Исследование полиморфизма генов фолатного цикла и коагуляционных факторов крови у супружеских пар с бесплодием

ДИАГНОСТИКА

JSfeBQ

Исследование полиморфизма генов фолатного цикла и коагуляционных факторов крови у супружеских пар с бесплодием

Шкурат Т. П., Машкина Е. В., Мирина Е. А., Коваленко К. А.; Южный федеральный университет, КДЛ «Наука», г. Ростов-на-Дону

В последнее время все более актуальной становится проблема нарушения мужской и женской фертиль-ности, приводящая, в большинстве случаев, к бесплодию и невынашиванию беременности (НБ). Нарушение репродуктивной функции рассматривают как мульти-факторное состояние, обусловленное взаимодействием многих причин, в том числе и генетических. Долгое время считалось, что основными наследственными причинами НБ ранних сроков являются хромосомные аберрации. В последнее время появляется все больше данных о возможном влиянии генных мутаций и полиморфизма генов на нарушение течения беременности. Генетическая природа НБ разнообразна и включает несколько функциональных групп генов, анализ которых должен проводиться не только для женщин, но и для мужчин. Среди генетических факторов бесплодия и НБ большое значение имеют полиморфизм генов фолатно-го обмена, факторов системы свертываемости крови, ренин-ангиотензиновой системы, системы биотрансформации ксенобиотиков. Полиморфизм генов фолат-ного цикла, по некоторым данным литературы, ассоциирован с риском формирования тромбов, что приводит к недостаточности маточно-плацентарного кровотока, гипоксии, а также риску возникновения геномных мутаций у плода. Носители полиморфизма генов коагу-ляционных факторов обладают повышенной склонностью к развитию сосудистых тромбозов, являющихся фактором риска венозных и артериальных тромбоэм-болий. Наличие полиморфизма по данным генам несет серьезную опасность для беременных, повышает вероятность развития целого ряда осложнений беременности. Однако данные литературы о влиянии генотипа

отца на характер течения беременности практически отсутствуют.

Целью данной работы было исследование частоты регистрации полиморфизма генов метилентетрагидро-фолатредуктазы (MTHFR), метионинсинтазы редуктазы (MTRR), метионинсинтазы (MTR), коагуляционных факторов F II, F V среди женщин и мужчин из бесплодных супружеских пар.

Материалом для исследования послужили образцы ДНК 107 человек (32 мужчины и 75 женщин) из бесплодных супружеских пар в возрасте от 20 до 45 лет, проживающих в Ростове-на-Дону. Популяционную группу сравнения составили 282 жителя Ростова-на-Дону (84 мужчины и 198 женщин).

Анализировали следующие полиморфизмы: Ala222Val (677C-T db SNP ID: rs1801133) гена MTHFR (MIM *607093), Ile22Met (66A-G db SNP: rs1801394) гена MTRR (MIM *602568), Asp919Gly (2756A-G) гена MTR (MIM *156570), 20210G-A коагуляционного фактора F II (MIM *176930), Arg506Gln (1691G-A db SNP: rs6025) коагуляционного фактора F V (MIM *612309). При статистической обработке результатов использовали критерий с2.

Определение частоты полиморфизма С677Т гена MTHFR в популяционной группе контроля показало, что доля гомозигот 677^ составляет 8,3% среди мужчин и 9,5% среди женщин (табл. 1), 45% лиц (вне зависимости от пола) в популяции являются гетерозиготами по полиморфизму С677Т гена MTHFR. Среди мужчин и женщин с нарушением репродуктивной функции распределение частот генотипов по гену МТHFR не отличается от контрольной группы (табл. 1). В то же время необходимо отметить, что среди мужчин из бесплодных супружеских пар

Таблица 1

Частота генотипов по полиморфизмам генов фолатного цикла, %

Генотип Популяционная группа Группа лиц из бесплодных супружеских пар

мужчины женщины мужчины женщины

Полиморфизм С677Т гена MTHFR

C ' C 52,4 42,7 48,0 52,0

C / T 39,3 47,8 44,0 44,0

T/T 8,3 9,5 8,0 4,0

Полиморфизм A66G гена MTRR

А / А 29,8 16,2 33,0 24,0

A / G 35,7 52,3 30,0 52,0

G / G 34,5 31,5 37,0 24,0

Полиморфизм A2756G гена MTR

А / А 63,9 59,9 52,0 58,7

A / G 31,4 35,5 37,0 36,0

G / G 4,7 4,6 11,0 5,3

www.akvarel2002.ru №3(26) • 2011

<efeBa j

ДИАГНОСТИКА

в 2 раза больше гомозигот по аллели 677Т гена MTHFR по сравнению с женщинами из обследуемой группы лиц.

