СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СЕБАЦИНОВОЙ КИСЛОТЫ
PROCESS FOR PREPARING SEBACIC ACID

Настоящее изобретение относится к новому способу получения себациновой кислоты. В частности, настоящее изобретение относится к химико-ферментативному получению себациновой кислоты исходя из линолевой кислоты, которая гидроксилируется до 10-гидрокси-12-октадеценовой кислоты и далее трансформируется в себациновую кислоту.
Уровень техники
Себациновую кислоту в настоящее время получают из касторового масла путем щелочного расщепления рициноленовой кислоты (12-гидрокси-9-цис-октадеценовой кислоты) под давлением и при высоких температурах.
Себациновая кислота и ее производные являются важными компонентами в биоразлагаемых полимерах, пластификаторах, смазочных веществах, гидравлических жидкостях, свечах и косметических средствах.
Обзор микробного окисления насыщенных жирных кислот раскрывается в следующей публикации: Hou С.Т. (1995) Adv. Appl. Microbiol., 41, 1-23.
Ферментативная гидратация линолевой кислоты до 10-гидрокси-12-октадеценовой кислоты посредством pseudomonas раскрывается с 57%-ым выходом в работе Schroepfer G.J. et al. (1970) J. Biol. Chem., 245, 3798-3801).
В US 4,582,804 Litchfield & Pierce раскрывается, что клетки Rhodococcus rhodochrous катализируют гидратацию линолевой кислоты до 10-гидрокси-12-октадеценовой кислоты с 22%-ым выходом.
Hou описывает гидратацию линолевой кислоты до 10-гидрокси-12-октадеценовой кислоты посредством ферментативной системы Flavobacterium DS5 с 55%-ым выходом (Hou СТ. (1994) J. Am. Oil Chem. Soc, 71, 975-978).
Такое же превращение было показано с применением штаммов Enterococcus faecalis из бычьего рубца с 22%-ым выходом (Hudson J.A. et al. (1998) FEMS Microbiology Letters, 169, 277-282).
Demir et al. раскрывают хемоферментативное превращение линолевой кислоты в цис-9,транс-11-октадекадиеновую кислоту (CLA), соединение, имеющее противораковые, редуцирующие жир и подавляющие гипертензию свойства. Линолевая кислота превращалась в 10-гидрокси-12-октадеценовую кислоту с помощью Lactobacillus plantarum, с последующей обработкой иодом при облучении микроволнами с получением CLA с высоким выходом (Demir A.S. et al. (2010) J. Agrie. Food Chem., 58, 1646-1652).
Хотя во многих отчетах раскрывается применение целых организмов или экстрактов клеток для гидратации ненасыщенных жирных кислот, фермент не был охарактеризован подробно до 2009 года. Bevers et al. первыми описали выделение, рекомбинантную экспрессию в Е. coli и охарактеризовали олеат-гидратазу (ЕС 4.2.1.53) из Elizabethkingia meningoseptica (Bevers L.E. et al. (2009) J. Bacteriol., 191, 5010-5012).
Способ получения жирных гидроксикислот с применением гидратазы из Streptococcus pyogenes был описан в WO 2008/119735.
В недавних отчетах было показано, что олеат-гидратазы из Stenotrophomonas maltophilia и из Lysinibacillus fusiformis способны гидратировать линолевую кислоту, хотя с пониженной специфичной активностью по сравнению с олеиновой кислотой (Young-Chul Joo et al. (2012) J. Biotechnol., 158, 17-23 and Bi-Na Kim et al. (2011) Appl. Microbiol. Biotechnol., online)
Задача изобретения
По причине увеличения потребности в себациновой кислоте задача настоящего изобретения состоит в обеспечении нового пути синтеза себациновой кислоты исходя из эдуктов, отличных от рицинолевой кислоты, которые являются легко доступными.
Объект изобретения
Задача настоящего изобретения достигается в соответствии с формулой настоящего изобретения посредством способа получения себациновой кислоты путем реакции на первой стадии (i) линолевой кислоты с водой, катализируемой олеатгидратазой, с образованием 10-гидрокси-12-октадеценовой кислоты, на второй стадии (ii) пиролизом 10-гидрокси-12-октадеценовой кислоты до 1-октена и 10-оксо-декановой кислоты и на третьей стадии (iii) окислением 10-оксо-декановой кислоты до себациновой кислоты.
