КОМБИНАЦИИ АНТАГОНИСТОВ PD-1 И ЦИКЛИЧЕСКИХ ДИНУКЛЕОТИДНЫХ АГОНИСТОВ STING ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАКА

1. Способ получения последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность, которая кодирует элемент тяжелой цепи (элемент HC) вариабельной области тяжелой цепи антитела (HCVR) и элемент легкой цепи (элемент LC) вариабельной области легкой цепи антитела (LCVR), и где HCVR и LCVR совпадают, где способ включает:
a) получение выделенного продуцирующего реакционного участка, который содержит:
i) нить тяжелой цепи (HC), где нить HC представляет собой нить двухцепочечной кДНК тяжелой цепи (дц кДНК HC), содержащую сегмент, который кодирует элемент HC из HCVR от клетки; и
ii) нить легкой цепи (LC), где нить LC представляет собой нить двухцепочечной кДНК легкой цепи (дц кДНК LC), содержащую сегмент, который кодирует элемент LC из LCVR от клетки, и
b) ковалентное связывание нити HC с нитью LC,
где выделенный продуцирующий реакционный участок не содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую HCVR или LCVR из клетки, отличной от определенной клетки,
тем самым получая последовательность нуклеиновой кислоты.
2. Способ по п. 1, в котором элемент HC содержит, или состоит из, последовательность вариабельной области тяжелой цепи (HCVRS) или ее антигенсвязывающий фрагмент.
3. Способ по п. 1 или 2, в котором элемент LC содержит, или состоит из, последовательность вариабельной области легкой цепи (LCVRS) или ее антигенсвязывающий фрагмент.
4. Способ по любому из пп. 1-3, в котором последовательность нуклеиновой кислоты выполнена с такой возможностью, что, когда экспрессируют, элемент HC и элемент LC образуют функциональную антигенсвязывающую молекулу in vitro, ex vivo или in vivo.
5. Способ по любому из пп. 1-4, в котором получение выделенного продуцирующего реакционного участка включает:
a) получение захватывающей подложки, связанной с:
(i) первой двухцепочечной кДНК (дц кДНК), содержащей нить, которая комплементарна первой мРНК, которая кодирует HCVR из клетки; и
(ii) второй дц кДНК, содержащей нить, комплементарную второй мРНК, кодирующей LCVR из клетки, чтобы получать нагруженную захватывающую подложку, и
b) поддержание выделенного продуцирующего реакционного участка в условиях, которые допускают амплификацию первой и второй дц кДНК, чтобы получать:
множество дц кДНК HC, содержащих сегмент, который кодирует элемент HC из HCVR от клетки; и
множество дц кДНК LC, содержащих сегмент, который кодирует элемент LC из LCVR от клетки.
6. Способ по любому из пп. 1-5, в котором захватывающая подложка содержит бусину и фрагмент, который связывается с кДНК.
7. Способ по любому из пп. 1-6, в котором выделенный продуцирующий реакционный участок содержит смесь реактивов, подходящих для получения, из первой и второй мРНК, первой дц кДНК, содержащей сегмент, который кодирует элемент HC из HCVR клетки, и второй дц кДНК, содержащей сегмент, который кодирует элемент LC из LCVR клетки.
8. Способ по любому из пп. 5-7, в котором первую и вторую дц кДНК амплифицируют в присутствии праймеров, где по меньшей мере один из праймеров содержит первый элемент, второй элемент и модификацию нуклеотида между первым и вторым элементами, где модификация нуклеотида снижает синтез ДНК.
9. Способ по п. 8, в котором модификация нуклеотида включает инсерцию спейсера между двумя смежными нуклеотидами или модификацию в рибозу.
10. Способ по п. 8 или 9, где первый элемент способен к отжигу со вторым элементом в том же праймере или другом праймере, образуя двухцепочечную структуру, содержащую дуплексную область из 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, больше пар оснований.
