Биосинтез ксиланаз аборигенными изолятами Trichoderma

Е. В. Скворцов, Ф. К. Алимова, Д. М. Абузярова БИОСИНТЕЗ КСИЛАНАЗ АБОРИГЕННЫМИ ИЗОЛЯТАМИ TRICHODERMA

Проведены исследования, показавшие высокую активность биосинтеза ксиланаз аборигенными почвенными штаммами Trichoderma. Всего исследовано более 200 штаммов. Аборигенный штамм Trichoderma 302 показал наибольшую активность синтеза ксиланаз, 8.82±0.21 IU/ml. Еще два штамма почвенных изолята Т.303 и Т.328 показали продуктивность синтеза ксиланаз выше промышленного продуцента Trichoderma reesei, ксиланазная активность препаратов которого была 2.22±0.23 IU/ml. Ксиланазы почвенного штамма Т.302 гидролизуют рожь глубже на 4%, сравнении с T.reesei.

Исходные данные и цель работы

Грибы и бактерии являются продуцентами ксиланаз, ферментов, осуществляющих гидролиз пентозанов [1-10]. В настоящее время основным биотехнологическим источником ксиланаз являются грибы. Наиболее изучена продукция ксиланаз у грибов родов Trichoderma, Aspergillus, Penicillium,Fusarium, Cellulomonas, Chaetomium. Промышленные препараты ксиланаз грибного происхождения получают из селектированных штаммов родов Trichoderma и Aspergillus[11].

Ксиланазы используются в технологии производства спирта, для гидролиза ржи. Применение ксиланаз при гидролизе вызвано составом углеводной фракции ржи. Рожь богата крахмалом, а также содержит достаточно крупную, в сравнении с пшеницей фракцию пентозанов [12]. По строению крахмал зерна ржи относится к восковидному типу, состоящему преимущественно из амилопектина. Эндосперм, который составляет 82.5% всего зерна окружен плодовой и семенной оболочками, состоящими из некрахмалистых полисахаридов: целлюлозы, гемицеллюлозы, пентозанов, Р-глюканов[13]. Часть пентозанов, около 2% воздушно сухого вещества (ВСВ) ржаного зерна растворимы в воде. Растворимые пентозаны ржи, переходящие при проведении гидролиза в раствор значительно увеличивают вязкость затора и замедляют действие амилолитических ферментов, обычно применяющихся при гидролизе.

Решение проблемы пентозанов при гидролизе достигается применением ксиланаз. Наилучший гидролизующий эффект достигается применением импортных ксиланаз. В настоящее время в спиртовой промышленности отработана технология ферментативного гидролиза углеводной фракции ржи. Эта технология предусматривает гидролиз шеарзи-мом- импортным ферментным препаратом ксиланаз, разрушающим пентозаны, растворение крахмала ржи, с применением разжижающего фермента амилосубтилина, и гидролиз его раствора глюкоавоморином. С помощью гидролиза получают растворы сахаров, подлежащие дальнейшему сбраживанию.

Целью проведенной нами работы являлось проведение скрининга грибов Tricho-derma на способность биосинтеза ксиланаз, определение эффективных штаммов продуцентов. Провести сравнительный анализ синтезированных способности ферментных препаратов гидролизовать рожь.

Экспериментальная часть

Для решения поставленных задач проведены исследования на базе кафедры микробиологии КГУ и центра аналитических исследований ТатНИИСХ.

Ксиланазную активность ферментных препаратов [14] определяли в международных единицах активности энзима (IU), одна единица соответствует количеству фермента, вызывающего выход одного мкМоля восстанавливающих сахаров в минуту при гидролизе ксилана. Раствор кси-лана для исследования активности ксиланаз готовили следующим образом: 750 мг ксилана (Sigma X0502) помещали в 40 мл ацетатного буфера (рН 5.0). Растворяли ксилан перемешиванием на кипящей водяной бане в течении 5 мин. После охлаждения до комнатной температуры рН раствора доводили до 5.0 25% HCl. Объем раствора доводили до 50 мл ацетатным буфером. Выход восстанавливающих сахаров определяли по Миллеру [15] с окрашиванием динитросалициловой кислотой (DNSA) и измерением оптической плотности при длине волны 530 нм, с использованием спектрофотометра Perkin Elmer Lambda 35(USA).

