АНТИТЕЛА, СПЕЦИФИЧЕСКИЕ К РЕЦЕПТОРУ ПОЛИОВИРУСА (PVR) ЧЕЛОВЕКА
ANTIBODIES SPECIFIC TO HUMAN POLIOVIRUS RECEPTOR (PVR)

Область техники, к которой относится настоящее изобретение
Настоящее изобретение касается области иммунотерапии и относится к антителам и их фрагментам, которые связываются с белком-рецептором полиовируса, полинуклеотидным последовательностям, кодирующим такие антитела, и клеткам гибридомы, продуцирующим такие антитела. Настоящее изобретение дополнительно относится к терапевтическим и диагностическим композициям, содержащим такие антитела, и к способам лечения и диагностирования заболеваний, в особенности рака, с применением таких моноклональных антител.
Предшествующий уровень техники настоящего изобретения
Иммунотерапию рака используют для выработки и усиления противоопухолевого иммунного ответа, например, путем лечения антителами, специфическими к антигенам на поверхности опухолевых клеток, с использованием гибридов антиген-представляющих клеток с опухолевыми клетками, или путем специфической активации противоопухолевых T-клеток. Способность к рекрутированию иммунных клеток (например, T-клеток) по отношению к опухолевым клеткам у пациента обеспечивает терапевтическое воздействие против типов рака и метастазирования, которые до настоящего времени считались неизлечимыми.
Опосредованный T-клетками иммунный ответ включает множество последовательных стадий, регулируемых определенным соотношением костимулирующих и коингибирующих сигналов, которые осуществляют контроль интенсивности иммунного ответа. Ингибирующие сигналы, называемые контрольными точками иммунного ответа, являются ключевыми для поддержания аутотолерантности, а также для ограничения иммунопосредованного сопутствующего повреждения тканей. Эти сигналы подвергаются изменению по мере иммунного клиренса, усугубления или персистирования инфекции, и такие изменения оказывают воздействие на ответ T-клеток и обуславливают изменение формы иммунного ответа.
Экспрессия белков, являющихся контрольными точками иммунного ответа, может регулироваться опухолями. Например, положительная регуляция лиганда белка-1 запрограммированной гибели клеток (PD-L1) на поверхности клеток рака позволяет им уклоняться от иммунной системы хозяина за счет ингибирования T-клеток посредством связывания с PD-1, которые в противоположном случае могут атаковать такие опухолевые клетки. Таким образом, контрольные точки иммунного ответа являются существенными препятствиями для активации функционального клеточного иммунитета против рака. Соответственно, антагонистические антитела, специфические к ингибирующим лигандам на поверхности иммунных клеток, считаются перспективными противораковыми средствами, и они подвергаются оценке в клинических учреждениях (например, ниволумаб и пембролизумаб). Другим примером молекулы, являющейся контрольной точкой иммунного ответа, является T-клеточный иммунорецептор с доменами Ig и ITIM (TIGIT). TIGIT представляет собой коингибирующую молекулу, экспрессируемую на поверхности ряда иммунных клеток, в том числе T-клеток и естественных клеток-киллеров (NK-клеток). TIGIT с высокой аффинностью связывается с рецептором полиовируса (PVR).
Рецептор полиовируса (PVR), также называемый CD155, представляет собой трансмембранный гликопротеин, вовлеченный в опосредование адгезии клеток к молекулам внеклеточного матрикса. Ранее он был описан как опухолевый антиген и как потенциальная мишень для терапевтического воздействия, поскольку уровень его экспрессии повышен при нейроэктодермальных злокачественных опухолях, в том числе мультиформной глиобластоме, медуллобластоме и карциноме толстой и прямой кишки (Solecki et al., J. Biol. Chem. 2002, 277: 25697-700), а также при раке поджелудочной железы (Nishiwada et al., Anticancer Res. 2015, 35(4): 2287-97). Также известно, что PVR усиливает индуцированную сывороткой активацию сигнального пути Ras-Raf-MEK-ERK, осуществляет положительную регуляцию циклинов D2 и E и отрицательную регуляцию p27Kip1, сокращая в конечном результате продолжительность фазы G0/G1 клеточного цикла (Kakunaga 2004, J. Biological Chemistry, 279, 36419-36425), поэтому предполагается, что блокирование PVR на поверхности опухолевых клеток обеспечивает снижение жизнеспособности опухолевых клеток. PVR также играет важную роль в процессе ангиогенеза и, как полагают, опосредует регуляцию VEGF-индуцированного ангиогенеза за счет контроля взаимодействия VEGFR2 с интегрином α(v)β(3) и опосредованного VEGFR2 сигнального пути Rap1-Akt (Kinugasa et al., 2012, Circ Res. 2012, 110(5),716-26). Кроме того, PVR образует комплекс с IGF1R и вовлечен в передачу сигнала с участием Met, и блокирование образования комплекса снижало жизнеспособность клеток и степень ангиогенеза (Lee et al., Scientific Reports 2014, 20, 4, 7139).
Вовлечение PVR в процесс метастазирования было продемонстрировано путем инъецирования клеток рака в хвост мышей и отслеживания степени метастазирования в легкие. Было показано, что PVR, уровень экспрессии которого повышен в клетках рака, перекрестно взаимодействует с его контррецептором на поверхности тромбоцитов, и что такое перекрестное взаимодействие усиливает метастазирование клеток рака в легкие (Morimoto et al., Oncogene (2008) 27, 264–273).
В публикации заявки на патент США № 20070041985 раскрыты молекулы, специфически связывающиеся по меньшей мере с одним внутри- или внеклеточным доменом PVR или любого его производного, где молекула характеризуется способностью модулировать характер опосредованной рецепторами адгезии, миграции и/или инвазии клетки, экспрессирующей PVR или любое его производное.
В публикации заявки на патент США № 20090215175 представлены молекулы (например, низкомолекулярные химические соединения, олигонуклеотиды, полипептиды, антитела и фрагменты антител), которые модулируют функции PVR, необходимые для обеспечения адгезии, миграции, инвазии и/или метастатического потенциала клеток. Указанные молекулы можно применять для лечения путем воздействия на клетки с метастатическим потенциалом, метастаза и рака.
В публикации заявки согласно PCT № WO 2006/124667 раскрыта модуляция белка zB7R1 (TIGIT) с помощью моноклональных антител, которые блокируют связывание TIGIT с его лигандом PVR.
Существует неудовлетворенная потребность в обеспечении дополнительных и более эффективных, специфических, безопасных и/или стабильных средств, которые отдельно или в комбинации с другими средствами стимулируют клетки иммунной системы к атаке опухолевых или инфицированных вирусом клеток посредством ингибирования связывания PVR с TIGIT.
Краткое раскрытие настоящего изобретения
Настоящее изобретение относится к антителам и их фрагментам, которые распознают рецептор полиовируса (PVR), препятствуют его связыванию с T-клеточным иммунорецептором с доменами Ig и ITIM (TIGIT) и ингибируют супрессорную активность в отношении лимфоцитов, таких как естественные клетки-киллеры (NK) и T-клетки. Раскрытые в настоящем документе антитела к PVR способны к связыванию с PVR, присутствующим на поверхности клеток рака. Такие антитела и их фрагмент характеризуются наличием уникальных наборов последовательностей определяющих комплементарность областей (CDR), высокой аффинностью и высокой специфичностью к PVR, и являются применимыми в иммунотерапии рака для противодействия уклонению опухоли от иммунного надзора, в качестве отдельной терапии и в комбинации с другими противораковыми средствами. Антитела также являются применимыми в лечении вирусных инфекций.
Ниже раскрыто, что раскрытые в настоящем документе высокоаффинные антитела к PVR блокируют взаимодействие TIGIT-PVR и возобновляют активность T- и NK-клеток. Было показано, что антитела характеризуются высокой специфичностью к PVR человека. Такие свойства делают моноклональные антитела (mAb) по настоящему изобретению ценными кандидатами для применения в иммунотерапии рака, обеспечивая возможность введения более низких доз с меньшей частотой побочных эффектов.
Предпочтительно mAb к PVR в соответствии с настоящим изобретением могут индуцировать пролиферацию T-клеток в большей степени, чем mAb к PD-1 и CTLA-4 mAb в in-vitro модели с использованием PD-L1 (A549). Эффект в виде индукции наблюдали для мононуклеарных клеток периферической крови (PMBC) и очищенных CD4 и CD8 T-клеток. Кроме того, mAb к PVR были способны индуцировать активацию NK-клеток среди большинства тестируемых целевых клеток. Более того, некоторые из описанных в настоящем документе антител к PVR характеризовались противораковой активностью in-vitro, сопоставимой с таковой у известного средства, Erbitux, применяемого в настоящее время в терапии. Кроме того, для некоторых из описанных в настоящем документе антител к PVR был показан синергический эффект при сравнении с дополнительными противораковыми средствами, такими как антитела к PD-1 и CTLA-1 и рецептору эпидермального фактора роста (EGFR). Кроме того, было обнаружено, что некоторые из антител к PVR индуцируют антителозависимую клеточноопосредованную цитотоксичность (ADCC). Дополнительно раскрыто, что некоторые антитела к PVR в соответствии с настоящим изобретением не оказывают блокирующего эффекта в отношении костимулирующей передачи сигнала с участием DNAM1, следовательно, они не оказывают вредного воздействия на другие сигналы, опосредующие индукцию иммунного ответа.
Интересно, что, несмотря на высокую степень сходства последовательностей среди последовательностей PVR человека и грызуна, антитела по настоящему изобретению являются высокоспецифичными к PVR человека.
Дополнительно раскрыто, что, неожиданным образом, для некоторых химерных моноклональных антител, содержащих константную цепь человека, был показан усиленный эффект в отношении активации иммунных клеток по сравнению с эквивалентными им моноклональными антителами мыши.
Некоторые из описанных в настоящем документе mAb к PVR были способны снижать жизнеспособность опухолевых клеток иммунонезависимым образом путем блокирования PVR на поверхности опухолевых клеток. Не вдаваясь в какой-либо механизм действия, полагают, что такая активность является результатом способности PVR сокращать продолжительность фазы G0/G1 клеточного цикла.
В соответствии с одним аспектом настоящее изобретение относится к выделенному моноклональному антителу, которое связывается с рецептором полиовируса (PVR), или его фрагменту антитела, содержащему по меньшей мере антигенсвязывающий участок, где выделенное антитело или фрагмент антитела выбраны из группы, состоящей из:
i. трех CDR вариабельной области тяжелой цепи (HC), содержащей SEQ ID NO: 77, и трех CDR вариабельной области легкой цепи (LC), содержащей SEQ ID NO: 79, или их аналога или производного, характеризующихся по меньшей мере 90% идентичностью последовательности с указанной последовательностью антитела или фрагмента;
ii. трех определяющих комплементарность областей (CDR) вариабельной области тяжелой цепи, содержащей SEQ ID NO: 69, и трех CDR вариабельной области легкой цепи, содержащей SEQ ID NO: 71, или их аналога или производного, характеризующихся по меньшей мере 90% идентичностью последовательности с указанной последовательностью антитела или фрагмента; и
iii.  трех CDR вариабельной области тяжелой цепи, содержащей SEQ ID NO: 73, и трех CDR вариабельной области легкой цепи, содержащей SEQ ID NO: 75, или их аналога или производного, характеризующихся по меньшей мере 90% идентичностью последовательности с указанной последовательностью антитела или фрагмента.
Антитела, содержащие последовательности CDR, содержащиеся в тяжелых и легких цепях, гомологичных SEQ ID No: 2, 10, 18, 26, 34 или 42, также включены в объем настоящего изобретения. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления SEQ ID NO: 2 является взаимозаменяемой с SEQ ID NO: 69. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления SEQ ID NO: 10 является взаимозаменяемой с SEQ ID NO: 71. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления SEQ ID NO: 18 является взаимозаменяемой с SEQ ID NO: 73. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления SEQ ID NO: 26 является взаимозаменяемой с SEQ ID NO: 75. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления SEQ ID NO: 34 является взаимозаменяемой с SEQ ID NO: 77. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления SEQ ID NO: 42 является взаимозаменяемой с SEQ ID NO: 79.
Существует несколько известных в данной области способов определения последовательностей CDR данной молекулы антитела, однако нет стандартного способа, дающего однозначные результаты. Определение последовательностей CDR из вариабельных областей тяжелой и легкой цепей антитела можно выполнять в соответствии с любым известным в данной области способом, включая без ограничения способы, известные как KABAT, Chothia и IMGT. Выбранный набор CDR может включать последовательности, идентифицированные с помощью более чем одного способа, т. е. некоторые последовательности CDR можно определять с применением KABAT, а некоторые можно определять с применением, например, IMGT.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления выделенное моноклональное антитело или фрагмент содержат последовательности CDR моноклонального антитела, обозначенного как 4E5 к PVR (или hPVR.07), т. е. три последовательности CDR, содержащиеся в пределах вариабельной области тяжелой цепи, изложенной в SEQ ID NO: 69, и три последовательности CDR, содержащиеся в пределах вариабельной области легкой цепи, изложенной в SEQ ID NO: 71.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления выделенное моноклональное антитело или фрагмент антитела содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую последовательность GFDFSRYW (SEQ ID NO: 4). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления выделенное моноклональное антитело или фрагмент антитела содержат CDR2 тяжелой цепи, содержащую последовательность EIHPDSSKINYTPSQ (SEQ ID NO: 6). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления выделенное моноклональное антитело или фрагмент антитела содержат CDR3 тяжелой цепи, содержащую последовательность PDGNYNALDYW (SEQ ID NO: 8).
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления выделенное моноклональное антитело или фрагмент антитела содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую последовательность RYW. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления выделенное моноклональное антитело или фрагмент антитела содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую последовательность RYWMT (SEQ ID NO: 80). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления выделенное моноклональное антитело или фрагмент антитела содержат CDR3 тяжелой цепи, содержащую последовательность PDGNYNALDY (SEQ ID NO: 82).
В соответствии с определенными вариантами осуществления выделенное моноклональное антитело или фрагмент антитела содержат: (i) CDR1 HC, содержащую последовательность GFDFSRYW (SEQ ID NO: 4); (ii) CDR2 HC, содержащую последовательность: EIHPDSSKINYTPSQ (SEQ ID NO: 6); и (iii) CDR3 HC, содержащую последовательность: PDGNYNALDYW (SEQ ID NO: 8).
В соответствии с определенными вариантами осуществления выделенное моноклональное антитело или фрагмент антитела содержат: (i) CDR1 HC, содержащую последовательность RYW; (ii) CDR2 HC, содержащую последовательность: EIHPDSSKINYTPSQ (SEQ ID NO: 6); и (iii) CDR3 HC, содержащую последовательность: PDGNYNALDY (SEQ ID NO: 82).
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления выделенное моноклональное антитело или фрагмент антитела содержат CDR1 легкой цепи, содержащую последовательность KASQDVGTAVT (SEQ ID NO: 12). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления выделенное моноклональное антитело или фрагмент антитела содержат CDR2 легкой цепи, содержащую последовательность WASTRHT (SEQ ID NO: 14). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления выделенное моноклональное антитело или фрагмент антитела содержат CDR3 легкой цепи, содержащую последовательность QQYSRYPYT (SEQ ID NO: 16). В соответствии с определенными вариантами осуществления выделенное моноклональное антитело или фрагмент антитела содержат: (i) CDR1 LC, содержащую последовательность KASQDVGTAVT (SEQ ID NO: 12); (ii) CDR2 LC, содержащую последовательность: WASTRHT (SEQ ID NO: 14); и (iii) CDR3 HC, содержащую последовательность: QQYSRYPYT (SEQ ID NO: 16).
В соответствии с некоторыми конкретными вариантами осуществления выделенное моноклональное антитело или фрагмент содержат последовательность CDR1 тяжелой цепи, предусматривающую последовательность: GFDFSRYW (SEQ ID NO: 4), CDR2 тяжелой цепи, содержащую последовательность: EIHPDSSKINYTPSQ (SEQ ID NO: 6), CDR3 тяжелой цепи, содержащую последовательность: PDGNYNALDYW (SEQ ID NO: 8), CDR1 легкой цепи, содержащую последовательность: KASQDVGTAVT (SEQ ID NO: 12), CDR2 легкой цепи, содержащую последовательность: WASTRHT (SEQ ID NO: 14), и CDR3 легкой цепи, содержащую последовательность: QQYSRYPYT (SEQ ID NO: 16), или их аналоги, предусматривающие не более 5% аминокислотных замен, делеций и/или вставок в последовательности гипервариабельной области (HVR).
В соответствии с некоторыми конкретными вариантами осуществления выделенное моноклональное антитело или фрагмент содержат набор из шести последовательностей CDR, состоящий из:
i. CDR1 тяжелой цепи с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 80,
ii. CDR2 тяжелой цепи с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 81,
iii. CDR3 тяжелой цепи с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 82,
iv. CDR1 легкой цепи с последовательностью, изложенной в SEQ ID NO: 12,
v.  CDR2 легкой цепи с последовательностью, изложенной в SEQ ID NO: 14, и
vi. CDR3 легкой цепи с последовательностью, изложенной в SEQ ID NO: 16.
В соответствии с некоторыми конкретными вариантами осуществления выделенное моноклональное антитело или фрагмент содержат набор из шести последовательностей CDR, состоящий из: SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 16.
В соответствии с другими конкретными вариантами осуществления выделенное моноклональное антитело или фрагмент содержат набор из шести последовательностей CDR, состоящий из: SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 16.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления выделенное моноклональное антитело или его фрагмент содержат вариабельную область тяжелой цепи, изложенную в SEQ ID NO: 69), или ее аналог или производное, характеризующиеся по меньшей мере 90% идентичностью последовательности с последовательностью вариабельной области тяжелой цепи.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления аналогом SEQ ID NO: 2 является вариабельная область тяжелой цепи с последовательностью, изложенной в SEQ ID NO: 69.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления выделенное моноклональное антитело или его фрагмент содержат вариабельную область легкой цепи, изложенную в SEQ ID NO: 71), или ее аналог, характеризующийся по меньшей мере 90% идентичностью последовательности с последовательностью вариабельной области легкой цепи.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления аналогом SEQ ID NO: 10 является вариабельная область легкой цепи с последовательностью, изложенной в SEQ ID NO: 71.
В соответствии с конкретным вариантом осуществления выделенное моноклональное антитело или его фрагмент содержат вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью, изложенной в SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 69, и вариабельную область легкой цепи с последовательностью, изложенной в SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 71, или их аналог, характеризующийся по меньшей мере 90% идентичностью последовательности с последовательностью легкой и/или тяжелой цепей.
Настоящее изобретение также охватывает антитело или фрагмент антитела, способные к связыванию с высокой аффинностью с эпитопом в пределах белка PVR человека, с которым связывается моноклональное антитело (mAb) 4E5.
В соответствии с другими вариантами осуществления выделенное моноклональное антитело содержит последовательности CDR моноклонального антитела, обозначенного как 7D4 (или hPVR.01), т. е. три последовательности CDR, содержащиеся в пределах вариабельной области тяжелой цепи, изложенной в SEQ ID NO: 73, и три последовательности CDR, содержащиеся в пределах вариабельной области легкой цепи, изложенной в SEQ ID NO: 75.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления выделенное моноклональное антитело или фрагмент антитела содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую последовательность GYTFTEYTMH (SEQ ID NO: 20). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления выделенное моноклональное антитело или фрагмент антитела содержат CDR2 тяжелой цепи, содержащую последовательность GIDPNNGGTNYNQNFKG (SEQ ID NO: 22). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления выделенное моноклональное антитело или фрагмент антитела содержат CDR3 тяжелой цепи, содержащую последовательность VIPLEY (SEQ ID NO: 24). В соответствии с определенными вариантами осуществления выделенное моноклональное антитело или фрагмент антитела содержат: (i) CDR1 HC, содержащую последовательность GYTFTEYTMH (SEQ ID NO: 20); (ii) CDR2 HC, содержащую последовательность: GIDPNNGGTNYNQNFKG (SEQ ID NO: 22); и (iii) CDR3 HC, содержащую последовательность: VIPLEY (SEQ ID NO: 24).
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления выделенное моноклональное антитело или фрагмент антитела содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую последовательность EYTMH (SEQ ID NO: 83).
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления выделенное моноклональное антитело или фрагмент антитела содержат CDR1 легкой цепи, содержащую последовательность KASQNVYTNVA (SEQ ID NO: 28). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления выделенное моноклональное антитело или фрагмент антитела содержат CDR2 легкой цепи, содержащую последовательность SASYRYR (SEQ ID NO: 30). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления выделенное моноклональное антитело или фрагмент антитела содержат CDR3 легкой цепи, содержащую последовательность QQYNSYPLA (SEQ ID NO: 32). В соответствии с определенными вариантами осуществления выделенное моноклональное антитело или фрагмент антитела содержат: (i) CDR1 LC, содержащую последовательность KASQNVYTNVA (SEQ ID NO: 28); (ii) CDR2 LC, содержащую последовательность: SASYRYR (SEQ ID NO: 30); и (iii) CDR3 HC, содержащую последовательность: QQYNSYPLA (SEQ ID NO: 32).
В соответствии с некоторыми конкретными вариантами осуществления выделенное моноклональное антитело содержит CDR1 тяжелой цепи, содержащую последовательность GYTFTEYTMH (SEQ ID NO: 20), CDR2 тяжелой цепи, содержащую последовательность: GIDPNNGGTNYNQNFKG (SEQ ID NO: 22), CDR3 тяжелой цепи, содержащую последовательность: VIPLEY (SEQ ID NO: 24), CDR1 легкой цепи, содержащую последовательность: KASQNVYTNVA (SEQ ID NO: 28), CDR2 легкой цепи, содержащую последовательность: SASYRYR (SEQ ID NO: 30), и CDR3 легкой цепи, содержащую последовательность: QQYNSYPLA (SEQ ID NO: 32), или их аналоги, предусматривающие не более 5% аминокислотных замен, делеций и/или вставок в последовательности HVR.
В соответствии с некоторыми конкретными вариантами осуществления выделенное моноклональное антитело или фрагмент содержат набор из шести последовательностей CDR, состоящий из: CDR1 тяжелой цепи с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 83, CDR2 тяжелой цепи с последовательностью, изложенной в SEQ ID NO: 22, CDR3 тяжелой цепи с последовательностью, изложенной в SEQ ID NO: 24, CDR1 легкой цепи с последовательностью, изложенной в SEQ ID NO: 28, CDR2 легкой цепи с последовательностью, изложенной в SEQ ID NO: 30, и CDR3 легкой цепи с последовательностью, изложенной в SEQ ID NO: 32.
