АНТИТЕЛО, СВЯЗЫВАЮЩЕЕ ЧЕЛОВЕЧЕСКИЙ IL-4R, ЕГО АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩИЙ ФРАГМЕНТ И ЕГО МЕДИЦИНСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ
ANTIBODY BINDING HUMAN IL-4R, ANTIGEN-BINDING FRAGMENT THEREOF, AND MEDICAL APPLICATION THEREOF

Данная заявка заявляет приоритет по китайской заявке CN 201810971269.2, поданной 24 августа 2018 года, китайской заявке CN 201811472752.2, поданной 4 декабря 2018 года, китайской заявке CN 201910221311.3, поданной 22 марта 2019 года, и китайской заявке CN 201910401923.0, поданной 15 мая 2019 года. Каждая из заявок, как описано выше, включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.
Область изобретения
Настоящее раскрытие относится к антителу, которое связывается с человеческим IL-4R, и его антигенсвязывающему фрагменту. Настоящее раскрытие также относится к химерным антителам или гуманизированным антителам, содержащим области CDR (от англ. complementary determining region - область, определяющая комплементарность) из указанного выше антитела; и фармацевтической композиции, содержащей антитело, которое связывается с человеческим IL-4R, и его антигенсвязывающий фрагмент; а также его применению в качестве лекарственного средства для лечения аутоиммунного заболевания.
Предшествующий уровень техники
Аллергическое заболевание представляет собой серьезное патологическое состояние, включающее: аллергические реакции, не представляющие угрозы для жизни, которые могут быть излечены на протяжении некоторого периода времени; и аллергические заболевания, представляющие угрозу для жизни.
Современные способы лечения аллергий включают избегание аллергенов, фармакологическое лечение симптомов и предупреждение посредством иммунотерапии, специфичной в отношении аллергена.
Интерлейкин-4 (IL-4, также известный как фактор стимуляции В-клеток или BSF-1 (от англ. В cell stimulating factor-1)) охарактеризован в отношении его способности симулировать пролиферацию В-клеток в ответ на низкую концентрацию антител против поверхностного иммуноглобулина. Оказалось, что IL-4 имеет широкий диапазон биологических активностей, включая стимуляцию роста Т-клеток, тучных клеток, гранулоцитов, мегакариоцитов и эритроцитов и т.д. IL-4 индуцирует экспрессию МНС-II (от англ. major histocompatibility complex - главный комплекс гистосовместимости) в покоящихся В-клетках и усиливает секрецию иммуноглобулина IgE и IgG1 активированными В-клетками.
Биологическая активность IL-4 опосредована конкретными рецепторами IL-4 поверхности клетки (IL-4R). Рецептор IL-4 (IL-4R) состоит из 802 аминокислотных остатков, и IL-4R экспрессируется на поверхности Т-клеток, В-клеток, тимоцитов, клеток костного мозга, макрофагов и тучных клеток. Цепь a IL-4R также представляет собой компонент рецептора IL-13 (IL-13R), таким образом, IL-4R может также опосредовать биологическую активность IL-13. В качестве нового терапевтического способа, лекарственное средство или композицию, содержащую антагонист IL-4R, можно вводить субъекту перед, во время или после того, как субъект подвергается воздействию аллергенов или демонстрирует аллергические симптомы.
В настоящее время многие фармацевтические компании в разных странах разрабатывают моноклональные антитела против IL-4R для лечения разных родственных аллергических заболеваний. Родственные патентные заявки включают, например, WO 2010053751, WO 2001092340, WO 2008054606, WO 2014031610 и т.д. Среди них Дупилумаб, лекарственное средство против астмы, которое было разработано Sanofi Regeneron, одобрено для продажи на рынке при признаках дерматита. При признаках астмы клинические испытания, фаза III, также выполнены и вступили в фазу регистрации.
Существующие стратегии лечения не являются эффективными или имеют большие риски. Таким образом, в данной области все еще существует необходимость в предложении антител, которые бы связывались с человеческим IL-4R (hIL-4R) с высокой селективностью и высокой биологической активностью, с возможностью предложить лекарственное средство и композицию, а также терапевтические способы, которые могут лечить IL-4R-опосредованное аллергическое заболевание за счет связывания с hIL-4R с высокой аффинностью и нейтрализации биологической активности IL-4R (включая блокирование взаимодействия с IL-4R).
Краткое изложение сущности изобретения
В некоторых воплощениях в данном документе предложено антитело, которое специфично связывается с IL-4R (также называемое антителом, которое связывается с человеческим IL-4R, антителом против человеческого IL-4R), или его антигенсвязывающий фрагмент, в котором вариабельная область тяжелой цепи содержит:
(I) определяющие комплементарность области тяжелой цепи (HCDR, от англ. - heavy-chain complementarity determining region) HCDR1, HCDR2 и HCDR3, как показано в SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4 и SEQ ID NO 5, соответственно; или варианты HCDR с 3, 2 или 1 отличием(ями) в аминокислотах, в сравнении с HCDR1, HCDR2 и HCDR3, как показано в SEQ ID NO 3, 4 и 5, соответственно; или
(II) HCDR1, HCDR2 и HCDR3, как показано в SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 12 и SEQ ID NO 13, соответственно; или варианты HCDR с 3, 2 или 1 отличием(ями) в аминокислотах, в сравнении с HCDR1, HCDR2 и HCDR3, как показано в SEQ ID NO 11, 12 и 13, соответственно;
и/или, вариабельная область легкой цепи содержит:
(I) определяющие комплементарность области легкой цепи (LCDR, от англ. - light-chain complementarity determining region) LCDR1, LCDR2 и LCDR3, как показано в SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 7 и SEQ ID NO 8, соответственно; или варианты LCDR с 3, 2 или 1 отличием(ями) в аминокислотах, в сравнении с LCDR1, LCDR2 и LCDR3, как показано в SEQ ID NO 6, 7 и 8, соответственно; или
(II) LCDR1, LCDR2 и LCDR3, как показано в SEQ ID NO 14, SEQ ID NO 15 и SEQ ID NO 16, соответственно; или варианты LCDR с 3, 2 или 1 отличием(ями) в аминокислотах, в сравнении с LCDR1, LCDR2 и LCDR3, как показано в SEQ ID NO 14, 15 и 16, соответственно; или
(III) LCDR1, LCDR2 и LCDR3, как показано в SEQ ID NO 38, SEQ ID NO 7 и SEQ ID NO 40, соответственно; или варианты LCDR с 3, 2 или 1 отличием(ями) в аминокислотах, в сравнении с LCDR1, LCDR2 и LCDR3, как показано в SEQ ID NO 38, 7 и 40, соответственно; или
(IV) LCDR1, LCDR2 и LCDR3, как показано в SEQ ID NO 42, SEQ ID NO 39 и SEQ ID NO 8, соответственно; или варианты LCDR с 3, 2 или 1 отличием(ями) в аминокислотах, в сравнении с LCDR1, LCDR2 и LCDR3, как показано в SEQ ID NO 42, 39 и 8, соответственно.
В некоторых воплощениях антитело, которое связывается с человеческим IL-4R или его антигенсвязывающим фрагментом, содержит любое, выбранное из группы, состоящей из нижеследующего (I)-(IV):
(I) вариабельная область тяжелой цепи, содержащая HCDR1, HCDR2 и HCDR3, как показано в SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4 и SEQ ID NO 5, соответственно; и
вариабельная область легкой цепи, содержащая LCDR1, LCDR2 и LCDR3, как показано в SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 7 и SEQ ID NO 8, соответственно;
(II) вариабельная область тяжелой цепи, содержащая HCDR1, HCDR2 и HCDR3, как показано в SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 12 и SEQ ID NO 13, соответственно; и
вариабельная область легкой цепи, содержащая LCDR1, LCDR2 и LCDR3, как показано в SEQ ID NO 14, SEQ ID NO 15 и SEQ ID NO 16, соответственно;
(III) вариабельная область тяжелой цепи, содержащая HCDR1, HCDR2 и HCDR3, как показано в SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4 и SEQ ID NO 5, соответственно; и
вариабельная область легкой цепи, содержащая LCDR1, LCDR2 и LCDR3, как показано в SEQ ID NO 38, SEQ ID NO 7 и SEQ ID NO 40, соответственно; и
(IV) вариабельная область тяжелой цепи, содержащая HCDR1, HCDR2 и HCDR3, как показано в SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4 и SEQ ID NO 5, соответственно; и
вариабельная область легкой цепи, содержащая LCDR1, LCDR2 и LCDR3, как показано в SEQ ID NO 42, SEQ ID NO 39 и SEQ ID NO 8, соответственно.
В некоторых воплощениях антитела, которое связывается с человеческим IL-4R, или его антигенсвязывающего фрагмента, вариабельная область тяжелой цепи содержит:
(I) последовательность, как показано в SEQ ID NO 1, последовательность, обладающую по меньшей мере 70%-ной, 80%-ной, 90%-ной, 95%-ной, 98%-ной, 99%-ной идентичностью с SEQ ID NO 1; или
(II) последовательность, как показано в SEQ ID NO 9, или последовательность, обладающую по меньшей мере 70%-ной, 80%-ной, 90%-ной, 95%-ной, 98%-ной, 99%-ной идентичностью с SEQ ID NO 9; или
(III) последовательность, как показано в SEQ ID NO 43, или последовательность, обладающую по меньшей мере 70%-ной, 80%-ной, 90%-ной, 95%-ной, 98%-ной, 99%-ной идентичностью с SEQ ID NO 43;
и/или,
вариабельная область легкой цепи содержит:
(I) последовательность, как показано в SEQ ID NO 2, или последовательность, обладающую по меньшей мере 70%-ной, 80%-ной, 90%-ной, 95%-ной, 98%-ной, 99%-ной идентичностью с SEQ ID NO 2; или
(II) последовательность, как показано в SEQ ID NO 10, или последовательность, обладающую по меньшей мере 70%-ной, 80%-ной, 90%-ной, 95%-ной, 98%-ной, 99%-ной идентичностью c SEQ ID NO 10; или
(III) последовательность, как показано в SEQ ID NO 37, или последовательность, обладающую по меньшей мере 70%-ной, 80%-ной, 90%-ной, 95%-ной, 98%-ной, 99%-ной идентичностью с SEQ ID NO 37; или
(IV) последовательность, как показано в SEQ ID NO 41, или последовательность, обладающую по меньшей мере 70%-ной, 80%-ной, 90%-ной, 95%-ной, 98%-ной, 99%-ной идентичностью с SEQ ID NO 41.
В по меньшей мере одном воплощении антитела, которое связывается с человеческим IL-4R, или его антигенсвязывающим фрагментом, где:
вариабельная область тяжелой цепи представляет собой такую, как показано в SEQ ID NO 1, и вариабельная область легкой цепи представляет собой такую, как показано в SEQ ID NO 2; или
вариабельная область тяжелой цепи представляет собой такую, как показано в SEQ ID NO 9, и вариабельная область легкой цепи представляет собой такую, как показано в SEQ ID NO 10; или
вариабельная область тяжелой цепи представляет собой такую, как показано в SEQ ID NO 43, и вариабельная область легкой цепи представляет собой такую, как показано в SEQ ID NO 37; или
вариабельная область тяжелой цепи представляет собой такую, как показано в SEQ ID NO 43, и вариабельная область легкой цепи представляет собой такую, как показано в SEQ ID NO 41.
В некоторых воплощениях антитела, которое связывается с человеческим IL-4R, или его антигенсвязывающего фрагмента, где
вариабельная область тяжелой цепи содержит:
(I) последовательность, как показано в одной из SEQ ID NO: 25-27, или последовательность, обладающую по меньшей мере 70%-ной, 80%-ной, 90%-ной, 95%-ной, 98%-ной или 99%-ной идентичностью с одной из SEQ ID NO: 25-27; или
(II) последовательность, как показано в одной из SEQ ID NO: 31-33, или последовательность, обладающую по меньшей мере 70%-ной, 80%-ной, 90%-ной, 95%-ной, 98%-ной или 99%-ной идентичностью с одной из SEQ ID NO: 31-33;
и/или
вариабельная область легкой цепи содержит:
(I) последовательность, как показано в одной из SEQ ID NO: 28-30, или последовательность, обладающую по меньшей мере 70%-ной, 80%-ной, 90%-ной, 95%-ной, 98%-ной или 99%-ной идентичностью с одной из SEQ ID NO: 28-30; или
(II) последовательность, как показано в одной из SEQ ID NO: 34-36, или последовательность, обладающую по меньшей мере 70%-ной, 80%-ной, 90%-ной, 95%-ной, 98%-ной или 99%-ной идентичностью с одной из SEQ ID NO: 34-36.
