Динамическая характеристика микроорганизмов в условиях неблагоприятного действия факторов абиотической природы методом сканирующей зондовой микроскопии

УДК 579.23:53.086:615.281

П.С. Ерохин, Н.П. Коннов, С.П. Заднова, Т.В. Бугоркова

ДИНАМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ В УСЛОВИЯХ НЕБЛАГОПРИЯТНОГО ДЕЙСТВИЯ ФАКТОРОВ АБИОТИЧЕСКОЙ ПРИРОДЫ МЕТОДОМ СКАНИРУЮЩЕЙ ЗОНДОВОЙ МИКРОСКОПИИ

Методами сканирующей зондовой микроскопии (СЗМ) показано изменение клеточной стенки и деструкция микроорганизмов на примере E.coli и V.cholerae в условиях неблагоприятного действия факторов абиотической природы. Приведена динамическая характеристика микроорганизмов под действием спиртов, альдегидов и соли в режимах прерывистого и непрерывного контакта атомно-силовой микроскопии (АСМ).

АСМ, микроорганизмы, этанол, глутаровый альдегид, хлорид натрия, индекс I, шероховатость, сила адгезии

P.S. Erokhin, N.P. Konnov, S.P. Zadnova, T.V. Bugorkova

DYNAMIC CHARACTERISTICS OF MICROORGANISMS UNDER ADVERSE IMPACT OF ABIOTIC AGENTS BY MEANS OF THE SCANNING PROBE MICROSCOPE

The scanning probe microscopy was applied for the E.coli and V.cholerae models simulated to show alteration of the cell wall and complete destruction of microorganisms under adverse impact of abiotic agents.

AFM, microorganisms, ethanol, glutaraldehyde, sodium chloride, index I, roughness, adhesion force

Визуализация морфологии клеточной стенки микроорганизмов и их ультраструктуры является основой для понимания путей взаимодействия бактерий с их условиями существования и конкурентных преимуществ [1]. Поэтому при изучении микроорганизмов возрастает интерес исследователей к использованию атомно-силовой микроскопии (АСМ), которая позволяет получать комплексную надежную количественную информацию о физической природе процессов, протекающих в биологических объектах [2, 3].

С использованием АСМ появились исследования по изучению морфофункциональных особенностей отдельных бактериальных клеток [4], а также при воздействии на них различных факторов биотической и абиотической природы [5].

Так, например, группа авторов с использованием атомно-силовой микроскопии изучили воздействие антибактериальных препаратов на клеточную стенку бактерий [6]. Ряд исследователей [7] успешно использовали полуконтактный метод АСМ для визуализации взаимодействия антигена с антителом и бактерии с бактериофагом [8].

Однако авторами использовался только один параметр (например, шероховатость клеточной стенки [9-11]), на основе которого проводилась характеристика микроорганизмов в условиях неблагоприятного действия вещества.

В соответствии с этим цель данной работы заключалась в динамической характеристике микроорганизмов в условиях неблагоприятного действия факторов абиотической природы методом сканирующей зондовой микроскопии с привлечением комплекса параметров, достоверно отражающих изменения бактерий.

Модельные микроорганизмы E.coli M-17, V.cholerae M-1261 (типичный штамм биовара Эль Тор), V.cholerae M-1293 (геновариант биовара Эль Тор) культивировали в LB бульоне в течение 24 ч при температуре 37°С.

Для оценки негативного действия спиртов и альдегидов на бактерии кишечной палочки использовались этиловый спирт в концентрациях от 40 до 96% и глутаровый альдегид в концентрациях 2,5 и 5% со временем экспозиции 30 и 60 минут.

При изучении влияния NaCl на морфологию и ультраструктуру V. cholerae, в LB бульон дополнительно добавляли раствор соли, доводя концентрацию агента до 3М. Время экспозиции составляло 20, 40, 60, 90 и 120 минут.

Затем бактериальные взвеси готовили в соответствии с МУ 1.3.3103-13 «Организация работы лабораторий, использующих методы электронной и атомно-силовой микроскопии при исследовании культур микроорганизмов I-IV групп патогенности».

