СХЕМЫ ДОЗИРОВАНИЯ ДЛЯ ВВЕДЕНИЯ АНАЛОГОВ ГЛЮКАГОНОПОДОБНОГО ПЕПТИДА 2 (ГПП-2)
DOSING SCHEMES FOR ADMINISTRATION OF GLUCAGON-LIKE PEPTIDE 2 (GLP-2) ANALOGUES

Область техники
Настоящее изобретение относится к схемам дозирования для введения аналогов глюкагоноподобного пептида-2 (GLP-2, ГПП-2) и их медицинскому применению, например, для лечения и/или предотвращения нарушений, связанных с желудком и кишечником, а также для уменьшения побочных эффектов химиотерапии и лучевой терапии. Настоящее изобретение также относится к схемам дозирования для введения аналогов глюкагоноподобного пептида-2 (GLP-2) для индукции продольного роста кишечника, например, для лечения пациентов с синдромом короткой кишки (СКК). Настоящее изобретение также относится к вариантам медицинского применения для корректировки объема парентерального питания (ПП), предоставляемого субъектам, получающим лечение аналогами GLP-2, в ответ на лечение, а также к алгоритмам для определения изменений объема ПП.
Уровень техники
GLP-2 человека представляет собой пептид из 33 аминокислот, имеющий следующую последовательность: Hy-His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-OH. Он образуется в результате специфического посттрансляционного процессинга проглюкагона в энтероэндокринных L-клетках кишечника и в определенных областях ствола мозга. GLP-2 связывается с единственным сопряженным с G-белком рецептором, относящимся к семейству глюкагона-секретина класса II.
Сообщалось, что GLP-2 индуцирует значительный рост эпителия слизистой оболочки тонкого кишечника за счет стимуляции пролиферации стволовых клеток в криптах и ингибирования апоптоза в ворсинках (Drucker et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 7911-7916). GLP-2 также влияет на рост толстой кишки. Кроме того, GLP-2 ингибирует опорожнение желудка и секрецию желудочной кислоты (Wojdemann et al., 1999, J. Clin. Endocrinol. Metab. 84: 2513-2517), усиливает барьерную функцию кишечника (Benjamin et al., 2000, Gut 47: 112-119), стимулирует транспорт гексозы в кишечнике за счет активации транспортеров глюкозы (Cheeseman, 1997, Am. J. Physiol. R1965-71) и увеличивает кровоток в кишечнике (Guan et al., 2003, Gastroenterology, 125: 136-147). Обзор GLP-2 и его свойств доступен по адресу: http://jn.nutrition.org/content/131/3/709.full.
В данной области техники признано, что аналоги рецептора глюкагоноподобного пептида-2 обладают терапевтическим потенциалом для лечения заболеваний кишечника. Однако нативный hGLP-2, пептид желудочно-кишечного тракта из 33 аминокислот, не подходит для применения в клинических условиях из-за его очень короткого периода полувыведения у человека, составляющего примерно 7 минут для полноразмерного GLP-2 [1-33] и 27 минут для усеченного GLP-2 [3-33]. Короткий период полувыведения в значительной степени обусловлен разрушением ферментом дипептидилпептидазой IV (DPP-IV). Соответственно, в данной области техники предпринимались попытки разработать агонисты рецептора GLP-2 с лучшими фармакокинетическими характеристиками, в частности, для улучшения периода полувыведения молекул GLP-2. Например, были предложены аналоги GLP-2 с заменами, такие как, например, аналоги GLP-2, содержащие замену Gly в положении 2 ([hGly2] GLP-2, тедуглутид), которая увеличивает период полувыведения с семи минут (нативный GLP-2) до примерно двух часов. Ацилирование пептидных лекарственных средств цепями жирных кислот также оказалось благоприятным для увеличения продолжительности циркуляции в системном кровотоке, а также для повышения ферментативной стабильности без нарушения биологической эффективности. Однако, несмотря на то, что эти попытки улучшили фармакокинетику аналогов GLP-2, и они иногда описываются в данной области техники как «длительно действующие», следует иметь в виду, что это относится к сравнению с нативным hGLP-2, период полувыведения которого составляет порядка нескольких часов, а не минут. В свою очередь, это означает, что аналоги GLP-2 по-прежнему необходимо вводить пациентам один или более раз в сутки.
Со стороны пациентов и медицинских работников существует значительный интерес к разработке недорогих, длительно действующих, «удобных для пользователя» терапевтических пептидов. Однако основной трудностью при доставке таких терапевтических пептидов является их короткий период полувыведения из плазмы, главным образом из-за быстрого клиренса из сыворотки крови и протеолитического разрушения под действием плазматических протеаз, что требует частых, обычно ежедневных, инъекций. Пациенты испытывают неприязнь к инъекциям, что приводит к снижению приверженности лечению и снижению эффективности лекарственного средства.
in vivo
in vitro
В WO 2006/117565 (Zealand Pharma A/S) описаны аналоги GLP-2, которые содержат одну из нескольких замен по сравнению с [hGly2]GLP-2 и которые имеют улучшенную биологическую активность в условиях  и/или улучшенную химическую стабильность, например, согласно оценке в анализах стабильности в условиях . В частности, описаны аналоги GLP-2, которые содержат замены в одном или более положениях 8, 16, 24 и/или 28 последовательности GLP-2 дикого типа, необязательно в комбинации с дополнительными заменами в положении 2 и одной или более в положениях 3, 5, 7, 10 и 11, и/или делецию одной или более аминокислот с 31 по 33. Эти замены также можно комбинировать с добавлением N-концевой или С-концевой стабилизирующей пептидной последовательности. Также описано введение указанных аналогов GLP-2 один раз в сутки или два раза в сутки. Среди молекул, описанных в WO 2006/117565, описан глепаглутид (ZP1848), который был разработан для придания ему стабильности в жидких составах и, как правило, вводится путем ежедневного дозирования с использованием шприц-ручки.
Краткое описание изобретения
В общих чертах, настоящее изобретение основано на неожиданном наблюдении, что фармакокинетические (ФК) и/или фармакодинамические (ФД) свойства аналогов GLP-2, например, типа, раскрытого в WO 2006/117565 и WO 2008/056155, обеспечивают возможность менее частого введения, чем предлагалось ранее. Предыдущие эксперименты свидетельствовали о том, что аналоги GLP-2, такие как ZP1848, имели период полувыведения примерно 17 часов, который значительно длиннее, чем период полувыведения GLP-2 или других аналогов GLP-2, это подразумевает, что при лечении пациентов следует применять ежедневное введение. Однако в клиническом исследовании фазы 2 с участием людей, проведенном с применением аналога GLP-2 ZP1848, на данный момент обнаружено, что терминальный период полувыведения молекулы из плазмы фактически составляет от 5 до 17 дней. Терминальный период полувыведения из плазмы представляет собой время, необходимое для двукратного уменьшения концентрации в плазме после достижения псевдоравновесия. В свою очередь, это неожиданно свидетельствует о том, что значительно менее частое дозирование аналогов GLP-2 согласно настоящему изобретению будет эффективным, включая еженедельное дозирование и дозирование дважды в неделю. Содержание WO 2006/117565 и WO 2008/056155 в явной форме полностью включено для всех целей и, в частности, в отношении аналогов GLP-2, описанных в этих документах.
in vivo
in vitro
in vivo
Результаты дальнейших исследований также подтвердили, что оба метаболита ZP1848, т.е. ZP2711 и ZP2469, присутствовали после его введения в условиях  и являются фармакологически активными, причем их эффективность в условиях  сопоставима с ZP1848. Уровень в плазме ZP2711 находится в пределах того же диапазона, как и уровень ZP1848, тогда как уровень в плазме ZP2469 во много раз выше, чем таковой для ZP1848. Следовательно, оба метаболита могут быть включены в оценку системного воздействия (экспозиции), поскольку они оба вносят вклад в эффективность в условиях . Из-за высокого уровня в плазме ZP2469 это соединение имеет уровни в плазме крови, которые превышают предел биоаналитического обнаружения (50 пМ для ZP2469, 25 пМ для ZP1848 и ZP2711), следовательно, представляется возможным определить период полувыведения соединения ZP2469. Терминальный период полувыведения из плазмы от 5 до 17 дней, как показано в примерах, свидетельствует о том, что дозирование ZP1848 один или два раза в неделю будет эффективным.
В свою очередь, это позволяет вводить аналоги GLP-2 в соответствии с настоящим изобретением, например, один или два раза в неделю. Альтернативно или дополнительно, схема дозирования аналогов GLP-2 согласно настоящему изобретению может включать множество или курс доз, разделенных во времени на 2 дня, 2,5 дня, 3 дня, 3,5 дня, 4 дня, 5 дней, 6 дней, 7 дней, 8 дней, 9 дней, 10 дней, 11 дней или 12 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения дозы разделены во времени на 3 дня, 3,5 дня, 4 дня, 5 дней, 6 дней, 7 дней или 8 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения дозы разделены во времени на 3 дня, 3,5 дня, 4 дня или 7 дней. Как будет понятно в данной области техники, время между дозами может изменяться до некоторой степени так, что любая и каждая доза не отделена точно одинаковым интервалом времени. Интервал часто будет установлен по усмотрению врача. Таким образом, дозы могут быть разделены во времени клинически приемлемым интервалом времени, например, от примерно 2 дней до примерно 10 дней или от примерно 3 или 4 дней до примерно 7 или 8 дней. Результаты клинического исследования, подтверждающие эти выводы, включены в приведенные ниже примеры.
Безотносительно к какой-либо теории, в настоящее время полагают, что неожиданный длительный период полувыведения аналогов GLP-2, который позволяет проводить дозирование один или два раза в неделю, может быть получен в результате комбинации образования подкожного депо и образования метаболитов, которые медленно высвобождаются из подкожного депо и которые также являются агонистическими по отношению к рецептору GLP-2. Авторы настоящего изобретения полагают, что подкожное депо образуется при введении аналогов GLP-2 в результате реакции между аналогами, т.е. лизиновым хвостом, и гиалуроновой кислотой в подкожном компартменте. Этот тип депо ранее не наблюдался для других соединений, имеющих лизиновый хвост, таких как ликсизенатид, период полувыведения которого составляет 2-4 часа.
Соответственно, согласно первому аспекту настоящего изобретения предложен аналог глюкагоноподобного пептида-2 (GLP-2) для применения в способе лечения и/или предотвращения нарушения, связанного с желудком и кишечником, у пациента-человека, причем указанный аналог GLP-2 представлен формулой:
1
1
2
2
R-Z-His-Gly-Glu-Gly-X5-Phe-Ser-Ser-Glu-Leu-X11-Thr-Ile-Leu-Asp-Ala-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-IIe-Ala-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-Z-R
в которой:
1
1-4
R представляет собой водород, C-алкил (например, метил), ацетил, формил, бензоил или трифторацетил;
Х5 представляет собой Ser или Thr;
X11 представляет собой Ala или Ser;
2
2
R представляет собой NH или OH; и
1
2
Z и Z независимо отсутствуют или представляют собой пептидную последовательность из 1-6 аминокислотных звеньев Lys;
или его фармацевтически приемлемой солью или производным; и
при этом указанный способ включает введение указанного аналога GLP-2 пациенту один или два раза в неделю.
В этом аспекте настоящего изобретения аналог глюкагоноподобного пептида-2 (GLP-2) можно применять для лечения и/или предотвращения нарушений, связанных с желудком и кишечником, таких как язвы, нарушения пищеварения, синдромы мальабсорбции, синдром короткой кишки, синдром «слепого мешка», воспалительное заболевание кишечника, спру-целиакия (например, вызванная глютен-индуцированной энтеропатией или целиакией), тропическая спру, гипогаммаглобулинемическая спру, энтерит, регионарный энтерит (болезнь Крона), язвенный колит, повреждение тонкого кишечника или синдром короткой кишки (СКК). Альтернативно или дополнительно, аналог глюкагоноподобного пептида-2 (GLP-2) можно применять для лечения и/или предотвращения нарушений, связанных с желудком и кишечником, таких как радиационный энтерит, инфекционный или постинфекционный энтерит или повреждение тонкого кишечника, вызванное токсичными или другими химиотерапевтическими агентами. В этом случае лечение с применением аналога GLP-2 необязательно можно комбинировать с одним или более видами противораковой терапии, и, следовательно, оно может включать введение пациенту одного или более химиотерапевтических агентов или лечение пациента лучевой терапией.
Согласно дополнительному аспекту настоящего изобретения предложен аналог глюкагоноподобного пептида-2 (GLP-2) для применения в способе лечения и/или предотвращения побочного эффекта химиотерапии или лучевой терапии у пациента-человека, причем указанный аналог GLP-2 представлен формулой:
1
1
2
2
R-Z-His-Gly-Glu-Gly-X5-Phe-Ser-Ser-Glu-Leu-X11-Thr-Ile-Leu-Asp-Ala-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-IIe-Ala-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-Z-R
в которой:
1
1-4
R представляет собой водород, C-алкил (например, метил), ацетил, формил, бензоил или трифторацетил;
Х5 представляет собой Ser или Thr;
X11 представляет собой Ala или Ser;
2
2
R представляет собой NH или OH; и
1
2
Z и Z независимо отсутствуют или представляют собой пептидную последовательность из 1-6 аминокислотных звеньев Lys;
или его фармацевтически приемлемой солью или производным; и
при этом указанный способ включает введение указанного аналога GLP-2 пациенту один или два раза в неделю.
Согласно дополнительному аспекту настоящего изобретения предложен аналог глюкагоноподобного пептида-2 (GLP-2) для применения в способе увеличения продольного роста кишечника у пациента-человека, причем указанный аналог GLP-2 представлен формулой:
1
1
2
2
R-Z-His-Gly-Glu-Gly-X5-Phe-Ser-Ser-Glu-Leu-X11-Thr-Ile-Leu-Asp-Ala-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-IIe-Ala-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-Z-R,
в которой:
1
1-4
R представляет собой водород, C-алкил (например, метил), ацетил, формил, бензоил или трифторацетил;
Х5 представляет собой Ser или Thr;
X11 представляет собой Ala или Ser;
2
2
R представляет собой NH или OH; и
1
2
Z и Z независимо отсутствуют или представляют собой пептидную последовательность из 1-6 аминокислотных звеньев Lys;
или его фармацевтически приемлемой солью или производным; и
при этом указанный способ включает введение указанного аналога GLP-2 пациенту один или два раза в неделю.