В некоторых конкретных воплощениях вариабельная область тяжелой цепи представляет собой такую, как показано в одной из SEQ ID NO: 25-27, и вариабельная область легкой цепи представляет собой такую, как определено в одной из SEQ ID NO: 28-30.
В других конкретных воплощениях вариабельная область тяжелой цепи представляет собой такую, как показано в одной из SEQ ID NO: 31-33, и вариабельная область легкой цепи представляет собой такую, как показано в одной из SEQ ID NO: 34-36.
В некоторых воплощениях тяжелая цепь антитела, которое связывается с человеческим IL-4R, или его антигенсвязывающего фрагмента содержит:
(I) последовательность, как показано в SEQ ID NO 17, или последовательность, обладающую по меньшей мере 70%-ной, 80%-ной, 90%-ной, 95%-ной, 98%-ной или 99%-ной идентичностью с SEQ ID NO 17; или
(II) последовательность, как показано в SEQ ID NO 19, или последовательность, обладающую по меньшей мере 70%-ной, 80%-ной, 90%-ной, 95%-ной, 98%-ной или 99%-ной идентичностью с SEQ ID NO 19; или
(III) последовательность, как показано в SEQ ID NO 44, или последовательность, обладающую по меньшей мере 70%-ной, 80%-ной, 90%-ной, 95%-ной, 98%-ной или 99%-ной идентичностью с SEQ ID NO 44.
В некоторых воплощениях легкая цепь антитела, которое связывается с человеческим IL-4R, или его антигенсвязывающего фрагмента содержит:
(I) последовательность, как показано в SEQ ID NO 18, или последовательность, обладающую по меньшей мере 70%-ной, 80%-ной, 90%-ной, 95%-ной, 98%-ной или 99% идентичностью c SEQ ID NO 18; или
(II) последовательность, как показано в SEQ ID NO 20, или последовательность, обладающую по меньшей мере 70%-ной, 80%-ной, 90%-ной, 95%-ной, 98%-ной или 99%-ной идентичностью с SEQ ID NO 20; или
(III) последовательность, как показано в SEQ ID NO 45, или последовательность, обладающую по меньшей мере 90%-ной, 95%-ной, 98%-ной или 99%-ной идентичностью с SEQ ID NO 45; или
(IV) последовательность, как показано в SEQ ID NO 46, или последовательность, обладающую по меньшей мере 90%-ной, 95%-ной, 98%-ной или 99%-ной идентичностью c SEQ ID NO 46.
В по меньшей мере одном воплощении тяжелая цепь представляет собой такую, как определено в SEQ ID NO 17, и легкая цепь представляет собой такую, как показано в SEQ ID NO 18.
В еще одном воплощении тяжелая цепь представляет собой такую, как определено в SEQ ID NO 19, и легкая цепь представляет собой такую, как показано в SEQ ID NO 20.
В еще одном воплощении тяжелая цепь представляет собой такую, как определено в SEQ ID NO 44, и легкая цепь представляет собой такую, как показано в SEQ ID NO 45.
В еще одном воплощении тяжелая цепь представляет собой такую, как определено в SEQ ID NO 44, и легкая цепь представляет собой такую, как показано в SEQ ID NO 46.
В некоторых воплощениях антитело против IL-4R или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой мышиное антитело, химерное антитело, человеческое антитело, гуманизированное антитело или его фрагмент.
В некоторых конкретных воплощениях антитело против IL-4R или его антигенсвязывающий фрагмент является гуманизированным.
В некоторых воплощениях антитело против IL-4R или его антигенсвязывающий фрагмент включает фрагмент или их комбинацию, выбранную из группы, состоящей из нижеследующего:
- последовательность каркасной области (FR, от англ. - framework region), происходящая из IGKV3-11 *01 легкой цепи зародышевой линии человека;
- последовательность с обратной мутацией, обладающая по меньшей мере 95%-ной идентичностью с областью FR, происходящей из IGKV3-11*01 легкой цепи зародышевой линии человека. В некоторых конкретных воплощениях обратная мутация представляет собой любую мутацию, выбранную из группы, состоящей из L46P, L47W и F71Y или их комбинации.
В некоторых воплощениях антитело против IL-4R или его антигенсвязывающий фрагмент содержит фрагмент или их комбинацию, выбранную из группы, состоящей из нижеследующего:
- последовательность области FR, происходящая из IGHV3-48*01 тяжелой цепи зародышевой линии человека;
- последовательность с обратной мутацией, обладающая по меньшей мере 95%-ной идентичностью с областью FR, происходящей из IGHV3-48*01 тяжелой цепи зародышевой линии человека. В некоторых конкретных воплощениях обратная мутация представляет собой любую мутацию, выбранную из группы, состоящей из S49A, F67S и А93Т или их комбинации.
В некоторых воплощениях антитело против IL-4R или его антигенсвязывающий фрагмент содержит фрагмент или их комбинацию, выбранную из группы, состоящей из нижеследующего:
- последовательность области FR, происходящая из IGKV2D-29*01 легкой цепи зародышевой линии человека;
- последовательность с обратной мутацией, обладающая по меньшей мере 95%-ной идентичностью с областью FR, происходящей из IGKV2D-29*01 легкой цепи зародышевой линии человека. В некоторых конкретных воплощениях обратная мутация выбрана из группы, состоящей из M4L и/или V58I.
В некоторых воплощениях антитело против IL-4R или его антигенсвязывающий фрагмент дополнительно содержит фрагмент или их комбинацию, выбранную из группы, состоящей из нижеследующего:
- последовательность области FR, происходящая из IGHV1-2*02 тяжелой цепи зародышевой линии человека;
- последовательность с обратной мутацией, обладающая по меньшей мере 95%-ной идентичностью с областью FR, происходящей из IGHV1-2*02 тяжелой цепи зародышевой линии человека. В некоторых конкретных воплощениях обратная мутация представляет собой любую мутацию, выбранную из группы, состоящей из M69L, R71I, T73K и R94K, или их комбинации.
В некоторых воплощениях вариабельная область тяжелой цепи антитела против IL-4R или его антигенсвязывающего фрагмента содержит каркасные области тяжелой цепи человеческого IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 их варианты. В некоторых конкретных воплощениях вариабельная область тяжелой цепи содержит каркасные области тяжелой цепи человеческого IgG1 или их варианты, например, вариабельная область тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO 43, или вариант вариабельной область тяжелой цепи, обладающий по меньшей мере 85%-ной идентичностью последовательностей с SEQ ID NO 43.
В некоторых воплощениях антитело против IL-4R или его антигенсвязывающий фрагмент содержит константную(ые) область(ти) человеческой цепи κ, λ или ее варианты, например, вариабельную область легкой цепи, как показано в SEQ ID NO 44, или вариант вариабельной области легкой цепи, обладающий по меньшей мере 85%-ной идентичностью последовательностей с SEQ ID NO 44.
В некоторых воплощениях гуманизированное антитело против IL-4R или его фрагмент, как описано выше, дополнительно содержит константную(ые) область(и) человеческого IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 или их варианты.
В по меньшей мере одном воплощении антитело содержит константную(ые) область(и) тяжелой цепи человеческого IgG2 или IgG4. IgG2 или IgG4 не обладает токсичностью ADCC (от англ. antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity антителозависимая клеточная цитотоксичность). В качестве альтернативы, можно использовать IgG1 без токсичности ADCC (антителозависимая клеточная цитотоксичность) после аминокислотной мутации.
В по меньшей мере одном воплощении вариант содержит мутацию(и) константной области тяжелой цепи, выбранную(ые) из группы, состоящей из: мутации(й), которая(ые) уменьшает(ют) функцию ADCC, или вызывает(ют) потерю функции ADCC, как например, N297A, L234A, L235A в IgG1, но, не ограничиваясь ими.
В некоторых воплощениях антитело против IL-4R или его антигенсвязывающий фрагмент, где антитело представляет собой гуманизированное антитело, и последовательность тяжелой цепи представляет собой такую, как показано в SEQ ID NO 17, или обладает по меньшей мере 85%-ной идентичностью последовательностей с SEQ ID NO 17; последовательность легкой цепи представляет собой такую, как показано в SEQ ID NO 18, или обладает по меньшей мере 85%-ной идентичностью последовательностей с SEQ ID NO 18.
В некоторых воплощениях антитела против IL-4R или его антигенсвязывающего фрагмента, где антитело представляет собой гуманизированное антитело, и последовательность тяжелой цепи представляет собой такую, как показано в SEQ ID NO 19, или обладает по меньшей мере 85%-ной идентичностью последовательностей с SEQ ID NO 19; последовательность легкой цепи представляет собой такую, как показано в SEQ ID NO 20, или обладает по меньшей мере 85%-ной идентичностью последовательностей с SEQ ID NO 20.
В некоторых воплощениях антитела против IL-4R или его антигенсвязывающего фрагмента, где антитело представляет собой гуманизированное антитело, и последовательность тяжелой цепи представляет собой такую, как показано в SEQ ID NO 44, или обладает по меньшей мере 85%-ной идентичностью последовательностей с SEQ ID NO 44; последовательность легкой цепи представляет собой такую, как показано в SEQ ID NO 45, или обладает по меньшей мере 85%-ной идентичностью последовательностей с SEQ ID NO 45.
В некоторых воплощениях антитела против IL-4R или его антигенсвязывающего фрагмента, где антитело представляет собой гуманизированное антитело, и последовательность тяжелой цепи представляет собой такую, как показано в SEQ ID NO 44, или обладает по меньшей мере 85%-ной идентичностью последовательностей с SEQ ID NO 44; последовательность легкой цепи представляет собой такую, как показано в SEQ ID NO 46, или обладает по меньшей мере 85%-ной идентичностью последовательностей с SEQ ID NO 46.
В некоторых воплощениях предложено выделенное антитело против IL-4R или его антигенсвязывающий фрагмент, которое характеризуется тем, что оно конкурирует за связывание с человеческим IL-4R с любым антителом, которое связывается с человеческим IL-4R или его антигенсвязывающий фрагментом, как описано выше.
В некоторых воплощениях предложено биспецифичное антитело или мультиспецифичное антитело, которое содержит вариабельную область легкой цепи и/или вариабельную область тяжелой цепи антитела, которое связывается с человеческим IL-4R, или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящей заявке.
В другом воплощении предложено одноцепочечное антитело, которое содержит вариабельную область легкой цепи и/или вариабельную область тяжелой цепи антитела, которое связывается с человеческим IL-4R, или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящей заявке.
В некоторых воплощениях предложен полинуклеотид, который кодирует антитело, которое связывается с человеческим IL-4R, или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящей заявке.
В других воплощениях предложен полинуклеотид, который кодирует антитело, которое конкурентно связывается с IL-4R или его эпитопом с антителом, которое связывается с человеческим IL-4R, или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящей заявке.
В других воплощениях предложен полинуклеотид, который кодирует биспецифичное антитело, мультиспецифичное антитело или одноцепочечное антитело, как описано выше.
В некоторых воплощениях полинуклеотид по настоящей заявке представляет собой ДНК или РНК.
В некоторых воплощениях предложен вектор, содержащий полинуклеотид, как описано выше, который представляет собой эукариотический экспрессионный вектор, прокариотический экспрессионный вектор или вирусный вектор.
В некоторых случаях предложена клетка-хозяин, которая трансформирована вектором, как описано выше, и клетка-хозяин выбрана из группы, состоящей из прокариотической клетки или эукариотической клетки.
В по меньшей мере одном воплощении прокариотическая клетка выбрана из бактерий, таких как Е. coli,
В по меньшей мере одном воплощении эукариотическая клетка выбрана из группы, состоящей из клеток дрожжей или млекопитающего, таких как клетки Pichia pastoris или СНО (от англ. - Chinese Hamster Ovary - яичник китайского хомячка).
В некоторых воплощениях предложен способ выявления или измерения IL-4R, включающий стадию приведения образца в контакт с антителом против IL-4R или его антигенсвязывающим фрагментом, как описано выше.
