ВОДНЫЙ ОФТАЛЬМОЛОГИЧЕСКИЙ РАСТВОР НА ОСНОВЕ ЦИКЛОСПОРИНА A
AQUEOUS OPHTHALMIC SOLUTION BASED ON CYCLOSPORIN A

Область техники
Настоящее изобретение предлагает водный офтальмологический раствор, содержащий в качестве действующего ингредиента иммуносупрессорное средство, такое как циклоспорин A. Указанный раствор обладает токсикологическими и аллергенными характеристиками, которые допустимы при лечении нарушений, связанных с глазной поверхностью, имеющих иммунно-воспалительную основу, таких как сухость глаза или потеря чувствительности роговицы.
Точнее говоря, настоящее изобретение касается водного офтальмологического раствора, в котором действующий ингредиент, в частности циклоспорин A, составлен с трехкомпонентной полимерной системой, так что он может быть солюбилизирован в терапевтически эффективном количестве и с превосходной стабильностью, даже без какого-либо консерванта.
Уровень техники
Синдром сухого глаза, также называемый сухость глаза или сухой кератоконъюнктивит (KCS), представляет собой состояние, при котором слезные железы не вырабатывают достаточное количество слез. Это приводит к неприятным ощущениям в глазу, сопровождаемым зудом, резью и/или ощущением жжения.
Сухость глаза может происходить в результате патологии слезных желез, воспаления век, воспаления глаза из-за аллергии, рефракционной хирургии (в частности, с применением лазера), нехватки определенных липидов в повседневном пищевом рационе, длительного ношения контактных линз, гормональных изменений, автоиммунного заболевания или побочных эффектов определенных лекарственных препаратов.
Потеря чувствительности роговицы может происходить, например, в результате осложнений после хирургического вмешательства, изъязвления или вирусной инфекции (вирусного кератита) роговицы.
При лечении сухости глаза применение искусственных слез, также известных как смазывающие или увлажняющие глазные капли, обеспечивает краткосрочное местное облегчение, но не решает проблему с системной точки зрения: они не помогают организму увеличить количество или улучшить качество слез и представляют собой только временный заменяющий раствор. Искусственные слезы низкой или средней вязкости, как правило, основаны на поливиниловых спиртах или производных целлюлозы, тогда как слезы с большей вязкостью содержат карбомеры или гиалуроновую кислоту.
Более перспективное лечение этих двух типов состояний основано на местном применении циклоспорина A.
Циклоспорин A, обычно называемый циклоспорин, представляет собой эффективное иммуносупрессорное средство, применяемое, в частности, при трансплантации органов и для предотвращения острого отторжения аллотрансплантатов.
По-видимому, все сходятся на том, что циклоспорин действует путем ингибирования кальциневрина, фосфатазы, вовлеченной в транскрипцию гена интерлейкина 2, в норме секретируемого T-лимфоцитами. Кроме того, циклоспорин A ингибирует выработку лимфокинов и высвобождение интерлейкинов, что ведет к существенному снижению активности эффекторных T-лимфоцитов. Другими словами, циклоспорин A представляет собой молекулу, которая может ингибировать или препятствовать активности иммунной системы.
Циклоспорин A представляет собой циклический пептид из одиннадцати аминокислот, синтезируемый микроскопическим грибом Tolypocladium inflatum. Циклоспорин A характеризуется формулой [R-[[R*,R*-(E)]]-циклический(L-аланил-D-аланил-N-метил-L-лейцил-N-метил-L-лейцил-N-метил-L-валил-3-гидрокси-N,4-диметил-L-2-амино-6-октеноил-L-α-амино-бутирил-N-метилглицил-N-метил-L-лейцил-L-валил-N-метил-L-лейцил) (номер по CAS 59865-13-3) со следующей структурой:
.
Сложностью при практическом использовании циклоспорина A является то, что он только очень слабо растворим в водных средах, порядка 20-30 мкг/л при 25°C, т.е. 0,002-0,003 вес. % (вес/объем). С другой стороны, эта молекула растворима в спиртах (например, этаноле или метаноле), ацетонитриле, этилацетате и маслах (например, оливковом масле, маисовом или касторовом масле).
Такая же проблема с растворимостью возникает в случае других офтальмологических иммуносупрессорных средств, таких как такролимус (номер по CAS: 104987-11-3) или рапамицин (номер по CAS: 53123-88-9).
Было сделано множество попыток получения состава глазной примочки для лечения сухих глаз и потери чувствительности роговицы, имеющих приемлемую переносимость при инстилляции и биодоступность циклоспорина A в тканях-мишенях.
Переносимость измеряют по раздражению, вызванному глазной примочкой в глазе после ее инстилляции, например, с помощью шкалы, разработанной Draize et al. (Methods for the study of irritation and toxicity of substances applied topically to the skin and mucous membranes. J. Pharmacol. and Exp. Therapeutics, 1944; 82: 377–390).
