Рекомбинантный штамм вируса гриппа A/PR8-NS124-Luc и способ оценки поствакцинальных нейтрализующих антител с использованием биолюминесцентной детекции
RECOMBINANT STRAIN OF A/PR8-NS124-Luc INFLUENZA VIRUS AND METHOD FOR EVALUATING POST-VACCINAL NEUTRALIZING ANTIBODIES USING BIOLUMINESCENT DETECTION

Существующие регламентированные методы оценки противогриппозных вакцин и химиопрепаратов основаны на измерении снижения репродукции вируса под действием специфичных поствакцинальных антител или вводимых препаратов. Разработаны эти методы еще в 1950-60 гг. Так, классический тест микронейтрализации, первоначально использовал детекцию вируса гриппа по цитопатическому действию или в реакции гемагглютинации и занимал 3 суток [WHO, 2010, WHO Manual on Animal Influenza Diagnosis and Surveillance]. С использованием иммуноферментного анализа срок проведения был сокращен до одних суток [WHO, 2011, Manual for the laboratory diagnosis and virological surveillance of influenza]. Использование репортерного вируса значительно упрощает и ускоряет детекцию вируса за счет прямого измерения флуоресцентного или биолюминесцентного сигнала. «Быстрый тест нейтрализации», основанный на данном принципе детекции уже разработан для тестирования антител и химиопрепаратов против вируса Эбола [Hoenen et al, 2013], метапневмовируса [Zhou et al, 2013], вируса бешенства [Xue et al., 2014], а также некоторых вирусов животных и птиц [Wang et al., 2014, Li et al., 2013, Hu et al., 2012]. Описан быстрый способ оценки нейтрализующих антител с помощью использования псевдовирусов гриппа, кодирующих флуоресцентные белки [Martmez-Sobrido et al., 2010, Baker at al., 2015]. Недостатком последнего метода является сложность культивирования псевдовирусов, поскольку для этого необходима специализированная культура клеток MDCK-HA, экспрессирующая гемагглютинин определенного подтипа.
Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, вирусологии и медицины и описывает способ получения репортерного рекомбинантного вируса гриппа, кодирующего биолюминесцентный белок NanoLuc в укороченной рамке считывания NS1 (1-124), и способ оценки поствакцинальных нейтрализующих антител с использованием биолюминесцентной детекции.
Использование штамма на основе аттенуированного вируса гриппа с люциферазным репортером в укороченном белке NS1 позволит существенно сократить время проведения вирусологических тестов и повысить их чувствительность за счет биолюминесцентной детекции репродукции вируса, а также снизить биориски, связанные с вирусологической работой.
Область и уровень техники
К настоящему времени сконструировано достаточно большое количество рекомбинантных вирусов гриппа, кодирующих репортерные флуоресцентные или люциферазные белки [Kittel et al., 2004, Tran et al., 2013, Eckiert et al., 2014, Fukuyama et al., 2014, Tran et al., 2015, Reuther et al., 2015, Yan et al., 2015, Breen et al, 2016 (обзорная статья)]. При этом в литературе отсутствует описание быстрых тестов нейтрализации на их основе, и кроме того, исследователи отмечают ограниченную генетическую стабильность большинства конструкций.
Нанолюцифераза (NanoLuc) это генно-инженерный белок, полученный методом направленной эволюции из малой субъединицы люциферазы глубоководной креветки Oplophorus gracilirostris [Hall et al., 2012]. NanoLuc имеет молекулярную массу 19 кДа и по размеру существенно меньше флуоресцентных белков и наиболее распространенных люцифераз Firefly (Flue, 61 кДа) и Renilla (Rluc, 36 кДа), что в случае гриппозного вектора обеспечивает большую генетическую стабильность репортерного гена.
Близким техническим решением к настоящему изобретению является рекомбинантный вирус гриппа A/WSN/33 (H1N1), экспрессирующий NanoLuc. Гетерологичная последовательность гена биолюминесцентного белка в данном штамме вставлена в открытую рамку считывания белка РА после сайта автопротеолиза 2А. Перед стоп-кодоном продублированы последние 50 концевых нуклеотидов (сигнал упаковки) с 18 мутациями, не ведущими к аминокислотным заменам и позволяющими избежать прямой повтор [Tran et al., 2013]. Аналогичная конструкция с модификациями в гене РА сделана на основе эпидемического вируса A/California/04/2009 (H1N1) [Karlsson et al., 2015].
Еще одним близким техническим решением к настоящему изобретению является рекомбинантный вирус гриппа A/PR/8/34, экспрессирующий биолюминесцентный белок Gaussia luciferase в составе открытой рамки считывания полноразмерного белка NS1. Модифицированный сегмент NS экспрессирует в виде одного полипептида слитый NS1 белок с биолюминесцентным белком Gaussia luciferase и NEP с сайтом протеолитического расщепления 2 А для высвобождения NEP. Акцепторный сайт сплайсинга NS 1 содержит две мутации для предотвращения сплайсинга мРНК NS [Eckiert et al., 2014].
