ВИТРИФИКАЦИЯ ПОЛУЧЕННЫХ INVITRO ЭМБРИОНОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА В ТРИАЦЕТАТ-ЦЕЛЛЮЛОЗНЫХ ПОЛЫХ ВОЛОКНАХ И НА НОСИТЕЛЯХ ОТКРЫТОГО ТИПА

_МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ И КЛЕТОЧНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ_

УДК 636.2:57.086.136:57.089.3

ВИТРИФИКАЦИЯ ПОЛУЧЕННЫХ in vitro ЭМБРИОНОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА В ТРИАЦЕТАТ-ЦЕЛЛЮЛОЗНЫХ ПОЛЫХ ВОЛОКНАХ И НА НОСИТЕЛЯХ ОТКРЫТОГО ТИПА

Маленко Г.П., Корниенко Е.В., Романова А.Б., Косовский Г.Ю.

Центр экспериментальной эмбриологии и репродуктивных биотехнологий, Москва, Российская Федерация

Витрификация с использованием в качестве носителя триацетат-целлюлозных полых волокон является перспективным методом криоконсервации групп ооцитов и полученных in vitro (in vitro production, IVP) эмбрионов млекопитающих, позволяющим существенно упростить и стандартизировать процедуры витрификации/отогревания. В работе проведено сравнение эффективности данного носителя с носителями открытого типа (Cryotop, полусоломинка) при витрификации IVP-бластоцист и расширенных бластоцист крупного рогатого скота в возрасте семи суток. Уровень выживаемости эмбрионов, верифицированных в полых волокнах, через 24 ч после отогревания был ниже (84%, P<0,05), чем на других носителях (97% на Cryotop и 94,3% на полусоломинке) и в контрольной группе (100%). Однако уровень выхода из блестящей оболочки эмбрионов из группы полого волокна в течение всего периода культивирования был сопоставим с аналогичными уровнями в других экспериментальных группах, а наибольшее снижение жизнеспособности наблюдалось у эмбрионов, витрифицированных с использованием полусоломинки. С целью оценки пригодности триацетат-целлюлозных волокон в качестве носителя для витрификации эмбрионов, получаемых при клонировании по методу zona-free, была проведена криоконсервация IVP-бластоцист и расширенных бластоцист крупного рогатого скота без блестящей оболочки. Уровень выживаемости верифицированных эмбрионов без блестящей оболочки через 24 ч после отогревания (84,7%) был сопоставим с аналогичным показателем у верифицированных интактных эмбрионов, но при этом наблюдалось увеличение среднего количества клеток с поврежденной мембраной.

Ключевые слова: крупный рогатый скот, эмбрионы, in vitro, витрификация, полые волокна Проблемы биологии продуктивных животных, 2016, 4: 5-16

Введение

Получение эмбрионов крупного рогатого скота in vitro (in vitro production, IVP) является одним из наиболее перспективных методов интенсификации воспроизводства стад и процесса генетической селекции в промышленном скотоводстве. При этом, в отличие от эмбрионов, полученных in vivo, лишь небольшая часть IVP-эмбрионов подвергается криоконсервации (Blondin, 2015), основная же часть трансплантируется непосредственно после их получения. Вследствие этого подготовленные реципиенты и/или эмбрионы часто используются нерационально (Pontes et al., 2011). Основной причиной, по которой IVP-эмбрионы крупного рогатого скота на практике не подвергаются криоконсервации, является низкая эффективность программируемого замораживания этих эмбрионов (Nedambale et al., 2004; Saragusty, Arav, 2011).

Альтернативой программируемому замораживанию для IVP-эмбрионов КРС может служить метод витрификации, широко применяющийся для криоконсервации ооцитов и эмбрионов человека в системе вспомогательных репродуктивных технологий. Наибольшее распространение получили методики и связанные с ними носители открытого типа (Saragusty, Arav,

2011), основанные на принципе охлаждения в минимальном объеме (minimal volume cooling, MVC) (Hamawaki et al., 1999). Однако при всей перспективности метода витрификации, до сих пор он не получил широкого распространения в животноводстве, так как включает в себя индивидуальную обработку каждого эмбриона в растворах, а эффективность метода зависит от квалификации исполнителя в большей степени, по сравнению с программируемым замораживанием (Do et al., 2015). Кроме того, большинство носителей открытого типа предназначены для криоконсервации ограниченного количества эмбрионов (Kuwayama et al., 2005), что не всегда удобно при работе с группой эмбрионов и при проведении научных исследований, и в практике животноводства.

Новый эффективный метод групповой витрификации эмбрионов свиньи и мыши в триацетат-целлюлозном полом волокне (hollow fiber vitrification, HFV) позволяет существенно упростить и стандартизировать процедуры витрификации и отогревания, так как группа эмбрионов, помещённая в полое волокно, обрабатывается в соответствующих растворах как единое целое (Matsunari et al., 2012). Кроме того, была показана более высокая эффективность полого волокна при витрификации таких криочувствительных биологических объектов, как партеногенетические морулы свиньи, по сравнению с использованием носителя открытого типа Cryotop (Nagashima et al., 2015). На основе HFV-метода было разработано устройство для групповой криоконсервации ооцитов и эмбрионов млекопитающих в триацетат-целлюлозном полом волокне (Маленко и др., 2016), которое пригодно для работы с группой IVP-эмбрионов и с отдельными эмбрионами. Метод HFV также может быть перспективен для криоконсервации бластомеров и лишенных блестящей оболочки эмбрионов КРС, получаемых, например, при проведении клонирования по методу zona-free (Taylor-Jonson et al., 2014). Блестящая оболочка выполняет ряд важных функций при оплодотворении и в раннем эмбриональном развитии, одна из которых — защита эмбриона от механических повреждений. Стенка триацетат-целлюлозного полого волокна сравнима по толщине с блестящей оболочкой (15 мкм) и может защитить эмбрионы без блестящей оболочки от возможных механических повреждений, связанных с переносом между растворами и нанесением на поверхность носителя открытого типа.

Целью данной работы было сравнение эффективности витрификации полученных in vitro 7-суточных эмбрионов крупного рогатого скота в полом волокне в составе разработанного авторами устройства и на носителях открытого типа (Cryotop, полусоломинка), а также оценка эффективности витрификации в полом волокне эмбрионов КРС без блестящей оболочки, используемых в качестве модели для клонированных эмбрионов, полученных по методу zona-free.

