СПОСОБ ОЦЕНКИ БЕЗОПАСНОСТИ ДЛЯ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ НЕТРАДИЦИОННЫХ УДОБРЕНИЙ НА ОСНОВЕ ОСАДКОВ СТОЧНЫХ ВОД
METHOD OF EVALUATING ENVIRONMENTAL SAFETY OF UNCONVENTIONAL SEWAGE SLUDGE BASED FERTILISERS

Изобретение относится к области экологии и предназначено для оценки степени токсичности нетрадиционных почвенных мелиорантов на основе органических отходов, в частности осадков сточных вод (ОСВ), в лабораторных условиях.
Известен метод определения токсичности техногенно загрязненных почв [1], где для анализа используются физиологические параметры растений.
Также известен метод оценки экологического состояния окружающей среды на основе величины флуктуирующей асимметрии (ФА) березы повислой [2] и других растений, где для анализа используются морфологические признаки растений.
Значительное число работ посвящено изучению флуктуирующей асимметрии в натурных условиях. На макроскопическом уровне флуктуирующую асимметрию предлагают использовать в качестве меры в оценке стабильности развития организма [2, 3]. Уровень морфогенетических отклонений (т.е. ФА) от нормы оказывается минимальным лишь при определенных (оптимальных) условиях среды и неспецифически возрастает при любых стрессовых воздействиях.
Однако использование только одного биоиндикационного уровня для оценки качества среды дает не вполне объективные результаты.
Используя принцип известных методов, предлагается способ объективной оценки возможной токсичности нетрадиционных органических удобрений (НОУ) в лабораторных условиях.
Описания комплексной оценки возможной токсичности НОУ на основе ОСВ, включающей морфологические и физиологические показатели, в литературе нами не выявлены.
Технический результат достигается тем, что способ включает определение в лабораторных условиях морфологических показателей растений гороха посевного путем определения ФА листовых пластинок листа гороха и аномалий их развития, а также физиологических параметров, путем определения энергии прорастания испытуемых растений, выращиваемых в емкостях с почвой легкого гранулометрического состава, модифицированной НОУ в рекомендуемых дозах. В качестве контроля используется образец почвы, не модифицированный НОУ, сходный по гранулометрическому составу и агрохимическим показателям, при этом.
на 1-м этапе отсортированные по размеру и качеству семена высевают в емкости с контрольными и опытными образцами почвы;
1
на 2-м этапе проводят оценку энергии прорастания семян гороха и, используя средние показатели энергии прорастания семян в вариантах с почвой, модифицированной НОУ, и в контрольном варианте, определяют индекс токсичности фактора (ИТФ) [4];
2
на 3-м этапе определяют частоту встречаемости аномалий развития листа у гороха по повторностям и проводят сравнение между средними значениями частоты аномалий (ЧА) на одно растение в вариантах с почвой, модифицированной НОУ, и в контрольном варианте, рассчитывают ИТФ (в данном случае берется величина, обратная ИТФ);
3
на 4-м этапе рассчитывают величину флуктуирующей асимметрии билатеральных признаков у листовых пластинок листа гороха, используя данные по трем параметрам: ширине половинки листовой пластинки листа гороха; расстоянию между основаниями второй и третьей жилки второго порядка и углу между главной жилкой и второй от основания жилкой второго порядка. Затем вычисляют среднее значение асимметрии по всем исследуемым вариантам и проводят сравнение между их значениями флуктуирующей асимметрии в вариантах с почвой, модифицированной НОУ, и в контрольном варианте, рассчитывают ИТФ (также берется величина, обратная ИТФ);
ср
на 5-м этапе для оценки степени токсичности испытуемого НОУ определяют среднее значение ИТФ и сравнивают его со шкалой токсичности [4].
Для проведения биотестирования используются семена растения горох посевной Pisum sativum L, сорт «Труженик» со всхожестью не менее 95% (возможно использование и других районированных сортов гороха за исключением сортов, имеющих «усатый» тип листа).
Все семена перед посевом отсортировывали по размеру и качеству. Норма высева семян в каждой повторности - 20 штук. Повторность опыта пятикратная. Полив растений проводили по мере подсыхания почвы, используя при этом отстоявшуюся водопроводную поду. Учитывая, что горох - влаголюбивая культура, - не допускали пересыхание почвы.
Обоснование выбора параметров листа гороха для оценки флуктуирующей асимметрии (статистический анализ флуктуирующей асимметрии билатеральных признаков листьев гороха).
Листовые пластинки листьев гороха как объект при исследовании флуктуирующей асимметрии используются впервые, поэтому выбор, идентификация билатеральных признаков и верификация их флуктуирующего характера требует статистического анализа.
