СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВЫСОКООЧИЩЕННОГО РЕКОМБИНАНТНОГО ИНГИБИТОРА С1-ЭСТЕРАЗЫ ЧЕЛОВЕКА ДЛЯ МЕДИЦИНСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ
METHOD FOR PRODUCING A HIGHLY PURIFIED RECOMBINANT HUMAN C1-ESTERASE INHIBITOR FOR APPLICATION IN MEDICINE

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к проблеме разработки высокоэффективных технологий производства, позволяющих получать высокоочищенные лекарственные средства для медицинского применения. В частности, изобретение относится к разработке технологии производства активной фармацевтической субстанции рекомбинантного ингибитора C1-эстеразы человека. Изобретение может быть использовано в фармацевтической промышленности, а именно, при создании лекарственного средства для терапии наследственного ангионевротического отека (отека Квинке).
В настоящее время при терапии вышеперечисленных заболеваний применяется препарат на основе рекомбинантного ингибитора C1-эстеразы человека, получаемого из молока генетически модифицированных кроликов, «Руконест», а также препарат, выделенный из плазмы доноров, «Беринерт». Рекомендуемая доза данных препаратов составляет 500 ME в виде медленной внутривенной инъекции или инфузии. С целью улучшения качества жизни пациентов, снижения частоты проявления нежелательных явлений, связанных, в основном, со степенью чистоты используемрго препарата, авторы изобретения предложили технологию получения высокоочищенного лекарственного средства.
В качестве критических параметров качества были использованы: содержание белков штамма-продуцента, содержание ДНК, содержание мономерной формы действующего вещества, содержание основной формы белка по данным обращенно-фазовой ВЭЖХ, специфическая активность.
Описание чертежей.
Рис. 1. Схема очистки рекомбинантного ингибитора С1 -эстеразы человека.
Из уровня техники известны следующие решения для технологии производства ингибитора C1-эстеразы человека.
Заявка ЕА201591278 раскрывает способ лечения или профилактики расстройства, ассоциированного с дефицитом ингибитора C1-эстеразы, введением композиции, содержащей ингибитор C1-эстеразы, где ингибитор присутствует в концентрации 400 ед/мл или более. Композиции вводят подкожно, внутривенно. Ингибитор может быть получен из плазмы или продуцирован рекомбинатным способом. Данные, приведенные в патенте, не раскрывают технологии производства и не позволяют оценить качество получаемого препарата.
Заявка WO 2015131154 раскрывает способ лечения острых приступов НАО введением последовательных доз рекомбинантного ингибитора C1-эстеразы в дозе 50 ед/кг веса тела, относится к терапевтическому применению лекарственного средства. В данном решении не раскрываются технологические аспекты получения лекарственного средства на основе рекомбинантного ингибитора C1-эстеразы человека.
Заявка WO 1992022320 раскрывает способ лечения системных воспалительных заболеваний млекопитающих, в т.ч. преэклампсии, введением терапевтически эффективного количества С1-INH или его вариантов, не раскрывая аспекты технологии производства.
