Способ количественного определения 4,4'-(пропандиамидо)дибензоата натрия в биологических объектах
METHOD FOR QUANTIFYING SODIUM 4,4'-(PROPANEDIAMIDO)DIBENZOATE IN BIOLOGICAL OBJECTS

Изобретение относится к аналитической и фармацевтической отрасли, а именно к определению остаточных количеств 4,4'-(пропандиамидо)дибензоата натрия в биологических жидкостях при установлении фармакокинетических параметров и определении терапевтической дозы препарата. Предлагаемый способ может быть применен в испытательных лабораториях контроля качества лекарственных средств, лабораториях ОКК фармацевтических предприятий, а также в научно-исследовательских лабораториях.
Известны способы определения родственных примесей в субстанции 4,4'-(пропандиамидо)дибензоата натрия, включающие анализ растворов субстанции 4,4'-(пропандиамидо)дибензоата натрия методами ВЭЖХ со спектрофотометрическим детектированием и методом капиллярного электрофореза [Ю.Э. Генералова, В.Ф. Апраксин, Г.М. Алексеева. Определение чистоты новой фармацевтической субстанции 4,4'-(пропандиамидо)дибензоат натрия хроматографическими методами // Вопросы обеспечения качества лекарственных средств. №3 (29) 2020. С. 19-26 https://www.doi.org/10.34907/JPOAI.2020.49.35.001; Патент 2 721 908 RU. Способ определения родственных примесей в 4,4'-(пропандиамидо)дибензоате натрия методом капиллярного электрофореза].
Недостатком данных способов является то, что описываемые методики не позволяют проводить количественное определение 4,4'-(пропандиамидо)дибензоате натрия и пригодны только для определения родственных примесей в субстанции 4,4'-(пропандиамидо)дибензоате натрия.
Известен также способ количественного определения 4,4'-(пропандиамидо)дибензоата натрия в готовой лекарственной форме (таблетки), включающий анализ растворов таблеток, содержащих 4,4'-(пропандиамидо)дибензоат натрия, методом ВЭЖХ со спектрофотометрическим детектированием при 270 нм с использованием хроматографической колонки ProntoSIL 120-5-С18 AQ 75мм×2мм×5 мкм, при введении в хроматограф объема пробы - 2 мкл, со скорость потока подвижной фазы, состоящей из смеси метанола с 0,02%-ным водным раствором о-фосфорной кислоты, 100 мкл/мин и температурой термостата 40°С [Новожихорева В.О. Разработка и валидация методики количественного определения активной фармацевтической субстанции в новом лекарственном средстве методом ВЭЖХ / В.О. Новожихорева; науч. рук. Г.М. Алексеева // Химия и химическая технология в XXI веке: материалы XIX Международной научно-практической конференции студентов и молодых ученых имени профессора Л.П. Кулева, 21-24 мая 2018 г., г. Томск. - Томск: Изд-во ТПУ, 2018. - С. 288-289].
Недостатком данного метода количественного определения 4,4'-(пропандиамидо)дибензоата натрия является использование неорганической мало летучей кислоты и отсутствие данных об аналитическом диапазоне методики, что не позволяет судить о ее практической применимости.
Наиболее близким по технической сущности к заявляемому способу является количественное определение основного вещества в субстанции 4,4'-(пропандиамидо)дибензоата натрия, которое заключается в растворении точной навески субстанции, добавлении 0,1 мл бромкрезолового зеленого (синего) и титровании 0,1 М раствором хлористоводородной кислоты от синего до желтого окрашивания раствора [Г.М. Алексеева, В.Ф. Апраксин, Ю.Э. Генералова. Изучение кислотно-основных свойств, разработка и валидация методики количественного определения оригинальной фармацевтической субстанции // Разработка и регистрация лекарственных средств. 2019. Т. 8, №1. С. 66-71. https://www.doi.org/10.33380/2305-2066-2019-8-1-66-71].
