Лектиноподобные белки повилики: характеристика и биологическая активность

ЛЕКТИНОПОДОБНЫЕ БЕЛКИ ПОВИЛИКИ: ХАРАКТЕРИСТИКА

И БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ

Кахарова Камола А Азаматовна

Докторант лаб. биорегуляторов ИБОХ АН РУз, Ташкент

Хашимова Зайнат Саттаровна

Докт. биол. наук, с.н.с лаб. биорегуляторов ИБОХ АН РУз, Ташкент

Сагдиев Наиль Жадитович

Канд. хим. наук, зав. лаб. биорегуляторов ИБОХ АН РУз, Ташкент

АННОТАЦИЯ

Целью данной работы является изучение цитотоксической активности лектиноподобных гликопротеидов повилики.

Лектиноподобные белки (ЛПБ) были выделены из семян повилики путем экстракции солевым раствором с последующим ступенчатым высаливанием 20% и 50% сульфатом аммония и обозначены ЛПБ20 и ЛПБ50. Установлено, что наибольшую гемагглютинирующую активность проявляли фракции ЛПБ20 и ЛПБ50. В полученных нами фракциях изучена углеводная специфичность и показано, что специфичность к глюкозе и маннозе проявляет фракция ЛПБ50.

Цитотоксичность ЛПБ оценивали биохимически на перевиваемых клеточных культурах U937 и Акат (выведеная нами новая стабильная клеточная линия из перевиваемой опухоли Акатон -рак тонкой кишки мыши),с помощью MTT-метода, подсчета живых клеток и по высвобождению из клеток лактатдегидрогеназы.

На клеточной культуре U937 наибольшую цитотоксическую активность проявили суммарная фракция и фракции ЛПБ20 и ЛПБ50 - 100%, 86% и 93% при дозе белка 100 мкг/мл. На клетках Акат фракции ЛПБ20 и ЛПБ50 также проявили высокую цитотоксическую активность. Аналогичные результаты подавления роста клеток получены при подсчете клеток трипано-вым синим и по определению уровня активности ЛДГ.

Таким образом, нами выделены и охарактеризованы лектиноподобные белки из повилики (Cuscuta europea). Изучено цитотоксическая активность лектиноподобных гликопротеидов повилики. Установлено, что наибольшую цитотоксическую активность проявляют суммарная фракция лектиноподобных белков и фракции ЛПБ20 и ЛПБ50 по трем тестам, а именно по включению МТТ в клетки, по подсчету живых клеток и по уровню активности ЛДГ.

ABSTRACT

The aim of the present work was to study a cytotoxic activity of lectin-like glycoproteins of dodder.

Lectin-like proteins (LLP) were extracted from the dodder seeds with salt solution followed by step-by-step precipitation with 20 and 50% ammonia sulfate, and marked as LLP20 and LLP50. It was established the highest haemo-agglutinating activity of LLP20 and LLP50 amongst the obtained fractions. We have investigated a carbohydrate specificity of obtained fractions and find the specificity of fraction LLP50 to glucose and mannose [14].

LLP cytotoxicity was evaluated biochemically with MTT test, calculation of living cells and lactate dehydrogenase release [6] in interweave cell cultures U937 and Akat (our new stable cell line generated from Akaton interweave tumor of mice small intestine).

The total, LLP20 and LLP50 fractions at a dose of a protein 100 mkg/ml showed the highest cytotoxic activity, 100%, 86% and 93% accordingly, in U937 cell culture. In Akat, LLP20 and LLP50 were also highly potent. The same results were obtained with trypan blue cell calculation and lactate dehydrogenase release methods.

Thus, we have isolated and characterized the lectin-like glycoproteins of dodder (Cuscuta europea), and investigated their cytotoxic activity. The total fraction of lectin-like proteins, as well LLP20 and LLP50 fractions were the most active in three tests, namely MTT inclusion into cells, living cells calculation, and LDG activity.

