Система для изучения бокового амиотрофического склероза на основе пациент-специфических индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

УДК 576.3

Система для изучения бокового амиотрофического склероза на основе пациент-специфических индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

И. В. Честков1*, Е. А. Васильева1, С. Н. Иллариошкин2, М. А. Лагарькова1, С. Л. Киселев1 'Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, 119991, Москва, ул. Губкина, 3 2Научный центр неврологии РАМН, 125367, Москва, Волоколамское ш., 8 *E-mail: ichestkov@vigg.ru Поступила в редакцию 09.09.2013

РЕФЕРАТ Технология генетического репрограммирования позволяет получать плюрипотентные стволовые клетки индивидуально для каждого пациента. Эти клетки, названные индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками (иПСК), могут стать неограниченным ресурсом для получения специализированных типов клеток. Таким образом, появляется возможность использования аутологичных соматических клеток в заместительной терапии, а также создания in vitro моделей для изучения механизмов патогенеза заболеваний и поиска новых лекарственных препаратов. Боковой амиотрофический склероз (БАС) - неизлечимое нейродегенеративное заболевание, при котором наблюдается поражение верхних и нижних двигательных (моторных) нейронов. Примерно в 10% случаев БАС генетически наследуется, и самая распространенная семейная форма этого заболевания ассоциирована с мутациями в гене SOD1. Мы использовали технологию репрограммирования для получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток пациентов с семейными формами БАС. Пациент-специфические иПСК получали при помощи интеграционных и неинтеграционных методов доставки транскрипционных факторов репрограммирования. Эти линии иПСК обладали свойствами плюрипотентных клеток и были способны к направленной дифференцировке в моторные нейроны.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА боковой амиотрофический склероз, дифференцировка, индуцированные плюрипотент-ные стволовые клетки, моторные нейроны.

ВВЕДЕНИЕ

Боковой амиотрофический склероз (БАС, также известный как болезнь моторных нейронов, болезнь Шарко, болезнь Лу Герига) - это прогрессирующее нейродегенеративное заболевание с поздним началом, при котором наблюдается специфическая гибель моторных нейронов спинного и головного мозга. В ходе развития заболевания происходит постепенная деиннервация мышц, и смерть наступает в результате поражения дыхательной мускулатуры. На сегодняшний день не существует эффективной ранней диагностики БАС, поэтому от момента появления первых симптомов до смерти больного проходит не более 5 лет. Большинство случаев БАС (приблизительно 90%) не имеют явной генетической наследуемости и характеризуются как спорадические. Наиболее распространенная семейная форма БАС (ALS1, 20% от всех семейных случаев) ассо-

циирована с аутосомно-доминантными мутациями в гене Си^п-супероксиддисмутазы 1 (SOD1). Охарактеризовано более 170 мутаций в гене SOD1, которые приводят к развитию БАС (база данных ALSoD от 28.06.2013).

Однако связь между генетическим дефектом и гибелью моторных нейронов до сих пор не обнаружена. Введение в мышей мутантного аллеля гена SOD1 человека позволило воспроизвести основные симптомы нейродегенерации при БАС и проверить ряд гипотез о патогенетических основах этого заболевания. Было показано, что токсическое действие SOD1 на моторные нейроны не связано с нарушением или потерей ферментативной активности. У животных, несущих как активные (hSOD1G37R [1], hSOD1G93A [2]), так и неактивные (hSOD1G85R [3], hSOD1G127X [4]) формы фермента, симптомы были сходными с симптомами при БАС, включая потерю

синаптических контактов моторных нейронов [5], нарушение митохондрий [6] и активацию глиальных клеток [7]. Более того, мыши с гомозиготным нокаутом гена SOD1 не имели никаких признаков нейро-дегенеративных нарушений [8].