Согласно дополнительному аспекту настоящего изобретения предложен аналог глюкагоноподобного пептида-2 (GLP-2) для применения в способе лечения синдрома короткой кишки (СКК) у субъекта-человека, получающего схему парентерального питания (ПП), причем указанный способ включает:
(i) введение субъекту аналога GLP-2, представленного формулой:
1
1
2
2
R-Z-His-Gly-Glu-Gly-X5-Phe-Ser-Ser-Glu-Leu-X11-Thr-Ile-Leu-Asp-Ala-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-IIe-Ala-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-Z-R
в которой:
1
1-4
R представляет собой водород, C-алкил (например, метил), ацетил, формил, бензоил или трифторацетил;
Х5 представляет собой Ser или Thr;
X11 представляет собой Ala или Ser;
2
2
R представляет собой NH или OH; и
1
2
Z и Z независимо отсутствуют или представляют собой пептидную последовательность из 1-6 аминокислотных звеньев Lys;
или его фармацевтически приемлемой солью или производным; и
при этом указанный аналог GLP-2 вводят один или два раза в неделю в течение времени, достаточного для удлинения и улучшения функции тонкого кишечника субъекта;
(ii) после этапа (i), уменьшение частоты или объема схемы парентерального питания (ПП) в ответ на улучшение функции тонкого кишечника; и
(iii) необязательно повторение этапов (i) и (ii) в ответ на демонстрацию субъектом улучшенной функции с течением времени в результате дополнительного продольного роста тонкого кишечника.
Согласно дополнительному аспекту настоящего изобретения предложен способ лечения синдрома короткой кишки (СКК) у субъекта-человека, получающего схему парентерального питания (ПП), причем указанный способ включает:
(i) введение субъекту аналога GLP-2, представленного формулой:
1
1
2
2
R-Z-His-Gly-Glu-Gly-X5-Phe-Ser-Ser-Glu-Leu-X11-Thr-Ile-Leu-Asp-Ala-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-IIe-Ala-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-Z-R
в которой:
1
1-4
R представляет собой водород, C-алкил (например, метил), ацетил, формил, бензоил или трифторацетил;
Х5 представляет собой Ser или Thr;
X11 представляет собой Ala или Ser;
2
2
R представляет собой NH или OH; и
1
2
Z и Z независимо отсутствуют или представляют собой пептидную последовательность из 1-6 аминокислотных звеньев Lys;
или его фармацевтически приемлемой соли или производного; и
при этом указанный аналог GLP-2 вводят один или два раза в неделю в течение времени, достаточного для удлинения и дальнейшего улучшения функции тонкого кишечника субъекта;
(ii) после этапа (i), уменьшение частоты или объема схемы парентерального питания (ПП) в ответ на улучшение функции тонкого кишечника; и
(iii) необязательно повторение этапов (i) и (ii) в ответ на демонстрацию субъектом продолжающегося улучшения функции тонкого кишечника.
Например, период лечения, в течение которого аналог GLP-2 вводят субъекту, может составлять от 18 до 150 недель, например, от 18 до 100 недель или от 18 до 52 недель. Однако в других случаях, если СКК является хроническим заболеванием, пациентам может потребоваться лечение до конца жизни.
Применительно к настоящему изобретению термин «парентеральное питание» или «ПП» включает введение питательных веществ и/или жидкостей субъекту, получающему терапию GLP-2, в качестве средства обеспечения субъекта питательными веществами и/или жидкостями, в которых он нуждается, но которые не могут полностью всасываться из-за его состояния. Определение корректного количества или объема ПП для предоставления субъектам с СКК, которые получают терапию GLP-2, вызывает затруднение, поскольку, если объем ПП не скорректирован своевременно и надлежащим образом, пациенты могут испытывать перегрузку жидкостью, подвергаются риску дегидратации и могут не достигать оптимальных клинических ответов на терапию. Эта ситуация дополнительно осложняется тем, что объем ПП, требуемый субъекту, как правило, изменяется в течение курса терапии GLP-2 в зависимости от ответа субъекта на лечение. Как правило, оценка объема ПП, необходимого субъекту в ходе терапии GLP-2, зависит от того, как долго продолжается терапия, и от восприимчивости отдельных пациентов к ней. Принимая во внимание это изменение, первоначальную оценку объема ПП можно осуществлять в течение первых нескольких дней терапии GLP-2, а затем, как правило, следует еженедельная оценка в течение первого месяца, ежемесячная оценка в течение следующих 1-3 месяцев и после этого оценка каждые 3-6 месяцев до завершения лечения. Это важно, поскольку субъекты могут иметь быстрый начальный ответ на терапию GLP-2 с улучшением функции тонкого кишечника, например, даже до того, как наблюдается какое-либо увеличение длины кишечника. В свою очередь, это позволяет уменьшить объем ПП, чтобы избежать риска побочных эффектов, таких как перегрузка жидкостью.
Соответственно, в вышеупомянутом способе этап (ii) может включать этап (а) определения объема ПП, необходимого субъекту в данной точке лечения, (b) сравнения его с начальным объемом ПП, определенным в начале терапии с применением аналога GLP-2, и (c) уменьшения частоты или объема ПП, если субъект демонстрирует улучшенную функцию тонкого кишечника. Необязательно уменьшение частоты или объема парентерального питания (ПП) на этапе (ii) может быть выполнено с применением алгоритма, описанного ниже.
В качестве иллюстрации взаимосвязи между количеством парентерального питания, требуемого пациентам, и степенью улучшения функции кишечника, в настоящее время полагают, что увеличение длины тонкого кишечника на 40% приведет к улучшению функции или всасывающей способности тонкого кишечника по меньшей мере еще на 10%. Обычно терапия GLP-2 в соответствии с настоящим изобретением приводит к улучшению функции или всасывающей способности тонкого кишечника по меньшей мере на 10%, более предпочтительно по меньшей мере на 20%, более предпочтительно по меньшей мере на 30%, более предпочтительно по меньшей мере на 40% и наиболее предпочтительно по меньшей мере на 50%. Дополнительно или альтернативно, количество, на которое уменьшают парентеральное питание в течение курса терапии GLP-2, составляет по меньшей мере 10%, более предпочтительно по меньшей мере 20%, более предпочтительно по меньшей мере 30%, более предпочтительно по меньшей мере 40% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 50%. Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения уменьшение парентерального питания составляет по меньшей мере 20%.
Согласно дополнительному связанному аспекту настоящего изобретения предложено решение одной из проблем, с которыми сталкиваются пациенты и врачи, начиная терапию GLP-2, а именно соответствующей и индивидуальной корректировки объема парентерального питания (ПП), предоставляемого пациенту. Это важно поскольку, если объем ПП не скорректирован своевременно и надлежащим образом, пациенты могут испытывать перегрузку жидкостью, подвергаются риску дегидратации и могут не достигать оптимальных клинических ответов на терапию.
Например, в предшествующем исследовании фазы 3 лечения в течение 24 недель с применением аналога GLP-2, тедуглутида, была предпринята попытка уменьшить объем парентерального питания на 10% в месяц не ранее, чем на 4 неделе после начала лечения, если диурез увеличился по меньшей мере на 10% относительно начального уровня. Многие из пациентов в этом исследовании страдали от перегрузки жидкостью и перестали пить (Jeppesen et al. 2011, Gut 2011; 60: 902-914). В последующем 24-недельном исследовании фазы 3 с участием пациентов с СКК, которые получали тедуглутид подкожно (Jeppesen et al. 2012, Gastroenterology 2012; 143: 1473-1481), протокол допускал уменьшение объема парентерального питания на по меньшей мере 10%, но не более чем на 30%, через 2 недели лечения, при увеличении диуреза по меньшей мере на 10% относительно начального уровня. Однако в этом исследовании пациенты также страдали от перегрузки жидкостью, в частности, в начале лечения.
Следовательно, согласно этому аспекту настоящего изобретения предложена ранняя оценка измененных потребностей в жидкости ПП (например, в течение нескольких дней после начала терапии GLP-2) и предложены алгоритмы для корректировки объема ПП во время курса терапии GLP-2. Специалисты в данной области техники поймут, что этот подход с применением алгоритма для корректировки объема ПП обеспечивает индивидуальную корректировку объема ПП для каждого пациента. Этот аспект настоящего изобретения применим к видам терапии GLP-2 с применением аналогов GLP-2, описанных в настоящей заявке, или с применением аналогов GLP-2, известных в данной области техники, таких как тедуглутид.
Соответственно, согласно дополнительному аспекту настоящего изобретения предложен способ корректировки объема парентерального питания (ПП) у субъекта-человека, получающего некоторое количество или объем парентерального питания каждую неделю, причем указанный способ включает вычисление нового объема ПП с применением алгоритма, в котором объем ПП на неделю вычисляют путем вычитания семикратного абсолютного увеличения суточного объема мочи относительно начального объема, т.е. объема ПП в начале терапии GLP-2, из текущего недельного объема парентерального питания, чтобы обеспечить новый объем ПП для субъекта. Таким образом, новый объем ПП (недельный) для субъекта равен текущему объему ПП (недельному) минус 7 × абсолютное увеличение суточного объема мочи относительно начального объема.
Согласно дополнительному аспекту настоящего изобретения предложен способ определения объема парентерального питания (ПП) для субъекта-человека, получающего терапию GLP-2, причем указанный способ включает:
необязательно определение начального суточного объема мочи в начале терапии GLP-2;
вычисление нового объема ПП (недельного) для субъекта на предстоящую неделю на основании текущего объема ПП (недельного) и суточного объема мочи (например, при посещении врача) с применением алгоритма, в котором новый объем ПП (недельного) для субъекта равен текущему объему ПП (недельному) минус 7 × абсолютное увеличение суточного объема мочи относительно начального объема.
В некоторых случаях этап вычисления осуществляют, если суточный объем мочи по меньшей мере на 10% превышает начальный объем мочи. Этот способ может включать дополнительный этап определения текущего объема ПП (недельного) для применения в вычислении нового объема ПП с применением описанного алгоритма.
Следует понимать, что способ может дополнительно включать этап введения объема ПП субъекту. Кроме того, способ можно повторять, например, каждую неделю, месяц или при посещении врача, что позволяет уменьшить объем ПП, если субъект демонстрирует продолжающееся улучшение функции тонкого кишечника. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения корректировка объема ПП приводит к тому, что объем мочи составляет по меньшей мере 800 мл/день (24 часа), например, по меньшей мере 1000 мл/день (24 часа) или более. Конкретное преимущество этого способа заключается в том, что эффекты лечения и последующую корректировку объема ПП можно осуществлять на очень ранних этапах терапии GLP-2, например, в первые несколько дней лечения, что значительно быстрее по сравнению с подходами предшествующего уровня техники. Например, в соответствии с настоящим изобретением субъекты могут проходить фазу оптимизации в течение 0-4 недель с последующей фазой стабилизации в течение 2-4 недель. Алгоритм уменьшения объема ПП может основываться на изменениях объема мочи, измеряемого  в течение 48 часов.
В некоторых вариантах реализации этого аспекта настоящего изобретения терапия GLP-2 может включать введение аналога GLP-2, представленного формулой, описанной в настоящей заявке, в частности, с применением примеров этих аналогов GLP-2. Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения аналог GLP-2 представляет собой ZP1848.
Предпочтительно способ включает первоначальные этапы определения начального объема и/или определения суточного объема мочи. Некоторые или все этапы способа можно повторять в течение курса терапии GLP-2, получаемого субъектом. Предпочтительно первую оценку и определение изменений при корректировках объема ПП выполняют на ранних этапах терапии GLP-2, например, через несколько дней после начала терапии GLP-2, например, через 2, 3, 4, 5, 6, 7 дней после начала терапии GLP-2. Предпочтительно промежуток времени между повторным тестированием для определения изменений при корректировках объема ПП первоначально составляет неделю, а затем примерно каждые 1-3 месяца. Например, согласно одному варианту реализации настоящего изобретения способ можно применять через 1, 2, 4, 8 и 12 недель после начала лечения с применением аналога GLP-2, корректируя объем ПП в ответ на эффекты лечения. Вводимый еженедельно объем ПП следует контролировать и корректировать в течение всего курса лечения с применением аналога GLP-2 (например, глепаглутида), чтобы избежать перегрузки жидкостью. Обычно, поскольку всасывающая способность кишечника увеличивается после лечения с применением аналога GLP-2, как правило, в результате удлинения или утолщения тонкого кишечника, объем ПП может быть снижен, чтобы избежать перегрузки жидкостью и улучшить потребности пациента в лечении.
Другие состояния, которые можно лечить с применением аналогов GLP-2 согласно настоящему изобретению или в отношении которых аналоги GLP-2 можно применять в профилактических или терапевтических целях, включают радиационный энтерит, инфекционный или постинфекционный энтерит и повреждение тонкого кишечника, вызванное токсическими или другими химиотерапевтическими агентами. Это может потребовать введения аналога GLP-2 до, одновременно или после курса химиотерапии или лучевой терапии, чтобы уменьшить побочные эффекты химиотерапии, такие как диарея, спазмы в животе и рвота, и уменьшить последующее структурное и функциональное повреждение эпителия кишечника в результате химиотерапии или лучевой терапии. Предпочтительно введение аналога GLP-2 в соответствии с настоящим изобретением начинают за 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 дней до начала цикла химиотерапии или облучения. Предпочтительно введение аналога GLP-2 в соответствии с настоящим изобретением начинают за день до начала или в день начала лечения с применением цикла химиотерапии или облучения, и один или два раза в неделю после этого.
Согласно дополнительному аспекту настоящего изобретения предложено применение аналога глюкагоноподобного пептида-2 (GLP-2) в изготовлении лекарственного средства для лечения и/или предотвращения нарушения, связанного с желудком и кишечником, у пациента-человека, причем указанный аналог GLP-2 представлен формулой:
1
1
2
2
R-Z-His-Gly-Glu-Gly-X5-Phe-Ser-Ser-Glu-Leu-X11-Thr-Ile-Leu-Asp-Ala-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-IIe-Ala-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-Z-R
в которой:
1
1-4
R представляет собой водород, C-алкил (например, метил), ацетил, формил, бензоил или трифторацетил;
Х5 представляет собой Ser или Thr;
X11 представляет собой Ala или Ser;
2
2
R представляет собой NH или OH; и
1
2
Z и Z независимо отсутствуют или представляют собой пептидную последовательность из 1-6 аминокислотных звеньев Lys;
или его фармацевтически приемлемой соли или производного; и
при этом указанный способ включает введение указанного аналога GLP-2 пациенту один или два раза в неделю.
Согласно дополнительному аспекту настоящего изобретения предложено применение аналога глюкагоноподобного пептида-2 (GLP-2) в изготовлении лекарственного средства для лечения и/или предотвращения побочного эффекта химиотерапии или лучевой терапии у пациента-человека, причем указанный аналог GLP-2 представлен формулой:
1
1
2
2
R-Z-His-Gly-Glu-Gly-X5-Phe-Ser-Ser-Glu-Leu-X11-Thr-Ile-Leu-Asp-Ala-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-IIe-Ala-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-Z-R
в которой:
1
1-4
R представляет собой водород, C-алкил (например, метил), ацетил, формил, бензоил или трифторацетил;
Х5 представляет собой Ser или Thr;
X11 представляет собой Ala или Ser;
2
2
R представляет собой NH или OH; и
1
2
Z и Z независимо отсутствуют или представляют собой пептидную последовательность из 1-6 аминокислотных звеньев Lys;
или его фармацевтически приемлемой соли или производного; и
при этом указанный способ включает введение указанного аналога GLP-2 пациенту один или два раза в неделю.
