СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ИММУНОСУПРЕССИВНОЙ ТЕРАПИИ ХРОНИЧЕСКОГО ГЛОМЕРУЛОНЕФРИТА С НЕФРОТИЧЕСКИМ СИНДРОМОМ
METHOD FOR PREDICTION OF PESPONSE RATE TO IMMUNOSUPPRESSIVE THERAPY OF CHRONIC GLOMERULONEPHRITIS WITH NEPHROTIC SYNDROME

Изобретение относится к области медицины, в частности к терапии и нефрологии.
В современной нефрологии для прогнозирования течения хронического гломерулонефрита (ХГН) с нефротическим синдромом (НС), эффективности иммуносупрессивной терапии и выбора тактики ведения больного используют клинические критерии (возраст, пол, наличие артериальной гипертензии, нарушения функции почек, длительность НС).
Например, в работе Shiiki H. et al. Prognosis and risk factors for idiopathic membranous nephropathy with nephritic syndrome in Japan // Kidney Int. 2004; 65: 1400-1407 на основании многофакторного анализа было показано, что факторами неблагоприятного прогноза у больных ХГН (мембранозной нефропатией) являются мужской пол, возраст старше 60 лет, повышение креатинина сыворотки крови и тубулоинтерстициальные изменения в биоптате почки.
Однако в этом случае клинические критерии разработаны только для одного варианта ХГН в определенной популяции. Для оценки дополнительных критериев прогноза - морфологических (тубулоинтерстициальный фиброз, артериолосклероз, гломерулосклероз в биоптате почечной ткани, морфологически неблагоприятные формы нефрита) необходимо проведение дорогостоящей инвазивной процедуры биопсии почки.
К одним из биомаркеров, отражающих степень повреждения подоцитов (подоцитарной дисфункции) у больных ХГН, относится уровень экскреции с мочой структурного белка щелевой диафрагмы - нефрина (нефринурия). До настоящего времени исследование нефринурии (НУ) проводилось, главным образом, в эксперименте. В работе Nakatsue Т., Koike H., Han G.D. et al. Nephrin and podocin dissociate at the onset of proteinuria in experimental membranous nephropathy. Kidney Int. 2005; 67: 2239-2253 уточнена роль экскреции нефрина с мочой и уменьшения его экспрессии в ткани почки как важной причины, лежащей в основе развития протеинурии.
У человека метод оценки нефринурии (Western blotting) применен в работе Patari A., Forsblom С., Havana M. et al. Nephrinuria in diabetic nephropathy of type 1 diabetes. Diabetes 2003; 52: 2969-2974. Однако показатель экскреции нефрина с мочой был оценен качественно только с целью ранней диагностики диабетической нефропатии у больных сахарным диабетом, не было установлено точных значений нефринурии для оценки прогноза.
Задачей изобретения является способ прогнозирования эффективности иммуносупрессивной терапии у больных хроническим гломерулонефритом с нефротическим синдромом.
Поставленная задача решается способом, который заключается в том, что у больных хроническим гломерулонефритом с нефротическим синдромом определяют в моче уровень нефрина до начала терапии и при его величине менее 17 нг/мл прогнозируют эффективность иммуносупрессивной терапии.
Практически способ осуществляют следующим образом:
1. 10 мл утренней мочи центрифугируют для отделения клеток и осадка при 3000 об. в течение 15 мин, надосадочную жидкость замораживают при температуре -20°C.
2. Непосредственно перед исследованием образцы мочи выдерживают при комнатной температуре до полного размораживания.
3. В каждую лунку набора добавляют по 100 мкл стандартного раствора (биотин-конъюгированные поликлональные антитела к нефрину) и образца мочи, инкубируют 2 часа при температуре 37°C; после жидкость удаляют без промывания лунок.
4. Добавляют 100 мкл реагента А (авидин, конъюгированный с пероксидазой), инкубируют 1 час при температуре 37°C.
5. Промывают 400 мкл Wash solution 3 раза, в конце удаляют остатки раствора адсорбентной бумагой.