Вместе с тем, эффективность проникновения глазной примочки отражает биодоступность циклоспорина A в различных тканях, имеющая место после инстилляции, т.е. в конъюнктиве (глазного яблока и века) и роговице.
Принимая во внимание очень низкую растворимость циклоспорина A в воде, разработки в области офтальмологии были сосредоточены на глазных примочках в форме эмульсий или водно-спиртовых растворов.
TM
Таким образом, циклоспорин A доступен в продаже в Соединенных Штатах в форме 0,05% эмульсии в касторовом масле. Этот продукт, реализуемый в виде не содержащих консерванта однократных доз под названием Restasis, рекомендован для лечения сухого кератоконъюнктивита.
В Европе, и более конкретно во Франции, введение циклоспорина A зависит в основном от госпитальных препаратов. Однако эти госпитальные препараты, у которых концентрация варьирует от 0,05 до 2% активного вещества в масляной среде (оливковое масло, касторовое масло или маисовое масло) и/или в присутствии спирта, стабильны только в течение нескольких недель.
При этом в обоих случаях, переносимость при инстилляции не является подходящей, что уменьшает правильное соблюдение режима лечения, и, вследствие этого, его эффективность.
TM
Nourry et al. (Etude de la cytotoxicité de différents collyres à base de ciclosporine A buvable (Sandimmun). J. Fr. Ophtalmol., 2006; 29, 3, 251-257) предположили, что вспомогательные вещества (масло и/или спирт) этих глазных примочек вызывают побочные эффекты, такие как раздражение конъюнктивы или гиперемия, токсичность в отношении эпителия роговицы, зуд или ощущения жжения. Те же авторы сравнили переносимость водно-спиртовых и масляных (эмульсионных) глазных примочек и пришли к выводу, что масляные глазные примочки вызывают меньше раздражений при инстилляции, чем водно-спиртовые глазные примочки.
Это причина того, почему самые последние разработки в области глазных примочек, в частности, на основе циклоспорина A, направлены на улучшение эффективности масляных или эмульсионных глазных примочек, чтобы увеличить их переносимость при инстилляции, при этом в то же самое время преодолеть проблемы растворимости.
Все же существует очевидная потребность в разработке офтальмологических составов на основе иммуносупрессоров, в частности, с применением циклоспорина A, со следующими характеристиками:
- представлены в форме водных растворов,
- стабильны в течение длительного времени,
- хорошо переносятся глазом после инстилляции,
- хорошее проникновение в роговицу,
- содержат подходящую дозу для лечения, в частности, синдрома сухого глаза и потери чувствительности роговицы.
Раскрытие изобретения
В настоящем изобретении, несмотря на низкую растворимость офтальмологических иммуносупрессоров, заявитель разработал стабильный водный раствор, необязательно не содержащий консервантов, в котором концентрация циклоспорина A обеспечивает то, что продукт является эффективным, а фармацевтический состав гарантирует очень хорошую переносимость при инстилляции.
Следовательно, согласно первому варианту осуществления настоящее изобретение касается водного офтальмологического раствора, содержащего иммуносупрессорное средство, предпочтительно циклоспорин A, и по меньшей мере три полимера.
Вследствие комбинированного применения 3 целесообразно выбранных полимеров в воде может быть растворено эффективное терапевтическое количество иммуносупрессора, предпочтительно циклоспорина A, при этом указанную композицию получают с вязкостью, подходящей для местного глазного применения. Другими словами, 3 полимера играют роль в солюбилизации и/или желатинизации и служат в качестве солюбилизирующих средств и/или желатинизирующих средств, даже совместно солюбилизирующих и/или совместно желатинизирующих средств.
Водный офтальмологический раствор согласно настоящему изобретению, таким образом, включает в качестве его действующего вещества слаборастворимое иммуносупрессорное средство, предпочтительно циклоспорин A. Тем не менее, можно применять тот же принцип составления для других местных глазных иммуносупрессорных средств, которые только слегка растворимы в воде, таких как другие формы циклоспорина, такролимус (номер по CAS: 104987-11-3) или рапамицин (номер по CAS: 53123-88-9).
Концентрация действующего вещества в растворе, в частности циклоспорина A, составляет, соответственно, от 0,01 до 0,2 вес. % раствора (вес к объему или вес/объем), предпочтительно от 0,05 до 0,1%. Эти значения представляют собой эффективные терапевтические количества и они сравнимы с предельными значениями солюбилизации предложенных систем составления. Согласно предпочтительному варианту осуществления, в частности для циклоспорина, концентрация больше или равна 0,05 вес. %, предпочтительно больше 0,05%, более предпочтительно больше или равна 0,1 вес. %, что соответствует солюбилизированному количеству, никогда не достигаемому в случае водного раствора. Для иммуносупрессорных средств, кроме циклоспорина, особенно для имеющих бóльшую растворимость в воде, отношение веса к объему в растворе согласно настоящему изобретению может быть больше или равно 0,1%, предпочтительно больше или равно 0,2%, более предпочтительно больше или равно 0,5% или даже 1%.