Изучение проводилось на сканирующем зондовом микроскопе Solver P47-PRO (NT-MDT, Россия). Применялись кремниевые кантилеверы NSG01 (NT-MDT, Россия), напыленные золотом, для режима прерывистого контакта (резонансная частота 120 кГц, константа жесткости - 5,5 Н/м) и CSG10 (NT-MDT, Россия) для режима непрерывного контакта (резонансная частота 20 кГц, константа жесткости - 0,1 Н/м). Исследования выполнялись в режимах прерывистого и непрерывного контакта АСМ следующими методами: полуконтактным, рассогласования, отображения фазы, постоянной силы, латеральных сил, модуляции силы.

Для обработки полученных результатов использовалась программа Nova (NT-MDT, Россия), позволяющая редактировать полученные АСМ изображения, а также определять комплекс параметров объекта исследований.

Для изучения морфологии бактериальных клеток был использован режим прерывистого контакта. С целью минимизации влияния на клеточную морфологию в процессе сканирования взаимодействия между иглой кантилевера и микроорганизмом, уровень значений амплитуды силы «SetPoint» применяли в соответствии с методическими рекомендациями «Оптимизация параметров сканирования микроорганизмов методом атомно-силовой микроскопии». С использованием полуконтактного метода получали изображения для оценки шероховатости бактериальной поверхности, основанной на вычислении RMS значений, то есть стандартного отклонения всех значений высот в пределах выбранной области. Количественный анализ воздействия выбранных абиотических факторов на бактериальную морфологию с целью динамической характеристики микроорганизмов осуществляли на основе использования отношения ширина/высота - индекса I, отражающего защиту формы бактериальной клетки в сравнении с интактными клетками. Оценку степени разрушений бактерий различными веществами и концентраций проводили с помощью коэффициента К, представляющего собой отношение 1кошроль/1эксперимент. К = 1 показывает отсутствие влияния вещества. В качестве второго показателя применяли величину RMS (шероховатость). Эти два показателя наиболее четко отражают действие агента на бактериальную клетку.

После обработки микроорганизмов этанолом наблюдали изменение обоих выбранных показателей. Так, при использовании 40 % этилового спирта через 30 минут происходит некоторое изменение коэффициента влияния агента (К = 2,27), что свидетельствует о невысоком повреждающем действии. Через 60 минут отмечали незначительное увеличение этого показателя до К = 2,5, что свидетельствует о минимальном сжатии (сморщивании) бактериальной клетки.

Повышение концентрации этанола до 70 и 96% при длительности воздействия 30 и 60 минут оказывало выраженное действие на морфологию клетки с максимальным сжатием через 60 минут. Значения коэффициента составляли 2,86 и 4,34 соответственно для экспозиции 30 минут, а также 3,45 и 5,88 соответственно для экспозиции 60 минут.

Оценка второго показателя RMS (шероховатость) также четко выявила количественные изменения значений за счет возрастания шероховатости бактериальной поверхности в зависимости от концентрации этилового спирта. Показано, что увеличение концентрации этанола до 70 и 96% приводит к увеличению величины средней арифметической шероховатости в 1,63-4,46 раза соответственно по сравнению с контролем при экспозиции в 30 минут и в 2,1-5,5 раза для 60 минут экспозиции. При этом наблюдали аналогичную динамику изменений величины среднеквадратичной шероховатости клеточной поверхности. Увеличение этого показателя составляло от 2,37 до 1,18 раза для выбранных концентраций этанола в течение 30 минут и от 3,96 до 1,36 раз в течение 60 минут.

Следует отметить сложность изучения ультраструктур клеточной поверхности, таких как жгутики, пили и внеклеточное полимерное вещество, так как они практически исчезали с поверхности.

Особенностью спиртового воздействия является способность разрушать липиды, формировать обширные поры в клеточной поверхности и удалять макромолекулы с поверхности клеток.

