Способ преимплантационного генетического тестирования семейной гипертрофической кардиомиопатии
METHOD FOR PRE-IMPLANTATION GENETIC TESTING OF FAMILIAL HYPERTROPHIC CARDIOMYOPATHY

Изобретение относится к преимплантационному генетическому тестированию моногенных заболеваний. В настоящее время в мире насчитывается более 350 миллионов людей, страдающих редким заболеванием (по данным RARE Project). Общее количество таких заболеваний по подсчетам European Organization for Rare Diseases (EURORDIS) варьируется от 5 до 7 тысяч. При этом около 80% редких заболеваний имеют генетическую причину. Известная генетическая основа заболевания позволяет с высокой точностью предсказать не только здоровье уже родившегося ребенка, но и оценить риск рождения такого ребенка при анализе генотипов родителей, а также провести генетическую диагностику на самых ранних этапах. Преимплантационное генетическое тестирование (ПГТ) моногенного заболевания становится мощным инструментом для профилактики таких заболеваний.
Настоящее изобретение относится к способу преимплантационного генетического тестирования семейной гипертрофической кардиомиопатии. Семейная гипертрофическая кардиомиопатия - это наследственное заболевание, характеризующееся патологическим асимметричным утолщением сердечной мышцы, способное привести к инвалидизации и ранней смерти носителя. Семейная гипертрофическая кардиомиопатия встречается с частотой 160-290 на 100000. Это заболевание приводит к гипертрофии, приемущественно, левого желудочка и межжелудочковой перегородки сердца, которая может проявляться загрудинными болями, синкопальными состояниями, одышкой и прочими симптомами сердечной недостаточности, а в некоторых случаях становится причиной внезапной сердечной смерти. При аутосомно-доминантном типе наследования заболевания вероятность рождения ребенка с этим заболеванием в семье составляет 50%.
К заболеванию семейная гипертрофическая кардиомиопатия могут приводить патогенные генетические варианты в гене CSRP3, располагающемся на хромосоме 11. [Geier С, et al. Hum Mol Genet. 2008 Sep 15;17(18):2753-65] Этот ген кодирует белок мышечный LIM-белок, стимулирующий дифференциацию миоцитов (в т.ч. кардиомиоцитов), поддерживающий их цитоскелет и играющий роль в сокращении мышц.
ПГТ семейной гипертрофической кардиомиопатии проводится для семей, имеющих подтвержденную молекулярно-генетическую природу заболевания. Важно отметить, что обоснование патогенности и каузативности генетических вариантов происходит до проведения ПГТ моногенного заболевания и не входит ни цели и задачи ПГТ моногенного заболевания, ни в комплекс мероприятий по проведению ПГТ моногенного заболевания. Оценку патогенности проводят по международному стандарту - по критериям, описанным в 2015 году Американским Колледжем Медицинской генетики и Геномики (American College of Medical Genetics and Genomics-Association for Molecular Pathology (ACMG-AMP)) в ходе поиска молекулярно-генетической причины заболевания. ПГТ рекомендуется семьям с высоким риском рождения ребенка с тяжелым (неизлечимым) наследственным заболеванием с установленным патогенными вариантом, обуславливающим этот риск. ПГТ позволяет выбрать из всех эмбрионов, полученных при ЭКО (экстракорпоральном оплодотворении), эмбрионы без патогенного варианта и, следовательно, без риска развития заболевания.
Основной проблемой при генетической диагностике эмбрионов является малое исходное количество биоматериала, так как биоптат содержит от одной до трех клеток. В этом случае для повышения эффективности и точности анализа важно как полностью исключить возможность контаминации, так и нивелировать возможный эффект неравномерной и/или неполной амплификации, а также деградации биоматериала. Это требует разработки тест-системы с особыми характеристиками. При этом тест-система разрабатывается с учетом возможности использовать биоматериал разного типа - тотальную дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК), выделенную из разных тканей, продукт полногеномной амплификации (Whole Genome Amplification, WGA), а также единичные клетки. Сочетание универсальности по отношению к биоматериалу с поэтапной амплификацией целевых фрагментов позволяет проводить анализ нескольких патогенных вариантов для одного образца, в том числе на единичных клетках, а также выявить ситуацию неполной амплификации, контаминации или деградации образца. Еще одной особенностью ПГТ является отсутствие информации о биологических особенностях эмбриона: в отличие от взрослого человека, у эмбриона могут быть любые хромосомные аномалии, которые усложняют задачу оценки статуса эмбриона по конкретному генетическому варианту. Поэтому тест-система для ПГТ моногенного заболевания должна давать возможность выявить такие случаи и оценить их влияние на достоверность результата диагностики.
