ГЛИПИКАН-3 (GPC3)-ПРОИЗВОДНЫЕ АНТИГЕННЫЕ ПЕПТИДЫ, ОТТОРГАЮЩИЕ ОПУХОЛИ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ДЛЯ НLA-A2-ПОЛОЖИТЕЛЬНЫХ ПАЦИЕНТОВ, И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ ПРОДУКЦИЯ, ВКЛЮЧАЮЩАЯ ИХ
TUMOUR-REJECTING GLYPICAN-3 (GPC3)-DERIVATIVE ANTIGENIC PEPTIDES USED FOR HLA-A2-POSITIVE PATIENTS, AND PHARMACEUTICAL PRODUCT CONTAINING SAID PEPTIDES

Описание
Область техники, к которой относится изобретение
Данное изобретение относится к новым пептидам, которые эффективны в качестве вакцины для злокачественных опухолей с высокой экспрессией глипикана-3 (GPC3), таких как гепатоцеллюлярная карцинома, злокачественная меланома (меланома), и фармацевтической продукции, включающей вышеупомянутые пептиды и используемой для лечения и предотвращения опухолей.
Уровень техники
Прежде всего, гепатоцеллюлярная карцинома является злокачественным заболеванием, которое встречается с высокой частотой в различных странах по всему миру. Как результат больших вспышек гепатита В и С по всему миру распространенность гепатоцеллюлярной карциномы быстро возрастала в азиатских и европейских странах. Принимая во внимание долгий инкубационный период от заражения вирусом гепатита до начала заболевания, ожидают, что такая тенденция будет продолжаться на протяжении последующих пятидесяти лет. Гепатоцеллюлярная карцинома, обстановка с которой ухудшилась, имеет неблагоприятный прогноз. Таким образом, желательно быстро развивать новую стратегию лечения.
С одной стороны, с развитием молекулярной биологии и иммунологии опухолей в последние годы было показано, что цитотоксические (киллерные) Т-клетки и хелперные Т-клетки узнают пептиды, образованные путем распада белков, высоко экспрессируемых специфически в опухолевых клетках, которые презентируются на поверхности раковых клеток или антиген-презентирующих клеток посредством HLA-молекул и что они проявляют иммунную реакцию, направленную на разрушение таких клеток злокачественной опухоли. Кроме того, было установлено большое количество опухолевых антигенных беков и пептидов, которые стимулируют такую иммунную реакцию, чтобы атаковать злокачественную опухоль, и развивалось применение антиген-специфичной опухолевой иммунотерапии в медицинской практике.
Молекулы HLA класса I экспрессируются на поверхностях всех ядерных клеток тела. Пептиды, полученные из распавшихся цитоплазматических и ядерных белков, связаны с молекулами HLA класса I и экспрессируются на поверхностях таких клеток. На поверхностях нормальных клеток пептиды, полученные из нормальных аутогенных белков, связываются с молекулами HLA класса I, и Т-клетки иммунной системы как не узнают, так и не отвечают на такие пептиды, связанные с молекулами HLA класса I. С другой стороны, в процессе, в котором нормальные клетки превращаются в опухолевые, такие опухолевые клетки могут экспрессировать большое количество белков, которые почти не экспрессируются или экспрессируются только в небольших количествах в нормальных клетках. Если пептид, образованный путем распада в цитоплазме такого белка, который высоко и специфически экспрессируется в опухолевых клетках, связывается с молекулой HLA класса I и экспрессируется на поверхности такой опухолевой клетки, киллерная Т-клетка узнает пептид и разрушает только раковую клетку. Помимо этого, вводя такой опухолеспецифический антиген или пептид индивидууму, возможно разрушить опухолевые клетки и подавить рост злокачественной опухоли, не повреждая нормальные клетки. Это относится к опухолевой иммунотерапии, использующей опухолеспецифический антиген. Кроме того, молекула HLA класса II экспрессируется в основном на поверхности антиген-презентирующей клетки. Такая молекула HLA класса II связывается с пептидом, полученным из опухолеспецифического антигена, образованного инкорпорированием опухолеспецифического антигена извне клетки и распадом его в клетке, и экспрессируется на поверхности клетки. Хелперная Т-клетка, которая узнала пептид, связанный с молекулой HLA класса II, активируется, чтобы вырабатывать различные цитокины, которые активируют другие иммунокомпетентные клетки, чтобы индуцировать или усилить иммунную реакцию против опухоли.
Таким образом, если можно развивать иммунотерапию, нацеленную на антиген, который высоко или специфически экспрессируется в такой злокачественной опухоли, она может стать методом лечения для эффективной элиминации только злокачественной опухоли, не повреждая нормальные аутологичные органы. Кроме того, ожидают, что такая иммунотерапия может стать методом лечения, применимым к пациентам, страдающим от терминальных стадий злокачественной опухоли, для которых не может осуществляться никакое другое лечение. К тому же, если опухолеспецифический антиген и пептид вводятся в форме вакцины человеку с высоким риском развития такой злокачественной опухоли, существует вероятность, что начало злокачественной опухоли может быть предотвращено.
Сообщалось, что в нормальных тканях α-фетопротеин (АФП) экспрессируется только в перинатальном периоде, и это так называемый раковый эмбриональный белок, экспрессия которого снова активируется во многих гепатоцеллюлярных карциномах. Помимо этого, несколько типов мышиных и человеческих Т-клеток узнают пептидный эпитоп, полученный из АФП, презентируемый молекулой МНС класса I. На протяжении стадии развития эмбрион подвержен действию АФП, высокий уровень которого содержится в плазме. Однако зрелые Т-клетки не приобретают полную иммунологическую толерантность к АФП, и АФП-специфичные Т-клетки обнаруживают в периферической крови. Другими словами, такой раковый эмбриональный белок может быть мишенью иммунотерапии.
