СПОСОБ РАЗДЕЛЕНИЯ, ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКИ СТЕВИОЛГЛИКОЗИДОВ
METHOD OF SEPARATION, ISOLATION AND CHARACTERISTICS OF STEVIOL GLYCOSIDES

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
Данная заявка заявляет приоритет предварительной заявки на патент США № 61/941018, поданной 18 февраля 2014 г., содержание которой в полном объеме включено в настоящую заявку посредством ссылки.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Изобретение относится к комплексному способу разделения, выделения и характеристики стевиолгликозидов из экстракта растений Stevia rebaudiana и их использованию в подслащивающих композициях.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
В настоящее время альтернативам сахару уделяется все большее внимание вследствие осведомленности о многих заболеваниях, связанных с потреблением пищевых продуктов и напитков с высоким содержанием сахара. Однако многие искусственные подсластители, такие как дульцин, цикламат натрия и сахарин, были запрещены или ограничены в некоторых странах в связи с опасениями относительно их безопасности. Таким образом, некалорийные подсластители природного происхождения становятся все более популярными.
Stevia rebaudiana Bertoni является многолетним кустарником из семейства сложноцветных (Compositae), произрастающим в некоторых районах Южной Америки. Листья растения содержат от 10 до 20% дитерпеновых гликозидов, которые примерно в 150-450 раз слаще сахара. Листья в течение сотен лет традиционно использовались в Парагвае и Бразилии для подслащивания местных сортов чая и лекарств.
Типичная практика предполагает выращивание растений в теплое время года, затем сбор урожая до начала цветения растений. David J. Midmore и Andrew H. Rank (A new rural industry - Stevia - to replace imported chemical sweeteners. A report for the Rural Industries Research and Development Corporation, August 2002; RIRDC Web Publication No. W02/022, RIRDC Project No UCQ-16A) сообщают, что многократные сборы урожая в год возможны в более теплом климате, таком как в Бразилии, Парагвае, Индии или Индонезии. «Данные по урожайности при промышленном производстве не приводятся кроме как в общем виде, например, 1600-2000 кг сухих листьев/га/год. Экспериментальные данные по урожайности позволяют предположить, что системы с многократными сборами урожая в год будет давать более высокие урожаи». Данный урожай относится к массе высушенного растения, а не к оптимизации стевиолгликозидов на гектар сбора урожая. За счет эффективного использования усовершенствованных аналитических методов и хорошего агрономического развития растений, выбранных для повышения выхода стевиолгликозидов с гектара, а также координированием созревания растений в пределах данного географического региона с перерывами в сборе урожая можно достигнуть повышения после сбора урожая выхода стевиолгликозидов за сезон сбора урожая.
Midmore и Rank продолжают сообщать, что «Обычный способ предполагает сбор урожая зеленой растительной массы и транспортирование ее к оборудованию для сушки: солнечной сушки или (искусственной) сушки в сушильной печи. При низкой влажности солнечная сушка тонкого слоя собранных растений может происходить достаточно быстро (9-10 часов) со снижением влажности растений от примерно 80% до 10% [116]. Искусственная сушка может занять два дня [37]. Быстрая сушка, вероятно, позволит получить сухие листья «лучшего качества». Если собранный растительный материал не высушивается быстро, то качество листьев может ухудшиться в результате окисления, теряя до одной трети содержания стевиозидов через три дня [116]. Высокая температура в процессе искусственной сушки также может привести к снижению содержания. Зеленый цвет высушенных листьев является желательным и свидетельствует о хорошем качестве». Мы обеспечили возможность совершенствования данного способа сбором урожая с перерывами и установлением времени для экстрактивной обработки влажных (то есть свежих, невысушенных) листьев, которые не подвергаются процессу сушки. Данное усовершенствование дает двойное преимущество снижения потерь гликозидов во время сушки и экономии затрат на обработку, устраняя необходимость в сушильном оборудовании.
Высушенные листья стевии, как сообщается, содержат примерно от 5% до 9% влаги, от 10% до 20% белка, от 35% до 62% углеводов, от 3% до 5% жиров (в основном пальмитиновой, линоленовой и линолевой кислот), от 7% до 13% золы и несколько летучих компонентов, включая спатуленол, бета-пинен, бета-кариофиллен и оксид кариофиллена. Стевия также является богатым источником щавелевой кислоты (смотри Wölwer-Rieck U. The Leaves of Stevia rebaudiana (Bertoni), Their Constituents and the Analysis Thereof: A Review. J. Agric. Chem. 2012, 60,886-895). Данные компоненты могут влиять на вкусоароматический букет подсластителя, если их не удалить или не уменьшить до существенно низкого уровня. Вследствие этого выделение индивидуальных подсластителей на основе стевии высокой чистоты повлекло за собой длительную обработку, включающую обработку различными смолами, разделение с использованием органических растворителей и кристаллизацию для предоставления продукта подходящего вкуса и качества.
В настоящее время насчитывается более 230 видов стевии с выраженными свойствами подсластителей. Растение успешно выращивают в различных условиях от его родных субтропиков до холодных северных широт. Состав стевиолгликозидов может быть модифицирован направленной селекцией растений. В то время как природные виды растений содержали стевиозид в качестве преобладающих стевиолгликозидов, новые культурные сорта были селектированы с повышенным содержанием ребаудиозида А, который считается подсластителем более высокого качества, чем стевиозид. Stevia rebaudiana продуцирует ряд других стевиолгликозидов, которые также обладают высокоинтенсивной сладостью и органолептическими свойствами, превосходящими в некоторых случаях многие другие встречающиеся в природе сильнодействующие подсластители. Стевиолгликозиды не метаболизируются для получения энергии в пищеварительной системе человека, и могут быть использованы для подслащивания пищевых продуктов без добавления калорий везде, где используется сахар. Они подходят для диабетических и низкокалорийных диет.
13
19
Вышеуказанные гликозиды имеют общий агликон, стевиол, и отличаются по количеству и типу углеводных остатков в положениях С и C (R2 и R1 соответственно на фиг.1). Листья стевии способны накапливать до 10-20% (в пересчете на сухой вес) стевиолгликозидов. Основными гликозидами, обнаруженными в природных листьях стевии, являются ребаудиозид А (2-10%), стевиозид (2-10%) и ребаудиозид С (1-2%). Другие гликозиды, такие как ребаудиозид В, D, Е и F, стевиолбиозид и рубузозид, также обнаружены на более низком уровне (менее 1%). Еще о других гликозидах недавно сообщили Ohta и др. в J. Appl. Glycosci. (2010) 57: 199-209.

Два главных гликозида - стевиозид и ребаудиозид А были широко изучены и охарактеризованы с точки зрения возможности их применения в качестве серийно выпускаемых высокоинтенсивных подсластителей. Например, исследования стабильности в газированных напитках подтвердили их термостабильность и pH-стабильность. Chang S. S. и др. (1983) Stability studies of Stevioside and Rebaudioside A in carbonated beverages. J. Agric. Food Chem. 31: 409-412. Даже в высокоочищенном состоянии данные стевиолгликозиды все еще обладают нежелательными вкусовыми свойствами, такими как горечь, сладкое послевкусие, вкус солодки и тому подобное. Одним из главных препятствий для успешного промышленного применения подсластителей на основе стевии являются такие нежелательные вкусовые свойства. Было показано, что данные вкусовые ноты становятся более заметными по мере того, как концентрация стевиолгликозидов увеличивается (Prakash et al. (2008) Development of Rebiana, a natural, non-caloric sweetener. Food Chem. Toxicol., 46, S75-S82).
Ребаудиозид А показал наименее вяжущее, наименее горькое и наименее стойкое послевкусие, таким образом, обладая подходящими вкусовыми свойства по сравнению с известными стевиолгликозидами (Tanaka O. (1987) Improvement of taste of natural sweeteners. Pure Appl. Chem. 69:675-683; Phillips K. C. (1989) Stevia: steps in developing a new sweetener. In: Grenby T. H. ed. Developments in sweeteners, vol. 3. Elsevier Applied Science, London. 1-43).
