Исследование антимикробной активности миелопероксидазы и лактоферрина

УДК 577.19

М. Н. Берлов, Е. С. Кораблева, В. Б. Филимонов, В. Н. Кокряков

ИССЛЕДОВАНИЕ АНТИМИКРОБНОЙ АКТИВНОСТИ МИЕЛОПЕРОКСИДАЗЫ И ЛАКТОФЕРРИНА

Санкт-Петербургский государственный университет, кафедра биохимии биолого-почвенного факультета

Введение. Нейтрофилы млекопитающих являются основными эффекторными клетками системы врожденного иммунитета. Двумя основными способами защиты организма от инфекции являются поглощение микробных клеток путем фагоцитоза и выделение антимикробных веществ во внеклеточную среду организма, зараженную патогеном. Нейтрофилы способны выполнять функцию защиты организма обоими указанными способами. Гранулярный аппарат этих клеток содержит большое количество антимикробных белков и пептидов — миелопероксидаза (МПО), лактоферрин (ЛФ), эластаза, катепсин G, лизоцим, дефенсины, кателицидины и другие, — обеспечивающих выполнение защитной функции [3]. Несмотря на то, что изучение антимикробных белков и пептидов как молекулярных факторов врожденного иммунитета интенсивно ведется на протяжении нескольких десятков лет, в большинстве исследований изучается антимикробная активность индивидуальных белков и пептидов. При этом упускается из вида тот факт, что в естественных условиях бактерии часто инактивируются сложной смесью физиологически активных молекул, а не индивидуальным ее компонентом. При совместном действии антимикробных агентов на микроорганизмы возможны проявления эффектов различного характера: аддитивный эффект, синергизм (эффект взаимного действия выше аддитивного), антагонизм (ниже аддитивного), потенцирование (частный случай синергизма, имеющий место, когда один из компонентов не обладает антимикробной активностью индивидуально).

Первые в мире работы, посвященные изучению синергических эффектов при совместном действии антимикробных белков, были выполнены в середине 70-х годов прошлого века британскими [27], шведскими [22] и советскими [1] учеными. В частности, в последней работе, выполненной на кафедре биохимии Ленинградского государственного университета, был описан синергизм совместного действия МПО и дефенсинов по отношению к грамположительной бактерии Staphylococcus epidermidis. В последующих работах коллектива кафедры на этом же объекте был показан синергический эффект при сочетании МПО с сериновыми протеиназами — эластазой или катепсином G [6] (для эластазы аналогичный эффект был ранее обнаружен шведскими исследователями [22]), а также МПО с ЛФ [4, 5].

Интерес, проявленный в этих работах к МПО, неслучаен, так как этот белок выделяется среди прочих лейкоцитарных компонентов механизмом антимикробного действия и относится к факторам кислород-зависимой антимикробной системы нейтрофилов. Будучи ферментом из группы оксидоредуктаз (К. Ф. 1.11.1.7), МПО катализирует образование

© М. Н. Берлов, Е. С. Кораблева, В. Б. Филимонов, В. Н. Кокряков, 2009

токсических для микробов молекул в реакции окисления перекисью водорода различных субстратов: галогенидов (Cl-, I-, Br-), тиоционата (SCN-). В частности, в реакции с участием хлорида образуется гипохлорит — HOCl, являющийся высокотоксичным для микробных клеток соединением [16].

ЛФ — железосвязывающий белок, содержащийся в секретах многих экзокринных желез, а также в гранулах нейтрофилов. Благодаря способности связывать ионы трехвалентного железа, ЛФ может существовать в двух формах: в виде комплекса с железом и в свободном от железа состоянии (апоЛФ). Поскольку только апоЛФ проявляет антимикробную активность, первоначально она объяснялась тем, что данный белок ограничивает доступность для микробных клеток железа, необходимого для их роста [18, 23]. Однако позднее было описано прямое бактерицидное действие апоЛФ [7, 8], подтвержденное впоследствии другими исследователями [2, 10, 11]. Для объяснения антимикробного действия ЛФ предлагаются, помимо создания дефицитной по железу среды, различные механизмы: способность ЛФ взаимодействовать с липополисахаридом и выщеплять его из наружной мембраны грамотрицательных бактерий [13], образование в результате ограниченного протеолиза из N-концевого участка белка катионных антимикробных пептидов (лактофер-рицинов) [28], присущая самому ЛФ протеолитическая активность, которая может быть направлена на ряд бактериальных белков [21, 25].

