ПРИМЕНЕНИЕ АДАПТИРОВАННЫХ РЕКОМБИНАЗ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РЕТРОВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ

1. Способ получения вектора экспрессии, кодирующего адаптированную рекомбиназу, которая рекомбинирует aсимметричные последовательности-мишени в LTR провирусной ДНК, встроенной в геном клетки-хозяина, включающий стадии:
(a) определения последовательности LTR провирусной ДНК, идентификации в ней последовательностей, которые гомологичны с последовательностями левой половины участка и правой половины участка известных участков-мишеней рекомбиназ по меньшей мере на 30%, при этом гомологичные последовательности разделены спейсером из 5-12 нуклеотидов, а гомологичные последовательности LTR с наибольшей гомологией с известным участком-мишенью представляют ассиметричную последовательность-мишень;
(b) получения двух синтетических последовательностей, где первая синтетическая последовательность соответствует последовательности ассиметричной последовательности-мишени стадии (а), гомологичной левой половине участка указанного известного участка-мишени плюс последовательность спейсера и ее обозначают как "последовательность половины участка 1", и где вторая синтетическая последовательность соответствует последовательности спейсера плюс последовательность ассиметричной последовательности-мишени стадии (а), гомологичная правой половине участка, и ее обозначают как "последовательность половины участка 2";
(c) определения нуклеотидов в синтетических последовательностях стадии (b), отличающихся от соответствующих гомологичных последовательностей левой половины участка и правой половины участка известного гомологичного участка-мишени стадии (а);
(d) получения первой подгруппы двух последовательностей-мишеней на основе синтетических последовательностей стадии (b), где первая последовательность-мишень в первой подгруппе содержит инвертированный повтор, состоящий из последовательности половины участка 1 стадии (а) и последовательности половины участка 1', разделенных последовательностью спейсера, и где вторая последовательность-мишень в первой подгруппе содержит инвертированный повтор, состоящий из последовательности половины участка 2' и последовательности половины участка 2 стадии (b), разделенных последовательностью спейсера, где последовательности половины участка 1' и 2' представляют инвертированные повторы соответствующих последовательностей половины участка 1 и 2 стадии (b);
(e) получение второй подгруппы последовательностей-мишеней на основе последовательностей-мишеней первой подгруппы стадии (d), где каждую из последовательностей половин участков вместе с соответствующей последовательностью спейсера последовательностей-мишеней в первой подгруппе стадии (d) используют для получения независимой последовательности-мишени второй подгруппы, формируя инвертированный повтор на основании выбранной последовательности половины участка так, что последовательность спейсера разделяет обе последовательности, формируя инвертированный повтор, где последовательности обеих последовательностей половин участков, полученные из одной из последовательностей-мишеней первой подгруппы стадии (d) при их синтезе и до их использования изменяют с получением инвертированного повтора, формирующего полную последовательность-мишень так, что в последовательности левой половины участка часть нуклеотидов, отличающихся от соответствующей гомологичной последовательности половины участка известного участка-мишени стадии (а), замещена природными нуклеотидами, находящимися в известном участке-мишени, а в последовательности правой половины участка оставшиеся нуклеотиды, отличающиеся от соответствующей гомологичной левой половины участка, замещены природными нуклеотидами, находящимися в известном участке-мишени так, что в обеих последовательностях половин участков, происходящей из одной из последовательностей-мишеней первой подгруппы стадии (d), взятых вместе, можно найти все отличающиеся нуклеотиды, тогда как ни одна из указанных последовательностей половин участков отдельно не содержит всех отличающихся нуклеотидов;
(f) получения дополнительных подгрупп последовательностей-мишеней на основе последовательностей-мишеней из второй подгруппы, полученных на стадии (e), посредством пошагового повторения процесса стадии (e), каждый раз получая новую подгруппу последовательностей-мишеней, пока последовательности половин участков, формирующие инвертированные повторы в каждой полученной последовательности-мишени содержат один, два или три нуклеотида, отличающихся от соответствующей гомологичной последовательности половины участка известного участка-мишени;
(g) применения направленной молекулярной эволюции для рекомбиназы, распознающей известный гомологичный участок-мишень, выбранный на стадии (a), с использованием в качестве субстрата последовательностей-мишеней из конечной подгруппы, полученной на стадии (f), содержащих один, два или три нуклеотида, отличающихся от соответствующей гомологичной последовательности половины участка указанного известного гомологичного участка-мишени;
(h) перестановки в библиотеках рекомбиназ, полученных на стадии (g);
(i) применения направленной молекулярной эволюции для библиотеки с перестановками, полученной на стадии (h), с использованием последовательностей-мишеней следующей подгруппы более высокого порядка в соответствии со стадией (f);
(j) повторения стадий (h) и (i) по меньшей мере до получения посредством направленной молекулярной эволюции одной рекомбиназы, которая активна в отношении ассиметричной последовательности-мишени в LTR ретровирусной ДНК стадии (а);
(k) выделения из библиотеки нуклеиновой кислоты по меньшей мере одной рекомбиназы, полученной на стадии (j); и
(l) клонирования нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (k) в подходящем векторе экспрессии.
