КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ ПЛОХО ЗАЖИВАЮЩИХ РАН
COMPOSITIONS AND METHODS OF TREATING PERSISTENT WOUNDS

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение касается щелевых контактов и ран и заживления ран, в частности ран, не заживающих с ожидаемой скоростью, как то медленно заживающих ран, неполностью заживающих ран, хронических ран и раскрывающихся ран.
Уровень техники
Нижеследующее содержит информацию, которая может оказаться полезной для понимания настоящего изобретения. Это не означает, что вся приведенная информация является предшествующим уровнем техники или является релевантной по отношению к описанным здесь или заявленным изобретениям или что какие-то публикации или документы, упомянутые прямо или косвенно, составляют предшествующий уровень техники.
У человека и других млекопитающих раневое повреждение вызывает упорядоченный сложный каскад клеточных и биохимических явлений, которые в большинстве случаев приводят к заживлению раны. Идеальное заживление раны означает восстановление нормальной анатомической структуры, функции и внешнего вида на клеточном, тканевом, органном и организменном уровне. Заживление ран, вызванных либо травмой, либо микробами, или чужеродными материалами, происходит посредством сложного процесса, охватывающего ряд перекрывающихся фаз, включая воспаление, эпителизацию, ангиогенез и отложение матрикса. В норме эти процессы ведут к созреванию раны и некоторому рубцеванию. Хотя воспаление и заживление чаще всего идут своим обычным ходом, чувствительность этого процесса зависит от сбалансированности различных факторов, модулирующих заживление ран, включающих, к примеру, сложную сеть регуляторных цитокинов и факторов роста.
Щелевые контакты представляют собой структуры клеточной мембраны, способствующие прямой коммуникации между клетками. Канал щелевого контакта образуется из двух коннексонов (полуканалов), причем каждый из них состоит их 6 субъединиц коннексина. Каждый гексамерный коннексон состыкован с коннексоном на противолежащей мембране, образуя единый щелевой контакт. Каналы щелевых контактов обнаруживаются по всему организму. В таких тканях, как эпителий роговицы, к примеру, имеется 6-8 слоев клеток, но в разных слоях экспрессируются различные каналы щелевых контактов, содержащие коннексин 43 в базальном слое и коннексин 26 от базального до средних слоев крылатых клеток. В общем, коннексины составляют семейство белков, которые обычно именуются по молекулярному весу или разбиваются по филогенетическому принципу на подклассы α-, β- и γ-коннексинов. Уже установлено, по меньшей мере, 20 изоформ у человека и 19 изоформ у мыши. Как оказалось, различные ткани и типы клеток имеют характерные профили экспрессии белков коннексинов, а в таких тканях, как роговица, профиль экспрессии белков коннексинов меняется после повреждения или трансплантации (Qui et al. (2003) Current Biology 13: 1967-1703; Brander et al. (2004) J. Invest. Dermatol. 122: 1310-20)).
Сообщалось, что нарушения функции коннексинов могут быть связаны с некоторыми заболеваниями (например, сердечными заболеваниями) (А.С. de Carvalho et al. (1994) J. Cardiovasc. Electrophysiol. 5: 686). У некоторых белков коннексинов можно вызвать изменения характеристик оборота и транспорта добавлением экзогенных агентов, способных влиять на уровень межклеточной коммуникации через щелевые контакты (Darrow et al. (1995) Circ. Res. 76: 381; Lin et al. (2001) J. Cell Biol. 154(4): 815)). Также сообщалось об антисмысловой технологии для модулирования экспрессии генов, вовлеченных в вирусные, грибковые и метаболические заболевания, например см. U.S. Pat. No. 5,166,195 (олигонуклеотидные ингибиторы ВИЧ), U.S. Pat. No. 5,004,810 (олигомеры для гибридизации с мРНК вируса Herpes simplex Vmw65 и ингибирования репликации), а также см. U.S. Pat. No. 7,098,190 to Becker and Green (композиции, содержащие антисмысловые нуклеотиды к коннексинам). Также сообщалось о белковых ингибиторах щелевых контактов и полуканалов, например, см. Berthoud et al. (2000) Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 279: L619-L622; Evans W.H. and Boitano S. Biochem. Soc. Trans. 29: 606-612; De Vriese A.S. et al. (2001) Kidney Int. 61: 177-185; а также Green and Becker, WO 2006/134494 ("Anti-connexin compounds and methods of use")).
Несмотря на прогресс в понимании принципов, лежащих в основе процесса заживления ран, все еще остается значительная неудовлетворенная потребность в подходящих способах терапии для лечения ран, в том числе ран, не заживающих с ожидаемой скоростью, как то медленно заживающих ран, неполностью заживающих ран и хронических ран. Такие лечебные композиции и способы лечения представлены в настоящем изобретении.
Раскрытие изобретения
Представленное изобретение имеет много признаков и воплощений, включая те, что изложены, описаны или приведены в данном разделе. Они не являются всеобъемлющими, а представленное изобретение не ограничивается особенностями или воплощениями, приведенными в данном разделе, которые приводятся только в целях иллюстрации, а не ограничения.
Изобретение, в общем, касается применения полинуклеотидов против коннексинов (антиконнексиновых полинуклеотидов), в том числе, к примеру, антисмысловых полинуклеотидов к коннексинам, а также композиций и способов лечения ран, не заживающих с ожидаемой скоростью, как то медленно заживающих ран, неполностью заживающих ран и хронических ран.
Настоящее изобретение обеспечивает усиление и улучшение заживления ран, не заживающих с ожидаемой скоростью, как то медленно заживающих ран, неполностью заживающих ран и хронических ран, посредством применения одного или нескольких антисмысловых полинуклеотидов к коннексинам.
Оно также касается применения антиконнексиновых полинуклеотидов в сочетании с перевязочными материалами, бинтами, матриксами и покрытиями. В одном аспекте изобретение включает синтетический или натуральный матрикс для заживления ран, содержащий антиконнексиновый полинуклеотид. В некоторых воплощениях антиконнексиновый полинуклеотид является полинуклеотидом против коннексина 43. Предпочтительными антиконнексиновыми полинуклеотидами являются олигодезоксинуклеотиды против коннексинов, как то олигодезоксинуклеотиды против коннексина 43.
Оно также касается применения антиконнексиновых полинуклеотидов, одних или в сочетании с перевязочными материалами, бинтами, матриксами и покрытиями, при многократном применении, например, раз в неделю до полного заживления или как потребуется.
Представлены композиции и способы изобретения, в которых применяются антиконнексиновые полинуклеотиды, включая антисмысловые полинуклеотиды к коннексинам.
В одном аспекте изобретением предусмотрена фармацевтическая композиция, включающая один или несколько антисмысловых полинуклеотидов к коннексинам. Предпочтительно фармацевтическая композиция дополнительно включает фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или наполнитель. Например, изобретение охватывает фармацевтические композиции, включающие: (а) терапевтически эффективное количество фармацевтически приемлемого антисмыслового полинуклеотида к коннексину и (b) фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.
В одном аспекте изобретением предусмотрены фармацевтические композиции, в том числе формы для местного применения, которые включают фармацевтически приемлемый носитель и терапевтически эффективное количество антиконнексинового полинуклеотида, предпочтительно антисмыслового полинуклеотида к коннексину, наиболее предпочтительно антисмыслового полинуклеотида к коннексину 43.
Примеры антисмысловых полинуклеотидов к коннексинам включают антиконнексиновые олигодезоксинуклеотиды (ODN), включая антисмысловые (в том числе антисмысловые с модифицированным и немодифицированным остовом, например антисмысловые полинуклеотиды из ДНК, связывающейся с мРНК коннексинов), полинуклеотиды РНК-интерференции (РНКи) и малые интерферирующие РНК (миРНК).
Подходящие антисмысловые полинуклеотиды к коннексинам включают, к примеру, антисмысловые ODN к коннексину 43 (Сх43), коннексину 26 (Сх26), коннексину 37 (Сх37), коннексину 30 (Сх30), коннексину 31.1 (Сх31.1) и коннексину 32 (Сх32). В некоторых воплощениях подходящие композиции включают несколько антисмысловых полинуклеотидов к коннексинам в комбинации, включающей, к примеру, полинуклеотиды против Сх43, 26, 30 и 31.1. Предпочтительно антисмысловые полинуклеотиды направлены против коннексина 43.
Соответственно, в одном аспекте изобретением предусмотрена лекарственная форма, включающая, по меньшей мере, один антисмысловой полинуклеотид к белку коннексина вместе с фармацевтически приемлемым носителем или наполнителем. В одной предпочтительной лекарственной форме содержатся полинуклеотиды только к одному белку коннексина. Наиболее предпочтительно таким белком является коннексин 43. В качестве альтернативы лекарственная форма может содержать олигодезоксинуклеотиды более чем к одному белку коннексина.
Изобретение включает лекарственные формы, включающие фармацевтически приемлемый антиконнексиновый полинуклеотид, например антисмысловой полинуклеотид к коннексину, в количестве, эффективно способствующем заживлению ран у субъектов с хроническими ранами или другими ранами, не заживающими с ожидаемой скоростью. Такие лекарственные формы включают, к примеру, формы для местного применения. Предпочтительными антиконнексиновыми полинуклеотидами и антисмысловыми полинуклеотидами к коннексинам являются антиконнексиновые полинуклеотиды против коннексина 43 и антисмысловые полинуклеотиды к коннексину 43.
Предпочтительно одним из белков коннексинов, против которых направлены олигодезоксинуклеотиды, является коннексин 43. Другие белки коннексинов, против которых направлены олигодезоксинуклеотиды, включают коннексин 26, коннексин 31.1 и коннексин 32.
Обычно олигодезоксинуклеотид против коннексина 43 выбирается из: GTA АТТ GCG GCA AGA AGA ATT GTT TCT GTC (SEQ ID NO:1); GTA ATT GCG GCA GGA GGA ATT GTT TCT GTC (SEQ ID NO:2); GGC AAG AGA CAC CAA AGA CAC TAC CAG CAT (SEQ ID NO:3); полинуклеотидов, по меньшей мере на 70% гомологичных SEQ ID NO:1, 2 или 3; либо полинуклеотидов, гибридизующихся с мРНК коннексина 43 в условиях средней или высокой строгости.
Обычно олигодезоксинуклеотидом против коннексина 26 служит: ТСС TGA GCA АТА ССТ ААС GAA CAA ATA (SEQ ID NO:4); полинуклеотид, по меньшей мере на 70% гомологичный SEQ ID NO:4; либо полинуклеотид, гибридизующийся с мРНК коннексина 26 в условиях средней или высокой строгости. Обычно олигодезоксинуклеотидом против коннексина 31.1 служит: CGT CCG AGC ССА GAA AGA TGA GGT С (SEQ ID NO:9); полинуклеотид, по меньшей мере на 70% гомологичный SEQ ID NO:9; либо полинуклеотид, гибридизующийся с мРНК коннексина 31.1 в условиях средней или высокой строгости. Обычно олигодезоксинуклеотидом против коннексина 32 служит: ТТТ СТТ ТТС TAT GTG CTG TTG GTG A (SEQ ID NO:12); полинуклеотид, по меньшей мере на 70% гомологичный SEQ ID NO:12; либо полинуклеотид, гибридизующийся с мРНК коннексина 32 в условиях средней или высокой строгости. Другие последовательности антисмысловых полинуклеотидов к коннексинам, применимых в соответствии со способами настоящего изобретения, включают: 5'-CATCTCCTTGGTGCTCAACC-3' (коннексин 37) (SEQ ID NO:5) 5'-CTGAAGTCGACTTGGCTTGG-3' (коннексин 37) (SEQ ID NO:6) 5'-CTC AGA TAG TGG ССА GAA TGC-3' (коннексин 30) (SEQ ID NO:7) 5'-TTGTCCAGGTGACTCCAAGG-3' (коннексин 30) (SEQ ID NO:8) 5'-AGA GGC GCA CGT GAG АСА С-3' (коннексин 31.1) (SEQ ID NO:10) 5'-TGAAGACAATGAAGATGTT-3' (коннексин 31.1) (SEQ ID NO:11). Антисмысловые полинуклеотиды предпочтительно применяются местно (на и/или вокруг подлежащего лечению места). Обычно антисмысловые полинуклеотиды комбинируют вместе с фармацевтически приемлемым носителем, наполнителем или разбавителем для получения фармацевтической композиции.
Подходящие фармацевтически приемлемые носители или наполнители включают любые из тех, что обычно применяются для местного применения. Лекарственные формы для местного применения могут, к примеру, иметь вид крема, мази, геля, эмульсии, лосьона, спрея, пены или краски. Лекарственные формы по изобретению также могут иметь вид импрегнированного перевязочного материала.
Предпочтительно фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель представляет собой гель, предпочтительно гель неионного сополимера полиоксиэтилена-полиоксипропилена, например гель Pluronic, предпочтительно Pluronic F-127 (BASF Corp). Этот гель можно использовать в жидком виде при низких температурах, но он быстро застывает при физиологических температурах, что способствует ограничению выделения антиконнексинового олигонуклеотида местом нанесения или в непосредственной близости от него. Гели замедленного действия, из которых антиконнексиновый олигонуклеотид высвобождается с течением времени, предпочтительны для местного применения. Таким образом, может быть получена фармацевтическая композиция, обеспечивающая продолжительное выделение антиконнексинового полинуклеотида, например антисмыслового полинуклеотида. Предпочтительными антиконнексиновыми полинуклеотидами и антисмысловыми полинуклеотидами к коннексинам являются антиконнексиновые полинуклеотиды против коннексина 43 и антисмысловые полинуклеотиды к коннексину 43.
В другом аспекте изобретение включает способы введения терапевтически эффективного количества одного или нескольких фармацевтически приемлемых антисмысловых полинуклеотидов к коннексинам в виде препарата замедленного действия, препарата медленного действия, препарата продолжительного действия, препарата контролируемого действия и/или препарата многократного действия субъектам с ранами, характеризующимися полностью или частично замедленным или неполным заживлением, либо иными ранами, не заживающими с ожидаемой скоростью. Такие лекарственные формы особенно предпочтительны для таких ран, которые не заживают с ожидаемой скоростью, как то хронических ран.
В некоторых других аспектах изобретение также касается способов применения таких композиций для лечения субъектов, страдающих различными заболеваниями, связанными с ранами, не заживающими с ожидаемой скоростью, как то медленно заживающими ранами, неполностью заживающими ранами или хроническими ранами. В еще одном аспекте изобретение включает способы лечения субъектов, страдающих или с подозрением на заболевания и/или состояния, характеризующиеся полностью или частично хроническими ранами или замедленным или неполным заживлением ран, либо иными ранами, не заживающими с ожидаемой скоростью. Такие композиции включают, к примеру, лекарственные формы для местного применения. Предпочтительными антиконнексиновыми полинуклеотидами и антисмысловыми полинуклеотидами к коннексинам являются антиконнексиновые полинуклеотиды против коннексина 43 и антисмысловые полинуклеотиды к коннексину 43.
В следующем аспекте изобретение включает трансдермальные пластыри, повязки, прокладки, обмотки, матриксы и бинты, способные прилипать или иным образом связываться с кожей субъекта, при этом они способны выделять терапевтически эффективное количество одного или нескольких фармацевтически приемлемых антиконнексиновых полинуклеотидов, например антисмысловых полинуклеотидов к коннексинам.
Изобретение включает устройства, содержащие терапевтически эффективное количество одного или нескольких фармацевтически приемлемых антиконнексиновых полинуклеотидов, например антисмысловых полинуклеотидов к коннексинам, к примеру, контролирующие скорость мембраны, вмещающие резервуар препарата, и устройства типа монолитного матрикса. Такие устройства могут применяться для лечения нуждающихся в этом субъектов, как изложено в настоящем изобретении. Предпочтительно предусматривается перевязочный материал или матрикс, имеющий вид твердого субстрата с антиконнексиновым полинуклеотидом, например антисмысловым полинуклеотидом к коннексину, диспергированным на или в твердом субстрате. В одном воплощении представлен фармацевтический препарат по изобретению в комбинации с раневой повязкой или способствующим заживлению раны матриксом. Предпочтительными антиконнексиновыми полинуклеотидами и антисмысловыми полинуклеотидами к коннексинам являются антиконнексиновые полинуклеотиды против коннексина 43 и антисмысловые полинуклеотиды к коннексину 43.
В следующем аспекте изобретение предусматривает способ усиления заживления ран у пациентов с замедленным заживлением ран или хроническими ранами, который включает стадию нанесения на рану лекарственной формы настоящего изобретения в количестве, эффективном для понижающей регуляции экспрессии белков коннексинов в самой ране и в непосредственной близости от нее. В рамки изобретения входит и многократное нанесение. Предпочтительной является понижающая регуляция коннексина 43.
Один аспект настоящего изобретения касается способа лечения субъектов с медленно или неполностью заживающими ранами или хроническими ранами либо иными ранами, не заживающими с ожидаемой скоростью, который включает продолжительное нанесение на рану эффективного количества антисмыслового полинуклеотида к коннексину 43. Обычно антисмысловой полинуклеотид наносится или применяется в течение, по меньшей мере, 0,5 ч, 1-2 ч, 2-4 ч, 4-6 ч или 6-8 ч, но можно и дольше, например, вплоть до 24 ч или больше. Предпочтительным является нанесение или применение в течение 1-2 ч, 2-3 ч и 4-8 ч. Согласно одному воплощению субъект болен диабетом. В других воплощениях у пациента есть диабетическая язва, диабетическая язва стопы, васкулитная язва, венозная язва, венозная гемостатическая язва, артериальная язва, пролежень, язвенный пролежень, инфекционная язва, травматическая язва, ожоговая язва, изъязвление, связанное с гангренозной пиодермией, либо смешанная язва или язвы. В рамки изобретения входит и многократное нанесение. Предпочтительным является многократное нанесение до тех пор, пока не будет наблюдаться закрытие раны, а затем повторное нанесение в том случае, если заживление раны опять приостановится или замедлится.