Существуют различные методы лечения гепатоцеллюлярной карциномы. Однако прогноз такой гепатоцеллюлярной карциномы хуже, чем у других типов злокачественных опухолей, и, таким образом, эта злокачественная опухоль считается трудноконтролируемой злокачественной опухолью. Это может происходить из-за того, что гепатоцеллюлярная карцинома развивается на базе цирроза печени и пациенты с гепатоцеллюлярной карциномой имеют недостаточную функцию печени. Это может также происходить из-за того, что хотя большая часть злокачественной опухоли была излечена, другая злокачественная опухоль развивается из другого участка. Следовательно, было необходимым быстро развивать новую стратегию лечения. Если иммунотерапевтическое выявление антигена, который высоко и специфически экспрессируется в гепатоцеллюлярной карциноме, можно развить, существует вероятность, что такая иммунотерапия станет терапевтическим методом для эффективной элиминации только злокачественной опухоли, не повреждая нормальные аутологичные органы. Кроме того, ожидается, что вышеупомянутая иммунотерапия может быть терапевтическим методом, доступным для пациентов, находящихся в терминальной стадии злокачественной опухоли, и, более того, для пациентов, функция печени у которых слишком слаба, чтобы позволить вынести другие способы лечения. На сегодняшний день сказано, что в Японии более 2000000 людей инфицированы вирусом гепатита С, и что такие люди являются потенциальными пациентами с гепатоцеллюлярной карциномой. Существует вероятность, что вышеупомянутая иммунотерапия будет также применяться к таким инфицированным пациентам, чтобы все-таки предотвратить заболевание гепатоцеллюлярной карциномой.
Меланома является одним из типов кожного рака, который часто называют злокачественной меланомой. Существует много типов кожных злокачественных опухолей. Среди таких кожных злокачественных опухолей меланому классифицируют как имеющую самый высокий уровень малигнизации, и, таким образом, ее сильно боятся. Среди клеток, которые входят в состав кожи, некоторые клетки вырабатывают пигмент меланин. Такие клетки называют меланоцитами. Когда такие меланоциты становятся раковыми, возникает меланома.
В Японии распространенность меланомы изменяется от 1,5 до 2 человек на 100000 в основной популяции. Таким образом, подсчитано, что приблизительно у 1500-2000 человек в год развивается меланома. С другой стороны, в западных странах более чем у десяти человек на 100000 в основной популяции развивается меланома. В частности, в Австралии у двадцати или более человек на 100000 в основной популяции развивается меланома, и, таким образом, говорят, что распространенность меланомы в Австралии самая высокая в мире. При таких обстоятельствах люди, которые живут в Европе, Соединенных Штатах и Австралии интересуются меланомой и обращают внимание на случаи меланомы. Помимо этого, частота случаев меланомы возрастала, особенно среди европейцев, в результате увеличения воздействия ультрафиолетовых лучей, благодаря уменьшению озонового слоя в атмосфере, вызванного разрушением окружающей среды. Кроме того, случаи меланомы в Японии тоже имеют тенденцию к возрастанию год от года. Согласно последним работам ежегодное количество погибших от меланом в Японии возросло до приблизительно 450. Меланома развивается независимо от возраста. Однако распространенность этого заболевания возрастает для тех, кому больше 40, и она самая высокая для тех, кому 60 и 70. Начало этого заболевания в детском возрасте очень редко, но это не значит, что заболевание никогда не развивается в детском возрасте. В последнее время случаи меланомы имеют тенденцию к возрастанию у молодых пациентов в возрасте 20 и 30 лет. Меланома развивается независимо от пола, и заболевают как пациенты мужчины, так и женщины. В случае японских пациентов, участком, на котором чаще всего развивается меланома, является ступня (подошва ноги), и она насчитывает 30% всех случаев меланомы. Особенностью японских пациентов является то, что меланома также развивается в подошвенной и ногтевой частях пальцев. Помимо этого, как в случае западных пациентов, так и у японских пациентов, меланома развивается на всех частях кожи, таких как туловище, рука, стопа, лицо и голова.
Во-первых, настоящие изобретатели провели общегеномный анализ экспрессии гена, включая рассмотрение 23040 видов генов человека, используя кДНК-микрочиповый анализ. Изобретатели проанализировали профили экспрессии этих генов в 20 случаях первичных гепатоцеллюлярных карцином и в различных типах нормальных органов, включая присутствующие в перинатальный период. В результате изобретатели выяснили, что глипикан-3 (GPC3) экспрессируется в печени, почке и легком на протяжении перинатального периода, а также, что такой глипикан-3 высоко экспрессируется во многих гепатоцеллюлярных карциномах, хотя он почти никогда не экспрессируется в нормальных взрослых органах, хотя он экспрессируется в плаценте. Более того, изобретатели сообщили, что GPC3 является секреторным белком, что такой GPC3 можно обнаружить в сыворотке у 40% пациентов с гепатоцеллюлярными карциномами при помощи метода ELISA и что это применяют в качестве нового опухолевого маркера гепатоцеллюлярной карциномы (Nakatsura, T. еt al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 306, 16-25 (2003)). Кроме того, они также сообщили, что GPC3 обнаружили в сыворотке пациентов с меланомой, и что его также применяют в качестве опухолевого маркера меланомы (Nakatsura, T. еt al., Clin. Cancer Res. 10: 6612-6621 (2004)).
d
Настоящие изобретатели уже установили GPC3 пептид, который связывается с HLA-A24 и презентируется киллерным Т-клеткам человека и который применяется для иммунотерапии, которая направлена на пациентов с HLA-A24 положительной гепатоцеллюлярной карциномой или меланомой. Изобретатели провели эксперимент на животных, используя мышей линии BALB/С, которые экспрессируют мышиные K молекулы, с которыми связывается пептид, имеющий такую же структуру, как пептид, связывающийся с HLA-A24. Посредством этого они продемонстрировали эффективность иммунотерапии с применением вышеупомянутого пептида и уже представили результаты (International Application No. PCT/JР2004/016374; International Filing Date: October 28, 2004). В нормальных органах, с того момента как GPC3 экспрессируется только в плаценте и в печени перинатального периода, даже когда осуществляется иммунотерапевтическое выявление GPC3 для подавления роста опухоли, такие неблагоприятные события как аутоиммунное заболевание не встречаются. Это было подтверждено экспериментами на мышах.
