СПОСОБ ИНДУЦИРОВАНИЯ ВРОЖДЕННОГО ВЫВИХА БЕДРА НА КУРИНОМ ЭМБРИОНЕ
METHOD FOR INDUCING CONGENITAL HIP DISLOCATION ON A CHICKEN EMBRYO

Изобретение относится к области экспериментальной медицины и биотехнологии - индуцирование врожденного вывиха бедра на экспериментальном животном путем ингибирования экспрессии РАХЗ гена липофильными малыми интерферирующими siPHK (липофильные siPHK) в склеротоме куриного эмбриона.
На основании современных статистических данных врожденные ортопедические заболевания занимают в количественном отношении второе место после врожденных болезней нервной системы. Среди врожденных заболеваний опорно-двигательной системы доминируют: врожденный вывих бедра (80% всех патологией опорно-двигательной системы детей).
Врожденный вывих бедра является одними из самых часто встречающихся пороков развития. По результатам международных исследований было выявлено, что распространенность данного заболевания в общей популяции составляет от 1% до 3% [Leek I., Wald N. Congenital dislocation of the hip.Antenatal and Neonatal Screening, 2nd ed. Oxford: Oxford University Press; 2000:398-424. doi: 10.1093/acprof:oso/9780192628268.003.0016]. В России врожденный вывих бедра встречается 3-4 случая на 1000 новорожденных. Чаще эта патология диагностируется у девочек [Баиндурашвили А.Г., Волошин С.Ю., Краснов А.И. Врожденный вывих бедра у детей грудного возраста. Клиника, диагностика, консервативное лечение и реабилитация. Санкт-Петербург, СпецЛит, 2016, 103 с].
В настоящее время существуют различные теории развития врожденного вывиха бедра, однако последнее десятилетие лидирующее положение занимают генетические теории [Li L, Sun К, Zhang L, Zhao Q, Cheng X, Dang Y. Heritability and sibling recurrent risk of developmental dysplasia of the hip in Chinese population. Eur. J. Clin. Invest. 2013;43:589-594. doi: 10.1111/eci.12084; Gkiatas I., Boptsi A., Tserga D., Gelalis I., Kosmas D., Pakos E. Developmental dysplasia of the hip: a systematic literature review of the genes related with its occurrence. EFORT Open Rev. 2019; 4: 595-601. doi: 10.1302/2058-5241.4.190006].
Изучение патогенетических механизмов развития врожденного вывиха бедра затруднено вследствие отсутствия экспериментальной модели этого заболевания. Ученые исследователи и клинические ортопеды вынуждены анализировать патофизиологические процессы уже сформированного врожденного вывиха бедра, тем самым не имея возможности прогнозирования и коррекции развивающегося патологического процесса. Отсутствие возможности анализировать течение процесса в ходе самого заболевания значительно сужают рамки прогнозирования и коррекции развития врожденного вывиха бедра.
В доступной зарубежной и отечественной литературе отсутствуют данные об экспериментальных моделях врожденного вывиха бедра.
Наиболее близким к предлагаемому способу является способ моделирования заболевания на курином эмбрионе [Патент №2728927 «Способ моделирования сколиоза на курином эмбрионе», регистрация от 03 августа 2020, Зайдман A.M., Пахомова Н.Ю., Строкова Е.Л., Черноловская Е.Л., Мелешко Е.М., Шило А.Р.].
В Новосибирском НИИТО в процессе исследования 50 случаев идиопатического сколиоза А.М. Зайдман впервые в мире выявлено наличие клеток нервного гребня на вогнутой стороне деформации позвоночника при идиопатическом сколиозе (A.M. Zaydman, Elena L. Strokova, Elena V. Kiseleva, Lubov A. Suldina, Anton A. Strunov, Alexander I. Shevchenko, Pavel P. Laktionov, Vladimir M. Subbotin. A New Look at Etiological Factors of Idiopathic Scoliosis: Neural Crest Cells. International Journal of Medical Sciences. 2018; 15(5):436-446. doi:10.7150/ijms.22894.) В результате была высказана гипотеза: причиной идиопатического сколиоза является депонирование клеток нервного гребня в формирующемся позвоночнике эмбриона. Методическое выполнение данного способа проводится на курином эмбрионе с целью стимулирования развития деформации позвоночника путем введения в нервную трубку куриного эмбриона на 11 стадии развития по классификации Гамбургер-Гамильтон siPHК к гену РАХЗ.
