ЧИСТЯЩИЕ КОМПОЗИЦИИ, СОДЕРЖАЩИЕ ТРАНСГЛЮКОЗИДАЗУ
CLEANING COMPOSITIONS CONTAINING TRANSGLYCOSIDASE

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к композициям, содержащим фермент трансглюкозидазу и полисахарид природной камеди, где полисахарид природной камеди является субстратом для фермента трансглюкозидазы. Настоящее изобретение также относится к способам применения фермента трансглюкозидазы для разрушения полисахарида природной камеди. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления эти композиции и способы находят применение в чистке.
Известный уровень техники
Детергент и другие чистящие композиции часто включают сложную комбинацию активных ингредиентов. Например, многие чистящие продукты содержат систему поверхностно активных веществ, ферменты для чистки, отбеливающие агенты, моющие компоненты, подавители пенообразования, суспендирующие грязь агенты, высвобождающие грязь агенты, флуоресцентные осветлители, смягчающие агенты, диспергирующие агенты, соединения, ингибирующие перемещение красителей, абразивные агенты, бактерицидные агенты и отдушки. Однако, несмотря на сложность современных детергентов, существует много загрязнений, которые трудно удалить. Таким образом, в данной области техники остается потребность в композициях и способах для эффективной очистки от различных загрязнений.
Краткое изложение сущности изобретения
Настоящее изобретение относится к композициям, содержащим фермент трансглюкозидазу и полисахарид природной камеди, где полисахарид природной камеди является субстратом для фермента трансглюкозидазы. Настоящее изобретение также относится к способам применения фермента трансглюкозидазы для разрушения полисахарида природной камеди. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления композиции и способы находят применение в чистке.
В некоторых вариантах осуществления композиции включают полисахариды природной камеди, такие как ксантановые камеди. В некоторых дополнительных вариантах осуществления фермент трансглюкозидаза обладает активностью, определенной как EC 2.4.1.24, по номенклатуре IUBMB. В некоторых дополнительных вариантах осуществления фермент трансглюкозидаза обладает аминокислотной последовательностью, которая по меньшей мере приблизительно на 90% идентична ферменту трансглюкозидазе Aspergillus. В некоторых других вариантах осуществления композиция дополнительно включает по меньшей мере одно поверхностно-активное вещество. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полисахарид природной камеди присутствует на предмете как загрязнение. В некоторых особенно предпочтительных вариантах осуществления предмет представляет собой ткань.
В настоящем изобретении также предлагаются методы, включающие объединение фермента трансглюкозидазы с по меньшей мере одним полисахаридом природной камеди для разрушения полисахарида природной камеди. В некоторых вариантах осуществления фермент трансглюкозидаза обладает активностью, определенной как EC 2.4.1.24, по номенклатуре IUBMB. В некоторых вариантах осуществления полисахарид природной камеди представляет собой ксантановую камедь.
Настоящее изобретение также относится к способам очистки, включающим: контактирование предмета, загрязненного полисахаридом природной камеди, с чистящей композицией, включающей фермент трансглюкозидазу; и поддержание предмета и чистящей композиции в условиях, достаточных для эффективного разрушения полисахарида природной камеди и тем самым очистки предмета. В некоторых вариантах осуществления предмет загрязнен пищей, которая содержит по меньшей мере один полисахарид природной камеди. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полисахарид природной камеди включает ксантановую камедь. В некоторых других вариантах осуществления предмет выбран из тканей и твердых покрытий. В некоторых дополнительных вариантах осуществления фермент трансглюкозидаза обладает аминокислотной последовательностью, которая по меньшей мере приблизительно на 90% идентична ферменту трансглюкозидазе Aspergillus. В некоторых вариантах осуществления чистящая композиция дополнительно включает по меньшей мере одно поверхностно-активное вещество. В некоторых дополнительных вариантах осуществления чистящая композиция дополнительно включает по меньшей мере один фермент, выбранный из протеаз, амилаз, целлюлаз, липаз, кутиназ, маннаназ, пектиназ, пектатлиаз и оксидоредуктаз для разрушения других загрязняющих компонентов. В некоторых других дополнительных вариантах осуществления чистящая композиция имеет рН от приблизительно рН 5,0 до приблизительно рН 11,5. В некоторых других дополнительных вариантах осуществления чистящая композиция включает фермент трансглюкозидазу в концентрации в диапазоне от приблизительно 0,01 ч/млн до приблизительно 100 ч/млн.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, содержащим: фермент трансглюкозидазу; и по меньшей мере один полисахарид природной камеди; где полисахарид природной камеди является субстратом для фермента трансглюкозидазы. В некоторых вариантах осуществления полисахарид природной камеди включает ксантановую и/или гуаровую камедь. Однако не подразумевается, что настоящее изобретение ограничивается каким-либо конкретным полисахаридом камеди. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления полисахарид природной камеди присутствует в виде загрязнения на предмете (например, ткани), в то время как в других вариантах осуществления он находится в свободном состоянии в растворе. В некоторых вариантах осуществления фермент трансглюкозидаза включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере приблизительно на 70% идентична, по меньшей мере приблизительно на 80% идентична, по меньшей мере приблизительно на 85% идентична, по меньшей мере приблизительно на 90% идентична, по меньшей мере приблизительно на 95% идентична или по меньшей мере приблизительно на 98% идентична трансглюкозидазе Aspergillus. В некоторых вариантах осуществления композиции дополнительно содержат по меньшей мере одно поверхностно активное вещество и/или другой чистящий агент.
Настоящее изобретение также относится к способам, которые включают объединение фермента трансглюкозидазы с по меньшей мере одним полисахаридом природной камеди для разрушения полисахарида природной камеди. В некоторых вариантах осуществления методы включают: контактирование предмета, загрязненного полисахаридом природной камеди, с чистящей композицией, включающей фермент трансглюкозидазу; и поддержание предмета и чистящей композиции вместе в условиях, достаточных для эффективного разрушения полисахарида природной камеди и тем самым очистки предмета.
В некоторых вариантах осуществления предмет (например, ткань) загрязнен пищей, которая содержит по меньшей мере один полисахарид природной камеди (например, пищей, которая содержит по меньшей мере одну ксантановую и/или гуаровую камедь). В некоторых вариантах осуществления чистящая композиция дополнительно содержит по меньшей мере одно поверхностно-активное вещество, другие чистящие агенты и/или по меньшей мере один дополнительный фермент (например, протеазу, амилазу, целлюлазу, липазу, кутиназу, оксидоредуктазу или тому подобное) для разрушения других загрязняющих компонентов. В некоторых вариантах осуществления чистящие композиции имеют рН в диапазоне от приблизительно рН 5,0 до приблизительно рН 11,5, и фермент трансглюкозидаза присутствует в чистящей композиции в концентрации в диапазоне от приблизительно 0,01 ч/млн до приблизительно м.
В некоторых вариантах осуществления способы, предлагаемые в настоящем описании, ведут к более эффективному удалению загрязнений, которые содержат полисахариды природной камеди, чем эквивалентные способы, в которых не применяется фермент трансглюкозидаза.
В некоторых дополнительных вариантах осуществления в настоящем изобретении предлагается выделенный фермент, содержащий трансглюкозидазу Aspergillus, продуцируемую клеткой-хозяином Trichoderma reesei. Настоящее изобретение также относится к чистящим композициям (например, детергентам для стирки), содержащим этот фермент, а также к способам применения этого фермента для чистки предмета (например, ткани).
Описание чертежей
Некоторые аспекты последующего подробного описания понимаются наилучшим образом при прочтении в сочетании с сопровождающими фигурами. Подчеркивается, что в соответствии с общей практикой различные детали фигур даются не в масштабе. Напротив, размеры различных деталей условно увеличены или уменьшены для ясности.
На фигуре 1 представлена карта вектора pTrex3(AGL51M).
На фигуре 2 представлена нуклеотидная последовательность экспрессионной кассеты pTrex3(AGL51M) (SEQ ID NO:1).
На фигуре 3 представлена гистограмма, демонстрирующая ферментативную активность трансглюкозидазы на 0,2% ксантане при измерении с помощью теста восстановления сахаров.
На фигуре 4 представлены гистограммы, демонстрирующие эффективность чистки Trip-TG в 50 мМ Hepes буфере (рН 7,4) и в AATCC HDL детергенте (рН 7,4) на загрязненных гуаром микрообразцах (верхняя панель) и на загрязненных салатным соусом микрообразцах (нижняя панель).
