СПОСОБ ИНДУЦИРОВАНИЯ СЕЛЕКТИВНОЙ МЕДИКАМЕНТОЗНОЙ АБЛЯЦИИ ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ БЕЗ ПОВРЕЖДЕНИЯ НЕРВОВ И С СОХРАНЕНИЕМ ПОЛОВОЙ ФУНКЦИИ
METHOD FOR INDUCING SELECTIVE DRUG ABLATION OF THE PROSTATE GLAND WITHOUT NERVE DAMAGE, WHILE PRESERVING THE SEXUAL FUNCTION

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
[0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет в соответствии с заявкой на патент США с регистрационным № 16/110,549, поданной 23 августа 2018 г., содержание которой включено в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
[0002] Настоящая заявка содержит перечень последовательностей, который был представлен в электронном виде в формате ASCII и настоящим включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. Указанный файл ASCII создан 22 августа 2019 г., имеет название Nymox-0505946-SeqListing.txt и размер, составляющий 635 байт.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
1. Область техники изобретения
[0003] Варианты осуществления включают способы селективной медикаментозной абляции предстательной железы с применением композиций, содержащих соединения на основе небольших пептидов и фармацевтически приемлемый носитель. Более конкретно, в вариантах осуществления предусмотрены способы селективного разрушения разрастания предстательной железы при сохранении основного нерва, стромальной, сосудистой, соединительной ткани, мускулатуры уретры и структурных элементов в непосредственной структурной близости к очагам абляции.
2. Описание предшествующего уровня техники
[0004] Суть многих терапевтических способов лечения и процедур заключается в удалении или разрушении вредной или нежелательной ткани. Примеры таких способов лечения включают удаление хирургическим путем раковых или предраковых новообразований, разрушение метастатических опухолей с помощью химиотерапии и уменьшение железистой (например, предстательной) гиперплазии. Другие примеры включают удаление нежелательной растительности на лице, удаление бородавок и удаление нежелательной жировой ткани.
[0005] Доброкачественная гиперплазия предстательной железы (ДГПЖ) часто встречается у пожилых мужчин с симптомами, которые влияют на качество жизни, включая препятствование некоторым видам деятельности и нарушение восприятия благополучия. ДГПЖ может быть прогрессирующей, с риском задержки мочи, инфекций, камней в мочевом пузыре и почечной недостаточности. Хотя многие мужчины с легкими или умеренными симптомами чувствуют себя хорошо без вмешательства, неприятные симптомы и осложнения могут прогрессировать у других, что приводит к применению лекарственной терапии или хирургического вмешательства.
et al., European Association of Urology, Eur.
[0006] США и Европа разработали руководства для оказания помощи врачам в лечении СНМП, ДГПЖ и СНМП/ДГПЖ. Oelke M,  Urol. 2013 Jul; 64(1):118-40. В руководстве обсуждаются варианты лечения, варьирующиеся от бдительного ожидания (watchful waiting, WW) для мужчин с симптомами, но недостаточно обеспокоенных, чтобы нуждаться в медикаментозном лечении или хирургическом вмешательстве, до способов лечения с применением лекарственных средств и хирургического вмешательства. Руководства по медикаментозному лечению включают применение альфа-блокаторов (антагонистов альфа-адренергических рецепторов), ингибиторов 5-альфа-редуктазы (5ARI), антимускариновых (антихолинергических) препаратов, ингибитора PDE5 (тадалафил), комбинированной терапии и аналогов вазопрессина. Также было рекомендовано применение комбинированной терапии, например, применение альфа-блокатора с 5ARI или антимускариновым препаратом.
[0007] Хирургическое вмешательство на предстательной железе, такое как трансуретральная резекция простаты, показано мужчинам с абсолютными показаниями или с лекарственно-резистентной ДГПЖ, СНМП или острой задержкой мочеиспускания (ОЗМ). Показания к хирургическому вмешательству включают тяжелые состояния, такие как задержка мочи, макроскопическая гематурия, инфекция мочевыводящих путей и камни в мочевом пузыре. Минимально инвазивные способы терапии включают трансуретральную микроволновую термотерапию и трансуретральную игольную абляцию. Альтернативой катетеризации для мужчин, не подходящих для хирургического вмешательства, являются стенты предстательной железы. Несмотря на различные доступные варианты лечения остаются неудовлетворенные медицинские потребности в эффективных и безопасных средствах для лечения этих неприятных симптомов, некоторые из которых могут быть вызваны увеличением предстательной железы, что может привести к более серьезным проблемам, таким как хронические инфекции мочевыводящих путей, недержание мочи, острая и хроническая задержка мочи и почечная недостаточность.
[0008] Существует потребность в эффективной композиции, которая будет разрушать и, следовательно, либо способствовать удалению, либо подавлять дальнейший рост вредных или нежелательных клеток и тканей, но будет иметь в основном местные эффекты и минимальную или отсутствующую системную токсичность. Также существует потребность в уменьшении потребности в инвазивном хирургическом вмешательстве даже после лечения посредством эффективной композиции.
[0009] Некоторые средства, которые, как известно, обладают способностью разрушать, а следовательно либо способствовать удалению, либо подавлять дальнейший рост вредных или нежелательных клеток и ткани, раскрыты в заявке на патент США № 14/808,713, поданной 24 июля 2015 года под названием: METHODS OF REDUCING THE NEED FOR SURGERY IN PATIENTS SUFFERING FROM BENIGN PROSTATIC HYPERPLASIA (СПОСОБЫ СНИЖЕНИЯ ПОТРЕБНОСТИ В ХИРУРГИЧЕСКОМ ВМЕШАТЕЛЬСТВЕ У ПАЦИЕНТОВ, СТРАДАЮЩИХ ДОБРОКАЧЕСТВЕННОЙ ГИПЕРПЛАЗИЕЙ ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ); заявке на патент США № 14/606,683, поданной 27 января 2015 года под названием: METHOD OF TREATING DISORDERS REQUIRING DESTRUCTION OR REMOVAL OF CELLS (СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ НАРУШЕНИЙ, ТРЕБУЮЩИХ РАЗРУШЕНИЯ ИЛИ УДАЛЕНИЯ КЛЕТОК), заявке на патент США № 14/738,551, поданной 12 июня 2015 года под названием: COMBINATION COMPOSITIONS FOR TREATING DISORDERS REQUIRING REMOVAL OR DESTRUCTION OF UNWANTED CELLULAR PROLIFERATIONS (КОМБИНИРОВАННЫЕ КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ НАРУШЕНИЙ, ТРЕБУЮЩИХ УДАЛЕНИЯ ИЛИ РАЗРУШЕНИЯ НЕЖЕЛАТЕЛЬНЫХ КЛЕТОЧНЫХ ПРОЛИФЕРАЦИЙ), публикациях заявок на патент США №№ 2007/0237780 (в настоящее время приостановлена); 2003/0054990 (теперь патент США № 7,172,893); 2003/0096350 (теперь патент США № 6,924,266); 2003/0096756 (теперь патент США № 7,192,929); 2003/0109437 (теперь патент США № 7,241,738); 2003/0166569 (теперь патент США № 7,317,077); 2005/0032704 (теперь патент США № 7,408,021) и 2015/0148303 (теперь патент США № 9,243,035), раскрытие каждой из которых включено в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.
[0010] Доброкачественные разрастания тканей представляют собой нарушения, при которых желательно удалять клетки из организма. Доброкачественные опухоли представляют собой клеточные пролиферации, которые не метастазируют по всему организму, но вызывают симптомы заболевания. Такие опухоли могут быть смертельными, если они расположены в недоступных областях в органах, таких как головной мозг. Существуют доброкачественные опухоли органов, в том числе опухоли легкого, головного мозга, кожи, гипофиза, щитовидной железы, коры надпочечников и мозгового вещества, яичника, матки, яичка, соединительной ткани, мышц, кишечника, уха, носа, горла, миндалин, рта, печени, желчного пузыря, поджелудочной железы, предстательной железы, сердца и других органов.
[0011] Хирургическое вмешательство часто является первой стадией в лечении рака. Цель хирургического вмешательства может быть различной. Иногда его используют для удаления как можно большей части выраженной опухоли или по меньшей мере для «уменьшения ее объема» (удаление основной массы опухоли, чтобы уменьшить потребность в лечении другими способами). В зависимости от типа и локализации рака, хирургическое вмешательство может также обеспечивать пациенту некоторое облегчение симптомов. Например, если хирург может удалить большую часть растущей опухоли головного мозга, давление внутри черепа снизится, что приведет к улучшению симптомов пациента.
[0012] Однако не все опухоли поддаются хирургическому вмешательству. Некоторые могут быть расположены в тех частях тела, которые делают невозможным их полное удаление. Примерами таких могут быть опухоли в стволе головного мозга (часть головного мозга, которая контролирует дыхание) или опухоль, которая выросла в крупном кровеносном сосуде и вокруг него. В этих случаях роль хирургического вмешательства ограничена из-за высокого риска, связанного с удалением опухоли.
[0013] В некоторых случаях хирургическое вмешательство не используется для уменьшения объема опухолевой ткани, поскольку это просто не является необходимым. Примером является лимфома Ходжкина, рак лимфатических узлов, который очень хорошо реагирует на комбинации химиотерапии и лучевой терапии. При лимфоме Ходжкина хирургическое вмешательство редко необходимо для достижения излечения, но почти всегда применяется для установления диагноза.
[0014] Химиотерапия является еще одной распространенной формой лечения рака. По существу, она включает применение лекарственных препаратов (обычно вводимых перорально или посредством инъекции), которые специфически воздействуют на быстро делящиеся клетки (например, обнаруженные в опухоли) по всему организму. Это делает химиотерапию пригодной в лечении видов рака, которые уже осуществили метастазирование, а также опухолей, которые характеризуются высокой вероятностью распространения через кровеносную и лимфатическую системы, но не проявляются за пределами первичной опухоли. Химиотерапию также можно применять для усиления реакции локализованных опухолей на хирургическое вмешательство и лучевую терапию. Это касается, например, некоторых видов рака головы и шеи.
[0015] К сожалению, другие клетки в организме человека, которые также обычно быстро делятся (такие как слизистая оболочка желудка и волосы), также подвержены химиотерапии. По этой причине многие химиотерапевтические средства вызывают нежелательные побочные эффекты, такие как тошнота, рвота, анемия, выпадение волос или другие симптомы. Эти побочные эффекты носят временный характер, и существуют лекарственные препараты, которые могут помочь облегчить многие из этих побочных эффектов. Поскольку наши знания продолжают расти, исследователи разработали новые химиотерапевтические средства, которые не только лучше убивают раковые клетки, но и имеют меньше побочных эффектов для пациента.
