СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РОГОВИЧНОГО ТРАНСПЛАНТАТА ДЛЯ ПОСЛОЙНОЙ КЕРАТОПЛАСТИКИ
METHOD OF CORNEAL GRAFT PREPARATION FOR LAYER-BY-LAYER KERATOPLASTY

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии, и может быть использовано для хирургического лечения эпителиально-эндотелиальной дистрофии (ЭЭД) роговицы различной этиологии.
Эпителиально-эндотелиальная дистрофия (ЭЭД) роговицы - тяжелое хроническое заболевание, сопровождающееся выраженным отеком стромы, роговичным синдромом с постепенным снижением остроты зрения вплоть до полной слепоты.
Консервативная терапия, применяемая при ЭЭД роговицы, обладает непродолжительным паллиативным эффектом. В течение многолетней истории хирургии роговицы при ЭЭД предлагались различные способы кератопластики с использованием донорской роговой оболочки. При этом на результат сложного хирургического вмешательства оказывает влияние ряд причин: этиология бельма, васкуляризация, воспаление, передние синехии, глаукома, синдром «сухого глаза», афакия, повторные трансплантации, жизнеспособность и характеристики донорской ткани, опыт врача, методики выполнения операции и послеоперационной фармакотерапии [Копаева, В.Г. Современные аспекты сквозной субтотальной кератопластики: дис… д-ра мед. наук. / В.Г. Копаева. - М., 1982. - 435 с.; Комах, Ю.А. Иммунодиагностика и иммунокоррекция при повторных пересадках роговицы / Ю.А. Комах, С.А. Борзенок, С.В. Петричук [и др.] // В книге: X съезд офтальмологов России. - 2015. - С. 189].
Задняя послойная кератопластика (ЗПК), рекомендуемая при ЭЭД роговицы, представляет собой наиболее щадящий способ избирательной замены пораженного эндотелиального слоя трансплантатом, состоящим из части стромы, десцеметовой мембраны и эндотелия [Sharma, N. Descemet stripping automated endothelial keratoplasty / N. Sharma, P.K. Maharana, S. Singhi [et al.] // Indian J Ophthalmol. - 2017. - Vol. 65, №3. - P. 198-209; Nishino, T. A 10-year review of under lying diseases for endothelial keratoplasty (DSAEK/DMEK) in atertiary referral hospital in Japan / T.: Nishino, A. Kobayashi, H. Yokogawa // Clin. Ophthalmol. - 2018. - №12. - P. 1359-1365].
Однако при этом способе операции нередко бывают случаи несостоятельности и отторжения трансплантата, требующие повторного хирургического вмешательства.
2
Наиболее близким аналогом изобретения является способ получения ультрафиолет-модифицированного донорского материала [Кератопластика с использованием кросслинкинг-модифицированного донорского материала при фистуле роговицы (клинический случай). Мороз З.И. с соавт., Офтальмохирургия. 2014; №2 [Электронный ресурс] Режим доступа: https://eyepress.ru/article.aspx?11219. Дата доступа: 12.03.2019]. Особенность подготовки донорского материала состояла в том, чтобы непосредственно перед проведением операции роговица помещалась в среду Борзенка-Мороз, содержащую среду М-199, среду Ф-10, среду Дюльбекко-Игла, хондроитин-сульфат, декстран-40, гентамицин-сульфат, амфотерицин Б при определенном соотношении компонентов, (раствор для хранения роговицы, ТУ №9398-013-29039336-2008) с, добавлением 1 мл 0,1% рибофлавина (рибофлавин-5-фосфат натрия, регистрационное свидетельство МЗ России П №013263/01 от 20.10.2006 г., «ДСМ Нутришнл Продактс Лтд», Франция) на 1 час, после чего роговицу перемещали в стерильную емкость и обрабатывали ультрафиолетом длиной волны 370 нм мощностью 3 мВ/см в течение 30 минут. Для облучения использовали прибор UV-X s/n 1000-401-39 (Швейцария). В процессе воздействия ультрафиолетового излучения на донорскую роговицу каждые 5 минут капали по 1 капле 0,1% рибофлавина.
Задачей изобретения является усовершенствование способа получения роговичного трансплантата для послойной кератопластики при лечении эпителиально-эндотелиальной дистрофии роговицы.
