Экспериментальная оценка эффективности гелевых форм раневых покрытий, содержащих биологически активные вещества из морских гидробионтов

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ГЕЛЕВЫХ ФОРМ РАНЕВЫХ ПОКРЫТИЙ, СОДЕРЖАЩИХ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ВЕЩЕСТВА ИЗ МОРСКИХ ГИДРОБИОНТОВ

Кузнецова Т.А.1, Беседнова Н.Н.1, Ковалев Н.Н.1, Сомова Л.М.1, УДК: 616-001.4:615.32

Земляной А.Б.2, Усов В.В.3

1 Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова, Владивосток

2 Национальный медико-хирургический Центр им. Н.И. Пирогова, Москва

3 Дальневосточный федеральный университет, Владивосток

Резюме

Представлены данные по экспериментальному изучению гелевых форм раневых покрытий на основе хитозана и альгината кальция, содержащих биологически активные вещества из морских гидробионтов. На модели термического ожога показано выраженное влияние испытуемых образцов гелевых покрытий на заживление ран, приведены данные планиметрических и патоморфологических исследований, свидетельствующие об ускорении регенераторных процессов в ране. Наибольшая активность выявлена у геля с пептидами из нервных ганглиев головоногих моллюсков.

Ключевые слова: термический ожог, гелевые покрытия, биологически активные вещества из морских гидробионтов, хитозан, альгинат.

EXPERIMENTAL EVALUATION OF THE EFFECTIVENESS OF GEL FORM WOUND DRESSINGS CONTAINING BIOLOGICALLY ACTIVE SUBSTANCES FROM MARINE HYDROBIONTS

Kuznetsova T.A. , Besednova N.N. , Kovalev N.N. , Somova L.M. , Zemlianoi A.B., Usov V.V.

The article represents the data on experimental testing of gel forms wound dressings based on chitosan and calcium alginate and containing biologically active substances from marine hydrobionts. On the models of thermal burn we revealed the wound healing activity of tested samples of the gels and provided the planimetric and pathomorphological evidences of acceleration the regenerative processes in the wound. The gel containing peptides from squid nerve revealed the most wound healing activity.

Keywords: thermal burn, gel wound dressings, biologically active substances, marine hydrobionts, chitosan, alginate.

Разработка новых биосовместимых и биодегради-руемых материалов для эффективного лечения ран не теряет своей актуальности, несмотря на широкий арсенал используемых в медицине перевязочных средств и, в частности, в восстановительной и реконструктивной хирургии при лечении дефектов покровных тканей, вызванных различными повреждениями (механические травмы, ожоги и др.). В настоящее время разрабатываются медицинские изделия на основе биодеградируемых и биосовместимых с организмом полимеров: альгината, хитозана, коллагена, желатина, полиоксибутиратов и их сополимеров, которые также являются эффективными биостимуляторами, исключающими при этом иммунологическое отторжение [2, 3]. Анализ зарубежного и российского рынка свидетельствует о наличии большого ассортимента раневых покрытий, среди которых покрытия на основе альгината и хитозана, в том числе содержащие биологически активные компоненты различной химической природы (антибиотики, антисептики, антиоксиданты, ферменты, факторы роста, серебро, пчелиный воск и пр.). Покрытий, в состав которых помимо вышеперечисленных входили бы биологически активные вещества (БАВ) из морских гидробионтов, среди используемых на практике нами не обнаружено, хотя во всем мире проводятся интенсивные исследования в этом направлении [3, 6, 9, 10].

В этом аспекте нами предпринята работа по конструированию линейки раневых покрытий на основе хитозана и кальциевой соли альгиновой кислоты, содержащих в качестве биологически активных компонентов БАВ из морских гидробионтов. Поливалентность действия предлагаемых нами новых покрытий обусловлена их структурными особенностями и использованием оригинальных БАВ с широким спектром фармакологического действия.