Ключевые слова: повилика, лектиноподобные белки, цитотоксичность, культуры клеток U937, Акат, чувствительность, тест-система, МТТ-тест, ЛДГ.

Keywords: dodder, lectin-like proteins, cytotoxicity, U937 and Akat cell cultures, sensitivity, test-system, MTT test, LDG

В последние годы возрос интерес исследователей к рас- вещества гликозидподобной природы [1, 5, 6]. тениям-паразитам в составе которых определены различные Ранее нами была изучена канцеролитическая активность

цитотоксины [1]. Наиболее изучены цитотоксины белковой различных видов повилики, произрастающих в Централь-

природы активно подавляющие рост раковых клеток в куль- ной Азии. Получены экстракты из трех видов: Cuscuta

туре тканей, что во многом стимулирует исследователей к europea, Cuscuta lupuliformis, Cuscuta attenuate, паразитиру-

поиску новых источников их выделения [2,3]. ющих соответственно на луговых травах, на побегах ивы и

Одним из малоизученных объектов являются лектино- на фруктовых кустарниках. Установлено, что экстракты раз-

подобные белки паразитирующих растений. Интерес к рас- ных видов повилики оказались цитотоксичными в культуре

тениям паразитам рода Cuscuta объясняется тем, что они тканей (от 40-80% подавления роста опухолевых клеток ме-

используются для лечения различных форм опухолей [4]. С ланомы - рак кожи) [7]

другой стороны в последние годы появилось ряд сообщений Целью данной работы является изучение цитотоксиче-

по выделению и характеристики белков, а также активного ской активности лектиноподобных гликопротеидов повили-

химического начала из кускуты, названный авторами ку- ки.

скутные кислоты - А и Д, обнаружены противоопухолевые В качестве растительного сырья использовали семена

повилики (Cuscuta europea) произрастающие на луговых травах. Лектиноподобные белки (ЛПБ) были выделены из семян повилики путем экстракции солевым раствором с последующим ступенчатым высаливанием сульфатом аммония.

Для этого сухое сырье измельчали и переносили в фос-фатно солевой буфер (ФСБ), содержащий 0,14 М NaCl, рН 7.7. Экстрагировали 2 ч на магнитной мешалке. Экстракт центрифугировали и собранные после центрифугирования супернатант (суммарные белки) подвергали ступенчатому высаливанию сульфатом аммония: одну часть осаждали сульфатом аммония до конечной концентрации 20% и вторую часть - до 50%. Центрифугировали и полученные су-пернатанты, обозначенные нами С20 и С50 и осадки - ЛПБ20 и ЛПБ50, диализовали против дистиллированной воды. Содержание белка определяли по методу Лоури [8]. Содержание углеводов определяли антрон-сернокислотным методом. [9]. Гемагглютинирующую активность ЛПБ определяли с использованием 2% суспензии крови человека или кролика в 96U - образных иммунологических планшетах [10].

Установлено, что наибольшую гемагглютинирующую активность проявляли фракции ЛПБ20 и ЛПБ50. Углеводную специфичность определяли, как описано в работе Поспелова [10]. Показано, что специфичность к глюкозе и маннозе проявила фракция ЛПБ50.

Ранее нами показано цитотоксическое действие белков ЛПБ20 и ЛПБ50 на клетках Hela и В-16 [11].

В данной работе изучена цитотоксическая активность на

Действие клинических противооп

клетках П и А .

937 кат

Клеточная культура Акат выведена нами из перевиваемой опухоли Акатон (рак тонкой кишки мыши) для изучения биологически активных веществ, в том числе и противоопухолевых. Нами изучена чувствительность данной клеточной линии к действию некоторых клинических противоопухолевых препаратов разных классов: алкилирующие вещества (циклофосфан); антиметаболиты (метотрексат); противоопухолевые антибиотики (доксорубицин); вещества растительного происхождения (винбластин); синтетические противоопухолевые препараты - цисплатин.

