ШТАММ МИКРОВОДОРОСЛИ Coelastrella sp. - ПРОДУЦЕНТ СМЕСИ НАТУРАЛЬНОГО БИОАНТИОКСИДАНТА АСТАКСАНТИНА И β-КАРОТИНА
MICROALGAE STRAIN COELASTRELLA SP. IS A PRODUCER OF A MIXTURE OF NATURAL BIOANTIOXIDANT ASTAXANTHIN AND Β-CAROTENE

Область применения
Изобретение относится к фотобиотехнологии и представляет собой новый штамм микроводоросли Coelastrella sp. K1, предназначенный для одновременного получения натуральных биоантиоксидантов астаксантина и β-каротина (провитамина А).
Уровень техники
2
Известно, что зеленая микроводоросль Coelastrella rubescens (ранее Scotiellopsis rubescens Vinatzer) [Kaufherova V., Elias M. The demise of the genus Scotiellopsis Vinatzer (Chlorophyta). Nova Hedwigia. 2013, 97, pp. 415-428] относится к группе экстремобионтных одноклеточных эукариот, способных при неблагоприятных условиях внешней среды переходить из вегетативного состояния в стадию покоя и накапливать в образующихся апланоспорах коммерчески значимое количество (1-2% сухого веса) специфических защитных кетокаротиноидов - продуктов многостадийного ферментативного окисления β-каротина в астаксантин [Lemoine, Y., Schoefs, В. Secondary ketocarotenoid astaxanthin biosynthesis in algae: a multifunctional response to stress. Photosynth. Res. 2010, 106, pp. 155-177; Чубчикова И.Н. Влияние состава среды на содержание вторичных каротиноидов у микроводоросли Scotiellopsis rubescens (Chlorophyceae). Морск. экол. журн. 2012, т. 11, №4, с. 95-101; Минюк Г.С. и др. Влияние рН и СО на рост и метаболизм микроводоросли Coelastrella (Scotiellopsis) rubescens. Физиология растений. 2016, т. 63, с. 601-610].
2
2
Астаксантин - кетокаротиноид красного цвета, наиболее эффективный природный антиокислитель, оказывающий благотворное влияние на организм человека и животных. Астаксантин широко востребован как компонент косметических формул, лекарственных средств, пищевых и кормовых добавок [Guerin, М. et al. Haematococcus astaxanthin: applications for human health and nutrition. Trends Biotechnol. 2003, 21, pp. 210-216.; Han, D. et al. Biology and commercial aspects of Haematococcus pluvialis. In Handbook of Microalgal Culture: Applied Phycology and Biotechnology. 2 ed.; Richmond, A.; Hu, Q., Eds. Blackwell: 2013; pp. 388-405]. Единственным источником астаксантина у животных является пища [Lorenz, R.T., Cysewski, G.R. Commercial potential for Haematococcus microalgae as a natural source of astaxanthin. Trends Biotechnol. 2000, 18, 160-167]. В настоящее время значительная доля астаксантина синтезируется химическим путем, но синтетический пигмент, в отличие от натурального, является рацематом с большим содержанием стереоизомеров, не обладающих биологической активностью. Для промышленного получения натурального астаксантина используют преимущественно штаммы зеленой микроводоросли Haematococcus pluvialis Flotow, способной накапливать астаксантин до 3-6% сухого веса [Lemoine, Y., Schoefs, В. Secondary ketocarotenoid astaxanthin biosynthesis in algae: a multifunctional response to stress. Photosynth. Res. 2010, 106, pp. 155-177] благодаря способности к образованию богатых астаксантином неподвижных коккоидных клеток, устойчивых к неблагоприятным условиям среды [Boussiba, S. Carotenogenesis in the green alga Haematococcus pluvialis: cellular physiology and stress response. Physiol. Plant. 2000, 108, pp. 111-117; Solovchenko, A. Physiology and adaptive significance of secondary carotenogenesis in green microalgae. Russ. J. Plant Physiol. 2013, 60, pp. 1-13]. Известен штамм микроводорослей Haematococcus pluvialis BM1, пригодный для получения астаксантина и характеризующийся способностью расти на средах, содержащих до 27% хлорида натрия, высокой способностью к накоплению астаксантина - до 3-6% сухой биомассы и обладающий высокой продуктивностью (до 300 мг сухой биомассы в сутки с 1 л культуры) [патент RU 2573944, 27.01.2016]. Известен способ культивирования Haematococcus pluvialis для промышленного производства биомассы, обогащенной астаксантином [патент US 6022701, 2000-02-08] (культивирование при освещении в диапазоне 30-140 мкЕ ФАР/(м⋅с) и температуре 15-28°С с использованием в качестве среды водопроводной воды и барботированием культуры газо-воздушной смесью с 1,5% СО). Также, известен способ эффективного производства каротиноидов, включая астаксантин, путем получения мутантных штаммов Haematococcus pluvialis [патент ЕР 1995325, 2008-11-26] ССАР 34/8 и SAG 34-1b с повышенной способностью к накоплению каротиноидов.
