СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОГО ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ ТРИПСИНА, ГИАЛУРОНОВОЙ КИСЛОТЫ И ПОЛИСАХАРИДОВ, МОДИФИЦИРОВАННЫХ ВИНИЛОВЫМИ МОНОМЕРАМИ
METHOD FOR OBTAINING IMMOBILIZED ENZYME PREPARATION BASED ON TRYPSIN, HYALURONIC ACID AND POLYSACCHARIDES MODIFIED WITH VINYL MONOMERS

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу стабилизации трипсина растворами гиалуроновой кислоты и графт-сополимерами с полисахаридной основной цепью из карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) или хитозана (ХТЗ) с боковыми цепями из гомополимеров N-винилимидазола (ВИ) или Ν,Ν-диметиламиноэтилметакрилата (ДМАЭМА). Изобретение может быть использовано в химико-фармацевтической промышленности, медицинской практике, косметологии.
Трипсин (КФ 3.4.21.4) - фермент класса гидролаз, расщепляющий пептиды и белки; обладает также эстеразной активностью. Молекула бычьего трипсина состоит из 223 аминокислотных остатков, образующих одну полипептидную цепь, и содержит 6 дисульфидных связей. Активный центр трипсина состоит из серина и гистидина. Трипсин используют для изготовления лекарств. Препараты трипсина обладают противовоспалительным и противоотечным действием (при внутривенном и внутримышечном введении); способны избирательно расщеплять ткани, подвергшиеся некрозу. В медицине трипсин применяют для лечения ран, ожогов, тромбозов, часто в сочетании с другими ферментами и антибиотиками.
Трипсин входит в состав композиции для обработки ран, нуждающихся в санации раневой поверхности [Патент RU 2619351 С1, МПК A61K 38/48, A61K 9/10, A61K 47/30, A61K 47/44, А61Р 17/02, С12Ν 9/00, опубл. 15.05.2017, Бюл. №14], используется для получения живой клеточной вакцины для профилактики рака молочных желез [Патент RU 2407789 С2, МКП C12N 5/00, А61Р 35/00, опубл. 27.12.2010, Бюл. №36]. Препараты трипсина применяются для лечения патологических процессов, сопровождающихся образованием гнойно-некротических масс, накоплением густых вязких экссудатов [Патент RU 2055600 С1, МКП 6A61L 15/44, A61K 31/71, 38/43, опубл. 10.03.1996]. Трипсин входит в состав мази для лечения послеоперационных ран, а также застаревших, обильно обсемененных патогенной микрофлорой ран, трудно поддающихся или неподдающихся заживлению, переходящих в трофические [Патент RU 2397752 С2, МПК A61K 9/06, A61K 33/38, A61K 38/43, A61K 47/30, А61Р 17/02, опубл. 27.08.2010, Бюл. №24]. Фармацевтическая композиция на основе трипсина используется для удаления мертвой или шелушащейся кожи со здоровой кожи [Патент RU 2264824 С2, МПК A61K 38/48, опубл. 27.11.2005, Бюл. №33].
Гиалуроновая кислота состоит из повторяющихся полианионных дисахаридных звеньев D-глюкуроновой кислоты и N-ацетилглюкозамина, соединенных между собой гликозидными связями. [Fujioka-Kobayashi Μ.,  Mueller Α., Lussi Α., Sculean Α., Schmidlin P.R. et al. In vitro effects of hyaluronic acid on human periodontal ligament cells. - BMC Oral Health. - 2017; 17(1): 44.].
