КОМБИНИРОВАННЫЙ ПРОБИОТИЧЕСКИЙ ПРЕПАРАТ НА ОСНОВЕ СПОРООБРАЗУЮЩИХ БАКТЕРИЙ РОДА BACILLUS (ВАРИАНТЫ) ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В ЖИВОТНОВОДСТВЕ, СПОСОБ ЕГО ПРОИЗВОДСТВА (ВАРИАНТЫ) И ШТАММ BACILLUS SUBTILIS (NATTO), ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ В КАЧЕСТВЕ ДОБАВКИ К ПРЕПАРАТУ
COMBINED PROBIOTIC PREPARATION BASED ON SPORE-FORMING BACTERIA OF BACILLUS GENUS (OPTIONS) FOR USE IN ANIMAL BREEDING, METHOD FOR PRODUCTION THEREOF (VARIANTS) AND BACILLUS SUBTILIS (NATTO) STRAIN USED AS ADDITIVE FOR PREPARATION

Изобретение относится к биотехнологии, в частности, к технологии получения комбинированных пробиотических препаратов для использования в составе комбикормов и премиксов в животноводстве.
Известно большое число пробиотических препаратов для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний человека и животных (ЕР 0097484, ЕР 0043962, US 4289888, RU 2528859, RU 2437563, RU 2493723). Такие препараты, обычно, содержат клетки бактерий, остатки культуральной жидкости (КЖ), жиры, белки, лактозу и различные добавки. Технология их получения включает в себя, как правило, подготовку раствора или взвеси биомассы микроорганизмов, введение в нее специальных добавок, сублимационное высушивание и получение готового продукта. Условия процесса и состав композиций определяются особенностями используемых микроорганизмов и характером поставленной задачи.
В настоящее время одним из перспективных направлений для обеспечения оздоровляющего воздействия пробиотиков на ЖКТ является применение препаратов, содержащих несколько штаммов микроорганизмов, обладающих синергетическим действием (RU 2506810, CN 20131206325, RU 2326692, RU 20040108554).
Bacillus subtilis
Bacillus licheniformis
9
Обычно осуществляют раздельное глубинное культивирование штаммов с получением жидких культур. Затем проводят концентрирование жидких культур с последующим высушиванием полученной биомассы. Недостатком препаратов являются их недостаточная эффективность в отношении повышения резистентности организма к неблагоприятным условиям внешней среды, недостаточная термоустойчивость, относительно узкий спектр воздействия на организм. Наиболее близким по технической сущности к заявляемой группе изобретений является препарат для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний, содержащий клетки штаммов  ВКПМ В--2287 D и  ВКПМ B-2414D в споровой форме с титром не менее 3×10 спор/г, а также наполнитель (RU 2432393). Препарат характеризуется высокой антагонистической активностью, однако, в его состав входят живые микроорганизмы, чувствительные к антибиотикам, что приводит к сужению сферы его применения.
Bacillus subtilis
Bacillus subtilis
Bacillus licheniformis
Bacillus licheniformis
Задачей, стоявшей перед авторами, являлось создание нового комбинированного препарата с повышенной эффективностью на основе симбиотических культур, имеющего более выраженную гидрозил-гидролазную (целлюлолитическую) и антагонистическую активность в отношении болезнетворных микроорганизмов, способного храниться в широком диапазоне потребительских температур. Кроме этого, авторы ставили задачу по увеличению усвояемости животными кальция, необходимого при росте молодых животных и периоде лактации. Для решения поставленной задачи авторы использовали новые штаммы бактерий  ВКМ-B-2998D (полученный из штамма  ВКПМ В-314) и  ВКМ-B-2999D (полученный из штамма  ВКПМ В-8054).
Bacillus subtilis
1.  (сенная палочка) является антагонистом патогенных и условно- патогенных микроорганизмов, таких как сальмонелла, протей, стафилококки, стрептококки, дрожжевые грибки; продуцирует ферменты, удаляющие продукты гнилостного распада тканей, восстанавливает численность популяций лакто- и бифидобактерий, кишечной палочки и других микроорганизмов, составляющих нормофлору желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) и обеспечивающих его нормальное функционирование; синтезирует аминокислоты, витамины и иммуноактивные вещества.
С помощью ненаправленного многоступенчатого УФ мутагенеза и селекции из штамма Bacillus subtilis ВКПМ В-314 был получен штамм Bacillus subtilis с индексом FL 31-14
обладающий высокой антагонистической и гликозил-гидролазной (целлюлолитической) активностью, который использовали при создании нового комплексного препарата.
(депонированный во Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ им. Скрябина РАН под номером ВКМ-B-2998D)
Bacillus licheniformis
2. продуцирует ряд белков, пептидов, ферментов и витаминов, способствует выработке организмом интерферона, которые уничтожают патогенные микробы и вирусы, приводя к нормализации микрофлоры кишечника, способствуют перевариванию пищи, снимают пищевые и химические отравления.
