СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РАДИОЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ОПУХОЛИ СЛИЗИСТЫХ ОБОЛОЧЕК ПОЛОСТИ РТА
METHOD OF DETERMINATION OF RADIATION SENSITIVITY OF TUMOUR OF MOUTH MUCOSA

Изобретение относится к медицине, а именно к методам прогноза и определения радиочувствительности опухоли при лечении онкологических больных посредством воздействия ионизирующего излучения на опухоль.
Известен способ прогнозирования степени тяжести реакции слизистой оболочки полости рта и глотки в процессе лучевой или химиолучевой терапии злокачественных новообразований орофарингеальной области (патент РФ №2320271, МПК А61В 8/13, публ. 2008). Способ заключается в том, что в процессе лечения ежедневно проводят клиническую оценку состояния слизистой оболочки полости рта, до появления первых клинических признаков лучевой реакции и в день их появления повторно проводят исследование слизистой оболочки полости рта методом оптической когерентной томографии. Полученное ОКТ-изображение сравнивают с ОКТ-изображением до облучения и по состоянию границы между эпителием и подлежащей соединительной тканью прогнозируют степень тяжести реакции.
Недостатком этого способа является невозможность прогнозирования степени тяжести реакции слизистой оболочки полости рта и глотки до начала лечения.
Наиболее близким к предлагаемому является способ диагностики реакции опухоли при лечении онкологических больных (патент №2107297, МПК G01N 33/483, A61N 5/06, публ. 1998), включающий воздействие на клетки опухоли низкоинтенсивным источником излучения до начала курса лечения, во время и после лечения, определение величины фракции роста в опухоли и интактной области, по отношению которых во времени и скорости изменения фракции роста в опухоли в процессе лечения определяют реакцию опухоли на лечение.
Недостатком данного способа является определение чувствительности опухоли только после проведенного лечения по степени ее регрессии.
Задача, поставленная авторами, разработать метод прогноза за счет определения радиочувствительности опухоли путем регистрации показателей флюоресценции фермента NADH, флавопротеинов и порфиринов и исходного уровня экспрессии антигена Ki-67 и их последующего анализа, упрощение методики, повышение достоверности метода и получение возможности прогнозирования чувствительности опухоли к ионизирующему излучению до начала курса лечения.
1
1
1
i
i
Для решения поставленной задачи, осуществляют диагностическое воздействие на клетки опухоли до начала лечения низкоинтенсивным источником лазерного излучения в интактной области и опухоли. Новым является то, что дополнительно проводят иммуногистохимическое исследование до начала лечения, при котором регистрируют уровень экспрессии антигена Ki-67, и при его значении >65% принимают критерий прогноза П равным +1, при значении 45-65% принимают П=0, при значении <45% принимают П=-1. При этом воздействие низкоинтенсивным источником лазерного излучения осуществляют при средней мощности излучения 1-10 мВт, последовательно на длине волны 370 нм с регистрацией интенсивности обратнорассеянного излучения флюоресценции на длинах волн 420, 460 и 520 нм и на длине волны 532 нм с регистрацией интенсивности обратнорассеянного излучения флюоресценции на длинах волн 560 и 608 нм. Определяют отношения зарегистрированных показателей I соответственно в опухоли и I' в интактной области, где i - соответствующая длина волны:
2
420
460
3
460
520
4
560
608
K=I/I, К=I/I, K=I/I
2
420
460
3
460
520
4
560
608
K'=I'/I', К'=I'/I', К'=I'/I',
2
3
4
после чего определяют критерии прогноза П, П, П как
2
3
4
2
2
3
3
4
4
П, П, П=+1, соответственно при К/K'<1, К/К'<1, K/К'<0,5,
2
3
4
2
2
3
3
4
4
2
3
4
2
2
3
3
4
4
П, П, П=0, соответственно при К/K'=1-4, К/К'=1-1,4, К/К'=0,5-1,5, П, П, П=-1, соответственно при К/К'>4, К/К'>1,4, К/К'>1,5.