В некоторых воплощениях предложен реагент для выявления или измерения человеческого IL-4R, и данный реагент содержит антитело против IL-4R или его антигенсвязывающий фрагмент, как описано выше.
В некоторых воплощениях предложен реагент для выявления или измерения человеческого IL-4R, содержащий антител, которое конкурентно связывается с IL-4R или его эпитопом с антителом, которое связывается с человеческим IL-4R, или его антигенсвязывающим фрагментом согласно настоящей заявке.
В некоторых воплощениях предложен реагент для выявления или измерения человеческого IL-4R, содержащий биспецифичное антитело, мультиспецифичное антитело и одноцепочечное антитело, как описано выше.
В некоторых воплощениях предложено диагностическое средство для осуществления диагностики заболевания, связанного с клетками позитивными в отношении человеческого IL-4R, причем данное диагностическое средство содержит указанное антитело против IL-4R или его антигенсвязывающий фрагмент, как описано выше. В еще одних воплощениях диагностическое средство содержит антитело, которое конкурентно связывается с IL-4R или его эпитопом с антителом, которое связывается с человеческим IL-4R, или его антигенсвязывающим фрагментом согласно настоящей заявке.
В некоторых воплощениях предложена фармацевтическая композиция, которая содержит:
- антитело, которое связывается с человеческим IL-4R, или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящей заявке, и
- фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество, разбавитель или носитель.
В некоторых конкретных воплощениях единица дозы фармацевтической композиции составляет от 1 мг до 1000 мг антитела против IL-4R или его антигенсвязывающего фрагмента согласно настоящей заявке.
В некоторых конкретных воплощениях концентрация антитела против IL-4R или его антигенсвязывающего фрагмента, содержащаяся в фармацевтической композиции, составляет от 1 мг/л до 1000 мг/л.
В некоторых конкретных воплощениях фармацевтическая композиция содержит буфер, содержание буфера составляет от 1 мМ до 1000 мМ.
В некоторых воплощениях предложено применение антитела, которое связывается с человеческим IL-4R, или его антигенсвязывающего фрагмента, как описано выше, в получении лекарственного средства для лечения или предупреждения заболевания или патологического состояния, опосредованного IL-4R.
В некоторых воплощениях предложено применение фармацевтической композиции, как описано выше, в получении лекарственного средства для лечения или предупреждения заболевания или патологического состояния, опосредованного IL-4R.
В некоторых воплощениях предложено антитело, которое связывается с человеческим IL-4R, или его антигенсвязывающий фрагмент, как описано выше, для применения в лечении или предупреждении заболевания или патологического состояния.
В некоторых воплощениях предложена фармацевтическая композиция, описанная выше, для применения в лечении или предупреждении заболевания или патологического состояния.
В контексте настоящей заявки состояние или патологическое состояние могут представлять собой заболевание или патологическое состояния иммунной системы.
В некоторых воплощениях заболевание или патологическое состояние выбрано из группы, состоящей из следующих заболеваний или патологических состояний: астма, полипы носовой полости, хронический синусит, аллергическое кожное заболевание, эозинофильный эзофагит, хроническая обструктивная болезнь легких, аллергический ринит, артрит, воспалительное заболевание, аллергическая реакция, аутоиммунный лимфопролиферативный синдром, аутоиммунная гемолитическая анемия, пищевод Барретта, аутоиммунный увеит, туберкулез и нефропатия.
В по меньшей мере одном воплощении заболевание или патологическое состояние представляет собой астму.
В еще одних воплощениях заболевание или патологическое состояние представляет собой аллергическое кожное заболевание.
В некоторых воплощениях предложено антитело, которое связывается с человеческим IL-4R, или его антигенсвязывающий фрагмент, где указанный антигенсвязывающий фрагмент представляет собой Fab, Fv, scFv или F(ab')2.
В некоторых воплощениях предложен способ лечения и/или предупреждения заболевания или патологического состояния, опосредованного IL-4R, причем способ включает: введение терапевтически эффективного количества (или профилактически эффективного количества) антитела, которое связывается с человеческим IL-4R, или его антигенсвязывающего фрагмента, как описано выше, пациенту (или субъекту), нуждающемуся в этом.
В некоторых воплощениях предложен способ лечения и/или предупреждения заболевания или патологического состояния, опосредованного IL-4R, причем способ включает: введение терапевтически эффективного количества (или профилактически эффективного количества) фармацевтической композиции, как описано выше, пациенту (или субъекту), нуждающемуся в этом. В некоторых воплощениях предложен способ лечения и/или предупреждения иммунного заболевания, включающий введение терапевтически эффективного количества (или профилактически эффективного количества) антитела, которое связывается с человеческим IL-4R, или его антигенсвязывающего фрагмента или фармацевтической композиции, как описано выше, пациенту (или субъекту), нуждающемуся в этом.
Терминология
Для более легкого понимания настоящего раскрытия некоторые технические и научные термины конкретно определены ниже. Если в другом месте данного документа конкретно не определено иное, все другие технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют значение, обычно подразумеваемое специалистом средней квалификации в области, к которой принадлежит настоящая заявка.
Термин «человеческий IL-4R (hIL-4R)» означает человеческий рецептор цитокинов, который специфично связывается с интерлейки ном-4 (IL-4), IL-4Rα.
В том виде, в котором они используются в данном документе, трехбуквенный код и однобуквенный код для аминокислот представляют собой такие, как описано в J. Biol. Chem, 243, (1968) р3558.
Термин «антитело» относится к иммуноглобулину, который представляет собой структуру четырех пептидных цепей, образованную посредством связывания двух идентичных тяжелых цепей и двух идентичных легких цепей дисульфидными связями. Разные константные области тяжелой цепи иммуноглобулина демонстрируют разные составы и порядок последовательности аминокислот, представляя, вследствие этого, разные виды антигенности. Соответственно, иммуноглобулины могут быть подразделены на пять категорий (или так называемых изотипов иммуноглобулинов), а именно IgM, IgD, IgG, IgA и IgE, их тяжелые цепи представляют собой цепь μ, цепь δ, цепь γ, цепь α и цепь ε, соответственно. В соответствии с аминокислотным составом шарнирной области, а также числом и локализацией дисульфидных связей тяжелой цепи, один и тот же тип lg может быть дополнительно подразделен на разные подкатегории; например, IgG может быть подразделен на IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Легкая цепь может быть подразделена на цепь κ или λ, с учетом разных константных областей. Каждый из пяти lg может иметь цепь  κ или λ.
Легкая цепь антитела дополнительно содержит константную область легкой цепи, которая содержит цепь κ, λ человека или мыши, или ее варианты.
Тяжелая цепь антитела дополнительно содержит константную область тяжелой цепи, которая содержит IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 человека или мыши, или ее варианты.
Рядом с N-концом тяжелых цепей и легких цепей антитела, последовательность, примерно 110 аминокислот, сильно варьирует, которая известна как вариабельная область (область V); остальная часть аминокислотной последовательности рядом с С-концом относительно стабильна, которая известна как константная область (область С). Вариабельная область содержит три гипервариабельные области (HVR - от англ. hypervariable region) и четыре каркасные области (FR - от англ. framework region), имеющие относительно консервативную последовательность. Данные три гипервариабельные области определяют специфичность антитела, также известные как области, определяющие комплементарность (CDR). Каждая вариабельная область легкой цепи (LCVR - от англ. light chain variable region) и каждая вариабельная область тяжелой цепи (HCVR - от англ. heavy chain variable region) состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от N-конца к С-концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. Три CDR легкой цепи относятся к LCDR1, LCDR2 и LCDR3; три CDR тяжелой цепи относятся к HCDR1, HCDR2 и HCDR3.
Антитела включают мышиные антитела, химерные антитела, гуманизированные антитела и человеческие антитела, которые могут быть получены посредством рекомбинации, например, могут представлять собой рекомбинантные человеческие антитела, полученные посредством созревания аффинности.
Термин «рекомбинантное человеческое антитело» включает человеческие антитела, получаемые, экспрессируемые, создаваемые или выделяемые посредством метода генной инженерии, и данные используемые методики и способы хорошо известны в данной области, как например: (1) антитела, выделенные из животных, трансгенных в отношении гена иммуноглобулина человека, или животных, трансхромосомных в отношении гена иммуноглобулина человека (например, мышей), или полученной из них гибридомы; (2) антитела, выделенные из трансформированных клеток-хозяев, экспрессирующих данные антитела, таких как трансфектома; (3) антитела, выделенные из комбинаторной библиотеки рекомбинантных человеческих антител; и (4) антитела, получаемые, экспрессируемые, созданные или выделенные в результате сплайсинга последовательности гена иммуноглобулина человека до других ДНК-последовательностей или т.п. Такие рекомбинантные человеческие антитела содержат вариабельную область и константную область, такие области включают специфичные последовательности иммуноглобулина зародышевой линии человека, кодируемые генами зародышевой линии, а также включают последующие перестройки и мутации, такие как перестройки и мутации, происходящие во время созревания антитела.
Термин «мышиное антитело» в данном документе относится к моноклональным антителам против человеческого IL-4R, которые получают в соответствии со знанием и умениями в данной области. Во время получения объекту испытания инъецируют антиген IL-4R или полипептид, содержащий его эпитоп, и затем отделяют гибридому, экспрессирующую антитело, которое имеет желаемую последовательность или функциональные характеристики. В некоторых конкретных воплощениях мышиное антитело против IL-4R или его антигенсвязывающий фрагмент дополнительно сдержит константную(ые) область(и) легкой цепи мышиной цепи κ, λ или ее варианты, или дополнительно содержит константную(ые) область(и) тяжелой цепи мышиного IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4, или ее варианты.
Термин «человеческое антитело» включает антитела, имеющие вариабельную(ые) и константную(ые) область(ти) из последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии человека. Человеческие антитела по настоящей заявке могут включать аминокислотные остатки, которые не кодируются последовательностями иммуноглобулина зародышевой линии человека (например, мутации, вводимые посредством случайного или сайт-специфичного мутагенеза in vitro или посредством соматической мутации in vivo). Однако, термин «человеческое антитело» не включает антитело, в котором последовательности CDR, происходящие из зародышевой линии млекопитающего другого вида (как например, мыши), были привиты на последовательность каркасной области человека (а именно, «гуманизированное антитело»).
Термин «гуманизированное антитело», также известное как антитело с привитыми CDR, относится к антителам, созданным посредством прививания последовательностей CDR вида, не являющегося человеческим, в каркас вариабельной области человеческого антитела. Гуманизированные антитела преодолевает сильный гуморальный ответ, вызываемый химерными антителами, которые несут большое количество гетерогенных белковых компонентов. Для того, чтобы избежать снижения активности наряду со снижением иммуногенности, вариабельная область человеческого антитела может подвергаться минимальной обратной мутации с сохранением активности.
Термин «химерное антитело» представляет собой антитело, которое образовано слиянием вариабельной области мышиного антитела с константной областью человеческого антитела, химерное антитело может смягчать иммунный ответ, вызываемый мышиным антителом. Для создания химерного антитела сначала создают гибридому, секретирующую специфичное мышиное моноклональное антитело, затем ген вариабельной области клонируют из клеток гибридомы мыши, затем при желании клонируют ген константной области человеческого антитела, ген вариабельной области мыши лигируют с геном константной области человека с образованием химерного гена, который может быть вставлен в человеческий вектор, и, наконец, молекула химерного антитела экспрессируется в эукариотической или прокариотической промышленной системе. Константная область человеческого антитела выбрана из константной(ых) области(ей) тяжелой цепи человеческого IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4, или ее вариантов, предпочтительно константной(ых) области(ей) тяжелой цепи человеческого IgG2 или IgG4, или IgG1, которая не обладает ADCC (антителозависимая клеточная цитотоксичность) после аминокислотной мутации.
Термин «антигенсвязывающий фрагмент» относится к Fab фрагменту, Fab' фрагменту, F(ab')2 фрагменту, обладающему антигенсвязывающей активностью, Fv фрагменту, scFv фрагменту, связывающемуся с человеческим IL-4R, а также полипептиду или белку, содержащему приведенные выше фрагменты. Указанный «антигенсвязывающий фрагмент» содержит одну или более CDR антитела согласно настоящей заявке. Fv фрагмент представляет собой минимальный фрагмент антитела, несущий все антигенсвязывающие сайты, он содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, но без константной области. Обычно антитело Fv дополнительно содержит полипептидный линкер между доменами VH и VL и способно к образованию структуры, необходимой для связывания антигена. Также, разные линкеры могут быть использованы для соединения вариабельных областей двух антител с образованием полипептидной цепи, а именно одноцепочечного антитела или одноцепочечного Fv (scFv).
