Оценка диагностической эффективности алгоритма выделения и ускоренной идентификации условно-патогенных энтеробактерий с использованием отечественных хромогенных питательных сред

При этом большую диагностическую ценность представляют данные по индуцированной пролиферации, а также ИС, меньшую — по спонтанной стимуляции. Вероятно, дальнейшие исследования в этом направлении с вовлечением большего числа обследованных позволят внести ряд уточнений в механизмы патогенеза АИТ и помогут в поисках адекватных методов лечения указанной патологии. При этом использование таких наборов, как «Цитокин-Стимул-БЕСТ», не требующих выделения мононуклеаров и предполагающих кратковременную культивацию образцов цельной крови, позволяет широко внедрить описанный метод в клиническую практику. Полагаем, что в качестве маркеров для оценки функциональной активности клеток крови при различных аутоиммунных заболеваниях наиболее оптимально использовать определение в суперна-тантах культур ИЛ-6, ФНОа, ИЛ-ф, ИФН-у.

Выводы

1. Спонтанная продукция ФНОа и ИЛ-6 клетками крови в реакции in vitro у больных АИТ с гипотиреозом повышена в сравнении с показателями у здоровых обследованных.

2. У больных с гипотиреозом на фоне АИТ снижена функциональная активность клеток крови в ответ на стимуляцию, что выражается в резком снижении ИС некоторых цитокинов (ФНОа, ИЛ-ip и ИЛ-6, ИЛ-10, ИФН-у) в митогенстимулиро-ванных супернатантах культур.

3. Предлагаемый метод может быть использован для оценки функционального состояния клеток крови — продуцентов цитокинов и ЛФ при аутоиммунных заболеваниях в условиях не только научно-исследовательских, но клинико-диагностических лабораторий.

ЛИТЕРАТУРА

1. Кузьменок А. И., Романовский А. А., Данилова Л. И. и др. // Иммунология. — 2000. — № 2. — С. 44—48.

2. Роберт Вольпе // Болезни щитовидной железы / Под ред. Р. Бра-вермана. — М., 2000. — С. 140—174.

3. Рустембекова С. А., Аметов А. С., Василенко И. А., Метелин В. Б. // Тер. арх. — 2008. — № 10. — С. 31—33.

4. Drugarin D., Negru S., Koreck A. et al. // Immunol. Lett. — 2000. — Vol. 71, N 2. — P. 73—77.

5. Guillen C., Prieto A., Alvarez-Escola C. et al. // Immunopharmacol. Immunotoxicol. — 1999. — Vol. 21, N 1. — P. 15—39.

6. Matsubayashi S., Aka.suF., Kasuga Y. et al. // Clin. Exp. Immunol. — 1990. — Vol. 82, N 1. — P. 63—68.

7. Nielsen C. H., Hegedus L., Rieneck K. et al. // Clin. Exp. Immunol. — 2007. — Vol. 147, N 2. — P. 287—295.

Поступила 22.03.11

микробиология

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012 УДК 579.842.17.083.18

м. м. меджидов, Э. Д. Степанова, Р. Ю. Юнусова, В. Г. Горелова, С. м. Омарова

оценка диагностической эффективности алгоритма выделения и ускоренной идентификации условно-патогенных энтеробактерий с использованием отечественных хромогенных питательных сред

Филиал ФГУП НПО «микроген» минздравсоцразвития РФ, НПО «Питательные среды», Дагестанская государственная медицинская академия, махачкала

Проведены испытания специфичности и диагностической эффективности новых отечественных хромогенных питательных сред, и предложен алгоритм выделения и ускоренной идентификации клинически значимых и санитарно-показательных условно-патогенных энтеробактерий с использованием хромогенных питательных сред.

Ключевые слова: хромогенные питательные среды, условно-патогенные энтеробактерии, биохимические тесты, лабораторная диагностика

M.M. Medjidov, E.D. Stepanova, R.Yu. Yunusova, V.G. Gorelova, S.M. Omarova THE EVALUATION OF DIAGNOSTIC EFFECTIVENESS OF ALGORITHM OF ISOLATION AND EXPRESS IDENTIFICATION OF OPPORTUNISTIC ENTEROBACTERIA USING NATIONAL CHROMOGENIC

GROWTH MEDIUMS

The testing of specificity and diagnostic effectiveness was applied to new national chromogenic growth mediums. The algorithm was developed to isolate and express identify the clinically .significant and sanitary demonstrative opportunistic enterobacteria using chromogenic growth mediums.

