Штамм A/goose/Kalmykia/813/16 H5N8 вируса гриппа птиц Influenza virus avicum типа А подтипа H5 для контроля антигенной и иммуногенной активности вакцин против гриппа птиц и для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики гриппа птиц типа А подтипа Н5
STRAIN A/GOOSE/KALMYKIA/813/16 H5N8 VIRUS AVICUM BIRD INFLUENZA VIRUS AVICUM INFLUENZA TYPE A AND SUBSTITUTE H5 FOR CONTROL OF ANTIGEN AND IMMUNIZING ACTIVITY OF VACCINE AGAINST AVIAN INFLUENZA AND FOR THE MANUFACTURE OF BIOPREPARATIONS FOR DIAGNOSTICS AND SPECIFIC PREVENTION OF INFLUENZA BIRDS OF TYPE A OF SUBSTITUTE H5

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, в частности к новому штамму Influenzae virus avicum, и может быть использовано для контроля антигенной и иммуногенной активности вакцин против гриппа птиц типа А подтипа Н5, а также при разработке и изготовлении средств диагностики и специфической профилактики гриппа птиц подтипа Н5.
Грипп птиц - болезнь домашних и диких птиц разных видов, способная протекать в форме эпизоотий и вызывать смертность инфицированной птицы, приближающуюся к 100%, нанося большой экономический ущерб.
Таксономически вирусы гриппа отнесены к семейству ортомиксовирусов (Orthomyxoviridae, по классификации ICTV - 00.046).
В рамках семейства Orthomyxoviridae (по классификации ICTV - 00.046) вирусы типов А и В образуют род Genus Influenzavirus А (по классификации ICTV - 00.046.0.01, по классификации NCBI соответственно ID: 197911 и ID: 197912).
Вирусы типа С образуют род Genus Influenzavirus С (по классификации ICTV - 00.046.02.001, по классификации NCBI ID: 197913).
Принадлежность штамма вируса гриппа к одному из этих родов определяется консервативными элементами генома, задающими антигенные характеристики нуклеокапсидов.
Вирионы вируса гриппа имеют наружную липопротеиновую оболочку, чаще сферической формы. Диаметр сферических форм около 100 нм. Встречаются нитевидные формы вирионов до 200-350 нм. Вирусные частицы содержат РНК - 1%, белки - 70%, жиры - 20%, углеводы - до 8%.
Три вирусных белка пронизывают липидный слой и образуют внешнюю поверхность вириона. Два из них - вирусные гликопротеины гемагглютинин (НА) и нейраминидаза (NA). Из 550-600 структурных элементов поверхности («шипов») на долю NA приходится 50-100. Функция НА состоит в прикреплении вируса к поверхности клетки и он же производит слияние вирусной оболочки с клеточной мембраной, что и позволяет вирусному генетическому материалу проникнуть в клетку и инфицировать ее. NA - это фермент, который отщепляет сиаловую (нейраминовую) кислоту, концевой сахарный остаток олигосахаридов, присутствующих в гликопротеинах и гликолипидах клеток млекопитающих и птиц. Сиаловая кислота является рецептором для НА вирусов гриппа А и В и ее устранение необходимо для предотвращения склеивания вирусных частиц друг с другом и для успешного распространения вируса от клетки к клетке. Именно против НА и NA направлен антивирусный иммунитет.
Помимо НА и NA на мембране вириона экспонированы тетрамеры белка М2, эктодомены которых, будучи намного мельче эктодоменов НА, тем не менее служат поверхностными антигенами, антитела к которым усиливают иммунитет к гриппу. Молекулы М2 функционируют в качестве протонных каналов, необходимых для запуска функции слияния вирусной и эндосомной мембран. Эти каналы служат мишенями таких противовирусных химиопрепаратов, как ремантадин и амантадин.
Внутренний листок оболочки вируса образован белком Ml, наиболее обильно представленным в вирусной частице (до 3 тыс. молекул на вирион). Внутренняя структура вирусной частицы - нуклеокапсид у вирусов гриппа представлена рибонуклеопротидными тяжами, содержащими вирусную РНК и 4 вирусных белка. Главный из них - белок NP предоставлен в количестве около 1 тыс. молекул на вирион. Остальные три белка - РВ1, РВ-2 и Ра - являются компонентами вирусной РНК - зависимой РНК-полимеразы.
Геном вируса гриппа представлен однонитевой РНК в виде 8 нитей (сегментов) в комплексе с белком нуклеопротеина (NP). Поскольку генетический материал вируса гриппа сегментирован, т.е. представлен отдельными блоками, которые реплицируются в клетке независимо один от другого, вирусы гриппа, принадлежащие к одному роду, легко могут скрещиваться, образуя вирусы - реассортанты. Геном вируса гриппа представлен однонитевой РНК негативной полярности («минус» -РНК), комплементарной по отношению к мРНК для вирусных белков.
Общий размер генома составляет около 13600 нуклеотидов (н.о.).
Фрагмент №1 (около 2341 н.о.) кодирует РВ2 (polymerase basic unite 2) - вторую субъединицу гетеротримерного РНК-полимеразного вирусного комплекса (основный белок 2), изоэлектрическая точка (pI) которого находится в щелочной области.
Фрагмент №2 (2341 н.о.) кодирует другой компонент того же комплекса - основной белок РВ1 (polymerase basic unite 1).
