Способ получения ультрадисперсных водных лиозолей терпентинного масла с заданными размерами частиц
METHOD FOR PRODUCTION OF ULTRAFINE AQUEOUS LYOSOLS OF TURPENTINE OIL WITH GIVEN PARTICLE SIZES

Настоящее изобретение относится к ветеринарии, в частности к способам получения лиозолей терпентинного масла, обладающих адъювантными свойствами.
При создании и проектировании различных типов вакцин необходимо введение адъювантов, которые не влияют на специфичность вакцин, но увеличивают иммунный ответ при их введении в организм. Механизм действия адъювантов основан на увеличении миграции клеток иммунной системы в область введения вакцины, что приводит к увеличению специфического иммунного ответа антигенов. Зачастую адъюванты в комплексе с вакцинами медленно резорбируются из тканей в зоне инъекции, в результате чего обеспечивается пролонгированное поступление антигена вакцины в кровоток, создавая условия для более эффективно вакцинации. Часто адъюванты включают в состав вакцин при низкой антигенности специфического вакцинного компонента. В частности, для многих внутриклеточных инфекций, например, возбудителя анаплазмоза Anaplasma ovis антигенная активность суспензии дезинтегрированных клеток возбудителя недостаточна для адекватной иммунной реакции и наработки антител. Добавление адъювантов к дезинтегрированным клетокам Anaplasma ovis приводит к устойчивой наработке антител, специфичных к возбудителю после при вакцинации.
Современные адъюванты представлены ограниченным числом групп родственных химических молекул. К первой группе относятся органические масла (например, ланолин) и неорганические масла (например, вазелиновое масло). Во вторую группу включены неорганические оксиды и гидроксиды (например, гидроксид алюминия). Третья группа представлена различными органическими соединениями, преимущественно биополимерами полисахаридной природы (например, хитин и хитозан). Однако проблема поиска эффективных адъювантов все еще остается крайне актуальной и арсенал композиций обладающих адъювантными свойствами постоянно пополняется новыми соединениями. Такое пополнение можно связать, с одной стороны со снижением токсичности адъювантов (например, нейротоксичность гидроксида алюминия), с другой стороны - необходимостью повышения миграции иммунных клеток в область введения вакцины. По этой причине все чаще качестве адъювантов стали использовать терпентинное масло или непосредственно скпидар. Все терпеноиды малотоксичны и в зоне инъекции вызывают асептическое воспаление с мощной миграцией макрофагов и лимфоцитов. Скипидар, как и все терпеноиды нерастворимы в воде, поэтому при использовании их в качестве адъювантов для вакцин они образуют эмульсии типа «масло : вода». Однако без предварительной эмульсификации и стабилизации, такие системы на основе не стабильны. Поэтому в при создании таких адъювантов их подвергают воздействию различных физических или химических факторов, на пример ультразвук, электрически ток или барбатирование газами. Однако в большинстве случаев, частицы формируемые при таком способе обработке имеют микронный размер, что снижает адъювантные свойства конечного продукта.
В патенте RU 2545717, опубл. 10.04.2015, Бюл. №10 описано получение адъюванта для вакцин, включающий растворение смеси тритерпеноидов бересты в тетрагидрофуране, добавление олеиновой кислоты, удаление тетрагидрофурана, добавление криопротектора и лиофилизацию, при этом получают смесь тритерпеноидов бересты в тетрагидрофуране с концентрацией 5-10 г/л, с последующим растворением полученной смеси в олеиновой кислоте в количестве 5-10% от массы тритерпеноидов бересты, проводят стерилизующую фильтрацию смеси, формируют гомогенную дисперсию сферических аморфных наночастиц путем добавления 25-кратного избытка 0,01 Μ трис буфера, рН - 9,0±0,2, при перемешивании, с последующей ультразвуковой обработкой в течение 5-10 минут, удаляют тетрогидрофуран с помощью ультрафильтрации при скорости 1,0-1,2 л/мин, при давлении 0,6-0,8 атм, при добавлении криопротектора замораживают полученную концентрированную смесь с содержанием смеси терпеноидов 1 мг/мл ниже температуры минус 35°С, выдерживают при этой температуре 4-6 часов и лиофилизируют при температуре минус 35°С в течение 15 часов, с последующим досушиванием при 20-25°С в течение 15 часов. Изобретение позволяет повысить иммуногенную активность вирусных вакцин и обеспечивает их стабильность при хранении. Недостатком адъюванта является низкая стабильность эмульсии при смешивании с водой.