На сегодняшний день существуют различные косметические, фармацевтические препараты и композиции на основе гиалуроновой кислоты. В офтальмологии для лечения травматических повреждений, химических ожогов и трофических нарушений роговицы, конъюнктивы могут быть использованы глазные капли, содержащие в качестве биологически активного вещества высокомолекулярную гиалуроновую кислоту [Патент RU 2163123 С2, МПК A61K 31/728, A61F 9/00, опубл. 20.02.2001]. Гиалуроновая кислота используется для увеличения резерва стволовых клеток в организме [Патент RU 2347583 С1, МПК A61K 38/47, А61Р 43/00, опубл. 27.02.2009, Бюл. №6]. Известен биорассасывающийся наполнитель, образованный гиалуроновой кислотой и/или ее производными, используемый в качестве наполнителя мягких тканей в эстетической хирургии и в лечебно-косметических средствах для коррекции дефектов кожи [Патент RU 2394552 С2, МПК A61K 8/14, A61K 8/73, A61K 9/127, A61Q 19/08, А61Р 19/02, опубл. 20.07.2010, Бюл. №20]. Низкомолекулярная гиалуроновая кислота входит в состав средства для профилактики и/или лечения аллергического ринита, конъюнктивита, атопического дерматита и астмы [Патент RU 2519781 С2, МПК С07Н 15/04, A61K 31/728, А61Р 37/08, А61Р 11/02, А61Р 11/06, А61Р 17/00, А61Р 27/14, опубл. 20.06.2014, Бюл. №17], косметической композиции для ухода за волосами и кожей головы, обладающей высокой эффективностью против выпадения волос, устраняющей причины алопеции, себореи, обеспечивающей усиление роста волос [Патент RU 2671511 С1, МПК A61K 8/03, A61Q 19/10, A61K 8/04, A61K 8/64, A61K  8/67, A61K 8/73, A61K 8/97, A61K 8/36, A61K 8/44, A61Q 5/00, A61Q 19/08, опубл. 01.11.2018, Бюл. №31]. Гиалуроновая кислота используется для увлажнения и заживления кожи головы, облегчает связывание с водой и влагоудержание, защиту кожи от неблагоприятного воздействия окружающей среды, эффективное восстановление, тонизирование, эпителизацию, регенерацию, уменьшение воспалений, болеутоляющее, противовоспалительное, омолаживающее, согревающее действие, стабильность готового продукта, улучшение потребительских свойств [Патент RU 2660350 С1, МПК A61K 8/67, A61K 8/73, A61K 8/97, A61Q 19/08, опубл. 05.07.2018, Бюл. №19]. Гиалуроновая кислота является одним из компонентов средства биологического омоложения кожи, обеспечивает повышение проникающей способности активных компонентов и усиление выраженного омолаживающего действия, а именно улучшение показателей влагометрии, эластометрии и профилометрии [Патент RU 2640188 С1, МПК A61K 8/14, A61K 8/63, A61K 8/64, A61K 8/73, A61Q 19/08, опубл. 26.12.2017, Бюл. №36].
Графт-сополимеры карбоксиметилцеллюлозы или хитозана с боковыми цепями из N-винилимидазола или Ν,Ν-диметиламиноэтилметакрилата благодаря своей низкой токсичности, биосовместимости и биодеградируемости находят применение в области биомедицины. Известно, что эти сополимеры могут образовывать нековалентно связанные коньюгаты с противоопухолевым препаратом «Паклитаксел» и позволяют обеспечить его контролируемое высвобождение в течение 144 часов. Отдельно стоит отметить, что такие полимеры характеризуется высокой эффективностью загрузки препарата за счет наличия боковых звеньев с высокой комплексообразующей способностью [V.A. Kuznetsov, Α.V. Sorokin, Μ.S. Lavlinskaya et al. Graft copolymers of carboxymethyl cellulose with N-vinylimidazole: synthesis and application for drug delivery. 2019. Polymer Bulletin. Vol. 76. P. 4929-949; V.A. Kuznetsov, Α.V. Sorokin, M.S. Lavlinskaya. Synthesis of graft copolymers of carboxymethyl cellulose and N,N-dimethylaminoethyl methacrylate and their study as Paclitaxel carriers. 2020. Polymer Bulletin. DOI: 10.1007/s00289-020-03250-z].
На данный момент нет сведений о комплексах трипсина с гиалуроновой кислотой и полисахаридами, модифицированными виниловыми мономерами, такими как графт-сополимеры карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) или хитозана (ХТЗ) с N-винилимидазолом (ВИ) или Ν,Ν-диметиламиноэтилметакрилатом (ДМАЭМА).
