ОПРЕДЕЛЕНИЕ БАПНА-АМИДАЗНОЙ АКТИВНОСТИ IgG МЕТОДОМ ВЭЖХ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ БАПНА-АМИДАЗНОЙ АКТИВНОСТИ IgG

МЕТОДОМ ВЭЖХ

МОИСЕЕВА А.М.*. ГЕНЕРАЛОВ И.И.*. МОИСЕЕВ Д.В.**

УО «Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский

университет»; кафедра клинической микробиологии *, кафедра фармацевтической химии с курсом ФПК и ПК**

Резюме. Разработана методика оценки БАПНА-амидазной активности препаратов IgG сыворотки крови путем определения продукта ферментативного гидролиза (п-нитроанилина) методом ВЭЖХ. Определение п-нитроанилина проводилось на обращенно-фазовой колонке (Zorbax SB C-18, 250x4.6 мм. 5 мкм) с изократическим режимом элюирования (ПФ: ацетонитрил и вода 20:80 по объему). График зависимости площади пика от концентрации п-нитроанилина был линеен в пределах концентрации 0.1-100 мкг/мл. Разработанная методика обладала высокой чувствительностью (предел определения при концентрации трипсина 0.05 мкг/мл) и воспроизводимостью (коэффициент вариации внутри одного определения - 2.46%. коэффициент вариации между анализами - 5.41%). Определена БАПНА-амидазная активность антител у части больных с кишечными инфекциями. Это подтверждает возможность использования данного метода в клинической практике.

Ключевые слова: абзимы. БАПНА-амидазная активность. ВЭЖХ.

Abstract. Method for the determination of the BAPNA-hydrolyzing activity of human IgG by HPLC is described. Determination of the reaction product (p-nitroaniline) was elaborated using the reversed-phase column (Zorbax SB C-18. 250x4.6 mm. 5 ^m) with isocratic elution (MP: acetonitrile and water 20:80 v.v.). The calibration graph for p-nitroaniline was linear from 0.1-100 ^g/ml. The method was sensitive (detection limit of trypsin concentration was 0.05 ^g/ml) and exact (coefficient of variation within the same analysis was 2.46%. coefficient of variation between analyses was 5.41%). BAPNA-hydrolyzing activity of antibodies of patients with enteric infections was assessed. Thus. this method can be implicated to clinical practice.

Адрес для корреспонденции: Республика Беларусь. 210023. г. Витебск. пр. Фрунзе. д.27. Витебский государственный медицинский университет. кафедра клинической микробиологии. р. тел. 37-06-12 - Моисеева А.М.

В последние годы нарастает интерес к изучению антител с каталитической активностью (абзимов). Определение абзимной активности иммуноглобу-

линов является одним из новых перспективных направлений в лабораторной диагностике аутоиммунных заболеваний. Особое значение придается оценке специфических видов абзимной активности. в частности. нуклеазной и протео-литической [1. 3]. Антитела с протеолитической активностью способны гидролизовать белки и пептиды. а также ряд их синтетических производных. например. амиды аминокислот. Следовательно. они обладают пептидазной и амидаз-ной активностью. Достоверно установлена взаимосвязь между возникновением и прогрессированием аутоиммунных. онкологических заболеваний и уровнем протеолитической активности антител [1. 3. 10. 11. 14]. Многие авторы [1. 2] склоняются к тому. что мониторинг абзимной активности может иметь важное значение в прогнозировании течения и исхода заболевания.

Однако при оценке протеолитической абзимной активности традиционными методами существует ряд принципиальных трудностей. Во многом они связаны с исходно невысокой каталитической активностью препаратов поликлональных абзимов. Для повышения концентрации продукта гидролиза приходится удлинять время инкубации фермента и субстрата до 20 часов и более.

В лабораторной практике для оценки протеолитической активности широко применяется БАПНА-амидазная реакция вследствие ее специфичности и хорошей воспроизводимости [4]. В этом случае используется хромогенный субстрат - К-а-бензоил-аргинин-п-нитроанилид (БАПНА). при ферментативном воздействии на который образуются бензоил-аргинин и п-нитроанилин. окрашенный в желтый цвет (рисунок 1).

