ЭЛИТНОЕ СОБЫТИЕ ЕЕ-GM3 И СПОСОБЫ И НАБОРЫ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ТАКОГО СОБЫТИЯ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБРАЗЦАХ
ELITE E-GM3 EVENT AND METHODS AND KITS FOR IDENTIFICATION OF SUCH EVENT IN BIOLOGICAL SAMPLES

Перекрестные ссылки на родственные заявки
Настоящая заявка претендует на приоритет согласно предварительной заявке на патент США No 61/367227, поданной 23 июля 2010 г.; предварительной заявке на патент США No 61/263690, поданной 23 ноября 2009 г.; и предварительной заявке на европейский патент No EP 09014564.0, поданной 23 ноября 2009 г., содержание каждой из которых полностью включено в настоящий документ посредством ссылки.
Область техники
Настоящее изобретение относится к трансгенным растениям, растительному материалу и семенам сои, характеризующимся содержанием специфического трансформационного события, в частности, присутствием генов, кодирующих белки, придающие устойчивость к гербицидам, и характеризующихся специфическим положением в геноме сои. Растения сои, согласно изобретению, объединяют фенотип устойчивости к гербицидам с агрономической продуктивностью, генетической стабильностью и функциональностью в различном генетическом окружении, эквивалентными нетрансформированной линии сои при отсутствии гербицида(ов). Кроме того, настоящее изобретение представляет способы и наборы для идентификации присутствия растительного материала, включающего специализированное трансформационное событие EE-GM3 в биологических образцах.
Уровень техники
Фенотипическая экспрессия трансгена в растениях определяется как структурой гена или генов самих по себе, так и его или их положением в геноме растения. В то же время присутствие трансгенов или "чужеродной ДНК" по различным положениям в пределах генома различными путями влияет на общий фенотип растения. Агрономически или промышленно успешное внедрение путем генетической манипуляции в организм растения признака, представляющего интерес с коммерческой точки зрения, в зависимости от различных факторов, может представлять собой продолжительную процедуру. Фактическая трансформация и регенерация генетически трансформированного растения является лишь первым этапом селекции, которая включает расширенное исследование генетических характеристик, скрещивание и полевые испытания, в конечном итоге приводящие к селекции элитного события.
Важность однозначной идентификации элитного события возрастает в свете обсуждения новых пищевых продуктов/кормов, разделения продуктов на основе генетически модифицированных и немодифицированных организмов и идентификации патентованных материалов. В идеале такой способ идентификации является как быстрым, так и простым, не требующим масштабного лабораторного оборудования. Кроме того, этот способ должен обеспечивать результаты, позволяющие однозначно определить элитное событие без экспертной интерпретации, однако при необходимости выдерживающие экспертную оценку. Специализированные инструменты для идентификации элитного события EE-GM3 в биологических образцах описаны в настоящей заявке.
В настоящем изобретении EE-GM3 идентифицировали как элитное событие из популяции трансгенных растений сои при разработке сои культурной (Glycine max), устойчивой к гербицидам, включающей ген, кодирующий устойчивость к глифосату, в комбинации с геном, придающим устойчивость к ингибиторам 4-гидроксифенилпируватдиоксигеназы (HPPD), каждый из которых находится под контролем промотора, обеспечивающего экспрессию в растительной клетке.
В литературе описаны растения сои, содержащие ген устойчивости к гербицидам. Однако ни одна из известных публикаций не сообщает о настоящем изобретении.
В данной области техники известно, что получение коммерческого элитного трансформационного события устойчивых к гербицидам растений сои, обладающих приемлемой агрономической продуктивностью без ухудшения урожайности и достаточной устойчивостью к гербицидам 2 различных классов является далеко не простой задачей.
В действительности, сообщалось, что первое событие сои (событие 40-3-2), поступившее на рынок как устойчивое к гербицидам, характеризовалось значительным ухудшением урожайности по сравнению с изогенными или приблизительно изогенными линиями (Elmore et al. (2001) Agron. J. 93:408-412).
Кроме того, была выведена соя Optimum GAT (TM), объединявшая свойства устойчивости к глифосату с устойчивостью к гербицидам, действующим на ацетолактатсинтазу, однако разработчики сообщали, что эта соя сама по себе не соответствовала стандартам устойчивости к глифосату (вне комбинации с другим событием устойчивости сои к глифосату, например, событием 40-3-2 (см., например, www.bloomberg.com/apps/news?pid=newsarchive&sid=ad4L0hH9MKWE)).
Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к трансгенному растению сои или его семени, клеткам и тканям, содержащим стабильно интегрированную в их геном экспрессионную кассету, включающую ген устойчивости к гербициду, включающий кодирующую последовательность гена 2mEPSPS и еще один ген устойчивости к гербициду, включающий кодирующую последовательность HPPD-PF W336 (в соответствии с описанием в Примере 1.1 настоящей заявки и как представлено в SEQ ID No 1), устойчивому к глифосату и гербициду-ингибитору HPDD, например, изоксафлютолу, и, при отсутствии гербицида(ов), обладающему агрономической производительностью, практически эквивалентной производительности нетрансгенной изогенной линии. После применения одного или более гербицидов, к которым растение обладает устойчивостью, оно демонстрирует агрономический фенотип, превосходящий фенотип нетрансгенного растения.
Согласно настоящему изобретению растение сои или его семя, клетки или ткани содержат элитное событие EE-GM3.
В частности, настоящее изобретение относится к трансгенным растениям сои, их семенам, клеткам или тканям, геномная ДНК которых характеризуется тем, что ее анализ согласно протоколу ПЦР-идентификации, как описано здесь, с использованием двух праймеров к 5’- или 3’-фланкирующей области EE-GM3 и чужеродной ДНК, включающей гены устойчивости к гербицидам, соответственно, обнаруживает фрагмент, специфический для EE-GM3. Мишенью праймеров могут являться 5’-фланкирующая область в пределах SEQ ID No: 2 и чужеродная ДНК, включающая гены устойчивости к гербицидам, соответственно. Мишенью праймеров, например, праймеров, включающих или состоящих (главным образом) из нуклеотидной последовательности SEQ ID No: 5 и SEQ ID No: 4 или SEQ ID No: 7, соответственно, также могут являться 3’-фланкирующая область в пределах SEQ ID No: 3 и чужеродная ДНК, включающая гены устойчивости к гербицидам, соответственно, при этом праймеры обнаруживают фрагмент ДНК размером от 100 до 800 п.о., например, фрагмент размером приблизительно 263 п.о. или 706 п.о.
Эталонные семена, содержащие элитное событие согласно изобретению, депонированы в NCIMB под номером доступа NCIMB 41659. Один из вариантов воплощения настоящего изобретения представляет семя, содержащее элитное событие EE-GM3, депонированное под номером доступа NCIMB 41659 и вырастающее в растение сои, устойчивое к гербицидам, в частности, устойчивое к глифосату и/или ингибиторам HPPD, например, изоксафлютолу. Семена, депонированные в NCIMB под номером доступа NCIMB 41659, представляют собой партию семян, состоящую по меньшей мере приблизительно на 95% из трансгенных семян, гомозиготных по внедренной ДНК и содержащих элитное событие согласно изобретению, которые вырастают в растения, устойчивые к гербицидам, причем эти растения являются устойчивыми к глифосату и/или изоксафлютолу. Семя или потомство семени, получаемое или полученное из депонированного семени (например, после скрещивания с другими растениями сои с другим генетическим окружением), можно высеять и обработать растущие растения глифосатом или изоксафлютолом, как описано здесь, получая растения, устойчивые к глифосату или изоксафлютолу, содержащие элитное событие согласно изобретению. Настоящее изобретение, кроме того, относится к клеткам, ткани и потомству растения, содержащего элитное событие согласно изобретению, выросшего из семени, депонированного в NCIMB под номером доступа NCIMB 41659. Настоящее изобретение, кроме того, относится к растениям, получаемым из (например, путем размножения или скрещивания с) растения сои, содержащего элитное событие согласно изобретению (например, растения, выросшего из семени, депонированного в NCIMB под номером доступа NCIMB 41659). Настоящее изобретение также относится к растениям сои, содержащим элитное событие EE-GM3.
Настоящее изобретение, кроме того, относится к способу идентификации трансгенного растения или его клеток или тканей, содержащих элитное событие EE-GM3, основанному на идентификации присутствия характерных последовательностей ДНК или аминокислотных последовательностей, кодируемых такими последовательностями ДНК трансгенного растения, клеток или тканей. Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения такие характерные последовательности ДНК представляют собой последовательности длиной 15 п.о. или по меньшей мере 15 п.о., предпочтительно 20 п.о. или по меньшей мере 20 п.о., наиболее предпочтительно 30 п.о. или более, содержащие сайты инсерции события, т.е. как фрагмент вставленной чужеродной ДНК, содержащей гены устойчивости к гербицидам, так и фрагмент генома сои (5’- или 3’-фланкирующую область), состыкованные друг с другом, что дает возможность специфической идентификации элитного события. Настоящее изобретение также относится к растениям, содержащим элитное событие EE-GM3, как описано здесь.
Настоящее изобретение, кроме того, относится к способам идентификации элитного события EE-GM3 в биологических образцах, основанным на использовании праймеров или зондов, специфически распознающих 5’- и/или 3’-фланкирующую последовательность чужеродной ДНК в EE-GM3, включающей гены устойчивости к гербицидам.
В частности, настоящее изобретение относится к способу, включающему амплификацию нуклеотидной последовательности, присутствующих в биологических образцах, с помощью полимеразной цепной реакции и. по меньшей мере, двух праймеров, один из которых распознает 5’- или 3’-фланкирующую область чужеродной ДНК в EE-GM3, включающей гены устойчивости к гербицидам, а другой распознает последовательность в пределах чужеродной ДНК, включающей гены устойчивости к гербицидам, предпочтительно для получения фрагмента ДНК размером между 100 и 800 п.о.. Праймеры могут распознавать последовательность в пределах 5’-фланкирующей области EE-GM3 (SEQ ID No 2, от положения 1 до положения 1451) или в пределах 3’-фланкирующей области EE-GM3 (комплементарную SEQ ID No 3, от положения 241 до положения 1408) и последовательность в пределах чужеродной ДНК, включающей гены устойчивости к гербициду (комплементарную SEQ ID No 2, от положения 1452 до положения 1843, или SEQ ID No 3, от положения 1 до положения 240), соответственно. Праймер, распознающий 3’-фланкирующую область, может включать нуклеотидную последовательность SEQ ID No 5, а праймер, распознающий последовательность в пределах чужеродной ДНК, включающей гены устойчивости к гербицидам, может включать нуклеотидную последовательность SEQ ID No 4 или SEQ ID No 7, описанные здесь. Настоящее изобретение также относится к специфическим праймерам и специфической ДНК, амплифицированной с помощью таких праймеров, как описано здесь.
В частности, настоящее изобретение относится к способу идентификации элитного события EE-GM3 в биологических образцах, причем этот способ включает амплификацию нуклеотидной последовательности, присутствующей в биологическом образце, с помощью полимеразной цепной реакции, использующей два праймера, включающие или состоящие (главным образом) из нуклеотидной последовательности SEQ ID No 4 и SEQ ID No 5, соответственно, и приводящей к получению фрагмента ДНК длиной приблизительно 263 п.о., либо два праймера, включающие или состоящие (главным образом) из нуклеотидной последовательности SEQ ID No 5 и SEQ ID No 7, соответственно, и приводящей к получению фрагмента ДНК длиной приблизительно 706 п.о.. Кроме того, настоящее изобретение включает растения, содержащие элитное событие EE-GM3, идентифицированное таким образом.
Настоящее изобретение, кроме того, относится к специфическим фланкирующим последовательностям EE-GM3, описанным здесь, которые можно использовать для разработки специфических способов идентификации EE-GM3 в биологических образцах. Такие специфические фланкирующие последовательности также можно использовать в качестве эталонного контрольного материала при анализах идентификации. А именно, настоящее изобретение относится к 5’- и/или 3’-фланкирующим областям EE-GM3, которые можно использовать для разработки специфических праймеров и зондов согласно дальнейшему описанию здесь. Кроме того, в качестве эталонного материала можно использовать молекулы нуклеиновых кислот, предпочтительно длиной приблизительно 150-850 п.о., включающие последовательность, которую можно амплифицировать с помощью праймеров, включающих или состоящих (главным образом) из нуклеотидной последовательности SEQ ID No 7 и SEQ ID No 5 или SEQ ID No 4 и SEQ ID No 5.
Настоящее изобретение, кроме того, относится к способам идентификации присутствия EE-GM3 в биологических образцах, основанным на использовании таких специфических праймеров или зондов. Праймеры могут включать, состоять из или главным образом состоять из нуклеотидной последовательности длиной от 17 до приблизительно 200 последовательных нуклеотидов, выбираемых из нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2, от нуклеотида 1 до нуклеотида 1451, или комплементарной цепи нуклеотидной последовательности SEQ ID No 3, от нуклеотида 241 до нуклеотида 1408, в комбинации с праймерами, включающими, состоящими из или главным образом состоящими из нуклеотидной последовательности длиной от 17 до приблизительно 200 последовательных нуклеотидов, выбираемых из нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2, например, нуклеотидной последовательности длиной от 17 до приблизительно 200 последовательных нуклеотидов, выбираемых из комплементарной цепи нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2, от нуклеотида 1452 до нуклеотида 1843, или нуклеотидной последовательности SEQ ID No 3, от нуклеотида 1 до нуклеотида 240. Праймеры также могут включать указанные нуклеотидные последовательности, расположенные непосредственно на их 3’-конце, и, кроме того, включать неродственные последовательности или последовательности, являющиеся производными упомянутых нуклеотидных последовательностей, но содержащие несоответствия.
Настоящее изобретение, кроме того, относится к наборам для идентификации элитного события EE-GM3 в биологических образцах, включающим по меньшей мере один праймер или зонд, специфически распознающий 5’- и/или 3’-фланкирующую последовательность чужеродной ДИК в EE-GM3.
Наборы, согласно изобретению, могут включать, кроме праймера, специфически распознающего 5’- или 3’-фланкирующую последовательность EE-GM3, второй праймер, специфически распознающий последовательность в пределах чужеродной ДНК в EE-GM3, содержащую гены устойчивости к гербицидам, для использования согласно Протоколу ПЦР-идентификации. Наборы, согласно изобретению, могут включать по меньшей мере два специфических праймера, один из которых распознает последовательность в пределах 5’-фланкирующей области EE-GM3, а второй распознает последовательность в пределах чужеродной ДНК в EE-GM3, содержащую гены устойчивости к гербицидам. Праймер, распознающий 3’-фланкирующую область, может включать нуклеотидную последовательность SEQ ID No 5, а праймер, распознающий трансгены или чужеродную ДНК, включающую гены устойчивости к гербицидам, может включать нуклеотидную последовательность SEQ ID No 4 или No: 7, или любой другой праймер или комбинацию праймеров, описанные здесь.
Настоящее изобретение, кроме того, относится к набору для идентификации элитного события EE-GM3 в биологических образцах, включающему праймеры для ПЦР, включающие или состоящие (главным образом) из нуклеотидной последовательности SEQ ID No 5 и SEQ ID No 4, для использования согласно Протоколу ПЦР-идентификации EE-GM3, описанному здесь.
Настоящее изобретение также относится к набору для идентификации элитного события EE-GM3 в биологических образцах, включающему специфический зонд, включающий или состоящий (главным образом) из последовательности, соответствующей (или комплементарной) последовательности, обладающей от 80% до 100% идентичности со специфической областью EE-GM3. В предпочтительном случае последовательность зонда соответствует специфической области, включающей часть 5’- или 3’-фланкирующей области EE-GM3. В наиболее предпочтительном случае специфический зонд включает или состоит (главным образом) из (или комплементарен) последовательности, обладающей от 80% до 100% идентичности с последовательностью, расположенной между нуклеотидами 1431-1472 SEQ ID No 2, или последовательности, обладающей от 80% до 100% идентичности с последовательностью, расположенной между нуклеотидами 220-260 SEQ ID No 3.
Согласно другому аспекту настоящего изобретения описанные последовательности ДНК включают сайт инсерции события и полинкулеотиды достаточной длины, относящиеся как к геному сои, так и к чужеродной ДНК, включающей гены устойчивости к гербицидам (трансгену), что обеспечивает возможность их использования в качестве праймера или зонда для обнаружения EE-GM3, и для определения характеристик растений, содержащих событие EE-GM3. Такие последовательности могут включать по меньшей мере 9 нуклеотидов геномной ДНК сои и аналогичное количество нуклеотидов чужеродной ДНК, включающей гены устойчивости к гербицидам, для EE-GM3 с каждой стороны сайта соединения, соответственно. В наиболее предпочтительном случае такие последовательности ДНК включают по меньшей мере 9 нуклеотидов геномной ДНК сои и аналогичное количество нуклеотидов чужеродной ДНК, включающей гены устойчивости к гербицидам (трансгена), примыкающие к сайту инсерции в SEQ ID No: 2 или SEQ ID No: 3. В одном из аспектов настоящего изобретения представлены растения сои, содержащие такие специфические последовательности ДНК.
Способы и наборы, охваченные настоящим изобретением, можно использовать для различных целей, например, не ограничиваясь этим: идентификации присутствия или определения (нижнего) порогового значения ЕЕ-СМ3 в растениях, растительном материале или продуктах, например, не ограничиваясь этим, в пищевых продуктах или кормах (свежих или обработанных), включающих или происходящих из растительного материала; дополнительно или альтернативно способы и наборы настоящего изобретения можно использовать для идентификации трансгенного растительного материала в целях разделения трансгенных и нетрансгенных материалов; дополнительно или альтернативно способы и наборы настоящего изобретения можно использовать для определения качества (т.е. процентного содержания чистого материала) растительного материала, включающего EE-GM3.
Настоящее изобретение также относится к 5’- и/или 3’-фланкирующим областям EE-GM3, а также к специфическим праймерам и зондам, разработанным на основе 5’- и/или 3’-фланкирующих последовательностей EE-GM3.
Настоящее изобретение также относится к геномной ДНК, полученной из растений, содержащих элитное событие EE-GM3. Такую геномную ДНК можно использовать в качестве эталонного контрольного материала при анализах идентификации, описанных здесь.
Кроме того, здесь представлены растения или клетки, части, семена или потомство трансгенной сои, устойчивой к гербицидам, каждое из которых содержит по меньшей мере одно элитное событие, причем указанное элитное событие включает чужеродную ДНК, включающую:
i) первый химерный ген, включающий модифицированный ген epsps из Zea mays, кодирующий фермент EPSPS, устойчивый к глифосату, под контролем промотора, обеспечивающего экспрессию в растительной клетке, и
ii) второй химерный ген, включающий модифицированный ген hppd из Pseudomonas fluorescens, кодирующий фермент HPPD, устойчивый к гербицидам-ингибиторам, под контролем промотора, обеспечивающего экспрессию в растительной клетке.
В одном варианте воплощения указанное элитное событие включает нуклеотиды 1-1451 SEQ ID No 2, примыкающие непосредственно сверху к указанной чужеродной ДНК, и нуклеотиды 241-1408 SEQ ID No 3, примыкающие непосредственно снизу к указанной чужеродной ДНК. В дополнительном варианте воплощения указанное элитное событие можно получить путем скрещивания с растением сои, выросшим из эталонного семени, содержащего указанное событие и депонированного в NCIMB под номером NCIMB 41659.
В еще одном варианте воплощения геномная ДНК указанного растения сои или его клеток, частей, семян или потомства при анализе согласно протоколу идентификации указанного элитного события с использованием двух праймеров, включающих нуклеотидную последовательность SEQ ID No 4 и SEQ ID No 5, соответственно, позволяет получить фрагмент ДНК длиной (приблизительно) 263 п.о.
Кроме того, здесь представлен способ идентификации трансгенного растения сои или его клеток, частей, семян или потомства, устойчивых к глифосату и/или гербициду-ингибитору HPPD, например, изоксафлютолу, в биологических образцах, причем указанный способ включает амплификацию фрагмента ДНК длиной между 100 и 500 п.о. из нуклеиновой кислоты, присутствующей в биологическом образце, с помощью полимеразной цепной реакции, использующей по меньшей мере два праймера, один из которых распознает 5’-фланкирующую область вышеуказанного элитного события, причем указанная 5’-фланкирующая область включает нуклеотидную последовательность SEQ ID No 2, от нуклеотида 1 до нуклеотида 1451, или 3’-фланкирующую область указанного элитного события, причем указанная 3’-фланкирующая область включает нуклеотидную последовательность комплементарной цепи SEQ ID No 3, от нуклеотида 241 до нуклеотида 1408, а другой из указанных праймеров распознает последовательность в пределах чужеродной ДНК, включающей нуклеотидную последовательность комплементарной цепи SEQ ID No 2, от нуклеотида 1452 до нуклеотида 1843, или нуклеотидную последовательность SEQ ID No 3, от нуклеотида 1 до нуклеотида 240.
Кроме того, здесь представлен набор для идентификации трансгенного растения сои или его клеток, частей, семян или потомства, устойчивых к глифосату и/или гербициду-ингибитору HPPD, например, изоксафлютолу, в биологических образцах, причем указанный набор включает праймер, распознающий 5’-фланкирующую область вышеуказанного элитного события, причем указанная 5’-фланкирующая область включает нуклеотидную последовательность SEQ ID No 2, от нуклеотида 1 до нуклеотида 1451, или праймер, распознающий 3’-фланкирующую область указанного элитного события, причем указанная 3’-фланкирующая область включает нуклеотидную последовательность комплементарной цепи SEQ ID No 3, от нуклеотида 241 до нуклеотида 1408, и праймер, распознающий последовательность в пределах чужеродной ДНК, причем указанная чужеродная ДНК включает нуклеотидную последовательность комплементарной цепи SEQ ID No 2, от нуклеотида 1452 до нуклеотида 1843, или нуклеотидную последовательность SEQ ID No 3, от нуклеотида 1 до нуклеотида 240.
