ПОТЕНЦИОМЕТРИЧЕСКИЙ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИОКСИДАНТНОЙ ЕМКОСТИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ 2,2'-ДИФЕНИЛ-1-ПИКРИЛГИДРАЗИЛА
POTENTIOMETRIC METHOD FOR DETERMINING ANTIOXIDANT CAPACITY WITH 2,2'-DIPHENYL-1-PICRYLHYDRAZIL

Изобретение относится к области физико-химических методов анализа, в частности к анализу растворов на предмет количественного определения антиоксидантной емкости и может быть использовано для анализа пищевых объектов и объектов фармации.
2,2'-дифенил-1-пикрилгидразила (DPPH•) является одним из стабильных N-центрированных органических радикалов, имеющих очень широкое распространение для определения антиоксидантной емкости
Известен способ определения антирадикальных свойств с использованием дифференциальной импульсной вольтамперометрии [Vasilescu I., Eremia S.A.V., Albua C., Radoi A., Litescu S-C., Radu G-L. Determination of the antir adical properties of olive oils using an electrochemical method based on DPPH radical // Food Chem. 2015, 166: 324-329.], основанный на регистрации вольтамперограмм на платиновом рабочем электроде и измерении снижения интенсивности тока пика восстановления DPPH• после взаимодействия с антиоксидантами. Антирадикальная емкость оценивается в единицах стандартного вещества (α-токоферола), вызывающего такое же снижение тока пика.
К недостаткам данного метода можно отнести то, что получаемая информация об антирадикальных свойствах может быть недостоверной в виду зависимости получаемого сигнала в виде величины силы тока от состояния поверхности электрода и его подготовки. Кроме того, результаты измерений выражаются в относительных единицах, точнее в эквивалентах α-токоферола, поэтому полученные значения зависят от выбранного эталонного вещества.
Известен способ определения антиоксидантной активности методом электронно-парамагнитной резонансной спектроскопии [RU 2614365]. Определение антиоксидантной активности в данном способе проводят по уменьшению числа парамагнитных центров стабильного радикала DPPH•, рассчитанных из ЭПР-спектров до реакции и после полного прохождения химической реакции между радикалом DPPH• и анализируемым веществом.
Недостатки способа заключаются в том, что реализация метода ЭПР-спектроскопии требует наличия сложного наукоемкого оборудования и представляет собой очень трудоемкий процесс, требующий высокой профессиональной квалификации исполнителя.
Наиболее близким решением служит спектрофотометрический способ определения антиоксидантной емкости (АОЕ), основанный на способности антиоксидантов ингибировать стабильные свободные радикалы 2,2'дифенил-1-пикрилгидразила (DPPH•) [Tuanjai N., Supalax S., Thawatchai T., Wittaya N. New approach for evaluation of the antioxidant capacity based on scavenging DPPH free radical in micelle systems // J. Food Research International. 04/2011; 44(3): 798-806]. Сущность способа заключается в измерении снижения оптической плотности раствора DPPH• в результате реакции с антиоксидантом при длине волны 528 нм. Антиоксидантную емкость определяют как отношение количества антиоксиданта, необходимого для снижения исходной концентрации DPPH• на 50%, к количеству эталонного соединения (галловой кислоты), необходимого для снижения исходной концентрации DPPH• на 50%.
Недостатком данного способа являются невозможность достоверного анализа окрашенных соединений, собственная окраска которых влияет на величину поглощения DPPH•. Данный способ имеет узкий концентрационный интервал исследуемых объектов, ограниченный выполнением основного закона светопоглощения. Кроме того, результаты измерений выражаются в относительных единицах по отношению к эталонному соединению - галловой кислоте. Получаемые значения зависят от выбранного эталонного вещества, что не позволяет сравнивать антиоксидантные емкости объектов, свойства которых определены в сравнении с разными эталонными веществами.
Проблемой изобретения является получение некорректных результатов при анализе окрашенных объектов, ограниченный интервал определяемых концентраций, что вызывает необходимость разбавлений большой кратности, вносящих погрешность в результаты анализа.
Решение проблемы достигается тем, что используется потенциометрический способ определения антиоксидантной емкости с использованием 2,2'-дифенил-1-пикрилгидразила, заключающийся в том, что предварительно смешивают исходный раствор 2,2'-дифенил-1-пикрилгидразила с концентрацией (в растворителе и анализируемый раствор, отличающийся тем, что после смешения добавляют электролит и измеряют потенциал (, вводят первую добавку 2,2'-дифенил-1-пикрилгидразила с концентрацией ( и измеряют потенциал (, вводят вторую добавку 2,2'-дифенил-1-пикрилгидразила с концентрацией ( и измеряют потенциал (, антиоксидантную емкость анализируемого раствора () находят решением системы уравнений:
где b - предлогарифмический коэффициент.
