ПРЯМОЙ ЗАХВАТ, АМПЛИФИКАЦИЯ И СЕКВЕНИРОВАНИЕ ДНК-МИШЕНИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ИММОБИЛИЗИРОВАННЫХ ПРАЙМЕРОВ

1. Способ захвата и амплификации избранной последовательности, включающий:
а) получение субстрата, состоящего из первой популяции связанных с поверхностью олигонуклеотидов и второй популяции связанных с поверхностью олигонуклеотидов, где члены указанных первой и второй популяций, связанных с поверхностью олигонуклеотидов, пространственно не направлены на указанный субстрат;
б) гибридизацию первого члена указанной первой популяции связанных с поверхностью олигонуклеотидов с олигонуклеотидом отбора, содержащим участок, который гибридизируется с указанным первым членом, и участок, который содержит геномную последовательность,
в) удлинение указанного первого члена указанной первой популяции связанных с поверхностью олигонуклеотидов для получения связанного с подложкой праймера отбора, который содержит последовательность, комплементарную указанной геномной последовательности;
г) гибридизацию указанного связанного с подложкой праймера отбора с фрагментом нуклеиновой кислоты, включающим указанную геномную последовательность;
д) удлинение указанного связанного с подложкой праймера отбора для получения продукта удлинения, который содержит последовательность, которая фланкирует указанную геномную последовательность;
е) амплификацию указанного геномного продукта на указанном субстрате с использованием неудлиненных членов указанных первой и второй популяций связанных с поверхностью олигонуклеотидов для получения продукта ПЦР.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный фрагмент нуклеиновой кислоты является дотированным с адаптером геномным фрагментом, включающим 5' концевой адаптер, и тем, что указанное удлинение производит продукт удлинения, который содержит на своем 3' конце последовательность, которая комплементарна указанному адаптеру, и тем, что члены указанной второй популяции указанных связанных с поверхностью олигонуклеотидов гибридизируются с указанной последовательностью, которая комплементарна указанному адаптеру, во время указанной мостиковой ПЦР.
3. Способ по п.2, отличающийся тем, что указанный 5' концевой адаптер содержит связующий сайт для праймера секвенирования на конце, который лигирован с указанным геномным фрагментом.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный способ содержит, между этапами д) и е), лигирование адаптера к 3' концу указанного продукта удлинения, и где члены указанной второй популяции указанных связанных с поверхностью олигонуклеотидов гибридизируются с указанным адаптером во время указанной амплификации.
5. Способ по п.4, отличающийся тем, что указанный адаптер содержит связывающий сайт для праймера секвенирования на конце, который лигирован с указанным фрагментом нуклеиновой кислоты.
6. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанная вторая популяция связанных с поверхностью олигонуклеотидов сделана путем:
i. гибридизации членов исходной второй популяции связанных с поверхностью олигонуклеотидов с олигонуклеотидом, включающим участок, который гибридизируется с членами указанной второй популяции связанных с поверхностью олигонуклеотидов, и участок, комплементарный последовательности указанного фрагмента нуклеиновой кислоты; и
ii. удлинение указанных членов указанной исходной второй популяции связанных с поверхностью олигонуклеотидов для получения указанной второй популяции связанных с поверхностью олигонуклеотидов.
7. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный олигонуклеотид отбора содержит связующий сайт для праймера секвенирования между указанным участком, который гибридизируется с указанным первым членом указанного участка, и указанным участком, который содержит указанную геномную последовательность.
8. Способ по п.1, отличающийся тем, что дополнительно включает секвенирование первой цепи указанного продукта ПЦР для получения, по меньшей мере, части нуклеотидной последовательности указанной последовательности, которая фланкирует указанную геномную последовательность.
9. Способ по п.1, отличающийся тем, что дополнительно включает секвенирование второй цепи указанного продукта ПЦР для получения, по меньшей мере, части нуклеотидной последовательности указанной последовательности, которая фланкирует указанную геномную последовательность.
10. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный способ содержит фрагментирование генома млекопитающих, с необязательным добавлением адаптеров к указанному фрагментированному геному и нанесением указанного фрагментированного генома на указанный субстрат.
