СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИНДИВИДУАЛЬНОЙ РАДИОЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ БОЛЬНЫХ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫМИ НОВООБРАЗОВАНИЯМИ ПРИ ПРОВЕДЕНИИ ЛУЧЕВОЙ ТЕРАПИИ
METHOD FOR DETECTING INDIVIDUAL RADIOSENSITIVITY OF PATIENTS WITH MALIGNANT GROWTHS IN RADIATION THERAPY

Изобретение относится к медицине, в частности к онкологии и радиологии, и может быть использовано для определения индивидуальной радиочувствительности больных злокачественными новообразованиями молочной железы и больных опухолями слюнных желез при проведении лучевой терапии.
В индустриально развитых странах около 70% онкологических больных получают лучевую терапию в виде основного, адъювантного, неоадъювантного и паллиативного лечения [5]. Тенденция к возрастанию роли ионизирующих излучений в лечении злокачественных новообразований обусловлена высокой эффективностью и органосохраняющей направленностью его воздействия на пораженный орган, позволяющей добиться выздоровления на фоне хорошей социальной и семейной реабилитации [4]. Между тем анализ клинических данных показывает, что у части больных после лучевой терапии развиваются ранние и отдаленные лучевые изменения нормальных тканей [3, 4, 5]. Проблема межиндивидуальной вариабельности в ответ радиационное воздействие является одной из основных в радиационной онкологии.
Фундаментальной задачей оценки индивидуальной реакции организма больного, испытывающего воздействие ионизирующей радиации в клинических условиях, является изучение общих закономерностей биологического ответа на это воздействие, которые могут являться научной основой регламентации использования радиационного фактора в медицине. Современная парадигма повреждения радиацией биологических тканей предусматривает, прежде всего, ее непосредственное воздействие на клетки-мишени, что приводит к лучевым модификациям молекул ДНК [6, 7, 8]. Центральным событием в развитии радиационного поражения клеток являются нарушения целостности молекул ДНК и гистоновых белков, которые в дальнейшем реализуются в хромосомные перестройки. Радиационно-индуцированный хромосомный дисбаланс приводит популяцию клеток к необратимой гибели, из чего следует, что объективная оценка лучевого повреждения организма требует детального исследования радиобиологических эффектов лучевой терапии в клетках нормальных тканей.
Известен способ оценки индивидуальной чувствительности больных ишемической болезнью сердца к лазерной терапии [1]. Сущность изобретения заключается в том, что у пациента до внутривенного облучения крови гелий-неоновым лазером и спустя 1 ч после сеанса в плазме крови определяют уровень малонового диальдегида и быструю вспышку хемилюминесценции, при снижении показателей после первого сеанса относительно контроля прогнозируют индивидуальную чувствительность больных к лазерной терапии, а при повышении значений этих показателей - ее отсутствие.
Недостатками данного способа является ограниченная область применения способа вследствие того, что:
- Оценка последствий лазерной терапии, которая не имеет отношения к терапии злокачественных новообразований
- Возможность определения индивидуальной чувствительности в рамках только одной нозологической единицы - ишемической болезни сердца.
Известен способ оценки вероятности возникновения побочных эффектов при проведении лучевой терапии с использованием ионов углерода для лечения опухолей органов мочеполовой системы [2]. Кроме того, также, описан ДНК-чип, позволяющий проводить такую оценку с помощью анализа вариантов генов SART1, ID3, EPDR1, PAH, XRCC6.