Фрагмент №3 (около 2250 н.о.) кодирует кислый белок РНК-полимеразного комплекса PA (polymerase acidic unite).
Комплекс РВ1-РВ2-РА осуществляет как транскрипцию, так и репликацию генов вируса. При этом РВ1 работает как «классическая» полимераза, обеспечивающая полимеризацию в сочетании с эндонуклеазным вырезанием; РВ2 специфически связывается с кэпом - 7-метил-гуанозиновым остатком на 5' - на конце плюс-РНК, пришитым к ней посредством 5' -5' - трифосфатного сегмента; РА задействована в репликации, элонгации и эндонуклеазной активности.
В 5' и 3'-концевых участках всех генов находятся повторяющиеся 13- и 12-нуклеотидные сегменты промоторов - специфических сайтов связывания
РВ 1. Повторы 5'- концевого участка (у вирусов типа А они имеют вид 5'- GUAGAAACAAGG) комплементарны инвертированным повторам,
расположенным на 3' - конце. Кроме того, 3' - концевые области некоторых фрагментов генома содержат консервативные отрезки, типичные для вирусных штаммов, поражающих субъектов определенного биологического вида.
Фрагмент №4 кодирует гемагглютинин (НА). Размеры 4 сегмента у вирусов гриппа сильно варьируют (1742-1778 н.о.). Молекула НА синтезируется как единая полипептидная цепь, которая в дальнейшем подвергается процессингу (глюкозилирование, сульфатирование, ацилирование), отщепление сигнального пептида и протеолитическое расщепление на 2 субъединицы (большую и малую). Субъединицы в зрелой молекуле НА связаны дисульфидной связью, при этом расщепление необходимо для слияния вирусной оболочки с клеточной мембраной, участок расщепления представлен либо одним остатком аргинина, либо цепочкой основных аминокислотных остатков (аргинина и лизина).
Фрагмент №5 (ген NP, около 1575 н.о.) кодирует нуклеопротеин (NP). NP не имеет кластеров основных аминокислот, но многие его регионы способны связываться с РНК. В составе нуклеокапсида вируса гриппа А каждая молекула белка NP связана с 24 нуклеотидами.
Фрагмент №6 (около 1420 н.о.) кодирует нейраминидазу (NA). Белок гликозилирован, но не подвергается протеолитическому расщеплению. В зрелом виде белок NA представлен грибообразным тетрамером, содержащим две пары молекул. В каждой паре молекулы соединены дисульфидным мостиком. В дистальной части тетрамера расположен активный центр нейраминидазы. Белок NA является гликопротеидом 2 типа. У него нет отщепляемого сигнального пептида, а Т-концевой участок играет роль якорного трансмембранного участка.
Фрагмент №7 (ген MP, около 1027 н.о.) кодирует нуклеокапсидный матриксный белок M1 и мембранный матриксный белок М2. Белок M1 кодируется полноразмерной колинеарной МРНК, комплементарной всей кодирующей части 7-го сегмента. Матричная РНК для белка М2 получается в результате сплайсинга. Белок M1 имеет несколько гидрофобных участков, в вирионе он образует внутренний листок оболочки. Белок М2 образует тетрамер, в котором центральная трансмембранная часть формирует канал, служащий для транспорта ионов водорода внутрь вирусной частицы, что является необходимым условием для отделения нуклеокапсида от белка M1 при проникновении вирусного генома в клетку.
Фрагмент №8 (ген NS, 890 н.о.), кодирует белки NS1 и NS2. Белок NS1 образуется в результате трансляции полноразмерной МРНК, не подвергнутой сплайсингу. Белок NS1 необходим вирусу для противодействия антивироснуму эффекту интерферона и других интерлейкинов. Те молекулы МРНК, которые подвергаются сплайсингу, транслируются с образованием белка NS2, функция которого состоит в экспорте новосинтезированных нуклеокапсидов из клеточного ядра в цитоплазму. Некоторое время белок NS2 считали неструктурным белком, но позднее его обнаружили в составе вирионов. Неструктурный белок NS1 регулирует сплайсинг и трансляцию РНК, а также модулирует синтез интерферона клеткой в ответ на заражение вирусом (1).
Инфекционный цикл начинается с контакта вирусной частицы с клеточной поверхностью. При этом рецепторсвязывающий карман НА связывает концевой остаток сиаловой кислоты в клеточном олигосахариде. В контакте участвуют одновременно несколько тримеров НА. Вирусная частица, находящаяся на стенке эндосомы, подвергается воздействию кислой реакции среды, что приводит к структурной перестройке НА. Участки длинной альфа-спирали в составе малой субъединицы НА перестраиваются таким образом, что гидрофобный N-концевой пептид («пептид слияния») оказывается в непосредственном контакте с липидным слоем клеточной мембраны. Происходит слияние липидных слоев и нуклеокапсид выходит в цитоплазму. За время пребывания в эндосоме внутренняя среда вириона делается все более и более кислой благодаря перекачке ионов водорода из эндосомы в вирион, осуществляемой через канал тетрамера М2. Закисление среды вызывает диссоциацию связи нуклеокапсида с белком M1 и позволяет нуклеокапсиду не только перейти в цитоплазму, но и транспортироваться в ядро клетки. Каждый сегмент вирусной РНК оказывается в клеточном ядре в составе рибонуклеопротеидного тяжа, в котором вирусная РНК ассоциирована с белком NP. Каждый рибонуклопротеидный тяж содержит по меньшей мере один тример РВ1-РВ2-РА, присоединенный к двум концам вирусной РНК. Прежде чем начать транскрипцию вирусной РНК, этот тримерный полимеразный комплекс связывает, а затем отщепляет 5'-концевой участок клеточной пре-мРНК длиной 10-13 н.о., содержащий на 5'-конце «кэп», т.е. метилированный остаток гуанозина, присоединенный пирофосфатной связью. При этом распознавание и связывание «кэпа» осуществляет белок РВ2, а эндорибонуклеазное отщепление на расстоянии 10-13 н.о. от «кэпа» выполняет белок РА. Отщепленные кэпсодержащие отрезки используются в качестве праймеров для вирусной транскрипции.
