МЕТИЛИРОВАНИЕ ГЕНОВ RASSF1A, RARβ2, SEMA3B В ЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ ОПУХОЛЯХ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ, ЯИЧНИКОВ И ПРИ ПОЛИНЕОПЛАЗИИ

Метилирование генов ЛАДОШ, ЛАЛр2, БЕМАЭБ в эпителиальных опухолях молочной железы, яичников и при полинеоплазии

Т.П. Казубская1, В.И. Логинов2, Д.С. Ходырев2, В.Д. Ермилова1, Ю.Г. Паяниди1, Н.В. Чхиквадзе1, В.Ю. Сельчук1, Э.А. Брага2

1ФГБУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН; 2Государственный научный центр РФ ГосНИИгенетика, Москва

Контакты: Татьяна Павловна Казубская kazubskaya@yahoo.com

Проведено изучение статуса метилирования генов-супрессоров RЛSSF1A, ЯЛЯр2 и 8ЕИА3Б в образцах рака и гистологически нормальной ткани молочной железы и яичников. Выявлена высокая частота аномального метилирования СрО-островка генов RASSF1A, ВАВ.р2 и SEMЛ3Б в опухолях молочной железы — 78 % (32/41), 46 % (26/56) и 35 % (22/65) соответственно, в опухолях яичников — 73 % (33/45), 30 % (15/50), 50 % (25/51). Впервые было установлено, что у 90 % пациенток с первично-множественными злокачественными опухолями с поражением молочной железы и яичников имеет место гиперметилирование в СрО-островках, принадлежащих генам RЛSSF1A, ВАВ.р2. Показано, что аномальное метилирование промоторной области гена RASSF1Л можно обнаружить на доклинической стадии развития этих опухолей. Выявлена корреляция частоты метилирования промоторных районов генов ВАВ.р2, SEMA3Б с клинической стадией и степенью анаплазии рака молочной железы и яичников. Анализ метилирования генов в биологических жидкостях предполагает большие возможности использования метилирования ДНК как маркера в клинической практике.

Ключевые слова: рак молочной железы, рак яичников, первично-множественный рак, метилирование, гены RЛSSF1A, ЯШв и SEMA3Б

Methylation of the RASSF1A, RARp2, and SEMA3B genes in epithelial breast and ovarian tumors,

and in patients with polyneoplasia

T.P. Kazubskaya1, V.I. Loginov2, D.S. Khodyrev2, V.D. Ermilova1,

Yu.G. Payanidi1, N.V. Chkhikvadze1, V.Yu. Selchuk1, E.A. Braga2

1N.N. Blokhin Russian Cancer Research Cancer, Russian Academy of Medical Sciences;

2State Research Center, State Research Institute of Genetics, Moscow

The methylation status of the tumor suppressor genes RASSF1A, RARft2, and SEMA3B was studied in the samples of cancer and its histologically normal tissue of the breast and ovaries. The high rate of abnormal methylation of the CpG islet in the RASSF1A, RARfi2, and SEMA3B genes was found in the tumors of the breast (78 % (32/41), 46% (26/56), and 35 % (22/65), respectively) and ovaries 73 % (33/45), 30 % (15/50), and 50 % (25/51). Hypermethylation in the CpG islets belonging to the RASSF1A and RARft2 genes was first ascertained in 90% of the patients with polyneoplasms involving the breast and ovaries. Abnormal methylation of the promotor region of the RASSF1A gene was shown to be detectable in preclinical-stage and anaplasia-degree breast and ovarian cancer. There was a correlation of the rate of methylation in the promoter regions of the RARft2 and SEMA3B genes with clinical-stage and anaplasia-degree breast and ovarian cancer. Analysis of gene methylation in biological fluids provides considerable opportunity to use methylation of DNA as a marker in clinical practice.