Каталитическая активность SOD1 зависит от присутствия в активном центре иона меди. Находясь в свободном состоянии, этот ион проявляет крайнюю реакционноспособность и токсичность, поэтому неэффективная доставка в активный центр SOD1 или нарушение связывания за счет конформационных изменений фермента (в результате мутаций) могут стать причиной внутриклеточных нарушений и гибели моторных нейронов. Однако удаление специализированного шаперона-переносчика меди для SOD1 (CCS) [9] или мутации в Си-связывающем сайте фермента [10] не снижали токсическое действие на моторные нейроны у мышей.

Тем не менее конформационные нарушения и токсичность мутантного SOD1 рассматриваются в настоящее время как основная причина возникновения БАС. В результате утраты ионов меди и цинка, разрыва внутримолекулярных дисульфидных связей происходит диссоциация гомодимерного нативного фермента на мономеры и формируются белковые агрегаты - один из признаков классического БАС [11]. Более того, обнаружение таких белковых агрегатов в моторных нейронах большинства пациентов со спорадическими формами БАС указывает на олигомеризацию SOD1 как на общую черту данного заболевания независимо от его генотипа [12]. В поддержку конформационной теории говорит и существование форм с различным проявлением и скоростью прогрессии в зависимости от мутации в гене SOD1.

Следует отметить, что гибель моторных нейронов при БАС может не быть автономным клеточным процессом, поскольку экспрессия мутантного гена SOD1 только в мотонейронах не приводит к появлению признаков нейродегенерации у трансгенных мышей [13], в то время как токсический эффект показан для астроцитов [14] и клеток микроглии [7].

Однако результаты, полученные на трансгенных животных, не всегда можно прямо перенести на человека, а системы с повышенной экспрессией мутантного гена SOD1 могут не воспроизводить действительную картину заболевания на молекулярном уровне. При этом изучение БАС у человека затрудняется труднодоступностью пораженных тканей. Технология генетического репрограммирования позволяет перевести практически любые доступные клетки пациента, например фибробласты кожи [15], эндотелиальные клетки [16, 17], в плюрипотентное состояние. Полученные при этом индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (иПСК) обладают

всеми свойствами эмбриональных стволовых клеток (ЭСК), включая неограниченный пролиферативный потенциал и способность к дифференцировке во все типы клеток организма.

В представленной работе получены иПСК для пациентов с семейными формами SOD1 -ассоциированного БАС путем репрограммирования первичных фибробластов кожи с помощью эктопической экспрессии генов четырех транскрипционных факторов Oct3/4, Sox2, c-Myc и Klf4. Полученные линии иПСК охарактеризованы, разработана методика их диффе-ренцировки в моторные нейроны.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Получение культуры фибробластов кожи

Биоптаты кожи размещали под покровные стекла на чашках Петри (Greiner Bio-One), покрытых 0.1% раствором желатина (Sigma), и культивировали в питательной среде DMEM («ПанЭко») с добавлением 10% FBS (Hyclone), 1% раствора заменимых аминокислот (Invitrogen), 2 мМ L-глутамина (Invitrogen), 50 ед./мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина («ПанЭко»), 4 нг/мл hrbFGF (PeproTech) (среда для фибробластов). При достижении конфлюэнтного монослоя, образующегося примерно на 14 день, клетки пассировали путем обработки 0.25% раствором трипсина (Hyclone). С целью длительного хранения культуры фибробластов клетки замораживали в DMEM с добавлением 20% FBS и 10% ДМСО.

Клеточные культуры

Первичные линии фибробластов кожи культивировали как описано выше. Клетки упаковывающей линии Phoenix культивировали в DMEM с добавлением 5% FBS, термически инактивированной (56°С), 2 мМ L-глутамина, 50 ед./мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина на чашках Петри, покрытых 0.1% раствором желатина. Линии иПСК культивировали в среде mTeSR1 (STEMCELL Technologies) на чашках Петри, покрытых матригелем (Matrigel, BD). Все клеточные линии культивировали в 5% CO2 при 37°С.

