Адресная миграция и выживание генетически модифицированных мононуклеарных клеток крови пуповины человека после трансплантации g93a мышам с моделью бокового амиотрофического склероза

АДРЕСНАЯ МИГРАЦИЯ И ВЫжИВАНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ МОНОНУКЛЕАРНЫХ КЛЕТОК КРОВИ ПУПОВИНЫ ЧЕЛОВЕКА ПОСЛЕ ТРАНСПЛАНТАЦИИ G93A МЫШАМ

с моделью бокового амиотрофического склероза

З.З. Сафиуллов 1, Е.Е. Гаранина 2, А.А. Измайлов 1, Р.Р. Гарифулин 1, В.Ю. Федотова 2, И.И. Салафутдинов 2, А.А. Ризванов 2, Р.Р. Исламов 1

1 Казанский государственный медицинский университет, Казань, Россия

2 Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань, Россия

Homing and survivability of genetically modified mononuclear umbilical cord blood cells after transplantation into transgenic G93A mice with amyotrophic lateral sclerosis

Z.Z. Safiullov1, EE. Garanina 2, A.A. Izmailov1, R.R. Garifulin 1, VY. Fedotova 2, I.I. Salafutdinov 2, AA. Rizvanov 2, R.R Islamov1

1 Kazan State Medical University, Kazan, Russia

2 Kazan (Volga region) Federal University, Kazan, Russia

С целью преодоления последствий нейродегенерации, в качестве альтернативного варианта фармакотерапии предложено использование генетически модифицированных мононуклеарных клеток пуповинной крови человека, экспрессирующих гены сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF), глиального нейротрофического фактора Шй^) и нейрональной молекулы клеточной адгезии ШСАМ) . В работе сравнивается миграционный потенциал и жизнеспособность генетически модифицированных моно-нуклеарных клеток крови пуповины в зависимости от экспрессии комбинаций терапевтических генов после трансплантации трансгенным G93A мышам с моделью бокового амиотрофического склероза . Иммунофлуоресцентный анализ выявил особенности адресной миграции и выживания генетически модифицированных клеток в веществе спинного мозга трансгенных мышей на разных сроках после трансплантации . Установлена связь продолжительности жизни G93A мышей от количества прижившихся клеток и комбинации терапевтических генов

Ключевые слова: боковой амиотрофический склероз, G93A мыши, мононуклеарные клетки крови пуповины, аденовирусный вектор, VEGF, GDNF, 1МСАМ .

Введение

Проблема лечения нейродегенеративных заболеваний остаётся одной из актуальных в фундаментальной и практической медицине [1]. Эти состояния сопровождаются гибелью нейронов, дегенерацией аксонов и нарушением функции иннервируемой ткани-мишени . Больные получают симптоматическое лечение, которое существенно не повышает качество жизни и не увеличивает ее продолжительность . Результаты преодоления последствий нейро-дегенерации и стимулирование нейрорегенерации в ходе лечения неврологических больных крайне неудовлетворительны и требуют разработки и внедрения новых терапевтических протоколов Повышение эффективности сдерживания дегенерации, нейро-протекции, поддержания роста нервных волокон и восстановления нервных связей связывают с применением современных клеточных и молекулярно-ге-нетических подходов . Для трансплантаций в нервную ткань, в том числе и как носителей терапевтических генов, применяют стволовые и прогениторные клетки многих видов [2, 3]. Список генов, кодирующих синтез потенциальных стимуляторов нейрорегенерации, достаточно велик . Из них нам представляются наиболее перспективными сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), глиальный нейротрофический

e-mail: redblackwhite@mail . ru

To overcome the effects of neurodegeneration, as an alternative option of pharmacotherapy, the genetically modified human umbilical cord blood mononuclear cells overexpressing vascular endothelial growth factor (VEGF), glial-derived neurotrophic factor (GDNF), neuronal cell adhesion molecule (NCAM) were suggested . The migration potential and survivability of the genetically modified cells based on expression of therapeutic gene in different combinations after transplantation into G93A mice with amyotrophic lateral sclerosis model was studied The pattern of homing and survivability of the genetically modified cells in a spinal chord after different period of time after treatment was shown by immunofluorescent analysis . Based on the level of survived cells and the combination of therapeutic genes the life extension of G93A mice was observed

Keywords: amyotrophic lateral sclerosis, G93A mice, umbilical cord blood cells, adenoviral vector, VEGF, GDNF, NCAM .