Известен способ иммобилизации трипсина [Патент RU 2437936 С1, МПК C12N 11/18, опубл. 27.12.2011, Бюл. №36]. Данный способ иммобилизации трипсина смешением полимерного носителя, включает использование сополимера винилиденфторида и гексафторпропилена, фторэласта, сополимера винилиденфторида и перфторметилвинилового эфира и сшивающего агента. Количество фермента варьируют от 0.0025 до 0.25 г на 1 г носителя и сшивающего агента - 1.4 бис(2-меркаптобензтиазолилметилен)-пиперазина в количестве 0.01-0.04 г на 1 г носителя. Смешение проводят на вальцах или в смесителе при температуре 37°С.Полученный иммобилизованный фермент обладает высокой протеолитической активностью нативного препарата и диспергирующей активностью, необходимой для получения полноценных клеточных культур.
Недостатком способа является получение ферментного препарата в твердой фазе, не позволяющей проникать молекулам трипсина в глубокие слои кожи.
Запатентован способ стабилизации ферментов - пепсина, химотрипсина, трипсина, панкреатина, папаина и других протеаз, путем добавления в их растворы полисахаридов - гуаровой камеди, ксантановой камеди, камеди бобов рожкового дерева, крахмала, декстрана, пуллулана, альгиновой кислоты, гиалуроновой кислоты, каррагинана, пектина, хитозана и прочих полисахаридов, а также производных целлюлозы: карбоксиметилцеллюлозы, метилцеллюлозы, этилцеллюлозы, гидроксипропилцеллюлозы [JPH034791A].
В отличие от этого способа предложенное нами использование полисахаридов (карбоксиметилцеллюлозы и хитозана), модифицированных виниловыми мономерами (N-винилимидазолом или Ν,Ν-диметиламиноэтилметакрилатом) обеспечивает большее количество связей между полисахаридом и ферментом в ходе иммобилизации, что увеличивает прочность образуемого комплекса и пролонгирует процесс высвобождения фермента в область поврежденных тканей.
Известно, что полимеры на основе поли-β-гликозидов (целлюлозы и ее производных, хитозана, гиалуроновой кислоты и т.д.) склонны к образованию пленок, которые могут защитить кожу от пересыхания или обеспечить дополнительную защиту на поверхности раневого повреждения. Однако способность образовывать конъюгаты у таких полимеров несколько ограничена рядом факторов: поверхностным зарядом, типом функциональной группы и т.д. Поэтому для придания ряда новых свойств целесообразно проводить химическую модификацию природных полисахаридов. Так, например, введение азольных заместителей повышает комплексообразующую способность полисахаридов и снижает поверхностный отрицательный заряд карбоксиметилцеллюлозы [V.A. Kuznetsov, Α.V. Sorokin, Μ.S. Lavlinskaya et al. Graft copolymers of carboxymethyl cellulose with N-vinylimidazole: synthesis and application for drug delivery. 2019. Polymer Bulletin. Vol. 76. P. 4929-4949], а введение звеньев Ν,Ν-диметиламиноэтилметакрилата не только снижает поверхностный заряд, но придает водному раствору модифицированного полисахарида стимулочувствительные свойства [V.A. Kuznetsov, Α.V. Sorokin, Μ.S. Lavlinskaya. Synthesis of graft copolymers of carboxymethyl cellulose and Ν,Ν-dimethylaminoethyl methacrylate and their study as Paclitaxel carriers. 2020. Polymer Bulletin. DOI: 10.1007/s00289-020-03250-z].