11. Способ по любому из пп. 8-10, в котором по меньшей мере один из праймеров является фосфорилированным и содержит последовательность, кодирующую по меньшей мере часть линкерной последовательности, или ее комплементарную последовательность.
12. Способ по любому из пп. 1-11, в котором дц кДНК HC содержит 5'-свисающий конец и тупой конец и дц кДНК LC содержит 5'-свисающий конец и тупой конец.
13. Способ по любому из пп. 1-12, в котором нить HC и нить LC ковалентно связывают для получения одноцепочечной последовательности нуклеиновой кислоты, где нити HC и LC обе представляют собой смысловые цепи или обе представляют собой антисмысловые цепи.
14. Способ по любому из пп. 1-13, в котором ковалентное связывание происходит в выделенном реакционном участке связывания, содержащем лигазу.
15. Способ по любому из пп. 1-14, в котором нить HC и нить LC ковалентно связывают в присутствии олигонуклеотидного шунта, где олигонуклеотидный шунт гибридизуют с последовательностью, содержащей сочленение нити HC и нити LC, чтобы формировать дуплексную область в участке связи.
16. Способ по п. 15, в котором олигонуклеотидный шунт содержит модификацию, которая ингибирует синтез ДНК.
17. Способ по любому из пп. 1-16, который дополнительно включает, перед получением выделенного продуцирующего реакционного участка, получение нагруженной мРНК захватывающей подложки, включающее:
a) получение выделенного клеточного реакционного участка, который содержит:
i) клетку; и
ii) захватывающую подложку, способную к связыванию первой мРНК, кодирующей HCVR из клетки, и второй мРНК, кодирующей LCVR из клетки; и
b) поддержание выделенного клеточного реакционного участка в условиях, которые допускают лизис клетки и связывание захватывающей подложки с первой мРНК и второй мРНК для того, чтобы формировать нагруженную мРНК захватывающую подложку,
где выделенный клеточный реакционный участок не содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую HCVR или LCVR из клетки, отличной от определенной клетки.
18. Способ по п. 17, который дополнительно включает высвобождение нагруженной мРНК захватывающей подложки из выделенного клеточного реакционного участка в присутствии поли(dA) или поли(dT) олигонуклеотида.
19. Способ по любому из пп. 1-18, который дополнительно включает амплификацию последовательности нуклеиновой кислоты.
20. Способ по любому из пп. 1-19, который дополнительно включает секвенирование всей или части последовательности нуклеиновой кислоты.
21. Способ по любому из пп. 1-20, который дополнительно включает встраивание всей или части последовательности нуклеиновой кислоты в вектор.
22. Способ по любому из пп. 1-21, который включает экспрессию последовательности нуклеиновой кислоты для получения полипептида, содержащего сегмент, который кодирует элемент HC из HCVR, и сегмент, который кодирует элемент LC из LCVR.
23. Способ по п. 22, который дополнительно включает приведение в контакт полипептида с антигеном и определение, если полипептид связывает антиген.
24. Способ получения библиотеки, содержащей множество уникальных элементов, способ включает:
получение множества элементов способом по любому из пп. 1-23,
где каждый из элементов содержит последовательность, которая кодирует элемент тяжелой цепи (элемент HC) вариабельной области тяжелой цепи (HCVR) и элемент легкой цепи (элемент LC) вариабельной области легкой цепи (LCVR), где HCVR и LCVR совпадают и где каждая уникальная последовательность нуклеиновой кислоты из множества содержит элемент HC и элемент LC из другой уникальной клетки,
тем самым получая библиотеку.
