Клеточные маркеры апоптоза при остром коронарном синдроме

УДК 616.127-005.8-092-097

© Л.Н. Хусаинова, Э.Р. Смакаева, Р.И. Садикова, Л.Н. Мингазетдинова, 2013

Л.Н. Хусаинова, Э.Р. Смакаева, Р.И. Садикова, Л.Н. Мингазетдинова КЛЕТОЧНЫЕ МАРКЕРЫ АПОПТОЗА ПРИ ОСТРОМ КОРОНАРНОМ СИНДРОМЕ

ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Минздрава России, г. Уфа

Целью исследования явилось изучение апоптотической реактивности лимфоцитов у больных острым коронарным синдромом (ОКС) и ее роли в исходе острого коронарного синдрома.

Под наблюдением находилось 52 больных: с нестабильной стенокардией (НС) 22 и острым инфарктом миокарда (ОИМ) - 30 больных. Проводились общеклиническое обследование, определение субпопуляции лимфоцитов и экспрессии цитокинов методом иммуноферментного анализа (ИФА) и оценка митогенеза в 24-часовых культурах мононуклеаров. Полученные данные свидетельствуют о нарушении в системе клеточного иммунитета, проявляющемся снижением количества Т-лимфоцитов, увеличении лимфоцитов, опосредующих апоптоз (CD25+, CD95+) у больных с ОКС. У больных ОИМ установлены наиболее выраженные иммунологические сдвиги, характеризующиеся достоверным повышением в крови ци-токинов Il-ip (интерлейкин-1-бета) и TNF-a (фактор некроза опухоли-a), понижением покоящихся клеток миокарда до 91,6±4,32% (p<0,05), увеличением активированных клеток в ранней фазе апоптоза до 3,85±0,10% (p<0,05) и активационно-го коэффициента до 0,493±0,3 (p<0,01). В целом при ОКС отмечается усиление клеточного апоптоза с активацией цитоки-новой системы и повышением острого воспалительного ответа.

Ключевые слова: острый коронарный синдром, апоптоз, острый инфаркт миокарда.

L.N. Khusainova, E.R. Smakaeva, R.I. Sadikova, L.N. Mingazetdinova CELL MARKERS OF ACUTE MYOCARDIAL ISCHEMIA APOPTOSIS

The aim of the research was lymphocytes apoptotic reactivity investigation in patients suffering from acute myocardial ischemia: 52 patients have been under examination: 22 patients with acute coronary syndrome and 30 patients with acute myocardial infarction. Clinical examination, lymphocytes subpopulation definition and expression of cytokines using the method of immunofluo-rescent assay and mitogenesis estimation of mononuclear cells cultures kept during 24 hours have been carried out. The obtained results show disorders in the cell immune system, resulting in number of T-lymphocytes reduction and lymphocytes increase mediating apoptosis with the patients with acute myocardial ischemia. More pronounced immune disorders have been discovered in patients with acute myocardial infarction. Their blood tests showed noticeable cytokines increase interleukin-ip and tumot necrosis factor-a, resting myocardial cells reduction up to 91.6±4.32% (p<0.05) and growth of the activated cells in the early apoptosis phase up to 3.85±0.10% (p<0.05) and rise of the activation rate up to 0.493±0.3% (p<0.01). Thus, in patients suffering from acute myo-cardial ischemia the following factors are observed: 1. cell apoptosis intensification, 2. cytokines system activation, 3. acute inflammatory response elevation. The above mentioned factors should be taken into consideration while treating such patients.

Key words: acute myocardial ischemia, apoptosis, acute myocardial infarction.

Сердечно-сосудистые заболевания, в том числе острый коронарный синдром (ОКС), остаются одной из основных причин смертности и инвалидности трудоспособного населения. Ежегодно в России от острого инфаркта миокарда (ОИМ) и цереброваскуляр-ных заболеваний умирает около 1 300 000 человек [4]. Негативное влияние ОИМ оказывает на качество жизни, а в 20% случаев становится первым проявлением ишемической болезни сердца [1].

Согласно современным представлениям в развитии ОКС имеет значение дисфункция эндотелия, а иммунологические нарушения определяют тяжесть течения ОИМ, а порой и его исход [2,3,8].

