СПОСОБ ДООПЕРАЦИОННОЙ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ДОБРОКАЧЕСТВЕННЫХ И ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЙ ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
METHOD FOR PREOPERATIVE DIFFERENTIAL DIAGNOSIS OF BENIGN AND MALIGNANT THYROID TUMOURS

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для дооперационной дифференциальной диагностики доброкачественных и злокачественных новообразований щитовидной железы.
Распространенность рака щитовидной железы увеличилась с 2003 до 2014 года почти в 2 раза - с 55 до 97,1 на 100000 населения. Проблема дифференциальной диагностики узловых образований щитовидной железы остается актуальной и является причиной выполнения большого количества «лишних» оперативных вмешательств, доходящих до 71% [2]. Нарушения процессов клеточного гомеостаза, такие как неограниченная пролиферация трансформированных клеток, приводящая к появлению опухолевых клеток одного клона, подавление процесса апоптоза, ведут к развитию неоплазий. Скорость роста новообразования, способность к метастазированию, выраженность ответа на лечение определяется пролиферативной активностью опухолевых клеток. Для диагностики различных гистопатологических групп узлового образования щитовидной железы было предложено множество биомаркеров.
Известен способ дифференциальной диагностики атипической фолликулярной аденомы и фолликулярного рака щитовидной железы путем дополнительного определения индексов мечения цитоплазмы клеток для каждого из белков Вс1-2 и р53 [3].
Известен способ диагностики рака щитовидной железы, который улучшает интраоперационную диагностику [4]. Область применения известных методов ограничена. Данные методы не позволяют решать задачу дооперационной дифференциальной диагностики и требуют выполнения «лишних» оперативных вмешательств.
Известен способ дифференциальной диагностики фолликулярной аденомы и фолликулярного рака щитовидной железы на основе компьютерной программы анализа цифровых изображений мазков опухоли, взятых при тонкоигольной аспирационной биопсии щитовидной железы [5]. Однако данный способ позволяет дифференцировать не все виды высокодифференцированного рака, а только фолликулярный рак.
Известен способ диагностики рака у больных с дооперационным цитологическим диагнозом «фолликулярная опухоль» щитовидной железы с помощью математического моделирования, включающего анализ анамнестических данных и параметров ультразвукового исследования, однако авторами не указана точность способа, а поскольку в методе используются неспецифические параметры, чувствительность и специфичность метода не может быть высокой [6].
Известен способ диагностики с помощью определения экспрессии маркера галектина-3 в аспирате из узла щитовидной железы на дооперационном этапе. Чувствительность метода 93,1% и специфичность метода 89,2%. Однако способ определения данного маркера путем проточной цитофлуометрии является трудоемким и дорогостоящим [7].
По данным зарубежной литературы известны маркеры [8, 9, 10, 11], которые могли бы значительно улучшить дооперационную диагностику узлового зоба, однако известные методы обладают более низкой чувствительностью и специфичностью.
Оптимальным для широкого использования в патологоанатомической практике и наиболее специфическим маркером для установления выраженности пролиферативных процессов в ткани является Ki-67 [1]. Экспрессия Ki-67 позволяет выделить опухолевые клетки, находящиеся во всех фазах (G1, S, G2 и М) клеточного цикла, кроме G0 и распознается с помощью моноклональных антител.
Известны способы, в которых предлагается использовать маркер Ki-67 для дифференциальной диагностики узловой патологии щитовидной железы, однако в них проводят исследования послеоперационного материала, что не позволяет осуществить дальнейший выбор адекватного метода лечения [12, 13, 14].
Наиболее близким к предлагаемому является способ диагностики, заключающийся в определении методом ИФА уровня галектина-3 в смыве аспирата, полученного при тонкоигольной аспирационной биопсии из узлов щитовидной железы [15]. При содержании галектина-3 ниже 1,0 нг/мл определяют отсутствие патологии, а при содержании выше 1,6 нг/мл диагностируют высокодифференцированный рак щитовидной железы. Чувствительность данного метода в диагностике рака щитовидной железы 59,7%, специфичность 90,7%. Известный способ имеет следующий недостаток: метод ИФА имеет низкую воспроизводимость, так как уровень маркера, определяемый методом ИФА, напрямую зависит от количества полученного пункционного материала, а, следовательно, результаты оценки данного белка при проведении пункционной биопсии в другом медицинском учреждении или другим специалистом будут отличаться.