В одном варианте воплощения настоящего изобретения чужеродная ДНК элитного события EE-GM3, как используется здесь, включает нуклеотидную последовательность SEQ ID No 11, от положения 1452 до положения 16638, или ее комплементарную цепь. или включает последовательность, обладающую по меньшей мере 95, 98, 99 или 99.5% идентичности с нуклеотидной последовательностью SEQ ID No 11, от положения 1452 до положения 16638, или ее комплементарной цепью.
Кроме того, здесь представлены растение, растительная клетка, ткань или семя сои, геном которых содержит молекулу нуклеиновой кислоты, включающую нуклеотидную последовательность, обладающую по меньшей мере 97, 98 или по меньшей мере 99% идентичности с нуклеотидной последовательностью SEQ ID No 11, от положения 1452 до положения 16638, или ее комплементарной цепью, или нуклеотидную последовательность, обладающую по меньшей мере 97, 98 или по меньшей мере 99% идентичности с SEQ ID No 11 или ее комплементарной цепью.
Один из вариантов воплощения настоящего изобретения представляет растение, растительную клетку, ткань или семя сои, геном которых содержит молекулу нуклеиновой кислоты, гибридизующуюся с нуклеотидной последовательностью SEQ ID No 1 или ее комплементарной цепью, или гибридизующуюся с нуклеотидной последовательностью SEQ ID No 11, от положения 1452 до положения 16638, или ее комплементарной цепью, или гибридизутощуюся с нуклеотидной последовательностью SEQ ID No 11 или ее комплементарной цепью.
Также здесь представлена выделенная молекула нуклеиновой кислоты, включающая нуклеотидную последовательность, по меньшей мере на 99% идентичную нуклеотидной последовательности SEQ ID No 11, от положения 1452 до положения 16638, или ее комплементарной цепи, или нуклеотидную последовательность, по меньшей мере на 99% идентичную SEQ ID No 11 или ее комплементарной цепи, или выделенная молекула нуклеиновой кислоты, включающая нуклеотидную последовательность, гибридизующуюся с нуклеотидной последовательностью SEQ ID No 11, от положения 1452 до положения 16638, или ее комплементарной цепью, или гибридизующуюся с нуклеотидной последовательностью SEQ ID No 11 или ее комплементарной цепью.
Краткое описание чертежей
Приведенные далее Примеры, не предназначенные для ограничения настоящего изобретения в рамках конкретных описанных вариантов воплощения, можно осмысливать в сочетании с прилагаемыми Фигурами, включенными в настоящий документ посредством ссылок, на которых:
Фиг.1: Схематическое представление взаимодействия между упомянутыми нуклеотидными последовательностями и праймерами. черный прямоугольник: чужеродная ДНК; заштрихованный прямоугольник: ДНК растительного происхождения; стрелка с клетчатой заливкой (а): химерный ген, кодирующий HPPD PF W366 (композицию химерного гена см. в Таблице 1); заштрихованная стрелка (б): химерный ген, кодирующий 2mEPSPS (композицию химерного гена см. в Таблице 1); черные стрелки: олигонуклеотидные праймеры, фигуры под прямоугольниками означают положения нуклеотидов; (в) относится к комплементарной цепи указанной нуклеотидной последовательности; Примечание: схема приведена без учета масштаба.
Фиг.2: Результаты, полученные с помощью протокола ПЦР-идентификации, разработанного для EE-GM3. Последовательность загрузки геля: Дорожка 1: Маркер молекулярной массы (лэддер 100 п.о.); дорожки 2 и 3: образцы ДНК из растений сои, содержащих трансгенное событие EE-GM3; дорожки 4-7: образцы ДНК из трансгенных растений сои, не содержащих элитное событие EE-GM3, но содержащих те же гены устойчивости к гербицидам (другие трансформационные события); дорожка 8: образец ДНК из сои дикого типа; дорожка 9: контроль, не содержащий матрицу ДНК; дорожка 10: маркер молекулярной массы.
Фиг.3: Результаты, полученные с помощью протокола ПЦР для оценки зиготности, разработанного для EE-GM3. Последовательность загрузки геля: Дорожка 1: Маркер молекулярной массы (лэддер 100 п.о.); дорожки 2 и 5: образцы ДНК из растений сои, содержащих трансгенное событие EE-GM3 в гомозиготной форме; дорожки 3, 8 и 9; образцы ДНК из растений сои, содержащих трансгенное событие EE-GM3 в гетерозиготной форме; дорожки 4, 6 и 7: контрольный образец ДНК из незиготического растения сои; дорожка 10: контроль, не содержащий матрицу ДНК; дорожка 11: маркер молекулярной массы.
Подробное описание предпочтительных вариантов воплощения изобретения
Включение молекулы рекомбинантной ДНК в геном растения обычно является результатом трансформации клетки или ткани. Конкретный сайт встраивания обычно обусловлен случайным встраиванием.
ДНК, включенную в геном растения в результате трансформации растительной клетки или ткани рекомбинантной ДНК, или "трансформирующей ДНК" и происходящую из такой трансформирующей ДНК, здесь и далее называют "чужеродной ДНК", включающей один или более "трансгенов". Трансгены EE-GM3 представляют собой гены устойчивости к глифосату и гербициду-ингибитору HPPD. "Растительная ДНК" в контексте настоящего изобретения относится к ДНК, происходящей из трансформированного растения. Растительная ДНК обычно находится в том же генетическом локусе соответствующего растения дикого типа. Чужеродную ДНК можно характеризовать по положению и конфигурации в сайте встраивания молекулы рекомбинантной ДНК в геном растения. Сайт генома растения, куда встраивают рекомбинантную ДНК, также называют "сайтом инсерции" или "сайтом-мишенью". Инсерция рекомбинантной ДНК в область генома растения, называемую "прединсерционная растительная ДНК" может быть связана с делецией растительной ДНК, называемой "делецией сайта-мишени". "Фланкирующая область" или "фланкирующая последовательность" здесь относится к последовательности длиной по меньшей мере 20 п.о., предпочтительно по меньшей мере 50 п.о., и до 5000 п.о. ДНК, отличающейся от внедренной ДНК, предпочтительно ДНК генома растения, примыкающей к чужеродной ДНК непосредственно сверху или примыкающей к чужеродной ДНК непосредственно снизу. Результатом процедур трансформации, приводящих к случайному встраиванию чужеродной ДНК, является получение трансформантов с различными фланкирующими областями, характерными и уникальными для каждого трансформанта. Если рекомбинантную ДНК внедряют в геном растения путем традиционного скрещивания, сайт ее инсерции в геноме растения или ее фланкирующие области в общем случае не изменяются.
"Выделенная нуклеиновая кислота (последовательность)" или "выделенная ДНК (последовательность)" здесь относится к нуклеиновой кислоте или ДНК (последовательности), которая более не находится в природном окружении, из которого ее выделили, например, нуклеотидной последовательности в геноме растения или другой бактерии-хозяина, или нуклеотидной кислоте или ДНК в составе гибрида с ДНК или нуклеиновой кислотой из другого источника, например, в составе химерного гена под контролем промотора, обеспечивающего экспрессию в растительной клетке.
Событием называют (искусственный) генетический локус, который в результате генно-инженерных манипуляций несет чужеродную ДНК или трансген, включающий по меньшей мере одну копию интересующего исследователя гена или генов. Типичные аллельные состояния события представляют собой наличие или отсутствие чужеродной ДНК. Событие описывают фенотипически по экспрессии трансгена. На генетическом уровне событие является частью генетической композиции растения. На молекулярном уровне событие можно описывать по рестриктазной карте (например, в соответствии с определением с помощью саузерн-блоттинга), по вверх и/или вниз фланкирующим последовательностям трансгена, положению молекулярных маркеров и/или молекулярной конфигурации трансгена. Обычно трансформация растения трансформирующей ДНК, включающей по меньшей мере один интересующий исследователя ген, приводит к получению популяции трансформантов, содержащей совокупность отдельных событий, каждое из которых является уникальным. Событие описывают по чужеродной ДНК и по меньшей мере одной из фланкирующих последовательностей.
Элитное событие в настоящем описании представляет собой событие, выбираемое из группы событий, полученных путем трансформации одной и той же трансформирующей ДНК, на основании экспрессии и стабильности трансгена(ов) и его совместимости с оптимальными агрономическими характеристиками растения, содержащего это событие. Таким образом, критерии селекции элитного события представляют собой один или более, предпочтительно два или более, наиболее предпочтительно - все критерии из следующего списка:
а) присутствие чужеродной ДНК не ставит под угрозу другие желательные характеристики растения, например, характеристики, относящиеся к агрономической производительности или коммерческой ценности;
б) событие описывается четко определенной молекулярной конфигурацией, которая стабильно наследуется и для которой можно разработать подходящие инструменты контроля идентичности;
в) ген(ы), интересующий(е) исследователя, демонстрирует(ют) корректную, адекватную и стабильную пространственную и временную фенотипическую экспрессию как в гетерозиготном (или гемизиготном), так и в гомозиготном состоянии события на коммерчески приемлемом уровне в диапазоне условий окружающей среды, при которых возможно нормальное агрономическое использование растений, несущих указанное событие.
В предпочтительном случае чужеродная ДНК ассоциирована с положением в геноме растения, позволяющим легко внедрять чужеродные последовательности в коммерчески желательное генетическое окружение.
Элитный статус события подтверждают интрогрессией элитного события в различные варианты генетического окружения, имеющие отношение к рассматриваемому вопросу, и наблюдением соответствия одному, двум или всем вышеприведенным критериям, например, а, б и в.
Таким образом, "элитное событие" относится к генетическому локусу, содержащему чужеродную ДНК и соответствующему вышеописанным критериям. Растение, растительный материал или потомство, например, семена, могут содержать одно или более элитных событий в составе своего генома.
Разработанные инструменты для идентификации элитного события либо растения, либо растительного материала, содержащего элитное событие, либо продукта, включающего растительный материал, содержащий элитное событие, основаны на специфических геномных характеристиках элитного события, например, специфической рестриктазной карте области генома, содержащей чужеродную ДНК, молекулярных маркерах или последовательности фланкирующей(и) области(ей) чужеродной ДНК.
После секвенирования одной или обеих фланкирующих областей чужеродной ДНК можно разработать праймеры и зонды, специфически распознающие эту (эти) последовательность(и) в нуклеиновой кислоте (ДНК или РНК) образца с помощью молекулярно-биологических методик. Например, можно разработать ПЦР-методику идентификации элитного события в биологических образцах (например, образцах растений, растительного материала или продуктов, содержащих растительный материал). Такая ПЦР основана по меньшей мере на двух специфических "праймерах", один из которых распознает последовательность в пределах 5’- или 3’-фланкирующей области элитного события, а второй распознает последовательность в пределах чужеродной ДНК. В предпочтительном случае праймеры обладают последовательностью длиной от 15 до 35 нуклеотидов, которая при оптимизированных для ПЦР условиях "специфически распознает" последовательность в пределах 5’- или 3’-фланкирующей области элитного события или чужеродной ДНК элитного события, соответственно, что приводит к амплификации специфического фрагмента ("интегрированного фрагмента" или отличительного ампликона) из образца нуклеиновой кислоты, содержащего элитное событие. Это означает, что при оптимизированных для ПЦР условиях происходит амплификация только интегрированного фрагмента-мишени и никакой другой последовательности, входящей в состав генома растения или чужеродной ДНК.
ПЦР-праймеры, подходящие для изобретения, могут представлять собой:
- олигонуклеотиды длиной от 17 до приблизительно 200 нуклеотидов, включающие на своем 3’-конце нуклеотидную последовательность длиной по меньшей мере 17 последовательных нуклеотидов, предпочтительно 20 последовательных нуклеотидов, выбираемых из ДНК растения в составе 5’-фланкирующей последовательности (SEQ ID No 2, от нуклеотида 1 до нуклеотида 1451) (праймеры, распознающие 5’-фланкирующие последовательности); или
- олигонуклеотиды длиной от 17 до приблизительно 200 нуклеотидов, включающие на своем 3’-конце нуклеотидную последовательность длиной по меньшей мере 17 последовательных нуклеотидов, предпочтительно 20 последовательных нуклеотидов, выбираемых из ДНК растения в составе 3’-фланкирутощей последовательности (комплементарной цепи SEQ ID No 3, от нуклеотида 241 до нуклеотида 1408) (праймеры, распознающие 3'-фланкирующие последовательности); или
- олигонуклеотиды длиной от 17 до приблизительно 200 нуклеотидов, включающие на своем 3’-конце нуклеотидную последовательность длиной по меньшей мере 17 последовательных нуклеотидов, предпочтительно 20 последовательных нуклеотидов, выбираемых из внедренных последовательностей ДНК (комплементарной цепи SEQ ID No 2, от нуклеотида 1452 до нуклеотида 1843) (праймеры, распознающие чужеродную ДНК); или
- олигонуклеотиды длиной от 17 до приблизительно 200 нуклеотидов, включающие нуклеотидную последовательность длиной по меньшей мере 17 последовательных нуклеотидов, предпочтительно 20 последовательных нуклеотидов, выбираемых из внедренных последовательностей ДНК (SEQ ID No 3, от нуклеотида 1 до нуклеотида 240); или
- подходящие олигонуклеотиды длиной от 17 до приблизительно 200 нуклеотидов, включающие нуклеотидную последовательность длиной по меньшей мере 17 последовательных нуклеотидов, предпочтительно 20 последовательных нуклеотидов, выбираемых из нуклеотидной последовательности фрагмента внедренной ДНК или ее комплементарной цепи (SEQ ID No 1 или SEQ ID No 11, от нуклеотида 1452 до нуклеотида 16638).
Разумеется, длина праймеров может быть более упомянутых 17 последовательных нуклеотидов, и может, например, составлять 20, 21, 30, 35, 50, 75, 100, 150, 200 нуклеотидов и даже более. Праймеры могут полностью состоять из нуклеотидной последовательности, выбираемой из упомянутых нуклеотидных последовательностей фланкирующих последовательностей и чужеродных последовательностей ДНК. В то же время, нуклеотидная последовательность 5’-конца праймеров (т.е. вне 17 последовательных нуклеотидов, расположенных на 3’-конце) является менее критичной. Так, 5’-последовательность праймеров может включать или состоять из нуклеотидной последовательности, выбираемой из фланкирующих последовательностей или чужеродной ДНК, если это необходимо, но может содержать несколько (например, 1, 2, 5 или 10) несовпадений. 5’-последовательность праймеров может даже полностью являться нуклеотидной последовательностью, не имеющей отношения к фланкирующим последовательностям или чужеродной ДНК, например, нуклеотидной последовательностью, представляющей собой один или несколько сайтов распознавания ферментов рестрикции. Такие неродственные последовательности или фланкирующие последовательности ДНК с несовпадениями в предпочтительном случае не должны превышать 100, а в более предпочтительном случае - 50 или даже 25 нуклеотидов в длину.
Кроме того, подходящие праймеры могут содержать, состоять (главным образом) из нуклеотидной последовательности на их 3’-конце, перекрывающей область соединения последовательностей растительной ДНК и последовательностей чужеродной ДНК (расположенной в положении 1451-1452 в SEQ ID No 2 и 24СЕ41 в SEQ ID No 3), что делает упомянутые 17 последовательных нуклеотидов, расположенных на 3’-конце, производными как чужеродной ДНК, так и последовательностей растительного происхождения SEQ ID No 2 или No 3.
Для специалиста будет очевидно, что правильно выбранная пара праймеров для ПЦР, кроме того, не должна содержать последовательностей, комплементарных друг другу.
Для целей настоящего изобретения "комплементарная цепь нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID No: X" представляет собой нуклеотидную последовательность, являющуюся производной представленной нуклеотидной последовательности путем замещения нуклеотидов их комплементарными нуклеотидами согласно правилам Чаргаффа (А<=>Т; G<=>С) и чтения последовательности в направлении от 5’ к 3’, т.е. противоположно представленной нуклеотидной последовательности.
Примеры подходящих праймеров представляют собой последовательности олигонуклеотидов SEQ ID No 5 (праймер, распознающий 3’-фланкирующую последовательность), SEQ ID No 4 (праймер, распознающий чужеродную ДНК для использования с праймерами, распознающими 3’-фланкирующую последовательность) или SEQ ID No 7 (праймер, распознающий чужеродную ДНК для использования с праймерами, распознающими 3’-фланкирующую последовательность).