Цель работы - оценка эффективности гелевых покрытий на основе хитозана и альгината кальция, содержащих БАВ из морских гидробионтов (сульфатиро-ванные полисахариды из бурых водорослей, гидролизат из двустворчатых моллюсков, пептиды из нервных ганглиев головоногих моллюсков), на модели термического ожога.

Материалы и методы

Эффективность гелевых покрытий изучали на модели ожоговой раны III степени. В эксперименте использовали неинбредных мышей-самцов массой 22-25 г, которым наносили термический ожог медным стержнем с плоским торцом диаметром 1 см, нагретым на кипящей водяной бане, который на 10 с прижимали к выбритому участку кожи в межлопаточной области. Экспериментальные исследования выполнены с соблюдением правил и

международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных работах, выведение животных из эксперимента осуществляли с использованием эфирного наркоза.

В исследовании были использованы 72 мыши, которые были разделены на 6 групп (по 12 в каждой). Были сформированы 3 контрольных группы: животным 1 группы лечение не проводилось, животным 2 группы местно применяли гель на основе хитозана и кальциевой соли альгиновой кислоты (гель), в 3 группе для лечения использовали мазь «Левомеколь» («Нижфарм», Россия). Также были сформированы три опытных группы животных, которым местно применяли гель с добавками БАВ: сульфатированных полисахаридов из бурых водорослей (ламинария японская) (4 группа); гидролизата из мантии двустворчатых моллюсков (гребешок приморский) (5 группа); пептидов из нервных ганглиев головоногих моллюсков (кальмара командорского) (6 группа). Лечение животных начинали сразу после нанесения ожога.

Осуществляли визуальное наблюдение за динамикой раневого процесса.

Планиметрические измерения проводили на 3, 7 и 10 сутки, определяли площадь раневой поверхности и рассчитывали показатель заживления ран в процентах по формуле: [^ ожога в 1 сутки - S ожога на текущие сутки) X 100%] : S ожога в 1 сутки.

В эти же сроки производили биопсию ткани на границе раневого дефекта для патоморфологическо-го исследования. Образцы ткани фиксировали в 10% нейтральном растворе забуференного формалина. Обработку материала и заливку в парафин осуществляли по стандартной методике, срезы окрашивали гематоксилином и эозином.

Статистическую обработку цифровых данных проводили с помощью пакета программы <^а^ка-7». Использовали непараметрический критерий Манна-Уитни (для сравнения независимых выборок).

Результаты и обсуждение

Результаты визуального наблюдения показали, что у животных контрольной и опытных групп ожоговый струп формировался к исходу 2-х суток. В динамике исследования обнаружено, что у животных всех опытных групп отторжение ожогового струпа за счет краевой эпителизации начиналось на 7-8-е сутки, что на 2-3 суток раньше, чем в контрольных группах.

При сравнительном изучении планиметрических показателей в контрольных и опытных группах выявлено, что применение гелевых покрытий с БАВ оказывало более выраженное лечебное воздействие. Начиная с 3-х суток после нанесения ожоговой раны, во всех опытных группах животных выявлены статистически значимые различия по сравнению с контрольными, а в 5 и 6 группах эти различия сохранялись до появления эпителизации на 7 сутки (таблица 1).

Табл. 1. Ранозаживляющая активность гелей на основе хитозана и альгината кальция, содержащих БАВ из морских гидробионтов, на модели термического ожога у мышей

Группы животных Показатель заживления ожоговой раны, %

3 сутки 7 сутки 10 сутки

1. Контроль(без лечения) 21,4 ± 7,1 49,3 ± 3,5 75,7 ± 6,1

2. Контроль (гель) 23,4 ± 7,3 р2-1 > 0,05 54,5 ± 7,9 р2-1 > 0,05 81,3 ± 7,3 р2-1 > 0,05

3. Контроль («Левомеколь») 20,7 ± 7,5 р3-1 > 0,05 р3-2 > 0,05 57,4 ± 4,2 р3-1 < 0,05 р3-2 > 0,05 78,9 ± 6,2 р3-1 > 0,05 р3-2 > 0,05