В опубликованной заявке США № 2013347140, поданной Wang, раскрывается способ селекции растений стевии, имеющих высокое содержание ребаудиозида А.
В патентах США № PP23164 и № PP23728 раскрываются культурные сорта стевии, названные AKH L1 и AKH L4. Данные культурные сорта имеют высокое содержание ребаудиозида А.
Способы экстракции и очистки сладких гликозидов из растения Stevia rebaudiana с использованием воды или органических растворителей описаны, например, в патентах США № 4361697, № 4082858, № 4892938, № 5972120, № 5962678, № 7838044 и № 7862845.
Dobberstein и Ahmed (патент США № 4361697) и Morita и др. (патент США № 4082858) описывают хроматографию на силикагеле стевиолгликозидов. Giovenatto (патент США N 4892938) использует гидроксид кальция для очищения общего экстракта подсластителей на основе стевии с последующим фильтрованием или центрифугированием. Данный осадок обрабатывают сильнокислотной ионообменной смолой, а затем слабоосновной ионообменной смолой, фильтруют и сушат. Magomet и другие (патент США № 7862845) также предлагают выделение частично очищенных стевиолгликозидов обработкой общего экстракта солями кальция, фильтрацией неочищенной суспензии с последующей кристаллизацией ребаудиозида А из смеси метанол-вода. Abelyan и др. (Патент США № 7838044) предлагают экстракцию сладких гликозидов из Stevia rebaudiana Bertoni в присутствии пектиназы и очистку контактированием экстракта с циклодекстрином и бентонитом, и ионообменными смолами с последующей кристаллизацией и перекристаллизацией из этанола. Kutowy и др. (Патент США № 5972120) раскрывают способ экстракции сладких соединений из Stevia rebaudiana (Bertoni) в вертикальной экстракционной колонке с последующей очисткой, фильтрацией, использованием микрофильтрации в качестве стадии предварительной обработки для очищения экстракта, затем ультрафильтрации с последующей нанофильтрацией. Payzant и др. (Патент США № 5962678) используют две ионообменные колонки для удаления примесей из сладких гликозидов, экстрагированных из Stevia rebaudiana, используя метанол для элюирования сладких гликозидов со второй колонки, и охлаждая раствор для кристаллизации стевиозида. Фильтрат затем концентрируют и охлаждают до выкристаллизовывания ребаудиозида А.
В патенте США № 4612942 раскрываются дитерпеновые гликозиды, включая ребаудиозид D, а также их использование в пищевых продуктах, медицинских композициях, композициях для гигиены полости рта, жевательных композициях и курительных композициях.
13
19
Было установлено, что некоторые из этих нежелательных свойств можно снизить или устранить, подвергая стевиолгликозиды реакции межмолекулярного трансглюкозилирования, когда новые углеводные остатки присоединяются к исходной молекуле в положениях С и C. В зависимости от количества углеводных остатков в этих положениях изменяется качество и выраженность вкуса композиций. В таблице 1 показано, каким образом качество и интенсивность сладости изменяются в зависимости от количества и положения гликозидов. Остатки глюкозы (обозначенные как Gluc или G в таблице) соединены бета-гликозидной связью. Пуллуланаза, изомальтаза (Lobov S. V. et al. (1991) Enzymatic production of sweet stevioside derivatives: transglycosylation by glucosidases. Agric. Biol. Chem. 55: 2959-2965), β-галактозидаза (Kitahata S. et al. (1989) Production of rubusoside derivatives by transglycosylation of various β-galactosidase. Agric. Biol. Chem. 53: 2923-2928) и декстрансахараза (Yamamoto K. et al. (1994) Effective production of glucosyl-stevioside by α-1,6-transglucosylation of dextran dextranase. Biosci. Biotech. Biochem. 58: 1657-1661) были использованы в качестве ферментов трансгликозилирования совместно с пуллуланом, мальтозой, лактозой и частично гидролизованным крахмалом, соответственно, в качестве доноров гликозидных остатков для линейного удлинения углеводного фрагмента в ядре стевиолгликозида альфа-связанными остатками глюкозы.
Трансглюкозилирование стевиолгликозидов также было осуществлено под действием циклодекстрин глюканотрансфераз (CGTase), продуцируемых Bacillus stearothermophilus (патенты США № 4219571 и № 7807206). В результате образовывались α-1,4-глюкозил-производные со степенью полимеризации до 10.
Было показано, что вкусовой профиль и степень сладости глюкозил-производных преимущественно зависят от целого ряда дополнительных глюкозил-производных, то есть степени полимеризации α-1,4-глюкозильной цепи. Увеличение количества α-1,4-глюкозильных остатков улучшило вкусовые качества, но в то же время снизило уровень сладости (Tanaka, 1987).
Также следует отметить, что многие продукты на основе глюкозила стевии содержат до 20% предельных декстринов, которые не обладают выраженными функциональными свойствами и снижают содержание стевиолгликозидов в продукте, кроме того уменьшая интенсивность сладости.
Таким образом, необходимо разработать простой и эффективный способ получения стевиолгликозидов высокой чистоты.
В опубликованной заявке Китая № CN103012516, поданной Wuxi Kingboon Stevia Internat Trade Co. Ltd., раскрываются способы получения стевиозидов, которые включают стадию вымачивания листьев стевии в воде; стадию грубой фильтрации и ультрафильтрации с получением раствора ультрафильтрации; стадию введения раствора ультрафильтрации в нано-, микро- предколонку; и, по меньшей мере, две стадии алкоголиза на нано-, микро- предколонке.
В опубликованной заявке Китая № CN102127129, поданной Liaoning Qianqian Biolog Technology Co., раскрывается способ получения экстракта стевии, который включает стадию механического измельчания листьев стевии; стадию фильтрации листьев стевии; стадию ультразвуковой экстракции; стадию флокуляции; стадию адсорбции; стадию анализа посредством элюирования этанолом; стадию обессоливания и обесцвечивания; стадию концентрирования; и стадию распылительной сушки.
В опубликованной заявке Китая № CN102406113, поданной Ningbo Green Health Pharmaceutical Co. Ltd., раскрывается способ получения препарата ребаудиозида А/ребаудиозида D, который включает стадию экстракции измельченных листьев стевии водой; стадию пропускания фильтрата через колонку с макропористой смолой; и стадию элюирования спиртовым растворителем с использованием анализа методом ВЭЖХ с детектированием содержания ребаудиозида А/ребаудиозида D.
В опубликованной заявке США № 20130071537, поданной E.P.C Plant Pharmaceutical Technology Co., Ltd., раскрываются композиции подсластителей на основе стевии, которые содержат солевую форму ребаудиозида B.
В опубликованной заявке США № 20140243514, поданной Cargill, Incorporated, раскрывается способ получения обогащенной композиции, содержащей, по меньшей мере, один из ребаудиозида В, ребаудиозида D или их смеси, который включает использование макропористой нейтральной пористой смолы.
В опубликованной заявке США № 20130309389, поданной Cargill, Incorporated, раскрывается композиция, содержащая установленные количества ребаудиозида D и ребаудиозида B.
В опубликованной заявке США № 20140004248, поданной LGL Life Tech Corporation, раскрывается способ получения композиции натурального подсластителя, содержащей, по меньшей мере, один из экстракта стевиолбиозида, экстракта ребаудиозида В и экстракта ребаудиозида D, включающий использование колонки с пористым адсорбционным слоем, имеющей установленные параметры. В опубликованной заявке США № 20130071339, поданной Markosyan, раскрываются способы получения высокоочищенных стевиолгликозидов, в частности ребаудиозида D.
В опубликованной заявке США № 20150017284, поданной Markosyan, раскрывается кристаллическая композиция ребаудиозида M и ребаудиозида D, содержащая, по меньшей мере, 75% ребаудиозида M.