На сегодняшний день, что касается глипикана-3 (GPC3), как антигена, отторгающего опухоли, настоящие изобретатели определили пептид, который презентируется в основном HLA-A24 киллерной Т-клетке (International Application No. PCT/JP03/10459; International Filing Date: August 19, 2003). Однако только с такими пептидами, презентируемыми HLA-A24 киллерным Т-клеткам, пептидные вакцины могут вводиться только 60% японцев, имеющим HLA-A24. Если пептид, презентируемый киллерной Т-клетке при помощи HLA-A2, по которому 40% японцев положительны, может быть определен, то приблизительно 85% японцев могут быть вакцинированы двумя типами пептидных вакцин. Кроме того, поскольку у европейцев западных стран частота HLA-A2 относительно высока, такой пептид, презентируемый HLA-A2, может быть использован для многих западноевропейцев. Следовательно, определение вышеупомянутого пептида, презентируемого HLA-A2 киллерным Т-клеткам, является важной целью. В частности, поскольку меланома является злокачественной опухолью, которая часто развивается у европейцев и в западных странах, и для которой иммунотерапия является эффективной, и, более того, поскольку частота гепатоцеллюлярной карциномы также быстро возросла в западных странах, предполагают, что будет большое количество пациентов, для которых сможет применяться иммунотерапия с использованием HLA-A2-связывающего GPC3 пептида.
Раскрытие изобретения
Проблемы, которые решает изобретение
Целью данного изобретения является установить пептиды, презентируемые HLA-A2 киллерным Т-клеткам, чтобы обеспечить средство проведения иммунотерапии, которая смогла бы проводиться у 40% японских пациентов, больных различными типами злокачественных опухолей, которые экспрессируют GPC3 на высоком уровне.
Средство решения проблем
in vitro
Ранее настоящие изобретатели, опираясь на кДНК-микрочиповый анализ, идентифицировали глипикан-3 (GPC3) как новый раковый эмбриональный белок, который специфически и избыточно экспрессируется в гепатоцеллюлярной карциноме человека. Более того, изобретатели выяснили, что растворимый белок GPC3 обнаруживается в сыворотке пациента с гепатоцеллюлярной карциномой и что такой GPC3 может являться новым опухолевым маркером гепатоцеллюлярной карциномы. Настоящие изобретатели обнаружили, что GPC3 экспрессируется в клеточной линии мышиной меланомы В16 и высоко экспрессируется в меланоме на высокой стадии прогрессии, как и в гепатоцеллюлярной карциноме. Таким образом, исследователи предположили, что GPC3 может стать опухолевым маркером применительно к меланоме. В результате проверочного эксперимента они выяснили, что GPC3 выступает в роли опухолевого маркера меланомы, облегчая раннюю диагностику, которая не была реализована до сих пор. На этот раз данные изобретатели стимулировали человеческие CD8-положительные киллерные Т-клетки при помощи их сокультивирования вместе с моноцитарными дендритными клетками человеческой периферической крови моноцитарного происхождения, к которым был сгенерирован GPC3 пептид человека, имеющий HLA-A2-связывающий мотив, индуцируя, благодаря этому, GPC3 пептид-специфичные киллерные Т-клетки. Присутствие или отсутствие индукции киллерных Т-клеток, специфичных для каждого GPC3 пептида, детектировалось при помощи ELISPOT метода, детектирующего γ-интерферон (ИФН-γ), вырабатываемый активированными киллерными Т-клетками, узнающими пептиды, презентируемые HLA-A2, и был обнаружен новый GPC3 пептид, который может быть кандидатом на таргетный антиген, применимый для иммунотерапии.
Другими словами, данное изобретение обеспечивает следующие характерные черты изобретения:
(1) Любой из следующих пептидов (А) и (Б):
(А) пептид, имеющий аминокислотную последовательность, как показано в одной из SEQ ID NOS: от 1 до 3; или
(Б) пептид, имеющий аминокислотную последовательность, включающую замену или добавление одной или двух аминокислот в аминокислотной последовательности, как показано в одной из SEQ ID NOS: от 1 до 3, и который способен индуцировать киллерные Т-клетки.
(2) Иммунный индуктор, применяемый для злокачественных опухолей, который включает хотя бы один тип пептида из вышеприведенного абзаца (1).
(3) Фармацевтическое средство для лечения и/или предотвращения опухолей, которое включает хотя бы один тип пептида из вышеприведенного абзаца (1).
(4) Агент, индуцирующий антиген-презентирующие клетки, имеющий высокую способность индуцировать опухолереактивные Т-клетки, который включает пептид из вышеприведенного абзаца (1).
(5) Агент, индуцирующий антиген-презентирующие клетки, имеющий высокую способность индуцировать опухолереактивные Т-клетки, включающие ген, кодирующий любой пептид из (А) или (Б):
(А) пептид, имеющий аминокислотную последовательность, как показано в одной из SEQ ID NOS: от 1 до 3; или
(Б) пептид, имеющий аминокислотную последовательность, включающую замену или добавление одной или двух аминокислот в аминокислотную последовательность, как показано в одной из SEQ ID NOS: от 1 до 3, и который способен индуцировать киллерные Т-клетки.
(6) Агент, индуцирующий опухолереактивные клетки, который включает пептид из вышеприведенного абзаца (1).
(7) Антитело к пептиду из вышеприведенного абзаца (1).
