Способ диагностики воспаления в эпикардиальной жировой ткани у пациентов с ишемической болезнью сердца и коронарным атеросклерозом
DIAGNOSTIC TECHNIQUE OF INFLAMMATION IN EPICARDIAL ADIPOSE TISSUE IN PATIENTS WITH ISCHEMIC HEART DISEASE AND CORONARY ATHEROSCLEROSIS

Изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии и может быть использовано для неинвазивной диагностики воспаления в эпикардиальной жировой ткани, что позволяет более точно прогнозировать сердечно-сосудистый риск у пациентов с коронарным атеросклерозом.
Эпикардиальная жировая ткань представляет собой специфическое депо висцеральной жировой ткани, которое заполняет пространство между миокардом и висцеральным листком перикарда и обладает специфическими метаболическими свойствами [1]. Установлено, что увеличение объема эпикардиальной жировой ткани ассоциируется с развитием локального и системного хронического субклинического воспаления, причем выраженность воспалительного ответа в значительной мере определяет тяжесть коронарного атеросклероза, скорость его прогрессирования и сердечно-сосудистый прогноз пациентов [2]. Показана также прямая взаимосвязь между накоплением эпикардиальной жировой ткани и развитием гипертрофии левого желудочка, диастолической дисфункции миокарда и сердечной недостаточности [3].
Поскольку активными участниками тканевого воспаления являются макрофаги (CD68+), а лейкоциты (CD45+) представляют собой его общепринятые эффекторы, увеличение количества этих клеток в эпикардиальной жировой ткани формирует инфильтрат и свидетельствует о наличии субклинического воспаления. Имеются данные о том, что развитие коронарного атеросклероза ассоциируется с увеличением содержания количества макрофагов (CD68+) в эпикардиальной жировой ткани [4]. Показано также, что количество CD68+-макрофагов в эпикардиальной жировой ткани, наряду с содержанием цитокина IL-1β и адипонектина, являются значимыми предикторами развития коронарного атеросклероза [5].
Существенным недостатком диагностики воспаления в эпикардиальной жировой ткани, ограничивающим ее использование в клинике, является необходимость проведения инвазивного хирургического вмешательства с забором интраоперационных биоптатов и последующим определением в них количества CD68+макрофагов и CD45+лейкоцитов.
Высвобождение N-терминального участка мозгового натрийуретического пропептида (NT-proBNP) кардиомиоцитами в плазму крови в ответ на растяжение камер сердца является установленным маркером и фактором риска развития сердечной недостаточности, при этом даже незначительное увеличение содержания NT-proBNP ассоциируется с неблагоприятным сердечно-сосудистым прогнозом и коррелирует с тяжестью коронарного атеросклероза [6, 7]. Сообщается о наличии прямой взаимосвязи между толщиной эпикардиальной жировой ткани и содержанием NT-proBNP в системной циркуляции у пациентов с острым ишемическим инсультом [8]. В то же время, установлено, что натрийуретические пептиды имеют рецепторы в жировой ткани и, таким образом, способны вносить вклад в регуляцию энергетического обмена, липолиза и секреторной функции адипоцитов [9].
Анализ результатов патентного поиска и мировой научно-медицинской литературы показал, что до настоящего времени не разработаны неинвазивные способы диагностики воспаления в эпикардиальной жировой ткани.
Задачей изобретения является создание способа, позволяющего неинвазивно диагностировать воспаление в эпикардиальной жировой ткани у пациентов с ишемической болезнью сердца и коронарным атеросклерозом.
Поставленная задача решается путем определения у пациентов с ишемической болезнью сердца и коронарным атеросклерозом в сыворотке крови концентрации N-терминального участка мозгового натрийуретического пропептида, и при его значении 19 фмоль/мл и более диагностируют воспаление в эпикардиальной жировой ткани.
