СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ ОСТЕОАРТРОЗА
METHOD FOR SIMULATING OSTEOARTHROSIS

Изобретение относится к области экспериментальной медицины, а именно к ревматологии, и может быть использовано как для биологического моделирования остеоартроза (OA) с поражением суставного хряща (СХ) 2-3 степени 2 стадии, так и для тестирования средств и методов его лечения.
OA (в иностранной литературе «остеоартрит») - самая распространенная возраст-ассоциированная группа заболеваний опорно-двигательного аппарата со сходным патогенезом, клинической картиной и поражением всех составляющих сустав элементов, в первую очередь хряща и субхондральной кости. Тотальная распространенность, физические страдания, инвалидизация потенциально работоспособных лиц и значительные финансовые потери выступают генератором поиска новых подходов к изучению OA. В последних научных работах [9, 10] используется термин «ранний» OA, который имеет четкие гистологические критерии (1-3 степени поражения СХ по классификации OARSI [11]). Ранний OA является объектом исследований ученых последних лет и представляет актуальную проблему ревматологии [9]. Но нетравматическое прижизненное исследование хряща у человека затруднительно, равно как и нет возможности динамической оценки его состояния на фоне лечения, что диктует необходимость моделирования OA в эксперименте.
Для экспериментального воспроизведения OA используют различные методы, которые условно можно разделить на несколько групп: использование животных с генетически детерминированными признаками, хирургические (оперативные) манипуляции, внутрисуставное введение химических соединений и травмирующих агентов, математическое моделирование, методы опосредованного влияния на сустав (изменением гормонального статуса, нарушением биомеханики, приемом токсических веществ и др.).
В группе методов, предполагающих использование животных с модификацией генетического аппарата, известна модель спонтанного OA, развивающегося у мышей линии STR/OPT [12]. У всех животных в возрасте 32-35 недель развивается преждевременная дегенерация СХ и других тканей коленного сустава, наиболее выраженная в области медиального плато большеберцовой кости. Данная модель крайне тяжело воспроизводима, так как для получения линии STR/OPT требуются мыши линии STR/1N, близкородственное скрещивание которых при определенных условиях (после периода нон-инбридинга) обеспечивает рождение животных с необходимыми генетическими и фенотипическими признаками. Также важными недостатками данной модели являются: длительный период формирования OA (в среднем 6 месяцев), индивидуальная вариабельность поражения тканей сустава, для модели не характерен синовит.
Среди группы хирургических способов получения OA известно нарушение регионального кровообращения сустава пересечением бедренной артерии [3]. В условиях операционной у собак одновременно на двух задних конечностях на уровне средней трети бедренной кости выделяют бедренную артерию, лигируют в двух местах и пересекают между лигатурами, затем послойно ушивают операционную рану и иммобилизируют конечности аппаратом Илизарова в течение 28 суток. Выведение животных из эксперимента осуществляют через 28 суток после рентгенологического подтверждения развития OA коленных суставов. Недостатки модели: развитие грубых деструктивных изменений в суставах, не предполагающих изучение ранних стадий заболевания, сложная техника исполнения (требуются хирургическая бригада, стерильная операционная, оборудование, анестетик, аппарат Илизарова, владение хирургическими навыками), травматизация тканей, риск гибели животных, развития послеоперационных осложнений.
Среди способов моделирования OA внутрисуставным введением химических веществ существует метод, предполагающий использование трипсина [8]. Беспородным белым мышам обоих полов вводился 0.1 мл 0.1% раствора трипсина в коленный сустав под внутрибрюшинным наркозом кетамином и ксалазином, на 14 и 28 дни животных выводили из эксперимента.
Недостатками модели являются: травматизация суставообразующих структур, острое локальное разрушение хрящевой ткани под действием препарата (несоответствие полученной патологии заболеванию человека), ограниченная возможность апробации препаратов для лечения OA, технические сложности при осуществлении метода (условия для манипуляций, препараты для наркоза), риск осложнений после инвазии, развитие моноартроза (у человека OA обычно поражает несколько суставов).
Среди методов неинвазивного влияния на сустав известен способ получения системного стероидного OA у крыс [2]. Для его воспроизведения авторы осуществляли троекратное внутримышечное введение дексаметазона фосфата в дозе 7 мг/кг с интервалом в одну неделю крысам-самцам линии Wistar массой 250-300 г. Ключевым недостатком модели является несоответствие этиопатогенеза кортикостероидной артропатии в эксперименте таковому при OA у человека: хроническая передозировка дексаметазона обеспечивает развитие у крыс вторичного, медикаментозно индуцированного OA. Воспроизведенная патология сопровождается системными побочными эффектами, это препятствует корректному исследованию состояния суставов, в т.ч. при апробации лекарственных средств. Таким образом, имеющиеся модели предполагают специфические триггеры развития OA, отличающиеся от реальных причин его развития у человека, и оптимальной биологической модели раннего OA до сих пор не предложено.