Материал и методы

Общие реактивы и рабочие растворы. В работе, кроме оговоренных случаев, были использованы реактивы фирмы Sigma-Aldrich (США). Среды были приготовлены на основе маточных растворов компонентов, хранящихся при 4 или -20°С. Дозревание ооцитов проводили в среде 199 (ПанЭко, Россия) с добавлением пирувата натрия, L-глутамина, L-цистеина, гонадотропина хорионического (Московский эндокринный завод, Россия), фолликулостиму-лирующего гормона (ФСГ-супер) (ООО Агробиомед, Россия), эстрадиола-17р и 10% феталь-ной сыворотки крови крупного рогатого скота (FCS) (HyClone, США). Манипуляции с ооци-тами, сперматозоидами и эмбрионами на воздухе проводили в модифицированной среде TALP-HEPES (TH) (Bavister, Yanagimachi, 1977). Для оплодотворения использовали модифицированную среду TALP-Fert (TF) (Parrish et al., 1986). Культивирование эмбрионов проводили в модифицированной среде SOF (Tervit et al., 1972) без альбумина и глюкозы, но с добавлением аминокислот и 5% FCS (mSOF). Перед использованием во все рабочие среды и растворы был добавлен гентамицин в концентрации 50 мкг/мл.

Получение эмбрионов крупного рогатого скота in vitro. Яичники крупного рогатого скота были получены на мясокомбинате (г. Железнодорожный Московской обл.). Дозревание ооцитов осуществлялось в С02-инкубаторе в течение 22-23 ч. Для оплодотворения использовали криоконсервированное семя быка. Для выделения фракции подвижных сперматозоидов, свободных от семенной плазмы и компонентов сред, разбавления и криоконсервации семени, использовали метод swim-up. Совместное инкубирование ооцитов и сперматозоидов осуществлялось в течение 18-20 ч в СО2-инкубаторе. Полученные зиготы освобождали от клеток ку-мулюса в растворе гиалуронидазы и культивировали в среде mSOF в атмосфере, содержавшей 5,6% СО2, 5,7% О2, 88,7% N2 при температуре 38,5°С в течение 7 сут. День оплодотворение считали нулевым. В возрасте 7 сут. из общей популяции отбирали эмбрионы, достигшие стадии бластоцисты и расширенной бластоцисты (Bo, Mapletoft, 2013), из которых формировали экспериментальные группы. При этом, бластоцисты и расширенные бластоцисты обрабатывали и культивировали отдельно.

Растворы для витрификации. Состав растворов и протоколы витрификации/отогревания эмбрионов соответствовали изложенным в работе (Kuwayama et al., 2005) с небольшими модификациями. Базовый раствор для проведения витрификации и отогревания эмбрионов - среда TLP-HEPES с удержанием сыворотки крови 20% (TH20).

Состав растворов: для эквилибрации: этиленгликоль — 7,5%, диметилсульфоксид — 7,5%; для витрификации: этиленгликоль — 15%, диметилсульфоксид — 15%, сахароза 0,5 M; для отогревания: сахароза 1 M; для разбавления - сахароза 0,5 M; для отмывания — базовый раствор TH20.

Все растворы имели комнатную температуру 22-24°C. Для проведения процедуры витрификации использовали триацетат-целлюлозные полые волокна (Nirpro, Japan) с внутренним диаметром 200 мкм, толщиной стенок 15 мкм и размером пор 7 нм в составе устройства для витрификации на основе стеклянного капилляра (Маленко и др., 2016), а также два вида носителей открытого типа: Cryotop (Kitazato, Japan) и полусоломинки (hemi-straws, HS), изготовленные из криосоломинок объемом 0,25 мл (Маленко и др., 2014).

Сравнение эффективности витрификации IVP эмбрионов крупного рогатого скота с использованием различных носителей: полого волокна, Cryotop и полусоломинки.

Витрификацию IVP-эмбрионов КРС в полом волокне (группа HFV) проводили согласно следующей схеме. Бластоцисты и расширенные бластоцисты группами по 5-10 экз. последовательно помещали в две смены раствора отмывания на 5 мин. Затем эмбрионы переносили в раствор эквилибрации и аспирировали в полое волокно. Через 5 мин инкубирования в растворе эквилибрации волокно с эмбрионами в составе устройства витрификации или при помощи пинцета перемещали в раствор витрификации на 60 с и сразу погружали в жидкий азот. Носитель находился в жидком азоте в течение 1-2 мин, затем его перемещали в раствор отогревания. Через 60 с волокно с эмбрионами при помощи пинцета последовательно переносили в растворы разбавления и две смены раствора отмывания, в каждом из растворов инкубирование проводилось в течение 5 мин. В последнем растворе отмывания эмбрионы выгружали из полого волокна и помещали в среду культивирования mSOF.

Витрификацию IVP-эмбрионов КРС скота с использованием Cryotop (группа Cryotop) и полусоломинки (группа HS) проводили согласно методике (Kuwayama et al., 2005). Каждый эмбрион витрифицировался индивидуально. После отогревания формировали группы по 5-10 эмбрионов и помещали в среду культивирования mSOF. Оценку жизнеспособности и стадий развития эмбрионов производили через 24, 48 и 72 ч после отогревания. В качестве контроля использовали бластоцисты и расширенные бластоцисты того же возраста, не подвергавшиеся витрификации.

Оценка эффективности витрификации IVP-эмбрионов КРС без блестящей оболочки в триацетат-целлюлозном полом волокне. Группы бластоцист и расширенных бластоцист в возрасте 7 сут. освобождали от блестящей оболочки с использованием проназы и помещали в среду mSOF на 1 ч. После этого были проведены этапы витрификации и отогревания эмбрионов в триацетат-целлюлозном полом волокне по вышеописанной схеме с небольшими модификациями — для работы с эмбрионами без блестящей оболочки использовали раствор отогревания, содержавший 0,5 М сахарозы, и раствор разбавления, содержавший 0,25 М сахарозы. После отогревания эмбрионы помещали в среду культивирования mSOF. Оценку жизнеспособности и степени развития эмбрионов производили через 24 ч после отогревания. В качестве контроля использовали IVP-бластоцисты и расширенные бластоцисты КРС в возрасте 7 сут. без блестящей оболочки, не подвергавшиеся витрификации.