В соответствии с другим аспектом настоящее изобретение предусматривает способ лечения субъектов с медленно или неполностью заживающими ранами или хроническими ранами либо иными ранами, не заживающими с ожидаемой скоростью, который включает продолжительное нанесение на рану (или на участок раны или вокруг раны) эффективного количества антисмыслового полинуклеотида к коннексину 43, при этом экспрессия коннексина 43 подвергается понижающей регуляции на продолжительное время. Обычно экспрессия коннексина 43 подвергается понижающей регуляции, по меньшей мере, на 0,5 ч, 1-2 ч, 2-4 ч, 4-6 ч или 6-8 ч, но можно и дольше, например, вплоть до 24 ч или больше. Предпочтительным является продолжительное нанесение в течение 0,5 ч, 1-2 ч и 4-8 ч. Подходящими субъектами являются больные диабетом. В других воплощениях у пациента есть диабетическая язва, диабетическая язва стопы, васкулитная язва, венозная язва, венозная гемостатическая язва, артериальная язва, пролежень, язвенный пролежень, инфекционная язва, травматическая язва, ожоговая язва, изъязвление, связанное с гангренозной пиодермией, либо смешанная язва или язвы. В рамки изобретения входит и многократное нанесение. Предпочтительным является многократное нанесение до тех пор, пока не будет наблюдаться закрытие раны, а затем повторное нанесение в том случае, если заживление раны опять приостановится или замедлится.
В соответствии со следующим аспектом предусматривается продолжительное нанесение на рану такого количества антисмыслового полинуклеотида к коннексину 43, которое эффективно вызывает понижающую регуляцию экспрессии коннексина 43 на продолжительное время. Также в соответствии с этим аспектом усиливается заживление ран, не заживающих с ожидаемой скоростью, включая медленно заживающие раны, плохо заживающие раны и хронические раны. В одном воплощении рана представляет собой диабетическую язву, диабетическую язву стопы, васкулитную язву, венозную язву, венозную гемостатическую язву, артериальную язву, пролежень, язвенный пролежень, инфекционную язву, травматическую язву, ожоговую язву, изъязвление, связанное с гангренозной пиодермией, либо смешанную язву или язвы. В рамки изобретения входит и многократное нанесение. Предпочтительным является многократное нанесение до тех пор, пока не будет наблюдаться закрытие раны, а затем повторное нанесение в том случае, если заживление раны опять приостановится или замедлится.
В соответствии с другими аспектами настоящего изобретения усиливается реэпителизация раны и/или образование грануляционной ткани.
В дополнительном аспекте настоящее изобретение предусматривает способ усиления заживления ран у субъектов с ранами, не заживающими с ожидаемой скоростью, включая медленно заживающие раны, неполностью заживающие раны или хронические раны, который включает продолжительное применение антисмыслового полинуклеотида к коннексину 43 и антисмыслового полинуклеотида к коннексину 31.1. В рамки изобретения входит и многократное применение.
Альтернативный аспект настоящего изобретения касается способа усиления реэпителизации кожных ран, который включает введение субъекту с раной, не заживающей с ожидаемой скоростью, включая, к примеру, медленно заживающие, неполностью заживающие раны или хронические раны, антиконнексинового полинуклеотида, например антисмыслового полинуклеотида в количестве, эффективном для усиления реэпителизации. Антиконнексиновый полинуклеотид может быть направлен против коннексина из числа коннексина 26, коннексина 30, коннексина 31.1 и коннексина 43. Подходящие полинуклеотиды можно выбрать из антисмысловых полинуклеотидов к коннексинам с модифицированным или немодифицированным остовом (например, антисмысловых полинуклеотидов из ДНК, связывающейся с мРНК коннексина), полинуклеотидов РНКи и полинуклеотидов мРНК. В рамки изобретения входит и многократное введение. Предпочтительной мишенью является коннексин 43.
В следующем дополнительном аспекте настоящее изобретение предусматривает способ усиления заживления ран у субъектов с ранами, не заживающими с ожидаемой скоростью, включая, к примеру, медленно заживающие раны, неполностью заживающие раны или хронические раны, который включает продолжительное применение такого антиконнексинового полинуклеотида, например антисмыслового полинуклеотида к коннексину, который эффективно регулирует деление и рост клеток базального слоя эпителия, и такого антиконнексинового полинуклеотида, например антисмыслового полинуклеотида к коннексину, который эффективно регулирует секрецию кератина во внешнем слое. В одном воплощении антиконнексиновый полинуклеотид, например антисмысловой полинуклеотид к коннексину, который эффективно регулирует деление и рост клеток базального слоя эпителия, представляет собой антисмысловой полинуклеотид к коннексину 26 или антисмысловой полинуклеотид к коннексину 43 либо их смесь. В соответствии с другим воплощением антиконнексиновый полинуклеотид, например антисмысловой полинуклеотид к коннексину, который применяется для регуляции кератинизации внешнего слоя, представляет собой антисмысловой полинуклеотид к коннексину 31.1. В рамки изобретения входит и многократное применение.
В другом воплощении хроническая рана представляет собой хроническую кожную рану, а антиконнексиновый полинуклеотид наносится на кожу или ткань, связанную с кожей данного субъекта, на эффективный период времени. Хроническая кожная рана, подходящая для лечения, к примеру, может быть выбрана из группы, состоящей из пролежней, язвенных пролежней, диабетических язв, диабетических язв стопы, венозных язв, венозных гемостатических язв, артериальных язв, васкулитных язв, инфекционных язв, травматических язв, ожоговых язв, изъязвлений, связанных с гангренозной пиодермией, и смешанных язв. Хроническая рана может представлять собой артериальную язву, включающую изъязвления, вызванные полной или частичной закупоркой артерий. Хроническая рана может представлять собой венозную или венозную гемостатическую язву, включающую изъязвления, вызванные нарушением функции венозных клапанов и связанными с этим сосудистыми заболеваниями. Хроническая рана может представлять собой травматическую язву. В рамки изобретения входит и многократное нанесение.
В соответствии с другим аспектом настоящее изобретение предусматривает способ повышения скорости заживления или закрытия ран у субъектов с ранами, не заживающими с ожидаемой скоростью (включая медленно заживающие раны, неполностью заживающие раны и хронические раны), который включает введение субъекту эффективного количества антиконнексинового полинуклеотида. Подходящий полинуклеотид выбирают из антисмысловых полинуклеотидов к коннексинам (например, антисмысловых полинуклеотидов из ДНК, связывающейся с мРНК коннексина), полинуклеотидов РНКи и полинуклеотидов миРНК. Подходящим антисмысловым полинуклеотидом к коннексину является полинуклеотид к коннексину 43. Особенно подходящие полинуклеотиды содержат от 18 до 32 нуклеотидов. В рамки изобретения входит и многократное введение. Одним из предпочтительных олигонуклеотидов является SEQ ID NO:1.
Изобретение включает способы применения терапевтически эффективного количества одного или нескольких фармацевтически приемлемых антиконнексиновых полинуклеотидов, включая антисмысловые полинуклеотиды к коннексинам, при изготовлении медикамента или лекарственной формы. Такие медикаменты, лекарственные и лекарственные формы включают, к примеру, лекарственные формы для местного применения. Такие медикаменты включают лекарства для лечения субъектов, как изложено в настоящем изобретении. Предпочтительными антиконнексиновыми полинуклеотидами и антисмысловыми полинуклеотидами к коннексинам являются антиконнексиновые полинуклеотиды против коннексина 43 и антисмысловые полинуклеотиды к коннексину 43. Предпочтительно медикамент, композиция или лекарственная форма представляет собой пену, крем, спрей или гель.
В следующем аспекте изобретение охватывает изделия, включающие сосуд, содержащий терапевтически эффективное количество одного или нескольких фармацевтически приемлемых антиконнексиновых полинуклеотидов, например антисмысловых полинуклеотидов к коннексинам, и инструкцию по применению. Такая инструкция может включать инструкции по применению для лечения субъектов с хроническими ранами или ранами, характеризующимися замедленным заживлением. Инструкция может включать инструкции по применению в отношении ран, не заживающих с ожидаемой скоростью, как то медленно заживающих ран, неполностью заживающих ран и хронических ран. Предпочтительными антиконнексиновыми полинуклеотидами и антисмысловыми полинуклеотидами к коннексинам являются антиконнексиновые полинуклеотиды к коннексину 43 и антисмысловые полинуклеотиды к коннексину 43.
Изобретение охватывает и изделия, включающие упаковочный материал, содержащий одну или несколько лекарственных форм, содержащих один или несколько фармацевтически приемлемых антиконнексиновых полинуклеотидов, например антисмысловых полинуклеотидов к коннексинам, причем упаковочный материал снабжен этикеткой, указывающей, что лекарственная форма может применяться для субъектов, страдающих или с подозрением на либо предрасположенных к любому из заболеваний и/или состояний, описанных или указанных в настоящем изобретении, включая заболевания и/или состояния, характеризующиеся полностью или частично плохим или замедленным заживлением ран или хроническими ранами либо иными ранами, не заживающими с ожидаемой скоростью. Такие лекарственные формы включают, к примеру, лекарственные формы для местного применения. Предпочтительными антиконнексиновыми полинуклеотидами и антисмысловыми полинуклеотидами к коннексинам являются антиконнексиновые полинуклеотиды к коннексину 43 и антисмысловые полинуклеотиды к коннексину 43.
В еще одном аспекте изобретение предусматривает упаковку, включающую антиконнексиновый полинуклеотид, например антисмысловой полинуклеотид к коннексину, вместе с инструкцией по применению для усиления заживления (например, снижения продолжительности заживления, лучшего исхода заживления) ран в отношении медленно или неполностью заживающих ран или хронических ран.
Во всех аспектах изобретения антиконнексиновым полинуклеотидом предпочтительно является антиконнексиновый полинуклеотид против коннексина 43, антисмысловым полинуклеотидом к коннексину предпочтительно является антисмысловой полинуклеотид к коннексину 43, а антисмысловым олигодезоксинуклеотидом к коннексину предпочтительно является олигодезоксинуклеотид к коннексину 43.
Эти и другие аспекты настоящего изобретения, которые не ограничиваются информацией, приведенной в данном разделе, представлены ниже.
Краткое описание фигур
На фиг.1A-1D представлено иммуноокрашивание на коннексин в кожных фибробластах, волосяных сумках, кровеносных сосудах и придатках. На фиг.1А представлено окрашивание на коннексин 43 в эпидермисе и дерме и окрашивание на коннексин 26 в эпидермисе в нормальной (светлые столбики) и диабетической коже (темные столбики) через 2 недели после индукции диабета. На фиг.1 В представлены эффекты на экспрессию коннексина через 8 недель после индукции диабета с помощью STZ. На фиг.1C представлено иммуноокрашивание на коннексин в контроле (С) и при диабете (D) через 8 недель, причем стрелками отмечена граница между эпидермисом и дермой. На фиг.1D представлено количественное определение расстояния переноса проникающего через щелевые контакты красителя через ткань за 5 мин в недиабетических (светлые столбики) и диабетических (темные столбики) эпидермисе и дерме.
На фиг.2A-2D представлены скорости реэпителизации и изменения уровня белков коннексина 43 и коннексина 26 при измерении окрашивания на коннексин после нанесения раны. На фиг.2А представлены зоны, в которых определяли окрашивание на коннексин в кератиноцитах: края раны (WE), примыкающая зона на расстоянии 500 мкм (AD) и передний край (LE). Окрашивание на коннексин в зонах WE и AD определяли через 1 и 2 дня после нанесения раны. Кератиноциты зоны LE снимали через 5 дней. На фиг.2В представлена скорость реэпителизации кожи через 1, 2 и 5 дней после нанесения раны в контроле (С) и при диабете (D). На фиг.2С представлено окрашивание на коннексин 43 через 1, 2 и 5 дней после нанесения раны в зонах WE, AD и LE у животных в контроле (светлые столбики) и при диабете (темные столбики). На фиг.2D представлено окрашивание на коннексин 26 через 1, 2 и 5 дней после нанесения раны в зонах WE, AD и LE у животных в контроле (светлые столбики) и при диабете (темные столбики).
На фиг.3а-3f и 3a'-3f представлено окрашивание на коннексины через 1, 2 и 5 дней после нанесения раны у животных в контроле и при диабете. На фиг.3а, 3с и 3е (контроль) и 3а', 3с' и 3е' (диабет) представлено окрашивание на коннексин 43 через 1 (фиг.3а и 3а'), 2 (фиг.3с и 3с') и 5 дней (фиг.3е и 3е') после нанесения раны. На фиг.3b, 3d и 3f (контроль) и 3b', 3d' и 3f (диабет) представлено окрашивание на коннексин 26 через 1 (фиг.3b и 3b'), 2 (фиг.3d и 3d') и 5 дней (фиг.3f и 3f') после нанесения раны.
На фиг.4А-4С представлены эффекты нанесения композиции антисмыслового олигодезоксинуклеотида к коннексину 43 на экспрессию коннексина 43 и заживление ран. На фиг.4А (смысловой контроль) и фиг.4 В (антисмысловой к коннексину 43) представлена экспрессия коннексина 43 в кератиноцитах зоны WE при диабете. На фиг.4С представлена реэпителизация ран в процентах через 1, 2 и 5 дней после нанесения раны в контроле (С) и при диабете (D) при обработке смысловым ("s") или антисмысловым ("as") полинуклеотидом к коннексину 43.
Осуществление изобретения
Раны, не заживающие с ожидаемой скоростью, включая медленно заживающие раны, плохо заживающие раны, неполностью заживающие раны, раскрывающиеся раны и хронические раны, часто заканчиваются инфекцией и могут привести к ампутации или смерти. В заживлении ран важнейшую роль играет межклеточная коммуникация через щелевые контакты. Оказалось, что применение некоторых соединений, включая те, что описаны или приведены в настоящем изобретении, может блокировать, ингибировать или изменить межклеточную коммуникацию, что способствует закрытию и заживлению ран, не заживающих с ожидаемой скоростью, включая медленно заживающие раны, плохо заживающие раны, неполностью заживающие раны, раскрывающиеся раны и хронические раны. Для всех применений предпочтительными являются вещества, модулирующие щелевые контакты с коннексином 43.
Определения
В настоящем изобретении "заболевание" означает любое заболевание, нарушение или состояние, на которое может благотворно воздействовать вещество, способствующее заживлению ран и/или уменьшающее рубцевание. Например, оно включает сопутствующие ранам аномалии в связи с невропатической, ишемической и микрососудистой патологией; давлением на костные зоны (крестец копчика, вертел бедра, седалищные кости ягодиц или стопы ног); реперфузионным повреждением; а также заболевания, связанные с рефлюксом клапанов, и родственные им заболевания.
В настоящем изобретении "субъект" означает любое млекопитающее, включая человека, домашних и сельскохозяйственных животных, а также животных в зоопарке, спортивных и комнатных животных, как то собак, лошадей, кошек, овец, свиней, коров и т.д. Предпочтительным млекопитающим является человек, включая взрослых, детей и пожилых.
В настоящем изобретении "предотвращение" означает полное или частичное предотвращение либо улучшение или сдерживание.
В настоящем изобретении "терапевтически эффективное количество" в отношении соединений или композиций настоящего изобретения означает количество, достаточное для оказания требуемого биологического, фармацевтического или терапевтического результата. Таким результатом может быть смягчение признаков, симптомов или причин заболевании или любое иное желательное изменение биологической системы. В настоящем изобретении результат означает усиление и/или улучшение заживления ран, в том числе скорости заживления ран и закрытия ран, полностью или частично. Другие благотворные результаты включают уменьшение отека, воспаления и/или рубцевания, полностью или частично.
В настоящем изобретении термин "лечение" относится и к терапевтическому лечению, и к профилактическим мероприятиям.
В настоящем изобретении "одновременно" применяется для обозначения того, что один или несколько антиконнексиновых полинуклеотидов, например антисмысловых полинуклеотидов, применяются одновременно, тогда как термин "в комбинации" служит для обозначения того, что если они применяются не одновременно или не в физическом сочетании, то "последовательно" в таком интервале времени, чтобы они оба были способны оказывать терапевтическое действие. Так, "последовательное" применение может означать, что одно вещество вводится через несколько (например, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30) минут или через несколько часов, дней, недель или месяцев после другого при условии, что один или несколько антиконнексиновых полинуклеотидов будут присутствовать одновременно в эффективном количестве. Промежуток времени между введением компонентов варьируется в зависимости от точной природы компонентов, взаимодействия между ними и соответствующих периодов полужизни.
В настоящем изобретении "антиконнексиновый полинуклеотид" снижает или ингибирует экспрессию мРНК или белка коннексина. К антиконнексиновым полинуклеотидам относятся антисмысловые соединения типа антисмысловых полинуклеотидов, другие полинуклеотиды (как то полинуклеотиды с функциями миРНК или рибозима). Примеры подходящих антиконнексиновых полинуклеотидов включают антисмысловые полинуклеотиды к коннексинам. Соответственно, к подходящим антиконнексиновым полинуклеотидам относятся, к примеру, антисмысловые полинуклеотиды (например, антисмысловые полинуклеотиды к коннексину 43), модулирующие экспрессию или активность коннексинов или щелевых контактов в отдельных тканях, клетках и субъектах.
Термин "раневая повязка" относится к повязкам для местного нанесения на раны и исключает композиции, предназначенные для системного введения. Например, можно диспергировать один или несколько антиконнексиновых полинуклеотидов (как то антисмысловых полинуклеотидов к коннексинам) в или на твердой полоске контактирующего с раной материала, как то тканого или нетканого текстильного материала, либо диспергировать в слое пены типа полиуретана или в гидрогеле типа гидрогеля из полиуретана, полиакрилата, желатина, карбоксиметилцеллюлозы, пектина, альгината и/или гиалуроновой кислоты, например в геле или мази. В некоторых воплощениях один или несколько антиконнексиновых полинуклеотидов диспергированы в или на полоске биоразрушимого материала, обеспечивающего продолжительное выделение активных ингредиентов в рану, например полоске лиофилизированного коллагена, лиофилизированной смеси коллагена/альгината (доступной под торговой маркой Fibracol фирмы Johnson & Johnson Medical Limited) или лиофилизированной смеси коллагена/окисленной регенерированной целлюлозы (доступной под торговой маркой Promogran фирмы Johnson & Johnson Medical Limited).