2. Способ по п.1, где известная рекомбиназа, последовательность-мишень которой используют на стадии (a) и к последовательности-мишени которой применяют направленную молекулярную эволюцию на стадиях (g) и (i), относится к семейству сериновых интеграз или тирозиновых интеграз, где рекомбиназа выбрана из группы, состоящей из Cre фага P1, FLP дрожжей и Dre фага D6.
3. Способ по п.1, где ассиметричная последовательность-мишень, идентифицированная на стадии (a) локализована в 5'-LTR и 3'-LTR провируса.
4. Способ по п.3, где провирусная ДНК, встроенная в геном клетки-хозяина представляет собой ДНК ретровируса, выбранного из группы, состоящей из вируса опухоли молочной железы мышей (MMTV), вируса обезьян Мэйзена-Пфейзера (MPMV), вируса T-клеточного лейкоза человека типа I (HTLV-I), вируса T-клеточного лейкоза человека типа II (HTLV-II), вируса T-клеточного лейкоза обезьян типа I (STLV-I), вируса T-клеточного лейкоза обезьян типа II (STLV-II), вируса лейкоза коров (BLV), вируса лейкоза кошек (FeLV) и вируса лейкоза мышей Молони (MoMLV), где ретровирус предпочтительно представляет собой лентивирус, выбранный из группы, состоящей из вируса иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1), вируса иммунодефицита человека типа 2 (ВИЧ-2), вируса иммунодефицита обезьян (SIV), вируса иммунодефицита кошек (FIV), вируса иммунодефицита коров (BIV), вируса Maedi-visna (MVV), вируса инфекционной анемии лошадей (EIAV) и вирус артрита-энцефалита коз (CAEV).
5. Способ по п.4, где ассиметричная последовательность-мишень, идентифицированная на стадии (a), расположена в 5'-LTR и 3'-LTR провируса ВИЧ и, предпочтительно, обладает последовательностью, приведенной как SEQ ID NO:3.
6. Способ по п.1, где применяемая направленная молекулярная эволюция представляет собой эволюцию на основе сшитых с субстратом белков.
7. Способ по п.1, где вектор экспрессии на стадии (l) представляет собой вектор экспрессии, выбранный из группы, состоящей из ретровирусных векторов, лентивирусных векторов, спумавирусных векторов и аденовирусных векторов, предпочтительно, лентивирусный вектор выбран из группы, состоящей из происходящих от ВИЧ-1, SIV, FIV или EIAV лентивирусных векторов.
8. Способ получения адаптированной рекомбиназы, где указанный способ включает способ по любому из пп.1-7 и дополнительную стадию экспрессии адаптированной рекомбиназы или слитого полипептида, содержащего аминокислотную последовательность адаптированной рекомбиназы кодирующей рекомбиназу нуклеиновой кислоты, встроенной в вектор экспрессии, в подходящей клетке-хозяине, где клетка-хозяин предпочтительно выбрана из группы, состоящей из бактериальных клеток, дрожжевых клеток, клеток насекомых и клеток млекопитающих.
9. Способ получения трансформированной стволовой клетки взрослого организма, включающий способ по любому из пп.1-7 и дополнительную стадию введения вектора экспрессии in vitro в подходящую стволовую клетку взрослого организма.
10. Нуклеиновая кислота, полученная на стадии (k) способа по любому из пп.1-7.
11. Нуклеиновая кислота по п.10, где указанная нуклеиновая кислота, кодирующая адаптированную рекомбиназу, обладает последовательностью нуклеиновой кислоты, приведенной как SEQ ID NO:2.
12. Вектор экспрессии, полученный способом по любому из пп.1-7.
13. Адаптированная рекомбиназа, полученная способом по п.8.
14. Адаптированная рекомбиназа по п.13, где белок обладает аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:3.
15. Слитый полипептид, полученный способом по п.8, где адаптированная рекомбиназа связана со вторым полипептидом, где второй полипептид содержит сигнальный пептид, где сигнальный пептид представляет собой домен белковой трансдукции, где домен белковой трансдукции представляет собой пептид TAT или пептид из третьей спирали гомеодомена Antennapedia.
16. Стволовая клетка взрослого организма, полученная способом по п.9, которая представляет собой стволовую клетку из гемопоэтической линии дифференцировки.