С помощью ненаправленного многоступенчатого УФ мутагенеза и селекции из штамма Bacillus licheniformis ВКПМВ-8054 был получен штамм Bacillus licheniformis с индексом FL 17-11
обладающий всеми перечисленными выше свойствами и отличающийся от исходного штамма устойчивостью к действию антибиотика вирджиниамицина, широко используемого в ветеринарии. Эти свойства позволили использовать его при создании нового комплексного препарата
депонированный во Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ им. Скрябина РАН под номером ВКМ-B-2999D
(), .
Добавки
1.
Кальция глюконат
- кристаллический порошок белого цвета хорошо растворим в воде.
Фармакологическое действие.
Восполняет дефицит кальция в организме - вещества, необходимого для формирования костной ткани, сокращения гладких, скелетных мышц, передачи нервных импульсов, деятельности миокарда, свертывания крови. Является источником органического кальция, который усваивается организмом лучше, чем кальций, входящий в состав неорганических солей.
2.
Bacillus subtilis natto
Для улучшения усвояемости кальция и расширения спектра антагонистической активности целевого пробиотика авторами была использована культура , которая синтезирует в процессе ферментации различные ферменты, витамины, аминокислоты и другие питательные вещества. Главным уникальным компонентом является поли (γ-глутаминовая кислота), которая обладает целым комплексом полезных свойств, а именно:
увеличивает растворимость кальция в толстом кишечнике, тем самым увеличивая
эффективность усвоения кальция;
снижает уровень холестерина в сыворотке крови;
действует как антиокислитель;
обладает фибринолитической активностью.
Bacillus subtilis (natto) также
Candida albicans
Штамм  продуцирует суфрацин - вещество, действующее на .
С помощью ненаправленного многоступенчатого УФ мутагенеза и селекции из штамма Bacillus subtilis (natto) ВКПМ В-12079 был получен штамм Bacillus subtilis (natto) с индексом FL-7, депонированный во Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ им. Скрябина РАН под номером BKM-B-3057D, обладающий всеми перечисленными выше свойствами и отличающийся от исходного штамма увеличенной антагонистической активностью в отношении Candida albicans, что позволило с успехом использовать его при создании нового комплексного препарата.
3.
Ферментный препарат
- Кемзайм Плюс представляет собой сыпучий порошок светло-серого цвета, не растворимый в воде. Кемзайм Плюс содержит комплекс ферментов (ксиланазу, β-глюканазу, целлюлазу, протеазу), а также вспомогательные вещества - известняк (73-83%), бентонит-монтмориллонит (3-7%), растительное масло (0,5-1,5%) Добавка не содержит генно-модифицированных продуктов и организмов.
Bacillus subtilis
Bacillus licheniformis
Бактерии  и  не являются элементами нормофлоры в микробных сообществах человека и животных, но обладают свойствами, которые обеспечивают организму возможность поддерживать состояние микрофлоры на уровне экологически естественного. Они оптимизируют обмен веществ и улучшают снабжение организма биологически активными и строительными веществами, обеспечивают качественное переваривание пищи, оказывают антигистаминное и антитоксическое действие, существенно повышая неспецифическую резистентность организма.
Технический результат
был достигнут созданием группы изобретений, включающей в себя:
Штаммы
B-2998D
B-2999D
ВКМ
Bacillus subtilis (natto)
1.  Bacillus subtilis ВКМ ) и Bacillus licheniformis ВКМ ) -B-3057D в споровой форме;
Препарат состава 1
ВКМ-B-2998D
ВКМ-B-2999D
Bacillus subtilis
Bacillus licheniformis
Bacillus subtilis (natto)
2. , включающий в себя смесь (1:1) штаммов  и  в споровой форме, а также добавки: штамм  ВКМ B-3057D и глюконат кальция.
Препарат состава 2
ВКМ-B-2998D
ВКМ-B-2999D
Bacillus subtilis
Bacillus licheniformis
3. , включающий в себя смесь (1:1) штаммов  и  в споровой форме, а также добавку ферментного препарата Кемзайм Плюс.
Способ получения препарата состава 1
ВКМ-B-2998D
ВКМ-B-2999D
ВКМ-B-2998D и ВКМ-B-2999D
Bacillus subtilis
Bacillus licheniformis
Bacillus subtilis (natto)
Bacillus subtilis (natto)
9
4. , включающий получение штаммов бактерий ,  и штамма  ВКМ B-3057D, последующее раздельное культивирование этих штаммов на мелассно-кукурузной среде при рН 6,8-7,0, концентрирование культуральных жидкостей, сушку, смешивание полученной биомассы штаммов  в споровой форме между собой в соотношении 1:1 и затем с биомассой штамма  ВКМ В- 3057D в количестве 0.15% от массы препарата и глюконатом кальция в количестве 0,1 мас. % от массы препарата с последующей добавкой сухой молочной сыворотки до 100% массы препарата (приводящей к получению препарата с содержанием живых микроорганизмов не менее 5×10 спор/г).
