ЭКЗОСОМАЛЬНЫЕ БИОМАРКЕРЫ
EXO-SOMATIC BIOMARKERS

Настоящее изобретение относится к биомаркерам внеклеточных микровезикул для определения состояния опухолевой трансформации или наличия опухоли у пациента, к использованию таких биомаркеров и методам диагностики, основанным на применении таких биомаркеров.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
В отличие от злокачественных (или раковых) опухолей, доброкачественные опухоли, как правило, представляют собой массу клеток, которые не обладают способностью проникать в соседние ткани или метастазировать. Кроме того, доброкачественные опухоли обычно имеют более медленную скорость роста, чем злокачественные опухоли, и доброкачественные опухолевые клетки обычно более дифференцированы.
Хотя большинство доброкачественных опухолей не опасны для жизни, многие виды доброкачественных опухолей имеют потенциал стать злокачественными посредством процесса, известного как опухолевая трансформация.
Неметастатический рак (первичный или рецидивирующий) - это рак, который не распространился из первичного очага (места возникновения) в другие органы.
Метастатический рак - это рак, который распространился из органа, где он возник (первичною очага), в другие органы.
1-3
1-3
Развитие доброкачественной нейрофибромы часто связано с мутацией гена-супрессора опухолевого роста NF1 в шванновских клетках. Эти новообразования часто подвергаются дальнейшей трансформации в злокачественные опухоли оболочек периферических нервов (MPNST). В настоящее время неясно, какие типы клеток особенно чувствительны к образованию MPNST, какие молекулярные изменения вызывают трансформацию нейрофибромы в MPNST, или какие другие факторы в среде опухолевого роста могут способствовать возникновению неоплазии.
3
Кроме того, глиомы, особенно пилоцитарные астроцитомы зрительного нерва, а также лейкозы, встречаются с повышенной частотой в популяции NF1.
4-7
8
Опухоли MPNST имеют очень неблагоприятный прогноз, поскольку они не чувствительны к стандартной химио- или лучевой терапии и имеют высокую склонность к метастазированию. Пациенты с NF1 и их семьи хорошо осведомлены об этих фактах, и именно поэтому развитие MPNST является осложнением, которого наиболее сильно опасаются пациенты, страдающие этим заболеванием. Вместе с тем, раннее выявление заболевания зачастую затруднено из-за того, что MPNST часто развивается в пределах уже существующих крупных нейрофибром, что затрудняет диагностику новообразования или его прогрессирования даже с помощью МРТ. Такая диагностическая задержка может стать причиной неблагоприятного исхода опухолей MPNST при NF1 по отношению к их спорадическим аналогам. Это основной стимул определения молекулярных изменений, которые могут быть обнаружены неинвазивным способом и являются показателями начала развития и прогрессирования MPNST у пациентов с NF1, и были бы полезны для скрининга и ранней диагностики, а также мониторинга заболевания или терапевтического результата в доклинических и клинических условиях.
i
1
По общему мнению, существуют множество подвидов нейрофибромы, которые различаются по своему местоположению и модели роста, их ассоциации с NF1 и потенциалом к злокачественной трансформации. Многие исследователи, как в клинической медицине, так и в фундаментальной науке, классифицируют нейрофибромы как кожные или плексиформные. Плексиформные нейрофибромы встречаются почти исключительно у пациентов с NF1 и считаются врожденными; они отличаются от локализованных интраневральных нейрофибром их характерной плексиформной моделью роста. Плексиформные нейрофибромы характеризуются самым высоким риском злокачественной трансформации в MPNST.
Аналогично трансформации нейрофибромы в MPNST, другие доброкачественные опухоли могут потенциально трансформироваться в злокачественные опухоли. Примером служат случаи трансформации доброкачественной гиперплазии предстательной железы (ДГПЖ) в рак простаты, полипов толстой кишки - в колоректальный рак, доброкачественных невусов - в меланому, незлокачественных образований молочной железы - в рак молочной железы, узелков в легких - в рак легких, ранней стадии астроцитомы - в глиобластому, и доброкачественных опухолей яичников - в рак яичников. Многие из этих видов злокачественных новообразований также могут метастазировать.
9
Внеклеточные везикулы (ВВ) представляют собой класс мембраносвязанных органелл, секретируемых различными типами клеток. ВВ включают (но не ограничиваются перечисленным): (i) экзосомы: мембранные везикулы эндоцитотического происхождения и диаметром 30-100 нм; (ii) эктосомы (называемые также почкующимися микровезикулами, ПМВ): крупные мембранные везикулы (диаметром 50-1000 нм), которые выделяются непосредственно из плазматической мембраны (ПМ), и (iii) апоптотические тельца (диаметром 50-5000 нм): выделяются умирающими клетками.
10-14
15-17
18-21
Экзосомы - естественные липидные внеклеточные нановезикулы, продуцируемые и высвобождаемые практически всеми типами клеток точно регулируемым и функционально соответствующим образом, при котором белок и состав мРНК отражают тип и состояние материнской клетки. Эти везикулы обладают внутренней стабильностью и способностью преодолевать биологические барьеры, поэтому экзосомы, происходящие из различных тканей, можно найти в доступных биологических жидкостях, таких как кровь. Принимая во внимание их биологические функции и особенности, экзосомы рассматриваются как ранние признаки изменений в клеточном и тканевом гомеостазе и метаболизме и являются перспективным источником для выявления новых биомаркеров болезней, а также для отображения роли известных биологических маркеров в парадигме жидкой биопсии. В этом заключаются основная предпосылка и перспективность использования экзосом-опосредованных анализов в диагностике сложных заболеваний, таких как злокачественные опухоли. Основная проблема заключается в выявлении связи экзосом-ассоциированных маркеров, белков и РНК с конкретной тканью, в определенном состоянии, и в оптимизации надежных, доступных по цене, неинвазивных экзосом-опосредованных решений и анализов, которые могут быть реально реализованы в клинических исследованиях и на практике.
В настоящее время существует потребность в биомаркерах внеклеточных везикул, с помощью которых можно определить наличие опухоли (доброкачественной, злокачественной и метастатической) или состояние опухолевой трансформации (доброкачественной в злокачественную и неметастатической в метастатическую).
РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Благодаря мицеллярной природе внеклеточных везикул, таких как экзосомы, некоторые биомолекулы, присутствующие в этих везикулах, могут быть обнаружены без лизиса везикул, так как они находятся на мембране, в то время как другие могут быть обнаружены только после лизиса везикул, так как они расположены внутри везикул.
Мы неожиданно обнаружили, что TM9SF4-положительные внеклеточные везикулы (т.е. внеклеточные везикулы, которые содержат белок TM9SF4) являются инструментами очень широкого назначения, которые могут быть использованы для определения наличия опухоли или состояния опухолевой трансформации у пациента, в частности, если используется биомаркер, выбранный из перечня, представленного в таблице 1.
22
21-24
25, 26
27-30
Белок TM9SF4 (SEQ ID NO: 1) - недавно описанный трансмембранный белок, который принадлежит к надсемейству с 9 трансмембранными сегментами (TM9SF), четко определенному семейству белков, которое характеризуется большим гидрофильным N-терминальным доменом, за которым следуют девять трансмембранных доменов. Известно об гиперэкспрессии этого белка при меланоме, острой миелоидной лейкемии и миелодиспластическом синдроме, в последнем случае вследствие амплификации (от трех до десяти раз) фрагмента 20-й хромосомы (20q11.21), содержащего полный ген TM9SF4. TM9SF4 вовлечен в фагоцитоз бактерий и в "каннибальский" фенотип метастатических клеток меланомы - явление, которое зачастую ассоциируется с неблагоприятным прогнозом. Раковые клетки-каннибалы часто обнаруживаются при раке желудка и толстой кишки
31
Недавно было продемонстрировано, что TM9SF4 связывается с АТФазой V-типа, протонным насосом, регулирующим уровень рН, гипеэкспрессированным в ряде опухолей. Такое взаимодействие аберрантно стабилизирует протонный насос в активном состоянии с последующим изменением градиента рН, что в свою очередь, ассоциируется с лекарственной устойчивостью и инвазивностью клеток рака толстой кишки.