Другие примеры подходящих олигонуклеотидных праймеров содержат на 3’-конце следующие последовательности или состоят (главным образом) из таких последовательностей:
а) праймеры, распознающие 5’-фланкирующую последовательность:
- нуклеотидная последовательность SEQ ID No 2 от нуклеотида 264 до нуклеотида 283
- нуклеотидная последовательность SEQ ID No 2 от нуклеотида 266 до нуклеотида 285
- нуклеотидная последовательность SEQ ID No 2 от нуклеотида 1240 до нуклеотида 1259
- нуклеотидная последовательность SEQ ID No 2 от нуклеотида 265 до нуклеотида 285
- нуклеотидная последовательность SEQ ID No 2 от нуклеотида 265 до нуклеотида 283
- нуклеотидная последовательность SEQ ID No 2 от нуклеотида 1239 до нуклеотида 1259
- нуклеотидная последовательность SEQ ID No 2 от нуклеотида 1241 до нуклеотида 1259
- нуклеотидная последовательность SEQ ID No 2 от нуклеотида 1244 до нуклеотида 1263
- нуклеотидная последовательность SEQ ID No 2 от нуклеотида 1248 до нуклеотида 1267
- нуклеотидная последовательность SEQ ID No 2 от нуклеотида 1250 до нуклеотида 1269
- нуклеотидная последовательность SEQ ID No 2 от нуклеотида 262 до нуклеотида 279
- нуклеотидная последовательность SEQ ID No 2 от нуклеотида 263 до нуклеотида 279
- нуклеотидная последовательность SEQ ID No 2 от нуклеотида 264 до нуклеотида 285
- нуклеотидная последовательность SEQ ID No 2 от нуклеотида 266 до нуклеотида 283
- нуклеотидная последовательность SEQ ID No 2 от нуклеотида 1238 до нуклеотида 1259
- нуклеотидная последовательность SEQ ID No 2 от нуклеотида 1242 до нуклеотида
- 1259 нуклеотидная последовательность SEQ ID No 2 от нуклеотида 1243 до нуклеотида 1263
- нуклеотидная последовательность SEQ ID No 2 от нуклеотида 1245 до нуклеотида 1263
- нуклеотидная последовательность SEQ ID No 2 от нуклеотида 1247 до нуклеотида 1267
- нуклеотидная последовательность SEQ ID No 2 от нуклеотида 1249 до нуклеотида 1269
- нуклеотидная последовательность SEQ ID No 2 от нуклеотида 1249 до нуклеотида 1267
- нуклеотидная последовательность SEQ ID No 2 от нуклеотида 263 до нуклеотида 285
- нуклеотидная последовательность SEQ ID No 2 от нуклеотида 267 до нуклеотида 283
- нуклеотидная последовательность SEQ ID No 2 от нуклеотида 1242 до нуклеотида 1263
- нуклеотидная последовательность SEQ ID No 2 от нуклеотида 1243 до нуклеотида 1259
- нуклеотидная последовательность SEQ ID No 2 от нуклеотида 1246 до нуклеотида 1267
- нуклеотидная последовательность SEQ ID No 2 от нуклеотида 1246 до нуклеотида 1263
- нуклеотидная последовательность SEQ ID No 2 от нуклеотида 1248 до нуклеотида 1269
-  нуклеотидная последовательность SEQ ID No 2 от нуклеотида 1250 до нуклеотида 1271
- нуклеотидная последовательность SEQ ID No 2 от нуклеотида 1250 до нуклеотида 1267
- нуклеотидная последовательность SEQ ID No 2 от нуклеотида 1241 до нуклеотида 1263
- нуклеотидная последовательность SEQ ID No 2 от нуклеотида 1245 до нуклеотида 1267
- нуклеотидная последовательность SEQ ID No 2 от нуклеотида 1247 до нуклеотида 1269
- нуклеотидная последовательность SEQ ID No 2 от нуклеотида 1247 до нуклеотида 1263
- нуклеотидная последовательность SEQ ID No 2 от нуклеотида 1249 до нуклеотида
- 1271 нуклеотидная последовательность SEQ ID No 2 от нуклеотида 1242 до нуклеотида
- 1261 нуклеотидная последовательность SEQ ID No 2 от нуклеотида 1241 до нуклеотида
- 1261 нуклеотидная последовательность SEQ ID No 2 от нуклеотида 1243 до нуклеотида
- 1261 нуклеотидная последовательность SEQ ID No 2 от нуклеотида 1240 до нуклеотида
- 1261 нуклеотидная последовательность SEQ ID No 2 от нуклеотида 1244 до нуклеотида
- 1261 нуклеотидная последовательность SEQ ID No 2 от нуклеотида 1239 до нуклеотида 1261
- нуклеотидная последовательность SEQ ID No 2 от нуклеотида 1245 до нуклеотида 1261
б) праймеры, распознающие чужеродную ДНК, для использования с праймерами, распознающими 5’-фланкирующую последовательность:
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1732 до нуклеотида 1751
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1735 до нуклеотида 1754
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1731 до нуклеотида 1750
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1732 до нуклеотида 1750
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1732 до нуклеотида 1752
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1731 до нуклеотида 1749
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1732 до нуклеотида 1749
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1731 до нуклеотида 1751
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1732 до нуклеотида 1753
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1731 до нуклеотида 1748
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1732 до нуклеотида 1748
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1735 до нуклеотида 1751
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1731 до нуклеотида 1752
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1732 до нуклеотида 1754
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1731 до нуклеотида 1747
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1731 до нуклеотида 1753
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1727 до нуклеотида 1746
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1727 до нуклеотида 1745
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1727 до нуклеотида 1747
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1727 до нуклеотида 1744
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1727 до нуклеотида 1748
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1727 до нуклеотида 1749
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1726 до нуклеотида 1745
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1726 до нуклеотида 1744
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1726 до нуклеотида 1746
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1726 до нуклеотида 1747
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1726 до нуклеотида 1748
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1724 до нуклеотида 1744
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1724 до нуклеотида 1745
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1724 до нуклеотида 1746
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1461 до нуклеотида 1478
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1670 до нуклеотида 1686
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1469 до нуклеотида 1486
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1508 до нуклеотида 1527
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1667 до нуклеотида 1686
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1670 до нуклеотида 1687
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1673 до нуклеотида 1689
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1688 до нуклеотида 1704
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1688 до нуклеотида 1705
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1692 до нуклеотида 1709
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1467 до нуклеотида 1486
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1481 до нуклеотида 1497
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1481 до нуклеотида 1498
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1491 до нуклеотида 1507
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 149 до нуклеотида 1508
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1672 до нуклеотида 1688
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1673 до нуклеотида 1690
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1673 до нуклеотида 1691
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1688 до нуклеотида 1706
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1691 до нуклеотида 1707
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1691 до нуклеотида 1708
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1469 до нуклеотида 1487
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1481 до нуклеотида 1499
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1489 до нуклеотида 1505
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1489 до нуклеотида 1506
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1489 до нуклеотида 1507
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1489 до нуклеотида 1508
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1666 до нуклеотида 1686
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1667 до нуклеотида 1687
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1670 до нуклеотида 1688
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1672 до нуклеотида 1689
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1688 до нуклеотида 1707
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1691 до нуклеотида 1709
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1692 до нуклеотида 1710
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1481 до нуклеотида 1500
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1491 до нуклеотида 1509
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1670 до нуклеотида 1689
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1672 до нуклеотида 1690
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1672 до нуклеотида 1691
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1687 до нуклеотида 1705
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1687 до нуклеотида 1706
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1691 до нуклеотида 1710
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1472 до нуклеотида 1488
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1488 до нуклеотида 1507
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1491 до нуклеотида 1510
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1495 до нуклеотида 1512
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1495 до нуклеотида 1513
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1495 до нуклеотида 1514
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1673 до нуклеотида 1692
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1678 до нуклеотида 1694
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1678 до нуклеотида 1695
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1678 до нуклеотида 1696
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1687 до нуклеотида 1703
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1687 до нуклеотида 1704
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1692 до нуклеотида 1711
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1469 до нуклеотида 1488
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1488 до нуклеотида 1506
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1491 до нуклеотида 1511
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1670 до нуклеотида 1690
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1678 до нуклеотида 1697
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1688 до нуклеотида 1709
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1467 до нуклеотида 1487
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1488 до нуклеотида 1508
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1495 до нуклеотида 1511
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1491 до нуклеотида 1512
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1666 до нуклеотида 1687
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1667 до нуклеотида 1688
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1672 до нуклеотида 1692
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1673 до нуклеотида 1693
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1687 до нуклеотида 1707
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1472 до нуклеотида 1490
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1472 до нуклеотида 1491
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1481 до нуклеотида 1501
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1489 до нуклеотида 1509
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1495 до нуклеотида 1515
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1670 до нуклеотида 1691
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1673 до нуклеотида 1694
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1678 до нуклеотида 1698
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1469 до нуклеотида 1489
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1667 до нуклеотида 1689
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1687 до нуклеотида 1708
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1688 до нуклеотида 1710
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1691 до нуклеотида 1711
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1472 до нуклеотида 1492
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1489 до нуклеотида 1510
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1666 до нуклеотида 1688
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1687 до нуклеотида 1709
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1692 до нуклеотида 1712
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1467 до нуклеотида 1488
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1469 до нуклеотида 1490
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1488 до нуклеотида 1509
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1489 до нуклеотида 1511
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1678 до нуклеотида 1699
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1472 до нуклеотида 1493
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1472 до нуклеотида 1494
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1481 до нуклеотида 1502
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1670 до нуклеотида 1692
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1469 до нуклеотида 1491
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1488 до нуклеотида 1510
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1691 до нуклеотида 1712
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1692 до нуклеотида 1713
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1692 до нуклеотида 1714
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1467 до нуклеотида 1489
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1678 до нуклеотида 1700
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1481 до нуклеотида 1503
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2 от нуклеотида 1691 до нуклеотида 1713
в) праймеры, распознающие 3’-фланкирующую последовательность:
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 3 от нуклеотида 828 до нуклеотида 847
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 3 от нуклеотида 830 до нуклеотида 849
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 3 от нуклеотида 828 до нуклеотида 846
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 3 от нуклеотида 828 до нуклеотида 848
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 3 от нуклеотида 830 до нуклеотида 848
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 3 от нуклеотида 830 до нуклеотида 850
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 3 от нуклеотида 828 до нуклеотида 845
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 3 от нуклеотида 830 до нуклеотида 847
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 3 от нуклеотида 828 до нуклеотида 849
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 3 от нуклеотида 830 до нуклеотида 851
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 3 от нуклеотида 828 до нуклеотида 844
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 3 от нуклеотида 830 до нуклеотида 846
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 3 от нуклеотида 828 до нуклеотида 850
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 3 от нуклеотида 830 до нуклеотида 852
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 3 от нуклеотида 992 до нуклеотида 1009
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 3 от нуклеотида 731 до нуклеотида 752
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 3 от нуклеотида 776 до нуклеотида 795
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 3 от нуклеотида 731 до нуклеотида 753
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 3 от нуклеотида 776 до нуклеотида 794
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 3 от нуклеотида 776 до нуклеотида 796
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 3 от нуклеотида 776 до нуклеотида 793
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 3 от нуклеотида 776 до нуклеотида 797
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 3 от нуклеотида 776 до нуклеотида 792
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 3 от нуклеотида 776 до нуклеотида 798
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 3 от нуклеотида 733 до нуклеотида 752
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 3 от нуклеотида 733 до нуклеотида 753
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 3 от нуклеотида 733 до нуклеотида 754
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 3 от нуклеотида 733 до нуклеотида 755
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 3 от нуклеотида 838 до нуклеотида 854
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 3 от нуклеотида 246 до нуклеотида 263
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 3 от нуклеотида 838 до нуклеотида 855
- комплементарная цепь нуклеотидной последовательности SEQ ID No 3 от нуклеотида 245 до нуклеотида 264
г. праймеры, распознающие чужеродную ДНК, для использования с праймерами, распознающими 3’-фланкирующую последовательность:
- нуклеотидная последовательность SEQ ID No 3 от нуклеотида 173 до нуклеотида 192
- нуклеотидная последовательность SEQ ID No 3 от нуклеотида 22 до нуклеотида 41
- нуклеотидная последовательность SEQ ID No 3 от нуклеотида 172 до нуклеотида 192
- нуклеотидная последовательность SEQ ID No 3 от нуклеотида 174 до нуклеотида 192
- нуклеотидная последовательность SEQ ID No 3 от нуклеотида 191 до нуклеотида 210
- нуклеотидная последовательность SEQ ID No 3 от нуклеотида 171 до нуклеотида 192
- нуклеотидная последовательность SEQ ID No 3 от нуклеотида 175 до нуклеотида 192
- нуклеотидная последовательность SEQ ID No 3 от нуклеотида 190 до нуклеотида 210
- нуклеотидная последовательность SEQ ID No 3 от нуклеотида 192 до нуклеотида 210
- нуклеотидная последовательность SEQ ID No 3 от нуклеотида 176 до нуклеотида 192
- нуклеотидная последовательность SEQ ID No 3 от нуклеотида 189 до нуклеотида 210
- нуклеотидная последовательность SEQ ID No 3 от нуклеотида 193 до нуклеотида 210
- нуклеотидная последовательность SEQ ID No 3 от нуклеотида 188 до нуклеотида 210
- нуклеотидная последовательность SEQ ID No 3 от нуклеотида 194 до нуклеотида 210
- нуклеотидная последовательность SEQ ID No 3 от нуклеотида 199 до нуклеотида 218
- нуклеотидная последовательность SEQ ID No 3 от нуклеотида 200 до нуклеотида 218
- нуклеотидная последовательность SEQ ID No 3 от нуклеотида 197 до нуклеотида 218
- нуклеотидная последовательность SEQ ID No 3 от нуклеотида 201 до нуклеотида 218
- нуклеотидная последовательность SEQ ID No 3 от нуклеотида 201 до нуклеотида 220
- нуклеотидная последовательность SEQ ID No 3 от нуклеотида 200 до нуклеотида 220
- нуклеотидная последовательность SEQ ID No 3 от нуклеотида 199 до нуклеотида 220
- нуклеотидная последовательность SEQ ID No 3 от нуклеотида 200 до нуклеотида 221
- нуклеотидная последовательность SEQ ID No 3 от нуклеотида 199 до нуклеотида 221
- нуклеотидная последовательность SEQ ID No 3 от нуклеотида 150 до нуклеотида 172
В настоящем описании "нуклеотидная последовательность SEQ ID No Z от положения Х до положения Y" означает нуклеотидную последовательность, включающую оба конечных нуклеотида.
В предпочтительном случае амплифицированный фрагмент обладает длиной между 50 и 500 нуклеотидами, например, между 100 и 350 нуклеотидами. Специфические праймеры могут обладать последовательностью, на 80-100% идентичной последовательности в пределах 5’- или 3’-фланкирующей области элитного события или чужеродной ДНК элитного события, соответственно, при условии, что несовпадения позволяют осуществлять специфическую идентификацию элитного события при использовании этих праймеров в условиях, оптимизированных для ПЦР. В то же время диапазон допустимых несовпадений легко определить экспериментально, и эти диапазоны известны специалистам.
Обнаружение интегрированных фрагментов можно осуществлять разными способами, например, за счет оценки размера фрагментов после анализа в геле. Интегрированные фрагменты также можно непосредственно секвенировать. Кроме того, известны другие способы обнаружения амплифицированных фрагментов ДНК, специфические по отношению к последовательностям.
Поскольку последовательность праймеров и их относительное расположение в геноме уникальны для элитного события, амплификация интегрированного фрагмента происходит только в биологических образцах, содержащих нуклеиновую кислоту элитного события. В предпочтительном случае при выполнении ПЦР для идентификации присутствия EE-GM3 в неизвестных образцах включают контроль с набором праймеров, при использовании которых можно амплифицировать фрагмент в пределах "гена домашнего хозяйства" вида растения, содержащего указанное событие. Гены домашнего хозяйства представляют собой гены, экспрессирующиеся в большинстве типов клеток и связанные с метаболической активностью, общей для всех клеток. В предпочтительном случае размер фрагмента, амплифицированного из гена домашнего хозяйства, превышает размер амплифицированного интегрированного фрагмента. В зависимости от анализируемых образцов можно включать другие контроли.
Стандартные протоколы ПЦР описаны, например, в "PCR Applications Manual" (Roche Molecular Biochemicals, 2nd Edition, 1999) и других источниках. Оптимальные условия для ПЦР, включая последовательность специфических праймеров, указаны в "Протоколе ПЦР-идентификации (или идентификации с помощью полимеразной цепной реакции)" для каждого элитного события. Вместе с тем, следует понимать, что может возникнуть необходимость коррекции ряда параметров протокола ПЦР-идентификации к условиям, специфическим для лаборатории, и их незначительной модификации для получения аналогичных результатов. Например, при использовании различных способов подготовки ДНК может требоваться коррекция, например, используемого количества праймеров, полимеразы и условий отжига. Аналогично выбор других праймеров может диктовать другие оптимальные условия протокола ПЦР-идентификации. Вместе с тем, эти варианты коррекции очевидны для специалистов и, более того, подробно описаны в современных руководствах по применению ПЦР, например, в указанном выше руководстве.
В качестве альтернативы для амплификации интегрированного фрагмента, который можно использовать в качестве "специфического зонда" для идентификации EE-GM3 в биологических образцах, можно использовать специфические праймеры. Взаимодействие нуклеиновой кислоты биологического образца с зондом в условиях, при которых возможна гибридизация зонда с соответствующим фрагментом нуклеиновой кислоты, приводит к образованию гибрида нуклеиновая кислота/зонд. Образование этого гибрида можно обнаружить (например, за счет мечения нуклеиновой кислоты или зонда), в соответствии с чем образование этого гибрида указывает на присутствие EE-GM3. Такие способы идентификации, которые основаны на гибридизации со специфическим зондом (на твердофазном носителе или в растворе), описаны в специальной литературе. Специфический зонд в предпочтительном случае представляет собой последовательность, которая при оптимизированных условиях специфически гибридизуется с областью в пределах 5’- или 3’-фланкирующей области элитного события, а также предпочтительно содержит непрерывный с этой областью фрагмент чужеродной ДНК (здесь и далее называемой "специфической областью"). В предпочтительном случае специфический зонд включает последовательность длиной от 50 до 500 п.о., предпочтительно от 100 до 350 п.о., которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 80-85%, более предпочтительно на 85-90%, особенно предпочтительно на 90-95%, наиболее предпочтительно на 95%-100%, идентична (или комплементарна) нуклеотидной последовательности специфической области. В предпочтительном случае специфический зонд включает последовательность длиной от приблизительно 15 до приблизительно 100 непрерывных нуклеотидов, идентичную (или комплементарную) специфической области элитного события.
Олигонуклеотиды, подходящие для использования в качестве ПЦР-праймеров для обнаружения элитного события EE-GM3, также можно использовать для разработки протокола определения статуса зиготности растений, содержащих указанное элитное событие, на основе ПЦР. Для этой цели сконструированы два праймера, распознающие локус дикого типа до интеграции, так что они являются мишенями друг для друга и обладают сайтом инсерции, расположенным между праймерами. Эти праймеры могут представлять собой праймеры, специфически распознающие 5’- и 3’-фланкирующие последовательности, находящиеся в пределах SEQ ID No 2 или 3, соответственно. Эти праймеры также могут представлять собой праймеры, специфически распознающие 5’- или 3’-фланкирующую последовательность. В настоящем изобретении особенно предпочтительные праймеры, распознающие локус дикого типа до интеграции, представляют собой праймеры, включающие или состоящие (главным образом) из нуклеотидной последовательности SEQ ID No 4 и SEQ ID No 6. Этот набор праймеров совместно с третьим праймером, комплементарным последовательностям трансформирующей ДНК (например, праймер, включающий или состоящий (главным образом) из нуклеотидной последовательности SEQ ID No 7), позволяет выполнять одновременную диагностическую ПЦР-амплификацию специфического локуса EE-GM3, а также локуса дикого типа. Если растение является гомозиготным по трансгенному локусу или соответствующему локусу дикого типа, диагностическая ПЦР приведет к образованию одиночного типичного продукта ПЦР, предпочтительно обладающего типичной длиной, для трансгенного локуса или локуса дикого типа. Если растение является гетерозиготным по трансгенному локусу, появятся два локус-специфичных продукта ПЦР, что отражает амплификацию как трансгенного локуса, так и локуса дикого типа.
Кроме того, используя представленную здесь специфическую информацию о последовательности элитного события, можно разработать специфические способы обнаружения элитного события EE-GM3, отличающиеся от способов амплификации на основе ПЦР. Такие альтернативные способы обнаружения включают способы обнаружения усиления линейного сигнала на основе инвазивного расщепления конкретных нуклеотидных структур, также известного как технология InvaderTM (согласно описанию, например, в патентах США 5985557 "Invasive Cleavage of Nucleic Acids", 6001567 "Detection of Nucleic Acid sequences by Invader Directed Cleavage", включенных в настоящий документ в качестве ссылок). С этой целью последовательность-мишень гибридизуют с меченным первым олигонуклеотидом, включающим нуклеотидную последовательность SEQ ID No 2, от нуклеотида 1452 до нуклеотида 1469, или ее комплементарную цепь, или указанным нуклеотидным зондом, включающим нуклеотидную последовательность SEQ ID No 3, от нуклеотида 223 до нуклеотида 240, или ее комплементарную цепь, а затем гибридизуют со вторым олигонуклеотидом, включающим нуклеотидную последовательность SEQ ID No 2, от нуклеотида 1434 до нуклеотида 1451, или ее комплементарную цепь, или указанным нуклеотидным зондом, включающим нуклеотидную последовательность SEQ ID No 3, от нуклеотида 241 до нуклеотида 258, или ее комплементарную цепь, причем первый и второй олигонуклеотид перекрываются по меньшей мере на один нуклеотид. Двойная или тройная структура, образующаяся при этой гибридизации, дает возможность селективного расщепления зонда ферментом (Cleavase) при сохранении последовательности-мишени. После этого выполняют обнаружение расщепленного меченного зонда, возможно, через промежуточный этап, приводящий к дальнейшему усилению сигнала.
Термин "набор", используемый здесь, относится к набору реактивов для осуществления способа согласно изобретению, в частности, идентификации элитного события EE-GM3 в биологических образцах или определения статуса зиготности растительного материала, содержащего EE-GM3. В частности, предпочтительный вариант воплощения набора, согласно изобретению, включает по меньшей мере один или два специфических праймера, согласно вышеприведенному описанию для идентификации элитного события или три специфических праймера для определения статуса зиготности. Необязательно набор может еще включать любой другой реактив, описанный здесь в Протоколе ПЦР-идентификации. В альтернативном случае, согласно еще одному варианту воплощения настоящего изобретения, набор может включать специфический зонд согласно вышеприведенному описанию, специфически гибридизующийся с нуклеиновой кислотой биологических образцов, для идентификации присутствия EE-GM3 в них. Необязательно набор может еще включать любой другой реактив (включая буфер для гибридизации, метку, но не ограничиваясь ими) для идентификации EE-GM3 в биологических образцах с использованием специфического зонда.
Набор, согласно изобретению, может быть использован, а его компоненты могут быть специфически адаптированы для целей контроля качества (например, чистоты партий семян), обнаружения присутствия или отсутствия элитного события в растительном материале, включающем растительный материал или являющимся его производным, например, не ограничиваясь этим, в пищевых продуктах или кормах Используемая здесь, "идентичность последовательности" по отношению к нуклеотидным последовательностям (ДНК или РНК) относится к количеству положений, содержащих идентичные нуклеотиды, разделенному на количество нуклеотидов в более короткой из двух последовательностей. Выравнивание двух нуклеотидных последовательностей осуществляют согласно алгоритму Уилбера и Липманна (Wilbur and Lipmann, 1983, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 80:726), используя размер окна, равный 20 нуклеотидам, длину слова, равную 4 нуклеотидам, и штраф за пропуск, равный 4. Компьютерный анализ и интерпретацию данных о последовательности, включая выравнивание последовательностей согласно вышеприведенному описанию, можно выполнить, например, с помощью программного пакета анализа последовательностей Genetics Computer Group (GCG, биотехнологический центр Висконсинского университета). Последовательности называют "существенно сходными", если такие последовательности обладают идентичностью, составляющей по меньшей мере приблизительно 75%, в частности, по меньшей мере приблизительно 80%, более конкретно - по меньшей мере приблизительно 85%, еще конкретнее - по меньшей мере приблизительно 90%, в особенности - по меньшей мере приблизительно 95%, в наибольшей степени - по меньшей мере приблизительно 98% или по меньшей мере приблизительно 99%. Очевидно, что если о последовательностях РНК говорят как о существенно сходных или обладающих некоторой степенью идентичности с последовательностями ДНК, то тимидин (Т) в последовательности ДНК приравнивают к урацилу (U) в последовательности РНК. Кроме того, очевидно, что со временем в последовательностях ДНК могут возникать небольшие различия или мутации и что некоторые несовпадения могут быть допустимы для специфических для события праймеров или зондов согласно изобретению, поэтому любая последовательность ДНК, указанная здесь в любом варианте воплощения настоящего изобретения для любой 3’- или 5’-фланкирующей ДНК, или для любой внедренной или чужеродной ДНК, или любого праймера или зонда согласно изобретению, также включает последовательности, существенно сходные с последовательностями, представленными здесь, например, последовательности, гибридизующиеся с или обладающие по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или по меньшей мере 99% идентичностью с последовательностями, приведенными для любой 3’- или 5’-фланкирутощей ДНК, для любого праймера или зонда или для любой внедренной или чужеродной ДНК согласно настоящему изобретению.
Термин "праймер", используемый здесь, включает любую нуклеиновую кислоту, способную являться затравкой синтеза образующейся нуклеиновой кислоты в процессе матричного синтеза, например, ПЦР. Обычно праймеры представляют собой олигонуклеотиды длиной от 10 до 30 нуклеотидов, однако можно использовать и более длинные последовательности. Праймеры могут быть представлены в двуцепочечной форме, хотя предпочтительной является одноцепочечная форма.
Зонды можно использовать в качестве праймеров, однако они предназначены для связывания с ДНК или РНК-мишенями и не требуются в процессе амплификации.
Термин "распознавание", используемый здесь в отношении специфических праймеров, относится к тому, что специфические праймеры специфически гибридизуются с последовательностью ДНК элитного события в условиях, установленных согласно способу (например, в условиях согласно Протоколу ПЦР-идентификации), причем специфичность определяют с помощью положительных и отрицательных контролей.