Техническим результатом при использовании изобретения является повышение приживляемости роговичного трансплантата, снижение антигенности и потенциального риска развития инфекционных осложнений в послеоперационном периоде.
2
2
Предлагаемый способ получения роговичного трансплантата для послойной кератопластики осуществляется следующим образом. В условиях операционной проводят ультрафиолетовый кросслинкинг роговицы донорского глазного яблока: с помощью микрохирургического шпателя производят механическое удаление роговичного эпителия диаметром около 10 мм. Далее выполняют насыщение деэпителизированной стромы роговицы рибофлавином посредством инсталляций фотосенсибилизатора «Декстралинк» (Россия), содержащего, мас. %: рибофлавина-мононуклеотид 0,14-0,15; декстран 18,0-22,0; трис-(гидроксиметил)-метиламин 0,08-0,12; нипагин 0,0075-0,0125; трилон Б 0,005-0,01; натрия хлорид 0,8-0,9 и воду дистиллированную очищенную до 100, в течение 40 мин. УФ облучение роговицы донорского глазного яблока выполняют на аппарате «УФалинк» (Россия) в импульсном акселерированном режиме. Параметры облучения: длина волны 370 нм, мощность 3 мВт/см, продолжительность 8 минут, из которых 1 секунда - засвет, 1 секунда - пауза (флюенс излучения 7,2 Дж/см) с одновременной инсталляцией раствора «Декстралинк», содержащего, мас. %: рибофлавина-мононуклеотид 0,08-0,12; декстран 18,0-22,0; трис-(гидроксиметил)-метиламин 0,08-0,12; нипагин 0,0075-0,0125; трилон Б 0,005-0,01; натрия хлорид 0,8-0,9 и воду дистиллированную очищенную до 100, непрерывно с помощью насоса для инфузии «Infutek 400».
Общая длительность процедуры около 48 минут.
После УФ кросслинкинга донорского глазного яблока проводят формирование трансплантата.
Хирургическую технику формирования трансплантата начинают с круговой перитомии конъюнктивы. Далее создают гипертонус (~90 мм рт.ст.) кадаверного глазного яблока в течение всей процедуры. Для этого через культю зрительного нерва вводят физиологический раствор и накладывают зажим. Ультразвуковым пахиметром определяют толщину донорской роговицы в центральной зоне: при исходном среднем значении более 750 мкм, используют аппланаторы «500» и «450», а далее аппланаторы «150» «200» мкм; при исходном среднем значении менее 750 мкм - аппланатор «300», а далее аппланаторы «150» и «200» мкм. Вычисление толщины сформированного лоскута проводят методом вычитания значения остаточной толщины стромы от исходного.
После проведения подготовительного этапа накладывают вакуумное кольцо на донорское глазное яблоко и прикрепляют аппликатор «PocketMaker», с которым состыковывают аппланатор. После создания вакуума деликатно помещают верификатор лезвия микрокератома «PocketMaker» в направляющую выемку аппликатора и формируют карман в строме роговицы на заданной глубине. После диссекции роговицы микрошпателем проводят ревизию сформированного кармана на отсутствие перетяжек. Завершают выкраивание трансплантата иссечением корнеосклерального лоскута диаметром 16 мм при помощи трепана. Таким образом, созданный трансплантат имеет толщину в среднем 125±35 мкм и представлен задней порцией стромы, десцеметовой мембраной и эндотелием в центральной его части с лимбально-скеральным ободком. Полученные передние слои роговицы используют для передней послойной кератопластики по поводу кератоконуса, язвы роговицы. Трансплантаты подвергают консервации. Иссечение от периферической части роговичных лоскутов выполняют в ходе операций. Далее выполняют заднюю и переднюю послойные кератопластики по стандартной методике.
В предлагаемой методике принимается во внимание то обстоятельство, что в донорском глазном яблоке сразу после изъятия за счет утраты естественных метаболических функций неизбежно формируется выраженный отек роговицы, являющийся одним из факторов возможного отторжения трансплантата в послеоперационном периоде.
