Развитие новых методов исследования фертильности сперматозоидов человека

Гончарова О.А., Королькова О.А., Осадчук Л.В., Шабалдин А.В., Филипенко М.Л.

Институт Химической Биологии и Фундаментальной Медицины СО РАН,

Институт Цитологии и Генетики, г. Новосибирск,

НИИ комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний СО РАМН,

г. Кемерово

РАЗВИТИЕ НОВЫХ МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ ФЕРТИЛЬНОСТИ СПЕРМАТОЗОИДОВ ЧЕЛОВЕКА

Как известно, изменения в структуре сперматозоидов являются важным фактором, приводящим к нарушению фертильности у мужчин. В частности, до 7 % мужчин испытывают проблемы с зачатием вследствие функциональных нарушений сперматозоидов. Использование современных молекулярно-биологических методов исследований способно расширить наше понимание о том, какие именно нарушения вносят основной вклад в развитие бесплодия у мужчин, а также может являться первым шагом для разработки будущей терапии. С другой стороны, тщательный мониторинг сперматозоидов, изучение их изменений, как на структурном, так и на молекулярном уровне, а также установление новых молекулярно-генетических маркеров, способных дискриминировать патологические отклонения от нормы, является необходимым условием для применения вспомогательных репродуктивных технологий.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: сперматозоид; фертильность; молекулярно-генетические маркеры; вспомогательные репродуктивные технологии.

Goncharova O.A., Korolkova O.A., Osadchuk L.V., Shabaldin A.V., Filipenko M.L.

Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine HAS,

Institute of Cytology and Genetics, Novosibirsk,

Scientific-Research Institute for complex studying of cardiovascular diseases SB RAMS, Kemerovo

DEVELOPMENT OF METHODS TO IDENTIFY THE FERTILITY POTENTIAL OF HUMAN SPERMATOZOA

Spermatozoa abnormalities have a great influence on men reproductive ability. According to statistics, approximately seven percent of men experience difficulties in fertilization due to abnormal structure of sperm. However, the using of modern molecular biology approaches expands our understanding of disease pathology and could lead to the development of new therapies. On the other side, thoroughly screen of spermatozoa in order to discriminate any pathological changes is an obligatory process for the successful in vitro fertilization procedure.

KEY WORDS: spermatozoa; fertility; molecular markers; in vitro fertilization.

КЛИНИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Согласно современным данным, около 7 % мужчин испытывают сложности с зачатием вследствие функциональных нарушений сперматозоидов [1]. В настоящий момент представляется особенно важным проведение детальной характеристики данных нарушений и выявление их влияния на оплодотворение.

На данный момент универсальным клиническим методом оценки качества сперматозоидов является спермограмма. Нормы основных параметров спермог-раммы, рекомендованные ВОЗ, представлены далее (табл.). Исследование морфологии является очень значимым этапом спермограммы, при этом успешное качество окрашивания сперматозоидов для подсчета по строгим критериям Крюгера может быть достигнуто лишь при использовании сложных методов, например, по Папаниколау, по Шорру, ШГ^Ошк, БрегМае.

Важным свойством сперматозоида является его способность связываться с гиалуроновой кислотой,

основным компонентом блестящей оболочки яйцеклетки. Более того, обнаружена ассоциация между связыванием с гиалуроновой кислотой и отсутствием фрагментации ДНК сперматозоида [2].

Оценка степени фрагментации ДНК сперматозоида важна для достижения оплодотворения, и разработаны зонды, позволяющие разделять живые сперматозоиды в магнитном поле по этому признаку — magnetic-activated cell sorting (MACS). Также этот метод позволяет выявлять другие отклонения, например, наличие маркеров апоптоза, нарушение мембранного потенциала митохондрий и др.

В настоящий момент проводятся исследования с целью выявить новые маркерные гены, экспрессия которых будет коррелировать со степенью целостности ДНК сперматозоида. Как было показано недавно, экспрессия неполной формы KIT тирозиновой киназы, активной во время митоза, коррелирует со степенью интегрированности ДНК сперматозоида и может служить в качестве потенциального маркера для оценки качества человеческой спермы [3].

Корреспонденцию адресовать:

ГОНЧАРОВА Ольга Андреевна,

630090, г. Новосибирск, пр. Лаврентьева, д. 8. Тел.: 8 (383) 363-51-71.

