СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИПЕПТИДНОГО ГЕТЕРОМУЛЬТИМЕРА

1. Способ получения гетеромультимера, включающий этапы:
a) обеспечения гомоварианта первых полипептидов, каждый из которых имеет первую антигенсвязывающую активность и включает участок Fc;
b) обеспечения гомоварианта вторых полипептидов, каждый из которых имеет вторую антигенсвязывающую активность, которая отличается от первой антигенсвязывающей активности, и включает участок Fc;
c) инкубации гомоварианта первых полипептидов и гомоварианта вторых полипептидов вместе при восстанавливающих условиях, которые позволяют цистеинам в шарнирных участках вызывать изомеризацию дисульфидной связи; и
d) получения гетеромультимера, включающего первый и второй полипептиды, где
1-3 наборы аминокислотных остатков, выбранные из следующих наборов аминокислотных остатков:
(1) аминокислотные остатки в положениях 356 и 439 в соответствии с нумерацией EU,
(2) аминокислотные остатки в положениях 357 и 370 в соответствии с нумерацией EU, и
(3) аминокислотные остатки в положениях 399 и 409 в соответствии с нумерацией EU
в СН3 участке, входящем в состав Fc участка первого и/или второго полипептида, имеют тот же тип заряда, и
когда аминокислотные остатки в том же наборе среди наборов аминокислотных остатков (1)-(3) имеют тот же тип заряда, что и каждый другой как в СН3 участке первого полипептида, так и в СН3 участке второго полипептида, аминокислотные остатки в этом наборе в СН3 участке второго полипептида имеют заряд, противоположный таковому в аминокислотных остатках в этом наборе в СН3 участке первого полипептида.
2. Способ по п. 1, где этап а) в п. 1 включает этап обеспечения третьего полипептида, который формирует мультимер с первым полипептидом, а этап b) включает этап обеспечения четвертого полипептида, который формирует мультимер со вторым полипептидом.
3. Способ по п. 1, где аминокислотные остатки, которые имеют тот же тип заряда, являются выбранными из одного или более аминокислотных остатков, включенных в любую из следующих групп (А) и (В):
(A) глутаминовая кислота (Е) и аспарагиновая кислота (D); и
(B) лизин (K), аргинин (R) и гистидин (Н).
4. Способ по п. 1, где набор(ы) аминокислотных остатков, который(е) имеет(ют) тот же тип заряда, что и каждый другой в каждом из первого и второго полипептидов, представляет(ют) собой любой из наборов аминокислотных остатков (1)-(4):
(1) аминокислотные остатки в положениях 356 и 439 в соответствии с нумерацией EU,
(2) аминокислотные остатки в положениях 357 и 370 в соответствии с нумерацией EU,
(3) аминокислотные остатки в положениях 399 и 409 в соответствии с нумерацией EU, и
(4) (i) аминокислотные остатки в положениях в соответствии с нумерацией EU 399 и 409 и
(ii) аминокислотные остатки в положениях 356 и 439 в соответствии с нумерацией EU.
5. Способ по п. 1, где набор(ы) аминокислотных остатков, который(е) имеет(ют) тот же тип заряда, что и каждый другой в каждом из первого и второго полипептидов, является(ются) любым из наборов аминокислотных остатков:
(i) аминокислотные остатки в положениях 399 и 409 в соответствии с нумерацией EU и
(ii) аминокислотные остатки в положениях 356 и 439 в соответствии с нумерацией EU.
6. Способ по любому из пп. 1-5, где в первом и/или втором полипептиде аминокислота изменяется таким образом, чтобы дестабилизировать стабильность СН3 участка первого и/или второго полипептида.
7. Способ по п. 6, где в первом и/или втором полипептиде аминокислота в положении 397 и/или 392 в соответствии с нумерацией EU является измененной.
8. Способ по п. 1, где Fc участок первого и/или второго полипептида является таким IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 типа.
9. Способ по п. 1, где Fc участок первого и/или второго полипептида представляет собой Fc участок, имеющий происхождение от мыши.
10. Способ получения гетеромультимера по п. 9, где
наборы аминокислотных остатков 1-3, выбранные из следующих наборов аминокислотных остатков:
(1) аминокислотные остатки в положениях 356 и 439 в соответствии с нумерацией EU,
(2) аминокислотные остатки в положениях 360 и 371 в соответствии с нумерацией EU, и
(3) аминокислотные остатки в положениях 399 и 409 в соответствии с нумерацией EU
в СН3 участке, который входит в состав Fc участка первого и/или второго полипептида, имеют тот же тип заряда, и
когда аминокислотные остатки в том же наборе среди наборов аминокислотных остатков (1)-(3) имеют тот же тип заряда, что и каждый другой как в СН3 участке первого полипептида, так и в СН3 участке второго полипептида, аминокислотные остатки в этом наборе в СН3 участке второго полипептида имеют заряд, противоположный таковому в аминокислотных остатках в этом наборе в СН3 участке первого полипептида.