Согласно дополнительному аспекту настоящего изобретения предложен способ лечения и/или предотвращения нарушения, связанного с желудком и кишечником, у пациента-человека, причем указанный способ включает введение пациенту терапевтически эффективного количества аналога глюкагоноподобного пептида-2 (GLP-2), представленного формулой:
1
1
2
2
R-Z-His-Gly-Glu-Gly-X5-Phe-Ser-Ser-Glu-Leu-X11-Thr-Ile-Leu-Asp-Ala-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-IIe-Ala-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-Z-R
в которой:
1
1-4
R представляет собой водород, C-алкил (например, метил), ацетил, формил, бензоил или трифторацетил;
Х5 представляет собой Ser или Thr;
X11 представляет собой Ala или Ser;
2
2
R представляет собой NH или OH; и
1
2
Z и Z независимо отсутствуют или представляют собой пептидную последовательность из 1-6 аминокислотных звеньев Lys;
или его фармацевтически приемлемой соли или производного; и
при этом указанный способ включает введение указанного аналога GLP-2 пациенту один или два раза в неделю.
Согласно дополнительному аспекту настоящего изобретения предложен способ лечения и/или предотвращения побочного эффекта химиотерапии или лучевой терапии у пациента-человека, причем указанный способ включает введение пациенту терапевтически эффективного количества аналога глюкагоноподобного пептида-2 (GLP-2), представленного формулой:
1
1
2
2
R-Z-His-Gly-Glu-Gly-X5-Phe-Ser-Ser-Glu-Leu-X11-Thr-Ile-Leu-Asp-Ala-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-IIe-Ala-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-Z-R
в которой:
1
1-4
R представляет собой водород, C-алкил (например, метил), ацетил, формил, бензоил или трифторацетил;
Х5 представляет собой Ser или Thr;
X11 представляет собой Ala или Ser;
2
2
R представляет собой NH или OH; и
1
2
Z и Z независимо отсутствуют или представляют собой пептидную последовательность из 1-6 аминокислотных звеньев Lys;
или его фармацевтически приемлемой соли или производного; и
при этом указанный способ включает введение указанного аналога GLP-2 пациенту один или два раза в неделю.
Согласно дополнительному аспекту настоящего изобретения предложено применение аналога глюкагоноподобного пептида-2 (GLP-2) в изготовлении лекарственного средства для увеличения продольного роста кишечника у пациента-человека, причем указанный аналог глюкагоноподобного пептида-2 (GLP-2) представлен формулой:
1
1
2
2
R-Z-His-Gly-Glu-Gly-X5-Phe-Ser-Ser-Glu-Leu-X11-Thr-Ile-Leu-Asp-Ala-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-IIe-Ala-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-Z-R
в которой:
1
1-4
R представляет собой водород, C-алкил (например, метил), ацетил, формил, бензоил или трифторацетил;
Х5 представляет собой Ser или Thr;
X11 представляет собой Ala или Ser;
2
2
R представляет собой NH или OH; и
1
2
Z и Z независимо отсутствуют или представляют собой пептидную последовательность из 1-6 аминокислотных звеньев Lys;
или его фармацевтически приемлемой соли или производного; и
при этом указанный способ включает введение указанного аналога GLP-2 пациенту один или два раза в неделю.
Согласно дополнительному аспекту настоящего изобретения предложен способ увеличения продольного роста кишечника у пациента-человека, причем указанный способ включает введение пациенту терапевтически эффективного количества аналога глюкагоноподобного пептида-2 (GLP-2), представленного формулой:
1
1
2
2
R-Z-His-Gly-Glu-Gly-X5-Phe-Ser-Ser-Glu-Leu-X11-Thr-Ile-Leu-Asp-Ala-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-IIe-Ala-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-Z-R
в которой:
1
1-4
R представляет собой водород, C-алкил (например, метил), ацетил, формил, бензоил или трифторацетил;
Х5 представляет собой Ser или Thr;
X11 представляет собой Ala или Ser;
2
2
R представляет собой NH или OH; и
1
2
Z и Z независимо отсутствуют или представляют собой пептидную последовательность из 1-6 аминокислотных звеньев Lys;
или его фармацевтически приемлемой соли или производного; и
при этом указанный способ включает введение указанного аналога GLP-2 пациенту один или два раза в неделю.
Во всех аспектах настоящего изобретения способ введения аналога глюкагоноподобного пептида-2 (GLP-2) необязательно включает введение пациенту множества доз аналога GLP-2, причем дозы разделены во времени одной неделей или половину недели. В некоторых случаях желательным может быть разделение общей дозы на множество (например, две или три) отдельных доз, например, для введения в пространственно разделенных местах инъекций, например, в местах инъекций, расстояние между которыми составляет по меньшей мере 5 см.
Предпочтительно дозы аналогов GLP-2, применяемые в соответствии с настоящим изобретением, находятся в диапазоне от 0,5 мг до 25 мг включительно на пациента один или два раза в неделю, необязательно от 1 мг до 20 мг включительно на пациента один или два раза в неделю, необязательно от 1 мг до 10 мг включительно на пациента один или два раза в неделю, необязательно от 2 мг до 7 мг включительно на пациента один или два раза в неделю, необязательно от 5 мг до 7 мг включительно на пациента один или два раза в неделю или необязательно от 2 мг до 5 мг включительно на пациента один или два раза в неделю. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения доза аналогов GLP-2, применяемых в соответствии с настоящим изобретением, составляет 10 мг включительно на пациента один или два раза в неделю. В ходе лечения дозы, принимаемые пациентом, могут быть как одинаковыми, так и разными в соответствии с инструкциями врача.
1
2
Предпочтительно аналог глюкагоноподобного пептида-2 (GLP-2) вводят пациентам путем инъекции, наиболее типично путем подкожной инъекции или внутримышечной инъекции. Согласно некоторым предпочтительным вариантам реализации настоящего изобретения аналог GLP-2 можно вводить с применением шприц-ручки, который позволяет пациентам самостоятельно вводить аналог. Согласно некоторым аспектам введение аналога GLP-2 вызывает образование подкожного депо, из которого высвобождается аналог GLP-2 или его метаболиты. Безотносительно к какому-либо конкретному объяснению, подкожное депо может образовываться за счет взаимодействия аналогов GLP-2, вводимых в соответствии с настоящим изобретением, в частности, если аналоги содержат лизиновый хвост (т.е. группу Z и/или группу Z), в результате реакции между аналогами и гиалуроновой кислотой в подкожном компартменте.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения в приведенной выше формуле X5 представляет собой Thr и/или X11 представляет собой Ala. Примеры этих аналогов глюкагоноподобного пептида-2 (GLP-2) включают:
2
ZP1848 H-HGEGTFSSELATILDALAARDFIAWLIATKITDKKKKKK-NH (SEQ ID NO: 1)
ZP2949 H-HGEGTFSSELATILDALAARDFIAWLIATKITDKKK-OH (SEQ ID NO: 2)
ZP2711 H-HGEGTFSSELATILDALAARDFIAWLIATKITDKK-OH (SEQ ID NO: 3)
ZP2469 H-HGEGTFSSELATILDALAARDFIAWLIATKITDK-OH (SEQ ID NO: 4)
2
ZP1857 H-HGEGTFSSELATILDALAARDFIAWLIATKITD-NH (SEQ ID NO: 5)
ZP2530 H-HGEGTFSSELATILDALAARDFIAWLIATKITD-OH (SEQ ID NO: 6).
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения в приведенной выше формуле X5 представляет собой Ser и/или X11 представляет собой Ser. Примеры этих аналогов глюкагоноподобного пептида-2 (GLP-2) включают:
2
ZP1846 H-HGEGSFSSELSTILDALAARDFIAWLIATKITDKKKKKK-NH (SEQ ID NO: 7)
2
ZP1855 H-HGEGSFSSELSTILDALAARDFIAWLIATKITD-NH (SEQ ID NO: 8)
ZP2242 H-HGEGSFSSELSTILDALAARDFIAWLIATKITDK-OH (SEQ ID NO: 9).
Варианты реализации настоящего изобретения будут далее описаны с помощью примера и не являются ограничивающими. Однако различные дополнительные аспекты и варианты реализации настоящего изобретения будут очевидны для специалистов в данной области техники с учетом настоящего описания.
В настоящей заявке «и/или» следует рассматривать как конкретное описание каждого из двух указанных признаков или компонентов, включая другой или без него. Например, «A и/или B» следует рассматривать как конкретное описание каждого из (i) A, (ii) B и (iii) A и B, как если бы каждый из них был указан в настоящей заявке по отдельности.
Если контекст не требует иного, описания и определения признаков, изложенных выше, не ограничиваются каким-либо конкретным аспектом или вариантом реализации настоящего изобретения и в равной степени применимы ко всем аспектам и вариантам реализации, которые описаны.
Подробное описание изобретения
Определения
Если не указано иное, следующие определения предоставлены для конкретных терминов, которые используются в приведенном выше письменном описании.
Во всем описании и формуле изобретения для природных аминокислот используются обычные однобуквенные и трехбуквенные коды. Все аминокислотные остатки в пептидах согласно настоящему изобретению предпочтительно имеют L-конфигурацию, однако аминокислоты с D-конфигурацией также могут присутствовать.
in vivo
Предпочтительные соединения согласно настоящему изобретению обладают по меньшей мере одним видом биологической активности GLP-2, в частности, вызывают рост кишечника. Это можно оценить в анализах в условиях , например, как описано в примерах, в которых массу кишечника или его части определяют после того, как испытываемое животное было обработано или подвергнуто воздействию аналога GLP-2.
1
4
Аналоги GLP-2 согласно настоящему изобретению содержат одну или более замен, делеций, инверсий или добавлений аминокислот по сравнению с нативным GLP-2 и как определено выше. Это определение также включает синонимические термины «миметики GLP-2» и/или «агонисты GLP-2». Кроме того, аналог согласно настоящему изобретению может дополнительно содержать химическую модификацию одной или более из боковых групп его аминокислот, α-атомов углерода, концевой аминогруппы или концевой карбоксильной группы. Химическая модификация включает, но не ограничивается ими, добавление химических фрагментов, создание новых связей и удаление химических фрагментов. Модификации в боковых группах аминокислот включают, но не ограничиваются ими, ацилирование ε-аминогрупп лизина, N-алкилирование аргинина, гистидина или лизина, алкилирование карбоксильных групп глутаминовой кислоты или аспарагиновой кислоты и дезамидирование глутамина или аспарагина. Модификации концевой аминогруппы включают но не ограничиваются ими, дезаминирование, N-низший алкил, N-ди-низший алкил и N-ацильные модификации. Модификации концевой карбоксильной группы включают, но не ограничиваются ими, амидирование, такие модификации как низший алкиламид, диалкиламид и сложный эфир низшего алкила. Предпочтительно в настоящей заявке низший алкил представляет собой C-C алкил. Кроме того, одна или более боковых групп или концевых групп могут быть защищены с помощью защитных групп, известных обычному специалисту по химии пептидов. α-Углерод аминокислоты может быть моно- или диметилированным.
+
3
4
3
4
3
1-6
2-6
Следует понимать, что пептиды согласно настоящему изобретению также могут быть предложены в форме соли или другого производного. Соли включают фармацевтически приемлемые соли, такие как кислотно-аддитивные соли и основные соли. Примеры кислотно-аддитивных солей включают гидрохлоридные соли, цитратные соли и ацетатные соли. Примеры основных солей включают соли, в которых катион выбран из щелочных металлов, таких как натрий и калий, щелочноземельных металлов, таких как кальций, и ионов аммония N (R)(R), где R и R независимо обозначают необязательно замещенный C-алкил, необязательно замещенный C-алкенил, необязательно замещенный арил или необязательно замещенный гетероарил. Другие примеры фармацевтически приемлемых солей описаны в «Remington's Pharmaceutical Sciences»,17 изд. под ред. Alfonso R. Gennaro (Ed.), Mark Publishing Company, Easton, PA, U.S.A., 1985 и более поздних изданиях, а также в Encyclopaedia of Pharmaceutical Technology.
2+
2+
in vivo
in vivo
in vitro
in situ
in vivo
Другие производные аналогов GLP-2 согласно настоящему изобретению включают координационные комплексы с ионами металлов, такими как Mn и Zn, сложные эфиры, такие как гидролизуемые в условиях  сложные эфиры, свободные кислоты или основания, гидраты, пролекарства или липиды. Сложные эфиры могут образовываться между гидроксильными или карбоксильными группами, присутствующими в соединении, и подходящей карбоксильной кислотой или спиртовым реактивным партнером, используя методики, хорошо известные в данной области техники. Производные в виде пролекарств соединений могут быть превращены в одно из исходных соединений в условиях  или в условиях . Как правило, в пролекарственной форме соединения по меньшей мере один вид биологической активности соединения будет снижен и может быть активирован путем превращения пролекарства с высвобождением соединения или его метаболита. Примеры пролекарств включают применение защитных групп, которые могут быть удалены  с высвобождением активного соединения или служат для ингибирования клиренса лекарственного средства в условиях .
1
2
1
2
Z и Z независимо присутствуют и/или отсутствуют или представляют собой пептидную последовательность из 1-6 аминокислотных звеньев Lys, т.е. 1, 2, 3, 4, 5 или 6 остатков Lys. Остатки Lys могут иметь D- или L-конфигурацию, однако имеют L-конфигурацию. Особенно предпочтительные последовательности Z представляют собой последовательности из четырех, пяти или шести последовательных остатков лизина и, в частности, шести последовательных остатков лизина. Примерные последовательности Z представлены в WO 01/04156. В определенных вариантах реализации Z отсутствует. В таких случаях Z может либо присутствовать, либо отсутствовать.
Фармацевтические композиции и введение
Аналоги GLP-2 согласно настоящему изобретению или их соли, или производные могут быть изготовлены в виде фармацевтических композиций, полученных для хранения или введения, которые содержат терапевтически эффективное количество пептида GLP-2 согласно настоящему изобретению или его соль, или производное в фармацевтически приемлемом носителе. В соответствии со схемами дозирования согласно настоящему изобретению аналоги GLP-2 вводят пациентам, например пациенту-человеку, один или два раза в неделю. Таким образом, курс введения в соответствии с настоящим изобретением может включать введение пациенту курса доз, разделенных во времени на 2 дня, 2,5 дня, 3 дня, 3,5 дня, 4 дня, 5 дней, 6 дней, 7 дней, 8 дней, 9 дней, 10 дней, 11 дней, 12 дней, 13 дней или 14 дней, и более предпочтительно разделенных во времени на 3 дня, 4 дня, 5 дней, 6 дней, 7 дней или 8 дней. В некоторых конкретных ситуациях настоящее изобретение может включать введение пациенту фиксированной дозы, например, 10 мг один или два раза в неделю.