МПО и ЛФ содержатся в нейтрофилах в гранулах различных типов: в азурофильных и специфических гранулах соответственно. Совместно локализованными эти белки оказываются в тот момент, когда необходима реализация их антимикробного потенциала — при образовании фаголизосомной вакуоли, а также внеклеточно в результате дегрануляции нейтрофилов.

Описанный синергический эффект МПО и ЛФ [4, 5] был обнаружен по отношению к грамположительной бактерии St. epidermidis с использованием иодида в качестве субстрата-донора электронов. В данной работе показано, что синергизм МПО и ЛФ имеет более универсальный характер и проявляется также по отношению к грамотрицательной бактерии E. coli в системе с участием хлорида.

Методы. Выделение белков. МПО и ЛФ выделяли из лейкоцитарной фракции крови полученной от здоровых доноров. Процедура выделения включала в себя три основных этапа: экстракция белков из целых лейкоцитарных клеток, ионообменная хроматография, гель-фильтрация. С целью экстракции катионных белков лейкоциты гомогенизировали в 0,02 М натрий-ацетатном буфере (рН 4,5), содержащим 0,3 % бромистого цетилтримети-ламмония. Гомогенат центрифугировали в течение 40-60 мин при 5000 g при температуре +4 °С. Ионообменную хроматографию проводили на колонке с КМ-целлюлозой СМ-52 («Whatman», Англия), уравновешенной 0,02 М натрий-ацетатным буфером (рН 4,5), содержащим 0,05 М NaCl. Элюцию ЛФ осуществляли 0,2 М NaCl на том же буфере, а МПО выходило с колонки в процессе увеличения концентрации NaCl линейным градиентом 0,2-1,2 М. Гель-фильтрацию проводили на колонке с сефадексом G-150 (“Pharmacia”, Швеция), уравновешенной 0,02 М натрий-ацетатным буфером, рН 4,5, содержащим 1 M NaCl.

Электрофорез в кислой буферной системе. Спектр белков в различных фракциях, а также гомогенность полученных препаратов оценивали методом электрофореза в 12,5 %-ном ПААГ в присутствии мочевины (6,25 М) в кислой буферной системе (5 %-ная уксусная кислота) по методу С. Паньима и Р. Челкли [24].

Определение ферментативной активности МПО. Активность МПО определяли по о-дианизидиновому методу С. Дж. Клебанова [17]. Продукт окисления о-дианизидина

перекисью водорода имеет максимум поглощения при длине волны 460 нм. Реакционная смесь содержала следующие компоненты: 2,25 мл воды, 0,3 мл 0,1 М натрий-фосфатного буфера (рН 5,8), 0,3 мл 0,001 М раствора Н2О2 (конечная концентрация — 0,1 мМ), 0,05 мл 0,02 М раствора о-дианизидина в метаноле (конечная концентрация — 0,33 мкМ), 0,1 мл белковой пробы (добавлялась в последнюю очередь). Ферментативную реакцию вели 15 с при температуре +25 °С, измеряя оптическую плотность раствора против контрольной пробы (2,35 мл воды, 0,3 мл буфера, 0,3 мл раствора Н2О2, 0,05 мл раствора о-дианизидина) с интервалом в 5 с.

Насыщение ЛФ железом и получение апоЛФ. ЛФ, насыщенный железом, получали путем диализа препарата ЛФ против буфера, содержащего 0,1 М цитрат натрия и 0,05 М бикарбонат натрия, рН 8,4-8,5, затем против того же буфера, содержащего FeCl3 в 10-20-кратном избытке по сравнению с количеством, требуемым для полного насыщения ЛФ железом. Далее белок диализовали против 0,15 М NaCl, чтобы избавиться от несвязавшегося железа [9]. ЛФ, лишенный железа (апоЛФ), получали путем диализа препарата ЛФ против буфера, содержащего 0,2 М цитрат натрия, 0,2 М фосфат натрия и 0,15 М NaCl, pH 3,0-3,1 [20].

Определение антимикробной активности белков. Объектом для изучения антимикробного действия белков стала грамотрицательная бактерия Escherichia coli, штамм ML-35p. Рост бактерий оценивали фотометрическим методом в присутствии ресазурина. Микроорганизмы предварительно культивировали в течение ночи при температуре +37 °С в 3 %-ном триптическом гидролизате сои (TSB). Суспензию ночной культуры бактерии центрифугировали при 4000 g 10 мин, затем отмывали холодным (+4 °С) 0,01 М натрий-фосфатным буфером, рН 7,4, путем центрифугирования при тех же условиях. Осадок ресуспендировали в том же буфере и определяли концентрацию бактерий измерением оптической плотности суспензии при длине волны 620 нм, исходя из того, что одной единице оптической плотности соответствует 2,5 х108 КОЕ/мл. В лунки 96-луночного плоскодонного планшета последовательно вносили исследуемые вещества в 0,01 М натрий-фосфатном буфере, рН 7,4; бактериальную суспензию (конечная концентрация в лунке — 1x104 КОЕ/мл); TSB (конечная концентрация — 0,12 %); ресазурин (конечная концентрация — 20 мкМ). Планшет инкубировали на шейкере при температуре +37 °С во влажной камере. Метаболическую активность бактерий оценивали по возрастанию показателя, представляющего собой разность оптической плотности пробы при длинах волны 540 и 620 нм (А540-А620). Измерение проводили с интервалами в один час с помощью многоканального спектрофотометра Multiskan MS-353 (“Labsystems”, Финляндия). Для оценки антимикробной активности использовали величину Т1/2 [26], представляющую собой время, за которое измеряемая величина (А540-А620) достигает значения, равного половине максимального. Значение Т1/2 нормировали, используя формулу: АМА = (Т^ - Т1/2к) / Т1/2к, где АМА — антимикробная активность, Ти^ - Т1/2, полученное в лунке с исследуемым веществом, Т1/2к — Т1/2 в контроле (бактериальные клетки без добавления какого-либо антимикробного агента). Продолжительность эксперимента ограничивала максимально определяемое значение антимикробной активности величиной 0,65.

Для оценки синергизма совместного действия белков использовалась величина суммарного FIC (fractional inhibitory concentration), определяемая по формуле FIC = [A]/MICa + [B] / MICB, где MICA и MICB — минимальные ингибирующие концентрации веществ А и B соответственно при их индивидуальном тестировании, а [А] и [B] — минимальные ингибирующие концентрации тех же веществ при совместном

тестировании. Согласно общепринятым критериям, значение индекса Б1С равное 0,5 или менее характеризует взаимодействие веществ как синергическое [29].

Результаты исследования. Благодаря описанным методам очистки белков, были получены электрофоретически гомогенные МПО и ЛФ из лейкоцитов крови человека. Оба белка проявляли характерные для них спектральные свойства: ЛФ, насыщенный железом, имеет максимум поглощения при 460-465 нм, основной максимум поглощения МПО в видимой области — при 430 нм. Отношение А430/А280 для МПО (Я2) равнялось 0,74, что характеризует полученный препарат как высокоочищенный.

Изучение антимикробных свойств МПО и ЛФ дало следующие результаты (таблица). В случае МПО в состав инкубационных проб входили субстраты: 5 мМ №С1 и 5 мкМ Н202. Видно, что в диапазоне концентраций 0,2—1,6 мкг/мл МПО проявляет выраженную антимикробную активность. При дальнейшем повышении концентрации фермента происходит ингибирование антимикробной активности. АпоЛФ проявляет антимикробное действие в концентрациях 40—160 мкг/мл. ЛФ, насыщенный железом, как и ожидалось, не обладает антимикробной активностью в исследованном диапазоне концентраций (в таблице не показано).

