СВЯЗЫВАЮЩИЕ ГИАЛУРОНОВУЮ КИСЛОТУ СИНТЕТИЧЕСКИЕ ПЕПТИДОГЛИКАНЫ, ПОЛУЧЕНИЕ И СПОСОБЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ
HYALURONIC ACID BINDING SYNTHETIC PEPTIDOGLYCANS, PREPARATION AND APPLICATION METHODS

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА СВЯЗАННЫЕ ЗАЯВКИ
По этой заявке испрашивают приоритет по 35 U.S.C. § 119(e) предварительной заявки США с серийным № 61/489602, которая подана 24 мая 2011 года, и предварительной заявки США с серийным № 61/550621, которая подана 24 октября 2011 года. Раскрытие их обеих включено в настоящий документ посредством ссылки.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Изобретение относится к области связывающих гиалуроновую кислоту синтетических пептидогликанов и способам их получения и использования.
ПРЕДПОСЫЛКИ И СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Суставной хрящ является важным компонентом для защиты костей в организме. В частности, суставной хрящ выполняет функцию защиты костей сустава от повреждения посредством предоставления почти не имеющей трения поверхности для движения костей и также предоставления суставам прочности на сжатие. Суставной хрящ широко содержит внеклеточный матрикс (ECM), получаемый из трех основных компонентов: коллагеновый каркас, гиалуроновая кислота (HA) и аггрекан. Вещественный состав суставного хряща определяет биологические, химические и механические свойства ткани. Внеклеточный матрикс (ECM) здорового хряща в первую очередь состоит из сети коллагеновых волокон (коллаген II типа 15-22% влажной массы), протеогликанов (4-7% влажной массы), гликопротеинов, воды (60-85%) и электролитов, что дает начало вязкоупругой ткани со структурной и механической анизотропией, зависящей от глубины.
Разрушение и износ хряща являются признаком остеоартрита (OA). Во время начальных этапов OA аггрекан, основной протеогликан в хряще, представляет собой компонент, подлежащий раннему разрушению. Мономер аггрекана представляет собой белковый кор с ковалентно прикрепленными гликозаминогликановыми (GAG) боковыми цепями, которые связываются с филаментами гиалуроновой кислоты через глобулярные домены и связывающий белок. Протеазы, такие как аггреканазы, расщепляют аггрекан в конкретных сайтах, создавая белковые фрагменты и свободные цепи GAG, которые не способны повторно связываться с HA. Вместо этого эти свободные цепи GAG выдавливаются из матрикса, в котором происходит не только снижение прочности на сжатие, но также начало повышения провоспалительных цитокинов и матриксных металлопротеаз. Показано, что присутствие аггрекана служит для того, чтобы снижать диффузию протеаз, защищая подлежащие коллагеновые волокна от протеолитического расщепления. Утрата аггрекана происходит даже в нормальном хряще и не имеет непосредственной корреляции с OA. Однако утрату коллагена II типа считают необратимым процессом, который ведет к преждевременному износу.
Остеоартрит представляет собой самую распространенную форму артрита, поражающую 27 миллионов человек только в США. Наиболее преобладающие симптомы остеоартрита включают сильную боль, тугоподвижность в суставах и болезненные и воспаленные суставы. Поздние стадии остеоартрита могут вести к полному разрушению суставного хряща, что вызывает неподвижность суставов и повреждение подлежащей кости. Прямые издержки на артрит в Соединенных Штатах оценивают приблизительно в 185,5 миллиарда долларов ежегодно.
Несмотря на то что изменения образа жизни и множество лекарств часто используют для лечения остеоартрита, имеет место небольшой успех в регенерации дефективного хряща и облегчении симптомов, обусловленных утратой хряща. Эта неспособность останавливать прогрессирование остеоартрита и восстанавливать существующее повреждение типично на конечной стадии ведет к инвазивной процедуре замены хряща. Таким образом, альтернативный вариант лечения остеоартрита крайне желателен.
В настоящем раскрытии описаны улучшенные биоматериалы для регенерации хряща, включая связывающие гиалуроновую кислоту синтетические пептидогликаны, которые можно использовать для того, чтобы восстанавливать поврежденный хрящ у пораженного пациента, наряду со способами получения и использования синтетических пептидогликанов. Кроме того, связывающие гиалуроновую кислоту синтетические пептидогликаны разрабатывают для того, чтобы функционально имитировать аггрекан, препятствовать разрушению аггреканазами, и ограничивать протеолитическое разрушение. Отсутствие нативной аминокислотной последовательности, встречаемой в аггрекане, делает эти молекулы менее восприимчивыми к протеолитическому расщеплению.
Предусмотрены следующие нумерованные варианты осуществления, которые не являются ограничивающими:
1. Связывающий гиалуроновую кислоту синтетический пептидогликан, который содержит синтетический пептид, конъюгированный с гликаном, где синтетический пептид содержит связывающую гиалуроновую кислоту последовательность.
2. Синтетический пептидогликан по п.1, где синтетический пептид содержит аминокислотную последовательность формулы B1-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-B2,
где X8 присутствует или не присутствует,
где B1 представляет собой основную аминокислоту,
где B2 представляет собой основную аминокислоту, и
где X1-X8 представляют собой не кислые аминокислоты.
3. Синтетический пептидогликан по п.1 или п.2, где синтетический пептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
GAHWQFNALTVRGG;
GDRRRRRMWHRQ;
GKHLGGKHRRSR;
RGTHHAQKRRS;
RRHKSGHIQGSK;
SRMHGRVRGRHE;
RRRAGLTAGRPR;
RYGGHRTSRKWV;
RSARYGHRRGVG;
GLRGNRRVFARP;
SRGQRGRLGKTR;
DRRGRSSLPKLAGPVEFPDRKIKGRR;
RMRRKGRVKHWG;
RGGARGRHKTGR;
TGARQRGLQGGWGPRHLRGKDQPPGR;
RQRRRDLTRVEG;
STKDHNRGRRNVGPVSRSTLRDPIRR;
RRIGHQVGGRRN;
RLESRAAGQRRA;
GGPRRHLGRRGH;
VSKRGHRRTAHE;
RGTRSGSTR;
RRRKKIQGRSKR;
RKSYGKYQGR;
KNGRYSISR;
RRRCGQKKK;
KQKIKHVVKLK;
KLKSQLVKRK;
RYPISRPRKR;
KVGKSPPVR;
KTFGKMKPR;
RIKWSRVSK; и
KRTMRPTRR.
В каждом из приведенных выше вариантов осуществления пептида пептид может иметь глицин-цистеин (GC), прикрепленный к C-концу пептида, или глицин-цистеин-глицин (GCG), прикрепленный к N-концу.
4. Синтетический пептидогликан по любому одному из пп. с 1 до 3, где гликан выбирают из группы, состоящей из декстрана, хондроитина, хондроитинсульфата, дерматана, дерматансульфата, гепарана, гепарина, кератина, кератансульфата и гиалуроновой кислоты.
5. Синтетический пептидогликан по любому одному из пп. с 1 до 4, где гликан выбирают из группы, состоящей из хондроитинсульфата и кератансульфата.
6. Синтетический пептидогликан по любому одному из пп. с 1 до 5, где синтетический пептидогликан устойчив к аггреканазе.
7. Синтетический пептидогликан по любому одному из пп. с 1 до 6, где синтетический пептидогликан лиофилизируют.
n
x
8. Соединение формулы PG, где n равен от 1 до 20;
где x равен от 1 до 20;
где P представляет собой синтетический пептид приблизительно от 5 приблизительно до 40 аминокислот, который содержит связывающую гиалуроновую кислоту последовательность; и
где G представляет собой гликан.
n
x
9. Соединение формулы (PL)G, где n равен от 1 до 20;
где x равен от 1 до 20;
где P представляет собой синтетический пептид приблизительно от 5 приблизительно до 40 аминокислот, который содержит связывающую гиалуроновую кислоту последовательность;
где L представляет собой линкер; и
где G представляет собой гликан.
n
x
10. Соединение формулы P(LG), где n равен от 1 до 20;
где x равен от 1 до 20;
где P представляет собой синтетический пептид приблизительно от 5 приблизительно до 40 аминокислот, который содержит связывающую гиалуроновую кислоту последовательность;
где L представляет собой линкер; и
где G представляет собой гликан.
n
x
11. Соединение формулы PG, где n представляет собой MWG/1000;
где MWG представляет собой молекулярную массу G, округленную до ближайшего 1 кДа;
где x равен от 1 до 20;
где P представляет собой синтетический пептид приблизительно от 5 приблизительно до 40 аминокислот, который содержит связывающую гиалуроновую кислоту последовательность; и
где G представляет собой гликан.
n
x
12. Соединение формулы (PL)G, где n представляет собой MWG/1000;
где MWG представляет собой молекулярную массу G, округленную до ближайшего 1 кДа;
где x равен от 1 до 20;
где P представляет собой синтетический пептид приблизительно от 5 приблизительно до 40 аминокислот, который содержит связывающую гиалуроновую кислоту последовательность;
где L представляет собой линкер; и
где G представляет собой гликан.
13. Соединение по любому одному из пп. с 8 до 12, где синтетический пептид содержит аминокислотную последовательность формулы B1-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-B2,
где X8 присутствует или не присутствует,
где B1 представляет собой основную аминокислоту,
где B2 представляет собой основную аминокислоту, и где X1-X8 представляют собой не кислые аминокислоты.
14. Соединение по любому одному из пп. с 8 до 13, где синтетический пептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
GAHWQFNALTVRGG;
GDRRRRRMWHRQ;
GKHLGGKHRRSR;
RGTHHAQKRRS;
RRHKSGHIQGSK;
SRMHGRVRGRHE;
RRRAGLTAGRPR;
RYGGHRTSRKWV;
RSARYGHRRGVG;
GLRGNRRVFARP;
SRGQRGRLGKTR;
DRRGRSSLPKLAGPVEFPDRKIKGRR;
RMRRKGRVKHWG;
RGGARGRHKTGR;
TGARQRGLQGGWGPRHLRGKDQPPGR;
RQRRRDLTRVEG;
STKDHNRGRRNVGPVSRSTLRDPIRR;
RRIGHQVGGRRN;
RLESRAAGQRRA;
GGPRRHLGRRGH;
VSKRGHRRTAHE;
RGTRSGSTR;
RRRKKIQGRSKR;
RKSYGKYQGR;
KNGRYSISR;
RRRCGQKKK;
KQKIKHVVKLK;
KLKSQLVKRK;
RYPISRPRKR;
KVGKSPPVR;
KTFGKMKPR;
RIKWSRVSK; и
KRTMRPTRR.
В каждом из приведенных выше вариантов осуществления пептида пептид может иметь глицин-цистеин (GC), прикрепленный к C-концу пептида, или глицин-цистеин-глицин (GCG), прикрепленный к N-концу.
15. Соединение по любому одному из пп. с 8 до 14, где гликан выбирают из группы, состоящей из декстрана, хондроитина, хондроитинсульфата, дерматана, дерматансульфата, гепарана, гепарина, кератина, кератансульфата и гиалуроновой кислоты.
16. Соединение по любому одному из пп. с 8 до 15, где гликан выбирают из группы, состоящей из хондроитинсульфата и кератансульфата.
17. Соединение по любому одному из пп. с 8 до 16, где синтетический пептидогликан устойчив к аггреканазе.
18. Сконструированный коллагеновый матрикс, который содержит полимеризованный коллаген, гиалуроновую кислоту и связывающий гиалуроновую кислоту синтетический пептидогликан.
19. Сконструированный коллагеновый матрикс по п.18, где коллаген выбирают из группы, состоящей из коллагена I типа, коллагена II типа, коллагена III типа, коллагена IV типа, коллагена IX типа, коллагена XI типа и их сочетаний.
20. Сконструированный коллагеновый матрикс по п.18 или 19, где пептидный компонент синтетического пептидогликана содержит аминокислотную последовательность формулы B1-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-B2,
где X8 присутствует или не присутствует,
где B1 представляет собой основную аминокислоту,
где B2 представляет собой основную аминокислоту, и
где X1-X8 представляют собой не кислые аминокислоты.
21. Сконструированный коллагеновый матрикс по любому одному из пп. с 18 до 20, где пептидный компонент синтетического пептидогликана содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
GAHWQFNALTVRGG;
GDRRRRRMWHRQ;
GKHLGGKHRRSR;
RGTHHAQKRRS;
RRHKSGHIQGSK;
SRMHGRVRGRHE;
RRRAGLTAGRPR;
RYGGHRTSRKWV;
RSARYGHRRGVG;
GLRGNRRVFARP;
SRGQRGRLGKTR;
DRRGRSSLPKLAGPVEFPDRKIKGRR;
RMRRKGRVKHWG;
RGGARGRHKTGR;
TGARQRGLQGGWGPRHLRGKDQPPGR;
RQRRRDLTRVEG;
STKDHNRGRRNVGPVSRSTLRDPIRR;
RRIGHQVGGRRN;
RLESRAAGQRRA;
GGPRRHLGRRGH;
VSKRGHRRTAHE;
RGTRSGSTR;
RRRKKIQGRSKR;
RKSYGKYQGR;
KNGRYSISR;
RRRCGQKKK;
KQKIKHVVKLK;
KLKSQLVKRK;
RYPISRPRKR;
KVGKSPPVR;
KTFGKMKPR;
RIKWSRVSK; и
KRTMRPTRR.
В каждом из приведенных выше вариантов осуществления пептида пептид может иметь глицин-цистеин (GC), прикрепленный к C-концу пептида, или глицин-цистеин-глицин (GCG), прикрепленный к N-концу.
22. Сконструированный коллагеновый матрикс по любому одному из пп. с 18 до 21, где гликановый компонент синтетического пептидогликана выбирают из группы, состоящей из декстрана, хондроитина, хондроитинсульфата, дерматана, дерматансульфата, гепарана, гепарина, кератина, кератансульфата и гиалуроновой кислоты.
23. Сконструированный коллагеновый матрикс по любому одному из пп. с 18 до 22, где гликановый компонент синтетического пептидогликана выбирают из группы, состоящей из хондроитинсульфата и кератансульфата.
24. Сконструированный коллагеновый матрикс по любому одному из пп. с 18 до 23, где синтетический пептидогликан устойчив к аггреканазе.
25. Сконструированный коллагеновый матрикс по любому одному из пп. с 18 до 24, где матрикс эффективен в качестве тканевого трансплантата.
26. Сконструированный коллагеновый матрикс по п.25, где тканевой трансплантат имплантируют пациенту.
27. Сконструированный коллагеновый матрикс по любому одному из пп. с 18 до 24, где матрикс присутствует в форме геля.
28. Сконструированный коллагеновый матрикс по п.27, где гель вводят пациенту посредством инъекции.
29. Сконструированный коллагеновый матрикс по любому одному из пп. с 18 до 24, где матрикс эффективен в качестве композиции для культуры клеток in vitro.
30. Сконструированный коллагеновый матрикс по п.29, где матрикс дополнительно содержит экзогенную популяцию клеток.
31. Сконструированный коллагеновый матрикс по п.30, где клетки выбирают из группы, состоящей из хондроцитов и стволовых клеток.
32. Сконструированный коллагеновый матрикс по п.31, где стволовые клетки выбирают из группы, состоящей из остеобластов, остеогенных клеток и мезенхимальных стволовых клеток.
33. Сконструированный коллагеновый матрикс по любому одному из пп. с 18 до 32, который дополнительно содержит одно или несколько питательных веществ.
34. Сконструированный коллагеновый матрикс по любому одному из пп. с 18 до 33, который дополнительно содержит один или несколько факторов роста.
35. Сконструированный коллагеновый матрикс по любому одному из пп. с 18 до 34, где матрикс стерилизуют.
36. Композиция для культуры хондроцитов или стволовых клеток in vitro, которая содержит связывающий гиалуроновую кислоту синтетический пептидогликан.
37. Композиция по п.36, где пептидный компонент синтетического пептидогликана содержит аминокислотную последовательность формулы B1-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-B2,
где X8 присутствует или не присутствует,
где B1 представляет собой основную аминокислоту,
где B2 представляет собой основную аминокислоту, и
где X1-X8 представляют собой не кислые аминокислоты.
38. Композиция по п.36 или п.37, где пептидный компонент синтетического пептидогликана содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
GAHWQFNALTVRGG;
GDRRRRRMWHRQ;
GKHLGGKHRRSR;
RGTHHAQKRRS;
RRHKSGHIQGSK;
SRMHGRVRGRHE;
RRRAGLTAGRPR;
RYGGHRTSRKWV;
RSARYGHRRGVG;
GLRGNRRVFARP;
SRGQRGRLGKTR;
DRRGRSSLPKLAGPVEFPDRKIKGRR;
RMRRKGRVKHWG;
RGGARGRHKTGR;
TGARQRGLQGGWGPRHLRGKDQPPGR;
RQRRRDLTRVEG;
STKDHNRGRRNVGPVSRSTLRDPIRR;
RRIGHQVGGRRN;
RLESRAAGQRRA;
GGPRRHLGRRGH;
VSKRGHRRTAHE;
RGTRSGSTR;
RRRKKIQGRSKR;
RKSYGKYQGR;
KNGRYSISR;
RRRCGQKKK;
KQKIKHVVKLK;
KLKSQLVKRK;
RYPISRPRKR;
KVGKSPPVR;
KTFGKMKPR;
RIKWSRVSK; и
KRTMRPTRR.
В каждом из приведенных выше вариантов осуществления пептида пептид может иметь глицин-цистеин (GC), прикрепленный к C-концу пептида, или глицин-цистеин-глицин (GCG), прикрепленный к N-концу.
39. Композиция по любому одному из пп. с 36 до 38, где гликановый компонент синтетического пептидогликана выбирают из группы, состоящей из декстрана, хондроитина, хондроитинсульфата, дерматана, дерматансульфата, гепарана, гепарина, кератина, кератансульфата и гиалуроновой кислоты.
40. Композиция по любому одному из пп. с 36 до 39, где гликановый компонент синтетического пептидогликана выбирают из группы, состоящей из хондроитинсульфата и кератансульфата.
41. Композиция по любому одному из пп. с 36 до 40, где синтетический пептидогликан устойчив к аггреканазе.
42. Композиция по любому одному из пп. с 36 до 41, где стволовые клетки выбирают из группы, состоящей из остеобластов, остеогенных клеток и мезенхимальных стволовых клеток.
43. Композиция по любому одному из пп. с 36 до 42, которая дополнительно содержит одно или несколько питательных веществ.
44. Композиция по любому одному из пп. с 36 до 43, которая дополнительно содержит один или несколько факторов роста.
45. Композиция по любому одному из пп. с 36 до 44, где композицию стерилизуют.
46. Добавка для хряща из биоматериала или костной замещающей композиции, которая содержит связывающий гиалуроновую кислоту синтетический пептидогликан, для добавления в существующий хрящ из биоматериала или костный замещающий материал.
47. Добавка по п.46, где пептидный компонент синтетического пептидогликана содержит аминокислотную последовательность формулы B1-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-B2,
где X8 присутствует или не присутствует,
где B1 представляет собой основную аминокислоту,
где B2 представляет собой основную аминокислоту, и
где X1-X8 представляют собой не кислые аминокислоты.
48. Добавка по п.46 или п.47, где пептидный компонент синтетического пептидогликана содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
GAHWQFNALTVRGG;
GDRRRRRMWHRQ;
GKHLGGKHRRSR;
RGTHHAQKRRS;
RRHKSGHIQGSK;
SRMHGRVRGRHE;
RRRAGLTAGRPR;
RYGGHRTSRKWV;
RSARYGHRRGVG;
GLRGNRRVFARP;
SRGQRGRLGKTR;
DRRGRSSLPKLAGPVEFPDRKIKGRR;
RMRRKGRVKHWG;
RGGARGRHKTGR;
TGARQRGLQGGWGPRHLRGKDQPPGR;
RQRRRDLTRVEG;
STKDHNRGRRNVGPVSRSTLRDPIRR;
RRIGHQVGGRRN;
RLESRAAGQRRA;
GGPRRHLGRRGH;
VSKRGHRRTAHE;
RGTRSGSTR;
RRRKKIQGRSKR;
RKSYGKYQGR;
KNGRYSISR;
RRRCGQKKK;
KQKIKHVVKLK;
KLKSQLVKRK;
RYPISRPRKR;
KVGKSPPVR;
KTFGKMKPR;
RIKWSRVSK; и
KRTMRPTRR.
