ТРАНСПОЗИЦИЯ КОНСТРУКЦИЙ НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ В ЭУКАРИОТИЧЕСКИЕ ГЕНОМЫ С ТРАНСПОЗАЗОЙ ИЗ AMYELOIS

1. Полинуклеотид, содержащий открытую рамку считывания, кодирующую транспозазу, аминокислотная последовательность которой по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 18, функционально связанную с гетерологичным промотором.
2. Полинуклеотид по п. 1, причем транспозаза содержит мутацию, показанную в столбцах С и D таблицы 1, относительно последовательности SEQ ID NO: 18.
3 Полинуклеотид по п. 2, причем транспозаза содержит мутацию в аминокислотном положении, выбранном из 79, 95, 115, 116, 121, 139, 166, 179, 187, 198, 203, 211, 238, 273, 304, 329, 345, 362, 366, 408, 416, 435, 458, 475, 483, 491, 529, 540, 560 и 563, относительно последовательности SEQ ID NO: 18.
4. Полинуклеотид по п. 3, причем транспозаза содержит мутацию, выбранную из D79N, R95S, L115D, Е116Р, H121Q, K139E, V166F, G179N, W187F, P198R, L203R, N211R, E238D, L273M, L273I, D304R, D304K, Q329G, T345L, K362R, T366R, L408M, S416E, S435G, L458M, V475I, N483K, I491M, А529Р, K540R, S560K и S563K, относительно последовательности SEQ ID NO: 18, транспозаза необязательно включает в себя по меньшей мере 2, 3, 4 или 5 выбранных из группы.
5. Полинуклеотид по п. 2, причем аминокислотная последовательность транспозазы выбрана из SEQ ID NO: 96-170.
6. Полинуклеотид по любому из предшествующих пунктов, причем транспозаза может вырезать или транспонировать транспозон из SEQ ID NO: 192.
7. Полинуклеотид по п. 6, причем активность вырезания или активность транспозиции транспозазы по меньшей мере в 2 раза выше, чем активность SEQ ID NO: 39, необязательно в 2-50 раз выше.
8. Полинуклеотид по любому из предшествующих пунктов, причем промотор активен в реакции транскрипции in vitro.
9. Полинуклеотид по любому из пп. 1-7, причем промотор активен в эукариотической клетке.
10. Полинуклеотид по п. 9, причем эукариотическая клетка представляет собой клетку млекопитающего, необязательно, причем кодоны открытой рамки считывания выбраны для экспрессии клеток млекопитающего.
11. Выделенная мРНК, кодирующая полипептид, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 18, и причем последовательность мРНК содержит по меньшей мере 10 синонимичных различий ко донов относительно SEQ ID NO: 929 в соответствующих положениях между мРНК и SEQ ID NO: 781, необязательно причем кодоны в мРНК в соответствующих положениях выбраны для экспрессии в клетках млекопитающих.
12. Полинуклеотид по любому из пп. 1-10, в котором открытая рамка считывания дополнительно кодирует последовательность внутриядерной локализации, слитую с транспозазой.
13. Полинуклеотид по любому из пп. 1-10 и 12, в котором открытая рамка считывания дополнительно кодирует домен связывания гетерологичной ДНК, слитый с транспозазой.
14. Полинуклеотид по п. 13, причем ДНК-связывающий домен происходит из системы Crispr Cas или белка цинкового пальца, или белка TALE.
15. Не встречающийся в природе полинуклеотид, кодирующий полипептид, последовательность которого по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 18, причем полинуклеотидная последовательность содержит по меньшей мере 10 синонимичных различий кодонов относительно SEQ ID NO: 929 в соответствующих положениях между полинуклеотидом и SEQ ID NO: 929, необязательно причем кодоны в полинуклеотиде в соответствующих положениях выбраны для экспрессии в клетках млекопитающих.
16. Не встречающийся в природе полипептид, кодируемый полинуклеотидом по любому из пп. 1-10 и 12 или не встречающимся в природе полинуклеотидом по п. 15.
17. Транспозон, содержащий SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10, фланкирующий гетерологичный полинуклеотид.
18. Транспозон по п. 17, дополнительно содержащий последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную SEQ ID NO: 13 с одной стороны гетерологичного полинуклеотида, и последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную SEQ ID NO: 16 с другой.
19. Транспозон по п. 17 или 18, причем гетерологичный полинуклеотид содержит гетерологичный промотор, который активен в эукариотических клетках.
