Метод моделирования острого панкреатита
ACUTE PANCREATITIS SIMULATING METHOD

Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной медицине, ветеринарии, и описывает методику моделирования острого деструктивного панкреатита (ОДП).
Острый панкреатит - полиэтиологическое заболевание поджелудочной железы воспалительно-деструктивной природы, ведущими звеньями которого являются процессы ферментативного аутолиза, некроза и эндогенного инфицирования с вовлечением в процесс тканей забрюшинного пространства, брюшной полости и систем экстраперитониальной локализации. [1]
Несмотря на достижения в диагностике и лечении ОДП, по данным литературы, заболеваемость из года в год растет и по-прежнему является актуальной проблемой ургентной хирургии. Распространенность острого панкреатита составляет до 389 человек на 1 млн. населения, смертность от этого заболевания колеблется от 6 до 12 человек на 1 млн. населения [2]. Данная статистика свидетельствует о необходимости детального изучения механизмов развития заболевания, а так же поиска новых методов патогенетического лечения.
С целью оптимизации временных и финансовых затрат требуется быстрый, простой, дешевый и эффективный метод моделирования острого панкреатита.
Согласно современным знаниям о этиопатогенезе острого панкреатита, методы моделирования удобно разделить на неинвазивные и инвазивные [3].
Из неинвазивных широко известны алкоголь индуцированные модели [4, 5]. Известна методика предложенная коллективом авторов  et al. [5]. Животным опытной группы, на протяжении 12 недель в питьевую воду добавляли 15% этиловый спирт, по истечению срока моделирования получали повышение активности липазы и амилазы крови. В гистологических образцах описывается воспалительная инфильтрация, кровоизлияние и некроз паренхиматозных клеток. Значимыми недостатком данных и других алкоголь индуцированных методов являются длительный период моделирования, плохая воспроизводимость, невозможность регулировать площадь панкреонекроза, а так же влияние алкоголя на другие органы и системы.
Известна модель ОП, инициированная диетой с добавлением в корм лабораторным мышам этионина [6]. Он основан на нарушении процессов обмена веществ в панкреас, путем ингибирования включения в состав ферментных молекул аминокислот метионина и глицина. Низкие дозы этионина приводят к изменению функции железы по гипосекреторному типу, а более высокие вызывают острый геморрагический панкреатит с системными проявлениями, такими как паротит, жировая дистрофия печени, которые затрудняют изучение системных проявлений связанных с ОДП. Так же, данная методика приводит к высокой смертности животных за счет тяжелого нарушения метаболизма. Патогенетический механизм развития ОДП разнится с таковым в клинической практике, что не позволяет использовать описанную модель для апробации новых лекарственных средств.
Известны иммунологические методы моделирования, основанные на феномене Артюса, результатом которых является повреждение микроциркуляторного русла поджелудочной железы иммунными комплексами [7]. Эти методы не получили широкого применения из-за своей сложности воспроизведения, дороговизны и недостаточной экстраполяции экспериментального процесса на реальную клиническую практику, в которой токсико-аллергический этиопатогенез является большой редкостью.
Наиболее часто используются инвазивные методы, подразумевающие интраоперационное моделирование.
Существует масса химиоиндуцированных методик создания острого панкреатита. Например, Вискунов В.Г. с соавторами [12] макроскопически исследовали морфологические изменения, происходившие на протяжении 90 минут после введения одной группе крыс раствора трипсина, другой группе животных - яда гадюки в билиопанкреатический проток. У выживших на следующий день животных, процент которых составил в первой группе 28,6%, во второй группе 19,1%, производили гистологическое исследование аутопсийного материала. Данная модель имеет низкую выживаемость животных, невозможность регулировать площадь повреждения, чрезмерно выраженное токсическое действие на другие органы и системы, что позволяет ее использовать для изучения механизмов развития полиорганной недостаточности при ОДП, но не дает возможности более детального изучения патогенез ОП и апробировать новые методы терапии.
Существуют методики с перевязкой билиопанкреатического протока и дальнейшим введением других агрессивных агентов. Например, ретроградное введения желчи, перманганата калия [13], хенодеоксихолевой кислоты (патент РФ №2553940 С2), поверхностно-активного соединения тритона-Х 100 (патент РФ №2286608), скипидара, кислот, солей, масла и др. Недостатками данных методов является их быстропрогрессирующий панкреонекроз с исходом в фиброз. Введение в общий желчный проток токсических веществ, требует регулировки объема и скорости их подачи для создания внутрипротоковой гипертензии, что приводит к трудной воспроизводимости данных моделей и невозможности управлять тяжестью заболевания и площадью некроза. Кроме того, создаваемая данными способами модель ОДП неадекватна с точки зрения современного представления о патогенезе панкреатита. Теория "общего канала", выдвинутая Е.L. Opie в 1901 г., является устаревшей, поскольку не нашла своего подтверждения в практике.