Терапевтически эффективное количество соединения согласно настоящему изобретению будет зависеть от пути введения, типа млекопитающего, которого лечат, и физических характеристик конкретного рассматриваемого млекопитающего. Эти факторы и их взаимосвязь с определением такого количества хорошо известны опытным специалистам в области медицины. Это количество и способ введения могут быть адаптированы для достижения оптимальной эффективности так, чтобы доставить пептид в толстый кишечник, но будут зависеть от таких факторов как масса, рацион, сопутствующая лекарственная терапия и другие факторы, хорошо известные специалистам в области медицины.
Согласно настоящему изобретению предложена фармацевтическая композиция, в которой аналог GLP-2, или его соль, присутствует в количестве, эффективном для лечения или предотвращения нарушений, связанных с желудком и кишечником, или для индукции продольного роста кишечника.
Фармацевтически приемлемые соли соединений согласно настоящему изобретению, содержащих кислотный фрагмент, могут быть получены с применением органических и неорганических оснований. Подходящие соли, образованные с основаниями, включают соли металлов, такие как соли щелочных металлов или щелочноземельных металлов, например, соли натрия, калия или магния; соли аммиака и соли органических аминов, например, соли, образованные с морфолином, тиоморфолином, пиперидином, пирролидином, низшим моно-, ди- или триалкиламином (например, этил-трет-бутил, диэтил-, диизопропил-, триэтил-, трибутил- или диметилпропиламином) или низшим моно-, ди- или тригидроксиалкиламином (например, моно-, ди- или триэтаноламином). Также могут образовываться внутренние соли. Аналогичным образом, если соединение согласно настоящему изобретению содержит основный фрагмент, соли могут быть образованы с применением органических и неорганических кислот. Например, соли могут быть образованы из следующих кислот: уксусная, пропионовая, молочная, лимонная, винная, янтарная, фумаровая, малеиновая, малоновая, миндальная, яблочная, фталевая, соляная, бромистоводородная, фосфорная, азотная, серная, метансульфоновая, нафталинсульфоновая, бензолсульфоновая, толуолсульфоновая и камфорсульфоновая, а также других известных фармацевтически приемлемых кислот. Соли присоединения аминокислоты также могут быть образованы с аминокислотами, такими как лизин, глицин или фенилаланин.
Специалист в области медицины поймет, что «терапевтически эффективное количество» пептидов или фармацевтических композиций согласно настоящему изобретению будет варьироваться в зависимости от возраста, массы и вида млекопитающего, которого лечат, конкретных применяемых соединений, конкретного способа введения и целевых эффектов и терапевтического показания. Поскольку эти факторы и их взаимосвязь с определением этого количества хорошо известны в медицине, определение терапевтически эффективных уровней дозировки, количества, необходимого для достижения целевого результата предотвращения и/или лечения заболеваний, связанных с кишечником и желудком, описанных в настоящей заявке, а также других медицинских показаний, описанных в настоящей заявке, для индукции продольного роста кишечника, будут в пределах компетенции специалиста в данной области техники.
В настоящей заявке термин «терапевтически эффективное количество» означает количество, которое уменьшает симптомы конкретного состояния или патологии и которое предпочтительно нормализует физиологические ответы у индивидуума, страдающего состоянием или патологией. Уменьшение симптомов или нормализация физиологических ответов могут быть определены с применением обычных способов в данной области техники и могут изменяться в зависимости от конкретного состояния или патологии. Согласно одному аспекту терапевтически эффективное количество одного или более аналогов GLP-2 или фармацевтической композиции, содержащей один или более аналогов GLP-2, представляет собой количество, которое восстанавливает измеримый физиологический параметр до по существу сходного значения (предпочтительно в пределах +30%, более предпочтительно в пределах +20% и еще более предпочтительно в пределах 10% от значения) параметра у индивидуума, не страдающего состоянием или патологией.
Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения введение соединений или фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению начинают при более низких уровнях дозировки, причем уровни дозировки увеличивают до тех пор, пока не будет достигнут целевой эффект предотвращения/лечения соответствующих медицинских показаний, таких как заболевания, связанные с кишечником и желудком, или до тех пор, пока не будет достигнуто увеличение продольного роста кишечника. Это будет определять терапевтически эффективное количество. Вне зависимости от применения по отдельности или в составе фармацевтической композиции, дозы аналогов GLP-2, применяемых в соответствии с настоящим изобретением, обычно находятся в диапазоне от 0,5 мг до 25 мг включительно на пациента один или два раза в неделю, необязательно от 1 мг до 20 мг включительно на пациента один или два раза в неделю, необязательно от 1 мг до 10 мг включительно на пациента один или два раза в неделю, необязательно от 2 мг до 7 мг включительно на пациента один или два раза в неделю, необязательно от 5 мг до 7 мг включительно на пациента один раз или два раза в неделю или необязательно от 2 до 5 мг включительно на пациента один или два раза в неделю. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения терапевтически эффективное количество аналогов GLP-2, применяемых в соответствии с настоящим изобретением, составляет примерно 10 мг на пациента один или два раза в неделю. Однако специалист в данной области техники сможет скорректировать эти дозы в случае, если выбрана альтернативная схема дозирования в соответствии с настоящим изобретением.
В аспектах настоящего изобретения, относящихся к достижению увеличенного продольного роста кишечника, предпочтительно лечение с применением аналогов GLP-2 согласно настоящему изобретению увеличивает рост кишечника по меньшей мере на 30% по сравнению с контролем, более предпочтительно по меньшей мере на 40% по сравнению с контролем и наиболее предпочтительно по меньшей мере на 50% по сравнению с контролем. В целом предпочтительно, чтобы увеличение продольного роста сопровождалось увеличением всасывающей способности во время лечения и до некоторой степени даже после прекращения лечения. При лечении пациента-человека, который нуждается в увеличении продольного роста кишечника, таких как пациенты с синдромом короткой кишки (СКК), лечение обычно длится по меньшей мере 1-3 лет и может необязательно включать лечение один или два раза в неделю или в соответствии с другими схемами лечения согласно настоящему изобретению, описанными в настоящей заявке.
Класс пациентов-людей, страдающих СКК, включает пациентов, страдающих СКК-синдромом кишечной недостаточности (intestinal failure) (СКК-СКН), и пациентов, состояние которых является промежуточным между СКК-кишечной недостаточностью (СКК-КН) и СКК-синдромом кишечной недостаточности (СКК-СКН). В некоторых случаях пациентов, страдающих СКК-синдромом кишечной недостаточности (СКК-СКН), также называют СКК-ПП, если они зависят от парентерального питания, а пациентов, страдающих СКК-кишечной недостаточностью (СКК-КН), также называют СКК без ПП, если они не зависят от парентерального питания.
Спектр типов пациентов с СКК рассматривается в Jeppensen, Journal of Parenteral and Enteral Nutrition, 38(1), 8S-13S, Май 2014, doi: 10.1177/0148607114520994. Дальнейшее разделение типов пациентов с СКК может быть сделано в соответствии с принципами, описанными в Schwartz et al., Clinical and Translational Gastroenterology (2016) 7, e142; doi:10.1038/ctg.2015.69. Оно позволяет разделить пациентов с СКК на пациентов с ранним ответом и поздним/медленным ответом. Безотносительно к какой-либо теории, авторы настоящего изобретения полагают, что пациенты с ранним ответом представляют собой тех, кто демонстрирует ранний эффект на лечение с применением аналога GLP-2, вызванный, помимо прочих эффектов, увеличением ширины/диаметра тонкого кишечника, в то время как пациенты с поздним или медленным ответом представляют собой пациентов, которые в основном или в первую очередь получают пользу от лечения с применением аналога GLP-2 в результате увеличения длины тонкого кишечника. Определение того, относится ли субъект к пациентам с ранним ответом или поздним ответом, можно применять для определения продолжительности схемы лечения с применением аналога GLP-2, сроков любого клинического решения об уменьшении парентерального питания и интервала между тестами, чтобы определить, возможно ли уменьшение парентерального питания. Соответственно, согласно одному варианту реализации настоящего изобретения пациент имеет поздний или медленный ответ. Длина тонкого кишечника может быть измерена, например, с помощью КТ-сканирования (компьютерной томографии), МРТ (магнитно-резонансной томографии), гистологических, лапароскопических или других измерений или методик, известных в данной области техники.
Согласно дополнительному аспекту настоящего изобретения предложен аналог глюкагоноподобного пептида-2 (GLP-2) для применения в способе лечения и/или предотвращения СКК-кишечной недостаточности (СКК-КН) у пациента, причем указанное лечение предотвращает или задерживает развитие СКК-синдрома кишечной недостаточности (СКК-СКН), при этом указанный аналог GLP-2 представлен формулой:
1
1
2
2
R-Z-His-Gly-Glu-Gly-X5-Phe-Ser-Ser-Glu-Leu-X11-Thr-Ile-Leu-Asp-Ala-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-IIe-Ala-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-Z-R
в которой:
1
1-4
R представляет собой водород, C-алкил (например, метил), ацетил, формил, бензоил или трифторацетил; и
Х5 представляет собой Ser или Thr;
X11 представляет собой Ala или Ser;
2
2
R представляет собой NH или OH; и
1
2
Z и Z независимо отсутствуют или представляют собой пептидную последовательность из 1-6 аминокислотных звеньев Lys;
или его фармацевтически приемлемой солью или производным.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения способ может включать введение аналога GLP-2 пациенту один или два раза в неделю и/или в соответствии с любой из других схем лечения, описанных в настоящей заявке.
Согласно другим связанным аспектам настоящего изобретения предложено применение аналога GLP-2, представленного формулой:
1
1
2
2
R-Z-His-Gly-Glu-Gly-X5-Phe-Ser-Ser-Glu-Leu-X11-Thr-Ile-Leu-Asp-Ala-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-IIe-Ala-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-Z-R
в которой:
1
1-4
R представляет собой водород, C-алкил (например, метил), ацетил, формил, бензоил или трифторацетил;
Х5 представляет собой Ser или Thr;
X11 представляет собой Ala или Ser;
2
2
R представляет собой NH или OH; и
1
2
Z и Z независимо отсутствуют или представляют собой пептидную последовательность из 1-6 аминокислотных звеньев Lys;
или его фармацевтически приемлемой соли или производного в изготовлении лекарственного средства для лечения и/или предотвращения для пациента, страдающего СКК-кишечной недостаточностью (СКК-КН), причем указанное лечение предотвращает или задерживает развитие СКК-синдрома кишечной недостаточности (СКК-СКН).
Согласно другим связанным аспектам настоящего изобретения предложен способ лечения и/или предотвращения для пациента, страдающего СКК-кишечной недостаточностью, причем указанный способ предотвращает или задерживает развитие СКК-синдрома кишечной недостаточности, при этом указанный аналог GLP-2 представлен формулой:
1
1
2
2
R-Z-His-Gly-Glu-Gly-X5-Phe-Ser-Ser-Glu-Leu-X11-Thr-Ile-Leu-Asp-Ala-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-IIe-Ala-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-Z-R
в которой:
1
1-4
R представляет собой водород, C-алкил (например, метил), ацетил, формил, бензоил или трифторацетил;
Х5 представляет собой Ser или Thr;
X11 представляет собой Ala или Ser;
2
2
R представляет собой NH или OH; и
1
2
Z и Z независимо отсутствуют или представляют собой пептидную последовательность из 1-6 аминокислотных звеньев Lys;
или его фармацевтически приемлемой солью или производным.
Для терапевтического применения выбранный аналог GLP-2 изготавливают с носителем, который является фармацевтически приемлемым и подходит для доставки пептида с помощью выбранного пути введения. Для цели настоящего изобретения периферические парентеральные пути включают внутривенный, внутримышечный, подкожный и внутрибрюшинный пути введения. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения путь введения представляет собой подкожный путь или подкожное введение. Фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению содержит аналог GLP-2 согласно настоящему изобретению или его соль, или производное и фармацевтически приемлемый носитель. Подходящие фармацевтически приемлемые носители включают те, которые обычно применяются с лекарственными средствами на основе пептидов, такие как разбавители, вспомогательные вещества и тому подобное. Фармацевтически приемлемые носители для терапевтического применения хорошо известны в области фармацевтики и описаны, например, в Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro edit., 1985). Например, можно применять стерильный солевой раствор и забуференный фосфатом солевой раствор при незначительно кислом или физиологическом pH. pH-буферные агенты могут представлять собой фосфат, цитрат, ацетат, трис(гидроксиметил)аминометан (TRIS), N-трис(гидроксиметил)метил-3-аминопропансульфоновую кислоту (TAPS), бикарбонат аммония, диэтаноламин, гистидин, который является предпочтительным буфером, аргинин, лизин или ацетат или их смеси. Предпочтительные диапазоны буферов включают рН 4-8, рН 6,5-8, более предпочтительно рН 7-7,5. В фармацевтической композиции могут быть предусмотрены консерванты, такие как пара-, мета- и орто-крезол, метил- и пропилпарабен, фенол, бензиловый спирт, бензоат натрия, бензойная кислота, бензилбензоат, сорбиновая кислота, пропановая кислота, сложные эфиры п-гидроксибензойной кислоты. В фармацевтической композиции могут быть предусмотрены стабилизаторы, предотвращающие окисление, дезамидирование, изомеризацию, рацемизацию, циклизацию, гидролиз пептидов, такие как, например, аскорбиновая кислота, метионин, триптофан, ЭДТА, аспарагин, лизин, аргинин, глутамин и глицин. В фармацевтической композиции могут быть предусмотрены стабилизаторы, предотвращающие агрегацию, фибрилляцию и осаждение, такие как додецилсульфат натрия, полиэтиленгликоль, карбоксиметилцеллюлоза, циклодекстрин. В фармацевтической композиции могут быть предусмотрены органические модификаторы для солюбилизации или предотвращения агрегации, такие как этанол, уксусная кислота или ацетат и их соли. В фармацевтической композиции могут быть предусмотрены вещества для поддержания изотоничности, такие как соли, например хлорид натрия, или наиболее предпочтительно углеводы, например, декстроза, маннит, лактоза, трегалоза, сахароза или их смеси.
В фармацевтической композиции могут быть предусмотрены детергенты, такие как Tween 20, Tween 80, ДСН, полоксамеры, например, Pluronic F-68, Pluronic F-127. В фармацевтической композиции могут быть предусмотрены красители и даже ароматизаторы. Согласно другому варианту реализации предложена фармацевтически приемлемая кислотно-аддитивная соль аналога пептида GLP-2. Можно применять суспендирующие агенты.
Органические модификаторы, такие как этанол, трет-бутанол, 2-пропанол, этанол, глицерин, полиэтиленгликоль, могут быть предусмотрены в фармацевтической композиции для лиофилизации лиофилизированного продукта. Наполняющие агенты и вещества для поддержания изотоничности, такие как соль, например, хлорид натрия, углеводы, например, декстроза, маннит, лактоза, трегалоза, сахароза или их смеси, аминокислоты, например, глицин, глутамат, или вспомогательные вещества, такие как цистеин, лецитин или сывороточный альбумин человека, или их смеси могут быть предусмотрены в фармацевтической композиции для лиофилизации.
Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению могут быть изготовлены и могут применяться в виде таблеток, капсул или эликсиров для перорального введения; суппозиторий для ректального введения; предпочтительно стерильных растворов или стерильного порошка или суспензий для инъекционного введения; и тому подобного. Доза и способ введения могут быть адаптированы для достижения оптимальной эффективности, но будут зависеть от таких факторов как масса, рацион, сопутствующая лекарственная терапия и другие факторы, которые установят специалисты в области медицины.
В случае если введение должно быть парентеральным, таким как внутривенное, подкожное или внутримышечное, инъекционные фармацевтические композиции могут быть приготовлены в виде обычных форм, либо в виде водных растворов или суспензий; лиофилизированных, твердых форм, подходящих для восстановления непосредственно перед применением, либо суспензии в жидкости перед инъекцией, либо в виде эмульсий.
Разбавители для восстановления лиофилизированного продукта могут представлять собой подходящий буфер из перечня, приведенного выше, воду, солевой раствор, декстрозу, маннит, лактозу, трегалозу, сахарозу, лецитин, альбумин, глутамат натрия, гидрохлорид цистеина; или воду для инъекций с добавлением детергентов, таких как Tween 20, Tween 80, полоксамеры, например, pluronic F-68 или pluronic F-127, полиэтиленгликоль, и/или с добавлением консервантов, таких как пара-, мета- и орто-крезол, метил- и пропилпарабен, фенол, бензиловый спирт, бензоат натрия, бензойная кислота, бензилбензоат, сорбиновая кислота, пропановая кислота, сложные эфиры п-гидроксибензойной кислоты, и/или с добавлением органического модификатора, такого как этанол, уксусная кислота, лимонная кислота, молочная кислота или их соли.
Кроме того, при необходимости, инъецируемые фармацевтические композиции могут содержать незначительные количества нетоксичных вспомогательных веществ, таких как смачивающие агенты или рН-буферные агенты. Можно применять препараты, улучшающие всасывание (например, липосомы, детергенты и органические кислоты).
Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения соединения изготовлены в форме для введения путем инфузии, например, при применении в виде жидких пищевых добавок для пациентов, получающих терапию полным парентеральным питанием (например, новорожденных или пациентов, страдающих кахексией или анорексией), или путем инъекции, например, подкожно, внутрибрюшинно или внутривенно, и, соответственно, применяются в виде водных растворов в стерильной и апирогенной форме и необязательно забуферены до физиологически переносимого рН, например, незначительно кислого или физиологического рН. Состав для внутримышечного введения может быть основан на растворах или суспензиях в растительном масле, например, масле канолы, кукурузном масле или масле соевых бобов. Эти составы на масляной основе могут быть стабилизированы с помощью антиоксидантов, например, BHA (бутилированный гидроксианизол) и BHT (бутилированный гидрокситолуол).
Таким образом, пептидные соединения согласно настоящему изобретению можно вводить в наполнителе, таком как дистиллированная вода или в солевом растворе, забуференном фосфатом солевом растворе, 5%-ных растворах декстрозы или маслах. Растворимость аналога GLP-2 может быть повышена, при необходимости, путем включения усилителя растворимости, например, детергентов и эмульгаторов.
Для применения в качестве инъекционных препаратов водный носитель или наполнитель может быть дополнен некоторым количеством желатина, который служит для депонирования аналога GLP-2 в месте инъекции или рядом с ним для его медленного высвобождения к целевому месту действия. В качестве депо-агентов также можно применять другие гелеобразующие агенты, такие как гиалуроновая кислота.
Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения состав содержит
a. L-гистидин, растворенный в воде, чтобы получить конечные концентрации от 0,5 мМ до 300 мМ, предпочтительно от 3 до 200 мМ, наиболее предпочтительно от 20 до 100 мМ;
b. маннит, чтобы получить до 350 мМ, предпочтительно от 30 до 300 мМ, наиболее предпочтительно от 100 мМ до 230 мМ; и
c. уксусную кислоту, чтобы получить до 200 мМ, предпочтительно от 0,05 до 100 мМ, наиболее предпочтительно от 0,5 до 50 мМ в растворе.
Подходящее количество терапевтического соединения добавляют для получения концентраций от 1 до 100 мг/мл, предпочтительно от 5 до 50 мг/мл, наиболее предпочтительно от 10 до 30 мг/мл.
рН корректируют до конечного значения рН от 4 до 8, предпочтительно от 6,5 до 7,5, наиболее предпочтительно от 6,7 до 7,3. Полученный раствор доводят до целевой массы, стерильно фильтруют и распределяют на соответствующие аликвоты во флаконах для фармацевтического применения. Состав дополнительно обрабатывают соответствующим образом для жидкого продукта или лиофилизированного продукта.
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения состав содержит
a. L-гистидин, растворенный в воде, чтобы получить конечные концентрации от 0,5 мМ до 300 мМ, предпочтительно от 3 до 200 мМ, наиболее предпочтительно от 20 до 100 мМ L-гистидина;
b. L-аргинин, чтобы получить до 200 мМ, предпочтительно от 0,5 до 100 мМ, наиболее предпочтительно от 5 до 50 мМ;
c. маннит, чтобы получить до 350 мМ, предпочтительно от 30 до 300 мМ, наиболее предпочтительно от 100 мМ до 230 мМ; и
d. уксусную кислоту, чтобы получить до 200 мМ, предпочтительно от 0,05 до 100 мМ, наиболее предпочтительно от 0,5 до 50 мМ в растворе.
Подходящее количество терапевтического соединения добавляют для получения концентраций от 1 до 100 мг/мл, предпочтительно от 5 до 50 мг/мл, наиболее предпочтительно от 10 до 30 мг/мл.
рН корректируют до конечного значения рН от 4 до 8, предпочтительно от 6,5 до 7,5, наиболее предпочтительно от 6,7 до 7,3. Полученный раствор доводят до целевой массы, стерильно фильтруют и распределяют на соответствующие аликвоты во флаконах для фармацевтического применения. Состав дополнительно обрабатывают соответствующим образом для жидкого продукта или лиофилизированного продукта.
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения состав содержит
a. L-гистидин, растворенный в воде, чтобы получить конечные концентрации до 200 мМ, предпочтительно от 3 до 100 мМ, наиболее предпочтительно от 5 до 50 мМ L-гистидина;
b. L-аргинин, чтобы получить до 200 мМ, предпочтительно от 0,5 до 100 мМ, наиболее предпочтительно от 5 до 50 мМ;
c. маннит, чтобы получить до 350 мМ, предпочтительно от 30 до 300 мМ, наиболее предпочтительно от 100 мМ до 230 мМ; и
d. уксусную кислоту, чтобы получить до 200 мМ, предпочтительно от 0,05 до 100 мМ, наиболее предпочтительно от 0,5 до 50 мМ в растворе.
Подходящее количество терапевтического соединения добавляют для получения концентраций от 1 до 100 мг/мл, предпочтительно от 5 до 50 мг/мл, наиболее предпочтительно от 10 до 30 мг/мл.
рН корректируют до конечного значения рН от 4 до 8, предпочтительно от 6,5 до 7,5, наиболее предпочтительно от 6,7 до 7,3. Полученный раствор доводят до целевой массы, стерильно фильтруют и распределяют на соответствующие аликвоты во флаконах для фармацевтического применения. Состав дополнительно обрабатывают соответствующим образом для жидкого продукта или лиофилизированного продукта.
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения состав содержит
a. N-ацетат, растворенный в воде, чтобы получить конечные концентрации до 200 мМ, предпочтительно от 0,5 до 100 мМ, наиболее предпочтительно от 5 до 50 мМ L-гистидина;
b. маннит, чтобы получить до 350 мМ, предпочтительно от 30 до 300 мМ, наиболее предпочтительно от 100 мМ до 230 мМ.
Подходящее количество терапевтического соединения добавляют для получения концентраций от 1 до 100 мг/мл, предпочтительно от 5 до 50 мг/мл, наиболее предпочтительно от 10 до 30 мг/мл.
рН корректируют до конечного значения рН от 4 до 8, предпочтительно от 6,5 до 7,5, наиболее предпочтительно от 6,7 до 7,3. Полученный раствор доводят до целевой массы, стерильно фильтруют и распределяют на соответствующие аликвоты во флаконах для фармацевтического применения. Состав дополнительно обрабатывают соответствующим образом для жидкого продукта или лиофилизированного продукта.
Аналоги GLP-2 согласно настоящему изобретению также могут быть изготовлены в виде устройства для имплантации с медленным высвобождением для пролонгированного и длительного введения аналога пептида GLP-2. Такие препараты с длительным высвобождением могут быть в форме пластыря, расположенного снаружи на теле. Примеры составов с длительным высвобождением включают композиты биосовместимых полимеров, таких как полимолочная кислота, сополимер молочной кислоты и гликолевой кислоты, метилцеллюлоза, гиалуроновая кислота, сиаловая кислота, силикат, коллаген, липосомы и тому подобное. Составы с длительным высвобождением могут представлять особый интерес, если желательно обеспечить высокую локальную концентрацию аналога GLP-2 согласно настоящему изобретению.
Аналог GLP-2 можно применять в форме стерильно заполненного флакона или ампулы, содержащей кишечнотрофное количество пептида, либо в виде единичной дозы, либо в виде нескольких доз. Флакон или ампула могут содержать аналог GLP-2 и целевой носитель в виде готового к введению состава. Согласно другому варианту флакон или ампула могут содержать пептид GLP-2 в форме, такой как лиофилизированная форма, подходящей для восстановления в подходящем носителе, таком как стерильная вода или забуференный фосфатом солевой раствор.
Пептидные соединения согласно настоящему изобретению можно применять по отдельности или в комбинации с соединениями, обладающими противовоспалительным эффектом. Безотносительно к какой-либо теории, предполагают, что такое комбинированное лечение может усиливать благоприятные терапевтические эффекты пептидных аналогов согласно настоящему изобретению.
Терапевтическое дозирование и схема, наиболее подходящие для лечения пациента, как известно, будут изменяться в зависимости от заболевания или состояния, подлежащего лечению, и в соответствии с параметрами пациента. Безотносительно к какой-либо конкретной теории, ожидается, что дозы от 0,1 до 25 мг на пациента и меньшая или большая продолжительность или частота лечения могут привести к получению терапевтически полезных результатов, таких как статистически значимое увеличение, в частности, массы тонкого кишечника. В некоторых случаях терапевтическая схема может включать введение поддерживающих доз, подходящих для предотвращения регрессии ткани, которая происходит после прекращения первоначального лечения. Размеры дозировки и схема дозирования, наиболее подходящие для применения у человека, могут основываться на результатах, полученных с помощью настоящего изобретения, и могут быть подтверждены в дальнейших клинических исследованиях.
Эффективную дозировку и протокол лечения можно определить с помощью обычных способов, начиная с низкой дозы у лабораторных животных, а затем увеличивая дозировку при мониторинге эффектов, а также систематически изменяя схему дозирования. При определении оптимальной дозировки для конкретного субъекта клиницист может принять во внимание множество факторов. Такие соображения известны специалисту в данной области техники.
У человека пептид GLP-2 согласно настоящему изобретению можно применять в дозе от примерно 0,01 мг/кг до 100 мг/кг массы тела, например, от примерно 0,01 мг/кг до 10 мг/кг массы тела, например, 10-100 мкг/кг массы тела. Согласно дополнительным вариантам реализации настоящего изобретения доза (общая доза) пептида GLP-2 в соответствии с настоящим изобретением у человека может находиться в диапазоне или составлять примерно от 0,1 мг до 25 мг на пациента, может находиться в диапазоне или составлять от 0,5 мг до 20 мг на пациента, например, может находиться в диапазоне или составлять от 1 мг до 15 мг на пациента, например, может находиться в диапазоне или составлять от 1 мг до 10 мг на пациента, один или два раза в неделю или в виде множества доз, как определено в настоящем документе, разделенных во времени на 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 дней. В некоторых случаях фиксированную дозу пептида GLP-2 согласно настоящему изобретению можно применять в соответствии с шаблоном дозирования, описанным в настоящей заявке, т.е. дозу, которая является одинаковой независимо от массы тела пациента и вводится один или два раза в неделю. Например, фиксированная доза может представлять собой дозу 5 мг, 6 мг, 7 мг, 8 мг, 9 мг, 10 мг, 11 мг, 12 мг, 13 мг, 14 мг или 15 мг. Удобной для применения является фиксированная доза 10 мг. Преимущество применения фиксированной дозировки заключается в повышении приверженности пациента лечению и в снижении риска ошибок при дозировании у пациента, включая риски неправильного расчета дозы, которая будет введена, на основании массы.
Медицинские показания
Пептиды согласно настоящему изобретению можно применять в качестве фармацевтического агента для предотвращения или лечения индивидуума, страдающего желудочно-кишечными нарушениями, включая верхний отдел желудочно-кишечного тракта в области пищевода, путем введения эффективного количества аналога GLP-2 или его соли, описанных в настоящей заявке. Нарушения, связанные с желудком и кишечником, включают язвы любой этиологии (например, пептидные язвы, язвы, вызванные лекарственными средствами, язвы, связанные с инфекциями или другими патогенами), нарушения пищеварения, синдромы мальабсорбции, синдром короткой кишки, синдром «слепого мешка», воспалительное заболевание кишечника, спру-целиакию (например, вызванную глютен-индуцированной энтеропатией или целиакией), тропическую спру, гипогаммаглобулинемическую спру, энтерит, язвенный колит, повреждение тонкого кишечника и вызванную химиотерапией диарею/мукозит (CID).
Как в общем упомянуто выше, индивидуумы, которые получат пользу от увеличения массы тонкого кишечника и результатов этого и/или поддержания нормальной структуры и функции слизистой оболочки тонкого кишечника, являются кандидатами для лечения с применением аналогов GLP-2 согласно настоящему изобретению. Конкретные состояния, которые можно лечить с применением аналога GLP-2, включают различные формы спру, включая спру-целиакию, которая развивается в результате токсической реакции на альфа-глиадин из пшеницы и может быть вызвана глютен-индуцированной энтеропатией или целиакией, и характеризуется значительной потерей ворсинок тонкого кишечника; тропическую спру, возникающие в результате инфекции и характеризующиеся частичным уплощением ворсинок; гипогаммаглобулинемическую спру, которая обычно наблюдается у пациентов с неклассифицируемым вариабельным иммунодефицитом или гипогаммаглобулинемией и характеризуется значительным уменьшением высоты ворсинок. Терапевтическую эффективность лечения с применением аналога GLP-2 можно контролировать с помощью кишечной биопсии для исследования морфологии ворсинок, биохимической оценки всасывания питательных веществ, по увеличению массы тела пациента или уменьшению симптомов, ассоциированных с этими состояниями.
Другим конкретным состоянием, которое можно лечить с применением аналогов GLP-2 согласно настоящему изобретению или в отношении которого аналоги GLP-2 можно применять в терапевтических и/или профилактических целях, является синдром короткой кишки (СКК), также известный как синдром короткого кишечника или просто короткая кишка, который возникает в результате хирургической резекции, врожденного дефекта или ассоциированной с заболеванием потери всасывания в кишечнике, при котором пациенты впоследствии не могут поддерживать баланс жидкости, электролитов и питательных веществ при обычном рационе. Несмотря на адаптацию, которая обычно происходит через два года после резекции, пациенты с СКК имеют уменьшенное алиментарное поступление и потерю жидкости.
