследуемом образце оценивается не по содержанию препарата в ткани, а по его убыли из среды инкубации образца опухоли (рис. 1).

На I этапе (см. рис.1, I) образец опухоли помещают в кварцевую флюориметрическую кювету в раствор доксорубицина в концентрации 10-6 М с измеренной величиной флюоресценции антрациклина. На протяжении 15 мин инкубации образец опухоли (3x3x3 мм) через каждые 5 мин на короткое время вынимают из кюветы и регистрируют остаточную флюо-

РАСТВОР ХЕНКСА

ВЕРАПАМИЛ

О 5 D Ъ 21

ГЕНИСТЕИН

Рис. 1. Схема оценки функциональной активности АВС-транспортеров в интактных образцах солидных опухолей человека:

По оси абсцисс - время инкубации с доксорубицином (мин);

по оси ординат - внутриклеточное накопление доксорубицина (в % к исходному) в опухоли толстой кишки. Цифрами в квадратах указано увеличение скорости внутриклеточного накопления доксорубицина после инкубации с ингибитором по отношению к контролю (инкубация в растворе Хенкса).

^ - интенсивность флуоресценции доксорубицина;

О О - образец опухоли во время инкубации с доксорубицином.

1 1

ДИАГНОСТИКА 85

>- ресценцию доксорубицина. Суммарная убыль флюо- мента получения образца опухоли во время хирурги-ресценции по окончании инкубации характеризует ин- ческой операции до начала эксперимента часто прохо-тегральный показатель - уровень внутритканевого дит достаточно длительное время - до 1ч и более. Это и внутриклеточного накопления препарата. не исключает возможности ингибирования энергети-На II этапе исследования (см. рис.1, II) образец ческих процессов в клетках, а следовательно, и веро-опухоли переносят из кюветы в раствор исследуемого ятность ингибирования функции энергетически зави-ингибитора (в контроле - в раствор Хенкса) и инкуби- симых транспортеров. В связи с этим для нормализа-руют при 37 °С в течение 10 мин. После этого опухоль ции энергетических процессов в клетках биопсийный вновь помещают в спектрофлюориметрическую кюве- образец опухоли в течение 40 мин инкубируют при ту с известной величиной флюоресценции раствора 37 °С в растворе Хенкса, содержащем 5 мМ глюкозы. доксорубицина и повторно регистрируют кинетику Эффективность такого подхода была продемонстриро-убыли препарата из среды инкубации, как на I этапе вана нами в опытах на суспензии клеток монослойной исследования. При отсутствии в клетках функцио- культуры аденокарциномы молочной железы человека нально активных АВС-транспортеров скорость внут- MCF-7 doxR с экспрессией Pgp [3]. риклеточного накопления доксорубицина остается не- При анализе результатов исследования образцов изменной по сравнению с контролем. В том случае, ес- первичных злокачественных опухолей молочной же-ли в клетках исследуемого образца опухоли лезы 159 больных (инфильтративный протоковый экспрессированы функционально активные транспор- и дольковый рак) нами выявлены разные сочетания теры цитостатиков, скорость уменьшения флюорес- эффектов верапамила, генистеина и азида натрия ценции доксорубицина в среде инкубации в результате (табл. 1). Это позволило выделить разные варианты повышения именно внутриклеточного накопления ан- фенотипа множественной лекарственной резистентно-тибиотика увеличивается по сравнению с контролем. сти, при которых экспрессирована функциональная Эффект исследуемого ингибитора оценивается как по- активность: ложительный, если увеличение скорости убыли флюо- 1) только Pgp; ресценции доксорубицина в среде инкубации в тече- 2) только MRP; ние 5 мин до и после воздействия ингибитора по срав- 3) Pgp и MRP; нению с аналогичным показателем в контроле 4) Pgp и других АВС-транспортеров, отличных составляет более 30 %. При этом следует отметить, что от Pgp; такая оценка полностью исключает погрешность за 5) MRP и других АВС-транспортеров, отличных счет возможных различий в размере исследуемого об- от MRP; разца опухоли, так как измерения проводят в одном 6) Pgp, MRP и других АВС-транспортеров, от-и том же образце. По существу в этих условиях экспе- личных от Pgp и MRP; римента величина исследуемого образца опухоли не 7) только АВС-транспортеров, отличных от Pgp влияет на результат. Количество же АВС-транспорте- и MRP. ров, функциональная активность которых может быть Такой широкий спектр вариантов экспрессии раз-исследована в одном образце опухоли, ограничивается ных транспортных белков и их сочетаний выявлен на-лишь числом доступных специфических ингибиторов ми в клетках рака не только молочной железы, АВС-транспортеров и размером биопсийного матери- но и толстой кишки, желудка, яичников, тела и шейки ала. В каждой опухоли эффективность воздействия матки, а также мочевого пузыря. Интересно, что при разных ингибиторов оценивается параллельно в 3 об- этом в ряде опухолей экспрессия функциональной ак-разцах. Биопсийный материал исследуется гистологи- тивности транспортеров, отличных от Pgp и MRP, вычески, каждый образец опухоли - цитологически. является наряду с экспрессией Pgp и MRP, в других -Пример реальных кривых, полученных при воз- при отсутствии активности последних. В одной из ра-действии разных ингибиторов АВС-транспортеров на бот, выполненных под руководством профессора опухолевые клетки, в которых выявлена экспрессия V.Ling, были получены аналогичные данные при ис-функциональной активности Pgp и MRP, приведен следовании бластных клеток больных острым миело-в нижней части рис. 1. Правомочность такого методи- идным лейкозом (исследования в суспензии клеток ме-ческого подхода первоначально была подтверждена тодом проточной цитофлюориметрии) [27]. в экспериментах с образцами солидного варианта рака На наш взгляд, такая мозаичность экспрессии молочной железы Эрлиха, трансплантируемого на функциональной активности АВС-транспортеров, вы-мышах. При сравнительной оценке влияния верапами- являемая в солидных опухолях, свидетельствует о том, ла и азида натрия на внутриклеточное накопление до- что оценка активности отдельных представителей се-ксорубицина в чувствительных опухолях и опухолях мейства не является адекватным тестом для предсказа-с индуцированной множественной лекарственной ре- ния множественной лекарственной резистентности. зистентностью эффект ингибиторов выявлен лишь По нашему мнению, маркером экспрессии множеств резистентных опухолях [3]. венной лекарственной резистентности может служить Следует отметить, что при изучении солидных лишь суммарная активность функционирования всех опухолей человека в методику исследования необхо- транспортеров, выявляемая с помощью панели специ-димо включать дополнительный этап, так как от мо- фических ингибиторов уже описанных транспортеров —(

