Биохимия соединительной ткани печени крыс в норме и при воспроизведении экспериментальной патологии

Косых A.A.

БИОХИМИЯ СОЕДИНИТЕЛЬНОЙ ТКАНИ ПЕЧЕНИ КРЫС В НОРМЕ И ПРИ ВОСПРОИЗВЕДЕНИИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ПАТОЛОГИИ ГОУ ВПО «Кировская ГМА Росздрава», г. Киров

Печень по своей структуре является паренхиматозным органом, поэтому количество соединительной ткани в нормальной печени очень невелико. Однако при хронических воспалительных процессах ее содержание может значительно увеличиваться с формированием фиброза и цирроза. Поэтому изучение механизмов фиброгенеза и обратимости патологического состояния является актуальной задачей как теоретической, так и практической медицины.

Исследования проводились на крысах линии «Вистар» в норме и при воспроизведении патологии путем введения тетрахлорметана (CCl4). В ткани печени определяли содержание коллагеновых белков (КБ) по гидроксипролину, неколлагеновых белков (НКБ) по тирозину, общих гликопротеидов (ГП) по гексозамину. Исследование данных показателей проводили в предварительно выделенных фракциях печеночного гомогената: нейтральносолерастворимой (НСРФ), цитратрастворимой (ЦРФ), щелочнорастворимой (ЩРФ) и нерастворимой (НРФ). Под НКБ имели в виду растворимые экстрацеллюлярные белки, специфичные для основного вещества соединительной ткани, нерастворимые экстрацеллюлярные белки, отличные от коллагена и эластина, являющиеся по своей химической структуре глико- и мукопротеинами (Л.И. Слуцкий,1969). Кроме того, в печени определяли содержание протеогликанов по глюкуроновой кислоте (ГУК). У животных определяли активность лизосомальных ферментов: кислой фосфатазы и катепсина Д, а также по расщеплению радиоактивного С14-коллагена общую коллагенолитическую активность ткани печени.

Известно, что образование межклеточного матрикса связано с деятельностью, в основном, клеток соединительной ткани. Поэтому одним из показателей функциональной активности соединительнотканных клеток принято считать содержание ДНК в ткани печени, косвенно отражающую пролиферативную активность этих клеток. При раздельном определении ДНК ядерной суспензии гепатоцитов (ДНКг) в общей ДНК гомогената по полученной разнице можно судить о содержании ДНК в непаренхиматозных клетках (ДНКнпк) и их соотношении (Косых A.A., 1992). По нашим данным, ДНК составляет 0,75 мг/г сырой ткани, а ее доля в общей ДНК гомогената - 31,5%, что согласуется с данными Д.Н. Маянского (1981) по относительному содержанию непаренхиматозных клеток в печени - около 30%.

Небольшому количеству соединительной ткани в нормальной печени соответствует низкое содержание основных ее компонентов, определяемых

биохимическими методами. Среднее содержание гидроксипролина в сухой обезжиренной ткани печени крыс равно 1,48±0,06 мг/г (в расчете на КБ - 1,09±0,05%), содержание тирозина - 24,63±0,04 мг/г (в расчете на НКБ - 0,5±0,02 %), содержание гексозаминов -4,62±0,26 мг/г, содержание ГУК - 26,0±0,38 мг/г.

При исследовании растворимости КБ в нормальной печени крыс в различных солевых растворах было обнаружено 88% нерастворимого (НРК) и щелочнорастворимого (ЩРК) коллагена. Фракция нейтральносолерастворимого коллагена (НСРК) составила 6,4%, цитратрастворимого (ЦРК) -5,9%. Относительное содержание различных фракций КБ изменяется в течение суток, хотя его общее содержание изменяется незначительно. Содержание НСРК обнаруживает четкую закономерность изменений в течение суток с двумя пиками в 4 часа и 16 часов, причем к 16 часам его содержание увеличивается в 3 раза по сравнению с предыдущим сроком. К 20 часам его уровень снижается до первоначального и сохраняется без изменений до 24 часов. Вслед за повышением синтеза НСРК в печени повышается уровень ЩРК и НРК. Относительная амплитуда суточных изменений была наибольшей для НСРК (± 63,6%), а самой низкой для общего коллагена (±19,3%). Эти данные свидетельствуют, с одной стороны, о высокой лабильности КБ за счет его растворимых фракций, с другой - о наличии гомеостатических механизмов, поддерживающих постоянство общего коллагена печени. Поэтому за фазой усиления синтеза КБ фибробластами и фибриллообразования в межклеточном пространстве наступает период спада коллагенсинтетической деятельности клеток и резорбции уже образовавшихся КБ.

