КОНФОКАЛЬНЫЙ СПЕКТРОАНАЛИЗАТОР ИЗОБРАЖЕНИЙ
CONFOCAL IMAGE SPECTRUM ANALYSER

Изобретение относится к устройствам сканирования двухмерного изображения поверхности и его представления в виде ряда изображений в разных диапазонах спектра, интервалы по длинам волн которых задаются системой управления и обработки данных.
Изобретение может быть использовано в медицинских целях для спектральной диагностики поверхностных областей различных биологических сред, включая флуоресцентную диагностику. Устройство предназначено, прежде всего, для оперативного получения результатов диагностического анализа.
Известно устройство для создания изображения в выбранном спектральном интервале посредством двухмерного и трехмерного сканирования биологических сред - лазерный сканирующий флуоресцентный микроскоп (LASER SCANNING MICROSCOPY LSM 510, Carl Zeiss). Микроскоп содержит устройство лазерного освещения исследуемого объекта, устройство пространственного сканирования объекта, объектив, передающий изображение освещенного участка объекта в сопряженную плоскость, содержащую конфокальную диафрагму, содержащий также коллимирующую линзу, фильтры селекции лазерного освещения, дифракционную решетку и спектральный детектор, систему управления и обработки данных, синтезирующий изображение поверхности в исследуемом спектральном интервале.
Недостатками данного устройства являются ограниченные возможности построения изображений относительно больших участков поверхностей во многих спектральных диапазонах одновременно, сложность механической системы сканирования, сравнительно большие временные затраты на синтез изображений в разных спектральных диапазонах по данным локальных (нульмерных) регистрируемых объектов.
Наиболее близким по совокупности признаков является прибор фирмы Dilor (Франция), ориентированный на проведение измерений с высоким спектральным разрешением, в котором флуоресцентные изображения объектов реконструируются только на основе записанных спектров (А.В. Феофанов. «Спектральная лазерная сканирующая конфокальная микроскопия в биологических исследованиях». - Успехи биологической химии. Т. 47, 2007, с. 371-410, рис. на с. 381). Прибор содержит устройство формирования линии лазерного освещения исследуемого объекта, устройство пространственного сканирования объекта, объектив, передающий изображение освещенного участка объекта в сопряженную плоскость, содержащую конфокальную диафрагму, содержащий также коллимирующую линзу, фильтры селекции лазерного освещения, дифракционную решетку и монохромную камеру, регистрирующую спектральное разложение на двухмерной матрице, содержащий также компьютер, управляющий процессом формирования данных видеокамеры и синтезирующий изображение поверхности.
Недостатками данного устройства являются: во-первых, сложная система сканирования. Лазерная линия формируется поворотом зеркала, и линия освещения создается движением сфокусированного луча по поверхности объекта. Соответственно, через конфокальную диафрагму передается информация о нульмерном объекте из области точечного освещения, а одномерное изображение, развернутое в спектр по второй координате, регистрируется двухмерной CCD матрицей за счет синхронного поворота второго зеркала. Во-вторых, синтез изображения осуществляется, фактически, из нульмерных регистрируемых объектов. Этим определяются дополнительные затраты времени на формирование двухмерного изображения в выбранном спектральном интервале. Кроме того, для возбуждения используется только одна длина волны лазера, а ее смена требует перенастройки прибора.
Заявляемое изобретение предназначено, прежде всего, для медицинских применений. В условиях диспансеризации, за короткое время, могут быть получены флуоресцентные изображения поверхности заданной площади во всех выбранных спектральных интервалах одновременно. Совместная обработка изображений с применением нейросетевых алгоритмов позволит классифицировать результат по диагностической базе данных. Применяя заявленное изобретение, можно существенно увеличить информативность регистрируемого изображения, упростить конструкцию, увеличить скорость достижения конечного результата. В отличие от известного конструктивного решения, заявленное изобретение позволяет оперативно менять спектральный состав лазерного излучения, возбуждающего флуоресценцию.