№3/том5/2006 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ

1 1

ДИАГНОСТИКА_____________________________________

Таблица 1

Воздействие вераиамила, геиистеииа и азида натрия на внутриклеточное накопление доксорубицина в опухолях молочной железы

>—

Увеличение внутриклеточного накопления доксорубицина после воздействия ингибиторов Соотношение эффектов ингибиторов Фенотип множественной лекарственной резистентности

Отсутствие эффекта всех ингибиторов Нет Не экспрессирован

Верапамил+, генистеин+ азид натрия"1" (вер + + ген +) 2 азид натрия + Pgp + , MRP +

(вер + + ген +) < азид натрия + Pgp + , MRP +, другие АВС-транспортеры +

Верапамил+, генистеин* азид натрия"1" вер - (ген + = азид натрия +) только MRP"1"

вер - (азид натрия + >ген+) MRP +, другие АВС-транспортеры +

Верапамил"1", генистеин-азид натрия+ ген ” (вер + = азид натрия + ) только Pgp +

ген - (азид натрия + > вер +) Pgp +, другие АВС-транспортеры +

Верапамил-, генистеин-азид натрия"1" вер -, ген -азид натрия + АВС-транспортеры +, отличные от Pgp и MRP

Верапамил+ (вер), генистеин+(ген), азид натрия+ - увеличение внутриклеточного накопления доксорубицина при воздействии ингибиторов; Верапамил-(вер), генистеин-(ген), азид натрия-- отсутствие воздействия ингибиторов на внутриклеточное накопление доксорубицина; Другие транспортеры - АВС-транспортеры, отличные от Pgp и MRP; Перечислебнные варианты экспрессии фенотипа множественной лекарственной резистентности выявлены при исследовании образцов первичного рака молочной железы 159 больных

н

и обязательно - при воздействии неспецифического ингибитора азида натрия. Последнее позволяет заключить, насколько полно проведенный анализ описывает спектр экспрессированных в опухоли транспортеров.

Необходимость такой комплексной оценки подтверждают и результаты сравнительной оценки частоты экспрессии функциональной активности АВС-

транспортеров в опухолях молочной железы, толстой кишки (аденокарциномы) и шейки матки (плоскоклеточный рак). Мы провели данное исследование, имея в виду, что эти злокачественные новообразования занимают полярные позиции по чувствительности к МОЯ-противоопухолевым препаратам, в частности, к антрациклинам, подофилотоксинам и таксанам. Опу-

Таблица 2

Экспрессия функциональной активности Pgp и других АВС-транспортеров в солидных опухолях человека

Рак молочной железы

Экспрессия Pgp (+ других АВС-транспортеров), %

28 63 25

Экспрессия АВС-транспортеров, отличных от Pgp, %

24 37 75

Отсутствует экспрессия АВС-транспортеров, %

48 - -

У каждого больного исследовано по 9 образцов, полученных из разных участков

биопсийного материала опухоли

холи молочной железы характеризуются исходно высокой чувствительностью к этим препаратам, тогда как для рака толстой кишки и шейки матки характерна врожденная множественная лекарственная резистентность. Результаты обследования 163 больных представлены в табл. 2.