фактор (Эй^) и нейрональная молекула клеточной адгезии ШСАМ) [4, 5].

Ранее, для достижения продолжительной ко-экспрессии различных трансгенов для терапии бокового амиотрофического склероза, мононону-клеарные клетки пуповинной крови (МКПК) были трансдуцированы аденовирусами, кодирующими гены человека VEGF, Эй^ и NCAM . Существенное улучшение показателей поведенческих тестов у животных (сила хватки и открытое поле), а также увеличение продолжительности жизни было зарегистрировано у животных, подвергнутых ксенотрансплантации клеток, трансдуцированных двумя аденовирусами NCAM-VEGF или NCAM-GDNF . Активная экспрессия трансгенов в спинном мозге была показана спустя 10 нед . после операции. Трансплантированные клетки были обнаружены в спинном мозге трансгенных животных, спустя 5 мес . после ксенотрансплантации [8].

В настоящем исследовании иммунофлуоресцент-ным методом изучена зависимость сдерживания развития заболевания и увеличение продолжительности жизни мышей с моделью бокового амиотрофического склероза от количества прижившихся после трансплантации монононуклеарных клеток крови пуповины, трансдуцированных аденовирусами, кодирующими гены VEGF, Эй^ и NCAM в различных комбинациях .

Материал и методы

МКПК человека трансдуцировали аденовирусами Ad-VEGF, Ad-GDNF, Ad-NCAM, Ad-EGFP в различных комбинациях, со значением множественности инфицирования (MOI) 10 (табл . ) . Получение рекомбинант-ныхаденовирусовописано в предыдущих работах [6, 7]. 2х10в генетически модифицированных клеток трансплантировали G93A мышам с моделью бокового амиотрофического склероза на 28 нед . жизни путем инъекции в ретроорбитальный синус в 100 мкл стерильного физиологического раствора [8]. По мере прогрессирования заболевания и наступления терминальной стадии, за 1—2 дня до предполагаемой смерти, мышей выводили из эксперимента . Животных наркотизировали и через большой круг кровообращения транскардиально перфузировали сначала холодным фосфатно-солевым буфером (рН = 7,4), затем холодным 4% раствором пара-формальдегида (рН = 7,4). Спинной мозг извлекали из позвоночного столба, постфиксировали в растворе параформальдегида в течение 4 ч на ротационном столике . В целях криопротекции фиксированную ткань насыщали 30% раствором сахарозы на фосфатно-солевом буфере (рН = 7,4). Для приготовления криостатных срезов поясничный отдел спинного мозга помещали в заливочную среду TBS (Triangle Biomedical Science, Durham, NC, США) и замораживали в криостате Microm HM 560 (Carl Zeiss, Германия) . Свободно плавающие поперечные срезы толщиной 20 мкм подвергали иммунофлуоресцент-ному окрашиванию с помощью моноклональных антител (АТ) против ядерного антигена человека (HNA, 1:150, Millipore, США) . Для визуализации первич-

Таблица. Группы животных

ных АТ использовали АТ, конъюгированные с Alexa 488 (1:150, Invitragen, США) . Для визуализации ядер срезы инкубировали в растворе 4',6-диамино-2-фенилиндола (DAPI, 10 мкг/мл в фосфатно-со-левом буфере, Sigma, США) 10 мин . при комнатной температуре . Окрашенные срезы помещали в среду, поддерживающую флуоресценцию, и изучали с помощью конфокального микроскопа LSM 780 Meta (Carl Zeiss, Германия) . HNA+ клетки подсчитывали на 100 поперечных срезах спинного мозга каждой мыши в нескольких повторениях. Полученные результаты представлены в виде среднего значения и стандартной ошибки, статистическая достоверность различий оценивалась при помощи t-критерия Стьюдента, при этом отличия считались достоверными при P<0,05 .

Результаты

После трансплантации МКПК в спинном мозге трансгенных мышей во всех экспериментальных группах обнаружены HNA+ клетки, экспрессирующие ядерный антиген человека . Достоверных различий в количестве выживших клеток на сроках до 8 нед . после трансплантации не выявлено . При этом на более поздних сроках в веществе спинного мозга мышей, для лечения которых был использован один терапевтический ген, встречаются лишь единичные трансплантированные клетки, а на том же сроке после трансплантации, в спинном мозге мышей, получивших клетки, содержащие комбинацию терапевтического гена с нейрональной молекулой адгезии, были обнаружены многочисленные скопления трансплантированных клеток (рис . 1) .