Key words: chromogenic growth mediums, opportunistic enterobacteria, biochemical test, laboratory diagnostics

Для корреспонденции:

Степанова Элеонора Давыдовна, канд. биол. наук, рук. лаб. кишечных инфекций

Адрес: 367025, Махачкала, ул. Леваневского, 24 Телефон: (8-8722) 67-05-75

Условно-патогенные энтеробактерии (УПЭ) привлекают к себе большое внимание ученых и практических бактериологов в связи с доминированием в структуре этиологических факторов кишечных, а также вне- и внутрибольничных гнойно-септических инфекций различной локализации [1, 2].УПЭ

являются обязательным санитарно-микробиологическим показателем, характеризующим фекальное загрязнение воды и продуктов питания. Они служат объективным свидетельством выраженности дисбиотических нарушений в микробной экологии пищеварительного и дыхательного трактов [5]. Идентификация УПЭ представляет определенные трудности из-за сходства многих биохимических свойств этих микроорганизмов, поэтому достаточно высок удельный вес острых кишечных и других инфекций неустановленной этиологии [3]. В последние годы в клиническую микробиологию интенсивно внедряются молекулярные методы исследования. Однако классический бактериологический метод, предполагающий обязательное выделение и идентификацию индикаторных микроорганизмов, до настоящего времени остается «золотым стандартом» при диагностике большинства инфекций. В конце ХХ века в практику бактериологии вошли хро-могенные питательные среды (ХПС) [6], позволяющие выявлять у исследуемых микроорганизмов только им присущие высокоспецифические ферменты и соответственно их идентифицировать по наличию того или иного фермента(ов).

В НПО "Питательные среды" в Махачкале разработаны ХПС для выделения и идентификации клинически-значимых и санитарно-показательных УПЭ: Е. соН-колиформ-Proteus хром-агар (Даг хром-агар — патент № 2386696) и Клебсиелла хром-агар (патент № 2416635).

Цель исследований — испытать диагностическую эффективность новых отечественных ХПС и предложить алгоритм выделения и ускоренной идентификации клинически значимых и санитарно-показательных УПЭ с использованием отечественных ХПС.

Материалы и методы. В работе использовали отечественные ХПС: Е. соН-колиформ-Proteus хром-агар и Клебсиелла хром-агар, а в качестве контрольных — питательные среды в соответствии с приказом № 535 Минздрава СССР. Испытания ХПС проводили на базе бактериологической лаборатории Республиканского медицинского центра и лаборатории клинической микробиологии ООО НПП "Питательные среды" Махачкалы. Объектом исследований служили 624 проб мочи, 190 проб от больных, страдающих неспецифическими воспалительными заболеваниями гениталий, 138 проб от пациентов с ЛОР-заболеваниями и 150 проб мокроты. При статистической обработке результатов исследований использовали программу Microsoft Excel.

Результаты и обсуждение. ХПС — Е. coli-колиформ-Proteus хром-агар и Клебсиелла хром-агар позволяют выявить УПЭ через 18 ± 2 ч инкубации посевов при 37 ± 1oC: Е. coli — по продукции p-глюкуронидазы, колиформные бактерии — по продукции р-галактозидазы, Proteus spp.—по продукции трип-тофандезаминазы (ТДА), а родовую идентификацию Klebsiella spp. — по продукции 5-аминосалицилатдекарбоксилазы (5-АСД). Для идентификации данных микроорганизмов со среды Эндо, согласно действующим регламентируемым документам, требуется не менее 72 ч.

Результаты исследования клинического материала урогенитального тракта представлены в табл. 1. Различия в проценте высеваемости УПЭ на ХПС и среде Эндо статистически незначимы. Однако на среде Эндо за указанное время идентификация УПЭ не представлялась возможной, так как требовалась постановка дополнительных тестов [4]. В то же время на ХПС через 18 ± 2 ч инкубации посевов удалось идентифицировать наиболее часто встречающиеся при заболеваниях мочеполовой системы Е. coli, K. pneumoniae, P. mirabilis.