Другим показателем влияния воздействия различных факторов абиотической природы на микроорганизм является сила адгезии, которая определяет связь бактерий с поверхностью. При исследовании биологического объекта в жидкой среде связь его с подложкой слабее, чем при исследовании на воздухе, а малейшие деформации могут снижать качество и достоверность получаемых результатов [5]. При изучении микроорганизмов на воздухе подобные явления могут также проявляться. Поэтому выбор метода воздействия является важным моментом при планировании эксперимента. Как показали наши исследования, при денатурирующем воздействии сила адгезии возрастала с увеличением времени экспозиции и концентрации действующего компонента и повторяла тенденцию изменений RMS показателя.

Экспериментально показано, что увеличение концентрации этанола до 96% способствует более жесткому прикреплению бактерий к стеклу, что проявляется в увеличении силы адгезии в 2,8 раза по сравнению с контролем. Более длительная экспозиция воздействия этанола определила наивысшее повышение адгезии микроорганизмов к подложке (в 3,6 раза).

При оценке действия глутарового альдегида на клеточную морфологию использовали индекс I. Полученные данные показали, что при воздействии 2,5% глутарового альдегида в течение 30 и 60 минут отмечено некоторое повышение коэффициента I (до 2,08) при сравнении с контрольными показателями, причем продолжительность воздействия на эту величину не влияла. Применение глутарового альдегида при экспозиции 30 и 60 минут в концентрации 5% не оказывало существенного отрицательного действия на клеточную морфологию, а коэффициент I = 2,32 достоверно не отличался от коэффициента, полученного при использовании 2,5% концентрации глутарового альдегида.

Оценка второго показателя RMS значений (шероховатость) выявила определенные количественные изменения величины средней арифметической и среднеквадратичной шероховатости при использовании 2,5 и 5% глутарового альдегида и экспозиции 30 и 60 минут, которые не влекли за собой глубокие изменения клеточных структур или их утрату. При неблагоприятном действии 2,5% глутаровым альдегидом в течение 30 минут наблюдали повышение значений средней арифметической шероховатости в 1,4 раза, средней квадратичной - в 1,5 раза по сравнению с контролем. Для 60 минут экспозиции полученное увеличение значений составляло 1,55 и 1,47 раза соответственно.

Таким образом, использование глутарового альдегида показало достаточную способность сохранения клеточной морфологии, при этом наблюдали минимальную деформацию бактерий, а также сохранение пилей, жгутиков, капсульных компонентов в естественной морфологии, которое невозможно при воздействии этанола. По-видимому, это связано с тем, что действие альдегидов на клетки формирует ковалентные химические связи между протеинами, поэтому может поддержать целостность мембранных липидов, так же как и поверхностных макромолекул.

Еще одним показателем влияния различных факторов абиотической природы на микроорганизм является сила адгезии (F), которая определяет связь бактерий с поверхностью.

Как показали наши исследования, при использовании 2,5%-го и 5%-го раствора глутарового альдегида изменяется сила адгезии F по сравнению с действием этанола (70-96% концентрации). Показатель был в 1,5 и 2,7 раза соответственно ниже, но при сравнении с контролем (интактные клетки) достоверно не отличался.

В дальнейших исследованиях для обеззараживания проб нами был использован 2,5%-й раствор глутарового альдегида. Были изучены морфология и ультраструктура различных видов микроорганизмов. Как показали проведенные исследования, выбранный метод воздействия существенно не влияет на морфологию микробной клетки и не нарушает ультраструктуру.

Морфометрическую оценку действия на бактериальные клетки гипертонического раствора хлорида натрия изучали на модели штаммов V.cholerae M-1261 и V.cholerae M-1293. Динамическая характеристика штаммов V.cholerae, подвергшихся действию NaCl, проводилась на основе комплекса трех параметров - индекса I, шероховатости и силы адгезии микроорганизмов к покровному стеклу.

Полученные экспериментальные данные показали, что под действием хлорида натрия происходили изменения показателей I. Так, при экспозиции 20 минут происходило незначительное изменение коэффициента влияния агента (К = 1,1), что свидетельствовало о невысоком повреждающем действии осмотического стресса. Через 60 минут отмечали незначительное увеличение этого показателя до К = 1,25, что свидетельствует о минимальном сжатии (сморщивании) бактериальной клетки. Спустя

120 минут экспозиции наблюдали сжатие и разрушение бактерий, что проявлялось в значительном увеличении индекса I (рис. 1).