Новым в предлагаемом способе диагностики воспаления в эпикардиальной жировой ткани является отсутствие необходимости интервенционного хирургического вмешательства, забора интраоперационных биоптатов эпикардиальной жировой ткани и проведения трудоемкого и очень дорогостоящего иммуногистохимического исследования количества CD68+макрофагов и CD45+лейкоцитов в ней, напротив, диагностика воспаления в эпикардиальной жировой ткани проводится неинвазивно - по содержанию в сыворотке крови N-терминального участка мозгового натрийуретического пропептида.
Предлагаемый способ основан на результатах клинического исследования. В исследование были включены 10 пациентов с ишемической болезнью сердца и коронарным атеросклерозом, госпитализированных в клиники Научно-исследовательского института кардиологии для проведения операции аорто-коронарного шунтирования. Критериями включения являлись диагноз ИБС и наличие коронарного атеросклероза, диагноз был выставлен в предыдущую госпитализацию на основании данных анамнеза, объективного обследования, инструментальных и лабораторных методов. Критерии исключения: наличие воспалительных процессов любой локализации. Пациенты не имели существенных различий по основным клиническим данным, все находились на регулярной кардиоактивной терапии. Все пациенты подписали информированное согласие на участие в исследовании после беседы и ответов на вопросы. Протокол исследования был одобрен комитетом по биомедицинской этике НИИ кардиологии (протокол №146 от 16.06.2016)
Изобретение будет понятно из следующего описания к приложенной к нему фигуре 1. На фигуре 1 представлены графики средних значений количества CD68+(1) и CD45+(2) в эпикардиальной жировой ткани, содержания в сыворотке крови NT-proBNP (3) в первом  и втором кластерах  пациентов.
За 2-3 дня до хирургического вмешательства в утренние часы натощак осуществлялось взятие крови из кубитальной вены в объеме 10 мл в пробирку с коагулянтом для получения сыворотки крови. Полученный образец крови при комнатной температуре доставляли в клинико-диагностическую лабораторию. Путем центрифугирования получали сыворотку крови для приготовления биообразцов и дальнейшего анализа. Методом твердофазного иммуноферментного анализа определяли концентрацию N-терминального участка мозгового натрийуретического пропептида (фмоль/мл) в соответствии с инструкцией (NT-proBNP, Biomedica, Германия).
Эпикардиальная жировая ткань в объеме 1 см была получена из эпикардиальной жировой клетчатки пациентов в ходе планового аорто-коронарного шунтирования, проводимого по показаниям. Образцы эпикардиальной жировой ткани забирали одномоментно до подключения аппарата искусственного кровообращения при помощи острого скальпеля без использования электрокоагуляции (2 образца).
Полученную жировую ткань фиксировали в течение суток в 10% забуференном формалине, подвергали стандартной гистологической проводке, заливке в парафин, после чего выполнялись серийные срезы толщиной 3-5 мкм, которые наносились на стекла с L-полилизиновым покрытием. Для исследования применяли иммуногистохимический метод окрашивания. Полученные препараты депарафинизировали в ксилолах и спиртах, промывали в дистилированной воде и проводили демаскировку антигенов на водяной бане при 970С в буфере Трис-ЭДТА (рН=9,0) в течение 20 минут. После демаскировки препараты остывали до комнатной температуры и промывались в буферном растворе PBS 2 раза. Каждый срез обводили парафиновым маркером и наносили раствор для блокировки эндогенной пероксидазы на 10 мин. Промывали 2 раза в буферном растворе PBS. Далее наносили протеиновый блок на 10 мин и промывали 2 раза в буферном растворе PBS. На 30 минут наносили мышиные моноклональные антитела CD68, CD3, CD45, после чего промывали 3 раза в буферном растворе PBS. Далее наносили на срезы пероксидазу хрена на 15 мин и промывали 4 раза в буферном растворе PBS. На 40 сек наносили раствор DAB, промывали 4 раза в буферном растворе PBS. Докрашивали препараты гематоксилином, проводили регидратацию и заключение под покровное стекло. Для подсчета клеток использовали световую микроскопию. Подсчет клеток проводился в 10 полях зрения при увеличении х400.