5. Способ получения препарата состава 2
ВКМ-B-2998D
ВКМ-B-2999D
ВКМ-B-2998D и ВКМ-B-2999D
Bacillus subtilis
Bacillus licheniformis
9
, включающий получение штаммов бактерий  и , последующее раздельное культивирование этих штаммов на мелассно-кукурузной среде при рН 6,8-7,0, концентрирование культуральных жидкостей, сушку, смешивание полученной биомассы штаммов  в споровой форме между собой в соотношении 1:1 и затем с ферментным препаратом Кемзайм Плюс в количестве 5% от массы препарата с последующей добавкой сухой молочной сыворотки до 100% массы препарата, приводящей к получению препарата с содержанием живых микроорганизмов не менее 5×10 спор/г.
Важными свойствами нового комбинированного спорового пробиотика являются:
- широкий спектр действия по отношению к патогенным бактериям;
- повышенное содержание кальция;
- обеспечение условий для эффективного усвоения кальция;
- повышенная усвояемость клетчатки;
- термостабильность;
- высокое качество при хранении;
- экологическая безопасность;
- удобство в применении (как в составе комбикорма, так и при выпойке молоком, в составе заменителей).
Bacillus subtilis
Bacillus licheniformis
Bacillus subtilis (natto)
Bacillus subtilis
Bacillus licheniformis
Bacillus subtilis (natto)
Bacillus subtilis
Bacillus licheniformis
ВКМ B-2998D и
ВКМ-B-2999D
состав 1
состав 2
по составу №1
ВКМ B-2998D
ВКМ-B-2999D
по составу 2
ВКМ B-2998D
и
ВКМ-B-2999D
9
9
Новый комбинированный препарат содержит штаммы (), добавки -штамм  ВКМ B-3057D, кальция глюконат и вспомогательное вещество-наполнитель (сухую молочную сыворотку) () или ферментный препарат Кемзайм Плюс (в качестве добавки) () и отличается тем, что  массовое соотношение (%) смеси штаммов ,  и культуры  ВКМ B-3057D, кальция глюконата и наполнителя составляет 0,35:0,15:0,1:99,4 с содержанием жизнеспособных спор не менее 5×10 КОЕ/грамм (колониеобразующих единиц), а  соотношение массы (%) смеси штаммов , ферментного препарата - Кемзайм Плюс и наполнителя составляет 0,5:5,0:94,5 с содержанием жизнеспособных спор не менее 5×10 КОЕ/грамм.
Практическое применение.
Новый препарат может использоваться как в сухой, так и в жидкой формах путем введения в корм или питье. Количество скармливаемых препаратов (по составу 1 и составу 2) было одинаковым и составляло 1 г/гол./сут. с молоком для телят до 1 мес. возраста + 0,5 кг/т комбикорма в составе комбикорма. В результате проведенных комплексных исследований было установлено, что использование препаратов при выпойке телят и в составе комбикормов-стартеров способствовало увеличению среднесуточных приростов живой массы на 5,9 и 8,5%, соответственно, повышению переваримости питательных веществ, снижению затрат кормов на единицу прироста.
для коров
Применение нового препарата  в период лактации в количестве 1,0 кг/т комбикорма (для состава 1 и состава 2) способствовало увеличению среднесуточных удоев 4%-ного молока на 11,1 и 6,8%, соответственно, повышению переваримости питательных веществ, снижению затрат кормов на единицу произведенной продукции.
Заключение по исследованию продуктивности поросят:
результаты выращивания свиней с 1 до 105-дневного возраста показали эффективность использования исследуемых препаратов при выпойке поросят-подсосков (0-45 дней), а также возможность включения их в состав комбикормов для поросят в период доращивания (45-105 дней) в составе комбикорма-стартера.
Исследования крови
поросят показало, что во всех опытных группах наблюдается статистически значимое увеличение количества эритроцитов по сравнению с контролем. Во всех группах эти показатели не выходили за рамки физиологической нормы. Тем не менее, достоверное увеличение количества эритроцитов говорит о потенциально высокой резистентности организмов животных опытных групп.
Заключение по исследованию кала:
На основании результатов исследования, можно сделать вывод, что процесс пищеварения и усвояемости пищевых веществ в организме животных опытной группы, протекают более интенсивно, степень перевариваемости выше, что отразилось в итоге на приросте живой массы животных.
В результате проведенных исследований было показано, что препарат повышает эффективность профилактики и лечения животных, сочетает противомикробную защиту организма со стимулирующим воздействием на него, при одновременном увеличении конверсии корма с высоким содержанием клетчатки и кальция и расширяет ассортимент лечебно-профилактических препаратов природного происхождения.
Сущность заявляемой группы изобретений иллюстрируются, но не ограничивается следующими примерами.
Пример 1.
Получение штамма Bacillus subtilis ВКМ B-2998D.
Bacillus subtilis
Bacillus subtilis
ВКМ B-2998D
С помощью ненаправленного многоступенчатого УФ мутагенеза и селекции из штамма  ВКПМ В-314 был получен новый штамм , обладающий высокой антагонистической и гликозил-гидролазной (целлюлолитической) активностью, который использовали при создании нового комплексного препарата.
