Аналитические системы контроля качественного и количественного состава ДНК

АНАЛИТИЧЕСКИЕ СИСТЕМЫ КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВЕННОГО И КОЛИЧЕСТВЕННОГО СОСТАВА ДНК

Р.А. Козулин, В.Е. Курочкин

Высокочувствительный анализ ДНК и РНК, необходимый для диагностики инфекционных, онкологических и генетических заболеваний человека и животных, идентификации мутаций, определения общей концентрации ДНК и РНК, требует чувствительной и высокопроизводительной аппаратуры. К таким приборам относятся анализаторы полимеразной цепной реакции (ПЦР), способные проводить ПЦР с возможностью определения концентрации ДНК в режиме реального времени, и секвенаторы, анализирующие последовательность ДНК.

Цель настоящей статьи - познакомить читателя, интересующегося вопросами аналитического приборостроения, с основными направлениями развития высокочувствительных измерений ДНК и РНК, методом «умножения» концентрации исследуемого компонента, методом капиллярного электрофореза, используемого для разделения компонент, и оптическими способами детектирования этих компонент.

Метод ПЦР (полимеразной цепной реакции, PCR, polymerase chain reaction) является прямым и самым современным методом анализа ДНК. Идея ПЦР заключается в многократном копировании (амплификации) в пробирке определенных участков ДНК в процессе повторяющихся температурных циклов, в результате чего ДНК можно размножить в миллионы раз. Процесс амплификации проводится в специальном программируемом термостате (амплификаторе), который по заданной программе автоматически осуществляет смену температур согласно числу циклов амплификации.

Каждый цикл амплификации включает 3 стадии, которые протекают в различных температурных режимах. На первой стадии при температуре 93-95°С в течение 30-40 с происходит денатурация ДНК (расплетение двойной спирали на две антипараллельные цепи). На второй стадии к антипараллельным цепям ДНК происходит присоединение праймеров, которые представляют собой специально синтезированные олиго-нуклеотиды длиной 20-30 нуклеотидов и являются затравками для достраивания ДНК. Праймеры комплементарны последовательностям ДНК на левой и правой границах ам-плифицируемого фрагмента и ориентированы таким образом, что достраивание новой цепи ДНК протекает между ними. Длительность этой стадии составляет 20-60 с, а температура понижается до 50-65°С.

На третьей стадии при температуре 70-72°С в течение 20-40 с происходит комплементарное достраивание цепей ДНК, начиная с участков присоединения праймеров. Материалом для синтеза служат добавляемые в раствор дезоксирибонуклеотидтрифос-фаты (дНТФ). Длина фрагментов ДНК, которые необходимо амплифицировать в ходе ПЦР обычно составляет несколько сот нуклеотидов.

В каждом цикле синтезированные ранее молекулы ДНК вновь вступают в реакцию амплификации и удваиваются. Благодаря этому количество продукта в ходе ПЦР нарастает в геометрической прогрессии по формуле 2й, где n - число циклов амплификации. Поэтому, даже если в исходном растворе первоначально находилась только одна двухцепочечная молекула ДНК, то за 30-40 циклов в растворе накапливается более 50 млрд. идентичных молекул. Этого количества достаточно для достоверной визуальной детекции методом электрофореза в гелевых пластинках.

Таким образом, с помощью ПЦР теоретически можно обнаружить даже 1 копию ДНК в образце, не имея, таким образом, предела чувствительности. Еще одной особенностью ПЦР является то, что для нее характерна не только абсолютная чувствительность, но и абсолютная специфичность (избирательность). Специфичность задается нуклеотидной последовательностью праймеров, что исключает возможность получения ложноположительных результатов при условии, что метод выполняется правильно.

Общеизвестно, однако, что существующие походы к оценке результата реакции не позволяют проводить количественную оценку и делают ее практически только качественной, либо количественность достигается методическими усложнениями, требует существенных затрат времени и реактивов, а также дополнительного оборудования. Основным источником этих недостатков является использование для детекции конечного продукта реакции, количество которого в силу особенностей реакции не строго зависит от исходного числа копий исследуемой ДНК.