E-mail: olgag.biol@gmail.com

БИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Очевидно, что введение новых функциональных маркеров, которые могли бы являться однозначным

РАЗВИТИЕ НОВЫХ МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ ФЕРТИЛЬНОСТИ СПЕРМАТОЗОИДОВ ЧЕЛОВЕКА

Таблица

Основные параметры спермограммы

Показатель Минимальная граница

Объем эякулята, мл 1,5

Концентрация сперматозоидов, млн/мл 15

Общее количество сперматозоидов, млн. 39

Подвижные сперматозоиды, % 4G

Сперматозоиды с прогрессивным движением, % 32

Жизнеспособность, % 5S

Индекс Крюгера 4

pH 7,2

Пероксидаза-позитивные лейкоциты, млн/мл 1,G

MAR-тест, подвижные сперматозоиды, связанные с частицами 5G

Примечание: Основные характеристики: объем эякулята, его вязкость, концентрация сперматозоидов, их подвижность, количество морфологически нормальных сперматозоидов (по строгому критерию Крюгера) и жизнеспособность.

Также исследуется наличие лейкоцитов и эритроцитов, клеток сперматогенеза, отмечаются некоторые другие компоненты, которые могут находиться в эякуляте (бактерии, кристаллы спермина и др.). Дополнительно выполняется MAR-тест, выявляющий 1дС и 1дА к сперматозоидам на их поверхности. Необходимо отметить, что нормы, предлагаемые ВОЗ, с каждым изданием снижаются. Поскольку они устанавливаются исходя из средних показателей фертильных мужчин, подобная тенденция вызывает тревогу многих специалистов. Также озадачивает тот факт, что если ранее существовали нормы ВОЗ по индексу Крюгера не менее 15 и рекомендации использовать ЭКО-ИКСИ в случае, если он не превышает 4, то издание 2010 года определяет индекс 4 и более как нормальный, то есть вообще не требующий коррекции и использования ВРТ.

способом оценки фертильности сперматозоидов человека, является крайне необходимым. Использование современных молекулярно-биологических методов исследований способно расширить наше понимание о том, какие именно нарушения вносят основной вклад в развитие бесплодия у мужчин.

Одним из новейших методов являются транскрип-томные исследования. Определение «транскриптом» включает в себя совокупность всех молекул РНК, находящихся в клетке и образующихся в результате геном-специфичной экспрессии. Транскриптомные исследования позволяют проводить изучение десятков тысяч генов одновременно, что значительно улучшает шансы при поиске новых маркерных генов. Транс-криптом сперматозоида является уникальным в своем роде явлением, так как широко известно, что ДНК

сперматозоида в результате череды событий сперматогенеза компактизуется при помощи специфичных белков протаминов и становится транскрипционно неактивной. Остаточная РНК, находящаяся в цитоплазме сперматозоида, является продуктом постмейоти-ческой транскрипции. Полагают, что она сохраняется в течение созревания и после слияния сперматозоида и яйцеклетки [4, 5].

Исследования специфичных транскриптов сперматозоида проводятся как с помощью метода ПЦР в реальном времени (в случае одиночных генов), так и экспрессионных чипов. При выполнении данного типа исследований чаще всего используется сравнение профилей экспрессии у мужчин с нарушением сперматогенеза и фертильных мужчин, с целью выявления характерных маркеров фертильности. Так, например, было показано, что уровень экспрессии гена ароматазы сперматозоидов коррелирует с подвижностью и патологическими изменениями морфологии сперматозоидов [6].

Областью исследования протеомики является изучение общего состава белков клетки, их функции и метаболизма. В частности, изучаются структурные изменения и химические модификации белков (посттран-сляционные модификации) [7, 8]. Протеомные исследования сперматозоидов пациентов с астенозоосперми-ей показали значительные различия в количествах белков-кандидатов по сравнению с контрольными образцами. Если рассматривать функциональные группы, к которым они могут быть отнесены, то преимущественно это белки, отвечающие за энергетический биосинтез, поддержание структуры клетки, подвижность, а также клеточной сигнализации и регуляции [9].

Представленные выше системные методы обладают очевидным преимуществом при общем скрининге, однако не являются исчерпывающими в плане исследования функций отдельных генов. В данном случае использование модельных животных является одним из прогрессивных методов, позволяющих изучать патологию развития болезни в контексте целого организма. Существуют различные стратегии получения модельных организмов, в частности, они могут быть направлены как на нарушение функции гена (нокаут), так и на изменение функции уже существующего гена (трансген). Например, при исследовании мышей с нокаутом по гену 8ЛС (растворимая аденилат циклаза) было выявлено, что данные мыши имеют нарушения в подвижности сперматозоидов, и таким образом была доказана значимость этого фермента для инициации подвижности [10].

