Способ моделирования гипоксического поражения тканей глаза с активацией апоптоза
METHOD FOR EYE TISSUE HYPOXIC DAMAGE SIMULATION WITH APOPTOSIS ACTIVATION

Изобретение относится к экспериментальной медицине и предназначено для моделирования гипоксического поражения поверхностных тканей глаза и сетчатки, приводящего к активации апоптоза в эксперименте.
На протяжении многих лет широко обсуждается роль различных типов гипоксии в развитии патологии глаза. Гипоксия играет важную роль в патогенезе дистрофических, ишемических, воспалительных и инфекционных заболеваний глазного яблока (Blasiak J., Petrovski G, Vereb Z.,  A., Kaarniranta K. Oxidative stress, hypoxia and autophagy in the neovascular processes of age-related macular degeneration // Biomed. Res. Int. 2014. P. 768026. doi: 10.1155/2014/768026). В ряде заболеваний глаза человека, таких как глаукома, катаракта, диабетическая ретинопатия, дистрофии сетчатки, наблюдается гибель клеток путем апоптоза (Каламкаров Г.Р. и др. Экспериментальная модель острой ишемии сетчатки глаза у крыс, Бюлл. Эксп.биологии и медицины. 2008. N 6. С. 634-638 и др.). Ранее было показано, что гипоксия индуцирует апоптотическую гибель в ганглиозных клетках сетчатки in vivo, а также в культуре ганглиозных клеток сетчатки и кератоцитах роговицы (Kaur С.et al., Hypoxia-ischemia and retinal ganglion cell damage, Clinic. Ophthalmol., 2008, Vol.2, N 4, p. 879-889; Peng Y. et al., Neuroprotective effect of protease-activated receptor-2 in the hypoxia-induced apoptosis of rat RGC-5 cells, J. Mol. Neurosci, 2013, Vol. 50, N l, p. 98-108.).
Наиболее часто гибель клеток происходит после преходящей ишемии, в патогенезе которой гипоксия играет важную роль. Апоптотический каскад включает активацию гена р53, ответственного за процесс повреждения и восстановления ДНК во время приходящей ишемии. Существует экспериментальная порода мышей, выведенных путем генной инженерии, у которых отсутствует ген р53. Доказана высокая резистентность этих животных к ишемическому повреждению, поэтому ген р53 считают одной из основных мишеней в терапевтической стратегии ишемии тканей глаза (Zhang SX et al., Genetic difference in susceptibility to the blood-retina barrier breakdown in diabetes and oxygen-induced retinopathy, Am J Pathol., 2005, 166 (1), p. 313-321). Известно много способов моделирования ишемического поражения тканей глаза с индукцией апоптоза, заключающихся в прекращении тока крови с нарушением баланса энергетических требований клетки, в этих экспериментах были задействованы обезьяны, собаки, кошки, грызуны. В большинстве экспериментальных исследований изучают влияние моделируемого ишемического повреждения глаза у крыс, кровоснабжение глаз у которых имеет сходство с кровотоком глаза у человека. Кроме того, данная модель является достаточно доступной (Киселева Т.Н. и др. Экспериментальное моделирование ишемического поражения глаза, Вестник РАМН, №11-12, 2014 г., с. 97-103).
Известен традиционный способ моделирования ишемии тканей глаза, включающий в себя окклюзию сосудов сетчатки глаза с помощью светового воздействия, при этом окклюзию осуществляют путем транспупиллярного воздействия на сосуды сетчатки I-III порядка и соответствующий им паравазальную сетчатку фотокоагулирующим лазерным излучение с определенными параметрами (RU 2313312 С1 от 03.05.2006 г.). С одной стороны, очевидно преимущество данного подхода, заключающегося в селективном воздействии на сетчатку. С другой стороны, данный способ не позволяет произвести комплексную оценку ишемического воздействия на функциональное состояние других тканей глаза.
Нужно подчеркнуть, что в связи с тем, что большинство известных способов нацелено на моделирование именно ретинальной ишемии или гипоксии, такой подход существенно сужает область возможных исследований последствий воздействия этих факторов на глаз, затрудняя оценку жизнеспособности и процессов клеточной гибели в других тканях глаза, таких как конъюнктива и передний эпителий роговицы.