Стадия (i)
Способ согласно настоящему изобретению начинается с превращения линолевой кислоты в 10-гидрокси-12-октадеценовую кислоту. На стадии (i) способа согласно настоящему изобретению может применяться химически чистая линолевая кислота, а также субстраты, которые содержат линолевую кислоту в качестве основного компонента, предпочтительно более 60%, более предпочтительно более 70% или 80 мас. % от субстрата.
Такие субстраты могут быть получены из масла, имеющего высокое содержание линолевой кислоты в форме сложных эфиров глицерина путем гидролиза сложных эфиров глицерина и извлечения линолевой кислоты в форме свободной кислоты или ее солей. Такими маслами являются, например, сафлоровое масло (78% линолевой кислоты), масло виноградных косточек (73% линолевой кислоты), маковое масло (70% линолевой кислоты) или, главным образом, предпочтительное подсолнечное масло (68% линолевой кислоты).
Если линолевую кислоту получают из сложного масла, такого как подсолнечное масло, полученная жирная кислота может содержать в дополнение к линолевой кислоте другие жирные кислоты, которые могут присутствовать при осуществлении стадии (i) реакции согласно настоящему изобретению. Эти другие жирные кислоты могут быть выделены из реакции на более поздних стадиях реакции, предпочтительно после стадии (ii).
В качестве ферментов, подходящих для стадии (i), существует ряд олеатгидратаз, известных из уровня техники, как раскрывается выше, например, из организмов Pseudomonas, Rhodoccocus, Flavobacterium, Enterococcus, Lysinibacillus, Lactobacillus, Stenotrophomonas, Elizabethkingia.
Эти ферменты известны из уровня техники для превращения линолевой кислоты в 10-гидрокси-12-октадеценовую кислоту. В дополнение к этим ферментам другие ферменты олеат-гидратазы могут быть легко обнаружены специалистом в данной области техники путем скрининга микроорганизмов, применяя в качестве модельной реакции превращение олеиновой кислоты в 10-гидроксистеариновую кислоту или нацеленную реакцию линолевой кислоты в 10-гидрокси-12-октадеценовую кислота. Эта реакция может осуществляться в ходе лабораторных анализов, и, таким образом, одновременно тысячи микроорганизмов могут быть скринированы за короткое время.
Так как последовательность некоторых олеатгидратаз известна, также возможно скринировать in silico геномы микроорганизмов для других олеатгидратаз и протестировать положительные популяции на превращение олеиновой кислоты в 10-гидроксистеариновую кислоту или нацеленную реакцию линолевой кислоты в 10-гидрокси-12-октадеценовую кислоту.
Другим путем является генетическая инженерия известных олеатгидратаз для получения ферментов с улучшенной -активностью или более хорошей устойчивостью к температуре или растворителям, путем сравнения последовательностей из известных олеатгидратаз для обнаружения консервативных или гомологических областей и для обнаружения исходных точек для направленного генного мутагенеза.
Предпочтительным ферментом является олеатгидратаза согласно ЕС 4.2.1.53. Представителем этого класса ферментов является фермент из Elizabethkingia miningoseptica (Bevers et al (2009) J. Bacteriol. 191, 5010-5012). Нуклеотидная последовательность и соответствующая аминокислотная последовательность описываются как SEQ ID NO: 1 и 2.
Предпочтительным ферментом является фермент, имеющий SEQ ID NO: 2, или фрагмент указанной полипептидной последовательности, где указанный фрагмент является достаточным для белка, имеющего ферментативную активность олеатгидратазы, или последовательности нуклеиновых кислот, содержащие нуклеотидную последовательность, которая кодирует олеатгидратазу и которая гибридизируется с комплементарной нитью нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 2 при строгих условиях, или содержащие фрагмент указанной нуклеотидной последовательности, или содержащие фрагмент указанной нуклеотидной последовательности, где фрагмент является достаточным, чтобы кодировать белок, имеющий ферментативную активность олеатгидратазы.
