Добавочный раствор для хранения концентрата тромбоцитов
ADDITIONAL SOLUTION FOR STORAGE OF THROMBOCYTE CONCENTRATE

Заявляемое изобретение относится к медицине, а именно к растворам для ресуспендирования и хранения компонентов заготовленной донорской крови (добавочным растворам), и в частности для ресуспендирования и хранения концентрата тромбоцитов. Переливание концентрата тромбоцитов является необходимой мерой коррекции тромбоцитопении, в первую очередь, в онкологической и гематологической практике.
Несмотря на высокий клинический запрос, обеспечение пациентов тромбоцитным концентратом создает определенные сложности для службы крови и для врачей клинической практики. Это связано как с коротким сроком его хранения, не превышающим 5-7 суток, и с длительностью процесса его приготовления, так и с вероятностью быстрого развития у пациентов клинически значимой тромбоцитопении. Создание достаточного запаса тромбоцитного концентрата необходимых групп крови также лимитирует его высокая себестоимость.
Основным требованием к концентрату тромбоцитов, используемому при трансфузии, является сохранение активности тромбоцитов при попадании их в сосудистое русло при трансфузии. Качество концентрата тромбоцитов обусловлено рядом факторов, среди которых немаловажным является среда, в которой он хранится -плазма или добавочный раствор. Естественной средой для тромбоцитов является плазма крови донора, но она же является наилучшей средой жизнедеятельности бактерий, и, кроме того, содержит антитела донора, которые могут повредить реципиенту при трансфузии концентрата тромбоцитов.
Использование добавочных растворов в качестве среды хранения позволяет минимизировать частоту побочных реакций, вызываемых трансфузией концентрата тромбоцитов, использовать для трансфузии неидентичные по группе крови тромбоциты с более низким титром гемоагглютининов, упрощает определение бактерий в контаминированных тромбоцитных концентратах, дает возможность фотохимической обработки для инактивации бактерий и других патогенов в тромбоцитах с использованием определенных техник, улучшает условия хранения и повышает выход активных тромбоцитов. Уменьшение количества плазмы, переливаемой вместе с тромбоцитами, позволяет также сохранить плазму для дальнейшей переработки.
Тромбоцитный концентрат, заготовленный аппаратным способом с использованием добавочного раствора для хранения тромбоцитов, обычно содержит около 30% нативной плазмы и около 70% добавочного раствора.
Исследования, посвященные поиску сред для сохранения тромбоцитов, начались за рубежом в 80-е годы прошлого века. Созданные за рубежом добавочные растворы для хранения тромбоцитов обозначаются аббревиатурой PAS - platelet additive solutions. Первый такой раствор PAS-A содержал хлорид натрия, цитрат и фосфат натрия, а также ионы калия. Дальнейшие разработки привели к созданию многокомпонентных солевых сред, включающих хлориды натрия, калия и магния, а также ацетат, цитрат, фосфат и глюконат натрия, различающихся составом и концентрацией включенных компонентов [Gulliksson Н. Platelet storage media // Vox sang. - 2014. - Vol. 107, N 2. - P. 205-212].
Наиболее известный и широко применяемый в наше время раствор SSP+(другие названия PAS-III М и PAS-E) содержит 69,3 мМоль/л хлорида натрия, 10,8 мМоль/л цитрата натрия, 32,5 мМоль/л ацетата натрия, 28,2 мМоль/л моно/динатрий фосфата, 5,0 мМоль/л хлорида калия и 1,5 мМоль/л хлорида магния [Gulliksson Н. Defining of optimal storage conditions for the long-term storage of platelets // Transfus. Med. Rev. - 2003. - Vol. 17. - P. 209-215]. Срок хранения тромбоцитов в среде, содержащей этот раствор, может достигать 7 суток.
Также известен добавочный раствор для хранения тромбоцитов, включающий на 1000 мл 4,21-5,14 г хлорида натрия, 0,84-1,26 г бикарбоната натрия, 0,37-0,45 г хлорида магния, 3,97-4,85 г цитрата натрия, 1,85-2,25 г ацетата натрия, 0,45-0,75 г дигидрофосфата натрия, 0,34-0,42 г хлорида калия, 22-35 мг L-аргинина и 1,80-3,60 г глюкозы [CN 101485886 (А), МПК A61K 47/26, 2009].
