Рост микромицетов и бактерий на различных целлюлозных субстратах

BIOLOGICAL SCIENCES

УДК: 579.61:577.15

Гордонова И.К., Никитина З.К.

ФГБНУ Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений

Москва

DOI: 10.24411/2520-6990-2019-10183 РОСТ МИКРОМИЦЕТОВ И БАКТЕРИЙ НА РАЗЛИЧНЫХ ЦЕЛЛЮЛОЗНЫХ СУБСТРАТАХ

Gordonova I.K., Nikitina Z.K.

All-Russian Scientific Institute of Medicinal and Aromatic Plants

Moscow

THE GROWTH OF MICROMYCETES AND BACTERIA ON DIFFERENT CELLULOSIC

SUBSTRATES

Аннотация

Изученные микромицеты и бактерии обладали способностью к росту на средах с частичной или полной заменой сахарозы на различные субстраты, содержащие целлюлозу. Анализ гидролитической активности микроорганизмов, включающий определение скоростей роста, зон лизиса и индексов лизиса показал, что все исследованные культуры могут быть использованы для гидролиза целлюлозы и растительного сырья.

Abstract

The studied micromycetes and bacteria were able to growth on media with partial or full replacement of sucrose in the culture medium on the different substrates containing cellulose. Analysis of the hydrolytic activity of microorganisms, including the determination of growth rates, lysis zones and lysis indexes showed that all studied cultures can be used for the hydrolysis of cellulose and plant raw material.

Ключевые слова: микромицеты, бактерии, целлюлоза, растительное сырье.

Key words: micromycetes, bacteria, cellulose, plant raw material.

Целлюлоза является самым распространенным органическим источником для получения продуктов питания, топлива и химических веществ [1]. Однако возможность использования этого биополимера требует его конверсии до уровня глюкозы или целлобиозы. Деструкция с помощью химических или температурных факторов малоэффективна, так как может приводить к разрушению сахаров. Поэтому наиболее применимым способом конверсии целлюлозного сырья является ее ферментативное расщепление с помощью различных микроорганизмов: бактерий, актиномицетов, мице-лиальных грибов [2 - 4]. В связи с этим поиск микроорганизмов - активных продуцентов целлюлаз является актуальной биотехнологической задачей. При этом для тестирования большого количества штаммов с успехом могут быть применены разнообразные скрининг-методы [5]. Целью настоящего исследования является изучение роста микромице-тов и бактерии на различных целлюлозных субстратах для выявления их гидролитического потенциала.

Объектом исследования служили бактерии -Escherichia coli АТСС 25922 (ГКПМ ГИСК им. Л.А. Тарасевича) и микромицеты- Aspergillus flavus F 52, Penicillium citrinum F 54, P. martensii F 63 (коллекция ФГБНУ ВИЛАР). Бактерии выращивали на скошенной поверхности мясо-пептонного агара

при 370С, микромицеты - на среде Чапека при 240С. Затем проводили посев тремя уколами на агаризо-ванные среды следующего состава. Для культивирования микромицетов среда содержала (%): NaNO3 - 0,2; KH2PO4 - 0,1; MgSO4 x 7H2O - 0,05; KCl

- 0,05; FeSO4 x 7H2O - 0,001; CaCO3 - 0,3; агар-агар

- 2 с 0,5% сахарозы или без нее. При культивировании бактерий использовался минеральный фон среды М9: Na2HPO4 - 6 г, КН2РО4 - 3 г, NaCl - 0,5 г, NH4Q - 1 г, 1М MgSO4 - 2 мл, 1М CaCl2 - 0,1 мл, тиамина хлорида - 5 мг, агар - 20 г, H2O - до 1 л с добавлением 0,1% глюкозы или без нее. В среды добавляли по 0,5% различных целлюлозных субстратов: HL-cellulosa (Serva) со степенью полимеризации 180-200, траву зверобоя («Красно-горсклексредства») и шрот цветков пижмы (ФГБНУ ВИЛАР). Целлюлолитическую активность микроорганизмов оценивали по скорости радиального роста колоний. Диаметр колоний измеряли в двух перпендикулярных направлениях. Кроме того, на разных этапах культивирования чашки Петри открывали, заливали на несколько минут раствором Люголя для окрашивания, измеряли диаметр зон лизиса и рассчитывали индексы лизиса по ранее предложенной схеме [6].

Известно, что рост микроорганизмов в условиях полной или частичной замены легко усвояе-

<<шушетим-ши©мак>>#Щ12)),2(

13

мых сахаров на труднометаболизируемые биополимеры, например, нерастворимые белки или целлюлозу, позволяет оценить их потенциальную гидролитическую активность. Появление зон лизиса целлюлозы вокруг колоний является показателем секреции ферментов в окружающую среду [5]. В

связи с этим на первом этапе исследования фиксировались диаметры колоний и диаметры зон лизиса при культивировании микроорганизмов на средах с полной или частичной заменой сахарозы на целлюлозу (табл. 1 - 4).

