РЕАССОРТАНТНЫЕ BTV И AHSV ВАКЦИНЫ
REASSORTANT BTV AND AHSV VACCINES

Перекрестные ссылки на родственные заявки
Эта заявка испрашивает приоритет согласно предварительной заявке США 61/659,198 опубликованной 13 июня 2012.
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение имеет отношение к композициям для борьбы с инфекцией вирусом катаральной лихорадки (вирусом синего языка, BTV) или вирусом африканской чумы лошадей (AHSV) у животных. Настоящее изобретение предоставляет фармацевтические композиции, содержащие рекомбинантный BTV или AHSV вектор, способы вакцинации против BTV или AHSV, и наборы для применения в таких способах и композициях.
Уровень техники изобретения
Катаральная лихорадка («синий язык», ВТ) представляет собой переносимую членистоногими инфекционную вирусную болезнь жвачных животных. Крупный рогатый скот и козы могут быть легко инфицированы вызывающим болезнь вирусом BTV, при этом у них не наблюдается обширное повреждение сосудов и поэтому у этих видов в большинстве случаев отсутствуют явные клинические признаки болезни. В противоположность этому, болезнь у овец характеризуется катаральным воспалением слизистых оболочек рта, носа и переднего отдела желудка, и воспалением эпителия венчика копыт и основы кожи копыт. Наблюдается экскориация (отделение) эпителия и, в конечном счете, некроз слизистой оболочки щек; распухший и воспаленный язык и рот может принимать синюю окраску, из-за которой болезнь получила свое название (Spreull 1905). Процент смертности у овец оценивается на уровне 1-30%.
BTV является прототипным вирусом рода Orbivirus (семейство Reoviridae) и состоит, по меньшей мере, из 24 различных серотипов (Wilson and Mecham 2000). Установлено, что разные штаммы BTV распространены по всему миру на всем протяжении тропических зон и зон умеренного климата. BTV инфекция встречается до 45°N в Европе, до 50°N в Азии и Северной Америке и до 35° в Южной. BTV не является заразным при контакте между жвачными животными, и поэтому распространение BTV зависит от присутствия членистоногого переносчика вида Culicoides sp. (кровососущая мошкара), в зависимости от разных видов переносчиков, встречающихся в разных регионах мира. Недавно полученные данные показывают, что генетический дрейф (случайное распространение генетических мутаций в популяции) и эффект основателя способствуют диверсификации отдельных сегментов гена полевых штаммов BTV (Bonneau, Mullens et al. 2001). Показано, что BTV-серопозитивные животные являются устойчивыми к повторному заражению гомологичным BTV-серотипом.
BTV-инфекция жвачных животных является временной, тогда как заражение насекомого переносчика Culicoides является постоянным. Продолжительность вирусемии зависит от вида животных и штамма BTV. Сообщалось, что вирусемия может быть очень кратковременной у овец и может продолжаться вплоть до 41 дней у животных, инфицированных BTV, до 42 дней у коз и до 100 дней у крупного рогатого скота. Поскольку BTV-инфекция крупного рогатого скота часто приводит к продолжительной, но не постоянной вирусемии, крупный рогатый скот служит резервуаром, из которого вирус может быть передан носителю Culicoides, а затем другим жвачным животным (Anderson, Stott et al. 1985; MacLachlan 1994; MacLachlan and Pearson 2004). Экология многих видов переносчиков Culicoides плохо изучена, места их размножения в большей степени неохарактеризованы, и скорость их распространения неизвестна. Culicoides sonorensis является основным переносчиком BTV в Северной Америке. Самки насекомых Culicoides становятся устойчиво инфицированными BTV и могут передавать вирус после инкубационного периода, составляющего до 14 дней (Mullens, Tabachnick et al. 1995). Перезимовавший в умеренном поясе BTV может распространяться вертикально посредством инфицированных насекомых переносчиков, хотя последние данные показывают, что наблюдается пониженная экспрессия генов внешнего капсида в условиях постоянной BTV инфекции в личиночной стадии насекомых переносчиков (White, Wilson et al. 2005).
Вирионы BTV имеют диаметр ~69 нм и покрыты двойной оболочкой (капсид), которая иногда окружена липопротеиновой "псевдооболочкой", происходящей из клеточных мембран инфицированных клеток. Геном BTV включает 10 различных сегментов двухцепочечной РНК, которые совместно кодируют семь структурных (с VP1 по VP7) и четыре неструктурных (NS1, NS2, NS3 и NS3a) белка (Roy 1996); 9 из геномных сегментов являются моноцистронными, в то время как сегмент 10 кодирует и NS3 и NS3A, используя второй кодон инициации внутри рамки. Геномная РНК инкапсулируется в икосаэдрическую частицу вириона двуслойным белковым капсидом (Verwoerd, Els et al. 1972). Икосаэдрическая сердцевина (кор) состоит из двух основных (VP3 и VP7) и трех минорных белков (VP1, VP4, VP6) и окружена внешним капсидом, состоящим из VP2 и VP5, которые соответственно кодируются геномными сегментами 2 и 5 (Roy 1996). VP2 несет ответственность за связывание и вход BTV в клетки, нейтрализацию, серотип-специфичность и гемагглютинацию. Мультимерные формы VP2 (димеры и тримеры) «украшают» значительную часть поверхности VP5, размещаясь на внешней поверхности вирусных частиц (Hassan and Roy 1999). VP2 разнятся больше всего между 24 серотипами BTV, а уровни анти-VP2 антитела коррелируют с нейтрализацией вируса in vitro и in vivo (Huismans and Erasmus 1981). VP5 также заметно варьирует между различными серотипами и штаммами BTV (de Mattos, de Mattos et al. 1994; DeMaula, Bonneau et al. 2000), и хотя до настоящего времени не установлены VP5-специфические нейтрализующие MAb, результаты подтверждают, что этот белок играет роль в нейтрализации и установлении серотипа посредством его конформационного влияния на VP2 (Huismans and Erasmus 1981; Roy, Urakawa et al. 1990; DeMaula et al., 2000). Очищенный VP2, иммуноадсорбированный с BTV-антикоровой сывороткой для удаления следовых количеств VP7, был введен овце. Первоначальная доза 50 микрограмм VP2 была достаточной, чтобы индуцировать VP2-приципитирующие антитела, а также нейтрализующие антитела и антитела, ингибирующие гемагглютинацию. Эти овцы были полностью защищены от заражения вирулентным штаммом того же самого серотипа BTV. Более низкие дозы VP2 по-прежнему обеспечивали значительный уровень защиты, несмотря на то, что нейтрализующие антитела не были обнаружены до заражения (Huismans, van der Walt et al. 1987). Недавние исследования показали, что VP2 и NS1 экспрессируют эпитопы, распознаваемые цитотоксическими Т-лимфоцитами (CTL) (Andrew, Whiteley et al. 1995), кроме того, маловероятно, что VP7 и VP5 имеют CTL эпитопы. До настоящего времени VP3, VP4, VP6, NS2 и NS3 не стимулировали CTL ответ у овцы (Lobato, Coupar et al. 1997). В таблице 1 (из работы Wilson and Mecham 2000) ниже суммированы гены BTV и функции их белков.
Конкретные BTV антигенные полипептиды, представляющие интерес, включают VP2 и VP5. Икосаэдрическая сердцевина состоит из двух основных (VP3 и VP7) и трех минорных белков (VP1, VP4, VP6) и окружена внешним капсидом, состоящим из VP2 и VP5, которые соответственно кодируются геномными сегментами 2 и 5 (Roy 1996). VP2 является ответственным за связывание и вход BTV в клетки, нейтрализацию, серотип-специфичность и гемагглютинацию. Мультимерные формы VP2 (димеры и тримеры) «украшают» значительную часть поверхности VP5, размещаясь на внешней поверхности вирусных частиц (Hassan and Roy 1999). VP2 разнятся больше всего между 24 серотипами BTV, а уровни анти-VP2 антитела коррелируют с нейтрализацией вируса in vitro и in vivo (Huismans and Erasmus 1981). VP5 также заметно варьирует между различными серотипами и штаммами BTV (de Mattos, de Mattos et al. 1994; DeMaula, Bonneau et al. 2000), и хотя до настоящего времени не установлены VP5-специфические нейтрализующие МАЬ, результаты подтверждают, что этот белок играет роль в нейтрализации и установлении серотипа посредством его конформационного влияния на VP2 (Huismans and Erasmus 1981; Roy, Urakawa et al. 1990; DeMaula et al., 2000). Очищенный VP2, иммуноадсорбированный с BTV-анти-коровой сывороткой для удаления следовых количеств VP7, был введен овце. Первоначальная доза 50 микрограмм VP2 была достаточной, чтобы индуцировать VP2-приципитирующие антитела, а также нейтрализующие антитела и антитела, ингибирующие гемагглютинацию. Эти овцы были полностью защищены от заражения вирулентным штаммом того же самого серотипа BTV. Более низкие дозы VP2 еще обеспечивали значительный уровень защиты, несмотря на то, что нейтрализующие антитела не были обнаружены до заражения (Huismans, van der Walt et al. 1987). Недавние исследования показали, что VP2 и NS1 экспрессируют эпитопы, распознаваемые цитотоксическими Т-лимфоцитами (CTL) (Andrew, Whiteley et al. 1995), и кроме того маловероятно, что VP7 и VP5 имеют CTL эпитопы. До настоящего времени VP3, VP4, VP6, NS2 и NS3 не стимулировали CTL ответ у овцы (Lobato, Coupar et al. 1997), смотри таблицу 1.
Африканская чума лошадей (AHS) представляет собой опасное, часто смертельное, переносимое членистоногими вирусное заболевание лошадей и мулов (African Horse Sickness, The Merck Veterinary Manual). Уровень смертности может составлять вплоть до 95% при некоторых формах этой болезни. Бессимптомные и легкие инфекции могут наблюдаться у лошадей, а также у зебр и ослов, в частности, у лошадей, которые ранее были инфицированы другим серотипом данного вируса. Инфицированные животные или переносчики могут переносить вирус в регионы, свободные от AHS. Некоторые авторы предполагают, что изменение климата может увеличивать риск распространения переносимых членистоногими болезней, таких как африканская чума лошадей, как последнее время происходило с родственным вирусом «синего языка» (Wilson A et al., Parasitol. Res. 2008; 103: 69-77). Culicoides imicola, основной переносчик этой болезни, проник в Северную Африку и Южную Европу. Потенциальные членистоногие переносчики также существуют практически во всех регионах мира, включая большую часть Соединенных Штатов Америки и остальную часть Северной и Южной Америки.
Африканская чума лошадей возникает в результате заражения вирусом африканской чумы лошадей, членом рода Orbivirus семейства Reoviridae. К настоящему времени известно 9 серотипов вируса африканской чумы лошадей. 9 серотип вируса африканской чумы лошадей имеет широкое распространение в эндемических зонах, тогда как серотипы с 1 по 8 обнаруживаются преимущественно в ограниченных географических областях. Серотип 9 несет ответственность за большинство вспышек африканской чумы лошадей вне Африки. Серотип 4 вызвал одну вспышку эпидемии в Испании и Португалии между 1987 и 1990 (Lubroth J., Equine Pract. 1988; 10: 26-33).
Первоначальное исследование вируса африканской чумы лошадей привело к созданию ослабленной модифицированной живой противовирусной вакцины, приготовленной с использованием клеток мозга мыши, против вируса африканской чумы лошадей в 1930-х годах. Эти вакцины были очищены и привели к созданию ослабленной модифицированной живой вакцины (MLV) с использованием культуры ткани в 1960-х годах.
Несмотря на эффективность этой вакцины, она имеет некоторые свойственные для нее ограничения, включающие реакции на вакцину (в том числе гибель) у отдельных животных, разный иммунный ответ у отдельных животных, трудности иммунизации молодых животных с пассивным материнским иммунитетом, возможность возврата к вирулентности вакцинного вируса и восстановление вакцинных штаммов после вакцинации с возможным возвратом к вирулентности (du Plessis M. et al. 1998, Onderstepoort Journal of Veterinary Research 65: 321-329). Существуют также социально-экономические последствия, связанные с использованием MLV вакцины. Южная Африка имеет соглашение, позволяющее экспортировать лошадей в Европейский союз и ряд других стран. Это соглашение также делает возможным ввоз лошадей из других стран в Южную Африку для участия в различных соревнованиях или «подроста» на ферме в течение кратковременного периода. Данный протокол основывается на убеждении, что лошадей надлежащим образом вакцинируют против вируса африканской чумы лошадей. Ветеринарные учреждения осознают возможные угрозы, связанные с использованием MLV вакцины. Большинство этих проблем, вероятно, разрешится при создании альтернативных вакцин против вируса африканской чумы лошадей.
Геном вируса африканской чумы лошадей состоит из десяти двухцепочечных РНК сегментов (Oellermann, R. А. et а1., 1970; Bremer, С.W. et al., 1976), которые кодируют, по меньшей мере, десять вирусных белков. Сегменты генома пронумерованы 1-10 в порядке их перемещения в PAGE. Семь из вирусных белков являются структурными и образуют вирусную частицу в двуслойной оболочке. Наружный капсид состоит из двух основных вирусных белков, VP2 и VP5, которые определяют антигенную изменчивость вирусов африканской чумы лошадей, тогда как внутренний капсид состоит из двух основных (VP3 и VP7) и трех минорных (VP1, VP4 и VP6) вирусных белков (Lewis SA and Grubman MJ, 1991; Martinez-Torrecuadrada JL et al., 1994); Bremer, CW, et al. 1990; Grubman, M. J. & Lewis, S. A., 1992). VP3 и VP7 являются высоко консервативными среди девяти серотипов (Oellermann et al., 1970; Bremer et al., 1990). Установлено, по меньшей мере, три неструктурных белка NS1, NS2 и NS3 (Huismans, Н. & Els, Н. J., 1979; van Staden, V. & Huismans, Н., 1991; Mizukoshi, N. et al., 1992).
Рекомбинантные канарипокс вирусы, полученные из ослабленных вирусов, были созданы в качестве векторов для экспрессии гетерологичных вирусных генов. Ряд из этих канарипокс-конструктов был лицензирован в качестве вакцин во многих странах, включая Южную Африку, Европейский союз и Соединенные Штаты Америки, для применения на лошадях (Minke JM, et al., 2004a and b; Minke JM, et al., 2007; Siger L, et al.2006) и других видах (Poulet Н, et al., 2003).
Тот факт, что эти вакцины содержат гены только представляющего интерес организма, делает их изначально более безопасными (Minke JM, et al., 2004b). Кроме того, появление обнаружимого нейтрализующего антитела происходит быстро даже после одной дозы вакцины (Minke JM et al., 2004b). Присущая безопасность таких вакцин и характер развития нейтрализующего антитела делают такие вакцины особенно привлекательными для использования при эпизоотиях (Minke JM et al., 2004а).
Предшествующие исследования показали, что у лошадей вырабатываются нейтрализующие антитела к AHS, когда им был инокулирован экзогенно экспрессированный VP2 и подходящий адъювант (Scanlen M, et al., 2002). Исследования на овцах показали, что ответ нейтрализующих антител на вирус «синего языка» усиливается при инокулировании овцы вирусоподобными частицами, в которых VP2 и VP5 являются ко-экспрессированными (Pearson LD, Roy P, 1993). Недавно было показано, что рекомбинантная канарипокс-вирусная вакцина, ко-экспрессирующая гены, кодирующие белки VP2 и VP5 наружного капсида вируса «синего языка», индуцирует высокие уровни защиты у овец (Boone JD, et al., 2007).
Не было показано, что у лошадей вырабатываются нейтрализующие антитела к вирусу африканской чумы лошадей при инокулировании вектором, содержащим и ко-экспрессирующим AHSV VP2 и VP5. Таким образом, следует иметь в виду, что настоящее изобретение восполняет потребность в данной области путем предоставления рекомбинантного поксвируса, включая композиции и продукты с его применением, в частности, рекомбинанты на основе ALVAC, и композиции и продукты с их использованием, в частности, подобные рекомбинанты, экспрессирующие AHSV VPs 2 и 5 или любые их комбинации и композиции и продукты из них.
Исследования, имеющие отношение к генетической модификации BTV или AHSV, описаны Piet A van Rijn et al. (Virology Journal, 2010, 7: 261), Polly Roy et al. (Journal of Viology, 2011, 85, 19; 10213-10221), Polly Roy et al. (Journal of Viology, 2008, p8339-8348), Massimo Palmarini et al. (PloS pathogens, 2011, 7(12): e1002477), и в WO 2009/068870.
Таким образом, было бы целесообразно предоставить улучшенные иммуногенные и вакцинные композиции против BTV и AHSV, и способы изготовления и использования таких композиций, включая подобные композиции, которые предназначаются для различных диагностических методов, анализов и наборов.
