СПОСОБЫ СНИЖЕНИЯ ЧИСЛА БАЗОФИЛОВ
METHOD OF REDUCING BASOPHILS NUMBER

Область изобретения
Настоящее изобретение относится к способам снижения числа эозинофилов в организме человека.
Предпосылки создания изобретения
Эозинофилы принимают участие в развитии различных заболеваний, включающих аллергические заболевания, и, как полагают, играют важную роль в росте заболеваемости аллергическими заболеваниями, такими как хроническая бронхиальная астма и атопический дерматит (Adv. Immunol., 39, 177 (1986), Immunol. Today, 13, 501 (1992)). Кроме того, эозинофилы также принимают участие в развитии заболеваний, которые обычно относятся к гиперэозинофильному синдрому (ГЭС), такому как эозинофилия, эозинофильный энтерогастрит, эозинофильный лейкоз, эозинофильная гранулема и болезнь Кимуры (Ann. Intern, Med., 97, 78 (1982)). ассоциировано с заметной тканевой эозинофилией (U.S. Armed Forces Med. J., 2, 1085 (1951)). Согласно реестру патентов Японии, относящихся к раку костной ткани, (за 1972-1984) 379 из 404 (93,8%) пациентов, страдают от эозинофильной гранулемы. Эозинофильная гранулема на ранней стадии главным образом включает эозинофилы и гистиоциты, а гранулема на поздней стадии включает фиброз или может привести к развитию пневмосклероза. Следовательно, наряду с воспалительными заболеваниями, такими как аллергия, эозинофилы могут вызывать другие различные заболевания.
Интерлейкин-5 (далее ИЛ-5), интерлейкин-3 (далее ИЛ-3) и гранулоцит/макрофаг колониестимулирующий фактор (далее КМ-КСФ), которые являются членами семейства цитокинов, принимают участие в регуляции дифференциации, пролиферации и активации эозинофилов. Установлено, что один из цитокинов, а именно ИЛ-5, специфично действует на эозинофилы и специфично индуцирует терминальную дифференциацию (Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 85, 2288 (1988)).
В условиях in vitro ИЛ-3 и/или ГМ-КСФ могут активировать эозинофилы или пролонгировать их выживание (J. Clin. Invest., 81, 1986 (1988)). Более того, ИЛ-3 и/или ГМ-КСФ действуют также преимущественно на индукцию незрелых эозинофилов из миелоидных стволовых клеток (Blood, 76, 1956 (1990)). Кроме того, хемокины, такие как эотаксин и RANTES (в норме контролирующие активацию экспрессированных и секретированных Т-клеток), индуцируют хемотаксис эозинофилов к очагам воспаления (Clin. Exp. Allergy, 26, 1005 (1996)). Факторы стволовых клеток (далее ФСК) принимают участие в накоплении эозинофилов при аллергическом бронхите. Наряду с ИЛ-5 существует множество факторов, влияющих на функцию эозинофилов.
Эозинофилы подразделяются на подгруппы, гранулированные эозинофилы и дегранулированные эозинофилы. Установлено, что эозинофилы превращаются гранулированные после активации (Immunology, 47, 531 (1982)). Дегранулированнные эозинофилы также относятся к активированным эозинофилам. Сообщается, что в эозинофилах периферической крови пациентов, страдающих от ГЭС, наряду с качественными изменениями происходят и количественные изменения (Clin. Exp. Immunol., 24, 423 (1976)). Активированные эозинофилы принимают в прогрессии симптома ГЭС (Am. J. Cardiol., 52, 321 (1983)). Кроме пациентов, страдающими от ГЭС, активированные эозинофилы присутствуют также в периферической крови и в бронхоальвеолярных смывах (БАС) пациента с диагнозом бронхиальная астма (Am. Rev. Respir. Dis, 132, 981 (1985)). На активированных эозинофилах экспрессируются различные рецепторы, такие как рецепторы цитокинов (J. Immunol., 142, 4416 (1989)). По сравнению с гранулированными эозинофилами указанные дегранулированные эозинофилы обладают повышенной чувствительностью к ИЛ-5 (Clin. Exp. Immunol., 85, 312 (1991), J. Exp. Med., 172, 1347 (1990)).
Установлено также, что указанные активированные эозинофилы выживают in vitro в отсутствии цитокинов, индуцирующих дифференциацию и пролиферацию эозинофилов (J. Exp. Med., 170, 343 (1989)). Таким образом, свойства активированных эозинофилов аналогичны свойствам эозинофилов, которые инфильтруют ткани, такие как альвеолы (Int. Arch. Allergy Immunol., 120, 91 (1999)). Подробные причины нечувствительности активированных эозинофилов к действию цитокинов неизвестны, однако их дегрануляция и пролонгированное выживание вероятно обусловлены различными функционально важными соединениями, иными чем ИЛ-5.
Соединения, ингибирующие активность цитокинов или хемокинов, которые принимают участие в дифференциации или пролиферации эозинофилов, можно рассматривать как агенты, которые ингибируют функции эозинофилов. Однако, в большинстве случаев указанные агенты не действуют на цитокин-нечувствительные эозинофилы, которые активированы и инфильтрованы в очаги воспаления. Следовательно, эозинофил-специфичное ингибирование и индукция гибели активированных эозинофилов необходимы для подавления функций любого эозинофила. Однако, до настоящего времени неизвестен противовоспалительный агент, которые способен индуцировать апоптоз активированных эозинофилов.
В настоящее время лечение пациентов, страдающих от эозинофильных заболеваний, включает введение стероидов. Однако, введение стероидов часто ассоциировано с побочными действиями. В частности, такое лечение сопровождается некоторыми другими проблемами, например, при временном прекращении введения стероидов патологическое состояние пациента может возвращаться к исходному уровню, а продолжительное введение стероидов индуцируют резистентность к лекарственному агенту. Следовательно, существует необходимость в разработке безопасных и эффективных способов лечения заболеваний и нарушений, опосредованных эозинофилами.
Краткое изложение сущности изобретения
В изобретении предлагается способ снижения числа эозинофилов в организме человека, который заключается в том, что указанному пациенту вводят соединение, связывающееся с ИЛ-5Р, которое включает (а) фрагмент, который специфично связывается с ИЛ-5Р и (б) Fc-фрагмент иммуноглобулина.
Краткое описание фигур
Некоторые варианты осуществления изобретения иллюстрируются следующими фигурами, не ограничивающими его объем.
Фиг. 1. Снижение содержания катионного белка эозинофилов (КБЭ) в сыворотке крови. КБЭ представляет собой маркер, продуцируемый эозинофилами. У пациентов из группы 1 указанное снижение содержания КБЭ (см. фиг. 1) соответствует снижению числа эозинофилов. На оси у приводится концентрация КБЭ (нг/мл), на оси х указано время (дни).
Фиг. 2. Обратимое снижение числа базофилов в периферической крови. Базофилы в кровотоке измеряли у пациентов группы 1. На оси у приводится число базофилов (базофилы/мм), а на оси х указано время (дни). Быстрое снижение числа базофилов в периферической крови наблюдается через 24 ч после введения.
Фиг. 3. Повышенный (обратимый) число hsCRP (с-реактивный белок, который ассоциируется с высокой чувствительностью) у субъектов с эозинофилией в начальной стадии (базовая линия). Анализ указанного маркера у пациентов группы 1 свидетельствует о том, что наблюдается ожидаемая иммунная ответная реакция на клетки, экспрессирующие ИЛ-5Р. На оси у приводится концентрация hsCRP (мг/дл), а на оси х указано время (дни).
Фиг. 4. Минимальное увеличение содержания ИЛ-6 в сыворотке крови. На фиг. приводятся результаты анализа цитокина ИЛ-6 у пациентов группы 1. На оси у приводится концентрация ИЛ-6 (пг/мл), а на оси х указано время (ч).
Фиг. 5. Вариабельное снижение числа нейтрофилов в кровотоке. На обеих панелях приводятся результаты анализа числа нейтрофилов у пациентов группы 1.
Фиг.6. Вариабельное снижение числа лимфоцитов в кровотоке. На обеих панелях приводятся результаты анализа числа лимфоцитов у пациентов группы 1.
Фиг. 7. Устойчивое и умеренное снижение числа NK-клеток (%) в день 1. Число NK-клеток у пациентов группы 1 измеряли до лечения, в день 1 после введения и в день 28 после введения.
NO
Фиг. 8. Пониженный FE у субъектов с более высокой базовой линией. Фракцию выдыхаемого оксида азота измеряли у пациентов группы 1. Указанный анализ является неинвазивным методом диагностики воспаления легких, причем данные указывают на тенденцию снижения тяжести заболевания.
Фиг. 9. Анализ цитотоксичности in vitro. Число MEDI-563 измеряли при анализе цитотоксичности in vitro по сравнению с контрольными антителами, которые не связываются с ИЛ-5Р (А), а также с дополнительным контрольным фукозилированным MEDI-563 (Б). В эксперименте использовали клетки-эффекторы KC 1333 и клетки-мишени CTLL2 в соотношении 5:1. Цитотоксичность измеряли через 4 ч. На оси Y приводится измеренная цитотоксичность (%), на оси Х указана концентрация антител.
Фиг. 10. Связывание MEDI-563 с рчИЛ-5Рα. Аффинность MEDI-563 к рекомбинантному ИЛ-5Рα измеряли методом плазменного поверхностного резонанса в трех отдельных экспериментах.
Фиг. 11. Связывание MEDI-563 с rhuFcγRs. На фиг. приводятся результаты измерения аффинности MEDI-563 к нескольким образцам рекомбинантного FcγRs человека при сравнении с аффиностью изотипически родственных фукозилированных контрольных антител. Следует отметить, что MEDI-563 связывается с huFcyRIIIa с более высокой аффинностью (в 5-10 раз) по сравнению с muFcyRIV.
Фиг. 12. На фиг. представлены результаты иммуногистохимического анализа экспрессии ИЛ-5Рα в легких мыши ИЛ-9tg.
Фиг. 13. На фиг. представлены результаты иммуногистохимического анализа экспрессии ИЛ-5Рα в назальных полипах с использованием MEDI-563, которое окрашивает все эозинофилы в назальных полипах.
3
Фиг. 14. Легкая степень транзиторной нейтропении у субъектов. На фиг. показано абсолютное число нейтрофилов у субъектов группы 1. На оси Y приводится число нейтрофилов (нейтрофилы/мм), а на оси Х указано время (дни).
Фиг. 15. Связывание MEDI-563 с эозинофилами цельной крови здоровых доноров. Анализ проточной цитометрией проводили с использованием образцов цельной крови, как описано в примере 6. На трех панелях, прежде всего на третьей панели, озаглавленной ʺсвязывание MEDI-563 с эозинофиламиʺ, приводятся данные цитофлуориметрии, свидетельствующие о связывании MEDI-563 с эозинофилами.
Фиг. 16. Анализ лейкоцитов из трансгенных по ИЛ-5 мышей проводили методом цитофлуориметрии. Анализ лейкоцитов из трансгенных по ИЛ-5 мышей проводили проточной цитометрией проводили, как описано в примере 7. На фиг. 16А показаны результаты анализа методом цитофлуориметрии эозинофилов SiglecF+CCR3+. На фиг. 16Б показано, что все эозинофилы (SiglecF+CCR3+) из костного мозга, селезенки, крови и легких экспрессируют ИЛ-5Рα+, при этом в анализе использовали МА Н7 анти-ИЛ-5Рα.
Фиг. 17. По данным ЗАКЦ in vitro MEDI-563 снижают число позитивных по ИЛ-5Р одноядерных клеток костного мозга. Изолированные, не прикрепленные к субстрату одноядерные клетки костного мозга, подвергали воздействию MEDI-563 или изотипических контрольных антител (R347) в присутствии клеток-эффекторов, окрашенных CFSE. Позитивные по ИЛ-5Р клетки идентифицировали с использованием антител КМ1257 и конъюгата ПЭ с козьим анти-Mu IgG. Контрольное окрашивание образцов проводили с использованием изотипических контрольных антител 1А7 и конъюгата ПЭ с козьим анти-Mu IgG. Профили окрашивания популяций клеток после обработки MEDI-563 или R347 представлены в виде отдельных графиков KM1257/ПЭ по сравнению с CFSE или 1А7/ПЭ по сравнению с CFSE. Сравнение графиков KM1257/ПЭ по сравнению с CFSE, полученных для образцов, обработанных MEDI-563 и R347, свидетельствует о том, что в результате ЗАКЦ, опосредованной MEDI-563, из образца практически полностью удаляются все клетки, позитивные по ИЛ-5Р.
3
Фиг. 18. MEDI-563 обратимо снижают число эозинофилов в периферической крови у субъектов с легкой формой астмы. Шести волонтерам с легкой формой астмы вводили однократную дозу внутривенно (А) 0,03 мг/кг или (Б) 0,1 мг/кг MEDI-563. Число эозинофилов в периферической крови определяли методом проточной цитометрии в день 0 до введения и через равные интервалы до дня 84 и в следующий период обследования. На оси y приводится число эозинофилов (эозинофилы/мм), а на оси x указано время (дни). Быстрое снижение числа эозинофилов в периферической крови наблюдалось через 24 ч после введения. Эозинопения, индуцированная MEDI-563, является обратимой.
Фиг. 19. По результатам иммуногистохимического анализа с использованием MEDI-563 все эозинофилы из легких здорового человека экспрессируют рецептор ИЛ-5Рα. На этой фигуре показаны результаты измерения образцов А, Б, В и Г.
Фиг. 20. По результатам иммуногистохимического анализа с использованием MEDI-563 все эозинофилы из образцов легочной биопсии у пациентов с диагнозом астма экспрессируют рецептор ИЛ-5Рα.
Фиг. 21. Экспрессию рецептора ИЛ-5Рα первичными базофилами и эозинофилами, полученными от здоровых доноров, анализировали методом проточной цитометрии. На фиг. приводятся профили окрашивания, полученные с использованием антител анти-ИЛ-5Рα MEDI-563 и изотипических контрольных антител с другой специфичностью. В качестве позитивного контроля использовали клетки CTLLh5r (опухолевые клетки, трансфектированные ИЛ-5Рα/β).
50
Фиг. 22. Анализ антител-зависимой клеточной цитотоксичности (ЗАКЦ) in vitro. Активность дефукозилированных и фукозилированных MEDI-563 сравнивали по данным ЗАКЦ in vitro. В качестве клеток-эффекторов и клеток-мишеней использовали изолированные первичные NK-клетки и эозинофилы, соответственно, при соотношении 5:1. Анализ проводили в присутствии 1 нг/мл ИЛ-2 человека. Гибель клеток регистрировали методом проточной цитометрии при окрашивании красителем Annexin V. На оси Y приводится цитотоксичность (% от максимальной цитотоксичности), а на оси X указана концентрация антитела. Величина ЕС дефукозилированных антител MEDI-563 составляет 0,965 пМ.
50
Фиг. 23. Анализ антител-зависимой клеточной цитотоксичности (ЗАКЦ) in vitro. Активность дефукозилированных и фукозилированных MEDI-563 сравнивали по данным ЗАКЦ in vitro. В качестве клеток-эффекторов и клеток-мишеней использовали изолированные первичные клетки NK-клетки и базофилы, соответственно. На оси Y приводится цитотоксичность (% от максимальной цитотоксичности), а на оси Х указана концентрация антител. Величина ЕС дефукозилированных антител MEDI-563 составляет 0,561 пМ.
Фиг. 24. Анализ дегрануляции эозинофилов по данным антител-зависимой клеточной цитотоксичности (ЗАКЦ) in vitro. Высвобождение продуцируемого эозинофилами нейротоксина (ПЭН) анализировали методом ЗАКЦ in vitro в присутствии различных концентраций фукозилированных (MEDI-563F) и дефукозилированных (MEDI-563) анти-ИЛ-5Рα антител. При проведении анализа в качестве клеток-мишеней и клеток-эффекторов использовали свежеизолированные эозинофилы и NK-клетки или клетки РВМС, соответственно. Для сравнения приводится максимальная дегрануляция эозинофилов при обработке 1% тритоном Х-100.
Фиг. 25. MEDI-563 специфично связывается с эпитопом в составе домена D1 внеклеточного фрагмента рецептора ИЛ-5Рα человека. Связывание антитела с трансгенными клетками, временно экспрессирующими гибридные белки ИЛ-5Рα, анализировали проточной цитометрией. На фиг.приводятся профили окрашивания флуоресцентным красителем. ʺПоликлональные антителаʺ и ʺMEDI-563ʺ обозначают профили окрашивания, наблюдаемые при использовании поликлональных антител против ИЛ-5Рα человека и MEDI-563, соответственно. ʺДвойное окрашиваниеʺ обозначает профиль флуоресцентного окрашивания с использованием ʺполиклональныхʺ антител (ось x) и MEDI-563 (ось y). (А) Для серии трансгенов гибридных ИЛ-5Рα человека/мыши наблюдается нестабильная экспрессия. ʺНокаутныеʺ трансгены представляют собой гибридные конструкты ИЛ-5Рα, включающие один внеклеточный домен рецептора мыши в составе основной последовательности (каркаса) рецептора человека. ʺНокинныеʺ трансгены представляют собой гибридные конструкты ИЛ-5Рα, включающие один внеклеточный домен рецептора человека в составе основной последовательности (каркаса) рецептора мыши. (Б) MEDI-563 специфично связывается с трансгенными клетками, экспрессирующими ИЛ-5Рα человека. MEDI-563 не связывается с трансгенными клетками, экспрессирующими ИЛ-5Рα мыши. (В) MEDI-563 не связывается с трансгенными клетками, экспрессирующими гибридные ИЛ-5Рα, включающие D1 рецептора мыши и внеклеточные домены D2-D3 рецептора человека (ʺнокаутные по D1ʺ). MEDI-563 специфично связывается с трансгенными клетками, экспрессирующими гибридные ИЛ-5Рα, включающие внеклеточные домены D2 или D3 рецептора мыши в составе основной последовательности (каркаса) рецептора человека (ʺнокаутные по D2 или D3ʺ). (Г) MEDI-563 специфично связывается с трансгенными клетками, экспрессирующими гибридные ИЛ-5Рα, включающие домен D1 рецептора человека и внеклеточные домены D2-D3 рецептора мыши (ʺнокинные по D1ʺ). MEDI-563 не связывается с трансгенными клетками, экспрессирующими гибридный ИЛ-5Рα мыши, включающий внеклеточный домен D2 или D3 рецептора человека (ʺнокинные по D2 или D3ʺ).
Фиг. 26. MEDI-563 специфично связывается с эпитопом в составе сегмента В внеклеточного домена D1 рецептора ИЛ-5Рα человека. Антитела, связывающиеся с трансгенными клетками, эспрессирующими гибридный ИЛ-5Рα, анализировали методом проточной цитометрии. На фиг. приводятся профили окрашивания флуоресцентным красителем. ʺПоликлональные антителаʺ и ʺMEDI-563ʺ обозначают профили окрашивания, наблюдаемые при использовании поликлональных антител против ИЛ-5Рα человека и MEDI-563, соответственно. ʺДвойное окрашиваниеʺ обозначает профиль флуоресцентного окрашивания с использованием ʺполиклональныхʺ антител (ось x) и MEDI-563 (ось y). (А) Аминокислотная последовательность внеклеточного домена D1 рецептора ИЛ-5Рα мыши на 75% идентична аналогичной аминокислотной последовательности рецептора ИЛ-5Рα человека. Внеклеточный домен D1 рецептора ИЛ-5Рα подразделяется на сегменты А, В и С. На фиг. приводятся аминокислотные последовательности ИЛ-5Рα человека и мыши, SEQ ID №5 и 6 (1-102), соответственно. (Б) Для серии трансгенов гибридных ИЛ-5Рα человека/мыши наблюдалась нестабильная экспрессия. ʺНокаутныеʺ трансгены представляют собой гибридные конструкты ИЛ-5Рα, включающие один сегмент внеклеточного домена рецептора D1 мыши в составе основной последовательности (каркаса) рецептора человека. ʺНокинныеʺ трансгены представляют собой гибридные конструкты ИЛ-5Рα, включающие один сегмент внеклеточного домена D1 рецептора человека в составе основной последовательности (каркаса) рецептора мыши ʺD1 человека/D2 мыши/D3-ТМ мышиʺ. (В) MEDI-563 специфично связывается с трансгенными клетками, экспрессирующими (1) ИЛ-5Рα человека, или (2) гибридный ИЛ-5Рα мыши, включающий внеклеточный домен D1 человека (нокинный по D1). MEDI-563 не связывается с трансгенными клетками, экспрессирующими (1) рецептор ИЛ-5Рα мыши, или (2) гибридный ИЛ-5Рα человека, включающий внеклеточный домен D1 рецептора мыши. (Г) MEDI-563 не связывается с трансгенными клетками, экспрессирующими рецептор, включающий сегмент В внеклеточного домена D1 рецептора мыши в составе каркаса рецептора человека (ʺнокаутные по Вʺ). MEDI-563 специфично связывается с трансгенными клетками, экспрессирующими гибридный ИЛ-5Рα, включающий сегмент А или С внеклеточного домена D1 мыши в составе основной последовательности (каркаса) рецептора человека (ʺнокаутный по А или Сʺ). (Д) MEDI-563 специфично связывается с трансгенными клетками, экспрессирующими гибридный ИЛ-5Рα, включающий сегмент В внеклеточного домена D1 в составе основной последовательности (каркаса) рецептора мыши ʺD1 человека/D2 мыши/D3-ТМ мышиʺ (ʺнокинный по Вʺ). MEDI-563 не связывается с трансгенными клетками, экспрессирующими гибридный ИЛ-5Рα, включающий сегмент А или С рецептора человека в составе основной последовательности (каркаса) рецептора мыши ʺD1 человека/D2 мыши/D3 мышиʺ, (ʺнокинный по А или Сʺ).
Фиг. 27. MEDI-563 специфично связывается с эпитопом рецептора человека ИЛ-5Рα, включающим аминокислотный остаток Ile61 в составе внеклеточного домена D 1. Антитела, связывающиеся с трансгенными клетками, эспрессирующими вариант ИЛ-5Рα, анализировали методом проточной цитометрии. На фиг. приводятся профили окрашивания флуоресцентным красителем. ʺПоликлональные антителаʺ и ʺMEDI-563ʺ обозначают профили окрашивания, наблюдаемые при использовании поликлональных антител против ИЛ-5Рα человека и MEDI-563, соответственно. ʺДвойное окрашиваниеʺ обозначает профиль флуоресцентного окрашивания с использованием ʺполиклональныхʺ антител (ось x) и MEDI-563 (ось у). (А) На фиг. приводятся аминокислотные последовательности 50-61 внеклеточного домена D1 рецептора ИЛ-5Рα человека (40-61 SEQ ID №5). Остатки, выделенные курсивом, отличаются от соответствующих аминокислотных остатков в составе рецептора ИЛ-5Рα мыши. В трансгенных клетках экспрессируются серии вариантов рецептора ИЛ-5Рα, включающих, по меньшей мере, один мутантный аминокислотный остаток. ʺНокаутныеʺ варианты ИЛ-5Рα представляют собой мутантные белки человека, включающие, по меньшей мере, одну замену аминокислоты в белке человека на соответствующую аминокислоту из белка мыши. Например, вариант ʺнокаут DEʺ представляет собой ИЛ-5Рα человека, включающий замены аминокислот D56E и E58D. ʺНокинныеʺ варианты ИЛ-5Рα представляют собой гибридные белки, включающие D1 мыши, D2 человека, D3 мыши и ТМ домен мыши, где домен D1 мыши включает мутантный сегмент В, содержащий по меньшей мере одну замену аминокислотного остатка в последовательности белка мыши на соответствующий остаток из последовательности рецептора человека. Например, ʺнокинный DEʺ вариант представляет собой гибридный ИЛ-5Рα, включающий мутантный сегмент В рецептора мыши, содержащий замены аминокислот E56D и D58E. (Б) MEDI-563 не связывается с трансгенными клетками, экспрессирующими мутантный ИЛ-5Рα человека, включающий замены аминокислот K53Q, D56E, E58D, I61K (ʺнокаутный по KDEIʺ), MEDI-563 специфично связывается с трансгенными клетками, экспрессирующими мутантный ИЛ-5Рα человека, включающий замены аминокислот N40H, N42D, Q46H (ʺнокаутный по NNQʺ) или D56E, E58D (ʺнокаутный по DEʺ) или N40H, N42D, D56E, E58D (ʺнокаутный по NNDEʺ). (В) MEDI-563 специфично связывается с трансгенными клетками, экспрессирующими гибридный ИЛ-5Рα, включающий мутантный сегмент В рецептора мыши, содержащий замены аминокислот Q53K, E56D, D58E, K61I (ʺнокинный по KDEIʺ). (Г) MEDI-563 не связывается с трансгенными клетками, экспрессирующими мутантный ИЛ-5Рα человека, включающий замену I61K (ʺнокаутный по 161ʺ). MEDI-563 специфично связывается с трансгенными клетками, экспрессирующими мутантный ИЛ-5Рα человека, включающий замену K53Q (ʺнокаутный по K53ʺ), (Д) MEDI-563 специфично связывается с трансгенными клетками, экспрессирующими гибридный ИЛ-5Рα, включающий мутантный сегмент В рецептора мыши, содержащий замену K61I (ʺнокинный по 161ʺ). MEDI-563 не связывается с трансгенными клетками, экспрессирующими гибридный ИЛ-5Рα, включающий мутантный сегмент В рецептора мыши, содержащий замену Q53K (ʺнокинный по K53ʺ).