Однако для известных штаммов микроводорослей Haematococcus pluvialis характерна невысокая скорость роста, узкий диапазон физико-химических параметров культивирования и высокий риск контаминации, требующий применения дорогостоящих закрытых систем культивирования, чрезмерно повышающих цену на натуральный астаксантин.
Также известен штамм дрожжей Phaffia rhodozyma [патент RU 2385925, 10.04.2010] ВКПМ Y-2982, способный продуцировать астаксантин (7,0-8,0 мг/г сухой биомассы в условиях оптимальной (60 лк) освещенности). Доля астаксантина в общем пуле каротиноидов может составлять до 70%. Описан штамм одноклеточной зеленой водоросли Chlorella zofingiensis АТСС 30412 [патент US 7063957, 2005-09-29], способный к гетеротрофному росту в темноте и после 2-х недель роста способный накапливать до 10 мг/л астаксантина.
β-каротин - оранжевый пигмент, непредельный углеводород из группы каротиноидов. Встречается во всех зеленых растениях и достаточно давно используется в качестве красителя в пищевой промышленности и кормах для животных [L.J. Borowitzka, М.А. Borowitzka, Т.Р. Moulton. The mass culture of Dunaliella salina for fine chemicals: From laboratory to pilot plant. Hydrobiologia. 1984, 1, pp. 115-121]. Кроме этого, β-каротин используется в качестве компонента биологически активных добавок и витаминных комплексов. Общий объем мирового рынка β-каротина оценивается примерно в 270-300 млн. долл. США, из них 20-30% - доля природного β-каротина [Borowitzka М.А. High-value products from microalgae - their development and commercialisation. Journal of Applied Phycology. 2013, V. 25, Issue 3, pp. 743-756].
В настоящее время известны микроводоросли - перспективные продуценты натурального β-каротина, особенно Dunaliella salina (до 10% β-каротина от сухого веса клеток) [Oren, A. Adaptation to life at high salt concentrations in Archaea, Bacteria, and Eukarya (Gunde-Cimerman, N., Oren A., and Plemenitas, A., eds), Springer. N.Y., 2005, pp. 493-502]. Известен штамм водоросли Dunaliella salina Teod. CALU-834, выделенный из прибрежной зоны лимана Сасык [патент SU 1324627, 19.11.1986], который используется в микробиологической промышленности как продуцент белка и β-каротина, в качестве кормовых, витаминных и биостимулирующих добавок в рацион животных, а также для утилизации отходов. Также известен штамм одноклеточных водорослей Dunaliella salina - продуцент биоантиоксидантов [патент RU 2497945, 10.11.2013] и способ культивирования Dunaliella salina [патент RU 2541446, 10.02.2015]. Известно изобретение, охватывающее сразу несколько новых галотолерантных гипераккумулирующих каротиногенных штаммов микроводоросли Dunaliella salina DF15, DF17 и DF40 [заявка WO 2018141978, 2018-08-09] с коммерчески значимым потенциалом накопления β-каротина. В последние годы гриб Blakeslea trispora стал важным альтернативным источником природного β-каротина, конкурирующего с водорослевым продуктом [заявка ЕР 1367131, 2003-12-03].
