Белково-антигенный спектр экстракта из протосколексов Cysticercus tenuicollis

марит была очень чёткая. Можно предположить, что исследованные нейромедиаторы, как и у других представителей трематод, вероятно, принимают участие в регуляции активности мышечных элементов, включая мускулатуру репродуктивного тракта и прикрепительных органов.

Работа была поддержана грантами РФФИ 09-04-00243а и Президента РФ МК-1093.2011.4.

Литература: 1.Корнийчук Ю.М. // Паразитология. - 2008.- 42(1)-С. 4152. 2.Рыбаков А.В., Незлин Л.П. // «Простые нервные системы и их значение для теории и практики». Материалы Всесоюзной конференции. Казань. 1988.-С. 256-260. 3. Boyle J.P. and Yoshino T.P. // J. Parasitol.- 2005.- V.91 (3).- P. 542-550. 4.Coons A.H., Leduc E.H., Connolly J.M. // J. Exper. Med. - 1955. - V. 102. - Р. 4960. 5.Halton D.W., Maule A.G. //2004.- Can J. Zool.-V.82.- Р.316-333. 6. Sebelova S., Stewart M.T., Mousley A., Fried B., Marks N.J., Halton D.W.// Parasitology Research.- 2004.- V.93.- P.196-206. 7.Stewart M.T., Marks N.J., Halton D.W. // Parasitology Research.-2003.-V.91- P.12-21.8.Terenina N.B., Tolstenkov O.O., Fagerholm H.-P., Serbina E.A., Vodjanitskaja S.N., Gustafsson M.K.S.// Tissue & Cell -2006-V.38 - P. 151-157. 9.Wahlberg M.H. // Cell and Tissue Research. - 1998. -V. 291. - Р. 561-570.

Serotoninergic and peptidergic components in nerve system of trematode Helicometra fasciata Rudolphi, 1819 (Opecoelidae) at different stages of life cycle. Tolstenkov O.O., Kornijchuk Ju.M., Terenina N.B. Centre of Parasitology of A.N. Severtsov Institute of Ecology and Evolution. A.A. Kovalevsky Institute of Biology of the Southern Seas, NASU.

Summary. The localization of serotoninergic and FMRFergic structures in nerve system of trematode Helicometra fasciata Rudolphi, 1819 (Opecoelidae) was studied at different stages of life cycle. The hermaphroditic stages - adult and metacercaria as well as the parthenogenetic stage - sporocysts were studied. FRMFamide and strotonin immunoreactive elements were detected in the central and peripheral parts of metacercaria and adult nerve system. The nerve system of cercariae inside of sporocysts showed the positive reaction on serotonin and FMRFamide. For the first time the positive serotonin immunostaining was observed in germ balls of sporocysts. The obtained data showed the high significance of neurotransmitters serotonin and neuropeptide FMREamide at different stages of life cycle of trematodes.

БЕЛКОВО-АНТИГЕННЫЙ СПЕКТР ЭКСТРАКТА ИЗ ПРОТОСКОЛЕКСОВ CYSTICERCUS TENUICOLLIS

Тхакахова А. А.

ВНИИ гельминтологии им. К.И. Скрябина

Введение. Иммунохимическими исследованиями антигенов цестод было установлено, что наибольшую специфичность при достаточной

515

чувствительности в иммунореакциях проявляют антигенные компоненты онкосфер, протосколексов, метаболиты личинок цестод (Rhoads et al., 1985; Jenkins, Rixard, 1986; Yong and Heath, 1984 и др.). Использование этих антигенов в качестве диагностических значительно повышает специфичность иммунологических реакций при цестодозах, однако не всегда позволяет дифференцировать инвазию. Последнее связано с характером иммунного ответа при цестодозах, в процессе которого синтезируются антитела различной специфичности, перекрестно реагирующие с гетерологичными антигенами (Ибрагимов, 1970; Мунтян, 1971; Баллад, 1973; Blazek et al., 1982; Kassai et al., 1984).