Фиг. 28. Связывание антитела Н7 против гибридного ИЛ-5α мыши с FcγRs мыши. На фиг. представлена аффинность гибридного анти-ИЛ-5α мыши (Н7) к рекомбинантному FcγRs мыши при сравнении с аффинностью изотипически родственных фукозилированных контрольных антител. Константы диссоциации приводятся в нМ. Анализ проводили методом плазменного поверхностного резонанса.
Фиг. 29. (А) Эозинофилы идентифицировали проточной цитометрией в виде клеток с высоким боковым светорассеянием, которые позитивно окрашивались по CCR3 и Siglec-F. (Б) Эозинофилы из костного мозга, крови, селезенки и ткани легкого мышей ИЛ-STg селективно экспрессируют ИЛ-5Р.
Фиг. 30. Дефукозилированные и фукозилированные антитела Н7 уменьшают число эозинофилов в селезенке (А), ткани легкого (А) и крови (Б) мышей ИЛ-5Tg. He наблюдается снижения числа эозинофилов в костном мозге (Б). Дефукозилированные антитела Н7 более эффективны при удалении эозинофилов по сравнению с фукозилированными Н7, прежде всего при использовании низких доз антител. Данные представлены в виде среднего значения ±СО, число мышей в группе n=6-8, при проведении анализа с использованием указанных антител по сравнению с контрольными IgG p<0,05, критерий U Манна-Уитни U.
Фиг. 31. Дефукозилированные Н7 также уменьшают число эозинофилов в модели стимуляции аллергеном. Дефукозилированные Н7 уменьшают число эозинофилов в просвете дыхательных путей человека, в ткани легких, крови и костном мозге. Снижение было максимальным во всех отделах организма через 72 ч после конечной стимуляции (96 ч после введения антител). Данные представлены в виде среднего значения ±СО, число мышей в группе n=6, при проведении анализа с использованием указанных антител по сравнению с контрольными IgG *р<0,05, критерий U Манна-Уитни U.
Подробное описание изобретения
Как указано выше без привлечения конкретной гипотезы или теории, эозинофилы принимают участие в патогенезе множества заболеваний и нарушений. Многие из указанных заболеваний или нарушений характеризуются высоким уровнем эозинофилов (эозинофолия) и называются гиперэозинофильными синдромами.
Примерами заболеваний и нарушений, в которых принимают участие эозинофилы, являются астма, иммуноглобулин (IgE)-опосредованная пищевая аллергия, эозинофильный эзофагит (воспаление пищевода), воспалительное заболевание кишечника, ХОЗЛ, аллергический колит, гастро-эзофагеальный рефлюкс, эозинофильное желудочно-кишечное заболевание (ЭЖКЗ), эозинофильный гастроэнтерит, эндомиокардиальный фиброз, эндокардит Леффлера, болезнь Девиса, эпизодический отек Квинке, ассоциированный с эозинофилией, синдром эозинофилии-миалгии/синдром токсичного масла, зарегистрированный в Испании, цирроз печени, герпетиформный дерматит, буллезный пемфигоид, синдром Чарга-Стросса, острый миелогенный эозинофильный лейкоз, острый лимфоцитарный эозинофильный лейкоз, системный мастоцитоз с эозинофилией, аллергический ринит, экзема, гранулематоз Вегенера, нодозный полиартериит, эозинофильный фасцит и ревматоидный артрит.
Таким образом, в изобретении предлагается способ снижения числа эозинофилов в организме человека, который заключается в том, что указанному пациенту вводят соединение, связывающееся с ИЛ-5Р, которое включает (а) фрагмент, который специфично связывается с ИЛ-5Р и (б) Fc-фрагмент иммуноглобулина.
В одном варианте изобретения предлагаются способы снижения числа эозинофилов в организме человека, которые заключаются в том, что указанному пациенту вводят соединение, связывающееся с ИЛ-5Р, которое включает (а) фрагмент, который специфично связывается с ИЛ-5Р и (б) Fc-фрагмент иммуноглобулина. В конкретном варианте способ по изобретению уменьшает число эозинофилов в крови, костном мозге, желудочно-кишечном тракте (например, в пищеводе, желудке, тонкой кишке и ободочной кишке) или легком. В еще одном конкретном варианте способ по изобретению уменьшает число эозинофилов в крови. В еще одном конкретном варианте способ по изобретению уменьшает число эозинофилов в легких. В конкретном варианте способ по изобретению уменьшает число клеток-предшественников эозинофилов.
В другом варианте способ по изобретению уменьшает число эозинофилов по меньшей мере на приблизительно 10%, по меньшей мере на приблизительно 20%, по меньшей мере на приблизительно 30%, по меньшей мере на приблизительно 40%, по меньшей мере на приблизительно 50%, по меньшей мере на приблизительно 60%, по меньшей мере на приблизительно 70%, по меньшей мере на приблизительно 80%, по меньшей мере на приблизительно 90%, по меньшей мере на приблизительно 95% или по меньшей мере на приблизительно 99%. В конкретном варианте способ по изобретению уменьшает число эозинофилов ниже предела детектирования.
В другом варианте способ по изобретению уменьшает число предшественников эозинофилов по меньшей мере на приблизительно 10%, по меньшей мере на приблизительно 20%, по меньшей мере на приблизительно 30%, по меньшей мере на приблизительно 40%, по меньшей мере на приблизительно 50%, по меньшей мере на приблизительно 60%, по меньшей мере на приблизительно 70%, по меньшей мере на приблизительно 80%, по меньшей мере на приблизительно 90%, по меньшей мере на приблизительно 95% или по меньшей мере на приблизительно 99%. В конкретном варианте способ по изобретению уменьшает число предшественников эозинофилов ниже предела детектирования.
В другом варианте способ по изобретению элиминирует все детектируемые эозинофилы после однократного введения соединения, связывающегося с ИЛ-5Р. В конкретном варианте однократное введение соединения, связывающегося с ИЛ-5Р, элиминирует все детектируемые эозинофилы по меньшей мере на приблизительно 1 день, по меньшей мере на приблизительно 2 дня, по меньшей мере на приблизительно 3 дня, по меньшей мере на приблизительно 4 дня, по меньшей мере на приблизительно 5 дней, по меньшей мере на приблизительно 6 дней, по меньшей мере на приблизительно 7 дней, по меньшей мере на приблизительно 2 недели, по меньшей мере на приблизительно 3 недели, по меньшей мере на приблизительно 4 недели, по меньшей мере на приблизительно 5 недель, по меньшей мере на приблизительно 6 недель, по меньшей мере на приблизительно 7 недель, по меньшей мере на приблизительно 8 недель, по меньшей мере на приблизительно 9 недель, по меньшей мере на приблизительно 10 недель, по меньшей мере на приблизительно 12 недель, по меньшей мере на приблизительно 14 недель, по меньшей мере на приблизительно 16 недель, по меньшей мере на приблизительно 20 недель или по меньшей мере на приблизительно 25 недель.
В другом варианте способ по изобретению элиминирует все детектируемые предшественники эозинофилов после однократного введения соединения, связывающегося с ИЛ-5Р. В конкретном варианте однократное введение соединения, связывающегося с ИЛ-5Р, элиминирует все детектируемые эозинофилы по меньшей мере на приблизительно 1 день, по меньшей мере на приблизительно 2 дня, по меньшей мере на приблизительно 3 дня, по меньшей мере на приблизительно 4 дня, по меньшей мере на приблизительно 5 дня, по меньшей мере на приблизительно 6 дней, по меньшей мере на приблизительно 7 дней, по меньшей мере на приблизительно 2 недели, по меньшей мере на приблизительно 3 недели, по меньшей мере на приблизительно 4 недели, по меньшей мере на приблизительно 5 недель, по меньшей мере на приблизительно 6 недель, по меньшей мере на приблизительно 7 недель, по меньшей мере на приблизительно 8 недель, по меньшей мере на приблизительно 9 недель, по меньшей мере на приблизительно 10 недель, по меньшей мере на приблизительно 12 недель, по меньшей мере на приблизительно 14 недель, по меньшей мере на приблизительно 16 недель, по меньшей мере на приблизительно 20 недель или по меньшей мере на приблизительно 25 недель.
В конкретном варианте способ по изобретению включает введение субъекту однократной дозы 0,03 мг/кг соединения, связывающегося с ИЛ-5Р, которое включает (а) фрагмент, который специфично связывается с ИЛ-5Р и (б) Fc-фрагмент иммуноглобулина, причем введение соединения, связывающегося с ИЛ-5Р, приводит к снижению числа эозинофилов в кровотоке субъекта по меньшей мере на приблизительно 99%, а снижение заканчивается через 24 ч после введения и продолжается в течение по меньшей мере приблизительно 28 дней после введения.
В конкретном варианте способ по изобретению включает введение субъекту однократной дозы 0,1 мг/кг соединения, связывающегося с ИЛ-5Р, которое включает (а) фрагмент, который специфично связывается с ИЛ-5Р и (б) Fc-фрагмент иммуноглобулина, причем введение соединения, связывающегося с ИЛ-5Р, приводит к снижению числа эозинофилов в кровотоке субъекта по меньшей мере на приблизительно 99%, а снижение заканчивается через 24 ч после введения и продолжается в течение по меньшей мере приблизительно 84 дней после введения.
В одном варианте соединения по настоящему изобретению, которые связываются с ИЛ-5Р, включает гибридные белки. В некоторых вариантах гибридные белки включают полипептидный фрагмент, который специфично связывается с ИЛ-5Р, а также Fc-фрагмент иммуноглобулина. Примеры полипептидного фрагмента, который специфично связывается с ИЛ-5Р, приводятся в US 7109299, 5677280 и в заявке US 2006/0014680 А1. В других вариантах полипептид, который специфично связывается с ИЛ-5Р, представляет собой ИЛ-5 человека (см., например, Tanabi и др., Journal of Biological Chemistry, 262 (34), 16580-16584 (1987)), или его фрагменты, производные или варианты (см., например, US 6465616).
В одном варианте соединения по настоящему изобретению, которые связываются с ИЛ-5Р, включают антитела. Антитела по настоящему изобретению включают, но, не ограничиваясь только ими, моноклональные антитела, синтетические антитела, полиспецифичные антитела (включая биспецифичные антитела), антитела человека, гуманизированные антитела, гибридные антитела, одноцепочечные Fvs (scFv) (включая биспецифичные scFvs), одноцепочечные антитела, Fab-фрагменты, F(ab’)-фрагменты, связанные дисульфидной связью Fvs (sdFv) и эпитоп-связывающие фрагменты любого из указанных выше антител. Антитела по настоящему изобретению прежде всего включают иммуноглобулины и иммунологически активные фрагменты молекул иммуноглобулинов, т.е., соединения, которые содержат антиген-связывающий участок, который специфично связывается с антигеном. Иммуноглобулины по изобретению включают белки любого типа (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и IgY), класса (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) или подкласса.
Антитела, которые можно использовать по настоящему изобретению, включают антитела, которые образуются в организме любого животного, включая птиц и млекопитающих (например, но, не ограничиваясь только ими, человека, мышей, обезьян, овец, кроликов, коз, морских свинок, верблюдов, лошадей и цыплят). В конкретных вариантах используются антитела человека или гуманизированные моноклональные антитела.
Антитела, которые можно использовать по настоящему изобретению, представляют собой моноспецифичные, биспецифичные, триспецифичные или полиспецифичные антитела. Полиспецифичные антитела специфично связываются с полипептидом, а также с гетерологичным эпитопом, таким как гетерологичный полипептид или материал твердой подложки. См.. например, WO 93/17715, WO 92/08802, WO 91/00360 и WO 92/05793, Tutt и др., J. Immunol., 147, 60-69 (1991), US 4474893, 4714681, 4925648, 5573920 и 5601819, и Kostelny и др., J. Immunol., 148, 1547-1553 (1992).
Антитела для применения по настоящему изобретению могут представлять собой одноцепочечные антитела. Схема и конструкция одноцепочечных антител описаны в статье Marasco и др., Proc. Natl. Acad. Sci., 90, 7889-7893 (1993).
Примеры антител по изобретению приводятся в US 7179464, 6538111, 6018032 и в заявках US 2004/0136996 A1 и 2005/0226867 А1.
В одном варианте соединения по настоящему изобретению, которые связываются с ИЛ-5Р, включают антитела. В другом варианте соединения по настоящему изобретению, которые связываются с ИЛ-5Р, представляют собой антитела, включающее любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID №1-4. В конкретном варианте соединение, связывающееся с ИЛ-5Р, по настоящему изобретению представляет собой антитела, включающее аминокислотную последовательность SEQ ID №1 и 3. В конкретном варианте соединение, связывающееся с ИЛ-5Р, по настоящему изобретению представляет собой антитела, включающее аминокислотную последовательность SEQ ID №2 и 4.
В одном варианте соединение по настоящему изобретению, которое связывается с ИЛ-5Р, представляет собой антитела, которое специфично связывается с таким эпитопом как MEDI-563. В конкретном варианте антителам является MEDI-563. В другом конкретном варианте соединение, связывающееся с ИЛ-5Р, по настоящему изобретению представляет собой антитела, которое специфично связывается с таким эпитопом как MEDI-563 при условии, что антитела не является MEDI-563.
В одном варианте соединение по настоящему изобретению, которое связывается с ИЛ-5Р, представляет собой антитела, которое специфично связывается с эпитопом, включающим аминокислотные остатки 1-102 SEQ ID №5. В конкретном варианте антителам является MEDI-563. В другом конкретном варианте антитела по настоящему изобретению, которое связывается с ИЛ-5Р, представляет собой антитела, которое специфично связывается с эпитопом, включающим аминокислотные остатки 1-102 SEQ ID №5 при условии, что антитела не является MEDI-563.
В одном варианте соединение по настоящему изобретению, которое связывается с ИЛ-5Р, представляет собой антитела, которое специфично связывается с эпитопом, включающим аминокислотные остатки 40-67 SEQ ID №5. В конкретном варианте антителам является MEDI-563. В другом конкретном варианте антитела по настоящему изобретению, которое связывается с ИЛ-5Р, представляет собой антитела, которое специфично связывается с эпитопом, включающим аминокислотные остатки 40-67 SEQ ID №5 при условии, что антитела не является MEDI-563.
В одном варианте соединение по настоящему изобретению, которое связывается с ИЛ-5Р, представляет собой антитела, которое специфично связывается с эпитопом, включающим аминокислотные остатки 52-67 SEQ ID №5. В конкретном варианте антителам является MEDI-563. В другом конкретном варианте антитела по настоящему изобретению, которое связывается с ИЛ-5Р, представляет собой антитела, которое специфично связывается с эпитопом, включающим аминокислотные остатки 52-67 SEQ ID №5 при условии, что антитела не является MEDI-563.
В одном варианте соединение по настоящему изобретению, которое связывается с ИЛ-5Р, представляет собой антитела, которое специфично связывается с эпитопом, включающим аминокислотный остаток 61 SEQ ID №5. В конкретном варианте антителам является MEDI-563. В другом конкретном варианте антитела по настоящему изобретению, которое связывается с ИЛ-5Р, представляет собой антитела, которое специфично связывается с эпитопом, включающим аминокислотный остаток 61 SEQ ID №5 при условии, что антитела не является MEDI-563.
В одном варианте соединение по настоящему изобретению, которое связывается с ИЛ-5Р, представляет собой антитела, которое специфично связывается с первым антигеном, включающим аминокислотные остатки 1-102 SEQ ID №5, но неспецифично связывается с вторым антигеном, включающим вариант остатков 1-102 SEQ ID №5, причем вариант включает замещение I61K. В конкретном варианте антителам является MEDI-563. В другом конкретном варианте антитела по настоящему изобретению, которое связывается с ИЛ-5Р, представляет собой антитела, которое специфично связывается с первым антигеном, включающим аминокислотные остатки 1-102 SEQ ID №5, но неспецифично связывается с вторым антигеном, включающим вариант остатков 1-102 SEQ ID №5, причем вариант включает замещение I61K, при условии, что антитела не является MEDI-563.
В одном варианте соединение по настоящему изобретению, которое связывается с ИЛ-5Р, представляет собой антитела, которое специфично связывается с первым антигеном, включающим аминокислотные остатки 40-67 SEQ ID №5, но неспецифично связывается с вторым антигеном, включающим вариант остатков 40-67 SEQ ID №5, причем вариант включает замещение I61K. В конкретном варианте антителам является MEDI-563. В другом конкретном варианте антитела по настоящему изобретению, которое связывается с ИЛ-5Р, представляет собой антитела, которое специфично связывается с первым антигеном, включающим аминокислотные остатки 40-67 SEQ ID №5, но неспецифично связывается с вторым антигеном, включающим вариант остатков 40-67 SEQ ID №5, причем вариант включает замещение I61K, при условии, что антитела не является MEDI-563.
В одном варианте соединение по настоящему изобретению, которое связывается с ИЛ-5Р, представляет собой антитела, которое специфично связывается с ИЛ-5Рα человека (SEQ ID №5), но неспецифично связывается с мутантом ИЛ-5Рα человека (SEQ ID №5), включающим замещение I61K. В конкретном варианте антителам является MEDI-563. В другом конкретном варианте соединение по настоящему изобретению, которое связывается с ИЛ-5Р, представляет собой антитела, которое специфично связывается ИЛ-5Рα человека (SEQ ID №5), но неспецифично связывается мутантом ИЛ-5Рα человека (SEQ ID №5), включающим замещение I61K, при условии, что антитела не является MEDI-563.
В настоящем изобретении предлагаются соединения, которые связываются с ИЛ-5Р и обладают повышенной эффекторной функцией. Примеры способов повышения эффекторной функции приводятся в US 5624821, 6602684, 7029872, в заявках 2006/0067930 А1, 2005/0272128 А1, 2005/0079605 А1, 2005/0123546 А1, 2004/0072290 А1, 2006/0257399 А1, 2004/0261148 А1, 2007/0092521, 2006/0040325 А1 и 2006/0039904 А1, и в WO 04/029207, WO 03011878, WO 05044859, WO 06071856 и WO 06071280.
Методы генетической инженерии Fc-областей антител с целью изменения эффекторных функций известны в данной области техники (см., например, Koenig и др., US 20040185045 и РСТ WO 2004/016750, где описано изменение Fc-области с целью повышения аффинности к FcγRIIB по сравнению с аффинностью к FCγRIIA, см., также Armour и др., РСТ WO 99/58572, Idusogie и др., WO 99/51642 и Deo и др., US 6395272, которые включены в описание заявки в полном объеме в качестве ссылок). Способы модификации Fc-области с целью понижения аффинности к FcγRIIB также известны (см., например, Ravetch и др., US 20010036459 и WO 01/79299, включенные в описание заявки в полном объеме в качестве ссылок). Описаны в литературе модифицированные антитела, содержащие вариантные Fc-области с повышенной аффинностью к FcγRIIIA и/или FcγRIIA по сравнению с нативной Fc-областью (см., например, Stavenhagen и др., WO 2004/063351, включенную в описание заявки в полном объеме в качестве ссылки).
Эффекторную функцию антител можно также модифицировать за счет получения антитела с измененным типом гликозилирования. Например, можно получить антитела с измененным типом гликозилирования, такие как дефузилированные/гипофукозилированные антитела с пониженным содержание остатков фукозы или антитела с повышенным содержание биразветвленных структур на основе N-ацетилглюкозамина (GlcNac). Подобные типы гликозилирования используются для повышения антитела-зависимой клеточной цитотоксичности (ЗАКЦ). Такие модификации полисахаридов достигаются, например, благодаря экспрессии антител в клетках хозяина с измененным механизмом гликозилирования. Клетки с измененным механизмом гликозилирования описаны в литературе и могут использоваться в качестве клеток хозяина для экспрессии рекомбинантных антител по изобретению с измененным типом гликозилирования. Например, в ЕР 1176195 (Hanai и др.) описана клеточная линия с функционально расчлененным геном FUT8, который кодирует фукозилтрансферазу, и, следовательно, антитела, экспрессированные в таких клетках характеризуются гипофукозилированием. В WO 03/035835 (Presta) описан вариант клеточной линии СНО, клетки Lee 13, которые обладают пониженной способностью присоединять фукозу к Asn(297)-полисахаридам, что приводит к гипофукозилированию антител, экспрессированных в таких клетках (см., также Shields R.L. и др., J. Biol. Chem., 277, 26733-26740 (2002)). В WO 99/54342 (Umana и др.) описано получение методами генной инженерии клеточной линии для экспрессии гликозилтрансфераз, принимающих участие в биосинтезе гликопротеинов (например, β(1,4)-N-ацетилглюкозаминилтрансферазы III (GnTIII)). Антитела, экспрессированные в таких клетках, характеризуются повышенным содержание биразветвленных структур на основе N-ацетилглюкозамина (GlcNac) и обладают повышенной ЗАКЦ (см., также Umana и др., Nat. Biotech., 17, 176-180 (1999)).
Способы получения антител с измененным типом гликозилирования известны в области техники и включают, но, не ограничиваясь только ими, методы, описанные в следующих публикациях: Umana и др., Nat. Biotechnol., 17, 176-180 (1999), Davies и др., Biotechnol. Bioeng, 74, 288-294 (20017), Shields и др., J. Biol. Chem., 277, 26733-26740 (2002), Shinkawa и др., J. Biol. Chem., 278, 3466-3473 (2003), US 6602684, US 10/277,370, US 10/113,929, PCT WO 00/61739 A1, PCT WO 01/292246 A1, PCT WO 02/311140 A1, PCT WO 02/30954 A1, технология Potillegent™ (фирма Biowa, Inc. Princeton, N.J.), генная инженерия GlycoMAb™ (фирма GLYCART biotechnology AG, Цюрих, Швейцария). См., также WO 00061739, EA 01229125, US 20030115614, Okazaki и др., J.M.B., 336, 1239-1249 (2004). Антитела с измененным типом фукозилирования можно также получать за счет пост-трансляционного удаления фукозы (например, с использованием фукозидазы).
В настоящем изобретении предлагаются антитела и их фрагменты, которые специфично связываются с ИЛ-5Р и характеризуются повышенным периодом полураспада in vivo. В настоящем изобретении прежде всего предлагаются антитела и их фрагменты, которые характеризуются периодом полураспада в организме млекопитающего (например, но, не ограничиваясь только им, человека) более 3 дней, более 7 дней, более 10 дней, более 15 дней, более 25 дней, более 30 дней, более 35 дней, более 40 дней, более 45 дней, более 2 месяцев, более 3 месяцев, более 4 месяцев или более 5 месяцев.
Для пролонгирования циркуляции антител в кровотоке (например, но, не ограничиваясь только ими, моноклональных антител и одноцепочечных антител) или фрагментов антител (например, но, не ограничиваясь только ими, Fab-фрагментов) in vivo, например, к антителам (или к их фрагментам) присоединяют инертные полимеры, такие как высокомолекулярный полиэтиленгликоль (ПЭГ), с использованием (или без использования) полифункционального линкера или за счет сайт-специфичной конъюгации ПЭГ по N- или С-концевым остаткам антитела или е-аминогруппам лизина. При этом необходимо использовать линейные или разветвленные полимеры, которые обеспечивают минимальную потерю биологической активности. Степень конъюгации определяют методом электрофореза ДСН-ПААГ и масс-спектрометрией с целью достижения оптимальной конъюгации ПЭГ с антителами. Непрореагировавший ПЭГ отделяют от конъюгатов антитела/ПЭГ методами эксклюзионной или ионообменной хроматографии. Эффективность модифицированных антител (или их фрагментов) оценивают по связывающей активности, а также по эффективности действия in vivo известными методами, например, иммунологическим анализом, описанным в тексте заявки.
Антитела, обладающие повышенным периодом полураспада in vivo, можно также получать благодаря модификациям одной или более аминокислот (т.е., за счет замещений, вставок или делеций) в консервативном домене IgG или его связывающем фрагменте FcRn (например, фрагменте домена Fc или шарнирном фрагменте Fc). См., например, WO 98/23289, WO 97/34631, а также US 6277375 (указанные работы включены в описание заявки в полном объеме в качестве ссылок).
Кроме того, антитела (или их фрагменты) можно конъюгировать с альбумином для получения антител (или их фрагментов) более стабильных in vivo или обладающих более продолжительным периодом полураспада in vivo. Способы конъюгации известны в данной области техники, см., например, WO 93/15199, WO 93/15200 и WO 01/77137, а также ЕР 413622 (указанные работы включены в описание заявки в полном объеме в качестве ссылок).
2
В настоящем изобретении предлагаются антитела и их фрагменты, которые специфично связываются с ИЛ-5Р, в виде рекомбинантных гибридных белков или конъюгатов (за счет ковалентного или нековалентного связывания) с гетерологичным белком или полипептидом (или фрагментом полипептида, содержащим по меньшей мере 10, по меньшей мере 20, по меньшей мере 30, по меньшей мере 40, по меньшей мере 50, по меньшей мере 60, по меньшей мере 70, по меньшей мере 80, по меньшей мере 90 или по меньшей мере 100 аминокислот). В изобретении прежде всего предлагаются препараты гибридных белков, включающих антиген-связывающий фрагмент антитела, описанного в тексте заявки, (например, но, не ограничиваясь только ими, Fab-фрагмент, Fd-фрагмент, Fv-фрагмент, F(ab)-фрагмент, домен VH, УК VH, домен VL или УК VL) и гетерологичный белок, полипептид или пептид.