Термин "гибридизующийся", используемый здесь в отношении специфических зондов, относится к тому, что зонд связывается со специфической областью нуклеотидной последовательности элитного события в условиях стандартной жесткости. Условия стандартной жесткости, как используется здесь, относятся к условиям гибридизации, описанным здесь, или к стандартным условиям гибридизации согласно описанию в Sambrook et al., 1989 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY), которая, например, может включать следующие этапы: 1) иммобилизацию фрагментов геномной ДНК растения на фильтре, 2) предварительную гибридизацию фильтра в течение 1-2 часов при 42°C в 50% формамиде, 5 Х стандартном фосфатно-солевом буфере с ЭДТА (SSPE), 2 Х реактиве Денхардта и 0.1% ДСН или в течение 1-2 часов при 68°C в 6 Х стандартном цитратно-солевом буфере (SSC), 2 Х реактиве Денхардта и 0.1% ДСН, 3) внесение меченного гибридизационного зонда, 4) инкубирование в течение 16-24 часов, 5) промывку фильтра в течение 20 мин при комнатной температуре в 1 Х SSC, 0.1% ДСН, 6) трехкратную промывку фильтра в течение 20 мин, каждый раз при 68°C в 0.2 Х SSC, 0.1% ДСН, и 7) экспонирование фильтра в течение 24-48 часов на рентгеновскую пленку при -70°C с усиливающим экраном.
Используемый здесь, биологический образец представляет собой образец растения, растительного материала или продуктов, содержащих растительный материал. Термин "растение" включает ткани растения сои культурной (Glycine max) на любой стадии развития, а также любые клетки, ткани или органы, собранные или происходящие от такого растения, включая любые семена, листья, стебли, цветки, корни, отдельные клетки, гаметы, культуры клеток, культуры тканей или протопласты, но не ограничивается ими. "Растительный материал", как используется здесь, относится к материалу, полученному или происходящему от растения. Продукты, включающие растительный материал, относятся к продуктам питания, кормам или другим продуктам, изготовленным с использованием растительного материала, или, возможно, загрязненным растительным материалом. Следует понимать, что в контексте настоящего изобретения такие биологические образцы проверяют на присутствие нуклеиновых кислот, специфических для EE-GM3, предполагая присутствие нуклеиновых кислот в этих образцах. Таким образом, способы в настоящей заявке для идентификации элитного события EE-GM3 в биологических образцах относятся к идентификации нуклеиновых кислот, включающих указанное элитное событие, в биологических образцах.
Используемый здесь, термин "включающий" следует понимать как обозначение наличия указанных свойств, единиц, этапов, реагентов или компонентов, к которым относится термин, не исключающее наличия или добавления одного или нескольких свойств, единиц, этапов, компонентов или их групп. Так, например, нуклеиновая кислота или белок, включающие нуклеотидную или аминокислотную последовательность, могут включать, кроме фактически указанных, дополнительные нуклеотиды или аминокислоты, т.е. являться частью более крупной нуклеиновой кислоты или белка. Химерный ген, включающий функционально или структурно определенную последовательность ДНК, может включать дополнительные последовательности ДНК, например, последовательности промотора и терминатора транскрипции.
Настоящее изобретение также относится к разработке элитного события EE-GM3 в сое, к растениям, включающим это событие, к потомству и семенам, включающим элитное событие EE-GM3 и полученным от этих растений, и к растительным клеткам или растительному материалу, происходящему от растений, включающих указанное событие. Растения, включающие элитное событие EE-GM3, можно получить согласно описанию в Примере 1. Настоящее изобретение также относится к семени, содержащему элитное событие EE-GM3 и депонированному в NCIMB под номером NCIMB 41659 или его производным, содержащим элитное событие EE-GM3. "Производные (семени)", как использовано здесь, относятся к растениям, которые могут вырасти из такого семени, потомству, полученному от скрещивания или возвратного скрещивания, а также к их клеткам, органам, частям, тканям, культурам клеток, протопластам и растительному материалу.
Растения сои или растительный материал, содержащий EE-GM3, можно идентифицировать согласно Протоколу ПЦР-идентификации, описанному для EE-GM3 в Примере 2. Вкратце геномную ДНК сои, присутствующую в биологическом образце, подвергают ПЦР-амплификации, используя праймер, специфически распознающий последовательность в пределах 5’- или 3’-фланкирующей последовательности EE-GM3, например, праймер с последовательностью SEQ ID No: 5, и праймер, распознающий последовательность чужеродной ДНК, например, праймер с последовательностью SEQ ID No: 4. ДНК-праймеры, амплифицирующие часть эндогенной последовательности сои, используют в качестве положительного контроля ПЦР-амплификации. Если при ПЦР-амплификации из материала получают фрагмент ожидаемого размера, то этот материал содержит растительный материал из растения сои, несущего элитное событие EE-GM3.
Растения, несущие EE-GM3, характеризуются устойчивостью к глифосату, а также к ингибиторам HPPD, например, изоксафлютолу. Растения, несущие EE-GM3, при отсутствии применения гербицидов также характеризуются агрономическими характеристиками, сопоставимыми с доступными для приобретения сортами сои. Обнаружено, что присутствие чужеродной ДНК в области инсерции генома растения сои, описанных здесь, придает растениям, содержащим это событие, особенно интересные фенотипические и молекулярные характеристики.
Один из вариантов воплощения настоящего изобретения представляет элитное событие в растениях сои, которое можно получить путем инсерции 2 трансгенов по специфическому положению в геноме сои, причем это элитное событие придает таким растениям сои устойчивость к глифосату и гербицидам-ингибиторам HPPD, например, изоксафлютолу, и не оказывает действия на агрономическую производительность такой сои, отрицательно влияя на урожайность таких растений сои по сравнению с изогенными линиями (как используется здесь, "изогенные линии" или "почти изогенные линии" представляют собой линии сои, обладающие таким же генетическим окружением, но не содержащие трансгенов, например, растения с генетическим окружением, аналогичным генетическому окружению растения, используемого для трансформации, или отделяющиеся сестринские линии, потерявшие трансгены). В частности, настоящее изобретение представляет элитное событие в растениях сои, причем инсерция или наличие указанного элитного события в геноме таких растений сои не вызывает повышенной подверженности к заболеваниям, потери урожайности или усиления полегания таких растений сои по сравнению с изогенными линиями. Следовательно, настоящее изобретение представляет элитное событие в растениях сои, обозначаемое как EE-GM3, приводящее к получению растений сои, устойчивых к применению глифосата и гербицидов-ингибиторов HPPD (одновременно или по отдельности), и не оказывающую отрицательного влияния на указанные растения сои по сравнению с изогенными линиями, причем указанные растения сои не обладают статистически значимыми различиями, касающимися подверженности заболеваниям или полегания, по сравнению с изогенными растениями сои. Указанные характеристики делают данное элитное событие очень интересным для контроля устойчивых к глифосату сорных растений на полях сои, а также могут использоваться в подходах для предотвращения или задержки дальнейшего развития устойчивости к глифосату на полях сои (например, путем применения глифосата и изоксафлютола, обеспечивая применение на поле сои гербицидов, обладающих 2 механизмами действия).
Здесь также представлено растение сои или его часть, содержащая событие EE-GM3, причем типичное семя сои, содержащее событие EE-GM3, депонировано в NCIMB под номером доступа 41659. Кроме того, здесь представлены семена таких растений, содержащие такое событие, а также соевые продукты, изготовленные из таких семян, содержащие событие EE-GM3. Такие соевые продукты могут представлять собой или содержать крупу, молотые семена, муку, хлопья и т.д.. В частности, такой соевый продукт содержит нуклеиновую кислоту, образующую ампликон, характерный или специфический для события EE-GM3 и включающий SEQ ID No 2 или 3. Кроме того, здесь представлен способ получения соевого продукта, включающий получение семян сои, содержащих событие EE-GM3, и изготовления из них такого соевого продукта.
Кроме того, здесь представлено растение сои, представляющее собой потомство любого из вышеописанных растений сои и содержащее событие EE-GM3.
Кроме того, здесь представлен способ получения растения сои, устойчивого к гербицидам глифосату и/или изоксафлютолу, включающий внедрение в геном такого растения события EE-GM3, в частности, путем скрещивания первого растения сои, не содержащего событие EE-GM3, с растением сои, содержащим ЕЕ-GM2, и путем селекции потомства, устойчивого к глифосату и/или изоксафлютолу.
Кроме того, здесь представлено растение, устойчивое к глифосату и/или изоксафлютолу без потери урожайности, обладающее приемлемыми агрономическими характеристиками, содержащее 2mEPSPS и белок HPPD, и способное образовывать ампликон, характерный для события EE-GM3. Кроме того, здесь представлены специфические выделенные ампликоны (фрагменты последовательности ДНК) сами по себе, которые можно получить с помощью специфических инструментов для обнаружения, описанных здесь, в частности, ампликоны, последовательность которых включает фрагмент ДНК, происходящий из растительной ДНК, и фрагмент ДНК, чужеродной или не соответствующей такому растению, например, ДНК, внедренной в геном растения путем трансформации, как описано здесь.
Кроме того, здесь представлен способ контроля сорных растений на поле сои, содержащей событие EE-GM3, или на поле, предназначенном для посадки таких растений сои, включающий обработку поля эффективным количеством гербицида на основе изоксафлютола, причем такие растения обладают устойчивостью к такому гербициду.
Кроме того, здесь представлена ДНК, включающая последовательность SEQ ID No 1 или последовательность, существенно сходную с ней, и любое растение, клетка, ткань или семя, в частности, сои, содержащее такую последовательность ДНК, например, растение, клетка, ткань или семя, содержащее EE-GM3, в частности, ДНК, включающая 2 смежных области, включающие или состоящие (главным образом) из SEQ ID No 1, или ДНК, включающая 2 смежных области, включающие или состоящие из SEQ ID No 1 с заменами, делениями или инсерциями некоторых нуклеотидов, например, ДНК, включающая дупликацию SEQ ID No 1 с делецией или заменой 4, 6, 8 или 10 нуклеотидов, расположенных вблизи (например, на расстоянии 200-500 нуклеотидов, или менее 2000 или 10000 нуклеотидов) друг от друга. В одном из вариантов воплощения эти объекты включают ДНК SEQ ID No 11, от нуклеотида 2257 до нуклеотида 16601, в которой 2, 4, 6, 8 или 10 нуклеотидов замещены другими нуклеотидами, или в которой делегированы или добавлены 2, 4, 6, 8 или 10 нуклеотидов, или DNA SEQ ID No 11, от нуклеотида 2257 до нуклеотида 16601 SEQ ID No 11, а также ДНК SEQ ID No. 11 и любое растение, клетку, ткань или семя, в частности, сои, содержащее любую из таких последовательностей ДНК. Кроме того, настоящая заявка включает растение, клетку, ткань или семя сои, содержащее последовательность ДНК (не соответствующую или чужеродную стандартному растению, семени, ткани или клетке сои) SEQ ID No 11, или содержащее последовательность ДНК SEQ ID No 11, от нуклеотида 2257 до нуклеотида 16601, или содержащее последовательность ДНК, по меньшей мере на 99% или 99.5% идентичную последовательности SEQ ID No 11, или содержащее последовательность ДНК, по меньшей мере на 99% или 99.5% идентичную последовательности SEQ ID No 11, от нуклеотида 2257 до нуклеотида 16601.
Кроме того, здесь представлены трансгенное растение, растительная клетка, ткань или семя сои, геном которых содержит событие EE-GM3, характеризующееся молекулой нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотидную последовательность, существенно сходную с SEQ ID No 2, от нуклеотида 1441 до нуклеотида 1462, и молекулой нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотидную последовательность, существенно сходную с SEQ ID No 3, от нуклеотида 230 до нуклеотида 251, или комплементарные цепи таких последовательностей, а также растение, растительная клетка, ткань или семя сои, геном которых содержит событие EE-GM3, характеризующееся молекулой нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотидную последовательность, существенно сходную с SEQ ID No 2, и молекулой нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотидную последовательность, существенно сходную с SEQ ID No 3, или комплементарные цепи таких последовательностей.
Кроме того, здесь представлены растение, ткань или семя сои, содержащие EE-GM3, характеризующиеся содержанием в геноме нуклеотидной последовательности, обладающей по меньшей мере 80%, 90%, 95% или 100% идентичности с SEQ ID No 2 от нуклеотида 1431 до нуклеотида 1472, и нуклеотидной последовательности, обладающей по меньшей мере 80%, 90%, 95% или 100% идентичности с SEQ ID No 3, от нуклеотида 220 до 261, или комплементарных цепей указанных последовательностей.
Используемый здесь, термин "изоксафлютол" относится к гербициду изоксафлютолу, т.е. [(5-циклопропил-4-изоксазолил)[2-(метилсульфонил)-4-(трифторметил)фенил]метанону], его активному метаболиту, дикетонитрилу и любым смесям растворов, содержащих указанные соединения. Гербициды, ингибирующие HPPD, пригодные для обработки события в соответствии с настоящим изобретением, представляют собой дикетонитрилы, например, 2-циан-3-циклопропил-1-(2-метилсульфонил-4-трифторметилфенил)пропан-1,3-дион и 2-циан-1-[4-(метилсульфонил)-2-трифторметилфенил]-3-(1-метилциклопропил)пропан-1,3-дион; другие изоксазолы; и пиразолинаты, например, топрамезон, т.е.[3-(4,5-дигидро-3-изоксазолил)-2-метил-4-(метилсульфонил)фенил](5-гидрокси-1 -метил-1 Н-пиразол-4-ил)метанон] и пирасульфотол [(5-гидрокси-1,3-диметилпиразол-4-ил(2-метилсульфонил-4-трифторметилфенил)метанон]; или пиразофен [2-[4-(2,4-дихлорбензоил)-1,3-диметилпиразол-5-илокси]ацетофенон].
В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения поле, предназначенное для посадки растений сои, содержащих событие EE-GM3, можно обработать гербицидом-ингибитором HPPD, например, изоксафлютолом ('IFT'), до посадки растений сои или посева семян, что очищает поле от сорных растений, уничтожаемых ингибитором HPPD, и дает возможность нулевой обработки почвы с посадкой или посевом сои на этом предварительно обработанном поле впоследствии (выжигающее применение гербицида-ингибитора HPPD). Остаточная активность IFT также защищает всходы и растущие растения сои от конкуренции с сорными растениями на ранних стадиях роста. После достижения растениями сои определенного размера и начала повторного появления сорных растений можно применять глифосат или смесь ингибитор HPPD-глифосат в качестве послевсходового гербицида над верхушками растений.
В еще одном варианте воплощения настоящего изобретения поле, на котором посеяны семена, содержащие событие EE-GM3, можно обработать гербицидом-ингибитором HPPD, например, IFT, до появления всходов растений сои, но после посева семян (поле можно очистить от сорных растений до посева другими средствами, обычно, с помощью общепринятых приемов обработки почвы, например, вспашки, культиваторной обработки или подготовки посевных мест), причем остаточная активность будет поддерживать поле свободным от сорных растений, уничтожаемых гербицидом, обеспечивая отсутствие конкуренции всходам и растущим растениям со стороны сорных растений (довсходовое применение гербицида-ингибитора HPPD). После достижения растениями сои определенного размера и начала повторного появления сорных растений можно применять глифосат или смесь ингибитор HPPD-глифосат в качестве послевсходового гербицида над верхушками растений.
В другом варианте воплощения настоящего изобретения растения, содержащие событие EE-GM3, можно обработать гербицидом-ингибитором HPPD, например, IFT, над верхушками растений сои, взошедших из посеянных семян, что очищает поле от сорных растений, уничтожаемых ингибитором HPPD, причем это применение можно осуществлять совместно с (например, в результате смешивания в опрыскивателе), до или после обработки глифосатом в качестве послевсходового гербицида над верхушками растений (послевсходовое применение гербицида-ингибитора HPPD (с глифосатом или без него)). Кроме того, в соответствии с настоящим изобретением, растения сои, несущие EE-GM3, можно обработать следующими инсектицидами, гербицидами или фунгицидами, либо семена сои, несущие EE-GM3, можно покрыть путем дражирования оболочкой, содержащей следующие инсектициды, гербициды или фунгициды:
Гербициды для сои:
алахлор, бентазон, трифторалин, хлоримурон-этил, хлорансулам-метил, феноксапроп, фомесафен, флуазифоп, глифосат, имазамокс, имазахин, имазетапир, (S-)метолахлор, метрибузин, пендиметалин, тепралоксидим, изоксафлютол.
Инсектициды для сои:
лямбда-цигалотрин, метомил, паратион, тиокарб, имидаклоприд, клотианидин, тиаметоксан, тиаклоприд, ацетамиприд, динотефуран, флубендиамид, ринаксипир, циазипир, спиносад, спиноторам, эмамектин бензоат, фипронил, этипрол, дельтаметрин, β-цифлутрин, гамма- и лямбда-цигалотрин, 4-[[(6-хлорпиридин-3-ил)метил](2,2-дифторэтил)амино]фуран-2(5Н)-он, спиротетрамат, спиродиклофен, трифлумурон, флоникамид, тиодикарб, бета-цифлутрин.
Фунгициды для сои:
азоксистробин, ципроконазол, эпоксиконазол, флутриафол, пираклостробин, тебуконазол, трифлоксистробин, протиоконазол, тетраконазол.
В следующих примерах описана разработка и идентификация элитного события EE-GM3, разработка различных линий сои, содержащих указанное событие, и разработка инструментов для специфической идентификации элитного события EE-GM3 в биологических образцах.
Если в Примерах не указано иное, все рекомбинантные методики осуществляли в соответствии со стандартными протоколами согласно описанию в "Sambrook J and Russell DW (eds.) (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York" и в "Ausubel FA, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA and Struhl K (eds.) (2006) Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, New York".
Стандартные материалы и ссылки описаны в "Croy RDD (ed.) (1993) Plant Molecular Biology LabFax, BIOS Scientific Publishers Ltd., Oxford and Blackwell Scientific Publications, Oxford" и в "Brown ТА, (1998) Molecular Biology LabFax, 2nd Edition, Academic Press, San Diego". Стандартные материалы и методики полимеразных цепных реакций (ПЦР) содержатся в "McPherson MJ and Meller SG (2000) PCR (The Basics), BIOS Scientific Publishers Ltd., Oxford" и в "PCR Applications Manual, 3rd Edition (2006), Roche Diagnostics GmbH, Mannheim или www.roche-applied-science.com".
Следует понимать, что может возникнуть необходимость коррекции ряда параметров любого лабораторного протокола, например, протоколов ПЦР-идентификации в нижеприведенных Примерах, к условиям, специфическим для лаборатории, и их незначительной модификации для получения аналогичных результатов. Например, при использовании различных способов подготовки ДНК или выборе других праймеров могут потребоваться другие оптимальные условия для протокола ПЦР. Вместе с тем, эти варианты коррекции очевидны для специалистов и, более того, подробно описаны в современных руководствах по применению ПЦР.
В описании и примерах приведены ссылки на следующие последовательности:
SEQ ID No 1: фрагмент Sail нуклеотидной последовательности вектора pSF10.
SEQ ID No 2: нуклеотидная последовательность, включающая 5’-область, фланкирующую чужеродную ДНК, включающую гены устойчивости к гербицидам в EE-GM3.
SEQ ID No 3: нуклеотидная последовательность, включающая 3’-область, фланкирующую чужеродную ДНК, включающую гены устойчивости к гербицидам в EE-GM3.
SEQ ID No 4: праймер SOY028
SEQ ID No 5: праймер SOY029
SEQ ID No 6: праймер SMP187
SEQ ID No 7: праймер STV019
SEQ ID No 8: нуклеотидная последовательность ампликона
SEQ ID No 9: праймер 1 для амплификации контрольного фрагмента (SOY01)
SEQ ID No 10: праймер 2 для амплификации контрольного фрагмента (SOY02)
SEQ ID No 11: нуклеотидная последовательность чужеродной ДНК и растительных фланкирующих последовательностей в в EE-GM3
SEQ ID No 12: праймер SHA130
SEQ ID No 13: праймер SHA178
Примеры
1. Трансформация Glycine max генами устойчивости к гербицидам.
1.1. Описание чужеродной DNA, включающей химерные гены 2mEPSPS и HPPD-Pf-W336
Плазмида pSF10 представляет собой вектор клонирования, производный от pUC19, содержащий химерный ген 2mepsps и химерный ген hppd-Pf-W336, расположенные во фрагменте SalI размером приблизительно 7.3 т.п.о.. Полное описание ДНК, содержащихся между двумя сайтами рестрикции SalI, приведено ниже в Таблице 1. Нуклеотидная последовательность представлена в SEQ ID No: 1.
Таблица 1.
Положения нуклеотидов в ДНК, содержащейся между сайтами рестрикции SalI в pSF10 (SEQ ID No 1)
Положения нуклеотидов
Ориентация
Описание и ссылки
188-479
комплементарная цепь
3’nos: последовательность, включающая 3’-нетранслируемую область гена нопалинсинтазы из Т-ДНК pTiT37 Agrobacterium tumefaciens (Depicker et al., 1982, Journal of Molecular and Applied Genetics, 1, 561-573)
480-1556
комплементарная цепь
hppdPf W336: кодирующая последовательность 4-гидроксифенилпируватдиоксигеназы штамма Pseudomonas fluorescens A32, модифицированная заменой аминокислоты глицин-336 триптофаном, согласно описанию в Boudec et al. (2001), патент США US 6245968 B1
1557-1928
комплементарная цепь
TPotp Y: кодирующая последовательность оптимизированного производного переходного пептида (замена на тирозин по положению 55), содержащая последовательность генов малой субъединицы рибулозо-1,5-бифосфаткарбоксилазы/оксигеназы Zea mays (кукурузы) и Helianthus annuus (подсолнечника), согласно описанию в Lebrun et al. (1996) US 5510471
1929-2069
комплементарная цепь
5’tev: последовательность, включающая лидирующую последовательность вируса гравировки табака согласно описанию в Carrington and Freed (1990) Journal of Virology, 64, 1590-1597
Положения нуклеотидов
Ориентация
Описание и ссылки
2070-3359
комплементарная цепь
Ph4a748 ABBC: последовательность, включающая промоторную область гена гистона Н4 Arabidopsis thaliana, включающую внутреннюю дупликацию (Chaboute et al., 1987) Plant Molecular Biology, 8, 179-191.
