СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ НООТРОПНЫМ ВОЗДЕЙСТВИЕМ НА ОРГАНИЗМ
MEDICATION, WHICH PRODUCES NOOTROPIC ACTION ON ORGANISM

Изобретение относится к области медицины, а именно к препаратам пептидного происхождения, обладающих ноотропным действием, а именно к циклическим пептидам (дикетопиперазинам) общей формулы:
, где X-аланин(Ala) или глютамин(Gln), а Pro-пролин.
Термин "ноотропы" (от греческих слов "ноос" - мышление и "тропос" - стремление) был принят в 1972 г., спустя два года после появления на мировом рынке препарата пирацетам (ноотрорпил), разработанного бельгийской фирмой UCB. В настоящее время под препаратами, обладающими ноотропным действием, понимают вещества, оказывающие специфическое влияние на высшие интегративные функции мозга, улучшающие память, облегчающие процесс обучения, стимулирующие интеллектуальную деятельность, повышающие устойчивость мозга к повреждающим факторам, улучшающие когнитивные (познавательные) функции как у здоровых людей, так и, в особенности, нарушенные при различных заболеваниях (Андреев Б.В. Ноотропные средства // Мир Медицины. - №8. - 1998. - С.25-28).
Ноотропные препараты являются весьма динамично развивающейся группой лекарственных средств и в России, и за рубежом. Это, в частности, связано с тем, что продолжительность жизни в развитых странах постоянно увеличивается, причем наиболее быстро растет часть общей популяции, которая состоит из людей старше 65 лет. Следовательно, можно ожидать, что частота заболеваний, ассоциирующихся с возрастом, таких как деменция и других, значительно возрастет, и ноотропные препараты будут все более и более востребованы.
Разработкой новых ноотропных препаратов в настоящее время занимается около 60 ведущих фармацевтических компаний в различных странах. (Варпаховская И. Состояние производства и разработок ноотропных препаратов за рубежом и в России // Ремедиум. - №7. - 1997. - С.3-8). По оценке ежегодника Pharmaprojects, в 1995 г. на различных стадиях исследований, клинического изучения и внедрения на рынок находилось 132 ноотропных препарата, из них 79 на этапе доклинического исследования, 34 - на различных стадиях клинического изучения и 19 - на стадии регистрации и внедрения на рынок. В России зарегистрировано около 15 лекарственных средств, отнесенных к группе ноотропов.
Такой интерес к этой группе препаратов объясняется, в частности, тем, что в отличие от психостимуляторов мобилизующего типа, ноотропы не вызывают психомоторного возбуждения, истощения функциональных возможностей организма, привыкания и пристрастия.
Согласно современным представлениям к ноотропным препаратам относятся (Воронина Т.А., Середенин С.Б. Ноотропные препараты, достижения и новые проблемы // Экспериментальная и клиническая фармакология. - №4. - 1998. - С.3-9; РЛС-Энциклопедия лекарств / Гл. ред. Крылов Ю.Ф. / М.: "РЛС-2001". - 2000. - 1504 с.; Справочник Видаль. Лекарственные препараты в России: Справочник. - М.: АстраФармСервис, 2000. - 1408 с.): пирацетам, его гомологи и аналоги (анирацетам, оксирацетам, прамирсцетам, нефирацетам и др.); производные диметиламиноэтанола: деанола ацеглюмат, меклофеноксат, центрофеноксин; препараты нейроаминокислот: гамма-аминомасляная кислота (ГАМК), производные гамма-аминомасляной кислоты (фенибут, никотиноил-гамма-аминомасляная кислота (пикамилон), гопантеновая кислота (пантогам), глицин, глутаминовая кислота; производные пиридоксина: пиритинол (пиридитол, энербол, энцефабол); холиномиметик центрального действия: холина альфосцерат; препараты Ginkgo biloba: билобил, мемоплант, ревайтл гинкго, танакан и др.
Ноотропным действием обладают также ряд препаратов с широким спектром эффектов (Воронина Т.А., Середенин С.Б. Ноотропные препараты, достижения и новые проблемы // Экспериментальная и клиническая фармакология. - №4. - 1998. - С.3-9): препараты, усиливающие мозговое кровообращение, микроциркуляцию и метаболизм: винпоцетин, винкамин, винконат, ницерголин, циннаризин, флунаризин, нимодипин, ксантиновые производные пентоксифиллина, карнитин, фосфатидилсерин, натрия оксибат; витамины и их производные: пиридоксин, пантотеновая кислота, фолиевая кислота, витамин Е; промежуточные продукты метаболизма клетки: оротовая и янтарная кислоты; энергодающие субстраты: рибоксин, АТФ, РНК, глюкозо-1- и глюкозо-6-фосфат; комбинированные препараты: инстенон.