Следует отметить, что раствор согласно настоящему изобретению также может содержать другие действующие вещества из той же категории (т.е. иммуносупрессорные средства) или из другой категории. С целью соответствия, указанное другое действующее вещество(а) также находится в солюбилизированной форме. Согласно предпочтительному варианту осуществления другое действующее вещество(а) не является кортикостероидом.
2
Композиция согласно настоящему изобретению обычно представлена как водный раствор. По определению, водный раствор представляет собой жидкую фазу, содержащую несколько химических веществ, из которых одно, т.е. вода (HO), представляет собой главное вещество и действует как растворитель (или среда) для второстепенных веществ, образующих растворенные компоненты или «растворенные химические вещества». Преимущественно, раствор согласно настоящему изобретению не содержит органический растворитель, в частности какой-либо спирт, такой как этанол.
В настоящем изобретении, таким образом, циклоспорин растворен в растворе и не находится в виде мицелл или в эмульсии (в масляной фазе), как, например, в известном уровне техники. Предпочтительно, раствор согласно настоящему изобретению, следовательно, не содержит масло, в частности какое-либо масло растительного происхождения, такое как касторовое масло.
Согласно другому предпочтительному варианту осуществления раствор согласно настоящему изобретению фактически не содержит частиц, в частности, определяемых с помощью способа 2.9.19 в Европейской фармакопее. Конкретно, раствор преимущественно не содержит мицелл.
Согласно настоящему изобретению эту солюбилизацию обеспечивает трехкомпонентная полимерная система.
Водный офтальмологический раствор согласно настоящему изобретению содержит первый полимер, предпочтительно выбранный из производных целлюлозы, точнее говоря, из эфиров целлюлозы. Хотя эти производные известны своими желатинизирующими свойствами, заявитель обнаружил, что они обеспечивают возможность предварительной солюбилизации иммуносупрессора, предпочтительно циклоспорина A. Этот первый полимер, следовательно, может служить в качестве совместного солюбилизатора/совместного желатинизирующего средства.
Предпочтительно производное целлюлозы выбрано из группы, включающей: метилцеллюлозу, этилцеллюлозу, гидроксиэтилцеллюлозу, гидроксипропилцеллюлозу, карбоксиметилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу или их соли. Более предпочтительно оно представляет собой карбоксиметилцеллюлозу натрия (Na).
Концентрация этого первого полимера, предпочтительно производного целлюлозы, соответственно, составляет от 0,1 до 3 вес. % раствора (вес к объему или вес/объем), предпочтительно от 0,5 до 1,5% и предпочтительно равна 0,8%.
Согласно предпочтительному варианту осуществления иммуносупрессорное средство, предпочтительно циклоспорин A, предварительно солюбилизируют на первом этапе в присутствии этого первого полимера в воде. В результате этого первого этапа получают суспензию, которую затем смешивают с двумя другими полимерами раствора.
Водный офтальмологический раствор согласно настоящему изобретению включает второй полимер, предпочтительно поливиниловый полимер, более предпочтительно поливиниловый спирт.
Поливиниловый спирт (номер по CAS 9002-89-5) известен своими желатинизирующими свойствами, поэтому его используют в качестве желатинизирующего средства. Примечательно, что это производное поливинила принимает заметное участие в совместной солюбилизации циклоспорина A, вероятно, через использование его гидроксильных групп.
Другое производное поливинила, которое можно использовать, представляет собой поливинилпирролидон или повидон (PVP) (номер по CAS 9003-39-8).
Концентрация второго полимера, предпочтительно производного поливинила, соответственно, составляет от 0,25 до 3 вес. % раствора (вес к объему или вес/объем), предпочтительно равна 0,5%.
TM
Причем эти 2 категории полимеров выбраны из семейства вспомогательных веществ, широко используемых для состава глазных примочек, предназначенных для лечения сухости глаза. Таким образом, тогда как для лечения при помощи Restasis рекомендуется сопутствующее применение искусственных слез, офтальмологический раствор согласно настоящему изобретению действует как продукт «2 в 1».