Способы гибридизации или конъюгации белков, полипептидов или пептидов с антителам (или его фрагментами) известны в данной области техники. См., например, US 5336603, 5622929, 5359046, 5349053, 5447851 и 5112946, ЕР 307434 и ЕР 367166, WO 96/04388 и WO 91/06570, Ashkenazi и др. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 10535-10539 (1991), Zheng и др., J. Immunol., 154, 5590-5600 (1995) и Vi1 и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 11337-11341 (1992) (указанные работы включены в описание заявки в полном объеме в качестве ссылок).
Дополнительные гибридные белки получают методами перегруппировки генов, перестройки мотивов последовательностей, перестройки экзонов и/или перестройки кодонов (в сумме обозначаемыми как ʺперестройка ДНКʺ). Перестройку ДНК можно использовать для изменения активности антител по изобретению или их фрагментов (например, для получения антител или их фрагментов с более высокой аффиностью и более низкой скоростью диссоциации). См., например, US 5605793,5811238, 5830721, 5834252 и 5837458, Patten и др., Curr. Opinion BiotechnoL, 8, 724-733 (1997), Harayama, Trends Biotechnol., 16(2), 76-82 (1998), Hansson, и др., J. Mol. Biol., 287, 265-276 (1999) и Lorenzo и Blasco, Biotechniques, 24(2), 308-313 (1998) (указанные работы включены в описание заявки в полном объеме в качестве ссылок). Антитела (или их фрагменты) или кодируемые антитела или их фрагменты можно изменять за счет неспецифического мутагенеза, методом ПЦР пониженной точности, неспецифической вставкой нуклеотидов или другими методами перед проведением последующей рекомбинации. Полинуклеотид, кодирующий антитела (или его фрагмент), можно рекомбинировать с одним или более компонентами, мотивами, сегментами, частями, доменами, фрагментами и т. п. одной или более гетерологичных молекул.
Более того, антитела (или их фрагменты) можно гибридизовать с маркерными последовательностями, такими как пептид, упрощающий очистку. Маркерная аминокислотная последовательность представляет собой, например, гексагистидин, такой как маркер, поставляемым в векторе pQE (фирма QIAGEN Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311) и др., многие из которых являются коммерческими препаратами. Например, как описано в статье Gentz и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 821-824 (1989), гексагистидин обеспечивает простую очистку гибридного белка. Другие пептидные метки, которые можно использовать для очистки таких белков, включают, но, не ограничиваясь только ими, фрагмент гемагглютинина (ʺГАʺ), который соответствует эпитопу, полученному из гемагглютинина вируса гриппа (Wilson и др.. Cell 37, 767 (1984)) и маркер ʺflagʺ.
131
125
123
121
14
35
3
115
113
112
111
99
201
68
67
103
99
133
18
153
177
159
149
140
175
166
90
47
186
188
142
105
97
68
57
65
85
32
153
169
51
54
75
113
117
В других вариантах антитела по настоящему изобретение или их фрагменты конъюгируют с диагностическим или детектируемым агентом. Такие антитела можно использовать для мониторинга или прогнозирования приступа, развития, прогрессии и/или тяжести заболевания или нарушения (например, но, не ограничиваясь только им, аутоиммунного нарушения), причем указанный мониторинг является составной частью методики клинических испытаний, такой как определение эффективности конкретного курса лечения. Такую диагностику и детектирование проводят благодаря взаимодействию антител с детектируемыми соединениями, включающими, но, не ограничиваясь только ими, различные ферменты, такие как, но, не ограничиваясь только ими, пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза, β-галактозидаза или ацетилхолинэстераза, простетические группы, такие как, но, не ограничиваясь только ими, стрептавидин/биотин и авидин/биотин, флуоресцентные материалы, такие как, но, не ограничиваясь только ими, умбеллиферон, флуоресцеин, флуоресцеинизоцианат, родамин, дихлортриазиниламинфлуоресцеин, дансилхлорид или фикоэритрин, люминесцентные материалы, такие как, но, не ограничиваясь только ими, люминол, биолюминесцентные материалы, такие как, но, не ограничиваясь только ими, люцифераза, люциферин и экворин, радиоактивные материалы, такие как, но, не ограничиваясь только ими, иод (In, I, I и I,), углерод (С), сера (S), тритий (H) индий (In, In, In и In,), технеций (Tc), таллий (Ti), галлий (Ga, Ga), палладий (Pd), молибден (Мо), ксенон (Хе), фтор (F), Sm, Lu, Gd, Pm, La, Yb, Ho, Y, Sc, Re, Re, Pr, Rh, Ru, Gu, Co, Zn, Sr, P, Gd, Yb, Cr, Mn, Se, Sn и Sn, позитрон-испускающие металлы с использованием различных методов позитронно-эмиссионной томографии, и нерадиоактивные парамагнитные ионы металлов.
В другом варианте антитела можно конъюгировать с вторыми антителам с образованием гетероконъюгата, как описано в US 4676980 (Segal), который включен в описание заявки в полном объеме в качестве ссылки.
Лекарственную группу или лекарственное средство, конъюгированное с исследуемыми антителам (например, специфичными к ИЛ-5Р) или их фрагментами, можно использовать для обеспечения требуемого профилактического или терапевтического действия на конкретное заболевание или нарушение у субъекта, например, заболевание или нарушение, характеризующееся или ассоциированное с нарушенной экспрессией и/или активностью α-интерферона, заболевание или нарушение, характеризующееся или ассоциированное с нарушенной экспрессией и/или активностью рецептора α-интерферона или одной или более его субъединиц, аутоиммунное заболевание, отторжение трансплантата, заболевание ʺтрансплантат против хозяинаʺ, или на один или более симптомов указанных заболеваний или нарушений. Решение о выборе лекарственного средства для конъюгирования с указанным антителам, например, антителам, которое специфично связывается с α-интерфероном, или его фрагментом, должен принимать практикующий врач или другой медицинский персонал с учетом таких факторов, как природа заболевания, тяжесть заболевания и состояние здоровья субъекта.
Антитела (или их фрагменты), которые специфично связываются с антигеном, можно получать любым известным способом синтеза антител, прежде всего химическим синтезом или методами рекомбинантной экспрессии (см., US 2007/0014724 A1).
Поликлональные антитела, специфичные в антигену, можно получать известными методами. Например, антиген человека можно вводить в организм различных животных, включая, но, не ограничиваясь только ими, кроликов, мышей, крыс и т. п., с целью индуцировать продуцирование сыворотки, содержащей поликлональные антитела, специфичные к антигену человека. Для увеличения иммунологической ответной реакции в зависимости от вида животного можно использовать различные адъюванты, включающие, но, не ограничиваясь только ими, полный и неполный адъювант Фрейнда, минеральные гели, такие как гидроксид алюминия, поверхностно-активные вещества, такие как лизолецитин, полиолы-плюроники, полианионы, пептиды, масляные эмульсии, гемоцианины фиссуреллы, динитрофенол, и адъюванты, которые используются для иммунизации человека, такие как BCG (бацилла Кольмета-Герена) и дифтериеподобная бактерия parvum. Такие адъюванты также известны в области техники.
Моноклональные антитела получают с использованием множества известных методов, включая использование гибридом, рекомбинантных технологий и методов фагового дисплея или их комбинации. Например, моноклональные антитела получают с использованием гибридом, включая известные и описанные в литературе методы, например, Harlow и др.. Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2 изд. (1988), Hammerling, и др., Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, 563-681 (Elsevier, N.Y. (1981) и Harlow и др. Using Antibodies: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1999) (указанные работы включены в описание заявки в полном объеме в качестве ссылок). Термин ʺмоноклональные антителаʺ, используемый в описании заявки, не ограничен антителами, продуцированными гибридомной технологией. Термин ʺмоноклональные антителаʺ относится к антителам, которые получены из одного клона, включая любой эукариотический, прокариотический или фаговый клон, а не к способу, которыми они получены.
Способы получения и анализа антител на специфичность к антигену с использованием гибридом известны в данной области техники. Например, мышей иммунизируют немышинным антигеном и при наличии иммунной ответной реакции, например, антител в сыворотке крови, специфичных к антигену, извлекают селезенку и выделяют спленоциты. Затем проводят слияние спленоцитов известными методами с любыми пригодными клетками миеломы, например, клетками линии SP20, полученной из коллекции АТСС. Гибридомы отбирают и клонируют ограниченным разведением. Кроме того, для иммунизации животного можно использовать метод ПИММС (повторяющаяся иммунизация по множеству сайтов), см., статью Kilpatrack и др., Hybridoma, 16, 381-389 (1997), включенную в описание в качестве ссылки. Затем клоны гибридомы анализируют известными методами на способность клеток секретировать антитела, связывающиеся с полипептидом по изобретению. Асцитную жидкость, в которой обычно содержится высокий уровень антител, получают, иммунизируя мышей позитивными клонами гибридомы.
В настоящем изобретении предлагаются способы получения моноклональных антител, а также антител, методом, включающим культивирование гибридом, секретирующих антитела по изобретению, где гибридому получают слиянием спленоцитов, выделенных из организма мыши, иммунизированной немышинным антигеном, с клетками миеломы, а затем отбирают полученные гибридизацией клоны гибридомы, секретирующие антитела, способные связываться с антигеном.
Фрагменты антител, которые специфично узнают конкретные эпитопы, получают любыми известными для специалиста методами. Например, Fab- и F(ab')2-фрагменты по изобретению получают протеолитическим расщеплением молекул иммуноглобулина ферментами, такими как папаин (для получения Fab-фрагментов) или пепсин (для получения F(ab')2-фрагментов). F(ab')2-фрагменты содержат вариабельную область, консервативную область легкой цепи и СН1 домен тяжелой цепи. Кроме того, антитела по настоящему изобретению можно также получать с использованием различных известных методов фагового дисплея.
Методы фагового дисплея включают презентацию функциональных доменов антител на поверхности частиц фага, которые содержат кодирующие их полинуклеотидные последовательности. Более конкретно последовательности ДНК, кодирующие домены VH и VL амплифицируют из библиотек кДНК животных (например, библиотек кДНК поврежденных тканей человека или мыши). ДНК, кодирующие домены VH и VL, гибридизуют с линкером scFv методом ПЦР и клонируют в фагмидный вектор. Вектор вводят в Е. coli электропорацией и Е. coli инфицируют фагом-хелпером. Используемые в этих методах фаги обычно являются нитевидными фагами, включая fd и М13, и домены VH и VL обычно гибридизуются рекомбинантным методом с геном III или геном VIII фага. Фаг, экспрессирующий антиген-связывающий домен, который связывается с конкретным антигеном, можно отобрать или идентифицировать с использованием антигена, например, меченого антигена или антигена, иммобилизованного или фиксированного на твердой подложке или гранулах. Примеры методов фагового дисплея, которые можно использовать для получения антител по настоящему изобретению, включают методы, описанные в литературе. (См., например, Brinkman и др., J. Immunol. Methods, 182, 41-50 (1995), Ames и др., J. Immunol. Methods, 184, 177-186 (1995), Kettleborough и др., Eur. J. Immunol., 24, 952-958 (1994), Persic и др., Gene, 187, 9-18 (1997), Burton и др., Advances in Immunology 57, 191-280 (1994), PCT/GB 91/O1 134, WO 90/02809, WO 91/10737, WO 92/01047, WO 92/18619, WO 93/11236, WO 95/15982, WO 95/20401 и WO 97/13844, и US 5698426, 5223409, 5403484, 5580717, 5427908, 5750753, 5821047, 5571698, 5427908, 5516637, 5780225, 5658727, 5733743, 5969108, 633187, 5824520 и 5702892 (указанные работы включены в описание заявки в полном объеме в качестве ссылок).
Как описано в вышеуказанных работах, после отбора фага кодирующие области антитела можно выделить из фага и использовать для конструирования полноразмерных антител, включая антитела человека, или любой другой антиген-связывающий фрагмент, и экспрессировать в любом требуемом организме-хозяине, включая клетки млекопитающих, клетки насекомых, клетки растений, дрожжей и бактерий, например, как описано ниже. Можно также использовать известные рекомбинантные методы получения Fab-, Fab'- и F(ab’)2-фрагментов, описанные в WO 92/22324 и статьях Mullinax и др., BioTechniques, 12(6), 864-869 (1992), Sawai и др., AJRI, 34, 26-34 (1995) и Better и др.. Science, 240, 1041-1043 (1988) (указанные работы включены в описание заявки в полном объеме в качестве ссылок).
Для получения полноразмерных антител используют праймеры ПЦР, включающие нуклеотидные последовательности VH или VL, сайт рестрикции и фланкирующую последовательность для защиты сайта рестрикции, а затем амплифицируют последовательности VH или VL в клонах scFv. С использованием методов клонирования, известных специалисту в данной области, амплифицированные методом ПЦР домены VH клонируют в векторах, экспрессирующих константную область VH, например, консервативную область антител человека γ4, а амплифицированные методом ПЦР домены VL можно клонировать в векторах, экспрессирующих константную область VL, например, консервативную область антител человека κ (каппа) или λ, (лямбда). Векторы для экспрессии доменов VH или VL могут включать промотор EF-1α, сигнал секреции, сайт клонирования вариабельного домена, консервативных доменов и маркер секреции, такой как неомицин. Домены VH и VL можно также клонировать в одном векторе, экспрессирующем необходимые консервативные области. Затем векторами конверсии тяжелой цепи и векторами конверсии легкой цепи совместно трансфектируют линии клеток для размножения стабильных или неустойчивых клеточных линий, которые экспрессируют полноразмерные антитела, например, но, не ограничиваясь только им, IgG, с использованием известных методов.
В некоторых случаях, включая применение антител in vivo для лечения человека или проведения анализов in vitro, можно использовать гуманизированные антитела или гибридные антитела. Полноразмерные антитела человека и гуманизированные антитела прежде всего целесообразно использовать для лечения человека. Антитела человека можно получать с использованием множества известных методов, включающих описанные выше методы фагового дисплея с использованием библиотек антител, полученных из последовательностей иммуноглобулинов человека. См. также US 4444887, 4716111 и WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 и WO 91/10741 (указанные работы включены в описание заявки в полном объеме в качестве ссылок).
Антитела человека можно также получить с использованием трансгенных мышей, которые неспособны экспрессировать функциональные эндогенные иммуноглобулины, но которые могут экспрессировать гены иммуноглобулина человека. Например, комплексы гена тяжелой и легкой цепи иммуноглобулина человека можно ввести произвольно или гомологичной рекомбинацией в эмбриональные стволовые клетки мыши. В другом варианте вариабельную область, консервативную область и отличающийся фрагмент антител человека можно ввести в эмбриональные стволовые клетки мыши дополнительно к генам тяжелой и легкой цепи человека. Гены тяжелой и легкой цепи иммуноглобулина мыши можно также превратить каждый в отдельности или одновременно в нефункциональные гены за счет введения локуса иммуноглобулина человека методом гомологичной рекомбинации. Например, гомозиготная делеция фрагмента JH предотвращает продуцирование эндогенных антител. Модифицированные эмбриональные стволовые клетки размножают и микроинъецируют в бластоциты для получения химерных мышей. Затем химерных мышей разводят для получения гомозиготного потомства, которое экспрессирует антитела человека. Трансгенных мышей иммунизируют соответствующим антигеном обычным образом, например, используя весь полипептид по изобретению или его часть. Моноклональные антитела к антигену можно получать из иммунизированных, трансгенных мышей по стандартной гибридомной технологии. Трансгены иммуноглобулина человека накапливаются в процессе перестройки в организме трансгенной мыши во время дифференциации В клеток, а затем происходит переключение синтеза класса (иммуноглобулина) и соматическая мутация. Таким образом, благодаря применению такого метода можно продуцировать антитела IgG, IgA, IgM и IgE для терапевтического применения. Обзор указанной технологии получения антител человека приводится в статье Lonberg и Huszar, Int. Rev. Immunol., 13, 65-93 (1995). Подробное описание указанной технологии получения антител человека, моноклональных антител человека и методики получения таких антител приводятся в литературе, см., например, WO 98/24893, WO 96/34096 и WO 96/33735, а также US 5413923, 5625126, 5633425, 5569825, 5661016, 5545806, 5814318 и 5939598 (указанные работы включены в описание заявки в полном объеме в качестве ссылок). Кроме того, антитела человека к выбранному антигену производятся по указанной технологии такими фирмами как Abgenix, Inc. (Freemont, СА) и Genpharm (San Jose, CA).
Гибридные антитела представляют собой вещества, в которых различные сегменты получены из разных иммуноглобулинов. Способы получения гибридных антител известны в данной области техники. См., например, Morrison, Science, 229, 1202 (1985), Oi и др., Bio.Techniques. 4, 214 (1986), Gillies и др., J. Immunol. Methods, 125, 191-202 (1989) и US 5807715, 4816567, 4816397 и 6331415 (указанные работы включены в описание заявки в полном объеме в качестве ссылок).
2
1
2
3
4
1
Гуманизированные антитела представляют собой антитела или их варианты или фрагменты, которые способны связываться с предварительно выбранным антигеном и которые включают каркасную область, содержащую в основном аминокислотную последовательность иммуноглобулина человека и УК, содержащий в основном аминокислотную последовательность иммуноглобулина другого вида. Гуманизированные антитела включают в основном все или по меньшей мере один и обычно два вариабельных домена (Fab, Fab', F(ab'), Fabc, Fv), в которых все или почти все УК соответствуют участкам, содержащимся в иммуноглобулине другого вида (т.е., в донорском антителе), а все или практически все каркасные области соответствуют консенсусной последовательности иммуноглобулина человека. В одном варианте Гуманизированные антитела также включают по меньшей мере часть консервативной области иммуноглобулина (Fc), обычно иммуноглобулина человека. Обычно антитела должны содержать как легкую цепь, так и по меньшей мере вариабельный домен тяжелой цепи. Антитела могут также включать области СН1, шарнирный участок, СН2, СН3 и СН4 тяжелой цепи. Гуманизированные антитела выбирают из любого класса иммуноглобулинов, включая IgM, IgG, IgD, IgA и IgE, и любого изотипа, включая IgG, IgG, IgG и IgG. Обычно консервативный домен является комплемент-фиксирующим константным доменом, чтобы Гуманизированные антитела обладали цитотоксической активностью, и обычно соответствуют классу IgG. Если в цитотоксической активности нет необходимости, консервативный домен соответствует классу IgGz. Гуманизированные антитела могут включать последовательности нескольких классов или изотипов, а выбор конкретных консервативных доменов для оптимизации необходимых эффекторных функций может сделать специалист в данной области. Каркасный участок (КУ) и участки комплементарности (УК) антител человека необязательно должны точно совпадать с исходными последовательностями, например, донорский УК или консенсусный КУ могут включать мутации за счет замещения, вставки или делеции по меньшей мере одного остатка и, следовательно, остаток в соответствующем сайте УК или КУ может не соответствовать консенсусной последовательности или импортированным антителам. Однако такие мутации должны носить ограниченный характер. Обычно в гуманизированных антителах по меньшей мере 75%, более 90% и более 95% остатков соответствуют последовательностям в исходных КУ и УК. Гуманизированные антитела можно получать известными методами, включающими, но, не ограничиваясь только ими, прививку УК (ЕР 239400, WO 91/09967 и US 5225539, 5530101 и 5585089), маскировку или демаскировку (ЕР 592106 и ЕР 519596, Padlan, Molecular Immunology, 28(4/5), 489-498 (1991), Studnicka и др., Protein Engineering, 7(6), 805-814 (1994) и Roguska и др., PNAS, 91, 969-973 (1994), перестановку цепи (US 5565332) и методы, описанные, например, в US 6407213, US 5766886, WO 9317105, Tan и др., J. Immunol.,169, 1119-1125 (2002), Caldas и др. Protein Eng., 13(5), 353-360 (2000), Morea и др.. Methods, 20(3), 267-279 (2000), Васа и др., J. Biol. Chem., 272(16), 10678-10684 (1997), Roguska и др.. Protein Eng., 9(10), 895-904 (1996), Couto и др.. Cancer Res., 55 (23 Supp), 5973-5977 (1995), Couto и др.. Cancer Res., 55(8), 1717-1722 (1995), Sandhu J.S., Gene, 150(2), 409-410 (1994) и Pedersen и др., J. Mol. Biol., 235(3), 959-973 (1994). Часто аминокислоты в каркасных областях необходимо заменить на соответствующий остаток из УК донорского антитела с целью изменить, предпочтительно улучшить связывание с антигеном. Указанные замены в каркасной области идентифицируют известными методами, например, но не ограничиваясь только ими, моделированием взаимодействий УК и каркасных остатков для идентификации каркасных остатков, важных для связывания с антигеном, и сравнением последовательности, чтобы идентифицировать необычные каркасные остатки в конкретных положениях (см., например. Queen и др., US 5585089 и Riechmann и др. Nature, 332, 323 (1988), включенные в описание заявки в полном объеме в качестве ссылок).
Монодоменные антитела, например, антитела, не содержащие легких цепей, получают известными методами. См. Riechmann и др., J. Immunol., 231, 25-38 (1999), Nuttall и др., Curr. Pharm. BiotechnoL, 1(3), 253-263 (2000), Muylderman, J. Biotechnol., 74(4), 277302 (2001), US 6005079 и WO 94/04678, WO 94/25591 и WO 01/44301 (указанные работы включены в описание заявки в полном объеме в качестве ссылок).
Кроме того, антитела, которые специфично связываются с антигеном (например, ИЛ-5Р) можно в свою очередь использовать для получения анти-идиотипических антител, которые ʺимитируютʺ антиген, известными методами. (См., например, Greenspan и Bona, FASEB J., 7(5), 437-444 (1989) и Nissinoff, J. Immunol., 147(8), 2429-2438 (1991).
Для рекомбинантной экспрессии антител по изобретению (т. е., тяжелой или легкой цепи антител по изобретению или их фрагмента или одноцепочечного антитела по изобретению) необходимо сконструировать вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид, который кодирует антитело. После получения полинуклеотида, кодирующего антитело, тяжелую или легкую цепи антитела или его фрагмент, по известной технологии рекомбинантных ДНК можно получить вектор, необходимый для продуцирования антитела. Таким образом, в заявке описаны способы получения белка экспрессией полинуклеотида, содержащего кодирующую антитело нуклеотидную последовательность. Конструирование векторов экспрессии, содержащих последовательности, кодирующие антитела, и соответствующие контрольные сигналы транскрипции и трансляции, проводят известными методами. Указанные методы включают, например, методы рекомбинантных ДНК in vitro, методы синтеза и методы генетической рекомбинации in vivo. Таким образом, в изобретении предлагаются реплицируемые векторы, включающие нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело по изобретению, тяжелую или легкую цепи антитела, вариабельный домен тяжелой или легкой цепи антитела (включая его фрагмент), или УК тяжелой или легкой цепи, связанные с промотором. Такие векторы могут включать нуклеотидную последовательность, кодирующую консервативную область молекулы антитела (см., например, WO 86/05807, WO 89/01036 и US 5122464), а вариабельный домен антитела можно клонировать в такой вектор для экспрессии полноразмерной тяжелой, полноразмерной легкой цепи или обеих полноразмерных тяжелой и легкой цепей.
Вектор экспрессии переносят в клетку организма-хозяина стандартными методами, затем трансфектированные клетки культивируют стандартными методами для получения антител по изобретению. Таким образом, изобретение включает клетки организма-хозяина, содержащие полинуклеотид, кодирующий антитело по изобретению или его фрагменты, или тяжелую или легкую цепь или их фрагмент, или одну цепь антитела по изобретению, связанную с гетерологичным промотором. В конкретных вариантах для экспрессии двухцепочечных антител векторы, кодирующие тяжелую и легкую цепи совместно экспрессируют в клетке организма-хозяина для экспрессии полноразмерной молекулы иммуноглобулина, как подробно указано ниже.
Для экспрессии антител по изобретению можно использовать множество векторных систем экспрессии в организме-хозяине (см., например, US 5807715). Такие системы экспрессии представляют собой носители, с помощью которых получают, а затем очищают соответствующие кодирующие последовательности, а также клетки, которые после трансформации или трансфекции соответствующими нуклеотидными кодирующими последовательностями также могут экспрессировать антитела по изобретению in situ. Указанными клетками являются, но, не ограничиваясь только ими, микроорганизмы, такие как бактерии (например, но, не ограничиваясь только ими, Е. соИ и В. subtilis), трансформированные векторами экспрессии в форме рекомбинантного ДНК-бактериофага, ДНК-плазмиды или ДНК-космиды, содержащими последовательности, кодирующие антитела, дрожжи (например, но, не ограничиваясь только ими, Saccharomyces Pichia), трансформированные рекомбинантными векторами экспрессии дрожжей, содержащими последовательности, кодирующие антитела, системы клеток насекомых, инфицированных рекомбинантными вирусными векторами экспрессии (например, но, не ограничиваясь только им, бакуловирусом), содержащими последовательности, кодирующие антитела, системы клеток растений, инфицированных рекомбинантными вирусными векторами экспрессии (например, но, не ограничиваясь только ими, вирусом мозаики цветной капусты (ВМЦК), вирусом мозаики табака (ВМТ), или трансформированные рекомбинантными плазмидными векторами экспрессии (например, но, не ограничиваясь только ей, плазмидой Ti), содержащими последовательности, кодирующие антитела, или системы клеток млекопитающих (например, но, не ограничиваясь только ими, клеток COS, СНО, ВНК, 293, NSO и 3Т3), включающие рекомбинантные конструкты экспрессии, содержащие промоторы, полученные из генома клеток млекопитающих (например, но, не ограничиваясь только им, промотор металлотионеина), или из вирусов млекопитающих (например, но, не ограничиваясь только ими, поздний промотор аденовируса, промотор вируса оспы 7,5К). Для экспрессии рекомбинантных антител, прежде всего для экспрессии полноразмерной молекулы рекомбинантного антитела, используются бактериальные клетки, такие как Escherichia coli, и клетки эукариот. Например, эффективной системой экспрессии антител являются клетки млекопитающих, такие как клетки яичника китайского хомячка (СНО) в сочетании с вектором, таким как основной промежуточный элемент промотора раннего гена цитомегаловируса человека (Foecking и др., Gene, 45, 101 (1986) и Cockett и др., Bio/Technology, 8, 2 (1990)). В конкретном варианте экспрессия нуклеотидной последовательности, кодирующей антитела по изобретению, их производное, аналог или фрагмент, регулируется конститутивным промотором, индуцибельным промотором или тканеспецифичным промотором.
