Модификация антибиотикорезистентности в условиях микробного симбиоза

Є

Модификация антибиотикорезистентности в условиях микробного симбиоза

Л. М. АЗНАБАЕВА, Б. Я. УСВЯЦОВ, О. В. БУХАРИН

Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН, Оренбург

Modification of Antibiotic Resistance Under Conditions of Microbial Symbiosis

L. M. AZNABAEVA, B. YA. USVYATSOV, O. V. BUKHARIN

Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis, the Urals Department of the Russian Academy of Science, Orenburg

При назначении лечения антибиотиками необходимо использовать препараты, к которым чувствителен возбудитель инфекционного заболевания в условиях его ассоциации с нормальной микрофлорой организма. Цель работы — изучение модификации антибиотикорезистентности в условиях ассоциации патогенов с представителями нормальной микрофлоры и разработка микробиологических критериев определения активности антибактериального препарата. В работе исследовалась модификация антибиотикорезистентности микроорганизмов в 408 микробных ассоциациях. Выявлены различные изменения резистентности к антибиотикам штаммов-ассоциантов: усиление (синергизм), снижение (антагонизм) и индифферентное отношение. На основе полученных результатов при выборе антибиотика против Staphylococcus aureus и Streptococcus pyogenes предпочтение можно отдать оксациллину, гентамицину и хлорамфениколу (левомицетину), так как к этим антибиотикам в условиях ассоциаций резистентность патогенов не увеличивалась, тогда как резистентность нор-мофлоры повышалась или не менялась, что важно для её сохранения в эконише. Полученные данные об изменении антибиотикорезистентности штаммов микроорганизмов в условиях микробных ассоциаций позволили разработать микробиологические критерии определения эффективности антибиотика для лечения воспалительных заболеваний микробной этиологии (патент РФ на изобретение №2231554).

Ключевые слова: антибиотикорезистентность, патоген, нормальная микрофлора, микробные ассоциации.

In antibiotic therapy it is necessary to use drugs active against the pathogen in its association with the host normal microflora. The aim of the study was to investigate modification of antibiotic resistance under conditions of the pathogen association with the representatives of the host normal microflora and to develop the microbiological criteria for determining effectiveness of antibacterials. Modification of microbial antibiotic resistance was investigated in 408 associations. Various changes in the antibiotic resistance of the strains were revealed: synergism, antagonism and indifference. On the basis of the results it was concluded that in the choice of the antibiotic active against Staphylococcus aureus and Streptococcus pyogenes the preference should be given to oxacillin, gentamicin and levomycetin, since the resistance of the pathogens to these antibiotics under the association conditions did not increase, which could contribute to their destruction, whereas the resistance of the normoflora increased or did not change, which was important for its retention in the bio-cenosis. The data on changeability of the antibiotic resistance of the microbial strains under the association conditions made it possible to develop microbiological criteria for determining effectiveness of antibiotics in the treatment of inflammatory diseases of microbial etiology (RF Patent No. 2231554).

Key words: antibiotic resistance, pathogen, normal microllora, microbial associations.

Введение

Микробиоценозы тела человека представляют собой сложные системы, отличающиеся мно-гокомпонентностью и количественным разнообразием [1]. Проблема нарушений нормальных микробиоценозов и связанных с этим неблагоприятных воздействий на организм человека возникла и стала усугубляться после появления современных антибиотиков, ухудшения эколо-

© Коллектив авторов, 2010

Адрес для корреспонденции: 460000 Оренбург, Пионерская, 11. Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН

гических условий окружающей среды, концентрации стрессовых воздействий на человека [2]. Воспалительные заболевания наиболее часто вызываются ассоциациями микроорганизмов [3]. В процессе жизнедеятельности микробы-симбионты выделяют вещества, усиливающие или подавляющие рост, размножение бактерий, экспрессию их биологических свойств, в частности антибиотикорезистентность [4—6]. Формирование антибиотикоустойчивости происходит путём селекции устойчивых микроорганизмов и распространения Я-плазмид среди популяции [7]. В отличие от хромосомных генов антибиотикоре-

О

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

зистентности, плазмидные гены контролируют преимущественно множественную устойчивость к антибиотикам [8]. Полирезистентность возбудителей инфекционных болезней к антибактериальным препаратам является основным из факторов, ограничивающим эффективность антимикробной терапии [9, 10].

