ПРОТИВОРАКОВАЯ ТЕРАПИЯ, НАПРАВЛЕННАЯ ПРОТИВ РАКОВЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК И ФОРМ РАКА, УСТОЙЧИВЫХ К ЛЕЧЕНИЮ ЛЕКАРСТВЕННЫМИ ПРЕПАРАТАМИ
ANTI-CANCER THERAPY, DIRECTED AGAINST CANCER STEM CELLS AND FORMS OF CANCER, RESISTANT TO TREATMENT BY MEDICATIONS

ПЕРЕКРЕСТНЫЕ ССЫЛКИ НА АНАЛОГИЧНЫЕ ЗАЯВКИ
[0001] Настоящая заявка включает в себя притязания на преимущество Предварительной заявки №61/241180, поданной в США 10 сентября 2009 года, полный текст которой приводится ниже.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
[0002] Настоящее изобретение описывает способы и лекарственные препараты для предотвращения и лечения рака и снижения числа или полного уничтожения раковых клеток; точнее, настоящее изобретение описывает профилактически или терапевтически эффективное количество или режим применения метаарсенита натрия для снижения числа или полного уничтожения раковых стволовых клеток и раковых клеток, устойчивых к лечению лекарственными препаратами.
ТЕХНИЧЕСКАЯ ОСНОВА ИЗОБРЕТЕНИЯ
n
[0003] Человеческие теломеры - это не кодирующие генов последовательности ДНК на концах хромосом, которые состоят из повторяющихся шестинуклеотидных (гексануклеотидных) последовательностей (TTAGGG). При каждом клеточном делении часть теломерной ДНК (30-100 пар оснований) теряется из-за проблемы репликации концов нуклеотидных последовательностей (Blackburn D.H., Nature, V.408, pp.53-56, 2000, и Phatak P. et al., Br. J. Pharmacol., V.152, pp.1003-1011, 2007). Теломеры помогают поддерживать целостность хромосом и предотвращают репликацию дефектных генов. Поскольку в начале жизни хромосомы содержат ограниченное количество теломерной ДНК, клетка может претерпеть лишь ограниченное число делений перед тем, как длина теломер уменьшится до критически низкого значения. Когда в нормальных клетках длина теломер уменьшается до критически низкого значения, они выходят из нормального клеточного цикла и переходят в состояние репликативной старости (Phatak P. et al., Br. J. Pharmacol., V.152, pp.1003-1011, 2007, и Holt S.E. et al., Nature Biotechnol., V.14, pp.1734-1741, 1996), однако на ранних стадиях онкогенеза, при превращении нормальных клеток в злокачественные, длина теломер уменьшается, но затем поддерживается на низком, но стабильном уровне в преобладающем большинстве случаев за счет реактивации фермента теломеразы (Blackburn D.H., Nature, V.408, pp.53-56, 2000; Phatak P. etal., Br. J. Pharmacol., V.152, pp.1003-1011, 2007, и Holt S.E. et al., Nature Biotechnol., V.14, pp.1734-1741, 1996).
Теломераза - это рибонуклеопротеин с активностью обратной транскриптазы, играющий роль матрицы при добавлении новых теломерных повторов и включающий в себя каталитическую субъединицу hTERT (сокр. - human telomerase reverse transcriptase / человеческую теломеразную обратную транскриптазу). Теломераза позволяет раковым клеткам преодолеть фундаментальное ограничение возможности бесконечного деления и делает эти клетки бессмертными. Вследствие этого теломераза и теломеры стали рассматриваться в качестве перспективных целей для способов противоракового лечения (Phatak P. et al.; Br. J. Pharmacol., V.152, pp.1003-1011, 2007, и Chumsri S. et a/., Curr. Opin. Mol. Ther, V.10, pp.323-333, 2008).
[0004] Серьезной проблемой при разработке эффективных и позволяющих достичь окончательного излечения способов лечения рака является то, что раковые образования гетерогенны: они содержат как зрелые клетки, так и клетки, отвечающие за самовозобновление клеточной популяции - так называемые стволовые клетки. Используемые в настоящее время противораковые средства направлены в основном на уничтожение популяции зрелых клеток, однако они не способны полностью уничтожить раковые стволовые клетки. Вследствие этого раковые заболевания часто дают рецидивы, и после этого опухоли состоят из более агрессивных раковых клеток, сходных со стволовыми клетками и устойчивых к лекарственному лечению (Chumsri S. et al., Curr. Opin. Mol. Ther., V.10, pp.323-333, 2008). Следовательно, существует потребность в новых терапевтических средствах и/или режимах лечения, которые были бы способны ингибировать активность теломеразы и/или воздействовать на теломеры для снижения числа или полного уничтожения как зрелых раковых клеток, так и раковых клеток, сходных со стволовыми клетками, включая раковые стволовые клетки, устойчивые к лекарственному лечению, и зрелые раковые клетки.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
2
[0005] В одном из аспектов настоящего изобретения предлагается способ лечения стойких к лечению форм рака у пациента. Лечение осуществляется с помощью введения пациенту терапевтически эффективного количества метаарсенита натрия (NaAsO или KML001), в форме монотерапии или в сочетании с другим противораковым средством или средствами. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения метаарсенит натрия вводится в единичной дозировке от 0,1 до 20 мг один или несколько раз в день. В некоторых вариантах его осуществления после лечения метаарсенитом натрия пациент может наблюдаться для выявления присутствия популяции стволовых клеток. В некоторых других вариантах его осуществления после лечения метаарсенитом натрия пациент может наблюдаться таким образом в течение срока до четырех лет или более. В некоторых его вариантах осуществления устойчивым к лечению раковым заболеванием является рак предстательной железы, рак легких, лимфома или лейкемия.
[0006] В другом аспекте настоящего изобретения предлагается способ лечения ракового пациента с повышенным сывороточным уровнем IL-6, включающий в себя введение пациенту терапевтически эффективного количества метаарсенита натрия и отслеживание сывороточного уровня IL-6 у пациента после его последнего лечения метаарсенитом натрия. Отслеживание уровня IL-6 у пациента может осуществляться периодически в течение срока до четырех лет и более после завершения его лечения метаарсенитом натрия.
[0007] В другом аспекте настоящего изобретения предлагается способ повышения эффективности противоракового средства у пациента, страдающего формой рака, устойчивой к лекарственному лечению, включающий в себя введение пациенту терапевтически эффективного количества метаарсенита натрия и противоракового средства, к лечению которым у соответствующей формы рака было показано наличие устойчивости.
[0008] В еще одном аспекте настоящего изобретения предлагается способ повышения чувствительности стойких к лечению раковых клеток у пациента к противораковому средству, к которому ранее раковые клетки были устойчивы, включающий в себя введение пациенту терапевтически эффективного количества метаарсенита натрия и соответствующего противоракового средства. Это противораковое средство может вводиться до начала режима лечения метаарсенитом натрия, во время его осуществления или после окончания режима лечения метаарсенитом натрия.
[0009] В еще одном аспекте настоящего изобретения предлагается способ снижения вероятности или полного предотвращения возникновения рецидивов ракового заболевания у пациента. Этот способ включает в себя введение пациенту терапевтически эффективного количества метаарсенита натрия после завершения режима лечения одним или несколькими противораковыми средствами. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения у пациента отслеживается присутствие популяции раковых стволовых клеток после лечения метаарсенитом натрия. Это отслеживание может осуществляться периодически в течение срока длительностью до четырех лет и более.
[0010] Независимо от конкретной теории или механизма, уменьшение или полное уничтожение популяции раковых стволовых клеток приводит к уменьшению или полному уничтожению популяции раковых клеток, производимых популяцией раковых стволовых клеток, и, таким образом, замедляет или полностью останавливает рост опухоли, уменьшает общий размер опухоли и замедляет или полностью подавляет образование опухоли и/или образование метастазов. Другими словами, уменьшение или полное уничтожение популяции раковых стволовых клеток подавляет образование, рост и повторное образование опухоли и/или метастазов за счет раковых клеток.
[0011] В соответствии с одним из аспектов настоящего изобретения, оно описывает способ лечения рака, включающий в себя введение индивидууму терапевтически эффективного количества метаарсенита натрия, достаточного для уменьшения или полного уничтожения популяции раковых стволовых клеток, устойчивых к лекарственному лечению. В другом варианте осуществления, связанном с этим аспектом изобретения, популяция раковых стволовых клеток является устойчивой к паклитакселу. В еще одном близком варианте осуществления популяция раковых стволовых клеток является устойчивой к доцетакселу.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ
[0012] На фиг.1А показано выявление боковой популяции (SP) в клетках DU145wt и в клетках DU145/Doc50, устойчивых к доцетакселу, с помощью красителя Hoechst 33342. На фиг.1В показана экспрессия Pgp на поверхности клеток у клонов дикого типа и у устойчивых клонов, определенная с помощью проточной цитометрии. Белым обозначены графики для клеток, окрашенных РЕ (фикоэритином) на контрольный изотип, а серым - графики для клеток, положительно окрашивающихся на Рgр. На фиг.1C показаны гистограммы для окрашивания на CD44 (серые графики) в сравнении с окрашиванием на контрольный изотип (белые графики) для клеток линии DU145wt и клеток, устойчивых к таксанам. На фиг.1D показаны графики роста, позволяющие сравнить клетки линии DU145wt и клетки, устойчивые к паклитакселу и к доцетакселу, после их обработки доцетакселом в МТТ-тесте. На фиг.1Е показаны графики роста, позволяющие сравнить клетки линии DU145wt и клетки, устойчивые к паклитакселу и к доцетакселу, после их обработки KML001 в МТТ-тесте.
[0013] На фиг.2А показана боковая популяция клеток из линии DU145wt, окрашенной красителем DCV. На фиг.2В показана боковая популяция клеток из линии DU145wt, обработанной фумитреморгином С (FTC), ингибитором BCRP/ABCG2. На фиг.2С показана боковая популяция клеток из линии DU145wt, обработанной верапамилом, ингибитором Pgp/ABCB1.
100
[0014] на фиг.3А показаны клетки линии DU145wt, обработанной обычной (контрольной) средой. На фиг.3В показаны клетки линии DU145wt, предварительно обработанной средой, содержащей KML001 в концентрации, равной IC (13 мкМ), в течение 72 ч.
[0015] На фиг.4А показаны результаты пролиферационного МТТ-теста для клеток линии DU145/Pac200, обработанной KML001. На фиг.4В показаны результаты пролиферационного МТТ-теста для клеток линии DU145/Pac200, обработанной GRN163L.
100
100
[0016] На фиг.5А показана боковая популяция клеток линии DU145/Pac200, обработанной только красителем DCV. На фиг.5В показана боковая популяция клеток линии DU145/Pac200, обработанной красителем DCV и фумитреморгином С (FTC). На фиг.5С показана боковая популяция клеток линии DU145/Pac200, обработанной красителем DCV и верапамилом. На фиг.5D показаны результаты теста на боковую популяцию для клеток линии DU145/Pac200, обработанной KML001 в концентрации, равной IC. На фиг.5Е показаны результаты теста на боковую популяцию для клеток линии DU145/Pac200, обработанной GRN163L в концентрации, равной IC.
[0017] На фиг.6А и фиг.6В показан рост клеток рака предстательной железы (DU145 и DU145/Pac200, соответственно) в тесте на клоногенные клетки, выраженный как среднее число колоний, образованных необработанными клеточными линиями и клеточными линиями, обработанными KML001.
[0018] На фиг.7 показаны графики роста, полученные в стандартном МТТ-тесте с пятидневной обработкой KML001. Они позволяют сравнить данные для фракции нерассортированных клеток, фракции SP- и фракции SP+, полученных из клеточной линии рака предстательной железы DU145/Pac200.
50
100
[0019] На фиг.8А и фиг.8В показана экспрессия гена hTERT, измеренная с помощью количественной RT-PCR. А. Уровень транскрипта мРНК теломеразы в отсортированных фракциях SP- и SP+ клеточной линии DU145/Pac200 характеризуется сходными уровнями экспрессии. В. Снижение уровня экспрессии hTERT после 72 ч обработки KML001 в концентрациях, равных IC и IC, определенное с помощью стандартного МТТ-теста.
ДЕТАЛЬНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0020] Настоящее изобретение описывает способы предотвращения, лечения и/контроля развития рака у млекопитающих, в особенности у людей. Эти способы включают в себя введение нуждающемуся в этом индивидууму терапевтически эффективного количества метаарсенита натрия, снижающего или полностью уничтожающего популяцию раковых стволовых клеток, а также зрелых раковых клеток, устойчивых к лекарственному лечению, и раковых стволовых клеток, устойчивых к лекарственному лечению.
[0021] Это изобретение частично основано на результатах экспериментов, в соответствии с которыми метаарсенит натрия (KML001), лекарственный препарат, проходящий клинические испытания фазы I/II при лечении рака предстательной железы, может воздействовать как на каталитическую субъединицу теломеразы, так и на теломеры, и подавляет рост популяций зрелых клеток и стволовых клеток клеточных линий рака предстательной железы, не подвергавшихся химиотерапевтическому лечению и устойчивых к химиотерапевтическому лечению.
ОПРЕДЕЛЕНИЯ
[0022] При его использовании в этой заявке, термином "раковая(ые) стволовая(ые) клетка(и)" обозначается клетка, которая может быть клеткой-предшественником высокопролиферативных раковых клеток. Раковая стволовая клетка обладает способностью воссоздавать опухоль, подтвержденной ее способностью образовывать опухоли у млекопитающих с ослабленным иммунитетом, например, у мышей, и обычно образовывать опухоли при последующих последовательных трансплантациях у млекопитающих с ослабленным иммунитетом, например, у мышей. Раковые стволовые клетки также обычно медленно растут по сравнению с основной массой опухоли; это означает, что раковые стволовые клетки являются, как правило, латентными. В некоторых (но не во всех) случаях раковые стволовые клетки могут составлять приблизительно от 0,1% до 20% от всей опухоли.
[0023] При его использовании в этой заявке, термином "противораковое средство" обозначается любой способ лечения рака, включая лекарственное лечение, иммунотерапию, таргетную терапию, гормональную терапию, химиотерапию, в том числе с использованием алкилирующих соединений, антиметаболитов, антрациклинов, растительных алкалоидов, ингибиторов топоизомеразы, ингибиторов киназы и других противоопухолевых средств, хирургию и радиационную терапию.
[0024] При его использовании в этой заявке, термином "терапевтически эффективное количество" обозначается количество метаарсенита натрия, достаточное для предотвращения развития, возникновения или рецидива рака или раковых стволовых клеток или одного или нескольких симптомов рака, для улучшения или усиления профилактического эффекта или эффектов другого лечения, снижения степени тяжести и длительности ракового заболевания, ослабления одного или нескольких симптомов ракового заболевания, предотвращения его перехода в более продвинутую стадию, для регрессии рака и/или для улучшения или усиления терапевтического эффекта или эффектов другого лечения. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения терапевтически эффективным количеством метаарсенита натрия является его количество, эффективное после его введения для достижения одного, двух, трех или более из указанных далее результатов: (1) уменьшения или полного уничтожения популяции раковых стволовых клеток; (2) уменьшения или полного уничтожения популяции раковых клеток; (3) замедления роста опухоли или новообразования; (4) нарушения формирования опухоли; (5) полного уничтожения, удаления или контроля развития первичного, местно-распространенного и/или метастатического рака; (6) снижения смертности; (7) повышения длительности или частоты выживаемости без заболевания, рецидивов или прогрессии и/или общей выживаемости; (8) повышения частоты отклика на лечение, длительности отклика или числа пациентов, у которых удается достичь отклика на лечение или ремиссии; (9) поддержания размера опухоли и предотвращения ее увеличения или поддержания ее увеличения на уровне менее 10% или менее 5% или менее 4% или менее 2%; (10) повышения числа пациентов, у которых удается достичь ремиссии; (11) увеличение периода или продолжительности ремиссии;
(12) снижения частоты рецидивирования ракового заболевания; (13) увеличения длительности промежутков времени между рецидивами ракового заболевания; (14) ослабления связанных с раком симптомов и/или улучшения качества жизни, и (15) снижения устойчивости раковых клеток к лекарственным препаратам.
[0025] При его использовании в этой заявке, термином "терапевтически эффективный режим лечения" обозначается режим, определяющий дозировку, время, частоту и длительность применения метаарсенита натрия для лечения и/или контроля ракового заболевания или его симптомов. В конкретном варианте осуществления режим лечения позволяет достигнуть одного или нескольких из следующих результатов: (1) уменьшения или полного уничтожения популяции раковых стволовых клеток, включая раковые стволовые клетки, устойчивые к лекарственному лечению; (2) уменьшения или полного уничтожения популяции раковых клеток; (3) замедления роста опухоли или новообразования; (4) нарушения формирования опухоли; (5) полного уничтожения, удаления или контроля развития первичного, местно-распространенного и/или метастатического рака; (6) снижения смертности; (7) повышения длительности или частоты выживаемости без заболевания, рецидивов или прогрессии и/или общей выживаемости; (8) повышения частоты отклика на лечение, длительности отклика или числа пациентов, у которых удается достичь отклика на лечение или ремиссии; (9) снижения частоты госпитализации; (10) снижения длительности госпитализации; (11) поддержания размера опухоли и предотвращения ее увеличения или поддержания ее увеличения на уровне менее 10%, предпочтительно менее 5%, предпочтительно менее 4%, предпочтительно менее 2%; (12) увеличения числа пациентов, у которых удается достичь ремиссии; (13) увеличения чувствительности раковых клеток пациента, устойчивых к лекарственному лечению, в том числе раковых стволовых клеток, к лекарственному препарату или препаратам, к лечению которыми они устойчивы.
[0026] При их использовании в этой заявке, термины "индивидуум" («субьект») и "пациент" являются синонимами. При его использовании в этой заявке, термином "индивидуум" могут обозначаться животные, преимущественно млекопитающие, в частности, не относящиеся к приматам (например, коровы, свиньи, лошади, кошки, собаки, крысы и т.д.) и приматы (например, обезьяны и люди), наиболее предпочтительно - люди. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения индивидуумом может являться млекопитающее, не являющееся человеком, например, сельскохозяйственное животное (в частности, лошадь, свинья или корова) или домашнее животное (в частности, собака или кошка). В другом варианте осуществления индивидуумом является человек пожилого возраста. В другом варианте осуществления индивидуумом является взрослый человек. В другом варианте осуществления индивидуумом является ребенок (человек). В еще одном его воплощении индивидуумом является младенец (человек).
[0027] При его использовании в этой заявке, термином "ремиссия" обозначается состояние здоровья индивидуума, характеризующееся отсутствием обнаружимого ракового заболевания и возможностью возобновления активности этого ракового заболевания в будущем.
[0028] Раковые стволовые клетки образуют уникальную субпопуляцию (часто приблизительно 0,1-10%, но иногда до 0,1-20% и более) в составе опухоли, которая, относительно остающихся ~90% опухоли (т.е. ее основной массы), является более туморогенной, относительно более медленно растущей или латентной и часто относительно более устойчивой к химиотерапевтическим средствам, чем основная масса опухоли. С учетом того, что стандартные способы и режимы лечения были, в значительной степени, разработаны для уничтожения быстро делящихся клеток (т.е. раковых клеток, составляющих основную массу опухоли), раковые стволовые клетки, которые зачастую растут более медленно, могут быть относительно более устойчивы, чем быстро растущая основная масса опухоли, к стандартным способам и режимам лечения. Раковые стволовые клетки могут обладать и другими особенностями, делающими их относительно более устойчивыми к химиотерапевтическим средствам, например, множественной лекарственной устойчивостью и антиапоптотическими механизмами. Вышеупомянутые особенности являются ключевой причиной неспособности стандартных онкологических режимов лечения обеспечить долгосрочный благоприятный эффект у большинства пациентов с продвинутыми стадиями раковых заболеваний, ибо они неспособны адекватно воздействовать на раковые стволовые клетки и уничтожать их. В некоторых случаях раковая стволовая клетка является клеткой-основательницей опухоли (т.е. является клеткой-предшественницей всех раковых клеток, составляющих основную массу опухоли).
[0029] Раковые стволовые клетки были выявлены для большого числа типов раковых заболеваний. Например, Bonnet et al., используя проточную цитометрию, смогли выделить лейкозные клетки, обладающие специфическим фенотипом, CD34+CD38-, и затем показать, что именно эти клетки (составляющие менее 1% от всех лейкозных клеток), а не остающиеся 99+% лейкозных клеток, способны вызывать лейкоз, подобный исходному, при их введении иммунодефицитным мышам (см., например, "Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell"/"Человеческий острый миелолейкоз организован в форме иерархии, в основании которой лежит примитивная гематопоэтическая клетка"), Nat. Med., V.3, pp.730-737, 1997). Это означает, что эти раковые стволовые клетки, доля которых составляет менее 1 на 10000 лейкозных клеток, даже при их столь низком содержании в популяции, способны инициировать и серийно передавать человеческий лейкоз мышам с тяжелым комбинированным иммунодефицитом и диабетом, не сопровождающимся ожирением (NOD/SCID), и этот лейкоз характеризуется тем же гистологическим фенотипом, как и исходная опухоль.
[0030] Сох et al. выявили небольшие субфракции клеток человеческого острого лимфобластного лейкоза (ALL), обладающие фенотипами CD34+/CD10- и CD34+/CD19-, и смогли привить опухоли ALL мышам с нарушенным иммунитетом - т.е. эти клетки являлись раковыми стволовыми клетками. Напротив, при использовании основной массы клеток ALL прививания опухолей у мышей не наблюдалось, несмотря на то, что в некоторых случаях им вводили в 10 раз большее количество клеток (см. Сох et al., "Characterization of acute lymphoblastic leukemia progenitor cells/"Определение характеристик клеток-предшественниц острого лимфобластного лейкоза", Blood, V.104(19), рр / 2919-2925, 2004).
[0031] Было установлено, что множественная миелома содержит небольшие субпопуляции клеток с фенотипом CD138-, которые, относительно большой основной популяции миеломных клеток с фенотипом CD138+, обладали более высоким клоногенным и туморогенным потенциалом (см. Matsui et al., "Characterization of clonogenic multiple myeloma cells"/"Определение характеристик кпоногенных клеток множественной миеломы", Blood, V.103(6), р.2332). Авторы этой работы пришли к выводу, что субпопуляция CD138-клеток множественной миеломы является популяцией раковых стволовых клеток.
[0032] Kondo et al. выделили небольшую популяцию клеток из глиомной клеточной линии С6, которые были идентифицированы как раковые стволовые клетки благодаря их способности прививать и поддерживать глиомы у мышей с нарушенным иммунитетом (см. Kondo et al., "Persistence of a small population of cancer stem-like cells in the С6 glioma cell line", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, V.101, pp.781-786, 2004). В этом исследовании Kondo et al. установили, что раковые клеточные линии содержат популяцию раковых стволовых клеток, придающую этим линиям способность к прививанию опухолей у иммунодефицитных мышей.
[0033] Было показано, что раковые образования молочных желез содержат небольшую популяцию клеток, обладающих характеристиками стволовых клеток, несущих поверхностные маркеры CD44+ CD24low (см. AI-Hajj et al., "Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells"/"Предположительная идентификация туморогенных клеток рака молочных желез", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, V.100, pp.3983-3988, 2003). Всего 200 подобных клеток, составляющих 1-10% от общей популяции опухолевых клеток, способны вызывать развитие опухолей у мышей NOD/SCID. Напротив, имплантация 20 000 клеток, не обладающих таким фенотипом (т.е. относящихся к основной массе опухоли) была неспособна приводить к повторному росту опухоли.
[0034] Было установлено, что субпопуляция клеток, полученных из опухолей предстательной железы человека, способна к самовозобновлению и к восстановлению фенотипа той опухоли предстательной железы, из которой они были получены, т.е. они являются популяцией стволовых клеток рака предстательной железы (см. Collins et al., "Prospective Identification of Tumorigenic Prostate Cancer Stem Cells"/"Предположительная идентификация туморогенных стволовых клеток рака предстательной железы", Cancer Res., V.65(23), pp.10946-10951, 2005).
