Способ получения антитела, специфически связывающего домен димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu, в растении, антитело, полученное этим способом, и его применение
METHOD OF OBTAINING THE ANTIBODY, WHICH SPECIFICALLY BINDS THE DOMAIN OF THE HER2/NEU EXCELLULAR PART OF THE HER2/NEU ONCOPROTEIN, IN THE PLANT, THE ANTIBODY, WHICH IS OBTAINED BY MEANS OF THIS METHOD AND ITS APPLICATION

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к биотехнологии, генной инженерии и медицине и может быть использовано для создания растений - суперпродуцентов антител, в частности против HER2/neu-позитивных раковых клеток. Настоящее изобретение может быть использовано для диагностики и лечения рака молочной железы.
Предшествующий уровень техники
Каждый год рак молочной железы (РМЖ) убивает больше чем 500000 женщин во всем мире (WHO Position Paper on Mammography Screening, 2014). Примерно у 30% больных РМЖ, так называемых HER2-позитивных и наиболее опасных форм рака, наблюдается суперпродукция онкобелка HER2 (от Human Epidermal growth factor Receptor 2), представляющего собой трансмембранную тирозиновую протеинкиназу ErbB2 с мол. массой 185 кДа. Аномальная активность HER2 вызывает ускоренное метастазирование и устойчивость к терапевтическому воздействию (Ahmed et al., 2015). Успех в лечении РМЖ связан с тем, что несколько лет назад в медицинскую практику был введен трастузумаб, созданный фирмой Дженентек (Genentech, США) и производимый фирмой Хоффман-Ля Рош (Hoffman La Roche, Швейцария). Это лекарство создано на основе гуманизированных моноклональных антител (MA) (huMab4D5-8 или rhuMabHer2), производимых мышиной гибридомой АТСС CRL-10463 из коллекции штаммов микроорганизмов и клеточных культур США (Hudziak et al., 1989) (Harries and Smith, 2002). Антитело, введенное в кровоток пациента, взаимодействует с внеклеточный частью HER2/neu и угнетает деление раковых клеток, редко сопровождающееся разрушением раковых клеток. В комбинации с химиотерапией антитела huMab4D5-8 оказывают выраженный лечебный эффект (Hudis, 2007). Показано, что использование трастузумаба снижает риск развития отдаленных метастазов и увеличивает продолжительность жизни пациентов (Hudis, 2007). Однако способ лечения трастузумабом имеет ряд недостатков. Обычно MA получают в культуре животных клеток, а это чаще всего опухолевые клетки яичника китайского хомячка (Chinese hamster ovary, СНО). Вообще, продукция белка в животных клетках сопряжена с риском контаминации продуктами и патогенами животного происхождения, такие как ретровирусы и прионы. Другим существенным недостатком является высокая стоимость MA, которая включает инновационные издержки, а также затраты на оборудование, систему поддержания стерильности, а также системы сертификации и контроля сред, использующих продукты животного происхождения и увеличивающих риск загрязнения препарата MA прионами и вирусами. Этим объясняется высокая стоимость лечения HER2/neu-позитивного РМЖ с использованием MA. Она составляет не менее 70000 долларов США для лечения РМЖ с применением трастузумаба (Fleck, 2006)(Macedo et al., 2010).
Растение - это источник дешевого белка, имеющий ряд преимуществ по сравнению с клетками млекопитающих при использовании для продукции фармацевтических белков. Растения как «фабрики» (а) не содержат патогенных для человека вирусов и прионов, и (б) не требуют применения дорогостоящей аппаратуры (например, ферментеров), культуральных сред и поддержания стерильности. Стоимость выращивания исходных опытных растений несравнимо ниже стоимости культивирования клеток бактерий, дрожжей или животных. Технология «временной» продукции (transient expression) белков в растении позволяет наработать чужеродный белок в количестве, достигающем 10%-30% от общего растворимого белка растения в короткое время (5-10 дней) (Komarova et al., 2010). Эта система успешно используется для продукции антираковых антител (Giritch et al., 2006). При использовании способа, когда целевой ген включается в бинарный вектор с последующей доставкой его в клетки инфицируемого растения методом агроинокуляции или агроинфильтрации, удалось получить в растении MA против онкогена HER2/neu, получившее название фитотрастузумаб (Komarova et al., 2011). У трастузумаба помимо высокой цены есть еще один недостаток, это появление при лечении РМЖ устойчивых к нему клеточных форм (Peake and Nahta, 2014). Одним из способов преодоления этой проблемы является создание антитела, способного узнавать другой, отличный от сайта узнавания трастузумабом, участок экзоклеточной части HER2 (Hu et al., 2014, p. 2) (Rimawi et al., 2015). Если трастузумаб взаимодействует с IV субдоменом (аминокислоты с 480 по 620), то поступивший недавно в клиническую практику пертузумаб, взаимодействуя со II субдоменом димеризации (аминокислоты с 165 по 310), блокирует димеризацию HER2 и HER3 (Barthélémy et al., 2014). Поскольку пертузумаб и трастузумаб блокируют HER2 в разных участках, то совместное использование этих антител приводит к синергидному эффекту (Kawajiri et al., 2015). Кроме того, использование пертузумаба дает возможность лечения форм рака, резистентных к трастузумабу (Chung and Lam, 2013) (Rimawi et al., 2015).
Однако продукция пертузумаба имеет все те отмеченные выше недостатки, что и продукция трастузумаба.
Настоящее изобретения направлено на преодоление недостатков, присущих трастузумабу, фитотрастузумабу и пертузумабу, известным из уровня техники, путем продукции в клетке растения антитела, специфически, связывающего домен димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu.
Краткое описание изобретения
Первый аспект настоящего изобретения предусматривает рекомбинантный экспрессионный неамплифицирующийся вектор для получения в клетках растения легкой цепи антитела, специфически связывающего домен димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu, содержащий последовательно расположенные элементы: функционально активный в клетках растения промотор, нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, состоящую из сигнального пептида, обеспечивающего секрецию антитела, и легкой цепи антитела, и терминатор транскрипции.
В предпочтительных вариантах воплощения промотор представляет собой промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты, промотор гена нопалин-синтетазы (nos), промотор гена октопин-синтетазы (ocs), промотор гена маннопин-синтетазы (mas) Agrobacteruim tumefaciens или промотор гена актин 2 Arabidopsis thaliana.
В предпочтительных вариантах воплощения терминатор транскрипции представляет собой терминатор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты, терминатор гена нопалин-синтетазы (nos), терминатор гена октопин-синтетазы (ocs), терминатор гена маннопин-синтетазы (mas) Agrobacteruim tumefaciens или терминатор гена актин 2 Arabidopsis thaliana.
В более предпочтительных вариантах воплощения промотор представляет собой промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты.
В более предпочтительных вариантах воплощения терминатор транскрипции представляет собой терминатор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты.
В наиболее предпочтительном варианте воплощения промотор представляет собой промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты и терминатор транскрипции представляет собой терминатор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты.
Второй аспект настоящего изобретения предусматривает рекомбинантный экспрессионный вирусный амплифицирующийся вектор для получения в клетках растения легкой цепи антитела, специфически связывающего домен димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu, содержащий последовательно расположенные элементы: функционально активный в клетках растения промотор, 5'-нетранслирумый участок генома Х-вируса картофеля, ген полимеразы Х-вируса картофеля, второй промотор субгеномной РНК Х-вируса картофеля, нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, состоящую из сигнального пептида, обеспечивающего секрецию антитела, и легкой цепь антитела, 3'-нетранслируемый участок генома Х-вируса картофеля и терминатор транскрипции.
В предпочтительных вариантах воплощения промотор представляет собой промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты, промотор гена нопалин-синтетазы (nos), промотор гена октопин-синтетазы (ocs), промотор гена маннопин-синтетазы (mas) Agrobacteruim tumefaciens или промотор гена актин 2 Arabidopsis thaliana.
В предпочтительных вариантах воплощения терминатор транскрипции представляет собой терминатор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты, терминатор гена нопалин-синтетазы (nos), терминатор гена октопин-синтетазы (ocs), терминатор гена маннопин-синтетазы (mas) Agrobacteruim tumefaciens или терминатор гена актин 2 Arabidopsis thaliana.