Недостатками данного способа являются:
- Ограниченное применение для оценки только неблагоприятных последствий терапии опухолей органов мочеполовой системы
- Необходимость использования дорогостоящего оборудования и реактивов для проведения ДНК-анализа
Наиболее близким к предлагаемому является способ определения индивидуальной радиочувствительности больных раком молочной железы при помощи хромосомного анализа облученных in vitro лимфоцитов [9]. Способ включает: забор крови из локтевой вены (4 мл), модельное рентгеновское облучение крови доноров в дозе 6 Гр, культивирование цельной крови (0,5 мл) в питательной среде (RPMI-1640) с добавлением фитогемагглютинина (ФГА), фиксация синхронизированной клеточной культуры на 52-часу, раскапывание клеточной суспензии на предметные стекла, приготовление и окраска (раствор 5% красителя Гимза) препаратов, анализ хромосомных аберраций под световым микроскопом. Для оценки структурных повреждений хромосом регистрируют обменные аберрации - дицентрические хромосомы, а также ацентрические фрагменты. Регистрацию хромосомных аберраций проводят в среднем на 100 метафазных пластинках. Такой учет позволяет выявить средний уровень аберраций на клетку. Превышение определенного порового значения средней частоты аберраций на клетку (в указанном способе порог составляет 6,18 аберраций на клетку) является критерием отнесения донора (больной раком молочной железы) к группе радиочувствительных индивидов. При этом стоит отметить, что авторы наблюдают корреляцию между повышенным уровнем in vitro радиационно-индуцированных аберраций хромосом и риском развития лучевого фиброза у больных раком молочной железы, то есть в данном способе обнаруживается связь клеточной и организменной радиочувствительности.
Недостатками данного метода являются:
- Длительность и сложность процедуры культивирования облученных лимфоцитов, а также некоторые погрешности в приготовлении препаратов, что, несомненно, ограничивает применение метода в клинических условиях.
- Анализ хромосомных аберраций требует значительного времени и хорошо подготовленных специалистов, несмотря на имеющиеся в настоящее время системы для автоматического кариотипирования.
- Процедура облучения крови больных раком молочной железы in vitro в виду неоднородности физических характеристик источников ионизирующей радиации в разных лечебно-профилактических учреждениях требует дополнительных исследований непосредственно на месте применения метода.
Новая техническая задача - сокращение времени исследования, упрощение способа.
Для решения поставленной задачи в способе оценки индивидуальной радиочувствительности больных злокачественными новообразованиями при проведении лучевой терапии путем исследования лимфоцитов венозной крови пациента, до применения лучевого воздействия на организм больного, в лимфоцитах венозной крови определяют средний уровень флуоресцентных фокусов гистона γH2AX и при значениях среднего порогового уровня гистона выше 1,0 на клетку, относят больного в группу радиочувствительных индивидов
Способ осуществляют следующим образом. У больных производят забор 8 мл периферической крови из локтевой вены за 2 суток до начала лучевой терапии. Из образца крови выделяют мононуклеарные клетки крови в градиенте Фиколл-Верографин. Полученные мононуклеарные клетки фиксируют на предметных стеклах с помощью раствора параформальдегида. Затем производят иммунофлуоресцентное окрашивание фосфорилированной формы белка γH2AX в ядрах клеток. Анализ числа фокусов белка γH2AX в ядрах клеток производят с помощью флуоресцентного микроскопа вручную или с помощью специализированного программного обеспечения. Производят анализ минимум 150 клеток с одного препарата для каждого больного. Уровень фокусов γH2AX выражают в долях единицы. За пороговое значении принимают 1,0 фокус на клетку. Уровень выше порогового является показанием для отнесения больного к радиочувствительной группе.