Применение метода потенциометрии позволяет проводить анализ объектов с собственной окраской любой интенсивности. Варьированием концентраций исходного DPPH• и последовательных добавок достигается существенное расширение интервалов определяемых концентраций и, таким образом, уменьшение погрешности определения, вносимой взятием малых аликвот исследуемого образца и высокой степени разбавления. Получаемые данным способом результаты выражены в абсолютных единицах (М-экв).
DPPH•
Соединения, обладающие антиоксидантной емкостью по отношению к радикалам DPPH• (АОЕ), смешивают с раствором стабильного радикала DPPH•, взятого в избытке по отношению к содержанию соединений с антиоксидантными (АО) свойствами.
Взаимодействия DPPH• с антиоксидантами происходит по реакциям:
•
•
1. DPPH + RH ↔ DPPH-H + R
•+
2. DPPH + RH ↔ DPPH + [R]
•
•
3. DPPH+ R↔ products
•
•
R+ R↔ recombination products
1
За счет избытка DPPH• в системе после прохождения химической реакции с АО устанавливается равновесие между DPPH• и образовавшейся восстановленной формой DPPH-H, образуется потенциалопределяющая система, фиксируется значение потенциала (Е).
-
где  потенциал раствора DPPH•, измеренный после введения добавки антиоксиданта, В;
C
-
(DPPH•) исходная концентрация DPPH•, M;
-
антиоксидантная емкость по отношению к радикалам DPPH• (М-экв), под которой понимается суммарная эквивалентная концентрация DPPH•, вступившего в реакцию с антиоксидантами.
b - предлогарифмический коэффициент в уравнении Нернста, равный:
где R - универсальная газовая постоянная, 8,314 Дж/(моль⋅K); Т - температура, K; F - постоянная Фарадея, 96485 Кл/моль; n - число электронов, участвующих в реакции.
2
Затем в систему вводится первая добавка DPPH• и фиксируется значение потенциала (Е).
2
где Е - потенциал, измеренный после введения первой добавки DPPH•, В;
- концентрация DPPH• в первой добавке, M.
3
Для корректного определения антиоксидантной емкости вводится вторая добавка DPPH•, измеряется потенциал (Е).
3
где Е - потенциал, измеренный после введения второй добавки DPPH•, В;
- концентрация DPPH• во второй добавке, M.
1
2
2
3
Производится расчет реального предлогарифмического коэффициента решением системы уравнений (1), (2), где неизвестными являются  и значение предлогарифмического коэффициента (b). Аналитическим сигналом для определения антиоксидантной емкости служит разница потенциалов (Е- Е), для определения значения предлогарифмического коэффициента (Е- Е).
Сущность заявляемого способа заключается в том, что после взаимодействия DPPH• с антиоксидантами образуется восстановленная форма DPPH-H и, соответственно, обратимая электрохимическая система DPPH•/DPPH-H, которая будет определять потенциал в электрохимической ячейке. Потенциал образуемой системы будет зависеть от соотношения окисленной и восстановленной формы 2,2'-дифенил-1-пикрилгидразила, и, таким образом, будет определено количество радикалов DPPH•, ингибируемых антиоксидантом путем введения второй добавки DPPH•. При этом предлогарифмический коэффициент в уравнении Нернста будет зависеть от вклада каждой из описанных выше реакций, поэтому вводится вторая добавка DPPH•, позволяющая оценить наклон Нерстовской зависимости на фоне реакции с антиоксидантом.
В качестве реагентов могут быть использованы стабильные катион- радикалы, например 2,2'-дифенил-1-пикрилгидразил (DPPH•).
В качестве растворителей могут быть использованы этиловый спирт, или ацетонитрил, или ацетон. Также может быть использована смесь растворителей.
В качестве электролитов могут быть использованы тетрабутиламмония тетрафторборат, или перхлорат лития, или тетрабутиламмония перхлорат.
Рабочий электрод может быть изготовлен из платины, или золота, или стеклоуглерода. Электродом сравнения может служить двухключевой хлоридсеребрянный электрод.