Белок CD9 (SEQ ID NO: 2) относится к надсемейству с 4-мя трансмембранными сегментами, известное как семейство тетраспанинов. Тетраспанины представляют собой гликопротеины клеточной поверхности с четырьмя трансмембранными доменами, которые образуют многомерные комплексы с другими белками клеточной поверхности. Кодируемый белок функционирует во многих клеточных процессах, включая дифференциацию, адгезию, и сигнальную трансдукцию, а экспрессия этого гена играет решающую роль в подавлении подвижности и метастазирования раковых клеток. Он находится на поверхности экзосом и считается конститутивным белком экзосом для количественного анализа нановезикул, полученных из плазмы.
33
34-35
36
miRNA21 (SEQ ID NO: 3) микроРНК представляют собой класс малых некодирующих РНК, зрелые продукты которых имеют длину ~22 нуклеотидов. Они отрицательно регулируют экспрессию генов путем индукции трансляционного ингибирования или деградации транскриптов. Известно, что активность miR-21 усиливается при многих патологических состояниях, включая раковые опухоли и сердечно-сосудистые заболевания. Идентификация нескольких мишеней микроРНК, которые на самом деле являются классическими онкогенами или опухолевыми супрессорами, привела к широко распространенной идее, что микроРНК играет основную роль в возникновении рака, его прогрессировании и метастазировании miR-21 сначала рассматривалась как апоптотический супрессор в различных клеточных линиях.
37
RNU6 (SEQ ID NO: 4) представляет собой некодирующую РНК молекулу, которая функционирует в модификации других малых ядерных РНК (мяРНК). Точное профилирование микроРНК является важным шагом в понимании функциональной значимости этих малых РНК как в физиологических, так и патологических процессах. Хорошо известно, что нормализация является одним из наиболее важных шагов при проведении количественной ПЦР с детекцией в реальном времени, и гены, часто используемые для этой цели, такие как U6 и 5S, уже описаны как те, которые дифференциально экспрессируются при раковых опухолях, что делает эти гены непригодными для использования в качестве внутреннего контроля.
Соответственно, в первом аспекте настоящего изобретения предложен способ определения наличия опухоли у пациента in vitro; такой способ содержит следующие этапы:
а) получают биологический образец, полученный от этого пациента,
б) выделяют внеклеточные везикулы из вышеуказанного образца, причем эта стадия выделения внеклеточных везикул включает выделение TM9SF4-положительных внеклеточных везикул,
в) определяют, с использованием внеклеточных везикул, выделенных на стадии б), уровень или наличие подходящего биомаркера, и
г) сравнивают уровень или наличие биомаркера, определенного на стадии в), с одним или несколькими референсными значениями.
В одном варианте изобретения есть подозрения на наличие опухоли у пациента.
В одном варианте изобретения TM9SF4-положительные внеклеточные везикулы выделяют посредством связывания с антителом против TM9SF4.
В другом варианте изобретения, по меньшей мере, часть внеклеточных везикул представлена экзосомами.
В дополнительном варианте изобретения внеклеточные везикулы являются экзосомами.
В одном варианте изобретения опухоль представляет собой злокачественную опухоль.
В одном варианте изобретения опухоль представляет собой рак толстой кишки.
В другом варианте изобретения опухоль представляет собой рак желудка.
В другом варианте изобретения опухоль представляет собой рак молочной железы.
В другом варианте изобретения опухоль представляет собой рак легких.
В другом варианте изобретения опухоль представляет собой меланому.
В другом варианте изобретения опухоль представляет собой рак поджелудочной железы.
В другом варианте изобретения опухоль представляет собой рак яичников.
В другом варианте изобретения опухоль представляет собой рак простаты.
В другом варианте изобретения опухоль представляет собой опухоль центральной нервной системы.
В конкретном варианте изобретения опухоль центральной нервной системы представляет собой глиобластому.
В другом варианте изобретения опухоль представляет собой MPNST.
В одном варианте изобретения биомаркером стадии в) является белок CD9.
В одном варианте изобретения биомаркером стадии в) является белок miR-21.
В одном варианте изобретения биомаркером стадии в) является белок RNU6.
В одном варианте изобретения образец представляет собой образец опухоли.
В другом варианте изобретения образец является биологической жидкостью.
В конкретном варианте изобретения образец представляет собой образец плазмы.
В конкретном варианте изобретения образец представляет собой образец крови.
В конкретном варианте изобретения образец представляет собой образец сыворотки крови.
В конкретном варианте изобретения образец представляет собой образец мочи.
В конкретном варианте изобретения образец представляет собой образец слюны.
В одном варианте изобретения субъектом является человек.
В одном варианте изобретения субъектом является млекопитающее.
В одном варианте изобретения референсным значением является уровень или наличие биомаркера стадии в) в более раннем образце от того же пациента, что и на стадии а).
В другом варианте изобретения референсным значением является уровень или наличие биомаркера стадии в) в образцах, полученных от других пациентов, чем те, которые участвуют в стадии а).
Любое сочетание вышеупомянутых вариантов изобретения первого аспекта настоящего изобретения представляет собой дополнительные варианты настоящего изобретения.
Во втором аспекте настоящего изобретения предлагают способ определения in vitro состояния опухолевой трансформации у пациента; такой способ содержит следующие этапы:
а) получают биологический образец, полученный от этого пациента,
б) выделяют внеклеточные везикулы из вышеуказанного образца, причем эта стадия выделения внеклеточных везикул включает выделение TM9SF4-положительных внеклеточных везикул,
в) определяют, с использованием внеклеточных везикул, выделенных на стадии б), уровень или наличие подходящего биомаркера, и
г) сравнивают уровень или наличие биомаркера, определенного на стадии в), с одним или несколькими референсными значениями.
В одном из вариантов изобретения биологический образец стадии а) получают из организма пациента с доброкачественной опухолью.
В конкретном варианте изобретения доброкачественная опухоль представляет собой доброкачественную опухоль толстой кишки.
В конкретном варианте изобретения доброкачественная опухоль представляет собой плексиформную нейрофиброму.
В другом варианте изобретения TM9SF4-положительные внеклеточные везикулы выделяют посредством связывания с антителом против TM9SF4.
В другом варианте изобретения, по меньшей мере, часть внеклеточных везикул представлена экзосомами.
В дополнительном варианте изобретения внеклеточные везикулы являются экзосомами.
В одном варианте изобретения состояние опухолевой трансформации представляет собой трансформацию в MPNST.
В другом варианте изобретения состояние опухолевой трансформации представляет собой трансформацию в колоректальный рак.
В одном варианте изобретения биомаркером стадии в) является белок CD9.
В одном варианте изобретения биомаркером стадии в) является белок miR-21.
В одном варианте изобретения биомаркером стадии в) является белок RNU6.
В одном варианте изобретения образец представляет собой образец опухоли.
В другом варианте изобретения образец является биологической жидкостью.
В конкретном варианте изобретения образец представляет собой образец плазмы.
В конкретном варианте изобретения образец представляет собой образец крови.