25. Способ по п. 24, в котором библиотека имеет одно, два, три или все из следующих свойств:
4
5
6
7
8
9
a) множество уникальных элементов содержит по меньшей мере 10, 10, 10, 10, 10 или 10 уникальных элементов;
4
9
4
8
4
7
4
6
4
5
8
9
7
9
6
9
5
9
5
8
6
7
4
5
5
6
6
7
7
8
8
9
b) множество уникальных элементов содержит от 10 до 10, от 10 до 10, от 10 до 10, от 10 до 10, от 10 до 10, от 10 до 10, от 10 до 10, от 10 до 10, от 10 до 10, от 10 до 10, от 10 до 10, от 10 до 10, от 10 до 10, от 10 до 10, от 10 до 10 или от 10 до 10 уникальных элементов;
c) по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% элементов в библиотеке представляют собой уникальные элементы; или
d) меньше чем 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% или 1% элементов в библиотеке представляют собой уникальные элементы.
26. Библиотека, полученная способом по п. 25.
27. Библиотека по п. 26, где библиотека представляет собой библиотеку дисплея.
28. Способ получения связывающего полипептида, способ включает:
a) получение библиотеки по п. 26 или 27; и
b) экспрессию полипептида, кодируемого уникальной нуклеиновой кислотой из библиотеки.
29. Способ по п. 28, который дополнительно включает приведение в контакт полипептида с антигеном и получение нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид, который связывает антиген.
30. Способ получения последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность, которая кодирует элемент α-цепи (элемент AC) вариабельной области α-цепи (ACVR) T-клеточного рецептора (TCR) и элемент β-цепи (элемент BC) вариабельной области β-цепи TCR (BCVR), и где ACVR и BCVR совпадают, способ включает:
a) получение выделенного продуцирующего реакционного участка, содержащего:
i) нить α-цепи (AC), где нить AC представляет собой нить двухцепочечной кДНК α-цепи (дц кДНК AC), содержащую сегмент, который кодирует элемент AC из ACVR от клетки; и
ii) нить β-цепи (BC), где нить BC представляет собой нить двухцепочечной кДНК β-цепи (дц кДНК BC), содержащую сегмент, который кодирует элемент BC из BCVR от клетки, и
b) ковалентное связывание нити AC с нитью BC,
где выделенный продуцирующий реакционный участок не содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую BCVR или ACVR из клетки, отличной от определенной клетки,
тем самым получая последовательность нуклеиновой кислоты.
31. Способ по п. 30, в котором последовательность нуклеиновой кислоты выполнена с такой возможностью, что, когда экспрессируют, элемент AC и элемент BC образуют функциональную антигенсвязывающую молекулу.
32. Способ по п. 31, в котором ковалентное связывание происходит в выделенном реакционном участке связывания, содержащем лигазу.
33. Способ получения библиотеки, содержащей множество уникальных элементов, способ включает:
получение множества элементов способом по любому из пп. 30-32,
где каждый из элементов содержит последовательность, которая кодирует элемент α-цепи (элемент AC) вариабельной области α-цепи (ACVR) и элемент β-цепи (элемент BC) вариабельной области β-цепи (BCVR), где ACVR и BCVR совпадают и где каждая уникальная последовательность нуклеиновой кислоты из множества содержит элемент AC и элемент BC из другой уникальной клетки,
тем самым получая библиотеку.
34. Библиотека, полученная способом по п. 33.
35. Способ получения связывающего полипептида, способ включает:
a) получение библиотеки по п. 34; и
b) экспрессию полипептида, кодируемого уникальной нуклеиновой кислотой из библиотеки.
36. Способ получения последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность, которая кодирует элемент γ-цепи (элемент GC) вариабельной области γ-цепи TCR (GCVR) и элемент δ-цепи (элемент DC) вариабельной области δ-цепи TCR (DCVR), и где GCVR и DCVR совпадают, способ включает:
a) получение выделенного продуцирующего реакционного участка, который содержит:
i) нить γ-цепи (GC), где нить GC представляет собой нить двухцепочечной кДНК γ-цепи (дц кДНК GC), содержащую сегмент, который кодирует элемент GC из GCVR от клетки; и
ii) нить δ-цепи (DC), где нить DC представляет собой нить двухцепочечной кДНК δ-цепи (дц кДНК DC), содержащую сегмент, который кодирует элемент DC из DCVR от клетки, и
b) ковалентное связывание нити GC с нитью DC,
где выделенный продуцирующий реакционный участок не содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую DCVR или GCVR из клетки, отличной от определенной клетки,
тем самым получая последовательность нуклеиновой кислоты.
