УСОВЕРШЕНСТВОВАННЫЕ ПРОТЕОМНЫЕ МУЛЬТИПЛЕКСНЫЕ АНАЛИЗЫ

1. Способ, включающий
a) приведение в контакт первого разведения образца с первым аптамером, причем первый аптамерный аффинный комплекс образуется посредством взаимодействия первого аптамера с его молекулой-мишенью при наличии молекулы-мишени в первом разведении образца;
b) приведение в контакт второго разведения образца со вторым аптамером, причем второй аптамерный аффинный комплекс образуется посредством взаимодействия второго аптамера с его молекулой-мишенью при наличии молекулы-мишени во втором разведении образца;
c) инкубацию первого и второго разведений образцов по отдельности с обеспечением возможности образования аптамерного аффинного комплекса;
d) перенос первого разведения образца с первым аптамерным аффинным комплексом в первую смесь, при этом первый аптамерный аффинный комплекс захватывается на твердой подложке в первой смеси;
e) после стадии d), перенос второго разведения образца в первую смесь с образованием второй смеси, при этом второй аптамерный аффинный комплекс второго разведения захватывается на твердой подложке во второй смеси;
f) обнаружение наличия или определение уровня первого аптамера и второго аптамера первого и второго аптамерных аффинных комплексов, или наличия или количества одного или более из первого и второго аптамерных аффинных комплексов;
при этом первое разведение и второе разведение представляют собой разные разведения одного и того же тестируемого образца,
дополнительно включающий приведение в контакт третьего разведения образца с третьим аптамером, причем третий аптамерный аффинный комплекс образуется посредством взаимодействия третьего аптамера с его молекулой-мишенью при наличии молекулы-мишени в третьем разведении образца.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что тестируемый образец выбран из плазмы, сыворотки, мочи, цельной крови, лейкоцитов, мононуклеарных клеток периферической крови, лейкоцитарной пленки, мокроты, слез, слизи, носовых промывных вод, назального аспирата, спермы, слюны, промывных вод брюшины, асцитной жидкости, кистозной жидкости, менингеальной жидкости, амниотической жидкости, жидкости, вырабатываемой железами, лимфатической жидкости, аспирата из сосков, бронхиального аспирата, материала бронхов, взятого с помощью щеточки, синовиальной жидкости, аспирата суставной жидкости, секретов органов, клеток, экстракта клеток и спинномозговой жидкости.
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что первый и второй аффинные комплексы из аптамера и молекулы-мишени являются нековалентными комплексами.
4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что молекула-мишень выбрана из белка, пептида, углевода, полисахарида, гликопротеина, гормона, рецептора, антигена, антитела, вируса, бактерии, метаболита, кофактора, ингибитора, лекарственного средства, красителя, питательного вещества, фактора роста, клетки и ткани.
5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что первое разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 0,001% до 0,009% (или составляет 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008% или 0,009%), или от 0,002% до 0,008%, или от 0,003% до 0,007%, или составляет приблизительно 0,005%, а второе разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 0,01% до 1% (или составляет 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9% или 1%), или от 0,1% до 0,8%, или от 0,2% до 0,75%, или составляет приблизительно 0,5%.
6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что первое разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 0,001% до 0,009% (или 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008% или 0,009%), или от 0,002% до 0,008%, или от 0,003% до 0,007% или составляет приблизительно 0,005%; а второе разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 5% до 39% (или составляет 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% или 39%), или от 15% до 30%, или от 15% до 25%, или составляет приблизительно 20%.
7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что первое разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 0,01% до 1% (или составляет 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9% или 1%), или от 0,1% до 0,8%, или от 0,2% до 0,75%, или составляет приблизительно 0,5%; а второе разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 5% до 39% (или составляет 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% или 39%), или от 15% до 30%, или от 15% до 25%, или составляет приблизительно 20%.
8. Способ по п. 1, отличающийся тем, что первое разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 0,01% до 1% (или составляет 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9% или 1%), или от 0,1% до 0,8%, или от 0,2% до 0,75%, или составляет приблизительно 0,5%; а второе разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 0,001% до 0,009% (или составляет 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008% или 0,009%), или от 0,002% до 0,008%, или от 0,003% до 0,007%, или составляет приблизительно 0,005%.
