Способ коррекции печеночной недостаточности в эксперименте
METHOD OF CORRECTION OF HEPATIC INSUFFICIENCY IN THE EXPERIMENT

Изобретение относится к экспериментальной и клинической медицине, а именно к гепатологии, трансплантологии и может быть использовано для лечения печеночной недостаточности.
В экономически развитых странах хронические заболевания печени (хронический гепатит, цирроз печени) входят в число шести основных причин смерти пациентов от 35 до 60 лет, составляя 14-30 случаев на 100 тысяч населения. Ежегодно в мире умирают 40 миллионов человек от цирроза печени. Возрастание медицинской и социальной значимости хронических заболеваний печени требует разработки новых более эффективных технологий лечения и профилактики этих заболеваний на основе достижений современной биологической и медицинской науки.
4
Известен способ коррекции хронической печеночной недостаточности при моделировании токсического цирроза печени (затравка CCl) у мышей путем внутрибрюшинного введения им цитоплазматической рибонуклеиновой кислоты (РНК), выделенной из печени здоровых крыс [Чернух A.M., Вышепан Е.Д., Разумова И.Л. и др. Особенности течения экспериментального цирроза печени под влиянием печеночной РНК Бюлл. экспер. биологии и медицины 1970, №10, с. 12-15]. В этом исследовании, выполненном на мышах, авторы использовали экзогенную РНК из печени здоровых крыс, исходя из представлений о видовой неспецифичности РНК.
Было констатировано, что введение мышам органоспецифичной цитоплазматической РНК из печени крыс достоверно уменьшило гибель животных и число очагов некроза в ткани печени, а также достоверно увеличило не только митотическую активность гепатоцитов, но и количество междольковых соединительнотканных волокон. Отсутствие полного восстановительного (регенерационного) эффекта от применения тканеспецифичной (печеночной) РНК для лечения фиброзирующего типа печеночной недостаточности предопределило тот факт, что в клинике препараты РНК, полученные из ткани печени, стали для повышения лечебного эффекта сочетать с органоспецифическими препаратами РНК, выделенными из других органов - желудка, селезенки, надпочечников, поджелудочной железы и др. Однако ввиду малой клинической эффективности этот метод, основанный на применении комплекса органных РНК, в настоящее время не находит широкого применения.
Основной недостаток применения органоспецифических РНК от здоровых доноров, прежде всего печеночных РНК, состоит в том, что в тканях органов здоровых животных из-за стабильного равновесного состояния и отсутствия необходимости выработки в них факторов, индуцирующих процессы быстрого роста и развития, имеет место низкий уровень пролиферативной (митотической) активности клеток и поэтому выделенная из них РНК имеет низкий регенерационный потенциал. Кроме того РНК, выделенная из печени, обладает только органоспецифической активностью и не способна участвовать в компенсаторной поддержке других систем организма (почки, легкие), активно участвующих в процессе восстановительной регенерации печени.
Костный мозг, будучи центральным органом иммуногенеза и системы крови в организме, обладает универсальными регуляторными свойствами и его клетки относятся к быстро реагирующим и быстро развивающимся клеткам, содержат постоянно самообновляющийся пул стволовых/прогениторных клеток, постоянно продуцируют цитокины и факторы роста, оказывая регуляторное воздействие на клетки различных паренхиматозных органов, и поэтому именно их предпочитают использовать для индукции процессов регенерации.
Известен способ лечения печеночной недостаточности путем применения универсальных регуляторов восстановительных процессов в органах - мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга (ММСК КМ) от здорового донора [Люндуп А.В., Крашенинников М.Е., Онищенко Н.А. Применение аллогенных мезенхимальных клеток костного мозга в лечении хронических заболеваний печени, Сборник материалов Всероссийской конференции «Клеточные исследования и технологии в современной биомедицине», Тула 2009, с 6-8], который выбран нами в качестве прототипа.