[0035] Fang et al. изолировали из меланомы субпопуляцию клеток, обладающих свойствами раковых стволовых клеток. В частности, эта субпопуляция клеток способна дифференцироваться и самовозобновляться. В культуре клетки из этой субпопуляции росли в виде сфер, тогда как клетки из более дифференцированной фракции из меланомных очагов демонстрировали более высокую способность к распластыванию. Более того, субпопуляция, содержащая сфероподобные клетки, обладала более высокой туморогенностью, чем распластывающиеся клетки, при ее прививании мышам (см. Fang et al., "A Tumorigenic Subpopulation with Stem Cell Properties in Melanomas"/"Туморогенная субпопуляция в меланомах, обладающая свойствами стволовых клеток", Cancer Res., V.65(20), pp.9328-9337, 2005).
[0036] Singh et al. идентифицировали стволовые клетки опухолей мозга. После их выделения и трансплантации безтимусным мышам раковые стволовые клетки с фенотипом CD133+, в отличие от клеток основной массы опухоли с фенотипом CD133-, образуют опухоли, которые могут быть последовательно трансплантированы (см. Singh et al., "Identification of human brain tumor initiating cells"/"Идентификация клеток, инициирующих опухоли головного мозга человека", Nature, V.432, pp.396-401, 2004; Singh et al., "Cancer stem cells in nervous system tumors"/"Раковые стволовые клетки в опухолях нервной системы", Oncogene, V.23, pp.7267-7273, 2004; Singh et al., "Identification of a cancer stem cell in human brain tumors"/"Идентификация раковых стволовых клеток в опухолях головного мозга человека", Cancer Res., V.63 pp.5821-5828, 2003).
[0037] Поскольку стандартные способы лечения рака направлены на уничтожение быстро делящихся клеток (т.е. клеток, образующих основную массу опухоли), эти способы лечения, как предполагается, являются относительно неэффективными против раковых стволовых клеток. В действительности было показано, что раковые стволовые клетки, включая лейкемические стволовые клетки, действительно являются относительно устойчивыми к стандартным химиотерапевтическим способам лечения (например, с использованием Ara-C и даунорубицина), а также к новым способам таргетной терапии (например, с использованием Gleevec и Velcade). Примеры раковых стволовых клеток из различных опухолей, являющихся устойчивыми к химиотерапии, и механизмы этой устойчивости описаны в приводимой ниже таблице.
Тип РСК
Устойчивость
Механизм устойчивости
Источник
AML
Ara-C
Латентные клетки
Guzman, Blood, '01
AML
Даунорубицин
Выведение лекарства
Costello, Cancer Res., '00
Антиапоптотический
механизм
AML
Даунорубицин,
Выведение лекарства
Wulf, Blood, '01
митоксантрон
AML
Латентные клетки
Guau, Blood, '03
AML, MDS
Антиапоптотический механизм
Suarez, Clin. Cancer Res., '04
CML
Латентные клетки
Holyoake, Blood, '99
CML
Gleevec
Латентные клетки
Graham, Blood, '02
Миелома
Velcade
Matsui, ASH, '04
[0038] Например, лейкемические стволовые клетки являются относительно медленнорастущими или латентными, экспрессируют гены множественной лекарственной устойчивости и используют другие антиапоптотические механизмы - и именно эти особенности способствуют их устойчивости к воздействию химиотерапевтических средств (см. Jordan et al., "Targeting the most critical cells: approaching leukemia therapy as a problem in stem cell biology"/"Targeting воздействие на наиболее критичные клетки: подход к лечению лейкемии как к проблеме, относящейся к биологии стволовых клеток", Nat. Clin. Pract. Oncol., V.2, pp.224-225, 2005). Более того, благодаря своей устойчивости к воздействию химиотерапевтических средств, раковые стволовые клетки могут приводить к неудачному исходу лечения и могут сохраняться в организме пациента после достижения клинической ремиссии, и эти остающиеся раковые стволовые клетки могут, таким образом, приводить в будущем к возникновению рецидивов (см. Behbood etal., "Will cancer stem cells provide new therapeutic targets?"/"Станут ли раковые стволовые клетки новыми мишенями для лечения?", Carcinogenesis, V.26(4), pp.703-711, 2004). По этой причине, как ожидается, целевое воздействие на раковые стволовые клетки может способствовать улучшению долгосрочных исходов у раковых пациентов. Соответственно, для достижения этой цели необходимы новые терапевтические средства и/или режимы лечения, предназначенные для целенаправленного воздействия на раковые стволовые клетки.
[0039] Настоящее изобретение позволяет достигнуть этой цели с помощью введения нуждающемуся в этом индивидууму терапевтически эффективного количества или применения терапевтически эффективного режима введения метаарсенита натрия.
[0040] Рак или опухолевое заболевание, включающее в себя, в частности, новообразования, опухоли, метастазы, лейкемии, или любое заболевание или нарушение, характеризующееся неконтролируемым ростом клеток, может быть предотвращено, излечено или контролируемо с помощью введения нуждающемуся в этом индивидууму профилактически или терапевтически эффективного количества или применения терапевтически эффективного режима введения метаарсенита натрия.
[0041] Настоящее изобретение описывает способ предотвращения, лечения и/контроля развития рака путем уменьшения числа или полного уничтожения зрелых раковых клеток, а также раковых стволовых клеток и, в особенности, раковых стволовых клеток, устойчивых к лекарственному лечению; этот способ включает в себя введение нуждающемуся в этом индивидууму профилактически или терапевтически эффективного количества или применения терапевтически эффективного режима введения метаарсенита натрия. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения это количество или режим введения метаарсенита натрия приводят по меньшей мере к ~5% уменьшению популяции раковых стволовых клеток, в том числе раковых стволовых клеток, устойчивых к лекарственному лечению. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения уменьшение популяции раковых стволовых клеток отслеживается периодически, например, в течение четырех и более лет после окончания лечения метаарсенитом натрия. Соответственно, в определенном варианте осуществления настоящее изобретение предоставляет способ предотвращения рецидивов ракового заболевания, его лечения и/или контроля его развития у индивидуума; этот способ включает в себя: (а) введение нуждающемуся в этом индивидууму одной или нескольких доз эффективного количества метаарсенита натрия; (b) отслеживание популяции раковых стволовых клеток перед, во время и/или после введения определенного числа доз и перед введением следующей дозы; и (с) выявление по меньшей мере 5% уменьшения популяции раковых стволовых клеток, в том числе раковых стволовых клеток, устойчивых к лекарственному лечению, достигаемого у индивидуума с помощью повторения, при необходимости, шага (а). Если, во время отслеживания популяции раковых стволовых клеток у пациента, станет очевидно, что популяция раковых стволовых клеток увеличилась, лечащий врач может вновь ввести пациенту метаарсенит натрия (в форме монотерапии или в сочетании с другим противораковым средством), в той же самой или иной дозировке и/или дозовом режиме.
[0042] Метаарсенит натрия может вводиться пациенту в любой форме, в том числе парентерально (например, внутривенно), внутрибрюшинно или орально. Его дневная дозировка может вводиться в виде одной или нескольких доз в течение дня. Режим лечения метаарсенитом натрия может включать в себя введение его дневной дозировки на протяжении одного или нескольких дней, например, от одного до десяти последовательных дней или любого числа дней от одного до десяти, например, от одного до пяти, четырех, трех или двух последовательных дней. Альтернативно, дозовый режим может включать в себя введение дозировок метаарсенита натрия в течение нескольких дней, например, от одной недели до одного месяца, непоследовательным образом, т.е., например, через день или на каждый третий или четвертый день или, например, после трех последовательных дней лечения может следовать перерыв в несколько последовательных дней, например, тоже в три дня, а затем эта схема может повторяться или, при необходимости, модифицироваться. Опытный врач (специалист) может легко определить наиболее эффективный способ введения и дозировку метаарсенита натрия, необходимую для достижения наилучшего результата для пациента, на основании состояния здоровья пациента, его возраста, массы тела, переносимости лекарства и т.д.
[0043] В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения количество или режим применения метаарсенита натрия приводят по меньшей мере к 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% или 99% уменьшению популяции раковых стволовых клеток, включая раковые стволовые клетки, устойчивые к лекарственному лечению. Например, в некоторых вариантах осуществления количество или режим применения метаарсенита натрия могут приводить по меньшей мере к ~5%-99%, 5%-80%, 5%-40%, 10%-99%, 10%-80%, 10-60%, 10%-40%, 20%-99%, 20%-80%, 20%-60%, 20%-40%, 50%-98%, 50%-80% или 60%-99% уменьшению популяции раковых стволовых клеток, включая раковые стволовые клетки, устойчивые к лекарственному лечению.
[0044] В других вариантах осуществления настоящего изобретения количество или режим применения метаарсенита натрия могут приводить по меньшей мере к 1,1-, 1,2-, 1,5-, 2-, 3-, 4-, 5-, 10-, 25-, 50-, 75-, 100-, 200- или 1000-кратному уменьшению популяции раковых стволовых клеток, включая раковые стволовые клетки, устойчивые к лекарственному лечению. В некоторых вариантах его осуществления уменьшение популяции раковых стволовых клеток, включая раковые стволовые клетки, устойчивые к лекарственному лечению, может достигаться после двух недель, месяца, двух месяцев, трех месяцев, четырех месяцев, шести месяцев, девяти месяцев, 1 года, 2 лет, 3 лет или 4 лет применения режима лечения. Способы определения популяции раковых стволовых клеток и определения изменений количества раковых стволовых клеток описаны ниже. Если в период мониторинга будет зафиксировано увеличение числа раковых стволовых клеток, пациенту может быть назначен другой режим лечения метаарсенитом натрия (такой же или отличающийся от предыдущего режима лечения) и/или другого противоракового средства или средств.
[0045] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения количество или режим применения метаарсенита натрия могут приводить к уменьшению популяции раковых клеток, а также раковых стволовых клеток, включая раковые стволовые клетки, устойчивые к лекарственному лечению. В некоторых вариантах его осуществления уменьшение популяции раковых клеток или уменьшение популяций раковых клеток и раковых стволовых клеток периодически отслеживаются. Соответственно, в одном из вариантов осуществления настоящее изобретение предоставляет способ предотвращения, лечения и/или контроля развития ракового заболевания у индивидуума, который включает в себя: (а) введение нуждающемуся в этом индивидууму одной или нескольких доз эффективного количества метаарсенита натрия; (b) отслеживание популяции раковых стволовых клеток перед, во время и/или после введения определенного числа доз и перед введением следующей дозы; и (с) выявление по меньшей мере 5% уменьшения популяции раковых стволовых клеток, в том числе раковых стволовых клеток, устойчивых к лекарственному лечению, и популяции раковых клеток, достигаемых у индивидуума с помощью повторения, при необходимости, шага (а).
[0046] В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения количество или режим применения метаарсенита натрия приводят по меньшей мере к ~5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% или 99% уменьшению популяции раковых клеток. Например, в некоторых вариантах его осуществления количество или режим применения метаарсенита натрия могут приводить по меньшей мере к ~2%-98%, 5%-80%, 5%-40%, 10%-99%, 10%-80%, 10%-60%, 10%-40%, 20%-99%, 20%-80%, 20%-60%, 20%-40%, 50%-98%, 50%-80% или 60%-99% уменьшению популяции раковых клеток. В других конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения режим применения метаарсенита натрия может приводить по меньшей мере к 1,1-, 1,2-, 1,5-, 2-, 3-, 4-, 5-, 10-, 25-, 50-, 75-, 100-, 200- или 1000-кратному уменьшению популяции раковых стволовых клеток, включая раковые стволовые клетки, устойчивые к лекарственному лечению. В некоторых вариантах его осуществления уменьшение популяции раковых клеток может достигаться после двух недель, месяца, двух месяцев, трех месяцев, четырех месяцев, шести месяцев, девяти месяцев, 1 года, 2 лет, 3 лет, 4 лет, 5 лет или 10 лет применения режима лечения. Способы определения популяции раковых клеток и определения изменений количества раковых клеток описаны ниже.