Сведения об авторах:

ГОНЧАРОВА Ольга Андреевна, мл. науч. сотрудник, Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, г. Новосибирск, Россия. E-mail: olgag.biol@gmail.com

КОРОЛЬКОВА Ольга Александровна, Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, г. Новосибирск, Россия. E-mail: suslay@mail.ru

ОСАДЧУК Людмила Владимировна, доктор биол. наук, ведущий науч. сотрудник, Институт цитологии и генетики, г. Новосибирск, Россия. E-mail: losadch@bionet.nsc.ru

ШАБАЛДИН Андрей Владимирович, доктор мед. наук, ведущий науч. сотрудник, НИИ комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний СО РАМН, г. Кемерово, Россия. E-mail: weit2GG7@yandex.ru

ФИЛИПЕНКО Максим Леонидович, канд. биол. наук, руководитель группы фармакогеномики, Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, г. Новосибирск, Россия. E-mail: max@niboch.nsc.ru

ИССЛЕДОВАНИЯ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МЕХАНИЗМОВ СОЗРЕВАНИЯ СПЕРМАТОЗОИДОВ И ИХ НАРУШЕНИЙ, КАК КЛЮЧ К ИДЕНТИФИКАЦИИ НОВЫХ МАРКЕРНЫХ ГЕНОВ

Процесс сперматогенеза

Сперматогенез — это комплексный процесс, в результате которого происходит формирование зрелых сперматозоидов.

На первой, пролиферативной, стадии первичные половые клетки сперматогонии интенсивно делятся митозом. Затем часть из них превращается в спер-матоциты первого порядка, вступив в профазу I ме-йоза, и наступает стадия роста: усиливается синтез РНК и белка, клетки увеличиваются в размерах. Во время следующей стадии созревания происходят два мейотических деления подряд: после первого образуются сперматоциты второго порядка, после второго — сперматиды. Эти клетки превращаются в сперматозоиды за время стадии формирования, длящейся у человека около 4 недель.

Пролиферация гамет находится в сильной зависимости от гонадотропина, который действует через О-белок связанные рецепторы, находящиеся на клетках Сертоли. Тестостерон также принимает участие в регуляции сперматогенеза, действуя через андро-геновые рецепторы на клетках Сертоли [11].

Во время стадии формирования сперматозоид приобретает свойственные высокоспецифичные черты. Для большей жизнеспособности в широком диапазоне условий клетка избавляется от большей части цитоплазмы, ее ядро становится компактным за счет плотной упаковки хромосом. При этом из аппарата Гольджи формируется акросома, фибриллы одной из центросом удлиняются, формируя хвост, у основания которого в шейке располагается большое количество митохондрий.

Важно, что после каждого деления большинство клеток сохраняют между собой цитоплазматические мостики, формируя таким образом синцитий [12].

Основные молекулярные нарушения сперматогенеза можно отнести к двум различным группам: изменения в сперматидных органеллах, влияющие на дальнейшее развитие сперматозоида, и самостоятельные нарушения структуры формирующегося сперматозоида.

Манжетка является сперматидной органеллой, представляющей собой скопление микротрубочек, окружающих ядро формирующейся сперматиды и сос-

тоящих из тубулинов и белков, ассоциированных с микротрубочками. К функциям манжетки следует отнести транспорт белков, а также участие в сборке хвостика и конденсации ядра сперматиды. Микротрубочки, в частности, содержат альфа-тубулин и бе-та-тубулин гетеродимеры, гамма-тубулин и кератин

[13].

Серьезные изменения морфологии манжетки наблюдаются в случае мутации белка Ие8Йп (СЫР-170), что последовательно приводит к нарушениям развития сперматозоидов. Например, мыши, содержащие мутантый белок СЫР-170, имеют сперматозоиды с аномальной формой головки. Ие811п является цитоплазматическим связывающим белком, также принимающим участие в регуляции тубулиновой динамики [13].

Сперматидный перинуклеарный РНК/ДНК связывающий белок БРЫИ экспрессируется в постмейо-тических герминальных клетках манжетки. В случае потери функции данного гена происходит развитие дефектного эпителия семенных извитых канальцев и образование сперматозоидов с нарушениями строения жгутика, как было выяснено в результате изучения нокаутных животных [13].