Сущность изобретения
Изобретательской задачей является создание нового рекомбинантного репортерного вируса на основе гриппозного вектора, предназначенного для получения инструмента для отслеживания развития гриппозной инфекции в живых биологических системах, оценки поствакцинальных нейтрализующих антител и проведения быстрой диагностики эффективности противовирусных препаратов.
Существенным отличием изобретения является то, что сконструированный репортерный вирус является аттенуированным и характеризуется высокой генетической стабильностью при культивировании в культурах клеток Vero и MDCK, а также в куриных эмбрионах. Кроме того, в репортерном вирусе ген NanoLuc встроен в рамку белка NS1, который активно экспрессируется в первые часы после инфекции [Young et al., 1983]. Это позволяет детектировать биолюминесцентный сигнал уже через 3-6 часов после заражения клеток в невысокой дозе и дает возможность оценивать развитие инфекции в первые часы после заражения, что важно для поиска антител и препаратов не только нейтрализующих, но также только частично замедляющих развитие гриппозной инфекции. Активность данных антител и препаратов не может быть детектирована существующими методами in vitro, но может иметь существенное значение для защиты от инфекции и ее осложнений in vivo.
Первым техническим результатом, достигаемым при осуществлении настоящего изобретения, является получение генетически стабильного рекомбинантного вируса гриппа, экспрессирующего NanoLuc в составе открытой рамки считывания укороченного белка NS1, способного размножаться в культурах клеток, куриных эмбрионах и лабораторных мышах, который может быть детектирован по наличию биолюминесценции в ранние сроки после заражения. Рекомбинантный штамм A/PR8-NS124-Luc (H1N1) депонирован в Государственной коллекции вирусов Национального исследовательского центра эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи Министерства здравоохранения Российской Федерации под №2906.
Вторым техническим результатом является способ быстрой оценки нейтрализующей активности антител в обработанной RDE сыворотке крови с использованием рекомбинантного вируса гриппа, экспрессирующего NanoLuc в составе рамки считывания укороченного белка NS1. Данный метод может быть использован для оценки иммуногенности вакцин и быстрого скрининга популяционного иммунитета к вирусу гриппа А.
Сущность изобретения поясняется с помощью графических изображений.
Фиг. 1, на которой обозначена карта плазмиды, кодирующей химерный ген NS рекомбинантного вируса гриппа А, обеспечивающий экспрессию белка NanoLuc в составе рамки считывания укороченно белка NS 1.
Фиг. 2, на которой представлена структура гена NS рекомбинантного вируса гриппа A/PR8-NS124-Luc и расположения открытых рамок считывания белков NS1, NanoLuc и NEP.
Фиг 3, на которой представлены результаты ОТ-ПЦР для определения длины гетерологичной вставки в гене NS клонов рекомбинантного вируса гриппа A/PR8-NS124-Luc, полученных по итогам последовательных пассажей в культуре клеток Vero (А) и системе куриных эмбрионов (Б). ММ - маркер молекулярного веса (М28, СибЭнзим, 100-3000 bp); pl - положительный контроль (ПЦР фрагмент необходимой длины, полученный с соответствующей плазмиды - см. Фиг. 1); цифрами 1-4 (фиг. 3А) обозначены индивидуальные клоны пассажа V1, цифрами 5-8 (фиг. 3А) обозначены индивидуальные клоны пассажа V2, цифрами 1-4 (фиг. 3Б) обозначены индивидуальные клоны пассажа V2E1.
Фиг. 4, на которой проиллюстрирована (А) динамика репродукции рекомбинантного вируса A/PR8-NS124-Luc при заражении клеток Vero в дозе 0,001 ТИД50/клетку в течение 24-72 часов после инфекции в сравнении с штаммами A/PR8-NS124 и A/PR8-NSwt, и (Б) динамика репродукции рекомбинантного вируса A/PR8-NS124-Luc при заражении мышей в течение 4 суток после инфекции.
50
Фиг. 5, на которой проиллюстрирована экспрессия биолюминисцентного белка NanoLuc рекомбинантным вирусом гриппа A/PR8-NS124-Luc в супернатанте и клеточном лизате клеток Vero (А) и А549 (Б) при заражающей дозе 0,005 ТИД/клетку в течение 24 часов после инфекции.
50
Фиг. 6, на которой проиллюстрирована дозозависимость экспрессии биолюминисцентного белка NanoLuc рекомбинантным вирусом гриппа A/PR8-NS124-Luc в супернатанте (А) и клеточном лизате (Б) клеток Vero (0,1-0,0001 ТИД/клетку) в течение 3-24 часов после инфекции.
Фиг. 7, на которой проиллюстрирована возможность измерения репродуктивной активности вируса A/PR8-NS124-Luc в ткани легких мышей с использованием биолюминесцентной детекции (А) активность биолюминисценции белка NanoLuc измеренная в суспензии легких мышей в течение 5-96 ч после инфекции рекомбинантным вирусом гриппа A/PR8-NS124-Luc (Б) корреляция биолюминисценции с вирусной нагрузкой в легких мышей, измеренной методом титрования суспензии легких в культуре клеток MDCK.