В более предпочтительных вариантах воплощения промотор представляет собой промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты.
В более предпочтительных вариантах воплощения терминатор транскрипции представляет собой терминатор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты.
В наиболее предпочтительном варианте воплощения промотор представляет собой промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты и терминатор транскрипции представляет собой терминатор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты.
Третий аспект настоящего изобретения предусматривает рекомбинантный экспрессионный вирусный амплифицирующийся вектор для получения в клетках растения легкой цепи антитела, специфически связывающего домен димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu, содержащий последовательно расположенные элементы: функционально активный в клетках растения промотор, 5'-нетранслирумый участок генома вируса табачной мозаики крестоцветных, ген полимеразы вируса табачной мозаики крестоцветных, включающий первый промотор субгеномной РНК вируса табачной мозаики крестоцветных, ген транспортного белка, включающий второй промотор субгеномной РНК вируса табачной мозаики крестоцветных, нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, состоящую из сигнального пептида, обеспечивающего секрецию антитела, и легкой цепи антитела, 3'-нетранслируемый участок генома вируса табачной мозаики крестоцветных и терминатор транскрипции.
В предпочтительных вариантах воплощения промотор представляет собой промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты, промотор гена нопалин-синтетазы (nos), промотор гена октопин-синтетазы (ocs), промотор гена маннопин-синтетазы (mas) Agrobacteruim tumefaciens или промотор гена актин 2 Arabidopsis thaliana.
В предпочтительных вариантах воплощения терминатор транскрипции представляет собой терминатор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты, терминатор гена нопалин-синтетазы (nos), терминатор гена октопин-синтетазы (ocs), терминатор гена маннопин-синтетазы (mas) Agrobacteruim tumefaciens или терминатор гена актин 2 Arabidopsis thaliana.
В более предпочтительных вариантах воплощения промотор представляет собой промотор гена актин 2 Arabidopsis thaliana.
В более предпочтительных вариантах воплощения терминатор транскрипции представляет собой терминатор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты.
В наиболее предпочтительном варианте воплощения промотор представляет собой промотор гена актин 2 Arabidopsis thaliana и терминатор транскрипции представляет собой терминатор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты.
Четвертый аспект настоящего изобретения предусматривает рекомбинантный экспрессионный неамплифицирующийся вектор для получения в клетках растения тяжелой цепи антитела, специфически связывающего домен димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu, содержащий последовательно расположенные элементы: функционально активный в клетках растения промотор, нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, состоящую сигнального пептида, обеспечивающего секрецию антитела, и тяжелой цепи антитела, и терминатор транскрипции.
В предпочтительных вариантах воплощения промотор представляет собой промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты, промотор гена нопалин-синтетазы (nos), промотор гена октопин-синтетазы (ocs), промотор гена маннопин-синтетазы (mas) Agrobacteruim tumefaciens или промотор гена актин 2 Arabidopsis thaliana.
В предпочтительных вариантах воплощения терминатор транскрипции представляет собой терминатор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты, терминатор гена нопалин-синтетазы (nos), терминатор гена октопин-синтетазы (ocs), терминатор гена маннопин-синтетазы (mas) Agrobacteruim tumefaciens или терминатор гена актин 2 Arabidopsis thaliana.
В более предпочтительных вариантах воплощения промотор представляет собой промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты.
В более предпочтительных вариантах воплощения терминатор транскрипции представляет собой терминатор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты.
В наиболее предпочтительном варианте воплощения промотор представляет собой промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты и терминатор транскрипции представляет собой терминатор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты.
Пятый аспект настоящего изобретения предусматривает рекомбинантный экспрессионный вирусный амплифицирующийся вектор для получения в клетках растения тяжелой цепи антитела, специфически связывающего домен димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu, содержащий последовательно расположенные элементы: функционально активный в клетках растения промотор, 5'-нетранслирумый участок генома Х-вируса картофеля, ген полимеразы Х-вируса картофеля, второй промотор субгеномной РНК Х-вируса картофеля, нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, состоящую из сигнального пептида, обеспечивающего секрецию антитела, и тяжелой цепи антитела, 3'-нетранслируемый участок генома Х-вируса картофеля и терминатор транскрипции.
В предпочтительных вариантах воплощения промотор представляет собой промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты, промотор гена нопалин-синтетазы (nos), промотор гена октопин-синтетазы (ocs), промотор гена маннопин-синтетазы (mas) Agrobacteruim tumefaciens или промотор гена актин 2 Arabidopsis thaliana.
В предпочтительных вариантах воплощения терминатор транскрипции представляет собой терминатор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты, терминатор гена нопалин-синтетазы (nos), терминатор гена октопин-синтетазы (ocs), терминатор гена маннопин-синтетазы (mas) Agrobacteruim tumefaciens или терминатор гена актин 2 Arabidopsis thaliana.
В более предпочтительных вариантах воплощения промотор представляет собой промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты.
В более предпочтительных вариантах воплощения терминатор транскрипции представляет собой терминатор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты.
В наиболее предпочтительном варианте воплощения промотор представляет собой промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты и терминатор транскрипции представляет собой терминатор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты.
Шестой аспект настоящего изобретения предусматривает рекомбинантный вирусный амплифицирующийся вектор для получения в клетках растения тяжелой цепи антитела, специфически связывающего домен димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu, содержащий последовательно расположенные элементы: функционально активный в клетках растения промотор, 5'-нетранслирумый участок генома вируса табачной мозаики крестоцветных, ген полимеразы вируса табачной мозаики крестоцветных, включающий первый промотор субгеномной РНК вируса табачной мозаики крестоцветных, ген транспортного белка, включающий второй промотор субгеномной РНК вируса табачной мозаики крестоцветных, нуклеотидная последовательность SEQ ID NO: 2, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, состоящую из сигнального пептида, обеспечивающего секрецию антитела, и тяжелой цепи антитела, 3'-нетранслируемый участок генома вируса табачной мозаики крестоцветных и терминатор транскрипции.
В предпочтительных вариантах воплощения промотор представляет собой промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты, промотор гена нопалин-синтетазы (nos), промотор гена октопин-синтетазы (ocs), промотор гена маннопин-синтетазы (mas) Agrobacteruim tumefaciens или промотор гена актин 2 Arabidopsis thaliana.
В предпочтительных вариантах воплощения терминатор транскрипции представляет собой терминатор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты, терминатор гена нопалин-синтетазы (nos), терминатор гена октопин-синтетазы (ocs), терминатор гена маннопин-синтетазы (mas) Agrobacteruim tumefaciens или терминатор гена актин 2 Arabidopsis thaliana.
В более предпочтительных вариантах воплощения промотор представляет собой промотор гена актин 2 Arabidopsis thaliana.
В более предпочтительных вариантах воплощения терминатор транскрипции представляет собой терминатор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты.
В наиболее предпочтительном варианте воплощения промотор представляет собой промотор гена актин 2 Arabidopsis thaliana и терминатор транскрипции представляет собой терминатор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты.
Седьмой аспект настоящего изобретения предусматривает способ получения антитела, специфически связывающего домен димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu, в растении, включающий стадии:
- обеспечение первого экспрессионного вектора, содержащего нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, состоящую из сигнального пептида, обеспечивающего секрецию антитела, и легкой цепи антитела; где указанный экспрессионный вектор содержит следующие последовательно расположенные элементы: функционально активный в клетках растения промотор, нуклеотидная последовательность SEQ ID NO: 1 и терминатор транскрипции;
- обеспечение второго экспрессионного вектора, содержащего нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, состоящую из сигнального пептида, обеспечивающего секрецию антитела, и тяжелой цепи антитела; где указанный экспрессионный вектор содержит следующие последовательно расположенные элементы: функционально активный в клетках растения промотор, нуклеотидная последовательность SEQ ID NO: 2 и терминатор транскрипции;
- получение штамма Agrobacterium tumefaciens. трансформированного первым экспрессионным вектором, и штамма Agrobacterium tumefaciens. трансформированного вторым экспрессионным вектором;
- совместное введение штамма Agrobacterium tumefaciens. трансформированного первым экспрессионным вектором, и штамма Agrobacterium tumefaciens, трансформированного вторым экспрессионным вектором, в клетки растения рода Nicotiana:
- культивирование полученного растения и сбор листьев;
- выделение и очистка антител из собранных листьев.
