Оптические биосенсоры на основе клеток микроводорослей в экологическом мониторинге водных сред

Вестник ДВО РАН. 2016. № 4

УДК 53.096; 535.337; 535.372

С.С. ВОЗНЕСЕНСКИЙ, А.Ю. ПОПИК, Е Л. ГАМАЮНОВ, Т.Ю. ОРЛОВА, Ж.В. МАРКИНА

Оптические биосенсоры на основе клеток микроводорослей в экологическом мониторинге водных сред

Экспериментально подтверждена зависимость флуоресценции хлорофилла-а микроводорослей от присутствия в среде их обитания ионов металлов. Полученные результаты, в частности воздействие ионов меди на исследованные культуры, демонстрируют специфичность реакции микроводорослей и могут быть использованы при создании биосенсоров для экологического мониторинга водной среды.

Ключевые слова: микроводоросли, лазерно-индуцированная флуоресценция, оптические биосенсоры.

Optical biosensors based on microalgae cells for ecological monitoring of the aquatic environment.

S.S. VOZNESENSKIY, A.Yu. POPIK, E.L. GAMAYUNOV (Institute of Automation and Control Processes, FEB RAS, Vladivostok, Far Eastern Federal University, Vladivostok), T.Yu. ORLOVA, Zh.V. MARKINA (A.V. Zhirmunsky Institute of Marine Biology, FEB RAS, Vladivostok).

Experimental confirmation of the influence of metal ions on the fluorescence of the microalgae chlorophyll-a is obtained. The obtained results, in particular, copper ion impact on microalgae, demonstrate the specificity of their reaction and can be used in the creation of biosensors for ecological monitoring of water environment.

Key words: microalgae, laser-induced fluorescence, optical biosensors.

Задача мониторинга состояния водных сред - получать информацию в режиме реального времени и задолго до появления видимых признаков загрязнения, значительно превышающего предельно допустимые концентрации (ПДК). В последние годы в качестве биоиндикаторов для экологического мониторинга состояния акваторий активно исследуются живые организмы с повышенной чувствительностью к воздействию неблагоприятных факторов. Известно, что одноклеточные микроорганизмы, в том числе микроводоросли фитопланктона, благодаря своим малым размерам (от единиц до десятков микрометров) и высокой скорости внутриклеточных обменных процессов быстро реагируют на изменения, происходящие в среде их обитания [8].

*ВОЗНЕСЕНСКИЙ Сергей Серафимович - доктор физико-математических наук, заведующий лабораторией, ПОПИК Александр Юрьевич - кандидат физико-математических наук, младший научный сотрудник, ГАМАЮНОВ Евгений Леонидович - кандидат технических наук, старший научный сотрудник (Институт автоматики и процессов управления ДВО РАН, Владивосток, Дальневосточный федеральный университет, Владивосток), ОРЛОВА Татьяна Юрьевна - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, МАРКИНА Жанна Васильевна - кандидат биологических наук, научный сотрудник (Институт биологии моря им. А.В. Жирмунского ДВО РАН, Владивосток). *Е-таП: vss@iacp.dvo.ru

Работа выполнена при поддержке грантом РНФ (соглашение № 14-50-00034) в части определения зависимости параметров флуоресценции микроводорослей от внешних факторов, грантом ДВО РАН по программе «Дальний Восток» № 0262-2015-0089 в части экспериментов с культурами микроводорослей и грантом РФФИ (№ 16-3400257) в части получения культур микроводорослей.

Нарушение жизнедеятельности одноклеточных микроорганизмов проявляется в изменении их функционирования, обратимом или необратимом. Первичное специфическое воздействие повреждающего фактора среды направлено на совершенно конкретные молекулярные структуры клетки. Нарушение функционирования этих структур вызывает целый каскад событий, заканчивающихся общим ответом клетки как целого. Практически у всех клеток при действии ионов металлов наблюдается изменение проницаемости клеточных мембран [6] с последующей активацией внутриклеточных систем, направленных на угнетение стрессовых реакций и сохранение внутриклеточного состояния [11]. Это первая, обратимая, стадия, когда клетка пытается компенсировать действие повреждающего фактора. При более сильном или более длительном воздействии повреждающего фактора происходит нарушение функций клеток. Данные свойства одноклеточных организмов определяют повышенный интерес к их использованию в составе сенсорных систем. Анализ публикаций подтверждает, что микроводоросли фитопланктона чувствительны к достаточно широкому спектру загрязнителей водных сред [4], в числе которых ионы металлов [10, 12], гербициды [9], поверхностно-активные вещества и др. [7, 13].