С учетом чувствительности животных, включая людей, к BTV или AHSV, способ предотвращения BTV или AHSV инфекции и защиты животных имеет существенное значение. Соответственно, существует потребность в эффективной вакцине против BTV или AHSV.
Подробное описание изобретения
Предоставляются композиции, содержащие один или более рекомбинантных реассортантных BTV или AHSV векторов, включающих один или более гетерологичных полинуклеотидов, кодирующих, по меньшей мере, один антиген BTV или AHSV.
Способы изобретения включают методы изготовления рекомбинантных реассортантных BTV или AHSV композиций или векторов. Способы также включают способы использования, включающие введение животному эффективного количества композиций или векторов с целью получения защитного иммунного ответа.
Краткое описание чертежей
Следующее подробное описание, предоставленное в виде примера, но не предназначающееся для ограничения изобретения только описанными конкретными вариантами осуществления, может быть лучше понято в сочетании с прилагаемыми чертежами.
Фигура 1 (А-В) показывает схематическое изображение реассортантных BTV-1 и BTV-8 и схему-алгоритм создания рекомбинантных реассортантных BTV векторов. На фигуре 1А отображена каждая комбинация монореассортанта. Кроме того, кор BTV-1 или 8 были спасены с помощью белков внешнего капсида VP-2 или VP-5 гетерологичного вируса. На фигруре 1В представлено общее представление о процессе спасения. РНК синтезируют из линеаризованной плазмиды и трансфицируют в BSR клетки. Спаснные вирусы отобрали и амплифицировали в клеточной культуре для подтверждения генотипа с помощью RT-PCT и секвенироания.
Фигура 2 показывает средние диаметры бляшек BTV реассортантов.
Фигура 3 показывает анализ кривых роста реассортантных вирусов. Большинство реассортантов растет аналогично исходным вирусам дикого типа.
8VP5
1VP2
1VP2,VP5
1VP5
8VP2
8VP2,VP5
Фигура 4 (А-В) показывает результаты нейтрализации BTV. VP2 оказался ответственным за нейтрализацию вируса. На 4А показано, что BTV-1, BTV-1 и BTV-8 и BTV-8 все были нейтрализованы BTV-1 антисывороткой, но не BTV-8 антисывороткой, тогда как BTV-8, BTV-8, BTV-1 и BTV-1 все были нейтрализованы BTV-8 антисывороткой, но не BTV-1 антисывороткой. На фигуре 4В представлен обобщенный рисунок: BTV нейтрализация коррелирует с VP2, вне зависимости от VP5 (для BTV-1: BTV-8 реассортантов)
Фигура 5 показывает получение BTV реассортантов. BTV реассортанты были «спасены» с помощью 9 сегментов BTV-1 дикого типа и включения VP2 любого из BTV-8 (В), из BTV-2 (С) или из BTV-9 (Е).
Фигура 6 показывает схематическое изображение получения BTV реассортантов с использованием реверсивной генетики.
Фигура 7 показывает таблицу, содержащую SEQ ID NO и последовательности ДНК и белков.
Фигура 8 показывает динамику изменения средних значений ректальной температуры после заражения.
Фигура 9 показывает разброс максимальной гипертермии.
Фигура 10 показывает динамику изменения среднего значения ежедневного клинического счета.
Фигура 11 показывает дисперсию (разброс) общего клинического показателя.
Фигура 12 показывает дисперсию средних титров виремии.
Фигура 13 показывает разброс AUC.
Фигура 14 показывает изменение среднего значения BTV-8 титров нейтрализующих антител.
Фигура 15 показывает морфологию бляшек sBTV, содержащих VP2 и VP5 белок каждого серотипа.
Фигура 16 показывает титры вирусов sBTV в ВНК-21.
Фигура 17 показывает титр инфекции, ELISA, Dot Blot Vp2 для BTV1+BTV8 VP2 (RAS10).
Фигура 18 показывает титр инфекции, ELISA, Dot Blot Vp2 for BTV1+BTV8 VP2/VP5 (RAS32).
Подробное описание
Предоставляются композиции, содержащие один или более рекомбинантных BTV или AHSV векторов, содержащих один или более гетерологичных полинуклеотидов, кодирующих, по меньшей мере, один антиген из BTV или AHSV, который вызывает иммуногенный ответ у животного. В одном варианте осуществления полипептидный антиген представляет собой BTV VP2 или VP5 полипептид или его активный фрагмент или вариант.
Понятно, что антигенные полипептиды изобретения могут быть полноразмерными полипептидами или их активными фрагментами или вариантами. Под "активными фрагментами" или "активными вариантами" подразумевается, что фрагменты или варианты сохраняют антигенную природу полипептида. Таким образом, настоящее изобретение рассматривает любой BTV или AHSV полипептид, антиген, эпитоп или иммуноген, вызывающий иммуногенный ответ у животного. BTV или AHSV полипептид, антиген, эпитоп или иммуноген может быть любым BTV или AHSV полипептидом, антигеном, эпитопом или иммуногеном, таким как, но без ограничения, белок, пептид или его фрагмент или вариант, который вызывает или стимулирует ответ у животного, такого как овца, корова, коза или лошадь.
Настоящее изобретение имеет отношение к овечьим, коровьим, козьим или лошадиным вакцинам или композициям, которые могут содержать эффективное количество рекомбинантного BTV или AHSV вектора и приемлемого фармацевтически или с точки зрения ветеринарии носителя, эксципиента, адъюванта (вспомогательного средства) или разбавителя (среды).
В некоторых вариантах осуществления вакцины дополнительно содержат адъюванты, такие как масло-в-воде (O/W), описанные в патенте США 7,371,395.
В других вариантах осуществления адъюванты включают EMULSIGEN, гидроксид алюминия и сапонин, и CpG, или их комбинации.
В некоторых вариантах осуществления ответ у животного является защитным иммунным ответом.
Под термином "животное" подразумевается млекопитающее, птица и тому подобное. Животное или хозяин включает млекопитающих и человека. Животное может быть выбрано из группы, состоящей из лошадиных (например, лошадь), псовых (например, собаки, волки, лисы, койоты, шакалы), кошачьих (например, львы, тигры, домашние кошки, дикие кошки, другие большие кошки и другие кошачьи, включая гепардов и рысей), овечьих (например, овцы), бычьих (например, крупный рогатый скот), свиньих (например, свинья), козлиных (например, коза), птичьих (например, курица, утка, гусь, индейка, перепелка, фазан, попугай, вьюрок, сокол, ворон, страус, эму и казуар), приматов (например, полуобезьяна, долгопят, гиббон, мартышка, человекообразная обезьяна) и рыбы. Термин "животное" также включает отдельное животное на всех стадиях развития, включая стадии эмбриона и плода.
Если не указано иное, все технические и научные термины, использованные в описании, имеют то же самое значение, которое обычно понятно среднему специалисту в той области техники, к которой относится это описание. Термины в единственном числе включают термины во множественном числе, если контекст явно не указывает иное. Аналогично, слово "или" включает "и", если контекст явно не указывает иначе.
Следует отметить, что в этом описании и в частности в формуле изобретения и/или параграфах, такие термины как "содержит", "содержащий" и тому подобные могут иметь значение, приписываемое им в законе о патенте США; например, они могут означать "включает", "включая", "включающий" и тому подобное; и что термины, такие как "состоящий в основном из" и "состоит в основном из" имеют значение, приписываемое им в законе о патенте США, например, термины допускают, что элементы непосредственно не упоминаются, но исключают элементы, обнаруженные в предшествующем уровне техники, или которые затрагивают основную или новую характеристику изобретения.
Термины "рекомбинантный BTV или AHSV вектор(ы)", "рекомбинантный реассортантный BTV или AHSV вектор(ы)", "реассортантный BTV или AHSV", "BTV или AHSV реассортанты" используются в описании взаимозаменяемым образом, чтобы относиться к любой модификации, изменению или инженерии BTV или AHSV вируса. Модификация, изменение или инженерия BTV или AHSV вируса может включать, но не ограничивается этим, делецию одного или более нуклеотидов или аминокислот, делецию полного гена, оптимизацию кодонов гена, консервативную замену нуклеиновых кислот, вставку одного или более гетерологичных полинуклеотидов, смешивание генов, транскриптов, РНК сегментов, ДНК сегментов различных серотипов или видов в новые комбинации.
Антигенные полипептиды изобретения способны защищать от BTV и AHSV. То есть, они способны стимулировать иммунный ответ у животного. Термин "антиген" или "иммуноген" означает субстанцию, которая вызывает специфический иммунный ответ у животного-хозяина. Антиген может включать весь организм, убитый, ослабленный или живой; субъединицу или часть организма; рекомбинантный вектор, содержащий вставку с иммуногенными свойствами; участок или фрагмент ДНК, способный вызвать иммунный ответ после презентирования животному-хозяину; полипептид, эпитоп, гаптен или любую их комбинацию. Альтернативно, иммуноген или антиген могут содержать токсин или антитоксин.
Использованный в описании термин "иммуногенный белок, полипептид или пептид" включает полипептиды, которые являются иммунологически активными в том смысле, что при введении хозяину, они способны вызвать иммунный ответ гуморального и/или клеточного типа, направленный против белка. Предпочтительно этот белковый фрагмент является таким, что он обладает фактически такой же иммунологической активностью, как полный белок. Таким образом, белковый фрагмент согласно изобретению содержит или в основном состоит или состоит, по меньшей мере, из одного эпитопа или антигенной детерминанты. "Иммуногенный" белок или полипептид, при использовании в описании, включает полноразмерную последовательность белка, его аналогов или иммуногенных фрагментов. Термин "иммуногенный фрагмент" означает фрагмент белка, который включает один или более эпитопов и таким образом вызывает иммунологический ответ, описанный выше. Такие фрагменты могут быть установлены с помощью любого из ряда методов картирования эпитопов, хорошо известных в данной области техники. Смотри, например, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996). Например, линейные эпитопы могут быть определены, например, с помощью одновременного синтеза большого количества пептидов на твердых подложках, пептидов, соответствующих частям белковой молекулы, и реагирования пептидов с антителами, в то время как пептиды по-прежнему прикреплены к подложкам. Такие методы известны в данной области техники и описаны, например, в патенте США №4,708,871; Geysen et al., 1984; Geysen et al., 1986. Аналогично, коформационные эпитопы легко идентифицировать путем установления пространственной конформации аминокислот, например, с помощью рентгеновской кристаллографии и 2-мерного ядерного магнитного резонанса. Смотри, например, Epitope Mapping Protocols, выше.
Как уже обсуждалось, изобретение включает активные фрагменты и варианты антигенного полипептида. Таким образом, термин "иммуногенный белок, полипептид или пептид" дополнительно рассматривает делеции, вставки и замены в последовательности, поскольку полипептид функционирует с целью вызвать иммунологический ответ, как определено в описании. Термин "консервативное изменение" означает замену аминокислотного остатка другим биологически подобным остатком или замену нуклеотида в последовательности нуклеиновой кислоты, так что кодированный аминокислотный остаток не изменяется или является другим биологически подобным остатком. В этом отношении, особенно предпочтительные замены будут в большинстве случаев консервативными по характеру, т.е., такими заменами, которые происходят в пределах семейства аминокислот. Например, аминокислоты делятся на четыре семейства: (1) кислые - аспартат и глутамат; (2) основные - лизин, аргинин, гистидин; (3) неполярные - аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан; и (4) незаряженные полярные - глицин, аспарагин, глутамин, цистеин, серин, треонин, тирозин. Фенилаланин, триптофан и тирозин иногда классифицируют как ароматические аминокислоты. Примеры консервативных изменений включают замену одного гидрофобного остатка, такого как изолейцин, валин, лейцин или метионин другим гидрофобным остатком, или замену одного полярного остатка другим полярным остатком, например, замена аргинина на лизин, глутаминовой кислоты на аспарагиновую кислоту, или глутамина на аспарагин и тому подобное; или подобную консервативную замену аминокислоты структурно родственной аминокислотой, которая не будет оказывать большого влияния на биологическую активность. Белки, в основном имеющие одинаковую аминокислотную последовательность с исходной молекулой, но имеющие несущественные аминокислотные замены, которые незначительно влияют на иммуногенность белка, следовательно, относятся к определению исходного полипептида. Все полипептиды, полученные с помощью этих модификаций, включаются в данное описание. Термин "консервативное изменение" также включает использование замещенной аминокислоты вместо незамещенной исходной аминокислоты, при условии, что антитела, возникшие к замещенному полипептиду, также вступают в иммунную реакцию с незамещенным полипептидом.
Термин "эпитоп" относится к участку на антигене или гаптене, на который реагируют специфические В-клетки и/или Т-клетки. Термин используется также взаимозаменяемым образом с "антигенной детерминантой" или "сайтом антигенной детерминанты". Антитела, распознающие один и тот же эпитоп, могут быть установлены с помощью обычного иммуноанализа, показывающего способность одного антитела блокировать связывание другого антитела с антигеном-мишенью.
"Иммунологический ответ" на композицию или вакцину - это развитие у хозяина клеточного и/или опосредованного антителами иммунного ответа на интересующую композицию или вакцину. Как правило, "иммунологический ответ" включает, но не ограничивается этим, один или более из следующих эффектов: выработку антител, В-клеток, хелперных Т-клеток и/или цитотоксических Т-клеток, направленных специфически на антиген или антигены, включенные в интересующую композицию или вакцину. Предпочтительно, хозяин будет проявлять или терапевтический или защитный иммунологический ответ, так что устойчивость к новой инфекции будет увеличиваться и/или будет уменьшаться клиническая тяжесть болезни. Такая защита будет проявляться в виде уменьшения или отсутствия симптомов, которые обычно проявляются у инфицированного хозяина, более быстрого времени восстановления и/или более низкой концентрации (титра) вируса у инфицированного хозяина.
Синтетические антигены также включаются в определение, например, полиэпитопы, фланкирующие эпитопы и другие рекомбинантные или полученные синтетическим методом антигены. Смотри, например, Bergmann et al., 1993; Bergmann et al., 1996; Suhrbier, 1997; Gardner et al., 1998. Иммуногенные фрагменты для целей настоящего изобретения будут включать, по меньшей мере, около 3 аминокислот, по меньшей мере, около 5 аминокислот, по меньшей мере, около 10-15 аминокислот, или около 15-25 аминокислот или более аминокислот молекулы. Не существует критической верхней границы для длины фрагмента, который может содержать почти всю длину белковой последовательности, или даже гибридный белок, содержащий, по меньшей мере, один эпитоп белка.
Соответственно, минимальная структура полинуклеотида, экспрессирующего эпитоп, заключается в том, что он содержит или состоит в основном из нуклеотидов, кодирующих эпитоп или антигенную детерминанту BTV или AHSV полипептида. Полинуклеотид, кодирующий фрагмент BTV или AHSV полипептида, может содержать или состоит в основном или состоит минимум из 15 нуклеотидов, примерно 30-45 нуклеотидов, примерно 45-75 или, по меньшей мере, 57, 87 или 150 последовательных или смежных нуклеотидов последовательности, кодирующей полипептид. При применении изобретения на практике могут использоваться такие методы определения эпитопов, как создание перекрывающихся библиотек пептидов (Hemmer et al., 1998), Pepscan (Geysen et al., 1984; Geysen et al., 1985; Van der Zee R. et al., 1989; Geysen, 1990; Multipin. RTM. Peptide Synthesis Kits de Chiron) и алгоритмы (De Groot et al., 1999; PCT/US 2004/022605). Термин "нуклеиновая кислота" и "полинуклеотид" относится к РНК или ДНК, которая является линейной или разветвленной, одно или двухцепочечной, или их гибридам. Данный термин также включает гибриды РНК/ДНК. Неограничивающими примерами полинуклеотидов являются ген или фрагмент гена, экзоны, интроны, мРНК, тРНК, рРНК, рибозимы, кДНК, рекомбинантные полинуклеотиды, разветвленные полинуклеотиды, плазмиды, векторы, изолированные ДНК любой последовательности, изолированные РНК любой последовательности, зонды нуклеиновых кислот и праймеры. Полинуклеотид может содержать модифицированные нуклеотиды, такие как метилированные нуклеотиды и нуклеотидные аналоги, урацил, другие сахара и связывающие группы, такие как фторрибоза и тиолат, и цепи нуклеотидов. Последовательность нуклеотидов может быть дополнительно модифицирована после полимеризации, например, путем соединения с компонентом-меткой. Другими типами модификаций, включенных в это определение, являются кэпы (caps), замена одного или более природных нуклеотидов аналогом и введение средств для присоединения полинуклеотида к белкам, ионов металлов, метящих компонентов, других полинуклеотидов или твердой подложки. Полинуклеотиды можно получить с помощью химического синтеза или из микроорганизма.