Фиг. 8, на которой представлена корреляция результатов определения титра поствакцинальных нейтрализующих антител в сыворотке крови хорьков, полученных в реакции люциферазной нейтрализации (РЛН) и реакции микронейтрализации (РМН).
Фиг. 9, на которой представлена корреляция результатов определения титра поствакцинальных нейтрализующих антител в сыворотке крови крыс, полученных в реакции люциферазной нейтрализации (РЛН), реакции микронейтрализации (РМН) и реакции торможения гемагглютинации (РТГА) с вирусами гриппа субтипов H1N1 (А, Б) и H3N2 (В, Г).
Фиг. 10, на которой представлено (А) изменение биолюминисцентной активности вируса гриппа A/PR8-NS124-Luc in vitro в клетках Vero в зависимости от концентрации противовирусного препарата рибавирин в культуральной среде (Б) изменение вирусной нагрузки и люциферазной активности в легких мышей, зараженных вирусом A/PR8-NS124-Luc и подвергшихся терапии противовирусным препаратом осельтамивир в сравнении с мышами, не подвергшимися терапии (плацебо).
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Конструкция плазмиды, обеспечивающей экспрессию белка NanoLuc в укороченной рамке считывания белка NS1 вируса гриппа А
На первом этапе проводили конструирование плазмид для сборки рекомбинантного вируса гриппа. Синтез генетических фрагментов, кодирующих белки вируса гриппа A/PR/8/34 (H1N1), в том числе химерный ген NS со вставкой белка NanoLuc выполняли de novo (Евроген, Россия).
В качестве основы для создания химерного гена была использована нуклеотидная последовательность генного сегмента NS вируса гриппа A/PR/8/34 (H1N1), включающая кодирующую, а также 5'-UTR и 3'-UTR некодирующие области (номер последовательности в базе GenBank AF389122). В последовательность были внесены три нуклеотидные мутации (329C→G, 763А→G, 765G→A), обеспечивающие аминокислотные замены в белке NS1 (101D→E) и NEP (89I→V), повышающие урожайность вируса в системе РКЭ [Horimoto et al., 2007]. Открытая рамка считывания NS1 была укорочена до 124 аминокислот, после которых вставлена гетерологичная последовательность, кодирующая белок NanoLuc (Promega, США), отделенная глициновыми линкерами. Рамка считывания была терминирована кассетой из трех стоп-кодонов. Последующие 30 нуклеотидов генного сегмента NS были удалены и заменены уникальным сайтом рестрикции NotI, оставшиеся 100 нуклеотидов перед началом рамки NS2 (NEP) были сохранены для процесса сплайсинга. Общая длина синтезируемой последовательности составляла 1512 нуклеотидов. Общая длина плазмиды составляла 4366 нуклеотидов. Карта гена NS представлена на фиг. 1, аминокислотная последовательность химерного белка NS1 приведена в Перечне последовательностей SEQ ID NO: 1. Особенностью конструкции является оптимизация частоты кодонов и GC-состава гена NanoLuc под соответствующие показатели вируса гриппа A/PR/8/34 (H1N1).
Синтезированные последовательности клонировали в аналог двунаправленного вектора на основе плазмиды pHW2000 [Hoffmann et al., 2000] по сайтам рестрикции SalI/NgoMIV.
Полученные плазмиды накапливали в клетках E.coli DH5alpha и очищали с использованием набора реагентов Endofree Maxi Kit (Qiagen) для выделения плазмид, свободных от эндотоксина. Нуклеотидные последовательности плазмид верифицировали секвенированием по Сенджеру с использованием следующих служебных праймеров:
INS-F: 5'TggCTAACTAgAgAACCCACTgCTTACTg
INS-R: 5' CTAgAAggCACAgTCgAggCTgATC (Syntol, Россия)
4
3
Экспрессию NanoLuc с открытой рамки считывания белка NS1 подтверждали трансфекцией клеток HEK293FT (Invitorgen) полученной плазмидой pHW-PR8-NS124-LucOpt с помощью липофектамина 3000 (Invitrogen) согласно инструкции производителя. Люциферазная активность, измеренная с помощью системы NanoGlo (Promega) в лизате трансфецированных клеток (≈10 клеток) достигала 10 RLU (отн. ед.) через 6 часов после трансфекции, фоновое значение биолюминисценции составляло менее 10 RLU. Таким образом, конструкция плазмиды обеспечивала экспрессию NanoLuc и возможность ее детектировать в ранние сроки после трансфекции клеток.