И, тем не менее, использование в качестве источника антигенных препаратов личиночных стадий цестод, их очистка от неспецифических соединений это один из основных путей повышения диагностической эффективности иммунодиагностических реакций при цестодозах.

Исходя из этого, была поставлена цель - получить очищенный антигенный препарат из протосколексов C.tenuicollis, имеющий

диагностическое значение.

Материалы и методы. Протосколексы C.tenuicollis для приготовления антигена-экстракта получали от убойных овец, естественно инвазированных тенуикольными цистицерками. Подготовленный биоматериал измельчали, растирали в ступке, помещенной в посуду со льдом, в полученную массу добавляли фосфатный буферный раствор рH 7,4 в соотношении 1:4 и озвучивали 10 мин на ультразвуковом дезинтеграторе MSE 100 при амплитуде 8 мКм и мощности генератора 80 Кгц. Полученную суспензию оставляли на ночь в холодильнике (40), а затем центрифугировали в течение 25 мин при 12000 об./мин на ультрацентрифуге с охлаждением тип К-24. Надосадочную жидкость (экстракт) использовали для дальнейших исследований после определения в нем белка по Lowry et al. (1951).

Фракционирование полученного экстракта проводили гель-хроматографией на носителе TSK Gel HW-50 (тонкий). Колонки диаметром 26 мм, высота столба геля - 1 м, объем наносимого образца - 10 мл (25,0 мг белка), объем каждой фракции - 5 мл. Элюирование осуществляли фосфатносолевым буферным раствором pH 7,2, скорость протока буфера составляла 10 мл/час. Регистрацию фракций проводили на Увикорде (LKB) при 280 нм, сбор фракций в коллекторе Мультирак. Весь процесс разделения проводили при 40С.

Антигенную активность полученных фракций осуществляли ИФР, используя в качестве контроля сыворотки инвазированных C. tenuicollis овец и клинически здоровых животных.

Результаты и обсуждение. В процессе гель-хроматографии экстракта из протосколексов C.tenuicollis было получено 65 фракций с различным содержанием белка (от 0,008 до 1,23 мг/мл).

Антигенную активность полученных белковых фракций определяли по разнице оптической плотности (ОП) между референс положительной и

516

отрицательной контрольной сывороткой (табл.). Анализ количественного распределения белка-антигена протосколексов C.tenuicollis по фракциям показал, что большая его часть находится в сравнительно низкомолекулярном спектре фракций, в то время как диагностическую эффективность проявили компоненты высокой молекулярной массы. Особенно четко это было продемонстрировано при анализе серологической активности каждой из 65 полученных белковых фракций исследуемого экстракта (табл.).

Результаты этого анализа показали, что значительное количество белковых фракций в экстракте из протосколексов паразита не представляют интереса в диагностическом плане, поскольку они не имеют в своем составе антигенные компоненты, способные выявлять противопарзитарные антитела. Из числа исследованных фракций только в 8 (12,3%) была зарегистрирована антигенная активность, позволяющая по разнице оптической плотности между положительными и отрицательными контрольными сыворотками дифференцировать зараженных животных. Антигеноактивные фракции в белковом спектре экстракта из протосколексов C. tenuicollis располагались в зоне распределения фракций 27-34 (табл.). Эти фракции были объединены и использованы для дальнейших испытаний по оценке их диагностической эффективности с сыворотками животных естественно инвазированных C.tenuicollis и другими гельминтами.

Таблица

Антигенная активность белковых фракций экстракта из протосколексов C.tenuicollis

№ фракций Оптическая плотность (ОП) в Иф №

ОП с положит. контр. сывор.

