ИММУНОИНДУЦИРУЮЩИЙ АГЕНТ
IMMUNE-INDUCING AGENT

Область, к которой относится изобретение
[0001] Настоящее изобретение относится к новому иммуноиндуцирующему агенту, который используется в качестве агента для лечения и/или профилактики рака или т.п.
Предпосылки создания изобретения
[0002] Рак является главной причиной смертности во всем мире. В настоящее время, основным методом лечения рака является хирургическая опреация, которую проводят в комбинации с лучевой терапией и химиотерапией. В последние годы, несмотря на развитие новых хирургических технологий и появление новых противораковых средств, лечение рака, за исключением рака некоторых типов, все еще не дает желаемых результатов. Так, например, в последние годы были идентифицированы раковые антигены, распознаваемые цитотоксическими T-клетками, которые реагируют с раковыми антигенами, и гены, кодирующие раковые антигены, а также были разработаны методы молекулярной биологии и противораковой иммунологии, что улучшает перспективы антигенспецифической иммунотерапии.
[0003] Сообщалось, что мембранный белок 1, экспрессируемый тучными клетками (MCEMP1), то есть, трансмембранный белок типа 2, экспрессируется на клеточной мембране по механизму, специфичному для тучных клеток, что позволяет предположить о вероятности участия этого белка в дифференцировке тучных клеток и в индуцировании иммунного ответа и аллергического ответа (Непатентный документ 1). Однако в литературе отсутствуют какие-либо данные о том, что белок MCEMP1 обладает иммуноиндуцирующей активностью против раковых клеток и может быть использован для лечения и профилактики рака.
Предшествующий уровень техники
Непатентные документы
[0004] Непатентный документ 1: Kang Li. et al. Genomics,86:68-75(2005)
Сущность изобретения
Проблемы, которые могут быть решены с помощью настоящего изобретения
[0005] Целью настоящего изобретения является обнаружение нового полипептида, который может быть использован в качестве терапевтического и/или профилактического средства для лечения рака, и применение такого полипептида в качестве иммуноиндуцирующего агента.
Средства решения проблемы
in vivo
in vivo
[0006] Авторами настоящего изобретения были проведены интенсивные исследования, в результате которых была получена кДНК, кодирующая белок, связывающийся с антителом, присутствующим в сыворотке живых индивидуумов с раковой опухолью, методом SEREX с использованием библиотеки кДНК, выделенной из яичек собак, а также в сыворотке собак с лейкозом. На основе этой кДНК, авторами настоящего изобретения был получен полипептид мембранного белка 1, экспрессирующегося в тучных клетках собак (далее обозначаемый MCEMP1) и имеющего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4. Кроме того, исходя из человеческих, кошачьих и мышиных генов, гомологичных собачьему гену, авторами настоящего изобретения были получены человеческие, кошачьи и мышиные полипептиды MCEMP1, имеющие аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 2, 6 и 8. Авторами настоящего изобретения было обнаружено, что эти полипептиды MCEMP1 специфически экспрессируются при лейкозе, миелодиспластическом синдроме, остеосаркоме, тимоме, мастоцитоме и перианальной аденокарциноме. Кроме того, авторами также было обнаружено, что иммунные клетки, направленные против MCEMP1, могут быть индуцированы  путем введения этих MCEMP1 живым индивидуумам, и что размер опухоли у живых индивидуумов, у которых экспрессируется MCEMP1, может снижаться. Кроме того, авторами настоящего изобретения было обнаружено, что рекомбинантный вектор, способный экспрессировать полинуклеотид, кодирующий полипептид MCEMP1 или его фрагмент, оказывает противоопухолевое действие на раковую опухоль, экспрессирующую MCEMP1 .
[0007] Авторами настоящего изобретения было также обнаружено, что полипептид MCEMP1 презентируется антигенпрезентирующей клеткой и обладает способностью (также называемой «иммуноиндуцирующей активностью») активировать и пролифирировать цитотоксические T-клетки, специфичные к этому полипептиду; и что благодаря такой способности, этот полипептид, может быть использован для лечения и/или профилактики рака, а также, что антигенпрезентирующие клетки, которые контактируют с этим полипептидом, и T-клетки, которые контактируют с антигенпрезентирующей клеткой, могут быть использованы для лечения и/или профилактики рака. На основании этих данных было разработано настоящее изобретение.
[0008] В соответствии с этим, настоящее изобретение включает следующий признаки (1)-(11):
in vitro
(1) Иммуноиндуцирующий агент, включающий в качестве активного ингредиента по меньшей мере один полипептид, обладающий иммуноиндуцирующей активностью и выбранный из любых нижеследующих полипептидов (a)-(d), или рекомбинантный вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий полипептид и способный экспрессировать указанный полипептид ;
(a) полипептид, состоящий из 7 или более следующих друг за другом аминокислот или имеющий полноразмерную аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, 4, 6 или 8 в списке последовательностей;
(b) полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, полученнной путем делеции, замены или добавления одной или нескольких аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2, 4, 6 или 8 в списке последовательностей;
(c) полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, которая на 90% или более идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2, 4, 6 или 8 в списке последовательностей;
(d) полипептид, содержащий любой из полипептидов (a)-(c) в виде неполной последовательности.
(2) Иммуноиндуцирующий агент в соответствии с (1), который представляет собой агент для обработки антигенпрезентирующих клеток.
(3) Иммуноиндуцирующий агент в соответствии с (1), который представляет собой активный ингредиент для лечения и/или профилактики рака.
(4) Иммуноиндуцирующий агент в соответствии с (3), где раковой опухолью является MCEMP1-экспрессирующая раковая опухоль.
(5) Иммуноиндуцирующий агент в соответствии с (3) или (4), где раком является лейкоз, миелодиспластический синдром, остеосаркома, тимома, мастоцитома или перианальная аденокарцинома.
(6) Иммуноиндуцирующий агент в соответствии с любым из (1)-(5), также содержащий иммуностимулятор.
(7) Иммуноиндуцирующий агент в соответствии с (6), где иммуностимулятором является по меньшей мере один агент, выбранный из группы, состоящей из неполного адъюванта Фрейнда, монтанида, Poly-IC и его производных, CpG-олигонуклеотидов, интерлейкина 12, интерлейкина 18, интерферона α, интерферона β, интерферона ω, интерферона γ и лиганда Flt 3.
ex vivo
in vitro
(8) Способ получения антигенпрезентирующей клетки, содержащей комплекс полипептида, определенного в (1), и молекулы MHC, где указанный способ включает контактирование полипептида с антигенпрезентирующей клеткой, взятой у индивидуума  или .
(9) Способ в соответствии с (8), где антигенпрезентирующей клеткой является дендритная клетка или В-клетка, содержащая молекулу МНС класса I.
ex vivo
in vitro
(10) Способ получения цитотоксической T-клетки, специфичной к полипептиду, определенному в (1), где указанный способ включает контактирование антигенпрезентирующей клетки, полученной способом в соответствии с (8) или (9), с T-клеткой, взятой у индивидуума  или , и тем самым активацию T-клетки.
in vivo
(11) Способ индуцирования иммунного ответа, включающий введение индивидууму по меньшей мере одного полипептида, обладающего иммуноиндуцирующей активностью и выбранного из любых нижеследующих полипептидов (a)-(d), или рекомбинантного вектора, содержащего полинуклеотид, кодирующий полипептид и способный экспрессировать указанный полипептид ;
(a) полипептида, состоящего из 7 или более следующих друг за другом аминокислот или имеющего полноразмерную аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, 4, 6 или 8 в списке последовательностей;
(b) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности, полученнной путем делеции, замены или добавления одной или нескольких аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2, 4, 6 или 8 в списке последовательностей;
(c) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности, которая на 90% или более идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2, 4, 6 или 8 в списке последовательностей;
(d) полипептида, содержащего любой из полипептидов (a)-(c) в виде неполной последовательности.
В соответствии с этим, настоящее изобретение относится к новому иммуноиндуцирующему агенту, который может быть использован для лечения и/или профилактики рака и т.п. При введении полипептида, используемого в настоящем изобретении, индивидууму, иммунные клетки могут индуцироваться в живом организме, а раковая опухоль, которая уже присутствует, может уменьшаться в размерах или регрессировать как конкретно описано ниже в примерах. Таким образом, полипептид может быть использован для лечения и профилактики рака.
[0009] Описание настоящего изобретения включает содержание заявки на патент Японии No. 2016-064034, приоритет которой испрашивается в настоящей заявке.
Краткое описание чертежей
[0010] [Фиг. 1] На этой фигуре показаны паттерны экспрессии идентифицированного гена MCEMP1 в опухолевых тканях собак. Под номером 1 указаны паттерны собачьего гена MCEMP1 в отдельных опухолевых тканях собак.
[Фиг. 2] На этой фигуре покзаны паттерны экспрессии гена MCEMP1 в отдельных тканях и раковых клеточных линиях человека. Под номером 2 указаны паттерны экспрессии человеческого гена MCEMP1 в отдельных здоровых тканях человека; а под номером 3 указаны паттерны экспрессии человеческого гена MCEMP1 в отдельных раковых клеточных линиях человека. На этой фигуре, МКПК означает мононуклеарные клетки периферической крови.
[Фиг. 3] На этой фигуре показаны паттерны экспрессии идентифицированного гена MCEMP1 в отдельных мышиных раковых клеточных линиях. Под номером 4 указаны паттерны экспрессии мышиного гена MCEMP1 в отдельных мышиных раковых клеточных линиях.
Способ осуществления изобретения
[0011] Настоящее изобретение более подробно описано ниже.
1. Полипептид
Поскольку полипептид содержится в качестве активного ингредиента в иммуноиндуцирующем агенте согласно изобретению, то в настоящее изобретение входят полипептиды, определенные в нижеследующих (a)-(d). Используемый здесь термин «полипептид» означает молекулу, образованную множеством аминокислот, которые связаны между собой полипептидной связью, и включает не только полипептидную молекулу, состоящую из большого числа аминокислот, но также и низкомолекулярную молекулу (то есть олигопептид), состоящую из небольшого числа аминокислот, или полноразмерный белок.
(a) Полипептид, состоящий из 7 или более следующих друг за другом аминокислот или имеющий полноразмерную аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, 4, 6 или 8 в списке последовательностей, и обладающий иммуноиндуцирующей активностью;
(b) полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, полученнной путем делеции, замены или добавления одной или нескольких аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2, 4, 6 или 8 в списке последовательностей; и обладающий иммуноиндуцирующей активностью;
(c) полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, которая на 90% или более идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2, 4, 6 или 8 в списке последовательностей; и обладающий иммуноиндуцирующей активностью;
(d) полипептид, содержащий любой из полипептидов (a)-(c) в виде неполной последовательности и обладающий иммуноиндуцирующей активностью.
[0012] В настоящем изобретении, словосочетание «имеющий аминокислотную последовательность» означает, что аминокислотные остатки расположены в последовательности в определенном порядке. В соответствии с этим, например, термин «полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 8» означает полипептид, имеющий размер в 183 аминокислотных остатка и состоящий из аминокислотной последовательности Met, His, Ala, Ser, Ala.. . Gln, Pro, Ser и Thr, представленной в SEQ ID NO: 8. «Полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 8», иногда просто называется здесь, например, «полипептидом SEQ ID NO: 8». То же самое относится и к словосочетанию «имеющий нуклеотидную последовательность». В этом выражении, слово «имеющий» может быть заменено словосочетанием «состоящий из».
[0013] Используемый здесь термин «иммуноиндуцирующая активность» означает способность индуцировать в живом организме иммунные клетки, секретирующие цитокины, такие как интерферон.
[0014] Иммуноиндуцирующая активность вышеуказанного полипептида может быть подтверждена, например, с помощью анализа ELISPOT, известного специалистам. Более конкретно, иммуноиндуцирующая активность может быть оценена путем получения клеток, таких как мононуклеарные клетки периферической крови, из живого организма, в который был введен полипептид, оцениваемый на иммуноиндуцирующую активность; совместного культивирования этих клеток с полипептидом; и измерения количества цитокина, продуцируемого этими клетками с использованием специфического антитела, и, тем самым, определения числа иммунных клеток в этих клетках.
in vivo
[0015] Как описано в приведенных ниже примерах, введение рекомбинантных полипептидов в соответствии с (а)-(d) в живые организмы с раковой опухолью может также приводить к регрессии опухоли благодаря иммуноиндуцирующей активности полипептидов. В соответствии с этим, иммуноиндуцирующая активность может быть оценена по ее способности подавлять пролиферацию раковых клеток или снижать размер раковой ткани (опухоли) или вообще удалять эту раковую ткань (опухоль) (такая способность далее будет называться «противоопухолевой активностью»). Противоопухолевая активность полипептида может быть фактически подтверждена путем введения полипептида в живой организм с раковой опухолью, и оценки, например, снижения размера опухоли или отсутствия такого снижения, например, как конкретно описано ниже в примерах. Альтернативно, противоопухолевая активность полипептида может быть оценена для того, чтобы определить, например, может ли цитотоксическая T-клетка, индуцируемая путем введения полипептида в живой организм с раковой опухолью, оказывать цитотоксическое действие на эту опухоль. Цитотоксическая активность T-клетки может быть определена  путем введения антитела, которое удаляет T-клетку из живого организма, и оценки увеличения размера опухоли или отсутствия такого увеличения. Однако, способ определения цитотоксической активности не ограничивается вышеупомянутым способом.
in vitro
51
[0016] Альтернативно, противоопухолевая активность полипептидов может быть оценена на способность Т-клеток, стимулированных полипептидами (более конкретно, Т-клеток, контактирующих с антигенпрезентирующими клетками, которые презентируют полипептиды), оказывать цитотоксическое действие на опухолевые клетки . T-клетки и антигенпрезентирующие клетки могут быть подвергнуты контактированию друг с другом путем совместного культивирования обеих клеток в жидкой среде, как описано ниже. Цитотоксическая активность может быть оценена известным методом, называемым анализом на высвобождение Cr, например, описанным в Int. J. Cancer, 58: p.317, 1994. Если вышеупомянутые полипептиды используются для лечения и/или профилактики рака, то иммуноиндуцирующую активность предпочтительно, оценивают по противоопухолевой активности, служащей в качестве индикатора, хотя такая оценка не ограничивается вышеупомянутой оценкой.