Настоящее изобретение, кроме того, относится к ферменту, имеющему ферментативную активность олеатгидратазы и аминокислотную последовательность, обозначенную как SEQ ID NO: 2, или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 75% или 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, 90% или 95%, более предпочтительно по меньшей мере на 95% или 97% и наиболее предпочтительно по меньшей мере на 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности, обозначенной как SEQ ID NO: 2.
Для повышения растворимости и уровня экспрессии фермента такие ферменты могут быть рекомбинантно экспрессированы с N- (или С)-терминальными сливающимися партнерами (белками или пептидами). Типичные белки или метки, применяемые в качестве сливающихся партнеров для повышенной растворимости и/или повышенных уровней экспрессии: мальтоза-связывающий белок, тиоредоксин, зеленый флуоресцентный белок, глутатион-8-трансфераза, дисульфидоксидоредуктаза/изомераза, Т7 метка, SET метка, Nus A, Mistic и SUMO.
В контексте настоящего изобретения выражение «гибридизация в строгих условиях" означает, что гибридизация осуществляется in vitro в условиях, достаточно строгих для обеспечения специфичной гибридизации. Строгие условия гибридизации in vitro известны специалисту в данной области техники, и могут быть найдены в литературе (например, Sambrook and Rus-sell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Har-bour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY). Термин «специфичная гибридизация» относится к тому факту, что молекула предпочтительно связывается с определенной последовательностью нуклеиновой кислоты, целевой последовательностью, при строгих условиях, если целевая последовательность является частью сложной смеси, например, ДНК или РНК молекул, но не связывается, или по меньшей мере связывается в значительно меньшей степени, с другими последовательностями.
Строгие условия зависят от условий. Более длинные последовательности гибридизуются специфически при более высоких температурах. В общем, строгие условия выбираются таким образом, чтобы температура гибридизации составляла около 5°C ниже точки плавления (Tm) для специфичной последовательности при определенной ионной силе и определенном значении рН. Tm представляет собой температуру (при определенном значении рН, определенной ионной силе и определенной концентрации нуклеиновой кислоты), при которой 50% молекул, комплементарных целевой последовательности, гибридизуются с целевой последовательностью в состоянии равновесия. Как правило, строгими условиями являются те, при которых концентрация соли составляет по меньшей мере около от 0.01 до 1.0 M концентрации ионов натрия (или концентрация другой соли) при значении рН от 7.0 до 8.3, и температура составляет по меньшей мере 30°C для коротких молекул (т.е., например, от 10 до 50 нуклеотидов). Кроме того, строгие условия могут включать добавление агентов, таких как формамид, который дестабилизирует гибриды. При гибридизации при строгих условиях, как применяется согласно настоящему изобретению, нуклеотидные последовательности, которые на по меньшей мере 60% гомологичны друг другу, как правило, остаются гибридизованными друг с другом. Предпочтительно, строгие условия выбираются таким образом, что последовательности, которые гомологичны друг другу на по меньшей мере около 65%, предпочтительно на по меньшей мере около 70%, и особенно предпочтительно на по меньшей мере около 75%, или более, как правило, остаются гибридизованными друг с другом. Предпочтительным неограничивающим примером строгих условий гибридизации являются гибридизации в 6 × хлориде натрия/цитрате натрия (SSC) при около 45°C, с последующей одной или более стадиями отмывки в 0.2 × SSC, 0.1% SDS при от 50 до 65°C. Диапазоны температур, например, при строгих условиях гибридизации в зависимости от типа нуклеиновой кислоты, составляют от 42°C до 58°C в водном буфере при концентрации от 0.1 до 5 × SSC (рН 7.2).