Получение рекомбинантных лентивирусов

Рекомбинантные лентивирусы получали путем трансфекции упаковывающей клеточной линии Phoenix лентивирусными векторами, кодирующими репрограммирующие факторы: LeGO-hOct3/4, LeGO-hSox2, LeGO-hKlf4, LeGO-hc-Myc по ранее описанной методике [18].

Трансфекция фибробластов и получение иПСК

Репрограммирование фибробластов неинтеграционным способом проводили с использова-

нием CytoTune-iPS Sendai Reprogramming Kit (Invitrogen) в соответствии с рекомендациями производителя.

Для репрограммирования рекомбинантными лен-тивирусными частицами фибробласты на первом пассаже рассевали на б-луночный планшет (Greiner Bio-One) по 100000 клеток каждой первичной линии на лунку и инкубировали в среде для фибробла-стов в течение ночи. На следующий день клеткам заменяли среду на свежую, содержащую 8 мкг/мл полибрена (Sigma), инкубировали в течение 1 ч, затем добавляли вирусные частицы всех четырех типов с множественностью заражения 5 для каждого лентивируса. Смену среды проводили 1 раз в 2 дня. На пятый день с момента трансфекции фибробласты, обработанные 0.25% раствором трипсина, пересевали на подложку из митотически инактивированных митомицином С (10 мкг/мл, Sigma) эмбриональных фибробластов мыши на 10-см чашки Петри, предварительно покрытые 0.1% раствором желатина. На шестой день среду для фибробластов заменяли средой для культивирования ЭСК человека следующего состава: DMEM/F12 (1 : 1) («ПанЭко»), 20% заменителя сыворотки Knockout Serum Replacement (KO SR, Invitrogen), 1% NEAA, 2 мМ L-глутамина, 50 ед./мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина, 0.1 мМ Р-меркаптоэтанола (Sigma), 4 нг/мл hrbFGF, содержащую ингибитор гистон-метилтрансферазы BIX-01294 (1 мкМ, Sigma), ингибитор деацетилазы гистонов вальпроевую кислоту (1 мМ, Sigma). Смену среды осуществляли ежедневно. BIX-01294 и валь-проевую кислоту добавляли в среду в течение 7 дней. Колонии, морфологически не отличимые от колоний ЭСК, были отобраны механически и помещены на подложку из матригеля в среду mTeSR1.

Визуализация активности эндогенной щелочной фосфатазы

С чашек Петри отбирали среду, клетки промывали 2 раза буферным раствором следующего состава: 100 мM Tрис-HCl, 100 мЖ NaCl, 5 мM MgCl2, 0.05% Tween-20, pH 9.5. Затем буферный раствор отбирали и добавляли рабочий раствор: 0.02% BCIP, 0.03% NBT в 0.1 M буфере TBS (Tris-Buffered Saline), pH 9.5. Инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре, промывали 2 раза буферным раствором и проводили микроскопический анализ с подсчетом позитивно окрашенных колоний.

Кариотипирование и иммуноокрашивание

Препараты метафазных хромосом линий иПСК и иммуноокрашивание проводили как описано в [17].

В качестве первичных антител использовали: мышиные моноклональные антитела к SSEA-4 (1 : 100),

TRA-1-60 (1 : 100), TRA-1-81 (1 : 50) (Cell Signaling Technology); к HB9 (1 : 50, Developmental Hybridoma Bank или DSHB); к PIII-тубулину (1 : 500, Abcam); к виментину (1 : 200, Dako); кроличьи моноклональные антитела против Nanog (1 : 200), Oct4 (1 : 300), Sox2 (1 : 400) (Cell Signaling Technology); кроличьи поликлональные антитела против ChAT, PIII-тубулина, GFAP (1 : 500, Abcam); против а-фетопротеина (1 : 400, Dako). В качестве вторичных антител использовали антитела козы к IgG кролика, конъюгированные с Alexa Fluor 555 (Invitrogen, 1 : 700), и антитела козы к IgG мыши, конъюгированные с Alexa Fluor 488 (Invitrogen, 1 : 500).