Далее мы рассмотрим некоторые самостоятельные нарушения структур формирующегося сперматозоида на примере дисплазии фиброзного слоя сперматозоида и нарушений формирования правильного осевого сочленения головки и шейки сперматозоида.

Нарушения в строении хвостика сперматозоида оказывают сильное влияние на его подвижность. Во многих случаях сперматозоиды с короткими и тонкими хвостиками имеют ярко выраженное нарушение строения фиброзного слоя или дисплазию фиброзного слоя. Как показал анализ тестикулярных биопсий, данное заболевание развивается в результате нарушения развития фиброзного слоя и цитоскелета хвостика в период поздней фазы сперматогенеза. На молекулярном уровне данное нарушение вызвано недостатком динеиновых «ручек» в сперматозоиде. Заболевание является системным, и также развивается по похожему механизму в дыхательном эпителии. Выявлены кандидатные гены, которые могут отвечать за развитие заболевания, такие как сигнальные трансдукторы АКАР3 и АКАР4, являющиеся одними из самых многочисленных белков фиброзного слоя, либо белок ОпаЬ8 (тяжелой цепи динеина). На данный момент остается неясным, является ли это заболевание наследуемым и передается ли оно с по-

Information about authors:

GONCHAROVA Olga Andreevna, junior research scientist, Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine RAS, Novosibirsk, Russia. E-mail: olgag.biol@gmail.com

KOROLKOVA Olga Aleksandrovna, Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine RAS, Novosibirsk, Russia. E-mail: suslay@mail.ru OSADCHUK Ludmila Vladimirovna, doctor of biological sciences, leader scientist, Institute of Cytology and Genetics, Novosibirsk, Russia. E-mail: lo-sadch@bionet.nsc.ru

SHABALDIN Andrey Vladimirovich, doctor of medical sciences, Scientific-Research Institute for complex studying of cardiovascular diseases SB RAMS, Kemerovo, Russia. E-mail: weit2007@yandex.ru

FILIPENKO Maxim Leonidovich, candidate of biological sciences, Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine RAS, Novosibirsk, Russia. E-mail: max@niboch.nsc.ru

РАЗВИТИЕ НОВЫХ МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ ФЕРТИЛЬНОСТИ СПЕРМАТОЗОИДОВ ЧЕЛОВЕКА

мощью моногенного либо полигенного признака. Терапия также находится в стадии разработки [14].

Неправильное прикрепление головки сперматозоида к шейке чаще всего встречается вследствие нарушения процесса расхождения центриолей и происходит в течение ранних событий сперматогенеза. В подобном случае наблюдаются неудачи в течение всех попыток ИКСИ. При снижении активности про-теасом происходит ослабление высвобождения центросомы и формирование центросомы после оплодотворения, что, в конечном счете, приводит к нарушению сингамии и выбрасыванию эмбриона [14]. Характеристика нарушений цитоскелета хвостика и центрио-лей является еще малоизученной областью патологии сперматогенеза, и необходимо развитие новых экспериментальных методов, способствующих изучению этих аномалий и, как следствие, разработке новых лекарственных препаратов в будущем.

Капацитация

В момент эякуляции сперматозоиды из эпидиди-миса смешиваются с секретом семенных пузырьков, содержащим семеногелин, и секретом простаты, содержащим ПСА и ионы цинка, и эта смесь имеет гелеобразную структуру. Для достижения сперматозоидами нормальной подвижности необходимо разжижение этого сгустка, обеспечиваемое трипсиноподобным про-теазным действием ПСА на семеноглин в условиях снижения концентрации ионов цинка, происходящего в половых путях [15].

В фаллопиевой трубе сперматозоид претерпевает капацитацию — ряд обратимых изменений, необходимых для успешного связывания с яйцеклеткой. При капацитации под влиянием прогестерона, во-первых, снижается содержание стеринов в плазматической мембране (что приводит к увеличению ее проницаемости), во-вторых, увеличивается внутриклеточная концентрация ионов кальция, бикарбоната и супероксидного радикала, что приводит к активации аденилатциклазы, в результате чего в клетке увеличивается содержание цАМФ и происходит цАМФ-зависимое фосфорилирование тирозина мембранных и цитозольных белков.

