ВЕЩЕСТВА, ЗАЩИЩАЮЩИЕ КЛЕТКИ ОТ РАССЕЧЕНИЯ ПРИ СБОРЕ МИКРОФИЛЬТРАЦИЕЙ
SUBSTANCES FOR PREVENTING CELL DISSECTION DURING MICROFILTRATION

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Эта заявка относится к области микрофильтрации, используемой при сборе культивируемых клеток.
ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
Настоящая заявка испрашивает приоритет предварительной заявки на патент США, серийный No. 60/647184, поданной 25 января 2005 года, включенной в данное описание посредством полной ссылки.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В зависимости от способа биотехнологического процесса диафильтрацию используют в биотехнологии с целью буферного обмена и извлечения продукта. При диафильтрации в рециркуляционный или ретентатный реактор вводят буфер, а фильтрат удаляют из системы. Диафильтрацию можно использовать в качестве способа промывания ретентата, который представляет собой продукт, или для промывания продукта с помощью фильтрационной системы сбора. Цель процессов микрофильтрации при сборе культивируемых клеток заключается именно в использовании диафильтрации для максимального извлечения продукта из технологического потока.
КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ

Настоящее изобретение связано с обнаружением того факта, что добавление неионогенного поверхностно-активного вещества, например, Pluronic F68, полиэтиленгликоля или других неионогенных блоксополимерных поверхностно-активных веществ, к буферу, используемому на стадии диафильтрации как части процесса микрофильтрации (например, тангенциальной фильтрации потока, ТФП), может уменьшить мутность технологической жидкости. Соответственно, в настоящем изобретении предложен способ диафильтрации. Способ включает диафильтрацию ретентата при добавлении к нему неионогенного поверхностно-активного вещества. Поверхностно-активное вещество может представлять собой, например, Pluronic F68 или поливиниловый спирт (ПВС). В некоторых вариантах реализации изобретения неионогенное поверхностно-активное вещество находится в буфере, например, фосфатно-солевом буфере (ФСБ). Концентрация неионогенного поверхностно-активного вещества в буфере может лежать в диапазоне от 0.2 до 4 г/л, от 0.2 до 3 г/л, от 0.5 до 2.5 г/л, от 0.5 до 2 г/л, от 0.5 до 1.5 г/л. В некоторых случаях концентрация неионогенного поверхностно-активного вещества в буфере составляет примерно 1 г/л или 2.5 г/л. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения ретентат содержит клетки и культуральную среду. Согласно некоторым аспектам изобретения мутность фильтрата, полученного в результате диафильтрации согласно настоящему изобретению, ниже по сравнению с мутностью продукта, полученного диафильтрацией, выполненной в отсутствие неионогенного поверхностно-активного вещества. Согласно другим вариантам реализации степень извлечения продукта из ретентата возрастает в присутствии неионогенного поверхностно-активного вещества по сравнению со степенью извлечения продукта в отсутствие неионогенного поверхностно-активного вещества. В еще одном варианте реализации ретентат содержит фармацевтический продукт, например, рекомбинантный белок, рекомбинантный пептид или белок или пептид природного происхождения. В некоторых случаях ретентат содержит буфер, изотоничный по отношению к клетке в ретентате, например, ФСБ. Согласно другим вариантам реализации изобретения диафильтрацию проводят при температуре, равной примерно 20 - 25°С, 2 - 37°С или 2 - 25°С. Диафильтрация может представлять собой, например, периодическую диафильтрацию или диафильтрацию при постоянном объеме. В некоторых случаях концентрация неионогенного поверхностно-активного вещества существенно не меняется во время диафильтрации. Неионогенное поверхностно-активное вещество может находиться в клеточной культуральной среде.
В настоящем изобретении также предложен продукт, получаемый с помощью способа, такого как диафильтрация, как описано в изобретении.

Согласно другому аспекту в настоящем изобретении предложен способ диафильтрации, который включает поддержание концентрации неионогенного поверхностно-активного вещества (например, Pluronic F68 или ПВС) на уровне примерно 1 г/л.

Согласно еще одному аспекту в изобретении предложен состав для диафильтрации, содержащий примерно 1 г/л (например, Pluronic F68) или 2.5 г/л (например, ПВС) неионогенного поверхностно-активного вещества. Состав может также содержать изотоничный буфер, например, ФСБ.