Известно, что конъюнктива и передний эпителий роговицы секретируют основные компоненты слезной жидкости и выполняют в глазу жизненно важные защитную и метаболическую функции. Благодаря слезной жидкости осуществляются как биохимические, так и иммунные реакции, необходимые для нормального функционирования роговицы и конъюнктивы. (Полунин Г.С. и др. Особенности клинического течения различных форм синдрома сухого глаза - основа для разработки адекватных методов лечения, Веста. Офтальмологии, 2006, Т. 102, N 5, с. 17-20). Гибель клеток конъюнктивы приводит к патологическим изменениям ее морфологии, изменению состава слезной жидкости и нарушению общего функционального состояния глаза. Поражение клеток поверхности глазного яблока является одним из характерных признаков синдрома сухого глаза - мультифакторного заболевания, патогенез которого включает изменения воспалительного, а также аутоиммунного характера. Синдром сухого глаза имеет высокую частоту встречаемости у населения, поражая от 5 до 39% людей разного возраста. Среди многочисленных причин развития этой патологии глаза отмечают важную роль экзогенных факторов, в том числе влияние неблагоприятной экологической ситуации в целом. У пациентов с синдромом сухого глаза в биоптате конъюнктивы отмечается возрастание уровня провоспалительных цитокинов, маркеров апоптоза, среди которых АР02.7. (De Paiva CS et al, Rationale for anti-inflammatorytherapy in dry eye syndrome // Arq. Bras. Oftalmol. 2008. Vol. 71. P. 89-95).
Наиболее широко используемый способ моделирования гипоксического поражения тканей глаза с индукцией апоптотической гибели клеток заключается в воздействии физического фактора на экспериментальное животное (искусственное повышение давления, что приводит к повышению внутриглазного давления, ВГД) и получение гистологических образцов тканей глаза от подопытных животных. (Buchi ER et al, Pressure induced retinal ischemia in rats: en experimental model for quantitative study, Ophtalmologica, 1991, 203 (3), P. 138-147). Однако данный способ имеет существенное ограничение, поскольку высокое ВГД вызывает комбинированную компрессионно-ишемическую травму, что более характерно для глаукомного процесса и препятствует объективной оценке апоптотических процессов в других, в частности, поверхностных тканях глаза.
Таким образом, существует потребность в способе моделирования гипоксического поражения тканей глаза с индукцией клеточной гибели, заключающемся в возможности изучения активации апоптотических процессов как в тканях поверхности глаза, так и в сетчатке.
Техническим результатом настоящего изобретения является простота, доступность, возможность селективного действия моделируемых условий гипоксии на ткани поверхности глаза (конъюнктива, передний эпителий роговицы), так и на сетчатку, и оценки роли гипоксии в числе факторов, которые могут вызывать синдром сухого глаза.
3
Этот технический результат достигается тем, что предлагаемый способ моделирования гипоксического поражения тканей глаза с активацией апоптоза, заключающийся в воздействии физического фактора на экспериментальное животное, получении гистологических образцов тканей глаза и выявления в них клеток, находящихся в состоянии апоптоза, отличается тем, что животное помещают в герметично закрывающуюся камеру объемом 0,10-0,15 м, в которую производят подачу газообразного азота со скоростью 2,0-2,4 л/мин до появления судорог у экспериментального животного.
Способ моделирования гипоксического поражения тканей глаза заключается в следующем.
Для исследования использовали 20 самцов крыс линии Wistar в возрасте 3-4 мес. Из них 10 животных были подвергнуты однократному действию азота, замещающего вдыхаемый воздух. В контроле (10 крыс) животные оставались в лабораторных условиях. Воздействие достигалось в результате подачи газообразного азота со скоростью 2,0-2,4 л/мин в герметично закрывающейся камере до появления судорог у экспериментального животного. Скорость подачи азота контролировали с помощью лабораторного реометра. Результаты опытов анализировали через 3 ч после завершения действия гипоксии. Подопытных и контрольных животных умерщвляли эфиром, энуклеированные глаза подвергали обработке для выявления клеток, находящихся в состоянии апоптоза. Для идентификации в тканях глаза поврежденных клеток с фрагментированной ДНК применяли традиционный метод TUNEL (Terminal desoxynucleotidyl transferase - mediated desoxyuridine triphosphate (UTP) - nick end - labeling), используя набор реагентов «DeadEnd Fluorometric TUNEL System» (Promega Corporation, USA). Для этой цели глаза в течение 4 ч фиксировали в 4%-ном нейтральном формалине, приготовленном на 0.1 М фосфатном буфере (рН 7.4). Образцы отмывали в фосфатном буфере, затем, последовательно, в фосфатном буфере с 5% сахарозой; фосфатном буфере с 10% сахарозой; 20% сахарозой (в каждом растворе в трех сменах по 15 минут) и оставляли на ночь в фосфатном буфере с 20% сахарозой при 4°С. Глаза замораживали в специальной среде (Tissue-Tec OCT, Leica, Германия), с помощью криостата (Leica Ml900, Германия) были получены поперечные срезы глазного яблока и отобраны для анализа. Толщина срезов составляла 12 мкм.
