СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ АУТОИММУННЫХ ВАРИАНТОВ САХАРНОГО ДИАБЕТА
DIAGNOSTIC TECHNIQUE FOR AUTOIMMUNE VERSIONS OF DIABETES MELLITUS

Способ диагностики аутоиммунных вариантов сахарного диабета отличается тем, что аутоиммунный вариант сахарного диабета диагностируется на основании сравнения показателей выработки фактора некроза опухоли альфа (ФНОα) (пкг/мл) в надосадочной жидкости после культивирования лимфоцитов, полученных из пробы крови пациента в условиях стимуляции аутоантигеном инсулином. Тест считается положительным, если значение показателя ФНОα в пробе после стимуляции инсулином превышает его значение в условиях отсутствия стимуляции.
Изобретение относится к медицине, а именно к терапии, эндокринологии, диабетологии, лабораторной диагностике.
В структуре сахарного диабета (СД) особое место занимают его аутоиммунный вариант. Латентный аутоиммунный диабет взрослых (LADA) относится к аутоиммунным вариантам СД и занимает промежуточное положение между СД1 и СД2, но не выделяется в отдельную номенклатурную единицу согласно последней классификации ВОЗ (1999). СД1 - тяжелое заболевание, ассоциированное как с острыми, так и с хроническими осложнениями, приводящими к ранней инвалидизации больных. LADA характеризуется более мягким течением по сравнению с СД1, при этом дебют заболевания практически не отличается от клинической картины СД2, что затрудняет его диагностику и своевременное начало инсулинотерапии.
Принципиальным отличием аутоиммунного СД от его неиммунных форм является то, что при аутоиммунном воспалении ткани поджелудочной железы постепенно снижается масса β-клеток, что приводит в конечном итоге к снижению секреции инсулина и его абсолютному дефициту.
Для оценки уровня секреции инсулина судят по концентрации С-пептида, измеренной после продолжительного голодания (более 10 часов) и на фоне стимуляции (GST, OGTT, MMTT). Инсулин и С-пептид секретируются поджелудочной железой в эквимолярных количествах, но 50% и более инсулина расщепляется при прохождении через печень. В настоящее время в международных исследованиях в качестве «золотого стандарта» для оценки секреторной функции β-клеток принято использовать MMTT с количественным определением концентрации С-пептида в крови [Greenbaum С., 2008].
Способ требует дополнительной подготовки (длительное голодание), значительных материальных затрат, не позволяет диагностировать аутоиммунный процесс на его начальных стадиях.
Известны аналоги
В качестве ближайшего аналога принят способ ранней диагностики аутоиммунных вариантов СД, который заключается в одновременном определении циркулирующих в крови аутоантител, характерных для СД:
1) к глютаматдекарбоксилазе (GADA), методом непрямого иммуноферментного анализа (чувствительность метода - 87,1%, специфичность - 85%);
2) к цитоплазматическим структурам бета-клеток (ICA), методом иммуноферментного анализа (чувствительность - 87%, специфичность - 85%);
3) к инсулину (IAA), с помощью непрямого иммуноферментного анализа (чувствительность метода - 89%, специфичность - 78%);
4) к тирозиновой фосфатазе лимфоцитов (IA-2) методом непрямого иммуноферментного анализа (ИФА) (чувствительность метода - 93%, специфичность - 75%).
К недостаткам способа относятся ложноположительные и ложноотрицательные результаты (по разным оценкам от 10 до 15%), что затрудняет диагностику данным методом. Кроме того, уровни титров аутоантител не отражают активность воспалительных изменений в ткани поджелудочной железы при аутоиммунном диабете.
Задачей изобретения является создание высокочувствительного и специфичного способа ранней диагностики аутоиммунных вариантов СД.
Способ диагностики аутоиммунных вариантов сахарного диабета, отличающийся тем, что аутоиммунный вариант сахарного диабета диагностируется на основании сравнения показателей выработки фактора некроза опухоли альфа (ФНОα) (пкг/мл) в надосадочной жидкости после культивирования лимфоцитов, полученных из пробы крови пациента в условиях стимуляции аутоантигеном инсулином. Тест считается положительным, если значение показателя ФНОα в пробе после стимуляции инсулином превышает его значение в условиях отсутствия стимуляции.