[0047] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения количество или режим применения метаарсенита натрия могут приводить к уменьшению общего размера опухоли, а также к уменьшению популяции раковых стволовых клеток, включая раковые стволовые клетки, устойчивые к лекарственному лечению. В некоторых вариантах его осуществления уменьшение общего размера опухоли, уменьшение общего размера опухоли и уменьшение популяции раковых стволовых клеток, включая раковые стволовые клетки, устойчивые к лекарственному лечению, или уменьшение общего размера опухоли и уменьшение популяций раковых клеток и раковых стволовых клеток периодически отслеживаются. Соответственно, в одном из вариантов осуществления настоящее изобретение предоставляет способ предотвращения, лечения и/или контроля развития ракового заболевания у индивидуума, который включает в себя: (а) введение нуждающемуся в этом индивидууму одной или нескольких доз эффективного количества метаарсенита натрия; (b) отслеживание популяции раковых стволовых клеток перед, во время и/или после введения определенного числа доз и перед введением следующей дозы; и (с) выявление по меньшей мере 5% уменьшения популяции раковых стволовых клеток, в том числе раковых стволовых клеток, устойчивых к лекарственному лечению, и популяции раковых клеток, и общего размера опухоли, достигаемых у индивидуума с помощью повторения, при необходимости, шага (а).
[0048] В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения количество или режим применения метаарсенита натрия приводят по меньшей мере к ~5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 98% или 99% уменьшению популяции раковых стволовых клеток, включая раковые стволовые клетки, устойчивые к лекарственному лечению, и общего размера опухоли. Например, в некоторых вариантах его осуществления режим применения метаарсенита натрия может приводить по меньшей мере к ~2%-98%, 5%-80%, 5%-40%, 10%-99%, 10%-80%, 10%-60%, 10%-40%, 20%-99%, 20%-80%, 20%-60%, 20%-40%, 50%-99%, 50%-80% или 60%-99% уменьшению популяции раковых стволовых клеток, включая раковые стволовые клетки, устойчивые к лекарственному лечению, и общего размера опухоли. В других его конкретных вариантах осуществления режим применения метаарсенита натрия может приводить по меньшей мере к 1,1-, 1,2-, 1,5-, 2-, 2,5-, 3-, 4-, 5-, 10-, 20-, 25-, 50-, 75-, 100-, 200- или 1000-кратному уменьшению популяции раковых стволовых клеток, включая раковые стволовые клетки, устойчивые к лекарственному лечению, и общего размера опухоли. В некоторых вариантах его осуществления уменьшение популяции раковых стволовых клеток, включая раковые стволовые клетки, устойчивые к лекарственному лечению, и общего размера опухоли может достигаться после двух недель, месяца, двух месяцев, трех месяцев, четырех месяцев, шести месяцев, девяти месяцев, 1 года, 2 лет, 3 лет, 4 лет, 5 лет или 10 лет применения режима лечения.
[0049] Для оценки общего размера опухолей можно использовать ряд известных методов. К ним относятся, в частности, методы визуализации (например, компьютерная томография (СТ), магнитно-резонансная интроскопия (MRI), ультразвуковое сканирование, рентгеновские снимки, маммография, позитронная эмиссионная томография (PET), радиоизотопное сканирование, сканирование костей скелета), визуальные методы (например, колоноскопия, бронхоскопия, эндоскопия), физическое обследование (например, обследование простаты, обследование молочных желез, обследование лимфатических узлов, обследование органов брюшной полости, ректальное обследование, общая пальпация), анализы крови (например, на специфический антиген простаты (PSA), на эмбриональный опухолевый антиген (СЕА), на раковый антиген 125 (СА-125), на альфа-фетопротеин (AFP), пробы функции печени), анализы костного мозга (например, в случае злокачественных заболеваний крови), гистопатологические исследования, цитологические исследования и проточная цитометрия.
[0050] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения общий размер опухоли может измеряться на основании оценок, сделанных на основании размеров опухолевых очагов, определенных с помощью методов визуализации. В его конкретных вариантах осуществления эти оценки делаются в соответствии с Рекомендациями по оценке отклика для солидных опухолей (Response Evaluation Criteria In Solid Tumors Guidelines/RECIST Guidelines), изложенными в работе Therasse P. et al., "New Guidelines to Evaluate the Response to Treatment in Solid Tumors"/"Новые рекомендации по оценке отклика у солидных опухолей", J. of the Nat. Cane. Inst, V.92(3), pp.205-216 (2000). Например, в конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения, опухолевые очаги у индивидуума, используемые для определения общих размеров опухолей, выбираются таким образом, чтобы их начальный максимальный диаметр (до лечения) был бы по меньшей мере больше 20 мм при использовании стандартных методик визуализации (например, обычной компьютерной томографии, позитронной эмиссионной томографии, сканирования костей скелета, магнитно-резонансной интроскопии или рентгеновских снимков), а при использовании спиральной компьютерной томографии опухолевые очаги следует выбирать таким образом, чтобы их начальный максимальный диаметр был бы по меньшей мере больше 10 мм.
[0051] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения для оценки уменьшения общего размера опухоли может использоваться сочетание методик визуализации и обнаружения сывороточных маркеров. В качестве примеров подобных маркеров можно указать, в частности, специфический антиген простаты (PSA), эмбриональный опухолевый антиген (СЕА), раковый антиген 125 (СА-125) и альфа-фетопротеин (AFP).
[0052] Настоящее изобретение описывает способ предотвращения рецидивов рака у индивидуума, находящегося в состоянии ремиссии, который включает в себя введение этому индивидууму терапевтически или профилактически эффективного количества или режима метаарсенита натрия. Этот способ включает в себя введение индивидууму метаарсенита натрия в дозах, равных максимальной переносимой дозе (MTD) или меньших этой дозы или равных дозе, не вызывающей обнаруживаемых нежелательных эффектов (no observed adverse effect level/NOAEL), или меньших этой дозы. Значения максимальных переносимых доз метаарсенита натрия обычно определяются на основании результатов испытаний Фазы 1 по увеличению его доз. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения для лечения пациента также используется терапевтически эффективное количество второго противоракового средства, например, противоракового средства, использовавшегося в первой линии лечения пациента, находящегося в состоянии ремиссии. Второе противораковое средство может вводиться перед введением метаарсенита натрия, одновременно с ним или после него.
2
[0053] NOAEL, определенная в исследованиях на животных, часто используется для определения максимальной рекомендованной начальной дозы для клинических испытаний на людях. Значения NOAEL можно экстраполировать для определения эквивалентных дозировок для человека (HEDs). Обычно подобная экстраполяция на другие виды осуществляется на основании доз, нормализованных на площадь поверхности тела (т.е., выраженных в мг/м). В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения значения NOAEL определяются на мышах, хомячках, крысах, хорьках, морских свинках, кроликах, собаках, приматах (мартышках, игрунках, саймири, бабуинах), микросвиньях и карликовых свиньях. Обсуждение использования значений NOAEL и их экстраполяции для определения эквивалентных доз для человека см. в "Guidance for Industry Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers"/"Отраслевое руководство по оценке максимальной безопасной начальной дозы в начальных клинических испытаниях терапевтических средств на взрослых здоровых добровольцах", U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research (CDER), Pharmacology and Toxicology, July 2005. Соответственно, в определенных воплощениях настоящего изобретения режим лечения включает в себя введение терапевтического средства в дозе, меньшей HED. Например, настоящее изобретение описывает способ предотвращения рецидивов рака у индивидуума, находящегося в состоянии ремиссии, включающий в себя введение нуждающемуся в этом индивидууму профилактически или терапевтически эффективного количества или режима метаарсенита натрия в дозе, равной или меньшей HED.
[0054] В соответствии с настоящим изобретением, профилактически и/или терапевтически эффективное количество или режим метаарсенита натрия назначаются индивидуумам, страдающим от рака или тем, у кого предположительно рак может развиться (например, индивидуумам с генетической предрасположенностью к определенной форме рака, индивидуумам, подвергшимся воздействию канцерогена, индивидуумам с недавно диагностированным раком, индивидуумам, прошедшим неудачное лечение от рака, индивидуумам с рецидивами ракового заболевания или индивидуумам с определенной формой рака, находящимся в стадии ремиссии). В конкретном вариантах осуществления настоящего изобретения индивидуум находится в состоянии ремиссии, или здоров от рака по данным используемых в настоящее время методик, в частности, по результатам физического обследования (например, обследования предстательной железы, обследования молочных желез, обследования лимфатических узлов, обследования органов брюшной полости, осмотра кожи, общей пальпации), визуальных методов (например, колоноскопии, бронхоскопии, эндоскопии), исследования мазков Папаниколау (для выявления рака шейки матки), гваяковых анализов кала, анализов крови (например, по результатам клинического анализа крови (СВС), анализа на специфический антиген простаты (PSA), анализа на эмбриональный опухолевый антиген (СЕА), анализа на раковый антиген 125 (СА-125), анализа на альфа-фетопротеин (AFP), проб функции печени), анализа кариотипа, анализов костного мозга (например, в случае злокачественных заболеваний крови), гистологических исследований, цитологических исследований, анализа мокроты и методов визуализации (например, компьютерной томографии (СТ), магнитно-резонансной интроскопии (MRI), ультразвукового сканирования, рентгеновских снимков, маммографии, позитронной эмиссионной томографии (PET), радиоизотопного сканирования, сканирования костей скелета). Эти индивидуумы ранее могли подвергаться лечению от рака или не подвергались такому лечению.
[0055] В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения терапевтически эффективное количество или режим метаарсенита натрия назначаются индивидууму, проходящему или прошедшему хирургическое лечение для удаления опухоли, раковых клеток или новообразования. В его конкретном варианте осуществления терапевтически эффективное количество или режим метаарсенита натрия назначаются индивидууму параллельно с хирургической операцией, направленной на удаление опухоли, раковых клеток или новообразования, или после такой операции. В другом его варианте осуществления терапевтически эффективное количество или режим метаарсенита натрия вводятся индивидууму перед проведением хирургической операции, направленной на удаление опухоли, раковых клеток или новообразования, а в некоторых других его вариантах осуществления - во время такой операции и/или после нее.
[0056] В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения терапевтически эффективное количество или режим метаарсенита натрия назначаются индивидуумам, которые проходят или будут проходить радиационную терапию. В число этих индивидуумов входят прошедшие химиотерапию, гормональную терапию и/или биологическую терапию, включая иммунотерапию, а также прошедшие хирургическое лечение.
[0057] В другом варианте осуществления настоящего изобретения терапевтически эффективное количество или режим метаарсенита натрия назначаются индивидуумам, которые проходили, проходят или будут проходить гормональную терапию и/или биологическую терапию, включая иммунотерапию, и/или таргетную терапию. В число этих индивидуумов входят прошедшие химиотерапию и/или радиационную терапию, а также прошедшие хирургическое лечение.
[0058] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения терапевтически эффективное количество или режим метаарсенита натрия назначаются индивидууму, у которого лечение прошло неудачно или устойчивому к одному или нескольким способам лечения. В одном из вариантов осуществления под "раком, устойчивым к лечению" понимается, что по меньшей мере какая-то значительная часть раковых клеток не убивается лечением, или что деление этих клеток останавливается. Определение того, являются ли раковые клетки устойчивыми к лечению, может проводиться как in vivo, так и in vitro любым известным способом, применяемым в настоящее время для определения эффективности воздействия терапии на раковые клетки (в данном случае термин "устойчивый к лечению" применяется в соответствии с его значениями, принятыми в данном контексте в онкологии).
[0059] В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения терапевтически эффективное количество или режим метаарсенита натрия назначаются пациентам с повышенными уровнями цитокина IL-6, которые ассоциируются с развитием устойчивости у раковых клеток к различным режимам лечения, в частности, к химиотерапии и к гормональной терапии.