Недостатком данного метода количественного определения 4,4'-(пропандиамидо)дибензоата натрия является невозможность количественного определения основного вещества в испытуемых растворах с концентрацией 4,4'-(пропандиамидо)дибензоата натрия менее 6,0 мг/мл из-за недостаточной чувствительности титриметрического метода и индикаторного способа детектирования точки эквивалентности, а также из-за низкой специфичности кислотно-основного титрования при анализе биологических жидкостей.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является возможность определения 4,4'-(пропандиамидо)дибензоата натрия в диапазоне концентраций от 2,00 до 100,00 нг/мл, повышение чувствительности и производительности при количественном определении за счет использования метода высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием.
Технический результат достигается тем, способ определения 4,4'-(пропандиамидо)дибензоата натрия в биологических объектах с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии, включает отбор пробы, осаждение, центрифугирование, фильтрацию, введение образца в жидкостный хроматограф, хроматографирование и обработку результатов анализа, в качестве детектора используют масс-спектрометрический детектор, регистрируют масс-хроматограммы при отрицательной ионизации в режиме выбранных ионов при m/z=341, хроматографирование осуществляют на колонке Zorbax Plus CN, длиной 150 мм с внутренним диаметром 4,6 мм и размером частиц 5 мкм, при скорости потока подвижной фазы, состоящей из смеси ацетонитрила и 1,0%-ного раствора муравьиной кислоты, 0,3 мл/мин и объеме вводимой пробы 20 мкл.
При этом в качестве пробы берут аликвоту около 0,5 мл биологической жидкости. Осаждение проводят ацетонитрилом с последующим центрифугированием образца, надосадочную жидкость фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм. Образец вводят в жидкостный хроматограф с масс-спектрометрическим детектором, регистрируют масс-хроматограммы при отрицательной ионизации в режиме выбранных ионов при m/z=341, используют хроматографическую колонку Zorbax Plus CN, 150 мм × 4,6 мм, 5,0 мкм, в качестве элюента используют ацетонитрил: 1,0%-ный раствор муравьиной кислоты в соотношении 30:70 при скорости потока подвижной фазы 0,3 мл/мин и объеме вводимой пробы 20 мкл.
Использование высокоэффективного жидкостного хроматографа с масс-спектрометрическим детектором и колонки Zorbax Plus CN, 150 мм с внутренним диаметром 4,6 мм, с размером частиц сорбента 5 мкм, а также элюента, состоящего из смеси ацетонитрил: 1,0%-ный раствор муравьиной кислоты в соотношении 30:70 при скорости потока подвижной фазы 0,3 мл/мин и объеме вводимой пробы 20 мкл, позволяет получить симметричный хроматографический пик аниона 4,4'-(пропандиамидо)дибензоата, коэффициент асимметрии которого близок к 1, что вместе с использованием масс-спектрометрического детектора позволяет определять 4,4'-(пропандиамидо)дибензоата натрия в диапазоне концентраций от 2,0 нг/мл до 100,0 нг/мл при высокой чувствительности, стабильности и повторяемости получаемых данных.
Способ количественного определения 4,4'-(пропандиамидо)дибензоата натрия в биологических объектах с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием осуществляют согласно методике.
Пример 1. Подготовка вспомогательных растворов
Растворитель пробы. Смешивают 70 мл 1,0%-ного раствора муравьиной кислоты и 30 мл ацетонитрила.
Основной раствор: 0,010 г 4,4'-(пропандиамидо)дибензоата натрия помещают в мерную колбу вместимостью 10 мл, добавляют 5 мл воды для хроматографии, выдерживают в УЗВ 10 мин, доводят объем раствора водой для хроматографии до метки и перемешивают. 0,1 мл полученного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 10 мл, доводят объем раствора водой для хроматографии до метки и перемешивают. 1 мл полученного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 10 мл, доводят объем раствора растворителем пробы до метки, перемешивают и фильтруют через фильтр с диаметром пор 0,45 мкм.
Калибровочные растворы
Калибровочные растворы готовят последовательным разбавлением основного раствора, получая семь калибровочных растворов с концентрацией 2,0, 10,0, 20,0, 40,0, 60,0, 80,0 и 100,0 нг/мл. В качестве растворителя используют растворитель пробы.