Термин «связывание с IL-4R» относится к способности взаимодействовать с человеческим IL-4R. Термин «сайт связывания антигена», в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к трехмерным сайтам, распознаваемым антителом или антигенсвязывающим фрагментом по настоящей заявке.
Термин «эпитоп» относится к сайтам на антигене, которые специфично связываются с иммуноглобулином или антителом. Эпитоп может быть образован смежными аминокислотами или несмежными аминокислотами, которые были приближены, благодаря третичной укладке белка. Эпитоп, образованный смежными аминокислотами, обычно сохраняется после воздействия денатурирующего растворителя, тогда как эпитоп, образованный третичной укладкой, обычно утрачивается после обработки денатурирующими растворителями. Эпитопы обычно включают по меньшей мере 3-15 аминокислот в уникальной пространственной конформации. Способы определения эпитопа, связанного данным антителом, хорошо известны в данной области, включая анализ иммуноблоттинг и иммунопреципитация и т.п. Способы определения пространственной конформации эпитопа включают методики в данной области и методики, описанные в данном документе, такие как рентгеноструктурный анализ и двумерный ядерный магнитный резонанс и т.п.
D
-7
Термины «специфично связывается с» и «селективно связывается с» относятся к связыванию антитела с эпитопом на заданном антигене. Обычно, антитело связывается с заданным антигеном с равновесной константой диссоциации (K) приблизительно меньше чем 10 М или даже меньше, и аффинность антитела в отношении связывания с заданным антигеном по меньшей мере в два раза выше, чем в случае неспецифичных антигенов (таких как БСА (бычий сывороточный альбумин)), отличных от заданного антигена или близкородственных антигенов, как измерено на приборе посредством методики поверхностного плазмонного резонанса (SPR - от англ. surface plasmon resonance), где рекомбинантный человеческий IL-4R используют в качестве аналита, в то время как антитело используют в качестве лиганда. Термин «антитело, распознающее антиген» может использоваться в данном документе взаимозаменяемо с термином «антитело, специфично связывающееся с».
Термин «перекрестная реакция» относится к способности антитела по настоящей заявке связываться с IL-4R из отличающегося вида. Например, антитело по настоящей заявке, которое связывается с человеческим IL-4R, может также связываться с IL-4R из другого вида. Перекрестную реактивность измеряют посредством выявления специфичной реактивности с очищенным антигеном в анализах связывания (например, SPR и ELISA), или посредством выявления связывания или функционального взаимодействия с клетками, физиологически экспрессирующими IL-4R. Способы определения перекрестной реактивности включают стандартные анализы связывания, как описано в данном документе, такие как анализ поверхностный плазмонный резонанс (SPR) или проточная цитометрия.
Термин «нейтрализация» или «блокирование» антитела относится к антителу, которое связывается с hIL-4R и приводит к ингибированию биологической активности hIL-4 и/или hIL-3. Данное ингибирование биологической активности hIL-4 и/или IL-13 может оцениваться посредством измерения одного или более индикаторов биологической активности hIL-4/или hIL-13, хорошо известных в данной области, как например, hIL-4 и/или hIL-13-индуцированная активация клеток и связывание hIL-4 с hIL-4R, например, таких как в CN 103739711 А. Предполагается, что термин «ингибирование роста» (например, в отношении клеток) включает любое поддающееся измерению уменьшение в росте клеток.
Термины «вызывающий иммунный ответ» и «усиливающий иммунный ответ» используются взаимозаменяемо и относятся к иммунному ответу на стимуляцию конкретным антигеном (а именно, пассивному или адаптивному). В отношении CDC (от англ. complement-dependent cytotoxicity - комплемент-зависимая цитотоксичность) или ADCC, термин «вызывающий» относится к стимуляции конкретного механизма для прямого уничтожения клеток.
Термин «ADCC» (антителозависимая клеточная цитотоксичность) относится к клеткам, экспрессирующим Fc-рецептор, которые непосредственно уничтожают клетки-мишени, покрытые антителом, в результате распознавания Fc-сегмента антитела. Эффекторная функция ADCC антитела может ослабляться или исключаться в результате модификации Fc-сегмента IgG. Модификация относится к мутациям, выбранным из группы, состоящей из N297A, L234A и L235A в IgG1, химере IgG2/4 и F235E или L234A/E235A мутации в IgG4.
Слитый белок представляет собой белковый продукт, который совместно экспрессируется двумя генами посредством ДНК-рекомбинации. Рекомбинантный слитый белок внеклеточной области IL-4R и Fc представляет собой слитый белок, полученный посредством совместной экспрессии внеклеточной области IL-4R с фрагментом Fc антитела человека в результате рекомбинации ДНК. Внеклеточная область IL-4R относится к части белка IL-4R, экспрессируемой за пределами клеточной мембраны.
Способы получения и очистки антител и антигенсвязывающих фрагментов хорошо известны в данной области и могут быть найдены, например, в руководстве по лабораторным технологиям с антителами Колд-Спринг-Харбор, глава 5-8 и 15. Например, мыши могут быть иммунизированы человеческим IL-4R или его фрагментом, и затем полученные антитела могут быть ренатурированы, очищены и секвенированы с использованием общепринятых способов, хорошо известных в данной области. Антигенсвязывающие фрагменты можно также получать общепринятыми способами. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент, описанные в данном документе, генетически конструируют с добавлением одной или более человеческих FR в CDR, не являющиеся человеческими. Последовательности FR зародышевой линии человека могут быть получены из ImMunoGeneTics (IMGT), через их веб-сайт http://imgt.cines.fr, или из The Immunoglobulin FactsBook, 2001ISBN012441351.
c
Сконструированное антитело или антигенсвязывающий фрагмент можно получать и очищать, используя традиционные способы. Например, последовательности кДНК, кодирующие тяжелую цепь и легкую цепь, могут быть клонированы и рекомбинированы в экспрессионный вектор GS. Затем клетки СНО можно подвергать стабильной трансфекции рекомбинантным экспрессионным вектором иммуноглобулина. Последовательность гуманизированного антитела в данном документе вставляют в соответствующий экспрессионный вектор посредством технологии молекулярного клонирования, и соответствующее гуманизированное антитело получают посредством экспрессии в экспрессионной системе на основе клеток HEK293. В качестве более рекомендованного способа в данной области экспрессионная система млекопитающего может приводить к гликозилированию антител, обычно на высоко консервативном N-конце в F области. Стабильные клоны могут быть получены в результате экспрессии антитела, специфично связывающегося с человеческим антигеном. Позитивные клоны могут быть размножены в культуральной среде, не содержащей сыворотку, для получения антител в биореакторах. Культуральная среда, в которую антитело секретировалось, может быть собрана и очищена общепринятыми методиками. Антитело может подвергаться фильтрованию и концентрированию с использованием стандартных методик. Растворимые смеси и мультимеры могут быть эффективно удалены стандартными методиками, включая молекулярное сито или ионный обмен. Полученный продукт будет сразу же заморожен, например, при -70°С, или может быть лиофилизирован.
Антитело по настоящему изобретению может представлять собой моноклональное антитело (mAb), которое относится к антителу, полученному из моноклональной линии, которая представляет собой эукариотическую, прокариотическую или фаговую клональную клеточную линию, но не ограничивается ими. Монокпональные антитела и их антигенсвязывающий фрагмент могут быть получены, например, посредством технологий на основе гибридомы, методов генной инженерии, технологий фагового дисплея, технологий синтеза (например, CDR-прививка) или других технологий, известных в данной области.
Антитела могут представлять собой моноспецифичные, биспецифичные или мультиспецифичные антитела. Мультиспецифичные антитела демонстрируют специфичность в отношении разных эпитопов пептида-мишени или могут также содержать антигенсвязывающие домены, которые демонстрируют специфичность в отношении более чем одного пептида-мишени. Человеческое антитело против IL-4R может быть связано с или совместно экспрессироваться с другой функциональной молекулой (такой как другой пептид или белок). Например, антитело или его фрагменты могут быть функционально (например, посредством химического связывания, слияния генов, нековалентного связывания или других способов) соединены с одной или более другими молекулами (например, другое антитело или антигенсвязывающий фрагмент) с получением биспецифичного или мультиспецифичного антитела, обладающего второй специфичностью связывания.
Термин «введение», «осуществление введения» и «обработка» при применении к животному, человеку, экспериментальному субъекту, клетке, ткани, органу или биологической жидкости, относится к приведению экзогенного фармацевтического, терапевтического, диагностического средства или композиции в контакт с животным, человеком, субъектом, клеткой, тканью, органом или биологической жидкостью. Термины «введение», «осуществление введения» и «обработка» могут относиться, например, к терапевтическим, фармакокинетическим, диагностическим, исследовательским и экспериментальным способам. Обработка клетки включает приведение реагента в контакт с клеткой, а также приведение реагента в контакт с жидкостью, где указанная жидкость находится в контакте с клеткой. Термины «введение», «осуществление введения» и «обработка» также означают обработку in vitro и ex vivo, например клетки, посредством использования реагента, диагностического средства, связывающей композиции или посредством использования другой клеткой. Термин «лечение», при применении к субъекту-человеку, субъекту ветеринарии или субъекту исследования, относится к терапевтическому лечению, профилактическим или превентивным мерам, к исследовательским, а также диагностическим применениям.
Термин «лечить» означает вводить терапевтическое средство (такое как композиция, содержащая любое из антител или их антигенсвязывающего фрагмента по настоящей заявке) внутрь или наружно пациенту (или субъекту), имеющему, с подозрением на то, что имеет, или чувствительному к одному или более симптомам заболевания, в отношении которого данное средство обладает известной терапевтической активностью. Типично терапевтическое средство вводят в количестве, эффективном для облегчения одного или более симптомов заболевания у пациента (или субъекта) или популяции, подлежащих лечению, или вызывая регрессию такого(их) симптома(ов) или ингибируя прогрессирование такого(их) симптома(ов) до какой-либо клинически измеряемой степени. Количество терапевтического средства, которое является эффективным для облегчения какого-либо определенного симптома заболевания (также называемое «терапевтически эффективным количеством»), может варьировать в зависимости от факторов, таких как течение заболевания, возраст и масса пациента (или субъекта), и способности лекарственного средства вызывать желаемый эффект у пациента (или субъекта). Был ли облегчен симптом заболевания можно оценить посредством любого клинического измерения, обычно используемого лечащими врачами или другими квалифицированными медицинскими работниками, для оценки тяжести или статуса прогрессирования того симптома. В то время как воплощение настоящей заявки (например, способ лечения или продукт производства) может не быть эффективным в облегчении исследуемого(ых) симптома(ов) заболевания у каждого пациента (или субъекта), оно должно облегчать исследуемый(е) симптом(ы) заболевания у статистически значимого числа пациентов (или субъектов), как определено любым статистическим критерием, известным в данной области, таким как t-критерий Стьюдента, критерий хи-квадрат, U-критерий Манна и Уитни, критерий Краскела - Уоллиса (Н-критерий), критерий Джонкхира-Терпстры и критерий Уилкоксона.
Термин «консервативная модификация» или «консервативное замещение или замена» означает замену аминокислот в белке другими аминокислотами, демонстрирующими похожие характеристики (например, заряд, размер боковых цепей, гидрофобность/гидрофильность, конформация и жесткость остова и т.д.), таким образом, что данную модификацию можно часто осуществлять без изменения биологической активности белка. Специалисты в данной области знают, что в общем одна аминокислотная замена в заменимой области полипептида существенно не изменяет биологическую активность (см., например, Watson et al. (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin / Cummings Pub. Co., page 224 (4th edition)). Кроме того, замена аминокислот с похожей структурой или функцией маловероятно нарушит биологическую активность.
Термин «эффективное количество» включает количество, достаточное для смягчения или предупреждения симптома или признака патологического состояния. Эффективное количество также означает количество, достаточное для обеспечения или облегчения диагностирования. Эффективное количество для конкретного субъекта или субъекта ветеринарии может варьировать в зависимости от факторов, таких как состояние, подлежащее лечению, общее здоровье субъекта, путь и доза введения, и тяжесть побочных эффектов. Эффективное количество может представлять собой максимальную дозу или протокол дозирования, которые позволяют избежать значимых побочных эффектов или токсичных эффектов.