[0016] Средства для химиотерапии вводят пациентам различными способами. Некоторые представляют собой таблетки, а другие вводят внутривенно или посредством других инъекций. В случае инъекционной химиотерапии пациент посещает медицинский кабинет или больницу для лечения. Другие химиотерапевтические средства требуют непрерывной инфузии в кровоток 24 часа в сутки. Для этих типов химиотерапии осуществляют малую хирургическую процедуру для имплантации небольшого насоса, предназначенного для ношения пациентом. Затем насос медленно вводит лекарственный препарат. Во многих случаях постоянный порт помещают в вену пациента для исключения необходимости повторных введений иглы.
[0017] Доброкачественные опухоли и мальформации также можно лечить различными способами, включая хирургическое вмешательство, лучевую терапию, медикаментозную терапию, термическую или электрическую абляцию, криотерапию и другие. Хотя доброкачественные опухоли не метастазируют, они могут стать большими и рецидивировать. Удаление хирургическим путем доброкачественных опухолей сопряжено со всеми трудностями и побочными эффектами хирургического вмешательства в целом и часто должно проводиться повторно для некоторых доброкачественных опухолей, таких как аденомы гипофиза, менингиомы головного мозга, гиперплазия предстательной железы и другие. Кроме того, некоторым пациентам, которые получают нехирургическое лечение для облегчения симптомов, вызванных доброкачественными опухолями, все еще необходимо последующее инвазивное хирургическое вмешательство. В Lepor, «Medical Treatment of Benign Prostatic Hyperplasia», Reviews in Urology, Vol. 13, No. 1, pp. 20-33 (2011) раскрыты различные исследования эффективности терапии лекарственным средством в лечении ДГПЖ и необходимости последующего инвазивного хирургического лечения.
[0018] Во всех или в большинстве этих случаев существует потребность в способах лечения, которые могут удалить, уничтожить или улучшить нежелательные состояния, связанные с ДГПЖ, СНМП или ОЗМ, без риска и побочных эффектов, сопутствующих общепринятым средствам терапии, или способах лечения, которые могут удалить, разрушить или улучшить нежелательные состояния с большей точностью.
[0019] При многих заболеваниях предстательной железы зачастую требуется удаление разросшейся ткани. Рак предстательной железы удаляют хирургическим путем и/или с помощью лучевой терапии, химиотерапии или местного лечения. В случае ДГПЖ, при тяжелых симптомах в связи с увеличенным разрастанием железистой ткани переходной зоны может потребоваться абляция путем хирургической резекции или посредством лазерного излучения, микроволновой энергии, высокоинтенсивного ультразвука, размещения иглы с термическим воздействием, пара или других способов разрушения ткани переходной зоны.
[0020] При использовании способов абляции, которые разрушают ткань, зоны разрушения ткани являются микроскопически неселективными, что может рассматриваться как следствие неселективности действующих сил (высокоэнергетическая трансдукция, излучение), которые вызывают некроз. Таким образом, существует потребность в способах лечения, которые могут эффективно вызывать разрушение тканей и которые являются структурно селективными на микроскопическом (гистологическом) уровне, чтобы избежать нежелательных токсических эффектов и невосстанавливаемого повреждения ключевых смежных структур. Например, трансуретральная резекция, высокоэнергетические лазерные экстирпации и другие способы зачастую поражают простатический нерв, стромальную, сосудистую и соединительную ткани, а также мускулатуру уретры с частым последующим возникновением постоянных нарушений семяизвержения и импотенции и, реже, развитием других нежелательных явлений, таких как недержание мочи.
[0021] Во всем данном описании, включая вышеприведенное описание предшествующего уровня техники, любые и все общедоступные документы, описанные в данном документе, включая любые и все опубликованные патентные заявки на патент США, специально включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. Вышеприведенное описание предшествующего уровня техники никоим образом не предназначено для признания того, что любой из документов, описанных в нем, включая находящиеся на рассмотрении заявки на патент США, является предшествующим уровнем техники для настоящего изобретения. Более того, описание в данном документе любых недостатков, связанных с описанными продуктами, способами и/или устройством, не предназначено для ограничения вариантов осуществления. Действительно, аспекты вариантов осуществления могут включать определенные признаки описанных продуктов, способов и/или устройств, не претерпевая от их описанных недостатков.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
[0022] В данной области техники остается потребность в новых, менее токсичных и менее часто применяемых (например, без необходимости ежедневного или еженедельного приема лекарственных средств) средствах для селективного индуцирования апоптоза в разросшейся ткани предстательной железы при сохранении простатического нерва, стромальной, сосудистой и соединительной ткани, а также мускулатуры уретры. Способы лечения согласно предшествующему уровню техники в отношении разрастания тканей предстательной железы либо сфокусировано на выборочной локализации в предстательной железе, что приводит к относительно неполному лечению, либо, если оно менее целенаправленно, вызывает невосстанавливаемое повреждение смежной ткани, нервов и мускулатуры. Кроме того, способы лечения согласно предшествующему уровню техники в отношении разрастания тканей предстательной железы, в которых использовали инъекцию пептидов, применяли небольшую дозу пептида (приблизительно 0,25 мг/мл), сфокусированную на ограниченной области предстательной железы. Соответственно, остается также потребность в средствах лечения для удаления разрастания тканей предстательной железы, которое можно вводить в ткани в более общем порядке, при этом сохранение примыкающей ткани, такой как простатический нерв, стромальная, сосудистая и соединительная ткани, а также мускулатуры уретры. Варианты осуществления, описанные в данном документе, удовлетворяют эти потребности.
[0023] Настоящее изобретение частично основано на открытии того, что некоторые пептиды, включая специфический пептид, описанный аминокислотной последовательностью Ile-Asp-Gln-Gln-Val-Leu-Ser-Arg-Ile-Lys-Leu-Glu-Ile-Lys-Arg-Cys-Leu (фексапотида трифлутат или «ФТ»), способны селективно индуцировать апоптоз в разросшейся ткани предстательной железы с сохранением простатического нерва, стромальной, сосудистой и соединительной ткани, а также мускулатуры уретры.
[0024] Настоящее изобретение также частично основано на открытии того, что применение ФТ либо отдельно, либо в комбинации с дополнительным активным средством оказывает терапевтическое действие и/или уничтожает нежелательные клеточные пролиферации у млекопитающих без значимых известных молекулярных нежелательных явлений при взаимодействии с другими тканями. Хотя ФТ ранее применяли для разрушения нежелательных клеточных пролифераций, не было известно, что он является селективным в индуцировании апоптоза. Следовательно, способы лечения согласно предшествующему уровню техники с использованием ФТ, как правило, включали прямую инъекцию в участки нежелательных клеточных пролифераций, чтобы избежать разрушения здоровых клеток, таких как нервная, стромальная, сосудистая и соединительная ткани, а также мускулатура уретры. Автор настоящего изобретения непредвиденно обнаружил, что ФТ индуцировал селективную медикаментозную абляцию предстательной железы, и, следовательно, композиции можно вводить в более общем порядке и предпочтительно менее инвазивно, и их можно вводить в значительно более высоких дозах. В соответствии с одним вариантом осуществления предложен способ индуцирования селективной медикаментозной абляции предстательной железы путем введения ФТ в количестве, достаточном для лечения значительной части предстательной железы.
[0025] Композиции можно вводить внутримышечно, перорально, внутривенно, интраперитонеально, интрацеребрально (интрапаренхимально), интрацеребровентрикулярно, интратуморально, внутриочагово, внутрикожно, интратекально, интраназально, интраокулярно, интраартериально, местно, трансректально, трансперитонеально, трансдермально, с помощью аэрозоля, инфузии, болюсной инъекции, имплантационного устройства, устройства замедленного высвобождения и т. д. В альтернативном варианте осуществления ФТ-пептид можно экспрессировать in vivo путем введения гена, который экспрессирует пептид, путем введения вакцины, которая индуцирует такую продукцию, или путем введения клеток, бактерий или вирусов, которые экспрессируют пептид in vivo вследствие генетической модификации или иным образом.
[0026] В другом варианте осуществления введение композиции, содержащей ФТ, либо отдельно, либо в комбинации с по меньшей мере одним дополнительным активным средством, способным лечить и/или уничтожать нежелательные клеточные пролиферации у млекопитающих, обеспечивает снижение объема предстательной железы на 10% или меньше по сравнению с введением контрольной композиции, которая не содержит ФТ.
[0027] Как вышеприведенное общее описание, так и последующее подробное описание являются иллюстративными и пояснительными и предназначены для обеспечения дополнительного пояснения заявленных вариантов осуществления. Другие объекты, преимущества и особенности будут очевидны для специалистов в данной области техники из следующего подробного описания вариантов осуществления.
ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
[0028] Фиг. 1a представляет собой график, демонстрирующий средний объем предстательной железы у млекопитающих, которым вводили ФТ, по сравнению с контрольными млекопитающими за период от 24 часов до 7 дней.
[0029] Фиг. 1b представляет собой график, демонстрирующий средний объем предстательной железы у млекопитающих, которым вводили ФТ, по сравнению с контрольными млекопитающими за период от 0 до 12 месяцев.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
[0030] Перед описанием вариантов осуществления следует понимать, что настоящее изобретение не ограничивается конкретными описанными методологией, протоколами, линиями клеток, векторами и реагентами, так как они могут различаться. Также необходимо понимать, что терминология, используемая в данном документе, предназначена лишь для описания конкретных вариантов осуществления, и не предназначена для ограничения объема вариантов осуществления настоящего изобретения, которые будут ограничиваться лишь прилагаемой формулой изобретения.
[0031] Термины и фразы, применяемые в данном документе, определены ниже, если не указано иное. Во всем данном описании формы существительного единственного числа включают и формы множественного числа, если контекст четко не определяет иное. Таким образом, например, ссылка на «клетку-хозяина» включает множество таких клеток-хозяев, а термин «антитело» представляет собой ссылку на одно или более антител и их эквивалентов, известных специалистам в данной области техники, и т. д.
[0032] Аминокислоты и аминокислотные остатки, описанные в данном документе, могут упоминаться в соответствии с принятым одно- или трехбуквенным кодом, приведенным в таблице ниже.