Способ - прототип основан на выделении из костного мозга донора - ММСК КМ, культивировании их для увеличения клеточной массы в течение 3-4 недель и внутривенном введении реципиенту с поврежденной печенью. ММСК КМ после введения реципиенту корригируют клинические и морфологические проявления печеночной недостаточности путем индукции митотической активности клеток печени, а также путем активации дефиброзирующих процессов в печени (фибролитический эффект) [Люндуп А.В. «Применение мезенхимальных стромальных клеток костного мозга для коррекции фиброзирующего повреждения печени» (экспериментальное исследование), автореферат диссертации канд. мед. наук, Москва 2011, 26 с]. Эффективность применения ММСК КМ, для коррекции и лечения печеночной недостаточности обусловлена тем, что эти клетки обладают высоким регенерационным потенциалом, так как являются стволовыми/прогениторными (малодифференцированными) активно пролиферирующими клетками и в процессе своей жизнедеятельности выделяют комплекс высокоактивных регуляторных рост стимулирующих и паракринных факторов.
Эти факторы, корригируют взаимодействия в системе мезенхимальных клеток организма, в том числе системе мезенхимальных клеток поврежденной печени (купферовских клеток, звездчатых клеток, фибробластов, лейкоцитов), восстанавливают их нарушенное взаимодействие между собой и с паренхиматозными клетками печени (гепатоцитами), обеспечивая, таким образом, регуляцию процессов восстановительной регенерации печени.
Однако внедрение в клиническую практику клеточных технологий для лечения заболеваний печени продолжает оставаться на стадии пилотных исследований. Даже применение аутологичных стволовых/прогениторных клеток не получает единодушной поддержки и не находит широкого клинического применения из-за опасности малигнизации и генетических мутаций стволовых/прогениторных клеток после трансплантации в организме реципиента, а также из-за быстрой гибели этих клеток при получении их от аллогенного или ксеногенного донора.
В настоящее время из ММСК КМ выделено несколько микро РНК (микро РНК-188, микро РНК-21) для ускорения процессов остеогенной дифференцировки ММСК КМ и заживления костных переломов [Li C.J., Cheng P., Liang M.K., Chen Y.S., Lu Q., Wang J.Y. et al., MicroRNA-188 regulates age-related switch between osteoblast and adipocyte differentiation. J Clin. Invest. 2015 Apr, 125(4): 1509-22. doi: 10.1172/JCI177716. Epub 2015, Mar 9; / Sun Y., Xu L., Huang S., Hou Y., Liu Y. et al., Mir-21 overexpressing mesenchymal stem cells accelerate fracture healing in a rat closed femur fracture model. Biomed Res. Int. 2015; 2015: 412327. doi: 10.1155/2015/412327. Epub 2015 Mar 23].
Описания исследований по выделению и применению микро РНК из ММСК КМ для лечения печеночной недостаточности в литературе отсутствуют.
Кроме того, следует иметь ввиду, что регулирование процесса восстановительной регенерации в печени не может осуществляться какой либо одной микро РНК (их в настоящее время идентифицировано в организме свыше 1800 типов), т.к. печень представляет собой гистологически сложный орган, состоящий из 5 типов клеток различного происхождения (гепатоциты, купферовские клетки, клетки Ито - звездчатые клетки, эндотелиальные клетки, лейкоциты) и выполняет комплекс важнейших гомеостатических функций (синтетическая, детоксикационная, пищеварительная, выделительная, иммунорегуляторная и др.), взаимодействуя с другими системами в организме.
Техническая проблема заключается в повышении качества, надежности и безопасности применения клеточной терапии с использованием стволовых/прогениторных ММСК КМ при лечении (коррекции) печеночной недостаточности.
Технический результат, достигаемый при осуществлении предлагаемого способа, заключается в повышении эффективности лечения печеночной недостаточности за счет возможности многократного применения препарата, выделенного из ММСК КМ (аллогенного или ксеногенного) донора, а также в предупреждении осложнений, связанных с применением биотехнологических методов коррекции и профилактики печеночной недостаточности стволовыми/прогениторными клетками - (малигнизация и генетические мутации при имплантации ММСК КМ, быстрая гибель аллогенных и ксеногенных клеток костного мозга) путем использования биологически активного комплекса, содержащего в себе все типы РНК, в том числе все типы регуляторных белок - некодирующихмикро РНК, способного осуществить перенос «регенерационной информации» клеткам поврежденного органа - печени, индуцируя в ней процесс ускоренной и эффективной восстановительной регенерации.
