СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РИСКА РАЗВИТИЯ ПЛОСКОКЛЕТОЧНОЙ МЕТАПЛАЗИИ В РЕСПИРАТОРНОМ ЭПИТЕЛИИ БРОНХОВ С НАЛИЧИЕМ ИЗОЛИРОВАННОЙ БАЗАЛЬНОКЛЕТОЧНОЙ ГТПЕРПЛАЗИИ
METHOD FOR PREDICTION OF RISK OF SQUAMOUS METAPLASIA IN RESPIRATORY BRONCHIAL EPITHELIUM WITH DETECTED ISOLATED BASAL CELL HYPERPLASIA

Изобретение относится к области медицины, конкретно к онкологии, и касается способа прогнозирования риска развития плоскоклеточной метаплазии в респираторном эпителии бронхов с наличием изолированной базальноклеточной гиперплазии.
Канцерогенез в бронхолегочном эпителии - сложный многоступенчатый процесс последовательного накопления молекулярно-генетических изменений, ведущий к морфологическим изменениям нормального эпителия и его переходу в рак. Эти изменения прогрессируют от базальноклеточной гиперплазии, через плоскоклеточную метаплазию, сопровождающую ее пре- (дисплазию I степени) и неоплазию (дисплазию II-III степени), к карциноме in situ и инвазивному плоскоклеточному раку [12, 13]. Особое значение имеет плоскоклеточная метаплазия (ПМ). Она является не только основой для последующего развития пре- и неоплазии, но и как было показано нами ранее, играет решающую роль в прогрессии и необратимости данных процессов [1]. Поэтому важно иметь критерии вероятности развития ПМ на фоне базальноклеточной гиперплазии (БКГ) в условиях хронического воспаления.
Появление дисрегенераторных изменений в респираторном эпителии и их прогрессия до пре- и неоплазии тесно связаны с нарушением процессов дифференцировки клеток, регуляции клеточного цикла и апоптоза [4, 5, 6, 8]. В настоящее время для определения злокачественного потенциала дисрегенераторных, пре- и неопластических изменений различными молекулярно-биологическими методами (иммуногистохимия, гибридизация in situ, полимеразная цепная реакция, лазерная микродиссекция) исследуются показатели пролиферативной активности, апоптоза, состояние молекул адгезии, различные факторы роста и их рецепторы [3, 10, 15].
Согласно данным большинства исследователей, значения показателя пролиферативной активности Ki67 возрастают по мере прогрессирования характера дисрегенераторных изменений [2, 11, 12, 16]. Причем, как отмечает М. Lai (2009), у больных с бронхиальной неоплазией (ДII-III) наблюдается аномальная пролиферация, заключающаяся в «гиперэкспрессии» Ki67 [11].
Мнения о роли молекулярных маркеров р53 и bcl-2 в динамике развития пренеопластических процессов противоречивы. U. Torrnanen et al. (2001) считают, что последовательность метаплазия-дисплазия-карцинома в легком ассоциируется с высокой пролиферативной активностью и не зависит от экспрессии р53 и bcl-2 [14]. По мнению Z. Vukobrat-Bijedic et al (2007) экспрессия p53 в «предраковых поражениях» может рассматриваться как индикатор канцерогенеза [15]. G. Wang et. al. (2006) выявили повышение уровня экспрессии р53 в ряду: «норма» - гиперплазия - дисплазия, отмечая при этом, что в случаях тяжелой дисплазии (неоплазии) значения данного показателя достигают 78% случаев [16]. S. Lantue joul et al (2009) наблюдали экспрессию р53 в 25% случаев при умеренной дисплазии, а при раке in situ - в 75%. Процент клеток, экспрессирующих bcl-2, также увеличивается с тяжестью диспластических изменений от легкой к тяжелой степени [12]. По результатам работ исследователей из НИИ онкологии СО РАМН показано достоверное увеличение пролиферативной активности и экспрессии белка р53 в последовательности базальноклеточная гиперплазия - плоскоклеточная метаплазия - дисплазия. Увеличение доли клеток, экспрессирующих Ki67, р53 и bcl-2 в данной последовательности, не зависело от индивидуальных особенностей, поскольку наблюдалось при сочетании разных форм дисрегенераторных изменений в бронхиальном эпителии одного больного [2].