[0017] В настоящем изобретении, аминокислотными последовательностями, представленными в SEQ ID NO: 2, 4, 6 и 8, соответственно, в списке последовательностей, являются аминокислотные последовательности MCEMP1, которые были выделены в виде полипептидов, связывающихся со специфическими антителами, присутствующими в сыворотке собак с раковой опухолью, методом SEREX с использованием библиотеки кДНК, полученной из яичек собак, и из сыворотки собак с раковой опухолью, а также в виде гомологов, выделенных у человека, кошек и мышей (см. пример 1). Человеческий MCEMP1, который представляет собой человеческий гомолог, гомологичный собачьему MCEMP1, имеет нуклеотидную последовательность, идентичную на 70%, и аминокислотную последовательность, идентичную на 51%. Кошачий MCEMP1, который представляет собой кошачий гомолог, имеет нуклеотидную последовательность, идентичную на 83%, и аминокислотную последовательность, идентичную на 64%. Мышиный MCEMP1, который представляет собой мышиный гомолог, имеет нуклеотидную последовательность, идентичную на 65%, и аминокислотную последовательность, идентичную на 47%.
[0018] Полипептид, определенный выше в (а), представляет собой полипептид, который состоит из 7 или более, а предпочтительно, из 8, 9 или 10 или более расположенных подряд аминокислот в полипептиде, имеющем аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, 4, 6 или 8, и который обладает иммуноиндуцирующей активностью. Особенно предпочтительно, чтобы полипептид имел аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, 4, 6 или 8. Как известно специалистам в данной области, если полипептид имеет приблизительно 7 или более аминокислотных остатков, то такой полипептид может обладать ангиогенностью и иммуногенностью. Таким образом, если полипептид состоит из 7 или более расположенных подряд аминокислотных остатков или содержит все аминокислотные остатки (полноразмерную последовательность) в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2, 4, 6 или 8, то он может обладать иммуноиндуцирующей активностью, и таким образом, может быть использован для получения иммуноиндуцирующего агента согласно изобретению.
[0019] Принцип индуцирования иммунного ответа путем введения антигенного ракового полипептида является известным и заключается в следующем: полипептид вводят в антигенпрезентирующие клетки, а затем эти полипептиды разлагаются на более мелкие фрагменты клеточными пептидазами с последующей презентацией этих фрагментов на поверхности клетки. Затем эти фрагменты распознаются цитотоксической T-клеткой или т.п., что приводит к селективному уничтожению клеток, презентирующих антиген. Полипептид, присутствующий на поверхности антигенпрезентирующей клетки, имеет относительно небольшой размер и состоит приблизительно из 7-30 аминокислот. Следовательно, с точки зрения презентации полипептида на поверхности антигенпрезентирующей клетки, одним из предпочтительных вариантов вышеописанного полипептида (а) является полипептид, состоящий приблизительно из 7-30 расположенных подряд аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2, 4, 6 или 8, а более предпочтительно, в качестве полипептида (а) может рассматриваться полипептид, состоящий приблизительно из 8-30 или приблизительно из 9-30 аминокислот. В некоторых случаях, эти относительно небольшие полипептиды презентируются непосредственно на поверхности антигенпрезентирующей клетки, но не проникают в эти антигенпрезентирующие клетки.
[0020] Кроме того, поскольку полипептид, введенный в антигенпрезентирующую клетку, расщепляется в неспецифических сайтах клеточными пептидазами с образованием различных полипептидных фрагментов, которые затем презентируются на поверхности антигенпрезентирующей клетки, то введение крупного полипептида, такого как полноразмерная область в SEQ ID NO: 2, 4, 6 или 8, неизбежно приводит к продуцированию полипептидных фрагментов посредством расщепления в антигенпрезентирующей клетке, и эти фрагменты являются эффективными для индуцирования иммунного ответа антигенпрезентирующей клеткой. Поэтому, для индуцирования иммунного ответа антигенпрезентирующими клетками, может быть, предпочтительно, использован крупный полипептид, который может состоять не менее чем из 30, предпочтительно не менее чем из 100, а более предпочтительно не менее чем из 200 аминокислот. Более предпочтительно, чтобы такой полипептид состоял из полноразмерной области SEQ ID NO: 2, 4, 6 или 8.
[0021] Полипептидом, описанным выше в (с), является полипептид, полученный путем замены, делеции и/или инсерции небольшого числа (предпочтительно, одного или нескольких) аминокислотных остатков в полипептиде, описанном выше в (а), и такая последовательность на 90% или более, предпочтительно на 95% или более, более предпочтительно на 98% или более, еще более предпочтительно на 99% или более или на 99,5% или более идентична исходной последовательности и обладает иммуноиндуцирующей активностью. Вообще говоря, специалистам хорошо известно, что белковый антиген, даже в случае замены, делеции или инсерции небольшого числа аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности белка, может, по существу, обладать такой же антигенностью, как и исходный белок. В соответствии с этим, полипептид, определенный выше в (с), может обладать иммуноиндуцирующей активностью, а поэтому, он может быть использован для получения иммуноиндуцирующего агента согласно изобретению. Также предпочтительно, чтобы полипептидом, определенным выше в (b), был полипептид, полученный путем замены, делеции и/или инсерции одного или нескольких аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2, 4, 6 или 8. Используемый здесь термин «несколько» означает целое число от 2 до 10, предпочтительно от 2 до 6, а более предпочтительно от 2 до 4.
[0022] Используемый здесь термин «идентичность аминокислотных последовательностей или нуклеотидных последовательностей» означает величину, вычисленную путем выравнивания двух аминокислотных последовательностей (или нуклеотидных последовательностей) так, чтобы число совпадающих аминокислотных остатков (или нуклеотидов) между аминокислотными последовательностями (или нуклеотидными последовательностями) было, по возможности, как можно более высоким, а затем число совпадающих аминокислотных остатков (или число совпадающих нуклеотидов) делят на общее число аминокислотных остатков (или общее число нуклеотидов), и эту величину выражают в процентах. При осуществлении выравнивания, если это необходимо, в одну или обе сравниваемые последовательности вводят пробел(ы). Такое выравнивание последовательностей осуществляют с использованием хорошо известной программы, такой как BLAST, FASTA или CLUSTAL W. При введении пробела(ов), вышеуказанное общее число аминокислотных остатков означает число остатков, вычисленное путем подсчета одного пробела как одного аминокислотного остатка. Если вычисленные таким образом общие количества аминокислотных остатков в двух сравниваемых последовательностях отличаются, то идентичность последовательностей (%) вычисляют путем деления числа совпадающих аминокислотных остатков на общее число аминокислотных остатков в более длинной последовательности.
[0023] Аминокислоты 20 типов, составляющие природные белки, могут быть подразделены на группы по их аналогичным свойствам, например, на нейтральные аминокислоты с боковыми цепями, имеющими низкую полярность (Gly, Ile, Val, Leu, Ala, Met, Pro), нейтральные аминокислоты, имеющие гидрофильные боковые цепи (Asn, Gln, Thr, Ser, Tyr, Cys), кислотные аминокислоты (Asp, Glu), основные аминокислоты (Arg, Lys, His) и ароматические аминокислоты (Phe, Tyr, Trp). Известно, что в большинстве случаев, замены аминокислот, принадлежащих к одной и той же группе, не приводят к изменению свойств полипептида. Следовательно. в случае замены аминокислотного(ых) остатка(ов) в полипептиде (а) согласно изобретению, вероятность сохранения иммуноиндуцирующей активности повышается благодаря замене аминокислотных остатков, принадлежащих к той же группе, и такая замена является предпочтительной.
[0024] Полипептид (d) включает любой из полипептидов (а)-(с) в виде неполной последовательности, и обладает иммуноиндуцирующей активностью. То есть, полипептид (а) или (b) имеет другую аминокислоту или другой полипептид, присоединенные к одному концу или к обоим концам любого из полипептидов (а)-(с), и обладает иммуноиндуцирующей активностью. Такой полипептид может быть также использован для получения иммуноиндуцирующего агента согласно изобретению.
[0025] Вышеописанные полипептиды могут быть синтезированы, например, методом химического синтеза, таким как метод Fmoc (метод с использованием флуоренилметилоксикарбонила) или метод tBoc (метод с использованием трет-бутилоксикарбонила). Кроме того, они могут быть синтезированы стандартными методами с использованием коммерчески доступных синтезаторов пептидов различных типов. Кроме того, представляющий интерес полипептид может быть получен известными методами генной инженерии путем синтеза полинуклеотида, кодирующего вышеуказанный полипептид, и включения полинуклеотида в экспрессионный вектор, который затем вводят в клетку-хозяина для продуцирования полипептида в этой клетке.
[0026] Полинуклеотид, кодирующий вышеуказанный полипептид может быть легко получен известным методом генной инженерии или стандартным методом с использованием коммерчески доступного синтезатора нуклеиновых кислот. Так, например, ДНК, имеющая нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3, может быть получена с помощью ПЦР с использованием библиотеки ДНК или кДНК собачьей хромосомы в качестве матрицы и пары праймеров, сконструированных так, чтобы нуклеотидная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 3, могла быть амплифицирована с использованием праймеров. ДНК, имеющая нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1, может быть аналогичным образом получена с использованием библиотеки ДНК или кДНК человеческой хромосомы в качестве матрицы. Условия проведения реакции ПЦР могут быть выбраны соответствующим образом, и примерами условий такой реакции являются, но не ограничиваются ими: 30 циклов реакций при 94°С, 30 секунд (денатурация), при 55°С, от 30 секунд до 1 минуты (отжиг), и 1 цикл при 72°С в течение 1 минуты (удлинение), а затем реакция при 72°С в течение 7 минут. Кроме того, нужная ДНК может быть выделена путем получения соответствующего(их) зонда(ов) или праймера(ов) на основе информации о нуклеотидных последовательностях и аминокислотных последовательностях, представленных в SEQ ID NO: 1 и 3 в списке последовательностей, имеющемся в настоящем документе, и скрининга библиотеки кДНК человека, собаки или т.п. с использованием зонда(ов) или праймера(ов). Библиотеку кДНК предпочтительно, получают из клеток, органов или тканей, экспрессирующих белок SEQ ID NO: 2 или 4. Вышеописанные процедуры, такие как получение зонда(ов) или праймера(ов), конструирование библиотеки кДНК, скрининг библиотеки кДНК, и клонирование представляющего интерес гена известны специалистам и могут быть осуществлены методами, описанными в руководстве Molecular Cloning, Second Edition; Current Protocols in Molecular Biology; и/или т.п. Из полученной таким образом ДНК может быть выделена ДНК, кодирующая полипептид (а). Кроме того, поскольку кодоны, кодирующие каждую аминокислоту, являются известными, то может быть легко определена нуклеотидная последовательность полинуклеотида, кодирующего конкретную аминокислотную последовательность. Следовательно, поскольку может быть также легко определена нуклеотидная последовательность полинуклеотида, кодирующего полипептид (b)-(d), то такой полинуклеотид может быть также легко синтезирован с использованием коммерчески доступного синтезатора нуклеиновых кислот стандартным методом.
E. coli
Xenopus laevis
[0027] Клетки-хозяева не имеют конкретных ограничений при условии, что они могут экспрессировать вышеописанный полипептид, и примерами таких клеток являются, но не ограничиваются ими, прокариотические клетки, такие как ; и эукариотические клетки, такие как культивированные клетки млекопитающих, включая клетки почек обезьяны COS1 и клетки яичника китайского хомячка СНО; дрожжи, размножающиеся почкованием; дрожжи, размножающиеся делением; клетки шелкопряда и яйцеклетки .
E. coli
[0028] При использовании прокариотических клеток в качестве клеток-хозяев применяется экспрессионный вектор, в котором присутствует ориджин, позволяющий осуществлять репликацию вектора в прокариотической клетке; промотор; сайт связывания с рибосомой; сайт клонирования ДНК; терминатор и/или т.п. Примерами экспрессионных векторов для  являются система pUC, pBluescript II, экспрессионная система pET и экспрессионная система pGEX. При включении ДНК, кодирующей вышеуказанный полипептид, в такой экспрессионный вектор, и трансформации прокариотических клеток-хозяев этим вектором с последующим культивированием полученных трансформантов, полипептид, кодируемый ДНК, может экспрессироваться в прокариотических клетках-хозяевах. В этом способе, полипептид может также экспрессироваться как гибридный белок, присоединенный к другому белку.