Основными недостатками перечисленных выше примеров являются отсутствие способности к одновременному накоплению коммерчески значимых количеств астаксантина и β-каротина.
Известна зеленая почвенная микроводоросль Bracteacoccus minor (Chodat)  накопливающая смесь вторичных кетокаротиноидов с доминированием диацильных эфиров астаксантина (37-42% суммы) [Г.С. Минюк и др. Особенности вторичного каротиногенеза у Bracteacoccus minor (Chlorophyta) в условиях двухстадийной культуры. Algologia. 2015, 25(1): 21-34].
Недавно описан штамм Scenedesmus sp. CCALA 1074 который был выделен из планктона реки Силь (Швейцария, 47°10'47.982ʺN, 8°41'33.504ʺЕ) [Pavel  et al. The role of light and nitrogen in growth and carotenoid accumulation in Scenedesmus sp. Algal Research. 2016, 16, pp. 69-75]. Сумма каротиноидов на ранней стационарной фазе роста культуры Scenedesmus sp. CCALA 1074 составляла 2,3% от сухого веса, при этом доля астаксантина составляла 9%, а β-каротина 5,4% от суммы каротиноидов. Scenedesmus sp. CCALA 1074 успешно выращивают в открытом тонкослойном фотобиореакторе объемом 150 л., при этом, он демонстрирует превосходный рост, высокую продуктивность каротиноидов и термотолерантность, что делает этот штамм перспективным кандидатом для биотехнологического производства богатой каротиноидами биомассы.
Известен штамм микроводоросли Coelastrella striolata var. multistriata, который был выделен с поверхности горной породы в Шизуоке, Япония [Katsuya Abe et al. Accumulation and antioxidant activity of secondary carotenoids in the aerial microalga Coelastrella striolata var. multistriata. Food Chemistry. 2007, 100, pp. 656-661]. Авторы заявляют о способности данной микроводоросли синтезировать значительное количество смеси каротиноидов, таких как кантаксантин, астаксантин и β-каротин. Красновато-оранжевые клетки микроводоросли могут накапливать до 56,0 мг вторичных каротиноидов на 1 г. биомассы. По содержанию в клетках каротиноиды кантаксантин, астаксантин и β-каротин составляли 47,5, 1,5 и 7,0 мг/г. сух. веса соответственно.
-1
-1
6
-1
-1
-1
-1
Наиболее близким аналогом является изобретение, описывающее микроводоросли Coelastrella rubescens и способ их культивирования для получения каротиноидов и липидов [патент RU 2661086, 11.07.2018]. Для реализации предлагаемого способа получения биомассы Coelastrella rubescens используют штамм Coelastrella (Scotiellopsis) rubescens IPPAS H-350 (Vinatzer/Innsbruck V195=CCALA475), который выращивают методом двухстадийной накопительной культуры. Полученную в конце «зеленой» стадии биомассу С. rubescens, состоящую из метаболически активных делящихся клеток, авторы предлагают использовать (частично или целиком) как самостоятельное сырье для получения смеси ксантофиллов (лютеина, зеаксантина, неоксантина и β-каротина) и незаменимых ЖКС18:2ω и С18:3ω пищевого назначения, а также (частично или целиком) в качестве инокулята для проведения II («красной») стадии культивирования с целью получения кетокаротиноидов группы астаксантина и технических липидов. Содержание суммарных каротиноидов в биомассе в конце «зеленой» стадии роста культуры, собранной на 11-е сутки, достигало 2,1±0,17% СВ при продуктивности 2,2±0,08 мг⋅л⋅сут. В составе каротиноидов доминировали лютеин/зеаксантин (51,9% от суммы), неоксантин (18,1%), α- и β-каротины (10,6%). Астаксантин и интермедиаты его биосинтеза в биомассе отсутствовали. При условии использования для проведения «красной» стадии всей «зеленой» биомассы выход суммарных каротиноидов из литра исходной культуры с начальной плотностью 1,1×10 кл⋅мл (или 0,17 г/л СВ) за 19 суток составил 52,3 мг⋅л, средняя продуктивность - 2,75 мг⋅л⋅сут, содержание суммарных каротиноидов в биомассе 0,9-1,0% СВ, доля астаксантина составляла 26%. К недостаткам прототипа можно отнести незначительное содержание β-каротина в биомассе на «красной» стадии культивирования и недостаточно высокую долю астаксантина, а также весьма скромные показатели по содержанию суммарных каротиноидов.