Первое, что обращает на себя внимание: почти в 50 % исследованных опухолей молочной железы не выявлено экспрессии каких-либо АВС-транспортеров, т. е. по данному показателю около половины больных с опухолью молочной железы имеют безусловно положительный прогноз в смысле чувствительности к MDR-противоопухолевым препаратам. Таких случаев не зарегистрировано ни в одном из исследованных образцов рака толстой кишки и шейки матки, и это согласуется с упомянутым выше фактом врожденной множественной лекарственной резистентности этих опухолей.

Что касается частоты экспрессии функциональной активности Pgp и других АВС-транспортеров, отличных от Pgp, то их роль в реализации врожденной множественной лекарственной резистентности в исследованных опухолях, по-видимому, различна. Судя по полученным данным, существенный вклад в резистентность опухолей толстой кишки вносит Pgp, функция которого экспрессирована более, чем в 60 % случаев. В то же время определяющей в реализации множественной лекарственной резистентности рака шейки матки может быть экспрессия АВС-транспор-теров, отличных от Pgp (75 % случаев). Иными словами, в последнем случае вклад Pgp в поддержание резистентности может быть минимальным, тогда как в опухолях толстой кишки - значительным. Тем не менее даже для опухолей толстой кишки, в 100 % случаев исходно резистентных к MDR-препаратам и происходящих из нормальных клеток с высокой эспрес-сией Pgp [24], функциональная активность этого транспортера не является единственной причиной врожденной множественной лекарственной резистентности. В пользу этого свидетельствует выявленное отсутствие экспрессии функциональной активности Pgp приблизительно в 40 % опухолей, в которых экспрессированы другие АВС-транспортеры, отличные от Pgp.

Эти результаты еще раз указывают на то, что попытка прогнозировать фенотип множественной лекарственной резистентности, определяя в опухоли экспрессию какого-либо одного транспортера, ошибочна. Об этом свидетельствуют и данные литературы. Например, показано, что механизм множественной лекарственной резистентности в клетках рака толстой кишки может реализоваться при отсутствии экспрессии Pgp и MRP [40]. Резистентность к одному и тому же препарату может развиваться при экспрессии разных АВС-транспортеров, которые в опухолях могут коэкспрессироваться [7]. Более того, в самое последнее время наряду с продолжающимся выявлением новых АВС-транспортеров описаны подсемейства (изоформы) их отдельных представителей, например 7

белков, ассоциированных с множественной лекарственной резистентностью (MRP) [19; 48].

Возвращаясь к опухолям молочной железы, следует заметить, что, по нашему мнению, в этом случае оценивать реакцию АВС-транспортеров на воздействие азида натрия целесообразно на первом этапе выявления множественной лекарственной резистент-

ГЕН ТАК A3

ВЕР ГЕН ТАК A3

ВЕР ГЕН ТАК A3

ГЕН ТАК A3

Рис. 2. Примеры воздействия ингибиторов ABC-транспортеров на внутриклеточное накопление доксо-рубицина в опухолях молочной железы:

по оси абсцисс - время инкубации с доксорубици-ном;

по оси ординат - внутриклеточное накопление до-ксорубицина (в % к исходному).

4 - время начала 10-мин инкубации в растворе Xенкcа или ингибитора.

B квадратах указано наличие (+) или отсутствие (-) стимуляции внутриклеточного накопления доксоруби-цина при воздействии ингибиторов.

1 - контроль (раствор Xенкcа) (----------------);

2 - верапамил (BEP) (--------------);

3 - генистеин (ГЕН) (--------------);

4 - таксол (TAK) (................);

5 - азид натрия (A3) (----------------).

Отношение изменения скорости убыли флюоресценции доксорубицина в среде инкубации в течение 5 мин до и после воздействия ингибитора к аналогичному показателю в контроле (инкубация в растворе Xенкcа): 1:

2 - 1,6; 3 - 2,0; 4 - 2,0; 5 - 3,1.

2:

2 - 1,2; 3 - 2,0; 4 - 2,3; 5 - 3,6.

3:

2 - 1,0; 3 - 2,6; 4 - 0,8; 5 - 3,2.

4:

2 - 1,7; 3 - 1,1; 4 - 1,2; 5 - 2,0.

ВЕР “ ГЕН “ ТАК “ A3

ВЕР“ ГЕН“ ТАК“ A3

Рис. 3. Примеры воздействия таксола на внутриклеточное накопление доксорубицина в опухолях молочной железы с экспрессией функциональной активности АВС-транспортеров, отличных от Pgp и MRP (А), или с отсутствием экспрессии фенотипа множественной лекарственной резистентности (Б):

по оси абсцисс - время инкубации с доксорубицином;

по оси ординат - внутриклеточное накопление доксорубицина (в % к исходному).

4 - время начала 10-мин инкубации в растворе Хенкса или ингибитора.