В патенте RU 2566068, опубл. 20.10.2015, Бюл. №29 описан способ получения стабильных ультрадисперсных водных лиозолей терпентинного масла с заданными дисперсионными параметрами заключается в том, что терпентинное масло диспергируется в два этапа: на первом этапе готовится маточная дисперсия с помощью ультразвукового диспергирования 1 мл терпентинного масла в 500 мл дистиллированной воды; на втором этапе маточная дисперсия фильтруется путем продавливания под давлением 0,2-0,3 МПа через пористую мембрану из полиэфирсульфона в основную дисперсионную среду, которая предварительно барботированая ионизированным газом. Группа изобретений относится также к устройству для осуществления указанного способа, представляющему собой стенд, состоящий из трех блоков: ионизационной камеры, блока ультразвукового диспергирования и блока фильтрации, содержащего пористую мембрану из полиэфирсульфона. Группа изобретений позволяет получить устойчивый к коалесценции и седиментации лиозоль терпентинного масла в водных средах с заданными параметрами дисперсности без применения стабилизаторов и эмульгаторов. Согласно изобретению, получение устойчивых дисперсий терпентинного масла и других скипидаров в водных средах производится приготовлением растворов скипидаров в воде посредством применения сложных составов, включающих сравнительно большое количество ингредиентов. Химический состав подбирается таким способом, чтобы обеспечить возможность полного растворения гидрофобных веществ в воде. Для этого используют состав при следующих соотношениях в массовых процентах (%): живичный скипидар 43,0; олеиновая кислота 25,0; касторовое масло 18,0; едкий натр 3,0; вода дистиллированная - остальное. Основным недостатком предложенного способа является включение в состав адъюванта очень большого количества поверхностно-активного вещества, которое образуется при взаимодействии олеиновой кислоты и едкого натра. Основным недостатком представленного способа является то, что при снижении концентрации поверхностно-активного вещества в результате смешивания адъюванта с водной фазой вакцинного компонента, содержащего специфические антигены, стабильность эмульсии типа «масло : вода» будет снижаться. Дополнительным недостатком является использование едкого натра, который будет создавать в вакцине сильно щелочную реакцию, которая может разрушить специфические антигены за счет щелочного гидролиза.
В патенте WO 01/68129 А2, опубл. 20.09.2001 описан адъювант следующего состава:
1. Сквален - около 5 мас. %
2. Полисорбат 80 (Tween 80) - около 0,5 мас. %
3. Сорбита trioleat 85 (Span 85) - около 0,5 мас. %
4. Цитратный буфер с рН 6,5 - до 100 мас. %
Недостатком предложенного адъюванта является низкая стабильность эмульсии типа «масло : вода».
В патенте RU 2675108, опубл. 10.01.2017, Бюл. №1, способе прототипе, описана композиции, выполненная в виде лиофилизата, для образования в организме млекопитающих антител, связывающих оболочечные белки вируса гепатита С и вирус гепатита С, содержащей в качестве синтетических пептидных антигенов пять пептидов, а также сквален, фосфолипид Липоид С100, твин 80, мальтозу. Композиция получена после лиофилизации водного раствора, содержащего синтетические пептидные антигены 0,002-0,01 мас. %, сквален 0,2 мас. %, фосфолипид Липоид С100 0,02 мас. %, твин 80 0,4 мас. %, мальтозу 10 мас. %, воду для инъекций до 100%. Изобретение обеспечивает выработку специфичного гуморального иммунного ответа с образованием антител, связывающих вирус гепатита С. Недостатком изобретения является низкая стабильность эмульсии типа «масло : вода» после растворения лиофилизата адъюванта в воде.
Целью настоящего изобретения является способ получения ультрадисперсных водных лиозолей терпентинного масла с заданными размерами частиц, обладающего высокой стабильностью эмульсии типа «масло: вода».
