СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО ПРОДУКТА ИЗ МИДИИ MYTILUS GALLOPROVINCIALIS
METHOD OF PRODUCING A FUNCTIONAL PRODUCT FROM MYTILUS GALLOPROVINCIALIS MUSSELS

Изобретение относится к области биотехнологии и предназначено для получения продукта, содержащего биологически активные вещества и стволовые клетки из оплодотворенных яйцеклеток мидии Mytilus galloprovincialis.
Известен Способ получения биологически активного вещества из черноморской мидии Mytilus galloprovincialis Lam. [7], обогащенного тестостероном, которое может быть использовано как средство для поддержания общего физиологического статуса и репродуктивной активности человека. В способе предварительно собранные гонады и/или половые продукты (яйцеклетки и сперматозоиды) дважды обрабатывают 95%-ным этиловым спиртом в соотношении 1:5 (сырье : этиловый спирт), настаивают в течение суток при температуре 20±2°С и отделяют экстракт. Метод ограничивается получением физиологически активного вещества только из гонад и/или половых продуктов мидии Mytilus galloprovincialis, но не предполагает получения продуктов из оплодотворенных яйцеклеток моллюсков, называемых в первые часы своей жизни эмбриональными стволовыми клетками, обладающих большим физиологическим эффектом. Известен Способ получения эмбриональных стволовых клеток из черноморской мидии [8]. В известном способе из оплодотворенных яйцеклеток культивируемых мидий или камбалы-калкан проводят отбор бластомеров в период от начала первого митотического деления и до образования стереобластулы в течение нескольких часов после оплодотварения. Связь между бластомерами разрушают путем снижения концентрации ионов кальция в морской воде соленостью  с помощью раствора лимоннокислого натрия, таким образом, чтобы его концентрация в соленой воде составляла 0,1 м, после чего эмбриональные стволовые клетки собирают на газ-сите с диаметром ячеек 32 и 20 мкм методом фильтрации бластомеров. Изобретение дает возможность экспериментировать с гаметами и диплоидными клетками после мейоза I, но не предполагает получение продукта на основе стволовых клеток мидий.
Задачей изобретения Способ получения функционального продукта из мидии Mytilus galloprovincialis является расширение арсенала средств, содержащих биологически активные вещества, путем получения продуктов на основе недифференцированных тотипотентных стволовых клеток из мидии Mytilus galloprovincialis.
Техническим результатом от решения поставленной задачи является:
- получение продукта, содержащего только стволовые клетки из мидии, который можно применять для исследовательских задач и для поддержки в физиологических границах функциональной активности органов человека;
- получение продукта, содержащего стволовые клетки и неоплодотворенные половые продукты из мидии, который можно применять аналогично.
Кроме того, Способ предлагает получение эмбриональных тотипотентных стволовых клеток из мидии М. galloprovincialis с разной степенью очистки, а также временем и затратами на производство стволовых клеток.
Этот способ открывает перспективы использования стволовых клеток из гидробионтов, т.к. жизнеспособные клеточные культуры моллюсков потенциально могут стать не только источником биологически активной РНК, но и содержать биологически активные вещества, например, полиненасыщенные жирные кислоты, тестостерон и аминокислоты, представляющие интерес для фармакологии, т.к. продукция таких веществ in vitro может стать альтернативой химическому синтезу.
Для достижения заявленного технического результата авторами предлагается группа изобретений, предполагающих два варианта выполнения способа.
В первом варианте Способа получения функционального продукта из мидии Mytilus galloprovincialis, включающем температурную стимуляцию нереста мидий; получение половых продуктов и, исключающее полиспермию искусственное оплодотворение; получение оплодотворенных яйцеклеток; разделение бластомеров в морской воде с соленостью  на отдельные клетки раствором лимоннокислого натрия при его концентрации в морской воде 0,1М; отбор бластомеров, предусмотрен ряд изменений. Так, для получения продукта, состоящего только из стволовых клеток мидий, для стимуляции нереста используют профильтрованную морскую воду с температурой 23-25°С, а искусственное оплодотворение проводят при температуре 20-22°С. Отбор эмбриональных стволовых клеток выполняют не позднее, чем через 60 мин после оплодотворения. Бластомеры, разделенные на отдельные стволовые клетки, отфильтровывают и промывают дистиллированной водой, после чего полученные стволовые клетки заливают 96%-ным этанолом в соотношении 1:2 (исходное сырье : этанол).