Оценка значимости маркера дифференцировки плоского эпителия в прогрессии дисрегенераторных, пре- и неопластических процессов в легких не проводилась. Имеющиеся в литературе сведения об экспрессии данного маркера касаются предопухолевой патологии шейки матки и ротовой полости. Так, Inki P., et.al (2007) наблюдали позитивную экспрессию CD138 в неизмененном и метапластическом плоском эпителии шейки матки. По мере прогрессирования степени тяжести цервикальной интраэпителиальной неоплазии уровень' экспрессии CD 138 снижался до полного отсутствия при низкодифференцированном плоскоклеточном раке [7]. Jackson L., et.al (2000) отметили, что в нормальном эпителии ротовой полости экспрессия CD138 в несколько раз выше, чем при диспластических изменениях, но статистически значимой разницы в ряду дисплазия (I-III) - рак in situ - инвазивный рак авторами не показано [9].
Таким образом, известные на сегодняшний день способы прогнозирования течения предраковых изменений связаны с поиском молекулярно-генетических маркеров их прогрессии. Причем данные показатели являются дополнительными параметрами, которые используют для выделения группы больных с повышенным риском прогрессирования пре- и неопластических процессов в инвазивный рак. Состав панели иммуногистохимических маркеров, характеризующих биологическую агрессивность этих процессов, не определен [11]. Методы, позволяющие прогнозировать вероятность развития плоскоклеточной метаплазии в эпителии бронхов на фоне хронического воспаления, отсутствуют.
Новая техническая задача - создание способа прогнозирования риска развития плоскоклеточной метаплазии в респираторном эпителии бронхов с наличием изолированной базальноклеточной гиперплазии.
Для решения поставленной задачи в способе прогнозирования риска развития плоскоклеточной метаплазии в респираторном эпителии бронхов с наличием изолированной базальноклеточной гиперплазии определяют позитивную ядерную экспрессию маркера пролиферации Ki67 и мембранную экспрессию маркера дифференцировки клеток плоского эпителия CD 138 в бронхиальном эпителии и при уровне экспрессии Ki67≥25%, a CD138 - ≤3,5% прогнозируют риск развития плоскоклеточной метаплазии в респираторном эпителии бронхов.
Способ осуществляют следующим образом. У пациентов проводят забор материала для морфологического исследования из главного, долевого, промежуточного или сегментарного бронхов (биоптаты, операционный материал). Если при гистологическом исследовании в бронхиальном эпителии находят изолированную базальноклеточную гиперплазию (БКГ+ПМ-Д-), проводят иммуногистохимическое исследование препаратов. При этом определяют позитивную ядерную экспрессию маркера пролиферативной активности Ki67 и позитивную мембранную экспрессию маркера дифференцировки клеток плоского эпителия CD 138. В тех случаях, когда уровень экспрессии Ki67≥25%, а CD138≤3,5% - прогнозируют высокий риск развития в бронхиальном эпителии плоскоклеточной метаплазии.
1-4
0-x
0
11
Критерии способа подобраны на основании анализа данных морфологического и клинического исследований. Изучался операционный материал от 53 больных, прооперированных по поводу плоскоклеточного рака легкого TN M стадии, в возрасте от 41 до 73 лет.
2
В предоперационном периоде 24 пациента (45,2%) получили НАХТ по схеме: паклитаксел 175 мг/м в/в 1день+карбоплатин AUC 6 в/в 1 день, 2-3 курса с интервалом в 3 недели. Во время проведения радикальной операции 12 пациентов (22,6%) однократно получали ИОЛТ в дозе 10-15 Гр, из них 7 больным (58,3%) перед облучением вводили радиосенсибилизатор цисплатин/гемзар.
Морфологический диагноз рака легкого устанавливался согласно «Гистологической классификации опухолей легкого» (ВОЗ, Женева, 2003). Пренеопластические (ДI степени) и неопластические процессы (Д II-III степени) оценивались согласно критериям, изложенным S. Lantue' joul et al. [12].