Описания близкого технического решения не обнаружено в общедоступных источниках.
Представленный нами метод ПГТ семейной гипертрофической кардиомиопатии решает задачу разработки более точного способа преимплантационного генетического тестирования этого моногенного заболевания без использования дорогостоящих приборов и реагентов, который можно было бы применять на биоматериале различного типа: ДНК, выделенную из разных тканей, продукт полногеномной амплификации (WGA), единичные клетки.
Техническим результатом стало создание тест-системы для диагностики патогенных вариантов (номер нуклеотида в референсной последовательности геномной ДНК обозначен префиксом NC, номер нуклеотида в референсной последовательности кодирующего транскрипта обозначен префиксом NM): NC_000011.9:g.19209773C>A (NM_003476.5:c.191G>T, p.Arg64Leu) в гене CSRP3 с двойной системой детекции - прямой и косвенной. Данный вариант не упоминался ранее в литературе как причина семейной гипертрофической кардиомиопатии. Однако, так как вызываемая этим вариантом утрата функции кодируемого белка представляет собой вероятный механизм патогенеза семейной гипертрофической кардиомиопатии, не встречается у здоровых людей, присутствует у пациентки с клиническим диагнозом гипертрофической кардиомиопатии, поставленном в молодом возрасте (пациентка из семьи, представленной ниже) - он был расценен как патогенный. Такая система необходима при работе с малым количеством биоматериала, так как нестабильная амплификация может привести к потере информации или сниженной точности анализа. Прямая диагностика подразумевает анализ непосредственно наличия-отсутствия патогенного варианта. В данном случае для генетического варианта NC_000011.9:g.19209773C>A (NM_003476.5:c.191G>T, p.Arg64Leu) типа однонуклеотидный полиморфизм (ОНП, англ. Single nucleotide polymorphism SNP) были подобраны эндонуклеазы рестрикции, которые позволяют произвести детекцию патогенного варианта методом ПЦР-ПДРФ (полиморфизм длин рестриктных фрагментов), основанным на разнице последовательности в сайте рестрикции у различных аллелей. Косвенная диагностика заключается в анализе наследования молекулярно-генетических маркеров, сцепленных с мутацией, т.е. наследуемых вместе с ней. Для этого на расстоянии не более 3 мБ (что соответствует 3% кроссинговера в среднем) от гена CSRP3 в каждую сторону были выбраны полиморфные локусы, называемые STR (short tandem repeat - короткий тандемный повтор), с гетерозиготностью не менее 0,70 для обеспечения максимальной информативности косвенной диагностики. STR представляют собой повторы 2х и более нуклеотидов расположенные друг за другом (например пара аденин-цитозин (АЦ), повторяющаяся несколько раз подряд: АЦАЦАЦАЦ) и в большом количестве присутствуют в геноме человека. Количество повторов в каждом из них может варьироваться от индивидуума к индивидууму, а также может быть разным у одного и того же человека на 2х гомологичных хромосомах. Гетерозиготность выше 0,70 означает, что высока вероятность того, что у одного и того же человека количество повторов нуклеотидов в данном STR на одной хромосоме будет отличаться от количества повторов в этом же STR на гомологичной хромосоме, другими словами, аллели данного маркера у этого человека будут отличаться между собой по длине. При амплификации фрагмента, содержащего такой маркер, будут получены ампликоны двух разных длин. Проанализировав количество повторов в нескольких маркерах, окружающих патогенный вариант, и изучив то, как они наследуются в тестируемой семье, можно установить сцепление между аллелями маркеров и патогенным вариантом. Диагностическая ценность исследования количества повторов в данных маркерах у эмбрионов состоит в том, что по тому, какой аллель каждого из маркеров был унаследован эмбрионом, можно судить о том, унаследовал ли эмбрион ген CSRP3, несущий патогенный вариант, или же он унаследовал ген CSRP3 с другой, гомологичной хромосомы, не содержащий патогенный вариант.Для каждого из этих локусов были подобраны праймеры для амплификации с помощью ПЦР. В тест-систему были включены 12 STR локусов для гена CSRP3: D11S1981, D11S4138, D11S4130, D11S1888, D11S1310, D11S4096, D11S2368, D11S899, D11S928, D11S1755, D11S4190, D11S4114,. Праймеры для амплификации находятся на 11 хромосоме в районе координат 17488442-20630307 (в соответствии с hg19). Важно отметить, что при подборе праймеров соблюдали ряд особенных требований: длина продукта ПЦР не должна превышать 500 п. н. в первом раунде в гнездовой ПЦР и 350 п. н. в простой ПЦР или 2 м раунде гнездовой ПЦР (для наработки с фрагментов, получаемых при полногеномной амплификации), высокая специфичность праймеров, температура отжига не отличается более, чем на 1°С.