В конкретном варианте изобретения образец представляет собой образец сыворотки крови.
В конкретном варианте изобретения образец представляет собой образец мочи.
В конкретном варианте изобретения образец представляет собой образец слюны.
В одном варианте изобретения субъектом является человек.
В одном варианте изобретения субъектом является млекопитающее.
В одном варианте изобретения референсным значением является уровень или наличие биомаркера стадии в) в более раннем образце от того же пациента, что и на стадии а).
В другом варианте изобретения референсным значением является уровень или наличие биомаркера стадии в) в образцах, полученных от других пациентов, чем те, которые участвуют в стадии а).
Любое сочетание вышеупомянутых вариантов второго аспекта настоящего изобретения представляет собой дополнительные варианты настоящего изобретения.
В третьем аспекте настоящего изобретения предлагают использование TM9SF4-положительных внеклеточных везикул для определения наличия опухоли или состояния опухолевой трансформации у пациента.
В одном варианте изобретения анализ представляет собой анализ in vitro.
В одном варианте осуществления внеклеточные везикулы являются экзосомами.
В одном варианте изобретения опухоль представляет собой злокачественную опухоль.
В одном варианте изобретения опухоль представляет собой рак толстой кишки.
В другом варианте изобретения опухоль представляет собой рак желудка.
В другом варианте изобретения опухоль представляет собой рак молочной железы.
В другом варианте изобретения опухоль представляет собой рак легких.
В другом варианте изобретения опухоль представляет собой меланому.
В другом варианте изобретения опухоль представляет собой рак поджелудочной железы.
В другом варианте изобретения опухоль представляет собой рак яичников.
В другом варианте изобретения опухоль представляет собой рак простаты.
В другом варианте изобретения опухоль представляет собой опухоль центральной нервной системы.
В конкретном варианте изобретения опухоль центральной нервной системы представляет собой глиобластому.
В другом варианте изобретения опухоль представляет собой MPNST.
В одном варианте изобретения состояние опухолевой трансформации представляет собой трансформацию в MPNST.
В другом варианте изобретения состояние опухолевой трансформации представляет
собой трансформацию в колоректальный рак.
В одном варианте изобретения субъектом является человек.
В одном варианте изобретения субъектом является млекопитающее.
Любое сочетание вышеупомянутых вариантов третьего аспекта настоящего изобретения представляет собой дополнительные варианты настоящего изобретения.
Четвертый аспект настоящего изобретения относится к применению TM9SF4-положительных внеклеточных везикул в тесте на определение наличия опухоли или состояния опухолевой трансформации у пациента.
В одном варианте изобретения анализ представляет собой анализ in vitro
В одном варианте изобретения, по меньшей мере, часть внеклеточных везикул представлена экзосомами.
В дополнительном варианте изобретения внеклеточные везикулы являются экзосомами.
В одном варианте изобретения опухоль представляет собой злокачественную опухоль.
В одном варианте изобретения опухоль представляет собой рак толстой кишки.
В другом варианте изобретения опухоль представляет собой рак желудка.
В другом варианте изобретения опухоль представляет собой рак молочной железы.
В другом варианте изобретения опухоль представляет собой рак легких.
В другом варианте изобретения опухоль представляет собой меланому.
В другом варианте изобретения опухоль представляет собой рак поджелудочной железы.
В другом варианте изобретения опухоль представляет собой рак яичников.
В другом варианте изобретения опухоль представляет собой рак простаты.
В другом варианте изобретения опухоль представляет собой опухоль центральной нервной системы.
В конкретном варианте изобретения опухоль центральной нервной системы представляет собой глиобластому.
В другом варианте изобретения опухоль представляет собой MPNST.
В одном варианте изобретения состояние опухолевой трансформации представляет собой трансформацию в MPNST.
В другом варианте изобретения состояние опухолевой трансформации представляет собой трансформацию в колоректальный рак.
В одном варианте изобретения субъектом является человек.
В одном варианте изобретения субъектом является млекопитающее.
Любое сочетание вышеупомянутых вариантов четвертого аспекта настоящего изобретения представляет собой дополнительные варианты настоящего изобретения.
В пятом аспекте настоящего изобретения предлагают набор для определения наличия опухоли или состояния опухолевой трансформации у пациента; такой набор включает антитело против TM9SF4.
В одном варианте изобретения набор дополнительно включает анти-CD9 антитело.
В другом варианте настоящего изобретения набор дополнительно включает праймер miR-21.
В другом варианте изобретения набор дополнительно включает праймер RNU6.
В одном варианте изобретения опухоль представляет собой злокачественную опухоль.
В одном варианте изобретения опухоль представляет собой рак толстой кишки.
В другом варианте изобретения опухоль представляет собой рак желудка.
В другом варианте изобретения опухоль представляет собой рак молочной железы.
В другом варианте изобретения опухоль представляет собой рак легких.
В другом варианте изобретения опухоль представляет собой меланому.
В другом варианте изобретения опухоль представляет собой рак поджелудочной железы.
В другом варианте изобретения опухоль представляет собой рак яичников.
В другом варианте изобретения опухоль представляет собой рак простаты.
В другом варианте изобретения опухоль представляет собой опухоль центральной нервной системы.
В конкретном варианте изобретения опухоль центральной нервной системы представляет собой глиобластому.
В другом варианте изобретения опухоль представляет собой MPNST.
В одном варианте изобретения состояние опухолевой трансформации представляет собой трансформацию в MPNST.
В другом варианте изобретения состояние опухолевой трансформации представляет собой трансформацию в колоректальный рак.
В другом варианте настоящего изобретения набор дополнительно содержит инструкции по применению в виде маркировки на упаковке или вкладыша.
Любое сочетание вышеупомянутых вариантов пятого аспекта настоящего изобретения представляет собой дополнительные варианты настоящего изобретения.
ПРИМЕРЫ
Приводится подробное описание настоящего изобретения только в качестве примера со ссылкой на прилагаемые чертежи, на которых:
На Фиг. 1 приводится сравнение уровней биомаркеров TM9SF4 и CD9, измеренных с помощью сортировки клеток с активированной флуоресценцией (FACS) на клеточной линии MPNST (S462, первый столбец), линии плексиформной нейрофибромы (54836Т_003, второй столбец) и клеточной линией дермальной нейрофибромы (1201А078, третий столбец). Средние значения показывают, что биомаркеры, обнаруженные на мембране экзосомы, позволяют различить доброкачественные (плексиформная нейрофиброма, дермальная нейрофиброма) и злокачественные (MPNST) заболевания.
На Фиг. 2 приведены результаты иммуноферментного анализа «сэндвич»-методом (sandwich-Elisa), в котором 40, 20, 10 и 5 мкг экзосом, очищенных по протоколу ультрацентрифугирования из кондиционированной среды, из линии клеток глиобластомы (U87) или трех клеточных линий MPNST (S462, Т265 и 88-14) из линии клеток эмбриональной почки человека (НЕК293) захватываются антителом к белку TM9SF4 и детектируются антителом к белку CD9, демонстрируя, что эти биомаркеры экспрессируются на экзосомальной мембране, и что анализ sandwich-Elisa может быть использован для обнаружения экзосом злокачественной нейрофибромы (MPNST) или других солидных опухолей (например, глиобластомы), а не экзосом, очищенных от НЕК293. Отношения к фону по оси ординат соответствуют значениям оптической плотности каждого образца, разделенным на фон средней оптической плотности (только PBS, 0 мкг = отношение к фону 1).