Кроме того, для оценки качества эмбрионов через 24 ч после отогревания производили подсчет общего количества клеток в эмбрионе и количества клеток с повреждённой мембраной. Бластоцисты и расширенные бластоцисты из витрификационной и контрольной групп переносили в 0,5 мл среды TH, содержавшей йодистый пропидий (10 мкг/мл), и инкубировали в течение 5 мин. в темноте при комнатной температуре. Затем эмбрионы переносили в свежую каплю среды TH и исследовали на микроскопе Nikon Eclipse Ti-U (Nikon, Japan), оснащённом блоком флуоресценции (EX 540/25, DM 565, BA 605/55). Количество ядер, окрашенных йодистым пропидием, подсчитывали у каждого эмбриона.

Общее количество клеток в бластоцистах и расширенных бластоцистах определяли по методике (Ushijima et al., 2009) с небольшими модификациями. Эмбрионы помещали в гипо-осмотический раствор (TH и дистиллированная вода в соотношении 1:2) и инкубировали в течение 5-10 мин. при комнатной температуре. После этого эмбрионы фиксировали в растворе этанола и уксусной кислоты (этанол, ледяная уксусная кислота, дистиллированная вода в соотношении 3:2:1) в течение 1 мин. и переносили на предметное стекло в минимальном объеме фиксирующего раствора. К препарату добавляли небольшую каплю раствора Карнуа (этанол и ледяная уксусная кислота в соотношении 3:1). Препараты высушивали в течение 1 ч при комнатной температуре, затем окрашивали 5%-ным раствором красителя Гимза. Общее количество ядер в составе эмбриона подсчитывали при увеличении ><200 или ><400.

По тем же методикам определяли среднее общее количество клеток и среднее количество клеток с поврежденной мембраной у контрольных и витрифицированных в полом волокне IVP-эмбрионов КРС с интактной блестящей оболочкой.

Статистический анализ

При оценке жизнеспособности выжившими считались витрифицированные эмбрионы, восстановившие свой объем через 24 ч после отогревания, сохранившие нормальную морфологию и продолжившие развитие на протяжении 72 ч культивирования. Уровни выживаемости и вылупления витрифицированных бластоцист в каждой экспериментальной группе оценивали в процентах от общего количества бластоцист, подвергшихся витрификации. Результаты подсчета количества клеток в эмбрионе и клеток с поврежденной мембраной представлены в виде среднего ± стандартное отклонение. Для статистического анализа полученных результатов использовали непараметрический критерий хи-квадрат Пирсона при сравнении уровней выживаемости и выхода эмбрионов из блестящей оболочки и параметрический t -критерий Стьюдента при сравнении среднего количества клеток в эмбрионе и среднего количества клеток с поврежденной мембраной.

Результаты и обсуждение

Эффективность витрификации IVP-эмбрионов КРС в полом волокне и на носителях открытого типа. Наиболее близкими к контролю показателями жизнеспособности обладали IVP-эмбрионы в возрасте 7 сут., верифицированные с использованием носителя Cryotop. Через 24 ч после отогревания уровень выживаемости у IVP-эмбрионов КРС, витрифицирован-

ных в полом волокне, был существенно ниже, чем в других экспериментальных группах. В группах И8 и ИБУ наблюдалось снижение жизнеспособности эмбрионов после 48 ч культивирования. Группы И8 и ЮУ по уровню выживаемости и выхода эмбрионов из блестящей оболочки после 24 ч культивирования статистически значимо не различались (табл. 1).

Таблица 1. Результаты витрификации 1УР эмбрионов крупного рогатого скота в полом волокне и на носителях открытого типа

Группы

Длительность культивирования эмбрионов после отогревания, ч

Всего эмбрионов

24

48

72

Живые (%) Вышедшие Живые (%) Вышедшие Живые (%) Вышедшие из из блестящей из блестящей блестящей

оболочки

Сгуо1ор 33 32 (97,0)а 11 (33,3) 32 (97,0)а4 24 (72,7)а,ь 32 (97,0) а 30 (90,9)м

ИГУ 150 126 (84,0)ь 39 (26,0) 124 (82,7) ь,с 87 (58,0)ь,а,с 121 (80,7) ь,с 113 (75,3)ь,с,й

Ш 53 50 (94,3)а 19 (35,9) 46 (87,5) с,а,ь 27 (50,9)с,ь 44 (83,0)с,ь 33 (62,3)с,ь

Контроль 43 43 (100,0)а 14 (32,6) 43 (100,0)^ 31 (72,1)а,ь 43 (100,0)а 37 (86,1)4а,с

Примечание: значения с различными верхними индексами в одной колонке различаются при Р<0,05.

Далее был оценен уровень жизнеспособности эмбрионов внутри экспериментальных групп в зависимости от достигнутой стадии развития перед витрификацией. В группе ИУ уровни выживаемости расширенных бластоцист через 24 ч (98,5%) и выхода из блестящей оболочки через 72 ч после отогревания (95,5%) были выше, чем у нерасширенных бластоцист (72,3 и 59% соответственно, Р<0,05). Такого различия между бластоцистами и расширенными бластоцистами ни по уровню выживаемости (93,3 и 100% соответственно), ни по уровню выхода эмбрионов из блестящей оболочки (88,9 и 93,3% соответственно) не наблюдалось в группе Сгуо1;ор. При этом показатели жизнеспособности расширенных бластоцист из обеих экспериментальных групп (ИБУ и СгуоШр) статистически значимо не отличались, в то время как у нерасширенных бластоцист, витрифицированных в полом волокне, оба этих показателя были существенно ниже, чем у эмбрионов из группы Сгуо1юр (Р<0,05). В контрольной группе также наблюдались различия между стадиями развития по уровню выхода эмбрионов из блестящей оболочки (73,9 и 100% соответственно, Р<0,05).

Оценка эффективности витрификации 1УР-эмбрионов КРС без блестящей оболочки в триацетат целлюлозном полом волокне. Уровень выживаемости эмбрионов без блестящей оболочки через 24 ч после отогревания составил 84,7% (116/137 эмбрионов), в контрольной группе — 97,2% (35/36 эмбрионов). Среднее количество клеток в составе верифицированных эмбрионов через 24 ч после отогревания (201±57 клеток) не отличалось существенно от контрольных значений (236±68 клеток). Среднее количество клеток с поврежденной мембраной у верифицированных эмбрионов было выше, чем у контрольных (9,1±4,3 и 5,8±4,4 соответственно, Р<0,05). У верифицированных эмбрионов того же возраста с интактной блестящей оболочкой среднее количество клеток в эмбрионе составило 168±59, среднее количество клеток с поврежденной мембраной — 3,4±3,1, а у контрольных — 178±65 и 2,9±3,5 соответственно. По этим показателям группы верифицированных и контрольных эмбрионов с блестящей оболочкой статистически значимо не различались. У верифицированных расширенных бластоцист без блестящей оболочки выявлен более высокий уровень выживаемости (88,7%), чем у верифицированных нерасширенных (77,6%), хотя эти различия не достигали статистически значимого уровня (Р>0,05).

