СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РИСКА РАЗВИТИЯ ЭНДОМЕТРИОЗА
METHOD FOR PREDICTION OF RISK OF ENDOMETRIOSIS

Изобретение относится к области медицинской диагностики, может быть использовано в гинекологии для прогнозирования риска формирования изолированного эндометриоза.
Во всем мире эндометриозом страдают примерно 176 млн. женщин, число которых постоянно растет, поэтому это заболевание относят к разряду современных эпидемий. Эндометриоз поражает женщин независимо от расовой принадлежности, социально-экономического статуса и возраста - от подростков 10-11 лет до женщин в возрасте 60-70 лет. При хронических тазовых болях и бесплодии наблюдается у 40-70% и 30-50% соответственно. Эндометриоз - доброкачественное разрастание ткани, функционально и морфологически подобной нормальному эндометрию, которое характеризуется повышенным локальным образованием эстрогенов и чувствительностью к ним, а также резистентностью к прогестерону. Эндометриоз - гормонально-зависимое заболевание, сложный патогенез которого остается до конца не расрытым. Выявлена дисфункция иммунной системы, нарушения молекул адгезии, пролиферации клеток и апоптоза. Увеличение уровня цитокинов и воспалительных медиаторов также является важным звеном патогенеза обоих нарушений [Адамян Л.В., Андреева Е.Н. Роль современной гормонмодулирующей терапии в комплексном лечении генитального эндометриоза. Пробл. Репрод. 2011; 17:6:66-77].
Традиционные симптомы эндометриоза - дисменорея, хроническая тазовая боль, диспареуния, бесплодие, однако в последние годы обнаружены достаточно высокие показатели аллергических и аутоиммунных заболеваний, определенную обеспокоенность вызывает возможность злокачественной трансформации при определенных формах эндометриоза. Сопутствующий воспалительный процесс, иммунологическая дизрегуляция, ингибирование апоптоза, активация ангиогенеза - патогенетичекие факторы, способствующие выживанию и росту эндометриоидных имплантов [Vigano Р., Infantino М., Lattuada D. et al. Intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) gene polymorphisms in endometriosis. Mol Hum Reprod 2003; 9:47-52].
Эндометриоз - трудно поддающееся диагностике заболевание, особенно на ранних этапах, чаще диагноз устанавливается, когда пациентка обращается к врачу по поводу бесплодия. Эндометриоз называют «упущенным» заболеванием, поскольку проходит 7-8 лет в среднем от момента появления первых симптомов заболевания до правильной постановки диагноза. К сожалению, до сих пор не разработано простого неинвазивного метода диагностики эндометриоза, что повышает риск рецидива заболевания после прекращения любого метода терапии как консервативного, так и хирургического.
За аналог выбран патент РФ №2360605 (опубл. 10.07.2009) по заявке: 2008102542/14 от 22.01.2008 «Способ диагностики ретроцервикального эндометриоза и эндометриоза крестцово-маточных связок» (Колпинский Г.И, Лобанова О.Г.), где предложен способ выявления минимальных очагов эндометриоза при ультразвуковом исследовании трансвагинальным датчиком в первые три дня после овуляции. Датчик устанавливают в заднем своде влагалища. При наличии в позадишеечной области округлых очагов средней и повышенной эхогенности неоднородной структуры с неровными контурами или при наличии подобных образований в одной из параметральных областей на уровне перешейка диагностируют соответственно ретроцервикальный эндометриоз или эндометриоз крестцово-маточных связок. Способ позволяет выявить минимальные очаги эндометриоза за счет использования овуляторной жидкости в качестве контраста.
Однако эхография не устраняет всех акустических помех со стороны прямой кишки, затрудняющих верификацию мелких очагов ретроцервикального эндометриоза, позволяет диагностировать эндометриоз матки только в активной форме, частота встречаемости которой составляет 66%, что исключает возможность диагностики неактивной формы заболевания, нет данных о точности использования данного метода и не дает возможность спрогнозировать формирование эндометриоидных очагов.