Пример 2. Способ получения генетически стабильного рекомбинантного вируса гриппа, экспрессирующего NanoLuc в составе открытой рамки считывания укороченного белка NS1
6
Рекомбинантный вирус гриппа A/PR8-NS124-Luc (H1N1), экспрессирующий NanoLuc в составе рамки считывания укороченного белка NS 1, получали методом обратной генетики из 8 двунаправленных плазмид в культуре клеток Vero, полученной из Американской Коллекции Клеточных Культур (#CCL-81, АТСС, США). Культура клеток была адаптирована к росту в бессывороточной среде OptiPro (Gidco, США) с добавлением GlutaMax (Gibco, США). Использованные для трансфекции плазмиды на основе вектора pHW кодировали 8 генных сегментов вируса гриппа A/PR/8/34 (H1N1): РВ2, РВ1, РА, НА, NP, NA, М и модифицированный ген NS, в который после 124 аминокислотного остатка рамки считывания NS1 был вставлен ген NanoLuc. Ко-трансфекцию клеток Vero проводили методом электропорации с помощью Nucleofector II (Lonza, Германия). Использовали суммарно 8 мкг плазмидной ДНК (по 1 мкг каждой) на 3*10 клеток и 100 мкл смеси буферов для трансфекции из набора реагентов Cell Line Nucleofector Kit V (Lonza, США). После трансфекции клетки высевали в лунки 6-луночного планшета, через 6 часов образовавшийся монослой отмывали и производили смену среды на бессывороточную OptiPro (Gibco), содержащую 1 мкг/мл TPCK-трипсина (Sigma), для обеспечения развития вирусной инфекции. Признаки развития инфекции наблюдали по цитопатическому действию (ЦПД) вируса и в реакции гемагглютинации (РГА) с использованием 0,5% суспензии куриных эритроцитов.
Через сутки после трансфекции в монослое клеток Vero наблюдали частичное вирусное ЦПД и положительную РГА в культуральной среде. Через 48 часов разрушение монослоя достигло 100%. Полученный на данном этапе материал культуральной жидкости содержал «нулевой» пассаж (V0) вируса. Культуральную среду собирали и использовали для последующего заражения клеток Vero или развивающихся куриных эмбрионов (РКЭ).
Генетическую стабильность гена NanoLuc в составе открытой рамки считывания NS1 рекомбинантного вируса A/PR8-NS124-Luc изучали в процессе последовательных пассажей вируса в культуре клеток Vero и РКЭ. Стабильность оценивали по длине гетерологичной вставки в гене NS определяемой методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) с последующим ДНК-электрофорезом (ЭФ).
Вирусную РНК выделяли из 140 мкл вируссодержащей жидкости с использованием набора RNEasy Mini Kit (Qiagen, США). Амплификацию целевого фрагмента химерного гена NS проводили с использованием специально подобранных праймеров PR8-NS1-332F (5'- TGGCAGGCCCTCTTTGTA) и PR8-NS1-523R (5'-TGACATCCTCAGCAGTATGTCC) (Syntol, Россия) и набора реагентов для «одношаговой» ОТ-ПЦР AgPath-ID OneStep RT-PCR Reagents (Ambion, Thermo Scientific, США). Предварительно проводили отжиг праймера для обратной транскрипции: смешивали 2 мкл РНК и 2 мкл праймера Uni12 AGCRAAAGCAGG (100 пмоль/мкл, Beagle, Россия) [Zhou et al., 2009], затем инкубировали при 70°С в течение 4 мин, после чего охлаждали во льду. Полимеразную цепную реакцию проводили в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 12.5 мкл 2х буфера, 1 мкл смеси ферментов Emix, 1 мкл MgCl2, по 0.25 мкл прямого и обратного праймера, 6 мкл воды и 4 мкл смеси РНК и праймера Uni12.
ПЦР проводили в амплификаторе CFX96 (Bio-Rad) по следующей программе: нагрев до 42°С; 42°С - 60 мин; денатурация 95°С - 10 мин; затем 39 циклов 95°С - 15 с, 58°С - 30 с, 72°С - 1 мин; 72°С - 5 мин; 8°С - хранение.
Для анализа результатов ОТ-ПЦР проводили горизонтальный ЭФ образцов в 2% агарозном геле (Thermo Scientific, США) в IX ТВЕ буфере (Thermo Scientific, ЕС), содержащем 5 мкг/мл бромистого этидия (Ethidium Bromide, Amresco, США). В качестве маркера молекулярного веса использовали М28 (Сибэнзим, Россия). ЭФ проводили в камере SE-2 (Helicon, Россия) при 150 В в течение 1,5 часов. Для детекции результатов ЭФ использовали систему гель-документирования ChemiDoc (Bio-Rad, США).
Результаты анализа длины вставки в гене NS вируса A/PR8-NS124-Luc представлены на фиг. 3. В процессе последовательных пассажей штамма в культуре клеток Vero и в РКЭ вирус A/PR8-NS124-Luc характеризовался генетической стабильностью гена NanoLuc в составе открытой рамки считывания NS1.