3360-4374
Ph4a748: последовательность, включающая промоторную область гена гистона Н4 Arabidopsis thaliana (Chaboute et al., 1987) Plant Molecular Biology, 8, 179-191.
4375-4855
introni h3At: первый интрон гена II варианта гистона Н3.III Arabidopsis thaliana (Chaubetet al., 1992) Journal of Molecular Biology, 225, 569-574.
4856-5227
TPotp С: кодирующая последовательность оптимизированного переходного пептида, содержащая последовательность генов малой субъединицы рибулозо-1,5-бифосфаткарбоксилазы/оксигеназы Zea mays (кукурузы) и Helianthus annuus (подсолнечник), согласно описанию в Lebrun et al. (1996) US 5510471
5228-6565
2mepsps: кодирующая последовательность двойного мутантного гена 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазы Zea mays (кукурузы) (Lebrun et al., 1997) WO 9704103-A1
6566-7252
3’histonAt: последовательность, включающая 3’-нетранслируемую область гена гистона Н4 Arabidopsis thaliana (Chaboute et al., 1987) Plant Molecular Biology, 8, 179-191.
1.2. Событие EE-GM3
Очищенный с помощью ВЭЖХ выровненный по SalI фрагмент pSF10 размером приблизительно 7.3 т.п.о. (содержащий ген устойчивости к глифосату 2mEPSPS и ген устойчивости к ингибиторам HPPD HPPD-Pf-W336) использовали для получения трансформированных растений сои путем прямого переноса генов в клетки сои типа Jack (Nickell, С.D, G.R.Noel, D.J.Thomas, and R.Waller. Registration of 'Jack' soybean. Crop Sci 1365. 30.1990) с последующей регенерацией трансформированных растительных клеток в трансгенные фертильные растения сои.
1.2.1. Идентификация элитного события EE-GM3
Селекцию элитного события EE-GM3 выполняли, основываясь на масштабной процедуре селекции на основе высокого уровня экспрессии и стабильности генов устойчивости к гербицидам и была оценена его совместимость с оптимальными агрономическими характеристиками, например, высотой растения, высотой до узла, устойчивостью к полеганию, ростом, урожайностью. Селекцию растений, содержавших это событие, осуществляли из широкого диапазона различных трансформационных событий, полученных с использованием одних и тех же химерных генов. Параметры, использованные при селекции этого события, представляли собой: а) приемлемую устойчивость к применению гербицида изоксафлютола при полевых испытаниях, б) приемлемую устойчивость к применению гербицида глифосата при полевых испытаниях, в) приемлемую устойчивость к комбинированному применению гербицидов изоксафлютола и глифосата при полевых испытаниях, г) внедрение трансгенов устойчивости к гербицидам в одиночный локус генома растения сои при отсутствии последовательности вектора, д) сходство общих агрономических характеристик с исходными растениями, использованными при трансформации (созревания, полегания, подверженности заболеваниям и т.д.), и е) отсутствие значительной потери урожайности вследствие инсерции трансформирующей ДИК (по сравнению с изогенной линией, не содержащей события, например, линией растений, использованной для трансформации, выращенной при тех же условиях).
Из поколения ТЗ выделили гомозиготную линию сои по трансформационному событию EE-GM3 для получения семян. В областях адаптации исходного сорта Jack провели многорайонные полевые исследования в нескольких повторах. Полевые испытания включали устойчивость к гербицидам и агрономическую производительность. Обнаружено, что агрономическая производительность растений, содержащих EE-GM3, была сопоставима с сортом Jack (при отсутствии применения гербицидов). Полевые испытания также показали, что растения, несущие EE-GM3, обладали:
- аналогичной сорту Jack морфологией растения и характеристиками семян
- отсутствием изменений реакции на заболевания сои по сравнению с сортом Jack и
- отсутствием изменений проращивания или покоя семян по сравнению с сортом Jack.
Семена (поколения Т1 или S1), собранные с исходного трансформанта (ТО) (растения, трансформированного конструктом с целью получения события EE-GM3) в вегетационном домике, высаживали на поле. Три участка засеяли и обработали глифосатом в количестве 0, 2 или 4 кг/га. Семена собирали с растений, демонстрировавших желательный уровень устойчивости к гербициду глифосату.
Семена (поколение Т2), собранные с самоопыленных растений Т1, выращенных на поле, сеяли из расчета "растение на гряду". Анализ расщепления данных в грядах (полностью или частично устойчивых) и отдельных растений в грядах (устойчивых или чувствительных) с использованием критерия хи-квадрат продемонстрировал ожидаемое менделевское наследование одиночной инсерции в EE-GM3.
Селекцию и накопление семян продолжали до определения гомозиготности линии по трансформационному событию EE-GM3 и его отбора для получения семян в четвертом поколении. Далее семена поколения Т5 использовали в качестве кандидата для разработки различных сортов. Растения шестого поколения (поколения Т6) скрещивали со стандартными линиями сои для скрещивания согласно программе интрогрессии, предназначенной для переноса события на расширенную основу зародышевой плазмы коммерческой сои. Гибридные растения F1 (линии EE-GM3 × стандартные линии) выращивали до созревания и высаживали семена F2. Образцы листьев 901 растения F2 анализировали, используя ПЦР-праймеры, предназначенные для определения зиготности инсерции EE-GM3. Наблюдали ожидаемое, согласно законам Менделя, соотношение расщепления одиночной инсерции 1:2:1.
Выбранное событие EE-GM3 внедряли в различные коммерческие генетические окружения и сравнивали результаты полевых испытаний в различных районах. Устойчивость растений к гербициду глифосату и/или гербициду изоксафлютолу оценивали при различных вариантах обработки. Растения демонстрировали хорошую устойчивость к гербицидам. Наследование изучали, используя сотни различных сортов сои, содержащих событие EE-GM3, и применяя гербициды. Выделенные в результате этих испытаний линии затем размножали на поле и также обрабатывали гербицидом. В результате этих испытаний размножили 50 выделенных линий и обработали их гербицидом. Показатели фитотоксичности для последних линий, опрысканных изоксафлютолом и глифосатом, показали некоторую вариабельность ответа, однако диапазон ответов среди линий отражал вариабельность, аналогичную наблюдавшейся среди 4 повторов события EE-GM3 в исходном окружении Jack, выращенного при таком же режиме обработки и условиях окружающей среды. Таким образом, у растений, содержащих EE-GM3, наблюдали устойчивость к релевантным гербицидам среди широкого диапазона зародышевой плазмы.
Кроме того, растения, содержавшие событие EE-GM3, обладали нормальной морфологией листьев, цветков и бобов, превосходной фертильностью и не проявляли аномальной подверженности заболеваниям или насекомым в различных вариантах генетического окружения. Во время интрогрессии в различные варианты генетического окружения не обнаружили проблем с нарушениями или аномалиями.
В один из сезонов выполнили исследование в 10 районах, предназначенное для сравнения агрономической производительности сои, содержавшей трансформационное событие EE-GM3 и характеризовавшейся двойной устойчивостью к гербицидам, с различными исходными трансформируемыми сортами - сортом Jack и некоторыми нетрансгенными сортами сои. Растения EE-GM3 выращивали на повторяющихся участках, используя случайное расположение делянок и либо стандартные меры борьбы с сорными растениями, либо предназначенные для использования гербициды - глифосат и изоксафлютол. Участки с растениями сои, содержащими трансформационное событие EE-GM3, опрыскивали гербицидом изоксафлютолом при запланированном расходе 70 граммов активного компонента/га и гербицидом глифосатом - при запланированном расходе 1060 граммов активного компонента/га. Применение гербицида на указанные растения осуществляли в виде листового аэрозоля приблизительно на стадии роста растения V4-V5. Агрономические наблюдения осуществляли в начале, середине и конце сезона. Густота растительного покрова (параметр: количество прямостоячих растений) для участка с сортом Jack и нетрансгенными сортами превышала густоту на участках с событием EE-GM3 на величину, равную одному стандартному отклонению. Раннее различие количества прямостоячих растений являлось результатом качества партии семян, поскольку семена для посадки растений, содержащих EE-GM3, получили в инкубаторе в течение противоположного сезона, в то время как семена нетрансгенных сортов получили в течение непрерывного нормального вегетационного периода в условиях США. В то же время количество дней до достижения 50% всхожести и показателей мощности растений были одинаковы, что указывало на сопоставимость партий семян по этим параметрам производительности. При подсчете прямостоячих растений в конце сезона сохранялось различие сорта Jack и нетрансгенных сортов от растений с EE-GM3 на величину одного стандартного отклонения. Урожай растений с событием EE-GM3 с участка также был ниже, чем урожай сорта Jack, на величину одного стандартного отклонения, возможно, в результате меньшей густоты растений на участках с растениями, содержавшими событие EE-GM3. Урожай нетрансгенных сортов был выше, чем у сорта Jack, что можно было ожидать ввиду усовершенствований потенциала урожайности в современных сортах.
В ходе одного из испытаний показатели жизнестойкости растений оценивали на трех стадиях роста: V4-5, R1 и полной зрелости. Первую оценку осуществляли вскоре после запланированного применения гербицидов. Во время последней оценки жизнестойкости растения, содержавшие EE-GM3, опрысканные обоими гербицидами, обладали теми же показателями, что и необработанные растения сорта Jack или необработанные растения, содержавшие EE-GM3. По оценкам, сделанным агрономами, на стадиях роста V4-5 и R1 растения, опрысканные гербицидами, получили оценку жизнестойкости, равную 3-4 (умеренное повреждение). Неопрысканные растения (нетрансформированные растения сорта Jack или растения сои, содержавшие EE-GM3) получили оценку, равную 4.6-4.8 (оценка, равная 5, означает отсутствие повреждений). При последней оценке жизнестойкости растений все участки получили одинаковые оценки, равные 5 (отсутствие повреждений).
Один из испытательных сезонов отличался особенно большим количеством осадков, и повреждение посевов, содержащих EE-GM3, после обработки предназначенными гербицидами было более очевидным, чем в другие сезоны. Полевые испытания также включали мониторинг характеристик приспосабливаемости (размножения, устойчивости к заболеваниям, фертильности, разлета семян, периода покоя, выживаемости). Воспроизводимые характеристики - количество дней до появления всходов, количество дней до 50% цветения и количество дней до 90% созревания бобов - у растений, содержавших EE-GM3, и растений сорта Jack не различались. Различий в реакции на природное заражение заболеваниями растений и насекомыми-вредителями не отмечено. Несмотря на то, что EE-GM3 давали меньший урожай, чем сорт Jack, различий в фертильности (масса 100 семян) не обнаружено. Оценка параметров разброса семян (разрушения бобов и полегания растений) показала, что растения EE-GM3 и Jack обладают одинаковым показателем разрушения бобов, однако растения EE-GM3 обладали меньшей склонностью к полеганию. Оценка семян, собранных с 10 районов, не обнаружила проблем, связанных с оценкой проращивания или покоя семян.
В ходе испытаний во время сезона с особенно большим количеством осадков конечный урожай растений с событием EE-GM3, независимо от способа борьбы с сорными растениями, был ниже, чем урожай сорта Jack, на величину одного стандартного отклонения (возможно, в результате меньшей густоты растений на участках с растениями, содержавшими событие EE-GM3). В течение особенно влажного сезона описывали повреждение посевов (выгорало до 10-30% площади посевов) на участках с растениями EE-GM3 в течение шести недель после обработки листьев гербицидами глифосатом и изоксафлютолом. Однако после созревания всем участкам присвоили оценку жизнестойкости растений "отсутствие повреждений". Ожидалось, что повторные многорайонные полевые испытания растений с EE-GM3, внедренным в окружение элитного сорта сои, по сравнению с почти изогенными сестринскими линиями, не содержавшими трансгена, не покажут различий урожайности между растениями, содержавшими событие EE-GM3, и почти изогенными линиями (при отсутствии обработки гербицидами).
Кроме того, при повторных полевых испытаниях обнаружили значительную устойчивость посевов (выгорание менее 10%) растений сои, содержавших EE-GM3, при до- или послевсходовой обработке IFT (70 г активного компонента/га с 0.5% NIS, Agridex), а также значительную устойчивость посевов (выгорание менее 10%) растений сои, содержавших EE-GM3, при послевсходовой обработке пирасульфотолом (35 г активного компонента/га с 0.5% NIS, Agridex) - еще одним гербицидом-ингибитором HPPD.
1.2.2. Идентификация фланкирующих областей и чужеродной ДНК элитного события EE-GM3
Последовательность областей, фланкирующих чужеродную ДНК, включающую гены устойчивости к гербицидам в элитном событии EE-GM3, определяли следующим образом:
1.2.2.1. Правая (5’-) фланкирующая область
Фрагмент, идентифицированный как содержащий 5’-фланкирующую область, секвенировали; его нуклеотидная последовательность представлена в SEQ ID No 2. Последовательность между нуклеотидами 1 и 1451 соответствовала ДНК растения, в то время как последовательность между нуклеотидами 1452 и 1843 соответствовала чужеродной ДНК.
1.2.2.2. Левая (3’-) фланкирующая область
Фрагмент, идентифицированный как содержащий 3’-фланкирующую область, секвенировали; его нуклеотидная последовательность представлена в SEQ ID No 3. Последовательность между нуклеотидами 1 и 240 соответствовала чужеродной ДНК, в то время как последовательность между нуклеотидами 241 и 1408 соответствовала ДНК растения.
1.2.2.3. Чужеродная ДНК в EE-GM3, содержащая гены устойчивости к гербицидам
С помощью различных молекулярных методик определили, что чужеродная ДНК элитного события EE-GM3, включавшая гены устойчивости к гербицидам, содержала две частичных 3’-последовательности histonAt в ориентации "голова-голова", а затем две почти полные копии SalI-фрагмента pSF10 в ориентации "голова-хвост" (см. Фигуру 1).
Чужеродная ДНК в EE-GM3, содержащая гены устойчивости к гербицидам, таким образом, содержала следующие последовательности по порядку:
- от нуклеотида 1 до нуклеотида 199: нуклеотидная последовательность, соответствовавшая комплементарной цепи нуклеотидной последовательности SEQ ID No 1 от нуклеотида 6760 до нуклеотида 6958;
- от нуклеотида 200 до нуклеотида 624: нуклеотидная последовательность, соответствовавшая нуклеотидной последовательности SEQ ID No 1 от нуклеотида 6874 до нуклеотида 7298;
- от нуклеотида 625 до нуклеотида 7909: нуклеотидная последовательность, соответствовавшая нуклеотидной последовательности SEQ ID No 1 от нуклеотида 7 до нуклеотида 7291;
- от нуклеотида 7910 до нуклеотида 15163: нуклеотидная последовательность, соответствовавшая нуклеотидной последовательности SEQ ID No 1 от нуклеотида 12 до нуклеотида 7265; и
- от нуклеотида 15164 до нуклеотида 15187: нуклеотидная последовательность, соответствовавшая нуклеотидной последовательности SEQ ID No 3 от нуклеотида 217 до нуклеотида 240 (эта последовательность не соответствует ни плазмидной ДНК pSF10, ни ДНК растения дикого типа и поэтому называется филлер-ДНК).
Непосредственно сверху этой чужеродной ДНК предшествовала непрерывная с ней 5’-фланкирующая последовательность SEQ ID No 2 от нуклеотида 1 до 1451, а непосредственно снизу от этой чужеродной ДНК располагалась непрерывная с ней 3’-фланкирующая последовательность SEQ ID No 3 от нуклеотида 241 до нуклеотида 1408.
Подтвержденное полное секвенирование чужеродной ДНК и фланкирующих последовательностей ДНК в EE-GM3 позволило получить последовательность, представленную в SEQ ID No 11. В этой последовательности внедренная ДНК располагалась от положения 1452 до положения 16638, а две почти полные копии pSF10 располагались в ориентации "голова-хвост" от положения 2257 до положения 16601. 5’-фланкирующая последовательность ДНК в SEQ ID No 11 представляла собой последовательность от положения 1 до положения 1451 в SEQ ID No 11, а фланкирующая последовательность ДНК в SEQ ID No 11 представляла собой последовательность от положения 16639 до положения 17806 в SEQ ID No 11.
2. Разработка протокола ПЦР-идентификации для EE-GM3.
2.1. Праймеры
Разработаны специфические праймеры, распознающие последовательности в пределах элитного события.
Разработан праймер, распознающий последовательность в пределах 3’-фланкирующей области EE-GM3. Второй праймер выбрали в пределах последовательности чужеродной ДНК, так что праймеры перекрывали последовательность размером приблизительно 263 нуклеотидов. Обнаружили, что следующие праймеры позволяли получить наиболее ясные и воспроизводимые результаты в ходе ПЦР с ДНК EE-GM3:
SOY028: 5’-ATC.gCT.TTA.ACg.TCC.CTC.Ag-3 (SEQ ID No: 4)
(мишень: внедренная ДНК)
SOY029: 5’-CAA.ggC.CTC.gAg.ATT.ATC-3’ (SEQ ID No.:5)
(мишень: ДНК растения)
Праймеры, мишенью которых являлась эндогенная последовательность, предпочтительно включали в смесь для ПЦР. Эти праймеры служили внутренним контролем для неизвестных образцов и положительного контроля ДНК. Положительный результат, полученный при использовании пары эндогенных праймеров (присутствие ПЦР-амплифицированного фрагмента размером 413 п.о.) продемонстрировал, что из препарата геномной ДНК можно получить достаточное количество продукта ПЦР - ДНК надлежащего качества. Выбрали эндогенные праймеры, распознававшие эндогенный ген актина сои:
SOY01: 5’-gTC.AgC.CAC.ACA.gTg.CCT.AT-3' (SEQ ID No: 9)
SOY02: 5’-gTT.ACC.gTA.CAg.gTC.TTT.CC-3’ (SEQ ID No: 10)
2.2. Амплифицированные фрагменты
Ожидаемые амплифицированные фрагменты при ПЦР представляли собой:
Для пары праймеров SOY01-SOY02: 413 п.о. (эндогенный контроль)
Для пары праймеров SOY028-SOY029: 263 п.о. (элитное событие EE-GM3)
2.3. Матричная ДНК
Матричную ДНК выделяли из фрагмента листа, полученного компостированием, согласно Edwards et al. (Nucleic Acid Research, 19, p1349, 1991). Если использовали ДНК, выделенную другими способами, следовало выполнить тестовый прогон с использованием различных количеств матрицы. Обычно наилучшие результаты получали при использовании 50 нг геномной матричной ДНК.
2.4. Назначенные положительный и отрицательный контроли
Во избежание ложных положительных или отрицательных результатов определили, что в ПЦР-прогон следовало включить следующие положительный и отрицательный контроли:
- Контроль мастер-микса (отрицательный контроль ДНК). Это - ПЦР, в ходе которой в реакционную смесь не вносили ДНК. Если получали ожидаемый результат - отсутствие продукта ПЦР, - это означало, что смесь для ПЦР не загрязнена ДНК-мишенью.
- Положительный контроль ДНК (образец геномной ДНК, заведомо содержавший трансгенные последовательности). Успешная амплификация положительного контроля демонстрировала, что ПЦР проходила при условиях, обеспечивавших амплификацию последовательностей-мишеней.
- Контроль ДНК дикого типа. Это - ПЦР, в ходе которой матрица ДНК представляла собой геномную ДНК, выделенную из нетрансгенного растения. Если получали ожидаемый результат - отсутствие амплификации трансгенного продукта ПЦР при амплификации эндогенного продукта ПЦР, - это означало, что в образце геномной ДНК не происходило обнаруживаемой фоновой амплификации трансгена.
2.5. Условия ПЦР
Оптимальные результаты получали при следующих условиях (Подразумевается, что при описании различных условий для оптимальных результатов представлены примеры таких условий. Ясно, что специалист может изменять условия, реагенты и параметры, например, использовать другие Taq-полимеразы и достигать желаемых результатов):
- смесь ПЦР для объема реакционной смеси 25 мкл содержала:
20 нг матричной ДНК
2.5 мкл 10× буфера для амплификации (поставлялся производителем с Taq-полимеразой)
0.5 мкл 10 мМ dNTP
0.4 мкл SOY01 (10 пмоль/мкл)
0.4 мкл SOY02 (10 пмоль/мкл)
0.7 мкл SOY028 (10 пмоль/мкл)
0.7 мкл SOY029 (10 пмоль/мкл)
0.1 мкл Taq-ДНК-полимеразы (5 единиц/мкл)
воду до объема 25 мкл
- профиль термоциклирования, позволявший получить оптимальные результаты, выглядел следующим образом:
4 мин при 95°C
Затем: 1 мин при 95°C
1 мин при 57°C
2 мин при 72°C
В течение 5 циклов
Затем: 30 с при 92°C
30 с при 57°C
1 мин при 72°C
В течение 25 циклов
Затем: 10 минут при 72°C
2.6. Анализ в агарозном геле
Для оптимальной визуализации результатов ПЦР определили, что от 10 до 20 мкл образцов ПЦР следовало нанести на 1.5% агарозный гель (трис-боратный буфер) с соответствующим маркером молекулярной массы (например, лэддером 100 п.о. Pharmacia).
2.7. Подтверждение результатов
Определили, что данные, полученные из образцов ДНК трансгенных растений с использованием одного прогона ПЦР и одной смеси ПЦР, не должны считаться приемлемыми, если 1) положительный контроль ДНК не позволял получить ожидаемых продуктов ПЦР (трансгенных и эндогенных фрагментов), 2) отрицательный контроль ДНК не являлся отрицательным при ПЦР-амплификации (не подтверждается отсутствие фрагментов) и 3) контроль ДНК дикого типа не позволял получить ожидаемых результатов (амплификации эндогенного фрагмента).