Антимикробная активность МПО и апоЛФ при индивидуальном тестировании

МПО апоЛФ

Концентрация, мкг/мл АМА Концентрация, мкг/мл АМА

0,1 0 20 0

0,2 0,03 40 0,06

0,4 0,09 80 0,14

0,8 0,31 160 >0,65

1,6 >0,65

При совместном тестировании МПО и ЛФ были использованы концентрации белков

0,05 и 10 мкг/мл соответственно. При этом была зафиксирована антимикробная активность, равная 0,09. Если принять указанные концентрации за минимальные ингибирующие, то значение индекса FIC будет равно 0,5. Таким образом, на основании полученных данных можно утверждать, что для комбинации МПО и ЛФ FIC < 0,5, следовательно, взаимодействие данных белков носит синергический характер.

В качестве одного из возможных механизмов, ответственных за синергизм МПО и ЛФ, можно было предположить прямое взаимодействие белков, приводящее к увеличению ферментативной активности МПО. Для проверки этого предположения исследовали ферментативную активность МПО (0,05 мкг/мл) в двух пробах, одна из которых содержала 10 мкг/мл апоЛФ. При этом белки предварительно смешивались, инкубировались 10 мин при комнатной температуре и только затем добавлялись в реакционную смесь. По результатам измерений различий в активности МПО в двух пробах не обнаружено.

Обсуждение результатов исследования. В данной работе расширены имеющиеся сведения [4, 5] о синергизме МПО и ЛФ и показано, что он может проявляться по отношению к грамотрицательной бактерии (E. coli) с использованием хлорида в качестве второго субстрата МПО. Аналогичные результаты были получены для МПО и ЛФ из лейкоцитов собаки, что позволяет высказать предположение об универсальном характере описанного явления. Механизмы данного эффекта пока не выявлены.

Одним из широко распространенных механизмов синергического действия мембраноактивных антимикробных белков и пептидов на бактерии является формирование ими

комплекса, который и выступает в качестве высокоэффективного антимикробного агента. Классическим примером можно считать синергический эффект совместного действия на бактерии PGLa и магейнина 2, антимикробных пептидов из кожи амфибии Xenopus laevis, сопряженный с образованием данными пептидами межмолекулярного гетерологи-ческого комплекса, обладающего повышенной способностью к формированию пор в мембранах [19]. Однако для МПО, чье действие на бактерии осуществляется опосредованно, такой механизм синергического взаимодействия с другими белками маловероятен. Никаких сведений о возможности формирования МПО и ЛФ межбелкового комплекса в литературе не имеется. Вариант, заключающийся в активации ферментативной активности МПО ЛФ, был проверен в данной работе и пока не получил подтверждения.

Другой широко распространенной моделью, объясняющей синергические эффекты, является независимое воздействие антимикробных веществ на различные бактериальные мишени, только совокупное поражение которых имеет для бактерии критические последствия. В случае грамотрицательных бактерий одной из таких мишеней, как правило, является наружная мембрана. Так, синергический эффект кооперативной системы, состоящей из лизоцима и ЛФ, на грамотрицательные бактерии [14] объясняется авторами известной способностью ЛФ выщеплять липополисахарид из наружной мембраны этих микроорганизмов [12, 13]. ЛФ в такой системе может нарушать структурно-функциональную целостность клеточной оболочки бактерий, делая подлежащий пептидогликановый слой доступным действию лизоцима. Не исключено, что подобный механизм может играть роль и в системе МПО-ЛФ.

Еще одним возможным механизмом является гипотетическое влияние апоЛФ на ка-талазную активность бактериальных клеток. Каталаза, разлагающая перекись водорода, является таким образом конкурентом МПО за субстрат и, соответственно, ингибитором ее антимикробной активности. Поскольку каталаза содержит в активном центре железо, можно ожидать, что апоЛФ способен, если не взаимодействовать с ферментом напрямую, то, по крайней мере, оказывать влияние на его метаболизм. Связывая ионы трехвалентного железа, апоЛФ создает среду, дефицитную по этому микроэлементу. Несмотря на несомненную важность каталазы для жизнедеятельности бактерий, ее пониженный биосинтез не будет для клеток столь критичным, как, например, пониженный биосинтез компонентов дыхательной цепи, многие из которых также содержат железо. Таким образом, можно предположить, что в условиях умеренного дефицита железа рост бактериальных клеток будет продолжаться, однако содержание в них каталазы будет снижено, что приведет к повышенной чувствительности микробов к МПО. Проверка этой гипотезы входит в планы нашей дальнейшей работы.