В каждом из приведенных выше вариантов осуществления пептида пептид может иметь глицин-цистеин (GC), прикрепленный к C-концу пептида, или глицин-цистеин-глицин (GCG), прикрепленный к N-концу.
49. Добавка по любому одному из пп. с 46 до 48, где гликановый компонент синтетического пептидогликана выбирают из группы, состоящей из декстрана, хондроитина, хондроитинсульфата, дерматана, дерматансульфата, гепарана, гепарина, кератина, кератансульфата и гиалуроновой кислоты.
50. Добавка по любому одному из пп. с 46 до 49, где гликан выбирают из группы, состоящей из хондроитинсульфата и кератансульфата.
51. Добавка по любому одному из пп. с 46 до 50, где синтетический пептидогликан устойчив к аггреканазе.
52. Способ лечения артрита у пациента, указанный способ включает стадию введения пациенту связывающего гиалуроновую кислоту синтетического пептидогликана, где синтетический пептидогликан уменьшает симптом, связанный с артритом.
53. Способ по п.52, где пептидный компонент синтетического пептидогликана содержит аминокислотную последовательность формулы B1-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-B2,
где X8 присутствует или не присутствует,
где B1 представляет собой основную аминокислоту,
где B2 представляет собой основную аминокислоту, и
где X1-X8 представляют собой не кислые аминокислоты.
54. Способ по п.52 или п.53, где пептидный компонент синтетического пептидогликана содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
GAHWQFNALTVRGG;
GDRRRRRMWHRQ;
GKHLGGKHRRSR;
RGTHHAQKRRS;
RRHKSGHIQGSK;
SRMHGRVRGRHE;
RRRAGLTAGRPR;
RYGGHRTSRKWV;
RSARYGHRRGVG;
GLRGNRRVFARP;
SRGQRGRLGKTR;
DRRGRSSLPKLAGPVEFPDRKIKGRR;
RMRRKGRVKHWG;
RGGARGRHKTGR;
TGARQRGLQGGWGPRHLRGKDQPPGR;
RQRRRDLTRVEG;
STKDHNRGRRNVGPVSRSTLRDPIRR;
RRIGHQVGGRRN;
RLESRAAGQRRA;
GGPRRHLGRRGH;
VSKRGHRRTAHE;
RGTRSGSTR;
RRRKKIQGRSKR;
RKSYGKYQGR;
KNGRYSISR;
RRRCGQKKK;
KQKIKHVVKLK;
KLKSQLVKRK;
RYPISRPRKR;
KVGKSPPVR;
KTFGKMKPR;
RIKWSRVSK; и
KRTMRPTRR.
В каждом из приведенных выше вариантов осуществления пептида пептид может иметь глицин-цистеин (GC), прикрепленный к C-концу пептида, или глицин-цистеин-глицин (GCG), прикрепленный к N-концу.
55. Способ по любому одному из пп. с 52 до 54, где гликановый компонент синтетического пептидогликана выбирают из группы, состоящей из декстрана, хондроитина, хондроитинсульфата, дерматана, дерматансульфата, гепарана, гепарина, кератина, кератансульфата и гиалуроновой кислоты.
56. Способ по любому одному из пп. с 52 до 55, где гликан выбирают из группы, состоящей из хондроитинсульфата и кератансульфата.
57. Способ по любому одному из пп. с 52 до 56, где синтетический пептидогликан устойчив к аггреканазе.
58. Способ по любому одному из пп. с 52 до 57, где артрит представляет собой остеоартрит.
59. Способ по любому одному из пп. с 52 до 57, где артрит представляет собой ревматоидный артрит.
60. Способ по любому одному из пп. с 52 до 59, где синтетический пептидогликан вводят пациенту посредством инъекции.
61. Способ по п.60, где инъекция представляет собой внутрисуставную инъекцию.
62. Способ по п.60, где инъекцию выполняют в суставную капсулу пациента.
63. Способ по любому одному из пп. с 52 до 62, где синтетический пептидогликан вводят с использованием иглы или устройства для инфузии.
64. Способ по любому одному из пп. с 52 до 63, где синтетический пептидогликан выполняет функцию смазывающего средства.
65. Способ по любому одному из пп. с 52 до 64, где синтетический пептидогликан предохраняет кость на костном суставе или препятствует утрате хряща.
66. Способ получения биоматериала или костно-хрящевой замены, указанный способ включает стадию объединения синтетического пептидогликана и существующего биоматериала или костно-хрящевого замещающего материала.
67. Способ по п.66, где пептидный компонент синтетического пептидогликана содержит аминокислотную последовательность формулы B1-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-B2,
где X8 присутствует или не присутствует,
где B1 представляет собой основную аминокислоту,
где B2 представляет собой основную аминокислоту, и
где X1-X8 представляют собой не кислые аминокислоты.
68. Способ по п.66 или п.67, где пептидный компонент синтетического пептидогликана содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
GAHWQFNALTVRGG;
GDRRRRRMWHRQ;
GKHLGGKHRRSR;
RGTHHAQKRRS;
RRHKSGHIQGSK;
SRMHGRVRGRHE;
RRRAGLTAGRPR;
RYGGHRTSRKWV;
RSARYGHRRGVG;
GLRGNRRVFARP;
SRGQRGRLGKTR;
DRRGRSSLPKLAGPVEFPDRKIKGRR;
RMRRKGRVKHWG;
RGGARGRHKTGR;
TGARQRGLQGGWGPRHLRGKDQPPGR;
RQRRRDLTRVEG;
STKDHNRGRRNVGPVSRSTLRDPIRR;
RRIGHQVGGRRN;
RLESRAAGQRRA;
GGPRRHLGRRGH;
VSKRGHRRTAHE;
RGTRSGSTR;
RRRKKIQGRSKR;
RKSYGKYQGR;
KNGRYSISR;
RRRCGQKKK;
KQKIKHVVKLK;
KLKSQLVKRK;
RYPISRPRKR;
KVGKSPPVR;
KTFGKMKPR;
RIKWSRVSK; и
KRTMRPTRR.
В каждом из приведенных выше вариантов осуществления пептида пептид может иметь глицин-цистеин (GC), прикрепленный к C-концу пептида, или глицин-цистеин-глицин (GCG), прикрепленный к N-концу.
69. Способ по любому одному из пп.66 до 68, где гликановый компонент синтетического пептидогликана выбирают из группы, состоящей из декстрана, хондроитина, хондроитинсульфата, дерматана, дерматансульфата, гепарана, гепарина, кератина, кератансульфата и гиалуроновой кислоты.
70. Способ по любому одному из пп.66 до 69, где гликан выбирают из группы, состоящей из хондроитинсульфата и кератансульфата.
71. Способ по любому одному из пп.66 до 70, где синтетический пептидогликан устойчив к аггреканазе.
72. Способ снижения или предотвращения разрушения гиалуроновой кислоты у пациента, указанный способ включает введение пациенту связывающего гиалуроновую кислоту синтетического пептидогликана.
73. Способ по п.72, где пептидный компонент синтетического пептидогликана содержит аминокислотную последовательность формулы B1-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-B2,
где X8 присутствует или не присутствует,
где B1 представляет собой основную аминокислоту,
где B2 представляет собой основную аминокислоту, и
где X1-X8 представляют собой не кислые аминокислоты.
74. Способ по п.72 или п.73, где пептидный компонент синтетического пептидогликана содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
GAHWQFNALTVRGG;
GDRRRRRMWHRQ;
GKHLGGKHRRSR;
RGTHHAQKRRS;
RRHKSGHIQGSK;
SRMHGRVRGRHE;
RRRAGLTAGRPR;
RYGGHRTSRKWV;
RSARYGHRRGVG;
GLRGNRRVFARP;
SRGQRGRLGKTR;
DRRGRSSLPKLAGPVEFPDRKIKGRR;
RMRRKGRVKHWG;
RGGARGRHKTGR;
TGARQRGLQGGWGPRHLRGKDQPPGR;
RQRRRDLTRVEG;
STKDHNRGRRNVGPVSRSTLRDPIRR;
RRIGHQVGGRRN;
RLESRAAGQRRA;
GGPRRHLGRRGH;
VSKRGHRRTAHE;
RGTRSGSTR;
RRRKKIQGRSKR;
RKSYGKYQGR;
KNGRYSISR;
RRRCGQKKK;
KQKIKHVVKLK;
KLKSQLVKRK;
RYPISRPRKR;
KVGKSPPVR;
KTFGKMKPR;
RIKWSRVSK; и
KRTMRPTRR.
В каждом из приведенных выше вариантов осуществления пептида пептид может иметь глицин-цистеин (GC), прикрепленный к C-концу пептида, или глицин-цистеин-глицин (GCG), прикрепленный к N-концу
75. Способ по любому одному из пп. с 72 до 74, где гликановый компонент синтетического пептидогликана выбирают из группы, состоящей из декстрана, хондроитина, хондроитинсульфата, дерматана, дерматансульфата, гепарана, гепарина, кератина, кератансульфата и гиалуроновой кислоты.
76. Способ по любому одному из пп. с 72 до 75, где гликан выбирают из группы, состоящей из хондроитинсульфата и кератансульфата.
77. Способ по любому одному из пп. с 72 до 76, где синтетический пептидогликан устойчив к аггреканазе.
78. Способ по любому одному из пп. с 72 до 77, где синтетический пептидогликан вводят пациенту посредством инъекции.
79. Способ по п.78, где инъекция представляет собой внутрисуставную инъекцию.
80. Способ по п.78, где инъекцию выполняют в суставную капсулу пациента.
81. Способ по любому одному из пп. с 72 до 80, где снижают скорость разрушения гиалуроновой кислоты.
82. Способ корректирования или модифицирования тканевого дефекта у пациента, который включает
введение в тканевой дефект связывающего гиалуроновую кислоту синтетического пептидогликана, где дефект корректируют или модифицируют.
83. Способ по п.82, где пептидный компонент синтетического пептидогликана содержит аминокислотную последовательность формулы B1-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-B2,
где X8 присутствует или не присутствует,
где B1 представляет собой основную аминокислоту,
где B2 представляет собой основную аминокислоту, и
где X1-X8 представляют собой не кислые аминокислоты.
84. Способ по п.82 или п.83, где пептидный компонент синтетического пептидогликана содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
GAHWQFNALTVRGG;
GDRRRRRMWHRQ;
GKHLGGKHRRSR;
RGTHHAQKRRS;
RRHKSGHIQGSK;
SRMHGRVRGRHE;
RRRAGLTAGRPR;
RYGGHRTSRKWV;
RSARYGHRRGVG;
GLRGNRRVFARP;
SRGQRGRLGKTR;
DRRGRSSLPKLAGPVEFPDRKIKGRR;
RMRRKGRVKHWG;
RGGARGRHKTGR;
TGARQRGLQGGWGPRHLRGKDQPPGR;
RQRRRDLTRVEG;
STKDHNRGRRNVGPVSRSTLRDPIRR;
RRIGHQVGGRRN;
RLESRAAGQRRA;
GGPRRHLGRRGH;
VSKRGHRRTAHE;
RGTRSGSTR;
RRRKKIQGRSKR;
RKSYGKYQGR;
KNGRYSISR;
RRRCGQKKK;
KQKIKHVVKLK;
KLKSQLVKRK;
RYPISRPRKR;
KVGKSPPVR;
KTFGKMKPR;
RIKWSRVSK; и
KRTMRPTRR.
В каждом из приведенных выше вариантов осуществления пептида пептид может иметь глицин-цистеин (GC), прикрепленный к C-концу пептида, или глицин-цистеин-глицин (GCG), прикрепленный к N-концу.
85. Способ по любому одному из пп. с 82 до 84, где гликановый компонент синтетического пептидогликана выбирают из группы, состоящей из декстрана, хондроитина, хондроитинсульфата, дерматана, дерматансульфата, гепарана, гепарина, кератина, кератансульфата и гиалуроновой кислоты.
86. Способ по любому одному из пп. с 82 до 85, где гликан выбирают из группы, состоящей из хондроитинсульфата и кератансульфата.
87. Способ по любому одному из пп. с 82 до 86, где синтетический пептидогликан устойчив к аггреканазе.
88. Способ по любому одному из пп. с 82 до 87, где синтетический пептидогликан вводят пациенту посредством инъекции.
89. Способ по п.88, где инъекция является подкожной.
90. Способ по любому одному из пп. с 82 до 89, где дефект представляет собой косметический дефект.
91. Дермальный наполнитель, который содержит связывающий гиалуроновую кислоту синтетический пептидогликан.
92. Дермальный наполнитель по п.91, где пептидный компонент синтетического пептидогликана содержит аминокислотную последовательность формулы B1-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-B2,
где X8 присутствует или не присутствует,
где B1 представляет собой основную аминокислоту,
где B2 представляет собой основную аминокислоту, и
где X1-X8 представляют собой не кислые аминокислоты.
93. Дермальный наполнитель по п.91 или п.92, где пептидный компонент синтетического пептидогликана содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
GAHWQFNALTVRGG;
GDRRRRRMWHRQ;
GKHLGGKHRRSR;
RGTHHAQKRRS;
RRHKSGHIQGSK;
SRMHGRVRGRHE;
RRRAGLTAGRPR;
RYGGHRTSRKWV;
RSARYGHRRGVG;
GLRGNRRVFARP;
SRGQRGRLGKTR;
DRRGRSSLPKLAGPVEFPDRKIKGRR;
RMRRKGRVKHWG;
RGGARGRHKTGR;
TGARQRGLQGGWGPRHLRGKDQPPGR;
RQRRRDLTRVEG;
STKDHNRGRRNVGPVSRSTLRDPIRR;
RRIGHQVGGRRN;
RLESRAAGQRRA;
GGPRRHLGRRGH;
VSKRGHRRTAHE;
RGTRSGSTR;
RRRKKIQGRSKR;
RKSYGKYQGR;
KNGRYSISR;
RRRCGQKKK;
KQKIKHVVKLK;
KLKSQLVKRK;
RYPISRPRKR;
KVGKSPPVR;
KTFGKMKPR;
RIKWSRVSK; и
KRTMRPTRR.
В каждом из приведенных выше вариантов осуществления пептида пептид может иметь глицин-цистеин (GC), прикрепленный к C-концу пептида, или глицин-цистеин-глицин (GCG), прикрепленный к N-концу.
94. Дермальный наполнитель по любому одному из пп. с 91 до 93, который дополнительно содержит гиалуроновую кислоту.
95. Способ снижения или предотвращения разрушения коллагена, указанный способ включает стадии
приведения связывающего гиалуроновую кислоту синтетического пептидогликана в контакт с гиалуроновой кислотой в присутствии коллагена, и
снижения или предотвращения разрушения коллагена.
96. Способ по п.95, где пептидный компонент синтетического пептидогликана содержит аминокислотную последовательность формулы B1-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-B2,
где X8 присутствует или не присутствует,
где B1 представляет собой основную аминокислоту,
где B2 представляет собой основную аминокислоту, и
где X1-X8 представляют собой не кислые аминокислоты.
97. Способ по п.95 или п.96, где пептидный компонент синтетического пептидогликана содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
GAHWQFNALTVRGG;
GDRRRRRMWHRQ;
GKHLGGKHRRSR;
RGTHHAQKRRS;
RRHKSGHIQGSK;
SRMHGRVRGRHE;
RRRAGLTAGRPR;
RYGGHRTSRKWV;
RSARYGHRRGVG;
GLRGNRRVFARP;
SRGQRGRLGKTR;
DRRGRSSLPKLAGPVEFPDRKIKGRR;
RMRRKGRVKHWG;
RGGARGRHKTGR;
TGARQRGLQGGWGPRHLRGKDQPPGR;
RQRRRDLTRVEG;
STKDHNRGRRNVGPVSRSTLRDPIRR;
RRIGHQVGGRRN;
RLESRAAGQRRA;
GGPRRHLGRRGH;
VSKRGHRRTAHE;
RGTRSGSTR;
RRRKKIQGRSKR;
RKSYGKYQGR;
KNGRYSISR;
RRRCGQKKK;
KQKIKHVVKLK;
KLKSQLVKRK;
RYPISRPRKR;
KVGKSPPVR;
KTFGKMKPR;
RIKWSRVSK; и
KRTMRPTRR.
98. Способ по любому одному из пп. с 95 до 97, где гликановый компонент синтетического пептидогликана выбирают из группы, состоящей из декстрана, хондроитина, хондроитинсульфата, дерматана, дерматансульфата, гепарана, гепарина, кератина, кератансульфата и гиалуроновой кислоты.
99. Способ по любому одному из пп. с 95 до 98, где гликан выбирают из группы, состоящей из хондроитинсульфата и кератансульфата.
100. Способ по любому одному из пп. с 95 до 99, где синтетический пептидогликан устойчив к аггреканазе.
101. Способ по любому одному из пп. с 95 до 100, где снижают скорость разрушения гиалуроновой кислоты.
102. Способ увеличения размера пор в сконструированном коллагеновом матриксе,
указанный способ включает стадии
объединения коллагена, гиалуроновой кислоты и связывающего гиалуроновую кислоту синтетического пептидогликана и
увеличения размера пор в матриксе.
103. Способ по п.102, где пептидный компонент синтетического пептидогликана содержит аминокислотную последовательность формулы B1-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-B2,
где X8 присутствует или не присутствует,
где B1 представляет собой основную аминокислоту,
где B2 представляет собой основную аминокислоту, и
где X1-X8 представляют собой не кислые аминокислоты.
104. Способ по п.102 или п.103, где пептидный компонент синтетического пептидогликана содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
GAHWQFNALTVRGG;
GDRRRRRMWHRQ;
GKHLGGKHRRSR;
RGTHHAQKRRS;
RRHKSGHIQGSK;
SRMHGRVRGRHE;
RRRAGLTAGRPR;
RYGGHRTSRKWV;
RSARYGHRRGVG;
GLRGNRRVFARP;
SRGQRGRLGKTR;
DRRGRSSLPKLAGPVEFPDRKIKGRR;
RMRRKGRVKHWG;
RGGARGRHKTGR;
TGARQRGLQGGWGPRHLRGKDQPPGR;
RQRRRDLTRVEG;
STKDHNRGRRNVGPVSRSTLRDPIRR;
RRIGHQVGGRRN;
RLESRAAGQRRA;
GGPRRHLGRRGH;
VSKRGHRRTAHE;
RGTRSGSTR;
RRRKKIQGRSKR;
RKSYGKYQGR;
KNGRYSISR;
RRRCGQKKK;
KQKIKHVVKLK;
KLKSQLVKRK;
RYPISRPRKR;
KVGKSPPVR;
KTFGKMKPR;
RIKWSRVSK; и
KRTMRPTRR.
105. Способ по любому одному из пп. со 102 до 104, где гликановый компонент синтетического пептидогликана выбирают из группы, состоящей из декстрана, хондроитина, хондроитинсульфата, дерматана, дерматансульфата, гепарана, гепарина, кератина, кератансульфата и гиалуроновой кислоты.
106. Способ по любому одному из пп. со 102 до 105, где гликан выбирают из группы, состоящей из хондроитинсульфата и кератансульфата.
107. Способ по любому одному из пп. со 102 до 106, где синтетический пептидогликан устойчив к аггреканазе.
108. Способ по любому одному из пп. со 102 до 107, где матрикс стерилизуют.
109. Способ по любому одному из пп. со 102 до 108, где матрикс дополнительно содержит хондроциты или стволовые клетки.
110. Способ по п.109, где стволовые клетки выбирают из группы, состоящей из остеобластов, остеогенных клеток и мезенхимальных стволовых клеток.