Таблица 1
<b>Наименование аминокислоты</b>
<b>Однобуквенное обозначение</b>
<b>Трехбуквенное обозначение</b>
Аланин
A
Ala
Аргинин
R
Arg
Аспарагин
N
Asn
Аспарагиновая кислота
D
Asp
Цистеин
C
Cys
Глутамин
Q
Gln
Глутаминовая кислота
E
Glu
Глицин
G
Gly
Гистидин
H
His
Изолейцин
I
Ile
Лейцин
L
Leu
Лизин
K
Lys
Метионин
M
Met
Фенилаланин
F
Phe
Пролин
P
Pro
Серин
S
Ser
Треонин
T
Thr
Триптофан
W
Trp
Тирозин
Y
Tyr
Валин
V
Val
[0033] Применяемый в данном документе термин «фексапотида трифлутат» (ФТ) означает 17-мерный пептид, имеющий аминокислотную последовательность: Ile-Asp-Gln-Gln-Val-Leu-Ser-Arg-Ile-Lys-Leu-Glu-Ile-Lys-Arg-Cys-Leu (SEQ ID NO. 1). ФТ раскрыт в патентах США №№ 6,924,266; 7,241,738; 7,317,077; 7,408,021; 7,745,572; 8,067,378; 8,293,703; 8,569,446 и 8,716,247, а также в публикациях заявок на патент США №№ 2017/0360885; 2017/0020957; 2016/0361380 и 2016/0215031. Раскрытия этих патентов и опубликованных заявок включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.
ФТ представлен:
SEQ ID NO.1
: IDQQVLSRIKLEIKRCL или Ile-Asp-Gln-Gln-Val-Leu-Ser-Arg-Ile-Lys-Leu-Glu-Ile-Lys-Arg-Cys-Leu.
[0034] Термин «фрагмент» относится к белку или полипептиду, который состоит из непрерывной подпоследовательности аминокислотной последовательности белка или пептида и включает встречающиеся в природе фрагменты, такие как сплайс-варианты и фрагменты, полученные с помощью встречающейся в природе протеазной активности in vivo. Такой фрагмент может быть усечен на амино-конце, карбокси-конце и/или внутри (например, путем естественного сплайсинга). Такие фрагменты могут быть получены с аминоконцевым метионином или без него. Термин «фрагмент» включает фрагменты, одинаковые или отличные от одного и того же белка или пептида, с общей непрерывной аминокислотной последовательностью или без нее, соединенные вместе либо непосредственно, либо через линкер. Специалист в данной области техники сможет выбрать подходящий фрагмент для применения в вариантах осуществления без излишних экспериментов с использованием руководств и процедур, изложенных в данном документе.
[0035] Термин «вариант» относится к белку или полипептиду, в которых присутствуют одна или более аминокислотных замен, делеций и/или вставок по сравнению с аминокислотной последовательностью белка или пептида, и включает встречающиеся в природе аллельные варианты или альтернативные сплайс-варианты белка или пептида. Термин «вариант» включает замену одной или более аминокислот в пептидной последовательности подобной или гомологичной аминокислотой(аминокислотами) или отличной аминокислотой(аминокислотами). Существует много шкал, по которым аминокислоты можно отнести к подобным или гомологичным. (Gunnar von Heijne, Sequence Analysis in Molecular Biology, p. 123-39 (Academic Press, New York, N.Y. 1987). Предпочтительные варианты включают замены аланина в одном или более положениях аминокислот. Другие предпочтительные замены включают консервативные замены, которые оказывают незначительное влияние или не влияют на общий суммарный заряд, полярность или гидрофобность белка. Консервативные замены изложены в таблице 2 ниже.
Таблица 2
Консервативные аминокислотные замены
Основные:
аргининлизингистидин
Кислые:
глутаминовая кислотааспарагиновая кислота
Незаряженные полярные:
глутаминаспарагинсеринтреонинтирозин
Неполярные:
фенилаланинтриптофанцистеинглициналанинвалинпролинметионинлейцинизолейцин
В таблице 3 представлена другая схема аминокислотных замен.
Таблица 3
<b>Исходный остаток</b>
<b>Замены</b>
Ala
gly;ser
Arg
lys
Asn
gln;his
Asp
glu
Cys
ser
Gln
asn
Glu
asp
Gly
ala;pro
His
asn;gln
Ile
eu;val
Leu
ile;val
Lys
arg;gln;glu
Met
leu;tyr;ile
Phe
met;leu;tyr
Ser
thr
Thr
ser
Trp
tyr
Tyr
trp;phe
Val
ile;leu
[0036] Другие варианты могут состоять из менее консервативных аминокислотных замен, таких как выбор остатков, которые в более значительной степени различаются своим влиянием на поддержание (a) структуры полипептидного остова в области замены, например, в виде листовой или спиральной конформации, (b) заряда или гидрофобности молекулы в целевом сайте или (c) объема боковой цепи. Замены, которые, как правило, должны иметь более существенный эффект в отношении функции, представляют собой замены, в которых (а) глицин и/или пролин замещены другой аминокислотой, удалены или вставлены; (b) гидрофильный остаток, например, серил или треонил, замещен (или заменен) гидрофобным остатком, например, лейцилом, изолейцилом, фенилаланилом, валилом или аланилом; (c) остаток цистеина замещен (или заменен) любым другим остатком; (d) остаток, имеющий электроположительную боковую цепь, например, лизил, аргинил или гистидил, замещен (или заменен) остатком, имеющим электроотрицательный заряд, например, глутамилом или аспартилом; или (е) остаток, имеющий объемную боковую цепь, например фенилаланин, замещен (или заменен) остатком, не имеющим такой боковой цепи, например, глицином. Другие варианты включают варианты, предназначенные либо для создания нового сайта(сайтов) гликозилирования и/или фосфорилирования, либо варианты, предназначенные для удаления существующего сайта(сайтов) гликозилирования и/или фосфорилирования. Варианты включают по меньшей мере одну аминокислотную замену в сайте гликозилирования, сайте протеолитического расщепления и/или остатке цистеина. Варианты также включают белки и пептиды с дополнительными аминокислотными остатками до или после аминокислотной последовательности белка или пептида на линкерных пептидах. Например, остаток цистеина может быть добавлен как к амино-, так и к карбоксиконцам ФТ с целью обеспечения циклизации пептида посредством образования дисульфидной связи. Термин «вариант» также охватывает полипептиды, которые имеют аминокислотную последовательность ФТ с по меньшей мере одной и не более 25 или более дополнительными аминокислотами, фланкирующими либо 3'-, либо 5'-конец пептида.
[0037] Термин «производное» относится к химически модифицированному белку или полипептиду, который был химически модифицирован либо посредством естественных процессов, таких как процессинг и другие посттрансляционные модификации, но также с помощью методик химической модификации, например, посредством добавления одной или более молекул полиэтиленгликоля, сахаров, фосфатов и/или других таких молекул, где молекула или молекулы не присоединены естественным образом к белкам дикого типа или ФТ. Производные включают соли. Такие химические модификации хорошо описаны в учебниках и в более подробных монографиях, а также в многочисленной исследовательской литературе, и они хорошо известны специалистам в данной области техники. Понятно, что один и тот же тип модификации может присутствовать в одинаковой или различной степени в нескольких сайтах данных белка или полипептида. Также данные белок или полипептид могут содержать множество типов модификаций. Модификации могут происходить в любом месте белка или полипептида, включая пептидный остов, аминокислотные боковые цепи и амино- или карбокси-концы. Модификации включают, например, ацетилирование, ацилирование, ADP-рибозилирование, амидирование, ковалентное присоединение флавина, ковалентное присоединение гемового фрагмента, ковалентное присоединение нуклеотида или производного нуклеотида, ковалентное присоединение липида или производного липида, ковалентное присоединение фосфотидилинозитола, перекрестное сшивание, циклизацию, образование дисульфидной связи, деметилирование, образование ковалентных перекрестных сшивок, образование цистеина, образование пироглутамата, формилирование, гамма-карбоксилирование, гликозилирование, образование GPI-якоря, гидроксилирование, йодирование, метилирование, миристоилирование, окисление, протеолитический процессинг, фосфорилирование, пренилирование, рацемизацию, гликозилирование, липидное присоединение, сульфатирование, гамма-карбоксилирование остатков глутаминовой кислоты, гидроксилирование и ADP-рибозилирование, селеноилирование, сульфатирование, добавление аминокислот, опосредованное транспортной РНК, к белкам, такое как аргинилирование и убиквитинирование. См., например, Proteins--Structure And Molecular Properties, 2nd Ed., T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York (1993) и Wold, F., «Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and Prospects», pgs. 1-12 в Posttranslational Covalent Modification Of Proteins, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York (1983); Seifter et al., Meth. Enzymol. 182:626-646 (1990) и Rattan et al., «Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging», Ann. N.Y. Acad. Sci. 663: 48-62 (1992). Термин «производные» включает химические модификации, в результате которых белок или полипептид становятся разветвленными или циклическими, с разветвлением или без него. Циклические, разветвленные и разветвленные кольцевые белки или полипептиды могут быть получены в результате посттрансляционных природных процессов и могут быть получены также посредством полностью синтетических способов.
[0038] Термин «гомолог» относится к белку, который на по меньшей мере 60 процентов идентичен по своей аминокислотной последовательности ФТ, что определяется стандартными способами, которые обычно применяются для сравнения сходства двух полипептидов по положениям аминокислот. Степень сходства или идентичности между двумя белками можно легко рассчитать известными способами, включая, без ограничения, способы, описанные в Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; и Carillo H. and Lipman, D., SIAM, J. Applied Math., 48:1073 (1988). Предпочтительные способы определения идентичности предназначены для обеспечения наибольшего соответствия между протестированными последовательностями. Способы определения идентичности и сходства кодифицированы в общедоступных компьютерных программах.
[0039] Предпочтительные способы с применением компьютерных программ, пригодные для определения идентичности и сходства между двумя последовательностями, включают, без ограничения, программный пакет GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research, 12(1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, and FASTA, Atschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215: 403-410 (1990). Программа BLAST X общедоступна в NCBI и других источниках (BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul, S., et al., J. Mol. Biol., 215: 403-410 (1990). Например, используя компьютерный алгоритм, такой как GAP (Genetic Computer Group, Университет Висконсина, Мэдисон, Висконсин), два белка или полипептида, для которых должна быть определена процентная идентичность последовательности, выравнивают для оптимального соответствия их соответствующих аминокислот («длина совпадения», как определено алгоритмом).
[0040] Штраф за открытие гэпа (который рассчитывается как 3-кратная средняя диагональ; «средняя диагональ» представляет собой среднее значение диагонали применяемой матрицы сравнения; «диагональ» представляет собой показатель или число, присвоенные каждому идеальному совпадению аминокислот по конкретной матрице сравнения) и штраф за продолжение гэпа (который обычно равен {доле (1/10)}, умноженной на штраф за открытие гэпа), а также матрица сравнения, такая как PAM 250 или BLOSUM 62, применяются в сочетании с алгоритмом. Стандартная матрица сравнения (см. Dayhoff et al. в Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, supp.3 для матрицы сравнения PAM250; см. Henikoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89:10915-10919 для матрицы сравнения BLOSUM 62) также может применяться алгоритмом. Процент идентичности затем рассчитывается по алгоритму. Гомологи обычно имеют одну или более аминокислотных замен, делеций и/или вставок по сравнению с белком или пептидом сравнения, в зависимости от обстоятельств.