Технический результат в заявленном изобретении достигается тем, что в известном конфокальном сканере, содержащем устройство лазерного освещения исследуемого объекта, устройство пространственного сканирования объекта, объектив, передающий изображение освещенного участка объекта в сопряженную плоскость, содержащую конфокальную диафрагму, содержащий также коллимирующую линзу, фильтры селекции лазерного освещения, дифракционную решетку и монохромную камеру, регистрирующую спектральное разложение на двухмерной матрице, содержащий также компьютер, управляющий процессом формирования данных видеокамеры и синтезирующий изображение поверхности, согласно изобретению содержит несколько лазеров, сопряженных с оптическим волокном, систему суммирования излучений оптоволоконных выходов лазеров в одно волокно, систему управления работой лазеров, линзовую систему формирования линии освещения объекта, фильтр выделения спектрального интервала лазерного освещения, предметное стекло, контактирующее с объектом, содержит объектив, в сопряженных плоскостях которого находятся поверхность объекта и конфокальная диафрагма в виде щели, на которую проецируется освещенная область объекта, содержит линзу, в фокальной плоскости которой расположена щель, содержит фильтр, подавляющий спектр возбуждающего лазерного освещения, дифракционную решетку и видеокамеру, работа которой синхронизирована с механическим сканированием спектроанализатора относительно объекта и предметного стекла, содержит компьютер, осуществляющий синтез изображений объекта в выбранных спектральных интервалах на основе видеоряда спектров линейных участков объекта.
Технический эффект, достижимый при использовании данного изобретения, в сравнении с известным техническим решением, основан, прежде всего, на использовании конфокальной диафрагмы в виде щели, что позволяет регистрировать изображение участка поверхности в виде линии, то есть выполнять последующие операции реконструкции флуоресцентного изображения, используя объект с размерностью единица. Вследствие этого исключается сложная и дорогая система сканирования, применяемая в различных вариантах конструкции сканирующего конфокального микроскопа. В заявленном изобретении сканирование сводится только к операции линейного перемещения спектроанализатора относительно объекта.
Конфокальная диафрагма выполняет функцию пространственного фильтра, ограничивающего угловой спектр, излучаемый освещенной областью. Ее применение необходимо, в основном, для достижения высокого контраста изображения. Замена точечной диафрагмы на щелевую не приводит к существенному снижению качества фильтрации. Кроме того, щелевая диафрагма необходима для обеспечения высокого разрешения в спектральном разложении изображения линии по длинам волн.
Линейное сканирующее освещение применено для того, чтобы реализовать высокую достижимую плотность мощности освещения в области фиксации изображения линейной области с целью увеличения уровня флуоресцентного отклика и, в то же время, применено с целью ограничения интегральной лучевой нагрузки на поверхность биологического объекта.
В аксиальной системе ввода излучения в волновод, применяемой при стыковке лазера с волокном, возбуждаются, в основном, аксиальные моды, формирующие, при несфокусированном в точку освещении, спекловую структуру распределения освещенности. Спекловая структура аксиальных мод подвержена низкочастотному пространственному дрейфу вследствие высокой чувствительности картины интерференции мод к изменению температуры и механическим деформациям волокна. В сформированном с помощью цилиндрической оптики освещении в виде линии также, из-за медленных вариаций аксиальных мод, свойственна зависимость распределения падающей мощности излучения вдоль линии от дестабилизирующих факторов. Для того, чтобы исключить этот эффект, в данном изобретении в качестве оптоволоконной системы суммирования излучений оптоволоконных выходов лазеров в одно волокно используется подложка, в направляющие канавки которой вклеиваются выходные торцы излучающих и входной торец приемного волокна, причем направление осей излучающих волокон находится в пределах апертурного угла приемного волокна. Ввод излучения в волновод под углом к оси волновода характеризуется тем, что возбуждаются только кольцевые моды, характеризующиеся высокими пространственными частотами спекловой структуры. Такой спекловый шум вследствие быстрых вариаций интенсивности излучения вдоль линии освещения интегрируется фотоприемником и не искажает регистрируемого распределения освещенности поверхности объекта. Ввод излучения под углом, кроме функции фильтрации спеклового шума, позволяет реализовать функцию суммирования излучения оптоволоконных выходов двух и более лазерных источников. Угловое распределение мощности излучения выходного торца приемного волокна наряду со спекловым шумом приводит к неравномерности освещенности линии по длине. Возникающая неравномерность имеет стационарный характер и, соответственно, может быть скомпенсирована после дифракционного разложения изображения линейной области объекта в спектр - на этапе программного синтеза изображений в различных диапазонах спектра.
Система управления работой каждого лазера предусматривает наличие обратной связи по оптическому каналу с целью стабилизации мощности излучения и задания уровня излучаемой мощности. Компьютерное управление мощностью нескольких лазеров позволяет оперативно менять длину волны возбуждающего излучения, включая и выключая лазерные источники, или формировать спектральный состав излучения при одновременной их работе.
