Выявление маркеров аттенуации отечественного холодоадаптированного штамма С-77 вируса краснухи

Выявление маркеров аттенуации отечественного холодоадаптированного штамма С-77 вируса краснухи

Г.В. Дмитриев (grigorij.d@mail.ru), Ю.И. Забияка, Е.Б. Файзулоев (faizuloev@mail.ru), Т.К. Борисова, Р.Г. Десятскова, В.В. Зверев

НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН, Москва

Резюме

Для иммунизации населения против вируса краснухи используют живую аттенуированную вакцину. Механизмы аттенуации вируса краснухи до сих пор полностью не изучены, поэтому остается актуальным выявление фенотипиче-ских и генетических маркеров аттенуации вируса краснухи. В данном исследовании был проведен анализ температурной чувствительности дикого и аттенуированного вариантов отечественного штамма вируса краснухи С-77 и были выявлены фенотипические маркеры аттенуации. Так, на основании анализа интенсивности репродукции дикого и ослабленного вариантов штамма С-77 при различных температурных режимах была установлена достоверная разница в титре холодоадаптированного варианта при температуре культивирования 33 и 39 °С, при отсутствии достоверной разницы для дикого варианта.

Ключевые слова: вирус краснухи, маркер аттенуации, температурная чувствительность, генотипирование

The Identification of Markers Attenuation Domestic Cold Adapted Strain-77 Rubella Virus

G.V. Dmitriev (grigorij.d@mail.ru), Yu.I. Zabiyaka, E.B. Faizuloev (faizuloev@mail.ru), T.K. Borisova, R.G. Desyatskova, V.V. Zverev I.I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera of Russian Academy of Medical Sciences, Moscow (instmech@iitp.ru) Abstract

Live attenuated rubella vaccine is used for vaccination. The molecular mechanisms of the attenuation have been poorly elucidated so identification of phenotypic and genotypic markers of attenuation for rubella virus remains operative. In the present study we performed analysis of temperature sensitivity of wildtype and attenuated rubella virus strain C-77 isolated in Russia and phenotypic markers of attenuation were determined. Thus, on the basis of growth kinetics analysis of wild-type and cold-adapted viruses at different temperature conditions we found significant difference in titers of cold-adapted virus at a temperature 33 and 39 °C, while wild-type virus did not show significant difference in titers.

Key words: rubella virus, marker of attenuation, temperature sensitivity, genotyping

Введение

Вакцинация - наиболее экономичное и доступное средство борьбы с краснухой. В настоящее время в Российской Федерации для иммунизации населения против краснухи используются вакцины зарубежного производства. Однако для проведения широкомасштабной иммунизации требуется создание вакцины, основанной на отечественном вакцинном штамме. В процессе создания вакцинных препаратов необходимо решить ряд важнейших задач: выбор клеточного субстрата для аттенуации вируса и получения высокоактивного препарата, контроль специфической активности, безопасности препарата на всех стадиях производства.

Механизмы аттенуации вируса краснухи изучены не полностью, поэтому актуальными являются изучение механизмов ослабления диких вариантов вируса, поиск ключевых мутаций, ведущих к аттенуации, а также выявление характерных фе-нотипических проявлений, которые могут служить маркерами аттенуации и использоваться наряду с секвенированием для контроля генетической стабильности вакцинных штаммов.

Цель данной работы - выявление фенотипи-ческих маркеров аттенуации холодоадаптированного варианта штамма С-77 вируса краснухи.

Материалы и методы

В работе был использован отечественный штамм вируса краснухи С-77, выделенный Р.Г. Де-сятсковой в 2001 году из носового смыва больного манифестной формой краснухи. Для получения ослабленного варианта штамма С-77 дикий вариант длительно культивировался в культуре клеток Vero (Европейская коллекция клеточных культур, Великобритания): 34 пассажа при температуре 35 °С и четыре пассажа при 33 °С. Показано, что по своим биологическим характеристикам аттенуирован-ный вариант штамма С-77 аналогичен вакцинному штамму Wistar RA 27/3. По иммунологическому маркерному тесту на кроликах аттенуированный вариант штамма С-77, так же как и вакцинный штамм Wistar RA 27/3, обладал пониженной антигенной активностью в сравнении с диким вариантом штамма С-77 [3].

