ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И ЭМБРИОТОКСИЧНОСТЬ ВОДОРАСТВОРИМОГО НАТРИЙ-, КАЛЬЦИЙ-, ЖЕЛЕЗО- ПОЛИГАЛАКТУРОНАТА

УДК 615.9

Токсикологические свойства и эмбриотоксичность водорастворимого натрий-, кальций-, железо-полигалактуроната

И

сследованы токсикологические свойства водорастворимого натрий-, кальций-, железо- полигалактуроната и его эмбриотоксичность. Установлено, что исследуемое соединение малотоксично, не вызывает гибели животных при однократном внутрижелудочном введении в дозах до 15000 мг/кг. Вещество не оказывает раздражающего действия на кожу, слизистые оболочки глаз и желудка и не обладает кожно-резорбтивным действием. Натрий-, кальций-, железо-полигалактуронат в дозе 1000 мг/кг не проявляет эмбриоток-сического действия и не оказывает отрицательного влияния на клиническое состояние беременных самок лабораторных крыс и течение беременности. Напротив, под влиянием препарата снижаются показатели эмбриональной смертности плодов, повышается масса и длина тела крысят при рождении, а также масса крысят в период постэмбрионального развития.

Фатеева И.А.1, Набиев Ф.Г.1, Выштакалюк А.Б.2, Минзанова С.Т.2, Миронова Л.Г 2, Зобов В.В.3, Ленина О.А.2, Ланцова А.В.2, Миронов В.Ф.2, Коновалов А.И.2

1 Казанская государственная академия ветеринарной медицины им. Н.Э.

2 Учреждение РАН Институт органической и физической химии им. А.Е. Каз НЦ РАН,

3 Казанский государственный университет

Ключевые слова: эмбриональная токсичность, пектиновые полисахариды, металлокомплексы, токсикологическая оценка, противоанемические средства

Введение. По данным Всемирной организации здравоохранения, число людей с дефицитом железа достигает 200 миллионов человек [9]. 18-25% женщин во время беременности страдают анемией, причем в большинстве случаев наблюдается обеднение организма железом еще до наступления беременности [15, 16]. Кроме того, отмечается сниженное по сравнению с рекомендуемыми нормативами потребление железа у детей даже в развитых странах

[14].

Для восполнения потребностей организма в макро- и микроэлементах обычно назначают препараты, содержащие неорганические соли соответствующих металлов. Однако в настоящее время все более актуальным становится поиск, разработка и внедрение менее токсичных и более эффективных органических соединений, содержащих необходимые металлы.

В Институте органической и физической химии им. А.Е. Арбузова синтезированы новые водорастворимые комплексы пектиновых полисахаридов с металлами - макро- и микроэлементами. На лабораторных крысах выявлено выраженное противоанемическое действие натрий-, железо-, кобальт-, медь- полигалактуроната [2, 3]. Показано [4], что комплексообразование ^-металлов Fe, Со, Си с пектиновыми биополимерами приводит к снижению токсичности металлов по сравнению с их неорганическими солями.

В настоящее время получен водорастворимый металлоком-плекс пектиновых полисахаридов с натрием и легко усвояемыми 2-х валентными ионами кальция и железа - натрий-, кальций-, железо- полигалактуронат (ПГ №, Са, Fe), содержащий 22,7 мг/г (2,27%) кальция и 10,3 мг/г (1,03%) железа и перспективный в качестве противоанемического средства и источника кальция [11]. Однако для рекомендации к применению данного вещества в качестве противоанемического средства необходимо изучение его токсикологических свойств. Ввиду того, что алиментарные анемии наиболее часто встречаются среди беременных женщин и детей, изучение эмбриональной токсичности и влияния препарата на развитие потомства у лабораторных животных имеет особенно высокую актуальность.