[0041] Термин «слитый белок» относится к белку, в котором один или более пептидов рекомбинантно слиты или химически конъюгированы (включая ковалентно и нековалентно) с белком, таким как (без ограничения) антитело или фрагмент антитела, такой как Fab-фрагмент или Fv короткой цепи. Термин «слитый белок» также относится к мультимерам (т. е. димерам, тримерам, тетрамерам и высшим мультимерам) пептидов. Такие мультимеры включают гомомерные мультимеры, содержащие один пептид, гетеромерные мультимеры, содержащие более одного пептида, и гетеромерные мультимеры, содержащие по меньшей мере один пептид и по меньшей мере один другой белок. Такие мультимеры могут быть результатом гидрофобных, гидрофильных, ионных и/или ковалентных соединений, связей или сшивок, могут быть образованы посредством перекрестных сшивок с применением линкерных молекул или могут быть связаны опосредованно посредством, например, образования липосом.
[0042] Термин «пептидомиметик» или «миметик» относится к биологически активным соединениям, которые имитируют биологическую активность пептида или белка, но уже не являются пептидными по химической природе, то есть они уже не содержат пептидных связей (то есть амидных связей между аминокислотами). В данном случае термин пептидомиметик используется в более широком смысле для включения молекул, которые уже не являются полностью пептидными по своей природе, таких как псевдопептиды, частичные пептиды и пептоиды. Примеры пептидомиметиков в этом более широком смысле (где часть пептида заменена структурой, в которой отсутствуют пептидные связи) описаны ниже. Независимо от того, являются ли они полностью или частично непептидными, пептидомиметики в соответствии с вариантами осуществления обеспечивают пространственное расположение реакционноспособных химических фрагментов, которые очень похожи на трехмерное расположение активных групп в пептиде, на котором основан пептидомиметик. В результате такой подобной геометрии активного сайта пептидомиметик обладает эффектом в отношении биологических систем, которые схожи с биологической активностью пептида.
[0043] Пептидомиметики согласно вариантам осуществления предпочтительно практически сходны как по трехмерной форме, так и по биологической активности с пептидами, описанными в данном документе. Примеры способов структурной модификации пептида, известных из уровня техники для создания пептидомиметика, включают инверсию хиральных центров остова, приводящих к структурированию остатка D-аминокислоты, что может, особенно на N-конце, приводить к повышенной стабильности для протеолитического разрушения без неблагоприятного влияния на активность. Пример приведен в статье «Tritriated D-ala.sup.1-Peptide T Binding», Smith C. S. et al., Drug Development Res., 15, pp. 371-379 (1988). Второй способ заключается в изменении циклической структуры для стабильности, такой как межцепочечные имиды и лактамы от N до C (Ede et al. в Smith and Rivier (Eds.) «Peptides: Chemistry and Biology», Escom, Leiden (1991), pp. 268-270). Пример этого приведен в конформационно ограниченных тимопентин-подобных соединениях, таких как раскрытые в патенте США № 4,457,489 (1985), Goldstein, G. et al., раскрытие которого включено посредством ссылки в данный документ во всей своей полноте. Третий способ заключается в замене пептидных связей в пептиде псевдопептидными связями, что придает устойчивость к протеолизу.
[0044] Был описан ряд псевдопептидных связей, которые в целом не влияют на структуру и биологическую активность пептида. Одним из примеров такого подхода является замена ретроинверсо-псевдопептидных связей («Biologically active retroinverso analogues of thymopentin», Sisto A. et al в Rivier, J. E. и Marshall, G. R. (eds) «Peptides, Chemistry, Structure and Biology», Escom, Leiden (1990), pp. 722-773) и Dalpozzo, et al. (1993), Int. J. Peptide Protein Res., 41:561-566, включенные в данный документ посредством ссылки). В соответствии с этой модификацией аминокислотные последовательности пептидов могут быть идентичны последовательностям пептида, описанным выше, за исключением того, что одна или более пептидных связей заменены ретроинверсо-псевдопептидной связью. Предпочтительно большая часть N-концевой пептидной связи является замещенной, поскольку такая замена придает устойчивость к протеолизу экзопептидазами, действующими на N-конец. Дополнительные модификации также можно осуществлять путем замещения химических групп аминокислот другими химическими группами с подобной структурой. Другой подходящей псевдопептидной связью, которая, как известно, повышает устойчивость к ферментативному расщеплению без потери или с незначительной потерей биологической активности, является уменьшенная изостерная псевдопептидная связь (Couder, et al. (1993), Int. J. Peptide Protein Res., 41:181-184, включено в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте).
[0045] Таким образом, аминокислотные последовательности этих пептидов могут быть иным образом идентичны последовательности ФТ, за исключением того, что одна или более пептидных связей заменены изостерной псевдопептидной связью. Предпочтительно, большая часть N-концевой пептидной связи является замещенной, поскольку такая замена придавала бы устойчивость к протеолизу экзопептидазами, действующими на N-конец. Синтез пептидов с одной или более восстановленными изостерными псевдопептидными связями известен из уровня техники (Couder et al. (1993), упомянуто выше). Другие примеры включают введение кетометиленовых или метилсульфидных связей для замены пептидных связей.
[0046] Пептоидные производные пептидов представляют собой другой класс пептидомиметиков, которые сохраняют важные структурные детерминанты для биологической активности, но устраняют пептидные связи, тем самым обеспечивая устойчивость к протеолизу (Simon, et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:9367-9371, включенный в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте). Пептоиды являются олигомерами N-замещенных глицинов. Был описан ряд N-алкильных групп, каждая из которых соответствует боковой цепи природной аминокислоты (Simon, et al. (1992), упомянуто выше). Некоторые или все аминокислоты пептидов могут быть заменены N-замещенным глицином, соответствующим замещенной аминокислоте.
[0047] Термин «пептидомиметик» или «миметик» также включает обратные D-пептиды и энантиомеры, определенные ниже.
d
d
d
d
d
d
d
d
d
[0048] Термин «обратный D-пептид» относится к биологически активному белку или пептиду, состоящему из D-аминокислот, расположенных в обратном порядке по сравнению с L-аминокислотной последовательностью пептида. Таким образом, карбоксиконцевой остаток пептида из L-аминокислот становится аминоконцевым для пептида из D-аминокислот и так далее. Например, пептид ETESH становится HSETE, где E, H, S, and T являются D-аминокислотами, соответствующими L-аминокислотам, E, H, S и T соответственно.
[0049] Термин «энантиомер» относится к биологически активному белку или пептиду, в котором один или более L-аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности пептида заменены соответствующим(и) D-аминокислотным(и) остатком(ами).
[0050] «Композиция», как используется в данном документе, в широком смысле относится к любой композиции, содержащей ФТ и необязательно дополнительное активное средство. Композиция может содержать сухой состав, водный раствор или стерильную композицию. Композиции, содержащие ФТ, могут быть использованы в качестве гибридизационных зондов. Зонды могут храниться в лиофилизированной форме и могут быть связаны со стабилизирующим средством, таким как углевод. При гибридизации зонд может быть размещен в водном растворе, содержащем соли, например, NaCl, детергенты, например, додецилсульфат натрия (SDS), и другие компоненты, например, раствор Денхардта, сухое молоко, ДНК из молок лососевых и т. д.
[0051] В одном варианте осуществления, в котором дополнительное активное средство используется в сочетании с ФТ, выражение «активное средство» используется для обозначения любого средства, обеспечивающего терапевтический эффект пациенту, нуждающемуся в этом и, предпочтительно, способного удалять нежелательные клеточные пролиферации и/или новообразование ткани. Подходящие активные средства могут включать, без ограничения: (i) противораковые активные средства (такие как алкилирующие средства, ингибиторы топоизомеразы I, ингибиторы топоизомеразы II, антиметаболиты РНК/ДНК и антимитотические средства); (ii) активные средства для лечения доброкачественных новообразований, такие как активные средства против акне и бородавок; (iii) антиандрогенные соединения (ципротеронацетат (1α,2ß-метилен-6-хлор-17α-ацетокси-6-дегидропрогестерон), тамоксифен, ингибиторы ароматазы); (iv) блокаторы альфа1-адренергических рецепторов (тамсулозин, теразозин, доксазозин, празозин, буназозин, индорамин, алфулзозин, силодозин); (v) ингибиторы 5α-редуктазы (финастерид, дутастерид); (vi) ингибиторы фосфодиэстеразы 5 типа (PDE5) (тадалафил) и их комбинации.
[0052] Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией или операцией, автор настоящего изобретения неожиданно обнаружил, что введение ФТ отдельно или в комбинации с другим активным средством приводило к апоптозу в железистом эпителии предстательной железы и распространенной, но селективной потере и атрофии эпителиальных клеток железы. Автор настоящего изобретения дополнительно обнаружил, что селективная потеря и атрофия эпителиальных клеток железы достигалась при сохранении смежной ткани, такой как простатический нерв, стромальная, сосудистая и соединительная ткани и мускулатура уретры.
[0053] У млекопитающих, пролеченных композициями, описанными в данном документе, наблюдалось уменьшение размера предстательной железы на одну дозу по сравнению с введением контрольной композиции, не содержащей ФТ, на величину в диапазоне от приблизительно 15 до приблизительно 75%, или от приблизительно 25 до приблизительно 50%, или от приблизительно 33 до приблизительно 48%.
[0054] Варианты осуществления включают способ лечения млекопитающего, страдающего разрастанием тканей предстательной железы, включающий введение ФТ однократно или более чем однократно млекопитающему отдельно или в комбинации с введением дополнительного активного средства. Способ включает, без ограничения, введение композиции, содержащей ФТ, внутримышечно, перорально, внутривенно, интраперитонеально, интрацеребрально (интрапаренхимально), интрацеребровентрикулярно, внутриочагово, интраокулярно, интраартериально, интратекально, интратуморально, интраназально, местно, трансдермально, подкожно, внутрикожно, трансректально, трансперитонеально либо отдельно, либо в конъюгированной с носителем форме. Композицию, содержащую ФТ, отдельно или в комбинации с дополнительным активным средством, можно вводить в количестве, достаточном для лечения значительной части предстательной железы. Под термином «значительный» подразумевается бóльшая часть или вся предстательная железа, и он может включать более 75% предстательной железы, более 80%, более 85%, более 90%, более 95%, более 98% или всю предстательную железу. Композицию можно вводить таким образом путем введения более высокой дозы в одну область железы и/или путем введения композиции более чем в одну, более чем в две или до 10 различных областей предстательной железы, в результате чего вводится значительно более высокая доза, чем вводилась ранее. При введении по существу во всю железу в повышенной дозе композиции, содержащие ФТ, могут дополнительно быть полезны для предупреждения более мелких злокачественных опухолей за счет бóльшего доступа ко всей железе. Например, введение композиций, описанных в данном документе, может приводить к значительному снижению частоты возникновения рака предстательной железы (1%, при этом обычно частота возникновения составляет приблизительно 20%).
