ОПТИМИЗИРОВАННЫЙ МОДУЛЬ АКЦЕПТОРНОГО САЙТА СПЛАЙСИНГА ДЛЯ БИОЛОГИЧЕСКОГО И БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ

1. Подвергаемая транс-сплайсингу молекула пре-мРНК, которая содержит
(i) участок акцептора сплайсинга, содержащий
(ia) пиримидиновый тракт, причем пиримидиновый тракт содержит
(iaa) 5–25 нуклеотидов;
(iab) причем по меньшей мере 60% нуклеотидов из указанных 5–25 нуклеотидов являются пиримидиновыми основаниями, такими как цитозин (C), тимин (T) и/или урацил (U);
(ib) сайт акцептора сплайсинга,
(iba) причем сайт акцептора сплайсинга расположен между 3’-концом и пиримидиновым трактом; и
(ibb) причем сайт акцептора сплайсинга содержит между 5’-концом и 3’-концом последовательность NAGG, в которой N представляет собой A, C, T/U или G;
(ii) требуемую последовательность нуклеотидов или ее часть; причем участок акцептора сплайсинга локализован между 3’-концом или 5’-концом и требуемой последовательностью нуклеотидов или ее частью;
(iii) связывающий домен, нацеленный на пре-мРНК, который локализован между 3’-концом или 5’-концом и требуемой последовательностью нуклеиновой кислоты или ее частью; и
(iv) необязательно спейсерную последовательность, причем спейсерная последовательность локализована между связывающим доменом и участком акцептора сплайсинга.
2. Подвергаемая транс-сплайсингу молекула пре-мРНК по п. 1, содержащая
(ii) требуемую последовательность нуклеотидов или ее часть, причем участок акцептора сплайсинга локализован между 5’-концом и требуемой последовательностью нуклеотидов или ее частью;
(iii) сайт донора сплайсинга, причем сайт донора сплайсинга локализован между 3’-концом и требуемой последовательностью нуклеотидов или ее частью;
(iv) первый связывающий домен, нацеленный на пре-мРНК, который расположен между 5’-концом и требуемой последовательностью нуклеотидов или ее частью;
(v) второй связывающий домен, нацеленный на пре-мРНК, который расположен между 3’-концом и требуемой последовательностью нуклеотидов или ее частью;
(vi) необязательно первую спейсерную последовательность, причем первый спейсер локализован между первым связывающим доменом и участком акцептора сплайсинга; и
(vii) необязательно вторую спейсерную последовательность, причем второй спейсер локализован между вторым связывающим доменом и сайтом донора сплайсинга;
3. Подвергаемая транс-сплайсингу молекула пре-мРНК по п. 1 или 2, в которой участок акцептора сплайсинга локализован между 5’-концом и требуемой последовательностью нуклеотидов или ее частью, а связывающий домен локализован между 5’-концом и участком акцептора сплайсинга.
4. Подвергаемая транс-сплайсингу молекула пре-мРНК по любому из пп. 1–3, дополнительно содержащая последовательность терминации, предпочтительно поли(А)-последовательность.
5. Подвергаемая транс-сплайсингу молекула пре-мРНК по любому из пп. 1–4, в которой
(a) 5–25 нуклеотидов пиримидинового тракта содержат последовательность, закодированную с помощью последовательности TTTTTT или TCTTTT;
(b) последовательность между последним пиримидином пиримидинового тракта и сайтом акцептора сплайсинга имеет менее 10 оснований, предпочтительно менее 5 оснований, более предпочтительно менее 3 оснований; и/или
(c) сайт акцептора сплайсинга имеет последовательность CAGG.
6. Подвергаемая транс-сплайсингу молекула пре-мРНК по любому из пп. 1–5, в которой участок акцептора сплайсинга дополнительно содержит
(a) 7 нуклеотидов между 5’-концом и пиримидиновым трактом, имеющим по меньшей мере 4 нуклеотида из последовательности CAACGAG, в которой первый нуклеотид на 5’-конце представляет собой C;
(b) 7 нуклеотидов между 5’-концом и пиримидиновым трактом, имеющим по меньшей мере 5 нуклеотидов из последовательности CAACGAG, в которой первый нуклеотид на 5’-конце представляет собой C;
(c) 7 нуклеотидов между 5’-концом и пиримидиновым трактом, имеющим по меньшей мере 4 нуклеотида из последовательности CAACGAG, в которой первые нуклеотиды на 5’-конце представляют собой CAA; или
(d) 7 нуклеотидов между 5’-концом и пиримидиновым трактом, имеющим по меньшей мере 5 нуклеотидов из последовательности CAACGAG, в которой первые нуклеотиды на 5’-конце представляют собой CAAC.
7. Молекула ДНК, содержащая промотор и последовательность, кодирующую подвергаемую транс-сплайсингу молекулу пре-мРНК по любому из пп. 1–6.