Для оценки ФА были предложены четыре билатеральных признака листовых пластинок листа гороха, которые были подвергнуты статистическому анализу: 1 - ширина половинки листовой пластинки листа гороха; 2 - расстояние между основаниями второй и третьей жилки второго порядка; 3 - угол между главной жилкой и третьей от основания жилкой второго порядка; 4 - угол между главной жилкой и второй от основания жилкой второго порядка.
Общий объем выборки составил 113 листовых пластинок, из которых 49 отобраны с растений варианта почва + НОУ (120 т/га), 64 - контроль.
Для оценки нормальности распределения признаков, а также для определения типа симметрии, были рассчитаны основные статистические параметры выборки.
Для уточнения характера направленности асимметрии проведено сравнение первичных данных по критерию Уилкоксона [5]. Результаты анализа в соответствии с таблицей 3 подтвердили наличие направленной асимметрии у признака 3 - угол между главной жилкой и третьей от основания жилкой второго порядка, что делает невозможным использование данного признака для оценки флуктуирующей асимметрии.
Необходимым условием для использования признаков в оценке ФА является отсутствие корреляции между ними. Чем менее скоррелированы величины асимметрии признаков, тем более объективную оценку можно получить, используя данный набор признаков. Корреляционный анализ значений исследуемых признаков показал отсутствие корреляции между всеми признаками.
Таким образом, величину флуктуирующей асимметрии возможно определить по признакам 1, 2 и 4. Оценка величины флуктуирующей асимметрии проводилась по дисперсии - относительной величины различия в промерах слева и справа, отнесенного к их сумме (L-R)/(L+R).
Таким образом, для определения величины флуктуирующей асимметрии возможно использовать лисья гороха, при этом целесообразно оценивать следующие параметры листа растений гороха:
1. ширина половинки листовой пластинки листа гороха;
2. расстояние между основаниями второй и третьей жилки второго порядка;
3. угол между главной жилкой и второй от основания жилкой второго порядка.
Пример 1. Определение энергии прорастания семян
Отсортированные по размеру и качеству семена высевают в емкости с контрольными и опытными образцами почвы. Оценку энергии прорастания семян гороха проводят на 7-10 день эксперимента. Подсчитывают количество проросших растений в каждом стакане (повторности). Энергию прорастания семян гороха определяли по формуле 2
<mrow><mi>B</mi><mo>=</mo><mrow><mo>(</mo><mrow><mi>a</mi><mo>/</mo><mi>b</mi></mrow><mo>)</mo></mrow><mo>×</mo><mn>100</mn><mi>%</mi><mo>,</mo><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mrow><mo>(</mo><mn>2</mn><mo>)</mo></mrow></mrow>
где B - энергия прорастания семян, %; a - число проросших семян, b - общее число семян, взятых для проращивания.
1
Вычисляют среднее значение всхожести семян в каждом варианте опыта. Проводят сравнение между средними значениями всхожести семян в вариантах с почвой, модифицированной НОУ, и в контрольном варианте, рассчитывают ИТФ в соответствии с формулой 3.
<mrow><mi>И</mi><mi>Т</mi><mi>Ф</mi><mo>=</mo><mi>Т</mi><msub><mi>Ф</mi><mn>0</mn></msub><mo>/</mo><mi>Т</mi><msub><mi>ф</mi><mi>к</mi></msub><mo>,</mo><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mrow><mo>(</mo><mn>3</mn><mo>)</mo></mrow></mrow>
0
к
где ТФ - значение регистрируемой тест-функции в опыте, Тф - в контроле. Величина ИТФ изменяется от 0 до M, где M - любая положительная величина.
1
Первый показатель наличия токсического воздействия экспериментальных образцов НОУ - снижение всхожести семян по сравнению с контролем (ИTФ). Например:
Влияние нетрадиционных мелиорантов на энергию прорастания семян растений гороха
Варианты опыта
Энергия прорастания семян растений гороха
кол-во проросших семян, шт.
энергия прорастания, %
ИТФ<sub>1</sub>
НОУ-3 120 т/га
13,0
88,0
0,88
Контроль
14,8
100
НСР<sub>05</sub>
0,75
Пример 2. Оценка частоты встречаемости аномалий развития у растений гороха
Подсчет количества аномалий развития у растений гороха проводят на стадии 5-6 листа (4-6 неделя эксперимента). Подсчитывают количество аномалий на листьях растений в каждом стакане (повторности). На одном растении может быть больше, чем один аномальный признак. Подсчитывают количество выживших на данный момент растений в каждой повторности. Рассчитывают частоту встречаемости аномальных признаков (ЧА) на 1 растение по повторностям по формуле 4:
<mrow><mi>Ч</mi><mi>А</mi><mo>=</mo><mi>a</mi><mo>/</mo><mi>n</mi><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mrow><mo>(</mo><mn>4</mn><mo>)</mo></mrow></mrow>
где ЧА - частота встречаемости аномалий развития, a - число аномалий в повторности, n - количество обследованных растений в повторности.
