ИММУНОФИЛЬТРАЦИОННОЕ УСТРОЙСТВО ДЛЯ АНАЛИЗА ФУКОЗИЛИРОВАННОГО ГЛИКОПРОТЕИНА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ

Область техники, к которой относится полезная модель
Настоящая полезная модель относится к области техники выявления белков, в частности к иммунофильтрационному устройству для выявления фукозилированного гликопротеина в сыворотке крови.
Уровень техники
Альфа-фетопротеин (AFP), вырабатываемый клетками первичной гепатокарциномы, в значительной степени отличается от альфа-фетопротеина, вырабатываемого при гепатите, циррозе или других доброкачественных заболеваниях печени, по структуре своих углеводных цепей, другими словами, по сравнению с альфа-фетопротеином при доброкачественных заболеваниях печени AFP, вырабатываемый клетками гепатокарциномы, имеет намного более высокий индекс фукозилирования. Фукоза обладает свойством связывания с лектином Lens culinaris (LCA). AFP можно подразделить на AFP-L1, AFP-L2 и AFP-L3 в зависимости от его (опосредованной фукозильными остатками) аффинности к LCA, при этом AFP-L1 преимущественно ассоциирован с доброкачественными заболеваниями печени, AFP-L2 преимущественно вырабатывается у беременных женщин, a AFP-L3 в качестве фукозилированной формы AFP преимущественно ассоциирован с гепатоцеллюлярной карциномой (НСС). В 2005 году FDA официально утвердило AFP-L3 в качестве одного из маркеров первичной гепатокарциномы. AFP-L3 характеризуется более высокой специфичностью и чувствительностью при ранней диагностике, дифференциальной диагностике, оценке терапевтической эффективности, прогнозировании, мониторинге и других аспектах, связанных с гепатокарциномой.
Фукоза в виде метилированной гексозы присутствует в углеводных цепях множества гликопротеинов, как, например, в тканях, сыворотке крови и т.д., и называется фукозой, связанной с белками (P-bf). Остатки фукозы присутствуют в углеводной цепи AFP, и такая гетерогенная молекула называется фукозилированным AFP (FucAFP), который имеет важное теоретическое значение, а также значение с точки зрения клинического применения, и его можно применять в качестве важного показателя в области диагностики и прогнозирования течения гепатокарциномы.
Традиционные способы выделения фукозилированных гликопротеинов из сыворотки крови включают перекрестный аффинный иммунный электрофорез, аффинный блоттинг, аффинную хроматографию, твердофазный иммуноферментный двухстадийный «сэндвич»-анализ (ELISA), контрольно-измерительное устройство LiBASys, технологию системы выявления μTASWakoi30 и технологию предварительной обработки с захватом гликозильных остатков на микроцентрифужной колонке Hotgen Biotech, при этом увеличение популярности и применения иммунного электрофореза с фитоагглютининами и технологии системы выявления μTASWakoi30 ограничено ввиду более высоких технических требований, трудоемких операций и дорогостоящих реагентов; тогда как трудоемкость операций захвата гликозильных остатков на микроцентрифужной колонке увеличивается, поскольку обработка и выявление образца проводятся по отдельности.
Краткое описание полезной модели
Настоящая полезная модель направлена на обеспечение иммунофильтрационного устройства для выявления фукозилированного гликопротеина в сыворотке крови; при этом иммунофильтрационное устройство является особенно применимым для выявления FucAFP в биологических образцах и характеризуется универсальностью в отношении различных фукозилированных гликопротеинов.
Для достижения данной цели настоящая полезная модель предусматривает следующие технические решения.
С помощью настоящей полезной модели достигается одновременное выявление нескольких антигенов или антител в образце сыворотки крови единовременно за короткий промежуток времени благодаря применению миллипорового фильтра, и процесс выявления может завершаться всего за 3-5 мин.
В данном документе FucAFP относится к гетерогенной форме остатков фукозы, присутствующих в углеводной цепи AFP.
Согласно настоящей полезной модели антиген AFP из стадии (1) представляет собой без ограничения антиген AFP человека, экспрессируемый в прокариотических клетках, или антиген AFP, экспрессируемый в эукариотических клетках.