4. Гель, содержащий сульфатированные полисахариды из бурых водорослей 38,3 ± 6,7 р4-1 < 0,05 р4-2 < 0,05 р4-3 < 0,05 р4-5 > 0,05 р4-6 < 0,05 53,4 ± 7,4 р4-1 > 0,05 р4-2 > 0,05 р4-3 > 0,05 р4-5 < 0,05 р4-6 < 0,05 82,9 ± 3,75 р4-1 > 0,05 р4-2 > 0,05 р4-3 > 0,05 р4-5 > 0,05 р4-6 > 0,05

5. Гель, содержащий гидролизат двустворчатых моллюсков 40,0 ± 6,2 р5-1 < 0,05 р5-2 < 0,05 р5-3 < 0,05 р5-4 > 0,05 р5-6 > 0,05 73,1 ± 4,8 р5-1 < 0,05 р5-2 < 0,05 р5-3 > 0,05 р5-4 > 0,05 р5-6 > 0,05 84,3 ± 3,01 р5-1 > 0,05 р5-2 > 0,05 р5-3 > 0,05 р5-4 > 0,05 р5-6 > 0,05

6. Гель, содержащий пептиды из нервных ганглиев головоногих моллюсков 47,0 ± 9,7 р6-1 < 0,05 р6-2 < 0,05 р6-3 < 0,05 р6-4 < 0,05 р6-5 > 0,05 79,4 ± 9,4 р6-1 < 0,05 р6-2 < 0,05 р6-3 > 0,05 р6-4 < 0,05 р6-5 > 0,05 90,7 ± 5,6 р6-1 < 0,05 р6-2 > 0,05 р6-3 > 0,05 р6-4 > 0,05 р6-5 > 0,05

Показатели: IV! ± m; п = 6; (использовали критерий Манна-Уитни для независимых малых выборок).

При сравнительном исследовании эффективности покрытий, применяемых в опытных группах, выявлено, что наиболее значимые результаты были получены при использовании геля с пептидами из нервных ганглиев головоногих моллюсков (6 группа). Так, уже на 7-е сутки с момента начала лечения у животных этой группы площадь раневого дефекта была существенно меньше, чем в 4 и 5 группах (р < 0,05). На 10-е сутки у большинства животных 6 группы наступала полная эпителизация ран, в то время как в 4 и 5 группах площадь дефекта оставалась до 16-18% от первоначального размера раны (таблица).

Результаты визуального контроля и планиметрического исследования были подтверждены патоморфоло-гическими методами. Наиболее выраженные изменения гистологической картины, характеризующие эффективность ранозаживления, также были выявлены у животных 6 группы.

Так, на 7-е сутки после нанесения ожога (рис. 1) у нелеченных животных (1 группа) в коже обнаружены значительные экссудативные явления с образованием многочисленных крупных пузырей, дезорганизация слоев эпидермиса и отслоение его от дермы, диапедезные кровоизлияния и цитолиз мышечных волокон, волосяные луковицы не визуализировались (рис. 1а). У животных, леченных гелем (2 группа), явления отека кожи и пузыре-образование под эпидермисом были менее выраженными по сравнению с 1 группой, выявлены многочисленные

Рис. 1. Патоморфологические изменения в коже при термическом ожоге у мышей, 7 сутки: а - деструктивно-воспалительные изменения с образованием многочисленных крупных пузырей, отслоением эпидермиса от дермы (1 группа), х100; б - новообразованные капилляры, распространенная клеточная реакция в дерме с участием лейкоцитов и соединительнотканных клеток (2 группа), х200; в - выраженный отек кожи с наличием многочисленных пузырей и повреждение эпидермиса (3 группа), х200; г - полиморфноклеточ-ная инфильтрация дермы (6 группа), х200. Окраска гематоксилином и эозином

В

Рис. 2.