Материалы и методика исследования. Согласно [1, 10, 12], проведено исследование токсикологических свойств ПГ №, Са, Fe. Исследование острой токсичности проведено на 120 белых мышах и 65 лабораторных крысах. Препарат вводили в дозах 500, 600 и 1000 мг/кг животным, выдержанным на голодной диете, через зонд в виде 2% раствора, а в дозах 1000, 2000, 3000, 4000, 10000 и 15000

мг/кг вводили с кормом - в виде болюсов с мукой. Изучение раздражающего действия исследуемого препарата на кожу проведено на 13 нелинейных лабораторных крысах, на слизистую оболочку глаза - на 7 кроликах и на слизистую оболочку желудка - на 5 лабораторных крысах и 10 мышах.

Для исследования кожно-раздражающего и кожно-резорбтив-ного действия за сутки до опыта у крыс с обеих сторон от позвоночника выстригали шерсть на участках 3х3 или 2х2 см. 2,0%-ный водный раствор препарата наносили с помощью щеточки на выстриженный участок кожи справа однократно или в течение 2-х дней. Время экспозиции составляло 1 или 4 часа соответственно. На левый бок (контроль) наносили эквивалентный объем дистиллированной воды. За животными вели наблюдение 7-10 дней. Для исследования раздражающего действия препарата на слизистую оболочку глаза в конъюнктивальный мешок левого глаза кролика вносили 1 - 2 капли 2,0%-ного водного раствора вещества. Слизистая оболочка правого глаза служила контролем (вводили эквивалентное количество дистиллированной воды). Наблюдение за состоянием роговицы глаз животных вели в течение 7-10 дней. Для исследования раздражающего действия препарата на слизистую желудка [12] за сутки до начала опыта животных лишали пищи, но не воды. В день тестирования животным (мыши, крысы) при помощи зонда вводили в желудок ПГ №, Са, Fe в дозе 600 мг/кг. Исследовали влияние препарата на слизистую желудка при разовом введении (крысы, мыши) и при четырехкратном введении в течение 4-х дней (мыши). По истечении четырех часов после введения препарата животное умерщвляли декапитацией, обескровливали и извлекали желудок. Желудок разрезали по малой кривизне, промывали физраствором. Изменения наблюдали под бинокуляром, учитывая при этом появление и выраженность гиперемии, кровоизлияний, эрозии, язв и других морфологических изменений слизистой оболочки.

Опыты по изучению эмбриональной токсичности были проведены на 20 самках нелинейных белых крыс массой 170-210 г согласно [9, 10]. В опытах были использованы белые крысы, которых содержали согласно рекомендациям в стандартных условиях вивария [6, 7].

Вечером подсаживали самцов из расчета 2 самца на 3 самки. Утром делали мазки из влагалища. Первым днем беременности считали день обнаружения спермиев в мазке. Беременные самки крыс были разделены на 2 группы по 10 штук. Животным опыт-

Токсикологический вестник №1

ной группы исследуемый препарат скармливали в дозе 1000 мг/ кг в течение всего периода беременности в виде болюсов массой 8-12 г, которые изготовляли из пшеничной муки, порошка препарата и дистиллированной воды. Животным контрольных групп давали болюсы из пшеничной муки и дистиллированной воды. Каждое животное до кормления основным рационом помещалось в отдельную клетку и содержалось до тех пор, пока не был съеден болюс.

Для изучения эмбриональной токсичности исследуемого препарата в пренатальный период развития на 19 день беременности из каждой группы животных умерщвляли по 5 штук и подсчитывали количество желтых тел в яичниках, число мест имплантаций, количество мест резорбций, и количество живых и мертвых плодов. Далее подсчитывали уровни пред- и постимплантационной, а также общей эмбриональной смертности. Для определения предим-плантационной смертности находили разницу между количеством желтых тел и количеством мест имплантаций, и вычисляли, какую долю в процентах составила эта цифра от числа желтых тел. Для определения постимплантационной смертности вычисляли разность между количеством мест имплантаций и количеством живых плодов, и вычисляли, какую долю в процентах составила эта цифра от числа имплантаций. Для вычисления общей эмбриональной смертности находили разность между числом желтых тел беременности и количеством живых плодов, и определяли, какую долю в процентах составила эта цифра от числа желтых тел беременности.