Согласно настоящей полезной модели меченное ферментом поликлональное антитело к AFP из стадии (3) представляет собой антитело кроличьего происхождения.
Согласно настоящей полезной модели фермент из стадии (3) представляет собой пероксидазу хрена (HRP), а также может представлять собой щелочную фосфатазу (ALP), каждая из которых применяется для проявления цвета при реакции с соответствующим субстратом.
В случае с положительной сывороткой крови области выявления антигена AFP и фукозилированного AFP демонстрируют голубое окрашивание; в случае с отрицательной сывороткой крови область выявления антигена AFP демонстрирует голубое окрашивание, а область выявления фукозилированного AFP не окрашивается. В случае с пятном BSA для отрицательного контроля ни положительная сыворотка крови, ни отрицательная сыворотка крови не дают окрашивание.
Выявление образца
Нанести каплю разведенного образца сыворотки крови, в котором нужно провести выявление, на область выявления, содержащуюся на миллипоровом фильтре, инкубировать в течение некоторого периода времени и проныть область выявления с помощью PBST для удаления неспецифических конъюгатов; добавить раствор меченного HRP антитела к AFP, разведенного с помощью PBS, инкубировать в течение некоторого периода времени и промыть с помощью PBST для удаления неспецифических конъюгатов; добавить раствор хромогенного субстрата для HRP и наблюдать результаты невооруженным глазом.
Согласно настоящей полезной модели инкубирование можно проводить при комнатной температуре в течение 3-5 с, как, например, 3 с, 3,5 с, 4 с, 4,5 с или 5 с.
Иммунофильтрационное устройство для выявления фукозилированного гликопротеина в сыворотке крови содержит миллипоровый фильтр, где на подложке миллипорового фильтра расположена по меньшей мере 1 область выявления, и в области выявления расположены подобласть выявления положительного контроля, подобласть выявления фукозилированного гликопротеина в сыворотке крови и область отрицательного контроля, и где дополнительно AFP фиксирован в подобласти выявления положительного контроля, LCA фиксирован в подобласти выявления фукозилированного гликопротеина в сыворотке крови, и бычий сывороточный альбумин (BSA) фиксирован в области отрицательного контроля; кроме того, пятна для выявления в одной и той же подобласти выявления имеют одну и ту же концентрацию вещества. Подобласть выявления и контрольная область соответственно содержат по меньшей мере 1 пятно для выявления, как, например, 2, 3, 4, 5 или 6 пятен для выявления.
Иммунофильтрационное устройство согласно настоящей полезной модели состоит из пластмассового изделия с хорошей прочностью, водопоглощающего бумажного материала и нитроцеллюлозного фильтра, при этом оно может выдерживать удары и столкновения, и его сложно разбить.
В варианте осуществления на подложке миллипорового фильтра имеется 1 область выявления, 1 пятно для выявления в подобласти выявления и 1 контрольное пятно в каждой из области положительного контроля и области отрицательного контроля; и AFP представляет собой AFP человека, экспрессируемый в прокариотических клетках.
Иммунофильтрационное устройство согласно настоящей полезной модели также содержит меченное HRP поликлональное антитело к AFP и растворы хромогенного субстрата; при этом меченное HRP поликлональное антитело к AFP представляет собой антитело кроличьего происхождения; и иммунофильтрационное устройство также содержит блокирующие буферы для промывания и разведения, т.е. PBST и PBS.
В настоящей полезной модели предпочтительно применяется иммунофильтрационное устройство с миллипоровым фильтром, которое по сравнению с белковым микрочипом обладает преимуществами меньшей длительности выявления, более низкой стоимости, лучшей стабильности и т.д., и процесс выявления на нем может осуществляться в пределах 3-5 мин.
С другой стороны, настоящая полезная модель также предусматривает иммунофильтрационное устройство для выявления фукозилированных гликопротеинов в сыворотке крови, которое содержит миллипоровый фильтр, где подложка миллипорового фильтра в иммунофильтрационном устройстве содержит по меньшей мере 1 область выявления, в которой расположены подобласть выявления положительного контроля с фиксированным в ней AFP, подобласть выявления фукозилированного гликопротеина в сыворотке крови с фиксированным в ней LCA и область отрицательного контроля с фиксированным в ней BSA; кроме того, пятна для выявления в одной и той же подобласти выявления имеют одну и ту же концентрацию вещества.