Раствор для определения предела обнаружения (LOD): раствор LOD готовят двукратным разбавлением калибровочного раствора с концентрацией 2,0 нг/мл (С=1,0 нг/мл).
Пример 2. Подготовка испытуемых растворов
Около 0,5 мл (точная аликвота) плазмы крови (мочи) переносят в пробирку, порционно прибавляют ацетонитрил до конечного объема 5 мл при постоянном встряхивании. Затем пробирки центрифугируют 20 минут со скоростью 5000 об/мин. Надосадочную жидкость количественно переносят в мерную колбу вместимостью 10 мл, доводят до метки растворителем пробы и перемешивают. Полученные экстракты фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм.
Срок годности растворов 72 часа при температуре 25°С.
Пример 3. Хроматографирование и обработка результатов
Хроматографические условия:
Хроматографируют калибровочные растворы, получая не менее 3 хроматограмм для каждого раствора в заданных условиях. Время удерживания аниона 4,4'-(пропандиамидо)дибензоата должно быть около 10,0 мин.
Хроматографическая система считается пригодной, если на хроматограмме калибровочных растворов выполняются следующие условия:
эффективность хроматографической колонки, рассчитанная по пику аниона 4,4'-(пропандиамидо)дибензоата не менее 5000 теоретических тарелок;
фактор асимметрии пика аниона 4,4'-(пропандиамидо)дибензоата от 0,8 до 1,5;
относительное стандартное отклонение (ОСО) времен удерживания и площадей пиков аниона 4,4'-(пропандиамидо)дибензоата, рассчитанные по 3 последовательным хроматограммам калибровочных растворов, не более 5,0%.
a
Строят график зависимости в координатах площадь пика аниона 4,4'-(пропандиамидо)дибензоата - концентрация (С, нг/мл). Определяют коэффициент корреляции (R), который должен быть не менее 0,990, и коэффициент Стьюдента свободного члена (t), который не должен превышать табличное значение.
Хроматографируют растворы для определения предела количественного определения и предела обнаружения не менее 10 раз. Рассчитывают среднее значение и относительное стандартное отклонение площадей пиков аниона 4,4'-(пропандиамидо)дибензоата, а также значение сигнал/шум для пика аниона 4,4'-(пропандиамидо)дибензоата. Относительное стандартное отклонение площадей пиков аниона 4,4'-(пропандиамидо)дибензоата, рассчитанное по хроматограммам раствора для определения предела количественного определения и предела обнаружения должно быть не более 5 и 20% соответственно. Значения сигнал/шум, рассчитанные по хроматограммам раствора для определения предела количественного определения и предела обнаружения должно быть не менее 10 и 3 соответственно.
Хроматографируют испытуемые растворы, получая не менее 3 хроматограмм в заданных условиях.
Концентрацию 4,4'-(пропандиамидо)дибензоата натрия в испытуемых растворах в нг/мл находят, используя калибровочный график.
Анализ метрологических характеристик способа определения 4,4'-(пропандиамидо)дибензоата натрия в биологических объектах (табл. 1) показывает высокую чувствительность, стабильность и повторяемость полученных результатов в диапазоне концентраций от 2,0 нг/мл до 100,0 нг/мл за счет высокой чувствительности масс-спектрометрического детектора, что приводит к возможности определения низких концентраций 4,4'-(пропандиамидо)дибензоата натрия в биологических жидкостях.
Способ определения 4,4'-(пропандиамидо)дибензоата натрия в биологических объектах с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием прост и экономичен в осуществлении.
Предлагаемый способ определения 4,4'-(пропандиамидо)дибензоата натрия в биологических объектах с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием может быть применен в испытательных лабораториях контроля качества лекарственных средств, лабораториях ОКК фармацевтических предприятий, а также в научно-исследовательских лабораториях.
Предлагаемый способ определения 4,4'-(пропандиамидо)дибензоата натрия в биологических объектах с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием апробирован в Центре Контроля Качества Лекарственных Средств федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Санкт-Петербургский государственный химико-фармацевтический университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации.