Способ диагностики риска обострения хронического воспалительного бронхолегочного процесса у детей с врожденными пороками развития легких
METHOD FOR DIAGNOSING THE RISK OF EXACERBATION OF CHRONIC INFLAMMATORY BRONCHOPULMONARY PROCESS IN CHILDREN WITH CONGENITAL LUNG MALFORMATIONS

Изобретение относится к медицине, а именно к педиатрии, пульмонологии и может быть использовано для прогнозирования риска обострения хронического воспалительного бронхолегочного процесса у детей с врожденными пороками развития легких (ВПРЛ).
В педиатрической пульмонологии проблема хронического воспаления остается актуальной. В основе патогенеза большинства хронических неспецифических заболеваний легких (ХНЗЛ) лежит длительно текущий воспалительный процесс, формирующийся в структурно измененной ткани легких и бронхов вследствие врожденных дефектов. Используется ряд инструментальных методов исследования для уточнения диагноза ХНЗЛ: бронхография, бронхоскопия, компьютерная томография, функциональные исследования легких. Однако все эти методы часто не отражают характер течения воспалительного процесса в легких при ХНЗЛ у детей с ВПРЛ, поэтому поиск маркеров ранней диагностики активности хронического воспалительного процесса, не только в периоде обострения, но и в периоде неполной клинико-лабораторной ремиссии является актуальным.
Одной из причин развития хронических форм заболеваний легких может быть неполноценность иммунного ответа, ключевая позиция в котором принадлежит лимфоцитам. Их функциональная активность может быть детерминирована нарушением функционирования важной клеточной органеллы - митохондрии [1]. В последнее время современная медицина уделяет все большее внимание процессам, лежащим в основе клеточного энергообеспечения, происходящим в митохондриях [2]. Во внутренней мембране митохондрий находятся элементы дыхательной цепи, в том числе и сукцинатдегидрогеназа, поэтому нарушение процессов энергообразования может изменять трансмембранный протонный потенциал. Поддержание мембранного потенциала служит индикатором «здоровья» митохондрий и уровня метаболической активности клеток.
Известен способ прогнозирования течения неспецифических заболеваний легких путем микробиологического исследования бронхиального секрета и/или мокроты с последующим расчетом суммы баллов [патент RU №2121675, 10.11.1998], однако данный способ сложно применить у детей с ХНЗЛ и выделение микрофлоры у них проблематично, так как зачастую у этих детей при лечении применяют антибиотики.
Известен способ диагностики активности воспалительного процесса при хроническом бронхите [патент RU №2206096, 20.06.2002], когда в динамике, с интервалом в 2 и более суток, определяют содержание холестерина и фосфолипидов в мембране эритроцитов и величину соотношения холестерин/фосфолипиды используют для диагностики обострения хронического бронхита. Недостатком способа является то, что исследуется одна нозология и отражаются изменения только в липидном обмене, но не учтены изменения в иммунной системе.
Известен способ определения степени тяжести обострения хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ) для выбора оптимального лечения пациентов [патент RU №2467685, 27.11.2012], по балльной оценке, анамнестических данных и объективных методов исследования. Недостатком способа является невозможность использования у детей, так как в полученных данных не отражается сложный патогенез заболевания, комплекс изменений в других системах гомеостаза, что не позволяет осуществить комплексный подход к терапии.
Известен способ прогнозирования течения хронического бронхита при воспалительных заболеваниях легких по данным исследования катионных белков в нейтрофилах [RU №1739250, 07.06.1992], однако данный способ ограничен одной нозологией.
Известен способ прогнозирования неблагоприятного течения острого ограниченного гнойно-воспалительного заболевания легких и плевры микробной этиологии [патент RU №2237248, 27.09.2004]. Для этого проводят забор патологического материала, выделяют чистые культуры возбудителей, их идентифицируют, определяют у них антилизоцимную и антикомплементарную активности (АЛА и АКА соответственно) и при уровне выраженности этих признаков прогнозируют неблагоприятное течение острого ограниченного гнойно-воспалительного заболевания легких и плевры. Данный способ не учитывает выраженность воспаления у ребенка и часто у детей с ХНЗЛ отсутствует выделение микробного возбудителя, что ограничивает применение данного метода.
