Сфингомиелиновый сигнальный путь апоптоза

Морфология роговицы кроликов 4 группы (новая гидродинамическая схема, игла 0,9 мм). В центральной части роговицы кролика структура переднего многослойного эпителия без особых изменений (рис. 10). В соединительнотканной строме роговицы коллагеновые волокна лежат плотными параллельными пучками. Со стороны задней пограничной мембраны лишь в отдельных участках выявляется слабое разволокнение отдельных пучков коллагеновых волокон, а также напротив этих участков - набухание клеток слоя заднего эпителия или единичные небольшие разрывы в нем (рис. 11).

Рис. 10. Структура переднего многослойного эпителия Рис. 11. Разрыв слоя клеток заднего эпителия

и стромы в центральной части в центральной части роговицы

роговицы кролика 4 группы. кролика 4 группы.

Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение *400 Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение *400

Заключение. Критерием оценки результатов служили изменения со стороны переднего и заднего эпителия роговой оболочки, коллагеновых волокон стромы, а также повреждения задней пограничной (десцемето-вой) мембраны, как одной из наиболее реактивных структур роговицы.

Проведенные экспериментальные исследования роговой оболочки глаз кроликов после моделирования постокклюзионной волны показали, что наименьшие морфологические изменения наблюдаются при использовании микрокоаксиальной системы с иглой 0,9 мм в сочетании с новой гидродинамической схемой.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Азнабаев Б.М. Ультразвуковая хирургия катаракты - факоэмульсификация. - М.: Август Борг. -2005. - 136 с.

2. Азнабаев Б.М., Рамазанов В.Н., Мухамадеев Т.Р. [и др.]. Снижение постокклюзионной волны - эффективность новой гидродинамической схемы // Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2010. Сборник научных статей. - М., 2010. - С. 19-24.

3. Бессонов И. Л. Микрокоаксиальная факоэмульсификация с использованием технологии OZIL в хирургии пациентов с увеальной катарактой. Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2009. Сборник научных статей / под ред. Х.П. Тахчиди. - М., 2009. - С. 43-48.

4. Зимина Т.Ю. О решении гидродинамических проблем в хирургии катаракты // Актуальные проблемы офтальмологии: Всерос. науч. конф. молодых ученых. Сб. науч. работ / под ред. Х.П. Тахчиди. -М., 2006. - С. 103-104.

5. Малюгин Б.Э. Медико-технологическая система хирургической реабилитации пациентов с катарактой на основе ультразвуковой факоэмульсификации с имплантацией интраокулярной линзы: дис. ... д-ра мед. наук. - М., 2002. - 298 с.

6. Buratto L. Хирургия катаракты: переход от экстракапсулярной экстракции к факоэмульсификации: пер. с англ. - Milano: Fabiano Editore - 1999. - 472 с.

7. Seibel B. Phacodynamics: mastering the tools and techniques of phacoemulsification surgery. 4th ed. Thoro-fare, - New Jersey: SLACK Incorporated, 2005. - 377 p.

Азнабаев Булат Маратович, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой офтальмологии с курсом оториноларингологии Института последипломного образования ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития России, Россия, Республика Башкортостан, 450000, г. Уфа, Ул. Ленина, 3, тел. (347) 223-24-21, e-mail: office@optimed-ufa.ru

Мухамадеев Тимур Рафаэльевич, кандидат медицинских наук, ассистент кафедры офтальмологии с курсом оториноларингологии Института последипломного образования ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский уни-

верситет» Минздравсоцразвития России, Россия, Республика Башкортостан, 450000, г. Уфа, Ул. Ленина, 3, тел. (347) 277-6262, e-mail: wetlab@mail.ru

Самигуллина Айгуль Фидратовна, кандидат медицинских наук, ассистент кафедры офтальмологии с курсом оториноларингологии Института последипломного образования ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития России, Россия, Республика Башкортостан, 450000, г. Уфа, Ул. Ленина, 3, тел. (347) 277-6262, e-mail: office@optimed-ufa.ru