Цитотоксический эффект препаратов оценивали МТТ - тестом. Для определения цитотоксического действия перевиваемую культуру клеток Акат рассевали в 96-луночные планшеты в количестве 20-30 тыс. клеток/мл в 100 мкл среды ЯРМ1 1640 с 10% сыворотки эмбриона теленка и культивировали при температуре 370С в СО2 - инкубаторе. Через сутки вводили вещества в концентрациях 100, 10 и 1 мкг/ мл на 100мкл среды, культивировали клетки в течение 24 часов и далее вводили в клетки МТТ [3-(4,5-диметилтиа-зол-2-ил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолиум бромид] для выявления живых клеток [12]. После часовой инкубации среду осторожно сливали, добавляли ДМСО и инкубировали 20 мин., затем измеряли оптическую плотность раствора при длине волны 620нм.

Результаты исследования действия клинических противоопухолевых препаратов на клеточную линию Акат представлены в таблице 1.

Таблица 1

олевых препаратов на клетки АКАТ

Дозы Препараты Процент подавления роста клеток, дозы мкг/мл.

100 10 1

Метотрексат 58 45 11

Винбластин 81 65 57

Доксорубицин 72 58 38

Циклофосфан 57 43 37

Цисплатин 96 82 63

Как следует из данных таблицы 1 стабильная клеточная линия АКАТ достаточно чувствительна к действию клинических препаратов различного механизма действия и может служит тест-системой для прескрининга широкого круга биологически активных веществ.

Цитотоксичность лектиноподобных белкв оценивали биохимически с помощью МТТ-метода, подсчета живых клеток и по высвобождению из клеток лактатдегидрогеназы [11,13]

Контролем служили клетки без воздействия веществ. Уровень активности ЛДГ в контрольных клетках брали 100%. Цисплатин взят нами в качестве положительного контроля, указывающего на чувствительность клеток к воздействию препаратов.

Данные, полученные на клетках и937 представлены в таблице 2

Таблица 2

Действие гликопротеидов Cuscuta europea на культуру клеток U

Доза, мкг/мкл Образцы Подавление включения МТТ в клетки, % Подавление роста клеток, % Активность ЛДГ, %

100 10 1 100 10 1 100 10 1

X фракция 100,0 31,0 17,0 98,0 35,0 17,0 24,0 6,0 4,0

С20 48,0 49,0 51,0 50,0 43,0 51,0 19,0 5,0 3,8

С50 49,0 51,0 42,0 52,0 49,0 40,0 14,5 6,5 3,0

ЛПБ20 86,0 64 61 80,0 60,0 59,0 24,5 7,8 4,6

ЛПБ50 93 76 53 95,0 70,0 46,0 23,0 7,5 4,2,

Цисплатин 100,0 96,0 45,0 97 88 34 25,0 23,4 3,9

Как видно из таблицы 2 наибольшую цитотоксическую активность проявляют суммарная фракция и фракции ЛПБ20 и ЛПБ50 - 100%, 86% и 93% при дозе белка 100 мкг/мл. Ана0 логичные результаты получены при подсчете клеток трипа-

Как видно из таблицы 3 фракции белков Cuscuta europea оказывает различное воздействие. Так, цитотоксическое действие на клетки оказывает суммарная фракция белка и фракции, полученные осаждением сульфатом аммония 20% и 50% - 100%, 89% и 96% при дозе белка 100 мкг/мл, соответственно. А также 60% цитотоксичность проявили фракция ЛПБ50 при дозе белка 10 мкг/мл. Аналогичные результаты подавления роста клеток получены при подсчете клеток трипановым синим и по определению уровня активности ЛДГ.