На Фиг. 3А. Иммуногистохимическая (ИГХ) оценка TM9SF4 у пациентов с колоректальным раком (CRC) и раком желудка (GC) по сравнению со здоровыми окружающими тканями и преднеопластическими поражениями (гиперпластические полипы, тубулярно-ворсинчатая аденома и дисплазия желудка, соответственно), продемонстрировала высокоспецифичное окрашивание ткани опухоли, как при ранних, так и при поздних стадиях, при слабой экспрессии или ее отсутствии в здоровых или диспластических тканях. В целом, у 90% исследуемых раковых заболеваний наблюдается сильно выраженная экспрессия TM9SF4, и уровень экспрессии (балл ИГХ) достоверно коррелирует со стадией заболевания. На Фиг. 3Б показано ИГХ окрашивание TM9SF4-положительных клеток/мм2 при раке молочной железы, легких и меланомы по сравнению со здоровыми окружающими тканями. На рисунке выявлено значительно большее количество TM9SF4-положительных клеток/мм2 во всех проанализированных опухолевых тканях.
На Фиг. 4 приведены результаты анализа sandwich-ELISA, в котором 100 мкл предварительно очищенных (см. раздел «Материалы и методы») образцов плазмы, полученных от больных с опухолью ранней (в классификации TNM - T1-2N0M0) или поздней стадии (в классификации TNM - T3-4NxMx), захватываются иммунногранулами с помощью 96-луночных планшетов с антителами против TM9SF4. Обнаружение с помощью антител к CD9 показало высокий удельный коэффициент к фоновым значениям для образцов плазмы опухоли, как при ранних, так и при поздних стадиях, с очень низким уровнем экспрессии в здоровых образцах донорской плазмы. Числа в столбчатой диаграмме соответствует числу наблюдений в каждой исследовательской группе. Отношение к фону рассчитывалось путем деления значения абсорбции образцов на фоновое значение (только PBS в лунке, при отношении к фону = 1).
На Фиг. 5 показано результаты анализа sandwich-ELISA, в котором 100 мкл предварительно очищенных (см. раздел «Материалы и методы») образцов плазмы, полученных от больных с опухолью, захватываются иммунногранулами с помощью 96-луночных планшетов с антителами против TM9SF4. Обнаружение с помощью антител к CD9 показало высокий удельный коэффициент к фоновым значениям для образцов плазмы опухоли с очень низким уровнем экспрессии в здоровых образцах донорской плазмы. На горизонтальной оси показаны группа с опухолями и количество наблюдений (N). Отношение к фону рассчитывалось путем деления значения абсорбции образцов на фоновое значение (только Натрий-фосфатный буфер (PBS) в лунке, при отношении к фону = 1).
На Фиг. 6 представлена кривая ROC (известная также как ROC-анализ или кривая ошибок), рассчитанная с помощью программы GraphPad Prism с использованием данных о колоректальном раке (CRC) из Фиг. 5. Здоровую группу доноров использовали для расчета специфичности и оптимального порога анализа sandwich-ELISA с TM9SF4/CD9 для образцов плазмы. На рисунке показано, как при условии порогового значения >6,925 анализ имеет чувствительность >92% и специфичность >95%.
На Фиг. 7 представлена кривая ROC, рассчитанная с помощью программы GraphPad Prism с использованием данных о раке желудка из Фиг. 5. Здоровую группу доноров использовали для расчета специфичности и оптимального порога анализа sandwich-ELISA с TM9SF4/CD9 для образцов плазмы. На рисунке показано, как при условии порогового значения >7,025 анализ имеет чувствительность >83,9% и специфичность >95%.
На Фиг. 8 представлена кривая ROC, рассчитанная с помощью программы GraphPad Prism с использованием данных о раке молочной железы из Фиг. 5. Здоровую группу доноров использовали для расчета специфичности и оптимального порога анализа sandwich-ELISA с TM9SF4/CD9 для образцов плазмы. На рисунке показано, как при условии порогового значения >7,004 анализ имеет чувствительность >88,2% и специфичность >95%.
На Фиг. 9 представлена кривая ROC, рассчитанная с помощью программы GraphPad Prism с использованием данных о раке простаты из Фиг. 5. Здоровую группу доноров использовали для расчета специфичности и оптимального порога анализа sandwich-ELISA с TM9SF4/CD9 для образцов плазмы. На рисунке показано, как при условии порогового значения >7,005 анализ имеет чувствительность >75,8% и специфичность >95%.
На Фиг. 10 показано результаты анализа sandwich-ELISA, в котором 100 мкл предварительно очищенных (см. раздел «Материалы и методы») образцов сыворотки, полученных от больных с опухолью, захватываются иммунногранулами с помощью 96-луночных планшетов с антителами к TM9SF4. Обнаружение с помощью антитела к CD9 характеризуется значительное более высоким коэффициентом к фоновым значениям опухолевых образцов сыворотки по сравнению со здоровыми образцами донорской сыворотки. Эти результаты свидетельствуют о том, что анализ ELISA TM9SF4/CD9 подходит также для оценки образцов плазмы рака поджелудочной железы.
На Фиг. 11-А показано результаты анализа sandwich-ELISA, в котором 100 мкл предварительно очищенных (см. раздел «Материалы и методы») семи образцов плазмы колоректального рака (CRC #1-#7) и контрольной группы (здоровые донорские - HD) захватываются иммунногранулами с помощью 96-луночных планшетов с антителами к TM9SF4. Фиг. 11-Б показывает относительную экспрессию miR-21 (нормированную к miR-451), полученную из внеклеточных везикул (ВВ) из 100 мкл ТОГО ЖЕ набора образцов. ТМ9$Р4-положительные везикулы были получены с помощью гранул, покрытых антителами TM9SF4, и РНК экстрагировали и анализировали с помощью количественной ПЦР в реальном времени, как описано в разделе «Материалы и методы». Диагностический порог (горизонтальная линия) для анализа ELISA был задан, как описано ранее (см. раздел «Материалы и методы»), а для анализа miR-21 это значение было в 2 раза больше, чем среднее значение в контрольной группе. Удивительно, 6 из 7 образцов CRC соответствовали результатам диагностики, что свидетельствует о корреляции между этими двумя анализами, основанными на иммунозахвате TM9SF4.
На Фиг. 12 показана относительная экспрессия miR-21 (нормированная к miR-451 или miR-574), полученной из ВВ из 100 мкл плазмы от пациентов, больных раком (колоректальный рак (CRC) N=7; рак желудка N=6; рак молочной железы N=6; рак простаты N=5; меланома N=5; рак яичников N=6; рак легких N=6), и контрольной группы (здоровые доноры N=11). TM9SF4-положительные ВВ были получены с помощью гранул, покрытых антителами TM9SF4, и РНК экстрагировали и анализировали с помощью количественной ПЦР в реальном времени, как описано в разделе «Материалы и методы». Данные свидетельствуют о том, что miR-21, полученная из ВВ, сверхэкспрессируется в плазме онкобольных, и что miR-451 и miR-574 представляют собой подходящие референсные микроРНК для определения относительной экспрессии микроРНК опухолевого происхождения из ВВ.
На Фиг. 13 показана относительная экспрессия RNU6 и miR-21, полученных из ВВ (нормированная к miR-223), из 1 мл концентрированного (10Х) клеточного супернатанта из дермальной, плексиформной клеточной линий и линии MPNST. TM9SF4-положительные ВВ были получены с помощью гранул, покрытых антителами TM9SF4, и РНК экстрагировали и анализировали с помощью количественной ПЦР в реальном времени, как описано в разделе «Материалы и методы». Данные свидетельствуют о том, что RNU6 и miR-21, полученные из ВВ, сверхэкспрессируются в супернатанте человеческих клеточных линий рака (MPNST), но не в супернатанте доброкачественных опухолевых линий (плексиформной) или нормальных клеточных линий (дермальные).
