СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА НА ОСНОВЕ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОТНОСИТЕЛЬНОГО СОДЕРЖАНИЯ ХИМИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ФОРМ МЕТАЛЛ-СВЯЗЫВАЮЩЕГО ДОМЕНА БЕТА-АМИЛОИДА В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ
DIAGNOSTIC TECHNIQUE FOR ALZHEIMER DISEASE BY MEASURING CHEMICALLY MODIFIED FORMS OF METAL-BINDING BETA-AMYLOID DOMAIN IN BIOLOGICAL FLUIDS

Область техники, к которой относится изобретение
Данное изобретение относится к области медицины, а именно к патологической физиологии нейродегенеративных заболеваний, в частности к биомаркерам и применению биомаркеров для лабораторной диагностики болезни Альцгеймера (рубрики «G01N 33/483», «G01N 33/49» и «G01N 33/50» в соответствии с Международной патентной классификацией последней редакции).
Уровень техники
Болезнь Альцгеймера является самой распространенной нейродегенеративной протеинопатией в мире и затрагивает около 30 миллионов пациентов (1). В России число таких больных насчитывает свыше полумиллиона человек (2). В настоящее время не существует эффективной терапии и лабораторной диагностики этой патологии, поэтому во всем мире ведутся интенсивные научные исследования, направленные на решение этих задач (3).
Известно множество эндогенных и экзогенных факторов, влияющих на протекание болезни Альцгеймера, однако важнейшим из них является появление в организме человека растворимых нейротоксичных олигомеров бета-амилоида (4), которые рассматриваются в качестве главных патогенных частиц, приводящих в конечном итоге к накоплению полимерных агрегатов бета-амилоида в виде сенильных нейритических (амилоидных) бляшек в тканях головного мозга пациентов и гибели нейронов (5). К сожалению, современные физико-химические методы не позволяют достоверно и воспроизводимо в условиях массовых клинических анализов оценить концентрацию растворимых патогенных олигомеров бета-амилоида в биологических жидкостях пациентов вследствие большой вариабельности в размерах и свойствах таких олигомеров (6).
Причины образования патогенных олигомеров из мономерных молекул бета-амилоида, являющихся нормальными физиологическими компонентами крови, не установлены (7, 8). Однако существуют экспериментальные свидетельства того, что химически модифицированные формы бета-амилоида (например, содержащие пироглутамат - 3, изоаспарагиновую кислоту - 7 или фосфосерин - 8) могут играть ключевую роль в олигомеризации интактного бета-амилоида (9-13). Соответственно, детектирование таких аберрантных форм бета-амилоида в образцах биологических жидкостей (например, крови) биохимическими и/или биофизическими методами (например, с помощью иммуноферментного анализа или масс-спектрометрии высокого разрешения) является крайне актуальной стратегией при разработке способов лабораторной диагностики болезни Альцгеймера.
Известно, что ионы цинка играют особую роль в возникновении патогенных агрегатов бета-амилоида (14). Нами были определены структурные детерминанты бета-амилоида, вовлеченные в процессы его патогенной цинк-зависимой олигомеризации (15-17). На основании полученных результатов было предположено, что посттрансляционные химические модификации минимального цинк-связывающего центра (участок 6-14 аминокислотной последовательности) бета-амилоида приводят к критическим изменениям в цинк-зависимой олигомеризации соответствующих форм бета-амилоида. Таким образом, именно эти формы могут быть предшественниками патогенных олигомеров, однако в отличие от последних доступны для аналитического определения при использовании современных способов пробоподготовки и детектирования. Действительно, нами был разработан аналитический метод количественной оценки относительного содержания изомеризованной по аспартату 7 формы бета-амилоида (18). Недавно были получены данные о роли фосфорилирования серина в положении 8 в патогенности соответствующей формы бета-амилиода (19). Эта химическая модификация также находится в металл-связывающем домене и может оказывать существенное влияние на процессы цинк-зависимой агрегации бета-амилоида и, как следствие, на патогенез болезни Альцгеймера. Несмотря на то, что в мире ведутся интенсивные работы по выявлению биомаркеров патологических процессов болезни Альцгеймера (20, 21), сведений об использовании химически модифицированных по металл-связывающему домену форм бета-амилоида в качестве соответствующих биомаркеров не существует.