Культура клеток почки африканской зеленой мартышки (Vero) была получена из Российской кол-

лекции клеточных культур (Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург).

Перевиваемую линию клеток Vero культивировали в питательной среде MEM (Invitrogen, США) в присутствии 10%-ной эмбриональной телячьей сыворотки (Hy Clone, США), 1 ммоль глютами-на (Invitrogen, США) и 100 мкг/мл гентамицина (Invitrogen, США), в матрасах на 650 мл (Greiner Bio-one, Австрия) при +37 °С и 5% СО2.

Отечественный штамм вируса краснухи С-77: дикий вариант (wt) (6 пассажей) и аттенуированный вариант (са) (39 пассажей).

Зараженные культуры инкубировали семь дней при 33 °С, 39 °С и 5%-ном СО2. Ежедневно отбирали аликвоту вируссодержащей жидкости, осветляли центрифугированием при 3000 об./мин в течение 10 минут и хранили при -70 °С.

Количественное определение вируса краснухи методом ПЦР с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени (ПЦР-РВ) проводили, как указано в статье Ю.И. Забияки с соавт. [2]. Из исследуемых образцов и образцов калибраторов (образцы с известным титром вируса) выделяли вирусную РНК с помощью набора реагентов ZR Viral RNA Kit (Zymo Research, США) или Viral RNA Mini Kit (Qiagen, Германия) и проводили реакцию обратной транскрипции (ОТ) и ПЦР-РВ с вирус-специфическими праймерами и зондом. Результат количественной ПЦР-РВ высчитывали по отношению к контрольному образцу с присвоенной специфической активностью, выраженной в ^ТЦД50/мл, и вследствие этого также выражали в ^ТЦД50/мл.

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с помощью t-критерия Стьюдента. Все вычисления осуществлялись с использованием пакета прикладных программ Microsoft Excel.

Результаты и обсуждение

С целью генотипирования выделенного штамма вируса краснухи С-77 было проведено секвениро-вание участка Е1 генома wt- и са-вариантов вируса размером 1442 нуклеотида.

С помощью программы Vector NTI Advance 9.0 был проведен филогенетический анализ полученных нуклеотидных последовательностей, в результате которого варианты вируса краснухи С-77 были отнесены к генотипу 1h [1].

В исследовании был проведен анализ интенсивности репродукции wt- и са-вариантов штамма С-77 при различных температурных режимах (33 °С, 39 °С) с использованием нового метода количественного определения вируса на основе ПЦР-РВ. Классические методы количественной оценки вируса краснухи - реакция бляшкообразования и реакция цитопатического действия - обладают рядом недостатков, такими как длительность теста (около 12 дней), трудоемкость, а также субъективность в интерпретации результатов. В работе [2]

была показана высокая степень корреляции между результатами определения титра вируса краснухи по реакции ЦПД и ПЦР-РВ при соблюдении определенных условий.

Для получения образцов вируссодержащей жидкости культуру клеток Vero инфицировали вирусом краснухи с множественностью заражения 0,01 инфекционной единицы на клетку. Сбор вирусного материала проводили на третьи - седьмые сутки после заражения и определяли титр вируса методом ПЦР-РВ.

При культивировании са-варианта штамма С-77 наблюдался рост титра вируса как при 33 °С, так и при 39 °С. Наибольших значений титр достигал при температуре культивирования 33 °С, тогда как при 39 °С наблюдалось более медленное накопление вируса. У wt-варианта рост титра вируса при всех температурах был менее выражен, чем у са-варианта, что может быть обусловлено лучшей адаптацией ослабленного вируса к культуре клеток Vero, также не отмечалось выраженного различия в титре при температурах культивирования 33 и 39 °С.