[0029] При использовании эукариотических клеток в качестве клеток-хозяев, экспрессионным вектором служит экспрессионный вектор для эукариотических клеток, имеющий промотор, область сплайсинга, сайт присоединения poly(A) и/или т.п. Примерами такого экспрессионного вектора являются pKA1, pCDM8, pSVK3, pMSG, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, EBV-вектор, pRS, pcDNA3.1, pSecTag (A, B, C), pMSG и pYES2. В аналогичном способе, описанном выше, при включении ДНК, кодирующей вышеуказанный полипептид, в такой экспрессионный вектор, и трансформации эукариотических клеток-хозяев этим вектором с последующим культивированием полученных трансформантов, полипептид, кодируемый ДНК, может экспрессироваться в эукариотических клетках-хозяевах. В случае, когда в качестве экспрессионного вектора используются pIND/V5-His, pFLAG-CMV-2, pEGFP-N1, pEGFP-C1 или т.п., вышеуказанный полипептид может экспрессироваться в виде гибридного белка, к которому присоединены метки, такие как His-метка, FLAG-метка, myc-метка, HA-метка или GFP.
[0030] Введение экспрессионного вектора в клетки-хозяева может быть осуществлено хорошо известными методами, такими как электропорация, метод с использованием фосфата кальция, липосомный метод и метод с использованием DEAE-декстрана.
[0031] Выделение и очистка представляющего интерес полипептида из клеток-хозяев могут быть осуществлены с применением комбинации известных методов разделения. Примерами известных методов разделения являются, но не ограничиваются ими, обработка денатурирующим агентом, таким как мочевина, или поверхностно-активным веществом; обработка ультразвуком; ферментативное расщепление; высаливание или фракционированное осаждение растворителем; диализ; центрифугирование; ультрафильтрация; гель-фильтрация; электрофорез в ДСН-ПААГ; изоэлектрическое фокусирование; ионообменная хроматография; гидрофобная хроматография; аффинная хроматография и обращенно-фазовая хроматография.
[0032] Полипептиды, полученные описанным выше методом, также включают, как описано выше, полипептиды в форме гибридного белка вместе с любым другим белком. Примерами таких белков являются гибридные белки с глутатион-S-трансферазой (GST) или с His-меткой. Такой полипептид, имеющий форму гибридного белка, также входит в объем настоящего изобретения как вышеуказанный полипептид (d). Кроме того, в некоторых случаях, полипептид, экспрессирумый в трансформированной клетке, модифицируют различными методами после его трансляции в клетке. Такой посттрансляционно модифицированный полипептид также входит в объем настоящего изобретения, при условии, что он будет обладать иммуноиндуцирующей активностью. Примерами таких посттрансляционных модификаций являются удаление N-концевого метионина, N-концевое ацетилирование, гликозилирование, ограниченное расщепление внутриклеточной протеазой, миристоилирование, изопренилирование и фосфорилирование.
2. Иммуноиндуцирующий агент
[0033]
Как более подробно описано в приведенных ниже примерах, введение полипептида, обладающего иммуноиндуцирующей активностью, в живой организм с опухолью, может вызывать регрессию опухоли. Таким образом, иммуноиндуцирующий агент согласно изобретению может быть использован для лечения и/или профилактики рака. Кроме того, полипептид, обладающий иммуноиндуцирующей активностью, может быть использован в способе лечения и/или профилактики рака посредством индуцирования иммунного ответа.
[0034] Используемые здесь термины «опухоль» и «рак» относятся к злокачественным новообразованием и являются синонимами.
[0035] В этом случае, неограничивающим примером рака-мишени является любая раковая опухоль, которая экспрессирует MCEMP1, а предпочтительно, раковая опухоль, которая экспрессирует MCEMP1 в значительно большем количестве, чем нормальные клетки, и такими раковыми заболеваниями являются, в частности, лейкоз, миелодиспластический синдром, остеосаркома, тимома, мастоцитома или перианальная аденокарцинома. Конкретными примерами таких раковых заболеваний являются, но не ограничиваются ими, острый нелимфоцитарный лейкоз, хронический лимфоцитарный лейкоз, острый гранулоцитарный лейкоз, хронический гранулоцитарный лейкоз, острый промиелоцитарный лейкоз, Т-клеточный лейкоз взрослых, нелейкемический лейкоз, лейкоцитемический лейкоз, базофильный лейкоз, бластный лейкоз, бычий лейкоз, хронический миелолейкоз, ограниченный лейкоз, эмбриональный лейкоз, эозинофильный лейкоз, лейкоз Гросса, клеточный лейкоз Ридера, лейкоз Шиллинга, лейкоз стволовых клеток, сублейкемический лейкоз, недифференцированный клеточный лейкоз, ретикулоэндотелиоз, гемобластный лейкоз, гемоцитобластный лейкоз, гистиоцитарный лейкоз, лейкоз стволовых клеток, острый моноцитарный лейкоз, лейкопения, лимфолейкоз, лимфобластный лейкоз, лимфоцитарный лейкоз, лимфотропный лейкоз, лимфоидный лейкоз, лимфосаркома, клеточный лейкоз, лейкоз тучных клеток, мегакариоцитарный лейкоз, микромиелобластный лейкоз, моноцитарный лейкоз, миелобластный лейкоз, миелолейкоз, миелоидный гранулоцитарный лейкоз, миеломоноцитарный лейкоз, лейкоз Найгели, плазмоклеточный лейкоз, плазмацитарный лейкоз, промиелоцитарный лейкоз, не поддающаяся лечению анемия (RA), не поддающаяся лечению анемия с кольцевыми сидеробластами (RARS), не поддающаяся лечению анемия с избыточным колиеством бластных клеток (RAEB), RAEB c трансформацией (RAEB-T), прелейкоз и хронический миеломоноцитарный лейкоз (CMML), стандартная центральная остеосаркома и ее подтипы (внутрикостная высокодифференцированная остеосаркома, остеосаркома круглых клеток, поверхностная остеосаркома, остеосаркома надкостницы, периостальная остеосаркома и высокозлокачественная поверхностная остеосаркома), тимома, мастоцитома, перианальная аденома и перианальная аденокарцинома.
[0036] Представляющим интерес индивидуумом (то есть животным) предпочтительно является млекопитающее, а более предпочтительно, приматы, домашние питомцы, любые животные, содержащиеся в зоопарках или т.п., сельскохозяйственные животные, и животные, участвующие в спортивных состязаниях, а особенно предпочтительными являются человек, собаки или кошки.
[0037] Способом введения иммуноиндуцирующего агента согласно изобретению в живой организм может быть пероральное введение или парентеральное введение, а предпочтительно, парентеральное введение, такое как внутримышечное введение, подкожное введение, внутривенное введение или внутриартериальное введение. Если для лечения рака используется иммуноиндуцирующий агент, то он может быть введен в региональный лимфоузел в непосредственной близости от подвергаемой лечению опухоли в целях повышения противораковой активности. Дозой может быть любая доза, при условии, что она будет эффективной для индуцирования иммунного ответа, например, в случае, когда такой агент используется для лечения и/или профилактики рака, то такой дозой может быть доза, эффективная для лечения и/или профилактики рака. Дозу, эффективную для лечения и/или профилактики рака, выбирают соответствующим образом в зависимости от размера и симптомов опухоли и т.п., а эффективная доза обычно составляет от 0,0001 мкг до 1000 мкг, а предпочтительно, от 0,001 мкг до 1000 мкг на животное в день, и такая доза может быть введена в виде одноразовой дозы или дробных доз. Этот агент, предпочтительно, вводят несколько раз, например, в течение нескольких дней или нескольких месяцев. Как описано ниже в примерах, иммуноиндуцирующий агент согласно изобретению может вызывать регрессию опухоли. Следовательно, поскольку агент может оказывать противораковое действие на небольшое число раковых клеток на ранней стадии, то развитие или рецидив рака могут быть предотвращены с использованием агента, вводимого до развития рака или после его лечения. Таким образом, иммуноиндуцирующий агент согласно изобретению является эффективным для лечения и профилактики рака.
[0038] Иммуноиндуцирующий агент согласно изобретению может состоять только из полипептида(ов), либо он может быть приготовлен в форме препарата путем соответствующего смешивания добавок, таких как фармакологически приемлемый носитель, разбавитель, наполнитель и т.п., подходящих для получения лекарственных форм. Метод приготовления препарата, а также подходящих добавок хорошо известен специалистам в области приготовления фармацевтических препаратов, причем, могут быть применены любые методы и любые добавки. Примерами добавок являются, но не ограничиваются ими, разбавители, такие как физиологические буферные растворы; наполнители, такие как сахар, лактоза, кукурузный крахмал, фосфат кальция, сорбит и глицин; связующие агенты, такие как сироп, желатин, аравийская камедь, сорбит, поливинилхлорид и трагакант; и лубриканты, такие как стеарат магния, полиэтиленгликоль, тальк и двуокись кремния. Примерами лекарственных форм могут быть пероральные препараты, такие как таблетки, капсулы, гранулы, порошки и сиропы; и парентеральные препараты, такие как ингаляторы, инъекции, суппозитории и растворы. Эти препараты могут быть получены методами, в основном, известными специалистам.
[0039] Иммуноиндуцирующий агент согласно изобретению может быть использован в комбинации с иммуностимулятором, который усиливает иммунный ответ в живом организме. Иммуностимулятор может содержаться в иммуноиндуцирующем агенте согласно изобретению, либо он может быть введен пациенту в виде отдельной композиции в комбинации с иммуноиндуцирующим агентом согласно изобретению.
Salmonella minnesota
Quillja saponaria
nd
[0040] Примерами иммуностимуляторов являются адъюванты. Адъюванты могут усиливать иммунный ответ посредством создания резервуара антигена (вне клеток или в макрофагах), активации макрофагов и стимуляции специфических наборов лимфоцитов, что будет приводить к усилению иммунного ответа и противоракового действия. Следовательно, в случаях, когда иммуноиндуцирующий агент согласно изобретению используется для лечения и/или профилактики рака, такой иммуноиндуцирующий агент, помимо вышеописанного полипептида, который является активным ингредиентом, предпочтительно, содержит адъювант. Адъюванты многих типов хорошо известны специалистам и могут быть использованы любые из этих адъювантов. Конкретными примерами адъювантов являются MPL (SmithKline Beecham), гомологи липополисахарида Re 595, полученные после очистки и кислотного гидролиза липополисахарида; QS21 (SmithKline Beecham), чистый сапонин QA-21, выделенный из экстракта ; DQS21, описанный в заявке PCT WO96/33739 (SmithKline Beecham); QS-7, QS-17, QS-18 и QS-L1 (So and 10 others., «Molecules and Cells», 1997, Vol. 7, p. 178-186); неполный адъювант Фрейнда; полный адъювант Фрейнда; витамин E; Монтанид; квасцы; CpG-олигонуклеотиды (см., например, Kreig and 7 others, Nature, Vol. 374, p. 546-549); poly-IC и их производные (например, poly-ICLC); и различные эмульсии типа «вода в масле», полученные из биологически разлагаемых масел, таких как сквален и/или токоферол. Из них, предпочтительными являются неполный адъювант Фрейнда; Монтанид; poly-IC и их производные, а также CpG-олигонуклеотиды. Отношение вышеописанного адъюванта и полипептида в смеси обычно составляет приблизительно от 1:10 до 10:1, предпочтительно, приблизительно от 1:5 до 5:1, а более предпочтительно, приблизительно 1:1. Однако, адъюванты не ограничиваются вышеописанными примерами, и при введении иммуноиндуцирующего агента согласно изобретению могут быть также использованы адъюванты, известные специалистам, но не описанные выше (см., например, Goding, «Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 2 edition», 1986). Методы получения смесей или эмульсий полипептида и адъювантов хорошо известны специалистам в области вакцинации.
[0041] Кроме того, помимо вышеописанных адъювантов, в качестве иммуностимулятора могут быть использованы факторы, которые стимулируют представляющий интерес иммунный ответ. Так, например, различные цитокины, обладающие способностью стимулировать лимфоциты или антигенпрезентирующие клетки, могут быть использованы в качестве иммуностимулятора в комбинации с иммуноиндуцирующим агентом согласно изобретению. Ряд таких цитокинов, способных стимулировать иммунный ответ, известен специалистам, и примерами таких цитокинов являются, но не ограничиваются ими, интерлейкин-12 (IL-12), GM-CSF, IL-18, интерферон-α, интерферон-β, интерферон-ω, интерферон-γ и лиганд Flt 3, которые, как сообщалось, усиливают профилактическое действие вакцин. Такие факторы могут быть использованы в качестве иммуностимулятора и введены пациенту путем его добавления к иммуноиндуцирующему агенту согласно изобретению, либо они могут быть введены в виде отдельной композиции в комбинации с иммуноиндуцирующим агентом согласно изобретению.
3. Антигенпрезентирующие клетки или цитотоксические T-клетки
[0042]
ex vivo
in vitro
Настоящее изобретение также относится к способу получения антигенпрезентирующих клеток, содержащих комплекс вышеупомянутого полипептида и молекулы МНС, где указанный способ включает контактирование полипептида с антигенпрезентирующей клеткой, взятой у индивидуума  или .