В рамках настоящего изобретения нами предложен способ лабораторной диагностики болезни Альцгеймера на основе количественного измерения в образцах биологических жидкостей относительного содержания двух химически модифицированных форм бета-амилоида человека: изомеризованной по аспарагиновой кислоте в положении 7 и фосфорилированной по серину в положении 8.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к способу лабораторной диагностики болезни Альцгеймера на основе количественной оценки относительного содержания в биологических жидкостях пациента, например, в сыворотке крови, следующих двух химически модифицированных по металл-связывающему домену форм бета-амилоида: (1) изомеризованной по аспарагиновой кислоте в положении 7; и (2) фосфорилированной по серину в положении 8. Преимущество использования данного способа диагностики состоит в том, что в качестве биомаркеров патологического состояния используют сразу две формы бета-амилоида, независимое появление каждой из которых в биологических образцах связано с патогенезом болезни Альцгеймера.
Технический результат
Технический результат, получаемый при использовании патентуемого изобретения, заключается в постановке диагноза болезни Альцгеймера исходя из данных лабораторного анализа образцов биологических жидкостей пациента.
Пример осуществления изобретения
Формируют репрезентативную выборку пациентов. Для получения образцов венозной крови были сформированы две группы: 1-я группа - пациенты (20 чел.) с болезнью Альцгеймера (БА) на разных стадиях заболевания (мягкой, умеренной и тяжелой), 2-я группа (контрольная) - лица пожилого возраста (10 чел.), не имеющие признаков когнитивного снижения. Пациенты, включенные в исследование, соответствовали следующим критериям включения (для пациентов 1-й группы):
1. Пациенты в возрасте 50 лет и старше;
2. Пациенты имеют ухаживающего за ним человека (caregiver), который контактирует с пациентом не менее 5 дней в неделю в течение всего периода исследования и сопровождает его (ее) во время визита в клинику.
3. Пациенты имеют готовность к сотрудничеству и способны полностью пройти все обследования, а также имеют образование, позволяющее больному читать, писать и эффективно общаться в преморбидном состоянии.
4. Пациенты должны соответствовать диагностическим критериям МКБ-10 и DSM-IV для БА и соответствовать клиническим критериям NINCDS-ADRDA для диагностики вероятной БА, уровень их когнитивного снижения должен соответствовать мягкой (легкой), умеренно выраженной или тяжелой деменции, с соответствующими оценками по Мини-тесту оценки психического состояния (MMSE), которая должна быть в пределах от 26 до 5 баллов (1я группа).
5. Оценка по ишемической шкале Хачински не должна превышать 4 балла.
6. Тяжесть болезни должна соответствовать 4-7 стадии по шкале общего снижения когнитивного функционирования (GDS).
7. Данные КТ и МРТ исследования головного мозга должны исключать другие церебральные причины деменции.
8. Данные физического, неврологического и лабораторного исследований должны исключать вторичную деменцию (см. Критерии исключения).
9. Получение письменного информированного согласия пациента и его ухаживающего лица (информанта).