Заявка WO 2017/087882 A1 (Recombinant human C1 esterase inhibitor and uses thereof) раскрывает большое количество аспектов, связанных медицинским применением, фармацевтической композицией и технологией производства ингибитора C1-эстеразы человека. В данном решении раскрывается процесс культивирования штамма-продуцента как в режиме перфузии, так и в режиме fed-batch в биореакторе объемом 5 л; 10 л; 200 л; 500 л; 500 л; 1000 л; 2000 л; 5000 л; 10000 л; 15000 л или 20000 л с конечной продуктивностью в культуральной жидкости на уровне 5, 6, 8, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, или 300 мг в день (в режиме перфузии). В заявке также указывается, что для очистки целевого продукта могут применяться один или более метод, основанный на применении аффинной хроматографии, гель-фильтрационной, анионообменной хроматографии, катионообменной хроматографии, мультимодальной хроматографии, гидрофобной хроматографии, а также нехроматографические методы (центрифугирование, преципитация этанолом и др.) с получением препарата ингибитора C1-эстеразы с чистотой не менее 90% (метод оценки чистоты не указывается). В описании указываются общие подходы к удалению контаминантов: белков штамма-продуцента, ДНК, вирусов с применением хроматографических методов с различным принципом действия. Дополнительно заявка раскрывает фармацевтические композиции, содержащие в качестве действующего вещества ингибитор C1-эстеразы человека и вспомогательные вещества из следующих категорий: соли, соли с буферными свойствами, спирты, различные сахара, аминокислоты и др. Указанные композиции могут иметь различные значения рН, а также различный формат: раствор или лиофилизат. Заявка WO 2017/087882 является наиболее близкой к заявленному изобретению, затрагивая технологические аспекты производства лекарственного средства. Основными недостатками решений, раскрытых в заявке WO 2017/087882, являются:
- описаны только общие подходы к производству, которые могут быть применены к производству любого лекарственного средства на основе белка, без привязки к конкретному продукту;
- описываемая в примерах технология очистки не имеет отношения к производственному процессу, а носит характер научно-исследовательской работы. При этом применяются методы элюции на сорбентах POROS XS, GigaCap Q с пофракционным анализом, которые являются нетехнологичными и требуют значительного количества ресурсов для реализации стратегии внутрипроизводственного контроля;
- авторы решения провели большой объем исследований с целью снижения уровня белков штамма-продуцента и ДНК в финальном препарате, однако полученные результаты свидетельствуют о крайне высоком уровне данных контаминантов в конечном продукте. В частности, стадия фильтрации через мембрану Sartobind STIC, заявляемая авторами в качестве основной для очистки белков штамма-продуцента, не является достаточно эффективной, что подтверждается приведенными в патенте результатами (таблица 1). Уровень снижения белков штамма-продуцента составил 0,21 Log, что позволило получить в финальном препарате содержание белков штамма-продуцента на уровне около 2000 нг/мг.
Известный из заявки WO 2017/087882 способ очистки может включать в себя различные стадии хроматографии, рутинно применяемые при очистке белков, такие как аффинная, ион-обменная, анион-обменная, катион-обменная, мультимодальная, гидрофобная хроматографии на сорбенте POROS XS, а также обязательными являются стадии вирусной инактивации и диафильтрации. Несмотря на разнообразие применяемых подходов, авторам заявки не удалось добиться необходимой для лекарственного средства финальной чистоты препарата: содержание НСР после всех стадий очистки составило около 1960 нг/мг. Выход мономерной формы составлял около 90%. Содержание остаточной ДНК после всех стадий очистки составляло от 5 до 13 пг/мг.
Полученные авторами решения результаты по содержанию ДНК приведены в таблице 2.
Таким образом, авторам WO 2017/087882 не удалось создать высокоэффективную технологию, позволяющую получать препарат с минимальным количеством контаминантов. Для более полного устранения НСР авторы заявленного изобретения существенно изменили условия очистки на гидрофобном сорбенте, использовав сорбент с фенильными группами. Данная модификация представляет собой неожиданный технический шаг, так как, насколько это известно из уровня техники (см. ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2009, том 45, №3, с. 378-383), очистка белка на фенилсефарозе позволяет получить только около 73% мономерной формы белка. Столь низкая доля мономерной формы теоретически является препятствием для использования фенилсодежащих сорбентов в очистке терапевтического белка, так как в случае ингибитора С1 именно данная форма проявляет биологическую активность. Тем не менее авторы применили данные сорбенты при очистке ингибитора С1 в одной из финальных стадий хроматографии, где они неожиданно показали высокую эффективность, при сохранении высокого выхода мономерной формы. При введении в процедуру очистки ингибитора C1-эстеразы стадии хроматографии на различных гидрофобных сорбентах, содержащих фенильную группу, авторы получили неожиданно высокий выход мономерной формы - 99%, при очень высокой чистоте по НСР (содержание менее 10 нг/мг) и по ДНК (менее 1.0 пг/мг). Применение гидрофобных сорбентов с фенильной группой для повышения чистоты ингибитора C1-эстеразы неизвестно из уровня техники, неочевидно для специалиста и непосредственно влияет на получение нового технического результата - получение ингибитора C1-эстеразы высокой степени очистки от белков клетки-хозяина и ДНК с высоким выходом целевого белка в его биологически активной мономерной форме.