111. Способ по любому одному из пп. со 102 до 110, где матрикс дополнительно содержит одно или несколько питательных веществ.
112. Способ по любому одному из пп. со 102 до 111, где матрикс дополнительно содержит один или несколько факторов роста.
113. Способ снижения или предотвращения разрушения хондроитинсульфата, указанный способ включает стадии
приведения связывающего гиалуроновую кислоту синтетического пептидогликана в контакт с гиалуроновой кислотой в присутствии коллагена и
снижения или предотвращения разрушения хондроитинсульфата.
114. Способ по п.113, где пептидный компонент синтетического пептидогликана содержит аминокислотную последовательность формулы B1-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-B2,
где X8 присутствует или не присутствует,
где B1 представляет собой основную аминокислоту,
где B2 представляет собой основную аминокислоту, и
где X1-X8 представляют собой не кислые аминокислоты.
115. Способ по п.113 или п.114, где пептидный компонент синтетического пептидогликана содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
GAHWQFNALTVRGG;
GDRRRRRMWHRQ;
GKHLGGKHRRSR;
RGTHHAQKRRS;
RRHKSGHIQGSK;
SRMHGRVRGRHE;
RRRAGLTAGRPR;
RYGGHRTSRKWV;
RSARYGHRRGVG;
GLRGNRRVFARP;
SRGQRGRLGKTR;
DRRGRSSLPKLAGPVEFPDRKIKGRR;
RMRRKGRVKHWG;
RGGARGRHKTGR;
TGARQRGLQGGWGPRHLRGKDQPPGR;
RQRRRDLTRVEG;
STKDHNRGRRNVGPVSRSTLRDPIRR;
RRIGHQVGGRRN;
RLESRAAGQRRA;
GGPRRHLGRRGH;
VSKRGHRRTAHE;
RGTRSGSTR;
RRRKKIQGRSKR;
RKSYGKYQGR;
KNGRYSISR;
RRRCGQKKK;
KQKIKHVVKLK;
KLKSQLVKRK;
RYPISRPRKR;
KVGKSPPVR;
KTFGKMKPR;
RIKWSRVSK; и
KRTMRPTRR.
116. Способ по любому одному из пп. со 113 до 115, где гликановый компонент синтетического пептидогликана выбирают из группы, состоящей из декстрана, хондроитина, хондроитинсульфата, дерматана, дерматансульфата, гепарана, гепарина, кератина, кератансульфата и гиалуроновой кислоты.
117. Способ по любому одному из пп. со 113 до 116, где гликан выбирают из группы, состоящей из хондроитинсульфата и кератансульфата.
118. Способ по любому одному из пп. со 113 до 117, где синтетический пептидогликан устойчив к аггреканазе.
119. Способ по любому одному из пп. со 113 до 118, где снижают скорость разрушения хондроитинсульфата.
120. Синтетический пептидогликан, соединение, сконструированный коллагеновый матрикс, композиция, добавка, способ или дермальный наполнитель по любому из предшествующих пп., где пептидный компонент синтетического пептидогликана имеет глицин-цистеин (GC), прикрепленный к C-концу пептида.
121. Синтетический пептидогликан, соединение, сконструированный коллагеновый матрикс, композиция, добавка, способ или дермальный наполнитель по любому из предшествующих пп., где пептидный компонент синтетического пептидогликана имеет глицин-цистеин-глицин (GCG), прикрепленный к N-концу пептида.
122. Синтетический пептидогликан, соединение, сконструированный коллагеновый матрикс, композиция, добавка, способ или дермальный наполнитель по любому из предшествующих пунктов, где синтетический пептидогликан устойчив к матриксным металлопротеазам.
123. Синтетический пептидогликан, соединение, сконструированный коллагеновый матрикс, композиция, добавка, способ или дермальный наполнитель по п.122, где матриксная металлопротеаза представляет собой аггреканазу.
124. Синтетический пептидогликан, соединение, сконструированный коллагеновый матрикс, композиция, добавка, способ или дермальный наполнитель по любому из предшествующих пп., где доза синтетического пептидогликана имеет концентрацию в диапазоне приблизительно от 0,01 мкМ приблизительно до 100 мкМ.
125. Синтетический пептидогликан, соединение, сконструированный коллагеновый матрикс, композиция, добавка, способ или дермальный наполнитель по любому из предшествующих пп., где доза синтетического пептидогликана имеет концентрацию в диапазоне приблизительно от 0,1 мкМ приблизительно до 10 мкМ.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На фиг.1 представлена схема реакции для получения варианта осуществления связывающего гиалуроновую кислоту синтетического пептидогликана. Стадии реакции подробно описаны полужирным начертанием.
На фиг.2 представлен калибровочная кривая поглощения N-[ß-малеимидопропаной кислоты]гидразида, соли трифторуксусной кислоты (далее в настоящем документе «BMPH») (215 нм), основываясь на количестве (мг) инъецированного BMPH. Калибровочную кривую использовали для того, чтобы определять количество BMPH, расходуемого во время реакции сочетания.
На фиг.3 представлено связывание связывающего гиалуроновую кислоту синтетического пептидогликана с иммобилизованной гиалуроновой кислотой (HA). Девять связывающих HA пептидов (например, GAHWQFNALTVRGGGC; далее в настоящем документе «GAH» или «mAGC») прикрепляли к функционализированному гликозаминогликановому (например, хондроитинсульфату, далее в настоящем документе «CS») остову. Концентрации синтетических пептидогликанов повышали с 0,01 мкМ до 100 мкМ.
На фиг.4 представлено связывание HA синтетического пептидогликана, как определяют посредством реологического качания частоты (диаграмма A). Динамический модуль упругости смесей HA анализировали при частоте колебаний 5,012 Гц. При этой частоте предоставляли значимую нагрузку, пока сохранялась целостность цепей HA. Статистический анализ (α=0,05) показывал, что HA+CS и HA значительно различались (обозначено *) и что HA+10,5GAH-CS и HA+CS значительно различались (обозначено **). Диаграмма B является альтернативным представлением тех же данных, которые представлены на диаграмме A.
На фиг.5 представлено количественное определение мутности коллагена I типа плюс группы лечения во время формирования коллагеновых волокон. Поглощение на 313 нм измеряли каждые 3 минуты. После одного часа (т.е. временная точка номер 20), все группы лечения имели полностью сформированные сети. Значительные различия (α=0,05) между группами лечения в отношении максимального поглощения или времени до половины максимального поглощения отсутствовали.
На фиг.6 представлено, как переносят компрессионное условное напряжение коллагеновые гели, основываясь на приложенной условной деформации 1% в секунду. Статистический анализ (α=0,05) показывал, что добавление 10,5GAH-CS вело к значительным различиям в пиковом условном напряжении, в дополнение к условному напряжению, анализируемому при условной деформации 5%, 7,5% и 10%.
На фиг.7 представлен динамический модуль упругости коллагеновых смесей, измеряемых при частоте колебаний 0,5012 Гц. Статистический анализ (α=0,05) показывал, что добавление 10,5GAH-CS вело к значительному повышению динамического модуля упругости коллагенового геля (обозначено *).
На фиг.8 представлен процент разрушения HA смесей из-за добавления гиалуронидазы к смесям (диаграмма A). Процент разрушения определяли посредством изменений динамической вязкости HA смесей. Изначально получали измерения динамической вязкости смесей, и они служили в качестве базового уровня, относительного которого вычисляли процент разрушения. Временную точку 0 часов брали после добавления гиалуронидазы, достаточного смешивания образцов и пипетирования на столик реометра, и приблизительно 2 минуты проходило между добавлением гиалуронидазы и измерением динамической вязкости. Статистический анализ показывал значительные различия (α=0,05) в проценте разрушения для образца 10,5GAH-CS в обеих временных точках 0 часов и 2 часа. На диаграмме B представлены те же данные, которые представлены нормализованной динамической вязкостью (среднее ± стандартная ошибка, n=3) HA смесей из-за добавления гиалуронидазы. Измерения динамической вязкости изначально выполняли для смесей перед тем, как добавляли гиалуронидазу, и эти значения служили в качестве базового уровня, относительно которого вычисляли нормализованные динамические вязкости. Для определения нормализованных динамических вязкостей брали каждую измеренную динамическую вязкость после добавления гиалуронидазы и делили это значение на начальную динамическую вязкость этого образца. Проводили статистический анализ (α=0,05), и значительные различия видели в нормализованном разрушении для образца 10,5GAH-CS в обеих временных точках 0 часов и 2 часа.
На фиг.9 представлены репрезентативные изображения из низкотемпературного СЭМ (увеличение 10000× с масштабной полоской 5 мкм) для CI каркаса, ассоциированного с каждой копией ECM хряща. На диаграмме A представлен CI контроль. На диаграмме B представлен CI+HA+CS. На диаграмме C представлен CI+HA+10,5GAH-CS.
На фиг.10 представлен процент разрушения (среднее ± стандартная ошибка, n=3) CI в копиях ECM, подверженных MMP-I на всем протяжении 50 часов. Статистический анализ (p<0,05) различных воздействий выявлял, что все три воздействия (CI контроль, CI+HA+CS и CI+HA+10,5GAH-CS) значительно отличались друг от друга.
На фиг.11 представлена кумулятивная утрата хондроитинсульфата (CS) в течение восьмисуточного периода культивирования в средах, которые стимулировали с использованием и без использования IL-1β. Утрату CS измеряли посредством анализа DMMB. Добавление mAGC оказывало достоверный эффект на утрату CS из каркасов (p<0,001). ** обозначает статистическую значимость между каркасом, полученным без аггреканового миметика, и таковым, полученным с использованием mAGC. + обозначает статистическую значимость между каркасом, на который воздействовали с использованием и без использования IL-1β (p<0,05). Столбцы представляют среднее ± стандартная ошибка среднего (n=3).
На фиг.12 представлена кумулятивная деструкция коллагена в течение восьмисуточного периода культивирования в средах, которые стимулировали с использованием и без использования IL-1β. Деструкцию коллагена измеряли посредством анализа Sircol. Добавление аггреканового миметика оказывало достоверный эффект на утрату коллагена из каркаса (p<0,02). ** обозначает статистическую значимость между каркасом, полученным без аггреканового миметика, и таковым, полученным с mAGC. + обозначает статистическую значимость между каркасом, на который воздействовали с использованием и без использования IL-1β (p<0,05). Столбцы представляют среднее ± стандартная ошибка среднего (n=3).
На фиг.13 представлена платформа для изучения эффективности пептидогликана ex vivo. 0,5% трипсин использовали для того, чтобы удалять нативный аггрекан из бычьих хрящевых эксплантов. Удаление аггрекана подтверждали посредством анализа DMMB. Графики представляют количество удаленного аггрекана по сравнению с положительным контролем.
На фиг.14 представлен анализ для того, чтобы осуществлять мониторинг диффузии пептидогликанов через хрящевой матрикс. Ось y представляет различие в значениях поглощения в анализе DMMB, которые считывали с обедненных аггреканом хрящевых пробок, на которые воздействовали с использованием/без использования пептидогликана. Ось x представляет расстояние от суставной поверхности хряща до субхондральной кости. Столбцы представляют среднее различие ± стандартная ошибка среднего (n=3).
На фиг.15 представлено окрашивание коровьих хрящевых эксплантов сафранином O и авидином-биотином. Выполняли среднесагиттальный разрез через матрикс и соответствующим образом исследовали остаточный аггрекан (верхняя часть, темное окрашивание) и биотин (нижняя часть, темное окрашивание). Связывающий коллаген II типа пептидогликан [WYRGRLGC; «mAG(II)C»] диффундировал через эксплант. Более сильное увеличение (20×) этого среза ткани показывало, что mAG(II)C проникает в ткань приблизительно на 200 мкм.
На фиг.16 представлено окрашивание хрящевых эксплантов авидином-биотином. Пептидогликаны (mAG(II)C и mAGC) диффундировали через хрящевой эксплант. Изображения показывают глубину проникновения для каждого (темное окрашивание).
На фиг.17 показано, что добавление пептидогликанов в обедненные аггреканом (AD) экспланты повышало компрессионную жесткость. Добавление связывающего HA пептидогликана (mAGC) значительно восстанавливало жесткость хрящевых эксплантов до более высокой степени по сравнению со связывающим коллаген II типа пептидогликаном (mAG(II)C). Значимость, обозначенная как *, определяла повышение компрессионной жесткости между дополненными AD и AD+mACG эксплантами (p<0,005). Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего (n=5).
На фиг.18 (A) показано схематическое представление зонда, связанного с MMP-13. Гаситель «черная дыра» BHQ-3 3 и CY5.5 абсорбировали и испускали на 695 нм соответственно. Стрелка и курсивное начертание обозначают сайт расщепления. На фиг. (B) представлен профиль концентраций активности зонда с использованием и без использования MMP-13: слева секции с флуоресцентной визуализацией 96-луночного микропланшет; справа восстановление интенсивности испускания флуоресценции (695 нм).
На фиг.19 представлена степень воспаления, показанная посредством зонда MMP-13 у крыс Sprague-Dawley, на которых воздействовали с использованием и без использования пептидогликана через четыре, шесть и восемь недель после хирургического вмешательства.
На фиг.20 представлены рентгеновские изображения коленных суставов крыс Sprague-Dawley, на которых показано травмированное колено через 6 недель и 8 недель после того, как индуцировали OA (изображения A и D, соответственно), травмированное колено, на которое воздействовали пептидогликаном (изображения B и E, соответственно), и нормальное колено (изображение C) через шесть недель после вызывающего остеоартрит хирургического вмешательства.
На фиг.21 представлены компьютерные микротомограммы крыс Sprague-Dawley, показывающие повторный рост нового хряща через шесть и восемь недель после вызывающего OA хирургического вмешательства. Травмированные колени через 6 недель и 8 недель после того, как вызывали OA, представлены на изображениях A и D, соответственно. Травмированные колени после воздействия пептидогликаном представлены на изображениях B и E, соответственно. Нормальное колено представлено на изображении C.
На фиг.22 показано, что добавление mAGC в коллагеновые каркасы повышало динамический модуль упругости и компрессионную жесткость. Качание частоты (A) на коллагеновых каркасах показывало повышение динамического модуля упругости в диапазоне 0,1-2,0 Гц. Аналогичным образом, показывали повышение значения компрессионной жесткости (B), когда получали каркас с добавлением mAGC. Значимость обозначена * (p<0,0001). Данные представляли в виде среднего ± стандартная ошибка среднего (n=5).
На фиг.23 представлена кумулятивная утрата хондроитинсульфата (CS) в течение восьмисуточного периода культивирования в средах, которые стимулировали с использованием и без использования IL-1β. Утрату CS измеряли посредством анализа DMMB. Композиции каркаса (A-H) описаны в таблице 3. Добавление mAGC оказывало достоверный эффект на утрату CS из каркасов (p<0,001). * обозначает статистическую значимость между каркасом A и C, и каркас E и G. (p<0,05). Столбцы представляют среднее ± стандартная ошибка среднего (n=3).
На фиг.24 представлена кумулятивная деструкция коллагена в течение восьмисуточного периода культивирования в средах, которые стимулировали с использованием и без использования IL-1β. Деструкцию коллагена измеряли посредством анализа Sircol. Композиции каркаса (A-H) описаны в таблице 3. Добавление аггреканового миметика оказывало достоверный эффект на утрату коллагена из каркасов (p<0,02). * обозначает статистическую значимость между каркасом A и C и каркасом E и G. (p<0,05). Столбцы представляют среднее ± стандартная ошибка среднего (n=3).
аггрекан
коллаген
На фиг.25 представлен в реальном времени ПЦР анализ для аггрекана и коллагена II типа, экспрессируемых хондроцитами коровы, культивируемыми в невыровненных (A) и выровненных (B) коллагеновых каркасах. Значения нормализовали относительно эндогенной экспрессии GAPDH. Добавление mAGC статистически меняло экспрессию аггрекана и коллагена II типа (p<0,02 и p<0,001) соответственно. Также имело место статистическое различие в экспрессии аггрекана и коллагена II типа между невыровненными и выровненными каркасами (p<0,001). Аналогичным образом, экспрессия аггрекана и коллагена II типа различалась между каркасами, на которые воздействовали с использованием и без использования IL-1β (p<0,01). Композиции каркаса (A-H) описаны в таблице 3. Столбцы представляют среднее ± стандартная ошибка среднего (n=4).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЛЛЮСТРАТИВНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
Как используют в настоящем документе, «связывающий гиалуроновую кислоту синтетический пептидогликан» обозначает синтетический пептид, конъюгированный с гликаном, где пептид содержит связывающую гиалуроновую кислоту последовательность.
В настоящем документе описаны следующие различные варианты осуществления изобретения. В одном из вариантов осуществления, описанном в настоящем документе, предусмотрен связывающий гиалуроновую кислоту синтетический пептидогликан. Связывающий гиалуроновую кислоту синтетический пептидогликан содержит синтетический пептид, конъюгированный с гликаном, где синтетический пептид содержит связывающую гиалуроновую кислоту последовательность.
n
x
В другом варианте осуществления описано соединение формулы PG, где n равен от 1 до 20; где x равен от 1 до 20; где P представляет собой синтетический пептид приблизительно от 5 приблизительно до 40 аминокислот, который содержит связывающую гиалуроновую кислоту последовательность; и где G представляет собой гликан.
n
x
В еще одном другом варианте осуществления описано соединение формулы (PL)G,
где n равен от 1 до 20;
где x равен от 1 до 20;
где P представляет собой синтетический пептид приблизительно от 5 приблизительно до 40 аминокислот, который содержит связывающую гиалуроновую кислоту последовательность;
где L представляет собой линкер; и
где G представляет собой гликан.
n
x
В другом варианте осуществления описано соединение формулы P(LG),
где n равен от 1 до 20;
где x равен от 1 до 20;
где P представляет собой синтетический пептид приблизительно от 5 приблизительно до 40 аминокислот, который содержит связывающую гиалуроновую кислоту последовательность;
где L представляет собой линкер; и где G представляет собой гликан.
n
x
В еще одном другом варианте осуществления описано соединение формулы PG,
где n представляет собой MWG/1000;
где MWG представляет собой молекулярную массу G, округленную до ближайшего 1 кДа;
где x равен от 1 до 20;
где P представляет собой синтетический пептид приблизительно от 5 приблизительно до 40 аминокислот, который содержит связывающую гиалуроновую кислоту последовательность; и
где G представляет собой гликан.
n
x
В другом варианте осуществления описано соединение формулы (PL)G
где n представляет собой MWG/1000;
где MWG представляет собой молекулярную массу G, округленную до ближайшего 1 кДа;
где x равен от 1 до 20;
где P представляет собой синтетический пептид приблизительно от 5 приблизительно до 40 аминокислот, который содержит связывающую гиалуроновую кислоту последовательность;
где L представляет собой линкер; и
где G представляет собой гликан.
Для целей этого раскрытия связывающие гиалуроновую кислоту синтетические пептидогликаны и соединения, описанные в предыдущих параграфах, совместно обозначают как «связывающие гиалуроновую кислоту синтетические пептидогликаны» или «синтетические пептидогликаны».
В каждом из приведенных выше вариантов осуществления пептида синтетический пептидогликан может содержать 5-15 пептидных молекул (n равен 5-15), 5-20 пептидных молекул (n равен 5-20), 1-20 пептидных молекул (n равен 1-20) или 1-25 пептидных молекул (n равен 1-25). В одном из вариантов осуществления n выбирают из группы, состоящей из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 и 25 пептидных молекул.
В другом иллюстративном варианте осуществления, описанном в настоящем документе, предусмотрен сконструированный коллагеновый матрикс. Матрикс содержит полимеризованный коллаген, гиалуроновую кислоту и связывающий гиалуроновую кислоту синтетический пептидогликан. В другом варианте осуществления предусмотрена композиция для культуры хондроцитов или стволовых клеток in vitro. Композиция содержит любой из связывающих гиалуроновую кислоту синтетических пептидогликанов, описанных в этом раскрытии.