В качестве линзовой системы формирования линии освещения объекта используется одна или несколько цилиндрических линз, формирующих на поверхности объекта изображение выходного торца излучающего волокна поперек линии освещения и растянутого изображения торца волокна вдоль линии, причем ось линзовой системы формирования линии освещения направлена под углом к оси объектива.
В прикладных задачах флуоресцентной диагностики фильтр выделения спектрального интервала возбуждающего излучения предназначен для подавления всех спектральных составляющих лазерного освещения за исключением основной линии, возбуждающей флуоресценцию. В противном случае дополнительный спектр войдет в спектральный состав флуоресцентного отклика и это приведет к искажению регистрируемой информации.
Предметное стекло в данном изобретении предназначено для придания биологическому объекту плоской поверхности, расположенной на расстоянии формирования изображения предметной области в плоскости диафрагмы.
Щель конфокальной диафрагмы ориентирована параллельно линии освещения. В этом же направлении ориентированы штрихи дифракционной решетки, расположенной ортогонально оси коллимирующего объектива, в фокальной плоскости которого расположена диафрагма.
Фильтр, расположенный после коллимирующей линзы, в задачах флуоресцентной диагностики предназначен для подавления спектра отраженного возбуждающего лазерного освещения, уровень которого в сравнении с флуоресцентным сигналом может быть достаточно высоким.
Фазовая дифракционная решетка с синусоидальным профилем фазовой задержки содержит, кроме нулевого, только первые порядки дифракционного разложения в спектр по длинам волн. Высокая дифракционная эффективность такой решетки позволяет получить максимум энергии в первом порядке спектра. Постоянная решетки и ширина щели диафрагмы рассчитываются таким образом, чтобы получить достаточное спектральное разрешение и развертку спектра по всей площади кадра.
Видеокамера, работа которой синхронизирована с механическим сканированием спектроанализатора относительно объекта и предметного стекла, локализует дифракцию Фраунгофера в параллельных лучах в фокальной плоскости камерного объектива на двухмерной монохромной матрице. Кадры видеоряда представляют собой изображения последовательно регистрируемых линейных участков объекта, расположенных по одной из координат кадра и разложение каждого линейного участка в спектр по другой координате.
В конфокальном спектроанализаторе изображений, согласно изобретению, в качестве линзовой системы формирования линии освещения объекта используется одна или несколько цилиндрических линз, причем ось линзовой системы формирования линии освещения направлена под углом к оси объектива. В этом случае в регистрируемом изображении снижается уровень зеркальной составляющей отраженного сигнала. Преимущество оптоволоконной системы освещения заключается, в частности, в том, что могут быть пространственно разнесены лазерные осветители, и линзовая система освещения.
Линзовая система формирования линии освещения объекта через объектив дополнительно содержит полупрозрачное зеркало, направляющее световой пучок через объектив и расположенное между объективом и конфокальной диафрагмой. Такое освещение целесообразно применять для регистрации изображений с высоким разрешением, когда параметры объектива не предусматривают непосредственного освещения объекта.
Заявляемое изобретение, содержащее конфокальную диафрагму, не пропускающую внефокусные лучи, позволяет регистрировать изображение сопряженной с конфокальной диафрагмой линейной области внутри объема полупрозрачной среды. Поэтому для регистрации изображений подповерхностного слоя изобретение содержит устройство изменения расстояния от объектива до предметного стекла.
Спектроанализатором регистрируется излучение, формируемое дифракционной решеткой в одном из первых порядков спектрального разложения, поэтому согласно изобретению ось объектива камеры расположена в пределах угла дифракционного разложения в спектр в первом порядке.
С целью исключения нежелательного воздействия при контакте с биологической средой предметное стекло, прижимаемое к исследуемой поверхности, изолировано от нее полимерной пленкой разового применения или иной средой, прозрачной для возбуждающего и анализируемого излучений.
В процессе механического перемещения спектроанализатора параллельно поверхности объекта, видеокамерой регистрируется видеоряд кадров спектра различных линейных участков объекта. Число кадров видеоряда соответствует числу градаций спектра, из которых, в последующем, синтезируется видеоряд спектральных изображений.
Каждый кадр видеоряда спектральных изображений формируется из идентичных спектральных интервалов видеоряда кадров спектра. При этом кадр формируется в соответствие с последовательностью регистрации различных линейных участков объекта в процессе сканирования.