Полиморфизм A66G гена MTRR в популяции встречается чаще. Так, в группе популяционного контроля доля гетерозигот A66G составила 35,7% среди мужчин и 52,3% среди женщин (табл. 1). Выявлены статистически значимые отличия в частоте генотипов по полиморфизму A66G гена MTRR среди мужчин и женщин популяционной группы контроля (c2=8,89 при р=0,012). Частоты генотипов по исследуемому полиморфизму гена MTRR среди мужчин и женщин с нарушением репродуктивной функции не отличаются от соответствующего контроля.

Частоты генотипов по полиморфизму гена MTR (A2756G) представлены в таблице 1. Необходимо отметить, что хотя статистически значимых различий в частотах генотипов не выявлено, однако среди мужчин из бесплодных супружеских пар доля гомозигот по аллели 2756G в 2,3 раза выше по сравнению с данными популя-ционной группы.

Таким образом, при анализе генотипов по генам фо-латного цикла среди мужчин и женщин с нарушением репродуктивной функции выявлено увеличение доли гомозигот по исследуемым полиморфизмам среди мужчин. В то же время большая часть исследований по бесплодию человека включает анализ ДНК только женщин и не учитывает вклад отцовского генотипа в развитие беременности.

Сочетанный анализ частоты исследуемых полиморфизмов показал, что 89,3% мужчин и 85% женщин с нарушением репродуктивной функции являются носителями хотя бы одного полиморфизма исследуемых генов, 21% мужчин и 20% женщин являются гетерозиготными носителями одновременно двух полиморфизмов. Около 11% мужчин и 16% женщин являются гетерозиготными носителями полиморфизма С677Т гена MTHFR и гомозиготами по аллели 66G гена MTRR.

Сочетанный анализ генотипов по исследуемым полиморфизмам генов фолатного цикла в супружеских парах показал, что в 54,2% пар у одного из супругов имеется хотя бы один из исследуемых полиморфизмов в гомозиготной форме: в 37,5% случаев это гомозиготы 66GG гена MTRR. В 29,2% случаях как мужчина, так и женщина являются носителями исследуемой аллели гена MTRR. В 20,8% пар у обоих супругов выявлен полиморфизм C677T гена MTHFR. Следовательно, большое значение для возможного прогноза имеет исследование носи-тельства полиморфных аллелей генов фолатного цикла у обоих супругов.

Данные литературы об ассоциации носительства полиморфизма С677Т гена MTHFR c репродуктивными потерями противоречивы. В ряде исследований показана ассоциация полиморфизма С677Т гена MTHFR с бесплодием женщин неясного генеза [2, 5]. В работах, выполненных на абортивном материале, показано значительное повышение риска привычного невынашивания беременности (ПНБ) при наличии у эмбриона аллелей 677Т и/или 1298С гена MTHFR в гомо- или гетерозиготном состоянии [8]. По некоторым данным литературы, показано наличие ассоциации между полиморфизмом гена MTHFR и мужской стерильностью [9, 11]. В то же время в ряде популяций таких ассоциаций не выявлено [13].

Prasmusinto c коллегами (2002) показали, что полиморфизм С677Т по гену MTHFR не увеличивает риск развития преэклампсии [12]. В опубликованном мета-анализе не доказана достоверная ассоциация между мутацией 677С/Т гена МTHFR, также как и недостаточности протеина С и антитромбина III с синдромом потери плода [14].

Результаты анализа частоты полиморфизма гена F II, обусловленного заменой гуанина в позиции 20210 на аде-нин, представлены в таблице 2. Этот полиморфизм гена ассоциирован с увеличением уровня протромбина в 1,5—2 раза, что обуславливает повышенный риск возникновения тромбозов. В популяционной группе доля гомозигот по нормальной аллели гена составила в среднем 98%. Гомозигот по полиморфизму не выявлено. В бесплодных супружеских парах 9% женщин и 12% мужчин являются гетерозиготными носителями полиморфного варианта гена F II (табл. 2). Доля мужчин из бесплодных супружеских пар, являющихся носителями полиморфизма гена F II, статистически значимо превышает таковой показатель для популяционного контроля (табл. 2).

Результаты анализа частоты Лейденской мутации в гене F V представлены в таблице 2. В контрольной группе гомозиготы по нормальной аллели составляли 92% среди мужчин и 96,5% среди женщин. Гомозиготы 1691АA не выявлены (табл. 2). В группе обследуемых мужчин из бесплодных супружеских пар были выявлены только гомозиготы по нормальной аллели гена. Среди исследуемой группы женщин с нарушением репродуктивной функции было выявлено 2% гетерозигот, что также соответствует данным контрольной группы.