В состав групп не включались пожилые лица, имеющие следующие критерии исключения:
1. Пациент не должен страдать любым заболеванием, находящимся на поздней стадии, в тяжелой степени или нестабильно протекающим, которое может повлиять на оценку первичных и вторичных переменных, включая любое патологическое состояние, которое может прогрессировать, рецидивировать или изменяться по тяжести и тем самым оказывать влияние на оценку клинического и психического статуса пациента. Кроме того, исключается любое тяжелое ограничение физической активности, нарушающее основную повседневную деятельность пациента;
2. Пациент не должен иметь физические недостатки, препятствующие выполнению им всех требований исследования, и которые, в особенности, влияют на оценку деменции (например: слепота, глухота, тяжелые нарушения речи и сенсомоторные нарушения, препятствующие проведению запланированного нейропсихологического тестирования);
3. Текущий диагноз тяжелого или нестабильного сердечно-сосудистого заболевания;
4. Наличие тахикардии (ЧСС более 100 ударов в минуту), брадикардии (ЧСС менее 50 ударов в минуту), синдром слабости синусового узла или нарушения проводимости (синоатриальная блокада, атриовентрикулярная блокада второй или третьей степени), неконтролируемая мерцательная аритмия (частота сокращения желудочков >100 ударов в минуту);
5. Диагноз нестабильной или плохо контролируемой артериальной гипертензией в течение последних 3 месяцев (максимальное систолическое и диастолическое давление более 160 и 100 мм рт.ст. соответственно);
6. Текущий диагноз умеренной или тяжелой сердечной недостаточности;
7. Более одного инфаркта миокарда (ИМ) в течение последних 5 лет;
8. Текущий диагноз тяжелой или нестабильной стенокардии.
9. Должны быть исключены пациенты, имеющие нарушение мозгового кровообращения в анамнезе;
10. Диагноз иного нейродегенеративного заболевания, кроме БА (например, болезнь Гентингона, болезнь Паркинсона);
11. Текущий диагноз активных неконтролируемых судорожных припадков (например, любые припадки в течение последних 6 месяцев);
12. Текущий диагноз большой депрессии по критериям DSM-IV (за исключением пациентов со стабильным состоянием, принимающих в течение как минимум последних 2 месяцев антидепрессанты);
13. Любые другие психиатрические диагнозы, в том числе олигофрения, шизофрения или биполярное расстройство;
14. Не могут быть включены в исследование больные, имеющие следующие отклонения лабораторных показателей:
- клинически значимые отклонения таких лабораторных показателей, как уровень в сыворотке витамина В12 и фолата, или тестов функции щитовидной железы (ТТГ/свободный Т4), определяемые во время скрининга и демонстрирующие недостаточность витамина В12, фолата или гипотиреоидизм;
- положительный серологический тест на сифилис;
- положительный тест на ВИЧ-инфекцию;
- клинически значимые отклонения других лабораторных показателей и/или ЭКГ, свидетельствующие о декомпенсации соматического заболевания.
У каждого пациента репрезентативной выборки из локтевой вены забирают не менее 15 мл цельной крови и помещают в содержащие ЭДТА вакуумные пробирки объемом 10 мл. Затем с использованием лабораторной центрифуги CapicomLaboratoryEquipment при 4000 об/мин в течение 25 минут при комнатной температуре получают сыворотку крови. Из полученной сыворотки готовят в криопробирках объемом 7.5 мл аликвоты по 5 мл. Аликвоты хранят при -20°C или при -80°C.
Из каждого образца сыворотки крови готовят денатурированный образец. Для этого 5 мл сыворотки крови смешивают с 46 мл 10 мМ фосфатного буфера (pH - 7.2), содержащего 6,5 М гуанидин хлорид. К полученному раствору добавляют 49 мл 0,5% фосфорной к-ты (доведя уровень pH до 2,5; конечная концентрация гуанидин хлорида должна составлять 3 М). Затем приготовленный раствор центрифугируют при 38000 g в течение 10 мин (темп - 15°С) в 250 мл центрифужных стаканах. После удаления пены, супернатант вновь центрифугируют при 48000 g в течение 30 мин (темп - 15°C) в 100 мл центрифужных пробирках.