Однако по нашим данным добавление аргинина в добавочный раствор для хранения тромбоцитов ускоряет расход глюкозы, оставшейся в растворе с нативной плазмой; ускорение расхода требует добавления в раствор экзогенной глюкозы, что и было сделано авторами. Однако введение дополнительного количества глюкозы повышает опасность бактериальной контаминации заготовленных тромбоцитов, что нежелательно; кроме того, добавление глюкозы создает дополнительные технологические трудности при стерилизации добавочного раствора.
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту к заявляемому раствору является добавочный раствор для хранения тромбоцитов [US 10271541 (В2), МПК A01N 1/02; A61J 1/10, 2019], включающий электролиты - хлориды натрия, калия, магния и кальция, - компоненты буферной смеси - дигидрофосфат и гидрофосфат натрия, - цитрат натрия, «питательный компонент» (nutrient component) -ацетат натрия и глюкозу, - и дополнительно 0,01-100 мМоля ингибитора β-галактосидазы и 0,01-100 мМоля ингибитора сиалидазы. В качестве ингибитора β-галактосидазы использовались, например, 1-деоксигалактонойримицин, N-(n-бутил)деоксигалактонойримицин и др.; в качестве ингибитора сиалидазы предлагаются фетуин, 2,3-дегидро-2-деокси-К-ацетилнейраминовая кислота (DANA), этил(3R,4R,5S)-5-амино-4-ацетамидо-3-(пентан-3-илокси)-циклогекс-1-ен-1-карбоксилат) и др. По данным, приведенным в прототипе, в присутствии ингибиторов галактосидазы и сиалидазы тромбоциты сохраняют свойства в течение 9 суток хранения.
В US 10271541 приводятся данные о положительном влиянии указанных ингибиторов на состояние тромбоцитов, но не приводится данных об их влиянии на реципиента, получающего трансфузию тромбоцитной массы, заготовленной в этом растворе. Нельзя исключить, что введение указанных в прототипе веществ в качестве ингибиторов может привести к нежелательным реакциям при клиническом использовании тромбоцитов, поскольку эти вещества не физиологичны, то есть они не являются участниками процессов естественного метаболизма. Этот аргумент особенно весом при использовании концентрата тромбоцитов в онкогематологической практике. Кроме того, этому раствору присущи недостатки, связанные с дополнительным введением экзогенной глюкозы.
Результат, на достижение которого направлено заявляемое изобретение, заключается в сохранении количества и функциональной активности тромбоцитов в период их хранения с использование метаболического компонента физиологической природы в добавочном растворе.
Указанный результат достигается тем, что добавочный раствор для хранения тромбоцитов, включающий хлориды натрия, калия и магния, одно- и двузамещенный фосфаты натрия и питательный компонент, включающий цитрат натрия, в составе питательного компонента дополнительно содержит фумарат натрия при следующем соотношении компонентов в миллимолях (мМоль) на 1 литр раствора:
хлорид натрия
61,0±3,0
хлорид калия
4,9±0,25
хлорид магния
1,45±0,25
гидрофосфат натрия
17,1±0,1
дигидрофосфат натрия
6,65±0,15
цитрат натрия
10,75±0,25
фумарат натрия
17,0±5,0
Раствор может включать 46±1 мМоль/л маннита, который вводят для регулировки и поддержания осмолярности раствора в пределах 300-330 мосм/л.
Заявляемый раствор получен растворением компонентов раствора в 1000 мл бидистиллированной воды; раствор был профильтрован через фильтр миллипор, разлит во флаконы и стерилизован автоклавированием.
В эксперименте на животных (крысы, кролики) выяснено, что заявляемый раствор не токсичен и апирогенен.
Для получения концентрата тромбоцитов сбор цельной крови осуществляли в одноразовый полимерный контейнер для сбора, хранения и транспортировки крови «ТЕРУМО», строенный, объемом 450/450/450 мл, CPD/SAGM, Top&Bottom, Япония. Заготовку донорской крови проводили на весах-помешивателях Transwaag KL (Transmed Medizintechnik GmbH&Co, Германия). Оптимальное время донации до 12 мин.
После выдерживания консервированной крови в течение 2 часов при температуре +22°С проводилось первичное «жесткое» центрифугирование на рефрижераторной центрифуге Cryofuge 5500i (Heraeus, Thermo Electron Corporation, США). Для фракционирования крови с дальнейшим получением эритроцитарной взвеси, плазмы и стандартной дозы лейкотромбослоя (ЛТС) в объеме 45-60 мл использовали систему автоматической экстракции компонентов крови Novomatic (LMB Tehnologie GmbH, Германия). Полученные дозы ЛТС хранили при температуре 22±2°С до 24 часов от момента заготовки крови без помешивания.