9. Способ по п. 1, отличающийся тем, что первое разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 5% до 39% (или составляет 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% или 39%), или от 15% до 30%, или от 15% до 25%, или составляет приблизительно 20%, а второе разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 0,01% до 1% (или составляет 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9% или 1%), или от 0,1% до 0,8%, или от 0,2% до 0,75%, или составляет приблизительно 0,5%.
10. Способ по п. 1, отличающийся тем, что первое разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 5% до 39% (или составляет 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% или 39%), или от 15% до 30%, или от 15% до 25%, или составляет приблизительно 20%, а второе разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 0,001% до 0,009% (или составляет 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008% или 0,009%), или от 0,002% до 0,008%, или от 0,003% до 0,007%, или составляет приблизительно 0,005%.
11. Способ по п. 1, отличающийся тем, что обнаружение наличия или определение уровня диссоциированных первого и второго захватывающих реагентов выполняется с помощью ПЦР, масс-спектрометрии, секвенирования нуклеиновых кислот, секвенирования нового поколения (NGS) или гибридизации.
12. Способ по п. 1, отличающийся тем, что первый аптамер и/или второй аптамер независимо содержит по меньшей мере один пиримидин, модифицированный в положении 5.
13. Способ по п. 12, отличающийся тем, что по меньшей мере один пиримидин, модифицированный в положении 5, содержит в положении 5 пиримидина линкер и присоединенный к линкеру фрагмент.
14. Способ по п. 13, отличающийся тем, что линкер выбран из амидного линкера, карбонильного линкера, пропинильного линкера, алкинового линкера, сложноэфирного линкера, мочевинного линкера, карбаматного линкера, гуанидинового линкера, амидинового линкера, сульфоксидного линкера и сульфонового линкера.
15. Способ по п. 13, отличающийся тем, что фрагмент представляет собой гидрофобный фрагмент.
16. Способ по п. 15, отличающийся тем, что фрагмент выбран из фрагментов, представленных в группах I, II, III, IV, V, VII, VIII, IX, XI, XII, XIII, XV и XVI на Фиг. 1.
17. Способ по п. 15, отличающийся тем, что фрагмент выбран из нафтильного фрагмента, бензильного фрагмента, фторбензильного фрагмента, тирозильного фрагмента, индольного фрагмента, морфолинового фрагмента, изобутильного фрагмента, 3,4-метилендиоксибензильного фрагмента, бензотиофенильного фрагмента и бензофуранильного фрагмента.
18. Способ по п. 12, отличающийся тем, что пиримидин модифицированного в положении 5 пиримидина представляет собой уридин, цитидин или тимидин.
19. Способ по п. 1, отличающийся тем, что третье разведение образца инкубируют отдельно от первого и второго разведений образцов с обеспечением возможности образования аптамерного аффинного комплекса из третьего аптамера и его молекулы-мишени.
20. Способ по п. 19, дополнительно включающий перенос третьего разведения образца во вторую смесь с образованием третьей смеси, причем третий аптамерный аффинный комплекс третьего разведения захватывается на твердой подложке в третьей смеси.
21. Способ по п. 20, дополнительно включающий обнаружение наличия или определение уровня третьего аптамера третьего аптамерного аффинного комплекса, или наличия или количества третьего аптамерного аффинного комплекса.
22. Способ по п. 1, отличающийся тем, что третье разведение представляет собой разведение, отличное от первого разведения и второго разведения одного и того же тестируемого образца.
23. Способ по п. 1, отличающийся тем, что третье разведение представляет собой разведение тестируемого образца, выбранное в диапазоне от 5% до 39% (или составляет 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% или 39%), от 15% до 30%, от 15% до 25%, приблизительно 20%; от 0,01% до 1% (или 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9% или 1%), от 0,1% до 0,8%, от 0,2% до 0,75%, приблизительно 0,5%; и от 0,001% до 0,009% (или 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008% или 0,009%), или от 0,002% до 0,008%, от 0,003% до 0,007%, приблизительно 0,005%.
24. Способ по п. 1, отличающийся тем, что третий аптамер содержит по меньшей мере один модифицированный в положении 5 пиримидин.
25. Способ по п. 24, отличающийся тем, что по меньшей мере один пиримидин, модифицированный в положении 5, содержит в положении 5 пиримидина линкер и присоединенный к линкеру фрагмент.
26. Способ по п. 25, отличающийся тем, что линкер выбран из амидного линкера, карбонильного линкера, пропинильного линкера, алкинового линкера, сложноэфирного линкера, мочевинного линкера, карбаматного линкера, гуанидинового линкера, амидинового линкера, сульфоксидного линкера и сульфонового линкера.