Подготовительный этап ПГТ
На подготовительном этапе проводится проводится отработка тест-системы: подбор условий амплификации, оптимальных для работы праймеров, анализ эффективности и специфичности ПЦР-амплификации в обоих раундах, оценки универсальности тест-системы для биообразцов различного типа (ДНК, продукт WGA, единичные клетки). При отработке тест-системы были приготовлены стоковые разведения праймеров с концентрацией 100 mM, и рабочие разведения комбинаций праймеров (комбинация пар праймеров для ПЦР) с концентрацией 10 mM каждого праймера в растворе. Так как в рамках диагностики клинического материала могут быть использованы различные типы матриц, при отработке тест-системы были использованы две биопсии единичных клеток, находящихся в специальном лизирующем буфере (1×PCR Buffer, 0,1% Tween-20, 0,1% Triton X-100, 1 мкг Proteinase K), два образца продуктов полногеномной амплификации биопсиий эмбриона (WGA), а также тотальной ДНК членов семьи, выделенной из крови, для составления родословной и выявления сцепления патогенного варианта с аллелями полиморфных маркеров.
В рамках гнездовой ПЦР для патогенного варианта амплификация проводится в два этапа. На первом этапе проводится ПЦР со всеми внешними праймерами для обогащения образца всеми целевыми фрагментами. На втором этапе проводится индивидуальная амплификация фрагмента с внутренними праймерами.
ПЦР
Были подобраны высокоспецифичные праймеры для амплификации фрагментов 350 п. н, а также были введены метки для детекции методом фрагментного анализа. В состав ПЦР смеси входили 1×PCR буфер с Мд2+ (Евроген, Россия), 0.5xRediLoad™ загрузочный буфер (Thermo Fisher Scientific, USA), 0.2 mM каждого деоксинуклеотида, 0.2 μΜ каждого праймера, 1 U/μΙ ДНК полимеразы HsTaq (Евроген, Россия), 6% диметилсульфоксида (DMSO) и 1 μΙ ПЦР-продукта первого этапа амплификации в качестве матрицы. Второй этап амплификации проводился по следующему протоколу: этап денатурации 95°С в течение 2 минут, 35 циклов: денатурация 95°С 30 секунд, отжиг праймеров - 57°С 30 секунд, синтез матрицы - 72°С 1 минута, этап достройки всех матриц 72°С 5 минут. Оценку эффективности и специфичности амплификации проводили с помощью электрофореза в 2% агарозном геле. Результат электрофореза в агарозном геле позволяет определить необходимую степень разведения продуктов амплификации для нанесения на фрагментный анализ (продукты амплификации ДНК членов семьи). Для детекции патогенного варианта 1 мкл продукта ПЦР был использован в качестве матрицы для 2 го раунда. Состав смеси и условия амплификации во втором раунде были те же.
Фрагментный анализ продуктов амплификации проводили с помощью капиллярного электрофореза на приборе 3130x1 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA). По результатам фрагментного анализа составляется родословная и отмечаются информативные полиморфные STR-локусы для каждой семьи, которые в дальнейшем будут использованы в клинической диагностике. Локусы делятся на неинформативыне (носитель патогенного варианта гомозиготен по этому локусу), полуинформативные (на некоторых и родительских хромосом аллели по этому маркеру совпадают), информативные (на всех хромосомах родителей аллели этого маркера разные, что дает возможность отличить каждую из них при анализе генотипа эмбриона).
Полимеразная цепная реакция - полиморфизм длин рестрикционных
фрагментов (ПЦР-ПДРФ) Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (Restriction fragment length polymorphism, RFLP) - это способ исследования геномной ДНК, путем специфичного расщипления ДНК с помощью эндонуклеаз рестрикции и дальнейшего анализа размеров образующихся фрагментов (рестриктов) путем гель-электрофореза. При использовании данного метода наблюдаются фрагменты различной длины в зависимости от различий в последовательности нуклеотидов в сайте рестрикции, что позволяет детектировать однонуклеотидные варианты, если они располагаются в сайте рестрикции. Более точную детекцию патогенного варианта может обеспечить секвенирование по методу Сэнгера, однако в условиях ПГТ метод ПЦР-ПДРФ оказывается более эффективным из-за сниженной вероятность выпадения аллеля (allele drop out, ADO) и, как следствие, ошибочного результата по оценке статуса эмбриона по патогенному варианту.