В соответствии с некоторыми конкретными вариантами осуществления выделенное моноклональное антитело или фрагмент содержат набор из шести последовательностей CDR, состоящий из: SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30 и SEQ ID NO: 32.
В соответствии с другими конкретными вариантами осуществления выделенное моноклональное антитело или фрагмент содержат набор из шести последовательностей CDR, состоящий из: SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30 и SEQ ID NO: 32.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления выделенное моноклональное антитело или его фрагмент содержат вариабельную область тяжелой цепи, изложенную в SEQ ID NO: 73, или ее аналог или производное, характеризующиеся по меньшей мере 90% идентичностью последовательности с последовательностью вариабельной области тяжелой цепи.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления аналогом SEQ ID NO: 18 является вариабельная область тяжелой цепи с последовательностью, изложенной в SEQ ID NO: 73.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления выделенное моноклональное антитело или его фрагмент содержат вариабельную область легкой цепи, изложенную в SEQ ID NO: 75, или ее аналог, характеризующийся по меньшей мере 90% идентичностью последовательности с последовательностью вариабельной области легкой цепи.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления аналогом SEQ ID NO: 26 является вариабельная область легкой цепи, характеризующаяся последовательностью, изложенной в SEQ ID NO: 75
В соответствии с конкретным вариантом осуществления выделенное моноклональное антитело или его фрагмент содержат вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью, изложенной в SEQ ID NO: 18 или SEQ ID NO: 73, и вариабельную область легкой цепи с последовательностью, изложенной в SEQ ID NO: 26 или SEQ ID NO: 75, или их аналог, характеризующийся по меньшей мере 90% идентичностью последовательности с последовательностью легкой и/или тяжелой цепей.
Настоящее изобретение также охватывает антитело или фрагмент антитела, способные к связыванию с высокой аффинностью с эпитопом в пределах белка PVR человека, с которым связывается mAb 7D4.
В соответствии с другими вариантами осуществления выделенное моноклональное антитело содержит последовательности CDR моноклонального антитела, обозначенного как 5B9 (или hPVR.09), т. е. три последовательности CDR, содержащиеся в пределах вариабельной области тяжелой цепи, изложенной в SEQ ID NO: 77, и три последовательности CDR, содержащиеся в пределах вариабельной области легкой цепи, изложенной в SEQ ID NO: 79.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления выделенное моноклональное антитело содержит последовательности определяющей комплементарность области (CDR), содержащиеся в пределах вариабельной области тяжелой цепи, изложенной в SEQ ID NO: 34, и три последовательности CDR, содержащиеся в пределах последовательности вариабельной области легкой цепи, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53 и SEQ ID NO: 54. Каждый вариант представляет собой отдельный вариант осуществления настоящего изобретения.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления выделенное моноклональное антитело или фрагмент антитела содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую последовательность GYTFSNYWIE (SEQ ID NO: 36). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления выделенное моноклональное антитело или фрагмент антитела содержат CDR2 тяжелой цепи, содержащую последовательность EIFPGSGRINFNEKFKG (SEQ ID NO: 38). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления выделенное моноклональное антитело или фрагмент антитела содержат CDR3 тяжелой цепи, содержащую последовательность TKIYGNSFDY (SEQ ID NO: 40). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления выделенное моноклональное антитело или фрагмент антитела содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую последовательность SNYWIE (SEQ ID NO: 84).
В соответствии с определенными вариантами осуществления выделенное моноклональное антитело или фрагмент антитела содержат: (i) CDR1 HC, содержащую последовательность SNYWIE (SEQ ID NO: 84); (ii) CDR2 HC, содержащую последовательность: EIFPGSGRINFNEKFKG (SEQ ID NO: 38); и (iii) CDR3 HC, содержащую последовательность: TKIYGNSFDY (SEQ ID NO: 40).
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления выделенное моноклональное антитело или фрагмент антитела содержат CDR1 легкой цепи, содержащую последовательность KASQDVGTAVV (SEQ ID NO: 44). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления выделенное моноклональное антитело или фрагмент антитела содержат CDR2 легкой цепи, содержащую последовательность WASSRHN (SEQ ID NO: 46). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления выделенное моноклональное антитело или фрагмент антитела содержат CDR3 легкой цепи, содержащую последовательность QQYSRYPLT (SEQ ID NO: 48).
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления выделенное моноклональное антитело или фрагмент антитела содержат CDR1 легкой цепи, содержащую последовательность KASQDVGTAV (SEQ ID NO: 85).
В соответствии с определенными вариантами осуществления выделенное моноклональное антитело или фрагмент антитела содержат: (i) CDR1 LC, содержащую последовательность KASQDVGTAV (SEQ ID NO: 85); (ii) CDR2 LC, содержащую последовательность: WASSRHN (SEQ ID NO: 46); и (iii) CDR3 HC, содержащую последовательность: QQYSRYPLT (SEQ ID NO: 48).
В соответствии с дополнительными вариантами осуществления CDR2 LC содержит последовательность, изложенную в SEQ ID No: 46, 56, 57, 58, 59, 60 или 61. Каждый вариант представляет собой отдельный вариант осуществления настоящего изобретения.
В соответствии с некоторыми конкретными вариантами осуществления выделенное моноклональное антитело или фрагмент содержат последовательность CDR1 тяжелой цепи, предусматривающую последовательность: GYTFSNYWIE (SEQ ID NO: 36), CDR2 тяжелой цепи, содержащую последовательность: EIFPGSGRINFNEKFKG (SEQ ID NO: 38), CDR3 тяжелой цепи, содержащую последовательность: TKIYGNSFDY (SEQ ID NO: 40), CDR1 легкой цепи, содержащую последовательность: KASQDVGTAVV (SEQ ID NO: 44), CDR2 легкой цепи, содержащую последовательность: WASSRHN (SEQ ID NO: 46), и CDR3 легкой цепи, содержащую последовательность: QQYSRYPLT (SEQ ID NO: 48), или их аналоги, предусматривающие не более 5% аминокислотных замен, делеций и/или вставок в последовательности HVR.
В соответствии с некоторыми конкретными вариантами осуществления выделенное моноклональное антитело или фрагмент состоят из: CDR1 тяжелой цепи с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 36 и SEQ ID NO: 84, CDR2 тяжелой цепи с последовательностью, изложенной в SEQ ID NO: 38, CDR3 тяжелой цепи с последовательностью, изложенной в SEQ ID NO: 40, CDR1 легкой цепи с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 44 и SEQ ID NO: 85, CDR2 легкой цепи с последовательностью, изложенной в SEQ ID NO: 46, и CDR3 легкой цепи с последовательностью, изложенной в SEQ ID NO: 48.
В соответствии с некоторыми конкретными вариантами осуществления выделенное моноклональное антитело или фрагмент состоят из: CDR1 тяжелой цепи с последовательностью, изложенной в SEQ ID NO: 36 или SEQ ID NO: 84, CDR2 тяжелой цепи с последовательностью, изложенной в SEQ ID NO: 38, CDR3 тяжелой цепи с последовательностью, изложенной в SEQ ID NO: 40, CDR1 легкой цепи с последовательностью, изложенной в SEQ ID NO: 44 или SEQ ID NO: 85, CDR2 легкой цепи с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60 и SEQ ID NO: 61; и CDR3 легкой цепи с последовательностью, изложенной в SEQ ID NO: 48. Каждый вариант представляет собой отдельный вариант осуществления настоящего изобретения.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления выделенное моноклональное антитело или его фрагмент содержат вариабельную область тяжелой цепи, изложенную в SEQ ID NO: 77, или ее аналог или производное, характеризующиеся по меньшей мере 90% идентичностью последовательности с последовательностью вариабельной области тяжелой цепи.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления аналогом SEQ ID NO: 34 является вариабельная область тяжелой цепи с последовательностью, изложенной в SEQ ID NO: 77.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления выделенное моноклональное антитело или его фрагмент содержат вариабельную область легкой цепи, изложенную в SEQ ID NO: 79, или ее аналог, характеризующийся по меньшей мере 90% идентичностью последовательности с последовательностью вариабельной области легкой цепи.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления аналогом SEQ ID NO: 42 является вариабельная область легкой цепи, характеризующаяся последовательностью, изложенной в SEQ ID NO: 79.
В соответствии с конкретным вариантом осуществления выделенное моноклональное антитело или его фрагмент содержат вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 34 и SEQ ID NO: 77, и вариабельную область легкой цепи с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 42 и SEQ ID NO: 79, или их аналог, характеризующийся по меньшей мере 90% идентичностью последовательности с последовательностью легкой и/или тяжелой цепей.
В соответствии некоторыми вариантами осуществления выделенное моноклональное антитело или его фрагмент содержат вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью, изложенной в SEQ ID NO: 34, и вариабельную область легкой цепи с последовательностью, изложенной в SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53 или SEQ ID NO: 54; или их аналог, характеризующийся по меньшей мере 90% идентичностью последовательности с последовательностью легкой и/или тяжелой цепей. Каждый вариант представляет собой отдельный вариант осуществления настоящего изобретения.
Настоящее изобретение также охватывает антитело или фрагмент антитела, способные к связыванию с высокой аффинностью с эпитопом в пределах белка PVR человека, с которым связывается mAb 5B9.
-8
-8
-9
-9
-10
-10
-11
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления выделенное антитело или его фрагмент распознают PVR человека с аффинностью по меньшей мере 10 M. В соответствии с другими вариантами осуществления антитело или фрагмент антитела связываются с PVR человека с аффинностью 10M, 5 × 10 M, 10 M, 5 × 10 M, 10 M, 5 × 10 M или даже выше. Каждый вариант представляет собой отдельный вариант осуществления настоящего изобретения.
Аналоги и производные выделенных антител, представляющих собой mAb, и фрагменты антител, описанные выше, также входят в объем настоящего изобретения. Согласно некоторым вариантам осуществления конкретные аналоги или выделенные mAb или их фрагмент, содержащие по меньшей мере одну вариабельную область, представленную последовательностью, выбранной из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 2, 10, 18, 26, 34 и 42, также входят в объем настоящего изобретения. Выделенные mAb или их фрагмент, содержащие по меньшей мере одну вариабельную область, представленную последовательностью, выбранной из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 69, 71, 73, 75, 77 и 79, также входят в объем настоящего изобретения.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления аналог антитела или фрагмента антитела характеризуется по меньшей мере 90% идентичностью последовательности с гипервариабельной областью последовательности эталонного антитела.
В соответствии с определенными вариантами осуществления аналог или производное выделенных антитела или его фрагмента характеризуются по меньшей мере 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичностью последовательности с вариабельной областью последовательности эталонного антитела. Каждый вариант представляет собой отдельный вариант осуществления настоящего изобретения.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления антитело или фрагмент антитела в соответствии с настоящим изобретением содержат вариабельную область тяжелой цепи, изложенную в SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 69, или аналог, характеризующийся по меньшей мере 95% сходством последовательности с указанной последовательностью. В соответствии с другими вариантами осуществления антитело или фрагмент антитела в соответствии с настоящим изобретением содержат вариабельную область тяжелой цепи, изложенную в SEQ ID NO: 18 или SEQ ID NO: 73, или аналог, характеризующийся по меньшей мере 95% сходством последовательности с указанной последовательностью. В соответствии с другими вариантами осуществления антитело или фрагмент антитела в соответствии с настоящим изобретением содержат вариабельную область тяжелой цепи, изложенную в SEQ ID NO: 34 или SEQ ID NO: 77, или аналог, характеризующийся по меньшей мере 95% сходством последовательности с указанной последовательностью.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления антитело или фрагмент антитела содержат вариабельную область легкой цепи, изложенную в SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 71, или аналог, характеризующийся по меньшей мере 95% сходством последовательности с указанной последовательностью. В соответствии с другими вариантами осуществления антитело или фрагмент антитела содержат вариабельную область легкой цепи, изложенную в SEQ ID NO: 26 или SEQ ID NO: 75, или аналог, характеризующийся по меньшей мере 95% сходством последовательности с указанной последовательностью. В соответствии с другими вариантами осуществления антитело или фрагмент антитела содержат вариабельную область легкой цепи, изложенную в SEQ ID NO: 42 или SEQ ID NO: 79, или аналог, характеризующийся по меньшей мере 95% сходством последовательности с указанной последовательностью.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления антитело или фрагмент антитела содержат тяжелую цепь и легкую цепь, где: (i) тяжелая цепь содержит SEQ ID NO: 2, а легкая цепь содержит SEQ ID NO: 10; (ii) тяжелая цепь содержит SEQ ID NO: 18, а легкая цепь содержит SEQ ID NO: 26; или (iii) тяжелая цепь содержит SEQ ID NO: 34, а легкая цепь содержит SEQ ID NO: 42. Аналоги антител или фрагментов, характеризующиеся по меньшей мере 95% сходством последовательности с указанными тяжелыми или легкими цепями, также включены.
В соответствии с другими вариантами осуществления антитело или фрагмент антитела содержат тяжелую цепь и легкую цепь, где: (i) тяжелая цепь содержит SEQ ID NO: 69, а легкая цепь содержит SEQ ID NO: 71; (ii) тяжелая цепь содержит SEQ ID NO: 73, а легкая цепь содержит SEQ ID NO: 75; или (iii) тяжелая цепь содержит SEQ ID NO: 77, а легкая цепь содержит SEQ ID NO: 79. Аналоги антител или фрагментов, характеризующиеся по меньшей мере 95% сходством последовательности с указанными тяжелыми или легкими цепями, также включены.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления аналог характеризуется по меньшей мере 96, 97, 98 или 99% идентичностью последовательности с описанными выше вариабельными областями легкой или тяжелой цепи антитела. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления аналог предусматривает не более одной аминокислотной замены, делеции или добавления в одной или нескольких последовательностях CDR гипервариабельной области, а именно, любой из последовательностей CDR, изложенных в SEQ ID NO: 4, 6, 8, 12, 14, 16, 20, 22, 24, 28, 30, 32, 36, 38, 40, 44, 46, 48, 80, 81, 82, 83, 84 и 85. Каждый вариант представляет собой отдельный вариант осуществления настоящего изобретения. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления аминокислотная замена представляет собой консервативную замену.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления антитело или фрагмент антитела содержат гипервариабельную область (HVR) с областями легкой и тяжелой цепей, определенными выше, в которых 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот были заменены, удалены и/или добавлены. Каждый вариант представляет собой отдельный вариант осуществления настоящего изобретения.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления антитело или фрагмент антитела содержат HVR с областями легкой и тяжелой цепей, определенными выше, в которых была заменена одна аминокислота. В соответствии с конкретными вариантами осуществления антитело или фрагмент антитела содержат CDR, как определено выше, в которой была заменена одна аминокислота. В соответствии с некоторыми конкретными вариантами осуществления антитело или фрагмент антитела содержат CDR2 легкой цепи, как определено выше, в которой была заменена одна аминокислота.
В соответствии с некоторыми конкретными вариантами осуществления антитело или фрагмент антитела содержат CDR2 легкой цепи с последовательностью, изложенной в SEQ ID NO: 55 (WASSRHX), где X выбрана из группы, состоящей из A, R, D, E, P и T. Каждый вариант представляет собой отдельный вариант осуществления настоящего изобретения.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления антитело или фрагмент антитела содержат CDR2 легкой цепи с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 56-61.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления выделенное моноклональное антитело или фрагмент антитела содержат набор CDR, выбранный из группы, состоящей из:
i. набор CDR из шести CDR, где: CDR1 HC выбрана из GYTFSNYWIE (SEQ ID NO: 36) и SNYWIE (SEQ ID NO: 84); CDR2 HC представляет собой EIFPGSGRINFNEKFKG (SEQ ID NO: 38); CDR3 HC представляет собой TKIYGNSFDY (SEQ ID NO: 40); CDR1 LC выбрана из KASQDVGTAVV (SEQ ID NO: 44) и KASQDVGTAV (SEQ ID NO: 85); CDR2 LC выбрана из группы, состоящей из: WASSRHN (SEQ ID NO: 46), WASSRHA (SEQ ID NO: 56), WASSRHR (SEQ ID NO: 57), WASSRHD (SEQ ID NO: 58), WASSRHE (SEQ ID NO: 59), WASSRHP (SEQ ID NO: 60) и WASSRHT (SEQ ID NO: 61); и
CDR3 LC представляет собой QQYSRYPLT (SEQ ID NO: 48).
ii. набор CDR из шести CDR, где: последовательность CDR1 HC выбрана из GFDFSRYW (SEQ ID NO: 4) и RYWMT (SEQ ID NO: 80); CDR2 HC выбрана из EIHPDSSKINYTPSQ (SEQ ID NO: 6) и EIHPDSSKINYTPSQKD (SEQ ID NO: 81); CDR3 HC выбрана из PDGNYNALDYW (SEQ ID NO: 8) и PDGNYNALDY (SEQ ID NO: 82); CDR1 LC представляет собой KASQDVGTAVT (SEQ ID NO: 12); CDR2 LC представляет собой WASTRHT (SEQ ID NO: 14); и CDR3 LC представляет собой QQYSRYPYT (SEQ ID NO: 16).
iii. набор CDR из шести CDR, где: последовательность CDR1 HC выбрана из GYTFTEYTMH (SEQ ID NO: 20) и EYTMH (SEQ ID NO: 83); CDR2 HC представляет собой GIDPNNGGTNYNQNFKG (SEQ ID NO: 22); CDR3 HC представляет собой VIPLEY (SEQ ID NO: 24); CDR1 LC представляет собой KASQNVYTNVA (SEQ ID NO: 28); CDR2 LC представляет собой SASYRYR (SEQ ID NO: 30); и CDR3 LC представляет собой QQYNSYPLA (SEQ ID NO: 32).
Таким образом, настоящее изобретение относится к моноклональному антителу, которое специфически связывает белок PVR человека, или его связывающему фрагменту, где указанное моноклональное антитело или фрагмент содержат набор из шести последовательностей CDR, где набор выбран из группы, состоящей из:
i. SEQ ID NO. 4, 6, 8, 12, 14 и 16;
ii. SEQ ID NO. 20, 22, 24, 28, 30 и 32;
iii. SEQ ID NO. 36, 38, 40, 44, 46 и 48;
iv. SEQ ID NO. 36, 38, 40, 44, 55 и 48;
v. SEQ ID NO. 80, 81, 82, 12, 14 и 16;
vi. SEQ ID NO. 83, 22, 24, 28, 30 и 32;
vii. SEQ ID NO. 84, 38, 40, 85, 46 и 48; и
viii. SEQ ID NO. 84, 38, 40, 85, 55 и 48.
Настоящее изобретение также относится к моноклональным антителам и их связывающим фрагментам, содержащим тяжелую цепь и легкую цепь, где указанные цепи содержат набор из последовательности вариабельной области тяжелой цепи и последовательности вариабельной области легкой цепи, причем указанный набор выбран из группы, состоящей из:
i. SEQ ID NO: 2 и 10;
ii. SEQ ID NO: 69 и 71;
iii. SEQ ID NO: 18 и 26;
iv. SEQ ID NO: 73 и 75;
v.  SEQ ID NO: 34 и 42; и
vi. SEQ ID NO: 77 и 79.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления антитело или фрагмент антитела способны к ингибированию связывания PVR человека с TIGIT, экспрессируемым на поверхности T-клеток или NK-клеток.
2
В соответствии с конкретным вариантом осуществления mAb выбрано из группы, состоящей из: химерного антитела и фрагмента антитела, содержащего по меньшей мере антигенсвязывающий участок антитела. В соответствии с конкретными вариантами осуществления антитело представляет собой химерное антитело. В соответствии с еще одними вариантами осуществления химерное антитело содержит константную область человека. В соответствии с еще одними вариантами осуществления химерное моноклональное антитело содержит константную область IgG1 человека. В соответствии с конкретным вариантом осуществления фрагмент антитела выбран из группы, состоящей из: Fab, Fab', F(ab'), Fd, Fd', Fv, dAb, выделенной CDR-области, одноцепочечного антитела (scab), «диател» и «линейных антител». Каждый вариант представляет собой отдельный вариант осуществления настоящего изобретения.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления антитело или фрагмент антитела содержат каркасную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: IgG2a мыши, IgG2b мыши, IgG3 мыши, IgG1 человека, IgG2 человека, IgG3 человека и IgG4 человека. Каждый вариант представляет собой отдельный вариант осуществления настоящего изобретения.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления предусмотрен конъюгат, содержащий антитело или его фрагмент, как описано выше.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления конъюгат содержит белок-носитель.
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предусмотрены полинуклеотидные последовательности, кодирующие моноклональные антитела, характеризующиеся высокой аффинностью и специфичностью к PVR, а также векторы и клетки-хозяева, несущие такие полинуклеотидные последовательности.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления предусмотрены полинуклеотидные последовательности, кодирующие описанные выше аминокислотные последовательности вариабельной области HC и вариабельной области легкой цепи (LC).
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления полинуклеотидная последовательность кодирует антитело или фрагмент или цепь антитела, способные к связыванию с эпитопом в пределах белка PVR человека, с которым связывается: (i) моноклональное антитело (в настоящем документе идентифицированное как 4E5) с вариабельной областью тяжелой цепи SEQ ID NO: 2 и вариабельной областью легкой цепи SEQ ID NO: 10; (ii) моноклональное антитело (в настоящем документе идентифицированное как 7D4) с вариабельной областью тяжелой цепи SEQ ID NO:18 и вариабельной областью легкой цепи SEQ ID NO: 26; или (iii) моноклональное антитело (в настоящем документе идентифицированное как 5B9) с вариабельной областью тяжелой цепи SEQ ID NO: 34 и вариабельной областью легкой цепи SEQ ID NO: 42.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления полинуклеотидная последовательность кодирует антитело или фрагмент или цепь антитела, содержащие последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 69. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления полинуклеотидная последовательность кодирует антитело или фрагмент или цепь антитела, содержащие последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 71.
В соответствии с другими вариантами осуществления полинуклеотидная последовательность кодирует антитело или фрагмент или цепь антитела, содержащие последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 18 или SEQ ID NO: 73. В соответствии с дополнительными вариантами осуществления полинуклеотидная последовательность кодирует антитело или фрагмент или цепь антитела, содержащие последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 26 или SEQ ID NO: 75.