27. Способ по п. 25, отличающийся тем, что фрагмент представляет собой гидрофобный фрагмент.
28. Способ по п. 27, отличающийся тем, что фрагмент выбран из фрагментов, представленных в группах I, II, III, IV, V, VII, VIII, IX, XI, XII, XIII, XV и XVI на Фиг. 1.
29. Способ по п. 27, отличающийся тем, что фрагмент выбран из нафтильного фрагмента, бензильного фрагмента, фторбензильного фрагмента, тирозильного фрагмента, индольного фрагмента, морфолинового фрагмента, изобутильного фрагмента, 3,4-метилендиоксибензильного фрагмента, бензотиофенильного фрагмента и бензофуранильного фрагмента.
30. Способ по п. 24, отличающийся тем, что пиримидин модифицированного в положении 5 пиримидина представляет собой уридин, цитидин или тимидин.
31. Способ, включающий
a) приведение в контакт первого захватывающего реагента с первым разведением с образованием первой смеси и второго захватывающего реагента со вторым разведением с образованием второй смеси, причем каждый из первого и второго захватывающих реагентов иммобилизован на твердой подложке, и при этом каждый из первого и второго захватывающих реагентов обладает аффинностью к разным молекулам-мишеням;
b) инкубацию первой смеси и второй смеси отдельно, при этом аффинный комплекс из первого захватывающего реагента и молекулы-мишени образуется в первой смеси в том случае, если в первой смеси присутствует молекула-мишень, к которой обладает аффинностью первый захватывающий реагент, при этом аффинный комплекс из второго захватывающего реагента и молекулы-мишени образуется во второй смеси в том случае, если во второй смеси присутствует молекула-мишень, к которой обладает аффинностью второй захватывающий реагент;
c) последовательное высвобождение и объединение аффинных комплексов в четвертой смеси в порядке, выбранном из (i) аффинный комплекс из первого захватывающего реагента и молекулы-мишени, а затем аффинный комплекс из второго захватывающего реагента и молекулы-мишени и (ii) аффинный комплекс из второго захватывающего реагента и молекулы-мишени, а затем аффинный комплекс из первого захватывающего реагента и молекулы-мишени;
d) присоединение первого тега к молекуле-мишени аффинных комплексов из первого и второго захватывающего реагента и молекулы-мишени;
e) приведение в контакт содержащих тег аффинных комплексов из первого и второго захватывающего реагента и молекулы-мишени с одной или более твердыми подложками таким образом, что тег иммобилизует аффинные комплексы из первого и второго захватывающего реагента и молекулы-мишени на одной или более твердых подложках;
f) диссоциацию захватывающих реагентов из аффинных комплексов из захватывающего реагента и молекулы-мишени;
g) обнаружение наличия или определение уровня диссоциированных захватывающих реагентов;
при этом первое разведение и второе разведение представляют собой разные разведения одного тестируемого образца,
дополнительно включающий приведение в контакт третьего захватывающего реагента с третьим разведением с образованием третьей смеси, причем третий захватывающий реагент иммобилизован на твердой подложке, и при этом третий захватывающий реагент обладает аффинностью к молекуле-мишени, отличной от молекул-мишеней первого и второго захватывающих реагентов.
32. Способ по п. 31, отличающийся тем, что тестируемый образец выбран из плазмы, сыворотки, мочи, цельной крови, лейкоцитов, мононуклеарных клеток периферической крови, лейкоцитарной пленки, мокроты, слез, слизи, носовых промывных вод, назального аспирата, спермы, слюны, промывных вод брюшины, асцитной жидкости, кистозной жидкости, менингеальной жидкости, амниотической жидкости, жидкости, вырабатываемой железами, лимфатической жидкости, аспирата из сосков, бронхиального аспирата, материала бронхов, взятого с помощью щеточки, синовиальной жидкости, аспирата суставной жидкости, секретов органов, клеток, экстракта клеток и спинномозговой жидкости.
33. Способ по п. 31, отличающийся тем, что аффинные комплексы из первого и второго захватывающего реагента и белка-мишени являются нековалентными комплексами.
34. Способ по п. 31, отличающийся тем, что первый захватывающий реагент и второй захватывающий реагент независимо выбраны из аптамера или антитела.