(8) Хелперная Т-клетка, киллерная Т-клетка или популяция иммуноцитов, включающая такие клетки, которая индуцируется при помощи пептида из вышеприведенного абзаца (1).
(9) Антиген-презентирующая клетка, которая презентирует комплекс, состоящий из молекулы HLA и пептида из вышеприведенного абзаца (1).
(10) Антиген-презентирующая клетка из вышестоящего пункта (9), которую индуцируют при помощи агента из вышеприведенных абзацев (4) или (5).
Лучший вариант осуществления изобретения
1) Пептиды данного изобретения и иммунный индуктор, включающий их, использующиеся при злокачественных опухолях
(
Пептидом данного изобретения является любой из следующих пептидов (А) или (Б):
(А) пептид, имеющий аминокислотную последовательность, как показано в одной из SEQ ID NOS: от 1 до 3; или
(Б) пептид, имеющий аминокислотную последовательность, включающую замену или добавление одной или двух аминокислот в аминокислотную последовательность, как показано в одной из SEQ ID NOS: от 1 до 3, и который способен индуцировать киллерные Т-клетки.
Термин «пептид, способный индуцировать киллерные Т-клетки» используется в данном описании для обозначения пептида, обладающего индуцирующей Т-клетки активностью, стимулирующей киллерные Т-клетки (цитотоксические Т-лимфоциты/CTL).
Способ получения/продукции пептида данного изобретения не имеет конкретных ограничений. Может применяться как химически синтезированный белок, так и рекомбинантный белок, полученный путем генетической рекомбинации.
Когда получают химически синтезированный пептид, пептид по изобретению могут синтезировать, например, путем такого метода химического синтеза, как Fmoc-метод (флуоренилметилоксикарбонильный метод) или tBoc-метод (трет-бутилоксикарбонильный метод). Помимо этого, пептид по данному изобретению может также быть синтезирован при помощи различных типов, доступных для приобретения синтезаторов пептидов.
Когда пептид по данному изобретению получают в форме рекомбинантного белка, получают ДНК, имеющую последовательность нуклеотидов, кодирующую вышеупомянутый пептид, ее мутант или ее гомолог, и затем ее помещают в подходящую систему экспрессии, чтобы получить пептид по данному изобретению.
В качестве вектора экспрессии предпочтительно может применяться вектор, допускающий репликацию в клетке-хозяине или допускающий встраивание в хромосому клетки-хозяина. Применяется вектор экспрессии, включающий промотор в положении, допускающем экспрессию гена, кодирующего пептид. Помимо этого, трансформант, содержащий ген, кодирующий пептид по данному изобретению, может быть получен при помощи введения вышеупомянутого вектора экспрессии в клетку-хозяина. В качестве хозяина может использоваться любая бактерия, дрожжи, животная клетка и клетка насекомого. Вектор экспрессии может быть вставлен в хозяина согласно известному методу, в зависимости от типа такого хозяина.
В данном изобретении трансформант, такой как полученный вышеупомянутым способом, культивируют и затем изобретенный пептид вырабатывается и накапливается в культуре. Впоследствии пептид по данному изобретению собирают с культуры, чтобы выделить рекомбинантный пептид.
Escherichia coli,
Когда таким трансформантом является прокариот, такой как  или такой эукариот как дрожжи, средой, применяемой для культивации таких микроорганизмов, может быть либо естественная среда, либо синтетическая среда, если только она включает источник углерода, источник азота, неорганические соли и нечто подобное тому, что может усваиваться вышеупомянутыми микроорганизмами, и если она способна эффективно поддерживать культуру трансформанта. Кроме того, такую культуру можно вести в условиях, которые обычно применяются для культивации вышеупомянутых микроорганизмов. После завершения ведения культуры изобретенный пептид можно выделить из культуры трансформанта и очистить, согласно общим методам выделения и очистки пептида.
Пептид, имеющий аминокислотную последовательность, включающую замещение или добавление одной или двух аминокислот в аминокислотную последовательность, как показано в любой из SEQ ID NOS: от 1 до 3, соответственно может быть получен или приобретен средним специалистом в данной области на основании информации, относящейся к последовательности нуклеотидов ДНК, кодирующей аминокислотную последовательность, как показано в любой из SEQ ID NOS: от 1 до 3. Другими словами, ген, кодирующий пептид, который имеет аминокислотную последовательность, включающую замещение или добавление одной или двух аминокислот в аминокислотную последовательность, как показано в любой из SEQ ID NOS: от 1 до 3, способен индуцировать киллерные Т-клетки, может быть получен при помощи любого приведенного метода, известного среднему специалисту в такой области, как химический синтез, средства генной инженерии или мутагенез. Например, сайт-направленный мутагенез, как средство генной инженерии, применяется потому, что является средством индукции специфической мутации в специфическом положении. Такой сайт-направленный мутагенез проводится при помощи метода, описанного в Молекулярном клонировании: Лабораторный справочник, 2-е доп., Лаборатория Колд Спринг Харбор, Колд Спринг Харбор, Нью-Йорк, 1989 (здесь и далее сокращенно как Молекулярное клонирование, 2-е доп.), Текущие протоколы в молекулярной биологии, Приложения 1-38, Джон Вилей и сыновья (1987-1997) 1989 (здесь и далее сокращенно как Текущие протоколы в молекулярной биологии), и т.д.
Как описано далее в примерах, вышеупомянутый пептид по данному изобретению способен индуцировать иммунитет против злокачественных опухолей. Таким образом, данное изобретение обеспечивает иммунный индуктор, используемый при злокачественных опухолях, который содержит пептид по данному изобретению.
in vitro
in vivo
Иммунный индуктор по данному изобретению, используемый при злокачественных опухолях, применяется  или  так, чтобы он мог индуцировать хелперную Т-клетку, киллерную Т-клетку или популяцию иммуноцитов, включающую такие клетки, обеспечивая, таким образом, иммунитет против злокачественных опухолей.
