СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ ЦИТОМЕГАЛОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ ЧЕЛОВЕКА ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ И ТЕСТИРОВАНИЯ ПРОТИВОВИРУСНЫХ СОЕДИНЕНИЙ И ТРАНСПЛАНТАТ ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
METHOD FOR SIMULATING CYTOMEGALOVIRUS INFECTION IN INDIVIDUAL FOR STUDYING AND TESTING ANTIVIRAL COMPOUNDS AND TRANSPLANT FOR IMPLEMENTING IT

Изобретение относится к вирусологии и к медицине и касается разработки способа и трансплантата для создания биологической модели цитомегаловирусной инфекции человека, может быть использована для изучения патогенеза инфекции, вызванной цитомегаловирусом человека для анализа взаимодействия вируса и макроорганизма, а также для исследования in vivo противовирусного действия агентов, обладающих анти-ЦМВ активностью.
Известно, что цитомегаловирус человека (чЦМВ) широко распространен в человеческой популяции. Наибольшую опасность цитомегаловирусная инфекция (ЦМВ-инфекция) представляет для лиц с различной природой иммунодефицита, таких как ВИЧ-инфицированные, беременные женщины, новорожденные дети, пациенты после трансплантации органов и тканей. Внутриутробное инфицирование чЦМВ часто приводит к нарушению в развитии плода, у новорожденных и у детей раннего возраста ЦМВ-инфекция сопровождается развитием тяжелых патологий [1, 2]. Однако до настоящего времени остается много невыясненных вопросов, связанных с патогенезом инфекции, как на молекулярном уровне, так и на уровне организма в целом. Одна из причин кроется в самой природе ЦМВ человека и связана с его узкой видовой специфичностью, а следовательно, с неспособностью вызывать заболевания у животных. Это ограничивает или делает невозможными исследования, направленные на изучение взаимодействия вирус-хозяин. Кроме того, отсутствие модельной системы с использованием лабораторных животных создает большие сложности для разработки эффективной противовирусной терапии, а также для поиска и тестирования в условиях in vivo новых соединений, обладающих противовирусными свойствами. В то же время доклиническая стадия испытаний противовирусных агентов включает как изучение соединений in vitro (как правило, на клеточных культурах), так и in vivo (на животных).
В настоящее время предложено несколько подходов для решения данной проблемы. В опытах на животных при изучении заболеваний с узкой видовой специфичностью используются только вирусы этого же вида животных. Так, при изучении ЦМВ-инфекции применяются пары: мышь - мышиный ЦМВ (мЦМВ); морская свинка - ЦМВ морской свинки (мсвЦМВ); крыса - ЦМВ крысы (кЦМВ) и т.д. Работы, выполненные с вирусами животных, дали много важной информации о жизненном цикле ЦМВ [3, 4, 5]. Однако изучение ЦМВ-инфекции с помощью биологической модели, основанной на использовании вирусов животных в сочетании с чувствительными к ним животными, имеет существенные недостатки. Так, показано, что несмотря на значительную гомологию геномов чЦМВ и мЦМВ ДНК мышиного вируса не содержит последовательности, кодирующие целые кластеры генов чЦМВ [6]. Кроме того, ряд белков мЦМВ отличаются по функциям от аналогичных белков чЦМВ. Так, белок IE2 чЦМВ блокирует клеточный цикл, тогда как белок IE3 - эквивалент в мЦМВ, не влияет на клеточную пролиферацию. Как следствие, инфицированные мышиные клетки продолжают делиться и таким образом распространяют мЦМВ и экспрессируют основные трансактивирующие вирусные белки. По мнению Maul G.G., Negorev D., такое отличие может неадекватно отражать события, происходящие при трансплантации инфицированных органов у человека [7]. Гомология между генами ЦМВ человека и ЦМВ обезьяны составляет лишь 52% [8]. Эти различия могут влиять на клеточные и вирусные мишени и указывают на недостаточную значимость использования животных и их вирусов в качестве модели заболеваний человека.
В то же время использование таких лабораторных животных, как мыши, имеет и ряд преимуществ: малые размеры, быстрое воспроизводство поголовья, простота операционных процедур, относительно невысокая стоимость животных и их содержания. В связи с этим представляет большой интерес разработка способов моделирования инфекций человека, в которых были бы использованы мыши, способные не отторгать клетки человека, чувствительные к вирусам человека. В экспериментальной биологии и медицине известно использование различных линий генномодифицированных иммунодефицитных мышей, не способных формировать иммунный ответ на чужеродные антигены вследствие нарушения Т-клеточного или обоих звеньев иммунитета [9]. Например, иммунодефицитные «голые» (nude) линейные или гибридные мыши успешно применяются для изучения опухолей человека, клетки которых дают ксенографты при имплантации мышам и позволяют изучать закономерности формирования опухолей и биологические особенности опухолевого процесса, а также тестировать вновь создаваемые лекарственные (противоопухолевые и иммунобиологические) средства. Однако для изучения многих вирусных инфекций человека, в том числе ЦМВ-инфекции, опухолевые клетки не пригодны, так как в них вирусы либо не способны размножаться, либо формируют абортивную инфекцию, блокируемую на ранних стадиях инфекционного процесса [10].