В другом варианте осуществления, описанном в настоящем документе, предусмотрен способ увеличения размера пор в сконструированном коллагеновом матриксе. Способ включает стадии объединения коллагена, гиалуроновой кислоты и связывающего гиалуроновую кислоту синтетического пептидогликана и увеличения размера пор в матриксе.
В еще одном другом иллюстративном варианте осуществления предусмотрен способ снижения износа или эрозии хряща у пациента. Способ включает стадию введения пациенту связывающего гиалуроновую кислоту синтетического пептидогликана, где синтетический пептидогликан снижает износ или эрозию хряща. В одном из вариантов осуществления эрозия или износ хряща могут быть обусловлены артритом. В одном из вариантов осуществления эрозия или износ хряща могут быть обусловлены старением, ожирением, травмой или повреждением, анатомической аномалией, генетическими заболеваниями, нарушениями метаболизма, воспалением или тому подобным.
В еще одном другом иллюстративном варианте осуществления предусмотрен способ лечения артрита у пациента. Способ включает стадию введения пациенту связывающего гиалуроновую кислоту синтетического пептидогликана, где синтетический пептидогликан уменьшает симптом, связанный с артритом.
В другом иллюстративном варианте осуществления предусмотрен способ снижения или предотвращения разрушения гиалуроновой кислоты у пациента. Способ включает введение пациенту связывающего гиалуроновую кислоту синтетического пептидогликана.
В другом иллюстративном варианте осуществления предусмотрен способ снижения или предотвращения разрушения коллагена. Способ включает стадии приведения связывающего гиалуроновую кислоту синтетического пептидогликана в контакт с гиалуроновой кислотой в присутствии коллагена и снижения или предотвращения разрушения коллагена.
В еще одном другом иллюстративном варианте осуществления предусмотрен способ корректирования или модифицирования тканевого дефекта у пациента. Способ включает введение в тканевой дефект связывающего гиалуроновую кислоту синтетического пептидогликана, где дефект корректируют или модифицируют. В другом иллюстративном варианте осуществления, описанном в настоящем документе, предоставлен дермальный наполнитель. Наполнитель содержит связывающий гиалуроновую кислоту синтетический пептидогликан. В одном из вариантов осуществления наполнитель дополнительно содержит гиалуроновую кислоту.
В еще одном другом варианте осуществления предоставлена добавка для хряща из биоматериала или костной замещающей композиции. Добавка содержит связывающий гиалуроновую кислоту синтетический пептидогликан для добавления в существующий хрящ из биоматериала или костный замещающий материал. В другом варианте осуществления, описанном в настоящем документе, предусмотрен способ получения биоматериала или костно-хрящевой замены. Способ включает стадию объединения синтетического пептидогликана и существующего биоматериала или костно-хрящевого замещающего материала.
В различных вариантах осуществления пептидный компонент синтетического пептидогликана содержит аминокислотную последовательность формулы B1-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-B2,
где X8 присутствует или не присутствует,
где B1 представляет собой основную аминокислоту,
где B2 представляет собой основную аминокислоту, и
где X1-X8 представляют собой не кислые аминокислоты.
В другом варианте осуществления пептидный компонент синтетического пептидогликана может содержать или может представлять собой аминокислотную последовательность формулы B1-X1-B2-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-B3,
где X9 присутствует или не присутствует,
где B1 представляет собой основную аминокислоту,
где B2 представляет собой основную аминокислоту,
где B3 представляет собой основную аминокислоту, и
где X1-X9 представляют собой не кислые аминокислоты.
В другом варианте осуществления синтетический пептид может содержать или может представлять собой аминокислотную последовательность формулы B1-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-B2-X9-B3,
где X8 присутствует или не присутствует,
где B1 представляет собой основную аминокислоту,
где B2 представляет собой основную аминокислоту,
где B3 представляет собой основную аминокислоту, и
где X1-X9 представляют собой не кислые аминокислоты.
Как используют в настоящем документе, «основную аминокислоту» выбирают из группы, состоящей из лизина, аргинина или гистидина. Как используют в настоящем документе, «не кислую аминокислоту» выбирают из группы, состоящей из аланина, аргинина, аспарагина, цистеина, глутамина, глицина, гистидина, изолейцина, лейцина, лизина, метионина, фенилаланина, пролина, серина, треонина, триптофана, тирозина и валина.
В различных иллюстративных вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, пептидный компонент синтетического пептидогликана может содержать аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
GAHWQFNALTVRGG;
GDRRRRRMWHRQ;
GKHLGGKHRRSR;
RGTHHAQKRRS;
RRHKSGHIQGSK;
SRMHGRVRGRHE;
RRRAGLTAGRPR;
RYGGHRTSRKWV;
RSARYGHRRGVG;
GLRGNRRVFARP;
SRGQRGRLGKTR;
DRRGRSSLPKLAGPVEFPDRKIKGRR;
RMRRKGRVKHWG;
RGGARGRHKTGR;
TGARQRGLQGGWGPRHLRGKDQPPGR;
RQRRRDLTRVEG;
STKDHNRGRRNVGPVSRSTLRDPIRR;
RRIGHQVGGRRN;
RLESRAAGQRRA;
GGPRRHLGRRGH;
VSKRGHRRTAHE;
RGTRSGSTR;
RRRKKIQGRSKR;
RKSYGKYQGR;
KNGRYSISR;
RRRCGQKKK;
KQKIKHVVKLK;
KLKSQLVKRK;
RYPISRPRKR;
KVGKSPPVR;
KTFGKMKPR;
RIKWSRVSK; и
KRTMRPTRR.
В каждом из приведенных выше вариантов осуществления пептида пептид может иметь глицин-цистеин, прикрепленный к C-концу пептида, и/или глицин-цистеин-глицин (GCG), прикрепленный к N-концу пептида. В различных вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, пептидный компонент синтетического пептидогликана содержит какую-либо аминокислотную последовательность, описанную в предыдущем параграфе, или аминокислотную последовательность с 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 100% гомологией по отношению к какой-либо из этих аминокислотных последовательностей.
Дополнительные пептиды, которые могут быть включены в качестве пептидного компонента связывающих гиалуроновую кислоту синтетических пептидогликанов, включают пептиды, описанные в Amemiya et al., Biochem. Biophys. Acta, vol. 1724, pp. 94-99 (2005), которая включена в настоящий документ посредством ссылки. Эти пептиды имеют мотив Arg-Arg и включают пептиды, выбранные из группы, состоящей из:
RRASRSRGQVGL;
GRGTHHAQKRRS;
QPVRRLGTPVVG;
ARRAEGKTRMLQ;
PKVRGRRHQASG;
SDRHRRRREADG;
NQRVRRVKHPPG;
RERRERHAVARHGPGLERDARNLARR;
TVRPGGKRGGQVGPPAGVLHGRRARS;
NVRSRRGHRMNS;
DRRRGRTRNIGN;
KTAGHGRRWSRN;
AKRGEGRREWPR;
GGDRRKAHKLQA;
RRGGRKWGSFEG; и
RQRRRDLTRVEG.
В каждом из приведенных выше вариантов осуществления пептида пептид может иметь глицин-цистеин, прикрепленный к C-концу пептида. В каждом из приведенных выше вариантов осуществления пептида, пептид может иметь глицин-цистеин-глицин (GCG), прикрепленный к N-концу пептида. В различных вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, пептидный компонент синтетического пептидогликана содержит какую-либо аминокислотную последовательность, описанную в предыдущем параграфе, или аминокислотную последовательность с 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 100% гомологией по отношению какой-либо из этих аминокислотных последовательностей.
В других вариантах осуществления пептиды, описанные в Yang et al., EMBO Journal, vol. 13, pp. 286-296 (1994), включенной в настоящий документ посредством ссылки, и Goetinck et al., J. Cell. Biol., vol. 105, pp. 2403-2408 (1987), включенной в настоящий документ посредством ссылки, можно использовать в связывающих гиалуроновую кислоту синтетических пептидогликанах, описанных в настоящем документе, включая пептиды, выбранные из группы, состоящей из RDGTRYVQKGEYR, HREARSGKYK, PDKKHKLYGV и WDKERSRYDV. В каждом из этих вариантов осуществления пептид может иметь глицин-цистеин, прикрепленный к C-концу пептида. В каждом из этих вариантов осуществления пептид может иметь глицин-цистеин-глицин (GCG), прикрепленный к N-концу пептида. В других вариантах осуществления пептидный компонент синтетического пептидогликана содержит аминокислотную последовательность с 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 100% гомологией по отношению к какой-либо из этих аминокислотных последовательностей.
В различных вариантах осуществления пептидный компонент синтетического пептидогликана, описанного в настоящем документе, можно модифицировать посредством введения одной или нескольких консервативных аминокислотных замен. Как общеизвестно специалистам в данной области, изменение какой-либо некритичной аминокислоты пептида посредством консервативной замены не должно значительно изменять активность этого пептида, поскольку боковая цепь заменяющей аминокислоты должна быть способна формировать связи и контакты, схожие с боковой цепью аминокислоты, которую заменили. Неконсервативные замены возможны при условии, что они не оказывают чрезмерного влияния на связывающую гиалуроновую кислоту активность пептида.
Как хорошо известно в данной области, «консервативная замена» аминокислоты или «вариант с консервативной заменой» пептида относится к замене аминокислоты, которая сохраняет: 1) вторичную структуру пептида; 2) заряд или гидрофобность аминокислоты; и 3) размеры боковой цепи или какую-либо одну или несколько из этих характеристик. Иллюстративно, общеизвестные термины «гидрофильные остатки» относятся к серину или треонину. «Гидрофобные остатки» относятся к лейцину, изолейцину, фенилаланину, валину или аланину или тому подобному. «Положительно заряженные остатки» относятся к лизину, аргинину, орнитину или гистидину. «Отрицательно заряженные остатки» относятся к аспарагиновой кислоте или глутаминовой кислоте. Остатки, которые имеют «объемные боковые цепи» относятся к фенилаланину, триптофану или тирозину или тому подобному. Список иллюстративных консервативных аминокислотных замен приведен в таблице 1.
Таблица 1
Заменяемая аминокислота
Заменяющая аминокислота
Аланин
D-Ala, Gly, Aib, β-Ala, L-Cys, D-Cys
Аргинин
D-Arg, Lys, D-Lys, Orn D-Orn
Аспарагин
D-Asn, Asp, D-Asp, Glu, D-Glu Gln, D-Gln
Аспарагиновая кислота
D-Asp, D-Asn, Asn, Glu, D-Glu, Gln, D-Gln
Цистеин
D-Cys, S-Me-Cys, Met, D-Met, Thr, D-Thr
Глутамин
D-Gln, Asn, D-Asn, Glu, D-Glu, Asp, D-Asp
Глутаминовая кислота
D-Glu, D-Asp, Asp, Asn, D-Asn, Gln, D-Gln
Глицин
Ala, D-Ala, Pro, D-Pro, Aib, β-Ala
Изолейцин
D-Ile, Val, D-Val, Leu, D-Leu, Met, D-Met
Лейцин
Val, D-Val, Met, D-Met, D-Ile, D-Leu, Ile
Лизин
D-Lys, Arg, D-Arg, Orn, D-Orn
Метионин
D-Met, S-Me-Cys, Ile, D-Ile, Leu, D-Leu, Val, D-Val
Фенилаланин
D-Phe, Tyr, D-Tyr, His, D-His, Trp, D-Trp
Пролин
D-Pro
Серин
D-Ser, Thr, D-Thr, allo-Thr, L-Cys, D-Cys
Треонин
D-Thr, Ser, D-Ser, allo-Thr, Met, D-Met, Val, D-Val
Тирозин
D-Tyr, Phe, D-Phe, His, D-His, Trp, D-Trp
Валин
D-Val, Leu, D-Leu, Ile, D-Ile, Met, D-Met
В одном из вариантов осуществления консервативные аминокислотные замены, которые можно применять к молекулам, описанным в настоящем документе, не изменяют мотивы, которые состоят из формулы B1-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-B2, формулы B1-X1-B2-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-B3, формулы B1-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-B2-X9-B3 или мотива Arg-Arg.
В различных вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, гликановый (например, гликозаминогликан, сокращенно GAG, или полисахарид) компонент синтетического пептидогликана, описанного в настоящем документе, можно выбирать из группы, состоящей из декстрана, хондроитина, хондроитинсульфата, дерматана, дерматансульфата, гепарана, гепарина, кератина, кератансульфата и гиалуроновой кислоты. В одном из вариантов осуществления гликан выбирают из группы, состоящей из хондроитинсульфата и кератансульфата. В другом иллюстративном варианте осуществления, гликан представляет собой хондроитинсульфат.
10
11
В одном из вариантов осуществления, описанном в настоящем документе, связывающий гиалуроновую кислоту синтетический пептидогликан содержит (GAHWQFNALTVRGG), конъюгированный с хондроитинсульфатом, где каждый пептид в молекуле пептидогликана связан отдельно с хондроитинсульфатом. В другом варианте осуществления, описанном в настоящем документе, связывающий гиалуроновую кислоту синтетический пептидогликан содержит (GAHWQFNALTVRGGGC), конъюгированный с хондроитинсульфатом, где каждый пептид в молекуле пептидогликана связан отдельно с хондроитинсульфатом. В каждом из приведенных выше вариантов осуществления пептида, число пептидов можно выбирать из группы, состоящей из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 и 25 пептидных молекул.
В различных вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, синтетический пептидогликан устойчив к аггреканазе. Аггреканазу характеризуют в данной области как какой-либо фермент, для которого известна способность расщеплять аггрекан.
В одном иллюстративном аспекте связывающий гиалуроновую кислоту синтетический пептидогликан можно стерилизовать. Как используют в настоящем документе, «стерилизация» или «стерилизовать» или «стерилизованный» обозначает дезинфицирование связывающих гиалуроновую кислоту синтетических пептидогликанов посредством удаления нежелательных контаминантов, включая в качестве неограничивающих примеров эндотоксины и инфекционные агенты.
В различных иллюстративных вариантах осуществления связывающий гиалуроновую кислоту синтетический пептидогликан можно дезинфицировать и/или стерилизовать с использованием стандартных способов стерилизации, включая обработку пропиленоксидом или этиленоксидом, газоплазменную стерилизацию, гамма-излучение (например, гамма-облучение 1-4 Мрад или гамма-облучение 1-2,5 Мрад), электронный пучок и/или стерилизацию надкислотой, такой как надуксусная кислота. Можно использовать способы стерилизации, которые не оказывают нежелательного влияния на структуру и биотропные свойства связывающего гиалуроновую кислоту синтетического пептидогликана. В одном из вариантов осуществления связывающий гиалуроновую кислоту синтетический пептидогликан можно подвергать одному или нескольким процессам стерилизации. В другом иллюстративном варианте осуществления, связывающий гиалуроновую кислоту синтетический пептидогликан подвергают стерилизующему фильтрованию. Связывающий гиалуроновую кислоту синтетический пептидогликан можно оборачивать в контейнер какого-либо типа, включая пластмассовую обертку или обертку из фольги, и дополнительно можно стерилизовать. Связывающий гиалуроновую кислоту синтетический пептидогликан можно получать в стерильных условиях, например, посредством лиофилизации, которую можно легко выполнять с использованием стандартных способов, общеизвестных специалистам в данной области.
В различных вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, связывающие гиалуроновую кислоту синтетические пептидогликаны можно комбинировать с минералами, аминокислотами, сахарами, пептидами, белками, витаминами (такими как аскорбиновая кислота) или ламинином, коллагеном, фибронектином, гиалуроновой кислотой, фибрином, эластином или аггреканом или факторами роста, такими как эпидермальный фактор роста, тромбоцитарный фактор роста, трансформирующий фактор роста β или фактор роста фибробластов, и глюкокортикоидами, такими как дексаметезон или изменяющими вязкоупругость средствами, такими как ионные и неионные водорастворимые полимеры; полимеры акриловой кислоты; гидрофильные полимеры, такие как полиэтиленоксиды, полиоксиэтилен-полиоксипропиленовые сополимеры и поливиниловый спирт; целлюлозные полимеры и производные целлюлозных полимеров, такие как гидроксипропилцеллюлоза, гидроксиэтилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, фталат гидроксипропилметилцеллюлозы, метилцеллюлоза, карбоксиметилцеллюлоза и этерифицированная целлюлоза; поли(молочная кислота), поли(гликолевая кислота), сополимеры молочной и гликолевой кислот или другие полимерные средства, как природные, так и синтетические.
В различных вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, пептидный компонент синтетического пептидогликана синтезируют в соответствии с протоколами твердофазного синтеза пептидов, которые общеизвестны специалистам в данной области. В одном из вариантов осуществления предшественник пептида синтезируют на твердом носителе в соответствии с общеизвестным протоколом с Fmoc, отщепляют от носителя трифторуксусной кислотой и очищают хроматографией в соответствии со способами, известными специалистам в данной области.
В различных вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, пептидный компонент синтетического пептидогликана синтезируют с использованием биотехнологических способов, которые общеизвестны специалистам в данной области. В одном из вариантов осуществления последовательность ДНК, которая кодирует информацию аминокислотной последовательности для желаемого пептида, лигируют способами рекомбинантной ДНК, известными специалистам в данной области, в экспрессирующую плазмиду (например, плазмиду, которая содержит аффинную метку для аффинной очистки пептида), плазмиду трансфицируют в организм-хозяин для экспрессии и затем пептид выделяют из организма-хозяина или среды для выращивания согласно способам, известным специалистам в данной области (например, посредством аффинной очистки). Способы технологий рекомбинантных ДНК описаны в Sambrook et al., «Molecular Cloning: A Laboratory Manual», 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2001), которая включена в настоящий документ посредством ссылки, и общеизвестны специалистам в данной области.
В различных вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, пептидный компонент связывающего гиалуроновую кислоту синтетического пептидогликана конъюгирован с гликаном посредством реакции свободной аминогруппы пептида с альдегидной функцией гликана в присутствии восстанавливающего средства, используя способы, известные специалистам в данной области, чтобы получать конъюгат пептида и гликана. В одном из вариантов осуществления альдегидную функцию гликана (например, полисахарида или гликозаминогликана) формируют посредством реакции гликана с метапериодатом натрия в соответствии со способами, известными специалистам в данной области.
В одном из вариантов осуществления пептидный компонент синтетического пептидогликана конъюгируют с гликаном посредством реакции альдегидной функции гликана с 3-(2-пиридилдитио)пропионилгидразидом (PDPH) для того, чтобы формировать промежуточный гликан, и последующей реакции промежуточного гликана с пептидом, содержащим свободную тиоловую группу для того, чтобы получать конъюгат пептида и гликана. В еще одном другом варианте осуществления последовательность пептидного компонента синтетического пептидогликана можно модифицировать для того, чтобы она содержала глицин-цистеиновый сегмент, чтобы предоставить точку присоединения для гликана или конъюгата гликан-линкер. В любом из варианты осуществления, описанных в настоящем документе, сшивателем может являться N-[β-малеимидопропановой кислоты]гидразид (BMPH).
Несмотря на то что конкретные варианты осуществления описаны в предыдущих параграфах, связывающие гиалуроновую кислоту синтетические пептидогликаны, описанные в настоящем документе, можно получать посредством использования какого-либо принятого в данной области способа конъюгации пептида с гликаном (например, полисахаридом или гликозаминогликаном). Это может включать образование ковалентных, ионных или водородных связей, или непосредственно или опосредованно через линкерную группу, такую как двухвалентный линкер. Конъюгат типично формируют посредством ковалентного связывания пептида с гликаном через формирование амидных, сложноэфирных или иминовых связей между кислотной, альдегидной, гидрокси-, амино- или гидразогруппами на соответствующих компонентах конъюгата. Все эти способы известны в данной области или дополнительно описаны в разделе с примерами в этой заявке или в Hermanson G.T., Bioconjugate Techniques, Academic Press, pp.169-186 (1996), включенной в настоящий документ посредством ссылки. Линкер типично содержит приблизительно от 1 приблизительно до 30 углеродных атомов, более типично приблизительно от 2 приблизительно до 20 углеродных атомов. Типично используют линкеры с более низкой молекулярной массой (т.е. те, которые имеют приблизительную молекулярную массу приблизительно от 20 приблизительно до 500).