(2) Антитело по данному изобретению
in vitro
Данное изобретение также относится к антителу, которое узнает часть или все из вышеупомянутых пептидов по данному изобретению в качестве эпитопа (антигена), и к киллерной Т-клетке, индуцируемой при помощи -стимуляции с использованием вышеупомянутого белка или пептида. В основном, такая киллерная Т-клетка проявляет противоопухолевую активность, которая сильнее, чем активность антитела.
Изобретенное антитело может быть как поликлональным, так и моноклональным антителом. Такое антитело может быть получено обычным методом.
Например, поликлональное антитело может быть получено при помощи иммунизации млекопитающего или примата пептидом по данному изобретению, использованным в качестве антигена, затем забирают кровь у млекопитающего или примата и затем выделяют и очищают антитело от забранной крови. Например, могут быть иммунизированы такие млекопитающие или приматы как мышь, хомяк, морская свинка, курица, крыса, кролик, собака, коза, овца или бык. Такой метод иммунизации известен среднему специалисту в данной области. Например, антиген может вводиться 2 или 3 раза с интервалами от 7 до 30 дней. В качестве дозы однократно может вводиться, например, примерно от 0,05 до 2 мг антигена. Путь введения может варьировать, и может быть выбрано, как подходящее, подкожное введение, внутрикожное введение, внутрибрюшинное введение, внутривенное введение, внутримышечное введение и т.д. Кроме того, антиген можно растворять в подходящем буфере, например, подходит буфер, включающий полный адъювант Фрейнда или такой обычно используемый адъювант как оксид алюминия, и можно использовать.
Иммунизированных таким образом млекопитающих или приматов выращивают в течение определенного периода времени. Впоследствии, если титр антител возрастает, может быть проведено усиление с использованием, например, от 100 до 1000 мкг антигена. Через один или два месяца после последней иммунизации забирают кровь у иммунизированного млекопитающего или примата. Затем собранную таким образом кровь разделяют и очищают обычным методом, включающим центрифугирование, преципитацию с использованием сульфата аммония или полиэтиленгликоля, такую хроматографию как фильтрационная хроматография, ионнообменная хроматография или аффинная хроматография и т.д., чтобы получить поликлональное антитело, узнающее пептид по данному изобретению, в форме поликлональной антисыворотки.
С другой стороны, моноклональное антитело может быть получено при помощи создания гибридомы. Например, такие гибридомы могут быть получены слиянием антиген-вырабатывающей клетки и клетки миеломы. Гибридома, которая вырабатывает моноклональное антитело по данному изобретению, может быть получена нижеупомянутым методом слияния клеток.
В качестве антитело-продуцирующей клетки используют селезеночную клетку, клетку лимфоузла, В-лимфоцит или нечто подобное из иммунизированного животного. В качестве антигена используют пептид по данному изобретению. В качестве животного для иммунизации используют мышь, крысу или подобное. Антиген вводят такому животному согласно обычному методу. Например, суспензия или эмульгированная жидкость, содержащая такой адъювант, как полный адъювант Фрейнда или неполный адъювант Фрейнда, и пептид по данному изобретению, используемый как антиген, вводится животному путем внутривенного введения, подкожного введения, внутрикожного введения, внутрибрюшинного введения и др. несколько раз, чтобы иммунизировать животное. Впоследствии, такую антитело-продуцирующую клетку как селезеночная клетка, получают из иммунизированного животного и затем полученную таким образом селезеночную клетку сливают с клеткой миеломы согласно известному методу (G. Kohler et al., Nature, 256 495 (1975)), получая, таким образом, гибридому. Примеры клеточного штамма миеломы, используемого в слиянии клеток, включают штамм P3X63Ag8, штамм P3U1 и штамм Sp2/0, в случае мыши. Когда проводят такое слияние клеток, используют такой промотор слияния, как полиэтиленгликоль или вирус Сендай. Для отбора гибридомы после завершения слияния по обычному методу используют гипоксантинаминоптеринтимидиновую (ГАТ) среду. Гибридому, полученную в результате слияния клеток, клонируют при помощи метода серийных разведений. Далее, если необходимо, проводят скрининг при помощи иммуноферментного анализа с использованием пептида по данному изобретению, чтобы получить клеточный штамм, который продуцирует моноклональное антитело, специфически узнающее пептид по данному изобретению.
Чтобы получить интересующее моноклональное антитело из полученной таким образом гибридомы, гибридому культивируют обычным методом культивации клеток или методом формирования асцитов и затем интересующее моноклональное антитело может быть очищено от клеточного супернатанта или асцита. Моноклональное антитело может быть очищено от клеточного супернатанта или асцита обычным методом. Могут комбинироваться и использоваться, например, фракционирование сульфатом аммония, фильтрация в геле, ионнообменная хроматография, аффинная хроматография и другие методы.
Кроме того, фрагменты вышеупомянутого антитела включены в объем данного изобретения. Примеры таких антительных фрагментов включают F(ab')2-фрагмент и Fab'-фрагмент.
3) Хелперная Т-клетка, киллерная Т-клетка или популяция иммуноцитов, включающая такие клетки
(
in vitro
in vitro,
in vitro
in vivo
Данное изобретение относится также к хелперной Т-клетке, киллерной Т-клетке или популяции иммуноцитов, включающей такие клетки, которую индуцируют при помощи -стимуляции с использованием пептида по данному изобретению. Например, когда стимулируют лимфоциты периферической крови и опухоль-инфильтрирующие лимфоциты  используя пептид по данному изобретению, индуцируются активные опухолереактивные Т-клетки. Активированные таким образом клетки могут использоваться для адаптивной иммунотерапии. К тому же, дендритные клетки, являющиеся сильными антиген-презентирующими клетками, имеют возможность экспрессировать изобретенный пептид или  и затем антиген-экспрессирующие дендритные клетки используются для осуществления иммунной индукции.
in vitro
Хелперная Т-клетка, киллерная Т-клетка или популяция иммуноцитов, включающая такие клетки, предпочтительно могут быть индуцированы при помощи -стимуляции с использованием пептида по данному изобретению и иммуностимулятора. Примеры такого иммуностимулятора, использованного здесь, включают клеточный фактор роста и цитокин.