В последние годы экспериментальным путем созданы так называемые гуманизированные мыши [11]. Эти «мышиные» модели были применены, например, для изучения ВИЧ-инфекции. В частности, известно использование мышей с тяжелым комбинированным иммунодефицитом - SCID (severe combined immunodeficient), были созданы модели с базовым названием SCID-hu. Для разработки одной из них - SCID-hu thy/liv, мышам SCID под капсулу почки трансплантировали фетальные кроветворные ткани человека (тимус и печень). Через 4-6 месяцев после имплантации у мышей развивался орган, похожий на тимус человека, после чего у них в течение года наблюдался лимфопоэз с преимущественным образованием Т-клеток человека [12]. На основе мышей SCID путем трансплантации им клеток периферической крови человека была создана также модель Hu-PBL-SCID [13]. «Мышиные» модели были применены для изучения ВИЧ-инфекции как менее дорогостоящие по сравнению с приматами и в связи с различиями, которые были обнаружены между ВИЧ-инфекцией у человека и шимпанзе [14, 15]. Однако использование таких животных имеет и очевидные ограничения. Они обусловлены как необходимостью проведения сложной хирургической операции мутантным животным, так и многомесячным периодом ожидания, необходимым для формирования в организме мышей человеческой иммунной системы и органоподобной структуры. Кроме того, на примере ВИЧ-инфекции было установлено, что описанные выше модели гуманизированных мышей позволяют изучать вирусную инфекцию только в течение короткого времени из-за отсутствия гемопоэза при быстром уменьшении популяции чувствительных к вирусу клеток и отсутствия иммунной реакции на вирусную инфекцию [16]. В мышах SCID-hu не происходит формирования иммунных клеток, относящихся к разным направлениями цитодифференцировки, что ограничивает возможности изучения патогенного действия вируса, в том числе под контролем иммунных механизмов. К недостаткам обеих моделей (SCID-hu thy/liv и Hu-PBL-SCID) относится и то, что с возрастом у гуманизированных мышей спонтанно образуются мышиные Т- и В- клетки и наблюдается высокая активность НК-клеток (натуральных киллеров), что препятствует эффективному и продолжительному функционированию пересаженных клеток человека. Кроме того, показано, что у мышей на основе линии SCID развиваются многочисленные спонтанные опухоли [17]. В настоящее время для экспериментов используют улучшенные модели гуманизированных мышей, среди которых в вирусологических исследованиях, как правило, используют мышей линии Rag1-/-γc-/- [18] или линии Rag2-/-γc-/- [19; 20], а также мышей линии NOD/SCIDγc-/-(hNSG) [21; 22]. Мыши Rag1-/-γc-/- были получены путем направленной мутации гена Rag1 или Rag2 соответственно в геноме эмбриональных стволовых клеток мыши. Мыши, дефицитные по активности RAG-1/2, не содержат зрелых Т- и В-лимфоцитов из-за блокирования ранних стадий их дифференцировки [23]. Мыши NOD/SCIDγc(-/-) - мутанты по генам Prkdc и NOD. В результате этих мутаций не происходит созревания Т- и В- лимфоцитов, а также уменьшается активность НК-клеток [24]. Гуманизированные мыши линий Rag1-/-γс-/-, Rag2-/-γc-/- и NOD/SCIDγc(-/-) содержат еще одну мутацию - в гене (γc) гамма цепи рецептора ИЛ-2 и некоторых других цитокинов [25]. Добавление этой мутации усиливает негативное действие на развитие Т- и В- клеток, блокируя сигнальные пути через ИЛ-15 [26].
Гуманизированных мышей, описанных выше, помимо отличий по ряду характеристик объединяет поддержание длительного функционирования имплантированных им человеческих клеток и обеспечение развития и дифференцировки человеческих гемопоэтических клеток, что создает условия для моделирования вирусных инфекций. Это дало основание утверждать, что функции иммунных систем гуманизированных мыши и человека близки. Однако гуманизированные мыши в настоящее время не используются в нашей стране. Основные причины: длительность и сложность получения линий с двойными/тройными мутациями (например, 8-кратные обратные скрещивания двух мутантных линий, внесение мутаций в эмбриональные стволовые клетки или подсадка фетальных органов и тканей человека [27]. Кроме того, высокая стоимость самих животных и обеспечение специальных условий их содержания значительно ограничивает возможности проведения опытов.