Новый технический результат - повышение точности и информативности способа. Для достижения нового технического результата в способе дооперационной дифференциальной диагностики доброкачественных и злокачественных новообразований щитовидной железы, включающем тонкоигольную аспирационную биопсию узловых образований щитовидной железы под контролем ультразвукового исследования и определение диагностического показателя, пункционную иглу с содержащимся в ней аспиратом промывают двукратно в консервирующем растворе NovaPrep, центрифугируют, отбирают супернатанты, проводят иммуноцитохимический анализ экспрессии Ki-67 и рассчитывают диагностический показатель по формуле
,
где HS=∑P(i)×i,
i - интенсивность окрашивания, выраженная в баллах (от 0 до 3),
P(i) - процент клеток, окрашенных с разной интенсивностью,
и при р>0,5 - образование признают злокачественным, при р<0,5 - доброкачественным.
Предложенный способ осуществляют следующим образом.
Проводят тонкоигольную аспирационную биопсию узловых образований щитовидной железы под контролем ультразвукового исследования. Пункционную иглу с содержащимся в ней аспиратом промывают двукратно в консервирующем растворе NovaPrep, центрифугируют, отбирают супернатанты, проводят иммуноцитохимический анализ экспрессии Ki-67 и рассчитывают диагностический показатель Р по формуле
,
где HS=∑P(i)×i,
i - интенсивность окрашивания, выраженная в баллах (от 0 до 3),
P(i) - процент клеток, окрашенных с разной интенсивностью,
и при р>0,5 - образование признают злокачественным, при р<0,5 - доброкачественным.
Предложенный способ разработан на основании анализа результатов исследования клеточного аспирата, полученного при тонкоигольной аспирационной биопсии методом иммуноцитохимии HS (Histochemical score) Ki-67 из узлов щитовидной железы у 28 пациентов с гистологическими диагнозами папиллярного рака - 10 пациентов, сочетание папиллярного с фокусами фолликулярного рака - 1 случай, 17 пациентов с доброкачественными образованиями щитовидной железы (с коллоидным зобом 12 случаев, 3 случая фиброзно-узловой формы аутоиммунного тиреоидита, 2 случая фолликулярной аденомы).
Всем пациентам проводили тонкоигольную аспирационную биопсию узлов щитовидной железы под контролем УЗИ и получали клеточный аспират, пункционную иглу с аспиратом промывали двукратно в консервирующем растворе NovaPrep, центрифугировали 5 мин при скорости вращения ротора 1000 об/мин (Cellspin II (Tharmac, Германия), окрашивали по Папаниколау на автоматическом приборе АФОМК-13-ПАП (ЭМКО, Россия), программа «ЕМСО-РАР-16». Далее определяли экспрессии маркеров - Ki-67, NFM, и галектину-3 методом иммуноцитохимии (ИЦХ). ИЦХ проводили непрямым трехступенчатым иммуноферментным LSAB (англ. Labeled streptavidin - biotin, «DAKOCytomation», LSAB 2 System - HRP) методом визуализации. В работе использовали моноклональные мышиные антитела («DAKO»): к белку пролиферативной активности Ki-67, NFM, и галектину-3. ИЦХ проводили непрямым трехступенчатым иммуноферментным LSAB. Осуществляли выявление пероксидазной активности с помощью 3,3-диаминобензидина. Докрашивали цитопрепараты гематоксилином Майера. Подсчитывали иммунопозитивные клетки в областях с максимальным проявлением диаминобензидина при анализе 200-300 клеток на микроскопе «Axioskop» («ZEISS», Germany). Оценивали HS (Histochemical score), который рассчитывали по формуле: Histochemical score (HS)=∑P(i)×i, где i - интенсивность окрашивания, выраженная в баллах (от 0 до 3), P(i) - процент клеток, окрашенных с разной интенсивностью для всех 3 маркеров. По результатам анализа детекция маркеров NFM и галектин-3 не была значима для дифференциальной диагностики доброкачественного и злокачественного процесса, а определение HS Ki-67 имело чувствительность 81,8% и 93,8% специфичность.
Использовали формулу для расчета диагностического показателя на основе метода бинарной логистической регрессии
1
1
2
2
n
n
1
1
где Z=b*X+b*X+…+b*X+а, где Х - значение независимых переменных, b - коэффициенты, расчет которых является задачей бинарной логистической регрессии, а - некоторая константа.