Установлено, что на пятый день культивирования зараженных клеток наблюдался значительный рост титра аттенуированного варианта штамма С-77 при температуре 33 °С, величина титра составила 5,5 ^ТЦД50/мл, и в то же время при 39 °С нарастание титра было менее выражено (4 ^ТЦД50/мл) (рис. 1).

На пятый день культивирования дикого варианта штамма С-77 титр при 33 и 39 °С составил 2,9 и 3,1 ^ТЦД50/мл соответственно (рис. 2).

Титр са-варианта штамма С-77 на пятый день культивирования был в 30 раз, а на шестой день - в 25 раз ниже при 39 °С, чем при температуре 33 °С (P < 0,05), в то время как у дикого варианта не наблюдалось достоверной разницы в титрах вируса при температуре культивирования 33 и 39 °С.

В настоящий момент в мире успешно применяется живая аттенуированная вакцина против краснухи. До сих пор точно не установлены механизмы аттенуации вируса и не выработаны четкие критерии контроля генетической стабильности вакцинных штаммов, а в случае с вакцинным штаммом RA27/3 это не представляется возможным.

В нескольких исследованиях было показано, что морфология бляшек, особенности роста на разных культурах клеток, иммуногенетический маркер напрямую связаны с аттенуацией вируса краснухи [4]. В то же время было показано, что все вакцинные штаммы вируса краснухи обладают ts-фенотипом - это выражается в сниженной репродукции при температуре 39 °С по сравнению с 35 °С [5] и является важным маркером аттенуации.

В настоящей работе был использован отечественный штамм вируса краснухи С-77. На основе анализа нуклеотидной последовательности гена Е1 было установлено, что данный штамм относится

Рисунок 1.

Накопление аттенуированного варианта штамма С-77 вируса краснухи в культуральной жидкости при температуре культивирования 33 и 39 °С

Дни после заражения

Рисунок 2.

Накопление дикого варианта штамма С-77 вируса краснухи в культуральной жидкости при температуре культивирования 33 и 39 °С

к генотипу Референс-штаммы данной группы были выделены на территории Томска и Республики Беларусь. В базе данных GenBank ^СВ1) зарегистрировано 16 вирусов, выделенных в недавнее время на территории СНГ и относящихся к этому генотипу.

В работе был проведен анализ интенсивности репродукции са- и wt-вариантов штамма С-77 вируса краснухи при различных температурных режимах с использованием ПЦР-РВ. Данный метод обеспечивает меньшую длительность проведения анализа по сравнению с классическими методами титрования, а также высокую чувствительность и специфичность.

Достоверная разница (А 33 - 39 °С) между значениями титра са-варианта штамма С-77 при разных температурах культивирования наблюдалась

на четвертый, пятый и шестой дни. Наиболее выраженное значение А 33 - 39 °С для са-варианта отмечено на пятый и шестой дни культивирования и составляло 1,5 и 1,4 ^ТЦД50/мл соответственно (P < 0,05), в то время как значение А 33 - 39 °С для wt-варианта было недостоверным.

Таким образом, са-вариант штамма С-77 обладает биологическими маркерами аттенуации: пониженной иммуногенностью на кроликах [3] и са-фенотипом, что позволяет рассматривать его в качестве отечественного кандидата в вакцинный штамм.

Вывод

На основании анализа интенсивности репродукции дикого и ослабленного вариантов штамма С-77 при различных температурных режимах был выявлен фенотипический маркер аттенуа-

ции вируса - достоверная разница в титре са- и 39 °С, при отсутствии достоверной разницы для варианта при температуре культивирования 33 дикого варианта.

Литература

1. Дмитриев Г.В., Забияка Ю.И., Файзулоев Е.Б. и др. Характеристика дикого и ослабленного вариантов штамма C-77 вируса краснухи / Актуальные вопросы эпидемиологии инфекционных болезней: Сб. научных трудов / Под ред. А.А. Шапошникова, Г. В. Ющенко. № 10 (в печати). - М.: Гигиена, 2011.

