СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МОДИФИЦИРОВАННЫХ НУКЛЕОТИДОВ РНК

1. Способ обнаружения модифицированного нуклеотида в составе исследуемой РНК, включающий получение контрольной РНК, двух олигонуклеотидных зондов разной длины, комплементарных исследуемой РНК, при этом один из зондов, имеющих меньшую длину, комплементарен РНК в области, содержащей исследуемый нуклеотид, и имеет температуру плавления меньшую, чем температура плавления второго зонда, один из зондов содержит молекулу донора флуоресценции, а другой - тушитель флуоресценции, при этом донор флуоресценции и тушитель флуоресценции подобраны с обеспечением перекрывания диапазона длин волн испускаемого донором флуоресценции излучения с диапазоном длин волн излучения, поглощаемого тушителем флуоресценции; смешение зондов с исследуемой и контрольной РНК, после чего полученные смеси подвергают нагреву до температуры, обеспечивающей полную денатурацию исследуемой РНК и зондов, медленному охлаждению до температуры, обеспечивающей образование стабильных дуплексов между РНК и зондами, и повторному медленному контролируемому нагреву с одновременным облучением и измерением интенсивности флуоресценции и получением кривых плавления для исследуемой и контрольной РНК, при этом выводы о наличии или отсутствии модификации в исследуемом нуклеотиде РНК делают по итогам сравнения кривых, и при совпадении характера кривых и/или температуры плавления делают вывод о наличии/отсутствии модификации в исследуемой РНК при наличии/отсутствии модификации в контрольной РНК в зоне гибридизации более короткого зонда.
2. Способ по п.1, характеризующийся тем, что в качестве контрольной РНК используют РНК с известной структурой в исследуемой области, а исследуемая РНК аналогична контрольной или отличается от контрольной наличием или отсутствием модификации в исследуемом нуклеотиде.
3. Способ по п.1, характеризующийся тем, что исследуемая и контрольная РНК являются рибосомными или матричными, или транспортными.
4. Способ по п.1, характеризующийся тем, что зонды подбирают из условия гибридизации их на РНК в непосредственной близости без перекрывания.
5. Способ по п.1, характеризующийся тем, что более длинный зонд подбирают с температурой плавления, превышающей температуру плавления второго зонда более чем на 5°С.
6. Способ по п.4, характеризующийся тем, что первый и второй зонды подбирают из условия гибридизации их на РНК на расстоянии друг от друга не далее, чем на 10 нуклеотидов между их ближайшими концами.
7. Способ по п.1, характеризующийся тем, что первый и второй зонды подбирают из условия расположения молекул донора флуоресценции и тушителя флуоресценции на расстоянии не более чем на 10 нуклеотидов друг от друга при гибридизации зондов на РНК.
8. Способ по п.1, характеризующийся тем, что молекулы донора флуоресценции и тушителя флуоресценции к зондам присоединяют ковалентно.
9. Способ по п.1, характеризующийся тем, что зонды состоят из рибонуклеотидов и/или дезоксирибонуклеотидов и/или из их аналогов и могут содержать любые модификации, не препятствующие проведению исследования.
10. Способ по п.1, характеризующийся тем, что смешение зондов с РНК осуществляют с добавлением буферного раствора, включающего вещество, поддерживающее рН раствора в диапазоне 6-8.5, и соль одновалентного или мультивалентного катиона.
11. Способ по п.10, характеризующийся тем, что для смешения зондов с РНК используют 2-10 пмоль РНК, 2-10 пмоль олигонуклеотида зонда, содержащего донор флуоресценции, 2-10 пмоль зонда, содержащего тушитель флуоресценции, 2-10 мкл 5-кратного буфера для гибридизации, содержащего 200-300 мМ Tris-HCl рН 8.3, 150-250 мМ KCl и деионизированную воду для доведения объема образца до 10-50 мкл.
12. Способ по п.11, характеризующийся тем, что смесь дополнительно содержит минеральное масло в количестве 3-10 мкл.
13. Способ по п.1, характеризующийся тем, что нагрев и охлаждение смесей осуществляют с контролируемой скоростью, при этом измерение интенсивности флуоресценции осуществляют в процессе нагревания.
14. Способ по п.1, характеризующийся тем, что первоначальный нагрев осуществляют до температуры смесей 70-95°С, медленное охлаждение происходит со скоростью 0.5-4°/мин. до достижения температуры смеси 30-10°С, повторный нагрев смесей производят со скоростью 0.5°/30 с до достижения смесями 55-95°С.
15. Способ по п.1, характеризующийся тем, что охлаждение проводят до температуры, значение которой ниже температуры плавления короткого зонда не менее чем на 5°С.
16. Способ по п.1, характеризующийся тем, что повторный нагрев смесей осуществляют до температуры, значение которой превышает температуру плавления более короткого зонда, не менее чем на 5°С.
17. Способ по п.1, характеризующийся тем, полученные кривые плавления преобразуют в кривые зависимости производных интенсивности флуоресценции по температуре от температуры (дифференциальные кривые).