и при р>0,5 - образование признавали злокачественным, а при р<0,5 - доброкачественным.
Применение предложенного способа обладает чувствительностью 81,8% и специфичностью 93,8%.
Примеры практического осуществления предлагаемого способа.
Пример 1. Пациентка 67 лет. При поступлении жалоб не предъявляла. Образование в щитовидной железе было выявлено около 3-х месяцев назад при пальпации врача. Семейный анамнез по наличию узлов в щитовидной железе не отягощен. На УЗИ щитовидная железа имела ровные, четкие контуры. Объем правой доли 5,6 мл, объем левой доли 5,5 мл, перешеек 3,5 мл, эхогенность железы в норме, васкуляризация повышена, структура неоднородная - в правой доле было выявлено гипоэхогенное узловое образование до 2 см в диаметре, с ровным контуром, периферическим типом кровотока. Оценка тиреостата не проводилась. Проведено исследование согласно предлагаемому способу - тонкоигольная аспирационная биопсия под контролем УЗИ, результат цитологии - АИТ: подозрение на рак.
Проведено исследование согласно предлагаемому способу. Иглу с аспиратом промыли в растворе NovaPrep. Оценивали HS Ki-67 по количеству иммунопозитивно окрашенных клеток и интенсивности окрашивания.
_
Выявлено: не имели окраску 33% клеток, клеток со слабой окраской не было, 28% клеток имели умеренную окраску, выраженное окрашивание имели 39% клеток, рассчитывали HS по формуле Histochemical score (HS)=∑P(i)×i, где i  интенсивность окрашивания, выраженная в баллах (от 0 до 3), P(i) - процент клеток, окрашенных с разной интенсивностью.
HS=33*0+0*1+28*2+39*3=173.
Полученные значения подставляли в формулу
Р=1, то есть больше 0,5, диагностировали злокачественное образование.
Пациентке была проведена тиреоидэктомия. После гистологического исследования был выставлено следующее заключение: папиллярный рак с инвазией в капсулу узла, в сосуды, без инвазии в прилежащий мышечный массив T3N0M0.
Пример 2. Пациента 59 лет. При поступлении были жалобы на неприятные ощущения в области щитовидной железы. Наблюдалась у эндокринолога около 8 лет с узловым зобом 1 степени, было рекомендовано оперативное лечение по результатам ТАБ-УЗИ, методом традиционной цитологии «подозрение на папиллярный рак». По данным гормонального статуса диагностировали эутиреоз. Данные УЗИ щитовидной железы: контуры железы неровные, эхогенность смешанная, нормальная васкуляризация, объем правой доли 7,7 мл, левой 13,3 мл, толщина перешейка 3,6 см, в правой доле узел 15×10×11 см, с ровными контурами, изоэхогенное, однородное, со смешанным типом кровотока.
Проведено исследование согласно предлагаемому способу. В пунктате, взятом при ТАБ-УЗИ, была определена экспрессия Ki-67 и подсчитан HS Ki-67. По данным жидкостной цитологии все клетки не имели окрашивания. Оценивали HS по формуле Histochemical score (HS)=∑P(i)× i, где i - интенсивность окрашивания, выраженная в баллах (от 0 до 3), P(i) - процент клеток, окрашенных с разной интенсивностью.
HS=100*0+0*1+0*2+0*3=0.
Полученные значения подставляли в формулу
Р=0,05, это меньше чем 0,5, на основании чего диагностировали доброкачественное образование.
Пациентке была проведена тиреоидэктомия. После гистологического исследования был выставлено следующее заключение: узловой зоб макро-микрофолликулярного строения с очаговой псевдопапиллярной гиперплазией отдельных фолликулов.
Таким образом, предлагаемый способ позволяет улучшить дооперационную диагностику узлового зоба и обладает чувствительностью и специфичностью 81,8% и 93,8% соответственно.
Источники информации
1. Лазарев А.Ф., Климачев В.В., Зорькин В.Г. и др. Особенности маркеров Ki-67, PCNA, р53 и активности неоангиогенеза в прогнозе рака желудка // Российский биотерапевтический журнал. - 2010. - Т. 9. - №4. - С. 117 - 122.
2. Bartolazzi A., Orlandi F. et al. Galectin_3_expression analysis in the sur_gical selection of follicular thyroid nodules with indeterminate fine_needle aspiration cytology: a prospective multicentre study | // Lancet On_col. 2008. V. 9. N 6. P. 508-510.