В качестве маркера роста клеток в данной работе использовался ресазурин, способный к превращению из окисленного состояния в восстановленное в присутствии в среде активно метаболизирующих и делящихся клеток [15, 26]. Несмотря на широкое применение ресазурина для оценки роста бактерий, следует помнить, что прямого определения количества клеток не производится, соответственно, результаты, полученные данным методом, следует интерпретировать с известной осторожностью.

Хотя опыты по изучению активности кооперативного действия антимикробных белков мы проводили in vitro, кажется вероятным, что обнаруженные эффекты могут реализовываться in vivo в фаголизосомной вакуоли, где оказываются совместно локализованными изучаемые белки в процессе фагоцитоза, либо внеклеточно в очагах воспаления. Эффективность кооперативных систем может в конечном итоге определять завершенность фагоцитоза, осуществляемого нейтрофилами.

1. Ашмарин И. П., Кокряков В. Н., Лызлова С. Н., Раменская Н. П. Взаимодействие катионных белков гранул и миелопероксидазы лейкоцитов // Вопр. мед. хим. 1977. № 4. С. 534-537.

2. Берлов М. Н., Кораблева Е. С., Андреева Ю. В., Овчинникова Т. В., Кокряков В. Н. Лактоферрин из нейтрофилов собаки: выделение, физико-химические и антимикробные свойства // Биохимия. 2007. Т. 72. № 4. С. 551-559.

3. Кокряков В. Н. Биология антибиотиков животного происхождения. СПб., 1999.

4. Кокряков В. Н., Ротова Г. М. Синергическое антимикробное действие миелопероксидазы и лактоферрина нейтрофилов свиньи // Деп. ВИНИТИ. Иммунология. 1985.

5. Кокряков В. Н., Пигаревский В. Е., Алешина Г. М., Шамова О. В. Синергическое антимикробное действие катионных белков при фагоцитозе // Моделирование и клиническая характеристика фагоцитарных реакций // Науч. труды / Под ред. А. Н. Маянского. Горький, 1989. С. 98-103.

6. Краева Л. Н., Кокряков В. Н., Чесноков И. Н, Яковлева М. Ф., Лызлова С. Н. Некоторые свойства катепсина G и эластазы из нейтрофилов периферической крови свиньи // Биохимия. 1988. Т. 53. С. 655-662.

7. Arnold R. R., Cole M. F., McGhee J. R. A bactericidal effect for human lactoferrin // Science. 1977. Vol. 197. P. 263-265.

8. Arnold R. R., Brewer M., Gauthier J. J. Bactericidal activity of human lactoferrin. Sensitivity of a variety of microorganisms // Infect. Immun. 1980. Vol. 28. N3. P. 893-898.

9. Azari P., Baugh R. F. A simple and rapid procedure for preparation of large quantities of pure ovotrans-ferrin // Arch. Biochem. Biophys. 1967. Vol. 118. N1. P. 138-144.

10. De Lillo A., Quiros L. M., Fierro J. M. Relationship between antibacterial activity and cell surface binding of lactoferrin in species of genus Micrococcus // FEMS Microbiol. Lett. 1997. Vol. 150. P. 89-94.

11. Dionysius D. A., Grieve P. A., Milne J. M. Forms of lactoferrin: their antibacterial effect on enterotoxigenic Escherichia coli // J. Dairy Sci. 1993. Vol. 76. P. 2597-2600.

12. Elass-RochardE., LegrandD., Salmon V., Roseanu A., Trif M., Tobias P. S., Mazurier J., Spik G. Lactoferrin inhibits the endotoxin interaction with CD14 by competition with the lipopolysaccharide-binding protein // Infect. Immun. 1998. Vol. 66. P. 486-491.