В предпочтительном варианте воплощения первый экспрессионный вектор представляет собой рекомбинантный экспрессионный неамплифицирующийся вектор согласно первому аспекту настоящего изобретения и второй экспрессионный вектор представляет собой рекомбинантный экспрессионный неамплифицирующийся вектор согласно четвертому аспекту настоящего изобретения.
В предпочтительном варианте воплощения первый экспрессионный вектор представляет собой рекомбинантный вирусный амплифицирующийся вектор на основе Х-вируса картофеля согласно второму аспекту настоящего изобретения и второй экспрессионный вектор представляет собой рекомбинантный вирусный амплифицирующийся вектор на основе вируса табачной мозаики крестоцветных согласно шестому аспекту настоящего изобретения.
В предпочтительном варианте воплощения первый экспрессионный вектор представляет собой рекомбинантный вирусный амплифицирующийся вектор на основе вируса табачной мозаики крестоцветных согласно третьему аспекту настоящего изобретения и второй экспрессионный вектор представляет собой рекомбинантный вирусный амплифицирующийся вектор на основе Х-вируса картофеля согласно пятому аспекту настоящего изобретения.
В предпочтительных вариантах воплощения растение выбирают из Nicotiana benthamiana, Nicotiana tabacum, Nicotiana excelsior.
В наиболее предпочтительном варианте воплощения растение представляет собой Nicotiana benthamiana.
В предпочтительных вариантах воплощения растения культивируют в почве в условиях теплицы или климатической камеры со световым режимом: день 16 часов, ночь 8 часов.
Восьмой аспект настоящего изобретения предусматривает антитело, специфически связывающее домен димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu, полученное заявленным способом.
Девятый аспект настоящего изобретения предусматривает применение заявленного антитела, специфически связывающего домен димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu, в качестве терапевтического агента для лечения HER2/neu-позитивного рака молочной железы.
В предпочтительных вариантах воплощения применение дополнительно включает введение второго терапевтического агента, ингибирующего активность HER2/neu.
В более предпочтительных вариантах воплощения вторым терапевтическим агентом является ингибитор тирозинкиназы.
В наиболее предпочтительном варианте воплощения ингибитор тирозинкиназы представляет собой лапатиниб.
В более предпочтительных вариантах воплощения второй терапевтический агент представляет собой антитело, взаимодействующее с экзоклеточной частью онкобелка HER2/neu.
В наиболее предпочтительном варианте воплощения второй терапевтический агент представляет собой антитело трастузумаб.
В наиболее предпочтительном варианте воплощения второй терапевтический агент представляет собой антитело фитотрастузумаб.
Десятый аспект настоящего изобретения предусматривает применение заявленного антитела, специфически связывающего домен димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu, при изготовлении лекарственного средства для лечения HER2/neu-позитивного рака молочной железы.
Перечень фигур
На Фиг. 1 представлена схему строения бинарного вектора рА16571, кодирующего легкую (L) цепь антитела, специфически связывающего домен димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu, где RB и LB - соответственно, правая и левая часть участка встраивания в геном растения бинарного вектора; 35S - транскрипционный промотор вируса мозаики цветной капусты (ВМЦК); Poly А/Т - полиаденилирующий сигнал ВМЦК/терминатор транскрипции геномной РНК ВМЦК. S1-лидер - 5'-нетранслируемая область геномной РНК ВМЦК.
На Фиг. 2 представлена схему строения бинарного вектора рА16671, кодирующего тяжелую (Н) цепь антитела, специфически связывающего домен димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu. Условные обозначения те же, что и на Фиг. 1.
На Фиг. 3 приведены результаты электрофореза растительных экстрактов в невосстанавливающих условиях (в отсутствие β-меркаптоэтанола) в 7,5% полиакриламидном геле с последующей окраской Кумасси. Показано накопление собранных полноразмерных антител в листьях N.benthamiana после совместной инфильтрации вектором, содержащем ген легкой цепи, и вектором, содержащем ген тяжелой цепи. Использованы последовательности, кодирующие разные сигнальные пептиды (указаны названия конструкций), дорожки:
Инфильтрированные листья были собраны 5, 7 или 9 день (dpi). Дорожка U, неинфицированный лист; дорожка S, 1 μg hIgG; дорожка M, маркеры мол. веса. Область полноразмерных антител выделена стрелкой.
На Фиг. 4 представлена схема строения бинарного вектора рА16921, основанного на кДНК ХВК и кодирующего легкую (L) цепь антитела, специфически связывающего домен димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu, где (слева направо) LB - левая часть участка встраивания в геном растения бинарного вектора; Τ - нопалинсинтазный терминатор; ΝΡΤ - ген неомицинфосфотрансферазы; Ρ - нопалинсинтазный транскрипционный промотор; 35S - транскрипционный промотор ВМЦК; ген репликазы ХВК, L-цепь - легкая цепь; НТО - 3'нетранслируемая область геномной РНК ХВК; Τ - 35S терминатор ВМЦК; RB - правая часть участка встраивания в геном растения бинарного вектора. Стрелки показывают направление транскрипции.
На Фиг. 5 представлена схема строения бинарного вектора pA16722, основанного на кДНК крВТМ и кодирующего тяжелую (Н) цепь антитела, специфически связывающего домен димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu, где (слева направо) LB - левая часть участка встраивания в геном растения бинарного вектора; Τ - нопалинсинтазный терминатор; ΝΡΤ - ген неомицинфосфотрансферазы; Ρ - нопалинсинтазный транскрипционный промотор; Act2 - актиновый транскрипционный промотор 2 из арабидопсиса; ген репликазы крВТМ; ТБ - транспортный белок крВТМ, Н-цепь - тяжелая цепь; НТО - 3'нетранслируемая область геномной РНК крВТМ; Τ - нопалинсинтазный терминатор; RB - правая часть участка встраивания в геном растения бинарного вектора. Стрелки показывают направление транскрипции.
На Фиг. 6 приведены результаты анализа тотального растворимого белка листьев N. benthamiana, агроинъецированных бинарными векторами рА16571 и рА16671. Разделение в 7,5% ПААГ в невосстанавливающих условиях с последующей окраской Кумасси. Дорожки: 1 - интактный лист (отрицательный контроль); 2, 4, 6 - листья, инъецированные бинарными векторами, кодирующими легкую (рА11866) и тяжелую (рА11903) цепь антитела трастузумаб; 3, 5, 7 - листья, инъецированные бинарными векторами рА16571 и рА16671 (зона, соответствующая полноразмерному антителу, отмечена *); +K - 3 мкг трастузумаба (положительный контроль); MR -маркеры молекулярного веса.
На Фиг. 7 приведены результаты анализа фракций очищенного на колонке с протеин-A сефарозой моноклонального антитела, выделенного из листьев N.benthamiana, агроинъецированных бинарными векторами рА16571 и рА16671. Разделение в 12% ПААГ в восстанавливающих условиях с последующей окраской Кумасси. Дорожки: MR - маркеры молекулярного веса; +K - 3 мкг трастузумаба (положительный контроль); 1 - 2 мкг из фракции №3; 2 - 2 мкг из фракции №4. Отмечены зоны, соответствующие тяжелой (Н) и легкой (L) цепи антитела.
На Фиг. 8 приведены результаты вестерн-блот анализа растительных экстрактов из листьев N.benthamiana, агроинъецированных бинарными векторами рА16571 и рА16671. Разделение в 12% ПААГ. Дорожки: 1 - интактный лист (отрицательный контроль); 2 - листья, инъецированные бинарными векторами, кодирующими легкую (рА11866) и тяжелую цепь (рА11903) антитела трастузумаб под контролем 35S-промотора; 3 - листья, инъецированные бинарными векторами рА16571 и рА16671; +K - 120 нг трастузумаба в случае L цепи, 60 нг трастузумаба в случае H цепи (положительный контроль). Зоны, соответствующие легкой и тяжелой цепи, отмечены * Слева: вестерн-блот с антителами против легкой каппа-цепи иммуноглобулина G человека. Справа: вестерн-блот с антителами против тяжелой гамма-цепи иммуноглобулина G человека.