35. Способ по п. 31, отличающийся тем, что молекула-мишень выбрана из белка, пептида, углевода, полисахарида, гликопротеина, гормона, рецептора, антигена, антитела, вируса, бактерии, метаболита, кофактора, ингибитора, лекарственного средства, красителя, питательного вещества, фактора роста, клетки и ткани.
36. Способ по п. 31, отличающийся тем, что первое разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 0,001% до 0,009% (или составляет 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008% или 0,009%), или от 0,002% до 0,008%, или от 0,003% до 0,007%, или составляет приблизительно 0,005%, а второе разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 0,01% до 1% (или составляет 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9% или 1%), или от 0,1% до 0,8%, или от 0,2% до 0,75%, или составляет приблизительно 0,5%.
37. Способ по п. 31, отличающийся тем, что первое разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 0,001% до 0,009% (или 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008% или 0,009%), или от 0,002% до 0,008%, или от 0,003% до 0,007% или составляет приблизительно 0,005%; а второе разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 5% до 39% (или составляет 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% или 39%), или от 15% до 30%, или от 15% до 25%, или составляет приблизительно 20%.
38. Способ по п. 31, отличающийся тем, что первое разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 0,01% до 1% (или составляет 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9% или 1%), или от 0,1% до 0,8%, или от 0,2% до 0,75%, или составляет приблизительно 0,5%; а второе разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 5% до 39% (или составляет 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% или 39%), или от 15% до 30%, или от 15% до 25%, или составляет приблизительно 20%.
39. Способ по п. 31, отличающийся тем, что первое разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 0,01% до 1% (или составляет 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9% или 1%), или от 0,1% до 0,8%, или от 0,2% до 0,75%, или составляет приблизительно 0,5%; а второе разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 0,001% до 0,009% (или составляет 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008% или 0,009%), или от 0,002% до 0,008%, или от 0,003% до 0,007%, или составляет приблизительно 0,005%.
40. Способ по п. 31, отличающийся тем, что первое разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 5% до 39% (или составляет 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% или 39%), или от 15% до 30%, или от 15% до 25%, или составляет приблизительно 20%, а второе разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 0,01% до 1% (или составляет 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9% или 1%), или от 0,1% до 0,8%, или от 0,2% до 0,75%, или составляет приблизительно 0,5%.
41. Способ по п. 31, отличающийся тем, что первое разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 5% до 39% (или составляет 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% или 39%), или от 15% до 30%, или от 15% до 25%, или составляет приблизительно 20%, а второе разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 0,001% до 0,009% (или составляет 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008% или 0,009%), или от 0,002% до 0,008%, или от 0,003% до 0,007%, или составляет приблизительно 0,005%.
42. Способ по п. 31, отличающийся тем, что обнаружение наличия или определение уровня диссоциированных первого и второго захватывающих реагентов выполняется с помощью ПЦР, масс-спектрометрии, секвенирования нуклеиновых кислот, секвенирования нового поколения (NGS) или гибридизации.
43. Способ по п. 31, дополнительно включающий инкубацию третьей смеси отдельно от первой смеси и второй смеси, причем аффинный комплекс из третьего захватывающего реагента и молекулы-мишени образуется в третьей смеси в том случае, если в третьей смеси присутствует молекула-мишень, к которой обладает аффинностью третий захватывающий реагент.
44. Способ по п. 43, дополнительно включающий последовательное высвобождение и объединение аффинного комплекса из третьего захватывающего реагента и молекулы-мишени с аффинными комплексами из первого и второго захватывающего реагента и молекулы-мишени в четвертую смесь в порядке, выбранном из (i) аффинный комплекс из первого захватывающего реагента и молекулы-мишени, затем аффинный комплекс из второго захватывающего реагента и молекулы-мишени, а затем аффинный комплекс из третьего захватывающего реагента и молекулы-мишени; (ii) аффинный комплекс из первого захватывающего реагента и молекулы-мишени, затем аффинный комплекс из третьего захватывающего реагента и молекулы-мишени, а затем аффинный комплекс из второго захватывающего реагента и молекулы-мишени; (iii) аффинный комплекс из второго захватывающего реагента и молекулы-мишени, затем аффинный комплекс из третьего захватывающего реагента и молекулы-мишени, а затем аффинный комплекс из первого захватывающего реагента и молекулы-мишени; (iv) аффинный комплекс из второго захватывающего реагента и молекулы-мишени, затем аффинный комплекс из первого захватывающего реагента и молекулы-мишени, а затем аффинный комплекс из третьего захватывающего реагента и молекулы-мишени; (v) аффинный комплекс из третьего захватывающего реагента и молекулы-мишени, затем аффинный комплекс из первого захватывающего реагента и молекулы-мишени, а затем аффинный комплекс из второго захватывающего реагента и молекулы-мишени; и (vi) аффинный комплекс из третьего захватывающего реагента и молекулы-мишени, затем аффинный комплекс из второго захватывающего реагента и молекулы-мишени, а затем аффинный комплекс из первого захватывающего реагента и молекулы-мишени.