Другие состояния, которые можно лечить с применением аналогов GLP-2 согласно настоящему изобретению или в отношении которых аналоги GLP-2 можно применять в профилактических целях, включают в дополнение к вышеупомянутому радиационный энтерит, инфекционный или постинфекционный энтерит и повреждение тонкого кишечника, вызванное противораковыми химиотерапевтическими или токсическими агентами.
Аналоги GLP-2 также можно применять для лечения недоедания, например, кахексии и анорексии.
Конкретный вариант реализации настоящего изобретения относится к применению пептидов согласно настоящему изобретению для предотвращения и/или лечения повреждения и дисфункции кишечника. Такое повреждение и дисфункция являются хорошо известным побочным эффектом химиотерапевтического лечения рака. Введение химиотерапии часто ассоциировано с нежелательными побочными эффектами, связанными с желудочно-кишечной системой, такими как мукозит, диарея, транслокация бактерий, мальабсорбция, спазмы в животе, желудочно-кишечные кровотечения и рвота. Эти побочные эффекты являются клиническими последствиями структурного и функционального повреждения эпителия кишечника и часто приводят к необходимости снижения дозы и частоты химиотерапии. Введение аналогов пептида GLP-2 согласно настоящему изобретению может усиливать трофический эффект в криптах кишечника и быстро обеспечивать новые клетки для замены поврежденного эпителия кишечника после химиотерапии. Конечная цель, достигаемая с помощью введения пептидов согласно настоящему изобретению, заключается в снижении заболеваемости, связанной с повреждением желудочно-кишечного тракта пациентов, проходящих химиотерапевтическое лечение, одновременно создавая наиболее оптимальную химиотерапевтическую схему для лечения рака. Сопутствующее профилактическое или терапевтическое лечение может быть предоставлено в соответствии с настоящим изобретением пациентам, проходящим или собирающимся проходить лучевую терапию.
Стволовые клетки слизистой оболочки тонкого кишечника особенно чувствительны к цитотоксическим эффектам химиотерапии из-за высокой скорости их пролиферации (Keefe et al., Gut 2000; 47: 632-7). Индуцированное химиотерапией повреждение слизистой оболочки тонкого кишечника клинически часто называется желудочно-кишечным мукозитом и характеризуется нарушениями всасывания и барьерной функции тонкого кишечника. Например, было показано, что широко используемые химиотерапевтические агенты 5-FU, иринотекан и метотрексат усиливают апоптоз, приводя к атрофии ворсинок и гипоплазии крипт в тонком кишечнике грызунов (Keefe et al., Gut 47: 632-7, 2000; Gibson et al., J Gastroenterol Hepatol. Sep; 18(9): 1095-1100, 2003; Tamaki et al., J Int Med Res. 31(1): 6-16, 2003). Было показано, что у человека химиотерапевтические агенты увеличивают апоптоз в криптах кишечника через 24 часа после введения и впоследствии уменьшают площадь ворсинок, длину крипт, митотический индекс на крипту и высоту энтероцитов через три дня после химиотерапии (Keefe et al., Gut 2000; 47: 632-7). Таким образом, структурные изменения в тонком кишечнике непосредственно приводят к дисфункции кишечника и в некоторых случаях к диарее.
Желудочно-кишечный мукозит после химиотерапии рака является все большей проблемой, которая по существу не поддается лечению после возникновения, хотя он постепенно ослабевает. Исследования, проведенные с обычно используемыми цитостатическими противораковыми лекарственными средствами, 5-FU и иринотеканом, продемонстрировали, что эффективная химиотерапия с применением этих препаратов преимущественно отрицательно влияет на структурную целостность и функцию тонкого кишечника, в то время как толстый кишечник менее чувствителен и в основном отвечает повышенным образованием слизи (Gibson et al., J Gastroenterol Hepatol. Sep; 18(9): 1095-1100, 2003; Tamaki et al., J Int Med Res. 31(1): 6-16, 2003).
Новые аналоги GLP-2 согласно настоящему изобретению можно применять для предотвращения и/или лечения повреждений желудочно-кишечного тракта и побочных эффектов химиотерапевтических агентов. Это потенциально важное терапевтическое приложение применимо к используемым в настоящее время химиотерапевтическим агентам, таким как, но не ограничиваясь ими: 5-FU, альтретамин, блеомицин, бусульфан, капецитабин, карбоплатин, кармустин, хлорамбуцил, цисплатин, кладрибин, крисантаспаза, циклофосфамид, цитарабин, дакарбазин, дактиномицин, даунорубицин, доцетаксел, доксорубицин, эпирубицин, этопозид, флударабин, фторурацил, гемцитабин, гидроксикарбамид, идарубицин, ифосфамид, иринотекан, липосомальный доксорубицин, лейковорин, ломустин, мелфалан, меркаптопурин, месна, метотрексат, митомицин, митоксантрон, оксалиплатин, паклитаксел, пеметрексед, пентостатин, прокарбазин, ралтитрексид, стрептозоцин, тегафур-урацил, темозоломид, тиотепа, тиогуанин/тиогуанин, топотекан, треосульфан, винбластин, винкристин, виндезин, винорелбин, блеомицин, бусульфан, капецитабин, карбоплатин, кармустин, хлорамбуцил, цисплатин, кладрибин, крисантаспаза, циклофосфамид, цитарабин, дакарбазин, дактиномицин, даунорубицин, доцетаксел, доксорубицин, эпирубицин, этопозид, флударабин, фторурацил, гемцитабин, гидроксикарбамид, идарубицин, ифосфамид, иринотекан, липосомальный доксорубицин, лейковорин, ломустин, мелфалан, меркаптопурин, метотрексат, митомицин, митоксантрон, оксалиплатин, паклитаксел, пеметрексед, пентостатин, прокарбазин, ралтитрексид, стрептозоцин, тегафур-урацил, темозоломид, тиотепа, тиогуанин/тиогуанин, топотекан, треосульфан, винбластин, винкристин, виндезин, винорелбин.
Дополнительный вариант реализации настоящего изобретения относится к применению пептидов согласно настоящему изобретению для увеличения продольного роста кишечника у пациента, например, у пациента-человека. Как показано в примерах ниже, аналоги GLP-2 согласно настоящему изобретению способны увеличивать продольный рост кишечника относительно контроля. Безотносительно к какой-либо теории, в настоящее время полагают, что более длительный период полувыведения приводит к более эффективной и продолжительной стимуляции рецепторов GLP-2, что приводит к увеличению продольного роста по сравнению с контролем. Также возможно, что больший терминальный период полувыведения из плазмы аналогов GLP-2, применяемых в соответствии с настоящим изобретением, приводит к более эффективной стимуляции продольного роста кишечника по сравнению с другими аналогами GLP-2 предшествующего уровня техники, которые, как известно, имеют относительно более короткие периоды полувыведения.
Эта возможность имеет особое значение у пациентов с СКК, поскольку приведет к увеличению всасывающей способности даже после прекращения лечения. Такой пациент будет получать лечение по меньшей мере от 1 до 3 лет, например, по меньшей мере от 1 до 4 лет, например, от 1 до 10 лет, например, от 1 до 20 лет, например, от 1 до 35 лет, чтобы индуцировать продольный рост кишечника.
Как уже было описано в настоящей заявке, пациенты с СКК, состояние которых является промежуточным между кишечной недостаточностью (СКК-КН) и СКК-ПП и синдромом кишечной недостаточности (СКК-СКН) или СКК без ПП, соответственно, могут получить конкретную пользу от удлинения их кишечника в течение курса лечения от 1 до 3 лет, после чего риск развития у них синдрома кишечной недостаточности снижается, например, при введении один раз в неделю или два раза в неделю в течение периода лечения. Это включает меньший риск, связанный с необходимостью введения центрального катетера, и риск сепсиса, ассоциированного с его применением.
Схемы дозирования, раскрытые в настоящей заявке, можно применять для лечения нарушений, связанных с желудком и кишечником, таких как СКК, при которых субъекту, получающему лечение, предоставляют парентеральное питание (ПП) во время лечения с применением аналогов GLP-2 в соответствии с настоящим изобретением. Парентеральное питание включает введение питательных веществ и жидкости пациентам, у которых желудочно-кишечный тракт поврежден или имеет нарушения, во время получения ими лечения с применением аналогов GLP-2. Однако одна из проблем, с которой сталкиваются пациенты и врачи в ходе терапии GLP-2, связана с определением количества или объема ПП, предоставляемого субъекту, которого лечат, и соответствующей и индивидуальной корректировкой количества или объема ПП, предоставляемого пациенту. В частности, это представляется важным, поскольку если количество или объем ПП не скорректированы надлежащим образом, субъекты, получающие лечение, могут испытывать перегрузку жидкостью, подвергаются риску дегидратации и могут не достигать оптимальных клинических ответов на терапию. Следовательно, согласно настоящему изобретению предложены алгоритмы для корректировки количества или объема ПП во время курса лечения с применением аналога GLP-2, описанного в настоящей заявке.
Соответственно, согласно дополнительному связанному с лечением аспекту настоящего изобретения предложен аналог глюкагоноподобного пептида-2 (GLP-2) для применения в способе лечения синдрома короткой кишки (СКК) у субъекта-человека, получающего схему парентерального питания (ПП), причем указанный способ включает:
(i) введение субъекту аналога GLP-2, определенного в настоящей заявке, причем указанный аналог GLP-2 вводят один или два раза в неделю в течение периода времени, достаточного для удлинения тонкого кишечника и улучшения его функции у субъекта; и
(ii) после этапа (i), уменьшение частоты или количества в схеме парентерального питания (ПП) в ответ на улучшение функции тонкого кишечника.
(iii) необязательно повторение этапов (i) и (ii) в ответ на демонстрацию пациентом продолжающегося улучшения функции тонкого кишечника.
Например, интервал времени, в течение которого аналог GLP-2 вводят на этапе (i) способа, составляет от 18 до 150 недель, от 18 до 100 недель или от 18 до 52 недель.
Обычно степень улучшения функции или всасывающей способности тонкого кишечника составляет по меньшей мере 10%, например, по меньшей мере 20%, например, по меньшей мере 30%, например, по меньшей мере 40%, например, по меньшей мере 50%. Дополнительно или альтернативно, количество, на которое уменьшают парентеральное питание, составляет по меньшей мере 10%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40% или по меньшей мере 50%. Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения парентеральное питание уменьшают по меньшей мере на 20%.
Чтобы облегчить определение количества или объема ПП, предоставленного субъектам, получающим терапию GLP-2, согласно дополнительному аспекту настоящего изобретения предложен способ корректировки парентерального питания (ПП) у субъекта-человека, получающего некоторое количество или объем парентерального питания каждую неделю, причем указанный способ включает вычисление нового количества или объема ПП с применением алгоритма, в котором количество или объем ПП на неделю вычисляют путем вычитания семикратного абсолютного увеличения суточного объема мочи относительно начального уровня из текущего недельного объема парентерального питания, чтобы обеспечить новое количество или объем ПП для субъекта. Предпочтительно способ включает первоначальные этапы определения начального объема и/или определения суточного объема мочи. Некоторые или все этапы способа можно повторять в течение курса терапии GLP-2, получаемого субъектом. Предпочтительно интервал времени между повторным испытанием для определения изменений объема ПП составляет примерно от 1 до 3 месяцев. Например, согласно одному варианту реализации настоящего изобретения способ можно применять через 1, 2, 4, 8 и 12 недель после начала лечения с применением аналога GLP-2, корректируя количество или объем ПП в ответ на эффекты лечения. Еженедельное количество или объем вводимого ПП следует контролировать и корректировать на протяжении всего лечения с применением аналога GLP-2 (например, глепаглутида), чтобы избежать перегрузки жидкостью. Поскольку обычно всасывающая способность кишечника увеличивается после лечения с применением аналога GLP-2, как правило, за счет удлинения или утолщения тонкого кишечника, количество или объем ПП могут быть уменьшены, чтобы избежать перегрузки жидкостью и улучшить потребности в лечении пациента.
Примеры
Следующие примеры приведены для иллюстрации предпочтительных аспектов настоящего изобретения и не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения. Аналоги GLP-2, вводимые в соответствии со схемами дозирования, описанными в настоящем документе, могут быть получены в соответствии со способами, такими как твердофазный синтез пептидов, описанный в WO 2006/117565, содержание которого явным образом полностью включено посредством ссылки.
Пример 1. Синтез метаболитов ZP1848
Твердофазный синтез пептидов проводили на синтезаторе пептидов CEM Liberty с применением стандартных Fmoc-химических реакций. Смола TentaGel S Ram S (1,33 г; 0,25 ммоль/г) перед применением набухала в ДМФА (10 мл), и ее переносили между пробиркой и реакционным сосудом с применением ДХМ и ДМФА.
Связывание
Fmoc-аминокислоту в ДМФА/ДХМ (2:1; 0,2 М; 5 мл) добавляли к смоле в микроволновой установке CEM Discover вместе с COMU/ДМФА (0,5 М; 2 мл) и DIPEA/ДМФА (2,0 М; 1 мл). Смесь для связывания нагревали до 75°C в течение 5 минут при барботировании смеси азотом. Затем смолу промывали ДМФА (4×10 мл). Псевдопролин Fmoc-Phe-Ser(Psi Me,Me,Pro)-OH применяли для аминокислот номер шесть и семь.
Снятие защиты
Пиперидин/ДМФА (20%; 10 мл) добавляли к смоле для первоначального снятия защиты, и смесь нагревали с помощью микроволн (30 с; 40°C). Реакционный сосуд опустошали, добавляли вторую порцию пиперидина/ДМФА (20%; 10 мл) и снова нагревали (75°C; 3 мин). Затем смолу промывали ДМФА (6×10 мл).
2
Смолу промывали EtOH (3×10 мл) и EtO (3×10 мл) и высушивали до достижения постоянной массы при комнатной температуре (к.т.). Неочищенный пептид отщепляли от смолы путем обработки ТФУ/DODT (95/5; 60 мл, 2 ч; к.т.). Большую часть ТФУ удаляли при пониженном давлении, и неочищенный пептид осаждали, трижды промывали простым диэтиловым эфиром и высушивали до достижения постоянной массы при комнатной температуре.
Очистка неочищенного пептида методом ВЭЖХ
Неочищенный пептид сначала очищали до 45% с помощью препаративной обращенно-фазовой ВЭЖХ с применением рабочей станции PerSeptive Biosystems VISION, оснащенной колонкой Gemini NX 5μ C-18 110A, 10×250 мм и коллектором фракций, и анализировали при скорости 35 мл/мин с градиентом буфера A (0,1% ТФУ, водн.) и буфера B (0,1% ТФУ, 90% MeCN, водн.). Фракции анализировали с помощью аналитической ВЭЖХ и МС, и соответствующие фракции объединяли и лиофилизировали. Продукт (143 мг) очищали второй раз на колонке C4 Jupiter 2, 12×25 см, с выходом 27 мг и чистотой 89%, определенной с помощью ВЭЖХ и МС. Рассчитанная моноизотопная молекулярная масса = 3377,61, обнаруженная молекулярная масса 3377,57.