Видовой спектр выделенных и идентифицированных УПЭ из мокроты и ЛОР-органов с использованием ХПС показан на

Таблица 1

микроорганизмы, выделенные и идентифицированные при бактериологическом исследовании инфекций урогенитального тракта на отечественных хПС

Показатель Е. coli-колиформ-Proteus хром-агар Клебсиелла хром-агар Среда Эндо

Количество по- 814 814 814

севов, абс.

Высеваемость, % 49,6 49,5 49,0

к общему количе-

ству посевов

Выделенные куль- 404 403 399

туры УПЭ, абс.

В том числе:

P. mirabilis 16 (О-форма) - 15 (чашек с

роением)

ОКБ 388 - 384

В том числе:

Е. coli 322 - -

K. pneumoniae - 58 -

S. marcescens 1 - -

Другие УПЭ 65 345 -

рис. 1. Независимо от места локализации возбудителя наиболее часто выделяли кишечную палочку и клебсиеллы: в образцах мокроты превалировали клебсиеллы, а в образцах из ЛОР-органов -

кишечная палочка.

40 и 35 -3025 -2015 -5 -

о-

E.coli P. mirabilis

K.pneumoniae S.marcescens

выявление родо-ского материала

Рис. 1. Видовой спектр (в %) УПЭ, выделенных из мокроты (а) и ЛОР-органов (б) (п = 41).

Таблица 2

и видоспецифических ферментов уПЭ, выделенных из клиниче-на хПС

Микроорганизм Всего Е. coli-колиформ-Proteus хром-агар Клебсиелла хром-агар

ß-глюкурони-даза-положи-тельный ß-галактози-даза-поло-жительный ТДА-поло-жительный АСД-положи-тельный

абс. % абс. % абс. % абс. %

Е. coli 382 374 98 382 100 0 0 0 0

Klebsiella spp. 125 0 0 125 100 0 0 125 100

Е. cloacae 4 0 0 4 100 0 0 0 0

С. freundii 3 0 0 3 100 0 0 0 0

P. mirabilis 28 0 0 0 0 28 100 0 0

S. marcescens 3 0 0 3 100 0 0 0 0

q i

E. со//- ко л и ф о p м - Pro te и s хром агар

А

Исследуемый материал ï

Клебсиелла хром агар

I I

Питательный Питательный

О

агар

бульон

о

01 "ч

Тест на оксидазу

Тест на индол

Агар Клиглер

Цитратный агар

О

Полужидкий агар

АГВ

Рис. 2. Алгоритм выделения и ускоренной идентификации клинически значимых и санитарно-показательных микроорганизмов УПЭ.

Анализируя результаты, полученные при идентификации клинических изолятов УПЭ на разработанных ХПС, обнаружили, что процент глюкуронизоположительных Е. coli был значительным (98), а выявление ß-галактозидазы колиформ-ных бактерий, ТДА протеев и 5-АСД клебсиелл происходило в 100% случаев, что свидетельствует о достаточно высокой диагностической специфичности и эффективности разработанных ХПС (табл. 2). Существующие схемы межродовой и внутриродовой дифференциации семейства энтеробактерий предусматривают использование 21 теста [4].

На основании проведенных клинических испытаний разработанных ХПС предложен алгоритм выделения и ускоренной идентификации клинически значимых и санитарно-показательных УПЭ, предусматривающий минимальный дифференцирующий ряд, который состоит из 11 биохимических тестов (табл. 3), и оптимизированную схему посева исследуемого материала (рис. 2), что позволяет в максимально короткие сроки идентифицировать до вида клинически значимые и санитарно-показательные УПЭ.

Согласно предлагаемому алгоритму, посев исследуемого материала следует проводить параллельно на две разработанные среды - Е. соН-колиформ-Prateus хром-агар и Клебси-

елла хром-агар, а также на питательный агар и питательный бульон. После 18 ± 2 ч инкубации чашек с посевами в случае обнаружения на среде Е. соН-колиформ-Prateus хром-агар сине-зеленых колоний с желтым ореолом (Е. coli) и коричневых колоний с коричневым преципитатом (Proteus spp.), а на среде Клебсиелла хром-агар — коричневых колоний с коричневым преципитатом (клебсиелл или Е. aerogenes) постановку теста на оксидазу, как и посев на среду Клиглера и цитратный агар, не требуется, хотя при необходимости постановка дополнительных тестов не исключается. Колонии Е. aerogenes дифференцируются от Klebsiella spp. по тесту подвижности посевом коричневых колоний с Клебсиелла хром-агара в полужидкий агар.

