Генотипическая идентификация изолятов ВЛКРС, выявленных в хозяйствах Республики

формированию комплексов мер, каждый из которых требует своевременной и полной реализации.

ЛИТЕРАТУРА: 1. Аганбегян А.Г. Кризис: беда и шанс для России.-М.: АСТ Астрель, 2009. -285с. 2. Антикризисное управление /Под ред. проф. Э.М. Короткова - М.: Инфра-М, 2007. -620 с. 3. Леонтьев С.В., Масютин С.А., Тренев В.Н. Стратегия успеха: обобщение опыта

реформирования российских предприятий.- М.: Новости, 2000.- 336с. 4. Балдин К.В., Передеряев И.И., Рукосуев А.В. Антикризисное управление: макро- и микроуровень:- М.: Дашков и К, 2009. - 268 с.

СИСТЕМЫ УПРАВЛЕНИЯ КРИЗИСНЫМИ ЯВЛЕНИЯМИ В УСЛОВИЯХ НЕРАВНОМЕРНОСТИ СОЦИАЛЬНО-ЭКОНОМИЧЕСКОГО РАЗВИТИЯ

Шагиева А.Х.

Резюме

Кризисную фазу в социально-экономическом развитии можно преодолеть с меньшими потерями при комплексном подходе к управлению организацией.

CONTROL SYSTEMS OF THE CRISIS PHENOMENA IN THE CONDITIONS OF NONUNIFORMITY OF SOCIAL AND ECONOMIC DEVELOPMENT

Shagieva A.

Summary

The crisis phase in social and economic development can be overcome with smaller losses at the complex approach to management of the organization.

УДК: 619:57.065:578.828

ГЕНОТИПИЧЕСКАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ ИЗОЛЯТОВ ВЛКРС, ВЫЯВЛЕННЫХ В ХОЗЯЙСТВАХ РЕСПУБЛИКИ ТАТАРСТАН

Шаева А.Ю., Вафин Р.Р.*, Хазипов Н.З., Камалов Б.В.**, Алимов А.М.,

Тагиров М.Ш.*

ФГОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана»

ГНУ «ТатНИИСХ РАСХН»*

Главное управление ветеринарии КМ РТ* *

Ключевые слова: ВЛКРС, типизация, ПЦР, ПДРФ,

филогенетический анализ.

Key words: BLV, typing, PCR, RFLP, phylogenetic analysis.

Введение. Лабораторно-диагностические исследования в системе мониторинга инфицированности стад вирусом лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) являются неразрывным звеном противолейкозных мероприятий [4, 5].

Вопросы диагностики лейкоза крупного рогатого скота в контексте изучения генетического многообразия его этиологического агента весьма актуальны, учитывая факт невозможности типизации возбудителя серологическими методами исследования (РИД, ИФА) [1, 2, 3, 4, 5].

Ранее предложенные стратегии типизации BLV [1, 2, 3], основанные на интерпретации env-ПЦР-ПДРФ-профилей, также оказались не способными охарактеризовать весь спектр генетического многообразия возбудителя, нежели современный подход оценки генотипического разнообразия ВЛКРС на основе филогенетического анализа env-гена [4, 5].

Основной целью нашего исследования являлась генотипическая идентификация изолятов ВЛКРС, выявленных в хозяйствах Республики Татарстан.

Материалы и методы. Исследованию было подвергнуто 70 проб крови BLV-позитивных коров сельхозпредприятий 9 районов Республики Татарстан на предмет генотипической идентификации выявленных представителей ВЛКРС на основе ПЦР-ПДРФ- и филогенетического анализа секвенированных последовательностей локуса env-гена провируса возбудителя.

При постановке ПЦР с выделенными образцами провирусной ДНК BLV использовалась модификация «nested» ПЦР с применением внешних (env5032+env5608) и внутренних (env5099+env5521) праймеров, инициирующих на заключительном этапе реакции амплификацию фрагмента env-гена ВЛКРС длиной 444 п.н. [1, 2, 3].