Раскрытие изобретения
Техническая проблема, на решение которой направлено изобретение, заключается в получении штамма микроводоросли с высоким уровнем одновременного накопления астаксантина и β-каротина при сохранении высокой продуктивностью культуры, способностью к биоизъятию фосфатов из среды и низкой контаминируемостью культуры.
Техническая проблема была решена получением штамма микроводоросли Coelastrella sp. K1, выделенного авторами из водоема в Средней полосе России, Тверская область, район Конаково (56°41'25.72ʺN, 36°45'42.11ʺЕ), депонированного в Российской Коллекции Микроводорослей при учреждении Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской Академии Наук (IPPAS) с присвоенным идентификатором IPPAS С-2028.
-1
-1
-1
-1
Техническим результатом заявляемого изобретения является получение штамма микроводоросли с высоким уровнем одновременного накопления астаксантина и β-каротина - не менее 45 масс. % каждого компонента при сохранении высокой продуктивностью культуры - не менее 2,1 мг⋅л⋅сут по сумме каротиноидов, способностью к биоизъятию фосфатов из среды - не менее 2,3 мг⋅л⋅сут и низкой контаминируемостью культуры.
-1
-1
Сущность изобретения заключается в том, что для достижения цели используют зеленую микроводоросль Coelastrella sp. штамм K1, выделенный и идентифицированный авторами заявки из водоема в Средней полосе России, Тверская область, район Конаково (56°41'25.72ʺN, 36°45'42.11ʺЕ). В результате полученный штамм характеризуется высокой способностью к одновременному накоплению астаксантина и β-каротина (45-50 масс. % и 45-50 масс. %, соответственно от суммы каротиноидов на «красной» стадии культивирования), при этом сумма каротиноидов оценивается в 1,3-1,7% сухого веса, культура обладает высокой продуктивностью (100-200 мг сухой биомассы и 2,1-2,3 мгкаротиноидов в сутки с 1 л культуры), способностью к биоизъятию фосфатов из среды (2,3-2,6 мг⋅л⋅сут), а также низкой контаминируемостью культуры.
-2
-2
-1
2
Для культивирования используют питательную среду BG-11 [Stanier, R., et al. Purification and properties of unicellular blue-green algae (order Chroococcales). Microbiology and Molecular Biology Reviews. 1971, 35(2): 171-205]. Инокулят вносят в среду до конечной концентрации хлорофилла 5-7 мкг/мл, культивирование проводят в фотобиореакторе при постоянном освещении с интенсивностью 200 моль квантов⋅м⋅с с помощью светодиодов (4700 К), при температуре 26-28°С и барботировании среды газо-воздушной смесью с содержанием СО 2-5% со скоростью 0,8-1,2 л/мин. Значение рН среды в начале культивирования - 7,5-8, в конце культивирования - 7,0-7,2. Для индукции каротиногенеза и перехода на «красную» стадию культивирования, клетки, находящиеся на экспоненциальной фазе роста, дважды промывают дистиллированной водой, ресуспендируют в дистиллированной воде и инкубируют при освещении 320 мкмоль фотонов ФАР м⋅с в течение 7 суток. Для достижения технического результата изобретения культуру водоросли Coelastrella sp. штамм K1 выращивают двухстадийным методом, направленным на достижение коммерчески значимого выхода целевых продуктов (смеси астаксантина и β-каротина). После этого отделяют биомассу от среды центрифугированием.
-1
-1
-1
В результате получают в сутки 100-200 мг⋅л биомассы (по сухому весу) и 2,1-2,3 мг каротиноидов в сутки с 1 л культуры, биомасса содержит 1,3-1,7% каротинодоиов, в которых доля астаксантина 45-50 масс. % и β-каротина 45-50 масс. %. Предлагаемый штамм культуры микроводоросли характеризуется способностью к биоизъятию фосфатов из среды (2,3-2,6 мг⋅л⋅сут) а также низкой контаминируемостью культуры.