Для идентификации колиформных бактерий (желтых колоний) со среды Е. coli-колиформ-Proteus хром-агар производят посев этих колоний в среды Клиглера и цитратный агар, а также исследуют в тесте на индол (см. рис. 2). Бесцветные колонии, выратающие на Е. coli-колиформ-Proteus хром-агаре, исследуют в тесте на оксидазу и при положительном результате идентифицируют как P. aeruginosa. Оксидазоотрицательные бесцветные колонии засевают в Клиглер, цитратный и полужидкий агары, с помощью которых дифференцируют шигел-

Таблица 3

Биохимические тесты для ускоренной идентификации клинически значимых и санитарно-показательных уПЭ

УПЭ Питательные среды Тест

Е. соН-шлиформ-Proteus хром-агар Клебсиелла хром-агар агар Клиглер полужидкий агар цитрат Сим-монса индол (тест) трип-тофаназа

ТДА галактози-даза глюкуро-нидаза 5-АСК лактоза глюкоза/газ h2s подвижность пигмент

E. coli - + +,- - +/+ - +,- - - +

K. pneumoniae - + - + + +/+ - - - + -

K. oxytoca - + - + + +/+ - - - + +

E. aerogenes - + - + + +/+ - + - + -

E. cloacae - + - - + +/+ - + - + -

C. freundii - + - - + +/+ + + - + -

S. marcescens - + - - - +/- - + +(красн),- + -

P. vulgaris + - - - - +/+ + + - + +

P. mirabilis + - - - - +/+ + + - + -

Y. enterocolitica - + - - - +/- - - (37оС) - - +

Примечание. + положительны для 90% изученных штаммов или более; - отрицательны для 90% изученных штаммов или более.

лы и сальмонеллы. Идентификацию клинически значимых и санитарно-показательных УПЭ проводят по совокупности биохимических свойств, представленных в табл. 3.

Отсутствие роста микроорганизмов на ХПС при наличии такового на питательном агаре свидетельствует о присутствии в исследуемом материале грамположительных микроорганизмов, что подтверждается окраской по Граму и результатами дальнейших исследований, регламентированных на грамположительную микрофлору.

Вывод. Предложенный алгоритм выделения и ускоренной идентификации клинически значимых и санитарно-показательных УПЭ с использованием отечественных хромо-генных питательных сред обеспечивает эффективную дифференциацию УПЭ, позволяет существенно сократить количество биохимических тестов и сроки идентификации возбудителя (с 3—5 сут до 18—36 ч), что значительно ускоряет и упрощает процесс проведения бактериологических исследований.

ЛИТЕРАТУРА

1. Батуро А. П. // Частная микробиология. Клиническая лабораторная аналитика / Под ред. В. В. Меньшикова. — М., 2003. — Т. 4. — С. 398—411.

2. Божкова С. А., Афиногенов Г. Е. // Журн. микробиол. — 2005. — Т. 7, № 2, прил. 1. — С. 16.

3. Онищенко Г. Г. // Журн. микробиол. — 2010. — № 4. — С. 13—22.

4. Приказ МЗ СССР № 535. Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений. — М., 1985.

5. Шендеров Б. А. Функциональное питание и его роль в профилактике метаболического синдрома. — М., 2008.

6. Sigma-aldrich. Реактивы для биохимии и исследований в области естественных наук. Каталог. — 2002—2003. — С. 1359—1360.

Поступила 13.05.11

хроника

© А. Ж. ГИЛЬМАНОВ, 2012

А. Ж. Гильманов

аасс-2011: конференция и выставка в атланте

Кафедра лабораторной диагностики Института последипломного образования ГБОУ ВПО Башкирский государственный медицинский университет Минздравсоцразвития РФ, Уфа