[0055] Любое млекопитающее может получить пользу от применения настоящего изобретения, включая людей, мышей, кроликов, собак, овец и другой домашний скот, любое млекопитающее, подвергающееся лечению или поддающееся лечению ветеринаром, сотрудником зоопарка или работником заповедника. Предпочтительными млекопитающими являются люди, овцы и собаки. На протяжении всего данного описания млекопитающие и пациенты используются взаимозаменяемо.
[0056] Специалисту в данной области техники будет очевидно, что другие меньшие фрагменты ФТ могут быть выбраны таким образом, что эти пептиды будут обладать одинаковой или схожей биологической активностью. Специалист в данной области техники может выбрать другие фрагменты ФТ таким образом, чтобы эти пептиды обладали одинаковой или схожей биологической активностью. Пептиды согласно вариантам осуществления охватывают эти другие фрагменты. В общем, пептиды согласно вариантам осуществления имеют по меньшей мере 4 аминокислоты, предпочтительно по меньшей мере 5 аминокислот и более предпочтительно по меньшей мере 6 аминокислот.
[0057] Варианты осуществления также охватывают способы лечения млекопитающих (или пациентов), страдающих от разрастания тканей предстательной железы, предусматривающие введение композиции, содержащей ФТ, которая включает две или более последовательностей ФТ, соединенных вместе, совместно с дополнительным активным средством. Поскольку ФТ обладает желаемой биологической активностью, из этого следует, что две или более последовательности ФТ также будут обладать желаемой биологической активностью.
[0058] ФТ и его фрагменты, варианты, производные, гомологи, слитые белки и миметики, охватываемые этим вариантом осуществления, можно получать с применением способов, известных специалистам в данной области техники, таких как технология рекомбинантной ДНК, синтез белка и выделение встречающихся в природе пептидов, белков, вариантов, их производных и гомологов. ФТ и его фрагменты, варианты, производные, гомологи, слитые белки и миметики можно получать из других пептидов, белков и фрагментов, вариантов, их производных и гомологов с применением способов, известных специалистам в данной области техники. Такие способы включают (без ограничения) применение протеаз для расщепления пептида или белка до ФТ. Любой способ, раскрытый, например, в патентах США №№ 6,924,266; 7,241,738; 7,317,077; 7,408,021; 7,745,572; 8,067,378; 8,293,703; 8,569,446; и 8,716,247 и публикациях заявок на патент США №№ 2017/0360885; 2017/0020957; 2016/0361380; и 2016/0215031, можно применять для получения ФТ-пептида, описанного в данном документе.
[0059] Варианты осуществления по настоящему изобретению направлены на способы лечения млекопитающих, страдающих ДГПЖ, СНМП, ОЗМ, раком предстательной железы или другими нарушениями, требующими удаления или разрушения клеточных разрастаний, при этом лечение селективно удаляет железистую ткань с полным или почти полным сохранением основного нерва, стромальной, сосудистой, соединительной ткани, мускулатуры уретры и структурных элементов в непосредственной структурной близости к участкам, в которых проводится лечение. Такие способы предусматривают введение млекопитающему, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества ФТ отдельно или в комбинации с дополнительным активным средством в количестве, достаточном для лечения значительной части предстательной железы. Нуждающиеся млекопитающие могут представлять собой млекопитающих, страдающих ДГПЖ, СНМП, ОЗМ или раком предстательной железы, независимо от млекопитающих, также страдающих доброкачественной гиперплазией предстательной железы.
[0060] Дополнительное активное средство, если оно используется, может представлять собой одно или более активных средств, выбранных из (i) противораковых активных средств (таких как алкилирующие средства, ингибиторы топоизомеразы I, ингибиторы топоизомеразы II, антиметаболиты РНК/ДНК и антимитотические средства); (ii) активных средств для лечения доброкачественных новообразований, таких как активные средства против акне и бородавок (салициловая кислота); (iii) антиандрогенных соединений (ципротеронацетат (1α,2ß-метилен-6-хлор-17α-ацетокси-6-дегидропрогестерон), тамоксифен, ингибиторы ароматазы); (iv) блокаторов альфа1-адренергических рецепторов (тамсулозин, теразозин, доксазозин, празозин, буназозин, индорамин, алфулзозин, силодозин); (v) ингибиторов 5α-редуктазы (финастерид, дутастерид); (vi) ингибиторов фосфодиэстеразы 5 типа (PDE5) (тадалафил) и их комбинаций. Предпочтительно дополнительное активное средство выбрано из группы, состоящей из тамсулозина, финастерида, теразозина, доксазозина, празозина, тадалафила, алфулзозина, силодозина, дутастерида, комбинации дутастерида и тамсулозина и их смесей и комбинаций.
[0061] Терапевтические композиции, описанные в данном документе, могут содержать терапевтически эффективное количество ФТ в смеси с фармацевтически приемлемым носителем. В некоторых альтернативных вариантах осуществления дополнительное активное средство можно вводить в той же композиции на основе ФТ, а в других вариантах осуществления при этом композицию, содержащую ФТ, вводят в виде инъекции, тогда как дополнительное активное средство составляют в лекарственный препарат для перорального введения (гель, капсула, таблетка, жидкость и т. д.). Материалом носителя может быть вода для инъекций, предпочтительно дополненная другими материалами, общепринятыми в растворах для введения млекопитающим. Как правило, ФТ будут вводить в форме композиции, содержащей очищенный ФТ-пептид в сочетании с одним или более физиологически приемлемыми носителями, вспомогательными веществами или разбавителями. Нейтральный буферный солевой раствор или солевой раствор, смешанный с сывороточным альбумином, представляют собой иллюстративные соответствующие носители. Предпочтительно продукт составляют в виде лиофилизата с использованием соответствующих вспомогательных веществ (например, сахарозы). Другие стандартные носители, растворители и вспомогательные вещества могут быть включены по желанию. Композиции согласно вариантам осуществления также могут содержать буферы, известные специалистам в данной области техники, с подходящим диапазоном значений pH, включая трис-буфер с pH приблизительно 7,0-8,5 или ацетатный буфер с pH приблизительно 4,0-5,5, который может дополнительно включать сорбитол или подходящую его замену.
[0062] Твердые лекарственные формы для перорального введения включают, без ограничения, капсулы, таблетки, пилюли, порошки и гранулы. В таких твердых лекарственных формах дополнительное активное средство и/или ФТ могут быть смешаны с по меньшей мере одним из следующих: (a) одним или более инертными вспомогательными веществами (или носителем), такими как цитрат натрия или дикальций-фосфат; (b) наполнителями или сухими разбавителями, такими как крахмалы, лактоза, сахароза, глюкоза, маннит и кремниевая кислота; (c) связующими веществами, такими как карбоксиметилцеллюлоза, альгинаты, желатин, поливинилпирролидон, сахароза и аравийская камедь; (d) увлажняющими средствами, такими как глицерин; (e) разрыхлителями, такими как агар-агар, карбонат кальция, картофельный и тапиоковый крахмал, альгиновая кислота, определенные комплексные силикаты и карбонат натрия; (f) замедлителями растворения, такими как парафин; (g) ускорителями абсорбции, такими как соединения четвертичного аммония; (h) смачивающими средствами, такими как ацетиловый спирт и моностеарат глицерина; (i) адсорбентами, такими как каолин и бентонит; и (j) смазывающими средствами, такими как тальк, стеарат кальция, стеарат магния, твердые полиэтиленгликоли, лаурилсульфат натрия или их смеси. Для капсул, таблеток и пилюль лекарственные формы также могут содержать буферные средства.
[0063] Жидкие лекарственные формы для перорального введения включают фармацевтически приемлемые эмульсии, растворы, суспензии, сиропы и настойки. Вдобавок к активным соединениям жидкие лекарственные формы могут содержать инертные разбавители, обычно используемые в данной области, такие как вода или другие растворители, солюбилизирующие средства и эмульгаторы. Примерами эмульгаторов являются этиловый спирт, изопропиловый спирт, этилкарбонат, этилацетат, бензиловый спирт, бензилбензоат, пропиленгликоль, 1,3-бутиленгликоль, диметилформамид, масла, такие как хлопковое масло, арахисовое масло, масло из зародышей кукурузы, оливковое масло, касторовое масло и кунжутное масло, глицерин, тетрагидрофурфуриловый спирт, полиэтиленгликоли, сложные эфиры жирных кислот с сорбитаном или смеси этих веществ и тому подобное.
[0064] Помимо таких инертных разбавителей композиция может также содержать вспомогательные средства, такие как смачивающие средства, эмульгирующие и суспендирующие средства, подсластители, ароматизаторы и отдушки.
[0065] Фактические уровни дозировки активных ингредиентов в композициях согласно вариантам осуществления могут варьировать для получения количества ФТ и дополнительного активного средства, которое эффективно для получения необходимого терапевтического ответа для конкретной композиции и способа введения. Следовательно, выбранный уровень дозировки зависит от необходимого терапевтического эффекта, пути введения, необходимой продолжительности лечения и других факторов.
2
[0066] В случае млекопитающих, включая людей, эффективные количества можно вводить из расчета площади поверхности тела. Взаимосвязь дозировок для животных различных размеров, видов и людей (в пересчете на мг/м поверхности тела) описана в E. J. Freireich et al., Cancer Chemother. Rep., 50 (4):219 (1966). Площадь поверхности тела может быть примерно определена исходя из роста и веса индивидуума (см., например, Scientific Tables, Geigy Pharmaceuticals, Ardsley, NY pp. 537-538 (1970)).
[0067] Общая суточная доза ФТ-пептида и необязательного дополнительного активного средства, вводимых в организм, может находиться в единичной или разделенной дозах. Единица дозирования композиции может содержать такое количество таких дольных единиц, которое можно использовать для составления суточной дозы. Однако следует понимать, что конкретный уровень дозы для любого конкретного пациента будет зависеть от множества факторов, включая вес тела, общее состояние здоровья, пол, рацион, время и путь введения, эффективность вводимого лекарственного средства, скорость абсорбции и экскреции, комбинацию с другими лекарственными средствами и тяжесть конкретного заболевания, лечение которого осуществляют. Предпочтительно, чтобы композицию вводили только один раз в виде инъекции или инфузии, или в другом предпочтительном варианте осуществления композицию вводят в железу более чем в одно место. В этом варианте осуществления период времени между введением композиции может варьировать в любое время от 2 месяцев до 10 лет, от 8 месяцев до 4 лет или более чем приблизительно один год (например, от 1 до 2 лет).
