Способ бесферментного получения островковой ткани из поджелудочной железы
METHOD FOR NON-ENZYMATIC PRODUCTION OF ISLET TISSUE FROM THE PANCREAS

Изобретение относится к медицине, а именно к клеточной трансплантации, эндокринологии и регенерационной медицине, и может быть использовано при трансплантационном лечении сахарного диабета 1 типа.
Наиболее эффективным способом лечения трудноуправляемых форм сахарного диабета 1 типа является интрапортальная трансплантация островков, изолированных из поджелудочной железы посмертных доноров [Shapiro AM, Lakey JR, Ryan EA, Korbutt GS, Toth E, Warnock GL et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. N Engl J Med 2000; 343:230-238]. Этот метод обеспечивает, помимо стабилизации течения заболевания, длительную (не менее 1 года) инсулинонезависимость более чем у половины реципиентов. Успешность таких пересадок в существенной мере зависит от количества и качества использованных островков, а также от адекватности иммуносупрессии, применяемой с целью предотвращения отторжения аллотрансплантата [Barton FB, Rickels MR, Alejandro R, Hering В J, Wease S, Naziruddin В et al. Improvement in outcomes of clinical islet transplantation: 1999-2010. Diabetes Care. 2012; 35:1436-1445].
Для выделения максимально возможного количества островков донорская панкреатическая ткань подвергается мощной обработке препаратами протеолитических ферментов (в основном коллагеназы), а также очистке от окружающей иммуногенной экзокринной ткани с помощью различных манипуляций (фильтрация, центрифугирование и др.) [Misawa R, Ricordi С, Miki A, Barker S, Molano RD, Khan A, et al. Evaluation of viable beta-cell mass is useful for selecting collagenase for human islet isolation: comparison of collagenase NB1 and liberase HI. Cell Transplant 2012; 21:39-47]. При этом происходит практически полное разрушение и удаление внеклеточного матрикса, который играет огромную роль во взаимодействии между островками и содержащимися в них гормонпродуцирующими клетками. Наступающая дезорганизация приводит к значительному снижению морфофункциональных качеств островковых клеток и в конечном счете - к ослаблению антидиабетического эффекта после трансплантации островков. Поэтому для получения клинически значимого результата требуется для выделения необходимого количества островков использование двух и более донорских поджелудочных желез. Такая потребность существенно увеличивает стоимость клинических пересадок островковых клеток и значительно ограничивает их количество из-за непреодолимого дефицита донорских органов. В связи с этим необходима разработка новых подходов к выделению островковой ткани поджелудочной железы, минимизирующих нарушения структуры и функции островковых клеток. Так как главной причиной снижения морфофункциональных характеристик изолируемых островков является применение мощного ферментного переваривания, важно, по возможности, максимально снизить как интенсивность протеолитического воздействия, так и его продолжительность вплоть до отказа от использования ферментных препаратов.
В качестве аналога нами приводится метод получения островковых клеток из поджелудочной железы новорожденных кроликов [Н.Н. Скалецкий, Г.Н. Скалецкая, Л.А. Кирсанова, Н.В. Баранова, Г.Н. Бубенцова,
2
В.И.Севастьянов. Культуры островковых клеток как компонент тканеинженерной конструкции поджелудочной железы. Вестник трансплантологии и искусственных органов. 2018, №2 (XX). 74-81]. Согласно этой технологии, после последовательного извлечения и помещения в чашку Петри с охлажденным до 4°С раствором Хэнкса 10 поджелудочных желез очищают от капсулы, видимых кровеносных сосудов и выводных панкреатических протоков с помощью глазных пинцетов. Затем каждый очищенный таким образом орган разрезают на кусочки размерами 2-3 мм. Полученные панкреатические микрофрагменты переносят на вогнутую поверхность часового стекла и 3 раза промывают охлажденным раствором Хэнкса, после чего с помощью острых глазных ножниц в течение 10-12 минут измельчают ткань поджелудочной железы до микрофрагментов размером не более 1 мм. Образовавшуюся тканевую массу трижды промывают охлажденным раствором Хэнкса. После удаления последнего измельченную ткань ресуспендируют в 5 мл среды 199 и переносят в культуральный флакон площадью 75 см, равномерно распределяя полученную суспензию по его дну. Затем во флакон вносят 20 мл среды 199 и 2 мл эмбриональной телячьей сыворотки. В процессе подготовки культуры в качестве сбалансированного солевого раствора используют раствор Хэнкса и среду 199, изготовленные в Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН, в качестве добавки - эмбриональную телячью сыворотку фирмы HyClone (Бельгия).