Аналогичным образом были получены репортерные вирусы гриппа А с другими поверхностными антигенами, кодирующие NanoLuc в составе укороченного белка NS1. Полученные рекомбинантные вирусы содержали гены внутренних и неструктурных белков штамма A/PR/8/34 (гены РВ2, РВ1, PA, NP, M, NS1 со вставкой NanoLuc) и поверхностные антигены следующих штаммов: A/Astana/06/2005 (H5N1) (репортерный вирус A/Astana/PR8-NS124-Luc), A/Mississipi/10/2013 (H1N1pdm09) (репортерный вирус A/Miss/PR8-NS124-Luc), A/Switzarland/9715293/2013 (H3N2) (репортерный вирус A/Switz/PR8-NS124-Luc). Репортерные вирусы депонированы в Коллекции вирусов гриппа и ОРЗ ФГБУ «НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева» Минздрава России.
Пример 3. Рекомбинантный вирус гриппа A/PR8-NS124-Luc обладает высокими репродуктивными характеристиками в различных клеточных культурах, системе развивающихся куриных эмбрионов и в ткани легких зараженных животных
После трех пассажей в культуре клеток Vero, вируссодержащей жидкостью заражали 10-дневные РКЭ. Через 48 ч собирали аллантоисную жидкость охлажденных РКЭ, разделяли на аликвоты, замораживали при -70°С или смешивали со стабилизатором и лиофильно высушивали. Лиофильно высушенный штамм передали в Государственную коллекцию вирусов, замороженные образцы использовали для характеристики рекомбинантного вируса.
Для характеристики репродуктивных свойств рекомбинантного вируса гриппа A/PR8-NS124-Luc (H1N1) определяли его инфекционную активность в культуре клеток Vero, культуре клеток MDCK, полученной из коллекции Международного ресурсного центра (#FR-58, International Reagent Resource, США) и в системе РКЭ.
-8
-4
Для заражения РКЭ готовили десятикратные падающие разведения вируссодержащей жидкости на фосфатно-солевом буфере (DPBS) с добавлением антибиотиков (100 ед/мл пенициллин, 100 мкг/мл стрептомицин, 5 мкг/мл амфотерицин В (Биолот)). Каждым разведением, начиная с 10 до 10, заражали по 3 РКЭ, вводя в аллантоисную полость 0,2 мл разведения. Эмбрионы инкубировали 48 часов при температуре 34°С, после чего охлаждали. О наличии вируса судили по положительной РГА в аллантоисной жидкости. Инфекционную активность рассчитывали по методу Рида и Менча (Reed, Muench, 1938) и выражали в десятичных логарифмах 50%-ной эмбриональной инфекционной дозы (ЭИД50).
2
Для оценки инфекционной активности вируса в культуре клеток Vero готовили десятикратные падающие разведения вируссодержащей жидкости в среде OptiPro с добавлением смеси антибиотиков (Anti-Anti, Gibco) и 1 мкг/мл TPCK-трипсина (Sigma). Для заражения использовали 96-луночные планшеты с плоским дном с суточным монослоем клеток. В каждую лунку планшета вносили по 100 мкл инокулята, используя по 4 лунки на разведение. Планшеты инкубировали при 37°С и 5% СО в течение 72 часов. О наличии вируса судили по положительной РГА в культуральной жидкости. Инфекционную активность рассчитывали по методу Рида и Менча и выражали в десятичных логарифмах 50%-ной тканевой инфекционной дозы (ТИД50).
2
Для оценки инфекционной активности вируса в культуре клеток MDCK готовили десятикратные падающие разведения вируссодержащей жидкости на питательной среде Альфа-MEM (Биолот) с добавлением смеси антибиотиков и 2,5 мг/мл TPCK-трипсина. Для заражения использовали 96-луночные планшеты с плоским дном с суточным монослоем клеток. Перед заражением клетки промывали 2 раза раствором DPBS (Биолот). В каждую лунку планшета вносили по 100 мкл инокулята, используя по 4 лунки на разведение. Планшеты инкубировали при 37°С и 5% СО в течение 72 часов. О наличии вируса судили по положительной РГА в культуральной жидкости. Инфекционную активность вируса рассчитывали по методу Рида и Менча и выражали в десятичных логарифмах ТИД50.
50
Для измерения инфекционной активности в легких зараженных животных были использованы линейные мыши C57/black, самки, массой 18-20 г. В исследованиях использовали здоровых животных, на которых ранее не проводили какие-либо испытания. Вирус вводили интраназально в объеме 30 мкл в дозе 6.4 lgТИД/мышь. Вирусную нагрузку оценивали в гомогенатах легких мышей на 4 сутки после заражения. Гомогенизацию легких проводили в 0,9 мл DPBS с использованием TissueLyser (Qiagen, США). Инфекционную активность в легких животных определяли по результатам титрования суспензии органов в культуре клеток MDCK.
Инфекционная активность рекомбинантного вируса гриппа A/PR8-NS124-Luc в различных экспериментальных моделях представлена в таблице 1. Рекомбинантный вирус A/PR8-NS124-Luc обладает высокую репродуктивную активность как в РКЭ, так и в культурах клеток Vero и MDCK, соответствующую требованиям к диагностическим штаммам вируса гриппа. Так же была продемонстрирована высокая инфекционная нагрузка в легких мышей на 4 сутки после заражения.