Изучение динамики изменения второго показателя - шероховатости выявило количественные изменения величины средней арифметической и среднеквадратичной шероховатости при использовании 3М хлорида натрия в диапазоне времен экспозиции от 20 и 120 минут, которые влекли за собой глубокие изменения клеточных структур или их утрату при времени экспозиции 120 минут.

При воздействии соли на клетки У.ско1егав в течение 60 минут наблюдали повышение значений средней арифметической шероховатости в 1,57-1,7 раза, средней квадратичной - в 1,5 раза по сравнению с контролем. Для 120 минут экспозиции полученные увеличение значений составляло в 22,1 раза. Полученные данные свидетельствуют о существенном осмотическом деструктивном влиянии хлорида натрия на бактериальную клетку.

Время экспозиции, мин Рис. 1. Динамика изменения индекса W.cholerae

Рис. 2. Динамика изменения шероховатости W.cholerae

Следующим изучаемым нами показателем, определяющим степень влияния хлорида натрия на микроорганизм, являлась сила адгезии. Как показали наши исследования, при воздействии соли на бактерии сила адгезии возрастала с увеличением времени экспозиции, повторяла тенденцию изменений RMS показателя.

39 п 38 -37 -36 -35 -34 -33 -

М-1261

25 -24 -23 -2221 -20-

-10 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130

Время экспозиции, мин

Рис. 3. Динамика изменения силы адгезии V.cholerae

Экспериментально показано, что увеличение времени экспозиции до 60 минут способствует более жесткому прикреплению бактерий к стеклу, что проявляется в увеличении силы адгезии в 1,2 раза (рис. 3) по сравнению с контролем. Более длительная экспозиция воздействия соли определила наивысшее повышение адгезии микроорганизмов к подложке (в 1,3 раза).

Таким образом, используя методы сканирующей зондовой микроскопии, проведена динамическая характеристика микроорганизмов в условиях неблагоприятного действия факторов абиотической природы на примере E.coli и V.cholerаe.

Использовали величину отношения ширина/высота - индекс I, который отражает защиту формы бактериальной клетки, а для сравнительной оценки нами был введен коэффициент К, представляющий собой отношение 1контроль/1эксперимент, при К=1 влияние вещества отсутствует. Кроме того, оценивали шероховатость и адгезивные свойства бактериальной поверхности. Представленные нами данные показали, что денатурирующее воздействие этанола в низких концентрациях не вызывает глубоких изменений бактериальной клетки, а также обеспечивает низкую силу адгезии к поверхности подложки. Высокие концентрации этанола, с одной стороны, способствуют высокой адгезии бактерий к подложке, что при световой микроскопии является положительным качеством, но для методов АСМ этот тип воздействия нарушает морфологию микробной клетки и препятствует исследованию ее ультраструктуры. Полученные результаты согласуются с данными зарубежных исследователей, которые отмечают, что действие спиртов способно разрушать липиды, формировать обширные поры в клетке и повреждать поверхностные макромолекулы бактериальной клетки [12].

Оценка влияния глутарового альдегида показала, что воздействие 2,5%-го раствора на микроорганизмы, не образующие споры, приводит к минимальному нарушению клеточной поверхности и полному ее сохранению ультраструктуры (жгутики и другие структуры). Проведенные исследования показали незначительные изменения оцениваемых показателей при сравнении двух концентраций глутарового альдегида, но более высокие адгезирующие свойства 5%-го глутарового альдегида.

Использование методов сканирующей зондовой микроскопии, позволяющих определять комплекс параметров для оценки воздействия хлорида натрия на морфологию и ультраструктуру бактериальной клетки, позволило провести динамическую характеристику бактерий холерного вибриона в условиях неблагоприятного действия выбранного агента. Установлены морфометрические параметры бактериальной клетки в условиях осмотического стресса.

1. Young K.D. Bacterial morphology: why have different shapes? // Current Opinion in Microbiology. 2007. № 10. P. 596-600.