Об активности фермента судят по оптической плотности раствора (методика Эрлангера. 1961 г.). Определение БАПНА-амидазной активности обычно проводят спектрофотометрическим методом. Основным недостатком данной методики является относительно невысокая чувствительность (определение ферментативной активности возможно при концентрации трипсина около 10 мкг/мл) [5]. Согласно данным разных авторов. спектрофотометрическое определение проводят после инкубации пробы от 10 мин [7] до 4 часов [8] при длине волны 400 нм [4]. 405 нм [13] или 410 нм [6. 8. 12]. Раствор БАПНА готовят в диапазоне значений рН от 7.5 [7] до 8.2 [6]. Для остановки каталитической реакции некоторые авторы использовали 30% уксусную кислоту [6.12]. Окуличем

трипсин

(СН2)з

ыи

ЫН

и2^^ыи

ЫН2

Ы-а-бензоил-аргинин-п-нитроанилид

п-нитроанилин

Рис.1. Ферментативный гидролиз БАПНА под действием трипсина

В.К. с соавторами была разработана методика определения БAПHA-амидазной активности микрометодом на планшетном колориметре «Мультискан AИФ М340» после инкубации пробы при 37°С в течение 20 часов. При этом ферментативная активность определялась при концентрации трипсина около 1 мкг/мл [2].

Целью данной работы была разработка чувствительной. экспрессной и точной методики оценки БAПHA-амидазной активности. Для этого нами предложено определение концентрации продукта реакции (п-нитроанилина) методом ВЭЖХ.

Методы

В работе использовали субстанции БAПHA («Sigma». Германия). п-нитроанилин (пр-ва ИБОХ HAHy. Украина). трипсин («CПОФA» Чехия). Растворы БAПHA готовили с использованием диметилсульфоксида («Фармтехно-логия». РБ). Для приготовления подвижной фазы для ВЭЖХ применяли ацетонитрил (сорт для ВЭЖХ. «Криохром». Россия) и бидистиллированную воду.

Получение препаратов Ig G сыворотки крови.

К чистой сыворотке крови прибавляли охлажденный до 4°С 0.75% раствор риванола в соотношении 1:2. Смесь инкубировали при температуре 4°С не менее 2 часов. Осадок отбрасывали. риванол из надосадочной жидкости удаляли адсорбцией на активированном угле. Далее проводили аффинную хроматографию. пропуская препарат через колонку с агарозой. коньюгированной с протеином A золотистого стафилококка. уравновешенную 0.1 М фосфатным буфером. со скоростью б-10 капель в минуту. После этого колонку последовательно промывали 0.01 М фосфатным буфером рH 7.4 с 1% раствором тритона Х-305. а затем без детергента в количестве 2-3 объемов колонки и 0.3 М раствором NaCl.

Элюцию связавшихся иммуноглобулинов класса G вели 0.1 М глицин-HCl буфером рH 2.S до исчезновения белка в элюенте. Отбирали аликвоты. содержащие максимальное количество белка (определяли по методике Бредфорд). нейтрализовали 1 М раствором Трис. рH 9.0. до рH 7.0-7.5. диализовали против 0.9% раствора хлорида натрия. Концентрацию белка в полученных препаратах иммуноглобулинов определяли спектрофотометрически на длине волны 2S0 нм. Препараты хранили в пластиковых пробирках при -20°С. Перед постановкой реакции концентрацию белка в пробах доводили до 1 мг/мл 0.9% раствором хлорида натрия.

Приготовление калибровочных растворов для ВЭЖХ.

а). Приготовление раствора п-нитроанилина.

Точную навеску п-нитроанилина (0.0250 г) растворяли в горячей дистиллированной воде в мерной колбе на 50.0 мл. охлаждали до комнатной температуры и доводили дистиллированной водой до метки (концентрация раствора 500 мкг/мл). Растворы с концентрацией 100; 50; 30; 10; 5; 3; 1; 0.5; 0.3; 0.1 мкг/мл готовили последовательным разведением из исходного раствора. Калибровку проводили три раза. каждый раствор инжектировали три раза.