Вклад различных полиморфизмов в риск развития патологии беременности не одинаков. Гетерозиготное носительство аллели G1691A гена F V ассоциировано с 2—7-кратным повышением риска тромбозов, гомозиготное носительство — с 40—80-кратным. Чаще всего у женщин с Лейденской мутацией обнаруживают тромбозы в плаценте, что и является причиной повышенного риска развития осложнений беременности. Частота встречаемости данного полиморфизма у беременных с тромбоэмболическими осложнениями составляет 30—50%. Одновременное выявление нескольких генетических факторов предрасположенности к тромбофи-лическим состояниям значительно увеличивает риск развития тромбозов. Сочетание Лейденской мутации F V и термолабильной мутации MTHFR увеличивает риск развития венозных тромбозов в 8 раз. Обществом акушеров-гинекологов Санкт-Петербурга и СЗ РФ разработан балльный метод оценки наследственной предрасположенности к некоторым осложнениям беременности (Определение наследственной предрасположенности ... , 2009). Наибольшее клиническое значение имеет гомози-готность по полиморфизму коагуляционных факторов F V и F II. Гетерозиготность по данным полиморфизмам, а также гомозиготность по полиморфизму С677Т MTHFR привносит по 3 балла риска.

На основании полученных результатов суммы баллов по полиморфизму генов можно оценить риск развития патологии беременности, связанной с тромбозами. В группу высокого риска попадают лица, имеющие 4 балла и выше, а также супружеские пары с общим количеством баллов 7 и выше. Проведенный нами анализ показал, что 55% проанализированных супружеских пар имеют средний или высокий риск развития осложнений беременности, обусловленный полиморфизмом генов фолатного цикла.

Дефицит фолата, а также нарушение функции мета-болизирующих гомоцистеин ферментов приводит к накоплению гомоцистеина в клетках и повышению общего уровня гомоцистеина в плазме. Гомоцистеин обладает выраженным токсическим действием, механизм которого определяется несколькими биохимическими каналами и в значительной степени связан с нарушением эндоте-лиальной функции. Рядом исследователей было отмечено значительное увеличение риска развития патологий, связанных с повышенным уровнем гомоцистеина в крови

м

№3(26) • 2011

www.akvarel2002.ru

Таблица 2

Частота генотипов по полиморфизмам генов коагуляционных факторов, %

Генотип Популяционная группа Группа лиц из бесплодных супружеских пар

мужчины женщины мужчины женщины

Полиморфизм G20210A гена F II

G ' G 98,8 96,9 87,5 90,7

G / A 1,2 3,1 12,5 9,3

A / A 0 0 0 0

c2 4,71

Полиморфизм G1691A гена F V

G / G 91,7 96,5 100 97,7

G/A 8,3 3,5 0 2,3

A / A 0 0 0 0

в случае наличия полиморфизмов в нескольких генах фолатного цикла [7]. Во время беременности повышенные уровни гомоцистеина приводят к нарушениям фетопла-центарного кровообращения, что может быть причиной невынашивания беременности и бесплодия в результате дефектов имплантации зародыша. На более поздних стадиях беременности гипергомоцистеинемия является причиной развития хронической фетоплацентарной недостаточности и хронической внутриутробной гипоксии плода.

По данным литературы [3], наследственные тромбо-филии среди причин привычной потери беременности составляют 10—30%. Дефекты свертывания крови тромбо-филического и геморрагического характера могут быть основной причиной бесплодия, ранних преэмбриониче-ских потерь, привычной потери беременности, отягощенного течения беременности. В условиях генетически обусловленного гипофибринолиза, активации внутрисо-судистого свертывания крови происходит десинхрониза-ция процессов фибринолиза и фибринообразования при имплантации. Это мешает адекватному внедрению оплодотворенной яйцеклетки в стенку матки на достаточную глубину. Имплантация, инвазия трофобласта и функционирование плаценты — это сложные многоступенчатые процессы эндотелиально-гемостазиологических взаимодействий со сложной гормональной регуляцией, которые объективно нарушаются при тромботической тенденции и в случае генетических дефектов свертывания.

Полиморфизм генов фолатного цикла влияет не только на уровень гомоцистеина в крови, но также способен изменять характер метилирования ДНК. MTR использует 5-метилтетрагидрофолат как донор метильных групп. Показано, некоторые нарушения репродуктивной функции ассоциированы с гиперметилированием промотора рецептора прогестерона (PR-B) и гипометилированием промоторов фактора 1 стероидогенеза (SF-1), эстрогено-вого рецептора 2 (ESR2), что влияет на уровень экспрессии данных молекул [15, 16]. Уровень метилирования ДНК влияет и на особенности иммунного ответа материнского организма.