В качестве прототипа служила топическая противомикробная дерматологическая композиция [Патент RU 2668827 С2, МПК A61K 38/08, A61K 31/728, А61Р 31/00, А61Р 17/00, A61K 31/722, опубл. 02.10.2018, Бюл. №28], предложенная в качестве лекарственного средства в медицине и ветеринарии, включающая комбинацию по меньшей мере одного положительно заряженного противомикробного пептида, соединенного с липидом, и гиалуроновой кислоты со средним молекулярным весом от 100 кДа до 800 кДа или одной из ее солей, причем противомикробный пептид представляет собой гексапептид, соединенный с пальмитиновой кислотой, содержащий дисульфидные мостики.
В отличие от прототипа в качестве действующего вещества мы используем не противомикробный пептид, а фермент трипсин, который кроме антимикробных свойств обладает противовоспалительным и противоотечным действием, способен избирательно расщеплять ткани, подвергшиеся некрозу, применяется для лечения ран, ожогов, пролежней, тромбозов, при парадонтите, периодоните, тромбофлебите, гайморите, заболеваниях дыхательных путей часто в сочетании с другими ферментами и с антибиотиками.
Кроме того, добавление нами в раствор графт-сополимеров карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) или хитозана (ХТЗ) с N-винилимидазолом (ВИ) или Ν,Ν-диметиламиноэтилметакрилатом (ДМАЭМА) позволяет путем включения в полисахаридный гель (один из способов физической иммобилизации ферментов) дополнительно стабилизировать трипсин и обеспечить ему пролонгированное действие.
Технический результат заявленного изобретения заключается в разработке способа получения иммобилизованного жидкого или гелеобразного ферментного препарата на основе трипсина, полисахаридов, модифицированных виниловыми мономерами, и гиалуроновой кислоты низкомолекулярной (300 кДа), среднемолекулярной (500 кДа) или высокомолекулярной (800 кДа), благодаря чему растворы трипсина можно хранить при температурах от 4 до 25°С в течение 21 суток, а фермент при этом становится более стабильным в сравнении с нативным и способен проникать в глубокие слои кожи, при этом внесение в состав препарата модифицированных полисахаридов позволяет не только варьировать вязкость и консистенцию образцов (от жидкого состояния до геля с различной текучестью), но также способствует образованию конъюгатов с ферментом с большим количеством связей и взаимодействий между полисахаридом и ферментом, по сравнению с немодифицированными карбоксиметилцеллюлозой и хитозаном, что дополнительно повышает стабильность препарата и концентрацию активного вещества в пораженном участке кожи, а также обеспечивает контролируемое (порционное) высвобождение трипсина, поддерживая его необходимую концентрацию в течение длительного времени. Кроме того, способность модифицированных полисахаридов образовывать устойчивые пленки защищает фермент и обрабатываемый участок кожи от пересыхания, позволяет легко удалить препарат вместе с гноем и экссудатом.
Технический результат достигается тем, что в способе получения иммобилизованного ферментного препарата на основе трипсина, полисахаридов, модифицированных виниловыми мономерами, и гиалуроновой кислоты, включающем растворение трипсина в водном растворе низкомолекулярной гиалуроновой кислоты 300 кДа или среднемолекулярной гиалуроновой кислоты 500 кДа или высокомолекулярной гиалуроновой кислоты 800 кДа в соотношении 10 мг трипсина на 2 мл водного раствора низкомолекулярной гиалуроновой кислоты 300 кДа или среднемолекулярной гиалуроновой кислоты 500 кДа или высокомолекулярной гиалуроновой кислоты 800 кДа в концентрации 1.5%, при этом осуществляют перемешивание до полного растворения при комнатной температуре; затем проводят иммобилизацию трипсина путем добавления к полученной смеси графт-сополимера карбоксиметилцеллюлозы 50-100 кДа (КМЦ) или хитозана 50-100 кДа (ХТЗ) с N-винилимидазолом (ВИ) или Ν,Ν-диметиламиноэтилметакрилатом (ДМАЭМА) в количестве от 100 до 290 мг для получения жидкого препарата или от 300 до 500 мг для получения геля.
Фиг. 1. Диаграмма значений каталитической активности (А) трипсина в присутствии гиалуроновой кислоты различной молекулярной массы после его хранения при 4°С.