Задача (технический результат предлагаемого изобретения) заключается в создании модели индуцированного врожденного вывиха бедра.
Поставленная задача решается тем, что в способе индуцирования врожденного вывиха бедра на курином эмбрионе введение липофильных siPHК для ингибирования миграции клеток нервного гребня осуществляется в 51 час инкубационного периода.
Нервный гребень встречается только в раннем эмбриональном периоде и отсутствует на более поздних стадиях. Это полоса клеток, расположенная вдоль дорсальной стороны ранней нервной трубки, образующая «гребень» по всей ее длине. Нервный гребень впервые виден как утолщенная область непосредственно перед закрытием нервной трубки. Его формирование и последующее развитие происходит от передней части к задней. Нервный гребень - эктодермальное производное, которое дает начало дифференцировке широкому спектру мезенхимальных структур. Эмиграция клеток из нервной трубки происходит волнообразно от головного конца к хвостовой части тела. Важным аспектом является то, что начало движения клеток нервного гребня следует непосредственно за волной сегментации сомитов, каждая пара сомитов влияет на выброс клеток нервного гребня в своей «окрестности» [Sela-Donenfeld, D., Kalcheim, С, 2000. Inhibition of noggin expression in the dorsal neural tube by somitogenesis: a mechanism for coordinating the timing of neural crest emigration. Development 127, 4845-4854]. Как только клетки нервного гребня покидают нервную трубку, они следуют по четко определенным путям в организме, пока не достигнут своих целевых тканей. Клетки нервного гребня, которым суждено стать меланобластами, становятся специфическими (детерминированными) вскоре после выхода из нервной трубки [Harris, M.L., Erickson, С.А., 2007. Lineage specification in neural crest cell pathfinding. Dev. Dyn. 236, 1-19.], в то время как другие остаются плюрипотентными, до тех пор, пока они не достигнут места назначения. Основные сигналы, которые направляют их миграцию, обеспечиваются окружающей средой: клетки нервного гребня проходят через переднюю половину каждого сомита, но никогда не проходят через заднюю половину. Контроль за миграцией клеток нервного гребня зависит от экспрессии эмбриональных генов группы Pax (Pax1, Рах3, Рах9), HNK1 и др. Но нарушение миграции по туловищному пути (миграция через склеротом) может быть связано с нарушением экспрессии Рах3 гена, регулирующего синтез матрикса вдоль миграционного пути. Изменение субстрата, по которому продвигаются клетки нервного гребня, может приводить к нарушению их пути продвижения.
Существуют два основных маршрута. Первые клетки мигрируют вниз по латеральной стороне нервной трубки и в переднюю часть соседних сомитов, следуя за базальной пластинкой дермамиотома. Это вентральный путь, который повторяется на уровне одного сомита за другим вниз по стволу. Его сменяет дорсо-латеральный путь, где клетки мигрируют под дермой.
Существуют три основные области нервного гребня:
Краниальный нервный гребень, который лежит впереди сомитов и дает начало скелетным структурам лица, меланоцитам; черепным нервам, нейронам, ганглиям и глиальным клеткам.
Вагальный нервный гребень, который связан с сомитами 1-7, и включает сердечный нервный гребень, на уровне сомитов 1-3, дает начало энтеральным нейронам кишечника, меланоцитам и т.д., а также компонентам сердца.
Крестцовый нервный гребень, который лежит после 8 пары сомитов до 44 пары сомитов. Включает в себя адренальный нервный гребень на уровне сомитов 16-24 (формируют мозговой слой надпочечников).