В опубликованной заявке США № 20130071339, поданной Markosyan, раскрывается способ очистки стевиолгликозидов, который включает использование последовательно соединенных колонок, заполненных адсорбирующей смолой, способной адсорбировать стевиолгликозиды.
В патенте США № 8299224, принадлежащем PureCircle Sdn Bhd, раскрывается способ очистки ребаудиозида D из экстракта стевии, который включает предоставление экстракта стевии; растворение экстракта в первом водном растворе органического растворителя с получением первой смеси стевиолгликозидов, при этом органический растворитель выбирают из группы, состоящей из метанола, этанола, 1-пропанола, изопропанола и их смеси, и органический растворитель составляет 75-99 об.%; индуцирование кристаллизации в первой смеси; фильтрование смеси с получением первого осадка и первого фильтрата; растворение первого осадка во втором водном растворе органического растворителя с получением второй смеси, при этом органический растворитель выбирают из группы, состоящей из метанола, этанола, 1-пропанола, изопропанола и их смеси, и органический растворитель составляет 70-80 об.%; индуцирование кристаллизации во второй смеси; фильтрование смеси с получением второго осадка и второго фильтрата; растворение второго осадка в третьем водном растворе органического растворителя с получением третьей смеси, при этом органический растворитель выбирают из группы, состоящей из метанола, этанола, 1-пропанола, изопропанола и их смеси, и органический растворитель составляет 10-80 об.%; индуцирование кристаллизации в третьей смеси; и фильтрование смеси с получением третьего осадка и третьего фильтрата; при этом сушка третьего осадка приводит к получению очищенного ребаудиозида D.
В опубликованных заявках США № 20140335253, № 20140335254, № 20140335264 и № 20140335265, поданных EPC Beijing Natural Products Co. Ltd., раскрываются ненатуральные композиции ребаудиозида D, которые содержат повышенное количество очищенного ребаудиозида D, при этом повышенное количество очищенного ребаудиозида D добавляют в виде очищенного ребаудиозида D в композиции.
В опубликованной заявке США № 20120269954, поданной Tate & Lyle Ingredients Americas LLC, раскрывается экстракт стевии, содержащий ребаудиозид B.
В опубликованной заявке США № 20110256588, поданной Lee и др., раскрывается способ получения ребаудиозида А с высоким выходом повторным использованием побочных продуктов, образующихся при получении ребаудиозида А из листьев Stevia rebaudiana Bertoni.
В опубликованной заявке США № 20110183056, поданной Morita и др., раскрываются выделенные стевиолгликозиды, имеющие структуры, раскрытые здесь. В ссылке раскрывается, что стевиолгликозиды, которые имеют структуры, в которых присутствует более гликозидных остатков, чем в молекуле стевиозида или ребаудиозида А, могут обеспечить слабое усиление вкуса подсластителя на основе стевии.
В патенте США № 8520527, принадлежащем PureCircle Sdn Bhd, раскрывается способ получения пищевого компонента на основе стевии, который включает стадию вымачивания биомассы стевии в воде для удаления растворимых компонентов; стадию инкубирования нерастворимой в воде биомассы стевии в щелочном растворе с получением пульпы; и затем стадию обработки с получением пищевого компонента на основе стевии, который содержит микрокристаллическую целлюлозу.
В патенте США № 8337928, принадлежащем Concentrate Manufacturing Company из Ирландии, раскрывается питьевой продукт, который содержит, по меньшей мере, один стевиолгликозидный подсластитель и анисовую кислоту.
В патентах США № 8318459 и № 8257948, принадлежащих PureCircle USA, раскрывается способ получения композиции высокоочищенного глюкозила стевии с использованием крахмала в качестве источника остатков глюкозы.
В патенте США № 8299224, принадлежащем PureCircle Sdn Bhd, раскрывается способ очистки ребаудиозида D из экстракта стевии.
В патенте США № 8277862, принадлежащем Concentrate Manufacturing Company из Ирландии, раскрывается питьевой продукт, который содержит ребаудиозид А, эритрит и кислотный компонент.
В патенте США № 8277862, принадлежащем Concentrate Manufacturing Company из Ирландии, раскрывается питьевой продукт, который содержит стевиолгликозид и кислотный компонент.
В патенте США № 7964232, принадлежащем PepsiCo, Inc., раскрываются изомеры стевиолгликозидов, причем здесь экзо-циклическая двойная связь формулы I была перемещена в эндо-циклическое положение внутри пятичленного кольца.
В патенте США № 7927851, принадлежащем Vineland Research и Innovation Centre, раскрывается способ получения стевиолгликозида в растение или растительной клетке, включающий: а) выбор растений или растительной клетки, которые продуцируют энт-кауреновую кислоту; b) трансформацию растения или растительной клетки первой нуклеотидной последовательностью, кодирующей полипептид, обладающий активностью 13-гидроксилазы энт-кауреновой кислоты, и, по меньшей мере, одной другой нуклеотидной последовательностью, кодирующей одну или более глюкозилтрансфераз, чтобы катализировать добавление одной или более молекул глюкозы к стевиолу или глюкозил-стевиолу; и c) экспрессию полипептида, имеющего 13-гидроксилазу энт-кауреновой кислоты и указанную одну или более глюкозилтрансфераз в клетке для превращения энт-кауреновой кислоты в один или более стевиолгликозидов.
Ohta и др., Characterization of novel steviol glycosides from leaves of Stevia rebaudiana morita, J. Appl. Glycosci., 57, 199-209 (2010), раскрывает структуры стевиолгликозидов, выделенных из листьев S. rebaudiana Morita, которую получили отбором и селекцией S. rebaudiana Bertoni.
Zimmerman, Tandem mass spectrometric fragmentation patterns of known and new steviol glycosides with structure proposals, Rapid Commun. Mass. Spectrom. 2011, 25, 1575-1582, раскрывает применение тандемной масс-спектрометрии для идентификации 12 ранее неизвестных стевиолгликозидов.
Brandle и др. (2002) Plant Molecular Biology 50: 613-622; Richman и др. (1999) The Plant Journal 19 (4), 411-421; и Richman и др. (2005) The Plant Journal 41, 55-67, раскрывают метаболические пути для получения стевиола и превращения стевиола в различные стевиолгликозиды.
Существующие способы относятся к выделению и очистке стевиолгликозидов из исходного экстракта и не предоставляют возможность для дальнейшей обработки остаточного раствора или очистки минорных соединений, индивидуально или в совокупности. Таким образом, сохраняется потребность в эффективном и экономичном способе комплексной повторной обработки экстракта, полученного из растений Stevia rebaudiana.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Изобретение относится к комплексному способу разделения, выделения, характеристики и использования двух или нескольких минорных стевиолгликозидов (и в частности тех, которые встречаются в природе на уровне менее чем 1% сухого веса листьев) из растений Stevia rebaudiana.
Согласно варианту осуществления обеспечивается эффективный способ разделения, выделения и характеристики комбинации двух или более стевиолгликозидов из экстракта стевии, таким образом, минимизируя отходы.
Комбинации двух или нескольких стевиолгликозидов, отдельно или в сочетании с другими подсластителями и/или другими компонентами, являются подходящими в качестве некалорийных подсластителей в пищевых и жевательных композициях, таких как напитки, кондитерские изделия, хлебопекарные изделия, печенье, жевательные резинки, фармацевтические препараты и тому подобное.