Водный офтальмологический раствор согласно настоящему изобретению обычно включает третий полимер, играющий роль главного солюбилизирующего средства, предпочтительно неионный полимер. Предпочтительно он представляет собой полимер с липофильной функциональной группой, такой как макроголглицерина гидроксистеарат. Макроголглицерина гидроксистеарат представляет собой неионное солюбилизирующее средство, подходящее для совместной солюбилизации, например, циклоспорина A, в частности, благодаря его неполярной части.
n
7
25
40
60
Эти полимеры состоят из молекулы жирной кислоты с C18, омега-9 гидроксилированной рицинолевой кислоты или (R)-(+)-12-гидрокси-9Z-октадеценовой кислоты (неполярная часть), и 35 молекул полиэтиленгликоля H-(O-CH=CH)-OH, с варьирующими длинами углеродной цепи (C, C, C или C), определяющими классы 7, 25, 40 или 60.
Еще более предпочтительно, третий полимер представляет собой макроголглицерина гидроксистеарат 40, также называемый PEG-40 гидрогенизированное касторовое масло, его номер по CAS 61788-85-0.
Концентрация третьего полимера, предпочтительно макроголглицерина гидроксистеарата, соответственно, составляет от 0,5 до 20 вес. % раствора (вес к объему или вес/объем), предпочтительно от 5 до 15% и более предпочтительно равна 10%. Таким образом он представляет собой главный полимер трехкомпонентной системы.
Предпочтительно раствор согласно настоящему изобретению не содержит циклодекстрин. Согласно другому предпочтительному варианту осуществления он не содержит вещество, способствующее проникновению, такое как BAK или DMSO, как известно, помогающие солюбилизации действующих веществ и дестабилизирующие мембрану клеток, составляющих эпителий роговицы.
Предпочтительно, комбинирование этих трех полимеров обеспечивает раствор согласно настоящему изобретению с вязкостью, подходящей для требуемого местного офтальмологического применения.
Таким образом, подходящая вязкость раствора согласно настоящему изобретению меньше или равна 50 мПа·с (сП), предпочтительно от 5 до 50 мПа·с и более предпочтительно от 5 до 15 мПа·с, при измерении с помощью ротационного вискозиметра Брукфильда RVDV III при 25°C.
По сути, эта вязкость предпочтительно близка к вязкости человеческих слез, оцениваемой как приблизительно 6,5 мПа·с при 20°C и имеющей градиент скорости близкий к нулю. Таким образом, применение раствора согласно настоящему изобретению не вызывает ощущение дискомфорта или раздражение. В самом деле, было определено, что легкое удаление, не вызывающее неприятных ощущений, возможно только в случае, когда вязкость смеси офтальмологического раствора/слез ниже 50 мПа·с.
Водный офтальмологический раствор, естественно, в дополнение может содержать добавку, выбранную из группы неионных средств изотоничности, антиоксидантных средств и/или буферных систем.
Раствор согласно настоящему изобретению предпочтительно имеет нейтральный pH, предпочтительно от 6,5 до 7. Предпочтительно он представляет собой изотонический состав, имеющий осмоляльность предпочтительно от 290 до 350 мосмоль/кг.
В определенном варианте осуществления раствор согласно настоящему изобретению состоит из ингредиентов, приведенных в таблице ниже, предпочтительно согласно показанному процентному составу:
ПРОДУКТ
ФУНКЦИЯ
ПРОЦЕНТНЫЙ СОСТАВ (г/100 г)
Циклоспорин A
Активный продукт
0,01 – 0,10
Макроголглицерина гидроксистеарат 40
Совместно солюбилизирующее средство/совместно желатинизирующее средство
10,0
Карбоксиметилцеллюлоза натрия
Совместно солюбилизирующее средство/совместно желатинизирующее средство
0,80
NaH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>·H<sub>2</sub>O
Буфер
0,520
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O
Буфер
0,652
PVA
Совместно солюбилизирующее средство/совместно желатинизирующее средство
0,50
Вода
-
qs 100
Как отмечено в заявке и предпочтительно, раствор согласно настоящему изобретению не содержит противомикробный консервант, в частности, не содержит консервант ряда четвертичного аммония, такой как, например, хлорид бензалкония (BAK).
В настоящем изобретении «противомикробный консервант» или «противомикробный» означает консервирующее средство с противомикробными свойствами, т.е. соединение, способное гарантировать защиту от возможного загрязнения микроорганизмами для офтальмологического раствора. Обычно в качестве консервантов применяют соединения ряда четвертичного аммония, в частности хлорид бензалкония (BAK) или поликвад, возможно связанные с EDTA (например, эдетатом динатрия).
Другие возможные консерванты включают без ограничений:
- консерванты на основе гуанидина (PHMB, хлоргексидин, …);
- бензиловый спирт;
- парабены (метил, пропил, …);
- консерванты на основе ртути, такие как тиомерсал;
- хлорбутанол;
- хлориды бензетония;
- консерванты окислительного типа (Purite, …);
-...

Состав по настоящему изобретению может предоставляться в качестве однодозовых (содержащих одну дозу) или многодозовых флаконов, таких как Abak, Comod или эквивалентных, чтобы обеспечить возможность подачи офтальмологического раствора без консервантов в течение нескольких дней.