«Почки» нижних конечностей начинают формироваться на уровне 26-32 пар сомитов. По мере формирования боковых складок тела конечности располагаются вдоль боковых стенок тела. На 3 день инкубации каждая почка конечностей составляет около 1 мм в длину и около 1 мм в ширину. Каждая из них состоит из оболочки эктодермы, заключающей в себе ядро мезодермы; эктодерма происходит из эктодермы боковой стенки тела, а мезодерма формируется из соматической латеральной пластинки, хотя впоследствии она дополняется клетками, мигрирующими из сомитов. Соматическая мезодерма дает начало сухожилиям, скелету, дерме и соединительным тканям конечностей, в то время как сомитные клетки формируют мышцы.
Первым морфологическим шагом в формировании почки нижней конечности является пролиферация клеток мезодермы латеральной пластинки.
Известно, что периодом формирования почек нижних конечностей -период гаструляции, является уровень 26-32 пар сомитов. Основываясь на эмбриональных закономерностях развития эмбриона и гипотезе A.M. Зайдман о депонировании клеток нервного гребня, было установлено, что для индуцирования врожденного вывиха бедра на курином эмбрионе ингибирование миграции необходимо произвести при прохождении клеток нервного гребня через 26 пару сомитов. Известно, что 26 пара сомитов формируется в период 50-51 час инкубационного периода. Экспериментально было определено время введения липофильных siPHК 51 час инкубационного периода для индуцирования врожденного вывиха бедра. На кончике конечности эктодерма утолщается и затем, становится известной как апикальный эктодермальный гребень [Johnson, R.L., Tabin, C.J., 1997. Molecular models for vertebrate limb development. Cell 90, 979-990]. Мезенхима, расположенная непосредственно под апикальным эктодермальным гребнем является областью высокой митотической активности, являясь источником дополнительных клеток, которые необходимы по мере удлинения почки конечности. Она известна как зона прогресса и состоит полностью из клеток, которые еще недифференцированны. Постепенно наиболее проксимальные клетки в зоне прогрессирования покидают ее, заменяясь все большим количеством клеток дистальнее по мере продолжающегося митоза. Первые клетки, которые покидают зону прогресса, формируют наиболее проксимальные структуры конечности, и последовательно, по мере того как все больше и больше клеток покидают зону прогресса, им суждено формировать все более дистальные структуры.
Нами установлено, что в 51 час инкубационного периода развития цыпленка при прохождении клеток нервного гребня через 26 пару сомитов ингибирование Рах3 приводит к «оседанию» мигрирующих клеток с последующим индуцированием врожденного вывиха бедра.
Принципиальная новизна настоящего изобретения заключается в создании модели индуцированного врожденного вывиха бедра на двуногом животном (цыпленок) и способе введения с целью ингибирования экспрессии Рах3 гена липофильными интерферирующими siPHК в склеротоме куриного эмбриона.
Фертильное куриное яйцо в физиологическом смысле расценивается как обособленная оплодотворенная яйцеклетка, в результате чего модель создается на формирующемся эмбрионе в период миграции клеток нервного гребня.
siPHК представляют собой 21 звенные дуплексы с 2 выступающими нуклеотидами на 3'-концах (19 в дуплексе, 2 выступают). Выбор последовательности siPHК, направленной на мРНК гена Рах3 проводили следующим образом. Последовательность мРНК гена Рах3 курицы брали из банка нуклеотидных последовательностей GenBank. Последовательности siPHК выбирали исходя из температуры плавления, наличия термодинамической ассимметрии дуплекса, комплементарности антисмысловой цепи мРНК гена-мишени с помощью программ для выбора последовательности siPHК BLOCK-iT ™ RNAi Designer (Invitrogen) или siDESIGN Center (Darmacon). Для увеличения устойчивости siPHК к действию рибонуклеаз в CpG, UpA, СрА мотивы последовательности вводили 2'-O-метильные модификации. Для определения специфичности действия использовали контрольную siPHК (siScr) не имеющую значимой гомологии с мРНК человека и кур. Все выбранные siPHК были получены синтетически с использованием твердофазного автоматического синтезатора, их биологическая активность была определена по способности подавлять экспрессию гена-мишени в культуре фибробластов кур. Последовательности наиболее активной siPHК и контрольной siPHК были использованы для конструирования холестерин-содержащих конъюгатов, конъюгат анти- Рах3 siPHК и конъюгат контрольной siScr.