Краткое описание чертежей
На Фиг. 1 представлены клетки микроводорослей Coelastrella sp. штамм К1. а, д - светлопольная микроскопия; б, в, г, е - электронные микрофотографии, а - вегетативные клетки; б - срез, вегетативная клетка; в - поверхность клеточной стенки, покрытая меридиональными бороздками; г - вегетативная клетка, спорангий; д - циста; е - гладка поверхность клеточной стенки цисты. Обозначения на рисунке б: (В) - вакуоль; (КЗ) - крахмальное зерно; (КС) - клеточная стенка, (М) - митохондрия; (П) - пиреноид; (X) - хлоропласт; (Я) - ядро.
На Фиг. 2 показан рост культуры Coelastrella sp. штамм К1 в оптимальных и стрессовых условиях (индукция вторичного каротиногенеза).
На Фиг. 3 показано сверху: клетки культуры Coelastrella sp. штамм К1, прижизненно окрашенные флуоресцентным красителем Нильский Красный, флуоресцирующим желтым цветом в гидрофобной среде нейтральных липидов. Снизу: изменение соотношения каротиноидов и хлорофиллов при культивировании в стрессовых условиях у представленного штамма микроводоросли.
На Фиг. 4 показаны филогенетические взаимоотношения штамма микроводоросли К1 и близких штаммов, основанные на частичной последовательности гена 18s рРНК.
На Фиг. 5 показана кинетика поглощения фосфатов культурой микроводорослей Coelastrella sp. штамм К1.
Осуществление изобретения
Штамм Coelastrella sp. К1 выделен из водоема в Средней полосе России, Тверская область, район Конаково (56°41'25.72ʺN, 36°45'42.11ʺЕ). Отселектирован в результате скрининга по способности к биосинтезу каротиноидов (смеси астаксантина и β-каротина).
Способ выделения - из накопительной культуры, полученной путем инокуляции среды BG-11 отобранными клетками с последующим рассевом по твердой среде BG-11.
Морфологические признаки.
Клетки мелкие (5-8 мкм) с одним пиреноидом в плоскости среза, хлоропласт пристенный с включениями крахмальных зерен (Фиг. 1б). При интенсивном культивировании большинство клеток культуры находятся в виде спорангиев (Фиг. 1г), дочерние клетки не покидают материнские и оказываются окруженными как собственной, так и материнской клеточной стенкой. Поверхность клеточной стенки покрыта меридиональными бороздками (Фиг. 1в). Клеточная стенка состоит из слоев разной электронной плотности: можно визуально выделить внешний и внутренний слои. В клетках культуры присутствуют следующие органеллы: клеточное ядро, пристенный хлоропласт с одним пиреноидом, окруженным крахмальными зернами, митохондрии, множество вакуолей, небольшое количество липидных глобул.
Особенности морфологии в условиях, обеспечивающих максимальный выход продукта: клетки приобретают оранжевую окраску. Клеточная стенка вегетативных клеток - 0,2-0,5 мкм, при стрессе не утолщается. Поверхность клеточной стенки при стрессе становится гладкой, меридиональные бороздки выражены хуже, чем у вегетативных клеток (Фиг. 1е). Набор органелл аналогичен таковому в вегетативном состоянии, однако хлоропласт претерпевает значительную деградацию. Накопление липидов начинается уже в вегетативном состоянии клеток на 5-6 день культивирования, на поздних стадиях стресса олеосомы занимают большую часть объема цитоплазмы.
Физиологические свойства штамма.
Оптимальные условия культивирования:
Для культивирования используют жидкую питательную среду BG-11 [Stanier, R. et al. Purification and properties of unicellular blue-green algae (order Chroococcales). Microbiology and Molecular Biology Reviews. 1971, 35(2): 171-205], готовится из стоковых растворов; все компоненты можно автоклавировать.