В соответствии с другими вариантами осуществления полинуклеотидная последовательность кодирует антитело или фрагмент или цепь антитела, содержащие последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 34 или SEQ ID NO: 77. В соответствии с дополнительными вариантами осуществления полинуклеотидная последовательность кодирует антитело или фрагмент или цепь антитела, содержащие последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 42 или SEQ ID NO: 79.
В соответствии еще с некоторыми вариантами осуществления полинуклеотидная последовательность в соответствии с настоящим изобретением кодирует антитело или фрагмент или цепь антитела, содержащие шесть последовательностей CDR: (i) CDR1 тяжелой цепи с последовательностью: GFDFSRYW (SEQ ID NO: 4) или RYWMT (SEQ ID NO: 80), CDR2 тяжелой цепи с последовательностью: EIHPDSSKINYTPSQ (SEQ ID NO: 6), CDR3 тяжелой цепи с последовательностью: PDGNYNALDY (SEQ ID NO: 82), CDR1 легкой цепи с последовательностью: KASQDVGTAVT (SEQ ID NO: 12), CDR2 легкой цепи с последовательностью: WASTRHT (SEQ ID NO: 14) и CDR3 легкой цепи с последовательностью: QQYSRYPYT (SEQ ID NO: 16); (ii) CDR1 тяжелой цепи с последовательностью EYTMH (SEQ ID NO: 83), CDR2 тяжелой цепи с последовательностью: GIDPNNGGTNYNQNFKG (SEQ ID NO: 22), CDR3 тяжелой цепи с последовательностью: VIPLEY (SEQ ID NO: 24), CDR1 легкой цепи с последовательностью: KASQNVYTNVA (SEQ ID NO: 28), CDR2 легкой цепи с последовательностью: SASYRYR (SEQ ID NO: 30) и CDR3 легкой цепи с последовательностью: QQYNSYPLA (SEQ ID NO: 32); или (iii) CDR1 тяжелой цепи с последовательностью SNYWIE (SEQ ID NO: 84), CDR2 тяжелой цепи с последовательностью: EIFPGSGRINFNEKFKG (SEQ ID NO: 38), CDR3 тяжелой цепи с последовательностью: TKIYGNSFDY (SEQ ID NO: 40), CDR1 легкой цепи с последовательностью: KASQDVGTAV (SEQ ID NO: 85), CDR2 легкой цепи с последовательностью: WASSRHN (SEQ ID NO: 46) и CDR3 легкой цепи с последовательностью: QQYSRYPLT (SEQ ID NO: 48).
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления определенные выше полинуклеотидные последовательности кодируют молекулу, выбранную из группы, состоящей из: антитела, фрагмента антитела, содержащего по меньшей мере антигенсвязывающий участок, и конъюгата антитела, содержащего указанное антитело или фрагмент антитела. Каждый вариант представляет собой отдельный вариант осуществления настоящего изобретения.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления полинуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи моноклонального антитела, содержит последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 68, или ее вариант, характеризующийся по меньшей мере 90% идентичностью последовательности.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления полинуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи моноклонального антитела, содержит последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 17 или SEQ ID NO: 72, или ее вариант, характеризующийся по меньшей мере 90% идентичностью последовательности.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления полинуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи моноклонального антитела, содержит последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 33 или SEQ ID NO: 76, или ее вариант, характеризующийся по меньшей мере 90% идентичностью последовательности.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления полинуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область легкой цепи моноклонального антитела, содержит последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 70, или ее вариант, характеризующийся по меньшей мере 90% идентичностью последовательности.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления полинуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область легкой цепи моноклонального антитела, содержит последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 25 или SEQ ID NO: 74, или ее вариант, характеризующийся по меньшей мере 90% идентичностью последовательности.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления полинуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область легкой цепи моноклонального антитела, содержит последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 41 или SEQ ID NO: 78, или ее вариант, характеризующийся по меньшей мере 90% идентичностью последовательности.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящее изобретение относится к полипептиду, содержащему по меньшей мере одну последовательность, кодируемую по меньшей мере одной раскрытой выше полинуклеотидной последовательностью.
Согласно дополнительному аспекту настоящее изобретение относится к конструкции нуклеиновой кислоты, содержащей молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую по меньшей мере одну цепь антитела или ее фрагмент в соответствии с настоящим изобретением. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления конструкция нуклеиновой кислоты представляет собой плазмиду.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления плазмида содержит полинуклеотидную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 17 или SEQ ID NO: 33.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления плазмида содержит полинуклеотидную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 72 или SEQ ID NO: 76.
В соответствии с другими вариантами осуществления плазмида содержит полинуклеотидную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 25 или SEQ ID NO: 41.
В соответствии с другими вариантами осуществления плазмида содержит полинуклеотидную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 74 или SEQ ID NO: 78.
Согласно еще одному аспекту настоящее изобретение относится к клетке гибридомы, способной к продуцированию антитела или фрагмента антитела, содержащих специфические последовательности CDR и/или специфические вариабельные области тяжелой и легкой цепей, определенные выше.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления предусмотрена клетка гибридомы, содержащая по меньшей мере одну раскрытую выше полинуклеотидную последовательность.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления гибридома способна к продуцированию моноклонального антитела, содержащего шесть последовательностей определяющих комплементарность областей (CDR): (i) CDR1 тяжелой цепи с последовательностью: GFDFSRYW (SEQ ID NO: 4) или RYWMT (SEQ ID NO: 80), CDR2 тяжелой цепи с последовательностью: EIHPDSSKINYTPSQ (SEQ ID NO: 6), CDR3 тяжелой цепи с последовательностью: PDGNYNALDY (SEQ ID NO: 82), CDR1 легкой цепи с последовательностью: KASQDVGTAVT (SEQ ID NO: 12), CDR2 легкой цепи с последовательностью: WASTRHT (SEQ ID NO: 14) и CDR3 легкой цепи с последовательностью: QQYSRYPYT (SEQ ID NO: 16); (ii) CDR1 тяжелой цепи с последовательностью EYTMH (SEQ ID NO: 83), CDR2 тяжелой цепи с последовательностью: GIDPNNGGTNYNQNFKG (SEQ ID NO: 22), CDR3 тяжелой цепи с последовательностью: VIPLEY (SEQ ID NO: 24), CDR1 легкой цепи с последовательностью: KASQNVYTNVA (SEQ ID NO: 28), CDR2 легкой цепи с последовательностью: SASYRYR (SEQ ID NO: 30) и CDR3 легкой цепи с последовательностью: QQYNSYPLA (SEQ ID NO: 32); или (iii) CDR1 тяжелой цепи с последовательностью SNYWIE (SEQ ID NO: 84), CDR2 тяжелой цепи с последовательностью: EIFPGSGRINFNEKFKG (SEQ ID NO: 38), CDR3 тяжелой цепи с последовательностью: TKIYGNSFDY (SEQ ID NO: 40), CDR1 легкой цепи с последовательностью: KASQDVGTAV (SEQ ID NO: 85), CDR2 легкой цепи с последовательностью: WASSRHN (SEQ ID NO: 46) и CDR3 легкой цепи с последовательностью: QQYSRYPLT (SEQ ID NO: 48).
Антитела или их фрагменты в соответствии с настоящим изобретением могут быть присоединены к цитотоксическому компоненту, радиоактивному компоненту или идентифицируемому компоненту.
В соответствии с другим аспектом настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного ингредиента по меньшей мере одно антитело, фрагмент антитела или конъюгаты на их основе, которые распознают PVR с высокой аффинностью и специфичностью, и необязательно по меньшей мере одно фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество, разбавитель, соль или носитель.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления фармацевтическая композиция содержит моноклональное антитело или его фрагмент, которые способны к связыванию с эпитопом в пределах белка PVR человека, с которым связывается моноклональное антитело, выбранное из группы, состоящей из: (i) антитела, в настоящем документе идентифицированного как 4E5 (обозначаемого также PVR.07), с вариабельной областью тяжелой цепи SEQ ID NO: 2 и вариабельной областью легкой цепи SEQ ID NO: 10; (ii) антитела, в настоящем документе идентифицированного как 7D4 (обозначаемого также PVR.01), с вариабельной областью тяжелой цепи SEQ ID NO: 18 и вариабельной областью легкой цепи SEQ ID NO: 26; и (ii) антитела, в настоящем документе идентифицированного как 5B9 (обозначаемого также PVR.09), с вариабельной областью тяжелой цепи SEQ ID NO: 34 и вариабельной областью легкой цепи SEQ ID NO: 42.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления фармацевтическая композиция содержит моноклональное антитело или его фрагмент антитела, содержащие шесть CDR: (i) CDR1 тяжелой цепи с последовательностью: GFDFSRYW (SEQ ID NO: 4) или RYWMT (SEQ ID NO: 80, CDR2 тяжелой цепи с последовательностью: EIHPDSSKINYTPSQ (SEQ ID NO: 6), CDR3 тяжелой цепи с последовательностью: PDGNYNALDY (SEQ ID NO: 82), CDR1 легкой цепи с последовательностью: KASQDVGTAVT (SEQ ID NO: 12), CDR2 легкой цепи с последовательностью: WASTRHT (SEQ ID NO: 14) и CDR3 легкой цепи с последовательностью: QQYSRYPYT (SEQ ID NO: 16); (ii) CDR1 тяжелой цепи с последовательностью EYTMH (SEQ ID NO: 83), CDR2 тяжелой цепи с последовательностью: GIDPNNGGTNYNQNFKG (SEQ ID NO: 22), CDR3 тяжелой цепи с последовательностью: VIPLEY (SEQ ID NO: 24), CDR1 легкой цепи с последовательностью: KASQNVYTNVA (SEQ ID NO: 28), CDR2 легкой цепи с последовательностью: SASYRYR (SEQ ID NO: 30) и CDR3 легкой цепи с последовательностью: QQYNSYPLA (SEQ ID NO: 32); или (iii) CDR1 тяжелой цепи с последовательностью SNYWIE (SEQ ID NO: 84), CDR2 тяжелой цепи с последовательностью: EIFPGSGRINFNEKFKG (SEQ ID NO: 38), CDR3 тяжелой цепи с последовательностью: TKIYGNSFDY (SEQ ID NO: 40), CDR1 легкой цепи с последовательностью: KASQDVGTAV (SEQ ID NO: 85), CDR2 легкой цепи с последовательностью: WASSRHN (SEQ ID NO: 46) и CDR3 легкой цепи с последовательностью: QQYSRYPLT (SEQ ID NO: 48).
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления фармацевтическая композиция содержит моноклональное антитело или его фрагмент, содержащие вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 34 и SEQ ID NO: 77. Каждый вариант представляет собой отдельный вариант осуществления настоящего изобретения.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления фармацевтическая композиция содержит моноклональное антитело или его фрагмент, содержащие вариабельную область легкой цепи с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 42 и SEQ ID NO: 79. Каждый вариант представляет собой отдельный вариант осуществления настоящего изобретения.
В соответствии с конкретным вариантом осуществления фармацевтическая композиция содержит моноклональное антитело или его фрагмент, содержащие вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью, изложенной в SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 69, и вариабельную область легкой цепи с последовательностью, изложенной в SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 71.
В соответствии с конкретным вариантом осуществления фармацевтическая композиция содержит моноклональное антитело или его фрагмент, содержащие вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью, изложенной в SEQ ID NO: 18 или SEQ ID NO: 73, и вариабельную область легкой цепи с последовательностью, изложенной в SEQ ID NO: 26 или SEQ ID NO: 75.
В соответствии с конкретным вариантом осуществления фармацевтическая композиция содержит моноклональное антитело или его фрагмент, содержащие вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью, изложенной в SEQ ID NO: 34 или SEQ ID NO: 77, и вариабельную область легкой цепи с последовательностью, изложенной в SEQ ID NO: 42 или SEQ ID NO: 79.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления фармацевтическая композиция предусматривает комбинацию по меньшей мере двух антител или фрагментов антител, которые распознают PVR человека.
В соответствии с еще одними вариантами осуществления фармацевтическая композиция содержит одно mAb или фрагмент, которые специфически связывают PVR в соответствии с настоящим изобретением, и одно mAb или фрагмент, которые специфически связывают другой антиген, такой как клеточный рецептор, опухолевый антиген или иммуномодулирующий белок.
Также предусмотрены фармацевтические композиции, содержащие по меньшей мере одно антитело, фрагмент антитела или конъюгат на основе антитела в соответствии с настоящим изобретением для применения в возобновлении цитотоксичности NK путем ингибирования связывания PVR с TIGIT, экспрессируемым на поверхности NK-клеток.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления антитело, фрагмент антитела или конъюгат на основе антитела способны к ингибированию связывания PVR человека с TIGIT, экспрессируемым на поверхности T-клеток.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления фармацевтическая композиция в соответствии с настоящим изобретением предназначена для применения в иммунотерапии рака или усилении иммунного ответа.
Рак может представлять собой любую злокачественную опухоль, которая экспрессирует PVR. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления рак сверхэкспрессирует PVR.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения рак представляет собой метастатическую злокачественную опухоль. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления фармацевтическая композиция в соответствии с настоящим изобретением предназначена для применения в ингибировании образования или распространения метастазов или уменьшении общего числа метастазов у субъекта.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения рак выбран из группы, состоящей из меланомы, рака молочной железы, рака яичника, рака поджелудочной железы, рака толстой и прямой кишки, рака толстой кишки, рака шейки матки, рака почки, рака легкого, рака щитовидной железы, рака предстательной железы, рака головного мозга, рака почки, рака горла, карциномы гортани, рака мочевого пузыря, рака печени, фибросаркомы, рака из клеток эндометрия, глиобластомы, саркомы, миелоидного новообразования, лейкоза и лимфомы. Каждый вариант представляет собой отдельный вариант осуществления настоящего изобретения.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления рак представляет собой солидный рак. В соответствии с некоторыми конкретными вариантами осуществления солидный рак выбран из группы, состоящей из меланомы (кожи), рака легкого, толстой кишки, молочной железы, матки, и почки. В соответствии с конкретными вариантами осуществления рак выбран из группы, состоящей из рака молочной железы, рака легкого и липосаркомы.
В соответствии с другими вариантами осуществления рак представляет собой гематологическую злокачественную опухоль. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления гематологическая злокачественная опухоль представляет собой миелоидный лейкоз, острый лимфобластный лейкоз, хронический лимфоцитарный лейкоз, миелопролиферативные заболевания, множественную миелому или миелодиспластический синдром. Каждый вариант представляет собой отдельный вариант осуществления настоящего изобретения. В соответствии с определенными вариантами осуществления рак представляет собой лейкоз. В соответствии с конкретными вариантами осуществления рак представляет собой острый миелоидный лейкоз (AML).
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления фармацевтическая композиция в соответствии с настоящим изобретением предназначена для применения в лечении вирусной инфекции.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления вирусная инфекция вызвана вирусом, который связывает целевую клетку посредством PVR на поверхности инфицированной клетки.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления фармацевтическая композиция в соответствии с настоящим изобретением предназначена для применения в лечении ассоциированного с ангиогенезом заболевания или нарушения. В соответствии с определенными вариантами осуществления ассоциированное с ангиогенезом заболевание или нарушение выбрано из группы, состоящей из: рака, заболеваний глаза (глазных болезней), ассоциированных с пролиферацией клеток, поражений сетчатки и воспалительного заболевания. Каждый вариант представляет собой отдельный вариант осуществления настоящего изобретения.
В соответствии с еще одним аспектом настоящее изобретение относится к способу ингибирования связывания PVR человека по меньшей мере с одним лигандом путем применения определенных выше моноклонального антитела или фрагмента антитела.
В соответствии с дополнительным аспектом настоящее изобретение относится к способу усиления иммунного ответа у нуждающегося в этом субъекта, предусматривающему введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества определенных выше моноклонального антитела, фрагмента антитела или конъюгата на основе антитела.
В соответствии с еще одним аспектом настоящее изобретение относится к способу лечения рака, предусматривающему введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере одно антитело, фрагмент антитела или конъюгат на их основе, которые распознают PVR человека с высокой аффинностью и специфичностью, и способны к ингибированию его связывания с его лигандом.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления антитело в составе вводимой фармацевтической композиции выбрано из группы, состоящей из: (i) моноклонального антитела, содержащего последовательности CDR, содержащиеся в пределах вариабельной области тяжелой цепи, изложенной в SEQ ID NO: 2, и последовательности CDR, содержащиеся в пределах вариабельной области легкой цепи, изложенной в SEQ ID NO: 10; (ii) моноклонального антитела, содержащего последовательности CDR, содержащиеся в пределах вариабельной области тяжелой цепи, изложенной в SEQ ID NO: 18, и последовательности CDR, содержащиеся в пределах вариабельной области легкой цепи, изложенной в SEQ ID NO: 26; или (iii) моноклонального антитела, содержащего последовательности CDR, содержащиеся в пределах вариабельной области тяжелой цепи, изложенной в SEQ ID NO: 34, и последовательности CDR, содержащиеся в пределах вариабельной области легкой цепи, изложенной в SEQ ID NO: 42.
В соответствии с некоторыми конкретными вариантами осуществления моноклональное антитело в составе вводимой фармацевтической композиции содержит: CDR1 тяжелой цепи, содержащую последовательность, выбранную из группы, состоящей из GFDFSRYW (SEQ ID NO: 4) и RYWMT (SEQ ID NO: 80); CDR2 тяжелой цепи, содержащую последовательность: EIHPDSSKINYTPSQ (SEQ ID NO: 6); CDR3 тяжелой цепи, содержащую последовательность: PDGNYNALDY (SEQ ID NO: 82); CDR1 легкой цепи, содержащую последовательность: KASQDVGTAVT (SEQ ID NO: 12); CDR2 легкой цепи, содержащую последовательность: WASTRHT (SEQ ID NO: 14); и CDR3 легкой цепи, содержащую последовательность: QQYSRYPYT (SEQ ID NO: 16). Каждый вариант представляет собой отдельный вариант осуществления настоящего изобретения.
В соответствии с другими конкретными вариантами осуществления моноклональное антитело в составе вводимой фармацевтической композиции содержит: CDR1 тяжелой цепи, содержащую последовательность EYTMH (SEQ ID NO: 83); CDR2 тяжелой цепи, содержащую последовательность: GIDPNNGGTNYNQNFKG (SEQ ID NO: 22); CDR3 тяжелой цепи, содержащую последовательность: VIPLEY (SEQ ID NO: 24); CDR1 легкой цепи, содержащую последовательность: KASQNVYTNVA (SEQ ID NO: 28); CDR2 легкой цепи, содержащую последовательность: SASYRYR (SEQ ID NO: 30); и CDR3 легкой цепи, содержащую последовательность: QQYNSYPLA (SEQ ID NO: 32).
В соответствии с другими конкретными вариантами осуществления моноклональное антитело в составе вводимой фармацевтической композиции содержит: CDR1 тяжелой цепи, содержащую последовательность SNYWIE (SEQ ID NO: 84); CDR2 тяжелой цепи, содержащую последовательность: EIFPGSGRINFNEKFKG (SEQ ID NO: 38); CDR3 тяжелой цепи, содержащую последовательность: TKIYGNSFDY (SEQ ID NO: 40); CDR1 легкой цепи, содержащую последовательность: KASQDVGTAV (SEQ ID NO: 85); CDR2 легкой цепи, содержащую последовательность: WASSRHN (SEQ ID NO: 46); и CDR3 легкой цепи, содержащую последовательность: QQYSRYPLT (SEQ ID NO: 48).
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения терапевтически эффективное количество обеспечивает в результате уменьшение размера опухоли или числа метастазов у субъекта.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления способ лечения рака предусматривает применение или проведение по меньшей мере одного вида дополнительной противораковой терапии. В соответствии с определенными вариантами осуществления дополнительная противораковая терапия представляет собой хирургическое вмешательство, химиотерапию, лучевую терапию или иммунотерапию.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления способ лечения рака предусматривает введение моноклонального антитела, которое распознает PVR человека с высокой аффинностью и специфичностью и дополнительного противоракового средства. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления дополнительное противораковое средство выбрано из группы, состоящей из: иммуномодулятора, активированного лимфоцита, ингибитора киназы и химиотерапевтического средства.
В соответствии с другими вариантами осуществления дополнительным иммуномодулятором является антитело, фрагмент антитела или конъюгат на основе антитела, которые связываются с антигеном, отличным от PVR человека.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления дополнительным иммуномодулятором является антитело к молекуле, являющейся контрольной точкой иммунного ответа. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления дополнительным иммуномодулятором является антитело к молекуле, являющейся контрольной точкой иммунного ответа, выбранной из группы, состоящей из белка 1 запрограммированной гибели клеток (PD-1) человека, PD-L1 и PD-L2, молекулы 1 клеточной адгезии, родственной эмбриональному опухолевому антигену (CEACAM1), гена 3 активации лимфоцитов (LAG3), CD137, OX40 (также называемого CD134), иммуноглобулин-подобных рецепторов клеток-киллеров (KIR), TIGIT и любой их комбинации. Каждый вариант представляет собой отдельный вариант осуществления настоящего изобретения.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления противораковое средство выбрано из группы, состоящей из: Erbitux, цитарабина, флударабина, фторурацила, меркаптопурина, метотрексата, тиогуанина, гемцитабина, винкристина, винбластина, винорелбина, кармустина, ломустина, хлорамбуцила, циклофосфамида, цисплатина, карбоплатина, ифосфамида, хлорметина, мелфалана, тиотепы, дакарбазина, блеомицина, дактиномицина, даунорубицина, доксорубицина, идарубицина, митомицина, митоксантрона, пликамицина, этопозида, тенипозида и любой их комбинации. Каждый вариант представляет собой отдельный вариант осуществления настоящего изобретения.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления противораковое средство представляет собой ингибитор рецептора эпидермального фактора роста (EGFR). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления ингибитор EGFR выбран из группы, состоящей из: цетуксимаба (Erbitux), панитумумаба (Vectibix) и нецитумумаба (Portrazza). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления ингибитор EGFR представляет собой цетуксимаб (Erbitux).
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения субъектом является субъект-человек.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения применение дополнительно предусматривает применение средства, которое осуществляет отрицательную регуляцию активности или экспрессии иммунного коингибирующего рецептора.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения иммунной клеткой является T-клетка.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения иммунный коингибирующий рецептор выбран из группы, состоящей из PD-1, TIGIT, DNAM-1, CTLA-4, LAG3, TIM3, BTLA, VISTA, B7H4, CD96, BY55, LAIR1, SIGLEC10 и 2B4. Каждый вариант представляет собой отдельный вариант осуществления настоящего изобретения.