Изменение характера метилирования ДНК, и прежде всего гипометилирование из-за недостаточной активности ферментов фолатного цикла, может быть одной из причин бесплодия, в том числе и мужского. Известно, что дефицит фолатов приводит к снижению пролифера-тивной активности различных типов клеток [4]. Показано,

Примечание: с2 - сравнение с популяционной выборкой.

что ингибирование ДНК-метилирования в сперматогенезе сопровождается снижением количества сперматид и сперматозоидов в тестикулах [10]. Гипометилирование индуцирует нарушение экспрессии генов, нарушение структуры ДНК, возникновение разрывов в хромосомах. В быстро делящихся клетках плода дефицит метильных групп приводит к повышенному включению dUMP вместо dTMP в синтезируемую цепь ДНК, что влечет за собой вырезание нуклеотидных пар, разрывы цепей ДНК и запуск механизмов апоптоза [6]. Учитывая, что фолатный цикл играет фундаментальную роль в делящихся клетках и развивающемся эмбрионе, и анализируя собственные данные, мы полагаем, что проведение сочетанного анализа полиморфизмов генов MTHFR, MTRR, MTR фо-латного цикла может иметь большое значение для пре-диктивной медицины.

Литература

1. Определение наследственной предрасположенности к некоторым частым заболеваниям при беременности. Генетическая карта репродуктивного здоровья / Под ред. В. С. Баранова, Э. К. Айламазяна. — Спб: Из-во Н-Л, 2009. — 68 с.

2. Altmae S., Stavreus-Evers A., Ruiz J. Variations in folate pathway genes are associated with unexplained female infertility // Fertil. Steril. — 2010. — V. 94. — Р. 130—137.

3. Bick R.L., Madden J., Heller K.B., Toofanian A. Recurrent miscarriage: causes, evaluation, and treatment // Medscape Womens Health. — 1998. — V. 3. — Р. 2—13.

4. Blount B., Mack M., Wehr C., et al. Folate deficiency causes uracil misincorporatiion into human DNA and chromosome breakage: implications for cancer and neuronal damage // Proc. Natl. Acad. Sci USA. — 1997. — V. 94. — P. 3290—3295.

5. Coulman C., Jeyendran R. Thrombophilic gene polymorphisms are risk factors for unexplained infertility // Fertil. Steril. — 2009. — V. 91. — P. 1516—1517.

6. Fell D., Selhub J. Disruption of thymidylate synthesis and glycine-serine interconversion by L-methionine and L-homocystine in Raji cells // Biochim Biophys Acta. — 1990. — V. 1033. — Р. 80—84.

7. Hobbs C.A., Sherman S.L., Yi P., et al. Polymorphisms in Genes Involved in Folate Metabolism as Maternal Risk Factors for Down Syndrome // Am. J. Hum. Genet. — 2000. — V. 67. — Р. 623—630.

www.akvarel2002.ru №3126) • 2011Д19

dim j

лапароскопия

8. Isotalo P.A., Wells G.A., Donnelly J.G. Neonatal and fetal methylenetetrahydrofolate reductase genetic polymorphisms: an examination of C677T and A1298C mutations // Am. J. Hum. Genet. - 2000. - V. 67. - P. 986-990.

9. Lee H., Jeong Y., Lee S., et al. Association study of four polymorphisms in three folate-related enzyme genes with non-obstructive male infertility // Hum. Reprod. — 2006. — V. 21. - P. 3162-3170.

10. Raman R., Narayan G. 5-Aza deoxyCytidine-induced inhibition of differentiation of spermatogonia into spermatocytes in the mouse // Mol. Reprod. Dev. - 1995. - V. 42. - P. 284-290.

11. Park J., Lee H., Jeong Y., Chung T., Kim H. MTHFR C677T polymorphism associates with unexplained infertile male factors // J. Assist. Reprod. Genet. - 2005. - V. 22. -P. 361 -368.

12. Prasmusinto D., Skrablin S., Hofstaetter C., Fimmers R., van der Ven K. The methylenetetrahydrofolate reductase

677 C-T polymorphism and preeclampsia in two populations // Obstet. Gynecol. - 2002. - V. 99. - P. 1085-1092.

13. Ravel C., Chantot-Bastaraud S., Chalmey C., Barreiro L., et al. Lack of association between genetic polymorphisms in enzymes associated with folate metabolism and unexplained reduced sperm counts // Plos. ONE 2009. - V. 4. - Is 8. E6540.