[0060] Любой тип рака может быть предотвращен, подвергнут лечению и/или контролю развития в соответствии с настоящим изобретением. Примерами раковых заболеваний, которые могут быть предотвращены, подвергнуты лечению и/или контролю развития в соответствии с настоящим изобретением являются, в частности: лейкемии, в частности, острая лейкемия, острый лимфоцитарный лейкоз, острые миелоцитарные лейкозы, в том числе миелобластный, промиелоцитарный, миеломоноцитарный и моноцитарный, эритролейкозные лейкемии и миелодиспластический синдром (MDS); хронические лейкемии, в частности, хронический миелоцитарный (гранулоцитарный) лейкоз, хронический лимфоцитарный лейкоз, волосатоклеточный лейкоз; истинная полицитемия; лимфомы, в частности, болезнь Ходжкина, неходжкинские лимфомы; множественные миеломы, в частности, вялотекущая множественная миелома, несекреторная миелома, остеосклеротическая миелома, плазмаклеточный лейкоз, изолированная плазмацитома и экстрамедуллярная плазмацитома; макроглобулинемия Вальденстрема; моноклональная гаммапатия неопределенной значимости; доброкачественная моноклональная гаммапатия; болезни тяжелых цепей; саркомы костной и соединительной тканей, в частности, костная саркома, остеосаркома, хондросаркома, саркома Юинга, гигантоклеточная саркома, фибросаркома кости, хордома, периостальная саркома, саркомы мягких тканей, ангиосаркома (злокачественная гемангиома), фибросаркома, саркома Капоши, лейомиосаркома, липосаркома, лимфангиосаркома, шваннома, рабдомиосаркома, злокачественная синовиома; опухоли головного мозга, в частности, глиома, астроцитома, глиома ствола головного мозга, эпендимома, олигодендроглиома, неглиальные опухоли, невринома слухового нерва, краниофарингиома, медуллобластома, менингиома, пинеоцитома, пинеобластома, первичная лимфома головного мозга; рак молочных желез, в частности, протоковая карцинома, аденокарцинома, лобулярная (мелкоклеточная) карцинома, внутрипротоковая карцинома, медуллярный рак молочной железы, муцинозный рак молочной железы, тубулярный рак молочной железы, папиллярный рак молочной железы, болезнь Педжета и отечно-инфильтративный рак молочной железы; рак надпочечников, в частности, феохромоцитома и карцинома коры надпочечника; рак щитовидной железы, в частности, папиллярный или фолликулярный рак щитовидной железы, медуллярный рак щитовидной железы и анапластический рак щитовидной железы; рак поджелудочной железы, в частности, инсулинома, гастринома, глюкагонома, випома, соматостатин-секретирующие опухоли и карциноидные опухоли или опухоли островков поджелудочной железы; различные формы рака гипофиза, в частности, болезнь Кушинга, пролактин-секретирующие опухоли, акромегалия и несахарный диабет; раковые заболевания глаз, в частности, глазная меланома, в том числе меланома радужной оболочки, хороидальная меланома и меланома ресничного тела, и ретинобластома; раковые заболевания влагалища, в частности, плоскоклеточная карцинома, аденокарцинома и меланома; рак наружных женских половых органов, в частности, плоскоклеточная карцинома, меланома, аденокарцинома, базальноклеточная карцинома, саркома и болезнь Педжета; раковые заболевания шейки матки, в частности, плоскоклеточная карцинома и аденокарцинома; раковые заболевания матки, в частности, карцинома эндометрия и саркома матки; раковые заболевания яичников, в частности, эпителиальная карцинома яичника, пограничная опухоль, герминома и стромальная опухоль; раковые заболевания пищевода, в частности, плоскоклеточный рак, аденокарцинома, аденокистозная карцинома, мукоэпидермоидная карцинома, аденосквамозная карцинома, саркома, меланома, плазмацитома, бородавчатая карцинома и овсяноклеточная (мелкоклеточная) карцинома; раковые заболевания желудка, в частности, аденокарцинома, некротически-язвенный (полипоидный) рак, изъязвленный рак, поверхностно-распространяющийся рак, диффузно-распространяющийся рак, злокачественная лимфома, липосаркома, фибросаркома и карциносаркома; раковые заболевания толстого кишечника; раковые заболевания прямой кишки; раковые заболевания печени, в частности, гепатоцеллюлярная карцинома и гепатобластома; раковые заболевания желчного пузыря, в частности, аденокарцинома; карциномы желчных протоков, в частности, папиллярная карцинома, узловая карцинома и диффузная карцинома; раковые заболевания легких, в частности, немелкоклеточный рак легкого, плоскоклеточная карцинома (эпидермоидная карцинома), аденокарцинома, крупноклеточная карцинома и мелкоклеточный рак легкого; раковые заболевания яичек, в частности, герминома, семинома, анапластический рак, классический (типичный) рак, сперматоцитная семинома, несеминомный рак, эмбриональная карцинома, тератокарцинома, хориокарцинома (опухоль желточного мешка); раковые заболевания предстательной железы, в частности, внутриэпителиальные новообразования предстательной железы, аденокарцинома, лейомиосаркома и рабдомиосаркома; раковые заболевания пениса; раковые заболевания полости рта, в частности, плоскоклеточная карцинома; базальные раковые заболевания; раковые заболевания слюнных желез, в частности, аденокарцинома, мукоэпидермоидная карцинома и аденокистозная карцинома; раковые заболевания глотки, в частности, плоскоклеточный рак и бородавчатый рак; раковые заболевания кожи, в частности, базальноклеточная карцинома, плоскоклеточная карцинома и меланома, поверхностная распространяющаяся меланома, узловая меланома, злокачественная меланома пигментного пятна, акральная лентигинозная меланома; раковые заболевания почек, в частности, светлоклеточная карцинома, аденокарцинома, гипернефрома, фибросаркома, переходноклеточный рак (почечной лоханки и/или уретры); опухоль Вильмса; раковые заболевания мочевого пузыря, в частности, переходноклеточная карцинома, плоскоклеточный рак, аденокарцинома и карциносаркома. Кроме того, в этот список раковых заболеваний входят миксосаркома, остеогенная саркома, эндотелиосаркома, эндотелиосаркома лимфатических сосудов, мезотелиома, синовиома, гемангиобластома, эпителиальная карцинома, цистаденокарцинома, бронхогенная карцинома, карцинома потовой железы, карцинома сальной железы, папиллярная карцинома и папиллярные аденокарциномы.
[0061] Профилактически и/или терапевтически эффективное количество или режим метаарсенита натрия также могут быть полезными при лечении, предотвращении и/или контроле развития ряда раковых заболеваний и других заболеваний, связанных с аномальной пролиферацией клеток, включая, в частности: карциному, в том числе мочевого пузыря, молочной железы, ободочной кишки, почки, печени, легкого, яичника, поджелудочной железы, желудка, шейки матки, щитовидной железы и кожи; в том числе плоскоклеточную карциному; гематобластозы лимфоидного происхождения, включая лейкемию, острый лимфоцитарный лейкоз, острый лимфобластный лейкоз, В-клеточную лимфому, Т-клеточную лимфому, лимфому Беркитта; гематобластозы миелоидного происхождения, включая острый миелолейкоз и хронический миелолейкоз; опухоли мезенхимального происхождения, включая фибросаркому и рабдомиосаркому; прочие опухоли, включая меланому, семиному, тератокарциному, нейробластому и глиому;
опухоли центральной и периферической нервной системы, включая астроцитому, нейробластому, глиому и шванномы; опухоли мезенхимального происхождения, включая фибросаркому, рабдомиосаркому и остеосаркому; и прочие опухоли, включая меланому, пигментную ксеродерму, кератоакантому, семиному, фолликулярный рак щитовидной железы и тератокарциному. В некоторых воплощениях настоящего изобретения раковые заболевания, связанные с нарушениями апоптоза, предотвращаются, лечатся или контролируются в соответствии со способами, описанными в этом изобретении. В число этих раковых заболеваний могут входить, в частности, фолликулярные лимфомы, карциномы с мутациями в гене p53, гормонозависимые опухоли молочных желез, предстательной железы и яичников, а также предраковые поражения, в частности, семейный аденоматозный полипоз и миелодиспластические синдромы. В конкретных воплощениях настоящего изобретения злокачественные новообразования или нарушения пролиферации клеток (например, метаплазии и дисплазии) или гиперпролиферативные заболевания кожи, легких, печени, костей, головного мозга, желудка, толстого кишечника, молочных желез, предстательной железы, мочевого пузыря, почек, поджелудочной железы, яичников и/или матки могут предотвращаться, лечиться и/или контролироваться в соответствии со способами, описанными в настоящем изобретении. В других его конкретных воплощениях саркома или меланома могут предотвращаться, лечиться и/или контролироваться в соответствии со способами, описанными в этом изобретении.
[0062] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения раковым заболеванием, предотвращаемым, лечащимся или/или контролируемым в соответствии с этим изобретением, является лейкемия, лимфома или миелома (например, множественная миелома).
[0063] В число лейкемий и других раковых заболеваний гемопоэтического происхождения, которые могут предотвращаться, лечиться и/или контролироваться с помощью способов, описанных в настоящем изобретении, можно включить, в частности, острый лимфобластный лейкоз (ALL), острый лимфобластный B-клеточный лейкоз, острый лимфобластный T-клеточный лейкоз, острый миелобластный лейкоз (AML), острый промиелоцитарный лейкоз (APL), острый монобластный лейкоз, острую эритролейкозную лейкемию, острый мегакариобластный лейкоз, острый миеломоноцитарный лейкоз, острый нелимфоцитарный лейкоз, острый недифференцированный лейкоз, хронический миелоцитарный лейкоз (CML), хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), миелодиспластический синдром (MDS) и волосатоклеточный лейкоз.
[0064] В число лимфом, которые могут предотвращаться, лечиться и/или контролироваться с помощью способов, описанных в настоящем изобретении, можно включить, в частности, болезнь Ходжкина, неходжкинские лимфомы, множественную миелому, макроглобулинемию Вальденстрема, болезнь тяжелых цепей и истинную полицитемию.
[0065] В другом варианте осуществления настоящего изобретения раковым заболеванием, предотвращаемым, лечащимся и/или контролируемым в соответствии с этим изобретением, является солидная опухоль. Примеры солидных опухолей, которые могут предотвращаться, лечиться и/или контролироваться с помощью способов, описанных в настоящем изобретении, включают в себя, в частности, фибросаркому, миксосаркому, липосаркому, хондросаркому, остеогенную саркому, хордому, ангиосаркому, эндотелиосаркому, ангиосаркому лимфатических сосудов, эндотелиосаркому лимфатических сосудов, синовиому, мезотелиому, опухоль Юинга, лейомиосаркому, рабдомиосаркому, рак толстой кишки, колоректальный рак, рак почек, рак поджелудочной железы, рак костей, рак молочных желез, рак яичников, рак предстательной железы, рак пищевода, рак желудка, рак полости рта, рак носовой полости, рак гортани, плоскоклеточную карциному, базальноклеточную карциному, аденокарциному, карциному потовых желез, карциному сальных желез, папиллярную карциному, папиллярные аденокарциномы, цистаденокарциному, медуллярную карциному, бронхогенную карциному, светлоклеточную карциному, гепатому, карциному желчных протоков, хориокарциному, семиному, эмбриональную карциному, опухоль Вильмса, рак шейки матки, рак матки, рак яичек, мелкоклеточную карциному легких, карциному мочевого пузыря, рак легких, эпителиальную карциному, глиому, мультиформную глиобластому, астроцитому, медуллобластому, краниофарингиому, эпендимому, пинеалому, гемангиобластому, невриному слухового нерва, олигодендроглиому, менингиому, рак кожи, меланому, нейробластому и ретинобластому.
[0066] В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения дозировка метаарсенита натрия, вводимая индивидууму для предотвращения, лечения и/или контроля ракового заболевания у него, составляет 500 мг/кг или менее, например, 250 мг/кг или менее, 100 мг/кг или менее, 95 мг/кг или менее, 90 мг/кг или менее, 85 мг/кг или менее, 80 мг/кг или менее, 75 мг/кг или менее, 70 мг/кг или менее, 65 мг/кг или менее, 60 мг/кг или менее, 55 мг/кг или менее, 50 мг/кг или менее, 45 мг/кг или менее, 40 мг/кг или менее, 35 мг/кг или менее, 30 мг/кг или менее, 25 мг/кг или менее, 20 мг/кг или менее, 15 мг/кг или менее, 10 мг/кг или менее, 5 мг/кг или менее, 2,5 мг/кг или менее, 2 мг/кг или менее, 1,5 мг/кг или менее или 1 мг/кг или менее в пересчете на массу тела пациента. Например, метаарсенит натрия может вводиться в количестве, варьирующем от приблизительно 0,1 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг, или от ~0,25 мг/кг до ~5 мг/кг от одного до пяти раз в день.
[0067] В другом варианте осуществления настоящего изобретения дозировка метаарсенита натрия, вводимая индивидууму для предотвращения, лечения и/или контроля ракового заболевания у него, соответствует единичной дозировке от 0,1 мг до 20 мг, от 0,1 мг до 15 мг, от 0,1 мг до 12 мг, от 0,1 мг до 10 мг, от 0,1 мг до 8 мг, от 0,1 мг до 7 мг, от 0,1 мг до 5 мг, от 0,1 мг до 2,5 мг, от 0,25 мг до 20 мг, от 0,25 мг до 15 мг, от 0,25 мг до 12 мг, от 0,25 мг до 10 мг, от 0,25 мг до 8 мг, от 0,25 мг до 7 мг, от 0,25 мг до 5 мг, от 0,5 мг до 2,5 мг, от 1 мг до 20 мг, от 1 мг до 15 мг, от 1 мг до 12 мг, от 1 мг до 10 мг, от 1 мг до 8 мг, от 1 мг до 7 мг, от 1 мг до 5 мг или от 1 мг до 2,5 мг.