Прототип
В качестве прототипа был использован способ, заключающийся в воздействии на крыс линии Wistar путем проведения двухнедельного курса ежедневных подкожных инъекций 1% 0.1 мл раствора мезатона с последующим плаванием после каждой инъекции в течение 20 минут в резервуаре с водой [4]. Данный препарат - адреномиметик - активирует гипертензивные механизмы и в сочетании с интенсивной физической нагрузкой используется для получения хронической сердечной недостаточности (ХСН) по методу В.И. Инчиной [6, 7].
При оценке полученных изменений в суставах животных можно сказать, что они соответствуют 1-й степени 1-й стадии поражения хряща по классификации OARSI. Однако метод не позволяет достигнуть и исследовать дальнейшие этапы поражения хряща (вплоть до 3-й степени по классификации OARSI), это стало ключевым недостатком метода.
Задача изобретения - создание наиболее физиологичной, нетравматичной, максимально учитывающей патогенетические и патоморфологические аспекты заболевания биологической модели OA с поражением суставного хряща 2-3 степени 2 стадии для дальнейшего его изучения и апробации лекарственных средств и методов лечения.
Сущность изобретения заключается в том, что крыс линии Wistar подвергают двухнедельному курсу ежедневных подкожных инъекций 1% 0.1 мл раствора мезатона с последующим плаванием в течение 20 минут после каждой инъекции в резервуаре с водой, после чего животных на 2 месяца помещают в тесные клетки и обеспечивают им высококалорийную диету, включающую не менее 55% углеводов, не менее 30% жиров и не менее 9% белков от рациона питания.
Осуществление способа
Предлагаемый способ был воспроизведен в экспериментальном исследовании на 20 половозрелых крысах-самцах линии Wistar весом 304-498 г. Все животные случайным образом были распределены на 3 группы. Крысы первой - контрольной - группы (5 голов) находились на стандартном рационе вивария, затем были выведены из эксперимента в его последний день передозировкой эфирного наркоза. Остальных крыс (15 животных) подвергали ежедневному 20-минутному плаванию после подкожной инъекции 0,1 мл 1% раствора мезатона в течение 14 дней. Из 15 животных 5 крыс (вторая группа) были выведены из эксперимента с помощью эфирного наркоза. Оставшиеся 10 животных составили третью группу, были помещены в тесные клетки и в течение 2 месяцев находились на высококалорийной многокомпонентной диете, включающей пшено (21%), сдобу (30%), жареный на растительном масле картофель (20%), сырое свиное сало (12%), шоколад (4%), фундук (4%), печенье (5%), подсолнечную халву (4%), вместо воды использовали 20% раствор фруктозы в свободном доступе (итого белки - 9,61%, жиры - 31,87%, углеводы - 58,52%). Животных взвешивали в 1-й, 30-й, 60-й дни, определяли общий и удельный прирост массы тела. В каждой группе проводили клиническую оценку состояния крыс. Через 2 месяца животных также вывели из эксперимента передозировкой эфирного наркоза.
Все крысы были декапитированы, для морфологического исследования у них взяли коленные суставы и внутренние органы (сердце, печень, почки, легкие) для подтверждения развития сосудистых и метаболических нарушений. После стандартной гистологической проводки приготовление серийных срезов толщиной 5-6 мкм осуществляли на ротационном микротоме МПС-2. Для обзорной микроскопии парафиновые срезы окрашивали гематоксилином Майера и эозином [5]. Идентификацию сидерофагов в легких крыс с ХСН проводили реакцией Перлса [5]. Гликозаминогликаны определяли 0,5% толуидиновым синим при разных значениях рН (7,4; 4,7) с проведением контроля (обработка гиалуронидазой). На парафиновых срезах на стеклах Super frost plus с помощью набора реактивов моноклональных антител для иммуногистохимии («BioCenex», США) идентифицировали коллаген II типа, выявляли экспрессию каспазы-3, матриксной металлопротеиназы ММР-9. Окраску проводили согласно протоколу фирм производителей. Степень экспрессии коллагена 2 типа и ММР-9 оценивали визуально по бальной системе от 1 до 4, количество клеток, экспрессирующих каспазу-3, подсчитывали и выражали в процентах. С помощью окуляр-микрометра МОВ-1-1.5*у 4,2 определяли толщину слоев СХ, используя окулярную сетку-вставку, подсчитывали относительную объемную плотность сосудов микроциркуляторного русла синовиальной мембраны (СМ) [1]. Статистическая обработка данных произведена с использованием пакета программ «MS Excel 2007» и «Statistica 6,6 for Windows». Производили подсчет среднеарифметических значений абсолютных и относительных величин, ошибок средних величин и стандартных отклонений. Достоверность различий сравниваемых показателей определяли по t-критерию Стьюдента, различия средних величин считали достоверными при уровне значимости р < 0,05%.