В квадратах указано наличие (+) или отсутствие (-) стимуляции внутриклеточного накопления доксорубицина при воздействии ингибиторов: верапамила (ВЕР), генистеина (ГЕН), таксола (ТАК) или азида натрия (АЗ).

----------- контроль (инкубация в растворе Хенкса);

------ - инкубация в растворе ингибитора.

ности. Отсутствие реакции на этот универсальный энергетический ингибитор позволяет сделать однозначное заключение об отсутствии экспрессии фенотипа множественной лекарственной резистентности в исследуемой опухоли. И только в случае выявления реакции на азид натрия необходимо дальнейшее изучение специфических ингибиторов для определения, какие именно АВС-транспортеры экспрессированы в опухоли.

Подтверждение того, что спектр функционально активных АВС-транспортеров, определяющих биологические эффекты цитостатиков в солидных опухолях, действительно очень широк, получено нами и при изучении влияния на активность АВС-транспортеров новых противоопухолевых препаратов из группы так-санов. Поводом для проведения этого исследования послужили данные последних лет об эффективности таксанов в отношении опухолей молочной железы, резистентных к антрациклинам, а также высокая эффективность комбинации доксорубицин+таксол, выявляемая в 30-50% случаев [50]. Эти факты достаточно неожиданны, так как оба препарата относятся к группе МОЯ-лекарств. Отсутствие же эффективности комбинации у значительного числа больных делает необхо-

димым рациональный отбор пациентов для проведения такой химиотерапии, так как речь идет о сочетанном применении 2 высокотоксичных цитостатиков. Основываясь на полученных нами ранее данных об ингибирующем воздействии противоопухолевого препарата вепезида на функцию Pgp [5], мы предположили, что причиной упомянутых эффектов может быть взаимодействие препаратов на уровне АВС-транспор-теров, которые отвечают за реализацию механизма множественной лекарственной резистентности и до-ксорубицина, и таксола.

Включение таксола в панель исследования 24 больных раком молочной железы позволило выявить опухоли с еще одним фенотипом множественной лекарственной резистентности: экспрессией АВС-транс-портеров, отличных от Pgp, MRP и чувствительных к воздействию таксола. Реальные кривые, демонстрирующие эффективность таксола в опухолях молочной железы с экспрессией функциональной активности разных АВС-транспортеров, представлены на рис. 2. На рис. 3 показана эффективность таксола при отсутствии экспрессии функциональной активности Pgp и MRP (см. рис. 3, А). Здесь же приведен пример опухоли, в которой не экспрессирован фенотип множест-

венной лекарственной резистентности и отсутствует эффект таксола (см. рис. 3, Б), что подтверждает специфичность его ингибирующего воздействия на активность АВС-транспортеров.

Полученные результаты позволяют объяснить описанную эффективность таксола и комбинации так-сол+доксорубицин в отношении солидных опухолей, резистентных к антрациклинам, следующим образом. Эффективность таксола при лечении опухолей молочной железы, резистентных к химиотерапии, включающей антрациклины, может быть связана с выявленным нами отсутствием экспрессии функции Pgp в ряде таких опухолей, так как именно Pgp отвечает за выброс таксанов из клеток [29]. Эффективности же комбинации таксол+доксорубицин при лечении антрациклин-резистентных опухолей можно ожидать при выявлении увеличения внутриклеточного накопления доксоруби-цина после воздействия таксола (среди исследованных больных такие опухоли выявлены приблизительно в 40 % случаев), особенно при отсутствии в опухоли экспрессии функции Pgp. При этом чрезвычайно важно заметить, что, исходя из представленных данных, последовательность введения цитостатиков таксол+до-ксорубицин должна рассматриваться как предпочтительная.

Эти рассуждения целиком справедливы и в отношении другого представителя таксанов - таксотера. Мы показали, что таксотер, так же, как и таксол, в ряде резистентных опухолей молочной железы оказывает стимулирующее воздействие на внутриклеточное накопление доксорубицина, т. е. ингибирует активность АВС-транспортеров. Также как таксол, таксотер ингибирует активность АВС-транспортеров, отличных от Pgp и MRP. При этом данные, представленные на рис. 4, свидетельствуют о том, что чувствительными к воздействию таксотера являются АВС-транспор-теры, отличные от чувствительных к таксолу, так как в ряде опухолей эффекты цитостатиков не совпадали.