siPHК проникает в цитоплазму клетки и связывается с клеточными белками, образуя комплекс RISC (RNA induced silencing complex), после активации этого комплекса, он связывается с комплементарной последовательностью в составе мРНК и находящийся в составе комплекса белок Ago2, обладающий рибонуклеазной активностью, расщепляет мРНК-мишень. После этого комплекс диссоциирует и может взаимодействовать с другой молекулой мРНК, а расщепленная мРНК деградирует. В результате этого снижается концентрация в клетке мРНК-мишени и перестает синтезироваться белок Рах3, который кодируется мРНК-мишенью.
Предлагаемое изобретение поясняется фотографиями, где на фиг. 1 представлен куриный эмбрион со сформированной 26 парой сомитов; на фиг. 2 - введение вещества в нервную трубку куриного эмбриона; на фиг. 3 - диффузия вещества в сегментированной мезодерме, на фиг. 4 - куриный эмбрион после введения вещества; на фиг. 5 - результаты рентгенографического обследования экспериментального цыпленка с врожденным вывихом бедра.
Промышленная применимость предлагаемого способа подтверждается примером конкретного выполнения.
Эксперимент проводился в стерильных условиях. Для реализации поставленной задачи, при выполнении эксперимента, скорлупу фертильного куриного яйца и яйца-донора обрабатывали 70% спиртом. Далее экспериментальное яйцо укладывали на подложку горизонтально, делали прокол стерильной иглой с вертикальной стороны, далее стерильными хирургическими ножницами делали отверстие в размере 0,8×1,5 см, отрезанную скорлупу убирали. Также удаляли подскорлуповую оболочку. Введение вещества производили в 51 час инкубационного периода.
На фиг. 1 видна полость нервной трубки (1) куриного эмбриона. При помощи инжекторного шприца фирмы NARISHAGE и стеклянного капилляра под визуальным контролем через конфокальный микроскоп фирмы (Ziess Discovery V12 SteREO) в нервную трубку (1) куриного эмбриона вводили липофильную siPHК (2), визуально контролируя заполнение нервной трубки до мозговых пузырей при помощи микроскопа фирмы (Ziess Discovery V12 SteREO) на увеличении 90.
Введенная в полость нервной трубки (1) липофильная siPHК (2) хорошо видна на фиг. 2.
Для визуализации применяли трепановый синий. (Ув. × 40). Для лучшей визуализации siPHК была предварительно подкрашена трепановым синим. На фиг. 3 визуализируется полная диффузия введенной siPHК (2) в сегментированной мезодерме. На фиг. 4 хорошо видно, что анатомическая целостность эмбриона сохранена.
Из скорлупы яйца-донора стерильными ножницами вырезали фрагмент для закрытия отверстия на скорлупе экспериментального яйца. После выполнения манипуляций накладывали крышечку из скорлупы яйца-донора вместе с подскорлуповой оболочкой. Оставляли на сутки дефектом вверх, после ротировали яйцо в соответствии с физиологией развития куриного эмбриона.
Экспериментально установлено, что ингибирование Рах3 гена в 51 час инкубационного периода приводит к депонированию клеток нервного гребня в 26 сомите - формирующихся «почках» нижних конечностей и, как следствие, к возникновению врожденного вывиха бедра. Нарушение дифференцировки эмбриональных тканей приводит к индуцированию врожденного вывиха бедра (3), которое представлено на рентгенограмме (фиг. 5).
Макроскопически определяется вывих правого тазобедренного сустава. Животному провели рентгенологическое исследование на аппарате рентгеновский стационарный Definium 8000, GE Healthcare, США. На обзорной рентгенограмме определяется вывих правого тазобедренного сустава с полным выведением головки тазобедренного сустава из вертлужной впадины.