Термин «экзогенный» относится к веществам, которые образуются вне организма, клетки или тела человека, в зависимости от контекста.
Термин «эндогенный» относится к веществам, которые продуцируются в клетке, организме или теле человека, в зависимости от контекста.
Термин «гомология» или «идентичность» относится к сходству последовательностей между двумя полинуклеотидными последовательностями или между двумя полипептидами. Когда положение в двух последовательностях, подлежащих сравнению, занято одной и той же мономерной субъединицей - основанием или аминокислотой - например, когда положение в каждой из двух молекул ДНК занято аденином, тогда данные молекулы являются гомологичными в данном положении. Процент идентичности двух последовательностей является функцией числа совпадающих/гомологичных положений, являющихся общими у данных двух последовательностей, деленного на число сравниваемых положений, и затем умноженного на 100%. Например, при оптимальном выравнивании последовательностей, если 6 из 10 положений в двух последовательностях совпадают или являются гомологичными, тогда данные две последовательности обладают 60%-ной идентичностью. В общем, сравнение проводят, когда две последовательности выравнивают с получением максимального процента идентичности. В том виде, в которой она используется в данном документе, фраза «по меньшей мере 85%-ная идентичность последовательностей» означает, что вариант обладает по меньшей мере 85%-ной гомологией с исходной последовательностью, две последовательности обладают по меньшей мере 85%-ной гомологией. В некоторых воплощениях, обладая по меньшей мере 86%-ной, 87%-ной, 88%-ной, 89%-ной, 90%-ной, 91%-ной, 92%-ной, 93%-ной, 94%-ной, 95%-ной, 96%-ной, 97%-ной, 98%-ной или 99%-ной гомологией последовательностей; в некоторых конкретных воплощениях, обладая 90%-ной, 95%-ной или 99%-ной или выше; в других конкретных воплощениях, обладая по меньшей мере 95%-ной гомологией последовательностей. Аминокислотная последовательность, обладающая по меньшей мере 85%-ной идентичностью последовательностей, включает одну или более аминокислотных делеций, вставок или мутаций по типу замены при сравнении с исходной последовательностью.
В том виде, в котором они используются в данном документе, выражения «клетка», «клеточная линия» и «клеточная культура» используются взаимозаменяемо, и все такие обозначения включают их потомство. Таким образом, слова «трансформант» и «трансформированная клетка» включают первичные исследуемые клетки и полученные из них культуры без учета числа переносов. Также следует понимать, что все потомство не может быть с точностью идентичным по содержанию ДНК вследствие целенаправленных или случайных мутаций. Также учитывается потомство с мутациями, полученное посредством скрининга, которое имеет такую же функцию или биологическую активность, как функция или биологическая активность исходно трансформированной клетки.
Термин «возможный» или «возможно» означает, что событие или ситуация, которая следует, может происходить, но не обязательно происходит. Описание включает примеры, в которых событие или ситуация происходит или не происходит. Например, фраза «возможно содержит 1-3 вариабельную(ые) область(ти) тяжелой цепи антитела» означает, что вариабельная область тяжелой цепи антитела с конкретной последовательностью может присутствовать, но не обязательно присутствует.
Термин «фармацевтическая композиция» относится к композиции, содержащей смесь одного или более антител или их антигенсвязывающих фрагментов, как описано в данном документе, или его(их) физиологически/фармацевтически приемлемой соли или пролекарства с другими химическими компонентами, а также дополнительными компонентами, такими как физиологически/фармацевтически приемлемые носители и вспомогательные вещества. Целью фармацевтической композиции является содействие введению в организм, облегчение поглощения активного вещества и оказание, таким образом, биологического действия.
Описание графических материалов
Фиг. 1: В мышиной модели дерматита после сенсибилизации ацетоном гуманизированные антитела hu25G7-A, hu25G7-B и референсное антитело Дупилумаб в качестве положительного контроля вводили подкожно дважды в неделю, в сутки 27 измеряли толщину уха мышей. Результаты показывают, что, в сравнении с контрольной группой, hu25G7-A, hu25G7-B и Дупилумаб может эффективно уменьшать толщину уха мышей, и hu25G7-B демонстрирует эффект, лучше, чем эффект Дупилумаба.
Подробное описание раскрытия
Далее в данном документе настоящее раскрытие дополнительно описано со ссылкой на примеры. Однако, объем настоящего раскрытия не ограничивается ими. В примерах, где не описаны конкретные условия, эксперименты обычно проводят в общепринятых условиях, как описано в руководстве по лабораторным технологиям с антителами и молекулярному клонированию, Колд-Спринг-Харбор, или в условиях, предложенных производителями сырья или продукта. Когда источник реагентов конкретным образом не приведен, реагенты представляют собой реагенты, имеющиеся в продаже.
Пример 1: Иммунизация мышей и тестирование
Рекомбинантный белок IL-4R человека с меткой his (h-IL-4R-his), рекомбинантный белок IL-4R с меткой his (m-IL-4R-his) и рекомбинантный белок IL-4R макака-резуса с меткой his (rhesus-IL-4R-his) синтезировали с помощью Acrobiosystems, экспрессировали в HEK293 и очищали.
Рекомбинантный белок человеческого IL-4R с Fc-меткой человека (h-IL-4R-Fc) конструировали, экспрессировали и очищали самостоятельно. Очищенный белок использовали в каждом из следующих экспериментов в разделе Примеры.
Число и положение аминокислотных остатков CDR в областях VL и VH антитела или антигенсвязывающего фрагмента в данном примере соответствуют известной системе нумерации Kabat (LCDR1-3, HCDR2-3) или соответствуют системе нумерации Kabat и CHOTHIA (ABM) (HCDR1).
Моноклональные антитела против человеческого IL4R получали посредством иммунизации мышей. В эксперименте использовали самок мышей C57BL/6 в возрасте 6-8 недель (JOINN Laboratories (Suzhou) Research Center Co., Ltd., номер лицензии на животноводство: 201503052).
Среда кормления: уровень SPF (от англ. Specified Pathogen Free - свободный от патогенной флоры). Сразу после приобретения мышей их содержали в лаборатории в течение 1 недели, адаптировали к циклу света и темноты 12/12-часов, при температуре 20-25°С с влажностью 40-60%. Адаптированных мышей делили на 3 клетки, по 5 в каждой клетке. Антиген иммунной системы представлял собой рекомбинантный белок человеческого IL-4R с Fc-меткой (h-IL4R-Fc, концентрация 0,73 мг/мл). Антиген эмульгировали посредством адъюванта Фрейнда (sigma, кат. №F5881): полный адъювант Фрейнда (CFA, Pierce, кат. №77140) использовали для первой иммунизации, и адъювант нуклеиновой кислоты (CpG, Shanghai Sangon) и алюминиевый адъювант (Alum, Thermo, кат.№77161) использовали для остальной части повторной иммунизации.
В сутки 0, 70 мкг/мышь эмульгированного антигена инъецировали внутрибрюшинно (в.б.). В сутки 14, 28, 42, 56, 77, в соответствии с массой спины и увеличением объема живота, антиген инъецировали в спину и внутрибрюшинно (каждая инъекция 0,1 мл). Осуществляли забор крови в сутки 21, 35, 49, 63 и 84 для анализа крови. Анализ ELISA (от англ. enzyme-linked immunosorbent assay - твердофазный иммуноферментный анализ) проводили на мышиной сыворотке в соответствии с Примером анализа 1 для определения титра антител в мышиной сыворотке. После четвертой иммунизации мышей с высоким титром антител в сыворотке и титром, имеющим тенденцию к выходу на плато, отбирали для слияния спленоцитов; за трое суток до слияния проводили повторную иммунизацию; раствор антигена, полученный посредством использования фосфатного буфера, инъецировали внутрибрюшинно в количестве 10 мкг/мышь. Используя оптимизированные ПЭГ-опосредованные стадии слияния, лимфоциты селезенки и миеломные клетки, клетки Sp2/0 (АТСС CRL-8287™) сливали с получением гибридом.
Пример 2: Анализ ELISA и осуществление скрининга антител
1. Анализ связывания ELISA:
Анализ ELISA использовали для выявления свойств связывания антител против IL-4R. Использовали планшет для микротитрования, непосредственно покрытый рекомбинантным белком IL-4R с меткой his, антитело добавляли в каждую лунку и затем активности связывания данного антитела с антигеном выявляли посредством добавления вторичного антитела (антитело против первичного антитела Fc, конъюгированное с HRP (от англ. horseradish peroxidase - пероксидаза хрена)), и субстрата HRP ТМВ (от англ. tetramethylbenzidine - тетраметилбензидин).
50
Белком IL-4R-his человека или макака-резуса покрывали 96-луночный планшет для микротитрования, 100 мкл на лунку в концентрации 0,5 мкг/мл, и инкубировали в течение ночи при 4°С. Планшет промывали промывочным раствором три раза, 250 мкл/лунка. Каждую стадию промывки проводили при встряхивании на протяжении 10 секунд для обеспечения достаточной промывки. 200 мкл/лунка блокирующего раствора добавляли и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 часов. Планшет промывали промывочным раствором три раза, 250 мкл/лунка. Каждую стадию промывки проводили при встряхивании в течение 10 секунд для обеспечения достаточной промывки. 100 мкл антитела против IL-4R, подлежащего анализу, разведенного разбавителем, добавляли в каждую лунку и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. Планшет промывали промывочным раствором три раза, 250 мкл/лунка. 100 мкл вторичного антитела козы против человеческого IgG, меченного HRP, (разведенного в соотношении 1:20000 разбавителем) добавляли в каждую лунку и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. Планшет промывали промывочным раствором три раза, 250 мкл/лунка. 100 мкл ТМВ добавляли в каждую лунку, и реакцию поддерживали в течение 15 минут в темноте. 50 мкл 0,16 М/л серной кислоты добавляли в каждую лунку. Значение OD (от англ. optical density - оптическая плотность) при 450 нм получали посредством микропланшет-ридера Thermo MultiSkanFc, рассчитывали значение ЕС (от англ. half maximal effective concentration - полумаксимальная эффективная концентрация) связывания антитела против IL-4R с IL-4R. 2. Анализ блокирования ELISA:
50
В данном анализе посредством эксперимента по блокированию in vitro, выявляли блокирование связывания человеческого IL-4R с человеческим IL-4 выбранными антителами против человеческого IL-4R. Конкретно, рекомбинантным белком IL-4R с меткой Fc покрывали 96-луночный планшет для микротитрования, антитело, которое связывает человеческий IL-4R, добавляли для полного связывания с эпитопом, и затем добавляли IL-4 (Biolegend, кат.№574004), антитело против IL-4, конъюгированное с биотином, и нейтравидин-HRP (Pierce, кат.№31001) использовали для выявления того, может ли IL-4 связываться с IL-4R, значение IC (от англ. half maximal inhibitory concentration - концентрация полумаксимального ингибирования) рассчитывали в отношении блокирования антителом против IL-4R связывания IL-4/IL-4R.
50
Человеческим белком IL-4R-Fc покрывали 96-луночный планшет для микротитрования, 100 мкл на лунку в концентрации 0,5 мкг/мл и инкубировали в течение ночи при 4°С. Планшет промывали промывочным буфером три раза, 250 мкл на лунку. Каждую стадию промывки проводили при встряхивании в течение 10 секунд для обеспечения достаточной промывки. 200 мкл/лунка блокирующего раствора добавляли и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 часов. Планшет промывали промывочным раствором три раза, 250 мкл на лунку. Каждую стадию промывки проводили при встряхивании в течение 10 секунд для обеспечения достаточной промывки. 100 мкл антитела против IL-4R, предназначенного для анализа, разведенного разбавителем, добавляли в каждую лунку и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. Планшет промывали промывочным раствором три раза, 250 мкл/лунка. 100 мкл разведенного IL-4 добавляли в каждую лунку и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. Планшет промывали промывочным раствором три раза. 100 мкл разведенного антитела против IL-4, конъюгированного с биотином, добавляли в каждую лунку и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. Планшет промывали промывочным раствором три раза. Нейтравидин, меченный HRP (разведенный в соотношении 1:5000 разбавителем), добавляли и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. Планшет промывали промывочным раствором три раза, 250 мкл/лунка. 100 мкл ТМВ добавляли в каждую лунку, и реакцию поддерживали в течение 15 минут в темноте. 50 мкл 0,16 М/л серной кислоты добавляли в каждую лунку. Значение OD при 450 нм получали посредством микропланшет-ридера Thermo MultiSkanFc, значение IC рассчитывали в отношении антитела против IL-4R, блокирующего связывание IL-4R с IL-4.