2
2
2
2
2
2
2
[0068] В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения дозировка метаарсенита натрия, вводимая индивидууму для предотвращения, лечения и/или контроля ракового заболевания у него, находится в диапазоне от 0,01 до 10 г/м и более, обычно в диапазоне от 0,1 г/м до 7,5 г/м в пересчете на массу тела индивидуума. В одном из вариантов осуществления дозировка метаарсенита натрия, вводимая индивидууму, находится в диапазоне от 0,5 г/м до 5 г/м или от 1 г/м до 5 г/м в пересчете на площадь поверхности тела индивидуума.
[0069] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения терапевтически эффективное количество или режим метаарсенита натрия могут назначаться индивидууму в комбинации с одним или несколькими дополнительными способами лечениями. Дозировки одного или нескольких дополнительных противораковых средств, используемых в составе комбинированной терапии, могут быть ниже, чем те, что используются в настоящее время для предотвращения, лечения и/или контроля раковых заболеваний у пациентов. Рекомендуемые дозировки одного или нескольких дополнительных противораковых средств, используемых в настоящее время для предотвращения, лечения и/или контроля раковых заболеваний, могут быть получены из любого онкологического источника, например, из книг Hardman et al., eds., Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis Of Basis Of Therapeutics, 10th ed. (Фармакологическая основа терапевтического лечения, 10-е издание), Mc-Graw-Hill, New York, 2001; Physician's Desk Reference (Настольный справочник терапевта) (60-е дополнительное издание, 2006), которые целиком включены в эту заявку в форме ссылок.
[0070] Примеры дополнительных противораковых средств включают в себя, в частности: ацивицин; акларубицин; гидрохлорид акодазола; акронин; адозелезин; альдеслейкин; альтретамин; амбомицин; ацетат аметантрона; аминоглутетимид; амсакрин; анастрозол; антрациклин; антрамицин; аспарагиназу; асперлин; азацитидин (Vidaza); азетепу; азотомицин; батимастат; бензодепу; бикалутамид; гидрохлорид бисантрена; димезилат биснафида; бифосфонаты (например, памидронат (Aredria), клодронат натрия (Bonefos), золедроновую кислоту (Zometa), алендронат (Fosamax), этидронат, ибандронат, цимадронат, ризедронат и тилудронат; бизелезин; сульфат блеомицина; натриевую соль брехинара; бропиримин; бусульфан; кактиномицин; калустерон; карацемид; карбетимер; карбоплатин; кармустин; гидрохлорид карубицина; карзелезин; целефингол; хлорамбуцил; циролемицин; цисплатин; кладрибин; мезилат криснатола; циклофосфамид; цитарабин (Ara-C); дакарбазин; дактиномицин; гидрохлорид даунорубицина; децитабин (Dacogen); деметилирующие средства; дексормаплатин; дезагуанин; мезилат дезагуанина; диазихон; доцетаксел; доксорубицин; гидрохлорид доксорубицина; дролоксифен; цитрат дролоксифена; пропионат дромостанолона; дуазомицин; эдатрексат; гидрохлорид эфлорнитина; ингибиторы EphA2; элсамитруцин; энлоплатин; энпромат; эпипропидин; гидрохлорид эпирубицина; эрбулозол; гидрохлорид эзорубицина; эстрамустин; натриевую соль фосфата эстрамустина; этанидазол; этопозид; фосфат этопозида; этоприн; гидрохлорид фадрозола; фазарабин; фенретинид; флоксуридин; фосфат флударабина; фторурацил; фторцитабин; фосхидон; натриевую соль фостриецина; гемцитабин; гидрохлорид гемцитабина; ингибиторы гистондеацетилазы (HDAC-Is); гидроксикарбамид; гидрохлорид идарубицина; ифосфамид; илмофозин; мезилат иматиниба (Gleevec, Glivec); интерлейкин II (в том числе рекомбинантный интерлейкин II или rIL2), интерферон α-2a; интерферон α-2b; интерферон α-n1; интерферон α-n3; интерферон β-I а; интерферон γ-I b; ипроплатин; гидрохлорид иринотекана; ацетат ланреотида; леналидомид (Revlimid); летрозол; ацетат лейпролида; гидрохлорид лиарозола; натриевую соль лометрексола; ломустин; гидрохлорид лозоксантрона; мазопрокол; майтанзин; гидрохлорид мехлоретамина; антитела против CD2 (например, сиплизумаб (компания "Medlmmune Inc."; Международная Публикация №WO 02/098370, которая целиком включена в эту заявку в форме ссылки)); ацетат мегестрола; ацетат меленгестрола; мелфалан; меногарил; меркаптопурин; метотрексат; натриевую соль метотрексата; метоприн; метуредепу; митиндомид; митокарцин; митокромин; митогиллин; митомальцин; митомицин; митоспер; митотан; гидрохлорид митоксантрона; микофеноловую кислоту; нокодазол; ногаламицин; ормаплатин; оксалиплатин; оксисуран; паклитаксел; пегаспаргазу; пелиомицин; пентамустин; сульфат пепломицина; перфосфамид; пипоброман; пипосульфан; гидрохлорид пироксантрона; пликамицин; пломестан; натриевую соль порфимера; порфиромицин; преднимустин; гидрохлорид прокарбазина; пуромицин; гидрохлорид пуромицина; пиразофурин; рибоприн; роглетимид; сафингол; гидрохлорид сафингола; семустин; симтразен; натриевую соль спарфосата; спарсомицин; гидрохлорид спирогермания; спиромустин; спироплатин; стрептонигрин; стрептозоцин; сулофенур; талисомицин; натриевую соль текогалана; тегафур; гидрохлорид телоксантрона; темопорфин; тенипозид; тероксирон; тестолактон; тиамиприн; тиогуанин; тиотепу; тиазофурин; тирапазамин; цитрат торемифена; ацетат трестолона; фосфат трицирибина; триметрексат; глюкуронат триметрексата; трипторелин; гидрохлорид тубулозола; урамустин; уредепу; вапреотид; вертепорфин; сульфат винбластина; сульфат винкристина; виндезин; сульфат виндезина; сульфат винепидина; сульфат винглицината; сульфат винлейрозина; тартрат винорелбина; сульфат винрозидина; сульфат винзолидина; ворозол; зениплатин; зиностатин и гидрохлорид зорубицина. В некоторых воплощениях настоящего изобретения метаарсенит натрия может использоваться в сочетании с цисплатином при лечении первичного или вторичного рака, например, рака легких.
[0071] Метаарсенит натрия и одно или несколько дополнительных противораковых средств могут вводиться по отдельности, вместе или последовательно или любым способом, лучше всего переносимым пациентом. Комбинация средств может вводиться индивидууму одним путем или разными путями. В альтернативных воплощениях настоящего изобретения два или более профилактических или лечебных средства вводятся в виде единого состава.
[0072] Как часть применения профилактически и/или терапевтически эффективного количества или режима метаарсенита натрия, популяция раковых стволовых клеток может отслеживаться для оценки эффективности лечения или режима, чтобы эти данные можно было использовать в качестве основы для продолжения или изменения лечения, а также для определения прогноза у больного раком индивидуума. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения индивидуум, проходящий режим лечения, наблюдается для оценки того, привело ли применение режима лечения к уменьшению популяции раковых стволовых клеток, в том числе раковых стволовых клеток, устойчивых к лекарственному лечению, в организме индивидуума.
[0073] Количество раковых стволовых клеток может отслеживаться/оцениваться с помощью стандартных методик, известных онкологам. Раковые стволовые клетки могут отслеживаться, например, с помощью отбора образцов, например, образцов ткани/опухоли, образцов крови или образцов костного мозга, у индивидуума и выявления раковых стволовых клеток в этих образцах. Количество раковых стволовых клеток в образце (которое может быть выражено в процентах, например, от общего числа клеток или от общего числа раковых клеток) может быть оценено с помощью определения экспрессии антигенов на раковых стволовых клеток. Для измерения активности экспрессии можно использовать методики, известные специалистам в данной области. Экспрессию антигенов можно оценивать, например, иммунологически, в частности, с помощью вестерн-блоттинга иммуногистохимически, радиоиммунными методами, с помощью ELISA (твердофазного иммуноферментного анализа), "сандвичевых" иммунологических методов, иммунопреципитации, реакций с преципитином, реакций с преципитином, проходящих в условиях диффузии в геле, иммунодиффузионных методов, реакций агглютинации, реакций связывания комплемента, иммунорадиометрических методов, флуоресцентных иммунологических методов, иммунофлуоресцентного анализа, иммунологических тестов с использованием белка А, проточной цитометрии и анализа на FACS. В подобных обстоятельствах количество раковых стволовых клеток в тестируемом образце, полученном от индивидуума, может быть определено путем сравнения полученных результатов с результатами для контрольного образца (например, образца, полученного от индивидуума, у которого рака не выявлено) или с заранее определенным эталонным диапазоном или с данными для того же самого индивидуума, полученными ранее (например, до начала лечения или во время его проведения).
[0074] В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения величина популяции раковых стволовых клеток в образце, полученном от пациента (например, образце крови или опухолевой ткани) определяется с помощью проточной цитометрии. Этот метод использует различия в экспрессии определенных поверхностных маркеров на раковых стволовых клетках по сравнению с клетками основной массы опухоли. Можно использовать меченые антитела (например, флуоресцентные антитела) для реакции с клетками, которые затем можно разделить с помощью FACS. В некоторых воплощениях настоящего изобретения комбинации клеточных поверхностных маркеров используется для определения количества раковых стволовых клеток в образце. Например, для оценки количества раковых стволовых клеток в образце может использоваться как положительная, так и отрицательная сортировка клеток. Для определенных типов опухолей раковые стволовые клетки могут быть выявлены с помощью оценки экспрессии маркеров на раковых стволовых клетках. В некоторых воплощениях настоящего изобретения опухоли содержат раковые стволовые клетки, которые связаны с фенотипами, указанными в приведенном ниже списке. В этом списке приведены примеры фенотипов раковых стволовых клеток, связанных с различными типами раковых заболеваний.
Опухоль
Фенотип раковых стволовых клеток
Лейкоз (AML)
CD34+/CD38-
Рак молочной железы
CD44+/CD24-
Рак головного мозга
CD133+
Лейкоз (ALL)
CD34+/CD10-/CD19-
Рак яичника
CD44+/CD24-
Множественная миелома
CD138-/CD34-/CD19+
Хронический миелолейкоз
CD34+/CD38-
Меланома
CD20+
Эпендимома
CD133+/RC2+
Рак предстательной железы
CD44+/α2β1hi/CD-133+
[0075] В список дополнительных маркеров раковых стволовых клеток входят, в частности, CD123, CLL-1, комбинации SLAMs (рецепторов семейства сигнальных молекул, активирующих лимфоциты; см. Yilmaz et al., "SLAM family markers are conserved among hematopoietic stem cells from old and reconstituted mice and markedly increase their purity"/"Маркеры из семейства SLAM сохраняются на кроветворных стволовых клеток из старых мышей и мышей с восстановленным иммунитетом, и их использование заметно повышает их чистоту", Hematopoiesis, V.107, pp.924-930, 2006), например, CD150, CD244 и CD48, и маркеры, описанные в Патенте США №6004528, выданном Бергстайну, в поданной в США патентной заявке №09/468 286 и в опубликованных в США патентных заявках №2006/0083682, №2007/0036800, №2007/0036801, №2007/0036802, №2007/0041984, №2007/0036803 и №2007/0036804, каждая из которых целиком включена в эту заявку в форме ссылки. См. также Таблицу 1 в Патенте США №6004528 и Таблицу 1, Таблицу 2 и Таблицу 3 в поданной в США патентной заявке №09/468286 и опубликованные в США патентные заявки №2006/0083682, №2007/0036800, №2007/0036801, №2007/0036802, №2007/0041984, №2007/0036803 и №2007/0036804.