В последние годы установлено участие ускоренного апоптоза в развитии тромбофи-лии путем увеличения прокоагулянтного потенциала с активацией комплекса тканевого фактора и фактора У11а [10,11].

Основной путь инициации апоптоза как реакции на «свое» разрушение осуществляется через активацию популяции СБ95-Ра8-антигена и реализуется через систему мем-бранно-связанных белков семейства туморне-

кротических (TNF) рецепторов [5,6]. Инициация в распознавании клеток-мишеней и их подготовка к апоптотической функции отводится естественным киллерам (NK или CD 16), сигнальная функция принадлежит CD95 (FaS-апоптоз) лимфоцитам, к тому же FaS может экспрессироваться на всех клетках организма, а их экспрессия возрастает при активации клеток [5,11]. Активированно-индуцирован-ный апоптоз реализуется по FaS-зависимому механизму. Нарушения FaS-зависимого апоптоза приводят к продолжительной активации лимфоцитов и риску аутоагрессии [2,7].

Однако исследования по содержанию в крови субпопуляций лимфоцитов, участвующих в апоптозе при ОКС, малочисленны и противоречивы. Учитывая, что разработка эффективных мер по ранней диагностике, лечению и профилактике ОИМ может быть связана с дальнейшим изучением функции эндо-телиоцитов и взаимосвязи с показателями иммунной системы, оценка структуры лимфоцитов периферической крови и их роли в реакции апоптоза остается актуальной.

Целью исследования явилось изучение апоптотической реактивности лимфоцитов у

больных острым коронарным синдромом и ее роли в исходе острого коронарного синдрома.

Материал и методы

В исследование включено 52 больных (21 женщина и 31 мужчина) с ОКС, средний возраст которых составил 54,7±7,4 года, поступивших через 12-24 часа от начала болевого приступа. Пациенты не имели хронических заболеваний, потенциально влияющих на функциональную активность лимфоцитов. Все больные были разделены на 2 группы: в первую группу вошли 22 пациента (42,3%), поступившие по поводу нестабильной стенокардии, во вторую - 30 больных с ОИМ. В дифференциальной диагностике между ОИМ без подъема сегмента 8Т и нестабильной стенокардией учитывался уровень тропонина I. Контрольную группу составили 18 условно здоровых лиц-доноров (средний возраст 49,5±2,6 года). У всех пациентов получено письменное согласие на участие в клиническом исследовании.

Диагноз устанавливался на основании выявленных маркеров некроза миокарда (миоглобин, МВ-фракция КФК) в сочетании с характерной клинической картиной, данными ЭКГ, ЭхоКГ. Критериями включения были верифицированный ОИМ без подъема сегмента 8Т, нестабильная стенокардия, средний возраст больного менее 70 лет, наличие изменений конечной части желудочкового комплекса на ЭКГ в день поступления в стационар (депрессия сегмента 8Т не менее чем на 1 мм в двух и более смежных отведениях, инверсия зубца Т глубиной более 1 мм, отсутствие зубца Q), кратковременный (12-24 часа) подъем содержания кардиоспецифических ферментов (КФК МВ), тропонина I в момент поступления или через 12 часов.

Критерии исключения составили клапанные пороки сердца, фибрилляция предсердий, заболевания легких, почек, крови, печени, острые и хронические заболевания аутоиммунного и пролиферативного характера.

С первого дня поступления больного в стационар проводился мониторинг ЭКГ. Для

определения жизнеспособности и активности лимфоцитов использовался тест восстановления 3-(4,5)-диметилтиазол-2 или 2,5-дифенилтетразолия бромида (МТТ-тест, De Maria R. et al., 1997). Результаты подтверждались морфологическим методом - реакцией бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ). Оценку субпопуляционной структуры лимфоцитов периферической крови осуществляли стандартным методами прямого двухпарамет-рического иммунофенотипирования лимфоцитов и непрямого иммунофлюоресцентного окрашивания с применением моноклональных антител (МКА) серии LT (ГНЦ НИИ иммунологии МЗ РФ) и ICO (ВОНЦ РАМН). Для вычисления FaS (CD95) использовали МКА мышей против антител человека CD95 клона DX-2 (Galtag Lab., USA). Анализ экспрессии CD95 лимфоцитов и интенсивности апоптоза проводили в 24-часовых культурах моно-нуклеаров с ФГА-Р и оценкой митогенеза.