При соблюдении Протокола ПЦР-идентификации для EE-GM3 согласно вышеприведенному описанию видимые количества трансгенных и эндогенных продуктов ПЦР ожидаемого размера в дорожках указывали на то, что соответствующее растение, из которого выделили геномную матричную ДНК, унаследовало элитное событие EE-GM3. Если в дорожках отсутствовали видимые количества трансгенных продуктов ПЦР и присутствовали видимые количества эндогенных продуктов ПЦР, это указывало на то, что соответствующее растение, из которого выделили геномную матричную ДНК, не содержало указанного элитного события. Если в дорожках отсутствовали видимые количества эндогенных и трансгенных продуктов ПЦР, это указывало на то, что качество и/или количество геномной ДНК не позволяло получить продукт ПЦР. Расчет оценок для этих растений был невозможен. Следовало повторить выделение геномной ДНК и выполнить новый прогон ПЦР с соответствующими контролями.
2.8. Использование дифференциального протокола ПЦР для идентификации EE-GM3
Перед попыткой скрининга неизвестных образцов выполняли тестовый прогон с соответствующими контролями. Для разработанного протокола могла требоваться оптимизация компонентов, которая могла различаться в разных лабораториях (выделение матричной ДНК, Taq-ДНК-полимераза, качество праймеров, dNTP, термоциклера и т.д.).
В этом протоколе ключевую роль играла амплификация эндогенной последовательности. Было необходимо достичь условий ПЦР и термоциклирования, в ходе которых возможна амплификация эквимолярных количеств как эндогенной, так и трансгенной последовательностей известной трансгенной матричной геномной ДНК. Во всех случаях, когда не происходила амплификация эндогенного фрагмента-мишени или когда не происходила амплификация последовательностей-мишеней, согласно электрофорезу в агарозном геле при одинаковой интенсивности окрашивания этидий-бромидом, могла требоваться оптимизация условий ПЦР.
Согласно вышеописанному протоколу тестировали материал листьев ряда растений сои, некоторые из которых содержали EE-GM3. Образцы элитного события EE-GM3 и сои дикого типа использовали в качестве положительного и отрицательного контролей, соответственно.
На Фигуре 2 показан результат, полученный при использовании Протокола ПЦР-амплификации элитного события EE-GM3 и ряда образцов растений сои. Обнаружено, что образцы в дорожках 2 и 3 содержали элитное событие EE-GM3, поскольку была обнаружена полоса, соответствовавшая 263 п.о., в то время как образцы в дорожках 4-8 не содержали EE-GM3. Дорожки 6 и 7 содержали образцы других трансформационных событий сои, полученных при использовании этих же химерных генов устойчивости к гербицидам; дорожка 8 содержала ДНК растений сои дикого типа, а дорожка 9 представляла собой образец отрицательного контроля (воды), дорожки 1 и 10 представляли собой маркер молекулярной массы (лэддер 100 п.о.).
2.9. Обнаружение EE-GM3 с помощью дПЦР-анализа в насыпной партии семян
Дифференциальный ПЦР-анализ (дПЦР) настроили на обнаружение низкого уровня EE-GM3 в насыпной партии семян. При воспроизводимых условиях минимальный успешно обнаруживаемый уровень трансгенных семян в насыпной партии нетрансгенных семян составлял 0.4% (масс/масс). Таким образом, определили, что предел обнаружения составлял 0.4% (масс/масс).
При целевой ПЦР использовали следующие праймеры:
Прямой праймер, мишенью которого являлась последовательность Т-ДНК:
SHA130 5’-CTA.TAT.TCT.ggT.TCC.AAT.TTA.TC-3’ (SED ID No 12)
Обратный праймер, мишенью которого являлась 3’-фланкирующая последовательность:
SMP178 5’-TgA.ggC.ACg.TAT.TgA.TgA.CC-3' (SEQ ID No 13)
Размер ожидаемого амплифицированного фрагмента при ПЦР с использованием этих праймеров составлял 115 п.о.
Целевую ПЦР выполняли, используя приблизительно 200 нг матричной ДНК, выделенной из семян, насыпанных на грунт, согласно инструкции модифицированного набора для выделения и очистки ДНК Centra Puregene DNA purification extraction kit (Qiagen). Если использовали ДНК, выделенную другими способами, следовало выполнить тестовый прогон с использованием известных относительных уровней EE-GM3.
Валидированную ПЦР с эталонной системой, мишенью которой являлась эндогенная последовательность,
в идеале следовало выполнять в виде отдельного прогона ПЦР для подтверждения пригодности образца ДНК для ПЦР-анализа во избежание ложных отрицательных результатов.
При использовании неизвестных тестируемых образцов ПЦР-эксперимент в идеале должен был включать соответствующие образцы положительных и отрицательных контролей, т.е.:
- Контроль мастер-микса (отрицательный контроль ДНК). Это - ПЦР, в ходе которой в реакционную смесь не вносили ДНК. Если получали ожидаемый результат (отсутствие продукта ПЦР) как для целевой, так и для эталонной систем, это означало, что смесь для ПЦР не загрязнена ДНК-мишенью.
- Положительный контроль ДНК (образец геномной ДНК, заведомо содержавший трансгенные последовательности). Успешная амплификация положительного контроля демонстрировала, что ПЦР проходила при условиях, обеспечивавших амплификацию последовательностей-мишеней.
- Также в эту ПЦР можно было вносить контроль ДНК дикого типа. Это - ПЦР, в ходе которой матрица ДНК представляла собой геномную ДНК, выделенную из нетрансгенного растения. Если получали ожидаемый результат - отсутствие амплификации трансгенного продукта ПЦР при амплификации эндогенного продукта ПЦР, - это означало, что в образце геномной ДНК не происходило обнаруживаемой фоновой амплификации трансгена.
Оптимальные результаты получали при следующих условиях
Очевидно, что можно использовать другие Taq-полимеразы, и в этом случае можно изменять условия для
соответствия рекомендациям поставщика.
- смесь ПНР для объема реакционной смеси 25 мкл содержала:
200 нг матричной ДНК
5 мкл 5× рабочего буферного раствора
0.25 мкл 20 мМ dNTP
0.7 мкл SHA130 (10 пмоль/мкл)
0.4 мкл SHA178 (10 пмоль/мкл)
0.1 мкл GO-Taq-ДНК-полимеразы (5 единиц/мкл)
воду до объема 25 мкл
профиль термоциклирования, позволявший получить оптимальные результаты, выглядел следующим образом:
4 мин при 95°C
Затем: 1 мин при 95°C
1 мин при 57°C
2 мин при 72°C В течение 5 циклов
Затем: 30 с при 92°C
30 с при 57°C
1 мин при 72°C
В течение 30 циклов
Затем: 10 минут при 72°C
Для оптимальной визуализации результатов ПЦР определили, что 25 мкл продукта ПЦР следовало нанести на 1.5% агарозный гель (трис-боратный буфер) с соответствующим маркером молекулярной массы (например, лэддером 50 п.о.).
При соблюдении способа ПЦР согласно вышеприведенному описанию видимые количества продуктов ПЦР целевой и эталонной систем ожидаемого размера в дорожках указывали на то, что тестируемый образец, из которого выделили геномную матричную ДНК, содержал уровень элитного события EE-GM3, превышавший предел обнаружения целевой реакции.
Если в дорожках отсутствовало видимое количество целевых продуктов ПЦР и присутствовали видимые количества продуктов ПЦР эталонной системы, это указывало на то, что тестируемый образец, из которого выделили геномную матричную ДНК, содержал уровень элитного события EE-GM3, составлявший величину ниже предела обнаружения целевой реакции.
Если в дорожках отсутствовали видимые количества эндогенных и трансгенных продуктов ПЦР, это указывало на то, что качество и/или количество геномной ДНК не позволяло получить продукт ПЦР. Расчет оценок для этих растений был невозможен. Следовало повторить выделение геномной ДНК и выполнить новый прогон ПЦР с соответствующими контролями.
3. Использование специфического интегрированного фрагмента в качестве зонда для обнаружения материала, включавшего EE-GM3
Специфический интегрированный фрагмент EE-GM3 получали путем ПЦР-амплификации при использовании специфических праймеров SOY028 (SEQ ID No 4) и SOY029 (SEQ ID No 5), позволявших получить ампликон с нуклеотидной последовательностью SEQ ID No 8, или путем химического синтеза, и метили. Этот интегрированный фрагмент использовали в качестве специфического зонда для обнаружения EE-GM3 в биологических образцах. Нуклеиновую кислоту выделяли из образцов согласно стандартным процедурам. Затем эту нуклеиновую кислоту приводили в контакт со специфическим зондом при условиях гибридизации, оптимизированных для образования гибрида. Обнаружение образования гибрида указывало на присутствие нуклеиновой кислоты EE-GM3 в образце. Необязательно нуклеиновую кислоту в образцах амплифицировали до контакта со специфическим зондом, используя специфические праймеры. В качестве альтернативы вместо интегрированного фрагмента метили нуклеиновую кислоту до контакта со специфическим зондом. Необязательно специфический зонд прикрепляли к твердому носителю (например, не ограничиваясь этим, к фильтру, стрипу или гранулам) до контакта с образцами.
4. Протокол для ПЦР-определения статуса зиготности по EE-GM3 растительного материала сои
4.1. Праймеры
Два праймера, распознающие нуклеотидные последовательности локуса дикого типа до инсерции элитного события, сконструировали так, что они являлись мишенями друг для друга и обладали сайтом инсерции чужеродной ДНК, содержащей гены устойчивости к гербицидам, расположенным между праймерами. Этот набор праймеров совместно с третьим праймером, комплементарным последовательностям чужеродной ДНК, мишенью которого являлась фланкирующая ДНК, позволял выполнять одновременную ПЦР-амплификацию специфической последовательности EE-GM3, а также последовательности дикого типа.
Обнаружили, что следующие праймеры позволяли получить наиболее ясные и воспроизводимые результаты в ходе оценки зиготности с помощью ПЦР с ДНК EE-GM3:
SMP187: 5’-ATA.TCA.ACC.CgT.AgC.TCg.AC-3’ (SEQ ID No.: 6)
(мишень: растительная ДНК дикого типа сверху от 3’-фланкирующей последовательности)
SOY029 5’-CAA.ggC.CTC.gAg.ATT.ATC-3’ (SEQ ID No.: 5)
(мишень: растительная ДНК 3’-фланкирующей последовательности)
STV019 5’-ggC.ATT.AAA.TTg.gTg.AAA.ATT.gC-3’ (SEQ ID No.:7)
(мишень: внедренная ДНК)
4.2. Амплифицированные фрагменты
Ожидаемые амплифицированные фрагменты при ПЦР представляли собой:
Для пары праймеров SMP187 - SOY029: 319 п.о. (локус дикого типа)
Для пары праймеров STV019 - SOY029: 706 п.о. (локус EE-GM3)
4.3. Матричная ДНК
Матричную ДНК выделяли из фрагмента листа, полученного компостированием, согласно Edwards et al. (Nucleic Acid Research, 19, p1349, 1991). Если использовали ДНК, выделенную другими способами, следовало выполнить тестовый прогон с использованием различных количеств матрицы. Обычно наилучшие результаты получали при использовании 25 или 50 нг геномной матричной ДНК.
4.4. Назначенные положительный и отрицательный контроли
Во избежание ложных положительных или отрицательных результатов рекомендовали, что в ПЦР-прогон следовало включить следующие положительный и отрицательный контроли:
- Контроль мастер-микса (отрицательный контроль ДНК). Это - ПЦР, в ходе которой в реакционную смесь не вносили ДНК. Если получали ожидаемый результат - отсутствие продукта ПЦР, - это означало, что смесь для ПЦР не загрязнена ДНК-мишенью.
- Положительный контроль ДНК (образец геномной ДНК, заведомо содержавший трансгенные последовательности). Успешная амплификация положительного контроля демонстрировала, что ПЦР проходила при условиях, обеспечивавших амплификацию последовательностей-мишеней.
- Контроль ДНК дикого типа. Это - ПЦР, в ходе которой матрица ДНК представляла собой геномную ДНК, выделенную из нетрансгенного растения. Если получали ожидаемый результат - отсутствие амплификации трансгенного продукта ПЦР при амплификации эндогенного продукта ПЦР, - это означало, что в образце геномной ДНК не происходило обнаруживаемой фоновой амплификации трансгена.
4.5. Условия ПЦР
Оптимальные результаты получали при следующих условиях. Очевидно, что можно использовать другие Taq-полимеразы, например, GO-Taq, и в этом случае можно изменять условия для соответствия рекомендациям поставщика.
- смесь ПЦР для объема реакционной смеси 25 мкл содержала:
x мкл матричной ДНК (25 нг)
2.5 мкл 10× буфера для амплификации (поставлялся производителем с Taq-полимеразой)
0.5 мкл 10 мМ dNTP
0.5 мкл SMP187 (10 пмоль/мкл)
0.5 мкл STV019 (10 пмоль/мкл)
1 мкл SOY029 (10 пмоль/мкл)
0.1 мкл Taq-ДНК-полимеразы (5 единиц/мкл)
воду до объема 25 мкл
- профиль термоциклирования, позволявший получить оптимальные результаты, выглядел следующим образом:
4 мин при 95°C
Затем: 1 мин при 95°C
1 мин при 57°C
2 мин при 72°C
В течение 5 циклов
Затем: 30 с при 92°C
30 с при 57°C
1 мин при 72°C
В течение 25 циклов
Затем: 10 минут при 72°C
4.6. Анализ в агарозном геле
Для оптимальной визуализации результатов ПЦР определили, что от 10 до 20 мкл образцов ПЦР следовало нанести на 1.5% агарозный гель (трис-боратный буфер) с соответствующим маркером молекулярной массы (например, лэддером 100 п.о. Pharmacia).
4.7. Подтверждение результатов
Данные, полученные для образцов ДНК трансгенных растений в течение одиночного прогона ПЦР и при использовании одиночного мастер-микса ПЦР являлись неприемлемыми, если:
- в положительном контроле не наблюдали продуктов ПЦР (амплификация трансгенной мишени)
- в положительном контроле ДНК дикого типа не наблюдали ожидаемого результата (амплификация мишени дикого типа)
- отрицательный контроль не давал отрицательного результата при ПЦР-амплификации (отсутствия фрагментов).
Дорожки, в которых присутствовали видимые количества трансгенных продуктов ПЦР ожидаемого размера и отсутствовали видимые количества ПЦР-продуктов дикого типа, указывали на то, что соответствующее растение, из которого выделили геномную матричную ДНК, являлось гомозиготным по кассете трансгенного гена.
Дорожки, в которых присутствовали видимые количества трансгенных продуктов ПЦР и ПЦР-продуктов дикого типа ожидаемых размеров, указывали на то, что соответствующее растение, из которого выделили геномную матричную ДНК, являлось гемизиготным по кассете трансгенного гена. Дорожки, в которых отсутствовали видимые количества трансгенных продуктов ПЦР и присутствовали видимые количества ПЦР-продуктов дикого типа, указывали на то, что соответствующее растение, из которого выделили геномную матричную ДНК, не унаследовало кассету трансгенного гена и, таким образом, являлось гомозиготным по локусу дикого типа.
Дорожки, в которых отсутствовали видимые количества трансгенных продуктов ПЦР и ПЦР-продуктов дикого типа, указывали на то, что качество и/или количество геномной ДНК не позволяло получить продукт ПЦР. Расчет оценок для этих растений был невозможен. Следовало повторить выделение геномной ДНК и выполнить новый прогон ПЦР с соответствующими контролями.
4.8. Использование протокола оценки зиготности для идентификации статуса зиготности растений, содержавших EE-GM3
На Фигуре 3 показан результат, полученный при ПЦР-оценке зиготности EE-GM3 в ряде образцов растений сои. Обнаружено, что образцы в дорожках 2 и 5 содержали только ПЦР-фрагмент (706 п.о.), характерный для элитного события EE-GM3, в то время как образцы в дорожках 4, 6 и 7 содержали только фрагмент, характерный для присутствия локуса дикого типа. Дорожки 3, 8 и 9 содержали оба фрагмента. Дорожки 2 и 5, следовательно, содержали EE-GM3 в гомозиготной форме, дорожки 3, 8 и 9 содержали ЕЕ-GM3 в гемизиготной форме, а дорожки 4, 6 и 7 содержали локус дикого типа в гомозиготной форме (были азиготны по EE-GM3). Дорожка 10 представляла отрицательный контрольный образец (воды), а дорожки 1 и 11 представляли маркер молекулярной массы (лэддер 100 п.о.).
5. Интрогрессия EE-GM3 в предпочтительные сорта.