При этом собственно функцию праймера выполняет только 3'-концевой аденозиловый остаток вирусного РНК-сегмента. Инициация транскрипции осуществляется посредством включения гуанозилового остатка, комплементарного предпоследнему цитозиловому остатку РНК-сегмента, в растущую цепь вирусной мРНК. Таким образом, в составе мРНК оказывается 10-13-нуклеотидный кэпированный праймер клеточного происхождения, за которым следует вирусоспецифическая последовательность, комплементарная вирусному геномному сегменту (начиная с предпоследнего нуклеотида на его 3'-конце). Далее происходит элонгация цепи мРНК. Как инициацию транскрипции, так и элонгацию осуществляет белок РВ1. Продвигаясь по нити геномной РНК от ее 3'-конца к 5'-концу, полимеразный комплекс постоянно сохраняет связь с 5'-концом геномного РНК-сегмента, постепенно уменьшая петлю, образованную еще нетранскрибированным участком. В каждом геномном РНК-сегменте имеется короткий (6-8 н.о.) олигоуридиловый участок на расстоянии 16 н.о. от 5'-конца. Полимераза, дойдя до этого места, не может продвинуться дальше, поскольку последний отрезок вРНК (5'-концевый 16 н.о.) находится в связи с самим полимеразным комплексом и для транскрипции механически недоступен. Поэтому полимераза останавливается и повторно транскрибирует несколько раз олигоуридиловый участок, синтезируя полиадениловую последовательность на 3'- конце мРНК. Таким образом, в составе любой молекулы вирусной мРНК присутствует на 5'-конце 10-13 - нуклеотидный участок клеточного происхождения, но отсутствует на 3'-конце участок, комплементарный 5'-концевому 16-нуклеотидному отрезку вРНК. Вирусоспецифические мРНК транспортируются из ядра в цитоплазму. Некоторые мРНК, транскрибированные с генов М и NS, предварительно подвергаются сплайсингу. В цитоплазме мРНК транслируются с образованием вирусных белков. Белки NP, РВ2, РВ1, PA, NS1, NS2 и частично M1 транспортируются в ядро. После достижения в ядре определенной концетрации белка NP вирусный полимеразный комплекс приобретает способность синтезировать полные комплементарные копии вирусных РНК-сегментов, не содержащие клеточных праймерных последовательностей, но имеющие участок, комплементарный последним 16 нуклеотидам вирусного РНК-сегмента. Такие полные комплементарные транскрипты (кРНК) сразу после синтеза вступают в ассоциацию с белком NP. Они в отличие от мРНК не транспортируются в цитоплазму, а остаются в ядре и используются вирусной РНК-полимеразной в качестве матриц для синтеза новых геномных РНК, т.е. для репликации вирусного генома. Новые геномные РНК, в свою очередь, подвергаются транскрипции с образованием основной массы вирусных мРНК. На поздней стадии инфекции новые нуклеокапсиды, содержащие вРНк, выходят в цитоплазму. В этом процессе принимают участие белки M1 и NS2 в ассоциации с клеточными белками, осуществляющими экспорт клеточных макромолекул в цитоплазму через ядерные поры.
Белки НА и NA синтезируются рибосомами, которые связаны с грубым цитоплазматическим ретикулумом. Эти белки сразу после синтеза попадают в просвет внутриклеточных везикул и транспортируются к поверхности клетки, подвергаясь при этом гликозилированию и фолдингу. Белки M1 (те молекулы, которые не попадают в ядро) и М2 синтезируются на свободных рибосомах, но тоже после синтеза связываются с внутриклеточными мембранами и транспортируются к поверхности клетки. На поздней стадии инфекции значительная часть клеточной поверхности занята вирусоспецифическими «пятнами», в которых наружный слой образован трансмембранными вирусными белками, а внутренний - белком M1. Клеточные белки из этих участков полностью вытеснены. Новосинтезированные вирусные рибонуклеопротеиды транспортируются к этим «пятнам» и здесь происходит «почкование» новых вирусных частиц. Подбор вирусных РНК - сегментов в состав вириона является высокоупорядоченным процессом, в ходе которого в каждую вирусную частицу попадает по одной копии геномного сегмента. Взаимное распознавание геномных сегментов в ходе этого процесса осуществляется с участием длинных 3'- и 5'- концевых участков вРНК, захватывающих обширные области кодирующей последовательности РНК-сегментов (1).
6
3
20w
Общая молекулярная масса вириона составляет 250×10, плотность 1,19 г/см, коэффициент седиментации сфероподобных частиц 700-800 S. Вирионы чувствительны к воздействию растворителей жиров, неионных детергентов, формальдегида, окислителей, бета-пропиолактона, производных азиридина, быстро инактивируется при нагревании, (56°С), ультрафиолетовом облучении и при снижении pH ниже 5,0 (ICTV - International Committee on Taxonomy of Viruses).