Эндонуклеазы рестрикции, используемые для ПЦР-ПДРФ-анализа: BamHI, PvuII, DdeI, SspI, HphI, Haelll, а также BclI и Bgll.

ПЦР-ПДРФ-моделирование: NEBcutter v.2.0.

ПЦР-ПДРФ-продукты разгоняли в 2,5% агарозном геле (20 В/см, 40 мин) и визуализировали в УФ-трансиллюминаторе (А=310 нм).

Секвенирование продуктов амплификации локуса env-гена BLV с внутренними праймерами «env5099» и «env5521» изолятов ВЛКРС «N10», «N28», «N72» и «N174» выполнено на приборе ABI-300 в лабораториях НПО «СибЭнзим».

Изоляты «N10» (GenBank A/N: HM102355), «N28» (GenBank A/N: HM102356), «N72» (GenBank A/N: JF683619) и «N174» (GenBank A/N: JF713455) были выравнены по длине 444 нуклеотидов локуса env-гена c соответствующими опубликованными в GenBank последовательностями

известных представителей BLV, используя программы BLAST и CLUSTAL W (v. 1.83) с последующим филогенетическим анализом.

Результаты исследования и их обсуждение. В результате филогенетического анализа выравненных нуклеотидных

последовательностей локуса env-гена типовых представителей известных генотипов ВЛРКС установлено, что изолят «N28», выявленный в Спасском районе РТ, принадлежит к кластеру 7-го генотипа, а изоляты «N10» и «N72», выявленные соответственно в Мензелинском и Дрожжановском районах РТ, относятся к 4-му генотипу BLV (рис. 1).

Еще один изолят «N174», выявленный также в Дрожжановском районе РТ, характеризуется признаком нового, ранее не изученного генотипа ВЛКРС, обозначенного нами «8-й генотип», ввиду формирования на выстраиваемой дендрограмме автономного генотипического кластера, в который также входят изученные другими исследователями близкородственные изоляты, выявленные в Украине [«4-1» (GenBank A/N: HM563766); «3-41» (GenBank A/N: HM563767]) и Хорватии

[«M1/ELG_Cro/08» (GenBank A/N: GU724606)], соответственно (рис. 1).

Следует отметить, что предложенная в 2009 году S.M. Rodriguez et al. [5] система классификации BLV на основе филогенетического анализа env-гена, предусматривает наличие 7 генотипов ВЛКРС, Однако, как в данной [5], так и поздней работе G. Moratorio et al (2010) [4], фактически регламентирующей наличие 7 генотипов, не были проанализированы изоляты охарактеризованного нами нового 8-го генотипа, ввиду депонирования их нуклеотидных последовательностей в базу данных GenBank позже публикаций указанных статей [4, 5].

По результатам анализа внутри- и межгенотипической гетерогенности BLV по env-гену установлено, что исключительно «гетерогенный» критерий оценки генетического разнообразия представителей ВЛКРС в контексте определения их таксономической принадлежности на уровне генотипирования не пригоден из-за отсутствия четкого алгоритма идентификации, так как диапазон значений внутригенотипической гетерогенности, выраженный через %-ое отношение, не разграничивает интервал значений межгенотипической гетерогенности (табл. 1).

В процессе системного анализа рестрикционных картирований локуса env-гена известных представителей BLV, в рамках разработки схемы ПЦР-ПДРФ-генотипирования, согласующейся с филогенетической классификацией ВЛКРС, нами подобраны условия идентификации по 6 эндонуклеазам рестрикции. Обобщенная информация с интерпретацией полученных env-ПЦР-ПДРФ-профилей BLV представлена в табл. 2.