В патенте РФ №2161311 (опубл. 27.12.2000) по заявке №99107082/14, 07.04.1999 «Способ прогнозирования развития эндометриоза, приводящего к нарушению репродуктивной функции у девочек с альгоменореей» (Филонова Л.В. (RU), Брусницина В.Ю. (RU), Александрова Н.Н. (RU)), выбранном за прототип, где предложен способ прогнозирования течения эндометриоза с развитием клинической симптоматики, включающий забор периферической крови и исследование ряда показателей иммунной системы, ответственных за формирование патогенеза эндометриоза, в частности иммуноглобулинов класса М, циркулирующих иммунных комплексов, уровня Т-лимфоцитов (-CD3). Определяют величину диагностического коэффициента F по формуле F=-K10,00793+K20,013-K30,043+3,09, где K1 - показатель IgM, K2 - показатель ЦИК, K3 - показатель Т-клеток (-CD3). Если F>0, то у пациента прогнозируют риск развития эндометриоза, при F<0 - возникновение эндометриоза маловероятно. Для прогнозирования изолированного развития эндометриоза чувствительность и специфичность этого способа недостаточна.
Задачей настоящего исследования является расширение арсенала способов диагностики, а именно создание способа прогнозирования риска формирования изолированного эндометриоза по комбинациям сочетаний генетических полиморфизмов: аллелей -174 С IL-6, -801 A SDF1, +1931 A MIP1β, -592 С IL-10; аллелей -801 A SDF1, -403 G RANTES,+1931 A MIP1β, -592 С IL-10; аллелей -801 A SDF1, -403 G RANTES, -511 С IL-1B, -592 С IL-10; аллелей -801 A SDF1, +1931 A MIP1β, -592 С IL-10; аллелей -174 С IL-6, -801 A SDF1, -403 G RANTES, -592 С IL-10; аллелей -801 А SDF1, AI-TAC, -511 СС IL-1B.
Технический результат использования изобретения - получение критериев оценки риска прогнозирования изолированного эндометриоза у женщин русской национальности, являющихся уроженками Центрального Черноземья России.
В соответствии с поставленной задачей был разработан способ прогнозирования формирования изолированного эндометриоза, включающий:
- забор периферической крови;
- выделение ДНК из периферической венозной крови;
- типирование генетических полиморфизмов генов интерлейкина 6 (-174 G/C IL-6), интерлейкина 1B (-511 С/Т IL-1B), интерлейкина 10 (-592 С/А IL-10), генов хемокинов фактора стромальных клеток (-801 G/A SDF1), макрофагального воспалительноо протеина -1β (+1931 А/Т MIP1β), регулятора активности нормальной экспрессии и секреции Т-клеток (-403 G/A RANTES), интерферона индуцебельного хемоаттрактанта Т-клеток (A/GI-TAC);
- анализ комбинаций сочетаний полиморфизмов гена интерлейкина 6 (-174 С IL-6), интерлейкина 1B (-511 С IL-1B), интерлейкина 10 (-592 С IL-10), генов хемокинов фактора стромальных клеток (-801 A SDF1), макрофагального воспалительноо протеина -1β (+1931 A MIP1β), регулятора активности нормальной экспрессии и секреции Т-клеток (-403 G RANTES), интерферона индуцебельного хемоаттрактанта Т-клеток (A I-TAC) - прогнозирование повышенного риска развития изолированного эндометриоза у больных в случае выявления комбинаций сочетаний аллелей -174 С IL-6, -801 A SDF1, +1931 A MIP1β, -592 С IL-10; аллелей -801 A SDF1, -403 G RANTES, +1931 A MIP1β, -592 С IL-10; аллелей -801 A SDF1, -403 G RANTES, -511 С IL-1B, -592 С IL-10; аллелей -801 A SDF1, +1931 A MIP1β, -592 С IL-10; аллелей -174 С IL-6, -801 A SDF1, -403 G RANTES, -592 С IL-10; аллелей -801 A SDF1, AI-TAC, -511 СС IL-1B.
Новизна и изобретательский уровень заключается в том, что из уровня техники не известна возможность прогноза развития изолированного эндометриоза у женщин русской национальности, являющихся уроженками Центрального Черноземья России, по наличию комбинаций сочетаний аллелей -174 С гена интерлейкина 6 (полиморфизм -174 С IL-6), аллеля -511 С интерлейкина 1 В (полиморфизм -511 С IL-1B), аллелей -592 С интерлейкина 10 (полиморфизм -592 С IL-10), аллелей -801 А фактора стромальных клеток (полиморфизм -801 A SDF1), аллелей+1931 А макрофагального воспалительноо протеина -1β (полиморфизм+1931 A MIP1β), аллелей -403 G регулятора активности нормальной экспрессии и секреции Т-клеток (полиморфизм -403 G RANTES), аллелей А интерферона индуцебельного хемоаттрактанта Т-клеток (полиморфизм A I-TAC).