На Фиг. 9 приведены результаты анализа аффинности рекомбинантных моноклональных антител против домена димеризации HER2/neu, продуцированных в растении, к антигену HER2/neu на поверхности клеток SKBR-3 по данным проточной цитометрии. Клетки инкубировались с антителами в указанных по оси абсцисс концентрациях от 0,01 до 100 мкг/мл. По оси ординат - процент связавшихся с антителами клеток.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение представляет собой способ продукции в клетках растения функционально активного моноклонального антитела против домена димеризации HER2/neu. Гены, кодирующие тяжелую и легкую цепи MA против домена димеризации онкогена HER2/neu, могут быть экспрессированы в клетке растения с получением полностью функционального антитела, специфически связывающегося с HER2/neu как in vitro, так и in vivo.
Описанный в изобретении способ предполагает создание экспрессионных векторов, направляющих в клетке растения синтез тяжелой (Н) и легкой (L) цепи антитела, введение указанных векторов в клетки растения с последующим культивированием в условиях, обеспечивающих совместную экспрессию в растительной клетке генов тяжелой и легкой цепи MA с последующей сборкой полноразмерного MA.
Для продукции MA в растительной клетке могут быть созданы как неамплифицирующиеся (см. Пример 2) экспрессионные векторы, так и амплифицирующиеся, на основе геномов вирусов растений (см. Пример 4). Экспрессионные векторы содержат транскрипционную кассету (промотор и терминатор транскрипции), узнаваемую ДНК-зависимой РНК полимеразой растительной клетки. В качестве промотора и терминатора могут быть использованы как последовательности из генома растений, так и из генома бактерий (например, агробактерий) или вирусов (например, ВМЦК) растений (см. Фиг. 1, 2 Примера 2, Фиг. 4, 5 Примера 4). При создании экспрессионных амплифицирующихся векторов - векторов на основе геномов вирусов растений - необходимо учитывать тот факт, что продукция легкой и тяжелой цепи MA в одной и той же клетке возможна при условии отсутствия конкуренции между вирусами, геномы которых использованы. Наши эксперименты показывают, что ВТМ и ХВК не только не конкурируют между собой, но ХВК даже стимулирует репродукцию ВТМ. Анализ механизмов репродукции синдбис-подобных фитовирусов показывает, что конкуренция между ними происходит на стадии формирования так называемых вирусных «фабрик», когда вирусная репликаза локализуется на мембранах эндоплазматического ретикулума. ВТМ и ХВК не конкурируют между собой на стадии формирования репликативного комплекса и вирусной «фабрики». Вирус желтой мозаики турнепса (ВЖМТ), формирующий вирусную «фабрику» на мембранах хлоропластов, также не конкурирует с ВТМ и ХВК и поэтому может быть использован в комбинации с ВТМ или ХВК для синтеза антитела.
Согласно изобретению, нуклеотидные последовательности, кодирующие легкую и тяжелую цепи MA, могут быть получены на основе аминокислотной последовательности с помощью инструмента «обратной трансляции» параллельно с проведением оптимизации кодонового состава с учетом частоты встречаемости тех или иных кодонов в тех растениях, которые в дальнейшем будут использованы для продукции MA.
Для осуществления эффективного процессинга и сборки MA аминокислотная последовательность каждой из цепей антитела должна содержать сигнальный пептид, направляющий белки через эндоплазматический ретикулум в апопласт. В отсутствие сигнальных пептидов MA в растительной клетке собираться не будет. Можно использовать как одинаковые, так и разные сигнальные пептиды для легкой и тяжелой цепи с целью определения наиболее оптимального сочетания (см. Пример 3).
В контексте настоящего изобретения экспрессионные векторы, кодирующие легкую и тяжелую цепи антитела против домена димеризации онкогена HER2/neu, могут быть созданы на основе бинарного вектора pCambia1300 или pBIN19 (см. Пример 2 и 4). Эти плазмиды обеспечивают возможность использования Agrobacterium tumefaciens для доставки генетического материала в клетки растения.
Для экспрессии чужеродного гена в листовой ткани можно использовать метод агроинфильтрации и агроинокуляции. Трансформация растительных клеток может быть стабильной, сопровождающейся интеграцией вводимой ДНК в клеточный геном, или же временной, когда ДНК, содержащая целевой ген, находится в виде эписомы, т.е. интеграции ДНК в хозяйский геном не происходит. Временная, или транзиентная, экспрессия чужеродных генов в растительной клетке позволяет получить более высокий выход целевого белка в короткие сроки (3-14 дней). Более того, экспрессия целевых генов наблюдается через 3 часа после отправки ДНК, а уже между 18 и 48 часами достигает максимума и сохраняется на протяжении 10 дней. Очевидными преимуществами использования такой растительной «фабрики» являются простота в обращении, скорость, низкая себестоимость конечного продукта, высокий уровень продуцируемого белка, масштабируемость и возможность контроля процесса синтеза белка (Makhzoum et al., 2014).
Настоящее изобретение подразумевает предпочтительное использование транзиентной экспрессии генов легкой и тяжелой цепей MA и осуществление доставки экспрессионных векторов с помощью агроинокуляции или вакуумной агроинфильтрации.
Важным и решающим преимуществом настоящего изобретения, является то, что описываемая система синтеза антитела против онкогена HER2/neu в растении может обеспечивать высокий уровень продукции целевого белка при небольших затратах и в короткие сроки: уже на 3 день после агроинъекции нереплицирующимися векторами, содержащими ген легкой и тяжелой цепи MA, в листьях N.benthamiana накапливается до 50-80 мг/кг антител (см. Фиг. 6 Примера 6). Наши эксперименты показывают, что по результатам ИФА выход антител при использовании амплифицирующихся векторов в несколько раз больше - 250-500 мг/кг листовой массы (2.5-5% от суммарного растворимого белка клетки). С помощью аффинной хроматографии на колонке с протеином G или А можно получить чистый препарат MA против домена димеризации HER2/neu (Фиг. 7).
Выделенные из растительного материала MA обладают способностью связывать HER2/neu на поверхности клеток SK-BR-3, что показано с помощью проточной цитометрии (Фиг. 9).
Продуцированные и выделенные из растений MA против домена димеризации HER2/neu являются полностью функционально активными. На мышах с перевитой опухолью РМЖ человека - клетки SK-BR-3 - была подтверждена эффективность полученных в растениях антител. Продемонстрировано подавление роста опухоли при использовании комбинации двух моноклональных антител, продуцированных в растении - фитотрастузумаб и MA против домена димеризации HER2/neu, причем эффективность этой комбинации, по крайней мере, в два раза выше, чем одного фитотрастузумаба. Сравнение с группой фитотрастузумаба показало достоверный почти двукратный терапевтический выигрыш. Таким образом, антираковое антитело против домена димеризации HER2/neu, полученное в растительной клетке, является функционально активным, что продемонстрировано как в системе in vitro, так и in vivo, при этом по нашим оценкам себестоимость препарата MA, полученного в клетке растения, может быть в 10-20 раз ниже стоимости аналогичного препарата, полученного из животных клеток.
Не менее существенным преимуществом данного изобретения является то, что на протяжении всего цикла получения MA из растительной клетки не используются какие-либо материалы животного происхождения, что гарантирует отсутствие вирусов или их генетического материала, прионов и прочих инфекционных агентов в получаемом продукте.
Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения.
Данное изобретение подробно проиллюстрировано ниже со ссылками на конкретные примеры, представляющие собой его наиболее предпочтительные воплощения.
Пример 1. Получение нуклеотидной последовательности, кодирующей легкую и тяжелую антитела, направленного против домена димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu, предназначенной для экспрессии в клетках растения рода Nicotiana.
Нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую и тяжелую антитела, направленного против домена димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu, предназначенной для экспрессии в клетках растения рода Nicotiana получали на основе опубликованной в драгбанке (DrugBank accession number DB06366) аминокислотной последовательности антитела, направленного против домена димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/ с помощью инструмента «обратной трансляции» с одновременной оптимизацией кодонового состава для экспрессии в растениях рода Nicotiana (http://www.entelechon.de/2008/10/backtranslation-tool/). К каждой последовательности с N-конца была добавлена аминокислотная последовательность сигнального пептида тяжелой цепи антител Р01749 (HVM05_MOUSE) Mus musculus. Аминокислотная последовательность тяжелой или легкой цепи вводилась в соответствующее поле сервиса «обратная трансляция», затем устанавливались следующие параметры: стандартный генетический код; таблица частоты использования кодонов для рода Nicotiana с включенным условием использования наиболее часто встречающихся кодонов; в качестве нежелательных мотивов были указаны сайты узнавания рестриктазами NcoI, XhoI, которые в дальнейшем использовались для получения генноинженерных конструкций. Выведенные нуклеотидные последовательности, кодирующие легкую и тяжелую цепь антитела, направленного против домена димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu, предназначенные для экспресии в клетках растения рода Nicotiana представлены в (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2) соответственно. По заказу авторов эти последовательности были синтезированы ЗАО «Евроген», каждая из них была вставлена в вектор pAL-TA (Евроген, Россия), причем на 5'-конце каждой из последовательностей был добавлен сайт узнавания рестриктазой NcoI, а на 3'-конце - XhoI. В результате были получены конструкции pAL-L и pAL-H, содержащие нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую и тяжелую цепь антитела против домена димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu, соответственно.
Пример 2. Создание экспрессионных неамплифицирующихся векторов для продукции антитела против домена димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu в растении Nicotiana.
Для получения экспрессионных неамплифицирующихся векторов для продукции антитела против домена димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu в растении Nicotiana использовали имеющиеся в распоряжении авторов настоящего изобретения бинарный вектор на основе pCambia 1300 (Cambia, Австралия) содержащий в качестве транскрипционного промотора конститутивный (Arce et al., 2008) транскрипционный промотор. В одном из вариантов рекомбинантного экспрессионного вектора согласно изобретению использовали конститутивный транскрипционный промотор 35S вируса мозаики цветной капусты. В другом варианте рекомбинантного экспрессионного вектора согласно изобретению использовали конститутивный транскрипционный промотор гена актин 2 Arabidopsis thaliana В качестве терминатора транскрипции использовали 35S-терминатор вируса мозаики цветной капусты или nos-терминатор Agrobacterium tumefaciens. Между последовательностью промотора и терминатора была помещена последовательность, кодирующая легкую (SEQ ID NO: 1) или тяжелую (SEQ ID NO: 2) цепь антитела против домена димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu.
Для получения экспрессионных неамплифицирующихся векторов в плазмиды на основе pCambia 1300 (Cambia, Австралия), содержащие 358-промотор и 358-терминатор транскрипции, по сайтам рестрикции NcoI-SalI из плазмид pAL-L и pAL-H были перенесены фланкированные сайтами NcoI-XhoI последовательности, кодирующие легкую и тяжелую цепь антитела против домена димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu, соответственно.
В результате были получены экспрессионные неамплифицирующиеся векторы: рА16571, содержащий ген легкой цепи антитела (SEQ ID NO: 1) (Фиг. 1), и рА16671, содержащий ген тяжелой цепи антитела (SEQ ID NO: 2) (Фиг. 2), продуцирующие легкую и тяжелую цепь антитела против домена димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu в растении Nicotiana. соответственно.
Пример 3. Определение оптимальной сигнальной последовательности для доставки цепей антител в апопласт
Для определения наиболее эффективной сигнальной последовательности для доставки цепей антител в апопласт проводили сравнение нескольких сигнальных последовательностей (Табл. 1).
Для этого ЗАО «Евроген» по заказу авторов были синтезированы последовательности, кодирующие легкую или тяжелую цепь антитела против домена димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu, содержащие с 5'-конца последовательности, кодирующие приведенные в таблице 1 сигналы апопластной локализации. Для получения экспрессионных неамплифицирующихся векторов в плазмиду на основе pCambia 1300 (Cambia, Австралия), содержащую 35S-промотор и 358-терминатор транскрипции, обработанную рестриктазами NcoI/SalI из плазмид, содержащих последовательности, кодирующие сигнальный пептид и легкую или тяжелую цепь антитела против домена димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu, были перенесены фланкированные сайтами NcoI-XhoI последовательности, кодирующие сигнальный пептид и легкую или тяжелую цепь антитела против домена димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu.
В результате были получены экспрессионные неамплифицирующиеся векторы, перечисленные в таблице 1.
Растения Nicotiana benthamiana совместно инфильтрировали полученными векторами в следующих комбинациях: 1. pA-L-cyt + pA-H-cyt; 2. pA-L-pec + рА-Н-рес; 3. pA-L-cal + pA-H-cal; 4. pA-L-iaa + pA-H-iaa; 5. pA-L-ea2 + pA-H-ea2; 6. pA-L-aa + pA-H-aa; 7. pA-L-abp + pA-H-abp; 8,9. pA16571 + pA16671. Затем через 5, 7 и 9 дней после инфильтрации собирали растительный материал, получали экстракт суммарного растворимого белка и аликвоту наносили на 7.5% полиакриламидный геле (ПААГ) в отсутствие бета-меркаптоэтанола. Электрофоретический анализ белков в денатурирующем ПААГ проводили в соответствии с методом Лэммли (Laemmli, 1970) по следующей схеме. К препарату, содержащему анализируемый белок, добавляли 2-3 объема буфера для нанесения на ПААГ, содержащего 60% глицерин, 10% ДСН, 1% бромфеноловый синий и 0,25 M Трис-HCl, рН 6,8, после чего пробу прогревали 3-10 мин при 95°С. Электрофорез проводили в ПААГ в приборе фирмы "Bio-Rad". Верхний (концентрирующий) гель с рН 6,8 содержал 3% акриламид, 0,08% Ν,Ν'-метиленбисакриламид, 0,125 M Трис-HCl и 0,1% ДСН. Нижний (разделяющий) гель с рН 8,8 содержал 7,5% или 12% акриламид и 0,075 или 0,12% Ν,Ν'-метиленбисакриламида соответственно, 0,4 M Трис-HCl и 0,1% ДСН. Пробы вносили в лунки верхнего геля. В качестве стандартов молекулярной массы использовали наборы маркерных белков фирм ThermoScientific (10-250 кДа). Электрофорез проводили в приборе фирмы "Bio-Rad" в трис-глициновом буфере, рН 8,4 (25 мМ Трис, 0,192 M глицин, 0,1% ДСН) при постоянном токе 10 мА на гель в приборе фирмы "Bio-Rad". Гель окрашивали Кумасси G-250 в течение 20 мин, затем отмывали. На Фигуре 3 приведены результаты электрофореза растительных экстрактов в невосстанавливающих условиях (в отсутствие β-меркаптоэтанола) в 7,5% полиакриламидном геле с последующей окраской Кумасси.
Для оценки эффективности работы разных сигнальных последовательностей сравнивали уровень накопления антител в растительном экстракте с помощью иммуноферментного анализа, измеряя количество тотального иммуноглобулина человека. Для этого использовали набор для определения концентрации иммуноглобулинов «IgG общий-ИФА-БЕСТ» (Вектор-Бест, Россия) согласно инструкции производителя. Как следует из результатов, приведенных на Фиг. 3, наиболее оптимальным оказался вариант последовательности, содержащей сигнальный пептид тяжелой цепи антител мыши, т.к. уровень накопления антитела в растительной клетке мы оценили как 65-75 мкг/мл растительного экстракта, для других же сигнальных пептидов этот уровень колеблется от 20 до 50 мкг/мл.
Пример 4. Создание экспрессионных вирусных амплифицирующихся векторов для продукции антитела против домена димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu в растении.