Таким образом, можно выделить два основных фактора, оказывающих влияние на процесс капаци-тации: концентрация внутриклеточного кальция, которая также играет важную роль при процессе слияния сперматозоида с оолеммой и акросомальной реакции, а также фосфорилирование белков по остатку тирозина. На данный момент остается неизвестным полный перечень киназ, осуществляющих тирозиновое фосфорилирование. Как было показано в исследованиях [16], в сперматозоиде человека находятся по крайней мере 18 тирозин-фосфорили-рованных белков, включающих структурные белки, белки ионных каналов и клеточного метаболизма. Например, заякоренные белки А-киназы являются одними из основных тирозин-фосфорилированных белков волокнистого слоя. Несмотря на то, что роль

фосфорилирования тирозина белков остается на данный момент неясной, тем не менее, мы можем утверждать с определенной долей уверенности, что она сильно коррелирует со способностью сперматозоида связываться с яйцеклеткой на более поздних этапах [1].

Модификация тирозиновых остатков именно в шейке и мембране хвоста необходима для перехода сперматозоида в гиперактивированное состояние, и ее недостаточность приводит к снижению вероятности оплодотворения в ЭКО. Кроме того, у мужчин с астенозооспермией при капацитации отмечается замедление фосфорилирования белков хвоста. Фос-форилирование в шейке важно для последующего связывания сперматозоида с блестящей оболочкой [17-19].

Ослабленная подвижность сперматозоида либо полное отсутствие подвижности являются одним из важнейших факторов мужского бесплодия. При помощи исследований нокаутных мышей были выявлены некоторые ключевые факторы, играющие важную роль в инициации подвижности. В частности, к ним можно отнести структурные белки хвостика, киназа А заякоренные белки (АКАР3, АКАР4), ди-неины, протеин киназу А, серин-треониновые киназы и фосфатазы, а также гликолитические и митохондриальные белки. Также стоит отметить значимость Р13 киназы, так как было показано, что ее ингибирование при помощи специфичного ингибитора ЬУ294002 приводит к значительному увеличению подвижности сперматозоида [20]. Выработка АТФ также является очень важным фактором. На данный момент известно, что не только процесс окислительного фосфорилирования в митохондриях, но и гликолиз обеспечивают сперматозоид необходимым количеством энергии. Так, например, фиброзный слой связан с такими ферментами, как ЬОН, ОАРОБ, гек-сокиназа, а мыши нокаутные по гену ОАРОБ имеют ярко выраженные нарушения подвижности и фертильности сперматозоидов [1].

Молекулярные механизмы капацитации являются достаточно сложными, так как происходит активация различных сигнальных путей. Предполагается, что аденозиновый рецептор А1, фактор роста фиб-робластов и рецептор для активации кровяных пластинок могут играть важную роль в данном процессе. Одной из характерных нокаутных мышиных моделей с нарушением капацитации являются мыши с дефектным геном бета-1,4-галактозилтрансферазы, который является потенциальным 7Р3 рецептором сперматозоида [1].

Для обеспечения своевременности капацитации сперматозоидов существует ряд декапацитирующих факторов, содержащихся в семенной плазме либо вырабатываемых клетками женского репродуктивного тракта, но окончательно механизм и компоненты капацитации-декапацитации еще не установлены. Однако известно, что сперматозоиды капацитируют-ся порциями на период 1-4 часа, за счет чего пос-

Работа поддержана грантом Президиума СО РАН (Интеграционный проект № 84).

тоянно происходит смена пула гамет, готовых к оплодотворению яйцеклетки.

ИССЛЕДОВАНИЕ РОЛИ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ИЗМЕНЕНИЙ СПЕРМАТОЗОИДА ВО ВЗАИМОДЕЙСТВИИ «СПЕРМАТОЗОИД-ЯЙЦЕКЛЕТКА»

Акросомальная реакция

Достигнув лучистого венца, сперматозоид высвобождает из акросомы гиалуронидазу, растворяющую кумулюс, и акрозин, способствующий проникновению через блестящую оболочку и слиянию мембран сперматозоида и ооцита. Слияние происходит при условии адекватного взаимодействия с белками блестящей оболочки 7Р3 и 7Р4, строение которых видоспецифично, благодаря чему акросомная реакция может развиваться только при взаимодействии гамет представителей одного вида [21].