[0068] Способ введения композиции, содержащей ФТ, в соответствии с вариантами осуществления предусматривает, без ограничения, введение композиций внутримышечно, перорально, внутривенно, интраперитонеально, интрацеребрально (интрапаренхимально), интрацеребровентрикулярно, интратуморально, внутриочагово, внутрикожно, интратекально, интраназально, интраокулярно, интраартериально, местно, трансректально, трансперитонеально, трансдермально, с помощью аэрозоля, инфузии, болюсной инъекции, имплантационного устройства, устройства замедленного высвобождения и т. д. Можно применять любой способ введения, раскрытый, например, в патентах США №№ 6,924,266; 7,241,738; 7,317,077; 7,408,021; 7,745,572; 8,067,378; 8,293,703; 8,569,446; и 8,716,247 и публикациях заявок на патент США №№ 2017/0360885; 2017/0020957; 2016/0361380; и 2016/0215031.
[0069] В некоторых вариантах осуществления выделенный ФТ-пептид можно вводить в комбинации с по меньшей мере одним активным средством, выбранным из группы, состоящей из (1) ингибитора 5α-редуктазы и/или антиэстрогена, (2) ингибитора 5α-редуктазы и/или ингибитора ароматазы, (3) ингибитора 5α-редуктазы и/или ингибитора 17β-HSD, (4) ингибитора 5α-редуктазы, антиэстрогена и ингибитора ароматазы, (5) ингибитора 5α-редуктазы, антиэстрогена и ингибитора 17β-HSD, (6) ингибитора 5α-редуктазы, ингибитора ароматазы, антиэстрогена и ингибитора 17β-HSD, (7) ингибитора 5α-редуктазы, антиандрогена и антиэстрогена, (8), ингибитора 5α-редуктазы, антиандрогена и ингибитора ароматазы, (9) ингибитора 5α-редуктазы, антиандрогена и ингибитора 17β-HSD, (10) ингибитора 5α-редуктазы, антиандрогена, антиэстрогена и ингибитора ароматазы, (11) ингибитора 5α-редуктазы, антиандрогена, ингибитора ароматазы и ингибитора 17β-HSD, (12) ингибитора 5α-редуктазы, антиандрогена, ингибитора ароматазы, антиэстрогена и ингибитора 17β-HSD, (13) ингибитора 17β-HSD и антиэстрогена, (14) ингибитора 17β-HSD и ингибитора ароматазы, (15) ингибитора 17β-HSD, ингибитора ароматазы и антиэстрогена, (16) ингибитора 17β-HSD, антиандрогена и антиэстрогена, (17) ингибитора 17β-HSD, антиандрогена и ингибитора ароматазы, (18) ингибитора 17β-HSD, антиандрогена, антиэстрогена и ингибитора ароматазы, (19) антиэстрогена и ингибитора ароматазы и (20) антиэстрогена, ингибитора ароматазы и антиандрогена, (21) агониста или антагониста LHRH, ингибитора 5α-редуктазы и антиэстрогена, (22) агониста или антагониста LHRH, ингибитора 5α-редуктазы и ингибитора ароматазы, (23) агониста или антагониста LHRH, ингибитора 5α-редуктазы и ингибитора 17β-HSD, (24) агониста или антагониста LHRH, ингибитора 5α-редуктазы, антиэстрогена и ингибитора ароматазы, (25) агониста или антагониста LHRH, ингибитора 5α-редуктазы, антиэстрогена и ингибитора 17β-HSD, (26) агониста или антагониста LHRH, ингибитора 5α-редуктазы, ингибитора ароматазы, антиэстрогена и ингибитора 17β-HSD, (27) агониста или антагониста LHRH, ингибитора 5α-редуктазы, антиандрогена и антиэстрогена, (28), агониста или антагониста LHRH, ингибитора 5α-редуктазы, антиандрогена и ингибитора ароматазы, (29) агониста или антагониста LHRH, ингибитора 5α-редуктазы, антиандрогена и ингибитора 17β-HSD, (30) агониста или антагониста LHRH, ингибитора 5α-редуктазы, антиандрогена, антиэстрогена и ингибитора ароматазы, (31) агониста или антагониста LHRH, ингибитора 5α-редуктазы, антиандрогена, ингибитора ароматазы и ингибитора 17β-HSD, (32) агониста или антагониста LHRH, ингибитора 5α-редуктазы, антиандрогена, ингибитора ароматазы, антиэстрогена и ингибитора 17β-HSD, (33) агониста или антагониста LHRH, ингибитора 17β-HSD и антиэстрогена, (34) агониста или антагониста LHRH, ингибитора 17β-HSD и ингибитора ароматазы, (35) агониста или антагониста LHRH, ингибитора 17β-HSD, ингибитора ароматазы и антиэстрогена, (36) агониста или антагониста LHRH, ингибитора 17β-HSD, антиандрогена и антиэстрогена, (37) агониста или антагониста LHRH, ингибитора 17β-HSD, антиандрогена и ингибитора ароматазы, (38) агониста или антагониста LHRH, ингибитора 17β-HSD, антиандрогена, антиэстрогена и ингибитора ароматазы, (39) агониста или антагониста LHRH, антиэстрогена и ингибитора ароматазы и (40) агониста или антагониста LHRH, антиэстрогена, ингибитора ароматазы и антиандрогена.
[0070] ФТ представляет собой новую молекулярную субстанцию, которая in vitro стимулирует сигнальные пути каспаз (активация каспаз 7, 8 и 10, доменов рекрутирования каспаз 6, 11, 14 и DIABLO), сигнальные пути факторов некроза опухоли (активация TNF1, TNFSF6, TNFSF8, TNFSF9, лигандов CD70 и рецепторов TNFRSF19L, TNFRSF25, TRAF2, TRAF3, TRAF4, TRAF6) и сигнальные пути BCL (активация HRK, BCL2L10 и BCL3) в эпителиальных клетках предстательной железы, как определено на основе генетических массивов данных культуры тканей. ФТ селективно вызывает нарушение целостности клеточной мембраны, блокировку митохондриального метаболизма, деплецию РНК, лизис и агрегацию ДНК, а также фрагментацию клеток и потерю клеток. Процесс апоптоза приводит к типичным ультраструктурным прогрессирующим изменениям разрушения и набухания мембраны, прогрессирующему углублению инвагинаций ядер с последующим образованием мембранных пузырьков и гибели клеток и их фрагментации в апоптотические тельца. При гистологическом исследовании типичные апоптотические изменения с положительным иммуногистохимическим окрашиванием маркеров апоптоза обнаруживают на всех участках инъекции в течение периода до нескольких недель после введения инъекции.
См., например,
et al
Ther Adv. Chronic Dis
[0071] ФТ прошел масштабные испытания у пациентов с ДГПЖ и у мужчин с раком предстательной железы низкой степени злокачественности (T1c). Соединение и контрольное плацебо вводили трансректальным путем в ходе более чем 1700 процедур в 9 клинических исследованиях с участием людей. В этих крупных долгосрочных клинических исследованиях мужчинам с ДГПЖ ФТ вводили в концентрации 0,25 мг/мл (2,5 мг ФТ, что означало введение приблизительно в 15-20% железы по объему).  Shore, ., «The potential for NX-1207 in benign prostatic hyperplasia: an update for clinicians», ., 2(6), pp. 377-383 (2011). В соответствии с описанными в данном документе вариантами осуществления и в свете неожиданного открытия того, что ФТ сохраняет простатический нерв, стромальную, сосудистую и соединительную ткани и мускулатуру уретры, ФТ можно вводить в значительно бóльших количествах, чем предполагалось ранее. В определенных вариантах осуществления ФТ можно вводить отдельно или в комбинации с другим активным средством в количестве от приблизительно 3,5 мг до приблизительно 350 мг мужчине со средней массой тела (приблизительно 86 кг, что преобразуется в дозу от приблизительно 0,04 до приблизительно 4 мг/кг массы тела), от приблизительно 4,0 мг до приблизительно 250 мг, от приблизительно 5,0 мг до приблизительно 150 мг, от приблизительно 10,0 мг до 350 мг или любое значение внутри этих диапазонов. В других вариантах осуществления такую же дозу ФТ, как ранее (2,5 мг - 12-20% по объему железы), или меньшие дозы можно вводить в несколько мест в предстательной железе во время одной и той же процедуры, или в одно и то же или в разные места с различными временными интервалами в диапазоне от одного дня до одной недели, повторно, по мере необходимости, в течение периода до приблизительно 8 недель для увеличения общей дозы в пределах вышеуказанных диапазонов и для лечения по существу всей предстательной железы. Автор настоящего изобретения также обнаружил в исследованиях на собаках породы бигль, которым вводили ФТ в дозах 0,28-1,6 мг/кг массы тела, что вес предстательной железы постоянно снижался после интрапростатической однократной инъекции ФТ (средний вес предстательной железы после введения ФТ при n=8 составил 4,36 г, среднее значение 3,4% от массы тела; по сравнению со средним значением у контрольных животных при n=9, 8,96 г, 6,4% от массы тела).
[0072] Следующие примеры предусмотрены для иллюстрации вариантов осуществления настоящего изобретения. Однако следует понимать, что варианты осуществления не должны быть ограничены конкретными условиями или деталями, описанными в этих примерах. Во всем описании любые и все ссылки на общедоступный документ, включая патент США, специально включены посредством ссылки. В частности, варианты осуществления прямо включают посредством ссылки примеры, содержащиеся в патентах США №№ 6,924,266; 7,241,738; 7,317,077; 7,408,021; 7,745,572; 8,067,378; 8,293,703; 8,569,446 и 8,716,247, а также в публикациях заявок на патент США №№ 2017/0360885; 2017/0020957; 2016/0361380 и 2016/0215031, в каждом(ой) из которых показано, что определенные пептиды, указанные в них, являются эффективными средствами, вызывающими гибель клеток in vivo в здоровой мышечной ткани, подкожной соединительной ткани, дерме и других тканях грызунов.
Примеры
[0073] Эксперименты проводили в разное время в течение 5 лет, поэтому количество крыс на группу не было строго одинаковым, хотя и сопоставимым. Все протоколы выполняли в соответствии с действующими нормативными актами и осуществлялись лицами, обученными обращению с животными, при использовании анестезии и других методик для неизменного обеспечения безболезненного проведения процедур и гуманного обращения с животными.
