Фотолюминесценция надосадочной жидкости отмытых эритроцитов при ультрафиолетовом возбуждении

УДК 535.361

ФОТОЛЮМИНЕСЦЕНЦИЯ НАДОСАДОЧНОЙ

ЖИДКОСТИ ОТМЫТЫХ ЭРИТРОЦИТОВ ПРИ УЛЬТРАФИОЛЕТОВОМ ВОЗБУЖДЕНИИ

К). П. Войнов, B.C. Горелик, А. Р. Зарицкий, М.Н. Маслова, Л. Л. Чайков

В данной работе представлены результаты исследования надосадочной жидкости отмытых эритроцитов методом фотолюминесценции при ультрафиолетовом возбуждении. Сравнивались спектры собственной фотолюминесценции водного раствора аденозинтрифосфата натрия - Виал (Ыа2АТФ) со спектрами надосадочной жидкости эритроцитов, полученной с добавлением Ыа2АТФ, глюкозы и без добавления, дополнительных веществ. Результаты сравнения, свидетельствуют о том. что в надосадочной жидкости возможна регистрация, АТФ, который выходит из отмытых эритроцитов в окружающую среду.

Ключевые слова: аденозинтрифосфат (АТФ), аденозинтрифосфат натрия (Ма2АТФ), ультрафиолетовое возбуждение, надосадочная жидкость, отмытые эритроциты.

Аденозинтрифосфат (АТФ) П рСДС Т&ВЛ Я6Т собой сложное молекулярное соединение, участвующее во всех энергозависимых процессах метаболизма. Как известно, в эритроцитах АТФ образуется в результате бескислородного окисления глюкозы в реакциях гликолиза. Концентрация этого макроэрга в них поддерживается на уровне 1.5 ммоль/л [1, 2]. В то же время в плазме крови измеряемая концентрация АТФ колеблется в преде-ЛЭХ ОТ 28 нмоль/'л до 11 мкмоль/'л [3 9]. Авторы работы [10] такие отличия оо ьяс [ i я ю г различиями в способах подготовки образцов крови к измерениям, что влияет в конечном итоге на выход АТФ из эритроцитов.

Для определения концентраций АТФ во всех известных случаях использовался ме-ТОД5 ОСНОВАННЫЙ НА биолюминесценции люциферин-люциферазной системы светляка

ФИАН, 119991 Россия, Москва, Ленинский проспект, 53; e-mail: maslova_marina87@mail.ru, gorelik@sci.lebedev.ru.

[11 13]. Хотя этот метод достаточно прост и удобен. он не является прямым; то есть люминесдирует не сама молекула АТФ. а люминофор. который добавляется к исследуемому раствору, интенсивность свечения которого зависит от концентрации этого макроэрга.

В данной работе для регистрации выхода АТФ из эритроцитов использовалось исследование спектров фотолюминесценции надосадочной жидкости эритроцитов и ре-перной жидкости, возбуждаемой монохроматическим ультрафиолетовым (266 нм) лазерным источником света. Молекулы АТФ. если они присутствуют в растворе, способны к фотолюминесценции при облучении раствора на длине волны 266 нм при комнатной температуре. Однако спектры фотолюминесценции АТФ и аденина при ультрафиолетовом возбуждении получали прежде литтть при 77 К [14. 15].

Цель данного исследования методами фотолюминесценции при 298 К получить спектральные характеристики соединений, присутствующих в надосадочной жидкости отмытых эритроцитов в разных условиях, и проверить возможность выхода АТФ из отмытых эритроцитов в надосадочную жидкость.

Для достижения поставленной цели получали и сравнивали спектры образцов надосадочной жидкости с добавлением КагАТФ, глюкозы и без добавления дополнительных веществ 5 т^кжб образцов фармацевтического препарата КагАТФ В водном растворе Рингера. который в данной работе был принят за реперньтй.

Методика эксперимента

Подготовка образцов для, измерений. Приготовление исследуемых образцов для исследований было следующим. Взятие донорской крови производилось из локтевой вены здорового донора (25 лет) в три пробирки по 10 мл каждая, в которые для предотвращения свертывания крови предварительно было добавлено по 1 мл гепарина. Для удаления плазмы крови все пробирки центрифугировались в течение 15 минут при 1500 об/мин. После этого эритроциты отмывались три раза клеточный осадок разбавлялся в 2 3 раза раствором Рингера с последующим центрифугированием и удалением надосадочной жидкости.