В соответствии с одним аспектом настоящее изобретение относится к способу модулирования функции и/или активности иммунной системы, предусматривающему модулирование связывания PVR с TIGIT с применением антитела в соответствии с настоящим изобретением.
В соответствии с одним аспектом настоящее изобретение относится к способу предупреждения или лечения вирусной инфекции, вызванной вирусом, который использует CD155 в качестве рецептора для проникновения в клетку, у нуждающегося в этом субъекта, причем способ предусматривает введение субъекту терапевтически эффективного количества описанного в настоящем документе моноклонального антитела к PVR. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления вирус выбран из группы, состоящей из: полиовируса, вируса Коксаки, аденовируса и вируса иммунодефицита человека (ВИЧ).
В соответствии с еще одним аспектом настоящее изобретение относится к способу лечения ассоциированного с ангиогенезом заболевания или нарушения. В соответствии с определенными вариантами осуществления ассоциированное с ангиогенезом заболевание или нарушение выбрано из группы, состоящей из: рака, заболеваний глаза (глазных болезней), ассоциированных с пролиферацией клеток, поражений сетчатки и воспалительного заболевания. Каждый вариант представляет собой отдельный вариант осуществления настоящего изобретения.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления способ лечения рака включает предупреждение или уменьшение степени образования, роста или распространения метастазов у субъекта путем ингибирования ангиогенеза.
В соответствии с одним аспектом настоящее изобретение относится к способу диагностирования или определения прогноза рака или инфекционного заболевания у субъекта, причем способ предусматривает определение уровня экспрессии PVR в биологическом образце от указанного субъекта с применением по меньшей мере одного антитела, как описано в настоящем документе.
В соответствии с другим аспектом настоящее изобретение дополнительно предусматривает способ определения или количественного определения экспрессии PVR, причем способ предусматривает приведение биологического образца в контакт с антителом или фрагментом антитела и измерение степени комплексообразования, при этом антитело или фрагмент антитела содержат определяющие комплементарность области (CDR), выбранные из группы, состоящей из: (i) CDR1 тяжелой цепи с последовательностью: GFDFSRYW (SEQ ID NO: 4) или RYWMT (SEQ ID NO: 80), CDR2 тяжелой цепи с последовательностью: EIHPDSSKINYTPSQ (SEQ ID NO: 6), CDR3 тяжелой цепи с последовательностью: PDGNYNALDY (SEQ ID NO: 82), CDR1 легкой цепи с последовательностью: KASQDVGTAVT (SEQ ID NO: 12), CDR2 легкой цепи с последовательностью: WASTRHT (SEQ ID NO: 14) и CDR3 легкой цепи с последовательностью: QQYSRYPYT (SEQ ID NO: 16); (ii) CDR1 тяжелой цепи с последовательностью EYTMH (SEQ ID NO: 83), CDR2 тяжелой цепи с последовательностью: GIDPNNGGTNYNQNFKG (SEQ ID NO: 22), CDR3 тяжелой цепи с последовательностью: VIPLEY (SEQ ID NO: 24), CDR1 легкой цепи с последовательностью: KASQNVYTNVA (SEQ ID NO: 28), CDR2 легкой цепи с последовательностью: SASYRYR (SEQ ID NO: 30) и CDR3 легкой цепи с последовательностью: QQYNSYPLA (SEQ ID NO: 32); или (iii) CDR1 тяжелой цепи с последовательностью SNYWIE (SEQ ID NO: 84), CDR2 тяжелой цепи с последовательностью: EIFPGSGRINFNEKFKG (SEQ ID NO: 38), CDR3 тяжелой цепи с последовательностью: TKIYGNSFDY (SEQ ID NO: 40), CDR1 легкой цепи с последовательностью: KASQDVGTAV (SEQ ID NO: 85), CDR2 легкой цепи с последовательностью: WASSRHN (SEQ ID NO: 46) и CDR3 легкой цепи с последовательностью: QQYSRYPLT (SEQ ID NO: 48).
in-vitro
ex-vivo
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления способы определения и количественного определения можно осуществлять  или , или можно применять их в диагностировании состояний, ассоциированных с экспрессией PVR. Антитела в соответствии с настоящим изобретением можно также применять для способов скрининга. Например, ферментный иммуносорбентный анализ (ELISA) или радиоиммунологический анализ (RIA) можно адаптировать для измерения уровней секретируемого или ассоциированного с клеткой полипептида с применением антител и известных в данной области способов.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления способ для выявления присутствия или количественного определения PVR предусматривает стадии:
i. инкубирования образца с антителом, специфическим к PVR, или его фрагментом антитела, содержащим по меньшей мере антигенсвязывающий участок;
ii. выявления связанного PVR с применением выявляемой пробы.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления способ дополнительно предусматривает стадии:
iii. сравнения количества (ii) с калибровочной кривой, полученной на основе результатов по эталонному образцу, содержащему известное количество PVR; и
iv. расчета количества PVR в образце из калибровочной кривой.
В соответствии с некоторыми конкретными вариантами осуществления образец представляет собой биологическую жидкость.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления способ осуществляют in-vitro или ex-vivo.
Также предусмотрен набор для измерения экспрессии PVR в биологическом образце, содержащий по меньшей мере одно антитело или фрагмент антитела, содержащие определяющие комплементарность области (CDR), выбранные из группы, состоящей из: (i) CDR1 тяжелой цепи с последовательностью: GFDFSRYW (SEQ ID NO: 4) или RYWMT (SEQ ID NO: 80), CDR2 тяжелой цепи с последовательностью: EIHPDSSKINYTPSQ (SEQ ID NO: 6), CDR3 тяжелой цепи с последовательностью: PDGNYNALDY (SEQ ID NO: 82), CDR1 легкой цепи с последовательностью: KASQDVGTAVT (SEQ ID NO: 12), CDR2 легкой цепи с последовательностью: WASTRHT (SEQ ID NO: 14) и CDR3 легкой цепи с последовательностью: QQYSRYPYT (SEQ ID NO: 16); (ii) CDR1 тяжелой цепи с последовательностью EYTMH (SEQ ID NO: 83), CDR2 тяжелой цепи с последовательностью: GIDPNNGGTNYNQNFKG (SEQ ID NO: 22), CDR3 тяжелой цепи с последовательностью: VIPLEY (SEQ ID NO :24), CDR1 легкой цепи с последовательностью: KASQNVYTNVA (SEQ ID NO: 28), CDR2 легкой цепи с последовательностью: SASYRYR (SEQ ID NO: 30) и CDR3 легкой цепи с последовательностью: QQYNSYPLA (SEQ ID NO: 32); или (iii) CDR1 тяжелой цепи с последовательностью SNYWIE (SEQ ID NO: 84), CDR2 тяжелой цепи с последовательностью: EIFPGSGRINFNEKFKG (SEQ ID NO: 38), CDR3 тяжелой цепи с последовательностью: TKIYGNSFDY (SEQ ID NO: 40), CDR1 легкой цепи с последовательностью: KASQDVGTAV (SEQ ID NO: 85), CDR2 легкой цепи с последовательностью: WASSRHN (SEQ ID NO: 46) и CDR3 легкой цепи с последовательностью: QQYSRYPLT (SEQ ID NO: 48).
В соответствии с одним аспектом настоящее изобретение относится к набору для выявления рака, причем диагностический набор содержит антитело или его фрагмент, как раскрыто в настоящем документе.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящее изобретение относится к способу диагностирования, оценки тяжести или стадирования связанного с иммунной системой заболевания или пролиферативного заболевания, предусматривающему определение экспрессии или активности PVR в образце от субъекта с применением антитела в соответствии с настоящим изобретением или его фрагмента или конъюгата на его основе, и сравнение экспрессии или активности PVR со стандартным значением экспрессии или активности PVR. Указанное стандартное значение может быть получено по результатам анализа образца, взятого у здорового субъекта, у того же субъекта на другой стадии заболевания, или его определяют по данным клинических исследований большой популяции субъектов.
Дополнительные варианты осуществления и полный спектр применимости настоящего изобретения будут очевидны из приведенного ниже подробного описания. Однако следует понимать, что подробное описание и конкретные примеры с указанием предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения приведены исключительно как иллюстративные, поскольку различные изменения и модификации в рамках сущности и объема настоящего изобретения будут очевидны для специалистов в данной области из данного подробного описания.
Краткое описание чертежей
Фигуры 1A-1C
представляют собой графики, на которых представлена корреляция уровней экспрессии мРНК PVR (высокий или низкий, как указано) с вероятностью выживания. Корреляцию измеряли для рака легкого (фиг. 1A), рака молочной железы (фиг. 1B) и липосаркомы (фиг. 1C). Массивы данных по экспрессии мРНК получали с сайта GEO, и анализировали их с использованием сайта bioprofiling.de, в следующем виде: массив данных для рака легкого, GEO ID: GSE31210, массив данных для рака молочной железы, GEO ID: GSE25055, и массив данных для липосаркомы, GEO ID: GSE30929.
Фиг. 2
представляет собой схематическое изображение экспрессии рецептора на поверхности иммунных и опухолевых клеток. TIGIT относится к коингибирующему рецептору на поверхности многих иммунных клеток (например, T-клеток); DNAM-1 (также называемый CD226) относится к активирующему рецептору на поверхности многих иммунных клеток (например, T-клеток); Fc-рецептор относится к сильному активирующему рецептору, экспрессируемому главным образом на поверхности NK-клеток, но также на поверхности миелоидных клеток, в том числе нейтрофилов и макрофагов; PVR относится к ингибирующему лиганду TIGIT (более слабое связывание с DNAM-1), экспрессируемому многими опухолевыми клетками; Nectin-2 относится к активирующему лиганду DNAM-1 (незначительное распознавание TIGIT), экспрессируемому многими опухолевыми клетками. В случае связывания антител к PVR в соответствии с настоящим изобретением наблюдали двойной эффект: 1) повышение степени уничтожения опухолевых клеток посредством Fc-рецепторов; и 2) усиление активации иммунных клеток за счет блокирования взаимодействия с TIGIT.
Фигуры 3A-3D
представляют собой графики, на которых представлены результаты FACS-анализа четырех полученных антител к PVR. Показана эффективность антител в отношении блокирования прямого связывания TIGIT-Fc с линией клеток опухоли. На фиг. 3A представлены результаты по неблокирующему антителу к PVR (mAb-антитело к PVR 2G3, также называемое hPVR.17). На фигурах 3B-3D показано, что три из полученных антител, а именно 5B9 (также называемое hPVR.09), 7D4 (также называемое hPVR.01) и 4E5 (также называемое hPVR.07) соответственно являются блокирующими mAb к PVR, как показано по блокированию связывания TIGIT-Ig. К клеткам HepG2 добавляли среды из культур гибридомы (5 мкл из/лунки). TIGIT-Fc применяли при 2 мкг/лунку с получением конечной концентрации 20 мкг/мл, и уровни связанного с клетками TIGIT измеряли с помощью FACS после добавления меченного флуоресцентной меткой Ab к Fc. Заполненные участки гистограммы представляют собой фоновое окрашивание реагентом, связывающимся с Fc.
Фиг. 4
представляет собой график, на котором показано, как блокирование взаимодействий PVR-TIGIT с помощью mAb-антитела к PVR 7D4 (также называемого hPVR.01) повышает степень уничтожения NK-клетками линии клеток человека MDA-MB-231 (аденокарцинома молочной железы). Специфическое уничтожение рассчитывали по секреции [35S]-метионина из целевых клеток. Контролем (Ctrl) является неродственное IgG мыши. P-значение = 0,0056.
Фиг. 5
представляет собой график, на котором показано, что блокирование взаимодействий PVR-TIGIT с помощью mAb к PVR 4E5 (также называемого hPVR.07) повышает степень уничтожения NK-клетками линии клеток рака человека HepG2 (гепатоцеллюлярная карцинома). Отсутствует - без mAb уничтожение HepG2 не наблюдали; 4E5 к PVR - уничтожение HepG2 с 4E5mIgG1 мыши к PVR (без активации Fc-рецептора человека); 4e5hIgG1 к PVR - уничтожение HepG2 с 4E5-hIgG1 к PVR (активация Fc-рецептора человека), Erbitux (P.C) - mAb Erbitux в качестве положительного контроля (антитело к EGFR). Все mAb применяли в концентрации 10 мкг/мл. P-значения: 4E5 к PVR - 0,04, 4e5hIgG1 к PVR - 0,000746 и Erbitux (положительный контроль) - 0,003219.
Фигуры 6A-6O
представляют собой графики, на которых показано, что линии клеток опухоли человека экспрессируют PVR и Nectin-2. Клетки меланомы (фигуры 6A-E), клетки рака молочной железы (фигуры 6F-H), клетки рака толстой и прямой кишки (фиг. 6I), клетки рака почки (фиг. 6J), клетки рака легкого (фиг. 6K), клетки рака предстательной железы (фиг. 6L), клетки опухоли головного мозга (фиг. 6M) и клетки гепатоцеллюлярной карциномы (фигуры 6N-O) все экспрессируют PVR и Nectin-2. mAb применяли в концентрации 0,2 мкг/лунку: коммерческое mAb к Nectin-2 и mAb к PVR 4E5 (также называемое hPVR.07).
Фигуры 7A-7C
представляют собой графики результатов FACS-анализа, на которых показано, что PVR является основным лигандом TIGIT. На фиг. 7A проиллюстрировано, что клетки HepG2 (клетки гепатоцеллюлярной карциномы человека) экспрессируют PVR и Nectin-2. На фиг. 7B проиллюстрировано, что очищенное mAb к PVR 4E5 (также называемое hPVR.07) (0,15 мкг) почти полностью (более 97%) блокирует связывание TIGIT-Ig (2 мкг/мл), независимо от того факта, что эти клетки также экспрессируют Nectin-2. На фиг. 7C проиллюстрировано, что клетки CHO на высоком уровне экспрессируют hNectin-2. На фиг. 7D показано отсутствие окрашивания тех же клеток CHO, что и на фиг. 7C, всеми mAb к PVR, что означает, что прямое распознавание Nectin-2 mAb к PVR отсутствует, и, таким образом, блокирование связывания TIGIT, наблюдаемое на фиг. 7B, не может быть объяснено блокированием Nectin-2, скорее, оно является результатом прямого блокирования PVR.
фигурах 8A-8C
На  представлена подобная эффективность связывания для всех mAb к PVR с PVR человека. Все три блокирующих клона обеспечивали подобную (различие менее 10%) степень связывания как с эндогенными клетками HepG2, экспрессирующими PVR (фиг. 8A), так и клетками B16-hPVR, сверхэкспрессирующими hPVR (фиг. 8B). Связывание также изучали с применением линии клеток Vero от африканской зеленой мартышки (фиг. 8C), которая экспрессирует белок PVR, характеризующийся 93% сходством с PVR человека. В этом случае для разных Ab наблюдали разные показатели интенсивности окрашивания. Во всех случаях применяли 0,2 мкг каждого mAb.
Фиг. 9
представляет собой график, на котором показано, что антитела к PVR по настоящему изобретению не распознают PVR представителя семейства псовых. TIGIT-Fc человека (10 мкг/мл) характеризуется сильной перекрестной реактивностью и связывается с линией клеток MDCK представителя семейства псовых. Ни одно из mAb к PVR не было способно к связыванию с этими клетками, что свидетельствует о том, что они не распознают PVR представителя семейства псовых.
фигурах 10A-10D
На показано, что Nectin-2 предпочтительно связывается DNAM-1, а не TIGIT. Клетки, сверхэкспрессирующие либо PVR, либо Nectin-2, окрашивали с применением указанных концентраций антител. На фиг. 10A проиллюстрировано связывание TIGIT-Fc с экспрессирующими Nectin-2 клетками; на фиг. 10B проиллюстрировано связывание DNAM-FC с экспрессирующими Nectin-2 клетками. На фиг. 10C проиллюстрировано связывание TIGIT с экспрессирующими PVR клетками. На фиг. 10D проиллюстрировано связывание DNAM-1 с экспрессирующими PVR клетками.
фиг. 11
-05
На показан эффект антител к PVR в отношении пролиферации T-клеток. PBMC человека метили CFSE и инкубировали с целевыми клетками в присутствии указанных антител. Результаты представлены в виде кратности повышенной степени пролиферации по сравнению с контролем. Результаты объединены из 7 экспериментов всего для 10 здоровых доноров. P-значения: для mAb 4E5 - 0,000241, для mAb 5B9 - 1,96E, для антитела к PD-1 - 0,016303, для антитела к CTLA4 - 0,000171 и для 4E5hIgG1 - 0,008176.
фиг. 12
-03
-02
-04
-03
-06
На показан комбинированный эффект антител к PVR и других антител в отношении пролиферации T-клеток. PBMC человека метили CFSE и инкубировали с целевыми клетками в присутствии указанной комбинации антител. Результаты представлены в виде кратности повышенной степени пролиферации по сравнению с контролем. Результаты включают 7 независимых экспериментов для 12 здоровых доноров. P-значения: антитело к PD1 + антитело к CTLA - 47,54E, антитело к PD-1 + 4E5 - 7,02E, антитело к PD-1 + 5B9 - 1,11E, антитело к CTLA4 + 4E5 - 1,37E, антитело к CTLA4 + 5B9 - 5,47E.
фиг. 13
На показан специфический эффект антител к PVR в отношении пролиферации CD8 T-клеток. PBMC человека метили CFSE и инкубировали с целевыми клетками (A549) в присутствии указанных антител. CD8-положительные клетки считали с помощью FACS спустя 9-12 дней культивирования. Результаты представлены в виде кратности повышенной степени пролиферации по сравнению с контролем. Результаты включают 2 независимых эксперимента для здоровых доноров PBMC.
фиг. 14
На показано соотношение CD8 клеток и CD4 клеток после индукции разными антителами. PBMC человека метили CFSE и инкубировали с целевыми клетками (A549) в присутствии указанных антител. Клетки считали спустя 9-12 дней культивирования. Результаты объединены из 2 экспериментов всего для 2 здоровых доноров.
фиг. 15
-05
-05
-05
На показан эффект антител к PVR в отношении дегрануляции NK-клеток. NK-клетки человека инкубировали с клетками MDA-MB-231 (линия клеток трижды негативного рака молочной железы) в присутствии указанных антител. Результаты представлены для 7 независимых экспериментов, выполненных для 5 разных здоровых доноров NK-клеток. P-значения: PVR4E5 - 0,005063, PVR5B9 - 0,00374, PVR7D4 - 0,019448, PVR4E5-hIgG1 - 2,03E, PVR5B9-hIgG1 - 1,45E, PVR7D4-hIgG1 5,8E.
фигурах 16A-16D
На  показан эффект антител к PVR в отношении выживаемости опухолевых клеток в отсутствие иммунных клеток. Выживаемость клеток A549 (фиг. 16A), клеток U373 (фиг. 16B), клеток HCT116 (фиг. 16C) и Mel-624 (фиг. 16D) изучали с применением MTT-анализа выживаемости клеток в присутствии 50 микрограмм/мл указанного mAb на протяжении 24 часов. Уровень значимости рассчитывали с помощью одностороннего критерия Стьюдента, *<0,05, ** <0,03 и ***< 0,02.
Подробное раскрытие настоящего изобретения
Настоящее изобретение относится к моноклональным антителам, специфическим к рецептору полиовируса (PVR) человека. Настоящее изобретение также относится к получению и применению mAb в качестве терапевтических средств. В частности, mAb по настоящему изобретению можно применять, отдельно или в комбинации с другими средствами, для возобновления и усиления активности иммунных клеток в отношении уничтожения опухоли, и в качестве реагентов для диагностики.
Термин «антиген» в контексте настоящего документа относится к молекуле или части молекулы, способной вызывать образование антитела и специфически связываться антителом. Антиген может иметь один или более одного эпитопа. Упоминаемое выше специфическое связывание означает, что антиген будет взаимодействовать, с высокой селективностью, с его соответствующим антителом, но не с множеством других антител, образование которых может быть индуцировано другими антигенами. Антиген в соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения представляет собой белок PVR.
Термин «PVR» в контексте настоящего документа относится к рецептору полиовируса, также известному как CD155 (кластер дифференцировки 155). PVR представляет собой трансмембранный гликопротеин с N-концевой сигнальной последовательностью, тремя внеклеточными иммуноглобулин- (Ig)-подобными доменами, трансмембранным доменом и цитоплазматическим хвостом. Он имеет молекулярную массу примерно 80 кДа и структуру, состоящую из трех Ig-подобных доменов, а именно, наиболее удаленного V-подобного домена, за которым расположены два C2-подобных домена. Иллюстративный PVR в соответствии с настоящим изобретением представлен в GenBank под номерами доступа: NP_001129240.1, NP_001129241.1, NP_001129242.2 и NP_006496.4. Эти рецепторы полиовируса имеют общую последовательность внеклеточного домена, и, следовательно, могут быть мишенью компонента аффинного связывания по настоящему изобретению.
Термин «антигенная детерминанта» или «эпитоп» в контексте настоящего документа относится к области молекулы антигена, которая специфически взаимодействует с конкретным антителом. Пептидные последовательности, происходящие из эпитопа, можно использовать, отдельно или в сочетании с компонентом в качестве носителя, с применением известных в данной области способов, для иммунизации животных и для получения дополнительных поликлональных или моноклональных антител. Выделенные пептиды, происходящие из эпитопа, можно применять в диагностических способах для выявления антител.
Следует отметить, что аффинность можно количественно определять с применением известных способов, таких как метод поверхностного плазмонного резонанса (SPR) (описанный в Scarano S, Mascini M, Turner AP, Minunni M. Surface plasmon resonance imaging for affinity-based biosensors. Biosens Bioelectron. 2010, 25: 957-66), и можно рассчитывать с применением, например, константы диссоциации, Kd, с таким расчетом, что более низкая Kd отображает более высокую аффинность.
Антитела или их фрагмент в соответствии с настоящим изобретением связываются с эпитопом в hPVR. В частности, антитела связываются с эпитопом в пределах аминокислот 1-343 PVR, изложенного под NP_006496.4.