Термин "ген" используется широко, чтобы относиться к любому сегменту полинуклеотида, связанного с биологической функцией. Таким образом, гены включают интроны и экзоны, как например геномная последовательность, или только кодирующие последовательности как, например кДНК и/или регуляторные последовательности, необходимые для их экспрессии. Например, ген также имеет отношение к фрагменту нуклеиновой кислоты, который экспрессирует мРНК или функциональную РНК или кодирует специфический белок и который включает регуляторные последовательности.
Термины "белок", "пептид", "полипептид" и "фрагмент полипептида" используются в описании взаимозаменяемым образом, чтобы относиться к полимерам из остатков аминокислот любой длины. Полимер может быть линейным или разветвленным, он может содержать модифицированные аминокислоты или аналоги аминокислот, и он может прерываться химическими фрагментами (молекулами), отличными от аминокислот. Данные термины также включают аминокислотный полимер, модифицированный естественным путем или путем вмешательства; например, образование дисульфидной связи, гликозилирование, липидизация, ацетилирование, фосфорилирование, или любой другой манипуляцией или модификацией, например, конъюгацией с меткой или биоактивным компонентом.
"Изолированный" биологический компонент (такой как нуклеиновая кислота или белок или органелла) относится к компоненту, который в основном отделен или очищен от других биологических компонентов в клетке организма, в котором этот компонент существует от природы, например, другая хромосомная и экстра-хромосомная ДНК и РНК, белки и органеллы. «Изолированные» нуклеиновые кислоты и белки включают такие, которые очищены с помощью стандартных методов очистки. Термин также включает нуклеиновые кислоты и белки, полученные с помощью рекомбинантных технологий, а также с помощью химического синтеза.
Использованный в описании термин "очищенный" не требует абсолютной чистоты; скорее предполагается, что это относительный термин. Таким образом, например, препарат очищенного полипептида - это препарат, который обогащен полипептидом, по сравнению с содержанием полипептида в его естественной среде. Говоря другими словами, полипептид является отделенным от клеточных компонентов. Под выражением "практически (в основном) очищенный" имеется в виду, что полипептид представляет несколько вариантов осуществления, в которых, по меньшей мере, 60%, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, или, по меньшей мере, 98%, или более клеточных компонентов или материалов удаляется. Аналогично, полипептид может быть частично очищенным. Под выражением "частично очищенный" имеется в виду, что удаляется менее чем 60%, клеточных компонентов или материалов. То же самое относится к полинуклеотидам. Раскрытые в описании полипептиды могут быть очищены любым известным в данной области техники способом.
Как уже было отмечено, антигенные полипептиды или их фрагменты или варианты представляют собой BTV или AHSV антигенные полипептиды. Фрагменты и варианты раскрытых полинуклеотидов и полипептидов, кодированных ими, также рассматриваются настоящим изобретением. Под "фрагментом" имеется в виду участок полинуклеотида или участок антигенной аминокислотной последовательности, кодированной им. Фрагменты полинуклеотида могут кодировать белковые фрагменты, сохраняющие биологическую активность нативного белка, и, следовательно, обладающие иммуногенной активностью, как уже отмечалось в данном документе. Фрагменты полипептидной последовательности сохраняют способность вызывать защитный иммунный ответ у животного.
Термин "варианты" обозначает по существу аналогичные последовательности. В отношении полинуклеотидов, вариант включает делецию и/или вставку одного или более нуклеотидов в одном или более сайтах в пределах нативного полинуклеотида и/или замену одного или более нуклеотидов в одном или более сайтах в нативном полинуклеотиде. При использовании в описании "нативный" полинуклеотид или полипептид включает природную последовательность нуклеотидов или аминокислот, соответственно. Варианты конкретного полинуклеотида изобретения (т.е., исходный полинуклеотид) могут оцениваться путем сравнения процента идентичности последовательности между полипептидом, кодированным вариантом полинуклеотида, и полипептидом, кодированным исходным полипептидом. "Вариант" белка означает белок, полученный из нативного белка путем делеции или вставки одной или более аминокислот в одном или более сайтах в нативном белке и/или заменой одной или более аминокислот в одном или более сайтах в нативном белке. Варианты белков, рассматриваемые настоящим изобретением, являются биологически активными, то есть они способны вызывать иммунный ответ.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение предоставляет композицию или вакцину, содержащую один или более рекомбинантных BTV или AHSV векторов, включающих один или более гетерологичных полинуклеотидов, кодирующих, по меньшей мере, один из полипептидов BTV или AHSV. Данные полипептиды могут быть любыми BTV или AHSV полипептидами, выбранными из группы, состоящей из VP1, VP2, VP3, VP4, VP6, VP5, VP7, NS1, NS2 и NS3/3A. В одном аспекте, рекомбинантные BTV или AHSV векторы содержат остов вектора, происходящий из геномов BTV или AHSV серотипов 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 и 26. В другом аспекте, гетерологичные полинуклеотиды кодируют антигены из серотипа BTV или AHSV, который отличается от серотипа BTV или AHSV, использованного в качестве остова вектора.
8VP1
В другом варианте осуществления рекомбинантные BTV или AHSV векторы содержат гетерологичные полинуклеотиды, кодирующие полипептиды VP1, VP2, VP3, VP4, VP5, VP7, NS1, NS2, VP6 и NS3/3A, при этом полипептиды могут быть из разных серотипов BTV или AHSV, таких как серотипы 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 и 26. Различные комбинации полипептидов из разных серотипов BTV или AHSV можно проиллюстрировать в следующих таблицах. Номенклатура, использованная для рекомбинантных реассортантных BTV (или AHSV) векторов, в настоящем изобретении определяется так: часть названия, написанная заглавными буквами, относится к вирусной основе, далее следует подпись, содержащая замещенный белок(белки), впереди указано происхождение серотипа сегмента, например BTV-1 относится к вирусу с остовом BTV-1, содержащим VP1 ген BTV-8.
BVPa
BVPc
VPd
BNSe
BPVc,NSe
Настоящее изобретение рассматривает рекомбинантные BTV векторы, содержащие реассортантный BTV, имеющий формулу BTV-A, BTV-A,, BTV-A, BTV-A, в которой А и В = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8. 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25 и 26 (для BTV или AHSV серотипов); с и d = 1, 2, 3, 4, 5, 6 и 7 (для VP1, VP2, VP3, VP4, VP5, VP6 или VP7); е = 1, 2 и 3/3А (для NS1, NS2 или NS3/3A).
В другом аспекте настоящее изобретение предоставляет BTV полипептид, имеющий последовательность, как установлено в SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189 или 190, и ее вариант или фрагмент.
Более того, гомологи BTV или AHSV полипептидов из семейств овечьих, бычьих, козьих или лошадиных включаются в объем настоящего изобретения. Использованный в описании термин "гомологи" включает ортологи, аналоги и паралоги. Термин "аналоги" относится к двум полинуклеотидам или полипептидам, имеющим одну и ту же или сходную функцию, но которые развивались обособленно в неродственных организмах. Термин "ортологи" относится к двум полинуклеотидам или полипептидам из разных видов, которые, однако, развивались из общего предкового гена при видообразовании. В большинстве случаев, ортологи кодируют полипептиды, имеющие одинаковые или сходные функции. Термин "паралоги" относится к двум полинуклеотидам или полипептидам, которые связаны с удвоением в геноме. Паралоги обычно имеют разные функции, однако эти функции могут быть связанными. Аналоги, ортологи и паралоги BTV или AHSV полипептида дикого типа могут отличаться от BTV полипептида дикого типа посттрансляционными модификациями, различиями в аминокислотных последовательностях или и тем и другим. В частности, гомологи изобретения, как правило, будут демонстрировать идентичность последовательностей, по меньшей мере, 80-85%, 85-90%, 90-95%, или 95%, 96%, 97%, 98%, 99% со всей или частью BTV или AHSV или полинуклеотидной последовательностью дикого типа, и будут проявлять сходную функцию. Варианты включают аллельные варианты. Термин "аллельный вариант" относится к полинуклеотиду или полипептиду, содержащему полиморфизмы, приводящие к изменениям в аминокислотных последовательностях белка, и который существует в естественной популяции (например, виды вируса или разнообразие). Как правило, такие природные аллельные варианты, могут давать в результате 1-5% расхождение в полинуклеотиде или полипептиде. Аллельные варианты могут быть установлены путем секвенирования (установления последовательности интересующих нуклеиновых кислот) в целом ряде различных видов, что можно легко осуществить путем использовании гибридизационных зондов для идентификации генетических локусов в аналогичных генах у этих видов. Все подобные изменения нуклеиновых кислот и обусловленные этим полиморфизмы аминокислот или изменения, которые являются результатом естественного аллельного разнообразия и которые не изменяют функциональную активность представляющего интерес гена, включаются в объем данного изобретения.
Использованный в описании термин "производное" или "вариант" относится к полипептиду или нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептид, которая имеет одно или более консервативных аминокислотных изменений или другие незначительные модификации, например, такие что (1) соответствующий полипептид имеет практически эквивалентную функцию по сравнению с полипептидом дикого типа, или (2) антитело, индуцированное к данному полипептиду, является иммунореактивным в отношении полипептида дикого типа. Эти варианты или производные включают полипептиды, имеющие незначительные модификации первичных аминокислотных последовательностей BTV или AHSV полипептида, которые могут давать в результате пептиды, обладающие по существу эквивалентной активностью по сравнению с немодифицированным аналогичным полипептидом. Такие модификации могут быть преднамеренными, как полученные с помощью сайт-направленного мутагенеза, или могут быть спонтанными. Термин "вариант" дополнительно предусматривает делеции, вставки и замены в последовательности, при условии, что полипептид способен вызывать иммунологический ответ, как определено в описании.
Термин "консервативное изменение" обозначает замену остатка аминокислоты другим биологически сходным остатком, или замену нуклеотида в нуклеиновокислотной последовательности, так что кодированный остаток аминокислоты не изменяется или является другим биологически сходным остатком. В этом смысле, особенно предпочтительными заменами будут являться замены, консервативные по природе, как описано выше.
Полинуклеотиды описания включают последовательности, которые являются вырожденными по причине вырожденности генетического кода, например, с оптимизированной частотой использования кодона для определенного хозяина. При использовании в описании "оптимизированный" относится к полинуклеотиду, созданному методами генетической инженерии для увеличения его экспрессии в определенных видах. Чтобы получить оптимизированные полинуклеотиды, кодирующие BTV или AHSV полипептиды, ДНК последовательность гена белка BTV или AHSV может быть модифицирована так, чтобы 1) содержать ко доны, «предпочитаемые» высоко экспрессированными генами в конкретных видах; 2) иметь содержание А+Т или G+C в композиции оснований нуклеотидов, фактически обнаруженное в указанных видах; 3) формировать инициирующую последовательность указанных видов; или 4) устранить последовательности, которые вызывают дестабилизацию, несоответствующее полиаденилирование, деградацию и терминацию РНК, или которые образовывают вторичную структуру в виде шпилек или сайты сплайсинга РНК. Увеличенная экспрессия BTV или AHSV белка в указанных видах может быть достигнута при помощи кривой распределения частоты использования кодона у эукариот и прокариот или в конкретных видах. Термин "частота использования предпочтительного кодона" имеет отношение к предпочтению, которое демонстрирует специфическая клетка-хозяин при использовании кодонов нуклеотидов для установления данной аминокислоты. Существует 20 природных аминокислот, большинство из которых кодируются более чем одним ко доном. Следовательно, все вырожденные нуклеотидные последовательности включаются в описание, при условии, что аминокислотная последовательность BTV или AHSV полипептида, кодированная последовательностью нуклеотидов, является функционально неизмененной.
Идентичность последовательности между двумя аминокислотными последовательностями может быть установлена с помощью программ Национального центра биотехнологической информации (NCBI) pairwise blast и blosum62 matrix, использующих стандартные параметры (смотри, например, алгоритм BLAST или BLASTX, доступные на сервере "National Center for Biotechnology Information" (NCBI, Bethesda, Md., USA), а также в работе Altschul et al.; тем самым этот документ упоминает об использовании алгоритма BLAST или BLASTX и матрицы BLOSUM62 под термином "blasts").
"Идентичность" в отношении последовательностей может относиться к количеству положений с идентичными нуклеотидами или аминокислотами, разделенному на количество нуклеотидов или аминокислот, в более короткой из двух последовательностей, при этом выравнивание двух последовательностей может определяться в соответствии с алгоритмом Wilbur и Lipman (Wilbur and Lipman), например, с использованием окна размером 20 нуклеотидов, длины слова из 4 нуклеотидов и штрафа за пропуск 4, причем анализ с использованием компьютера и интерпретацию результатов секвенирования, включая выравнивание, может быть легко проведен с помощью коммерчески доступных программ (например, Intelligenetics™ Suite, Intelligenetics Inc. CA). В том случае, когда РНК-последовательности считаются подобными или имеют степень идентичности последовательности или гомологии с ДНК-последовательностями, тимидин (Т) в ДНК-последовательности считается равным урацилу (U) в РНК-последовательности. Таким образом, РНК последовательности входят в объем изобретения и могут быть получены из ДНК последовательностей, при этом тимидин (Т) в ДНК-последовательности считается равным урацилу (U) в РНК-последовательности.
Идентичность последовательности или сходство последовательности двух последовательностей аминокислот, или идентичность последовательности между двумя нуклеотидными последовательностями может быть определена с помощью пакета программ Vector NTI (Invitrogen, 1600 Faraday Ave., Carlsbad, CA).
Следующие документы предоставляют алгоритмы для сравнения относительной идентичности или гомологии последовательностей и, дополнительно или альтернативно, в отношении изложенного выше, идеи в этих ссылках могут использоваться для определения процента гомологии или идентичности: Needleman SB and Wunsch CD; Smith TF and Waterman MS; Smith TF, Waterman MS and Sadler JR; Feng DF and Dolittle RF; Higgins DG and Sharp PM; Thompson JD, Higgins DG and Gibson TJ; and, Devereux J, Haeberlie P and Smithies О. И, без чрезмерного экспериментирования, специалист в данной области может обращаться ко многим другим программам и ссылкам для установления процента гомологии.
Реакции гибридизации могут проводиться при условиях различной "жесткости". Условия, которые увеличивают «жесткость» реакции гибридизации, хорошо известны. Смотри, например, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", second edition (Sambrook et al., 1989).
Изобретение дополнительно рассматривает BTV полинуклеотиды, содержащиеся в векторной молекуле или векторе экспрессии, и функционально связанные с промотором и необязательно энхансером.
"Вектор" относится к рекомбинантной ДНК или РНК плазмиде или вирусу, который содержит гетерологичный полинуклеотид, предназначенный для доставки в клетку-мишень, или in vitro или in vivo. Гетерологичный полинуклеотид может содержать представляющую интерес последовательность в целях предотвращения или лечения и может необязательно быть в форме кассеты экспрессии. При использовании в описании вектор может и не быть способным к репликации в конечной целевой клетке или субъекте. Термин включает векторы клонирования и вирусные векторы.
Термин "рекомбинантный" означает полинуклеотид, полусинтетического или синтетического происхождения, который или не существует в природе, или прикреплен к другому полинуклеотиду в порядке, не найденном в природе.
"Гетерологичный" означает происходящий из субъекта, генетически отличающегося от субъекта, с которым проводится сравнение. Например, полинуклеотид может быть помещен с помощью методов генной инженерии в плазмиду или вектор, происходящий из другого источника, и является гетерологичным полинуклеотидом. Промотор, удаленный из его нативной кодирующей последовательности и функционально связанный с кодирующей последовательностью, отличной от нативной последовательности, является гетерологичным промотором.
Настоящее изобретение имеет отношение к овечьим, бычьим, козьим и свиным вакцинам или фармацевтическим или иммунологическим композициям, которые могут содержать эффективное количество рекомбинантных BTV антигенов и приемлемый фармацевтически или с точки зрения ветеринарии носитель, эксципиент, адъювант или разбавитель.
Описанный в данном документе объект изобретения отчасти имеет отношение к композициям и методам, связанным с BTV антигеном, полученным в экспрессирущей системе растения или водоросли, который был высоко иммуногенным и защищал животных от заражения гомологичными и гетерологичными BTV штаммами.
Настоящее изобретение имеет отношение к композиции или вакцине, содержащей один или более рекомбинантных BTV или AHSV векторов, включающих один или более гетерологичных полинуклеотидов, кодирующих, по меньшей мере, один из полипептидов BTV или AHSV и приемлемый фармацевтически или с точки зрения ветеринарии носитель, эксципиент, адъювант или разбавитель.
В другом варианте осуществления приемлемый фармацевтически или с точки зрения ветеринарии носитель, эксципиент, адъювант или разбавитель может представлять собой эмульсию вода-в-масле. В еще одном варианте осуществления эмульсия масло-вводе может быть тройной эмульсией вода/масло/вода (W/O/W).