Из каждого денатурированного образца сыворотки крови выделяют общую пептидную фракцию. Для этого полученный супернатант вводят в картридж С18 SepPak (Waters C18 SepPakPluscartridge), предварительно уравновешенный водным р-ром 0,1% ТФУ к-ты. Несвязавшийся с матрицей картриджа материал удаляют промыванием данного картриджа водным р-ром 0,1% ТФУ. Связавшийся материал элюируют 70% р-ром ацетонитрила (содержащего 0,1% ТФУ (v/v)), собирают, высушивают при помощи вакуумной сушки и хранят при - 20°C.
Каждый полученный образец общей пептидной фракции растворяют в 0,5 мл 25% уксусной кислоты и обрабатывают в ультразвуковой бане в течение 30 минут. После добавления к раствору 1 мл 0,1% ТФУ (v/v) полученный образец вновь обрабатывают в ультразвуковой бане в течение 30 минут. Бета-амилоидную фракцию выделяют из общей пептидной фракции при помощи препаративной колонки Zorbax 300SB-C18 (21,2×250 мм). Регистрацию элюата ведут при 254 нм. Скорость элюции должна составлять 5 мл/мин. Используют метод линейного градиентного элюирования (с 20% до 70% ацетонитрила, содержащего 0.1% ТФУ (v/v), против 0.1% водного раствора ТФУ (v/v)), на протяжении 40 мин). Собирают элюат (время выхода с колонки - 21,5 мин по 23,5 мин %-ное содержание ацетонитрила - 45%). Объем полученного образца - 10 мл материала. Растворитель удаляют на вакуумной центрифуге при +30°C. Сухой остаток хранят при -20°C.
Для получения фрагментов 1-16 бета-амилоида каждую бета-амилоидную фракцию растворяют в 100 мкл 75 мМ Tris-HCl буфера (pH-8.0). К полученному раствору добавляют 100 нг лизилэндопептидазы. Инкубацию ведут 15 часов при 37°С. Ход реакции остановливают добавлением 100 мкл 10% муравьиной кислоты. Полученный раствор хранят при - 20°C.
Фракцию фрагментов 1-16 бета-амилоида выделяют из обработанной лизилэндопептидазой бета-амилоидной фракции при помощи препаративной колонки Zorbax 300SB-C18 (21,2×250 мм). Регистрацию элюата ведут 254 нм. Скорость элюции должна составлять 5 мл/мин. Используют метод линейного градиентного элюирования (с 20% до 70% ацетонитрила, содержащего 0.1% ТФУ (v/v), против 0.1% водного раствора ТФУ (v/v), на протяжении 40 мин). Собирают элюат (время выхода с колонки - 10,5 мин по 12,5 мин, %-ное содержание ацетонитрила - 27%). Объем полученного образца - 10 мл материала. Растворитель удаляют на вакуумной центрифуге при +30°C. Сухой остаток хранят при -20°C.
Для определения изомерного состава фракции фрагментов 1-16 бета-амилоида проводят масс-спектрометрический анализ образцов этой фракции. Для этого сухой остаток, содержащий фракцию фрагментов 1-16 бета-амилоида, растворяют в 500 мкл раствора ацетонитрил/вода (1/1 об). Полученные пробы анлаизируют на масс-спектрометрах ионного циклотронного резонанса с преобразованием Фурье BRUKER ApexQe (BrukerDaltonics, Billerica, США) или Finnigan LTQ FT (ThermoElectron, Bremen, Германия) с использованием калибровочных кривых, построенных на основании данных об относительных интенсивностях характеристических ионных фрагментов, отвечающих двум химически модифицированным по металл-связывающему домену формам бета-амилоида: (1) изомеризованной по аспарагиновой кислоте в положении 7; и (2) фосфорилированной по серину в положении 8.
Для исследованной выборки пациентов были получены следующие сведения о содержании вышеуказанных форм бета-амилоида. Для 17 пациентов с диагнозом болезни Альцгеймера содержание изомеризованной по аспарагиновой кислоте в положении 7 формы бета-амилоида составляло от 6 до 33%, для оставшихся 3 пациентов эта форма бета-амилоида отсутствовала, зато содержание фосфорилированной по серину в положении 8 формы бета-амилоида у этих больных составляло от 3 до 8%. При этом у здоровых добровольцев не было обнаружено ни одной из химически модифицированных по металл-связывающему домену 1-16 формы бета-амилоида.