Уровень выживаемости верифицированных в полом волокне (группа ИБУ) 1УР-эмбрионов через 24 ч после отогревания (84,0%) сопоставим с результатами, приведенными в

литературе, полученными при групповой витрификации 7- и 8-дневных эмбрионов КРС (Abdalla et al., 2010; Kim et al., 2012; Beck et al., 2013). В наших экспериментах уровень выживаемости в группе HFV был ниже, чем в других экспериментальных группах (97,0% в группе Cryotop, 93,3% в группе HS). В группах HFV и HF наблюдалось снижение жизнеспособности эмбрионов к 72 ч культивирования (80,7% и 83,0% соответственно), в то время как уровень выживаемости в группе Cryotop оставался неизменным (97,0%). Более низкая жизнеспособность в группе HFV по сравнению с группой Cryotop согласуется с данными (Saucedo et al., 2015a,b), полученными при сравнении эффективности витрификации смешанной группы 7-дневных IVP-эмбрионов КРС в полом волокне и витрификации с использованием носителя Cryotech — близкого аналога Cryotop (Saucedo et al., 2015a,b). Однако в наших опытах по уровню выхода из блестящей оболочки эмбрионы из группы HFV статистически значимо не отличались от эмбрионов из других экспериментальных групп до 72 ч культивирования. Наиболее существенное снижение уровня выживаемости и наиболее низкий уровень выхода из блестящей оболочки выявлены в группе эмбрионов, витрифицированных индивидуально с использованием носителя открытого типа — полусоломинка.

При более подробном анализе эмбрионов из группы HFV выяснилось, что наименьшей жизнеспособностью после витрификации/отогревания обладали бластоцисты, классифицированные как нерасширенные. Их выживаемость через 24 ч культивирования (72,3%) была существенно ниже, чем у расширенных бластоцист (98,5%, P<0,05). Такая же ситуация наблюдалась при сравнении уровней выхода эмбрионов из блестящей оболочки через 72 ч после отогревания (59,9 и 75,5% соответственно, P<0,05). Уровень выживаемости расширенных бла-стоцист практически не снижался в течение всего периода культивирования — 97% эмбрионов оставались жизнеспособными через 72 ч после отогревания. Полученные результаты согласуются с данными, приведенными в литературе для IVP-эмбрионов КРС, криоконсервирован-ных по методу медленного замораживания (Han et al., 1994; Hasler et al., 1997) и по методу витрификации (Dynnies et al., 1999; Rios et al., 2010). Согласно этим данным, морфологически нормальные эмбрионы КРС, находящиеся на более поздней стадии развития в конкретной временной точке, обладают более высоким качеством и способны лучше переносить криокон-сервацию (Dynnies et al., 1999). Следует отметить, что и замораживание, и витрификация в приведенных примерах проводились с использованием в качестве носителя криосоломинок (Han et al., 1994; Hasler et al., 1997; Dynnies et al., 1999) или open pulled straws (OPS; Rios et al., 2010), не позволяющих строго соблюсти принцип MVC. Метод HFV позволяет верифицировать группу эмбрионов млекопитающих в сверхмалом объеме (Matsunari et al., 2012; Malenko et al., 2015). Однако эмбрионы, находящиеся в полом волокне, отделены от растворов витри-фикации и отогревания триацетат-целлюлозной пористой стенкой, сопоставимой по толщине с блестящей оболочкой, что может влиять на скорость перераспределения криопротекторов и других веществ между растворами, находящимися в просвете волокна и снаружи. При использовании приведенного протокола HFV можно получить уровень выживаемости IVP расширенных бластоцист, близкий к 100%, однако необходима дальнейшая модификация метода для повышения эффективности при работе с IVP-эмбрионами КРС, находящимися на более ранних стадиях развития, возможно, более чувствительными к криоповреждениям и к высоким концентрациям криопротекторов.

В то же время следует отметить, что при проведении витрификации с использованием Cryotop различие между стадиями эмбрионов в наших опытах нивелировалось (после отогревания выжило 17/18 бластоцист и 15/15 расширенных бластоцист). Однако эти показатели получены нами при индивидуальной витрификации эмбрионов, которая при использовании носителей открытого типа оказывается более эффективной (Gutnisky et al., 2013), по сравнению с групповой (Abdalla et al., 2010). Необходимость индивидуальной обработки эмбрионов в растворах витрификации и отогревания делает процесс более трудоёмким. Кроме того, в устройства открытого типа эмбрионы должны наноситься в минимальном объёме наиболее вязкого раствора витрификации, что ставит эффективность метода в зависимость от квалификации

оператора (Do et al., 2015). На обработку одной партии эмбрионов тратится большое количество времени. В то же время, при витрификации по методу HFV группа эмбрионов помещается в полое волокно в растворе эквилибрации и далее обрабатывается как единое целое.

Полое волокно, как и большинство трубчатых носителей, способно обеспечить механическую защиту находящихся в нем биологических объектов. Этот фактор может быть особенно важен при криоконсервации отдельных бластомеров или клонированных эмбрионов без блестящей оболочки (Taylor-Robinson et al., 2014). Метод zona-free, включая его разновидность hand made cloning (HMC) (Vajta, 2007), является одним из наиболее перспективных и простых методов получения клонированных эмбрионов сельскохозяйственных животных (Taylor-Robinson et al., 2014; Verma et al., 2015). Однако такие эмбрионы, помимо наличия недостатков, характерных для клонированных и IVP-эмбрионов (Vajta, 2007), включая повышенное содержание липидов в цитоплазме и чувствительность к высоким концентрациям криопротекторов и процедурам витрификации, лишены блестящей оболочки, выполняющей функцию механической защиты и регулятора непосредственного микроокружения ооцитов и ранних эмбрионов млекопитающих (Valbuena et al., 2012; Choi et al., 2015). Сведений об успешной криоконсервации и последующей трансплантации клонированных эмбрионов КРС без блестящей оболочки крайне мало (Tecirlioglu et al., 2003; Gong et al., 2004; Sirisha et al., 2013), и для оценки эффективности методик требуются дополнительные исследования. На данный момент в большинстве работ используются open pulled straws (Tecirlioglu et al., 2003; Sirisha et al., 2013). В качестве возможной альтернативы предлагается использовать носители открытого типа, такие как Cryotop, позволяющие витрифицировать эмбрионы со строгим соблюдением принципа MVC. Однако при криоконсервации групп бластомеров мыши и человека было показано, что трубчатые носители более эффективны, чем носители открытого типа (Valbuena et al., 2012). Одним из перспективных подходов к решению задачи криоконсервации эмбрионов без блестящей оболочки может быть использование метода HFV.