Всё вышеперечисленное свидетельствует о том, что при назначении лечения антибиотиками необходимо использовать препараты, к которым чувствителен возбудитель инфекционного заболевания в условиях его ассоциации с другими микроорганизмами, которые могут обеспечить терапевтический эффект при минимальных побочных явлениях [11].

Целью настоящей работы было изучение изменения антибиотикорезистентности в условиях ассоциаций микросимбионтов и разработка микробиологических критериев определения эффективности антибактериального препарата в отношении патогена при его симбиозе с представителями нормофлоры.

Материал и методы

В работе изучена микрофлора 50 биоценозов слизистой оболочки миндалин у больных хроническим тонзиллитом людей. Патогенные виды микроорганизмов (Staphylococcus aureus и Streptococcus pyogenes) выявлялись в 52,0+7,1% биоценозов.

Нормальную микрофлору представляли штаммы микроорганизмов родов Staphylococcus (44,3+3,4% коагулазоотрица-тельных штаммов), Streptococcus (24,4+2,3% штаммов), Aerococcus (7,2+1,3% штаммов), Micrococcus (4,5+1,1% штаммов) и Neisseria (0,5+0,4% штаммов).

Исследовалась антибиотикорезистентность микроорганизмов в монокультуре и в условиях микробных ассоциаций. Была изучена резистентность к наиболее часто применяемым в практическом здравоохранении антибиотикам: оксацилли-ну, ампициллину, ванкомицину, хлорафениколу (левомице-тину), эритромицину и гентамицину. Для определения резистентности микроорганизмов к антибиотикам использовался диско-диффузионный метод согласно «Методическим указаниям по определению чувствительности микроорганизмов к антибиотикам» (МУК 4.2.1890-04).

Оценка изменения резистентности выделенных штаммов к антибиотикам в условиях симбиоза проводилась с использованием разработанного метода [12] (рис.1). Для стандартизации посевов применялся разработанный авторами штамп из нержавеющей стали (ГОСТ 5949-75). Размеры поверхности соприкосновения — 9x30 мм. Применение данного штампа обеспечивало равномерное нанесение микробной взвеси на поверхность агара. Стерильный штамп смачивался взвесью микроорганизмов путем соприкосновения с кругом стерильной фильтровальной бумаги d=50 мм (ГОСТ 12026), пропитанной 1,0 мл 1 млрд взвеси микроорганизма. Прикрепившиеся микроорганизмы переносились на плотную питательную среду: контрольные посевы — по периферии чашки (отступя от края чашки 20 мм), опытные — перекрестом в центре. На место перекреста в опыте и в центр посева в контроле накладывался стандартный бумажный диск, пропитанный антибиотиком («Диски индикаторные картонные с противомикробными лекарственными средствами ДИ-ПЛС-50-01», ЗАО «Научно-исследовательский центр фармакотерапии», С.-Петербург, ТУ 9398-001-39484474-00). Чашки инкубировались в термостате при температуре 37°С в течение 24 ч, затем измерялся диаметр зоны задержки роста культур в опыте и в контроле.

Рис. 1. Изучение изменений чувствительности штам-мов-симбионтов к антибиотикам.

а — Методика постановки опыта; б— Учёт результатов через 24 ч инкубации при температуре 37°С (замер зоны задержки роста микроорганизмов, в мм).

В клинической практике, исходя из различных диаметров зон задержки роста бактерий вокруг дисков с антибиотиками, микроорганизмы распределяют на группы по степени чувствительности к антибиотикам: устойчивые, с промежуточной устойчивостью, чувствительные (МУК 4.2.1890-04). Разница в диаметре зоны задержки роста микроорганизма при действии антибактериального препарата (АБТ) между этими группами составляет 1 мм, что и было принято считать за основу изменений роста микробов-симбионтов при оценке изменения антибиотикорезистентности микроорганизмов.