В настоящее время вирусы гриппа птиц (ВГП) разделяют на 16 подтипов по гемагглютинину (H1-H16) и 9 подтипов по нейраменидазе (N1-N9). Также признано существование новых подтипов вируса гриппа типа А - H17N10 и H18N11, выделенных от рукокрылых в Гватемале (2).
Вирусы гриппа обладают огромной экологической пластичностью за счет высоких темпов эволюции, связанных с изменчивостью их генома. Основным резервуаром вирусов гриппа птиц в природе являются дикие птицы и их взаимоотношение существенно не отражается на состоянии популяции хозяев. Но занос вируса в неадаптированные популяции сельскохозяйственных птиц приводит к тяжелым эпизоотиям с колоссальным экономическим ущербом. Прежде всего это относится к вирусу гриппа птиц подтипов Н5, Н7 и Н9.
Вирус высокопатогенного гриппа H5N8 (генетическая клада 2.3.4.4.) нанес колоссальный экономический ущерб птицеводческой отрасли многих стран в 2016-2017 гг. Вирусы гриппа A (H5N8) быстро распространяются через диких мигрирующих птиц в Азии и Европе и вызывают гибель как домашних, так и диких птиц (3). Вовлечение промышленных птицеводческих предприятий закрытого типа в эпизоотию высокопатогенного гриппа птиц ведет к огромным экономическим потерям, связанным с необходимостью уничтожения всего восприимчивого поголовья и с утилизацией птицеводческой продукции. Возникновение заболевания среди ценной племенной птицы может повлечь резкое сокращение генофонда, потерю кросса. По данным Всемирной организации здравоохранения животных (OIE), наибольшее количество вспышек среди диких и домашних птиц, вызванных вирусом H5N8, зарегистрировано в Венгрии, Германии и Франции. Вспышки гриппа птиц подтипа H5N8 в конце 2016 г. зарегистрированы и на территории Российской Федерации в Р. Калмыкия, Астраханской, Ростовской, Воронежской, Московской областях, Краснодарском крае. В эпизоотию вовлечены крупные птицеводческие предприятия Ростовской, Астраханской и Московской областей (4).
Известен ряд отечественных и зарубежных штаммов вируса ГП, используемых для изготовления диагностических и вакцинных препаратов (6-13).
Известен штамм №125-ДЕП «Новосибирский» для контроля иммуногенной и антигенной активности вакцин и изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики гриппа птиц (5).
Известен штамм А / duck / Hokkaido / Vac-3/2007 (H5N1) вируса ГП, используемый для изготовления вакцины (6).
Известен штамм A/Chicken/Mexico/232/94/CPA (H5N2), используемый для производства вакцинных препаратов (7).
Известен штамм А/Turkey/Wisconsin/68 (H5N9), используемый для производства вакцинных препаратов (8).
Известен штамм A/chicken/Italy/22A/98 (H5N9), используемый для производства вакцинных и диагностических препаратов (9).
Известен штамм A/CK/Italy/22A/H5N9/1998, используемый для производства вакцинных препаратов (10).
Известен штамм A /turkey/Ontario/7732/66 (H5N9) вируса ГП, используемый для изготовления диагностических и вакцинных препаратов (11).
Известен штамм A /chicken /Queretaro/14588-19/95 (H5N2) вируса ГП, используемый для изготовления диагностических и вакцинных препаратов (12).
Известен штамм A /mallard/Ohio/556/87 (H5N9) вируса ГП, используемый для изготовления диагностических и вакцинных препаратов (12).
Известен штамм А /chicken/Mexico/31381-7/94 (H5N2) вируса ГП, используемый для изготовления диагностических и вакцинных препаратов (12).
Известен штамм A /chicken/Mexico/26654-1374/94 (H5N2) вируса ГП, используемый для изготовления диагностических и вакцинных препаратов (12).
Известен штамм A /turkey/Minnesota/10734-5/95 (H5N2) вируса ГП, используемый для изготовления диагностических и вакцинных препаратов (13).
Известен штамм A /chicken/Jalisco/14589-660/94 (H5N2) вируса ГП, используемый для изготовления диагностических и вакцинных препаратов (12).
Известен штамм A /chicken/Veracruz/28159-398/95 (H5N2) вируса ГП, используемый для изготовления диагностических и вакцинных препаратов (12).
Известен штамм A /chicken/Puebla/28159-474/95 (H5N2) вируса ГП, используемый для изготовления диагностических и вакцинных препаратов (12).
Известен штамм A /chicken/Chiapas/28159-488/95 (H5N2) вируса ГП, используемый для изготовления диагностических и вакцинных препаратов (12).
Известен штамм A /turkey/Minnesota/3689-1551/81 (H5N2) вируса ГП, используемый для изготовления диагностических и вакцинных препаратов (13).
Известен штамм A /duck/Singapore/F119/97 (H5N3) вируса ГП, используемый для изготовления диагностических и вакцинных препаратов (13).
Известен штамм A /Hong Kong/156/97 (H5N1) вируса ГП, используемый для изготовления диагностических и вакцинных препаратов (13).
Известен штамм A /Hong Kong/483/97 (H5N1) вируса ГП, используемый для изготовления диагностических и вакцинных препаратов (13).
