Ферменты-антиоксиданты: структурно-функциональные свойства и роль в регулировании метаболических процессов

УДК 577.112

ФЕРМЕНТЫ-АНТИОКСИДАНТЫ: СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА И РОЛЬ В РЕГУЛИРОВАНИИ МЕТАБОЛИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ

Л.Т. Рязанцева

Изложены представления о структурно-функциональных свойствах основных ферментов антиоксидантной системы: супероксиддисмутазы и каталазы. Анализируются кинетические параметры процессов структурнофункциональных модификаций указанных белков

Ключевые слова: антиоксиданты, супероксиддисмутаза, каталаза, кинетические параметры

Существование живых организмов на Земле (кроме небольшого числа бактерий -облигатных анаэробов) невозможно без кислорода, являющегося неотъемлемым компонентом метаболических процессов. Однако при включении кислорода в процессы жизнедеятельности организма образуются активированные производные молекулярного кислорода -активные формы кислорода (АФК). АФК инициируют реакции свободнорадикального окисления (в том числе перекисное окисление липидов), приводящие к химической модификации и разрушению биомолекул. В тканях благодаря наличию сложных ферментативных комплексов со специфическими электрон-транспортными простетическими и кофер-ментными группировками процесс восстановления кислорода протекает по многоступенчатому механизму, что сводит к минимуму возможность образования высокореакционных промежуточных соединений кислорода.

Ферментативные антиоксиданты (АО) характеризуются высокой специфичностью действия, а также клеточной и органной локализации, использованием в качестве катализаторов некоторых металов (Си, 2п, Мп, Бе) (рисунок). Уровень внутриклеточных ферментативных АО находится под генетическим контролем. У животных в условиях гипоксии и гипероксии, усиливающих образование активных форм кислорода, повышается уровень внутриклеточных ферментов АО системы, что связано с механизмами поддержания устойчивости организма к окислительному стрессу (рисунок).

Супероксиддисмутаза (КФ 1.15.1.11, СОД) - фермент, катализирующий реакцию дисмутации супероксидных анион-радикалов с

Рязанцева Лариса Тихоновна - ВГТУ, канд. биол. наук, доцент, тел. (4732) 521939

образованием пероксида водорода и триплетного кислорода:

02 + 02 + 2Н+ ^ Н2О2 + О2

СОД принадлежит к наиболее интенсивно изучаемым белкам, так как она является ключевым ферментом, непосредственно обеспечивающим обрыв цепей кислородзависимых свободнорадикальных реакций в клетках аэробных организмов [1]. К настоящему времени получены три типа СОД человека, для функционирования которых необходимо наличие марганца, меди и цинка. Медь-цинковая форма (Си,2п-СОД) содержится в цитозоле и межмембранном пространстве митохондрий, Мп-СОД локализована в митохондриях. Экст-рацеллюлярная высокомолекулярная форма СОД, содержащая медь, рассматривается как третий тип фермента - эСОД.

Молекула Си,2п-СОД состоит из двух идентичных субъединиц с молекулярной массой 16,3 Да, связь между которыми осуществляет дисульфидный мостик. По другим данным, субъединицы объединены через ионы металлов, причем места связывания металлов неидентичны.

Химическими методами, методами атомной абсорбционной спектроскопии и ЭПР показано присутствие в молекуле фермента по два иона меди и цинка. Установлено, что ионы меди (Си2+)в молекуле СОД играют важную роль при катализе реакции дисмутации, тогда как цинк имеет отношение к сохранению определенной конформации белка, необходимой для формирования реактивного медьсвязы-вающего участка. Ион меди в молекуле СОД окружен тремя прочно связанными с ним и одним слабым лигандами, которые являются имидазольными группами гистидиновых остатков [2]. Пятое место занимает вода, которая может быть заменена на другие лиганды; расстояние Си2+-О составляет примерно 0,2 нм.

Фагоцитирующие лейкоциты (нейтрофилы

ЫАОРН-

ЫАОР 4

Ткани

Активация фосфолипазы А2

пол/ пол * *

Арахидоновая кислота А А

Циклоокси- Липоокси-генация генация

‘ ч02 О

02 ^ ^ 2

Простаглан- * дины,тром-боксаны

>

Н2О2+О2 02 V *

Каталаза Гидрокси-перокси- эйкотетра-дазы еновая кислота, лейкотри-ены

Пути превращения активизированных метаболитов кислорода в тканях

Ионы меди и цинка связаны через азот имидазольного кольца гистидина, причем цинк может оттягивать на себя пару электронов в ходе одной из стадий ферментативного процесса.

В настоящее время существуют 2 модели функционирования СОД.

1. На основании исследования спектров ЭПР фермента было разработано представление о двухтактном механизме действия СОД (“пинг-понг”) [3], заключающемся в последовательном восстановлении и реокислении меди в активном центре фермента:

Е-Си2+ + 02 ^ Е-Си+ + О2,

Е-Си+ + 02 + 2Н+ ^ Е-Си2+ + Н2О2.