[0043] Настоящее изобретение также относится к антигенпрезентирующей клетке, отличающейся тем, что она содержит комплекс вышеупомянутого полипептида и молекулы МНС, и была получена описанным способом.
ex vivo
in vitro
[0044] При контактировании вышеописанного полипептида с антигенпрезентирующими клетками  или , антигенпрезентирующие клетки могут быть получены так, чтобы они презентировали полипептид. То есть, полипептиды (a)-(d), описанные выше, могут быть использованы в качестве агента для обработки антигенпрезентирующих клеток. В настоящем описании, примерами антигенпрезентирующих клеток, которые, предпочтительно, используются, являются дендритные клетки или В-клетки, имеющие молекулу MHC класса I. Различные молекулы MHC класса I были идентифицированы и являются хорошо известными. Человеческие молекулы MHC обозначаются HLA. Примерами молекул HLA класса I являются HLA-A, HLA-B и HLA-C, а более конкретно, HLA-A1, HLA-A0201, HLA-A0204, HLA-A0205, HLA-A0206, HLA-A0207, HLA-A11, HLA-A24, HLA-A31, HLA-A6801, HLA-B7, HLA-B8, HLA-B2705, HLA-B37, HLA-Cw0401 и HLA-Cw0602.
[0045] Дендритные клетки или В-клетки, несущие молекулу МНС класса I, могут быть получены из периферической крови хорошо известным методом. Так, например, опухоль-специфичные дендритные клетки могут быть индуцированы путем выделения дендритных клеток из костного мозга, крови пупочного канатика или периферической крови пациента с использованием гранулоцитарного-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF) и IL-3 (или IL-4) и последующим добавлением опухоль-ассоциированного пептида в культуральную систему.
2
[0046] При введении эффективного количества таких дендритных клеток может вырабатываться ответ, необходимый для лечения рака. Используемыми клетками могут быть клетки костного мозга или клетки крови пупочного канатика, взятые у здорового индивидуума, или костный мозг и периферическая кровь иои т.п., взятые у самого пациента. При использовании аутологичных клеток пациента может быть обеспечена высокая степень безопасности, и при этом считается, что в данном случае можно избежать серьезных побочных эффектов. Периферическая кровь или костный мозг могут представлять собой любой свежий образец, образец, хранящийся в холодильнике и замороженный образец. Как и в случае периферической крови, культивированию может быть подвергнута цельная кровь, либо отдельно взятые лейкоцитарные компоненты могут быть отделены и культивированы, и в этом виде, они являются более эффективными, а поэтому предпочтительными. Кроме того, из лейкоцитарных компонентов могут быть выделены мононуклеарные клетки. В случае, когда клетки происходят от костного мозга или крови пупочного канатика, цельные клетки, составляющие костный мозг, могут быть культивированы, либо из этих клеток могут быть выделены и культивированы мононуклеарные клетки. Периферическая кровь и ее лейкоцитарные компоненты и клетки костного мозга содержат мононуклеарные клетки, гемопоэтические стволовые клетки и незрелые дендритные клетки, от которых происходят дендритные клетки, а также CD4-позитивные клетки и т.п. Что касается используемых цитокинов, то метод их получения не имеет конкретных ограничений, и природные или рекомбинантные цитокины или т.п. могут быть использованы в любом виде, при условии, что они будут безопасными и будут обладать физиологической активностью. Предпочтительно, препарат, качество которого является подходящим для его применения в медицине, используется в необходимом минимальном количестве. Концентрация добавляемого(ых) цитокина(ов) не имеет конкретных ограничений, при условии, что такая концентрация позволит индуцировать дендритные клетки, а обычно, общая концентрация цитокина(ов) составляет, предпочтительно, приблизительно 10-1000 нг/мл, а более предпочтительно, приблизительно 20-500 нг/мл. Культивирование может быть осуществлено с использованием хорошо известной среды, обычно применяемой для культивирования лейкоцитов. Температура культивирования не имеет конкретных ограничений, при условии, что она будет подходящей для пролиферации лейкоцитов, причем, наиболее предпочтительной является температура приблизительно 37°C, которая представляет собой температуру тела человека. Окружающая среда во время культивирования не имеет конкретных ограничений, при условии, что она будет подходящей для пролиферации лейкоцитов, причем, вентиляцию проводят, предпочтительно, при 5% CO. Время культивирования не имеет конкретных ограничений, при условии, что этот период времени будет достаточным для индуцирования необходимого числа клеток, а обычно, период культивирования составляет от 3 дней до 2 недель. Что касается оборудования, используемого для разделения и культивирования клеток, то может быть использовано соответствующее оборудование, а предпочтительно, оборудование, которое будет безопасным для его применения в медицине и для проведения стабильных и простых процедур. В частности, что касается оборудования для культивирования клеток, то могут быть использованы не только стандартные сосуды, такие как чашки Петри, колбы или бутыли, но также и сосуды универсального типа, сосуды для проведения множества стадий, роллерные бутыли, бутыли центифужного типа, сосуды для культивирования в виде пакетов, колонки из полого волокна или т.п.
ex vivo
in vitro
ex vivo
in vitro
3
7
4
6
2
[0047] Само контактирование вышеуказанного полипептида с антигенпрезентирующей клеткой  или  может быть осуществлено методом, хорошо известным специалистам, например, методом культивирования антигенпрезентирующей клетки в культуральной жидкости, содержащей полипептид. Концентрация пептидов в среде не имеет конкретных ограничений и обычно составляет приблизительно от 1 до 100 мкг/мл, а предпочтительно приблизительно от 5 до 20 мкг/мл. Клеточная плотность во время культивирования не имеет конкретных ограничений и обычно составляет приблизительно от 10 до 10 клеток/мл, а предпочтительно, приблизительно от 5×10 до 5×10 клеток/мл. Культивирование, предпочтительно, осуществляют рутинными методами при 37°C в атмосфере 5% СО. Длина пептида, который может быть презентирован антигенпрезентирующей клеткой на поверхности клеток, обычно составляет приблизительно максимум 30 аминокислотных остатков. В соответствии с этим, в случае контактирования антигенпрезентирующей клетки с полипептидом  или , полипептид может быть получен так, чтобы его длина составляла приблизительно 30 аминокислотных остатков или менее, однако, длина этого пептида не ограничивается этим числом остатков.
in vivo
ex vivo
in vitro
[0048] При культивировании антигенпрезентирующей клетки в присутствии вышеописанного полипептида, этот пептид интегрируют в молекулу МНС антигенпрезентирующей клетки и презентируют на поверхности антигенпрезентирующей клетки. В соответствии с этим, можно получить выделенную антигенпрезентирующую клетку, содержащую комплекс полипептида и молекулы МНС. Такая антигенпрезентирующая клетка может презентировать Т-клетке полипептид ,  или , что будет приводить к индуцированию и пролиферации цитотоксических Т-клеток, специфичных к этому полипептиду.
ex vivo
in vitro
[0049] Настоящее изобретение также относится к способу получения цитотоксической T-клетки, специфичной к вышеописанному полипептиду, где указанный способ включает контактирование антигенпрезентирующих Т-клеток с T-клеткой, взятой у индивидуума,  или  для активации T-клетки.
[0050] Настоящее изобретение также относится к цитотоксической T-клетке, специфичной к вышеописанному полипептиду и полученной этим способом.
ex vivo
in vitro
2
[0051] При контактировании антигенпрезентирующей клетки, содержащей комплекс вышеописанного полипептида и молекулы МНС, полученный вышеописанным способом, с Т-клеткой или , может быть индуцирована цитотоксическая T-клетка, специфичная к полипептиду, и эта клетка может быть подвергнута пролиферации. Контактирование может быть осуществлено путем совместного культивирования антигенпрезентирующей клетки и T-клетки в жидкой среде, например, путем суспендирования антигенпрезентирующей клетки в жидкой среде, помещения полученной суспензии в контейнер, такой как лунки микропланшета, добавления Т-клеток в лунки и их культивирования. Отношение смеси антигенпрезентирующих клеток и Т-клеток при совместном культивировании не имеет конкретных ограничений и обычно составляет приблизительно от 1:1 до 1:100, а предпочтительно приблизительно от 1:5 до 1:20. Плотность антигенпрезентирующих клеток в жидкой среде не имеет конкретных ограничений и обычно составляет приблизительно от 100 до 10000000 клеток/мл, а предпочтительно приблизительно от 10000 до 1000000 клеток/мл. Совместное культивирование предпочтительно осуществляют рутинными методами при 37°C в атмосфере 5% СО. Время культивирования не имеет конкретных ограничений и обычно составляет от 2 дней до 3 недель, а предпочтительно, приблизительно от 4 дней до 2 недель. Совместное культивирование предпочтительно осуществляют в присутствии интерлейкинов одного или более типов, таких как IL-2, IL-6, IL-7 и IL-12. В этом случае, концентрация IL-2 и IL-7 обычно составляет приблизительно от 5 до 20 ед./мл, концентрация IL-6 обычно составляет приблизительно от 500 до 2000 ед./мл, а концентрация IL-12 обычно составляет приблизительно от 5 до 20 нг/мл, однако, эти концентрации не ограничивается указанными концентрациями. Совместное культивирование может быть осуществлено один или несколько раз путем добавления свежих антигенпрезентирующих клеток. Так, например, процедура, включающая удаление супернатанта культуры после совместного культивирования, добавление суспензии свежих антигенпрезентирующих клеток и проведение совместного культивирования, может быть повторена один или несколько раз. Условия совместного культивирования могут быть такими же, как они описаны выше.
[0052] Во время совместного культивирования проводят индуцирование и пролиферацию цитотоксической T-клетки, специфичной к полипептиду. В соответствии с этим, вышеуказанный полипептид может быть использован для получения выделенной Т-клетки, которая селективно связывается с комплексом полипептида и молекулы МНС.
in vivo
in vivo
[0053] Как описано в приведенных ниже примерах, ген MCEMP1 специфически экспрессируется при лейкозе, миелодиспластическом синдроме, остеосаркоме, тимоме, мастоцитоме или перианальной аденокарциноме. В соответствии с этим, считается, что при таких видах рака, MCEMP1 присутствует в значительно больших количествах, чем в нормальных клетках. В соответствии с этим, если цитотоксическую Т-клетку, полученную вышеописанным способом, вводят , а часть полипептида MCEMP1, присутствующего в раковых клетках, презентируется молекулой МНС на поверхности раковой клетки, то цитотоксическая Т-клетка может разрушать раковую клетку благодаря использованию части полипептида MCEMP1 в качестве маркера. Антигенпрезентирующая клетка, презентирующая часть полипептида MCEMP1, может способствовать индуцированию и пролиферации цитотоксической Т-клетки, специфичной к полипептиду . Таким образом, раковые клетки могут быть также разрушены путем введения антигенпрезентирующей клетки в живой организм. Более конкретно, цитотоксическая Т-клетка и антигенпрезентирующая клетка, полученные с использованием вышеописанного полипептида, могут быть также использованы для лечения и/или профилактики рака по аналогии с иммуноиндуцирующим агентом согласно изобретению.
[0054] В случае, когда вышеописанные выделенные антигенпрезентирующие клетки или выделенные T-клетки вводят в живой организм, то эти клетки, предпочтительно, получают путем обработки антигенпрезентирующих клеток или T-клеток, взятых у пациента, подвергаемого лечению, полипептидом (а)-(d) как описано выше для предотвращения иммунного ответа в живом организме, атакующего эти клетки как чужеродные клетки.
[0055] Агент для лечения и/или профилактики рака, включающий в качестве активного ингредиента антигенпрезентирующие клетки или T-клетки, предпочтительно вводят парентерально, например, внутривенно или внутриартериально. Дозу соответствующим образом выбирают в зависимости от симптомов, цели введения и т.п., но обычно такая доза составляет от 1 клетки до 10 000 000 000 000 клеток, а предпочтительно, от 1000000 клеток до 1000000000 клеток, и такую дозу, предпочтительно, вводят один раз в несколько дней или один раз в несколько месяцев. Таким препаратом могут быть, например, клетки, суспендированые в забуференном физиологическом растворе, где указанный препарат может быть использован в комбинации с другим(и) противораковым(и) агентом(ами), цитокином(ами) или т.п. Кроме того, могут быть также добавлены одна или более добавок, хорошо известных специалистам-фармацевтам.
[0056] 4. ДНК-вакцина
При экспрессии полинуклеотида, кодирующего любые полипептиды (а)-(d), в организме животного может также индуцироваться продуцирование антитела и цитотоксических T-клеток, и такой эффект сравним с эффектом, наблюдаемым в случае введения полипептида. То есть иммуноиндуцирующим агентом согласно изобретению может быть агент, содержащий в качестве активного ингредиента рекомбинантный вектор, имеющий полинуклеотид, кодирующий любой из полипептидов (а)-(d), где такой рекомбинантный вектор способен экспрессировать полипептид в живом организме. Как описано ниже в примерах, такой рекомбинантный вектор, способный экспрессировать антигенный полипептид, также называется ДНК-вакциной.
[0057] Вектор, используемый для продуцирования ДНК-вакцины, не имеет конкретных ограничений, при условии, что он будет представлять собой вектор, способный экспрессировать полипептид в клетке животного (предпочтительно, в клетке млекопитающего), и этот вектор может представлять собой плазмидный вектор или вирусный вектор, причем, может быть использован любой вектор, известный специалистам в области приготовления ДНК-вакцин. Полинуклеотид, такой как ДНК или РНК, кодирующий вышеописанный полипептид, может быть легко получен стандартным методом, как описано выше. Введение полинуклеотида в вектор может быть осуществлено методом, хорошо известным специалистам.