11. Способ получения гетеромультимера, включающий этапы:
a) обеспечения гомоварианта первых полипептидов, каждый из которых имеет первую антигенсвязывающую активность и включает Fc участок;
b) обеспечения гомоварианта вторых полипептидов, каждый из которых имеет вторую антигенсвязывающую активность, которая отличается от первой антигенсвязывающей активности, и включает Fc участок;
c) инкубации гомоварианта первых полипептидов и гомоварианта вторых полипептидов вместе при восстанавливающих условиях, которые позволяют цистеинам в шарнирных участках вызывать изомеризацию дисульфидной связи; и
d) получения гетеромультимера, включающего первый и второй полипептиды, где
аминокислота в положении 397 и/или 392 в соответствии с нумерацией EU в СН3 участке, который входит в состав Fc участка первого и/или второго полипептида, является измененной.
12. Способ по любому из пп. 1-5 и 7-10, где в первом и/или втором полипептиде,
аминокислота в положении 397 в соответствии с нумерацией EU является измененной на Met (М), Phe (F) или Tyr (Y), и/или
аминокислота в положении 392 в соответствии с нумерацией EU является измененной на Asp (D), Glu (Е), Thr (Т), Val (V) или Ile (I).
13. Способ по п. 11, где в первом и/или втором полипептиде,
аминокислота в положении 397 в соответствии с нумерацией EU является измененной на Met (М), Phe (F) или Tyr (Y), и/или
аминокислота в положении 392 в соответствии с нумерацией EU является измененной на Asp (D), Glu (Е), Thr (Т), Val (V) или Ile (I).
14. Способ по любому из пп. 1-5 и 7-10, где в первом и/или втором полипептиде аминокислота в положении 397 в соответствии с нумерацией EU является измененной на Phe (F) или Tyr (Y).
15. Способ по п. 11, где в первом и/или втором полипептиде аминокислота в положении 397 в соответствии с нумерацией EU является измененной на Phe (F) или Tyr (Y).
16. Способ по любому из пп. 1-5 и 7-10, где в первом полипептиде аминокислота в положении 356 в соответствии с нумерацией EU является измененной на Lys (K), а аминокислота в положении 397 в соответствии с нумерацией EU является измененной на Phe (F) или Tyr (Y); и во втором полипептиде аминокислота в положении 397 в соответствии с нумерацией EU
является измененной на Phe (F) или Tyr (Y), а аминокислота в положении 439 в соответствии с нумерацией EU является измененной на Glu (Е).
17. Способ по п. 11, где в первом полипептиде аминокислота в положении 356 в соответствии с нумерацией EU является измененной на Lys (K), а аминокислота в положении 397 в соответствии с нумерацией EU является измененной на Phe (F) или Tyr (Y); и во втором полипептиде аминокислота в положении 397 в соответствии с нумерацией EU является измененной на Phe (F) или Tyr (Y), а аминокислота в положении 439 в соответствии с нумерацией EU является измененной на Glu (Е).
18. Способ по любому из пп. 1-5 и 7-10, где этапы а) и b) осуществляют путем смешивания клеточной линии, которая продуцирует гомовариант первых полипептидов, с клеточной линией, которая продуцирует гомовариант вторых полипептидов, и этап с) осуществляют в культуральном супернатанте.
19. Способ по п. 11, где этапы а) и b) осуществляют путем смешивания клеточной линии, которая продуцирует гомовариант первых полипептидов, с клеточной линией, которая продуцирует гомовариант вторых полипептидов, и этап с) осуществляют в культуральном супернатанте.
20. Способ по любому из пп. 1-5 и 7-10, где гетеромультимер представляет собой мультиспецифическое антитело или гетеро-Fc слитый белок.
21. Способ по п. 11, где гетеромультимер представляет собой мультиспецифическое антитело или гетеро-Fc слитый белок.
22. Способ по любому из пп. 1-5 и 7-10, где гетеромультимер представляет собой биспецифическое антитело.
23. Способ по п. 11, где гетеромультимер представляет собой биспецифическое антитело.
24. Способ по любому из пп. 1-5 и 7-10, где этап с), описанный в п. 1, предусматривает контакт с восстанавливающим агентом.
25. Способ по п. 11, где этап с), описанный в п. 11, предусматривает контакт с восстанавливающим агентом.
26. Способ по п. 24, где этап с) предусматривает прибавление активного вещества, выбранного из группы, которая состоит из глутатиона, L-цистеина, дитиотреитола, β-меркаптоэтанола, ТСЕР и 2-МЕА.
27. Способ по п. 25, где этап с) предусматривает прибавление активного вещества, выбранного из группы, которая состоит из глутатиона, L-цистеина, дитиотреитола, β-меркаптоэтанола, ТСЕР и 2-МЕА.
28. Способ по п. 26 или п. 27, где этап с) предусматривает прибавление активного вещества, выбранного из глутатиона и 2-МЕА.
29. Гетеромультимер, который получают с помощью способа по любому из пп. 1-28.
30. Гетеромультимер по п. 29, где гетеромультимер представляет собой биспецифическое антитело.
31. Композиция, включающая гетеромультимер по п. 29 или 30 фармацевтически приемлемый носитель.