2. Б. С. Маринов с соавторами предложили многоцентровую модель функционирования СОД [4], сочетающую экспериментальные наблюдения и результаты квантовомеханических расчетов. Согласно этой модели,

одна молекула субстрата (°2) связывается с ионом меди в активном центре фермента, а вторая - взаимодействует с участком на периферии молекулы белка. Неспаренный электрон из активного центра передается по белку к пе-

ном центре образуется молекула кислорода, а на внешней поверхности фермента - пероксид водорода.

Функциональные свойства СОД из эритроцитов человека всесторонне изучены [5]. Для нее характерен широкий температурный оптимум, фермент стабилен при нагревании в течение 40 мин в температурном интервале 20 г 70 °С. Фермент также устойчив к колебаниям значений рН в широком диапазоне, он сохраняет свою активность в интервале рН 5,5 -

11,5, причем в области рН 8,0 - 9,5 ферментативная активность СОД достигает максимального значения и практически не изменяется.

При концентрации супероксидного анион-радикала 10-10 моль/л фермент в 105 раз ус-

02

коряет спонтанную реакцию дисмутации 2 (к * 2' 109 М'1'с'1).

У человека ген, кодирующий синтез СОД, локализован в хромосоме 21; выявлены случаи генетически детерминированного как снижения, так и повышения содержания СОД (у людей с трисомией по хромосоме 21). Интересно отметить, что в обоих случаях изменения концентрации фермента являются причиной развития патологических процессов: в первом - вследствие недостаточности защиты от активных форм кислорода, во втором - в

риферийному °2, в результате чего в актив-

результате усиления цитотоксического действия Н2О2, образующегося при дисмутации 02.

Рассмотренная Си, 2п-СОД является внутриклеточным энзимом и в межклеточных жидкостях (плазма крови, лимфа, синовиальная жидкость) быстро, в течение 5-10 мин, разрушается.

В 1982 г Marklund впервые выделил СОД из плазмы крови человека [6]. По своим свойствам этот фермент отличается от извест-

ных типов СОД и рассматривается как новый (третий) тип супероксиддисмутазы - экстра-целлюлярная СОД (эСОД). Высокомолекулярная форма СОД представляет собой тетрамер-ный Си,2п-содержащий гликопротеин с молекулярной массой около 120-150 кДа [7].

В таблице представлен сравнительный анализ свойств СОД эритроцитов и плазмы, откуда следует, что СОД плазмы представляет собой новый тип супероксиддисмутазы.

Таблица

Сравнительный анализ свойств супероксиддисмутазы плазмы и эритроцитов человека

Свойства Супероксиддисмутаза эритроцитов Супероксиддисмутаза плазмы крови

Молекулярная масса, кДа Содержание меди, ммоль/мг белка Максимум поглощения в видимой области, нм Влияние 2,510-5 моль/л ацетонци-ангидрина Влияние 0,47 моль/л МаБ Влияние азида натрия ЭПР-спектры 32,0; 33,6 9,010-6 675-680 Полностью ингибирует Ингибирует 1мМ - активирует, 10 мМ - ингибирует & = 2,68; Я2 = 2,96; я = 3,24

Хроматографическое разделение фермента позволило выделить три его фракции: А, В и С, отличающихся различным сродством к гепарину. Фракции А и В фермента, обладающие слабым сродством к гепарину, присутствуют преимущественно в плазме; фракция С (с высоким сродством к гепарину) находится, в основном, в сосудистой стенке. Выявлено динамическое равновесие между содержанием фракции С в плазме и в эндотелии сосудов. Причем, супероксиддисмутаза С хорошо связывается с гепаринсульфатом гликокаликса эндотелиоцитов, но не с лейкоцитами и эритроцитами.

При определенных условиях (длительное хранение при 1=4-5 °С, тепловое воздействие в диапазоне от 20 до 40 °С, действие Н0С1) наблюдается диссоциация молекулы на отдельные субъединицы, затем следует агрегация и образование лабильных комплексов, что сопровождается изменением биологической активности СОД. Вероятно, такого рода структурные изменения фермента можно рассматривать как механизм адаптации организма к изменению окружающей среды.

Каталаза (Н2О2:Н2О 2-оксидоредуктаза; КФ 1.11.1.6) - фермент, относящийся к классу оксидоредуктаз, катализирует гетеролитиче-

ское расщепление О-О-связи в Н2О2 и, таким образом, является синергистом супероксид-дисмутазы в клетке [8]:

Н2О2 + Н2О2 ^ О2 + Н2О

Каталаза всегда присутствует в системах, где осуществляется транспорт электронов с участием цитохромов, т.е. там, где образуется токсичный для клетки пероксид водорода. Она локализована преимущественно в перок-сисомах клеток, где ее концентрация достигает 10-6 моль, и в цитоплазме. У человека высокое содержание каталазы обнаружено в эритроцитах, а также в печени и почках; концентрация ее в мозге и щитовидной железе мала.