Изобретение дополнительно рассматривает BTV полинуклеотиды, содержащиеся в векторной молекуле или векторе экспрессии и функционально связанные с промотором и необязательно энхансером.
В другом аспекте настоящее изобретение предоставляет полипептид, имеющий идентичность последовательности, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% с антигенным полипептидом изобретения, в частности с полипептидами, имеющими последовательность, как установлено в SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189 или 190.
В еще одном аспекте настоящее изобретение предоставляет фрагменты и варианты BTV полипептидов, установленных выше (SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189 или 190), которые могут быть легко получены специалистом в данной области при помощи хорошо известных методов молекулярной биологии.
Варианты являются гомологичными полипептидами, имеющими идентичность аминокислотной последовательности, по меньшей мере, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, или 99% с аминокислотной последовательностью, установленной в SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187,188, 189 или 190.
В другом аспекте настоящее изобретение предоставляет полинуклеотид, кодирующий BTV полипептид, такой как полинуклеотид, кодирующий полипептид, имеющий последовательность, установленную в SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, или 190. В еще одном аспекте настоящее изобретение предоставляет полинуклеотид, кодирующий полипептид, имеющий идентичность последовательности, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% с полипептидом, имеющим последовательность, установленную в SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, или 190, или консервативный вариант, аллельный вариант, гомолог или иммуногенный фрагмент, содержащий, по меньшей мере, восемь или, по меньшей мере, десять последовательных аминокислот одного из этих полипептидов, или комбинацию этих полипептидов.
В другом аспекте настоящее изобретение предоставляет полинуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность, установленную в SEQ ID NO: 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130. 131, или 132, или его вариант. В еще одном аспекте настоящее изобретение предоставляет полинуклеотид, имеющий идентичность последовательности, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% с одним из полинуклеотидов, имеющих последовательность, установленную в SEQ ID NO: 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, или 132, или его вариант.
Полинуклеотиды изобретения могут содержать дополнительные последовательности, такие как дополнительные кодирующие последовательности в той же самой единице транскрипции, контролирующие элементы, такие как промоторы, сайты связывания рибосом, 5'UTR, 3'UTR, терминаторы транскрипции, сайты полиаденилирования, дополнительные транскрипцинные единицы под контролем того же самого или другого промотора, последовательности, которые разрешают клонирование, экспрессию, гомологичную рекомбинацию и трансформацию клетки-хозяина, и любые подобные конструкты, которые могут быть целесообразны для обеспечения вариантов осуществления этого изобретения.
Предпочтительно в разработанном векторе присутствуют элементы для экспрессии BTV или AHSV полипептида, антигена, эпитопа или иммуногена. Как минимум, он содержит, состоит в основном или состоит из инициирующего кодона (ATG), стоп-кодона и промотора, и необязательно также последовательность полиаденилирования для некоторых векторов, таких как плазмида и некоторые вирусные векторы, например, вирусные векторы, отличные от поксвирусов. Когда полинуклеотид кодирует фрагмент полипротеина, например, BTV пептид, в векторе ATG размещается преимущественно на 5' конце рамки считывания, а стоп-кодон размещается на 3' конце. Могут присутствовать другие элементы для контролирования экспрессии, такие как энхансерные последовательности, стабилизирующие последовательности, такие как интрон, и сигнальные последовательности, разрешающие секрецию белка.
Настоящее изобретение также имеет отношение к препаратам, содержащим векторы, такие как векторы экспрессии, например, терапевтическим композициям. Такие препараты могут содержать один или более векторов, например, векторы экспрессии, такие как in vivo векторы экспрессии, содержащие и экспрессирующие один или более BTV или AHSV полипептидов, антигенов, эпитопов или иммуногенов. В одном варианте осуществления вектор содержит и экспрессирует полинуклеотид, который содержит, состоит в основном или состоит из полинуклеотида, кодирующего (и преимущественно экспрессирующего) BTV или AHSV антиген, эпитоп или иммуноген, в фармацевтически или с точки зрения ветеринарии приемлемом носителе, эксципиенте или разбавителе. Таким образом, согласно одному варианту осуществления изобретения другой вектор или векторы в препарате содержит, состоит в основном или состоит из полинуклеотида, который кодирует, и при соответствующих обстоятельствах данный вектор экспрессирует один или более других белков BTV полипептида, антигена, эпитопа или иммуногена, или его фрагмент.
Согласно другому варианту осуществления вектор или векторы в препарате содержит, состоит в основном или состоит из полинуклеотида(ов), кодирующего один или более белков или его фрагмент(ы) BTV или AHSV полипептида, антигена, эпитопа или иммуногена, причем вектор или векторы экспрессирующие полинуклеотид(ы). В другом варианте осуществления препарат содержит один, два или более векторов, содержащих полинуклеотиды, кодирующие и экспрессирующие, преимущественно in vivo, BTV или AHSV полипептид, антиген, гибридный белок или его эпитоп. Изобретение также имеет отношение к смесям векторов, которые содержат полинуклеотиды, кодирующие и экспрессирующие различные BTV или AHSV полипептиды, антигены, эпитопы или иммуногены, например, BTV или AHSV полипептид, антиген, эпитоп или иммуноген от других видов животных, таких как, но без ограничения, животные семейств овечьих, бычьих, козьих или свиньих.
Согласно еще одному дополнительному варианту осуществления изобретения вектор экспрессии является плазмидным вектором или вектором ДНК плазмиды, в частности in vivo экспрессирующим вектором. В специфическом неограничивающем примере в качестве вектора для вставки полинуклеотидной последовательности может использоваться плазмида pVR-1020 или 1012 (VICAL Inc.; Luke et al., 1997; Hartikka et al., 1996, смотри, например, патенты США №5,846,946 и 6,451,769). Плазмида pVR1020 была получена из pVR.1012 и содержит человеческую tPA сигнальную последовательность. В одном варианте осуществления человеческая tPA сигнальная последовательность включает аминокислоты от М(1) до S(23) в Genbank под учетным номером HUMTPA14. В другом отдельном неограничивающем примере, плазмида, используемая в качестве вектора для вставки полинуклеотидной последовательности, может содержать лошадиную сигнальную пептидную последовательность IGF1 от аминокислоты М(24) до аминокислоты А(48) в Genbank под учетным номером U28070. Дополнительную информацию в отношении ДНК плазмид, которая может быть принята во внимание или применена на практике, можно найти, например, в США патентах №6,852,705; 6,818,628; 6,586,412; 6,576,243; 6,558,674; 6,464,984; 6,451,770; 6,376,473 и 6,221,362.
Термин плазмида охватывает любую единицу транскрипции ДНК, содержащую полинуклеотид согласно изобретению и элементы, необходимые для ее экспрессии in vivo в клетке или клетках желательного хозяина или мишени; в этом отношении следует отметить, что суперспиральная или несуперспиральная, кольцевая плазмида, также как и линейная форма, включаются в объем изобретения.
Каждая плазмида содержит или состоит или состоит в основном из, в дополнение к полинуклеотиду, кодирующему BTV или AHSV антиген, эпитоп или иммуноген, необязательно соединенный с гетерологичной пептидной последовательностью, вариант, аналог или фрагмент, функционально связанный с промотором или под контролем промотора или зависящий от промотора. В общем, предпочтительно использовать сильный промотор, функционирующий в эукариотических клетках. Сильный промотор может быть, но без ограничения, предранним промотором цитомегаловируса (CMV-IE) человеческого или мышиного происхождения, или необязательно другого происхождения, например, крысиного или от морской свинки. Super promoter (Ni, M. et al., Plant J, 7, 661-676, 1995.). Промотор CMV-IE может содержать действительную промоторную часть, которая может быть или не быть связана с энхансерной частью. Можно сослаться на ЕР-А-260 148, ЕР-А-323 597, патенты США №5,168,062, 5,385,839 и 4,968,615, а также на РСТ заявку № WO 87/03905. Промотор CMV-IE является преимущественно человеческим CMV-IE (Boshart et al., 1985) или мышиным CMV-IE.
В более обобщенных терминах, промотор имеет вирусное, растительное или клеточное происхождение. Сильный вирусный промотор, отличный от CMV-IE, который может успешно использоваться при осуществлении изобретения, является ранним/поздним промотором SV40 вируса или LTR промотором вируса саркомы Рауса. Сильный клеточный промотор, который может успешно использоваться при осуществлении изобретения, является промотором гена цитоскелета, такой как, например, десминовый промотор (Kwissa et al., 2000) или актиновый промотор (Miyazaki et al., 1989).
Может использоваться любой из конститутивных, индуцибельных или зависимых от стимула промоторов. Например, конститутивные промоторы могут включать промотор маннопин синтазы от Agrobacterium tumefaciens. Альтернативно, можно успешно использовать промоторы гена белка температурного шока, промоторы гена, индуцируемого засухой (drought), промотор патоген-индуцибельного гена, промоторы гена, индуцируемого повреждением, и промоторы гена, индуцируемого светом/темнотой. Можно успешно использовать промоторы, которые контролируются регуляторами роста растений, такими как абсцизовая кислота, ауксины, цитокины и гиббереллиновая кислота. Также могут быть выбраны промоторы, вызывающие тканеспецифическую экспрессию (например, промоторы, специфичные для корня, листа и цветка).
Плазмиды могут содержать другие элементы, контролирующие экспрессию. В частности, может быть полезно включать стабилизирующие последовательностей), например, интронную последовательность(и), например, интрон алкогольдегидрогеназы кукурузы (Callis et al. Genes & Dev. 1(10): 1183-1200, Dec. 1987), первый интрон hCMV-IE (РСТ заявка № WO 1989/01036), интрон II гена β-глобина кролика (van Ooyen et al., 1979). В другом варианте осуществления плазмиды могут содержать 3' UTR. 3' UTR может быть, однако без ограничения, agrobacterium нопалин синтазой (Nos) 3' UTR (Nopaline synthase: transcript mapping and DNA sequence. Depicker, A. et al. J. Mol. Appl. Genet., 1982; Bevan.NAR, 1984, 12(22): 8711-8721).
Что касается сигнала полиаденилирования (полиА) для плазмид и вирусных векторов, отличных от поксвирусов, может использоваться поли(А) сигнал гена бычьего гормона роста (bGH) (смотри США 5,122,458), или поли(А) сигнал гена β-глобина кролика или поли(А) сигнал SV40 вируса.
"Клетка-хозяин" или "клетка" означает прокариотическую или эукариотическую клетку, которая была генетически изменена или может быть генетически изменена путем введения экзогенного полинуклеотида, такого как рекомбинантная плазмида или вектор или оцРНК или дцРНК. При упоминании генетически измененных клеток, термин относится и к первоначально измененной клетке и к ее потомству.
В одном варианте осуществления объект изобретения, раскрытый в данном описании, имеет отношение к способу получения рекомбинантного BTV или AHSV вектора, включающему трансфицирование клетки а) РНК, кодирующими один или более полипептидов серотипа BTV или AHSV; и b) РНК, содержащими транскрипты полного генома другого серотипа BTV или AHSV, и у которого легетированы транскрипты, кодирующие антигены в а).
В другом варианте осуществления объект изобретения, раскрытый в данном описании, имеет отношение к способу вакцинирования овец, коров, коз или свиней, включающему введение овцам, коровам, козам или свиньям эффективного количества вакцины, которая может содержать эффективное количество рекомбинантных BTV векторов и фармацевтически приемлемый или приемлемый с точки зрения ветеринарии носитель, эксципиент или разбавитель.
В одном варианте осуществления объект изобретения, раскрытый в данном описании, имеет отношение к способу получения иммунного ответа, включающему введение овцам, коровам, козам или свиньям вакцины, содержащей овечьи, коровьи, козьи или свиные рекомбинантные BTV или AHSV векторы, при этом вызывается иммунный ответ.
Введение может быть подкожным или внутримышечным. Введение может быть безыгольным (например, Pigjet или Bioject).
В одном варианте осуществления изобретения может использоваться режим «прайм-буст», который состоит, по меньшей мере, из одного первичного введения и, по меньшей мере, одного вторичного (бустерного) введения с использованием, по меньшей мере, одного обычного полипептида, антигена, эпитопа или иммуногена. В большинстве случаев иммунологическая композиция или вакцина, используемая для первичного введения, отличается по природе от вакцины, используемой в качестве бустерной. Однако следует отметить, что та же самая композиция может использоваться в качестве первичной вакцины и как бустер-доза. Этот протокол введения называется "прайм-буст".
Прайм-буст согласно настоящему изобретению может включать рекомбинантный вирусный вектор, который используется для экспрессии BTV кодирующей последовательности или ее фрагментов, кодирующих антигенный полипептид или его фрагмент или вариант. В частности, вирусный вектор может экспрессировать BTV или AHSV ген или его фрагмент, кодирующий антигенный полипептид. Вирусный вектор, рассматриваемый в описании, включает, но без ограничения, поксвирус [например, вирус осповакцины или ослабленный вирус осповакцины, авипокс вирус или ослабленный авипокс вирус (например, канарипокс вирус, вирус оспы кур, вирус оспы голубей, вирус оспы голубиных, вирус оспы перепелов, ALVAC, TROVAC; смотри, например, США 5,505,941, США 5,494,8070), вирус оспы енотов, вирус оспы свиней и т.д.], аденовирус (например, аденовирус человека, аденовирус собак), вирус герпеса (например, вирус герпеса собак, вирус герпеса индюшек, вирус болезни Марека, вирус инфекционного ларинготрахеита, вирус герпеса кошек, вирус ларинготрахеита (ILTV), вирус герпеса коров, свиной вирус герпеса), бакуловирус, ретровирус и т.д. В другом варианте осуществления авипокс-вектор экспрессии может быть канарипокс-вектором, таким как ALVAC. В еще одном варианте осуществления авипокс-вектор экспрессии может быть fowlpox вектором, таким как, TROVAC. С целью экспрессии BTV или AHSV антиген изобретения вводится под контроль специфического промотора поксвируса, например, промотора entomopoxvirus Amsacta moorei 42K (Barcena, Lorenzo et al. 2000), промотора вируса осповакцины 7.5 кДа (Cochran et al., 1985), промотора вируса осповакцины I3L (Riviere et al., 1992), промотора вируса осповакцины HA (Shida, 1986), промотора вируса коровьей оспы ATI (Funahashi et al., 1988), промотора вируса осповакцины Н6 (Taylor et al., 1988b; Guo et al., 1989; Perkus et al., 1989), в том числе.
В другом варианте осуществления авипокс-вектор экспрессии может быть канарипокс вектором, таким как, ALVAC. BTV или AHSV полипептид, антиген, эпитоп или иммуноген может быть BTV или AHSV VP2 или BTV VP5. Вирусный вектор может быть vCP2289, который кодирует BTV кодон-оптимизированный синтетический VP2 и VP5 (смотри, США 2007/0280960).
В другом аспекте прайм-буст протокола изобретения вводится композиция, содержащая рекомбинантные BTV векторы изобретения, с последующим введением вакцины или композиции, содержащей BTV или AHSV антиген, или инактивированной вирусной вакцины, или ДНК плазмидной вакцины или композиции, которая содержит или экспрессирует BTV или AHSV антиген. Подобным образом, прайм-буст протокол может включать введение вакцины или композиции, содержащей инактивированную вирусную вакцину, или композиции, содержащей BTV или AHSV антиген, или ДНК плазмидной вакцины или композиции, которая содержит или экспрессирует BTV или AHSV антиген, с последующим введением композиции, содержащей рекомбинантные BTV или AHSV векторы изобретения. Кроме того, следует отметить, что и первичное и вторичное введения могут включать композицию, содержащую BTV антиген изобретения.
Прайм-буст протокол содержит, по меньшей мере, одно прайм-введение и, по меньшей мере, одно буст-введение с использованием, по меньшей мере, одного обычного полипептида и/или его вариантов или фрагментов. Вакцина, использованная в прайм-введении, может отличаться по природе от вакцины, использованной в качестве последующей бустерной вакцины. Прайм-введение может включать одно или более введений. Аналогично, буст-введение может включать одно или более введений.
Объем дозы композиций, предназначенных для видов животных, являющихся млекопитающими, например, объем дозы композиций, предназначенных для овец, коров, коз или свиней, на основе вирусных векторов, например, композиций на основе векторов, не являющихся поквирусными векторами, составляет примерно от 0.1 до 5.0 мл, примерно от 0.1 до 3.0 мл и примерно от 0.5 мл до 2.5 мл.
