Этиологическая значимость условно патогенных энтеробактерий при острых кишечных заболеваниях и дисбиотических состояниях кишечника

Инфекция и иммунитет 2011, Т. 1, № 2, с. 181-184

Краткие сообщения

ЭТИОЛОГИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ УСЛОВНО ПАТОГЕННЫХ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ ПРИ ОСТРЫХ КИШЕЧНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ И ДИСБИОТИЧЕСКИХ СОСТОЯНИЯХ КИШЕЧНИКА

С.А. Егорова, М.А. Макарова, Л.А. Кафтырева

ФГУН«Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Пастера» Роспотребнадзора, Санкт-Петербург

Резюме. Проведена детекция факторов патогенности у 67 штаммов K. pneumonia, выделенных из фекалий. Определяли гены, кодирующие факторы вирулентности возбудителей кишечных инфекций (Shigella, Salmonella, Escherichia coli). Исследование показало, что штаммы Klebsiella не имеют генов, кодирующих: способность к адгезии (sfa, afa, aaf/1, eae), инвазии (ipaH, ial), продукции термолабильных (elt, LTII), термостабильных (st1, st2) и Шига-токсинов (stx1, stx2). Klebsiella spp. хорошо известны как возбудители оппортунистических инфекций мочевыводящих путей, крови, ран, дыхательных путей. В тоже время, этот микроорганизм не имеет факторов вирулентности диареегенных энтеробактерий и не способен вызывать диарею и другую патологию желудочно-кишечного тракта.

Ключевые слова: условно патогенные энтеробактерии, Klebsiella, факторы патогенности, острые кишечные заболевания.

OPPORTUNICTIC ENTEROBACTERIACAE AS THE CAUSE OF THE ACUTE DIARRHEA AND GUT DISBIOSIS

Egorova S.A., Makarova M.A., Kaftyreva L.A.

Abstract. Strains of Klebsiella pneumonia isolated from faces were studied to detect virulence factors of "classical" enteric pathogens causing acute diarrhea

Key words: opportunistic Enterobacteriaceae, Klebsiella, virulence factors, diarrhea.

Введение

В настоящее время вопрос об этиологической значимости условно патогенных энтеробактерий (УПЭ), включая Klebsiella spp, при возникновении острых кишечных заболеваний (ОКЗ) в нашей стране является спорным. Согласно

существующим нормативным документам (МУ № 11-33/6-40, Москва, 1987), диагностика ОКЗ, вызванных условно патогенными энтеробак-териями, включает идентификацию микроорганизма и количественную характеристику, выраженную в КОЕ/1,0 г испражнений. В тоже время известно, что УПЭ являются представи-

поступила в редакцию 09.03.2011 Адрес для переписки:

принята к печати 15.03.2011 Егорова Светлана Александровна, 197101, Санкт-Петербург, ул. Мира, 14,

к.м.н., старший научный сотрудник ФГУН НИИЭМ имени Пастера

лаборатории кишечных инфекций ФГУН Роспотребнадзора.

НИИЭМ имени Пастера Роспотребнадзора Тел.: (812) 232-48-83 (служебн.).

© Егорова С.А., Макарова М.А., Факс: (812) 232-92-17.

Кафтырева Л.А., 2011 E-mail: pasteur@LK14290.spb.edu

телями факультативной микрофлоры толстого кишечника и достаточно часто обнаруживались в значительном количестве в испражнениях практически здоровых людей, не имеющих каких-либо нарушений со стороны желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) [3, 4, 8, 9]. Согласно современным представлениям о патогенности бактериальных возбудителей ОКЗ, они должны иметь определенный набор факторов патоген-ности (специфических и неспецифических), обеспечивающих выживание, размножение и развитие патологического процесса в ЖКТ человека. Энтеробактерии как возбудители ОКЗ могут содержать различные факторы па-тогенности: адгезии, инвазии, персистенции, токсины и токсические продукты, бактериальные модулины, индуцирующие синтез цитоки-нов и медиаторов воспаления и др. [1]. Официально признанные патогенные энтеробактерии (Shigella, Salmonella, E. coli) имеют специфические факторы патогенности, определяющие патогенез ОКЗ. Так, Shigella и энтероинвазив-ные E. coli (ЭИКП) обладают способностью к внутриклеточной инвазии, энтеропатоген-ные E. coli (ЭПКП) вызывают изменение цито-скелета энтероцитов и слущивание кишечного эпителия, энтеротоксигенные E. coli (ЭТКП) продуцируют энтеротоксины, энтерогеморра-гические E. coli (ЭГКП) способны к продукции шига-подобных токсинов [12, 13, 16, 27]. Кроме специфических факторов, обуславливающих собственно специфический патологический процесс, патогенные энтеробактерии обладают набором неспецифических факторов, необходимых для адгезии и персистенции в организме хозяина [1]. По современным данным многие виды УПЭ могут обладать десятью и более факторами патогенности. Вероятно, с этим связано отсутствие нозологической специфичности вызываемых ими заболеваний, отличающее их от официально признанных патогенных микроорганизмов [5, 10]. УПЭ являются признанными возбудителями гнойно-воспалительных заболеваний (пневмоний, менингитов, конъюнктивитов, сепсиса, инфекций мочевыводя-щих путей [МВП]), в основном возникающих у пациентов, находящихся в стационарных условиях [2, 6, 7, 11, 18].