Изобретения характеризуют следующие графические изображения:
Фиг. 1. Дискриминация аллелей по локусу+1931 А/Т MIP-lp, где ● - гомозиготы +1931АА,  - гомозиготы +1931ТТ,  - гетерозиготы +1931 AT, ♦ - отрицательный контроль.
Фиг. 2. Дискриминация аллелей по локусу -801 G/A SDF1, где ● - гомозиготы -801GG,  - гомозиготы -801АА,  - гетерозиготы -801GA, ♦ - отрицательный контроль.
Фиг. 3. Дискриминация аллелей по локусу -403 G/A RANTES, где ● - гомозиготы -403GG,  - гомозиготы -403АА,  - гетерозиготы -403GA, ♦ - отрицательный контроль.
Фиг. 4. Электрофоретическое разделение продуктов рестрикции гена IL-1B -511, где 1, 9 - гомозиготы -511ТТ; 2, 3, 5, 7, 8- гетерозиготы -511СТ, 4, 6,- гомозиготы -511СС.
Фиг. 5. Электрофоретическое разделение продуктов рестрикции гена -592С/А IL-10, где 1, 8-10 - гомозиготы - 592СС, 4-7, 11-12 - гетерозиготы - 592СА, 2 - гомозигота - 592АА.
Способ осуществляют следующим образом:
ДНК выделяют из образцов периферической венозной крови больных с изолированными гиперпластическими процессами эндометрия методом фенольно-хлороформной экстракции в 2 этапа.
2
На первом этапе к 4 мл крови добавляют 25 мл лизирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% тритон Х-100, 5 мМ MgCl, 10 мМ трис-HCl (pH 7,6). Полученную смесь перемешивают и центрифугируют при 4°C, 4000 об/мин в течение 20 мин. После центрифугирования надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 4 мл раствора, содержащего 25 мМ ЭДТА (pH 8,0) и 75 мМ NaCl, ресуспензируют. Затем прибавляют 0,4 мл 10% SDS, 35 мкл протеиназы K (10 мг/мл) и инкубируют образец при 37°C в течение 16 ч.
На втором этапе из полученного лизата последовательно проводят экстракцию ДНК равными объемами фенола, фенол-хлороформа (1:1) и хлороформа с центрифугированием при 4000 об/мин в течение 10 мин. После каждого центрифугирования производят отбор водной фазы. ДНК осаждают из раствора двумя объемами охлажденного 96% этанола. Сформированную ДНК растворяют в бидистиллированной, деионизованной воде и хранят при -200°С.
Выделенную ДНК затем подвергают полимеразной цепной реакции с использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров (табл. 1).
Структура праймеров и зондов, используемых для генотипирования исследуемых ДНК-маркеров
Молекулярно-генетический анализ проводят методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК. ПЦР осуществляют на амплификаторах IQ5 (BioRad) и ТП4-ПЦР-01-«ТЕРЦИК».
2
На амплификаторе IQ5 (Bio-Rad) проводят анализ полиморфизмов генов +1931 А/Т MIP1β, -801 G/A SDF-1, -403 G/A RANTES, A/G I-TAC, -174 G/C IL-6 полимеразной цепной реакции синтеза ДНК с использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров и специфических зондов с последующим анализом полиморфизма методом дискриминации аллелей. Реакционная смесь объемом 25 мкл включает: 6,7 мМ трис-HCl (pH 8,8), 2,5 мМ MgCl, 0,1 мкг геномной ДНК, по 10 пМ каждого праймера, по 5 пкмоль каждого зонда, по 200 мкМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP и 1 единицу активной Taq-полимеразы. После денатурации выполняют 40 циклов амплификации по схеме: отжиг праймеров и денатурация.
2
На амплификаторе ТП4-ПЦР-01-«ТЕРЦИК» проводят анализ полиморфизма гена -511 С/Т IL-1B, -592 С/А IL-10 методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК с использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров по методике указанной в работе (10). Реакцию проводят в 12,5 мкл общего объема смеси, содержащей 33,5 мМ трис-HCl (pH 8,8), 1,25 мМ MgCl, 0,5 мкг геномной ДНК, по 5 пМ каждого праймера, по 100 мкМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP и 1 единицу активной Taq-полимеразы. После денатурации выполняют 32 цикла амплификации по схеме: денатурация, отжиг праймеров и элонгация. Затем пробы выдерживают 5 мин при 72С и охлаждают. Продукты амплификации анализируют в 2%-ном агарозном геле, окрашенным бромистым этидием, в течение 30 мин при 160V. В качестве электрофорезного буфера используют 1xTAE (трис-ацетатный буфер). Затем пробы идентифицируют в проходящем УФ-свете.