Указанная цель достигается тем, что ультрадисперсный водный лиозоль терпентинного масла изготавливается в виде наноструктурированной эмульсии типа «масло: вода». Для этого готовят смесь следующего состава:
1. Терпентин (Живичный скипидар)
0,03 мас. %
2. Дистиллированная вода для инъекций
до 100 мас. %
Полученную смесь гомогенизируют с помощью ультразвукового
дезинтегратора для получения маточного лиозоля, затем эмульсию подвергают воздействию электрического тока, барбатированию азотом и пропускают через микропористые фильтры с диаметром пор 0,25 мкм. В результате получают стабильный ультрадисперсный водный лиозоль терпентинного масла типа «масло: вода» с размером частиц 40-80 нм. Стерильный адъювант разливают в стерильные флаконы по 100 мл, укупоривают резиновыми пробками и закатывают алюминиевыми колпачками.
Определяющим существенным отличием, новизной заявляемого способа получения адъюванта от способа прототипа является возможность управлять размерными параметрами формируемых частиц в составе лиозоля типа «масло: вода». Получаемый лиозоль стабилен при комнатной температуре не мене одного месяца. Эмульсия типа «масло: вода», приготовленная при добавлении воды в лиофилизат адъюванта изготовленного по способу прототипу стабильна не более 30 минут, далее наблюдается расслаивание эмульсии и образование водной и масляной фазы. Эмульсия терпеноидного адъюванта, приготовленная заявляемым способом стабильна в процессе хранения в течение 1 месяца при 20°С.
Предлагаемый способ получения терпеноидного адъюванта является новым и неочевидным, его нельзя было предвидеть из существующих представлений о свойствах его компонентов и способе получения.
Заявляемое техническое решение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.
Пример 1
Во всех случаях базовую эмульсию получали смешиванием дистиллированной воды 450 мл и 10 мл эфирное масло хвои. При перемешивании смесь обрабатывали ультразвуком с частотой 26 кГц, амплитуда 80% с использованием ультразвукового дезинтегратора в течение 2-5 минут. После чего базовую эмульсию помещали в специальную ванну и воздействовали электрическим постоянным током с напряжением 120 В, в течение 30 мин. Полученную базовую эмульсию фильтровали через фильтр с соответствующим размером пор, прикапывали при постоянном перемешивании в дистиллированной воде и барботировалии атмосферным воздухом или азотом со скоростью потока воздуха 1 л/мин в течение 30 минут. Объемы воды и базовой эмульсии для смешивания выбирали таким образом, чтобы получить на выходе эмульсию с содержанием органической фазы 1%.
Пример 2
Во всех случаях базовую эмульсию получали смешиванием дистиллированной воды 450 мл и 10 мл скипидар. При перемешивании смесь обрабатывали ультразвуком с частотой 26 кГц, амплитуда 80% с использованием ультразвукового дезинтегратора в течение 2-5 минут. После чего базовую эмульсию помещали в специальную ванну и воздействовали электрическим постоянным током с напряжением 120 В, в течение 30 мин. Полученную базовую эмульсию фильтровали через фильтр с соответствующим размером пор, прикапывали при постоянном перемешивании в дистиллированной воде и барботировалии атмосферным воздухом со скоростью потока воздуха 1 л/мин в течении 30 минут. Объемы воды и базовой эмульсии для смешивания выбирали таким образом, чтобы получить на выходе эмульсию с содержанием органической фазы 1%.
Пример 3
Во всех случаях базовую эмульсию получали смешиванием дистиллированной воды 450 мл и 10 мл скипидар. При перемешивании смесь обрабатывали ультразвуком с частотой 26 кГц, амплитуда 80% с использованием ультразвукового дезинтегратора в течение 2-5 минут. После чего базовую эмульсию помещали в специальную ванну и воздействовали электрическим постоянным током с напряжением 120 В, в течение 30 мин. Полученную базовую эмульсию фильтровали через фильтр с соответствующим размером пор, прикапывали при постоянном перемешивании в дистиллированной воде и барботировалии атмосферным азотом со скоростью потока воздуха 1 л/мин в течение 30 минут. Объемы воды и базовой эмульсии для смешивания выбирали таким образом, чтобы получить на выходе эмульсию с содержанием органической фазы 1%.