20. Транспозон по п. 19, причем промотор функционально связан по меньшей мере с одним или несколькими из: i) открытой рамки считывания; ii) нуклеиновой кислоты, кодирующей селективный маркер; iii) нуклеиновой кислоты, кодирующей контрселективный маркер; iv) нуклеиновой кислоты, кодирующей регуляторный белок; v) нуклеиновой кислоты, кодирующей ингибирующую РНК.
21. Транспозон по п. 19, причем гетерологичный промотор содержит последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 474-558.
22. Транспозон по любому из пп. 17-21, причем гетерологичный полинуклеотид содержит гетерологичный энхансер, который активен в эукариотических клетках.
23. Транспозон по п. 22, причем гетерологичный энхансер выбран из SEQ ID NO: 453-473.
24. Транспозон по любому из пп. 17-23, причем гетерологичный полинуклеотид содержит гетерологичный интрон, который может быть сплайсирован в эукариотических клетках.
25. Транспозон по п. 24, причем нуклеотидная последовательность гетерологичного интрона выбрана из SEQ ID NO: 561-621.
26. Транспозон по любому из пп. 17-25, причем гетерологичный полинуклеотид содержит последовательность инсулятора.
27. Транспозон по п. 26, причем последовательность нуклеиновой кислоты инсулятора выбрана из SEQ ID NO: 435-441.
28. Транспозон по любому из пп. 17-27, причем гетерологичный полинуклеотид содержит или кодирует селективный маркер.
29. Транспозон по п. 28, причем селективный маркер выбран из фермента глутаминсинтетазы, фермента дигидрофолатредуктазы, фермента пуромицинацетилтрансферазы, фермента бластицидин-ацетилтрансферазы, фермента гигромицин В-фосфотрансферазы и фермента аминогразамикозид-3'-фосфотрансферазы и флуоресцентного белка.
30. Эукариотическая клетка, геном которой содержит SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10, фланкирующие гетерологичный полинуклеотид.
31. Эукариотическая клетка по п. 30, причем клетка представляет собой клетку животного.
32. Клетка животного по п. 31, причем клетка представляет собой клетку млекопитающего.
33. Клетка млекопитающего по п. 32, причем клетка представляет собой клетку грызуна.
34. Клетка млекопитающего по п. 32, причем клетка представляет собой клетку человека.
35. Транспозон по любому из пп. 17-29, причем гетерологичный полинуклеотид содержит две открытые рамки считывания, каждая функционально привязана к отдельному промотору.
36. Транспозон по п. 35, причем гетерологичный полинуклеотид дополнительно содержит последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 745-928.
37. Способ интеграции транспозона в эукариотическую клетку, предусматривающий
a. введение в клетку транспозона, содержащего SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10, фланкирующего гетерологичный полинуклеотид
b. введение в клетку транспозазы, последовательность которой по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 18, причем транспозаза транспонирует транспозон с образованием генома, содержащего SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10, фланкирующего гетерологичный полинуклеотид.
38. Способ по п. 37, при котором транспозаза вводится как полинуклеотид, кодирующий транспозазу.
39. Способ по п. 38, при котором полинуклеотид, кодирующий транспозазу, представляет собой молекулу мРНК.
40. Способ по п. 38, при котором полинуклеотид, кодирующий транспозазу, представляет собой молекулу ДНК.
41. Способ по п. 37, при котором транспозаза вводится в виде белка.
42. Способ по любому из пп. 37-41, при котором гетерологичный полинуклеотид кодирует селективный маркер, и способ дополнительно предусматривает
c. выбор клетки, содержащей селективный маркер.
43. Способ по п. 37, при котором клетка представляет собой клетку животного.
44. Клетка животного по п. 43, причем клетка представляет собой клетку млекопитающего.
45. Клетка млекопитающего по п. 44, причем клетка представляет собой клетку грызуна.
46. Клетка млекопитающего по п. 44, причем клетка представляет собой клетку человека.
47. Способ экспрессии полипептида, предусматривающий культивирование эукариотической клетки, имеющей геном, содержащий SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10, фланкирующие гетерологичный полинуклеотид, причем полинуклеотид экспрессируется.
48. Способ по п. 47, дополнительно предусматривающий очистку полипептида из культуральной среды.
49. Способ по п. 47 или 48, дополнительно предусматривающий включение очищенного полипептида в фармацевтическую композицию.