Согласно варианту осуществления способ включает:
1. использование хроматографического метода для идентификации и количественного определения комбинаций двух или более минорных стевиолгликозидов (присутствующих на уровне менее чем 5% сухого веса листьев) в качестве средства информирования селекционной программы для оптимизации получения этого определенного набора стевиолгликозидов, которые в настоящее время не используются в промышленном масштабе в качестве подсластителей,
2. способ экстрагирования, в частности ступенчатой экстракцией, листьев стевии, свежих листьев или высушенных для сохранения, для оптимизации выделения двух или более минорных стевиолгликозидов с молекулярным весом более чем приблизительно 900 г/моль и минимизации необходимости в последующих стадиях обработки,
3. использование хроматографии для выделения набора двух или нескольких стевиолгликозидов с молекулярным весом более, чем приблизительно 900 г/моль, предпочтительно ребаудиозидов D, I, О, М и/или N, каждый из которых по отдельности присутствует на уровне ниже 5% в пересчете на сухой вес листьев,
4. способ, который позволяет избежать необходимости в кристаллизации при выделении стевиолгликозидов D, I, О, М и/или N, который включает градиентное элюирование с использованием 2 или более растворителей при постоянной температуре, или при градиенте температуры с элюирующим растворителем,
5. применение в качестве подсластителя комбинации двух или нескольких стевиолгликозидов, предпочтительно ребаудиозидов D, I, О, М и/или N, которые по отдельности присутствуют на уровнях ниже 5% в пересчете на сухой вес листьев,
6. два или более стевиолгликозидов могут быть использованы отдельно или в комбинации с более преобладающими стевиолгликозидами, включая, но не ограничиваясь ими, ребаудиозид А, ребаудиозид B, ребаудиозид D, в количестве менее чем приблизительно 25% преобладающего стевиолгликозида, менее чем приблизительно 15% преобладающего стевиолгликозида, менее чем приблизительно 10% преобладающего стевиолгликозида, менее чем приблизительно 5% преобладающего стевиолгликозида. Таблица 9, взятая из публикации Ohta и др. (2010), предоставляет относительные количества стевиолгликозидов из листьев S. rebaudiana Morita и S. rebaudiana Bertoni.
Непрерывный противоточный ионный обмен и адсорбция, такие как технология SepTor компании Outotec, Espoo, Финляндия, являются методом, который можно использовать для удаления загрязняющих веществ. Непрерывная хроматография отличается от традиционной (одноколоночной или многоколоночной) стационарной твердофазной хроматографии тем, что несколько колонок, используемых в непрерывной хроматографии, функционируют, как если бы они были одной колонкой, но с несколькими точками ввода и точками выхода между колонками, что обеспечивает постепенное перемещение точек ввода для смеси и элюирующего растворителя и точек выхода для более быстро и более медленно элюирующихся компонентов, находящихся в смеси. Данный режим работы позволяет каждому составному сегменту колонки функционировать автономно по отношению к элюирующей смеси или скорости потока. Моделирование непрерывного процесса разделения описывается Johan Samuelsson в публикации «Simulation of continuous chromatographic processes» и Niklas Andersson в публикации «Simulation of continuous preparative chromatography: A case study in MCSGP» (2009) для использования градиента растворителя (SG) в многоколоночной системе (MC). «Препаративный» (P) относится к проведению разделения в большем масштабе, чем для аналитических целей, вплоть до масштаба промышленного производства. Применение непрерывного хроматографического разделения сахаров хорошо разработано в свеклосахарной промышленности и описано Bubnik и соавторами в публикации «Application of continuous chromatographic separation in sugar processing», Journal of Food Engineering 61 (2004) 509-513. Применение непрерывных методов разделения должно быть адаптировано для типа проводимого разделения. Например, стратегия разделения в целях выделения ребаудиозида А высокой чистоты будет отличаться от функционирования системы для нестандартной смеси из других стевиолгликозидов. До настоящего времени методы непрерывного разделения не использовались для выделения нестандартных смесей стевиолгликозидов, содержащих, по меньшей мере, два стевиолгликозида, выбранных из ребаудиозидов A, D, I, O, M и N.
Другим важным отличием непрерывной хроматографии является применение постоянного запаса материала, который подвергается разделению, находясь в многоколоночной системе, и который непрерывно циркулирует в системе. Такой запас преимущественно используют для облегчения разделения посредством регулирования запаса отдельных компонентов для поддержания требуемой композиции. Например, если исходная смесь имеет низкое содержание набора требуемых компонентов (например, 3-5% ребаудиозидов A, D, I, O, M и N), но преобладающее количество (>20%) ребаудиозида А, то сначала с колонки может осуществляться выход в основном преобладающего компонента, при этом позволяя минорным компонентам оставаться в запасе на колонке. Это может позволить лучше отделить минорные компоненты исходного материала в запасе на колонке от других компонентов, обеспечивая выход потока, обогащенного требуемыми (минорными) компонентами.
Возможность каждой колонки функционировать независимо имеет решающее значение при разделениях, включающих два или более входов в систему разделения (например, исходного материала, элюента А и элюента В) и два или более выходов (например, продукта 1, продукта 2, продукта 3 и так далее), где скорости потоков выхода различаются для каждого. Баланс потока в колонке рассчитывается как:
вход(предыдущая колонка)
вход(исходный материал)
выход(продукт)
выход(следующая колонка)
F+F=F+F
вход(исходный материал)
выход(продукт)
Где F может быть входом исходного материала или элюирующего растворитела и F является выходом продукта.
Псевдодвижущийся слой
В производстве метод псевдодвижущегося слоя (SMB) представляет собой высокоинженерный метод для осуществления хроматографического разделения. Он используется для отделения одного химического соединения или одного класса химических соединений от одного или более других химических соединений с целью предоставления значительных количеств очищенного или обогащенного материала при более низкой стоимости, чем можно было бы получить использованием обычной (периодической) хроматографии. Он не может обеспечить разделение или очистку, которые не могут быть осуществлены обычной очисткой на колонке. Данный процесс является достаточно сложным. Преимущество, которое он привносит в хроматографическую очистку, заключается в том, что он позволяет получать большие количества высокоочищенного материала при существенном снижении затрат. Снижении затрат происходит за счет: использования меньшего количества хроматографической разделяющей среды неподвижной фазы, непрерывного и высокоскоростного получения продукта и сокращения требуемого количества растворителя и энергии. Такой улучшенный экономический результат обусловлен расположением клапан-и-колонка, которое используется для неограниченного удлинения неподвижной фазы и обеспечения очень высоких концентраций растворенных веществ в процессе.
В традиционном методе подвижного слоя производственной хроматографии вход исходного материала и выход аналита происходят одновременно и непрерывно, но из-за практических трудностей с непрерывно подвижным слоем был предложен метод псевдодвижущегося слоя. В методе псевдодвижущегося слоя вместо перемещения слоя непрерывно перемещаются входное отверстие для исходного материала, входное отверстие для растворителя или элюента, и выходное отверстие для требуемого продукта, и выходное отверстие для нежелательного продукта, создавая впечатление движущегося слоя, с непрерывным потоком твердых частиц и непрерывным потоком жидкости в направлении, противоположном направлению твердых частиц.
Другим видом непрерывного хроматографического разделения является кольцевой хроматографии. В опубликованном обзоре Frank Hilbrig и Ruth Freitag («Continuous annular chromatography», Journal of Chromatography B, 790 (2003) 1-15) сообщают «Принцип непрерывной кольцевой хроматографии (CAC) был известен на протяжении нескольких десятилетий. CAC представляет собой непрерывный режим хроматографии, который подходит для разделения многокомпонентных смесей, а также двухкомпонентных смесей. В CAC подвижные и неподвижные фазы движутся в режиме поперечного потока, что обеспечивает преобразование типичного одномерного разделения на колонке периодического действия в непрерывное двумерное разделение. За исключением линейного градиентного элюирования все хроматографические режимы были в настоящее время применены в CAC». Ранее Bart и соавторы (Continuous chromatographic separation of fructose, mannitol and sorbitol. Chemical Engineering and Processing 35 (1996) 459-471) применили метод для разделения простых сахаров, но данный метод не был использован для разделения стевиолгликозидов.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На фиг.1 представлена структура агликонов стевиолгликозидов с обозначенным местом гликозилирования (R1 и R2).
На фиг.2 приведена структура стевиолгликозидов.
Фиг.3 представляет собой диаграмму, которая показывает, как субъективное вкусовое качество и сладость можно прогнозировать по молекулярному размеру стевиолгликозида.
На фиг.4 представлена масс-спектра стевиолгликозидов, представляющих интерес.