[0058] Способом введения ДНК-вакцины, предпочтительно, является парентеральное введение, такое как внутримышечное, подкожное, внутривенное или внутриартериальное введение, а доза может быть соответствующим образом выбрана в зависимости от типа антигена и т.п., но обычно она составляет приблизительно от 0,1 мкг до 100 мг, а предпочтительно, приблизительно от 1 мкг до 10 мг по массе ДНК-вакцины на 1 кг массы тела.
[0059] Примерами метода с использованием вирусного вектора являются методы, в которых полинуклеотид, кодирующий вышеописанный полипептид, вводят в РНК-вирус или ДНК-вирус, такой как ретровирус, аденовирус, аденоассоциированный вирус, герпесвирус, вирус коровьей оспы, поксвирус, полиовирус или вирус Синдбис, а затем животное инфицируют полученным вирусом. Из этих методов, особенно предпочтительными являются методы с использованием ретровируса, аденовируса, аденоассоциированного вируса, вируса коровьей оспы или т.п.
[0060] Примерами других методов являются методы, в которых экспрессионную плазмиду вводят непосредственно вовнутрь мышцы (метод на основе ДНК-вакцины), липосомный метод, метод с использованием липофектина, метод микроинъекции, метод с использованием фосфата кальция и метод электропорации, а особенно предпочтительными являются метод на основе ДНК-вакцины и липосомный метод.
in vivo
ex vivo
in vivo
[0061] Методы использования гена, кодирующего вышеописанный полипептид согласно изобретению в качестве лекарственного средства, включает  метод, в котором ген вводят непосредственно в организм, и  метод, в котором у животного берут клетки некоторых типов, а затем в них вводят ген, после чего эти клетки снова возвращают индивидууму (Nikkei Science, 1994, April, p. 20-45; The Pharmaceutical Monthly, 1994, Vol. 36, No. 1, p. 23-48; Experimental Medicine, Extra Edition, 1994, Vol. 12, No. 15; и работы, цитируемые в этих публикациях и т.п.). Более предпочтительным является метод .
in vivo
in vivo
[0062] При введении гена методом , такой метод введения зависит от заболевания, подвергаемого лечению, его симптомов и т.п. Ген может быть введен, например, внутривенно, внутриартериально, подкожно или внутримышечно. При введении гена методом , этот ген может быть получен в виде препарата, такого как раствор, а в основном, в виде раствора для инъекций или т.п., содержащего ДНК, кодирующую вышеописанный полипептид согласно изобретению в качестве активного ингредиента, а при необходимости, в этот раствор может быть также добавлен стандартный носитель. В случае использования липосомы или липосомы, связанной с мембраной (например, липосомы, связанной с вирусом Сендай (HVJ)) и содержащей ДНК, эта липосома может быть получена в виде липосомного препарата, такого как суспензия, замороженный препарат или замороженный препарат, концентрированный на центрифуге.
[0063] Используемый здесь термин «нуклеотидная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 1», включает, например, не только нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, но также и последовательность, комплементарную этой последовательности. Так, например, термин «полинуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1» включает одноцепочечный полинуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1; одноцепочечный полинуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность, комплементарную этой последовательности; и двухцепочечный полинуклеотид, состоящий из этих одноцепочечных полинуклеотидов. Для получения полинуклеотида, кодирующего полипептид, используемый в настоящем изобретении, соответствующим образом выбирают любую из этих нуклеотидных последовательностей, и такая процедура отбора может быть легко осуществлена специалистом в данной области.
Примеры
[0064] Настоящее изобретение более подробно описано ниже со ссылками на Примеры. Однако объем настоящего изобретения не ограничивается этими примерами.
[Пример 1]
Получение нового ракового антигенного белка методом SEREX
(1) Получение библиотеки кДНК
Общую РНК экстрагировали из яичек собак методом с использованием кислоты-гуанидиния-фенола-хлороформа, а затем РНК poly(A) очищали с использованием набора для очистки мРНК Oligotex-dT30 (Takara Shuzo Co., Ltd.) в соответствии с протоколом, прилагаемым к набору.
6
[0065] С использованием полученной мРНК (5 мкг) была синтезирована библиотека фаговой кДНК. Для получения библиотеки фаговой кДНК использовали набор для синтеза кДНК, набор для синтеза Zap-кДНК или набор для клонирования ZAP-кДНК GigapackIII Gold Cloning Kit (STRATAGENE) в соответствии с протоколом, прилагаемым к набору. Размер полученной библиотеки фаговой кДНК составлял 1×10 б.о.е./мл.
[0066] (2) Скрининг библиотеки кДНК с использованием сыворотки
E. coli
С использованием полученной библиотеки фаговой кДНК был проведен иммунологический скрининг. Более конкретно, клетки-хозяева (XL1-Blue MRF') инфицировали фагом с получением приблизительно 2500 клонов на планшете с агарозой NZY размером φ90×15 мм и культивировали при 42°C в течение 3-4 часов до образования бляшек. Планшет сенсибилизировали нитроцеллюлозной мембраной (Hybond C Extra: GE Healthcare Bio-Science), пропитанной IPTG (изопропил-β-D-тиогалактозидом) при 37°C в течение 4 часов для индуцирования экспрессии белка, и этот белок переносили на мембрану. Затем, мембрану смачивали в TBS (10 мМ трис-HCl, 150 мМ NaCl, pH 7,5), содержащем 0,5% сухое сепарированное молоко, и встряхивали при 4°C в течение ночи для подавления неспецифической реакции. Этот фильтр оставляли для реакции с 500-кратно разведенной сывороткой собак на 2-3 часа при комнатной температуре.
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli,
3
[0067] В случае использования вышеописанной сыворотки собак, эту сыворотку брали у собак с лейкозом. Сыворотку хранили при -80°C и предварительно обрабатывали непосредственно перед использованием. Метод предварительной обработки сыворотки заключается в следующем. Сначала, клетки-хозяева (XL1-Blue MRF') инфицировали фагом λ ZAP Express, в который не был введен чужеродный ген, а затем культивировали на среде в планшете NZY при 37°C в течение ночи. После этого, в планшет добавляли 0,2 M NaHCO-буфера (pH 8,3), содержащего 0,5 M NaCl, а затем планшет оставляли на 15 часов при 4°C и собирали супернатант в виде экстракта /фага. Затем собранный экстракт /фага пропускали через NHS-колонку (GE Healthcare Bio-Science) для иммобилизации белков, происходящих от /фага, на колонке. Собачью сыворотку пропускали через колонку и подвергали реакции с иммобилизованным на колонке белком для удаления антител, адсорбированных на и фага с колонки. Фракцию сыворотки, пропущенную через колонку, 500-кратно разводили TBS, содержащем 0,5% сухое сепарированное молоко, и полученный разбавитель использовали в качестве материала для иммунологического скрининга.
4
[0068] Вышеуказанную мембрану, на которую были нанесены пятнами обработанная сыворотка и белки, 4 раза промывали TBS-T (0,05% твин 20/TBS) и подвергали реакции с козьим антителом против собачьего IgG (ПХ-конъюгированным козьим антителом против собачьего IgG-h+L; BETHYL Laboratories), 5000-кратно разведенным TBS, содержащим 0,5% сухое сепарированное молоко, в качестве «второго» антитела при комнатной температуре в течение 1 часа, а затем детектировали с помощью ферментной цветной реакции с использованием реакционного раствора NBT/BCIP (Roche). Колонии на участках, на которых наблюдалась положительная цветная реакция, брали из планшета с агарозой NZY, имеющего размер φ90×15 мм, и растворяли в 500 мкл SM-буфера (100 мМ NaCl, 10 мМ MgClSO, 50 мМ трис-HCl, 0,01% желатина; pH 7,5). Этот скрининг повторяли два-три раза способом, описанным выше дл образования одной позитивно окрашенной колонии, а затем, после скрининга приблизительно 10000 фаговых клонов, реагирующих с IgG в сыворотке, выделяли один позитивный клон.
[0069] (3) Поиск идентичных последовательностей выделенного антигенного гена
Escherichia coli
Escherichia coli
600
600
Для анализа нуклеотидной последовательности одного позитивного клона, выделенного вышеописанным методом, была проведена процедура превращения фагового вектора в плазмидный вектор. В частности, раствор (200 мкл), содержащий клетки-хозяева (XL1-Blue MRF'), полученные так, чтобы они имели оптическую плотность OD=1,0; очищенный раствор фага (100 мкл), и еще 1 мкл хелперного фага ExAssist (STRATAGENE) смешивали и оставляли на 15 минут для реакции при 37°C. Затем добавляли среду LB (3 мл) и проводили культивирование при 37°C в течение 2,5-3 часов. Полученную культуру сразу помещали в водяную баню на 20 минут при 70°C, а затем центрифугировали при 4°C при 1000×g в течение 15 минут для сбора супернатанта в виде фагмидного раствора. Затем, раствор (200 мкл), содержащий фагмидные клетки-хозяева (SOLR), полученные так, чтобы они имели оптическую плотность OD=1,0, и очищенный раствор фага (10 мкл) смешивали и оставляли на 15 минут для реакции при 37°C. Полученный раствор (50 мкл) высевали на агаровую среду LB, содержащую ампициллин (конечная концентрация: 50 мкг/мл), и культивировали в течение ночи при 37°C. Одну трансформированную колонию SOLR собирали, культивировали в среде LB, содержащей ампициллин (конечная концентрация: 50 мкг/мл) при 37°C, а затем очищали с использованием набора для получения плазмиды QIAGEN Miniprep Kit (QIAGEN), в результате чего получали плазмидную ДНК, имеющую нужную вставку.
[0070] Очищенную плазмиду подвергали «прогулке» по праймеру с использованием праймера Т3, представленного в SEQ ID NO: 9, и праймера Т7, представленного в SEQ ID NO: 10, для анализа полноразмерной последовательности вставки. Генную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3, получали путем анализа методом секвенирования. С использованием нуклеотидной последовательности гена и аминокислотной последовательности проводили анализ на идентичность последовательностей известных генов с помощью программы поиска идентичности последовательностей BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). В результате было обнаружено, что полученным геном является ген MCEMP1. В человеческом MCEMP1, который представляет собой человеческий гомолог собачьего MCEMP1, идентичность нуклеотидных последовательностей составляет 70%, а идентичность аминокислотных последовательностей составляет 51%. В кошачьем гомологе, то есть, в кошачьем MCEMP1, идентичность нуклеотидных последовательностей составляет 83%, а идентичность аминокислотных последовательностей составляет 64%. В мышином гомологе, то есть, в мышином MCEMP1, идентичность нуклеотидных последовательностей составляет 65%, а идентичность аминокислотных последовательностей составляет 47%. Нуклеотидная последовательность человеческого MCEMP1 представлена в SEQ ID NO: 1, а его аминокислотные последовательности представлены в SEQ ID NO: 2. Нуклеотидная последовательность кошачьего MCEMP1 представлена в SEQ ID NO: 5, а его аминокислотные последовательности представлены в SEQ ID NO: 6. Нуклеотидная последовательность мышиного MCEMP1 представлена в SEQ ID NO: 7, а его аминокислотные последовательности представлены в SEQ ID NO: 8.
[0071] (4) Анализ на экспрессию генов в различных тканях
6
Экспрессию генов, полученных вышеописанным методом, в нормальных тканях, в опухолевых тканях и в раковых клеточных линиях собак, человека и мышей оценивали методом ОТ-ПЦР (ПЦР с обратной транскриптазой). Реакцию обратной транскрипции осуществляли, как описано ниже. Сначала, общие РНК экстрагировали из отдельных тканей (50-100 мг) и отдельных клеточных линий (5-10×10 клеток) с использованием реагента TRIZOL (Life technology) в соответствии с прилагаемым протоколом. С использованием общих РНК были синтезированы кДНК с помощью системы синтеза первой цепи Superscript для ОТ-ПЦР (Life technology) в соответствии с прилагаемым протоколом. В качестве кДНК нормальных человеческих тканей (головного мозга, яичек, толстой кишки и плаценты) использовали кДНК генного пула (Life technology), кДНК клона QUICK (Clontech) и библиотеку кДНК крупной вставки (Clontech). Реакцию ПЦР осуществляли с использованием полученных геноспецифических праймеров (собачьи праймеры представлены в SEQ ID NO: 11 и 12, человеческие праймеры представлены в SEQ ID NO: 13 и 14, а мышиные праймеры представлены в SEQ ID NO: 15 и 16) следующим образом. То есть к связанному буферу добавляли реагенты, которые содержали 0,25 мкл образца, полученного с помощью реакции обратной транскрипции, вышеописанные праймеры (2 мкМ каждого), dNTP (0,2 мМ каждого) и 0,65 ед. полимеразы ExTaq (Takara Shuzo Co., Ltd.). Всего 25 мкл реакционной смеси подвергали ПЦР в термоячейке (BIO RAD). В этой ПЦР проводили 30 циклов, где один цикл состоял из обработки при 94°C в течение 30 секунд; при 55°C в течение 30 секунд; и при 72°C в течение одной минуты. В результате, как показано на фиг. 1, собачий ген MCEMP1 экспрессировался на высоком уровне в собачьих опухолевых тканях, то есть, в тканях мастоцитомы и перианальной аденокарциномы (фиг. 1). Человеческий ген MCEMP1 не экспрессировался почти ни в одной из нормальных человеческих тканей, но экспрессировался на высоком уровне в человеческих раковых клетках, то есть, при лейкозе, миелодиспластическом синдроме и в клеточных линиях остеосаркомы (фиг. 2). Кроме того, экспрессия мышиного гена MCEMP1 детектировалась в клеточных линиях лейкоза и тимомы (фиг. 3).