45. Способ по п. 43, отличающийся тем, что третье разведение представляет собой разведение, отличное от первого разведения и второго разведения одного и того же тестируемого образца.
46. Способ по п. 43, отличающийся тем, что третье разведение представляет собой разведение тестируемого образца, выбранное в диапазоне от 5% до 39% (или составляет 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% или 39%), от 15% до 30%, от 15% до 25%, приблизительно 20%; от 0,01% до 1% (или 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9% или 1%), от 0,1% до 0,8%, от 0,2% до 0,75%, приблизительно 0,5%; и от 0,001% до 0,009% (или 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008% или 0,009%), или от 0,002% до 0,008%, от 0,003% до 0,007%, приблизительно 0,005%.
47. Способ по п. 44, дополнительно включающий обнаружение наличия или определение уровня третьего аптамера третьего аптамерного аффинного комплекса, или наличия или количества третьего аптамерного аффинного комплекса.
48. Способ по пп. 31-47, отличающийся тем, что аптамер содержит по меньшей мере один модифицированный в положении 5 пиримидин.
49. Способ по п. 48, отличающийся тем, что по меньшей мере один пиримидин, модифицированный в положении 5, содержит в положении 5 пиримидина линкер и присоединенный к линкеру фрагмент.
50. Способ по п. 49, отличающийся тем, что линкер выбран из амидного линкера, карбонильного линкера, пропинильного линкера, алкинового линкера, сложноэфирного линкера, мочевинного линкера, карбаматного линкера, гуанидинового линкера, амидинового линкера, сульфоксидного линкера и сульфонового линкера.
51. Способ по п. 49, отличающийся тем, что фрагмент представляет собой гидрофобный фрагмент.
52. Способ по п. 51, отличающийся тем, что фрагмент выбран из фрагментов, представленных в группах I, II, III, IV, V, VII, VIII, IX, XI, XII, XIII, XV и XVI на Фиг. 1.
53. Способ по п. 51, отличающийся тем, что фрагмент выбран из нафтильного фрагмента, бензильного фрагмента, фторбензильного фрагмента, тирозильного фрагмента, индольного фрагмента, морфолинового фрагмента, изобутильного фрагмента, 3,4-метилендиоксибензильного фрагмента, бензотиофенильного фрагмента и бензофуранильного фрагмента.
54. Способ по п. 48, отличающийся тем, что пиримидин модифицированного в положении 5 пиримидина представляет собой уридин, цитидин или тимидин.
55. Способ, включающий
a) приведение в контакт первого захватывающего реагента с первым разведением с образованием первой смеси, второго захватывающего реагента со вторым разведением с образованием второй смеси и третьего захватывающего реагента с третьим разведением с образованием смеси третьего разведения, причем каждый из первого, второго и третьего захватывающих реагентов иммобилизован на твердой подложке, и при этом каждый из первого, второго и третьего захватывающих реагентов обладает аффинностью к разным молекулам-мишеням;
b) инкубацию первой смеси, второй смеси и третьей смеси отдельно, при этом аффинный комплекс из первого захватывающего реагента и молекулы-мишени образуется в первой смеси в том случае, если в первой смеси присутствует молекула-мишень, к которой обладает аффинностью первый захватывающий реагент, при этом аффинный комплекс из второго захватывающего реагента и молекулы-мишени образуется во второй смеси в том случае, если во второй смеси присутствует молекула-мишень, к которой обладает аффинностью второй захватывающий реагент, и при этом аффинный комплекс из третьего захватывающего реагента и молекулы-мишени образуется в третьей смеси в том случае, если в третьей смеси присутствует молекула-мишень, к которой обладает аффинностью третий захватывающий реагент;