Нами во избежание негативных последствий применения терапии ММСК КМ для повышения качества и безопасности применения биотехнологических методов регенерационной терапии предложено использовать не ММСК КМ, а выделенный из них комплекс биологически активных компонентов, включающий в себя все типы РНК, в том числе все типы регуляторных микро РНК, способных осуществить перенос содержащейся в них «регенерационной информации» клеткам поврежденного органа (печени) и тем самым активизировать в них восстановительные процессы.
Достоинством предлагаемого способа лечения печеночной недостаточности, позволяющим по существу достигнуть более выраженного и надежного лечебного эффекта является:
- отказ от необходимости поиска антиген совместимого донора для получения и использования ММСК КМ, так как суммарная РНК, выделенная из ММСК КМ здорового донора, обладает иммуно-неспецифичными (видо-неспецифичными) свойствами и может быть получена из ММСК КМ как аутологичного, так и аллогенного и ксеногенного донора;
- возможность проводить (курсовую терапию) путем парентерального многократного применения препарата суммарной РНК до полного выздоровления или ремиссии;
- возможность обеспечить компенсаторную поддержку регенерации печени, стимулируя адаптационную и регенерационную поддержку другим органам (почки, легкие), относящимся к единой системе детоксикации организма;
- возможность обеспечения безопасности проведения регенерационной терапии препаратом суммарной РНК из ММСК КМ, так как введенная РНК, являясь химическим веществом, не может стать объектом малигнизации, генетических мутаций, а также утратить свою регуляторную активность.
- возможность проводить эффективную регенерационную терапию различных органов и систем в организме, т.к. суммарная РНК, выделенная из ММСК КМ, сохраняет универсальность регуляторных свойств этих клеток
Сущность изобретения заключается в следующем.
Для коррекции (лечения) печеночной недостаточности в эксперименте выделяют из костного мозга донора-крысы мононуклеарную фракцию клеток. Затем после их культивирования выделяют из них фракцию ММСК КМ. Далее из полученной фракции выделяют суммарную РНК ММСК КМ и вводят ее внутрибрюшинно или в паренхиму печени в дозе 15-45 мкг на 100 г веса лабораторного животного - крысы, по меньшей мере, трехкратно с интервалом 1-3 суток между первым и вторым введением и далее через 2-5 суток между последующими введениями.
Способ осуществляется следующим образом.
Для лечения печеночной недостаточности используют не ММСК КМ донора, а биологически активный комплекс, выделенный из этих клеток. Комплекс содержит суммарную (общую) РНК, в состав которой входят все типы регуляторных РНК (прежде всего микро РНК), обеспечивающие перенос «регенерационной информации», содержащейся в ММСК КМ, клеткам поврежденной печени.
Выполнение способа начинают с получения мононуклеарной фракции клеток из аспирата костного мозга. Для этого под эфирным наркозом из костномозгового канала большеберцовых и бедренных костей крысы получали клетки костного мозга путем аспирации их шприцем с иглой 18G, содержащим среду для забора (0,5 мл фосфатно-буферного раствора с 50 ЕД/мл гепарина и 0,25 мг/л гентамицина).
4
3
Суспензию клеток КМ центрифугировали при 1500 об/мин (350g) 5 минут, осадок клеток ресуспендировали в растворе для лизиса эритроцитов (114 мМ NHCl, 7,5 мМ КНСО, 100 мкМ EDTA) в течение 3 мин и повторно центрифугировали. Гемолизированный супернатант удаляли отсасыванием, а клеточный осадок ресуспендировали в среде DMEM (ПанЭко, Россия), содержащей 10% телячью эмбриональную сыворотку («HyClonegold», USA), инсулин 0,4 мкМ и 0,25 мг/л гентамицина.
Выделенные клетки, представляли собой фракцию, преимущественно мононуклеарных клеток костного мозга (первичная культура), которые затем высевали в количестве 2,0-2,5 млн. кл/мл в культуральные флаконы.
2
2
6
Затем культуральные флаконы помещали в СО-инкубатор с 5% концентрацией СО и 95% содержанием атмосферного воздуха с повышенной влажностью. Через 2 суток после выделения первичной культуры не прикрепившуюся клеточную взвесь удаляли, а оставшиеся клетки с фибробластоподобной морфологией продолжали культивировать. Замену культуральной среды на свежую, осуществляли каждые 3-4 суток. После образования субконфлюэнтного монослоя клетки однократно отмывали раствором Версена, затем снимали раствором Версена с 0,25% трипсина, ресуспендировали в ростовой среде и разливали в новую культуральную посуду. Для работы использовали клетки после 2-го пассажа, в концентрации 2,5-3,0×10 клеток/мл.