Если органический растворитель, например, 50% формамид, присутствует в вышеупомянутом буфере, температура при строгих условиях составляет около 42°C. Предпочтительно, условия гибридизации для ДНК:ДНК гибридов составляют, например, 0.1 × SSC и от 20°C до 45°C, предпочтительно от 30°C до 45°C. Предпочтительно, условия гибридизации для ДНК:РНК гибридов составляют, например, 0.1 × SSC и от 30°C до 55°C, предпочтительно от 45°C до 55°C. Температуры гибридизации, упомянутые выше, определяются, например, для нуклеиновой кислоты, имеющей длину около 100 пар оснований и содержание G/C, равное 50%, в отсутствии формамида. Специалисту в данной области техники известно как можно определить требуемые условия гибридизации, применяя приведенные выше сведения или следующую литературу: Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), Hames und Higgins (publisher) 1985, Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (publisher) 1991, Essential Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford.
Стереоспецифичность ферментативной гидратации не важна для способа согласно настоящему изобретению. Следовательно, либо 10(R), либо 10(S)-гидрокси-12-октадеценовая кислота или смеси (рацематы), получаемые на стадии (i), могут применяться на следующей стадии (ii).
Ферментативное превращение линолевой кислоты в 10-гидрокси-12-октадеценовую кислоту может проводиться в реакционной среде, которая содержит линолевую кислоту и воду. Если линолевая кислота применяется в форме свободной кислоты (масляная фаза) вода или буферизованный содержащий воду раствор с ферментом образует вторую жидкую фазу (водная фаза). Две жидкие фазы должны быть тщательно смешаны для того, чтобы образовать эмульсию для быстрой реакции.
Однако стадия (ii) может также осуществляться с иммобилизованными ферментами, которые могут быть легко удалены из реакционной среды и могут быть рециклизованы. Ферменты могут, в общем, быть иммобилизованы различными способами, такими как адсорбция, ковалентное связывание, мембранная инкапсуляция, гелевая инкапсуляция и поперечное сшивание. Свойства вещества носителя для иммобилизации должны быть оптимизированы, чтобы избежать инактивации фермента. Типичные носители могут быть либо органическими (природными и синтетическими), либо неорганическими веществами. Неорганические вещества, как правило, имеют хорошую устойчивость к давлению, тогда как органические вещества имеют хорошую химическую стабильность. Неорганические носители, как правило, представляют собой пористые материалы на основе оксидов кремния или алюминия, или их смеси. Природными органическими носителями являются, например, полисахариды, такие как целлюлоза, крахмал, декстран, агар или хитин. Белки, такие как коллаген, желатин или альбумин, также могут применяться. Синтетические органические носители включают поли(мет)акрилаты, полиакриламид, винил- и аллилполимеры, сложные полиэфиры, полиамиды.
Стадия (i) может осуществляться в 2-х фазной системе, где ферментный препарат (водная фаза) добавляется в органическую фазу, содержащую линолевую кислоту. Соотношение фаз водная фаза/ линолевая кислота может варьироваться в широком диапазоне.
Реакция может осуществляться с дополнительными растворителями или без них. В отношении выбора растворителя специалист в данной области техники должен руководствоваться выходом продукта, скоростью реакции, легкостью обработки образованных суспензий и стоимостью растворителя.
Предпочтительные растворители, которые могут быть смешаны с линолевой кислотой, являются химически инертными, т.е. не вступают в реакцию с ферментом или не ингибируют ферментативную активность.
Типичными органическими растворителями в биокаталитических процессах являются: гексан, гептан, додекан, гексадекан, простой этиловый эфир, простой изопропиловый эфир, простой бутиловый эфир, тетрагидрофуран, диоксан, толуол, диметилсульфоксид, ацетон, 2-пентанон, 2-гептанон. Температура реакции для стадии (i) зависит от термической стабильности применяемого фермента и, как правило, составляет от 10 до 50°C, предпочтительно от 20 до 40°C. Однако если применяется фермент с высокой термической стабильностью, температура реакции также может составлять более 50°C.
Образованная 10-гидрокси-12-октадеценовая кислота может быть выделена из реакционной среды обычными способами, такими как кристаллизация или экстракция.
Для следующей стадии реакции согласно настоящему изобретению, т.е. стадии (ii), 10-гидрокси-12-октадеценовая кислота может применяться в форме свободной кислоты или в форме сложного эфира, предпочтительного сложного низшего алкилового эфира, такого как сложный метиловый или этиловый эфир 10-гидрокси-12-октадеценовой кислоты.