Полученные данные показывают, что присутствие в экспериментальных пробах, полученных из образцов крови, относительного содержания изомеризованной по аспарагиновой кислоте в положении 7 или фосфорилированной по серину в положении 8 форм бета-амилоида на уровне более 5 и 2% соответственно, отражает наличие клинических проявлений болезни Альцгеймера.
Ллитература
1. (2010) 2010 Alzheimer's disease facts and figures, Alzheimers Dement 6, 158-194.
2. Гаврилова, С.И. (2007) Фармакотерапия болезни Альцгеймера, Пульс, Москва.
3. Nelson, P.Т., Head, E., Schmitt, F.A., Davis, P.R., Neltner, J.Н., Jicha, G.A., Abner, E.L, Smith, C.D., Van Eldik, L.J., Kryscio, R.J., and Scheff, S.W. (2011) Alzheimer's disease is not "brain aging": neuropathological, genetic, and epidemiological human studies, Acta Neuropathol 121, 571-587.
4. Larson, M.E., and Lesne, S.E. (2012) Soluble Abeta oligomer production and toxicity, J Neurochem120 Suppl 1, 125-139.
5. Karran, E., Mercken, M., and De Strooper, B. (2011) The amyloid cascade hypothesis for Alzheimer's disease: an appraisal for the development of therapeutics, Nat Rev Drug Discov 10, 698-712.
6. Haass, C., and Selkoe, D.J. (2007) Soluble protein oligomers in neurodegeneration: lessons from the Alzheimer's amyloid beta-peptide, Nat Rev Mol Cell Biol 8, 101-112.
7. Meyer-Luehmann, M., Coomaraswamy, J., Bolmont, T., Kaeser, S., Schaefer, C., Kilger, E., Neuenschwander, A., Abramowski, D., Frey, P., Jaton, A.L, Vigouret, J.M., Paganetti, P., Walsh, D.M., Mathews, P.M., Ghiso, J., Staufenbiel, M., Walker, L.C, and Jucker, M. (2006) Exogenous induction of cerebral beta-amyloidogenesis is governed by agent and host, Science 313, 1781-1784.
8. Stohr, J., Watts, J.C., Mensinger, Z.L, Oehler, A., Grillo, S.K., DeArmond, S.J., Prusiner, S.В., and Giles, K. (2012) Purified and synthetic Alzheimer's amyloid beta (Aβ) prions, Proceedings of the National Academy of Sciences 109, 11025-11030.
9. Hu, W.Т., Holtzman, D.M., Fagan, A.M., Shaw, L.M., Perrin, R., Arnold, S.E., Grossman, M., Xiong, C., Craig-Schapiro, R., Clark, С.M., Pickering, E., Kuhn, M., Chen, Y., Van Deerlin, V.M., McCluskey, L., Elman, L., Karlawish, J., Chen-Plotkin, A., Hurtig, H.I., Siderowf, A., Swenson, F., Lee, V.M.-Y., Morris, J.C., Trojanowski, J.Q., and Soares, H. (2012) Plasma multianalyte profiling in mild cognitive impairment and Alzheimer disease, Neurology.
10. Kozin S.A., Cheglakov I.B., A.A., O., Telegin G.B., Tsvetkov P.O, Lisitsa A.V., and A.A., M. (2013) Peripherally applied synthetic peptide isoAsp7-Aβ(1-42) triggers cerebral β-amyloidosis, Neurotoxicity Researchunder review.
11. Kumar, S., Singh, S., Hinze, D., Josten, M., Sahl, H.G., Siepmann, M., and Walter, J. (2012) Phosphorylation of amyloid-beta peptide at serine 8 attenuates its clearance via insulin-degrading and angiotensin-converting enzymes, J Biol Chem 287, 8641-8651.
