Использование ДНК-маркеров в современных программах селекции сахарной свёклы

УДК 633.63:575:632.52.577.1

Использование ДНК-маркеров в современных программах селекции сахарной свёклы

Т.П. ФЕДУЛОВА, д-р биол. наук, Д.Н. ФЕДОРИН, канд. биол. наук, А.А. НАЛБАНДЯН, канд. биол. наук, М.А. БОГОМОЛОВ, д-р с/х. наук

ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт сахарной свёклы и сахара имени А.Л. Мазлумова»

Введение

Технологии генотипирования сельскохозяйственных растений открывают новые возможности для эффективного решения различных задач современной селекции: поддержание генетических коллекций, подбор родительских форм для скрещивания, составление родословных, контроль интрогрессии генетического материала, паспортизация и сертификация сортов, создание «генетических паспортов» [1]. В настоящее время особое значение приобретает разработка технологий генотипирования, позволяющих надёжно различать и идентифицировать растительные формы на генетическом уровне.

Наиболее важным подходом для исследования генетического полиморфизма является применение методов молекулярного анализа, позволяющих получать индивидуальную характеристику отдельного генотипа — ДНК-профиль. Однако применение молекулярных маркеров на сахарной свёкле значительно отстаёт от других полевых культур. Одними из надёжных и эффективных молекулярных маркеров являются микросателлиты — первые, полученные с использованием ПЦР, высокополиморфные маркеры для индивидуальных локусов, которые относят к диспергированным тандемно повторяющимся последовательностям. Высокий полиморфизм в сочетании с повсеместным распространением и мультиаллелиз-мом делает их очень перспективными в качестве молекулярных маркеров [7, 8, 3]. Так, китайскими учёными для исследования генетического разнообразия и взаимоотношений сахарной свёклы были задействованы 64 пары SRAP- и 11 пар SSR-маркеров для наиболее полного использования генетического материала и рационального выбора родительских форм в целях повышения эффективности селекции [10]. Иранские учёные исследовали генетическое разнообразие 30 генотипов сахарной свёклы с применением 10 RAPD-праймеров [4]. Полиморфизм всех прай-меров составил 82,33 %. Изученные генотипы были классифицированы по 13 группам на основе резуль-

татов и полученных дендрограмм. Результаты кластерного анализа, выполненного с использованием коэффициента сходства Жаккара, выявили генетическое разнообразие генотипов, которые подчеркивают эффективность отбора генотипов сахарной свёклы. Немецкими учёными было изучено использование 8 RAPD-маркеров, позволяющих быстро и экономично выявлять полиморфизм ДНК среди близких генотипов сахарной свёклы [6]. Методом UPGMA образцы были разделены на две группы с относительно высоким коэффициентом подобия. Представленные результаты показали, что RAPD-маркеры могут быть пригодны для анализа генетического разнообразия в размножающемся материале с высоким уровнем гомологии и гомозиготности.

Цель данных исследований заключалась в выявлении специфических ДНК-маркеров для молекулярного маркирования и изучения генетического разнообразия селекционного материала свёклы рода Beta.

Материалы и методы исследований

В качестве материалов для исследования генетического разнообразия были использованы проростки следующих разновидностей корнеплодной свёклы: кормовой красной (convar. crassa Alef.), кормовой белой свёклы; МС-линии сахарной свёклы (convar. saccharifera Alef.), гибриды, полученные с их участием. Выделение геномной ДНК из растительной ткани свёклы осуществлялось фенолхлороформным методом [2, 9] из 0,2 г зелёных листьев. Качество выделенной суммарной ДНК было определено путём электрофореза в 1%-ном агарозном геле в присутствии бромистого этидия. Полученную ДНК растворяли в 10 мМ трис-НС1-буфере (рН 8,0), содержащем 0,1 мМ ЭДТА, и использовали для ПЦР-анализа. Поли-меразно-цепную реакцию с используемыми прайме-рами проводили в амплификаторе «Терцик» («ДНК-технология», Россия). В работе были использованы следующие праймеры к микросателлитным локу-сам генома: Bvm 1, Bvm 2, Bvm 3 [5], а также RAPD-

праймеры: OPA-IO, OPC-O6, OPP-18 [4]. Параметры амплификации для RAPD-локусов ОРА-10, ОРС-06 и ОРР-18: предварительная денатурация при 95 0С в течение 5 мин, затем 35 циклов при 92 0С — 45 с, 37 0С - 30 с, 45 0C - 15 с, 72 0С - 2 мин и финальный этап элонгации цепи при 72 0С — 1 мин. Параметры амплификации для SSR-праймеров Bvm 1, 2, 3: предварительная денатурация при 95 0С в течение 5 мин, затем 35 циклов при 95 0С - 30 с, 54-56 0С - 30 с, 72 0С - 30 с и финальный этап элонгации цепи при 72 0С - 1 мин.