Среда BG-11 следующего состава:
2
4
3
4
2
KНРO - 0,04 г/л, NaNO - 0,3 г/л, MgSO⋅7HO - 0,075 г/л,
2
2
СаСl⋅2НO - 0,036 г/л, лимонная кислота - 0,006 г/л,
4
2
2
3
FeSO⋅7HO - 0,006 г/л, NaCO - 0,2 г/л, ЭДТА - 0,001 г/л,
4
2
раствор FeSO⋅7HO (7,45 г/л)+ЭДТА (5,57 г/л) - 1 мл/л,
3
3
2
2
4
2
4
2
2
4
2
3
2
2
раствор микроэлементов (НВО - 2,86 г/л, МnСl⋅4НO - 1,86 г/л, ZnSO⋅7HO - 0,22 г/л, CuSO⋅5HO - 0,08 г/л, NaMoO⋅7HO - 0,39 г/л, Co(NO)⋅6HO - 0,05 г/л) - 1 мл/л,
рН в начале культивирования - 7,5-8,0
рН в конце культивирования 7,0-7,2
2
содержание СO в ГВС - 2-5%, скорость барботажа 0,8-1,2 л/мин
температура 26-28°С
2
освещение круглосуточное, освещенность 200 моль квантов /м/сек
тип ламп: светодиодные, 4700 К
Продуктивность в оптимальных условиях культивирования:
по накоплению биомассы (сухой вес, мг/мл в сутки): 100-200;
выход полезного продукта: сумма каротиноидов оценивается в 1,3-1,7% сухого веса, продуктивность по каротиноидам 2,1-2,3 мг в сутки с 1 л культуры, одновременное накопление астаксантина и β-каротина (45-50 масс. % и 45-50 масс. %, соответственно от суммы каротиноидов).
Биотехнологическая характеристика штамма.
-1
-1
Штамм микроводоросли Coelastrella sp. K1, депонированный в Российской Коллекции Микроводорослей при учреждении Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской Академии Наук (IPPAS) с присвоенным идентификатором IPPAS С-2028, продуцент смеси натурального биоантиоксиданта астаксантина и β-каротина (провитамина А) в соотношении 45-50 масс. % и 45-50 масс. % от суммы каротиноидов, соответственно, которая составляет 1,3-1,7% сухого веса, при продуктивности по сумме каротиноидов 2,1-2,3 мг в сутки с 1 л культуры, способный к биоизъятию фосфатов из среды со скоростью 2,3-2,6 мг⋅л⋅сут.
-1
-1
Условия культивирования, обеспечивающие максимальный уровень (выход) полезного свойства (продукта): любой стрессор, снижающий скорость деления клеток (яркое освещение более 250 моль квантов⋅м⋅сек не менее 1 суток, исключение азота из состава среды культивирования).
Генотипирование.
Выделение ДНК.
Для выделения ДНК отбирают 5-10 мг биомассы культуры микроводоросли. Выделение ДНК проводят методом фенол-хлороформной экстракции. Перед выделением проводят трехкратное замораживание образцов при -4°С с последующим оттаиванием. Это необходимо для разрушения прочных клеточных стенок водорослей. Образцы инкубируют в течение часа в 300 мкл ТЕ буфера (10 mM Tris-Cl (рН 7.5), 1 mМ EDTA), содержащего 10 мг/мл лизоцима при 37°С. Затем добавляют 2% додецилсульфата натрия и инкубируют в течение часа при 40°С и интенсивном перемешивании. Далее добавляют 1 М NaCl и оставляют на ночь на льду для высаливания белков. После чего проводят процедуру фенол-хлороформной экстракции. Чистоту образцов ДНК оценивают методом электрофореза в 1,5% агарозном геле. Полученные образцы ДНК хранят в ТЕ-буфере при -4°С.
Филогенетический анализ.
Филогенетические взаимоотношения штамма К1 и близких штаммов оценивают по сходству частичной последовательности гена 18s рРНК. Представленное филогенетическое дерево получено методом NJ (Фиг. 4). Филогенетический анализ проведен в программе BioNJ. Визуализация проведена в программе TreeDyn 198.3. Процент репликативных деревьев, в которые были объединены таксоны в бустрап-тесте показаны рядом ветками.