Молекула каталазы представляет собой тетрамер с молекулярной массой 250 кДа, состоящий из четырех идентичных субъединиц, каждая из которых содержит протопорфирин IX с хелатированным атомом железа [9]. Железо в активном центре фермента находится в трехвалентном состоянии; четыре места в координационной сфере геминового железа заняты порфириновым циклом, пятое - имида-зольным остатком гистидина, а у шестого происходит реакция каталитического разложения пероксида водорода.

Процесс разложения Н2О2 каталазой может быть представлен следующей схемой:

Е-Бе3+ + Н2О2 ^ > [Е-Бе3+ ...ООН];

Н

[Е-Бе3+ ...ООН] -----» [Е-Бе5+ О2' ] + Н2О;

Н Комплекс I

[Е-Бе5+ О2’ ] + Н2О2---> Е-Бе3+ + О2 + Н2О;

Комплекс I

Нуклеофильный атом азота имидазоль-ной группы гистидина оттягивает на себя протон, активируя молекулу Н2О2, которая замещает ОН-группу у атома железа. Последняя протонируется гистидином и образуется молекула воды. Пероксосоединение разлагается с образованием второй молекулы воды, одновременно присоединяя депротонированную гистидином молекулу Н2О2. При этом происходит гетеролитическое расщепление О-О-связи в пероксиде водорода:

Н Н Н Н

о —о ____________• о-о-

Для регенерации исходной структуры активного центра достаточно обратимой ионизации имидазола, что является быстрым процессом в области рН 6-8.

Кроме характерной функции каталазы -высокоэффективного катализа разложения пероксида водорода на воду и кислород (к=107 моль^с-1), фермент проявляет умеренную пе-роксидазную активность, т.е. катализирует реакции окисления пероксидом водорода различных доноров электронов (к=103 моль-1с-1).

В заключении хотелось бы отметить, что в условиях оксидантного стресса или усиленного образования форм кислорода (как, например, в результате фагоцитоза) может происходить нарушение функционирования ферментов антиоксидантной системы и, как следствие, возникновение и накопление окислительных повреждений, что сопровождает ряд

физиологических и патофизиологических феноменов - таких, как воспаление, реперфузное поражение тканей, старение, канцерогенез [10]. В этой связи необходим поиск путей регулирования антиоксидантного статуса в биологической системе.

Литература

1. Hough M.A., Strange R.W., Hasnain S.S. Conformational variability of the Cu site in one subunit of bovine Cu,Zn superoxide dismutase: the importance of mobility in the Glu 119-Leu 142 loor regionb for catalytic function // J. Mol. Biol. 2000. V. 204 (2). P. 231-141.

2. Tainer J.A, Hallewell R.A., Roberts V.A. et al. Probing enzyme-substrate recognition and catalytic mechanism in Cu,Zn-superoxide dismutase // Oxygen Radicals in Biol. and Med.: Proc. IV Int. Congr., La Jolla, 1987. London, 1988. P. 635-640.

3. Kajihara J., Enomoto M., Katoh K. Relation between ESR-detectabl Cu (II) and superoxide dismutase activity // J. Biochem. 1988. V. 104. № 5. P. 855-857.

4. Гуляева Н.В., Обидин А.Б., Маринов Б.С.

Механизм функционирования СОД: многоцентровая

модель // Изв. АН СССР. Сер. биол. 1989. № 6. С. 890898.

5. Башарина О.В. Анализ фото- и термоиндуцированных структурно-функциональных изменений су-пероксиддисмутазы и каталазы: Дис. ... канд. биол. наук. Воронеж, 1995. 140 с.

6. Marklund S.L., Karlsson K. Antioxidants in therapy and preventive medicine. N.Y.: Plenum press, 1990. P. 1.

7. Marklund S.L. Location and regulation of ex-tracellular-superoxide dismutase synthesis // Free Rad. Biol. a. Med. 1990. V. 9. Suppl. 1. P. 127.

8. Артюхов В.Г., Башарина О.В., Вашанов Г.А., Наквасина М.А., Путинцева О.В. Олигомерные белки: структурно-функциональные модификации и роль субъ-единичных контактов. - Воронеж, 1997. 264 с.

9. Соломон Х., Снайдер С.Х., Дейвид С., Бредт Д. С. Биологическая роль окиси азота // В мире науки. 1992. № 7. С. 16-26.

10. Рязанцева Л.Т. Особенности функционирования нейтрофилов крови человека в условиях лазерного облучения: Дис. ... канд. биол. наук. Воронеж, 2002. 155 с.

Воронежский государственный технический университет

ENZYMES-ANTIOXIDANTS: STRUCTURALLY FUNCTIONAL PROPERTIES AND A ROLE IN REGULATION OF METABOLIC PROCESSES

L.T. Ryazantseva

Concepts about structurally functional properties of the basic enzymes antioxidant system are stated: superoxide-dismutase and catalase. Kinetic parameters of processes of structurally functional modifications of the specified proteins are analyzed

Key words: antioxidants, superoxide-dismutase, catalase, kinetical parameters