Материалом для морфологического исследования были опухоль и находящиеся от нее на расстоянии 4-5 см фрагменты ткани удаленного легкого с главным, промежуточным или сегментарным бронхами. Ткань фиксировалась в нейтральном формалине, проводилась по стандартной методике и заливалась в парафин. Срезы бронхов толщиной 5-6 мкм окрашивались гематоксилином и эозином. Морфологическое исследование осуществлялось с помощью светового микроскопа «Axiostar plus» фирмы «К. Zeiss» - Германия.
Иммуногистохимическое исследование проводилось по общепринятой методике. Демаскировку антигенов осуществляли путем инкубации срезов в микроволновой печи в течение 20 мин в нитратном буфере или ЭДТА-8. В качестве хромогена применяли диаминобензидин (ДАБ). Визуализацию реакции антиген - антитело осуществляли с помощью системы «Super Sensitive Polymer - HRP Detection System» (Bio Genex, США).
Для исследования респираторного эпителия в смежных с опухолью участках использовались моноклональные антитела к белкам р53 (clon СМ1, рабочее разведение 1:150, «Novocastra»), выявляющие «дикий» и «мутантный» варианты протеина, bcl-2 (clon bcl-2/100/D5, рабочее разведение 1:80, «Novocastra»), Ki 67 (clon MIB - 1, RTU, «Daco») и CD 138 (clon MI15, RTU, «Daco»). Результаты иммуногистохимической реакции оценивали по процентному содержанию окрашенных клеток при любой степени положительной экспрессии маркера в разных участках препарата (по 100 клеток в 10 полях зрения), соответствующих различным морфологическим процессам - гиперплазии бокаловидных клеток, базальноклеточной гиперплазии, плоскоклеточной метаплазии, пренеоплазии (дисплазии I степени) и неоплазии (дисплазии II-III степени).
Статистическая обработка результатов выполнялась с помощью пакета программ «Statistica 6.0 for Windows».
Определяли спектр дисрегенераторных изменений, встречающихся в участках респираторного эпителия, смежного с опухолью. По результатам микроскопического исследования гистологического материала в респираторном эпителии бронхов, пограничном с опухолью, наблюдались разные варианты дисрегенераторных - БКГ, ПМ, а также пре- и неопластических изменений. Данные дисрегенераторные изменения встречались в пределах исследуемого препарата, как самостоятельные процессы, так и в различных сочетаниях.
Из 53 больных, вошедших в исследование, у 30 (56,6%), в смежном с опухолью бронхиальном эпителии наблюдалась изолированная базальноклеточная гиперплазия (БКГ+ПМ-). У 23 пациентов (43,4%) базальноклеточная гиперплазия сочеталась с плоскоклеточной метаплазией (БКГ+ПМ+).
В данных группах сопоставлялись эксирессионные характеристики клеток БКГ (в группе БКГ+ПМ+подсчитывалось количество клеток с позитивной экспрессией отдельно в участках БКГ и ПМ), отражающие  уровень пролиферативной активности и участвующие в апоптозе (Ki 67, р53, bcl-2). Изучалась экспрессия маркера syndican-1 (CD 138), тесно связанного с сохранением дифференцировки клеток плоского эпителия.
1-3
1-3
1-3
2
Иммунофенотип базальноклеточной гиперплазии оказался напрямую связанным с наличием или отсутствием плоскоклеточной метаплазии. БКГ в присутствии ПМ (БКГ+ПМ+) характеризовалась более высокой экспрессией показателей пролиферативной активности и апоптоза по сравнению с изолированной БКГ (БКГ+ПМ-). Иммунофенотип изолированной базальноклеточной гиперплазии и базальноклеточной гиперплазии, сочетающейся с плоскоклеточной метаплазией, представлен в таблице 1. Экспрессия CD138 в участках базальноклеточной гиперплазии также зависела от наличия ПМ и снижалась в ее присутствии (табл.1, р). Наиболее значимые отличия, на наш взгляд, отмечались в показателях экспрессии маркера пролиферативной активности Ki 67 (p=0,00000) и дифференцировки клеток плоского эпителия CD138 (р=0,0003). Поэтому в тех случаях, когда выявляется только базальноклеточная гиперплазия респираторного эпителия и уровень экспрессии Ki67≥25%, a CD138≤3,5%, можно с высокой вероятностью прогнозировать развитие плоскоклеточной метаплазии (χ=37,97; р=0,0000). Частота возникновения плоскоклеточной метаплазии в зависимости от характера экспрессии маркеров пролиферативной активности и дифференцировки плоского эпителия представлена в таблице 2.