Таблица 1: Синтезированные соединения
Соединение
Последовательность
Тедуглутид
H-HGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD-OH
ZP1848
H-HGEGTFSSELATILDALAARDFIAWLIATKITDKKKKKK-NH<sub>2</sub>
ZP2949
H-HGEGTFSSELATILDALAARDFIAWLIATKITDKKK-OH
ZP2711
H-HGEGTFSSELATILDALAARDFIAWLIATKITDKK-OH
ZP2469
H-HGEGTFSSELATILDALAARDFIAWLIATKITDK-OH
Пример 2. Измерения ЭК
GLP-2R
50
Получение линии клеток, экспрессирующей рецепторы GLP-2 человека

hGLP2-R приобрели у MRC-geneservice, Babraham, Кембридж как клон Image: 5363415 (11924-I17). Для субклонирования в вектор экспрессии у млекопитающих праймеры для субклонирования получали от DNA-Technology, Риссков, Дания. В 5' и 3'-праймеры, используемые для ПЦР-реакции, включали концевые сайты рестрикции для клонирования, и последовательность 5'-праймера модифицировали для включения консенсусной последовательности Козак без изменения последовательности продукта, кодируемого ORF. Стандартную реакцию ПЦР проводили с применением Image clone 5363415 (11924-I17) в качестве матрицы с указанными выше праймерами и полимеразы Herculase II Fusion в общем объеме 50 мкл. Полученный продукт ПЦР очищали с применением набора для GFX™ ПЦР и очистки полос геля, расщепляли рестрикционными ферментами и клонировали в вектор экспрессии у млекопитающих с применением набора для быстрого лигирования ДНК. Реакцию лигирования трансформировали в ультракомпетентные клетки XL10 Gold, и колонии для получения ДНК отбирали с применением набора EndoFree Plasmid maxi kit. Последующий анализ последовательности проводился MWG Eurofins, Германия. Было подтверждено, что клон представляет собой рецептор hGLP-2, вариант сплайсинга rs17681684.
6
Клетки HEK293 трансфецировали с применением метода трансфекции Lipofectamine PLUS. За день до трансфекции клетки НЕК293 высевали в две колбы Т75 при плотности 2×10 клеток/колбу Т75 в среде для культивирования клеток без антибиотиков. В день трансфекции клетки промывали 1×DPBS и среду заменяли Optimem до объема 5 мл/колбу T75, затем к клеткам в колбах T75 аккуратно по каплям добавляли комплексы липофектамин-плазмида, через 3 часа среду заменяли свежей ростовой средой, а через 24 часа ростовой средой с добавлением 500 мкг/мл G418. Через 4 недели отбора под давлением G418 клоны отбирали и тестировали в функциональном анализе. Один клон отбирали для применения при профилировании соединения.
Анализ эффективности рецептора GLP-2

50
Анализ цАМФ AlphaScreen от Perkin Elmer применяли для количественной оценки ответа цАМФ на активацию рецептора GLP2. Тедуглутид применяли в качестве эталонного соединения для активации рецептора GLP2. Данные для тестируемых соединений, вызывающих повышение внутриклеточного уровня цАМФ, нормировали относительно положительного (тедуглутид) и отрицательного контроля (наполнитель) для вычисления ЭК и максимального ответа на основании кривой зависимости ответа от концентрации. Результаты приведены в таблице 2.
Таблица 2: Измерения ЭК
GLP-2R
50
ZP No.
ЭК<sub>50</sub>_среднее значение (нМ)
ЭК<sub>50</sub>_станд. откл. сред. (нМ)
Тедуглутид
0,03
0,019
ZP1848
0,3
0,14
ZP2949
0,11
0,013
ZP2711
0,072
0,0076
ZP2469
0,052
0,0057
ZP1846
0,26
Пример 3: Фармакокинетическое и фармакодинамическое профилирование аналогов GLP-2
Клиническое исследование фазы 2 проводили, чтобы определить профиль ФК ZP1848 и метаболитов у пациентов-людей с СКК, помимо всего прочего.
Способ
Исследование было разработано как рандомизированное, двойное слепое исследование в перекрестных группах с применением трех различных доз ZP1848 (10 мг, 1 мг, 0,1 мг) у 16 пациентов с СКК.
Протокол исследования был одобрен Датским медицинским агентством и Датским комитетом по этике медицинских исследований.
18 пациентов с СКК (16 пациентов завершили исследование) рандомизировали поровну и двойным слепым методом для каждой из шести перекрестных комбинаций уровней доз: 10 мг/1 мг, 10 мг/0,1 мг, 1 мг/10 мг, 1 мг/0,1 мг, 0,1 мг/10 мг, 0,1 мг/1 мг ZP1848. Вышеуказанные дозы ZP1848 вводили пациентам путем подкожной инъекции один раз в сутки (QD).
Образцы крови для анализа ФК собирали во время нескольких предусмотренных исследованием визитов в течение периода исследования: исследование включало 1 исследование баланса в начальных условиях (4 дня), 1 период лечения (21 день), включая 1 исследование баланса в ходе лечения (последние 4 дня 1 периода лечения) с последующим периодом вымывания (не менее 4 недель); и 2 исследование баланса в начальных условиях (4 дня), 2 период лечения (21 день), включая 2 исследование баланса в ходе лечения (последние 4 дня 2 периода лечения) и период наблюдения (не менее 4 недель).
Отбор образцов для ФК проводили во время 11 визита (1 период лечения, исследование баланса) и 17 визита (второй день 2 исследования начального уровня - после периода вымывания), и снова во время 25 визита (2 исследование баланса в ходе лечения) и 29 визита (последний день периода наблюдения).
В день 11 и 25 визита изучили полный профиль ФК в стационарном состоянии. Образцы для ФК отбирали до инъекционного введения ZP1848 и в следующие моменты времени (+/- 10 минут) после введения исследуемого продукта: 1 час, 2 часа, 4 часа, 6 часов, 8 часов, 10 часов, 12 часов и 24 часа. Каждый образец для ФК содержал 2 мл крови, в результате чего для целей ФК отобрали в общей сложности 46 мл крови. Образец плазмы непосредственно после отбора хранили при -80°С.
e
e
Образцы плазмы анализировали после иммуноаффинной экстракции и затем методом жидкостной хроматографии с масс-спектрометрией (ЖХ-МС/МС). Для каждого пациента концентрации в плазме использовали для расчета в Excel фармакокинетических параметров с применением некомпартментного подхода. Терминальный период полувыведения из плазмы  определяли как ln(2)/k, где k представляет собой величину наклона логарифмической линейной регрессии на графике зависимости логарифма концентрации от времени в конечной фазе.
Результаты
При введении ZP1848 путем инъекции в п/к (подкожный) компартмент, образуются два функционально активных метаболита (ZP2469 и ZP2711, оба представляют собой укороченные на С-конце аналоги глепаглутида, ZP1848). Таким образом, общий профиль ФК ZP1848 включает эффект ZP1848 и двух его основных метаболитов.
in vitro
in vivo
Оба метаболита являются фармакологически активными, как показано выше, при этом эффективность в условиях  сопоставима с таковой ZP1848. Уровень в плазме ZP2711 находится в том же диапазоне, что и уровень в плазме ZP1848, тогда как уровень в плазме ZP2469 во много раз выше, чем таковой ZP1848. Следовательно, при оценке системного воздействия необходимо учитывать оба метаболита, поскольку они оба вносят вклад в эффективность в условиях .
Из-за высокого уровня в плазме ZP2469 это соединение имеет уровень в плазме, который выше биоаналитического предела обнаружения (50 пМ для ZP2469, 25 пМ для ZP1848 и ZP2711), следовательно, можно определить период полувыведения соединения ZP2469. Терминальный период полувыведения из плазмы от 5 до 17 дней, как показано в таблице, свидетельствует о том, что однократное еженедельное дозирование ZP1848 будет эффективным.
Таблица 3: Результаты оценки ФК из клинического исследования фазы 2
Субъект
Соединение
День
№ визита
Конц. (пМ)
Период полувыведения (дни)
1003
ZP2469
0
25
4490
7,2
1003
ZP2469
32
29
209
1007
ZP2469
0
25
14700
7,2
1007
ZP2469
36
29
460
1008
ZP2469
0
11
6770
9,5
1008
ZP2469
56
17
116
1010
ZP2469
0
11
4340
11
1010
ZP2469
56
17
112
1013
ZP2469
0
25
4940
9,6
1013
ZP2469
35
29
394
1014
ZP2469
0
11
2220
5,2
1014
ZP2469
28
17
52.8
1015
ZP2469
0
11
556
7,9
1015
ZP2469
28
17
56.4
1015
ZP2469
0
25
3640
8,7
1015
ZP2469
32
29
288
1016
ZP2469
0
11
4750
11
1016
ZP2469
49
17
236
1018
ZP2469
0
25
4660
8,7
1018
ZP2469
40
29
195
1020
ZP2469
0
11
1040
12
1020
ZP2469
35
17
133
1013
ZP2711
0
11
131
14
1013
ZP2711
28
17
32.6
1015
ZP2711
0
25
543
10
1015
ZP2711
32
29
61,4
Пример 4: Продольный рост в результате подкожного введения ZP1848 собакам породы бигль в течение 39 недель с последующим 6-недельным периодом восстановления
Способ
ZP1848 (0,25, 1 или 5 мг/кг/сутки) вводили подкожно в течение 39 недель собакам породы бигль (от 22 до 24 недель). В качестве контроля применяли наполнитель. Восстановление от любого эффекта оценивали в течение 6-недельного периода восстановления. Исследование проводили в соответствии с применимыми разделами Закона от 1986 года о животных (научных процедурах) Соединенного Королевства, Положения о поправках 2012 года (Закон).
Через 39 недель собак умерщвляли, и всех животных подвергали детальному вскрытию. Длину тонкого и толстого кишечника измеряли по отдельности и регистрировали в сантиметрах. Весь желудочно-кишечный тракт (начиная с двенадцатиперстной кишки и заканчивая прямой кишкой) извлекали и обрезали любую излишнюю брыжейку, соединительную или жировую ткани, регистрировали измерения тонкого и толстого кишечника, выкладывая тонкую кишку и толстую кишку на чистую поверхность и измеряя рулеткой. Срезы, необходимые для гистопатологии, оставляли невскрытыми и промывали водой. Остальные части вскрывали, промывали водой и тщательно высушивали с помощью промакивания перед взвешиванием. По завершении измерений длины и массы желудочно-кишечный тракт обрабатывали и фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине в соответствии со стандартной практикой вскрытия для этого вида.
Результаты
Наблюдали увеличение длины тонкого кишечника через 39 недель лечения при всех дозах и у обоих полов, причем степень увеличения была наибольшей у самцов и самок, получавших 5 мг/кг/сутки, при этом наблюдали увеличение на 46% и 37% у самцов и самок, соответственно. Этот результат частично восстановился к концу шестинедельного периода восстановления, при этом наблюдали 16% и 19% увеличение у самцов и самок, соответственно, по сравнению с контролями. В том же исследовании наблюдали увеличение массы тонкого кишечника через 39 недель лечения при всех дозах и у обоих полов, причем степень увеличения была наибольшей у самцов и самок, получавших 5 мг/кг/сутки, при этом наблюдали 103% и 80% увеличение у самцов и самок, соответственно. Этот результат частично восстановился к концу шестинедельного периода восстановления, при этом наблюдали 78% и 34% увеличение у самцов и самок, соответственно, относительно контролей.
Пример 5: открытое, частично рандомизированное, состоящее из 3 частей клиническое исследование фазы 1 в параллельных группах для оценки фармакокинетического профиля глепаглутида (ZP1848) после однократной внутривенной инъекции и после многократных подкожных инъекций у здоровых субъектов-людей
Проводили клиническое исследование фазы 1 для характеристики фармакокинетических (PK) профилей глепаглутида (ZP1848) и его основных активных метаболитов после подкожных (п/к) инъекций один раз в неделю и один раз в сутки и после однократной внутривенной (в/в) инфузии у здоровых субъектов. Исследование включало оценку фармакодинамического эффекта на уровни в плазме цитруллина после п/к дозирования у здоровых субъектов. Исследование подтвердило выполнимость схем дозирования, при которых аналоги GLP-2 вводили пациентам по схемам еженедельного дозирования и сравнивали схемы еженедельного дозирования и суточного дозирования.
Дизайн исследования
По дизайну исследование представляло собой одноцентровое, открытое, частично рандомизированное, состоящее из 3 частей исследование в параллельных группах для характеристики профиля ФК глепаглутида, вводимого путем п/к инъекции один раз в сутки в течение 7 дней (часть 1), путем п/к инъекции один раз в неделю в течение 6 недель (часть 2) и путем однократной в/в инфузии (часть 3), у здоровых субъектов.
В части 1 подходящих субъектов рандомизировали в соотношении 1:1 в группу А или В; в части 2 подходящих субъектов рандомизировали в соотношении 1:1 в группу C или D; всем субъектам в части 3 (группа E) был назначен одинаковый уровень дозы.
Количество субъектов
Приблизительно 75 субъектов мужского и женского пола были зачислены в исследование, по 15 субъектов в каждой из 5 групп доз, чтобы гарантировать, что по меньшей мере 12 субъектов завершат лечение в каждой группе.
Диагноз и основные критерии для включения:
2
2
Здоровые субъекты мужского и женского пола в возрасте от 18 до 60 лет включительно, с индексом массы тела (ИМТ) от 18,0 до 30,0 кг/м включительно, и предпочтительно субъекты с ИМТ≤25,0 кг/м.
Испытываемые продукты, доза и способ введения
Глепаглутид поставлялся в виде водного раствора в концентрациях 2 и 10 мг/мл.
Группа A: 1 мг глепаглутида один раз в сутки, вводимого в виде однократных п/к инъекций с 1 по 7 день.
Группа B: 5 мг глепаглутида один раз в сутки, вводимого в виде однократных п/к инъекций с 1 по 7 день.
Группа C: 5 мг глепаглутида один раз в неделю, вводимого в виде однократных п/к инъекций в 1, 8, 15, 22, 29 и 36 день.
Группа D: 10 мг глепаглутида один раз в неделю, вводимого в виде однократных п/к инъекций в 1, 8, 15, 22, 29 и 36 день.
Группа E: 1 мг глепаглутида, вводимого в виде в/в инфузии при скорости 4 мг/ч в течение 15 минут в 1 день.