УФ мутагенез
2
6
3
3
2
4
4
. Водную суспензию спор помещали на расстояние 40 см от УФ лампы (Mineralight, мощность 12,5 Вт с длиной волны 254 нм), при этом интенсивность излучения лампы составляла 0,25 мВт/см. Смыв с поверхности агаризованной среды фильтровали через стерильный ватный фильтр или через фильтровальную воронку Шотта (размер пор 100 мкм). В полученной суспензии при помощи камеры Горяева-Тома подсчитывали концентрацию спор. При необходимости суспензию разводили до концентрации (1,5-2)*10 спор/см. После подсчета и разведения суспензия подвергалась облучению в открытой чашке Петри. Посев производили на предварительно подготовленные чашки Петри с агаром, содержащим микрокристаллическую целлюлозу (МКЦ) или карбоксиметилцеллюлозу (КМЦ) в составе, %: NaNO - 0,2; KHPO - 0,1; MgSO - 0,05; KCl - 0,05; МКЦ (КМЦ) - 1,0; пептон - 0,02; агар - 2,0. Чашки инкубировали при температуре 37°C в течение суток.
Скрининг и отбор изолированных колоний.
В. subtilis
На первом этапе были построены кривые выживаемости колоний  в зависимости от дозы облучения, а также определена зависимость частоты возникновения морфологических мутаций от дозы облучения. С учетом этих данных была определена оптимальная доза облучения, дающая максимальное число мутаций и в то же время обеспечивающая определенную степень выживаемости изолированных колоний. Степень выживаемости изолятов определяли по соотношению выросших колоний в необлученном контроле и после УФ-облучения. Колонии с измененной морфологией визуально отбирали и пересевали на свежую агаризованную среду. После инкубирования чашки Петри с выросшими изолированными культурами окрашивали водным раствором Люголя. Предварительно приготовленный раствор Люголя (KI - 2 гр, I - 1 гр, 300 мл дист. воды) в количестве 20-25 мл наливали в чашки Петри, оставляли на 3-5 минут, затем чашки осушали. Отбор полученных штаммов осуществляли по наличию и величине зон просветления на агаре. В результате был отобран штамм с индексом FL 31-14, дающий максимальную величину зоны просветления.
Идентификация полученного штамма
х
2
4
2
FL 31-14. Для проведения полимеразной цепной реакции и дальнейшего секвенирования ПЦР-фрагментов гена 16SpPHK были использованы универсальные праймерные системы, позволяющие детектировать как эубактерии (11f-1492r), так и археи (8fa-A915R). Объем амплификационной смеси составлял 50 мкл и имел следующий состав: 1 буфер ДНК полимеразы BioTaq (17 мМ (NH4)SO, 67 мMTris-HCl, рН 8.8, 2 мМMgCl); по 12.5 нмоль каждого из dNTP, 50 нг ДНК-матрицы; по 5 пмоль соответствующих праймеров и 3 ед. ДНК полимеразы BioTaq (Диалат ЛТД, Россия). Температурно-временной профиль ПЦР был следующим: первый цикл - 94°C × 9 мин, 55°C × 1 мин, 72° × 2 мин; последующие 30 циклов - 94°C × 1 мин, 55°C × 1 мин, 72°C × 2 мин; завершающий цикл - 72°C × 7 мин.
Анализ продуктов ПЦР проводили при помощи электрофореза в 2% геле агарозы при напряженности электрического поля 6 В/см.
Выделение и очистку продуктов ПЦР проводили из легкоплавкой агарозы с применением набора реактивов WizardPCRPreps (Promega, США), согласно рекомендациям производителя.
Секвенирование полученных ПЦР-фрагментов генов, кодирующих 16SpPHK, проводили по методу Сэнгера с соавт. с помощью набора реактивов BigDyeTerminatorv.3.1 (Applied Biosystems, Inc., USA) на генетическом анализаторе ABIPRIZM 3730 (Applied Biosystems, Inc., USA) согласно инструкциям производителя. При этом для секвенирования использовали праймеры и чтение проводили в двух направлениях.
Bacillus subtilis
По данным RDPClassifier, исследованный штамм с индексом FL-31-14 принадлежит к представителям рода  на уровне сходства нуклеотидных последовательностей генов 16SpPHK 95%
Первичный анализ сходства нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК изучаемого штамма проводили с помощью программного пакета BLAST. Согласно данным BLAST - анализа, ближайшими последовательностями генов 16SpPHK были последовательности, представленные в (см. Таблице 1)
Культурально-морфологические признаки.
Bacillus subtilis
Полученный штамм  с индексом FL-31-14 имеет клетки-палочки с закругленными концами, расположенные одиночно, парами. Колонии белые, матовые, с неровным краем. Образуют анаэробно споры овальной формы, которые располагаются в клетки центрально. Окраска по Грамму - грамположительная. Штамм хорошо растет на мясо-пептонном агаре (МПА), БТН-агаре, а также на среде Гаузе №2, образуя матовые колонии кремоватого цвета с неровными краями.
Физиолого-биохимические признаки.