Динамику репродукции рекомбинантного вируса гриппа A/PR8-NS124-Luc определяли в культуре клеток Vero. В качестве контрольных вирусов для сравнения использовали рекомбинантный вирус A/PR8-NS124 (H1N1) с укороченным белком NS1 без вставки и вирус «дикого типа» A/PR/8/34 (H1N1) с полноразмерным белком NS1, полученные из рабочей коллекции лаборатории векторных вакцин ФГБУ «НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева» Минздрава России. Монослой клеток Vero в 6-луночном планшете заражали указанными вирусами в дозе 0.001 ТИД50/клетку, инкубировали при 37°С. Изменение инфекционной активности вируса в течение 24-72 часов оценивали с помощью метода титрования и выражали в lgТИД50.
Динамика репродукции вируса A/PR8-NS124-Luc (H1N1) в культуре клеток Vero в течение 24-72 часов приведена на фиг. 4А. Показано, что рекомбинантный вирус A/PR8-NS124-Luc (H1N1) обладает высокими репродуктивными характеристиками, как и контрольные вирусы A/PR8-NS124 (H1N1), A/PR/8/34 (H1N1), и достигает пика репродуктивной активности через 48 часов после заражения.
Динамика развития инфекции вирусом A/PR8-NS124-Luc (H1N1) в легких мышей при интраназальном заражении в дозе 6.4 lgТИД50/мышь в течение 96 часов после инфекции продемонстрирована на фиг. 4Б, показано, что в течение 4 суток инфекционная нагрузка в легких мышей нарастает, однако составляет 4-5 lgТИД50, что на 1-2 lg ниже, чем инфекционная активность в легких мышей вируса «дикого типа» A/PR/8/34 (H1N1), которая составляет от 6,5 до 7,0 lgТИД50 (Vasiliev et al., 2018).
Пример 4. Репродукция вируса A/PR8-NS124-Luc в клеточных культурах и ткани легких зараженных животных может быть измерена с использованием биолюминесцентной детекции.
Биолюминисцентную активность NanoLuc оценивали в супернатанте и в клеточном лизате при заражении культур клеток Vero и А549 (АТСС, #CCL-185) рекомбинантным вирусом гриппа A/PR8-NS124-Luc.
Клетки растили в среде OptiPro (Gibco) с добавлением 1% GlutaMAX (Gibco) и 10% FBS при 37°С, 5% CO2. Перед заражением суточный монослой клеток два раза промывали DPBS, заражали вирусом в дозе 0.005 ТИД50/клетку и инкубировали при 37°С, 5% С02 в течение 1 часа. Клетки повторно отмывали два раза DPBS и заменяли среду. Планшет с зараженными клетками инкубировали в течение 1-24 часов. Перед определением биолюминисценции супернатант отделяли от клеток, монослой два раза промывали DPBS. Люциферазную активность измеряли в супернатанте и лизате клеток, используя планшеты с темными стенками, набор реагентов Nano-Glo Luciferase Assay System (Promega) и мультифотометр CLARIOstar (BMG LABTECH). Результаты представлены на фиг. 5.
Показано, что репродукция рекомбинантного вируса гриппа A/PR8-NS124-Luc, детектируемая по возрастанию сигнала биолюминисценции наблюдается в супернатанте культуры клеток Vero уже через 6 часов после заражения и увеличивается на протяжении 24 часов (фиг. 5А). В культуре клеток А549 люциферазная активность в клеточном лизате появляется через 6 часов после заражение, в супернатанте - через 9 часов, и возрастает на протяжении 24 часов (фиг. 5Б).
Для оценки дозозависимости люциферазной активности рекомбинантного вируса гриппа A/PR8-NS124-Luc, культуру клеток Vero заражали в диапазоне инфекционных доз 0.0001-0.1 ТИД50/клетку. После инкубации при 37°С, 5% CO2 в течение часа клетки два раза отмывали DPBS и заменяли среду. Планшет с зараженными клетками инкубировали в течение 3-24 часов. Затем супернатант отделяли от клеток, монослой два раза промывали DPBS. Люциферазную активность измеряли в супернатанте и лизате клеток, используя планшеты с темными стенками, набор реагентов Nano-Glo Luciferase Assay System (Promega) и ридер CLARIOstar (BMG LABTECH). Результаты, демонстрирующие четкую дозозависимость люциферазной активности рекомбинантного вируса гриппа A/PR8-NS124-Luc в супернатанте и лизате зараженных клеток в течение 24 часов после инфекции показаны на фиг 6А и фиг. 6Б, соответственно.