В настоящем изобретении "способствующий заживлению ран матрикс" включает, к примеру, такие синтетические или природные матриксы, как коллаген, бесклеточный матрикс, сшитые молекулы биологического каркаса клетки, тканевые биоинженерные структурные конструкции, биопротезы биологического происхождения и другие имплантируемые структуры, такие, к примеру, как сосудистые трансплантаты, пригодные для инфильтрации и пролиферации клеток и применимые для усиления заживления ран. Другие подходящие материалы биоматриксов могут включать химически модифицированную коллагеновую ткань для уменьшения антигенности и иммуногенности. Другие подходящие примеры включают полоски коллагена для раневых повязок, лишенный или почти лишенный антигенов бесклеточный матрикс (Wilson G.J. et al. (1990) Trans. Am. Soc. Artif. Intern. 36: 340-343) или иной биоматрикс, подвергнутый биоинженерии для снижения антигенной реактивности на материал ксенотрансплантата. Другие матриксы, применимые для усиления заживления ран, могут включать, к примеру, обработанные белки перикарда быка, содержащие нерастворимый коллаген и эластин (Courtman D.W. et al. (1994) J. Biomed. Mater. Res. 28: 655-666), и другие бесклеточные ткани, которые могут оказаться полезными для ускорения регенерации тканей, обеспечивая естественную микросреду для миграции клеток хозяина (Malone J.M. et al. (1984) J. Vase. Surg. 1: 181-191). Изобретение предусматривает синтетический или природный матрикс, включающий один или несколько описанных в нем антиконнексиновых полинуклеотидов, в том числе полинуклеотиды против коннексина 43. Предпочтительными являются антисмысловые олигодезоксинуклеотиды к коннексину 43.
В настоящем изобретении термин "рана" охватывает повреждения любых тканей, включая, к примеру, медленно или плохо заживающие раны и хронические раны. Примеры ран могут включать как открытые, так и закрытые раны. Термин "рана" также может включать, к примеру, повреждения кожи и подкожной ткани, возникающие различным образом (например, пролежни, вызванные длительным постельным режимом, и раны, вызванные травмой) и с разными характеристиками. Раны могут относиться к одной из 4 степеней в зависимости от глубины раны: i) раны I степени, огранивающиеся эпителием; ii) раны II степени, проникающие в дерму; iii) раны III степени, проникающие в подкожную ткань; и iv) раны IV степени (глубокие раны), при которых открываются кости (например, костная точка, подверженная давлению, как то большой вертел или крестец).
Термин "неглубокая рана" относится к ранам, охватывающим степени I-III. Примеры неглубоких ран включают пролежни, венозные гемостатические раны и диабетические раны. Настоящее изобретение предусматривает лечение всех ран, относящихся к типу не заживающих с ожидаемой скоростью, включая медленно заживающие раны, неполностью заживающие раны и хронические раны.
"Рана, не заживающая с ожидаемой скоростью" означает повреждение любой ткани, включая медленно или плохо заживающие раны (в том числе медленно или неполностью заживающие раны) и хронические раны. Примеры ран, не заживающих с ожидаемой скоростью, включают язвы, как то диабетические язвы, диабетические язвы стопы, васкулитные язвы, артериальные язвы, венозные язвы, венозные гемостатические язвы, пролежни, язвенные пролежни, инфекционные язвы, травматические язвы, ожоговые язвы, изъязвления, связанные с гангренозной пиодермией, и смешанные язвы. Другие раны, не заживающие с ожидаемой скоростью, включают раскрывающиеся раны.
В настоящем изобретении медленно или плохо заживающие раны могут включать, к примеру, раны, характеризующиеся хотя бы частично: 1) продолжительной фазой воспаления; 2) медленным формированием внеклеточного матрикса и/или 3) снижением скорости эпителизации или закрытия.
Термин "хроническая рана" в общем относится к ранам, которые не заживают. К примеру, раны, не заживающие в течение 3 месяцев, считаются хроническими. Хронические раны включают венозные язвы, венозные гемостатические язвы, артериальные язвы, пролежни, диабетические язвы, диабетические язвы стопы, васкулитные язвы, язвенные пролежни, ожоговые язвы, травматические язвы, инфекционные язвы, смешанные язвы и гангренозную пиодермию. Хроническая рана может представлять собой артериальную язву, которая включает изъязвления, возникающие при полной или частичной закупорке артерий. Хроническая рана может представлять собой венозную или венозную гемостатическую язву, которая включает изъязвления, возникающие при нарушении функции венозных клапанов и связанными с этим сосудистыми заболеваниями. В некоторых воплощениях предусмотрен способ лечения хронических ран, в котором хронические раны характеризуются по одной или нескольким стадиям образования пролежней по AHCPR: 1-й стадии, 2-й стадии, 3-й стадии и/или 4-й стадии.
В настоящем изобретении хроническая рана может означать, к примеру, такую рану, которая характеризуется хотя бы частично: (1) хроническим непрерывным воспалением раны; (2) неполным и дефектным внеклеточным матриксом раны; (3) плохо реагирующими (стареющими) клетками раны, особенно фибробластами, что ограничивает образование внеклеточного матрикса; и/или (4) неспособностью к реэпителизации, что частично обусловлено отсутствием необходимого устройства внеклеточного матрикса и отсутствием каркаса для миграции. Хронические раны также могут характеризоваться: 1) продолжительным воспалением и протеолитической активностью, что приводит к язвенным повреждениям, включающим, к примеру, пролежни (язвенные), диабетические, венозные и артериальные язвы; 2) прогрессирующим отложением матрикса в зоне поражения; 3) большим временем восстановления; 4) меньшим рубцовым сморщиванием; 5) замедленной реэпителизацией и 6) большей толщиной грануляционной ткани.
Примеры хронических ран могут включать "пролежни". Типичные пролежни можно квалифицировать по 4 стадиям согласно директивам AHCPR (Агентства по политике и исследованиям в области здравоохранения, Департамент здравоохранения и сферы услуг США). Пролежень 1 стадии представляет собой заметное и связанное с давлением изменение интактной кожи, показатели которого, в сравнении с соседним или противоположным участком тела, могут включать изменения хотя бы одного из следующего: температуры кожи (потепление или похолодание), консистенции ткани (плотной или размягченной) и/или ощущения (боли, зуда). Язва выглядит как оформленная зона постоянного покраснения на светлой коже, а на более темной коже она может давать стойкий красный, синий или пурпурный оттенок. Изъязвление 1 стадии может включать эритему интактной кожи, которая не бледнеет и является предвестником изъязвления кожи. У лиц с темной кожей показателем 1 стадии изъязвления может быть изменение цвета кожи, жжение, отек, огрубение или твердость. Изъязвление 2 стадии может характеризоваться неглубоким разрушением кожи, задевающим эпидермис, дерму или то и другое. Язва является поверхностной и клинически выглядит как ссадина, волдырь или неглубокая воронка. Изъязвление 3 стадии может характеризоваться глубоким разрушением кожи, включающим повреждение или некроз подкожной ткани, который может доходить до нижележащей фасции, не проникая через нее. Язва клинически выглядит как глубокая воронка с поражением примыкающей ткани или без него. Изъязвление 4 стадии может характеризоваться глубоким поражением кожи с обширным разрушением, некрозом ткани или повреждением мышцы, кости или опорных структур (например, сухожилий, суставной сумки). В некоторых воплощениях предусмотрен способ лечения хронических ран, в котором хронические раны характеризуются по одной или нескольким стадиям образования пролежней по AHCPR: 1-й стадии, 2-й стадии, 3-й стадии и/или 4-й стадии.
Примеры хронических ран также могут включать "язвенные пролежни". Типичные язвенные пролежни могут возникать в результате продолжительного и неослабевающего давления на костный выступ, что ведет к ишемии. Такие раны обычно возникают у пациентов, которые неспособны переменить положение для снятия нагрузки, как то парализованных, бессознательных или сильно ослабленных лиц. Согласно определению Департамента здравоохранения и сферы услуг США основные профилактические мероприятия включают идентификацию пациентов с высокой степенью риска; частое обследование и такие профилактические мероприятия, как перемена положения по графику, надлежащее устройство кровати для ослабления давления, влагоизолирующие прокладки и адекватное питание. Возможные варианты лечения могут включать, к примеру, ослабление давления, хирургическую и энзиматическую обработку, обработку мокнущих ран и контроль бактериального загрязнения. В некоторых воплощениях предусмотрен способ лечения хронических ран, в котором хронические раны характеризуются как язвенные пролежни, возникающие вследствие продолжительного и неослабевающего давления на костный выступ, что ведет к ишемии.
Хронические раны также могут включать "артериальные язвы". Под хроническими артериальными язвами понимаются изъязвления, сопровождающие сердечно-сосудистые заболевания - артериосклероз и гипертоническую болезнь. Они болезненны, имеют острые края и часто находятся на боковой поверхности нижних конечностей и пальцев стопы. Артериальные язвы могут характеризоваться полной или частичной закупоркой артерий, что может привести к некрозу и/или изъязвлению тканей. Признаки артериальной язвы могут включать, к примеру, отсутствие пульса в конечности; болезненное изъязвление; небольшие, точечные язвочки, обычно с хорошо очерченными краями; прохладную или холодную кожу; замедленное наполнение капилляров (если быстро нажать на кончик пальца стопы и отпустить, то нормальный цвет кожи должен восстановиться через 3 секунды или меньше); атрофический вид кожи (например, глянцевитая, истонченная, сухая); и выпадение волос на пальцах и стопах. В некоторых воплощениях предусмотрен способ лечения хронических ран, в котором хронические раны характеризуются как артериальные язвы или изъязвления, вызванные полной или частичной закупоркой артерий.
Примеры хронических ран могут включать "венозные язвы". Типичные венозные язвы являются самым распространенным типом язв, поражающих нижние конечности, и могут характеризоваться нарушением функции венозных клапанов. В нормальных венах имеются клапаны, предотвращающие обратное течение крови. Когда эти клапаны ослабляются, то обратное течение венозной крови вызывает застой крови в венах, Гемоглобин вытекает из эритроцитов и просачивается во внесосудистое пространство, обычно вызывая появление коричневатых пятен. Было показано, что в коже, окружающей венозную язву, снижается чрескожное давление кислорода, свидетельствуя о наличии каких-то сил, затрудняющих нормальную васкуляризацию этого участка. Лимфатическая сеть и отток лимфы также играют роль в возникновении этих язв. Венозная язва может появиться посреди лодыжки и обычно возникает в сочетании с отеком и отвердением нижней конечности; она может быть неглубокой, не очень болезненной и может сопровождаться выделением жидкости из пораженного места. В некоторых воплощениях предусмотрен способ лечения хронических ран, в котором хронические раны характеризуются как венозные язвы или изъязвления, вызванные нарушением функции венозных клапанов и связанными с этим сосудистыми заболеваниями.
Примеры хронических ран могут включать "венозные гемостатические язвы". Гемостатические язвы представляют собой повреждения, связанные с венозной недостаточностью, которые чаще всего возникают посреди лодыжки, обычно вместе с ямочным отеком, варикозами, мраморной пигментацией, эритемой, непальпируемой петехией и пурпурой. Гемостатический дерматит и гемостатические язвы обычно являются скорее зудящими, чем болезненными. Типичные венозные гемостатические язвы могут характеризоваться хронической пассивной закупоркой вен нижних конечностей, что ведет к локальной гипоксии. Один из возможных механизмов патогенеза этих ран включает затрудненность диффузии кислорода в ткань через толстые периваскулярные фибриновые "манжеты". Другой механизм состоит в том, что макромолекулы, просачивающиеся в периваскулярные ткани, поглощают факторы роста, необходимые для поддержания целостности кожи. Кроме того, вследствие закупорки вен замедляется прохождение крупных лейкоцитов, которые закупоривают капилляры, активируются и повреждают эндотелий сосудов, что располагает к образованию язв. В некоторых воплощениях предусмотрен способ лечения хронических ран, в котором хронические раны характеризуются как венозные гемостатические язвы или изъязвления, вызванные хронической пассивной закупоркой вен нижних конечностей и/или возникающей при этом локальной гипоксией.
Примеры хронических ран могут включать "диабетические язвы". Больные диабетом предрасположены к изъязвлениям, включая изъязвления стопы, что обусловлено как неврологическими, так и сосудистыми осложнениями. Периферическая невропатия может вызвать изменение или полную потерю чувствительности в ступнях и/или ногах. Больные диабетом с запущенной невропатией полностью теряют способность отличить острую боль от тупой. У больных с невропатией любые порезы или травмы ступни могут оставаться незамеченными по несколько дней или недель. Довольно часто больные с невропатией замечают, что язва "только что появилась", тогда как в действительности она уже была довольно долго. Было показано, что у больных с невропатией строгий контроль глюкозы замедляет прогрессирование болезни. В результате снижения чувствительности стопы может возникнуть деформация Шарко. Люди с "нормальной" чувствительностью стопы способны автоматически почувствовать, когда на область стопы приходится слишком большое давление. Как только это ощущается, наше тело инстинктивно меняет положение, чтобы ослабить напряжение. Больной с запущенной невропатией теряет способность воспринимать непрерывное давление, в результате чего может возникнуть ишемия и некроз тканей, что ведет, например, к изъязвлению подошвы стопы. Кроме того, микротрещины в костях стопы, если их не заметить и не лечить, могут привести к деформации, хроническому опуханию и появлению дополнительных костных выступов. Микрососудистые заболевания являются одним из существенных осложнений диабета, что также может привести к изъязвлению. В некоторых воплощениях предусмотрен способ лечения хронических ран, в котором хронические раны характеризуются как диабетические язвы и/или изъязвления стопы, вызванные как неврологическими, так и сосудистыми осложнениями диабета.
Примеры хронических ран могут включать "травматические язвы". Травматические язвы могут образоваться в результате травматических повреждений организма. Такие повреждения включают, к примеру, повреждения артериальной, венозной или лимфатической системы; изменения костной архитектуры скелета; разрушение тканевых слоев - эпидермиса, дермы, подкожной мягкой ткани, мышцы или кости; повреждение частей тела или органов и разрушение частей тела или органов. В некоторых воплощениях предусмотрен способ лечения хронических ран, в котором хронические раны характеризуются как изъязвления, связанные с травматическими повреждениями организма.
Примеры хронических ран могут включать "ожоговые язвы", включая ожоги 1-й степени (т.е. покраснение поверхности участка кожи); ожоги 2-й степени (пузыри на месте повреждения, которые могут заживать спонтанно после удаления жидкости из пузырей); ожоги 3-й степени (ожоги по всей коже, которые обычно требуют хирургического вмешательства для их заживления); ошпаривание (при ошпаривании горячей водой, жиром или радиаторной жидкостью); термальные ожоги (при воспламенении, обычно это глубокие ожоги); химические ожоги (от кислоты или щелочи, обычно это глубокие ожоги); электрические ожоги (низковольтные на дому или высоковольтные на работе); ожоги при взрывах (обычно это поверхностные повреждения); и контактные ожоги (обычно глубокие, от глушителя выхлопной трубы, горячего утюга или печи). В некоторых воплощениях предусмотрен способ лечения хронических ран, в котором хронические раны характеризуются как изъязвления, связанные с ожоговыми повреждениями организма.
Примеры хронических ран могут включать "васкулитные язвы". Васкулитные язвы тоже встречаются на нижних конечностях и представляют собой болезненные поражения с четкими краями, с которыми могут быть связаны пальпируемые пурпуры и геморрагические пузырьки. Причиной этого тяжелого, острого заболевания может быть коллагеновая болезнь, септицемия и различные гематологические заболевания (например, тромбоцитопения, диспротеинемия).
Примеры хронических ран могут включать "гангренозную пиодермию". Гангренозная пиодермия возникает в виде одиночных или множественных, очень болезненных язв нижней части ног. Темно-красная или багровая, размытая кромка окружает гнойный центральный дефект. Как правило, биопсия не дает картины васкулита. У половины больных она связана с таким системным заболеванием, как язвенный колит, регионарный илеит или лейкемия. В некоторых воплощениях предусмотрен способ лечения хронических ран, в котором хронические раны характеризуются как изъязвления, связанные с гангренозной пиодермией.
Примеры хронических ран могут включать "инфекционные язвы". Инфекционные язвы возникают при прямом попадании различных организмов и могут быть связаны с существенной регионарной аденопатией. Примерами являются заражение микобактериями, сибирская язва, дифтерия, бластомикоз, споротрихоз, туляремия и болезнь от кошачьих царапин. Генитальные язвы при первичном сифилисе обычно безболезненны и имеют четкое, плотное основание. Шанкроидные язвы и венерическая гранулема обычно представляют собой шероховатые, нечеткие и более причудливые поражения. В некоторых воплощениях предусмотрен способ лечения хронических ран, в котором хронические раны характеризуются как изъязвления, связанные с инфекцией.
В настоящем изобретении термин "раскрывающаяся рана" относится к ранам, как правило, хирургическим ранам, которые вскрываются или раскрываются. В некоторых воплощениях предусмотрен способ лечения ран, не заживающих с ожидаемой скоростью, в котором раны характеризуются как раскрывающиеся.
Антиконнексиновые полинуклеотиды
Антиконнексиновые полинуклеотиды включают антисмысловые полинуклеотиды к коннексинам, а также полинуклеотиды с такими функциональными возможностями, которые позволяют им подавлять экспрессию коннексинов (например, посредством понижающей регуляции транскрипции мРНК или трансляции). В случае понижающей регуляции это будет оказывать эффект снижения межклеточной коммуникации через щелевые контакты в том месте, в котором подавляется экспрессия коннексинов.
Подходящие антиконнексиновые полинуклеотиды включают полинуклеотиды РНКи и полинуклеотиды миРНК.