Приведенная технология хроматографической очистки позволяет получать препарат с низким содержанием ДНК, однако, в процессе производства серии в GMP условиях полученный уровень ДНК составил 13 пг/мг, что почти соответствует заявленной верхней границе нормы (14 пг/мг), и свидетельствует о вариабельности процесса с т.з. удаления ДНК.
Технический результат, на достижение которого направлено заявляемое изобретение, заключается в разработке способа получения высокоочищенного рекомбинантного ингибитора C1-эстеразы человека для медицинского применения, с высоким выходом биологически активной мономерной формы белка относительно содержания целевого белка в культуральной жидкости.
Для достижения указанных технических результатов была разработана, масштабирована и перенесена на производство высокоэффективная технология получения активной фармацевтической субстанции рекомбинантного ингибитора C1-эстеразы человека, позволяющая получать лекарственное средство, содержащее не более 10 нг/мг белков штамма-продуцента; не более 5 пг/мг ДНК; не менее 99,0% мономерной формы белка; не менее 99,5% основной формы по данным обращенно-фазовой ВЭЖХ и удельной активностью не менее 9,0 МЕ/мг.
Заявляемая технология производства позволяет получать активную фармацевтическую субстанцию, пригодную для применения в клинических испытаниях и коммерческого выпуска.
Разработка высокоэффективной технологии производства осуществлялась с учетом следующих критериев:
- обеспечение приемлемых ключевых параметров качества конечного препарата;
- высокий выход конечного биологически активного очищенного белка относительно содержания белка в культуральной жидкости;
- низкая стоимость производства.
Осуществление изобретения
Очистка на металл-хелатном сорбенте
Авторы изобретения впервые показали, что для целей заявленного изобретения при захвате целевого белка из культуральной жидкости наилучшым образом подходят металл-хелатные сорбенты. При выборе сорбента для захвата оценивали следующие параметры процесса:
- выход целевого белка со стадии;
- содержание мономерной формы целевого белка в элюате;
- содержание белков штамма-продуцента в элюате;
- содержание ДНК в элюате;
- степень окрашивания сорбента компонентами культуральной жидкости и возможность регенерации сорбента;
- емкость сорбента по целевому белку.
Полученные результаты по скринингу сорбентов для стадии захвата представлены в таблице 3.
Полученные данные продемонстрировали, что наилучшие результаты могут быть достигнуты при применении металл-хелатных сорбентов, к примеру, IMAC Sepharose или EMD Chelate. При этом экспериментально обнаружено, что при очистке ингибитора С1 эстеразы сорбенты с катионобменными и гидрофобными свойствами недостаточно эффективны, так как имеют крайне низкую емкость, а при использовании сорбентов с анионообменными свойствами уровень контаминантов в элюате (белки штамма-продуцента и ДНК) находится на высоком уровне. Для данной стадии дополнительно разработан этап промывки буферным раствором, содержащим от 5 до 50 мМ имидазола, значение рН от 5,5 до 8,5 ед., при этом допускается добавление в промывочный буферный раствор хлорида натрия в концентрации от 200 мМ до 1 М. Также разработан состав элюирующего буферного раствора, содержащего от 100 мМ до 1 М имидазола, значение рН от 5,5 до 8,5 ед.
Комбинация вышеприведенных условий позволила получить раствор белка с содержанием белков штамма-продуцента на уровне 5000 нг/мг; ДНК на уровне 7000-8000 пг/мг; содержание мономерной формы белка на уровне 95,0%; при этом выход белка со стадии составил около 95% от его содержания в культуральной жидкости.