2
Вычисляют среднее значение частоты встречаемости аномалий на вариант опыта. Проводят сравнение между средними значениями частоты аномалий на одно растение в вариантах с почвой, модифицированной мелиорантами и в контрольном варианте, рассчитывают ИТФ.
2
Второй показатель наличия токсического воздействия экспериментальных образцов НОУ - увеличение частоты встречаемости аномалий на одно растение по сравнению с контролем - ИТФ (берется величина, обратная ИТФ).
Наиболее часто встречающиеся аномалии листа растений гороха:
1. Непарноперистый лист. 2. Разноразмерность листовых пластинок и деформация листа. 3. Увеличение количества листовых пластинок (3-4) на листе. 4. Пятнистость листьев. 5. Аномальные прилистники: бабочковидные, разного размера. 6. Зубчатый край листовой пластинки. 7. 3амена листовой пластинки усиком. 8. Сросшиеся листовые пластинки. 9. Аномальное количество пар листовых пластинок на листе гороха. 10. Вогнутый кончик листовой пластинки (нормально развитый лист гороха сорт «Труженик» имеет 1-3 пары цельнокрайних листочков среднего размера; прилистники хорошо развиты, полусердцевидные, зеленые). Например:
Влияние нетрадиционных мелиорантов на частоту встречаемости аномалий развития листа
Варианты опыта
Частота встречаемости аномалий развития листа на различных уровнях загрязнения токсикантами (ед./растение)
Частота аномалий
ИТФ<sub>2</sub>
НОУ-3 120 т/га
0,658
0,71
Контроль
0,462
НСР<sub>05</sub>
0,11
*- в данном случае берется величина, обратная ИТФ
Пример 3. Оценка флуктуирующей асимметрии билатеральных признаков у листовых пластинок листа гороха
Оценка флуктуирующей асимметрии. После подсчета аномалий развития у растений можно приступать к сбору листовых пластинок листьев гороха. Целесообразно срезать 4-6 листьев гороха, которые имеют, как правило, более крупные листовые пластинки и рисунок жилок на них более четкий. Для получения статистически достоверных результатов количество листовых пластинок с каждого варианта должно быть не менее 100. Собранные листья помещали в гербарий между листами фильтровальной бумаги и высушивали. Далее каждая листовая пластинка сканируется и увеличивается в 10 раз для удобства измерения. Измерения проводятся при помощи стандартного программного средства «Линейка» в графической программе Adobe Photoshop 5.0 или другими способами (например, распечатываются и измеряются с помощью линейки и транспортира).
С каждой листовой пластинки снимаются показатели по трем параметрам с левой и правой стороны:
1. ширина половинки листовой пластинки листа гороха;
2. расстояние между основаниями второй и третьей жилки второго порядка;
3. угол между главной жилкой и второй от основания жилкой второго порядка.
Необходимо обратить внимание на жилки второго порядка: на листовых пластинках листьев гороха первая жилка второго порядка обычно плохо выражена, изогнута, часто проходит вблизи края листовой пластинки. Вторая жилка второго порядка, как третья и четвертая,  выражены хорошо, видны обычно четко.
Для проведения статистического анализа полученные первичные данные переводятся в натуральные значения. Величина асимметричности оценивается с помощью интегрального показателя - величины среднего относительного различия на признак (средняя арифметическая отношения разности к сумме промеров листа слева и справа, отнесенная к числу признаков). [2, 3].