Экспрессия цитокиновой системы определялась в сыворотках крови методом ИФА с использованием тест-системы ООО «Протеиновый контур» (СКП-п8). Постановку метода осуществляли согласно рекомендациям фирмы производителя с определением интерлей-кина lß (Il-lß) и фактора некроза опухоли-а (TNF-а). Результаты иммуноферментного анализа оценивали на планшетном фотометре Multiscan Plus (Lab systems).

Статистическую обработку данных проводили с помощью пакета программ STATISTICA 6.0. Количественные данные представлены в виде средних значений и их стандартной ошибки (М±т). При сравнении независимых групп проводили ранговый анализ вариаций с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни. Статистическую значимость различий оценивали на уровне p<0,05.

Результаты

Данные о количестве субпопуляций лимфоцитов у больных и в контрольной группе представлены в табл. l.

Таблица l

Субпопуляции лим( оцитов периферической крови у больных с острым коронарным синдромом

Показатели Контрольная группа ОКС

Лейкоциты 5,5±0,54 5,8±0,87 6,6±1,1

Лимфоциты 30,3±5,3 32,3±1,87 28,17±0,61

CD4+,%кл/мкл 39,74±1,2 34,16±2,52 32,15±1,89

CDS^/o^mn 26,02±0,9 28,2±1,12 32,16±0,82

CD4/CD8 1,4±0,05 1,2±0,02 1,0±0,05

CD16+,%кл/мкл 12,33±2,7 10,2±0,78 9,12±1,8

11,3±1,1 15,32±1,0 18,9±3,6

НЬА^+,%кл/мкл 28,4±1,3 34,2±2,2 35,86±2,9

Примечание. ОКС - острый коронарный синдром, НС - нестабильная стенокардия, ОИМ - острый инфаркт миокарда. * Результат статистически достоверен по отношению к контролю (р<0,05).

У больных НС и ОИМ отмечены достоверное по сравнению с контролем снижение Т-хелперов (СБ4) и увеличение содержания лимфоцитов, экспрессирующих активацион-ные антигены-рецепторы к 11-2 (СБ25), а также установлено значимое увеличение количества СБ8+ и НЬА-БЯ+ Т-лимфоцитов в группе больных ОИМ (32,16±0,82% и 35,86±2,9% соответственно; р<0,05) по сравнению с контрольной группой (26,02±0,9% и 28,4±1,3%).

Данные о содержании ассоциированного с мембраной клетки Ба8- рецептора (СБ95) как ключевой молекулы, опосредующей апоптоз лимфоцитов, у больных и лиц контрольной группы представлены в табл. 2.

Из представленных в таблице данных видно, что у больных ОКС наблюдалось высокозначимое по сравнению с контролем повышение в крови содержания СБ95+ (Ба8) лимфоцитов, наиболее выраженное при ОИМ.

Таблица 2

Показатель Контроль ОКС

НС ОИМ

CD95+ (FaS), % 16,9±2,8 32,6±3,4* 38,7±4,5^

- между группами больных.

* Результат статистически достоверный с контролем, p<0,05; •

Установлено достоверное увеличение содержания CD95 + (FaS) у пациентов с ОИМ по сравнению с больными НС (уровень CD95 при ОИМ составил 38,7±4,5%, при НС -32,6±3,4%). При анализе содержания провос-палительных цитокинов, участвующих в апоптозе (I1-1P и TNF-a), значительное повышение уровня TNF-a в крови отмечено у больных ОИМ по сравнению с больными НС (26,2±5,48 пг/мл против 6,28±2,4 пг/мл). У больных НС и ОИМ также показано значимое повышение в крови I1-1P, при ОИМ он составил 28,3±6,55 пг/мл по сравнению с НС -23,7±4,78 пг/мл. Выявлена прямая корреляционная зависимость между уровнем CD95+ Т-лимфоцитов и интерлейкином ip (r=0,78; p=0,01).