2. Chao Y., Zhang T. Optimization of fixation methods for observation of bacterial cell morphology and surface ultrastructures by atomic force microscopy // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2011. Vol. 92.

ЛИТЕРАТУРА

P. 381-392.

3. Understanding the cleaning effect with sodium hypochlorite of Enterococcus Faecalis endodontic pathogen using electrochemical impedance spectroscopy (EIS), atomic force microscopy (AFM) and surface plasmon resonance (SPR) / V. Penta, D. Vornicescu, M. Keusgen, C. Pirvu // Dig. J. of Nanomat. and Bio-struc. 2013. Vol. 8. №. 3. P. 1205-1214.

4. Трансмиссионная электронная и сканирующая зондовая микроскопия белков S-слоя сибиреязвенного микроба / Н.П. Коннов, Ю.П. Волков, А.Ю. Корсакова и др. // Проблемы особо опасных инфекций. 2004. Вып. 2(88). С. 34-36.

5. Kinetics of antimicrobial peptide activity measured on individual bacterial cells using high-speed atomic force microscopy / G.E. Fantner, R.J. Barbero, D.S. Gray, A.M. Belcher // Nature Nanotechnology. 2010. doi: 0.1038/nnano.2010.29.

6. Wang H., Brown H.R. Atomic force microscopy study of the photografting of glycidyl methacrylate onto HDPE and the microstructure of the grafted chains // Polymer. 2007. Vol. 48. P. 477-487.

7. Observing structure, function and assembly of single proteins by AFM / D.J. Muller, H. Janovjak, T. Lehto, L. Kuerschner, K. Anderson // Progress in Biophysics and Molecular Biology. 2002. Vol. 79. P. 1-43.

8. Оценка фаголизабельности штаммов холерного вибриона с использованием атомно-силовой микроскопии / Д.В. Уткин, П.С. Ерохин, Н.А. Осина, Н.П. Коннов // Известия Саратовского университета. Новая серия. Сер. Химия. Биология. Экология. 2013. Т. 13. Вып. 3. С. 81-84.

9. Biological applications of the AFM: from single molecules to organs / S. Kasas, N.H. Thomson, B.L. Smith et al. // International Journal Imaging System Technology. 1997. Vol. 8. P. 151-161.

10. Contribution of Type IV Pili to the virulence of Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida in Atlantic Salmon (Salmo salar L.) / J.M. Boyd, A. Dacanay, L.C. Knickle et al. // Infection and Immunity. 2008. Vol. 76. № 4. P. 1445-1455.

11. Interactions of oritavancin, a new lipoglycopeptide derived from vancomycin, with phospholipid bilayers: effect on membrane permeability and nanoscale lipid membrane organization / O. Domenech, G. Francius, P.M. Tulkens et al. // Biochimica et Biophysica Acta. 2009. Vol. 1788. P. 1832-1840.

12. Biofilm formation by a Fimbriae-Deficient mutant of Actinobacillus actinomycetem comitans / T. Inoue, R. Shingaki, N. Sogawa et al. // Microbiol. Immunol. 2003. Vol. 47. № 11. P. 877-881.

Ерохин Павел Сергеевич -

младший научный сотрудник

Pavel S. Erokhin -

junior researcher Russian Research

Anti-Plague Institute «Microbe», Saratov

Федерального казенного учреждения здравоохранения «Российский научно исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов

Коннов Николай Павлович -

главный научный сотрудник Федерального казенного учреждения здравоохранения «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов

Nikolay P. Konnov -

chief researcher Russian Research

Anti-Plague Institute «Microbe», Saratov

Заднова Светлана Петровна -

старший научный сотрудник Федерального казенного учреждения здравоохранения «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов

Svetlana P. Zadnova -

senior researcher Russian Research

Anti-Plague Institute «Microbe», Saratov

Бугоркова Татьяна Васильевна -

старший научный сотрудник Федерального казенного учреждения здравоохранения «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов

Tatyana V. Bugorkova -

senior researcher Russian Research

Anti-Plague Institute «Microbe», Saratov

Статья поступила в редакцию 17.09.15, принята к опубликованию 10.11.15