Одно из важнейших свойств одноклеточных водорослей - вызванное лазерным излучением флуоресцентное свечение пигментов клетки, называемое лазерно-индуцированной флуоресценцией (ЛИФ). Методы измерения ЛИФ характеризуются высокой чувствительностью, оперативностью, возможностью анализа нелинейных параметров флуоресцентного сигнала [5]. Кроме того, флуоресцентный отклик клеток микроводорослей зависит не только от вида и концентрации культуры, но и от условий, в которых они находятся во время измерений: температуры и освещенности, присутствия растворенных в воде органических и неорганических веществ [1]. В настоящее время ЛИФ широко используется в современных методиках и приборах для исследования состояния фитопланктона и измерения концентрации микроводорослей [3]. При этом важно, что измерения можно проводить непосредственно в среде обитания без повреждения клеток.

Стабильность работы биологических сенсоров определяется постоянством состава и концентрации клеток микроводорослей, а также стабильностью их внутреннего состояния, которое в свою очередь зависит от химического состава, температуры, освещенности и солености морской воды.

Материалы и методы

Для исследований были выбраны две культуры микроводорослей из зал. Петра Великого Японского моря (коллекция Института биологии моря им. А.В. Жирмунского Дальневосточного отделения РАН) - Tisochrysis lutea и Nannochloris maculata.

T. lutea Bendif et Probert (Haptophyta) штамм TL-V 08. Клетки размером 5,7 х 7,5 мкм, эллипсовидные. Это гаптофитовая водоросль, обладающая высокой устойчивостью к неблагоприятным условиям внешней среды, в частности к недостатку питательных веществ. Благодаря своему строению этот вид фитопланктона сохраняется в неблагоприятной среде в течение долгих месяцев и может быть использован как потенциальная основа для создания хемосенсоров.

N. maculata (Chlorophyta) штамм NM-86. Клетки мелкие (2-3 мкм в диаметре), шаровидные, реже эллипсовидные. Nannochloris maculata является представителем зеленых водорослей, которые, в свою очередь, принадлежат к самому обширному отделу, включающему более 13 000 видов. Большое видовое разнообразие позволяет предположить, что представители зеленых водорослей могут присутствовать во всех типах водоемов, а значит, могут стать удобным индикатором загрязнения водоемов, в том числе солями тяжелых металлов.

Возбуждение ЛИФ осуществлялось непрерывным лазерным излучением с длиной волны 445 нм, т.к. на этой длине волны поглощение света хлорофиллом-а, основным

пигментом микроводорослей, максимально. Время воздействия лазерного излучения на пробу во время измерения во всех случаях составляло 2 с. Спектры ЛИФ фитопланктона измерялись спектрометром Shamrock 303i компании Andor Technology (США) с EMCCD камерой Newton 970. Измерение спектров выполнялось в режиме аккумуляции: время экспозиции промежуточного спектра - 0,2 с, количество аккумуляций - 10, частота измерений промежуточных спектров - 5 Гц.

Кюветы с пробами культур объемом 1,5 мл помещались в термостатируемый держатель кювет QPOD-2E производства компании Quantum (США).

Результаты и обсуждение

Особый интерес представляет группа параметров, характеризующих чувствительность каждого вида микроводоросли к присутствию в среде ионов тяжелых металлов. Их исследование позволяет выявить виды микроводорослей, пригодные в качестве биоиндикаторов присутствия загрязняющих или опасных неорганических веществ.

Для проведения экспериментов были использованы растворы солей меди с концентрацией равной и ниже ПДК (в водных объектах хозяйственно-питьевого и культурно-бытового назначения ПДК ионов меди не должно превышать 1 мг/л) [2].

На рис. 1 (см. вклейку) представлены результаты воздействия солей меди на зеленые микроводоросли Nannochloris maculata. Видно, что соли металла увеличивают интенсивность флуоресценции культуры микроводорослей в первые полтора часа после их внесения, затем она стабилизируется на постоянном значении.

При проведении измерений важно учитывать не только абсолютное содержание ионов меди в растворе, но и их удельную концентрацию по отношению к количеству клеток фитопланктона. Превышение концентрации клеток фитопланктона приводит к тому, что эффект воздействия солей металла на клетки исчезает.