На фиг.5 представлена масс-спектра стевиолгликозидов, представляющих интерес.
На фиг.6 показаны стадии экстракции и очистки, которые можно использовать по настоящему изобретению.
На фиг.7 показано применение хроматографии с псевдодвижущимся слоем по настоящему изобретению.
Настоящее изобретение может быть более полно понятно со ссылкой на чертежи, нижеследующие подробное описание и примеры.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Считается, что специалист в данной области на основе приведенного здесь описания может использовать настоящее изобретение в наиболее полном объеме. Нижеперечисленные конкретные варианты осуществления следует рассматривать только как иллюстративные, а не как ограничивающие остальную часть описания каким-либо образом.
Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые здесь, имеют такое же значение, как обычно понимаемое средним специалистом в данной области, к которой принадлежит изобретение. Кроме того, все публикации, заявки на патенты, патенты и другие ссылки, упомянутые здесь, включены посредством ссылки. Все используемые здесь проценты являются весовыми, если не указано иное. Кроме того, все диапазоны, указанные здесь, подразумевают включение любой комбинации значений между двумя конечными точками включительно.
ОПРЕДЕЛЕНИЯ
Под термином «вкусовые ноты» подразумеваются тонкие органолептические показатели, обычно определяемые на вкус или запах, ощущаемый при выдохе через нос после приема внутрь (ретроназальное обоняние).
Под термином «стевиол» подразумевается дитерпеновое соединение гидрокси-энт-каур-16-ен-13-ол-19-овой кислоты, которое представляет собой гидроксилированную форму соединения, называемого «энт-кауреновой кислотой», которая является энт-каур-16-ен-19-овой кислотой.
Под термином «стевиолгликозид» подразумеваются любые гликозиды агликона стевиола, включающие, но не ограничивающиеся ими, стевиозид, ребаудиозид А, ребаудиозид В, ребаудиозид С, ребаудиозид D, ребаудиозид E, ребаудиозид F, ребаудиозид I, ребаудиозид M, ребаудиозид N, ребаудиозид O, дулькозид, рубузозид, стевиолмонозид, стевиолбиозид и 19-О-β-глюкопиранозил-стевиол.
Примеры синтетических подсластителей включают сукралозу, ацесульфам калия, аспартам, алитам, сахарин, синтетические производные неогесперидин дигидрохалькон, цикламат, неотам дульцин, суосан, 1-метиловый эфир N-[N-[3-(3-гидрокси-4-метоксифенил)пропил]-L-α-аспартил]-L-фенилаланина (Адвантам), 1-метиловый эфир N-[N-[3-(3-гидрокси-4-метоксифенил)-3-метилбутил]-L-α-аспартил]-L-фенилаланина, 1-метиловый эфир N-[N-[3-(3-метокси-4-гидроксифенил)пропил]-L-α-аспартил]-L-фенилаланина, их соли и тому подобное.
Примеры природных высокоинтенсивных подсластителей включают стевиозид, ребаудиозид А, ребаудиозид B, ребаудиозид С, ребаудиозид Е, ребаудиозид F, стевиолбиозид, дулькозид А, рубузозид, некоторые могрозиды (например, могрозид V), браззеин, неогесперидин дигидрохалкон (NHDC), глицирризиновую кислоту и ее соли, тауматин, периллартин, пернандульцин, мукурозиозид, байюнозид, фломизозид I, диметил-гексагидрофлуорен-дикарбоновую кислоту, абрузозиды, периандрин, карнозифлозиды, циклокариозид, птерокариозиды, полиподозид А, бразилин, гернандульцин, филлодульцин, глицифиллин, флоризин, трилобатин, дигидрофлавонол, дигидрокверцетин-3-уксусную кислоту, неоастилбин, транс-коричный альдегид, монатин и его соли, селлигвеин А, гематоксилин, монеллин, осладин, птерокариозид A, птерокариозид B, мабинлин, пентадин, миракулин, куркулин, неокулин, хлорогеновую кислоту, цинарин, сиаменозид и другие.
Подходящие «термостабильные, высокоинтенсивные подсластители» включают химические соединения или смеси соединений, которые вызывают сладкий вкус, по меньшей мере, в пять раз слаще сахарозы, если измерять в соответствии с методом испытаний, описанным в патенте Великобритании № 1543167, который включен здесь посредством ссылки. Обычно такие подсластители по существу не содержат продуктов разложения после нагревания в течение примерно одного часа при температуре около 40°С. Примеры таких подходящих подсластителей включают, но не ограничиваются ими, сукралозу, неотам, сахарин, ацесульфам-K, цикламат, неогесперидин DC, стевию, тауматин, браззеин, аспартам и их смеси.
Стевия является некалорийным натуральным подсластителем из растения Stevia rebaudiana. Растение продуцирует множество сладких соединений, совместно называемых стевиолгликозидами, которые делают стевию до 300 раз слаще сахарозы. Эти гликозиды можно экстрагировать из растения водой и другими растворителями, которые хорошо известны специалистам в данной области. Они являются термостабильными, рН-стабильными, не ферментируются и не вызывают гликемическую реакцию.
Стевиозид, иногда называемый сложным β-D-глюкопиранозиловым эфиром 13-[(2-О-β-D-глюкопиранозил-α-D-глюкопиранозил)окси]-каур-16-ен-18-овой кислоты, и ребаудиозид А являются типичными гликозидами дитерпеновых производных стевиола, экстрагированными и очищенными из листьев Stevia rebaudiana (также известной как Eupatorium rebaudianum). Данные гликозиды являются высокоинтенсивными подсластителями примерно в 100-500 раз слаще сахарозы, но имеют металлические и горькие ноты. Их можно использовать в широком диапазоне низкокалорийных или с пониженным содержанием калорий пищевых продуктов и напитков.
Другие сладкие гликозиды можно также экстрагировать из Stevia rebaudiana. Они имеют разную степень сладости. Используемый здесь термин «экстракт стевии» означает сладкий гликозид, экстрагированный из растения стевии.
Из гликозидов, обнаруженных в экстрактах стевии, ребаудиозид А, как в целом полагают, обладает наименьшим послевкусием. Это послевкусие, которое было описано многими как горькое и подобное вкусу солодки, присутствует во всех современных продуктах, подслащенных стевией. Такие композиции обычно требуют объемного разбавления или маскирующих вкус технологий.
Подобно всем высокоинтенсивным подсластителям, содержащим подслащивающие композиции, содержащие стевию подслащивающие композиции обычно получали с наполнителем для облегчения измерения и распределения при применении потребителями. В число раскрытых или использованных наполнителей включают фруктоолигосахарид (ФОС) и другие волокна, мальтодекстрины и эритрит. Эритрит является особенно популярным, так как он может немного смягчить горький вкус.
В заявках на патент США № 20120201952 и № 20120201940, поданных Catani и др., раскрывается способ получения природной подслащивающей композиции, включающий перегонку с водяным паром неочищенной смеси, содержащей, по меньшей мере, одно природное высокоинтенсивное подслащивающее соединение растительного происхождения, и фильтрацию неочищенной смеси.
В заявке на патент США № 20100285201, поданной Catani и др., раскрывается синергическая подслащивающая композиция, которая содержит сукралозу и очищенный экстракт стевии, при этом очищенный экстракт стевии содержит ребаудиозиды и дулкозиды.
В заявке на патент США № 20090017185, поданной Catani и др., раскрывается подслащивающая композиция с пониженным содержанием калорий, состоящая из экстракта стевии и простого сахара. Ссылка раскрывает, что экстракт стевии может содержать ребаудиозид А в количестве от около 80 вес.% до около 99,5 вес.% относительно всех стевиолгликозидов, а простым сахаром может быть сахароза, фруктоза или глюкоза.
В заявке на патент США № 20090004355, поданной Catani, раскрывается подслащивающая композиция, содержащая эритрит и экстракт стевии.