Для детекции патогенного варианта NC_000011.9:g.19209773C>A (NM_003476.5:c.191G>T, p.Arg64Leu) была разработана тест-система на основе ПЦР-ПДРФ. Стадия амплификации подробно описана в предыдущем разделе. Были использованы следующие праймеры:
Внешние праймеры:
5'-TGCTATGGGAACGAAATGAACTG -3' (Fout)
5'-CATGGCATTGGGAGTGCAAAG-3' (Rout)
Внутренние праймеры:
5'-GGCAGTAACTCACTGTTGGAACT-3' (fin)
5'-CTTTTCCTGGCAGTGGCCTG-3' (rin)
Далее продукты амплификации с внутренних праймеров для детекции патогенного варианта использовали в реакции рестрикции. Эндонуклеаза HspAI разрезает только аллель дикого типа, эндонуклеаза BstDEI разрезает только мутантный аллель варианта NC_000011.9:g.19209773C>A (NM_003476.5:c.191G>T, p.Arg64Leu). Детекция проводилась с помощью электрофореза в 12% полиакриламидном геле.
Пример 1
Пациенты А
В ЦГРМ Генетико обратилась семья А, в которой родился ребенок с заболеванием семейная гипертрофическая кардиомиопатия с гетерозиготным носительством патогенного варианта NC_000011.9:g.19209773C>A (NM_003476.5:c.191G>T, p.Arg64Leu), в гене CSRP3. Паре было рекомендовано проведение ПГТ заболевания семейная гипертрофическая кардиомиопатия в рамках ЭКО для отбора эмбрионов, не унаследовавших заболевание.
Гаплотипирование семьи
На первом этапе был получен биоматериал (периферическая кровь) членов семьи для детекции патогенного варианта и выявления групп сцепления аллелей полиморфных маркеров. Было проанализировано 12 STR локусов. Из них 8 оказались информативными по матери и/или отцу. Таким образом, образцы эмбрионов тестировались только на информативные маркеры. Полученные результаты по информативным маркерам (аллели, указанные с одной стороны от символа «/», для разных маркеров располагаются на одной хромосоме, то есть составляют группу сцепления): партнер пациентки: D11S4138 - 206/202, D11S4130 - 271/267, D11S1888 - 219/215, D11S1310 - 223/221, D11S4096 - 300/317, CSRP3 -N/N, D11S928 - 277/275, D11S4190 - 204/210, D11S4114 - 223/251; пациентка: D11S4138- 198/188, D11S4130 - 277/269, D11S1888 - 217/226, D11S1310 - 223/221, D11S4096 - 289/257, CSRP3 - N/c.191G>T, D11S928 - 275/279, D11S4190 - 206/204, D11S4114 - 246/223; ребенок без заболевания (не унаследовавший патогенный вариант с. 931С>Т): D11S4138 - 206/198, D11S4130 - 271/277, D11S1888 - 219/217, D11S1310 - 223/223, D11S4096 - 300/289, CSRP3 - N/N, D11S928 - 277/275, D11S4190 - 204/206, D11S4114 - 223/246.
В результате гаплотипирования был сделан вывод, что у пациентки с патогенным вариантом были связаны следующие аллели STR-маркеров: D11S4138- 188, D11S4130 - 269, D11S1888 - 226, D11S1310 - 221, D11S4096 - 257, D11S928-279, D11S4190 - 204, D11S4114 - 223;
Преимплантационное генетическое тестирование
В цикле ЭКО было получено 2 эмбрионов, проведена биопсия на 5 день развития (в клинике ЭКО), биоптат в буфере для WGA (1×PBS (Invitrogen, США), 1% поливинилпирролидона (PVP) (Fertipro, Бельгия)) направлен в лабораторию «Генетико». Для контроля контаминации на разных этапах работы с образцом в лаборатории разработана система контролей: контроль контаминации буфера для биопсии, контроль контаминации при транспортировке (одна пробирка с буфером не открывается эмбриологом), контроль контаминации каждого образца (проба среды из последней отмывочной капли биопсиийного материала). Все эти контроли вместе с образцами проходят этап полногеномной амплификации, после которого будет заметно малейшее количество ДНК, контаминировавшей контроли. Полногеномную амлификацию проводили с помощью коммерческого набора SurePlex (Illumina, США).