Bacillus subtilis
Штамм  с индексом FL-31-14 ферментирует лактозу, глюкозу, арабинозу, ксилозу с образованием кислоты без газа. Редуцирует нитраты, обеспечивает метиленовую синь. Коагулазной, гиалуронидазной, лецитазной активностью не обладает. Обладает высокой гликозил-гидролазной (целлюлолитической) и антогонистической активностью. Культуру поддерживают на среде Гузе №2 следующего состава, %: триптон - 0,3; мясной пептон - 0,5; глюкоза - 1,0; натрий хлористый - 0,05; агар - 2,0, с пересевом не реже 1 раза в месяц, хранят на МПА и Гаузе №2. Оптимальная температура роста - 37°C, рН - 7,0.
Состав среды: LB-среда, %: триптон - 1; дрожжевой экстракт - 0,5; NaCl -1.
Отобранный в результате УФ мутагенеза и селекции штамм
Bacillus subtilis
с индексом FL-31-14 депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ им. Скрябина РАН под номером ВКМ-B-2998D.
Пример 2.
Получение штамма Bacillus licheniformis ВКМ B-2999D
Bacillus licheniformis
Bacillus licheniformis
ВКМ B-2999D
С помощью ненаправленного многоступенчатого УФ мутагенеза и селекции из штамма  ВКПМ В-8054 был получен новый штамм , устойчивый к действию антибиотика вирджиниамицина, (используемого в ветеринарии), который в дальнейшем использовали при получении нового комплексного препарата.
УФ мутагенез
2
6
3
В. licheniformis
. Водную суспензию спор помещали на расстояние 40 см от УФ лампы (Mineralight, мощность 12,5 Вт с длиной волны 254 нм), при этом интенсивность излучения лампы составляла 0,25 мВт/см. Смыв с поверхности агаризованной среды фильтровали через стерильный ватный фильтр или через фильтровальную воронку Шотта (размер пор 100 мкм). В полученной суспензии при помощи камеры Горяева-Тома подсчитывали концентрацию спор. При необходимости суспензию разводили до концентрации (1,5-2)*10 спор/см. После подсчета и разведения суспензия подвергалась облучению в открытой чашке Петри. Посев производили на предварительно подготовленные чашки Петри со средой БТН, состава, %: мясной пептон - 2,0; дрожжевой экстр. - 0,3; NaCl - 0,5; агар - 2,0. Чашки инкубировали при температуре 37°С в течение суток. Скрининг и отбор изолированных колоний. На первом этапе были построены кривые выживаемости колоний  в зависимости от дозы облучения, а также определена зависимость частоты возникновения морфологических мутаций от дозы облучения. С учетом этих данных была определена оптимальная доза облучения, дающая максимальное число мутаций и в то же время обеспечивающая определенную степень выживаемости колоний. Степень выживаемости колоний определяли по соотношению выросших колоний в необлученном контроле и после УФ-облучения. Колонии с измененной морфологией визуально отбирали и пересевали на свежую агаризованную среду, содержащую сублетальную для исходного штамма дозу вирджиниамицина (1000 мкг/мл). Выросшие на такой среде наиболее крупные изолированные колонии отбирали для дальнейшего культивирования на среде, содержащей различные концентрации вирджиниамицина. В результате был отобран штамм с индексом FL-17-11, устойчивый к антибиотику вирджиниамицину в минимально ингибирующей концентрации >1000 мкг/мл.
Идентификация полученного штамма
х
4
2
4
2
с индексом FL-17-11. Для проведения полимеразной цепной реакции и дальнейшего секвенирования ПЦР-фрагментов гена 16SpPHK были использованы универсальные праймерные системы, позволяющие детектировать как эубактерии (11f-1492r), так и археи (8fa-A915R). Объем амплификационной смеси составлял 50 мкл и имел следующий состав: 1 буфер ДНК полимеразы BioTaq (17 мМ (NH)SO, 67 мМTris-HCl, рН 8.8, 2 мМMgCl); по 12.5 нмоль каждого из dNTP, 50 нг ДНК-матрицы; по 5 пмоль соответствующих праймеров и 3 ед. ДНК полимеразы BioTaq (Диалат ЛТД, Россия). Температурно-временной профиль ПНР был следующим: первый цикл - 94°С × 9 мин, 55°С × 1 мин, 72°С × 2 мин; последующие 30 циклов - 94°С × 1 мин, 55°С × 1 мин, 72°С × 2 мин; завершающий цикл - 72°С × 7 мин.
Анализ продуктов ПЦР проводили при помощи электрофореза в 2% геле агарозы при напряженности электрического поля 6 В/см.
Выделение и очистку продуктов ПЦР проводили из легкоплавкой агарозы с применением набора реактивов WizardPCRPreps (Promega, США), согласно рекомендациям производителя.
Секвенирование полученных ПЦР-фрагментов генов, кодирующих 16SpPHK, проводили по методу Сэнгера с соавт. с помощью набора реактивов BigDyeTerminatorv.3.1 (Applied Biosystems, Inc., US А) на генетическом анализаторе ABIPRIZM 3730 (Applied Biosystems, Inc., USA) согласно инструкциям производителя. При этом для секвенирования использовали праймеры и чтение проводили в двух направлениях.