На Фиг. 1 изображена схема конфокального спектроанализатора изображений. Лазеры 1 с системой ввода излучения в оптические волокна 2 связаны с компьютером 3 системой управления работой лазеров. Система суммирования излучения оптоволоконных выходов лазеров 4 в выходное волокно 5 формирует излучение, расходимость которого определяется числовой апертурой волокна и спектром кольцевых мод. Это излучение проходит через фильтр 6 выделения спектрального интервала возбуждающего излучения. Линзовая система 7 формирует линию освещения объекта через предметное стекло 8. Объектив 9 формирует изображение освещенной линейной области 10 поверхности объекта в плоскости щелевой конфокальной диафрагмы 11. Коллимирующая линза 12, в фокальной плоскости которой расположено изображение щели, формирует оптический пучок, проходящий через фильтр 13, подавляющий спектр возбуждающего излучения. Прошедший через фильтр пучок дифракционной решеткой 14 разлагается в спектр. Первый порядок этого разложения регистрируется видеокамерой 15, работа которой синхронизирована с системой 16 механического сканирования спектроанализатора относительно объекта и предметного стекла. Объектив 17 камеры локализует первый порядок дифракции пучка в параллельных лучах на матрице 18.
На Фиг. 2 изображена схема реконструкции видеоряда спектральных изображений объекта в конфокальном спектроанализаторе изображений. Кадры 1 - последовательность изображений линейных областей объекта и их разложения в спектр в процессе смещения освещенной области по координате х, 2 - спектральные интервалы, выбранные для реконструкции спектральных изображений объекта. Кадры 3 - изображения объекта, сформированные в выбранных спектральных интервалах.
Работа конфокального спектроанализатора изображений осуществляется следующим образом. Несколько различных по излучаемому спектру лазеров 1 с вводом излучения в оптическое волокно 2 связаны по цепям управления с компьютером 3. Программным обеспечением компьютера 3 формируются управляющие сигналы, активизирующие работу лазеров 1. Лазерное излучение одного лазера или двух и более лазеров объединяются сумматором 4 в оптическом волноводе 5. Расходящийся пучок из волновода 5 проходит через оптическую систему, включающую фильтр 6, пропускающий заданный устройством 3 спектральный состав излучения, и проходит через систему цилиндрических линз 7. Положительная линза преобразует расходящийся пучок в линию 10 на поверхности объекта. Для дополнительного увеличения длины линии может быть применена отрицательная линза, ориентированная ортогонально относительно положительной. Для медицинских применений устройство содержит предметное стекло 8. Внешняя плоскость предметного стекла 8 контактирует с исследуемым объектом и является рабочей областью настройки объектива 9. Предметное стекло конструктивно связано с остальной частью спектроанализатора посредством механической системы сканера 16, осуществляющего смещение спектроанализатора в плоскости предметного стекла ортогонально линии освещения 10. Процессом сканирования по заданной программе управляет компьютер 3. При этом положение линии освещения 10 фиксировано относительно спектроанализатора и в процессе сканирования освещенный участок перемещается в диапазоне регистрации изображения. Изображение освещенной линейной области объекта проецируется в сопряженную плоскость щелевой конфокальной диафрагмы 11, фильтрующей угловой спектр падающего на нее пучка. Ширина диафрагмы 11 определяет размер освещенной области объекта, которая станет частью изображения. Прошедший через диафрагму пучок попадает на коллимирующую линзу 12, в фокальной плоскости которой расположена диафрагма 11. Линза 12 необходима для осуществления дифракции Фраунгофера в параллельных лучах на дифракционной решетке 14. На пути пучка, перед решеткой 14, расположен фильтр 13 для подавления отраженного от объекта лазерного излучения источников 1, возбуждающих флуоресценцию. Видеокамера 15 ориентирована таким образом, чтобы первый порядок спектрального разложения был локализован объективом 17 камеры на двухмерной монохромной матрице 18. Процесс регистрации последовательности кадров разложения в спектр синхронизирован со сканером 16 системой программного управления компьютера 3.
Реконструкция изображений в различных диапазонах спектра представлена на Фиг. 2. В памяти компьютера сохраняются данные видеоряда кадров 1 со спектрами, записанными через интервалы смещения 2 при сканировании линии освещения. В каждом элементе 2 содержится информация о распределении яркости изображения зарегистрированного линейного участка объекта в соответствующем спектральном интервале. Величина этого интервала выбирается исходя из заданных параметров спектрального разрешения и энергетических характеристик дифракционного разложения в спектр. Изображения 3 в выбранных спектральных интервалах составляются из элементов 2 видеоряда 1. Последующая обработка изображений 3 с использованием информационных технологий позволяет сделать заключение о степени соответствия параметров исследуемого объекта признакам объектов диагностической базы данных.