Если сложный эфир 10-гидрокси-12-октадеценовой кислоты должен применяться в реакции, 10-гидрокси- 12-октадеценовая кислота, выделяемая на стадии (i), может быть эстерифицирована химическими или ферментативными способами перед пиролизом на стадии (ii). Предпочтительным путем эстерификации является ферментативное превращение посредством липазы.
Стадия (ii)
В контексте описания стадии (ii) термин "10-гидрокси-12-октадеценовая кислота" должен означать либо свободную 10-гидрокси-12-октадеценовую кислоту, либо сложный эфир 10-гидрокси-12-октадеценовой кислоты, например, метиловый или этиловый сложный эфир 10-гидрокси-12-октадеценовой кислоты.
Пиролиз 10-гидрокси-12-октадеценовой кислоты в 10-оксо-декановую кислоту представляет собой реакцию ретроенового типа. Для того чтобы выбрать ретроеновую перегруппировку и подавить конкурирующую реакцию дегидратации лучше всего обеспечить быстрое парообразование 10-гидрокси-12-октадеценовой кислоты.
Реакция может осуществляться при температуре от выше 400 до 800°C, предпочтительно от 500 до 600°C. Оптимальный диапазон температур зависит от времени пребывания субстрата, а также от природы субстрата. Если применяется сложный метиловый эфир 10-гидрокси-12-октадеценовой кислоты самые лучшие результаты были достигнуты при температурах 600°C и времени пребывания в микрореакторе, равном 1-2 секунды. Если вместо сложного эфира применяется свободная 10-гидрокси-12-октадеценовая кислота полное превращение 10-гидрокси-12-октадеценовой кислоты может быть обнаружено при более низких температурах, таких как 575°C. Однако более высокая селективность в отношении ретроеновой реакции по сравнению с дегидратацией уменьшается при применении свободной 10-гидрокси-12-октадеценовой кислоты вместо сложного метилового эфира 10-гидрокси-12-октадеценовой кислоты. Подробное сравнение можно увидеть на демонстрационных примерах.
Реакция может осуществляться в милли- или микрореакторе, например, капилляре с диаметром от 0.1 до 3 мм. Важными условиями являются высокая скорость нагревания и быстрое парообразование в милли- или микропарообразователе с временем пребывания <10 секунд, предпочтительно <1 секунды. Для того чтобы поддерживать эти характеристики, милли- или микроструктурные устройства, известные специалистам в данной области техники, являются подходящими. Реакция может осуществляться с растворителем или без него. Если растворитель применяется, он может быть добавлен в количестве до 99% (мас/мас). Применяемый растворитель не должен вступать в реакцию или разлагаться при температурах и условиях, применяемых в ходе пиролиза. Предпочтительный растворитель выбирается из группы стабильных простых эфиров, таких как ТГФ или диоксан. ТГФ является наиболее предпочтительным растворителем для стадии (ii).
Вода также может быть добавлена к реакционной смеси.
10-Оксо-декановая кислота, образованная на стадии (ii), может быть в зависимости от исходного вещества 10-гидрокси-12-октадеценовой кислоты либо в виде свободной 10-оксо-декановой кислоты, либо в виде соответствующего сложного эфира 10-оксо-декановой кислоты. В контексте описания этой стадии (ii) термин "10-оксо-декановая кислота" должен означать свободную кислоту, а также сложный эфир 10-оксо-декановой кислоты.
10-Оксо-декановая кислота может быть отделена от второго продукта ретроеновой перегруппировки (1-октен) обычными способами, такими как дистилляция или экстракция. В случае неочищенной линолевой кислоты в качестве исходного вещества, например, гидролизаты подсолнечного масла, нетрансформированные жирные кислоты (например, стеариновая кислота или 10-гидроксостеариновая кислота) могут быть удалены обычными способами, такими как дистилляция, кристаллизация или экстракция.
На следующей стадии, окисление 10-оксо-декановой кислоты в себациновую кислоту, смесь продуктов стадии (ii), состоящая из 10-оксо-декановой кислоты, 1-октена и возможно других жирных кислот, может в общем применяться без очищения, или 10-оксо-декановая кислота может быть очищена вышеописанными способами. Могут применяться как сложный метиловый эфир, так и свободная кислота.
