Применение штамма Anabaena sp. PCC 7120 для получения наночастиц серебра
APPLICATION OF ANABAENA SP. PCC 7120 STRAIN FOR SILVER NANOPARTICLES PRODUCTION

Изобретение относится к получению серебряных наночастиц с использованием биологического процесса, в частности, изобретение относится к применению цианобактерий, а именно - нитчатой азотфиксирующей цианобактерии Anabaena sp.
В течение последних лет внимание исследователей привлекла возможность получения наночастиц биологическим методом, с использованием бактерий, грибов, растений и водорослей. Этот подход рассматривается как перспективная альтернатива имеющимся химическим методам получения наночастиц металлов. Бактерии и другие микроорганизмы обладают способностью восстанавливать ионы металлов с образованием наночастиц металлов. Процесс получения наночастиц металлов с использованием бактерий является достаточно дешевой, экологически безопасной, удобной для коммерциализации процедурой, в отличие от токсичных химических методов получения наночастиц металлов.
Эти наночастицы могут быть использованы в медицине и в различных других областях нанобиотехнологии. Наибольший интерес вызывают наночастицы серебра и их применение в медицине для борьбы с инфекциями патогенных микроорганизмов в связи с широким распространением форм патогенов, устойчивых к обычно используемым антибиотикам. Предполагается также использовать наночастицы серебра против таких социально значимых заболеваний, как малярия, для уничтожения малярийных комаров.
Известен (RU, патент 2238140, опубл. 2010.2004) способ получения коллоидных растворов серебра в присутствии органического соединения, содержащего гетероатом - кислород или азот, путем электрохимического взаимодействия, причем электрохимическое взаимодействие осуществляют при изменении скорости процесса растворения металла в условиях циклического изменения полярности электродов каждые 10 с при необходимости при постоянном снижении напряженности с 1,8 до 0,2 В, при использовании водного раствора органического соединения с концентрацией 0,1-100 ммоль в литре полученный конечный продукт - коллоидный раствор металла - имеет концентрацию 0,01-4 ммоль в литре и размер частиц 0,1-90 мкм.
Также известен (RU, патент 2456356, опубл. 20.07.2012) способ получения коллоидного раствора наносеребра, включающий электрохимическое растворение серебра в деионизированной воде, причем электрохимическому растворению подвергают серебро в виде мелкодисперсного порошка серебра с химической чистотой 99,999% и с размерами наночастиц до 100 нм и проводят его в электролизере, содержащем корпус, выполненный из химически нейтрального материала, внутри которого расположены электроды, представляющие собой выполненные из химически нейтрального материала емкости, в которые помещают от 100 до 150 г мелкодисперсного порошка серебра и посредством проводника, находящегося в химически нейтральной оболочке, подают постоянное напряжение от 30 до 45 В посредством источника питания постоянного тока, в условиях циклического изменения полярности напряжения каждые 2 ч, и механического перемешивания раствора 2 раза в сутки, до достижения в коллоидном растворе концентрации серебра от 5,0 до 100,0 мг/л, при этом доля наночастиц металлического серебра составляет от 5 до 90% от общей концентрации серебра в растворе, доля наночастиц размером от 2 до 15 нм составляет от 65 до 85% от общего объема наночастиц металлического серебра в растворе, доля наночастиц размером от 15 до 35 нм составляет соответственно от 15 до 35%, оставшуюся долю в общей концентрации серебра в растворе составляют ионы серебра.
Недостатком указанных способов следует признать их технологическую сложность.
Наиболее близким аналогом разработанного способа можно признать (RU, патент 2460797, опубл. 10.09.2012) способ получения композиции, содержащей коллоидное наносеребро. При реализации известного способа проводят стадию инкубирования пробиотических бактерий, выбранных из видов Lactobacillus fermentum, с водным раствором, содержащим, по меньшей мере, 4 мМ нитрата серебра.
Недостатком известного способа следует признать использование в процессе получения наносеребра лактобактерий, а не цианобактерий, которые имеют целый ряд преимуществ по сравнению с лактобактериями для биосинтеза наночастиц серебра.
Цианобактерии - прокариотические организмы, которые являются модельными организмами для изучения фотосинтеза, фиксации атмосферного азота, клеточного деления, получения молекулярного водорода и решения других фундаментальных и прикладных задач. Они обладают следующими преимуществами:
1) легкостью их культивирования. Для роста цианобактериям нужны лишь свет, вода и простые минеральные соли. В плане выращивания - это самые экономически выгодные микроорганизмы. Они могут культивироваться в простых биореакторах, в открытых водоемах естественного и искусственного происхождения.
В отличие от гетеротрофных бактерий, к которым относятся и лактобактерии, цианобактериям для роста не нужны богатые органикой дорогостоящие среды. Они сами синтезируют органические соединения на основе биоконверсии солнечной энергии, используя для этого воду и минеральные соли.
2) цианобактерии обладают более высокой по сравнению с высшими растениями скоростью роста. Кроме того, можно получать синхронизированные культуры цианобактерий, что может привести к увеличению их производительности в процессе получения целевого продукта.