Это наблюдение дополняет сделанные выше выводы. Во-первых, в опухолях молочной железы выявляются не только описанные выше АВС-транспортеры, но и транспортеры, чувствительные к воздействию таксотера. Во-вторых, эффективность комбинации таксол+доксорубицин может отличаться от эффективности комбинации таксотер+доксорубицин. Положительным фактором прогноза эффективности той или другой комбинации может служить стимулирующее воздействие таксола или таксотера на внутриклеточное накопление доксорубицина. В-третьих, отличием в чувствительности разных АВС-транспортеров к ингибирующему воздействию таксола и таксотера, возможно, объясняется эффективность таксанов не только в отношении антрациклин-резистентных опухолей, о чем упоминалось выше, но и активность таксотера в отношении опухолей, резистентных к таксолу [47]. И, наконец, необходимо отметить, что спектр АВС-транспортеров, экспрессируемых в солидных опухолях, не ограничивается Pgp, MRP, транспортерами, чувствительными к воздействию таксола или таксоте-

ТАКСОЛ ТАКСОТЕР

1" 2,0 15 Î 2,8

ТАКСОЛ ТАКСОТЕР“

КОНТРОЛЬ

Рис. 4. Примеры воздействия таксола и таксотера на внутриклеточное накопление доксорубицина в опухолях молочной железы с экспрессией функциональной активности АВС-транспортеров:

по оси абсцисс - время инкубации с доксорубици-

ном

по оси ординат - внутриклеточное накопление до-ксорубицина (в % к исходному).

4 — время начала 10 минутной инкубации в

растворе Хенкса или таксана.

В квадратах указано наличие (+) или отсутствие (-) стимуляции внутриклеточного накопления доксоруби-цина при воздействии таксола или таксотера.

----------контроль (инкубация в растворе Хенкса);

------ — инкубация в растворе таксана.

ра, так как в ряде опухолей при отсутствии функциональной активности перечисленных транспортеров мы все еще регистрировали увеличение внутриклеточного накопления доксорубицина при воздействии азида натрия. В совокупности эти результаты свидетельствуют о необходимости дальнейшего изучения влияния МОЯ-препаратов, а также цитостатиков, используемых в комбинации с ними, на функциональную активность АВС-транспортеров, что позволит прогнозировать оптимальные схемы и режимы введения цитостатиков при химиотерапии резистентных опухолей.

В заключение хотелось бы подвести некоторые первые итоги результатов экспериментального изучения функциональной активности АВС-транспортеров в солидных опухолях человека и попытаться оценить их

1 1

90 ДИАГНОСТИКА

к возможную значимость для онкологической ное охлаждение или нагревание опухоли, ограничение клиники. доступа глюкозы. Во всяком случае в наших экспери-Во-первых, представляется важным сам факт вы- ментах эффект этих воздействий на образцы солидных явления функциональной активности АВС-транспор- опухолей был аналогичным воздействию азида на-теров в разных солидных опухолях человека и выявле- трия: внутриклеточное накопление доксорубицина ние новых транспортеров, отличных от ранее изучен- увеличивалось в опухолях с фенотипом множественных. Спектр сочетаний экспрессии функциональной ной лекарственной резистентности. Последнее очень активности разных АВС-транспортеров, определяю- важно, так как этого эффекта мы не наблюдали в чув-щих фенотип множественной лекарственной резис- ствительных опухолях. Поэтому речь может идти не тентности, широк и не является некой постоянной ха- о перспективе повышения эффективности воздействия рактеристикой определенного вида опухоли или опре- цитостатиков в отношении любой солидной опухоли, деленного типа резистентности - врожденной но только в отношении опухолей с фенотипом множе-и индуцированной. Создается впечатление, что тя- ственной лекарственной резистентности. Возможно, жесть (“злокачественность”) фенотипа множествен- примеры недостаточной клинической эффективности ной лекарственной резистентности может определять- использования кратковременной локальной гипертер-ся не только выраженностью экспрессии отдельных мии опухолей в сочетании с химиотерапией объясня-транспортеров, но в