б). Приготовление растворов БАПНА и трипсина.

Растворяли 25.0 мг БАПНА в 5 мл диметилсульфоксида в течение 5-10 мин при комнатной температуре и доводили Трис-HCl буфером рН 8.3 в мерной колбе до 50.0 мл.

25.0 мг трипсина переносили в мерную колбу на 250.0 мл. добавляли около 150 мл 0.9% раствора хлорида натрия. встряхивали до растворения трипсина и доводили до метки 0.9% раствором хлорида натрия. Из этого раствора трипсина готовили путем разведения концентрации 500; 100; 50; 10; 5; 1; 0.5; 0.1;

0.05; 0.01; 0.005; 0.001 мкг/мл.

Постановка реакции определения БАПНА-амидазной активности трипсина.

К 1.00 мл раствора БАПНА добавляли 1.00 мл раствора трипсина в разных концентрациях. инкубировали при 37°С в течение 20 часов.

Постановка реакции определения БАПНА-амидазной активности IgG сыворотки крови больных.

К 1.00 мл раствора БАПНА добавляли 1.00 мл растворов IgG с концентрацией 1 мг/мл. инкубировали при 37°С в течение 20 часов.

Аппаратура для ВЭЖХ.

Работа выполнялась на жидкостном хроматографе фирмы Agilent HP 1100. в комплекте с системой подачи и дегазации на четыре растворителя G1311A. диодно-матричным детектором G1315B. термостатом колонок G1316A. устройством для автоматического ввода образцов (автосэмплер) G1313A. Сбор данных. обработка хроматограмм и спектров поглощения проводилась с помощью программы Agilent ChemStation for LC 3D.

Разделение проводилось на хроматографической колонке Zorbax Stable-Bond C-18 250x4.6 мм. размер частиц 5 мкм. Подвижная фаза: ацетонитрил и вода 20:80 (по объему). скорость подачи подвижной фазы 1 мл/мин. объем пробы 50 мкл. Рабочая длина волны 380 нм выбрана на основании анализа спектров поглощения в области максимума пика п-нитроанилина с помощью фотодиодноматричного детектора Diode-array detector Agilent HP 1100 G1315B и программы Agilent ChemStation for LC 3D. Разделение проводилось при температуре колонки 20°С. давление в системе около 130 bar.

Результаты

В ходе проведенного исследования нами построен калибровочный график зависимости отклика детектора хроматографа (площадь пика вещества на хроматограмме) от концентрации п-нитроанилина во вводимой пробе. Уравнение зависимости имеет вид: SпиKa=235.61xСмKг/мЛ в диапазоне концентрации п-нитроанилина от 0.1 мкг/мл до 100 мкг/мл; коэффициент корреляции уравнения равен 1.00.

Для построения градуировочного графика зависимости ферментативного расщепления БАПНА от концентрации трипсина в пробе использовали растворы с постоянной концентрацией БАПНА (500 мкг/мл) и различными концентрациями трипсина (50; 10; 5; 1; 0.5; 0.1; 0.05; 0.01; 0.005; 0.001 мкг/мл). приготовленные последовательным разведением. В качестве контроля использовали раствор БАПНА без добавления трипсина (см. таблицу 1).

Таблица 1

Зависимость площади пика п-нитроанилина от концентрации трипсина в пробе

Концентрация трипсина, мкг/мл © «л О 1Г5 1Г5 О о 0,05 0,01 0,005 0,001 контроль

Площадь пика п-нитроанилина 10420 8943.6 81 1669.9 .5 81 240.1 156.6 95.9 87.6 .5 81 79.9

Полученный калибровочный график линеен при концентрациях трипсина

0.001-5 мкг/мл (уравнение 8пика=1548.7хСмкг/мл+79.843; коэффициент корреляции уравнения 0.9999).

Коэффициент вариации внутри анализа по пяти параллельным определениям составил 2.29% при концентрации трипсина 0.001 мкг/мл; 2.62% - при концентрации 10 мкг/мл.