13. Ellison R. T., Giehl T. J., LaForce F. M. Damage to the outer membrane of enteric Gram-negative bacteria by lactoferrin and transferrin // Infect. Immun. 1988. Vol. 56. P. 2774-2781.

14. Ellison R. T., Giehl T. J. Killing of Gram-negative bacteria by lactoferrin and lysozyme // J. Clin. Invest. 1991. Vol. 88. P. 1080-1091.

15. Gabrielson J., Hart M., JarelovA., Kuhn I., McKenzie D., Mollby R. Evaluation ofredox indicators and the use of digital scanners and spectrophotometer for quantification of microbial growth in microplates // J. Microbiol. Methods. 2002. Vol. 50. N1. P. 63-73.

16. Klebanoff S. J. Myeloperoxidase: friend and foe // J. Leuk. Biol. 2005. Vol. 77. P. 598-625.

17. Klebanoff S. J., Luebke R. G. The antilactobacillus system of saliva. Role of salivary peroxidase // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1965. Vol. 118. P. 483-486.

18. Masson P. L., Heremans J. F., Prignot J. J., Wauters G. Immunohistochemical localization and bacteriostatic properties of an iron-binding protein from bronchial mucus // Thorax. 1966. Vol. 21. P. 538-544.

19. Matsuzaki K., Mitani Y., Akada K. Y., Murase O., Yoneyama S., Zasloff M., Miyajima K. Mechanism of synergism between antimicrobial peptides magainin 2 and PGLa // Biochemistry. 1998. Vol. 27. N.43. P. 15144-15153.

20. Mazurier J., Spik G. Comparative study of the iron-binding properties of human transferrins. I. Complete and sequential iron saturation and desaturation of the lactotransferrin // Biochim. Biophys. Acta. 1980. Vol. 629. P. 399-408.

21. Ochoa T. J., Noguera-Obenza M., Ebel F., Guzman C. A., Gomez H. F., Cleary T. G. Lactoferrin Impairs Type III Secretory System Function in Enteropathogenic Escherichia coli // Infect. Immun. 2003. Vol. 71. P. 5149-5155.

22. Odeberg H., Olsson I. Microbicidal mechanisms of human granulocytes: Synergistic effects of granulocyte elastase and myeloperoxidase or chymotrypsin-like cationic protein // Infect. Immun. 1976. Vol. 14. N6. P. 1276-1283.

23. Oram J. D., Reiter B. Inhibition of bacteria by lactoferrin and other iron-chelating agents // Biochim. Biophys. Acta. 1968. Vol. 170. P. 351-365.

24. Panyim S., Chalkley R. High resolution acrylamide gel electrophoresis of histones // Arch. Biochem. Biophys. 1969. Vol. 130. P. 337-346.

25. Qiu J., Hendrixon D. R., Baker E. N., Murphy T. F., Geme J. W. S., Plaut A. G. Human milk lactofer-rin inactivates two putative colonization factors expressed by Haemophilus influenzae // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 199S. Vol. 95. P. 12б41-12б4б.

26. Shiloh M. U., Ruan J., Nathan C. Evaluation of bacterial survival and phagocyte function with a fluorescence-based microplate assay // Infect. Immun. 1997. Vol. б5. N S. P. 3193-319S.

27. Thorne K. J. I., Oliver R. C., Barrett A. J. Lysis and killing of bacteria by lysosomal proteinases // Infect. Immun. 197б. Vol. 14. N 2. P. 555-5б3.

2S. TomitaM., Bellamy W., TakaseM., YamauchiK., WakabayashiH., Kawase K. Potent antibacterial peptides generated by pepsin digestion of bovine lactoferrin // J. Dairy Sci. 1991. Vol. 74. N 12. P. 4137-4142.

29. Yan H., Hancock R. E. W. Synergistic interactions between mammalian antimicrobial defense peptides // Antimicrob. Agents Chemother. 2QQ1. Vol. 45. N 5. P. 155S-156Q.