Первичный анализ сходства нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК изучаемого штамма проводили с помощью программного пакета BLAST. Согласно данным BLAST - анализа, ближайшими последовательностями генов 16SpPHK были следующие последовательности, (см. Таблицу 2)
Bacillus licheniformis
Bacillus licheniformis
По данным RDPClassifier, исследованный штамм с индексом FL-17-11, полученный из штамма  ВКПМ В-8054, принадлежит к представителям рода  на уровне сходства нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК95%.
Культурально-морфологические признаки.
Bacillus licheniformis
Штамм  с индексом FL-17-11 имеет клетки прямые, палочковидные, длиной 2-3 мкм, подвижные. Образуют анаэробно споры овальной формы, которые располагаются в клетки центрально. Окраска по Грамму - грамположительная. Штамм хорошо растет на мясо-пептонном агаре (МПА), сусло-агаре, БТН-агаре и среде Гаузе №2 образуя матовые гладкие колонии белого цвета с неровными краями.
Физиолого-биохимические признаки
. Ферментирует лактозу, глюкозу, арабинозу, ксилозу с образованием кислоты без газа. Редуцирует нитраты, обеспечивает метиленовую синь. Коагулазной, гиалуронидазной, лецитазной, целлюлолитической активностью не обладает, устойчив к действию антибиотика вирджиниамицина. Культуру поддерживают на БТН-агаре следующего состава %: пептон - 2,0; дрожжевой экстр. - 0,3; NaCl - 0,5; агар - 2,0; с пересевом не реже 1 раза в месяц, хранят на среде Гаузе №2 и БТН-агаре.
Оптимальная температура роста - 37°С, рН - 7,0. Состав среды: LB-среда, %: триптон - 1; дрожжевой экстракт - 0,5; NaCl -1.
Отобранный в результате УФ мутагенеза и селекции штамм
Bacillus licheniformis
с индексом 17-11 депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ им. Скрябина РАН под номером ВКМ-B-2999D.
Пример 3.
Получение штамма
Bacillus subtilis
(natto)
BKM-B-3057D
С помощью ненаправленного многоступенчатого УФ мутагенеза и селекции из штамма Bacillus subtilis (natto) ВКПМ В-12079 был получен новый штамм Bacillus subtilis (natto)
-B-3057D, обладающий всеми свойствами характерными для исходного штамма и отличающийся от него увеличенной антагонистической активностью в отношении Candida albicans.
ВКМ
УФ мутагенез
2
6
3
3
2
4
4
. Водную суспензию спор помещали на расстояние 40 см от УФ лампы (Mineralight, мощность 12,5 Вт с длиной волны 254 нм), при этом интенсивность излучения лампы составляла 0,25 мВт/см. Смыв с поверхности агаризованной среды фильтровали через стерильный ватный фильтр или через фильтровальную воронку Шотта (размер пор 100 мкм). В полученной суспензии при помощи камеры Горяева-Тома подсчитывали концентрацию спор. При необходимости суспензию разводили до концентрации (1,5-2)*10 спор/см. После подсчета и разведения суспензия подвергалась облучению в открытой чашке Петри. Посев производили на предварительно подготовленные чашки Петри с агаром, содержащим микрокристаллическую целлюлозу (МКЦ) или карбоксиметилцеллюлозу (КМЦ) в составе, %: NaNO - 0,2; KHPO - 0,1; MgSO - 0,05; KCl - 0,05; МКЦ (КМЦ) - 1,0; пептон - 0,02; агар - 2,0. Чашки инкубировали при температуре 37°С в течение суток.
В. subtilis (natto)
Candida albicans
Candida albicans
Скрининг и отбор изолированных колоний. На первом этапе были построены кривые выживаемости колоний  в зависимости от дозы облучения, а также определена зависимость частоты возникновения морфологических мутаций от дозы облучения. С учетом этих данных была определена оптимальная доза облучения, дающая максимальное число мутаций и в то же время обеспечивающая определенную степень выживаемости колоний. Степень выживаемости колоний определяли по соотношению выросших колоний в необлученном контроле и после УФ-облучения. Колонии с измененной морфологией визуально отбирали и пересевали на свежую агаризованную среду. После инкубирования чашки Петри с выросшими изолированными колониями использовали для выявления наибольшей антагонистической активности по отношению к тест-культуре  АТСС10231 методом отсроченного антагонизма [ОФС.1.7.2.0009.15 Определение специфической активности пробиотиков, раздел 3 Фармакопея 13]. Отбор штаммов осуществляли по наличию максимальной зоны подавления роста тест-культуры  АТСС10231. В результате был отобран штамм с индексом FL 7, дающий максимальную величину зоны подавления роста на уровне 25 мм.
Идентификация изолированного штамма
х
4
2
4
2
с индексом FL 7 Для проведения полимеразной цепной реакции и дальнейшего секвенирования ПЦР-фрагментов гена 16SpPHK были использованы универсальные праймерные системы, позволяющие детектировать как эубактерии (11f-1492r), так и археи (8fa-A915R). Объем амплификационной смеси составлял 50 мкл и имел следующий состав: 1 буфер ДНК полимеразы BioTaq (17 мМ (NH)SO, 67 мМTris-HCl, рН 8.8, 2 мМMgCl); по 12.5 нмоль каждого из dNTP, 50 нг ДНК-матрицы; по 5 пмоль соответствующих праймеров и 3 ед. ДНК полимеразы BioTaq (Диалат ЛТД, Россия).