Результаты исследований и их обсуждение

Результаты ПЦР-анализа селекционных материалов сахарной, кормовой красной свёклы и созданных на их основе гибридов лаборатории исходного материала с RAPD-праймером 0РА-10 показали их невысокий генетический полиморфизм (рис. 1). Уровень полиморфизма по данному локусу составляет от 60 до 100 %.

В результате амплификации геномных ДНК растений установлено, что гибриды иностранной селекции фирмы Li0n Seeds - Шаннон, Гранате, Хамбер, Портланд - имеют однородный генетический материал. При этом выявлены продукты амплификации с длинами 250, 350, 500, 900 и 1000 п.н. Анализ гибридов, полученных при скрещивании мужскосте-рильных форм с элементами апомиксиса МС-94-Ар, МС-90-47 и кормовой свёклы, показал заимствование аллелей кормовой свёклы во всех гибридных формах. В частности, общими в данном случае являются аллели с длинами 250, 500 и 900 п.н. При этом специфический аллель для МС-94-Ар с длиной 350 п.н. не обнаруживается в соответствующем гибриде. Аналогичная ситуация наблюдается и для ампликона с длиной 1000 п.н., характерного для образца МС-94-Ар. Данный аллель не передаётся потомству при гибридизации. Анализ результатов ПЦР образцов с праймером 0РС-06 свидетельствует об однородности

ампликонов со всеми используемыми для генетического анализа ДНК (рис. 2).

Г

Рис. 1. Амплификация геномной ДНК образцов свёклы с праймером ОРА-10. Справа представлен маркер молекулярных масс ДНК GeneRuler™ (Thermo Scientific, США). Обозначения: Ш - Шаннон, Г - Гранате, Х-Хамбер, П- Портланд; № 11 - МС-90-47; 13 - МС-94-Ар; 33 - МС-90-47х кормовая красная; 34 - МС-94-Ар х кормовая красная; 38 - кормовая красная

Рис. 2. Амплификация геномной ДНК образцов с праймером ОРС-06. Справа представлен маркер молекулярных масс ДНКGeneRuler™ (Thermo Scientific, США). Обозначения: Обозначения: Ш - Шаннон, Г - Гранате, Х — Хамбер, П- Портланд; № 11 - МС-90-47; 13 - МС-94-Ар; 33 - МС-90-47 у- кормовая красная; 34 - МС-94-Ар х кормовая красная; 38 - кормовая красная.

Полиморфизм по данному локусу у изученных со-ртообразцов составляет 100 %. Для образцов, проанализированных с помощью праймера ОРР-18, характерен высокий полиморфизм продуктов амплификации как для родительских форм, так и для гибридов (рис. 3).

П 11 13 33 34 38

Рис. 3. Амплификация геномной ДНК образцов с праймером ОРР-18.

Анализ результатов ПЦР образцов с праймером ОРР-18 свидетельствует о наличии специфического ампликона для гибрида Хамбер с длиной 400 п.н., что генетически отличает его от других изученных материалов. Выявленный ампликон у данного гибрида единственный. Для всех исследуемых образцов был установлен сходный признак, проявляющийся в амплификации продукта с длиной 400 п.н. При анализе гибрида № 33 выявлено, что он наследует родительский аллель длиной 500 п.н. от родительской формы МС-90-47, а гибрид № 34 имеет идентичный набор аллелей с родительской формой — кормовой красной свёклой. Анализ результатов ПЦР образцов с SSR-праймерами Bvm 1 свидетельствует о наличии специфических ампликонов для всех исследуемых генотипов. Установлено наличие трёх продуктов амплификации размером 150, 160 и 250 п.н. (рис. 4).

Уровень полиморфизма по данному локусу составляет 100 %. Анализ результатов ПЦР образцов с прай-

г: .1\ц,г .