Кроме того, структурные модификации линкерной части конъюгатов предусмотрены в настоящем документе. Например, в линкер могут входить аминокислоты, а также в линкерной части конъюгата можно создавать множество замен аминокислот, включая в качестве неограничивающих примеров встречающиеся в природе аминокислоты, а также те, которые доступны для стандартных синтетических способов. В другом аспекте можно использовать бета-, гамма- аминокислоты и аминокислоты с более длинными цепями вместо одной или нескольких альфа-аминокислот. В другом аспекте линкер можно укорачивать или удлинять, или посредством изменения числа аминокислот, входящих в него, или включая больше или меньше бета-, гамма-аминокислот или аминокислот с более длинной цепью. Аналогичным образом, можно модифицировать длину и геометрическую форму других химических фрагментов линкеров, описанных в настоящем документе.
В различных вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, линкер может содержать один или несколько двухвалентных фрагментов, выбираемых независимо в каждом случае из группы, состоящей из алкилена, гетероалкилена, циклоалкилена, циклогетероалкилена, арилена и гетероарилена, каждый из которых необязательно замещен. Как используют в настоящем документе, гетероалкилен представляет группу, являющуюся результатом замены одного или нескольких углеродных атомов в линейной или разветвленной алкиленовой группе, атомом, независимо выбираемым в каждом случае из группы, состоящей из кислорода, азота, фосфора и серы. В альтернативном варианте осуществления линкер не присутствует.
В одном из вариантов осуществления, описанном в настоящем документе, предусмотрен сконструированный коллагеновый матрикс. Ранее описанные варианты осуществления связывающего гиалуроновую кислоту синтетического пептидогликана можно применять к сконструированному коллагеновому матриксу, описанному в настоящем документе. В одном из вариантов осуществления сконструированный коллагеновый матрикс содержит полимеризованный коллаген, гиалуроновую кислоту и связывающий гиалуроновую кислоту синтетический пептидогликан. В одном из вариантов осуществления сконструированный коллагеновый матрикс содержит полимеризованный коллаген и связывающий гиалуроновую кислоту синтетический пептидогликан. В различных иллюстративных вариантах осуществления, сшивающие средства, такие как карбодиимиды, альдегиды, лизил-оксидаза, N-гидроксисукцинимидные сложные эфиры, имидоэфиры, гидразиды и малеимиды, а также различные природные сшивающие средства, включая генипин и т.п., можно добавлять до, во время или после полимеризации коллагена в растворе.
В различных иллюстративных вариантах осуществления коллаген, используемый в настоящем документе для того, чтобы получать сконструированный коллагеновый матрикс, может представлять собой коллаген любого типа, включая коллаген с I до XXVIII типов, отдельно или в любой комбинации, например, можно использовать коллаген I, II, III и/или IV типов. В некоторых вариантах осуществления коллаген, используемый для того, чтобы получать сконструированный коллагеновый матрикс, выбирают из группы, состоящей из коллагена I типа, коллагена II типа, коллагена III типа, коллагена IV типа, коллагена IX типа, коллагена XI типа и их сочетаний. В одном из вариантов осуществления сконструированный коллагеновый матрикс формируют с использованием коммерчески доступного коллагена (например, Sigma, St. Louis, MO). В альтернативном варианте осуществления коллаген можно очищать из материала ткани, содержащей подслизистую основу, такой как ткань кишечника, мочевого пузыря или желудка. В дополнительном варианте осуществления коллаген можно выделять из сухожилий хвоста. В дополнительном варианте осуществления, коллаген можно выделять из кожи. В различных аспектах коллаген также может содержать эндогенные или экзогенно добавляемые неколлагеновые белки в дополнение к связывающим коллаген синтетическим пептидогликанам, такие как фибронектин или белки шелка, гликопротеины и полисахариды или тому подобное. Сконструированный коллагеновый матрикс, получаемый способами, описанными в настоящем документе, может быть в форме тканевого трансплантата (например, в форме геля), который может приобретать отличительные признаки ткани(ей), с которой он ассоциирован в месте имплантации или инъекции. В одном из вариантов осуществления сконструированный коллагеновый матрикс представляет собой тканевой трансплантат, который можно имплантировать пациенту. В другом варианте осуществления сконструированный коллагеновый матрикс можно вводить пациенту посредством инъекции. В любом варианте осуществления матрикс может быть, например, в форме геля или порошка.
В одном из вариантов осуществления коллаген в сконструированном коллагеновом матриксе составляет приблизительно от 40 приблизительно до 90% сухой массы (масс.) матрикса, приблизительно от 40 приблизительно до 80% сухой массы матрикса, приблизительно 40 приблизительно до 70% сухой массы матрикса, приблизительно от 40 приблизительно до 60% сухой массы матрикса, приблизительно от 50 приблизительно до 90% сухой массы матрикса, приблизительно от 50 приблизительно до 80% сухой массы матрикса, приблизительно от 50 приблизительно до 75% сухой массы матрикса, приблизительно от 50 приблизительно до 70% сухой массы матрикса или приблизительно от 60 приблизительно до 75% сухой массы матрикса. В другом варианте осуществления коллаген в сконструированном коллагеновом матриксе составляет приблизительно 90% сухой массы, приблизительно 85% сухой массы, приблизительно 80% сухой массы, приблизительно 75% сухой массы, приблизительно 70% сухой массы, приблизительно 65% сухой массы, приблизительно 60% сухой массы, приблизительно 50% сухой массы, приблизительно 45% сухой массы, приблизительно 40% сухой массы или приблизительно 30% сухой массы матрикса.
В одном из вариантов осуществления конечная концентрация коллагена в матриксе в гелевой форме составляет приблизительно от 0,5 приблизительно до 6 мг/мл, приблизительно от 0,5 приблизительно до 5 мг/мл, приблизительно от 0,5 приблизительно до 4 мг/мл, приблизительно от 1 приблизительно до 6 мг/мл, приблизительно от 1 приблизительно до 5 мг/мл или приблизительно от 1 приблизительно до 4 мг/мл. В одном из вариантов осуществления конечная концентрация коллагена в матриксе составляет приблизительно 0,5 мг/мл, приблизительно 1 мг/мл, приблизительно 2 мг/мл, приблизительно 3 мг/мл, приблизительно 4 мг/мл или приблизительно 5 мг/мл.
В одном из вариантов осуществления связывающий гиалуроновую кислоту синтетический пептидогликан в сконструированном коллагеновом матриксе составляет приблизительно от 2 приблизительно до 60% сухой массы (масс.) матрикса, приблизительно от 2 приблизительно до 50% сухой массы матрикса, приблизительно от 5 приблизительно до 50% сухой массы матрикса, приблизительно от 10 приблизительно до 50% сухой массы матрикса, приблизительно от 10 приблизительно до 20% сухой массы матрикса, приблизительно от 10 приблизительно до 30% сухой массы матрикса, приблизительно от 10 приблизительно до 25% сухой массы матрикса, приблизительно от 15 приблизительно до 30% сухой массы матрикса или приблизительно от 15 приблизительно до 45% сухой массы матрикса. В другом варианте осуществления связывающий гиалуроновую кислоту синтетический пептидогликан в сконструированном коллагеновом матриксе составляет приблизительно 2% сухой массы, приблизительно 5% сухой массы, приблизительно 10% сухой массы, приблизительно 15% сухой массы, приблизительно 20% сухой массы, приблизительно 25% сухой массы, приблизительно 30% сухой массы, приблизительно 35% сухой массы, приблизительно 40% сухой массы, приблизительно 45% сухой массы или приблизительно 50% сухой массы матрикса.
В другом варианте осуществления сконструированный коллагеновый матрикс содержит гиалуроновую кислоту и гиалуроновая кислота в сконструированном коллагеновом матриксе составляет приблизительно от 2 приблизительно до 60% сухой массы (масс.) матрикса, приблизительно от 2 приблизительно до 50% сухой массы матрикса, приблизительно от 5 приблизительно до 50% сухой массы матрикса, приблизительно от 10 приблизительно до 50% сухой массы матрикса, приблизительно от 10 приблизительно до 20% сухой массы матрикса, приблизительно от 10 приблизительно до 30% сухой массы матрикса, приблизительно от 10 приблизительно до 25% сухой массы матрикса, приблизительно от 15 приблизительно до 30% сухой массы матрикса или приблизительно от 15 приблизительно до 45% сухой массы матрикса. В другом варианте осуществления гиалуроновая кислота в сконструированном коллагеновом матриксе составляет приблизительно 2% сухой массы, приблизительно 5% сухой массы, приблизительно 10% сухой массы, приблизительно 15% сухой массы, приблизительно 20% сухой массы, приблизительно 25% сухой массы, приблизительно 30% сухой массы, приблизительно 35% сухой массы, приблизительно 40% сухой массы, приблизительно 45% сухой массы или приблизительно 50% сухой массы матрикса.
В одном из вариантов осуществления сконструированный коллагеновый матрикс содержит гиалуроновую кислоту и связывающий гиалуроновую кислоту синтетический пептидогликан. Гиалуроновая кислота и связывающий гиалуроновую кислоту синтетический пептидогликан в сконструированном коллагеновом матриксе составляют приблизительно от 10 приблизительно до 60% сухой массы (масс.) матрикса, приблизительно от 20 приблизительно до 60% сухой массы матрикса, приблизительно от 30 приблизительно до 60% сухой массы матрикса, приблизительно от 40 приблизительно до 60% сухой массы матрикса, приблизительно от 10 приблизительно до 50% сухой массы матрикса, приблизительно от 20 приблизительно до 50% сухой массы матрикса, приблизительно от 25 приблизительно до 50% сухой массы матрикса, приблизительно от 30 приблизительно до 50% сухой массы матрикса или приблизительно от 25 приблизительно до 40% сухой массы матрикса. В другом варианте осуществления гиалуроновая кислота и связывающий гиалуроновую кислоту синтетический пептидогликан в сконструированном коллагеновом матриксе составляют приблизительно 10% сухой массы, приблизительно 15% сухой массы, приблизительно 20% сухой массы, приблизительно 25% сухой массы, приблизительно 30% сухой массы, приблизительно 35% сухой массы, приблизительно 40% сухой массы, приблизительно 50% сухой массы, приблизительно 55% сухой массы, приблизительно 60% сухой массы или приблизительно 70% сухой массы матрикса.
В одном иллюстративном аспекте сконструированный коллагеновый матрикс можно стерилизовать. Как используют в настоящем документе, «стерилизация» или «стерилизовать» или «стерилизованный» обозначают дезинфицирование матрикса посредством удаления нежелательных контаминантов, включая в качестве неограничивающих примеров эндотоксины, контаминанты из нуклеиновых кислот и инфекционные агенты.
В различных иллюстративных вариантах осуществления сконструированный коллагеновый матрикс можно дезинфицировать и/или стерилизовать с использованием стандартных способов стерилизации, включая дубление глутаральдегидом, дубление формальдегидом при кислом pH, обработку пропиленоксидом или этиленоксидом, газоплазменную стерилизацию, гамма-излучение (например, гамма-облучение 1-4 Мрад или гамма-облучение 1-2,5 Мрад), электронный пучок и/или стерилизацию с использованием надкислоты, такой как надуксусная кислота. Можно использовать способы стерилизации, которые не оказывают нежелательного влияния на структуру и биотропные свойства матрикса. В одном из вариантов осуществления сконструированный коллагеновый матрикс можно подвергать одному или нескольким процессам стерилизации. В иллюстративных вариантах осуществления коллаген в растворе перед полимеризацией также можно стерилизовать или дезинфицировать. Сконструированный коллагеновый матрикс можно оборачивать в контейнер любого типа, включая пластмассовую обертку или обертку из фольги, и дополнительно можно стерилизовать.
В любом из этих вариантов осуществления сконструированный коллагеновый матрикс дополнительно может содержать экзогенную популяцию клеток. Добавляемая популяция клеток может содержать одну или несколько популяций клеток. В различных вариантах осуществления популяции клеток содержат популяции некератинизированных или кератинизированных эпителиальных клеток или популяцию клеток, выбранную из группы, состоящей из клеток эндотелия, клеток мезодермального происхождения, мезотелиальных клеток, синовиоцитов, нервных клеток, глиальных клеток, остеобластов, фибробластов, хондроцитов, теноцитов, гладкомышечных клеток, клеток скелетных мышц, клеток сердечной мышцы, мультипотентных клеток-предшественников (например, стволовых клеток, включая клетки-предшественники костного мозга) и остеогенных клеток. В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток выбирают из группы, состоящей из хондроцитов и стволовых клеток. В некоторых вариантах осуществления стволовые клетки выбирают из группы, состоящей из остеобластов, остеогенных клеток и мезенхимальных стволовых клеток. В различных вариантах осуществления сконструированный коллагеновый матрикс можно засевать одним или несколькими типами клеток в комбинации.
В различных аспектах сконструированный коллагеновый матрикс или сконструированные трансплантаты по настоящему изобретению можно комбинировать с питательными веществами, включая минералы, аминокислоты, сахара, пептиды, белки, витамины (такие как аскорбиновая кислота), или ламинином, фибронектином, гиалуроновой кислотой, фибрином, эластином или аггреканом или факторами роста, такими как эпидермальный фактор роста, тромбоцитарный фактор роста, трансформирующий фактор роста бета или фактор роста фибробластов, и глюкокортикоидами, такими как дексаметезон, или изменяющими вязкоупругость средствами, такими как ионные и неионные водорастворимые полимеры; полимерами акриловой кислоты; гидрофильными полимерами, такими как полиэтиленоксиды, полиоксиэтилен-полиоксипропиленовые сополимеры и поливинилспирт; целлюлозными полимерами и производными целлюлозных полимеров, такими как гидроксипропилцеллюлоза, гидроксиэтилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, фталат гидроксипропилметилцеллюлозы, метилцеллюлоза, карбоксиметилцеллюлоза и этерифицированная целлюлоза; поли(молочной кислотой), поли(гликолевой кислотой), сополимерами молочной и гликолевой кислот или другими полимерными средствами, как природными, так и синтетическими. В других иллюстративных вариантах осуществления сшивающие средства, такие как карбодиимиды, альдегиды, лизил-оксидаза, N-гидроксисукцинимидные сложные эфиры, имидоэфиры, гидразиды и малеимиды, а также природные сшивающие средства, включая генипин, и т.п. можно добавлять до, одновременно с или после добавления клеток.
Как рассмотрено выше, в соответствии с одним из вариантов осуществления, клетки можно добавлять в сконструированный коллагеновый матрикс или сконструированный трансплантат после полимеризации коллагена или во время полимеризации коллагена. Сконструированный коллагеновый матрикс, содержащий клетки, впоследствии можно инъецировать или имплантировать в организм-хозяин для применения в качестве сконструированного трансплантата. В другом варианте осуществления клетки на сконструированном коллагеновом матриксе или внутри него можно культивировать in vitro, в течение предварительно определяемого временного промежутка, чтобы увеличивать число клеток или вызывать желаемое ремоделирование перед имплантацией или инъекцией пациенту.
В одном из вариантов осуществления, описанном в настоящем документе, предоставлена композиция для культуры хондроцитов или стволовых клеток in vitro (т.е. для культуры клеток in vitro без последующей имплантации или инъекции пациенту). Композиция для культуры in vitro содержит связывающий гиалуроновую кислоту синтетический пептидогликан. Ранее описанные варианты осуществления связывающего гиалуроновую кислоту синтетического пептидогликана можно применять к композиции для культуры in vitro, описанной в настоящем документе.
В различных аспектах композицию для культуры in vitro по настоящему изобретению можно комбинировать с питательными веществами, включая минералы, аминокислоты, сахара, пептиды, белки, витамины (такие как аскорбиновая кислота), или ламинином, фибронектином, гиалуроновой кислотой, фибрином, эластином или аггреканом, или факторами роста, такими как эпидермальный фактор роста, тромбоцитарный фактор роста, трансформирующий фактор роста бета или фактор роста фибробластов, и глюкокортикоидами, такими как дексаметезон.
В некоторых вариантах осуществления композиция для культуры in vitro содержит стволовые клетки, выбранные из группы, состоящей из остеобластов, остеогенных клеток и мезенхимальных стволовых клеток. В различных вариантах осуществления композицию для культуры in vitro можно засевать одним или несколькими типами клеток в комбинации.
В одном иллюстративном аспекте композицию для культуры in vitro можно стерилизовать. Как используют в настоящем документе «стерилизация» или «стерилизовать» или «стерилизованный» обозначает дезинфицирование композиции посредством удаления нежелательных контаминантов, включая в качестве неограничивающих примеров эндотоксины, контаминанты из нуклеиновых кислот и инфекционные агенты. Процедуры стерилизации, способы и варианты осуществления, предусмотренные в предыдущих параграфах, также можно применять к композиции для культуры in vitro, описанной в настоящем документе. Композицию культуры in vitro можно использовать для размножения популяций клеток для имплантации или инъекции пациенту.
В одном из вариантов осуществления, описанном в настоящем документе, предоставлена добавка для композиции биоматериала для замены хряща. Добавка содержит связывающий гиалуроновую кислоту синтетический пептидогликан для добавления в существующий материал из биоматериала для замены хряща. Ранее описанные варианты осуществления связывающего гиалуроновую кислоту синтетического пептидогликана можно применять к добавке, описанной в настоящем документе.
Как используют в настоящем документе, фраза «существующий материал из биоматериала для замены хряща» обозначает биологически совместимую композицию, которую можно использовать для замены поврежденного, дефективного или утраченного хряща в организме. Различные типы существующих композиций биоматериала для замены хряща хорошо известны в данной области и предусмотрены. Например, существующие хрящи из биоматериала или костные замещающие композиции включают DeNovo NT Natural Tissue Graft (Zimmer), MaioRegen™ (JRI Limited) или коллекцию криосохранненных костно-суставных тканей, полученную в Biomet.
В одном из вариантов осуществления предусмотрен способ получения биоматериала или костно-хрящевой замены. Способ включает стадию объединения синтетического пептидогликана и существующего биоматериала или костно-хрящевого замещающего материала. Ранее описанные варианты осуществления связывающего гиалуроновую кислоту синтетического пептидогликана можно применять к способу, описанному в настоящем документе.
В одном из вариантов осуществления предусмотрен способ лечения артрита у пациента. Способ включает стадию введения пациенту связывающего гиалуроновую кислоту синтетического пептидогликана, где синтетический пептидогликан уменьшает один или несколько симптомов, связанных с артритом. Ранее описанные варианты осуществления связывающего гиалуроновую кислоту синтетического пептидогликана можно применять к способу, описанному в настоящем документе.
В различных вариантах осуществления синтетический пептидогликан, используемый в способе лечения артрита, уменьшает один или несколько симптомов, связанных с артритом. В данной области известны различные симптомы, связанные с артритом, включая в качестве неограничивающих примеров боль, тугоподвижность, болезненность, воспаление, отек, покраснение, повышение температуры и снижение подвижности. Симптомы артрита могут присутствовать в суставе, сухожилии или других частях организма. Как используют в настоящем документе, «уменьшение» обозначает предотвращение или полное или частичное облегчение симптома артрита.
В различных вариантах осуществления артрит представляет собой остеоартрит или ревматоидный артрит. Патогенез и клинические симптомы остеоартрита и ревматоидного артрита хорошо известны в данной области. В одном из вариантов осуществления этого способа синтетический пептидогликан выполняет функцию смазывающего средства после введения или препятствует утрате хряща. В другом варианте осуществления синтетический пептидогликан предохраняет костный сустав у пациента. Например, синтетический пептидогликан задерживает сочленение кости с костью у пациента с уменьшенным или поврежденным хрящом.