Клеточный материал, представляющий собой прикрепившиеся к пластику распластанные фибробластоподобные клетки - ММСК КМ считался пригодным как для применения при лечении печеночной недостаточности по способу прототипу, так и для получения суммарной РНК при лечении печеночной недостаточности по предлагаемому способу, так как выделенная фракция ММСК КМ сохраняла популяционную активность и не содержала погибшие клетки. Гомогенность культуры ММСК КМ была подтверждена иммуногистохимическим исследованием путем выявления в них коллагена I типа с помощью кроличьих моноклональных антител («Имтэк»).
6
Далее приступали к выделению суммарной РНК из полученной культуры ММСК КМ (суммарный выход ММСК обычно составлял 8-10×10 клеток) по методике ExtractRNA, разработанной фирмой «Евроген» (Россия). Культуру ММСК КМ после 2-го пассажа снимали раствором Версена с 0,25% трипсина, дважды отмывали средой ДМЕМ без добавок, каждый раз центрифугируя при комнатной температуре при скорости 1500 об./мин в течение 5 минут и удаляли надосадочную жидкость.
6
Далее к выделенной культуре ММСК (в камере Горяева предварительно подсчитываем количество клеток) добавляли реагент ExtractRNA из расчета 1 мл реагента на 1×10 клеток, инкубировали смесь 15 минут (периодически пипетируя) и центрифугировали при 13400 об/мин 10 минут для удаления нерастворенных фрагментов. Супернатант переносили в новую пробирку и приступали к разделению фаз. Для этого добавляли 0,2 мл хлороформа на каждый 1 мл реагента ExtractRNA, инкубировали смесь в течение 5 минут при комнатной температуре, периодически встряхивая образец; затем образец центрифугировали при 13400 об/мин в течение 15 минут при комнатной температуре.
В ходе центрифугирования происходило разделение смеси на три фазы: нижнюю - органическую фенол хлороформную фазу желтоватого оттенка, интерфазу белого цвета и верхнюю бесцветную водную фазу. РНК находится в верхней водной фазе, которую аккуратно собирали и переносили в чистую пробирку.
Затем приступали к непосредственному выделению РНК. Для этого в водную фазу добавляли 0,5 мл 100% изопропанола на каждый 1 мл использованного реагента (ExtractRNA). Полученную смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 10 минут и центрифугировали при 13400 об/мин в течение 10 минут при комнатной температуре. Затем аккуратно отбирали супернатант, оставляя осадок РНК на дне пробирки. Далее аккуратно, по стенке пробирки, добавляли 2 мл 75% этанола на каждый 1 мл изопропанола, использованного ранее. Полученный образец центрифугировали на максимальной скорости (13400 об/мин) в течение 5 минут. Удаляли этанол пипеткой и осадок выделенной РНК растворяли в 1 мл воды и определяли концентрацию РНК в 100 мкл образца на спектрофотометре при длине волны 260 нм. Из каждых 8-10 млн исходно использованных ММСК КМ в 1 мл определялось 750 -950 мкг РНК. Далее из этого концентрированного раствора РНК готовили рабочие растворы РНК требуемой концентрации для введения в организм с целью коррекции печеночной недостаточности.
Суммарная РНК, выделенная из ММСК КМ, представляет собой биотехнологический продукт высокой степени очистки, который вводят внутрибрюшинно или в паренхиму печени.
Для экспериментального животного - (крысы) рабочий раствор РНК содержал 75-95 мкг РНК/мл (к 0,5 мл концентрированного раствора РНК добавляли 9,5 мл дистиллированной воды). Введение РНК осуществляют в дозе 15-45 мкг на 100 г веса животного трехкратно с интервалами в 1-3 суток между первым и вторым введениями и 2-5 суток между последующими введениями внутрибрюшинно или в паренхиму печени. Т.е. крысе массой 400 г вводят 0,2-0,6 мл рабочего раствора РНК в сутки трехкратно по выше указанной схеме.