Наиболее близким аналогом может служить способ, разработанный Bravo F.J. с соавторами [28], который заключается в том, что мышам линии SCID имплантируют полоску желатинового геля (Gelfoam), в который предварительно вводят зараженные чЦМВ клетки крайней плоти человека.
Учитывая аргументы, перечисленные выше, в настоящем изобретении предложены новый оригинальный способ и имплантат (варианты) для моделирования ЦМВ-инфекции человека in vivo. Способ значительно удобнее и экономически выгоднее, чем ранее описанные, основанные на использовании дорогостоящих и малодоступных животных с двойными мутациями с ксенотрансплантацией человеческих органов и тканей (фетального тимуса, печени, сетчатки глаза) под капсулу почки, в селезенку или в переднюю камеру глаза. Предлагаемый способ включает использование 3 основных компонентов: мышей линии nude, имплантатов в виде 3-мерного (3D) пористого биодеградируемого матрикса (скеффолда) и высокочувствительных к вирусу чЦМВ нормальных, т.е. неопухолевых клеток человека.
К существенным признакам предлагаемого изобретения совпадающими с признаками аналога, относятся следующие.
1. Применение иммунодефицитных мышей разных генетических линий.
2. Имплантация нормальных человеческих клеток в организм мыши с помощью биодеградируемого матрикса.
3. Подкожная имплантация.
4. Использование чЦМВ для заражения имплантируемых клеток.
5. Способ заражения: инфицирование клеток до имплантации в мышь.
6. Пригодность для изучения развития ЦМВ человека в макроорганизме животного.
7. Тестирование терапевтических средств против чЦМВ in vivo.
К существенным признакам изобретения, отличающимся от признаков аналога, можно отнести следующее:
1. В качестве иммунодефицитных предложены мыши генотипа nude (с генетически детерминированной аплазией тимуса) вместо мышей генотипа SCID (с тяжелым комбинированным иммунодефицитом). Преимущества мышей линии nude в качестве реципиентов для имплантатов состоят в том, что у них менее выражена иммунодепрессия, сохраняется активность В-клеток, что позволяет анализировать реакции не только клеточного, но и гуморального звена иммунитета на ЦМВ-инфекцию. Мыши nude отличаются большей продолжительностью жизни, имеют сравнительно меньшую стоимость, а содержание их менее затратное.
2. Применение для заселения и культивирования человеческих клеток иных биодеградируемых матриксов, которые легко можно имплантировать мышам.
3. Использование этих матриксов позволяет четко локализовать имплантированные в организм мыши нормальные клетки человека, получить большое количество пролиферирующих клеток за счет пористой структуры, а также контролировать параметры инфекционного процесса.
4. Билатеральный способ подкожной имплантации мышам матриксов с клетками человека, что позволяет получить значительно большее количество зараженных чЦМВ клеток для исследования.
5. Иной способ заражения: возможность ЦМВ-инфицирования клеток имплантата, посаженного в организм мыши.
6. Предлагаемый способ пригоден не только для тестирования антивирусных средств, применяемых для терапевтических целей, но и для экстренной профилактики ЦМВ-инфекции в качестве микробицидов.
Сущность предложенного изобретения заключается в том, что разработан способ и имплантаты в виде биодеградируемого матрикса для изучения ЦМВ-инфекции человека в макроорганизме (мыши), тестирования новых противовирусных агентов in vivo, предназначенных для терапевтических и профилактических целей, а также для разработки микробицидов. Способ заключается в имплантации мышам линии nude 3-мерных биодеградируемых матриксов, нагруженных нормальными человеческими клетками, в точно локализованном инфицировании клеток человека чЦМВ. Предлагаемый способ позволяет определить дозовые характеристики терапевтического, профилактического и микробицидного действия тестируемых агентов.
Задача, на решение которой направлено изобретение, заключается в разработке способа и имплантата (варианты) для изучения ЦМВ-инфекции человека и для оценки эффективности анти-ЦМВ средств in vivo.
Указанный результат достигается имплантацией биодеградируемого матрикса, содержащего фибробласты человека, иммунодефицитным nude мышам. При этом возможно применение двух вариантов моделирования ЦМВ-инфекции. Первый вариант осуществления изобретения - это моделирование ЦМВ-инфекции человека, включающее введение цитомегаловируса человека в имплантат, предварительно посаженный (вживленный) мышам, представляющий собой биодеградируемый матрикс на основе или хитозана, или коллагеновой губки, или полилактидной матрицы и содержащий жизнеспособные нормальные клетки человека, высокочувствительных к вирусу. Второй вариант осуществления изобретения - это моделирование ЦМВ-инфекции человека, включающее прививку (вживление) мышам имплантата, представляющего собой биодеградируемый матрикс на основе или хитозана, или коллагеновой губки, или полилактидной матрицы, содержащий инфицированные чЦМВ нормальные клетки человека.
Разработанный способ характеризуется следующими признаками.