Вторым важным компонентом соединительной ткани являются ГП. Их содержание в норме в течение суток оказалось более динамичным, чем КБ. Основную массу гексозаминов составляют гексозамины нейтральносолерастворимой (НСРГ) и щелочнорастворимой (ЩРГ) фракций. Среднее суточное количество их соответственно составляет 46,2% и 42%. На долю гексозаминов нерастворимой (НРГ) фракции приходится в среднем 2,6%, а цитратрастворимых (ЦРГ) гексозаминов - 9,2%. Максимум синтеза НСРГ приходится на 8 часов, его доля составила 59,7%, а наименьшей - в 20 часов (26,5%). Доля ЩРГ была наибольшей в 20 часов (59,7%), а наименьшей - в 8 часов (26,4%). Доля ЦРГ была самой большой в 20 часов, а наименьшей - в 16 часов; доля НРГ достигла максимума в 8 часов и снизилась к 20 часам. В связи с этим общее содержание гексозаминов в течение суток имело два значительных подъема - в 8 часов (самый высокий) и в 20 часов. Следовательно, в течение суток в печени наблюдается один пик синтеза НСРГ в 8 часов, который обусловливает последовательный переход в течение 12 часов гексозаминов в ЦРГ и ЩРГ.

Так же как и для КБ отмечена большая амплитуда суточных колебаний содержания ГП. Для НСРГ она составила ±65,2% от среднесуточного уровня; для ЦРГ - ±72,8%; для ЩРГ - ±61,9%; для НРГ - ±154%; для общих ГП - ±43,3%. Эти данные свидетельствуют о высокой лабильности ГП печени, принимающих участие в различных метаболических процессах. Нерастворимая фракция, составляющая, в основном, волокнистый матрикс, содержится в очень небольшом количестве.

При сравнении суточной динамики КБ и ГП просматривается отчетливая обратная взаимосвязь между ними. В часы максимального синтеза ГП синтез НСРК резко снижен, а в часы максимального синтеза КБ синтез ГП минимален. Эти данные позволяют заключить, что синтез этих биополимеров происходит разобщенно по времени со сдвигом фаз. Известно, что основную часть межклеточного матрикса синтезируют фибробласты, имеющие для этого генетически детерминированный специализированный аппарат. Судя по полученным данным, этот аппарат в клетке работает строго синхронно, включая вначале синтез ГП, затем КБ.

Изучение содержания тирозина в различных фракциях печеночного гомогената показало, что более половины всего тирозина находится в НСРФ (58,0 %). Содержание тирозина в ЩРФ составило 35,5 %, а в НРФ всего 3,0%. Синтез тирозина в клетках печени происходит из фенилаланина, поэтому его высокая концентрация в нейтральносолевых растворах свидетельствует об активном синтезе гепатоцитами этого биологически важного предшественника тиреоидных гормонов и катехоламинов (адреналина и норадреналина). Низкое содержание тирозина в НРФ указывает на низкое количество структурных ГП в нормальной печени.

Общая активность кислой фосфатазы в печени крыс равна 3,0±0,05, неседиментируемая активность -0,6±0,08. Доля свободной активности в общей составляет 20%. Общая активность катепсина Д равна 4,9±0,36, неседиментируемая активность - 1,2±0,18, а доля неседиментируемой активности в общей составила 24,4%. Коллагенолитическая активность ткани печени составила 0,55±0,05 ЕД.

В начальной стадии токсического воспаления, вызванного СС14 (5 инъекций), в печени повышается общее содержание ДНК, при этом в большей степени за счет ДНКнпк (44,2 %), ДНК, почти не изменяется. В результате этого в печени усиливается синтез КБ на 13 % и ГП на 47 %. Под влиянием СС14 в печени нарушается синтез тирозина. Его содержание снижается на 26,5 %.

Таким образом, ранние изменения в печени под влиянием СС14 существенным образом касаются не только функции гепатоцитов, но и соединительной ткани. В ответ на повреждение гепатоцитов усиливается функциональная активность клеток соединительной ткани, возрастает продукция КБ и ГП.