37. Способ по п. 36, в котором последовательность нуклеиновой кислоты выполнена с такой возможностью, что, когда экспрессируют, элемент GC и элемент DC образуют функциональную антигенсвязывающую молекулу.
38. Способ по п. 36 или 37, в котором ковалентное связывание происходит в выделенном реакционном участке связывания, содержащем лигазу.
39. Способ получения библиотеки, содержащей множество уникальных элементов, способ включает:
получение множества элементов способом по любому из пп. 36-38,
где каждый из элементов содержит последовательность, которая кодирует элемент γ-цепи (элемент GC) вариабельной области γ-цепи (GCVR) и элемент δ-цепи (элемент DC) вариабельной области δ-цепи (DCVR), где GCVR и DCVR совпадают и где каждая уникальная последовательность нуклеиновой кислоты из множества содержит элемент GC и элемент DC из другой уникальной клетки,
тем самым получая библиотеку.
40. Библиотека, полученная способом по п. 39.
41. Способ получения связывающего полипептида, способ включает:
a) получение библиотеки по п. 40; и
b) экспрессию полипептида, кодируемого уникальной нуклеиновой кислотой из библиотеки.
42. Выделенный продуцирующий реакционный участок, который содержит:
a) нить тяжелой цепи (HC), где нить HC представляет собой нить двухцепочечной кДНК тяжелой цепи (дц кДНК HC), содержащую сегмент, который кодирует элемент HC из HCVR от клетки; и
b) нить легкой цепи (LC), где нить LC представляет собой нить двухцепочечной кДНК легкой цепи (дц кДНК LC), содержащую сегмент, который кодирует элемент LC из LCVR от клетки,
c) праймер, содержащий первый элемент, второй элемент и модификацию нуклеотида между первым и вторым элементами, где модификация нуклеотида снижает синтез ДНК,
где HCVR и LCVR совпадают и где выделенный продуцирующий реакционный участок не содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую LCVR или HCVR из клетки, отличной от определенной клетки.
43. Выделенный продуцирующий реакционный участок по п. 42, где первый элемент способен к отжигу со вторым элементом в том же праймере или другом праймере, образуя двухцепочечную структуру, содержащую дуплексную область из 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, больше пар оснований.
44. Самоотжигающийся олигонуклеотид, содержащий первый элемент, второй элемент и спейсер, расположенный между первым и вторым элементами, где первый элемент способен к отжигу со вторым элементом в том же олигонуклеотиде или другом олигонуклеотиде, образуя структуру шпильки или двухцепочечную структуру, содержащую дуплексную область из 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, больше пар оснований.
45. Олигонуклеотид по п. 44, в котором спейсер представляет собой гибкий спейсер или PEG спейсер.
46. Выделенный реакционный участок связывания, который содержит:
a) нить тяжелой цепи (HC), где нить HC представляет собой нить двухцепочечной кДНК тяжелой цепи (дц кДНК HC), содержащую сегмент, который кодирует элемент HC из HCVR от клетки;
b) нить легкой цепи (LC), где нить LC представляет собой нить двухцепочечной кДНК легкой цепи (дц кДНК LC), содержащую сегмент, который кодирует элемент LC из LCVR от клетки; и
c) олигонуклеотидный шунт, который способен к гибридизации с последовательностью, содержащей сочленение нити HC и нити LC, чтобы формировать дуплексную область в участке связи,
где HCVR и LCVR совпадают, где нить HC и нить LC ковалентно связывают и где выделенный реакционный участок связывания не содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую HCVR или LCVR из клетки, отличной от определенной клетки,
47. Выделенный реакционный участок связывания по п. 46, дополнительно содержащий лигазу.