Для окрашивания ядер использовали DAPI. Препараты анализировали на эпифлуоресцентном микроскопе Axio Imager A1 (Carl Zeiss). Цветные фотографии микрообъектов в псевдоцветах получали с помощью программы AxioVision (Carl Zeiss).

Формирование эмбриоидных телец и дифференцировка in vitro

Спонтанную дифференцировку плюрипотентных клеток индуцировали по ранее описанной методике [18].

Нейрональная дифференцировка

Для получения мотонейронов in vitro использовали протокол дифференцировки [19] с некоторыми модификациями. Эмбриоидные тельца получали с помощью планшета AggreWell400 (STEMCELL Technologies) в среде DMEM/F12 c добавлением 5% заменителя сыворотки Knockout Serum Replacement (KO SR), 1% NEAA, 2 мМ L-глутамина, 50 ед/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина, 0.1 мМ Р-меркаптоэтанола, 200 нг/мл рекомбинантного белка Noggin человека (Biological Industries) и 2 мкМ SB431542 (Stemgent) в течение 12 дней. Затем в течение 10 дней эмбриоидные тельца культивировали в Neurobasal Medium (Gibco) c добавлением 2 мМ L-глутамина, B27 (Gibco), 1 мкМ ретиноевой кислоты, 200 нг/мл рекомбинантного Sonic hedgehog (PeproTech), 10 нг hrbFGF, после чего переносили на чашки Петри, покрытые матригелем в Neurobasal Medium, содержащей 2 мМ L-глутамина, по 10 нг/мл BDNF, GDNF (все от PeproTech) и культивировали еще в течение 14 дней. Прикрепленные колонии обрабатывали аккутазой (Sigma), разбивали до одноклеточной суспензии и культивировали на чашках Петри, покрытых матригелем в течение 5 дней, после чего проводили иммуноокрашивание.

Направленную дифференцировку плюрипотент-ных клеток в астроциты проводили как описано в [20].

Рис. 1. Получение стабильных линий иПСК и определение эффективности репрограммирования первичных фибробластов кожи пациентов с семейными формами БАС. А - первичная культура фибробластов кожи; Б -формирование колоний иПСК на 15 день после введения генов репрограммирующих факторов; В - колония иПСК в бесфидерных условиях культивирования после механического отбора; Г, Д - визуализация колоний иПСК, полученных с помощью лентивирусных частиц (Г) и рекомбинантного вируса Сендай (Д), при окраске на активность эндогенной щелочной фосфатазы;

Е - сравнение эффективности репрограммирования при использовании двух систем

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Генетическое репрограммирование фибробластов кожи больных семейной формой БАС

Биоптаты кожи пациентов с охарактеризованными формами БАС были предоставлены Научным центром неврологии РАМН. Из материала биопсий были получены гомогенные культуры первичных фибро-бластов кожи. Миграция клеток из кожных эксплан-тов происходила в течение 2 недель до формирования первого монослоя. Не позднее 1-2 пассажа в клеточные культуры с помощью лентивирусной системы доставки или рекомбинантных вирусов Сендай были введены гены четырех факторов транскрипции -0^3/4, Sox2, с-Мус, К^4. Для повышения эффективности генетического репрограммирования в среду культивирования добавляли низкомолекулярные соединения: ингибитор гистон-метилтрансферазы (В1Х-01294) [21] и ингибитор деацетилазы гистонов (вальпроевая кислота) [22]. Индукция плюрипотент-ного состояния в соматических клетках сопровождается целым каскадом эпигенетических событий,

Сравнение профилей коротких тандемных повторов (КТП) первичных фибробластов кожи пациентов (ФЧ) с семейными формами БАС и полученных линий иПСК