Исследование влияния ПГ Na, Ca, Fe на эмбриотоксичность в постнатальный период развития проводили по следующей схеме. В первый день после рождения крысят, как в опытной, так и в контрольной группе, производили измерение длины и массы тела. Массу крысят определяли также на десятый и двадцатый день жизни, регистрировали сроки отлипания ушей, опушения, прозрения глаз и прорезывания резцов [5].

Статистическую обработку цифровых данных проводили с помощью программы Microsoft Excel. Достоверность различий определяли по методу Стьюдента-Фишера [8, 13].

Результаты и обсуждение. При исследовании токсикологических свойств препарата ПГ Na, Ca, Fe были получены следующие результаты. В опытах по изучению острой токсичности при однократном внутрижелудочном введении ПГ Na, Ca, Fe во всех испытуемых дозах (500, 600, 1000, 2000, 3000, 4000, 10000 и 15000 мг/ кг) гибели животных не наблюдалось, что свидетельствует о низкой токсичности препарата. При изучении кожно-раздражающего и кожно-резорбтивного действия в обоих вариантах опыта (однократное нанесение 2%-ного раствора с экспозицией 1 час или 2-х кратное нанесение в течение 2-х дней с экспозицией по 4 часа) в месте нанесения препарата на кожу не выявлено покраснений, признаков раздражения и каких-либо иных функциональных и морфологических нарушений кожи (эритем, отеков, трещин, изъязвлений). Также не наблюдалось проявления кожно-резорбтивных (системных) эффектов. При введении 2%-ного водного раствора ПГ Na, Ca, Fe в конъюнктивальный мешок глаза кролика местных раздражающих эффектов, инъекций сосудов склеры и выделений из глаза не наблюдалось. При изучении раздражающего действия препарата на слизистую оболочку желудка не было обнаружено гиперемии, кровоизлияний, эрозии, язв и других морфологических изменений слизистой оболочки. Таким образом, при исследовании токсикологических свойств препарата было показано, что ПГ Na, Ca, Fe является малотоксичным соединением, не оказывающим раздражающего действия на кожу, слизистые оболочки глаза и желудка и не обладающим кожно-резорбтивным действием.

В эксперименте по изучению эмбриональной токсичности было показано, что клиническое состояние самок крыс опытных групп, получавших в течение всего периода беременности ПГ Na, Ca, Fe в дозе 1000 мг/кг, не отличалось от состояния животных контрольной группы. Все животные хорошо поедали корм, адекватно реагировали на тактильные, болевые, звуковые и световые раздражители. Состояние кожного покрова и слизистых оболочек крыс из опытной группы визуально не отличалось от таковых в контроле.

В опыте по изучению эмбриональной токсичности в пренаталь-ный период развития было показано, что в опытной группе самок крыс, получавших ПГ Na, Ca, Fe, снизились показатели эмбриональной смертности плодов. Так, предимплантационная смерт-

ность в опытной группе была на 2,42% ниже, чем в контроле, а по-стимплантационная смертность - на 2,38% и общая эмбриональная смертность - на 4,40%, соответственно. Однако данные различия были статистически не достоверными (табл. 1).

Таблица 1

Влияние пГ Na, Ca, Fe, вводимого в рацион самок крыс во время беременности,

на эмбриональную смертность крысят

показатели Группа животных

контрольная

Количество желтых тел, шт. 10,4±0,27 10,8±0,41

Количество мест имплантаций, шт. 8,8±0,22 9,4±0,57

Количество живых плодов, шт. 8,4±0,22 9,2±0,54

Предимплантационная смертность,% 15,38 12,96

Постимплантационная смертность,% 4,5 2,12

Общая эмбриональная смертность,% 19,2 14,8

Количество мертвых плодов, шт. 0 0

Таблица 2

Влияние пГ Na, Ca, Fe, вводимого в рацион самок крыс во время беременности, на развитие крысят в постнатальный период