Прототипом заявляемого изобретения избран способ диагностики нарушения энергетического метаболизма лимфоцитов при внебольничной пневмонии у детей по увеличению процента лимфоцитов со сниженным мембранным потенциалом митохондрий (Δψ) (МПМ) [патент RU №2579317, 03.03.2016].с использованием метода проточной цитометрии, при котором проводят учет лимфоцитов со сниженным мембранным потенциалом митохондрий и при показателях от 0 до 35% диагностируют уровень нормы, 36 до 75% - субкомпенсированные нарушения, не требующие специфической терапии, 76% и более - декомпенсированные нарушения, требующие в комплексном лечении внебольничных пневмоний назначения энерготропных препаратов.
Известный способ имеет следующие недостатки:
1. Алгоритм способа разработан только для диагностики нарушения энергетического метаболизма лимфоцитов при внебольничной пневмонии, поэтому его невозможно использовать для прогноза течения заболевания в условиях хронического заболевания легких.
2. Авторы принимают во внимание только показатель МПМ, что недостаточно для возможности оценивать степень тканевой гипоксии.
Технический результат предлагаемого способа - улучшение диагностики и возможность прогнозирования риска обострения хронического воспалительного бронхолегочного процесса у детей с врожденными пороками развития легких с учётом особенностей течения хронического воспалительного процесса.
Технический результат достигается тем, что методом проточной цитометрии определяют количество лимфоцитов со сниженным мембранным потенциалом, а также проводят цитохимическое исследование активности сукцинатдегидрогеназы (СДГ) лимфоцитов методом, основанным на реакции восстановления солей тетразолия и выпадения осадка диформазана в местах активности фермента, активность СДГ определяется средним числом гранул в одной клетке, также проводят учет процента лимфоцитов периферической крови с неизмененным мембранным потенциалом митохондрий (МПМ). Затем на основании полученных результатов проводят определение величины индекса МПМ/СДГ и при показателях 2,4 и менее диагностируют отсутствие осложненного течения заболевания, а при показателях более 2,4 - прогнозируется риск частых обострений хронического бронхолегочного процесса.
Использование цитохимического показателя активности сукцинатдегидрогеназы (СДГ) в качестве диагностического и прогностического теста позволит путем цитохимического определения в лимфоцитах периферической крови активности окислительно-восстановительного фермента (СДГ) и учетом процента лимфоцитов с не измененным МПМ оценить энергетические процессы, происходящие внутри клетки и, что особенно важно, дает возможность оценивать степень тканевой гипоксии [3].
Способ осуществляют следующим образом: из локтевой вены утром, натощак, спустя 12-14 ч после последнего приема пищи берут 1 мл крови в гепаринизированную пробирку. 800 мкл крови наслаивается на 400 мкл фиколл-верографина, центрифугируется при 1500 об/мин в течение 15 минут, собирается лимфоцитарное кольцо, которое центрифугируется 5 минут при 1000 об./мин, надосадочная жидкость сливается. Клетки окрашивается красителем JC-1, после чего инкубируются 15 минут при температуре 37°С, затем дважды промываются буфером, после чего подвергаются анализу на цитометре BD FACS Calibur (США) в программе Cell Quest Pro. Используется краситель JC-1 (5,5',6,6'-тетрахлор-1,1',3,3' тетраэтилбензимидазолкарбоцанин иодид/хлорид) (Bector Dikcenson, США). JC-1, который является катионным красителем, поглощение его митохондриями напрямую связано с величиной митохондриального мембранного потенциала [4].
Параллельно проводят исследование активности ферментов сукцинатдегидрогеназы (СДГ) в лимфоцитах периферической крови количественным методом [5], основанным на реакции восстановления солей тетразолия и выпадения осадка диформазана в местах активности фермента. Активность СДГ выражалась средним числом гранул в одной клетке.