Стимуляция лимфоцитов здоровых доноров привела к закономерному снижению покоящихся клеток (00-фаза), нарастанию содержания клеток, находящихся в пресинап-тической фазе (G1) и суммарному увеличению клеток в фазе клеточного цикла (G2). При ОКС наблюдалась тенденция к снижению доли покоящихся лимфоцитов (G0) при НС до 94,37±4,18% с понижением до 91,6±4,32% у больных ОИМ (p<0,05). С активацией лимфоцитов увеличилось число активированных клеток в ранней фазе апоптоза с 3,30±0,41% при НС до 3,85±0,10% при ОИМ (p<0,05). Параллельно при ОИМ нарастал ак-тивационный коэффициент до 0,493±0,3 (p<0,01).

Обсуждение

В настоящее время иммунные нарушения наряду с уровнем TNF-a, ангиотензина II, оксидативным стрессом относятся к основным индукторам апоптоза эндотелиальных клеток in vivo. Увеличение депрессии иммунной системы может привести к ослаблению и даже потере контактов эндотелиальных кле-

ток, что становится дополнительным фактором в инициации программированной гибели клеток [8].

При ОКС показано усиление апоптоза эндотелия [2]. В результате проведенных исследований нами установлено, что у больных НС и ОИМ отмечено достоверное снижение по сравнению с контролем количества жизнеспособных мононуклеаров с гибелью активированных СБ4+ Т-лимфоцитов, мигрировавших в миокард, что осуществляется по Ба8-Ба8а-зависимому механизму при контакте с FаSa, экспрессированных на мембране кар-диомиоцитов параллельно с развитием некроза. Также установлено достоверное увеличение количества ОБ95 + (Ба8) рецептора лимфоцитов периферической крови у больных ОИМ по сравнению с больными НС как ключевого механизма, опосредующего апоптоз, и важнейшего показателя иммунного гомеоста-за.

Особое место в эндогенных механизмах развития апоптоза при атеросклерозе занимает провоспалительный цитокин ТОТ-а, при этом цитокиновый профиль иммунокомпе-тентных клеток рассматривается в качестве одной из важнейших характеристик иммунной системы [11]. Показана способность ТОТ-а ингибировать клеточную гибель, индуцированную анти-Ба8-антителами, возможно, за счет высокой активности воспалительного процесса и повышенного риска развития тромбоза [10]. Маркером такого процесса может стать повышение комплекса гистосовме-стимости НЬА-ОЯ, который значимо увеличивается при ОИМ. Это подтверждается наличием прямой корреляционной связи НЬА-ОЯ с уровнем кардиоспецифических ферментов (КФК-МВ и тропонин I - г=0,42; р=0,048 и г=0,45; р=0,04 соответственно), что, вероятно, на фоне снижения активности анти-

оксидантной системы вызывает оксидативный стресс с повреждением кардиомиоцитов.

Результаты собственных исследований и имеющиеся в литературе данные свидетельствуют о значительном увеличении СБ95 + (Ба8) при атеросклерозе [9].

Известно, что зрелые Т- и В-лимфоциты в неактивном состоянии лишены мембранного рецептора и экспрессируют протоонко-гены Вс1-2 и Вс1-х, что определяет их устойчивость к индукторам апоптоза. Установлено, что помимо антиапоптотической функции Вс1-2 также обладает противовоспалительными свойствами, значительно снижая опосредованную ТОТ-а гиперэкспрессию Е-селектина и почти полностью блокируя экспрессию УСЛМ-1 на эндотелии [11]. Увеличение экспрессии СБ95 + (Ба8) на лимфоцитах при их активации сопровождается повы-

шением чувствительности клеток к лиганду FaSа, присоединение которого определяет запуск программы гибели клеток [7]. Полученные нами данные повышения СБ95+ Т-лимфоцитов и нарастания активационного коэффициента с развитием острой ишемии при НС можно расценивать как признак повышенной готовности лимфоцитов к апопто-зу, а с развитием ОИМ - как активацию программированной гибели клеток.

Таким образом, при ОКС отмечается усиление клеточного апоптоза в результате иммунных нарушений, что приводит к активации цитокиновой системы с повышением медиаторов острого воспалительного ответа (II-1Р), спонтанного апоптоза по экспрессии СБ95+ (Ба8)-Т-лимфоцитов, направленных на увеличение тромбогенного потенциала эндо-телиоцитов, подвергшихся апоптозу.