На фигуре 5 представлена гистограмма эксперимента по дозозависимости ответа, демонстрирующая, что Trip-TG активен на загрязненных салатным соусом микрообразцах в концентрации от 1 до 5 ч/млн в AATCC HDL.
На фигуре 6 представлена гистограмма, демонстрирующая чистящую активность Trip-TG на загрязненных салатным соусом микрообразцах в сверхмощном твердом детергенте (HDD).
На фигуре 7 представлена гистограмма, демонстрирующая чистящую активность Trip-TG на загрязнении джемом в Tergotometer тесте с использованием 0,15% AATCC HDL.
Описание изобретения
Настоящее изобретение относится к композициям, содержащим фермент трансглюкозидазу и полисахарид природной камеди, где полисахарид природной камеди является субстратом для фермента трансглюкозидазы. Настоящее изобретение также относится к способам применения фермента трансглюкозидазы для разрушения полисахарида природной камеди. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления композиции и способы находят применение в чистке.
Перед тем как экспериментальные варианты осуществления будут описаны более подробно, должно быть понятно, что это изобретение не ограничивается конкретными описываемыми вариантами осуществления и в качестве такового может, конечно, варьировать. Должно быть понятно также, что используемая в настоящем описании терминология предназначена для описания только конкретных вариантов осуществления и не рассматривается как лимитирующая.
При использовании в настоящем описании, когда предлагается диапазон величин, должно быть понятно, что каждая промежуточная величина до десятой части единицы нижнего предела, если в контексте ясно не указано иначе, между верхним и нижним пределами этого диапазона также конкретно раскрывается. Каждый более мелкий диапазон между любой установленной величиной или промежуточной величиной в установленном диапазоне и любая другая установленная или промежуточная величина в этом установленном диапазоне охватывается изобретением. Верхние и нижние пределы этих более мелких диапазонов в диапазоне могут быть независимо включены в диапазон или исключены из него, и каждый диапазон, где тот или другой, ни тот, ни другой или оба предела включены в более мелкие диапазоны, также охватывается изобретением в зависимости от любого конкретно исключаемого предела в установленном диапазоне. Когда установленный диапазон включает один или оба предела, диапазоны, исключающие тот или другой, или оба из этих включенных пределов, также включаются в изобретение.
Хотя любые методы и материалы, сходные или эквивалентные описываемым в настоящем документе, могут быть использованы в методах или тестировании настоящего изобретения, далее будут описываться иллюстративные методы и материалы. Все приводимые в настоящем описании патенты и публикации включены в настоящий документ в качестве ссылок для раскрытия и описания методов и/или материалов, включая последовательности, в связи с которыми, цитируются публикации. Любые номера поступления в базу данных GENBANK, перечисленные в настоящем описании, включены в качестве ссылки в их полном объеме, включая указанные там последовательности нуклеиновых кислот и белков и комментарии к этим последовательностям, начиная с наиболее ранней даты подачи этой патентной заявки.
Публикации, обсуждаемые в настоящем описании, предлагаются единственно из-за их раскрытия до даты подачи настоящей заявки. Ничего в настоящем описании не должно истолковываться как допущение того, что настоящее изобретение не дает право датировать задним числом такую публикацию на основании предшествующего изобретения. Далее, даты предоставленной публикации могут отличаться от действительных дат публикации, что может нуждаться в независимом подтверждении.
Если в настоящем описании не указано иначе, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют то же значение, что и обычно понимаемое специалистом в той области техники, к которой принадлежит это изобретение. Хотя многие методы и материалы, сходные или эквивалентные описываемым в настоящем документе, находят применение в методах или тестировании настоящего изобретения, некоторые из предпочтительных методов и материалов описываются в настоящем документе. Цифровые диапазоны включают цифры, задающие диапазон, также как и каждую цифру между ними.
Определения
При использовании в настоящем описании и прилагаемой формуле изобретения единственное число включает ссылку на множественное, если в контексте ясно не указано иначе. Таким образом, например, ссылка на «клетку-хозяина» включает множество таких клеток-хозяев.
Если не указано иначе, нуклеиновые кислоты представлены слева направо в ориентации от 5'- к 3'-концу; аминокислотные последовательности представлены слева направо в ориентации от амино- к карбоксильному концу, соответственно. Предлагаемые в настоящем описании главы не ограничивают различных аспектов вариантов осуществления изобретения, которые можно получить с помощью ссылки на описание в целом. Соответственно, термины, определяемые непосредственно ниже, более полно определяются при ссылке на описание в целом.
Термин «рекомбинантный» обозначает полинуклеотид или полипептид, который в природе не существует в клетке-хозяине. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные молекулы содержат две или более природных последовательности, которые связаны друг с другом таким способом, который не существует в природе. Рекомбинантная клетка содержит рекомбинантный полинуклеотид или полипептид.
Термин «гетерологичные» обозначает элементы, которые в норме не связаны друг с другом. Например, если клетка-хозяин продуцирует гетерологичный белок, этот белок в норме не продуцируется в этой клетке-хозяине. Таким же образом промотор, который оперативно связан с гетерологичной кодирующей последовательностью, представляет собой промотор, который оперативно связан с кодирующей последовательностью, с которой он обычно не является оперативно связанным в клетке-хозяине дикого типа. Термин «гомологичный» со ссылкой на полинуклеотид или белок обозначает полинуклеотид или белок, который существует в клетке-хозяине в природе.
Термины «белок» и «полипептид» используются в контексте настоящего описания взаимозаменяемо.
«Сигнальная последовательность» представляет собой последовательность аминокислот, присутствующую на N-концевой части белка, облегчающую секрецию зрелой формы белка из клетки. Определение сигнальной последовательности является функциональным. У зрелой формы внеклеточного белка отсутствует сигнальная последовательность, которая отщепляется в процессе секреции.
«Кодирующая последовательность» представляет собой сегмент ДНК, который кодирует полипептид.
Термин «нуклеиновая кислота» охватывает ДНК, РНК, одноцепочечные или двухцепочечные, и их химические модификации. Термины «нуклеиновая кислота» и «полинуклеотид» используются в контексте настоящего описания взаимозаменяемо.
«Вектор» обозначает полинуклеотид, созданный для введения нуклеиновых кислот в одну или более клеток-хозяев. Подходящие векторы автономно реплицируются в различных клетках-хозяевах и включают: клонирующие векторы, экспрессионные векторы, челночные векторы, плазмиды, фаговые частицы, кассеты и тому подобное.
Используемый в настоящем описании термин «экспрессионный вектор» обозначает конструкт ДНК, включающий область, кодирующую белок, которая оперативно связана с подходящей контролирующей последовательностью, способной влиять на экспрессию белка в подходящей клетке-хозяине. В некоторых вариантах осуществления такие контролирующие последовательности включают промотор, воздействующий на транскрипцию, необязательную операторную последовательность, контролирующую транскрипцию для продукции мРНК, последовательность, кодирующую подходящие сайты связывания рибосом на мРНК, а также энхансеры и другие последовательности, которые контролируют терминацию транскрипции и трансляции.
«Промотор» представляет собой регуляторную последовательность, которая инициирует транскрипцию нижележащей нуклеиновой кислоты.
Термин «оперативно связанный» обозначает расположение элементов, которое позволяет им быть функционально связанными. Например, промотор является оперативно связанным с кодирующей последовательностью, если он контролирует транскрипцию последовательности.
Термин «селективный маркер» относится к белку, способному к экспрессии в хозяине, что дает возможность легко отобрать тех хозяев, которые содержат введенную нуклеиновую кислоту или вектор. Примеры селективных маркеров включают, но не ограничиваются этим, гены устойчивости к антибиотикам (например, гигромицину, блеомицину или хлорамфениколу) и/или гены, которые придают метаболическое преимущество, такое как преимущество в питании клетки-хозяина.
Термин «происходящий» охватывает термины «происходящий из», «полученный», «получаемый из» и «выделенный из» и относится к источнику последовательности и/или белка.
«Непатогенный» организм представляет собой организм, который не является патогенным для человека и/или других животных.
Используемые в настоящем описании термины «выделять», «изолировать» и «отделять» относятся к белку, клетке, нуклеиновой кислоте или аминокислоте, которые выделяются из по меньшей мере одного компонента, с которым они связаны в природе.
Используемые в настоящем описании термины «трансформированная» и «трансгенная», используемые в отношении клетки, обозначают, что клетка обладает неприродной (например, гетерологичной) последовательностью нуклеиновой кислоты, интегрированной в ее геном или находящейся в виде эписомальной плазмиды, существование которой поддерживается на протяжении многих генераций.