Полученная таким образом хелперная Т-клетка, киллерная Т-клетка или популяция иммуноцитов, включающая такие клетки, переносится в тело так, что опухоль может быть подавлена и что рак может быть предотвращен и/или излечен.
К тому же, с использованием пептида по данному изобретению может быть получена хелперная Т-клетка, киллерная Т-клетка или популяция иммуноцитов, включающая такие клетки, которая способна подавить опухоль, как описано выше. Следовательно, данное изобретение включает раствор клеточной культуры, который содержит пептид по данному изобретению. При использовании такого раствора клеточной культуры можно получить хелперную Т-клетку, киллерную Т-клетку или популяцию иммуноцитов, включающую такие клетки, способную подавить опухоль. Более того, данное изобретение также включает набор, содержащий клеточную культуру для получения хелперной Т-клетки, киллерной Т-клетки или популяции иммуноцитов, включающей такие клетки, который включает раствор вышеупомянутой клеточной культуры и емкость с клеточной культурой.
(4) Фармацевтическое средство по данному изобретению для лечения и/или предотвращения опухоли (раковая вакцина)
В силу того, что пептид по данному изобретению способен индуцировать опухолеспецифические киллерные Т-клетки, можно ожидать, что он является антигеном для лечения и/или предотвращения злокачественной опухоли. Например, такая бактерия, как BCG (Bacillus Calmette-GuErin), трансформированная рекомбинантной ДНК, полученная при помощи встраивания гена, кодирующего пептид по данному изобретению, в подходящий вектор или в такие вирусы, как вирус коровьей оспы, в геном, из которого ДНК, кодирующая пептид по данному изобретению, была встроена, может быть эффективно использована в качестве вакцины для лечения и/или предотвращения злокачественной опухоли человека. Следует отметить, что доза и метод введения таких противоопухолевых вакцин те же, что и при обычной вакцинации от оспы или при BCG-вакцинации.
Другими словами, ДНК, кодирующая пептид по данному изобретению (которая используется сама или существует в форме плазмиды ДНК, встроенной в вектор экспрессии), или рекомбинантный вирус, или рекомбинантная бактерия, включающая вышеупомянутую ДНК, могут быть введены в качестве противоопухолевой вакцины млекопитающим, включая человека, прямо или в состоянии, где они диспергированы в адъюванте. Аналогично пептид по данному изобретению может также быть введен в качестве противоопухолевой вакцины в форме, где он диспергирован в адъюванте.
Примерами адъювантов, используемых в данном изобретении, являются неполный адъювант Фрейнда, BCG, димиколат трегалозы (TDM), липополисахарид (LPS), квасцовый адъювант и адъювант оксида кремния. С точки зрения способности индуцировать антитела предпочтительно используется неполный адъювант Фрейнда (IFA).
В данном описании не указан определенный тип злокачественной опухоли. Специфические примеры злокачественных опухолей включают рак пищевода, рак груди, рак щитовидной железы, колоректальный рак, рак поджелудочной железы, злокачественную меланому (меланому), злокачественную лимфому, остеосаркому, феохромоцитому, рак головы и шеи, рак матки, рак яичника, опухоль мозга, хронический миелогенный лейкоз, острый миелогенный лейкоз, рак почки, рак простаты, рак легкого, рак желудка, рак печени, рак желчного пузыря, рак яичка, рак мочевого пузыря и саркому.
Пептид по данному изобретению играет роль Т-клеточного эпитопа и индуцирует киллерные Т-клетки, специфичные для опухолевых клеток. Таким образом, пептид по данному изобретению используется в качестве агента для предотвращения и/или лечения злокачественных опухолей у человека. В дополнение, поскольку антитело по данному изобретению способно ингибировать активность GРC3 в качестве антигена злокачественной опухоли, оно также является полезным для профилактики и/или лечения злокачественных опухолей человека. Фактическое использование пептида или антитела по данному изобретению может заключаться во введении его в качестве продукта для инъекции, напрямую или вместе с фармацевтически подходящим носителем и/или разбавителем и, при необходимости, также вместе с нижеупомянутыми вспомогательными веществами. Кроме того, пептид или антитело по данному изобретению могут также вводиться при помощи такого метода, как распыление, посредством чрезкожной абсорбции и абсорбции через слизистую оболочку. Термин «носитель» используется здесь для обозначения, например, сывороточного альбумина. Помимо этого, в качестве разбавителя может использоваться PBS, дистиллированная вода или нечто подобное.
Дозировка, в которой могут вводиться исследуемые пептид или антитело, лежит в пределах от 0,01 до 100 мг для взрослого на введение. Однако дозировка не сводится к вышеупомянутым пределам. Лекарственная форма также конкретно не ограничена. Подходящими могут являться сублимированный продукт или гранулы, полученные добавлением такого инертного наполнителя, как сахар.