КТП- маркер ФЧ1 иПСК1.2 ФЧ2 иПСК2.2

AMEL X Y X Y X X X X

CSF1PO 10 14 10 14 10 12 10 12

D10S1248 13 14 13 14 14 15 14 15

D12S391 1б 23 1б 23 20 23 20 23

D13S317 11 12 11 12 11 11 11 11

D16S539 12 12 12 12 11 13 11 13

D18S51 15 15 15 15 13 14 13 14

D1S1656 13 17.3 13 17.3 12 1б.3 12 1б.3

D22S1045 15 1б 15 1б 15 1б 15 1б

D2S441 10 13 10 13 11 14 11 14

D3S1358 15 1б 15 1б 17 18 17 18

D5S818 11 11 11 11 12 13 12 13

D7S820 9 11 9 11 10 12 10 12

D8S1179 13 14 13 14 14 15 14 15

FGA 21 23 21 23 21 21 21 21

SE33 1б 30.2 1б 30.2 2б.2 2б.2 2б.2 2б.2

TH01 9 9.3 9 9.3 б 9.3 б 9.3

TPOX 9 11 9 11 8 8 8 8

vWA 17 18 17 18 17 18 17 18

включая метилирование промоторных участков генов, экспрессирующихся в терминально дифференцированных клетках; активацию генов плюрипотент-ного состояния при гипометилировании промоторов; глобальные изменения хроматина и реактивацию Х-хромосомы, замолкающей при развитии организма [17]. Начиная с 11 дня после введения репрограммирующих генов происходило формирование компактных колоний, состоящих из активно делящихся клеток с увеличенным соотношением ядро/цитоплазма, по сравнению с изначальной культурой фи-бробластов (рис. 1А,Б). На основе морфологического сходства с ЭСК был проведен механический отбор индивидуальных колоний с целью создания стабильных линий иПСК (рис. 1В). При окраске на щелочную

Л

Г <у>- • • *уЯВ V - ‘ Ж ШШ&* Щ'' Ж

7 ' •  Д шршд З — :ф  'ЛігНк' '

;.4я? •*, 4 • * $ • . і • . • - :

Е §н И  * - • Г ’ ' - »" .у ' 4 я '«*, * V ЧЇ '* Я 'у , 1 - ? *" ‘ ’ -. ' ' •: ’' С»*- * Ч Ч.*П'

К

Л

П ПЛ И II 1> и

іі ** I* и п и

ТССЄЄ ІЧТбТЄ с

А А д цдА 1ы

111 1 /\ 1 /11 А' А А \ \ Л / \ / 1 1 \ 1

и 1/ \/ VI л/V V V V

-1 -> ' 1-І 1-І

ит/дєт Т Є ТСТМАСТСТС

Рис. 2. Характеристика пациент-специфических линий иПСК. А—И - визуализация маркеров плюрипотентного состояния при иммуноцитохимическом окрашивании на транскрипционные факторы Ос+3/4 (Г), Sox2 (Д),

№под (Е) и поверхностные антигены SSEA-4 (Ж), TRA-1-60 (3), TRA-1-81 (И). Показано также окрашивание ядер клеток с помощью DAPI (А - В); К - кариотип линии иПСК, GTG-бэндинг; Л, М - результаты секвенирования, подтверждающие мутации в гене SOD1, в полученных иПСК

Б

В

фосфатазу, активность которой возрастает в плю-рипотентных клетках [23], мы обнаружили, что эффективность репрограммирования при использовании лентивирусной системы (0.77 ± 0.025%) в 10 раз выше, чем при использовании рекомбинантного вируса Сендай (0.083 ± 0.006%) (рис. 1Г,Д,Е). Кроме того, стабилизация плюрипотентного состояния в полученных с помощью вируса Сендай линиях иПСК, не содержащих трансгенов, происходила постепенно, в течение нескольких пассажей, что сопровождалось высоким процентом спонтанно дифференцированных клеток (данные не приведены). Тем не менее использование неинтеграционных методов позволяет получать генетически немодифицированные плюри-потентные клетки для каждого пациента, что важно в случае использования клеток как в заместительной терапии, так и при изучении патогенеза заболеваний, так как интеграция трансгенов в районы активного хроматина может привести к изменению экспрессии генов.