Элитное событие EE-GM3 внедряли путем повторного возвратного скрещивания в коммерческие сорта сои, например, но не ограничиваясь, в сорт сои 7631014 (US 2009252860); сорт сои 7431014 (US 2009252859); сорт сои 7925084 (US 2009252858); сорт сои 7311153 (US 2009252857); сорт сои S070159 (US 2009252856); сорт сои 7535357 (US 2009246353); сорт сои S070160 (US 2009246352); сорт сои 26074414 (US 2009249508); сорт сои 7509171 (US 2009249507); сорт сои S070158 (US 2009246351); сорт сои 7511119 (US 2009249506); сорт сои 7113111 (US 2009238945); сорт сои S06-02RMO 18047 (US 7592518); сорт сои 7013345 (US 2009232957); сорт сои 7041461 (US 2009235376); сорт сои 7549450 (US 2009232956); сорт сои 7317090 (US 2009232955); сорт сои 2N2V58015 (US 2009226597); сорт сои 7243182 (US 2009226596); сорт сои 7143182 (US 2009226595); сорт сои 7043182 (US 2009220673); сорт сои S070157 (US 2009222950); сорт сои 306924721 (US 2009220672); сорт сои 7614385 (US 2009220671); сорт сои 7925118 (US 2009214750); сорт сои 7821295 (US 2009214749); сорт сои 7811336 (US 2009214748); сорт сои S070150 (US 2009214747); сорт сои 6214260 (US 2009214746); сорт сои S070152 (US 2009214745); сорт сои 7429331 (US 2009214751); сорт сои 26034631 (US 2009208634); сорт сои S07-03JR 108674 (US 7560621); сорт сои S07-03KL016279 (US 7560620); сорт сои S06-CL959411 (US 7554017); сорт сои SG3870NRR (US 2009158453); сорт сои HFPR-G (СА 2645702); сорт сои S06-02JR423016 (US 7521606); сорт сои S06-01JR119814 (US 7518039); сорт сои S06-01JR119448 (US 7518038); сорт сои 6540220 (US 2009055960); сорт сои S060292 (US 2009055959); сорт сои S050228 (US 2009055958); сорт сои S06-02JR423003 (US 7491873); сорт сои S06-02JR423005 (US 7491872); сорт сои S06-02JR409114 (US 7485782); сорт сои S06-SJ144056 (US 7473823); сорт сои (US 7470835); сорт сои 6910450 (US 2008282369); сорт сои 6223012 (US 7446246); сорт сои 6549250 (US 7446245); сорт сои 17731225 (US 2008271204); сорт сои 6928285 (US 2008271203); сорт сои 6736054 (US 2008271169); сорт сои S060299 (US 2008271199); сорт сои S060294 (US 2008271202); сорт сои 6943322 (US 2008271201); сорт сои 5343260 (US 2008263719); сорт сои 6439359 (US 2008263704); сорт сои 6238359 (US 2008263703); сорт сои 6547272 (US 2008263702); сорт сои 6929431 (US 2008263701); сорт сои 6703392 (US 2008263700); сорт сои 6044483 (US 2008263699); сорт сои S050224 (US 2008263698); сорт сои 6719022 (US 2008263697); сорт сои 5826056 (US 2008263696); сорт сои 6265047 (US 2008263724); сорт сои 6928331 (US 2008263695); сорт сои 6719331 (US 2008263694); сорт сои 6636454 (US 2008263693); сорт сои 6226454 (US 2008263718); сорт сои Q0073801 (US 2008256657); сорт сои 6326393 (US 2008256652); сорт сои 6408448 (US 2008256651); сорт сои 6449315 (US 2008250524); сорт сои S060296 (US 2008250523); сорт сои 6012078 (US 2008250522); сорт сои 6342078 (US 2008250521); сорт сои 6419156 (US 2008250520); сорт сои 5723264 (US 2008250519); сорт сои S050225 (US 2008250518); сорт сои S060298 (US 2008244783); сорт сои 6935331 (US 2008244782); сорт сои 6819456 (US 2008244787); сорт сои S060297 (US 2008244781); сорт сои 6135319 (US 2008244786); сорт сои 6819331 (US 2008244780); сорт сои 6137445 (US 2008244779); сорт сои 6917445 (US 2008244778); сорт сои 6111333 (US 2008244777); сорт сои S050229 (US 2008244776); сорт сои 6114011 (US 2008244775); сорт сои 6900358 (US 2008244784); сорт сои 6345184 (US 2008244774); сорт сои 6836085 (US 2008244773); сорт сои 6635047 (US 2008244772); сорт сои 6139105 (US 2008244771); сорт сои 6434385 (US 2008244770); сорт сои S060295 (US 2008244769); сорт сои 6035184 (US 2008244768); сорт сои S060293 (US 2008209590); сорт сои 6733322 (US 2008209594); сорт сои 6421326 (US 2008209593); сорт сои S060077 (US 2008209589); сорт сои 6600375 (US 2008209592); сорт сои S06-CL821457 (US 7420104); сорт сои S07-02KG294306 (US 7414178); сорт сои S06-BA046119 (US 7414175); сорт сои S07-02KG294307 (US 7411114); сорт сои SG3865N (US 2008189802); сорт сои 6701475 (US 7408097); сорт сои 1335025 (US 2008178316); сорт сои 1686017 (US 2008178315); сорт сои 2388028 (US 2008178314); сорт сои 2387029 (US 2008178313); сорт сои S06-WW152330 (US 7388129); сорт сои 6424090 (US 7385118); сорт сои 6723322 (US 7385115); сорт сои SG4377NRR (US 7385114); сорт сои S0602JR111334 (US 7381864); сорт сои 6141287 (US 7378577); сорт сои МТ110501 (US 7378576); сорт сои (US7 378575); сорт сои S06-WW 169267 (US 7375261); сорт сои 6223392 (US 7371939); сорт сои S06-CL968413 (US 7371937); сорт сои S06-CL951107 (US 7368636); сорт сои S06-MT9152077 (US 7361810); сорт сои 4211676 (US 2008092253); сорт сои S06-M059029 (US 7355101); сорт сои 6548193 (US 7345228); сорт сои 6440261 (US 7345227); сорт сои S060291 (US 7342151); сорт сои S06-MT9206166 (US 7339094); сорт сои S06-WW013107 (US 7339093); сорт сои S06-M03256 (US 7335820); сорт сои 6134466 (US 7332656); сорт сои S06-01JR123373 (US 7329800); сорт сои S06-MT9211059 (US 7326831); сорт сои 26170838 (US 2008016590); сорт сои 306612412 (US 2008016588); сорт сои 26660135 (US 2008016587); сорт сои 306734323 (US 2008016586); сорт сои S06-01JR122235 (US 7317144); сорт сои 5900450 (US 7314986); сорт сои S06-MT116260 (US 7314984); сорт сои S06-SJ143606 (US 7312381); сорт сои S06-98181-G01-35167 (US 7309819); сорт сои 26082635 (US 7304219); сорт сои ВА922834 (US 7304217); сорт сои OUR123480 (US 7304216); сорт сои М061422 (US 7304215); сорт сои 17082821 (US 2007277262); сорт сои 17621620 (US 2007277261); сорт сои 00977706 (US 2007277260); сорт сои S060182 (US 2007277259); сорт сои 26312034 (US 7301078); сорт сои 26143837 (US 7301077); сорт сои 435.TCS (US 2007271626); сорт сои 495.RC (US 2007271625); сорт сои 5306230 (US 7297845); сорт сои S06-WW167686 (US 7291772); сорт сои 6141145 (US 2007245426); сорт сои S050232 (US 2007226829); сорт сои 5333301 (US 2007226828); сорт сои S050215 (US 2007226827); сорт сои 3235020 (US 2007226826); сорт сои 5720482 (US 2007226825); сорт сои S050216 (US 2007226824); сорт сои 5512112 (US 2007226823); сорт сои 3233021 (US 2007226822); сорт сои 1336024 (US 2007226821); сорт сои 5348287 (US 2007226820); сорт сои 5204220 (US 2007226819); сорт сои 6188027 (US 2007226818); сорт сои 4183026 (US 2007226817); сорт сои S06-WW157958 (US 7271325); сорт сои 5733056 (US 2007209091); сорт сои 90501911 (US 2007209090); сорт сои S050221 (US 2007204361); сорт сои 5802205 (US 2007204360); сорт сои 1000642 (US 2007204359); сорт сои 5420128 (US 2007204358); сорт сои S050222 (US 2007199094); сорт сои S050217 (US 2007199093); сорт сои S050223 (US 2007199092); сорт сои S050218 (US 2007199091); сорт сои 5419227 (US 2007199089); сорт сои 5319227 (US 2007199088); сорт сои 5723045 (US 2007199087); сорт сои 5051007 (US 2007199086); сорт сои 5826175 (US 2007192893); сорт сои S050231 (US 2007192892); сорт сои 5826376 (US 2007192891); сорт сои 5628386 (US 2007192890); сорт сои 5138236 (US 2007186307); сорт сои 5608398 (US 2007186306); сорт сои S050230 (US 2007186305); сорт сои 5624126 (US 2007180561); сорт сои 5019225 (US 2007180560); сорт сои 5549483 (US 2007180559); сорт сои 4189010 (US 2007180551); сорт сои 1486018 (US 2007180550); сорт сои S050235 (US 2007180549); сорт сои 5023230 (US 2007180548); сорт сои S050238 (US 2007174930); сорт сои 5830261 (US 2007174928); сорт сои S050226 (US 7247772); сорт сои 5806063 (US 7247771); сорт сои S050233 (US 7244881); сорт сои 5726085 (US 7241939); сорт сои МТ000792 (US 7238867); сорт сои 5521161 (US 7235718); сорт сои WW109447 (US 7235717); сорт сои ВА947474 (US 7220898); сорт сои 5939002 (US 7217870); сорт сои 5726175 (US 7217869); сорт сои 5432082 (US 7217868); сорт сои SG0850RR (US 7211715); сорт сои SG1750NRR (US 7208658); сорт сои МТ017827 (US 7208657); сорт сои 4N2V74028 (US 7205458); сорт сои CL431203 (US 7202400); сорт сои 4N0S63222 (US 7199288); сорт сои 5520279 (US 7196253); сорт сои 5834401 (US 7196252); сорт сои 5621161 (US 7196251); сорт сои CL722114 (US 7196250); сорт сои 5741081 (US 7193140); сорт сои CL727422 (US 7186895); сорт сои 4N2V55022 (US 7183468); сорт сои 5083011 (US 7173169); сорт сои 5626085 (US 7169976); сорт сои S050051 (US 7169974); сорт сои 4506816 (US 2006294626); сорт сои WW152201 (US 7132594); сорт сои CL727636 (US 7132593); сорт сои М08851 (US 7126047); сорт сои 4324401 (US 7105728); сорт сои S050164 (US 7105727); сорт сои 4136015 (US 2006195931); сорт сои 3133014 (US 2006195930); сорт сои S040132 (US 2006195929); сорт сои 4328386 (US 2006195928); сорт сои 1339013 (US 2006195927); сорт сои 4423183 (US 2006195925); сорт сои S040131 (US 2006195924); сорт сои 4929388 (US 2006195923); сорт сои 4817034 (US 2006195922); сорт сои 4916816 (US 7098385); сорт сои 4713487 (US 2006191032); сорт сои 4348019 (US 2006191031); сорт сои S040122 (US 2006191030); сорт сои S040133 (US 2006185031); сорт сои CL821418 (US 7091404); сорт сои 4441080 (US 7091403); сорт сои 4805442 (US 2006179509); сорт сои 4921237 (US 2006179508); сорт сои 4417380 (US 2006174369); сорт сои 4405070 (US 2006174368); сорт сои 4417779 (US 7084328); сорт сои S040125 (US 2006168678); сорт сои 4909380 (US 7081572); сорт сои S050162 (US 7081571); сорт сои 6084016 (US 7081570); сорт сои S050163 (US 7078600); сорт сои S040135 (US 7078598); сорт сои S040117 (US 7078597); сорт сои М03393 (US 7071391); сорт сои 4145306 (US 7064253); сорт сои 900213 (US 2006117405); сорт сои 1000126 (US 2006117404); сорт сои 901023 (US 2006117403); сорт сои S040130 (US 7053280); сорт сои 4706198 (US 7053279); сорт сои S040118 (US 7053278); сорт сои S040119 (US 7053277); сорт сои S040123 (US 7053276); сорт сои 4442112 (US 7049497); сорт сои 917013 (US 7045689); сорт сои S040124 (US 7045691); сорт сои 4238491 (US 7045690); сорт сои SO 10136 (US 7041882); сорт сои 900613 (US 7030297); сорт сои 4337175 (US 7030301); сорт сои S040121 (US 7030300); сорт сои 4216033 (US 7030299); сорт сои S040128 (US 7022901); сорт сои S040120 (US 7022900); сорт сои S040127 (US 7019199); сорт сои S040134 (US 7015378); сорт сои S040129 (US 7015377); сорт сои 4513420 (US 7005564); сорт сои 943013 (US 2006031958); сорт сои S030136 (US 2006021083); сорт сои 927013 (US 2006021080); сорт сои 1000109 (US 2006015962); сорт сои 90046112 (US 2006010530); сорт сои 90897327 (US 2006010529); сорт сои 90362421 (US 2006010528); сорт сои 03022253 (US 2006010527); сорт сои 02022433 (US 2006010526); сорт сои 02022323 (US 2006010525); сорт сои 02912951 (US 2006010524); сорт сои 0102115 (US 2006010523); сорт сои 915034 (US 2006010522); сорт сои 0509255 (US 2006010521); сорт сои 4803070 (US 6982368); сорт сои 4704310 (US 6979762); сорт сои SJ919784 (US 2005268362); сорт сои CL615261 (US 2005268361); новый сорт сои (US 2004199964); сорт сои 0509214 (US 2005210542); сорт сои 70826751 (US 2005193442); сорт сои 0509243 (US 2005193441); сорт сои 0509246 (US 2005193440); сорт сои 0509253 (US 2005193439); сорт сои 0509247 (US 2005193438); сорт сои 0509252 (US 2005193437); сорт сои 0509241 (US 2005193436); сорт сои 0509249 (US 6884927); сорт сои 0509244 (US 2005183158); сорт сои 0509240 (US 2005183157); сорт сои 0509239 (US 2005183156); сорт сои 0509254 (US 2005183155); сорт сои 0509245 (US 2005183154); сорт сои 0509251 (US 2005183153); сорт сои 4283008 (US 6888050); сорт сои 2386009 (US 2005183152); сорт сои 3282002 (US 6870080); сорт сои 0509248 (US 2005183151); сорт сои 5091007 (US 6906249 (); сорт сои 0509236 (US 2005166281); сорт сои 0509235 (US 2005166280); сорт сои 0509237 (US 2005166279); сорт сои SG5322NRR (US 2005164390); сорт сои SG5030NRR (US 2005166278); сорт сои SG4911NRR (US 2005166277); сорт сои S030153 (US 2005160504); сорт сои S030158 (US 2005144680); сорт сои S030160 (US 2005144679); сорт сои S030161 (US 2005144678); сорт сои S030157 (US 2005144677); сорт сои S030155 (US 2005144676); сорт сои S030156 (US 2005144675); сорт сои S030159 (US 2005144674); сорт сои S030154 (US 6900376); сорт сои S020030 (US 2005114929); сорт сои S030010 (US 2005114928); сорт сои SG1431RR (US 2005097629); сорт сои SG1330NRR (US 2005097642); сорт сои S030150 (US 2005071900); сорт сои S022209 (US 2005050601); сорт сои S022217 (US 2005050600); сорт сои S022219 (US 2005050599); сорт сои S030151 (US 2005050598); сорт сои 0491735 (US 2005022272); сорт сои S022218 (US 2005022271); сорт сои 6190006 (US 2004268447); сорт сои SG1120RR (US 2004250316); сорт сои 0487681 (US 2004237153); сорт сои 0491717 (US 2004237152); сорт сои S022220 (US 2004237151); сорт сои 0491715 (US 2004237150); сорт сои 0491712 (US 2004237149); сорт сои 0491718 (US 2004237148); сорт сои 99271316 (US 2004221344); сорт сои S022212 (US 2004221343); сорт сои 0491737 (US 2004221342); сорт сои S022211 (US 2004221341); сорт сои S022210 (US 2004221340); сорт сои S022213 (US 2004221339); сорт сои 0491725 (US 2004221346); сорт сои 03129016 (US 2004221329); сорт сои S022208 (US 2004221328); сорт сои S022207 (US 2004221345); сорт сои 02932 (US 2004210968); сорт сои 94137321 (US 2004205862); сорт сои 94106224 (US 2004205861); сорт сои 94143901 (US 2004205859); сорт сои 0487685 (US 2004205858); сорт сои 92440927 (US 2004205857); сорт сои 0487686 (US 2004205856); сорт сои S022215 (US 2004205855); сорт сои S022214 (US 2004205854); сорт сои 0491726 (US 2004205849); сорт сои 92478609 (US 2004205853); сорт сои 922013 (US 6781040); сорт сои 0491727 (US 2004205852); сорт сои 0491728 (US 2004205851); сорт сои 1465003 (US 2004098766); сорт сои 3186004 (US 2004019936); сорт сои 7085005 (US 2004205850); сорт сои S022204 (US 2004199958); сорт сои S022206 (US 2004199957); сорт сои 0491731 (US 2004199956); сорт сои 0491733 (US 2004199955); сорт сои 0491738 (US 2004199954); сорт сои 0491732 (US 2004199953); сорт сои 0491729 (US 2004199952); сорт сои S020011 (US 2004199951); сорт сои 0491739 (US 2004199950); сорт сои 0491730 (US 2004199949); сорт сои 13873 (US 2004199948); сорт сои 954011 (US 2004181822); сорт сои 010022 (US 2004181831); сорт сои 4181001 (US 2003229926); сорт сои 0491721 (US 2004168228); сорт сои 0491723 (US 6911581); сорт сои 0491716 (US 2004168226); сорт сои 0491713 (US 2004168225); сорт сои 0491711 (US 2004168224); сорт сои 0491722 (US 2004168223); сорт сои 0491724 (US 2004168222); сорт сои 0491720 (US 2004168221); сорт сои 0487682 (US 2004168220); сорт сои 0491714 (US 2004168219); сорт сои 0491719 (US 2004168218); сорт сои DP 5634 RR (US 2003177540); сорт сои S56-D7 (US 2004098765); сорт сои 926877 (US 2004064859); сорт сои SE73753 (US 2004055059); сорт сои SN83594 (US 2004055058); сорт сои SE71112 (US 2004055056); сорт сои SE73090 (US 2004055054); сорт сои SN79526 (US 2004055053); сорт сои SW90702 (US 2004055052); сорт сои SN79525 (US 2004055051); сорт сои SE90345 (US 2004055050); сорт сои 0149928 (US 2004055049); сорт сои SN83780 (US 2004055048); сорт сои 0053840 (US 2004055047); сорт сои 924001 (US 2004055046); сорт сои 0004747 (US 2004055057); сорт сои 0037357 (US 2004055045); сорт сои SN83366 (US 2004055044); сорт сои SN76208 (US 2004055043); сорт сои 0037370 (US 2004055042); сорт сои SX95512 (US 2004049821); сорт сои 0096008 (US 2004049820); сорт сои SN83544 (US 2004049819); сорт сои 0088401 (US 2004049818); сорт сои SN64195 (US 2004049817); сорт сои 0034754 (US 2004049816); сорт сои SN71173 (US 2004049815); сорт сои SN83211 (US 2004049814); сорт сои 92422749 (US 2004045058); сорт сои 0120311 (US 2004045057); сорт сои S010344 (US 2004003438); сорт сои 70876922 (US 2004003437); сорт сои 924496 (US 2004003436); сорт сои 19705120 (US 2003237116); сорт сои 19704220 (US 2003235914); сорт сои 19704280 (US 2003237115); сорт сои 19704210 (US 2003237114); сорт сои S37-N4 (US 2003237113); сорт сои 19602310 (US 2003233685); сорт сои 19704120 (US 2003233684); сорт сои 19704230 (US 2003233683); сорт сои 1000126 (US 2003233682); сорт сои 93831526 (US 2003221226); сорт сои 0322581 (US 2003221225); сорт сои 0332149 (US 2003213028); сорт сои 0332144 (US 2003213027); сорт сои 924788 (US 2003213026); сорт сои 924861 (US 2003213025); сорт сои 928070 (US 2003213 024); сорт сои S010354 (US 2003213023); сорт сои S010360 (US 2003213022); сорт сои S010361 (US 2003213021); сорт сои S010363 (US 2003213020); сорт сои SO 10364 (US 2003213019); сорт сои 0332148 (US 2003208805); сорт сои 0332147 (US 2003208804); сорт сои 0332146 (US 2003208803); сорт сои 0332135 (US 2003208802); сорт сои 1000144 (US 2003208801); сорт сои 0332143 (US 2003208800); сорт сои 0332145 (US 2003208799); сорт сои S010345 (US 2003204884); сорт сои 0332131 (US 2003204883); сорт сои 0332130 (US 2003204882); сорт сои 0332129 (US 2003204881); сорт сои 0332122 (US 2003204880); сорт сои S010350 (US 2003204879); сорт сои S010355 (US 2003204878); сорт сои 031766 (US 2003204877); сорт сои S010353 (US 2003204876); сорт сои 0322580 (US 2003200579); сорт сои 0322579 (US 2003200578); сорт сои SO 10347 (US 2003200577); сорт сои S010349 (US 2003200576); сорт сои 0332141 (US 2003200575); сорт сои 0332142 (US 2003200574); сорт сои 0332133 (US 2003200573); сорт сои 0332134 (US 2003 200572); сорт сои 0332139 (US 2003200571); сорт сои 0332137 (US 2003200570); разновидность сои XB33U08 (US 7598435); разновидность сои XB27D08 (US 7592519); разновидность сои ХВ4М08 (US 7589261); разновидность сои XB05J08 (US 7589260); разновидность сои ХВЗЗТ08 (US 7589259); разновидность сои XB30Y08 (US 7586025); разновидность сои XB40U08 (US 7582813); разновидность сои ХВ29М08 (US 7582811); разновидность сои 93Y10 (US 2009144843); разновидность сои D4325666 (US 2009055957); разновидность сои D4125897 (US2009055956); разновидность сои D4698573 (US2009055955); разновидность сои D4356652 (US 2009019592); разновидность сои D4456885 (US 2009019591); разновидность сои D4698013 (US 2009019590); разновидность сои D4637114 (US 20090I9589); разновидность сои D4102367 (US 2009019595); разновидность сои D4266582 (US 2009019594); разновидность сои D4422801 (US 2009019593); разновидность сои D4520980 (US 2009019588); разновидность сои D4521369 (US 2009019587); разновидность сои D4223057 (US2009019586); разновидность сои D4682156 (US 2009019585); разновидность сои D4233569 (US 2009019584); разновидность сои D4925614 (US 2009019583); разновидность сои D4203144 (US 2009019604); разновидность сои D4102536 (US2009019582); разновидность сои D4865324 (US 2009019581); разновидность сои D4825495 (US 2009019580); разновидность сои D4659251 (US 2009019579); разновидность сои D4258962 (US 2009019578); разновидность сои D4253969 (US 2009019577); разновидность сои D4696658 (US 2009019603); разновидность сои D4256925 (US 2009019576); разновидность сои D4253681 (US 2009019575); разновидность сои D4789254 (US 2009019574); разновидность сои D4713125 (US 2009019573); разновидность сои D4526223 (US 2009019572); разновидность сои D4556201 (US 2009019571); разновидность сои D4012368 (US 2009019570); разновидность сои D4452019 (US 2009019569); разновидность сои D4201483 (US 2009019568); разновидность сои D4463892 (US 2009019567); разновидность сои D4159630 (US 2009019566); разновидность сои D4470236 (US 2009019565); разновидность сои D4063284 (US 2009019564); разновидность сои D4021792 (US 2009013429); разновидность сои D4902530 (US 2009013428); разновидность сои D4367012 (US 2009013427); разновидность сои D4923560 (US 2009013426); разновидность сои D4253854 (US 2009013425); разновидность сои D4210110 (US 2009007290); разновидность сои D4523081 (US 2009007289); разновидность сои D4328762 (US 2009007288); разновидность сои D4483789 (US 2009007287); разновидность сои D4311702 (US2009007286); разновидность сои D4127789 (US2008313765); разновидность сои D4361423 (US 2008313764); разновидность сои D4208814 (US 2008313763); разновидность сои D4201139 (US 2008313762); разновидность сои D4120384 (US 2008313761); разновидность сои D4572906 (US 2008313760); разновидность сои D4301279 (US 2008313759); разновидность сои D4422957 (US 2008313758); разновидность сои D4256958 (US 2008313757); разновидность сои 4074328 (US 2008282366); разновидность сои XB47Q06 (US2008244767); разновидность сои XB26R06 (US 2008244766); разновидность сои 4991629 (US 2008216190); разновидность сои 4158090 (US 2008216189); разновидность сои ХВ40К07 (US 2008209582); разновидность сои D0069201 (US2008178345); разновидность сои D0064801 (US 2008178320); разновидность сои D0063801 ( ); разновидность сои D0061501 (US 2008178343); разновидность сои 4938051 (US 