Продолжительность лечения
Планируемая продолжительность скрининга: приблизительно 28 дней
Общая продолжительность (от скрининга до конца исследования):
Группы A и B: 71 день
Группы C и D: 100 дней
Группа E: 51 день
Критерии оценки:
Фармакокинетика:
1-34
1-35
1/2
ss
ss
z
z
τ
inf
last
max
max
τ
inf
1-34
1-35
Образцы крови отбирали для анализа концентраций в плазме глепаглутида и его основных активных метаболитов, ZP2469 (ZP1848) и ZP2711 (ZP1848); образцы анализировали с применением утвержденных аналитических способов. Следующие оценки параметров ФК вычисляли с применением стандартных некомпартментных способов: терминальный период полувыведения (t), общий клиренс лекарственного средства из организма после внутривенного введения (CL; в/в доза, только исходное лекарственное средство), кажущийся общий клиренс (CL/F; п/к дозы, только исходное лекарственное средство), объем распределения в стационарном состоянии (V; в/в доза, только исходное лекарственное средство), кажущийся объем распределения в стационарном состоянии (V/F; п/к дозы, только исходное лекарственное средство), объем распределения (V; в/в доза, только исходное лекарственное средство), кажущийся объем распределения (V/F; п/к дозы, только исходное лекарственное средство), максимальная наблюдаемая концентрация в плазме (Cmax), площадь под кривой зависимости концентрации в плазме от времени (AUC) в течение интервала дозирования (AUC), AUC от нулевого момента времени до бесконечности (AUC), AUC от нулевого момента времени до последней временной точки с измеримой концентрацией (AUC) и время достижения максимальной наблюдаемой концентрации в плазме (t). Воздействие метаболита (на основании C, AUC и AUC) определяли для каждой группы как отношение 2 первичных активных метаболитов, ZP2469 (ZP1848) и ZP2711 (ZP1848), к исходному лекарственному средству, глепаглутиду.
Фармакодинамика
Образцы крови собирали для измерения цитруллина в плазме (только для п/к доз).
Статистические методы
Фармакокинетика
1-34
1-35
1/2
1-34
1-35
ss
ss
z
z
e
e
max
e
e
e
2
2
2
2
2
2
2
R
=1-((1-R
)
(n-1))/(n-2)
Оценки параметров ФК для глепаглутида, ZP2469 (ZP1848) и ZP2711 (ZP1848) перечислены и обобщены с применением стандартной описательной статистики. Первичные параметры ФК включают t для глепаглутида, ZP2469 (ZP1848) и ZP2711 (ZP1848); и CL (в/в доза), CL/F (п/к дозы), V (в/в доза), V/F (п/к доза), V (в/в доза) и V/F (п/к дозы) для глепаглутида. Период полувыведения вычисляли как LN(2)/k, где ÷k представляет собой оценку наклона терминальной части кривой зависимости LN (концентрация) от времени, с повторением регрессии значений LN (концентрация) с применением последних трех точек с ненулевыми концентрациями, затем последних четырех точек, последних пяти точек и т.д. Точки с нулевым значением концентрации не учитывали. Не использовали точки до C. Для каждой регрессии вычисляли скорректированное R: скорректированное ×; где n представляет собой количество точек данных в регрессии, а R представляет собой квадрат коэффициента корреляции. Применяли k, используя регрессию с наибольшим скорректированным R и, 1) если скорректированный R не улучшается, но находится в пределах 0,0001 от наибольшего значения скорректированного R, регрессию с бóльшим числом точек. 2) k должен быть вычислен по меньшей мере из трех точек данных. 3) Расчетный наклон должен быть отрицательным, чтобы отрицательное значение k для него было положительным. Результаты вычислений, выполненных на предварительных данных, представлены в таблице 4, а результаты вычислений с полным окончательным набором данных представлены в таблице 5.
Фармакодинамика
Концентрации цитруллина в плазме и изменения относительно начального уровня перечислены и обобщены с применением описательной статистики.
Результаты
Первоначальные результаты и анализ для отбора субъектов, включенных в группы A, B, C и D, выявили, что период полувыведения ZP2469 исчисляется в часах, как показано в таблице 4 ниже. Период полувыведения, обнаруженный при использовании однократного еженедельного дозирования, подтверждает возможность применения дозирования пептидов GLP-2 согласно настоящему изобретению один раз в неделю или два раза в неделю.
Таблица 4: предварительные результаты вычисления периода полувыведения
Кол-во доз
1
6
7
Группа
№ субъекта
Период полувыведения ZP2469
(ч)
A
101
20
Один раз в сутки
104
95
105
76
109
36
110
33
112
87
B
102
94
Один раз в сутки
103
75
106
108
107
209
108
59
111
139
C
201
38
11
Один раз в неделю
203
100
17
204
17
16
208
38
32
209
48
40
212
20
22
D
202
56
60
Один раз в неделю
205
52
55
206
38
74
207
43
34
211
34
58
2
После завершения исследования стал доступен окончательный более полный набор данных, который также использовали для вычисления периода полувыведения. Период полувыведения, вычисленный в конкретный период времени от 72 до 168 часов после дозирования (независимо от значения скорректированного R и количества точек данных) для метаболита ZP2469, представлен в таблице 5 ниже.
Таблица 5: Окончательные результаты вычисления периода полувыведения
Кол-во доз
1
6
7
Группа
Субъект
Период полувыведения ZP2469 в интервале от 72 до 168 часов после введения дозы (ч)
A
105
75
1 мг
112
87
Один раз в сутки
115
94
119
80
125
54
126
57
B
102
42
5 мг
103
168
Один раз в сутки
106
77
107
101
108
53
111
101
114
34
116
46
122
100
123
94
127
40
128
84
129
50
C
203
329
26
5 мг
204
41
35
Один раз в неделю
208
38
59
209
48
94
212
59
75
213
48
57
214
61
43
216
Нет данных
52
219
217
107
221
45
33
222
39
68
225
Нет данных
47
226
91
65
229
75
452
D
202
66
60
10 мг
205
54
55
Один раз в неделю
206
120
74
207
36
58
210
46
Нет данных
211
35
70
215
60
59
217
26
30
218
158
102
220
53
53
223
43
60
224
33
42
227
45
48
228
43
56
230
38
17
Пример 6: Трофические эффекты глепаглутида в отношении кишечника после длительного воздействия у крыс
Способы
Крысам линии Вистар ежедневно подкожно (п/к) вводили наполнитель, 1, 3 и 10 мг/кг ZP1848 в течение 26 недель. Дополнительным подгруппам контрольных животных и животных, получавших высокие дозы, обеспечивали 6-недельный период восстановления после завершения периода дозирования. Подгруппам контрольных животных и животных, получавших высокие дозы, обеспечивали 6-недельный период восстановления после завершения периода дозирования. Длину и массу тонкого кишечника и толстого кишечника измеряли при вскрытии как показатели трофических эффектов в отношении кишечника, и кишечный тракт оценивали гистологически.
Результаты
ZP1848 индуцировал значительное дозозависимое (р<0,01) увеличение длины и массы тонкого кишечника у крыс (см. таблицу 5). Кроме того, длина и масса толстого кишечника также незначительно увеличилась. ZP1848 вызывал дозозависимое увеличение гиперплазии слизистой оболочки двенадцатиперстной кишки, тощей кишки и подвздошной кишки. Интересно отметить, что в конце периода восстановления в группах, получавших высокие дозы, все еще присутствовали значительные трофические эффекты в отношении кишечника, несмотря на то, что наблюдали частичное восстановление.
Таблица 6: Процент (%) увеличения относительно контрольной группы (самцы/самки)
Животные в основном исследовании
Животные в период восстановления
Доза (мг/кг)
10
10
Длина тонкого кишечника
38/47
39/45
Масса тонкого кишечника
190/238
85/101
SI = тонкий кишечник.
Вывод
У крыс через 26 недель воздействия ZP1848 наблюдали значительный дозозависимый трофический эффект в отношении кишечника. Подобный эффект также наблюдали у крыс через 7 дней дозирования. При всех дозах в 26-недельном исследовании увеличение длины и массы, а также макроскопическое утолщение и гипертрофию ворсинок отмечали во всех сегментах тонкого кишечника. Эти наблюдения все еще сохранялись после 6-недельного периода восстановления, что указывает на длительные трофические эффекты глепаглутида в отношении кишечника.
Пример 7: Абсолютные изменения абсолютного выделения фекальной массы во влажном состоянии у пациентов с СКК-КД/СКК-КН
Способ
Исследование было разработано как рандомизированное двойное слепое исследование в перекрестных группах с применением трех различных доз ZP1848 (10 мг, 1 мг, 0,1 мг) у 16 пациентов с СКК. Протокол исследования был одобрен Датским медицинским агентством и Датским комитетом по этике медицинских исследований.
18 пациентов с СКК рандомизировали поровну и двойным слепым методом для каждой из шести перекрестных комбинаций уровней доз: 10 мг/1 мг, 10 мг/0,1 мг, 1 мг/10 мг, 1 мг/0,1 мг, 0,1 мг/10 мг, 0,1 мг/1 мг ZP1848. Группа пациентов с СКК включала 9 женщин, 9 мужчин; из них 13 пациентов с СКК-КД и 5 пациентов с СКК-КН. Средний возраст составил 62 года, средняя длина короткого кишечника составила 110 см, и два пациента с СКК-КД имели >50% толстой кишки в целостном состоянии. Пациентам вводили вышеуказанные дозы ZP1848 путем подкожной инъекции один раз в сутки.
Цель данного исследования состояла в том, чтобы оценить эффективность ZP1848 в отношении выделения фекальной массы во влажном состоянии у пациентов с СКК-КН и СКК-КД и, соответственно, абсолютного изменения выделения фекальной массы во влажном состоянии по сравнению с начальным уровнем, измеренным в исследованиях метаболического баланса до начала и в последние 3 дня каждого периода лечения.
Результаты
Из 18 пациентов, рандомизированных и получавших ZP1848, 16 завершили исследование. Результаты изменений абсолютного выделения фекальной массы во влажном состоянии (г/день) представлены в таблице 7 ниже. Улучшения были одинаковыми по величине во всех группах пациентов, т.е. СКК-КН, СКК-КД и у пациентов с ненарушенной целостностью толстой кишки. Это свидетельствует о том, что ZP1848 эффективен для лечения обоих классов пациентов с СКК. Кроме того, авторы настоящего изобретения полагают, что эти результаты подтверждают то, что терапия аналогами GLP-2 с применением ZP1848 эффективна при предотвращении или лечении пациентов с СКК-КН, заболевание которых ухудшается до СКК-КД.
Таблица 7: Изменения абсолютного выделения фекальной массы во влажном состоянии, СКК-КН в сравнении с СКК-КД
Изменения абсолютного выделения фекальной массы во влажном состоянии (г/день)(средние значения [95% ДИ])
0,1 мг
1 мг
10 мг
1 мг + 10 мг
КН+КД (n=16)
173[-160, 506]p=0,274
-592[-913, -272]p=0,002
-833[-1152, -515]p=0,0002
-713[-935, -490]p<0,0001
КД (n=11)
196[-301, 693]p=0,3575
-587[-1080, -95]p=0,0280
-894[-1420, -368]p=0,0072
-741[-1079, -402]p=0,0025
КН (n=5)
-37[-873, 800]p=0,9094
-303[-1310, 704]p=0,4503
-837[-1495, -178]p=0,0243
-570[-1459, -45]p=0,0393
***
Несмотря на то что настоящее изобретение было описано в отношении примерных вариантов реализации, описанных выше, многие эквивалентные модификации и изменения будут очевидны для специалистов в данной области техники, при рассмотрении настоящего описания. Соответственно, изложенные примерные варианты реализации настоящего изобретения рассматриваются как иллюстративные, а не ограничивающие. Различные изменения в описанных вариантах реализации могут быть сделаны без отклонения от сущности и объема настоящего изобретения. Все документы, цитируемые в настоящей заявке, в явной форме включены посредством ссылки.
--->
Перечень последовательностей
<110>  ЗИЛАНД ФАРМА А/С
<120>  СХЕМЫ ДОЗИРОВАНИЯ ДЛЯ ВВЕДЕНИЯ АНАЛОГОВ
ГЛЮКАГОНОПОДОБНОГО ПЕПТИДА-2 (GLP-2)
<130>  SJK/FP7369903
<150>  GB 1709643.9
<151>  2017-06-16
<150>  GB 1714203.5
<151>  2017-09-05
<150>  GB 1800873.0
<151>  2018-01-19
<160>  9
<170>  PatentIn, версия 3.5
<210>  1
<211>  39
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая пептидная последовательность
<400>  1
His Gly Glu Gly Thr Phe Ser Ser Glu Leu Ala Thr Ile Leu Asp Ala
1               5                   10                  15
Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Ala Thr Lys Ile Thr
20                  25                  30
Asp Lys Lys Lys Lys Lys Lys
35
<210>  2
<211>  36
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая пептидная последовательность
<400>  2
His Gly Glu Gly Thr Phe Ser Ser Glu Leu Ala Thr Ile Leu Asp Ala
1               5                   10                  15
Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Ala Thr Lys Ile Thr
20                  25                  30
Asp Lys Lys Lys
35
<210>  3
<211>  35
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая пептидная последовательность
<400>  3
His Gly Glu Gly Thr Phe Ser Ser Glu Leu Ala Thr Ile Leu Asp Ala
1               5                   10                  15
Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Ala Thr Lys Ile Thr
20                  25                  30
Asp Lys Lys
35
<210>  4
<211>  34
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая пептидная последовательность
<400>  4
His Gly Glu Gly Thr Phe Ser Ser Glu Leu Ala Thr Ile Leu Asp Ala
1               5                   10                  15
Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Ala Thr Lys Ile Thr
20                  25                  30
Asp Lys
<210>  5
<211>  33
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая пептидная последовательность
<400>  5
His Gly Glu Gly Thr Phe Ser Ser Glu Leu Ala Thr Ile Leu Asp Ala
1               5                   10                  15
Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Ala Thr Lys Ile Thr
20                  25                  30
Asp
<210>  6
<211>  33
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая пептидная последовательность
<400>  6
His Gly Glu Gly Thr Phe Ser Ser Glu Leu Ala Thr Ile Leu Asp Ala
1               5                   10                  15
Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Ala Thr Lys Ile Thr
20                  25                  30
Asp
<210>  7
<211>  39
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая пептидная последовательность
<400>  7
His Gly Glu Gly Ser Phe Ser Ser Glu Leu Ser Thr Ile Leu Asp Ala
1               5                   10                  15
Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Ala Thr Lys Ile Thr
20                  25                  30
Asp Lys Lys Lys Lys Lys Lys
35
<210>  8
<211>  33
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая пептидная последовательность
<400>  8
His Gly Glu Gly Ser Phe Ser Ser Glu Leu Ser Thr Ile Leu Asp Ala
1               5                   10                  15
Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Ala Thr Lys Ile Thr
20                  25                  30
Asp
<210>  9
<211>  34
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая пептидная последовательность
<400>  9
His Gly Glu Gly Ser Phe Ser Ser Glu Leu Ser Thr Ile Leu Asp Ala
1               5                   10                  15
Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Ala Thr Lys Ile Thr
20                  25                  30
Asp Lys
<---