[0072][Пример 2]
in vivo
Анализ на раковую антигенность MCEMP1
in vivo
(1) Получение рекомбинантного вектора, экспрессирующего мышиный MCEMP1
in vivo
Рекомбинантный вектор, экспрессирующий мышиный MCEMP1 , получали на основе нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 7, описанным ниже методом. ПЦР осуществляли следующим образом. Реакционную смесь получали путем добавления реагентов: кДНК (1 мкл), которая была получена из клеточной линии мышиного лейкоза EL4 (закупленной в ATCC), экспрессия которой наблюдалась как описано в Примере 1; праймеров двух типов (0,4 мкM каждого), имеющих последовательности, расщепленные рестриктирующими ферментами EcoRI и NotI (представленные SEQ ID NO: 17 и 18); 0,2 мМ dNTP и 1,25 ед. полимеразы PrimeSTAR HS (Takara Shuzo Co., Ltd.), и связанного буфера с получением общего количества 50 мкл смеси, которую подвергали ПЦР в термоячейке (BIO RAD). В этой ПЦР проводили 30 циклов, где один цикл состоял из обработки при 98°C в течение 10 секунд; при 55°C в течение 15 секунд; и при 72°C в течение 1 минуты. Вышеупомянутые праймеры двух типов использовали для амплификации области, кодирующей полноразмерную аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 8. После ПЦР, амплифицированную ДНК подвергали электрофорезу в 1% агарозном геле, и фрагмент ДНК размером приблизительно 550 п.о. очищали с использованием набора для экстракции из геля QIAquick (QIAGEN).
E. coli
[0073] Очищенный фрагмент ДНК лигировали с клонирующим вектором pCR-Blunt (Life technology), а затем этот вектор трансформировали в клетки  и собирали плазмидный вектор. Секвенирование подтвердило, что последовательность амплифицированного генного фрагмента была идентична нужной последовательности. Плазмиду, последовательность которой была идентична нужной последовательности, обрабатывали рестриктирующими ферментами EcoRI и NotI. После очистки, проведенной с помощью набора для экстракции из геля QIAquick, нужную генную последовательность встраивали в экспрессионный вектор млекопитающего pcDNA3.1 (Invitrogen), обработанный рестриктирующими ферментами EcoRI и NotI (далее этот вектор будет называться мышиным MCEMP1/pcDNA3.1). С использованием вектора, мышиный белок MCEMP1 был продуцирован в клетке млекопитающего.
2
[0074] К плазмидной ДНК (100 мкг), полученной как описано выше, добавляли 50 мкг золотых частиц (Bio Rad), спермидин (100 мкл) (SIGMA) и 1M CaCl (100 мкл (SIGMA)). Смесь перемешивали на вихревой мешалке и оставляли на 10 минут при комнатной температуре (далее эта смесь будет называться «золотыми частицами ДНК»). После центрифугирования при 3000 оборотов в минуту в течение одной минуты, супернатант отбрасывали, а затем осадок три раза промывали 100% этанолом (WAKO). К золотым частицам ДНК добавляли 100% этанол (6 мл), и смесь перемешивали в течение достаточного периода времени на вихревой мешалке. Золотые частицы ДНК выливали в систему пробирок Tefzel Tubing (Bio Rad) для осаждения этих частиц на стенках пробирок. Систему пробирок Tefzel Tubing с осажденными на них золотыми частицами ДНК сушили воздухом путем удаления этанола, а затем частицы разрезали на кусочки, имеющие длину, подходящую для их использования в устройстве для «выстреливания» генов (далее они будут называться мышиным MCEMP1/пробирку).
[0075] (2) Противоопухолевое действие мышиного MCEMP1, достигаемое методом с использованием ДНК-вакцины-1
Было использовано пять мышей A/J (7-недельные самцы, закупленные у Japan SLC, Inc.). Пробирки (мышиный MCEMP1/пробирку), приготовленные как описано выше, устанавливали на устройство для «выстреливания» генов. ДНК-вакцину чрезкожно вводили три раза в течение всего 7 дней в выбритую брюшинную полость мышей путем подачи чистого газообразного гелия под давлением 400 фунтов на квадратный дюйм (количество вводимой плазмидной ДНК составляло 2 мкг/животное). После чрезкожного введения, клетки клеточной линии мышиного лейкоза EL4, которые, как было обнаружено, экспрессировали ген MCEMP1 как описано в Примере 1, трансплантировали каждой мыши для оценки противоопухолевого эффекта (эта модель называется профилактической моделью). В случае контроля, пяти мышам профилактической модели вводили плазмидную ДНК без встроенного мышиного гена MCEMP1.
2
3
3
[0076] Противоопухолевое действие оценивали по размеру опухоли (более длинный диаметр × короткий диаметр/2) и по выживаемости мышей. В результате этого исследования, у профилактической модели, размеры опухоли через 28 дней у контрольной группы, и у группы, которой вводили мышиную плазмиду MCEMP1, составляли 1153 мм и 480 мм, соответственно. Таким образом, было обнаружено, что размер опухоли у группы, которой вводили мышиную плазмиду MCEMP1, значительно снижался. В результате, в соответствии с выживаемостью, наблюдаемой для профилактической модели, было установлено, что все животные в контрольной группе погибали через 59 дней после введения, а в группе, которой вводили мышиную плазмиду MCEMP1, 60% мышей были живы. Исходя из этих результатов можно сказать, что противоопухолевое действие у группы, которой вводили мышиную плазмиду MCEMP1, было более заметным, чем у контрольной группы.
[0077] (3) Противоопухолевое действие мышиного MCEMP1, достигаемое методом с использованием ДНК-вакцины-2
Было использовано пять мышей A/J (7-недельные самцы, закупленные у Japan SLC, Inc.). Пробирки (мышиный MCEMP1/пробирку), приготовленные как описано выше, устанавливали на устройство для «выстреливания» генов. ДНК-вакцину чрезкожно вводили три раза в течение всего 7 дней в выбритую брюшинную полость мышей путем подачи чистого газообразного гелия под давлением 400 фунтов на квадратный дюйм (количество вводимой плазмидной ДНК составляло 2 мкг/животное). После чрезкожного введения, клетки клеточной линии мышиного лейкоза EG7, которые, как было обнаружено, экспрессировали ген MCEMP1 как описано в Примере 1, трансплантировали каждой мыши для оценки противоопухолевого эффекта (эта модель называется профилактической моделью). В случае контроля, пяти мышам профилактической модели вводили плазмидную ДНК без встроенного мышиного гена MCEMP1.
2
3
3
[0078] Противоопухолевое действие оценивали по размеру опухоли (более длинный диаметр × короткий диаметр/2) и по выживаемости мышей. В результате этого исследования, у профилактической модели, размеры опухоли через 28 дней у контрольной группы, и у группы, которой вводили мышиную плазмиду MCEMP1, составляли 982 мм и 521 мм, соответственно. Таким образом, было обнаружено, что размер опухоли у группы, которой вводили мышиную плазмиду MCEMP1, значительно снижался. В результате, в соответствии с выживаемостью, наблюдаемой для профилактической модели, было установлено, что все животные в контрольной группе погибали через 68 дней после введения, а в группе, которой вводили мышиную плазмиду MCEMP1, 60% мышей были живы. Исходя из этих результатов можно сказать, что противоопухолевое действие у группы, которой вводили мышиную плазмиду MCEMP1, было более заметным, чем у контрольной группы.
in vivo
[0079] (4) Получение рекомбинантного вектора, экспрессирующего человеческий MCEMP1
in vivo
Рекомбинантный вектор, экспрессирующий человеческий MCEMP1 , получали на основе нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1, описанным ниже методом. ПЦР осуществляли следующим образом. Реакционную смесь получали путем добавления реагентов: кДНК (1 мкл), которая была получена из клеточной линии человеческого лейкоза U937 (закупленной в ATCC), экспрессия которой наблюдалась как описано в Примере 1; праймеров двух типов (0,4 мкM каждого), имеющих последовательности, расщепленные рестриктирующими ферментами EcoRI и NotI (представленные в SEQ ID NO: 19 и 20); 0,2 мМ dNTP и 1,25 ед. полимеразы PrimeSTAR HS (Takara Shuzo Co., Ltd.), и связанного буфера с получением общего количества 50 мкл смеси, которую подвергали ПЦР в термоячейке (BIO RAD). В этой ПЦР проводили 30 циклов, где один цикл состоял из обработки при 98°C в течение 10 секунд; при 55°C в течение 15 секунд; и при 72°C в течение 1 минуты. Вышеупомянутые праймеры двух типов использовали для амплификации области, кодирующей полноразмерную аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2. После ПЦР, амплифицированную ДНК подвергали электрофорезу в 1% агарозном геле, и фрагмент ДНК размером приблизительно 550 п.о. очищали с использованием набора для экстракции из геля QIAquick (QIAGEN).
E. coli
[0080] Очищенный фрагмент ДНК лигировали с клонирующим вектором pCR-Blunt (Life technology), а затем этот вектор трансформировали в клетки  и собирали плазмидный вектор. Секвенирование подтвердило, что последовательность амплифицированного генного фрагмента была идентична нужной последовательности. Плазмиду, последовательность которой была идентична нужной последовательности, обрабатывали рестриктирующими ферментами EcoRI и NotI. После очистки, проведенной с помощью набора для экстракции из геля QIAquick, нужную генную последовательность встраивали в экспрессионный вектор млекопитающего pcDNA3.1 (Invitrogen), обработанный рестриктирующими ферментами EcoRI и NotI (далее этот вектор будет называться человеческим MCEMP1/pcDNA3.1). С использованием вектора, человеческий белок MCEMP1 был продуцирован в клетке млекопитающего.
2
[0081] К плазмидной ДНК (100 мкг), полученной как описано выше, добавляли 50 мкг золотых частиц (Bio Rad), спермидин (100 мкл) (SIGMA) и 1M CaCl (100 мкл (SIGMA)). Смесь перемешивали на вихревой мешалке и оставляли на 10 минут при комнатной температуре (далее эта смесь будет называться «золотыми частицами ДНК»). После центрифугирования при 3000 оборотов в минуту в течение одной минуты, супернатант отбрасывали, а затем осадок три раза промывали 100% этанолом (WAKO). К золотым частицам ДНК добавляли 100% этанол (6 мл), и смесь перемешивали в течение достаточного периода времени на вихревой мешалке. Золотые частицы ДНК выливали в систему пробирок Tefzel Tubing (Bio Rad) для осаждения этих частиц на стенках пробирок. Систему пробирок Tefzel Tubing с осажденными на них золотыми частицами ДНК сушили воздухом путем удаления этанола, а затем частицы разрезали на кусочки, имеющие длину, подходящую для их использования в устройстве для «выстреливания» генов (далее они будут называться человеческим MCEMP1/пробирку).
[0082] (5) Получение клеток, стабильно экспрессирующих полноразмерный человеческий MCEMP1
Человеческий MCEMP1/pcDNA3.1, полученный как описано выше, вводили методом липофекции в клетки клеточной линии мышиной нейробластомы N2a (ATCC), а затем проводили отбор с использованием 500 мкг/мл G418 (Nacalai Tesque, Inc.) с получением клеточной линии N2a, стабильно экспрессирующей полноразмерный человеческий MCEMP1 (N2a-человеческий MCEMP1). Клетки, полученные после введения экспрессионного вектора (далее обозначаемого emp/pcDNA3.1) без встроенной кДНК, кодирующей человеческий MCEMP1, с последующим отбором вышеописанным способом, были использованы в качестве контрольных клеток (далее обозначаемых N2a-emp).
[0083] (6) Противоопухолевое действие человеческого MCEMP1, достигаемое методом с использованием ДНК-вакцины
Было использовано пять мышей A/J (7-недельные самцы, закупленные у Japan SLC, Inc.). Пробирки (человеческий MCEMP1/пробирку), приготовленные как описано выше, устанавливали на устройство для «выстреливания» генов. ДНК-вакцину чрезкожно вводили три раза в течение всего 7 дней в выбритую брюшинную полость мышей путем подачи чистого газообразного гелия под давлением 400 фунтов на квадратный дюйм (количество вводимой плазмидной ДНК составляло 2 мкг/животное). После чрескожного введения N2a-человеческий MCEMP1 или N2a-emp, используемые в качестве контрольных клеток, приготовленных, как описано выше, трансплантировали каждой мыши для оценки противоопухолевого эффекта (эта модель называется профилактической моделью). В случае контроля, 5 мышам профилактической модели вводили плазмидную ДНК без встроенного человеческого гена MCEMP1.
2
3
3
[0084] Противоопухолевое действие оценивали по размеру опухоли (более длинный диаметр × короткий диаметр/2) и по выживаемости мышей. В результате этого исследования, у профилактической модели N2a-человеческий MCEMP1, размеры опухоли через 28 дней у контрольной группы и у группы, которой вводили человеческую плазмиду MCEMP1, составляли 1379 мм и 513 мм, соответственно. Таким образом, было обнаружено, что размер опухоли у группы, которой вводили человеческую плазмиду MCEMP1, значительно снижался. В результате, в соответствии с выживаемостью, наблюдаемой для профилактической модели, было установлено, что все животные в контрольной группе погибали через 61 день после введения, а в группе, которой вводили человеческую плазмиду MCEMP1, 60% мышей были живы. Исходя из этих результатов можно сказать, что противоопухолевое действие у группы профилактической модели с N2a-человеческий MCEMP1, которой вводили человеческую плазмиду MCEMP1, было более заметным, чем у контрольной группы. С другой стороны, какого-либо противоопухолевого действия у группы профилактической модели с N2a-emp, которой вводили человеческую плазмиду MCEMP1, не наблюдалось, как и у контрольной группы.