Образующийся при деструкции ацинарных клеток детрит удаляют при очередной замене культуральной среды. В результате сформировывается культура, почти полностью состоящая из флотирующих (свободно плавающих) плотных шаровидных или овоидных структур.
Гистологический анализ культур показал, что они состоят из эпителия и окружены по периферии слоем эпителиоподобных или фибробластоподобных клеток. Иммуногистохимическое окрашивание позволило идентифицировать содержащийся в культурах эпителий как инсулин-позитивные клетки (в большей степени) и глюкагон-позитивные клетки, то есть островковые β- и α-клетки. Характерная шарообразная и/или овоидная форма полученных свободно плавающих культур, содержащих островковые клетки, дали основания назвать их флотирующими островковоподобными культурами.
Описанный метод-аналог имеет следующие недостатки:
- его неэффективность при использовании в качестве источника островков поджелудочной железы взрослых кроликов, что обусловлено существенно большей долей экзокринной панкреатической ткани по сравнению с неонатальной поджелудочной железой; при этом выраженное действие высвобождающихся из ацинарных клеток протеолитических ферментов на островковую ткань отрицательно сказывается на ее морфофункциональном состоянии, что препятствует формированию островковоподобных культур;
- длительное (10-12 минут) механическое измельчение ткани поджелудочной железы усугубляет ее ишемию и отрицательно влияет на жизнеспособность островковых β-клеток;
- использование в ростовой среде эмбриональной телячьей сыворотки, стимулирующей миграцию β-клеток из инкубируемых панкреатических микрофрагментов, снижает инсулинпродуцирующую способность получаемых флотирующих островковоподобных культур.
В качестве прототипа нами выбран следующий способ выделения островковой ткани поджелудочной железы (RU 2450052, С2). Согласно этой технологии, микрофрагменты измельченных поджелудочных желез новорожденных кроликов помещают в CO2 инкубатор в свободной от сыворотки среде при первой температуре инкубации, равной от 36,6 до 37°С. В течение первого инкубационного периода проводится периодическая замена среды и удаление спонтанно разрушившихся нежелательных клеток, включающих экзокринные клетки, клетки крови и элементы соединительной ткани, до тех пор, пока, по меньшей мере, 80% оставшихся клеток не будут представлять собой бета-клетки, и инкубацию при температуре от 22 до 29°С, при которой до 90% оставшихся клеток будут представлять собой бета-клетки.
Недостатками описанного метода являются:
использование поджелудочных желез именно новорожденных кроликов и невозможность его применения при обработке поджелудочной железы взрослых кроликов из-за содержания в ней существенно большей доли экзокринной ткани, обладающей высокой протеолитической активностью, которая приводит к гибели бета-клеток;
- требование высокой степени очистки клеточного препарата до достижения содержания в нем 90% бета-клеток, что превышает естественную долю бета-клеток в островке (65-70%) и может нарушить физиологические взаимоотношения островковых клеток и адекватность их секреторной активности;
- достижение высокой степени очистки островковых клеток приводит к разрушению и элиминации внеклеточного матрикса и нарушению межклеточного взаимодействия и эндокринной секреции;
- применение культивирования панкреатических микрофрагментов в атмосфере с необходимой подачей газов (СО2 и/или О2);
- требование последовательной инкубации в нормотермических (от 36,6 до 37°С) и гипотермических (от 22 до 29°С) условиях общей длительностью до 15 суток.