Таким образом, увеличение концентрации фитопланктона в биосенсоре при одной и той же концентрации солей металла снижает чувствительность сенсора, в то время как уменьшение концентрации фитопланктона, наоборот, увеличивает ее. Для подтверждения данного вывода эксперименты повторили с культурой микроводорослей T. lutea. На рис. 2 (см. вклейку) приведены результаты измерения интенсивности флуоресценции образцов с разными концентрациями микроводорослей при фиксированном содержании ионов меди (1 мг/л).

На рис. 3 (см. вклейку) показаны результаты измерения интенсивности флуоресценции T. lutea при разных вариациях концентраций меди и фитопланктона в исследуемых образцах. Для удобства представления интенсивность флуоресценции культур в пробах с медью приводится в значениях, нормированных на интенсивность флуоресценции контрольных культур (пробы без меди).

Из рис. 3 следует, что чем выше концентрация фитопланктона, тем меньше влияние меди на интенсивность ЛИФ. Однако если концентрация меди достигает больших значений, то ее воздействие на фитопланктон практически одинаково независимо от концентрации микроводорослей. Это позволяет сделать вывод о том, что для изготовления датчиков необходимо использовать культуры микроводорослей с малой концентрацией клеток. В этом случае они будут чувствительны не только к высоким (вызывающим токсическое отравление), но и к малым концентрациям меди, значительно ниже ПДК. В то же время следует учитывать, что когда уровень стресса принимает критические значения (в нашем эксперименте при концентрациях меди 1 мг/л), скорость изменения интенсивности флуоресценции хлорофилла растет с увеличением концентрации фитопланктона.

Кроме изменения интенсивности флуоресценции хлорофилла в культурах с содержанием солей металлов возникают спектральные изменения интенсивностей флуоресценции в диапазоне длин волн от 645 до 740 нм. Пик флуоресценции на длине волны 740 нм

обусловлен свечением хлорофилла, принадлежащего к первой фотосистеме микроводоросли, которая не участвует в первичных реакциях фотосинтеза. Тем не менее на эту фотосистему также воздействуют соли металла, что видно на спектральных графиках, изображенных на рис. 4 (см. вклейку).

Изменение интенсивности флуоресценции на длине волны 685 нм происходит значительно быстрее, чем на длине волны 740 нм. Это связанно с тем, что ионы металлов в первую очередь воздействуют на вторую фотосистему микроводоросли и ее флуоресценцию.

На рис. 5 и 6 (см. вклейку) приведены интенсивности ЛИФ для культуры T. lutea на характерных длинах волн при концентрации фитопланктона в исследуемых образцах 27,25 х 104 кл/л.

Важным спектральным признаком является отношение интенсивностей флуоресценции на разных длинах волн - 740 и 685 нм (рис. 7, см. вклейку). Это отношение отображает воздействие ионов металла на весь фотосинтетический аппарат.

Заключение

В результате выполненных работ экспериментально подтверждена зависимость ЛИФ хлорофилла-а исследованных микроводорослей от наличия в образце ионов металлов. Полученные результаты, в частности воздействие ионов меди на исследованные культуры фитопланктона, демонстрируют специфичность реакции микроводорослей и могут быть использованы при создании биосенсоров для экологического мониторинга водной среды.

ЛИТЕРАТУРА

1. Гамаюнов Е.Л., Попик А.Ю. Зависимость флуоресценции фитопланктона от внешних воздействий // Биофизика. 2015. Т. 60, вып. 1. С. 143-151.

2. Гигиенические нормативы. Предельно допустимые концентрации (ПДК) химических веществ в воде водных объектов хозяйственно-питьевого и культурно-бытового водопользования. Утв. Пост. Главного государственного санитарного врача Российской Федерации, № 78 от 30.04.2003 г.

3. Кульчин Ю.Н., Вознесенский С.С., Гамаюнов Е.Л., Коротенко А.А., Попик А.Ю., Майор А.Ю. Комплексный контроль состояния морских акваторий оптическими методами. Ч. 4. Оптоволоконная система измерения концентрации фитопланктона // Оптика атмосферы и океана. 2013. Т. 26, № 1. С. 40-45.

4. Chlorophyll a Fluorescence. A Signature of Photosynthesis / eds G.C. Papageorgiou, Govindjee. Dordrecht: Springer, 2004. 644 p. (Advances in Photosynthesis and Respiration; vol. 19).