Если не определено иначе, все технические и научные термины, использованные в настоящем описании, имеют те же значения, которые обычно использует рядовой специалист в области, к которой относится это изобретение. Хотя на практике при применении настоящего изобретения или его исследовании можно использовать способы и материалы, аналогичные или эквивалентные описанным здесь, подходящие способы и материалы описаны ниже. Все публикации, патентные заявки, патенты и другие документы, ссылки на которые приведены в настоящем описании, включены в данное описание во всей их полноте. Кроме того, материалы, способы и примеры приведены в качестве иллюстрации и не ограничивают настоящее изобретение.
Другие особенности и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из подробного описания, рисунков и формулы изобретения.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
При производстве белков ТФП можно использовать как часть процесса извлечения с целью отделения интактных клеток и дебриса от других компонентов в питающем потоке. Например, в производственном процессе, в котором применяют культивируемые клетки, можно использовать стадию микрофильтрации, которая включает концентрирование и диафильтрацию, для сбора культивируемых клеток. В этом процессе отделяют клеточную культуральную жидкость, содержащую продукт, например, рекомбинантный белок, от полученной клеточной линии, используя, например, ТФП. После первичной стадии сбора клеток микрофильтрацией (стадии концентрирования) ретентат, плотность клеток в котором обычно выше, чем плотность до первичной фильтрации, снова направляют через фильтрующую систему и подвергают диафильтрации для извлечения дополнительного продукта, который удерживается в микрофильтрационной системе (стадия диафильтрации). На этой стадии диафильтрации к ретентату, как правило, добавляют изотонический буфер (например, ФСБ). Такую диафильтрацию можно проводить при добавлении буфера в периодическом режиме или в режиме постоянного объема.
Как правило, термин «технологический поток» включает питающий поток, поток пермеата и поток ретентата, т.е. участвующую в процессе подвижную жидкость, которая содержит продукты клеточной культуры. Фильтрат представляет собой любой материал, который проходит через фильтр, т.е. поток пермеата. Термин «ретентат» относится к материалу, который не проходит через фильтр, а задерживается фильтрационным устройством и возвращается в резервуар. Термин «питающий поток» относится к материалу, который выходит из резервуара, проходит через насос и подается на фильтр.
Задача таких процедур, как описано выше, состоит в том, чтобы довести до максимума количество продукта, например, секретированного белка или пептидного продукта, извлекаемого из клеточной культуры или ретентата, одновременно минимизируя количество нежелательного материала в клеточной культуре и технологическом потоке. Увеличение степени мутности клеточной культуры или ретентата обычно связано с увеличением мутности пермеата. Нежелательный материал может включать, например, субклеточные частицы и дебрис. Как правило, мутность используют в качестве критерия оценки количества нежелательного материала в технологическом потоке. Чрезмерная мутность в растворе, в котором суспендированы клетки, например, в культуральной среде или буфере, или их смеси, является нежелательной, поскольку мутность указывает на условия, которые могут вызвать засорение фильтра, закупоривание в системе очистки (например, вследствие забивания пор) и могут оказывать вредное воздействие на качество продукта, в том числе, путем высвобождения клеточных ферментов. Деструкция клеток (например, путем их рассечения) в собираемой культуре может вызвать увеличение мутности технологического потока. Как сообщалось выше, было замечено, что добавление буфера к ретентату во время диафильтрации может увеличить мутность, даже если буфер является изотоничным.