Температурно-временной профиль ПНР был следующим: первый цикл - 94°С × 9 мин, 55°С × 1 мин, 72°С × 2 мин; последующие 30 циклов - 94°С × 1 мин, 55°С × 1 мин, 72°С × 2 мин; завершающий цикл - 72°С × 7 мин.
Анализ продуктов ПЦР проводили при помощи электрофореза в 2% геле агарозы при напряженности электрического поля 6 В/см.
Выделение и очистку продуктов ПЦР проводили из легкоплавкой агарозы с применением набора реактивов WizardPCRPreps (Promega, США), согласно рекомендациям производителя.
Секвенирование полученных ПЦР-фрагментов генов, кодирующих 16SpPHK, проводили по методу Сэнгера с соавт. с помощью набора реактивов BigDyeTerminatorv.3.1 (Applied Biosystems, Inc., USA) на генетическом анализаторе ABIPRIZM 3730 (Applied Biosystems, Inc.,USA) согласно инструкциям производителя. При этом для секвенирования использовали праймеры и чтение проводили в двух направлениях.
Первичный анализ сходства нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК изучаемых штаммов проводили с помощью программного пакета BLAST. Согласно данным BLAST - анализа, ближайшими последовательностями генов 16SpPHK были следующие последовательности (см. Таблицу 3)
Bacillus subtilis
По данным RDPClassifier, исследованный штамм с индексом FL-7, принадлежит к представителям рода  на уровне сходства нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК 95%.
ХАРАКТЕРНЫЕ ПРИЗНАКИ:
I. Культурально-морфологические и микроскопические особенности штамма
Bacillus subtilis (natto) с индексом FL-7.
Клетки культуры имеют вид палочек с закругленными концами, расположенные одиночно, парами. Споры овальные, не превышающие размер клетки, расположены центрально. Окраска по Грамму - грамположительная. На мясо-пептонном агаре (МПА), БТН-агаре, а также на среде Гаузе №2, образует матовые колонии кремоватого цвета с неровными краями.
Candida albicans
II. Физиолого-биохимические свойства. Хорошо растет в интервале температур от 30 до 45°С. Минимальная температура 10°С, максимальная 50°С. Растет в интервале рН от 4,5 до 9,0, оптимально - при рН 7,5. При сбраживании сахаров газа не образует. Гидролизует крахмал. Реакция Фогес-Проскауэра (образование ацетилметилкарбинола) положительная. Индол не образует.Дезаминирование фенилаланина не происходит.Разлагает тирозин и использует цитрат. Проявляет гемолитическую активность - β гемолиз, Обладает значительной антагонистической активностью в отношении .
Условия хранения:
Культуру поддерживают пересевом не реже 1 раза в месяц, хранят на МПА и Гаузе №2. Культура хорошо хранится при замораживании (-70°С) в 40% глицерине, в лиофилизированном состоянии (защитная среда - обезжиренное молоко).
Отобранный штамм
Bacillus subtilis (natto)
с индексом FL-7 депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ им. Скрябина РАН под номером ВКМ-B-3057D.
Пример 4
Получение сухой биомассы штаммов
В. subtilis
ВКМ B-2998D и
В. licheniformis
BKMB-2999D.
В. subtilis
В. licheniformis
Штаммы  ВКМ B-2998D и  ВКМ B-2999D культивируются раздельно в ферментере с мелассно-кукурузной средой:
Среда для культивирования
Bacillus subtilis
3
ВКМ B-2998D в 1 дм
Меласса - 25 г
Кукурузный экстракт -12,5 г
2
CaCl - 1 г
4
MgSO - 0,25 г
4
MnSO- 0.03 г
2
CoCl - 0.046 г
4
FeSO - 0.001 г
4
CuSO - 0.001 г
3
пеногаситель - 0,5 см
3
вода водопроводная - до 1 дм
Среда для культивирования Bacillus licheniformis
в 1 дм
3
ВКМ B-2999D
Меласса - 33 г
Кукурузный экстракт -17,5 г
2
CaCl - 1 г
4
MgSO - 0,25 г
4
MnSO - 0.03 г
2
CoCl - 0.046 г
4
FeSO - 0.001 г
4
CuSO - 0.001 г
3
пеногаситель - 0,5 см
3
вода водопроводная - до 1 дм.
3
2
Ферментацию проводят при рН 6,8-6,9 и температуре 37°С, расходе воздуха (100- 150) дм в минуту, скорости перемешивания 50-200 об/мин; pO - 30-50% в фазе интенсивного роста культуры. Продолжительность процесса ферментации 18-22 часа.