Для получения экспрессионных амплифицирующихся векторов для продукции антитела против домена димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu в растении Nicotiana использовали векторы на основе генома X вируса картофеля (ХВК) и на основе генома вируса табачной мозаики (ВТМ). Вектор на основе ХВК содержал 35S транскрипционный промотор вируса мозаики цветной капусты, 5'-НТО ХВК, ген репликазы, первый субгеномный промотор, ген легкой цепи (SEQ ID NO: 1) и 3'-НТО ХВК. Вектор на основе ВТМ содержал эукариотический транскрипционный промотор актина 2 A.thaliana (EMBL AF308778 (An et al., 1996), обеспечивающий синтез репликазы; ген репликазы крВТМ, содержащий 8 интронов и часть последовательности гена транспортного белка крВТМ, ген тяжелой цепи (SEQ ID NO: 2) и 3'-нетранслируемую область (НТО) крВТМ.
Для получения экспрессионного амплифицирующегося вектора на основе ХВК была создана промежуточная конструкция (ПК) 1. В плазмиду pGEM3Z (Promega), обработанную рестриктазами HindIII и SacI, были вставлены следующие фрагменты: фрагмент 1 (с 3452 нт по 4485 нт геном ХВК), фланкированный сайтами узнавания рестриктаз HindIII и XbaI, содержал часть гена полимеразы ХВК и участок субгеномного промотора, фрагмент 2 представлял собой ген легкой цепи с внесенными сайтами XbaI, BamHI и NcoI на 5'-конце и XhoI на 3'- конце, фрагментом 3 (с 6380 по 6552 нт генома ХВК), имеющим XhoI и SacI сайты на 5'- и 3'-конце, являлся 3'-концевой участок гена белка оболочки с частью 3'-нетранслируемой области. В результате была получена ПК1. Затем плазмиду PVXdt-GFP (Komarova et al., 2006) обработали рестриктазами AvrII-XhoI и перенесли в нее фрагмент из ПК1 по тем же сайтам. В результате получена плазмида pA16921 (Фиг. 4), несущая последовательность гена легкой цепи антитела (SEQ ID NO: 1) в составе вектора на основе генома ХВК.
Для создания вектора на основе генома вируса табачной мозаики (ВТМ) (Фиг. 5) была использована кДНК ВТМ крестоцветных (Dorokhov YuL et al., 1994), в которой ген репликазы был привнесен из близкородственного вирусного штамма - вируса просветления жилок турнепса (Lartey et al., 1994). Вирусный вектор, содержащий ген тяжелой цепи антитела против Her2/neu на основе генома крВТМ был создан через ряд промежуточных конструкций. Получение ПК2. Фрагмент, фланкированный сайтами EcoRI-BamHI, из плазмиды BTM(и):GFP (Комарова и др., 2012) был перенесен в pGEM3Z (Promega), в результате была создана ПК2. Для получения ПК3 в ПК2 ген GFP был заменен на ген тяжелой цепи (SEQ ID NO: 2) по сайтам NcoI-XhoI. Затем из ПК3 фрагмент, содержащий часть гена транспортного белка крВТМ, ген тяжелой цепи и 3'-нетранслируемую область из генома крВТМ, был перенесен в плазмиду BTM(h):GFP (Комарова и др., 2012) по сайтам EcoRI-BamHI. В результате была получена конструкция рА16722 (Фиг. 5).
В результате были получены экспрессионные амплифицирующиеся векторы: рА16921, содержащий ген легкой цепи антитела (SEQ ID NO: 1) (Фиг. 4), и рА16722, содержащий ген тяжелой цепи антитела (SEQ ID NO: 2) (Фиг. 5), продуцирующие легкую и тяжелую цепь антитела против домена димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu в растении Nicotiana соответственно.
Пример 5. Продуцирование антитела, направленного против домена димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu в растении Nicotiana.
Для получения растения Nicotiana, продуцирующего антитела, направленного против домена димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu полученными плазмидами рА16571 и рА16671 или рА16921 и рА16722 трансформировали клетки Agrobacterium tumefaciens. после чего осуществляли агроинфильтрацию листьев суспензией трансформированных клеток.
2
Для этого выращивали полученные штаммы A.tumefaciens в ночной культуре в жидкой среде LB. Ночную культуру выращивали в течение 18 часов при 28°С, затем разводили в 10-100 раз буфером для агроинфильтрации, содержащем 10 мМ MgCl и 10 мМ MES рН 5,0. В лист вводили суспензию смеси A.tumefaciens, содержащей плазмиды, соответствующие нереплицирующимся векторам, pA16571 (Фиг. 1) и рА16671 (Фиг. 2), или реплицирующимся векторам, pA16921 (Фиг. 3) и pA16722 (Фиг. 4). Агроинфильтрацию осуществляли с помощью шприца без иглы или путем погружения растения в суспензию агробактерий с последующим созданием вакуума. При одновременной ко-инъекции векторами, кодирующими легкую и тяжелую цепь антитела, в листьях N.benthamiana синтезируются легкая (SEQ ID NO: 3) и тяжелая цепи антитела (SEQ ID NO: 4), содержащие сигнальный пептид, обеспечивающий секрецию и сборку антитела.
Пример 6. Получение и очистка антитела, направленного против домена димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu.
Антитела, направленные против домена димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu, выделяли из растительного экстракта листьев, инфильтрированных агробактерией, несущей пары плазмид рА16571 и рА16671 или рА16921 и рА16722. Для этого растительный материал, замороженный в жидком азоте, растирали до состояния пудры. К нему добавляли 4-6 объемов буфера для экстракции (200 мМ цитрат натрия, 0.1% Tween 20, 5 мМ ЭДТА, рН 6.0). Суспензию инкубировали на льду при покачивании в течение 20-30 мин, после чего центрифугировали 5000 g × 15 мин. К осадку добавляли 2 объема буфера для экстракции и проводили повторную инкубацию на льду при покачивании в течение 20-30 мин, центрифугировали при 5000 g × 15 мин. Объединенный супернатант фильтровали через Miracloth, затем центрифугировали при 15000 g × 25 мин.
Растительные экстракты анализировали с помощью электрофореза в невосстанавливающих условиях (в отсутствие β-меркаптоэтанола) в 7,5% полиакриламидном геле с последующей окраской Кумасси.
Как следует из результатов, приведенных на Фигуре 6, в листьях N.benthamiana через 3 дня после агроинъекции нереплицирующимися векторами, рА16571 и рА16671 накапливаются полноразмерные антитела против онкогена Her2/neu. Подобный профиль мы наблюдаем и в экстрактах растений, агроинъецированных амплифицирующимися вирусными векторами, рА16722 и pA16921. Для оценки выхода антител использовали набор для определения концентрации иммуноглобулинов «IgG общий-ИФА-БЕСТ» (Вектор-Бест, Россия) согласно инструкции производителя. По результатам ИФА выход антител с амплифицирующихся векторов возрастает в несколько раз по сравнению с неамплифицирующимися векторами и составляет от 250 до 500 мг с кг листовой массы.
2
4
2
4
2
4
2
4
На следующем этапе растительный экстракт последовательно фильтровали через фильтры Millipore с диаметрами пор, начиная с 0,8 мкм, заканчивая 0,25 мкм и наносили на колонку с протеин А сефарозой, уравновешенной буфером, содержащем 10 мМ NaHPO, 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ NaHPO, рН 8,5. Оптимальная скорость - 1 мл/мин. Экстракт наносили на колонку 2-4 раза для улучшения связывания. После нанесения, колонка промывается однократным натрий-фосфатным буфер (PBS), а затем 10 мМ Na-фосфатным буфером, рН 6.0. Элюцию осуществляли 10 мМ NaHPO, рН 3, с немедленной нейтрализацией 0,4 M NaHPO. Для дальнейшей очистки и для удаления вирусов, ДНК и эндотоксинов была использована фильтрация «Sartobind Q нано» мембрана (Sartorius Stedim Biotech).
На Фигуре 7 представлены результаты электрофореза белков, элюированных с колонки с протеин-A сефарозой.
Для вестерн-блот анализа белков проводили их перенос на мембрану Hybond-Р (GE Healthcare) в буфере для переноса (47,9 мМ Трис, 38,6 мМ глицин) под действием электрического тока 150 мА в течение 2 часов. Мембраны затем инкубировали с блокирующим раствором (5% обезжиренное молоко) на 1x TBS-t (1x TBS, 0,1% Tween-20), после чего проводили инкубацию с антителами к гамма (тяжелой)-цепи или каппа (легкой)-цепи. Проявка осуществлялась системой ECL (GE Healthcare). Время экспозиции мембран с рентгеновской пленкой составляло 10-60 мин.