Во втором варианте Способа получения функционального продукта из мидии Mytilus galloprovincialis, включающего температурную стимуляцию нереста мидий; получение половых продуктов и исключающее полиспермию искусственное оплодотворение; получение оплодотворенных яйцеклеток, также предусмотрены изменения, по сравнению с прототипом. При получении продукта, содержащего стволовые клетки и неоплодотворенные половые продукты, для стимуляции нереста мидии используют профильтрованную морскую воду с температурой 23-25°С, а искусственное оплодотворение проводят в морской воде при температуре 20-22°С. Отбор эмбриональных стволовых клеток выполняют на стадии образования бластомеров не позднее, чем через 60 мин после оплодотворения. Отбор эмбриональных стволовых клеток проводят путем их осаждения вместе с неоплодотворенными половыми продуктами при 1500 об/мин, образовавшуюся надосадочную жидкость сливают. Затем осадок, содержащий стволовые клетки и половые продукты, промывают повторно дистиллированной водой при 1500 об/мин, удаляют водный слой, после чего осадок заливают 96%-ным этанолом в соотношении 1:2 (исходное сырье : этанол).
Отличия заявляемого изобретения от прототипа заключаются в том, что:
- температурная стимуляция нереста мидий происходит профильтрованной морской водой с температурой 23-25°С, что обеспечивает скорое наступление искусственного нереста. В природных условиях весенний нерест у мидии М. galloprovincialis наступает при 7,5°С, а осенний - при 17°С. Учитывая среднюю температуру воды в Черном море, разница температур способствует более быстрому вымету яйцеклеток и сперматозоидов;
- искусственное оплодотворение проводят при температуре 20-22°С, что установлено экспериментально;
- отбор эмбриональных стволовых клеток выполняют не позднее, чем через 60 мин после оплодотворения, когда происходит первое митотическое деление и образование двух бластомеров. Это сокращает время получения конечного продукта и повышает эффективность способа;
- осуществление способа по второму варианту позволяет значительно упростить способ отбора стволовых клеток, а полученный продукт содержит больше веществ, обладающих положительной физиологической активностью, за счет дополнительного присутствия неоплодотворенных половых продуктов;
- консервация клеток в 96%-ном этаноле, предназначенная для кратковременного хранения эмбриональных тотипотентных стволовых клеток, создает возможности изучения применения спиртовой настойки из них.
Заявляемое изобретение обладает рядом преимуществ и соответствует критерию новизны. Авторами предлагается установленное экспериментальным путем сочетание оптимальных условий для получения продуктов, содержащих эмбриональные тотипотентные стволовые клетки из мидии Mytilus galloprovincialis. Проведенные патентные исследования, а также изучение доступных научных публикаций, относящихся к стволовым клеткам, полученным из морских гидробионтов, не обнаружили решений, имеющих признаки, сходные с заявляемым изобретением, что позволяет сделать вывод о соответствии критерию технический уровень.
Закономерности размножения мидии М. galloprovincialis в лабораторных условиях хорошо изучены [3], что дает возможность в контролируемых условиях получать в массовом количестве стволовые клетки. При слиянии сперматозоида с яйцеклеткой образуется зигота, которая начинает делиться, не увеличиваясь в размерах, т.е. дробиться, образуя клетки - бластомеры (зигота и образованные ею бластомеры 2-8 клеточной стадии). Это и есть первые стволовые клетки - т.е. клетки, способные делиться неопределенное число раз и превращаться (специализироваться) в клетки тканей. Такая особенность стволовых клеток связана с наличием фермента теломеразы. В соматических клетках такой фермент неактивен или отсутствует, и, следовательно, клетка запрограммирована на определенное число делений. В конечном итоге клетка теряет жизненно важные гены и погибает.