Эффективность вакцин может быть проверена примерно через 2-4 недели после последней иммунизации путем заражения животных, таких как овцы, коровы, козы или свиньи, вирулентным штаммом BTV, таким как штаммы BTV-1/2/3/4/8/9/16 или 17. Например, BTV штамм может быть серотипом 17, который был первоначально выделен из крови овцы Tulare County, СА (смотри Bormeau, DeMaula et al. 2002; DeMaula, Leutenegger et al. 2002). Штамм BTV может также быть серотипом 8, для которого в настоящее время доступна инактивированная вакцина от компании Merial Limited.
Другие штаммы могут включать BTV1 (изолят Австралии), BTV1 (изолят Южной Африки), BTV2 (изолят США), BTV3 (изолят Южной Африки), BTV4-9, BTV10 (изолят США), BTV11 (изолят США), BTV12, BTV13 (изолят США), BTV14-17, BTV17 (изолят США), BTV18, BTV19, BTV20 (изолят Австралии), BTV21-24 или корсиканский BTV.
Для заражения с целью проверки эффективности вакцины используются и гомологичные и гетерологичные штаммы. Животное может быть заражено внутрикожно, подкожно, с использованием спрея, внутриназально, внутриокулярно, внутритрахеально и/или перорально.
В случае BTV у коров и коз оценивается экстенсивность сосудистого повреждения. Также в случае BTV у овец оценивается катаральное воспаление слизистых оболочек рта, носа и преджелудка, воспаление венчика копыт и основы кожи копыт, отделение эпителия, некроз слизистой оболочки щеки и опухший/воспаленный/синий язык и рот. После заражения у всех животных берутся мазки для выделения вируса. Наличие или отсутствие вирусных антигенов в выше указанных тканях может быть оценено с помощью количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой в реальном времени (qRRT-PCR). Образцы крови могут быть собраны до и после заражения и исследованы на наличие анти-BTV-специфических антител.
Прайм-буст введения предпочтительно могут проводиться с интервалом от 2 до 6 недель, например, примерно с 3 недельным интервалом. Согласно одному варианту осуществления также предусматриваются полугодовые бустер-инъекции или ежегодные бустер-инъекции, предпочтительно использующие вакцину на основе вирусного вектора. Предпочтительными являются животные, по меньшей мере, 6-8 недельного возраста на момент первого введения.
Композиции, содержащие рекомбинантные антигенные полипептиды изобретения, используемые в прайм-буст протоколах, содержатся в фармацевтически приемлемом или приемлемом с точки зрения ветеринарии носителе, разбавителе или эксципиенте. Протоколы изобретения защищают животное от овечьего, коровьего, козьего или свиного BTV или AHSV и/или предотвращают прогрессирование болезни у инфицированного животного.
Разные введения предпочтительно проводятся с интервалом от 1 до 6 недель, и конкретнее, примерно с 3 недельным интервалом. Согласно предпочтительному способу также предусматривается ежегодная бустер-инъекция, предпочтительно использующая иммунологическую композицию на основе вирусного вектора. Предпочтительными являются животные, по меньшей мере, суточного возраста на момент первого введения.
Специалисту в данной области техники должно быть понятно, что данное описание предоставляется в качестве примера, причем настоящее изобретение этим не ограничивается. Исходя из предоставленного здесь описания и знаний в данной области, квалифицированный специалист может определить количество введений, способ введения и дозы, которые должны использоваться для каждого протокола введений, без какого-либо излишнего экспериментирования.
Настоящее изобретение предполагает, по меньшей мере, одно введение животному эффективного количества терапевтической композиции, изготовленной согласно изобретению. Животное может быть самцом, самкой, беременной самкой или новорожденным. Это введение может осуществляться различными путями, включая, без ограничения, внутримышечную (IM), внутрикожную (ID) или подкожную (SC) инъекцию или путем интраназального или перорального введения. Терапевтическая композиция согласно изобретению также может быть введена с помощью безыгольного устройства (например, с помощью устройства Pigjet, Dermojet, Biojector, Avijet (Merial, GA, США), Vetjet или Vitajet (Bioject, Oregon, США)). Другим подходом к введению плазмидных композиций является использование электропорации (смотри, например, Tollefsen et al., 2002; Tollefsen et al., 2003; Babiuk et al., 2002; PCT заявка № WO 99/01158). В другом варианте осуществления терапевтическая композиция доставляется животному с помощью генной пушки или бомбардировки золотыми частицами.
В одном варианте осуществления изобретение обеспечивает введение терапевтически эффективного количества композиции для доставки и экспрессии BTV или AHSV антигена или эпитопа в клетку-мишень. Определение терапевтически эффективного количества является обычной практикой для специалиста в данной области техники. В одном варианте осуществления композиция содержит вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид, который экспрессирует BTV или AHSV антиген или эпитоп, и приемлемый фармацевтически или с точки зрения ветеринарии носитель, разбавитель или эксципиент. В другом варианте осуществления приемлемый фармацевтически или с точки зрения ветеринарии носитель, разбавитель или эксципиент облегчает трансфекцию или другие способы переноса полинуклеотидов животному-хозяину и/или улучшает сохранность вектора или белка у хозяина.
В одном варианте осуществления раскрытый в описании объект изобретения предоставляет метод обнаружения для установления различий между инфицированными и вакцинированными животными (DIVA).
В настоящее время существует несколько доступных BTV вакцин. Merial и Intervet предлагают инактивированные BTVS вакцины. Недавно был описан способ установления различий между BTV-вакцинированными и BTV-инфицированными животными (Silvia С. Barros et al., Veterinary-Microbiology, 2009).
В данном описании раскрывается, что использование вакцины или композиции настоящего изобретения дает возможность обнаружения BTV или AHSV инфекции у животного. Раскрывается, что использование вакцины или композиции настоящего изобретения дает возможность обнаружения инфекции у животного путем установления различий между инфицированными и вакцинированными животными (DIVA). В данном описании раскрывается способ диагностирования инфекции BTV у животного, использующий иммуногенный метод обнаружения BTV на основе NS3, такой как, NS3-специфический метод ELISA.
Готовое изделие
В одном варианте осуществления раскрытый в описании объект изобретения имеет отношение к набору, предназначенному для осуществления способа стимулирования или индуцирования иммунного ответа, который может содержать любую из рекомбинантных BTV или AHSV иммунологических композиций или вакцин, или инактивированных BTV или AHSV иммунологических композиций или вакцин, рекомбинантных BTV или AHSV вирусных композиций или вакцин, и инструкции для осуществления данного способа.
Другим вариантом осуществления изобретения является набор, предназначенный для стимулирования иммунологического или защитного ответа против BTV или AHSV у животного, включающий композицию или вакцину, содержащую BTV антиген изобретения и рекомбинантную BTV или AHSV вирусную иммунологическую композицию или вакцину, и инструкции для осуществления способа доставки в эффективном количестве для стимулирования иммунного ответа у животного.
Другим вариантом осуществления изобретения является набор, предназначенный для стимулирования иммунологического или защитного ответа против BTV или AHSV у животного, включающий композицию или вакцину, содержащую BTV или AHSV антиген изобретения и инактивированную BTV иммунологическую композицию или вакцину, и инструкции для осуществления способа доставки в эффективном количестве для стимулирования иммунного ответа у животного.
Еще один аспект настоящего изобретения имеет отношение к набору для прайм-буст вакцинации согласно настоящему изобретению, как описано выше. Набор может содержать, по меньшей мере, два флакона: первый флакон, содержащий вакцину или композицию для прайм-вакцинации согласно настоящему изобретению, и второй флакон, содержащий вакцину или композицию для буст-вакцинации согласно настоящему изобретению. Предпочтительно, набор может содержать дополнительные первый и второй флаконы для дополнительных прайм-вакцинаций или для дополнительных буст-вакцинации.
Изобретением рассматриваются следующие варианты осуществления. В некотором варианте осуществления раскрывается композиция, содержащая рекомбинантный BTV или AHSV вектор и приемлемый фармацевтически или с точки зрения ветеринарии носитель, эксципиент, адъювант или разбавитель. В некотором варианте осуществления раскрываются вышеупомянутые композиции, в которых приемлемый фармацевтически или с точки зрения ветеринарии носитель, эксципиент, адъювант или разбавитель является эмульсией вода-в-масле или эмульсией масло-в-воде. В другом варианте осуществления раскрывается способ вакцинирования животного, чувствительного к овечьему, коровьему, козьему или свиному BTV или AHSV, включающий введение композиций вышеупомянутому животному. В некотором варианте осуществления раскрывается способ вакцинирования животного, чувствительного к овечьему, коровьему, козьему или свиному BTV или AHSV, включающий прайм-буст режим. В одном варианте осуществления раскрывается способ диагностирования гриппа у животного. В другом варианте осуществления раскрывается набор для прайм-буст вакцинации, содержащий, по меньшей мере, два флакона, при этом первый флакон содержит композицию настоящего изобретения, а второй флакон содержит состав для буст-вакцинации, включающий композицию, содержащую рекомбинантный вирусный вектор, или композицию, содержащую инактивированную вирусную композицию, или ДНК плазмидную композицию, которая содержит или экспрессирует BTV или AHSV антиген.
Приемлемые фармацевтически или приемлемые с точки зрения ветеринарии носители или разбавители или адъюванты или эксципиенты хорошо известны специалисту в данной области техники. Например, приемлемый фармацевтически или с точки зрения ветеринарии носитель или разбавитель или эксципиент может представлять собой 0.9% раствор NaCl (например, физиологический раствор) или фосфатный буфер. Другой фармацевтически или с точки зрения ветеринарии приемлемый носитель или разбавитель или эксципиент, который может использоваться для осуществления способов этого изобретения, включает, но не ограничиваются этим, поли-(L-глутамат) или поливинилпирролидон. Фармацевтически или с точки зрения ветеринарии приемлемый носитель или разбавитель или эксципиент может быть любым соединением или комбинацией соединений, способствующих введению вектора (или белка, экспрессирующегося из изобретательского вектора in vitro); предпочтительно, носитель, разбавитель или эксципиент может способствовать трансфекции и/или повышать стабильность вектора (или белка). Дозы и дозовые объемы обсуждаются в общем описании, а также могут быть определены специалистом в данной области техники на основе этого описания в сочетании со знаниями в данной области техники, без проведения излишних экспериментов.
Катионные липиды, содержащие соль четвертичного аммония, предпочтительно, но не исключительно пригодные для плазмид, преимущественно являются катионными липидами, имеющими следующую формулу:
в которой R1 представляет собой насыщенный или ненасыщенный неразветвленный алифатический радикал, имеющий от 12 до 18 атомов углерода, R2 представляет собой другой алифатический радикал, содержащий 2 или 3 атома углерода, и Х является аминной или гидроксильной группой, например, DMRIE. В другом варианте осуществления катионный липид может быть связан с нейтральным липидом, например, DOPE.
Из числа этих катионных липидов предпочтение отдается DMRIE (N-(2-гидроксиэтил)-N,N-диметил-2,3-бис(тетрадецилокси)-1-пропан аммонию; WO 96/34109), предпочтительно связанному с нейтральным липидом, предпочтительно DOPE (диолеоил-фосфатидил-этаноламин; Behr, 1994) с образованием DMRIE-DOPE.
Предпочтительно, смесь из плазмиды с адъювантом приготавливается непосредственно перед и предпочтительно одновременно с введением препарата или непосредственно перед введением препарата; например, незадолго до или перед введением, причем смесь плазмида-адъювант получают преимущественно таким образом, чтобы дать смеси достаточно времени перед введением для образования комплекса, например, примерно от 10 до 60 минут до введения, например, приблизительно 30 минут до введения.
В том случае, когда присутствует DOPE, молярное отношение DMRIE: DOPE составляет преимущественно приблизительно от 95:5 до около 5:95, более предпочтительно от около 1: до около 1, например, 1:1.
Весовое соотношение между плазмидой и адъювантом DMRIE или DMRIE-DOPE может составлять приблизительно 50:1 и приблизительно 1:10, например, примерно 10:1 и примерно 1:5, и примерно 1:1 и примерно 1:2, например, 1:1 и 1:2.
В другом варианте осуществления фармацевтически приемлемый или приемлемый с точки зрения ветеринарии носитель, эксципиент, разбавитель или адъювант может быть эмульсией вода-в-масле. Примеры подходящих эмульсий вода-в-масле включают масляные вакцинные эмульсии вода-в-масле, которые являются стабильными и жидкими при 4°С и содержат от 6 до 50 об/об% антиген-содержащей водной фазы, предпочтительно от 12 до 25 об/об%, от 50 до 94 об/об% масляной фазы, содержащей в целом или частично неметаболизируемое масло (например, минеральное масло, такое как парафиновое масло) и/или метаболизируемое масло (например, растительное масло или жирную кислоту, полиол или эфиры оксикислоты), от 0.2 до 20 p/v% поверхностно-активных веществ, предпочтительно от 3 до 8 p/v%, или в смеси любых полиглицериновых сложных эфиров, указанные полиглицериновые сложные эфиры предпочтительно являются полиглицерин (поли)рицинолеатами, или полиоксиэтилен рициновыми маслами или гидрогенизированными полиоксиэтиленовыми рициновыми маслами. Примеры поверхностно-активных веществ, которые могут использоваться в эмульсии вода-в-масле, включают этоксилированные эфиры сорбита (например, полиоксиэтилен (20) сорбитанмоноолеат (TWEEN 80), доступный от компании AppliChem, Inc., Cheshire, CT) и сложные эфиры сорбита (например, сорбитанмоноолеат (SPAN 80), доступный от компании Sigma Aldrich, St. Louis, МО). В дополнение к этому, в отношении эмульсии вода-в-масле смотри также патент США №6,919,084, например, его Пример 8, включенный в описание путем отсылки. В некоторых вариантах осуществления антигенсодержащая водная фаза включает физиологический раствор, содержащий одно или более буферных веществ. Примером подходящего буферного раствора является забуференный фосфатом физиологический раствор. В предпочтительном варианте осуществления эмульсия вода-в-масле может быть тройной эмульсией вода/масло/вода (W/O/W) (патент США №6,358,500). Примеры других подходящих эмульсий описаны в патенте США №7,371,395.
Иммунологические композиции и вакцины согласно изобретению могут содержать или состоять в основном из одного или более фармацевтически приемлемого или с точки зрения ветеринарии приемлемого носителя, эксципиента, разбавителя или адъювантов. Подходящими носителями или адъювантами для использования на практике настоящего изобретения являются (1) полимеры акриловой или метакриловой кислоты, полимеры малеинового ангидрида и алкенильных производных, (2) иммуностимулирующие последовательности (ISS), такие как последовательности олигодезоксирибонуклеотидов, имеющих одну или более неметилированных СрО единиц (Klinman et al., 1996; WO 98/16247), (3) эмульсия масло в воде, такая как SPT эмульсия, описанная на странице 147 "Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach" published by M. Powell, M. Newman, Plenum Press 1995, и эмульсия MF59, описанная на странице 183 той же самой работы, (4) катионные липиды, содержащие соль четвертичного аммония, например, DDA, (5) цитокины, (6) гидроксид алюминия или фосфат алюминия, (7) сапонин или (8) другие адъюванты, обсуждаемые в любом цитированном документе, включенном в текущее описание путем отсылки, или (9) любые их комбинации или смеси.
Эмульсия масло в воде (3), которая, в частности, подходит для вирусных векторов, может быть приготовлена на основе легкого жидкого парафина (типа, предусмотренного Европейской фармакопеей), изопреноидного масла, такого как сквалан, сквален; масла, полученного в результате олигомеризации алкенов, например, изобутена или децена; сложных эфиров кислот или спиртов, имеющих неразветвленную алкильную группу, таких как растительные масла, этилолеат, пропиленликоль, ди(каприлат/капрат), глицерол три(каприлат/капрат) и пропиленгликоль диолеат; или сложных эфиров кислот или жирных спиртов с разветвленной цепью, в частности сложных эфиров изостеариновой кислоты.
Для образования эмульсии масло используется вместе с эмульгаторами. Эмульгаторами могут служить неионные поверхностно-активные вещества, такие как: сложные эфиры с одной стороны сорбитана, маннида (например, ангидроманнитололеата), глицерина, полиглицерина или пропиленгликоля, и, с другой стороны, олеиновой, изостеариновой, рицинолевой или гидроксистеариновой кислот, причем указанные сложные эфиры при необходимости являются этоксилированными; или блок-сополимеры полиоксипропилен-полиоксиэтилен, такие как, Плюроник, например, L121.