На Фигуре 7 представлены результаты вестерн-блот анализа растительных экстрактов листьев, инфильтрированных агробактерией, несущей плазмиды рА16571 и рА16671, с использованием антител, специфических к легкой (каппа) или тяжелой (гамма) цепи человеческих иммуноглобулинов G. Электрофоретическое разделение белков проведено в восстанавливающих условиях (в присутствии β-меркаптоэтанола). Результаты экспериментов показывают, что из 1 кг листьев N.benthamiana, агроинъецированных вирусными векторами, рА16722 (Фиг. 4) и рА16921 (Фиг. 5) можно выделить до 300-500 мг очищенных антител. В результате определения биосинтетической активностью листьев различного возраста и яруса растений N.benthamiana было выявлено, что максимального выхода 500 мг антител на 1 кг листьев удается достичь при 7-дневной инфекции и, прежде всего, в листьях 3-4 яруса растений.
Результаты препаративной очистки на колонке с протеин G сефарозой (Фиг. 6) и последующего анализа методом иммуноблота со специфическими антителами против иммуноглобулина G человека (Фиг. 7) показывают существенное накопление в трансформированном растении N.benthamiana легкой и тяжелой цепей антитела против домена димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu.
Для биологических экспериментов препарат антител в концентрации 1 мг/мл в растворе 10 мМ фосфатного буфера, рН 7,0 хранили в стерильных условиях в холодильнике при температуре 4°С.
Пример 7. Взаимодействие антитела против домена димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu, продуцированного в растении N.benthamiana с раковыми клетками SK-BR-3.
5
Аффинность рекомбинантных моноклональных антител против домена димеризации HER2/neu, продуцированных в растении, к антигену HER2/neu на поверхности клеток SK-BR-3, проводили с помощью проточной цитометрии. Для этого из каждой лунки 96-ячеечной платы было собрано 5×10 клеток SKBR-3. Клетки промывал дважды 1xPBS и далее инкубировали в течение 30 мин при 4°С с рекомбинантными моноклональными антителами против домена димеризации HER2/neu, продуцированными в растении. Клетки затем три раза промывали 1xPBS, после чего инкубировали в PBS с добавлением 0,1% БСА, содержащем конъюгированные с FITC иммуноглобулины, специфичные к человеческому IgG. Клетки инкубировали с антителами в концентрациях от 0,01 до 100 мкг/мл с последующей оценкой доли связавшихся с антителами клеток. Каждое разведение антител было протестировано в трех повторностях. Результаты приведены на Фиг. 9. Как следует из приведенных результатов, антитело, полученное в N.benthamiana, является полностью функциональным и способно специфически узнавать онкобелок HER2/neu на поверхности опухолевых клеток SK-BR-3, характеризующихся повышенным уровнем экспрессии онкогена HER2/neu.
Пример 8. Подавление роста HER2/neu позитивных опухолей у мышей с подкожными ксенографтами рака молочной железы человека SK-BR-3 при использовании комбинации двух антител против HER2/neu, продуцированных в растении.
Для этой работы было проведено разведение и содержание в бестимусном отсеке половозрелых мышей-самок Balb/c nude для трансплантации опухолевого материала. Мышей содержали в специализированном бестимусном отсеке (зона SPF) в макролоновых клетках с твердым основанием, аксессуарами и аэросистемой (бумажный фильтр, бутылка внутри, Cage Type II - Hood of open design) фирмы EHRET GNBA (Германия) со свободным доступом к воде. Для разведения и содержания мышей использованы:
- подстилка из бумаги ГОСТ 8273-75 (пищевая), нарезанной с помощью бумагорезательной машины BLS-272 и шреддера Kobra 240 S4 (Германия) и стерилизованная в стерилизаторе для бумаги ВК75-01;
- экструзированный гранулированного корма («МЭСТ», РФ) соответствующей пищевой ценности для разведения и содержания мышей, стерилизованный в сухожаровом шкафу;
- питьевая вода, стерилизованная в сухожаровом шкафу.
В день начала опыта всех мышей взвешивали на электронных весах MW-T series, User's Manual (фирма CAS, США), цена деления 0,01 г под контролем стандартной динамики прироста массы тела. Для введения в эксперимент мышей перед началом лечения делили на группы по 10 особей. После завершения экспериментов мышей умерщвляли передозировкой эфирного наркоза в соответствии с методами гуманного обращения в лабораторными животными, принятыми в РФ и за рубежом.
5
Получение донорского прививочного материала включало выполнение двух пассажей клеток SK-BR-3 на бестимусных мышах. Использовали штамм перевиваемого рака молочной железы человека SK-BR-3 из Коллекции штаммов опухолей человека РОНЦ им. Н.Н. Блохина. Перевиваемый рак молочной железы человека SK-BR-3 представляет собой аденокарциному, содержащую на своей поверхности до 8×10 рецепторов HER2/neu на клетку. Использованная в данном исследовании культура клеток также была проверена на наличие экспрессии поверхностного антигена Her2/neu методом цитофлюорометрии. Эта линия клеток формирует подкожные ксенографты у nude мышей и отличается отсутствием рецепторов эстрогенных и прогестероновых гормонов. В связи с этим, для ее трансплантации и роста не требуется создания гормонального фона, резко сниженного у мышей nude
3
Для получения мышей-ксенографтов взвесь опухоли размораживали после хранения стандартным методом, затем содержимое каждой ампулы имплантировать мышам подкожно по 0,5 мл (3 млн клеток на мышь в 0,1 мл питательной среды) на мышь. Полученные опухолевые узлы (1-й пассаж, n=5) были использованы в качестве донорского материала для трансплантации. Инокулят для опыта готовили по стандартной методике и трансплантировали по 60 мг взвеси на мышь (2-й пассаж, n=20). На 6-е сутки после трансплантации, когда опухолевые узлы появляются у всех мышей (100% прививаемость), измеряли объемы опухолей, после чего животных ранжировали на 2 группы (контроль и опыт) по 10 мышей так, чтобы средний объем опухолей в каждой из групп составил 41±15,5 мм. Группа контроля не получала специфического лечения, животным проводили внутрибрюшинные инъекции физиологического раствора в режиме, аналогичном исследуемому агенту.
Другая контрольная группа получала лечение Фитотрастузумабом. Опытная группа получала лечение при совместном введении фитотрастузумаба и антитела против домена димеризации (АПДД) HER2/neu, которое начинали вводить на 5 сутки после трансплантации внутрибрюшинно курсом по аналогичной фитотрастузумабу схеме: 1-я инъекция в дозе 20 мг/кг, остальные 8 инъекций через 48 часов в разовой дозе 10 мг/кг. Длительность курса лечения - 16 дней, курсовая доза - 100 мг/кг. Таким образом, введение АПДД HER2/neu совместно с Фитотрастузумабом осуществляли внутрибрюшинно одновременно всем мышам последовательно на 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 и 21 сутки после трансплантации опухоли. Противоопухолевый эффект оценивали по общепринятому показателю торможению роста опухоли (ТРО). Для вычисления показателя ТРО с помощью электронного измерителя многократно в процессе и после лечения измеряли опухолевые узлы и рассчитывали средние объемы (Vcp) в каждой группе. Для контроля стандартности опухолевой модели в процессе роста определяли скорость роста опухолевых узлов по соотношению средних объемов к исходному (Vt/Vo). Статистическая обработка полученных данных проведена с использованием доверительных интервалов средних сравниваемых величин, рассчитанных по стандартному методу Стьюдента в модификации Р.Б. Стрелкова. Достоверными считаются различия при р≤0,05. Наблюдение проводили в течение 30-ти дней после трансплантации опухолей, после чего животных умертвляли передозировкой эфирного наркоза в рамках правил гуманного обращения с лабораторными животными. Результаты одновременного использования двух антител против онкобелка HER2/neu, продуцированных в растении, представлены в таблице 2.