3. Патент на изобретение №2332172 Способ дифференциальной диагностики атипической фолликулярной аденомы и фолликулярного рака щитовидной железы / Шкурупий В.А., Полоз Т.Л., Полоз В.В. Опубл. 27.08.2008.
4. Патент на изобретение №2521239 Способ интраоперационной диагностики рака щитовидной желез / Астахова Т.М., Шарова Н.П., Сумеди И.Р., Плеханова А.С., Родоман Г.В., Люпина Ю.В., Карпова Я.Д., Горелова B.C., Богомягкова Ю.В. Опубл. 27.06.2014.
5. Патент на изобретение №2353295 Способ дифференциальной диагностики фолликулярной аденомы и фолликулярного рака щитовидной железы / Полоз Т.Л., Тарков М.С., Полоз В.В., Шкурупий В.А. Опубл. 27.04.2009.
6. Патент №2493770 Способ диагностики рака у больных с дооперационным цитологическим диагнозом «фолликулярная опухоль» щитовидной железы с помощью математического моделирования / Олифирова О.С., Трынов Н.Н., Кналян С.В., Ильюшенок А.С. Опубл. 27.09.2013.
7. Семенов Д.Ю. Колоскова Л.Е., Борискова M.E., Панкова П.А, Фещенко Н.С, Филиппова О.И., Фарафонова У.В. Экспрессия галектина-3 в дооперационной диагностике высокодифференциорованного рака щитовидной железы // Проблемы эндокринологии, №4, 2010. С.9-15.
8. Cochand-Priollet В., Dahan H., Laloi-Michelin M. et al. Immunocytochemistry with cytokeratin 19 and anti-human mesothelial cell antibody (HBME1) increases the diagnostic accuracy of thyroid fine-needle aspirations: preliminary report of 150 liquid-based fine-needle aspirations with histological control // Thyroid. - 2011. - Vol. 21, N 10. - P. 1067-73. doi: 10.1089/thy.2011.0014. Epub 2011 Aug 29.
9. Guerriero E., Ferrara A., Desiderio D. et al. UbcH10 expression on thyroid fine-needle aspirates // Pallante Cancer Cytopathol. - 2010. - Vol. 118, N 3. - P. 157-65. doi: 10.1002/cncy.20046.
10. Pazaitou-Panayiotou K., Mygdakos N., Boglou K. et al. The immunocytochemistry is a valuable tool in the diagnosis of papillary thyroid cancer in FNA's using liquid-based cytology // J. Oncol. - 2010. 963926. doi: 10.1155/2010/963926. Epub 2010 Oct 27.
11. Raggio E., Camandona M., Solerio D. et al. The diagnostic accuracy of the immunocytochemical markers in the pre-operative evaluation of follicular thyroid lesions // J Endocrinol. Invest. - 2010. - Vol. 33, N 6. - P. 378-81. doi: 10.3275/6444.
12. Choudhury M., Singh S., Agarwal S. Diagnostic utility of Ki67 and p53 immunostaining on solitary thyroid nodule-a cytohistological and radionuclide scintigraphic study // Indian J Pathol Microbiol. - 2011. - Vol. 54, N 3 - P. 472-5, doi: 10.4103/0377-4929.85077.
13. Dinets A., Hulchiy M., Sofiadis A. et al. Clinical, genetic, and inrmunohistochemical characterization of 70 Ukrainian adult cases with post-Chornobyl papillary thyroid carcinoma // Eur J Endocrinol. - 2012. - Vol.166, N 6. - P. 1049-60, doi: 10.1530/EJE-12-0144.
14. Pujani M., Arora В., Pujani M.et al. Role of Ki-67 as a proliferative marker in lesions of thyroid // Indian J Cancer. - 2010. - Vol. 47, N 3. - P. 304-7. doi: 10.4103/0019-509X.
15. Патент на изобретение №2546011 Способ высоко дифференцированного рака щитовидной железы / Олиферова О.С., Кналян С.В., Трынов Н.Н., Проклова Н.И., Ильюшенок А.С., Тальченкова Т.Е. Опубл. 10.04.2015.
16. Патент на изобретение №2553378 Способ дифференциальной диагностики высокодифференцированного рака у больных с узловыми формами заболеваний щитовидной железы / Олиферова О.С., Кналян СВ., Трынов Н.Н., Проклова Н.И., Ильюшенок А.С., Тальченкова Т.Е. 10.06.2015.