Из добавляемых полимеров типа (1) предпочтительными являются сшитые полимеры акриловой или метакриловой кислоты, в частности, сшитые полиалкиленовыми эфирами Сахаров или многоатомных спиртов. Такие соединения известны под названием "карбомеры" (Pharmeuropa, т. 8, №2, июнь 1996 г.). Специалист может также обратиться к патенту US-A-2909462, в котором описаны такие акриловые полимеры, сшитые полигидроксилированным соединением, содержащим, по меньшей мере, 3 гидроксильных группы, предпочтительно не более 8, при этом атомы водорода, по меньшей мере, в трех гидроксилах замещены алифатическими ненасыщенными радикалами, содержащими, по меньшей мере, 2 атома углерода. Предпочтительными радикалами являются радикалы, содержащие от 2 до 4 атомов углерода, например, винилы, аллилы и другие ненасыщенные группы этиленового ряда. Ненасыщенные радикалы также могут содержать другие заместители, такие как метил. Особо пригодными являются продукты, предлагаемые под названием Carbopol (BF Goodrich, штат Огайо, США). Они сшиты, в частности, аллильным производным сахарозы или аллилпентаэритритолом. Из них можно указать, в частности, на Carbopol 974P, 934Р и 971P.
Из сополимеров малеинового ангидрида и производного алкилена предпочтительными являются EMA (Monsanto), которые представляют собой сополимеры малеинового ангидрида и этилена, линейные или сшитые, например, сшитые дивиниловым эфиром. Можно сделать ссылку на работу J. Fields et al., 1960.
Что касается структуры, полимеры акриловой или метакриловой кислоты и ЕМА образованы преимущественно структурными звеньями следующей формулы:
в которой:
- R1 и R2, которые могут быть одинаковыми или разными, представляют собой Н или СН3
- х=0 или 1, предпочтительно х=1
- y=1 или 2, при этом х+y=2.
Для ЕМА, х=0 и y=2 и для карбомеров х=y=1.
Эти полимеры растворимы в воде или физиологическом солевом растворе (20 г/л NaCl), при этом значение рН может быть доведено до 7.3-7.4, например, едким натром (NaOH), для получения раствора адъюванта, в который будут вводиться вектор(ы) экспрессии. Концентрация полимера в окончательной иммунологический или вакцинной композиции может находиться в пределах примерно от 0.01 до 1.5% вес/об, примерно от 0.05 до 1% вес/об, и примерно от 0.1 до 0.4% вес/об.
Цитокин или цитокины (5) могут вводиться в иммунологическую композицию или вакцину в виде белка или могут экспрессироваться в хозяине совместно с иммуногеном или иммуногенами или эпитопом(ами). Предпочтительной является коэкспрессия цитокина или цитокинов либо тем же самым вектором, который экспрессирует иммуноген или иммуногены или эпитоп(ы), или его отдельным вектором.
Изобретение включает приготовление таких комбинированных композиций, например, путем смешивания активных компонентов, предпочтительно вместе с адъювантом, носителем, цитокином и/или разбавителем.
Цитокины, которые могут использоваться в настоящем изобретении, включают, но не ограничиваются этим, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), интерферон α (IFNα), интерферон β (IFNβ), интерферон γ, (IFNγ), интерлейкин-1α (IL-1α), интерлейкин-1β (IL-1β), интерлейкин-2 (IL-2), интерлейкин-3 (IL-3), интерлейкин-4 (IL-4), интерлейкин-5 (IL-5), интерлейкин-6 (IL-6), интерлейкин-7 (IL-7), интерлейкин-8 (IL-8), интерлейкин-9 (IL-9), интерлейкин-10 (IL-10), интерлейкин-11 (IL-11), интерлейкин-12 (IL-12), фактор некроза опухоли α (TNFα), фактор некроза опухоли β (TNFβ) и трансформирующий фактор роста β (TGFβ). Следует понимать, что цитокины могут вводиться совместно и/или последовательно с иммунологической или вакцинной композицией настоящего изобретения. Так, например, вакцина рассматриваемого изобретения также может содержать экзогенную молекулу нуклеиновой кислоты, которая экспрессирует in vivo подходящий цитокин, например, цитокин, подобранный для того хозяина, которого следует вакцинировать, или у которого должен быть получен иммунологический ответ (например, бычий цитокин для препаратов, предназначенных для введения крупному рогатому скоту).
Предпочтительно, иммунологическая композиция и/или вакцина согласно изобретению содержит или состоит в основном или состоит из эффективного количества для индуцирования терапевтического ответа одного или более полипептидов, как описано в документе; при этом эффективное количество может быть определено из данного описания, включая документы, включенные в него, и уровень техники, без проведения дополнительных экспериментов.
В случае иммунологической композиции и/или вакцины на основе экспрессированных полипептидов, доза может включать примерно от 1 мкг до 2000 мкг, предпочтительно от 50 мкг до 1000 мкг и более предпочтительно примерно от 100 мкг до 500 мкг BTV или FMDV антигена, эпитопа или иммуногена. Объемы доз могут составлять примерно от 0.1 до 10 мл, предпочтительно примерно от 0.2 до 5 мл.
Далее изобретение будет дополнительно описано с помощью следующих неограничивающих примеров.
Примеры
Создание ДНК-вставок, плазмид и рекомбинантных вирусных или растительных векторов осуществлялось с использованием стандартных методов молекулярной биологии, описанных J. Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New Y или k, 1989).
Пример 1. Получение реассортантного BTV
Клетки и вирусы
2
BSR клетки являются клоном ВНК-21 клеток; клетки культивировали в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (DMEM, Gibco) с добавлением 5% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS) и 25 мкг/мл пенициллина/стрептомицина (p/s, Gibco). Клетки Vero культивировали в DMEM с добавлением 5% FBS и p/s. Клетки СРТ-Tert являются иммортализованной линией клеток хориоидного сплетения овцы (59). Эти клетки культивировали в среде Дульбекко, модифицированной по способу Исков (IMDM, Gibco) с добавлением 10% FBS и p/s. Все клетки млекопитающих инкубировали при 37°С в инкубаторе с влажной атмосферой с добавлением 5% СО.
BTV-1 представляет собой исходный штамм серотипа 1 из Южной Африки, который использовался в качестве основы для первой BTV системы реверсивной генетики. Европейский BTV-8 штамм (BTV-8NET2008/06 (IAH Orbivirus collection)) был выделен у пораженных (с клинической точки зрения) болезнью коров в Нидерландах, его история пассирования включает только один пассаж в KC клетках, а затем один дополнительный пассаж в клетках ВНК-21.
Плазмиды
Плазмиды, использованные для «спасения» BTV-1 и BTV-8, были описаны ранее (Ratinier et al, 2011). Каждая плазмида содержит одну BTV кДНК копию геномного сегмента фланкированного 5' Т7 промотором и 3' сайтом рестрикции. И Т7 промотор и сайт рестрикции были расположены так, что плазмиды, линеаризованные с подходящим рестрикционным ферментом, обеспечивали in vitro транскрипцию «кэппированных» РНК транскриптов с аутентичным BTV концом. Дополнительные плазмиды, содержащие Seg-2 вирулентных полевых изолятов BTV-2, BTV-4 и BTV-9 (13), в том же самом контексте как другие плазмиды «спасения» были синтезированы коммерчески (GenScript).
Реверсивная генетика
Плазмиды, содержащие геномные сегменты BTV-1 или BTV-8, или полученные мутанты были линеаризованы с подходящими рестрикционными ферментами, а затем очищены с помощью экстракции фенол-хлороформом. Усвоенные плазмиды были использованы в качестве матрицы in vitro транскрипции с использованием набора mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit (Ambion), согласно инструкциям производителя. оцРНК были последовательно очищены экстракцией фенол/хлороформом и на колонках Illustra Microspin G25 (GE Healthcare Life Sciences), в соответствии с протоколом производителя.
Комбинации индивидуальных РНК были собраны в соответствии с желательными реассортантами (смотри таблицу 1 и фигуру 1А и 1В).
5
11
2×10 BSR клеток культивировали в 12-луночных планшетах в ростовой среде с антибиотиками в течение 24 часов до трансфекции. Клетки были трансфицированы два раза РНК с использованием липофектамина 2000. Для первой трансфекции 1×10 копий in vitro транскрибированной BTV-подобной кэппированной РНК, кодирующей VP1, 3, 4, 6, NS1 и NS2, смешивали с OptiMEM (Gibco), содержащей RNAsin Plus (0.5 U/мкл, Promega) в окончательном объеме 10 мкл. 2 мкл липофектамина 2000 смешали с 10 мкл OptiMEM (c RNAsin Plus) и инкубировали в течение 5 минут до объединения с РНК. Давали возможность образоваться трансфекционным комплексам в течение 20 минут до того, как трансфекционная смесь была добавлена по каплям к клеткам. Приблизительно через 18 часов после первой трансфекции, среду заменили, и клетки трансфицировали второй раз в соответствии с первой трансфекцией, но используя все 10 сегментов и 3 мкл липофектамина. Через 4 часа после второй трансфекции среду заменили слоем агара.
На всем протяжении этого документа применяется стандартная номенклатура: часть названия, написанная заглавными буквами, относится к вирусной основе за которым следует подпись, содержащая замещенный белок, впереди указано происхождение серотипа сегмента, например BTV-1 gvpi относится к вирусу с BTV-1 основой, содержащей VP1 ген BTV-8.
Схематичное изображение получения реассортантного BTV показано на фигуре 6.
Кривые роста
5
6
50
Для исследования развития вируса in vitro 2×10 CPT-Tert клеток/лунку или 3×10КС клеток/лунку было высеяно в 12-луночные планшеты в 1 мл ростовой среды за день до инфицирования. Клетки инкубировали в среде, содержащей релевантный вирус, в течение 2 час при 37°С. Затем среду отбросили, промыли клетки один раз DMEM и затем инкубировали с 1 мл соответствующей свежей ростовой среды. Образцы 100 мкл супернатанта отбирали через 0, 8, 24, 48 и 72 часа после инфекции (p.i.), добавляя 100 мкл свежей ростовой среды. Образцы 100 мкл очищали центрифугированием в течение 5 минут при 500×g и затем хранили при 4°С. Затем образцы титровали методом серийных разведении (60) в BSR клетках, а титры вирусов выражали как TCID/мл.
Анализ бляшкообразования
5
CPT-Tert клетки были высеяны с плотностью 4×10 клеток/лунку в 6-луночные планшеты за 24 часа до инфицирования BTV. Клетки инфицировали в течение 2 часов при 37°С. После этого, среду, содержащую вирус, отбрасывали, клетки промывали DMEM и инкубировали в течение 72 час в 3 мл полутвердого агара (1.2% Avicel в DMEM с добавлением 4% FBS и p/s). Затем верхний слой агара удалили, промыли клетки PBS и затем окрашивали в течение > 1 часа кристаллическим фиолетовым в формальдегиде.
Исследование нейтрализации
50
2
50
4
В 96-луночных планшетах (в четырех экземплярах) получили трехкратные серийные разведения BTV-1 или BTV-8 специфической антисыворотки, используя 50 мкл каждой тестируемой сыворотки, разведенной в DMEM, содержащей 3% FBS. Затем 100 TCID BTV-1, BTV-8 и отобранных реассортантов добавили в соответствующие лунки и планшеты и инкубировали при 37°С в течение 1 часа. Наконец, к каждой лунке добавили 2.5×10 клеток Vero и инкубировали планшеты при 37°С в течение 5 дней в инкубаторе с влажной атмосферой с содержанием 5% CO, после чего визуально оценивали СРЕ вирусов. Затем была определена защитная доза 50 (PD) для каждого образца сыворотки, установленная как сывороточное разведение, которое ингибирует BTV инфекцию в 50% Vero клеток в культуре, с использованием метода Рида-Мюнча (60). Суспензию ВНК-21 клеток увеличили в масштабе для крупномасштабного производства реассортантного BTV. Обогащенные реассортантные BTV были инактивированы. Для получения препарата вакцины к реассортантным BTV были добавлены подходящие адъюванты.
Результаты
Реверсивную генетику использовали, чтобы определить, можно ли «пересортировать» какой-либо индивидуальный сегмент BTV-1 или BTV-8 в альтернативной основе. Все комбинации вируса с отдельным сегментом BTV-8 в основе BTV-1 были успешно «спасены» и наоборот (фигура 1А и 1В). Генотип каждого реассортантного вируса был проверен путем амплификации с помощью RT-PCR и секвенирования фрагмента из каждого сегмента (фигура 1). Результаты показали, что любой BTV сегмент можно пересортировать между BTV-1 и BTV-8.
8NS2
1NS2
Характеристика накопления in vitro каждого реассортантного вируса была оценена путем анализа бляшкообразования и с помощью кривых нарастания вируса. Средний диаметр бляшек определяли на основе двух независимых циклов анализа бляшкообразования. В большинстве случаев диаметр бляшек значительно не изменялся и мало отличался от родительской основы, в которую был вставлен альтернативный индивидуальный сегмент (фигура 2А-В). Однако некоторые вирусы неизменно показывали более мелкие или более крупные бляшки относительно родительской основы. Замена BTV-8 Seg-8 (кодирующий NS2) в BTV-1 основе (BTV-1) давала в результате бляшки, которые были приблизительно на 33% меньше, чем BTV-1 дикого типа (фигура 2А). Бляшки противоположного реассортанта, т.е. BTV-8, также были уменьшены, хотя в меньшей степени (фигура 2 В). Другие монореассортанты, которые неизменно давали бляшки с меньшим диаметром по сравнению с исходными вирусами, были монореассортантами с пересортированными сегментами, кодирующими VP1, VP4 и NS1.
Анализ кривых нарастания проводили с целью оценки кинетики роста каждого реассортанта. Большинство реассортантов продемонстрировали динамику роста, сходную с соответствующими вирусами дикого типа (фигура 3).
8VP2
8VP2,VP5
1VP2
1VP2,VP5
Некоторые исследования подтвердили, что VP2 неразрывно связан с серотипом BTV. Однако это также означало, что VP5 участвует в определении серотипа для отдельных штаммов. Чтобы исследовать относительный вклад VP2 и VP5 в установление серотипа, проводили анализ нейтрализации сыворотки с использованием реассортантов BTV-1, BTV-8 и реассортантов с основой или BTV-1 или BTV-8 и гетерологичного VP2 в отдельности или VP2 и VP5 (BTV-1, BTV-1, BTV-8 и BTV-8). BTV-1 и BTV-8 нейтрализующие антисыворотки были получены от животных, вакцинированных против BTV-1 или BTV-8 и зараженных гомологичным штаммом.
Результаты показали, что BTV-8 антисыворотка полностью нейтрализовала BTV-8 дикого типа, в то же время, не показав нейтрализующей способности против BTV-1 (фигура 4А). Аналогично, BTV-1 был нейтрализован BTV-1 антисывороткой, но не BTV-8 антисывороткой (фигура 4А).
Эксперименты с реассортантами, содержащими VP2 в отдельности или VP2 и VP5 гетерологичного вируса, показали, что вирус нейтрализуется только тогда, когда сыворотка соответствует VP2 белку, что подкрепляет исследования, связывающие серотип исключительно с VP2.
2VP2
4VP2
9VP2
Результаты показывающие, что VP2 в отдельности может обуславливать серотип, побудили нас получить дополнительные BTV-1 реассортанты, включающие Seg-2 из набора серотипов. BTV-1 реассортантные вирусы, содержащие VP2 BTV-2, BTV-4 и BTV-9, приводящие к BTV-1, BTV-1 и BTV-1, соответственно, были успешно «спасены». Во всех случаях были «спасены» вирусы, которые нарастали одинаково с вирусом дикого типа (фигура 5).
Пример 2. Клиническое и серологическое исследование вакцинированных животных
Два конструкта, использующие основу BTV-1 и замену (VP2BTV1) или (VP2BTV1+VP5BTV1) на (VP2BTV8) или (VP2BTV8+VP5BTV8), соответственно, были использованы при исследовании заражения. Характеристики антигенов, полученных с целью создания тестируемых вакцин, суммированы в таблице 2 ниже.
Реассортантные вирусы наращивали, инактивировали и обрабатывали с целью получения двух партий антигенов. Эти антигены заключали в состав вакцины, смешивая их с алюминиевым гелем (2.7 мг гидроксида алюминия) и сапонином (30HU сапонина на 1 мл дозы вакцины) в качестве адъювантов. Протестированные вакцины перечислены в таблице 3.
Вакцины вводили в виде 1 или 2 инъекций обыкновенной BTV серонегативной овце. Защиту оценивали посредством проведения вирулентного BTV-8 заражения на 21 день после завершения вакцинации и после клинического и вирусологического мониторинга. Исследование заражения проводили в соответствии с таблицей 4 ниже.
До начала вакцинации контролировали состояние здоровья всех животных и измеряли ректальную температуру. На день D0 и/или D21 каждое животное из групп G1-G6 получило одну дозу (1 мл) соответствующей вакцины, как описано в таблице 4. Инъекции делали подкожно в левую (D0) или правую (D21) боковую поверхность грудной клетки, рядом с локтем, после локальной дезинфекции места инъекции. Животные из группы G7 не были обработаны и служили в качестве контролей.