В наших экспериментах в качестве модели были использованы IVP-эмбрионы КРС, у которых перед витрификацией в возрасте 7 дней удаляли блестящую оболочку. Эмбрионы без блестящей оболочки оказались более чувствительными к условиям обработки и механическим повреждениям при переносе, по сравнению с интактными бластоцистами того же возраста. Так, при проведении предварительных экспериментов по витрификации с использованием носителя открытого типа были выявлены технические сложности при нанесении и отогревании образца, приводившие к разрушению части эмбрионов без блестящей оболочки. Уровень выживаемости оставшихся эмбрионов не превышал 75%. Для получения приемлемого уровня выживаемости при использовании в качестве носителя полого волокна потребовалось модифицировать режим отогревания, понизив концентрацию сахарозы в растворе до 0,5 М. Выживаемость витрифицированных и отогретых таким образом бластоцист без блестящей оболочки через 24 ч после отогревания (116/137 эмбрионов, 84,7%) была сравнима с выживаемостью эмбрионов, верифицированных с интактной блестящей оболочкой (84%).

Контрольная и верифицированная группы не различались существенно по количеству клеток в составе эмбрионов без блестящей оболочки (236±68 и 201±57 соответственно), однако среднее количество клеток с поврежденной мембраной у витрифицированных бластоцист было выше (9,1 и 5,8 клеток на эмбрион соответственно, P<0.05). В то же время уровень выживаемости в контрольной группе эмбрионов без блестящей оболочки был несколько ниже, чем в контрольной группе интактных эмбрионов (97,2 и 100%), а среднее количество клеток с поврежденной мембраной — несколько выше (5,8 и 2,9 клеток соответственно).

В целом, витрифицированные в полом волокне эмбрионы без блестящей оболочки обладали более низкой жизнеспособностью, чем соответствующие невитрифицированные эмбрионы. Однако и в контрольной группе отсутствие блестящей оболочки приводило к некоторому снижению качества эмбрионов по сравнению с интактными. При этом в витрифициро-ванной группе без блестящей оболочки наблюдалось нивелирование различий в уровнях выживаемости расширенных и нерасширенных эмбрионов. Этот факт косвенно свидетельствует

о существенном влиянии блестящей оболочки на эффективность витрификации IVP-эмбрионов КРС на стадии развития бластоцисты и расширенной бластоцисты; этот эффект, возможно, обусловлен её ролью в защите эмбриона от механических повреждений и в качестве регулятора микроокружения. Данный результат может оказаться существенным при дальнейших модификациях метода HFV с целью повышения эффективности витрификации, так как по ряду параметров полое волокно сопоставимо с блестящей оболочкой.

В заключение следует отметить, что использование триацетат-целлюлозного полого волокна в качестве носителя для витрификации приводит к достижению уровней выживаемости и выхода из блестящей оболочки IVP-эмбрионов крупного рогатого скота, сопоставимых с результатами, полученными на других носителях (Abdalla et al., 2010; Kim et al., 2012; Beck et al., 2013), уступая только индивидуальной витрификации на Cryotop и его близких аналогах. Снижение уровня выживаемости эмбрионов в группе HFV было не столь значительным, как у эмбрионов, витрифицированных индивидуально с использованием носителя открытого типа — полусоломинки, а уровень выхода из блестящей оболочки — существенно выше. При этом основные потери после витрификации в полом волокне наблюдались среди бластоцист, классифицированных как нерасширенные, а показатели жизнеспособности расширенных бласто-цист существенно не отличались от показателей, полученных в группе Cryotop и в контрольной группе. В целом, метод HFV является перспективной альтернативой витрификации IVP-эмбрионов КРС на открытых носителях, так как позволяет обрабатывать и криоконсервиро-вать группу эмбрионов как единое целое с соблюдением принципа MVC (Matsunari et al., 2012; Malenko et al., 2015), существенно упростить и стандартизировать процедуры обработки эмбрионов в растворах витрификации и отогревания (Matsunari et al., 2012), а также дополнительно защитить эмбрионы от механических повреждений. В нашей работе полое волокно позволило обеспечить выживаемость IVP-эмбрионов КРС без блестящей оболочки, сравнимую с выживаемостью интактных эмбрионов. Применение полого волокна в качестве носителя для витрификации может помочь в решении проблемы криоконсервации клонированных эмбрионов сельскохозяйственных животных, в том числе полученных по методу zona-free.

ЛИТЕРАТУРА

1. Маленко Г.П., Корниенко Е.В., Косовский Г.Ю. Устройство для витрификации ооцитов и эмбрионов млекопитающих: патент РФ № 141452, 2014.

2. Маленко Г.П., Корниенко Е.В., Косовский Г.Ю. Система и устройство (варианты) для криоконсервации группы ооцитов и эмбрионов млекопитающих по методу витрификации при использовании в качестве носителя полого волокна: патент РФ № 2584584, 2016.

3. Abdalla H., Shimoda M., Hara H., Morita H., Kuwayama M., Hirabayashi M., Hochi S. Vitrification of ICSI- and IVF-derived bovine blastocysts by minimum volume cooling procedure: effect of developmental stage and age // Theriogenology. - 2010. - Vol. 74. - P. 1028-1035.

4. Bavister B.D., Yanagimachi R. The effects of sperm extracts and energy sources on the motility and acrosome reaction of hamster spermatozoa in vitro //Biol. Reprod. - 1977. - Vol. 16. - P. 228-237.