Для получения исследуемых образцов надосадочной жидкости в пробирки с отмытыми эритроцитами добавляли по 3 мл: раствора Рингера (пробирка 1); раствора Рингера с добавлением аденозинтрифосфата натрия - КагАТФ (пробирка 2); раствора Рингера с добавлением раствора глюкозы (пробирка 3). После чего все пробы выдерживались при температуре +4 °С в течение 5 суток. Для измерения использовалась часть

приготовленной надосадочной жидкости из каждой пробирки, поскольку для одного измерения достаточно нескольких микролитров. Стоит отметить, что ни в одной из проб не наблюдалось видимых признаков гемолиза, то есть разрушения эритроцитов.

Помимо образцов надосадочной жидкости, был приготовлен раствор фармацевтического препарата "Аденозинтрифосфата натрия - Впал", разбавленный стандартным раствором Рингера до концентрации 1 г/л. В состав препарата "Аденозинтрифосфата натрия - Впал", кроме АТФ, входят натрия карбонат безводный, натрия гидрокарбонат (натрия бикарбонат), динатрия эдетат (ЭДТА), пропиленгликоль, вода для инъекций.

Состав стандартного раствора Рингера, используемого для приготовления образцов аденозинтрифосфата натрия и надосадочной жидкости, был следующим: натрия хлорид - 8.6 г/л, калия хлорид - 0.3 г/л, кальция хлорид - 0.25 г/л.

Используемая установка и ее возможности. Принципиальная схема установки для регистрации спектров фотолюминесценции в исследуемых веществах представлена на рис. 1.

Рис. 1: Схема волоконно-оптической установки для регистрации спектров фотолюминесценции при ультрафиолетовом лазерном возбуждении. 1 - зеркала, 2 - активный элемент лазера, 3 - нелинейно-оптические кристаллы, 4 ~ линзы, 5 - юстируемый цилиндр, 6 - держатели световодов, 7 - световоды, 8 - исследуемая жидкость, 9 -цилиндрическая кювета, 10 - держатель кюветы, 11 - стойка, 12 - миниспектро-метр, 13 - компьютер.

Для возбуждения спектров фотолюминесценции в биологических объектах использовался импуттьсно-периодический лазер (см. рис. 1) на алюмоиттриевом гранате YAG:Nd3+, исходное излучение которого соответствовало длине волны 1064 нм. В резонаторе лазера присутствовали два нелинейно-оптических кристалла, обеспечивающих генерацию второй (532 нм) и четвёртой (266 нм) оптических гармоник. Излучение с длинои волны 532 нм отражалось назад с помощью выходного бихроматического зеркала. пропускающего ультрафиолетовое излучение с длиной волны 266 нм. Импульсы ультрафиолетового излучения длительностью 10 не генерировались с частотой следования 3000 Гц при средней мощности лазерного излучения, равной 5 мВт. Ультрафиолетовое излучение с помощью кварцевой линзы (4) фокусировалось в торец световода (7), закреплённого в юстируемом цилиндре (5) с помощью держателя (6). Возбуждающее излучение подводилось к цилиндрической кювете (9) из дюралюминия с внутренним диаметром 3 мм. Толщина слоя исследуемой жидкости (8) в кювете варьировалась в диапазоне 1 3 мм. Вторичное излучение от люминесцируютцего раствора с помощью световода направлялось на входную щель волоконно-оптического миниспектрометра типа FSD-8 (12). Миниспектрометр позволял регистрировать спектры вторичного излучения в диапазоне 200 800 нм со спектральным разрешением 2 нм. Спектры регистрировались многоэлементным приёмником излучения и обрабатывались в цифровом виде с использованием компьютера (13). Экспозиции при записи спектров фотолюминесценции составляли 0.1 10 с.

Экспериментальная 'часть. В первую очередь в качестве реперных были получены спектральные характеристики препарата "Натрия аденозинтрифосфат Виал". состав и методика приготовления которого описана выттте. На рис. 2 представлен спектр его фотолюминесценции в водном растворе Рингера в концентрации 1 г/л. В этом спектре, помимо возбуждающей линии 266 нм. присутствуют линии 297, 473, 588, 646 нм. При этом на левом склоне линии 473 НМ 3&М6ТНЫ следы более слабой линии ~449 нм, а на правом склоне ~500 нм. С этим спектром производилось сравнение всех спектров фотолюминесценции, полученных в различных образцах надосадочной жидкости.

На рис. 3 представлен спектр фотолюминесценции надосадочной жидкости, полученной при выдержке отмытых эритроцитов в растворе Рингера с добавлением раствора Ма2АТФ. В этом спектре наблюдаются такие же линии, что и в реперном спектре фотолюминесценции раствора чистого Ка2АТФ - 298, 449, 473, 502, 588 и 646 нм. Однако в относительных интенсивностях наблюдаются существенные отличия интенсивность линий 298, 588, 646 нм стала меньше по сравнению с основной линией 473 нм. Или, воз-

200 300 400 500 600 700 800 X, пш

Рис. 2: Спектр фотолюминесценции аденозинтрифосфата натрия в водном растворе Рингера.