Результаты, получаемые с использованием потенциометрического способа сравнивали с результатами, полученными спектрофотометрическим способом, указанном в наиболее близком решении. Для корректного сравнения в спектрофотометрическом методе оценена антиоксидантная емкость с использованием градуировочного графика зависимости оптической плотности DPPH• от его концентрации, выраженная в М-экв. На фиг. 1 представлены результаты определения антиоксидантной емкости по отношению к радикалам DPPH•, полученные методом потенциометрии и спектрофотометрии.
Фиг. 1. Результаты определения антиоксидантной емкости по отношению к радикалам DPPH•, полученные методом потенциометрии и спектрофотометрии (n=5, Р=0,95).
crit
Корреляция результатов определения антиоксидантной емкости по отношению к радикалам DPPH•, полученных методом потенциометрии и спектрофотометрии, составляет 0,99 (r=0,71, n=8, P=0,95).
На фиг. 2 приведены результаты определения антиоксидантной емкости водных и водно-этанольных растительных экстрактов, полученные с использованием потенциометрического и спектрофотометрического методов.
Фиг. 2. Результаты определения антиоксидантной емкости водных и водно-этанольных растительных экстрактов, полученные с использованием потенциометрического и спектрофотометрического методов (n=5, P=0.95).
crit
Корреляция результатов, полученных с использованием метода потенциометрии и фотометрии, составляет 0.98 (r=0,67, n=8, P=0,95) для экстрактов ноготков цветков, пустырника травы, березы листьев, зверобоя травы, душицы обыкновенной травы, мяты перечной листья. Для экстрактов каркаде и клитории тройчатой, интенсивно окрашенных соответственно в красный и синий цвет, наблюдается перекрывание спектров поглощения DPPH• и экстрактов. В этом случае собственная окраска раствора влияет на регистрируемое значение оптической плотности DPPH• при 528 нм, вызывая
занижение полученных результатов, и нарушая, тем самым, корректность определения антиоксидантной емкости. Результаты антиоксидантной емкости, полученными потенциометрическим и спектрофотометрическим методами для экстракта каркаде существенно различаются. Провести определения антиоксидантной емкости экстракта клитории тройчатой спектрофотометрическим методом не удалось в виду интенсивного поглощения при 528 нм и отсутствию изменений в величине регистрируемой оптической плотности от первоначального значения поглощения DPPH•.
На фиг. 3 представлена зависимость потенциала от времени в раствор DPPH• α-токоферола и двух последующих добавок DPPH•.
Фиг. 3. Зависимость потенциала от времени при введении в раствор DPPH• α-токоферола (0,1 мМ) .
На фиг. 4 приведена зависимость потенциала от времени при введении в раствор DPPH• экстракта каркаде и двух последующих добавок DPPH•.
Фиг. 4. Зависимость потенциала от времени при введении в раствор DPPH• 0,1 мл экстракта каркаде .
На фиг. 5. представлена зависимость потенциала от времени при введении в раствор DPPH• экстракта клитории тройчатой и двух последующих добавок DPPH•.
Фиг. 5. Зависимости потенциала от времени при введении в раствор DPPH• 0,1 мл экстракта клитории тройчатой (0,1 мМ) .
Пример 1
1
2
1
В 10 мл 0,5 мМ раствора DPPH• в ацетонитриле, содержащем 0,05 М тетрабутиламмония тетрафторборат, вносят 0,1 мл 0,01 М спиртового раствора α-токоферола, опускают рабочий платиновый электрод и электрод сравнения и фиксируют установившееся значение потенциала Е=375 мВ. Далее вносят 0,1 мл 0,05 М раствора DPPH• в ацетонитриле и фиксируют значение потенциала Е=395 мВ. Затем вносят вторую добавку 0,3мл 0,05М раствора DPPH• в ацетонитриле и фиксируют значение потенциала Е=417 мВ.
-4
Результаты измерений приведены на фиг.3. Решают систему уравнений (1) и (2). Расчет показывает, что значение  составляет 1,84⋅10 М-экв, величина предлогарифмического коэффициента 49 мВ/декада.
-5
5
-4
Результаты, полученные потенциометрическим методом, сравнивались с результатами, полученными спектрофотометрическим методом. Измерена оптическая плотность растворов DPPH• в ацетонитриле при 518 нм в диапазоне концентраций (1-10)⋅10 M, уравнение градуировочного графика A=(0.1556⋅10)⋅. Величина оптической плотности, полученная смешением 0,2 мМ раствора DPPH• в ацетонитриле и 0,1мМ спиртового раствора α-токоферола составила 0,05. Расчет показывает, что значение  составляет 1,71⋅10 М-экв.