Согласно настоящей полезной модели подобласть выявления содержит по меньшей мере 1 пятно для выявления, как, например, 2, 3, 4, 5 или 6 пятен для выявления.
Согласно настоящей полезной модели на подложке миллипорового фильтра имеется 1 область выявления, подобласть выявления имеет 1 пятно для выявления, и область положительного контроля и область отрицательного контроля соответственно имеют по 1 контрольному пятну.
Согласно настоящей полезной модели AFP представляет собой AFP человека, экспрессируемый в прокариотических клетках.
Согласно настоящей полезной модели иммунофильтрационное устройство также содержит меченное HRP поликлональное антитело к AFP и растворы хромогенного субстрата.
Согласно настоящей полезной модели меченное HRP поликлональное антитело к AFP представляет собой антитело кроличьего происхождения.
Согласно настоящей полезной модели иммунофильтрационное устройство также содержит блокирующие буферы для промывания и разведения, т.е. PBST и PBS.
Настоящая полезная модель также предусматривает применение иммунофильтрационного устройства в выявлении фукозилированных гликопротеинов в сыворотке крови для недиагностической и/или нетерапевтической цели.
Настоящая полезная модель обладает по меньшей мере следующими преимуществами:
(1) с помощью настоящей полезной модели достигается одновременное выявление нескольких антигенов или антител в образце сыворотки крови единовременно за короткий промежуток времени благодаря применению миллипорового фильтра;
(2) для иммунофильтрационного устройства, предусматриваемого в настоящей полезной модели, количество требуемых сырьевых материалов и стоимость инструментов и оборудования в значительной степени снижены; при этом иммунофильтрационное устройство представляет собой бумажное или пластмассовое изделие с очень невысокой стоимостью, составляющей приблизительно 1 юань RMB, и, помимо этого, для подготовки экспериментальной процедуры, инкубирования и сканирования результатов не требуется никаких инструментов и оборудования, и вследствие этого стоимость выявления и расходы на него в значительной степени снижены.
Краткое описание графических материалов
На фиг. 1 показано схематическое изображение иммунофильтрационного устройства согласно настоящей полезной модели с 1 - крышкой, 2 - миллипоровым фильтром, 3 - водопоглощающим бумажным материалом и 4 - пластмассовой основой.
На фиг. 2 показано изображение результатов согласно настоящей полезной модели, где 1-3 представляют собой положительные результаты, на которых пятна для положительного контроля выявления на миллипоровом фильтре вверху демонстрируют голубой и коричневый положительные сигналы, пятна LCA для выявления посредине демонстрируют голубой и коричневый положительные сигналы, а контрольное пятно BSA внизу не окрашено; 4-5 представляют собой отрицательные результаты, на которых пятна для положительного контроля выявления на миллипоровом фильтре вверху демонстрируют голубой и коричневый положительные сигналы, а пятна LCA для выявления посредине и контрольное пятно BSA внизу не окрашены.
На фиг. 3 показано схематическое изображение подготовки нитроцеллюлозного фильтра для иммунофильтрации, при которой AFP фиксируется в области положительного контроля, LCA фиксируется в области выявления посредине, a BSA фиксируется в области отрицательного контроля.
Настоящая полезная модель более подробно объясняется ниже. Однако приведенные ниже варианты осуществления являются лишь простыми примерами настоящей полезной модели, но не будут представлять или ограничивать область охранительного действия прав на настоящую полезную модель, и при этом область охранительного действия прав на настоящую полезную модель определяется формулой полезной модели.
Конкретные варианты осуществления
Варианты осуществления настоящей полезной модели будут подробно описаны ниже со ссылкой на графические материалы.
На фиг. 1 показано схематическое изображение иммунофильтрационного устройства согласно настоящей полезной модели, которое имеет миллипоровый фильтр и в котором крышка 1, миллипоровый фильтр 2, водопоглощающий бумажный материал 3 и пластмассовая основа 4 расположены по порядку сверху вниз. При сборке миллипоровый фильтр предварительно вырезают в виде круга диаметром приблизительно 1,5 см, водопоглощающий бумажный материал 3 помещают на пластмассовую основу 4, предварительно вырезанный миллипоровый фильтр 2 располагают над центром водопоглощающего бумажного материала, а затем накрывают крышкой 1.