6. Добавляют 100 мкл реагента В (ТМВ раствор), инкубируют 30 мин при температуре 37°C, раствор при этом становится голубым.
7. Добавляют 50 мкл стоп-раствора (серной кислоты), инкубируют 15-25 мин (не более 30 мин) при температуре 37°C, при добавлении стоп-реагента раствор становится желтым.
8. Показатели снимают на спектрофотометре с длиной волны 450 нм.
9. Полученные показатели спектрофотометра переводят в значения нг/мл путем построения стандартной калибровочной кривой с помощью программы STATISTICA 6,0.
Показатели нефринурии были получены в результате обследования 74 больных с различной степенью активности и прогрессирования ХГН (от 18 до 74 лет), из них - у 38 больных с нефротическим синдромом (НС), находившихся на стационарном лечении в клинике нефрологии, внутренних и профболезней Первого МГМУ им. И.М.Сеченова с 2007 по 2010 год.
Детальный анализ экскреции нефрина с мочой был проведен у больных с НС - в группе с клинически наиболее выраженным повреждением гломерулярного фильтра. Показатель НУ у данной категории пациентов характеризовался высокой вариабельностью от 0,5 до 58 нг/мл. Сроки достижения ремиссии нефротического синдрома при назначении иммуносупрессивной терапии были оценены у 23 больных с исходно разным уровнем нефринурии. Рассчитав диагностические чувствительность и специфичность показателя НУ для прогнозирования эффективности лечения у больных с НС, была построена ROC-кривая и определена точка разделения «cut-off», равная 17 нг/мл. Группы больных ХГН с показателями НУ выше и ниже этого уровня достоверно не отличались по возрасту, полу, выраженности нефротического синдрома, наличию артериальной гипертензии и нарушения функции почек к началу иммуносупрессивной терапии.
У 9 из 11 (82%) больных с низкой (<17 нг/мл) экскрецией нефрина с мочой ремиссия НС была достигнута в течение полугода лечения (медиана составила 4 мес), причем у 5 больных этой подгруппы НС купирован достаточно быстро - в течение 4 месяцев. В то же время среди 12 пациентов с высокими (>17 нг/мл) показателями НУ только у 2 к 6 месяцам лечения наступила частичная ремиссия НС, еще у 2 больных удалось купировать НС в результате более длительной иммуносупрессивной терапии (в течение 10 и 27 мес). У 8 из 12 (67%) больных с высокой НУ не был получен ответ на адекватную терапию различными иммуносупрессивными препаратами (включая введение сверхвысоких доз преднизолона и циклофосфана, лечение циклоспорином и микофенолата мофетилом), проводимую в течение длительного срока (медиана 27 мес) от 9 мес до 2,5 лет (фиг.1). На фиг.1 представлены две кривые, построенные по методу Каплана-Майера, отражающие сроки достижения ремиссии нефротического синдрома при назначении иммуносупрессивной терапии. По оси абсцисс отложена длительность иммуносупрессивной терапии в месяцах, по оси ординат - доля (%) больных с сохраняющимся НС в группе. Непрерывная кривая отражает сроки достижения ремиссии НС (эффективность иммуносупрессивной терапии) у больных с НУ менее 17 нг/мл, пунктирная кривая - с НУ более 17 нг/мл. Пустой маркер (о) свидетельствует об эффективности иммуносупрессивной терапии и достижении ремиссии нефротического синдрома, крестик (+) - об отсутствии ответа на проводимую иммуносупрессивную терапию и сохранении НС. Различия между группами статистически достоверны (критерий Гехана = -3,154, p=0,002, критерий logrank = 2,97, p=0,003).
Рассчитав отношения шансов, было показано, что при отсутствии эффекта иммуносупрессивной терапии через 6 мес у больных с НУ>17 нг/мл шансы достичь ремиссии НС в дальнейшем снижаются в 7 раз. Напротив, у больных с НУ<17нг/мл вероятность достижения ремиссии НС в течение первых 6 месяцев лечения очень высока - в 23 раза выше, чем у больных с высоким ее уровнем (ОШ=22,5, р<0,05).