24—28 июля 2011 г. в конгресс-центре г. Атланта (штат Джорджия, США) проходили ежегодная конференция Американской ассоциации клинической химии (ААСС) и выставка лабораторного оборудования и технологий (Lab. Expo) — главное событие для специалистов лабораторной диагностики США и многих других стран. ААСС является лидирующей профессиональной организацией специалистов лабораторной медицины в мире; она насчитывает около 20 тыс. членов не только в США, но и по всему миру и проводит многочисленные мероприятия (семинары, вебинары, конференции и др.) по аспектам патологии и лабораторной медицины. В 2011 г. был в очередной раз побит рекорд представительности и посещаемости: в работе конференции и выставки приняло участие около 19 700 человек из 100 стран; на более чем 2000 выставочных стендов разместились 675 компаний из 25 стран, представляющих все регионы мира и экспонировавших все, что имеет отношение к лабораторной медицине, — лабораторное оборудование, реагенты, расходные материалы, программное обеспечение, лабораторные услуги и др. Поскольку принять такой большой симпозиум достаточно сложно, ААСС проводит конференции лишь в городах, имеющих очень крупные конгресс—центры, развитую сеть отелей и транспорта; Атланта в полной мере удовлетворяет этим требованиям.

Конференция включала как традиционные, так и новые виды сессий, имеющих в основном образовательную направленность. Лекции, семинары и симпозиумы были ориентированы на профессионалов в области лабораторной медицины: клинических патологов, консультантов, администраторов и менеджеров лабораторий, медицинских технологов, специалистов по клинической химии и молекулярной патологии, практических врачей — гематологов, онкологов, кардиологов и др., а также ученых и производителей реагентов и аппаратуры для клинических лабораторий.

В ходе пленарных лекций (Plenary Sessions), которые ежедневно представляли признанные лидеры в области научных исследований и клинической лабораторной практики, освещались актуальные проблемы, демонстрирующие современные возможности и перспективы лабораторной медицины. По темам лекций можно косвенно судить о наиболее существенных (по мнению организаторов) достижениях науки, связанных с медико-биологическими исследованиями в целом. В этом году темами лекций были:

• Наследственно обусловленный рак молочной железы и яичников: состояние и перспективы персонализированных геномных исследований (Mary-Claire King — одна из ведущих ученых, стоявших у основ исследования мутаций гена BRCA1 и связанных с ними случаев семейных онкологических заболеваний).

• Эпидемия ожирения: где мы находимся? (Jeffrey Koplan — директор Института глобального здоровья в университете Emory, Атланта; один из ведущих специалистов мира по ожирению в детском возрасте, здоровому образу жизни и питания).

• Стволовые клетки и бесклеточная основа: будущее конструирования органов (Doris Taylor — директор Центра восстановления сердца в университете Миннесоты, лидер в области клеточной и геномной терапии сердечно-сосудистых заболеваний).

• Оценка уровня креатинина: «неудобная» правда (Josef Coresh — профессор университета Джона Хопкинса в Мериленде, ведущий специалист в области хронической патологии почек, риска и эпидемиологии сердечно-сосудистых заболеваний).

• От фармакогенетики к фармакогеномике (Richard Weinshilboum — известный специалист в области канцерогеномики и молекулярной фармакологии в клинике Мауо, Миннесота).

Встречи с экспертами (Meet The Experts) были хорошей возможностью для заинтересованных слушателей пообщаться и подискутировать со специалистами, только что представлявшими пленарные лекции.

Каждый из многочисленных симпозиумов (Symposia Sessions) состоял из 2—5 сообщений, последовательно раскрывающих значимую медицинскую проблему с позиций лабораторной медицины. Доступ на симпозиумы был свободным, они занимали половину дня или целый день, и всегда собирали большую аудиторию — до 150—200 слушателей.

Сессия «коричневого портфеля» (Brown Bag Sessions) — небольшие, до 10 человек дискуссионные группы, собиравшиеся на 1 ч за круглым столом рано утром (до пленарной лекции) или в обеденное время. В ходе этих сессий проходили живые дискуссии по конкретной тематике, давались ответы на часто возникающие вопросы, и осуществлялся активный обмен мнениями с признанными экспертами в данной области.

Образовательная программа ААСС (ААСС University) включала краткие обучающие курсы и интерактивные семинары; участие в них было платным (150—300 долл.) и требовало предварительной записи.

• Краткие курсы (Short Courses), рассчитанные на целый день или половину дня — интенсивная лекционно-интерактивная форма обучения небольшой аудитории слушателей (обычно до 50 чел.) какому-либо аспекту лабораторной медицины с раздачей лекционных и методических материалов.

• Интерактивные семинары (Interactive Workshops) — сессии, в ходе которых шел активный обмен информацией в форме диалога и дискуссии между ведущими и слушателями (до 30—50 чел.) по актуальным проблемам лабораторной медицины.