Ректальную температуру у всех животных регистрировали на D42 (до заражения) и затем ежедневно с D47 по D56. С D47 по D56 регистрировали общее поведение и физическое состояние всех животных. Общее состояние оценивали в баллах следующим образом: хорошее оценивалось как 0; апатичное - 1; подавленное - 2; ослабленное - 3. Физическое состояние: нормальное оценивалось как 0; худое животное - 1; истощенное животное - 2.
С D47 по D56 регистрировали часто наблюдаемые клинические признаки при инфицировании вирусом Bluetongue, включая:
- Гиперемия и/или отек, в частности, на голове: глаза, ноздри, уши, губы, chamfer (скошенный край), межчелюстное пространство
- Повышенное слюноотделение
- Выделения из носа/корки
- Жалобное блеяние
- Петехия (точечное кровоизлияние)
- Затруднение при передвижении (хромота)
- Затрудненность дыхания (кашель/одышка)
- Расстройство желудка (диарея)
- Эритема
Также регистрировали другие клинические признаки, в случае их наличия. В те дни, когда не проводился индивидуальный мониторинг клинических признаков, общее состояние здоровья стада отмечали каждый день в качестве части ежедневного ухода и содержания.
В дни D0 (до вакцинации), D21 (до вакцинации), D42 (до заражения) и D56 у всех овец были взяты образцы крови с помощью пункции из яремной вены с использованием простых пробирок. Из всех образцов была собрана сыворотка. Сыворотку поделили на аликвоты и инактивировали нагреванием (56°С, 30 мин) до передачи в лабораторию клинических анализов. Титры BTV-8 специфических антител были определены в отдельных образцах сыворотки на каждую дату сбора образцов путем проведения тестов серонейтрализации.
Тесты серонейтрализации проводили в соответствии с методом (№002488), используемым в настоящее время в лаборатории клинических анализов. Вкратце, сыворотку тестировали в трехкратных разведениях (0.48 Log10), начиная с 1/3, в микротитровальных планшетах. Сто микролитров разведенной сыворотки инкубировали 1 час при 37°С с 50 микролитрами вирусной суспензии данного BTV серотипа (серотип 8). Затем к смеси добавили пятьдесят микролитров суспензии VERO клеток, содержащей 500000 клеток на мл, и инкубировали планшеты при 37°С. Снятие показаний с планшетов основывалось на цитопатическом эффекте после 7-дневной инкубации. Сывороточные титры, выраженные в Log10 (PD50%), были вычислены с помощью регрессии после тригонометрического преобразования.
На D42 (до заражения), D47, D49, D51, D54 и D56 у всех овец были взяты образцы крови из яремной вены в пробирки с EDTA.
С целью обнаружения и количественного определения РНК вируса BTV в крови проводили исследование этих образцов с помощью qRT-PCR. Эти анализы проводили в соответствии с методикой №200336, используемой в настоящее время лабораторией клинических исследований (автоматизированный метод).
Вкратце, после экстракции с использованием коммерческого набора (Nucleospin multi 96), РНК сначала была денатурирована нагреванием. Затем одну аликвоту инкубировали с MGB зондом, специфическими праймерами и реагентом из набора Invitrogen Super Script III Platinium One step kit для обеспечения возможности амплификации в термоциклере. Эту стадию проводили дважды. Сигнал флуоресценции является пропорциональным количеству синтезированной ДНК. Амплификация имела отношение к любому из 24 BTV серотипов. Количественное определение нуклеиновых кислот BTV в образцах было проведено путем сравнения со стандартизированными образцами РНК. Количество РНК было выражено в Log10 количества копий РНК на мл крови, учитывая результаты, полученные при каждом повторе, когда оба были положительными, и только один положительный, когда один из дупликатов был установлен как отрицательный. Положительная отсекаемая точка 95% данного метода (определенная как минимальное количество последовательностей-мишеней на объем образца, которое может быть обнаружено в 95% испытаний) или порог положительного ответа 95% (PRT95) был определен при 3.68 log10 РНК копий/мл. Результаты образцов, титруемые ниже 3.68 log10 РНК копий/мл, были выражены как < PRT95 и считались отрицательными. Результаты образцов, титруемые ≥ Р RT95, предоставлялись как таковые и считались положительными.
В целях описания и анализа результатов (вычисление среднего значения, среднего квадратического отклонения и площади под кривой) титр 3.68 log10 РНК копий/мл был отнесен к отрицательным образцам.
Гипертермия
Процесс изменения (динамика) средних значений температуры после заражения показаны на фигуре 8. Дисперсия максимальных значений гипертермии показана на фигуре 9.
Повышенная ректальная температура явно наблюдалась в контрольной группе, начиная с D48 (т.е. через 6 дней после заражения), достигая максимума на D49 (41.3°С в среднем), затем постепенно уменьшаясь до D56.
Во всех вакцинированных группах средняя температура была достаточно постоянной на протяжении всего периода наблюдения. По сравнению с контрольной группой (G7) максимальные значения гипертермии были статистически значимо (р<0.01) снижены в вакцинированных группах G1, G3 и G4. В группах G2 и G6 различия не были статистически значимыми.
Клинические признаки и клинический показатель
Процесс изменения средних значений клинического показателя (показан на фигуре 10. Разброс GCS на группу показан на фигуре 11.
После заражения наиболее часто наблюдаемыми клиническими признаками были гиперемия и отек на голове. В числе других эпизодически отмечались следующие признаки - эритема, вялость, худоба, выделения из носа и корки, затрудненность дыхания и передвижения.
Частота и продолжительность наличия этих признаков были заметно выше в контрольных группах, чем в вакцинированных группах.
В контрольной группе (G7) средний ежедневный клинический показатель достигал пика на D50 (т.е. 8 дней после заражения) в объеме 8.8 и всегда был выше, чем в любой вакцинированной группе. Средний счет GCS в группе G7 был 50. В вакцинированных группах средний ежедневный клинический показатель был очень низким на всем протяжении периода наблюдения. По сравнению с контрольной группой (G7), показатели GCS были статистически значимо уменьшены (р<0.01) во всех вакцинированных группах за исключением G2. Для G2 различие было близко к статистически значимому значению.
Результаты виремии
Процесс изменения средних значений титров виремии суммирован на фигуре 12. Количество PCR-положительных образцов и площадь под кривой (AUC) показаны в таблице 5. Фигура 13 показывает разброс AUC.
Все овцы были «негативными» до заражения, что подтверждено методом RT-PCR. В контрольной группе все овцы были положительные на D47 (т.е. через 5 дней после заражения) и все они оставались «позитивными», при достаточно высоких титрах, до конца периода наблюдения.
В вакцинированных группах G3 и G4 одна овца была установлена как в незначительной степени положительная в день взятия образцов непосредственно после инокуляции. Затем обе овцы всегда были «негативными». Наиболее вероятно, что эти временные результаты «позитивности в незначительной степени» были следствием обнаружения остатка инокулума, использованного для заражения, и очевидно, что они не были связаны с размножением вируса.
По сравнению с контрольной группой (G7) площади под кривой были статистически значимо (р<0.01) уменьшены во всех вакцинированных группах за исключением G2. Для G2 различие было близко к статистически значимому значению. Посчитали, что полное предотвращение виремии было достигнуто в G1, G3, G4 и G5.
Результаты серологического исследования
Процесс изменения средних значений титров BTV-8 нейтрализующих антител суммирован на фигуре 14.
Было подтверждено, что все овцы были серонегативными до вакцинации, а контроли оставались серонегативными до заражения.
В группах вакцинированных 2 впрыскиваниями (G1 и G4) наблюдалась некоторая сероконверсия на день D21. В D42 у всех овец была отмечена сероконверсия в обеих группах, причем средние значения титров были почти одинаковыми.
В группах вакцинированных одним впрыскиванием (G2, G3, G5 и G6) некоторая сероконверсия наблюдалась через 21 день после вакцинации (т.е. D42). В то время как наблюдалось очевидное различие серологических титров (D42) между группами, вакцинированными одним или двумя впрыскиваниями (G1 vs G2 и G4 vs G5), различия серологических титров в соответствии с нагрузкой антигеном (G2 vs G3) были менее очевидны.
Все овцы были выражено сероконвертированными после заражения (D56) и наблюдался очевидный вторичный иммунный ответ во всех вакцинированных группах.
Заключение
Результаты показали, что конструкты обеспечивали значительное уменьшение гипертермии, значительное уменьшение клинических признаков и полное или значительное предотвращение виремии.
Пример 3. Получение синтетического BTV некоторых серотипов
С использованием обратно-генетической системы, как описано в Примере 1, были получены "синтетические" BTV реассортанты (sBTV), включающие 24 из 26 различных серотипов, в которых каждый VP2 был соединен с гомологичным VP5 белком в BTV-1 основе (VP1, VP3, VP4, NS1, VP7, NS2, VP6 и NS3 белки), как показано в таблице 6 ниже. Термин "синтетический" был использован для описания данной платформы, так как сегменты генома могут быть синтезированы in vitro из известной последовательности, а не путем амплификации генома изолята вируса.
Интересно и неожиданно, хотя BTV-25 (Toggenburg Orbivirus) не «нарастал» в клеточной культуре, путем введения нетранслируемых областей BTV-1 в кодирующую последовательность VP2 и VP5 белков мы были способны «спасти» sBTV BTV-25 серотипа. Таким образом, платформа на основе вакцин может быть чрезвычайно полезна для тех вирусных штаммов, которые не могут быть легко изолированы в тканевой культуре.
Характеристика и репликация in vitro sBTV
Вирусные исходные «культуры» каждого sBTV вируса были выращены и оттитрованы в BSR клетках. Фенотип бляшек оценивали методом анализа бляшкообразования в клетках овцы через 72 часа после инфицирования (фигура 15). Как уже упоминалось выше, все «спасенные» серотипы имеют гомологичную VP2/VP5 комбинацию.
50
10
50
sBTV репликация была установлена в BHK-21 клетках (инфицированных MOI 0.001). Клеточные супернатанты собирали через 72 часа после инфицирования (фигура 16). Затем образцы в трех экземплярах были оттитрованы TCID в клетках BHK-21 (с использованием метода Рида-Мюнча) и нанесены на график в виде LogTCID/мл.
Пример 4. Получение инактивированного реассортантного вируса
Два штамма-конструкта как реассортантные BTV, один соответствующий VP2 из BTV8 в BTV-1-основе и второй с VP2/VP5 из BTV8 в BTV-1-основе, были амплифицированы в BHK21 клетках.
Получение клеток
9
-4
50
Биореактор 7 л инокулировали (пассаж 48) вместе с 5 литрами среды GMEM с 7% телячьей сыворотки и 2×10 клеток (6BHK2M12-пассаж 47). Осуществляли регуляцию культурой, используя в качестве параметров: рН: 7.1±0.1, температура: 37.0±1.5°С, DO2: 40±10% и встряхивание: 300 rpm ±10%. Через 2 дня культивирования проводили исчисления. Общий объем суспензии был перенесен в В4 биореактор, заранее простерилизованный и содержащий 35 литров среды GMEM + 7%CS. Культуру регулировали, используя в качестве параметров: рН: 7.1±0.1, температуру: 37.0±1.5°С, DO2: 40±10% и встряхивание: 150 rpm ±10%. Через 3 дня культивирования перемешивание биореактора прекращали для отстаивания клеток в течение примерно 24 часов при +5°С. После отстаивания среду убирали (оставшийся объем =5 литров). Добавили среду VMM (30 литров). После перемешивания проводили подсчет клеток и добавляли инокулум: инокулум BTV1+BTV8 VP2 (RAS10) для первого активного ингредиента и инокулум BTV1+BTV8 VP2/VP5 (RAS32) для второго активного ингредиента. Окончательный объем в биореакторе составлял 35 литров, объемы инокулумов были вычислены с получением MOI, равного 5×10 CCID/клеток. Параметры культивирования были следующие: рН: 7.4±0.1, температура: 37.0±1.5°С, DO2: 40±10%, встряхивание: 100 об/мин ± 10% и давление: 0.1 бар ± 10%. Культивирование прекращали примерно через 46 часов путем охлаждения при перемешивании.
Обработка до активации
Регуляцию кислорода прекращали, добавляли хлороформ до получения окончательной концентрации 0.05%. Смесь перемешивали примерно при 8°С в течение одного часа, при этом было отрегулировано значение рН 7.4±0.1. Регулирование рН прекращали и хранили продукт примерно при +8°С без перемешивания до обработки. Около 24 литров культуры обрабатывали ultra-turrax T50: 8 образцов 3000 мл при 1000 ватт в течение 3 минут при лабораторной температуре. После обработки образцы были объединены.
Затем продукт был очищен центрифугированием (20 минут при 3500 об/мин, 20°С). Супернатант профильтровали и хранили при +5°С до инактивации.
Инактивация
Фильтрат супернатанта нагревали при 37°С и доводили значение рН до 7.4±0.1. Добавили раствор формальдегида, чтобы получить окончательную концентрацию 0.5 мг/мл. Через 20 минут добавили одну дозу EI, чтобы получить окончательную концентрацию 1.5 мМ. Через 18 часов добавили вторую дозу EI (такая же концентрация). Стадию инактивации проводили при 37°С в течение 24 часов (Т0 = время первого добавления EI). Во время стадии инактивации, образцы протекали и обрабатывались раствором L-цистеина.
Фильтрование и концентрация
Инактивированный продукт профильтровали (CUNO 30S). Новый объем измерили. Фильтрат концентрировали при лабораторной температуре, вычислили коэффициент концентрации.
Очистка и обработка формальдегидом
Концентрат был очищен с использованием колонки ХК 25/100 с S6FF. Было проведено два прогона. Использовали следующие условия очистки: объем образца: 15% колонки (около 60 мл); буфер для элюирования: фосфатный буфер рН 7.4; скорость элюирования: 2.5 мл/мин. Эксклюзионный пик (активный ингредиент), сохраняемую фракцию и белковую фракцию собирали отдельно. К активному ингредиенту добавляли раствор формальдегида для получения окончательной концентрации 1 мг/мл и хранили при +5°С.
Результаты инфекционного титра, ELISA, Dot Blot Vp2 для BTV1+BTV8 VP2 (RAS10) и BTV1+BTV8 VP2/VP5 (RAS32) показаны на фигурах 17 и 18. Получение двух очищенных инактивированных BTV реассортантов было успешно осуществлено. Эти два реассортантна были использованы для создания вакцин.
Таким образом, имея подробно описанные предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения, следует понимать, что изобретение, определенное вышеуказанными положениями, не ограничивается конкретными деталями в представленном выше описании, поскольку возможны его явные многочисленные изменения без отступления от сущности или объема настоящего изобретения.
Все документы, изложенные или упоминаемые в процитированных в заявке документах, и все документы, изложенные или упомянутые в данном документе ("цитируемые здесь документы"), и все документы, изложенные или упомянутые в цитируемых здесь документах, вместе с любыми инструкциями производителя, описаниями, спецификациями любых продуктов, упомянутых в данном документе или в любом документе, включенном в описание путем отсылки, тем самым включаются в данное описание путем отсылки, и могут использоваться при осуществлении изобретения на практике.
Ссылки
Anderson, G. A., J. L. Stott, et al. (1985). "Subclinical and clinical bluetongue disease in cattle: clinical, pathological and pathogenic considerations." Prog Clin Biol Res 178: 103-7.
Andreansky, S. S., B. He, et al. (1996). "The application of genetically engineered herpes simplex viruses to the treatment of experimental brain tumors." Proc Natl Acad Sci U S A 93(21): 11313-8.
Andrew, M., P. Whiteley, et al. (1995). "Antigen specificity of the ovine cytotoxic Т lymphocyte response to bluetongue virus." Vet Immunol Immunopathol 47(3-4): 311-22.
Antoine, G., F. Scheiflinger, et al. (1998). "The complete genomic sequence of the modified vaccinia Ankara strain: comparison with other orthopoxviruses." Virology 244(2): 365-96.
Ballay, A., M. Levrero, et al. (1985). "In vitro and in vivo synthesis of the hepatitis В virus surface antigen and of the receptor for polymerized human serum albumin from recombinant human adenoviruses." Embo J 4(13B): 3861-5.
Barcena, J., M. M. Lorenzo, et al. (2000). "Sequence and analysis of a swinepox virus homologue of the vaccinia virus major envelope protein P37 (F13L)." J Gen Virol 81(Pt 4): 1073-85.
Bernard, K. A., B. A. Israel, et al. (1997). "Sequence and cognitive analyses of two virulence-associated markers of bluetongue virus serotype 17." Intervirology 40(4): 226-31.
Bonneau, K. R., С. D. DeMaula, et al. (2002). "Duration of viremia infectious to Culicoides sonorensis in bluetongue virus-infected cattle and sheep," Vet Microbiol 88(2): 115-25.