После 11 инъекций CCl4 наблюдаются отчетливые компенсаторные реакции в печени, направленные на восстановление нарушенного гомеостаза. Снижается по сравнению с начальным периодом интоксикации содержание общей ДНК, хотя ее уровень сохраняется достоверно выше нормального (Р<0,05). Резко возрастает ДНКг (на 42% по сравнению с нормой). В результате снижается доля ДНК до 18%. В этот период в печени определяется повышенное содержание гексозаминов и низкий уровень тирозина. Содержание КБ продолжает увеличиваться.

При хроническом токсическом гепатите (20 инъекций CCl4) доля ДНКнпк несколько увеличивается до 32,8%, заметно активируется их функция. Содержание КБ увеличивается на 34% по сравнению с интактными животными. Через 3 суток после окончания инъекций CCl4 доля НСРК составляет 25,2% общего количества коллагена (в норме - 14,7%). Достоверно выше нормы, как в относительных, так и в абсолютных значениях, была фракция ЩРК, а доля НРК снизилась до 44,4%. Общее количество КБ в печени имело тенденцию к повышению и в течение суток изменялось незначительно. В утренние часы происходит повышение доли растворимых фракций, а доля НРК уменьшается до 37,4%. Наибольшее повышение общего коллагена наблюдается в 16 часов, а снижение - в 8 часов. Абсолютная амплитуда суточных колебаний НСРК уменьшилась по сравнению с нормой в 2,6 раза. Следовательно, при хроническом гепатите в печени накапливаются незрелые КБ. Значительная часть вновь синтезированных КБ распадается под действием коллагенолитических ферментов еще до образования нерастворимых фибриллярных форм. Общая активность кислой фосфатазы при хроническом гепатите возрастает в 2,3 раза, неседиментируемая - в 2,6 раза. Общая активность катепсина Д увеличивается в 1,74 раза, а неседиментируемая активность - в 2,4 раза, составляя 39,1% от общей.

При хроническом гепатите усиливается биосинтез ГП. Общее количество гексозаминов в печени увеличивается в 2,3 раза и имеет два выраженных подъема в 8 и 20 часов, при этом доля растворимых фракций составляет 63,9%, а их содержание превышает в 3,2 раза норму. Максимум синтеза НСРГ приходится на 8 и 20 часов (у интактных крыс один максимум в 8 часов). Наибольшее содержание НРГ приходится на дневные часы, а не на ночные, как в норме.

Таким образом, при хроническом гепатите происходит активация клеток соединительной ткани, при этом наряду с увеличением общего содержания КБ и ГП в печени, увеличивается доля растворимых форм. Нарушается суточный биоритм основных компонентов соединительной ткани - КБ и ГП. Содержание тирозина остается ниже нормальных значений.

У животных с хроническим гепатитом эти нарушения слабо подвергаются регрессу даже после

прекращения введений СС14. Через 1 сутки происходит повышение ДНКг, но при высоком занчении ДНКнпк, составляющей 50% от общей ДНК печени. Через 2-е суток эти соотношения, в основном, сохраняются, а к 3 суткам происходит увеличение количества ДНК и снижение ДНКнпк, в результате чего ее доля уменьшается до 18%. Через 7 суток содержание ДНКнпк вновь увеличивается. Только через 1 месяц содержание ДНК в печени приближается к норме.

Полученные данные по динамике ДНК в основном, коррелируют с активностью лизосомальных ферментов и с содержанием КБ. Высоким показателям ДНК соответствует, в основном, высокая активность катепсина Д и кислой фосфатазы. Содержание КБ у данных животных в течение 60 суток наблюдения сохранялось высоким, кроме 4 и 7 суток.

Дальнейшее продолжение инъекций СС14 способствует углублению возникших нарушений и усилению продукции межклеточного вещества. После 24 инъекций СС14 в печени достоверно повышается содержание КБ, сохраняется высоким содержание ГП и сниженное количество тирозина. Характерно то, что в этот период вновь повышается содержание ДНК в печени, в основном за счет ДНК . Ее доля увеличивается до 49,5%. После 37 инъекций СС14 в печени возрастает содержание ДНКг. Доля ДНКнпк оказалась равной 34,9%. Эти данные свидетельствуют о повышении активности гепатоцитов, направленной на поддержание клеточного гомеостаза. Высокая активность клеток фибробластического ряда привела к повышенному синтезу межклеточного вещества. Содержание КБ и ГП увеличивается более, чем в 2,5 раза по сравнению с нормой, сохраняется низкое содержание тирозина.