c) последовательное высвобождение и объединение аффинных комплексов в четвертой смеси в порядке, выбранном из: (i) аффинный комплекс из первого захватывающего реагента и молекулы-мишени, затем аффинный комплекс из второго захватывающего реагента и молекулы-мишени, а затем аффинный комплекс из третьего захватывающего реагента и молекулы-мишени; (ii) аффинный комплекс из первого захватывающего реагента и молекулы-мишени, затем аффинный комплекс из третьего захватывающего реагента и молекулы-мишени, а затем аффинный комплекс из второго захватывающего реагента и молекулы-мишени; (iii) аффинный комплекс из второго захватывающего реагента и молекулы-мишени, затем аффинный комплекс из третьего захватывающего реагента и молекулы-мишени, а затем аффинный комплекс из первого захватывающего реагента и молекулы-мишени; (iv) аффинный комплекс из второго захватывающего реагента и молекулы-мишени, затем аффинный комплекс из первого захватывающего реагента и молекулы-мишени, а затем аффинный комплекс из третьего захватывающего реагента и молекулы-мишени; (v) аффинный комплекс из третьего захватывающего реагента и молекулы-мишени, затем аффинный комплекс из первого захватывающего реагента и молекулы-мишени, а затем аффинный комплекс из второго захватывающего реагента и молекулы-мишени; и (vi) аффинный комплекс из третьего захватывающего реагента и молекулы-мишени, затем аффинный комплекс из второго захватывающего реагента и молекулы-мишени, а затем аффинный комплекс из первого захватывающего реагента и молекулы-мишени;
d) присоединение первого тега к молекуле-мишени аффинных комплексов из первого, второго и третьего захватывающего реагента и молекулы-мишени;
e) приведение в контакт содержащих тег аффинных комплексов из первого, второго и третьего захватывающего реагента и молекулы-мишени с одной или более твердыми подложками таким образом, что тег иммобилизует аффинные комплексы из первого, второго и третьего захватывающего реагента и молекулы-мишени на одной или более твердых подложках;
f) диссоциацию захватывающих реагентов из аффинных комплексов из захватывающего реагента и молекулы-мишени;
g) обнаружение наличия или определение уровня диссоциированных захватывающих реагентов;
при этом первое разведение, второе разведение третье разведение представляют собой разные разведения одного тестируемого образца.
56. Способ по п. 55, отличающийся тем, что тестируемый образец выбран из плазмы, сыворотки, мочи, цельной крови, лейкоцитов, мононуклеарных клеток периферической крови, лейкоцитарной пленки, мокроты, слез, слизи, носовых промывных вод, назального аспирата, спермы, слюны, промывных вод брюшины, асцитной жидкости, кистозной жидкости, менингеальной жидкости, амниотической жидкости, жидкости, вырабатываемой железами, лимфатической жидкости, аспирата из сосков, бронхиального аспирата, материала бронхов, взятого с помощью щеточки, синовиальной жидкости, аспирата суставной жидкости, секретов органов, клеток, экстракта клеток и спинномозговой жидкости.
57. Способ по п. 55, отличающийся тем, что аффинные комплексы из первого, второго и третьего захватывающего реагента и белка-мишени являются нековалентными комплексами.
58. Способ по п. 55, отличающийся тем, что первый захватывающий реагент, второй захватывающий реагент и третий захватывающий реагент независимо выбраны из аптамера или антитела.
59. Способ по п. 55, отличающийся тем, что молекула-мишень выбрана из белка, пептида, углевода, полисахарида, гликопротеина, гормона, рецептора, антигена, антитела, вируса, бактерии, метаболита, кофактора, ингибитора, лекарственного средства, красителя, питательного вещества, фактора роста, клетки и ткани.
60. Способ по п. 55, отличающийся тем, что обнаружение наличия или определение уровня диссоциированных первого и второго захватывающих реагентов выполняется с помощью ПЦР, масс-спектрометрии, секвенирования нуклеиновых кислот, секвенирования нового поколения (NGS) или гибридизации.
61. Способ по п. 58, отличающийся тем, что аптамер содержит по меньшей мере один модифицированный в положении 5 пиримидин.
62. Способ по п. 61, отличающийся тем, что по меньшей мере один пиримидин, модифицированный в положении 5, содержит в положении 5 пиримидина линкер и присоединенный к линкеру фрагмент.
63. Способ по п. 62, отличающийся тем, что линкер выбран из амидного линкера, карбонильного линкера, пропинильного линкера, алкинового линкера, сложноэфирного линкера, мочевинного линкера, карбаматного линкера, гуанидинового линкера, амидинового линкера, сульфоксидного линкера и сульфонового линкера.