Таким образом, нами выделены и охарактеризованы лек-тиноподобные белки из повилики (Cuscuta europea). Изучено цитотоксическая активность и установлено, что наибольшую цитотоксическую активность проявляют суммарная фракция лектиноподобных белков и фракции ЛПБ20 и ЛПБ50 по трем тестам, а именно по включению МТТ в клетки, по подсчету живых клеток и по уровню активности ЛДГ.

Список литературы

1. Du X-Mkohinata K., Kawasaki T., Guo Y-T., Miyahara K., Phytochemistry, 1998, v. 48, p. 843-850

2. . Lord J.M. The use of cytotoxic plant lectins in cancer therapy. // Plant Physiol. 1987. V. 85. P. 1 -3.

3. Dwek B.A., Glycobiology: toward understanding the function of sugars // Chem. Rev. 1996. V. 96. P. 683-720

4. Федюшин М.П. Некоторые материалы к истории русской онкологии // Вопр. онкол., 1953, XXVI, 6, P. 278-

новым синим и по определению уровня активности ЛДГ.

Нами также изучена цитотоксическая активность на культуре клеток Акат (Таблица 3).

Таблица 3

287).

5. Anis E. et. al.Sterols and Sterol Glycosides from Cuscuta reflexa // Natural Product Sciences, 1999, N. 5 P. 124126

6. Zhelev ZH. D et. al., Isolation , partial characterization and complement inhibiting activity of a new glycoprotein from cuscuta euroea // BBRC, 1994, V. 202, P. 186-194

7. Мавлонов Г.Т., Убайдуллаева Х.А. и др., Исследование антираковых компонентов повилики Cuscuta I. // Труды международной конф., 2004, Алматы, стр.201-203.

8. Lowry O., Rosenbroung R., Parr A., Randall R.I. Protein measuremen with the folin phenol reagent // J. Biol. Chem. 1951. V. 193. P.265-269

9. Хашимова З.С., Мангутова Ю.С., Леонтьев В.Б. Структурно - функциональное изучение гликопротеидов хлопчатника // Химия природ. соедин. 1999. №. 3. С.376-384.

10. Поспелов С.В. Лектины представителей рода эхи-нацея (Echinacea mjench.). Методические аспекты оценки активности. // Химия растительного сырья 2012, № 3 С. 143148

11. Кахарова К.А.,Хашимова З.С., Сагдиев Н.Ж. Гли-копротеиды паразитирующих растений (Cuscuta Europea) // Труды межд. симпозиума Фундаментальные и прикладные проблемы науки,2014, т. 3, С. 122-128

12. Berridge MV, Herst PM , and Tan AS. Tetrazolium dyes as tools in cell biology: new insights into their cellular

Действие гликопротеидов Cuscuta europea на культуру клеток Ак

Доза, мкг/мкл Образцы, Подавление включения МТТ в клетки, % Подавление роста клеток, % Активность ЛДГ, %

100 10 1 100 10 1 100 10 1

X фракция 86,0 33,0 10,0 80,0 34,0 11,0 30,0 8,0 3,0

С20 35,0 15,0 8,0 33,0 17,0 5,0 26,0 5,0 4,0

С50 40,0 12,0 10,0 46,0 12,0 8,0 23,0 5,0 3,0

ЛПБ20 89,0 58,0 43,0 90,0 55,0 41,0 28,0 9,0 5,0

ЛПБ50 96,0 60,0 40,0 95,0 58,0 37,0 27,0 7,0 5,0

Цисплатин 98,0 85,0 35,0 97 59 34 26,0 22,0 5,0

reduction. Biotechnology Annual Review, 11: 127-152 (2005). ствии гепарина в условиях in vitro // Вестник Нижегородско-

13. Бочкарев А.В., Зимин Ю.В., Хомутов А.Е. Измене- го университета им. Н.И. Лобачевского, 2006, № 5, с. ние активности лактатдегидрогеназы печени крыс при дей- 86-88