Следовательно, настоящее изобретение также касается однодозового (содержащего одну дозу) или многодозового флакона, содержащего ранее описанный офтальмологический раствор, например, сделанного из LDPE, предпочтительно, с качеством, соответствующим EP, не содержащего добавок.
В дополнение, раствор согласно настоящему изобретению стабилен по меньшей мере в течение 24 месяцев или по меньшей мере в течение 36 месяцев при температуре окружающей среды (25°C – 30°C).
Настоящее изобретение также касается применения данного раствора при лечении нарушений, связанных с поверхностью глаза, которые имеют иммунно-воспалительную основу.
В офтальмологии человека данный раствор особенно подходит для лечения синдрома сухого глаза и/или потери чувствительности роговицы.
Признаки, связанные с потерей чувствительности роговицы, например, связаны с:
- операцией, оказывающей негативное влияние на роговицу;
- вирусной инфекцией (например, вирусами герпеса HSV-I, HSV-II или VZV);
- кераторефракционной хирургией или проникающей кератопластикой;
- пациентом, у которого проводят радиальную кератотомию;
- фотореактивной кератотомией;
- операцией LASIK (лазерной кератопластикой in situ), в частности EPI-LASIK (эпителиальный LASIK) или LASEK (лазерный субэпителиальный кератомилез).
- Кроме того, раствор согласно настоящему изобретению можно применять в ветеринарной медицине, в частности, в следующих случаях:
- сухой кератоконъюнктивит у собак;
- проблемы неоваскуляризации роговицы, пигментации роговицы и клеточной инфильтрации при хроническом поверхностном кератите у собак (CSK собак), кошек и лошадей;
- лимфоплазмоцитарная инфильтрация мигательной перепонки у собак;
- эозинофильный кератит у кошек и лошадей;
- точечный кератит у собак (такс и т.д.) и лошадей;
- кератоувеит, эндотелит, определенные вялотекущие язвы и периодические приливы крови у лошадей;
- в комбинации, при лечении воспалительных реакций иммунного происхождения у собак, кошек и лошадей;
- при профилактике отторжения трансплантатов роговицы у собак, кошек и лошадей.
По сути, раствор согласно настоящему изобретению вводят людям или животным с помощью местного пути введения, в форме одной или нескольких капель в день в каждый глаз.
В другом варианте осуществления и, в частности, касательно применения производного целлюлозы, настоящее изобретение касается способа получения раствора согласно настоящему изобретению, включающего следующие этапы:
- предварительная солюбилизация иммуномодулирующего средства, предпочтительно циклоспорина A, в присутствии по меньшей мере части первого полимера (предпочтительно 25 вес. %), предпочтительно производного целлюлозы, в присутствии воды и предпочтительно при помешивании;
- смешивание оставшейся части, если таковая имеется, первого полимера (предпочтительно, 75 вес. %), предпочтительно производного целлюлозы, с двумя другими полимерами, водой и, необязательно, буферными системами и средствами изотоничности, предпочтительно при помешивании и/или нагревании, например, до температуры 60°C;
- смешивание продуктов, полученных в предыдущих этапах, предпочтительно при помешивании и/или нагревании, например, до температуры 60°C.
В конце указанного способа указанный раствор можно стерилизовать нагреванием, предпочтительно с помощью автоклава, ввиду его сохранения и применения в офтальмологии.
Как очевидно из заявки, водный офтальмологический раствор согласно настоящему изобретению имеет несколько оригинальных признаков и преимуществ:
- он стабилен в течение длительного времени;
- он лучше переносится при инстилляции, чем масляная эмульсия и/или водно-спиртовой раствор;
- он хорошо проникает в роговицу, не накапливаясь в конъюнктиве или не переходя в водянистую влагу или в кровь;
- он содержит дозу циклоспорина A, подходящую для лечения нарушений, связанных с поверхностью глаза, с воспалительно-иммунной основой, таких как сухость глаза и/или потеря чувствительности роговицы.
Примеры вариантов осуществления
Настоящее изобретение и преимущества, вытекающие из него, лучше проиллюстрировать с помощью следующих неисчерпывающих примеров, приведенных для сведения, подкрепленных прилагаемыми фигурами, на которых:
фигура 1 изображает глазное проникновение в динамике по времени в конъюнктиву (A) и роговицу (B) циклоспорина A при трех концентрациях (0,01, 0,05 и 0,1%, соответственно);
ой
фигура 2 изображает фармакокинетический профиль в конъюнктиве (Cj) и роговице (Co) раствора согласно настоящему изобретению, содержащего 0,1% циклоспорин A, после повторных инстилляций (3 дозы в день в течение 9 дней (мультидоза) и анализа 28дозы в день 10).