Известен штамм A /duck/Potsdam/1402/86 (H5N2) вируса ГП, используемый для изготовления диагностических и вакцинных препаратов (13).
Техническая проблема, на решение которой направлено настоящее изобретение, заключается в расширении арсенала штаммов вируса гриппа птиц типа А подтипа Н5, обладающих высокой инфекционной, антигенной и иммуногенной активностью, сохраняющих иммуногенные свойства после инактивации, обеспечивая тем самым получение чувствительных и высокоспецифичных диагностикумов и вакцинных препаратов, создающих эффективную защиту домашней птицы против гомологичного вируса.
Указанная проблема решена получением штамма A/goose/Kalmykia/813/16 H5N8 вируса гриппа типа А подтипа Н5, используемого для контроля иммуногенной и антигенной активности вакцин и изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ГП подтипа Н5.
Вирусный изолят, послуживший источником для получения штамма A/goose/Kalmykia/813/16 H5N8, был выделен в ФГБУ «ВНИИЗЖ» в ноябре 2016 г. из проб, поступивших их личного подворного хозяйства с. Октябрьское Яшалтинского р-на Р. Калмыкия. Вследствие вирусвыделения из гомогената внутренних органов от домашнего гуся (Anser anser) был получен штамм вируса гриппа птиц A/goose/Kalmykia/813/16 H5N8.
Штамм прошел 3 пассажа в 10-суточных эмбрионах СПФ-кур. Способен вызывать гибель эмбрионов кур в течение 24-48 ч инкубации.
Подтип H5N8 идентифицирован методами ПЦР, нуклеотидного секвенирования, РТГА (реакция торможения гемагглютинации) и РТНА (реакция торможения нейраминидазной активности).
При проведении сравнительного анализа нуклеотидной последовательности фрагмента гена Н длиной 258 н.о. было установлено, что исследуемый изолят принадлежит к азиатской генетической линии вируса высокопатогенного гриппа птиц (линия A/Gs/Guangdong/96, клада 2.3.4.4).
По фрагменту гена Н наиболее генетически близкими оказались последовательности вирусов гриппа А птиц подтипа Н5, выделенные в Р. Тыва в 2016 г. (98,8-99,2% совпадений), а также последовательности вирусов гриппа А птиц подтипов H5N2, H5N6 и H5N8, выделенные на территории стран Юго-Восточной Азии в 2013-2014 гг. (98-99% совпадений).
Сайт расщепления гемагглютинина содержит основные аминокислоты и имеет структуру REКRRKR (Arg Glu Lys Arg Arg Lys Arg), что позволяет охарактеризовать вирус как потенциально высоковирулентный для птиц.
Штамм A/goose/Kalmykia/813/16 H5N8 вируса ГП типа А, подтипа H5N8, депонирован 24 апреля 2017 г. в Коллекцию штаммов микроорганизмов ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» под регистрационным номером Штамм ВГП A/goose/Kalmykia/813/16 H5N8 (диагностический).
Экспериментально подтверждена возможность использования штамма A/goose/Kalmykia/813/16 H5N8 для контроля иммуногенной и антигенной активности вакцин и для приготовления биопрепаратов для специфической профилактики и диагностики ГП.
Сущность изобретения пояснена на графическом изображении. Представлена дендрограмма, отражающая филогенетические взаимоотношения штамма вируса A/goose/Kalmykia/813/16 H5N8 с эпизоотическими и вакцинными штаммами вируса гриппа птиц типа А подтипа Н5. Дендрограмма основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностей участка гена гемагглютинина.
Показано, что исследуемый штамм высокопатогенного гриппа (ВГП) A/goose/Kalmykia/813/16 H5N8 принадлежит к обширной линии штаммов A/goose/Guangdong/96 клада 2.3.4.4, впервые выявленных на территории Юго-Восточной Азии в 1996 г.
Сущность изобретения пояснена следующим перечнем последовательностей:
SEQ ID №1: представляет последовательность нуклеотидов фрагмента гена гемагглютинина штамма A/goose/Kalmykia/813/16 H5N8 вируса ГП типа А;
SEQ ID №2: представляет последовательность аминокислот фрагмента гемагглютинина штамма A/goose/Kalmykia/813/16 H5N8 вируса ГП типа А.
Исследования основывались на определении первичной структуры фрагмента гена Н испытуемого образца штамма ВГП A/goose/Kalmykia/813/16 H5N8 с последующим анализом филогенетического родства с другими штаммами и изолятами ВГП подтипа H5N8. В результате секвенирования была определена нуклеотидная (258 н.о.) и аминокислотная (86 а.о.) последовательности фрагмента гена Н штамма ВГП A/goose/Kalmykia/813/16 H5N8. Сайт расщепления гемагглютинина штамма ВГП A/goose/Kalmykia/813/16 H5N8 содержит основные аминокислоты и имеет структуру REКRRKR, что позволяет охарактеризовать вирус как потенциально высоковирулентный.
Штамм A/goose/Kalmykia/813/16 H5N8 вируса ГП характеризуется следующими признаками и свойствами.
Морфологическая характеристика
Штамм A/goose/Kalmykia/813/16 H5N8 вируса ГП относится к семейству Orthomyxoviridae, серотипу А, подтипу H5N8 и обладает морфологическими признаками, характерными для вируса гриппа типа А.