Предложено использование мутантных мышей nude, в организме которых не развиваются зрелые функционально полноценные Т-лимфоциты. В связи с этим мыши не способны отторгать чужеродные клетки и ткани, но поддерживают рост и размножение фибробластов человека, в том числе фибробластов кожи человека, чувствительных к чЦМВ.
В разработанном способе в качестве имплантата применяют биодеградируемый матрикс, например, на основе хитозана, или коллагена, или полилактидов. Такой биодеградируемый матрикс используют в качестве 3-мерного носителя для нормальных клеток человека, например фибробластов человека. Человеческие клетки, помещенные в матрикс, сохраняют жизнеспособность и пролиферативную активность в течение времени, достаточного для полного цикла репликации чЦМВ и развития ЦМВ-инфекции.
Способ может быть осуществлен в двух вариантах. Первый способ осуществления изобретения, включает:
а) культивирование клеток - фибробластов человека;
б) посев фибробластов человека в биодеградируемый матрикс;
в) нагруженный матрикс операционным способом имплантируют подкожно мышам;
г) введение цитомегаловируса человека в имплантат через 24 ч после операции.
Согласно второму аспекту настоящего изобретения предложен способ, который включает:
а) культивирование клеток - фибробластов человека;
б) инфицирование клеток инокулятом чЦМВ;
в) зараженные клетки вводят в биодеградируемый матрикс;
г) подкожная имплантация нагруженного матрикса мышам (через 24 часа).
Матриксы, нагруженные незараженными клетками человека (1-й вариант) или клетками человека, зараженными чЦМВ (2-й вариант), вживляют мышам nude билатерально хирургическим путем в стерильных условиях. Подкожную имплантацию проводят под наркозом. Оценку развития ЦМВ-инфекции проводят через несколько суток после заражения.

Разработанный способ и имплантат пригодны для тестирования in vivo новых средств, обладающих противовирусной активностью в лечебной схеме воздействия в отношении ЦМВ. Обнаружено, что ЦМВ-инфекция, развивающаяся в человеческих клетках, введенных мышам nude, чувствительна к терапевтическому референс-препарату ганцикловиру (ГЦВ) (Цимевен, Roche, Швейцария). Установлено, что лечение ЦМВ-инфицированных животных ГЦВ (однократное введение в дозе 50 мг/кг) приводит к снижению вирусной нагрузки более чем в 10 раз.
Разработанный способ пригоден также для тестирования агентов, обладающих противовирусной активностью в микробицидной схеме воздействия, применяемой для экстренной профилактики ЦМВ-инфекции в условиях макроорганизма. Это подтверждено при использовании препарата рекомбинантного интерферона α2b (ИФН α2b) (фирма ООО «ФЕРОН», Москва) в качестве микробицидного средства, который вводили мышам за 1 час до заражения ЦМВ. В образцах от мышей, получивших ИФН, количество копий ДНК было снижено более чем в 20 раз по сравнению с мышами, не получавшими инъекцию ИФН.
Оценку и пригодность разработанного способа для изучения in vivo ЦМВ-инфекции в макроорганизме и для анализа действия новых антивирусных соединений против ЦМВ-инфекции осуществляли поэтапно.
На первом этапе оценивали 3 типа матриксов для введения человеческих клеток животным по следующим параметрам: по поддержанию жизнеспособности клеток в структуре матрикса, по продуктивности ЦМВ-инфекции и по чувствительности зараженных клеток к действию противовирусного препарата.
На втором этапе определяли способность имплантированных клеток матрикса к инфицированию чЦМВ in vivo, к поддержанию продуктивной инфекции и пригодность разработанного способа для тестирования соединений, обладающих анти-ЦМВ активностью, в макроорганизме мышей nude.
Статистическую обработку проводили с использованием U-критерия Манна-Уитни.
Краткое описание чертежей
Для более ясного понимания разработанного способа и имплантата (варианты) и для его осуществления, суть которого отражена в формуле способа, а также для демонстрации его особенностей и преимуществ далее приводится подробное описание со ссылками на фигуры чертежей.
2
На фиг. 1 представлена диаграмма содержания клеток человека (фибробластов) в биодеградируемых матриксах при культивировании in vitro, например, в коллагеновом матриксе непосредственно после введения клеток в структуру и через 5 сут культивирования при 37°C в СО-инкубаторе. Содержание клеток оценивали по количеству клеточного β-глобинового гена методом ПЦР в реальном времени. Отмечен существенный прирост фибробластов человека, введенных в структуру коллагенового матрикса. Подобные результаты получены при использовании биодеградируемых матриксов на основе хитозана и полилактидной матрицы.
На фиг. 2 представлена диаграмма, демонстрирующая прирост вирусной ДНК в чЦМВ-инфицированных клетках, введенных в структуру биодеградируемого матрикса, например, из коллагена и снижение вирусной нагрузки в присутствии референс-препарата ГЦВ в концентрации 1 мкг/мл. ДНК вируса определяли с помощь ПЦР в реальном времени через 5 сут после заражения клеток. Опыты in vitro.