Для получения инокулята культуры Trichoderma выращивали на агаризованной среде Чапека при температуре 28 оС, 7 суток. В качестве инокулята использовали суспензию с содержанием 1106 спор/мл.

Для проведения биосинтеза препаратов ксиланаз, проведено культивирование штаммов на экстрактах ржи. Использование экстрактов ржи позволяло получать в культуральном растворе нативные ржаные ксиланы и таким образом вызывать биосинтез микроорганизмами специфических ферментов для их гидролиза. Состав экспериментальной среды, щелочного экстракта ржи: пенто-заны-0.2%, белок -0.5%, (NH4)2SO4 -0.5%, pH -6.0. Культуральные среды, засевали 2% инокулята. Культуры выращивали в 200 мл колбах, содержавших 100 мл среды в течение 72 часов на лабораторных качалках с интенсивностью качания 200 об/мин при температуре 280С при исходном значении рН 6.0. Пробы для определения биомассы и ферментативной активности отбирали через 72 часа после начала культивирования. Клетки отделяли центрифугированием (5000 г, 30 мин).

Для исследования биосинтеза использовались грибы Trichoderma sp., выделенные из почв могильника г.Беляр, совхоза «Казанский тепличный», совхоза «Майский», использована культура грибов из Всероссийской Всероссийской коллекциии коллекции микроорганизмов (ВКМ): Trichoderma reesei F-2433.

Для анализа содержания пентозанов в средах применяли хроматаграфическое исследование, после мягкого кислотного гидролиза среды [16] с использованием жидкостного хроматографа Perkin Elmer Series 200(USA), оборудованного автосамплером. В качестве элюэнта при проведении исследований использовали ацетонитрил. Для регистрации выходящих фракций моносахаридов применялся рефракционный детектор.

Все реагенты, использованные в работе, имели аналитическую степень чистоты.

Математическая обработка результатов исследований проведена с использованием математического аппарата программы Microsoft Excel. Все приведенные в отчете результаты имеют высокую степень достоверности, уровень значимости a^0.05.

Результаты и обсуждение

Используя почвенные изоляты, а также промышленный штамм T.reesei, было проведено культивирование штаммов на средах, содержащих пентозаны для биосинтеза ферментов. Очищенные препараты культуральных жидкостей исследовались на ксиланазную активность. Всего исследовано более 200 штаммов. Наибольшую активность показали следующие штаммы, выделенные из почв РТ: Trichoderma 2,14,16,302,303,328.

Результаты, приведенные в таблице 1, показали высокую активность грибных кси-ланаз, синтезированных штаммами аборигенных изолятов Trichoderma из почв РТ в сравнении с промышленным продуцентом T.reesei. Аборигенный штамм Trichoderma 302 показал наибольшую активность синтеза ксиланаз, 8.82 IU/ml. Еще два штамма почвенных изо-

Штамм Ксиланазная активность,ГО/мл

Т.тее8еі 2.22±0.23

Тгіекойетша 2 1.67±0.16

Тгіекойетша 14 1.33±0.11

Тгіекойетша 16 2. 3 0±0. 15

Тгіекойетша 302 8.82±0.21

Тгіекойетша 303 8.25±0.25

Тгіекойетша 328 5.03±0.22

лята Т. 303 и Т. 328 показали продуктивность синтеза ксиланаз выше промышленного продуцента.

Нами проведены исследования ферментативного гидролиза зерна ржи с применением синтезированных нами препаратов ксиланаз.

Применяли ступенчатую схему варки с применением препаратов ксиланаз Тгіско-ёегша, в виде очищенных препаратов культуральных жидкостей в количестве 10%, амило-субтилин Г3х 0.1% и глюкавоморин 0.2% количества гидролизуемой ржи. Используя препарат ксиланаз Т.302 удается добиться гидролиза 58.4% сырья таблица 2. Применяя препараты Т.тее$еі по этой схеме варки гидролизуется 54.4% сырья, таблица 3. Кинетика гидролиза ржи с использованием препаратов Т.тее$еі и Т.302 показана на рисунке 1.