Предлагаемый способ основан на анализе результатов экспериментальных исследований на лимфоцитах периферической крови, полученных от 21 здорового индивида, при проведении модельного облучения в условиях in vitro, и 9 пациентов, у которых проводилось наблюдение за радиочувствительностью лимфоцитов периферической крови в ходе курса нейтронной терапии. Было обнаружено, что в обоих случаях уровень спонтанных фокусов гистона γH2AX в контрольных образцах, полученных от конкретного индивида, был связан с частотой хромосомных повреждений в лимфоцитах того же индивида после облучения в условиях in vitro или in vivo обратной связью. При этом уровень фокусов гистона γH2AX ниже 1,0 фокуса на клетку был ассоциирован с повышенной частотой хромосомных повреждений после облучения (Пример 1). Это дает основания для использования анализа спонтанного уровня фокусов γH2AX в качестве биомаркера индивидуальной радиочувствительности человека в клинических условиях. В основе предлагаемого способа лежит феномен, известный как адаптивный ответ, описывающий снижение повреждающего действия радиации на клетки, подвергшиеся ранее влиянию малых доз радиации или окислительного стресса. Клетки, несущие спонтанные фокусы гистона γH2AX, имеют активированную систему репарации повреждений ДНК, что приводит к повышенной эффективности ответа нормальных тканей на облучение. Пороговый уровень в 1,0 фокус на клетку соответствует ситуации, когда в среднем каждая клетка несет спонтанный фокус γH2AX.
Для определения индивидуальной радиочувствительности больных злокачественными новообразованиями при лучевой используют фундаментальную связь активности репарационной системы ДНК с уровнем радиационно-индуцированных хромосомных аберраций после лечения.
Предлагаемый способ дает возможность анализировать изменение состояния организма человека в процессе проведения ему лучевой терапии, используя комплексную оценку состояния сыворотки крови.
Пример 1
3
1
0
Больная Б., 57 лет. Местно-распространенный рецидив рака молочной железы. Состояние после комбинированного лечения РМЖ TNM. Была назначена нейтронная терапия (средняя энергия нейтронного пучка 6,3 МэВ) с суммарной очаговой дозой 8,4 Гр (30-40 Гр по изоэффекту). До начала курса терапии зафиксировали средний уровень фокусов белка γH2AX в лимфоцитах, который составил 0,8 на клетку (ниже порогового значения равного 1,0), что явилось критерием к отнесению данного больного в группу радиочувствительных. До лечения и после лучевой терапии был зарегистрирован уровень хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови, который составил 0,9% и 4,1% соответственно. Таким образом, в конце лечения уровень хромосомных аберраций превысил спонтанный в 4 раза. Согласно современным представлениям высокий темп роста хромосомных аберраций ассоциирован с отдаленными лучевыми осложнениями, что в свою очередь явилось критерием к отнесению больного в группу риска развития лучевой патологии.
Заключение: выявленный до начала лучевого лечения уровень фокусов белка γH2AX в лимфоцитах больного (менее 1,0 на клетку) позволил прогнозировать повышенную реакцию хромосомного аппарата на действие терапевтического облучения, что подтвердилось цитогенетическим методом исследования. Пациентке проведена коррекция дозы облучения.
Пример 2
3
1
0
Больная О., 47 лет. Аденокистозная карцинома левой околоушной слюнной железы TNM. Выполнена паротидэктомия с выделением ствола лицевого нерва и его ветвей. Проведена послеоперационная нейтронная терапия (средняя энергия нейтронного пучка 6,3 МэВ) по схеме: РОД - 2,0 Гр, СОД - 8,0 Гр. До начала курса терапии зафиксировали средний уровень фокусов белка γH2AX в лимфоцитах, который составил 3,1 на клетку (выше порогового значения равного 1,0 на клетку), что явилось критерием к отнесению данного больного в группу радиорезистентных. До лечения и после лучевой терапии был зарегистрирован уровень хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови, который составил 0,6% и 0,9% соответственно. Видно, что в конце лечения уровень хромосомных аберраций превысил спонтанный в 1,5 раза.
Заключение: выявленный до начала лучевого лечения уровень фокусов белка γH2AX в лимфоцитах больного (более 1,0 на клетку) позволил прогнозировать пониженную реакцию хромосомного аппарата на действие терапевтического облучения, что подтвердилось цитогенетическим методом исследования.