Приводим пример осуществления предлагаемого способа.
Сравнительное изучение эффективности коррекции печеночной недостаточности по способу прототипу (внутривенное введение ММСК КМ) и по предлагаемому способу (внутрибрюшинное введение или введение в паренхиму печени суммарной РНК) выполняли на модели хронической печеночной недостаточности (ХПН).
4
4
Для этого создавали модель хронического фиброзирующего повреждения печени у крыс путем длительной (в течение 42 дней) затравки четыреххлористым углеродом (CCL) по описанной ниже методике. Длительным введением раствора CCL достигалось развитие хронического токсического гепатита и стимуляция заместительного регенерационного ответа печени (развитие склероза и фиброза печени). Метод поддается высокой степени стандартизации и является «классической» моделью для изучения регенерации печени при хроническом токсическом повреждении.
Моделирование хронического токсического фиброзирующего повреждения печени проводили на белых крысах самцах породы Вистар (вес к началу затравки 250-300 г, n=85), содержащихся в виварии на смешанном рационе питания со свободным доступом к воде.
4
4
4
4
Затравку крыс CCL проводили под кратковременным эфирным наркозом в интервале между 9-ю и 12-ю часами дня, что исключало суточные колебания митотической активности клеток печени. Подкожные инъекции 60% раствора CCL на персиковом масле проводили 2 раза в неделю (понедельник, четверг) в течение 6 недель (42 суток) в дозе 0,3 мл раствора на 100 г веса животного. Первая инъекция проводилась в дозе 0,5 мл 60% раствора CCL на 100 г веса животного. Суммарная курсовая доза чистого CCL составляла 3,5 мл на 100 г веса животного.
6
Через трое суток после завершения моделирования ХПН (на 46 сутки от начала моделирования ХПН) всех животных разделили на 3 группы: 1 группа - контроль (ХПН без применения терапии, n=35); 2 группа - ХПН и внутривенное введение ММСК КМ в хвостовую вену в дозе 2,5×10кл/мл на крысу двукратно с интервалом в 7 суток, т.е. на 4 и 11 сутки после завершения моделирования ХПН (группа сравнения, n=20), 3 группа включала две подгруппы животных: с внутрибрюшинным введением РНК в дозе 15 мкг на 100 г веса животного (подгруппа 3.1, n=15) и с введением в паренхиму печени РНК в дозе 45 мкг на 100 г веса животного (подгруппа 3.2, n=15), причем РНК вводили трехкратно с интервалом в 1-3 суток после первого введения и 2-5 суток для последующих введений после завершения моделирования ХПН.
Результаты оценивали в трех группах опытов на 1, 30, 90, 180 и 270 сутки после проведения терапии с помощью биохимических, гистологических и морфометрических методов. Так как результаты исследования в подгруппах 3.1 и 3.2 достоверно не различались между собой (отмечена лишь тенденция к ускорению процессов регенерации в подгруппе 3.2) они все были объединены в группу 3.
Биохимическими методами исследовали кровь на содержание аланин-аминотрансферазы (АлАТ), аспарагин-аминотрансферазы (АсАТ) и щелочную фосфатазу (ЩФ). Для этого у крысы под эфирным наркозом надсекали кончик хвоста, пипеткой забирали 28-32 мкл крови, капали на специальные тест-полоски Reflotron™, которые сразу же устанавливали в биохимический анализатор Reflotron™ («Roche», Швейцария) (Принцип измерения - рефлексионная фотометрия, точность измерения - ±0.5%, воспроизводимость - <=0.2%, линейность: ±0.05%).
Для гистологического исследования печени животных забивали под эфирным наркозом декапитацией, извлекали фрагмент средней доли печени, разрезали его на кусочки размерами 3×4×5 мм и помещали в раствор Буэна (через 24 часа раствор Буэна меняли на 70% этанол) для фиксации. После завершения фиксации кусочки промывали в проточной воде в течение 2-3 ч, обезвоживали в спиртах восходящей концентрации и заливали в парафин. Парафиновые срезы толщиной 4-5 мкм наклеивали влажным способом на стекла с поли-L-лизиновым покрытием («Thermo», США). Затем препараты высушивали в течение 48 ч в термостате при 37°С, депарафинировали, регидратировали и окрашивали срезы гематоксилин-эозином и по Маллори (на соединительную ткань).