Используемый в настоящем описании термин «экспрессия» относится к процессу, с помощью которого на основе последовательности нуклеиновой кислоты гена продуцируется полипептид. Процесс включает как транскрипцию, так и трансляцию.
Термин «введенная» в контексте введения последовательности нуклеиновой кислоты в клетку относится к «трансфекции», «трансформации» или «трансдукции» и включает ссылку на введение последовательности нуклеиновой кислоты в эукариотную или прокариотную клетку, где последовательность нуклеиновой кислоты может быть введена в геном клетки (например, в хромосому, плазмиду, пластиду или митохондриальную ДНК), превращена в автономный репликон или временно экспрессирована (например, трансфецированная мРНК).
Термин «гибридизация» относится к процессу, с помощью которого цепь нуклеиновой кислоты соединяют с комплементарной цепью путем образования пар оснований, как известно в данной области техники. Нуклеиновая кислота рассматривается как являющаяся «селективно гибридизуемой» с реперной последовательностью нуклеиновой кислоты, если две последовательности специфично гибридизуются одна с другой в условиях от умеренной до высокой жесткости гибридизации и отмывки. Условия умеренной и высокой жесткости гибридизации известны специалистам в данной области техники. Один пример условий высокой жесткости включает гибридизацию при приблизительно 42°С в 50% формамиде, 5X SSC, 5X раствор Денхардта, 0,5% SDS и 100 мкг/мл денатурированной ДНК-носителя с последующим отмыванием два раза в 2X SSC и 0,5% SDS при комнатной температуре и дополнительно два раза в 0,1 X SSC и 0,5% SDS при 42°С.
Используемые здесь термины «чистящая композиция» и «чистящий состав» относятся к композиции, которая находит применение в удалении нежелательных соединений (например, «загрязнений») с предметов, подвергаемых чистке, таких как ткани, посуда, контактные линзы, другие твердые субстраты, волосы (шампуни), кожа (мыло и кремы), зубы (ополаскиватели рта и зубные пасты). Термин охватывает любые материалы/соединения, выбранные для конкретного типа чистящей композиции в желаемой форме продукта (например, жидкость, гель, гранулы или композицию в виде спрея), при условии, что композиция совместима с испытываемым ферментом в композиции. Конкретный выбор материалов чистящей композиции легко осуществляется при рассмотрении поверхности, предметов и/или ткани, подвергаемых чистке, и желаемой формы композиции при использовании для условий чистки.
Подразумевается, что термины включают, но не ограничиваются этим, композиции детергентов (например, жидкие детергенты, детергенты в виде геля и/или твердые детергенты для стирки и детергенты для тонких тканей; чистящие составы для твердых поверхностей, таких как стеклянные, деревянные, керамические и металлические поверхности прилавка и окна; чистящие составы для ковров; чистящие составы для духовки; освежители тканей; смягчители тканей; и предварительные пятновыводители для текстиля и белья для стирки, а также детергенты для посуды).
Используемый в настоящем описании термин «чистящая композиция» включает, если не указано иначе, гранулированные, таблетированные моющие агенты или моющие агенты в форме порошка для всех целей, или сверхмощные моющие агенты, особенно чистящие детергенты; моющие агенты в виде жидкости, геля или в форме пасты для всех целей, особенно так называемые сверхмощные жидкие типы (HDL); жидкие детергенты для тонких тканей; агенты для мытья посуды вручную или агенты для мытья посуды в облегченном режиме, включая тип агентов с высоким пенообразованием; моющие агенты для посудомоечной машины, включая различные таблетированные, гранулированные, жидкие типы и типы ополаскивателей для отсутствия капель на посуде для использования в домашних условиях и учреждениях; жидкие чистящие и дезинфекционные агенты, включая антибактериальные типы для мытья вручную, чистящие бруски, жидкости для полоскания рта, чистящие агенты для зубных протезов, шампуни для машин или ковров, чистящие агенты для ванных комнат; шампуни для волос и ополаскиватели для волос; гели для душа и пену для ванн; чистящие агенты для металла; а также чистящие вспомогательные агенты, такие как отбеливающие добавки и добавки типа «наклеек на пятна», типы добавок для предварительной обработки или стирки.
Используемые здесь термины «композиция детергентов» и «состав детергентов» используются в отношении композиций, которые составлены для использования в моющей среде для очистки загрязненных предметов. В конкретных вариантах осуществления термин используется в отношении подвергаемых стирке тканей и/или предметов одежды (например, «детергенты для стирки»). В альтернативных вариантах осуществления термин относится к другим детергентам, таким как детергенты, используемые для мытья посуды, столовых приборов и т.д. (например, «детергенты для мытья посуды»). Не подразумевается, что настоящее изобретение ограничивается каким-либо конкретным составом или композицией детергентов. Действительно, подразумевается, что в дополнение к испытываемому ферменту композиция детергента может также включать поверхностно-активные вещества, трансферазу(зы), гидролитические ферменты, оксидоредуктазы, моющие компоненты, отбеливающие агенты, активаторы отбеливания, подсинивающие агенты и флуоресцентные красители, ингибиторы слеживания, маскирующие агенты, активаторы ферментов, антиоксиданты и/или солюбилизаторы и т.д.
Используемый в настоящем описании термин «усиленная эффективность» в чистящей композиции определяется как усиленная очистка (например, удаление и/или обесцвечивание) пятен (особенно пятен, включающих полисахариды природной камеди, таких как шоколадный крем, салатный соус, гуар и т.д.) при определении с помощью обычной оценки после стандартного цикла стирки.
Используемый в настоящем описании термин «чистящая композиция для твердой поверхности» относится к детергентным композициям для очистки твердых поверхностей, таких как полы, стены, кафель, ванна и кухонные приборы и тому подобное. Такие композиции предлагаются в любой форме, включая, но не ограничиваясь этим, твердые агенты, жидкости, эмульсии и т.д.
Используемый в настоящем описании термин «композиция для мытья посуды» относится ко всем формам композиций для мытья посуды, включая, но не ограничиваясь этим, форму геля, гранулированные и жидкие формы.
Используемый в настоящем описании термин «чистящая композиция для тканей» относится ко всем формам детергентных композиций для чистки тканей, включая, но не ограничиваясь этим, форму геля, гранулированные, жидкие формы и форму бруска.
Используемый в настоящем описании термин «текстиль» относится к текстильным тканям, а также к штапельным волокнам и нитям, подходящим для превращения в пряжу или для использования в качестве пряжи, текстильных, вязаных и нетекстильных тканей. Термин охватывает пряжу, изготовленную из природных, а также из синтетических (например, обработанных) волокон.
Используемый в настоящем описании термин «ткань» охватывает любой текстильный материал. Таким образом, подразумевается, что термин охватывает предметы одежды, а также ткани, пряжу, волокна, нетекстильные материалы, природные материалы, синтетические материалы и любой другой текстильный материал.
Используемый в настоящем описании термин «эффективное количество трансглюкозидазы» относится к количеству фермента трансглюкозидазы, необходимому для достижения ферментативной активности, требуемой для конкретного применения (например, в чистящей композиции и т.д.). Такие эффективные количества легко устанавливаются специалистом в данной области техники и основываются на многих факторах, таких как используемый конкретный вариант фермента, применение чистки, конкретный состав чистящей композиции и потребности в жидкой или сухой (например, гранулированной, брусочной) композиции и тому подобное.
Термин «трансглюкозидаза» относится к ферменту, который переносит остаток D-глюкозила в 1,4-α-D-глюкане на первичную гидроксильную группу глюкозы, свободную или соединенную с 1,4-α-D-глюканом. Описанная в настоящем документе трансглюкозидаза обладает активностью, описанной как EC 2.4.1.24, в соответствии с номенклатурой ферментов IUBMB. Систематическим названием описанной в настоящем документе трансглюкозидазы является 1,4-α-D-глюкан:1,4-α-D-глюкан(D-глюкоза)-6-α-D-глюкозилтрансфераза. Этот фермент может быть обозначен в некоторых публикациях как α-глюкозидаза.
Термин «загрязненный предмет» относится к предмету (например, ткани или посуде), который загрязнен (например, «окрашен») второй композицией. Термином «загрязненный предмет» охватываются грязные ткани, такие как грязная одежда, белье и ткани, окрашенные продуктами питания, содержащими полисахарид природной камеди. В некоторых вариантах осуществления при загрязнении проявляется видимое окрашивание, в то время как в других вариантах осуществления видимое окрашивание не проявляется.