Так как в клинической практике аллотрансплантации островков в качестве их источника используют поджелудочную железу взрослых доноров, понятна актуальность вопросов, связанных с разработкой способов получения островковой ткани из поджелудочной железы взрослых кроликов, потому что полученные данные могут быть использованы при выделении островков из донорской поджелудочной железы с последующей их трансплантацией в клинике.
Нами была поставлена задача разработать эффективный метод получения островковой ткани из поджелудочной железы взрослых кроликов без использования ферментных препаратов.
Технический результат, достигаемый при осуществлении изобретения, заключается в возможности эффективного бесферментного получения островковой ткани, содержащей инсулинпродуцирующие β-клетки, из поджелудочной железы взрослых кроликов за счет использования оригинальной технологии культивирования панкреатической ткани, позволяющей создать условия для ускоренной гибели экзокринной ткани, при обеспечении морфологической целостности и функциональной способности β-клеток благодаря сохранению внеклеточного матрикса и созданию благоприятных конкурентных условий для выживания островковой ткани.
Нами разработан способ получения островковой ткани из поджелудочной железы взрослого кролика, в основу которого положен оригинальный режим инкубации панкреатической ткани при умеренной гипертермии, в естественных атмосферных условиях (в воздушной среде без добавления какого-либо газа), с использованием специальной среды культивирования.
Предлагаемый режим культивирования обеспечивает ускорение гибели экзокринной ткани, создает благоприятные для выживания эндокринной ткани конкурентные условия благодаря сохранению внеклеточного матрикса. Протеолиз, приводящий к самоперевариванию ацинарных клеток, не оказывает значимого повреждающего действия на эндокринные островки в значительной мере благодаря сокращению длительности обработки панкреатической ткани до нескольких минут.
Сущность изобретения заключается в следующем.
3
Предложен способ получения β-клеток поджелудочной железы взрослого кролика, в котором поджелудочную железу взрослого кролика помещают в раствор Хэнкса, охлажденный до 4°С, удаляют ее капсулу, видимые кровеносные сосуды и выводные протоки. Поджелудочную железу разрезают на фрагменты размером 2-4 мм, дважды промывают их охлажденным до 4°С раствором Хэнкса и измельчают до получения частиц объемом не более 1 мм. Образовавшуюся тканевую суспензию не менее трех раз промывают охлажденным до 4°С раствором Хэнкса и переносят в культуральный флакон. Во флакон вносят среду RPMI-1640, без глутамина, с HEPES и инкубируют в воздушной среде при 38°-40°С в течение 6-8 суток. Замену среды на свежую выполняют каждые 2 суток. Способ осуществляется следующим образом.
Сразу после эвтаназии взрослого кролика-донора и извлечения у него поджелудочной железы последнюю помещают в охлажденный до 4°С раствор Хэнкса (ПанЭко), затем максимально быстро, с помощью глазных пинцетов, удаляют капсулу, видимые кровеносные сосуды, выводные протоки и разрезают орган на фрагменты величиной 2-4 мм, которые дважды промывают охлажденным до 4°С раствором Хэнкса, после чего в течение 5-7 минут тщательно измельчают острыми глазными ножницами до получения частиц объемом не более 1 мм. Образовавшуюся густую тканевую суспензию не менее трех раз промывают охлажденным до 4°С раствором Хэнкса. В результате указанных манипуляций обрабатываемая при комнатной температуре (20-24°С) панкреатическая ткань подвергается лишь щадящему воздействию эндогенных протеолитических ферментов, которые после обильного промывания полученной тканевой суспензии удаляют вместе с обрывками аутолизированной экзокринной ткани.
2
2
Полученную после обработки поджелудочной железы взрослого кролика тканевую суспензию переносят в культуральный флакон с площадью дна 75 см (Corning), куда сразу же вносят 25 мл среды RPMI 1640, без глутамина, с HEPES (ПанЭко). Флаконы помещают в инкубатор с естественной воздушной атмосферой (без подачи СО и/или О) и культивируют в течение 6-8 суток при 38°-40°С. Замену ростовой среды на свежую выполняют каждые 2 суток.