Морфометрический анализ срезов фрагмента средней доли печени был произведен с помощью морфометрической программы ImageScopeM (ООО «Системы для микроскопии и анализа», Россия). Исследуемые изображения получены с использованием микроскопа Leica DM1000 и камеры Leica LTDCH9435 DFC 295 (Leica Camera AG, Германия).
Данным методом определяли:
1) наличие цирроза (подсчет количества ложных долек);
2) долю соединительной ткани (в процентном соотношении к общей площади среза печени), кровеносных сосудов и желчных протоков в %;
3) выраженность жировой дистрофии (оценивали 10 полей зрения среза каждого образца);
4) количество двуядерных гепатоцитов (на 10 полей зрения среза при увеличении ×400);
5) количество гепатоцитов с внутриядерными липидными включениями.
Приводим результаты сравнительного исследования эффективности применения ММСК КМ и РНК из ММСК КМ для восстановительной регенерации поврежденной печени.
На фиг. 1 представлена динамика АлАТ у крыс с печеночной недостаточностью без лечения (1 группа) и с применением ММСК КМ (2 группа) или суммарной РНК из ММСК КМ (3 группа).
На фиг. 2 представлена динамика AcAT у крыс с печеночной недостаточностью без лечения (1 группа) и с применением ММСК КМ (2 группа) или суммарной РНК из ММСК КМ (3 группа).
На фиг. 3 представлена динамика ЩФ у крыс с печеночной недостаточностью без лечения (1 группа) и с применением ММСК КМ (2 группа) или суммарной РНК из ММСК КМ (3 группа).
На фиг. 4 представлена динамика формирования ложных долек у крыс с печеночной недостаточностью без лечения (1 группа) и с применением ММСК КМ (2 группа) или суммарной РНК из ММСК КМ (3 группа).
Результаты гистологического и морфометрического исследования представлены в таблицах 1 и 2 соответственно.
Обозначения:
*- р<0,05 по сравнению с нормой;
#- р<0,05 по сравнению с 30 сутками в контрольной группе.
Обозначения:
**- р<0,05 по сравнению с 30 сутками в контрольной группе;
#- р<0,05 по сравнению с аналогичным сроком в контрольной группе.
4
Исследование динамики восстановительных процессов в печени в трех группах опытов показали, что сразу после затравки CCL во всех трех группах имело место достоверное повышение ферментов цитолитического повреждения - печени - АлАТ, АсАТ и ЩФ - (фиг. 1, 2, 3). Однако в отличие от 1 контрольной группы во 2 и 3 группах уже на седьмые сутки после окончания затравки происходило достоверное снижение в крови ферментов цитолиза, как после первого внутривенного введения ММСК КМ (2 группа), так и после двукратного внутрибрюшинного введения суммарной РНК из ММСК КМ или введения суммарной РНК из ММСК КМ в паренхиму печени (3 группа).
К 14 суткам (уже после второго введения ММСК КМ) во 2 группе и после третьего введения суммарной РНК из ММСК КМ в 3 группе, а также к 21 суткам во 2 группе и в 3 группе происходило дальнейшее достоверное снижение уровня цитолитических ферментов печени по сравнению с 1 контрольной группой к этим срокам.
К 28 суткам наблюдения значения АлАТ, АсАТ и ЩФ во 2 и 3 группах продолжали снижаться, приближаясь к исходному уровню, тогда как в 1 группе показатели оставались достоверно на более высоком уровне по сравнению с исходными значениями. На протяжении всего этого срока наблюдения достоверных различий в уровне печеночных ферментов между 2 и 3 группой выявлено не было.
Продолжая динамическое наблюдение за содержанием ферментов цитолиза в крови в течение 180 суток, было установлено (фиг. 1, 2, 3), что во 2 и 3 группах значения АлАТ, АсАТ и ЩФ снижались до исходных значений уже к 28-30 дню, тогда как в 1 контрольной группе значения этих показателей нормализовались только через 6 месяцев (к 180 суткам наблюдения).