Настоящее изобретение связано с обнаружением того факта, что добавление буфера (например, ФСБ), содержащего неионогенное поверхностно-активное вещество (например, такое неионогенное блоксополимерное поверхностно-активное вещество, как Pluronic F68 или поливиниловый спирт (ПВС)), уменьшает степень мутности в потоках ретентата и пермеата по сравнению с добавлением к ретентату одного буфера. Как правило, мутность ретентата ниже в присутствии неионогенного поверхностно-активного вещества в буфере или растворе, который добавляют к ретентату, чем при отсутствии поверхностно-активного вещества. Кроме того, обычно уменьшается мутность фильтрата. Как правило, неионогенное поверхностно-активное вещество представляет собой Pluronic F68 или ПВС. Другие неионогенные поверхностно-активные вещества, которые могут быть использованы, включают полиэтиленгликоль (ПЭГ), например, ПЭГ с молекулярным весом по меньшей мере около 1000. Можно использовать некоторые соединения, которые имеют ионные свойства, но могут действовать в качестве веществ, защищающих клетки при их рассечении, например, декстран. Типичная концентрация декстрана, используемого в способах, изложенных в настоящем описании, составляет по меньшей мере 10 г/л. Используя описанные здесь способы, можно определить другие подходящие соединения. Как правило, концентрация неионогенного поверхностно-активного вещества или другого защитного средства, применяемого в способах, описанных здесь, находится в диапазоне между 0.2 и 3 г/л, 0.2 и 4 г/л, 0.5 и 2 г/л, 0.5 и 2.5 г/л, 0.5 и 1.5 г/л или примерно равна 1 г/л. В некоторых случаях концентрация неионогенного поверхностно-активного вещества или другого защитного средства составляет по меньшей мере 1 г/л или по меньшей мере 1.5 г/л. Максимальное количество может быть в некоторых случаях не более 2 г/л, не более 5 г/л или не более 10 г/л.

В некоторых случаях к ретентату до начала ТФП добавляют буфер, например, такой изотоничный буфер, как ФСБ. Буфер обычно содержит неионогенное поверхностно-активное вещество, например, Pluronic F68.
В примере применения описанного способа был использован процесс промышленного производства лекарственного вещества на основе рекомбинантного белка, в котором при сборе культивируемых клеток применяют стадию микрофильтрации для отделения клеточной культуральной жидкости, содержащей рекомбинантный белок, от производственной клеточной линии. Система сбора культивируемых клеток представляла собой прибор для фильтрации тангенциального потока (ТФП) Prostak Tangential Flow Filtration (TFF) unit (Millipore, Billerica, Массачусетс), который содержал 0.65 мкм микрофильтрационные (МФ) мембранные модули. Вся клеточная культуральная жидкость (содержащая клетки) рециркулировала через серию модулей Prostak с ретентатной стороны системы ТФП и направлялась обратно в резервуар - сборник культивированных клеток. Культуральная жидкость, не содержащая клеток, проходила на другую сторону 0.65 мкм фильтровальных модульных мембран Prostak и собиралась для дальнейшей переработки.
Всю клеточную культуральную жидкость концентрировали десятикратно в процессе первичной ТФП. Получившуюся жидкость с ретентатной стороны фильтрационной системы называют в настоящем описании ретентатом. После концентрирования клеток проводили стадию буферной диафильтрации при 1.8-кратном увеличении конечного объема ретентата с целью увеличения выхода продукта, удерживаемого в микрофильтрационной системе и системе очистки.

Буфер, используемый при диафильтрации в схеме сбора культивируемых клеток, представлял собой ФСБ. В описанных здесь способах можно использовать другие изотонические растворы, например, такие буферы, как забуференный физраствор Tris или питательную среду. Можно также использовать неионные растворы. ФСБ является изотоническим раствором и, как ожидают, не оказывает вредного воздействия на жизнеспособность клеток. Однако после добавления буфера к ретентату наблюдали появление нежелательного уровня мутности. Добавление Pluronic F68 с концентрацией 1 г/л или ПВС с концентрацией 2.5 г/л к буферу, используемому при диафильтрации в процессе сбора культивируемых клеток, приводит к уменьшению степени мутности технологического потока.
Не связывая себя конкретной теорией, пониженная степень мутности, которую наблюдают при использовании неионогенного поверхностно-активного вещества в описанном здесь процессе извлечения, может быть обусловлена уменьшением числа клеток, разрушенных в результате рассечения во время сбора культуры благодаря действию неионогенного поверхностно-активного вещества, выступающего, по меньшей мере частично, в качестве такого средства, защищающего клетки от рассечения.

Преимуществами добавления неионогенного поверхностно-активного вещества, такого как Pluronic F68 или ПВС, к буферу во время диафильтрации могут являться:
1) повышенная стабильность продукта в сборнике культивируемых клеток, например, как результат более низких уровней протеаз, высвобождаемых из технологической клеточной линии во время сбора культивируемых клеток, 2) уменьшение количества примесей, образующихся при разрушении клеток, в технологическом потоке до последующей переработки и 3) менее строгие требования к поверхности системы фильтров при сборе культивируемых клеток.