1
2
3
4
1
2
3
4
1
2
3
4
При значении П+П+П+П>0 прогнозируют высокую степень радиочувствительности, при значении П+П+П+П=0 прогнозируют умеренную степень радиочувствительности, при значении П+П+П+П<0 прогнозируют низкую степень радиочувствительности.
Данное изобретение явилось следствием анализа и систематизации полученных экспериментально-клинических исследований по наблюдению в течение ряда лет за пациентами радиологического отделения МОНИКИ, проходящими курс лучевой терапии по поводу местно-распространенных злокачественных опухолей полости рта. Критерии прогноза радиочувствительности опухоли получены эмпирически при сравнительном анализе данных иммуногистохимических исследований на Ki-67, лазерной флюоресцентной диагностики и данных клинических наблюдений по непосредственным результатам лечения, оцениваемым по степени регрессии первичного опухолевого очага.
Известно, что эндогенная флюоресценция биотканей в синей и сине-зеленой областях спектра (400-530 нм) при ее возбуждении на длине волны 375 нм нм обусловлена главным образом находящимися в тканях флавопротеинами. Из флюорофоров дермы, дающих наибольший вклад в регистрируемый сигнал флюоресценции в этом спектральном диапазоне длин волн, можно выделить эластин - протеин соединительной ткани, максимум флюоресценции которого приходится на длине волны 420 нм. Из флюорофоров эпидермиса особо следует отметить восстановленную (NAD-Н) формы кофермента никотинамид-аденин-динуклеотид с максимумом спектра флюоресценции на длине волны 460 нм.
2
Основной вклад в интенсивность эндогенной флюоресценции биотканей в области 520 нм обусловлен эмиссией излучения рибофлавином и его производными - коферментами FAD и FMN (флавиноадениндинуклеотид и флавиномононуклеотитд). В отличие от NAD-H эти вещества ярко флюоресцируют в окисленном состоянии, а восстановленная форма, например FADH, практически не флюоресцирует. Совместно молекулы NAD-H, FAD и FMN функционируют как коферменты дегидрогеназ в окислительно-восстановительных реакциях в тканях, выступая акцептором электрона субстрата при реакции. Большинство нарушений клеточного метаболизма и клеточного дыхания заметно отражаются в динамике различных форм этих молекул, что может представлять особый интерес для диагностики дыхательных и обменных процессов в живых биологических тканях.
В желтом диапазоне спектра (550-600 нм) с максимумом на длине волны 560 нм сильной эндогенной флюоресценцией обладают гранулы внутриклеточного пигмента старения - липофусцина (каротиноксисомы). Липофусциновые гранулы в своем составе содержат каратиноиды, гемопротеины типа миоглобина и некоторые окислительные ферменты типа цитохромоксидаз. По современным представлениям считается, что каратиноиды вместе с миоглобином выполняют в этих гранулах функции внутриклеточного депо кислорода, а с ними гранулы липофусцина благодаря наличию в них дыхательных ферментов способны к производству энергии в гипоксических условиях. В связи с этим накопления в тканях липофусцина с возрастом и в условиях хронической гипоксии может рассматриваться как механизм адаптации клеток с высокой метаболитической активностью к уменьшению скорости поступления кислорода к тканям.
12
В красной области оптического спектра (600-750 нм) сильной фотоактивностью и интенсивной эндогенной флюоресценцией обладают природные порфирины и различные порфириновые соединения. Именно с этим классом веществ связано сегодня подавляющее большинство исследований методами флюоресцентной in vivo диагностики в онкологии и дерматологии. Эндогенные порфирины в тканях участвуют в реакциях катализа и полимеризации, входят в состав ферментов класса оксиредуктаз, витамина B и ряда других веществ, так что их роль в организме весьма высока. Нарушение порфиринового обмена часто приводит к анемии, ряду нейропсихических и кожных заболеваний (красной волчанке, фотодерматозу, трофическим язвам и т.п.). При этом порфириновую флюоресценцию в тканях при ее возбуждении излучением зеленого лазера 532 нм наблюдается на длине волны 608 нм, вероятно, совместно с флюоресценцией липофусцинов. Известно, что повышенное накопление эндогенных порфиринов в тканях хорошо коррелирует с состоянием хронической гипоксии в тканях, поэтому их, видимо, вместе с липофусцином можно считать индикаторами нарушений в снабжении тканей кислородом.