Бикчураев Дамир Ринатович, врач-офтальмолог офтальмологического отделения МУЗ «Городская клиническая больница № 2 им. братьев Губиных», Россия, 414057, г. Астрахань, ул. Кубанская, 1, тел. (8512) 65-61-87, e-mail: damirio@bk.ru

Дибаев Тагир Ильдарович, младший научный сотрудник Научно-медицинская ассоциация «Оптимедсервис», Россия, 450000, г. Уфа, ул. 50 лет СССР, 8, тел. (347) 277-60-60, e-mail: dibaev@yandex.ru

УДК 616.136.7-002.4:577.213/217: 616.136.7-61-002.4:577.213/.217 © Ю.А. Белоус, И.А. Комаревцева, Е.А. Орлова, Е.В. Комаревцева, А.В. Заика, О.И. Филиппова, А.В. Тачко, А.Е. Мажник, 2011

Ю.А. Белоус1, И.А. Комаревцева2, Е.А. Орлова2, Е.В. Комаревцева2, А.В. Заика2, О.И. Филиппова2, А.В. Тачко2, А.Е. Мажник2

СФИНГОМИЕЛИНОВЫЙ СИГНАЛЬНЫЙ ПУТЬ АПОПТОЗА

1ГОУ ВПО «Российский университет дружбы народов», г. Москва 2«Луганский государственный медицинский университет», Украина, г. Луганск

Цель исследования - изучить динамику изменения концентрации сфингомиелина и деградацию ДНК в клетках почечной ткани. Выделение липидов проводилось по Фолчу, измерение сфингомиелина - спектрофотометрическим методом. Ядерная ДНК выделялась по модифицированному методу Бартона, содержимое фрагментированной ДНК рассчитывалось по оптической плотности. В эксперименте наблюдалось снижение количества сфингомиелина при противоположной динамике деградации ядерной ДНК. Таким образом, одновременное понижение содержания сфингомиелина и повышения деградации ДНК в клетках почек связано с включением программы клеточной гибели.

Ключевые слова: сфингомиелин, фрагментированная ДНК, почки, апоптоз.

Yu.A. Belous, I.A. Komarevtseva, E.A. Orlova, E.V. Komarevtseva, A.V. Zaika, O.I. Philippova, A.V. Tachko, A.E. Majnik

SPHINGOMYELIN SIGNALING WAY OF APOPTOSIS

The purpose of the work was to study the dynamics of sphingomyelin and degradation of DNA in cells of the kidney tissue. The extraction of lipids was done by Folch, the sphingomyelin was measured spectrophotometrically. The nuclear DNA was extracted by modified Barton's method, content of fragmentated DNA was settled on the optical density. It was explored in the experiment the decreasing of amount sphingomyelin and contrary dynamics of the nuclear DNA was observed. A simultaneous decreasing of the sphingomyelin and increasing of degradation DNA in cells of kidney was connected with inclusion of the programmed cell death.

Key words: sphingomyelin, DNA, apoptosis, kidney.

Программируемая клеточная смерть развивается по специфической программе, в которой генератор вторичных посредников - сфингомиелиновый цикл - играет важную роль. Вторичными посредниками сфинго-миелинового цикла являются сфингомиелин, церамид, сфингозин и ферменты сфингомиелиназа и церамидаза, они обеспечивают трансдукцию различных внешних сигналов в клетку, и, одновременно, действуют как межклеточные медиаторы. Ряд исследователей подтвердили существование специфического метаболического пути от сфингомиелина, необходимого для активации апоптоза при действии облучения [8].

Окислительный стресс, вызванный как непосредственно прооксидантными агентами (УФ-облучение, перекисью водорода), так и опосредованными воздействиями (цитокинами, ишемией - реперфузией) [6], вызывают активацию сфингомиелинового цикла. Механизм этой активации до сих пор не изучен полностью, однако, в настоящее время в литературе появились сведения о зависимости активности основного фермента сфингомие-линового цикла - сфингомиелиназы от уровня окислительных процессов в клетке [9]. И, хотя о функциональных свойствах продуктов сфингомиелинового цикла в литературе накопилось достаточно сведений, механизм действия сфингозина до сих пор полностью не изучен. В частности, несмотря на несомненную связь апоптоза с окислительными реакциями, сведений о влиянии сфингозина на свободнорадикальные процессы при введении его животным в литературе мы не обнаружили.

Имеются единичные литературные данные [11], демонстрирующие изменение содержания сфингомие-лина, церамида и сфингозина в индукционной фазе острой почечной недостаточности (ОПН). При этом показано, что ишемия вызывает повышение уровня сфингозина и церамида приблизительно на 50% и предполагается важное значение их уровня в индукционной фазе и развитии постишемической ОПН.

Достаточно мало изучены механизмы передачи апоптозиндуцируемого сигнала по сфингомиелиновому пути при ишемических повреждениях разных органов, в т.ч. почек. Связь активности сфингомиелиназы с уровнем протеолитической активности, с уровнем оксида азота и активностью супероксиддисмутазы (СОД) в почках in vivo в литературе нами также не обнаружено.

Установлено, что при острой и хронической почечной недостаточности одним из значимых ферментов, регулирующих апоптоз, является интерлейкин-бета-конвертирующий энзим [6]. Показано, что при взаимодействии сигнальных молекул (фактора некроза опухоли (ФНО), гамма-интерферонов или инерлейкина-1Р) с рецепторами плазматической мембраны индуцируется резкая активация липолитических ферментов - фосфоли-пазы А2, С и D [14] и сфингомиелиназы [10], что приводит к накоплению продуктов гидролиза фосфолипидов (арахидоновой кислоты, диацилглицерина, церамида и др.). Однако только продукты сфингомиелинового цикла (церамид и сфингозин) обладают ярко выраженным проапоптотическим действием при непосредственном контакте с клеткой. Анализ литературных данных показывает, что арахидоновая кислота активирует ключевой фермент сфингомиелинового цикла, продукты которого служат токсическим звеном в проведении сигнала апоптоза [1, 15, 18].

Для определения наличия или отсутствия взаимосвязи сфингомиелиназной активности с апоптотически-ми процессами проводили исследования изменения содержания сфингомиелина и сфингозина в почках при экспериментальных моделях ОПН.

Материалы и методы. Исследования выполнены на 300 половозрелых белых крысах 16-18-ти недельного возраста. Животные содержались в условиях, соответствующих международному этическому кодексу работы с экспериментальными животными.

У контрольных животных (контроль-1) проводили двухсторонние надрезы кожи и мышц в области спины (ложнооперированные).

Ишемия/реперфузия в почках вызывалась пережатием сосудистой ножки обеих почек в течение 30-минут у анестезированных крыс. Через 1 час после ишемии (контроль-2) и в течение 1, 2, 3-х суток (ОПН-1,ОПН-2,ОПН-3) изучали уровень апоптоза, содержание сфингомиелина и сфингозина в клетках почек.

Для определения фрагментированной ДНК нами был использован удобный, достаточно чувствительный и дешевый метод спектрофотометрического определения фрагментированной ДНК в нашей модификации [4, 16]. Метод основан на цветной реакции накопленных в клетках почек низкомолекулярных фрагментов ДНК, экстрагированных в раствор с низкой ионной силой, с дифениламиновым реагентом. Суть модификации заключалась в том, что из пробы предварительно удалялись некротические обломки ДНК. После проведения цветной реакции ДНК с дифениламином измеряли оптическую плотность проб при 1=570 нм. Количество фрагментиро-ванной ДНК (ф-ДНК) рассчитывали в процентах как отношение количества экстрагированной ДНК к общему количеству ДНК в пробе.

Выделение сфингомиелина из ткани проводилось нами поэтапно. На первом этапе извлекали общую ли-пидную фракцию из почечной ткани по методу Фолча [3]. На втором этапе выделяли фракцию фосфолипидов из общей липидной фракции по методу Васьковского [17]. Содержание сфингомиелина определяли в элюатах проб после разделения фракции общих фосфолипидов методом тонкослойной хроматографии на стандартных пластинках «Silufol» в системе растворителей хлороформ : метанол : вода (65:30:5). Фракцию сфингомиелина с пластинок элюировали смесью растворителей хлороформ : метанол (2:1). Количество сфингомиелина определяли по методу Чена [7]. Пробу сфингомиелина сжигали до неорганического фосфата, затем проводили цветную реакцию с хромогенным реагентом. Оптическую плотность окрашенных проб измеряли при 1=700 нм. Содержание неорганического фосфата определяли по калибровочной кривой стандартного раствора КН2РО4.

Для выделения свободного сфингозина нами был использован метод, основанный на экстракции сфинго-идных оснований диэтиловым эфиром, в нашей модификации. Модификация заключалась в отсутствии этапа гидролиза сфингомиелинов. Количественно пул свободного сфингозина определяли по методу Lauter-Trams [1], основанного на образовании окрашенного комплекса сфингозина и метилоранжа. Пробы спектрофотометриро-вали при 1=415 нм. Количество свободного сфингозина определяли по калибровочной кривой стандартного раствора сфингозина (Amersham).

Достоверность полученных данных определяли с помощью t-критерия Стьюдента.

Результаты и их обсуждение. В таблице 1 представлено изменение содержания сфингомиелина (СМ) в почках при ишемической модели ОПН. Установлено, что в почках уже через 30 минут наблюдалось снижение уровня сфингомиелина в 1,4 раза по сравнению с контролем-1. На 1-е сутки реперфузии содержание сфингозина уменьшилось еще больше - в 1,7 раза, на 2-е сутки - в 2,8 раза, на 3-и сутки - в 2,7 раза. Динамика изменения данного параметра указывает на максимальный гидролиз СМ на 2-3 сутки развития ОПН.

Следовательно, экспериментальная ОПН сопровождается деградацией сфингомиелина в почках, вследствие активации сфингомиелиназы.

Таблица 1

Содержание сфингомиелина (мкг/мг белка) и сфингозина (нг/мг белка) в клетках почек

при экспериментальной ОПН

Контроль-1 Контроль-2 ОПН - 1 сутки ОПН - 2 сутки ОПН - 3 сутки

СМ, мкг/мг белка 7,78±0,65 5,44±0,50* 4,58±0,67* 3,61±0,28* 3,75±0,55*

СФЗ, нг/мг белка 20,41±1,23 36,33±2,65* 34,28±2,77* 42,2±2,53* 40,62±2,58*

Примечание: * - различия достоверны относительно контроля-1, р<0,05

Однако известно, что продукты метаболического цикла сфингомиелина могут выступать в качестве вторичных посредников пролиферативных сигналов [13]. Но в исследованиях на моделях, аналогичных нашим, установлено [12], что пролиферативные и апоптотические процессы протекают с четко обозначенными временными периодами: пик пролиферативных процессов приходится на 4-е сутки развития ишемии, а апоптоза - на 2-е сутки.

Последнее было подтверждено собственными исследованиями [2], а установленная отрицательная корреляционная зависимость между гидролизом сфингомиелина и деградацией ДНК указывает на взаимосвязь этих процессов при данных моделях ОПН (табл. 2).

Продукт сфингомиелинового цикла - сфингозин, как оказалось, может имитировать клеточные эффекты цитокинов, липополисахаридов и других биологически активных соединений в процессах клеточной пролиферации и апоптозе [1]. В таблице 1 представлены данные об изменении количества сфингозина при ишемии / гипоксии в клетках почек крыс.