Важным направлением современных исследований является выявление ведущих факторов патогенности УПЭ и кодирующих их генов, оценка их влияния на развитие ОКЗ и дисбио-тических состояний кишечника, а также на выраженность клинических проявлений.

Целью данного исследования была детекция генов, кодирующих факторы патогенности, характерные для признанных возбудителей ОКЗ, у штаммов K. pneumoniae — УПЭ энтеробакте-рий, часто выделяющихся при бактериологическом исследовании испражнений.

Материалы и методы

Материалом исследования служили 67 штаммов K. pneumoniae, выделенных при бактериологическом исследовании испражнений пациентов, которые не имели признаков ОКЗ и предъявляли жалобы на различные дисбио-тические проявления со стороны ЖКТ: неоформленный стул, запоры, боли в животе, повышенное газообразование. Группу сравнения составили штаммы патогенных энтеробактерий (S. sonnei, E. coli О:124, E. coli О:148, E. coli О:142, E. coli О:157:Н7), выделенные от пациентов с выраженными клиническими проявлениями ОКЗ (синдромами колита или энтерита).

Наличие ведущих факторов патогенности у штаммов энтеробактерий изучали путем детекции кодирующих их генов методом ПЦР со специфическими праймерами. Выявляли гены, кодирующие адгезины (sfa, afa, aaf/1, eaeA), инвазины (ial, ipaH), продукцию термолабильного (elt1, elt2), термостабильного (st1, st2) и шига-подобного (stx1, stx2) токсинов. Использованные праймеры, а также соответствующие им температуры отжига, указаны в табл. 1. Выделение тотальной ДНК проводили с использованием набора реагентов InstaGene matrix (BioRad, Франция) согласно инструкции производителя. Амплификацию проводили согласно разработанным протоколам [16, 19] в DNAThermal Cycler (РТС-100, MJ Research, Inc.). Амплифицированные фрагменты идентифицировали путем электрофореза в 1,2% агароз-ном геле с добавлением бромистого этидия при 100 В в течение 45 мин и визуализировали в ультрафиолетовом свете при длине волны 200 нм. В качестве маркера молекулярного веса использовали DNA Ladder 100 bp (Fermentas, Латвия).

Результаты

Результаты исследования представлены в табл. 2. Молекулярно-генетическими методами нам не удалось обнаружить гены, кодирующие конкретные адгезины, присущие многим патогенным и УПЭ: S-пили, аггрегативно-адгезивные фимбрии, белок интимин, афим-бриальный адгезин. Также не были обнаружены генетические детерминанты, кодирующие инвазины, энтеротоксины и шига-подобные токсины, определяющие патогенез ОКЗ у «классических» возбудителей.

В то же время, в геноме классических энте-ропатогенов удалось подтвердить наличие генов, кодирующих ведущие факторы патогенно-сти. Так, у штаммов S. flexneri и S. sonnei, а также энтероинвазивных E. coli 0:124 идентифицированы гены, отвечающие за продукцию плаз-мидных и хромосомных факторов инвазии ipaH и ial. У штаммов E. coli 0157:Н7 выявлены гены факторов патогенности, по которым они относятся к группе энтерогеморрагических эшери-

2011, Т. 1, № 2

Этиологическая значимость условно патогенных энтеробактерий.

хий: гены шига-подобных токсинов (stxl и stx2) и eaeA ген, ответственный за синтез белка ин-тимина. Штаммы E. coli O:148, принадлежащие к группе энтеротоксигенных эшерихий, имели гены, ответственные за продукцию термолабильного и термостабильного энтеротоксинов (eltl, elt2 и stl, st2).

Обсуждение

Полученные нами данные подтверждают тот факт, что генетические маркеры, ассоциируе-

мые с патогенностью истинных возбудителей ОКЗ, обнаруживаются среди штаммов УПЭ достаточно редко. По данным отечественных авторов [1, 5, 10] около 10% штаммов УПЭ имеют следующие генетические детерминанты па-тогенности: ген sfa, гены МуА, ген ЫуБ, ген еп/1, определяющие способность к адгезии, гемолитическую активность и продукцию цитонекро-тического фактора. Все перечисленные факторы не являются специфическими и достаточными для того, чтобы обуславливать развитие патоло-

ТАБЛИЦА 1. ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ПРАЙМЕРЫ И СООТВЕТСТВУЮЩИЕ ИМ ТЕМПЕРАТУРЫ ОТЖИГА

Ген Название Нуклеотидная последовательность праймера Tm

afa AFA1 5'-GCTGGGCAG CAAACTGATAACTCTC -3' 65

AFA2 5'-CATCAAGCTGTTTGTTCGTCCGCCG-3'

sfa SFA1 5'-CTCCGGAGAACTGGGTGCATCTTAC-3' 65

SFA2 5'-CGGAGGAGTAATTACAAACCTGGCA-3'

aaf AAF1A 5'-G CGTTAGAAAGACCTCCAATA-3' 57

AAF1B 5'-GCCGGATCCTTAAAAATTAATTCCGGC-3'

eae FM1 5' - CATTATGGAACGGCAGAGGT-3' 57

RU4 5'-ATCTTCTGCGTACTGCGTTCA-3'

ial PR1 5'-CTGGATGGTATG GTGAGG-3' 70

PR2 5'-CCAGGC CAACAATTATTTC C-3'

ipaH IpaH14a 5'-GTTCCTTGACCGCCTTTCCGATACCGTC-3' 70

IpaH14a 5'-GCCGGTCAGCCACCCTCTGAGAGTAC -3'

elt1-2 LT1 5 '-ATTTAC G G CGTTACTATC CTC-3' 50

LT2 5'-TTTTGGTCTCGGTCAGATATG-3'

sta Sta1 5'-TCTTTCCCCTCTTTTAGTCAG-3' 50

Sta2 5'-ACAGGCAG GATTACAACAAAG - 3'

stxl Stx1F 5'-ATAAATCGCCATTCGTTGACTAC-3' 50

Stx1R 5'-AGAACGCCCACTGAGATCATC-3'

VT VT2fP 5'-TAAACTGCACTTCAGCAAAT-3' 43

VT2eP 5'-AATACATTATGGGAAAGTAATA-3'

stx LIN 3' 5'-TTTGATTGTTACAGTCAT-3' 50

LIN 5' 5'-GAACGAAATAATTTATATGT-3'

Ген штаммы энтеробактерий

K. pneumoniae E. coli O:157^7 E. coli О:124 E. coli О:148 S. sonnei

n = 67 n = 2 n = 4 n = 4 n = 12

Факторы адгезии

sfa - - - - -

afa - - - - -

aafl - - - - -

eaeA - + - - -

Факторы инвазии

ial - - + - +

ipaH - - + - +

Токсины

stl, st2 - - - + -

lt1, lt2 - - - + -

stxl, stx2 - + - - -

ТАБЛИЦА 2. ГЕНЫ, КОДИРУЮЩИЕ ФАКТОРЫ ПАТОГЕННОСТИ, ВЫЯВЛЕННЫЕ У ШТАММОВ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ

гического процесса в кишечнике. Однако только этих факторов недостаточно для того, чтобы микроорганизмы вызвали ОКЗ. Различные фимбриальные и нефимбриальные адгезины способствуют адгезии микроорганизма к слизи и эпителию кишечного тракта, МВП и дыхательных путей, а также к абиотическим поверхностям, покрытым коллагеном [14, 15]. Это обеспечивает персистенцию условно патогенных микроорганизмов в кишечнике, развитие патологических процессов в биотопах, в норме не являющихся постоянным местом обитания этих микроорганизмов (МВП и респираторный тракт), а также формирование биопленок на поверхностях различных инструментов, используемых при проведении инвазивных процедур.

Для более полного суждения об УПЭ как о возбудителях ОКЗ необходимо углубленное сравнительное изучение биологических свойств штаммов, выделенных от больных при различных патологических состояниях, с применением современных молекулярно-генетических методов.

Список литературы

1. Бондаренко В.М., Петровская В.Г., Потатуркина-Нестерова Н.И. Проблема патогенности клеб-сиелл. — Ульяновск: УлГУ, 1996. — 132 с.