Поскольку точная количественная идентификация абсолютных уровней накопления отдельных классов флюоресцирующих биомолекул в тканях существующими методами лазерной флюоресцентной диагностики in vivo пока находится за гранью возможного, в данном изобретении предлагается использовать метод относительной оценки их присутствия и активности в тканях, реализуемый через вычисление отношений регистрируемых аппаратурой интенсивностей флюоресценции на выбранных длинах волн и исходного уровня экспрессии антигена Ki-67. При этом данный способ позволяет осуществлять прогноз непосредственных результатов лечения по регрессии объема опухоли, не заменяет собой и не отрицает общеклинические исследования, оценивающие объем опухоли, а также гистоморфологическое строение опухоли и наличие метастазов.
Способ осуществляется следующим образом.
До начала лечения на опухоль и окружающую ее интактную ткань воздействуют низкоинтенсивным лазерным излучением мощностью 1-10 мВт с длиной волны 370 нм, на аппарате «ЛЭСА-01 БИОСПЕК» регистрируется выходящее из тканей излучение флюоресценции на длинах волн 420 нм, 460 нм и 520 нм. Затем на опухоль и окружающую ее интактную ткань воздействуют низкоинтенсивным лазерным излучением мощностью 1-10 мВт с длиной волны 532 нм, на аппарате «ЛЭСА-01 БИОСПЕК» регистрируется выходящее из тканей излучение флюоресценции на длинах волн 560 нм и 608 нм. Далее определяют исходный уровень экспрессии антигена Ki-67 методом иммуногистохимии непосредственно того участка опухоли, на который ранее воздействовали лазерным излучением, и регистрируют флюоресценцию.
Затем приступают к анализу полученных результатов:
1
- определяют критерий прогноза П по исходному уровню экспрессии антигена Ki-67.
- вычисляют отношения интенсивностей флюоресценции на длинах волн 420/460 нм, 460/520 нм и 560/608 нм, полученных с поверхности опухоли:
2
420/460
420
460
К=I=I/I,
3
460/520
460
520
К=I=I/I,
4
560/608
560
608
K=I=I/I,
- определяют отношения интенсивностей флюоресценции на длинах волн 420/460 нм, 460/520 нм и 560/608 нм по данным, полученным с интактной ткани:
2
420/460
420
460
К'=I'=I'/I',
3
460/520
460
520
К'=I'=I'/I',
4
560/608
560
608
К'=I'=I'/I',
- вычисляют отношение интенсивности флюоресценции опухоль/интактная ткань на длинах волн 420/460 нм, 460/520 нм и 560/608 нм:
2
2
3
3
4
4
К/K',K/K', K/K'.
1
2
3
4
Принимают критерии прогноза П, П, П, П равными +1, 0 или -1 по полученным результатам (см табл.1)
Таблица 1
П<sub>1</sub>, П<sub>2</sub>, П<sub>3</sub>, П<sub>4</sub>
+1
0
-1
Ki-67
>65%
45-65%
<45%
К<sub>2</sub>/К'<sub>2</sub>
<1
1-4
>4
К<sub>3</sub>/К'<sub>3</sub>
<1
1-1,4
>1,4
К<sub>4</sub>/К'<sub>4</sub>
<0,5
0,5-1,5
>1,5
По сумме всех критериев прогноза определяют степень чувствительности опухоли к лучевой терапии:
1
2
3
4
П+П+П+П>0 - высокая;
1
2
3
4
П+П+П+П=0 - умеренная;
1
2
3
4
П+П+П+П<0 - низкая радиочувствительность.