На фиг.2 представлена ROC-кривая, по оси ординат отложены точки чувствительности метода определения нефринурии для прогнозирования эффективности иммуносупрессивной терапии, по оси ординат - 1-специфичность, пунктиром отмечены оптимальные показатели чувствительности (80%) и специфичности (85%) для уровня нефринурии менее 17 нг/мл. Характер расположения ROC-кривой и высокий показатель площади под кривой (AUC=0,864) свидетельствует о том, что уровень НУ обладает высокой информативностью в прогнозировании ответа на лечение иммуносупрессивными препаратами.
Следующие примеры иллюстрируют способ по изобретению.
Клинический пример N1.
Больная Р., 36 лет, находилась в нефрологическом отделении клиники с 27.10.2009 г. по 17.02.2009 г. с диагнозом: Хронический гломерулонефрит нефротического типа (морфологически - фокальный сегментарный гломерулярный склероз, биопсия от 18.11.2009 г.) с сохранной функцией почек.
Жалобы при поступлении: на головные боли, выраженные отеки голеней, эпизоды повышения АД до 150/100 мм рт.ст.
Из анамнеза: с мая 2009 г. отметила повышение АД до 150/100 мм рт.ст., принимала антигипертензивные препараты (ингибиторы АПФ), несколько месяцев спустя появились отеки голеней (до верхней трети). Обследована в Российском кардиологическом центре. Выявлен нефротический синдром: СПУ до 3,92 г/сут, общий белок - 38,3 г/л, альбумин - 15,8 г/л, функция почек сохранна (креатинин сыворотки крови в пределах нормы - 95-88 мкмоль/л). Для проведения биопсии почки и решения вопроса о тактике ведения больная направлена в клинику нефрологии, внутренних и профессиональных болезней ММА им. И.М.Сеченова.
При поступлении: состояние средней тяжести. Кожные покровы нормальной окраски, чистые. Периферические лимфоузлы не увеличены. Выраженные отеки голеней. В легких дыхание везикулярное, хрипов нет. ЧДД 16 в мин. Тоны сердца приглушены, ритм правильный. АД 120/80 мм рт.ст., ЧСС=Ps=60 уд. в мин. Живот мягкий, безболезненный при пальпации. С/м Пастернацкого отрицательный с обеих сторон. Дизурии, никтурии нет.
12
9
При обследовании в ан. крови: гемоглобин 134-127 г/л, эритроциты - 4,4-4,0×10/л, лейкоциты - 4,2-4,48×10, СОЭ - 51-32 мм/ч,
В ан. мочи: белок - 12,96-3,5 г/л, эритроциты - 0-3; 1-2 в п/зр., лейкоциты - 1-3 в п/зр.
Суточная протеинурия - 5,51-10
Биохим. ан. крови: общий белок - 4,3-5,1-5,2 г/дл, альбумин - 2,3-2,4-2,6 г/дл, креатинин - 0,93-1,1 мг/дл, глюкоза - 4,2 ммоль/л, мочевая кислота - 312 мкмоль/л (149-416). Натрий - 141-123 мэкв/л, калий 4,6-4,8 мэкв/л.
Проба Реберга: СКФ - 108-78 мл/мин, реабсорбция - 99,0-98,0%
Электрофорез белков сыворотки крови: альбумины:46%, альфа-1 - 4,7%, альфа-2 - 21,6%, бета - 20,9%, гамма - 6,8%
Липиды крови: триглицериды - 3,23-1,74 ммоль/л (0,57-2,28), общий холестерин - 14,55-7,87 (3,88-6,47) ммоль/л, ЛОНП - 0,6-0,3 (0,114-0,342) моль/л.
Иммунология: IgA - 275 мг/дл, IgM - 174 мг/дл, IgG - 620 мг/дл, РФ - отр., комплемент - 31,2.
Коагулограмма: АЧТВ - 1,11 (0,75-1,25), ПИ - 110% (86-110), фибриноген - 7,10 г/л (1,8-4,0).