Промышленное применение
[0085] Настоящее изобретение относится к иммуноиндуцирующему агенту, содержащему полипептид, обладающий противораковой активностью, а поэтому, этот агент может быть использован для лечения и/или профилактики рака.
[0086] Все цитируемые здесь публикации, патенты и патентные заявки во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  TORAY INDUSTRIES, INC.
<120>  Иммуноиндуцирующий агент
<130>  PH-6863-PCT
<150>  JP 2016-064034
<151>  2016-03-28
<160>  20
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  1326
<212>  ДНК
<213>  Homo sapiens
<220>
<221>  CDS
<222>  (26)..(589)
<400>  1
tggacaaatt tgcgggctgg ggacc atg gaa gtg gag gaa atc tac aag cac         52
Met Glu Val Glu Glu Ile Tyr Lys His
1               5
cag gaa gtc aag atg caa gca cca gcc ttc agg gac aag aaa cag ggg        100
Gln Glu Val Lys Met Gln Ala Pro Ala Phe Arg Asp Lys Lys Gln Gly
10                  15                  20                  25
gtc tca gcc aag aat caa ggt gcc cat gac cca gac tat gag aat atc        148
Val Ser Ala Lys Asn Gln Gly Ala His Asp Pro Asp Tyr Glu Asn Ile
30                  35                  40
acc ttg gcc ttc aaa aat cag gac cat gca aag ggt ggt cat tca cga        196
Thr Leu Ala Phe Lys Asn Gln Asp His Ala Lys Gly Gly His Ser Arg
45                  50                  55
ccc acg agc caa gtc cca gcc cag tgc agg ccg ccc tca gac tcc acc        244
Pro Thr Ser Gln Val Pro Ala Gln Cys Arg Pro Pro Ser Asp Ser Thr
60                  65                  70
cag gtc ccc tgc tgg ttg tac aga gcc atc ctg agc ctg tac atc ctc        292
Gln Val Pro Cys Trp Leu Tyr Arg Ala Ile Leu Ser Leu Tyr Ile Leu
75                  80                  85
ctg gcc ctg gcc ttt gtc ctc tgc atc atc ctg tca gcc ttc atc atg        340
Leu Ala Leu Ala Phe Val Leu Cys Ile Ile Leu Ser Ala Phe Ile Met
90                  95                  100                 105
gtg aag aat gct gag atg tcc aag gag ctg ctg ggc ttt aaa agg gag        388
Val Lys Asn Ala Glu Met Ser Lys Glu Leu Leu Gly Phe Lys Arg Glu
110                 115                 120
ctt tgg aat gtc tca aac tcc gta caa gca tgc gaa gag aga cag aag        436
Leu Trp Asn Val Ser Asn Ser Val Gln Ala Cys Glu Glu Arg Gln Lys
125                 130                 135
aga ggc tgg gat tcc gtt cag cag agc atc acc atg gtc agg agc aag        484
Arg Gly Trp Asp Ser Val Gln Gln Ser Ile Thr Met Val Arg Ser Lys
140                 145                 150
att gat aga tta gag acg aca tta gca ggc ata aaa aac att gac aca        532
Ile Asp Arg Leu Glu Thr Thr Leu Ala Gly Ile Lys Asn Ile Asp Thr
155                 160                 165
aag gta cag aaa atc ttg gag gtg ctg cag aaa atg cca cag tcc tca        580
Lys Val Gln Lys Ile Leu Glu Val Leu Gln Lys Met Pro Gln Ser Ser
170                 175                 180                 185
cct caa taa atgagaggac attgtggcag ccaaagccac aacttggaag                629
Pro Gln
atggggctgc acctgccaac gaagacggga aatgaccccc cccccccagc ctagtgtgaa      689
cctgcccctc gtcccacgta tagaaaaacc tcgagtcatg gtgaatgagt gtctcggagt      749
tgctcgtgtg tgtgtacacc tgcgtgcgtg tgtgtgcgtg tgtgcgcgtg tgttcgtgta      809
tgtgcgtgtg tgcgtgcgcg tgtgtgtgca ttttgcaaag ggtggacatt tcagtgtatc      869
tcccagaaag gtgatgaatg aataggactg agagtcacag tgaatgtggc atgcatgcct      929
gtgtcatgtg acatatgtga gtctcggcat gtcacggtgg gtggctgtgt ctgagcacct      989
ccagcagatg tcactctgag tgtgggtgtt ggtgacatgc attgcacggg cctgtctccc     1049
tgtttgtgta aacatactag agtatactgc ggcgtgtttt ctgtctaccc atgtcatggt     1109
gggggagatt tatctccgta catgtgggtg tcgccatgtg tgccctgtca ctatctgtgg     1169
ctgggtgaac ggctgtgtca ttatgagtgt gccgagttat gccaccctgt gtgctcaggg     1229
cacatgcaca cagacattta tctctgcact cacattttgt gacttatgaa gataaataaa     1289
gtcaagggaa aacagcgtca aaaaaaaaaa aaaaaaa                              1326
<210>  2
<211>  187
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  2
Met Glu Val Glu Glu Ile Tyr Lys His Gln Glu Val Lys Met Gln Ala
1               5                   10                  15
Pro Ala Phe Arg Asp Lys Lys Gln Gly Val Ser Ala Lys Asn Gln Gly
20                  25                  30
Ala His Asp Pro Asp Tyr Glu Asn Ile Thr Leu Ala Phe Lys Asn Gln
35                  40                  45
Asp His Ala Lys Gly Gly His Ser Arg Pro Thr Ser Gln Val Pro Ala
50                  55                  60
Gln Cys Arg Pro Pro Ser Asp Ser Thr Gln Val Pro Cys Trp Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Arg Ala Ile Leu Ser Leu Tyr Ile Leu Leu Ala Leu Ala Phe Val Leu
85                  90                  95
Cys Ile Ile Leu Ser Ala Phe Ile Met Val Lys Asn Ala Glu Met Ser
100                 105                 110
Lys Glu Leu Leu Gly Phe Lys Arg Glu Leu Trp Asn Val Ser Asn Ser
115                 120                 125
Val Gln Ala Cys Glu Glu Arg Gln Lys Arg Gly Trp Asp Ser Val Gln
130                 135                 140
Gln Ser Ile Thr Met Val Arg Ser Lys Ile Asp Arg Leu Glu Thr Thr
145                 150                 155                 160
Leu Ala Gly Ile Lys Asn Ile Asp Thr Lys Val Gln Lys Ile Leu Glu
165                 170                 175
Val Leu Gln Lys Met Pro Gln Ser Ser Pro Gln
180                 185
<210>  3
<211>  1124
<212>  ДНК
<213>  Canis familiaris
<220>
<221>  CDS
<222>  (66)..(689)
<400>  3
ctcatctgcc atgacacctt ccggtgggtg gggatgtgtg tgggtaaact ggcccactgg       60
gaacc atg gag tct gag gaa atc tac acg aat cag aag gtc gag atg cag      110
Met Glu Ser Glu Glu Ile Tyr Thr Asn Gln Lys Val Glu Met Gln
1               5                   10                  15
gca gcc ttc aaa gac aag aaa cag agg gtc cca gct gat aag gaa ggt        158
Ala Ala Phe Lys Asp Lys Lys Gln Arg Val Pro Ala Asp Lys Glu Gly
20                  25                  30
gca gat aac cct gac tat gag aat atc acc ttg gcc ttc aga aac cag        206
Ala Asp Asn Pro Asp Tyr Glu Asn Ile Thr Leu Ala Phe Arg Asn Gln
35                  40                  45
gac cag cca aag ggc agc cat tta cca ccc aag aat cag agc aag cag        254
Asp Gln Pro Lys Gly Ser His Leu Pro Pro Lys Asn Gln Ser Lys Gln
50                  55                  60
cca cct gcc agg aca cat cac acg gcc ttg gga ggg gcc cac gtc cca        302
Pro Pro Ala Arg Thr His His Thr Ala Leu Gly Gly Ala His Val Pro
65                  70                  75
acc ctg tct agg ctg ccc tca gac tct ggc cag ctc ccc cgt tgt ctg        350
Thr Leu Ser Arg Leu Pro Ser Asp Ser Gly Gln Leu Pro Arg Cys Leu
80                  85                  90                  95
cac aga gtc atc atg agc ctg tac atg ctc ctc gcc ctg tcc tgc atc        398
His Arg Val Ile Met Ser Leu Tyr Met Leu Leu Ala Leu Ser Cys Ile
100                 105                 110
att ctc tta gtc ttg gtc ctc atg aag aat ctg gag atg tcc cag gag        446
Ile Leu Leu Val Leu Val Leu Met Lys Asn Leu Glu Met Ser Gln Glu
115                 120                 125
ttg ctg gcc ctg aaa agg gag ctc tgg aat gtg tcc gtc tcg gtg caa        494
Leu Leu Ala Leu Lys Arg Glu Leu Trp Asn Val Ser Val Ser Val Gln
130                 135                 140
gag tgc cag gag cag cag aat cag ggc tgg agc acc gtc cgg cag ctc        542
Glu Cys Gln Glu Gln Gln Asn Gln Gly Trp Ser Thr Val Arg Gln Leu
145                 150                 155
ctg gtg gag gcc aag cgt gac att tcc atg gtc ggg aga aat gcc cag        590
Leu Val Glu Ala Lys Arg Asp Ile Ser Met Val Gly Arg Asn Ala Gln
160                 165                 170                 175
ctt gcg agt gag aag gtg aag acg ctg aca gca gac ata agc cat atc        638
Leu Ala Ser Glu Lys Val Lys Thr Leu Thr Ala Asp Ile Ser His Ile
180                 185                 190
aag agt aag tta cag gaa atc tcc aag atg ctg gag aag cca aag cca        686
Lys Ser Lys Leu Gln Glu Ile Ser Lys Met Leu Glu Lys Pro Lys Pro
195                 200                 205
tag acctcaacat acgcgaggac atcgaagccc tggctgcagc ttggcggacg             739
gggctgcgcc tcccagtgaa gatggccacg tgtgtgcacc acgtgtgttg tgagcctaag      799
gcgtgacaca gtgggtggct gtgtcagcag ggaccacgaa agtgtgtcag cgtgttgttg      859
gcagcatgtg tagcaccgtg aacgcgtgtg actgtcctgt ggtatgttgt gtgtaaatgt      919
gtcacggcag agccgtggcg ggggcacccc acgtgtcact gtaattgtgg gtgccctgtc      979
actacctgtg ttggtgtgaa caggtgtctg ccaacgagcg actgaggatg tcacggaggg     1039
ggttcggagc atgtacacat gtatgtccat ttgttcccgc gctcacgttg tgtgatttgt     1099
gaagataaag gccgatggaa aagaa                                           1124
<210>  4
<211>  207
<212>  PRT
<213>  Canis familiaris
<400>  4
Met Glu Ser Glu Glu Ile Tyr Thr Asn Gln Lys Val Glu Met Gln Ala
1               5                   10                  15
Ala Phe Lys Asp Lys Lys Gln Arg Val Pro Ala Asp Lys Glu Gly Ala
20                  25                  30
Asp Asn Pro Asp Tyr Glu Asn Ile Thr Leu Ala Phe Arg Asn Gln Asp
35                  40                  45
Gln Pro Lys Gly Ser His Leu Pro Pro Lys Asn Gln Ser Lys Gln Pro
50                  55                  60
Pro Ala Arg Thr His His Thr Ala Leu Gly Gly Ala His Val Pro Thr
65                  70                  75                  80
Leu Ser Arg Leu Pro Ser Asp Ser Gly Gln Leu Pro Arg Cys Leu His
85                  90                  95
Arg Val Ile Met Ser Leu Tyr Met Leu Leu Ala Leu Ser Cys Ile Ile
100                 105                 110
Leu Leu Val Leu Val Leu Met Lys Asn Leu Glu Met Ser Gln Glu Leu
115                 120                 125
Leu Ala Leu Lys Arg Glu Leu Trp Asn Val Ser Val Ser Val Gln Glu
130                 135                 140
Cys Gln Glu Gln Gln Asn Gln Gly Trp Ser Thr Val Arg Gln Leu Leu
145                 150                 155                 160
Val Glu Ala Lys Arg Asp Ile Ser Met Val Gly Arg Asn Ala Gln Leu
165                 170                 175
Ala Ser Glu Lys Val Lys Thr Leu Thr Ala Asp Ile Ser His Ile Lys
180                 185                 190
Ser Lys Leu Gln Glu Ile Ser Lys Met Leu Glu Lys Pro Lys Pro
195                 200                 205
<210>  5
<211>  1416
<212>  ДНК
<213>  Felis catus
<220>
<221>  CDS
<222>  (24)..(641)
<400>  5
tctgcttgaa tcaggaggtc agg atg caa gca gca gac ttc aaa ggc aag aaa       53
Met Gln Ala Ala Asp Phe Lys Gly Lys Lys
1               5                   10
cag agg gcc cca gac cat aag gaa ggt tcg gta cct caa ggt gca gac        101
Gln Arg Ala Pro Asp His Lys Glu Gly Ser Val Pro Gln Gly Ala Asp
15                  20                  25
cct gac tat gag aat atc acc ttg acc ttc aga aac cag gag caa cca        149
Pro Asp Tyr Glu Asn Ile Thr Leu Thr Phe Arg Asn Gln Glu Gln Pro
30                  35                  40
agg ggc agc cat tca cca ccc aag aat cga ggc aag cag cca cct gcc        197
Arg Gly Ser His Ser Pro Pro Lys Asn Arg Gly Lys Gln Pro Pro Ala
45                  50                  55
agc ccg cac ctc aca gcc tcg gga ggg gcc cct gtc cca gcc tgg tcg        245