На фиг. 3 представлена диаграмма содержания вирусной ДНК в ЦМВ-инфицированных клетках имплантата при втором способе осуществления изобретения непосредственно после введения инокулята и через 5 сут после операции. ГЦВ вводили однократно внутрибрюшинно в дозе 50 мг/кг через 1 час после заражения. ДНК вируса определяли с помощью ПЦР в реальном времени через 5 сут после заражения клеток. Установлены прирост вирусной ДНК в ЦМВ-инфицированных человеческих клетках, имплантированных в мышей линии nude, и подавление вирусной нагрузки при лечении ГЦВ.
На фиг. 4 представлена диаграмма содержания ДНК ЦМВ в человеческих клетках, имплантированных мышам линии nude первым способом осуществления изобретения. ИФН-α2b вводили в места имплантации матриксов за 1 час до заражения вирусом в концентрации 20000 МЕ/мл. ДНК вируса определяли с помощь ПЦР в реальном времени через 5 сут после заражения клеток. Отмечены прирост вирусной ДНК в инфицированных клетках имплантата и подавление вирусной нагрузки при профилактической инъекции рекомбинантного интерферона ИФН-α2b.
Для более полной иллюстрации настоящего изобретения ниже приводятся примеры. Однако эти примеры не должны рассматриваться как некое ограничение объема настоящего изобретения во всех отношениях.
Пример 1. Оценка жизнеспособности клеток человека при культивировании в биодеградируемом матриксе.
Исследования проводили in vitro. Для человеческих клеток были использованы 3 типа биодеградируемых матриксов: 1 - на основе хитозана, например, производства «Olimp» Украина, 2 - на основе коллагена, например, производства «Белкозин» Россия), 3 - на основе полимера OPLA (Open-Cell Polylactic Acid) фирмы BD™ Biosciences (Канада).
2
Матриксы помещали в культуральную среду на 24 часа. Затем на пропитанные средой матриксы вносили 1 млн клеток человека - фибробластов, чувствительных к чЦМВ, и инкубировали 5 сут при 37°C в СО-инкубаторе. Затем в трех типах матриксов определяли жизнеспособность и прирост клеток. Для этого матриксы диспергировали, выделяли ДНК из полученного материала с использованием набора «ДНК-сорб-В» (ИнтерЛабСервис, Россия) по протоколу фирмы производителя. Содержание клеток определяли по количеству клеточного β-глобинового гена методом ПЦР в реальном времени (референс-анализ) с использованием тест-системы фирмы «ИнтерЛабСервис» (Россия) по протоколу фирмы производителя. Отмечено, что клетки не только сохраняли жизнеспособность, но и их количество увеличивалось по сравнению с исходным количеством (фиг. 1).
На фиг. 1 представлены результаты, полученные при использовании коллагеновых губок. Подобные результаты получены при использовании биодеградируемых матриксов на основе хитозана и полилактидной матрицы, что является положительным фактором для развития ЦМВ-инфекции.
Пример 2. Продукция вируса в клетках, введенных в различные матриксы.
2
Исследования проводили in vitro. Суспензию клеток - фибробластов человека, заражали чЦМВ с множественностью инфицирования 0,001 БОЕ/кл, что соответствует 0,1 копий вирусной ДНК/кл. Затем ЦМВ-инфицированные клетки вносили в предлагаемые матриксы (1 млн клеток на матрикс) и инкубировали при 37°C в СО-инкубаторе.

эмп
Через 5 сут выявляли ДНК вируса в диспергированных матриксах методом ПЦР в реальном времени с использованием тест-системы «АмплиСенс CMV-скрин/монитор-FL» («ИнтерЛабСервис», Россия) по протоколу фирмы производителя. Количественное определение вирусной ДНК показало увеличение содержания ДНК во всех образцах относительно инокулята. Отмечено, что во всех использованных вариантах матриксов клетки длительно сохраняют жизнеспособность, обладают пролиферативной активностью и поддерживают высокопродуктивную ЦМВ-инфекцию. Например, статистически значимый прирост вирусной ДНК отмечен в фибробластах человека, введенных в коллагеновые губки (U=0). В этом варианте количество ДНК ЦМВ возросло, в среднем, более чем в 30 раз (фиг. 2), что свидетельствует о наличии высокопродуктивной ЦМВ-инфекции в клетках человека.
Пример 3. Использование ЦМВ-инфицированных клеток, введенных в биодеградируемые матриксы, для изучения противовирусной активности соединений.