Примеры вспомогательного вещества, которое можно добавлять агенту по данному изобретению, чтобы усилить активность, индуцирующую опухолереактивные Т-клетки, включают: мурамилдипептид (MDP); такие бактериальные компоненты как бактерия BCG; ISCOM, описанный в Nature, том 344, стр. 873 (1990); сапонин QS-21, описанный в J. Immunol., том 148, стр. 1438 (1992); липосома и оксид алюминия. Кроме того, такие иммуностимуляторы как лентинан, шизофиллан или Пицибанил, также могут использоваться в качестве вспомогательных веществ. Другие примеры продуктов, используемых здесь, в качестве вспомогательных веществ включают: такие цитокины для усиления роста или дифференцировки Т-клеток, как IL-2, IL-4, IL-12, IL-1, IL-6 или TNF; α-галактозилцерамид для активации NKT-клеток; CpG, который связывается с Toll-подобными рецепторами, чтобы активировать систему врожденного иммунитета, и липополисахарид (LPS).
in vitro
in vitro
in vitro
К тому же, вышеупомянутый антигенный пептид  добавляют к клеткам, взятым у пациента, или (аллогенным) клеткам другого человека, имеющего несколько таких же HLA аллелей, с последующей презентацией антигена клеток. Впоследствии клетки вводятся в кровеносный сосуд пациента так, что киллерные Т-клетки могут быть эффективно индуцированы в теле пациента. Помимо этого, данный пептид добавляют к лимфоцитам периферической крови пациента и затем полученную смесь культивируют . Таким образом, киллерные Т-клетки могут быть индуцированы , и затем они могут быть возвращены в кровеносный сосуд пациента. Такая терапия, включающая перенос клеток, уже проводилась в качестве метода лечения злокачественной опухоли, и, таким образом, она является хорошо известным методом для среднего специалиста в данной области.
in vitro
При введении пептида по данному изобретению в тело происходит индукция и активация киллерных Т-клеток, и, в результате, ожидается противоопухолевый эффект. Кроме того, когда стимулируются лимфоциты при помощи изобретенного пептида , происходит индукция активированных Т-клеток. Активированные Т-клетки инъецируют в пораженную область. Таким образом, эта техника может эффективно использоваться для адоптивной иммунотерапии.
Далее данное изобретение будет описано в нижеупомянутых примерах. Однако эти примеры не предполагают ограничения границ данного изобретения.
Примеры
[Пример 1]
(1) Выделение GPC3 пептида, проявляющего способность связываться с HLA-A2
Аминокислотная последовательность человеческого GPC3 была найдена при помощи системы BIMAS, и 4 типа последовательностей, имеющих предположительную связывающую аффинность к HLA-A2, были выбраны из 20 или более типов.
[Таблица 1]
Расположение пептида
Аминокислотная последовательность пептида
Рамки связывающей активности
GPC3 44-52
RLQPGLKWV
879
GPC3 144-152
FVGEFFTDV
828
GPC3 155-163
YILGSDINV
162
GPC3 169-177
ELFDSLFPV
1055
[Пример 2]
Индукция человеческих киллерных Т-клеток при помощи HLA-A2-связывающего GPC3 пептида
(1) Забор крови
От HLA-A2-положительных пациентов с гепатоцеллюлярной карциномой, находившихся на лечении в гастроэнтерологической хирургии Университета школы медицины Кумамото и в Западной больнице Национального ракового центра, было получено информированное согласие. Впоследствии образец крови в 30 мл был получен от индивидуальных пациентов, и затем были изолированы мононуклеарные клетки периферической крови, используя метод центрифугирования в градиенте плотности Фиколл-Конрея, согласно ранее доложенному методу (Nakatsura, T. et al., Eur. J. Immunol. 32, 826-836 (2002)).
2) Отделение CD8-положительных клеток и CD14-положительных клеток от мононуклеарных клеток периферической крови и индукция киллерных Т-клеток
(
Из изолированных мононуклеарных клеток периферической крови были индуцированы киллерные Т-клетки при помощи ранее известного метода (Monji М. et al., Clin Cancer Res 10, 6047-6057, 2004). Сначала CD8-положительные клетки и CD14-положительные клетки были отделены от мононуклеарных клеток, используя MACS. CD14-положительные клетки культивировали в присутствии GM-CSF (100 нг/мл) и IL-4 (20 нг/мл) в течение 5 дней так, что была индуцирована дифференцировка дендритных клеток. Впоследствии туда добавляли TNF-α (20 нг/мл) для созревания. На седьмой день добавляли каждый GPC3-пептид (10 мкМ), и затем проводилось сокультивирование с CD8-положительными клетками. Такая антигенная стимуляция при помощи собственных CD14-положительных производных дендритных клеток повторялась 3 или 4 раза каждую неделю, чтобы индуцировать пептидспецифичные киллерные Т-клетки. В процессе индукции половина среды заменялась на новую каждые два дня, и добавляли IL-2 в концентрации 10 ед./мл.
(3) Анализ активности GPC3-специфичных киллерных Т-клеток при помощи метода ELISPOT
Присутствие или отсутствие киллерной Т-клетки, которая прочно и специфично реагирует с GPC3 и продуцирует ИФН-γ, детектируется с использованием набора «Человеческий ИФН-γ ELISPOT» (BD). Когда киллерная Т-клетка (эффектор) реагирует с стимулирующей клеткой (мишенью), чтобы выработать ИФН-γ, каждый ИФН-γ детектируется как красная точка. В качестве клеток мишеней использовались клетки SK-Hep-1, как клетки пациента, которые являются HLA-A2-положительными и не экспрессируют GPC3, и клетки SK-Hep-1/GPC3, в которых ген GPC3 был вставлен в клетки SK-Hep-1, чтобы экспрессировать белок GPC3. Сначала плашка ELISPOT (BD Bioscience) была покрыта антителом против человеческого ИФН-γ на 18 часов. Впоследствии оно было заблокировано 10% FCS/RPMI на 2 часа. Эффекторные клетки (100 мкл/на лунку) смешивали с клетками-мишенями (100 мкл/на лунку), и смесь культивировали при 37°С в течение 22 часов. Эксперимент проводился при соотношении эффектора и мишени (отношение Э/М) 5:1. Впоследствии, детектировали ИФН-γ-положительные точки в растворе субстрата. Количество таких точек подсчитывали, используя автоматический анализ программного обеспечения MINERVA TECH. В результате активность GPC3-специфичных киллерных Т-клеток может детектироваться в случае киллерных Т-клеток, индуцированных GPC3 44-52, 114-152 и 155-163 пептидов. Однако активность GPC3-специфичных киллерных Т-клеток не детектировалась в случае киллерных Т-клеток, индуцированных GPC3 169-177 пептидом (фигуры 1 и 2). Аналитические результаты по киллерным Т-клеткам, индуцированным типичным GPC3 155-163 пептидом, показаны на фигуре 1.