Key words: breast cancer, ovarian cancer, polyneoplasia, methylation, RASSF1A, RARft2, and SEMA3B genes

Введение

По темпам прироста заболеваемости рак молочной железы (РМЖ) занимает 1-е место среди других злокачественных новообразований. Ежегодная заболеваемость РМЖ в Европе составляет 109,9, а смертность — 38,5 случаев на 100 тыс. женщин в год. Рак яичников (РЯ) — 5-я по частоте причина смерти от злокачественных новообразований среди женщин и наиболее распространенная причина смерти у всех больных с опухолями женских половых органов [1]. В настоящее время реальных тестов для раннего выявления РМЖ и РЯ не существует. Известно, что мутации в генах БRCA1 и БRCA2 ассоциированы с повышенным риском развития РМЖ и РЯ и отвечают за

большинство наследственных форм этих заболеваний. Однако мутации данных генов в популяции встречаются очень редко (1 на 400 индивидов) и еще реже — в спорадических формах этих заболеваний [2, 3]. Пациентки, пораженные РМЖ и РЯ, имеют высокий риск развития второго первичного рака в парном органе и в таких органах, как толстая кишка, эндометрий, щитовидная железа, меланома кожи [4]. Выявление малигнизации молочной железы и яичников на ранней стадии развития заболевания могло бы улучшить выживаемость этих больных. На развитие РМЖ и РЯ оказывают влияние многие факторы, в том числе образ жизни, гормональные, генетические, окружающие факторы среды, и, как теперь известно, их

Гинекология

Гинекология

канцерогенез является многоступенчатым процессом, включающим различные мол екулярно-генетические изменения. В настоящее время эпигенетические изменения генов играют важную роль в механизме развития этих заболеваний и рассматриваются как потенциальные маркеры канцерогенеза. Корреляция специфических эпигенетических изменений в опухоли может иметь потенциальные возможности для ранней диагностики РМЖ и РЯ и прогнозирования течения заболевании, так же как и для терапевтической стратегии.

В нормальных клетках метилирование ДНК гена встречается первоначально в его промоторном регионе, который включает CpG-островки. Обозначение CpG применяется для пар цитозин-гуанин, которые последовательно располагаются в одной и той же цепи ДНК, где цитозины предшествуют гуанинам и имеют повышенную чувствительность к метилированию. В норме метилирование CpG-островков регулирует экспрессию генов. Механизм этого процесса заключается в том, что промоторные (регуляторные) регионы генов характеризуются накоплением большого количества CpG-пар, и если они подвергаются метилированию, угнетается транскрипция этого гена [5, 6]. Гены, подвергающиеся метилированию во время ранней фазы туморогенеза, являются потенциальными маркерами ранней диагностики рака. Гены, подвергающиеся метилированию в процессе прогрессии малиг-низации, служат потенциальными прогностическими маркерами [5, 6].

Цель исследования — комплексный анализ метилирования генов-супрессоров RASSF1A (Ras-association domain family), SEMA3B (semaphorin 3B), RARfi2 (retinoic acid receptor) при РМЖ и РЯ, направленный на изучение роли метилирования этих генов в первичных опухолях молочной железы и яичников, а также на поиск и характеристику маркеров заболевания.

Материалы и методы

Для исследования статуса метилирования генов RASSF1A, RARfi2, SEMA3B использовали образцы пациенток, которые до операции не были подвергнуты лучевой или химиотерапии. Исследовались парные образцы опухолевой и прилежащей гистологически нормальной ткани 56 образцов РМЖ и 50 эпителиальных опухолей яичников. Все случаи классифицировали по TNM в соответствии с требованиями Международного противоракового союза (UICC, 1998). Для отбора образцов с высоким содержанием опухолевых клеток проводился гистологический анализ микросрезов (толщина —

5 мкм) после их окрашивания эозин-гематоксилином, что позволяло получить в исследуемом материале не менее 70 % опухолевых клеток. Образцы тканей хранили при температуре -70 °С. В качестве контроля использовали лимфоциты периферической крови здоровых ин-

дивидов (п = 15). ДНК выделяли из ткани опухоли и из лимфоцитов крови по стандартной методике. Работа была проведена на базе Государственного научного центра РФ ГосНИИгенетика.