В стволовых клетках еще не экспрессированы белки гистосовместимости, поэтому при трансплантации они не вызывают иммунной реакции отторжения. Эмбриональные клетки мидии М galloprovincialis способны направленно изменять свои функции и свойства в зависимости от сигналов из окружающей среды, т.е. обладают эффектом Хоуминга. Последнее заставляет клетки дифференцироваться в клетки соответствующей ткани [1]. Кроме этого, эмбриональные стволовые клетки моллюсков обладают свойством тотипотентности [12]. В культурах клеток двустворчатых моллюсков сигнал к делению воспринимают только малодифференцированные клетки - клетки ранних стадий эмбрионального развития. В тканях морских беспозвоночных обнаружены вещества, подобные эпидермальному фактору роста млекопитающих. Эти вещества обладают значительным митогенным потенциалом, стимулируя синтез ДНК в клетках, как позвоночных, так и беспозвоночных животных [6].
Тотипотентные стволовые клетки могут применяться не только в клеточной терапии и при выращивании органов для трансплантации, но и содержат ростовые факторы, антиоксиданты, противовоспалительные соединения и биологически активные вещества [5, 7], которые длительное время сохраняют свои свойства в 96%-ном этаноле. Физиологическую активность клеток в спиртовом растворе оценивают по уровню синтеза РНК [11].
2+
Изобретение реализуется следующим образом. Путем температурной стимуляции нереста одноразмерных мидий получают яйцеклетки и сперматозоиды [3]. Проводят искусственное оплодотворение таким образом, чтобы на одну яйцеклетку приходилось не более 10 сперматозоидов. Через 60 мин после оплодотворения в первом варианте выполнения способа для разделения образовавшихся бластомеров снижают концентрация ионов Саво внеклеточном пространстве с помощью раствора лимоннокислого натрия. Затем разделенные клетки собирают на газ-сите с диаметром ячеек 20 мкм, промывают дистиллированной водой и заливают 96%-ным этанолом. Во втором варианте выполнения, стволовые клетки, не разделяя на бластомеры, осаждают вместе с половыми продуктами при 1500 об/мин, нижний мутный слой отмывают дистиллированной водой при 1500 об/мин, сливают водный слой, осадок заливают 96%-ным этанолом в соотношении 1:2 (исходное сырье : этанол).
Примеры реализации способа
Пример 1
2+
Моллюсков с длиной раковин 50-60 мм собирали водолазным способом в период нереста с коллекторов фермы с глубины 2-3 м. В Черном море существует два четко выраженных пика размножения мидий: осенний и весенний [10]. Для определения начала массового нереста в лабораторных условиях из выборки, насчитывающей 150 экземпляров мидий, извлекали гонады. Половую принадлежность и стадии репродуктивного цикла моллюсков определяли на мазке гонад с помощью микроскопа, основываясь на анализе гистологических препаратов гонад [9]. Когда около 50% обследованных мидий находилось в состоянии нереста (гонады текли) и не менее 25% мидий имели пустые гонады, наступал нерестовый период - время, в течение которого происходил многократный вымет половых продуктов. Для стимуляции нереста и сбора половых продуктов мидии (после механической очистки раковин) рассаживали по 1 экземпляру в стаканы объемом 0,5 л и заливали профильтрованной морской водой, нагретой до 23-25°С. Яйцеклетки в процессе нереста оседали на дно в виде оранжевого осадка. Сперма образовывала в воде мутное белое облако. Одна самка мидий способна выметать в среднем до 6-8 млн. яйцеклеток [10]. При стимуляции нереста был вероятен вымет незрелых яйцеклеток, поэтому зрелость яйцеклеток определяли с помощью микроскопа по отсутствию ядер. Количество яйцеклеток подсчитывали с помощью бинокуляра МБС-9 в камере Богорова. Концентрацию сперматозоидов