В одном из вариантов осуществления предусмотрен способ снижения или предотвращения разрушения компонентов ECM у пациента. Например, предусмотрен способ снижения или предотвращения разрушения компонентов ECM в хрящ пациента. Способ включает введение пациенту связывающего гиалуроновую кислоту синтетического пептидогликана. Ранее описанные варианты осуществления связывающего гиалуроновую кислоту синтетического пептидогликана можно применять к способу, описанному в настоящем документе. В одном из вариантов осуществления синтетический пептидогликан устойчив к матриксным металлопротеазам, например, аггреканазе.
В другом варианте осуществления предусмотрен способ снижения или предотвращения разрушения гиалуроновой кислоты у пациента. Способ включает введение пациенту связывающего гиалуроновую кислоту синтетического пептидогликана. Ранее описанные варианты осуществления связывающего гиалуроновую кислоту синтетического пептидогликана можно применять к способу, описанному в настоящем документе.
В другом варианте осуществления предусмотрен способ снижения или предотвращения разрушения коллагена. Способ включает стадии приведения связывающего гиалуроновую кислоту синтетического пептидогликана в контакт с гиалуроновой кислотой в присутствии коллагена и уменьшения или предотвращения разрушения коллагена. Ранее описанные варианты осуществления связывающего гиалуроновую кислоту синтетического пептидогликана можно применять к способу, описанному в настоящем документе.
В другом варианте осуществления предусмотрен способ снижения или предотвращения разрушения хондроитинсульфата. Способ включает стадии приведения связывающего гиалуроновую кислоту синтетического пептидогликана в контакт с гиалуроновой кислотой в присутствии коллагена и уменьшения или предотвращения разрушения хондроитинсульфата. Ранее описанные варианты осуществления связывающего гиалуроновую кислоту синтетического пептидогликана можно применять к способу, описанному в настоящем документе.
«Уменьшение» разрушения компонентов ECM, например, разрушения гиалуроновой кислоты, коллагена или хондроитинсульфата обозначает полное или частичное уменьшение разрушения гиалуроновой кислоты, коллагена или хондроитинсульфата, соответственно.
В одном из вариантов осуществления уменьшение разрушения гиалуроновой кислоты у пациента обозначает уменьшение скорости разрушения гиалуроновой кислоты. Например, на фиг.8, описанной в заявке в разделе с примерами, показано, что скорость разрушения гиалуроновой кислоты в смеси гиалуроновой кислоты и связывающего гиалуроновую кислоту синтетического пептидогликана значительно снижают при добавлении синтетического пептидогликана.
В одном из вариантов осуществления уменьшение разрушения коллагена обозначает уменьшение скорости разрушения коллагена. Например, на фиг.10, описанной в заявке в разделе с примерами, показано, что скорость разрушения коллагена в присутствии гиалуроновой кислоты и связывающего гиалуроновую кислоту синтетического пептидогликана значительно уменьшают при добавлении синтетического пептидогликана.
В одном из вариантов осуществления уменьшение разрушения хондроитинсульфата обозначает уменьшение скорости разрушения хондроитинсульфата. Например, на фиг.11, описанной в заявке в разделе с примерами, показано, что скорость разрушения хондроитинсульфата в присутствии связывающего гиалуроновую кислоту синтетического пептидогликана значительно снижают при добавлении синтетического пептидогликана.
В одном из вариантов осуществления, описанном в настоящем документе, предусмотрен способ корректирования или модифицирования тканевого дефекта у пациента. Способ включает введение в тканевой дефект гиалуроновой кислоты и связывающего гиалуроновую кислоту синтетического пептидогликана, где дефект корректируют или модифицируют. Ранее описанные варианты осуществления связывающего гиалуроновую кислоту синтетического пептидогликана можно применять к способу, описанному в настоящем документе. В одном из вариантов осуществления тканевой дефект представляет собой косметический дефект.
Следующие варианты осуществления можно применять к описанным в настоящем документе способам, где связывающий гиалуроновую кислоту синтетический пептидогликан вводят пациенту. В различных вариантах осуществления связывающий гиалуроновую кислоту синтетический пептидогликан можно инъецировать или имплантировать (например, встраивать в восстанавливающую хрящ композицию или устройство). В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, инъекция представляет собой внутрисуставную инъекцию. В другом варианте осуществления, описанном в настоящем документе, инъекцию выполняют в суставную капсулу пациента. В других вариантах осуществления инъекция является подкожной инъекцией, как в случае дермальных наполнителей. Подходящее средство для инъекции содержит игольное (включая микроигольное) устройство для инъекции или устройство для инфузии.
В иллюстративном варианте осуществления фармацевтические составы для использования со связывающими гиалуроновую кислоту синтетическими пептидогликанами для введения пациенту содержат: a) фармацевтически активное количество связывающего гиалуроновую кислоту синтетического пептидогликана; b) фармацевтически приемлемое pH буферное средство для того, чтобы обеспечивать pH в диапазоне приблизительно от pH 4,5 приблизительно до pH 9; c) модифицирующее ионную силу средство в диапазоне концентраций приблизительно от 0 приблизительно до 300 ммоль; и d) водорастворимое модифицирующее вязкость средство в диапазоне концентраций приблизительно от 0,25% приблизительно до 10% общей массы состава или какого-либо индивидуального компонента a), b), c) или d) или какой-либо комбинации из a), b), c) и d).
В различных вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, pH буферные средства представляют собой те средства, которые известны специалисту в данной области и включают, например, ацетатный, боратный, карбонатный, цитратный и фосфатный буферы, а также соляную кислоту, гидроксид натрия, оксид магния, фосфат монокалия, бикарбонат, аммиак, углекислый газ, соляную кислоту, цитрат натрия, лимонную кислоту, уксусную кислоту, вторичный кислый фосфат натрия, буру, борную кислоту, гидроксид натрия, диэтилбарбитуровую кислоту и белки, а также различные биологические буферы, например, TAPS, бицин, трис, трицин, HEPES, TES, MOPS, PIPES, какодилат или MES.
В различных вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, модифицирующие ионную силу средства включают те средства, которые известны в данной области, например, глицерин, пропиленгликоль, маннит, глюкозу, декстрозу, сорбит, хлорид натрия, хлорид калия и другие электролиты.
Эффективные модулирующие вязкость средства включают, но не ограничиваясь этим, ионные и неионные водорастворимые полимеры; сшитые полимеры акриловой кислоты, такие как семейство полимеров «карбомеров», например, карбоксиполиалкилены, которые можно получать коммерчески под торговой маркой Carbopol; гидрофильные полимеры, такие как полиэтиленоксиды, полиоксиэтилен-полиоксипропиленовые сополимеры и поливинилспирт; целлюлозные полимеры и производные целлюлозных полимеров, такие как гидроксипропилцеллюлоза, гидроксиэтилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, фталат гидроксипропилметилцеллюлозы, метилцеллюлоза, карбоксиметилцеллюлоза и этерифицированная целлюлоза; камеди, такие как трагакантовая и ксантановая камедь; альгинат натрия; желатин, гиалуроновую кислоту и ее соли, хитозаны, гелланы или какое-либо их сочетание. Типично, не кислые усиливающие вязкость средства, такие как нейтральное или основное средство, используют для того, чтобы облегчать достижение желаемого pH состава.
В различных вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, составы для инъекции можно соответствующим образом формулировать в виде стерильного не водного раствора или в виде высушенной формы (например, лиофилизированной), подлежащей использованию в сочетании с подходящим наполнителем, таким как стерильная апирогенная вода. Получение составов для инъекции в стерильных условиях, например, посредством лиофилизации, можно легко выполнять с использованием стандартных фармацевтических способов, общеизвестных специалистам в данной области. В одном из вариантов осуществления вязкость раствора, содержащего гиалуроновую кислоту, повышают посредством добавления связывающего гиалуроновую кислоту синтетического пептидогликана.
В различных вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, растворимость связывающего гиалуроновую кислоту синтетического пептидогликана, используемого при получении составов для введения посредством инъекций, можно увеличивать посредством подходящих способов получения составов, таких как включение увеличивающих растворимость композиций, таких как маннит, этанол, глицерин, полиэтиленгликоли, пропиленгликоль, полоксомеры и другие, известные специалистам в данной области.
В различных вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, составы для введения посредством инъекции можно формулировать для незамедлительного и/или модифицированного высвобождения. Составы с модифицированным высвобождением включают составы с отсроченным, замедленным, импульсным, контролируемым, нацеленным и программируемым высвобождением. Таким образом, связывающий гиалуроновую кислоту синтетический пептидогликан можно формулировать в виде твердого вещества, полутвердого вещества или тиксотропной жидкости для введения в виде имплантированного депо, обеспечивающего модифицированное высвобождение активного соединения. Иллюстративные примеры таких составов включают покрытые лекарственными средствами стенты и микросферы из сополимера (DL-молочной, гликолевой) кислоты (PGLA). В другом варианте осуществления связывающие гиалуроновую кислоту синтетические пептидогликаны или композиции, содержащие связывающий гиалуроновую кислоту синтетический пептидогликан, можно вводить непрерывно, где это применимо.
В любом из вариантов осуществления, описанных в настоящем документе, связывающий гиалуроновую кислоту синтетический пептидогликан можно вводить отдельно или в комбинации с подходящими фармацевтическими носителями или разбавителями. Ингредиенты разбавители или носители, используемые в составе связывающего гиалуроновую кислоту синтетического пептидогликана, можно выбирать с тем, чтобы они не ослабляли желаемые эффекты связывающего гиалуроновую кислоту синтетического пептидогликана. Состав связывающего гиалуроновую кислоту синтетического пептидогликана может быть в любой подходящей форме. Примеры подходящих лекарственных форм включают водные растворы связывающего гиалуроновую кислоту синтетического пептидогликана, например, раствор в изотоническом физиологическом растворе, 5% глюкозе или других общеизвестных фармацевтически приемлемых жидких носителях, таких как спирты, гликоли, сложные эфиры и амиды.
Подходящие дозы связывающего гиалуроновую кислоту синтетического пептидогликана можно определять стандартными способами, например, посредством создания кривых доза-эффект на лабораторных животных моделях или в клинических исследованиях. В различных вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, доза связывающего гиалуроновую кислоту синтетического пептидогликана может варьировать значительно в зависимости от состояния пациента, состояния заболевания, подлежащего лечению, пути введения и распределения в тканях, а также возможности совместного использования с другим терапевтическим лечением. Иллюстративно, подходящие дозы связывающего гиалуроновую кислоту синтетического пептидогликана (вводимого одним болюсом или с течением времени) включают приблизительно от 1 нг/кг приблизительно до 10 мг/кг, приблизительно от 100 нг/кг приблизительно до 1 мг/кг, приблизительно от 1 мкг/кг приблизительно до 500 мкг/кг или приблизительно от 100 мкг/кг приблизительно до 400 мкг/кг. В каждом из этих вариантов осуществления доза/кг относится к дозе на килограмм массы пациента или массы тела. В других иллюстративных аспектах, эффективные дозы могут находиться в диапазоне приблизительно от 0,01 мкг приблизительно до 1000 мг/доза, приблизительно от 1 мкг приблизительно до 100 мг/доза, или приблизительно от 100 мкг приблизительно до 50 мг/доза, или приблизительно от 500 мкг приблизительно до 10 мг/доза, или приблизительно от 1 мг до 10 мг/доза, или приблизительно от 1 приблизительно до 100 мг/доза, или приблизительно от 1 мг до 5000 мг/доза, или приблизительно от 1 мг до 3000 мг/доза, или приблизительно от 100 мг до 3000 мг/доза, или приблизительно от 1000 мг до 3000 мг/доза. В одном из вариантов осуществления подходящие дозы связывающего гиалуроновую кислоту синтетического пептидогликана включают концентрации в диапазоне приблизительно от 0,01 мкМ приблизительно до 100 мкМ, приблизительно от 0,05 приблизительно до 100 мкМ, приблизительно от 0,1 мкМ приблизительно до 100 мкМ, приблизительно от 0,1 мкМ приблизительно до 50 мкМ, приблизительно от 0,1 мкМ приблизительно до 20 мкМ, приблизительно от 0,1 мкМ приблизительно до 10 мкМ, приблизительно от 0,5 мкМ приблизительно до 10 мкМ, приблизительно от 0,5 мкМ приблизительно до 50 мкМ и приблизительно от 0,5 мкМ приблизительно до 100 мкМ. В другом варианте осуществления подходящие дозы связывающего гиалуроновую кислоту синтетического пептидогликана включают концентрации приблизительно 0,01 мкМ, 0,1 мкМ, 0,2 мкМ, 0,5 мкМ, 1 мкМ, 2 мкМ, 5 мкМ, 10 мкМ, 20 мкМ, 50 мкМ и 100 мкМ.
Связывающий гиалуроновую кислоту синтетический пептидогликан можно формулировать в эксципиенте. В любом из вариантов осуществления, описанных в настоящем документе, эксципиент может иметь концентрацию в диапазоне приблизительно от 0,4 мг/мл приблизительно до 6 мг/мл. В различных вариантах осуществления концентрация эксципиента может находиться в диапазоне приблизительно от 0,5 мг/мл приблизительно до 10 мг/мл, приблизительно от 0,1 мг/мл приблизительно до 6 мг/мл, приблизительно от 0,5 мг/мл приблизительно до 3 мг/мл, приблизительно от 1 мг/мл приблизительно до 3 мг/мл, приблизительно от 0,01 мг/мл приблизительно до 10 мг/мл и приблизительно от 2 мг/мл приблизительно до 4 мг/мл.
В вариантах осуществления, где связывающий гиалуроновую кислоту синтетический пептидогликан имплантируют в качестве части восстанавливающей хрящ композиции или устройства (например, геля для имплантации), можно использовать любой описанный выше подходящий состав.
Можно использовать любую эффективную схему введения связывающего гиалуроновую кислоту синтетического пептидогликана. Например, связывающий гиалуроновую кислоту синтетический пептидогликан можно вводить в виде однократной дозы или в виде многодозовой суточной схемы. Кроме того, в качестве альтернативы каждодневному лечению можно использовать чередующуюся схему, например, от одних до пяти суток в неделю.
В различных вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, пациента лечат множеством инъекций связывающего гиалуроновую кислоту синтетического пептидогликана. В одном из вариантов осуществления пациенту инъецируют множество раз (например, приблизительно от 2 приблизительно до 50 раз) связывающий гиалуроновую кислоту синтетический пептидогликан, например, с 12-72-часовыми интервалами или с 48-72-часовыми интервалами. Дополнительные инъекции связывающего гиалуроновую кислоту синтетического пептидогликана можно вводить пациенту с интервалом в сутки или месяцы после начальной инъекции(ий).
В любом из вариантов осуществления, описанном в настоящем документе, следует понимать, что комбинацию двух или более связывающих гиалуроновую кислоту синтетических пептидогликанов, отличающихся пептидной частью, гликановой частью или обеими, можно использовать вместо одного связывающего гиалуроновую кислоту синтетического пептидогликана.
Также следует принимать во внимание, что в приведенных выше вариантах осуществления определенные аспекты соединений, композиций и способов представлены в списках альтернатив, например, в качестве иллюстрации, выбор какого-либо одного или нескольких из G и P. Следовательно, следует понимать, что различные альтернативные варианты осуществления изобретения включают отдельные элементы этих списков, а также различные подмножества из этих списков. Каждую из этих комбинаций следует понимать как описанную в настоящем документе посредством списков.
В следующих иллюстративных примерах термины «миметик аггрекана» и «миметик» используют синонимично с термином «связывающий гиалуроновую кислоту синтетический пептидогликан».
ПРИМЕР 1
Синтез пептидов
Все пептиды синтезировали с использованием пептидного синтезатора Symphony (Protein Technologies, Tucson, AZ), в котором используют протокол с FMOC на смоле Кнорра. Неочищенный пептид освобождали от смолы с использованием TFA и очищали посредством хроматографии с обращенной фазой на AKTAexplorer (GE Healthcare, Piscataway, NJ) с использованием колонки с обращенной фазой Grace-Vydac 218TP C-18 и градиентом воды/ацетонитрила 0,1% TFA. Дансил-модифицированные пептиды получали посредством добавления дополнительной стадии сочетания с дансил-глицином (Sigma) перед освобождением от смолы. Структуры пептидов подтверждали масс-спектрометрией. Следующие пептиды получали, как описано выше: GAHWQFNALTVRGGGC, KQKIKHVVKLKGC и KLKSQLVKRKGC.
ПРИМЕР 2
Функционализация хондроитинсульфата и получение синтетического пептидогликана
Схему реакции для создания аггреканового миметика (т.е. GAH) можно видеть на фиг.1. Функционализацию хондроитинсульфата (CS) (Sigma, St. Louis, MO) осуществляли с использованием периодата натрия (Thermo Scientific, Waltham, MA) для того, чтобы окислять CS. Изменяя длительность реакции и концентрацию периодата натрия, управляли числом альдегидных групп, получаемых посредством реакции окисления, значения представлены в таблице 2. В таблице 2 приведены детали относительно концентрации периодата натрия и длительности реакции, необходимых для получения желаемого числа альдегидов на цепь CS. В ходе постепенных химических реакций, схема представлена на фиг.1, число BMPH, прикрепляемых к каждой цепи CS, полагали равным числу получаемых альдегидов и числу прикрепленных связывающих гиалуроновую кислоту (HA) пептидов. Основываясь на длительности реакции и концентрации периодата натрия, в таблице 2 представлено число пептидов (среднее) на одну цепь CS.
Таблица 2
Концентрация периодата натрия (мМ)
Длительность реакции (ч)
Число альдегидов/цепь CS
10
24
3
20
24
7,2
30
24
8,5
20
48
9
30
48
10,5
Концентрацию CS сохраняли постоянной на уровне 20 мг/мл для всех реакций окисления. Защищая от света, проводили реакции измеренных количеств CS и периодата натрия в 0,1M натрий-ацетатном буфере (pH 5,5) с указанными длительностями. Завершения реакции достигали посредством удаления периодата натрия посредством осуществления гельфильтрационной хроматографии с колонкой Bio-Scale Mini Bio-Gel, наполненной полиакриламидными гранулами (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), с использованием ÄKTA Purifier FPLC (GE Healthcare, Piscataway, NJ). Подвижный буфер, используемый для процесса обессоливания, представлял собой 1× фосфатно-солевой буфер (PBS, pH 7,4, Invitrogen, Carlsbad, CA).
Проводили реакцию N-[β-малеимидопропановой кислоты]гидразида,трифторуксусной кислоты соли (BMPH, Pierce, Rockford, IL) в 50M избытке с обессоленным окисленным CS в 1× PBS. Гидразидный конец BMPH вступал в реакцию с ковалентным присоединением к функционализированному CS, через новые созданные альдегиды, чтобы формировать промежуточное шиффово основание. Цианоборгидрид натрия (5M, Pierce) добавляли в реакцию для того, чтобы восстанавливать промежуточное иминовое шиффово основание до более стабильного амина. Избыток BMPH удаляли из раствор посредством FPLC обессоливания в деионизированной воде. Благодаря способности ÄKTA Purifier FPLC, к обнаружению поглощения, измеряли количество избыточного BMPH. Маленький размер и низкая молекулярная масса BMPH (297,19 г/моль) вели к его элюированию из колонки в отдельный, значительно более поздний момент времени. В присутствие его множественных одинарных связей и случайных двойных связей, BMPH создавал спектр сильного поглощения как на длине волны 215 нм (характерна для одинарных связей), так и на длине волны 254 нм (характерна для двойных связей). Следовательно, получали калибровочную кривую, отражающую корреляцию известной массы BMPH с интегрированной площадью спектров поглощения 215 нм, фиг. 2. С использованием этой калибровочной кривой определяли массу избыточного BMPH. Вычитание массы избыточного BMPH из исходной массы в реакции позволяет определить массу BMPH, израсходованного в реакции. Используя израсходованную массу, вычисляли число связей BMPH с окисленным CS. Собранный продукт CS-BMPH замораживали, лиофилизировали и хранили при -80°C.