I- Получение раствора 0,1% (вес/вес) циклоспорина A (партия 100 кг)
I-1/Получение части A:
200 г порошка карбоксиметилцеллюлозы натрия (первый полимер; 25% конечного количества) смешивали с 100 г порошка циклоспорина A (действующее вещество, с качеством, соответствующим статье в Европейской фармакопее), затем добавляли 3 литра воды. Смешивали при помешивании в течение часа.
Циклоспорин A находится в форме мелкодисперсного порошка, токсичного для оператора. Этот первый этап предварительной солюбилизации дает молочно-белую суспензию циклоспорина A, намного более безопасную для оператора.
I-2/Получение части B:
500 г поливинилового спирта (или PVA, второй полимер) добавляли к приблизительно 65 литрам холодной воды (75% конечного объема воды). Их смешивали при помешивании, постепенно повышая температуру до 60°C.
Когда PVA растворился (после минимум 30 минут при 300 об./мин.), добавляли 10 кг макроголглицерина гидроксистеарата 40 (или PEG-40 гидрогенизованное касторовое масло, третий полимер). Раствор смешивали при помешивании в течение приблизительно 20 минут при 60°C.
2
4
2
2
4
2
Затем вводили буферы (NaHPO·HO и NaHPO·2HO) и раствор смешивали при помешивании в течение 20 минут при 60°C. При тех же условиях (приблизительно 20 минут при 60°C) постепенно добавляли 600 г карбоксиметилцеллюлозы натрия (первый полимер; 75% конечного количества).
I:-3/Получение конечного раствора:
Часть A добавляли к части B. После гомогенизации, конечный объем дополняли водой и смешивали в течение 10 минут при 60°C.
Полученный таким образом водный офтальмологический раствор стерилизовали при 121°C в течение 20 минут при помешивании. Его можно фасовать без какого-либо консерванта, в частности, противомикробного консерванта, либо во флаконы из LDPE (полиэтилен низкой плотности) одноразового применения, либо в многодозовые флаконы ABAK или COMOD или другого типа.
Следует отметить, что время получения стерильного водного офтальмологического раствора согласно настоящему изобретению заметно сокращено (максимум 8 часов) по сравнению с протоколами из известного уровня техники, в частности, документа WO 2009/099467, в котором по меньшей мере один из этапов смешивания происходит на протяжении ночи.
Данный способ производства обеспечивает возможность традиционного подхода для промышленного производства стерильных офтальмологических продуктов, без длительного обездвиживания промышленного оборудования, фактора риска с точки зрения роста микроорганизмов.
I-4/Композиция полученного раствора:
ПРОДУКТ
ФУНКЦИЯ
ПРОЦЕНТНЫЙ СОСТАВ (г/100 г или %)
Циклоспорин A
Действующее вещество
0,10
Макроголглицерина гидроксистеарат 40
Солюбилизирующее средство
10,0
Карбоксиметилцеллюлоза натрия
Совместно солюбилизирующее средство/желатинизирующее средство
0,80
NaH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>·H<sub>2</sub>O
Буфер
0,520
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O
Буфер
0,652
PVA
Желатинизирующее средство
0,50
Вода
Среда
qs 100
Следует отметить, что тот же протокол можно применять для получения раствора с концентрацией циклоспорина A от 0,01 до 0,1% (вес/объем), например, из расчета 0,05%.
I-5/Характеристики полученного раствора:
Тесты
Описания
Внешний вид
Слегка опалесцентный бесцветный раствор
pH
6,79
Осмоляльность (мосмоль/кг)
303
Опалесценция (NTU)
3,65
Окраска (метод 2.2.2 по Евр. Фарм.: говорится, что раствор является бесцветным, если он имеет внешний вид воды или растворителя, или если он не более окрашен, чем контрольный раствор B<sub>9</sub>)
<B9
Частицы (метод 2.9.19 Евр. Фарм.)Частицы>=10 мкмЧастицы>=25 мкм
Соответствует570 (<6000)17 (<600)
Вязкость (мПа•с)
7,55
Концентрация действующего вещества (г/100 мл)
0,099
Очевидно, что полученный раствор имеет следующие преимущества:
- нейтральный pH;
- изотонический состав;
- вязкость, близкую к таковой человеческих слез. На самом деле, вязкость человеческих слез при 20°C будет составлять приблизительно 6,5 мПа·с с градиентом скорости, близким в нулю. Сила, прилагаемая веками во время нормального моргания, составляет приблизительно 0,2 Н, а во время усиленного моргания – приблизительно 0,7-0,8 Н. В присутствии раствора согласно настоящему изобретению пациент не испытывает каких-либо неприятных ощущений или раздражения, которые возникают во время моргания, когда веки должны двигаться с силой больше или равной 0,9 Н, поскольку это ощущение дискомфорта вызывается рефлекторным морганием для стимуляции быстрого удаления с помощью слез.