Синтез антисмысловых полинуклеотидов и других антиконнексиновых полинуклеотидов, как то полинуклеотидов типа РНКи, миРНК и рибозимов, а также полинуклеотидов с модифицированным или смешанным остовом, известен специалистам в этой области, например см. Stein C.A. and Krieg A.M. (eds). Applied Antisense Oligonucleotide Technology, 1998 (Wiley-Liss).
В соответствии с одним аспектом понижающая регуляция экспрессии коннексинов в общем может основываться на антисмысловом подходе с использованием антисмысловых полинуклеотидов (как то полинуклеотидов из ДНК или РНК), в частности, на использовании антисмысловых олигодезоксинуклеотидов (ODN). Такие полинуклеотиды (например, ODN) нацелены на подлежащие понижающей регуляции белки коннексинов. Как правило, эти полинуклеотиды одноцепочечные, но могут быть и двухцепочечными.
Антисмысловой полинуклеотид может ингибировать транскрипцию и/или трансляцию коннексина. Предпочтительно полинуклеотид является специфическим ингибитором транскрипции и/или трансляции из гена или мРНК коннексина и не ингибирует транскрипцию и/или трансляцию из других генов или мРНК. Продукт может связываться с геном или мРНК коннексина либо (i) с 5'-стороны от кодирующей последовательности и/или (ii) с самой кодирующей последовательностью и/или (iii) с 3'-стороны от кодирующей последовательности.
Антисмысловой полинуклеотид обычно является антисмысловым по отношению к мРНК коннексина. Такой полинуклеотид может обладать способностью к гибридизации с мРНК коннексина и тем самым ингибировать экспрессию коннексина путем воздействия на один или несколько аспектов метаболизма мРНК коннексина, включая транскрипцию, процессинг мРНК, транспорт мРНК из ядра, трансляцию или деградацию мРНК. Как правило, антисмысловой полинуклеотид гибридизуется с мРНК коннексина с образованием двойного комплекса (дуплекса), что может вызвать прямое ингибирование трансляции и/или дестабилизацию мРНК. Такой дуплекс может быть подвержен деградации нуклеазами.
Антисмысловой полинуклеотид может гибридизоваться со всей или с частью мРНК коннексина. Как правило, антисмысловой полинуклеотид гибридизуется с участком рибосомного связывания или с кодирующей областью мРНК коннексина. Полинуклеотид может быть комплементарен всей или части мРНК коннексина. Например, полинуклеотид может быть в точности комплементарен всей или части мРНК коннексина. Однако абсолютная комплементарность не обязательна, поэтому полинуклеотиды, обладающие достаточной комплементарностью для образования двойного комплекса с температурой плавления более 20°С, 30°С или 40°С при физиологических условиях, особенно подходят для применения в настоящем изобретении.
Таким образом, полинуклеотид обычно гомологичен последовательности, комплементарной данной мРНК. Полинуклеотид может представлять собой полинуклеотид, гибридизующийся с мРНК коннексина в условиях средней или высокой строгости, как то 0,03 М хлорида натрия или 0,03 М цитрата натрия при температуре от 50°С до 60°С.
Для некоторых аспектов подходящие полинуклеотиды обычно имеют длину от 6 до 40 нуклеотидов. Предпочтительно полинуклеотид имеют длину от 12 до 35 нуклеотидов или же от 12 до 20 нуклеотидов, более предпочтительно от 18 до 32 нуклеотидов. В соответствии с альтернативным аспектом полинуклеотид может иметь длину по меньшей мере 40, к примеру, по меньшей мере 60 или по меньшей мере 80 нуклеотидов, а также вплоть до 100, 200, 300, 400, 500, 1000, 2000 или 300 или больше нуклеотидов.
На какой белок коннексина или белки коннексинов нацелен полинуклеотид, зависит от того места, в котором должна происходить понижающая регуляция. В этом отражается неоднородность состава щелевых контактов в различных местах по всему организму в отношении субъединичного строения коннексинов. Таким коннексином является коннексин, который в природе встречается у человека или животного в одном аспекте либо встречается в той ткани, в которой нужно понизить экспрессию или активность коннексина. Ген коннексина (включая кодирующую последовательность) обычно гомологичен кодирующей последовательности одного или нескольких из конкретных коннексинов, приведенных в настоящем изобретении, как то гомологичен кодирующей последовательности коннексина 43, приведенной в табл.2. Как правило, коннексин представляет собой α- или β-коннексин. Предпочтительно коннексин представляет собой α-коннексин и экспрессируется в подлежащей лечению ткани.
Некоторые белки коннексинов, однако, более распространены, чем другие в смысле распределения в тканях. Одним из наиболее распространенных является коннексин 43. Полинуклеотиды, направленные против коннексина 43, особенно подходят для применения в настоящем изобретении. В других аспектах мишенями являются другие коннексины.
В одном предпочтительном аспекте антисмысловые полинуклеотиды направлены против мРНК только одного белка коннексина. Наиболее предпочтительно таким белком коннексина является коннексин 43. В другом аспекте таким белком коннексина является коннексин 26, 30, 31.1, 32, 36, 37, 40 или 45. В других аспектах таким белком коннексина является коннексин 30.3, 31, 40.1 или 46.6.
Также предусматривается, что можно использовать комбинации полинуклеотидов, направленных против разных белков коннексинов (к примеру, направленных против 1, 2, 3, 4 или больше различных белков коннексинов). Например, можно использовать комбинации из полинуклеотидов, направленных против коннексина 43 и одного или нескольких представителей семейства коннексинов (как то коннексинов 26, 30, 30.3, 31.1, 32, 36, 37, 40, 40.1, 45 и 46.6).
С другой стороны, антисмысловые полинуклеотиды могут входить в состав композиций, которые могут содержать полинуклеотиды против более чем одного белка коннексина. Предпочтительно одним из таких белков коннексинов, против которых направлены полинуклеотиды, является коннексин 43. Другие белки коннексинов, против которых направлены олигодезоксинуклеотиды, могут включать, к примеру, коннексины 26, 30, 30.3, 31.1, 32, 36, 37, 40, 40.1, 45 и 46.6). Примеры подходящих полинуклеотидов (и ODN), направленных против различных коннексинов, приведены в таблице 1.
Индивидуальные антисмысловые полинуклеотиды могут быть специфичными к определенному коннексину либо направлены против 1, 2, 3 или больше различных коннексинов. Специфические полинуклеотиды обычно направлены против таких последовательностей в гене или мРНК коннексина, которые не являются консервативными среди коннексинов, тогда как неспецифические полинуклеотиды направлены против консервативных последовательностей у различных коннексинов.
Полинуклеотиды для применения в изобретении предпочтительно являются немодифицированными фосфодиэфирными олигомерами. Такие олигодезоксинуклеотиды могут иметь разную длину. Особенно подходящим оказался 30-мерный полинуклеотид.
Многие аспекты изобретения описаны в отношении олигодезоксинуклеотидов. Однако подразумевается, что в этих аспектах можно использовать и другие подходящие полинуклеотиды (как то полинуклеотиды РНК).
Антисмысловые полинуклеотиды могут подвергаться химической модификации. Это может повысить их устойчивость к нуклеазам и увеличить их способность к проникновению в клетки. Например, можно использовать фосфоротиоатные олигонуклеотиды. Другие аналоги дезоксинуклеотидов включают метилфосфонаты, фосфорамидаты, фосфородитиоаты, N'-3-Р-5'-фосфорамидаты и фосфоротиоаты олигорибонуклеотидов, а также их 2'-O-алкильные аналоги и 2'-O-метилрибонуклеотидметилфосфонаты. В качестве альтернативы можно использовать олигонуклеотиды со смешанным остовом ("МВО"), Они содержат сегменты фосфоротиоатных олигодезоксинуклеотидов и в соответствующих местах сегменты модифицированных олигодезокси- или олигорибонуклеотидов. МВО содержат сегменты с фосфоротиоатными связями и иные сегменты других модифицированных олигонуклеотидов, как то метилфосфоната, который нетоксичен и очень устойчив к нуклеазам, или 2'-O-алкилолигорибонуклеотидов. Методы получения олигонуклеотидов с модифицированным остовом и со смешанным остовом известны в этой области.
Точная последовательность используемых в изобретении антисмысловых полинуклеотидов будет зависеть от искомого белка коннексина. В одном воплощении подходящие антисмысловые полинуклеотиды к коннексинам могут включать такие полинуклеотиды, как олигодезоксинуклеотиды из числа следующих последовательностей, приведенных в таблице 1.
Таблица 1
5'-GTAATTGCGGCAAGAAGAATTGTTTCTGTC-3'
коннексин 43
SEQIDNO:!
5'-GTAATTGCGGCAGGAGGAATTGTTTCTGTC-3'
коннексин 43
SEQ ID NO:2
5'-GGCAAGAGACACCAAAGACACTACCAGCAT-3'
коннексин 43
SEQ ID NO:3
5'-TCCTGAGCAATACCTAACGAACAAATA-3'
коннексин 26
SEQ ID NO:4
5'-CATCTCCTTGGTGCTCAACC-3'
коннексин 37
SEQ ID NO:5
5'-CTGAAGTCGACTTGGCTTGG-3'
коннексин 37
SEQ ID NO:6
5'-CTCAGATAGTGGCCAGAATGC-3'
коннексин 30
SEQ ID NO:7
5'-TTGTCCAGGTGACTCCAAGG-3'
коннексин 30
SEQ ID NO:8
5'-CGTCCGAGCCCAGAAAGATGAGGTC-3'
коннексин31.1
SEQ ID NO:9
5'-AGAGGCGCACGTGAGACAC-3'
коннексин31.1
SEQ ID NO:10
5'-TGAAGACAATGAAGATGTT-3'
коннексин31.1
SEQ ID NO:11
5'-TTTCTTTTCTATGTGCTGTTGGTGA-3'
коннексин 32
SEQ ID NO:12
Подходящие полинуклеотиды для получения комбинированной композиции полинуклеотидов, описанной в настоящем изобретении, включают, к примеру, полинуклеотиды к коннексину 43 и полинуклеотиды к коннексинам 26, 30, 31.1, 32 и 37, приведенные выше в таблице 1.
Несмотря на то, что точная последовательность используемых в изобретении антисмысловых полинуклеотидов будет зависеть от искомого белка коннексина, для коннексина 43 особенно подходящими оказались антисмысловые полинуклеотиды со следующими последовательностями: СТА АТТ GCG GCA AGA AGA ATT GTT TCT GTC (SEQ ID NO:1); GTA ATT GCG GCA GGA GGA ATT GTT TCT GTC (SEQ ID NO:2); и GGC AAG AGA CAC CAA AGA CAC TAC CAG CAT (SEQ ID NO:3).
Например, подходящие антисмысловые полинуклеотиды для коннексинов 26, 31.1 и 32 имеют следующие последовательности:
5'-ТСС TGA GCA АТА ССТ AAC GAA CAA АТА-3' (коннексин 26) (SEQ ID NO:5);
5'-CGTCCGAGCCCAGAAAGATGAGGTC-3' (коннексин 31.1) (SEQ ID NO:9);
5'-TTT СТТ ТТС TAT GTG CTG TTG GTG А-3' (коннексин 32) (SEQ ID NO:12).
Последовательности других антисмысловых полинуклеотидов к коннексинам, применимых в способах настоящего изобретения, включают:
5'-САТ СТС СТТ GGT GCT CAA СС-3' (коннексин 37) (SEQ ID NO:5);
5'-CTG AAG TCG ACT TGG СТТ GG-3' (коннексин 37) (SEQ ID NO:6);
5'-CTC AGA TAG TGG CCA GAA TGC-3' (коннексин 30) (SEQ ID NO:7);
5'-TTG TCC AGG TGA СТС CAA GG-3' (коннексин 30) (SEQ ID NO:8);
5'-AGA GGC GCA CGT GAG АСА С-3' (коннексин 31.1) (SEQ ID NO:10);
5'-TGA AGA CAA TGA AGA TGT T-3' (коннексин 31.1) (SEQ ID NO: 11).
Полинуклеотиды, включая ODN, направленные против белков коннексинов, можно выбрать в отношении их нуклеотидных последовательностей любым удобным и стандартным способом. Например, можно использовать программы MacVector и OligoTech (фирмы Oligos etc., Eugene, Oregon, USA). После этого можно синтезировать ODN с помощью синтезатора ДНК.
Гомологи полинуклеотидов
Обсудим далее гомологичность и гомологи (например, полинуклеотид может быть гомологом последовательности, комплементарной мРНК коннексина). Как правило, такой полинуклеотид по меньшей мере на 70%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97% или по меньшей мере на 99% гомологичен соответствующей последовательности, к примеру, на участке в по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 40, по меньшей мере 100 и больше прилегающих друг к другу нуклеотидов (гомологичной последовательности).
Гомологичность можно вычислить по любой известной методике. Например, в пакете UWGCG есть программа BESTFIT, которую можно использовать для вычисления гомологичности (к примеру, используя ее параметры по умолчанию) (Devereux et al. (1984) Nucleic Acids Research 12, 387-395). Для вычисления гомологичности или сопоставления последовательностей можно использовать алгоритмы PILEUP и BLAST (как правило, с параметрами по умолчанию), например, как описано в Altschul S.F. (1993) J. Mol. Evol. 36: 290-300; Altschul S.F. et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410.
Программное обеспечение для проведения анализа BLAST общедоступно через Национальный центр информации по биотехнологии (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Этот алгоритм сначала выполняет идентификацию пар последовательностей с высоким баллом (HSP) путем идентификации коротких отрезков длиной W в запрашиваемой последовательности, которые либо совпадают, либо дают положительное значение порогового показателя Т при сопоставлении с отрезком такой же длины в последовательности из базы данных. Т называют пороговым показателем родственности отрезков (Altschul et al., supra). Эти первоначальные родственные отрезки действуют как затравки при запуске поиска для выявления содержащих их HSP. Родственные отрезки расширяют в обоих направлениях вдоль каждой последовательности до тех пор, пока будет повышаться кумулятивный показатель совмещения. Расширение по родственным отрезкам в каждом направлении прекращают, когда кумулятивный показатель совмещения упадет на величину Х от максимального достигнутого значения; кумулятивный показатель доходит до 0 и ниже вследствие накопления дающих отрицательные значения совмещений остатков или при достижении конца одной из последовательностей.
В алгоритме BLAST параметры W, Т и Х определяют чувствительность и быстроту совмещения. В программе BLAST по умолчанию используется длина отрезка (W), матрица показателей BLOSUM62 (см. Henikoffand Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919), количество совмещений (В)=50, ожидание (Е)=10, М=5, N=4 и сравнение по обоим нитям.
Алгоритм BLAST выполняет статистический анализ сходства между двумя последовательностями, например см. Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787). В качестве меры сходства алгоритм BLAST выдает вероятность наименьшей суммы (P(N)), которая служит показателем вероятности того, что совпадение между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательностями произойдет случайным образом. Например, последовательность считается подобной другой последовательности, если вероятность наименьшей суммы при сравнении первой последовательности со второй последовательностью будет меньше 1, предпочтительно меньше 0,1, более предпочтительно меньше 0,01 и наиболее предпочтительно меньше 0,001.
Гомологичная последовательность обычно отличается от соответствующей другой последовательности по меньшей мере (или не больше чем) на 2, 5, 10, 15, 20 или больше мутаций (которые представляют собой замены, делеции или вставки). Эти мутации можно подсчитывать по любому из участков, указанных выше в связи с вычислением гомологичности.
Гомологичная последовательность обычно избирательно гибридизуется с исходной последовательностью в степени, значительно превышающей фон. Избирательная гибридизация обычно выполняется в условиях средней или высокой строгости (например, 0,03 М хлорида натрия и 0,03 М цитрата натрия при температуре от 50°С до 60°С). Однако такая гибридизация может проводиться в любых подходящих условиях, известных в этой области (см. Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual), Например, если нужна высокая строгость, подходящие условия включают 0,2×SSC при 60°С. Если нужна меньшая строгость, подходящие условия включают 2×SSC при 60°С.
Лекарственные формы и составы и способы применения
Агенты изобретения могут вводиться нуждающимся в этом субъектам, как то субъектам с любыми ранами, указанными в нем. Состояние субъекта при этом может улучшиться. При лечении организма субъекта могут применяться антиконнексиновые полинуклеотиды. Они могут применяться при изготовлении медикамента для лечения любых ран, указанных в изобретении.
Антиконнексиновый полинуклеотид может находиться по существу в выделенном виде. Предусматривается, что продукт можно смешивать с такими носителями или разбавителями, которые не влияют на предназначение препарата, при этом он все-таки будет считаться практически выделенным. Продукт изобретения может находиться и в практически очищенном виде, при этом он обычно составляет 80%, 85% или 90%, в том числе, к примеру, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% полинуклеотида или сухой массы препарата.
В зависимости от предписанного способа применения фармацевтические препараты, фармацевтические композиции, комбинированные препараты и медикаменты по изобретению могут, к примеру, иметь вид растворов, суспензий, капель, аэрозолей, мазей, кремов, гелей, пены, притираний, эмульсий, лосьонов, красок, составов для продолжительного выделения или порошков, которые обычно содержат от 0,01% до 1% активных ингредиентов, от 1% до 50% активных ингредиентов, от 2% до 60% активных ингредиентов, от 2% до 70% активных ингредиентов или вплоть до 90% активных ингредиентов. Другие подходящие формы включают гели на основе Pluronic, на основе карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) и на основе гидроксипропилметилцеллюлозы (ГПМЦ). Другие полезные формы включают препараты для медленного или замедленного выделения.
Гели или желе можно получить с помощью подходящего гелеобразующего агента, в том числе желатина, трагаканта или производных целлюлозы, причем они могут включать глицерин в качестве увлажнителя, смягчающего и консерванта. Мази представляют собой полутвердые препараты, состоящие из активного ингредиента, заключенного в жировую, восковую или синтетическую основу. Примеры подходящих кремов включают эмульсии типа "вода в масле" и "масло в воде". Кремы типа "вода в масле" можно составить с помощью подходящего эмульгирующего вещества, имеющего свойства, близкие свойствам таких жирных спиртов, как цетиловый или цетостеариловый спирт, или эмульгирующего воска. Кремы типа "масло в воде" можно составить с помощью такого эмульгирующего вещества, как эмульгирующий воск цетомакрогол. Подходящие свойства включают способность модифицировать вязкость эмульсии, а также физическая и химическая стабильность в широком интервале рН. Водорастворимая или смешанная основа крема может содержать консерванты, а также может быть забуферена для поддержания приемлемого физиологического значения рН.