Характеристика пациент-специфических линий иПСК

Согласно результатам иммуноцитохимического окрашивания полученные линии иПСК экспрес-

А

Ж

А \2к -5

Рис. 3. Спонтанная дифференцировка иПСК в производные трех зародышевых листков. А - репрезентативная фотография эмбриоидных телец; Б, В, Г - имму-ноцитохимическое окрашивание на а-фетопротеин

В

Г

сируют специфические для ЭСК поверхностные антигены: SSEA-4, ТИА-1-60, ТИА-1-81, а также ядерные факторы транскрипции, ассоциированные с плюрипотентностью - Nanog, Ос14, Sox2 (рис. 2А-И). Анализ кариотипа линий иПСК методом GТG-бэндинга не выявил изменений в числе и структуре хромосом, возникших в процессе репрограммирования (рис. 2К). С целью определения способности иПСК к дифференцировке в производные трех зародышевых листков все анализируемые линии были помещены в суспензионную культуру, где образовывали трехмерные структуры - эмбриоидные тельца. После 14 дней культивирования эмбриоидные тельца переносили на покрытый желатином культуральный пластик для адгезии и последующей миграции клеток. Прикрепленные клетки обладали различной морфологией, и при иммуноцитохимическом окрашивании

были выявлены клеточные популяции, позитивные по рШ-тубулину (маркер эктодермы), виментину (маркер мезодермы) и а-фетопротеину (маркер эндодермы) (рис. 3).

Для подтверждения того, что полученные линии иПСК произошли именно из первичных фибро-бластов пациентов, мы проверили профили коротких тандемных повторов (КТП) этих линий клеток. Оказалось, что иПСК полностью совпадают с изначальными линиями фибробластов по 18 КТП-маркерам (таблица). При этом в полученных линиях иПСК детектируется также генетическая причина БАС - мутация в гене SOD1, своя для каждого пациента (рис. 2Л,М).

Таким образом, по морфологическим признакам, экспрессии маркеров плюрипотентности, способности дифференцироваться в производные всех трех зародышевых листков линии иПСК, полу-

А

Г

Ж

К

Б

Д

З

В

Е

И

Рис. 4. Нейрональная дифферен-цировка пациент-специфических иПСК с мутациями в гене SOD1. А,

Б - репрезентативные фотографии нейроноподобных клеток при диффе-ренцировке иПСК; В - иммуноцито-химическое окрашивание на общий нейрональный маркер рШ-тубулин (ТиВВЗ); Г-И - визуализация маркеров моторных нейронов НЬ9 (Д,

Е) и 0)АТ (3, И);

К - детекция белка GFAP при диффе-ренцировке иПСК в астроциты. Ядра клеток окрашены DAPI

ченные из фибробластов кожи пациентов с SOD1-ассоциированным БАС, являются плюрипотент-ными.