Пример 3: Эксперимент по оценки активности репортерных клеток с использованием антител, которые связываются с человеческим IL-4R
Клетки HEK-Blue IL-4 приобретали в Invivogen (кат. №hkb-stat6). Клетки стабильно трансфицировали геном человеческого IL-4R и STAT6-опосредованным геном SEAP (от англ. secreted embryonic alkaline phosphatase - секретируемая эмбриональная щелочная фосфатаза). SEAP, секретируемую в супернатант, можно выявлять посредством субстрата SEAP QUANTI-Blue для характеристики уровня активации IL-4R-сигнального пути.
50
2
2
5
В данном эксперименте выявляли активацию клеток HEK-Blue IL-4, и клеточную активность in vitro антитела против IL-4R оценивали в соответствии с IC. Клетки HEK-Blue IL-4 культивировали в среде DMEM (от англ. Dulbecco modified Eagle's medium -среда Иглу, модифицированная по Дульбекко), содержащей 10% FBS (от англ. Fetal Bovine Serum - фетальная телячья сыворотка), 100 мкг/мл Зеоцина (Invivogen, кат. № ant-zn-05) и 10 мкг/мл бластицидина (Invivogen, кат. № ant-bl-05); клетки субкультивировали 2-3 раза в неделю, в соотношении 1:5 или 1:10. Для субклонирования среду удаляли, и слой клеток промывали 5 мл 0,25% трипсина, затем трипсин удаляли, клетки помещали в инкубатор на 3 - 5 минут, и свежую среду добавляли для ресуспендирования клеток. 100 мкл клеточной суспензии добавляли в 96-луночный планшет для культуры клеток, при плотности 5×10 клеток/мл, среда представляла собой DM ЕМ, содержащую 10% FBS, 100 мкг/мл Зеоцина и 30 мкг/мл бластицидина, и 100 мкл стерильной воды добавляли по всему 96-луночному планшету. Планшет для культуры инкубировали в инкубаторе в течение 24 часов (37°С, 5% CO). Как только клетки прилипали к стенке, 100 мкл серийно разведенного антитела, подлежащего анализу, добавляли в каждую лунку. Планшет для культуры инкубировали в инкубаторе в течение 20-24 часов (37°С, 5% CO). 20 мкл клеточного супернатанта переносили из каждой лунки в новый 96-луночный плоскодонный планшет. 180 мкл раствора субстрата QUANTI-Blue добавляли, и планшет для культуры инкубировали в инкубаторе в темноте в течение 1-3 часов. Поглощение при 620 нм измеряли посредством микропланшет-ридера (Thermo MultiSkanFc).
Пример 4: Антитело, которое связывается с человеческим IL-4R, ингибирует пролиферацию клеток TF-1
5
2
Клетки TF-1 (АТСС CRL-2003) представляют собой клетки лимфомы, которые экспрессируют IL-4R и являются чувствительными к цитокинам, таким как IL-4/IL-13. IL-4 может стимулировать пролиферацию клеток TF-1 в отсутствии GM-CSF (от англ. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor - Гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор). Нейтрализующие активности разных антител против IL-4R сравнивали в эксперименте посредством добавления нейтрализующих антител для блокирования пути IL-4 и для ингибирования пролиферации клеток TF-1. Клетки TF-1 культивировали в среде RPMI1640, содержащей 10% FBS, 2 нг/мл GM-CSF (R&D, кат. №215-GM-010); клетки субкультивировали 2-3 раза в неделю в соотношении 1:10. 100 мкл клеточной суспензии добавляли в 96-луночный планшет для культуры клеток, при плотности 2×10 клеток/мл, среда представляла собой среду RPMI1640, содержащую 10% FBS, и 100 мкл стерильной воды добавляли по всему 96-луночному планшету. 50 мкл серийно разведенного антитела, подлежащего анализу, и 50 мкл IL-4 (R&D, кат. №204-IL-050) в конечной концентрации 0,7 нг/мл добавляли в каждую лунку, планшет для культуры инкубировали в инкубаторе в течение 72 часов (37°С, 5% CO). Когда культивирование заканчивали, пролиферацию клеток выявляли, используя набор CTG (Promega, кат. №G7572).
Пример 5:
Эксперименты по аффинности и кинетике связывания in vitro Прибор Biacore, GE использовали для определения аффинности связывания гуманизированного антитела против человеческого IL-4R с человеческим IL-4R.
Человеческое антитело против захватывающего антитела ковалентно связывалось с биосенсорным чипом СМ5 прибора Biacore (Biacore Х100, GE) в соответствии со способом, описанным в инструкции набора человеческих антител против захватывающего антитела (кат. №BR-1008-39, GE), таким образом, некоторое количество антитела, подлежащего анализу, захватывалось за счет аффинности; серия градиентов концентраций антигенов IL-4R (антигены IL-4R, приобретенные у Acrobiosystems, кат .№ILR-H5221) пропускалась через поверхность чипа, сигналы взаимодействия выявляли в реальном времени, используя приборы Biacore (Biacore Х100, GE), с получением кривых связывания и диссоциации. После диссоциации каждый цикл завершался, биочип очищали и регенерировали посредством раствора для регенерации, предоставленного внутри набора человеческих антител против захватывающего антитела. Набор для связывания аминогрупп, используемый в эксперименте, приобретали у GE (кат. №BR-1000-50, GE), и буфер представлял собой буферный раствор HBS-EP+10× (кат. №BR-1006-69, GE), разбавленный д.и. водой (деионизированной водой) до 1× (рН 7,4).
Данные, полученные из эксперимента, аппроксимировали с помощью (1:1) модели связывания, используя программное обеспечение для оценки 2.0 GE BiacoreX100, и получали значение аффинности.
Пример 6: Последовательность и получение антител
Посредством эксперимента по ELISA связывания (ELISA связывания человеческого IL-4R-his) и эксперимента по ELISA блокирования (ELISA блокирования hIL-4/IL-4R) в приведенном выше Примере 2, анализа ингибирования активации клеток HEK293-Blue IL-4, стимулированных IL-4 в Примере 3, и анализа ингибирования пролиферации клеток TF-1, стимулированных IL-4 в Примере 4, отбирали две линии моноклональных клеток гибридомы, демонстрирующие наилучшую активность in vitro. Результаты анализа активности показаны в Таблице 2.
Отбирали линии моноклональных клеток гибридомы 25G7 и 7В10 с наилучшей активностью in vitro, и оттуда клонировали последовательность моноклонального антитела. Способ клонирования последовательности из гибридомы выглядит следующим образом. Клетки гибридомы собирали в логарифмическую фазу роста, РНК выделяли посредством тризола (Invitrogen, 15596-018) (в соответствии с инструкциями к набору), проводили обратную транскрипцию (обратная транскриптаза PrimeScript™, Takara, кат.№2680А). кДНК, полученную в результате обратной транскрипции, амплифицировали посредством ПЦР (полимеразная цепная реакция), используя набор праймеров к мышиному lg (Novagen, ТВ326 Rev. В0503), и затем доставляли в компанию, занимающуюся секвенированием, для секвенирования, и анализировали полученную последовательность антитела.
Последовательности вариабельной области тяжелой цепи и легкой цепи мышиного моноклонального антитела 25G7 выглядят следующим образом:
HCVR 25G7
LCVR 25G7
Последовательности CDR, содержащиеся в них, показаны в Таблице 3.
Последовательности вариабельной области тяжелой цепи и легкой цепи мышиного моноклонального антитела 7В10 выглядят следующим образом:
HCVR 7В10
LCVR7B10
Последовательности CDR, содержащиеся в них, показаны в Таблице 4.
Полученную последовательность вариабельной области связывали с последовательностью константной области человека с получением последовательности химерного антитела человека-мыши. Используя технологию молекулярного клонирования, последовательность химерного антитела вставляли в соответствующий экспрессионный вектор. Используя экспрессионную систему клеток HEK293, могут быть получены химерные антитела человека-мыши 25G7-C и 7В10-С.
Согласно способу Примеров 2-5, очищенное химерное антитело анализировали в отношении активности in vitro. Данные показаны в Таблице 5. Результаты показали, что в случае антитела 25G7-C, и блокирующее действие на связывание IL-4 и ингибирующее действие на пролиферацию клеток были значимо лучше, чем блокирующее действие на связывание IL-4 и ингибирующее действие на пролиферацию клеток референсного антитела Дупилумаб (синтезированного в соответствии с WHO Drug Information, Vol. 26, No. 4, 2012 synthesis).
Пример 7: Эксперимент по гуманизации мышиного антитела
Две линии (25G7 и 7В10), демонстрирующие самую сильную функциональную активность среди полученных мышиных антител, подвергали гуманизации. На основе полученной типичной структуры мышиного антитела VH/VLCDR, последовательности вариабельной области тяжелой, легкой цепей выравнивали посредством базы данных по антителам зародышевой линии, с получением матрицы зародышевой линии человека с высокой гомологией. Среди них, каркасная область легкой цепи зародышевой линии человека происходит из генов легкой цепи каппа человека, предпочтительно матриц IGKV3-1T01 (SEQ ID NO 22, в случае антитела 25G7) и IGKV2D-29*01 (SEQ ID NO 24, в случае антитела 7В10) легкой цепи зародышевой линии человека. Каркасная область тяжелой цепи зародышевой линии человека происходит из тяжелой цепи человека, предпочтительно матрицы IGHV3-48*01 (SEQ ID NO 21, в случае антитела 25G7) и IGHV1-2*02 (SEQ ID NO 23, в случае антитела 7В10) тяжелой цепи зародышевой линии человека.
Последовательности матрицы зародышевой линии человека показаны ниже.
Матрица IGHV3-48*01 тяжелой цепи зародышевой линии человека:
Матрица IGKV3-11*01 легкой цепи зародышевой линии человека:
Матрица IGHV1-2*02 тяжелой цепи зародышевой линии человека:
Матрица IGKV2D-29*01 легкой цепи зародышевой линии человека:
Области CDR мышиного антитела прививали на выбранную матрицу для гуманизации с замещением гуманизированной вариабельной области, которую затем рекомбинировали с константной областью IgG. Затем, в зависимости от трехмерной структуры мышиного антитела, вставленные остатки, остатки, которые непосредственно взаимодействуют с областями CDR, и остатки, которые оказывают важное влияние на конформацию VL и VH, подергали обратной мутации с получением целого ряда гуманизированных молекул.
Среди них, Hu7B10-VH-a, hu7B10-VH-b и hu7B10-VH-c модифицировали с фармацевтической целью, и первое положение матрицы зародышевой линии человека тяжелой цепи меняли с Q на Е. hu25G7 также подвергали модификации с фармацевтической целью. Последовательности вариабельной области тяжелой цепи двух гуманизированных антител представляют собой такие, как показано в SEQ ID NO: 25-27 и SEQ ID NO: 31-33, соответственно; последовательности вариабельной области легкой цепи представляют собой такие, как показано в SEQ ID NO: 28-30 и SEQ ID NO: 34-36, соответственно.
hu25G7-VH-a:
hu25G7-VH-b:
hu25G7-VH-c:
hu25G7-VL-a:
hu25G7-VL-b:
hu25G7-VL-c:
hu7B10-VH-a:
hu7B10-VH-b:
hu7B10-VH-c:
hu7B10-VL-a:
hu7B10-VL-b:
hu7B10-VL-c:
Выбор матриц и схема обратных мутаций для клона гибридомы 25G7 показаны в Таблице 6.
Выбор матриц и схема обратных мутаций для клона гибридомы 7В10 показаны ниже в Таблице 7:
После маломасштабного анализа экспрессии приведенных выше комбинаций легкой и тяжелой цепей и сравнения числа обратных мутаций, конечную молекулу гуманизированного антитела hu25G7 (с тяжелой цепью VH-c и легкой цепью VL-a) и антитела hu7B10 (с тяжелой цепью VH-b и легкой цепью VL-b) всесторонне оценивали и проводили отбор; их соответствующие полные последовательности легкой и тяжелой цепей представляют собой такие, как показано в SEQ ID NO: 17-20.