50
Для оценки люциферазной активности в легких зараженных животных были использованы линейные мыши C57/black, самки, массой 18-20 г. В исследованиях использовали здоровых животных, на которых ранее не проводили какие-либо испытания. Вирус вводили интраназально в объеме 30 мкл по 6.4 lgТИД/мышь. Люциферазную активность оценивали через 5-96 часов после заражения в гомогенате легких с использованием набора реагентов NanoGlo (Promega). Полученные результаты представлены на фиг. 7. Было показано, что рекомбинантный вирус гриппа A/PR8-NS124-Luc экспрессирует активную NanoLuc при репродукции в ткани легких мышей (фиг. 7А), при этом оценка репродукции вируса с использованием биолюминесцентной детекции коррелирует с методом оценки вирусной нагрузки в легких мышей с использованием метода предельных разведений (р=0,0192, фиг. 7Б).
Пример 5. Определение нейтрализующих антител в сыворотках крови с использованием рекомбинантного вируса гриппа, экспрессирующего NanoLuc в составе рамки считывания укороченного белка NS 1
cut_off
VC
VC
cut_off
Наличие нейтрализующих антител определяли в сыворотках иммунизированных животных. После обработки сывороток RDE, согласно инструкции производителя, готовили их 2-кратные разведения в среде OptiPro (для культуры клеток Vero) или АльфаМЕМ (для культуры клеток MDCK) с добавлением 1% антибиотиков (Anti-Anti, Gibco). В каждую лунку, содержащую 50 мкл разведенной сыворотки, добавляли по 50 мкл ранее оттитрованного вирусного антигена в дозе, соответствующей люциферазной активности 250 RLU. После контакте в течение 1 ч при 37°С смесь вносили в 96-луночный планшет с суточным монослоем культуры клеток Vero или MDCK. Титр нейтрализующих антител оценивали через 6 часов после внесения инокулята. Перед измерением люциферазной активности монослой клеток дважды промывали DPBS. Затем клетки лизировали и вносили субстрат из набора реагентов NanoGlo (Promega). Измерение биолюминисценции осуществляли в планшетах с темными стенками (Nunc) с помошью мультифотометра с LVF монохроматорами CLARIOstar (BMG LABTECH). Для определения порогового значения биолюминисценции пользовались формулой RLURLU/2, где RLU - люциферазная активность контроля вируса (лунки без добавления сыворотки). Конечный титр сыворотки выражали как обратное значение максимального разведения, в котором значение люциферазной активности было меньше или равно значению RLU. Постановку реакции микронейтрализации (РМН) и реакции торможения гемагглютинации (РТГА) проводили по протоколам, рекомендованным ВОЗ [WHO. 2011. Manual for the laboratory diagnosis and virological surveillance of influenza.]
Для сравнения титров антител в сыворотках крови хорьков в качестве антигена был использован рекомбинантный вирус гриппа A/PR8-NS124-Luc (H1N1). Значения титров сывороточных антител, измеренных методами РМН и РЛН представлены в таблице 2. Результаты корреляционного теста Пирсона для сравнения данных, полученных двумя методами, представлены на фиг. 8. Было показано, что средний геометрический титр РЛН коррелирует со средним геометрическим титром РМН (р=0.0119).
Для сравнения титров антител в сыворотках крови крыс в качестве антигена были использованы рекомбинантные вирусы гриппа A/PR8-NS124-Luc (H1N1) и A/Switz-PR8/NS124-Luc (H3N2). Значения титров сывороточных антител, измеренных методами РТГА, РМН и РЛН представлены в таблице 3. Результаты корреляционного анализа для сравнения данных, полученных с использованием различных методов представлены на фиг 9.
В целом полученные результаты демонстрируют, что титры антител в сыворотках животных, измеренные в РЛН коррелируют с титрами, полученными в РМН как в тесте с вирусом H1N1, так и H3N2 (р<0.0001). Кроме того, показано, что титры РЛН коррелируют также с титрами в РТГА (р<0.0001).
Таким образом, разработанный метод позволяет оценивать титр нейтрализующих антител в сыворотках крови животных, а полученные результаты хорошо коррелируют со стандартным методом РМН. При этом постановка теста РМН, согласно рекомендованному ВОЗ протоколу, занимает 2 суток, а результаты теста РЛН были получены в течение 1 суток.
Пример 6. Определение эффективности противовирусных химиопрепаратов с использованием рекомбинантного вируса гриппа, экспрессирующего NanoLuc в открытой рамке считывания NS1.
Для моделирования эксперимента по оценке эффективности противовирусного препарата in vitro использовали суточный монослой клеток Vero в 96-луночных планшетах. Клетки заражали рекомбинантным вирусом A/PR8/NS124-Luc в дозе 0,01 ТИД50/клетку, затем в лунки добавляли химиопрепарат рибавирин в различных дозах (конечная концентрация 0,3-300 мкг/мл в среде OptiPro (Gibco)). Планшет инкубировали в течение 6 ч при 37°С, после чего монослой клеток дважды отмывали DPBS (Биолот) и определяли люциферазную активность в лизате клеток с помощью набора NanoGlo Luciferase Assay System (Promega) согласно рекомендациям производителя. Биолюминисценцию считывали в планшете с черными стенками (Nunc) с помощью ридера с LVF монохроматорами CLARIOstar (BMG LABTECH). Полученные результаты (фиг. 10A) демонстрируют четкую дозозависимость противовирусного действия рибавирина (снижение активности вируса) в зависимости от концентрации вещества в среде. Таким образом, показано, что рекомбинантный вирус гриппа, экспрессирующий NanoLuc в открытой рамке считывания NS1, может быть использован для тестирования эффективности противовирусных химиопрепаратов in vitro.