Получение моторных нейронов из иПСК с мутациями в гене SOD1

Как показано ранее, гибель моторных нейронов при БАС может быть не автономным клеточным процессом, а зависеть от клеток микроокружения [7, 14]. Поэтому нашей дальнейшей задачей стала разработка протоколов дифференцировки иПСК в моторные нейроны и астроциты. Ранее в экспериментах in vivo было показано, что при развитии организма моторные нейроны формируются в результате воздействия на нейрональные прогениторные клетки двух последовательных сигналов: ретиноевой кислоты (каудализация)и Sonic hedgehog (вентрали-зация) [24]. Нейрональные предшественники были получены из суспензионных эмбриоидных телец с помощью ингибирования сигнального пути SMAD. Направленную дифференцировку в моторные нейроны проводили через 12 дней, добавляя в культуральную среду ретиноевую кислоту и рекомбинантный белок Sonic hedgehog. После диссоциации нейросфер до единичных клеток нейрональные предшественники переносили на чашки Петри, покрытые матриге-лем, и культивировали как прикрепленную культуру. Эти клетки экспрессируют общий нейрональный маркер piII-тубулин, что доказывает нейрональное происхождение полученной популяции клеток (рис. 4А-В). На последнем этапе под воздействием нейроспецифических факторов роста BDNF и GDNF происходило созревание моторных нейронов. Имму-ноцитохимический анализ показал, что в полученных культурах рШ-тубулинпозитивные нейроны коэк-спрессировали такие маркеры, как Hb9 (или MNX1;

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Wong PC., Pardo C.A., Borchelt D.R., Lee M.K., Copeland N.G., Jenkins N.A., Sisodia S.S., Cleveland D.W., Price D.L. // Neuron. 1995. V. 14. P 1105-1116.

2. Howland D.S., Liu J., She Y., Goad B., Maragakis N.J., Kim B., Erickson J., Kulik J., DeVito L., Psaltis G., et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. V. 99. P 1604-1609.

3. Bruijn L.I., Becher M.W., Lee M.K., Anderson K.L., Jenkins N.A., Copeland N.G., Sisodia S.S., Rothstein J.D., Borchelt D.R., Price D.L., et al. // Neuron. 1997. V. 18. P. 327-338.

4. Jonsson P.A., Ernhill K., Andersen P.M., Bergemalm D., Brannstrom T., Gredal O., Nilsson P., Marklund S.L. // Brain. 2004. V. 127. P 73-88.

5. Frey D., Schneider C., Xu L., Borg J., Spooren W., Caroni P. // J. Neurosci. 2000. V. 20. P. 2534-2542.

6. Liu J., Lillo C., Jonsson P.A., Vande Velde C., Ward C.M.,

Miller T.M., Subramaniam J.R., Rothstein J.D., Marklund S., Andersen P.M., et al. // Neuron. 2004. V. 43. P. 5-17.

7. Boillee S., Yamanaka K., Lobsiger C.S., Copeland N.G.,

транскрипционный фактор, специфичный для моторных нейронов) и ^АТ (холин-ацетилтрансфераза) (рис. 4Г—И). Таким образом, полученные линии пациент-специфических иПСК способны к направленной дифференцировке в моторные нейроны, гибель которых происходит при БАС.

Кроме того, при дифференцировке линий иПСК в астроглиальном направлении мы идентифицировали клетки, экспрессирующие GFAP - основной маркер астроцитов (рис. 4К), токсический эффект которых показан при патологии БАС.

Таким образом, получены пациент-специфические линии иПСК, которые имеют преимущество перед другими опубликованными моделями [25], так как генетически идентичны изначальным клеткам пациентов и потенциально позволяют наиболее точно воспроизвести молекулярные события при развитии БАС. Кроме того, культивирование полученных линий иПСК в определенных, заданных условиях (среда mТeSR1) позволяет поддерживать плюрипо-тентное состояние клеток для стабильного и неограниченного получения моторных нейронов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В нашей работе получены иПСК для пациентов с SOD1-ассоциированным боковым амиотрофическим склерозом. Показано, что эффективность репрограммирования при использовании лентиви-русной системы доставки генов в 10 раз выше, чем при использовании рекомбинантного вируса Сендай. Эти линии иПСК с мутациями в гене SOD1 плюрипо-тентны и способны к направленной дифференциров-ке в моторные нейроны. •

Работа поддержана РФФИ (грант № 12-04-32018).

Jenkins N.A., Kassiotis G., Kollias G., Cleveland D.W. // Science. 2006. V. 312. P 1389-1392.