НС hu25G7
LC hu25G7
НС hu7B10
LC hu7B10
Последовательность гуманизированного антитела вставляли в соответствующий экспрессионный вектор посредством технологии молекулярного клонирования, и соответствующие гуманизированные антитела получали посредством экспрессии в экспрессионной системе клеток HEK293.
D
Пример 8: Данные по активности гуманизированного антитела Гуманизированные антитела hu25G7 и hu7B10 анализировали in vitro, как описано в Примерах 2-5, и результаты анализа показаны в Таблице 8. Результаты показали, что как hu25G7, так и hu7B10 связываются исключительно с человеческим IL-4R, а не с IL-4R макака-резуса, указывая на то, что оба антитела связываются с эпитопом(ами) человеческого IL-4R, который не гомологичен IL-4R макака-резуса; и могут специфично связываться с человеческим IL-4R. Оба антитела могут блокировать связывание IL-4/IL-4R и внутриклеточные сигнальные пути, приводя к нейтрализации эффекта активации IL-4 и ингибированию пролиферации клеток TF-1, где блокирующая и ингибирующая активность hu25G7 еще значимо лучше, чем блокирующая и ингибирующая активность референсного антитела Дупилумаб, тогда как значение K аффинности относительно ниже.
Пример 9: Эксперимент по созреванию аффинности гуманизированного антитела hu25G7
9
Для получения более эффективных антител против человеческого IL-4R антитело 25G7 подвергали созреванию аффинности посредством платформенной технологии дрожжевого дисплея, и библиотеку с дрожжевым дисплеем созревания аффинности, нацеленную на 6 CDR, конструировали и получали на основе антитела hu25G7, и конструировали вырожденные праймеры. Сконструированные мутантные аминокислоты вводили в библиотеку антител hu25G7-scFv посредством ПЦР и гомологичной рекомбинации; размер каждой библиотеки составлял примерно 10. Сконструированную дрожжевую библиотеку проверяли способом секвенирования второго поколения (GENEWIZ) для подтверждения разнообразия библиотеки.
Человеческий IL-4R, меченный биотином, использовали для отбора высокоаффинных антител из дрожжевой библиотеки hu25G7-scFv. После двух раундов скрининга MACS (от англ. Magnetic-activated cell sorting - магнитно-активированная сортировка клеток) (магнитные шарики со стрептомицином, Invitrogen) и двух раундов скрининга FACS (от англ. fluorescence-activated cell sorting - сортировка клеток с активированной флуоресценцией) (BD FACSAriaTM FUSION), одиночный дрожжевой клон отбирали для моноклонального культивирования и индукции экспрессии. FACS (BD FACSCanto II) использовали для выявления связывания одиночного дрожжевого клона с человеческим IL-4R, и одиночный дрожжевой клон с более высокой аффинностью, чем аффинность антитела 25G7 дикого типа, отбирали для проверки последовательности. После выравнивания и анализа секвенируемых клонов, удаляли избыточную последовательность, неизбыточную последовательность превращали в молекулу полноразмерного человеческого антитела для экспрессии в клетках млекопитающего. Полноразмерное антитело после аффинной очистки анализировали в отношении аффинности, используя BIAcoreTM Х-100 (GE Life Sciences), и молекулы антитела -кандидата с более высокой аффинностью в отношении человеческого IL-4R отбирали следующим образом. Аффинность данных молекул антител к человеческому IL-4R выше, чем аффинность антитела hu25G7 дикого типа, где аффинность молекулы антитела hu25G7-A сопоставима с аффинностью Дупилумаба, в то время как аффинность молекулы hu25G7-B значимо лучше, чем аффинность Дупилумаба.
После созревания аффинности последовательность вариабельной области легкой цепи антитела hu25G7-A выглядит следующим образом:
LCVR hu25G7-A
Последовательности CDR, содержащиеся в вышеуказанном, показаны в Таблице 9.
Последовательность вариабельной области легкой цепи антитела hu25G7-B выглядит следующим образом:
LCVR hu25G7-B
Последовательности CDR, содержащиеся в вышеуказанном, показаны в Таблице 10.
Упомянутая выше вариабельная область легкой цепи LCVR hu25G7-A подвергалась рекомбинации с константной областью легкой цепи hu25G7 с получением легкой цепи антитела hu25G7-A; упомянутая выше вариабельная область легкой цепи LCVR hu25G7-B подвергалась рекомбинации с константной областью легкой цепи hu25G7 с получением легкой цепи антитела hu25G7-B.
Нестабильные аминокислотные остатки в hu25G7-VH-c оптимизировали для усиления способности к получению лекарственного средства, что приводило к получению вариабельной области тяжелой цепи hu25G7-VH:
Вариабельную область тяжелой цепи, описанную выше, можно рекомбинировать с константной областью тяжелой цепи hu25G7, что приводит к получению тяжелой цепи антитела hu25G7-A/hu25G7-B.
Полноразмерные последовательности тяжелой цепи hu25G7-A и hu25G7-B показаны в SEQ ID NO 44.
НС hu25G7
Каждая из полноразмерных последовательностей легкой цепи показана в SEQ ID NO: 45-46.
LC hu25G7-A
LC hu25G7-B
Пример 10: Данные по активности созревания аффинности гуманизированного антитела
Два антитела hu25G7-A и hu25G7-B тестировали, как описано в Примере 3 и Примере 4; оба антитела hu25G7-A и hu25G7-B могут блокировать связывание IL-4/IL-4R и внутриклеточный сигнальный путь, приводя к нейтрализации эффекта активации IL-4 и IL-13 и ингибированию пролиферации клеток TF-1; данные по активности показаны в Таблице 11.
50
50
В эксперименте по ингибированию пролиферации клеток TF-1, вызываемой стимуляцией IL-13, оба hu25G7-A и hu25G7-B демонстрировали полезные эффекты. Эффект повторно проверяли, и результаты показывали, что в одних и тех же условиях значение ингибирования (IC) hu25G7-A в отношении пролиферации клеток TF-1, стимулируемой IL-13, составляло 11,68, и значение ингибирования (IC) контрольного Дупилумаба в отношении пролиферации клеток TF-1, стимулируемой IL-13, составляло 22,85. По сравнению с Дупилумабом, hu25G7 оказывает значимо улучшенное действие в блокировании связывания IL-4, IL-13 с IL-4R, а также пролиферации клеток, вызываемой таким связыванием.
Пример 11: Исследование эффекта гуманизированного антитела, оказываемого на мышиный дерматит
Для создания модели мышиного дерматита использовали трансгенных по IL-4/IL-4Rα мышей (приобретенных в Cyagen Bioscience Biological Research Center (Taicang) Co., Ltd.). 100 мкл 1,5% раствора смеси ацетона и оливкового масла OXZ (соотношение ацетон:оливковое масло составляет 4:1) равномерно наносили на брюхо каждой мыши, от примерно 3 см х 3 см, для сенсибилизации. Сутки сенсибилизации принимали за DO (Сутки 0). В Сутки 7, 20 мкл 1% раствора смеси ацетона и оливкового масла OXZ равномерно наносили на оба уха (обе стороны) мышей для стимуляции и стимулировали один раз каждые 72 часа.
В данном эксперименте формировали в общей сложности 5 групп, включая нормальную контрольную группу (для сенсибилизации и стимуляции наносили только раствор ацетона и оливкового масла), контрольную группу модели, группу hu25G7-A, hu25G7-B и Дупилумаба, с 3-5 мышей на группу. Дозировка введения для группы введения составляла 50 мг/кг, и способ введения представлял собой подкожное введение, дважды в неделю (см. Таблицу 12 для получения подробной информации). В сутки 27 толщину ушей измеряли посредством штангенциркуля, и результаты показаны на Фиг. 12.
Результаты показали, что уши мыши в контрольной группе модели демонстрировали очевидное патологическое повреждение, и толщина уха была значимо больше, чем толщина уха нормальной контрольной группы. Толщина уха мышей в группах hu25G7-A, hu25G7-B и Дупилумаба была значимо меньше, чем толщина уха контрольной группы модели в сутки 27. Иными словами, hu25G7-A, hu25G7-B и Дупилумаб могут быть использованы для лечения дерматита, и hu25G7-B является более эффективным, чем Дупилумаб.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  JIANGSU HENGRUI MEDICINE CO., LTD.; SHANGHAI HENGRUI PHARMACEUTICAL
CO., LTD.
<120>  АНТИТЕЛО, СВЯЗЫВАЮЩЕЕ ЧЕЛОВЕЧЕСКИЙ IL-4R, ЕГО АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩИЙ
ФРАГМЕНТ И ЕГО МЕДИЦИНСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ
<130>  719056CPCT
<160>  46
<170>  SIPOSequenceListing 1.0
<210>  1
<211>  118
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  Домен
<222>  (1)..(118)
<223>  Вариабельная область тяжёлой цепи мышиного моноклонального
антитела (mAb) 25G7
<400>  1
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ala Phe Ile Ser Ser Gly Ser Ser Ile Ile Tyr Tyr Ala Asp Ile Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Ser Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Thr Arg Gly Asn Lys Arg Gly Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Ile Leu Thr Val Ser Ser
115
<210>  2
<211>  108
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  Домен
<222>  (1)..(108)
<223>  Вариабельная область легкой цепи мышиного mAb 25G7
<400>  2
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Met Ser Ala Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Asn Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20                  25                  30
Tyr Trp Tyr Gln Arg Lys Pro Arg Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35                  40                  45
Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser
50                  55                  60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65                  70                  75                  80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Arg Ser Asn Pro Pro Met
85                  90                  95
Leu Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys
100                 105
<210>  3
<211>  10
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  Домен
<222>  (1)..(10)
<223>  Определяющая комплементарность область 1 тяжелой цепи (HCDR1)
мышиного mAb 25G7
<400>  3
Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Gly Met His
1               5                   10
<210>  4
<211>  17
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  Домен
<222>  (1)..(17)
<223>  HCDR2 мышиного mAb 25G7
<400>  4
Phe Ile Ser Ser Gly Ser Ser Ile Ile Tyr Tyr Ala Asp Ile Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>  5
<211>  9
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  Домен
<222>  (1)..(9)
<223>  HCDR3 мышиного mAb 25G7
<400>  5
Gly Asn Lys Arg Gly Phe Phe Asp Tyr
1               5
<210>  6
<211>  10
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  Домен
<222>  (1)..(10)
<223>  Определяющая комплементарность область 1 легкой цепи (LCDR1)
мышиного mAb 25G7
<400>  6
Asn Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Tyr
1               5                   10
<210>  7
<211>  7
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  Домен
<222>  (1)..(7)
<223>  LCDR2 мышиного mAb 25G7
<400>  7
Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1               5
<210>  8
<211>  11
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  Домен
<222>  (1)..(11)
<223>  LCDR3 мышиного mAb 25G7
<400>  8
Gln Gln Trp Arg Ser Asn Pro Pro Met Leu Thr
1               5                   10
<210>  9
<211>  125
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  Домен
<222>  (1)..(125)
<223>  Вариабельная область тяжёлой цепи мышиного mAb 7B10
<400>  9
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Thr Glu Leu Leu Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Ser Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Leu Ile His Pro Asn Ser Asp Thr Thr Lys Phe Ser Glu Asn Phe
50                  55                  60
Lys Thr Arg Ala Thr Leu Thr Ile Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Lys Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Lys Ser Lys Ile Ile Thr Thr Ile Val Ala Arg His Trp Tyr Phe
100                 105                 110
Asp Val Trp Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115                 120                 125
<210>  10
<211>  111
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  Домен
<222>  (1)..(111)
<223>  Вариабельная область легкой цепи мышиного mAb 7B10
<400>  10
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Pro Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Gly
20                  25                  30
Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Gln Pro Pro
35                  40                  45
Lys Val Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala
50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65                  70                  75                  80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Asn
85                  90                  95
Glu Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105                 110
<210>  11
<211>  10
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  Домен
<222>  (1)..(10)
<223>  HCDR1 мышиного mAb 7B10
<400>  11
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met His
1               5                   10
<210>  12
<211>  17
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  Домен
<222>  (1)..(17)
<223>  HCDR2 мышиного mAb 7B10
<400>  12
Leu Ile His Pro Asn Ser Asp Thr Thr Lys Phe Ser Glu Asn Phe Lys
1               5                   10                  15
Thr
<210>  13
<211>  16
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  Домен
<222>  (1)..(16)
<223>  HCDR3 мышиного mAb 7B10
<400>  13
Ser Lys Ile Ile Thr Thr Ile Val Ala Arg His Trp Tyr Phe Asp Val
1               5                   10                  15
<210>  14
<211>  15
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  Домен
<222>  (1)..(14)
<223>  LCDR1 мышиного mAb 7B10
<400>  14
Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Gly Gly Asp Ser Tyr Met Asn
1               5                   10                  15
<210>  15
<211>  7
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  Домен
<222>  (1)..(7)
<223>  LCDR2 мышиного mAb 7B10
<400>  15
Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser
1               5
<210>  16
<211>  9
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  Домен
<222>  (1)..(9)
<223>  LCDR3 мышиного mAb 7B10
<400>  16
Gln His Ser Asn Glu Asn Pro Pro Thr
1               5
<210>  17
<211>  445
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  Цепь
<222>  (1)..(445)
<223>  Тяжелая цепь гуманизированного антитела hu25G7
<400>  17
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ala Phe Ile Ser Ser Gly Ser Ser Ile Ile Tyr Tyr Ala Asp Ile Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Ser Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Thr Arg Gly Asn Lys Arg Gly Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115                 120                 125
Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly
130                 135                 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145                 150                 155                 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165                 170                 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180                 185                 190
Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser
195                 200                 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys
210                 215                 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225                 230                 235                 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245                 250                 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln
260                 265                 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275                 280                 285
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290                 295                 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305                 310                 315                 320
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325                 330                 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340                 345                 350
Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
355                 360                 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370                 375                 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385                 390                 395                 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405                 410                 415
Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420                 425                 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435                 440                 445
<210>  18
<211>  215
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  Цепь
<222>  (1)..(215)
<223>  Легкая цепь гуманизированного антитела hu25G7
<400>  18
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Asn Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20                  25                  30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
35                  40                  45
Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50                  55                  60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65                  70                  75                  80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Arg Ser Asn Pro Pro Met
85                  90                  95
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100                 105                 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115                 120                 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130                 135                 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145                 150                 155                 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165                 170                 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180                 185                 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195                 200                 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210                 215
<210>  19
<211>  455
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  Цепь
<222>  (1)..(455)
<223>  Тяжелая цепь гуманизированного антитела hu7B10
<400>  19
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Leu Ile His Pro Asn Ser Asp Thr Thr Lys Phe Ser Glu Asn Phe
50                  55                  60
Lys Thr Arg Val Thr Met Thr Ile Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Lys Ser Lys Ile Ile Thr Thr Ile Val Ala Arg His Trp Tyr Phe
100                 105                 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
115                 120                 125
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
130                 135                 140
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
145                 150                 155                 160
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
165                 170                 175
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
180                 185                 190
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
195                 200                 205
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
210                 215                 220
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
225                 230                 235                 240
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
245                 250                 255