Анализ метилирования методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) и бисульфитной модификации ДНК.

Метилирование генов RASSF1A, RARв2, SEMA3Б изучали с помощью ПЦР, специфичной к метилированному аллелю (метилспецифичная (МСП) ПЦР). Метод МСП основан на бисульфитной конверсии ДНК, которая достигается взаимодействием молекул гидросульфита с цитозином с превращением последнего в урацил. В дальнейшем осуществляется амплификация исследуемого фрагмента ДНК с помощью ПЦР. При этом все остатки урацила и тимина амплифици-руются как тимин, и только 5-метилцитозин воспроизводится как цитозин [7].

Анализ метилирования с использованием метилчув-ствительных рестрикционных эндонуклеаз (метилчув-ствительный рестрикционный анализ — МЧРА). Метод основан на способности метилчувствительных ре-стриктаз гидролизовать ДНК, не содержащую модифицированных оснований, и оставлять негидролизованными участки, содержащие 5-метилцитозин. ДНК последовательно гидролизовали Нра11 (CCGG) НИа1 (GCGC), АсП (CCGC), и ВбЫ2361 (CGCG) и использовали в качестве матрицы для ПЦР. Расщепление ДНК рестриктазами НИа1 и Нра11 проводили в буфере Y, ВбЫ2361 — в буфере R, АсИ — в буфере КЕВийег № 3. Для амплификации применяли 2,5 мкл гидролизованной ДНК. Последовательности олигонуклеотид-ных праймеров и условия проведения ПЦР приведены в табл. 1.

Статистический анализ

Конкордантность методов МСП и МЧРА оценивали статистически методом ранговой корреляции Спирмана. Достоверность коэффициента корреляции Спирмана (Кб) проверяли с помощью 1-теста Стью-дента: 1 = Кб / ^((1 — Кб2) / (К — 2)) с числом степеней свободы V = N — 2, где N — размер выборки. Соответствие данных МЧРА и секвенирования, значимость повышенной частоты и плотности метилирования в опухолях по сравнению с образцами прилежащей морфологически не измененной ткани оценивали статистически с помощью ранговой корреляции Спир-мана и теста Фишера.

Результаты и обсуждение

Выбор генов RASSF1A, RЛRp2, SEMA3Б для изучения метилирования обусловлен тем, что на коротком плече хромосомы 3 (3р21.31) выявлены критичные районы, характеризующиеся высокой плотностью

Таблица 1. Параметры маркеров, использованных при анализе метилирования промоторного района генов RЛSSF1A, RARp2, SEMA3Б методом МЧРА

Маркер Структура праймеров Т / Mg, мМ§ отж Продукт ПЦР, п.н.