Рис. 1. Дендрограмма типовых представителей известных генотипов BLV

Табл. 1. Внутри- и межгенотипическая гетерогенность BLV по ену-гену

ГЕНОТИП 1-й 2-й 3-й 4-й 5-й 6-й 7-й 8-й

1-й 0-5% 2-6% 3-6% 2-7% 4-7% 2-6% 3-7% 2-5%

2-й 2-6% 0-2% 3-4% 2-5% 3-5% 3-4% 3-5% 2-4%

3-й 3-6% 3-4% 0-2% 3-5% 4-6% 3-4% 3-5% 3-4%

4-й 2-7% 2-5% 3-5% 0-4% 3-5% 2-5% 3-6% 2-4%

5-й 4-7% 3-5% 4-6% 3-5% 0-3% 4-5% 4-6% 4-5%

6-й 2-6% 3-4% 3-4% 2-5% 4-5% 0-2% 3-5% 2-3%

7-й 3-7% 3-5% 3-5% 3-6% 4-6% 3-5% 0-4% 3-5%

8-й 2-5% 2-4% 3-4% 2-4% 4-5% 2-3% 3-5% 0-2%

Г Типовой изолят GenBank A/N ПЦР- продукт (п.н.) ПДРФ-фрагменты (п.н.) К N

BamHI PvuII DdeI SspI HphI HaeIII

1-й AL-63 FJS0S571 444 316/12S 444 444 399/45 224/220 19S/94/S7/32/27/6 1 4S

1-й Cow 527 AF007764 444 316/12S 444 444 399/45 224/220 2S5/94/32/27/6 2 S

1-й 23 US7S73 444 316/12S 444 444 399/45 224/220 312/94/32/6 3 1

1-й AL-2106 FJS0S57S 444 444 444 444 399/45 224/220 19S/94/S7/32/27/6 4 36

1-й UruC06II FM95555S 444 444 444 444 399/45 224/220 2S5/94/32/27/6 5 1

1-й Uru3S FM209471 444 444 444 330/114 399/45 224/220 19S/94/S7/32/27/6 6 3

1-й VdM M35239 444 316/12S 444 444 399/45 224/1S1/39 19S/94/S7/32/27/6 7 1

1-й Kurdistan EU266062 444 316/12S 444 444 399/45 220/196/2S 19S/119/94/27/6 S 1

2-й AL-164 FJS0S574 444 316/12S 2S0/164 276/16S 399/45 224/220 19S/94/S7/32/27/6 9 34

2-й PL-4960 FJS0S590 444 316/12S 2S0/164 276/16S 399/45 224/220 19S/S7/49/45/32/27/6 10 1

2-й ARGSFS AF4S5773 444 316/12S 2S0/164 276/16S 399/45 444 19S/94/S7/32/27/6 11 1

2-й AL-1453 FJS0S577 444 316/12S 2S0/164 276/16S 444 224/220 19S/94/S7/32/27/6 12 1

3-й JPFU EF065650 444 316/12S 444 276/16S 399/45 444 2S5/94/32/27/6 13 3

3-й USCA-1 EF065647 444 316/12S 444 276/16S 399/45 444 2S5/94/32/21/6/6 14 1

4-й N72 JF6S3619 444 444 2S0/164 276/16S 399/45 224/220 19S/94/S7/32/27/6 15 24

4-й N10 HM102355 444 444 2S0/164 16S/162/114 399/45 224/220 19S/94/S7/32/27/6 16 1

4-й 3 US7S72 444 444 444 16S/162/114 399/45 224/220 19S/94/S7/32/27/6 17 1

5-й CRAS-2 EF065636 444 316/12S 2S0/164 276/16S 399/45 224/1S1/39 19S/94/S7/32/27/6 1S 7

5-й CRGC EF065639 444 316/12S 2S0/164 276/16S 399/45 224/1S1/39 2S5/94/32/27/6 19 1

5-й CRLC-1 EF065655 444 316/12S 2S0/164 276/16S 444 224/1S1/39 19S/94/S7/32/27/6 20 2

6-й PL-123S FJS0S5S2 444 316/12S 444 276/16S 399/45 224/220 2S5/94/32/27/6 21 3

6-й 151 AY1S5360 444 316/12S 444 276/16S 399/45 224/220 19S/94/S7/32/27/6 22 7

7-й N2S HM102356 444 316/12S 444 276/16S 444 224/137/S3 19S/94/S7/32/27/6 23 17

7-й I2 SS3530 444 316/12S 444 276/16S 444 224/220 2S5/94/32/27/6 24 1

7-й 14 AY515274 444 316/12S 444 276/16S 444 145/137/S3/79 19S/94/S7/32/27/6 25 1

7-й 30 DQ059417 444 316/12S 444 276/16S 444 444 19S/S7/49/45/32/27/6 26 1

S-й N174 JF713455 444 316/12S 444 276/16S 399/45 224/220 225/94/S7/32/6 27 4

Обозначения: Г - генотип; К - комбинация; N - количество известных изолятов БЬУ с соответствующей комбинацией ПЦР-ПДРФ-профилей, чьи нуклеотидные последовательности локуса впу-гена депонированы в базу данных ОепБапк (по состоянию на апрель 2011 г).