Рис. 4. Электрофорез ПЦР-продуктов, полученных с праймерами Bvm 1

мерами к микросателлитному локусу Bvm 2 свидетельствует о наличии специфического ампликона для гибридов Хамбер, Гранате и № 11 длиной 500 п.н. Для остальных генотипов свёклы как родительских форм, так и гибридов данный ампликон не обнаруживался (рис. 5).

Рис. 5. Амплификация геномной ДНК образцов с праймерами Bvm 2

Анализ ПЦР-продуктов растений гибрида Шаннон свидетельствует, что для него характерно слабое выражение общего для всех образцов ампликона с длиной 200 п.н. Полиморфизм, выявленный по локусу Bvm 2, варьирует от 50 до 100 %. Всего по данному SSR-локусу обнаружено 4 ДНК-фрагмента длиной 200, 400, 750 и 1000 п.н. Анализ результатов ПЦР образцов свёклы с праймерами к микросателлитному локусу Bvm 3 свидетельствует о слабой гетерогенности исследуемого генетического материала (рис. 6).

образца, его передача при гибридизации не наблюдается. Также можно отметить, что гибриду № 34 не передался признак родительской формы — кормовой красной, для которой характерен ампликон длиной 100 п.н. Показано, что сходный генетический материал по данному локусу характерен для следующих образцов: № 13, № 34, Шаннон и Портланд, в данных селекционных материалах исследуемый признак не наблюдается. Уровень полиморфизма по данному локусу находится в пределах 50—100 %. По результатам проведённого ПЦР-анализа составлены генетические паспорта исследованных генотипов свёклы по 6 ДНК-маркерам (табл. 1, 2). Созданные молекулярные паспорта позволяют осуществлять идентификацию исследованных генотипов свёклы для использования их при получении гетерозисных гибридов.

Вместе с тем корреляционной зависимости между изученными молекулярными RAPD- и SSR-маркерами, продуктивностью и формой корнеплода у исследованных селекционных материалов не выявлено. Данные исследования будут продолжены в плане увеличения количества изучаемых образцов, количества праймеров и использования фрагментно-го анализа на генетическом анализаторе.

Заключение

В результате проведённого ПЦР-анализа установлена молекулярно-генетическая структура родительских форм: МС-растений сахарной, кормовой свёклы и гибридного потомства Fp полученного от их скрещивания, по микросателлитным локусам Bvm 1, Bvm 2, Bvm 3 и RAPD-локусам 0PA-10, 0PC-06, OPP-18, позволившая провести их идентификацию. Выявлен специфический ПЦР-продукт (400 п.н.) по RAPD-локусу ОРР-18 для гибрида Хамбер, что

Таблица 1. Генетические паспорта исследованных генотипов сахарной свёклы с SSR-праймерами*

Рис. 6. Амплификация геномной ДНК образцов с праймерами Bvm 3

Родительская форма МС-90-47 обладает максимальным набором ампликонов. ДНК-фрагмент длиной 200 п.н. является уникальным для данного

Образец

Шаннон

Гранате

Хамбер

Портланд

11

13

33"

34

38~

Локус

Bvm 1

150 160 250

Bvm 2

200

1/0

400

750

1000

Bvm 3

100

200

*Цветом обозначены локусы, по которым установлены различия между генотипами

0

0

0

1

1

0

1

0

1

0

0

0

1

1

1

0

0

0

0

0

1

0

0

1

1

0

0

Таблица 2. Генетические паспорта исследованных генотипов сахарной

свёклы с RAPD-праймерами*

Образец

Шаннон

Гранате

Хамбер

Портланд

11

13

33

34

38

OPA-10

250 350 500 900 1000

1

Локус

0PC-06

250 400 500 750 900

OPP-18

200 300 400 500 700

0

0

0

*Цветом обозначены локусы, по которым установлены различия между генотипами

генетически отличает его от других изученных материалов. Для материнской формы МС-94-Ар обнаружен специфический ДНК-ампликон по локусу 0РА-10 длиной 1000 п.н. Данный аллель не передаётся по наследству при гибридизации. Показано, что максимальная гетерогенность селекционных материалов сахарной, кормовой красной и кормовой белой свёклы обнаруживается с использованием праймеров 0РА-10, 0РС-06, Bvm 2. Данные праймеры могут быть рекомендованы для использования при проведении паспортизации генотипов свёклы. Установлен уникальный ампликон (200 п.н.) по SSR-локусу Bvm 3 для образца МС-90-47. Его передача гибридному потомству не наблюдается. Получены экспериментальные данные по выявлению специфических ДНК-маркеров для разработки методики идентификации и отбора селекционного материала рода Beta на основе ДНК-маркеров. Проведённые исследования представляют как теоретическое, так и практическое значение для использования молекулярно-генетиче-ских маркеров при генотипировании исходного и селекционного материала свёклы.