5. Beck A., Kurome M., Nagashima H., Reichenbach M., Reichenbach H.D., Wolf E. Hollow fiber vitrification of biopsied in vitro produced bovine blastocysts // Reprod. Biol. - 2013. - Vol. 13. - Suppl 2. - P. 57.

6. Blondin P. Status of embryo production in the world // Anim. Reprod. - 2015. - Vol. 12. - No. 3. - P. 356-358.

7. Bo G.A., Mapletoft R.J. Evaluation and classification of bovine embryos // Anim. Reprod. - 2013. - Vol. 10. - P. 344-348.

8. Choi J.K., Yue T., Huang H., Zhao G., Zhang M., He X. The crucial role of zona pellucida in cryopreservation of oocytes by vitrification // Cryobiology. - 2015. - Vol. 71. - No. 2. - P. 350-355.

9. Dinnyes A., Lonergan P., Fair T., Boland M.P., Yang X. Timing of the first cleavage post-insemination affects cryosurvival of in vitro-produced bovine blastocysts // Mol. Reprod. Dev. - 1999. - Vol. 53 - P. 318-324.

10. Do V.H., Walton S., Catt S., Taylor-Robinson A.W. Requirements for cryopreservation of in vitro-produced bovine embryos by a standard method of vitrification // J. Vet. Sci. Anim. Husb. - 2016.- Vol. 3. - No. 4. - P. 1-8.

11. Gong G., Dai Y., Fan B., Zhu H., Zhu S., Wang H., Wang L., Tang B., Li R., Wan R. et al. Birth of calves expressing the enhanced green fluorescent protein after transfer of fresh or vitrified/thawed blastocysts produced by somatic cell nuclear transfer // Mol. Reprod. Dev. - 2004. - Vol. 69. - P. 278-288.

12. Gutnisky C., Alvarez G.M., Cetica P.D., Dalvit G.C. Evaluation of the cryotech vitrification kit for bovine embryos // Cryobiology - 2013 - Vol. 67. - P. 391-393.

13. Hamawaki A., Kuwayama M., Hamano S. Minimum volume cooling method for bovine blastocyst vitrification // Theriogenology. - 1999. - Vol. 51 - P. 165.

14. Han Y.M., Yamashina H., Koyama N., Lee K.K., Fukui Y. Effects of quality and developmental stage on the survival of IVF-derived bovine blastocysts cultured in vitro after freezing and thawing // Theriogenology. - 1994. - Vol. 42 - P. 645-654.

15. Hasler J.F., Hurtgen P.J., Jin Z.Q., Stokes J.E. Survival of IVF-derived bovine embryos frozen in glycerol or ethylene glycol // Theriogenology. - 1997. - Vol. 46. - P. 563-579.

16. Kim Y.M., Uhm S.J., Gupta M.K., Yang J.S., Lim J-G., Das Z.C., Heo Y.T., Chung H-J., Kong I-K., Kim N-H., Lee H.T., Ko D.H. Successful vitrification of bovine blastocysts on paper container // Theriogenology. - 2012. - Vol. 78. - P. 1085-1093.

17. Kuwayama M., Vajta G., Ieda S., Kato O. Comparison of open and closed methods for vitrification of human embryos and the elimination of potential contamination // Reprod. Biomed. Online. - 2005. - Vol. 11. - P. 608-614.

18. Malenko G.P., Kornienko E.V., Nesterov I.I., Popov D.V., Kosovsky G.Y. Effect of the rewarming temperature on survival rate of IVP bovine embryos vitrified in triacetate cellulose hollow fiber incorporated into a new vitrification device // Anim. Reprod. - 2015. - Vol. 12. - No. 3. - P. 853.

19. Matsunari H., Maehara M., Nakano K., Ikezawa Y., Hagiwara Y., Sasayama N., Shirasu A., Ohta H., Takahashi M., Nagashima H. Hollow fiber vitrification: A novel method for vitrifying multiple embryos in a single device // J. Reprod. Dev. - 2012. - Vol. 58. - P. 599-608.

20. Nagashima H., Uchikura A., Maehara M., Hatae S., Nakano K. 2015. Direct comparison of the hollow-fiber vitrification and conventional vitrification methods // In: IFFS/JSRM International Meeting 26-29th April 2015. - Yokohama, Japan, 2015. - P. 24.

21. Nedambale T.L., Dinnyes A., Groen W., Dobrinsky J.R., Tian X.C., Yang X. Comparison on in vitro fertilized bovine embryos cultured in KSOM or SOF and cryopreserved by slow freezing or vitrification // Theriogenology. - 2004. - Vol. 62. - P. 437-449.

22. Parrish J.J., Susko-Parrish J.L., Winer M.A., First N.L. Capacitation of bovine sperm by heparin // Biol. Reprod. - 1988. - Vol. 38. - P. 1171-1180.

23. Pontes J.H.F., Silva K.C.F., Basso A.C., Rigo A.G., Ferreira C.R., Santos G.M.G., Sanches B.V., Porcionato J.P.F., Vieira P.H.S., Faifer F.S., Sterza F.A.M., Schenk J.L., Seneda M.M. Large-scale in vitro embryo production and pregnancy rates from Bos taurus, Bos indicus, and indicus-taurus dairy cows using sexed sperm // Theriogenology. - 2010. - Vol. 74. - P. 1349-1355.

24. Rios G.L., Mucci N.C., Kaiser G.G., Alberio R.H. Effect of container, vitrification volume and warming solution on cryosurvival of in vitro-produced bovine embryos // Anim. Reprod. Sci. - 2010. - Vol. 118. -P. 19-24.

25. Saragusty J., Arav A. Current progress in oocyte and embryo cryopreservation by slow freezing and vitrification // Reproduction. - 2011. - Vol. 141 - P. 1-19.

26. Saucedo M.N., Kurome M., Reichenbach M., Wolf E., Reichenbach H.D. Cryopreservation of bovine in vitro-produced embryos: intrinsic factors determining vitrification outcomes // Reprod. Fertil. Dev. -2015a. - Vol. 27. - Suppl. 1. - P. 120.

27. Saucedo M.N., Reichenbach M., Kurome M., Wolf E., Reichenbach H.D. Vitrification of intact and splitted in vitro produced d7 bovine embryos // Anim. Reprod. - 2015b. - Vol. 12. - No. 3. - P. 858.

