СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛОВЫХ ПРОДУКТОВ МИДИИ MYTILUS GALLOPROVINCIALIS LAM
METHOD FOR PRODUCING REPRODUCTIVE PRODUCTS OF MUSSELS MYTILUS GALLOPROVINCIALIS LAM

Изобретение относится к биотехнологии и конхиокультуре и предназначено для повышения эффективности работы морских ферм, а также может быть применено для биохимических и физиологических исследований половых продуктов мидий М. galloprovincialis Lam. в период нереста с целью получения биологически активных веществ, используемых в отечественной медицине и фармацевтическом производстве.
Ранее отмечалось [1], что экономическая и экологическая эффективность работы морских ферм зависит от плодовитости выращиваемых моллюсков и качества посадочного материала. Успешность размножения культивируемых мидий обеспечивается не только количеством, но и качеством половых продуктов, которое может быть оценено по морфологическим, биохимическим и физиологическим показателям сперматозоидов и яйцеклеток [2, 3]. Однако решение этой задачи осложняется трудностью сбора необходимого материала и получения чистых суспензий половых клеток, поэтому количественный сбор и качественная очистка половых клеток от примесей представляют большой практический интерес.
Известный способ отбора половых продуктов мидий [8] заключается в сборе яйцеклеток на сите с размером ячеи 56 мкм. Но используя сито или газ невозможно собрать необходимое количество половых продуктов поскольку, если размеры яйцеклеток колеблются в диапазоне 50-80 мкм, то средний размер спермиев составляет 5 мкм, т.е. применение сита для сбора половых клеток самцов нецелесообразно. Недостатком является и то, что невозможно качественно, без примесей, получить суспензию половых клеток моллюсков.
Наиболее близким к заявляемому является способ отбора половых продуктов мидий [1], в котором осуществляют отбор мидий в морской среде, подготовку их к нересту, для чего очищают створки мидий и содержимое желудков. Затем проводят температурную стимуляцию нереста. От момента стимуляции начало нереста самцов происходит через 15 мин., у самок - через 20-30 мин. После нереста выполняют осаждение половых клеток и очищение полученных осадков от морской воды и биоотложений. Для этого используют многократное центрифугирование половых продуктов со скоростью 3000-3500 об./мин., при которой половые клетки хорошо концентрируются. Яйцеклетки, осевшие на дно емкости, отделяют от пробы воды и центрифугируют со скоростью 3000 об./мин. Суспензию сперматозоидов, активность которых сохраняется до 2 суток, поступают следующим образом. Вначале центрифугируют 2-3 раза по 10 мин. до получения прозрачного раствора над осадком. Затем надосадочную жидкость удаляют, осадок растворяют в небольшом количестве фильтрованной морской воды и переносят в другие пробирки, оставляя на дне 0,1-0,2 мл пробы, содержащей посторонние примеси. При центрифугировании на дно пробирки вместе с половыми клетками оседают примеси биоотложений моллюсков. Для получения чистой пробы половых продуктов суспензию клеток 4 раза переносят в чистые пробирки, оставляя на дне 0,05-0,1 мл пробы, содержащей примеси, и вновь центрифугируют при 3000 об./мин. На заключительном этапе воду над осадком максимально удаляют. Недостатком способа является то, что большое количество половых продуктов теряется при осаждении и очистке и затруднительно получить на выходе достаточное количество половых клетки даже в условиях промышленного производства.
Задачей изобретения «Способ получения половых продуктов мидии Mytilus galloprovincialis Lam.» является увеличение количества отбираемых половых клеток, а также получение чистых суспензий сперматозоидов и яйцеклеток черноморских мидий.
Техническим результатом изобретения является количественный отбор чистых половых продуктов мидий: яйцеклеток и сперматозоидов, что повышает эффективность биохимических и физиологических исследований для мидийных ферм. Кроме того, количественный отбор чистых половых продуктов мидий позволяет использовать их как сырье для получения биологически активных веществ, используемых в отечественной медицине и фармацевтическом производстве.