4) Анализ цитотоксической активности киллерных Т-клеток при помощи теста на цитотоксичность
(
Цитотоксическую активность индуцированных киллерных Т-клеток анализировали при помощи цитотоксического теста, используя в качестве стимулированных клеток SK-Hep-1, как клетки пациента, которые являются HLA-A2-положительными и не экспрессируют GPC3, и клетки SK-Hep-1/GPC3, в которых ген GPC3 был вставлен в клетки SK-Hep-1, чтобы экспрессировать белок GPC3. Цитотоксическую активность киллерных Т-клеток оценивали при помощи цитотоксического теста с использованием Terascan VP. Сначала клетки мишени флуоресцентно метили кальцеин АМ окрашивающим раствором при 37°С в течение 30 минут. Такие клетки сокультивировали с киллерными Т-клетками на 96-луночных полуплощадных плашках Coster и затем детектировали флуоресцентно меченые клетки в динамике по времени, измеряя с помощью этого уровень цитотоксичности. Анализ проводили с использованием теста на цитотоксичность для обработки данных, при помощи программного обеспечения CalCt-961 MINERVA TECH, который использовался во флуоресцентном методе. Эксперимент проводился при отношении Э/М 20:1. В результате подтверждалась GPC3-специфичная цитотоксическая активность в киллерных Т-клетках, индуцированных GPC3 44-52, 144-152 и 155-163 пептидами. Однако GPC3-специфичная цитотоксичная активность не наблюдалась в киллерных Т-клетках, индуцированных GPC3 169-177 пептидом (фигура 2).
Промышленная применимость
Эффективность противоопухолевой иммунотерапии, выявляющей GPC3-пептид, презентируемый HLA-A24, была подтверждена экспериментами на животных с использованием мышей. Однако с использованием таких пептидов, презентируемых HLA-A24 киллерным Т-клеткам, пептидные вакцины могли вводиться только 60% японцев. На этот раз, за счет установления пептида, презентируемого киллерной Т-клетке при помощи HLA-A2, приблизительно 85% японцев могут быть вакцинированы двумя типами пептидных вакцин. Если эффективность экспериментальной терапии с использованием пептида, презентируемого HLA-A2 киллерной Т-клетке, будет продемонстрирована, весьма похоже, что такой пептид будет клинически применяться для европейцев в западных странах. Помимо этого, установив такой пептид, презентируемый HLA-A2 киллерной Т-клетке, мы не можем применять установленный пептид только для 40% японских пациентов, болеющих гепатоцеллюлярной карциномой и меланомой, но он может также применяться для многих европейцев, у которых частота HLA-A2 выше, чем у японцев.
Краткое описание чертежей
Фигура 1 отображает показательные результаты, полученные при помощи ELISPOT анализа ИФН-γ, продуцируемого киллерными Т-клетками, которые содержат специфически узнаваемые GPC3-пептиды и были активированы. Что касается киллерных Т-клеток, индуцированных стимуляцией CD8-положительных клеток периферической крови пациента с гепатоцеллюлярной карциномой дендритными клетками-производными CD14-положительных моноцитов, нагруженными GPC3 155-163 пептидом, количество точек и общая площадь таких точек в случае, где в качестве клеток-стимуляторов использовались клетки SK-Hep-1/GPC3, в которых ген GPC3 был вставлен в клетки SK-Hep-1, чтобы экспрессировать белок GPC3 (на правой стороне фигуры), были значительно больше, чем в случае, где использовались в качестве клеток-стимуляторов клетки SK-Hep-1, как клетки пациента, которые были HLA-A2-положительными и не экспрессировали GPC3 (на левой стороне фигуры 1). На основании таких результатов было установлено, что GPC3 155-163 пептид является эпитопным пептидом, допускающим индукцию GPC3-специфичных киллерных Т-клеток.
Фигура 2 отображает результаты ELISPOT анализа и теста на цитотоксичность. CD8-положительные Т-клетки были отобраны из периферической крови HLA-A2-положительных пациентов с гепатоцеллюлярной карциномой и затем отобранные клетки простимулировали дендритными клетками производными моноцитов, нагруженными каждым GPC3-пептидом. При помощи ELISPOT исследования было исследовано, реагировали ли специфически на GPC3-экспрессирующие клетки и продуцировали ли ИФН-γ полученные таким образом киллерные Т-клетки. Кроме того, при помощи теста на цитотоксичность было исследовано, убивали ли вышеупомянутые киллерные Т-клетки специфично GPC3-экспрессирующие клетки. В качестве клеток-мишеней использовались SK-Hep-1, как клетки пациента, которые являются HLA-A2-положительными и не экспрессируют GPC3, и клетки SK-Hep-1/GPC3, в которых ген GPC3 был вставлен в клетки SK-Hep-1, чтобы экспрессировать белок GPC3. В результате киллерные Т-клетки, индуцированные GPC3 44-52, 144-152 и 155-163 пептидами, GPC3-специфично узнавали клетки SK-Hep-1/GPC3 и продуцировали ИФН-γ, и они также проявляли сильную цитотоксическую активность. Киллерные Т-клетки, индуцированные GPC3 169-177 пептидом, напротив, не проявляли GPC3-специфичной Т-киллерной активности. На основании таких результатов было установлено, что GPC3 44-52, 144-152 и 155-163 пептиды являются эпитопными пептидами, допускающими индукцию GPC3-специфичных киллерных Т-клеток.