Так, прослеживалось повышение концентрации сфингозина в почках контрольной группы-2 в 1,8 раза, в группах односуточных животных - в 1,7 раза, в группах двухсуточных животных - в 2,1 раза, в группах трехсуточных животных - в 2,0 раза по сравнению с контролем. Из полученных результатов следует, что наблюдаемая динамика повышения содержания сфингозина и распада сфингомиелина является противонаправленной и совпадает во времени, т.е. максимум показателя по сфингозину соответствует минимуму показателя по сфин-гомиелину, что достоверно коррелирует с высоким коэффициентом гху (табл. 2). Поэтому вполне вероятно, что источником накапливаемого сфингозина в клетках почек может быть сфингомиелин. Также была отмечена позитивная корреляционная зависимость между деградацией ДНК и накоплением сфингозина в клетках почек при ОПН. Полученные результаты дают основание предположить, что сфингозин может выполнять функции информационной молекулы в почках на ранней стадии развития ОПН, которая способна проводить внеклеточные сигналы гибели клеток.

Таблица 2

Корреляционные связи между содержанием сфингомиелина (СМ), сфингозина (СФЗ) и фрагментацией ДНК

(ф-ДНК) в почках при экспериментальной ОПН

Пары корреляционных связей Коэффициент корреляции ,rjy Достоверность корреляционных связей

СМ - ф-ДНК -0,75 <0,05

СМ - СФЗ -0,98 <0,001

СФЗ - ф-ДНК 0,99 <0,001

Итак, на основании полученных данных, мы можем сделать вывод, что при экспериментальной ОПН распад сфингомиелина сопряжен с увеличением количества сфингоидных оснований в почках. Противоположная динамика содержания сфингомиелина и сфингозина в клетках почек косвенно свидетельствует об активации сфингомиелиназы и непосредственно о накоплении продуктов сфингомиелинового цикла.

Так как наблюдаемое увеличение содержания сфингозина в клетках в ответ на ишемию / реперфузию и гипоксию происходит в результате ферментативного расщепления церамида, а не за счет синтеза de novo [5], поэтому источником активного церамида является только сфингомиелин, что и показало наше исследование.

Выявленная отрицательная корреляционная зависимость между распадом СМ, накоплением СФЗ и деградацией ДНК, указывает на вовлечение сфингомиелинового цикла в активацию апоптотических процессов.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Алесенко А.В. Функциональная роль сфингозина в индукции пролиферации и гибели клеток // Биохимия. - 1998. - Т. 63, Вып. 1. - С. 75-78.

2. Комаревцева И. А., Орлова О. А., Благодаренко Е.А. Содержание оксида азота в тканях почек при активации апоптоза // Укр. биохим. журнал. - 2002. - Т. 74, № 4. - С. 116-119.

3. Лемешко В.В, Бровкович В.М., Листопад А.П. Простой метод определения фосфолипидов в биологических объектах // Укр. биохим. журн. - 1991. - Т. 63, № 1. - С. 60-66.

4. Орлова Е.А., Комаревцев В.Н. Определение фрагментации ДНК в клетках почечной ткани // Акт. проблемы акушерства и гинекологии, клинической иммунологии и мед. генетики. - 2001. - Вып. 6. -С. 206-209.

5. Цаликова Ф.Д. Апоптоз в патогенезе нефропатий // Нефрология и диализ. - 1999. - № 2-3. - С. 24-28.

6. Barinaga M. Cell suicide: but ICE, not fire. // Science. - 1994. - Vol. 263, № 5148. - P. 754-756.

7. Bissonnette R.P., Echeverri F., Mahoubi A. [et al.]. Apoptotic cell death induced by c-myc is inhibited by bcl-2 // Nature. - 1992. - Vol. 359. - P. 552-554.

8. Bonnaud S., Niaudet C., Legoux F. Sphingosine-1-phosphate activates the AKT pathway to protect small intestines from radiation-induced endothelial apoptosis // Cancer Res. - 2010. - Vol. 70, № 23. - P. 99059915.

9. Dinesh, Goswami A. [et al.]. Molecular modeling of human neutral sphingomyelinase provides insight into its molecular interactions // Bioinformation. - 2011. - № 7. - P. 21-28.