В настоящее время активно внедряется новая технология ПЦР - ПЦР в реальном времени (Real-Time PCR). Ее принципиальной особенностью является возможность регистрация цикла за циклом накопления продуктов ПЦР в режиме текущего времени. Такая технология исключает все послеамплификационные манипуляции с продуктом реакции, тем самым не только ускоряется анализ, но и сводится к минимуму риск контаминации лаборатории и оборудования продуктами ПЦР.

Анализатор ПЦР в реальном времени представляет собой систему из высокоскоростного амплификатора для проведения ПЦР и многоканального флуориметра, измеряющего уровень флуоресценции пробы непосредственно в течении амплификации. В таком методе для детекции используется зонд, несущий флуорофор и тушитель, комплементарный средней части амплифицируемой ДНК. Когда флуорофор и тушитель связаны с олигонуклеотидным зондом, наблюдается лишь незначительная флуоресцентная эмиссия. Во время циклов ПЦР по мере достраивания последовательности цепи ДНК флуоресцентная метка переходит в раствор, освобождаясь от соседства с тушителем, и генерирует сигнал флуоресценции. Таким образом, уровень флуоресценции увеличивается от цикла к циклу и пропорционален накоплению ДНК в течение реакции.

Оптическую систему прибора ПЦР в реальном времени можно представить в следующем виде (рис. 1).

блок ов егодиодов

опттеские волокна

опттеское волокно

пробирка в температурном блоке

ФЭУ

набор светофильтров

Рис. 1 Принципиальная оптическая схема прибора ПЦР

Излучение от четырех светодиодов доводится с помощью световодов до пробирки, в которой возбуждается флуоресценция пробы. Светодиоды включаются попеременно, излучают в разных спектральных диапазонах и могут возбуждать 4 разные флуоресцентные метки. Флуоресценция из пробирки посредством другого световода направляется через блок светофильтров на фотоэлектронный умножитель (ФЭУ). Каждый светофильтр пропускает спектр определенного флуорофора, прикрепленного к определенной молекуле ДНК.

На рис. 2 отображен процесс ПЦР из 40 циклов в виде нарастания и спада сигнала флуоресценции пробы. В данном случае в качестве флуорофора использовался краситель FAM (производная флуоресцеина), который возбуждается на 490 нм и излучает на 525 нм. Объем пробы составлял 25 мкЛ. Реакция проведена на приборе, разработанном в Институте аналитического приборостроения РАН.

Так как интенсивность флуоресценции зависит от температуры, то на первой стадии цикла при нагревании пробы до 94°С для денатурации ДНК сигнал флуоресценции

идет вниз. При охлаждении пробы для присоединения праймеров флуоресценция растет. Первые 24 цикла имеют примерно равную амплитуду сигнала, но в районе 25-го цикла начинается рост флуоресценции. Это связано с тем, что на начальных циклах ПЦР количество накопленной ДНК мало, и флуоресценция очень слабо выражена и мало изменяется. Этот уровень свечения называется базовым. Показателем накопления продукта реакции является так называемые «пороговый цикл», при котором интенсивность флуоресценции начинает превышать базовый порог. На рис. 2 за пороговый можно принять 25-й цикл амплификации. Чем выше изначальная концентрация ДНК в

ШШЯ, сек.

Рис. 2 Пример проведения ПЦР.

Проанализировав изменение количества продукта в экспоненциальной фазе ПЦР, при помощи определенных математических методов можно с высокой точностью определить количество исходной ДНК или РНК в образце. Применение 4-х канального флуориметра в анализаторе ПЦР расширяет аналитические возможности и повышает производительность прибора, позволяя анализировать несколько образцов генетического материала в одной пробирке.

Таким образом, использование данного прибора не только реализует в диагностической и исследовательской практике всю мощь ПЦР применительно к анализу ДНК и РНК, но и позволяет сделать его строго количественным, что повышает точность результатов и позволяет проводить математическую и статистическую обработку.