2008178319); разновидность сои 4880500 (US 2008178318); разновидность сои 4835953 (US 2008178317); разновидность сои 4684181 (US 2008178342); разновидность сои 4427363 (US 2008178340); разновидность сои 4676311 (US2008178339); разновидность сои 4953710 (US 2008178337); разновидность сои 4857548 (US 2008178336); разновидность сои 4551757 (US 2008178335); разновидность сои 4027271 (US 2008178334); разновидность сои 4274171 (US 2008178333); разновидность сои 0341931 (US2008178332); разновидность сои 4282159 (US2008178331); разновидность сои 4852004 (US 2008178330); разновидность сои 4688589 (US 2008178329); разновидность сои 4614131 (US 2008178327); разновидность сои 4201823 (US 20081783 26); разновидность сои 92М22 (US2008178350); разновидность сои 4174206 (US 2008178322); разновидность сои 4305498 (US 2008178321); разновидность сои 4423586 (US 2008172761); разновидность сои 4568207 (US 2008172756); разновидность сои 4840308 (US 2008172755); разновидность сои 4256323 (US 2008172754); разновидность сои 4789516 (US 7399907); разновидность сои 90Y40 (US 2008168581); разновидность сои 4959932 (US 7396983); разновидность сои 4062885 (US 7394000); разновидность сои 4858197 ( ); разновидность сои 4092390 (US 7390939); разновидность сои 4735486 (US 7390938); разновидность сои 4219527 (US 7388132); разновидность сои 4599695 (US 7388131); разновидность сои 4554257 (US 7388130); разновидность сои 4896902 (US 7385113); разновидность сои 4367308 (US 7385112); разновидность сои 4589609 (US 7385111); разновидность сои 4640250 (US 7385110); разновидность сои 4540394 (US 7385109); разновидность сои 4297661 (US7385108); разновидность сои 4958786 (US 7381866); разновидность сои 4440685 (US 7375262); разновидность сои 4008211 (US 7371938); разновидность сои 4778469 (US 7368637); разновидность сои 4766295 (US 7355103); разновидность сои 4436909 (US 7355102); разновидность сои 4812469 (US 7351886); разновидность сои 4761767 (US 7351885); разновидность сои 4142393 (US 7329801); разновидность сои 4502135 (US 7326832); разновидность сои 4353363 (US 7321082); разновидность сои 91В42 (US 7317143); разновидность сои 0330739 (US 2007271622); разновидность сои 0384279 (US 7294768); разновидность сои 4175567 (US 2007256187); разновидность сои 4336643 (US 2007256186); разновидность сои 4671685 (US 2007256185); разновидность сои 4309194 (US 2007256190); разновидность сои 0330738 (US 2007256184); разновидность сои 0045477 (US 2007256183); разновидность сои 0437973 (US 2007256182); разновидность сои 0457028 (US 2007256181); разновидность сои 0367478 (US 2007256180); разновидность сои 0358232 (US 2007256179); разновидность сои 0417158 (US 2007256178); разновидность сои 4559809 (US 2007256177); разновидность сои 0196172 (US 2007256176); разновидность сои 4785923 (US 2007256175); разновидность сои 4587513 (US 2007256174); разновидность сои 0409670 (US 2007256173); разновидность сои 4010165 (US 2007256172); разновидность сои 0421133 (US 2007256171); разновидность сои 0240187 (US 2007256170); разновидность сои 0387907 (US 2007256169); разновидность сои 0232405 (US 2007256168); разновидность сои 0146529 (US 2007256167); разновидность сои 4788561 (US 2007256166); разновидность сои 457114 (US 2007256165); разновидность сои 0149217 (US 2007256164); разновидность сои 4247825 (US 2007254366); разновидность сои 0212938 (US 2007256163); разновидность сои 0146565 (US 2007256162); разновидность сои 4647672 (US 2007256161); разновидность сои 0215818 (US 2007256160); разновидность сои 0384531 (US 2007256159); разновидность сои 4878185 (US 2007254365); разновидность сои 4498438 (US 2007256158); разновидность сои 0436052 (US 2007256157); разновидность сои 4782157 (US 2007256156); разновидность сои 0385457 (US 2007256155); разновидность сои 0385240 (US 2007256154); разновидность сои 4735316 (US 2007256153); разновидность сои 0277524 (US 2007256152); разновидность сои 0276951 (US 2007256151); разновидность сои XB37L07 (US 2007245429); разновидность сои ХВ35Х07 (US 2007226837); разновидность сои XB35S07 (US 2007226836); разновидность сои XB35F07 (US 2007226835); разновидность сои XB34R07 (US 2007226834); разновидность сои XB34L07 (US 2007226833); разновидность сои XB34D07 (US 2007226832); разновидность сои XB33G07 (US 2007226831); разновидность сои 98Y11 (US 2007169220); разновидность сои 0137335 (US 7241941); разновидность сои ХВ15Е07 (US 2007150980); разновидность сои 92М52 (US 2007150979); разновидность сои XB47R07 (US 2007136888); разновидность сои XB46V07 (US 2007136887); разновидность сои ХВ57Е07 (US 2007136886); разновидность сои ХВ54Х07 (US 2007136885); разновидность сои XB54V07 (US 2007136884); разновидность сои XB52Q07 (US 2007136883); разновидность сои ХВ37М07 (US 2007136882); разновидность сои XB37J07 (US 2007136881); разновидность сои XB34Q07 (US 2007136880); разновидность сои XB32S07 (US 2007136879); разновидность сои XB32J07 (US 2007136878); разновидность сои XB31R07 (US 2007136877); разновидность сои XB31J07 (US 2007136876); разновидность сои ХВ29К07 (US 2007136875); разновидность сои ХВ31Н07 (US 2007136874); разновидность сои XB30G07 (US 2007136873); разновидность сои ХВ30Е07 (US 2007136872); разновидность сои ХВ25Е07 (US 2007136871); разновидность сои ХВ26Х07 (US 2007136870); разновидность сои XB23L07 (US 2007136869); разновидность сои XB19Z07 (US 2007136868); разновидность сои ХВ19Е07 (US 2007136867); разновидность сои ХВ18М07 (US 2007136866); разновидность сои ХВ18К07 (US 2007136865); разновидность сои XB18J07 (US 2007136864); разновидность сои XB17W07 (US 2007136863); разновидность сои XB17U07 (US 2007136862); разновидность сои ХВ15В07 (US 2007136861); разновидность сои XB12R07 (US 2007136860); разновидность сои XB11J07 (US 2007136859); разновидность сои ХВ04Е07 (US 2007136858); разновидность сои ХВ02К07 (US 2007136857); разновидность сои XB49V07 (US 2007136856); разновидность сои ХВ48Х07 (US 2007136855); разновидность сои 92М75 (US 2007136854); разновидность сои XB48W07 (US 2007136853); разновидность сои XB44G07 (US 2007136852); разновидность сои XB42K07 (US 2007136851); разновидность сои ХВ42Н07 (US 2007136850); разновидность сои XB41J07 (US 2007136849); разновидность сои XB40Y07 (US 2007136848); разновидность сои ХВ40Х07 (US 2007136847); разновидность сои ХВ39Е07 (US 2007136846); разновидность сои XB38W07 (US 2007136845); разновидность сои XB38S07 (US 2007136844); разновидность сои XB23V07 (US 2007136843); разновидность сои ХВ31М07 (US 2007130652); разновидность сои ХВ28Е07 (US 200713 0651); разновидность сои XB25S07 (US 2007130650); разновидность сои XB21N07 (US 2007130649); разновидность сои XB03Q07 (US 2007130648); разновидность сои XB49Q07 (US 2007130647); разновидность сои ХВ06М07 (US 2007130646); разновидность сои S04-97130-15-02 (US 7196249); разновидность сои S04-97026-N99-42648-01 (US 7189896); разновидность сои S05-97016-G99-21212 (US 7186894); разновидность сои S05-99048-19 (US 7164064); разновидность сои 92В14 (US 7161065); разновидность сои 98R31 (US 2007006350); разновидность сои S05-97177-NOO-22972 (US 7132592); разновидность сои XB25G06 (US 2006225160); разновидность сои 91М70 (US 2006174381); разновидность сои XB24R06 (US 2006162029); разновидность сои S03-95368-N98-52902 (US 7078594); разновидность сои S05-97130-51 (US 7078599); разновидность сои XB11L06 (US 2006130187); разновидность сои 94В13 (US 7064251); разновидность сои 94В74 (US 7064250); разновидность сои XB27J06 (US 2006112462); разновидность сои XB29N06 (US 2006112460); разновидность сои ХВ28Т06 (US 2006112459); разновидность сои XB16W06 (US 2006112458); разновидность сои ХВ18С06 (US 2006112456); разновидность сои ХВ10М06 (US 2006107391); разновидность сои ХВ06К06 (US 2006107390); разновидность сои XB28V06 (US 2006107389); разновидность сои ХВ004А06 (US 2006107388); разновидность сои XB12L06 (US 2006107387); разновидность сои ХВ005А06 (US 20061073 86); разновидность сои ХВ25Н06 (US 2006107385); разновидность сои XB39W06 (US 2006107384); разновидность сои ХВ27К06 (US 2006107383); разновидность сои XB29R06 (US 20061073 82); разновидность сои XB16S06 (US 20061073 81); разновидность сои XB36V06 (US 20061073 80); разновидность сои XB07N06 (US 20061073 79); разновидность сои ХВ23Н06 (US 2006107378); разновидность сои ХВ35С06 (US 2006107377); разновидность сои XB32L06 (US 2006107376); разновидность сои ХВ58Р06 (US 2006107375); разновидность сои ХВ36М06 (US 2006107374); разновидность сои XB22G06 (US 2006107373); разновидность сои XB36Q06 (US 2006107372); разновидность сои 91М61 (US 2006107371); разновидность сои ХВ32А06 (US 2006107370); разновидность сои XB19V06 (US 2006107369); разновидность сои ХВ43С06 (US 2006107368); разновидность сои XB22N06 (US 2006107367); разновидность сои ХВ38Е06 (US 2006107366); разновидность сои XB37U06 (US 2006107365); разновидность сои XB37Q06 (US 2006107364); разновидность сои XBOOD06 (US 2006107363); разновидность сои XB14N06 (US 2006107362); разновидность сои ХВ31Н06 (US 2006107361); разновидность сои XB21Z06 (US 2006107360); разновидность сои ХВ005В06 (US 2006107359); разновидность сои XB15W06 (US 2006107358); разновидность сои XB33N06 (US 2006107357); разновидность сои XB18W06 (US 2006107356); разновидность сои ХВ32М06 (US 2006107355); разновидность сои XB19F06 (US 2006107354); разновидность сои S03-95021-55-138-АВ (US 7026531); разновидность сои 94М41 (US 7002061); разновидность сои 91М50 (US 6998518); разновидность сои 92В13 (US 6989475); разновидность сои 93 В68 (US 6989474); разновидность сои 93В09 (US 6979759); разновидность сои 92М00 (US 6972352); разновидность сои ХВ08Р05 (US 2005120433); разновидность сои XB26V05 (US 2005150023); разновидность сои XB21R05 (US 2005108795); разновидность сои ХВ28Е05 (US 2005114942); разновидность сои ХВ58К05 (US 2005114941); разновидность сои ХВ27 В05 (US 2005114940); разновидность сои XB21S05 (US 2005150022); разновидность сои XB26U05 (US 2005138695); разновидность сои ХВ35К05 (US 2005150021); разновидность сои XB18S05 (US 2005120436); разновидность сои ХВ25С05 (US 2005120435); разновидность сои 90М01 (US 2005120434); разновидность сои ХВ22Н05 (US 2005150020); разновидность сои ХВ22К05 (US 2005114939); разновидность сои XB58G05 (US 2005114938); разновидность сои XB57U05 (US 2005120432); разновидность сои ХВ49М05 (US 2005120431); разновидность сои XB20D05 (US 2005144683); разновидность сои ХВ41В05 (US 2005150019); разновидность сои ХВ38Т05 (US 2005120430); разновидность сои ХВ13Т05 (US 2005120429); разновидность сои XB19Y05 (US 2005120428); разновидность сои XB43D05 (US 2005120427); разновидность сои ХВ40Е05 (US 2005120426); разновидность сои XB39N05 (US 2005120425); разновидность сои 93М01 (US 2005120424); разновидность сои XB31W05 (US 2005223439); разновидность сои ХВ32С05 (US 2005114937); разновидность сои XB40D05 (US 2005120423); разновидность сои 92М61 (US 2005120422); разновидность сои 91М91 (US 2005114936); разновидность сои XB33Y05 (US 2005120421); разновидность сои ХВ34А05 (US 2005120420); разновидность сои XB13U05 (US 2005114935); разновидность сои ХВ12К05 (US 2005114934); разновидность сои ХВ30Р05 (US 2005120419); разновидность сои ХВ57Т05 (US 2005114933); разновидность сои XB17S05 (US 2005114932); разновидность сои XB25Y05 (US 2005114930); разновидность сои XB25S05 (US 2005150017); разновидность сои XB43W04 (US 2004177420); разновидность сои XB44W04 (US 2004177419); разновидность сои XB53J04 (US 2004199960); разновидность сои XB43V04 (US 2004216192); разновидность сои XB49K04 (US 2004172668); разновидность сои ХВ27Р04 (US 2004205864); разновидность сои XB29L04 (US 2004177418); разновидность сои ХВ29К04 (US 2004177417); разновидность сои XB41U04 (US 2004231017); разновидность сои XB34D04 (US 2004177416); разновидность сои XB09J04 (US 2004172711); разновидность сои XB32Y04 (US 2004194169); разновидность сои XB44D04 (US 2004172710); разновидность сои ХВ44С04 (US 2004172709); разновидность сои XB10L04 (US 2004172708); разновидность сои XB19U04 (US 2004172707); разновидность сои XB02F04 (US 2004172706); разновидность сои ХВ25Х04 (US 2004172705); разновидность сои XB26L04 (US 2004172704); разновидность сои XB11F04 (US 2004172703); разновидность сои XB40Z04 (US 2004177415); разновидность сои XB40Y04 (US 2004181833); разновидность сои ХВ007С04 (US 2004181832); разновидность сои 96M20 (US 2004172702); разновидность сои XB39J04 (US 2004172701); разновидность сои ХВ29А04 (US 2004172700); разновидность сои ХВ35Р04 (US 2004172699); разновидность сои XB58Z04 (US 2004177414); разновидность сои XB43R04 (US 2004172698); разновидность сои XB35L04 (US 2004172697); разновидность сои ХВ06Н04 (US 2004172696); разновидность сои XB59U04 (US 2004172695); разновидность сои ХВ64С04 (US 2004172694); разновидность сои 95М80 (US 2004172693); разновидность сои XB35Q04 (US 2004177413); разновидность сои XB04D04 (US 2004177412); разновидность сои XB08L04 (US 2004177411); разновидность сои XB18Q04 (US 2004177410); разновидность сои XB16Q04 (US 2004177409); разновидность сои ХВ55К04 (US 2004172692); разновидность сои ХВ57М04 (US 2004172691); разновидность сои XB25L04 (US 2004205863); разновидность сои ХВ48Т04 (US 2004194168); разновидность сои ХВ42Х04 (US 2004199959); разновидность сои ХВ31Т04 (US 2004177408); разновидность сои XB31U04 (US 2004194167); разновидность сои ХВ30Е04 (US 2004177407); разновидность сои XB31R04 (US2004177406); разновидность сои S03-95341-A98-60618 (US 6909033); разновидность сои SN97-6946 (US 2004168227); разновидность сои 94М70 (US 6864408); разновидность сои 92М70 (US 6797866); разновидность сои 92М71 (US 6858782); разновидность сои 91М40 (US 6828490); разновидность сои 93М80 (US 6849789); разновидность сои XB39N03 (US 6864407); разновидность сои 93М90 (US 6846975); разновидность сои 90М90 (US 6852913); разновидность сои 92М72 (US 6960708); разновидность сои 91М90 (US 6849788); разновидность сои 92М50 (US 6855876); разновидность сои 92М30 (US 6951974); разновидность сои 93М60 (US6797865); разновидность сои 93М40 (US 6791016); разновидность сои 93М41 (US6835875); разновидность сои ХВ15Р03 (US 6797864); разновидность сои ХВ24Н03 (US 6936752); разновидность сои ХВ05А03 (US 6815585); разновидность сои 92М80 (US 6849787); разновидность сои XB33S03 (US 6855875); разновидность сои ХВ48Р03 (US 6797863); разновидность сои ХВ29Х03 (US 6806406); разновидность сои ХВ02С03 (US 6800795); разновидность сои XB29W03 (US 6858781); разновидность сои 91М10 (US 6958437); разновидность сои 92М10 (US 6916975); разновидность сои XB10G03 (US 6806405); разновидность сои 92М31 (US 6846974); разновидность сои XB38D03 (US 6806404); разновидность сои XB34N03 (US 6803508); разновидность сои XB30W03 (US 6809236); разновидность сои XB37J03 (US 6844488); разновидность сои SE72581 (US 2004148665); разновидность сои SE90076 (US 2004148664); разновидность сои SD82997 (US 2004148663); разновидность сои 0037393 (US 2004148662); разновидность сои 0088414 (US 2004148661); разновидность сои 0149926 (US 2004148660); разновидность сои 0037209 (US 2004148659); разновидность сои 93В36 (US 6833498); разновидность сои 90В74 (US 68123 84); разновидность сои 90 В51 (US 6818809); разновидность сои 91В03 (US 6815584); разновидность сои 95В43 (US 6818808); разновидность сои 95В42 (US 6815583); разновидность сои 92В47 (US 6812383); разновидность сои SE90346 (US 2004055055); разновидность сои 0007583 (US 2004010824); разновидность сои 0008079 (US 2004010823); разновидность сои S02-AP98041-2-333-01 (US 2003121076); разновидность сои S02-98041-2-251-01 (US 2003182694); разновидность сои S02-АР98041-2-262-02 (US 2003196220); разновидность сои S02-95021-55-240-BA (US 2003188348); разновидность сои АРА94-31572 (US 2003061641); разновидность сои АР98041-1-203 (US 2003056251); разновидность сои АРА95-15294 (US 2003061640); разновидность сои АР98041-4-117 (US 2003056250); разновидность сои 91В33 (US 6580018); разновидность сои 93В85 (US 6605762); разновидность сои 92В76 (US 6610911); разновидность сои 92В38 (US 6605761); разновидность сои 94В24 (US 6613967); разновидность сои 94В73 (US 6605760); разновидность сои 93В86 (US 6610910); разновидность сои 91В12 (US 6583343); разновидность сои 95В34 (US 6605759); разновидность сои 94В23 (US 6605758); разновидность сои 90В11 (US 6583342); разновидность сои 91В92 (US 6586659); разновидность сои 95В96 (US 6605757); разновидность сои 93В72 (US 6566589); разновидность сои 95В97 (US 6613966); разновидность сои 92В95 (US 6608243); разновидность сои 93В47 (US 6583341); разновидность сои 97В52 (US 6605756); разновидность сои 93В15 (US 6617499); разновидность сои 94В54 (US 6613965); разновидность сои 93В67 (US 6573433); разновидность сои 93В87 (US 6727410); разновидность сои 96В51 (US 6613964); разновидность сои 92В84 (US 6730829); разновидность сои 92В12 (US 6605755); разновидность сои 90А07 (US 6320105); разновидность сои 93В26 (US 6342659); разновидность сои 96В21 (US 6369301); разновидность сои 92В63 (US 6326529); разновидность сои 93В46 (US 6323402); разновидность сои 92В75 (US 6362400); разновидность сои 93В08 (US 6323401); разновидность сои 97В62 (US 6323400); разновидность сои 92В37 (US 6323399); разновидность сои 92В56 (US 6339186); разновидность сои 93В66 (US 6307131); разновидность сои 92 В62 (US 6346657); разновидность сои 92В36 (US 6369300); разновидность сои 90В73 (US 6316700); разновидность сои 95В95 (US 6323398); разновидность сои 93В65 (US 6229074); разновидность сои 92В24 (US 6284950); разновидность сои 94В53 (US 6235976); разновидность сои 94В22 (US 6140557); разновидность сои 93В84 (US 6143956); разновидность сои 95В32 (US 6229073); разновидность сои 95В53 (US 6147283); разновидность сои 93В35 (US 6153816); разновидность сои 93В07 (US 6143955); разновидность сои 92В74 (US 6124526); разновидность сои 92В35 (US 6166296); разновидность сои 94В45 (US 6162968); разновидность сои 96В01 (US 6143954); разновидность сои 93В53 (US 6335197).
Обнаружено, что интрогрессия элитного события в указанные сорта не оказывала существенного влияния на любую из желательных фенотипических или агрономических характеристик этих сортов (без потери урожайности), в то время как экспрессия трансгена, определяемая по устойчивости к глифосату и/или изоксафлютолу, соответствовала коммерчески приемлемому уровню. Эти факты подтверждали элитный статус события EE-GM3.
Элитное событие EE-GM3 можно выгодно объединить с одним или несколькими другими событиями сои, доступными на рынке, включая другие события устойчивости к гербицидам, например, события, описанные в заявлениях Службы инспекции здоровья животных и растений Министерства сельского хозяйства США: 09-349-01p, 09-201-01p, 09-183-01p, 09-082-01p, 09-015-01p, 06-354-01p, 06-271-01p, 06-178-01p, 98-238-01p, 98-014-01p, 97-008-01p, 96-068-01p, 95-335-01p, 93-258-01p, (см., например, www.aphis.usda.gov/brs/notj-eg.html) или событие MON89788 (устойчивость к глифосату), описанное в US 2006-282915, событие DP-305423-1 (высокое содержание олеиновой кислоты/устойчивость к ингибиторам ацетолактатсинтазы), описанное в WO 2008/054747, события А2704-12 и А5547-127 (устойчивость к глюфосинату) описанные в WO 2006/108674 или WO 2006/108675, соответственно, MON87701, описанное в US2009130071, событие 3560.4.3.5, описанное в US 2009036308, или событие DP-305423-1, описанное в US 2008312082, или событие BPS-CV 127-9 (Событие 127) согласно заявке WO 2010/080829.
В нижеприведенной формуле изобретения, если не указано иное, термин "растение" включает ткани растения на любой стадии развития, а также любые клетки, ткани или органы, собранные или происходящие от такого растения, включая любые семена, листья, стебли, цветки, корни, отдельные клетки, гаметы, культуры клеток, культуры тканей или протопласты, но не ограничиваясь ими.
Эталонные семена, содержащие элитное событие EE-GM3, депонированы как 32-RRMM-0531 в NCIMB (Ferguson Building, Craibstone Estate, Баксберн, Абердин AB9YA, Шотландия) 12 октября 2009 г. под номером доступа NCIMB 41659, и подтверждена их жизнеспособность. Альтернативные названия EE-GM3 - событие FG-072 или событие MST-FG072-3.
Вышеприведенное описание изобретения должно рассматриваться в качестве иллюстративного, а не ограничивающего.
Специалисты могут осуществить различные изменения или модификации описанных вариантов воплощения. Эти модификации можно осуществить без отклонения от основных аспектов изобретения.