Вирионы вируса гриппа - оболочечные, плеоморфные. Диаметр сфероподобных частиц около 100 нм; нитевидные частицы около 17 нм в диаметре, длиной 250 нм и более. На поверхности вириона находятся шипообразные выступы (до 14 нм), образованные гомотримерами НА. В промежутках между кластерами НА у вирусов типа А размещаются молекулы NA.
Липидная мембрана окружает петлеобразные филаменты нуклеокапсидов с восемью фрагментами вирусного генома, каждый из которых представлен линейной одноцепочечной антисмысловой РНК.
Общая длина генома составляет около 13600 нуклеотидов (нт). Наиболее крупный фрагмент (№1) содержит около 2350 н.о.; №2 - чуть менее 2350 н.о.; №3, как правило, - 2250 н.о.; №4 - 1780 н.о.; №5 - 1575 н.о.; №6 - 1420 н.о.; №7 - 1050 н.о.; №8 - 900 н.о.
На обоих концах каждой геномной цепи РНК содержатся
повторяющиеся отрезки, причем повторы 5'- концевого участка (у вирусов типа А они имеют вид 5'-AGUAGAAACAAGG) комплементарны инвертированным повторам, расположенным на 3' - конце. Кроме того, 3' - концевые участки некоторых фрагментов генома содержат консервативные отрезки, типичные для вирусных штаммов, поражающих субъектов определенного биологического вида [ICTV-International Committee on Taxonomy of Viruses].
Антигенные свойства
По своим антигенным свойствам штамм A/goose/Kalmykia/813/16 H5N8 вируса ГП относится к семейству Orthomyxoviridae, роду Influenzavirus, виду Avian influenza virus, типу А, подтипу H5N8.
Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Гемагглютинирующая активность штамма составляет 1:32 и подавляется специфической сывороткой к ВГП подтипа H5N1 (ФГБУ «ВНИИЗЖ»).
Нейраминидазная активность штамма подавляется специфической сывороткой к ВГП подтипа H4N8 («IZSVe», Италия).
Биотехнологические свойства
3
2
Инактивированный вирус индуцирует антитела, выявляемые методами РТГА и ИФА. Так, через 14 дней  и 21 день после однократной иммунизации цыплят инактивированной вакциной из штамма A/goose/Kalmykia/813/16 H5N8 вируса ГП в прививном объеме 0,5 см/гол средний титр антител по группе к НА, обеспечивающих реакцию торможения гемагглютинации, составил 2,3 и 4,7 log соответственно; титр антител, определяемых методом ИФА, составил 3263 и 7036 соответственно (таблицы 5, 6).
Гено- и хемотаксономическая характеристики
6
Штамм A/goose/Kalmykia/813/16 H5N8 вируса гриппа птиц типа А подтипа Н5 является РНК-содержащим вирусом с молекулярной массой 250×10 Д.
Геном вируса гриппа представлен однонитевой РНК негативной полярности в виде 8 нитей(сегментов) в комплексе с белком нуклеопротеина (NP).
Вирионы вируса гриппа имеют наружную липопротеиновую оболочку, чаще сферической формы. Диаметр сферических форм около 100 нм. Вирусные частицы содержат РНК - 1%, белки - 70%, жиры - 20%, углеводы - до 8%.
Антигенная вариабельность и таксономическая классификация вируса основана на идентификации двух основных поверхностных белков -гемагглютинина и нейраминидазы.
Устойчивость к внешним факторам
Штамм A/goose/Kalmykia/813/16 H5N8 вируса ГП чувствителен к детергентам, формальдегиду, бета-пропиолактону, производным азиридина, быстро инактивируется при прогревании (56°С), ультрафиолетовом облучении и при рН ниже 5,0.
Дополнительные признаки и свойства
Иммуногенная активность - иммуногенен в составе инактивированной вакцины.
Реактогенность - реактогенными свойства не обладает.Иммунизация цыплят дозой, в два раза превышающей прививную, не вызывает видимых клинических изменений в общем состоянии птицы, а также локальных поражений ткани в месте введения.
Патогенные свойства
6,0
50
Вирулентность - высокая (вызывает 100%-ную гибель зараженной птицы в дозе 10 ЭЛД).
Контагиозность - контагиозен. Неиммунные цыплята заражаются при совместном содержании с зараженными.
Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения:
Пример 1
Определение подтиповой антигенной характеристики штамма проводили с помощью перекрестной реакции торможения гемагглютинации (РТГА) и реакции торможения нейраминидазной активности (РТНА) с референтными гипериммунными сыворотками к антителам 16 Н-типов вируса ГП и с референтными сыворотками против гриппа птиц подтипов N1-N2 по нейраминидазе. Образцы вирусной суспензии исследовали предварительно в реакции гемагглютинации (РГА) для определения гемагглютинирующей активности вируса. Активность штамма ВГП A/goose/Kalmykia/813/16 H5N8 (Д) в РГА составила 1:32. В качестве отрицательного контроля использовали нормальную сыворотку крови кур производства ФГБУ «ВНИИЗЖ». Результаты представлены в таблице 1 и таблице 2.
2
В РТГА гемагглютинирующая активность испытуемого образца подавлялась специфической сывороткой к ВГП подтипа H5N1 (ФГБУ "ВНИИЗЖ»). Титр сыворотки составил 1:128 (7 log). В РИНА нейраминидазная активность испытуемого образца подавлялась специфической сывороткой к ВГП подтипа H4N8 («IZSVe», Италия).