В результате проведенного филогенетического анализа установлена родовая принадлежность исследуемого изолята. Изолят идентифицирован как Coelastrella sp. и получил идентификатор К1; после депонирования в Российской Коллекции Микроводорослей при учреждении Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской Академии Наук (IPPAS) ему присвоен идентификатор IPPAS С-2028.
Оценка уровня контаминируемости культуры.
Оценку уровня контаминируемости культуры микроводоросли Coelastrella sp. штамм К1 проводят путем микроскопирования после 7, 14 и 21 дней культивирования в фотобиореакторе. В результате проведенных исследований клетки соответствуют морфологическому описанию для данного штамма, других организмов не выявлено. Дополнительно производят высев культуральной жидкости на твердую среду LB с 2% агара (Bertani G. Lysogeny at mid-twentieth century: P1, P2, and other experimental systems. // Journal of bacteriology. - 2004. - Vol. 186, no. 3. - P. 595-600.) после 14 дней культивирования в фотобиореакторе. Тестовую среды разливают по чашкам, высевают культуральную жидкость методом истончающегося штриха, инкубируют в темноте при комнатной температуре и подсчитывают бактериальные и грибные колонии на 3, 7, 14 и 21 день. В результате тестирования наличие бактериальных и грибных колоний до накопления максимального количества каротиноидов не зафиксировано.
Кинетика поглощения фосфатов
-1
2
-1
-1
-1
Кинетику поглощения фосфатов культурой микроводоросли Coelastrella sp. штамм К1 оценивают по остаточному содержанию ортофосфата в среде методом ионной хроматографии. Начальная плотность культуры - 0,5 г с.в.⋅л, освещенность - 120 мкмоль квантов ФАР/м/с. При добавлении ортофосфата до конечной концентрации 400 мкмол⋅л к культуре штамма К1, предварительно проинкубированной в течение 10 суток на среде BG-11, не содержащей источника фосфора, наблюдается быстрое поглощение ортофосфата. В результате способность штамма микроводоросли К1 к биоизъятию фосфатов из среды составляет 2,3-2,6 мг⋅л⋅сут в пересчете на ортофосфат.
Следующие материалы иллюстрируют достижение цели.
-1
-1
Штамм микроводоросли Coelastrella sp. K1 демонстрирует высокую способность к одновременному накоплению астаксантина и β-каротина, что не встречается у известных аналогов. Накопление астоксантина и β-каротина составляет 45-50 масс. % и 45-50 масс. %, соответственно от суммы каротиноидов на «красной» стадии культивирования, что в 2 раза превосходит аналогичный показатель у известного прототипа. Сумма каротиноидов составляет 1,3-1,7% сухого веса, что в 1,5 раза выше, по сравнению с прототипом. Штамм Coelastrella sp. K1 сохраняет высокую продуктивность (100-200 мг сухой биомассы и 2,1-2,3 мг каротиноидов в сутки с 1 л культуры) и одновременную способность к биоизъятию фосфатов из среды со скоростью 2,3-2,6 мг⋅л⋅сут., что соответствует уровню известных аналогов, не способных к одновременному накоплению астаксантина и β-каротина.
Штамм микроводоросли Coelastrella sp. K1 успешно прошел предварительное тестирование и этап пробного культивирования в экспериментальных и полупромышленных фотобиореакторах объемом до 50 л. Таким образом, можно считать степень готовности штамма к масштабированию культуры для промышленного применения высокой.
В результате получен штамм микроводоросли Coelastrella sp. K1, депонированный в Российской Коллекции Микроводорослей при учреждении Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской Академии Наук (IPPAS) с присвоенным идентификатором IPPAS С-2028, который обладает высоким уровнем накопления смеси натурального биоантиоксиданта астаксантина и провитамина А (β-каротина), сохраняющий высокую продуктивность при выращивании, обладающий способностью к одновременному биоизъятию фосфатов из среды и низкой контаминируемостью культуры по сравнению с известными аналогами.