5. Fadeev V.V., Gostev T.S., Gorbunov M.Y. Studying photoprotective processes in the green alga Chlorella pyre-noidosa using nonlinear laser fluorimetry // J. Biophotonics. 2012. Vol. 5, iss. 7. P. 502-507.

6. Machado M.D., Lopes A.R., Soares E.V. Responses of the alga Pseudokirchneriella subcapitata to long-term exposure to metal stress // J. Hazard. Mater. 2015. Vol. 296. P. 82-92.

7. Markina Zh.V., Ayzdaycher N.A. Influence of the ariel detergent on the growth and physiological state of the unicellular algae Dunaliella salina (Chlorophyta) and Plagioselmis prolonga (Cryptophyta) // Hydrobiol. J. 2010. Vol. 46, iss. 2. P. 49-56.

8. Metal Ions in Biological Systems / eds H. Sigel, A. Sigel , R.K.O. Sigel. N.Y., 2005. 348 p. (Biogeochemistry, Availability, and Transport of Metals in the Environment; vol. 44, N 6).

9. Nguen-Ngoc H., Durrieu C., Tran-Minh C. Synchronous-scan fluorescence of algal cells for toxicity assessment of heavy metals and herbicides // Ecotoxicology and Environmental Safety. 2009. Vol. 72, iss. 2. P. 316-320.

10. Pena-Vazquez E., Maneiro E., Perez-Conde C., Moreno-Bondi M.C., Costas E. Microalgae Fiber Optic Biosensors for Herbicide Monitoring Using Sol-Gel Technology // Biosensors and Bioelectronics. 2009. Vol. 24, iss.12. P. 3538-3543.

11. Poliak Y.M., Zaytseva T.B., Petrova V.N., Medvedeva N.G. Development of mass cyanobacteria species under heavy metals pollution // Hydrobiol. J. 2011. Vol. 47, iss. 3. P. 75-90.

12. Smolyakov B.S., Ryzhikh A.P., Romanov R.E. The fate of Cu, Zn, and Cd in the initial stage of water system contamination: the effect of phytoplankton activity // J. Hazard. Mater. 2010. Vol. 184, iss. 1-3. P. 819-825.

13. Wolfe G.V. The Chemical Defense Ecology of Marine Unicellular Plankton: Constraints, Mechanisms, and Impacts // Biol. Bull. 2000. Vol. 198. P. 225-244.

К статье: С.С. Вознесенский, А.Ю. Попик, Е.Л. Гамаюнов, Т.Ю. Орлова, Ж.В. Маркина «Оптические биосенсоры на основе клеток микроводорослей в экологическом мониторинге водных сред»

Рис. 1. Изменение интенсивности ЛИФ микроводорослей ЫаппосЫоп. таеи1Ла при разных концентрациях Си2+

¡SJ 2x104

S 1x10

1 х 104  0,5 х 104 • 4 х 104 С 3 х 104 ♦ 8х 104 О 5 х Ю4 , 1 .  >

> \

1 f

1 i

Рис. 2. Интенсивность ЛИФ разных концентраций микроводорослей Tisochrysis lutea при фиксированной концентрации Cu2+, равной 1 мг/л. Заштрихованные символы - показатели флуоресценции контрольной пробы, незаштрихованные - пробы с Cu2+

Время,

i 5 » , n J = i 1............... ]

>

! >

) 1

) 1 > )

1

С1Г+/фитопланктон > 0.1/0.1 l> 0.5/0.1  1/0 0 0,1/0.2 С 0,5/0.2 • 1/0  0.1/1 ш 0.5/1  1/1 1 . 1 . 1 . 1 .

2

Г^- 1 1

0,0

0,5

1.0

1,5 2,0 2,5 Время , ч

3,0

3,5

Рис. 3. Интенсивность ЛИФ микроводорослей Tisochrysis lutea при разных концентрациях Cu2+ и фитопланктона в исследуемых образцах

4,0

Рис. 4. Изменения в спектрах ЛИФ микроводорослей Tisochrysis lutea под действием Cu2+ в концентрации 1 ПДК

Рис. 5. Интенсивность ЛИФ микроводорослей Tisochrysis lutea (27,25 х 104 кл/л) на длине волны 685 нм под действием Cu2+

Рис. 6. Интенсивность ЛИФ микроводорослей Tisochrysis lutea (27,25 х 104 кл/л) на длине волны 740 нм под действием Cu2+

Рис. 7. Зависимость изменения спектрального признака микроводорослей Tisochrysis lutea под действием Cu2+