Например, величина асимметрии по 3-м исследуемым признакам в варианте «контроль» рассчитывается по формуле 5:
<mrow><mi>Ф</mi><msub><mi>А</mi><mrow><mi>с</mi><mi>р</mi><mtext> </mtext><mi>к</mi><mo>−</mo><mi>л</mi><mi>ь</mi></mrow></msub><mo>=</mo><mstyle displaystyle="true"><munderover><mo>∑</mo><mrow><mi>n</mi><mo>=</mo><mn>1</mn></mrow><mn>3</mn></munderover><mrow><mfrac><mrow><mrow><mo>(</mo><mrow><msub><mi>L</mi><mi>n</mi></msub><mo>−</mo><msub><mi>R</mi><mi>n</mi></msub></mrow><mo>)</mo></mrow></mrow><mrow><mn>3</mn><mrow><mo>(</mo><mrow><msub><mi>L</mi><mi>n</mi></msub><mo>+</mo><msub><mi>R</mi><mi>n</mi></msub></mrow><mo>)</mo></mrow></mrow></mfrac></mrow></mstyle><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mrow><mo>(</mo><mn>5</mn><mo>)</mo></mrow></mrow>
ср к-ль
n
n
n
n
где ФА - величина флуктуирующей асимметрии по 3-м признакам; (L-R) - разность между значениями n-го признака на левой и правой стороне; (L+R) - сумма значений n-го признака на левой и правой стороне листа; n - количество исследуемых признаков в варианте опыта «контроль».
3
Вычисляют среднее значение асимметрии по всем исследуемым вариантам удобрения. Затем проводят сравнение между их значениями флуктуирующей асимметрии в вариантах с почвой, модифицированной НОУ, и в контрольном варианте, рассчитывают ИТФ (берется величина, обратная ИТФ).
3
Например, расчет величины флуктуирующей асимметрии в контроле равнялась 0,12, а в опыте (почва + НОУ-3 120 т/га) - 0,16. В этом случае индекс токсичности фактора - ИТФ составил 0,75 (бралась обратная величина).
Пример 4. Определение общей токсичности исследуемого НОУ
Для оценки степени токсичности испытуемого НОУ рассчитывалось среднее значение ИТФ по всем показателям (энергия прорастания семян, величина аномалий развития и величина ФА), по формуле 6:
<mrow><mi>И</mi><mi>Т</mi><msub><mi>Ф</mi><mrow><mi>с</mi><mi>р</mi></mrow></msub><mo>=</mo><mstyle displaystyle="true"><munderover><mo>∑</mo><mrow><mi>n</mi><mo>=</mo><mn>1</mn></mrow><mn>3</mn></munderover><mrow><mfrac><mrow><mi>И</mi><mi>Т</mi><msub><mi>Ф</mi><mi>n</mi></msub></mrow><mn>3</mn></mfrac><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mrow><mo>(</mo><mn>6</mn><mo>)</mo></mrow></mrow></mstyle></mrow>
ср.
Значение ИТФ сравнивают со шкалой токсичности [4].
Например, полученный результат - 0,76, что по шкале токсичности соответствует слабой токсичности. Таким образом, исследуемый мелиорант на основе осадков сточных вод - НОУ-3 (120 т/га) обладает слабой токсичностью. Для сравнения: определение степени токсичности НОУ-3 методом биотестирования с помощью водорослей, дафний и микроорганизмов по аттестованным методикам показало 4 класс опасности, т.е. слабую токсичность.
Таким образом, использование предлагаемого метода позволит дать объективную оценку качества нетрадиционных мелиорантов и окружающей среды, а полученные результаты сопоставимы с результатами биотестирования на тест-организмах, рекомендуемых МПР РФ.
Отличием предложенного способа от ближайших аналогов является то, что для оценки возможной токсичности новых НОУ в условиях лабораторного опыта берутся как морфологические, так и физиологические показатели растений. Тестирование НОУ на различных биоиндикационных уровнях позволяет получить наиболее объективные результаты.
Литературные источники
1. Методика выполнения измерений всхожести семян и длины корней проростков высших растений для определения токсичности техногенно-загрязненных почв. С-Пб. 2009. - 19 с.
2. Шестакова Г.А. Методика сбора и обработки материала для оценки качества среды (по березе повислой) / Г.А.Шестакова, А.Б.Стрельцов, Е.Л.Константинов // Очерк экологии города Калуги. Калуга, 2000. С.378-385.
3. Гелашвили, Д.Б. Статистический анализ флуктуирующей асимметрии билатеральных признаков разноцветной ящурки. / Д.Б.Гелашвили, В.Н.Якимов, В.В.Логинов, Г.В.Епланова // Актуальные проблемы гепертологии и токсикологии: Сборник научных трудов. Вып.7. Тольятти. 2004. - С.45-59.
4. Кабиров, P.P. Разработка и использование многокомпонентной тест-системы для оценки токсичности почвенного покрова городской территории / P.P.Карибов, А.Р.Санитова, Н.В.Суханова // Экология. - 1997. - №6. - С.411.
5. Айвазян, С.А. Прикладная статистика. Основы моделирования и первичная обработка данных / Айвазян С.А., Енюков И.С., Мешалкин Л.Д. М: Финансы и статистика, 1983, 471 с.