Пример один
[0074] Двухмесячных крыс линии Спрег-Доули (n=268) весом 200-300 г, размещенных в группах по 2-5 на клетку при комнатной температуре (24-26°C) со стандартным неограниченным кормом и водой, анестезировали эфиром, а затем им вводили инъекции методом открытой лапароскопии, с применением стерильных мер предосторожности и стерильных методик без применения антибиотиков, 0,3 мл ФТ 0,1-2,0 мг/мл в фосфатно-солевом буферном растворе (phosphate buffered saline, PBS) pH 7,4; инъекции вводили через стерильные иглы калибра 26G, прикрепленные к стерильным шприцам. Животным вводили инъекцию во «всю железу» в количестве, примерно в 20 раз превышающем количество, ранее вводимое людям. Контрольным животным (n=103) вводили 0,5 мл растворов (1) только среды-носителя PBS; (2) HCl в воде с pH 3,0-5,0; (3) неактивные синтетические пептиды (n=8) в PBS с pH 7,4 или (4) не вводили никаких инъекций. За крысами ежедневно наблюдали и безболезненно умерщвляли в интервалах от 24 часов до 12 месяцев после инъекции под каким-либо наркозом.
[0075] Подгруппы крыс получали повторные инъекции (2X-8X, один раз в неделю) (таблица 1). Посмертные обследования ограничивались простатой (полные независимые токсикологические исследования на крысах, кроликах и собаках проводили независимо в отдельных исследованиях, сведения о которых не представлены в данном документе, которые показали отсутствие токсических эффектов ФТ).
[0076] Предстательные железы удаляли, разрезали пополам и погружали в 10% раствор формалина, а затем заливали в парафин, рассекали и окрашивали (1) гематоксилин-эозином (H&E); (2) методом Бильшовского серебрения нервных волокон; и (3) с помощью иммуногистохимического окрашивания TUNEL. TUNEL (введение концевой метки биотинилированным dUTP с использованием терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы) выявляет фрагментацию ДНК путем мечения 3’-гидроксильных концов в двунитевых разрывах ДНК, возникших в процессе апоптоза. Клеточные линии предстательной железы (PC3 и LNCAP) обрабатывали с помощью ФТ 0,001 или 0,25 мг/мл на планшетах с 6, 24 и 48 лунками, собирали и осаждали через 0, 12, 24 и 48 часов. Электронную микроскопию проводили на срезах осадков (компания Analytical Biological Services, г. Уилмингтон, шт. Делавэр; и компания Paragon BioServices, г. Балтимор, шт. Мэриленд). Те же обработанные клеточные линии в тех же условиях также окрашивали in vitro после обработки с применением иммунофлуоресценции с окрашиванием аннексином V и просматривали в ультрафиолетовом свете, а потерю клеток in vitro оценивали количественно (Multitox-Fluor, Promega). Аннексин V связывается с фосфатидилсерином, который является маркером апоптоза при проявлении на внешней поверхности плазматической мембраны.
3
[0077] Апоптоз оценивали микроскопически в окрашенных H&E срезах, в том числе у крыс, умерщвленных через 24, 48 и 72 часа, 4-8 дней и 1, 3, 6 и 12 месяцев. Все срезы, полученные у крыс, которым вводили ФТ, были исследованы двумя независимыми экспертами, которые в табличном виде указывали степень атрофии и апоптоза, наличие или отсутствие нерва и соответствие норме или отклонения от нормы гистологического строения нервов в каждом срезе. Окрашивание TUNEL оценивали у 21 животного (через 72 часа; 7 дней после введения инъекции). Объем предстательной железы (рассчитанный путем аппроксимации к сфере с использованием среднего значения 8 перпендикулярных диаметров (2 на срез при 90 градусах; на четырех срезах) по формуле 4/3 π(D/2)) оценивали у всех животных и у всех контрольных особей. Блоки и срезы с тангенциальным разрезом исключали из измерений.
[0078] Краткий обзор групп животных в зависимости от введенной инъекции (концентрация введенного соединения, частота введения, интервал после введения инъекций до умерщвления) и полученные микроскопически измерения объема приведены в таблице 1.
Таблица 1. Объем предстательной железы у крыс, которым вводили ФТ, и у контрольных особей
1
<b>Группа</b>
<b>Кол-во</b>
<b>Объем, мм</b><sup><b>3</b></sup><b> - среднее значение (СО)</b>
<b>Группа</b>
<b>Кол-во</b>
<b>Объем, мм</b><sup><b>3</b></sup><b> - среднее значение (СО)</b>
Среда-носитель, 24 ч.
2
566,4 (58,6)
ФТ 1 мг/мл, 6 мес.
8
986,2 (560,9)<sup>7</sup>
Среда-носитель, 48 ч.
4
664,9 (475,8)
ФТ 1 мг/мл, 12 мес.
4
450,3 (129,0)<sup>8</sup>
Среда-носитель, 72 ч.
8
621,6 (266,6)
ФТ 2 мг/мл, 7 дней
5
251,7 (24,3)<sup>9</sup>
Среда-носитель, 96 ч.
5
392,6 (117,0)
ФТ 2 мг/мл, 3 мес.
4
616,8 (148,7)<sup>10</sup>
Среда-носитель, 5 дней
2
1182,9 (453,0)
ФТ 2 мг/мл, 6 мес.
4
776,3 (453,7)<sup>11</sup>
Среда-носитель, 7 дней
11
560,5 (205,9)
ФТ 2 мг/мл, 12 мес.
6
754,9 (483,3)<sup>12</sup>
Среда-носитель, 8 дней
4
400,2 (99,7)
ФТ 5 мг/мл, 7 дней
4
422,9 (33,2)
Среда-носитель, 1 мес.
2
1313,0 (406,7)
ФТ 1 мг/мл еженедельно X2 нед., 3 мес.
4
509,2 (200,3)
Среда-носитель, 3 мес.
2
966,3 (83,6)
ФТ 1 мг/мл, еженедельно, X2 нед., 12 мес.
4
497,3 (150,3)
Среда-носитель в группе контроля, 12 мес.
1
1291,7
ФТ 2 мг/мл еженедельно X2 нед., 3 мес.
4
651,9 (183,9)
Отсутствие инъекций, 24 ч.
5
444,8 (74,0)
ФТ, 2 мг/мл, еженедельно, X2 нед., 6 мес.
4
1401,1 (439,9)
Отсутствие инъекций, 72 ч.
4
338,1 (144,5)
ФТ, 2 мг/мл, еженедельно, X2 нед., 12 мес.
4
574,9 (264,1)
Отсутствие инъекций, 5 дней
4
327,6 (112,1)
ФТ 1 мг/мл ежедневно X3 дня, 3 дня
12
240,0 (51,0)
Отсутствие инъекций, 3 мес.
3
899,3 (174,7)
ФТ 1 мг/мл еженедельно X4 нед., 3 мес.
4
536,9 (87,7)
Отсутствие инъекций, 6 мес.
3
1809,7 (130,6)
ФТ 1 мг/мл еженедельно X4 нед., 6 мес.
5
705,4 (246,2)
HCl, pH 3,0-5,0, 24 ч-10 дней
12
859,7 (278,1)
ФТ 1 мг/мл еженедельно X4 нед., 12 мес.
8
745,9 (316,9)
Различные неактивные пептиды n=8, 5-10 дней
8
550,6 (76,8)
ФТ 2 мг/мл еженедельно X4 нед., 3 мес.
4
643,7 (270,3)
Среда-носитель еженедельно X2, 12 мес.
2
1720,9 (606,9)
ФТ, 2 мг/мл, еженедельно, X4 нед., 6 мес.
4
551,6 (246,8)
Среда-носитель еженедельно X4, 12 мес.
2
1099,5 (271,9)
ФТ, 2 мг/мл, еженедельно, X4 нед., 12 мес.
6
770,5 (222,4)
Среда-носитель еженедельно X8, 12 мес.
2
1030,3 (174,0)
ФТ 1 мг/мл еженедельно X8 нед., 3 мес.
4
663,5 (70,9)
ФТ 1 мг/мл, 24 ч.
20
387,0 (117,5)<sup>2</sup>
ФТ 1 мг/мл еженедельно X8 нед., 6 мес.
5
734,5 (203,3)
ФТ 1 мг/мл 48 ч.
16
226,4 (66,9)<sup>3</sup>
ФТ 1 мг/мл еженедельно X8 нед., 12 мес.
3
738,0 (153,5)
ФТ 1 мг/мл, 72 ч.
54
287,9 (104,7)<sup>4</sup>
ФТ 2 мг/мл еженедельно X8 нед., 3 мес.
3
728,4 (116,2)
ФТ 1 мг/мл, 7 дней
46
303,0 (102,7)<sup>5</sup>
ФТ 2 мг/мл еженедельно X8 нед., 6 мес.
4
897,6 (353,6)
ФТ 1 мг/мл 3 мес.
4
674,2 (195,0)<sup>6</sup>
ФТ 2 мг/мл еженедельно X8 нед., 12 мес.
8
805,7 (223,7)
Все контрольные особи (все частоты, все временные интервалы)
92
661,4 (368,4)
Все ФТ (все частоты, все временные интервалы)
268
476,8 (310,3)<sup>13</sup>
Все контрольные особи (≤ 7 дней)
64
587,5 (292,8)
Все ФТ (≤ 7 дней)
157
297,3 (106,8)<sup>14</sup>
Все контрольные особи с многократным введением, 12 мес.
7
1264,9 (421,4)
Все особи с многократным введением ФТ, 12 мес.
90
658,1 (317,1)<sup>15</sup>
<sup>1</sup>Однократное введение, если не указано иное
<sup>6</sup>p < 0,0001 в сравнении с введением только среды-носителя
<sup>11</sup>p=0,013 в сравнении с отсутствием инъекций
<sup>2</sup> Среда-носитель PBS при pH 7,4
<sup>7</sup>p=0,0374 в сравнении с отсутствием инъекций
<sup>12</sup>p=0,0667 в сравнении с многократными инъекциями среды-носителя
<sup>3</sup>p < 0,05 в сравнении с введением только среды-носителя
<sup>8</sup>p=0,005 в сравнении с многократными инъекциями
<sup>13</sup>p < 0,0001 в сравнении со всеми контрольными особями
<sup>4</sup>p=0,0012 в сравнении с введением только среды-носителя
<sup>9</sup>p=0,0055 в сравнении с введением только среды-носителя
<sup>14</sup>p < 0,0001 в сравнении со всеми контрольными особями, ≤ 7 дней
<sup>5</sup>p < 0,0001 в сравнении с введением только среды-носителя
<sup>10</sup>p=0,0405 в сравнении с введением только среды-носителя
<sup>15</sup>p < 0,0001 в сравнении со всеми контрольными особями, которым вводили многократные инъекции, 12 мес.