8. Reaume A.G., Elliott J.L., Hoffman E.K., Kowall N.W., Ferrante R.J., Siwek D.R., Wilcox H.M., Flood D.G., Beal M.F., Brown R.H. Jr., et al. // Nat. Genet. 1996. V. 13. P. 43-47.

9. Subramaniam J.R., Lyons W.E., Liu J., Bartnikas T.B., Rothstein J., Price D.L., Cleveland D.W., Gitlin J.D., Wong PC. // Nat. Neurosci. 2002. V. 5. № 4. P 301-307.

10. Wang J., Slunt H., Gonzales V., Fromholt D., Coonfield M., Copeland N.G., Jenkins N.A., Borchelt D.R. // Hum. Mol.

Genet. 2003. V. 12. P. 2753-2764.

11. Kabashi E., Valdmanis PN., Dion P., Rouleau G.A. // Ann. Neurol. 2007. V. 62. № 6. P. 553-559.

12. Gruzman A., Wood W.L., Alpert E., Prasad M.D., Miller R.G., Rothstein J.D., Bowser R., Hamilton R., Wood T.D., Cleveland D.W., et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2007. V. 104. P. 12524-12529.

13. Pramatarova A., Laganiere J., Roussel J., Brisebois K., Rouleauet G.A. // J. Neurosci. 2001. V. 21. P 3369-3374.

14. Nagai M., Re D.B., Nagata T., Chalazonitis А., Jessell Т.М., Wichterle Н., Przedborski S. // Nat. Neurosci. 2007. V. 10.

P. б15—б22.

15. Takahashi K., Tanabe K., Ohnuki M., Narita M., Ichisaka T., Tomoda K., Yamanaka S. // Cell. 2007. V. 131. № 5. P. 8б1—872.

16. Shutova M.V., Bogomazova A.N., Lagarkova M.A., Kiselev

S.L. // Acta Naturae. 2009. V. 1. № 2. P. 91-92.

17. Lagarkova M.A., Shutova M.V., Bogomazova A.N., Vassina E.M., Glazov E.A., Zhang P., Rizvanov A.A., Chestkov I.V., Kiselev S.L. // Cell Cycle. 2010. V. 9. Р. 937-94б.

18. Shutova M.V., Chestkov I.V., Bogomazova A.N., Lagarkova M.A., Kiselev S.L. // Springer Protocols Handbook ser. 2012.

P. 133-149.

19. Egawa N., Kitaoka S., Tsukita K., Naitoh M., Takahashi K., Yamamoto T., Adachi F., Kondo T., Okita K., Asaka I., et al. // Sci. Transl. Med. 2012. V. 4. № 145. P. 145.

20. Krencik R., Zhang S.C. // Nat. Protoc. 2011. V. 6. № 11.

P. 1710-1717.

21. Shi Y., Desponts C., Do J.T., Hahm H.S., Scholer H.R., Ding S. // Cell Stem Cell. 2008. V. 3. P. 568-574.

22. Huangfu D., Maehr R., Guo W., Eijkelenboom A., Snitow M., Chen A.E., Melton D.A. // Nat. Biotechnol. 2008. V. 26.

P. 795-797.

23. Hanna J., Markoulaki S., Schorderet P., Carey B.W., Beard C., Wernig M., Creyghton M.P., Steine E.J., Cassady J. P, Foreman R., et al. // Cell. 2008. V. 133. № 2. P 250-264.

24. Wichterle H., Lieberam I., Porter J.A., Jessell T.M. // Cell. 2002. V. 110. № 3. P. 385-397.

25. Dimos J.T., Rodolfa K.T., Niakan K.K., Weisenthal L.M., Mitsumoto H., Chung W., Croft G.F., Saphier G., Leibel R., Goland R., et al. // Science. 2008. V. 321. № 5893. P. 1218-1221.