Таблица 2 - Ферментативный гидролиз ржи, гидромодуль 1:4 *

Фермент, часы гидролиза % сахаров в растворе % гидролиза сырья

0 3±0.5 12±2.4

Ксиланаза Т.302, 1 6.5±1.1 26±4.4

Амилосубтилин, 2 14. 6± 1. 5 58.4±6.0

Амилосубтилин, 4 14. 6± 1. 5 58.4±6.0

Глюкоамилаза, 1 14. 6± 1. 4 58.4±5.6

Фермент, часы гидролиза % сахаров в растворе % гидролиза сырья

0 3±0.5 12±2.4

Ксиланаза Т.гее8е1, 1 6±1.1 24±4.4

Амилосубтилин, 2 13.1±1.5 52.5±6.0

Амилосубтилин, 4 13.4±1.5 53.3±6.0

Глюкоамилаза, 1 13.6±1.4 54.4±5.6

Время применения фермента, ч

Рис. 1 - Исследование ксиланаз Trichoderma. Кинетика ферментативного гидролиза, гидромодуль 1:4

Заключение

Результаты проведенного исследования показали, что более предпочтительным, для использования при гидролизе, исходя из глубины гидролиза сырья, является применение препаратов аборигенного штамма Т.302.

На основании результатов исследований можно сделать следующие выводы:

1. получены лабораторные препараты ксиланаз с использованием в качестве продуцентов почвенных штаммов Тпскойегша в виде очищенных от продуцентов и нерастворимых компонентов культуральных жидкостей;

2. эффективность полученных лабораторных препаратов ксиланаз, полученных с использованием в качестве продуцентов высокопродуктивных по ксиланазе аборигенных штаммов Тпскоёегша превосходит препараты известного промышленного продуцента T.reesei.

Результаты проведенных исследований показали высокую активность аборигенных штаммов грибов Trichoderma, выделенных из разных почв, к синтезу ксиланаз. Таким образом, почвенные изоляты Trichoderma являются перспективными продуцентами препаратов ксиланаз, гидролизующих пентозаны ржи.

Литература

1. Khalil B.O., Bharat B., Muresh K.// Enzyme and Microb. Technol. 2000. Т.27, №7. P.459-466.

2. Fujimoto Z.// J. Mol. Biol.2000. V.300. P. 575-585.

3. Hidenori T., Ryuichiro N., Satoshi N. //Biotechnol. and biochem. 2000. №4. P.887-890.

4. Bisaria V. S.; Mishra, S. // Crit. Rev. Biotechnol. 1989. № 9. P.61-103.

5. Kubicek C. P., Messner R., Gruber F. // Enzyme Microb. Technol. 1993. №15. P.90-99.

6. Jagruti G.P., Koteswara R.K., Prafulla D.J. //J. Chem. Technol. and Biotechnol. 1994. V.60. №1. P. 55-60.

7. Saha B.C. //Process Biochemistry. 2002. V.37. №11. P. 1279-1284.

8. Vega-Estrada J.,Flores-Cotera L.,Santiago A.//Appl.Microbiol and Biotechnol. 2002. V.58. №4. P. 435-438

9. Lu W., Li D., Wu Y. //Enzyme and Microbial Technology. 2003. V.32, №2. P. 305-311

10. Jorgensen H., Eriksson T., Borjesson J.// Enzyme and Microbial Technology. 2003. V.32, №2. P.851-861.

11. Грачева И.М.//Технология ферментных препаратов. -М.:Агропромиздат, 1987. С.169.

12. Околелова Т.М., Кулаков А.В., Молоскин С.А., Грачев Д.М. Корма и ферменты. ВНИТИП, Сергиев Посад, 2001. С.122.

13. Кретович В.Л. Биохимия зерна и хлеба. -М.:Наука, 1991. С.136.

14. Konig J., Grasser R., Pikor H.// Anal Bioanal Chem. 2002. V.374. P.80-87.

15. Miller G.L.//Anal. Chem. 1959. V.31. Р.426-428.

16. Bartolome B., Santos M., Jimenez JJ// Journal of Cereal Science. 2002. V.36. Р.51-58.

© Е. В. Скворцов, Ф. К. Алимова, Д. М. Абузярова