В результате 6-8-суточной инкубации происходит формирование очищенных от балласта островковоподобных культур.
2
Таким образом, предлагаемый способ предполагает использование одной поджелудочной железы взрослого кролика, проведения культивирования в естественной воздушной атмосфере, без дополнительной подачи CO, при температуре инкубации равной 38°-40°, в течение 6-8 суток с использованием среды RPMI-1640, без глутамина, с HEPES (ПанЭко).
Используемая технология позволяет не только создать благоприятные конкурентные условия для выживания эндокринной ткани с сохранением внеклеточного матрикса, но и обеспечить быстрое и полное избавление панкреатической ткани от ненужной и иммуногенной экзокринной ткани.
Пример 1.
Поджелудочную железу взрослого кролика обрабатывали в соответствии с предлагаемым способом.
3
Сразу после эвтаназии взрослого кролика-донора и извлечения у него поджелудочной железы последнюю помещали в охлажденный до 4°С раствор Хэнкса (ПанЭко), затем максимально быстро, с помощью глазных пинцетов, удаляли капсулу, видимые кровеносные сосуды, выводные протоки и разрезали орган на фрагменты величиной 2 мм, которые дважды промывали охлажденным до 4°С раствором Хэнкса, после чего в течение 5 минут тщательно измельчали острыми глазными ножницами до получения частиц размером не более 1 мм. Образовавшуюся густую тканевую суспензию три раза промывали охлажденным раствором Хэнкса. В результате указанных манипуляций обрабатываемая при комнатной температуре (22°С) панкреатическая ткань подвергалась лишь щадящему протеолитическому воздействию эндогенных панкреатических ферментов, которые после обильного промывания полученной тканевой суспензии удалялись вместе с обрывками аутолизированной экзокринной ткани.
2
2
Полученную после обработки поджелудочной железы взрослого кролика тканевую суспензию переносили в культуральный флакон с площадью дна 75 см (Corning), куда сразу же вносили 25 мл среды RPMI-1640, без глутамина, с HEPES (ПанЭко). Флакон помещали в инкубатор с естественной воздушной атмосферой (без подачи СО) и культивировали в течение 8 суток при 38°С. Замену ростовой среды на свежую выполняли каждые 2 суток.
Наблюдения, проводившиеся с помощью инвертированного микроскопа Nikon Eclipse TS 100, показали, что уже к 3-4 суткам инкубации наблюдалась отчетливая деградация экзокринной ткани (рис. 1).
Последующий ежедневный мониторинг выявил прогрессирующую дегенерацию и элиминацию экзокринной части панкреатических микрофрагментов с одновременным их уплотнением и приобретением к окончанию 8-дневного срока инкубации шаровидной или овоидной форм. На рис. 2 представлены очищенные от экзокринной ткани флотирующие культуры на 8-е сутки инкубации микрофрагментов поджелудочной железы взрослого кролика в гипертермических (38°С) условиях.
Как показало гистологическое исследование полученных флотирующих культур, они состоят в основном из жизнеспособных эпителиальных клеток (рис. 3).
С помощью иммуногистохимического окрашивания в центральной их части были выявлены гранулы инсулина, свидетельствующие о секреторной активности островковых β-клеток (рис. 4).
Этими данными было подтверждено получение из поджелудочной железы взрослых кроликов флотирующих островковоподобных культур.
Пример 2.
Поджелудочную железу взрослого кролика обрабатывали в соответствии с предлагаемым способом.