После выбраковки отдельные дозы ЛТС объединяли по групповой совместимости в контейнер для разделения, хранения и транспортировки компонентов крови TAKSI PL KIT, Terumo. Далее проводили экстракцию путем разбавления заявляемым добавочным раствором или раствором SSP+.
Для отделения тромбоцитного концентрата от других клеточных элементов пула использовали «мягкий» режим центрифугирования на специализированном центрифужном сепараторе TACSI (Бельгия). Экстракция тромбоцитов происходила во время центрифугирования. Пресс системного блока под контролем микропроцессора и оптических датчиков «выжимал» пул тромбоцитов через лейкоцитарный фильтр в мешок для длительного хранения. При этом среда для хранения содержала 30% аутологичной (нативной) плазмы и 70% добавочного раствора.
Было изучено изменение показателей сохранности тромбоцитов при хранении в заявляемом растворе в течение 9 суток; для сравнения был взят раствор SSP+.
Метаболическую активность тромбоцитов определяли по снижению содержания в пробах нативной глюкозы и нарастанию содержания лактата и по изменению рН. Содержание глюкозы, молочной кислоты (лактат) и значение рН в образцах тромбоцитного концентрата исследовали с помощью биохимического анализатора Radiometer ABL-800 (Дания). Для определения концентрации тромбоцитов и объема клеток использовали гематологический анализатор SISMEX, КХ 21N (Япония). Результаты испытаний представлены в Таблице 1.
Функциональное состояние тромбоцитов оценивали по степени индуцированной агрегации тромбоцитов. Исследование агрегационных свойств тромбоцитов проводилось по методу Борна на 4-х канальном анализаторе агрегации тромбоцитов АТ-2. Температура в термостатируемой исследуемой ячейке 37°С, скорость вращения магнитной мешалки 750 об/мин.
Для оценки агрегации тромбоцитов была использована наиболее информативная величина - максимальная амплитуда агрегации (МА). 100% светопропускания (контроль) выставляли по смеси бестромбоцитной плазмы и буферного раствора в соотношении 3:2 (0,3 мл плазмы + 0,2 мл буфера).
9
Количество тромбоцитов в исследуемой плазме влияло на результат измерения, и для исследования плазму стандартизовали до получения концентрации тромбоцитов 200-250×10/л. Концентрацию тромбоцитов определяли в режиме подсчета тромбоцитов на анализаторе SISMEX. Если концентрация тромбоцитов в плазме была выше заданного уровня, то ее разбавляли, добавляя бестромбоцитную плазму.
9
Исследуемую суспензию тромбоцитов разводили бестромбоцитной донорской плазмой IV группы для увеличения белковой фракции и нормирования количества тромбоцитов до 200×10/л. Кювету с 450 мкл тестируемой суспензии помещали в агрегометр, добавляли 50 мкл индуктора и регистрировали агрегацию тромбоцитов.
Использовались реактивы CHRONO-PAR: аденозиндифосфат (АДФ), коллаген, ристоцетин фирмы CHRONO-LOG. Реактивы расфасовывали в микропробирки типа «Эппендорф» и хранили в холодильной или морозильной камере. Перед началом исследования реактивы разводили буферным раствором. Результаты измерений представлены в Таблице 2.
Сравнительное исследование показателей сохранности тромбоцитов в процессе хранения в заявляемом растворе и в растворе SSP+ показало (Табл. 1), что заявляемый раствор создает лучшие условия для хранения тромбоцитов по сравнению с раствором SSP+. Количество тромбоцитов в заявляемом растворе к 9 дню хранения составляет 93,3±4,0% от первоначального количества, в растворе SSP+ 87,6±6,1%.
Количество глюкозы в двух растворах в начале хранения было практически одинаковым: 3,87±0,30 ммоль/л в заявляемом растворе и 3,73±0,23 ммоль/л в растворе SSP+, но к 6 дню хранения в заявляемом растворе осталось 0,97±0,63 ммоль/л глюкозы, а в растворе SSP+ 0,16±0,04 ммоль/л, а к 8 дню хранения в заявляемом растворе осталось 0,57±0,14 ммоль/л глюкозы, а в растворе SSP+ 0,10±0,00 ммоль/л, различие статистически достоверно.
Количество лактата в начале хранения было разным в растворах и составило в заявляемом растворе 6,09±0,74 ммоль/л, в растворе SSP+ 7,87±0,76 ммоль/л; при хранении в заявляемом растворе к 6 дню хранения составляет 9,87±1,09 ммоль/л, в растворе SSP+ 14,45±0,44 ммоль/л, а к 9 дню хранения составляет в заявляемом растворе.