2
Еще одним фактором несостоятельности трансплантата может быть развитие в донорской роговице потенциальной инфекции бактериальной и вирусной природы. Для устранения вероятных нежелательных постоперационных последствий подобного рода нами предлагается использование кросслинкинга донорской роговицы в увеличенной (до 7,2 Дж/см), но допустимой дозе УФ воздействия [Mazzotta С., Traversi С., Paradiso A.L., Latronico М.Е., Rechichi М. Pulsed light accelerated crosslinking versus continuous light accelerated crosslinking: one-year results // J Ophthalmol. 2014. - 2014:604731]. При этом следует отметить бактерицидный эффект УФ-облучения на биоткань [Ramona В., Catalina С., Andrei М., Daciana S., Calin Т. Collagen crosslinking in the management of microbial keratitis // Rom J. Ophthalmol. - 2016. - Vol. 60. - N 1. - P. 28-30; Martins S.A., Combs J.C., Noguera G., Camacho W., Wittmann P., Walther R., Cano M., Dick J., Behrens A. Antimicrobial efficacy of riboflavin/UVA combination (365 nm) in vitro for bacterial and fungal isolates: a potential new treatment for infectious keratitis // Invest Ophthalmol Vis Sci. - 2008. 4 Vol. 49. - N8. - P. 3402-3408].
Импульсный режим обработки позволяет увеличить глубину проникновения ультрафиолета и, соответственно, эффективность сшивания фибриллярного коллагена. Благодаря увеличению времени предварительного насыщения стромы с 30 до 40 мин происходит пропитывание фотосенсибилизатором исходно отечной роговицы. Глубина проникновения УФ излучения достигает 300-370 мкм за счет использования импульсного режима облучения. При этом обеспечивается безопасность для эндотелия роговицы, в тоже время доставка рибофлавина в задние слои стромы и его непосредственное включение в метаболизм эндотелиальных клеток позволяет поддерживать их жизнеспособность, в т.ч. посредством антиоксидантного эффекта фотосенсибилизатора. Общая продолжительность УФ-облучения снижена за счет увеличения мощности излучения.
Важным преимуществом использования раствора «Декстралинк» для УФ кросслинкинга при ЭЭД роговицы, в отличие от обычного водного рибофлавина, является включение в состав препарата полимера декстрана, обладающего дегидратационными свойствами. Декстран, входящий в состав раствора «Декстралинк», улучшает диффузию рибофлавина через биологические мембраны, частично метаболизируется до глюкозы и легко усваивается тканями рецепиента и донорского материала, оказывает дезинтоксикационный эффект и антигипоксическое действие, что особенно важно в условиях дефицита кислорода в тканях роговицы в процессе УФ-облучения. Полимер повышает вязкостные свойства раствора и обеспечивает пролонгирующий эффект препарата, оказывает выраженное противоотечное действие непосредственно при выполнении процедуры и в раннем послеоперационном периоде [Халимов А.Р. Роль декстрана в офтальмологическом растворе рибофлавина для УФ кросслинкинга роговицы // Точка зрения. Восток-Запад. - 2018. - №1. - С. 136-138].
Сущность изобретения иллюстрируется следующим примером.
Исходная толщина роговицы донорского глаза, измеренная ультразвуковым пахиметром («Nidek», Япония) в центральной зоне, составила 855 мкм. После деэпителизации роговицы (диаметром 10 мм) проводили насыщение деэпителизированной стромы роговицы рибофлавином посредством инсталляций фотосенсибилизатора «Декстралинк», содержащего, мас. %: рибофлавина-мононуклеотид 0,14-0,15; декстран 18,0-22,0; трис-(гидроксиметил)-метиламин 0,08-0,12; нипагин 0,0075-0,0125; трилон Б 0,005-0,01; натрия хлорид 0,8-0,9 и
2
воду дистиллированную очищенную до 100, в течение 40 мин. Затем выполняли ее УФ-облучение на аппарате «УФалинк» (Россия). Параметры УФО: длина волны 370 нм, мощность 3 мВт/см, продолжительность 8 минут (1 секунда - засвет, 1 секунда - пауза) с одновременной инсталляцией этого же раствора «Декстралинк», непрерывно с помощью насоса для инфузии «Infutek 400».
Проводили повторную пахиметрию, зарегистрирована толщина роговицы - 760 мкм, что указывает о ее снижении после процедуры УФ кросслинкинга роговицы, за счет деэпителизации и уменьшения отечности роговичной ткани.