2. Воробьева О.Н. Этиологическая структура возбудителей внутрибольничных раневых инфекций // Современные проблемы медицинской микробиологии: мат. ХХХХ юбилейной науч. конф. «Хлопинские чтения» (СПб., 2007). — СПб., 2007. — С. 178-179.

3. Егорова С.А., Забровская А.В., Лавренева И.С. Характеристика микрофлоры при дисбиозе кишечника и способы ее коррекции // Современные средства иммунодиагностики, иммуно- и экстренной профилактики актуальных инфекций: материалы науч. конф. с междунар. участием (ВМА, СПб., 2004). — СПб., 2004. — С. 179-181.

4. Егорова С.А. Обнаружение клебсиелл при дис-бактериозах кишечника // Актуальные вопросы инфекционной патологии — 2005: материалы Всеросс. науч. конф. молодых ученых с между-нар. участием (СПб., 27-28 января 2005). — СПб., 2005. — С. 58.

5. Жеребцова Н.Ю., Баймиев А.Х., Валишин Д.А., Мавзютов А.Р. Генетические маркеры патоген-ности условно патогенных энтеробактерий, выделенных у детей и подростков при острых кишечных инфекциях // Журн. микробиол. — 2007. — № 2. — С. 3.

6. Камачкова И.М. Этиологическая значимость условно-патогенных бактерий в развитии инфекции мочевыделительной системы // Материалы

VIII съезда Всеросс. общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. — М., 2002. — Т. 1. — С. 182.

7. Красноголовец В.Н., Киселева Б.С. Клебсиеллез-ные инфекции. — М.: Медицина, 1996. — 256 с.

8. Леванова Л.А., Алешкин В.А., Воробьев А.А., Афанасьев С.С., Сурикова Е.В., Рубальский О.В., Алешкин А.В. Становление микрофлоры кишечника у детей первого года жизни // Журн. микро-биол. — 2001. — № 4. — С. 47-50.

9. Леванова Л.А., Алешкин В.А., Воробьев А.А., Афанасьев С.С., Зинин-Бернес Н.Н., Алеш-кин А.В. Микробиоценоз кишечника в критические периоды развития ребенка // Журн. микро-биол. — 2001. — № 6. — С. 69-73.

10. Мавзютов А.Р. Факторы патогенности оппортунистических энтеробактерий и их роль в развитии диареи // Журн. микробиол. — 2007. — № 1. — С. 89-97.

11. Турчанинов Д.В. Гнойно-септические инфекции новорожденных в перинатальном центре // Материалы VIII съезда Всеросс. общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. — М.: 2002. — Т. 3. — С. 172.

12. Caprioli A., Morabito S., Brugere H. Enterohaemor-rhagic Escherichia coli: emerging issues on virulence and modes of transmission // Vet. Res. — 2005. — Vol. 36. — P. 289-311.

13. Clarke S.C., Haigh R.D., Freestone P.P.E., Williams P.H. Virulence of enteropathogenic Escherichia coli, a global pathogen // Clin. Microbiol. Rev. — 2003. — Vol. 16, N 3. — P. 365-378.

14. Lavender H.F., Jagnow J.R., Clegg S. Biofilm formation in vitro and virulence in vivo of mutanys of Klebsiella pneumoniae // Infect. Immun. — 2004. — Vol. 72, N 8. — P. 4888-4890.

15. Martino P.D. Klebsiella pneumoniae type 3 pili facilitate adherence and biofilm formation on abiotic surfaces // Res. Microbiol. — 2003. — Vol. 154, N 1. — P. 9-16.

16. Mühldorfer I., Hacker J.. Genetic aspects of Escheri-chia coli virulence. Mini-review // Microb. Pathog. — 1994. — Vol. 16. — P. 171-181.

17. Nataro J., Caper J.B. Diarrheagenic Escherichia coli // Clin. Microbiol. Rev. — 1998. — Vol. 11, N 1. -P. 142-201.

18. Sardan Y.C., Zarakolu P., Altun B., Yildirim A., Yildirim G., Hascelik G., Uzun O. A cluster of nosocomial Klebsiella oxytoca bloodstream infections in a university hospital // Infect. Control Hosp. Epidemiol. — 2004. — Vol. 25, N 10. — P. 878-882.

19. Tamaki Y., Narimatsu H., Miyazato T., Nakasone N., Higa N., Toma C., Iwanaga M. The relationship between O-antigens and pathogenic genes of diarrhea-associated Escherichia coli // Jpn. J. Infect. Dis. — 2005. — Vol. 58, N 2. — P. 65-69.