После слияния мембран происходит повышение уровня кальция в ооплазме, кортикальные гранулы ооцита сливаются с мембраной и экзоцитируют в пе-ривителлиновое пространство протеолитические ферменты, модифицирующие гликопротеины блестящей оболочки, что приводит к потере сродства к рецепторам сперматозоидов и к невозможности развития у них акросомальной реакции. Ооцит активируется и завершает второе деление мейоза, отделяется второе полярное тельце, ядра гамет деконденсируются и формируют пронуклеусы. При этом критичным фактором для осуществления этих событий является осцилляция концентрации ионов кальция в ооците, вызванная сперматозоидом. На данный момент считается,

что триггером этой осцилляции является фосфоли-паза С дзета — РЬСж [22], и показано, что ее недостаточность или дефектность вследствие мутаций приводит к снижению фертильности мужчин [23].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

С развитием методов вспомогательных репродуктивных технологий стало очевидно влияние состояния сперматозоида на вероятность оплодотворения и развития эмбриона при использовании методов ЭКО, ЭКО-ИКСИ и ИМСИ (ИКСИ при 6000-кратном увеличении), что способствовало разработке более совершенных систем определения морфологии гамет [24]. В действительности, даже сперматозоиды с патологической морфологией способны оплодотворить яйцеклетку, однако в данном случае мы не можем с большой уверенностью утверждать, насколько функционален вклад генетического и эпигенетического материала, переносимый таким сперматозоидом [14].

Изучение механизмов оплодотворения у человека затруднено по этическим причинам, и большинство исследований проводятся на клетках, использованных в программах вспомогательных репродуктивных технологий без адекватного оплодотворения и развития эмбриона, что делает невозможным оценить все последствия.

Соответственно, тщательный мониторинг сперматозоидов, изучение их изменений, как на структурном, так и на молекулярном уровне, а также установление новых молекулярно-генетических параметров, способных дискриминировать патологические изменения от нормы, является первостепенной научной задачей современной эмбриологии.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Molecular markers of human sperm functions /Muratori M., Luconi M., Marchiani S. et al. //Int. J. Androl. - 2008 - V. 32(1). - P. 25-45.

2. Hyaluronic acid binding ability of human sperm reflects cellular maturity and fertilizing potential: selection of sperm for intracytoplasmic sperm injection /Huszar G., Ozkavukcu S., Jakab A. et al. //Curr Opin. Obstet. Gynecol. - 2006. - V. 18(3). - P. 260-267.

3. Expression of a truncated form of KIT tyrosine kinase in human spermatozoa correlates with sperm DNA integrity /Muciaccia B., Sette C., Paronetto M.P. et al. //Hum. Reprod. - 2004. - V. 25(9). - P. 2188-2202.

4. Martins, R.P. RNA in human sperm /Martins R.P., Krawetz S.A. //Asian J. Androl. - 2005. - V. 7(2). - P. 115-120.

5. Miller, D. Towards a better understanding of RNA carriage by ejaculate spermatozoa / Miller D., Ostermeier G.C. //Hum. Reprod. Update. -2006. - V. 12(6). - P. 757-767.

6. Carreau, S. Mammalian sperm quality and aromatase expression /Carreau S., Delalande C., Galeraud-Denis I. //Microsc. Res. Tech. - 2009. -V. 72(8). - P. 552-557.

7. Testicular postgenomics: targeting the regulation of spermatogenesis /Calvel P., Rolland A.D., Jegou B. et al. //Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. - 2010. - V. 365(1546). - P. 1481-1500.

8. Novel epididymal proteins as targets for the development of post-testicular male contraception /Sipila P., Jalkanen J., Huhtaniemi I.T. et al. //Reproduction. - 2009. - V. 137(3). - P. 379-389.

9. Oliva, R. Sperm cell proteomics /Oliva R., de Mateo S., Estanyol J.M. //Proteomics. - 2009. - V. 9(4). - P. 1004-1017.

10. Jamsai, D. Mouse models as tools in fertility research and male-based contraceptive development /Jamsai D., O'Bryan M.K. //Handb. Exp. Pharmacol. -2010. - V. 198. - P. 179-194.

11. Ruwanpura, S.M. Hormonal regulation of male germ cell development /Ruwanpura S.M., McLachlan R.I., Meachem S.J. //Endocrinol. - 2010. -V. 205(2). - P. 117-131.

12. Moens, P.B. Intercellular bridges and division patterns of rat spermatogonia /Moens P.B., and Go V.L. //Z Zellforsch Mikrosk Anat. - 1972. -V. 127(2). - P. 201-208.