УСИЛЕНИЕ ПРОТИВОСВЕРТЫВАЮЩИХ СВОЙСТВ ПЕПТИДОВ СЕМАКСА, ТАФЦИНА C PRO-GLY-PRO ПУТЕМ ИХ КОМПЛЕКСООБРАЗОВАНИЯ С ГЕПАРИНОМ

Ляпина Людмила Анисимовна

Проф., докт. биол. наук, кафедра физиологии человека и животных Биологического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова,

зав.лаб., Москва

Григорьева Марина Евгеньевна

Канд. биол.наук, вед.н.сотр. кафедры физиологии человека и животных Биологического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова, Москва

Оберган Тамара Юрьевна

Канд.биол.наук, ст.н.сотр. кафедры физиологии человека и животных Биологического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова, Москва

Майстренко Евгения Семеновна

Канд.биол.наук, ст.н.сотр. кафедры физиологии человека и животных Биологического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова, Москва

АННОТАЦИЯ

Цель - повысить антикоагулянтную активность пептидов семакса и тафцина с Pro-Gly-Pro. Использованы современные коагулологические методы исследования. Показано повышение антикоагулянтного действия пептидов встедствие создания их соединений с гепарином; продемонстрированы их защитные противосвертывающие эффекты на систему гемостаза в условиях in vitro и при внутривенном введении в организм здоровых животных (крыс). Делается вывод о способности комплексов олигопептидов с гепарином предупреждать процессы тромбообразования в организме при их угрозе.

ABSTRACT

Goal - increase the anticoagulant activity of the peptides Semax and taftsin with Pro-Gly-Pro. Coagulological modern methods used in research. Shown to increase the anticoagulant action of peptides due to their connections with heparin; anticoagulation demonstrated their protective effects on the hemostatic system in vitro and when administered intravenously in healthy animals (rats). The conclusion about the ability of complexes of oligopeptides with heparin to prevent thrombus formation process in the body when they are threatened.

Ключевые слова: регуляторные пролинсодержащие пептиды, система гемостаза, фибринолиз, гепарин.

Keywords: regulatory proline-containing peptides, the system of haemostasis, fibrinolysis, heparin.

Установлено, что последовательность Pro-Arg на С-кон-це природного лиганда крови - тетрапептида тафцина (Thr-Lys-Pro-Arg) обусловливает его антиполимеризационное действие в отношении фибрин-мономера [1] и способствует повышению антикоагулянтной активности плазмы крови [7]. Препарат Селанк (H-Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro-OH) - синтетический аналог природного тафцина с присоединенным трипептидом Pro-Gly-Pro обладает анксиолити-ческим действием и используется в основном при терапии генерализованного тревожного расстройства и неврастении [2]. Показано его ингибирующее действие на процессы гемостаза [11]. Синтетический препарат Семакс (H-Met-Gly-His-Phe-Pro-Gly-Pro-OH), также имеющий в своей структуре Pro-Gly-Pro, применяется в клинике в качестве ноотропного, нейропротективного и противоинсультного средства, поскольку он нормализует кровообращение мозга. В организме Семакс активирует противосвертывающую си-

стему, повышая антикоагулянтную и фибринолитическую активность крови и снижая агрегацию тромбоцитов [9]. Эти эффекты, однако, не проявляются в условиях in vitro, что связано с опосредованным действием препаратов на гемостаз.

Установлено, что каждый из пептидов способен действовать в кровотоке как самостоятельно, так и через взаимодействие с антикоагулянтом крови гепарином [4]. Одним из доказательств взаимодействия олигопептидов с гепарином служат экспериментальные данные, свидетельствующие о снижении уровня гепарина после появления в крови этих пептидов [3].

Спектр физиологического действия гепарина широк: он обладает антикоагулянтным, антилипемическим, ней-ропротективным и другими свойствами [4]. Благодаря своим структурным особенностям он способен образовывать комплексы со многими веществами. Комплексные соедине-