СПОСОБ ЭКСТРАКЦИИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ ИЗ ЗВЕРОБОЯ ПРОДЫРЯВЛЕННОГО (Hypericum perforatum L.)
METHOD FOR EXTRACTING BIOLOGICALLY ACTIVE SUBSTANCES FROM COMMON ST JOHN'S WORT (Hypericum perforatum L)

Изобретение относится к способу экстракции фенольных кислот, флавонидов, нафтодиантронов из зверобоя продырявленного, а именно к получению водно-спиртового извлечения, содержащего биологически активные компоненты.
Согласно фармакопейной статье [Фармакопейная статья 42-1889-95 Настойка зверобоя. - 6 с.] настойку зверобоя получают методом перколяции с использованием 40%-го спирта. При этом требуется предварительное смачивание сырья в течение 4 часов, после чего материал переносят в перколятор на 24 часа, затем медленно перколируют до получения необходимого количества настойки. Осуществление данного способа экстрагирования биологически активных веществ (БАВ) из зверобоя требует больших временных затрат, что является существенным недостатком.
Известен способ извлечения гиперицинов, флавоноидов (гиперозида, рутина, кверцетрина) и гиперфорина из зверобоя продырявленного (Hypericum perforatum L.) при повышенном давлении [Smelcerovic L.А., Spiteller М., Zuehlke S. Comparison of Methods for the Exhaustive Extraction of Hypericins, Flavonoids, and Hyperforin from Hypericum perforatum. J. Agric. Food Chem. 2006, 54, 2750-2753]. Для экстракции использовали 5 г сырья, в качестве экстрагента - метанол общего объема 128 мл, температура и давление процесса экстракции составляли 40°С и 100 бар соответственно. Извлечение осуществляли на установке Dionex ASE 200 (США). Полученный экстракт анализировали методом ВЭЖХ-МС/МС.
Недостатком способа является использование в качестве экстрагента токсичного метанола, что не позволяет применять полученное извлечение в фармацевтике без замены растворителя.
Известен способ экстракции водой нафтодиантронов из зверобоя (Hypericum perforatum L.) при повышенном давлении [Mannila М., Wai Ch. М. Pressurized water extraction of naphtodianthrones in St. John's wort (Hypericum perforatum L.). Green Chemistry, 2003, 5, 387-391]. Введение добавок спирта в состав экстрагента и увеличение давления до 100 бар позволяет повысить степень извлечения нафтодиантронов из растительного материала.
Недостатком данного способа извлечения, согласно выводам авторов, является низкая эффективность извлечения по сравнению с экстракцией метанолом при воздействии УЗ-волн. Более того, отсутствуют данные, подтверждающие возможность извлечения данным способом таких фармакологически активных соединений, как флавоноиды и нафтодиантроны.
Известен способ экстракции биологически активных компонентов из растительных образцов субкритической водой (температура 100-374°С и давление до 218 атм), в частности, кверцетина из горца перечного и спорыша (лат. Polygonum aviculare) (А.В. Лекарь, С.Н. Борисенко, Е.В. Максименко, Р.Н. Борисенко, Е.В. Ветрова, Н.И. Борисенко, В.И. Минкин. Извлечение биофлавоноида - кверцетина из растительного сырья в среде субкритической воды. Сверкритические Флюиды: Теория и Практика. Том 3, №2, 2008, с. 33-36) и дигидрокверцетина из лиственницы древесной (О.В. Филонова, С.Н. Борисенко, Е.В. Максименко, Р.Н. Борисенко, А.В. Лекарь, Н.И. Борисенко, В.И. Минкин. Разработка методики экстракции дигидрокверцетина из древесины лиственницы в среде субкритической воды. Сверкритические Флюиды: Теория и Практика. Том 3. №2. 2008. С. 37-42).