Очистка на аффинном сорбенте
На следующем этапе была разработана стадия очистки с использованием аффинного сорбента Heparin Sepharose FF. Данный сорбент позволяет значительно снизить содержание белков штамма-продуцента и ДНК. Установлено, что при значении рН от 7,0 до 8,0 и проводимости от 0,1 до 10,0 mS/cm (мСм/см) наносимого раствора белка, а также элюции целевого белка путем увеличения содержания хлорида натрия в подвижной фазе до значения 0,2 - 0,4 М содержание белков штамма-продуцента снижается до уровня около 3000 нг/мг, а содержание ДНК до уровня менее 50 пг/мг. В таблице 4 приведены данные по скринингу условий элюции на Heparin Sepharose FF.
Таким образом, была разработана стадия очистки, позволяющая значительно снизить количество белков штамма-продуцента в элюате целевого белка - до уровня менее 3000 нг/мг, содержание ДНК при этом довести до уровня менее 50 пг/мг.
Разработка финальной стадии очистки от ДНК штамма-продуцента Для удаления ДНК штамма-продуцента применен стандартный подход с использованием анионообменного сорбента. Показано, что проведение процесса на сорбенте Q Sepharose FF в условиях низкой проводимости элюирующего буферного раствора и значения рН от 6,0 до 8,5 ед. позволяет снизить содержание остаточной ДНК до уровня ниже
Разработка финальной стадии очистки от белков штамма-продуцента
Для удаления белков штамма-продуцента был выбран подход, основанный на высокой гидрофильное™ целевой молекулы, позволяющий проводить очистку целевого белка в режиме фильтрации через колонку с сорбентом. Была проведена экспериментальная проверка возможности применения гидрофобных сорбентов в различных условиях для снижения содержания белков штамма-продуцента в конечном продукте до уровня ниже 10 нг/мг.Результаты исследований неожиданно показали, что, вне зависимости от нагрузки на сорбент, выход мономерной формы белка был неожиданно высок. При содержании хлорида натрия в наносимом растворе белка менее 3 моль\литр общий выход целевого белка составлял не менее 80%. Результаты скрининга условий проведения гидрофобной хроматографии представлены в таблице 6.
Таким образом, была разработана стадия процесса хроматографической очистки, позволяющая снизить содержание белков штамма-продуцента до уровня менее 10 нг/мг.
Дополнительно в схему очистки были внесены этапы вирусной инактивации после стадии очистки на металл-хелатном сорбенте, а также нанофильтрации и диафильтрации для перевода в финальный буферный раствор. Финализированная схема очистки приведена на рисунке 1. Данная схема очистки позволяет получать активную фармацевтическую субстанцию со следующими характеристиками:
-содержание мономера не менее 99%;
- содержание основной формы целевого белка по данным обращенно-фазовой ВЭЖХ не менее 99,5%;
- содержание белков штамма-продуцента не более 10 нг/мг;
- содержание ДНК штамма-продуцента не более 5 пг/мг;
- удельная специфическая активность не менее 9,0 МЕ/мг.
Выход целевого белка относительно его содержания в культуральной жидкости составил около 80% (500 мг целевого белка с 1 л культуральной жидкости).
В качестве подходящего гидрофобного сорбента, содержащего фенильные группы, могут быть использованы Phenyl Sepharose FF, Tosoh Butyl 650M, Capto Phenyl, а также иные коммерчески доступные сорбенты с аналогичным принципом действия.
Пример 1.
Проведение хроматографической очистки.
Культуральную жидкость объемом 1 л наносили на колонку с сорбентом IMAC Sepharose (объем колонки (CV) 0,2 л), предварительно активированную 2 CV 0,1 М раствора хлорида цинка и уравновешенную буферным раствором 20 мМ трис, рН 7,2. После нанесения сорбент промывали 3 CV того же буферного раствора. Колонку промывали 3 CV буферного раствора 20 мМ трис, 15 мМ имидазол, рН 7,5. Связанный с сорбентом целевой белок элюировали буферным раствором 20 мМ трис, 150 мМ имидазол, рН 7,2.
