Штамм Cobetia marina ARC 10 ВКПМ В-12349 - деструктор нефти и нефтепродуктов
STRAIN COBETIA MARINA ARC 10 VKPM B-12349 IS DESTRUCTOR OF OIL AND OIL PRODUCTS

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к области биотехнологии, микробиологии, экологии, охране окружающей среды и представляет собой новый бактериальный штамм Cobetia marina ARC 10 ВКПМ В-12349, обладающий способностью к деструкции нефти и нефтепродуктов. Штамм может быть использован для очистки акваторий водоемов, береговой линии, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, при температуре от +4 до +20°C и солености 30 г/л.
Уровень техники
Известен штамм Rhodococcus sp. - деструктор нефтяных углеводородов (патент РФ №2518349, приоритет 11.04.2013, опубл. 10.06.2014). Данный штамм показал высокую степень деструкции углеводородов при температуре +30°С. Однако данный штамм не способен производить утилизацию углеводородов при низких температурах.
Известен штамм Pseudomonas alcaligenes В-1 (патент РФ 2133770, приоритет 25.03.1998, опубл. 27.07.1999). Недостатком данного штамма также является то, что он не утилизирует нефтезагрязнения при низких температурах.
Известен штамм Exiguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011 (патент РФ №2523584, приоритет 2013-03-27, опубл. 20.07.2014). Штамм может быть использован для очистки почв и водоемов, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, в широком диапазоне температур от +4 до +37°C. Недостатком штамма является то, что он не способен утилизировать нефтезагрязнения при высокой солености воды до 30 г/л.
Наиболее близким аналогом является штамм Rhodococcus erythropolis, депонирован под регистрационным номером ВКМ Ac-2613D (патент РФ 2553336, приоритет20.08.2013, опубл. 10.06.2015). Штамм используется для очистки пресноводных, солоноватоводных и морских объектов и донных отложений. Микроорганизм обеспечивает деструкцию нефти в водных объектах при температуре от +2 до +25°C и солености до 2,7%. Недостатком изобретения является то, что штамм утилизирует углеводороды в условиях, богатых по питательным веществам (в состав среды входит пептон 5 г/л и сахароза 15 г/л). В реальных условиях утилизации углеводородных загрязнений количество питательных веществ значительно снижено.
Раскрытие изобретения
Задачей настоящего изобретения является получение бактериального штамма, способного осуществлять деструкцию нефти и нефтепродуктов при температуре от +4 до +20°C и солености 30 г/л.
Поставленная задача решается тем, что получен штамм Cobetia marina ARC 10 ВКПМ В-12349, способный осуществлять деструкцию нефти и нефтепродуктов, который может быть использован для очистки акваторий водоемов, береговой линии, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, при температуре от +4 до +20°C и солености 30 г/л.
Штамм выделен из портовой зоны города Мурманск 3 июня 2014 г. Штамм депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУП ГосНИИгенетика (ВКПМ, Москва, 1-й Дорожный пр., д.1) под регистрационным номером ARC 10 ВКПМ В-12349.
Идентификация штамма была осуществлена на основании изучения его культурально-морфологических и физиолого-биохимических характеристик, а также на основании изучения последовательности гена 16S рРНК.
Полученный штамм характеризуется следующими признаками.
Культурально-морфологические признаки
Колонии бежевые с сероватым оттенком, округлые, гладкие, плоские, блестящие, с ровным краем, однородной структуры, мягкой консистенции, слизистые, размеры около 1,5 мм. Клетки подвижные, короткие палочки. Окраска по Граму отрицательная.
Физиолого-биохимические признаки
Штамм растет при температуре от +4 до +20°C, в аэробных условиях. Оптимум роста от +4 до +10°C. Растет при рН 4,0-8,0. Растет на плотных и жидких питательных средах с содержанием NaCl 30 г/л. Способен расти в жидкой среде с углеводородами в качестве единственного источника углерода и энергии.