Статистический анализ полученных в ходе экспериментальных исследований результатов проводили с использованием t-теста Стьюдента в программе Microsoft Excel-XP professional. Критерий вероятности ^<0,05 принимали достаточным для статистически достоверной разницы данных опытной и контрольной групп [13].

Результаты и обсуждение

В условиях симбиоза было исследовано 408 ассоциаций выделенных штаммов микроорганизмов. Выявлены различные изменения резистентности к антибиотикам штаммов-ассоциантов: усиление (синергизм), снижение (антагонизм) и индифферентность. Штаммы патогенов усиливали антибиотикорезистентность нормофлоры в 35,5+3,2% случаев, в 45,0+3,3% случаев штаммы

-е-

e

нормофлоры оказышали стимулирующее действие на резистентность патогенов к изученным антибиотикам. Эффекты подавления антибио-тикорезистентности как патогена под действием нормофлоры, так и обратное влияние отмечались в 24,0+3,1% случаев.

Была изучена модификация резистентности к определенным антибиотикам в ассоциациях «пато-ген+нормофлора» и результаты сопоставлены с данными об устойчивости изученных штаммов в монокультуре. На рис. 2 представлена модификация антибиотикорезис-тентности в условиях ассоциации патогенов и представителей нормальной микрофлоры. Из приведенных данных видно, что под влиянием нормофлоры происходило увеличение количества полирезистентных штаммов патогенов в 1,3 раза по сравнению с монокультурой (42,1+3,3% случаев против 31,6+3,1% случаев, р<0,05). Устойчивость к ампициллину и эритромицину увеличивалась в 1,2 раза: она составляла 94,7+1,5% против 78,9+2,7% (р<0,05) и 31,6+3,1% против 26,3+2,9% (р<0,05) соответственно. Резистентность штаммов патогенов к ван-комицину в ассоциациях увеличивалась в 3,2 раза: она составляла 15,8+2,4% против 5,3+1,5% в монокультуре (р<0,05).

Устойчивость к антибиотикам нормальной микрофлоры под влиянием патогена также претерпевала изменения. Количество полиантибио-тикорезистентных штаммов увеличивалось в 1,3 раза и составило 37,8+3,2% против 28,9+3,0% в монокультуре (р<0,05). Устойчивость к оксацил-лину выросла в 5 раз: она составляла 11,1+1,9% против 2,2+1,1% (р<0,05), к ванкомицину и лево-мицетину в 1,3 раза: она составляла 8,9+2,5% против 6,7 +1,6% для каждого из изучаемых антибиотиков (^<0,05).

Таким образом, взаимодействие патогена с представителями нормальной микрофлоры сопровождается селекцией штаммов, резистентных к двум и более антибиотикам. Наиболее часто происходило повышение устойчивости патогена под действием нормальной микрофлоры к ванкомицину, ампициллину и эритромицину. По отношению к другим антибиотикам — оксацил-лину, гентамицину и левомицетину сохраняется чувствительность патогенов как в монокультуре, так и в ассоциациях, тогда как резистентность нормальной микрофлоры повышалась к окса-циллину, ванкомицину, левомицетину и не изменялась к ампициллину, эритромицину и гентамицину.

Рис. 2. Изменение антибиотикорезистентности в условиях ассоциаций патогенов и представителей нормофлоры.

При лечении воспалительных заболеваний микробной этиологии важно определять эффективным антибиотик, который губительно действует на возбудителя, выиышающего воспаление, и не влияет или повышает резистентность представителей нормальной микрофлоры данной экологической ниши.

На основе полученных результатов при выборе антибиотика для лечения больных хроническим тонзиллитом, выгзванным Staphylococcus aureus и Streptococcus pyogenes, предпочтение можно отдать оксациллину, гентамицину и левомицетину, так как к этим антибиотикам в условиях ассоциаций резистентность патогенов не увеличивалась, что может способствовать их эрадикации, тогда как резистентность нормофлоры повышалась или не изменялась, что важно для ее сохранения в эконише.