Согласно проведенным исследованиям штамм A/goose/Kalmykia/813/16 H5N8 был отнесен к вирусу гриппа птиц подтипа H5N8.
Для выявления генома вируса ГП из проб тканей птиц и экстраэмбриональной жидкости (ЭЭЖ) зараженных эмбрионов кур выделяли общую РНК, которую использовали для реакций ОТ и ПЦР. Первичную индикацию гена М проводили, используя праймеры AIVM49F и AIVM941R. После амплификации ДНК, полученной с применением указанных праймеров, в результате секвенирования была определена нуклеотидная (258 н.о.) и аминокислотная (86 а.о.) последовательности фрагмента гена Н штамма ВГП A/goose/Kalmykia/813/16 H5N8. Было установлено, что по фрагменту гена Н к штамму ВГП A/goose/Kalmykia/813/16 H5N8 наиболее близкими оказались последовательности вирусов гриппа А птиц подтипа Н5, выделенные в Республике Тыва в 2016 г. (98,8-99,2% совпадений), а также последовательности вирусов гриппа А птиц подтипов H5N2, H5N6 и H5N8, выделенные на территории стран Юго-Восточной Азии в 2013-2014 гг. (98-99% совпадений). Сайт расщепления гемагглютинина штамма ВГП A/goose/Kalmykia/813/16 H5N8 (Д) содержит основные аминокислоты и имеет структуру REKRRKR, что позволяет охарактеризовать вирус как потенциально высоковирулентный.
Таким образом, на основании серологических и молекулярно-биологических исследований, установлена принадлежность штамма A/goose/Kalmykia/813/16 H5N8 семейству Orthomyxoviridae, вирусам гриппа А, подтипу H5N8.
Пример 2
-1
-10
3
3
3
50
Для использования штаммов вируса в качестве контрольных штаммов при заражении в целях контроля антигенной и иммуногенной активности вакцин, а также для использования в качестве диагностического и производственного необходимо получить штамм вируса с высокой инфекционной активностью. Для определения инфекционной активности из вирусного материала готовили ряд десятикратных последовательных разведений (от 10 до 10). Каждое разведение вируса инокулировали в аллантоисную полость четырем 9-11-суточным СПФ-КЭ в объеме 0,2 см. Четырем эмбрионам контрольной группы вводили ФБР тем же способом в объеме 0,2 см. Специфичность гибели подтверждали в РГА исследованием ЭЭЖ от каждого зараженного эмбриона. Титр вируса в депонируемом образце определяли по методу Кербера и выражали в единицах ЭИД/см (табл. 3).
Таким образом, инфекционная (in vivo) активность штамма
50
3
A/goose/Kalmykia/813/16 H5N8 вируса гриппа птиц при титровании в СПФ-КЭ составила 8,2 lg ЭИД/см.
Пример 3
50
3
При изучении стабильности штамма установлено, что штамм A/goose/Kalmykia/813/16 H5N8 вируса гриппа птиц в течение 3 последних последовательных пассажей в 9-11-суточных СПФ-КЭ оставался стабильным, т.е. не снижал инфекционную активность при титре около 8,25 lg ЭИД/см.
Результаты представлены в таблице 4.
Пример 4
Для использования штамма для контроля антигенной и иммуногенной активности, а также для приготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики гриппа подтипа Н5 необходимо получить штамм, свободный от контаминации чужеродными вирусами, бактериями и грибами. Подтверждение отсутствия контаминации бактериальной, грибной микрофлорой и микоплазмами проводили в соответствии с ГОСТ 28085-89 «Препараты биологические. Метод контроля стерильности».
В результате исследований установлено, что штамм A/goose/Kalmykia/813/16 H5N8 вируса гриппа птиц не контаминирован бактериями, грибами и микоплазмами. В результате испытаний с применением методов полимеразной цепной реакции (ПНР) и полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) было установлено, что штамм ВГП A/goose/Kalmykia/813/16 H5N8 не контаминирован вирусами ньюкаслской болезни (НБ), инфекционного бронхита кур (ИБК), инфекционной бурсальной болезни (ИББ), синдрома снижения яйценоскости (ССЯ-76), инфекционного ларинготрахеита птиц (ИЛТ), реовирусом птиц, а также микоплазмой синовиа и микоплазмой галлисептикум, и содержит в своем составе только геном вируса ГП типа А подтипа H5N8.
Пример 5
3
6
3
50
Изучали патогенные свойства штамма A/goose/Kalmykia/813/16 H5N8 вируса гриппа птиц на цыплятах 30-суточного возраста. В опыте использовали птицу яичного кросса. Вирус штамма A/goose/Kalmykia/813/16 H5N8 вводили цыплятам внутримышечно в объеме 0,5 см с инфекционной активностью 10 ЭИД/см. В результате эксперимента первые признаки высокопатогенного гриппа птиц отмечали через 48 часов после заражения в виде угнетения и взъерошенности оперения. Через 72 часа все зараженные птицы погибли, при этом характерных признаков цианоза бесперьевых участков тела, как при гриппе H5N1 не отмечали.
Таким образом, штамм A/goose/Kalmykia/813/16 H5N8 вируса гриппа птиц является высоковирулентным и вызывает сверхострое течение высокопатогенного гриппа птиц.