Связывающую HA пептидную последовательность идентифицировали по Mummert. Небольшие модификации в идентифицированной последовательности позволяли получать специфическую связывающую HA последовательность, GAHWQFNALTVRGGGC (обозначена как GAH), которую использовали в этом исследовании. Пептид получали с помощью и приобретали в Genscript (Piscataway, NJ). Аминокислоту цистеин включали для того, чтобы сделать возможным сочетание, посредством формирования тиоэфирной связи, с малеимидной группой в BMPH. Эта реакция протекает с соотношением 1:1, что позволяет допустить, что число BMPH, связанных с функционализированным CS, равно числу прикрепленных пептидов GAH. Пептид GAH, в избытке 1 моль по отношению к числу BMPH, связанных с каждой цепью, растворяли в диметилсульфоксиде (DMSO, Sigma) и добавляли в раствор CS-BMPH с 15 минутными интервалами по четверти объема за раз. После последнего добавления пептида GAH, реакции позволяли протекать два часа. В течение этого времени избыточный пептид GAH формировал частицы. Перед очисткой раствора для получения GAH функционализированного CS, раствор пропускали через фильтр Acrodisc с диаметром пор 0,8 мкм (Pall, Port Washington, NY) для того, чтобы удалять избыток пептидных частиц. Затем раствор пропускали, с деионизированной водой, через ÄKTA Purifier FPLC для того, чтобы очищать соединение GAH-CS. Затем собираемое соединение замораживали при -80°C и лиофилизировали для того, чтобы получать желаемый аггрекановый миметик. По принятому в лаборатории соглашению, аггрекановый миметик называли как (число прикрепленных пептидов) (первые три буквы последовательности пептида) - (GAG сокращение для функционализации), т.е. для аггреканового миметика, 3GAH-CS для 3 GAH связывающих HA пептидов, функционализированных на остов хондроитинсульфата GAG.
ПРИМЕР 3
Связывание синтетического пептидогликана с гиалуроновой кислотой
Связывание синтетического пептидогликана с иммобилизованной гиалуроновой кислотой
Гиалуроновую кислоту (HA, из Streptococcus equi, Sigma) в концентрации 4 мг/мл, иммобилизовали в 96-луночном планшете (Costar, blk/clr, Corning, Corning, New York) в течение ночи при 4°C. Меченные биотином пептиды GAH связывали, посредством BMPH, с функционализированным CS в концентрации 1 биотин-GAH на каждую цепь CS. Немеченные пептиды GAH связывали с остающимися не вступившими в реакцию альдегидами в CS. Стандартные способы обнаружения с биотином-стрептавидином использовали для того, чтобы определять степень связывания аггреканового миметика с иммобилизованной HA. Блокирование HA поверхности выполняли в течение одного часа с использованием 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA, Sera Care Life Sciences, Milford, MA) в 1× растворе PBS. После промывания с использованием 1× PBS, меченный биотином аггрекановый миметик инкубировали в лунке в течение 30 минут и затем промывали с использованием 1× PBS. Стрептавидин-пероксидазу хрена (R&D Systems, Minneapolis, MN) раствор добавляли в каждую лунку и проводили реакцию в течение 20 минут. После завершения реакции и промывания, добавляли раствор хромогена (Substrate Reagent Pack, R&D Systems) и осуществляли проявку в течение 15 мин. На 15 мин серную кислоту (Sigma) добавляли непосредственно в каждую лунку для того, чтобы останавливать реакцию. Затем планшет с лунками считывали на считывателе планшетов M5 SpectraMax (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) при длинах волн 450 и 540 нм. Посредством вычитания двух полученных показаний поглощения определяли поглощение из-за связанного меченного биотином аггреканового миметика.
Один пептид GAH на каждом аггрекановом миметике замещали меченным биотином пептидом GAH и теперь меченный аггрекановый миметик инкубировали с иммобилизованной HA. Коммерчески доступные продукты обнаружения биотина (через стрептавидин и HRP) демонстрировали степень связывания миметика с иммобилизованной HA (см. фиг.3). Начиная с концентрации 1 мкМ аггрекановый миметик имел зависящее от дозы увеличение присутствия на иммобилизованной HA, доказывая, что миметик связывался с HA. Однако определение аффинности связывания миметика не осуществляли из-за неопределенности количества иммобилизованной HA.
Полученное на реометре связывание синтетического пептидогликана с гиалуроновой кислотой
Растворы HA получали для того, чтобы тестировать способность аггреканового миметика связываться с HA в физиологически более релевантной ситуации. Способность аггреканового миметика связываться с HA определяли по улучшению динамического модуля упругости раствора, которое указывает на сшивание HA миметиком. В 1× PBS pH 7,4 получали множество воздействий для того, чтобы тестировать способность аггреканового миметика связывать HA: 2,5% масс. HA контроль, HA+CS в молярном соотношении CS:HA 25:1, HA+3GAH-CS 25:1, HA+7,2GAH-CS 25:1, HA+10,5GAH-CS 25:1.
Используя реометр AR-G2 (TA Instruments, New Castle, DE), качания частоты (0,1-100 Гц, 2,512 Па) и механического напряжения (0,1-100 Па, 1,0 Гц) проводили для того, чтобы измерять динамический модуль упругости каждого раствора.
Реология изучает течение вещества в ответ на приложенные усилия и часто используется, когда измеряют вязкоупругие материалы. В частности, реометр определяет динамический модуль упругости и модуль потерь, основываясь на обратной реакции вещества на приложенное усилие. Динамический модуль упругости представляет собой меру количества энергии, которую эластически поглощает вещество, а модуль потерь отражает количество потерь энергии через тепло. Большой динамический модуль упругости указывает на гелеобразное вещество с более жесткой, эластической структурой; тогда как маленький динамический модуль упругости и большой модуль потерь указывают на вязкий материал, который эластически не удерживает приложенную нагрузку. Высокомолекулярная HA (~1,5 МДа) представляет собой очень вязкий материал, который эластически удерживает часть приложенной нагрузки из-за псевдогеля, образуемого посредством запутывания цепей HA. Создаваемый аггрекановый миметик содержит множество связывающих HA пептидов, которые могут действовать в качестве определенного типа сшивателя цепей HA, предполагая достаточное связывание миметика с HA. В растворе с высокомолекулярной HA гипотетически аггрекановый миметик может повышать жесткость раствора, создавая более высокий динамический модуль упругости. Более высокий динамический модуль упругости может отражать обширное сшивание HA, свидетельствуя о сильной аффинности связывания между аггрекановым миметиком и цепями HA, присутствующими в смеси. Тестировали множество версий аггреканового миметика, которые различались числом пептидов GAH (в среднем 3, 7,2 или 10,5), прикрепленных к каждой функционализированной цепи CS.
Результаты эксперимента, представленные на фиг.4, показывали, что добавление CS значительно (α=0,05) снижало динамический модуль упругости раствора HA. Добавление плотных отрицательных зарядов, связанных с CS, помогало расправлять цепи HA, снижая степень запутывания HA и удаляя псевдогель, который хранил приложенную энергию. В подтверждение этой гипотезы, с увеличением числа пептидов GAH на один CS от 3 до 10,5 динамический модуль упругости смеси также возрастал. Это возрастание можно приписать двум полезным атрибутам присутствия более высокого числа пептидов GAH на каждом аггрекановом миметике. Во-первых, чем больше пептидов GAH прикреплено к каждому CS, тем выше авидность миметика, что ведет к более сильному связыванию миметика с молекулой HA. Во-вторых, чем больше пептидов GAH прикреплено к каждому CS, тем выше вероятность того, что миметик действует в качестве сшивателя между молекулами HA. Оба эффекта благоприятствуют более гелеобразным смесям, что ведет к более высокому измеряемому динамическому модулю упругости. Более слабое связывание между миметиком и HA не будет восстанавливать псевдогель и он не будет способен хранить приложенную с реометра энергию. Повышение динамического модуля упругости подтверждает сильное связывание миметика с иммобилизованной HA, как показано на фиг.3. В частности, при 10,5 пептида GAH на каждую цепь CS, динамический модуль упругости значительно (α=0,05) выше, чем у HA+CS контроля, достигая среднего динамического модуля упругости, схожего с HA контролем.
ПРИМЕР 4
Исследования сжатия синтетического пептидогликана
Формирование коллагенового геля и мутность
2
4
Для того, чтобы имитировать внеклеточный матрикс нативного хряща, коллаген использовали для того, чтобы задерживать агрегаты HA и аггреканового миметика внутри природного каркаса. Коллаген II типа (CII) получали из двух различных коммерческих источников (Affymetrix, Santa Clara, CA и Sigma). Смеси компонентов ECM хряща получали в буфере TES (60 мМ TES, 20 мМ NaHPO, 0,56M NaCl, реактивы из Sigma) pH 7,6 в соответствии с деструкцией нативных компонентов, где CII составлял 70% сухой массы и комбинация контроля из HA и аггреканового миметика/CS составляла остальные 30% сухой массы смеси. Конечная концентрация CII в геле составляла 2 мг/мл. Образцы состояли из CII контроля, CII+HA+CS контроля и CII+HA+аггрекановый миметик (10,5GAH-CS). Для того чтобы предотвращать преждевременный фибриллогенез и формирование геля, растворы держали на льду при кислом pH. Растворенные смеси компонентов помещали в 384-луночный планшет (Greinier blk/clr, Monroe, NC), помещали в 37°C и физиологический pH для того, чтобы инициировать фибриллогенез, и осуществляли мониторинг при 313 нм на M5 SpectraMax для того, чтобы определять образование геля. CII не был способен формировать гели, когда содержался с различными обработками (см. дополнительную информацию). Следовательно, коллаген I типа (CI, High Concentration Rat Tail Collagen Type 1, BD Biosciences, Bedford, MA) использовали для образования геля. Для CI использовали те же обработки и процедуру, за исключением того, что массы компонентов смещали к конечной концентрации CI 4 мг/мл. CI использовали для всех следующих экспериментов.
Мутность с использованием CI осуществляли для того, чтобы измерять образование копии хряща, результаты представлены на фиг.5. Как подемонстрировано, добавление HA+10,5GAH-CS не влияло на фибриллогенез коллагеновых волокон. Все воздействия придерживались схожей кривой и достигали схожих пиков поглощения приблизительно в одно и то же время. Воздействие HA+10,5GAH-CS имело более высокое начальное поглощение из-за склонности аггрекановых миметиков к образованию спонтанных агрегатов в 1× растворе PBS, не из-за преждевременного образования волокон CI. Агрегирование 10,5GAH-CS распознавали во время начальных реометрических тестов HA, но агрегирование не ингибировало способность аггреканового миметика связывать с HA.
Тестирование свойств коллагенового геля
Тесты сжатие геля на основе коллагена и качания частоты проводили с использованием реометра AR-G2 и параллельных пластин на расстоянии 20 мм (TA Instruments). 375 мкл гелевых смесей получали на льду и пипетировли на базовую пластину реометра. Расстояние уменьшали до расстояния зазора 1 мм и раствор нагревали до 37°C. Удерживатель влаги использовали для того, чтобы предотвращать дегидратацию геля, пока смесь образовывала гель в течение двух часов. Это двухчасовое значение определяли посредством продемонстрированных данных до времени желатинирования из данных мутности. После двухчасового периода времени гели сжимали или заставляли колебаться, в зависимости от теста. Тесты на сжатие проходили при скорости условной деформации 1% (10 мкм) в секунду. Измеряли расстояние зазора и нормальное усилие на измерительной головке. Посредством качания частоты измеряли динамический модуль упругости полученных гелей во время логарифмического десятичного увеличения частоты от 0,1 до 1 Гц.
Одновременно измеряли нормальное усилие и смещение и для воздействий вычисляли условное напряжение и деформацию. Как показано на фиг.6, включение аггреканового миметика значительно (α=0,05) повышало прочность на сжатие гелевого комплекса. Пиковое условное напряжение коллагена+HA+AGG миметика достигало 7,5 кПа при условной деформации 9%, тогда как контроль коллаген+HA+CS достигал пика 4,8 кПа при 4% и коллагеновый контроль достигал пика 4,2 кПа при 15% деформации.
Два фактора вносили вклад в повышение прочности на сжатие геля CI+HA+10,5, первым является способность миметика привлекать воду, а вторым является способность аггреканового миметика сшивать HA. В нативном хряще преобладание захваченных отрицательных зарядов, предоставляемых HA и CS, привлекает воду и замедляет ее диффузию из хряща. Когда компрессионное усилие прикладывают к хрящу, вода не способна диффундировать наружу в синовиальную капсулу. Удерживание этой несжимаемой воды повышает прочность структуры на сжатие. Аналогичным образом в тестируемых гелевых комплексах включение отрицательных зарядов, связанных с CS, в гель обеспечивает такое же привлечение. Как можно видеть на фиг.6, воздействие как с использованием CS, так и с использованием 10,5GAH-CS, имеет повышенную прочность на сжатие. Воздействие CS не фиксировано внутри комплекса CI (он не связан с HA) и, следовательно, после небольшой компрессионной деформации, CS и привлеченная им вода диффундируют из комплекса в окружающее текучее вещество. Диффузия CS и воды из комплекса снижает прочность комплекса на сжатие, что обуславливает схожесть компрессионного профиля получаемого геля с таковым контроля из коллагенового каркаса. В отличие от этого 10,5GAH-CS связан с вплетенной HA. Следовательно, значительно более высокое компрессионное напряжение необходимо для того, чтобы преодолеть связывание миметика с HA и вызывать диффузию CS и привлеченной воды из комплекса.
Во-вторых, способность аггреканового миметика действовать в качестве сшивателя HA ведет к более высокой степени задержания для HA и миметика. Сшивающие HA свойства эффективно создают большие агрегаты внутри коллагенового комплекса, подобно агрегатам нативного аггрекана/HA. Основное различие между аггрекановым миметиком и нативным аггреканом заключается в размере молекулы. Отдельно остов белка аггрекана имеет массу ~220 кДа, тогда как аггрекановый миметик целиком имеет массу только приблизительно 30 кДа. Следовательно, нативный агрегатный комплекс более чем 100 молекулами аггрекана, связанными с HA, создает значительно более крупные агрегаты, чем может создавать аггрекановый миметик. Однако, действуя в качестве сшивателя между цепями HA, аггрекановый миметик может создавать свою собственную форму агрегата, который также имеет основные характеристики нативных агрегатов; объемные отрицательно-заряженные структуры. Роль аггреканового миметика в качестве сшивателя HA дополнительно изучали посредством приложения сдвигающей нагрузки в реологических тестах на CI гелях, описанных выше. Результаты этих экспериментов можно видеть на фиг.7.
Включение 10,5GAH-CS значительно (α=0,05) повышало динамический модуль упругости формируемого геля. Сеть, создаваемая посредством связывания миметика с HA, дополняла существующую жесткость CI матрикса, делая возможным повышенное эластическое поглощение энергии, прикладываемой посредством сдвигающей нагрузки. Это исследование имело важное значение, поскольку оно верифицирвало сшивающую способность 10,5GAH-CS и создание альтернативной формы агрегата.
ПРИМЕР 5
Защита синтетическими пептидогликанами от разрушения гиалуроновой кислоты
Значения динамической вязкости растворов HA определяли с использованием AR-G2. растворы высокомолекулярной HA имеют высокую вязкость из-за сильного запутывания цепей, обусловленного большой длиной цепей. Гиалуронидаза (Type II from Sheep Testes, Sigma) расщепляет цепь HA, создавая более короткие цепи с меньшим запутыванием. Более короткие цепи HA будут иметь заметно более низкую вязкость. Растворы HA инкубировали гиалуронидазой с 100 Ед/мл. Динамическую вязкость определяли с использованием развертки по времени с постоянной угловой частотой и колебательным напряжением в нулевой момент и во временных точках 2 и 4 часа. Образцы (с 0,5% масс. HA) состояли из HA, HA+CS и HA+10,5GAH-CS. Значения воздействия добавляли при молярном соотношении воздействия к HA 75:1. Процент разрушения вычисляли для каждого измерения посредством деления начальной вязкости из разности измеренной вязкости минус начальная вязкость.
В работе Pratta et al. и Little et al. показана важность аггрекана для предотвращения разрушения компонентов хряща. Разрушение хрящевого матрикса при остеоартрите начинается с расщепления аггрекановых протеогликанов. Удаление богатых GAG области протеогликана обнажает остальные компоненты, CII и HA, для разрушающих ферментов. Зная о важности аггрекана для предотвращения разрушения, проводили исследования для того, чтобы определять способность аггреканового миметика предотвращать разрушение HA.
Вязкость раствора HA зависит от размера цепей HA. Из-за запутывания более крупные цепи HA создают более высокую вязкость. Под действием гиалуронидазы происходит расщепление цепи HA на более мелкие блоки. Следовательно, происходит уменьшение размера HA и количества запутывания HA. Это снижение вызывает схожее снижение измеряемой вязкости. Процент изменения вязкости растворов HA в присутствии гиалуронидазы предоставляет ключевую информацию о том, какому количеству разрушения подверглась HA. На фиг.8 представлен процент разрушения HA контроля в сравнении с ассоциированными воздействиям. Как можно видеть, AGG миметик, GAH, значительно снижал скорость разрушения HA, указывая на то, что он ведет себя аналогично нативному AGG при защите компонентов ECM.
Вязкость для каждого воздействия без гиалуронидазы (TES буфером замещали объем гиалуронидазы) изначально измеряли и использовали в качестве базового уровня для вычисления процента разрушения. Во временной точке 0 часов выполняли добавление гиалуронидазы, смешивание раствора, пипетирование на реометр и начинали операцию уравновешивания прибора. Следовательно, временная точка 0 ч наступала приблизительно через две минуты после добавления гиалуронидазы. Высокую концентрацию гиалуронидазы (25 Ед/мл) использовали для воспроизведения наихудшего возможного сценария. Кроме того, молекулы HA были диспергированы в растворе, а не плотно вплетены в коллагеновую сеть. Как можно видеть на фиг.8, как HA контроль, так и воздействие HA+CS имели почти полное разрушение раствора HA во временной точке 0 ч. В отличие от этого добавление 10,5GAH-CS значительно (α=0,05) снижало количество разрушения HA. Фактически присутствие 10,5GAH-CS повышало вязкость выше базовых значений. Полагают, что добавление гиалуронидазы расщепляет некоторый избыток HA. Это позволяет 10,5GAH-CS лучше сшивать остающиеся интактные цепи, создавая более плотный гель, который создавал более высокую вязкость.
Во временной точке 2 часа как HA контроль, так и HA+CS полностью разрушались с процентом разрушения выше 90%, но HA раствор с 10,5GAH-CS имел значительно (α=0,05) более низкий процент разрушения. Наконец, во временной точке 4 часа разрушались все воздействия, причем у всех процент разрушения превышал 90%. В трех временных точках 10,5GAH-CS не был способен полностью предотвращать разрушение HA, но он существенно снижал скорость разрушения по сравнению с разрушением HA контроля и HA+CS. Эта сниженная скорость демонстрирует, что 10,5GAH-CS предотвращает разрушение цепей HA. Полагают, что это предотвращение осуществляется через конкурентное ингибирование точки расщепления гиалуронидазой на цепи HA. Нековалентное связывание миметика с цепью HA в сочетании со ступенчатой скоростью разрушения цепей HA, похоже, подтверждает это предположение. Кроме того, скорость разрушения раствора 10,5GAH-CS все еще считают искусственно завышенной. При инкубации миметика с раствором HA происходило образование агрегатов HA+10,5GAH-CS. Однако эти агрегаты не распространялись единообразно по всему объему раствора. Следовательно, растворы смешивали аналогично другим образцам перед выполнением измерения. Смешивание раствора разрушало агрегаты, вытесняя 10,5GAH-CS и обнажая точку расщепления гиалуронидазой. Даже после временной точки 4 часа, когда предположительно наступало полное разрушение, все еще происходило значительное агрегирование HA+10,5GAH-CS. В компактном матриксе, таком как ECM хряща, возможно, что 10,5GAH-CS могло не только значительно снижать скорость разрушения, но и подавлять разрушение HA.