Широко известны механические способы моделирования, например криомоделирование. Они основаны на образовании кристаллов льда из воды, что ведет к увеличению внутриклеточной жидкости на 10% и механическому разрыву мембраны панкреатоцита [9, 10]. Например, Андреева С.Д. [8], моделирует криодеструкцию железы на поросятах, аппликационным методом, аэрозолем «КриоФарма» с экспозицией в 20 секунд, проводимое на поросятах. Высокая летальность, несоответствие этиопатогенеза ОДП с таковым в клинической практике, основные недостатки метода.
Другой моделью ОП является апробированное на кроликах механическое сдавливание дистальной части железы зажимом на протяжении 3 см, в трех разных местах с дальнейшим введением 1 мл бактериальной взвеси, содержащей E.Coli и протеи. После моделирования животным рассекали париетальную брюшину и формировали карман в забрюшинной клетчатке, куда помещали травмированную железу, с целью экстраполяции анатомического положения панкреас с кролика на человека [11]. Стоит отметить большой объем оперативных вмешательств, неоправданную травму и инфицирование брюшины и забрюшинного пространства, высокий уровень смертности животных. Данная методика будет предпочтительной при изучении гнойно-некротической формы панкреатита и его системных осложнений, однако не подходит для изучения асептического ОДП. Кроме того, удобнее проводить эксперимент на крысах, так как они имеют схожую с человеком пищеварительную систему и схожий тип питания, не требуют больших затрат на приобретение, содержание.
Технической задачей нашего изобретения является создание простой, быстрой, легко воспроизводимой модели, морфологически и патогенетически адекватной изменениям, происходящим при ОДП в клинике.
Моделирование острого деструктивного панкреатита производится на половозрелых крысах, самках линии Вистар, массой 180±20 грамм, содержащихся в стандартных условиях вивария. При проведении оперативных вмешательств соблюдаются правила асептики и антисептики, а так же правила, предусмотренные Европейской комиссией по надзору за проведением лабораторных и других опытов с участием экспериментальных животных разных видов. Для анестезии используется раствор рометара и 2% раствор лидокаина (согласно инструкции). После обработки операционного поля проводится верхнесрединная лапаротомия по белой линии живота. В рану выводится желудок, панкреас и петля двенадцатиперстной кишки. По поверхности паренхимы железы, иглой от инсулинового шприца, на глубину среза иглы, наносятся две параллельные надсечки длинной по 1 см. После нанесения травмы органы погружаются в брюшную полость, которая наглухо ушивается узловыми шелковыми швами. Рана обрабатывается 0,02% раствором фурацилина. Животные находятся в условиях свободного доступа к воде и пище. Экспозиция моделирования составляет 7 дней. По завершении моделирования получают кровь для биохимического исследования, вводится смертельная доза рометара и забираются ткани поджелудочной железы для морфологического исследования.
Положительными сторонами предложенного метода является:
1) С патогенетической точки зрения методика отражает последствия воздействий различных повреждающих этиологических и триггерных факторов на железу, приводящих к развитию воспаления, расстройству микроциркуляции, экссудации, нарушению оттока протеолетических соков, аутолизу железы и, в конечном счете, к некрозу.
2) Техническая простота способа, дающая возможность в максимально короткие сроки проводить моделирование.
3) Не требует использования дорогостоящего оборудования, реагентов и большого опыта экспериментатора в проведении оперативных вмешательств.
4) Метод дает морфологически верифицированную картина ОДП у всех животных опытной группы (которая составляет более 50 экспериментальных крыс), что говорит о его высокой эффективности и воспроизводимости.
6) Низкие показатели летальности животных, позволяют проводить лечебно-диагностические вмешательства на протяжении семи и более дней.
Результаты моделирования:
Пример 1.
Половозрелой самке крысы линии «Вистар», массой 207 грамм, по кличке «Беглянка» под наркозом, произвели верхнюю срединную лапаротомию, с применением правил асептики и антисептики. В операционную рану вывели часть желудка и двенадцатиперстную кишку с поджелудочной железой, после чего на глубину среза иглы от инсулинового шприца произвели 2 параллельные надсечки длиной по 1 см. После моделирования органы погрузили обратно в брюшную полость и послойно ушили переднюю брюшную стенку узловыми шелковыми швами. По истечению срока эксперимента, через 7 дней, крыс повторно наркотизировали, производили забор биологических жидкостей для диагностических исследований и забор тканей для морфологического исследования. В описанном патоморфологическом образце №1, спустя 7 суток от начала моделирования, определяется морфологическая картина острого воспаления. При окраске тканей гематоксилин-эозином отмечается умеренно выраженное полнокровие сосудов интерстиция, с очаговым разволокнением стенок сосудов, умеренно выраженным отеком и воспалительной инфильтрацией эозинофилами, макрофагами, лимфоцитами. Имеются очаговые дистрофические изменения клеток ацинусов.
Пример 2.