28. Sirisha K., Selokar N.L., Saini M., Palta P., Manik R.S., Chauhan M.S., Singla S.K. Cryopreservation of zona-free cloned Buffalo (Bubalus Bubalis) embryos: slow freezing vs open-pulled straw vitrification // Reprod. Dom. Anim. - 2013. - Vol. 48. - No. 4. - P. 538-44.

29. Taylor-Robinson A.W., Walton S., Swain D.L., Walsh K.B., Vajta G. The potential for modification in cloning and vitrification technology to enhance genetic progress in beef cattle in Northern Australia // Anim. Reprod. Sci. - 2014. - Vol. 148. - P. 91-96.

30. Tecirlioglu R.T., French A.J., Lewis I.M., Vajta G., Korfiatis N.A., Hall V.J., Ruddock N.T., Cooney

M.A., Trounson A.O. Birth of a cloned calf derived from a vitrified hand-made cloned embryo // Reprod. Fertil. Dev. - 2003. - Vol. 15. - P. 361-366.

31. Tervit H.R., Whittingham D.G., Rowson L.E.A. Successful culture in vitro of sheep and cattle ova // J. Reprod. Fertil. - 1972. - Vol. 30. - P. 493-49.

32. Ushijima H., Akiyama K., Tajima T. Classification of morphological changes based on the number of cleavage divisions in bovine embryos // J. Reprod. Dev. - 2009. - Vol. 55 - P. 83-87.

33. Vajta G. Handmade cloning: the future way of nuclear transfer // Trends Biotechnol. - 2007. - Vol. 25. -P. 250-253.

34. Valbuena D., Poo M.E., Aguilar-Gallardo C., Martinez S., Cobo A.C., Pellicer A., Simon C. Comparison of Cryotip vs. Cryotop for mouse and human blastomere vitrification // Fertility and Sterility. - 2012 -Vol. 97. - No. 1. - P. 209-217.

35. Verma G., Arora J.S., Sethi R.S., Mukhopadhyay C.S., Verma R. Handmade cloning: recent advances, potential and pitfalls // J. Anim. Sci. Biotech. - 2015. - Vol. 6. - P. 43-53.

REFERENCES

1. Abdalla H., Shimoda M., Hara H., Morita H., Kuwayama M., Hirabayashi M., Hochi S. Vitrification of ICSI- and IVF-derived bovine blastocysts by minimum volume cooling procedure: effect of developmental stage and age. Theriogenology. 2010, 74: 1028-1035.

2. Bavister B.D., Yanagimachi R. The effects of sperm extracts and energy sources on the motility and acro-some reaction of hamster spermatozoa in vitro. Biol. Reprod. 1977, 16: 228-237.

3. Beck A., Kurome M., Nagashima H., Reichenbach M., Reichenbach H.D., Wolf E. Hollow fiber vitrification of biopsied in vitro produced bovine blastocysts. Reprod. Biol., 2013, 13(Suppl 2): 57.

4. Blondin P. Status of embryo production in the world. Anim. Reprod. 2015, 12(3): 356-358.

5. Bo G.A., Mapletoft R.J. Evaluation and classification of bovine embryos. Anim. Reprod. 2013, 10: 344-348.

6. Choi J.K., Yue T., Huang H., Zhao G., Zhang M., He X. The crucial role of zona pellucida in cryopreser-vation of oocytes by vitrification. Cryobiology. 2015, 71(2): 350-355.

7. Dinnyes A., Lonergan P., Fair T., Boland M.P., Yang X. Timing of the first cleavage post-insemination affects cryosurvival of in vitro-produced bovine blastocysts. Mol. Reprod. Dev. 1999, 53: 318-324.

8. Do V.H., Walton S., Catt S., Taylor-Robinson A.W. Requirements for cryopreservation of in vitro-produced bovine embryos by a standard method of vitrification. J. Vet. Sci. Anim. Husb. 2016, 3(4): 1-8.

9. Gong G., Dai Y., Fan B., Zhu H., Zhu S., Wang H., Wang L., Tang B., Li R., Wan R. et al. Birth of calves expressing the enhanced green fluorescent protein after transfer of fresh or vitrified/thawed blastocysts produced by somatic cell nuclear transfer. Mol. Reprod. Dev. 2004, 69: 278-288.

10. Gutnisky C., Alvarez G.M., Cetica P.D., Dalvit G.C. Evaluation of the cryotech vitrification kit for bovine embryos. Cryobiology. 2013, 67: 391-393.

11. Hamawaki A., Kuwayama M., Hamano S. Minimum volume cooling method for bovine blastocyst vitrification. Theriogenology. 1999, 51: 165.

12. Han Y.M., Yamashina H., Koyama N., Lee K.K., Fukui Y. Effects of quality and developmental stage on the survival of IVF-derived bovine blastocysts cultured in vitro after freezing and thawing. Theriogenology. 1994, 42: 645-654.

13. Hasler J.F., Hurtgen P.J., Jin Z.Q., Stokes J.E. Survival of IVF-derived bovine embryos frozen in glycerol or ethylene glycol. Theriogenology. 1997, 46: 563-579.

14. Kim Y.M., Uhm S.J., Gupta M.K., Yang J.S., Lim J-G., Das Z.C., Heo Y.T., Chung H-J., Kong I-K., Kim N-H., Lee H.T., Ko D.H. Successful vitrification of bovine blastocysts on paper container. Theriogenology. 2012, 78: 1085-1093.

15. Kuwayama M., Vajta G., Ieda S., Kato O. Comparison of open and closed methods for vitrification of human embryos and the elimination of potential contamination. Reprod Biomed Online. 2005, 11: 608-614.

16. Malenko G.P., Kornienko E.V., Kosovsky G.Y. PatentRFNo. 141452. 2014

17. Malenko G.P., Kornienko E.V., Kosovsky G.Y. Patent RF No. 2584584. 2016

18. Malenko G.P., Kornienko E.V., Nesterov I.I., Popov D.V., Kosovsky G.Y. Effect of the rewarming temperature on survival rate of IVP bovine embryos vitrified in triacetate cellulose hollow fiber incorporated into a new vitrification device. Anim. Repr. 2015, 12(3): 853.

19. Matsunari H., Maehara M., Nakano K., Ikezawa Y., Hagiwara Y., Sasayama N., Shirasu A., Ohta H., Takahashi M., Nagashima H. Hollow fiber vitrification: A novel method for vitrifying multiple embryos in a single device. J. Reprod. Dev. 2012, 58: 599-608.