В бактериальных системах предпочтительно выбирают ряд векторов экспрессии для получения антител, подлежащих экспрессии, в зависимости от предполагаемого применения. Например, если предполагается получать большое количество таких антител, например, для приготовления фармацевтических композиций антител, то целесообразно использовать векторы, которые стимулируют экспрессию высокого числа продуктов гибридных белков, которые легко поддаются очистке. Такими векторами являются, но, не ограничиваясь только ими, вектор экспрессии Е. coli pUR278 (Ruther и др., ЕМВО, 12, 1791 (1983)), в котором последовательность, кодирующая антитела, индивидуально лигирована в вектор в рамке с кодирующей областью lac Z, так что продуцируется гибридный белок, а также векторы pIN (Inouye и Inouye, Nucleic Acids Res., 13, 3101-3109 (1985), Van Heeke и Schuster, J. Biol. Chem., 24, 5503-5509 (1989)), и т. п. Для экспрессии инородных полипептидов в составе гибридных белков с глутатион-5-трансферазой (GST) можно также использовать векторы pGEX. В общем случае, такие гибридные белки растворимы и их можно выделить из клеточного лизата адсорбцией на гранулах глутатионагарозы и последующим элюированием в присутствии глутатиона. Векторы pGEX предназначены для включения сайтов, расщепляемых протеазой, например, тромбином или фактором Ха, и, следовательно, продукт клонированного гена-мишени можно отщепить от GST.
В системе клеток насекомого Autographa californica для экспрессии инородных генов используется вирус ядерного полиэдроза (АсВЯП). Вирус растет в клетках Spodoptera frugiperda. Последовательность, кодирующую антитела, можно клонировать индивидуально в заменимые участки (например, гена полиэдрина) вируса и культивировать под контролем промотора АсВЯП (например, промотора полиэдрина).
В клетках млекопитающих можно использовать ряд систем вирус-опосредованной экспрессии. При использовании в качестве вектора экспрессии аденовируса, последовательность, кодирующую антитела, можно лигировать в комплекс контроля транскрипции/трансляции аденовируса, например, в поздний промотор и трехкомпонентную лидерную последовательность. Затем указанный гибридный ген можно вставить в геном аденовируса за счет рекомбинации in vitro или in vivo. Вставка в заменимый участок вирусного генома (например, область Е1 или Е3) приводит к получению рекомбинантного вируса, который жизнеспособен и может экспрессировать молекулы антитела в инфицированных клетках организма-хозяина (например, см. Logan и Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 8, 1, 355-359 (1984)). Для эффективной трансляции вставленной последовательности, кодирующей антитела, могут также потребоваться специфические сигналы инициации. Эти сигналы включают кодон инициации АТГ и смежные последовательности. Кроме того, кодон инициации должен находиться в одной фазе с рамкой считывания требуемой кодирующей последовательности для обеспечения трансляции полной вставки. При этом используются указанные экзогенные сигналы контроля трансляции и кодоны инициации различного происхождения, природные или синтетические. Эффективность экспрессии можно повысить за счет включения соответствующих элементов усиления транскрипции, терминаторов транскрипции и т.п. (см., например, Bittner и др.. Methods in Enzymol., 153, 51-544 (1987)).
Кроме того, можно выбрать штамм клеток организма-хозяина, который модулирует экспрессию вставленных в клетку последовательностей или модифицирует и перерабатывает генный продукт требуемым специфическим образом. Такие модификации (например, но, не ограничиваясь только им, гликозилирование) и процессинг (например, но, не ограничиваясь только им, расщепление) белковых продуктов могут оказаться существенными для функции белка. Различные клетки организма-хозяина характеризуются особыми и специфическими механизмами пост-трансляционного процессинга и модификации белков и генных продуктов. Для обеспечения необходимой модификации и процессинга экспрессированного инородного белка можно подобрать соответствующие линии или системы клеток. Наконец, можно использовать эукариотические клетки, которые содержат клеточные механизмы для соответствующего процессинга первичного транскрипта, гликозилирования и фосфорилирования генного продукта. Такими клетками млекопитающих являются, но, не ограничиваясь только ими, клетки СНО, VERY, BHK, Hela, COS, MDCK, 293, 3T3, W138, ВТ483, Hs578T, HTB2, BT20 и T47D, NSO (линия клеток миеломы мыши, которые неспособны эндогенно продуцировать любые цепи иммуноглобулина), клетки CRL7O3O и HsS78Bst.
Для продолжительного продуцирования рекомбинантных белков с высоким выходом необходимо использовать стабильную экспрессию. Например, необходимо разработать клеточные линии, способные стабильно экспрессировать молекулы антител. Вместо использования векторов экспрессии, которые содержат вирусный репликатор, целесообразно трансформировать клетки организма-хозяина введением ДНК, содержащей соответствующие элементы экспрессии (например, промотор, усилитель, последовательности, терминаторы транскрипции, сайты полиаденилирования и т. п. ), и селектируемый маркер. После введения инородной ДНК, модифицированные клетки выращивают в течение 1-2 дней в обогащенной среде, а затем переносят в селективную среду. Селектируемый маркер в составе рекомбинантной плазмиды придает клеткам устойчивость при селекции, позволяет клеткам стабильно интегрировать плазмиду в хромосомы и расти с образованием клона, который в свою очередь можно клонировать и размножать до клеточных линий. Указанный способ успешно используется для создания клеточных линий, экспрессирующих молекулы антител. Такие линии можно прежде всего использовать при скрининге и оценке композиций, которые непосредственно или опосредованно взаимодействуют с молекулой антитела.
В одном варианте клеточная линия, которая используется для экспрессии соединения, связывающегося с ИЛ-5Р, представляет собой клетки, которые неспособны фукозилировать Fc-область антитела, связывающегося с ИЛ-5Р. Примеры таких типов клеток приводятся в US 6946292 и в заявках US 2006/0078991 А1, 2004/0110282 А1, 2006/0024800 А1, 2005/0216958 А1, 2004/0132140 и 2004/0259150. В конкретном варианте соединение, связывающееся с ИЛ-5Р, представляет собой гуманизированную, дефукозилированную α-цепь моноклонального антитела IgGI к ИЛ-5Р. В другом конкретном варианте антителом является MEDI-563 (известное также как BIW-8405). В еще одном конкретном варианте антитело не является MEDI-563.
В качестве систем селекции можно использовать, но, не ограничиваясь только ими, тимидинкиназу вируса простого герпеса (Wigler и др.. Cell, 11, 223 (1977)), гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазу (Szybalska и Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 48, 202 (1992)) и аденинфосфорибозилтрансферазу (Lowy и др.. Cell, 22, 8-17 (1980)), гены которых можно использовать в tk-, hgprt- или aprt-клетках, соответственно. Кроме того, устойчивость к антиметаболитам можно использовать в качестве основы селекции, например, по гену dhfr, который придает устойчивость к метотрексату (Wigler и др., Natl. Acad. Sci. USA, 77, 357 (1980), O'Hare и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 1527 (1981)), гену gpt, который придает устойчивость к микофеноловой кислоте (Mulligan и Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 2072 (1981)), гену пео, который придает устойчивость к аминогликозиду G-418 (Wu и Wu, Biotherapy, 3, 87-95 (1991), Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 32, 573-596 (1993), Mulligan, Science, 260, 926-932 (1993) и Morgan и Anderson, Ann. Rev. Biochem., 62, 191-217 (1993), May, TIB TECH, 11(5), 155-215 (1993)), и гену hygro, который придает устойчивость к гигромицину (Santerre и др. Gene, 30, 147 (1984)). Требуемый рекомбинантный клон отбирают стандартными методами, известными в технологии рекомбинантных ДНК и подробно описанными в литературе (см., например, Ausubel и др. (ред.). Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley и Sons, NY (1993), Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990), Dracopoli и др. (ред.). Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY, гл. 12 и 13 (1994), Colberre-Garapin и др., J. Mol. Biol., 150, 1 (1981) (указанные работы включены в описание заявки в полном объеме в качестве ссылок).
Уровень экспрессии антител можно повысить за счет амплификации вектора (см. обзор Bebbington и Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, т.3. Academic Press, New York (1987)). Если в системе вектора, экспрессирующего антитела, маркер является амплифицируемым, повышение уровня ингибитора, присутствующего в клеточной культуре, приводит к повышению числа копий гена-маркера. Поскольку амплифированный участок ассоциирован с геном антитела, при этом также повышается продуцирование антитела (Crouse и др., Mol. Cell. Biol., 3, 257 (1983)).
Клетку хозяина можно также совместно трансфектировать двумя векторами экспрессии по изобретению, при этом первый вектор кодирует полипептид тяжелой цепи, а второй вектор кодирует полипептид легкой цепи. Оба вектора могут содержать идентичные селектируемые маркеры, которые обеспечивают равную экспрессию полипептидов тяжелой и легкой цепи. В другом варианте можно использовать один вектор, который кодирует и способен экспрессировать полипептиды тяжелой и легкой цепи. В таких случаях легкую цепь следует располагать перед тяжелой цепью, чтобы исключить избыток токсичной свободной тяжелой цепи (Proudfoot, Nature, 322, 52 (1986), и Kohler, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77(2), 197 (1980)). Кодирующие последовательности тяжелой и легкой цепей включают кДНК или геномную ДНК.
После получения антител по изобретению рекомбинантной экспрессией продукт очищают любым известным методом очистки иммуноглобулинов, например, хроматографией (например, ионообменной, аффинной, прежде всего благодаря аффинности к конкретному антигену белка А, и эксклюзионной хроматографией), центрифугированием, за счет различной растворимости, или любым другим стандартным методом очистки белков. Кроме того, для упрощения методики очистки антитела по настоящему изобретению или их фрагменты можно гибридизировать с гетерологичными полипептидными последовательностями, описанными в тексте заявки, или можно использовать другие способы очистки.
Доза соединений, связывающихся с ИЛ-5Р (например антител, белков, полипептидов, пептидов и гибридных белков), по изобретению, при введении пациенту обычно составляет от 0,0001 мг/кг до 100 мг/кг массы тела, предпочтительно от 0,0001 мг/кг до 20 мг/кг, от 0,0001 мг/кг до 10 мг/кг, от 0,0001 мг/кг до 5 мг/кг, от 0,0001 мг/кг до 2 мг/кг, от 0,0001 мг/кг до 1 мг/кг, от 0,0001 мг/кг до 0,75 мг/кг, от 0,0001 мг/кг до 0,5 мг/кг, от 0,0001 мг/кг до 0,25 мг/кг, от 0,0001 мг/кг до 0,15 мг/кг, от 0,0001 мг/кг до 0,10 мг/кг, от 0,001 мг/кг до 0,5 мг/кг, от 0,01 мг/кг до 0,25 мг/кг или от 0,01 мг/кг до 0,10 мг/кг массы тела. Обычно антитела человека характеризуются более продолжительным периодом полураспада в организме человека по сравнению с антителами других видов из-за иммунной ответной реакции на инородные полипептиды. Таким образом, становится возможным введение более низких доз антител человека и менее частое введение. Кроме того, дозу и частоту введения антител по изобретению или его фрагмента можно уменьшить за счет усиления всасывания и проникновения в ткани благодаря модификации антител, например, липидизации.
В конкретном варианте доза соединения, связывающегося с ИЛ-5Р, для профилактики, лечения, контроля и/или смягчения заболевания или одного или более его симптомов составляет 150 мкг/кг или менее, предпочтительно 125 мкг/кг или менее, 100 мкг/кг или менее, 95 мкг/кг или менее, 90 мкг/кг или менее, 85 мкг/кг или менее, 80 мкг/кг или менее, 75 мкг/кг или менее, 70 мкг/кг или менее, 65 мкг/кг или менее, 60 мкг/кг или менее, 55 мкг/кг или менее, 50 мкг/кг или менее, 45 мкг/кг или менее, 40 мкг/кг или менее, 35 мкг/кг или менее, 30 мкг/кг или менее, 25 мкг/кг или менее, 20 мкг/кг или менее, 15 мкг/кг или менее, 10 мкг/кг или менее, 5 мкг/кг или менее, 2,5 мкг/кг или менее, 2 мкг/кг или менее, 1,5 мкг/кг или менее, 1 мкг/кг или менее, 0,5 мкг/кг или менее или 0,5 мкг/кг или менее. В другом варианте стандартная доза соединения, связывающегося с ИЛ-5Р, для профилактики, лечения, контроля и/или смягчения заболевания или одного или более его симптомов составляет от 0,1 мг до 20 мг, от 0,1 мг до 15 мг, от 0,1 мг до 12 мг, от 0,1 мг до 10 мг, от 0,1 мг до 8 мг, от 0,1 мг до 7 мг, от 0,1 мг до 5 мг, от 0,1 до 2,5 мг, от 0,25 мг до 20 мг, от 0,25 до 15 мг, от 0,25 до 12 мг, от 0,25 до 10 мг, от 0,25 до 8 мг, от 0,25 мг до 7 мг, от 0,25 мг до 5 мг, от 0,5 мг до 2,5 мг, от 1 мг до 20 мг, от 1 мг до 15 мг, от 1 мг до 12 мг, от 1 мг до 10 мг, от 1 мг до 8 мг, от 1 мг до 7 мг, 1 мг до 5 мг или от 1 мг до 2,5 мг.
В других вариантах субъекту вводят одну или более доз, содержащих эффективное количество одного или более лекарственных средств по изобретению, причем доза обеспечивает достижение титра в сыворотке крови по меньшей мере 0,1 мкг/мл, по меньшей мере 0,5 мкг/мл, по меньшей мере 1 мкг/мл, по меньшей мере 2 мкг/мл, по меньшей мере 5 мкг/мл, по меньшей мере 6 мкг/мл, по меньшей мере 10 мкг/мл, по меньшей мере 15 мкг/мл, по меньшей мере 20 мкг/мл, по меньшей мере 25 мкг/мл, по меньшей мере 50 мкг/мл, по меньшей мере 100 мкг/мл, по меньшей мере 125 мкг/мл, по меньшей мере 150 мкг/мл, по меньшей мере 175 мкг/мл, по меньшей мере 200 мкг/мл, по меньшей мере 225 мкг/мл, по меньшей мере 250 мкг/мл, по меньшей мере 275 мкг/мл, по меньшей мере 300 мкг/мл, по меньшей мере 325 мкг/мл, по меньшей мере 350 мкг/мл, по меньшей мере 375 мкг/мл или по меньшей мере 400 мкг/мл лекарственного средства по изобретению. В других вариантах субъекту вводят дозу, содержащую эффективное количество одного соединения по изобретению, связывающегося с ИЛ-5Р, для достижения титра в сыворотке крови по меньшей мере 0,1 мкг/мл, по меньшей мере 0,5 мкг/мл, по меньшей мере 1 мкг/мл, по меньшей мере 2 мкг/мл, по меньшей мере 5 мкг/мл, по меньшей мере 6 мкг/мл, по меньшей мере 10 мкг/мл, по меньшей мере 15 мкг/мл, по меньшей мере 20 мкг/мл, по меньшей мере 25 мкг/мл, по меньшей мере 50 мкг/мл, по меньшей мере 100 мкг/мл, по меньшей мере 125 мкг/мл, по меньшей мере 150 мкг/мл, по меньшей мере 175 мкг/мл, по меньшей мере 200 мкг/мл, по меньшей мере 225 мкг/мл, по меньшей мере 250 мкг/мл, по меньшей мере 275 мкг/мл, по меньшей мере 300 мкг/мл, по меньшей мере 325 мкг/мл, по меньшей мере 350 мкг/мл, по меньшей мере 375 мкг/мл или по меньшей мере 400 мкг/мл соединения, связывающегося с ИЛ-5Р, и последующую дозу, содержащую эффективное количество одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р, для поддержания в сыворотке крови титра по меньшей мере 0,1 мкг/мл, по меньшей мере 0,5 мкг/мл, по меньшей мере 1 мкг/мл, по меньшей мере 2 мкг/мл, по меньшей мере 5 мкг/мл, по меньшей мере 6 мкг/мл, по меньшей мере 10 мкг/мл, по меньшей мере 15 мкг/мл, по меньшей мере 20 мкг/мл, по меньшей мере 25 мкг/мл, по меньшей мере 50 мкг/мл, по меньшей мере 100 мкг/мл, по меньшей мере 125 мкг/мл, по меньшей мере 150 мкг/мл, по меньшей мере 175 мкг/мл, по меньшей мере 200 мкг/мл, по меньшей мере 225 мкг/мл, по меньшей мере 250 мкг/мл, по меньшей мере 275 мкг/мл, по меньшей мере 300 мкг/мл, по меньшей мере 325 мкг/мл, по меньшей мере 350 мкг/мл, по меньшей мере 375 мкг/мл или по меньшей мере 400 мкг/мл. В соответствии с указанными вариантами субъекту можно вводить 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или более последовательных доз.
В конкретном варианте изобретения предлагаются способы профилактики, лечения, контроля и/или смягчения заболевания, опосредованного эозинофилами, или одного или более его симптомов, причем указанные способы заключаются в том, что субъекту, который нуждается в лечении, вводят дозу, содержащую по меньшей мере 10 мкг, предпочтительно по меньшей мере 15 мкг, по меньшей мере 20 мкг, по меньшей мере 25 мкг, по меньшей мере 30 мкг, по меньшей мере 35 мкг, по меньшей мере 40 мкг, по меньшей мере 45 мкг, по меньшей мере 50 мкг, по меньшей мере 55 мкг, по меньшей мере 60 мкг, по меньшей мере 65 мкг, по меньшей мере 70 мкг, по меньшей мере 75 мкг, по меньшей мере 80 мкг, по меньшей мере 85 мкг, по меньшей мере 90 мкг, по меньшей мере 95 мкг, по меньшей мере 100 мкг, по меньшей мере 105 мкг, по меньшей мере 110 мкг, по меньшей мере 115 мкг, or по меньшей мере 120 мкг одного или более лекарственных средств (например, терапевтических или профилактических агентов), комбинации лекарственных средств или композиции по изобретению. В другом варианте изобретения предлагаются способы профилактики, лечения, контроля и/или смягчения заболевания, опосредованного эозинофилами, или одного или более его симптомов, причем указанные способы заключаются в том, что субъекту, который нуждается в лечении, вводят дозу, содержащую по меньшей мере 10 мкг, предпочтительно по меньшей мере 15 мкг, по меньшей мере 20 мкг, по меньшей мере 25 мкг, по меньшей мере 30 мкг, по меньшей мере 35 мкг, по меньшей мере 40 мкг, по меньшей мере 45 мкг, по меньшей мере 50 мкг, по меньшей мере 55 мкг, по меньшей мере 60 мкг, по меньшей мере 65 мкг, по меньшей мере 70 мкг, по меньшей мере 75 мкг, по меньшей мере 80 мкг, по меньшей мере 85 мкг, по меньшей мере 90 мкг, по меньшей мере 95 мкг, по меньшей мере 100 мкг, по меньшей мере 105 мкг, по меньшей мере 110 мкг, по меньшей мере 115 мкг или по меньшей мере 120 мкг одного или более соединений по изобретению, связывающихся с ИЛ-5Р, комбинации лекарственных средств или композиций по изобретению однократно каждые 3 дня, предпочтительно однократно каждые 4 дня, однократно каждые 5 дней, однократно каждые 6 дней, однократно каждые 7 дней, однократно каждые 8 дней, однократно каждые 10 дней, однократно каждые 2 недели, однократно каждые 3 недели или один раз в месяц.
В настоящем изобретении предлагаются способы профилактики, лечения, контроля и/или смягчения нарушения или заболевания, опосредованного эозинофилами, или одного или более его симптомов, причем указанные способы заключаются в том, что (а) субъекту, который нуждается в лечении, вводят одну или более доз, содержащих профилактически или терапевтически эффективное количество одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р, комбинации лекарственных средств или композиций по изобретению, и (б) регистрируют уровень/концентрацию в сыворотке крови субъекта указанных введенных соединений, связывающихся с ИЛ-5Р, после введения некоторого количества доз указанных лекарственных средств (например, терапевтических или профилактических агентов). Более того, предпочтительно указанное количество доз, содержащих терапевтически или профилактически эффективное количество одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р, комбинации лекарственных средств или композиций по изобретению, может составлять 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12.
В конкретном варианте изобретения предлагается способ профилактики, лечения, контроля и/или смягчения нарушения или заболевания, опосредованного эозинофилами, или одного или более его симптомов, причем указанные способы заключаются в том, что (а) субъекту, который нуждается в лечении, вводят дозу, содержащую по меньшей мере 10 мкг (предпочтительно по меньшей мере 15 мкг, по меньшей мере 20 мкг, по меньшей мере 25 мкг, по меньшей мере 30 мкг, по меньшей мере 35 мкг, по меньшей мере 40 мкг, по меньшей мере 45 мкг, по меньшей мере 50 мкг, по меньшей мере 55 мкг, по меньшей мере 60 мкг, по меньшей мере 65 мкг, по меньшей мере 70 мкг, по меньшей мере 75 мкг, по меньшей мере 80 мкг, по меньшей мере 85 мкг, по меньшей мере 90 мкг, по меньшей мере 95 мкг, по меньшей мере 100 мкг) одного или более лекарственных средств (например, терапевтических или профилактических агентов) по изобретению, и (б) указанному субъекту вводят одну или более дополнительных доз, если уровень соединения, связывающегося с ИЛ-5Р, в сыворотке крови субъекта составляет менее 0,1 мкг/мл, предпочтительно менее 0,25 мкг/мл, менее 0,5 мкг/мл, менее 0,75 мкг/мл или менее 1 мкг/мл. В другом варианте изобретения предлагается способ профилактики, лечения, контроля и/или смягчения нарушения или заболевания, опосредованного эозинофилами, или одного или более его симптомов, причем указанный способ заключаются в том, что (а) субъекту, который нуждается в лечении, вводят дозу, содержащую по меньшей мере 10 мкг (предпочтительно по меньшей мере 15 мкг, по меньшей мере 20 мкг, по меньшей мере 25 мкг, по меньшей мере 30 мкг, по меньшей мере 35 мкг, по меньшей мере 40 мкг, по меньшей мере 45 мкг, по меньшей мере 50 мкг, по меньшей мере 55 мкг, по меньшей мере 60 мкг, по меньшей мере 65 мкг, по меньшей мере 70 мкг, по меньшей мере 75 мкг, по меньшей мере 80 мкг, по меньшей мере 85 мкг, по меньшей мере 90 мкг, по меньшей мере 95 мкг, по меньшей мере 100 мкг) одного или более соединений по изобретению, связывающихся с ИЛ-5Р, (б) регистрируют уровень указанных введенных соединений, связывающихся с ИЛ-5Р, в сыворотке крови субъекта после введения некоторого количества доз, и (в) указанному субъекту вводят дополнительную дозу соединений по изобретению, связывающихся с ИЛ-5Р, если уровень соединения, связывающегося с ИЛ-5Р, в сыворотке крови указанного субъекта составляет менее 0,1 мкг/мл, предпочтительно менее 0,25 мкг/мл, менее 0,5 мкг/мл, менее 0,75 мкг/мл или менее 1 мкг/мл. В некоторых вариантах количество доз, содержащих эффективное количество одного или более соединений по изобретению, связывающихся с ИЛ-5Р, может составлять 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12.
Лекарственные средства (например, профилактические или терапевтические агенты), не идентичные соединениям по изобретению, связывающимися с ИЛ-5Р, которые в настоящее время используются для профилактики, лечения, контроля и/или смягчения гиперпролиферативного заболевания или одного или более его симптомов, можно вводить в комбинации с одним или более соединений, связывающимися с ИЛ-5Р, согласно способам по изобретению, для лечения, контроля, профилактики и/или смягчения эозинофил-опосредованного нарушения или заболевания или одного или более его симптомов. Предпочтительно дозы профилактических или терапевтических агентов, используемых в комбинации лекарственных средств по изобретению ниже доз, которые использовались или используются в настоящее время для профилактики, лечения, контроля и/или смягчения эозинофил-опосредованного нарушения или заболевания или одного или более его симптомов. Рекомендованные дозы агентов, используемых в настоящее время для профилактики, лечения, контроля и/или смягчения гиперпролиферативного заболевания или одного или более его симптомов можно найти в соответствующей литературе, включающей, но, не ограничиваясь только ими, Hardman и др., ред., Goodman & Gilman, The Pharmacological Basis of Basis of Therapeutics, 10-е изд. (2001), Mc-Graw-Hill, New York; Physician's Desk Reference (PDR), 58-е изд., Medical Economics Co., Inc., Montvale, NJ (2004), которые включены в описание заявки в полном объеме в качестве ссылок.