Этот способ экстракции является экологически чистым вариантом извлечения фенольных соединений из лекарственного растительного сырья, однако нет данных о возможности извлечения фенольных кислот, флавоноидов (кроме кверцетина, дигидрокверцетина), флороглюцинолов (гиперфорина, адгиперфорина), которые являются активными компонентами зверобоя продырявленного.
Известен способ получения экстракта зверобоя путем экстрагирования травы с последующей сушкой целевого продукта (патент RU 2067452, Мухамедзянов P.M., Кулавский В.А., Пушкарев В.А., Хасанов Р.А.  «Способ получения экстракта зверобоя»). Экстракцию проводят последовательно ацетоном, 70-30%-ным этанолом, затем извлечения упаривают и перед сушкой объединяют.
К недостаткам способа относится его многостадийность, большое количество используемых органических растворителей, т.е. он является затратным и по количеству используемых реактивов, и по времени его осуществления.
Наиболее близким аналогом предлагаемого изобретения является способ получения средства, обладающего антидепрессантной активностью, включающий экстракцию травы зверобоя продырявленного (Hypericum perforatum L.). В качестве экстрагента используют этиловый спирт в диапазоне концентраций 60…90% и при соотношении сырье-экстрагент в интервале значений 1:11÷1:13. (Патент RU 2327481, Куркин В.А., Правдивцева О.Е., Дубищев А.В., Кадацкая Д.В. «Способ получения средства, обладающего антидепрессантной активностью»).
К недостаткам способа относится его многостадийность, большое количество используемых органических растворителей, а также большие затраты времени при достижении результата.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является уменьшение времени получения экстракта, богатого биологически активными веществами, и упрощение способа.
Технический результат достигается тем, что для получения экстракта зверобоя извлечение биологически активных веществ проводят этиловым спиртом при температуре 60-120°С и давлении 80-100 атм. в течение 30-50 минут.
Отличительными признаками заявляемого способа от наиболее близкого аналога, взятого за прототип, являются условия экстрагирования, а именно:
- температурный интервал, который составляет 60-120°С,
- давление 80-100 атм,
- время экстрагирования 30-50 минут.
На фиг. 1 изображена схема установки для проведения динамического экстрагирования БАВ из зверобоя продырявленного; на фиг. 2 размещены зависимости содержаний извлекаемых БАВ (мг/г сухого сырья (СС)) от температуры процесса извлечения (°С) из зверобоя продырявленного. При этом, кривая с квадратами относится к извлеченному рутину, кривая с ромбами - к извлеченному кверцетину, кривая с треугольниками - к извлеченной 5-О-кофеилхинной кислоте; на фигуре 3а) представлена зависимость количества извлекаемого рутина (мкг) от времени экстрагирования (мин); на фиг. 3б) представлена зависимость количества извлекаемого кверцетина (мкг) от времени экстрагирования (мин).
Для осуществления способа экстракции биологически активных веществ из растительного сырья используют установку, собранную из серийно выпускаемых узлов (1 - емкость с экстрагентом; 2 - насос для подачи экстрагента; 3 - печь-термостат; 4 - капилляр для предварительного нагрева экстрагента; 5 - ячейка для экстрагирования; 6 - растительное сырье; 7 - капилляр для охлаждения экстракта; 8 - ограничитель противодавления; 9 - емкость для сбора экстракта) (фиг. 1).
Экспериментальные исследования показали, что для одновременного динамического экстрагирования адгиперфорина, I3, II8-биапигенина, гиперозида, гиперфорина, изокверцетрина, кверцетина, кверцетрина, 5-О-кофеилхинной кислоты, протокатеховой кислоты, рутина, (-)-эпикатехина при повышенных давлении и температуре предпочтительнее использовать в качестве экстрагента этиловый спирт или 70%-ный этиловый спирт в воде (v/v) при температуре 60-120°С (фиг. 2) и давлении 80-100 атм.