Данный раствор представляет собой состав с хорошей переносимостью, полученный вопреки очень слабой растворимости действующего вещества в воде.
II- Стабильность раствора согласно настоящему изобретению
Тесты на стабильность при 25°C (таблица 1) и 40°C (таблица 2) продемонстрировали очень хорошую стабильность раствора согласно настоящему изобретению, так что можно заявить срок хранения 36 месяцев в условиях хранения при температуре окружающей среды.
Таблица 1. Стабильность водного офтальмологического раствора согласно настоящему изобретению при 25°C и относительной влажности 40%
ТЕСТЫ
НОРМЫ
Начальный
6 месяцев
12 месяцев
24 месяца
36 месяцев
Внешний вид
Вязкий, опалесцентный, бесцветный - слегка желтый раствор
Соответствует
Соответствует
Соответствует
Соответствует
Соответствует
pH
6,5-7,0
6,79
6,72
6,70
6,71
6,58
Осмолярность (мосмоль/кг)
290-350
303
300
303
296
301
Опалесценция (NTU)
<5,1 NTU (раств. III Евр. Фарм.)
3,65
4,33
4,03
4,37
4,81
Окраска
<B9
<B9
<B9
<B9
<B9
<B9
Частицы
Отсутствуют
Отсутствуют
Отсутствуют
Отсутствуют
Отсутствуют
Отсутствуют
Вязкость (мПа•с)
>5 мПа·с
7,55
7,55
7,51
7,17
7,25
Содержание циклоспорина A
0,090%-0,110%
0,099
0,100
0,100
0,099
0,100
Общее содержание примесей
<2,5%
1,15
1,22
1,03
0,92
1,14
Тест на стерильность
Соответствует
Соответствует
Соответствует
Соответствует
Соответствует
Соответствует
Таблица 2. Стабильность водного офтальмологического раствора согласно настоящему изобретению при 40°C и относительной влажности 25%
ТЕСТЫ
НОРМЫ
Начальный
3 месяца
6 месяцев
12 месяцев
Внешний вид
Вязкий, опалесцентный, бесцветный - слегка желтый раствор
Соответствует
Соответствует
Соответствует
Соответствует
Осмолярность (мосмоль/кг)
290-350
303
304
311
318
Опалесценция (NTU)
<5,1 NTU (раств. III Евр. Фарм.)
3,65
4,04
4,60
4,62
Окраска
<B9
<B9
<B9
<B9
<B9
Частицы
Отсутствуют
Отсутствуют
Отсутствуют
Отсутствуют
Отсутствуют
Вязкость (мПа•с)
>5 мПа·с
7,55
7,17
7,08
6,66
Содержание циклоспорина A
0,0900%-0,1100%
0,0994
0,0991
0,0992
0,0981
Общее содержание примесей
<2,5%
1,15
1,12
1,23
1,04
III- Переносимость для глаз раствора согласно настоящему изобретению
Раствор с 0,1 вес. % циклоспорина A, полученный как описано выше, тестировали на кролике, с помощью 8 ежедневных инстилляций 50 мкл в течение 7 дней.
Выполняли следующие исследования на глазах:
- осмотр обоих глаз с применением офтальмоскопа для оценивания их по шкале Дрейза перед обработкой и после последней инстилляции этого дня;
- исследования обоих глаз с применением щелевой лампы для оценивания их при помощи шкалы МакДональда-Шаддука перед обработкой, в день 1 непосредственно перед последним введением, затем в день 8;
- сбор и фиксация всех глаз.

У кролика наблюдали хорошую переносимость для глаз раствора согласно настоящему изобретению в сравнении с другими составами, в частности, в сравнении со спиртовыми препаратами, содержащими неионное поверхностно-активное вещество, такими как MODUSIK-A.
IV- Кинетические исследования раствора согласно настоящему изобретению в сравнении с коммерческой эмульсией (RestasisTM)
Распределение циклоспорина A в глазу анализировали на объединенных конъюнктивах (глазного яблока и века) и на роговице, после однократной инстилляции 50 мкл в правый глаз кроликов:
- водного раствора согласно настоящему изобретению, содержащего 0,05% (весовых) циклоспорина A, полученного как описано в пункте I и обозначенного T1580;
TM
- Restasis, коммерческой эмульсии, содержащей 0,05% (весовых) циклоспорина A.
TM
Для осуществления этого 48 пигментированных кроликов (Fauve de Bourgogne – номер партии: HY R NZ 104) разделяли на 2 группы из 24 животных. Затем каждую подгруппу подразделяли на 6 групп из 4 животных, в соответствии с 6 временами для анализа (20 минут, 40 минут, 1 час, 4 часа, 12 часов и 24 часа, соответственно). Животные получали однократную инстилляцию 50 мкл T1580 или Restasis в правый глаз. В каждое время для анализа животных умерщвляли для получения образцов конъюнктивы (глазного яблока и века) (Cj) и роговицы (Co), сохраняли при -20°C до проведения измерений. Содержание циклоспорина A определяли в конъюнктивах и роговицах с помощью ВЭЖХ-МС (высокоэффективной жидкостной хроматографии в комбинации с масс-спектрометрией).