Сведения об авторах статьи: Хусаинова Леонора Нурфаизовна - доцент, к.м.н., зав. отделением терапии клиники ГБОУ ВПО БГМУ Минздрава России. Адрес: 450083, г. Уфа, ул. Шафиева, 2.

Смакаева Элина Равилевна - аспирант кафедры терапии и клинической фармакологии ГБОУ ВПО БГМУ Минздрава России. Адрес: 450000, г. Уфа, ул. Ленина, 3.

Садикова Регина Ильгизовна - аспирант института биохимии и генетики УНЦ РАН. Адрес: г. Уфа, Пр. Октября, 71. Мингазетдинова Лира Набиевна - профессор кафедры терапии и клинической фармакологии ИПО ГБОУ ВПО БГМУ Минздрава России. Адрес: 450000, г. Уфа, ул. Ленина, 3.

ЛИТЕРАТУРА

1. Алмазов, В.А. Эндотелиальная дисфункция у больных с дебютом ишемической болезни сердца в разном возрасте /В.А. Алмазов, О.А. Беркович, М.Ю. Симникова [и др.]//Кардиология. - 2001. - № 5. - С. 24-29.

2. Васина, Л. В. Клеточные и гуморальные маркеры апоптоза при остром коронарном синдроме в сочетании с гипертонической болезнью//Артериальная гипертензия. - 2008. - .№14 (4). - С. 332-335.

3. Ковалев, И.А. Дисфункция эндотелия у лиц с отягощенной по атеросклерозу сердечной недостаточностью/ И.А. Ковалев, Г.И. Марцинкевич, Т.Е. Суслова [и др.]//Кардиология. - 2004. - №1. - С. 39-42.

4. Оганов, Р.Г. Профилактика сердечно-сосудистых заболеваний - реальный путь улучшения демографической системы в России /Р.Г. Оганов, Г.Я. Масленникова //Кардиология. - 2007. - №1. - С. 4-7.

5. Пальцев, М.А. Межклеточные взаимодействия / М.А. Пальцев, А.А. Иванов, С.Е. Северин - М.: Медицина, 2003. - С. 15861591.

6. Петрищев, Н.Н. Содержание растворимых маркеров апоптоза и циркулирующих аннексин V-связанных апоптотических клеток в крови больных острым коронарным синдомом /Н.Н. Петрищев, Л.В.Васина, А.В.Луговая //Вестник Санкт-Петербургского университета. - 2008. - №11 (1). - С. 14-23.

7. Bcl-2 and Bax regulate the channel activity of the mithochondrial adenine nucleotide translocator / C. Brenner [et al.] //Oncogene. -2000. - № 19. - Р. 329-336.

8. Beta-cell deficit and increased beta-cell apoptosis in humens with type 2 diabetes / A. E. Butler [et al.] //Diabetes. - 2003. - No. 52. - P. 102-110.

9. Hansson G. K. Immune mechanisms in atherosclerosis / G.K. Hansson //Arterioscler. Tromb. Vase. Biol. - 2001. - No. 21 (12). -P. 7690.

10. Selective suppression of endo thelial cell apoptosis by the high molecular weight of adiponectin / H. Kobayaschi [et al.] //Cli. Res. -2004. - No. 94. - P. 27-31.

11. Bombeli, T. Apoptotic vascular endothelial cells become procoagulant / T. Bombeli, A. Karsan, J. M. Harlan //Blood. 1997. No. 89. 2429-2442.

УДК 616.351-006.6; 616.34-007.272

© З.В. Тотиков, В.З. Тотиков, Р.Ю. Мальсагов, И.М. Талапова, 2013

З.В. Тотиков1, В.З. Тотиков1, Р.Ю. Мальсагов2, И.М. Талапова3 К ВОПРОСУ О КЛАССИФИКАЦИИ ОБТУРАЦИОННОЙ ТОЛСТОКИШЕЧНОЙ НЕПРОХОДИМОСТИ ОПУХОЛЕВОГО ГЕНЕЗА

'ГБОУ ВПО «Северо-Осетинская государственная медицинская академия» Минздрава России, г. Владикавказ 2Ингушская республиканская клиническая больница, г. Назрань 3ФГБОУ ВПО «Кабардино-Балкарский государственный университет имени Х.М. Бербекова», г. Нальчик