Таблица 1

Параметры роста A. flavus при культивировании на средах с целлюлозой

Среда Время культивирования, сутки

3 4 5 6 7

Дк Дл Дк Дл Дк Дл Дк Дл Дк Дл

Пижма 8,4 - 14,9 - 16,8- - 19,4 - 23,4 38,4

Зверобой 12,5 - 13,3 - 19,7 - 26,2 29,3 26,4 29,2

HL-cellulosa 10,6 - 13,6 - 16,0 30,3 19,6 28,6 21,3 39,5

Примечание: здесь и в других таблицах Дк - диаметр колоний в мм, Дл - диаметр зон лизиса в мм, рн роста нет, ин - исследования не проводились.

При этом при использовании ИЬ-целлюлозы в среды добавляли небольшое количество сахарозы (0,5% среды для микромицетов) или глюкозы (0,1% среда для бактерий) для инициации начального роста культуры при культивировании [7], а при использовании в средах шрота цветов пижмы и травы зверобоя необходимости в добавлении углеводов

не наблюдалось. Культура A. flavus хорошо растет на всех субстратах, содержащих целлюлозу, и образовывает зоны лизиса (рис. 1). Практически на всех этапах культивирования наибольшая скорость роста наблюдается на средах с травой зверобоя (табл. 1).

Рис. 1. Колонии и зоны лизиса A. flavus при культивировании на среде с частичной заменой сахарозы на

HL-cellulosa. Окраска раствором Люголя.

Микромицет P. citrinum также активно рос на всех целлюлозных субстратах (табл. 2) с образованием зон лизиса (рис. 2). Однако в данном случае скорость роста на средах с травой зверобоя была минимальной по сравнению с двумя другими сре-

дами. Так, средняя скорость роста культуры P. а^ rinum на среде со шротом цветов пижмы была в 1,5 раза больше, а при росте на среде с целлюлозой в 1,7 раза больше, чем на среде с травой зверобоя. Диаметр зон лизиса был также минимален на среде с травой зверобоя.

Таблица 2

Параметры роста Р. сЫгтиш при культивировании на средах с целлюлозой

Среда Время культивирования, сутки

3 4 5 6 7

Дк Дл Дк Дл Дк Дл Дк Дл Дк Дл

Пижма 8,4 - 13,0 - 16,8 - 19,9 - 23,4 38,4

Зверобой 5,5 - 7,9 - 11,1 - 17,2 - 17,6 22,6

HL-cellulosa 7,9 11,6 15,1 22,2 20,0 28,3 23,0 29,2 27,2 42,2

Рис. 2. Колонии и зоны лизиса P. citrinum при культивировании на среде со шротом цветов пижмы.

Окраска раствором Люголя.

Из трех изученных микромицетов мицелиальный гриб P. martensii F 63 обладал наибольшими скоростями роста на всех средах, содержащих целлюлозу, также образовывая большие зоны лизиса (рис. 3). Это приводило к необходимости досрочного прекращения культивирования на 5 и 6 сутки на средах со зверобоем и целлюлозой соответственно в связи с большими размерами колоний и ограниченным размером питательной среды в чашке Петри.

Таблица 3

Параметры роста P. martensii при культивировании на средах с целлюлозой_

Среда Время культивирования, сутки

3 4 5 6 7

Дк Дл Дк Дл Дк Дл Дк Дл Дк Дл

Пижма 19,3 - 14,9 - 23,5 - 26,8 - 31,0 41,6

Зверобой 17,3 - 23,3 - 42,7 45,7 ин ин ин ин

HL-cellulosa 15,5 25,3 27,9 29,9 35,8 39,3 43,7 47,7 ин ин

Рис. 3. Колонии и зоны лизиса P. martensii на средах с частичной заменой сахарозы на HL-cellulosa. Слева - 3 сутки культивирования, без окраски. Справа - 4 сутки культивирования, окраска раствором Люголя

Известно, что некоторые штаммы аэробных и анаэробных бактерий могут обладать целлюлазной активностью [3]. В связи с этим на следующем этапе исследования проводилось изучение гидролитической активности E.coli (табл. 4). Активнее всего бактерии росли на среде с целлюлозой. С 5

суток рост колоний прекращался, однако зоны лизиса продолжали увеличиваться, что может свидетельствовать о продолжающейся секреции гидро-лаз. При этом скорости роста E.coli были значительно ниже, чем у грибов на всех средах с целлюлозными субстратами.