Чувствительность способа - 0,91%; специфичность - 0,93%.
Пример 1. Больной М., 58 лет. По результатам микроскопического исследования гистологического материала в респираторном эпителии бронха выявлена диффузная базальноклеточная гиперплазия (БКГ+ПМ-Д-). Проведенное согласно предлагаемому способу иммуногистохимическое исследование показало позитивную ядерную экспрессию Ki67 в 25% клеток с признаками базальноклеточной гиперплазии и мембранную экспрессию CD 138 в 3,1% клеток. У данного пациента прогнозировалось развитие в бронхиальном эпителии плоскоклеточной метаплазии. В биопсийном материале, взятом при контрольной фибробронхоскопии через 11 месяцев после первичного обращения, выявлена плоскоклеточная метаплазия.
Пример 2. Больной В., 52 года. При микроскопии гистологического материала в респираторном эпителии бронха выявлена диффузная базальноклеточная гиперплазия (БКГ+ПМ-). При проведении иммуногистохимического исследования согласно предлагаемому способу определен иммунофенотип БКГ. Уровень экспрессии Ki67 составил 18%, a CD138 - 5,7%. В данном случае прогнозировалось, что риск развития ПМ маловероятен. При динамическом наблюдении за пациентом в течение 16 месяцев в биопсийном материале наблюдалась базальноклеточная гиперплазия. Плоскоклеточной метаплазии не найдено.
2
1
Пример 3. Больной Ш., 52 года. Центральный рак левого легкого. Прооперирован в объеме пневмонэктомии слева. В предоперационном периоде проведена неоадъювантная химиотерапия по схеме: паклитаксел 175 мг/м в/в 1 день+карбоплатин AUC 6 в/в 1 день, 2 курса с интервалом в 3 недели. Проведено исследование согласно предлагаемому способу. При гистологическом исследовании ткани первичной опухоли поставлен диагноз - плоскоклеточный умеренно-дифференцированный неороговевающий рак легкого, стадии T3N0M0. При микроскопии гистологического материала в респираторном эпителии бронхов, смежном с опухолью, выявлена диффузная БКГ (БКГ+ПМ-). Проведенное согласно предлагаемому способу иммуногистохимическое исследование показало позитивную экспрессию К167 в 37% клеток с признаками базальноклеточной гиперплазии, a CD138 - в 4,0% клеток. У данного пациента прогнозировалось развитие в бронхиальном эпителии плоскоклеточной метаплазии. Во взятом при контрольной фибробронхоскопии материале для морфологического исследования через 6 месяцев после операции, как в культе, так и в симметричном бронхе была найдена плоскоклеточная метаплазия. Общее количество больных, обследованных данным способом - 11 человек. Таким образом, предлагаемый способ позволяет с большей информативностью прогнозировать риск развития плоскоклеточной метаплазии в бронхиальном эпителии по иммуногистохимическим параметрам изолированной базальноклеточной гиперплазии. Возможность прогнозировать развитие плоскоклеточной метаплазии в слизистой бронхов позволит на ранних этапах формировать группу больных с высоким риском развития плоскоклеточного рака легкого и соответственно оптимизировать тактику ведения таких пациентов.
Способ прогнозирования риска  развития плоскоклеточной метаплазии в респираторном эпителии бронхов с наличием изолированной базальноклеточной гиперплазии.
Таблица 1
РИ
% клеток с позитивной экспрессией
Ki 67
р53
Вс1-2
CD 138
1.
БКГ+(БКГ+ПМ+) n=23
41,3±9,8 p<sub>1-3 </sub>=0,00000
17,8±5,7 р<sub>1-3 </sub>=0,00001
11,9±3,4 p<sub>1-2 </sub>=0,002
2,8±2,6 p<sub>1-2 </sub>=0,0003
2.