Таким образом, при одинаковых исходных значениях содержания глюкозы в растворах заявляемый раствор обеспечивал более экономичное ее потребление. При этом 11,9±0,1 ммоль/л, в растворе SSP+ 14,2±1,7 ммоль/л, различие статистически достоверно.
Нарастание концентрации лактата в присутствии фумарата натрия происходит медленнее, чем в растворе SSP+. Более низкие значения содержания лактата в сочетании с более высоким содержанием глюкозы к концу хранения тромбоцитов в заявляемом растворе свидетельствует о способности этого раствора поддерживать процессы аэробного окисления, позволяющие обеспечить более эффективную выработку АТФ. В растворе SSP+, судя по результатам, преобладают реакции анаэробного гликолиза, косвенно отражающие состояние энергетического дефицита тромбоцитов.
Значение рН во время хранения тромбоцитов в двух растворах менялось незначительно: в заявляемом растворе от 7,16±0,02 в начале хранения до 7,09±0,02 к 9 дню, а в растворе SSP+ от 7,07±0,04 до 7,13±0,06 в те же сроки. И, хотя динамика значений рН за период наблюдений в обоих растворах была различной, сами значения рН менялись крайне незначительно, что свидетельствует о достаточной компенсационной возможности буферных систем в растворах.
Согласно данным литературы, с увеличением срока хранения тромбоцитов в добавочных растворах, увеличивается их объем. По нашим наблюдениям средний объем тромбоцитов незначительно увеличивался по мере возрастания сроков хранения в обоих растворах: от 8,0±0,2 мкм в начале хранения до 8,9±0,6 мкм к 9 дню в заявляемом растворе, а в растворе SSP+ от 8,4±0,2 до 9,8±0,2 мкм в те же сроки. Выявленные изменения размеров тромбоцитов укладывались в границы физиологической нормы.
Однако наблюдаемое различие статистически достоверно и свидетельствует о лучшей сохранности тромбоцитов в заявляемом растворе по сравнению с раствором SSP+.
Исследование агрегационной способности тромбоцитов с различными индукторами (Табл. 2) во время хранения показало, что в начале хранения максимальная амплитуда агрегации (МА) составляла при использовании АДФ 11,4±1,8% для заявляемого раствора и 15,9±2,3% для раствора SSP+, однако к 9 дню хранения эти цифры составили 3,6±1,5% и 0,4±0,4 соответственно. При более высокой начальной агрегационной способности тромбоцитов, заготовленных в растворе SSP+, к концу хранения клеток она падала до нуля, в то время как тромбоциты в заявляемом растворе сохраняли некоторую способность к агрегации. Эта же тенденция прослеживалась и в случае использования индукторов ристоцетина и коллагена.
Чтобы быть клинически эффективными, тромбоциты должны вернуться в циркуляцию после их трансфузии. По литературным данным [Н.М. Rinder, E.L. Snyder, J.B. Tracey et al II Transfusion. - 2003. - Vol. 43, N 9. - P. 1230-1237; S.J. Slichter, D. Bolgano, M.K. Jones et al. // Transfusion. - 2006. - Vol. 46, N 10. - P. 1763-1769] ни один из тестов in vitro не коррелирует с возмещением и выживаемостью тромбоцитов, хотя они и дают важную информацию о физиологии тромбоцитов и степени убывания их функций во время хранения. Возмещение in vivo и выживаемость - необходимые показатели в оценке качества тромбоцитов.
Для определения этих показателей были поставлены модельные опыты на кроликах. Методом массивного кровопускания у животных удаляли около 40% объема циркулирующей крови, вызывая тем самым выраженную тромбоцитопению. Через 24 часа после кровопускания число тромбоцитов в кровеносном русле кроликов составляло 13-15% от исходных величин. Введение терапевтической дозы тромбоконцентрата, заготовленного на заявляемом растворе, приводило к возрастанию содержания тромбоцитов до исходных значений, а порой и к превышению исходного уровня. У кроликов, не получавших трансфузии тромбоконцентрата, спонтанное восстановление числа тромбоцитов в кровеносном русле в те же сроки наблюдения не превышало 60%.
Таким образом, заявляемый добавочный раствор, содержащий в качестве метаболического компонента фумарат натрия - один из субстратов цикла Кребса, - позволяет в значительной степени сохранить метаболическую и функциональную активность тромбоцитного концентрата, а также их выживаемость в период хранения и возмещение в условиях in vivo.