ПРИМЕР 6
Низкотемпературная сканирующая электронная микроскопия (SEM)
Конструкции на основе ECM, как описано для измерения мутности, формировали на пластине SEM при 37°C в течение ночи. Пластины SEM крепили в держателе и погружали в талый снег из азота. В предварительную камеру Gatan Alto 2500 образец переносили в вакууме. Внутри камеры, охлажденной до -170°C, охлажденный скальпель использовали для того, чтобы на образце создавать поверхность свободного разлома. Образец подвергали сублимации при -85°C в течение 15 минут с последующим покрытием платиновым напылением в течение 120 секунд. После покрытия напылением образец переносили на столик микроскопа и изображения получали при -130°C.
Репрезентативные изображения получали на увеличении 10000×, как показано на фиг.9. На изображении A представлен CI контроль, который отличается посредством обширным сшиванием между основными волокнами и относительно маленьким размером пор в матриксе. На изображении B представлен CI+HA+CS, который содержит обширное сшивание, но поры более крупного размера из-за присутствия больших цепей HA. На изображении C представлен CI+HA+10,5GAH-CS, который иллюстрирует заметно меньшую степень сшивания в дополнение к очень большому размеру пор. AGG миметик может связываться с HA, создавая относительно большой, громоздкий комплекс, который затрудняет сшивание CI.
Как можно определить по репрезентативным изображениям, добавление HA+CS не оказывает эффекта на вариацию диаметра коллагеновых волокон, но образец HA+CS имеет большее репрезентативное пустое пространство. В сравнении с контрольными группами, добавление AGG миметика с HA вело к меньшей вариации диаметра коллагеновых волокон из-за ограниченного числа волокон маленького диаметра, и общего увеличения пустого пространства образца. Связывание AGG миметика с молекулой HA создавало агрегатный комплекс, который был захвачен коллагеновым каркасом и исключал образование меньших волокон между большими волокнами из-за стерического затруднения.
ПРИМЕР 7
Защита коллагена
2
Конструкции на основе ECM, содержащие только коллаген, коллаген+HA+CS или коллаген+HA+10,5GAH-CS, создавали в 8-луночных камерных слайдах, как описано ранее. Конечный объем образца составлял 200 мкл и состоял из 0,8 мг коллагена I типа. Матриксную металлопротеазу I (MMP-I, R&D Systems, Minneapolis, MN) в концентрации 0,133 мг/мл, активировали, придерживаясь протокола, подробно изложенного в инструкциях производителя. В кратком изложении, MMP-1, уже растворенную в буфере производителя (50 мМ Tris, 10 мМ CaCl, 150 мМ NaCl, 0,05% Brij-35, pH 7,5), объединяли с равным объемом 25 мМ APMA (Sigma) в DMSO при 37° C в течение 2 часов для того, чтобы активировать фермент. После активации, раствор MMP-1 разводили два раза водой и добавляли в образец в виде 100 мкл супернатанта. Образцы инкубировали при 37°C и мягком встряхивании. Через двадцать пять часов после добавления начального раствора фермента, супернатант удаляли и заменяли на свежую порцию фермента. После всего 50 часов инкубации с ферментом, остающиеся гели удаляли из камерных слайдов, промывали деионизированной водой для того, чтобы удалять какой-либо раствор фермента или продукты разрушения, и повторно солюбилизировали в 12M HCl. Образцы разводили в воде для того, чтобы достигать конечной концентрации 6M HCl, и гидролизовали в течение ночи при 110°C. После гидролиза количество гидроксипролина (hyp) анализировали согласно протоколу, разработанному Reddy et al. (Clin Biochem, 1996, 29: 225-9). В кратком изложении, гидролизованные образцы инкубировали с раствором хлорамина T (0,56M) в течение 25 минут при комнатной температуре до добавления реактива Эрлиха и последующего проявления хлорофора в течение 20 минут при 65°C. после проявления хлорофора, образцы считывали на спектрофотометре при длине волны 550 нм. Показания поглощения сравнивали с таковыми, полученными для известных концентраций коллагена для того, чтобы определять количество коллагена, остающегося в каждом образце.
Каждый образец копии конструировали с использованием 0,8 мг CI и после разрушения остающееся CI количество определяли с помощью протокола, разработанного Reddy et al., и переводили это в количество CI с помощью набора стандартов CI. Процент разрушения определяли посредством вычитания остающегося CI из исходного CI, деления на исходный CI и умножения на 100. Процент разрушения для трех воздействий представлен на фиг.10. Все воздействия значительно отличались друг от друга (p<0,05). В частности, процент разрушения образца с AGG миметиком (CI+HA+10,5GAH-CS=41,0%) значительно ниже (p<0,05) других двух воздействий (CI=64,5% и CI+HA+CS=74,7%). Присутствие AGG миметика значительно снижало разрушение CI. Присутствие AGG миметика может действовать в качестве препятствия для сайтов расщепления разрушающих ферментов. Создавая большие агрегаты с HA, которые плотно захватывались коллагеновым каркасом, AGG миметик может занимать пространство близко к коллагену, предотвращая доступ фермента к местоположениям разрушения.
ПРИМЕР 8
Диффузия пептидогликанов через хрящевой матрикс
Хрящевые экспланты получали из несущих нагрузку областей коленных суставов коров в возрасте трех месяцев. Нативный аггрекан удаляли из собранных хрящевых эксплантов, оставляя матрикс, состоящий в первую очередь из коллагена II типа и остаточный GAG. Этого добивались посредством обработки эксплантов 0,5% (масс./об.) трипсинов в HBSS в течение 3 часов при 37°C (фиг. 13). После обработки трипсином экспланты промывали три раза в HBSS и инкубировали в 20% FBS для того, чтобы инактивировать остаточную активность трипсина. Пептидогликан растворяли в дистиллированной воде в концентрации 10 мкМ и осуществляли его диффузию через суставную поверхность хрящевых эксплантов посредством размещения 10 мкл раствора на поверхности каждые десять минут в течение одного часа при комнатной температуре (фиг.14). Нормальный хрящ и обедненный аггреканом хрящ обрабатывали в 1× PBS в качестве положительных и отрицательных контролей, соответственно. После диффузии экспланты промывали три раза в 1× PBS и хранили при -20°C до дальнейшего тестирования. Диффузию пептидогликана подтверждали посредством окрашивания срединного сагиттального среза ткани красителем со стрептавидином-пероксидазой хрена. Краситель со стрептавидином связывается с меченными биотином молекулами и изображен коричневым цветом (фиг.15 и 16).
ПРИМЕР 9
Тестирование на объемное сжатие
Неограниченное сжатие с контролируемым смещением осуществляли на реометре AR G2 с преобразователями силы, способными обнаруживать нормальное усилие в диапазоне 0,01-50Н (TA Instruments). Экспланты приклеивали к дну гидрофобного печатного слайда (Tekdon) и покрывали в ванне с 1× PBS. Измерительную головку с параллельными пластинами из нержавеющей стали 20 мм в диаметре опускали до образования начального контакта. Высоту экспланта измеряли с использованием цифрового микрометра (Duratool). Компрессионные нагрузки 0-30% номинальной деформации (с 5% интервалами) прикладывали к эксплантам с использованием поэтапного нагружения, которое развивали линейно в интервале 5 с (т.е. скорость деформации 1,0%/с), и времени удержания 30 с. Значения компрессионной жесткости получали посредством использования спада значений равновесного напряжения, вычисляемого во время каждого отрезка удержания, с учетом соответствующих значений деформации, основываясь на модели линейного приближения. Каркасы, которые тестировали на объемное сжатие, включают: 1) нормальный хрящ, 2) обедненный аггреканом хрящ (AD) и 3) AD+mAGC (фиг. 17). Добавление связывающего HA пептидогликана (mAGC) значительно восстанавливало жесткость хрящевых эксплантов в более высокой мере по сравнению со связывающим коллаген II типа пептидогликаном (mAG(II)C).
ПРИМЕР 10
Животная модель
Крыс Sprague-Dawley (250~300 г) использовали для хирургического вмешательства. Рассекали надколенное сухожилие, переднюю и заднюю крестообразные связки и медиальную, латеральную коллатеральную связки. Выполняли полную менискэктомию медиального и латерального менисков. Восстанавливали капсулу коленного сустава с использованием рассасывающегося шва и кожу закрывали с использованием 4-0 монофиламентного нейлона. Начиная с недели 4 еженедельно вводили по 10 мкл 1 мкм mAGC.
На степень воспаления указывал MMP-13 зонд (фиг.18) у крыс Sprague-Dawley, на которых воздействовали с использованием и без использования пептидогликана через четыре, шесть и восемь недель после хирургического вмешательства (фиг.19). Рентгеновские изображения коленных суставов крыс Sprague-Dawley показывали травмированное колено через 6 недель и 8 недель после того, как индуцировали OA (фиг.20, изображения A и D, соответственно), травмированное колено с воздействием пептидогликанами (фиг.20, изображения B и E, соответственно) и нормальное колено (фиг.20, изображение C) через шесть недель после хирургического вмешательства, вызывавшего остеоартрит. МикроКТ крыс Sprague-Dawley показывала повторный рост нового хряща через шесть и восемь недель после вызывающего OA хирургического вмешательства. Показаны травмированные колени через 6 недель и 8 недель после того, как вызывали OA, (фиг.21, изображения A и D, соответственно), травмированные колени после воздействия пептидогликанами (фиг.21, изображения B и E, соответственно) и нормальное колено (фиг.21, изображение C).
ПРИМЕР 11
Реактивы
Пептид GAHWQFNALTVRGGGC (GAH) приобретали в Genscript (Piscataway, NJ). N-[ß-малеимидопропановой кислоты]гидразид, соль трифторуксусной кислоты (BMPH) приобретали в Pierce (Rockford, IL). Коллаген I типа хвоста крысы приобретали в BD Biosciences (Bedford, MA). Рекомбинантный интерлейкин-1β человека приобретали в Peprotech (Rocky Hill, NJ). Все другие товары приобретали в VWR (West Chester, PA) или Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), если не указано иное.
ПРИМЕР 12
Синтез коллагенового каркаса
2
4
Коллагеновые каркасы получали в буфере TES (60 мМ TES, 20 мМ NaPO, 0,56M NaCl) при pH 7,6. Композиция каркаса для механического тестирования и исследования на модели воспаления in vitro описаны в их соответствующих разделах. Все растворы хранили на льду до тех пор, пока не инициировали фибриллогенез при 37°C. Выровненные коллагеновые каркасы создавали, помещая раствор коллагена в изоцентр магнита 9,4 Тл (Chemagnetics CMX400) при 37°C в течение одного часа, тогда как невыровненные гели получали аналогичным образом, но без воздействия магнитного поля. Слайд, содержащий раствор коллагена, помещали параллельно магнитному полю, ориентирующему коллагеновые волокна в направлении, перпендикулярном дну слайда. Затем гели хранили при 37°C в течение 24 часов в камере с контролируемой влажностью для того, чтобы предотвращать испарение.
ПРИМЕР 13
Реологическое механическое тестирование
Тестирование на сдвиг и сжатие осуществляли на реометре с контролируемым напряжением AR G2 (TA Instruments) с использованием измерительной головки с параллельными пластинами из нержавеющей стали диаметром 20 мм. Коллагеновые каркасы получали на гидрофобных печатных слайдах диаметром 20 мм (Tekdon). Для тестов на сдвиг измерительную головку опускали до образования контакта при высоте зазора 950 мкм. Предварительные качания частоты и напряжения осуществляли для того, чтобы определять диапазон линейного и независящего от напряжения динамического модуля упругости. Затем осуществляли качание частоты на всех гелях с колебательным напряжением 0,2 Па в диапазоне частот от 0,1 до 2 Гц. Для тестов на сжатие измерительную головку опускали до образования контакта с каркасом при высоте зазора 1000 мкм. Компрессионные нагрузки 0-30% номинальной деформации (с 5% интервалами) прикладывали к коллагеновому каркасу с использованием поэтапного нагружения, которое развивали линейно в интервале 5 с (т.е. скорость деформации 1,0%/с) и времени удержания 30 с. Значения компрессионной жесткости получали посредством использования спада значений равновесного напряжения, которые вычисляли во время каждого отрезка удержания, с учетом соответствующих значений деформации, основываясь на модели линейного приближения. Композиции коллагенового каркаса для механических тестов: 1) невыровненный коллаген, 2) выровненный коллаген, 3) невыровненный коллаген+mAGC и 4) выровненный коллаген+mAGC.
Объемный механический анализ: Аггрекановый миметик, mAGC, улучшал объемные механические свойства каркасов, независимо от выравнивания волокон (фиг.22). Для тестов на сдвиг значения динамического модуля упругости при 0,5 Гц для невыровненных и выровненных коллагеновых гелей составляли 104,1±3,6 Па и 49,9±5,4 Па, соответственно. Добавление mAGC в коллагеновый каркас показывало значительное повышение динамического модуля упругости невыровненных и выровненных гелей до 113,9±4,6 Па и 76,6±3,6 Па, соответственно (p<0,001). Невыровненные гели показывали более высокий динамический модуль упругости по сравнению с выровненными гелями (p<0,0001). Для тестов на сжатие компрессионная жесткость для выровненных каркасов (2478±250 Па) была ниже, чем у невыровненных каркасов (3564±315 Па) (p<0,001). Добавление mAGC в эти каркасные системы повышало компрессионную жесткость выровненных и невыровненных каркасов до 4626±385 Па и 5747±306 Па, соответственно (p<0,0001).
ПРИМЕР 14
Модель воспаления in vitro
Коллагеновые каркасы засевали хондроцитами, которые стимулировали с использованием IL-1β, и оценивали продукты разрушения.
2
Выделение хондроцитов: Первичные хондроциты собирали из коленных суставов коров в возрасте трех месяцев, которых получали со скотобойни в течение 24 часов от забоя (Dutch Valley Veal). Срезы хряща, по 150-200 мкм толщиной, срезали с латерального мыщелка бедренной кости и промывали три раза в бессывороточной среде DMEM/F-12 (50 мкг/мл 2-фосфата аскорбиновой кислоты, 100 мкг/мл пирувата натрия, 0,1% бычьего сывороточного альбумина, 100 Ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 25 мМ HEPES) перед расщеплением с использованием 3% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) и 0,2% коллагеназы-P (Roche Pharmaceuticals) при 37°C в течение шести часов. Высвобожденные хондроциты фильтровали через 70 мкм клеточный фильтр и центрифугировали при 1000 об/мин три раза в течение пяти минут каждый раз в описанной выше среде с добавлением 10% FBS. Клеточный осадок ресуспендировали в средах с добавлением 10% FBS и высевали на 10 см чашки в концентрации 10000 клеток/мл в увлажненный инкубатор 37°C, 5% CO до смыкания слоя.
Изготовление каркаса: После смыкания слоя клетки трипсинизировали и инкапсулировали в концентрации 10000 клеток/мл внутри коллагеновых каркасов (таблица 3) и оставляли уравновешиваться в течение 3 суток перед воздействием.
Таблица 3
Композиция каркаса для тестирования in vitro
Постановка эксперимента с невыровненным коллагеном
Постановка эксперимента с выровненным коллагеном
A: Коллаген+CS+HA+IL-1βB: Коллаген+CS+HAC: Коллаген+mAGG+HA+IL-1βD: Коллаген+mAGG+HA
E: Коллаген+CS+HA+IL-1βF: Коллаген+CS+HAG: Коллаген+mAGG+HA+IL-1βH: Коллаген+mAGG+HA
Модель воспаления: Конструкции инкубировали с или без 20 нг/мл IL-1β в химически определенных средах с добавлением 5% FBS и антибиотиков (100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина). Среду для культивирования заменяли каждые двое суток. Экстракты удаленных сред хранили при -80°C до дальнейшего тестирования.
Анализ разрушения: осуществляли мониторинг разрушения GAG посредством измерения CS, высвобождаемого в среды клеточных культур, с использованием анализа с красителем диметилметиленовым синим (DMMB) и вычисление с использованием калибровочной кривой хондроитин-6-сульфата. Аналогичным образом, осуществляли мониторинг разрушения коллагена I типа в средах клеточных культур с использованием Sircol Collagen Analysis, используя точно описанные производителем протоколы (Bio-Color). Разрушение GAG и коллагена представляли в виде кумулятивного высвобождения в течение восьмисуточного периода культивирования.
CS
коллаген
Анализ протеолитического разрушения: количество CS и коллагена, высвобождаемых в среды клеточных культур, значительно снижались, когда каркасы содержали mAGC (фиг.11, 12, 23 и 24) (p<0,001 и p<0,02, соответственно). Выровненные коллагеновые гели показывали статистически более высокое высвобождение CS и коллагена в среды по сравнению с невыровненными коллагеновыми волокнами (p<0,001).
Как описано в настоящем документе, связывающий гиалуроновую кислоту синтетический пептидогликан способен защищать HA и подлежащие коллагеновые волокна в каркасе от протеолитического расщепления. Синтез связывающего гиалуроновую кислоту синтетического пептидогликана использовал хондропродективные эффекты CS. Показано, что CS обеспечивает понижающую регуляцию образования матриксных металлопротеаз. Конструкция синтетического пептидогликана авторов настоящего изобретения, описанная в настоящем документе, позволяла прикреплять цепи CS к HA, предотвращая разрушение обеих молекул. Посредством размещения синтетического пептидогликана в среде, богатой протеолитическими ферментами, демонстрировали его способность предотвращать чрезмерную утрату компонентов ECM.
ПРИМЕР 15
ПЦР в реальном времени
После исследования клеточных культур конструкции хранили в растворе RNAlater (Ambion) при 4°C в течение меньше чем одной недели. Общую мРНК экстрагировали с использованием Nucleospin РНК II (Clontech) в соответствии с протоколами производителя. Экстрагированную мРНК из всех образцов определяли количественно с использованием спектрофотометра Nanodrop 2000 (Thermo Scientific) и осуществляли ее обратную транскрипцию в кДНК с использованием High Capacity cDNA Reverse Transcriptase Kit (Applied Biosystems). ПЦР в реальном времени осуществляли с использованием Taqman Gene Expression Assay (Applied Biosystems) со следующими праймерами: GAPDH (Bt03210913_g1), аггрекан (Bt03212186_m1) и коллаген II типа (Bt03251861_m1). 60 нг кДНК матрицы получали на 20 мкл реакции для двух генов, представляющих интерес, и эндогенного гена. ПЦР анализ в реальном времени осуществляли с использованием Taqman PCR Master Mix и 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems). Представленные данные нормализовали по экспрессии гена GAPDH.
выравнвиание
пептидогликан
IL-1
выравнивание
пептидогликан
IL-1
Анализ экспрессии мРНК: выравнивание коллагена, присутствие аггреканового миметика и стимуляция IL-1β значительно действовали на экспрессию аггрекана (p<0,001, p <0,02 и pβ<0,001) и коллагена II типа (p<0,01, p<0,001 и pβ<0,015). Присутствие mAGC ограничивало чрезмерную утрату CS из каркаса, что вело к более низкой экспрессии аггрекана (p<0,02) (фиг.25). Присутствие mAGC также ограничивало разрушение коллагена. Однако экспрессия коллагена II типа зависела от степени утраты коллагена во время разрушения (фиг.25). В невыровненных каркасах уровень экспрессии коллагена II типа был выше в каркасах, полученных без mAGC, тогда как в выровненных коллагеновых каркасах уровень коллагена II типа был выше в каркасах, полученных с использованием mAGC (p<0,05).
ПРИМЕР 16
Статистический анализ
Каждый эксперимент повторяли два раза, причем в каждом наборе данных n был равен по меньшей мере 3. Статистическую значимость для данных механического теста анализировали с использованием двухфакторного дисперсионного анализа с выравниванием и добавлением пептидогликана в качестве факторов. Данные клеточных культур анализировали с использованием трехфакторного дисперсионного анализа с выравниванием, добавлением пептидогликана и воздействием IL-1β в качестве факторов. Апостериорное попарное сравнение Тьюки (α=0,05) использовали для того, чтобы непосредственно сравнивать каркасы, полученные с использованием и без использования аггреканового миметика в каждой системе.