Одной из распространенных задач для дальнейшего анализа продуктов ПЦР является секвенирование, т.е. определение в молекуле ДНК последовательности 4-х нуклео-тидов - аденина, цитозина, гуанина и тимина. Секвенирование проводится электрофорезом, который можно разделить по принципу проведения на электрофорез в гелевых пластинах и капиллярный электрофорез (КЭ).

КЭ является наиболее подходящим методом для секвенирования ДНК, так как обладает высокой скоростью и эффективностью разделения многокомпонентных смесей на составляющие [1]. Разделение происходит в кварцевом капилляре с внутренним диаметром 50-100 мкм и длиной 40-100 см, заполненном гелем. Когда источник высокого напряжения подает на коны капилляра разность потенциалов (рис. 3), происходит движение фрагментов ДНК в капилляре, так как они имеют заряд. Фрагменты движутся с разной скоростью, потому что гель в капилляре имеет структуру сита, и более короткие компоненты пробы испытывают меньше препятствий и движутся быстрее. Такая система позволяет разделять и детектировать молекулы ДНК, которые имеют разницу по длине даже в один нуклеотид.

Рис. 3. Схема аппаратуры КЭ

Для регистрации миграции молекул в капилляре используется лазерное флуоресцентное детектирование, которое для капиллярного электрофореза является наиболее чувствительным, так как короткий оптический путь в капилляре (50-100 мкм) не позволяет применить при регистрации низких концентраций фотометрирование. Для этого к секвенируемым фрагментам ДНК прикрепляются флуоресцентные метки. При детектировании флуоресценции в КЭ хорошо подходит конфокальная система [2]. В такой системе (рис. 4) возбуждение и сбор флуоресценции происходит на одной оси, где один микрообъектив фокусирует излучение в капилляр и собирает флуоресценцию.

....... .......

© ©

Сь

Ш <

I I

* 1

-е со

капилляры

Рис. 4. Схема 4-х цветного лазерного флуоресцентного детектора для капиллярного электрофореза.

Пройдя через светоделитель, отражательные и полосовые светофильтры, флуоресценция регистрируется ФЭУ. Паразитный свет от стенок капилляра в этой схеме большей частью отражается в других направлениях, что уменьшает его проникновение на фотоприемник и снижает интенсивность фоновой засветки. В конфокальной системе может использоваться высокоапертурный микрообъектив, который позволяет сильно сконцентрировать свет в капилляр и собрать флуоресценцию в большом телесном угле. Глубина поля такой оптической системы достаточно мала, поэтому облучается только внутренняя область капилляра, что также снижает рассеянный свет. Некоторые трудности в работе конфокальным детектором могут возникнуть при юстировке светоделителя, чтобы сделать соосными возбуждающий луч и флуоресценцию, особенно при работе с невидимым УФ диапазоном.

Конфокальная система детектирования также открывает возможность детектирования флуоресценции во многих капиллярах одновременно, что значительно увеличи-

вает производительности КЭ. В этом случае можно сканировать микрообъективом поперек оси капилляров, которые уложены параллельно друг другу. Таким образом было выполнено секвенирование ДНК в 96 капиллярах с применением четырехцветного детектирования флуоресценции [3]. Для возбуждения использовался ион-аргоновый лазер (488 нм) мощность 3-4 мВт. При сканировании микрообъектив перемещается со скоростью 1 см/сек. Флуоресценция от четырех красителей разделяется на четыре канала детектирования с помощью дихроичных светоделителей и, пройдя узкополосные светофильтры, фокусируется на 4 фотоумножителя. Такая система обладает высокой чувствительностью и производительностью.

Выводы

Аппаратное обеспечение методов анализа ДНК с помощью ПЦР и капиллярного электрофореза использует флуоресцентные системы детектирования как наиболее чувствительные. Так как анализ ДНК практически всегда отличается низкими концентрациями и малыми количествами пробы (вплоть до нескольких молекул), то усовершенствование техники детектирования остается актуальным вопросом.

Работа выполнена при частичной поддержке Федеральной целевой программы «Интеграция науки и высшего образования России на 2002-2006 годы», Проект № Б0120 -Направление 1.1.-УНЦ «Оптика и научное приборостроение».