На основании полученных результатов осуществлен анализ градации показателей и рассчитаны диапазоны значений отношения МПМ/СДГ: при показателях 2,4 и менее диагностируют отсутствие риска осложненного течения заболевания, при показателях более 2,4 - прогнозируется риск частых обострений хронического бронхолегочного процесса, требующие в комплексном лечении детей с ВПРЛ использовать препараты, корригирующие митохондриальную дисфункцию и энергодефицит лимфоцитов.
Для раскрытия сущности изобретения приведены результаты исследования 19 детей с ВПРЛ в длительной ремиссии и 58 детей с ВПРЛ, у которых заболевание протекало с обострениями 2 и более раз в год (табл. 1).
Таблица 1Медианные значения доли лимфоцитов с не измененным МПМ и активности СДГ лимфоцитов периферической крови у детей с ВПРЛ, (Me)
Показатели
Дети с ВПРЛ в ремиссии (n=19)
Значения отношения МПМ/СДГ
Дети с ВПРЛ с частыми обострениями (n=58)
Значения отношения МПМ/СДГ
СДГ, гр./кл.
24,0
2,4
19,7
2,5
МПМ, %
57,6
50,1
Пример 1.
Пациентка Ангелина Л., 11 лет. Наблюдается в клинике НИИОМИД с диагнозом «Врожденный порок развития легких: простая гипоплазия верхней доли правого легкого. Трахеальный бронх верхней доли, стеноз главного бронха 2 степени, компенсированная форма». Жалоб при поступлении не предъявляла. Поступила на плановое обследование.
Исследование показателей: МПМ - 57,6%; СДГ - 12,4 гр./кл. Индекс МПМ/СДГ = 4,6. При наблюдении в течение 1 года пациентка 2 раза перенесла обострение воспалительного процесса в легких.
Пример 2.
Пациентка Юлия Т., 6 лет. Наблюдается в клинике НИИОМИД с диагнозом «Врожденный порок развития легких: простая гипоплазия нижней доли правого легкого». Жалоб при поступлении не предъявляла. Поступила на плановое обследование.
Исследование показателей: МПМ - 41,66%; СДГ - 21,4 гр./кл. Индекс МПМ/СДГ = 1,7. При наблюдении в течение 1 года обострений заболевания не было.
Метод апробирован в клинике Хабаровского филиала Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Дальневосточный научный центр физиологии и патологии дыхания» - Научно-исследовательского института охраны материнства и детства.Результаты проверки заявленного способа показали его эффективность. Правильный прогноз определялся в 82% случаев.
Таким образом, предлагаемый способ может быть использован в педиатрической практике для прогнозирования риска обострения хронического бронхолегочного процесса на фоне врожденных пороков развития легких у детей для разработки индивидуального плана динамического наблюдения и проведения необходимых лечебно-оздоровительных мероприятий.
Список использованной литературы
1. Aravamudan B., Thompson M.A., Pabelick C.M.,Prakash Y.S. Mitochondria in Lung Diseases // Expert Rev.Respir. Med. 2013; 7(6): 631-646.
2. Иванова И.И., Гнусаев С.Ф., Ильина А.А. Клинические проявления нарушений клеточного энергообмена при соматических заболеваниях у детей // Российский вестник перинатологии и педиатрии. 2018; 63(2): 27-33.
3. Лукьянова Л.Д. Сигнальные механизмы гипоксии. М.:РАН, 2019. 215 с.
4. Perelman A., Wachtel C., Cohen M., Haupt S., Shapiro H., Tzur A, JC-1: alternative excitation wavelengths facilitate mitochondrial membrane potential cytometry // Cell. Death and Disease. 2012; 3:e430.
5. Нарциссов Р.П. Применение пара-нитротетразолия фиолетового для количественного цитохимического определения дегидрогеназ лимфоцитов человека // Архив анатомии, гистологии, эмбриологии. 1969; 5:85-91.