7
5
эмп
Исследования проводили in vitro. Здесь представлены данные при применении биодеградируемого матрикса на основе коллагена. Биодеградируемый матрикс с ЦМВ-инфицированными фибробластами человека в течение 5 сут обрабатывали ГЦВ (Цимевен, Roche, Швейцария) в концентрации 1 мкг/мл. В качестве контроля взят биодеградируемый матрикс с ЦМВ-инфицированными фибробластами, не обработанными антивирусным агентом. Через 5 сут инкубации в экспериментальном и контрольном материале определяли количество вирусной ДНК методом ПЦР в реальном времени, как указано выше. Установлено, что в контрольных образцах было, в среднем, 3,4×10 копий ДНК на образец, в то время как в образцах из клеток, инкубированных в присутствии ГЦВ - 4,3×10 копий на образец. Значимое снижение вирусной нагрузки (U=0) в образцах, обработанных ГЦВ, свидетельствует об эффективности использования инфицированных клеток, введенных в биодеградируемый матрикс, например, на основе коллагена, для изучения противовирусного действия новых агентов в отношении ЦМВ in vitro (фиг. 2).
Таким образом, клетки человека, введенные в матриксы различной природы (на основе хитозана, на основе коллагена и полимера OPLA), способны к заражению ЦМВ и поддерживают продуктивную вирусную инфекцию. Кроме того, этот способ тестирования пригоден для определения противовирусной активности соединений при ЦМВ-инфекции в экспериментах in vitro.
Следующим этапом разработки способа для изучения ЦМВ-инфекции in vivo было проведение экспериментов с заражением мышей, содержащих клетки человека, например, фибробласты кожи человека. В качестве животных были использованы мутантные мыши nude, которых содержали в специальных условиях: в стерильных боксах с обеззараженным воздухом, экструзированным кормом, водой, в поликарбонатных клетках на стерильной бумажной подстилке и такими же поилками.
Пример 4. Репликация чЦМВ в клетках человека, введенных животным разработанным способом.

Исследование in vivo. Имплантацию проводили по второму варианту осуществления изобретения. Биодеградирующие матриксы, например, на основе коллагена с ЦМВ-инфицированными клетками вводили мутантным мышам nude. Через 5 сут после операции матрикс извлекали, диспергировали, из полученных образцов выделяли вирусную ДНК. Количественное определение вирусной ДНК проводили с использованием тест-системы «АмплиСенс CMV-скрин/монитор-FL» («ИнтерЛабСервис», Россия) по протоколу фирмы-производителя. Установлено увеличение ДНК ЦМВ в человеческих клетках в 1,6 раза по сравнению с введенным количеством вируса (фиг. 3). Сходные результаты получены и при первом способе осуществления изобретения.
Т.о., при моделировании цитомегаловирусной инфекции отмечена активная репликации чЦМВ.
Пример 5. Использование изобретения для тестирования анти-ЦМВ активности противовирусных агентов в терапевтической схеме воздействия.
Исследование in vivo. Изучение эффективности использования разработанного способа для тестирования анти-ЦМВ активности агентов в терапевтической схеме воздействия проводили в соответствии с исследованиями противовирусного действия соединений in vivo [29]. Для этого биодеградируемый матрикс с ЦМВ-инфицированными клетками имплантировали мышам nude, как указано в примере 4.
В качестве противовирусного препарата использован ГВЦ, разрешенный для лечения ЦМВ-инфекции у людей. ГЦВ вводили однократно внутрибрюшинно в дозе 50 мг/кг через 1 час после операции. В качестве биодеградируемого матрикса использовали, например, коллагеновую губку.
5
4
Для определения влияния противовирусной терапии ГЦВ на ЦМВ-инфекцию через 5 сут после операции матриксы извлекали и определяли титр вируса в образцах культуральным методом. Было установлено, что у нелеченых мышей, взятых в качестве контроля, титр вируса увеличен более чем в 1,5 раза относительно инокулята, введенного до имплантации, и равен 1600 инфекционных вирусных частиц на губку. У леченных ГЦВ мышей урожай вируса составил в среднем 120 инфекционных вирусных частиц на губку. Сходные данные получены при количественном анализе вирусной ДНК. В имплантантах контрольных мышей, не обработанных ГЦВ, содержание ДНК ЦМВ составило 1,6×10 копий на губку, а однократное введение ГЦВ привело к снижению вирусной нагрузки до 1,2×10 копий ДНК на губку (фиг. 3).
Пример 6. Использование изобретения для тестирования анти-ЦМВ активности противовирусных агентов в микробицидной схеме воздействия.
Изучение эффективности разработанного способа проведено также при тестировании анти-ЦМВ активности противовирусных агентов в микробицидной схеме воздействия, применяемой для экстренной профилактики заболевания.