Можно составить пенные препараты для выделения из аэрозольного баллончика, через подходящий аппликатор, с помощью инертного газа-вытеснителя, Подходящие наполнители для получения пенообразующей основы включают пропиленгликоль, эмульгирующий воск, цетиловый спирт и глицерилстеарат. Возможные консерванты включают метилпарабен и пропилпарабен.
Предпочтительно агенты по изобретению смешиваются с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем для получения фармацевтической композиции. Подходящие носители и разбавители включают изотонические солевые растворы, к примеру, физраствор с фосфатным буфером. Подходящие разбавители и наполнители также включают, к примеру, воду, физраствор, декстрозу, глицерин и др., а также их комбинации. Кроме того, если нужно, могут присутствовать и такие вещества, как смачивающие или эмульгирующие агенты, стабилизирующие или рН-буферные вещества.
Термин "фармацевтически приемлемый носитель" относится к любым фармацевтическим носителям, которые сами по себе не вызывают образования антител, вредных для лица, принимающего композицию, и которые можно вводить без нежелательной токсичности. Подходящими носителями могут быть большие, медленно подвергающиеся метаболизму макромолекулы, как то белки, полисахариды, полимеры молочной кислоты, полимеры гликолевой кислоты, полимеры и сополимеры аминокислот.
Также могут присутствовать фармацевтически приемлемые соли, например соли минеральных кислот, как то гидрохлориды, гидробромиды, фосфаты, сульфаты и др., и соли органических кислот, как то ацетаты, пропионаты, малонаты, бензоаты и др.
Подходящие материалы носителей включают любые носители, обычно используемые в качестве основы для кремов, лосьонов, аэрозолей, пен, гелей, эмульсий, лосьонов или красок для местного применения. Примеры включают эмульгирующие вещества, инертные носители, в том числе на углеводородной основе, эмульгирующей основе, нетоксическом растворителе или водорастворимой основе. Особенно подходящие примеры включают Pluronics, ГПМЦ, КМЦ и другие ингредиенты на основе целлюлозы, ланолин, парафин, вазелиновое масло, желтый парафин или бесцветный парафин, белый воск, желтый воск, цетостеариловый спирт, цетиловый спирт, диметикон, эмульгирующий воск, изопропилмиристат, микрокристаллический воск, олеиловый спирт и стеариловый спирт.
Предпочтительно фармацевтически приемлемый носитель представляет собой гель, предпочтительно гель неионного сополимера полиоксиэтилена-полиоксипропилена, к примеру гель Pluronic, предпочтительно Pluronic-127 (BASF Corp.). Этот гель особенно предпочтителен, так как он жидкий при низких температурах, но быстро застывает при физиологических температурах, что ограничивает выделение агента местом нанесения или в непосредственной близости от него.
В состав лекарственной формы по изобретению могут входить вспомогательные вещества, как то казеин, желатин, альбумин, клей, альгинат натрия, карбоксиметилцеллюлоза, метилцеллюлоза, гидроксиэтилцеллюлоза или поливиниловый спирт.
Другие подходящие лекарственные формы включают гели на основе Pluronic, на основе карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) и на основе гидроксипропилметилцеллюлозы (ГПМЦ). Композиция может быть изготовлена для любого нужного способа применения, включая местное, капельное, парентеральное, внутримышечное, подкожное или трансдермальное применение. Другие полезные формы включают препараты для медленного или замедленного выделения.
TM
TM
Вводимая форма может содержать вещества, способствующие трансфекции. Примеры таких веществ включают катионные вещества (например, фосфат кальция и ДЭАЭ-декстран) и липофектанты (например, Lipofectam и Transfectam), а также поверхностно-активные вещества.
В одном воплощении лекарственная форма дополнительно включает поверхностно-активное вещество, способствующее проникновению полинуклеотида в клетки, либо она может содержать какое-нибудь подходящее несущее вещество. Можно включить любое подходящее нетоксическое поверхностно-активное вещество, как то DMSO. В качестве альтернативы можно включить вещество, способствующее проникновению через кожу, как то мочевину.
Эффективная дозировка для данного субъекта предпочтительно лежит в интервале доз, терапевтически эффективных по меньшей мере для 50% населения, и почти или совсем не проявляющих токсичности на этом уровне.
Эффективная дозировка каждого из антиконнексиновых полинуклеотидов, используемых в способах и композициях изобретения, может колебаться в зависимости от ряда факторов, включая то, какой именно применяется антиконнексиновый полинуклеотид, способ применения, частоту применения, какая рана подлежит лечению, тяжесть этой раны, способ нанесения, потребности подлежащей лечению субпопуляции больных или потребности индивидуального пациента, причем различия в потребностях могут быть обусловлены возрастом, полом, весом тела, спецификой раны у пациента.
Подходящая доза может составлять от 0,001 до 1 мг/кг массы тела, как то от 0,01 до 0,4 мг/кг массы тела. Однако подходящая доза может составлять и от 0,001 до 0,01 мг/кг массы тела, как то от 0,01 до 0,05 мг/кг массы тела. Подходят дозы от 1 до 100, 200, 300, 400 и 500 мкг. Как указано выше, предусматривается и многократное применение. Как правило, повторное нанесение применяется по одному разу в неделю, либо когда заживление раны приостановится или замедлится.
Другие варианты дозировки составляют от 1 нг/кг до 1 мг/кг массы тела в день для каждого из описанных в изобретении веществ. В некоторых воплощениях дозировка каждого из указанных соединений обычно составляет от 1 нг до 1 мкг на кг массы тела, от 1 нг до 0,1 мкг на кг массы тела, от 1 нг до 10 нг на кг массы тела, от 10 нг до 0,1 мкг на кг массы тела, от 0,1 мкг до 1 мкг на кг массы тела, от 20 нг до 100 нг на кг массы тела, от 0,001 мг до 100 мг на кг массы тела, от 0,01 мг до 10 мг на кг массы тела или от 0,1 мг до 1 мг на кг массы тела. В некоторых воплощениях дозировка каждого из указанных соединений обычно составляет от 0,001 мг до 0,01 мг на кг массы тела, от 0,01 мг до 0,1 мг на кг массы тела, от 0,1 мг до 1 мг на кг массы тела или около 1 мг на кг массы тела. Если используется более чем один антиконнексиновый полинуклеотид, то дозировка каждого антиконнексинового полинуклеотида не обязательно будет в том же интервале, что и других. Например, дозировка одного антиконнексинового полинуклеотида может составлять от 0,01 мг до 1 мг на кг массы тела, а дозировка другого антиконнексинового полинуклеотида может составлять от 0,1 мг до 1 мг на кг массы тела. Как указано выше, предусматривается и многократное применение. Как правило, повторное нанесение применяется по одному разу в неделю, либо когда заживление раны приостановится или замедлится.
2
2
Другие применимые дозировки составляют от 1 до 10 мкг на см площади раны. Некоторые дозировки составляют 1-2, 1-5, 2-4, 5-7 и 8-10 мкг на см площади раны.
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
Другие применимые дозы превышают 10 мкг на см площади раны, включая 15 мкг на смплощади раны, 20 мкг на см площади раны, 25 мкг на см площади раны, 30 мкг на смплощади раны, 35 мкг на см площади раны, 40 мкг на см площади раны, 50 мкг на см площади раны и 100 мкг на см площади раны. Другие применимые дозы составляют 150 мкг на см площади раны, 200 мкг на см площади раны, 250 мкг на см площади раны или 500 мкг на см площади раны. Как указано выше, предусматривается и многократное применение. Как правило, повторное нанесение применяется по одному разу в неделю, либо когда заживление раны приостановится или замедлится.
Например, в некоторых воплощениях композицию антиконнексинового полинуклеотида можно наносить на место обработки и/или в непосредственной близости от него в конечной концентрации от 0,01 мкМ или 0,05 мкМ до 200 мкМ. Предпочтительно композиция антисмыслового полинуклеотида наносится в конечной концентрации от 0,05 мкМ до 100 мкМ, более предпочтительно от 1,0 мкМ до 50 мкМ, еще более предпочтительно от 5-10 мкМ до 30-50 мкМ. Кроме того, композиция антиконнексинового полинуклеотида наносится в конечной концентрации от 8 мкМ до 20 мкМ или же от 10 мкМ до 20 мкМ либо от 10 до 15 мкМ. В некоторых других воплощениях антиконнексиновый полинуклеотид наносится в конечной концентрации около 10 мкМ. В еще одном воплощении композиция антиконнексинового полинуклеотида наносится в конечной концентрации 1-15 мкМ. Уровни дозы антиконнексиновых полинуклеотидов включают, к примеру, 0,1-1, 1-2, 2-3, 3-4 или 4-5 мкг, от 5 до 10 мкг, от 10 до 15 мкг, от 15 до 20 мкг, от 20 до 30 мкг, от 30 до 40 мкг, от 40 до 50 мкг, от 50 до 75 мкг, от 75 до 100 мкг, от 100 до 250 мкг и от 250 до 500 мкг. Также предусмотрены уровни дозы от 0,5 до 1,0 мг или больше, как указано выше. Объем дозы зависит от размера подлежащего лечению места и может составлять, к примеру, от 25-100 мкл до 100-200 мкл, от 200-500 мкл до 500-1000 мкл и больше для больших по размерам участков. Как указано выше, предусматривается и многократное применение. Как правило, повторное нанесение применяется по одному разу в неделю, либо когда заживление раны приостановится или замедлится.
Обычно антиконнексиновые полинуклеотиды применяются в количестве, достаточном для подавления экспрессии белка коннексина или модуляции образования щелевых контактов по меньшей мере на 0,5-1 час, по меньшей мере на 1-2 часа, по меньшей мере на 2-4 часа, по меньшей мере на 4-6 часов, по меньшей мере на 6-8 часов, по меньшей мере на 8-10 часов, по меньшей мере на 12 часов или по меньшей мере на 24 часа после применения.
Дозировка каждого из антиконнексиновых полинуклеотидов в композициях и способах настоящего изобретения может быть определена и в плане концентрации композиции относительно размера, длины, глубины, площади или объема того участка, на который она будет нанесена. Например, в некоторых местных и других применениях, например при закапывании, дозировка фармацевтических композиций может рассчитываться в единицах массы (например, мкг) или концентрации фармацевтической композиции (например, мкг/мкл) на длину, глубину, площадь или объем обрабатываемого участка.
Начальная и все последующие вводимые дозы зависят от факторов, указанных выше. В зависимости от олигонуклеотида дозировка и способ применения будут варьировать, а дозировка также будет зависеть от выбранного способа применения, к примеру местного или местного применения.
Дозы можно вводить целиком или дробными дозами. Дозы можно вводить один раз или многократно.
Один или несколько антиконнексиновых полинуклеотидов можно вводить одним и тем же или разными способами. Различные агенты по изобретению можно вводить по отдельности в разное время курса терапии либо одновременно в раздельных или единых комбинированных формах.
Предпочтительно один или несколько антиконнексиновых полинуклеотидов, применимых для заживления ран, вводятся топическим способом (периферически или прямо на место), включая местное применение с помощью твердых носителей (как то повязок и твердых матриксов) и лекарственных форм (как то гелей, смесей, суспензий и мазей). В одном воплощении твердый носитель включает биосовместимую мембрану или вносится в место обработки. В другом воплощении твердый носитель включает перевязочный материал или матрикс. В одном воплощении изобретения композиция твердого носителя может представлять собой композицию твердого носителя для медленного выделения, в которой один или несколько антиконнексиновых полинуклеотидов, применимых для заживления ран, диспергированы в твердом матриксе для медленного выделения, как то матриксе из альгината, коллагена или синтетического биоразрушимого полимера. Предпочтительно композиция твердого носителя стерильна или с низким содержанием биоорганизмов. В одном воплощении может применяться промывочный раствор, содержащий один или несколько антиконнексиновых полинуклеотидов.
Введение одного или нескольких антиконнексиновых полинуклеотидов может происходить в течение какого-то периода времени, в некоторых случаях в течение 0,5 ч, 1-2 ч, 2-4 ч, 4-6 ч, 6-8 или 24 часов или больше, что дает определенное преимущество при более тяжелых ранах. В некоторых случаях разрушение клеток может распространяться из места обработки на окружающие клетки. Такое разрушение может происходить в течение 24 часов после исходной обработки и опосредовано межклеточной коммуникацией через щелевые контакты. Введение антиконнексиновых полинуклеотидов будет модулировать коммуникацию между клетками и минимизировать разрушение или повреждение других клеток или последствия повреждения.
Поскольку продолжительность введения будет зависеть и от места, в котором должна иметь место понижающая регуляция, и от требуемого терапевтического эффекта, то предусматривается непрерывное введение или замедленное выделение в течение 0,5 ч, 1-2 ч, 2-4 ч, 4-6 ч, 6-8 или 24 часов и больше. В соответствии с настоящим изобретением это может осуществляться включением антиконнексиновых полинуклеотидов в лекарственную форму вместе с фармацевтически приемлемым носителем или наполнителем, особенно в виде формы для непрерывного введения или замедленного выделения.
Как уже отмечалось, один или несколько агентов изобретения можно применять до, во время, сразу же после образования раны, к примеру либо в течение 180 или больше, 120, 90, 60 или 30 дней после образования раны, к примеру.
Способы применения и дозировки, описанные в изобретении, служат только в качестве рекомендаций, поскольку оптимальный способ применения и дозировку должен определять врач-специалист для конкретного пациента и раны.
В любом из способов лечения субъектов, страдающих или с подозрением на заболевания и/или раны, указанные или описанные в изобретении, можно использовать любые дозировки, лекарственные формы, составы и/или композиции, описанные в изобретении.
Перевязочные материалы и матриксы
2
4
2
4
В одном аспекте предусмотрены один или несколько антиконнексиновых полинуклеотидов в виде перевязочного материала или матрикса. В некоторых воплощениях предусмотрены один или несколько агентов изобретения в виде жидкой, полутвердой или твердой композиции непосредственно для нанесения либо композиция наносится на поверхность или заключается в твердый контактирующий слой типа перевязочной марли или матрикса. Перевязочная композиция может быть представлена, к примеру, в виде жидкости или геля. Один или несколько антиконнексиновых полинуклеотидов могут быть представлены в комбинации со стандартными фармацевтическими наполнителями для местного применения. Подходящие носители включают: гели Pluronic, гели Polaxamer, гидрогели, содержащие производные целлюлозы, включая гидроксиэтилцеллюлозу, гидроксиметилцеллюлозу, карбоксиметилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу и их смеси; а также гидрогели, содержащие полиакриловую кислоту (Carbopol). Подходящие носители также включают кремы/мази, используемые для топических фармацевтических препаратов, например кремы на основе эмульгатора цетомакрогола. Вышеприведенные носители могут включать альгинат (в качестве загустителя или стимулятора), консерванты типа бензилового спирта, буферы для контроля рН типа NaHPO/NaHPO, вещества для поддержания осмолярности типа хлорида натрия и стабилизаторы типа ЭДТА.
В одном воплощении один или несколько антиконнексиновых полинуклеотидов, например антисмысловой полинуклеотид к коннексину 43, предпочтительно антисмысловой олигодезоксинуклеотид к коннексину 43, наносятся на природный или синтетический матрикс.
Подходящие перевязочные материалы или матриксы могут включать, к примеру, нижеследующие с одним или несколькими антиконнексиновыми полинуклеотидами. Предпочтительным является антиконнексиновый олигонуклеотид против коннексина 43, например антисмысловой олигонуклеотид против коннексина 43:
1) влагопоглощающие: подходящие влагопоглощающие перевязочные материалы могут включать, к примеру, влагопоглощающие материалы, которые могут представлять собой, к примеру, полулипкий или нелипкий слой в сочетании с сильно поглощающими слоями волокон, таких, к примеру, как целлюлоза, хлопок или вискоза. С другой стороны, влагопоглощающие материалы могут использоваться в качестве первичного или вторичного перевязочного материала.
2) альгинатные: подходящие альгинатные перевязочные материалы включают, к примеру, материалы, представляющие собой нетканые, неприлипающие тампоны и полоски, состоящие из природных полисахаридных волокон, либо ксерогель, полученный из морских водорослей. Подходящие альгинатные материалы могут, к примеру, образовывать влажный гель через процесс ионообмена при контакте с экссудатом. В некоторых воплощениях альгинатные перевязочные материалы делают мягкими и податливыми, они легко укладываются, вставляются или наносятся на неровные поверхности. В некоторых воплощениях альгинатные материалы могут применяться вместе со вторым перевязочным материалом.
3) антимикробные: подходящие антимикробные перевязочные материалы могут включать, к примеру, материалы, способствующие выделению биоактивных веществ, таких, к примеру, как серебро и полигексаметиленбигуанид (РНМВ), для поддержания эффективности против инфекций, если это нужно или желательно. В некоторых воплощениях подходящие антимикробные перевязочные материалы могут представлять собой, к примеру, тампоны, импрегнированные тканые бинты, пленочные материалы, влагопоглощающие изделия, компрессы, нейлоновые материи, неприлипающие защитные материалы или их комбинации.
4) биологические и биосинтетические: подходящие биологические или биосинтетические перевязочные материалы могут включать, к примеру, гели, растворы или полупроницаемые пластинки, полученные из природного источника. В некоторых воплощениях гель или раствор наносится на место обработки и закрывается повязкой для защитного барьера. В другом воплощении ставится пластинка in situ, которая может служить мембраной, оставаясь на месте после однократного нанесения.