Вирусную инактивацию проводили сольвент-детергентным методом. Во фракцию белка добавляли при перемешивании 20% раствор полисорбата-80 до 1% (1/20 часть от объема фракции) и трибутилфосфат до 0,3% (3/1000 части от объема элюата). Инкубировали при постоянном перемешивании при комнатной температуре в течение 1 часа.
Полученную фракцию белка разбавляли водой в 2 раза и наносили на колонку с Heparin Sepharose (CV 0,1 л), предварительно уравновешенную буферным раствором 20 мМ трис, рН 7,2. После нанесения промывали сорбент 3 CV того же буферного раствора. Связавшийся с сорбентом целевой белок элюировали буферным раствором 20 мМ трис, 200 мМ натрия хлорид, рН 7,2.
Следующий этап очистки осуществляли на колонне с сорбентом Q Sepharose FF (CV 0,1 л), которую предварительно уравновешивали буферным раствором 20 мМ трис, 50 мМ натрия хлорида, рН 7,0. Далее наносили раствор белка в 50% градиенте воды очищенной на уравновешенную колонну. После нанесения отмывали сорбент с адсорбированным белком буферным раствором 20 мМ трис, 50 мМ натрия хлорида, рН 7,2. Элюцию целевого белка производили градиентом буферного раствора 20 мМ HEPES, 200 мМ натрия хлорид, рН 7,5 в буферном растворе 20 мМ трис, 50 мМ натрия хлорида, рН 7,5 (от 0 до 100% за 10 колоночных объемов).
Следующий этап очистки осуществляли на сорбенте Capto Phenyl High Sub. Объем колонны составлял 10 мл. Нагрузка по целевому белку не более 50 г целевого белка на 1 л сорбента.
Колонну с Capto Phenyl High Sub предварительно уравновешивали буферным раствором 20 мМ HEPES, 2 М натрия хлорид, рН 7,0. Целевой белок для нанесения подготавливали путем добавления раствора 5 М натрия хлорида до проводимости 145-155 мСм/см. Далее наносили раствор белка на уравновешенную колонну, собирая фильтрат, содержащий целевой белок. После нанесения колонну промывали буферным раствором 20 мМ HEPES, 2 М натрия хлорид, рН 7,0, продолжая собирать фильтрат.
Проводили противовирусную нанофильтрацию полученной фракции белка на фильтре Planova 15N, затем фильтрат концентрировали на мембране для тангенциальной фильтрации VIVAFLOW 200 с диаметром пор 30 кДа и диализовали против буферного раствора 9,4 г/л глицин, 2,9 г/л натрия цитрат, 8 г/л натрия хлорид, рН 7,0.
Полученный раствор белка фильтровали через стерилизующий фильтр с размером пор 0,22 мкм в стерильную емкость в асептических условиях.
Общий выход по очищенному белку составил около 500 мг с 1 л культуральной жидкости.
Полученная активная фармацевтическая субстанция имеет следующие качественные характеристики: 99,7% мономерной формы целевого белка; 99,8% основной формы по данным обращенно-фазовой ВЭЖХ; 1,9 пг/мг ДНК штамма-продуцента; 2,9 нг/мг белков штамма-продуцента; удельная активность 9,3 МЕ/мг.
Пример 2.
Проведение хроматографической очистки в промышленном объеме.
На первом этапе очистки культуральную жидкость объемом 250 л наносили на колонку с IMAC Sepharose (объем колонки (CV) 25,0 л).
Подготовку колонны осуществляли путем промывки 25,0 л 0,5 М раствора хлорида цинка с последующей промывкой стартовым буферным раствором: 20 мМ трис, рН 7,2.
Культуральную жидкость не подвергали предварительной подготовке.
На подготовленный сорбент наносили культуральную жидкость, после чего последовательно промывали сорбент стартовым буферным раствором и буферным раствором 20 мМ трис, 5 мМ имидазол, рН 7,2.