3
5
Исследование in vivo. Имплантацию проводили по первому варианту осуществления изобретения. Через сутки после имплантации человеческие клетки заражали чЦМВ путем введения в места расположения имплантатов (инфекционная множественность 5×10 БОЕ/мл) в объеме 0,4 мл на мышь, что соответствовало 2×10 копий ДНК ЦМВ. Через 5 сут после заражения определяли количество копий вирусной ДНК в имплантатах. Количественный анализ продемонстрировал прирост вирусной ДНК в губках в 1,4 раза относительно инокулята (фиг. 4). Это также является экспериментальным доказательством: 1 - чувствительности мышей nude, содержащих клетки человека, к ЦМВ-инфекции; 2 - возможности экспериментально получать продуктивную ЦМВ-инфекцию при заражении человеческих клеток непосредственно внутри макроорганизма. Таким образом, предлагаемая разработка применима для тестирования in vivo соединений, обладающих профилактическим действием в отношении ЦМВ-инфекции (ЦМВИ),
Для подтверждения эффективности использования разработки для изучения профилактических и/или микробицидных свойств соединений в отношении ЦМВИ в качестве микробицидного анти-ЦМВ агента использовали препарат рекомбинантного ИФН-α2b (фирма ООО «ФЕРОН», Москва). ИФН-α2b в концентрации 20000 МЕ/мл в объеме 1,0 мл вводили в места расположения имплантатов за 1 час до заражения чЦМВ. Заражение клеток проводили, как указано выше. Через 5 сут после заражения определяли количество копий вирусной ДНК в имплантатах. В образцах от мышей, обработанных ИФН-α2b, количество копий ДНК ЦМВ на губку было снижено более чем в 20 раз по сравнению с контрольными мышами, не получавшими инъекцию ИФН-α2b.
Таким образом, предлагаемые разработки пригодны для изучения патогенеза продуктивной чЦМВ-инфекции в условиях макроорганизма, а также для тестирования противовирусной активности соединений против чЦМВ как в терапевтической, так и в профилактической и/или микробицидной схемах воздействия. Разработанный способ позволяет изучать in vivo патогенез ЦМВ-инфекции человека и тестировать новые противовирусные средства в отношении чЦМВ. Предлагаемый способ позволяет определить дозовые характеристики терапевтического, профилактического и микробицидного действия тестируемых агентов. Изобретение основано на использование различных биодеградируемых матриксов для внесения клеток человека, имплантации их в организм иммунодефицитных мышей nude. При этом инфицирование цитомегаловирусом человека нормальных клеток человека можно производить как до, так и после имплантации.
Библиография:
1. Khare M.D., Sharland M. Cytomegalovirus treatment options in immunocompromised patients. Expert. Opin. Pharmacother. 2001, V. 2, P. 1247-1257.
2. Pass R.F. Cytomegalovirus infection. Pediatr. Rev. 2002, V. 23, P. 163-170.
3. Wu C.A, Paveglio S.A., Lingenheld E.G., Zhu L., Lefrançois L., Puddington L. Transmission of murine cytomegalovirus in breast milk: a model of natural infection in neonates. J. Virol. 2011, V. 85, N 10, P. 5115-5124.
4. Schachtele S.J., Mutnal M.B., Schleiss M.R., Lokensgard J.R. Cytomegalovirus-induced sensorineural hearing loss with persistent cochlear inflammation in neonatal mice. J. Neurovirol., 2011, V. 17, N. 3, P. 201-211.
5. Juanjuan C., Yan F., Li C, Haizhi L, Ling W., Xinrong W., Juan X., Tao L., Zongzhi Y., Suhua C. Murine model for congenital CMV infection and hearing impairment. Virol J., 2011, V. 8, N l, P.70-77.
6. Rawlinson W.D., Farrell H.E., Barrell B.G. Analysis of the complete DNA sequence of murine cytomegalovirus. J Virol., 1996, V. 70, N 12, P. 8833-8849.
7. Maul G.G., Negorev D. Differences between mouse and human cytomegalovirus interactions with their respective hosts at immediate early times of the replication cycle. Med. Microbiol. Immunol. 2008, V. 197, N 2, P. 241-249.
8. Marsh A.K., Willer D.O., Ambagala A.P., Dzamba M., Chan J.K., Pilon R., Fournier J., Sandstrom P., Brudno M., MacDonald K.S. Genomic sequencing and characterization of cynomolgus macaque cytomegalovirus. J. Virol. 2011, V. 85, N 24, P. 12995-13009.
9. Fulop G.M., Phillips R.A. The scid mutation in mice causes a general defect in DNA repair. Nature. 1990, V. 347, N 6292, P. 479-482.
10. Bystrevskaya V.B., Lobova T.V., Smirnov V.N., Makarova N.E., Kushch A.A. Centrosome injury in cells infection with human cytomegalovirus. Journal of Structure Biology, 1997, V. 120, P. 52-60.
11. Pearson Т., Greiner D.L., Shultz L.D. Humanized SCID mouse models for biomedical research. Curr. Top. Microbiol. Immunol., 2008, V. 324, P. 25-51.