ЭКГ: ЭОС расположена вертикально. Ритм синусовый, правильный. Умеренно выраженные изменения миокарда левого желудочка.
УЗИ почек: Почки обычно расположены, контуры ровные, нормальных размеров: левая 102×57 мм, толщина паренхимы - 18 мм, правая - 111×55 мм, толщина паренхимы 17 мм, кортико-медуллярная дифференциация сохранена. ЧЛС не расширена. Подвижность почек при дыхании обычная. При ЦДК кровоток не изменен, прослеживается до периферических отделов. Биопсия почки: Биоптат почки представлен корковым слоем (до 14 клубочков), 2 клубочка полностью склерозированы. В 2 клубочках определяются участки очагового расширения и гиалиноза/склероза мезангия в области рукоятки, очаговые утолщения БМК, расширение и склероз мезангия, склероз сосудистых петель, единичные синехии. В остальных клубочках минимальные изменения, полнокровие. Эпителий извитых канальцев в состоянии белковой дистрофии и очаговой субатрофии, очаговый склероз и очаговая лимфогистиоцитарная инфильтрация стромы. Артериолосклероз. Амилоида не найдено. При ИГ исследовании обнаружена фиксация IgG, А, М и С3 и фибриногена на ГБМ очагового гранулярного характера. Заключение: морфология укладывается в картину фокального сегментарного гломерулярного гиалиноза.
Выявлен невысокий уровень нефрина в моче - 14,4 нг/мл, позволяющий сделать вывод о том, что назначенная иммуносупрессивная терапия будет эффективна.
С учетом морфологического варианта нефрита, была назначена терапия циклоспорином 150 мг/сут, метипредом 24 мг per os. Через 2 мес терапии достигнута ремиссия нефротического синдрома - суточная протеинурия составила 1,1 г/сут, общий белок - 6,0 г/дл, альбумин - 3,4 г/дл, функция почек сохранна (креатинин 1,1-1,06 мг/дл). В связи с развитием инфекционных осложнений циклоспорин был отменен, продолжила прием метипреда в дозе 12 мг/сут. Нефротический синдром не рецидивировал, сохраняется протеинурия до 1 г в сутки, функция почек сохранна.
На основании клинических особенностей (длительно персистирующий нефротический синдром), неблагоприятного морфологического варианта ХГН (ФСГС) с признаками формирующегося интерстициального фиброза, у данной пациентки можно было предполагать прогрессирующее течение и высокую вероятность отсутствия ответа на проводимую терапию. Однако уже в начале лечения наметился положительный эффект: уменьшилась протеинурия, увеличился уровень общего белка и альбумина сыворотки, а в течение 2-х месяцев, несмотря на вынужденную по причине рецидивирующей инфекции более быструю отмену циклоспорина, была достигнута ремиссия заболевания. Это было прогнозировано по невысокому уровню нефринурии (<17 нг/мл), отражающему умеренную подоцитарную дисфункцию и обратимость нарушений фильтрационного барьера при своевременном проведении иммуносупрессии.
Клинический пример N2.
Больная М., 23 лет, находилась в нефрологическом отделении клиники с 26.09.2006 г. по 09.10.2006 г. с диагнозом: Хронический гломерулонефрит нефротического типа (морфологически - мезангиопролиферативный вариант, биопсия от 19.10.2006 г.) с сохранной функцией почек.
Из анамнеза. С января 2006 г. после кишечной инфекции и приема иммуномодуляторов появились отеки голеней. При обследовании выявлен НС (СПУ составляла 2,6-3,5 г/сут, общ. Белок - 4,9-5,1 г/дл, альбумин 2,8-3,1 г/дл, ХС - 319 мг/дл), креатинин 1,0-0,9 мг/дл, СКФ - 66-104 мл/мин. Проводилась терапия ингибиторами АПФ, статинами. Госпитализирована в клинику для проведения биопсии почки и выработки тактики ведения больной.