12. Nussbaum, J.M., Schilling, S., Cynis, H., Silva, A., Swanson, E., Wangsanut, T., Tayler, K., Wiltgen, В., Hatami, A., Ronicke, R., Reymann, K., Hutter-Paier, B., Alexandru, A., Jagla, W., Graubner, S., Glabe, C.G., Demuth, H.U., and Bloom, G.S. (2012) Prion-like behaviour and tau-dependent cytotoxicity of pyroglutamylated amyloid-beta, Nature 485, 651-655.
13. Tsvetkov, P.O., Popov, I.A., Nikolaev, E.N., Archakov, A.I., Makarov, A.A., and Kozin, S.A. (2008) Isomerization of the Asp7 residue results in zinc-induced oligomerization of Alzheimer's disease amyloid beta(1-16) peptide, Chembiochem 9, 1564-1567.
14. Alies, B., Hureau, C., and Faller, P. (2013) The role of metal ions in amyloid formation: general principles from model peptides, Metallomics 5, 183-192.
15. Kozin, S.A., Mezentsev, Y.V., Kulikova, A.A., Indeykina, M.I., Golovin, A.V., Ivanov, A.S., Tsvetkov, P.O., and Makarov, A.A. (2011) Zinc-induced dimerization of the amyloid-beta metal-binding domain 1-16 is mediated by residues 11-14, Mol Biosyst 7, 1053-1055.
16. Tsvetkov, P.O., Kulikova, A.A., Golovin, A.V., Tkachev, Y.V., Archakov, A.I., Kozin, S.A., and Makarov, A.A. (2010) Minimal Zn(2+) binding site of amyloid-beta, Biophys 199, L84-86.
17. Zirah, S., Kozin, S.A., Mazur, A.K., Blond, A., Cheminant, M., Segalas-Milazzo, I., Debey, P., and Rebuffat, S. (2006) Structural changes of region 1-16 of the Alzheimer disease amyloid beta-peptide upon zinc binding and in vitro aging, J Biol Chem 281, 2151-2161.
18. Indeykina, M.I., Popov, I.A., Kozin, S.A., Kononikhin, A.S., Kharybin, O.N., Tsvetkov, P.O., Makarov, A.A., and Nikolaev, E.N. (2011) Capabilities of MS for analytical quantitative determination of the ratio of alpha- and betaAsp7 isoforms of the amyloid-beta peptide in binary mixtures, Anal Chem 83, 3205-3210.
19. Kumar, S., Rezaei-Ghaleh, N., Terwel, D., Thal, D.R., Richard, M., Hoch, M., Mc Donald, J.M., Wullner, U., Glebov, K., Heneka, M.Т., Walsh, D.M., Zweckstetter, M., and Walter, J. (2011) Extracellular phosphorylation of the amyloid beta-peptide promotes formation of toxic aggregates during the pathogenesis of Alzheimer's disease, Embo J30, 2255-2265.
20. Lista, S., Faltraco, F., Prvulovic, D., and Hampel, H. (2013) Blood and plasma-based proteomic biomarker research in Alzheimer's disease, Progress in Neurobiology 101-102, 1-17.
21. Burnham, S.C., Faux, N.G., Wilson, W., Laws, S.M., Ames, D., Bedo, J., Bush, A.I., Doecke, J.D., Ellis, K.A., Head, R., Jones, G., Kiiveri, H., Martins, R.N., Rembach, A., Rowe, С.C, Salvado, O., Macaulay, S.L., Masters, C.L., Villemagne, V.L., Alzheimer's Disease Neuroimaging, I., Australian Imaging, В., and Lifestyle Study Research, G. (2013) A blood-based predictor for neocortical Abeta burden in Alzheimer's disease: results from the AIBL study, Mol Psychiatry.