В различных вариантах лекарственные средства (например, профилактические или терапевтические агенты) вводят через 5 мин или менее, через 30 мин или менее, через 1 ч, через приблизительно 1 ч, через приблизительно 1-2 ч, через приблизительно 2-3 ч, через приблизительно 3-4 ч, через приблизительно 4-5 ч, через приблизительно 5-6 ч, через приблизительно 6-7 ч, через приблизительно 7-8 ч, через приблизительно 8-9 ч, через приблизительно 9-10 ч, через приблизительно 10 ч-11 ч, через приблизительно 11-12 ч, через приблизительно 12-18, через 18-24 ч, через 24-36 ч, через 36-48 ч, через 48-52 ч, через 52-60 ч, через 60-72 ч, через 72-84 ч, через 84-96 ч или через 96-120 ч. В других вариантах два иди более лекарственных средств вводят во время одного визита пациента к врачу.
В некоторых вариантах одно или более соединений по изобретению, связывающихся с ИЛ-5Р, и одно или более других лекарственных средств (например, профилактических или терапевтических агентов) вводят циклически. Циклическая терапия включает введение первого лекарственного средства (например, первого профилактического или терапевтического агента) в течение определенного периода времени, введение второго лекарственного средства (например, второго профилактического или терапевтического агента) в течение определенного периода времени, а затем необязательно введение третьего лекарственного средства (например, профилактического или терапевтического агента) в течение определенного периода времени и т. д., и повторение указанной последовательности введения препаратов, т.е. повторение цикла с целью снижения развития резистентности к одному из лекарственных средств, исключения или снижения побочного действия одного или более лекарственных средств и/или повышения эффективности лекарственных средств.
В некоторых вариантах введение указанного соединения по изобретению, связывающегося с ИЛ-5Р, можно повторить и вводить через по меньшей мере 1 день, 2 дня, 3 дня, 5 дня, 10 дней 15 дней, 30 дней, 45 дней, 2 месяца, 75 дней, 3 месяца или по меньшей мере через 6 месяцев. В других вариантах введение указанного лекарственного средства (например, профилактического или терапевтического агента) не идентичного соединению по изобретению, связывающемуся с ИЛ-5Р, можно повторить и вводить через по меньшей мере 1 день, 2 дня, 3 дня, 5 дней, 10 дней, 15 дней, 30 дней, 45 дней, 2 месяца, 75 дней, 3 месяца или по меньшей мере через 6 месяцев.
В конкретном варианте соединение по изобретению, связывающееся с ИЛ-5Р, можно вводить в виде однократной внутривенной дозы 0,03 мг/кг.
В настоящем изобретении предлагаются способы профилактики, лечения, контроля и/или смягчения эозинофил-опосредованного нарушения или заболевания или одного или более его симптомов, причем указанный способ заключается в том, что (а) субъекту, который нуждается в лечении, вводят одну или более доз, содержащих профилактически или терапевтически эффективное количество одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р, комбинации лекарственных средств, или композиции по изобретению, и (б) у субъекта регистрируют по меньшей мере один признак или симптом заболевания до и после введения одной или более доз указанных лекарственных средств (например, терапевтических или профилактических агентов).
В одном варианте субъект страдает от ХОЗЛ.
В еще одном варианте субъект страдает от слабых устойчивых или слабых перемежающихся приступов астмы в соответствии с определением Рабочей группы экспертов NAEPP (2002).
В одном варианте признак или симптом заболевания у субъекта регистрируют до и после введения однократной дозы одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В другом варианте признак или симптом заболевания у субъекта регистрируют до и после введения множества доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р.
В одном варианте признаком или симптомом заболевания является самооценка симптома астмы по бальной шкале. Примером бальной оценки является ежедневная самооценка симптома астмы субъектом на дому. Оценка симптомов астмы в баллах в течение последних 24 ч основана на тяжести утренних, ночных и дневных симптомов. Симптомы и их оценка в баллах описаны в таблице 1. Максимальный суточный балл равен 9, минимальный балл равен 0. Субъекты производят самооценку и регистрацию в непрерывном режиме.
В одном варианте показатель симптома астмы в баллах до введения субъекту одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р, равен X, а показатель симптома астмы в баллах после введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р, равен X-Y, где Х равно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9, а Y рано 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9, а балл после введения никогда не бывает менее 0.
В одном варианте показатель симптома астмы в баллах до введения субъекту одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р, равен от 0 до 9. В еще одном варианте показатель симптома астмы в баллах до введения субъекту одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р, равен от 0 до 3, от 1 до 4, от 2 до 5, от 3 до 5, от 4 до 7, от 5 до 8 или от 6 до 9. В еще одном варианте показатель симптома астмы в баллах до введения субъекту одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р, равен 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9. В еще одном варианте показатель симптома астмы в баллах до введения субъекту одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р, равен 1. В еще одном варианте показатель симптома астмы в баллах до введения субъекту одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р, равен 2. В еще одном варианте показатель симптома астмы в баллах до введения субъекту одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р, равен 3. В еще одном варианте показатель симптома астмы в баллах до введения субъекту одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р, равен 4. В еще одном варианте показатель симптома астмы в баллах до введения субъекту одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р, равен 5. В еще одном варианте показатель симптома астмы в баллах до введения субъекту одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р, равен 6. В еще одном варианте показатель симптома астмы в баллах до введения субъекту одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р, равен 7. В еще одном варианте показатель симптома астмы в баллах до введения субъекту одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р, равен 8. В еще одном варианте показатель симптома астмы в баллах до введения субъекту одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р, равен 9.
В одном варианте показатель симптома астмы в баллах после введения субъекту одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р, равен от 0 до 9. В еще одном варианте показатель симптома астмы в баллах после введения субъекту одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р, составляет от 0 до 3, от 1 до 4, от 2 до 5, от 3 до 5, от 4 до 7, от 5 до 8 или от 6 до 9. В еще одном варианте показатель симптома астмы в баллах после введения субъекту одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р, равен 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9. В еще одном варианте показатель симптома астмы в баллах после введения субъекту одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р, равен 1. В еще одном варианте показатель симптома астмы в баллах после введения субъекту одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р, равен 2. В еще одном варианте показатель симптома астмы в баллах после введения субъекту одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р, равен 3. В еще одном варианте показатель симптома астмы в баллах после введения субъекту одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р, равен 4. В еще одном варианте показатель симптома астмы в баллах после введения субъекту одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р, равен 5. В еще одном варианте показатель симптома астмы в баллах после введения субъекту одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р, равен 6. В еще одном варианте показатель симптома астмы в баллах после введения субъекту одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р, равен 7. В еще одном варианте показатель симптома астмы в баллах после введения субъекту одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р, равен 8. В еще одном варианте показатель симптома астмы в баллах после введения субъекту одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р, равен 9.
В одном варианте показатель симптома астмы в баллах уменьшается после введения субъекту одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р, по сравнению с показателем до введения субъекту одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р, причем после введения показатель никогда не бывает менее 0. В конкретном варианте показатель симптома астмы в баллах уменьшается на 1. В конкретном варианте показатель симптома астмы в баллах уменьшается на 2. В конкретном варианте показатель симптома астмы в баллах уменьшается на 3. В конкретном варианте показатель симптома астмы в баллах уменьшается на 4. В конкретном варианте показатель симптома астмы в баллах уменьшается на 5. В конкретном варианте показатель симптома астмы в баллах уменьшается на 6. В конкретном варианте показатель симптома астмы в баллах уменьшается на 7. В конкретном варианте показатель симптома астмы в баллах уменьшается на 8. В конкретном варианте показатель симптома астмы в баллах уменьшается по меньшей мере на 1. В конкретном варианте показатель симптома астмы в баллах уменьшается по меньшей мере на 9. В конкретном варианте показатель симптома астмы в баллах уменьшается по меньшей мере на 2. В конкретном варианте показатель симптома астмы в баллах уменьшается по меньшей мере на 3. В конкретном варианте показатель симптома астмы в баллах уменьшается по меньшей мере на 4. В конкретном варианте показатель симптома астмы в баллах уменьшается по меньшей мере на 5. В конкретном варианте показатель симптома астмы в баллах уменьшается по меньшей мере на 6. В конкретном варианте показатель симптома астмы в баллах уменьшается по меньшей мере на 7. В конкретном варианте показатель симптома астмы в баллах уменьшается по меньшей мере на 8.
В одном варианте признаком или симптомом заболевания симптомом является фракция выдыхаемого оксида азота (FENO). FENO измеряют в соответствии с объединенными рекомендациями Европейского общества по заболеваниям дыхательных путей и Американского торакального общества (American Thoracic Society, European Respiratory Society. ATS/ERS Recommendations for Standardized Procedures for the Online and Offline Measurements of Exhaled Lower Respiratory Nitric Oxide and Nasal Nitric Oxide (2005), Am. J. Respir. Crit. Care Med., 171, 912-930 (2005)). Измерения FENO проводят с использованием препарата NIOX при скорости потока 50 мл/с (стандарт АТО).
В одном варианте субъект характеризуется величиной FENO от 20 до 500 част./млрд до введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется величиной FENO от 20 до 500 част./млрд, от 20 до 400 част./млрд, от 20 до 300 част./млрд, от 20 до 200 част./млрд, от 50 до 500 част./млрд, от 100 до 500 част./млрд, от 150 до 500 част./млрд, от 200 до 500 част./млрд, от 20 до 50 част./млрд, от 50 до 100 част./млрд, от 100 до 200 част./млрд, от 200 до 300 част./млрд, от 300 до 500 част./млрд до введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется величиной FENO по меньшей мере 50 част./млрд, по меньшей мере 100 част./млрд, по меньшей мере 150 част./млрд, по меньшей мере 200 част./млрд, по меньшей мере 250 част./млрд, по меньшей мере 300 част./млрд, по меньшей мере 350 част./млрд, по меньшей мере 400 част./млрд до введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В одном варианте субъект характеризуется величиной FENO 50 част./млрд до введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р.
В еще одном варианте субъект характеризуется величиной FENO 100 част./млрд до введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется величиной FENO 150 част./млрд до введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется величиной FENO 200 част./млрд до введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется величиной FENO 250 част./млрд до введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется величиной FENO 300 част./млрд до введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется величиной FENO 350 част./млрд до введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется величиной FENO 400 част./млрд до введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р.
В одном варианте субъект характеризуется величиной FENO от 20 до 500 част./млрд после введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется величиной FENO от 20 до 500 част./млрд, от 20 до 400 част./млрд, от 20 до 300 част./млрд, от 20 до 200 част./млрд, от 50 до 500 част./млрд, от 100 до 500 част./млрд, от 150 до 500 част./млрд, от 200 до 500 част./млрд, от 20 до 50 част./млрд, от 50 до 100 част./млрд, от 100 до 200 част./млрд, от 200 до 300 част./млрд, от 300 до 500 част./млрд после введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется величиной FENO не более 50 част./млрд, не более 100 част./млрд, не более 150 част./млрд, не более 200 част./млрд, не более 250 част./млрд, не более 300 част./млрд, не более 350 част./млрд, не более 400 част./млрд после введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется величиной FENO не более 20 част./млрд после введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется величиной FENO не более 50 част./млрд после введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется величиной FENO не более 100 част./млрд после введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется величиной FENO не более 150 част./млрд после введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется величиной FENO не более 200 част./млрд после введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется величиной FENO не более 250 част./млрд после введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется величиной FENO не более 300 част./млрд после введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется величиной FENO не более 350 част./млрд после введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется величиной FENO не более 400 част./млрд после введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р.
В одном варианте уровень FENO у субъекта снижается после введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р, по сравнению с уровнем до введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р, причем уровень FENO никогда не опускается ниже 0 част./млрд. В конкретном варианте величина FENO снижается по меньшей мере на 50 част./млрд. В конкретном варианте величина FENO снижается по меньшей мере на 100 част./млрд. В конкретном варианте величина FENO снижается по меньшей мере на 150 част./млрд. В конкретном варианте величина FENO снижается по меньшей мере на 200 част./млрд. В конкретном варианте величина FENO снижается по меньшей мере на 250 част./млрд. В конкретном варианте величина FENO снижается по меньшей мере на 300 част./млрд. В конкретном варианте величина FENO снижается по меньшей мере на 10%. В конкретном варианте величина FENO снижается по меньшей мере на 20%. В конкретном варианте величина FENO снижается по меньшей мере на 30%. В конкретном варианте величина FENO снижается по меньшей мере на 40%. В конкретном варианте величина FENO снижается по меньшей мере на 50%. В конкретном варианте величина FENO снижается по меньшей мере на 60%. В конкретном варианте число FENO снижается по меньшей мере на 70%. В конкретном варианте величина FENO снижается по меньшей мере на 80%. В конкретном варианте величина FENO снижается по меньшей мере на 90%. В конкретном варианте величина FENO снижается на 10%. В конкретном варианте величина FENO снижается на 20%. В конкретном варианте величина FENO снижается на 30%. В конкретном варианте величина FENO снижается на 40%. В конкретном варианте величина FENO снижается на 50%. В конкретном варианте величина FENO снижается на 60%. В конкретном варианте величина FENO снижается на 70%. В конкретном варианте величина FENO снижается на 80%. В конкретном варианте величина FENO снижается на 90%.
В одном варианте признаком или симптомом заболевания является эозинофильный катионный белок (КБЭ). Содержание КБЭ в сыворотке крови определяют известными для специалиста способами, например, но, не ограничиваясь только ими, методом ИФА и радиоиммуноанализом. Кроме того, уровень КБЭ можно оценить любым коммерческим методом анализа.
В одном варианте субъект характеризуется уровнем КБЭ в сыворотке крови от 20 до 500 нг/мл до введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В одном варианте субъект характеризуется уровнем КБЭ в сыворотке крови от 20 до 200 нг/мл, от 20 до 150 нг/мл, от 20 до 100 нг/мл, от 20 до 50 нг/мл, от 30 до 200 нг/мл, от 40 до 200 нг/мл, от 50 до 200 нг/мл, от 30 до 100 нг/мл, от 30 до 80 нг/мл, от 30 до 70 нг/мл, от 20 до 80 нг/мл, от 20 до 70 нг/мл, от 20 до 60 нг/мл до введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В одном варианте субъект характеризуется уровнем КБЭ в сыворотке крови по меньшей мере 20 нг/мл, по меньшей мере 30 нг/мл, по меньшей мере 40 нг/мл, по меньшей мере 50 нг/мл, по меньшей мере 60 нг/мл, по меньшей мере 100 нг/мл, по меньшей мере 150 нг/мл, по меньшей мере 200 нг/мл до введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется уровнем КБЭ в сыворотке крови 25 нг/мл до введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется уровнем КБЭ в сыворотке крови 30 нг/мл до введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется уровнем КБЭ в сыворотке крови 35 нг/мл до введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется уровнем КБЭ в сыворотке крови 40 нг/мл до введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется уровнем КБЭ в сыворотке крови 50 нг/мл до введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется уровнем КБЭ в сыворотке крови 60 нг/мл до введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется уровнем КБЭ в сыворотке крови 70 нг/мл до введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется уровнем КБЭ в сыворотке крови 80 нг/мл до введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется уровнем КБЭ в сыворотке крови 100 нг/мл до введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется уровнем КБЭ в сыворотке крови 150 нг/мл до введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется уровнем КБЭ в сыворотке крови 200 нг/мл до введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р.
В одном варианте субъект характеризуется недетектируемым уровнем КБЭ в сыворотке крови после введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется уровнем КБЭ в сыворотке крови от 1 до 500 нг/мл после введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется уровнем КБЭ в сыворотке крови от 1 до 200 нг/мл, от 1 до 150 нг/мл, от 1 до 100 нг/мл, от 1 до 50 нг/мл, от 1 до 20 нг/мл, от 10 до 200 нг/мл, от 10 до 100 нг/мл, от 10 до 50 нг/мл, от 20 до 100 нг/мл, от 20 до 50 нг/мл после введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется уровнем КБЭ в сыворотке крови не более 1 нг/мл, не более 5 нг/мл, не более 10 нг/мл, не более 20 нг/мл, не более 30 нг/мл, не более 50 нг/мл после введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется уровнем КБЭ в сыворотке крови не более 1 нг/мл после введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется уровнем КБЭ в сыворотке крови не более 5 нг/мл после введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется уровнем КБЭ в сыворотке крови не более 10 нг/мл после введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется уровнем КБЭ в сыворотке крови не более 15 нг/мл после введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется уровнем КБЭ в сыворотке крови не более 20 нг/мл после введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется уровнем КБЭ в сыворотке крови не более 25 нг/мл после введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется уровнем КБЭ в сыворотке крови не более 30 нг/мл после введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р.
В одном варианте уровень КБЭ в сыворотке крови снижается после введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р по сравнению с уровнем, который наблюдается до введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р, причем уровень КБЭ никогда не опускается ниже 0 нг/мл. В конкретном варианте содержание КБЭ в сыворотке крови снижается по меньшей мере на 50 нг/мл. В конкретном варианте содержание КБЭ в сыворотке крови снижается по меньшей мере на 100 нг/мл. В конкретном варианте содержание КБЭ в сыворотке крови снижается по меньшей мере на 150 нг/мл. В конкретном варианте содержание КБЭ в сыворотке крови снижается по меньшей мере на 200 нг/мл. В конкретном варианте содержание КБЭ в сыворотке крови снижается по меньшей мере на 250 нг/мл. В конкретном варианте содержание КБЭ в сыворотке крови снижается по меньшей мере на 300 нг/мл. В конкретном варианте содержание КБЭ в сыворотке крови снижается по меньшей мере на 10%. В конкретном варианте содержание КБЭ в сыворотке крови снижается по меньшей мере на 20%. В конкретном варианте содержание КБЭ в сыворотке крови снижается по меньшей мере на 30%. В конкретном варианте содержание КБЭ в сыворотке крови снижается по меньшей мере на 40%. В конкретном варианте содержание КБЭ в сыворотке крови снижается по меньшей мере на 50%. В конкретном варианте содержание КБЭ в сыворотке крови снижается по меньшей мере на 60%. В конкретном варианте содержание КБЭ в сыворотке крови снижается по меньшей мере на 70%. В конкретном варианте содержание КБЭ в сыворотке крови снижается по меньшей мере на 80%. В конкретном варианте содержание КБЭ в сыворотке крови снижается по меньшей мере на 90%. В конкретном варианте содержание КБЭ в сыворотке крови снижается по меньшей мере на 95%. В конкретном варианте содержание КБЭ в сыворотке крови снижается на 10%. В конкретном варианте содержание КБЭ в сыворотке крови снижается на 20%. В конкретном варианте содержание КБЭ в сыворотке крови снижается на 30%. В конкретном варианте содержание КБЭ в сыворотке крови снижается на 40%. В конкретном варианте содержание КБЭ в сыворотке крови снижается на 50%. В конкретном варианте содержание КБЭ в сыворотке крови снижается на 60%. В конкретном варианте содержание КБЭ в сыворотке крови снижается на 70%. В конкретном варианте содержание КБЭ в сыворотке крови снижается на 80%. В конкретном варианте содержание КБЭ в сыворотке крови снижается на 90%. В конкретном варианте содержание КБЭ в сыворотке крови снижается на 95%. В конкретном варианте содержание КБЭ в сыворотке крови снижается на 99%.
В одном варианте субъект характеризуется недетектируемым уровнем КБЭ в сыворотке крови после введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р.
В конкретном варианте содержание КБЭ в сыворотке крови остается недетектируемым в течение по меньшей мере приблизительно 1 дня, по меньшей мере приблизительно 2 дней, по меньшей мере приблизительно 3 дней, по меньшей мере приблизительно 4 дней, по меньшей мере на приблизительно 5 дней, по меньшей мере приблизительно 6 дней, по меньшей мере приблизительно 7 дней, по меньшей мере приблизительно 2 недель, по меньшей мере приблизительно 3 недель, по меньшей мере приблизительно 4 недель, по меньшей мере приблизительно 5 недель, по меньшей мере приблизительно 6 недель, по меньшей мере приблизительно 7 недель, по меньшей мере приблизительно 8 недель, по меньшей мере приблизительно 9 недель, по меньшей мере приблизительно 10 недель, по меньшей мере приблизительно 12 недель, по меньшей мере приблизительно 14 недель, по меньшей мере приблизительно 16 недель, по меньшей мере приблизительно 20 недель или по меньшей мере приблизительно 25 недель.
1
1
20
1
В одном варианте признаком или симптомом заболевания является провокационная проба с метахолином (ППМ). ППМ проводят согласно инструкции Американского торакального общества (АТО), Guidelines for Methacholine and Exercise Testing - 1999. Am. J. Respir. Crit. Care Med., 161, 309-329 (2000), в присутствии врача, который специализируется на лечении бронхоспазм с применении соответствующих быстродействующих терапевтических агентов. В кратком изложении, спирометр калибруют согласно инструкции АТО. Распылитель должен продуцировать частицы размером с масс-медианным аэродинамическим диаметром (ММАД) 1-4 мкм при скорости потока 0,13±10% мл/мин. Для проведения анализа используется метахолин, полученный от производителей, утвержденных Комиссией по контролю за пищевыми продуктами и лекарственными препаратами (FDA), который разводится стерильным нормальным солевым раствором. Ингаляцию проводят при дыхании вдох/выдох в течение 2 мин или методом измерения по пяти вдохам-выдохам, как описано в цитируемой публикации. Раствор метахолина вводят при различных концентрациях согласно установленному порядку в интервале от 0,06 мг/дл до 25.0 мг/дл. FEV (объем форсированного выдоха за 1 с) измеряли через 30 и 90 с после завершения введения каждой дозы и регистрировали более высокое из двух значений. Растворы с более высокой концентрацией вводили до тех пор пока FEV не уменьшится по меньшей мере на 20% от базовой линии. РС обозначает концентрацию метахолина, которая вызывает снижение FEV по меньшей мере на 20% от базовой линии. После завершения введения конечной дозы субъекту можно давать албутерол дозирующим пульверизатором или распылителем по усмотрению главного специалиста.
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
В одном варианте субъект характеризуется величиной РС от 0,06 до 25 мг/дл до введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется величиной РС от 0,06 до 25 мг/дл, от 0,1 до 10 мг/дл, от 0,06 до 3 мг/дл, от 0,06 до 2 мг/дл, от 0,06 до 1 мг/дл, от 0,1 до 3 мг/дл, от 0,1 до 2 мг/дл, от 0,1 до 1 мг/дл, от 0,2 до 10 мг/дл, от 0,5 до 10 мг/дл, от 1 до 10 мг/дл, от 0,1 до 5 мг/дл, от 0,2 до 5 мг/дл, от 0,5 до 5 мг/дл, от 0,1 до 2 мг/дл, от 0,2 до 2 мг/дл, от 0,5 до 2 мг/дл, от 0,06 до 0,1 мг/дл, от 0,1 до 0,2 мг/дл, от 0,2 до 0,5 мг/дл, от 0,5 до 1 мг/дл, от 1 до 2 мг/дл, от 2 до 5 мг/дл, от 5 до 10 мг/дл до введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется величиной РС не более 0,1 мг/дл, не более 0,2 мг/дл, не более 0,4 мг/дл, не более 0,5 мг/дл, не более 1 мг/дл, не более 2 мг/дл, не более 5 мг/дл, не более 10 мг/дл до введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В одном варианте субъект характеризуется величиной РС 10 мг/дл до введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется величиной РС 5 мг/дл до введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется величиной РС 2 мг/дл до введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется величиной РС 1 мг/дл до введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется величиной РС 0.5 мг/дл до введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется величиной РС 0,2 мг/дл до введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется величиной РС 0,1 мг/дл до введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р.
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
В одном варианте субъект характеризуется величиной РС от 0,5 до 25 мг/дл после введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется величиной РС от 1 до 25 мг/дл, от 2 до 25 мг/дл, от 5 до 25 мг/дл, от 10 до 25 мг/дл, от 1 до 10 мг/дл, от 2 до 10 мг/дл, от 2 до 10 мг/дл после введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется величиной РС по меньшей мере 1 мг/дл, по меньшей мере 2 мг/дл, по меньшей мере 5 мг/дл, по меньшей мере 10 мг/дл, по меньшей мере 20 мг/дл после введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте, субъект характеризуется величиной РС по меньшей мере 0,2 мг/дл после введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется величиной РС по меньшей мере 0,3 мг/дл после введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется величиной PC по меньшей мере 0,4 мг/дл после введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется величиной РС по меньшей мере 0,5 мг/дл после введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется величиной PC по меньшей мере 0,7 мг/дл после введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется величиной РС по меньшей мере 1 мг/дл после введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется величиной РС по меньшей мере 2 мг/дл после введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется величиной РС по меньшей мере 5 мг/дл после введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется величиной РС по меньшей мере 10 мг/дл после введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется величиной РС по меньшей мере 20 мг/дл после введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется величиной РС по меньшей мере 25 мг/дл после введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р.