K1* TGCCCTCTGGACTGGAACCT CCTGAGCCCAGCCCAAGTC 64 “C 1,5 445

K2** AGAGTTTGATGGAGTTGGGT CATTCGGTTTGGGTCAATCC 62 “C 1,5 229

RASSF1A GTAAAGCTGGCCTCCAGAAACACGG GCAGCTCAATGAGCTCAGGCTCCCC 65 “C 2,5# З57

RASSF1A-inte GGGGTGGGGTGTGAGGAGGGGACGAA GGGCGGCGGGAAGGAGCTGAGGAGA 64 “C 1,5 150

RAR-F1-RAR-R1 F:ATTT GAAGGTTAGCAGCCCG 56 “C 680

R:CATTCGGTTTGGGTCAATCC

Rar-m-F-Rar-m-R F:AAGTGAGTTGTTTAGAGGTAGGAGGG 6З “C 280

R:CCTATAATTAAT CCAAATAAT CATTTACC

SEMAJB TTGAGATATTGGAGTCCACGGGTG CAGTGTT GGCCT GGAAGACCT C 56 “C 1,5 450

SEMAJB-int CCTTTGCCTGCTGAGCCCCTGGAG ACCGCCCGCCGTGCCGTAAAGT 64 “C 1,5 242

Примечание. *K1 — контроль полноты гидролиза ДНК, фрагмент гена р-ЗЛ-адаптина (ID Gen Bank AF247736.2, [22]); **K2 — контроль сохранности ДНК, фрагмент экзона 1 гена RARf>2 [8]; fRASSF1A — фрагмент гена RASSF1A, использованный в M4PA и при поиске HD; eRASSFlA-int — фрагмент гена RASSF1A, использованный при поиске HD; §состав буфера (кроме #): 60мM Трис-HCl, рН8.5, 10мM2-мер-каптоэтанол, 25мMKCl, 0,1% ТритонХ-100, 1,5мMMgCl2; *состав буфера: 67^M Трис-HCl, рН 8.8; 16,7мM(NH4)2s04; 0,01% твин-20[8].

и содержащие группы генов, обладающих способностью подавлять рост опухолевых клеток человека [5]. Изучение метилирования ДНК в опухолях молочной железы и яичников проводилось с использованием комбинации методов (бисульфитное секвенирование, МЧРА и МСП-ПЦР), что позволило не только более полно определить долю образцов, в которых эти гены были метилированы, но и оценить плотность метилирования CpG-островка в каждом образце.

Следует отметить, что клиническая информация для всех анализируемых групп больных не была известна до окончания изучения, которое показало, что из 59 изученных образцов РМЖ 12 принадлежали пациенткам с первично-множественными злокачественными опухолями (ПМЗО), а из 50 образцов РЯ — 5 были с ПМЗО, одной из которых являлся РЯ.

Исследован статус метилирования 18 CpG-пар в локусе гена RЛSSF1A. Данные по метилированию этого гена в 4 опухолях молочной железы и 5 опухолях яичников представлены на рис. 1, где видно, что уровень метилирования гена RЛSSF1A в эпителиальных структурах РМЖ и РЯ выше, чем в гистологически нормальном эпителии тех же пациенток.

Частоты метилирования гена RЛSSF1A в опухолях и нормальной ткани достоверно отличались (р < 0,005).

Плотность метилирования CpG-пар была менее выражена, и согласно МЧРА достоверность различий по Фишеру при РМЖ составила 1,6 х 10-5, а при РЯ — 0,22 (табл. 2). Метилирования промоторного района гена RASSF1A в ДНК крови 15 здоровых доноров не выявлено. В табл. 2 представлены данные метилирования гена RЛSSF1A. Согласно МЧРА плотность метилирования CpG-пар достигает 63 % (361/576) в опухоли молочной железы и 40 % (43/108) — в гистологически нормальной ткани.

Для всех исследованных опухолей установлена достоверная положительная корреляция полученных результатов методами МСП и МЧРА. Частота метилирования в опухоли молочной железы методом МЧРА была определена в 78 % (32/41), методом МСП — в 64 % (18/28) случаев против 62 % (28/45) [9]. Частота метилирования в РЯ, установленная методами МЧРА и МСП, составила 73 % (33/45) и 59 % (17/29) соответственно, что почти в 1,5 раза превышает известное значение в литературе (40 %) [10]. Полученные данные по частоте метилирования промоторного региона гена RЛSSF1A оказались близкими к наибольшим, имеющимся в литературе значениям. Однако следует отметить, что наблюдаемые различия гена RЛSSF1A могут быть связаны как с чувствительностью метода,

6З

Гинекология

Гинекология

T

T

N

BC

T

N

T

N

M

180

170

160

506 511 541 542 552

TNTNT N T N TNM

EOC 1 і

180

170

160

M

304

516

540

545

T T

445 п.н. 357 п.н.

229 п.н.