Таблица 4

Параметры роста E. coli при культивировании на средах с целлюлозой_

Среда Время культивирования, сутки

3 4 5 6

Дк Дл Дк Дл Дк Дл Дк Дл

Пижма 4,6 7,4 8,6 10,6 8,6 11,6

Зверобой 5,8 - 9,0 - 9,5 11,5 9,5 15,4

HL-cellulosa 10,3 - 12,3 - 12,3 14,3 12,3 19,2

Наряду с такими параметрами роста микроорганизмов, как диаметр колоний и зон лизиса, важным показателем является индекс лизиса. Индекс лизиса определяется соотношением площади колонии и площади зоны лизиса и характеризует удельную протеолитическую активность культуры, так как площадь колонии пропорциональна ее биомассе, а площадь зоны лизиса - активности секре-тируемых целлюлаз. В связи с этим на следующем этапе исследования были рассчитаны индексы лизиса микроорганизмов при росте на средах, содержащих целлюлозу (табл. 5).

Установлена способность исследованных микроорганизмов утилизировать целлюлозу. На основании сравнения средних индексов лизиса можно считать, что гидролитическая активность культур меняется следующим образом: A. flavus > P. cit-rinum > E. coli > P. martensii. Однако относительно небольшие диаметры колоний E. coli на средах с целлюлозой, свидетельствующие о незначительном накоплении биомассы, не позволяют на данном этапе исследования рекомендовать культуру в качестве потенциального продуцента целлюлаз. В то же время высокие скорости роста P. martensii на фоне относительно низких индексов лизиса делает микромицет перспективным для дальнейшего исследования.

Список литературы

1. Рабинович М.Л., Болобова А.В., Кондра-шенко В.И. Теоретические основы биотехнологии древесных композитов. Древесина и разлагающие ее грибы. М.: Наука. - 2001. 264 с.

2. Рабинович М.Л., Мельник М.С., Болобова А.В. Структура и механизм действия целлюлолити-ческих ферментов // Биохимия. 2002. - Т. - 67. № 8. - С. 1026-1050.

Можно видеть, что индексы лизиса лежат в диапазоне от 1,14 до 3,59. Стабильно высокие индексы отмечены для микромицетов A.flavus и P.cit-rinum при росте на среде с целлюлозой. При росте микроорганизмов на растительных субстратах индексы лизиса обычно ниже. Возможно, это связано с присутствием в них других питательных веществ, отличных от целлюлозы, использование которых не требует активной секреции целлюлаз. Индексы лизиса у E. coli на всех трех субстратах подобны и в целом не сильно отличаются от аналогичных показателей у грибов.

Таблица 5

3. Скомаровский А.А., Марков А.В., Гусаков А.В. Новые целлюлазы для высокоэффективного гидролиза лигноцеллюлазной биомассы // Прикл. биохим. и микробиология. - 2006. - Т - 42. № 6. - С. 674-680.

4. Рабинович М.Л., Мельник М.С., Болобова А.В. Целлюлазы микроорганизмов // Прикл. биохим. и микробиология. - 2002. - Т. 38. №4. - С. 355373.

5. Яковлева М.Б., Никитина З.К. Скрининг-методы в биотехнологии (Обзор). Часть 1. Поиск микроорганизмов-продуцентов ферментов. // Вопросы биол., медицинской и фармацевтической химии -2016. - № 4. - С. 23-32.

6. Никитина З.К., Яковлева М.Б., Гордонова И.К., Зон Хы Чол Сравнительная оценка роста дей-теромицетов при использовании различных белок-содержащих субстратов // Вопросы биол., медицинской и фармацевтической химии. - 2015. - № 11. -С. 56-59.

7. Никитина З.К., Гордонова И.К. Влияние состава питательной среды на целлюлолитическую активность микроорганизмов // Проблемы и вопросы современных наук.- 2018. - № 1(1). - С. 21-25 DOI: 10.18411/pivsn-4, IDSP: pivsn-4.

Индексы лизиса микроорганизмов при росте на средах с целлюлозой

Культура Среда Время культивирования, сутки

3 4 5 6 7

E. coli Пижма - - 1,56 2,08 ин

Зверобой - - 1,47 2,63 ин

HL-cellulosa - - 1,35 2,44 ин

A.flavus Пижма - - - - 2,71

Зверобой - - - 1,25 1,23

HL-cellulosa 1,0 1,0 3,59 2,13 3,44

P.citrinum Пижма - - - - 1,79

Зверобой - - - - 1,65

HL-cellulosa 2,25 2,17 2,08 1,93 2,41

P. martrnsii Пижма - - - 1,21 ин

Зверобой - - 1,15 ин ин

HL-cellulosa 2,85 1,14 1,24 1,19 ин