[0076] В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения при анализе образца с помощью проточной цитометрии для идентификации раковых стволовых клеток в опухолях можно использовать протокол окрашивания Хехст. Если говорить кратко, опухолевые клетки инкубируются с двумя хехстовскими красителями различных цветов (обычно красным и синим). Раковые стволовые клетки, по сравнению с основной массой раковых клеток, овер-экспрессируют на своей поверхности насосы, отвечающие за выведение красителей из клеток, что позволяет этим клеткам выкачивать красители из себя. Основная масса раковых клеток экспрессирует меньшее количество этих насосов, и поэтому они сильнее окрашиваются красителями, что можно выявить с помощью проточной цитометрии. Обычно при анализе всей популяции клеток обнаруживается градиент от сильно окрашивающихся клеток ("dye+") до практически не окрашивающихся клеток ("dye-"). Раковые стволовые клетки попадают в популяцию не окрашивающихся клеток ("dye-") или в популяцию слабо окрашивающихся клеток ("dyelow"). Примеры использования протокола окрашиваниях Хехст для определения характеристик стволовых клеток или популяции стволовых клеток можно найти в работах Goodell et al., "A leukemic stem cell with intrinsic drug efflux pump capacity in acute myeloid leukemia"/"Лейкозная стволовая клетка с естественной способностью экспрессировать насос для выкачивания лекарственных препаратов при остром миелолейкозе" Blood, V.98(4), pp.1166-1173, 2001, и Kondo et al., "Persistence of a small population of cancer stemlike cells in the C6 glioma cell line"/"Персистенция небольшой популяции раковых клеток, напоминающих стволовые клетки, в глиомной клеточной линии C6", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, V.101, pp.781-786, 2004. Таким образом, проточная цитометрия может быть использована для измерения величины популяции раковых стволовых клеток до и после лечения для оценки изменения количества раковых стволовых клеток под действием применяемого лечения или режима.
[0077] В других вариантах осуществления настоящего изобретения образец (например, образец опухоли или нормальной ткани, образец крови или образец костного мозга), полученный от пациента, культивируется в системах in vitro для оценки величины популяции раковых стволовых клеток или их количества. Например, образцы опухоли можно культивировать в мягком агаре, и количество раковых стволовых клеток может определяться по способности образца образовывать колонии клеток, которые могут подсчитываться визуально. Способность к образованию колоний считается косвенной мерой содержания раковых стволовых клеток, и поэтому ее можно использовать для количественного определения содержания раковых стволовых клеток. Например, при гемобластозах анализы на образование колоний включают в себя анализы для определения числа колониеобразующих клеток (CFC), анализы для определения числа клеток, способных инициировать долгосрочные культуры (LTC-IC), и анализы для определения числа клеток, способных инициировать культуры, растущие в суспензии (SC-IC). Таким образом, анализы на образование колоний или сходные анализы, например, на способность клеточной линии к долгосрочному сохранению/пассированию, можно использовать для измерения количества раковых стволовых клеток до и после лечения для оценки изменения количества раковых стволовых клеток под действием применяемого лечения или режима.
[0078] В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения количество раковых стволовых клеток определяется у индивидуума in vivo в соответствии со способом, включающим в себя следующие шаги: (а) введение индивидууму эффективного количества меченого средства, способного специфически связываться с маркером на поверхности раковых стволовых клеток, и (b) детектирование меченого средства в организме индивидуума по прошествии времени, достаточного для его концентрации в тех частях его организма, где происходит экспрессия поверхностного маркера раковых стволовых клеток. В соответствии с этим вариантом осуществления настоящего изобретения, средство, способное связываться с поверхностным маркером раковых стволовых клеток, вводится в организм индивидуума любым подходящим способом, применяемым в онкологии, например, парентерально (в частности, внутривенно) или внутрибрюшинно. В соответствии с этим его вариантом осуществления, эффективным количеством такого средства является то его количество, которое позволяет обнаруживать это средство в организме индивидуума. Это количество может варьировать в зависимости от конкретного индивидуума, способа мечения применяемого средства и способа, используемого для его обнаружения. Например, на современном уровне техники считается, что количество меченого средства, необходимое для его обнаружения с помощью методов визуализации, будет определяться размерами индивидуума и используемой визуализационной системой. В случае использования радиоактивно меченного средства для человеческого индивидуума, количество меченного средства измеряется по его радиоактивности, например, для "Те оно составляет приблизительно от 5 до 20 милликюри. Длительность временного интервала после введения меченного средства, достаточная для его концентрации в тех местах в организме индивидуума, где происходит экспрессия поверхностного маркера раковых стволовых клеток, будет зависеть от нескольких факторов, например, от типа используемой метки, способа введения средства и части тела пациента, для которой будет осуществляться визуализация. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения длительность этого временного интервала будет равняться 6-48 ч, 6-24 ч или 6-12 ч. В другом его варианте осуществления длительность этого интервала будет равняться 5-20 дням или 5-10 дням. Присутствие меченного средства, способного связываться с поверхностным маркером раковых стволовых клеток, в организме индивидуума может быть обнаружено с использованием методов визуализации, известных в онкологии. Как правило, применяемые методы визуализации зависят типа используемой метки. Опытные специалисты смогут определить способы, наиболее подходящие для обнаружения метки конкретного типа. Используемые для этого методы и устройства могут включать в себя, в частности, компьютерную томографию (СТ), методы сканирования всего организма в целом, в частности, позитронную эмиссионную томографию (PET), магнитно-резонансную интроскопию (MRI), ультразвуковое сканирование и устройства, способные обнаруживать флуоресцентные метки и определять их положение. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения средство, способное связываться с поверхностным маркером раковых стволовых клеток, метится радиоактивным изотопом и обнаруживается в организме пациента с помощью хирургического инструмента, чувствительного к радиации (Thurston et а/., Патент США №5441050). В другом его варианте осуществления средство, способное связываться с поверхностным маркером раковых стволовых клеток, метится флуоресцентным соединением и обнаруживается в организме пациента с помощью сканирующего прибора, чувствительного к флуоресценции. В другом варианте осуществления настоящего изобретения средство, способное связываться с поверхностным маркером раковых стволовых клеток, метится атомами металла, испускающими позитроны, и обнаруживается в организме пациента с помощью позитронной эмиссионной томографии (PET). В еще одном его варианте осуществления средство, способное связываться с поверхностным маркером раковых стволовых клеток, метится парамагнитной меткой и обнаруживается в организме пациента с помощью магнитно-резонансной интроскопии (MRI).
[0079] Любые способы анализов in vitro или in vivo (ex vivo), известные опытным онкологам и пригодные для использования для обнаружения и/или определения количества раковых стволовых клеток, могут использоваться для отслеживания наличия и/или количества раковых стволовых клеток для оценки профилактической и/или терапевтической полезности применения метаарсенита натрия. Результаты этих анализов могут затем использоваться определения для возможного продолжения или изменения противоракового лечения или режима.
[0080] Все публикации, патенты и патентные заявки, упомянутые в этом описании, включены в него в виде ссылок в той же степени, как если бы для каждой индивидуальной публикации, патентной заявки или патента было специально указано, что они включены в нее в виде ссылок. Цитирование или обсуждение ссылок в этой заявке не должно трактоваться так, что они рассматриваются как ранее известный уровень техники по отношению к настоящему изобретению.
ПРИМЕРЫ
В описанных ниже примерах использовались следующие материалы и методы:
2
[0081] Клеточные линии: клетки DU145wt, DU145/Pac200 и DU145/Doc50 были предоставлены доктором Хуссэйном, UMGCC, Университет Мэриленда. Клеточные линии культивировались в соответствии с рекомендациями в средах 1:1 DMEM/F12 (компания "Invitrogen") с добавлением 5% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS) и 1% антибиотиков; рост осуществлялся в стандартных условиях при температуре 37°С в атмосфере с 5% CO. Клоны, устойчивые к паклитакселу и доцетакселу, поддерживались в условиях селективного давления с помощью этих препаратов.
[0082] Лекарственные препараты: KML001 (метаарсенит натрия) был приобретен в компании "Sigma-Aldrich Co." (номер CAS: 7784-46-5); 50 мМ маточные растворы препарата были приготовлены с использованием буфера PBS, и их аликвоты хранились при температуре -20°С. GRN163L был приобретен у компании "Geron Corp." (Менло-Парк, Калифорния, США). 10 мМ рабочий стоковый раствор препарата был приготовлен с использованием буфера PBS.
50
100
[0083] Пролиферационный МТТ-тест: Экспоненциально растущие клетки собирались и наносились на плашки с 96 ячейками (1500 клеток в одну ячейку для DU145wt и 2000-3000 клеток в одну ячейку для DU145/Pac200 и DU145/Doc50). Тестируемые лекарственные препараты добавлялись в концентрациях, варьировавших от 0,01 мкМ до 100 мкМ, для оценки их потенциальной способности угнетать рост клеток. После 5 дней непрерывной инкубации с лекарственным препаратом в плашки добавляли прижизненный краситель, бромид 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия (МТТ). Превращение МТТ в пурпурный формазан жизнеспособными клетками измерялось с использованием аппарата для анализа плашек "Synergy2" на длине волны 550 нм и программного пакета Gen5. Графики роста клеток строились с использованием программы Microsoft Excel, после чего проводилось определение концентраций, ингибирующих рост на 50% и на 100% (IC и IC).
50
100
[0084] Предварительная обработка клеточных линий: Клеточные линии DU145wt и DU145/Pac200 выращивались в средах с добавлением KML001 или GRN163L в концентрациях в мкМ, соответствующих их значениям IC и IC, в течение 48 ч (Рас200) или 72 ч (DU145wt) перед проведением анализа на боковую популяцию.
6
[0085] Анализ на боковую популяцию: Почти достигшие стадии сплошного слоя жизнеспособные клетки подсчитывались (на одну пробирку было необходимо 10 клеток) и обрабатывались либо красителем Н33343, либо красителем DCV (Dye Cycle Violet); оба этих красителя позволяют отличать стволовые клетки (боковую популяцию) от зрелых клеток. Для анализа использовался протокол, описанный Goodell et al. (Goodell M.A. et al., J. Exp.Med., V.183 pp.1797-806, 1996). Каждый раз анализу подвергали по три образца. Из этих образцов один обрабатывался только красителем DCV, другой обрабатывался красителем DCV и 50 мкМ верапамила (ингибитора Pgp), а третий обрабатывался красителем DCV и 10 мкМ фумитреморгина С (FTC, ингибитора BCRP). После этого образцы считывали и анализировали с помощью проточной цитометрии.
[0086] Проточная цитометрия: Считывание образцов осуществлялось с использованием проточного цитометра "BDLSR II". Фиолетовый лазер возбуждал молекулы красителя DCV, которые переизлучали свет на различных длинах волн в зависимости от стадии дифференцировки клеток. Детекторы на длинах волн 450/50 (синий) и 680/30 (красный) улавливали переизлученный свет, и на основании полученных данных строился график разброса данных. Окрашивание на CD44 и Pgp осуществлялось с использованием антител, меченых РЕ (Pgp) или АРС (CD44) и их изотипных контролей после стандартных процедур мечения эпитопов.
ПРИМЕР 1
Идентификация раковых стволовых клеток в раковых клеточных линиях.
[0087] В этом исследовании раковые стволовые клетки (также обозначаемые как "боковая популяция" (SP)) и белок-переносчик из семейства АТФ-связывающих кассет (АВС), являющийся маркером SP, были выявлены в следующих. клеточных линиях рака предстательной железы: DU145wt (родительской клеточной линии), DU145/Pac200 (устойчивой к паклитакселу) и DU145/Doc50 (устойчивой к доцетакселу).
[0088] Все изученные клеточные линии рака предстательной железы (DU145wt, DU145/Pac200 и DU145/Doc50) показали наличие в них боковой популяции (см. фиг.1, фиг.3 и фиг.5). Важно отметить, что было установлено, что клетки DU145/Pac200 и DU145/Doc50 содержали очень большую боковую популяцию (см. фиг.1 и фиг.5), численность которой составляла порядка 40-60% от всей популяции клеток, что соответствует нашей гипотезе о том, что из раковых стволовых клеток могут образовываться клетки, устойчивые к лекарственному лечению.
ПРИМЕР 2
Чувствительность раковых стволовых клеток, устойчивых к лекарственному лечению, и зрелых раковых клеток к метаарсениту натрия.