Способы выявления подходящих неионогенных поверхностно-активных веществ
Неионогенные поверхностно-активные вещества можно тестировать на их способность улучшать качество ретентата, например, путем уменьшения количества нежелательного материала (например, клеточного дебриса) в потоке собираемых культивируемых клеток при использовании способов, описанных выше. Качество также можно определять путем анализа фильтрата на, например, чистоту продукта или количество продукта, извлекаемого при использовании или неиспользовании неионогенного поверхностно-активного вещества. Как правило, неионогенное поверхностно-активное вещество включают в буфер, добавляемый во время диафильтрации так, чтобы ретентат содержал буфер в количестве по меньшей мере 1%, 5%, 10%, 20%, 50%, 80% (по весу) или больше. Анализируют количество нежелательного материала в ретентате и сравнивают с количеством нежелательного материала в ретентате, диафильтрацию которого проводят с использованием того же буфера, но без добавления неионогенного поверхностно-активного вещества. Неионогенное поверхностно-активное вещество, добавляемое с буфером, может представлять собой то же поверхностно-активное вещество, что присутствует в клеточной культуральной среде, или отличаться от него. Как правило, неионогенное поверхностно-активное вещество является тем же самым веществом, что присутствует в клеточной культуральной среде, и его концентрация в буфере такая же, как и концентрация в этой среде. Для определения концентрации, предпочтительной с точки зрения минимизации количества нежелательного материала в ретентате и максимального извлечения продукта, можно исследовать различные концентрации неионогенного поверхностно-активного вещества. В некоторых случаях помимо анализа ретентата или вместо него анализируют мутность фильтрата.
В некоторых вариантах реализации изобретения мутность ретентата тестируют после того, как буфер или буфер, содержащий неионогенное поверхностно-активное вещество, подвергают диафильтрации в ретентате. Мутность является критерием содержания субклеточных частиц и клеточного дебриса. Как правило, более низкий уровень мутности связан с более желательным качеством ретентата. Мутность можно анализировать с применением известных в этой области способов. Например, можно использовать нефелометрические методы (Baker et al., Trends Biotechnol. 2002 Apr; 20(4): 149-56) или оптическую плотность. Оптическую плотность обычно определяют, измеряя логарифм коэффициента пропускания при 550-650 нм. Пониженная мутность в присутствии неионогенного поверхностно-активного вещества указывает на то, что данное поверхностно-активное вещество увеличивает качество ретентата при ТФП. В некоторых случаях для определения предпочтительной концентрации в конкретном процессе исследуют различные концентрации неионогенного поверхностно-активного вещества.
Для оценки способности неионогенного поверхностно-активного вещества улучшать качество ретентата, содержащего буфер, можно использовать другие способы, известные специалистам в данной области и применяемые при определении качества ретентата или тестировании на присутствие клеточного дебриса. Например, в качестве способа обнаружения клеточного лизиса можно использовать тестирование на присутствие внутриклеточной лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в ретентате и/или пермеате. Другие способы, которые могут быть использованы, включают определение количества клеток в ретентате, к которому был добавлен буфер. Как правило, количество клеток в ретентате определяют в присутствии буфера, содержащего неионогенное поверхностно-активное вещество, и в присутствии буфера в чистом виде. Подходящий буферный состав представляет собой состав, в котором общее число клеток в ретентате сохраняется постоянным в конце диафильтрации по сравнению с началом диафильтрации, при проведении диафильтрации с буфером, содержащим неионогенное поверхностно-активное вещество. Подходящие составы, т.е. буфер плюс неионогенное поверхностно-активное вещество, также включают буферные составы, при использовании которых общее количество клеток в ретентате после диафильтрации выше, чем количество клеток в ретентате после диафильтрации с использованием одного буфера.
Можно также регулировать температуру процесса диафильтрации для улучшения извлечения продукта из ретентата, снижения мутности, уменьшения засорения фильтров или уменьшения других нежелательных свойств ретентата, содержащего буфер. Как правило, диафильтрацию выполняют при температурах, например, примерно равных 20 - 25°С, 2 - 37°С или 2 - 25°С.