5) коллагеновые: подходящие коллагеновые перевязочные материалы могут включать, к примеру, гели, тампоны, частицы, пасты, порошки, пластинки или растворы, полученные, к примеру, из быка, свиньи или птицы либо иных природных источников или доноров. В некоторых воплощениях коллагеновый материал может взаимодействовать с экссудатом из места обработки с образованием геля. В некоторых воплощениях коллагеновый материал может применяться в сочетании со вторым перевязочным материалом.
6) составные: подходящие составные перевязочные материалы могут включать, к примеру, материалы, в которых физически разные компоненты объединены в одно изделие, выполняющее множественные функции, такие, к примеру, как барьер для бактерий, влагопоглощение и прилипание. В некоторых воплощениях материалы состоят, к примеру, из нескольких слоев и включают полулипкий или нелипкий тампон. В некоторых воплощениях составные материалы могут включать, к примеру, липкую кайму из нетканой материи или прозрачной пленки.
7) контактные слоистые: подходящие контактные слоистые перевязочные материалы могут включать, к примеру, неприлипающие пластыри, накладываемые на поверхность для защиты ткани, к примеру, от прямого контакта с другими агентами или материалами, наложенными на место обработки. В некоторых воплощениях контактные слоистые материалы можно использовать так, чтобы они соответствовали форме поверхности места обработки и были пористыми, пропуская экссудат для поглощения его вышележащим вторым перевязочным материалом.
8) эластичные бинты: подходящие эластичные бинты могут включать, к примеру, перевязочные материалы, которые растягиваются и соответствуют форме тела. В некоторых воплощениях в состав материи может входить, к примеру, хлопок, полиэфирное волокно, вискоза или нейлон. В некоторых других воплощениях эластичный бинт может, к примеру, обеспечивать влагопоглощение в качестве второго слоя или перевязочного материала, удерживать покрытие на месте, создавать давление или предохранять место обработки.
9) пеноматериалы: подходящие пеноматериалы могут включать, к примеру, пластины и другие формы вспененных растворов полимеров (включая полиуретан) с мелкими открытыми ячейками, способными удерживать жидкость. Подходящие пеноматериалы могут быть, к примеру, импрегнированные или слоистые в сочетании с другими материалами. В некоторых воплощениях поглощающую способность можно регулировать на основе толщины и состава пеноматериала. В некоторых других воплощениях поверхность, контактирующая с местом обработки, может быть нелипкой для легкости удаления. В следующем воплощении пеноматериал может использоваться в сочетании с липкой каймой и/или прозрачным пленочным покрытием, служащим в качестве барьера против инфекции.
10) марлевые и нетканые: подходящие марлевые и нетканые перевязочные материалы могут включать, к примеру, сухие тканые или нетканые тампоны и накладки с различной степенью влагопоглощения. Как правило, в состав материи может входить, к примеру, хлопок, полиэфирное волокно или вискоза. В некоторых воплощениях марлевые и нетканые перевязочные материалы могут быть стерильными или нестерильными без упаковки и с липкой каймой или без нее. Как правило, марлевые и нетканые перевязочные материалы могут применяться для очистки, уплотнения и закрытия различных мест обработки ран.
11) гидроколлоидные: подходящие гидроколлоидные перевязочные материалы могут включать, к примеру, облатки, порошки или пасты, состоящие из желатина, пектина или карбоксиметилцеллюлозы. В некоторых воплощениях облатки являются липучими и могут быть с липкой каймой или без нее и в широком диапазоне форм и размеров. Как правило, гидроколлоидные материалы применяются там, где требуется облегание контура. В некоторых воплощениях порошки и пасты гидроколлоидов могут использоваться в сочетании со вторым перевязочным материалом.
12) гидрогелевые (аморфные): подходящие аморфные гидрогелевые перевязочные материалы могут включать, к примеру, бесформенные композиции из воды, полимеров и других ингредиентов, предназначенные для выделения влаги и поддержания влажной среды для заживления и/или регидратации места обработки. В некоторых воплощениях гидрогели могут использоваться в сочетании со вторым материалом-оболочкой.
13) гидрогелевые (импрегнированные): подходящие импрегнированные гидрогелевые перевязочные материалы могут включать, к примеру, марлевые и нетканые тампоны, жгуты и ленты, насыщенные аморфным гидрогелем. Аморфные гидрогели могут включать, к примеру, бесформенные композиции из воды, полимеров и других ингредиентов, предназначенные для выделения влаги на сухие места обработки и поддержания влажной среды для заживления.
14) гидрогелевые (пластинчатые): подходящие пластинчатые гидрогели могут включать, к примеру, трехмерные сети сшитых гидрофильных полимеров, которые нерастворимы в воде и набухают при взаимодействии с водными растворами. Типичные гидрогели являются сильно податливыми и проникающими и могут поглощать различное количество дренируемой жидкости в зависимости от их состава. В некоторых воплощениях гидрогель не прилипает к месту обработки или подвергнут обработке для легкости удаления.
15) импрегнированные: подходящие импрегнированные перевязочные материалы могут включать, к примеру, марлевые и нетканые тампоны, жгуты и ленты, насыщенные раствором, эмульсией, маслом, гелем или любым другим носителем фармацевтически активного соединения или агента, включая, к примеру, физраствор, масло, соли цинка, вазелин, ксероформ и азокраситель, а также соединения, описанные в изобретении.
16) пластины из силиконового геля: подходящие пластинчатые перевязочные материалы из силиконового геля могут включать, к примеру, мягкие оболочки, состоящие из сшитого полимера, армированного или соединенного с сеткой или материей.
17) растворы: подходящие жидкие перевязочные материалы могут включать, к примеру, смеси из нескольких белковых материалов и других элементов, встречающихся во внеклеточном матриксе. В некоторых воплощениях подходящие растворы можно наносить на место обработки после очищения раны, а затем закрывать влагопоглощающей повязкой или неприлипающей накладкой.
18) прозрачные пленки: подходящие прозрачные пленочные перевязочные материалы могут включать полимерные мембраны различной толщины, покрытые с одной стороны клеем. В некоторых воплощениях прозрачные пленки непроницаемы для жидкости, воды и бактерий, но проницаемы для выделяющегося пара и атмосферных газов. В некоторых воплощениях прозрачность позволяет осматривать место обработки.
19) заполнители: подходящие заполняющие перевязочные материалы могут включать, к примеру, шарики, кремы, пеноматериалы, гели, мази, прокладки, пасты, подушечки, полоски или другие формы. В некоторых воплощениях заполнители не прилипают и могут содержать противомикробное средство для продолжительного высвобождения. Типичные заполнители могут использоваться для поддержания влажной среды, удаления экссудата и для обработки, к примеру, неглубоких и глубоких ран, инфицированных ран, дренируемых ран и глубоких ран, требующих тампонирования.
Итак, в соответствии с изобретением предусмотрены лекарственные формы, при помощи которых можно подавлять межклеточную коммуникацию кратковременно и в заданном месте для лечения ран, не заживающих с ожидаемой скоростью. Поэтому эти формы имеют применение в способах лечения.
Лечение ран
При повреждении тканей (особенно при медленно заживающих и хронических ранах) лекарственные формы изобретения оказались эффективными, способствуя процессу заживления ран, уменьшая воспаления и сводя к минимуму образование рубцовой ткани. Поэтому эти формы оказывают явную пользу при лечении ран, не заживающих с ожидаемой скоростью, возникших в результате внешней травмы или болезни (как то диабетических язв) либо заболевания (как то венозных язв, артериальных язв и васкулитных язв) или физических процессов (как то пролежней).
В одном аспекте изобретение касается способа усиления или улучшения заживления ран у субъектов, страдающих хроническими ранами, медленно заживающими ранами, неполностью заживающими ранами или иными ранами, не заживающими с ожидаемой скоростью, который включает введение терапевтически эффективного количества одного или нескольких антиконнексиновых полинуклеотидов. В некоторых воплощениях введение одного или нескольких антиконнексиновых полинуклеотидов эффективно уменьшает отложение грануляционной ткани, усиливает миграцию клеток для ускорения закрытия и заживления ран, способствует росту эпителия или любой их комбинации.
В одном аспекте изобретение касается способа усиления или улучшения заживления ран у субъектов, который включает введение одного или нескольких антиконнексиновых полинуклеотидов в количестве, эффективно регулирующем деление и рост базальных клеток эпителия в хронических ранах, медленно заживающих ранах, неполностью заживающих ранах или иных ранах, не заживающих с ожидаемой скоростью. В одном воплощении антиконнексиновый полинуклеотид представляет собой антисмысловой полинуклеотид к коннексину, эффективно регулирующий деление и рост базальных клеток эпителия. В одном воплощении антисмысловой полинуклеотид к коннексину представляет собой антисмысловой полинуклеотид к коннексину 26, антисмысловой полинуклеотид к коннексину 43 или их смесь.
В одном аспекте изобретение касается способа усиления или улучшения заживления ран, который включает введение одного или нескольких антиконнексиновых полинуклеотидов в количестве, эффективно регулирующем секрецию кератина во внешнем слое в хронических ранах, медленно заживающих ранах, неполностью заживающих ранах или иных ранах, не заживающих с ожидаемой скоростью. В одном воплощении антиконнексиновый полинуклеотид представляет собой антисмысловой полинуклеотид к коннексину, эффективно регулирующий секрецию кератина во внешнем слое. В одном воплощении антисмысловой полинуклеотид к коннексину представляет собой антисмысловой полинуклеотид к коннексину 26, антисмысловой полинуклеотид к коннексину 43 или их смесь.
В одном аспекте изобретение касается способа уменьшения, предотвращения или облегчения повреждения тканей у субъектов, страдающих хроническими ранами, медленно заживающими ранами, неполностью заживающими ранами или иными ранами, не заживающими с ожидаемой скоростью, который включает введение одного или нескольких антиконнексиновых полинуклеотидов.
В одном аспекте изобретение касается продолжительного введения одного или нескольких антиконнексиновых полинуклеотидов. В одном воплощении антиконнексиновые полинуклеотиды вводятся на протяжении по меньшей мере 1-24 часов, по меньшей мере 0,5 ч, по меньшей мере 1 ч, по меньшей мере 2 ч, по меньшей мере 3 ч, по меньшей мере 4 ч, по меньшей мере 5 ч, по меньшей мере 6 ч, по меньшей мере 7 ч, по меньшей мере 8 ч, по меньшей мере 9 ч, по меньшей мере 10 ч, по меньшей мере 11 ч, по меньшей мере 12 ч или по меньшей мере 24 ч. В одном воплощении экспрессия коннексина подавляется на продолжительное время. Предпочтительно на продолжительное время подавляется экспрессия коннексина 43. Обычно экспрессия коннексина 43 подавляется по меньшей мере на 0,5,1, 2, 4, 6, 8, 10, 12 или 24 часа. Полное восстановление коннексина обычно происходит по меньшей мере за 48-72 часа после подавления экспрессии. Подходящими субъектами являются больные диабетом или иные субъекты с ранами, не заживающими с ожидаемой скоростью.
В одном аспекте настоящего изобретения предусмотрен способ лечения субъектов с хроническими ранами, медленно заживающими ранами, неполностью заживающими ранами или иными ранами, не заживающими с ожидаемой скоростью, который включает продолжительное введение эффективного количества одного или нескольких антиконнексиновых полинуклеотидов. В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрен способ усиления или улучшения заживления ран у субъектов, который включает продолжительное введение одного или нескольких антиконнексиновых полинуклеотидов в хронические раны, медленно заживающие раны, неполностью заживающие раны или иные раны, не заживающие с ожидаемой скоростью.
В соответствии со следующим аспектом настоящего изобретения предусмотрен способ усиления или улучшения заживления ран у субъектов с хроническими ранами, медленно заживающими ранами, неполностью заживающими ранами или иными ранами, не заживающими с ожидаемой скоростью, который включает продолжительное введение одного или нескольких антиконнексиновых полинуклеотидов в область раны в количестве, эффективно повышающем скорость реэпителизации в области раны. В одном воплощении способ включает продолжительное введение антисмыслового полинуклеотида к коннексину 43 и/или антисмыслового полинуклеотида к коннексину 31.1. В одном воплощении композиция или композиции вводятся в виде лекарственной формы для продолжительного выделения. В другом воплощении композиция или композиции вводятся в течение продолжительного времени. Обычно композиция эффективно снижает уровень или экспрессию коннексина 43 и/или 31.1 по меньшей мере на 24 часа. Субъекты, которых можно лечить, включают больных диабетом или иных субъектов с ранами, не заживающими с ожидаемой скоростью.
В следующем аспекте настоящего изобретения предусмотрен способ усиления или улучшения заживления ран у субъектов с хроническими ранами, медленно заживающими ранами, неполностью заживающими ранами или иными ранами, не заживающими с ожидаемой скоростью, который включает продолжительное введение одного или нескольких антиконнексиновых полинуклеотидов в область раны в количестве, эффективно регулирующем деление и рост базальных клеток эпителия и/или эффективно регулирующем секрецию кератина во внешнем слое. В одном воплощении композиция включает антисмысловой полинуклеотид к коннексину, эффективно регулирующий деление и рост базальных клеток эпителия, предпочтительно антисмысловой полинуклеотид к коннексину 26, антисмысловой полинуклеотид к коннексину 43 или их смесь. В одном воплощении композиция включает антисмысловой полинуклеотид к коннексину, эффективно регулирующий кератинизацию внешнего слоя, предпочтительно антисмысловой полинуклеотид к коннексину 31.1. В одном воплощении композиция или композиции вводятся в виде лекарственной формы для продолжительного выделения. В другом воплощении композиция или композиции вводятся в течение продолжительного времени. Обычно композиция эффективно снижает уровень или экспрессию коннексина 43, 26 и/или 31.1 по меньшей мере на 24 часа. Субъекты, которых можно лечить, включают больных диабетом.
В одном аспекте изобретение касается способа лечения или профилактики хронических ран, медленно заживающих ран, неполностью заживающих ран или иных ран, не заживающих с ожидаемой скоростью, который включает введение нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества антиконнексинового полинуклеотида прямо на рану или ткань, связанную с этой раной. В одном воплощении хроническая рана представляет собой хроническую кожную рану, а композиция настоящего изобретения наносится на кожу или ткань, связанную с кожей субъекта, на эффективный период времени. Обычно композиция эффективно снижает уровень коннексина 43 либо блокирует или уменьшает открытие полуканалов коннексина 43 по меньшей мере на 0,5 ч, по меньшей мере 1 ч, на 1-2 ч, на 2-4 ч, на 4-6 ч, на 4-8 ч, на 12 ч, на 18 ч или на 24 ч. Хронические кожные раны, подходящие для лечения, можно к примеру, выбрать из группы, состоящей из пролежней, диабетических язв, венозных язв, артериальных язв, васкулитных язв и смешанных язв. Хроническая рана может представлять собой артериальную язву, включающую изъязвления, вызванные полной или частичной закупоркой артерий. Хроническая рана может представлять собой венозную гемостатическую язву, включающую изъязвления, вызванные нарушением функции венозных клапанов и связанными с этим сосудистыми заболеваниями. Хроническая рана может представлять собой травматическую язву. Субъекты с другими язвами, включая венозные и другие язвы, описаны в изобретении и известны в этой области.
Композиции
Настоящее изобретение касается фармацевтических композиций, лекарственных форм и способов их изготовления и применения, причем композиции включают терапевтически эффективное количество антиконнексиновых полинуклеотидов, включая, к примеру, антисмысловые полинуклеотиды к коннексинам. Композиции применимы для усиления или ускорения заживления ран, не заживающих с ожидаемой скоростью, включая плохо заживающие раны или раны, не поддающиеся стандартным способам лечения ран или усиления заживления ран.
В одной предпочтительной форме композиция содержит один или несколько антиконнексиновых полинуклеотидов, например антисмысловой полинуклеотид к мРНК только одного белка коннексина. Наиболее предпочтительно этим белком коннексина является коннексин 43.
С другой стороны, композиции могут содержать полинуклеотиды к более чем одному белку коннексина. Предпочтительно одним из белков коннексинов, против которых направлены полинуклеотиды, является коннексин 43. Другие белки коннексинов, против которых направлены полинуклеотиды, могут включать, к примеру, коннексины 26, 30, 31.1, 32 и 37. Подходящие типичные полинуклеотиды (и ODN), направленные против различных коннексинов, приведены в таблице 1.
Многие аспекты изобретения описаны в отношении олигодезоксинуклеотидов. Однако следует понимать, что в этих аспектах можно использовать и другие подходящие полинуклеотиды (как то полинуклеотиды РНК). Другие антиконнексиновые олигонуклеотиды представляют собой олигонуклеотиды РНКи и миРНК.
Соответственно, в одном аспекте изобретения предусмотрены композиции, предназначенные для терапевтического лечения, которые включают по меньшей мере один антиконнексиновый полинуклеотид, предпочтительно полинуклеотид против коннексина 43. В предпочтительном воплощении композиция дополнительно включает фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель.
Наборы, медикаменты и готовые изделия
Необязательно один или несколько антиконнексиновых полинуклеотидов могут использоваться и при изготовлении медикаментов. В одном воплощении медикамент включает терапевтически эффективное количество антиконнексинового полинуклеотида, предпочтительно полинуклеотида против коннексина 43, и фармацевтически приемлемый носитель.
В одном аспекте изобретения предусмотрены наборы, включающие одну или несколько описанных композиций или лекарственных форм. Например, набор может включать композицию, содержащую эффективное количество одного или нескольких антисмысловых полинуклеотидов к коннексину 43.
Предусмотрены и готовые изделия, включающие сосуд, содержащий композицию или лекарственную форму, описанную в настоящем изобретении, и инструкцию по применению для лечения субъектов. Например, готовое изделие, включающее сосуд, содержащий антисмысловой полинуклеотид к коннексину и инструкцию по применению для лечения субъектов, страдающих хроническими, медленно заживающими или неполностью заживающими ранами либо иными ранами, не заживающими с ожидаемой скоростью.