Настоящее изобретение относится к способу разделения, выделения и характеристики комбинации двух или более сладких гликозидов из экстракта растения Stevia rebaudiana с молекулярным весом в диапазоне от около 966 г/моль до около 1436 г/моль и с ребаудиозидом А менее чем 25% стевиолгликозидов, более предпочтительно с ребаудиозидом А менее чем 15% стевиолгликозидов, более предпочтительно с ребаудиозидом А менее чем 10% стевиолгликозидов и более предпочтительно с ребаудиозидом А менее чем 5% стевиолгликозидов.
Преимущества настоящего изобретения станут более очевидными из подробного описания, приведенного ниже. Однако следует понимать, что подробное описание и конкретные примеры, как демонстрирующие предпочтительные варианты осуществления изобретения, даются только с целью иллюстрации, поскольку различные изменения и модификации в пределах сущности и объема изобретения станут очевидными для специалистов в данной области из этого подробного описания.
Среди сладких гликозидов, встречающихся в стевии, только стевиозид, ребаудиозид А и ребаудиозид C доступны при умеренной стоимости с чистотой <80% и при высокой стоимости с чистотой >80%. Самая высокая чистота серийно выпускаемого продукта обычно составляет более 97%. В дальнейшем термин «высокоочищенный» относится к композиции стевиолгликозидов, которая содержит, по меньшей мере, от около 90% до около 100% стевиолгликозидов в пересчете на сухой вес. На рынке не существует промышленных количеств высокоочищенного ребаудиозида B или ребаудиозида D, два компонента стевии с вкусовым качеством и интенсивностью, сопоставимыми с ребаудиозидом А. Ребаудиозиды Е и F, также подсластители с хорошим вкусом, доступны в небольших количествах в качестве аналитических стандартов. Промышленное применение не получили встречающиеся в природе стевиолгликозиды с молекулярным весом, сопоставимым или больше, чем у ребаудиозида D. Настоящее изобретение направлено на определение композиции таких крупномолекулярных компонентов и недорогостоящий способ получения этой композиции, который компенсирует низкую концентрацию компонентов в Stevia rebaudiana использованием их в совокупности в качестве подслащивающего вещества.
Существует потребность в эффективном и экономичном способе комплексного разделения, выделения и/или характеристики комбинаций двух или более сладких гликозидов из экстракта стевии с молекулярным весом более чем примерно 900 г/моль. Индивидуальные стевиолгликозиды, которые были разработаны для промышленного применения, имеют ограничения с точки зрения вкусового качества и сладости временного профиля. Характеристики и ограничения выделенных встречающихся в природе и синтетических подсластителей описываются Grant E. DuBois и Indra Prakash в Annu. Rev. Food Sci. Technol. (2012), 3:353-380 (Non-Caloric Sweeteners, Sweetness Modulators, and Sweetener Enhancers). Настоящее изобретение избегает концепции выделения индивидуальных сладких компонентов в пользу разделения, выделения и/или характеристики комбинации двух или более молекул из стевии.
ПРИМЕРЫ
Известные стевиолгликозиды можно прогнозировать на основе характера замещения сахара (гликозида). Это создает возможность для прогнозирования других отсутствующих или еще неидентифицированных стевиолгликозидов, которые могут присутствовать пусть даже и на очень низком уровне в различных препаратах. Структура стевиолгликозидов приведена на фиг.2.
Качество и интенсивность сладости стевиолгликозидов, как установлено, коррелирует со степенью гликозилирования стевиола агликона. На фиг.3 ниже показано, каким образом субъективное вкусовое качество и сладость можно прогнозировать по молекулярному размеру, хотя могут возникать исключения, такие как ребаудиозид B. Это соединение может быть показательным для значимости конкретной структуры гликозида в R2, даже при отсутствии гликозилирования в R1, при определении качества и интенсивности сладости.
Качество и интенсивность сладости также зависят от наличия моносахаридов кроме глюкозы. Таким образом, наличие рамнозы (Rh) в молекуле, например, дулькозида А или ребаудиозида С, приводит к меньшей интенсивности и качеству сладости по сравнению с стевиолгликозидами, замещенными тем же количеством моносахаридов исключительно глюкозы, такими как стевиозид или ребаудиозид А соответственно.
Таблица 1.
Характер гликозилирования стевиолгликозидов коррелирует со сладостью.
Стевиолгликозид
R1
R2
№глюкозы(G)
№рамнозы (Rh)
Мол. вес
Интенсивность сладости
Качество сладости
стевиол
318
стевиолмонозид
G-
1
480
40
-3
стевиолбиозид
G-2G-
2
642
40
-3
рубузозид
G-
G-
2
642
115
-2
дулькозид A
G-
Rh2-G-
2
1
788
70
-2
стевиозид
G-
G2-G-
3
804
145
0
ребаудиозид B
G2-(G3)-G-
3
804
300
3
ребаудиозид C
G-
Rh2-(G3)-G-
3
1
950
200
-1
ребаудиозид E
G2-G-
G2-G-
4
966
200
1
ребаудиозид A
G-
G3-(G2)-G-
4
966
250
2
ребаудиозид D
G2-G-
G2-(G3)-G-
5
1128
300
3
Примечание: данные по качеству и интенсивности сладости из публикации Osamu Tanaka. «Improvement of taste of natural sweeteners», Pure & Appl. Chem. 1997, 69(4), 675-683. Интенсивность сладости, как понимается, соотносится с соответствующим весом сахарозы. Качество сладости представляет собой субъективное относительное ранжирование.
Стевиолгликозиды отличаются друг от друга не только молекулярной структурой, но и их вкусовыми свойствами. Обычно стевиозид, как установлено, слаще сахарозы в диапазоне от около 110 до около 270 раз, ребаудиозид А - в диапазоне от около 150 до около 320 раз, а ребаудиозид С слаще сахарозы в диапазоне от около 40 до около 60 раз. Дулькозид А примерно в 30 раз слаще сахарозы. Интенсивность сладости, как известно, немного изменятся в зависимости от температуры и вязкости среды носителя.
Несмотря на то, что некоторые стевиолгликозиды в настоящее время являются известными, не все были оценены по качеству и интенсивности сладости. Кроме того, несмотря на то, что многие способы используются для выделения и применения индивидуальных стевиолгликозидов в качестве подсластителей, современный уровень знаний не позволяет прогнозировать показатели сладости смеси стевиолгликозидов, особенно в пропорциях иных, чем присутствующие в природных условиях, или вкусовые характеристики в сочетании с другими подсластителями, или калорийными, или некалорийными, высокоинтенсивными или более сопоставимыми с простыми моно- и дисахаридами, такими как глюкоза, фруктоза или сахароза.
МЕТОД АНАЛИЗА

Традиционные методы анализа стевиолгликозидов требуют двойных градиентов растворителей для отделения стевиолгликозидов от других несладких компонентов растительного экстракта. Следовательно, детекторы, использующие изменения показателя преломления элюента, не подходят. Обычно используются ультрафиолетовые (УФ) детекторы для анализа стевиолгликозидов, которые содержат слабый УФ хромофор. Данный метод имеет ограниченную применимость для анализа общих экстрактов за счет присутствия компонентов с более сильными хромофорами, которые препятствуют обнаружению компонентов, представляющих интерес, поскольку компоненты с высокими молярными коэффициентами поглощения на выбранной длине волны будут казаться более видимыми, чем компоненты с более низкими коэффициентами поглощения, которые, несмотря на присутствие в более высокой концентрации по весу, будут давать значительно более слабый сигнал. Другая альтернатива показателя преломления (RI) для масс-детектирования включает испарительное светорассеяние (ELS) и детектирование заряженного аэрозоля (CAD). Компания Thermo Scientific (Determination of Steviol Glycosides by HPLC with UV and ELS Detections. Application Note 241 (2012)) указывает, каким образом ELS может предоставить преимущества по сравнению с УФ-детектированием при определении содержания ребаудиозида А и стевиозида в композициях настольных подсластителей. Однако в нашем эксперименте ELS может иметь ограниченное применение при определении концентрации минорного компонента в присутствии другого близко элюируемого основного компонента. H.Y. Eom и др. (J. Chromatogr. 1217 (2010) 4347-4354) указывает, что обнаружение сапонинов, полученных из корней Bupleurum falcatum L. (Umbelliferae), является более чувствительным при использовании CAD, чем при использовании ELS. Мы обнаружили, что использование детектора заряженного аэрозоля, компании ESA, Inc., Chelmsford, MA, обеспечивает надежное количественное определение стевиолгликозидов в общих экстрактах Stevia rebaudiana, препараты которой богаты белками и другими растительными компонентами, которые обладают сильным УФ-поглощением, а также в присутствии больших количеств полисахаридов или других стевиолгликозидов, которые могут «ослепить» детектор для малых концентраций компонентов, представляющих интерес.