Стадия (ИГ)
Для стадии (iii) выделенная 10-оксо-декановая кислота может применяться в форме свободной кислоты или сложного эфира.
Окисление альдегидной функциональной группы в 10-оксо-декановой кислоте в дикарбоновую себациновую кислоту может быть осуществлено в соответствии с хорошо известными методиками, как например, при окислении оксо-альдегидов в оксо-карбоновые кислоты, путем применения мягких окисляющих агентов, таких как кислород или воздух при до 100°C и при до 7 бар, либо без катализатора, либо при гомогенном катализе посредством редокс-активных металлов, как например, Cu, Fe, Со, Μn и т.д. (Industrial Organic Chemistry, Wiley-VCH, H.-J. Arpe (publisher), 2007, pp.149).
В зависимости от чистоты исходного вещества, применяемого в качестве источника линолевой кислоты на стадии (i), и в зависимости от применения себациновой кислоты, может быть необходимым обеспечить дополнительное очищение и стадии выделения в способе согласно настоящему изобретению, которые хорошо известны специалисту в данной области техники. При применении сложного эфира 10-оксо-декановой кислоты на стадии (iii), гидролиз сложного эфира приведет к свободной себациновой кислоте.
Демонстрационные примеры
Пример 1
Экспрессия и характеризация олеат-гидратазы
Ген, кодирующий олеатгидратазу из Elizabethkingia meningoseptica, был синтезирован с применением кодона, оптимизированного для Е. coll. Следующая методика получения была адоптирована на основе Bevers et al. (Bevers L.E. et al. (2009) J. Bacteriol., 191, 5010-5012).
Для рекомбинантного получения фермента ген клонировали в векторе pBAD(HisA) (Invitrogen), который обеспечивает индукцию экспрессии с помощью арабинозы. Е. coli ТОР10 one shot (Invitrogen) трансформировали pBAD(HisA)-OH и поместили на LB-Agar-Amp пластины (в ночь при 37°С). Одну колонию инокулировали в 2xYT-Amp и культивировали в течение еще 5 часов при 37°С.
2
Индукцию экспрессии белка обеспечили путем добавления 5 мл этой культуры к 500 мл 2xYT-Amp с добавкой 0,2% арабинозы и путем инкубации при 37° в течение еще 18 часов. После индукции клетки собрали посредством центрифугирования (20', 4000 оборотов в минуту, 4°С) и ресуспендировали в 20 мМ Tris-HCl (рН 8), 50 мМ NaCl и 1 мМ CaCl.
2
2
Клеточную суспензию разрушили ультразвуком (3', 15'' циклы по принципу включено/выключено, 80% амплитуда при 4°С), и чистый супернатант применяли в большинстве биокаталитических превращений, описанных в данном документе (как правило, 40 мг/мл всего белка; ≈13% олеатгидратазы на основе Agilent 2100 Bioanalyzer). Фермент далее очистили с помощью Ni-аффинной хроматографии (His-tag очистка). В этом случае индуцированные клетки ресуспендировали в 20 мМ Tris-HCl (рН8), 50 мМ NaCl, 1 мМ CaCl и 10 мМ имидазола. Отмывочный буфер в ходе очистки содержал 20 мМ имидазола, и элюцию белка достигли с 500 мМ в том же буфере. Фракции, содержащие олеатгидратазу, собрали и подвергли диализу с помощью 20 мМ Tris-HCl (рН 8), 50 мМ NaCl и 1 мМ CaCl. Сток-раствор фермента (5,8 мг/мл) хранили при 4°C.
Идентичность экспрессированного белка также подтвердили с помощью N-терминального секвенирования белка.