Применяемый в настоящей полезной модели миллипоровый фильтр может представлять собой нитроцеллюлозный фильтр. В варианте осуществления настоящей полезной модели применяется RPN303B от GE Healthcare. Кроме того, водопоглощающий бумажный материал может представлять собой водопоглощающую бумагу; и как крышка, так и основа представляют собой пластмассовые изделия.
На фиг. 2 показано изображение результатов согласно настоящей полезной модели, где в случае с положительной сывороткой крови (1-3 на фиг. 2) как положительный контроль, так и область выявления FucAFP демонстрируют голубое окрашивание; в случае с отрицательной сывороткой крови (4-6 на фиг. 2) область выявления FucAFP не окрашивается, тогда как положительный контроль демонстрирует голубое окрашивание; и в случае с любой из положительной или отрицательной сыворотки крови отрицательный контроль не окрашивается.
На фиг. 3 показано схематическое изображение подготовки нитроцеллюлозного фильтра для иммунофильтрации, при которой AFP фиксируется в области положительного контроля, LCA фиксируется в области выявления посредине, a BSA фиксируется в области отрицательного контроля.
Для лучшего пояснения настоящей полезной модели и для удобства понимания технического решения настоящей полезной модели ниже приведены следующие типичные, но не ограничивающие примеры настоящей полезной модели.
Пример 1. Процедура подготовки и применения иммунофильтрационного устройства
Реагенты и инструменты, применяемые для эксперимента: AFP, экспрессируемый в прокариотических клетках (Abcam, США); LCA (Sigma); нитроцеллюлозный фильтр (GE Healthcare) и меченное HRP антитело кроличьего происхождения (Abcam, США); растворы хромогенного субстрата для HRP (Millipore, США).
2
4
2
4
Состав PBS: 8 г NaCl, 0,2 г KCl, 1,44 г NaHPO, 0,24 г KHPO при значении рН, доведенном до 7,4, и при постоянном объеме, составляющем 1 л.
Состав PBST: 1 л PBS + 1 мл Tween-20.
Нитроцеллюлозный фильтр (GE Healthcare), каждое иммунофильтрационное устройство содержит 1 область выявления, при этом в каждой области выявления может происходить выявление маркера AFPL3 в одном образце сыворотки крови за один раз.
В каждой области выявления на нитроцеллюлозный фильтр по порядку производят нанесение пятнами по 0,5 мкл AFP человека, экспрессируемого в прокариотических клетках (Abcam, США), и 0,5 мкл LCA (Sigma), чтобы получить концентрацию при нанесении образца, составляющую 0,5 мг/мл для AFP и 4 мг/мл для LCA; в качестве отрицательного контроля берут 10% BSA, и производят нанесение пятном 0,5 мкл в область контрольного пятна.
Операционная процедура иммунофильтрации
Опухолевый маркер AFPL3 в динамических образцах сыворотки крови из контрольной группы здоровых субъектов и экспериментальной группы пациентов с гепатокарциномой выявляли с помощью подготовленного иммунофильтрационного устройства.
При комнатной температуре 10 мкл образца сыворотки крови наносят каплями на фильтр иммунофильтрационного устройства, при этом LCA связывается с фукозой в сыворотке крови с образованием соединения антиген-LCA благодаря использованию связывающих свойств LCA и фукозы; спустя 3 с вода в фильтре, пропитанном жидкостью сыворотки крови, поглощается водопоглощающим материалом под фильтром.
10 мкл PBST наносят каплями для промывания, чтобы удалить неспецифические конъюгаты, что повторяют трижды. Затем добавляют разведенное в PBS меченное HRP первичное антитело кроличьего происхождения, и антитело к AFP кроличьего происхождения связывается с антигеном AFP в сыворотке крови с образованием соединения LCA-фукоза (AFP)-меченное HRP первичное антитело кроличьего происхождения; при этом антитело кроличьего происхождения одновременно связывается с AFP положительного контроля, фиксированным на фильтре, с образованием соединения AFP-меченное HRP первичное антитело кроличьего происхождения. Спустя 3 с вода в фильтре, пропитанном жидкостью сыворотки крови, поглощается водопоглощающим материалом под фильтром.