Термин «полисахарид природной камеди» относится к полисахариду природного происхождения, не являющемуся крахмалом, который способен вызывать значительное повышение вязкости раствора при низкой концентрации. Такие полисахариды обычно применяются в пищевой промышленности и используются в качестве загустителей, желирующих агентов, эмульгаторов и стабилизаторов во многих продуктах питания (например, в соусах, кремах, молочных продуктах, мороженом, муссах, молочных коктейлях, салатных соусах и т.д.). Гуаровая камедь (пищевая добавка E412), съедобный загуститель, экстрагируемый из стручковых бобов кустов гуара, и ксантановая камедь (пищевая добавка E415), полисахарид, который продуцируется путем ферментации глюкозы или сахарозы (например, с помощью Xanthomonas campestris), являются примерами полисахаридов природной камеди. Другие полисахариды природной камеди включают, но не ограничиваются этим, агар (E406), альгиновую кислоту (E400), β-глюкан, каррагенин (E407), камедь натурального каучука, даммаровую камедь, геллановую камедь (E418), глюкоманнан (E425), гуммиарабик (E414), камедь гхати, камедь трагаканта (E413), камедь карайа (E416), камедь бобов робинии (E410), камедь мастичной фисташки, альгинат натрия (E401), еловую камедь и камедь тары (E417).
Термин «фермент, разрушающий пищевой полисахарид, не являющийся крахмалом» обозначает фермент, который разрушает полисахариды пищи, не являющиеся крахмалом. Примеры ферментов включают, но не ограничиваются этим, гемицеллюлазу, манназу, пектиназу, ксиланазу, β-галактозидазу и α-галактозидазу.
Термин «рабочий рН» обозначает рН детергента в процессе его применения. Например, рабочий рН детергента для стирки представляет собой рН детергента, когда он используется для стирки тканей в стиральной машине и/или при ручной стирке белья. Сходно, рабочий рН детергента для мытья посуды представляет собой рН этого детергента в момент использования его в посудомоечной машине и/или при ручном мытье посуды. В некоторых вариантах осуществления детергенты, которые находятся в концентрированной или твердой форме, разводят или растворяют перед тем, как рН этого детергента становится его рабочим рН.
Термин «рабочая концентрация» относится к концентрации фермента в детергенте в процессе его использования. Например, рабочая концентрация фермента в детергенте для стирки представляет собой концентрацию этого фермента при использовании детергента для стирки в процессе стирки тканей в стиральной машине и/или при ручной стирке белья. Сходным образом, рабочая концентрация фермента в детергенте для мытья посуды представляет собой концентрацию этого фермента в детергенте в момент использования его в посудомоечной машине и/или при ручном мытье посуды. В некоторых вариантах осуществления детергенты, которые находятся в концентрированной или твердой форме, разводят или растворяют перед тем, как концентрация фермента в детергенте становится его рабочей концентрацией.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к композициям, содержащим фермент трансглюкозидазу и полисахарид природной камеди, где полисахарид природной камеди является субстратом для фермента трансглюкозидазы. Настоящее изобретение также относится к способам применения фермента трансглюкозидазы для разрушения полисахарида природной камеди. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления композиции и методы находят применение в очистке. Действительно, настоящее изобретение относится к различным композициям, содержащим ферменты трансглюкозидазы, а также к способам применения композиций.
Содержащие фермент трансглюкозидазу композиции
Как отмечалось выше, настоящее изобретение относится к композициям, содержащим трансглюкозидазу. В некоторых вариантах осуществления композиция включает по меньшей мере один фермент трансглюкозидазу и полисахарид природной камеди, где полисахарид природной камеди является субстратом для фермента трансглюкозидазы.
Как отмечалось выше, фермент трансглюкозидаза обычно обладает активностью, определяемой как EC 2.4.1.24 согласно номенклатуре ферментов IUBMB, причем эта активность переносит гликозильные остатки в определенных гликанах на первичную гидроксильную группу глюкозы. В некоторых вариантах осуществления фермент может также обладать активностью, которая разрушает полисахарид природной камеди (например, ксантан и содержащие галактоманнан полисахариды, такие как гуаровая смола или смола лимской фасоли) путем отрезания боковых цепей сахара или расщепления внутренних связей для разрушения остова полисахарида.
Aspergillus niger
Trichoderma reesei
В настоящем изобретении находит применение любой подходящий фермент трансглюкозидаза (см., например, Pazur et al., Carbohydr. Res. 1986 149:137-47 [1986]; и Nakamura et al., J. Biotechnol., 53:75-84 [1997]). В некоторых вариантах осуществления находящие применение в настоящем изобретении ферменты трансглюкозидазы имеются в продаже (например, но не ограничиваясь этим, ферменты, поставляемые Megazyme, Wicklow, Ireland; или Danisco US Inc., Genencor Division, Palo Alto, CA). В некоторых вариантах осуществления фермент представляет собой трансглюкозидазу , продуцируемую клетками . В некоторых дополнительных вариантах осуществления трансглюкозидаза является грибковой трансглюкозидазой дикого типа (например, но не ограничиваясь этим, грибковой трансглюкозидазой, имеющей аминокислотную последовательность, депонированную в базе данных NCBI's GENBANK с регистрационными номерами: D45356 (GID:2645159; Aspergillus niger), BAD06006.1 (GID:4031328; Aspergillus awamori), BAA08125.1 (GID:1054565; Aspergillus oryzae), XP_001210809.1 (GID:115492363; Aspergillus terreus), XP_001271891.1 (GID:121707620; Aspergillus clavatus), XP_001266999.1 (GID:119500484; Neosartorya fischeri), XP_751811.1 (GID:70993928; Aspergillus fumigatus), XP_659621.1 (GID:67523121; Aspergillus nidulans), XP_001216899.1 (GID:115433524; Aspergillus terreus) и XP_001258585.1 (GID:119473371; Neosartorya fischeri)), или ее вариантом, который имеет аминокислотную последовательность, являющуюся по меньшей мере приблизительно на 70%, по меньшей мере приблизительно на 80%, по меньшей мере приблизительно на 85%, по меньшей мере приблизительно на 90%, по меньшей мере приблизительно на 95% или по меньшей мере приблизительно на 98% идентичной грибковой трансглюкозидазе дикого типа.
В некоторых предпочтительных вариантах осуществления фермент обычно присутствует в композиции в диапазоне концентраций от приблизительно 0,01 ч/млн (частей на миллион, масс/об) до приблизительно 100 ч/млн (например, от приблизительно 0,01 ч/млн до приблизительно 0,05 ч/млн, от приблизительно 0,05 ч/млн до приблизительно 0,1 ч/млн, от приблизительно 0,1 ч/млн до приблизительно 0,5 ч/млн, от приблизительно 0,5 ч/млн до приблизительно 1 ч/млн, от приблизительно 1 ч/млн до приблизительно 5 ч/млн, от приблизительно 5 ч/млн до приблизительно 10 ч/млн, от приблизительно 10 ч/млн до приблизительно 100 ч/млн).
В некоторых предпочтительных вариантах осуществления композиция представляет собой чистящую композицию. В некоторых особенно предпочтительных вариантах осуществления композиция дополнительно содержит по меньшей мере одно поверхностно-активное вещество, чистящие агенты и/или другие агенты по уходу за тканью, описанные подробнее ниже.
В некоторых вариантах осуществления полисахарид природной камеди находится в водном растворе, тогда как в других вариантах осуществления он приклеен к предмету (например, в виде пятна, которое находится на поверхности предмета, такого как ткань или твердая поверхность). В некоторых вариантах осуществления полисахарид природной камеди находится в высушенной форме. Поскольку полисахариды природной камеди широко используют во множестве пищевых продуктов, в некоторых вариантах осуществления предмет загрязнен пищевым продуктом, который содержит полисахарид природной камеди. Типичные пищевые продукты, которые содержат полисахарид природной камеди, включают, но не ограничиваются этим, соусы, кремы, молочные продукты, мороженое, муссы, молочные коктейли, салатные соусы, напитки с фруктовыми соками, фруктовые консервы, желе, соевый соус, устричный соус, расфасованные продукты, сыр и хлебопекарные продукты. В некоторых вариантах осуществления полисахарид природной камеди находится в пищевом продукте в концентрации от приблизительно 0,1% до приблизительно 1,5%, от приблизительно 0,1% до приблизительно 0,5%, от приблизительно 0,5% до приблизительно 1,0%, приблизительно 1,0% или приблизительно 1,5%.