64. Способ по п. 62, отличающийся тем, что фрагмент представляет собой гидрофобный фрагмент.
65. Способ по п. 64, отличающийся тем, что фрагмент выбран из фрагментов, представленных в группах I, II, III, IV, V, VII, VIII, IX, XI, XII, XIII, XV и XVI на Фиг. 1.
66. Способ по п. 64, отличающийся тем, что фрагмент выбран из нафтильного фрагмента, бензильного фрагмента, фторбензильного фрагмента, тирозильного фрагмента, индольного фрагмента, морфолинового фрагмента, изобутильного фрагмента, 3,4-метилендиоксибензильного фрагмента, бензотиофенильного фрагмента и бензофуранильного фрагмента.
67. Способ по п. 61, отличающийся тем, что пиримидин модифицированного в положении 5 пиримидина представляет собой уридин, цитидин или тимидин.
68. Способ по п. 55, отличающийся тем, что первое разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 0,001% до 0,009% (или составляет 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008% или 0,009%), или от 0,002% до 0,008%, или от 0,003% до 0,007%, или составляет приблизительно 0,005%, второе разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 0,01% до 1% (или составляет 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9% или 1%), или от 0,1% до 0,8%, или от 0,2% до 0,75%, или составляет приблизительно 0,5%; и третье разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 5% до 39% (или составляет 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% или 39%), или от 15% до 30%, или от 15% до 25%, или составляет приблизительно 20%.
69. Способ по п. 55, отличающийся тем, что первое разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 0,001% до 0,009% (или 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008% или 0,009%), или от 0,002% до 0,008%, или от 0,003% до 0,007% или составляет приблизительно 0,005%; второе разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 5% до 39% (или составляет 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% или 39%), или от 15% до 30%, или от 15% до 25%, или составляет приблизительно 20%; и третье разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 0,01% до 1% (или составляет 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9% или 1%), или от 0,1% до 0,8%, или от 0,2% до 0,75%, или составляет приблизительно 0,5%.
70. Способ по п. 55, отличающийся тем, что первое разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 0,01% до 1% (или составляет 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9% или 1%), или от 0,1% до 0,8%, или от 0,2% до 0,75%, или составляет приблизительно 0,5%; второе разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 5% до 39% (или составляет 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% или 39%), или от 15% до 30%, или от 15% до 25%, или составляет приблизительно 20%; и третье разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 0,001% до 0,009% (или 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008% или 0,009%), или от 0,002% до 0,008%, или от 0,003% до 0,007%, или составляет приблизительно 0,005%.
71. Способ по п. 55, отличающийся тем, что первое разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 0,01% до 1% (или составляет 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9% или 1%), или от 0,1% до 0,8%, или от 0,2% до 0,75%, или составляет приблизительно 0,5%; второе разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 0,001% до 0,009% (или составляет 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008% или 0,009%), или от 0,002% до 0,008%, или от 0,003% до 0,007%, или составляет приблизительно 0,005%; и третье разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 5% до 39% (или составляет 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% или 39%), или от 15% до 30%, или от 15% до 25%, или составляет приблизительно 20%.
72. Способ по п. 55, отличающийся тем, что первое разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 5% до 39% (или составляет 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% или 39%), или от 15% до 30%, или от 15% до 25%, или составляет приблизительно 20%, второе разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 0,01% до 1% (или составляет 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9% или 1%), или от 0,1% до 0,8%, или от 0,2% до 0,75%, или составляет приблизительно 0,5%; и третье разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 0,001% до 0,009% (или 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008% или 0,009%), или от 0,002% до 0,008%, или от 0,003% до 0,007%, или составляет приблизительно 0,005%.
73. Способ по п. 55, отличающийся тем, что первое разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 5% до 39% (или составляет 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% или 39%), или от 15% до 30%, или от 15% до 25%, или составляет приблизительно 20%; второе разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 0,001% до 0,009% (или составляет 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008% или 0,009%), или от 0,002% до 0,008%, или от 0,003% до 0,007%, или составляет приблизительно 0,005%; и третье разведение представляет собой разведение тестируемого образца от 0,01% до 1% (или составляет 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9% или 1%), или от 0,1% до 0,8%, или от 0,2% до 0,75%, или составляет приблизительно 0,5%.