Процесс считается законченным, если концентрация клеток в споровой форме составляет 93-95%
В. subtilis
В. licheniformis
3
По окончании инкубации штаммов  ВКМ B-2998D и  ВКМ B-2999D культуральную жидкость концентрируют на высокоскоростной центрифуге с периодической выгрузкой концентрата. Центрифугирование культуральной жидкости проводят при скорости вращения ротора - 15000 об/мин. Скорость подачи культуральной жидкости 130-150 л/ч. Содержание сухих веществ в полученном концентрате биомассы - 35-40%).
В. subtilis
В. licheniformis
По окончании центрифугирования концентраты биомассы штаммов  ВКМ B-2998D и  ВКМ B-2999D подвергают распылительной сушке.
Режимы сушки: Температура на входе в сушильную камеру - 130-135°С; Температура на выходе из сушильной камеры - 80-84°С.
Bacillus subtilus
Bacillus licheniformis
12
Высушенная биомасса содержит не более 5% влаги, выход в расчете на культуральную жидкость 65-66,5%. Содержание жизнеспособных спор  ВКМ B-2998D и  ВКМ B-2999D -не менее 1,0×10 КОЕ/г.
Пример 5
Получение целевого продукта состава 2
состава 2
Bacillus subtilus
Bacillus licheniformis
9
Для получения целевого продукта  с содержанием жизнеспособных спор штаммов  ВКМ B-2998D и  ВКМ B-2999D 5×10 КОЕ/г используют смеситель периодического действия.
Bacillus subtilus
Bacillus licheniformis
В смеситель, вносят сухие концентраты биомассы штаммов  ВКМ B-2998D и  ВКМ B-2999D в количестве 125 г каждой культуры и тщательно перемешивают в течение 10 мин., затем добавляют 2500,0 г комплексного ферментного препарата - Кемзайм Плюс и вновь перемешивают в течение 20 мин. После этого загружают 50 кг сухой молочной сыворотки, перемешивают еще 30 минут и получают целевой продукт.
Пример 6.
Получение сухой биомассы штамма Bacillus subtilis (natto) ВКМВ-3057D
Среда для культивирования Bacillus subtilus (natto)
в 1 дм
3
ВКМ B-3057D
Меласса - 25 г
Кукурузный экстракт -12,5 г
Дрожжевой экстракт - 1 г
Триптон - 0,3 г
2
CaCl - 1 г
4
MgSO - 0,25 г
4
MnSO - 0.03 г
2
CoCl - 0.046 г
4
FeSO - 0.001 г
4
CuSO - 0.001 г
3
пеногаситель - 0,5 см
3
вода водопроводная - до 1 дм.
3
2
Ферментацию проводят при рН 6,8-6,9 и температуре 37°С, расходе воздуха 100-200 дм в минуту, скорости перемешивания 50-200 об/мин; pO - 30-50% в фазе интенсивного роста культуры. Продолжительность процесса ферментации 20-24 часа.
Процесс считается законченным, если концентрация клеток в споровой форме составляет 93-95%.
По окончании инкубации штамма культуральную жидкость концентрируют на высокоскоростной центрифуге с периодической выгрузкой концентрата.
Центрифугирование культуральной жидкости проводят при скорости вращения ротора - 15000 об/мин. Скорость подачи культуральной жидкости 130-150 л/ч. Содержание сухих веществ в биомассе - 35-40%.
Bacillus subtilis natto
По окончании центрифугирования полученный концентрат биомассы штамма  ВКМ B-3057D подвергают распылительной сушке.
Режимы сушки: Температура на входе в сушильную камеру - 130-135°С; Температура на выходе из сушильной камеры - 80-84°С.
natto
12
Высушенная биомасса содержит не более 5% влаги, выход в расчете на культуральную жидкость 60-65%. Содержание жизнеспособных спор в сухой биомассе Bacillus subtilus  ВКМ B-3057D не менее 1,0×10 КОЕ/г.
Пример 7
Получение целевого продукта состава 1
состава 1
Для получения целевого продукта  используют смеситель периодического действия.
Bacillus subtilus
Bacillus licheniformis
Bacillus subtilis natto
9
В смеситель загружают сухие биомассы штаммов  ВКМ B-2998D,  ВКМ B-2999D в количестве 87,5 г каждой культуры и перемешивают в течение 10 минут. Затем добавляют сухую биомассу штамма  ВКМ B-305D в количестве 75 граммов и 50 г глюконата кальция и вновь порошки тщательно перемешивают в течение 20 мин. После этого загружают 50 кг сухой молочной сыворотки, перемешивают еще 30 минут и получают целевой продукт с содержанием жизнеспособных спор на уровне 5×10 КОЕ/г.
Пример 8.
Изучение стабильности нового комплексного пробиотика.
Была изучена стабильность препарата методом естественного хранения при температуре 22±2°С во влагонепроницаемом бумажном пакете с полимерным покрытием.
Полученные результаты приведены в таблице 4.
Как показывают полученные результаты, после хранения препарата при комнатной температуре на протяжении 24 мес. содержание живых микробных клеток остается на высоком уровне.
Результаты проведенных экспериментов показали высокую термостабильность нового препарата. Кратковременное повышение температуры не оказывает существенного влияния на качество препарата.