Вышеперечисленные перечисленные препараты обладают положительным влиянием на память (ноотропным действием) и у них отсутствуют ярко выраженные эффекты традиционных психотропных и кардиотропных препаратов. Для ноотропов также свойственна низкая токсичность и отсутствие выраженных побочных эффектов даже в субтоксических дозах (за исключением некоторых холинергических препаратов).
В настоящее время большой интерес вызывают ноотропные препараты на основе пептидов, такие как кортексин, церебролизин, дельтаран, селанк, ноопепт (РЛС-Энциклопедия лекарств / Гл. ред. Крылов Ю.Ф. / М.: "РЛС-2001". - 2000. - 1504 с.; Справочник Видаль. Лекарственные препараты в России: Справочник. - М.: АстраФармСервис, 2000. - 1408 с.).
2
2
В частности, показано (RU 2394836, 2010), что пептид общей формулы: Ac-X-Met-Pro-Arg-Gly-NH, где X-Met - L-Met или DL-Met перспективен для создания лекарственных препаратов с нейротропной активностью. Известны цистинсодержащие пептиды, являющиеся фрагментами C-концевой последовательности вазопрессина, стимулирующие обучаемость лабораторных животных в дозах, в 100-1000 раз превышающих дозы вазопрессина в аналогичных тестах, но лишенные его гормональных эффектов (3. Burbach J.P.H., Leboille J.L.M. // J. Biol. Chem. - 1983. - V.258, N 3. - P.1487-1489; Valter M.P., De Wied D., Van Ree J.M. // Neuropeptides. - 1997. - V.31, N 5. - P.489-494). Показано (Голубович В.П., Мартинович В.П., Усенко А.Б и др. //. Химико-фармацевтический журнал, 1888. №6. - С.675-679; Мартинович В.П., Слободчикова Л.К., Голубович В.П., Ахрем А.А., Титов С.А., Воскресенская О.Г. // Химико-фармацевтический журнал - 1989. №9. - С.1054-1057), что тетрапептид Cys-Pro-Arg-Gly-NH является активным стимулятором памяти и обучаемости, эффективные дозы которого сопоставимы с дозами вазопрессина.
Недостатками данных препаратов является недостаточно высокая активность при воздействии на высшие интегративные функции мозга.
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту является циклический пролил-глицин, используемый в качестве нейропротективного агента для лечения поражений нервной системы, включая инсульты, травмы мозга, болень Альгеймера, болезнь Паркинсона и иные поражения нервной системы человека (US 2007/0244039, 2007).
Недостатком препарата является его недостаточно высокая ноотропная активность, в частности, относительно невысокое стимулирующее воздействие на процессы обучения.
Задачей, решаемой авторами, являлось создание новых средств на основе пептидов, обладающих более высокой ноотропной активностью.
Для решения поставленной задачи были синтезированы и исследованы различные циклические пептиды, содержащие пролин. Сопоставление их свойств проводилось как с ближайшим аналогом - цикло (Pro-Gly), так и с наиболее широко используемым ноотропным препаратом Ноопепт (таблетки 10 мг, ЗАО «Мастерклон», г. Москва).
Технический результат был достигнут созданием новых циклических пептидов общей формулы  где Х-аланин или глютамин, а Pro-пролин.
Соединения получают по стандартной технологии пептидного синтеза на твердой фазе или в растворе (например, J.M. Steward and J.D. Young, "Solid Phase Peptide Synthesis", W.H. Freeman Co., San Francisco, 1969)
Сущность изобретения иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Синтез пептидов
2
2
В работе в качестве исходного сырья были использованы: оксим-полимер (IRIS, С=0.9 мМ/г), трет-бутилоксикарбонильные производные аминокислот (Boc-Aa-OH), 1-гидроксибензотриазол (HOBt), диметиламинопиридин (DMAP), диизопропилкарбодиимид (DIC), диизопропилэтиламин (DIPEA), трифторуксусная кислота (TFA), хлористый метилен (CHCl), диметилформамид (DMF), уксусная кислота (AcOH).