6
Способ осуществляется следующим образом. Перед определением интерлейкинов - ИЛ-2, ФНОα, ИФНγ, характерных для ТН1, а также ИЛ-4, продуцируемый ТН2, лимфоциты пациентов и здоровых доноров выделяют из периферической крови методом градиентного центрифугирования с использованием смеси фиколл-верографина, с плотностью 1,077. Клетки дважды отмывают фосфатно-солевым буфером с рН 7,2 и ресуспендируют в бессывороточной среде RPMI 1640 («Панэко», Россия) с добавлением 20 мкг/мл гентамицина, 2 мМ L-глутамина и 2 мМ HEPES. Суспензию лимфоцитов в концентрации 10 клеток на 1 мл среды культивируют в пластиковых 24-луночных планшетах («Nunc», Дания) в течение 18-20 часов в CO2-инкубаторе.
Культивирование лимфоцитов проводят в 3-х различных вариантах: без добавок - контрольный образец (спонтанный тест), с добавлением ФГА (10 мкг/мл) (положительный контроль культуральной системы) и образец с добавлением инсулина в концентрации 0,01 МЕ/мл. Супернатанты каждого образца собирают в микропробирки и центрифугируют 5 минут при 3000 оборотах/мин, в центрифуге с охлаждением.
Продукцию интерлейкинов оценивают методом проточной флюориметрии на двулучевом лазерном автоматическом анализаторе (BioPlex Protein Assay System, Bio-Rad, USA).
В контрольной группе Т-клеточный ответ на инсулин отсутствует. При аутоиммунных вариантах СД значение уровня продукции ФНОα по сравнению с другими исследованными интерлейкинами в ответ на инсулин возрастает по сравнению со спонтанным уровнем продукции ФНОα, а также после стимуляции ФГА. Для регистрации Т-клеточной сенсибилизации на инсулин и оценки его интенсивности нами впервые был введен коэффициент аутоиммунного воспаления (КАИВ). Он рассчитывается как соотношение показателя продукции ФНОα в ответ на инсулин к спонтанному значению продукции ФНОα (пкг/мл). При положительном ответе на инсулин данный коэффициент больше 1. В нашей выборке значения коэффициента варьировали в пределах от 3,09 до 19,23.
Техническим результатом заявляемого изобретения является способ диагностики аутоиммунного воспалительного процесса в ткани поджелудочной железы, что позволяет также оценить степень аутоиммунной агрессии на ткань поджелудочной железы.
Технический результат достигается за счет определения сенсибилизации Т-лимфоцитов на инсулин, по выработке ФНОα в системе in vitro.
Преимуществами способа являются:
- простота выполнения,
- исследование требует небольшого количества материала (цельной крови),
- экономичность - не требует больших материальных затрат,
- сроки исполнения - результат готов в течение 24 часов,
- способ минимально инвазивен,
- чувствительность способа - 99%, специфичность - 100%,
- способ не требует предварительной подготовки больных (проводится утром натощак),
- его можно осуществлять в амбулаторных условиях.
Способ испытан в ФГБУ Эндокринологический научный центр МЗ РФ, в институте сахарного диабета. Исследовано 34 человека.
Пример 1. Больной К., 58 лет, поступил в ФГБУ Эндокринологический научный центр МЗ РФ с жалобами на снижение веса, появление ацетона в моче, высокие цифры гликемии, подъем АД до 170/110 мм рт.ст., сердцебиение, отеки голеней во второй половине дня. Из анамнеза известно, что в возрасте 46 лет (в 1995 г.) на фоне стресса появилась жажда, полиурия, сухость во рту, похудел на 8 кг за 2 мес. Была выявлена гликемия 7 ммоль/л. Пациенту был поставлен диагноз: сахарный диабет 2 типа на инсулинотерапии, стадия декомпенсации. При исследовании спонтанной продукции ФНОα и после стимуляции инсулином было установлено, что уровень ФНОα после стимуляции инсулином [66, 78] выше спонтанного уровня [14], что указывает на наличие аутоиммунного ответа на инсулин (КАИВ=4,77). Полученные данные послужили основанием для изменения диагноза с заменой диагноза СД2 на СД1.
Пример 2. Пациентка Т., 46 лет, наблюдалась амбулаторно в ФГБУ Эндокринологический научный центр МЗ РФ с диагнозом: диффузный токсический зоб II ст. (ВОЗ), тиреотоксикоз средней степени тяжести в стадии субкомпенсации. Пациентка получала лечение тиреостатическими препаратами без отчетливого эффекта, в связи с чем ей была произведена операция - тиреоидектомия. При дальнейшем обследовании у пациентки были выявлены положительные титры к GADA, специфичные в отношении иммунных вариантов СД. При исследовании спонтанной продукции ФНОα и после стимуляции инсулином было установлено, что уровень ФНОα после стимуляции инсулином оказался выше спонтанного уровня: 5,28 и 18,99 соответственно, что указывает на наличие аутоиммунного ответа на инсулин (КАИВ=3,6). Полученные данные послужили основанием для доклинической диагностики СД1.