3
3
3
t1-3
0
Видно, что без лечения на 22, 28 и 31 дни после имплантации опухоль достигает средних объемов Vcp=704±137 мм, 1083±218 мм и 1410±384 мм. На эти сроки (10 дней) кратность увеличения опухолей составила, соответственно V/V=20,7-31,9-41,5. За весь период роста в группе КРО опухолевые узлы увеличились боле чем в 40 раз.
В основной группе, получившей сочетание Фитотрастузумаб и АПДД Her2/neu, средний объем и кратность увеличения опухоли на все сроки после окончания лечения были достоверно меньше контрольных.
Из таблицы 2 видно, что наиболее эффективное достоверное (р<0,05) подавление роста опухоли наблюдается при использовании комбинации двух моноклональных антител, продуцированных в растении - фитотрастузумаб и АПДД HER2/neu, причем эффективность этой комбинации по крайней мере в два раза выше, чем одного фитотрастузумаба. Сравнение с группой Фитотрастузумаба показало достоверный почти двукратный терапевтический выигрыш. Соответственно, показатели эффективности по срокам измерения составили в группе с сочетанием Фитотрастузумаба + АПДД Her2/neu против группы Фитотрастузумаба (Таблица 3):
Т/С=21, 35 и 41% (р<0,05) против Т/С=45 и 59 (р<0,05);
t1-3
0
t1-3
0
V/V=4,2-11,2-16,9 против V/V=9,3-18,9-27,7.
Переносимость лечения во всех группах мышей была удовлетворительной. Состояние и поведение мышей было в пределах физиологической нормы, гибели от токсичности не отмечали.
Таким образом, вышеописанные примеры иллюстрируют разработанный авторами способ продукции в растительной клетке MA против домена димеризации HER2/neu, позволяющий получать функционально активный препарат MA против РМЖ для использования в комплексной терапии.
Конкретные гены, векторы, виды растений, применения, используемые материалы и методы, описанные здесь, относятся к предпочтительным вариантам осуществления, приведены в качестве примеров и не предназначены для ограничения объема данного изобретения. При изучении этого описания другие объекты, аспекты и воплощения будут приходить в голову специалистам в данной области, и они охватываются рамками данного изобретения. Специалистам в данной области будет понятно, что различные замены и модификации могут быть произведены в отношении описанного здесь изобретения без отклонения от его объема и рамок, которые определяются прилагаемой формулой изобретения.
Цитированная литература
Комарова Т.В., Шеваль Е.В., Поздышев Д.В., Колесникова B.C., Дорохов Ю.Л. (2012).
Интенсивный синтез зеленого флуоресцирующего белка ведет к формированию
Y-тел включения в растительной клетке. Биохимия, 77, №6, 742-749. Ahmed, S., Sami, Α., Xiang, J., 2015. HER2-directed therapy: current treatment options for
HER2-positive breast cancer. Breast Cancer Tokyo Jpn. doi: 10.1007/s12282-015-0587-x
An, Y.Q., McDowell, J.M., Huang, S., McKinney, E.C., Chambliss, S., Meagher, R.B., 1996.
Strong, constitutive expression of the Arabidopsis ACT2/ACT8 actin subclass in vegetative tissues. Plant J. Cell Mol. Biol. 10, 107-121.
Arce, A.L., Cabello, J.V., Chan, R.L., 2008. Patents on plant transcription factors. Recent Pat. Biotechnol. 2, 209-217.
Barthélémy, P., Leblanc, J., Wendling, F., Wissler, M.-P., Bergerat, J.-P., 2014. Pertuzumab and solid tumors: perspectives. Bull. Cancer (Paris) 101, 1114-1121. doi:10.1684/bdc.2014.2026
Chung, C., Lam, M.S.H., 2013. Pertuzumab for the treatment of human epidermal growth factor receptor type 2-positive metastatic breast cancer. Am. J. Health-Syst. Pharm. AJHP Off. J. Am. Soc. Health-Syst. Pharm. 70, 1579-1587. doi:10.2146/ajhpl20735
Dorokhov YuL, null, Ivanov, P.A., Novikov, V.K., Agranovsky, A.A., Morozov SYu, null, Efimov, V.A., Casper, R., Atabekov, J.G., 1994. Complete nucleotide sequence and genome organization of a tobamovirus infecting cruciferae plants. FEBS Lett. 350, 5-8.
Fleck, L.M., 2006. The costs of caring: Who pays? Who profits? Who panders? Hastings Cent. Rep. 36, 13-17.
Giritch, Α., Marillonnet, S., Engler, C, van Eldik, G., Botterman, J., Klimyuk, V., Gleba, Y., 2006. Rapid high-yield expression of full-size IgG antibodies in plants coinfected with noncompeting viral vectors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 14701-14706. doi: 10.1073/pnas.0606631103
Harries, M, Smith, I., 2002. The development and clinical use of trastuzumab (Herceptin). Endocr. Relat. Cancer 9, 75-85.
Hudis, C.A., 2007. Trastuzumab-mechanism of action and use in clinical practice. N. Engl. J. Med. 357, 39-51. doi:10.1056/NEJMra043186
Hudziak, R.M., Lewis, G.D., Winget, M., Fendly, B.M., Shepard, H.M., Ullrich, Α., 1989. p185HER2 monoclonal antibody has antiproliferative effects in vitro and sensitizes human breast tumor cells to tumor necrosis factor. Mol. Cell. Biol. 9, 1165-1172.
Hu, S., Sun, Y., Meng, Y., Wang, X., Yang, W., Fu, W., Guo, H., Qian, W., Hou, S., Li, В., Rao, Z., Lou, Z., Guo, Y., 2014. Molecular architecture of the ErbB2 extracellular domain homodimer. Oncotarget.
Kawajiri, H., Takashima, T., Kashiwagi, S., Noda, S., Onoda, N., Hirakawa, K., 2015. Pertuzumab in combination with trastuzumab and docetaxel for HER2-positive metastatic breast cancer. Expert Rev. Anticancer Ther. 15, 17-26. doi:10.1586/14737140.2015.992418
Komarova, T.V., Baschieri, S., Donini, M., Marusic, C., Benvenuto, E., Dorokhov, Y.L., 2010. Transient expression systems for plant-derived biopharmaceuticals. Expert Rev. Vaccines 9, 859-876. doi:10.1586/erv.10.85
Komarova, T.V., Kosorukov, V.S., Frolova, O.Y., Petrunia, I.V., Skrypnik, K.A., Gleba, Y.Y., Dorokhov, Y.L., 2011. Plant-made trastuzumab (herceptin) inhibits HER2/Neu+ cell proliferation and retards tumor growth. PloS One 6, e17541. doi:10.1371/journal.pone.0017541
Komarova, T.V., Skulachev, M.V., Zvereva, A.S., Schwartz, A.M., Dorokhov, Y.L., Atabekov, J.G., 2006. New viral vector for efficient production of target proteins in plants. Biochem. Biokhimii€a 71, 846-850.
Laemmli, U.K., 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227, 680-685.
Lartey, R.T., Lane, L.C., Melcher, U., 1994. Electron microscopic and molecular characterization of turnip vein-clearing virus. Arch. Virol. 138, 287-298.
Macedo, Α., Monteiro, I., Andrade, S., Cirrincione, Α., Ray, J., 2010. [Cost-effectiveness of trastuzumab in the treatment of early stages breast cancer patients, in Portugal]. Acta Médica Port. 23, 475-482.
Makhzoum, Α., Benyammi, R., Moustafa, K., Trémouillaux-Guiller, J., 2014. Recent advances on host plants and expression cassettes' structure and function in plant molecular pharming. BioDrugs Clin. Immunother. Biopharm. Gene Ther. 28, 145-159. doi:10.1007/s40259-013-0062-1
Peake, B.F., Nahta, R., 2014. Resistance to HER2-targeted therapies: a potential role for FOXM1. Breast Cancer Manag. 3, 423-431. doi:10.2217/bmt.14.33
Rimawi, M.F., Schiff, R., Osborne, C.K., 2015. Targeting HER2 for the Treatment of Breast Cancer. Annu. Rev. Med. 66, 111-128. dor.10.1146/annurev-med-042513-015127
WHO Position Paper on Mammography Screening, 2014., WHO Guidelines Approved by the Guidelines Review Committee. World Health Organization, Geneva.