Коэффициент вариации между анализами по результатам трех определений составил 5.02% при концентрации трипсина 0.001 мкг/мл; 5.12% - при концентрации 10 мкг/мл; межанализная воспроизводимость контролей равнялась 6.1%.

По калибровочному графику п-нитроанилина определяли коэффициент зависимости (а) площади пика от количества вещества в пробе. Активность трипсина выражали в международных единицах (МЕ). 1 МЕ - это количество мкмоль субстрата (БАПНА). гидролизованное ферментом за 1 минуту. Расчет производили при помощи градуировочного графика зависимости расщепления БАПНА от концентрации фермента по формуле:

Х=(8оп-Зкон)хах3.15/1.

где Х - активность фермента. МЕ; 8оп - площадь пика п-нитроанилина на хроматограмме опытной пробы; 8кон - площадь пика п-нитроанилина на хроматограмме контроля; а - коэффициент. равный 0.0000015 мкмоль (см. выше); 3.15 - коэффициент соотношения молярных масс БАПНА и п-нитроанилина. 1 -время инкубации. мин. Активность трипсина в опыте составила 0.063x10" -407.0х10-7 МЕ (мкмоль/мин).

Для сравнения методик спектрофотометрической и ВЭЖХ оценки проте-олитической активности параллельно определяли оптическую плотность опытных растворов на планшетном колориметре «Мультискан АИФ М340». Для этого в лунки планшета вносили по 0.2 мл пробы. фотометрировали при длине волны 405 нм (см. таблицу 2).

Таблица 2

Зависимость оптической плотности растворов п-нитроанилина от

концентрации трипсина

Концентрация трипсина, мкг/мл 10 1 0,1 0,01 0,001 контроль

Оптическая плотность раствора 1,335 0,217 0,083 0,071 0,075 0,081

Коэффициент вариации внутри анализа по двенадцати параллельным определениям составил 14.74 % при концентрации трипсина 0.1 мкг/мл.

С целью клинической апробации методики для оценки БАПНА-амидазной активности иммуноглобулинов нами были использованы препараты 1^0 двадцати больных кишечными инфекциями (шигеллез. сальмонеллез). В восьми случаях получили достоверное отличие от контроля (рисунок 2).

20 -

15 і 10 -І 5 -І о

mAU 15 -і 10 -

5 -і 0

1 - концентрация трипсина 0,5 мкг/мл; 2 - IgG больного сальмонеллезом;

3 - контроль

Рисунок 2 - Хроматограмма п-нитроанилина - время удерживания 18,9 мин, коэффициент удерживания 7,8.

В этих пробах активность иммуноглобулинов у больных сальмонеллезом составила 26.96х10-7. 14.49х10-7. 10.06х10-7. 8.32х10-7. 7.55х10-7 МЕ. у больных шигеллезом - 4.18х10-7. 3.35х10-7. 3.09х10-7 МЕ.

Обсуждение

В настоящее время активно исследуется влияние протеолитической аб-зимной активности на клинические проявления ряда заболеваний. В частности. показано. что при аутоиммунном тиреоидите возникают каталитические антитела. специфически расщепляющие тиреоглобулин [10]. При миеломной болезни как полные 1^0. так и их легкие цепи (белки Бенс-Джонса) оказались способными гидролизовать ряд синтетических пептидов [11]. Наконец. недавно было показано. что аутоантитела способны разрушать основной белок миелина у больных рассеянным склерозом [14]. Кроме того. опубликованы данные об отрицательной взаимосвязи БАПНА-амидазной активности антител с тяжестью процесса при хронических вирусных гепатитах В и С [1]; установлено положительное влияние протеолитических абзимов на благоприятный исход при сепсисе [9]. Все эти. а также другие данные подтверждают участие антител с каталитической активностью в развитии аутоиммунной. онкологической и системной инфекционной патологии [1]. Поэтому можно предполагать. что разработанная высокочувствительная и точная методика оценки протеолитической активности иммуноглобулинов будет использована в дальнейшем в качестве диагностической при широком спектре патологических процессов. Кроме того. с помощью предложенной методики возможно исследование каталитической активности других биологических жидкостей организма (сыворотки крови. синовиальной жидкости и т.д.).