2
H
H
L
L
Антитела, или иммуноглобулины, содержат две тяжелые цепи, соединенные вместе дисульфидными связями, и две легкие цепи, причем каждая легкая цепь соединена с соответствующей тяжелой цепью дисульфидными связями в конфигурации формы «Y». В результате протеолитического расщепления антитела образуются домены Fv (фрагмент вариабельной области) и Fc (кристаллизующийся фрагмент). Антигенсвязывающие домены, Fab, включают области, в которых полипептидная последовательность варьирует. Термин F(ab') означает два Fab'-плеча, соединенных вместе дисульфидными связями. Центральная ось антитела называется Fc-фрагментом. Каждая тяжелая цепь содержит на одном конце вариабельный домен (V), за которым расположен ряд константных доменов (C). Каждая легкая цепь содержит вариабельный домен (V) на одном конце и константный домен (C) на другом своем конце, причем вариабельный домен легкой цепи расположен параллельно вариабельному домену тяжелой цепи, а константный домен легкой цепи расположен параллельно первому константному домену тяжелой цепи (CH1). Вариабельные домены каждой пары легких и тяжелых цепей образуют антигенсвязывающий сайт. Домены легких и тяжелых цепей характеризуются одинаковой общей структурой, и каждый домен содержит четыре каркасные области, последовательности которых являются относительно консервативными, соединенные тремя гипервариабельными доменами, известными как определяющие комплементарность области (CDR 1-3). Эти домены обеспечивают специфичность и аффинность антигенсвязывающего сайта.
J Exp Med
Dev Comp Immunol
Идентификацию или определение CDR из данной вариабельной последовательности тяжелой или легкой цепи обычно выполняют с применением одного из нескольких известных в данной области способов. Например, такое определение выполняют в соответствии с Kabat (Wu T.T and Kabat E.A., , 1970; 132:211–50) и IMGT (Lefranc M-P, et al., , 2003, 27:55-77).
Если используется термин «CDR с последовательностью» или подобный термин, он включает варианты, где CDR содержит указанные последовательности, а также варианты, где CDR состоит из указанной последовательности.
Антигенная специфичность антитела обусловлена гипервариабельной областью (HVR), а именно уникальными последовательностями CDR как легких, так и тяжелых цепей, которые вместе образуют антигенсвязывающий сайт.
Изотип тяжелой цепи (гамма, альфа, дельта, эпсилон или мю) определяет класс иммуноглобулина (IgG, IgA, IgD, IgE или IgM соответственно). Легкая цепь принадлежит к одному из двух изотипов (каппа, κ, или лямбда, λ). Оба изотипа встречаются среди всех классов антител.
Термин «антитело» применяют в самом широком смысле, и он включает моноклональные антитела (в том числе полноразмерные или интактные моноклональные антитела), поликлональные антитела, поливалентные антитела и фрагменты антител длиной, достаточной для проявления требуемой биологической активности, а именно связывания с PVR человека.
2
Антитело или антитела в соответствии с настоящим изобретением включают интактные антитела, такие как поликлональные антитела или моноклональные антитела (mAb), а также их фрагменты, образующиеся в результате протеолиза, такие как Fab- или F(ab')-фрагменты. Одноцепочечные антитела также охвачены объемом настоящего изобретения.
Фрагменты антител
2
«Фрагменты антител» содержат только часть интактного антитела, включая обычно антигенсвязывающий сайт интактного антитела, и, следовательно, сохраняя способность связывать антиген. Примеры фрагментов антител, охваченные настоящим определением, включают: (i) Fab-фрагмент с доменами VL, CL, VH и CH1; (ii) Fab'-фрагмент, который представляет собой Fab-фрагмент с одним или несколькими цистеиновыми остатками на C-конце домена CH1; (iii) Fd-фрагмент с доменами VH и CH1; (iv) Fd'-фрагмент с доменами VH и CH1 и одним или несколькими цистеиновыми остатками на C-конце домена CH1; (v) Fv-фрагмент с доменами VL и VH одного плеча антитела; (vi) dAb-фрагмент (Ward et al., Nature 1989, 341, 544-546), который состоит из домена VH; (vii) выделенные CDR-области; (viii) F(ab')-фрагменты, двухвалентный фрагмент, в том числе два Fab'-фрагмента, соединенные дисульфидным мостиком в шарнирной области; (ix) молекулы одноцепочечных антител (например, одноцепочечный Fv; scFv) (Bird et al., Science 1988, 242, 423-426; и Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 1988, 85,5879-5883); (x) «диатела» с двумя антигенсвязывающими сайтами, содержащие вариабельный домен тяжелой цепи (VH), присоединенный к вариабельному домену легкой цепи (VL) в пределах той же полипептидной цепи (см., например, EP 404,097; WO 93/11161; и Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90, 6444-6448); (xi) «линейные антитела», содержащие пару тандемных Fd-сегментов (VH-CH1-VH-CH1), которые, вместе с полипептидами комплементарной легкой цепи, образуют пару антигенсвязывающих областей (Zapata et al. Protein Eng., 1995, 8, 1057-1062; и патент США № 5641870).
24
229
10
2
2
Для получения фрагментов антител были разработаны различные методики. Традиционно такие фрагменты получали посредством протеолитического расщепления интактных антител (см., например, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods :107-117 (1992) и Brennan et al., Science, :81 (1985)). Однако в настоящее время такие фрагменты могут быть продуцированы рекомбинантными клетками-хозяевами. Например, фрагменты антител могут быть выделены из фаговой библиотеки антител. В качестве альтернативы, Fab'-SH-фрагменты можно непосредственно извлекать из E. coli и подвергать химическому связыванию с образованием F(ab')-фрагментов (Carter et al., Bio/Technology :163-167 (1992)). В соответствии с другим подходом F(ab')-фрагменты можно выделять непосредственно из культуры рекомбинантных клеток-хозяев. Другие методики получения фрагментов антител будет очевидны для практикующего специалиста. Согласно другим вариантам осуществления выбранное антитело представляет собой одноцепочечный Fv-фрагмент (scFv).
H
L
Одноцепочечные антитела могут представлять собой одноцепочечные составные полипептиды, характеризующиеся антигенсвязывающими способностями, и содержащие аминокислотные последовательности, гомологичные или аналогичные вариабельным областям легкой и тяжелой цепей иммуноглобулинов, т. е. соединенный V-V или одноцепочечный Fv (scFv). Методики получения одноцепочечных антител (патент США № 4946778) могут быть модифицированы для получения одноцепочечных антител к PVR.
Термин «моноклональное антитело» (mAb) в контексте настоящего документа относится к антителу, полученному из популяции практически гомогенных антител, т. е. отдельные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными за исключением возможных встречающихся в природе мутаций, которые могут быть представлены незначительными количествами. Моноклональные антитела являются высокоспецифичными, будучи направленными против одного антигена. Кроме того, в отличие от фракций поликлональных антител, которые обычно включают разные антитела, направленные против разных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против единственной детерминанты на антигене. Модификатор «моноклональный» не должен толковаться как предусматривающий необходимость получения антитела каким-либо конкретным способом. mAb могут быть получены известными специалистам в данной области способами. Например, моноклональные антитела, подлежащие применению в соответствии с настоящим изобретением, можно получать с помощью гибридомного способа, впервые описанного Kohler et al., Nature 1975, 256, 495, или можно получать с помощью способов на основе технологии рекомбинантной ДНК (см., например, патент США № 4816567). Моноклональные антитела также можно выделять из фаговых библиотек антител с применением методик, описанных, например, в Clackson et al., Nature 1991, 352, 624-628 или Marks et al., J. Mol. Biol., 1991, 222:581-597.
Конструирование и разработка рекомбинантных одновалентных антигенсвязывающих молекул, происходящих из моноклональных антител, посредством быстрой идентификации и клонирования функциональных генов вариабельной области тяжелой (VH) и вариабельной области легкой (VL) цепей и конструирование и клонирование синтетической последовательности ДНК, оптимизированной для экспрессии в рекомбинантных бактериях, описаны в Fields et at. 2013, 8(6):1125-48.
in-vitro
in-vivo
in-vivo
mAb по настоящему изобретению могут принадлежать к любому классу иммуноглобулинов, в том числе IgG, IgM, IgE, IgA и IgD. Продуцирующая mAb гибридома может быть культивирована  или . Высокие титры mAb можно получать посредством  продукции, при которой клетки отдельных гибридом вводят путем внутрибрюшинной инъекции мышам Balb/c, которых подвергали первичной стимуляции пристином, для получения асцитной жидкости, содержащей высокие концентрации требуемого mAb. mAb можно очищать из такой асцитной жидкости или из супернатантов культуры с применением хорошо известных специалистам в данной области способов.
Также включены антиидиотипические антитела, являющиеся специфически иммунореактивными в отношении гипервариабельных областей антитела по настоящему изобретению.
Настоящее изобретение относится к моноклональному антителу или фрагменту антитела, содержащим антигенсвязывающий домен (ABD), который содержит три CDR легкой цепи и три CDR тяжелой цепи, где указанный ABD характеризуется по меньшей мере 90% идентичностью или сходством последовательности с ABD моноклонального антитела мыши, содержащего: (I) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 69, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 71 (в настоящем документе идентифицированного как 4E5 или hPVR.07); (ii) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 73, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 75 (в настоящем документе идентифицированного как 7D4 или hPVR.01); или (iii) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 77, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 79 (в настоящем документе идентифицированного как 5B9 или hPVR.09). Такое антитело может иметь ABD-домен, характеризующийся по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96, по меньшей мере 97, по меньшей мере 98, по меньшей мере 99% идентичностью или сходством последовательности или 100% идентичностью последовательности с соответствующим ABD 4E5, 7D4 или 5B9.
Идентичностью последовательностей является количество аминокислот или нуклеотидов, которые точно совпадают для двух разных последовательностей. Сходство последовательностей допускает консервативную замену аминокислот, определяемых как идентичные аминокислоты.
Настоящее изобретение также относится к вариантам молекул антител в соответствии с настоящим изобретением с консервативными аминокислотными заменами. Также можно получать варианты в соответствии с настоящим изобретением, которые сохраняют общую молекулярную структуру кодируемых белков. С учетом свойств отдельных аминокислот, образующих раскрытые белковые продукты, некоторые целесообразные замены будут известны специалисту в данной области. Аминокислотные замены, т. е. «консервативные замены», можно выполнять, к примеру, исходя из сходства по полярности, заряду, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или амфипатической природы рассматриваемых остатков. Термин «аналог антитела» в контексте настоящего документа относится к антителу, полученному из другого антитела путем выполнения одной или нескольких консервативных аминокислотных замен.
Термин «вариант антитела» в контексте настоящего документа относится к любой молекуле, предусматривающей антитело по настоящему изобретению. Например, слитые белки, в которых антитело или его антигенсвязывающий фрагмент соединены с другим химическим соединением, считаются вариантом антитела.
Аналоги и варианты последовательностей антитела также входят в объем настоящей заявки. Они включают без ограничения консервативную и неконсервативную замену, вставку и делецию аминокислот в пределах последовательности. Такая модификация и полученный в результате аналог или вариант антитела входят в объем настоящего изобретения при условии, что они обеспечивают или даже улучшают связывание антитела с PVR человека.
Консервативные замены аминокислот, известные специалистам в данной области, входят в объем настоящего изобретения. Консервативные аминокислотные замены включают замещение одной аминокислоты другой с функциональной группой или боковой цепью того же типа, например, алифатической, ароматической, положительно заряженной, отрицательно заряженной. Такие замены могут обеспечить повышение биодоступности при пероральном введении, проникновения и нацеливания на конкретные популяции клеток, иммуногенности и т. д. Специалисту в данной области будет понятно, что отдельные замены, делеции или добавления в пептидной, полипептидной или белковой последовательности, которые обеспечивают изменение, добавление или удаление одной аминокислоты или небольшого процента аминокислот в кодируемой последовательности, относятся к «консервативно модифицированному варианту», где изменение приводит в результате к замене аминокислоты на подобную по химическим свойствам аминокислоту. Таблицы консервативных замен, в которых представлены функционально подобные аминокислоты, известны в данной области. Например, в соответствии с одной известной в данной области таблицей каждая из следующих шести групп содержит аминокислоты, которые являются друг для друга консервативными заменами:
1) Аланин (A), серин (S), треонин (T);
2) Аспарагиновая кислота (D), глутаминовая кислота (E);
3) Аспарагин (N), глутамин (Q);
4) Аргинин (R), лизин (K);
5) Изолейцин (I), лейцин (L), метионин (M), валин (V); и
6) Фенилаланин (F), тирозин (Y), триптофан (W).
Следует отметить, что вариантные последовательности цепи определяют с помощью способов секвенирования с применением специфических праймеров. Разные способы секвенирования, используемые по отношению к одной и той же последовательности, могут давать несколько разные последовательности, что обусловлено техническими аспектами и применением разных праймеров, особенно на концах последовательностей. Следовательно, в настоящей заявке указаны разные варианты последовательностей вариабельных областей цепей антитела к PVR.
2
Подразумевается, что термины «молекула с антигенсвязывающей частью антитела» и «антигенсвязывающие фрагменты» в контексте настоящего документа включают не только интактные молекулы иммуноглобулинов любого изотипа и полученные с применением любой линии животных клеток или микроорганизма, но также их антигенсвязывающую реакционноспособную часть, в том числе без ограничения Fab-фрагмент, Fab'-фрагмент, F(ab')-фрагмент, вариабельную часть их тяжелых и/или легких цепей, Fab-мини-антитела (см., например, WO 93/15210, публикацию заявки на патент США 08/256,790, WO 96/13583, публикацию заявки на патент США 08/817788, WO 96/37621, публикацию заявки на патент США 08/999554) и одноцепочечные антитела, включающие такую реакционноспособную часть, а также любой другой тип молекулы, в которую была физически вставлена такая реакционноспособная часть антитела. Такие молекулы можно получать с помощью любой известной методики, в том числе без ограничения ферментативного расщепления, пептидного синтеза или рекомбинантных методик.
81
Моноклональные антитела в настоящем документе включают в частности «химерные» антитела, в которых часть тяжелой и/или легкой цепи является идентичной или гомологичной соответствующим последовательностям антител, происходящих из определенного вида, или принадлежащих к определенному классу или подклассу антител, тогда как остальная часть цепи(-ей) является идентичной или гомологичной соответствующим последовательностям антител, происходящих из другого вида, или принадлежащих к другому классу или подклассу антител, а также фрагменты таких антител, при условии, что они проявляют требуемую биологическую активность (патент США № 4816567; и Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA :6851-6855 (1984)). Кроме того, для изменения определенных свойств молекулы антитела, в том числе аффинности или специфичности, можно осуществлять прививание определяющей комплементарность области (CDR). Неограничивающий пример прививания CDR раскрыт в патенте США 5225539.
Химерные антитела представляют собой молекулы, разные части которых происходят из разных видов животных, как, например, таковые, содержащие происходящую из mAb мыши вариабельную область и константную область иммуноглобулина человека. Антитела, которые содержат остатки каркасного участка вариабельной области главным образом из антитела человека (называемого акцепторным антителом) и CDR главным образом из антитела мыши (называемого донорным антителом) также называют гуманизированными антителами. Химерные антитела применяют прежде всего для снижения иммуногенности при применении и для увеличения выхода при получении, например, в случае, когда mAb мыши продуцируются гибридомами с более высоким выходом, но характеризуются более высокой иммуногенностью у людей, вследствие чего применяют химерные mAb человека/мыши. Химерные антитела и способы их получения известны в данной области (например, заявки на патент согласно PCT WO 86/01533, WO 97/02671, WO 90/07861, WO 92/22653 и патенты США 5693762, 5693761, 5585089, 5530101 и 5225539).
В соответствии с некоторыми конкретными вариантами осуществления моноклональное антитело представляет собой химерное моноклональное антитело.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления химерное антитело содержит константные области человеческого происхождения.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления константные области человека химерного антитела выбраны из группы, состоящей из: IgG1 человека, IgG2 человека, IgG3 человека и IgG4 человека.
В соответствии с конкретным вариантом осуществления химерное моноклональное антитело или его фрагмент содержат константную область подкласса IgG1 человека.
В соответствии с конкретным вариантом осуществления предусмотрено химерное моноклональное антитело, которое распознает PVR, содержащее набор из шести CDR, выбранный из группы, состоящей из: (i) SEQ ID NO: 4 или 80, 6 или 81, 8 или 82, 12, 14 и 16; (ii) SEQ ID No: 20 или 83, 22, 24, 28, 30 и 32; и (iii) SEQ ID No: 36 или 84, 38, 40, 44 или 85, 46 и 48.
Фармакология
В фармацевтических и лекарственных составах активное средство предпочтительно используют вместе с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями и необязательно любыми другими терапевтическими ингредиентами. Носитель(-и) должен(-ны) быть фармацевтически приемлемым(-и) в том смысле, что он(они) совместим(-ы) с другими ингредиентами состава и не является(-ются) излишне вредным(-и) для соответствующего реципиента. Активное средство предусмотрено в количестве, эффективном для достижения требуемого фармакологического эффекта, как описано выше, и в дозе, подходящей для достижения требуемой экспозиции.
Обычно антитела и фрагменты и конъюгаты на их основе по настоящему изобретению, содержащие антигенсвязывающую часть антитела или содержащие другой полипептид, в том числе пептидомиметик, будут суспендированы в стерильном солевом растворе для терапевтических применений. Фармацевтические композиции в качестве альтернативы могут быть составлены с возможностью контролируемого высвобождения активного ингредиента (молекулы, содержащей антигенсвязывающую часть антитела) или для продления его пребывания в организме пациента. Известно множество подходящих систем доставки лекарственного средства, и они включают, например, имплантируемые системы с возможностью высвобождения лекарственного средства, гидрогели, гидроксиметилцеллюлозу, микрокапсулы, липосомы, микроэмульсии, микросферы и т. д. Препараты с контролируемым высвобождением можно получать путем применения полимеров для адсорбции молекулы в соответствии с настоящим изобретением или связывания ее в комплекс. Например, биологически совместимые полимеры включают матрицы из сополимера этилена и винилацетата и матрицы из полиангидридного сополимера димера стеариновой кислоты и себациновой кислоты. Скорость высвобождения молекулы в соответствии с настоящим изобретением, т. е. антитела или фрагмента антитела, из такой матрицы зависит от молекулярной массы молекулы, количества молекулы в составе матрицы и размера диспергированных частиц.
Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно вводить любым подходящим способом, например, перорально, местно, интраназально, подкожно, внутримышечно, внутривенно, внутриартериально, внутрисуставно, внутриочагово, внутриопухолево или парентерально. Как правило, для доставки антител применяют внутривенное (i.v.) введение.
Специалистам в данной области будет понятно, что терапевтически эффективное количество молекулы в соответствии с настоящим изобретением будет зависеть, среди прочего, от схемы введения, разовой дозы вводимой молекула, от того, вводят ли молекулу в комбинации с другими терапевтическими средствами, иммунного статуса и состояния здоровья пациента, терапевтической активности вводимой молекулы, ее устойчивости в системе кровообращения и мнения лечащего врача.
В контексте настоящего документа термин «терапевтически эффективное количество» относится к количеству лекарственного средства, эффективному для лечения заболевания или нарушения у млекопитающего. В случае рака терапевтически эффективное количество лекарственного средства может обеспечивать уменьшение числа клеток рака; уменьшение размера опухоли; ингибирование (т. е. замедление до некоторой степени, и предпочтительно остановку) инфильтрации клеток рака в периферические органы; ингибирование (т. е. замедление до некоторой степени, и предпочтительно остановку) метастазирования опухоли; ингибирование, до некоторой степени, роста опухоли; и/или облегчение, до некоторой степени, одного или нескольких из ассоциированных с нарушением симптомов. Если лекарственное средство может обеспечивать предупреждение роста и/или уничтожение имеющихся клеток рака, его можно считать цитостатическим и/или цитотоксическим. В случае терапии рака эффективность in vivo может быть измерена, например, с помощью оценки продолжительности выживания, время до прогрессирования заболевания (TTP), показателей частоты ответа (RR), продолжительности ответа и/или качества жизни.
Рак, поддающаяся лечению с применением настоящего изобретения, включает без ограничения: карциному, лимфому, бластому, саркому и лейкоз или формы лимфонеоплазии. Более конкретные примеры таких злокачественных опухолей включают плоскоклеточный рак, рак легкого (в том числе мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, аденокарциному легкого и плоскоклеточную карциному легкого), злокачественную опухоль брюшины, гепатоцеллюлярный рак, рак желудка или злокачественную опухоль желудка (в том числе злокачественную опухоль желудочно-кишечного тракта), рак поджелудочной железы, глиобластому, рак шейки матки, рак яичника, злокачественную опухоль печени, рак мочевого пузыря, гепатому, рак молочной железы, рак толстой кишки, рак толстой и прямой кишки, карциному эндометрия или матки, карциному слюнных желез, злокачественную опухоль или рак почки, злокачественную опухоль печени, рак предстательной железы, рак вульвы, злокачественную опухоль щитовидной железы, карциному печени и различные типы рака головы и шеи, а также B-клеточную лимфому (в том числе неходжкинскую лимфому (NHL) низкой степени злокачественности/фолликулярную неходжкинскую лимфому; мелкоклеточную лимфоцитарную (SL) NHL; NHL промежуточной степени злокачественности/фолликулярную NHL; диффузную NHL промежуточной степени злокачественности; иммунобластную NHL высокой степени злокачественности; лимфобластную NHL высокой степени злокачественности; NHL с клетками с нерасщепленным ядром высокой степени злокачественности; NHL с массивным поражением лимфатических узлов; лимфому из клеток маргинальной зоны; СПИД-ассоциированную лимфому; и макроглобулинемию Вальденстрема); хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL); острый лимфобластный лейкоз (ALL); волосатоклеточный лейкоз; хронический миелобластный лейкоз; и посттрансплантационное лимфопролиферативное заболевание (PTLD), а также аномальную пролиферацию клеток сосудов, ассоциированную с факоматозами, отек (например, таковой, ассоциированный с опухолями головного мозга) и синдром Мейгса. Предпочтительно рак выбран из группы, состоящей из рака молочной железы, рака толстой и прямой кишки, рака прямой кишки, немелкоклеточного рака легкого, неходжкинской лимфомы (NHL), почечно-клеточного рака, рака предстательной железы, рака печени, рака поджелудочной железы, саркомы мягких тканей, саркомы Капоши, карциноидной опухоли, рака головы и шеи, меланомы, рака яичника, мезотелиомы и множественной миеломы. Раковые состояния, поддающиеся лечению по настоящему изобретению, включают метастатические злокачественные опухоли.