В некоторых предпочтительных вариантах осуществления трансглюкозидазу получают с помощью традиционных методов. Например, в некоторых вариантах осуществления она секретируется в периплазму (например, грамотрицательными организмами, такими как E. coli) или во внеклеточное пространство (например, грамположительными организмами, такими как Bacillus и Actinomycetes) или эукариотными хозяевами (например, Trichoderma, Aspergillus, Saccharomyces и Pichia).
В некоторых вариантах осуществления фермент трансглюкозидазу получают путем экспрессии гибридного белка, содержащего сигнальную последовательность, функционально связанную с ферментом трансглюкозидазой в клетке-хозяине T. reesei. В некоторых из этих вариантов осуществления фермент трансглюкозидаза секретируется в среду культивирования, из которой его извлекают. Любая сигнальная последовательность, которая облегчает секрецию белка из клетки-хозяина Trichoderma, находит применение в подходящих гибридных белках. В некоторых вариантах осуществления сигнальная последовательность является эндогенной, тогда как в других вариантах осуществления она не является эндогенной для клетки-хозяина Trichoderma, а в некоторых вариантах осуществления она представляет собой сигнальную последовательность белка, о котором известно, что он секретируется из клетки-хозяина Trichoderma sp. на высоком уровне. Такая сигнальная последовательность включает, но не ограничивается этим: сигнальную последовательность целлобиогидролазы I, целлобиогидролазы II, эндоглюканаз I, эндоглюканаз II, эндоглюканаз III, α-амилазы, аспартиловых протеаз, глюкоамилазы, маннаназы, гликозидазы и эндопептидазы B ячменя (см., например, Saarelainen, Appl. Environ. Microbiol., 63:4938-4940 [1997]). В некоторых вариантах осуществления, и как дополнительно описано в разделе Примеры настоящего раскрытия, трансглюкозидаза секретируется с использованием ее собственной сигнальной последовательности (т.е. сигнальных последовательностей AGL1, AGL2 или AGL3).
В некоторых вариантах осуществления, следовательно, трансглюкозидазу получают с помощью нуклеиновой кислоты, которая включает: нуклеиновую кислоту, кодирующую сигнальную последовательность, функционально связанную с нуклеиновой кислотой, кодирующей трансглюкозидазу, где трансляция нуклеиновой кислоты дает гибридный белок, включающий трансглюкозидазную часть, содержащую N-концевую сигнальную последовательность для секреции трансглюкозидазной части из клетки-хозяина Trichoderma.
В некоторых вариантах осуществления гибридный белок кроме сигнальной последовательности дополнительно содержит «белок-носитель», который представляет собой часть белка, который является эндогенным и секретируется клеткой-хозяином T. reesei sp. на высоком уровне. Подходящие белки-носители включают, но не ограничиваются этим, белки маннаназы I T. reesei (Man5A или MANI), целлобиогидролазы II T. reesei (Cel6A или CBHII) (см., например, Paloheimo et al., Appl. Environ. Microbiol., 69:7073-7082 [2003]) или целлобиогидролазы I T. reesei (CBHI). В некоторых вариантах осуществления белок-носитель представляет собой укороченный белок CBH1 T. reesei, который включает центральную область CBH1 и часть линкерной области CBH1. Так, в некоторых вариантах осуществления используют нуклеиновую кислоту, кодирующую белок, содержащий с аминоконца к карбоксильному концу сигнальную последовательность, белок-носитель и рассматриваемую фитазу, функционально связанные между собой.
В некоторых вариантах осуществления кодирующая последовательность трансглюкозидазы оптимизирована по кодонам для экспрессии трансглюкозидазы в используемой клетке-хозяине. Поскольку в данной области техники известны или могут быть легко получены таблицы использования кодонов, в которых приведено использование каждого из кодонов во многих клетках-хозяевах, включая Trichoderma reesei (см., например, Nakamura et al., Nucl. Acids Res., 28:292 [2000]), такие нуклеиновые кислоты могут быть легко сконструированы с учетом аминокислотной последовательности подлежащей экспрессии трансглюкозидазы.
В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кроме кодирующей последовательности дополнительно содержит другие элементы, которые необходимы для экспрессии фермента трансглюкозидазы в клетке-хозяине. Например, в некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота содержит промотор для транскрипции кодирующей последовательности и терминатор транскрипции. Типичные промоторы, которые находят применение в T. reesei, включают, но не ограничиваются этим, промоторы cbh1, cbh2, egl1, egl2, eg5, xln1 и xln2 T. reesei или их гибридный или укороченный вариант. Например, в некоторых вариантах осуществления промотор представляет собой промотор cbh1 T. reesei. Подходящие терминаторы включают терминаторы cbh1, cbh2, egl1, egl2, eg5, xln1 и xln2 T. reesei и многие другие, включая, например, терминаторы генов глюкоамилазы A. niger или A. awamori, как известно специалистам в данной области техники, а также генов антранилатсинтазы Aspergillus nidulans, генов TAKA амилазы Aspergillus oryzae или trpC A. nidulans (Punt et al., Gene 56:117-124 [1987]). В некоторых вариантах осуществления промотор и/или терминатор являются естественными для клетки-хозяина Trichoderma sp., тогда как в других вариантах осуществления они не являются эндогенными для клетки-хозяина Trichoderma sp.
В некоторых вариантах осуществления, в которых для экспрессии фермента трансглюкозидазы используют T. reesei в качестве клетки-хозяина, клетка является генетически модифицированной для снижения экспрессии секретируемых белков, эндогенных для данной клетки. В некоторых вариантах осуществления клетка включает один или более природных генов, в частности, генов, которые кодируют секретируемые белки, которые были удалены или инактивированы. Например, в некоторых вариантах осуществления удалены или инактивированы один или более генов, кодирующих протеазы (например, ген, кодирующий аспартиловую протеазу; см. Berka et al., Gene 86:153-162 [1990]; и патент США № 6509171), или гены, кодирующие целлюлазу. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин Trichoderma sp. представляет собой клетку-хозяина T. reesei, содержащую инактивирующие делеции в генах cbh1, cbh2, egl1 и egl2, как описано в патенте WO 05/001036. В некоторых вариантах осуществления описанная выше нуклеиновая кислота находится в геноме клетки-хозяина Trichoderma sp., тогда как в других вариантах осуществления она находится в плазмиде, которая реплицируется в клетке-хозяине Trichoderma.
В настоящем изобретении находит применение любой метод введения нуклеиновых кислот в клетки-хозяева Trichoderma (например, электропорация, ядерная микроинъекция, трансдукция, трансфекция, трансфекция, опосредуемая липофекцией и ДЭАЭ-декстрином, инкубация с преципитатом ДНК с фосфатом кальция, высокоскоростная бомбардировка покрытыми ДНК микроснарядами и слияние протопласта). Действительно, обычные методы трансформации хорошо известны в данной области техники (см., например, Campbell et al., Curr. Genet., 16:53-56 [1989]; патент WO 05/001036; патент США № 6022725; патент США № 6103490; патент США № 6268328; и опубликованные патентные заявки США сер. №№ 20060041113, 20060040353, 20060040353 и 20050208623, причем эти публикации включены в настоящее описание в качестве ссылки). В некоторых вариантах осуществления подготовка Trichoderma для трансформации включает подготовку протопластов из мицелия гриба. (См., например, Campbell et al., выше). В некоторых вариантах осуществления мицелий получают из проросших вегетативных спор.
В некоторых вариантах осуществления фермент трансглюкозидазу после секреции в культуральную среду извлекают с помощью любого подходящего традиционного метода (например, путем осаждения, центрифугирования, по сродству, фильтрации или любым другим методом, известным в данной области техники. Например, находят применение аффинная хроматография (Tilbeurgh et al., FEBS Lett., 16:215 [1984]); методы ионообменной хроматографии (Goyal et al., Biores. Technol., 36:37 [1991]; Fliess et al., Eur. J. Appl. Microbiol., Biotechnol., 17:314 [1983]; Bhikhabhai et al., J. Appl. Biochem., 6:336 [1984]; и Ellouz et al., Chromatogr., 396:307 [1987]), включая ионный обмен с использованием веществ с высокой разрешающей силой (Medve et al., J. Chromatogr. A 808:153 [1998]; хроматография с гидрофобным взаимодействием (Tomaz and Queiroz, J. Chromatogr. A 865:123 [1999]; двухфазное распределение (Brumbauer et al., Bioseparation 7:287 [1999]); осаждение этанолом; ВЭЖХ с обратной фазой; хроматография на диоксиде кремния или на катионобменной смоле, такой как ДЭАЭ; хроматофокусирование; SDS-ПАГЭ; осаждение сульфатом аммония; или гель-фильтрация (например, с помощью сефадекса G-75). В некоторых вариантах осуществления трансглюкозидазу используют без очистки от других компонентов культуральной среды. В некоторых вариантах осуществления культуральную среду просто концентрируют и затем используют без дополнительной очистки белка от компонентов среды выращивания, тогда как в других вариантах осуществления ее используют без какой-либо дополнительной модификации или обработки.