Заключение

1. Разработанная методика ВЭЖХ определения БАПНА-амидазной активности является высокочувствительной (предел определения ферментатив-

-7

ной активности по трипсину равен 3.02х10" МЕ (мкмоль/мин)) и хорошо воспроизводимой (коэффициент вариации внутри одного определения составил 2.46%. между анализами - 5.41%).

2. Простота. чувствительность и точность данной методики позволяют использовать ее для качественного и количественного анализа специфической протеолитической активности иммуноглобулинов и ферментов в микробиологических. иммунологических и биохимических исследованиях.

3. Проведенная оценка БАПНА-амидазной активности препаратов 1^0. полученных от больных кишечными инфекциями. показала достоверное наличие абзимной активности антител у части лиц данной группы. Это подтверждает возможность использования разработанного метода в клинической практике.

Литература

1. Генералов. И. И. Абзимная активность иммуноглобулинов / И. И. Генералов. - Витебск: Издательство ВГМУ. 2000.

2. Определение БАПНА-амидазной активности микроорганизмов. сывороток крови и иммуноглобулинов класса 0: инструкция по применению /

В. К. Окулич [и др.]. - Минск: МЗ РБ. 2002. - Рег. № 6-0101.

3. ДНК-абзимы при ревматоидном артрите: патогенетическая и клиническая значимость / А. Н. Хитров [и др.] // Терапевтический архив. - 2005. -№11. - С. 75-80.

4. Kinetics of Papain / K. Comely [et al.] // Journal of Chemical Education.

- 1999. - Vol. 76. N 5. - Р. 644-645.

5. Erlanger. B. F. The preparation of two new chromogenic substrates of trypsin / B. F. Erlanger. N. Kokowsky. W. Cohen // Arch. Biochem. Biophys. - 1961.

- N 95. - Р. 271-278.

6. Finehout. E. J. Kinetic characterization of sequencing grade modified trypsin // E. J. Finehout. J. R. Cantor. K. H. Lee // Proteomic. - 2005. - N 5. - Р. 23192321.

7. Heiman. C. Salmonella typhimurium Mutants Lacking Protease II /

C. Heiman. C. G. Miller // Journal of Bacteriology. - 1978. - Vol. 135. N 2. - P. 588-

594.

8. Kulka. M. High resolution tracking of cell division demonstrates differential effects of Th1 and Th2 cytokines on SCF-dependent human mast cell production in vitro: correlation with apoptosis and Kit expression / M. Kulka. D. Metcalfe // Blood First Edition Paper. - 2004. - 14 September.

9. High levels of catalytic antibodies correlate with favorable outcome in sepsis / S. Lacroix-Desmazes [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2005. - Vol. 11. N 102. - P. 4109-4113.

10. Catalytic activity of anti-thyroglobulin antibodies / L. Li [et al.] // J. Immunol. - 1995. - Vol. 154. - P. 3328 - 3332.

11. Natural Catalytic Antibodies: Peptide-hydrolyzing Activities of Bence Jones Proteins and VL Fragment / S. Paul [et al.] // The Journal of Biological Chemistry. - 1995. - N 25. - Р. 15257 - 15261.

12. Perspectives of digestive pest control with proteinase inhibitors that mainly affect the trypsin-like activity of Anticarsia gemmatalis Hubner (Lepidoptera: Noctuidae) / M. E. Pereira [et al.] // Brazilian Journal of Medical and Biological Research. - 2005. - N 38. - Р. 1633-1641.

13. Potempa. J. The Multiple Forms of Trypsin-like Activity Present in Various Strains of Porphyromonas gingivalis are due to the Presence of either Arg-Gingipain or Lys-Gingipain / J. Potempa. R. Pike. J. Travis // Infection and Immunity. - 1995. - Vol. 63. N 4. - Р. 1176-1182.

14. Hydrolysis of myelin basic protein by IgA and IgM antibodies from sera of patients with multiple sclerosis / D. I.. Polosukhina [et al.] // Medical Science Monitor. - 2005. -Vol. 6. N 11. - Р. 1-7.