В соответствии с другими вариантами осуществления фармацевтическая композиция в соответствии с настоящим изобретением предназначена для применения в лечении рака, характеризующейся сверхэкспрессией PVR. Связанные со сверхэкспрессией PVR типы злокачественных опухолей могут быть идентифицированы с применением известных баз данных, таких как Атлас ракового генома (The Cancer Genome Atlas, TCGA). В соответствии с определенными вариантами осуществления рак выбран из группы, состоящей из адренокортикальной карциномы (ACC), хромофобного почечно-клеточного рака (KICH), гепатоцеллюлярной карциномы печени (LIHC), аденокарциномы толстой и прямой кишки (COAD, READ), аденокарциномы протоков поджелудочной железы (PAAD), феохромоцитомы и параганглиомы (PCPG), папиллярной карциномы почки (KIRP), аденокарциномы легкого (LUAD), плоскоклеточной карциномы головы и шеи (HNSC), аденокарциномы предстательной железы (PRAD), карциномы эндометрия тела матки (UCEC), рака шейки матки (CESC), меланомы кожи (SKCM), мезотелиомы (MESO), уротелиального рака мочевого пузыря (BLCA), светлоклеточной карциномы почки (KIRC), плоскоклеточной карциномы легкого (LUSC), карциносаркомы матки (UCS), саркомы (SARC), серозной цистаденокарциномы яичника (OV), папиллярной карциномы щитовидной железы (THCA), мультиформной глиобластомы (GBM), рака молочной железы (BRCA), глиомы низкой степени злокачественности (LGG) и диффузной В-крупноклеточной лимфомы (DLBC). Каждый вариант представляет собой отдельный вариант осуществления настоящего изобретения.
Молекулы по настоящему изобретению в качестве активных ингредиентов растворяют, диспергируют или подмешивают во вспомогательное вещество, которое является фармацевтически приемлемым и совместимым с активным ингредиентом, как хорошо известно. Подходящими вспомогательными веществами являются, например, вода, солевой раствор, забуференный фосфатом солевой раствор (PBS), декстроза, глицерин, этанол и т. д. и их комбинации. Другие подходящие носители хорошо известны специалистам в данной области. Кроме того, при необходимости, композиция может содержать незначительные количества вспомогательных веществ, таких как смачивающие или эмульгирующие средства, средства, поддерживающие pH в определенном диапазоне.
Фармацевтическую композицию в соответствии с настоящим изобретением можно вводить вместе с антинеопластической композицией.
Термин «лечение» в контексте настоящего документа относится как к терапевтическому лечению, так и к профилактическим или превентивным мерам. Нуждающиеся в лечении включают таковых с уже существующим нарушением, а также таковых, у которых нарушение подлежит предупреждению.
Термины «рак» и «злокачественный» относятся к или описывают физиологическое состояние у млекопитающих, которое обычно характеризуются неконтролируемым ростом клеток. К примерам рака относятся без ограничения карцинома, лимфома, бластома, саркома и лейкоз. Более конкретные примеры таких злокачественных опухолей включают меланому, рак легкого, злокачественную опухоль щитовидной железы, рак молочной железы, толстой кишки, предстательной железы, печени, мочевого пузыря, почки, шейки матки, поджелудочной железы, лейкоз, лимфому, миелоидное новообразование, рак яичника, злокачественную опухоль матки, саркому, злокачественную опухоль билиарной системы или злокачественную опухоль эндометрия.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления способ лечения рака предусматривает введение фармацевтической композиции как части схемы лечения, предусматривающей введение по меньшей мере одного дополнительного противоракового средства.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления противораковое средство выбрано из группы, состоящей из антиметаболита, ингибитора митоза, таксана, ингибитора топоизомеразы, ингибитора топоизомеразы II, аспарагиназы, алкилирующего средства, противоопухолевого антибиотика и их комбинаций. Каждый вариант представляет собой отдельный вариант осуществления настоящего изобретения.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления антиметаболит выбран из группы, состоящей из цитарабина, флударабина, фторурацила, меркаптопурина, метотрексата, тиогуанина, гемцитабина и гидроксимочевины. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления ингибитор митоза выбран из группы, состоящей из винкристина, винбластина и винорелбина. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления ингибитор топоизомеразы выбран из группы, состоящей из топотекана и иренотекана. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления алкилирующее средство выбрано из группы, состоящей из бусульфана, кармустина, ломустина, хлорамбуцила, циклофосфамида, цисплатина, карбоплатина, ифосфамида, хлорметина, мелфалана, тиотепы, дакарбазина и прокарбазина. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления противоопухолевый антибиотик выбран из группы, состоящей из блеомицина, дактиномицина, даунорубицина, доксорубицина, идарубицина, митомицина, митоксантрона и пликамицина. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления ингибитор топоизомеразы II выбран из группы, состоящей из этопозида и тенипозида. Каждый вариант представляет собой отдельный вариант осуществления настоящего изобретения.
В соответствии с некоторыми конкретными вариантами осуществления дополнительное противораковое средство выбрано из группы, состоящей из бевацизумаба, карбоплатина, циклофосфамида, доксорубицина гидрохлорида, гемцитабина гидрохлорида, топотекана гидрохлорида, тиотепы и их комбинаций. Каждый вариант представляет собой отдельный вариант осуществления настоящего изобретения.
Моноклональные антитела в соответствии с настоящим изобретением можно применять как часть комбинированной терапии по меньшей мере с одним противораковым средством. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления дополнительное противораковое средство представляет собой иммуномодулятор, активированный лимфоцит, ингибитор киназы или химиотерапевтическое средство.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления противораковое средство представляет собой иммуномодулятор, будь то агонист или антагонист, такой как антитело к молекуле, являющейся контрольной точкой иммунного ответа.
Было доказано, что иммунотерапия с блокированием контрольных точек является перспективной мерой в рамках лечения рака. Сигнальные пути с участием контрольных точек иммунного ответа состоят из ряда костимулирующих и ингибирующих молекул, которые функционируют согласованно с целью поддержания аутотолерантности и защиты тканей от повреждения иммунной системой в физиологических условиях. Опухоли используют преимущество определенных сигнальных путей с участием контрольных точек с целью уклонения от иммунной системы. Следовательно, ингибирование таких сигнальных путей оказалось многообещающей стратегией противоракового лечения.
Антитело к ассоциированному с цитотоксическими T-лимфоцитами белку 4 (CTLA-4) ипилимумаб (одобрено в 2011 году) было первым иммунотерапевтическим средством, для которого была показана польза от лечения для пациентов со злокачественными опухолями. Указанное антитело препятствует ингибирующим сигналам в процессе представления антигена T-клеткам. Антитело к белку 1 запрограммированной гибели клеток (PD-1) пембролизумаб (одобрено в 2014 году) блокирует передачу сигнала с участием экспрессируемого T-клетками рецептора PD-1, обеспечивающего отрицательную регуляцию иммунного ответа. Дополнительное средство, связывающееся с PD-1, было зарегистрировано регуляторными органами в 2014 году для лечения немелкоклеточного рака легкого (NSCLC). В рамках активных исследований на сегодняшний день изучают множество других контрольных точек иммунного ответа, среди которых: CEACAM1, NKG2A, B7-H3, B7-H4, VISTA, CD112R, ген 3 активации лимфоцитов (LAG3), CD137, OX40 (также называемый CD134) и иммуноглобулин-подобные рецепторы клеток-киллеров (KIR).
В соответствии с некоторыми конкретными вариантами осуществления иммуномодулятор выбран из группы, состоящей из: антитела, ингибирующего CTLA-4, антитела к белку 1 запрограммированной гибели клеток (PD-1) человека, антитела к PD-L1 и PD-L2, активированного цитотоксического лимфоцита, средства, активирующего лимфоциты, антитела к CEACAM, антитела к TIGIT и ингибитора сигнального пути RAF/MEK. Каждый вариант представляет собой отдельный вариант осуществления настоящего изобретения. В соответствии с некоторыми конкретными вариантами осуществления дополнительный иммуномодулятор выбран из mAb к PD-1, mAb к PD-L1, mAb к PD-L2, mAb к CEACAM1, mAb к CTLA-4, mAB к TIGIT, интерлейкина 2 (IL-2) или лимфокин-активированной клетки-киллера (LAK).
В соответствии с другими вариантами осуществления дополнительное противораковое средство представляет собой химиотерапевтическое средство. Химиотерапевтическое средство, которое можно вводить вместе с антителом в соответствии с настоящим изобретением, или отдельно, может предусматривать любое такое средство, известное в данной области, проявляющее противораковую активность, включая без ограничения: митоксантрон, ингибиторы топоизомеразы, веретенный яд из барвинка: винбластин, винкристин, винорелбин (taxol), паклитаксел, доцетаксел; алкилирующие средства: хлорметин, хлорамбуцил, циклофосфамид, мелфалан, ифосфамид; метотрексат; 6-меркаптопурин; 5-фторурацил, цитарабин, гемцитабин; подофиллотоксины: этопозид, иринотекан, топотекан, дакарбазин; антибиотики: доксорубицин (адриамицин), блеомицин, митомицин; нитрозомочевины: кармустин (BCNU), ломустин, эпирубицин, идарубицин, даунорубицин; неорганические ионы: цисплатин, карбоплатин; интерферон, аспарагиназу; гормоны: тамоксифен, лейпрорелин, флутамид и мегестрол ацетат.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления химиотерапевтическое средство выбрано из алкилирующих средств, антиметаболитов, аналогов фолиевой кислоты, аналогов пиримидина, аналогов пурина и соответствующих ингибиторов, алкалоидов барвинка, эпиподофиллотоксинов, антибиотиков, L-аспарагиназы, ингибитора топоизомеразы, интерферонов, координационных комплексов платины, мочевины, замещенной антрацендионом, производных метилгидразина, препарата, подавляющего синтез гормонов коры надпочечников, адренокортикостероидов, прогестинов, эстрогенов, антиэстрогена, андрогенов, антиандрогена и аналога гонадолиберина. В соответствии с другим вариантом осуществления химиотерапевтическое средство выбрано из группы, состоящей из 5-фторурацила (5-FU), лейковорина (LV), иренотекана, оксалиплатина, капецитабина, паклитаксела и доцетаксела. Можно применять одно или несколько химиотерапевтических средств.
Согласно некоторым вариантам осуществления фармацевтическая композиция в соответствии с настоящим изобретением предназначена для применения в лечении рака или для применения в усилении иммунного ответа.
Термин «усиление иммунного ответа» относится к повышению реактивности иммунной системы и индуцированию или пролонгированию ее памяти. Фармацевтическую композицию в соответствии с настоящим изобретением можно применять для стимуляции иммунной системы в результате вакцинации. Таким образом, согласно одному варианту осуществления фармацевтическую композицию можно применять для увеличения эффективности вакцинации.
Согласно определенным вариантам осуществления рак выбран из рака легкого, рака щитовидной железы, рака молочной железы, рака толстой кишки, меланомы, рака предстательной железы, печени, мочевого пузыря, почки, шейки матки, поджелудочной железы, лейкоза, лимфомы, миелоидного новообразования, рака яичника, рака матки, саркомы, рака билиарной системы и рака из клеток эндометрия. Каждый вариант представляет собой отдельный вариант осуществления настоящего изобретения.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления фармацевтическую композицию, содержащую по меньшей мере одно антитело или его фрагмент в соответствии с настоящим изобретением, и фармацевтическую композицию, содержащую дополнительный иммуномодулятор или ингибитор киназы, применяют в лечении рака путем раздельного введения.
В соответствии с еще одним аспектом настоящее изобретение относится к способу лечения рака у нуждающегося в этом субъекта, предусматривающему введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества моноклонального антитела или фрагмента антитела в соответствии с настоящим изобретением.
Термин «эффективное количество» в контексте настоящего документа относится к достаточному количеству моноклонального антитела или фрагмента антитела, которое при введении субъекту будет оказывать предполагаемый терапевтический эффект. Эффективное количество, требуемое для достижения терапевтического конечного результата, может зависеть от ряда факторов, в том числе, например, конкретного типа опухоли и тяжести состояния пациента, и от того, применяют ли комбинацию дополнительно совместно с облучением. Эффективное количество (доза) активных средств в контексте настоящего изобретения должно быть достаточным для обеспечения благоприятного терапевтического ответа у субъекта в течение продолжительного периода, включая без ограничения ингибирование роста опухоли, снижение скорости роста опухоли, предупреждение роста опухоли и метастазирования и повышенную выживаемость.
Токсичность и терапевтическая эффективность описанных в настоящем документе композиций могут быть определены с помощью стандартных фармацевтических процедур в культурах клеток или у подопытных животных, например, путем определения IC50 (концентрация, которая обеспечивает 50% ингибирование) и максимальной переносимой дозы для изучаемого соединения. Данные, полученные на основе таких анализов с использованием культур клеток и исследований на животных, можно применять при составлении дозировок для применения у людей. Дозировка может варьироваться в зависимости от, среди прочего, используемой лекарственной формы, выбранного режима дозирования, композиции средств, применяемых для лечения, и используемого пути введения, в числе других соответствующих факторов. Точный состав, путь введения и дозировка могут быть выбраны лечащим врачом с учетом состояния пациента. В зависимости от тяжести и отвечаемости подлежащего лечению состояния дозирование может также представлять собой однократное введение композиции с медленным высвобождением препарата, при этом курс лечения длится от нескольких дней до нескольких недель или до тех пор, пока не будет достигнуто излечение или облегчение течения заболевания. Количество вводимой композиции будет зависеть, как уже упоминалось, от подлежащего лечению субъекта, тяжести болезни, способа введения, мнения лечащего врача и всех других соответствующих факторов.
Термин «применение» или «введение» вещества, соединения или средства субъекту предусматривает осуществление с применением одного из ряда способов, известных специалистам в данной области. Например, соединение или средство можно вводить энтерально или парентерально. Термин «энтерально» относится к введению через желудочно-кишечный тракт, в том числе перорально, сублингвально или ректально. Парентеральное введение включает введение внутривенно, внутрикожно, внутримышечно, внутрибрюшинно, подкожно, в глаза, сублингвально, интраназально, путем ингаляции, интраспинально, интрацеребрально и чрескожно (за счет поглощения, например, через протоки кожных желез). Соединение или средство также подходящим образом можно вводить с применением перезагружаемых или биоразлагаемых изделий на основе полимеров или других изделий, например, пластырей и насосов, или составов, которые обеспечивают продолжительное, медленное или контролируемое высвобождение соединения или средства. Введение также можно осуществлять, например, однократно, множество раз и/или в течение одного или нескольких длительных периодов. Согласно некоторым вариантам осуществления введение включает как прямое введение, в том числе самостоятельное введение, так и косвенное введение, в том числе протокол назначения лекарственного средства. Например, в контексте настоящего документа считается, что врач, который дает указания пациенту касательно самостоятельного введения лекарственного средства, или касательно введения лекарственного средства иным лицом, и/или который предоставляет пациенту назначение лекарственного средства, вводит лекарственное средство пациенту.
Антитела обычно вводят в концентрации в диапазоне от приблизительно 0,1 до приблизительно 20 мг/кг веса пациента, как правило, от приблизительно 0,5 до приблизительно 10 мг/кг, и зачастую от приблизительно 1 до приблизительно 5 мг/кг. В этом отношении предпочтительным является применение антител с временем полужизни в кровотоке по меньшей мере 12 часов, предпочтительно по меньшей мере 4 дня, более предпочтительно до 21 дня. Ожидается, что время полужизни в кровотоке химерных антител составляет до 14-21 дня. В некоторых случаях преимущественным может быть введение большой нагрузочной дозы с последующими периодичными (например, раз в неделю) поддерживающими дозами в течение периода лечения. Антитела также могут быть доставлены с применением систем доставки с медленным высвобождением, насосов и других известных систем доставки для непрерывной инфузии.
Термин «приблизительно» означает, что для конкретного значения следует принимать во внимание приемлемый диапазон погрешностей, например, до 5% или 10%.
Ангиогенез
В соответствии с одним аспектом настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции в соответствии с настоящим изобретением для применения в лечении ассоциированного с ангиогенезом заболевания или нарушения.
Ангиогенез представляет собой важное клеточное событие, при котором эндотелиальные клетки сосудов пролиферируют, подвергаются упрощению и реорганизации с образованием новых сосудов из предшествующих сосудистых сетей. Имеются убедительные доказательства того, что развитие кровоснабжения является крайне необходимым для нормальных и патологических процессов пролиферации и воспаления. Сосудистый компартмент необходим не только для развития органов и дифференцировки в процессе эмбриогенеза, но также для заживления ран, восстановления тканей и репродуктивной функции у взрослого организма.
Ангиогенез также вовлечен в патогенез ряда нарушений, включая без ограничения опухоли, ретинопатии, ассоциированные с пролиферацией, возрастную макулодистрофию, ревматоидный артрит и псориаз. Ангиогенез крайне важен для роста большинства первичных опухолей и, впоследствии, их метастазов. Опухоли могут поглощать достаточное количество питательных веществ и кислорода путем простой диффузии, пока их размер не достигнет 1-2 мм, после чего для их дальнейшего роста требуется формирование кровоснабжения. Полагают, что этот процесс включает вовлечение соседних участков зрелой сосудистой системы организма-хозяина для начала прорастания новых кровеносных сосудов в виде капилляров, которые растут в направлении опухолевой массы, и, впоследствии, проникают в нее. Кроме того, ангиогенез опухоли включает вовлечение циркулирующих в кровотоке предшественников эндотелиальных клеток из костного мозга для содействия неоваскуляризации.
Диагностика
В настоящем изобретении дополнительно раскрыты способы диагностирования и определения прогноза рака.
В соответствии с одним аспектом настоящее изобретение относится к способу диагностирования и/или определения прогноза рака или инфекционного заболевания у субъекта, причем способ предусматривает стадию определения уровня экспрессии PVR в биологическом образце от указанного субъекта с применением по меньшей мере одного антитела, как описано в настоящем документе.
Термин «биологический образец» охватывает различные типы образцов, полученных от организма, которые можно применять в диагностическом или мониторинговом анализе. Термин охватывает образцы крови и других жидкостей биологического происхождения, образцы солидных тканей, такие как биоптат, или культуры тканей или клеток, происходящие из них и являющиеся их потомками. Кроме того, термин может охватывать циркулирующие в кровотоке клетки опухоли или другие клетки. Термин, в частности, охватывает клинический препарат, и дополнительно включает клетки в культуре клеток, клеточные супернатанты, клеточные лизаты, сыворотку крови, плазму крови, мочу, амниотическую жидкость, биологические жидкости, в том числе внутриглазную жидкость и жидкость стекловидного тела для образцов биологического материала глаз, и образцы ткани. Термин также охватывает образцы, с которыми проводили какие-либо манипуляции после получения, например, обработку определенными реагентами, солюбилизацию или обогащение определенными компонентами.
Определение уровня экспрессии PVR можно осуществлять с применением меченного антитела к PVR, как описано в настоящем документе. Определение экспрессии можно осуществлять, например, с помощью ELISA.
Способ по настоящему изобретению может дополнительно предусматривать стадию сравнения указанного уровня экспрессии с контрольным уровнем.
Следующие примеры представлены для более полной иллюстрации некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения. Они никоим образом не должны истолковываться как ограничивающие объем настоящего изобретения.
Примеры
Процедуры экспериментов
Ниже приведены следующие примеры, которые вместе с вышеприведенными описаниями иллюстрируют настоящее изобретение неограничивающим образом.
В общем случае терминология, применяемая в настоящем документе, и лабораторные процедуры, используемые в настоящем изобретении, предусматривают молекулярные, биохимические, микробиологические методики и методики рекомбинантных ДНК. Такие методики хорошо известны в данной области. Другие общие ссылки, относящиеся к хорошо известным процедурам, представлены в настоящем документе для удобства читателя.
Пример 1. Высокий уровень экспрессии PVR коррелирует с неблагоприятным прогнозом.
PVR и Nectin-2 являются лигандами ингибирующего рецептора TIGIT (фиг. 2). Из результатов видно, что высокие уровни экспрессии PVR коррелировали с неблагоприятным прогнозом для рака в случае рака легкого, рака молочной железы и липосаркомы (фигуры 1A-C соответственно). Корреляцию экспрессии PVR согласно GEO с выживанием определяли с помощью bioprofiling.de, при этом релевантные массивы данных представляют собой ID: GSE31210, GSE25055, GSE30929. Кроме того, с применением этого же анализа было определено, что экспрессия Nectin-2 была, главным образом, положительным маркером выживаемости.
Пример 2. Получение и очистка mAb к PVR.
С целью получения антител к PVR получали и очищали рекомбинантный белок, hPVR-Fc, который объединяет внеклеточную часть PVR человека и Fc-область человека иммуноглобулина G-носителя в качестве иммуногена.
Мышам BALB/c путем инъекции вводили 50 мкг иммуногена в полном адъюванте Фрейнда, а спустя 2 недели – в неполном адъюванте Фрейнда. Через 2 недели сыворотку крови подвергали скринингу в отношении титра антител. Мышей с наилучшим ответом (сыворотку крови отслеживали с помощью ELISA-анализа на предмет титра антител к hPVR-Fc) подвергали повторной стимуляции иммуногеном в PBS. Спустя три дня собирали клетки селезенки, и после лизиса эритроцитов, сливали с клетками SP2/0. Клетки высевали в 20% среду RPMI 1640, содержащую гипоксантин, аминоптерин и тимидин для отбора гибридом, и подвергали скринингу в отношении продукции mAb с применением ELISA. Стабильные линии клеток гибридомы получали путем слияния клеток миеломы SP2/0 с клетками селезенки иммунизированной мыши.
Положительные результаты (линии клеток, секретирующие антитела, которые распознают hPVR-Fc) дополнительно подвергали отбору для выявления продукта, который будет обладать несколькими отличительными характеристиками: a) высокий выход для снижения стоимости производства антител; b) отсутствие перекрестной реактивности между PVR мыши и человека и несколькими другими лигандами рецепторов иммунной клетки; c) сильная связывающая способность в отношении нативных зрелых молекул PVR человека, экспрессируемых на поверхности живых клеток (антитела были выбраны из общего пула моноклональных антител к hPVR с доказанной способностью к распознаванию hPVR при проведении разных методик, например, проточной цитометрии, вестерн-блоттинга, ELISA). В действительности, PVR человека и мыши характеризуется высоким уровнем гомологии, и непросто получить моноклональное антитело мыши, которое распознает гомолог человека. Что еще более важно, PVR человека обширно гликозилирован в его внеклеточной области. Ввиду этих причин непросто получить антитело, которое распознает нативный белок, с применением обычных антигенов (как, например, таковых, полученных из E. coli).