Мечение фрагментированной ДНК по методу TUNEL проводили по протоколу фирмы-производителя. Перед проведением энзиматической реакции срезы отмывали в 0.1 М PBS, фиксировали в 4% параформальдегиде в течение 5 минут, затем отмывали от фиксатора в 0.1 М PBS трижды в течение 5 минут. Реакцию проводили в течение часа при температуре 37°С, затем реакцию останавливали путем отмывания срезов в 2-кратном растворе SSC (Фиг. 1а, 2а, 3а). Для подтверждения специфичности реакции мечения фрагментированных участков ДНК, образующихся в клетках глаза, подвергающихся апоптозу, также проводили стандартную контрольную реакцию в отсутствие рекомбинантной терминальной дезоксинуклеотидил трансферазы. Ядра клеток окрашивали ядерным красителем Hoechst 33342, разведенным в 0.1 М PBS (1:1000, Leica, Германия), в течение двух минут. После окрашивания, срезы отмывали в нескольких сменах 0.1 М PBS, по 15 минут в каждом растворе, и заключали в специальную среду для препаратов с флуоресцентной меткой - Vectashield (Vector, США). Локализацию флуоресцентного свечения и его интенсивность в меченых клетках тканей глаза (Фиг. 16, 26, 36) анализировали с использованием флуоресцентного микроскопа Leica DM RXA2 (Германия), с передачей изображения на компьютерную приставку, оснащенную программой Leica for Windows. Результаты анализировали на поперечных срезах глаза. Изображения обрабатывали с помощью компьютерной программы Image J.
3
Выбранные в предлагаемом способе параметры воздействия (использование герметично закрывающейся камеры объемом 0,10-0,15 м, в которую производят подачу газообразного азота со скоростью 2,0-2,4 л/мин до появления судорог у лабораторного животного) являются оптимальными для запуска избирательного интенсивного поражения ДНК в клетках тканей поверхности глаза и сетчатке, не затрагивая других тканей - хрусталик, радужку, цилиарное тело, хориодею, что позволяет одновременно смоделировать состояние тканей при синдроме сухого глаза и гипоксическое поражение сетчатки.
Так, нами приведены микрофотографии срезов тканей глаза экспериментальной модели: (Фиг. 1 - сетчатка, Фиг. 2 - конъюнктива, Фиг. 3 - роговица, а - мечение фрагментированной ДНК (1) по методу TTJNEL, 6 - флуоресцентное свечение апоптозированных клеток (2), окрашенных ядерным красителем Hoechst 33342). Избирательное интенсивное апоптотическое поражение наблюдалось только в клетках передней поверхности глаза (клетках конъюнктивы и переднего эпителия роговицы) и в клетках сетчатки. Окрашивание срезов глаза ядерным красителем Hoechst 33342 подтверждает локализацию апоптоза в ядрах клеток. Во всех изученных глазах наблюдали сходное распределение поврежденных клеток. В препаратах, приготовленных по протоколу производителя набора, служивших отрицательным контролем для подтверждения специфичности реакции в опыте с отсутствием фермента - терминальной дезоксинуклеотидил трансферазы, меченых клеток не наблюдали. В глазах контрольной группы животных, не подвергавшейся воздействию гипоксии, в исследуемых областях тканей поверхности глаза были отмечены лишь единичные меченые клетки. В других тканях глаза - хрусталике, радужке, цилиарном теле, хориодее апоптотические клетки отсутствовали как в опыте, так и в контроле. Таким образом, гипоксия в условиях, моделируемых с помощью предлагаемого способа, вызывала интенсивный процесс апоптоза только в клетках тканей поверхности глаза и в сетчатке.
Таким образом, предлагаемый способ достаточно прост, доступен, обеспечивает возможность селективной активации апоптотических процессов в тканях поверхности глаза (конъюнктива, передний эпителий роговицы) и сетчатке, и оценки гипоксии в числе факторов, вызывающих синдром сухого глаза и ретинопатию.