Эффективность данного способа экстракции веществ подтверждена методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с УФ- и масс-спектрометрическим детектированием. Содержания фенольных компонентов в полученных экстрактах определяли на основе градуировочных кривых веществ с использованием стандартных образцов и относительных коэффициентов чувствительности спектрофотометрического детектора для различных соединений [Brolis М., Gabetta В., Fuzzati N., Расе R., Panzeri F., Peterlongo F. // J. Chromatogr. A. 1998. V. 825. № 1. P. 9-16].
Продувка экстрагента азотом перед извлечением позволяет избавиться от растворенного в нем кислорода, который в дальнейшем может привести к окислению БАВ. [Maisenbacher P., Kovar K.А. Adhyperforin: A Homologue of Hyperforin from Hypericum perforatum. Planta Med. 1992 Jun; 58(3):291-3; Цыб A.Ф., Бозаджиев Л.Л., Гончарова А.Я., Розиев Р.А., Клепов А.Н., Скворцов B.Г., Подгородниченко В.К., Григорьев А.Н., Хомиченок В.В., Жмаева С.В. Способ получения флавоноидов (патент РФ №2201750)].
Пример получения экстракта зверобоя продырявленного
Пример. Навеску сырья зверобоя 6 массой 0,2000 г помещают в ячейку-экстрактор 5, которую устанавливают в печь-термостат 3. Предварительно емкость с экстрагентом 1 продувают азотом для удаления растворенного кислорода из экстрагента. С помощью насоса 2 заполняют капилляр 4 для предварительного нагрева экстрагента, ячейку 5 для экстрагирования, капилляр 7 для охлаждения экстракта этанолом, останавливают поток экстрагента и включают нагрев термостата 3. После достижения термостатом 3 заданной температуры в 120°С выдерживают 10 минут при постоянной температуре и остановленном потоке экстрагента, после чего начинают подавать экстрагент из емкости 1 для экстрагента со скоростью 1 мл/мин. Величина давления составляет 80 атм, которая обеспечивается ограничителем противодавления 8. На выходе собирают 30 мл экстракта в емкость 9 для сбора экстракта, фильтруют через вату, центрифугируют и фильтруют через полипропиленовый фильтр Whatman с диаметром пор 0,20 мкм.
Для получения экстракта зверобоя продырявленного (Hypericum perforatum L.) не требуется дорогостоящего оборудования, затраты времени сокращаются до 50 мин (фиг. 3а), 3б), что значительно быстрее, т.к. у прототипа этот параметр составляет 5 суток. При этом полученный нами экстракт содержит адгиперфорин, I3, II8-биапигенин, гиперфорин, которые обладают антидепрессантными свойствами (L. Cervo, M. Rozio С.В. Ekalle-Soppo. Role of hyperforin in the antidepressant-like activity of Hypericum perforatum Extracts. Psychopharmacology. 2002. - №164. - P. 423-428; R.S. Obach. Inhibition of Human Cytochrome P450 Enzymes by Constituents of St. John's Wort, an Herbal Preparation Used in the Treatment of Depression. The Journal Of Pharmacology And Experimental Therapeutics. - 2011. - V. 294 - №1. - P. 88-95).
Предлагаемый способ позволяет в течение 30-50 мин получить экстракт с выходом флавоноидов 134% относительно способа по Фармакопее (Государственная Фармакопея СССР. - Одиннадцатое издание. - Вып.2. - М.: Медицина, 1990. С. 323-325), в то время как это значение для прототипа составляет 96%. Как видно, эффективность предлагаемого способа не уступает прототипу и даже превосходит ее. Многостадийность извлечения БАВ по способу прототипа требует больших временных затрат и большого расхода экстрагентов. Сравнительные данные способов экстрагирования приведены в таблице 2.
Для получения 50 мл экстракта зверобоя в предлагаемом способе необходимо затратить 50 мл растворителя, а в способе прототипа не менее 77 мл.
Таким образом, можно сделать вывод о том, что предлагаемый способ является новым, промышленно применимым, а совокупность существенных признаков позволяет достичь технического результата, т.е. он обладает существенными отличиями.