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
В одном варианте величина РС у субъекта повышается после введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р по сравнению величиной РС до введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В конкретном варианте величина РС у субъекта повышается по меньшей мере на 0,3 мг/дл. В другом конкретном варианте величина РС у субъекта повышается по меньшей мере на 0,5 мг/дл. В другом конкретном варианте величина PC у субъекта повышается по меньшей мере на 0,7 мг/дл. В другом конкретном варианте величина РС у субъекта повышается по меньшей мере на 1 мг/дл. В другом конкретном варианте величина РС у субъекта повышается по меньшей мере на 3 мг/дл. В другом конкретном варианте величина РС у субъекта повышается по меньшей мере на 5 мг/дл. В другом конкретном варианте величина РС у субъекта повышается по меньшей мере на 10 мг/дл. В другом конкретном варианте величина РС у субъекта повышается по меньшей мере на 15 мг/дл. В другом конкретном варианте величина РС у субъекта повышается по меньшей мере на 20 мг/дл. В другом конкретном варианте величина РС у субъекта повышается по меньшей мере в 2 раза. В еще одном конкретном варианте величина РС у субъекта повышается по меньшей мере в 4 раза. В еще одном конкретном варианте величина РС у субъекта повышается по меньшей мере в 8 раз. В еще одном конкретном варианте величина РС у субъекта повышается по меньшей мере в 10 раз. В еще одном конкретном варианте величина РС у субъекта повышается по меньшей мере в 12 раз. В еще одном конкретном варианте величина РС у субъекта повышается по меньшей мере в 15 раз. В еще одном конкретном варианте величина РС у субъекта повышается по меньшей мере в 20 раз. В еще одном конкретном варианте величина РС у субъекта повышается в 2 раза. В еще одном конкретном варианте величина РС у субъекта повышается в 4 раза. В еще одном конкретном варианте величина РС у субъекта повышается в 8 раз. В еще одном конкретном варианте величина РС у субъекта повышается в 10 раз. В еще одном конкретном варианте величина РС у субъекта повышается в 15 раз. В еще одном конкретном варианте величина РС повышается на 60%. В еще одном конкретном варианте величина РС повышается в 20 раз.
В одном варианте признаком или симптомом заболевания является число эозинофилов в кровотоке. Число эозинофилов в кровотоке определяют известными способами, например, но, не ограничиваясь только ими, гистологией и проточной цитометрией. Количество эозинофилов в кровотоке можно определять с использованием любого коммерческого набора.
В одном варианте субъект характеризуется числом эозинофилов в кровотоке от 50 до 1000 клеток/мкл до введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется числом эозинофилов в кровотоке от 50 до 1000 клеток/мкл, от 100 and 1000 клеток/мкл, от 150 до 1000 клеток/мкл, от 200 до 1000 клеток/мкл, от 250 до 1000 клеток/мкл, от 300 до 1000 клеток/мкл, от 400 до 1000 клеток/мкл, от 500 до 1000 клеток/мкл, от 50 до 500 клеток/мкл, от 100 до 500 клеток/мкл, от 100 до 400 клеток/мкл, от 150 до 500 клеток/мкл, от 200 до 500 клеток/мкл до введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется числом эозинофилов в кровотоке по меньшей мере 50 клеток/мкл, по меньшей мере 100 клеток/мкл, по меньшей мере 150 клеток/мкл, по меньшей мере 200 клеток/мкл, по меньшей мере 250 клеток/мкл, по меньшей мере 300 клеток/мкл, по меньшей мере 400 клеток/мкл, по меньшей мере 500 клеток/мкл до введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В одном варианте субъект характеризуется числом эозинофилов в кровотоке 50 клеток/мкл до введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р.
В еще одном варианте субъект характеризуется числом эозинофилов в кровотоке 100 клеток/мкл до введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется числом эозинофилов в кровотоке 150 клеток/мкл до введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется числом эозинофилов в кровотоке 200 клеток/мкл до введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется числом эозинофилов в кровотоке 250 клеток/мкл до введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется числом эозинофилов в кровотоке 300 клеток/мкл до введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется числом эозинофилов в кровотоке 350 клеток/мкл до введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется числом эозинофилов в кровотоке 400 клеток/мкл до введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется числом эозинофилов в кровотоке 500 клеток/мкл до введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р.
В одном варианте субъект характеризуется числом эозинофилов в кровотоке от 1 до 400 клеток/мкл после введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется числом эозинофилов в кровотоке от 1 до 200 клеток/мкл, от 1 до 100 клеток/мкл, от 1 до 50 клеток/мкл, от 1 до 40 клеток/мкл, от 10 до 200 клеток/мкл, от 10 до 100 клеток/мкл, от 10 до 40 клеток/мкл, от 20 до 200 клеток/мкл, от 20 до 100 клеток/мкл, от 20 до 50 клеток/мкл после введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется числом эозинофилов в кровотоке не более 1 клетки/мкл, не более 5 клеток/мкл, не более 10 клеток/мкл, не более 20 клеток/мкл, не более 30 клеток/мкл, не более 40 клеток/мкл, не более 50 клеток/мкл, не более 60 клеток/мкл, не более 80 клеток/мкл, не более 100 клеток/мкл после введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В одном варианте субъект характеризуется числом эозинофилов в кровотоке не более 1 клетки/мкл после введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется числом эозинофилов в кровотоке не более 5 клеток/мкл после введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется числом эозинофилов в кровотоке не более 10 клеток/мкл после введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется числом эозинофилов в кровотоке не более 20 клеток/мкл после введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется числом эозинофилов в кровотоке не более 30 клеток/мкл после введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется числом эозинофилов в кровотоке не более 40 клеток/мкл после введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется числом эозинофилов в кровотоке не более 50 клеток/мкл после введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется числом эозинофилов в кровотоке не более 60 клеток/мкл после введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется числом эозинофилов в кровотоке не более 80 клеток/мкл после введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р.
В одном варианте число эозинофилов в кровотоке субъекта снижается после введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р, по сравнению с числом эозинофилов в кровотоке до введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р, причем число эозинофилов в кровотоке никогда не опускается ниже О клеток/мкл. В конкретном варианте число эозинофилов в кровотоке снижается по меньшей мере на 50 клеток/мкл. В конкретном варианте число эозинофилов в кровотоке снижается по меньшей мере на 100 клеток/мкл. В конкретном варианте число эозинофилов в кровотоке снижается по меньшей мере на 150 клеток/мкл. В конкретном варианте число эозинофилов в кровотоке снижается по меньшей мере на 200 клеток/мкл. В конкретном варианте число эозинофилов в кровотоке снижается по меньшей мере на 250 клеток/мкл. В конкретном варианте число эозинофилов в кровотоке снижается по меньшей мере на 300 клеток/мкл. В конкретном варианте число эозинофилов в кровотоке снижается по меньшей мере на 10%. В конкретном варианте число эозинофилов в кровотоке снижается по меньшей мере на 20%. В конкретном варианте число эозинофилов в кровотоке снижается по меньшей мере на 30%. В конкретном варианте число эозинофилов в кровотоке снижается по меньшей мере на 40%. В конкретном варианте число эозинофилов в кровотоке снижается по меньшей мере на 50%. В конкретном варианте число эозинофилов в кровотоке снижается по меньшей мере на 60%. В конкретном варианте число эозинофилов в кровотоке снижается по меньшей мере на 70%. В конкретном варианте число эозинофилов в кровотоке снижается по меньшей мере на 80%. В конкретном варианте число эозинофилов в кровотоке снижается по меньшей мере на 90%. В конкретном варианте число эозинофилов в кровотоке снижается по меньшей мере на 95%. В конкретном варианте число эозинофилов в кровотоке снижается по меньшей мере на 99%. В конкретном варианте число эозинофилов в кровотоке снижается на 10%.
В конкретном варианте число эозинофилов в кровотоке снижается на 20%. В конкретном варианте число эозинофилов в кровотоке снижается на 30%. В конкретном варианте число эозинофилов в кровотоке снижается на 40%. В конкретном варианте число эозинофилов в кровотоке снижается на 50%. В конкретном варианте число эозинофилов в кровотоке снижается на 60%. В конкретном варианте число эозинофилов в кровотоке снижается на 70%. В конкретном варианте число эозинофилов в кровотоке снижается на 80%. В конкретном варианте число эозинофилов в кровотоке снижается на 90%. В конкретном варианте число эозинофилов в кровотоке снижается по на 95%. В конкретном варианте число эозинофилов в кровотоке снижается на 99%.
В одном варианте субъект характеризуется недетектируемым числом эозинофилов в кровотоке после введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В конкретном варианте число эозинофилов в кровотоке сохраняется на недетектируемом уровне в течение по меньшей мере приблизительно 1 дня, по меньшей мере приблизительно 2 дней, по меньшей мере приблизительно 3 дней, по меньшей мере приблизительно 4 дней, по меньшей мере приблизительно 5 дней, по меньшей мере приблизительно 6 дней, по меньшей мере приблизительно 7 дней, по меньшей мере приблизительно 2 недель, по меньшей мере приблизительно 3 недель, по меньшей мере приблизительно 4 недель, по меньшей мере приблизительно 5 недель, по меньшей мере приблизительно 6 недель, по меньшей мере приблизительно 7 недель, по меньшей мере приблизительно 8 недель, по меньшей мере приблизительно 9 недель, по меньшей мере приблизительно 10 недель, по меньшей мере приблизительно 12 недель, по меньшей мере приблизительно 14 недель, по меньшей мере приблизительно 16 недель, по меньшей мере приблизительно 20 недель или по меньшей мере приблизительно 25 недель.
В одном варианте признаком или симптомом заболевания является содержание (%) эозинофилов в индуцированной мокроте. Содержание (%) эозинофилов в индуцированной мокроте можно определять любым известным способом, например, но, не ограничиваясь только ими, способами, описанными в статье Belda и др.. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 161, 475-478 (2000). Содержание (%) эозинофилов в индуцированной мокроте можно определять с использованием любого коммерческого набора.
В одном варианте субъект характеризуется содержанием (%) эозинофилов в индуцированной мокроте от 0,1% до 10% до введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется содержанием (%) эозинофилов в индуцированной мокроте от 0,1% до 2%, от 0,1% до 5%, от 0,5% до 2%, от 0,5% до 5%, от 0,5% до 10%, от 1% до 2%, от 1% до 5%, от 1% до 10%, от 2% от 5%, от 2% до 10%, от 3% до 5%, от 3% до 10%, от 1,5% до 5%, от 2,5% до 5% до введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется содержанием (%) эозинофилов в индуцированной мокроте по меньшей мере 0,1%, по меньшей мере 0,5%, по меньшей мере 1%, по меньшей мере 1,5%, по меньшей мере 2%, по меньшей мере 2,5%, по меньшей мере 3%, по меньшей мере 4%, по меньшей мере 5%, по меньшей мере 6%, по меньшей мере 7%, по меньшей мере 8%, по меньшей мере 9%, по меньшей мере 10% до введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется содержанием (%) эозинофилов в индуцированной мокроте 0,5% до введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется содержанием (%) эозинофилов в индуцированной мокроте 1% до введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется содержанием (%) эозинофилов в индуцированной мокроте 1,5% до введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется содержанием (%) эозинофилов в индуцированной мокроте 2% до введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется содержанием (%) эозинофилов в индуцированной мокроте 2,5% до введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется содержанием (%) эозинофилов в индуцированной мокроте 3% до введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется содержанием (%) эозинофилов в индуцированной мокроте 4% до введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется содержанием (%) эозинофилов в индуцированной мокроте 5% до введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется содержанием (%) эозинофилов в индуцированной мокроте 6% до введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется содержанием (%) эозинофилов в индуцированной мокроте 7% до введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется содержанием (%) эозинофилов в индуцированной мокроте 8% до введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется содержанием (%) эозинофилов в индуцированной мокроте 9% до введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется содержанием (%) эозинофилов в индуцированной мокроте 10% до введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р.
В одном варианте субъект характеризуется содержанием (%) эозинофилов в индуцированной мокроте от 0,1% до 5% после введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется содержанием (%) эозинофилов в индуцированной мокроте от 0,1% до 3%, от 0,1% до 2%, от 0,1% до 1,5%, от 0,5% до 5%, от 0,5% до 3%, от 0.5% до 1%, от 1% до 5%, от 1% до 3%, от 2% до 5%, от 3% до 5%, от 2,5% до 5% после введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В одном варианте субъект характеризуется содержанием (%) эозинофилов в индуцированной мокроте не более 1%, не более 2%, не более 3%, не более 4%, не более 5%, не более 6%, не более 7%, не более 8%, не более 9%, не более 10% после введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В одном варианте субъект характеризуется содержанием (%) эозинофилов в индуцированной мокроте не более 1% после введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется содержанием (%) эозинофилов в индуцированной мокроте не более 2% после введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется содержанием (%) эозинофилов в индуцированной мокроте не более 3% после введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется содержанием (%) эозинофилов в индуцированной мокроте не более 4% после введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется содержанием (%) эозинофилов в индуцированной мокроте не более 5% после введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В одном варианте субъект характеризуется содержанием (%) эозинофилов в индуцированной мокроте не более 6% после введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется содержанием (%) эозинофилов в индуцированной мокроте не более 7% после введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В одном варианте субъект характеризуется содержанием (%) эозинофилов в индуцированной мокроте не более 8% после введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В одном варианте субъект характеризуется содержанием (%) эозинофилов в индуцированной мокроте не более 9% после введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется содержанием (%) эозинофилов в индуцированной мокроте не более 10% после введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р.
В одном варианте содержание (%) эозинофилов в индуцированной мокроте субъекта снижается после введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р, по сравнению содержанием (%) эозинофилов до введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р, причем содержание (%) эозинофилов в индуцированной мокроте никогда не опускается ниже 0%. В конкретном варианте содержание (%) эозинофилов в индуцированной мокроте снижается по меньшей мере на 10%. В конкретном варианте содержание (%) эозинофилов в индуцированной мокроте снижается по меньшей мере на 9%. В конкретном варианте содержание (%) эозинофилов в индуцированной мокроте снижается по меньшей мере на 8%. В конкретном варианте содержание (%) эозинофилов в индуцированной мокроте снижается по меньшей мере на 7%. В конкретном варианте содержание (%) эозинофилов в индуцированной мокроте снижается по меньшей мере на 6%. В конкретном варианте содержание (%) эозинофилов в индуцированной мокроте снижается по меньшей мере на 5%. В конкретном варианте содержание (%) эозинофилов в индуцированной мокроте снижается по меньшей мере на 4%. В конкретном варианте содержание (%) эозинофилов в индуцированной мокроте снижается по меньшей мере на 3%. В конкретном варианте содержание (%) эозинофилов в индуцированной мокроте снижается по меньшей мере на 2%. В конкретном варианте содержание (%) эозинофилов в индуцированной мокроте снижается по меньшей мере на 1%.
В одном варианте субъект характеризуется недетектируемым содержанием эозинофилом в индуцированной мокроте после введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В конкретном варианте эозинофилы в индуцированной мокроте сохраняются на недетектируемом уровне в течение по меньшей мере приблизительно 1 дня, по меньшей мере приблизительно 2 дней, по меньшей мере приблизительно 3 дней, по меньшей мере приблизительно 4 дней, по меньшей мере приблизительно 5 дней, по меньшей мере приблизительно 6 дней, по меньшей мере приблизительно 7 дней, по меньшей мере приблизительно 2 недель, по меньшей мере приблизительно 3 недель, по меньшей мере приблизительно 4 недель, по меньшей мере приблизительно 5 недель, по меньшей мере приблизительно 6 недель, по меньшей мере приблизительно 7 недель, по меньшей мере приблизительно 8 недель, по меньшей мере приблизительно 9 недель, по меньшей мере приблизительно 10 недель, по меньшей мере приблизительно 12 недель, по меньшей мере приблизительно 14 недель, по меньшей мере приблизительно 16 недель, по меньшей мере приблизительно 20 недель или по меньшей мере приблизительно 25 недель.
В одном варианте признаком или симптомом заболевания является число базофилов в кровотоке. Число базофилов в кровотоке определяют известными способами, например, но, не ограничиваясь только ими, гистологией и проточной цитометрией. Число базофилов в кровотоке можно определять с использованием любого коммерческого набора.
В одном варианте субъект характеризуется числом базофилов в кровотоке от 5 до 500 клеток/мкл до введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В одном варианте субъект характеризуется числом базофилов в кровотоке от 50 до 500 клеток/мкл, от 10 до 500 клеток/мкл, от 20 до 500 клеток/мкл, от 30 до 500 клеток/мкл, от 40 до 500 клеток/мкл, от 50 до 500 клеток/мкл, от 10 до 400 клеток/мкл, от 10 до 300 клеток/мкл, от 10 до 200 клеток/мкл, от 10 до 100 клеток/мкл, от 20 до 100 клеток/мкл, от 30 до 100 клеток/мкл, от 10 до 75 клеток/мкл после введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В одном варианте субъект характеризуется числом базофилов в кровотоке по меньшей мере 5 клеток/мкл, по меньшей мере 10 клеток/мкл, по меньшей мере 15 клеток/мкл, по меньшей мере 20 клеток/мкл, по меньшей мере 30 клеток/мкл, по меньшей мере 50 клеток/мкл, по меньшей мере 60 клеток/мкл, по меньшей мере 100 клеток/мкл до введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В одном варианте субъект характеризуется числом базофилов в кровотоке 5 клеток/мкл до введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется числом базофилов в кровотоке 10 клеток/мкл до введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется числом базофилов в кровотоке 15 клеток/мкл до введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется числом базофилов в кровотоке 20 клеток/мкл до введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется числом базофилов в кровотоке 30 клеток/мкл до введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется числом базофилов в кровотоке 50 клеток/мкл до введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется числом базофилов в кровотоке 60 клеток/мкл до введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется числом базофилов в кровотоке 100 клеток/мкл до введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р.
В одном варианте субъект характеризуется числом базофилов в кровотоке от 1 до 100 клеток/мкл после введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В одном варианте субъект характеризуется числом базофилов в кровотоке от 1 до 100 клеток/мкл, от 1 до 50 клеток/мкл, от 1 до 30 клеток/мкл, от 1 до 20 клеток/мкл, от 1 до 10 клеток/мкл, от 5 до 100 клеток/мкл, от 5 до 50 клеток/мкл, от 5 до 20 клеток/мкл, от 5 до 10 клеток/мкл, от 10 до 30 клеток/мкл после введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В одном варианте субъект характеризуется числом базофилов в кровотоке не более 1 клеток/мкл, не более 5 клеток/мкл, не более 10 клеток/мкл, не более 20 клеток/мкл, не более 30 клеток/мкл, не более 50 клеток/мкл, не более 100 клеток/мкл после введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В одном варианте субъект характеризуется числом базофилов в кровотоке не более клетки/мкл после введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется числом базофилов в кровотоке не более 5 клеток/мкл после введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется числом базофилов в кровотоке не более 10 клеток/мкл после введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется числом базофилов в кровотоке не более 20 клеток/мкл после введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется числом базофилов в кровотоке не более 30 клеток/мкл после введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется числом базофилов в кровотоке не более 40 клеток/мкл после введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В еще одном варианте субъект характеризуется числом базофилов в кровотоке не более 50 клеток/мкл после введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р.
В одном варианте число базофилов в кровотоке организме субъекта снижается после введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р по сравнению с числом базофилов в кровотоке до введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р до введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р, причем число базофилов в кровотоке никогда не опускается ниже 0 клеток/мкл. В конкретном варианте числом базофилов в кровотоке снижается по меньшей мере на 10 клеток/мкл. В конкретном варианте число базофилов в кровотоке снижается по меньшей мере на 20 клеток/мкл. В конкретном варианте число базофилов в кровотоке снижается по меньшей мере на 30 клеток/мкл. В конкретном варианте число базофилов в кровотоке снижается по меньшей мере на 50 клеток/мкл. В конкретном варианте число базофилов в кровотоке снижается по меньшей мере на 75 клеток/мкл. В конкретном варианте число базофилов в кровотоке снижается по меньшей мере на 100 клеток/мкл. В конкретном варианте число базофилов в кровотоке снижается по меньшей мере на 10%. В конкретном варианте число базофилов в кровотоке снижается по меньшей мере на 20%. В конкретном варианте число базофилов в кровотоке снижается по меньшей мере на 30%. В конкретном варианте число базофилов в кровотоке снижается по меньшей мере на 40%. В конкретном варианте число базофилов в кровотоке снижается по меньшей мере на 50%. В конкретном варианте число базофилов в кровотоке снижается по меньшей мере на 60%. В конкретном варианте число базофилов в кровотоке снижается по меньшей мере на 70%. В конкретном варианте число базофилов в кровотоке снижается по меньшей мере на 80%. В конкретном варианте число базофилов в кровотоке снижается по меньшей мере на 90%. В конкретном варианте число базофилов в кровотоке снижается по меньшей мере на 95%. В конкретном варианте число базофилов в кровотоке снижается по меньшей мере на 99%. В конкретном варианте число базофилов в кровотоке снижается на 10%.
В конкретном варианте число базофилов в кровотоке снижается на 20%. В конкретном варианте число базофилов в кровотоке снижается на 30%. В конкретном варианте число базофилов в кровотоке снижается на 40%. В конкретном варианте число базофилов в кровотоке снижается на 50%. В конкретном варианте число базофилов в кровотоке снижается на 60%. В конкретном варианте число базофилов в кровотоке снижается на 70%. В конкретном варианте число базофилов в кровотоке снижается на 80%. В конкретном варианте число базофилов в кровотоке снижается на 90%. В конкретном варианте число базофилов в кровотоке снижается на 95%. В конкретном варианте число базофилов в кровотоке снижается на 99%.
В одном варианте субъект характеризуется недетектируемым содержанием базофилов в кровотоке после введения одной или более доз одного или более соединений, связывающихся с ИЛ-5Р. В конкретном варианте содержание циркулирующих базофилов сохраняется недетектируемым в течение по меньшей мере приблизительно 1 дня, по меньшей мере приблизительно 2 дней, по меньшей мере приблизительно 3 дней, по меньшей мере приблизительно 4 дней, по меньшей мере приблизительно 5 дней, по меньшей мере приблизительно 6 дней, по меньшей мере приблизительно 7 дней, по меньшей мере приблизительно 2 недель, по меньшей мере приблизительно 3 недель, по меньшей мере приблизительно 4 недель, по меньшей мере приблизительно 5 недель, по меньшей мере приблизительно 6 недель, по меньшей мере приблизительно 7 недель, по меньшей мере приблизительно 8 недель, по меньшей мере приблизительно 9 недель, по меньшей мере приблизительно 10 недель, по меньшей мере приблизительно 12 недель, по меньшей мере приблизительно 14 недель, по меньшей мере приблизительно 16 недель, по меньшей мере приблизительно 20 недель или по меньшей мере приблизительно 25 недель.
Конкретные варианты осуществления изобретения
1. Способ снижения числа эозинофилов в организме человека, который заключается в том, что указанному субъекту вводят соединение, связывающееся с ИЛ-5Р, которое включает (а) фрагмент, который специфично связывается с ИЛ-5Р, и (б) Fc-фрагмент иммуноглобулина.
2. Способ по варианту 1, где указанными соединениями, которые связываются с ИЛ-5Р, являются антитела.
3. Способ по варианту 2, где указанные антитела являются моноклональными антителами.
4. Способ по варианту 3, где указанные антитела являются гибридными антителами.
5. Способ по варианту 3, где указанные антитела являются гуманизированными антителами.
6. Способ по варианту 3, где указанные антитела являются антителами человека.
7. Способ по варианту 1, где указанный фрагмент, который специфично связывается с ИЛ-5Р, включает аминокислотную последовательность ИЛ-5 или его фрагменты, варианты, включающие замены аминокислот, или производные.
8. Способ по варианту 7, где указанный фрагмент, который специфично связывается с ИЛ-5Р, включает нефункциональный вариант ИЛ-5.
9. Способ по любому из вариантов 1-8, где указанное соединение, которое связывается с ИЛ-5Р, связывается с α-цепью ИЛ-5Р.
10. Способ по варианту 1, где указанный Fc-фрагмент иммуноглобулина модифицирован с целью повышения эффекторной функции.
11. Способ по варианту 1, где указанный Fc-фрагмент иммуноглобулина содержит пониженное количество фукозы.
12. Способ по варианту 11, где указанный Fc-фрагмент иммуноглобулина не содержит фукозы.
13. Способ по варианту 1, где указанный Fc-фрагмент иммуноглобулина включает замены аминокислот, которые приводят к повышенной эффекторной функции.
14. Способ по варианту 1, где указанные замены аминокислот включают вставки в Fc-фрагмент следующих аминокислотных последовательностей: 332Е, 239D и 330L, обозначенных EU индексом, по Кабату.