При поступлении состояние удовлетворительное. Кожные покровы сухие, угревая сыпь на коже лица. Пальпируются подчелюстные л/у, безболезненные, эластичные. Небольшие отеки стоп. В легких дыхание везикулярное, хрипов нет. ЧДД 16 в мин. Тоны сердца ясные, ритмичные. АД 140/80 мм рт.ст., ЧCC=Ps=70 уд. в мин. Живот мягкий, безболезненный при пальпации. Синдром Пастернацкого отрицательный с обеих сторон. Дизурии, никтурии нет.
12
9
При обследовании в ан. крови: гемоглобин 134 г/л, эритроциты - 4,1,0×10/л, лейкоциты - 5,64×10, СОЭ - 35 мм/ч,
В ан. мочи: Белок - 7,55 г/л, эритроциты - 3-6 в п/зр., лейкоциты - 3-5 в п/зр.
Суточная протеинурия - 3,9 г
Биохим. Ан. крови: общий белок - 4,8 г/дл, альбумин - 2,9 г/дл, креатинин - 0,9 мг/дл, глюкоза - 89 мг/дл, мочевая кислота - 3,7 мг/дл. Натрий - 142 мэкв/л, калий 4,2 мэкв/л.
Проба Реберга: СКФ - 81 мл/мин, реабсорбция - 99,5%. Электрофорез белков сыворотки крови: альбумины: 50,9%, альфа-1 - 4,8%, альфа-2 - 16,2%, бета - 18,1%, гамма - 10%
Липиды крови: триглицериды - 142 мг/дл, общ. Хс - 336 мг/дл, ЛОНП - 28,4 мг/дл.
Иммунология: IgA - 500 мг/дл, IgM - 170 мг/дл, IgG - 84 мг/дл, РФ - отр., комплемент - 34,9, СРБ - отр.
УЗИ почек: Правая почка опущена на 7 см, размеры: левая 123×48 мм, толщина паренхимы - 16 мм, правая - 115×50 мм, толщина паренхимы 17 мм, кортико-медуллярная дифференциация сохранена. ЧЛС не расширена.
Биопсия почки: Биоптат почки представлен корковым слоем (до 8 клубочков). В клубочках отмечается очаговая пролиферация мезангиоцитов, очаговое расширение мезангия, очаговое утолщение БМК, склероз отдельных сосудистых петель. Эпителий извитых канальцев в состоянии белковой дистрофии, очаговый склероз стромы. Встречаются мелкие лимфогистиоцитаные инфильтраты. Амилоида не найдено. Заключение: изменения укладывается в картину мезангиопролиферативного ГН.
Выявлен высокий уровень нефрина в моче - 20,7 нг/мл, который позволяет прогнозировать неэффективность иммуносупрессивной терапии.
С ноября 2006 г. начато лечение МП в дозе 48 мг в сутки и внутривенными введениями сверхвысоких доз МП и ЦФА. В течение года проведено 9 сочетанных «пульсов» МП (суммарная доза 7975 мг) и ЦФА (суммарная доза 4200 мг), однако сохранялся НС (СПУ - 4,5-6,96 г/сут, общ. Белок - 4,9 г/л (57-82), альбумин - 27,2 (32-48)г/л, Хс - 359 мг/дл (150-250).
У больной в дебюте болезни и на протяжении всего срока наблюдения выявлялся умеренно выраженный нефротический синдром с сохранной функцией почек, мягкой артериальной гипертонией, что в сочетании с нетяжелым морфологическим вариантом заболевания - мезангиопролиферативный ГН с низкой степенью склероза в тубулоинтерстициальных структурах почки, позволяло предполагать благоприятный прогноз. Однако, несмотря на адекватную по дозе и длительности иммуносупрессивную терапию, не было получено ожидаемого эффекта. На высокий риск неэффективности иммуносупрессивной терапии указывает выявленный у больной высокий уровень нефрина в моче, отражающий тяжесть повреждения подоцитов.
Предложен способ, который позволяет прогнозировать эффективность иммуносупрессивной терапии у больных ХГН с нефротическим синдромом и является отправной точкой для выбора тактики лечения этих больных.