Пример 1.
Пациент Г., 60 лет (история б-ни №10001/2007), поступил в клинику с диагнозом рак корня и тела языка IV ст. T4NoMo, гистологическое заключение №13268 от 28.04.07 г. - умеренно дифференцированный плоскоклеточный рак. Местно: опухоль занимала левую половину корня, задней и средней трети языка, размером 3,0×2,0×1,0 см, без признаков инфильтрации средней линии языка.
2
2
До начала лечения на опухоль и окружающую ее интактную ткань воздействовали низкоинтенсивным лазерным излучением освещенностью 1 мВт/см длиной волны 370 нм. На аппарате «ЛЭСА-01 БИОСПЕК» регистрировали выходящее из тканей излучение флюоресценции на длинах волн 420 нм, 460 нм и 520 нм. Затем воздействовали НИЛИ освещенностью 3 мВт/см длиной волны 532 нм. На аппарате «ЛАКК-02» регистрировали выходящее из тканей излучение флюоресценции на длинах волн 560 нм и 680 нм. Далее определяли исходный уровень экспрессии антигена Ki-67 методом иммуногистохимии участка опухоли, с которого регистрировали флюоресценцию.
Затем приступили к анализу полученных результатов:
1. Исходный уровень экспрессии антигена Ki-67 45%.
2. Вычислили отношения интенсивностей флюоресценции на длинах волн 420/460 нм, 460/520 нм и 560/608 нм, полученных с поверхности опухоли:
2
420/460
420
460
К=I=I/I=0,14,
3
460/520
460
520
К=I=I/I=1,56,
4
560/608
560
608
K=I=I/I=0,21.
3. Вычисляют отношения интенсивностей флюоресценции на длинах волн 420/460 нм, 460/520 нм и 560/608 нм, полученных с интактной ткани:
2
420/460
420
460
К'=I'=I'/I'=0,15,
3
460/520
460
520
К'=I'=I'/I'=1,21,
4
560/608
560
608
К'=I'=I'/I'=0,45.
4. Вычисляют отношения интенсивности флюоресценции опухоль/интактная ткань на длинах волн 420/460 нм, 460/520 нм и 560/608 нм:
2
2
К/К'=0,14/0,15=0,93,
3
3
К/К'=1,56/1,21=1,29,
4
4
К/К'=0,21/0,45=0,47.
1
2
3
4
5. Согласно табличным данным (см. табл.1) критерии прогноза составили: П=0; П=+1; П=0; П=+1
6. Степень чувствительности опухоли к лучевой терапии:
1
2
3
4
П+П+П+П=0+1+0+1=+2, - прогнозируется как высокая.
Далее больному проведена лучевая терапия на аппарате дистанционной гамма-терапии (ДГТ) «Рокус-АМ» в автоматическом режиме на первичный очаг по 3-польной методике: переднего 5×9 см под углом 5° и двух боковых полей под углом 110° каждое слева и справа размером 7×9 см при разовой очаговой дозе (РОД) 1,8 Гр дважды в сутки с интервалом между сеансами 4-6 часов до суммарной очаговой дозы (СОД) 10,8 Гр. Затем при РОД 1,2 Гр дважды в сутки с интервалом между сеансами 4-6 часов до СОД 34,8 Гр в режиме облучения 5 раз в неделю. На зоны регионарных лимфатических путей передней поверхности слева и справа проведена ДГТ шейно-надключичными полями 8×6 см при РОД=3 Гр до СОД=30 Гр в режиме облучения 5 раз в неделю. Больной выписан домой на перерыв для реализации эффекта лучевой терапии. На 14 сутки, учитывая выраженную регрессию опухоли (>90%), было принято решение продолжать лучевую терапию. ДГТ на первичный очаг проводили по аналогичной методике облучения до СОД=69,6 Гр, по окончании которой отмечена полная регрессия опухоли. При наблюдении через год признаков рецидива опухоли не обнаружено. Таким образом, мы получили подтверждение нашего прогноза.