473

200 300 400 500 600 700 800 X, пш

Рис. 3: Спектр фотолюминесценции надосадочной жидкости эритроцитов, полученной с добавлением натрия аденозинтрифосфата (Иа2АТФ).

можно, интенсивность основной линии увеличилась, и при нормировке относительная интенсивность других линий уменьшилась. Так как в этом спектре присутствуют все линии, которые характерны для реперного спектра чистого раствора аденозинтрифосфата натрия, то это открывает возможность для идентификации АТФ, который может выходить из эритроцитов.

Далее проводилось исследование образцов иадосадочиой жидкости, полученной в результате выдержки отмытых эритроцитов в растворе Рингера с добавлением глюкозы и без нее в течение 5 суток. Напомним, что после последнего отмывания эритроцитов в одну из проб было добавлено 3 мл раствора Рингера с концентрацией глюкозы 5 ммоль/л для нормального протекания метаболических процессов в них.

475

200 300 400 500 600 700 800

X, пш

Рис. 4: Спектр фотолюминесценции надосадочной жидкости эритроцитов с добавлением глюкозы.

На рис. 4 представлен спектр фотолюминесценции надосадочной жидкости, полученной с добавлением глюкозы. В нем, помимо линии ультрафиолетового возбуждения (266 нм), имеются достаточно интенсивные линии 475 нм и 506 нм, а также менее интенсивная линия 446 нм, которые характерны для спектра реперного раствора. Однако в данном спектре отсутствует линия 298 нм, и наблюдается уширение полосы, состоящей из наиболее интенсивных линий - 446, 475 и 506 нм. Кроме того, в данном спектре не имеется ярко выраженных линий 588 нм и 646 нм.

Исследование образца надосадочной жидкости, полученной без добавления глюкозы, проводилось для выяснения возможности выхода АТФ из эритроцитов с метаболизмом, угнетенным за счет отсутствия внешнего источника глюкозы.

В спектре фотолюминесценции надосадочной жидкости эритроцитов, полученной без добавления глюкозы, представленном на рис. 5, наблюдаются интенсивные линии 475 и 502 нм. Линии 473 нм и 500 нм (см. рис. 2) имеются в спектре фотолюминесценции реперного раствора №2АТФ, однако в данном спектре отсутствует линия 449 нм на левом крыле линии 475 нм, а также линии 298, 588 и 646 нм.

475

200 300 400 500 600 700 800

пш

Рис. 5: Спектр фотолюминесценции надосадочной жидкости эритроцитов без добавления дополнительных веществ.

Помимо этого, в спектре на рис. 5 имеется линия 656 нм (возможно, со слабым сателлитом на 680-690 нм), которая характерна для спектра фотолюминесценции гемоглобина. Для иллюстрации этого последнего утверждения на рис. 6 представлен спектр фотолюминесценции эритроцитов, взятых из пробы без добавления глюкозы. При этом из-за сильного поглощения возбуждающего света пришлось разбавлять эритроциты раствором Рингера до тех пор, пока не стал виден сигнал люминесценции.

656

200 300 400 500 600 700 800 X, пш

Рис. 6: Спектр фотолюминесценции эритроцитов, разбавленных раствором Рингера.

В полученном спектре, помимо возбуждающей линии (266 нм). имеется линия 656 нм (с сателлитом на правом крыле 680 нм). которая также наблюдалась в спектре люминесценции надосадочной жидкости, полученной без добавления гл ю коз ы (рис. 5).

Обсуждение результатов. Проведенные измерения и сравнение спектров фотолюминесценции надосадочной жидкости отмытых эритроцитов в разных условиях позволили заключить, что в надосадочной жидкости появляется вещество, спектральные особенности люминесценции которого характерны для КагАТФ. Это позволяет утвер-жд&ть5 что в тех условиях^ в которых проведены опыты5 АТ^^З? выходит из эритроцитов и образует соединение с натрием, имеющимся в растворе Рингера.