Группа Генетическая модификация

МКПК* Нативные мононуклеарные клетки крови пуповины человека

МКПК-Ad EGFP МКПК, трансдуцированные аденовирусом Ad-EGFP

МКПК-Ad VEGF МКПК, трансдуцированные аденовирусом Ad-VEGF

МКПК-Ad GDNF МКПК трансдуцированные аденовирусом Ad-GDNF

МКПК-Ad VEGF-NCAM МКПК, трансдуцированные аденовирусами Ad-VEGF и Ad-NCAM

МКПК-Ad GDNF-NCAM МКПК, трансдуцированные аденовирусами Ad-GDNF и Ad-NCAM

МКПК-Ad GDNF- VEGF МКПК, трансдуцированные аденовирусами Ad- GDNF и Ad-VEGF

МКПК — моноуклеарные клетки пуповинной крови .

А

Б

Merge

Merge

Рис. 1.

Мононуклеарные клетки крови пуповины человека в спинном мозге G93A мыши через 9 нед. после трансплантации: А — HNA+ клетки, трансдуцированные Ad-GDNF; Б — HNA+ клетки, трансдуцированые Ad-GDNF и Ad-NCAM.

Синий — ядра клеток, окрашены DAPI; зелёный — ядра клеток окрашены с помощью антител к ядерному антигену человека (HNA); merge — совмещение двух изображений. Масштабный отрезок — 20 цм

На гистограмме представлено соотношение количества выявленных в паренхиме спинного мозга клеток, экспрессирующих ядерный антиген человека в период с 5 по 17 неделю после трансплантации (рис . 2) . Одной из целей эксперимента являлось установить макимальную продолжительность выживания мышей на фоне лечения с помощью генетически модифицированных клеток. По этой причине животных выводили из эксперимента по мере вступления в терминальную стадию заболевания и в этой связи некоторые экспериментальные группы представлены одним животным . Кроме того, учитывая, что сроки вывода из эксперимента разнятся у всех мышей, то для получения более наглядной демонстрации различий групп, было решено объединить две недели эксперимента в одну точку на шкале абсцисс . Вместе с тем нами получены данные в пользу того, что нейрональная молекула клеточной адгезии — NCAM поддерживает жизнеспособность трансплантированных клеток В экспериментальной серии МКПК^^й^^САМ количество клеток было больше, чем в серии МКПК-Ad-GDNF на сроке 9—10 нед . , а на сроке 17 нед . HNA+ клетки были обнаружены только в серии МКПК-Ad-GDNF-NCAM . При этом единичные HNA+ клетки были выявлены и на более поздних сроках в сериях МКПК-Ad-GDNF-NCAM и МКПК-Ad-VEGF-NCAM [8].

Обсуждение

Ранее нами была выдвинута гипотеза, что эффективность доставки терапевтического гена в нервную ткань в клеточных носителях можно увеличить путём введения в клетки гена, экспрессирующего нейро-нальную молекулу адгезии L1 [9]. Другими словами, одновременная сверхэкспрессия терапевтического гена, например, гена нейропротекторного фактора и нейрональной молекулы адгезии в мононуклеар-

ных клетках крови пуповины усилит их адресную миграцию, выживаемость и, как следствие, продолжительность действия нейротрофического фактора на клетки мишени . Существенное улучшение показателей поведенческих тестов (сила хватки и открытое поле), а также увеличение продолжительности жизни было зарегистрировано у животных, подвергнутых ксенотрансплантации клеток, транс-дуцированных двумя аденовирусами NCAM-VEGF или NCAM-GDNF . Активная экспрессия трансгенов в спинном мозге была показана спустя 10 нед после операции. Трансплантированные клетки были обнаружены в спинном мозге трансгенных животных, спустя 5 мес . после ксенотрансплантации [8]. Сопоставление этих данных с результатами настоящего исследования подтверждают нашу гипотезу Максимальное количество трансплантированных клеток и на самых отдалённых сроках после трансплантации было установлено для группы мышей, которым вводили клетки, трансдуцированные терапевтическим геном и геном нейрональной молекулы адгезии При этом эта группа мышей имела и самую высокую продолжительность жизни Следовательно, сверхэкспрессия нейрональной молекулы адгезии моно-нуклеарными клетками крови пуповины человека повышала миграционный потенциал и жизнеспособность трансплантированных клеток и, как следствие, продлевала жизнь мышей с моделью бокового ами-отрофического склероза Таким образом, целесообразность введения гена NCAM в мононуклеар-ные клетки крови пуповины человека для терапии нейродегенеративных заболеваний обусловлена: (1) повышением жизнеспособности трансплантированных клеток в ЦНС реципиента, (2) адресной доставкой специфических ростовых и трофических факторов в область нейродегенерации и (3) пролонгированием действия терапевтических молекул на клетки-мишени

Рис. 2.