На двумерных диаграммах рассеяния NT-proBNP и ЭЖТ.CD45+лейкоцитов и NT-proBNP и ЭЖТ.CD68+макрофагов было обнаружено, что все пациенты делятся на два кластера в зависимости от уровня в сыворотке крови NT-proBNP, воспаление в виде одновременной регистрации инфильтрата CD68+макрофагов и CD45+лейкоцитов в биоптатах эпикардиальной жировой ткани присутствовало только у пациентов первого кластера (n=4), у которых содержание в сыворотке крови NT-proBNP составляло 19 фмоль/мл и более. У этих пациентов в эпикардиальной жировой ткани определялось одновременно большое количество CD68+макрофагов и CD45+лейкоцитов: количество CD68+макрофагов составляло 27 клеток в 10 полях зрения (увеличение х400) и более, а CD45+лейкоцитов составляло 14 клеток в 10 полях зрения (увеличение х400) и более. У пациентов второго кластера (n=6), у которых содержание в сыворотке крови NT-proBNP составляло 12 фмоль/мл и менее, в эпикардиальной жировой ткани воспаление отсутствовало: количество CD68+макрофагов и CD45+лейкоцитов было низким, составляя 16 клеток в 10 полях зрения (увеличение х400) и менее, и 6 клеток в 10 полях зрения (увеличение х400) и менее, соответственно. С помощью кластерного анализа методом k-средних были получены средние значения количества CD68+макрофагов, CD45+лейкоцитов в эпикардиальной жировой ткани и содержания NT-proBNP (3) в сыворотке крови у пациентов 1-го и 2-го кластера (фиг. 1).
Таким образом, на основании данных статистического анализа можно сделать вывод о том, что предлагаемый способ позволяет неинвазивно с использованием определения в сыворотке крови содержания NT-proBNP оценить активность воспалительного процесса в эпикардиальной жировой ткани (инфильтрация CD68+макрофагами и CD45+лейкоцитами).
Ниже приводятся 2 клинических примера использования разработанного способа.
Пример 1
Пациентка И., 67 лет, поступила в плановом порядке в отделение атеросклероза и хронической ИБС для проведения аорто-коронарного шунтирования по поводу многососудистого стенозирующего атеросклероза коронарных артерий.
Жалобы: ангинозные боли соответствуют III ФК.
Из анамнеза: давящие боли за грудиной при небольшой физической нагрузке беспокоят в течение 4 мес, по результатам ЭКГ и ЭхоКГ - данные за перенесенный инфаркт миокарда, выполнена КАГ - выявлено многососудистое поражение коронарного русла, рекомендовано оперативное лечение в объеме АКШ. Фоновые заболевания: гипертоническая болезнь, дислипидемия, нарушение толерантности к глюкозе.
Объективно: общее состояние удовлетворительное, ИМТ 25,8 кг/м2.
Проведено исследование согласно предлагаемому способу:
Концентрация NT-proBNP в сыворотке крови 31,599 фмоль/мл.
В эпикардиальной жировой ткани: количество CD68+макрофагов - 28 клеток в 10 полях зрения (увеличение х400), количество CD45+лейкоцитов - 23 клетки в 10 полях зрения (увеличение х400).
Таким образом, было выявлено субклиническое воспаление в эпикардиальной жировой ткани.
Пример 2
Пациентка С., 54 года, поступила в плановом порядке в отделение атеросклероза и хронической ИБС для проведения аорто-коронарного шунтирования по поводу многососудистого стенозирующего атеросклероза коронарных артерий.
Жалобы: быструю утомляемость, слабость, одышку при быстрой ходьбе.