12. McCune J.M., Namikawa R., Kaneshima H., Shultz L.D., Lieberman M., Weissman I.L. The SCID-hu mouse: murine model for the analysis of human hematolymphoid differentiation and function. Science, 1988, V. 241, P. 1632-1639.
13. Mosier D.E., Gulizia R.J., Baird S.M., Wilson D.B. Transfer of a functional human immune system to mice with severe combined immunodeficiency. Nature, 1988, V. 335, P. 256-259.
14. Mosier D.E. Human immunodeficiency virus infection of human cells transplanted to severe combined immunodeficient mice. Adv. Immun., 1996, V. 63, P. 79-125.
15. Stoddart C.A., Moreno M.E., Linquist-Stepps V.D., Bare C., Bogan M.R., Gobbi A., Buckheit R.W.J., Bedard J., Rando R.F., McCune J.M. Antiviral activity of 2′-deoxy-3′-oxa-4′-thiocytidine (BCH-10652) against lamivudine-resistant human immunodeficiency virus type 1 in SCID-hu Thy/Liv mice. Antimicrob Agents Chemother, 2000; V. 44, P. 783-786.
16. Mosier D.E,. Gulizia R.J., Baird S.M., Wilson D.B., Spector D.H., Spector S.A. Human immunodeficiency virus infection of human-PBL-SCID mice. Science, 1991, V. 251, P. 791-794.
17. Huang P. Westermoreland s.V., Jain R.K., Fukumura D. Spontaneous nonthymic tumors in SCID mice. Comp. Med., 2011, V. 61, N 3, P. 227-234.
18. Akkina R., Berges B.K., Palmer B.E., Remling L., Neff C.P., Kuruvilla J., Connick E., Folkvord J., Gagliardi K., Kassu A., Akkina S.R. Humanized Rag1-/-gamma-chain-/-mice support multilineage hematopoiesis and are susceptible to HIV-1 infection via systemic and vaginal routes. PLoS One, 2011, V. 6, e.20169.
19. Berges B.K., Akkina S.R., Remling L., Akkina R. Humanized Rag2(-/-)gammac(-/-) (RAG-hu) mice can sustain long-term chronic HIV-1 infection lasting more than a year. Virol., 2010, V. 397, P. 100-103.
20. Zhang L., Jiang Q., Li G., Jeffrey J., Kovalev G.I., Su L. Efficient infection and impairment of pDC in the bone marrow and peripheral lymphoid organs during early HIV-1 infection in humanized rag2-/-{gamma}C-/- mice in vivo. Blood, 2011 V. 117, P. 6184-6192.
21. Bente D.A., Melkus M.W., Garcia J.V., Rico-Hesse R. Dengue fever in humanized NOD/SCID mice. J. Virol., 2005, V. 79, P. 13797-13799.
22. Mukherjee R., Plesa G., Sherrill-Mix S., Richardson M.W., Riley J.L., Bushman F.D. HIV sequence variation associated with env antisense adoptive T-cell therapy in the hNSG mouse model. Mol. Ther., 2010, V. 18, P. 803-811.
23. Mombaerts P., Iacomini J., Johnson R.S., Herrup K., Tonegawa S., Papaioannou V.E. RAG-1-deficient mice have no mature В and T lymphocytes. Cell, 1992, V. 68, P. 869-877.
24. Suwanai H., Wilcox M.A., Mathis D., Benoist C. A defective Il15 allele underlies the deficiency in natural killer cell activity in nonobese diabetic mice. Proc. Natl. Acad. Sc.i USA, 2010, V. 107, P. 9305-9310.
25. Sugamura К., Asao H., Kondo M., Tanaka N., Ishii N., Ohbo K., Nakamura M., Takeshita T. The interleukin-2 receptor gamma chain: its role in the multiple cytokine receptor complexes and T cell development in XSCID. Annu. Rev. Immunol., 1996, V. 14, P. 179-205.
26. Ohbo K., Suda Т., Hashiyama M., Mantani A., Ikebe M., Miyakawa K., Moriyama M., Nakamura M., Katsuki M., Takahashi K. et al. Modulation of hematopoiesis in mice with a truncated mutant of the interleukin-2 receptor gamma chain. Blood, 1996, V. 87, P. 956-967.
27. Ito M., Hiramatsu H., Kobayashi K., Suzue K., Kawahata M., Hioki K., Ueyama Y., Koyanagi Y., Sugamura K., Tsuji K., Heike Т., Nakahata T. NOD/SCID/gamma(c)(null) mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood, 2002, V. 100, N 9, P. 3175-3182.
28. Bravo F.J., Cardin R.D., Bernstein D.I. A model of human cytomegalovirus infection in severe combined immunodeficient mice. Antiviral Res. 2007, V. 76, N 2, P. 104-110.
29. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Под редакцией Хабриева Р.У. Москва, 2005, С. 557.