Синтез пептидов cyclo(Pro-Gln) (DKP-5); cyclo(Pro-Ala) (DKP-9); cyclo(Pro-D-Ala) (DKP-10); cyclo(Pro-Gly) (DKP-40) проходил в несколько последовательных стадий в условиях традиционного пептидного синтеза..
2
2
Присоединение первого аминокислотного остатка. 1 мМ оксим-полимера помещают в реактор для твердофазного синтеза пептидов, добавляют 40 мл DMF и перемешивают в течение 1 часа. 5 мМ Вос-Аа-ОН (Boc-Gln-OH, Boc-Ala-OH, Boc-D-Ala-OH, Boc-Gly-OH) и 5 мМ HOBt растворяют в 10 мл DMF и после охлаждения до 4°С добавляют 5 мМ DIC. Полученный раствор выдерживают при 4°С 15 минут, затем при комнатной температуре 25 минут, переносят в реактор с полимером и добавляют 1 мМ DM АР в 1 мл DMF. Реакционную смесь перемешивают в течение 20 часов при комнатной температуре, отфильтровывают и полимер промывают 40 мл DMF 3 раза и 40 мл CHCl 2 раза.
2
2
2
2
Деблокирование проводят, внося в реакционный сосуд 30 мл 25% раствора TFA в CHCl 2 раза на 2 и 30 минут. Полимер отфильтровывают и промывают 40 мл CHCl 3 раза и 40 мл DMF 3 раза.
2
2
Присоединение второго аминокислотного остатка. 5 мМ Boc-Aa-OH (Boc-Pro-OH, Boc-(N-Me-Ala-OH) и 5 мМ HOBt растворяют в 10 мл DMF и после охлаждения до 4°C добавляют 5 мМ DIC. Полученный раствор выдерживают при 4°C 15 минут, затем при комнатной температуре 25 минут, переносят в реактор с аминоацилполимером и добавляют 6 мМ DIPEA в 1 мл DMF. Реакционную смесь перемешивают в течение 30 минут при комнатной температуре, отфильтровывают и полимер промывают 40 мл DMF 3 раза и 40 мл CHCl 2 раза.
2
2
2
2
Деблокирование проводят, внося в реакционный сосуд 30 мл 25% раствора TFA в CHCl 2 раза на 2 и 30 минут. Полимер отфильтровывают и промывают 40 мл CHCl 3 раза и 40 мл DMF 3 раза.
Циклизация. В реакционный сосуд с дипептидил-полимером вносят 10 мл DMF, 6 мМ DIPEA и перемешивают в течение 30 минут. Затем добавляют 10 мМ AcOH и перемешивают реакционную смесь в течение 2 суток. Полимер отфильтровывают, собирая фильтрат, и промывают 20 мл DMF 2 раза. Объединенные фильтраты упаривают досуха. Остаток растворяют в 20 мл 0,1% водного раствора TFA, замораживают и лиофилизируют.
Полученная субстанция подвергается очистке с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на колонке Waters Prep Nova-Pak HR С-18, 6µ, 60Å, 19×300 mm в градиенте ацетонитрила 5-75% за 30 минут. Детекция при 220 нм. Фракцию, соответствующую пику основного продукта, после лиофильной сушки подвергали аминокислотному, масс-спектральному и ВЭЖХ анализам:
- условия ВЭЖХ анализа: аналитический хроматограф Gilson, Франция, колонка Purospher STARRP-18e, 5µm, 100Å, 4,6×150 mm; градиент (1-25)% ацетонитрила в 0,1% TFA за 20 минут;
- условия аминослотного анализа: аминокислотный анализатор LKB Alpha Plus 4151, Швеция; гидролиз: 4M метансульфокислота, содержащая 0.2% триптамина, 110°C, 22 часа;
- условия масс-спектрального анализа: массспектрометр Voyager-DE BioSpectrometry Workstation, Per Sepetive Biosystems, США.
Все синтезированные пептиды имели аминокислотный состав и молекулярную массу, соответствующие теоретическим значениям. Чистота соединений по данным аналитической ОФ-ВЭЖХ составляла не менее 98%.
Характеристики полученных препаратов приведены в таблице 1.
Таблица 1
Пептид
ВЭЖХ
Мол. масса
Аминокислотный состав
Выход, %
градиент
чистота
теор.
экспер.