3
3
3
3
[0079] Средний объем у крыс, которым вводили ФТ, при всех частотах, концентрациях и временных интервалах составлял 476,8 мм (СО 310,3) по сравнению со средним объемом у контрольных особей 717,3 мм (СО 402,4) (p < 0,0001, ДИ от -317,62 до -163,38). Средний объем у всех крыс, которым вводили ФТ, при всех концентрациях через < 7 дней после введения инъекций (n=157) составлял 297,3 мм (СО 106,9) по сравнению со средним объемом у контрольных особей в течение < 7 дней (n=64) 587,5 мм (СО 292,8) (p < 0,0001, ДИ от -343,15 до -237,31).
[0080] Средние объемы у крыс, получавших ФТ в дозе 1 мг/мл, в сравнении только со средой-носителем (PBS) показаны графически на Фиг. 1a и b. Все значения, соответствующие отдельным временным точкам с достаточной статистической мощностью, были статистически значимо снижены у крыс, которым вводили ФТ, по сравнению с животными, которым вводили среду-носитель. Не было очевидных постоянных различий в снижении объема, обнаруживаемого при однократных дозах в диапазоне 0,5-5,0 мг/мл, и не было никаких очевидных различий между крысами, которым вводили однократную инъекцию ФТ и многократные инъекции ФТ при дозах 1 мг/мл или 2 мг/мл.
[0081] В срезах контрольных животных были случайные примеры (6/92 контрольных крыс) с распознаваемыми следами введения иглы. У двух (2/12) крыс, которым инъецировали HCl с pH 3,0-5,0, наблюдались очаговые ишемические или геморрагические инфаркты и некроз, поражающие < 5% площади поперечного сечения. У других животных, которым вводили HCl с pH 3,0-5,0, наблюдались микроскопические очаги (< 2% площади поперечного сечения) с очаговым некрозом. Не было никаких других примеров индуцированной инъекцией гематомы > 5% площади поперечного сечения. У всех контрольных особей отмечалось наличие нервов. У контрольных особей не наблюдалось гистологических признаков, описанных ниже в отношении предстательной железы крысы, которым вводили ФТ. Количество апоптотических клеток у контрольных животных, которым не вводили активное соединение, было незначительным (< 1 в поле зрения 100X). В железистом эпителии у контрольных животных, которым не вводили активное соединение или вводили только среду-носитель или неактивные пептиды в PBS, не было обнаружено значимых длительных изменений. Предстательные железы, в которые вводили PBS, были опухшими через интервалы времени < 72 часов. В интервалах времени > 7 дней у крыс, которым в предстательные железы вводили физиологический раствор, не было обнаружено дальнейшего отека.
[0082] У крыс, которым вводили ФТ, наблюдались следующие гистологические изменения, которые не были обнаружены у контрольных особей: (1) апоптотические изменения, состоящие из больших участков с очень выраженными клеточными изменениями гиперхроматических пикнотических ядер с изогнутой конфигурацией, прогрессирующих до появления меньших кругловатых разрушенных ядер и апоптотических телец, с клеточным растворением с бледностью, «тенями» клеток и исчезновением клеток через 24, 48, 72 часа, 1 неделю и в меньшей степени в последующие недели. Через 6 месяцев и через один год апоптотические изменения были нечастыми или больше не наблюдались; (2) положительный результат исследования TUNEL: в областях апоптотических изменений, описанных выше в пункте 1 отмечалось иммунопероксидазное окрашивание TUNEL в темно-коричневый цвет; (3) неизмененные по виду нервы во все моменты времени, включая через 6 месяцев и через 1 год; и (4) атрофия, состоящая из значительно сниженного общего объема предстательной железы. При гистологическом исследовании железистый эпителий изначально был нарушен, а затем постепенно отслаивался и постепенно исчез. Через 6 месяцев - 1 год во всей предстательной железе наблюдалась почти полная или полная потеря железистого эпителия. Стромальная соединительная ткань была сохранена, нервы и кровеносные сосуды были интактными через все интервалы времени. Таким образом, введение ФТ приводит к апоптозу железистого эпителия предстательной железы у млекопитающего и к обширной, но селективной потере и атрофии эпителиальных клеток желез.
[0083] Ультраструктурные изменения, обнаруженные in vitro через 24-48 часов, состояли из: (1) ядерных изменений (гиперконволюционных плотных ядер электронов с выраженными инвагинациями и складками); (2) разрушения ядерной мембраны и, в конечном итоге, образования выраженных ядерных пузырьков; (3) разрушения органелл с везикулярным отеком и разрушением и (4) прогрессирующего разрушения клеток, фрагментации и исчезновения в продуктах распада. Положительный результат in vitro по аннексину V был продемонстрирован в клеточных линиях предстательной железы. Необработанные контрольные образцы и контрольные лунки, обработанные средой или средой-носителем PBS, были отрицательными.
[0084] Количественные измерения РНК показали истощение в клеточных линиях предстательной железы, обработанных ФТ, через 24 часа. Количественные измерения гибели и потери клеток in vitro показали значимое истощение клеток при дозе ФТ 0,25 мг/мл по сравнению с дозой ФТ 0,001 мг/мл (таблица 2). Статистических различий в объеме предстательной железы у крыс in vivo после инъекций доз в диапазоне 0,5-5,0 мг/мл не наблюдалось. Также не было обнаружено стабильно значимых изменений в целом после многократных инъекций по сравнению с однократными инъекциями.
[0085] Исследования, приведенные в данном документе в качестве примера, демонстрируют, что ФТ приводит к апоптозу железистого эпителия предстательной железы у крыс и к обширной, но селективной потере и атрофии эпителиальных клеток желез. Снижение объема предстательной железы в исследованиях, представленных в данном документе, находится в диапазоне от 33 до 50% по сравнению с контрольными особями. Дозировка в исследованиях, представленных в данном документе, предусматривала объем инфузии, приблизительно равный объему предстательной железы, что обеспечивало возможность для ФТ достигнуть всех или почти всех популяций клеток ацинарного эпителия железы. Предстательная железа крысы является высококлеточной по сравнению с железой человека при ДГПЖ, при этом последняя имеет стромальную структуру до 50%. Кроме того, предстательная железа человека при ДГПЖ весит до 70-100 г или больше, и объем ФТ (доза 10 мл) на дозу объема предстательной железы у людей пропорционально меньше по сравнению с объемом у крыс на экспериментальную дозу объема предстательной железы.
[0086] Специфическая для железы молекулярная абляция разросшихся предстательных желез в переходной зоне предстательной железы с сохранением нерва, стромальной, сосудистой и соединительной ткани, а также мускулатуры уретры является новым механизмом действия для терапии простаты, который имеет важные преимущества. Предстательная железа выполняет жизненно важные мужские репродуктивные функции и расположена в непосредственной близости ко многим важным тазовым органам (уретра, мочевой пузырь, прямая кишка, семенные пузырьки). Неспецифическая абляция у некоторого процента пациентов неизбежно приводит к необратимому повреждению важных тазовых органов с развитием дисфункции. Обзор известных абляционных устройств, средств и их токсических эффектов, вызывающих сопутствующие повреждения, указывает на то, что, в целом, повреждение простатического нерва, стромальной, сосудистой и соединительной тканей обычно приводит к половому дефициту (эякуляторная дисфункция, импотенция, потеря либидо); повреждение уретры обычно приводит к ретроградной эякуляции и/или стриктурам; и повреждение прямой кишки или мочевого пузыря может привести к недержанию мочи, образованию свища, стриктур и/или дисфункции. Специфичность ФТ позволяет избежать большого спектра нежелательных явлений, связанных с неспецифическим повреждением других структур, связанным с абляцией.
[0087] Обширные, хорошо известные токсические эффекты неспецифической абляции хорошо задокументированы в опубликованных исследованиях устройств и инструкциях по эксплуатации устройств для выполнения высокоэнергетической трансдукционной абляции (лазерной; игольной абляции; микроволновой; криотерапии; высокоинтенсивной ультразвуковой), лучевой терапии (дистанционной; введение радиоактивных зерен для брахитерапии); а также в опубликованных данных по неспецифическим абразивным материалам (карболовая кислота; спирт и т. п.). В вышеупомянутых и других способах наблюдается неспецифическая абляция и неизбежное необратимое повреждение в некоторой степени чувствительных смежных структур. Системное введение химиотерапевтических препаратов является эффективным в отношении быстро растущих раковых тканей с побочными эффектами на другие уязвимые ткани с высокой скоростью базального метаболизма или с теми же рецепторами, на которые воздействует химиотерапия, при этом традиционные химиотерапевтические препараты обычно являются токсичными в отношении других тканей в некоторой различной степени. Например, ингибиторы 5-альфа-редуктазы (5-ARI) являются блокаторами пути тестостерона, которые уменьшают размер предстательной железы за счет уменьшения объема отдельных железистых клеток предстательной железы. 5-ARI-индуцированное уменьшение размера клеток является обратимой и не является абляцией само по себе. Препараты 5-ARI не подвергают абляции клетки предстательной железы или какие-либо соседние клетки; однако 5-ARI имеют много нежелательных побочных эффектов на другие ткани, связанные с дисбалансом пути тестостерона (такие как гинекомастия, импотенция, потеря либидо и возможный риск развития рака предстательной железы более высокой степени злокачественности).
[0088] Как продемонстрировано в данном документе, введение ФТ стабильно приводит к значительной и селективной потере эпителиальных апоптотических клеток предстательной железы и уменьшению размеров железы в отсутствие заметных повреждений смежных и окружающих тканей, включая нервы, стромальную, сосудистую и соединительную ткани, мускулатуру уретры и другие важные структуры. Селективный характер ФТ позволяет вводить более крупные дозы, чем ранее, и вводить по существу во всю железу, что приводит к полной или почти полной реверсии доброкачественного разрастания и устраняет необходимость в последующем лечении.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> НИМОКС КОРПОРЕЙШН
АВЕРБЕК, Пол
<120> СПОСОБ ИНДУЦИРОВАНИЯ СЕЛЕКТИВНОЙ МЕДИКАМЕНТОЗНОЙ АБЛЯЦИИ
ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ БЕЗ ПОВРЕЖДЕНИЯ НЕРВОВ И С СОХРАНЕНИЕМ ПОЛОВОЙ
ФУНКЦИИ
<130> 063307-0505946
<140> 16/110549
<141> 23.08.2018
<160> 1
<170> PatentIn версии 3.5
<210> 1
<211> 17
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид
<400> 1
Ile Asp Gln Gln Val Leu Ser Arg Ile Lys Leu Glu Ile Lys Arg Cys
1               5                   10                  15
Leu
<---