Рис. 1. Pезультат анализа метилирования промоторной области гена RASSF1A с применением метода MСП-ПЦP в образцах PMЖ и PЯ. Электрофоретическое разделение в 10 % полиакриламидном геле продуктов MСП-ПЦP, полученных для образцов ДНК. П..P проводили на ДНК, конвертированной бисульфитом. Исследован фрагмент 168 п.н. гена RASSF1A. M — маркер длин фрагментов с шагом 10 п.н. (10 bp DNA ladder). Контроль полноты рестрикции — фрагмент 445 п.н., контроль целостности ДНК — фрагмент 229 п.н., анализируемый фрагмент гена RASSF1A — 357п.н. К (-) — отрицательный контроль (в отсутствие ДНК). M — маркер длин фрагментов с шагом 100 п.н. (100 bp DNA ladder). Т — опухоль, N — норма

так и с этнографическими особенностями исследуемых популяций.

Примечательным является то, что нами впервые была обнаружена значительная корреляция между метилированием гена RASSF1A и пациентками с ПМЗО. Метилирование промоторной области гена

RЛSSF1A зарегистрировано у 90 % (12/11) больных с ПМЗО, причем у 6 из них наблюдался билатеральный РМЖ, а у 5 — одной из первичных опухолей был РМЖ. Пациентка, у которой метилирование этого участка ДНК выявлено не было, имела 3 первичных опухоли (рак эндометрия в 40 лет, рак слепой кишки

Таблица 2. Частота и плотность метилирования промоторного района гена RASSF1A в РМЖ, РЯ и гистологически нормальной ткани по данным МСП и МЧРА*

Вид рака МСП МЧРА

Частота метилирования** Частота метилирования** Плотность метилирования*** Уровень метилирования, %****

РМЖ:

p 6,39 x 10 -7 0,0051 1,6 x 10 -5

T 18|28; 64 % З2|41; 78 % З61|576; 63 % 49

N 0|28; 0 % 6|17; 35 % 4З|108; 40 % 14

РЯ:

p 2,16 x 10 -6 4,14 x 10 -6 0,2249

T 17|29; 59 % ЗЗ|45; 73 % З46|594; 58 % 42

N 1|29; 3 % 2|19;11 % 17|З6; 47 % 5,2

Примечание. *Рассчитано на сновании данных МЧРА и МСП (59 образцов РМЖ и 50 — РЯ). **Частота метилирования — доля образцов, в которых выявлено метилирование. ***Плотность метилирования — доля метилированных CpG-nар группы. За 100 % принято произведение CpG на число образцов, в которых обнаружено метилирование. ****Уровень метилирования рассчитывали как произведение частоты метилирования на его плотность. Достоверность (р) рассчитана с помощью теста Фишера.

№

образца

Бисульфитное секвенирование

5 6

12 13

14 15

16

3801

3851

5181

3641

5411

3221

3631

5061

5431

380п

518п

541п

585п

МЧРА

Нра11 АеП ВвЫ23б1

1,11, 15 Н 5, 6

Рис. 2. Данные бисульфитного секвенирования и МЧРА при анализе метилирования CpG-островка промоторной области гена RARp2. Черный прямоугольник — метилирование установлено, белый прямоугольник — метилирование не выявлено. Сверху позиции CpG-динуклеотидов; CpG- динуклеотиды 4,5, 6, 11,14 и 15, исследованные двумя методами, отмечены белым шрифтом на сером фоне; с левого края приведены номера образцов РЯ