Пример 6
50
2
3
3
3
Для получения иммунных сывороток крови к штамму A/goose/Kalmykia/813/16 H5N8 приготовили вакцину. Для изготовления вакцины использовали адъювант Montanide ISA 70 (SEPPIC, Франция). Для приготовления антигена использовали экстраэмбриональную жидкость зараженных СПФ КЭ с инфекционной активностью 8,2 ЭИД/см, при этом гемагглютинирующая активность составляла значение 4 log. Для инактивации инфекционных свойств вируса гриппа птиц использовали бета-пропиолактон (БПЛ). Для этого из исходного раствора БПЛ готовили рабочий 10%-ный раствор на стерильной деминерализованной воде. В сосуд с вирусосодержащей жидкостью вносили рабочий раствор БПЛ до конечной концентрации 0,05%. Сосуд с содержимым инкубировали при комнатной температуре (25°С) в течение 24 ч при постоянном перемешивании на шейкере. После окончания процесса инактивации вирусный материал помещали в бытовой холодильник (4°С), предварительно из сосуда отбирали пробу материала в объеме 5,0 см для проведения исследований по определению полноты инактивации вируса и стерильности материала. После подтверждения полноты инактивации готовили серию лабораторного образца вакцины. Для этого смешивали 30 частей антигена с заданными характеристиками и 70 частей адъюванта. Эмульсию получали на гомогенизаторе 3000 об/мин. Провели иммунизацию цыплят 30-суточного возраста внутримышечно в прививном объеме 0,5 см на голову. На 14 и 21 сутки после вакцинации у иммунизированных птиц отбирали кровь и исследовали на наличие специфических антител к вирусу гриппа птиц типа А подтипа Н5 в ИФА и РТГА (таблица 5, 6).
Результаты исследований свидетельствуют о выраженной антигенной активности лабораторного образца вакцины на основе штамма A/goose/Kalmykia/813/16 H5N8, т.к. установлено наличие специфических антител к вирусу гриппа типа А в ИФА и антигемагглютининов к вирусу гриппа подтипа H5N8.
Источники информации
1. Каверин Н.В., Львов Д.К., Щелканов М.Ю. / Ортомиксовирусы. Руководство по вирусологии. - М.: МИА, 2013, С. 307-313.
2. Tong SX, Li Y, Rivailler P, Conrardy C, Castillo DAA, et al. (2012) A distinct lineage of influenza A virus from bats. Proc Natl Acad Sci USA 109: 4269-4274. doi: 10.1073/pnas.1116200109.
3. Assessment of risk associated with influenza A(H5N8) virus /http://www.who.int/influenza/human animal interface/avian influenza/riskassessment AH5N8 201611/en.
4. Всемирная организация здравоохранения животных (МЭБ) / http://www.oie.int/wahis.
5. Пат. РФ №2323740 A61K 39/145, C12N 7/00 Штамм "Новосибирский" вируса гриппа птиц Influenzae virus avicum для контроля иммуногенной и антигенной активности вакцин и изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики гриппа птиц, 10.05.2008.
6. Shintaro Shichinohe, Masatoshi Okamatsu, Naoki Yamamoto, Yu Noda, Yuka Nomoto, Takashi Honda, Noriyasu Takikawa, Yoshihiro Sakoda, Hiroshi Kida /Potency of an inactivated influenza vaccine prepared from a non-pathogenic H5N1 virus against a challenge with antigenically drifted highly pathogenic avian influenza viruses in chickens //Veterinary Microbiology 164 (2013) 39-45.
7. Van der Goot JA, van Boven M, de Jong MC, Koch G. / Effect of vaccination on transmission of HPAI H5N1: the effect of a single vaccination dose on transmission of highly pathogenic avian influenza H5N1 in Peking ducks // Avian Dis. 2007 Mar; 51 (1 Suppl):323-4.
8. Toro H, Tang DC / Protection of chickens against avian influenza with nonreplicating adenovirus-vectored vaccine // Poult Sci. 2009 Apr; 88(4):867-71.
9. Bublot M, Le Gros FX, Nieddu D, Pritchard N, Mickle TR, Swayne DE. / Efficacy of two H5N9-inactivated vaccines against challenge with a recent H5N1 highly pathogenic avian influenza isolate from a chicken in Thailand // Avian Dis. 2007 Mar; 51(1 Suppl):332-7.
10. Пат. CA №2581355 A61K 39/145; A61K 39/295; A61K 39/39 Multivalent avian influenza vaccines, 20.04.2006.
11. Narayan G., Rouse B.T., Lang G. A virus infection in turkeys. VI Artificial immunization against the Malignant virus strain Turkey/Ontario/7732/66/ - Gen. J. Сотр. Med., 1970. 34, 1, 72-79.
12. Swayne D.E., Beck J.R., Garcia M. et. al. Influents of virus strain and antigen mass on efficacy of H5 avian influenza inactivated vaccines. - Avian Pathol, 1999, 28, 245-255.
13. Swayne D.E., Beck J.R., Perdue M.L. et. al. Efficacy of vaccines in Chickens against Highly Pathogenic Hong Kong H5N1 Avian Influenza. - Avian Dis., 2001, 45, N2, 355-365.
Примечание: * - проба окрашена в розовый цвет;
** - окрашивание пробы отсутствует.
Примечание: «+» - положительная проба, выявленная в РГА;
«-» - проба, отрицательная в РГА.
Примечание: «+» - положительная проба, выявленная в РГА;
«-» - проба, отрицательная в РГА.
СГТ - средний геометрический титр