значительной степени - числом ются отсутствием предварительного контроля экс-экспрессированных АВС-транспортеров. Именно по- прессии в опухолях АВС-транспортеров и проведени-этому мы считаем, что адекватным маркером множес- ем сочетанного лечения больных, в опухолях которых твенной лекарственной резистентности является сум- не экспрессирован фенотип множественной лекар-марная активность функционирования всех транспор- ственной резистентности. теров, выявляемая с помощью панели специфических И, наконец, хотелось бы отметить, что, несмотря ингибиторов уже описанных транспортеров и обяза- на множество вопросов, на которых мы не останавли-тельно — при воздействии неспецифического ингиби- вались и которые требуют изучения функционирова-тора азида натрия, позволяющего заключить, насколь- ния и кофункционирования не только АВС-транспор-ко полно проведенный анализ описывает спектр экс- теров, но и других опухолевых маркеров, исследова-прессированных в опухоли АВС-транспортеров. ния судьбы экспрессии отдельных транспортеров В этой связи необходимо отметить, что, с нашей в нормальной ткани при ее малигнизации и затем -точки зрения, полученные данные в значительной сте- при прогрессии опухоли, понимания того, насколько пени объясняют неудачи попыток преодолеть множест- широк и конечен круг АВС-транспортеров и многого венную лекарственную резистентность с помощью другого, с нашей точки зрения, первые шаги на этом специфического ингибитора, когда речь идет не о мо- пути изучения солидных опухолей человека и даже на дельных системах с экспрессией единичного АВС- пути в клинику сделаны. транспортера. Неэффективность такого подхода уже не- Исследования поддержаны грантами Российско-однократно демонстрировалась в клинических исследо- го фонда фундаментальных исследований (№ 94-04-ваниях [18; 42; 43], однако попытки преодолеть 11676-а, № 01-04-49213-a, № 04-04-49391-а), Между-множественную лекарственную резистентность при ис- народного фонда фундаментальных исследований пользовании специфических ингибиторов АВС-транс- Дж. Сороса, Французского онкологического обще-портеров, к сожалению, продолжаются. При этом надо ства, Международного противоракового союза заметить, что в подавляющем большинстве случаев (UICC). в клинике испытываются ингибиторы Pgp. В реальной Авторы выражают глубокую благодарность науч-жизни, как мы видели, в клетках солидных опухолей ным сотрудникам лаборатории медицинской химии, выявляется широкий спектр комбинаций разных транс- принимавшим участие на разных этапах выполнения портеров, и Pgp не всегда является наиболее часто экс- этого исследования: Е. Ю. Колдаевой, И. Ж. Шуби-прессируемым транспортером. Преодолеть такую мно- ной и Е. Ф. Чмутину. Отдельная благодарность — жественную лекарственную резистентность, на наш сотрудникам клинических отделений Онкологическо-взгляд, можно лишь, воздействуя на некую общую точ- го научного центра им. Н. Н. Блохина и профессорам ку, которой, в частности, является энергетическая зави- Д. В. Комову, Н. Н. Петровичеву и В. Ф. Царюку симость функционирования АВС-транспортеров. Ко- за помощь в проведении исследования и обсуждении нечно, энергетический яд азид натрия для этой цели не полученных результатов. подходит, но правомочность предложенного подхода подтверждают, например, данные о препарате лонида- ЛИТЕРАТУРА мине, который ингибирует функцию АВС-транспорте- 1. Богуш Т. А., Баранов Е. П., Егудина С. В., Тан-ров, уменьшая в клетке продукцию АТФ и подавляя кович Н. И. Количественное определение связывания процессы фосфорилирования (Fanciulli et al., 2000). Об- антрациклиновых антибиотиков с ДНК // Бюл. экспе-надеживающие данные о преодолении множественной римент. биол. и мед. - 1992. - № 6. - С. 636-638. лекарственной резистентности при применении лони- 2. Богуш Т. А., Егудина С. В., Баранов Е. П., дамина в клинике уже получены [23; 37]. Крисъко Ш. И. Использование флуоресцентного зонда Перспективным представляется и кратковремен- Хехст - 33258 для количественного определения свя- ч