подсчитывали в камере Горяева после их обездвиживания в парах формальдегида. Оплодотворение проводили из расчета 10 сперматозоидов на 1 яйцеклетку при температуре морской воды 20-22°С. Для этого из 150 мидий получали примерно 20-30 растворов с яйцеклетками, которые отфильтровывали от биоотложений в сосуд объемом 5 л на газ-сите с диаметром ячеек 40 мкм. Если количество жидкости в сосуде получалось примерно 1-1,5 литра, то объем доводили до 5 литров профильтрованной морской водой, нагретой до температуры 20-22°С. Воду из стаканов, содержащую сперму, отфильтровывали от биоотложений в другой пятилитровый сосуд на газ-сите с диаметром ячеек 40 мкм (соотношение отнерестившихся самцов и самок составляло или 1:1, или 2:1). После этого для предотвращения полиспермии к раствору с яйцеклетками добавляли 10 мл раствора со сперматозоидами. Слияние мужского и женского пронуклеусов происходило при температуре 20-22°С через 15-20 мин после оплодотворения. Первую интерфазу митоза наблюдали на 25-30 минуте, первое митотическое деление и образование двух бластомеров происходило примерно через 60 мин. Сбор стволовых клеток мидий проводили через час после оплодотворения, так как после начала дробления наступало личиночное развитие, и клетки начинали дифференцироваться [4]. Используя камеру Богорова и бинокуляр МБС-9, подсчитывали количество эмбрионов. В 1 л такого раствора содержалось примерно 1700±300 эмбриональных клеток. На данном этапе проводили разделение бластомеров на отдельные клетки, снижая концентрацию ионов кальция во внеклеточной системе, соединяющей бластомеры. Для этого в морскую воду с соленостью  (концентрация ионов Сасоставляла 0,339 мг/л) добавляли лимоннокислый натрий таким образом, чтоб его концентрация в растворе морской воды составила 0,1 М. Эмбриональные стволовые клетки собирали на газ-сите с диаметром ячеек 20 мкм и промывали дистиллированной водой. Полученные клетки заливали 96%-ном этанолом в соотношении 1:2 (исходное сырье : этанол). Полученная настойка, содержащая стволовые клетки из мидии М. galloprovincialis, может быть использована в медицинских и косметических препаратах, а мидия М. galloprovincialis является перспективным объектом для получения клеточного материала. Физиологическую активность клеток в спиртовом растворе оценивают по уровню синтеза РНК [11].
Пример 2
Так как половые продукты, следовательно, и стволовые клетки мидии М. galloprovincialis содержат биологически активные вещества, например, тестостерон, аминокислоты и полиненасыщенные жирные кислоты [5, 2], то можно получать суспензию, содержащую эмбриональные стволовые клетки и неоплодотворенные половые продукты, в 96%-ном этаноле в соотношении 1:2 (исходное сырье : этанол). При этом получение стволовых клеток проводили, как в способе 1, но через 60 мин после оплодотворения бластомеры не разделяли с помощью лимоннокислого натрия, а осаждали вместе с половыми продуктами при 1500 об/мин. Надосадочную жидкость сливали. Помутневший осадок отмывали дистиллированной водой путем повторного центрифугирования при 1500 об/мин. Удаляли водный слой, а осадок, содержащий бластомеры и половые продукты, заливали 96%-ным этанолом в соотношении 1:2 (исходное сырье : этанол). Полученная спиртовая настойка содержит как стволовые клетки, так и неоплодотворенные половые продукты, поэтому ее физиологическая активность повышается. Настойку можно употреблять внутрь как средство, обладающее физиологической активностью.
Источники литературы:
1. Исаева В.В. Стволовые клетки беспозвоночных животных с репродуктивной стратегией, включающей бесполовое размножение / В.В Исаева, А.И. Шукалюк, А.В. Ахмадиева // Биология моря. - 2007. - Т. 33, №1. - С. 3-10.