Авторы настоящего изобретения применяли иммуноген hPVR-Fc, молекулу, продуцируемую в клетках млекопитающих, представляющих собой клетки эмбриональной почки человека 293 (HEK 293T), и очищали в нативных условиях с помощью иммуноаффинной хроматографии, с целью близкой имитации нативного белка, PVR человека. В заключение, из пула полученных mAb к hPVR были идентифицированы представители, которые распознают нативную форму PVR человека на поверхности живых клеток, что является необходимым условием для разработки производного, которое будет воздействовать на ответ иммунной клетки человека в ходе лечения.
Было получено четыре антитела к PVR. Из них три антитела представляли собой блокирующие mAb к PVR, а именно антитело 5B9 (также называемое hPVR.09), антитело 7D4 (также называемое hPVR.01) и антитело 4E5 (также называемое hPVR.07). Все из этих антител блокируют связывание TIGIT-Ig (как проиллюстрировано на фигурах 3B-D соответственно). Было получено четвертое антитело, которое не блокирует связывание TIGIT-Ig, и оно было названо 2G3 (также называемое hPVR.17) (фиг. 3A).
D
Метод поверхностного плазмонного резонанса (SPR) Biosensor Biacore™ T100 (GE Healthcare) применяли для определения Koff, Kon и K для взаимодействий антител и hPVR (таблица 1).
Таблица 1. Измерение аффинности антител с помощью Biacore
™
<b>mAB</b>
<b>Аффинность</b>
4E5
7,22E<sup>-10</sup>
5B9
1,62E<sup>-09</sup>
7D4
1,93E<sup>-10</sup>
Химерные моноклональные антитела, содержащие константную область тяжелой цепи IgG1 человека, изложенную в SEQ ID NO: 86 (в соответствии с GenBank: AAA02914.1), получали из вышеприведенных трех антител с применением известных в данной области способов.
Пример 3. Блокирование взаимодействий PVR-TIGIT с помощью mAb к PVR повышало степень уничтожения NK-клетками линий клеток человека.
За 12 часов до анализа целевые клетки метили [35S]-метионином. Указанные антитела добавляли в конченой концентрации 5 мкг/мл и инкубировали с меченными мишенями (5000 клеток/лунку) в течение 30 минут на льду. Анализы осуществляли в среде RPMI в 96-луночных планшетах с лунками с U-образным дном при 37ºC в течение 5 часов. Меченные мишени инкубировали с эффекторными NK-клетками при соотношении E:T 10:1. После инкубации планшеты центрифугировали (1600 об./мин., 5 мин., 4ºC) и супернатанты (50 мкл) собирали и переносили в непрозрачные планшеты Opti-plates (Packard). Добавляли 150 мкл сцинтилляционной жидкости (Perkin Elmer) и анализировали с помощью β-счетчика MicroBeta (Perkin Elmer). Максимальный уровень мечения определяли путем добавления 100 мкл 0,1 N NaOH к равному количеству мишеней (5000/лунку). Спонтанное высвобождение определяли в лунках, содержащих только целевые клетки. Конечный показатель специфического уничтожения рассчитывали следующим образом: ((показание радиоактивности - спонтанное высвобождение)/(максимальный уровень мечения - спонтанное высвобождение))*100 = специфическое уничтожение. Как показано на фиг. 4, культивирование NK-клеток с mAb к PVR 7D4 (также называемым hPVR.01) усиливало степень уничтожения (в два раза) NK-клетками линии клеток аденокарциномы молочной железы человека MDA-MB-231.
Пример 4. Блокирование взаимодействий PVR-TIGIT с помощью mAb к PVR повышало степень уничтожения NK-клетками линий клеток рака человека.
За 12 часов до анализа целевые клетки метили [35S]-метионином. Указанные антитела добавляли в конченой концентрации 5 мкг/мл и инкубировали с меченными мишенями (5000 клеток/лунку) в течение 30 минут на льду. Клетки инкубировали с эффекторными NK-клетками при соотношении E:T 10:1. Анализы осуществляли в среде RPMI в 96-луночных планшетах с лунками с U-образным дном при 37ºC в течение 5 часов. После инкубации планшеты центрифугировали (1600 об./мин., 5 мин., 4ºC) и супернатанты (50 мкл) собирали и переносили в непрозрачные планшеты Opti-plates (Packard). Добавляли 150 мкл сцинтилляционной жидкости (Perkin Elmer) и анализировали с помощью β-счетчика MicroBeta (Perkin Elmer). Максимальный уровень мечения определяли путем добавления 100 мкл 0,1 N NaOH к равному количеству мишеней (5000/лунку). Спонтанное высвобождение определяли в лунках, содержащих только целевые клетки. Конечный показатель специфического уничтожения рассчитывали следующим образом: ((показание радиоактивности - спонтанное высвобождение)/(максимальный уровень мечения - спонтанное высвобождение))*100 = специфическое уничтожение.
Как показано на фиг. 5, блокирование взаимодействий PVR-TIGIT с помощью mAb к PVR 4E5 (также называемого hPVR.07) повышает степень уничтожения NK-клетками линии клеток рака человека HepG2 (гепатоцеллюлярная карцинома). Таким образом, очевидно, что блокирование PVR обеспечивает повышенную степень уничтожения целевых клеток. Степень уничтожения дополнительно повышалась при применении аналога IgG человека 4E5 в виде химерной версии mAb. Степень уничтожения является эквивалентной таковой для положительного контроля (Erbitux©).
Пример 5. Линии клеток опухоли человека экспрессируют PVR и Nectin-2.
С целью изучения экспрессии PVR и Nectin-2 на поверхности опухолевых клеток уровни экспрессии этих белков в разных линиях клеток опухоли изучали с помощью FACS-анализа с применением Ab к PVR-4E5 и Ab к Nectin-2 (клон TX-31), оба в концентрации 2 мкг/мл. Как показано на фигурах 6A-O, различные линии клеток опухоли человека экспрессируют PVR и Nectin-2. В частности, показано, что клетки меланомы (фигуры 6A-E), клетки рака молочной железы (фигуры 6F-H), клетки рака толстой и прямой кишки (фиг. 6I), клетки рака почки (фиг. 6J), клетки рака легкого (фиг. 6K), клетки рака предстательной железы (фиг. 6L), клетки опухоли головного мозга (фиг. 6M) и клетки гепатоцеллюлярной карциномы (фигуры 6N-O) все экспрессируют PVR и Nectin-2.
Пример 6. PVR является основным лигандом TIGIT.
На фигурах 7A-7C продемонстрировано, что PVR является основным лигандом TIGIT. В частности, было показано, что клетки HepG2 (клетки гепатоцеллюлярной карциномы человека) экспрессируют как PVR, так и Nectin-2 (фиг. 7A). Культивирование клеток HepG2 с очищенным mAb к PVR 4E5, также называемым hPVR.07 (0,15 мкг/лунку), обеспечивало практически полное блокирование связывания TIGIT-Ig (2мкг/мл) (фиг. 7B), независимо от того факта, что эти клетки также экспрессируют Nectin-2. Как показано на фиг. 7C и 7D, очевидно, что прямого распознавания Nectin-2 mAb к PVR не происходило.
Пример 7. Связывание клонов mAb с PVR человека и примата.
5
Как показано на фигурах 8A-C, все тестируемые клоны антитела к PVR связываются с PVR человека (hPVR), как определено с применением FACS-анализа. Вкратце, клетки трипсинизировали и переносили для окрашивания в концентрации 2 × 10 клеток на лунку. Указанные антитела на 30 мин. помещали на лед. Все антитела применяли в конечной концентрации 2 мкг/мл. Выявление связанного Ab к PVR осуществляли с применением IgG-647 к Ig мыши. В качестве отрицательного контроля применяли IgG1 мыши, каппа.
На фиг. 8A проиллюстрировано, что эндогенный hPVR выявляли с помощью FACS с окрашиванием на поверхности клеток гепатоцеллюлярной карциномы HepG2. На фиг. 8B, применяли линию клеток мыши B16. Последовательность PVR мыши отличается от таковой человека и не распознается антителами к PVR человека, как можно увидеть по отсутствию сигнала (левая панель). В случае, когда полноразмерный белок hPVR (NP_006496.4, аминокислоты 1-418) был сверхэкспрессирован в этих клетках, все три клона давали идентичный сигнал (правая панель), что дополнительно подтверждает утверждение о том, что такое окрашивание является результатом специфического связывания этих Ab с белком PVR человека.
in-silico
Аминокислотная последовательность PVR является консервативной среди некоторых видов. Аминокислотную консервативность PVR человека сравнивали с таковой у африканских зеленых мартышек , и было обнаружено, что сходство с PVR человека составляет 93%. По результатам FACS с окрашиванием клеток Vero африканской зеленой мартышки было продемонстрировано, что PVR мартышки эффективно распознается всеми тремя mAb человека (фиг. 8C). Далее было обнаружено, что такие антитела человека к PVR не распознают PVR представителя семейства псовых и грызунов, таких как хомяк или мышь. На фиг. 9 показаны результаты FACS-анализа для PVR-экспрессирующих клеток MDCK представителя семейства псовых. Как можно увидеть, ни одно из Ab к белку человека не давало положительный сигнал, тогда как экспрессия PVR сама по себе подтверждалась сильным сигналом TIGIT-Ig.
Пример 8. Nectin-2 предпочтительно связывается DNAM-1.
Согласно фигурам 10, TIGIT-Fc и DNAM-1-Fc применяли в указанных концентрациях для окрашивания клеток, сверхэкспрессирующих hNectin-2: линии клеток RPMI-8866 (фигуры 10A и 10B) или линии клеток B16-hPVR (фигуры 10C и 10D). Выявление связанного слитого белка выполняли с применением APC-меченного антитела к IgG человека и анализировали с помощью FACS.
В случае связывания PVR сигнал, обусловленный TIGIT-Fc, в 2-4 раза превышал таковой для DNAM-1-Fc, аналогично ранее опубликованным данным (Yu. X et al., 2009, Nat Immunol., 10(1):48-57). При этом связывание hNectin-2 с DNAM-1-Fc было в 2-10 раз сильнее, чем его связывание с TIGIT-Fc, что не согласовывается с результатами одной работы (Yu. X et al 2009), но подтверждается другим исследованием (Zhu Y et al., 2016, J Exp Med., 8;213(2):167-76). Вместе эти результаты показывают, что DNAM-1 является предпочтительным рецептором для связывания Nectin-2. Соответственно, блокирование PVR будет препятствовать передачи ингибирующего сигнала от TIGIT, при этом обеспечивая возможность передачи костимулирующего сигнала от DNAM-1. DNAM-1 опосредует адгезию клеток с другими клетками, несущими его лиганды.
Пример 9. Антитела к PVR обеспечивают усиление пролиферации T-клеток.
Для тестирования эффекта mAb к PVR в отношении пролиферации T-клеток мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) человека окрашивали сукцинимидиловым сложным эфиром карбоксифлуоресцеина (CFSE) и инкубировали с целевыми клетками в присутствии антител в концентрации 4 мкг/мл. Разбавление CFSE измеряли для CD45-положительных клеток спустя 5-9 дней культивирования. Как показано на фиг. 11, активность 5B9 к PVR превышает активность антител к PD-1 и CTLA4 в качестве отдельного средства. Кроме того, химерный клон 4E5hIgG1 к PVR с константной областью IgG1 человека превосходил его аналог у мыши. Далее изучили комбинированный эффект mAb к PVR и других антител, которые, как было обнаружено, обеспечивают усиление пролиферации T-клеток. PBMC человека окрашивали сукцинимидиловым сложным эфиром карбоксифлуоресцеина (CFSE) и инкубировали с целевыми клетками в присутствии антител в концентрации 4 мкг/мл. Разбавление CFSE измеряли для CD45-положительных клеток спустя 5-9 дней культивирования. Из результатов видно, что активность 5B9 к PVR в отношении пролиферации при комбинировании либо с антителом к PD-1, либо с антителом CTLA-4, превышает активность в случае комбинации PD-1 и CTLA4 (фиг. 12). Кроме того, активность комбинации 4E5 к PVR и CTLA-4 аналогична таковой комбинации PD-1 и CTLA4. Далее изучали специфическую индукцию CD8. Как показано на фиг. 13, активность антител к PVR в отношении пролиферации CD8 T-клеток превышает активность PD1. Кроме того, активность антитела 5B9 к PVR в отношении индукции превышает таковую CTLA1. Для разных антител оценивали соотношение пролиферации CD8/CD4 клеток (фиг. 14). 5B9 к PVR характеризовалось наиболее высоким CD8/CD4-соотношением. Последовательность ДНК вариабельной области тяжелых и легких цепей применяли для конструирования химерных антител, содержащих константные домены изотипа IgG1 человека и константный домен легкой (CL) каппа-цепи IgG человека. Пролиферацию T-клеток, индуцированную химерными аналогами антител мыши и человека, измеряли с помощью анализа с использованием CFSE. Представленные в таблице 2 числа отображают относительный уровень пролиферации по сравнению с контролем.
Таблица 2. Краткое описание эффекта антител к PVR в отношении пролиферации T-клеток.
Название клона
Тип Fc
Эффект в отношении пролиферации T-клеток (CFSE)
Эффект в отношении пролиферации T-клеток, количество клеток
<b>4E5</b>
IgG1 мыши
198%
320%
IgG1 человека
275%
353%
<b>5B9</b>
IgG1 мыши
300%
410%
IgG1 человека
270%
364%
<b>7D4</b>
IgG1 мыши
141%
260%
IgG1 человека
280%
360%
Далее изучали эффект PVR-антител в отношении дегрануляции NK-клеток. В ходе дегрануляции из NK-клеток высвобождаются цитолитические гранулы, и ассоциированный с лизосомами мембранный белок-1 (LAMP-1, CD107a), который присутствует на поверхности цитолитических гранул, транспортируется к поверхности клетки и становится доступным для связывания антителом. Этот маркер позволяет идентифицировать активированные NK-клетки. NK-клетки инкубировали с 5 разными целевыми клетками, вместе с антителами к PVR (антителами мыши и их химерными аналогами с последовательностями человека). Дегрануляцию оценивали с применением антител к CD107a.
Таблица 3. Эффект антител к PVR в отношении активности дегрануляции NK-клеток
.
Целевые клетки рака
Клон
Тип Fc
MDA-MB-231
HepG2
MV-411
Mel-624*
A549
4E5
IgG1 мыши
125%
150%
150%
120%
-
IgG1 человека
305%
260%
160%
145%
260%
5B9
IgG1 мыши
132%
160%
150%
120%
-
IgG1 человека
300%
260%
220%
145%
240%
7D4
IgG1 мыши
124%
160%
150%
115%
-
IgG1 человека
220%
200%
130%
120%
165%
*уровень экспрессии hPVR в Mel 624 является низким, следовательно, относительный эффект является низким.
Как показано в таблице 3 и на фиг. 15, для всех антител была показана активность в отношении дегрануляции NK, где химерные антитела характеризовались значительно более высокой активностью по сравнению с их соответствующими антителами мыши.
Пример 10. Антитела к PVR обеспечивают снижение выживаемости опухолевых клеток в отсутствие иммунных клеток.
Выживаемость клеток A549, U373, HCT116 и Mel-624 изучали с применением MTT-анализа выживаемости клеток в присутствии 50 микрограмм/мл разных mAb к PVR на протяжении 24 часов. Как показано на фигурах 16A-16D и в таблице 4, блокирование PVR mAb 5B9 приводило к существенному снижению жизнеспособности на 20-40% по сравнению с mIgG.
Таблица 4. Эффект антител к PVR в отношении выживаемости опухолевых клеток.
Процентная доля мертвых клеток за период 24 часа среди нескольких целевых линий клеток по сравнению с клетками, обработанными mIgG.
mAb
MDA-MB-231
HCT-116
Mel-624
A549
4E5
12%
20%
-
25%
5B9
20%
22%
32%
25%
7D4
17%
27%
12%
25%
Пример 11. In-vivo эффект антител к PVR в отношении опухоли человека в модели гуманизированных мышей – кратковременная гуманизация.
Противоопухолевую эффективность антител изучали исследовали in vivo. Для оценки эффективности описанных в настоящем документе антител в отношении ингибирования рака человека антитело исследовали в модели, объединяющей как опухоли, так и лимфоциты, происходящие из организма человека. Мышам NOD scid gamma (NSG) прививали hPBMC для восстановления иммунокомпетентности и вводили клетки рака человека. В заданный момент времени мышей с определенным размером опухоли обрабатывали антителом к PVR человека в соответствии с настоящим изобретением, вводимым в виде нескольких доз в разные моменты времени после введения опухоли. Такие же эксперименты осуществляли с химерными антителами к PVR. Кривые роста опухоли и вес тела измеряли 3x/неделю, и после умерщвления мышей проводили подробный фенотипический анализ TIL и популяций иммунных клеток в разных органах.
Подобную модель с линиями опухолевых клеток у мышей huNSG с прививанием PBMC создавали в соответствии с Gupta P., Oncoimmunology. 2015 Mar 6; 4(2): e981449.
Пример 12. In-vivo эффект антител к PVR в отношении опухоли человека в модели гуманизированных мышей - долгосрочная гуманизация.
Для оценки эффективности антител к PVR в отношении ингибирования рака человека антитело исследовали в модели, объединяющей как опухоли, так и лимфоциты, происходящие из организма человека. Новорожденных детенышей NOD scid gamma (NSG) подвергали облучению и прививали им CD34+ HSC для восстановления иммунокомпетентности. Спустя 1-2 недели после определения восполнения иммунных клеток, мышам вводили клетки рака человека, и в заданный момент времени/с определенным размером опухоли обрабатывали антителом к PVR человека в соответствии с настоящим изобретением, вводимым в виде нескольких доз в разные моменты времени. Такие же эксперименты осуществляли с гуманизированными антителами к PVR. Кривые роста опухоли и вес тела измеряли 3x/неделю. После умерщвления мышей проводили подробный фенотипический анализ TIL и популяций иммунных клеток в разных органах.
Подобная модель, применяемая для исследования ингибирующей развитие опухоли активности антител по настоящему изобретению, была создана в Лаборатории Джексона (The Jackson Laboratory) (http://immune-checkpoint.com/wp-content/uploads/sites/24/2015/01/Day-1-15.45-Rick-Huntress.pdf).
Пример 13. Индукция секреции IFNγ.
-11
-08
Для тестирования эффекта mAb к PVR в отношении секреции цитокинов мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) человека от 2 здоровых доноров инкубировали с целевыми клетками в присутствии антител (mIgG, 5B9mIgG, антитела к CTL-4, называемого ипилимумабом) в концентрациях 1 и 0,1 мкг/мл. Уровни IFNγ измеряли спустя 6 дней культивирования. Наблюдали значимую индукцию IFNγ антителом к PVR 5B9 (P = 7,34548E для 1 мкг/мл и 2,73179E для 0,1 мкг/мл).
Секреция IFNγ является ключевым компонентом противоопухолевого иммунитета, индукция секреции IFNγ mAb к PVR свидетельствует о наличии потенциального дополнительного противоонкогенного эффекта этих соединений при лечении рака.
Предшествующее описание конкретных вариантов осуществления достаточно полно раскрывает общий характер настоящего изобретения, чтобы другие лица могли, с использованием имеющихся знаний, легко модифицировать и/или адаптировать для различных применений такие конкретные варианты осуществления без излишнего проведения экспериментов и без отклонения от общей концепции, и, следовательно, такие адаптации и модификации следует понимать, и как подразумевается, в свете и в серии эквивалентов раскрытых вариантов осуществления. Следует понимать, что используемые в настоящем документе формулировки или терминология приведены в целях описания, а не ограничения.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  ЮССУМ РИСЁРЧ ДЕВЕЛОПМЕНТ КОМПАНИ ОФ ЗЭ ХИБРУ
ЮНИВЕРСИТИ ОФ ИЕРУСАЛИМ ЛТД.