1 0,080 0,079 0,001 35 0,780 0,670 0,110

2 0,085 0,082 0,003 36 0,765 0,690 0,075

3 0,135 0,121 0,014 37 0,760 0,705 0,055

4 0,139 0,134 0,005 38 0,630 0,605 0,025

5 0,142 0,140 0,002 39 0,790 0,780 0,010

6 0,217 0,209 0,008 40 0,789 0,790 -0,001

7 0,224 0,215 0,009 41 0,855 0,845 0,010

8 0,312 0,296 0,016 42 0,875 0,870 0,005

9 0,360 0,330 0,030 43 0,925 0,890 0,035

10 0,390 0,375 0,015 44 1,020 1,00 0,020

11 0,202 0,198 0,004 45 1,205 1,105 0,100

12 0,200 0,201 0,001 46 0,870 0,865 0,005

13 0,190 0,180 0,010 47 0,815 0,820 -0,005

14 0,171 0,185 -0,014 48 0,750 0,735 0,015

517

15 0,315 0,300 0,015 49 0,615 0,605 0,010

16 0,317 0,315 0,002 50 0,407 0,380 0,027

17 0,320 0,309 0,011 51 0,390 0,250 0,140

18 0,335 0,320 0,015 52 0,360 0,270 0,090

19 0,337 0,360 -0,023 53 0,370 0,250 0,120

20 0,355 0,340 0,015 54 0,380 0,300 0,080

21 0,380 0,340 0,340 55 0,290 0,275 0,015

22 0,407 0315 0,092 56 0,270 0,265 0,005

23 0,409 0,290 0,119 57 0,305 0,300 0,005

24 0,412 0,305 0,107 58 0,215 0,200 0,015

25 0,415 0,131 0,284 59 0,202 0,190 0,012

26 0,460 0,138 0,322 60 0,195 0,180 0,015

27 0,639 0,141 0,398 61 0,103 0,100 0,003

28 0,668 0,132 0,536 62 0,098 0,090 0,008

29 0,875 0,140 0,735 63 0,080 0,089 -0,09

30 1,015 0,140 0,965 64 0,075 0,060 0,005

31 1,107 0,135 0,972 65 0,058 0,050 0,008

32 1,112 0,131 0,981

33 0,902 0,120 0,782

34 0,890 0,118 0,772

Литература: 1. Баллад Н.Е. // Мед. паразитол. и паразитарн. болезни. -1973. - № 2. - С. 131-136. 2. Ибрагимов Р.М. Получение и биохимическая характеристика антигенных (аллергенных) фракций эхинококка. Автореф. дис. канд. биол. наук. - Алма-Ата. - 1970. -21с. 3. Мунтян Н.А. // Мед. паразитол. и паразитарн. болезни. - 1971. - №5. - С.558-665. 4. Blazec R., Brec K.A., Buchwalder R. et al. // Folia parasitol. - 1982. - t. 29, № 3. - P. 253-258. 5. Jenkins D.J., Rickard M.D. // Aust. Vet. J. - 1986. - V. 63. № 2. - P. 40-42. 6. Kassai T., Takats C., Rede P. // mady. allotorv. Lapja. - 1984. - V. 39 - № 3. - P. 165-169. 7. Lowry O.H., Rosenbrongh N.J., Farr A.L., Randall R.S. // J. Biol. Chem. - 1951. - V. 193. - № 1. - P. 265-275. 8. Rhoads M.L., Murrell K.D., Dilling G.W. // J. Parasitol. - 1985. - V. 71. - № 6. - P. 779-787. 9. Yong W. K., Heath D.D., Knapen F. // Res. Vet. Sc. - 1984. - V. 36. - № 1 - P. 24-31.

Protein-antigenic spectrum of Cysticercus tenuicollis protoscolices extract. Thakahova A.A. All-Russian K.I. Skryabin Scientific Research Institute of Helminthology.

Summary. One performed fractionation of C. tenuicollis protoscolices extract using gel filtration at TSK-Gel HW-50 (bine). As a result 65 protein fractions were obtained the most part of which were in low molecular spectrum. Using ELISA with reference positive and negative control sera 8 fractions (27-34; 12,3%) were isolated from of 65 obtained fractions in which diagnostic antigen-active components were recorded.

518