Bonneau, K. R., B. A. Mullens, et al. (2001). "Occurrence of genetic drift and founder effect during quasispecies evolution of the VP2 and NS3/NS3A genes of bluetongue virus upon passage between sheep, cattle, and Culicoides sonorensis." J Virol 75(17): 8298-305.
Bonneau, K. R., N. Zhang, et al. (1999). "Sequence comparison of the L2 and S10 genes of bluetongue viruses from the United States and the People's Republic of China." Virus Res 61(2): 153-60.
Boshart, M., F. Weber, et al. (1985). "A very strong enhancer is located upstream of an immediate early gene of human cytomegalo virus." Cell 41(2): 521-30.
Bradel-Tretheway, B. G., Z. Zhen, et al. (2003). "Effects of codon-optimization on protein expression by the human herpesvirus 6 and 7 U51 open reading frame." J Virol Methods 111(2): 145-56.
Can-oil, M. W., W. W. Overwijk, et al. (1997). "Highly attenuated modified vaccinia vims Ankara (MVA) as an effective recombinant vector: a murine tumor model." Vaccine 15(4): 387-94.
Cochran, M. A., C. Puckett, et al. (1985). "In vitro mutagenesis of the promoter region for a vaccinia virus gene: evidence for tandem early and late regulatory signals." J Virol 54(1): 30-7.
Cowley, J. A. and B. M. Gorman (1989). "Cross-neutralization of genetic reassortants of bluetongue virus serotypes 20 and 21." Vet Microbiol 19(1): 37-51.
De Groot, A. S. and F. G. Rothman (1999). "In silico predictions; in vivo veritas." Nat Biotechnol 17(6): 533-4.
de Mattos, C. A., C. C. de Mattos, et al. (1994). "Heterogeneity of the L2 gene of field isolates of bluetongue virus serotype 17 from the San Joaquin Valley of California." Virus Res 31(1): 67-87.
DeMaula, C. D., K. R. Bonneau, et al. (2000). "Changes in the outer capsid proteins of bluetongue virus serotype ten that abrogate neutralization by monoclonal antibodies." Virus Res 67(1): 59-66.
DeMaula, C. D., H. W. Heidner, et al. (1993). "Neutralization determinants of United States bluetongue virus serotype ten." Virology 195(1): 292-6.
DeMaula, C. D., C. M. Leutenegger, et al. (2002). "The role of endothelial cell-derived inflammatory and vasoactive mediators in the pathogenesis of bluetongue." Virology 296(2); 330-7.
Disbrow, G. L., I. Sunitha, et al. (2003). "Codon optimization of the HPV-16 E5 gene enhances protein expression." Virology 311(1): 105-14.
Felgner, J. H., R. Kumar, et al. (1994). "Enhanced gene delivery and mechanism studies with a novel series of cationic lipid formulations." J Biol Chem 269(4): 2550-61.
Frolov, I., T. A. Hoffman, et al. (1996). "Alphavirus-based expression vectors: strategies and applications." Proc Natl Acad Sci U S A 93(21): 11371-7.
Funahashi, S., T. Sato, et al. (1988). "Cloning and characterization of the gene encoding the major protein of the A-type inclusion body of cowpox virus." J Gen Virol 69 (Pt I): 35-47.
Geysen, H. M. (1990). "Molecular technology: peptide epitope mapping and the pin technology." Southeast Asian J Trop Med Public Health 21(4): 523-33.
Geysen, H. M., S. J. Barteling, et al. (1985). "Small peptides induce antibodies with a sequence and structural requirement for binding antigen comparable to antibodies raised against the native protein." Proc Natl Acad Sci U S A 82(1): 178-82.
Geysen, H. M., R. H. Meloen, et al. (1984). "Use of peptide synthesis to probe viral antigens for epitopes to a resolution of a single amino acid." Proc Natl Acad Sci U S A 81(13): 3998-4002.
Ghiasi, H., A. Fukusho, et al. (1987). "Identification and characterization of conserved and variable regions in the neutralization VP2 gene of bluetongue virus." Virology 160(1): 100-9.
Graham, F. L. (1990). "Adenoviruses as expression vectors and recombinant vaccines." Trends Biotechnol 8(4): 85-7.
Guo, P. X., S. Goebel, et al. (1989). "Expression in recombinant vaccinia virus of the equine herpesvirus 1 gene encoding glycoprotein gp13 and protection of immunized animals." J Yirol 63(10): 4189-98.
Hartikka, J., M. Sawdey, et al. (1996). "An improved plasmid DNA expression vector for direct injection into skeletal muscle." Hum Gene Ther 7(10): 1205-17.
Hassan, S. S. and P. Roy (1999). "Expression and functional characterization of bluetongue virus VP2 protein: role in cell entry." J Virol 73(12): 9832-42.
Heidner, H. W., P. V. Rossitto, et al. (1990). "Identification of four distinct neutralizing epitops on bluetongue virus serotype 10 using neutralizing monoclonal antibodies and neutralization-escape variants." Virology 176(2): 658-61.
Hemmer, В., С. Pinilla, et al. (1998). "The use of soluble synthetic peptide combinatorial libraries to determine antigen recognition of Т cells." J Pept Res 52(5): 338-45.
Huang, I. J., G. Y. Hwang, et al. (1995). "Sequence analyses and antigenic epitop mapping of the putative RNA-directed RNA polymerase of five U.S. bluetongue viruses." Virology 214(1): 280-8.
Huismans, H. and B. J. Erasmus (1981). "Identification of the serotype-specific and group-specific antigens of bluetongue virus." Onderstepoort J Vet Res 48(2); 51-8.
Huismans, H., N. T. van der Walt, et al. (1987). "Isolation of a capsid protein of bluetongue virus that induces a protective immune response in sheep." Virology 157(1); 172-9.
Jewell, J. E. and J. O. Mecham (1994). "Identification of an amino acid on VP2 that affects neutralization of bluetongue virus serotype 10." Virus Res 33(2): 139-44.
Ju, Q., D. Edelstein, et al. (1998). "Transduction of non-dividing adult human pancreatic beta cells by an integrating lentiviral vector." Diabetologia 41(6): 736-9.
Kim, С. H., Y. Oh, et al. (1997). "Codon optimization for high-level expression of human erythropoietin (EPO) in mammalian cells." Gene 199(1-2): 293-301.
Kitson, J. D., K. L. Burke, et al. (1991). "Chimeric polioviruses that include sequences derived from two independent antigenic sites of foot-and-mouth disease virus (FMDV) induce neutralizing antibodies against FMDV in guinea pigs." J Virol 65(6): 3068-75.
Klinman, D. M., A. K. Yi, et al. (1996). "CpG motifs present in bacteria DNA rapidly induce lymphocytes to secrete interleukin 6, interleukin 12, and interferon gamma." Proc Natl Acad Sci U S A 93(7): 2879-83.
Kwissa, M., K. van Kampen, et al. (2000). "Efficient vaccination by intradermal or intramuscular inoculation of plasmid DNA expressing hepatitis В surface antigen under desmin promoter/enhancer control." Vaccine 18(22): 2337-44.
Laval, F., R. Paillot, et al. (2002). "Quantitative analysis of the antigen-specific IFNgamma+ Т cell-mediated immune response in conventional outbred pigs: kinetics and duration of the DNA-induced IFNgamma+ CD8+ Т cell response." Vet Immunol Immunopathol 90(3-4): 191-201.
Lobato, Z. I., В. Е. Coupar, et al. (1997). "Antibody responses and protective immunity to recombinant vaccinia virus-expressed bluetongue virus antigens." Vet Immunol Immunopathol 59(3-4): 293-309.
Luckow, V. A. and M. D. Summers (1988). "Signals important for high-level expression of foreign genes in Autographa califomica nuclear polyhedrosis virus expression vectors." Virology 167(1): 56-71.
MacLachlan, N. J. (1994). "The pathogenesis and immunology of bluetongue virus infection of ruminants." Comp Immunol Microbiol Infect Pis 17(3-4); 197-206.
MacLachlan, N. J. and J. Е. Pearson (2004). Bluetongue: Prodeedings of the Third International Symposium. Bluetongue: Prodeedings of the Third International Symposium. N. J. MacLachlan and J. Е. Pearson, Vet Italiana. 40: 1-730.
Marshall, Е., L. B. Woolford, et al. (1997). "Continuous infusion of macrophage inflammatory protein MIP-1 alpha enhances leucocyte recovery and haemopoietic progenitor cell mobilization after cyclophosphamide." Br J Cancer 75(12); 1715-20.
Martinez-Torrecuadrada, J. L., J. P. Langeveld, et al. (1999). "Antigenic profile of African Horse sickness virus serotype 4 VP5 and identification of a neutralizing epitop shared with bluetongue virus and epizootic hemorrhagic disease virus." Virology 257(2): 449-59.
McClements, W. L., M. Е. Armstrong, et al. (1996). "Immunization with DNA vaccines encoding glycoprotein D or glycoprotein B, alone or in combination, induces protective immunity in animal models of herpes simplex virus-2 disease." Proc Natl Acad Sci U S A 93(21): 11414-20.
Mecham, J. O., V. С. Dean, et al. (1986). "Correlation of serotype specificity and protein structure of the five U.S. serotypes of bluetongue virus." J Gen Virol 67 (Pt 12): 2617-24.
Mecham, J. O. and D. J. Johnson (2005). "Persistence of bluetongue virus serotype 2 (BTV-2) in the southeast United States." Virus Res 113(2); 116-22.
Miyazaki, J., S. Takaki, et al. (1989). "Expression vector system based on the chicken beta-actin promoter directs efficient production of interleukin-5." Gene 79(2): 269-77.
Moss, В. (1996). "Genetically engineered poxviruses for recombinant gene expression, vaccination, and safety." Proc Natl Acad Sci U S A 93(21): 11341-8.
Mullens, В. A., W. J. Tabachnick, et al. (1995). "Effects of temperature on virogenesis of bluetongue virus serotype 11 in Culicoides variipennis sonorensis." Med Vet Entomol 9(1); 71-6.
Paoletti, E. (1996). "Applications of pox virus vectors to vaccination: an update." Proc Natl Acad Sci USA 93(21): 11349-53.
Pearson, W. R. and D. J. Lipman (1988). "Improved tools for biological sequence comparison." Proc Natl Acad Sci U S A 85(8): 2444-8.
Pennock, G. D., C. Shoemaker, et al. (1984). "Strong and regulated expression of Escherichia coli beta-galactosidase in insect cells with a baculovirus vector." Mol Cell Biol 4(3): 399-406.
Perkus, M. E., K. Limbach, et al. (1989). "Cloning and expression of foreign genes in vaccinia virus, using a host range selection system." J Virol 63(9): 3829-36.
Powell, M. F. and M. J. Newman (1995). Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach. A Compendium of Vaccine Adjuvants and Excipients. F. Vogel and M. Powell. New York, Plenum Press. 6: 147, 183.
Prevec, L., M. Schneider, et al. (1989). "Use of human adenovirus-based vectors for antigen expression in animals." J Gen Virol 70 (Pt 2): 429-34.
Pritchard, L. I. and A. R. Gould (1995). "Phylogenetic comparison of the serotype-specific VP2 protein of bluetongue and related Orbiviruses." Virus Res 39(2-3); 207-20.
Regelson, W., S. Kuhar, et al. (1960). "Synthetic polyelectrolytes as tumour inhibitors." Nature 186: 778-80.
Riviere, M., J. Tartaglia, et al. (1992). "Protection of mice and swine from pseudorabies virus conferred by vaccinia virus-based recombinants." J Virol 66(6): 3424-34.
Robertson, E. S., T. Ooka, et al. (1996). "Epstein-Barr virus vectors for gene delivery to В lymphocytes." Proc Natl Acad Sci U S A 93(21): 11334-40.
Robinson, H. L. and С.A. Torres (1997). "DNA vaccines." Semin Immunol 9(5): 271-83.
Roizman, В. (1996). "The function of herpes simplex virus genes: a primer for genetic engineering of novel vectors." Proc Natl Acad Sci U S A 93(21): 11307-12.
Rossitto, P. V. and N. J. MacLachlan (1992). "Neutralizing epitops of the serotypes of bluetongue virus present in the United States." J Gen Virol 73 (Pt 8): 1947-52.
Roy, P. (1992). "Bluetongue virus proteins." J Gen Virol 73 (Pt 12): 3051-64.
Roy, P. (1996). "Orbivirus structure and assembly." Virology 216(1): 1-11.
Roy, P. (1996). Orbiviruses and their replication. Fields Virology. B. N. Fields, D.M.
Knipe, P.M. Howley. Philadelphia, PA, Lippincott-Raven: 1709-1734.
Roy, P., T. Urakawa, et al. (1990). "Recombinant vims vaccine for bluetongue disease in sheep." J Virol 64(5): 1998-2003.
Sambrook, J. and D. W. Russell (2001). Molecular Cloning: a laboratory manual / Joseph Sambrook, David W. Russell. Cold Spring Harbor, N.Y., Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Schneider, K., F. Puehler, et al. (2000). "cDNA cloning of biologically active chicken interleukin-18." J Interferon Cvtokine Res 20(10): 879-83.
Shida, H. (1986). "Nucleotide sequence of the vaccinia virus hemagglutinin gene." Virology 150(2): 451-62.
Smith, G. E., M. D. Summers, et al. (1983). "Production of human beta interferon in insect cells infected with a baculovirus expression vector." Mol Cell Biol 3(12): 2156-65.
Snedecor, G. W. & COCHRAN, W. G. (1971) Transformation de proportions en Arcsinus. In Methodes Statistiques. 6th edn. Eds H. Boelle, E. Camhaji. Association de Coordination Technique Agricole. pp 366-367.
Spreull, J. (1905). "Malarial catarrhal fever (bluetongue) of sheep in South Africa." J. Comp. Path.. Ther. 18: 321-337.
Stickl, H. and V. Hochstein-Mintzel (1971). "[Intracutaneous smallpox vaccination with a weak pathogenic vaccinia virus ("MVA virus")]." Munch Med Wochenschr 113(35); 1149-53.
Stittelaar, K. J., L. S. Wyatt, et al. (2000). "Protective immunity in macaques vaccinated with a modified vaccinia virus Ankara-based measles virus vaccine in the presence of passively acquired antibodies." J Virol 74(9): 4236-43.
Sutler, G. and B. Moss (1992). "Nonreplicating vaccinia vector efficiently expresses recombinant genes." Proc Natl Acad Sci U S A 89(22): 10847-51.
Sutler, G., L. S. Wyatt, et al. (1994). "A recombinant vector derived from the host range-restricted and highly attenuated MVA strain of vaccinia virus stimulates protective immunity in mice to BTV or FMDV virus." Vaccine 12(11): 1032-40.
Tang, D. C., M. DeVit, et al. (1992). "Genetic immunization is a simple method for eliciting an immune response." Nature 356(6365): 152-4.
Taylor, J., R. Weinberg, et al. (1988). "Protective immunity against avia BTV or FMDV induced by a fowlpox virus recombinant." Vaccine 6(6): 504-8.
Thompson, J. D., D. G. Higgins, et al. (1994). "CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice." Nucleic Acids Res 22(22): 4673-80.
Ulmer, J. В., J. J. Donnelly, et al. (1993). "Heterologous protection against BTV or FMDV by injection of DNA encoding a viral protein." Science 259(5102); 1745-9.
Van der Zee, R., W. Van Eden, et al. (1989). "Efficient mapping and characterization of a Т cell epitop by the simultaneous synthesis of multiple peptides." Eur J Immunol 19(1): 43-7.
van Ooyen, A., J. van den Berg, et al. (1979). "Comparison of total sequence of a cloned rabbit beta-globin gene and its flanking regions with a homologous mouse sequence." Science 206(4416); 337-44.
Verwoerd, D. W., H. J. Els, et al. (1972). "Structure of the bluetongue virus capsid." J Virol 10(4): 783-94.
Vialard, J., M. Lalumiere, et al. (1990). "Synthesis of the membrane fusion and hemagglutinin proteins of measles virus, using a novel baculovirus vector containing the beta-galactosidase gene." J Virol 64(1); 37-50.
Wang, L. F., D. H. Du Plessis, et al. (1995). "Use of a gene-targeted phage display random epitop library to map an antigenic determinant on the bluetongue virus outer capsid protein VP5." J Immunol Methods 178(1); 1-12.
White, D. M., W. C. Wilson, et al. (2005). "Studies on overwintering of bluetongue viruses in insects." J Gen Virol 86(Pt 2): 453-62.
Wilson, W. C. and J. O. Mecham (2000). "Molecular Evolution of Orbiviruses." Proc USAHA 104: 169-180.
Xin, K. Q., K. Hamajima, et al. (1999). "IL-15 expression plasmid enhances cell-mediated immunity induced by an HIV-1 DNA vaccine." Vaccine 17(7-8): 858-66.