в 49 лет и РМЖ в 50 лет.) Анализ ее родословной позволил идентифицировать синдром наследственного неполипозного колоректального рака (ННКРР) или Линча-2. Метилирование гена RЛSSF1A также обнаружено в 90 % (4/5) имеющихся образцов больных с ПМЗО, у которых одной из первичных опухолей был РЯ. Кроме того, у исследуемых пациенток, помимо высокой частоты метилирования в малигнизирован-ном эпителии, аналогичное эпигенетическое изменение имело место в гистологически нормальной, прилежащей к опухоли ткани как молочных желез, так и яичников. Установлены четкие различия в уровнях метилирования этого участка ДНК в опухолевой и прилежащей нормальной ткани: 49 % против 14 % и 42 % против 5 % — при РМЖ и РЯ соответственно. При этом метилирование гена RЛSSF1A в нормальной ткани молочной железы выявлялось в 10 % случаев, в то время как при изучении метилирования этого гена в ДНК крови 15 здоровых пациенток было показано полное его отсутствие (0/15), что позволяет считать метилирование данного гена ранним молекулярным маркером злокачественной трансформации РМЖ и РЯ. Полученные данные согласуются с результатами работ, в которых было установлено, что характерное для опухоли метилирование ДНК обнаруживается также в морфологически нормальной, смежной с опухолью ткани, находящейся на определенном расстоянии от очага и не представляющей опухолевое микроокружение. Все это указывает на то, что характерные для опухоли эпигенетические изменения возникают раньше, чем структурные изменения ДНК [11—14].

Определение статуса метилирования промоторной области гена RARp проводилось на тех же образцах

опухолей больных РМЖ и РЯ. Результаты анализа метилирования 9 образцов ДНК опухолей яичников и 4 — ДНК гистологически нормальной ткани яичников представлены на рис. 2. При сопоставлении этих данных отмечается схожесть результатов, полученных двумя независимыми методами. Методом бисульфит-ного секвенирования метилирование промоторной области гена RARp2 выявлено в 5, а методом МЧРА — в 4 из 9 образцов РЯ.

Проведенный анализ впервые показал, что частота метилирования промоторного района гена RARfi2 со-

а

%

60

50

40

30

20

10

0

б

%

60 -| 50 -40 -30 -20 -10 -0

РМЖ р = 3,59 х 10

РЯ

0,0006

1/11 III 1/11 ШЛУ

Степень анаплазии

р = 4,48 х 10<

Стадия р = 3,82 х 10-

Рис. 3. Показатели уровня метилирования промоторной области гена RARfi2 в ДНК РМЖ и РЯ: а — частота метилирования промоторного CpG-островка гена RARp2 в образцах ДНК первичных опухолей РМЖ и РЯ по сравнению с таковой в образцах ДНК гистологически нормальной ткани тех же пациенток; б — корреляция уровня метилирования

Гинекология

Гинекология

G17

GNAI2

SEMA3B

IFRD2/SM15

coding region  - inslated region

II 11 J  го п № 1

CpG  ! 1 4

~ 1400 bp Г

ATG 2

ATG 1

Рис. 4. Расположение и структурная организация гена БЕМАЗБ. Показаны 2 CpG-островка: проксимальный — в области интрона между не-транслируемым экзоном-1 и транслируемым экзоном-2

ставляет 46 % (26/56) при РМЖ и 30 % (15/50) — при РЯ. Частота метилирования при РМЖ достигает 46 % (26/56) и сопоставима с данными литературы (41 %) [10].

У пациенток с полинеоплазиями метилирование этого гена выявлено в 67 % (8/12) образцов ПМЗО с поражением молочной железы и в 90 % (4/5) — с поражением яичника. Метилирования гена ВЛЯ.р2 в образцах РМЖ 4 больных билатеральным РМЖ и 1 пациентки с синдромом Линча-2 не обнаружено. Показатели уровня метилирования промоторной области гена ВЛЯ.р2 в ДНК РМЖ и РЯ представлены на рис. 3.

На рис. 3а видно, что частота метилирования в ДНК опухолей молочной железы и яичников достоверно выше соответствующих величин, полученных для ДНК из морфологически нормальной ткани этих органов от тех же больных (р < 0,001). Наличие метилирования промоторной области гена ВЛЯ.р2 в некоторых образцах ДНК гистологически нормальной ткани молочной железы и яичников пациенток, выявляемое с частотой до 3—4 %, означает, что эта модификация может происходить в начале онкогенеза и предшествовать структурным изменениям в ДНК тканей больных. В ДНК из лимфоцитов крови 15 здоровых доноров с использованием 3 метилчувствитель-ных рестриктаз не зафиксировано ни одного случая метилирования CpG-островка промоторной области гена ЯЛЯв2.