Неограничивающие изобретение примеры продуктов, которые могут быть извлечены с использованием способов, изложенных в настоящем описании, включают белки и пептиды, например, антитела, фрагменты антител, рекомбинантные белки, природные секретированные белки, белки и пептиды, полученные методами генной инженерии с целью секретирования, и небелковые продукты, продуцируемые клеткой.
ПРИМЕРЫ
Настоящее изобретение также проиллюстрировано следующими примерами. Примеры приведены только с иллюстративными целями. Их не следует понимать как в какой-либо мере ограничивающие объем или содержание изобретения.
Пример 1: Совершенствование микрофильтрации при сборе культивируемых клеток

Процесс сбора и очистки культивируемых клеток, описанный выше, был протестирован с использованием клеток, продуцирующих рекомбинантный белок. На всем протяжении фазы концентрирования клеток стадии микрофильтрации клетки рециркулировали в клеточной культуральной среде в присутствии таких веществ, защищающих их от рассечения, как ПВС (Celvol, Celanese Chemicals, Даллас, Техас) или Pluronic F68 (BASF Ludwigshafen, Германия). В этих условиях мутность пермеата (фильтрата) сохранялась низкой, а ретентата увеличивалась пропорционально росту клеточной массы. Мутность, измеренную нефелометрическим способом, использовали для определения количества субклеточных частиц и дебриса в технологических потоках. Добавление при диафильтрации к ретентату буфера ФСБ (без добавления неионогенного поверхностно-активного вещества) приводило к увеличению мутности ретентата и пермеата.
Чрезмерная мутность потока пермеата является нежелательной, поскольку может вызывать засорение/закупорку фильтров в системе очистки вследствие забивания пор и других механизмов. Добавление одного буфера ФСБ может привести к уменьшению концентрации защитного средства вследствие разбавления, происходящего при добавлении буфера. Следовательно, в отсутствие защитного средства клеточная линия подвержена возрастающим уровням рассечения. Деструкция клеток вследствие рассечения в системе сбора культивируемых клеток может привести к увеличению мутности технологических потоков.

1
6
1
6
6
6
Влияние добавления к буферу при диафильтрации неионогенного поверхностно-активного вещества, которое может действовать в качестве защитного средства при рассечении (например, ПВС или Pluronic F68), проиллюстрировано в таблице 1. Эти исследования показывают, что мутность конечного ретентата в конце диафильтрации составляет 8-33 NTU/10 ( нефелометрическая единица мутности) клеток, а пермеата - 2.6-4.1 NTU/10 клеток. Сборы, в которых при диафильтрации к буферу добавляли защитное средство, имели мутность в диапазоне от 9.7 до 10.1 NTU/10 клеток для ретентата и от 0.7 до 2.4 NTU/10 клеток для пермеата. Таким образом, существует корреляция между присутствием неионогенного поверхностно-активного вещества и уменьшением мутности ретентата во время диафильтрации. Мутность пермеата также уменьшается.
Таблица 1
Количество клеток, мутность ретентата после центрифугирования (1000 оборотов в течение 5 минут (приблизительно 201 хг)) и мутность пермеата в начале и конце диафильтрации. Мутность после центрифугирования является критерием мутности супернатанта после отделения клеток от технологической пробы путем центрифугирования
Партия
Начало диафильтрации
Конец диафильтрации
Отношение NTU/10<sup>6 </sup>клеток ретентат
Отношение NTU/10<sup>6 </sup>клеток пермеат
Буфер
Количество клеток
Мутность ретентата после вращения
Мутность пермеата
Мутность ретентата после вращения
Мутность пермеата
×10<sup>6</sup>
Начало
Начало
Конец
Конец
SFP-150-004 R2
58,9
371
9,82
1160
151
19,7
2,6
ФСБ
SFP-150-004 R1
55,4
918
14
1836
157
33,1
2,8
ФСБ
SFP-150-005 R2
92,1
569
9,05
739
377
8
4,1
ФСБ
SFP-150-006 R2
86,6
493
6,73
874
155
10,1
1,8
ФСБ + ПВС
SFP-150-007 R1
120,0
546
6,47
814
286
6,8
2,4
ФСБ + Pluronic
SFP-150-007 R2
82,6
381
6,33
802
58,5
9,7
0,7
ФСБ + Pluronic
Пример 2: Лабораторные испытания
Исследование выполняли с использованием лабораторной модели с целью изучения воздействия добавления защитного средства в буфер при диафильтрации собранных культивируемых клеток. Модель состояла из резервуара с клетками, из которого клетки откачивали через устройство для микрофильтрации тангенциальных потоков (МФТП) и затем возвращали обратно в резервуар. Супернатант удаляли из устройства МФТП, при этом в резервуар добавляли буфер, осуществляя диафильтрацию в постоянным объеме. Для каждого исследования использовали клетки из одного и того же биореактора и идентичные тестовые условия, при этом единственное различие заключалось в самом буфере. Буфер представлял собой или ФСБ или ФСБ, содержащий защитное средство в виде поливинилового спирта (ПВС) с концентрацией 2,4 г/л. Мутность определяли, используя нефелометрический способ.