Через 125 суток от начала введения СС14 (66 инъекций) в печени формируется выраженный фиброз, переходящий в цирроз. Содержание в ней КБ более, чем в 2 раза, а ГП более, чем в 3,5 раза превышает нормальные значения. Доля ДНКнпк составила 69,6%. Остается низким содержание тирозина. Увеличение числа инъекций СС14 до 90 (5,5 месяца 4 раза в неделю) вызывает массовую гибель животных (72,8% по сравнению с животными, получавшими СС14 в количестве 66 инъекций). По степени выраженности цирротических изменений животные данной группы были разделены на 2 подгруппы: умеренно выраженный и резко выраженный цирроз.

У животных с умеренно выраженным циррозом общее содержание КБ в печени достоверно (Р<0,01) увеличивается по сравнению как с нормой, так и с хроническим гепатитом. Обращает на себя внимание высокий уровень НРК (57,3%), а доля растворимых фракций составляет 27,8% (при хроническом гепатите - 25,2%). Эти данные свидетельствуют об активации фибробластов, синтезирующих КБ, и отложения межклеточного коллагена.

У животных с резко выраженным циррозом печени общее содержание КБ оказалось значительно

выше (в 1,45 раза выше, чем у крыс с умеренно выраженным циррозом). Особенно резко повышается уровень НРК, превышая уровень у интактных крыс почти в 3 раза. При этом в печени сохраняется высокое содержание НСРК, однако, его доля снижается до 20,4%.

Таким образом, у крыс с резко выраженным циррозом снижается растворимость КБ, повышается зрелость коллагеновых волокон и происходит стабилизация патологического процесса на более высоком метаболическом уровне соединительной ткани.

Изучение растворимости ГП в печени при разной степени выраженности цирроза не выявило существенной разницы как в относительных, так и в абсолютных величинах растворимых и нерастворимых фракций. Содержание ГП в печени при циррозе разной степени выраженности не отличалось и от значений, полученных у крыс с хроническим гепатитом. Содержание тирозина в печени крыс также достоверно не отличалось в группах с разной степенью выраженности цирроза. Доля растворимых и нерастворимых фракций была практически одинаковая. Однако обращает на себя внимание значительное по сравнению с нормой, увеличение тирозина в нерастворимой фракции. Это указывает на повышение доли структурных ГП в печени, составляющих большую часть соединительнотканного межклеточного матрикса. Количество тирозина в НРФ при циррозе увеличено в 6,5 - 7,5 раз по сравнению с нормой, а его доля возросла с 3% в норме до 8,2 - 9,5 % при циррозе. Содержание ГУК у животных с циррозом печени было выше нормы в 1,6 раза (Р<0,01).

Увеличение ДНКнпк в цирротически измененной печени сочетается с увеличением активности лизосомальных гидролаз. Общая активность кислой фосфатазы увеличивается почти в 3 раза, а неседиментируемая активность в 3,5 раза, что составляет 23,6% от общей. Общая активность катепсина Д возрастает более, чем в 4 раза, а неседиментруемая - в 4,6 раза. При этом доля свободной активности увеличивается только в 2,9 раза по сравнению с нормой.

Эти данные показывают, что увеличение активности лизосомальных ферментов связано, в основном, с увеличением числа клеток, богатых гидролитическими ферментами, имеющих нормальный лизосомальный аппарат. Выход ферментов в цитоплазму и межклеточное пространство ограничен, расщепление субстратов происходит внутриклеточно путем эндоцитоза. В то же время коллагенолитическая активность ткани печени заметно снижается.

Таким образом, при циррозе резко тормозится катаболизм зрелых КБ, а увеличение в органе фибробластов способствует активному синтезу КБ и ГП, формированию коллагеновых фибрилл. При циррозе печени, по С.М. Ьар1еге (1965), осуществляется «длинный» путь метаболизма КБ. Основная масса НСРК превращается в НРК, который накапливается в печени при сниженной активности коллагенолитических ферментов.