Половозрелой самке крысы линии «Вистар», массой 189 грамм, по кличке «Зазнайка» под наркозом, произвели верхнюю срединную лапаротомию, с применением правил асептики и антисептики. В операционную рану вывели часть желудка и двенадцатиперстную кишку с поджелудочной железой, после чего на глубину среза иглы от инсулинового шприца произвели 2 параллельные надсечки длиной по 1 см. После моделирования органы погрузили обратно в брюшную полость и послойно ушили переднюю брюшную стенку узловыми шелковыми швами. По истечению срока эксперимента, через 7 дней, крыс повторно наркотизировали, производили забор биологических жидкостей для диагностических исследований и забор тканей для морфологического исследования. В описанном патоморфологическом образце №2, спустя 7 суток от начала моделирования, определяется морфологическая картина острого воспаления. Отмечается полнокровие капилляров и венул, очаговый отек, значительные кровоизлияния, очаговая периваскулярная воспалительная инфильтрация макрофагами, эозинофилами, нейтрофилами, лимфоцитами.
Пример 3.
Половозрелой самке крысы линии «Вистар», массой 203 грамма, по кличке «Прожера» под наркозом, произвели верхнюю срединную лапаротомию, с применением правил асептики и антисептики. В операционную рану вывели часть желудка и двенадцатиперстную кишку с поджелудочной железой, после чего на глубину среза иглы от инсулинового шприца произвели 2 параллельные надсечки длиной по 1 см. После моделирования органы погрузили обратно в брюшную полость и послойно ушили переднюю брюшную стенку узловыми шелковыми швами. По истечению срока эксперимента, через 7 дней, крыс повторно наркотизировали, производили забор биологических жидкостей для диагностических исследований и забор тканей для морфологического исследования. В описанном патоморфологическом образце №3, спустя 7 суток от начала моделирования, определяется морфологическая картина острого воспаления. Отмечается полнокровие капилляров и венул, очаговый отек, очаговое кровоизлияние, воспалительная инфильтрация макрофагами, эозинофилами, нейтрофилами, лимфоцитами.
Анализ полеченных результатов показывает, что в тканях железы развивается классическое воспаление, что позволяет рекомендовать использовать предлагаемый метод моделирования панкреатита в ветеринарии и медицине для испытания новых медикаментозных лекарственных препаратов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Воробьева А.С., Наумова О.Н., Стяжкина С.Н. Острый панкреатит - проблема 21 века [Acute pankreatitis - the problem of the 21st century] // LII International Scientific Review of the Problems and Prospects of Modern Science and Education. Paris, France - 18 December, 2018 c. 42.
2. Кубышкин B.A., Затевахин И.И., Багненко С.Ф. и др. Национальные клинические рекомендации по острому панкреатиту. Российское общество хирургов. Официальный сайт «Российское общество хирургов».2015. 38 с.
3. Агапов М.А., Горский В.А., Петров В.А., Поливода М.Д., Кравченко А.Ю., и др. Способы моделирования острого панкреатита (обзор литературы) // Вестник Российского государственного медицинского университета. 2014. №3. С. 25-29.
4. Andrzewska A., Plugosz J.W., Jurkiwska G., The effekt of antecedent acute ethanol ingestion on the pankreas ultrastructure taurochlate pancreatitis in rats // Experimental and Molecular Pathology Volume 65, Issue 2, October 1998, P. 64-77.
5.  O. Juhani &  Tom &  Anu & Jalovaara, Pekka. The effect of long-term ethanol ingestion on pancreatic lipolytic enzymes and their behaviour in acute experimental pancreatitis in rats. // Surgical Research Communications. 1987. №2. P. 143-148.
6. Lombardi В., Influence of dietary factors on the pancreatotoxicity of ethionine // Am J Pathol. 1976. V. 84. №3. P 633.
7. Thai A., Studies on pancreatitis.II.Acute pancreatic necroses producted experementallyny the arthus sensitization reaction // Surgery. 1955. V. 37(6). P. 911.
8. Андреева С.Д., Моделирование острого панкреатита у свиней и цитохимическая характеристика лейкоцитов // Актуальные вопросы ветеринарной биологии. 2013 №2 (18). С. 17.
9. Дорошкевич С.В., Дорошкевич Е.Ю., Экспериментальное моделирование острого панкреатита. // Новости хирургии 2008. №2. Т. 16. С. 14.
10. С.И. Иващук, О.Я. Стойко, Р.Р. Коваль, О.В. Бесединская Способ моделирования дискретных форм острого панкреатита с использованием локального криоинфлюенса // Клiнiчна анатомiя та оперативна хiрургiя 2017.Т. 16. №1. С. 103.
11. А.Л Ушкевич, К.Н. Жандаров, Н.И. Прокопчик Моделирование острого деструктивного панкреатита, парапанкреатита в эксперименте // Новости хирургии. 2010. Т. №2 18. С. 8-14.
12. Вискунов В.Г., Пупышев А.Б., Проценко С.И., Надеев А.П., Синицына М.А., Фещенко A.M., Чубенидзе З.Ю. Моделирование острого панкреатита у крыс введением трипсина и змеиного яда. // Бюллетень СО РАМН. 2008. №6 (134). С. 18-21.
13. Шалимов С.А., Радзиховской А.П. и Кейсевич Л.В. / Руководство по экспериментальной хирургии. М.: Медицина. 1989. С. 190-199.