На Фиг. 14-А показана относительная экспрессия miR-21, полученной из ВВ (нормированная к miR-451), из 100 мкл плазмы пациента с раком простаты и здорового донора. ВВ были получены с помощью гранул, покрытых антителами анти-CD9, или гранул, покрытых антителами анти-TM9SF4. РНК экстрагировали и анализировали с помощью количественной ПЦР в реальном времени, как описано в разделе «Материалы и методы». На Фиг. 14-Б показана относительная экспрессия miR-21, полученной из ВВ (нормированная к miR-451), из 100 мкл плазмы пациента с колоректальным раком (CRC) и здорового донора. ВВ были получены с помощью гранул, покрытых антителами анти-CD9 и анти-CD63, или гранул, покрытых антителами анти-TM9SF4, и РНК экстрагировали и анализировали с помощью количественной ПЦР в реальном времени, как описано в разделе «Материалы и методы». Данные Фиг. 14-А и Б позволяют предположить, что при иммунозахвате ВВ, полученных из опухоли, с помощью гранул, покрытых антителами анти-TM9SF4, как из плазмы, так и из сыворотки, они богаты содержанием miR-21 (известная опухоль-ассоциированная микроРНК). И наоборот, при захвате ВВ с помощью антител, направленных на генерические ВВ-маркеры (CD9 или CD63), они не богаты содержанием miR-21.
На Фиг. 15 показана относительная экспрессия miR-21, полученной из ВВ (нормированная к miR-451) из 100 мкл плазмы пациента с раком простаты и здорового донора. ВВ были получены с помощью гранул, покрытых антителами анти-TM9SF4, или гранул, покрытых IgG-антителами сходного изотипа (ISO), для оценки неспецифического связывания. РНК экстрагировали и анализировали с помощью количественной ПЦР в реальном времени, как описано в разделе «Материалы и методы». Данные демонстрируют специфический захват TM9SF4-положительных ВВ с помощью гранул, покрытых антителами анти-TM9SF4, и в то же время низкое неспецифическое связывание, наблюдаемые в плазме онкобольного.
На Фиг. 16 приводятся результаты анализа sandwich-ELISA, в котором 100 мкл предварительно очищенных (см. раздел «Материалы и методы») образцов плазмы, полученных от пациентов с опухолью и здоровых пациентов, были подвергнуты иммунному захвату с помощью антител к CD9, покрывающих 96-луночные планшеты. Проведение детекции с помощью антител к TM9SF4 показало, что изменение порядка связывания детекции антител, продемонстрированного на Фиг. 5, не пригодно для различения опухолевых образцов плазмы от образцов плазмы здоровых доноров. Отношение к фону рассчитывалось путем деления значения абсорбции образцов на фоновое значение (только PBS в лунке, при отношении к фону = 1.
МЕТОДЫ
Ниже приводится описание способов, используемых в примерах для выделения и анализа экзосом. Специалисту в данной области техники понятно, что существуют альтернативные, эквивалентные способы.
Изоляция экзосом по протоколу ультрацентрифугирования.
Кондиционированную среду для подготовки и анализа экзосом собирают интересующих клеток, конфлюэнтных на 80-90% (образующих монослой, заселенный на 80-90%).
Супернатант из клеточной культуры собирают в стерильных условиях и добавляют ингибиторы протеазы, разведенные в соотношении 1:1000, предварительно очищают путем фильтрации (0,2 мкм) и ультрацентрифугирования (приблизительно 50 мл/пробирку) при скорости 110000 g в течение 1,5 часа при температуре +4°С. Затем супернатант отбирают и удаляют. Осадок ресуспендируют в 100 мкл PBS, охлажденного до 0°С, перед разбавлением в 50 мл 1xPBS, охлажденного до 0°С, и ультрацентрифугируют при 110000 g в течение 1,5 ч при +4°С. Полученный в результате осадок ресуспендируют в 100 мкл PBS и встряхивают в течение 30 секунд перед отбором для экспериментов.
Стандартный протокол обнаружения белковых маркеров с помощью FACS-анализа
Экзосомальная концентрация определяется количественно с использованием метода Бредфорда для количественной оценки белка.
Экзосомы, выделенные из супернатантов клеточных линий, инкубировали при температуре 4°С в течение ночи с альдегидом/сульфатными латексными гранулами (4% по массо-объему, 4 мкм) в соотношении 1:20. После промывки в PBS, экзосомы, адсорбированные на поверхности гранул, инкубируют в PBS + 0,5% БСА с соответствующим первичным антителом (для конечной концентрации 5 мкг/мл) и выдерживают 1 ч при температуре 4°С. После стадии промывки с PBS + 0,5% БСА, образцы инкубируют в течение 45' при температуре 4°С с соответствующим вторичным антителом (из мыши AlexaFluor 488, кролика или козы, разбавленного в соотношении 1:1000). После окончательной стадии промывки в PBS, образцы повторно суспендируют в 300 мкл PBS и анализируют в системе FACSCalibur (производитель BD). В качестве отрицательного контроля используют антитела сходного изотипа или только вторичные антитела. Медиана интенсивности флуоресценции каждого образца считывается с помощью FLI канала и нормализуется для отрицательного контроля.
Сбор образцов:
Критерии включения составляли только недавно диагностированные случаи рака, пациентов, которые ранее не получали радио- или химиотерапевтическое лечение, или пациенты, которым не была проведена операция перед сбором крови. Все пациенты подписали согласие перед включением в исследование. Исследование проводилось в Рижской Восточной клинической университетской больнице, было одобрено местным этическим комитетом и соответствовало Хельсинкской декларации. Кровь собирали в пробирки с ЭДТА объемом 10 мл, осторожно переворачивали и центрифугировали при 1500 g 10' при комнатной температуре в течение 30 минут с момента сбора крови.
Центр крови Северо-Эстонской региональной больницы предоставлял здоровую сертифицированную донорскую плазму.
Иммуногистохимическое исследование тканей
2
2
Срезы тканей подвергают иммуноокрашиванию для визуализации TM9SF4-положительных клеток. Антиген извлекают путем инкубации слайдов в буфере Трис/ЭДТА при рН=9,0 в научной микроволновой печи в течение 30 мин. Активность эндогенной пероксидазы блокируют с помощью 3,0% HO в течение 10 мин. Неспецифическое связывание первичного антитела блокируют с помощью нормальной лошадиной сыворотки перед инкубацией антител. Срезы инкубируют в течение ночи при температуре 4°С с кроличьим поликлональным антителом TM9SF4 (разведение 1:400). Срезы инкубируют при комнатной температуре в течение 1 ч при разведении 1:100. Связывание антител определяют с использованием реагента EnVision (1 час при комнатной температуре). Цветная реакция иммунопероксидазы была разработана путем инкубирования слайдов с диаминобензидином в течение 7 мин. Отрицательный контроль, в котором нет первичного антитела, включают в каждый эксперимент.
Визуализация и количественное определение клеток.
Каждый образец оценивают в соответствии с интенсивностью нуклеинового или цитоплазматического окрашивания (отсутствие = 0, слабое окрашивание = 1, умеренное окрашивание = 2, сильное окрашивание = 3) и степенью окрашивания клеток (0% = 0 баллов; 1-10% = 1 балл; 11-50% = 2 балла; >51 = 3 балла). Отрицательный означает 0% окрашивания. Фокально-положительный означает, что 1-80% площади окрашено; диффузно-положительный означает, что 81-100% площади окрашено. При раке молочной железы, легкого и меланоме подсчитывают количество раковых позитивных клеток/мм2.