Генотипирование осуществляют методом дискриминации аллелей с использованием Tag Man зондов. При проведении ПЦР в амплификаторе с флюоресцентной детекцией (амплификатор IQ5) генотипирование осуществляют методом Tag Man зондов по данным величин RFU каждого зонда, где RFU - уровень относительной флуоресценции.
Две полосы, вертикальная и горизонтальная, делят график на четыре секции: одна для каждого гомозиготного состояния, одна для гетерозиготного состояния и секция без реакции. Присвоение генотипов неизвестным образцам определяется вычерчиванием RFU для одного флуорофора на оси x относительно RFU для другого флуорофора на оси y на диаграмме дискриминации аллелей.
Если значения RFU неизвестного образца находятся выше горизонтальной полосы и правее вертикальной полосы, генотип гетерозиготен (GA).
Если значения RFU неизвестного образца находятся выше горизонтальной полосы и левее вертикальной полосы, генотип гомозиготен по аллелю 2 (RFU по аллелю 2 отложены по оси y).
Если значения RFU неизвестного образца находятся ниже горизонтальной полосы и правее вертикальной, генотип гомозиготен по аллелю 1 (RFU аллеля 1 отложены по оси x).
Если значения RFU неизвестного образца находятся ниже горизонтальной полосы и левее вертикальной, определение генотипа невозможно (в данном случае неопределенный образец - отрицательный контроль).
Генотипирование ДНК-маркеров (локус -511 С/Т IL-1B, -592 С/А IL-10) производят методом анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) продуктов ПЦР-амплификации специфических участков генома с использованием соответствующих ферментов рестрикции производства фирмы «Сибэнзим» (Новосибирск).
После инкубации рестрикционной смеси в течение 16 ч при температуре 37°C проводят разделение фрагментов ДНК с помощью горизонтального электрофореза на электрофоретических ячейках производства фирмы «Хеликон» (Россия). В зависимости от размера разделяемых фрагментов ДНК используют агарозный гель 2-3% концентрации, приготовленный на основе ТВЕ-буфера, окрашенный раствором бромистого этидия (0,01%). Визуализацию фореграмм осуществлют в темном боксе с трансиллюминатором фирмы UVP (Швеция).
Проводят контроль качества генотипирования с использованием положительных контрольных образцов ДНК с разными генотипами и отрицательного контрольного образца, где вместо ДНК к реакционной смеси добавляют воду.
Формирование базы данных и статистические расчеты осуществляют с использованием программы «STATISTICA 6.0» [Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета программ Ststistica / О.Ю. Реброва // М.: МедиаСфера. - 2006. - 312 с.].
Изучение роли комбинаций генетических вариантов полиморфных маркеров генов интерлейкинов в формировании изолированной миомы матки проводят с помощью программного обеспечения APSampler [http:sources.redhat.com/cygwin/], использующего метод Монте-Карло марковских цепей и байесовсовскую непараметрическую статистику [Favorov А.V. A Gibbs sampler for identification of symmetrically structured, spaced DNA motifs with improved estimation of the signal length / A.V. Favorov, M.S. Gelfand, A.V. Gerasimova [et al.] // Bioinformatics. - 2005. - Vol. 21, №10. - P. 2240-2245].
cor
Оценку уровня статистической значимости полученных результатов проводят с использованием поправки Бонферрони (p), т.е. поправки, минимизирующей вероятность получения ложноположительньгх результатов [Боровиков, В. Statistica: искусство анализа данных на компьютере / В. Боровиков. - 2-е изд. - СПб.: Питер, 2003. - 688 с.: ил. - (Для профессионалов)].
Возможность использования предложенного способа для оценки риска развития изолированного эндометриоза подтверждает анализ результатов наблюдений 713 больных с различными пролиферативными процессами репродуктивной системы (миомой матки, эндометриозом, гиперпластическими процессами эндометрия) и группы популяционного контроля из 500 человек. Среди 713 обследуемых больных у 104 женщин наблюдался эндометриоз. Пациенты включались в соответствующую группу больных только после установления диагноза заболевания, подтвержденного с помощью клинических, лабораторно-инструментальных методов обследования и подтвержденного результата гистологического исследования. В исследуемые группы включались индивидуумы русской национальности, являющиеся уроженцами Центрального Черноземья России и не имеющие родства между собой.