11. Способ по п.10, отличающийся тем, что указанное фрагментирование выполняется физически, химически или путем использование рестрикционного фермента.
12. Способ по п.11, отличающийся тем, что указанное фрагментирование выполняется путем обработки ультразвуком или гидродинамической фрагментацией.
13. Способ по п.10, отличающийся тем, что указанная гибридизация выполняется путем приготовления множества фрагментированных геномов из множества различных индивидуумов, собирания в пул указанного множества фрагментированных геномов для получения пула, нанесение указанного пула фрагментированных геномов на указанный субстрат и получения продуктов ПЦР, которые содержат последовательность, которая фланкирует указанную геномную последовательность у указанных различных индивидуумов.
14. Способ по п.13, отличающийся тем, что дополнительно включает секвенирование, по меньшей мере, первой цепи указанного продукта ПЦР для получения, по меньшей мере, части нуклеотидной последовательности указанной последовательности, которая фланкирует указанную геномную последовательность у указанных различных индивидуумов.
15. Способ по п.13, отличающийся тем, что перед собиранием в пул различные адаптеры дотируются с указанными фрагментированными геномами от указанных различных индивидуумов, где указанный адаптер содержит «штрих-код»-последовательность, которая позволяет идентифицировать источник указанного лигированнного с адаптером геномного фрагмента после секвенирования указанных продуктов ПЦР.
16. Способ по п.15, отличающийся тем, что указанный способ содержит:
лигирование с адаптером фрагментированной геномной ДНК от первого субъекта, с использованием первого адаптера, который содержит первую «штрих-код»-последовательность, для получения первого продукта;
лигированние с адаптером фрагментированной геномной ДНК от второго субъекта, с использованием второго адаптера, который содержит вторую «штрих-код»-последовательность, для получения второго продукта;
комбинирование указанных первого и второго продуктов для получения смешанной матрицы и
выполнение способа по п.1 с использованием указанной смешанной матрицы для предоставления первого и второго продуктов ПЦР, каждый из которых содержит указанную «штрих-код»-последовательность.
17. Способ по п 16, отличающийся тем, что указанная смешанная матрица содержит фрагментированную геномную ДНК от, по меньшей мере, 1000 субъектов.
18. Способ по п.1, отличающийся тем, что включает:
i. лигирование фрагментов нуклеиновой кислоты с адаптером, который содержит сайт для праймера секвенирования и нуклеотидную последовательность такую же, как и вторые связанные с поверхностью олигонуклеотиды,
ii. гибридизацию дотированных с адаптером геномных фрагментов с первым членом первой популяции связанных с поверхностью олигонуклеотидов,
iii. удлинение первого члена первой популяции связанных с поверхностью олигонуклеотидов, с которыми гибридизируется дотированный с адаптером фрагмент; и
iv. гибридизацию содержащего адаптер конца продукта удлинения со вторым связанным с подложкой полинуклеотидом, тем самым создавая мостик и способствуя мостиковой ПЦР.
19. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанная вторая популяция связанных с поверхностью олигонуклеотидов готовится путем лигирования олигонуклеотида, содержащего участок, который комплементарен последовательности указанного фрагмента нуклеиновой кислоты, с исходной второй популяцией связанных с поверхностью олигонуклеотидов для получения указанной второй популяции связанных с поверхностью олигонуклеотидов.
20. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанная амплификация производится путем мостиковой ПЦР.
21. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный фрагмент нуклеиновой кислоты является геномным фрагментом или кДНК.
22. Система, содержащая:
а) субстрат, содержащий первую популяцию связанных с поверхностью олигонуклеотидов и вторую популяцию связанных с поверхностью олигонуклеотидов, где первая и вторая популяции связанных с поверхностью олигонуклеотидов пространственно не направлены на субстрат;
б) олигонуклеотид отбора, который содержит участок, который гибридизируется с первым членом первой популяции, и участок, который содержит геномную последовательность;
в) адаптер и
г) инструкции для выполнения способа по п.1.