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
260                 265                 270
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
275                 280                 285
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
290                 295                 300
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
305                 310                 315                 320
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
325                 330                 335
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
340                 345                 350
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
355                 360                 365
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
370                 375                 380
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
385                 390                 395                 400
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
405                 410                 415
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
420                 425                 430
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
435                 440                 445
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450                 455
<210>  20
<211>  218
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  Цепь
<222>  (1)..(218)
<223>  Легкая цепь гуманизированного антитела hu7B10
<400>  20
Asp Ile Val Leu Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Gly
20                  25                  30
Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35                  40                  45
Gln Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp
50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser
65                  70                  75                  80
Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Asn
85                  90                  95
Glu Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100                 105                 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115                 120                 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130                 135                 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145                 150                 155                 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165                 170                 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180                 185                 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195                 200                 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210                 215
<210>  21
<211>  98
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  Домен
<222>  (1)..(98)
<223>  Матрица IGHV3-48*01 тяжелой цепи зародышевой линии человека
<400>  21
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg
<210>  22
<211>  95
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  Домен
<222>  (1)..(95)
<223>  Матрица IGKV3-11*01 легкой цепи зародышевой линии человека
<400>  22
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro
85                  90                  95
<210>  23
<211>  98
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  Домен
<222>  (1)..(98)
<223>  Матрица IGHV1-2*02 тяжелой цепи зародышевой линии человека
<400>  23
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20                  25                  30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg
<210>  24
<211>  100
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  Домен
<222>  (1)..(100)
<223>  Матрица IGKV2D-29*01 легкой цепи зародышевой линии человека
<400>  24
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20                  25                  30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro
35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ser
85                  90                  95
Ile Gln Leu Pro
100
<210>  25
<211>  118
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  Домен
<222>  (1)..(118)
<223>  hu25G7-VH-a
<400>  25
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ala Phe Ile Ser Ser Gly Ser Ser Ile Ile Tyr Tyr Ala Asp Ile Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Gly Asn Lys Arg Gly Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  26
<211>  118
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  Домен
<222>  (1)..(118)
<223>  hu25G7-VH-b
<400>  26
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ala Phe Ile Ser Ser Gly Ser Ser Ile Ile Tyr Tyr Ala Asp Ile Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Thr Arg Gly Asn Lys Arg Gly Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  27
<211>  118
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  Домен
<222>  (1)..(118)
<223>  hu25G7-VH-c
<400>  27
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ala Phe Ile Ser Ser Gly Ser Ser Ile Ile Tyr Tyr Ala Asp Ile Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Ser Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Thr Arg Gly Asn Lys Arg Gly Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  28
<211>  108
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  Домен
<222>  (1)..(108)
<223>  hu25G7-VL-a
<400>  28
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Asn Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20                  25                  30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
35                  40                  45
Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50                  55                  60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65                  70                  75                  80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Arg Ser Asn Pro Pro Met
85                  90                  95
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  29
<211>  108
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  Домен
<222>  (1)..(108)
<223>  hu25G7-VL-b
<400>  29
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Asn Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20                  25                  30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
35                  40                  45
Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50                  55                  60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65                  70                  75                  80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Arg Ser Asn Pro Pro Met
85                  90                  95
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  30
<211>  108
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  Домен
<222>  (1)..(108)
<223>  hu25G7-VL-c
<400>  30
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Asn Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20                  25                  30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Pro Trp Ile Tyr
35                  40                  45
Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50                  55                  60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65                  70                  75                  80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Arg Ser Asn Pro Pro Met
85                  90                  95
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  31
<211>  125
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  Домен
<222>  (1)..(125)
<223>  hu7B10-VH-a
<400>  31
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Leu Ile His Pro Asn Ser Asp Thr Thr Lys Phe Ser Glu Asn Phe
50                  55                  60
Lys Thr Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Ser Lys Ile Ile Thr Thr Ile Val Ala Arg His Trp Tyr Phe
100                 105                 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115                 120                 125
<210>  32
<211>  125
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  Домен
<222>  (1)..(125)
<223>  hu7B10-VH-b
<400>  32
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Leu Ile His Pro Asn Ser Asp Thr Thr Lys Phe Ser Glu Asn Phe
50                  55                  60
Lys Thr Arg Val Thr Met Thr Ile Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Lys Ser Lys Ile Ile Thr Thr Ile Val Ala Arg His Trp Tyr Phe
100                 105                 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115                 120                 125
<210>  33
<211>  125
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  Домен
<222>  (1)..(125)
<223>  hu7B10-VH-c
<400>  33
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Leu Ile His Pro Asn Ser Asp Thr Thr Lys Phe Ser Glu Asn Phe
50                  55                  60
Lys Thr Arg Val Thr Leu Thr Ile Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Lys Ser Lys Ile Ile Thr Thr Ile Val Ala Arg His Trp Tyr Phe
100                 105                 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115                 120                 125
<210>  34
<211>  111
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  Домен
<222>  (1)..(111)
<223>  hu7B10-VL-a
<400>  34
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Gly
20                  25                  30
Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35                  40                  45
Gln Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp
50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser
65                  70                  75                  80
Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Asn
85                  90                  95
Glu Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105                 110
<210>  35
<211>  111
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  Домен
<222>  (1)..(111)
<223>  hu7B10-VL-b
<400>  35
Asp Ile Val Leu Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Gly
20                  25                  30
Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35                  40                  45
Gln Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp
50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser
65                  70                  75                  80
Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Asn
85                  90                  95
Glu Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105                 110
<210>  36
<211>  111
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  Домен
<222>  (1)..(111)
<223>  hu7B10-VL-c
<400>  36
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Gly
20                  25                  30
Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35                  40                  45
Gln Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Asp
50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser
65                  70                  75                  80
Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Asn
85                  90                  95
Glu Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105                 110
<210>  37
<211>  108
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  Домен
<222>  (1)..(108)
<223>  вариабельная область легкой цепи hu25G7-A
<400>  37
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Pro Tyr Met
20                  25                  30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
35                  40                  45
Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50                  55                  60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65                  70                  75                  80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Arg Ala Tyr Pro Pro Met
85                  90                  95
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  38
<211>  10
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  Домен
<222>  (1)..(10)
<223>  LCDR1 hu25G7-A
<400>  38
Arg Ala Ser Ser Ser Val Pro Tyr Met Tyr
1               5                   10
<210>  39
<211>  7
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  Домен
<222>  (1)..(7)
<223>  LCDR2 hu25G7-B
<400>  39
Leu Ala Ser Ser Arg Pro Ser
1               5
<210>  40
<211>  11
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  Домен
<222>  (1)..(11)
<223>  LCDR3 hu25G7-A
<400>  40
Gln Gln Trp Arg Ala Tyr Pro Pro Met Leu Thr
1               5                   10
<210>  41
<211>  108
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  Домен
<222>  (1)..(108)
<223>  вариабельная область легкой цепи hu25G7-B
<400>  41
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Pro Gly Val Pro Pro Leu
20                  25                  30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
35                  40                  45
Leu Ala Ser Ser Arg Pro Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50                  55                  60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65                  70                  75                  80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Arg Ser Asn Pro Pro Met
85                  90                  95
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  42
<211>  10
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  Домен
<222>  (1)..(10)
<223>  LCDR1 hu25G7-B
<400>  42
Arg Ala Ser Pro Gly Val Pro Pro Leu Ala
1               5                   10
<210>  43
<211>  118
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  Домен
<222>  (1)..(118)
<223>  оптимизированная вариабельная область тяжёлой цепи hu25G7-VH-c
<400>  43
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ala Phe Ile Ser Ser Gly Ser Ser Ile Ile Tyr Tyr Ala Asp Ile Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Ser Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Thr Arg Gly Asn Lys Arg Gly Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  44
<211>  445
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  Цепь
<222>  (1)..(445)
<223>  Тяжелая цепь hu25G7-A и hu25G7-B
<400>  44
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ala Phe Ile Ser Ser Gly Ser Ser Ile Ile Tyr Tyr Ala Asp Ile Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Ser Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Thr Arg Gly Asn Lys Arg Gly Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115                 120                 125
Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly
130                 135                 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145                 150                 155                 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165                 170                 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180                 185                 190
Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser
195                 200                 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys
210                 215                 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225                 230                 235                 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245                 250                 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln
260                 265                 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275                 280                 285
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290                 295                 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305                 310                 315                 320
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325                 330                 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340                 345                 350
Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
355                 360                 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370                 375                 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385                 390                 395                 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405                 410                 415
Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420                 425                 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435                 440                 445
<210>  45
<211>  215
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  Цепь
<222>  (1)..(215)
<223>  Легкая цепь hu25G7-A
<400>  45
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Pro Tyr Met
20                  25                  30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
35                  40                  45
Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50                  55                  60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65                  70                  75                  80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Arg Ala Tyr Pro Pro Met
85                  90                  95
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100                 105                 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115                 120                 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130                 135                 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145                 150                 155                 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165                 170                 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180                 185                 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195                 200                 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210                 215
<210>  46
<211>  215
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  Цепь
<222>  (1)..(215)
<223>  Легкая цепь hu25G7-B
<400>  46
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Pro Gly Val Pro Pro Leu
20                  25                  30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
35                  40                  45
Leu Ala Ser Ser Arg Pro Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50                  55                  60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65                  70                  75                  80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Arg Ser Asn Pro Pro Met
85                  90                  95
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100                 105                 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115                 120                 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130                 135                 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145                 150                 155                 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165                 170                 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180                 185                 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195                 200                 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210                 215
<---