2. Забияка Ю.И., Файзулоев Е.Б., Борисова Т.К. и др. Экспресс-метод оценки титра вируса краснухи в вируссодержащей жидкости с помощью ПЦР-РВ // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 2010. № 5. С. 57 - 62.

3. Зверев В.В., Десятскова Р.Г., Юминова Н.В. и др. Лабораторная характеристика ослабленных вариантов отечественного штамма вируса краснухи, адаптированных к культуре клеток Vero // Эпидемиология и Вакцинопрофилактика. 2008. № 4. С. 46 - 53.

4. Masafumi S., Katsuhiro K., Tetsuo N. Histidine at position 1042 of the p150 region of a KRT live attenuated rubella vaccine strain is responsible for the temperature sensitivity // Vaccine. 2009. V. 27. P. 234 - 242.

5. Ohtawara M., Kobune F., Umino Y., Sugiura A. Inability of Japanese rubella vaccines to induce antibody response in rabbits is due to growth restriction at 39 degrees C // Arch. Virol. 1985. V. 83 (3 - 4). P. 217 - 227.

Особенности врожденного иммунитета при вирусных инфекциях

С.Г. Маркушин

НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН, Москва

Резюме

В обзоре охарактеризованы основные элементы врожденной иммунной системы, включая различные классы патоген-распознающих рецепторов (TLRs, RLRs, NLRs), компоненты сигнальных внутриклеточных путей и основные семейства цитокинов (интерлейкины, интерфероны, хемокины и другие медиаторы межклеточных взаимодействий). Описаны методы активации различных иммунотропных клеток. Изложены факты, касающиеся экспрессии различных цитокинов при вирусных инфекциях. Подробно рассматриваются агонисты различных Толл-рецепторов и обсуждаются их адъювант-ные свойства. Освещены некоторые аспекты взаимодействия клеток и молекул врожденной и адаптивной иммунных систем, входящих в общий сложный механизм противовирусного иммунитета.

Ключевые слова: врожденная иммунная система, адаптивная иммунная система, противовирусный иммунитет, патогенраспознающие рецепторы, цитокины

Features of Innate Immunity in Virus Infections

S.G. Markushin

I.I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera, RAMS,

Moscow

Abstract

In review basic elements of innate immune system are characterized, including different classes of pathogen-recognized receptors (TLRs, RLRs, NLRs) components of intracellular signaling pathways and other mediators of cell interactions. The facts, concerning of the expression of different cytokines are presented. The agonists of different Toll-receptors are considered in detailand their adjuvant properties are discussed. Some aspects of cell and molecules interaction of innate and adaptive immune systems, forming a common complicated mechanism of antiviral immunity, are elucidated.

Key words: innate immune system, the adaptive immune system, antiviral immunity, pathogen-recognize receptors, cytokines

Любой живой организм при столкновении с тем или иным чужеродным антигенным материалом, будь то бактерии, вирусы, му-тационно измененные собственные клетки, тканевые или органные трансплантаты, приводит в действие иммунные механизмы защиты. Индукция защитного ответа на патоген включает комплексное взаимодействие клеток и молекул врожденной и адаптивной иммунных систем, входящих в общий сложный механизм иммунитета.

Механизмы формирования специфического (адаптивного) иммунного ответа подробно исследованы на различных структурно-иерархических уровнях.

Основные элементы врожденной иммунной системы были обнаружены в последние два десятилетия. Важнейшую роль во взаимосвязи врожденной и адаптивной иммунных систем играют дендритные клетки. Эти, а также другие клетки врожденной иммунной системы экспрессируют патогенраспознаю-щие рецепторы (PRR), которые еще носят название Толл-подобных рецепторов (Toll-like receptors - TLR) млекопитающих по аналогии с Толл-белками насекомых [42]. Эти рецепторы имеют широкую специфичность, способную определить общие структурные черты патоген-ассоциированных молекулярных паттернов (PAMP) [29]. PAMP, полученные из различных классов патогенов, распознаются