Результаты исследования
Клиническая оценка состояния животных контрольной группы не выявила патологии. У второй группы животных появились признаки сердечной недостаточности: цианоз, учащенное дыхание, крысы опирались передними конечностями за бортик клетки для вовлечения дополнительной дыхательной мускулатуры, задние были отечны и синюшны. Длительность нормализации частоты дыхания составляла 10-15 минут, акроцианоз (синюшность кожи ушек, лап, хвоста) сохранялся в покое. Клиническая оценка состояния крыс третьей группы помимо симптомов ХСН выявила изменение поведения крыс: увеличение количества и кратности приемов пищи и раствора фруктозы, замедленные реакции, малоподвижность, взвешивание животных выявило увеличение их массы тела на 30-36% от исходной (табл. 1).
Для подтверждения развития патологии (ХСН, ожирение) проводилось морфологическое исследование внутренних органов крыс (сердца, печени, почек, легких). В контрольной группе в препаратах миокарда, окрашенных гематоксилином Майера - эозином, определялись сократительные кардиомиоциты с овальными ядрами, четкими контурами, равномерной окраской, поперечной исчерченностью, между ними находились прослойки межмышечной рыхлой соединительной ткани (фиг. 1, увеличение 300). В печени гепатоциты формировали балки, между которыми располагались синусоидные капилляры, направленные к центральным венам, печеночные клетки разделялись желчными капиллярами (фиг. 2, увеличение 600). В почках определялось мозговое и корковое вещество с почечными тельцами и извитыми канальцами, клубочки имели нормальные размеры, просвет капсулы свободный, эпителий канальцев кубической формы с четкими контурами, просвет сохранен. В легочной ткани определялись респираторные альвеолоциты, формирующие с макрофагами межальвеолярные перегородки, перибронхиально располагалась интерстициальная ткань. Микроскопия внутренних органов животных контрольной группы не выявила патологии.
При морфологическом исследовании внутренних органов, окрашенных гематоксилином Майера - эозином, у крыс второй группы в миокарде (фиг. 3, увеличение 300) были выявлены участки мышечного пересокращения, сближение вставочных дисков, увеличение доли соединительной ткани. В печени (фиг. 4, увеличение 600) отмечены явления застоя (расширенные синусоидные капилляры со сладжированными клетками крови, явления мелкокапельной жировой дистрофии в гепатоцитах центролобулярных зон). В легких сосуды были расширены, в просветах альвеол определены сидерофаги, в межальвеолярных перегородках - гемосидерин. В почках было отмечено венозное полнокровие и начальные признаки гиалиново-капельной дистрофии эпителиоцитов канальцев. Эти данные подтвердили факт развития ХСН у крыс.
При микроскопическом исследовании внутренних органов животных третьей группы были обнаружены наиболее выраженные признаки их дистрофии. В микропрепаратах миокарда, окрашенных гематоксилином Майера и эозином (фиг. 5, увеличение 400), преобладала соединительная ткань, в ее прослойках и под эпикардом - скопления адипоцитов, в кардиомиоцитах участки пересокращения и сближения вставочных дисков. В печени (фиг. 6, увеличение 400) наблюдался крупнокапельный стеатоз в центролобулярных (повреждение ишемического генеза) и периферических зонах (обусловлен преимущественно алиментарным фактором), часть гепатоцитов подверглась некрозу с обнажением синусоидных капилляров (признак «мускатной» печени при ХСН). Определялись участки инфильтрации лимфоцитами. В легочной ткани обнаружились участки фиброза, бурой индурации легких (межальвеолярные перегородки утолщались, реакцией Перлса идентифицировались сидерофаги), в стенках некоторых сосудов - дистрофическое обызвествление (атерокальциноз). В почках отмечены признаки гиалиново-капельной и гидропической дистрофии, скопление адипоцитов в интерстициальной ткани, гиалиновых капель в канальцах, сосуды были расширены и заполнены сладжированными эритроцитами. Полученные данные подтвердили развитие ожирения на фоне ХСН у крыс третьей группы.