Анализ данных
Результаты морфологических данных выражаются как среднее значение ±SD (стандартное отклонение). Морфологические и иммуногистохимические данные анализируют двухфакторным дисперсионным методом с последующим применением критерия Бонферрони для сравнения между группами. Корреляцию с клиническими и гистологическими данными оценивают с применением критерия Спирмена. Во всех анализах, значение р<0,05 рассматривается как статистически значимое. SPSS 21. версия программного обеспечения используется для статистического анализа.
Стандартный протокол обнаружения белковых маркеров с помощью анализа sandwich-ELISA:
ELISA анализ очищенных экзосом путем ультрацентрифугирования кондиционированной среды: 40, 20, 10 и 5 мкг/100 мкл PBS изолированных экзосом и 100 мкл PBS в качестве отрицательного контроля (0 мкг) наносят на 96-луночный планшет с предварительно нанесенными антителами к TM9SF4 (2 мкг/мл) (прозрачный планшет). Вкратце, 96-луночные планшеты предварительно покрывают соответствующим иммобилизующим антителом, промывают трижды, используя PBS + 0,05% TWEEN (буфер для промывки) с выделенными экзосомами, и инкубируют в течение ночи при температуре 37°С. После трех промывок буфером для промывки планшеты инкубируют с детекторным антителом CD9, инкубируют в течение 2 часов при температуре 37°С, промывают трижды буфером для промывки, инкубируют в течение одного часа при температуре 37°С с соответствующим вторичным антителом, и промывают трижды буфером для промывки. 100 мкл ТМВ (тетраметилбензидина) добавляют в каждую лунку, и через 5 минут реакцию останавливают добавлением 100 мкл стоп-раствора (1N серной кислоты).
Оптическую плотность считывают с помощью прибора M1000 (Tecan) при длине волны 450 нм.
Анализ ELISA для биологических жидкостей (плазмы и сыворотки): Образцы плазмы и сыворотки хранят при -80°С, размораживают при комнатной температуре и предварительно очищают после добавления 1:500 ингибиторов протеаз, центрифугируя со скоростью 1200 g 20' при температуре 4°С, перенося супернатант в другую пробирку, и еще раз центрифугируют при 10000 g 30' при температуре 4°С. Полученный супернатант называют предварительно очищенным и используют для последующего анализа. 100 мкл предварительно очищенной плазмы или сыворотки инкубируют в течение ночи при температуре 4°С в 96-луночных планшетах с предварительно нанесенным антителом к TM9SF4 (2 мкг/мл). После трех промывок буфером для промывки планшеты инкубируют с детекторным антителом CD9, инкубируют в течение 2 часов при температуре 4°С, промывают трижды буфером для промывки, инкубируют в течение одного часа при температуре 4°С с соответствующим вторичным антителом, и промывают трижды буфером для промывки. 100 мкл ТМВ (тетраметилбензидина) добавляют в каждую лунку, и через 5 минут реакцию останавливают добавлением 100 мкл стоп-раствора (1N серной кислоты).
Оптическую плотность считывают с помощью прибора M1000 (Tecan) при длине волны 450 нм.
Получение гранул, покрытых TM9SF4
Гранулы, покрытые антителом к TM9SF4, можно получить способом, известным специалистам в данной области техники, или его модификациями.
Извлечение РНК и микроРНК из экзосом, захваченных иммуногранулами.
Изоляция экзосом посредством захвата с помощью иммуногранул, предварительно покрытых TM9SF4: питательные среды ши биологические жидкости (плазмы и сыворотки) 10 мл супернатанта из культуры клеток добавляют с ингибиторами протеаз, разбавленными в соотношении 1:1000, и концентрируют до уровня 10Х с использованием центробежных блоков фильтрации (Millipore). 1 мл среды 10Х затем инкубируют в течение ночи при температуре 4°С с иммуногранулами, на которые предварительно наносят антитело к TM9SF4.
Иммунозахваченные ВВ промывают трижды, используя PBS + 0,01% Tween, и обрабатывают с 0,7 мл QIAZOL.
100 мкл предварительно очищенной плазмы или сыворотки разбавляют 900 мкл PBS IX и инкубируют в течение ночи при температуре 4°С в ротаторе с 10 мкл гранулами, предварительно покрытыми TM9SF4. ВВ промывают трижды, используя PBS + 0,01% Tween, и обрабатывают 0,7 мл QIAZOL.
Полную РНК извлекают с помощью набора для экстракции Total RNA extraction kit (Hansabiomed) и определяют количественно элюированную РНК в NanoDrop.
Амплификация микроРНК и мякРНК и ПЦР в реальном времени
МикроРНК ретро-транскрибируют с помощью набора miScript IIRT Kit (Qiagen) и 0,3 нг полученной кДНК амплифицируют с помощью ПЦР с детекцией в реальном времени в системе CFX96™ real-time PCR detection system (BIORAD) с помощью набора miScript SYBR Green PCR (Qiagen), используя наборы праймеров miScript (Qiagen), подобранных для miR-21 (Кат. номер: MS00009079), RNU6, (Кат.номер: MS00033740) и для контрольных микроРНК, miR-451 (Кат. номер: MS00004242), miR-574 (Кат. номер: MS00032025) и miR-223 (Кат. номер: MS00003871).
Ссылки
1. Carroll SL, Ratner N. How does the Schwann cell lineage form tumors in NF1? Glia. 2008; 56(14):1590-605. Epub 2008/09/23. doi: 10.1002/glia.20776. PubMed PMID: 18803326; PubMed Central PMCID: PMC2652636.
2. Evans DG, Baser ME, McGaughran J, Sharif S, Howard E, Moran A. Malignant peripheral nerve sheath tumours in neurofibromatosis 1. J Med Genet. 2002; 39(5):311-4. Epub 2002/05/16. PubMed PMID: 12011145; PubMed Central PMCID: PMC1735122.
3. Korf BR. Malignancy in neurofibromatosis type 1. Oncologist 2000; 5(6):477-85.
4. Lewis JJ, Brennan MF. Soft tissue sarcomas. Curr Probl Surg. 1996; 33(10):817-72. Epub 1996/10/01. PubMed PMID: 8885853.
5. Woodruff JMK, H.P.; Louis, D.N.; Scheithauer, B.W. Malignant peripheral nerve sheath tumour (MPNST). In: Kleihues PC, W.K., editor. Pathology and Genetics of Tumours of the Nerv ous System. First ed. Lyon: IARC Press; 2000. p. 172-4.
6. Ducatman BS, Scheithauer BW, Piepgras DG, Reiman HM, Ilstrup DM. Malignant peripheral nerve sheath tumors. A clinicopathologic study of 120 cases. Cancer. 1986; 57(10):2006-21. Epub 1986/05/15. PubMed PMID: 3082508.
7. Ferner RE, Gutmann DH. International consensus statement on malignant peripheral nerve sheath tumors in neurofibromatosis. Cancer Res. 2002; 62(5): 1573-7. Epub 2002/03/16. PubMed PMID: 11894862.
8. McQueen M, MacCollin M, Gusella J, Plotkin SR. Patient and physician attitudes regarding clinical trials in neurofibromatosis 1. J Neurosci Nurs. 2008; 40(6):341-5. Epub 2009/01/28. PubMed PMID: 19170300.
9. Mathivanan S, Ji H, Simpson RJ (2010) Exosomes: extracellular organelles important in intercellular communication. J Proteomics 73: 1907-1920.