Технический результат изобретения достигается тем, что в способе отбора половых продуктов мидии Mytilus galloprovincialis выполняют сбор мидий, подготовку к нересту и температурную стимуляцию нереста, предусматривающую помещение отдельных экземпляров мидий в емкости с фильтрованной водой температурой 18-20°С с поддержанием температуры в течение нереста, а также осаждение половых продуктов и их очищение от биоотложений и морской воды. Для осаждения и очищения половые продукты четырежды центрифугируют со скоростью 3000 об./мин., каждый раз помещая в чистые пробирки. Для яйцеклеток проводят центрифугирование со скоростью 3000 об./мин., а для сперматозоидов центрифугирование проводят 3 раза по 10 мин со скоростью 3500 об./мин. и один раз со скоростью 3000 об./мин. Дополнительно водится новая операция количественного отбора половых продуктов после нереста мидий, для чего яйцеклетки пропускают дважды через газ-сито с диаметром ячей 112 мкм и 56 мкм соответственно, а сперматозоиды пропускают дважды через газ-сито с диаметром ячеи 56 мкм.
Общими операциями с прототипом являются подготовка мидий к нересту, температурная стимуляция и осаждение половых продуктов путем многократного центрифугирования со скоростью 3000-3500 об./мин, а также очищение от примесей и биоотложений 4-кратным центрифугированием.
Новым по сравнению с прототипом является дополнительная операция количественного отбора половых продуктов, которую проводят перед осаждением и очищением яйцеклеток и сперматозоидов, позволяющая сконцентрировать яйцеклетки на сите, отчистить материал от фекалий и получить максимальное количество половых клеток при массовом нересте черноморских мидий. Новым является повышение качества очистки, т.к. очищение сперматозоидов проводят в два этапа, когда пробу трижды центрифугируют со скоростью 3500 об./мин. по 10 мин, а затем со скоростью 3000 об./мин.
Пример реализации способа.
Подготовка к нересту. Отбор проб мидий проводили в феврале и апреле. Моллюсков с длиной створки от 5 до 7 см в возрасте 2-х лет отбирали с фермы, расположенной в б. Ласпи, с глубины 2 м. Пол и стадию зрелости гонад моллюсков определяли по 6-ти бальной шкале на мазке гонад с помощью микроскопа МБИ-6 [5]. Нерест моллюсков, проходящих 5-ю стадию репродуктивного цикла, вызывали по методике температурной стимуляции нереста [4]. Всего проанализировано 109 моллюсков.
После извлечения из морской воды мидий очищали от обрастаний и тщательно промывали фильтрованной морской водой. Моллюсков выдерживали в фильтрованной морской воде в течение 12 часов (с полной сменой воды через 6 часов) для освобождения желудков от содержимого. В весенне-зимний период температура морской воды, в среднем, составляла 10-12°С, в осенний - 20°С.При этом, во время осеннего нереста, моллюсков, после освобождения желудков от содержимого, помещали на 2 часа в холодильник при температуре 5°С.
воды
Нерест. Для стимуляции нереста мидий рассаживали по 1 экз. в пластмассовые стаканы емкостью 0,5 л с фильтрованной водой (t=18-20°С), поддерживая выбранную температуру в течение эксперимента. В течение нереста выделяемые моллюсками фекалии удаляли из сосудов при помощи дозатора. У самцов начало нереста отмечалось через 15 мин. от момента стимуляции, у самок - через 20-30 мин. Общая продолжительность нереста в условиях эксперимента составляла в среднем 4-6 часов. Выметанные яйцеклетки сразу оседали на дно, образовывая желто-оранжевый осадок, подвижные сперматозоиды оставались во взвешенном состоянии, образуя суспензию бело-кремового цвета. Чтобы исключить попадание в пробы гермафродитных особей, осуществляли контроль однородности полученных проб на мазке суспензии ПП под микроскопом. По окончании эксперимента мидий извлекали из стаканов и возвращали на мидийную ферму.
Количественный отбор яйцеклеток и сперматозоидов мидий. Для количественного отбора половых клеток, их отбирали на сито и промывали фильтрованной морской водой. Морскую воду фильтровали через ядерные мембраны с диаметром пор 1 мкм. Суспензию яйцеклеток переносили в чистый стакан, объемом 0,5 литров содержащий 200 мл фильтрованной воды. Для первой промывки использовали газ с диаметром ячеи 112 мкм, пропуская через него яйцеклетки в стакан с фильтрованной водой, при этом фекалии оставались на газе. На втором этапе яйцеклетки промывали через газ диаметром ячеи 56 мкм, яйцеклетки с небольшим количеством воды оставались на сите, далее их переносили в центрифужные пробирки (V=15 мл). Суспензию сперматозоидов дважды промывали фильтрованной морской водой объемом 200 мл, пропуская через газ диаметром ячеи 56 мкм. Фекалии оставались на сите, а спермин переходили в чистую воду. Затем половые клетки переносили в центрифужные стаканы (V=200 мл).