15. Способ по варианту 1, где указанное уменьшение числа эозинофилов происходит в периферической крови.
3
16. Способ по варианту 1, где число эозинофилов понижается до уровня менее 50 эозинофилов/мм.
17. Способ по варианту 1, где снижение числа эозинофилов наблюдается в течение первых 48 ч после введения.
18. Способ по варианту 1, где снижение числа эозинофилов наблюдается в течение первых 24 ч после введения.
19. Способ по варианту 1, где снижение числа эозинофилов является обратимым.
3
20. Способ по варианту 1, где наблюдается пролонгированное (после введения) снижение абсолютного числа эозинофилов по меньшей мере на приблизительно 25 эозинофилов/мм.
3
21. Способ по варианту 1, где наблюдается пролонгированное (после введения) снижение абсолютного числа эозинофилов по меньшей мере на приблизительно 50 эозинофилов/мм.
3
22. Способ по варианту 1, где наблюдается пролонгированное (после введения) снижение абсолютного числа эозинофилов по меньшей мере на приблизительно 75 эозинофилов/мм.
3
23. Способ по варианту 1, где наблюдается пролонгированное (после введения) снижение абсолютного числа эозинофилов по меньшей мере на приблизительно 100 эозинофилов/мм.
3
24. Способ по варианту 1, где наблюдается пролонгированное (после введения) снижение абсолютного числа эозинофилов по меньшей мере на приблизительно 125 эозинофилов/мм.
3
25. Способ по варианту 1, где наблюдается пролонгированное (после введения) снижение абсолютного числа эозинофилов по меньшей мере на приблизительно 150 эозинофилов/мм.
3
26. Способ по варианту 1, где наблюдается пролонгированное (после введения) снижение абсолютного числа эозинофилов по меньшей мере на приблизительно 175 эозинофилов/мм.
3
27. Способ по варианту 1, где наблюдается пролонгированное (после введения) снижение абсолютного числа эозинофилов по меньшей мере на приблизительно 200 эозинофилов/мм.
3
28. Способ по варианту 1, где наблюдается пролонгированное (после введения) снижение абсолютного числа эозинофилов по меньшей мере на приблизительно 225 эозинофилов/мм.
3
29. Способ по варианту 1, где наблюдается пролонгированное (после введения) снижение абсолютного числа эозинофилов по меньшей мере на приблизительно 250 эозинофилов/мм.
3
30. Способ по варианту 1, где наблюдается пролонгированное (после введения) снижение абсолютного числа эозинофилов по меньшей мере на приблизительно 275 эозинофилов/мм.
3
31. Способ по варианту 1, где наблюдается пролонгированное (после введения) снижение абсолютного числа эозинофилов по меньшей мере на приблизительно 300 эозинофилов/мм.
32. Способ по варианту 1, где наблюдается пролонгированное (после введения) снижение абсолютного числа эозинофилов по меньшей мере на приблизительно 325 эозинофилов/мм.
3
33. Способ по варианту 1, где наблюдается пролонгированное (после введения) снижение абсолютного числа эозинофилов по меньшей мере на приблизительно 325 эозинофилов/мм.
3
33. Способ по варианту 1, где наблюдается пролонгированное (после введения) снижение абсолютного числа эозинофилов по меньшей мере на приблизительно 350 эозинофилов/мм.
3
34. Способ по варианту 1, где наблюдается пролонгированное (после введения) снижение абсолютного числа эозинофилов по меньшей мере на приблизительно 375 эозинофилов/мм.
3
35. Способ по варианту 1, где наблюдается пролонгированное (после введения) снижение абсолютного числа эозинофилов по меньшей мере на приблизительно 400 эозинофилов/мм.
3
36. Способ по варианту 1, где наблюдается пролонгированное (после введения) снижение абсолютного числа эозинофилов по меньшей мере на приблизительно 425 эозинофилов/мм.
3
37. Способ по варианту 1, где наблюдается пролонгированное (после введения) снижение абсолютного числа эозинофилов по меньшей мере на приблизительно 450 эозинофилов/мм.
3
38. Способ по варианту 1, где наблюдается пролонгированное (после введения) снижение абсолютного числа эозинофилов по меньшей мере на приблизительно 475 эозинофилов/мм.
3
39. Способ по варианту 1, где наблюдается пролонгированное (после введения) снижение абсолютного числа эозинофилов по меньшей мере на приблизительно 500 эозинофилов/мм.
3
40. Способ по варианту 1, где наблюдается пролонгированное (после введения) снижение абсолютного числа эозинофилов на приблизительно от и включительно 50 до приблизительно 500 эозинофилов/мм.
3
41. Способ по варианту 1, где наблюдается пролонгированное (после введения) снижение абсолютного числа эозинофилов на приблизительно от и включительно 75 до приблизительно 250 эозинофилов/мм.
3
42. Способ по варианту 1, где наблюдается пролонгированное (после введения) снижение абсолютного числа эозинофилов на приблизительно от и включительно 100 до приблизительно 200 эозинофилов/мм.
3
43. Способ по варианту 1, где наблюдается пролонгированное (после введения) снижение абсолютного числа эозинофилов на приблизительно от и включительно 50 до приблизительно 250 эозинофилов/мм.
3
44. Способ по варианту 1, где наблюдается пролонгированное (после введения) снижение абсолютного числа эозинофилов на приблизительно от и включительно 50 до приблизительно 200 эозинофилов/мм.
3
45. Способ по варианту 1, где наблюдается пролонгированное (после введения) снижение абсолютного числа эозинофилов на приблизительно от и включительно 50 до приблизительно 150 эозинофилов/мм.
3
46. Способ по варианту 1, где наблюдается пролонгированное (после введения) снижение абсолютного числа эозинофилов на менее приблизительно 100 эозинофилов/мм.
3
47. Способ по варианту 1, где наблюдается пролонгированное (после введения) снижение абсолютного числа эозинофилов на менее приблизительно 75 эозинофилов/мм.
3
48. Способ по варианту 1, где наблюдается пролонгированное (после введения) снижение абсолютного числа эозинофилов на менее приблизительно 50 эозинофилов/мм.
3
49. Способ по варианту 1, где наблюдается пролонгированное (после введения) снижение абсолютного числа эозинофилов на менее приблизительно 25 эозинофилов/мм.
3
50. Способ по варианту 1, где абсолютное содержание эозинофилов в организме субъекта до введения (препарата) составляет от приблизительно 50 до приблизительно 500 эозинофилов/мм.
3
51. Способ по варианту 1, где абсолютное содержание эозинофилов в организме субъекта до введения (препарата) составляет от приблизительно 75 до приблизительно 475 эозинофилов/мм.
3
52. Способ по варианту 1, где абсолютное содержание эозинофилов в организме субъекта до введения (препарата) составляет от приблизительно 75 до приблизительно 200 эозинофилов/мм.
3
53. Способ по варианту 1, где абсолютное содержание эозинофилов в организме субъекта до введения (препарата) составляет от приблизительно 100 до приблизительно 200 эозинофилов/мм.
3
54. Способ по варианту 1, где абсолютное содержание эозинофилов в организме субъекта до введения (препарата) составляет приблизительно 25 эозинофилов/мм.
3
55. Способ по варианту 1, где абсолютное содержание эозинофилов в организме субъекта до введения (препарата) составляет приблизительно 50 эозинофилов/мм.
3
56. Способ по варианту 1, где абсолютное содержание эозинофилов в организме субъекта до введения (препарата) составляет приблизительно 50 эозинофилов/мм.
3
57. Способ по варианту 1, где абсолютное содержание эозинофилов в организме субъекта до введения (препарата) составляет приблизительно 100 эозинофилов/мм.
3
58. Способ по варианту 1, где абсолютное содержание эозинофилов в организме субъекта до введения (препарата) составляет приблизительно 125 эозинофилов/мм.
3
59. Способ по варианту 1, где абсолютное содержание эозинофилов в организме субъекта до введения (препарата) составляет приблизительно 150 эозинофилов/мм.
3
60. Способ по варианту 1, где абсолютное содержание эозинофилов в организме субъекта до введения (препарата) составляет приблизительно 175 эозинофилов/мм.
3
61. Способ по варианту 1, где абсолютное содержание эозинофилов в организме субъекта до введения (препарата) составляет приблизительно 200 эозинофилов/мм.
3
62. Способ по варианту 1, где абсолютное содержание эозинофилов в организме субъекта до введения (препарата) составляет приблизительно 225 эозинофилов/мм.
3
63. Способ по варианту 1, где абсолютное содержание эозинофилов в организме субъекта до введения (препарата) составляет приблизительно 250 эозинофилов/мм.
3
64. Способ по варианту 1, где абсолютное содержание эозинофилов в организме субъекта до введения (препарата) составляет приблизительно 275 эозинофилов/мм.
3
65. Способ по варианту 1, где абсолютное содержание эозинофилов в организме субъекта до введения (препарата) составляет приблизительно 300 эозинофилов/мм.
3
66. Способ по варианту 1, где абсолютное содержание эозинофилов в организме субъекта до введения (препарата) составляет приблизительно 325 эозинофилов/мм.
3
67. Способ по варианту 1, где абсолютное содержание эозинофилов в организме субъекта до введения (препарата) составляет приблизительно 350 эозинофилов/мм.
3
68. Способ по варианту 1, где абсолютное содержание эозинофилов в организме субъекта до введения (препарата) составляет приблизительно 375 эозинофилов/мм.
3
69. Способ по варианту 1, где абсолютное содержание эозинофилов в организме субъекта до введения (препарата) составляет приблизительно 400 эозинофилов/мм.
3
70. Способ по варианту 1, где абсолютное содержание эозинофилов в организме субъекта до введения (препарата) составляет приблизительно 425 эозинофилов/мм.
3
71. Способ по варианту 1, где абсолютное содержание эозинофилов в организме субъекта до введения (препарата) составляет приблизительно 450 эозинофилов/мм.
3
72. Способ по варианту 1, где абсолютное содержание эозинофилов в организме субъекта до введения (препарата) составляет приблизительно 475 эозинофилов/мм.
3
73. Способ по варианту 1, где абсолютное содержание эозинофилов в организме субъекта до введения (препарата) составляет приблизительно 500 эозинофилов/мм.
3
74. Способ по любому из вариантов 1-73, где абсолютное содержание базофилов в организме субъекта снижается после введения (препарата) по меньшей мере на приблизительно 5 базофилов/мм.
3
75. Способ по любому из вариантов 1-73, где абсолютное содержание базофилов в организме субъекта снижается после введения (препарата) по меньшей мере на приблизительно 20 базофилов/мм.
3
76. Способ по любому из вариантов 1-73, где абсолютное содержание базофилов в организме субъекта снижается после введения (препарата) по меньшей мере на приблизительно 15 базофилов/мм.
3
77. Способ по любому из вариантов 1-73, где абсолютное содержание базофилов в организме субъекта снижается после введения (препарата) по меньшей мере на приблизительно 20 базофилов/мм.
3
78. Способ по любому из вариантов 1-73, где абсолютное содержание базофилов в организме субъекта снижается после введения (препарата) по меньшей мере на приблизительно 25 базофилов/мм.
3
79. Способ по любому из вариантов 1-73, где абсолютное содержание базофилов в организме субъекта снижается после введения (препарата) по меньшей мере на приблизительно 30 базофилов/мм.
3
80. Способ по любому из вариантов 1-73, где абсолютное содержание базофилов в организме субъекта снижается после введения (препарата) по меньшей мере на приблизительно 35 базофилов/мм.
3
81. Способ по любому из вариантов 1-73, где абсолютное содержание базофилов в организме субъекта снижается после введения (препарата) по меньшей мере на приблизительно 40 базофилов/мм.
3
82. Способ по любому из вариантов 1-73, где абсолютное содержание базофилов в организме субъекта снижается после введения (препарата) по меньшей мере на приблизительно 45 базофилов/мм.
3
83. Способ по любому из вариантов 1-73, где абсолютное содержание базофилов в организме субъекта снижается после введения (препарата) по меньшей мере на приблизительно 50 базофилов/мм.
3
84. Способ по любому из вариантов 1-73, где абсолютное содержание базофилов в организме субъекта снижается после введения (препарата) по меньшей мере на приблизительно 55 базофилов/мм.
3
85. Способ по любому из вариантов 1-73, где абсолютное содержание базофилов в организме субъекта снижается после введения (препарата) по меньшей мере на приблизительно 60 базофилов/мм.
3
86. Способ по любому из вариантов 1-73, где абсолютное содержание базофилов в организме субъекта снижается после введения (препарата) по меньшей мере на приблизительно 65 базофилов/мм.
3
87. Способ по любому из вариантов 1-73, где абсолютное содержание базофилов в организме субъекта снижается после введения (препарата) по меньшей мере на приблизительно 70 базофилов/мм.
3
88. Способ по любому из вариантов 1-73, где абсолютное содержание базофилов в организме субъекта после введения (препарата) составляет от 0 до приблизительно 10 базофилов/мм.
3
89. Способ по любому из вариантов 1-73, где абсолютное содержание базофилов в организме субъекта после введения (препарата) составляет приблизительно 2 базофила/мм.
3
90. Способ по любому из вариантов 1-73, где абсолютное содержание базофилов в организме субъекта после введения (препарата) составляет приблизительно 5 базофилов/мм.
3
91. Способ по любому из вариантов 1-73, где абсолютное содержание базофилов в организме субъекта после введения (препарата) составляет приблизительно 7 базофилов/мм.
3
92. Способ по любому из вариантов 1-73, где абсолютное содержание базофилов в организме субъекта после введения (препарата) составляет приблизительно 9 базофилов/мм.
93. Способ по любому из вариантов 1-73, где снижение числа базофил происходит в течение 48 ч после введения.
94. Способ по любому из вариантов 1-73, где снижение числа базофил происходит в течение 24 ч после введения.
95. Способ по любому из вариантов 1-94, где указанное соединение, связывающееся с ИЛ-5Р, вводят указанному субъекту в дозе от приблизительно 0,001 до приблизительно 100 мг/кг.
96. Способ по варианту 95, где указанная доза составляет приблизительно 0,03 мг/кг.
97. Способ по варианту 95, где указанная доза составляет 0,03 мг/кг.
98. Способ по любому из вариантов 1-97, где указанное соединение, связывающееся с ИЛ-5Р, вводят парентерально.
99. Способ по варианту 98, где указанное соединение, связывающееся с ИЛ-5Р, вводят внутривенно.
100. Способ по любому из вариантов 1-99, при условии, что соединение, связывающееся с ИЛ-5Р, не обозначает MEDI-563.
101. Способ по любому из вариантов 1-100, где указанное снижение числа эозинофилов приводит к уменьшению симптомов астмы.
102. Способ по любому из вариантов 1-100, где указанное снижение числа эозинофилов приводит к уменьшению симптомов ХОЗЛ.
Примеры
Изобретение иллюстрируется следующими примерами, не ограничивающими его объем. Подразумевается, что примеры включают все варианты, которые становятся очевидными при ознакомлении с описанием изобретения.
Пример 1
MEDI-563, антитела против рецептора интерлейкина-5, характеризуются высокой толерантностью и индуцируют обратимую эозинопению крови у пациентов с легкой формой астмы по данным испытаний (фаза 1)
Введение
Эозинофилы играют основную роль в патогенезе астмы. Интерлейкин-5 (ИЛ-5) является основным цитокином в биологии эозинофилов, и экспрессия его рецептора (IL-5R) наблюдается в основном только на поверхности эозинофилов, базофилов и тучных клеток. Низкая эффективность способов лечения астмы, в которых мишенью является ИЛ-5, обусловлена недостаточным снижением уровня эозинофилов в легочной ткани. Полное удаление эозинофилов из легких позволит получить дополнительную информацию о роли указанных клеток в патогенезе астмы, и позволит разработать новую стратегию лечения.
Цели
Для оценки безопасности и биологической активности MEDI-563 (ранее известных, как BIW-8405) моноклональные антитела MEDI-563 (дефукозилированный гуманизированный IgGI анти-ИЛ-5Р), которые значительно повышают антитело-зависимую клеточную цитотоксичность, получали на фирме BioWa Inc. с использованием запатентованной технологии Potelligent. MEDI-563 подавляют активность ИЛ-5 и снижают уровень эозинофилов в тканях в доклинических моделях с приемлемым токсикологическим профилем.
Методы
В первую группу (BIW-8405-001) испытаний MEDI-563 с открытой этикеткой, которые впервые проводили на людях, были включены шесть субъектов с легкой формой астмы, которые не проходили курс лечения с использованием кортикостероидов. Пациентам вводили 0,03 мг/кг MEDI-563 в виде однократной внутривенной дозы, последующее введение проводили в день 84.
Результаты
MEDI-563 характеризуется высокой переносимостью и не оказывают существенного побочного действия. Все побочные действия (ПД) характеризуются умеренной интенсивностью, наиболее часто в качестве ПД отмечалась повышенная утомляемость на следующий день после введения дозы (у 3 из 6 субъектов). У всех 6 субъектов в течение 24-48 ч после введения дозы отмечается снижение числа эозинофилов в кровотоке ниже порога обнаружения (с учетом величины среднеквадратичного отклонения, рассчитанного до введения дозы). Указанное побочное действие сохранялось в течение 8-12 недель, у некоторых субъектов эозинофилы были обнаружены в день 58 после введения дозы, причем у всех обследуемых субъектов в день 84 после введения дозы уровень эозинофилов достигал ≥70% от исходного уровня. Число базофилов в кровотоке изменялось аналогичным способом. Как и ожидалось, с учетом механизма действия MEDI-563, в течение 72 ч после введения дозы уровень нейтрофилов снижался незначительно и постепенно, при этом развивалась нейтропения средней тяжести у 2 из 6 субъектов, интенсивность которой снижалась в течение 3 сут. Введение MEDI-563 сопровождалось повышением количества С-реакцивного белка в сыворотке крови (у 2 из 6 субъектов) и ИЛ-6 (у 2 из 3 субъектов) достаточно быстро (в течение 6 ч), до среднего уровня (<10× величины базовой линии) и постепенно (в течение <1 недели).
Выводы
Введение 0,03 мг/кг MEDI-563 в виде однократной внутривенной дозы индуцирует устойчивую эозинопению крови, причем указанная доза характеризуется приемлемым утвержденным в настоящее время профилем безопасности.
Пример 2
Опосредованная антителами клеточная цитотоксичность
Клетки-эффекторы КС 1333 (NK-клетки человека, сверхэкспрессирующие FcgRIIIa и FceRIg человека) инкубировали в течение 4 ч совместно с клетками-мишенями CTLL-2 (клеточная линия модифицированных методом генной инженерии клеток лимфомы мыши со сверхэкспрессией ИЛ-5Ра человека) в присутствии MEDI-563 или контрольных антител, при этом соотношение клетки-эффекторы/клетки-мишени составляло 5:1. Опосредованную антителами цитотоксичность оценивали методом окрашивания жизнеспособных клеток с использованием красителя кальцеин-АМ. Результаты представлены на фиг. 9А. Указанную методику использовали при анализе других контрольных препаратов (фукозилированные MEDI-563). Результаты представлены на фиг. 9Б.
Пример 3
Оценка равновесного связывания MEDI-563 с ИЛ-5Р методом плазменного поверхностного резонанса
on
off
D
В эксперименте использовали коммерческий препарат растворимого внеклеточного домена ИЛ-5Рα человека, который не связан с носителем (R+D Systems). Рекомбинантный чИЛ-5Рα иммобилизовали непосредственно на поверхность сенсорного чипа по стандартной методике через аминогруппы. Динамику связывания MEDI-563 с иммобилизованным чИЛ-5Ра контролировали по изменению коэффициента преломления, величины k, k, и K рассчитывали по стандартным методикам. Результаты представлены на фиг. 10.
Пример 4
Оценка равновесного связывания MEDI-563 с FcγRs методом плазменного поверхностного резонанса
on
off
D
MEDI-563 иммобилизовали непосредственно на поверхность сенсорного чипа по стандартной методике через аминогруппы. Динамику связывания растворимого FcγRs человека (фирма MedImmune) с иммобилизованными MEDI-563 контролировали по изменению коэффициента преломления, величины k, k, и K рассчитывали по стандартным методикам. Результаты представлены на фиг. 11.
Пример 5
Иммуногистохимический анализ экспрессии ИЛ-5Рα
Иссеченную ткань назального полипа фиксировали формальдегидом в течение 24 ч и заливали в парафин. Последовательно полученные срезы окрашивали для обнаружения ИЛ-5Рα, ИЛ-9Р, CCR3 и c-kit человека по стандартным методикам с использованием коммерческих поликлональных антител против ИЛ-5Р (R+D Systems, фирма Santa Cruz Biotechnology). Образцы легочной ткани трансгенных по ИЛ-9 мышей или штамма дикого типа, соответствующие образцам контрольных мышей FVB, фиксировали в формальдегиде в течение 24 ч и заливали в парафин. Для оценки экспрессии ИЛ-9Р (pAb, фирма Santa Cruz Biotechnology) и ИЛ-5Р (pAb, R+D Systems) срезы анализировали с использованием стандартных иммуногистохимических методов. Результаты представлены на фиг.12 и фиг. 13.
Пример 6
Связывание Medi-563 с эозинофилами цельной крови здоровых доноров
6
Гранулоциты выделяли из цельной крови здоровых доноров центрифугированием в градиенте плотности. Реагенты на основе первичных антител, содержащих метки, использовали для анализа экспрессии CD 16 (флурохром ФИТЦ) и MEDI-563 F(Ab)'2 (флурохром Alexa-647). Смесь CD16/ФИТЦ+MEDI-563/Alexa-647 или CD16/ФИТЦ+изотипическое контрольное антитело, с меткой Alexa-647, добавляли в препарат гранулоцитов в количестве 1 мкг на 10 клеток. После инкубирования на ледяной бане в течение 45 мин клетки трижды промывали холодным солевым раствором и анализировали связывание антител с поверхностью клеток методом проточной цитометрии. При этом анализировали также эозинофилы, которые не экспрессируют CD 16, а также определяли уровень связывания MEDI-563 с клетками популяции гранулоцитов, не экспрессирующих CD 16, по сравнению с уровнем связывания изотипических контрольных антител. Результаты представлены на фиг. 15.
Пример 7
Окрашивание лейкоцитов из трансгенных по ИЛ-5Рα мышей методом проточной цитометрии
Лейкоциты выделяли из крови, костного мозга, легких и селезенки трансгенных по ИЛ-5 мышей. Суспензии клеток окрашивали в буферном растворе ФСБ, содержащем 1% ЭТС. Для снижения уровня неспецифического связывания клетки перед окрашиванием инкубировали в течение 15 мин в присутствии реагента Fc Block (фирма BD Biosciences). В качестве антител использовали антитела против CCR3 мыши (R&D systems), против Siglec F мыши (фирма BD Biosciences) и против ИЛ-5Р мыши (Н7). Клетки окрашивали в течение 30 мин, при инкубировании на ледяной бане, затем дважды промывали, и фиксировали в буферном растворе cytofix (фирма BD Biosciences). Образцы анализировали методом проточной цитометрии на цитометре LSRII (фирма Becton Dickinson), с использованием программного обеспечения FACS Diva (фирма Becton Dickinson). Результаты анализировали с использованием программного обеспечения FlowJo (фирма TreeStar Inc.). Результаты представлены на фиг. 16А и фиг. 16Б.
Пример 8
Снижение числа позитивных по ИЛ-5Рα одноядерных клеток из костного мозга, опосредованное Medi-563
Замороженные одноядерные клетки из костного мозга (ОККМ, Lonza) размораживали, промывали, переносили в планшеты для культивирования клеток, и инкубировали в течение 2 ч при 37°С. После инкубирования одноядерные клетки из костного мозга, не прикрепившиеся к поверхности (НП-ОККМ), удаляли из планшетов. Для оценки ЗАКЦ (антитело-зависимой клеточной цитотоксичности) 100000 НП-ОККМ и 50000 клеток-эффекторов КС 1333 совместно инкубировали в течение 18 ч в 96-луночном планшете для культивирования клеток, при этом в каждую лунку добавляли 200 мкл суспензии указанных клеток (в качестве среды культивирования использовали среду RPMI 1640, содержащую 10% ЭТС и антитела Medi-563 в концентрации 10 мкг/мл). Отрицательные контрольные реакции проводили с использованием контрольных изотипических антител R347 с другой специфичностью. Для оценки ЗАКЦ клетки-эффекторы КС 1333 окрашивали красителем CFDA SE. После инкубирования в течение 18 ч клетки, содержащиеся в каждой реакционной смеси, трижды промывали теплой средой, добавляли окрашивающие антитела, и анализировали методом проточной цитометрии. Позитивные по ИЛ-5Рα клетки детектировали по окрашиванию первичными антителами КМ1257/конъюгатом ПЭ+вторичные козьи анти-Mu IgG Fcg антитела. Контрольное окрашивание образцов проводили с использованием первичных изотипических контрольных антител 1А7 в комбинации с конъюгатом ПЭ+вторичные козьи анти-Mu Fcg антитела. Окрашивание антителами и проточную цитометрию проводили по стандартным методикам. Число клеток, позитивных по ИЛ-5Рα, оставшихся в образце после оценки ЗАКЦ, оценивали подсчетом числа позитивных клеток КМ 1257 в гейте лимфоцитов. Окрашивание антителами и проточную цитометрию проводили с использованием калибровочной кривой, полученной с использованием трансгенных клеток клеточной линии CTLL-2, экспрессирующих ИЛ-5Рα человека. В результате зависимой от антител клеточной цитотоксичности, опосредованной MEDI-563, происходит практически полное удаление из образцов НП-ОККМ клеток, позитивных по ИЛ-5Рα. Результаты представлены на фиг. 17А и фиг. 17Б.