Патоморфологические изменения в коже при термическом ожоге у мышей, 10 сутки: а - полиморфно-клеточная реакция с преобладанием лейкоцитов в дерме (1 группа), х100; б - отчетливая фибро-бластная реакция (2 группа), х200; в - лейкоцитарная инфильтрация в дерме (3 группа), х200; г - регенерация эпителиального пласта, обильная клеточная пролиферация преимущественно соединительнотканных элементов (6 группа), х200. Окраска гематоксилином и эозином

новообразованные капилляры, диффузная клеточная реакция преимущественно за счет лейкоцитов (рис. 1б). У животных, леченных мазью «Левомеколь» (3 группа), наблюдался выраженный отек кожи и повреждение эпидермиса, лейкоцитарная инфильтрация дермы (рис. 1в). В этот же срок у животных, леченных гелем, содержащим пептиды из нервных ганглиев головоногих моллюсков (6 группа), обнаружены умеренный отек кожи без наличия пузырей и полиморфноклеточная инфильтрация дермы (рис. 1г).

На 10-е сутки после нанесения ожога (рис. 2) у животных 6 группы, леченных гелем с добавлением пептидов из нервных ганглиев головоногих моллюсков, наблюдалась обильная клеточная пролиферация за счет преимущественно соединительнотканных элементов, относительно большее количество клеток фибробла-стического ряда, образование молодого эпителиального пласта (рис. 2г), что свидетельствовало об ускорении развития регенераторных процессов по сравнению как с контрольными, так и с другими опытными группами животных (рис. 2а, б, в).

Использование раневых покрытий на основе геля хитозана и кальциевой соли альгиновой кислоты является обоснованным. Такие гели имеют устойчивую консистенцию, обладают пластичностью, удобны для нанесения на раневую поверхность. Основу геля составляют биодеградируемые полимеры хитозан и кальциевая соль альгиновой кислоты. Хитозаны, являясь природным продуктом, безопасны и совместимы с тканями организма [3], обладают высокой сорбционной способностью, а

также иммуномодулирующей, антикоагулянтной, анти-тромбогенной, бактерицидной активностью, проявляют противовоспалительное действие [5, 14]. Важным свойством хитозана является его положительное влияние на процессы заживления в ранах [8]. Альгинат кальция, составляющий основу геля, как водорастворимый полисахарид, хорошо адсорбирует раневой экссудат и подобно хитозану обладает высокой биологической активностью, в том числе способствуя ускорению процессов регенерации и эпителизации [4, 7, 13]. В связи с этим альгинаты являются идеальными кандидатами в качестве основы перевязочных материалов в составе медицинских гидрогелей. Обладая высокой гидрофильностью и биосовместимостью, они могут быть использованы для лечения разнообразных раневых дефектов с умеренной и обильной экссудацией, например, язв, ожогов, пролежней и хирургических ран [4]. Многочисленные клинические и экспериментальные данные показывают, что эффективность лечения ран гидрогелями может быть улучшена путем включения в их состав факторов роста и биологически активных веществ [7, 11, 12], которые благодаря свойствам этих гелей могут выделяться в рану и оказывать свое действие в течение длительного времени. Это было учтено нами при разработке комбинаций гелевых покрытий. В качестве БАВ в состав гелей нами были введены сульфатированные полисахариды из бурых водорослей, гидролизат из двустворчатых моллюсков, пептиды из нервных ганглиев головоногих моллюсков, несущие огромный потенциал фармакологической активности, включая иммуномодулирующее,

антиоксидантное, антиадгезивное, антикоагулянтное, противовоспалительное, антиинфекционное действие [1]. Сочетание этих свойств обеспечивает оптимизацию течения раневого процесса в ожоговой ране. Было выявлено, что наиболее выраженное влияние на процессы регенерации оказывают пептиды из нервных ганглиев головоногих моллюсков в составе геля.

Полученные результаты позволяют рекомендовать гели с БАВ в качестве основы для разработки линейки раневых покрытий для лечения дефектов покровных тканей различного генеза (механические травмы, ожоги и др.) с целью возможного применения в хирургической практике.