Как правило, мутность пермеата при добавлении ПВС в буфер при диафильтрации уменьшалась. На это указывают результаты измерения мутности потока пермеата, относительно исходной концентрации клеток до диафильтрации (таблица 2, тесты 1 и 2). Третий тест (таблица 2, тест 3) имеет менее отчетливый эффект, при этом значения мутности пермеата были в значительной степени эквивалентными в присутствии ФСБ и ФСБ/ПВС.
Таблица 2
Диафильтрация клеток с использованием ФСБ или ФСБ, содержащего ПВС
Начало диафильтрации
Конец диафильтрации
ПЖК
Мутность пермеата
Мутность пермеата
Отношение (пермеат)
Тест
×10<sup>6 </sup>клеток/мл
NTU
NTU
NTU/10<sup>6 </sup>клеток/мл
Буфер
1а
55
9.1
54.5
1.0
ФСБ
1b
55
12.5
40.7
0.7
ФСБ/ПВС
2а
57
13.3
77.8
1.1
ФСБ
2b
57
11.9
64.3
1.1
ФСБ/ПВС
3а
73
14.1
80.8
1.1
ФСБ
3b
73
15.1
87.3
1.2
ФСБ/ПВС
Исследование концентраций жизнеспособных клеток (ПЖК) и потерь жизнеспособных клеток в присутствии и в отсутствие ПВС в буфере при диафильтрации ясно показывает защитную природу используемого в процессе диафильтрации буфера, содержащего ПВС (см. таблицу 3). Образующийся в тесте 3 в результате разрушения клеток материал, вызывающий мутность, может быть эффективно задержан на ретентатной стороне фильтрующего устройства таким образом, что при этом не происходит заметного увеличения мутности пермеата. Это может быть обусловлено повышенной концентрацией жизнеспособных клеток в начале диафильтрации, в результате чего может измениться удерживающая способность фильтра, например, за счет образования дополнительных сгустков и/или поляризации мембран.
Минимизация потерь жизнеспособных клеток путем включения ПВС во все тестовые примеры (тесты 1-3) приводит к улучшению фильтрационных характеристик технологического потока и уменьшению риска засорения фильтров по механизму закупорки пор.
Таблица 3
Концентрации жизнеспособных клеток до и после диафильтрации для тестов 1-3, описанных в таблице 2
Начало диафильтрации
Конец диафильтрации
ПЖК
ПЖК
Потери жизнеспособных клеток
Тест
×10<sup>6</sup> клеток/мл
×10<sup>6</sup> клеток/мл
×10<sup>6</sup> клеток/мл
Буфер
1а
55
42
13
ФСБ
1b
55
47
8
ФСБ/ПВС
2а
57
40
17
ФСБ
2b
57
40
14
ФСБ/ПВС
3а
73
49
24
ФСБ
3b
73
59
14
ФСБ/ПВС
Другие варианты реализации изобретения
Следует понимать, что хотя изобретение описано на примере приведенного выше подробного описания, вышеизложенное описание предназначено для иллюстрации и не ограничивает область изобретения, которая определяется объемом прилагаемой формулы изобретения. Другие аспекты, преимущества и модификации находятся в рамках объема следующей формулы изобретения.