Все полученные спектры, представленные на рис. 2 5, имеют схожие конфигурации в области ДЛИН волн от 400 до 600 нм и включают в себя наиболее интенсивные линии 473 475 нм и 500-506 нм. По указанному участку спектра с такими характерными линиями представляется возможным идентифицировать КагАТФ. При в ыходе АТФ из эритроцитов в надосадочную жидкость, где концентрация ионов Ка+ существенно болытте. чем в самих эритроцитах, он может с ним взаимодействовать с образованием натриевой соли. Поэтому спектры фотолюминесценции образцов надосадочной жидко-сти5 полученных с добавлением и без добавления ГЛ ю коз ы, близки к реперному спектру фармацевтического аденозинтрифосфата натрия (который также является натриевой солью АТФ).

Особенностью спектров фотолюминесценции образцов надосадочной жидкости, полученных с добавлением (рис. 4) и без добавления ГЛЮКОЗЫ (РИС. 5); является отсутствие по сравнению с реперньтм спектром линий 298, 588, 646 нм. Отсутствие линии 298 нм можно объяснить ее попаданием на край поглощения аденина [15] и безьтзлучательньтм переходом энергии на другой энергетический уровень (например, на верхний уровень перехода 475 нм). Тем же эффектом может оыть ооъяснено возрастание интенсивности основной линии 473 нм по сравнению с линией 298 нм в спектре, представленном на рис. 3. Присутствие линий 588 нм и 646 нм в спектре реперного образца КагАТФ и в образце надосадочной жидкости, полученной с его добавлением (рис. 2. 3), и отсутствие их в спектрах на рис. 4. 5 может быть обусловлено влиянием примесей других соединений в фармацевтическом препарате, спектры люминесценции которых отдельно не получали. Отсутствие линии 446 нм в надосадочной жидкости эритроцитов с угнетенным метаболизмом требует отдельного анализа.

Сравнение спектров люминесценции эритроцитов и образцов надосадочной жидкости (рис. 6 и 5), полученных без добавления глюкозы, показало, что отдельные молекулы гемоглобина могут выходить из эритроцитов с угнетенным метаболизмом.

Заключение. В работе приведены результаты сравнения спектров фотолюминесценции образцов надосадочной жидкости отмытых эритроцитов, приготовленных по различным методикам, с реперньтм спектром водного раствора препарата "Аденоз-интрифосфата натрия Виал". Спектры фотолюминесценции получали, используя волоконно-оптическую методику с применением ультрафиолетового лазера с длиной волны 266 нм.

Установлено, что в образцах надосадочной жидкости, полученных с добавлением и без добавления в нее глюкозы, наблюдались некоторые линии, характерные для спектра реперного раствора. Это свидетельствует в пользу выхода АТФ из отмытых эритроцитов в надосадочную жидкость и образования его соединения с натрием. Отметим, что примененный в настоящей работе метод позволил получить описанные результаты без добавления в кровь каких-либо веществ, которых нет в плазме крови in vivo.

ЛИТЕРАТУРА

[1] Е. А. Черницкий. А. В. Воробей. Структура и функции эритроцита,рных льем,бран (Минск. Наука и техника. 1981).

[2] А. И. Атауллаханов. Ф. И. Атауллаханов. В. М. Витвицкий и др.. Биохимия 50(6), 1005 (1985).

[3] Т. Forrester, A. R. Lind, J Physiol. 204, 347 (1969).

[4] P. I. Parkinson, J Physiol. 234, 72 (1973).

[5] M. W. Gorman, D. R. Marble, K. Ogimoto, E. O. Feigl, Lumenescence 18, 173 (2003).

[6] G. R. Bergfeld, Т. Forrester, Cardiovasc Res. 26, 40 (1992).

[7] R. A. Harkness, S. B. Coade, A. D. Webster, Clin. Chim. Acta 143, 91 (1984).

[8] С. V. Born, M. A. Kratzer, J Physiol. 354, 419 (1984).

[9] В. B. Fredholm, P. Hedqvist, K. Lindstrom, M. Wennmalm, Acta Physiol Scand. 116, 285 (1982).

[10] M. W. Gorman, E. 0. Feigl, C. W. Buffingston, Clinical Chemistry 53(2), 318 (2007).

[11] H. К). Филлипова, H. H. Угарова, Биохимия 44(10), 1899 (1979).

[12] H. H. Угарова, Л. К). Бровко, Г. Д. Кутузова, Биохимия 53(9), 1351 (1993).

[13] Ф. И. Атауттлаханов. В. М. Витвицкий. А. М. Жаботинский и др.. Известия Академии наук СССР, сер. Биологическая 6. 813 (1989).

[14] J. W. Longworth. R. О. Rahn. R. G. Shulman. Journal of Chemical Physics 45(5), 2930 (1966).

[15] E. P. Gibson. J. H. Turnbull. Journal of Photochemistry 11. 313 (1979).

Поступила в редакцию 10 июля 2013 г.