2
4
2
4
4
4
2
4
2
4
2
4
4
4
2
4
Штамм поддерживается пересевами 1 раз в 14 дней на плотной питательной среде modPCA следующего состава (г/л): KHPO - 1,5; KHPO - 0,75; MgSO - 1,0; (NH)SO - 4,0; NaCl - 30; гидролизат казеина - 5,0; дрожжевой экстракт - 2,5; D-глюкоза - 1,0; агар - 14; рН 7,0 или жидкой питательной среде №1 следующего состава (г/л): KHPO - 1,5; KHPO - 0,75; MgSO - 1,0; (NH)SO - 4,0; NaCl - 30; гидролизат казеина - 0,5; дрожжевой экстракт - 0,1; рН 7,0. В жидкой питательной среде в качестве углеводородного субстрата использовали смесь товарной нефти Возейского месторождения (плотность 37,9° API, сернистость 0,66%, характеризуется как тяжелая, вязкая, с высоким содержанием смол и асфальтенов) и дизельного топлива в соотношении 1:1 по объему.
Также штамм может храниться при +6±2°C в лиофилизированном состоянии с использованием сухого обезжиренного молока в качестве защитной среды.
Осуществление изобретения
Пример 1. Выделение и культивирование Cobetia marina ARC 10 ВКПМ В-12349.
Штамм выделен из образцов грунта береговой линии порта города Мурманск 3 июня 2014 г. Образец грунта массой 5±2 г вносили в 100 мл питательной среды №1. Культивирование проводили при температуре +4°C, на орбитальном шейкере (130 об/мин). Время культивирования 7 суток. Полученную накопительную культуру вносили в количестве 10 мл в 100 мл питательной среды №1. Было проведено не менее 30 пассажей накопительной культуры. Выделение штамма из накопительной культуры проводили на среде modPCA, полученную чистую культуру далее культивировали на среде №1.
Пример 2. Исследование нефтеокисляющей активности Cobetia marina ARC 10 ВКПМ В-12349.
Штамм, выращенный на жидкой питательной среде №1, вносили в качестве инокулята в 100 мл питательной среды №1. В качестве контроля была использована питательная среда без добавления культуры. После проведения культивирования при температуре +4°C, 130 об/мин в течение 7 суток проводилась экстракция углеводородов гексаном согласно ГОСТ 31953-2012, хроматографическая оценка убыли углеводородов проводилась на приборе DSA 100 , оснащенном микрокапиллярной колонкой DB-lms, газ-носитель - гелий, расход газа -39 мл/мин, детектор - ПИД, температура детектора - 320°C. Измерения проводили в условиях температурного градиента в термостате от 60 до 320°C. Результаты анализа были обработаны при помощи программного обеспечения OpenLAB CDS (Agilent).
Суммарная убыль для среднекипящей и высококипящей фракции составляла не менее 50% за 7 суток культивирования при температуре +4°C и солености среды 30 г/л.
Пример 3. Способ производства препарата на основе Cobetia marina ARC 10 ВКПМ В-12349.
2
4
2
4
4
4
2
4
9
Штамм Cobetia marina ARC 10 ВКПМ В-12349, выращенный на среде PC А при температуре +4°C в течение 7 суток, вносят в жидкую питательную среду следующего состава (г/л): KHPO - 1,5; KHPO - 0,75; MgSO - 1,0; (NH)SO - 4,0; NaCl - 30; гидролизат казеина -5,0; дрожжевой экстракт - 2,5; D-глюкоза - 1,0; рН 7,0. Далее культивируют при температуре +10°C на орбитальном шейкере в течение 3 суток до конечного титра 10 КОЕ/мл. В полученную суспензию клеток в питательной среде вносят защитную среду (сухое обезжиренное молоко в количестве 10%). Далее полученную жидкую биомассу замораживают и обезвоживают методом лиофилизации. Полученную сухую биомассу штамма Cobetia marina ARC 10 ВКПМ В-12349 смешивают с питательным премиксом (сухое обезжиренное молоко) в соотношении 1:10.
Таким образом, получен штамм, способный осуществлять деструкцию нефти и нефтепродуктов при температуре+4°С и солености 30 г/л.