В другом аспекте изобретение включает готовые изделия, включающие сосуд, содержащий терапевтически эффективное количество одного или нескольких антиконнексиновых полинуклеотидов и инструкцию по применению, включая применение для лечения субъектов с хроническими ранами, медленно заживающими или неполностью заживающими ранами либо иными ранами, не заживающими с ожидаемой скоростью. В следующем аспекте изобретение включает готовые изделия, включающие сосуд, содержащий терапевтически эффективное количество одного или нескольких антиконнексиновых полинуклеотидов и инструкцию по применению, включая применение для лечения субъектов, страдающих или с подозрением на заболевания и/или состояния, характеризующиеся полностью или частично хроническими ранами, медленно или неполностью заживающими ранами либо иными ранами, не заживающими с ожидаемой скоростью.
Как уже отмечалось, заживление ран оказывается медленным при диабете, что часто вызывает инфекционные или хронические раны, которые могут привести к ампутации. Важнейшую роль в заживления ран, как сообщалось, играет межклеточная коммуникация через щелевые контакты с белком коннексина 43 и динамическая регуляция экспрессии коннексина 43. В таких нормальных тканях, как кожа, в первые 24 часа после образования раны коннексин 43 в норме подвергается понижающей, а коннексин 26 - повышающей регуляции в кератиноцитах по краям раны по мере того, как они принимают мигрирующий фенотип. Однако авторы обнаружили, что в диабетической ткани вообще и коже в частности коннексин 43 подвергается повышающей регуляции сразу после образования раны.
Заживление ран у диабетических крыс использовалось в качестве одной из моделей хронических ран. Пример 1 свидетельствует, что применение антиконнексинового олигонуклеотида улучшает нарушение заживления ран у диабетических крыс. В примере 1 при остром, индуцированном стрептозотоцином диабете у крыс изменяется экспрессия коннексинов в коже, при этом в эпидермисе снижается белок коннексина 43 и коннексина 26 и ухудшается коммуникация, а в дерме возрастает белок коннексина 43 и улучшается коммуникация. Пример 1 свидетельствует, что диабет вызывает динамические изменения коннексинов в связи с заживлением ран. За 24 часа коннексин 43 возрастал в утолщенной луковице из кератиноцитов на краю раны (а не падал, как в контроле, при котором образовался тонкий нарост мигрирующих клеток). Падение коннексина 43 замедлялось до 48 часов, когда уже начиналась реэпителизация. Хотя при диабете коннексин 26 возрастал, как обычно, его распределение по краям раны было аномальным, становясь более широким. Пример 1 также показывает связь между аномальной динамикой экспрессии коннексина 43 и замедленной реэпителизацией, что подтверждается при нанесении антисмыслового геля против коннексина 43 на диабетические раны в сравнении с нанесением геля с соответствующим смысловым олигодезоксинуклеотидом. Такая обработка предотвращает аномальное возрастание коннексина 43 и вдвое повышает скорость реэпителизации до уровня контроля (без диабета) и выше.
Результаты, приведенные в примере 1, подтверждают концепцию о том, что вызванные диабетом изменения динамики экспрессии коннексинов способствуют замедлению заживления ран, и о том, что воздействие на экспрессию коннексина 43 имеет терапевтическое значение как средство усиления заживления диабетических и других хронических ран.
Пример 2 свидетельствует об успешном применении олигонуклеотида против коннексина 43 для усиления заживления незаживающей кожной язвы у человека.
Пример 3 свидетельствует об успешном применении олигонуклеотида против коннексина 43 для усиления заживления незаживающей венозной язвы у человека.
Далее различные аспекты изобретения будут описаны с привлечением следующих примеров, которые следует понимать как представленные только для иллюстрации, а не для наложения ограничений на рамки изобретения.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
Приготовили олигодезоксинуклеотиды со следующими последовательностями: GTA АТТ GCG GCA GGA GGA АТТ GTT ТСТ СТС (коннексин 43) (SEQ ID NO:2) GAC AGA AAC AAT TCC TCC TGC CGC АТТ TAC (смысловой контроль) (SEQ ID NO:7)
Диабет у взрослых крыс Sprague-Dawley (350-400 г) вызывали путем однократного внутрибрюшинного введения сирептозотоцина 65 мг/кг в цитратном буфере (Shorten HR et al. (2003) Diabetes 52: 157-64) (n=6 при диабете и 6 в контроле). Большинство опытов по заживлению диабетических ран проводили через 2 недели после индукции диабета и тот же момент времени использовали для данного опыта по заживлению ран. Однако экспрессию коннексина в коже диабетических крыс также изучали через 8 недель (n=6 при диабете и 6 в контроле) для подтверждения того, что изменения, выявленные через 2 недели, оставались такими же. Вырезали кусок кожи со спины, замораживали и делали срезы, проводили иммуноокрашивание на коннексины, делали снимки методом конфокальной микроскопии и измеряли окраску, как в работе Saitongdee et al. (2000) Cardiovascular Res. 47, 108-115.
Крыс анестезировали галотаном и брили им спину. Наносили две пары глубоких эксцизионных ран размером 5×5 мм, на одну рану наносили гель с 10 мкМ антисмысловым олигодезоксинуклеотидом к коннексину 43 в Pluronic F-127, на другую - контрольный (смысловой) гель (Qiu С.et al. (2003) Cell Biol. Int. 27: 525-541). Через 1, 2, 5, 10 и 15 дней после нанесения ран извлекали ткани и делали срезы для иммуногистохимии на коннексин или окрашивание Н&Е (Id.). Динамика изменений в экспрессии коннексина коррелировала с главными событиями в процессе заживления ран. N=6 при диабете и 6 в контроле на одну временную точку.
Межклеточную коммуникацию оценивали путем нанесения 4% раствора Lucifer Yellow CH (Sigma) в тампоне из Gel Foam на свежий глубокий надрез кожи. Краситель оставляли впитываться на 5 мин, а затем убирали тампон и фиксировали ткань. В качестве контроля использовали ПТС-декстран с массой 10 кДа, который проникает в поврежденные клетки, но не проходит через щелевые контакты. Ткани замораживали, готовили срезы и делали снимки методом конфокальной микроскопии на приборе Leica SP2UV (Leica, Milton Kaynes, UK; n=4 при диабете и 4 в контроле).
2
Перенос красителя и иммуноокрашивание на коннексины исследовали с помощью конфокального микроскопа. Заранее устанавливали оптимальное усиление и контрастность и сохраняли при получении снимков. Делали серию оптических изображений одиночных срезов для создания фотомонтажа кожи из надреза. Цифровые изображения 8-битовые анализировали с помощью программы Image-J (NIH). Для оценки переноса красителя отбирали представляющий интерес участок в 1500×30 пикселей из края надреза в среднем слое дермы и создавали граф интенсивности изображения по всему участку. В качестве точки, до которой дошел Lucifer Yellow, произвольно выбрали падение уровня интенсивности серого цвета ниже 50 единиц. Аналогичным образом в эпидермисе отмечали расстояние от надреза до того места, где сигнал от Lucifer Yellow падал ниже 50. Анализировали как минимум 3 изображения от каждого животного. Для сравнения уровней белка коннексина отбирали 6 оптических изображений одиночных срезов дермы или эпидермиса из разных срезов по каждой ране. Все параметры мощности лазера, точечной диафрагмы, усиления/контраста и объектива держали постоянными по группам контроля и диабета. Экспрессию коннексина измеряли, как в работе Saitongdee et al. (2000), supra с помощью программы Image-J (NIH). Устанавливали порог для обнаружения бляшек щелевых контактов с минимальным фоном, который держали постоянным для всех изображений. Отмечали количество и размер бляшек коннексина для каждого изображения и выражали в пересчете на 100 мкм эпидермиса или 10000 мкм дермы. Такой подход оказался намного более точным, чем westem-гибридизация, так как он дает информацию об экспрессии белка на клеточном уровне. Westem-гибридизация не смогла бы отличить клетки дермы от клеток эпидермиса или обнаружить эффект близости к краю раны. Используя этот подход, можно было измерить уровень коннексина в кератиноцитах в зоне на краю раны (WE) и в зоне на расстоянии 500 мкм (AD) через один или два дня после нанесения раны. Через 5 дней после нанесения раны появлялась и дополнительная зона переднего края (LE) нарастающим эпидермисом. Снимки окрашивания Н&Е делали с помощью микроскопа Leica DMLFS с цифровой камерой DC300F. Измерение скорости реэпителизации было подробно описано ранее (Qiu С.et al. (2003), supra). Все числовые отличия между разными обработками проверяли на значимость по обобщенному парному критерию Уилкоксона со знаком, встроенному в Statview 5.0.1.
На фиг.1А и 1В представлено окрашивание на коннексины 43 и 26 в коже нормальных и STZ-диабетических крыс через 2 недели (фиг.1А) и 8 недель (фиг.1В) после индукции диабета. На гистограммах представлено количество бляшек в эпидермисе и дерме. Окрашивание на коннексин 43 и коннексин 26 значительно снижается в диабетическом эпидермисе, тогда как окрашивание на коннексин 43 повышается в дерме уже через 2 недели после индукции диабета и больше не меняется через 8 недель. На фиг.1C представлены снимки типичного иммуноокрашивания на коннексин 43 и коннексин 26 в коже в контроле (С) и при диабете (D) через 8 недель, а стрелками обозначена граница между эпидермисом и дермой. Метка масштаба: 25 мкм. На фиг.1D представлено измерение расстояний, которые проникающий через щелевые контакты краситель Lucifer Yellow проходит за 5 минут в эпидермисе и дерме контрольных и диабетических крыс. Перенос красителя значительно снижался в диабетическом эпидермисе, но значительно возрастал в диабетической дерме.
Как правило, точечное иммуноокрашивание на коннексин 43 обнаруживалось в базальном слое эпидермиса и в фибробластах дермы, волосяных сумках, кровеносных сосудах и придатках (фиг.1A-1D). Однако в диабетической коже окрашивание на коннексин 43 значительно снижалось в эпидермисе как в отношении размера, так и числа бляшек щелевых контактов (фиг.1А). Окрашивание на коннексин 26 в верхних слоях эпидермиса также значительно снижалось при диабете (фиг.1А). Однако это не было глобальным падением коннексинов в ответ на диабет, так как в фибробластах дермы наблюдался противоположный эффект; у них наблюдалось заметное повышение размера и числа положительных к коннексину 43 бляшек. Аналогичные эффекты на экспрессию коннексинов наблюдались в коже через 2 недели и 8 недель после индукции диабета с помощью STZ (фиг.1В).
Для оценки межклеточной коммуникации в диабетических эпидермисе и дерме исследовали степень переноса проникающего через щелевые контакты красителя Lucifer Yellow через ткань за 5 минут. При этом обнаружилось значительное снижение коммуникации в диабетическом эпидермисе, но значительное повышение ее в дерме (фиг.1D), что согласуется с изменениями экспрессии белков коннексинов. Уже отмечалось повышение экспрессии белка коннексина 43 и возрастание коммуникации в диабетических фибробластах человека (Abdullah KM et al. (1999) Endocrine 10:35-41) и смешанные ответы различных коннексинов на диабет в почечной системе (Zhang J, Hill СЕ (2005) Kidney Int. 68: 1171-1185) и мочевом пузыре (Poladia DP et al. (2005) Acta Diabetol.42:147-152).
На фиг.2A-2D представлены скорости реэпителизации и изменения уровня белков коннексина 43 и коннексина 26 после повреждения в контрольном и диабетическом эпидермисе. Окрашивание измеряли путем подсчета бляшек через 1 и 2 дня после нанесения раны в эпидермисе на краю раны (WE) и в примыкающей зоне (AD) на расстоянии 500 мкм (фиг.2А). Через 5 дней измеряли дополнительную зону на переднем крае (LE) нарастающего эпидермиса и присовокупили эти данные. Скорость реэпителизации значительно снижалась у диабетических крыс (D) по сравнению с контрольными (С) во все моменты времени: через 1, 2 и 5 дней после нанесения раны (фиг.2В). Окрашивание на коннексин 43 в зоне WE в норме снижается в первые 24 часа после повреждения, но в диабетической коже оно значительно повышается, возвращаясь почти к контрольному уровню во всех трех зонах через 2 дня после нанесения раны, а через 5 дней после нанесения раны оно оказывается на значительно пониженном уровне во всех трех зонах (фиг.2С). В норме ответ коннексина 26 на повреждение заключается в повышении уровня окраски в зоне WE, и это происходило и у контрольных, и у диабетических животных через 1 день после нанесения раны (фиг.2D). Однако через 2 дня после нанесения раны в диабетической коже окрашивание на коннексин 26 значительно повышалось в зонах WE и AD, и только через 5 дней после нанесения раны оно заметно снижалось в этих зонах.
На фиг.3а-3f и 3a'-3f представлено окрашивание на коннексин 43 (а, а', с, с', е, е') и коннексин 26 (b, b', d, d', f, f) (зеленым) и окрашивание ядер (синим) в эпидермисе по краям раны в контроле и при диабете в процессе заживления ран. Через 1 день экспрессия белка коннексина 43 подавляется в кератиноцитах переднего края контрольных крыс (фиг.3а), но возрастает на этом участке, который выглядит распухшим, у диабетических животных (фиг.3а'), Видно, что коннексин 26 тоже возрастает в эпидермисе и в контроле (фиг.3b), и при диабете (фиг.3b'). Через 2 дня окрашивание на коннексин 43 уменьшается в кератиноцитах переднего края при диабете (фиг.3с') и оказывается близким к контролю (фиг.3с), тогда как коннексин 26 продолжает возрастать во всех диабетических кератиноцитах (фиг.3d') до значительно более высокого уровня, чем в контроле (фиг.3d). Через 5 дней после нанесения раны нарастающий эпидермис в контроле (фиг.3е) и при диабете (фиг.3е') проявляет очень слабое точечное окрашивание на коннексин 43 между кератиноцитами, тогда как окрашивание на коннексин 26 почти не снижается в ранах при диабете (фиг.3f) по сравнению с контролем (фиг.3f). Стрелками отмечены края раны. Метки масштаба: 50 мкм (а, с, е) и 100 мкм (b, d, f).
Для определения динамики изменений экспрессии коннексинов при повреждении измеряли окрашивание на коннексины по краям раны (WE) и в примыкающей зоне на расстоянии 500 мкм (AD) через 1 и 2 дня после нанесения раны, тогда как через 5 дней делали снимки кератиноцитов переднего края (LE) (фиг.2А). Через 1 день после нанесения раны отмечалось значительное снижение окрашивания на коннексин 43 в контрольных кератиноцитах в зоне WE по сравнению с зоной AD (фиг.2С, 3а и 3а'). В явном противоречии с этим у диабетических животных отмечалось значительное повышение окрашивания на коннексин 43 в зоне WE по сравнению с зоной AD. Это было противоположно нормальному заживлению ран и было неожиданным, поскольку уровень коннексина 43 значительно снижался в интактной коже при диабете. Динамика изменений коннексина 26 была одинаковой в диабетической и контрольной коже, со значительным повышением окрашивания в зоне WE (фиг.2D, 3b и 3b'), хотя в диабетической коже повышение окрашивания на коннексин 26 не ограничивалось зоной WE, как в контроле, но распространялось на некоторое расстояние в зону AD, что означает больший разброс в реакции на повреждение. Кроме того, оказалось, что кератиноциты переднего края раны образуют утолщенную луковицу в диабетической ткани, тогда как в контроле они редели, а затем наползали вперед, закрывая рану.
Через 2 дня в контрольных ранах начиналась реэпителизация (12% закрытых), но диабетические раны отставали (5% закрытых), еще только лишь приняв мигрирующую морфологию. Это изменение формы диабетических кератиноцитов сопровождалось значительным снижением окрашивания на коннексин 43 в пределах зоны WE, которая на этой стадии походила на контрольную (фиг.2С, 3с и 3с'). Однако в кожных ранах при диабете уровень окрашивания на коннексин 26 продолжал возрастать в обеих зонах WE и AD (фиг.2D, 3d и 3d'), свидетельствуя о более широкой реакции ткани на повреждение.
Через 5 дней реэпителизация хорошо продвинулась в группах диабета и контроля, хотя диабетические раны значительно отставали (20% закрытых по сравнению с 33% в контроле; р<0,008; обобщенный попарный критерий Уилкоксона со знаком; фиг.2С). В обеих группах диабета и контроля в кератиноцитах зоны LE окрашивание на коннексин 43 оказалось слабым. Оно значительно возрастало в зонах WE и AD, но меньше в диабетической коже, в которой, как и в интактной коже, экспрессировалось меньше коннексина 43, чем в контроле (фиг.2С, 3е и 3е'). На этой стадии также возрастало окрашивание на коннексин 26 в зоне LE как при диабете, так и в контроле (фиг.2D, 3f и 3f'). Ранее повышенное окрашивание на коннексин 26 в зонах WE и AD при диабете почти вернулось к норме. Реэпителизация у животных в контроле и при диабете завершилась через 10 дней, когда наблюдался высокий уровень коннексина 43 в пролиферативном, сильно утолщенном эпидермисе.
На фиг.4А-4С представлены эффекты применения антисмыслового олигодезоксинуклеотида к коннексину 43 ("Cx43asODN) на экспрессию коннексина 43 через 1 день после нанесения раны и на скорость реэпителизации через 1, 2 и 5 дней после нанесения раны по сравнению с контрольным смысловым олигодезоксинуклеотидом к коннексину 43 ("sODN"). Повышенный уровень окрашивания на коннексин 43 (зеленые точки) наблюдается в утолщенной луковице эпидермиса на краю раны при диабете через 1 день после нанесения раны (фиг.4А). Однако это повышение экспрессии белка коннексина 43 предотвращалось при обработке asODN к коннексину 43, что также ведет к поредению слоя кератиноцитов,который больше похож на контроль, чем на луковицу клеток (фиг.4 В). Обработка пар ран в контроле и при диабете с помощью asODN или контрольного sODN приводит к удвоению скорости реэпителизации после применения asODN во все исследованные моменты времени (фиг.4С). Скорость реэпителизации в диабетической коже при обработке asODN близка скорости в контрольной коже при обработке sODN через 1 и 2 дня после нанесения раны, но становится значительно быстрее через 5 дней после нанесения раны. Метка масштаба: 50 мкм.