10 мкл PBST наносят каплями для промывания, чтобы удалить неспецифические конъюгаты, что повторяют трижды. Добавляют хромогенный субстрат для HRP, и после выдерживания без доступа света в течение 1 мин вносят каплями 10 мкл PBST для промывания. В области пятен для выявления с положительной сывороткой крови проявляются голубые пятна.
Пример 2
Опухолевый маркер AFPL3 в динамических образцах сыворотки крови из контрольной группы здоровых субъектов и экспериментальной группы пациентов с гепатокарциномой выявляли с помощью подготовленного иммунофильтрационного устройства.
При комнатной температуре 2,5 мкл образца сыворотки крови разводят в четыре раза и затем наносят каплями на фильтр иммунофильтрационного устройства, при этом LCA связывается с фукозой в сыворотке крови с образованием соединения LCA-фукоза (AFP) благодаря использованию связывающих свойств LCA и фукозы; спустя 5 с вода в фильтре, пропитанном жидкостью сыворотки крови, поглощается водопоглощающим материалом под фильтром.
10 мкл PBST наносят каплями для промывания, чтобы удалить неспецифические конъюгаты, что повторяют пять раз. Затем добавляют разведенное в PBS меченное HRP первичное антитело кроличьего происхождения, и антитело кроличьего происхождения связывается с антигеном AFP в сыворотке крови с образованием соединения LCA-фукоза (AFP)-меченное HRP первичное антитело кроличьего происхождения; при этом антитело кроличьего происхождения одновременно связывается с AFP положительного контроля, фиксированным на фильтре, с образованием соединения AFP-меченное HRP первичное антитело кроличьего происхождения. Спустя 5 с вода в фильтре, пропитанном жидкостью сыворотки крови, поглощается водопоглощающим материалом под фильтром.
10 мкл PBST наносят каплями для промывания, чтобы удалить неспецифические конъюгаты, что повторяют пять раз. Добавляют хромогенный субстрат для HRP, и после выдерживания без доступа света в течение 1 мин. вносят каплями 10 мкл PBST для промывания. В области пятен для выявления с положительной сывороткой крови проявляются голубые пятна.
Подводя итог, следует отметить, что с помощью настоящей полезной модели достигается одновременное выявление нескольких антигенов или антител в образце сыворотки крови единовременно за более короткий промежуток времени благодаря применению миллипорового фильтра, и процесс выявления может осуществляться всего за 3-5 мин. Он обладает преимуществами экономии времени, низкой стоимости, хорошей стабильности и т.д.
Заявитель указывает, что подробно описанные структурные признаки настоящей полезной модели объясняются в вышеизложенных вариантах осуществления, но настоящая полезная модель не ограничивается вышеизложенными подробно описанными структурными признаками, другими словами, это не означает, что настоящая полезная модель должна быть реализована на основе изложенных выше подробно описанных структурных признаков. Специалисты в данной области техники должны понимать, что любое улучшение настоящей полезной модели, эквивалентная замена компонентов, выбранных для настоящей полезной модели, добавление вспомогательных компонентов, выбор конкретных вариантов и т.д., находятся в пределах объема правовой охраны и объема раскрытия настоящей полезной модели.
Предпочтительные варианты реализации настоящей полезной модели подробно описаны выше, и, тем не менее, настоящая полезная модель не ограничивается конкретными подробностями в приведенных выше вариантах реализации. В пределах объема технической идеи настоящей полезной модели для технического решения настоящей полезной модели допустимы многочисленные простые модификации, и все такие простые модификации находятся в пределах объема правовой охраны, предоставляемой настоящей полезной моделью.
Также необходимо указать, что, в случае отсутствия противоречия, конкретные технические признаки, описанные в приведенных выше вариантах реализации, можно комбинировать любым подходящим способом; и во избежание ненужных повторений в настоящей полезной модели не будут приведены дополнительные пояснения различных возможных способов комбинирования.
Более того, различные варианты реализации настоящей полезной модели также можно комбинировать любым способом. При условии отсутствия противоречия с идеей настоящей полезной модели они также будут считаться содержанием, раскрытым в настоящей полезной модели.