10. Keller S, Sanderson MP, Stoeck A, Altevogt P. Exosomes: from biogenesis and secretion to biological function. Immunol Lett. 2006 Nov 15; 107(2):102-8. Epub 2006 Oct 17.
11. Simons M, Raposo G. Exosomes-vesicular carriers for intercellular communication. CurrOpinCell Biol. 2009; 21(4):575-81.
12. Simpson RJ, Jensen SS, Lim JW. Proteomic profiling of exosomes: current perspectives. Proteomics. 2008 Oct; 8(19):4083-99. doi: 10.1002/pmic.200800109.
13. Mathivanan S, Lim JW, Tauro BJ, Ji H, Moritz RL, Simpson RJ. Proteomics analysis of A33 immunoaffinity-purified exosomes released from the human colon tumor cell line LIM 1215 reveals a tissue-specific protein signature. MolCell Proteomics. 2010; 9(2):197-208.
14. Valadi H, Ekstrom K, Bossios A, Sjostrand M, Lee JJ, Lotvall JO. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. NatCell Biol. 2007; 9(6):654-9.
15. Caby MP, Lankar D, Vincendeau-Scherrer C, Raposo G, Bonnerot C. Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma. Int Immunol. 2005 Jul; 17(7):879-87.
16. Mitchell PJ, Welton J, Staffurth J, Court J, Mason MD, Tabi Z, Clayton A. Can urinary exosomes act as treatment response markers in prostate cancer? 12; 7:4. doi: 10.1186/1479-5876-7-4.
17. Skog J, Wurdinger T, van Rijn S, Meijer DH, Gainche L, Sena-Esteves M, et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers. NatCell Biol. 2008; 10(12):1470-6.
18. Logozzi M, De Milito A, Lugini L, Borghi M, Calabro L, Spada M, Perdicchio M, Marino ML, Federici C, Iessi E, Brambilla D, Venturi G, Lozupone F, Santinami M, Huber V, Maio M, Rivoltini L, Fais S. High levels of_exosomes_expressing CD63 and caveolin-1 in plasma of melanoma patients. PLoS One. 2009; 4(4):e5219.
19. Duijvesz D, Luider T, Bangma CH, Jenster G. Exosomes_as biomarker treasure_chests_for prostate cancer. Eur Urol. 2011 May;
20. Vlassov AV, Magdaleno S, Setterquist R, Conrad R. Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials. Biochim Biophys Acta. 2012 Jul; 1820(7):940-8.
21. Corrado C, Raimondo S, Chiesi A, Ciccia F, De Leo G, Alessandro R. Exosomes_as intercellular signaling organelles involved in health and disease: basic science and clinical applications. Int J Mol Sci. 2013 Mar 6; 14(3):5338-66.
22. Chluba-de Tapia J, de Tapia M, Jaggin V, Eberle AN. Cloning of a human multispanning membrane protein cDNA: evidence for a new protein family. Gene. 1997 Sep 15; 197(1-2): 195-204.
23. Lozupone F, Perdicchio M, Brambilla D, Borghi M, Meschini S, Barca S, Marino ML, Logozzi M, Federici C, Iessi E, de Milito A, Fais S. The human homologue of Dictyostelium discoideum phg1A is expressed by human metastatic melanoma cells. EMBO Rep.2009 Dec; 10(12):1348-54. doi: 10.1038/embor.2009.236. Epub 2009 Nov 6.
24. Mackinnon RN, Selan C, Wall M, Baker E, Nandurkar H, Campbell LJ. The paradox of 20q11.21 amplification in a subset of cases of myeloid malignancy with chromosome 20 deletion. Genes Chromosomes Cancer. 2010 Nov; 49(11):998-1013. doi: 10.1002/gcc.20806.
25. Fais S. Proton pump inhibitor-induced tumour cell death by inhibition of a detoxification mechanism. J Intern Med. 2010 May; 267(5):515-25. doi: 10.1111/j.1365-2796.2010.02225.x.
26. Perrin J, Mortier M, Jacomin AC, Viargues P, Thevenon D, Fauvarque MO. The nonaspanins TM9SF2 and TM9SF4 regulate the plasma membrane localization and signalling activity of the peptidoglycan recognition protein PGRP-LC in Drosophila. J Innate Immun. 2015; 7(1):37-46. doi: 10.1159/000365112. Epub 2014 Aug 13.
27. Caruso RA, Fedele F, Finocchiaro G, Arena G, Venuti A. Neutrophil-tumor cell phagocytosis (cannibalism) in human tumors: an update and literature review. Exp Oncol. 2012 34:306-11.
28. Caruso RA, Muda AO, Bersiga A, Rigoli L, Inferrera C. Morphological evidence of neutrophil-tumor cell phagocytosis (cannibalism) in human gastric adenocarcinomas. Ultrastruct Pathol. 2002 26:315-21.
29. McBumey McBumey MI, Van Soest PJ, Jeraci JL. Colonic carcinogenesis: the microbial feast or famine mechanism. Nutr Cancer. 1987; 10(l-2):23-8.
30. Bansal C, Tiwari V, Singh U, Srivastava A, Misra J. Cell Cannibalism: A cytological study in effusion samples. J Cytol. 2011 28:57-60.
31. Lozupone F, Borghi M, Marzoli F, Azzarito T, Matarrese P, Iessi E, Venturi G, Meschini S, Canitano A, Bona R, Cara A, Fais S. TM9SF4 is a novel V-ATPase-interacting protein that modulates tumor pH alterations associated with drug resistance and invasiveness of colon cancer cells. Oncogene. 2015 Feb 9. doi: 10.1038/onc.2014.437. [Epub ahead of print]
32. Ambros V, Lee RC, Lavanway A, Williams PT, Jewell D. MicroRNAs and other tiny endogenous RNAs in C. elegans. Curr Biol. 2003; 13:807-818.
33. Jazbutyte V, Thum T. MicroRNA-21: From cancer to cardiovascular disease. Curr Drug Targets. 2010; 11:926-935.
34. Esquela-Kerscher A, Slack FJ. Oncomirs-microRNAs with a role in cancer. Nat Rev Cancer. 2006; 6:259-269. [PubMed]
35. Zhang W, Dahlberg JE, Tarn W. MicroRNAs in tumor-igenesis: A primer. Am J Pathol. 2007; 171:728-738. [PMC free article] [PubMed]
36. Chan JA, Krichevsky AM, Kosik KS. MicroRNA-21 is an antiapoptotic factor in human glioblastoma cells. Cancer Res. 2005; 65:6029-6033.
37. Lim QE, Zhou L, Ho YK, Too HP. snoU6 and 5S RNAs are not reliable miRNA reference genes in neuronal differentiation. Neuroscience 2011; 199:32-43.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  EXOSOMICS SIENA S.P.A.