Установлено, что у пациенток с изолированной формой эндометриоза сочетания генетических вариантов аллелей:
cor
-174 CIL-6, -801 A SDF1,+1931 A MIP1β, -592 CIL-10 встречается у 40,00%, что в 3,4 раза чаще, чем в контрольной группе (11,72%, р=0,0000008, p=0,006, OR=5,02 95% CI 2,52-10,01),
cor
-801 A SDF1, -403 G RANTES, +1931 A MIP1β, -592 С IL-10 встречается у 49,18%, что в 2,5 раза чаще, чем в контрольной группе (19,44%, р=0,000001, p=0,009, OR=4,00),
cor
-801 A SDF1, -403 G RANTES, -511 С IL-1B, -592 С IL-10, встречается у 41,77%, что в 2,4 раза чаще, чем в контрольной группе (16,77%, р=0,000004, p=0,03, OR=3,55),
cor
-174 С IL-6, -801 A SDF1, -403 G RANTES, -592 CIL-10 встречается у 37,31%, что в 2,7 раза чаще по сравнению с контрольной группой (;13,84%, р=0,000006, p=0,05, OR=3,70).
cor
-801 A SDF1, +1931 A MIP1β, -592 С IL-10 встречается у 48,38%, что в 2,2 раза чаще по сравнению с контрольной группой (22,00%, р=0,000005, p=0,04, OR=3,32).
cor
и -801 A SDF1, A I-TAC, -511 СС IL-1B встречается у 24,73%, что в 3 раза чаще по сравнению с контрольной группой (8,03%, р=0,000008, p=0,05, OR=3,76).
Конкретный пример использования предложенного способа.
Пациентке X., русской национальности, являющейся уроженкой Центрального Черноземья России, был проведен забор периферической венозной крови, выделение ДНК из периферической венозной крови; типирование генетических полиморфизмов генов интерлейкинов (-174 G/C IL-6), интерлейкина 1B (-511 С/Т IL-1B), интерлейкина 10 (-592 С/А IL-10), генов хемокинов фактора стромальных клеток (-801 G/A SDF1), макрофагального воспалительного протеина -1β (+1931 А/Т MIP1β), регулятора активности нормальной экспрессии и секреции Т-клеток (-403 G/A RANTES), интерферона индуцебельного хемоаттрактанта Т-клеток (A/G I-TAC) и анализ сочетаний полиморфизмов гена интерлейкина 6 (-174 С IL-6), интерлейкина 1 В (-511 С IL-1B), интерлейкина 10 (-592 С IL-10), генов хемокинов фактора стромальных клеток (-801 А SDF1), макрофагального воспалительного протеина -1β (+1931 A MIP1β), регулятора активности нормальной экспрессии и секреции Т-клеток (-403 G RANTES), интерферона индуцебельного хемоаттрактанта Т-клеток (A I-TAC).
Результаты представлены на фиг. 1-5.
Полученные данные свидетельствуют о наличии сочетаний аллелей:
-174 С IL-6, -801 A SDF1,+1931 A MIP1β, -592 С IL-10 (OR=5,02),
-801 A SDF1, -403 G RANTES, +1931 A MIP1β, -592 С IL-10 (OR=4,00),
-801 A SDF1, -403 G RANTES, -511 CIL-1B, -592 С IL-10 (OR=3,55),
-801 A SDF1, +1931 A MIP1β, -592 С IL-10 (OR=3,32),
-174 CIL-6, -801 A SDF1, -403 G RANTES, -592 С IL-10 (OR=3,70),
-801 A SDF1, A I-TAC, -511 CC IL-1B (OR=3,76), что подтверждает необходимость отнесения пациентки в группу риска развития изолированного эндометриоза.
Применение данного способа позволит сформировать группу женщин русской национальности, являющихся уроженками Центрального Черноземья России с повышенным риском развития изолированного эндометриоза. В данной группе женщин рекомендовано проводить исследование концентрации опухолевых маркеров СА125, С А 19-9, РЭА методом иммуноферментного анализа, динамический осмотр УЗИ органов малого таза, простая и расширенная кольпоскопия, бактериоскопическое исследование мазков, МРТ исследование, приоритет выполнения репродуктивных целей осуществлять в молодом репродуктивном возрасте.