показатели Группа животных

контрольная

Количество животных, шт. 5 5

Продолжительность беременности, сут. 20-22 20-22

Количество приплода: живых в группе, шт. на одну самку, шт. 46 46 9,2 ± 1,18 45 45 9,0 ± 1,8

Средняя масса крысят: при рождении, г на 10 сутки на 20 сутки 5,25 ± 0,10 10,27 ± 0,14 13,40 ± 0,23 6,02 ± 0,10 12,16 ± 0,16 17,20 ± 0,19

Средняя длина тела крысят при рождении, см 4,79 ± 0,04 4,99 ± 0,06 *

Срок отлипания ушей, сут. 5,0 ± 0,0 5,0 ± 0,0

Срок опушения, сут. 8,0 ± 0,0 8,0 ± 0,0

Срок прозрения, сут. 16,4 ± 0,51 15,8 ± 0,2

Срок прорезывания резцов, сут. 10,0 ± 0,5 9,6 ± 0,4

Сохранность к 20-му дню после родов, % 100 100

Примечание: * - различия с контролем достоверны при р < 0,05.

В опыте по изучению эмбриональной токсичности препарата в постнатальный период развития в опытной группе самок от 5 крыс было получено лишь на 1 крысенка меньше, чем в контрольной группе (45 против 46 соответственно).

Средняя масса тела и средняя длина крысят при рождении в

опытной группе были больше по сравнению с соответствующими показателями в контрольной группе на 14,57 и на 4,17% соответственно (табл. 2), причем длина крысят в опытной группе превышала показатели контроля статистически достоверно при р < 0,05. После родов кормление и уход за самками крыс и потомством в обе-

Токсикологический вестник №1

их группах были одинаковыми. Сохранность приплода в течение 20 дней наблюдения в обеих группах составляла 100%.

В процессе наблюдения за полученным потомством было выявлено, что рост и развитие крысят в опытной группе по многим параметрам опережает соответствующие показатели контрольной группы. Так, на 10 день масса молодняка крыс в опытной группе превышала соответствующие показатели контроля на 18,40%. На 20 день различия массы тела между группами составили 28,35%. Сроки отлипания ушей и опушения были одинаковыми как в опытной, так и в контрольной группе. Сроки прозрения (открывания глаз) и прорезывания резцов в опытной группе немного сократились.

Выводы. • Натрий-, кальций-, железо- полигалактуронат является малотоксичным соединением, не вызывает гибели животных при однократном внутрижелудочном введении даже при дозе 15000. Вещество не оказывает кожно-раздражающего и кожно-резорбтивно-го действия, не вызывает раздражения и морфологических нарушений со стороны слизистых оболочек глаза и желудка.

• Применение натрий-, кальций-, железо- полигалактуроната в дозе 1000 мг/кг беременным самкам крыс не оказывает эмбриоток-сического действия в пре- и постнатальный периоды развития. Более того, под влиянием препарата отмечается снижение показателей эмбриональной смертности плодов.

• Натрий-, кальций-, железо- полигалактуронат в дозе 1000 мг/ кг не оказывает отрицательного влияния на клиническое состояние беременных самок крыс и течение беременности.

• Натрий-, кальций-, железо- полигалактуронат, применяемый беременным самкам крыс в дозе 1000 мг/кг, не оказывает отрицательного влияния на рост и развитие крысят в постнатальный период жизни. Напротив, развитие крысят, рожденных от самок, получавших испытуемый препарат, опережает развитие крысят контрольной группы: увеличивается масса и длина тела при рождении, масса в процессе роста (на 10 и 20 день), немного сокращаются сроки прорезывания резцов и прозрения.

Исследования проводили в соответствии с планом научных раСПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Андроносов Ф.В. Справочник ветеринарного лаборанта. - М.: Колос, 1981. - 248с.

2. Выштакалюк А.Б., Карасева А.Н., Карлин В.В., и др. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2007. - Т. 143. - № 1. С. 46-49.