Для моделирования эксперимента по оценке эффективности противовирусного препарата in vivo использовали линейных мышей BALB/c, самок, массой 18-20 г. Вирус A/PR8/NS124-Luc вводили интраназально в объеме 30 мкл в дозе 6 lgТИД50/мышь. Терапию инфекции проводили препаратом осельтамивир (50 мг/кг) по следующей схеме: за 2 часа до инфекции, через каждые 24 часа после инфекции 4 раза. Препарат вводили перорально по 100 мкл/мышь с помощью зондов. Контрольным мышам (плацебо) вводили воду по той же схеме. Люциферазную активность оценивали в гомогенатах легких на 2, 4 и 6 сутки после заражения. Гомогенизацию легких проводили в DPBS с использованием TissueLyser (Qiagen). Люциферазную активность измеряли в планшетах с темными стенками (Nunc) с использованием набора реагентов Nano-Glo Luciferase Assay System (Promega) с помощью ридера с LVF монохроматорами CLARIOstar (BMG LABTECH). Параллельно оценивали вирусную нагрузку в легких методом титрования гомогенатов в культуре клеток MDCK. Результаты двух методов детекции вируса в легких мышей представлены на фиг. 10Б. Показано, что осельтамивир снижает вирусную нагрузку в легких мышей как по результатам измерения инфекционной активности вируса, так и по результатам измерения люциферазной активности вируса, что согласуется с его прямым противовирусным действием. Таким образом, показано, что рекомбинантный вирус гриппа, экспрессирующий NanoLuc в открытой рамке считывания NS1, может быть использован для тестирования эффективности противовирусных химиопрепаратов in vivo.
--->
Перечень последовательностей
<110> Smorodintsev Research Institute of Influenza of the Ministry of Health
of the Russian Federation
<120> Recombinant influenza virus vector A/PR8-NS124-Luc and a method for
estimation of neutralizing post-vaccination antibodies using bioluminescent
detection
<160> 1
<210> 1
<211> 298
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Recombinant chimearic protein consisted of truncated NS1 from
Influenza A virus and genetically modified Nanoluciferase protein
<400> 1
Met Asp Pro Asn Thr Val Ser Ser Phe Gln Val Asp Cys Phe Leu Trp His Val Arg Lys
1               5                  10                  15                  20
Arg Val Ala Asp Gln Glu Leu Gly Asp Ala Pro Phe Leu Asp Arg Leu Arg Arg Asp Gln
25                  30                  35                  40
Lys Ser Leu Arg Gly Arg Gly Ser Thr Leu Gly Leu Asp Ile Glu Thr Ala Thr Arg Ala
45                  50                  55                  60
Gly Lys Gln Ile Val Glu Arg Ile Leu Lys Glu Glu Ser Asp Glu Ala Leu Lys Met Thr
65                  70                  75                  80
Met Ala Ser Val Pro Ala Ser Arg Tyr Leu Thr Asp Met Thr Leu Glu Glu Met Ser Arg
85                  90                  95                 100
Glu Trp Ser Met Leu Ile Pro Lys Gln Lys Val Ala Gly Pro Leu Cys Ile Arg Met Asp
105                 110                 115                 120
Gln Ala Ile Met Gly Ser Gly Gly Val Phe Thr Leu Glu Asp Phe Val Gly Asp Trp Arg
125                 130                 135                 140
Gln Thr Ala Gly Tyr Asn Leu Asp Gln Val Leu Glu Gln Gly Gly Val Ser Ser Leu Phe
145                 150                 155                 160
Gln Asn Leu Gly Val Ser Val Thr Pro Ile Gln Arg Ile Val Leu Ser Gly Glu Asn Gly
165                 170                 175                 180
Leu Lys Ile Asp Ile His Val Ile Ile Pro Tyr Glu Gly Leu Ser Gly Asp Gln Met Gly
185                 190                 195                 200
Gln Ile Glu Lys Ile Phe Lys Val Val Tyr Pro Val Asp Asp His His Phe Lys Val Ile
205                 210                 215                 220
Leu His Tyr Gly Thr Leu Val Ile Asp Gly Val Thr Pro Asn Met Ile Asp Tyr Phe Gly
225                 230                 235                 240
Arg Pro Tyr Glu Gly Ile Ala Val Phe Asp Gly Lys Lys Ile Thr Val Thr Gly Thr Leu
245                 250                 255                 260
Trp Asn Gly Asn Lys Ile Ile Asp Glu Arg Leu Ile Asn Pro Asp Gly Ser Leu Leu Phe
265                 270                 275                 280
Arg Val Thr Ile Asn Gly Val Thr Gly Trp Arg Leu Cys Glu Arg Ile Leu Ala
285                 290                 295         298
<---