В настоящем изобретении также предлагаются методы разрушения полисахаридов природной камеди. В некоторых вариантах осуществления методы включают соединение (например, смешивание) фермента трансглюкозидазы с полисахаридом природной камеди в таких условиях, что полисахарид природной камеди разрушается. Условия, подходящие для активности ферментов трансглюкозидазы (например, температурный диапазон, диапазон pH, и другие компоненты реакции, пригодные для активности фермента трансглюкозидазы), известны в данной области техники.
Методы очистки
Кроме описанных выше содержащих трансглюкозидазу композиций в настоящем изобретении предлагаются также методы очистки. Эти методы обычно включают: контактирование предмета, загрязненного по меньшей мере одним полисахаридом природной камеди, с чистящей композицией, включающей фермент трансглюкозидазу; и совместное выдерживание предмета и чистящей композиции в условиях, достаточных для осуществления разрушения полисахарида природной камеди и тем самым очистки предмета.
В некоторых предпочтительных вариантах осуществления используемая в этих методах чистящая композиция представляет собой композицию для очистки ткани (например, поверхностно-активное вещество для стирки), композицию для очистки поверхности, композицию для очистки посуды, композицию поверхностно-активного вещества для автоматической посудомоечной машины и тому подобное. В настоящем изобретении находят применение разные составы чистящих композиций, включая, но не ограничиваясь этим, подробно описанные в патенте WO 0001826, включенном в настоящее описание в качестве ссылки.
В некоторых вариантах осуществления композиция для очистки предмета (например, поверхностно-активное вещество для стирки) включает от приблизительно 1% до приблизительно 80% (например, от приблизительно 5% до приблизительно 50% (по массе)) по меньшей мере одного поверхностно-активного вещества (например, неионного поверхностно-активного вещества, катионного поверхностно-активного вещества, анионного поверхностно-активного вещества и/или амфионного поверхностно-активного вещества или их смеси, такой как смесь анионного и неионного поверхностно-активных веществ). Типичные поверхностно-активные вещества включают, но не ограничиваются этим: алкилбензолсульфонат (ABS), включая линейный алкилбензолсульфонат и линейный алкилсульфонат натрия, алкилфеноксиполиэтоксиэтанол (например, нонилфеноксиэтоксилат или нонилфенол), диэтаноламин, триэтаноламин и моноэтаноламин. Типичные поверхностно-активные вещества, которые находят применение в различных чистящих средствах, особенно в стиральных порошках, описаны в патентах США №№ 3664961, 3919678, 4222905 и 4239659, каждый из которых включен в настоящее описание в качестве ссылки.
В некоторых вариантах осуществления композиция для очистки предмета представляет собой твердое вещество (например, в форме порошка или таблетки), жидкость или гель. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления композиция дополнительно включает по меньшей мере один буфер (например, карбонат натрия или бикарбонат натрия), основной детергент, отбеливатель, активатор отбеливателя, фермент, агент, стабилизирующий фермент, усилитель пены, гаситель, присадку, препятствующую осмолению, противокоррозийный агент, суспендирующий грязь агент, высвобождающий грязь агент, бактерицидный агент, агент, доводящий pH, источник защелачивания, отличный от основного детергента, хелатирующий агент, органический или неорганический наполнитель, растворитель, гидротроф, флуоресцентный осветлитель, краситель и/или отдушку. В некоторых вариантах осуществления чистящую композицию соединяют с детергентом до использования в качестве добавки для стирки.
В некоторых вариантах осуществления чистящие композиции дополнительно содержат по меньшей мере один фермент, разрушающий отличный от крахмала пищевой полисахарид (например, гемицеллюлазу, маннаназу, пектиназу, ксиланазу или пектатлиазу), и необязательно один или более других ферментов (например, протеазы, такие как субтилизиновая протеаза и/или белок SSI; липазу, амилазу, целлюлазу, кутиназу, липазу, оксидоредуктазу и т.д.) для удаления других загрязнений.
10
16
В предлагаемых в настоящем описании композициях находит применение множество других ингредиентов, пригодных для детергентных чистящих композиций, включая, но не ограничиваясь этим, другие активные ингредиенты, носители, гидротрофы, вспомогательные средства процессинга, красители или пигменты, растворители для жидких составов и т.д. В тех вариантах осуществления, в которых желателен дополнительный вклад мылкости, в композиции включают усилители пены, такие как C-C алколамиды, обычно от приблизительно 1% до приблизительно 10% от массы композиции.
В некоторых вариантах осуществления детергентные композиции включают воду и другие растворители в качестве носителей. В качестве таких носителей находят применение низкомолекулярные первичные или вторичные спирты, такие как метанол, этанол, пропанол и изопропанол. В некоторых вариантах осуществления для растворения поверхностно-активных веществ предпочтительны одноатомные спирты, однако находят применение и полиолы, такие как полиолы, содержащие от приблизительно 2 до приблизительно 6 атомов углерода и от приблизительно 2 до приблизительно 6 гидроксильных групп (например, 1,3-пропандиол, этиленгликоль, глицерин и 1,2-пропандиол). В некоторых дополнительных вариантах осуществления композиции включают от приблизительно 5% до приблизительно 90%, обычно от приблизительно 10% до приблизительно 50% таких носителей.
В некоторых предпочтительных вариантах осуществления предлагаемые в настоящем описании детергентные композиции составлены таким образом, что во время использования при водных процедурах очистки вода для промывки имеет pH между приблизительно 5,0 и приблизительно 11,5. Таким образом, конечные продукты обычно составляются в этом диапазоне. Методы контроля pH на рекомендуемом для применения уровне включают использование буферов, щелочей, кислот и т.д. и хорошо известны специалистам в данной области техники. В некоторых вариантах осуществления чистящие композиции представляют собой детергенты для автоматических посудомоечных машин, имеющие рабочий диапазон pH от приблизительно pH 9,0 до приблизительно pH 11,5, от приблизительно pH 9,0 до приблизительно pH 9,5, от приблизительно pH 9,5 до приблизительно pH 10,0, от приблизительно pH 10,0 до приблизительно pH 10,5, от приблизительно pH 10,5 до приблизительно pH 11,0 или от приблизительно pH 11,0 до приблизительно pH 11,5. В некоторых других вариантах осуществления чистящие композиции представляют собой жидкие детергенты для стирки, имеющие рабочий диапазон pH от приблизительно pH 7,5 до приблизительно pH 8,5, от приблизительно pH 7,5 до приблизительно pH 8,0 или от приблизительно pH 8,0 до приблизительно pH 8,5. В некоторых других вариантах осуществления чистящие композиции представляют собой твердые стиральные порошки, имеющие рабочий диапазон pH от приблизительно pH 9,5 до приблизительно pH 10,5, от приблизительно pH 9,5 до приблизительно pH 10,0 или от приблизительно pH 10,0 до приблизительно pH 10,5.
В предлагаемых в настоящем описании различных композициях также находят применение различные отбеливающие соединения, такие как перкарбонаты, пербораты и тому подобное, обычно на уровне от приблизительно 1% до приблизительно 15% по массе. Если это желательно, композиции могут также содержать активаторы отбеливателя, такие как тетраацетилэтилендиамин, нонаноилоксибензолсульфонат и тому подобное, которые также известны в данной области техники. Используемые уровни обычно варьируют от приблизительно 1% до приблизительно 10% по массе.
В различных композициях также находят применение разные удаляющие грязь агенты, особенно агенты типа анионных сложных олигоэфиров, разные хелатирующие агенты, особенно аминофосфонаты и этилендиаминдисукцинаты, разные агенты, удаляющие глинистый грунт, особенно этоксилированный тетраэтиленпентанамин, разные диспергирующие агенты, особенно полиакрилаты и полиаспарататы, разные осветлители, особенно анионные осветлители, разные гасители пены, особенно силиконы и вторичные спирты, разные смягчители ткани, особенно бентонитовая глина, на уровне в диапазоне от приблизительно 1% до приблизительно 35% по массе. Стандартные составы и опубликованные патенты содержат множество подробных описаний таких традиционных веществ, которые находят применение в композициях, предлагаемых в настоящем изобретении.