Количество HNA+ клеток в 100 поперечных срезах спинного мозга G93A мышей после трансплантации мононуклеарных клеток крови пуповины человека на разных сроках эксперимента. Свободная от значений колонка в серии GDNF-NCAM на сроке 6 нед. обусловлена отсутствием гибели животных этой серии на этом сроке. Свободная от значений колонка в серии VEGF на сроке 9 нед. свидетельствует о гибели всех животных этой серии до данного срока. На сроке 17 нед. HNA+ клетки выявлены только в сериях GDNF-NCAM. п — количество животных, в скобках указано количество повторностей исследования

Количество недель со дня трансплантации

Благодарности

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (Проект № 15-15-20036). Анализы выполнены в лаборатории лазерной конфокальной микроскопии Междисциплинарного центра аналитической микроскопии на приборе LSM 780 компании CARL ZEISS. Работа выполнена в рамках программы повышения конкурентоспособности Казанского федерального университета и субсидии, выделенной Казанскому федеральному университе-

ту для выполнения государственного задания в сфере научной деятельности. Работа частично выполнена на оборудовании Междисциплинарного центра коллективного пользования Казанского федерального университета при финансовой поддержке государства в лице Министерства образования и науки России (Ю RFMEFI59414X0003) и Научно-образовательного центра фармацевтики Казанского (Приволжского) федерального университета.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Federici Т . , Boulis M . N . Gene therapy for amyotrophic lateral sclerosis . Neurobiol . Dis . 2012; 48(2): 236-6 .

2 . Taha M . F . Cell based-gene delivery approaches for the treatment of spinal cord injury and neurodegenerative disorders . Curr . Stem Cell Ther . 2010; 5(1): 23-13 .

3 . Garbuzova-Davis S ., Rodrigues M . C ., Mirtyl S . et al . Multiple intravenous administrations of human umbilical cord blood cells benefit in a mouse model of ALS . PLoS One 2012; 7(2): e31254 .

4 . Chen J ., Bernreuther C ., Dihne M . et al . Celladhesion molecule l1-transfected embryonic stem cells with enhanced survival support regrowth of corticospinal tract axons in mice after spinal cord injury . Neurotrauma 2005; 22(8): 896-10 .

5 . Krakova D ., Mulcrone P ., Meyer M . et al . Synergistic effects of GDNF and VEGF on lifespan and disease progression in familial ALS rat model . Mol . Ther 2013; 21(8): 1602-8 .

6 . Федотова, Е . Е . Черенкова, Р . Р . Исламов и др . Создание рекомбинантных аденовирусов, кодирующих гены нейральных мо-

лекул клеточной адгезии ncam1, ncam2 и l1cam . Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2013; 8(3): 142-6 .

7 . Черенкова Е . Е ., Федотова В . Ю ., Борисов М .А . и др . Создание рекомбинантных аденовирусов и лентивирусов, экспрессирующих ангиогенные и нейропротекторные факторы, с помощью технологии клонирования Gateway клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2012; 7(3): 164-8 .

8 . Islamov R . R ., Rizvanov A.A., Mukhamedyarov M .A. et al . Symptomatic improvement, increased life-span and sustained cell homing in amyotrophic lateral sclerosis mouse model after transplantation of human umbilical cord blood cells genetically modified with adenoviral vectors expressing a neuroprotective factor and a neural cell adhesion molecule . Curr . Gene Ther . 2015; 15(3): 266-10 .

9 . Rizvanov A .A ., Kiyasov A . P ., Gazizov I . M . et al . Human umbilical cord blood cells transfected with VEGF and L(1)CAM do not differentiate into neurons but transform into vascular endothelial cell and secrete neuro-trophic factors to support neuro-genesis-a novel approach in stem cell therapy . Neurochem . Int . 2008; 53(6-8): 389-5 .

Поступила: 13.10.2015