Исследование корреляции частоты метилирования промоторной области гена ЯЛЯв2 с прогрессией РМЖ позволило установить, что частота метилирования этого гена увеличивалась как при более высокой степени ана-плазии, так и при прогрессии опухоли (см. рис. 36). Таким образом, уровень метилирования (с учетом плотности метилирования CpG-островка) гена ЯЛЛв2 достоверно коррелирует с прогрессией РМЖ.

Для определения частоты метилирования промо-торной области гена SEMЛ3B применялись те же образцы опухолей больных РМЖ и РЯ. Исследование продемонстрировало, что дистальный CpG-островок, расположенный в промоторной области гена SEMЛ3B перед ЛTG2 (рис. 4), характеризуется высокой плотностью CpG-динуклеотидов.

Проведенный анализ показал, что согласно данным МЧРА метилирование гена SEMЛ3B выявляется в > 35 % образцов ДНК РМЖ и в 50 % — РЯ. У пациенток с первично-множественным раком метилирование гена SEMЛ3B обнаружено в 33 % (4/12) образцов РМЖ (причем в 2 из этих образцов имела место деле-ция) и в 60 % (3/5) — РЯ (в 1 из образцов выявлена делеция), что свидетельствует о наличии аномального метилирования этого гена при ПМЗО с поражением тканей молочной железы и яичников.

В ходе изучения метилирования гена SEMЛ3B (с учетом плотности метилирования) в зависимости от

%

70

б0

50

40

30

20

10

0

23/б5

I

2б/51

1/35

N T РМЖ p = 1,0б x 10-

N T

РЯ

p = 5,07 x 10-

%

80

70

б0

50

40

30

20

10

11/15

12/50

I/II III/IV p = 0,0013

%

70 -б0 -50 -40 -30 -20 -10 -0

LlI

I/II III

Степень анаплазии p = 3,бб x 108

I/II III/IV Стадия

p « 108

Рис. 5. Метилирование гена БЕМАЗВ: а — частота метилирования дистального промоторного CpG-островка гена БЕМАЗВ в образцах ДНК первичных опухолей РМЖи РЯ в гистологически нормальной ткани; б — корреляция частоты метилирования гена БЕМАЗВ с клинической стадией РМЖ; в — корреляция плотности метилирования промоторного CpG-островка гена БЕМАЗВ со степенью анаплазии и клинической стадией РМЖ. Достоверность рассчитана с помощью теста Фишера

б

а

в

0

клинической стадии и степени злокачественности указанных опухолей отмечена достоверная корреляция частоты метилирования с прогрессией РМЖ (р < 0,03) и степени метилирования (с учетом плотности) с прогрессией РМЖ (р < 10-7) и РЯ (р < 0,02) (рис. 5).

Кроме того, установлено, что промоторная область гена БЕМАЗВ достоверно чаще метилирована в ДНК опухоли, чем в ДНК соответствующей гистологически нормальной ткани той же пациентки (р < 10-4 по Фишеру) (см. рис. 5а), тогда как в ДНК из лимфоцитов крови 15 здоровых доноров не выявлено ни одного случая метилирования этого участка ДНК. Полученные данные указывают на функциональное значение и специфичность метилирования промоторной области гена БЕМАЗВ в онкогенезе этих опухолей.

Данные по метилированию гена БЕМАЗВ ранее были получены только для рака одной локализации — легкого, причем для более проксимального CpG-островка [15]. В работе впервые выявлено метилирование не исследованного ранее дистального промоторного CpG-островка гена БЕМАЗВ в опухолях молочной железы и яичников.