8.Способ создания последовательности нуклеиновой кислоты, включающий в себя
(A) предоставление первой последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей одну или несколько последовательностей сайта донора сплайсинга;
(B) предоставление второй последовательности нуклеиновой кислоты, причем вторая последовательность нуклеиновой кислоты содержит
(i) последовательность участка акцептора сплайсинга, содержащую
(ia) пиримидиновый тракт, причем пиримидиновый тракт содержит
(iaa) 5–25 нуклеотидов;
(iab) причем по меньшей мере 60 % нуклеотидов из указанных 5–25 нуклеотидов являются пиримидиновыми основаниями, такими как цитозин (C), тимин (T) и/или урацил (U);
(ib) сайт акцептора сплайсинга,
(iba) причем сайт акцептора сплайсинга расположен между 3’-концом и пиримидиновым трактом; и
(ibb) причем сайт акцептора сплайсинга содержит между 5’-концом и 3’-концом последовательность NAGG, в которой N представляет собой A, C, T/U или G;
(C) расщепление первой последовательности нуклеиновой кислоты на одной или нескольких последовательностях сайта донора сплайсинга и расщепление второй последовательности нуклеиновой кислоты на сайте акцептора сплайсинга,
(D) лигирование первой расщепленной последовательности нуклеиновой кислоты со второй расщепленной последовательностью нуклеиновой кислоты,
для получения последовательности нуклеиновой кислоты.
9. Способ по п. 8, в котором первая последовательность нуклеиновой кислоты дополнительно содержит требуемую последовательность нуклеотидов или ее часть, причем по меньшей мере часть требуемой последовательности нуклеотидов расположена между 5’-концом и сайтом донора сплайсинга и причем вторая последовательность нуклеиновой кислоты также содержит требуемую последовательность нуклеотидов или ее часть, при этом по меньшей мере часть требуемой последовательности нуклеотидов расположена между 3’-концом и участком акцептора сплайсинга.
10. Способ по п. 8 или 9, в котором первую и вторую последовательности нуклеиновой кислоты вводят в клетку-хозяина, причем предпочтительно первая и вторая последовательности нуклеиновой кислоты являются рекомбинантными последовательностями нуклеиновой кислоты.
11. Способ по любому из пп. 8–10, включающий в себя
(A) введение в клетку-хозяина первой последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность подвергаемой транс-сплайсингу молекулы пре-мРНК или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую подвергаемую транс-сплайсингу молекулу пре-мРНК, причем первая подвергаемая транс-сплайсингу молекула пре-мРНК содержит между 5’-концом и 3’-концом
(a) часть требуемой последовательности нуклеиновой кислоты на 5’-конце;
(b) сайт донора сплайсинга;
(c) необязательно спейсерную последовательность;
(d) первый связывающий домен; и
(e) необязательно последовательность терминации, предпочтительно поли(А)-последовательность; и
(B) введение в клетку-хозяина второй последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность подвергаемой транс-сплайсингу молекулы пре-мРНК или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую подвергаемую транс-сплайсингу молекулу пре-мРНК, причем вторая подвергаемая транс-сплайсингу молекула пре-мРНК содержит между 5’-концом и 3’-концом
(i) второй связывающий домен, являющийся комплементарным первому целевому домену первой последовательности нуклеиновой кислоты;
(ii) последовательность участка акцептора сплайсинга, содержащую
(iia) пиримидиновый тракт, причем пиримидиновый тракт содержит
(iiaa) 5–25 нуклеотидов;
(iiab) причем по меньшей мере 60 % нуклеотидов из указанных 5–25 нуклеотидов являются пиримидиновыми основаниями, такими как цитозин (C), тимин (T) и/или урацил (U);
(iib) сайт акцептора сплайсинга,
(iiba) причем сайт акцептора сплайсинга расположен между 3’-концом и пиримидиновым трактом; и
(iibb) причем сайт акцептора сплайсинга содержит между 5’-концом и 3’-концом последовательность NAGG, в которой N представляет собой A, C, T/U или G;
(iii) часть требуемой последовательности нуклеотидов на 3’-конце и
(iv) последовательность терминации, предпочтительно поли(А)-последовательность,
(C) расщепление первой последовательности нуклеиновой кислоты на последовательности сайта донора сплайсинга и расщепление второй последовательности нуклеиновой кислоты на сайте акцептора сплайсинга; и
(D) лигирование первой расщепленной последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей часть требуемой последовательности нуклеотидов на 5’-конце, со второй расщепленной последовательностью нуклеиновой кислоты, содержащей часть требуемой последовательности нуклеотидов на 3’-конце, для получения требуемой последовательности нуклеиновой кислоты.
12. Вектор аденоассоциированного вируса (AAV), содержащий по меньшей мере два инвертированных концевых повтора, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты между этими двумя инвертированными концевыми повторами, причем последовательность нуклеиновой кислоты содержит между 5’-концом и 3'-концом
(i) промотор;
(ii) связывающий домен;
(iii) необязательно спейсерную последовательность;
(iv) последовательность участка акцептора сплайсинга, содержащую
(a) пиримидиновый тракт, причем пиримидиновый тракт содержит
(aa) 5–25 нуклеотидов;
(ab) причем по меньшей мере 60 % нуклеотидов из указанных 5–25 нуклеотидов являются пиримидиновыми основаниями, такими как цитозин (C), тимин (T) и/или урацил (U);
(b) сайт акцептора сплайсинга,
ba) причем сайт акцептора сплайсинга расположен между 3’-концом и пиримидиновым трактом; и
bb) причем сайт акцептора сплайсинга содержит между 5’-концом и 3’-концом последовательность NAGG, в которой N представляет собой A, C, T/U или G;
(v) требуемую последовательность нуклеотидов или ее часть; и
(vi) необязательно поли(А)-последовательность.