ЮНИВЕРСИТИ ОФ РИЕКА ФЭКАЛТИ ОФ МЕДИСИН
<120>  АНТИТЕЛА, СПЕЦИФИЧЕСКИЕ К РЕЦЕПТОРУ ПОЛИОВИРУСА (PVR) ЧЕЛОВЕКА
<130>  Yissum/0137 PCT
<150>  US 62/301727
<151>  2016-03-01
<150>  US 62/364924
<151>  2016-07-21
<160>  86
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  390
<212>  ДНК
<213>  Mus musculus
<400>  1
gaggtgaagc tgcaggagtc tggaggtggc ctggtgcagc ctggaggatc cctgaaactc       60
tcctgtgcag cctcaggatt cgattttagt agatactgga tgacttgggt ccggcaggct      120
ccagggaaag ggctagaatg gattggagaa attcatccag atagcagtaa gataaactat      180
acgccatctc aaaaggataa attcatcatc tccagagaca acgccaaaaa tacgctgttc      240
ctgcaaatga gcaaagtgag atttgaggac acagcccttt atttctgtgc aagacctgat      300
ggtaactaca atgctctgga ctactggggt caaggaacct cagtcaccgt ctcctcagcc      360
aaaacgacac ccccatctgt ctatgtcgac                                       390
<210>  2
<211>  130
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  2
Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr
20                  25                  30
Trp Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Glu Ile His Pro Asp Ser Ser Lys Ile Asn Tyr Thr Pro Ser Gln
50                  55                  60
Lys Asp Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Ser Lys Val Arg Phe Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Phe Cys
85                  90                  95
Ala Arg Pro Asp Gly Asn Tyr Asn Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100                 105                 110
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr
115                 120                 125
Val Asp
130
<210>  3
<211>  24
<212>  ДНК
<213>  Mus musculus
<400>  3
ggattcgatt ttagtagata ctgg                                              24
<210>  4
<211>  8
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  4
Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr Trp
1               5
<210>  5
<211>  45
<212>  ДНК
<213>  Mus musculus
<400>  5
gaaattcatc cagatagcag taagataaac tatacgccat ctcaa                       45
<210>  6
<211>  15
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  6
Glu Ile His Pro Asp Ser Ser Lys Ile Asn Tyr Thr Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
<210>  7
<211>  33
<212>  ДНК
<213>  Mus musculus
<400>  7
cctgatggta actacaatgc tctggactac tgg                                    33
<210>  8
<211>  11
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  8
Pro Asp Gly Asn Tyr Asn Ala Leu Asp Tyr Trp
1               5                   10
<210>  9
<211>  374
<212>  ДНК
<213>  Mus musculus
<400>  9
ctgcaaccgg tgtacattcc gacattgtga tgactcagtc tcacaaattc atgtccacat       60
cagtgggaga cagggtcagc atcacctgca aggccagtca ggatgtgggt actgctgtaa      120
cctggtatca acagaaacca ggacaatctc ctaaactact gatttactgg gcatccaccc      180
ggcacactgg agtccctgat cgcttcacag gcagtgaatc tgggacagat ttcactctca      240
ccattagtga tgtgcaatct gaagacttgg caaattattt ctgtcagcaa tatagcaggt      300
atccgtacac gttcggaggg gggaccaagc tggaaataaa acgggccgat gctgcaccaa      360
ctgtatccgt cgac                                                        374
<210>  10
<211>  124
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  10
Ala Thr Gly Val His Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe
1               5                   10                  15
Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser
20                  25                  30
Gln Asp Val Gly Thr Ala Val Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35                  40                  45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val
50                  55                  60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Glu Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65                  70                  75                  80
Ile Ser Asp Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala Asn Tyr Phe Cys Gln Gln
85                  90                  95
Tyr Ser Arg Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100                 105                 110
Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Val Asp
115                 120
<210>  11
<211>  33
<212>  ДНК
<213>  Mus musculus
<400>  11
aaggccagtc aggatgtggg tactgctgta acc                                    33
<210>  12
<211>  11
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  12
Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala Val Thr
1               5                   10
<210>  13
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Mus musculus
<400>  13
tgggcatcca cccggcacac t                                                 21
<210>  14
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  14
Trp Ala Ser Thr Arg His Thr
1               5
<210>  15
<211>  27
<212>  ДНК
<213>  Mus musculus
<400>  15
cagcaatata gcaggtatcc gtacacg                                           27
<210>  16
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  16
Gln Gln Tyr Ser Arg Tyr Pro Tyr Thr
1               5
<210>  17
<211>  526
<212>  ДНК
<213>  Mus musculus
<400>  17
gaattcgagg tgaagctgca ggagtctgga cctgagctgg tgaagcctgg ggcttcagtg       60
aagatttcct gcaagacttc tggatacact ttcactgaat acaccatgca ctgggtgagg      120
cagagccatg gagagagcct tgagtggatt ggaggtattg atcctaacaa tggtggtact      180
aactacaacc agaacttcaa gggcaaggcc acattgactg tagacaagtc ctccagcaca      240
gcctacatgg agctccgcag cctgacatct gaggattctg cggtctatta ctgtgcagga      300
gtgattcctc tggagtactg ggggcaagga acctcagtca ccgtctcctc agccaaaacg      360
acacccccat ctgtctatgt cgaccatatg ggagagctcc caacgcgttg gatgcatagc      420
ttgagtattc tatagtgtca cctaaatagc ttggcgtaat catggtcata gctgtttcct      480
gtgtgaaatt gttatccgct cacaattcca cacaacatac gagccg                     526
<210>  18
<211>  144
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  18
Glu Phe Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro
1               5                   10                  15
Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
20                  25                  30
Glu Tyr Thr Met His Trp Val Arg Gln Ser His Gly Glu Ser Leu Glu
35                  40                  45
Trp Ile Gly Gly Ile Asp Pro Asn Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Gln
50                  55                  60
Asn Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr
65                  70                  75                  80
Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr
85                  90                  95
Tyr Cys Ala Gly Val Ile Pro Leu Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Val Asp
115                 120                 125
His Met Gly Glu Leu Pro Thr Arg Trp Met His Ser Leu Ser Ile Leu
130                 135                 140
<210>  19
<211>  30
<212>  ДНК
<213>  Mus musculus
<400>  19
ggatacactt tcactgaata caccatgcac                                        30
<210>  20
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  20
Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr Thr Met His
1               5                   10
<210>  21
<211>  51
<212>  ДНК
<213>  Mus musculus
<400>  21
ggtattgatc ctaacaatgg tggtactaac tacaaccaga acttcaaggg c                51
<210>  22
<211>  16
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  22
Gly Ile Asp Pro Asn Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Gln Asn Phe Lys
1               5                   10                  15
<210>  23
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Mus musculus
<400>  23
gtgattcctc tggagtac                                                     18
<210>  24
<211>  6
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  24
Val Ile Pro Leu Glu Tyr
1               5
<210>  25
<211>  321
<212>  ДНК
<213>  Mus musculus
<400>  25
gatattgtga tgacacagtc tcaaaaattc atgtccacat cagtaggaga cagagtcagc       60
gtcacctgca aggccagtca gaatgtgtat actaatgtag cctggtatca acagaaacca      120
gggcaatctc ctaaagcact gatttactcg gcatcctacc ggtacagggg agtccctgat      180
cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcaa tgtgcagtct      240
gaagacttgg cagactattt ctgtcagcaa tataacagct atcctctcgc gttcggctcg      300
gggaccaagc tggagctgaa a                                                321
<210>  26
<211>  118
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  26
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Tyr Thr Asn
20                  25                  30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Arg Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65                  70                  75                  80
Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu
85                  90                  95
Ala Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala
100                 105                 110
Pro Thr Val Ser Val Asp
115
<210>  27
<211>  33
<212>  ДНК
<213>  Mus musculus
<400>  27
aaggccagtc agaatgtgta tactaatgta gcc                                    33
<210>  28
<211>  11
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  28
Lys Ala Ser Gln Asn Val Tyr Thr Asn Val Ala
1               5                   10
<210>  29
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Mus musculus
<400>  29
tcggcatcct accggtacag g                                                 21
<210>  30
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  30
Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Arg
1               5
<210>  31
<211>  27
<212>  ДНК
<213>  Mus musculus
<400>  31
cagcaatata acagctatcc tctcgcg                                           27
<210>  32
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  32
Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu Ala
1               5
<210>  33
<211>  345
<212>  ДНК
<213>  Mus musculus
<400>  33
caactgcagc agtctggagc tgagctgatg aagcctgggg cctcagtgaa gatttcctgc       60
aaggctactg gctacacatt cagtaactac tggattgagt ggataaaaca gaggcctgga      120
catggccttg agtggattgg agagattttt cctggaagtg gtcgtattaa cttcaatgag      180
aagttcaagg gcaaggccac attcactgca gacacatcct ccgacacaac ctacatgcaa      240
ctcagcagcc tgacatctgc ggactctgcc gtctattact gtgcaagaac gaagatctat      300
ggtaactcct ttgactactg gggccaaggc accactctca cagtc                      345
<210>  34
<211>  115
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  34
Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala Ser Val
1               5                   10                  15
Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Asn Tyr Trp Ile
20                  25                  30
Glu Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu
35                  40                  45
Ile Phe Pro Gly Ser Gly Arg Ile Asn Phe Asn Glu Lys Phe Lys Gly
50                  55                  60
Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asp Thr Thr Tyr Met Gln
65                  70                  75                  80
Leu Ser Ser Leu Thr Ser Ala Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
85                  90                  95
Thr Lys Ile Tyr Gly Asn Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100                 105                 110
Leu Thr Val
115
<210>  35
<211>  30
<212>  ДНК
<213>  Mus musculus
<400>  35
ggctacacat tcagtaacta ctggattgag                                        30
<210>  36
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  36
Gly Tyr Thr Phe Ser Asn Tyr Trp Ile Glu
1               5                   10
<210>  37
<211>  51
<212>  ДНК
<213>  Mus musculus
<400>  37
gagatttttc ctggaagtgg tcgtattaac ttcaatgaga agttcaaggg c                51
<210>  38
<211>  16
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  38
Glu Ile Phe Pro Gly Ser Gly Arg Ile Asn Phe Asn Glu Lys Phe Lys
1               5                   10                  15
<210>  39
<211>  30
<212>  ДНК
<213>  Mus musculus
<400>  39
acgaagatct atggtaactc ctttgactac                                        30
<210>  40
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  40
Thr Lys Ile Tyr Gly Asn Ser Phe Asp Tyr
1               5                   10
<210>  41
<211>  324
<212>  ДНК
<213>  Mus musculus
<400>  41
gacatcgtga tgactcagtc tcacaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcaac       60
atcacctgca aggccagtca ggatgtgggt actgctgtgg tctggtatca acagaaacca      120
ggacaatctc ctaaattatt gatttactgg gcatccagtc ggcacaatgg agtccctgat      180
cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcactctca cgattagtaa tgtgcagtct      240
gaagacttgt cagattattt ctgtcagcaa tatagcaggt atccactcac attcggggct      300
gggaccaagc tggagctgaa acgt                                             324
<210>  42
<211>  108
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  42
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Asn Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala
20                  25                  30
Val Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Trp Ala Ser Ser Arg His Asn Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65                  70                  75                  80
Glu Asp Leu Ser Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Arg Tyr Pro Leu
85                  90                  95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg
100                 105
<210>  43
<211>  33
<212>  ДНК
<213>  Mus musculus
<400>  43
aaggccagtc aggatgtggg tactgctgtg gtc                                    33
<210>  44
<211>  11
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  44
Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala Val Val
1               5                   10
<210>  45
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Mus musculus
<400>  45
tgggcatcca gtcggcacaa t                                                 21
<210>  46
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  46
Trp Ala Ser Ser Arg His Asn
1               5
<210>  47
<211>  27
<212>  ДНК
<213>  Mus musculus
<400>  47
cagcaatata gcaggtatcc actcaca                                           27
<210>  48
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  48
Gln Gln Tyr Ser Arg Tyr Pro Leu Thr
1               5
<210>  49
<211>  107
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Мутированная цепь
<400>  49
Asp Ile Met Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Asn Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala
20                  25                  30
Val Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Trp Ala Ser Ser Arg His Ala Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65                  70                  75                  80
Glu Asp Leu Ser Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Arg Tyr Pro Leu
85                  90                  95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100                 105
<210>  50
<211>  107
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Мутированная цепь
<400>  50
Asp Ile Met Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Asn Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala
20                  25                  30
Val Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Trp Ala Ser Ser Arg His Arg Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65                  70                  75                  80
Glu Asp Leu Ser Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Arg Tyr Pro Leu
85                  90                  95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100                 105
<210>  51
<211>  107
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Мутированная цепь
<400>  51
Asp Ile Met Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Asn Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala
20                  25                  30
Val Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Trp Ala Ser Ser Arg His Asp Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65                  70                  75                  80
Glu Asp Leu Ser Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Arg Tyr Pro Leu
85                  90                  95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100                 105
<210>  52
<211>  107
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Мутированная цепь
<400>  52
Asp Ile Met Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Asn Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala
20                  25                  30
Val Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Trp Ala Ser Ser Arg His Glu Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65                  70                  75                  80
Glu Asp Leu Ser Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Arg Tyr Pro Leu
85                  90                  95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100                 105
<210>  53
<211>  107
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Мутированная цепь
<400>  53
Asp Ile Met Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Asn Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala
20                  25                  30
Val Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Trp Ala Ser Ser Arg His Pro Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65                  70                  75                  80
Glu Asp Leu Ser Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Arg Tyr Pro Leu
85                  90                  95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100                 105
<210>  54
<211>  107
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Мутированная цепь
<400>  54
Asp Ile Met Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Asn Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala
20                  25                  30
Val Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Trp Ala Ser Ser Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65                  70                  75                  80
Glu Asp Leu Ser Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Arg Tyr Pro Leu
85                  90                  95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100                 105
<210>  55
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Мутированный CDR
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (7)..(7)
<223>  Xaa представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из: Ala, Arg, Asp, Glu, Pro и Thr
<400>  55
Trp Ala Ser Ser Arg His Xaa
1               5
<210>  56
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Мутированный CDR
<400>  56
Trp Ala Ser Ser Arg His Ala
1               5
<210>  57
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Мутированный CDR
<400>  57
Trp Ala Ser Ser Arg His Arg
1               5
<210>  58
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Мутированный CDR
<400>  58
Trp Ala Ser Ser Arg His Asp
1               5
<210>  59
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Мутированный CDR
<400>  59
Trp Ala Ser Ser Arg His Glu
1               5
<210>  60
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Мутированный CDR
<400>  60
Trp Ala Ser Ser Arg His Pro
1               5
<210>  61
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Мутированный CDR
<400>  61
Trp Ala Ser Ser Arg His Thr
1               5
<210>  62
<211>  321
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Мутированный полинуклеотид
<400>  62
gacatcatga tgacccagtc tcacaaattc atgtctacat ctgtaggaga cagagtcaac       60
atcacttgca aggcgagtca ggatgtgggt actgctgtgg tctggtatca gcagaaacca      120
gggcaatctc ctaagttgct gatctattgg gcatccagtc ggcacgctgg ggtcccagat      180
aggttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcaa tgtgcagtct      240
gaagatttgt cagattattt ctgccaacag tatagcagat accctctcac attcggggct      300
gggaccaagc tggagctcaa a                                                321
<210>  63
<211>  321
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Мутированный полинуклеотид
<400>  63
gacatcatga tgacccagtc tcacaaattc atgtctacat ctgtaggaga cagagtcaac       60
atcacttgca aggcgagtca ggatgtgggt actgctgtgg tctggtatca gcagaaacca      120
gggcaatctc ctaagttgct gatctattgg gcatccagtc ggcacagagg ggtcccagat      180
aggttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcaa tgtgcagtct      240
gaagatttgt cagattattt ctgccaacag tatagcagat accctctcac attcggggct      300
gggaccaagc tggagctcaa a                                                321
<210>  64
<211>  321
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Мутированный полинуклеотид
<400>  64
gacatcatga tgacccagtc tcacaaattc atgtctacat ctgtaggaga cagagtcaac       60
atcacttgca aggcgagtca ggatgtgggt actgctgtgg tctggtatca gcagaaacca      120
gggcaatctc ctaagttgct gatctattgg gcatccagtc ggcacgatgg ggtcccagat      180
aggttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcaa tgtgcagtct      240
gaagatttgt cagattattt ctgccaacag tatagcagat accctctcac attcggggct      300
gggaccaagc tggagctcaa a                                                321
<210>  65
<211>  321
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Мутированный полинуклеотид
<400>  65
gacatcatga tgacccagtc tcacaaattc atgtctacat ctgtaggaga cagagtcaac       60
atcacttgca aggcgagtca ggatgtgggt actgctgtgg tctggtatca gcagaaacca      120
gggcaatctc ctaagttgct gatctattgg gcatccagtc ggcacgaggg ggtcccagat      180
aggttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcaa tgtgcagtct      240
gaagatttgt cagattattt ctgccaacag tatagcagat accctctcac attcggggct      300
gggaccaagc tggagctcaa a                                                321
<210>  66
<211>  321
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Мутированный полинуклеотид
<400>  66
gacatcatga tgacccagtc tcacaaattc atgtctacat ctgtaggaga cagagtcaac       60
atcacttgca aggcgagtca ggatgtgggt actgctgtgg tctggtatca gcagaaacca      120
gggcaatctc ctaagttgct gatctattgg gcatccagtc ggcaccctgg ggtcccagat      180
aggttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcaa tgtgcagtct      240
gaagatttgt cagattattt ctgccaacag tatagcagat accctctcac attcggggct      300
gggaccaagc tggagctcaa a                                                321
<210>  67
<211>  321
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Мутированный полинуклеотид
<400>  67
gacatcatga tgacccagtc tcacaaattc atgtctacat ctgtaggaga cagagtcaac       60
atcacttgca aggcgagtca ggatgtgggt actgctgtgg tctggtatca gcagaaacca      120
gggcaatctc ctaagttgct gatctattgg gcatccagtc ggcacactgg ggtcccagat      180
aggttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcaa tgtgcagtct      240
gaagatttgt cagattattt ctgccaacag tatagcagat accctctcac attcggggct      300
gggaccaagc tggagctcaa a                                                321
<210>  68
<211>  356
<212>  ДНК
<213>  Mus musculus
<400>  68
gaggtgaagc ttctcgagtc tggaggtggc ctggtgcagc ctggaggatc cctgaaactc       60
tcctgtgcag cctcaggatt cgattttagt agatactgga tgacttgggt ccggcaggct      120
ccagggaaag ggctagaatg gattggagaa attcatccag atagcagtaa gataaactat      180
acgccatctc aaaaggataa attcatcatc tccagagaca acgccaaaaa tacgctgttc      240
ctgcaaatga gcaaagtgag atttgaggac acagcccttt atttctgtgc aagacctgat      300
ggtaactaca atgctctgga ctactggggt caaggaacct cagtcaccgt ctcctc          356
<210>  69
<211>  119
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  69
Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr
20                  25                  30
Trp Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Glu Ile His Pro Asp Ser Ser Lys Ile Asn Tyr Thr Pro Ser Gln
50                  55                  60
Lys Asp Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Ser Lys Val Arg Phe Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Phe Cys
85                  90                  95
Ala Arg Pro Asp Gly Asn Tyr Asn Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100                 105                 110
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  70
<211>  321
<212>  ДНК
<213>  Mus musculus
<400>  70
gacattgtga tgacccagtc tcacaaattc atgtccacat cagtgggaga cagggtcagc       60
atcacctgca aggccagtca ggatgtgggt actgctgtaa cctggtatca acagaaacca      120
ggacaatctc ctaaactact gatttactgg gcatccaccc ggcacactgg agtccctgat      180
cgcttcacag gcagtgaatc tgggacagat ttcactctca ccattagtga tgtgcaatct      240
gaagacttgg caaattattt ctgtcagcaa tatagcaggt atccgtacac gttcggaggg      300
gggaccaagc tggaaataaa a                                                321
<210>  71
<211>  107
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  71
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala
20                  25                  30
Val Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50                  55                  60
Ser Glu Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Val Gln Ser
65                  70                  75                  80
Glu Asp Leu Ala Asn Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Arg Tyr Pro Tyr
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105
<210>  72
<211>  345
<212>  ДНК
<213>  Mus musculus
<400>  72
gaggtccagc tgcaacagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagatt       60
tcctgcaaga cttctggata cactttcact gaatacacca tgcactgggt gaagcagagc      120
catggagaga gccttgagtg gattggaggt attgatccta acaatggtgg tactaactac      180
aaccagaact tcaagggcaa ggccacattg actgtagaca agtcctccag cacagcctac      240
atggagctcc gcagcctgac atctgaggat tctgcggtct attactgtgc aggagtgatt      300
cctctggagt actgggggca aggaacctca gtcaccgtct cctca                      345
<210>  73
<211>  115
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  73
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr
20                  25                  30
Thr Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Glu Ser Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Gly Ile Asp Pro Asn Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Gln Asn Phe
50                  55                  60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Gly Val Ile Pro Leu Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr
100                 105                 110
Val Ser Ser
115
<210>  74
<211>  321
<212>  ДНК
<213>  Mus musculus
<400>  74
gacattgtga tgacccagtc tcaaaaattc atgtccacat cagtaggaga cagagtcagc       60
gtcacctgca aggccagtca gaatgtgtat actaatgtag cctggtatca acagaaacca      120
gggcaatctc ctaaagcact gatttactcg gcatcctacc ggtacagggg agtccctgat      180
cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcaa tgtgcagtct      240
gaagacttgg cagactattt ctgtcagcaa tataacagct atcctctcgc gttcggctcg      300
gggacaaagt tggaaataaa a                                                321
<210>  75
<211>  107
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  75
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Tyr Thr Asn
20                  25                  30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Arg Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65                  70                  75                  80
Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu
85                  90                  95
Ala Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105
<210>  76
<211>  357
<212>  ДНК
<213>  Mus musculus
<400>  76
caggttcagt tgcagcagtc tggagctgag ctgatgaagc ctggggcctc agtgaagatt       60
tcctgcaagg ctactggcta cacattcagt aactactgga ttgagtggat aaaacagagg      120
cctggacatg gccttgagtg gattggagag atttttcctg gaagtggtcg tattaacttc      180
aatgagaagt tcaagggcaa ggccacattc actgcagaca catcctccga cacaacctac      240
atgcaactca gcagcctgac atctgcggac tctgccgtct attactgtgc aagaacgaag      300
atctatggta actcctttga ctactggggc caaggcacca ctctcacagt ctcccca         357
<210>  77
<211>  119
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  77
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Asn Tyr
20                  25                  30
Trp Ile Glu Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Glu Ile Phe Pro Gly Ser Gly Arg Ile Asn Phe Asn Glu Lys Phe
50                  55                  60
Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asp Thr Thr Tyr
65                  70                  75                  80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Ala Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Thr Lys Ile Tyr Gly Asn Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100                 105                 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Pro
115
<210>  78
<211>  321
<212>  ДНК
<213>  Mus musculus
<400>  78
gacattatga tgacccagtc tcacaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcaac       60
atcacctgca aggccagtca ggatgtgggt actgctgtgg tctggtatca acagaaacca      120
ggacaatctc ctaaattatt gatttactgg gcatccagtc ggcacaatgg agtccctgat      180
cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcactctca cgattagtaa tgtgcagtct      240
gaagacttgt cagattattt ctgtcagcaa tatagcaggt atccactcac attcggggct      300
gggaccaagc tggagctgaa a                                                321
<210>  79
<211>  107
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  79
Asp Ile Met Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Asn Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala
20                  25                  30
Val Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Trp Ala Ser Ser Arg His Asn Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65                  70                  75                  80
Glu Asp Leu Ser Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Arg Tyr Pro Leu
85                  90                  95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100                 105
<210>  80
<211>  5
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  80
Arg Tyr Trp Met Thr
1               5
<210>  81
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  81
Glu Ile His Pro Asp Ser Ser Lys Ile Asn Tyr Thr Pro Ser Gln Lys
1               5                   10                  15
Asp
<210>  82
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  82
Pro Asp Gly Asn Tyr Asn Ala Leu Asp Tyr
1               5                   10
<210>  83
<211>  5
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  83
Glu Tyr Thr Met His
1               5
<210>  84
<211>  6
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  84
Ser Asn Tyr Trp Ile Glu
1               5
<210>  85
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  85
Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala Val
1               5                   10
<210>  86
<211>  329
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  86
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
1               5                   10                  15
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
20                  25                  30
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
35                  40                  45
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
50                  55                  60
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
65                  70                  75                  80
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys
85                  90                  95
Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
100                 105                 110
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
115                 120                 125
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
130                 135                 140
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
145                 150                 155                 160
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
165                 170                 175
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
180                 185                 190
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
195                 200                 205
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
210                 215                 220
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
225                 230                 235                 240
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
245                 250                 255
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
260                 265                 270
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
275                 280                 285
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
290                 295                 300
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
305                 310                 315                 320
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<---