Ser Pro His Leu Thr Ala Ser Gly Gly Ala Pro Val Pro Ala Trp Ser
60                  65                  70
aag cag gcc cca gac tct gcc cag gtc cct cgt tgg ctg cac aga gtc        293
Lys Gln Ala Pro Asp Ser Ala Gln Val Pro Arg Trp Leu His Arg Val
75                  80                  85                  90
acc ctg agc ctg tac atc ctc ctt gcc ctg ttc tgc atc gtt ctc ttg        341
Thr Leu Ser Leu Tyr Ile Leu Leu Ala Leu Phe Cys Ile Val Leu Leu
95                  100                 105
gcc ttg gtc ctg gtg aag aat tct gag gtg tcc cag gag ctg ctg gtc        389
Ala Leu Val Leu Val Lys Asn Ser Glu Val Ser Gln Glu Leu Leu Val
110                 115                 120
gtg aaa agg gag ctc cag aat gtc tcc atc tcg gga caa cag tgt cag        437
Val Lys Arg Glu Leu Gln Asn Val Ser Ile Ser Gly Gln Gln Cys Gln
125                 130                 135
gag gag cag aaa cag ggc tgg agc agc gtc cag cag ctc atc acg gag        485
Glu Glu Gln Lys Gln Gly Trp Ser Ser Val Gln Gln Leu Ile Thr Glu
140                 145                 150
gcc agg cag gac att gac atg atc aag aga aat gtc cac atc ggg aac        533
Ala Arg Gln Asp Ile Asp Met Ile Lys Arg Asn Val His Ile Gly Asn
155                 160                 165                 170
gag aaa gtg aag acg ctg tca aca gac tta agc caa atc aag act aaa        581
Glu Lys Val Lys Thr Leu Ser Thr Asp Leu Ser Gln Ile Lys Thr Lys
175                 180                 185
tta cat gaa atc tcc aag ata cta gag aag aag ccg cag cca cag ccc        629
Leu His Glu Ile Ser Lys Ile Leu Glu Lys Lys Pro Gln Pro Gln Pro
190                 195                 200
aca gct caa taa atgagaagac attgacaccc aggctgcagc ttggaggacg            681
Thr Ala Gln
205
gggctgcact tccccgtgaa gacggccgca tgtgtgcctc atggtgtcac gggagcgata      741
acacatgata cagtgggcgg ctgtgtcagc aaggaccgca gaagtgtgtc agcctgggcg      801
cgggtgttgg taacacgtgt tgcactgtga acacgtgtga atgtcctgtg gtatgttgtg      861
tgtgaatgtc atggagctgt gtgtgtgtgt gcgcgtgcgt gtgtgtgtgt ggagcacccc      921
ctacatcact gtaactgcgg gtgttgaggg tgtaccccgt cactccctgt gttgtgtgaa      981
caggtgggtg tcagtgtgtg actgattatg tcaccgaggg tgtgcagagc gggtacattt     1041
gtgcgttccc ttgtttctgc actcacgttt tgtgatttgt gacgataaag gccaatggga     1101
aagaatgtgg ctttcagatc tgttcctggg agcatctggg ggtgggggtg gggacccggt     1161
ggcggagggt ctgcaagtat taagggatga ggaaagtcac acagcaagca cgcggacgtg     1221
ataaccagga gccctggggg cacgagtgtg tgtgagcatg aatgccctga atgggtcctt     1281
ttgtgcccat gaacttgtac ccagcaagga acagtctccg tgtctgagac tgtgtgccca     1341
gcagggtttg tggcccgaga tatacactgt ttccctaagt ggggctcctg ggtggctcag     1401
tcggttaagc gtccg                                                      1416
<210>  6
<211>  205
<212>  PRT
<213>  Felis catus
<400>  6
Met Gln Ala Ala Asp Phe Lys Gly Lys Lys Gln Arg Ala Pro Asp His
1               5                   10                  15
Lys Glu Gly Ser Val Pro Gln Gly Ala Asp Pro Asp Tyr Glu Asn Ile
20                  25                  30
Thr Leu Thr Phe Arg Asn Gln Glu Gln Pro Arg Gly Ser His Ser Pro
35                  40                  45
Pro Lys Asn Arg Gly Lys Gln Pro Pro Ala Ser Pro His Leu Thr Ala
50                  55                  60
Ser Gly Gly Ala Pro Val Pro Ala Trp Ser Lys Gln Ala Pro Asp Ser
65                  70                  75                  80
Ala Gln Val Pro Arg Trp Leu His Arg Val Thr Leu Ser Leu Tyr Ile
85                  90                  95
Leu Leu Ala Leu Phe Cys Ile Val Leu Leu Ala Leu Val Leu Val Lys
100                 105                 110
Asn Ser Glu Val Ser Gln Glu Leu Leu Val Val Lys Arg Glu Leu Gln
115                 120                 125
Asn Val Ser Ile Ser Gly Gln Gln Cys Gln Glu Glu Gln Lys Gln Gly
130                 135                 140
Trp Ser Ser Val Gln Gln Leu Ile Thr Glu Ala Arg Gln Asp Ile Asp
145                 150                 155                 160
Met Ile Lys Arg Asn Val His Ile Gly Asn Glu Lys Val Lys Thr Leu
165                 170                 175
Ser Thr Asp Leu Ser Gln Ile Lys Thr Lys Leu His Glu Ile Ser Lys
180                 185                 190
Ile Leu Glu Lys Lys Pro Gln Pro Gln Pro Thr Ala Gln
195                 200                 205
<210>  7
<211>  1132
<212>  ДНК
<213>  Mus musculus
<220>
<221>  CDS
<222>  (21)..(572)
<400>  7
acgtgaatca accaagcaga atg cat gca tca gcc tcc cag gat aag aac cgg       53
Met His Ala Ser Ala Ser Gln Asp Lys Asn Arg
1               5                   10
agg aag cca ggt cat gat gaa ggt gct cac aat cct gac tac gag aat        101
Arg Lys Pro Gly His Asp Glu Gly Ala His Asn Pro Asp Tyr Glu Asn
15                  20                  25
ata acc ttg gcc ttc aga aac aag gac caa ctc aaa ctc agc caa tca        149
Ile Thr Leu Ala Phe Arg Asn Lys Asp Gln Leu Lys Leu Ser Gln Ser
30                  35                  40
aca ccc aca aaa caa gcc aag ttc aag aca tcc ctg gac cca gct gag        197
Thr Pro Thr Lys Gln Ala Lys Phe Lys Thr Ser Leu Asp Pro Ala Glu
45                  50                  55
tcc ccg cct tgg ttg tac aga acc att atg atg ttg tat gtt ctc ctt        245
Ser Pro Pro Trp Leu Tyr Arg Thr Ile Met Met Leu Tyr Val Leu Leu
60                  65                  70                  75
gct ctc gtc ttt tta tcc tgc atc gtc ctc tct gct ttg gtc ttg gtg        293
Ala Leu Val Phe Leu Ser Cys Ile Val Leu Ser Ala Leu Val Leu Val
80                  85                  90
aaa aat tct gag atg tcc aag gag ctg tgg acc ttg aaa gca gag ctt        341
Lys Asn Ser Glu Met Ser Lys Glu Leu Trp Thr Leu Lys Ala Glu Leu
95                  100                 105
tcg aat gtt tca gac acg gtg tgg aat atc cgg gag ctc cag aat cag        389
Ser Asn Val Ser Asp Thr Val Trp Asn Ile Arg Glu Leu Gln Asn Gln
110                 115                 120
caa acg agg att tgg gaa gct gcc cag ggg gac atc aag gag gtc aag        437
Gln Thr Arg Ile Trp Glu Ala Ala Gln Gly Asp Ile Lys Glu Val Lys
125                 130                 135
aag acc ctt ggc aca gtc atg agt agc atc cag act gga aac gac cgg        485
Lys Thr Leu Gly Thr Val Met Ser Ser Ile Gln Thr Gly Asn Asp Arg
140                 145                 150                 155
ctg aag act gtg ccg gca gat ata acc caa atc aag aaa act ctt gag        533
Leu Lys Thr Val Pro Ala Asp Ile Thr Gln Ile Lys Lys Thr Leu Glu
160                 165                 170
gcg cta gaa aag aag gca cag cct cag ccc agt aca taa gaggacacca         582
Ala Leu Glu Lys Lys Ala Gln Pro Gln Pro Ser Thr
175                 180
cagcagtacc tgtgaagact ccgaattgca cctgctagtg aagatggcag atgggggtgg      642
gtactgagct tgagtgtgaa cctgccgtgc atcctcatat aaaaaagatt ctccaccagg      702
gggaatgagt gttgaagagg tgtgtatgca aatgagcatt tggggtttcc atgtattcca      762
ggagaagggt ttatggtgga aagagaacat ggcagtcaca gcaggtgtta ctctttatgg      822
gccacatagg tgtatgccct ggcttatgtg agtataggca tgtcctggtt ggcagctatt      882
cccgagaagt ccccaaagtg taagtgacat gtaggacatg cctccccatt ctcttgctca      942
tgtatgtgca tctggctgtt ctgtatgtgt gtcactgaag tggtgggtga tagacatcac     1002
cctggagatg tgtcatggca tgggtcattc ctagtgtttt tggtcatgtc agcttgtgtg     1062
ttcagggcat gcacacaaat gtagccatcg atttctgcac ttgtatttat gattcaagaa     1122
gataaatgcc                                                            1132
<210>  8
<211>  183
<212>  PRT
<213>  Mus musculus
<400>  8
Met His Ala Ser Ala Ser Gln Asp Lys Asn Arg Arg Lys Pro Gly His
1               5                   10                  15
Asp Glu Gly Ala His Asn Pro Asp Tyr Glu Asn Ile Thr Leu Ala Phe
20                  25                  30
Arg Asn Lys Asp Gln Leu Lys Leu Ser Gln Ser Thr Pro Thr Lys Gln
35                  40                  45
Ala Lys Phe Lys Thr Ser Leu Asp Pro Ala Glu Ser Pro Pro Trp Leu
50                  55                  60
Tyr Arg Thr Ile Met Met Leu Tyr Val Leu Leu Ala Leu Val Phe Leu
65                  70                  75                  80
Ser Cys Ile Val Leu Ser Ala Leu Val Leu Val Lys Asn Ser Glu Met
85                  90                  95
Ser Lys Glu Leu Trp Thr Leu Lys Ala Glu Leu Ser Asn Val Ser Asp
100                 105                 110
Thr Val Trp Asn Ile Arg Glu Leu Gln Asn Gln Gln Thr Arg Ile Trp
115                 120                 125
Glu Ala Ala Gln Gly Asp Ile Lys Glu Val Lys Lys Thr Leu Gly Thr
130                 135                 140
Val Met Ser Ser Ile Gln Thr Gly Asn Asp Arg Leu Lys Thr Val Pro
145                 150                 155                 160
Ala Asp Ile Thr Gln Ile Lys Lys Thr Leu Glu Ala Leu Glu Lys Lys
165                 170                 175
Ala Gln Pro Gln Pro Ser Thr
180
<210>  9
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Праймер T3
<400>  9
aattaaccct cactaaaggg                                                   20
<210>  10
<211>  19
<212>  ДНК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Праймер T7
<400>  10
taatacgact cactatagg                                                    19
<210>  11
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Смысловой праймер для собачьей ОТ
<400>  11
ccacgtccca accctgtcta                                                   20
<210>  12
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Смысловой праймер для собачьей ОТ
<400>  12
gtgctccagc cctgattctg                                                   20
<210>  13
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Смысловой праймер для человеческой ОТ
<400>  13
tggccttcaa aaatcaggac                                                   20
<210>  14
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Антисмысловой праймер для человеческой ОТ
<400>  14
aggctcagga tggctctgta c                                                 21
<210>  15
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная
<220>
<223> Смысловой праймер для мышиной ОТ
<400>  15
tccaaggagc tgtggacctt                                                   20
<210>  16
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Антисмысловой праймер для мышиной ОТ
<400>  16
agtcttcagc cggtcgtttc                                                   20
<210>  17
<211>  37
<212>  ДНК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Смысловой EcoRI-праймер мышиного mcemp1
<400>  17
gaattcgccg ccaccatgca tgcatcagcc tcccagg                                37
<210>  18
<211>  29
<212>  ДНК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Антисмысловой NotI-праймер мышиного mcemp1
<400>  18
gcggccgctt atgtactggg ctgaggctg                                         29
<210>  19
<211>  39
<212>  ДНК
<213>  Искусственная
<220>
<223> Смысловой EcoRI-праймер человеческого MCEMP1
<400>  19
gaattcgccg ccaccatgga agtggaggaa atctacaag                              39
<210>  20
<211>  29
<212>  ДНК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Антисмысловой NotI-праймер человеческого MCEMP1
<400>  20
gcggccgctt attgaggtga ggactgtgg                                         29
<---