Пример 2
Превращение олеиновой кислоты в 10-гидрокси-стеариновую кислоту (10-HSA)
2
В качестве первой стадии рекомбинантно полученную олеатгидратазу из Примера 1 охарактеризовали с точки зрения ее активности дикого типа в отношении превращения олеиновой кислоты (OA) с получением 10-гидроксистеариновой кислоты (10-HSA). Бактерии, экспрессирующие олеатгидратазу, разрушили ультразвуком, как описано в Примере 1, и 200 мкл чистого супернатанта (содержание всего белка 5 мг/мл, ≈600 мг олеатгидратазы) добавили к эмульсии, содержащей 10 мМ олеиновой кислоты в 20 мМ Tris-HCl (рН 8), 50 мМ NaCl и 1 мМ CaCl (конечный объем 2 мл).
В качестве отрицательного контроля ту же реакцию осуществили с применением супернатанта разрушенных ультразвуком Е. coli TOP10, не экспрессирующих олеатгидратазу (содержание всего белка 5,6 мг/мл, нет олеатгидратазы). Реакционную смесь инкубировали при строгих условиях, в ночь, при комнатной температуре. Реакцию остановили путем добавления 50 мкл 3М HCl (конечное значение рН составляет 1-2).
В этот момент 4 мл МТВЕ добавили к реакционной смеси, чтобы экстрагировать органический субстрат (OA) и продукт (10-HSA). Реакционные продукты дериватизировали путем добавления 500 мкл триметилсульфония гидроксида (TMSH; 0,1 M в метаноле) к 100 мкл раствора продукта (30' при 100°C) и проанализировали с помощью GC.
На Фиг. 1 показаны результаты GC в аналитической форме этого ферментативного превращения.
Фиг. 1: (А) олеиновую кислоту инкубировали в ночь при комнатной температуре с применением только E.coli TOP10. Время удерживания олеиновой кислоты: 8,161 минут.(В) олеиновую кислоту инкубировали в ночь при комнатной температуре с применением Е. coli TOP10, экспрессирующей олеатгидратазу. Время удерживания 10-HSA: 9,340 минут.
Как ожидалось, олеатгидратаза, экспрессированная в клетках ТОРЮ Е. coli, была способна превращать олеиновую кислоту в 10-HSA почти полностью (>95%). Разрушенные ультразвуком клетки Е. coli TOP10 без олеатгидратазы не превращали олеиновую кислоту.
Пример 3
Превращение линолевой кислоты в 10-гидрокси-12-октадеценовую кислоту (10-НОА)
2
Олеатгидратазу экспрессировали в Е. coli TOP10 (10 л культура) согласно Примеру 1. Клеточный лизис осуществили путем ресуспендирования сгустка клеток в 100 мл 20 мМ Tris-HCl (рН 8), 50 мМ NaCl, 1 мМ CaCl, с последующим разрушением ультразвуком, как описано ранее. Общая концентрация белка составила 26 мг/мл (13% олеат-гидратазы).
2
Супернатант (300-400 мг олеат-гидратазы) добавили в раствор, содержащий 900 мл 20 мМ Tris-HCl (рН 8), 50 мМ NaCl, 1 мМ CaCl и 14,4 г линолевой кислоты (≈50 мМ). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 72 часов. После завершения реакции значение рН довели до 1,5 путем добавления 3М HCl. Продукт затем экстрагировали с помощью 1 л МТВЕ и отфильтровали через 100 г Celite 535. После удаления МТВЕ с помощью дистилляции, продукт реакции 10-НОА получили с высоким выходом (13,6 г, выход: 89%). Образцы для GC и GC-MS анализов получили путем добавления 400 мкл N-триметилсилилимидазола (TSIM) к 100 мкл раствора продукта (30' при 100°С).
На Фиг. 2: (A) GC анализ 10-НОА: время удерживания 10-НОА: 9,971 минут. (В) GC-MS анализ продукта реакции, показывающий типичную модель фрагментации для 10-НОА.
Пример 4
Пиролиз 10-гидрокси-12-октадеценовая кислота (10-НОА) в микрореакторе
Микрореактор применяли для реакций пиролиза. Экспериментальная установка схематически показана на Фиг. 3. Подача в реактор дозирована с помощью Bischoff HPLC насоса. Реактор представляет собой стальную трубку с внутренним диаметром 1/16'', погруженную в твердый медный блок, который может быть нагрет до 800°C. После прохождения охладителя (алюминиевый блок при комнатной температуре), смесь продуктов собрали в колбу. С этой установкой возможно достичь время пребывания <1 секунды. Более того, вся смесь нагрелась до желательной температуры очень быстро.