Хирургическую технику формирования трансплантата начали с проведения круговой перитомии конъюнктивы. Создали гипертонус (~ 90 мм рт. ст.) путем введения через культю зрительного нерва физиологического раствора и наложения зажима. Первый срез микрокератомом провели с аппланатором «500». Вычислили толщину остаточной стромы от исходного (820-500=320 мкм). Второй срез выполняли оппозитно, для снижения риска перфорации с применением аппланатора «200» мкм.
Завершали выкраивание трансплантата иссечением корнеосклерального лоскута диаметром 16 мм при помощи трепана. Таким образом, полученный трансплантат имел толщину непосредственно после его изготовления 120 мкм в центральной его части с лимбально-скеральным ободком. В таком виде он и подвергался консервации. Иссечение от периферической части выполняли в ходе операции.
2
2
Заготовленный роговичный лоскут поместили в среду для консервации Corneal Chamber containing Eusol-C, «Alchimia» (Италия), хранили при гипотермии (+4°С) 24 часа. Выполняли зеркальную микроскопию. До операции плотность эндотелиальных клеток, измеренная с помощью компьютерного кератоанализатора «Konan EKA-04» (Япония), варьировала от 2620 до 2970 клеток/мм, в среднем 2976±220 клеток/мм.
Далее изготовленный трансплантат применяли при проведении задней автоматизированной послойной кератопластики по стандартной методике у пациента Б., 75 лет, с диагнозом: Вторичная эпителиально-эндотелиальная дистрофия роговицы. Артифакия. Жалобы пациента на светобоязнь, слезотечение, периодические боли появились через 10 месяцев после факоэмульсификации с имплантацией интраокулярной линзы. Острота зрения 0,1, не корригирует. Внутриглазное давление 15 мм рт. ст.
Во время операции и в послеоперационном периоде осложнений не наблюдали. Достигнуто прозрачное приживление роговицы. Острота зрения через 7 дней, 1, 3 месяцев после операции составила соответственно: 0,1 не корригирует, 0,3 не корригирует, 0,5 не корригирует, после 6 месяцев наблюдения - 0,5 с коррекцией 0,7. Роговичный синдром полностью купирован.
Данным способом было проведена 21 операция, прозрачное приживление трансплантата через 12 месяцев было достигнуто в 19 (90,5%) случаях. Получен лечебно-оптический результат операции.
Роговичные лоскуты после выполнения первого среза микрокератомом «PocketMaker» подвергали гистологическому исследованию. Кусочки роговицы фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина в течение 24-48 часов, после экспозиции в спиртах восходящей концентрации заливали в парафин. Полученные гистологические срезы толщиной 2-4 мкм окрашивались гематоксилином и эозином. Визуальный анализ гистопрепаратов выполняли с помощью светового микроскопа «Axiostar» (CarlZeiss, Германия) при увеличении х1000. Фотофиксацию и компьютерную обработку образцов гистопрепаратов проводили с помощью цифровой фотокамеры Jen optic ProgRes С10, персонального компьютера Pentium-IV и программы «Video test morphologia».
Проведенное гистологическое исследование послойных образцов трансплантатов роговицы различной толщины после УФ кросслинкинга показало наличие умеренного отека стромы. Соединительнотканные пластинки роговицы, состоящие из коллагеновых волокон, были с очагами разволокнения, свидетельствующими о явлениях отека. Отмечали незначительное утолщение десцеметовой мембраны. Визуализировали единичные фибробласты (активированные кератоциты), которые имели овальную форму и были расположены преимущественно в центральной строме роговицы. Важно отметить, что в отличие от необработанного рибофлавин-ультрафиолетом материала характерное набухание стромы УФ-сшитых роговичных трансплантатов было существенно менее выраженным.
Таким образом, предлагаемое ультрафиолетовое сшивание донорской роговицы в присутствии рибофлавина позволяет значительно повысить приживляемость роговичного трансплантата за счет увеличения глубины его УФ-обработки посредством использования импульсного акселерированного режима облучения и декстран-опосредованной дегидратации стромы раствором «Декстралинк», способствующими уменьшению характерного набухания стромы; снижению антигенности и потенциального риска развития инфекционных осложнений в послеоперационном периоде.