Фиг. 2. Диаграмма значений каталитической активности (А) трипсина в присутствии гиалуроновой кислоты различной молекулярной массы после его хранения при 25°С.
Фиг. 3. Таблица 1. Вязкость препаратов, содержащих трипсин, гиалуроновую кислоту и полисахариды, модифицированные виниловыми мономерами.
Пример реализации способа.
В качестве объекта исследования был выбран трипсин фирмы «МР biomedicals)), субстратом для гидролиза служил азоказеин фирмы «Sigma-Aldrich)). В качестве стабилизирующих агентов применяли три вида гиалуроновой кислоты (ООО «Лаборатория Гиалика») с молекулярной массой 300 (НМГК), 500 (СМГК) и 800 (ВМГК) кДа. В качестве матрицы для иммобилизации трипсина применяли графт-сополимеры карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) или хитозана (ХТЗ) с N-винилимидазолом (ВИ) или Ν,Ν-диметиламиноэтилметакрилатом (ДМАЭМА) с молекулярной массой 50-100 кДа.
Стабилизацию трипсина осуществляли путем растворения его навески массой 10 мг в 2 мл водного раствора гиалуроновой кислоты с молекулярной массой 300 (НМГК), 500 (СМГК) или 800 (ВМГК) кДа в концентрации 1.5% с последующим перемешиванием при комнатной температуре до полного растворения. Затем к полученной смеси добавляли для иммобилизации трипсина графт-сополимер карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) или хитозана (ХТЗ) (при молекулярной массе полисахарида 50-100 кДа) с N-винилимидазолом (ВИ) или Ν,Ν-диметиламиноэтилметакрилатом (ДМАЭМА) в количестве от 100 до 290 мг для получения жидкого препарата или от 300 до 500 мг для получения геля (табл. 1).
Содержание белка в иммобилизованных препаратах трипсина определяли методом Лоури [Lowry О.Н., Rosebrough N.J., Faar A.L., Randall R.J. Protein measurement with folin-phenol reagent // J. Biol. Chem. - 1951. -V. 193. - P. 265-275]. Измерение уровня протеолитической активности фермента проводили на субстрате азоказеине [ F. L. The digestive proteases of langostilla (Pleuroncodes planipes, Decapoda): their partial characterization and the effect of feed on their composition // Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Comparative Biochemistry - 1992. - V. 103. - P. 575-578]. К 200 мкл образца добавляли 200 мкл фосфатного буфера (рН 6.5), 800 мкл азоказеина (0.5% в 50 мМ фосфатном буфере, рН 6.5) и инкубировали 2 часа при 37°С.Далее добавляли 800 мкл трихлоруксусной кислоты (ТХУ) (5%), инкубировали 10 минут при минус 4°С, затем центрифугировали в течение 3 мин при 13000 об/мин для удаления негидролизованного азоказеина. К 1200 мкл супернатанта добавляли 240 мкл 3% NaOH для нейтрализации кислоты, после чего измеряли оптическую плотность опытной пробы при 410 нм в 1 см кювете. Контрольная проба содержала 800 мкл азоказеина, 800 мкл ТХУ, 200 мкл фосфатного буфера и 200 мкл образца, который вносили после инкубации смеси в течение 2 часов при 37°С. За единицу каталитической активности трипсина принимали количество фермента, которое в условиях эксперимента гидролизует 1 мкМ субстрата за 1 мин. Удельную протеолитическую активность трипсина рассчитывали по формуле:
ПА=D*l 000/120/200/С,
где ПА - протеолитическая активность, мкМ/мин на 1 мг белка,
D - оптическая плотность пробы при 410 нм,
С - концентрация белка в пробе, мг/мл, измеренная по методу Лоури,
120 - время инкубации в минутах,
200 - объем пробы, в мкл,
1000 - пересчет в мкМ.
Статистическую обработку полученных результатов проводили при уровне значимости 5% с использованием t-критерия Стьюдента.