[0089] Устойчивые к таксанам клеточные линии DU145/Pac200 (обладающая высокой устойчивостью к паклитакселу) и DU145/Doc50 (обладающая высокой устойчивостью к доцетакселу), их родительская клеточная линия DU145, а также устойчивые к андрогенам раковые клеточные линии (LNCaP/C81 и LAPC-4/CSS100) и их чувствительные к гормонам родительские клеточные линии (LNCaP и LAPC-4) были протестированы на их отклик на воздействие метаарсенита натрия. Графики роста, полученные в стандартных МТТ-тестах, показали, что эти клеточные линии демонстрируют сходный уровень чувствительности к метаарсениту натрия, не зависящий от их чувствительности к другим препаратам (см. Таблицу 1).
[0090] Каждая из клеточных линий рака предстательной железы была проанализирована на присутствие в ней фракции клеток, напоминающих раковые стволовые клетки с помощью анализа на наличие боковой популяции с помощью красителя DCV. Боковые популяции (SP) были выявлены в клеточных линиях, устойчивых к лекарственному лечению, по выведению из их клеток красителя DCV, что подтверждает предыдущие результаты, полученные с использованием красителя Hoechst 33342 для клеток линии DU145/Doc50 (данные не показаны). Наличие SP выявляется по экспрессии насосов, осуществляющих выброс лекарственных веществ из клеток, в частности, Р-гликопротеина или BCRP, которые делают стандартную цитотоксическую терапию неэффективной. Клеточные линии рака предстательной железы DU145, устойчивые к действию стандартных химиотерапевтических средств паклитаксела и доцетаксела, содержали самые большие боковые популяции (см. Таблицу 1). Хотя устойчивая к действию гормонов клеточная линия LnCaP/C81 и ее родительская линия также показали четкое наличие боковой популяции, которую можно было подавить с помощью ингибиторов насосов, осуществляющих выведение лекарственных веществ из клеток, верапамила (ингибитора Pgp) или фумитреморгина С (FTC, ингибитора BCRP), достоверно установить наличие боковой популяции для LAPC-4 и ее производной линии, устойчивой к действию гормонов, с помощью этого способа не удалось. Поскольку гормональные лечебные средства, в частности, ингибитора синтеза андрогенов, не являются субстратами для насосов, осуществляющих выброс лекарственных веществ из клеток, то полученные результаты не являются столь уж неожиданными.
Таблица 1.
Процентное отношение боковой популяции в клеточных линиях рака предстательной железы и в клетках, предварительно обработанных ингибиторами белков-переносчиков PgP и BRCP (верапамилом и фумитреморгином С (FTC) по данным окрашивания красителем DCV, чувствительность к KML001, длина теломер (TRF) и относительная активность теломеразы (ТА).
Клеточная линия
SP,%
SP при использовании верапамила, %
SP при использовании FTC, %
IC<sub>50</sub> KML001, мкМ
Длина TRF, тысяч пар оснований
Относительная ТА
DU145
1,04
0,1
0,006
4
2,7
1
DU145/Pac200
55
0,07
56,5
6
3
1,05
DU145/Doc50
40,3
1,35
18,35
5
3,4
0,97
LnCaP
0,66
0,12
0,04
4
3
1,18
LnCaP/C81
0,16
0,007
0,11
1
2,6
1,10
LAPC-4
1,54
1,63
2,24
4
6,7
1,27
LAPC-4/CSS100
0,36
0,19
0,30
3
4,9
1,26
ПРИМЕР 3
Определение активности теломеразы и длины теломер в раковых стволовых клетках,
устойчивых к лекарственному лечению.
[0091] В этом исследовании было установлено, что обладающие высокой устойчивостью к паклитакселу и доцетакселу клеточные линии DU145/Pac200 и DU145/Doc50 характеризуются почти такой же активностью теломеразы и длиной теломер, как и клетки их родительской линии, DU145, чувствительной к действию лекарств (см. Таблицу 1).
Таблица 1.
Значения IC<sub>50</sub> для таксанов и длина теломер в клеточных линиях рака предстательной железы.
Паклитаксел
Доцетаксел
Средняя длина TRF, тысяч пар оснований
№
Клеточные линии
IC<sub>50</sub>, мкМ
Относительная устойчивость
IC<sub>50</sub>, мкМ
Относительная устойчивость
Относительная ТА
1
DU145wt
0,0025
1
0,0005
1
1
2.5
2
DU145/Pac<sup>10</sup>
N/A
N/A
N/A
N/A
0,79
3,0
3
DU145/Pac<sup>200</sup>
0,35
140
0,2
400
0,96
2,8
4
Du145/Doc<sup>10</sup>
N/A
N/A
N/A
N/A
1,1
2,2
5
Du145/Doc<sup>50</sup>
1
400
1
2000
0,73
2.8
N/A = нет данныхТА = активность теломеразыTRF = теломерный рестрикционный фрагмент
ПРИМЕР 4
Воздействие верапамила на раковые стволовые клетки, устойчивые к лекарственному
лечению.
[0092] Боковые популяции клеток из линии DU145, устойчивых к паклитакселу и доцетакселу, подавлялись верапамилом, но не FTC, что говорит о том, что Pgp (P-гликопротеин) является доминирующим белком-переносчиком из семейства АВС, ответственным за образование этих боковых популяций (см. фиг.1 и фиг.5). Это согласуется с данными о высокой экспрессии Pgp на поверхности этих клеток, а также специфичного для рака предстательной железы маркера стволовых клеток CD44 (см. фиг.1В).
ПРИМЕР 5
Воздействие KML001 и GRN163L на раковые клетки и раковые стволовые клетки.
[0093] В этом исследовании воздействие ингибитора теломеразы KML001 (метаарсенита натрия) на клетки линий DU145wt, DU145/Pac200 и DU145/Doc50 сравнивалось с воздействием GRN163L, ингибитора теломеразы, в настоящее время проходящего поздние стадии клинических испытаний.
[0094] МТТ-тесты для клеток линий DU145wt, DU145/Doc50 и DU145/Pac200, обработанных KML001 или GRN163L, показали выраженное подавление их роста (см. Таблицу 1, фиг.1 и фиг.4). KML001 был одинаково эффективен как против клеток родительской линии DU145wt, так и против клеток, устойчивых к лекарственному лечению (см. Таблицу 1 и фиг.1D).
ПРИМЕР 6
Воздействие метаарсенита натрия и GRN163L на раковые стволовые клетки.
100
[0095] В этом исследовании была изучена способность метаарсенита натрия и GRN163L уничтожать боковые популяции в клеточных линиях DU145wt и DU145/Pac200 после их предварительной обработки их IC в течение 48-72 ч.
[0096] Это исследование показало, что клетки линий DU145wt и DU145/Pac200, предварительно обработанные KML001 в концентрации, подавляющей их рост на 100%, были способны резко снижать их боковые популяции (см. фиг.3В и фиг.5D). При этом, однако, происходило уничтожение не только боковых популяций, но и зрелых клеток (не относящихся к SP). Для валидации воздействия метаарсенита натрия на SP был использован специфичный ингибитор GRN163L, воздействующий только на теломеразу. GRN163L также значительно снижал боковые популяции, однако он был не способен убивать клетки, не относящиеся к SP, в той же степени, как KML001 (см. фиг.5).
[0097] В целом, полученные данные свидетельствуют, что метаарсенит натрия способен эффективно уничтожать как зрелые раковые клетки, устойчивые к лекарственному лечению, так и раковые стволовые клетки устойчивые к лекарственному лечению.
ПРИМЕР 7
Выделение SP в популяции раковых клеток, устойчивых к лекарственному лечению/Отклик на обработку KML001.
50
Все линии клеток рака предстательной железы, линии раковых клеток, устойчивых к воздействию таксанов и к воздействию андрогенов и клетки родительской линии, чувствительные к воздействию гормонов, демонстрировали сходную чувствительность к KML001 (IC были равны 1-6 мкМ). Линии раковых клеток, устойчивые к паклитакселу и доцетакселу, были протестированы с использованием хорошо отработанного теста на клоногенные опухолевые стволовые клетки на их отклик на воздействие KML001 (см. фиг.6). Этот тест позволяет расти в матриксе мягкого агара лишь популяции раковых стволовых клеток, ибо они обладают способностью к самовозобновлению. Благодаря этому он позволяет специфично тестировать чувствительность популяции стволовых клеток к противораковому средству.
50
Эффективность посева этих клеток на чашки (2% для DU145wt и DU145/Pac200) была сходной с той, которая ранее была зафиксирована для популяции стволовых клеток в тесте на боковую популяцию (1% для DU145wt и 50% для DU145/Pac200). Как у родительской клеточной линии, так и у клеточной линии, устойчивой к паклитакселу, наблюдалась сходная чувствительность к KML001, как это видно по уменьшению их колониеобразующей способности в присутствии KML001. Для этих клеточных линий в этом тесте было получено значение IC (6 мкМ), аналогичное тому, которое было получено ранее в стандартном МТТ-тесте (4 мкМ для DU145wt и 6 мкМ для DU145/Pac200).
Устойчивые к таксанам клеточные линии характеризовались максимальной долей боковых популяций, а чувствительная к воздействию гормонов клеточная линия LAPC-4 и полученная на ее основе клеточная линия, устойчивая к воздействию гормонов, демонстрировали менее выраженные боковые популяции SP, которые можно было подавить с помощью ингибиторов насосов, отвечающих за выброс лекарственных средств из клеток, верапамила (ингибитора Pgp) и фумитреморгина С (FTC, ингибитора BCRP). Клеточная линия DU145wt, в которой присутствовала боковая популяция, была протестирована на присутствие CD44 и CD133, и полученные результаты показали, что 0,46% клеток несли оба маркера (данные не показаны).
Боковая популяция была отделена от общей массы опухолевых клеток, и графики роста, полученные с помощью стандартного МТТ-теста, показали, что обе фракции, и положительная фракция SP+, содержащая клетки боковой линии, подобные раковым стволовым клеткам, и отрицательная фракция SP-, не содержавшая клеток боковой линии, отвечали на обработку KML001 и обладали сходной чувствительностью к нему (см. фиг.7).
ПРИМЕР 8
Определение длины теломер, активности теломеразы и активности hTERT.
50
100
Как было показано выше (в Примере 3), фракция клеток, подобных раковым стволовым клеткам, идентифицированная с помощью теста на боковую популяцию, характеризовалась более высокой активностью теломеразы, чем фракция основной массы клеток. Предварительные исследования свидетельствуют. Что уровень содержания транскрипта мРНК каталитической субъединицы человеческой теломеразы (hTERT) в обеих популяциях является сходным (см. фиг.8A), что может говорить о том, что более высокая активность теломеразы в популяции клеток, подобных раковым стволовым клеткам, может являться результатом стимуляции сигнальных каскадов белками, ассоциированными с теломеразой. Предварительные результаты для нерассортированной клеточной линии DU145/Pac200 свидетельствуют, что обработка KML001 в концентрациях IC и IC значительно понижает уровень содержания транскрипта hTERT через 72 ч (см. фиг.8B).
50
Насос, осуществляющий выкачивание молекул лекарств из клеток (Pgp), функционально экспрессируется (на мембране) в большинстве клеток в клеточных линиях рака предстательной железы, устойчивых к таксанам, что является вполне ожидаемым, поскольку боковые популяции в этих клеточных линиях можно подавить с помощью ингибитора насосов, осуществляющих выкачивание молекул лекарств из клеток, верапамила. Обработка KML001 в концентрации IC в течение 72 ч уменьшала популяцию клеток, положительных на Pgp, что подтверждает результаты теста на боковую популяцию и теста на клоногенные клетки.
ПРИМЕР 9
50
Воздействие цисплатина на линию клеток рака предстательной железы DU145/Pac200, устойчивую к паклитакселу, а также на родительскую клеточную линию DU145wt было исследовано с помощью стандартного МТТ-теста. Полученные результаты свидетельствуют, что обе эти клеточные линии отвечают на обработку цисплатином, и их чувствительность к нему приблизительно одинакова (IC равны 3 мкМ и 4 мкМ, соответственно). Предварительные результаты свидетельствуют о наличии синергического эффекта у цисплатина и KML001 как в родительской клеточной линии, так и в клеточной линии, устойчивой к паклитакселу (результаты не показаны).