Пример 2
Водный экстракт готовили каркаде следующим образом: 2 г сухого растительного сырья экстрагируется 100 мл кипящей воды в термостойком стеклянном стакане в течение 15 минут. Перед проведением измерений экстракт был охлажден до комнатной температуры.
1
2
3
В 10 мл 1 мМ раствора DPPH• в этиловом спирте, содержащем 0,05 М тетрабутиламмония перхлорат, вносят 0,1 мл водного экстракта каркаде, опускают рабочий стеклоуглеродный электрод и электрод сравнения и фиксируют установившееся значение потенциала Е=367 мВ. Далее вносят 0,2 мл 0,05 М раствора DPPH• в этиловом спирте и фиксируют значение потенциала Е=399 мВ. Затем вносят вторую добавку 0,6 мл 0,05 М раствора DPPH• в ацетонитриле и фиксируют значение потенциала Е=425 мВ.
-4
-5
Результаты измерений приведены на фиг.4. Решают систему уравнений (1) и (2). Расчет показывает, что значение  составляет 7,03⋅10 М-экв, величина предлогарифмического коэффициента 50 мВ/декада. Проводят пересчет антиоксидантной емкости на 1 г растительного сырья, полученное значение составляет 3,5⋅10 М-экв/г.
-5
5
-5
Результаты, полученные потенциометрическим методом, сравнивались с результатами, полученными спектрофотометрическим методом. Измерена оптическая плотность растворов DPPH• в этиловом спирте при 518 нм в диапазоне концентраций (1-10)⋅10 M, уравнение градуировочного графика A=(0.1556⋅10)⋅. Величина оптической плотности, полученная смешением 10 мл 0,1 мМ раствора DPPH• в этиловом спирте и 0,01 мл водного экстракта каркаде составила 0,75. Рассчитанное значение антиоксидантной емкости с учетом разбавления экстракта составило 2,6⋅10 М-экв/г.
Результаты, полученные методом потенциометрии и спектрофотометрии, существенно различаются, что может быть связано с интенсивной красной окраской исследуемого экстракта, обладающего поглощением при длине волны 518 нм.
Пример 3
Водно-спиртовый экстракт клейтории тройчатой был получен при экстрагировании 2 г сухого растительного сырья 100 мл водно-спиртовой смесью (соотношение этилового спирта к воде 40/60) в течение 15 минут.
1
2
1
В 10 мл 0,1 мМ раствора DPPH• в ацетоне, содержащем 0,05М перхлорат лития, вносят 0,1мл водно-этанольного экстракта клитории тройчатой, опускают рабочий золотой электрод и электрод сравнения и фиксируют установившееся значение потенциала Е=387 мВ. Далее вносят 0,2мл 0,05М раствора DPPH• в ацетоне и фиксируют значение потенциала Е=410 мВ. Затем вносят вторую добавку 0,6мл 0,05М раствора DPPH• в ацетоне и фиксируют значение потенциала Е=427 мВ.
-4
-3
Результаты измерений приведены на фиг.5. Решают систему уравнений (1) и (2). Расчет показывает, что значение  составляет 7,68⋅10 М-экв, величина предлогарифмического коэффициента 32 мВ/декада. Проводят пересчет антиоксидантной емкости на 1 г растительного сырья, полученное значение составляет 3,8⋅10 М-экв/г.
-5
5
Результаты, полученные потенциометрическим методом, сравнивались с результатами, полученными спектрофотометрическим методом. Измерена оптическая плотность растворов DPPH• в этиловом спирте при 518 нм в диапазоне концентраций (1-10)⋅10 M, уравнение градуировочного графика A=(0.1556⋅10)⋅. Величина оптической плотности, полученная смешением 10 мл 0,1 мМ раствора DPPH• в ацетоне и 0,01 мл водного экстракта клитории тройчатой составила 1,75. Уменьшения оптической плотности смеси DPPH• и экстракта клитории тройчатой от первоначального значения (А=1,56) не наблюдается, соответственно определить антиоксидантную емкость данного экстракта спектрофотометрическим способом невозможно, что может быть связано с интенсивной синей окраской исследуемого экстракта, обладающего поглощением при длине волны 528 нм.
Техническим результатом изобретения является повышение правильности получаемых результатов величины антиоксидантной емкости за счет использования метода потенциометрии путем снижения систематической погрешности, обусловленной влиянием собственной окраски объектов, расширение интервала определяемых концентраций и отсутствию необходимости многократных разбавлений исследуемых объектов.