На Фиг. 3 схематически показана экспериментальная установка для термического расщепления 10-гидрокси-12-октадеценовой кислоты (10-НОА) в микрореакторе.
а. Пиролиз сложного метилового эфира 10-НОА (Me-10-НОА)
В первых экспериментах в микрореакторе сложный метиловый эфир 10-гидрокси-12-октадеценовой кислоты был выбран в качестве реагента, чтобы обеспечить более простую обработку (т.е. более хорошие свойства парообразования). МТВЕ и ТГФ были протестированы в качестве растворителей. В случае МТВЕ наблюдалось большее количество деметилированной 10-оксо-декановой кислоты (образование ацеталя вместо метанола), что позволяет сделать заключение, что растворитель расщепляется в ходе реакции. Поэтому для дальнейших экспериментов был выбран ТГФ (никакие продукты расщепления не наблюдались). Различные температуры и времена пребывания были оценены, а также влияние добавления воды (почти эквимолярное количество воды растворилось в растворе реагентов). Результаты приведены в Таблице 1.
Как показано в Таблице 1, температура оказывает самое большое влияние на сложный метиловый эфир 10-гидрокси-12-октадеценовой кислоты, тогда как изменение времени пребывания имеет только небольшое влияние (большее изменение времени пребывания было невозможным из-за реакторной установки, но возможно оно оказывает большее влияние на превращение и селективность). При 500°C превращается только около 25% сложного метилового эфира 10-гидрокси-12-октадеценовой кислоты (номер 1 и 2), при 550°C уже около 40% (номера 3-6) и при 600°C можно достичь полного превращения (номер 7 и 8). Добавление воды, как оказалось, оказывает благоприятный эффект на селективность. Самые лучшие результаты были получены при 600°C и времени пребывания τ=1.3 секунды с полным превращением сложного метилового эфира 10-гидрокси-12-октадеценовой кислоты, с селективностью около 75% в отношении ретроенового продукта и с селективностью только 6.5% в отношении продуктов дегидратации (сложный метиловый эфир линолевой кислоты и изомеры, номер 8).
b. Пиролиз 10-гидроксиооктадец-12-еновой кислоты (10-гидрокси-12-октадеценовая кислота)
Так как применение сложного метилового эфира 10-гидрокси-12-октадеценовой кислоты приводит к увеличению стадий на еще одну в общей схеме превращения линолевой кислоты в себациновую кислоту, эффективная микрореакторная установка была также протестирована с применением свободной 10-гидрокси-12-октадеценовой кислоты (в виде 10 мас. % раствора в ТГФ). По сравнению с пиролизом сложного метилового эфира 10-гидрокси-12-октадеценовой кислоты, полное превращение 10-гидрокси-12-октадеценовой кислоты достигается уже при более низких температурах (575°C, номер 5 в Таблице 2). Так как в случае сложного метилового эфира 10-гидрокси-12-октадеценовой кислоты время пребывания не влияет на реакцию в большей степени. Тем не менее, селективность в отношении 10-оксо-декановой кислоты является значительно более низкой (48 по сравнению с 74%, сравните номер 8 в Таблице 1). Наблюдается большая дегидратация в качестве побочной реакции, что может быть обусловлено слабой способностью к парообразованию свободной жирной кислоты по сравнению с ее сложным метиловым эфиром.
Пример 5
Окисление 10-оксо-декановой кислоты в себациновую кислоту
Окисление 10-оксо-декановой кислоты в себациновую кислоту может осуществляться, как описано H.-J. Агре (Industrial Organic Chemistry, Wiley-VCH, 2007, pp.149): альдегид окисляется мягкими окисляющими агентами, как, например, воздух или чистый кислород в жидкой фазе, при до 100°C и при до 7 бар, либо без катализатора, либо при гомогенном катализе с помощью редокс-активных металлов, как, например, Cu, Fe, Со, Mn.