Список литературы

1. Шилов, ИЛ. Применение технологии микроса-теллитного анализа ДНК в растениеводстве / И.А. Шилов // Проблемы агробиотехнологии. — М., 2012. -С. 140-162.

2. Chomczynski, P. Single-Step Metod of RNA Isolation by Acid Guanidinium Thiocyanate-Phenol-Chloroform Extraction / P. Chomczynski, N. Sacchi // Anal. Biochem. - 1987. - V. 162. - P. 156-159.

3. Filippi, C.V. Population structure and genetic diversity characterization of a sunflower association mapping population using SSR and SNP markers / C.V. Filippi [and oth.] / BMC Plant Biology. - 2015. - P. 15-52.

4. Ghasemi, A.R. Analysis of genetic diversity of sugar

beet genotypes using random amplified polymorphic DNA marker / A.R. Ghasemi, A.R. Golparvar, M.N. Isfahani // Genetika. - 2014. - Vol. 46. - No 3. - P. 975-984.

5. Morchen, M. Abudance and length Polymorphism of microsatellite repearts / M. Morchen [and oth.] // Theor. Appl. Genet. - 1996. - T. 2. -P. 326-333.

6. Nagl, N. Estimation of genetic variation among related Sugar Beet genotypes by using RAPD / N. Nagl [and oth.] // Genetika. - 2011. - Vol. 43. - No 3. - P. 575-582.

7. Nguyen, H.T. Molecular Marker Systems for Genetic Mapping / H.T.

Nguyen, Wu X. // The Handbook of Plant Genome Mapping. Genetic and Physical Mapping. Eds.: Meksem K. and Kahl G. Wiley. - VCH. - Weinheim. - 2005.

8. Paniego, N. Microsatellite isolation and characterization in sunflower (Helianthus annuus L.) / N. Paniego [and oth.] // Genome. - 2002. - V. 45. - № 1.

- Р. 34-43.

9. Rogers, S. Extraction of DNA from milligram amounts of fresh, herbarium and mummified plant tissues / S. Rogers, A. Bendich // Plant Molecular Biologi. - 1985.

- V. 5. - P. 67-69.

10. Wang, H.-Z. Analysis of the genetic Diversity in Different Types of Sugar Beets by SR AP and SSR Markers / H.-Z. Wang [and oth.] // Acta Agnon. Sin. - 2008. -Vol. 34. - Issue (01). - P. 37-46.

Аннотация. В статье представлены результаты молекулярно-генетического скрининга селекционных материалов сахарной, кормовой свёклы и гибридов, созданных на их основе. По результатам ПЦР-анализа установлены молекулярно-генетические особенности изученных образцов свёклы по RAPD-локусам OPA-10, OPC-06, OPP-18 и микросателлитным локусам генома: Bvm 1, Bvm 2, Bvm 3. Это позволило составить генетические паспорта исследованных генотипов свёклы и провести их идентификацию для использования в дальнейших программах скрещиваний.

Ключевые слова: сахарная свёкла, кормовая свёкла, ПЦР-анализ, генетический полиморфизм, RAPD-локусы, SSR-праймеры.

Summary. In the paper, the results of molecular-genetic screening of sugar beet and fodder beet materials and hybrids produced on their basis are presented. Based on the PCR-analysis results, molecular-genetic characteristic features of the studied beet samples have been determined using RAPD-loci (OPA-10, OPC-06, and OPP-18) and genome micro-satellite loci (Bvm 1, Bvm 2, Bvm 3). It has allowed making genetical passports of the studied beet genotypes and their identification to use in further crossing programs.

Keywords: sugar beet, fodder beet, PCR-analysis, genetic polymorphism, RAPD-loci, SSR- primers.

1

0

1

0

1

0

1

0

1

1

0

0

0

0

0

0

0

0

0