Были проведены исследования стабильности трипсина в растворах гиалуроновой кислоты (300, 500 и 800 кДа) по сравнению с нативным энзимом. Препараты инкубировали при 4 и 25°С в течение 0, 1, 2, 3, 7, 14 и 21 суток с дальнейшим измерением протеолитической активности. Полученные результаты отражены на фиг. 1, 2.
В ходе наших экспериментов было выявлено, что гиалуроновая кислота не ингибирует трипсин. На фиг. 1 представлена диаграмма зависимости каталитической активности энзима от времени его хранения при 4°С. Установлено, что нативный трипсин сохраняет свою активность после 3 суток инкубации при 4°С на 74%. На 7 и 14 день хранения ферментативная способность энзима составляет 55 и 44% соответственно. После 21 дня инкубации трипсин практически полностью инактивирован, его каталитическая активность - 29% от первоначального уровня. Раствор трипсина с низкомолекулярной гиалуроновой кислотой (300 кДа) на 7 сутки хранения проявляет каталитическую способность на 57%, после 2 и 3 недель инкубации она составляет 37-38% от исходного уровня. Трипсин в растворе со среднемолекулярной гиалуроновой кислотой (500 кДа) на 7 сутки хранения активен на 81% от начального уровня. После 14 и 21 суток инкубации при 4°С фермент сохраняет не более 68-69% активности от интактного образца. Трипсин в растворе высокомолекулярной гиалуроновой кислоты (800 кДа) на 7 и 14 сутки хранения проявляет активность на 52-53%. После 3 недель инкубации энзим сохраняет 43% каталитической способности.
На фиг. 2 изображена диаграмма изменения каталитической активности трипсина после его хранения при 25°С. Выявлено, что свободный фермент на 7 сутки инкубации при температуре 25°С сохраняет 37% активности, а на 14 и 21 сутки инактивируется до 27 и 18%. Раствор трипсина в низкомолекулярной гиалуроновой кислоте (300 кДа) после 7, 14 и 21 суток инкубации при температуре 25°С стабильнее раствора нативного фермента и сохраняет соответственно 80, 52 и 40% от исходной протеолитической способности. Раствор трипсина в среднемолекулярной гиалуроновой кислоте (500 кДа) на 7 сутки теряет 53% каталитической активности по сравнению с неинкубированным препаратом, при повышении срока хранения происходит более значительная инактивация энзима (до 28%). Трипсин в растворе высокомолекулярной гиалуроновой кислоты (800 кДа) оказался наиболее стабильным из растворов фермента в гиалуроновой кислоте при трехнедельной инкубации и проявлял 46% первоначальной протеолитической способности.
Таким образом, был разработан способ получения иммобилизованного ферментного препарата на основе трипсина, низкомолекулярной (300 кДа), среднемолекулярной (500 кДа) и высокомолекулярной (800 кДа) гиалуроновой кислоты с последующим добавлением графт-сополимера карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) или хитозана (ХТЗ) с N-винилимидазолом (ВИ) или Ν,Ν-диметиламиноэтилметакрилатом (ДМАЭМА) для иммобилизации трипсина.
Полученный предложенным способом препарат можно хранить при температурах от 4 до 25°С в течение 21 суток, а трипсин при этом становится более стабильным в сравнении с нативным и способен проникать в глубокие слои кожи. Внесение в состав препарата модифицированных полисахаридов позволяет не только варьировать вязкость и консистенцию образцов (от жидкого состояния до геля с различной текучестью), но также способствует образованию конъюгатов с ферментом с большим количеством связей и взаимодействий между полисахаридом и ферментом, по сравнению с немодифицированными карбоксиметилцеллюлозой и хитозаном, что дополнительно повышает стабильность препарата и концентрацию активного вещества в пораженном участке кожи, а также обеспечивает контролируемое (порционное) высвобождение трипсина, поддерживая его необходимую концентрацию в течение длительного времени. Кроме того, способность модифицированных полисахаридов образовывать устойчивые пленки защищает фермент и обрабатываемый участок кожи от пересыхания, позволяет легко удалить препарат вместе с гноем и экссудатом.