Пример 9
Снижение числа эозинофилов в периферической крови, опосредованное MEDI-563
В испытания MEDI-563 с открытой этикеткой включали две группы по шесть субъектов с легкой формой астмы. Субъектам из группы 1 и группы 2 вводили 0,03 мг/кг и 0,1 мг/кг MEDI-563, соответственно, в виде однократной внутривенной дозы. Уровни эозинофилов в периферической крови указанных субъектов определяли в день 0 до введения дозы с равными интервалами до дня 84 в следующий период обследования. Число эозинофилов в кровотоке определяли методом проточной цитометрии. У всех 6 субъектов в обеих группах число эозинофилов в кровотоке снижалось ниже уровня детектирования в течение 24 ч после введения дозы. Эозинопения, опосредованная MEDI-563, сохранялась на протяжении 8-12 недель. В группе 1 после введения 0,03 мг/кг MEDI-563 в виде однократной дозы у пяти субъектов, для которых испытания были завершены через 84 сут, у одного субъекта были обнаружены эозинофилы на детектируемом уровне в день 58, у трех субъектов в день 84, у пятого субъекта эозинофилы не детектировались в день 84. В группе 2 после введения 0,1 мг/кг MEDI-563 в виде однократной дозы ни у одного субъекта эозинофилы в кровотоке не детектировались в день 84. Однако в период обследования после испытаний у всех шести субъектов из второй группы в периферической крови были обнаружены эозинофилы. На фиг. 18А и 18Б представлено изменение уровней эозинофилов в периферической крови субъектов из первой и второй групп в зависимости от времени после введения MEDI-563 в виде однократной дозы.
Пример 10
Иммуногистохимичекий анализ клеток, экспрессирующих ИЛ-5Рα
Образцы легочной ткани здорового человека окрашивали MEDI-563 по стандартной гистохимической методике. Результаты представлены на фиг. 19 (клетки, экспрессирующие ИЛ-5Рα, окрашены черным цветом).
Образцы легочной ткани, полученные при бронхиальной или трансбронхиальной биопсии пациентов с диагнозом астма, окрашивали MEDI-563 по стандартной гистохимической методике. Результаты представлены на фиг. 20 (клетки, экспрессирующие ИЛ-5Рα, окрашены темно-серым/черным цветом).
Пример 11
MEDI-563 эффективно действует на изолированные базофилы и эозинофилы по данным анализа зависимой от антител клеточной цитотоксичности (ЗАКЦ)
Базофилы и эозинофилы получали от здоровых доноров, с использованием коммерческого набора RoboSep (набор для негативной селекции NK-клеток/эозинофилов/базофилов, фирма Stem Cell Technologies, Ванкувер, Канада). Экспрессию ИЛ-5Рα в изолированных клетках анализировали методом проточной цитометрии. Клетки окрашивали антителами MEDI-563 или изотипическими контрольными антителами с другой специфичностью по стандартным методикам. Окрашенные антителами клетки анализировали методом проточной цитометрии. Профили окрашивания представлены на фиг. 21. Согласно полученным данным интенсивность окрашивания изолированных базофилов и эозинофилов антителами MEDI-563 выше по сравнению с интенсивностью окрашивания изотипическими контрольными антителами. В качестве позитивного контроля использовали окрашенные трансгенные клетки, экспрессирующие ИЛ-5Рα/β человека.
-15
-7
50
Активность фукозилированных и дефукозилированных MEDI-563 оценивали in vitro методом ЗАКЦ с использованием изолированных эозинофилов и аутологичных NK-клеток. Эозинофилы и NK-клетки были получены от здоровых доноров, при этом использовали коммерческий набор RoboSep (набор для негативной селекции NK-клеток/эозинофилов/базофилов, фирма Stem Cell Technologies, Ванкувер, Канада). В указанном анализе использовали изолированные NK-клетки и эозинофилы в качестве клеток-эффекторов и клеток-мишеней в соотношении 5:1. В анализе использовали антитела в диапазоне концентраций от 10 М до 10 М. Клетки инкубировали в течение 24 ч, затем цитотоксичность оценивали методом проточной цитометрии при окрашивании красителем Annexin V. Уровень ЗАКЦ дефукозилированных MEDI-563 превышал уровень ЗАКЦ фукозилированных MEDI-563 на несколько порядков. Величина ЕС дефукозилированных MEDI-563 составляет 0,965 пМ. Результаты типичного эксперимента представлены на фиг. 22.
-15
-11
50
Активность дефукозилированных MEDI-563 оценивали in vitro методом ЗАКЦ с использованием изолированных базофилов и аутологичных NK-клеток. Базофилы и NK-клетки были получены от здоровых доноров, при этом использовали коммерческий набор RoboSep (набор для негативной селекции NK-клеток/эозинофилов/базофилов, фирмы Stem Cell Technologies, Ванкувер, Канада). При оценке ЗАКЦ выделенные NK-клетки и эозинофилы использовали в качестве клеток-эффекторов и клеток-мишеней в соотношении 5:1. В анализе использовали антитела в диапазоне концентрации от 10 М до 10 М. Клетки инкубировали в течение 24 ч, затем цитотоксичность оценивали методом проточной цитометрии, определяя уровень клеток, позитивных в отношении реагента Annexin V. В указанном анализе величина ЕС дефукозилированных MEDI-563 составляет 0,561 пМ. Результаты типичного эксперимента представлены на фиг. 23.
Пример 12
По данным анализа ЗАКЦ, опосредованной MEDI-563, эозинофилы не высвобождают цитотоксические гранулы
При анализе ЗАКЦ, опосредованной MEDI-563, оценивали дегрануляцию эозинофилов по уровню ПЭН (продуцируемого эозинофилами нейротоксина), высвобождаемого в супернатант. ЗАКЦ оценивали in vitro, как описано в примере 11. Эозинофилы и NK-клетки или ОКПК (одноядерные клетки из периферической крови) получали от здоровых доноров и использовали в качестве клеток-мишеней и клеток-эффекторов, соответственно. Анализ проводили с использованием фукозилированных MEDI-563, дефукозилированных MEDI-563 или контрольных изотипических дефукозилированных антител R347. Максимальный уровень дегрануляции детектировали при обработке эозинофилов 1% тритоном Х-100, при этом концентрация ПЭН составляла >220 нг/мл. Результаты типичных экспериментов представлены на фиг. 24. В результате ЗАКЦ, опосредованной MEDI-563, уровни ПЭН снижались до менее 25 нг/мл (базовая линия). MEDI-563 в концентрации 33 мкг/мл или 100 мкг/мл или указанные фукозилированные антитела не оказывали существенного действия на уровни дегрануляции.
Пример 13
Картирование эпитопа, с которым связывается MEDI-563
MEDI-563 специфично связывались с трансгенными клетками, экспрессирующими ИЛ-5Рα человека, MEDI-563 не связывались с клетками, экспрессирующими ИЛ-5Рα мыши (см. фиг. 25Б и фиг. 26В). Аминокислотные последовательности ИЛ-5Рα человека и мыши характеризуются очень высокой степенью гомологии. Специфичность связывания MEDI-563 с эпитопом определяли по связыванию MEDI-563 с использованием широкой панели гибридных (мыши/человека) ИЛ-5Рα (см. фиг. 25-27). В экспериментах использовали трансгенные клетки, на поверхности которых экспрессируются гибридные ИЛ-5Рα. Трансгенные конструкты получали и экспрессировали по стандартной методике. Связывание антител с гибридным ИЛ-5Рα, который экспрессируется на поверхности трансгенных клеток, анализировали методом проточной цитометрии. Профили флуоресцентного окрашивания представлены на фиг. 25-27. ʺПоликлональные антителаʺ и ʺMEDI-563ʺ обозначают профили окрашивания, наблюдаемые при использовании поликлональных антител против ИЛ-5Рα человека и MEDI-563, соответственно. В то время как MEDI-563 специфично связывались с одним эпитопом в составе ИЛ-5Рα человека, поликлональные антитела связывались с множеством эпитопов в составе ИЛ-5Рα человека (см. фиг. 25Б и фиг. 26В). ʺДвойное окрашиваниеʺ обозначает профиль флуоресцентного окрашивания с использованием поликлональных антител (ось x) и MEDI-563 (ось y).
Во-первых, эпитоп, с которым связываются MEDI-563, картировали в отношении фрагмента внеклеточного домена D1 рецептора ИЛ-5Рα. ИЛ-5Рα включает 3 внеклеточных домена (D1, D2 и D3), трансмембранный домен и внутриклеточный домен (см. фиг. 25А). Так как MEDI-563 связывались с ИЛ-5Рα интактных клеток, эпитоп, с которым они связываются, должен располагаться в одном из внеклеточных доменов. Для картирования эпитопа в одном из трех внеклеточных доменов, с которым связываются MEDI-563, были получены трансгенные клетки, экспрессирующие гибридные ИЛ-5Рα, включающие внеклеточные домены рецепторов мыши и человека, по стандартной методике молекулярного клонирования. Схематичное изображение гибридных белков, использованных в экспериментах, представлено на фиг. 25А. ʺНокаутныеʺ варианты гибридных ИЛ-5Рα представляют собой рецепторы, включающие один внеклеточный домен рецептора мыши в составе основной последовательности рецептора человека. ʺНокинныеʺ варианты гибридных ИЛ-5Рα представляют собой рецепторы мыши, включающие один внеклеточный домен рецептора человека в составе основной последовательности рецептора мыши.
На фиг. 25Б-В представлены результаты типичного эксперимента. MEDI-563 и поликлональные антитела окрашивали трансгенные клетки, экспрессирующие ИЛ-5Рα человека, при этом ни одно из указанных антител не окрашивало трансгенные клетки, экспрессирующие ИЛ-5Рα мыши (см. фиг. 25Б). MEDI-563 не связывались с трансгенными клетками, экспрессирующими гибридный ИЛ-5Рα, включающий D1 домен рецептора мыши и внеклеточные домены D2-D3 рецептора человека (см. фиг. 25В, ʺнокаутный по D1ʺ). MEDI-563 специфично связывались с трансгенными клетками, экспрессирующими гибридный ИЛ-5Рα, включающий внеклеточные домены D2 или D3 мыши в составе основной последовательности рецептора человека (см. фиг. 25В, ʺнокаутные по D2 или D3ʺ). MEDI-563 специфично связывались с трансгенными клетками, экспрессирующими гибридный ИЛ-5Рα, включающий внеклеточный домен D1 рецептора человека и внеклеточные домены D2-D3 рецептора мыши (см. фиг. 25Г, ʺнокинные по D1ʺ). MEDI-563 не связывались с трансгенными клетками, экспрессирующими гибридный ИЛ-5Рα мыши, включающий внеклеточный домен D2 или D3 рецептора человека (см. фиг. 25Г, ʺнокинный по D2 или D3ʺ). Все клетки, экспрессирующие гибридный ИЛ-5Рα, содержащий, по меньшей мере, один внеклеточный домен рецептора человека, окрашивались поликлональными антителами против ИЛ-5Рα человека, что свидетельствовало о том, что различие в картине окрашивания образцов трансгенных клеток антителами MEDI-563 не связано с различиями уровней экспрессии гибридного белка.
Во-вторых, эпитоп MEDI-563 располагается в сегменте В внеклеточного домена D1 рецептора ИЛ-5Рα человека (см. фиг. 26). Внеклеточный домен D1 рецептора ИЛ-5Рα подразделяется на три сегмента (см. фиг. 26А, сегменты А, В и С). Были получены серии трансгенов гибридных ИЛ-5Рα человека/мыши, включающие различные комбинации сегментов внеклеточного домена D1 человека и мыши. Гибридные белки, использованные на данном этапе, включали все аминокислотные последовательности внеклеточного домена D 1 рецептора человека. ʺНокаутныеʺ трансгены представляют собой гибридные конструкты ИЛ-5Рα, включающие один сегмент внеклеточного домена D1 рецептора мыши в составе основной последовательности рецептора человека. ʺНокинныеʺ трансгены представляют собой гибридные конструкты ИЛ-5Рα, включающие один сегмент внеклеточного домена D1 рецептора человека в составе основной последовательности рецептора мыши D1 человека/D2 мыши/D3-ТМ мыши (см. фиг. 26Б). На фиг. 26В представлен результат контрольного эксперимента. MEDI-563 специфично связывались с трансгенными клетками, экспрессирующими: (1) ИЛ-5Рα человека, или (2) гибридный ИЛ-5Рα мыши, включающий внеклеточный домен D1 рецептора человека (ʺИЛ-5Рα человекаʺ и ʺнокинный по D1ʺ). MEDI-563 не связывались с трансгенными клетками, экспрессирующими: (1) ИЛ-5Рα мыши, или (2) гибридный ИЛ-5Рα человека, включающий внеклеточный домен D1 рецептора мыши (ʺИЛ-5Рα мышиʺ, ʺнокаутный по D1ʺ). На фиг. 26Г и 26Д представлен результат типичного эксперимента по картированию. MEDI-563 не связывались с трансгенными клетками, экспрессирующими гибридный ИЛ-5Рα, включающий сегмент В внеклеточного домена D1 рецептора мыши в составе основной последовательности рецептора человека (ʺнокаутный по Вʺ), MEDI-563 специфично связывались с трансгенными клетками, экспрессирующими гибридный ИЛ-5Рα, включающий сегмент А или С внеклеточного домена D1 рецептора мыши в составе основной последовательности рецептора человека (ʺнокаутный по Аʺ, ʺнокаутный по Сʺ), На фиг. 26Д представлен пример результатов экспериментов, в которых использовали ʺнокинныеʺ конструкты. MEDI-563 специфично связывались с трансгенными клетками, экспрессирующими гибридный ИЛ-5Рα, включающий сегмент В внеклеточного домена D1 рецептора человека в составе основной последовательности рецептора мыши D1 человека/D2 мыши/D3-TM мыши (ʺнокинный по Вʺ). MEDI-563 не связывались с трансгенными клетками, экспрессирующими гибридный ИЛ-5Рα, включающий сегмент А или С внеклеточного домена D1 рецептора человека в составе основной последовательности рецептора мыши D1 человека/D2 мыши/D3-TM мыши (ʺнокинный по А или Сʺ), Все клетки, экспрессирующие гибридный ИЛ-5Рα, окрашивались поликлональными антителами против ИЛ-5Рα человека, что свидетельствует о том, что различие в картине окрашивания образцов трансгенных клеток антителами MEDI-563 не связано с различием уровня экспрессии гибридного белка.
В-третьих, эпитоп MEDI-563 располагается в сегменте В1 внеклеточного домена D1 рецептора ИЛ-5Рα человека. Были получены серии вариантов рецептора ИЛ-5Рα, включающих, по меньшей мере, один мутантный аминокислотный остаток в сегменте В1 внеклеточного домена D1, которые экспрессировались в трансгенных клетках. Положение мутантных остатков выбирали, сравнивая аминокислотную последовательность белка человека и мыши. Схематичное изображение вариантов белков, использованных в экспериментах, представлено на фиг. 27А. ʺНокаутныеʺ варианты ИЛ-5Рα представляют собой мутантные белки человека, включающие, по меньшей мере, одну замену аминокислотного остатка белка человека на соответствующий остаток белка мыши. Например, вариант, ʺнокаутный по DEʺ, представляет собой ИЛ-5Рα человека, включающий замены аминокислот D56E и E58D. ʺНокинныеʺ варианты ИЛ-5Рα представляют собой гибридные белки, включающие D1 мыши, D2 человека, D3 мыши и ТМ домены мыши, где домен D1 рецептора мыши включает мутантный сегмент В, содержащий, по меньшей мере, одну замену аминокислотного остатка рецептора мыши на соответствующий остаток рецептора человека. Например, вариант, ʺнокинный по DEʺ, представляет собой гибридный ИЛ-5Рα, включающий мутантный сегмент В рецептора мыши в составе основной последовательности рецептора мыши D1 человека/D2 мыши/D3-TM мыши, где мутантный сегмент В рецептора мыши включает замены аминокислот E56D и D58E. На фиг. 27Б представлены результаты экспериментов, в которых использовали ʺнокаутныеʺ конструкты. MEDI-563 не связывались с трансгенными клетками, экспрессирующими мутантный ИЛ-5Рα человека, включающий замены аминокислот K53Q, D56E, E58D, I61K (ʺнокаутные по KDEIʺ), MEDI-563 специфично связывались с трансгенными клетками, экспрессирующими мутантный ИЛ-5Рα человека, включающий замены аминокислот N40H, N42D, Q46H (ʺнокаутные по NNQʺ) или D56E, E58D (ʺнокаутные по DEʺ), или N40H, N42D, D56E, E58D (ʺнокаутные по NNDEʺ). На фиг. 27В представлены примеры результатов, которые получены при использовании нокинных конструктов. MEDI-563 специфично связывались с трансгенными клетками, экспрессирующими вариант ИЛ-5Рα, включающий мутантный сегмент В домена D1 рецептора мыши, включающий замены аминокислот Q53K, E56D, D58E, K61I (ʺнокинные по KDEIʺ). На фиг. 27Г представлен пример результатов, которые получены при использовании нокаутных конструктов. MEDI-563 не связывались с трансгенными клетками, экспрессирующими мутантный ИЛ-5Рα человека, включающий замену аминокислот I61K (ʺнокаутный по I61ʺ). MEDI-563 специфично связывались с клетками, экспрессирующими мутантный ИЛ-5Рα человека, включающий замену аминокислот K53Q (ʺнокаутный по К53ʺ). (Д) На фиг. 27Д представлен пример результатов, которые получены при использовании нокинных конструктов. MEDI-563 специфично связывались с трансгенными клетками, экспрессирующими вариант ИЛ-5Рα, включающий мутантный сегмент В домена D1 рецептора мыши, включающий замену аминокислот K61I (ʺнокинный по 161ʺ). MEDI-563 не связывались с трансгенными клетками, экспрессириющими вариант ИЛ-5Рα включающий мутантный сегмент В домена D1 рецептора мыши, включающий замену аминокислоты Q53K (ʺнокинный по К53ʺ). Все клетки, экспрессирующие гибридный ИЛ-5Рα, окрашивались поликлональными антителами против ИЛ-5Рα человека, что свидетельствует о том, что различие в картине окрашивания образцов трансгенных клеток антителами MEDI-563 не связано с различиями уровней экспрессии гибридного белка.
Пример 14
Оценка снижения числа эозинофилов в различных тканях организма при анализе in vivo
Эффективность селективного снижения числа эозинофилов в различных тканях, опосредованного дефукозилированными антителами против ИЛ-5Рα мыши (afuc H7), оценивали in vivo по сравнению с фукозилированными антителами H7 (fuc H7).
Методы
Моноклональные антитела H7
Вариабельные участки антител H7 присоединяли (прививали) к hIgG1 Fc (Fc-фрагмент hIgG1). Антитела fuc H7 экспрессировали в клетках СНО дикого типа, антитела afuc H7 в клетках СНО, дефицитных по гену FUT8.
Оценка аффинности антител (KD)
Аффинность антител оценивали методом плазменного поверхностного резонанса.
Мыши
В испытаниях использовали трансгенных по ИЛ-5 мышей, а также мышей BALB/c в возрасте 6-8 недель.
Снижение числа эозинофилов у мышей ИЛ-5Tg
Мышам вводили внутрибрюшинно 0,01-10 мг/кг afuc H7 и fuc H7, и оценивали число эозинофилов через 48 ч.
Индукция аллергического воспаления дыхательных путей
Мышей BALB/c сенсибилизировали к овальбумину (ОА), включенному в квасцы, ответная реакция на введение ОА развивалась в дни 17-22. В день 22 мышам вводили 0,1 мг/кг afuc H7 (внутрибрюшинно), и анализ проводили через 1 ч, 24 ч и 72 ч после введения последней сенсибилизирующей дозы. Полученные результаты соответствовали состоянию после лечения с использованием антител через 25, 48 и 96 ч.
Получение лейкоцитов
1. Получение лейкоцитов из крови
Образцы крови получали пункцией из сердца и хранили в гепаринизированных пробирках. Лейкоциты крови фенотипировали на гематологическом анализаторе Sysmex (фирма Sysmex Corp.) или методом проточной цитометрии.
2. Получение клеток из просвета дыхательных путей
Проводили лаваж дыхательных путей (3×0,6 мл буферного раствора ФСБ). Образцы бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ) центрифугировали при 1200 об/мин, супернатант удаляли, и клетки ресуспендировали в среде RPMI. Клетки подсчитывали с использованием счетчика частиц Coulter Z2 (фирма Beckman-Coulter), и сортировали в зависимости от фенотипа клеток методом проточной цитометрии.
3. Получение клеток из легочной ткани
Долю легкого инкубировали в течение 1 ч при 37°С в среде RPMI, содержащей 10% ЭТС, в присутствии реагента для дезинтеграции (18 мкг/мл либеразы (Blenzyme 2, фирма Roche), 25 мкг/мл ДНКазы (тип 1, фирма Roche)). Полученные клетки отделяли фильтрованием через нейлоновые фильтры с диаметром пор 70 мкм (фирма Falcon), дважды промывали, подсчитывали, и сортировали в зависимости от фенотипа клеток, как описано для БАЛ.
4. Получение клеток из костного мозга
В эксперименте использовали бедренные кости мыши, из которых костный мозг вымывали струей буферного раствора ФСБ (не содержащего кальций/магний), используя шприц с иглой размером 25. Полученную суспензию перемешивали с использованием шприца с иглой размером 22 до получения суспензии, содержащей дискретные клетки костного мозга. Клетки костного мозга отделяли центрифугированием в течение 5 мин при 1200 об/мин, дважды промывали буферным раствором ФСБ (не содержащего добавки), ресуспендировали в среде RPMI, подсчитывали, и сортировали в зависимости от фенотипа клеток методом проточной цитометрии.
5. Получение клеток из селезенки
У субъекта удаляли селезенку, и получали суспензию, содержащую дискретные клетки, используя нейлоновый фильтр с диаметром пор 70 мкм. Лейкоциты ресуспендировали в среде RPMI, подсчитывали, и сортировали в зависимости от фенотипа клеток, как описано для БАЛ.
Проточная цитометрия
Клетки сортировали в зависимости от их фенотипа методом проточной цитометрии, при этом использовали антимышиные антитела против CD4, CD19, CD11b, Siglec-F, Gr-1, ИЛ-5Р, c-kit (фирма BD Biosciences), FcεR1 (фирма Biosciences) и CCR-3 (фирма R&D Systems), в качестве контрольных антител использовали соответствующие изотипические антитела. Образцы анализировали на проточном цитометре LSRII, при этом использовали программное обеспечение FACS DIVA (фирмы BD Biosciences). Полученные результаты анализировали с использованием программного обеспечения FlowJo (фирмы TreeStar Corp.)
Идентификация эозинофилов
Эозинофилы идентифицировали методом проточной цитометрии в виде клеток с высоким боковым светорассеянием, которые позитивно окрашивались антителами к CCR3 и Siglec-F.
Результаты
ИЛ-5Р селективно экспрессируется эозинофилами костного мозга, крови, селезенки и легочной ткани мышей IUI-5Tg. ИЛ-5Р экспрессируется только эозинофилами и не детектируется в любых клетках другого типа, включая тучные клетки и базофилы. Антитела против ИЛ-5Р селективно снижали число эозинофилов в селезенке, легочной ткани и крови мышей ИЛ-5Tg. Дефукозилированные (afuc H7) и фукозилированные (fuc H7) антитела против ИЛ-5Р не снижали число нейтрофилов (Gr-1hi), макрофагов/моноцитов (CD11b+), Т-клеток (CD3+), В-клеток (CD19+). Антитела afuc H7 и fuc H7 снижали число эозинофилов в селезенке, легочной ткани и крови мышей ИЛ-5Tg. Снижение числа указанных клеток в костном мозге не наблюдалось. Антитела afuc H7 более эффективны при удалении эозинофилов по сравнению с антителами fuc H7, прежде всего при использовании низких доз антител.
Антитела afuc H7 также селективно снижали число эозинофилов в модели индукции аллергеном. Антитела afuc H7 снижали число эозинофилов в просвете дыхательных путей, легочной ткани, крови и костном мозге. Снижение составляло максимальную величину во всех отделах организма через 72 ч после последней индукции (96 ч после доставки антител).
Хотя настоящее изобретение описано со ссылкой на конкретные варианты его осуществления, для специалиста в данной области техники представляется очевидным, что в пределах сущности и объема изобретения возможны различные изменения указанных вариантов.
Все публикации, патенты и патентные заявки, цитированные в описании, включены в описание в качестве ссылки в каждом случае в той же степени, как, если бы каждый патент, патентная заявка и публикация цитировались отдельно. Кроме того, патентные заявки US 60/924422 (зарегистрирована 14 мая 2007 г.), US 60/924832 (зарегистрирована 1 июня 2007 г.), US 60/935005 (зарегистрирована 20 июля 2007 г.) и US 61/064612 (зарегистрирована 14 марта 2008 г.) включены в описание в качестве ссылок в полном объеме.