Результаты приведены в таблице 3 ниже, в которой:
max
- C представляет собой максимальную наблюдаемую концентрацию;
max
-  T представляет собой время, требуемое для достижения максимальной концентрации; и
- AUC представляет собой площадь под кривой времени от времени нуль до времени, соответствующему последней измеримой концентрации. Для этих расчетов применяли метод случайного отбора непоследовательных образцов.
Фармакокинетическое сравнение водного офтальмологического раствора согласно настоящему изобретению и коммерческой эмульсии RestasisTM, каждый содержит 0,05% циклоспорина A
Таблица 3.
Циклоспорин A в конъюнктиве (Cj)
Циклоспорин A в роговице (Co)
C<sub>max </sub>(нг/г)
T<sub>max</sub> (ч)
AUC
C <sub>max</sub> (нг/г)
T<sub>max</sub> (ч)
AUC
T1580
453
0,33
966
769
0,66
8189
Restasis<sup>TM</sup>
257
0,33
924
504
1
6516
TM
TM
Можно увидеть, что после инстилляции 50 мкл T1580 или Restasis в правый глаз пигментированных кроликов, циклоспорин A, главным образом, обнаруживается в конъюнктиве от 20 минут до 4 часов, и в роговице от 20 минут до 24 часов и позже. Животные, обработанные с помощью T1580, имели большее количество циклоспорина A в конъюнктиве и роговице от 20 минут до 12 часов, особенно в роговице, по сравнению с животными, обработанными с помощью Restasis. Это показывает лучшую доступность действующего вещества, составленного согласно настоящему изобретению.
V- Фармакокинетическое исследование раствора согласно настоящему изобретению, вводимому в виде однократной дозы при трех различных концентрациях
Проникновение в глаз однократной дозы раствора согласно настоящему изобретению определяли в конъюнктиве и роговице после инстилляции 25 мкл в каждый глаз пигментированных кроликов в зависимости от времени (0,33, 0,66, 1, 2, 4, 8, 12 и 24 часов после инстилляции). Тестировали три концентрации циклоспорина A: 0,01, 0,05 и 0,1% вес/вес. Исследование проводили на 72 кроликах, т.е. по 3 кролика на момент времени.
На фигуре 1A, для конъюнктив, и фигуре 1B, для роговиц, показан дозозависимый эффект концентрации циклоспорина A на фармакокинетический профиль, полученный для конъюнктив и роговиц.
AUC, полученная для роговиц, в 4-5 раз превышала таковую, измеренную для конъюнктив, и циклоспорин A дольше оставался в роговицах, чем в конъюнктивах, что демонстрирует определенный тропизм циклоспорина A в отношении роговицы.
VI- Фармакокинетическое исследование раствора согласно настоящему изобретению, вводимому в виде повторных инстилляций
В данном исследовании, пигментированные кролики получали инстилляцию в каждый глаз (правый и левый глаза) с дозой (25 мкл) раствора согласно настоящему изобретению, содержащего 0,1% (вес/вес) циклоспорина A трижды в день в течение 10 дней.
ой
Точнее говоря, инстилляции продолжались в течение 9 дней (т.е. 27 инстилляций), затем определяли фармакокинетический профиль во время 28 инстилляции, т.е. утром в день 10 (D10). Образцы отбирали во время 0 (C0 низшая точка оценки), затем через 0,33 часа и 0,66 часа, что соответствовало Cmax для конъюнктив и роговиц, затем через 1, 2, 4, 8 и 24 часа.
Результаты приведены на фигуре 2. При данной концентрации и дозе:
- не наблюдали ни накопления циклоспорина A в конъюнктивах, ни сохранения его концентрации, в этой структуре, суточное действие иммуномодулятора, по-видимому, ограничено во времени;
- накопление происходило в роговице и доза 1000-2000 нг циклоспорина A/г роговицы сохраняется в роговице в течение 24 часов. В роговице, следовательно, суточное действие иммуномодулятора, следовательно, является удовлетворительным.
Более того, не наблюдали переход в водянистую влагу, а переход в кровь был незначительным.
TM
,
В заключение необходимо отметить, что эффективность раствора согласно настоящему изобретению была продемонстрирована, поскольку полученные значения имеют тот же порядок, что и частичные результаты, доступные для Restasis и соответствуют значениям из литературы, где для получения иммуномодуляторного эффекта рекомендуется концентрация действующего вещества в тканях-мишенях от 100 до 400 нг/г.