Определение эффективного детектора является лишь частью системы для эффективного количественного определения представляющих интерес компонентов в неочищенном препарате. Другой частью системы является определение системы растворителей (подвижной фазы) и твердого носителя (неподвижной фазы) для осуществления разделения. Успешная разработка подходящей комбинации подвижной и неподвижной фаз является эмпирическим методом проб и ошибок, результат которого не предсказуем априори. Мы экспериментировали с различными системами градиентной системы подвижной фазы для установления градиентов растворителей, которые подходят для разделения стевиолгликозидов, представляющих интерес, а значит позволяют их идентификацию методом масс-спектрометрии и количественное определение посредством CAD. Ниже приведен пример. Градиент можно регулировать для обеспечения более высокого разрешения около области конкретного пика, например, близко к пику ребаудиозида D.
Хроматографический метод анализа:
Неподвижная фаза: Phenomenex Kinetex C-18, 150×4,6, 2,6 мкм; Температура колонки: 55°C; Инжектируемый объем составляет 10 мкл.
Подвижная фаза (ПФА и ПФБ; скорость потока: 0,35 мл/мин):
ПФА: 0,1% муравьиная кислота в воде
ПФБ: 0,1% муравьиная кислота в ацетонитриле
Таблица 2.
Время (минуты)
%A
%Б
0
95
5
5
95
5
30
70
30
45
30
70
55
30
70
55,1
95
5
60
95
5
Таблица 3.
Идентификация стандартного образца
RT<sup>1</sup> (мин)
Мол.вес
Ребаудиозид D
35,920
1128
Ребаудиозид A
39,544
966
Стевиозид
39,704
804
Ребаудиозид F
40,207
936
Ребаудиозид C
40,468
950
Ребаудиозид A
40,745
788
Рубузозид
41,474
642
Ребаудиозид B
42,027
804
Стевиолбиозид
42,368
642
Стевиол
50,012
318
Изостевиол
52,427
318
1
RT - Время выхода пика
Смотрите также фиг.4.
Как известно, градиент можно изменить для ускорения разделения (0-2 мин 80% ПФА, 20% ПФБ; 2-35 мин от 80% до 0% ПФА, от 20% до 100% ПФБ, 35,01-40 мин 80% ПФА, 20% ПФБ; скорость потока 0,35 мл/мин, инжектируемый объем: 5 мкл), например, для обеспечения возможности масс-спектрометрической идентификации стевиолгликозидов. Пример приведен на фиг.5.
Таблица 4.
Идентификация пика
RT (мин)
Мол.вес
Ребаудиозид D
14,08
1128
Ребаудиозид N
14,33
1274
Ребаудиозид M
14,42
1290
Впервые полученный стевиолгликозид (возможно Reb. O)
14,75
Не определен
Ребаудиозид I
15,97
1128
Ребаудиозид A
16,29
966
Стевиозид
16,43
804
Внедрение аналитического метода в развитие сельского хозяйства
Мы разработали стратегию оптимизации выбора конкретного селекционного посадочного материала растений стевии на основе содержания стевиолгликозидов. Хорошо известно, что исторически природные виды стевии содержат преимущественно стевиозид в качестве основного стевиолгликозида, но селекционное выращивание способствовало внедрению посадочного материала, в котором преобладает ребаудиозид А. Мы применили наш новый анализ для предоставления возможности идентификации селекционного посадочного материала, который в дальнейшем обеспечит ребаудиозид D или другие требуемые стевиолгликозиды с молекулярным весом (мол. вес), равным или больше, чем у ребаудиозида А (мол. вес 966 г/моль), в частности ребаудиозиды I, O, M, N, которые среди прочих впоследствии могут быть обнаружены в новом селекционном посадочном материале.
РАЗДЕЛЕНИЕ ТРЕБУЕМЫХ СТЕВИОЛГЛИКОЗИДОВ БЕЗ КРИСТАЛЛИЗАЦИИ
Затем мы преобразовали информационные данные, полученные в результате аналитического разделения стевиолгликозидов, в новый способ, который устраняет необходимость в выделении и очистке отдельного компонента (обычно ребаудиозида А) кристаллизацией. Кроме того, мы разработали систему растворителей, в которой используется пищевой этанол (спирт из зернового сырья) и вода, для разделения стевиолгликозидов, представляющих интерес, без необходимости кристаллизации.
Пример:
Общий экстракт получали, подвергая 208,6 г высушенных листьев экстракции горячей водой (3 л) в течение 2 ч при 95°С. Экстракт концентрировали под вакуумом при температуре менее 40°C, очищали центрифугированием, декантировали, охлаждали и высушивали лиофилизацией с выходом 76,5 г сухого общего экстракта. Часть общего экстракта (100 г, содержащие примерно 1,7 г сухого вещества) непосредственно фракционировали на препаративной колонке с обращенной фазой (RediSep С18, 360 г) с использованием градиента этанола в воде, как показано ниже:
Таблица 5.
Время (минуты)
% вода
% этанол
0
100
0
10
100
0
38,2
0
100
44,1
0
100
44,1
50
50
50
50
50
Точку элюции заранее отмечали с использованием подлинных образцов ребаудиозидов А и D, которые выходят в диапазоне 25-30 мин, и фракции собирали через равные промежутки времени приблизительно в этом диапазоне, объединяли и высушивали в пересчете на композицию ВЭЖХ. Выделяли в общей сложности 628 мг стевиолгликозидов. Из этого образца выделяли 18 мг, содержащие около 23% ребаудиозида D, 21% ребаудиозидов N и M, 1,4% неохарактеризованных стевиолгликозидов, 2% ребаудиозида А и около 16% других известных стевиолгликозидов. Твердое вещество имело от почти белого до бежевого цвет и чистый сладкий вкус. Продукт подходит для использования в качестве подсластителя без дополнительной обработки или очистки.
Пример:
Общий экстракт получали, подвергая 208,6 г высушенных листьев экстракции горячей водой (3 л) в течение 2 ч при 95°С. Экстракт концентрировали под вакуумом при температуре менее 40°C, очищали центрифугированием, декантировали, охлаждали и высушивали лиофилизацией с выходом 76,5 г сухого общего экстракта. Часть общего экстракта (100 г, содержащие примерно 1,7 г сухого вещества) непосредственно фракционировали на препаративной колонке с обращенной фазой (RediSep С18, 360 г) с использованием градиента этанола в воде, как показано ниже:
Таблица 6.
Время (минуты)
% вода
% этанол
0
100
0
10
100
0
38,2
0
100
44,1
0
100
44,1
50
50
50
50
50
Таблица 7.