Полученные данные об изменении антибиотикорезистентности микроорганизмов в условиях ассоциаций позволили разработать микробиологические критерии определения эффективности антибиотика для лечения воспалительных заболеваний микробной этиологии (патент РФ на изобретение №2231554). В качестве критериев выбора эффективного антибиотика предложено оценивать результат действия препарата на патоген и симбионты нормальной микрофлоры в условиях их сокультивирования на плотной питательной среде. Снижение резистентности к данному антибиотику у патогена в ассоциации с представителем нормальной микрофлоры и одновременное повышение резистентности или сохранение прежних значений у представителей нормальной микрофлоры, позволяет рекомендовать антибиотик для элиминации патогена и профилактики дисбиоза в эконише за счёт сохранения нормальной микрофлоры. Повышение резистентности

Є

патогена к данному антибиотику при одновременном снижении резистентности нормальной микрофлоры не позволяет рекомендовать антибиотик для лечения, так как возможно формирование дисбиоза и персистенции антибиотикорезистентного возбудителя гнойных заболеваний

Быводы

1. Разработан метод оценки антибиотикоре-зистентности микроорганизмов-ассоциантов в

ЛИТЕРАТУРА

1. Воробьев А. А., Гuнцбypг А. Л., Бондаренко В. M. Мир микробов. Вестник РАМН 2000; 11: 11—14.

2. Cmpaчyнcкuй Л. С., Каманш Е. И., Тарасов А. А. Влияние антиби-отикорезистентности на выбор антимикробных препаратов в оториноларингологии. Consilium medicum 2001; 3: 8: 352—351.

3. Фадеев С. Б. Видовой состав и персистентные характеристики возбудителей хирургической инфекции мягких тканей. Автореферат дисс. ... канд.мед.наук. Оренбург, 1998; 24.

4. Хмель И. А. Микроцины — пептидные антибиотики энтеробактерий: генетический контроль синтеза, структура, механизм действия jj Генетика. 1999. 1 (35). 5—16.

5. Tuтова А. В. Изучение антибактериального действия низкомолекулярного поликатионного пептида варнерина на антибиотикорезистентные штаммы S.epidermidis. Автореф. дис. ... канд.мед.наук. Пермь, 2002; 22.

6. Коробов В. П., Tuтова А. В., Лемкжа Л. M., Механошжа И. И. Изменение антибиотикочувствительности стафилококков в условиях реализации эффекта пептидного антибактериального фактора. Антибиотики и химиотер 2002; : 2: 11—15.

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

условиях их сокультивирования на плотной питательной среде.

2. Взаимодействие патогенов с представителями нормофлоры в биоценозе сопровождается модификацией их антибиотикорезистентности.

3. Предложены микробиологические критерии выбора эффективного антибактериального препарата для элиминации возбудителя из микробиоценоза, с сохранением представителей ин-дигенной микрофлоры.

7. Сидоренко С. В. Происхождение, эволюция и клиническое значение антибиотикорезистентности. Там же 1999; 12: 19—22.

8. Зубов Л. А., Богданов Ю. М. Современные проблемы антибиотикорезистентности в педиатрической практике. Там же 1998; 4: 43—50.

9. Антибактериальная терапия. Практическое руководство / Под ред. Л. С. Страчунского, Ю. В. Белоусова, С. Н. Козлова. М.: 2000; 192.

10. Рязанцев С. В. Рациональная антимикробная химиотерапия острых заболеваний верхних дыхательных путей. Consilium medicum

2004; 6: 1.

11. Жуковицкий В. Г. Обоснование рациональной антибактериальной терапии в оториноларингологии с позиции бактериолога. Там же 2001; 3: 8: 362—371.

12. Бухарин О. В., Усвяцов Б. Я., Хуснутдинова Л. М. Способ определения эффективности антибиотика для лечения воспалительных заболеваний микробной этиологии. Патент РФ на изобретение №2002125475 от 27.06.2004.

13. Лакин Г. Ф. Биметрия (учебное пособие для биологических специальностей университетов). М.: 1990.