DKP-5
1-25
>98%
225.25
226.12
Gln 1.00; Pro 0.96
50
DKP-9
1-25
>98%
168.19
169.00
Pro 0.98; Ala 1.00
90
DKP-10
1-25
>98%
168.19
169.00
Pro 0.98; Ala 1.00
77
DKP-40 (прототип)
1-25
>98%
154.16
155.00
Pro 0.98; Gly 1.00
25
Пример 2. Оценка биологической активности пептидов
Базисной моделью для оценки влияния веществ на формирование и воспроизведение памятного следа в норме и в условиях его экспериментального нарушения является методика условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ) [Буреш Я. Методики и основные эксперименты по изучению мозга и поведения. - М.: Высш. шк., 1991. - 399 с.]. Метод основан на торможении врожденной деятельности или приобретенных навыков, приводящим к отрицательным последствиям для организма. В условиях пассивного избегания животное обучается избегать вредные факторы путем подавления определенных форм поведения, в данном исследовании - избегать предпочитаемого темного пространства.
Эксперименты проводили на беспородных белых крысах-самцах массой 180-200 г. Каждая экспериментальная и контрольная группа включала по 10 животных. Перед выработкой УРПИ экспериментальным животным на протяжении 10 дней вводили исследуемые препараты в дозах: от 0.01 мг/кг до 1 мг/кг в/б в объеме 0.2 мл на 100 г массы животного. Контрольным животным вводили в/б 0.9% раствор хлорида натрия в аналогичном объеме.
Препарат сравнения - «Ноопепт» вводили в/ж в виде водной взвеси также на протяжении 10 дней в дозе 5 мг/кг (адаптированная для грызунов максимальная терапевтическая доза для человека в расчете на активный компонент).
На 11 день у крыс проводили выработку УРПИ в установке, запускающим стимулом которой было нахождение животного в ярко освещенном пространстве. Крысу помещали в светлый отсек двухсекционной камеры. После перехода крысы в темный отсек сразу же наносили неустранимое болевое воздействие 5 последовательными стимулами переменного тока (1 мА, длительностью 1 секунда каждый с интервалом 2 секунды).
При тестировании (повторном помещении в освещенный отсек через 24 часа с целью определения сохранения УРПИ) наблюдение за животным велось в течение 180 секунд, регистрировалось время латентного периода перехода крысы в темную часть камеры, время пребывания в светлом и темном отсеках и число животных, не зашедших в темный отсек (число обученных животных).
Результаты эффекта исследуемых препаратов по влиянию на УРПИ представлены в таблице 2.
Таблица 2
Влияние природы сравниваемых препаратов на выработку УРПИ крыс
Экспериментальные группы
Показатели
Латентный период реакции перехода, с
Время пребывания в светлой камере, с
Время пребывания в темной камере, с
Число обученных животных (% ко всей группе)
Контроль, физиологический раствор
80±5
79±5
24.5±2.5
5 (50)
DKP-5
0.01 мг/кг
138±9*
118±7*
5.0±0.5*
10 (100)
0.1 мг/кг
140±12*
120±11*
4.5±0.5*
10 (100)
1 мг/кг
142±11*
123±14*
4.5±0.5*
10 (100)
DKP-9
0.01 мг/кг
122±6*
103±5*
7.0±0.5*
8 (80)
0.1 мг/кг
129±8*
107±5*
6.5±0.5*
9 (90)
1 мг/кг
132±9*
113±4*
7.0±0.5*
9 (90)
DKP-10
0.01 мг/кг
135±9*
114±8*
6.5±0.5*
9 (90)
0.1 мг/кг
138±10*
117±6*
7.0±0.5*
9 (90)
1 мг/кг
140±11*
120±4*
6.5±0.5*
10 (100)
DKP-40 (прототип)
0.01 мг/кг
110±8*
88±4
9.0±0.5*
7 (70)
0.1 мг/кг
115±7*
96±5
7.5±0.5*
7 (70)
1 мг/кг
120±9*
100±3*
8.5±0.5*
8 (80)
Ноопепт
115±10*
95±5
7.5±0.5*
7 (70)
* - достоверные отличия от контрольных животных при p<0.05
Рассматривая данные, представленные в таблице, можно отметить, что препараты улучшают мнестические функции ЦНС животных, причем для каждого препарата его положительный эффект не зависит от дозы в рассматриваемом диапазоне доз.
По эффективности препараты можно расположить в следующем ряду по убыванию активности: DKP-5 > DKP-9 = DKP-10 > DKP-40 - Ноопепт, т.е. заявляемые пептиды по показателям УРПИ превосходили препараты сравнения.