Таким образом, анализ спонтанного уровня фокусов γH2AX в качестве маркера индивидуальной радиочувствительности человека, обладает следующими преимуществами по сравнению с рассмотренными прототипами:
- Отсутствие необходимости культивирования клеток. За счет использования для анализа некультивированных лимфоцитов периферической крови человека, результаты анализа могут быть получены уже на следующий день после забора крови, что позволит более оперативно изменять тактику лечения онкологических больных.
- Не требуется модельное облучение in vitro. Оценке подвергается спонтанный уровень фокусов γH2AX в лимфоцитах человека, что, с одной стороны, исключает временные затраты на проведение процедур облучения, а с другой стороны, снимает возможные погрешности анализа за счет исключения лишних этапов.
- Возможность автоматизации анализа. Оценка уровня фокусов γH2AX в клетках возможна в полуавтоматическом режиме с использованием автоматизированных систем обработки изображений на базе флуоресцентных микроскопов. Наиболее перспективной из этих систем является программно-аппаратный комплекс Metafer (Metasystems) на базе микроскопа Axio Imager (Zeiss) последнего поколения.
- Перспективным является переход от анализа числа фокусов γH2AX в клетках с помощью флуоресцентной микроскопии к экспресс-методам оценки уровня белка γH2AX с помощью количественных иммунофлуоресцентных методов. Такой переход позволит разработать инновационный продукт - набор реагентов для проведения экспресс-диагностики индивидуальной радиочувствительности человека, который потенциально может использоваться в любой онкологической клинике. Единственным необходимым оборудованием для такой диагностики будет флуориметр для проведения количественной оценки содержания γH2AX.
В целом, перечисленные преимущества разработанного метода позволят быстро и надежно оценить индивидуальную радиочувствительность онкологических больных в ходе лучевой терапии с последующей коррекцией курса лечения в зависимости от полученных результатов. Такой подход позволит снизить частоту возникновения побочных лучевых реакций, часто сопутствующих проведению лучевой терапии опухолей.
Источники информации
1. Патент РФ №2031408, опубл 20.03.1995 / Способ определения индивидуальной чувствительности больных ишемической болезнью сердца к лазерной терапии.
2. Патент США №2010130376, опубл 27.05.2010 / DNA chip for prediction of occurrence of late adverse reaction in urinary organ after radiotherapy, and method for prediction of occurrence of late adverse reaction in urinary organ after radio therapy using the same.
3. Терновой C.К., Васильев А.Ю., Синицин B.E. Лучевая диагностика и терапия: Учебник для студентов медицинских вузов. - Том 1. Общая лучевая диагностика. М.: Медицина, 2008. - 574 с.
4. Терновой С.К., Васильев А.Ю., Синицин В.Е. Лучевая диагностика и терапия: Учебник для студентов медицинских вузов. - Том 2. Частная лучевая диагностика. М.: Медицина, 2008. - 574 с.
5. Сосюкин А.Е. Клиническая радиология. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2008. - 224 с.
6. Cao J., Liu Y., Sun H. et al. Chromosomal aberrations, DNA strand breaks and gene mutations in nasopharyngeal cancer patients undergoing radiation therapy // Mutation Research. - 2002. - Vol.504. - P.85-90.
7. Carrano A.V. Induction of chromosomal aberrations in human lymphocytes by x rays and fission neutrons: dependence on cell cycle stage // Radiat Res. - 1975. - Vol.63, №8. - P.403-421.
8. Fatehi D., Mozdarani H. Modification of 10 cGy neutron or gamma-rays induced chromosomal damages by hyperthermia: an in vitro study // J. Radiat. Res. - 2009. - Vol.7, №2. - P.69-77.
9. Hoeller U., Borgmann K., Bonacker M., Kuhlmey A., Bajrovic A., Jung H., Alberti W., Dikomey E. Individual radiosensitivity measured with lymphocytes may be used to predict the risk of fibrosis after radiotherapy for breast cancer // Radiother Oncol. - 2003. - Vol.69. №2. - P.137-44.