Микроскопическое исследование коленных суставов крыс выявило их неодинаковое морфофункциональное состояние, сравнительная характеристика СМ, СХ и субхондральной кости животных приведена в таблицах 2, 3. Анализ морфологии суставов крыс первой группы выявил, что они являются здоровыми тканями, в остальных отмечены признаки их реорганизации. Во второй группе обнаружены начальные изменения цитоархитектоники и функциональной активности клеток дегенеративного характера, у крыс третьей группы отмечены наиболее выраженные признаки дезорганизации компонентов суставов.
Технический результат
Первые признаки дегенеративно-дистрофического поражения суставов экспериментальных животных обнаруживаются на 14-й день моделирования OA. Морфологически подтвержденный OA с поражением СХ, соответствующим 2-3 степени 2 стадии по классификации OARSI [11], развивается в течение последующих 2 месяцев.
Таким образом, у экспериментальных животных была получена полиэтиологическая, максимально приближенная к реальным клиническим условиям и технически несложная биологическая модель OA со 2-3 степенью 2 стадией поражения СХ. Она характеризуется 100%-ной воспроизводимостью, нулевой летальностью, отсутствием воздействия токсических веществ, кортикостероидных препаратов, предполагает опосредованное, не травмирующее влияние на сустав. Данный способ получения OA экономически выгоден, он не требует специального оборудования, животных с модифицированным генетическим аппаратом, значительных временных затрат, он осуществим в условиях вивария.
Предложенное решение не является модификацией или суммацией известных способов; оно основано на совершенно оригинальной идее и имеет большое практическое значение, так как позволяет проводить неосуществимые в клинике эксперименты по изучению ранних этапов развития OA, находящихся в фокусе внимания современных исследователей, а также апробировать новые средства и методы лечения этого заболевания на экспериментальных животных.
Источники информации
1. Автандилов, Г.Г. Медицинская морфометрия / Г.Г. Автандилов. - М.: Медицина, 1990. - 384 с.
2. Зупанец, И.А. Влияние комбинации глюкозамина гидрохлорида с парацетамолом на апоптоз хондроцитов в условиях развития системного стероидного артроза у крыс / И.А. Зупанец, В.А. Туляков, С.К. Шебеко // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2012 - Т. 75, №4. - С. 34-37.
3. К вопросу моделирования остеоартроза коленного сустава у собак для изучения патогенеза (экспериментально-морфологическое исследование) / В.И. Шевцов [и др.] // Гений ортопедии. - 2012. - №1. - С. 38-42.
4. Корочина, К.В. Реорганизация структур коленных суставов крыс с хронической сердечной недостаточностью / К.В. Корочина, В.С. Полякова, И.Э. Корочина // Фундаментальные исследования. - 2014. - №10. - Ч. 7. - С. 1335-1340. (ПРОТОТИП)
5. Меркулов, Г.А. Курс патолого-гистологической техники / Г.А. Меркулов. - 5-е изд., испр. и доп. Л.: Медицина, Ленингр. отд-ние, 1969. - 423 с.
6. Саликова, С.П. Структурный анализ миокарда крыс с экспериментальной сердечной недостаточностью при культивировании in vitro / С.П. Саликова, С.В. Пресняков, Ф.М. Фарекс // Морфология. - 2002. - Т. 121. - N 23. - С. 128-129.
7. Состояние миокарда в модельной ситуации активации гипертензивных механизмов / В.И. Инчина [и др.] // Второй Российский конгресс по патофизиологии. - М., 2000. - С. 68.
8. Ханиех, Саттари Фард. Моделирование остеоартроза коленного сустава // Ветеринарная медицина. - 2013. - №1. - С. 21-2.
9. Early knee osteoarthritis [Electronic resource] / M. Favero, R. Ramonda, M.B. Goldring [et al.] // Rheumatic and Musculoskeletal Diseases. - 2015; 1 (Suppl 1). URL: https://www.researchgate.net/profile/Marta_Favero2/publications
10. Madry H., Luyten F.P., Facchini A. Biological aspects of early osteoarthritis // Knee Surgery, Sports Traumatology, Arthroscopy. - 2012. - Vol. 20. - P. 407-422
11. Osteoarthritis cartilage histopathology: grading and staging / K.P. Pritzker [et al.] // Osteoarthritis Cartilage. - 2006. - Vol. 14. - Iss. 1. - P. 13-29
12. The STR/ort mouse and its use as a model of osteoarthritis / R.M. Mason [et al.] // Osteoarthritis Cartilage. - 2001. - Vol. 9. - P. 85-91