3
Сразу после эвтаназии взрослого кролика-донора и извлечения у него поджелудочной железы последнюю помещали в охлажденный до 4°С раствор Хэнкса (ПанЭко), затем максимально быстро, с помощью глазных пинцетов, удаляли капсулу, видимые кровеносные сосуды, выводные протоки и разрезали орган на фрагменты величиной 4 мм, которые дважды промывали охлажденным до 4°С раствором Хэнкса, после чего в течение 7 минут тщательно измельчали острыми глазными ножницами до получения частиц размером не более 1 мм. Образовавшуюся густую тканевую суспензию три раза промывали охлажденным раствором Хэнкса. В результате указанных манипуляций обрабатываемая при комнатной температуре (22°С) панкреатическая ткань подвергалась лишь щадящему протеолитическому воздействию эндогенных панкреатических ферментов, которые после обильного промывания полученной тканевой суспензии удалялись вместе с обрывками аутолизированной экзокринной ткани.
2
Полученная после обработки поджелудочной железы взрослого кролика тканевую суспензию переносили в культуральный флакон с площадью дна 75 см (Corning), куда сразу же вносили 25 мл среды RPMI-1640, без глутамина, с HEPES. Флакон помещали в инкубатор с естественной воздушной атмосферой (без подачи СО) и культивировали в течение 6 суток при 40°С. Замену ростовой среды на свежую выполняли каждые 2 суток.
Наблюдения, проводившиеся с помощью инвертированного микроскопа Nikon Eclipse TS 100, показали, что уже на 6-е сутки формировались очищенные от экзокринной ткани флотирующие островковоподобные культуры, гистологический и иммуногистохимический анализ которых подтвердил наличие в них гормонально-активных островковых клеток.
Пример 3.
Флотирующие островковоподобные культуры получали, как описано в примере 1. Исследование функциональных возможностей полученных культур провели путем определения концентрации инсулина в ростовой среде с помощью иммуноферментного анализа (RDG) до и после проведения стимуляционного теста с введением в ростовую среду высоких концентраций глюкозы (до 25 ммоль/л).
На рис. 5 показано, что базальная концентрация инсулина в культуральной жидкости, составившая в результате 10 последовательных измерений в среднем 4910 мкЕД/мл, значительно (до 8250 мкЕД/мл) увеличивалась после 60-минутной стимуляционной пробы. Это свидетельствовало о высокой способности содержавшихся в культуре β-клеток к секреции инсулина.
Пример 4.
Флотирующие островковоподобные культуры получали, как описано в примере 2. С целью изучения функциональных способностей полученных культур островковых клеток в условиях in vivo осуществили внутрибрюшинную их трансплантацию лабораторным мышам (линия CD) с экспериментальным сахарным диабетом. Последний индуцировали путем внутрибрюшинного введения диабетогенного препарата. Этим веществом служил стрептозотоцин, который обладает избирательных цитотоксическим действием в отношении островковых β-клеток. Стрептозотоцин (Sigma) вводили внутрибрюшинно в дозе 200 мг на 1 кг массы тела животного. Через 2 недели после индукции диабета отобрали 16 мышей с выраженным и стабильным течением заболевания.
Восемь из них стали реципиентами: каждому из них внутрибрюшинно ввели (шприцем через иглу с большим просветом) суспензию флотирующих островковоподобных культур, полученных из поджелудочной железы взрослого кролика в соответствии с предлагаемым способом, как показано в примере 2. Остальные 8 мышей со стрептозотоциновым сахарным диабетом составили контрольную группу, и им не проводили никакого лечения.
Через 10-14 суток после трансплантации у мышей-реципиентов произошло существенное уменьшение гликемии, которое сопровождалось исчезновением характерных признаков диабетического статуса. Позитивный эффект сохранялся у подопытных животных до окончания 8-недельного наблюдения (рис. 6). В контрольной группе признаков ремиссии диабетического статуса отмечено не было.
Таким образом, было продемонстрировано антидиабетическое действие трансплантации культур флотирующих островковоподобных культур, полученных с помощью описанного выше способа из поджелудочной железы взрослых кроликов.
Преимуществом предлагаемой технологии является получение островковоподобных культур без использования экзогенных ферментных препаратов, что предотвращает гибель внеклеточного матрикса и обеспечивает сохранение морфологической целостности и функциональной способности островковых клеток.