2. Капранова Л.Л. Жирнокислотный состав гонад и половых продуктов двустворчатого моллюска Mytilus galloprovincialis Lam. (1819) из Черного моря на разных стадиях половой зрелости / Л.Л. Капранова, М.В. Нехорошев, Л.В. Малахова, В.И. Рябушко, С.В. Капранов, Т.В. Кузнецова // Журнал эволюционной биохимии и физиологии. - 2019. - Т. 55, №6. - С. 398-406. doi: 10.1134/S0044452919050085.
3. Караванцева Н.В. Методика отбора половых продуктов мидии Mytilus galloprovincialis Lam. / Н.В. Караванцева, Н.В. Поспелова, Н.И Бобко, М.В. Нехорошев // Системы контроля окружающей среды. - 2012. - №17. - С. 184-187.
4. Малахов В.В., Медведева Л.А. Эмбриональное развитие двустворчатых моллюсков в норме и при воздействии тяжелых металлов / В.А. Свешников. - М.: Наука, 1993. - 134 с.
5. Никонова Л.Л. Общий тестостерон и эстрадиол в гонадах и половых продуктах двустворчатого моллюска Mytilus galloprovincialis Lam. / Л.Л. Никонова, М.В Нехорошев, В.И Рябушко // Журнал эволюционной биохимии и физиологии. - 2017. - Т. 53, №6. - С. 459-461.
6. Одинцова Н.А. Репродукция и дифференцировка клеток двустворчатых моллюсков и иглокожих in vitro: дисс. … докт. биол. наук: 03.00.11 / Нэлия Адольфовна Одинцова. - Владивосток, 1999. - 240 с.
7. Пат. 2599834 Российская Федерация. МПК A23L 33/10, A23L 17/50. Способ получения биологически активного вещества из черноморской мидии Mytilus galloprovincialis Lam / Никонова Л.Л. (RU), Нехорошев М.В. (RU); патентообладатель Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Институт морских биологических исследований им. A.О. Ковалевского РАН» (RU). - №2014138314/13; заявл. 22.09.2014; опубл. 20.10.2016. Бюл.№29.
8. Пат. UA 84810 C12N 5/16 Украина. МПК А01 611/00 Cnoci6 одержання ембрiональних стовбурових клiтин iз  мiдii / Iванов B.М. (UA); заявитель и патентообладатель Iнститут  пiвденних мopiв iм. О.О. Ковалевського НАН  - №200709248; заявл. 13.08.2007, опубл. 10.04.2008. Бюл. №7.
9. Пиркова А.В. Формирование поселений мидий Mytilus galloprovincialis (Lamarck, 1819) на коллекторах фермы в бухте Ласпи в зависимости от экологических факторов / А.В. Пиркова, Л.В. Ладыгина, С.В Щуров // Ученые записки Крымского федерального университета имени В. И. Вернадского. Биология. Химия. - 2019. - Т. 5. - Вып. 71, №1. - С .92-106.
10. Холодов В.И., Пиркова А.В., Ладыгина Л. В. Выращивание мидий и устриц в Черном море / Рябушко В.И. - Воронеж: ООО "Издат-Принт", 2017. - 508 с.
11. Odintsova N.A., Belogortseva N.I., Ermak А.V., Molchanova V.I., Luk'yanov P.A. Adhesive and growth properties of lectin from the ascidian Didemnum ternatanum on cultivated marine invertebrate cells // Biochimica et Biophysica Acta. - 1999. - Vol. 1448, iss. 3. - P. 381-389. doi:10.1016/S0167-4889(98)00150-5.
12. Yoshino T.P., Bickham U., Bayne C.J. Molluscan cells in culture: primary cell cultures and cell lines // Canadian Journal of Zoology. - 2013. - Vol. 91, iss. 6. - P. 391-404. doi: 10.1139/cjz-2012-0258.