14. Rey E., Kahn S., Daviv M., Shrier J. Thrombophilic disorders and fetal loss: a meta-analysis // The Lancet. -2003. - V. 361. - P. 901-908.

15. Wu Y., Strawn E., Basir Z., Halverson G., Guo S. Promoter hypermethylation of progesterone receptor isoform B (PR-B) in endometriosis // Epigenetics. - 2006. - V. 1. -P. 106-111.

16. Xue Q., Lin Z., Cheng Y. Promoter methylation regulates estrogen receptor 2 in human endometrium and endometriosis // Biol. Reprod. - 2007. - V. 77. - P. 681-687.

Лапароскопическая хирургия и беременность

Федоров И. В., д.м.н., професор; Мазитова М. И., к.м.н., доцент; Центр обучения эндоскопической хирургии, г. Казань

Осложнения лапароскопии у беременных

Беременность представляет уникальный вызов хирургу при необходимости выполнения плановых и ур-гентных операций. И не только потому, что речь идет о двух человеческих жизнях. При беременности многие физиологические параметры претерпевают существенные изменения: кардиопульмонарные, свертываемость крови, уровень гемоглобина, артериальное давление. По мере прогрессирования беременности хирургическая визуализация существенно меняется, не говоря о доступе. Та или иная операция на органах брюшной полости бывает необходима по ходу беременности одной из 150 женщин [1].

Традиционно беременность считали абсолютным противопоказанием для лапароскопии, но в последнее десятилетие ситуация меняется. Наиболее частая операция при беременности — холецистэктомия (45—48% процедур), вмешательства на придатках матки (28— 34%) и аппендэктомия (15—16%). Каждая из них дает хороший результат в опытных руках [2].

Существует несколько показаний к гинекологической хирургии при беременности: доброкачественные кисты яичника, перекрут придатков матки, рак, и, в редких случаях, некроз миоматозного узла. Предполагается, что у одной из 81 беременной женщины находят кисту яичника. Выявляемость повысилась в последние годы, по мере широкого внедрения УЗИ. Однако, всего у одной из 600 женщин во II триместре беременности обнаруживают доброкачественные кисты яичника, требующие хирургического лечения [3].

Большинство кист, обнаруживаемых на УЗИ, оказываются кистами желтого тела, они рассасываются самостоятельно. К сожалению, в некоторых случаях клиническая ситуация требует немедленной интервенции до ожидаемого рассасывания. Перекрут яичника обычно наблюдают в I триместе с частотой 1 на 5000 беременностей [4].

Показания к операциям на яичниках при беременности диктуют два фактора: опасность малигнизации кист, составляющая 1—8%, и вероятность осложнений

в виде перекрута, разрыва, кровотечения с частотой 10—42%. Опасность преждевременных родов после ургентной операции значительно выше, чем после плановой. Поэтому риск выжидательной тактики и отказа от хирургии весьма велик [5, 6].

Преимущества лапароскопии

Для лечения заболеваний, возникающих на фоне беременности, лапароскопия имеет существенные отличия от лапаротомии. Во-первых, это те же преимущества, что и у небеременных женщин: снижение продолжительности койко-дней и сроков реабилитации, уменьшение частоты осложнений и потребности в наркотических препаратах, что важно для жизнедеятельности плода [7, 8].

Ранее существовавшее мнение об опасности лапароскопии, в сравнении с лапаротомией, для жизни плода не подтвердилось многочисленным опытом последних лет. В большом шведском ретроспективном исследовании 2181 лапароскопий и 1522 лапаротомий, выполненных по ходу беременности за два десятилетия, не было различий в продолжительности беременности, врожденных пороках, мертворождении и неонатальных смертях [9]. Два ретроспективных исследования, проведенных в Израиле, подтвердили то же самое [7, 10].

Теоретически лапароскопия дает лучшую визуализацию и требует меньших манипуляций с маткой, что в последующем предотвращает ранние роды. Лапароскопия эффективнее в диагностическом плане, что особенно важно для исключения острого аппендицита. От 35 до 50% случаев подозрения на острый аппендицит в III триместре оказываются негативными. Ошибки в этой ситуации весьма печальны, многие осложнения связаны с задержкой диагноза воспаления червеобразного отростка. Снижение продолжительности заболевания благодаря диагностической лапароскопии представляет идеальную хирургическую модель разрешения дилеммы, обязательно присутствующей в критической ситуации. Muench с соавторами показали, что задержка операции при желчнокаменной болезни увеличивает продолжительность болезни в сравнении со своевременным лапароскопическим лечением [11].

ж

№3(26) • 2011

www.akvarel2002.ru