После наблюдения такой аномальной картины иммуноокрашивания на коннексин, коммуникации через щелевые контакты и морфологической реакции в ранах при диабете исследовали эффект аномального повышения белка коннексина 43 в диабетических кератиноцитах зоны WE, предотвращая это повышение с помощью специфичного к коннексину 43 антисмыслового геля, который наносили на рану во время повреждения. При этом эффективно предотвращалось повышение коннексина 43 (фиг.4А), а также улучшалась скорость заживления ран, которая удваивалась, достигая уровня контроля без обработки или больше (фиг.4В), хотя скорость заживления была еще выше в ранах, обработанных антисмысловым гелем у контрольных крыс.
Механизм, посредством которого диабет вызывает изменения экспрессии коннексинов, оказывая разнонаправленные эффекты на различные белки коннексинов, неизвестен. В возникновении других осложнений диабета, таких как невропатия и ангиопатия, подозревается гипергликемия и/или окислительный стресс, вызванный гипергликемией (American Diabetes Association (1999) Consensus development conference on diabetic foot wound care: 7-8 April 1999, Boston, Massachusetts). Высокий уровень глюкозы и окислительный стресс in vitro, как сообщалось, вызывают изменения экспрессии коннексинов и/или коммуникации через щелевые контакты в нескольких различных типах клеток (Fukuda Т et al. (2000) J. Gastroenterol. 35: 361-368; Cho JH et al. (2002) Carcinogenesis 23(7): 1163-9; Rouach N et al. (2004) Glia 45(1): 28-38), причем известно, что коннексин 43 и коннексин 26 имеют разные промоторы (Hennemann Н et al. (1992) Eur. J. Cell Biol. 58(1): 81-9; Chen ZQ et al. (1995) J. Biol. Chem. 270(8): 3863-8)).
Однако нарушение заживления ран отмечалось у крыс уже через 1 неделю после индукции диабета, еще до возникновения невропатии и ангиопатии (Witte MB et al. (2002) Br. J. Surg. 89: 1594-1601; Shi HP et al. (2003) Wound Repair Regen 11: 198-203). Таким образом, изменения, наблюдавшиеся в этих экспериментах в пределах 2 недель, вероятно, являются прямым следствием заболевания диабетом, а не вторичным последствием долгосрочных осложнений диабета.
Значительным результатом является аномальное возрастание коннексина 43 в эпидермисе на краю раны при диабете. Это может повлиять на процесс закрытия раны различным образом. Высказывалось предположение, что в заживлении ран играет роль образование коммуникационных компартментов (ячеек) в регенерирующем эпидермисе (Martin Р (1997) Science 276: 75-81; Lampe PD et al. (1998) J. Cell Biol. 143(6): 1735-47; Hodgins M (2004) J. Invest. Dermatol. 122: commentary). Компартментализация могла бы эффективно возникать в нормальных условиях при экспрессии коннексина 26 и удалении коннексина 43 в клетках переднего края, так как эти коннексины не образуют соединений друг с другом. Следовательно, задержка в заживлении ран при диабете могла бы отражать дополнительное время, необходимое для подавления экспрессии коннексина 43 до такого уровня, когда сможет произойти такая Компартментализация. С другой стороны, известно, что С-конец коннексина 43 взаимодействует с компонентами цитоскелета или с ГТФазой P120ctn/Rho, так что понижающая регуляция коннексина 43 могла быть нужна для изменения подвижности кератиноцитов на краю раны, позволяя им мигрировать и закрыть рану (Wei CJ et al. (2004) Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 20: 811-38). В этом отношении примечательно, что через 1 день после нанесения раны, когда экспрессия коннексина 43 была высокой, диабетические кератиноциты образовывали утолщенную луковицу на краю раны, а не распластывались и не начинали наползать на рану.
Авторы показали, что подавление экспрессии коннексина 43 путем однократного нанесения специфичного к коннексину 43 антисмыслового геля во время нанесения раны дает возможность осуществления всего процесса, от начальной миграции до полного закрытия раны, с нормальной и даже более высокой скоростью несмотря на наличие заболевания диабетом. Таким образом, обработка антиконнексиновым олигонуклеотидом, к примеру антисмысловым, обладает значительным потенциалом в качестве нового подхода к лечению ран, не заживающих с ожидаемой скоростью, включая хронические раны у диабетических и других пациентов.
Пример 2
Изобретение было успешно применено для лечения субъекта - человека с большой хронической раной, в данном случае васкулитной язвой, на благотворительной основе.
49-летний мужчина с основным заболеванием периферических сосудов впервые обратился по поводу осложнений, возникающих от незаживающей раны на ноге. Этот пациент подвергался ампутации левой ноги ниже колена вследствие травмы, которая впоследствии раскрылась в результате падения. На протяжении более чем 6 месяцев рана не реагировала на все формы общепринятого лечения. Пациент неоднократно подвергался местной обработке в попытках заживления раны, включая применение фактора роста, антимикробных повязок, VAC (закрытие с помощью вакуума), материала с ксенотрансплантатом, но без существенных изменений. Пациент снова упал и дополнительно повредил раневой очаг. За этим последовали множественные хирургические обработки и замена ксенотрансплантата. Рана продолжала увеличиваться в размере и была признана угрожающей всей конечности.
2
2
Так, из-за характера раны и уровня и типа ампутации было признано, что у пациента нет другого выбора лечения, кроме как пройти ампутацию выше колена. Отдел дерматологии FDA одобрил применение экспериментального препарата подателей заявки (SEQ ID NO:1) для этого пациента под рубрикой применения в крайнем случае. После этого рану обработали 2 мл 20 мкМ препарата SEQ ID NO: 1 в геле Pluronic (общая доза 400 мкг). Во время нанесения препарата рана составляла примерно 7 см × 5 см (около 35 см) при глубине в 3-4 мм. Таким образом, было введено около 12 мкг/см SEQ ID NO:1. Рану перевязали и оставили закрытой на протяжении 7 дней. После снятия повязки через 7 дней врач сообщил, что больше не было отека и эритемы, а рана как будто начала зарастать, хотя ее размеры (длина и ширина) остались почти такими же на этой стадии.
2
Провели вторую обработку (общая доза 400 мкг). После этой обработки рана продолжала заживать, и глубина повреждения впоследствии составила 1 мм (уменьшилась в 3-4 раза) с 1-1,5 см новой ткани со всех сторон. Рана была чистой, а грануляционная ткань имела "здоровый" вид. Пациент был признан "готовым к пересадке", если бы можно было использовать другую ткань для пересадки, например бедро. Однако это оказалось невозможным для данного пациента из-за наличия у него основного заболевания периферических сосудов.
2
Никаких опасений по поводу безопасности после этого экспериментального лечения не возникало и не было отмечено. Пациента снова подвергали осмотру через 2 месяца, и рана продолжала уменьшаться по размеру. Размер раны уменьшился приблизительно в 7 раз, до 5 см, и медперсонал, проводивший осмотр раны, пришел к выводу, что рана дойдет до полного закрытия. Было установлено, что ампутация выше колена больше не нужна.
Пример 3
Изобретение было успешно применено для лечения субъекта - человека с хронической венозной раной. 86-летний мужчина с основным заболеванием - периферическим отеком, обратился по поводу осложнений от 5-месячной незаживающей хронической венозной язвы. За этот период рана не реагировала на все формы общепринятого лечения по месту жительства. Пациент неоднократно подвергался местной обработке в попытках заживления раны, включая антимикробные средства и наложение давящей повязки для уменьшения отека. За этот период времени рана продолжала увеличиваться в размере. Пациенту была назначена операция протезирования колена, но его поставили в известность, что операция невозможна при наличии открытой хронической раны.
2
2
Так, из-за характера раны, которая к тому же была воспалена и распухла в своем ложе и особенно по краям, пациент был признан подлежащим благотворительности, и от него было получено информированное согласие на лечение. После этого рану обработали 200 мкл 10 мкМ препарата SEQ ID NO:1 в геле Pluronic (общая доза примерно 20 мкг). Во время нанесения препарата рана составляла примерно 3 см×3 см (около 9 см) при глубине в 2-3 мм. Таким образом, общая доза составила около 2,2 мкг/см. Затем рану перевязали неприлипающей повязкой на 24 часа.
После снятия повязки через 24 часа больше не было воспаления и отека, а рана стала подсыхать. Рану затем оставили без повязки до прошествия 72 часов после обработки, за это время прежде незаживающая кожная язва полностью засохла и поверх нее образовался струп. После этого рану перевязали и снова осматривали через 1 неделю, за это время ее размеры (длина и ширина) значительно уменьшились, не было воспаления и отека, а рана заживала и приближалась к закрытию.
Вторую обработку (общая доза примерно 40 мкг SEQ ID NO:1) проводили через 1 месяц после нового повреждения раны, которое привело к прекращению закрытия. После этой обработки была наложена давящая повязка для уменьшения отека и рана снова начала быстро заживать. Повреждение уменьшилось по глубине, ширине и длине, а новая кожа там, где рана зажила, имела здоровый вид.
Никаких опасений по поводу безопасности после этого экспериментального лечения не возникало и не было отмечено. Пациента снова подвергали осмотру через 6 недель. Рана уменьшилась приблизительно в 4 раза от первоначального размера и приближалась к закрытию.
Таблица 2
Таблица 2А
Коннексин 43 человека из GenBank, № доступа М65188 (SEQ ID NO: 13)
1
ggcttttagc
gtgaggaaag
taccaaacag
cagcggagfct
ttaaacttta
aatagacagg
61
tctgagtgcc
tgaacttgcc
ttttcattfcfc
acttcatcct
ccaagqagtt
caatcacttg
121
gcgtgacttc
actactttta
agcaaaagag
tggtgcccag
igcaacatggg
tgactggagc
181
gccttaggca
aactccttga
caaggttcaa
gcctactcaa
ctgctggagg
gaaggtgtgg
241
ctgtcagtac
ttfctcatttt
ccgaatcctg
ctgctgggga
cagcggttga
gtcagcctgg
301
ggagatgagc
agtctgcctt
tcgttgtaac
actcagcaac
ctggfctgtga
aaatgtctgc
361
tatgacaagt
ctttcccaat
ctctcatgtg
cgcttctggg
tcctgcagat
catattfcgtg
421
fcctgtaccca
cacfccttgta
cctggctcat
gtgttcfcatg
tgatgcgaaa
ggaagagaaa
481
ctgaacaaga
aagaggaaga
actcaaggtt
gcccaaactg
atggtgtcaa
fcgtggacatg
541
cacttgaagc
agattgagat
aaagaagttc
aagtacggta
ttgaagagca
tggtaaggfcg
601
aaaatgcgag
gggggttgct
gcgaacctac
atcatcagta
tcctcttcaa
gtctatcttt
661
gaggtggcct
tcttgctgat
ccagtggtac
atctatggat
tcagcttgag
tgctgtttac
721
acttgcaaaa
gagatccctg
cccacafccag
gtggactgtt
tcctctctcg
ccccacggag
781
aaaaccatct
tcatcatctt
catgctggtg
gtgtccttgg
tgtccctggc
cttgaatatc
841
attgaactct
tctatgtttt
cttcaagggc
gttaaggatc
gggttaaggg
aaagagcgac
901
ccttaccatg
cgaccagtgg
tgcgctgagc
cctgccaaag
actgtgggfcc
tcaaaaatat
961
gcttatfctca
atggctgctc
ctcaccaacc
gctcccctct
cgcctatgtc
tcctcctggg
1021
fcacaagctgg
ttactggcga
cagaaacaat
tctfccttgcc
gcaattacaa
caagcaagca
1081
agtgagcaaa
actgggcfcaa
ttacagtgca
gaacaaaatc
gaatggggca
ggcgggaagc
1141
accatctcta
actcccatgc
acagcctttt
gattfcccccg
atgataacca
gaattctaaa
1201
aaactagctg
ctggacatga
attacagcca
ctagccattg
tggaccagcg
accttcaagc
1261
agagccagca
gtcgtgccag
cagcagacct
cggccfcgatg
acctggagat
ctag
Таблица 2В
Коннексин 43 человека (SEQ ID NO:14)
1
atgggtgact
ggagcgcctt
aggcaaactc
cttgacaagg
ttcaagccfca
ctcaactgct
61
ggagggaagg
fcgtggctgtc
agtacttttc
attttccgaa
tcctgctgct
ggggacagcg
121
gttgagtcag
cctggggaga
tgagcagtct
gcctttcgfct
gtaacactca
gcaacctggt
181
tgtgaaaatg
tctgctatga
caagtctttc
ccaatctctc
atgtgcgctt
ctgggtcctg
241
cagatcafcat
ttgtgtctgt
acccacactc
ttgtacctgg
ctcafcgtgtt
ctatgtgatg
301
cgaaaggaag
agaaactgaa
caagaaagag
gaagaactca
aggttgccca
aactgatggt
361
gtcaatgtgg
acatgcactt
gaagcagatt
gagataaaga
agttcaagta
cggtattgaa
421
gagcatggfca
aggtgaaaat
gcgagggggg
tfcgctgcgaa
cctacatcafc
cagtatcctc
481
ttcaagtcfca
tctttgaggt
ggccttcttg
ctgatccagfc
ggtacatcta
tggattcagc
541
ttgagtgctg
tttacacttg
caaaagagat
ccctgcccac
atcaggtgga
ctgtttcctc
601
tctcgcccca
cggagaaaac
catctfccatc
atcttcatgc
tggtggtgtc
cttggtgtcc
661
ctggccttga
atatcattga
actcttctat
gttttcttca
agggcgttaa
ggatcgggtt
721
aagggaaaga
gcgaccctta
ccatgcgacc
agtggtgcgc
tgagccctgc
caaagactgt
781
gggtcfccaaa
aatafcgctta
tttcaatggc
tgctcctcac
caaccgctcc
cctctcgcct
841
atgtctcctc
ctgggtacaa
gctggttact
ggcgacagaa
acaattctfcc
ttgccgcaat
901
tacaacaagc
aagcaagtga
gcaaaactgg
gctaafctaca
gtgcagaaca
aaatcgaatg
961
gggcaggcgg
gaagcaccat
ctctaactcc
catgcacagc
cttttgattt
ccccgatgat
1021
aaccagaatt
ctaaaaaact
agctgctgga
catgaattac
agccactagc
cattgtggac
1081
cagcgaccfct
caagcagagc
cagcagtcgt
gccagcagca
gacctcggcc
tgatgacctg
1141
gagatctag
***
Все патенты, публикации, научные статьи, веб-сайты и другие документы и материалы, приведенные или указанные в настоящем изобретении, показывают уровень квалификации специалистов в той области, к которой относится изобретение, и каждый такой приведенный документ или материал включен в настоящее изобретение путем ссылки в той же степени, как если бы он был включен индивидуально путем ссылки во всей полноте или изложен в настоящем изобретении во всей полноте. Заявители оставляют за собой право физически включать в настоящее описание любые материалы и информацию из таких патентов, публикаций, научных статей, веб-сайтов, электронной информации и других приведенных материалов или документов.
Конкретные способы и композиции, описанные в настоящем изобретении, являются репрезентативными для предпочтительных воплощений и типичными и не могут служить в качестве ограничения рамок изобретения. Другие предметы, аспекты и воплощения, которые могут возникнуть у специалистов в этой области после рассмотрения настоящего описания, охватываются сущностью изобретения, как это определено рамками формулы изобретения. Специалистам должно быть известно, что в изложенном здесь изобретении можно делать различные замены и модификации, не выходящие за рамки и не отходящие от сути изобретения. Описанное для иллюстрации изобретение обычно может применяться на практике в отсутствие какого-либо элемента или элементов либо ограничения или ограничений, которые не указаны конкретно как существенные. Так, например, во всяком случае в воплощениях или примерах настоящего изобретения любой из терминов "включающий", "состоящий в основном из" и "состоящий из" может быть заменен любым из двух других терминов в описании. Также и термины "состоящий", "включающий", "содержащий" и т.д. следует понимать в расширительном смысле и без ограничения. Способы и процессы, описанные в изобретении для иллюстрации, обычно могут применяться на практике и в другом порядке стадий, а не обязательно ограничиваться порядком стадий, указанным в описании или формуле изобретения. Кроме того, в настоящем описании и формуле изобретения употребление форм единственного числа включает значения множественного, если только контекст четко не предписывает иначе. Ни при каких обстоятельствах не следует полагать, будто патент ограничивается конкретными примерами, воплощениями или способами, специально в нем раскрытыми. Ни при каких обстоятельствах не следует полагать, будто патент ограничивается каким-либо утверждением со стороны экспертизы либо иных чиновников или работников Ведомства по делам патентов и товарных знаков, если только такое утверждение специально и безоговорочно не принято в явном виде в письменном ответе заявителей.
Используемые термины и выражения применяются как термины для описания, а не ограничения, и притом без намерения использовать такие термины и выражения для исключения каких-либо эквивалентов представленных и описанных особенностей или их частей, однако признается, что в рамках заявленного изобретения возможны различные модификации. Так, следует понимать, что хотя настоящее изобретение было изложено конкретно в виде предпочтительных воплощений и необязательных особенностей, однако специалисты в этой области могут предпринимать модификации и вариации приведенных в нем концепций, причем такие модификации и вариации считаются входящими в рамки настоящего изобретения, как определено в прилагаемой формуле изобретения.
Изобретение было описано в широком и общем смысле. Каждая из более узких и менее общих разновидностей, попадающих под общее описание, является составной частью изобретения. Сюда входит и общее описание изобретения с каким-либо условием или отрицательным ограничением, устраняющим какую-либо тематику из общего целого, независимо от того, указан в нем специально или нет устраняемый материал.
Другие воплощения входят в рамки нижеследующей формулы изобретения. Кроме того, если какие-то особенности или аспекты изобретения описаны в терминах групп Маркуша, то специалисты в этой области должны понимать, что изобретение при этом также описано и в отношении индивидуальных членов или подгруппы членов группы Маркуша.