17. Способ по любому из пп.1-9, дополнительно включающий стадию получения вектора экспрессии, белка, слитого белка или взрослой стволовой клетки в виде фармацевтической композиции для снижения вирусной нагрузки у индивида, инфицированного ретровирусом, где фармацевтическая композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель, эксципиент и/или вспомогательное средство.
18. Фармацевтическая композиция, полученная способом по п.17, где указанная фармацевтическая композиция снижает вирусную нагрузку у индивида, инфицированного ретровирусом ниже 5000 эквивалентов генома/мл плазмы, предпочтительно, ниже 500 эквивалентов генома/мл плазмы, а более предпочтительно, ниже 50 эквивалентов генома/мл плазмы, где ретровирус представляет собой ретровирус, выбранный из группы, состоящей из вируса опухоли молочной железы мышей (MMTV), вируса обезьян Мэйзена-Пфейзера (MPMV), вируса T-клеточного лейкоза человека типа I (HTLV-I), вируса T-клеточного лейкоза человека типа II (HTLV-II), вируса T-клеточного лейкоза обезьян типа I (STLV-I), вируса T-клеточного лейкоза обезьян типа II (STLV-II), вируса лейкоза коров (BLV), вируса лейкоза кошек (FeLV) и вируса лейкоза мышей Молони (MoMLV), или лентивирус выбран из группы, состоящей из вируса иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1), вируса иммунодефицита человека типа 2 (ВИЧ-2), вируса иммунодефицита обезьян (SIV), вируса иммунодефицита кошек (FIV), вируса иммунодефицита коров (BIV), вируса Maedi-visna (MVV), вируса инфекционной анемии лошадей (EIAV) и вируса артрита-энцефалита коз (CAEV).
19. Фармацевтическая композиция по п.18, где фармацевтическая композиция предназначена для совместного введения с другими активными средствами для высокоактивной противоретровирусной терапии (HААРТ) или для совместного или последовательного введения для терапии с общей активацией иммунной системы или специфической активацией экспрессии генов провируса.
20. Способ оптимизации лечения ретровирусной инфекции у индивида in vitro, включающий стадии:
(a) определения последовательности нуклеиновой кислоты ретровирусной ДНК, находящейся в образце крови пациента;
(b) сканирования последовательности LTR у последовательности стадии (а) на известные последовательности рекомбинации, для которых специфические адаптированные рекомбиназы уже получены;
(c) в случае когда, по меньшей мере, одна из указанных известных последовательностей рекомбинации существует, получения соединения, выбранного из группы, состоящей из вектора экспрессии, содержащего нуклеиновую кислоту адаптированной рекомбиназы, специфически распознающей указанную известную последовательность рекомбинации, указанной адаптированной рекомбиназы, слитого белка, содержащего аминокислотную последовательность указанной адаптированной рекомбиназы, или взрослой стволовой клетки, содержащей указанный вектор экспрессии, в виде фармацевтической композиции для снижения вирусной нагрузки у индивида; в противном случае идентификации последовательности с гомологией с последовательностями левой половины участка и правой половины участка известных участков-мишеней рекомбиназ, соответственно по меньшей мере 30%, где гомологичные последовательности разделены подходящим спейсером из 5-12 нуклеотидов, и обозначения ее как "ассиметричной последовательности-мишени";
(d) проведение стадий (b)-(l) способа получения вектора экспрессии, кодирующего адаптированную рекомбиназу, осуществляющую специфическую рекомбинацию ассиметричной последовательности-мишени, идентифицированной в LTR провирусной ДНК по любому из пп.1-18; и
(e) получения вектора экспрессии, полученного на стадии (d), белка или слитого белка, экспрессированных с указанного вектора экспрессии, или стволовой клетки, трансфицированной или инфицированной указанным вектором экспрессии в виде фармацевтической композиции для снижения вирусной нагрузки у индивида,
где до получения указанной рекомбиназы в виде фармацевтической композиции проводят необязательную стадию тестирования in vitro эффективности рекомбиназы, идентифицированной на стадии (c) способа или специфически адаптированной рекомбиназы, полученной на стадии (d) способа, в отношении вырезания провирусной ДНК ретровируса, которой инфицирован указанный индивид,
и/или, предпочтительно, способ дополнительно включает стадию включения адаптированной рекомбиназы, полученной на стадии (e), в коллекцию специфически адаптированных рекомбиназ.
21. Способ по п.20, где на стадии (d) направленную молекулярную эволюцию применяют для адаптированной рекомбиназы уже распознающей участок-мишень, отличающийся от участков-мишеней рекомбиназ дикого типа.
22. Коллекция адаптированных рекомбиназ, где каждый из представителей указанной коллекции получен способом по любому из пп.1-8 или по любому из пп.20-21.