Время (минуты)
Масса (мг)
Композиция (методом ВЭЖХ/CAD)
Внешний вид образца
Вкус(посредством 2 независимых оценок)
22,8-23,6
78
Компоненты, не являющиеся стевиолгликозидами
Светло-бежевое твердое вещество
Горький(не сладкий)
23,6-25
18
Преимущественно Reb. D, N, М
Средне-коричневое твердое вещество
Чистый сладкий вкус
26-31,5
610
Reb. А и более мелкие стевиолгликозиды
Светло-желтое твердое вещество
«Классический» вкус Reb. А, то есть сладкий с горькими нотами
Точку элюции заранее отмечали с использованием подлинных образцов ребаудиозидов А и D, которые выходят в диапазоне примерно 25-30 мин, и фракции собирали через равные промежутки времени приблизительно в этом диапазоне, объединяли и высушивали в пересчете на композицию ВЭЖХ. Выделяли в общей сложности 628 мг стевиолгликозидов. Из этого образца выделяли 18 мг, содержащие около 23% ребаудиозида D, 21% ребаудиозидов N и M, 1,4% неохарактеризованных стевиолгликозидов, 2% ребаудиозида А и около 16% некоторых других известных стевиолгликозидов, присутствующих в небольших количествах. Твердое вещество имело от почти белого до светло-коричневого цвет и чистый сладкий вкус. Продукт подходит для использования в качестве подсластителя без дополнительной обработки или очистки.
Стевиолгликозиды, полученные способом по данному изобретению, могут быть включены в качестве высокоинтенсивного натурального подсластителя в пищевые продукты, напитки, фармацевтические композиции, косметические средства, жевательные резинки, настольные продукты, хлопья, молочные продукты, зубные пасты и другие композиции для полости рта и тому подобное. В вышеуказанных примерах приведены репрезентативные пропорции, которые могут быть использованы.
Кроме того, стевиолгликозиды можно использовать в качестве подсластителя не только для напитков, пищевых продуктов и других продуктов, предназначенных для потребления человеком, но и в корме для животных с улучшенными характеристиками.
При производстве пищевых продуктов, напитков, фармацевтических препаратов, косметических средств, настольных продуктов, жевательных резинок можно использовать традиционные способы, такие как смешивание, замешивание, растворение, маринование, пропитывание, перколяция, обсыпание, распыление, настаивание и другие способы.
Подсластитель, полученный в данном изобретении, можно использовать в сухой или жидкой формах. Его можно добавить до или после тепловой обработки пищевых продуктов. Количество подсластителя зависит от цели использования. Его можно добавить отдельно или в комбинации с другими соединениями.
Таблица 8.
Показана химическая структура стевиола и стевиолгликозидов, присутствующих в листьях Stevia rebaudiana Bertoni.
Патент США
30 октября 2012
лист 1 из 11
США 8299224 В2
Название соединения
R<sub>1</sub>(С-19)
R<sub>2</sub>(С-13)
1. Стевиол
H
H
2. Стевиолмонозид
H
β-Glc
3. Рубузозид
β-Glc
β-Glc
4. Стевиолбиозид
H
β-Glc-β-Glc(2⇒1)
5. Стевиозид
β-Glc
β-Glc-β-Glc(2⇒1)
6. Ребаудиозид А
β-Glc
<img file="00000002.jpg" he="10" wi="37" img-content="undefined" img-format="jpg" />
7. Ребаудиозид B
H
<img file="00000002.jpg" he="10" wi="37" img-content="undefined" img-format="jpg" />
8. Ребаудиозид C(Дулькозид B)
β-Glc
<img file="00000003.jpg" he="10" wi="37" img-content="undefined" img-format="jpg" />
9. Ребаудиозид D
β-Glc-β-Glc(2⇒1)
<img file="00000002.jpg" he="10" wi="37" img-content="undefined" img-format="jpg" />
10. Ребаудиозид E
β-Glc-β-Glc(2⇒1)
β-Glc-β-Glc(2⇒1)
11. Ребаудиозид F
β-Glc
<img file="00000004.jpg" he="10" wi="36" img-content="undefined" img-format="jpg" />
12. Дулькозид A
β-Glc
β-Glc-α-Rha(2⇒1)
Таблица 9.
Предлагаемые структуры и их относительное процентное содержание в стевиолгликозидах из листьев S. rebaudiana Morita и S. rebaudiana Bertoni
Стевиолгликозид
R<sub>1</sub>
R<sub>2</sub>
Morita (%)<sup>1</sup>
Bertoni (%)<sup>1,2</sup>
SG1 (стевиолмонозид)
H-
Glcβ1-
1,7
1,7
SG2 (стевиолбиозид)
H-
Glcβ1-2Glcβ1-
1,0
5,0
SG3 (рубузозид)
Glcβ1-
Glcβ1-
0,8
ND<sup>3</sup>
SG4 (дулькозид B)<sup>4</sup>
H-
Rhaα1-2(Glcβ1-3)G1cβ1-
0,6
0,8
SG5 (дулькозид A)
G1cβ1-
Rhaα1-2Glcβ1-
0,3
2,6
SG6 (ребаудиозид B)
H-
Glcβ1-2(Glcβl-3)Glcβ1-
2,5
2,0
SG7 (ребаудиозид G)<sup>4</sup>
Glcβ1-
G1cβ1-3G1cβ1-
1,1
0,8
SG8 (стевиозид)
Glcβ1-
Glcβ1-2Glcβ1-
9,2
49,8
SG9 (ребаудиозид C)
Glcβ1-
Rhaα1-2(Glcβ1-3)G1cβ1-
7,5
6,8
SG10 (ребаудиозид F)
G1cβ1-
Xylβ1-2(Glcβ1-3)Glcβ1-
1,9
1,4
SG11 (ребаудиозид A)
Glcβl-
Glcβ1-2(Glcβ1-3)Glcβ1-
61,6
21,5
SG12 (ребаудиозид I)<sup>4</sup>
Glcβ1-3Glcβ1-
G1cβ1-2(Glcβ1-3)G1cβ1-
0,1
ND<sup>3</sup>
SG13 (ребаудиозид E)
Glcβ1-2Glcβ1-
Glcβ1-2Glcβ1-
0,3
0,9
SG14 (ребаудиозид H)<sup>4</sup>
Glcβ1-
G1cβ1-3Rhaα1-2(G1cβ1-3)Glcβ1-
0,5
ND<sup>3</sup>
SG15 (ребаудиозид L)<sup>4</sup>
Glcβ1-
Glcβ1-6G1cβ1-2(Glcβ1-3)Glcβ1-
0,3
ND<sup>3</sup>
SG16-I (ребаудиозид K)<sup>4</sup>
Glcβ1-2Glcβ1-
Rhaα1-2(Glcβ1-3)Glcβ1-
0,3
ND<sup>3</sup>
SG16-II (ребаудиозид J)<sup>4</sup>
Rhaα1-2Glcβ1-
Glcβ1-2(Glcβ1-3)Glcβ1-
0,5
0,1
SG17 (ребаудиозид M)<sup>4</sup>
Glcβ1-2(Glcβ1-3)Glcβ1
Glcβ1-2(Glcβ1-3)Glcβ1-
1,0
ND<sup>3</sup>
SG18 (ребаудиозид D)
G1cβ1-2Glcβ1-
Glcβ1-2(Glcβ1-3)Glcβ1-
2,1
0,4
SG19 (ребаудиозид N)<sup>4</sup>
Rhaα1-2(Glcβ1-3)Glcβ
Glcβ1-2(Glcβ1-3)Glcβ1-
1,4
<0,1
SG20 (ребаудиозид 0)<sup>4</sup>
Glcβ1-3Rhaα1-2(Glcβ1-3)G1cβ1-
Glcβ1-2(Glcβl-3)Glcβ1-
0,6
ND<sup>3</sup>
-
*из публикации Ohta и др. (2010). 1. Относительные количества выражены в процентах от суммы площадей детектируемых пиков на основе их УФ-поглощения при 210 нм методом Amide-SO/ВЭЖХ. Пропорция SG16-I и SG16-II получена относительной интенсивностью ионов продукта при m/z 787 и 803 соответственно, напряжением CID 60 В анализом ESI-MS/MS в качестве иона-предшественника [М-Н] при m/z 1111. 2. Структуры были предложены на основании результатов сопоставления ВЭЖХ подвижности и анализов ESI-MS и MS/MS. 3. Не обнаружено. 4. Названия были предложены в данном исследовании.