Осаждение половых клеток, очищение от морской воды и фекальных пеллет.
Для получения чистого материала применяли многократное центрифугирование. Яйцеклетки центрифугировали при скорости 3000 об./мин., вследствие чего половые клетки хорошо концентрировались, оболочка клеток не разрушалась и содержимое не переходило в раствор.
Скорости центрифугирования установлены авторами экспериментально, путем многократного исследования состава проб под микроскопом.
Поскольку сперматозоиды довольно подвижны и практически не оседают на дно сосуда, всю суспензию, полученную за время нереста, центрифугировали в стаканах (V=200 мл) при скорости 3500 об./мин. 3 раза по 10 минут до получения прозрачного раствора над осадком. Надосадочную жидкость удаляли, осадок суспензировали в небольшом количестве фильтрованной морской воды и переносили в пробирки (V=15 мл), оставляя на дне 0,1-0,2 мл пробы, содержащей посторонние примеси и вновь центрифугировали при 3000 об./мин.
При центрифугировании на дно пробирки вместе с половыми клетками оседали примеси фекалий моллюсков. Для получения чистых проб ПП суспензии клеток 4 раза переносили в чистые пробирки, оставляя на дне 0,05 -0,1 мл пробы, содержащей примеси. На заключительном этапе воду над осадком ПП максимально удаляли при помощи дозатора. В результате получали чистые однородные пробы живых клеток - сперматозоидов и яйцеклеток.
Масса половых продуктов, полученных от одной самки, достигала 360 мг сухого веса, у самцов - 70 мг сухого веса. Заявляемое изобретение было апробировано при выполнении исследований биохимического состава сперматозоидов и яйцеклеток мидий [1, 6, 7].
Литературные источники, принятые во внимание:
1. Караванцева Н.В., Поспелова Н.В., Бобко Н.И., Нехорошев М.В. Методика отбора половых продуктов мидии Mytilus galloprovincialis Lam. Системы контроля окружающей среды. - Севастополь, 2012. - Вып. 17. - С. 184-187.
2. Пиркова А.В. Размножение мидии Mytilus galloprovincialis Lam. и элементы биотехнологии ее культивирования: автореф. дисс. на соискание учен, степени канд. биол. наук: спец. 03.00.18 «Гидробиология» / А.В. Пиркова. - Севастополь, 1994. - 25 с.
3. Cosson J., Groison A. - L., Suquet M. et al. Studying sperm motility in marine fish: an overview on the state of the art // J. Appl. Ichthyol. - 2008. - No 24. - P. 460-486.
4. Newel R., Thompson R. Reduced clearance rates associated with spawning in the mussel, Mytilus edulis (L) (Bivalvia, Mytilidae) / R. Newel, R. Thompson // Mar. Biol. Lett. - 1984. - Vol. 5, №1. - P. 21-23.
5. Пиркова A.B., Столбова H.T., Ладыгина Л.В. Сезонная динамика нереста мидии Mytilus galloprovincialis Lam. в иловых поселениях разных районах Черного моря // Гидробиол. журн. - 1994. - 30, №2. - С.22 - 27.
6. Караванцева Н.В. Половая структура мидий Mytilus galloprovincialis (Lam.) обитающих у берегов Крыма // Экология моря. -2009. - Вып. 77. - С. 57-61.
7. Иванов В.К, Караванцева Н.В., Нехорошев М.В. Содержание липидов и каротиноидов в выметанных половых продуктах черноморской Mytilus galloprovincialis Lam. // Мор. экол. журн. - 2009. - Т. 4, №1. - С. 84.
8. Холодов В.И. Выращивание мидий и устриц в Черном море /В.И. Холодов, А.В. Пиркова., Л.В Ладыгина / под ред. В.Н. Еремеева // Национальная академия наук Украины, Институт биологии южных морей им. А.О. Ковалевского. - Севастополь. - 2010. - 424 с.