В некоторых вариантах осуществления в предлагаемых в настоящем описании композициях также находят применение стабилизаторы фермента. Такие стабилизаторы включают, но не ограничиваются этим, пропиленгликоль (предпочтительно от приблизительно 1% до приблизительно 10%), формиат натрия (предпочтительно от приблизительно 0,1% до приблизительно 1%) и формиат кальция (предпочтительно от приблизительно 0,1% до приблизительно 1%).
В некоторых вариантах осуществления чистящие композиции для твердых поверхностей и/или чистящие композиции для ткани составляют с включением разных основных детергентов на уровне от приблизительно 5% до приблизительно 50% по массе. Типичные основные детергенты включают, но не ограничиваются этим, 1-10-микронные цеолиты, поликарбоксилаты, такие как цитрат и оксидисукцинаты, слоеные силикаты, фосфаты и тому подобное. Другие традиционные основные детергенты приводятся в стандартных составах и находят применение в настоящем изобретении.
Другие необязательные ингредиенты включают хелатирующие агенты, агенты, удаляющие глинистую грязь/агенты против повторного отложения, полимерные диспергирующие агенты, отбеливатели, осветлители, гасители пены, растворители и эстетические агенты.
Предлагаемые в настоящем изобретении методы очистки являются более эффективными в удалении определенных пятен (например, пятен от пищевых продуктов, содержащих полисахариды природной камеди) по сравнению с эквивалентными методами, в которых не используется фермент трансглюкозидаза. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления по сравнению с во всем остальном эквивалентным методом, который не содержит фермент трансглюкозидазу, чистящие композиции настоящего изобретения более эффективны в удалении пятен. При использовании стандартного теста на основе рефлектометра, например, рассматриваемый метод обеспечивает удаление и/или обесцвечивание, по меньшей мере, приблизительно на 20%, по меньшей мере приблизительно на 40%, по меньшей мере приблизительно на 60%, по меньшей мере приблизительно на 80%, или в некоторых вариантах осуществления по меньшей мере приблизительно на 90% больше пятен по сравнению с эквивалентным методом, в котором не используется фермент трансглюкозидаза.
Для дополнительной иллюстрации настоящего изобретения и его преимуществ представлены следующие конкретные примеры с пониманием того, что они предлагаются для иллюстрации настоящего изобретения, и их не следует толковать каким-либо образом как ограничивающие его объем.
Экспериментальная часть
Следующие примеры предлагаются таким образом, чтобы обеспечить специалиста в данной области техники полным раскрытием и описанием того, как выполнить и использовать настоящее изобретение, и не предназначены для ограничения объема того, что заявители рассматривают как свое изобретение, и они не предназначены для представления того, что представленные ниже эксперименты являются всеми или единственными проведенными экспериментами. Были предприняты усилия для обеспечения точности в отношении используемых чисел (например, количеств, температуры и т.д.), но следует принимать во внимание и некоторые экспериментальные погрешности и отклонения. Если это не указано иначе, части представляют собой части по массе, молекулярная масса представляет собой средневзвешенную молекулярную массу, температура представлена в градусах по шкале Цельсия, а давление равно или близко к атмосферному.
Пример 1
Экспрессия трансглюкозидазы A. niger в T. reesei
Нуклеиновую кислоту, кодирующую зрелый фермент трансглюкозидазу A. niger, амплифицировали из геномной ДНК A. niger с помощью ПЦР и клонировали в вектор pTrex3 для получения pTrex3(AGL51M). pTrex3(AGL51M) показан на фигуре 1. Кодируемый этим вектором белок трансглюкозидаза был функционально связан с сигнальной последовательностью CBH1 для облегчения его секреции в среду для выращивания. По соседству с кодирующей трансглюкозидазу последовательностью располагали промотор и терминатор T. reesei cbh1. Нуклеотидная последовательность экспрессионной кассеты вектора pTrex3(AGL51M) показана на фигуре 2.
XbaI-XbaI фрагмент 7,57 т.п.н. плазмиды pTrex3(AGL51M) очищали с помощью электрофореза в агарозном геле и использовали для трансформации спор T. reesei путем электропорации. Параметры электропорации были следующими: напряжение - 16 кВ/см, емкость - 25 мкФ, сопротивление - 50 Ом. Электропорацию проводили с использованием суспензии свежеполученных спор T. reesei, суспендированных в охлажденном на льду 1,2 М сорбите. После электропорации споры инкубировали в течение ночи в роторном встряхивателе (30ºС, 200 об/мин) в среде, содержащей 1 М сорбит, 0,3% глюкозы, 0,3% бактопептона и 0,15% дрожжевого экстракта. Прорастающие споры высевали на селективную среду, содержащую ацетамид в качестве единственного источника азота (ацетамид 0,6 г/л; хлорид цезия 1,68 г/л; глюкоза 20 г/л; первичный кислый фосфат калия 15 г/л; сульфата магния гептагидрат 0,6 г/л; хлорида кальция дигидрат 0,6 г/л; сульфат железа (II) 5 мг/л; сульфат цинка 1,4 мг/л; хлорид кобальта (II) 1 мг/л; сульфат марганца (II) 1,6 мг/л; агар 20 г/л; pH 4,25). Колонии трансформанта появлялись приблизительно через 1 неделю. Индивидуальные трансформанты переносили на свежие чашки с селективным ацетамидом и давали им расти в течение 3-4 дней.
Изоляты, проявляющие стабильный рост на селективной среде, использовали для инокуляции 5 мл описанной лактозной среды (см., например, патент WO 2005/001036, p. 60) в 20×175 мм пробирках для тестирования. Пробирки фиксировали в роторном встряхивателе под углом приблизительно 45º и встряхивали при 200 об/мин и 28ºС в течение 4-5 дней. Электрофоретический анализ культуральных супернатантов показал наличие новой белковой полосы приблизительно ожидаемой молекулярной массы.
405
Продукция трансглюкозидазной активности трансформантами была также подтверждена с помощью ферментативного теста. Тестирование проводили в 100 мМ натрий-ацетатном буфере, pH 4,5, содержащем 4 мМ пара-нитрофенил-α-глюкозид и 1 мг/мл БСА. Через 30 мин инкубации при 30ºС реакцию останавливали добавлением равного объема 1 М карбоната натрия и записывали ОП. Обычно трансформанты экспрессировали 1-2 Е трансглюкозидазной активности (выраженной в микромолях пара-нитрофенола, выделяющегося за мин) на мл культурального бульона. В нетрансформированных контролях активность была ниже предела измерения.
Пример 2
Трансглюкозидаза разрушает ксантановую камедь
Гидролитическую активность ферментов в отношении ксантановой камеди измеряли с помощью теста восстановления сахара с использованием реагента PAHBAN (гидразида пара-гидроксибензойной кислоты), как известно в данной области техники (см. Lever et al., Anal. Biochem., 47:273 [1972]). Ксантановую камедь (CAS 111 38-66-2) получали от Sigma Chemicals, St. Louis MO и растворяли в 50 мМ натрий-ацетатном буфере pH 6,0 в концентрации 0,2%. Для некоторых экспериментов добавляли AATCC стандартный сверхмощный жидкий детергент (AATCC HDL 2003 без осветлителя, Test Fabrics, Inc. West Pittston, PA) в количестве 1,5 мл/л (0,15%). Жидкий детергент AATCC HDL содержал 12% линейных алкилсульфонатов, 8% алкогольэтоксилатов, 8% пропандиола, 1,2% лимонной кислоты, 4% жирной кислоты и 4% гидроксида натрия с доведением водой.
Тестирование проводили в 24-луночном микропланшете (COSTAR 3526, Corning Incorporated, Corning, N.Y.) следующим образом: в лунку 1 добавляли один мл буфера, в лунку 2 добавляли один мл буфера плюс фермент, в лунку 3 - один мл буфера и субстрат и в лунку 4 добавляли один мл буфера плюс субстрат и фермент. Для статистических целей каждая лунка может быть повторена от 2 до 4 раз. Подлежащие тестированию ферменты обычно разбавляют в буфере для реакции от 1- до 10-кратно, от 1- до 1000-кратно. После добавления всех реагентов микропланшет накрывали пластиковой крышкой и зазор между крышкой и планшетом тщательно заклеивали несколькими слоями парафильма (Pechiney Plastic Packing, Menasha, WI) для предотвращения испарения. Реакционный планшет инкубировали в течение от 1 до 16 час при 37ºС на встряхивателе, вращающемся при 100 об/мин.