Продукт полногеномной амплификации, а также ДНК всех членов семьи амплифицировали на 1 этапе в мультиплексной ПЦР с праймерами для детекции патогенного варианта и праймерами для информативных для семьи А полиморфных маркеров в соответствии с разработанным в рамках подготовительного этапа протоколом для тест-системы. На 2 этапе амплификацию проводили для каждого маркера отдельно в соответствии с разработанным протоколом для тест-системы. Таким образом были установлены группы сцепления, унаследованные каждым эмбрионом. Полученные результаты: эмбрион1: D11S4138-206/188, D11S4130 - 271/269D11S1888 - 219/226, D11S1310 - 223/221D11S4096 - 300/257, CSRP3 - N/c.191G>TD11S928 - 277/279, D11S4190 -204D11S4114-223; эмбрион2: D11S4138 - 202/188, D11S4130 - 267/269, D11S1888 - 215/226, D11S1310 - 221, D11S4096 - 317/257, CSRP3 - N/c.191G>T, D11S928 -275/279, D11S4190-210/204, D11S4114 - 251/223.
По результатам прямой и косвенной диагностики у обоих эмбрионов выявлен гаплотип, соответствующий унаследованному заболеванию, и они не были рекомендованы к переносу.
Перечень последовательностей праймеров:
D11S1981
SEQ ID NO  1: 5’-AATTCCTTTACTCCAGAAAGG-3’ (Fin);
SEQ ID NO : 2 5’-(HEX)-CAGATTTCTGCTTTCCCAGA-3’ (Rin),
D11S4138
SEQ ID NO  3: 5’-GTGCTGACCGCTCCAAGG-3’ (Fin);
SEQ ID NO  4: 5’-(FAM)-CCAAAGGGGTTAATAGGGGTCCA-3’ (Rin),
D11S4130
SEQ ID NO  5 5’-(HEX)-AGCTCTGGAATCTCATCTTC-3’ (Fin);
SEQ ID NO  6: 5’-AGCTCATGTGTGAGTCTGTG-3’ (Rin),
D11S1888
SEQ ID NO  7: 5’-(HEX)-CCCCAGTACCCTGTATAGGC-3’ (Fin);
SEQ ID NO  8 5’-CACTTGTGTGTTTGTATCGAGTCA-3’ (Rin),
D11S1310
SEQ ID NO  9 5’-GGCCTGGGAAACATCC-3’ (Fin);
SEQ ID NO  10: 5’-(FAM)-ACTTCCAGTAGGTAGGGG-3’ (Rin),
D11S4096
SEQ ID NO  11: 5’-(FAM)-TTAGGATTCACGGGCA-3’ (Fin);
SEQ ID NO 12: 5’-AGCTAATACATAGTGTAGCAGGG-3’ (Rin),
D11S2368
SEQ ID NO  13: 5’-AAAAAAGACTATGAAGTGGGTAGG-3’ (Fin);
SEQ ID NO  14: 5’-(FAM)-CTGTTTCTACAGTGCATTGTATACG-3’ (Rin),
D11S899
SEQ ID NO  15: 5’-(FAM)-CAGGAGGCAGACACAAGGAC-3’ (Fin);
SEQ ID NO  16 5’-GAATTGGATTCTCTGGGGAG-3’ (Rin),
D11S928
SEQ ID NO 17: 5’-(HEX)-AAGTGATCCACCTGCCTTG-3’ (Fin);
SEQ ID NO  18 5’-GCCTCTGAGAATTAGTGTCTGTC-3’ (Rin),
D11S1755
SEQ ID NO  19: 5’-AAGAGCCCAGAGTGAAAAT-3’ (Fin);
SEQ ID NO 20: 5’-(FAM)-TCTTTGCATGTACCCCATA-3’ (Rin),
D11S4190
SEQ ID NO  21: 5’-GATAATGGTTTGTGGTTGC-3’ (Fin);
SEQ ID NO  22: 5’-(HEX)-ACTCTCTATGGAACCCCC-3’ (Rin),
D11S4114
SEQ ID NO 23: 5’-GATCCAGTCAACATGCTCAG-3’ (Fin);
SEQ ID NO 24: 5’-(HEX)-ATGGAACTAGGACACTATTTAACCC-3’ (Rin)