20. Nagashima H., Uchikura A., Maehara M., Hatae S., Nakano K. 2015. Direct comparison of the hollow-fiber vitrification and conventional vitrification methods. IFFS/JSRMInternational Meeting 26-29th April 2015. Yokohama, Japan, 2015, P.24.

21. Nedambale T.L., Dinnyes A., Groen W., Dobrinsky J.R., Tian X.C., Yang X. Comparison on in vitro fertilized bovine embryos cultured in KSOM or SOF and cryopreserved by slow freezing or vitrification. Theriogenology. 2004, 62: 437-449.

22. Parrish J.J., Susko-Parrish J.L., Winer M.A., First N.L. Capacitation of bovine sperm by heparin. Biol Reprod. 1988, 38: 1171-1180.

23. Pontes J.H.F., Silva K.C.F., Basso A.C., Rigo A.G., Ferreira C.R., Santos G.M.G., Sanches B.V., Porcionato J.P.F., Vieira P.H.S., Faifer F.S., Sterza F.A.M., Schenk J.L., Seneda M.M. Large-scale in vitro embryo production and pregnancy rates from Bos taurus, Bos indicus, and indicus-taurus dairy cows using sexed sperm. Theriogenology. 2010, 74: 1349-1355.

24. Rios G.L., Mucci N.C., Kaiser G.G., Alberio R.H. Effect of container, vitrification volume and warming solution on cryosurvival of in vitro-produced bovine embryos. Anim. Reprod. Sci. 2010, 118: 19-24.

25. Saragusty J., Arav A. Current progress in oocyte and embryo cryopreservation by slow freezing and vitrification. Reproduction. 2011, 141: 1-19.

26. Saucedo M.N., Kurome M., Reichenbach M., Wolf E., Reichenbach H.D. Cryopreservation of bovine in vitro-produced embryos: intrinsic factors determining vitrification outcomes. Reprod. Fertil. Dev. 2015, 27(Suppl 1): 120.

27. Saucedo M.N., Reichenbach M., Kurome M., Wolf E., Reichenbach H.D. Vitrification of intact and splitted in vitro produced d7 bovine embryos. Anim. Reprod. 2015, 12(3): 858.

28. Sirisha K., Selokar N.L., Saini M., Palta P., Manik R.S., Chauhan M.S., Singla S.K. Cryopreservation of zona-free cloned Buffalo (Bubalus Bubalis) embryos: slow freezing vs open-pulled straw vitrification. Reprod. Dom. Anim. 2013, 48(4): 538-44.

29. Taylor-Robinson A.W., Walton S., Swain D.L., Walsh K.B., Vajta G. The potential for modification in cloning and vitrification technology to enhance genetic progress in beef cattle in Northern Australia. Anim. Reprod. Sci. 2014, 148: 91-96.

30. Tecirlioglu R.T., French A.J., Lewis I.M., Vajta G., Korfiatis N.A., Hall V.J., Ruddock N.T., Cooney M.A., Trounson A.O. Birth of a cloned calf derived from a vitrified hand-made cloned embryo. Reprod. Fertil. Dev. 2003, 15: 361-366.

31. Tervit H.R., Whittingham D.G., Rowson L.E.A. Successful culture in vitro of sheep and cattle ova. J. Reprod. Fertil. 1972, 30: 493-497.

32. Ushijima H., Akiyama K., Tajima T. Classification of morphological changes based on the number of cleavage divisions in bovine embryos. J. Reprod. Dev. 2009, 55: 83-87.

33. Vajta G. Handmade cloning: the future way of nuclear transfer. TrendsBiotechnol. 2007, 25: 250-253.

34. Valbuena D., Poo M.E., Aguilar-Gallardo C., Martinez S., Cobo A.C., Pellicer A., Simon C. Comparison of Cryotip vs. Cryotop for mouse and human blastomere vitrification. Fertility and Sterility. 2012, 97(1): 209-217.

35. Verma G., Arora J.S., Sethi R.S., Mukhopadhyay C.S., Verma R. Handmade cloning: recent advances, potential and pitfalls. J. Anim. Sci. Biotech. 2015, 6: 43-53.

Vitrification of bovine in vitro produced embryos in triacetate cellulosic hollow fibers and on open type carriers

Malenko G.P., Kornienko E.V., Romanova A.B., Kosovskii G.Yu.

Center of Experimental Embryology and Reproductive Biotechnologies, Moscow, Russian Federation

ABSTRACT. Use of triacetate cellulose hollow fibers as a vitrification carrier is a perspective modification of the method to preserve groups of mammalian oocytes and in vitro produced (IVP) embryos. Hollow fiber vitrification allows significant simplification and standardization of vitrification/warming procedures. In the current work, hollow fiber carrier was compared to two open-type vitrificatin carriers: Cryotop and hemi-straw. Experiments were conducted using seven-day-old IVP bovine blastocysts and expanded blastocysts. At 24 hours past warming, survival level of the embryos vitrified using hollow fibers (84%, P<0.05) was significantly lower than in other experimental groups (97% using Cryotop and 94.3% using hemi-straw) and in the control group (100%). However, hatching rates in the hollow fiber group were comparable to those from other groups throughout culture period and the most drastic drop in viability was observed in the hemi-straw group. With the aim to test aptitude of the triacetate cellulosic hollow fibers for cryopresrevation of cloned zona-free embryos, IVP bovine blastocysts and expanded blastocysts without zona pellucida were vitrified in hollow fibers. Viability of vitrified embryos without zona pellucida 24 hours post warming (84.7%) was comparable to those of intact vitrified embryos. However, the average number of cells with damaged membrane was higher in zona-free embryos.

Keywords: bovine embryo, in vitro production, vitrification, hollow fibers

Problemy biologii productivnykh zhivotnykh - Problems of Productive Animal Biology, 2016, 4: 5-16

Поступило в редакцию: 28.09.2016 Получено после доработки: 24.10.2016

Маленко Галина Петровна, д.б.н., зав. отд., т. +7 (909) 901-78-05; galina_malenko@mail.ru Корниенко Екатерина Валерьевна, н.с., т. +7 (916) 880-55-03; kornienko.katerina@gmail.com Романова Анастасия Борисовна, м.н.с., info-ceerb@mail.ru Косовский Глеб Юрьевич, д.б.н., дир., т. +7 (985) 761-45-11; info-ceerb@mail.ru