Литература

1. Беленький Б.Г. Капиллярные сепарационные методы и их использование в аналитической химии // Российский химический журнал ЖРХО им. Д.И. Менделеева. 1994. Т 38. С. 25-32.

2. L. Hernandez, J. Escalona, N. Joshi, N. Guzman. J. Chromatogr. 1991.183, 559.

3. X. C. Huang, M. A. Quesada, R. A. Mathies. Anal. Chem. 1992. 64, 967.

СВЕТОСИЛЬНЫЙ ДВОЙНОЙ ПОЛИХРОМАТОР С НИЗКИМ УРОВНЕМ РАССЕЯННОГО СВЕТА

М.М. Кочергин, Д.М. Королев, Ю.К. Михайловский, Е.Е. Мухин, Г. Т. Раздобарин

Рассмотрены результаты расчета и моделирования светосильного по потоку двойного полихроматора с низким уровнем паразитной засветки спектра. Разработка такого полихроматора и на его базе - спектрометра для диагностики плазмы методом томсоновского рассеяния является одним из этапов многолетней работы коллективов лаборатории физики высокотемпературной плазмы ФТИ им. А.Ф. Иоффе РАН и кафедры физической оптики и спектроскопии СПбГУИТМО по оснащению нескольких поколений ТОКОМАКОВ спектральной аппаратурой.

Назначение полихроматора

Полихроматор входит в состав диагностического комплекса, предназначенного для исследования плазмы с помощью метода томсоновского рассеяния. На базе такого полихроматора строится спектрометр, регистрирующий контур томсоновского рассеяния лазерного излучения. Ширина измеряемого контура рассеяния однозначно связана с электронной температурой плазмы. Возможность регистрации контура и, таким образом, определения температуры электронов осложняются очень малой интенсивностью рассеянного излучения и сильной паразитной засветкой спектра от излучения лазера, рассеиваемого в приборе.

Для понижения уровня паразитной засветки спектра в работе [1 ] была реализована зеркальная оптическая схема, выполненная в виде двойного полихроматора с вычитанием в два раза различающихся дисперсий и отсечением половины контура томсонов-ского рассеяния, не используемого при измерениях.

В работе [2] были рассмотрены результаты реализации двойного полихроматора по подобной схеме, но выполненного с применением простых линз в его проекционной системе. Повышение светосилы по потоку достигалось благодаря использованию значительных по площади дифракционных решеток в схеме скользящего падения лучей (ф = 75o). Большая угловая дисперсия в такой схеме, а также высокое светопропускание ~60% в поляризованном свете спектра томсоновского рассеяния обеспечивает повышение светосилы не менее чем в 3 раза по сравнению с серийными спектральными приборами приблизительно тех же габаритов [3]. Проведенные измерения показали, что коэффициент режекции паразитного рассеянного света в непосредственной близости к лазерной линии может достигать значения ~106. Это позволяет настраивать первый измерительный канал на область спектра, максимально близкую к линии лазера, и производить измерение в узких контурах рассеяния, соответствующих низким температурам плазмы.

В настоящей работе рассмотрены результаты компьютерного моделирования модернизированного варианта такого полихроматора. Основная задача модернизации направлена на повышение светосилы благодаря выявленной возможности применения очень высоких и прямых входной и выходной щелей. Достигнутое значение угловой высоты щелей h/F = 0,52 обеспечивает дополнительное увеличение светосилы, по крайней мере, в 3 раза, а также позволяет организовать несколько каналов по высоте щели для измерения температуры в разных участках плазмы вдоль зондирующего лазерного пучка. Возможность получения требуемых характеристик облегчается тем, что полихроматор предназначен для работы в узкой спектральной области 1055-955 нм с широкой щелью b = 1 мм, что обусловлено высокой угловой дисперсией решеток и линейной дисперсией полихроматора в целом.

Принципиальная схема полихроматора

Собранное из плазмы рассеянное излучение проходит через входную щель 1 и падает на коллиматорную линзу 2, которая формирует коллимированный пучок, дифраги-