Пример 2.
Пациент Т., 67 лет (история б-ни №1894/2008), поступил в клинику с диагнозом рак корня языка IV ст. T4N2Mo, Цитологическое заключение от 9.01.08 г. - плоскоклеточный рак. Местно: опухоль занимала левую половину корня языка, размером 3,0×2,5×2,5 см, без признаков инфильтрации средней линии языка. На шее слева от угла нижней челюсти по ходу кивательной мышцы отмечается конгломерат лимфатических узлов, размером 5,0×3,0×2,0 см. Цит. от 9.01.08 г. - метастаз плоскоклеточного рака.
До начала лечения пациенту провели диагностические исследования, аналогичные, как в 1 примере. По вышеописанной методике был проведен анализ полученных результатов:
1) исходный уровень экспрессии антигена Ki-67 63,5%.
2
420/460
420
460
3
460/520
460
520
2) K=I=I/I=0,01, К=I=I/I=1,2,
4
560/608
560
608
K=I=I/I=0,02.
2
420/460
420
460
3
460/520
460
520
3) K'=I'=I'/I'=0,28, К'=I'=I'/I'=1,0,
4
560/608
560
608
К'=I'=I'/I'=0,01.
2
2
3
3
4) К/К'=0,01/0,28=0,04, К/К'=1,2/1,0=1,20,
4
4
К/К'=0,02/0,01=2,0.
5) Сумма критериев прогноза составила
1
2
3
4
П+П+П+П=0+1+0+(-1)=0,
т.е. у данного пациента выявлена опухоль умеренной степени чувствительности к лучевой терапии.
Пациенту провели лучевую терапию по аналогичной примеру №1 методике: СОД 34,8 Гр на первичную опухоль и 30 Гр на зоны регионарных лимфатических путей. Больной был выписан домой на перерыв для реализации эффекта лучевой терапии. На контрольном осмотре через 2 недели отмечены значительная регрессия опухоли (>50%) и незначительная регрессию конгломерата лимфатических узлов на шее (<20%). В данном случае мы также получили соответствие с нашим прогнозом. Больной направлен на хирургическое лечение.
Пример 3.
Пациент В., 37 лет (история б-ни №1981/2008), поступил в клинику с диагнозом рак корня и тела языка IV ст. T4N2Mo, Цитологическое заключение от 30.01.08 г. - высокодифференцированный плоскоклеточный ороговевающий рак. Местно: опухоль занимала все отделы правой половины языка, размером 4,0×2,5×2,5 см, с переходом в задней трети за среднюю линию языка. В подчелюстных областях справа и слева увеличенные лимфатические узлы, размером до 2,5 см в диаметре каждый. Цит. от 30.01.08 г. - метастаз плоскоклеточного рака.
До начала лечения пациенту провели диагностические исследования, аналогичные как в 1 примере. Затем приступили к анализу полученных результатов:
1) исходный уровень экспрессии антигена Ki-67 43%.
2
3
4
2) К=0,24, К=1,36, К=0,25.
2
3
4
3) К'=0,5, К'=0,91, К'=1,14.
2
2
3
3
4
4
4) К/К'=0,48, К/К'=1,49, К/К'=1,79.
5) таким образом, критерии прогноза составили
1
2
3
4
П=-1; П=+1; П=-1; П=-1
1
2
3
4
и их сумма П+П+П+П=-1+1+(-1)+(-1)=-2,
т.е. по предлагаемому способу у данного пациента выявлена опухоль низкой степени чувствительности к лучевой терапии.
Правильность прогноза, полученного данным способом, подтверждена на контрольном осмотре после проведенной лучевой терапии, где отмечена умеренная <50% регрессия опухоли и незначительная <20% регрессия конгломерата лимфатических узлов на шее.
Способ упрощает прогнозирование результатов до начала курса лечения по чувствительности опухоли к ионизирующему излучению, повышает его достоверность, что позволяет вносить коррекцию в план лечения.