Из анамнеза: давящие боли за грудиной при физической нагрузке беспоколи 4 года назад, затем прошли, отмечала отдышку при быстрой ходьбе; в течение 18 лет страдает сахарным диабетом 2 типа, выполнена КАГ - выявлено многососудистое поражение коронарного русла, рекомендовано оперативное лечение в объеме АКШ. Фоновые заболевания: гипертоническая болезнь, дислипидемия, стенозирующий атеросклероз сонных артерий.
Объективно: общее состояние удовлетворительное, ИМТ 27,6 кг/м2. Проведено исследование согласно предлагаемому способу: Концентрация NT-proBNP в сыворотке крови 3,985 фмоль/мл.
В эпикардиальной жировой ткани: количество CD68+макрофагов - 10 клеток в 10 полях зрения (увеличение х400), количество CD45+лейкоцитов - 3 клетки в 10 полях зрения (увеличение х400).
Таким образом, активность воспалительного процесса в жировой ткани не подтверждена.
Предлагаемый в качестве изобретения способ апробирован на 10 больных и может быть использован в практическом здравоохранении для прогнозирования наличия хронического субклинического воспаления в эпикардиальной жировой ткани больного и выделения когорты пациентов с ишемической болезнью сердца и высоким риском развития неблагоприятных сердечно-сосудистых событий с последующей коррекцией терапии у них с целью улучшения прогноза.
Источники информации
1. Le Jemtel Т.Н., Samson R., Ayinapudi K., Singh Т., Oparil S. Epicardial Adipose Tissue and Cardiovascular Disease // Curr Hypertens Rep. 2019; 21(5):36.
doi: 10.1007/s11906-019-0939-6
2. Packer M., Epicardial Adipose Tissue May Mediate Deleterious Effects of Obesity and Inflammation on the Myocardium // JACC. 2018;71(20):2360-72.
doi: 10.1016/j.jacc.2018.03.509
3. Matloch Z., Cinkajzlova A., Mraz M., Haluzik M. The Role of Inflammation in Epicardial Adipose Tissue in Heart Diseases // Curr Pharm Des. 2018; 24(3): 297-309. doi: 10.2174/1381612824666180110102125
4. Tanaka K., Sata M. Roles of Perivascular Adipose Tissue in the Pathogenesis of Atherosclerosis // Front Physiol. 2018; 9: 3. doi: 10.3389/fphys.2018.00003.
5. Shimabukuro M., Hirata Y., Tabata M., et al. Epicardial adipose tissue volume and adipocytokine imbalance are strongly linked to human coronary atherosclerosis // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 2013; 33: 1077-1084.
doi: 10.1161/ATVBAHA.112.300829
6. Reinhard H., Wiinberg N., Hansen P.R., et al. NT-proBNP levels, atherosclerosis and vascular function in asymptomatic type 2 diabetic patients with microalbuminuria: peripheral reactive hyperaemia index but not NT-proBNP is an independent predictor of coronary atherosclerosis // Cardiovasc Diabetol. 2011; 10:71.
doi: 10.1186/1475-2840-10-71.
7. Caselli C, Prontera C, Liga R., et al. Effect of Coronary Atherosclerosis and Myocardial Ischemia on Plasma Levels of High-Sensitivity Troponin T and NT-proBNP in Patients With Stable Angina // Arterioscler Thromb Vase Biol. 2016; 36: 757-764. doi: 10.1161/ATVBAHA.115.306818
8. Altun I., Unal Y., Basaran O., et al. Increased Epicardial Fat Thickness Correlates with Aortic Stiffness and N-Terminal Pro-Brain Natriuretic Peptide Levels in Acute Ischemic Stroke Patients // Tex Heart Inst J. 2016; 43(3): 220-6. doi: 10.14503/THIJ-l 5-5428
9. Gruden G., Landi A., Bruno G. Natriuretic Peptides, Heart, and Adipose Tissue: New Findings and Future Developments for Diabetes Research // Diabetes Care. 2014; 37(11): 2899-2908. doi: 10.2337/dc14-0669.