При гистологической оценке динамики репаративных процессов в печени у животных этих 3-х групп было установлено, что восстановление морфологических показателей печени во всех исследуемых группах происходит в более замедленном темпе, чем восстановление биохимических показателей (ферменты) (таблицы 1, 2).
Так, из таблицы 1 следует, что количество гепатоцитов с признаками жировой дистрофии и с дегенерирующими ядрами, а также количество двуядерных гепатоцитов и гепатоцитов с внутриядерными липидными включениями в 1 контрольной группе не нормализуется ни к 180, ни к 270 дню наблюдения.
Во 2 группе (с двукратным введением ММСК КМ) и в 3 группе (с 3 - кратным введением суммарной РНК из ММСК КМ) восстановление морфологических показателей происходит более активно: к 180 суткам не все исследуемые показатели возвратились к исходным значениям, но уже на 270 сутки все исследуемые показатели в этих группах не отличались от значений в интактной печени (норма).
В таблице 2 представлены результаты морфометрического определения удельной площади соединительной ткани, площади кровеносных сосудов и желчных протоков в срезах ткани печени в трех группах опытов при динамическом наблюдении в течение 270 суток. Из таблицы видно, что в 1 контрольной группе на 270 сутки исследуемые показатели были достоверно выше не только по сравнению с интактными животными, но и по сравнению с 30 сутками у животных этой же группы, свидетельствуя об усилении процессов склерозирования ткани печени. Во 2 и 3 группах имеет место постепенная нормализация исследуемых показателей и к 270 суткам они в плотную приближаются к значениям у интактных животных, причем часть из этих показателей имеет достоверно более низкие значения, чем аналогичные показатели в 1- контрольной группе к 270 суткам наблюдения.
Достоверных различий в динамике исследуемых показателей во 2 и 3 группах обнаружено не было, хотя в 3 группе имела место тенденция к более выраженному снижению площади соединительной ткани и площади кровеносных сосудов, что может быть связано с 3 - кратным введением суммарной РНК из ММСК КМ в течение первого месяца после моделирования печеночной недостаточности. Подсчет ложных долек в течение 180 суток (в баллах) также подтвердил (фиг. 4), что во 2 и 3 группах имеет место процесс дефиброзирования ткани печени, тогда как в 1-группе он практически отсутствует. Достоверные различия в содержании ложных долек в печени животных 2 и 3 групп не выявлены.
Таким образом, с помощью биохимических, морфологических и морфометрических исследований ткани печени в динамике после моделирования ХПН нами установлено, что двукратное внутривенное введение ММСК КМ (2 группа) и трехкратное внутрибрюшинное введение или введение в паренхиму печени суммарной РНК из ММСК КМ (3 группа) на всех исследуемых сроках обеспечивают постепенную коррекцию нарушенных показателей печени и индуцируют в ней восстановительные процессы по сравнению с 1 контрольной группой.
6
Мы констатировали также, что достоверные различия в динамике восстановления биохимических и морфологических показателей печени во 2 и 3 группах отсутствовали. Этот факт свидетельствует о том, что двукратное внутривенное введение ММСК КМ (суммарная доза 5,0×10 кл. на животное) и 3 - кратное внутрибрюшинное введение или введение в паренхиму печени суммарной РНК из ММСК КМ (в подгруппе 3.1 суммарная доза составила 45 мкг на 100 г животного и в подгруппе 3.2 суммарная доза составила 135 мкг на 100 г веса животного) идентичны по своему биологическому регенераторному воздействию на печень.
Важно подчеркнуть, что заявленное назначение и указанный технический результат были достигнуты как при использовании «крайних значений» заявленного диапазона доз суммарной РНК из ММСК КМ, так и «крайних значений» заявленного диапазона временного интервала между введениями суммарной РНК из ММСК КМ. В целом анализ результатов проведенных экспериментов показал, что предлагаемый биологически активный комплекс РНК оказывает лечебное (корригирующее) воздействие при печеночной недостаточности с использованием корректной (классической) модели ее развития.
Таким образом, применение суммарной РНК из ММСК КМ в соответствии с предлагаемым способом будет способствовать безопасной восстановительной регенерации печени, т.к. препарат суммарной РНК не несет в своей структуре малигнизирующих и мутационных свойств, не обладает иммуноспецифичностью и пригоден для многократного применения.