№3/том5/2006 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ

1 1

1

ДИАГНОСТИКА 91

>- зывания антрациклиновых антибиотиков с ДНК porters in breast cancer biopsy specimens // в клетках // Антибиотики и химиотерапия. - 1992. - European J. Cancer. - 1998. - 34. - Suppl. 5. - S106. 37. - №5. - С. 21-24. 16. Bogush T., Shubina I., Smirnova G. Doxorubicin 3. Богуш T.A., Смирнова Г.Б., Богуш E.A., Робер Ж. bound to DNAis the major part of intracellular accumulat-Новый метод прижизненной оценки функциональной ed drug // Can. J. Infect. Dis. - 1995. - 6. - Suppl. - P. 437. активности мембранных транспортеров, осуществляю- 17. Bogush T. A., Syrkin A. B., Baranov E. P. A new щих выброс препаратов из клеток, в образцах солид- methodology for determination of anthracycline intracel-ных опухолей // Антибиотики и химиотерапия. - 1999. lular active concentration in sensitive and multidrug resist- № 2. - С. 19-24. ant cells // Anti-Cancer Agents. - 1994. - 5. - Suppl.1. - 4. Богуш T. A., Смирнова Г. Б., Шубина И. Ж. P. 16. и др. Внутриклеточное накопление свободного и ин- 18. Boote D. J., Dennis I. F., Twentyman P. R. et al. капсулированного в наносферы доксорубицина // Бюл. Phase I study of etoposide with SDZ PSC 833 as a modu-эксперимент. биол. и мед. - 1994. - №10. - С. 406-409. lator of multidrug resistance in patients with cancer // 5. Богуш T. A., Чмутин E. Ф., Сыркин A. Б. Вли- J. Clin. Oncol. - 1996. - 14. - P. 610-618. яние ингибитора топоизомеразы II вепезида на связы- 19. Borst P., Evers R., Kool M., Wijnholds J. A fami-вание доксорубицина с ДНК в чувствительных к ант- ly of drug transporters: multidrug resistance associated рациклинам опухолевых клетках // Бюл. эксперимент. proteins // J. Natl. Cancer Inst. - 2000. - 92, № 16. - P. биол. и мед. - 1997. - № 1. - С. 87-90. 1295-1302. 6. Богуш Т. A., Шубина И. Ж., Смирнова Г. Б. 20. Broxterman H. J., Lancelma J., Pinedo H. N. et и др. Прижизненная количественная оценка внутрик- al. Theoretical and practical considerations for the meas-леточного распределения доксорубицина в опухоле- urement of P-glycoprotein function in acute myeloid вых клетках // Бюл. эксперимент. биол. и мед. - 1995. leukemia // Leukemia. - 1997. - 11, № 7. - P. 1110-1118. - № 11. - 518-521. 21. Chan H. S., Grogan T. М., Haddad G. et al. P-gly- 7. Arts H. J., Katsaros D., de Vries E. G. et al. Drug coprotein expression: critical determinant in the response resistance-associated markers P-glycoprotein, multidrug to osteosarcoma chemotherapy // J. Natl. Cancer Inst. -resistance-associated protein 1, multidrug resistance-asso- 1997. - 89, № 22. - P. 1706-1715. ciated protein 2, and lung resistance protein as prognostic 22. Childs S., Yeh R. L., Hui D., Ling V. Taxol resistfactors in ovarian carcinoma // Clin Cancer Res. - 1999. - ance mediated by transfection of the liver -specific sister Vol. 5, № 10. - P. 2798-2805. gene of P-glycoprotein // Cancer Res. - 1998. - 58, № 18. 8. Baekelandt M. M., Holm R., Nesland J. M. et al. - P. 4160-4167. P-glycoprotein expression is a marker for chemotherapy 23. Dogliotti L., Berruti A., Buniva T. et al. resistance and prognosis in advanced ovarian cancer // Lonidamine significantly increases the activity of epiru-Anticancer Res. - 2000. - Vol. 20, № 2B. - P. 1061-1067. bicin in patients with advanced breast cancer: results 9. Baldini N., Scotlandi K., Serra M., et al. P-glyco- from a multicenter prospective randomized trial // J. Clin. protein expression in osteosarcoma: a basis for risk-aju- Oncol. - 1996. - 14. - P. 1165-1172. vant chemotherapy // J. Orthop. Res. - 1999. - 17, № 5. - 24. Fillpits M., Suchomel R. W., Dekan G. et al. P. 629-632. Expression of the multidrug resistance-associated protein 10. Bogush T. A., Robert J. Idarubicin and daunoru- (MRP) gene in colorectal carcinomas // Br. J. Cancer. -bicin binding to DNA in sensitive and resistant leukemia 1997. - 75. - P. 208-212. K562 cells // European J. Cancer. - 1995. - 31A. - Suppl. 25. Fisher G. A., Lum B. L., Hausdorff J., 5. - P. 27. Sikic B. L. Pharmacological considerations in the modula- 11. Bogush T. A., Robert J. Comparative evaluation tion of multidrug resistance // European J. Cancer. - 1996. of the intracellular accumulation and DNA binding of - 32A, № 6. - P. 1082-1088. idarubicin and daunorubicin in sensitive and multidrug- 26. German U. V. P-glycoprotein - a mediator of resistant human leukaemia K562 cells // Anticancer Res. multidrug resistance in tumour cells // European J. Cancer. - 1996. - № 16. - P. 365-368. - 1996. - 32A, № 6. - P. 927-944. 12. Bogush T., Robert J. Direct evaluation of doxoru- 27. Hedley D. W., Xiu-Yan Xie, Minden M. D. et al. A bicin accumulation and efflux in living breast cancer cells novel energy dependent mechanism reducing daunoru-with different mechanisms of multidrug resistance // bicin accumulation in acute myeloid leukemia // Therapeutic Drug Monit. - 1997. - 19, № 5. - P. 547. Leukemia. - 1997. - 11. - P. 48-53. 13. Bogush T. A., Robert J., Smirnova G. B. et al. 28. HornicekF. J., GebhardtM. C., WolfeM. W. et al. Direct evaluation of free and polymer-bound anthracy- P-glycoprotein levels predict poor outcome in patients with cline // Cancer Chemother. Pharmacol. - 1995. - 35, № 6. osteosarcoma // Clin. Orthop. - 2000. - № 373. - P. 11-17. - P. 501-505. 29. Jang S. H., Wienties M. G., Au J. 'L. Kinetic of P- 14. Bogush T., Smirnova G., Chmutin E. Functional glycoprotein-mediated efflux of paclitaxel // J. Pharmacol. assay of Pgp activity in solid tumor specimens ex vivo // Exp. Ther. - 2001. - 3. - P. 1236-1242. British J. Cancer. - 1997. - 76. - Suppl. 1. - P. 46. 30. Kolk D. M., Vries E. G. E., Putten W. L. J. et al. 15. Bogush T., Smirnova G., Koldaeva E. et al. P-glycoprotein and multidrug resistance protein Functional intravital assay of anticancer drug efflux trans- activities in relation to treatment outcome in acute ч

№3/том5/2006 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ

I

myeloid leukemia // Clin. Cancer Res. - 2000. - 6. - P. 3205-3214.