Заключение

Таким образом, нами разработаны гелевые формы перспективных биосовместимых раневых покрытий на основе БАВ из морских гидробионтов, обеспечивающие комплексное оптимизирующее воздействие на течение раневого процесса. Сочетание свойств компонентов, входящих в состав гелей, обеспечивает ускорение процессов регенерации. Данные планиметрических и пато-морфологических исследований показали их способность стимулировать регенераторные процессы и ускорять заживление ран. Наилучший эффект выявлен под действием геля, содержащего пептиды из нервных ганглиев головоногих моллюсков.

5. Chitin and Chitosan Derivatives: Advances in Drug Discovery and Developments / Ed. by Se-Kwon K. Taylor & Francic Group LLC Boca Raton FL. 2013. - 527 p.

6. Jones A. Hydrogel dressing in the management of a variety of wound types: a review / A. Jones, D. Vaughan // J. Orthop. Nurs. - 2005. - Vol. 9. - P. 51-60.

7. Murakam K. Hydrogel blends of chitin/chitosan, fucoidan and alginate as healing-impaired wound dressings / K. Murakami, H. Aoki, S. Nakamura et al. // Biomaterials. - 2010. - Vol. 31. - P. 83-90.

8. Novel Chitin and Chitosan Materials in Wound Dressing, Biomedical Engineering, Trends in Materials Science / Ed. by Mr Anthony Laskovski. 2011. - 564 p.

9. Omidian H. Introduction to Hydrogels / H. Omidian, K. Park // Biomedical Applications of Hydrogels Handbook. - Springer: New York, 2010. - P. 1-17.

10. Pal K. Polymer hydrogels: Characterization and Biomedical Applications - A mini review / K. Pal, A.K. Banthia, D.K. Majumdar // Des. Monomers Polym. - 2009. -Vol. 12. - P. 197-220.

11. Saarai A. On the Characterization of Sodium Alginate / Gelatine-Based Hydrogels for Wound Dressing / A. Saarai, T. Sedlacek, V. Kasparkova et al. // Journal of Applied Polymer Science. - 2012. - Vol. 126. - P. 79-88.

12. Sezer A.D. Chitosan film containing fucoidan as a wound dressing for dermal burn healing: Preparation and in vitro/in vivo evaluation / A.D. Sezer, F. Hatipoglu, E. Cev-her et al. // AAPS Pharm Sci Tech. - 2007. - Vol. 8. - P. 94-101.

13. Thomas A. Alginates from wound dressings activate human macrophages to secrete tumour necrosis factor-a / A. Thomas, K.G. Harding, K. Moore // Biomaterials. - 2000. - Vol. 21. - P. 1797-1802.

14. Zhang J. Chitosan Modification and Pharmaceutical / Biomedical Applications / J. Zhang, W. Xia, P. Liu et al. // Mar. Drugs. - 2010. - Vol. 8. - P. 1962-1987.

Литература

1. Беседнова Н.Н. Биологически-активные вещества из морских гидробионтов

- источник новых фармакологических субстанций и лекарств / Н.Н. Беседнова, С.П. Крыжановский, Т.С. Запорожец, И.Д. Макаренкова // Проблемы стандартизации в здравоохранении. - 2011. - № 9-10. - С. 27-33.

2. Севастьянов В.И. Биоматериалы, системы доставки лекарственных веществ и биоинженерия / В.И. Севастьянов // Вестник трансплантологии и искусственных органов. - 2009. - Т. XI, № 3. - С. 14-24.

3. Alsarra I.A. Chitosan topical gel formulation in the management of burn wounds/ I.A. Alsarra // International Journal of Biological Macromolecules. - 2009. - Vol. 45.

- Р.16-21.

4. Balakrishnan B. Evaluation of an in situ forming hydrogel wound dressing based on oxidized alginate and gelatin / B. Balakrishnan, M. Mohanty, P.R. Umachankar, A. Jayakrishnan // Biomaterials. - 2005. - Vol. 26. - P. 6335-6342.

КОНТАКТНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Кузнецова Т.А. е-mail: takuznets@mail.ru.