3) разработан целый арсенал разнообразных методов молекулярной генетики и микробиологии для различных штаммов цианобактерий. Эти методы позволяют глубже понять роль цианобактерий в различных экосистемах; использовать их потенциал в разнообразных прикладных проектах, таких как получение молекулярного водорода; продукция фикобилипротеинов и цианофицина; формирование наночастиц; удаление из окружающей среды тяжелых металлов; использование биодеградирующих способностей цианобактерий; изучение проблем образования цианобактериальных токсинов в пресных водоемах и морских акваториях; применение природных продуктов, получаемых из цианобактерий, в медицине и в пищевой индустрии.
4) в настоящее время доступна информация о нескольких десятках геномных последовательностей различных цианобактерий, что в сочетании с транскриптомикой, протеомикой и метагеномикой позволяет глубже понять ключевые аспекты биологии этих удивительных организмов и использовать их еще более эффективно при решении задач экологии и биотехнологии.
Техническая задача, решаемая посредством разработанного способа, состоит в расширении ассортимента методов получения наночастиц серебра.
Технический результат, получаемый при реализации разработанного способа, состоит в получении раствора наночастиц серебра, в котором наночастицы существуют в свободном состоянии.
Для достижения указанного технического результата предложено использовать разработанный способ. Согласно разработанному способу проводят инкубирование штамма Anabaena sp. РСС 7120 при постоянном освещении в безазотистой среде с нитратом серебра.
2
2
4
4
2
2
2
3
2
2
3
3
3
2
2
4
2
2
4
2
4
2
3
2
2
3
-2
-1
Как было экспериментально установлено, наиболее перспективным штаммом для получения наночастиц серебра оказался штамм Anabaena sp. РСС 7120. Этот штамм достаточно известен и широко используется (http://www.rfbr.ru/rffi/ru/proiect_search/o_285291). При проведении экспериментов по биологическому восстановлению серебра с получением наночастиц клетки этого штамма выращивали на безазотистой среде BG11/0 (на 1 л дистиллированной воды): NaEDTA - 0.001 г, KHPO - 0.04 г, MgSO⋅7HO - 0.075 г, CaCl⋅2HO - 0.036 г, лимонная кислота - 0.006 г, FeCl⋅6HO - 0.003 г, NaCO - 0.02 г. Раствор микроэлементов (на 1 л дистиллированной воды): HBO - 2.86 г, MnCl⋅4HO - 1.81 г, ZnSO⋅7HO - 0.222 г, NaMoO⋅2HO - 0.39 г, CuSO⋅5HO - 0.079 г, Co(NO)⋅6HO - 0.0444 г. Использовали также среду с добавлением 1.5 г/л NaNO (BG11/N). Культуры росли в 250 мл колбах стационарно при 25°C при постоянном освещении (18 μEms). Для поддержания штамма использовали ту же среду с 1,5% агар-агара.
3
Для получения наночастиц серебра жидкие культуры в стационарной фазе роста разводили в 2 раза свежей средой и подращивали в течение 3 дней. AgNO добавляли в среду в концентрации 10 мкг/мл. Полученные образцы растили в пенициллиновых флаконах объемом 20 мл (по 4 мл культуры) при комнатной температуре без качания в аэробных условиях роста в течение от 1 суток до 4 недель.
Первоначально оценку образования наночастиц проводили визуально, по изменению цвета культуральной жидкости. После этого измеряли спектры поглощения суспензий клеток с образованными наночастицами серебра и без них на спектрофотометре «Shimadzu» (Япония).
Спектры поглощения суспензии клеток с серебряными наночастицами и без них снимали в 1 мм кювете при комнатной температуре на спектрофотометре «Shimadzu». Оптические изображения клеток получали с использованием микроскопа «Leica» (Германия) с масляно-иммерсионным объективом 100х N.A. 1.4, в неполяризованном и поляризованном свете. Электронную микроскопию клеток проводили с использованием растрового электронного микроскопа высокого разрешения «JSM-7001F (JEOL)» (Франция).
Использование разработанного способа позволяет получить наночастицы серебра различных формы и размеров, в зависимости от вида биопродуцента и времени культивирования. Концентрация до 20 мкг/мл по соли азотнокислого серебра. Форма НЧС варьирует от сферической до иглообразной. Линейные размеры варьируют от 5 до 50 нм.
Важным свойством культуры биопродуцента является коэффициент конверсии серебра, находящегося в ионной форме в растворе, в восстановленное серебро наночастицы. Средняя величина коэффициента конверсии для Anabaena sp. РСС 7120 составляет 0,85 (т.е. 85% серебра переходит в форму НЧС), вариабельность в пределах 0,1. Т.е. значение коэффициента конверсии следует принять как 0,85(+/-0,1), что отражает разброс значений от 0,75 до 0,95.
Культуральную среду, содержащую наночастицы серебра с бактериями, подвергают ультразвуковому диспергированию в течение 30 мин при температуре от 60°C в ультразвуковой ванне «Сапфир» 4 л, при мощности 150 Вт. Полученную суспензию центрифугируют при 14000 оборотах в минуту в течение 7 минут, наночастицы серебра оседают, супернатант удаляют, объем удаленного супернатанта заменяют на такой же объем деионизированной воды, проводят ультразвуковое диспергирование в течение 2 мин, повторное центрифугирование 14000 оборотов в минуту в течение 7 минут, супернатант сливается. Процедура отмывки наночастиц серебра водой повторяют пятикратно. Наночастицы серебра могут быть получены в виде порошка после просушки или в виде коллоидного раствора.