Восстанавливающую сахар активность измеряли с помощью термоциклера Eppendorf Mastercycler Gradient (Eppendorf Scientific, Westbury, NY) и 0,2-мл одноразовых ленточных пробирок и крышек для ПЦР (полимеразной цепной реакции) от VWR International, West Chester, PA. Восстанавливающий сахар реагент готовили следующим образом: к 10 мл 2% гидроксида натрия в дистиллированной воде добавляли 0,15 г тетрагидрата виннокислого натрия-калия (Rochelle Salt, Sigma Chemical Co.) и 0,15 г гидразида парагидроксибензойной кислоты (H-9882, Sigma Chemical Co.). Раствор (называемый «реагентом PAHBAH») вращали для растворения всех ингредиентов и помещали на лед в темноте до использования. Этот реагент заново готовили ежедневно. Непосредственно перед анализом образца в каждую пробирку ленты для ПЦР добавляли 0,160 мл реагента PAHBAH и затем от 5 до 20 мкл образцов фермента и контролей. Все пробирки плотно закрывали крышками, помещали в термоциклер и инкубировали в течение 15 мин при 99ºС с последующим охлаждением до 4ºС в течение по меньшей мере 15 мин. После охлаждения крышки с ленточных пробирок снимали и 0,15 мл каждого образца помещали в 96-луночный плоскодонный микропланшет (COSTAR 9017, Corning Inc. Corning, NY), и считывали с помощью планшетного ридера Spectra Max 250 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) при 405 нм против блэнка дистиллированной воды. Каждый образец фермента анализировали следующим образом: оптическую плотность (ОП) контрольного образца вычитали из ОП образца с буфером и полученную величину добавляли к контролю с субстратом и буфером. ОП реакции фермента с субстратом сравнивали с суммой контролей субстрата и образца.
На фигуре 3 показано, что трансглюкозидазы, продуцируемые в Trichoderma (Trip-TG) и в Aspergillus (Mega-TG), проявляют значительную активность в восстановлении сахара на ксантановой камеди в 50 мМ ацетатном буфере плюс AATCC сверхмощный жидкий детергент при pH 6,0.
Пример 3
Трансглюкозидаза удаляет загрязнение с загрязненных лоскутов
Образцы хлопчатобумажной ткани, загрязненные салатным соусом с пигментом (STC CFT CS-6) и пигментом гуара (STC CFT CS-43), получали от Test Fabrics, Inc. West Pittston, PA, USA. Образцы для исследования в микропланшетах нарезали в виде 15 мм кружков (дисков) с помощью Punch Press Model B для тканей, оборудованного 5/8" высекательным прессом. Одинарные образцы дисков помещали в каждую лунку 24-луночного микропланшета (Costar 3526). Один (1) мл отмывающего раствора, содержащего на литр 1,5 мл AATCC HDL детергента, 50 мМ Hepes буфера и от 6 до 60 ч/млн фермента, разведенного в 50 мМ Hepes буфера, рН 7,4, добавляли к каждой лунке. Микропланшет покрывали пластиковой крышкой и алюминиевой фольгой и инкубировали при 37°С при осторожном вращении при 100 об/мин в течение 4-16 час. Планшеты вынимали из шейкера и раствор детергента удаляли отсасыванием. Каждую лунку микропланшета промывали три (3) раза 1,5 мл Dulbecco's ЗФР, pH 7,3, и три (3) раза 1,5 мл дистиллированной воды. Каждый диск вынимали из его лунки и сушили в течение ночи между листами бумажного полотенца без экспозиции с прямым освежением. Диски осматривали визуально и затем анализировали с помощью Minolta Reflectometer CR-200, откалиброванного по стандартному белому кафелю. Рассчитывали величины L со стандартным отклонением.
Гистограммы, представленные на фигуре 4, показывают, что Trip-TG (разведенный 1/50 в 50 мМ Hepes буфере) удаляет грязь как при загрязнениях салатным соусом, так и при загрязнениях гуаровым пигментом в 50 мМ Hepes буфере, рН 7,4, и в 50 мМ Hepes буфере, рН 7,4, плюс 0,15% AATCC HDL.
На фигуре 5 представлены результаты, полученные в эксперименте по дозозависимости ответа микрообразцов на Trip-TG. Trip-TG удалял загрязнения салатным соусом в концентрации 1 ч/млн в 0,15% AATCC сверхмощном жидком детергенте.
На фигуре 6 показано, что Trip-TG удалял загрязнение салатным соусом в эксперименте по очистке микрообразца в 0,1% североамериканском стандартном AATCC-1993 HDD без осветлителя. Этот детергент содержал 18% сульфонатов линейных алкилов, 25% Zeolite A, 18% кальцинированной соды, 0,5% силиката натрия, 22% сульфата натрия, 10% увлажнителя и 6,3% сополимера или других добавок.
Этот эксперимент продемонстрировал активность трансглюкозидазы в отношении удаления загрязнений как в сверхмощных жидких (HDL), так и в сверхмощных твердых (HDD) детергентах.
Пример 4
Анализ чистящей активности трансглюкозидазы с помощью терготометра
В исследованиях с помощью терготометра использовали 6-резервуарный терготометр модели 7243S (U.S. Testing, Co. Inc. Hoboken, N.J.), поддерживаемый при 30°С. Скорость перемешивания устанавливали на 100 об/мин. Образцы хлопчатобумажной ткани (5 на каждый резервуар терготометра), полученные от Warwick Equest Limited, Consett, County Durham, England, окрашенные кружками пищевых продуктов, добавляли к 1 литру 0,15% AATCC HDL детергента с жесткостью воды 6 гран в галлоне (разведенного из маточного раствора с жесткостью воды 15000 гран в галлоне, содержащего 1,735 М хлорида кальция и 0,67 М хлорида магния) и 25 мМ Hepes буфера рН 7,4. После цикла промывки в течение 30 мин образцы промывали три раза в 1,5 л холодной водопроводной воды, откручивали в течение 7 мин в цикле отжима для удаления избытка воды и сушили в течение ночи при комнатной температуре. Процент высвобождения загрязнения (%SRI) рассчитывали с помощью стандартных методов после анализа каждого загрязнения с помощью рефлектометра. На фигуре 7 показано, что трансглюкозидаза существенно очищает загрязнение джемом по сравнению с контролем без фермента или с контролем с неродственным белком, бычьим сывороточным альбумином (BSA-50, Fraction V, Immunoglobulin and Protease Free), полученным от Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, PA.
Представленные выше примеры демонстрируют, что трансглюкозидаза вызывает эффективное разрушение ксантана и удаляет определенные загрязнения из образцов хлопчатобумажных тканей.
Все патенты и публикации, упомянутые в описании, являются показателями уровня, достигнутого специалистами в области техники, к которой относится это изобретение. Все патенты и публикации включены в настоящее описание в качестве ссылки в такой же степени, как если бы каждая индивидуальная публикация была бы конкретно и индивидуально указана как включенная в качестве ссылки.
Специалисты в данной области техники легко оценят, что настоящее изобретение хорошо адаптировано для осуществления целей и получения указанных результатов и преимуществ, а также тех, которые ему присущи. Композиции и методы, описанные в настоящем документе, являются типичными для предпочтительных вариантов осуществления и иллюстративными и не рассматриваются в качестве ограничений объема изобретения. Специалисту в данной области техники вполне очевидно, что в раскрытом в настоящем документе изобретении могут быть сделаны разнообразные замены и модификации без отклонения от объема и сущности изобретения.
Изобретение, описанное в настоящем документе как иллюстративное, может быть подходящим образом осуществлено на практике в отсутствие какого-либо элемента или элементов, ограничения или ограничений, которые конкретно не раскрыты в настоящем описании. Термины и выражения, которые были применены, используются в качестве терминов описания, а не ограничения, и при употреблении таких терминов и выражений не подразумевается исключение каких-либо эквивалентов представленных и описанных характеристик или их частей, но признается, что различные модификации возможны в пределах объема изобретения. Таким образом, должно быть понятно, что хотя настоящее изобретение конкретно раскрыто с помощью предпочтительных вариантов осуществления и необязательных характеристик, специалисты в данной области техники могут прибегнуть к модификации и вариации раскрытых в настоящем описании принципов, и что такие модификации и вариации рассматриваются как входящие в объем настоящего изобретения.
В настоящем описании изобретение описано в широком и общем смысле. Каждые из более узких видов и менее общих группировок, попадающих в общее раскрытие, также составляют часть изобретения. Это включает общее описание изобретения с оговоркой или негативным ограничением, удаляющим любой предмет обсуждения из ряда, независимо от того, указан ли исключаемый предмет специально в настоящем документе.