Табл. 3. Идентификационная оценка БЬУ-позитивных проб в зависимости от выбранной стратегии типизации

Район Республики Татарстан Исследовано проб ГЕНОТИП

1-й 2-й 3-й 4-й 5-й 6-й 7-й 8-й

К15 К16 К23 К27

Арский 7 6 1

Дрожжановский 12 4 7 1

Кайбицкий 7 7

Лениногорский 10 6 4

Мензелинский 6 4 2

Муслюмовский 3 3

Рыбнослободский 8 5 3

Спасский 8 2 6

Чистопольский 9 3 6

ИТОГО 70 37 5 27 1

ТИПИЗАЦИЯ ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКАЯ КЛАССИФИКАЦИЯ

ГЕНОТИП

1-й 2-й 3-й 4-й 5-й 6-й 7-й 8-й

К15 К16 К23 К27

го < 5г ё ІД И і рц В В ПОДТИП [1] Бельгийский 37 5

Австралийский 27 1

Японский

ГЕНОТИП [3] 1-й 27

2-й

3-й

4-й

5-й

6-й 37 5

? 1

ГРУППА [2] А 37 5

В

С 27

Б

Е 1

Е

Є

В результате применения разработанной нами схемы ПЦР-ПДРФ-генотипирования ВЛКРС, согласующейся с филогенетической классификацией, установлено, что из 70 проанализированных БЬУ-позитивных проб 42 выделенных образца ДНК провируса возбудителя идентифицированы как 4-й генотип ВЛКРС, 27 образцов относятся к 7-му генотипу, а 1 образец изолята «N174» характеризуется признаком нового, ранее не изученного генотипа, обозначенного нами «8-й генотип» БЬУ (табл. 3). Исследованные образцы ДНК провируса ВЛКРС также были проанализированы и с помощью предложенных ранее способов типизации представителей БЬУ, основанных на ПЦР-ПДРФ-анализе [1 2, 3], но не

согласующихся с новым подходом оценки генотипического разнообразия ВЛКРС, основанным на филогенетическом анализе env-гена [4, 5] (табл. 3).

ЛИТЕРАТУРА. 1. Beier, D. Identification of different BLV provirus isolates by PCR, RFLPA and DNA sequencing / D. Beier, P. Blankenstein, O. Marquardt, J. Kuzmak // Berl Munch Tierarztl Wochenschr - 2001. - V. 114. -№ 7-8. - P. 252-256. 2. Fechner, H. Provirus variants of the bovine leukemia virus and their relation to the serological status of naturally infected cattle / H. Fechner, P. Blankenstein, A.C. Looman, J. Elwert, L. Geue, C. Albrecht, A. Kurg, D. Beier, O. Marquardt, D. Ebner // Virology -1997. - V. 237. - № 2. -P. 261-269. 3. Licursi, M. Genetic heterogeneity among bovine leukemia virus genotypes and its relation to humoral responses in hosts / M. Licursi, Y. Inoshima, D. Wu, T. Yokoyama, E.T. Gonzalez, H. Sentsui // Virus Res. - 2002. - V. 86. - № 1-2. - P. 101-110. 4. Moratorio, G. Phylogenetic analysis of bovine leukemia viruses isolated in South America reveals diversification in seven distinct genotypes / G. Moratorio, G. Obal, A. Dubra, A. Correa, S. Bianchi, A. Buschiazzo, J. Cristina, O. Pritsch // Arch. Virol. - 2010. - V. 155. -№ 4. - P. 481-489. 5. Rodriguez, S.M. Bovine leukemia virus can be classified into seven genotypes: evidence for the existence of two novel clades / S.M. Rodriguez, M.D. Golemba, R.H. Campos, K. Trono, L.R. Jones //J Gen Virol. -2009. - V. 90. - № 11. - P. 2788-2797.

ГЕНОТИПИЧЕСКАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ ИЗОЛЯТОВ ВЛКРС, ВЫЯВЛЕННЫХ В ХОЗЯЙСТВАХ РЕСПУБЛИКИ ТАТАРСТАН

Шаева А.Ю., Вафин Р.Р., Хазипов Н.З., Камалов Б.В., Алимов А.М.,

Тагиров М.Ш.

Резюме

В результате филогенетического анализа выравненных нуклеотидных последовательностей локуса впу-гена типовых представителей известных генотипов ВЛРКС установлено, что изолят «N28», выявленный в Спасском районе РТ, принадлежит к кластеру 7-го генотипа, а изоляты «N10» и «N72», выявленные соответственно в Мензелинском и Дрожжановском районах РТ, относятся к 4-му генотипу БЬУ. Еще один изолят «N174», выявленный также в Дрожжановском районе РТ, характеризуется признаком нового, ранее не изученного генотипа ВЛКРС, обозначенного нами «8-й генотип».

GENOTYPIC IDENTIFICATION OF BLV ISOLATES DETECTED IN LIVESTOCK FARMS OF THE REPUBLIC OF TATARSTAN

Shaeva A.Y., Vafin R.R., Khazipov N.Z., Kamalov B.V., Alimov A.M.,

Tagirov M.Sh.

Summary

As a result, phylogenetic analysis of aligned nucleotide sequences of the env-gene locus of typical representatives of known BLV genotypes found that an isolate «N28» detected in Spassky area of RT belongs to a cluster of 7-th genotype, and isolates «N10» and «N72» detected respectively in Menzelinsky and Drozhzhanovsky areas of RT refer to the 4-th genotype of BLV. Another isolate «N174» also detected in the Drozhzhanovsky area of RT is characterized by a new feature not previously studied BLV genotype designated as «8-th genotype».

УДК 619: 618.19

ДИНАМИКА НЕКОТОРЫХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ КРОВИ КОРОВ ПРИ ЛЕЧЕНИИ СУБКЛИНИЧЕСКОЙ ФОРМЫ МАСТИТА БИОГЕННЫМИ СТИМУЛЯТОРАМИ

Шаев Р.К.

ФГОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана»

Ключевые слова: мастит, биогенный стимулятор, состав крови,

лейкоформула, иммуноглобулин, пролактин.

Key words: mastitis, biogenic stimulators, blood composition,

leykoformula, immune globulin, prolactin.

Для лечения субклинической формы мастита у коров мы использовали биогенные стимуляторы «ЭПЛ» и «ПДЭ», которые вводили подкожно в область наружного пахового лимфатического узла, отступя на 2-3 см вниз в лимфатическую сеть согласно утвержденной инструкции и наставлению.

Как видно из таблицы, результатами проведенных гематологических исследований установлено, что в составе крови коров, больных субклиническим маститом, произошли характерные изменения. Так, у коров обеих групп содержание гемоглобина находилось на очень низком уровне и составляло 92,3% и 92,5%, количество эритроцитов составляло 5,92 млн/мкл и 5,82 млн/мкл. Одновременно подсчёт общего числа