31. Larsen A. K., Escargueil A. E., Skladanowski A. Resistance mechanisms associated with altered intracellular distribution of anticancer agents // Pharmacol. Ther. -2000. - 85, № 3. - P. 217-229.

32. Leighton J. C., Golstein L. J. P-glycoprotein in adult solid tumors: expression and prognostic significance // Hematol. Oncol. Clin. North Am. - 1995. - 9. - P. 251-274.

33. List A. F. Non-p-glycoprotein drug export mechanisms of multidrug resistance // Semin. Hematol. - 1997.

- 4. - Suppl 5. - P. 20-24.

34. Litman T., Brangi M., Hudson E. et al. The multidrug-resistant phenotype associated with overexpression of the new ABC half-transporter, MXR (ABCG2) // J. Cell Science. - 2000. - 113, № 11. - P. 2011-2021.

35. MaliepaardM., van Gastelen M. A., de JongL. A. et al. Overexpression of the BCRP/MXR/ABCP gene in a topotecan-selected ovarian tumor cell line // Cancer Res. -

1999. - 59. - P. 4559-4563.

36. Meschini S., Calcabrini A., Monti E. et al. Intracellular P-glycoprotein expression is associated with the intrinsic multidrug resistance phenotype in human colon adenocarcinoma cells // Int. J. Cancer. - 2000. - 87, № 5. - P. 615-628.

37. Nistico C., Garufi C., Milella M. Weekly epiru-bicin plus lonidamine in advanced breast carcinoma // Breast Cancer Res. Treat. - 1999. - 56, № 3. - P. 233-237.

38. Oguri T., Isobe T., Suzuki T. et al. Increased expression of the MRP5 gene is associated with exposure to platinum drugs in lung cancer // Int. J. Cancer. - 2000.

- 86, № 1. - P. 95-100.

39. Pinedo H. M., Giaccone G. P-glycoprotein - a marker of cancer cell behavior // New Engl. J. Med. -1995. - 333. - P. 1417-1419.

40. Rabindran SK, He H, Singh M et al. Reversal of novel multidrug resistance mechanism in human colon carcinoma cells by fumitremorgin C // Cancer Res. - 1998.

- 58, № 24. - P. 5850-5858.

41. Rajewskaya T., Goncharova S., Shoobina I., Bogush T. Anthracycline antibiotics accumulation in tumors with classic and atypical multidrug resistance (MDR) // European J. Cancer. - 1995. - 31A. - Suppl. 5. - P. 32.

42. Rowinsky E. K., Smith L., Wang Y. M. et al. Phase

I and pharmacokinetic study of paclitaxel in combination with biricodar, a novel agent that reverses multidrug resistance conferred by overexpression of both MDR1 and MRP // J. Clin. Oncol. - 1998. - 16. - P. 2964-2976.

43. Sandor V., Fojo T., Bates S. E. Future perspectives for the development of P-glycoprotein modulators, in preparation // Drug Resistance Updates. - 1998. - I. - P. 190-200.

44. Scheffer G. L., Maliepaard M., Pijnenborg A. C. et al. Breast cancer resistance protein is localized at the plasma membrane in mitoxantrone- and topotecan-resist-ant cell line // Cancer Res. - 2000. - 60, № 10. - P. 2589-2593.

45. Serra M., Maurici D., Scotlandi K. et al. Relationship between P-glycoprotein expression and p53 status in high-grade osteosarcoma // Int. J. Oncol. - 1999.

- 14. - N2. - C. 301-307.

46. Silverman JA. Multidrug-resistance transporters // Pharm. Biotechnol. - 1999. - 12. - P. 353-386.

47. Valero V., Burris H. A., Jones S. E. Multicenter pilot study of Taxoter in Taxol-resistant metastatic breast cancer // Proc. ASCO. - 1996. - abst. 95.

48. Van der Heuvel-Eibrink M. M., Sonneveld P., Pieters R. The prognostic significance of membrane transport-associated multidrug resistance (MDR) proteins in leukemia // Int. J. Clin. Pharmaco.l Ther. - 2000. - 38, № 3.

- P. 94-110.

49. Volk E. L., Rohde K., Rhee M. et al. Methotrexate cross-resistance in a mitoxantrone-selected multidrug-resistant MCF7 breast cancer cell line is attributable to enhanced energy-dependent drug efflux // Cancer Res. -2000. - 60. - P. 3514-3521.

50. Wiseman L. R., Spencer C. M. Paclitaxel: an update of its use in the treatment of metastatic breast cancer and ovarian and other gynecological cancers // Drugs Aging. - 1998. - 12. - P. 305-334.

51. Wuchter C., Karawajew L., Ruppert V et al. Clinical significance of P-glycoprotein expression and function for response to induction chemotherapy, relapse rate and overall survival in acute leukemia // Haematol. -

2000. - 85. - P. 711-721.

Поступила 31.07.2006.