Целевой белок элюировали с колонны буферным раствором 20 мМ трис, 150 мМ имидазол, рН 7,2.
На следующем этапе осуществляли вирусную инактивацию полученного раствора путем добавления детергентов: полисорбат 80 до 1%; трибутилфосфат до концентрации 0,3%. Время инкубации составляло не менее 1 часа при комнатной температуре.
На следующем этапе осуществляли очистку целевого белка на аффинном сорбенте Heparin Sepharose FF.
Колонну с Heparin Sepharose FF (объем колонки (CV) 12,0 л) предварительно уравновешивали буферным раствором 20 мМ трис, рН 7,5. Далее наносили раствор белка в 50% градиенте воды очищенной на уравновешенную колонну.
После нанесения отмывали сорбент с адсорбированным белком буферным раствором 50 мМ трис, рН 7,5. Элюцию целевого белка производили буферным раствором 50 мМ трис, 200 мМ натрия хлорид, рН 7,5
Следующий этап хроматографической очистки осуществляли на сорбенте Q Sepharose FF. Объем колонны составлял 2 л. Нагрузка по целевому белку не более 70 г целевого белка на 1 л сорбента.
Колонну с Q Sepharose FF предварительно уравновешивали буферным раствором 20 мМ трис, 50 мМ натрия хлорида, рН 7,5. Далее наносили раствор белка в 50% градиенте воды очищенной на уравновешенную колонну. После нанесения отмывали сорбент с адсорбированным белком буферным раствором 20 мМ трис, 50 мМ натрия хлорида, рН 7,2. Элюцию целевого белка производили градиентом буферного раствора 20 мМ HEPES, 200 мМ натрия хлорид, рН 7,0 в буферном растворе 20 мМ трис, 50 мМ натрия хлорида, рН 7,5 (от 0 до 100% за 10 колоночных объемов).
Следующий этап очистки осуществляли на сорбенте Capto Phenyl High Sub. Объем колонны составлял 2 л. Нагрузка по целевому белку не более 50 г целевого белка на 1 л сорбента.
Колонну с Capto Phenyl High Sub предварительно уравновешивали буферным раствором 20 мМ HEPES, 2 М натрия хлорид, рН 7,0. Целевой белок для нанесения подготавливали путем добавления раствора 5 М натрия хлорида до проводимости 145-155 мкСм/см. Далее наносили раствор белка на уравновешенную колонну, собирая фильтрат, содержащий целевой белок. После нанесения отмывали целевой белок буферным раствором 20 мМ HEPES, 2 М натрия хлорид, рН 7,0.
Для перевода полученного белка в конечный буферный раствор проводили диафильтрацию с использованием диафильтрационных кассет Sartorius, материал PES, с размером отсечения 50 кДа. Предварительно осуществляли промывку кассет буферным раствором 125 мМ глицина, 11,2 мМ цитрата натрия, 136,8 мМ натрия хлорида, рН 7,0. Процесс диафильтрации осуществляли при концентрации белка 50 мг/мл. После завершения процесса диафильтрации доводили концентрацию белка до значения 15-18 мг/мл.
Далее проводили противовирусную нанофильтрацию полученного раствора белка на фильтре Millipore Virosolve. Предварительно промывали фильтр буферным раствором 125 мМ глицина, 11,2 мМ цитрата натрия, 136,8 мМ натрия хлорида, рН 7,0. Далее подвергали раствор белка через подготовленный противовирусный фильтр.
Полученный раствор белка фильтровали через стерилизующий фильтр с размером пор 0,22 мкм в стерильную емкость в асептических условиях.
Общий выход по очищенному белку составил около 500 мг с 1 л культуральной жидкости.
Полученная активная фармацевтическая субстанция имеет следующие качественные характеристики: 99,8% мономерной формы целевого белка; 99,9% основной формы по данным обращенно-фазовой ВЭЖХ; 1,0 пг/мг ДНК штамма-продуцента; 5,0 нг/мг белков штамма-продуцента; удельная активность 9,5 МЕ/мг.