13. Surfing the wave, cycle, life history, and genes/proteins expressed by testicular germ cells. Part 2: changes in spermatid organelles associated with development of spermatozoa /Hermo L., Pelletier R.M., Cyr D.G. et al. //Microsc. Res. Tech. - 2010. - V. 73(4). - P. 279-319.

14. Chemes, H.E. The making of abnormal spermatozoa: cellular and molecular mechanisms underlying pathological spermiogenesis /Chemes H.E., Rawe V.Y. //Cell Tissue Res. - 2010. - V. 341(3). - P. 349-357.

15. Yoshida, M. Control of sperm motility and fertility: diverse factors and common mechanisms /Yoshida M., Kawano N., Yoshida K. //Cell Mol. Life Sci. - 2008. - V. 65(21). - P. 3446-3457.

16. Phosphoproteome analysis of capacitated human sperm. Evidence of tyrosine phosphorylation of a kinase-anchoring protein 3 and va-losin-containing protein/p97 during capacitation /Ficarro S., Chertihin O., Westbrook V.A. et al. //J. Biol. Chem. - 2003. - V. 278(13). -P. 11579-11589.

17. Soluble adenylyl cyclase as an evolutionarily conserved bicarbonate sensor /Chen Y., Cann M.J., Litvin T.N. et al. //Science. - 2000. -V. 289(5479). - P. 625-628.

РАЗВИТИЕ НОВЫХ МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ ФЕРТИЛЬНОСТИ СПЕРМАТОЗОИДОВ ЧЕЛОВЕКА

18. Identification of sterol acceptors that stimulate cholesterol efflux from human spermatozoa during in vitro capacitation /Langlais J., Kan F.W., Granger L. et al. //Gamete Res. - 1988. - V. 20(2). - P. 185-201.

19. Capacitation of mouse spermatozoa. II. Protein tyrosine phosphorylation and capacitation are regulated by a cAMP-dependent pathway /Visconti P.E., Moore G.D., Bailey J.L. et al. //Development. - 1995. - V. 121(4). - P. 1139-1150.

20. Phosphatidylinositol 3-kinase inhibition enhances human sperm motility /Luconi M., Marra F., Gandini L. et al. //Hum. Reprod. - 2001. -V. 16(9). - P. 1931-1937.

21. Cracking the egg: increased complexity in the zona pellucida /Conner S.J., Lefievre L., Hughes D.C. et al. //Hum. Reprod. - 2005. - V. 20(5). -P. 1148-1152.

22. PLC zeta: a sperm-specific trigger of Ca(2+) oscillations in eggs and embryo development /Saunders C.M., Larman M.G., Parrington J. et al. //Development. - 2002. - V. 129(15). - P. 3533-3544.

23. Reduced amounts and abnormal forms of phospholipase C zeta (PLCzeta) in spermatozoa from infertile men /Heytens E., Parrington J., Coward K. et al. //Hum. Reprod. - 2009. - V. 24(10). - P. 2417-2428.

24. Intracytoplasmic morphologically selected sperm injection: a prospective randomized trial /Antinori M., Licata E., Dani G. et al. //Reprod Bi-omed Online. - 2008. - V. 16(6). - P. 835-841.

СЕМЕЙНАЯ ТРАПЕЗА - ЛЕКАРСТВО ОТ ДЕТСКОЙ АСТМЫ По данным исследования Университета Иллинойса, помочь детям-астматикам значительно легче, чем можно представить. Приемы пищи в семейном окружении способны помочь в борьбе с недугом.

Притом, условия лечения очень просты. Отсутствие перекусов в течение дня, мобильных телефонов, прессы и телевизора во время обеда или ужина, соблюдение этикета за столом и общение с ребенком - вот и все, что требуется соблюдать.

Родители, тратя всего 5 минут на воспитательные беседы и 12-15 минут на позитивные разговоры, помогают больным детям расслабиться.

Конечно, для достижения результата, такие трапезы должны быть регулярными и проходить примерно в одно и то же время. Иными словами, нужно создать правильный режим питания.

В процессе эксперимента, с детьми 5-12 лет велись беседы об их жизни, а семейные ужины записывались на видео. Анализ полученной информации показал, что снятие симптомов тревоги, прием лекарств в назначенное время и умственная активность ребенка напрямую связаны с общением с родителями и приемом пищи в семейном кругу. Нарушение режима питания, напротив, вело к ухудшению состояния детей-астматиков.

Источник: medici.ru