<120>  ЭКЗОСОМАЛЬНЫЕ БИОМАРКЕРЫ
<130>  PC1375EC
<150>  EP14171464.2
<151>  2014-06-06
<160>  4
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  642
<212>  ПРТ
<213>  Homo sapiens
<400>  1
Met Ala Thr Ala Met Asp Trp Leu Pro Trp Ser Leu Leu Leu Phe Ser
1               5                   10                  15
Leu Met Cys Glu Thr Ser Ala Phe Tyr Val Pro Gly Val Ala Pro Ile
20                  25                  30
Asn Phe His Gln Asn Asp Pro Val Glu Ile Lys Ala Val Lys Leu Thr
35                  40                  45
Ser Ser Arg Thr Gln Leu Pro Tyr Glu Tyr Tyr Ser Leu Pro Phe Cys
50                  55                  60
Gln Pro Ser Lys Ile Thr Tyr Lys Ala Glu Asn Leu Gly Glu Val Leu
65                  70                  75                  80
Arg Gly Asp Arg Ile Val Asn Thr Pro Phe Gln Val Leu Met Asn Ser
85                  90                  95
Glu Lys Lys Cys Glu Val Leu Cys Ser Gln Ser Asn Lys Pro Val Thr
100                 105                 110
Leu Thr Val Glu Gln Ser Arg Leu Val Ala Glu Arg Ile Thr Glu Asp
115                 120                 125
Tyr Tyr Val His Leu Ile Ala Asp Asn Leu Pro Val Ala Thr Arg Leu
130                 135                 140
Glu Leu Tyr Ser Asn Arg Asp Ser Asp Asp Lys Lys Lys Glu Lys Asp
145                 150                 155                 160
Val Gln Phe Glu His Gly Tyr Arg Leu Gly Phe Thr Asp Val Asn Lys
165                 170                 175
Ile Tyr Leu His Asn His Leu Ser Phe Ile Leu Tyr Tyr His Arg Glu
180                 185                 190
Asp Met Glu Glu Asp Gln Glu His Thr Tyr Arg Val Val Arg Phe Glu
195                 200                 205
Val Ile Pro Gln Ser Ile Arg Leu Glu Asp Leu Lys Ala Asp Glu Lys
210                 215                 220
Ser Ser Cys Thr Leu Pro Glu Gly Thr Asn Ser Ser Pro Gln Glu Ile
225                 230                 235                 240
Asp Pro Thr Lys Glu Asn Gln Leu Tyr Phe Thr Tyr Ser Val His Trp
245                 250                 255
Glu Glu Ser Asp Ile Lys Trp Ala Ser Arg Trp Asp Thr Tyr Leu Thr
260                 265                 270
Met Ser Asp Val Gln Ile His Trp Phe Ser Ile Ile Asn Ser Val Val
275                 280                 285
Val Val Phe Phe Leu Ser Gly Ile Leu Ser Met Ile Ile Ile Arg Thr
290                 295                 300
Leu Arg Lys Asp Ile Ala Asn Tyr Asn Lys Glu Asp Asp Ile Glu Asp
305                 310                 315                 320
Thr Met Glu Glu Ser Gly Trp Lys Leu Val His Gly Asp Val Phe Arg
325                 330                 335
Pro Pro Gln Tyr Pro Met Ile Leu Ser Ser Leu Leu Gly Ser Gly Ile
340                 345                 350
Gln Leu Phe Cys Met Ile Leu Ile Val Ile Phe Val Ala Met Leu Gly
355                 360                 365
Met Leu Ser Pro Ser Ser Arg Gly Ala Leu Met Thr Thr Ala Cys Phe
370                 375                 380
Leu Phe Met Phe Met Gly Val Phe Gly Gly Phe Ser Ala Gly Arg Leu
385                 390                 395                 400
Tyr Arg Thr Leu Lys Gly His Arg Trp Lys Lys Gly Ala Phe Cys Thr
405                 410                 415
Ala Thr Leu Tyr Pro Gly Val Val Phe Gly Ile Cys Phe Val Leu Asn
420                 425                 430
Cys Phe Ile Trp Gly Lys His Ser Ser Gly Ala Val Pro Phe Pro Thr
435                 440                 445
Met Val Ala Leu Leu Cys Met Trp Phe Gly Ile Ser Leu Pro Leu Val
450                 455                 460
Tyr Leu Gly Tyr Tyr Phe Gly Phe Arg Lys Gln Pro Tyr Asp Asn Pro
465                 470                 475                 480
Val Arg Thr Asn Gln Ile Pro Arg Gln Ile Pro Glu Gln Arg Trp Tyr
485                 490                 495
Met Asn Arg Phe Val Gly Ile Leu Met Ala Gly Ile Leu Pro Phe Gly
500                 505                 510
Ala Met Phe Ile Glu Leu Phe Phe Ile Phe Ser Ala Ile Trp Glu Asn
515                 520                 525
Gln Phe Tyr Tyr Leu Phe Gly Phe Leu Phe Leu Val Phe Ile Ile Leu
530                 535                 540
Val Val Ser Cys Ser Gln Ile Ser Ile Val Met Val Tyr Phe Gln Leu
545                 550                 555                 560
Cys Ala Glu Asp Tyr Arg Trp Trp Trp Arg Asn Phe Leu Val Ser Gly
565                 570                 575
Gly Ser Ala Phe Tyr Val Leu Val Tyr Ala Ile Phe Tyr Phe Val Asn
580                 585                 590
Lys Leu Asp Ile Val Glu Phe Ile Pro Ser Leu Leu Tyr Phe Gly Tyr
595                 600                 605
Thr Ala Leu Met Val Leu Ser Phe Trp Leu Leu Thr Gly Thr Ile Gly
610                 615                 620
Phe Tyr Ala Ala Tyr Met Phe Val Arg Lys Ile Tyr Ala Ala Val Lys
625                 630                 635                 640
Ile Asp
<210>  2
<211>  228
<212>  ПРТ
<213>  Homo sapiens
<400>  2
Met Pro Val Lys Gly Gly Thr Lys Cys Ile Lys Tyr Leu Leu Phe Gly
1               5                   10                  15
Phe Asn Phe Ile Phe Trp Leu Ala Gly Ile Ala Val Leu Ala Ile Gly
20                  25                  30
Leu Trp Leu Arg Phe Asp Ser Gln Thr Lys Ser Ile Phe Glu Gln Glu
35                  40                  45
Thr Asn Asn Asn Asn Ser Ser Phe Tyr Thr Gly Val Tyr Ile Leu Ile
50                  55                  60
Gly Ala Gly Ala Leu Met Met Leu Val Gly Phe Leu Gly Cys Cys Gly
65                  70                  75                  80
Ala Val Gln Glu Ser Gln Cys Met Leu Gly Leu Phe Phe Gly Phe Leu
85                  90                  95
Leu Val Ile Phe Ala Ile Glu Ile Ala Ala Ala Ile Trp Gly Tyr Ser
100                 105                 110
His Lys Asp Glu Val Ile Lys Glu Val Gln Glu Phe Tyr Lys Asp Thr
115                 120                 125
Tyr Asn Lys Leu Lys Thr Lys Asp Glu Pro Gln Arg Glu Thr Leu Lys
130                 135                 140
Ala Ile His Tyr Ala Leu Asn Cys Cys Gly Leu Ala Gly Gly Val Glu
145                 150                 155                 160
Gln Phe Ile Ser Asp Ile Cys Pro Lys Lys Asp Val Leu Glu Thr Phe
165                 170                 175
Thr Val Lys Ser Cys Pro Asp Ala Ile Lys Glu Val Phe Asp Asn Lys
180                 185                 190
Phe His Ile Ile Gly Ala Val Gly Ile Gly Ile Ala Val Val Met Ile
195                 200                 205
Phe Gly Met Ile Phe Ser Met Ile Leu Cys Cys Ala Ile Arg Arg Asn
210                 215                 220
Arg Glu Met Val
225
<210>  3
<211>  22
<212>  РНК
<213>  Homo sapiens
<400>  3
uagcuuauca gacugauguu ga                                                22
<210>  4
<211>  107
<212>  ДНК
<213>  Homo sapiens
<400>  4
gtgctcgctt cggcagcaca tatactaaaa ttggaacgat acagagaaga ttagcatggc       60
ccctgcgcaa ggatgacacg caaattcgtg aagcgttcca tattttt                    107
<---