13. Векторная система аденоассоциированного вируса (AAV), содержащая
(I) первый вектор AAV, содержащий по меньшей мере два инвертированных концевых повтора, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты между этими двумя инвертированными концевыми повторами, причем указанная последовательность нуклеиновой кислоты, находящаяся между этими двумя инвертированными концевыми повторами, содержит между 5’-концом и 3’-концом
(a) промотор,
(b) последовательность нуклеотидов, кодирующую N-терминальную часть требуемого полипептида;
(c) сайт донора сплайсинга;
(d) необязательно спейсерную последовательность;
(e) первый связывающий домен; и
(f) необязательно последовательность терминации, предпочтительно поли(А)-последовательность;
(II) второй вектор AAV, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую по меньшей мере два инвертированных концевых повтора, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты между этими двумя инвертированными концевыми повторами, причем указанная последовательность нуклеиновой кислоты, находящаяся между этими двумя инвертированными концевыми повторами, содержит между 5’-концом и 3’-концом
(i) промотор;
(ii) второй связывающий домен, являющийся комплементарным первому связывающему домену первого вектора AAV;
(ii) необязательно спейсерную последовательность;
(iii) последовательность участка акцептора сплайсинга, содержащую
(a) пиримидиновый тракт, причем пиримидиновый тракт содержит
(aa) 5–25 нуклеотидов;
(ab) причем по меньшей мере 60 % нуклеотидов из указанных 5–25 нуклеотидов являются пиримидиновыми основаниями, такими как цитозин (C), тимин (T) и/или урацил (U);
(b) сайт акцептора сплайсинга,
(ba) причем сайт акцептора сплайсинга расположен между 3’-концом и пиримидиновым трактом; и
(bb) причем сайт акцептора сплайсинга содержит между 5’-концом и 3’-концом последовательность NAGG, в которой N представляет собой A, C, T/U или G;
(iv) последовательность нуклеотидов, кодирующую C-терминальную часть требуемого полипептида;
(iva) причем C-терминальная часть требуемого полипептида и N-терминальная часть требуемого полипептида восстанавливает требуемый полипептид; и
(v) последовательность терминации, предпочтительно поли(А)-последовательность.
14. Векторная система AAV по п. 13, в которой полипептид представляет собой полноразмерный полипептид, первый вектор AAV содержит N-терминальную часть полноразмерного требуемого полипептида, а второй вектор AAV содержит C-терминальную часть полноразмерного требуемого полипептида.
15. Последовательность нуклеиновой кислоты, содержащая
(i) последовательность участка акцептора сплайсинга, содержащую
(ia) пиримидиновый тракт, причем пиримидиновый тракт содержит
(aa) 5–25 нуклеотидов;
(ab) причем по меньшей мере 60 % нуклеотидов из указанных 5–25 нуклеотидов являются пиримидиновыми основаниями, такими как цитозин (C), тимин (T) и/или урацил (U);
(ib) сайт акцептора сплайсинга,
ba) причем сайт акцептора сплайсинга расположен между 3’-концом и пиримидиновым трактом; и
bb) причем сайт акцептора сплайсинга содержит между 5’-концом и 3’-концом последовательность NAGG, в которой N представляет собой A, C, T/U или G; и
(ii) требуемую последовательность нуклеотидов, причем требуемая последовательность нуклеотидов
(iia) расположена между 3’-концом или 5’-концом и участком акцептора сплайсинга.
16. Способ по любому из пп. 8–11, вектор AAV по п. 12, векторная система AAV по п. 13 или 14 и нуклеиновая кислота по п. 15, в которых
(a) 5–25 нуклеотидов пиримидинового тракта содержат последовательность TTTTTT или TCTTTT;
(b) последовательность между последним пиримидином пиримидинового тракта и сайтом акцептора сплайсинга имеет менее 10 оснований, предпочтительно менее 5 оснований, более предпочтительно менее 3 оснований;
(c) сайт акцептора сплайсинга имеет последовательность CAGG;
(d) участок акцептора сплайсинга дополнительно содержит 7 нуклеотидов между 5’-концом и пиримидиновым трактом, имеющим по меньшей мере 4 нуклеотида из последовательности CAACGAG, причем первый нуклеотид на 5’-конце представляет собой C; и/или
(e) причем участок акцептора сплайсинга содержит последовательность SEQ ID NO: 3 или 4.
17. Применение подвергаемой транс-сплайсингу молекулы пре-мРНК по любому из пп. 1–6, вектора аденоассоциированного вируса по п. 12 или векторной системы аденоассоциированного вируса по п. 13 или 14 в терапии.