ПМ+(БКГ+ПМ+) n=23
58,8±8,2 Р<sub>1-2 </sub>=0,0001
29,4±7,6 p<sub>1-2 </sub>=0,0003
19,1±4,5 p<sub>1-2 </sub>=0,00007
0 p<sub>1-2 </sub>=0,0008
3.
БКГ+(БКГ+ПМ-) n=30
18,3±7,1
10,2±2,2
8,2±4,3
5,8±1,7
Таблица 2
Процент клеток с позитивной экспрессией
Кол-во больных с ПМ
Кол-во больных без ПМ
Ki67≥25%
21
2
CD138≤3,5%
Ki67≤25%
2
28
CD138≥3,5%
итого
23
30
χ<sup>2</sup>=37,97 р=0,0000
Источники информации
1. Панкова О.В., Перельмутер В.М., Ялова М.Ф. Способ прогнозирования течения диспластического процесса в респираторном эпителии - Патент на изобретение №2293323. 2007.
2. Панкова О.В., Перельмутер В.М., Савенкова О.В. Характеристика экспрессии маркеров пролиферации и регуляции апоптоза в зависимости от характера дисрегенераторных изменений в эпителии бронхов при плоскоклеточном раке легкого. - Сибирский онкологический журнал. - 2010. - №5. - С.36-41.
3. Banerjee А.К. Preinvasive lesions of the bronchus // Thorac. Oncol. 2009. Vol.4. P. 45-51.
4. Chyczewski L., Niklinski J., Chyczewska E., Niklinska W. Morphological aspects of carcinogenesis in the lung // Histopathology. 2001. Vol.39, №2. P149-52.
5. Dacic S. Pulmonary Preneoplasia // Arch. Pathol. Lab. Med. 2008. Vol 132. P. 1073-1078.
6. Greenberg A., Yee H., Rom W. Preneoplastic lesions of the lung // Respiratory Research. 2002. Vol.3, №1. Pl-10.
7. Inki P., Stenback F. et.al. Immunohistochemical localization of syndecan-1 in normal and pathological human uterine cervix// The Journal of Pathology. Vol.172, №4. P. 349-355.
8. Ishizumi Т., Mc Williams A., Mc Aulay C, Gazdar A., Lam S. Natural history of bronchial preinvasive lesions // Cancer Metastasis Rev. 2010. Vol.29, №1. P. 5-14.
9. Jackson L., Wade Z., et. al. Quantitative Analysis of Syndecan-1 Expression in Dysplasia and Squamous Cell Carcinoma of the Oral Cavity // The Laryngoscope. Vol.117, №5..P. 868-871.
10. Kerr К. M. Preneoplastic and Preinvasive Lesions // Diagnostic Pulmonary Pathology. Lung Biology in Health and Disease. Cagle P. Т., Allen Т. C, Beasley M. B. 2008. Vol.226. P. 519-526.
1
11. Lai M. Intraepithelial Neoplasia of the Lower Respiratory Tract // Intraepithelial Neoplasia. 2009. Chapter 1. P. 30-58.
1
12. Lantue'joul S., Salameire D., Salon C, Brambilla E. Pulmonary preneoplasia - sequential molecular carcinogenetic events // Histopathology. 2009. Vol.54. P. 43-54.
13. Pankiewicz W., Minarowski L., Niklinska W., et. al. Immunohistochemical markers of cancerogenesis in the lung // Folia Histochemica et Cytobiologica. 2007. Vol.45, №2. P. 65-74.
14. Tormanen U., Nuorva K., Soini Y., Paakko P. Apoptotic activity is increased in parallel with the metaplasia-dysplasia-carcinoma sequence of the bronchial epithelium // Br.J.Cancer. 2001. Vol.79, №5-6. P. 996-1002.
15. Ulmeanu R., Rajnoveanu R., Halic E. et. al. Natural course of preneoplastic bronchial lesions // Pneumologia. 2011. Vol.60, №2. P. 93-101.
16. Wang G.F., Lai M.D., Yang R.R., et. al. Histological types and significance of bronchial epithelial dysplasia // Modern Pathology. 2006. Vol.19. P. 429-437.