3. Выштакалюк АБ., Карасева А.Н., Карлин В.В., и др. // Химико-фармацевтический журнал, 2008. - Т. 42. - № 5. С. 78-81.

4. Выштакалюк А.Б., Карасева А.Н., Карлин

B.В., и др. // Токсикологический вестник, 2006. - № 6.

C. 10-15. 4. Миронов, В.Ф.

5. Елизарова О.Н., Л.В. Жидкова, Т.А. Кочеткова Пособие по токсикологии для лаборантов. - Москва 1974, 168с.

6. Западнюк ВП., Западнюк И.П. Лабораторные животные. Разведение и содержание. - Киев, 1984. -305с.

бот ФГОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана» и Учреждения РАН Института органической и физической химии им. А.Е. Арбузова КазНЦ РАН. Работа поддержана Программой № 5 ОХНМ РАН.

7. Западнюк ИП., Западнюк ВИ., Захария Е.А., и др. Лабораторные животные. Разведение, содержание и использование в эксперименте. - Киев, 1983.

8. Лаккин Г.Ф. Биометрия. - М.: Высш. Шк., 1990. - 352с.

9. Лялякин П.В. Лекарства, которые вы выбираете. - Москва: ТФ «Мир» ОНИКС 21 век, 2001. - С. 7-25.

10. Маланин Л.П. Ветеринарные препараты. Справочник. - М.: Агропромиздш;1988. С. 239-249.

11. Миронов В.Ф., Коновалов А.И., Карасева А.Н., и др. Патент РФ № 2281957 (2006). БИ 2006. № 23.

12. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. - М.: Минздрав РФ ЗАО «ИИА «Ремедиум», 2000. - 398 с.

13. Тукшаитов Р.Х. Основы динамической метрологии и анализа результатов статистической обработки (биология, медицина, химия, физика). - Казань, 2001, 282с.

14. Bossher D., Cawenbergh R.V., Robberecht H., Van Callie-Bertrand M., Deelstra H. Daily dietary iron, zinc and copper intake of infants in Belgium // European Food Research and Technology (Zeitschrift fur Lebensmittel-Untersuchung und -Forchung A). - 2002. -Vol. 215, № 4. - P. 275-278.

15. Haram K., Nilsen S.T., Ulvik R.J. Iron supplementation in pregnancy-evidence and controversies // Acta Obstetricia et Gynecologica Scandinavica - 2001. - Vol. 80. - P. 683-688.

16. Milman N., Clausen J., Byg K.-E. Iron status in 268 Danish women aged 18-30 years: influence of menstruation, contraceptive method, and iron

supplementation // Ann Hematol. - 1998. - Vol. 77. - P. 13-19.

Fateyeva I.A.1, Nabiyev F.G.1, Vyshtakalyuk A.B.2, Minzanova S.T.2, Mironova L.G.2, Zobov V.V.3, Lenina O.A.2, Lantsova A.V.2,

Mironov V.F.2, Konovalov A.I.2

Toxicological properties and embryo toxicity of water-soluble sodium-,calcium-, ferrous polygalacturonate

1 N.E. Bauman Kazan State Academy of Veterinary Medicine; 2 A.Ye. Arbuzov Institute of Organic and Physical Chemistry, Kazan Research Center, Russian Academy of Sciences; 1 Kazan State University

Toxicological properties and embryo toxicity of water-soluble sodium-,calcium-, ferrous polygalacturonate were investigated. It was established that the substance under investigation is low toxic, does not cause animals death at a single intragastric administration in doses up to 15000 mg/kg. The substance does not produce irritation effect on skin, eye mucous conjunctiva and stomach mucous membrane, does not have skin-absorptive effect. Sodium-,calcium-, ferrous polygalacturonate in the dose of 1000mg/kg does not pose embryotoxic effect and does not affect the clinical state of pregnant laboratory rat females during the pregnancy. On the contrary, the preparation lowers indicators of fetuses embryonal lethality, increases the body weight and length of infant rats at birth and their weight during the embryonal development.

Материал поступил в редакцию 27.02.2010 г.