Заключение

При изучении статуса метилирования генов ЯАББЕМ, ЯАЯр2 и БЕМАЗВ было установлено, что эпигенетическое изменение этих генов может являться одним из последовательных молекулярных изменений при РМЖ и РЯ, а метилирование ВАББЕ1А и ВАЕ$2 коррелирует с тенденцией к развитию ПМЗО в молочной железе и яичниках. Возможно, изменение метилирования в ДНК представляет одну из самых значимых причин появления молекулярных изменений у пациенток на пути к развитию ПМЗО. Выявленные особенности эпигенетических изменений ЯАББЕМ, ЯАЯр2 и БЕМАЗВ могут быть использованы как в целях ранней диагностики РМЖ (метилирование гена ВАББЕЫ), так и в качестве новых прогностических тестов (метилирование генов БЕМАЗВ и ВАЯр2), и позволят выделить группы риска больных по развитию РМЖ и РЯ — как солитарных, так и ПМЗО.

Анализ метилирования генов в биологических жидкостях предполагает большие возможности применения метилирования ДНК как маркера в клинической практике.

1. Минимальные клинические рекомендации Европейского общества медицинской онкологии (ESMO). М., 2009.

2. Pharoah P.D., Antoniou A., Bobrow M. et al. Polygenic 48 susceptibility to breast cancer and implications for prevention.

Nat Genet 2002;31:33-6.

3. Narod S.A., Foulkes W.D. BRCA1 and BRCA2: 1994 and beyond. Nat Rev Cancer 2004;(9):665-76.

ЛИТЕРАТУРА

4. Galper S., Gelman R., Recht A. et al. Second non-breast malignancies after conservative surgery and radiation therapy for early-stage breast cancer. Int J Radiat Oncol Biol Phys 2002;52:406-14.

5. Dammann R., Li C., Yoon J.H. et al. Epigenetic inactivation of a RAS association domain family protein from the lung tumour suppressor locus 3p21.3. Nat Genet 2000; 25:315-9.

6. Имянитов Е.Н., Хансон К.П. Молекулярная онкология: клинические аспекты. СПб., 2GG7.

7. Clark S.J., Harrison J., Paul C.L., Frommer M. High sensitivity mapping of methylated cytosines. Nucl Acids Res 1994;22:299G-7.

8. Ivanova T., Petrenko A., Gritsko T. et al. Methylation and silencing of the retinoic acid receptor-в2 gene in cervical cancer.

BMC Cancer 2GG2;2:4—11.

Гинекология

Гинекология

9. Dreijerink K., Braga E., Kuzmin I. et al. The candidate tumor suppressor gene, RASSF1A, from human chromosome 3p21.3 is involved in kidney tumorigenesis.

Proc Natl Acad Sci 2001;98:7504-9.

10. Dammann R., Schagdarsurengin U., Seidel C. et al. The tumor suppressor RASSF1A in human carcinogenesis:

an update. Histol Histopathol 2005; 20(2):645—66.

11. Lerman M.I., Minna J.D.

The 630-kb lung cancer homozygous deletion region on human chromosome

3p21.3: identification and evaluation of the resident candidate tumor suppressor genes. Cancer Res 2000;60(21):6116—33.

12. Логинов В.И., Малюкова А.В., Серегин Ю.А. и др. Уровень метилирования гена RASSF1A в эпителиальных опухолях почки, молочной железы и яичников. Мол биол 2004; 38:654—67.

13. Брага Э.А., Киселев Л.Л., Забаровский Е.Р. От идентификации геномных полиморфизмов к диагностическим и прогностическим маркерам

эпителиальных опухолей человека. Мол биол 2004;38:179-90.

14. Angeloni D. Molecular analysis of deletions in human chromosome 3p21 and the role of resident cancer genes

in disease. Brief Funct Genom Proteom 2007;6(1):19—39.

15. Tomizawa Y., Kohno T., Kondo H., Otsuka A. et al. Clinicopathological signifycance of epigenetic inactivation of RASSF1A at 3p21.3 in stage I lung adenocarcinoma. Clin Cancer Res 2002; 8:2362—8.