10. Dyatavitskaya E.V., Beznglov V.V. Lipids as bioeffectors. Introduction // J. Biochem. - 1998. - № 63. -P. 57-63.

11. Iwata M., Prington I.H., Zager R.A. Sphingosine: A mediator of acute renal tubular injury and subsequent cytoresistance // Proc. Natl. Acad. Set. USA. - 1995. - Vol. 92, № 4. - P. 8970-8974.

12. Gobe G. Zhang X-J., Desley A. [et al.]. Relation ship between expression of bcl-2 genes and growth factors in ichemic acute renal failure in the rat // J.Am.Soc.Nefrol. - 2000. - Vol. 11. - P. 454-467.

13. Huang Y.L., Huang W.P., Lee H. Roles of sphingosine 1-phosphate on tumorigenesis // World J. Biol. Chem. - 2011. - Vol. 2, № 2. - P. 25-34.

14. Linardic C.M., Hannum Y.A. Identification of a distinct pool of sphingomyelin involved in the sphingomyelin cycle// J. Biol. Chem. - 1994. - Vol. 269. - P. 23530-23537.

15. Liu G., Kleine L., Hebert L.R. Advances in the signal transduction of ceramide and related sphingolipids // Crit. Rev. Clin. Lab. Sci. - 1999. - Vol. 36. - P. 511-573.

16. Messmer U.K., Verena A.B. Basic fibroblast growth factor selectively enhances TNF - induced apoptotic cell death in glomerular endotelial cells // Biochem. I. - 1996. - Vol. 319. - P. 299-305.

17. Rouser G., Fliescher S., Yamamoto A. Two dimentional thin layer chromatographic separation of polar lipids and determination by phosphorus analysis of spots // Lipids. - 1970. - Vol. 5, № 5. - P. 494-496.

18. Zhang P., Liu B.Jenkins G.M. Expression of neutral sphingomyelinase identifies a distinct pool of sphingomyelin involved in apoptosis // J. Biol. Chem. - 1997. - Vol. 272. - P. 9609-9612.

Белоус Юрий Александрович, кандидат медицинских наук, доцент кафедры психотерапии и наркологии факультета повышения квалификации медицинских работников ГОУ ВПО «Российский университет дружбы народов», Россия, 117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 21, корп. 3, тел./факс: (499) 476-25-02.

Комаревцева Ирина Александровна, доктор медицинских наук, профессор, заведующая кафедрой медицинской химии «Луганский государственный медицинский университет», Украина, 91045, г. Луганск, квартал 50-летия Обороны Луганска, 1 Г.

Орлова Елена Анатольевна, доктор медицинских наук, заведующая кафедрой фармацевтической химии «Луганский государственный медицинский университет», Украина, 91045, г. Луганск, квартал 50-летия Обороны Луганска, 1Г.

Комаревцева Екатерина Витальевна, кандидат медицинских наук, кафедра хирургии и урологии «Луганский государственный медицинский университет», Украина, 91045, г. Луганск, квартал 50-летия Обороны Луганска, 1Г.

Заика Александр Викторович, ассистент, кафедра хирургии «Луганский государственный медицинский университет», Украина, 91045, г. Луганск, квартал 50-летия Обороны Луганска, 1Г.

Филиппова Ольга Ивановна, младший научный сотрудник Научно-исследовательского центра «Луганский государственный медицинский университет», Украина, 91045, г. Луганск, квартал 50-летия Обороны Луганска, 1Г.

Тачко Александр Викторович, ассистент, кафедра медицинской химии «Луганский государственный медицинский университет», Украина, 91045, г. Луганск, квартал 50-летия Обороны Луганска, 1Г.

Мажник Александр Евгеньевич, ассистент, кафедра медицинской химии «Луганский государственный медицинский университет», Украина, 91045, г. Луганск, квартал 50-летия Обороны Луганска, 1Г.