УЛУЧШЕННЫЕ СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ ОПУХОЛЕЙ
IMPROVED METHODS FOR TREATING TUMOURS

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к сочетаниям аплидина (Aplidine) или аналогов аплидина с другими противоопухолевыми средствами и применению этих сочетаний для лечения злокачественных опухолей, в частности для лечения рака легких, рака молочной железы, рака толстого кишечника, рака предстательной железы, злокачественной опухоли почки, меланомы, множественной миеломы, лейкоза и лимфомы.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Aplidium albicans
Аплидин (дегидродидемнин B) представляет собой циклический депсипептид, который выделен из средиземноморских морских туникат, , и представляет собой предмет WO 91/04985. Он родственен соединениям, известным как дидемнины, и имеет следующую структуру:
Дополнительную информацию об аплидине, аналогах аплидина, его применениях, препаратах и синтезе можно найти в патентных заявках WO 99/42125, WO 01/35974, WO 01/76616, WO 02/30441, WO 02/02596, WO 03/33013 и WO 2004/080477. Авторы данного изобретения включили содержание каждого из этих текстов PCT в качестве отдельной ссылки.
В преклинических исследованиях на животных и в исследованиях у людей в клинической фазе I показано, что аплидин обладает цитотоксическим потенциалом в отношении широкого спектра типов опухолей, включая лейкоз и лимфомы. См., например:
New Drugs Cancer Ther.
Faircloth, G. et al.: "Dehydrodidemnin В (DDB) a new marine derived anticancer agent with activity against experimental tumour models", 9th NCI-EORTC Symp. (March 12-15, Amsterdam) 1996, Abst 111;
Proc. Amer. Assoc. Cancer Res.
Faircloth, G. et al.: "Preclinical characterization of aplidine, a new marine anticancer depsipeptide", 1997, 38: Abst 692;
Br. J. Cancer,
Proc. Am. Assoc. Cancer Res.
Depenbrock H, Peter R, Faircloth GT, Manzanares I, Jimeno J, Hanauske AR.: "In vitro activity of Aplidine, a new marine-derived anti-cancer compound, on freshly explanted clonogenic human tumour cells and haematopoietic precursor cells" 1998; 78: 739-744; Faircloth G, Grant W, Nam S, Jimeno J, Manzanares I, Rinehart K.: "Schedule-dependency of Aplidine, a marine depsipeptide with antitumor activity", 1999; 40: 394;
Clin. Cancer Res.
Broggini M, Marchini S, D'Incalci M, Taraboletti G, Giavazzi R, Faircloth G, Jimeno J.: "Aplidine blocks VEGF secretion and VEGF/VEGF-R1 autocrine loop in a human leukemic cell line", 2000; 6 (suppl): 4509;
Br. J. Cancer
Erba E, Bassano L, Di Liberti G, Muradore I, Chiorino G, Ubezio P, Vignati S, Codegoni A, Desiderio MA, Faircloth G, Jimeno J and D'Incalci M.: "Cell cycle phase perturbations and apoptosis in tumour cells induced by aplidine", 2002; 86: 1510-1517;
Clin. Cancer Res.
Paz-Ares L, Anthony A, Pronk L, Twelves C, Alonso S, Cortes-Funes H, Celli N, Gomez C, Lopez-Lazaro L, Guzman C, Jimeno J, Kaye S.: "Phase I clinical and pharmacokinetic study of aplidine, a new marine didemnin, administered as 24-hour infusion weekly" 2000; 6 (suppl): 4509;
Clin. Cancer Res.
Clin. Cancer Res.
Raymond E, Ady-Vago N, Baudin E, Ribrag V, Faivre S, Lecot F, Wright T, Lopez Lazaro L, Guzman C, Jimeno J, Ducreux M, Le Chevalier T, Armand JP.: "A phase I and pharmacokinetic study of aplidine given as a 24-hour continuous infusion every other week in patients with solid tumor and lymphoma", 2000; 6 (suppl): 4510; Maroun J, Belanger K, Seymour L, Soulieres D, Charpentier D, Goel R, Stewart D, Tomiak E, Jimeno J, Matthews S. :"Phase I study of aplidine in a 5 day bolus q 3 weeks in patients with solid tumors and lymphomas", 2000; 6 (suppl): 4509;
Clin. Cancer Res.
Izquierdo MA, Bowman A, Martinez M, Cicchella B, Jimeno J, Guzman C, Germa J, Smyth J.: "Phase I trial of Aplidine given as a 1 hour intravenous weekly infusion in patients with advanced solid tumors and lymphoma", 2000; 6 (suppl): 4509.
de novo
in vitro
in vitro
Исследование механизма показывает, что аплидин может блокировать секрецию VEGF в клетках ALL-MOLT4, а в образцах AML и ALL от пациентов-детей с ALL и AML  или с рецидивами ALL и AML наблюдали цитотоксическую активность  при низких концентрациях (5 нМ). По-видимому, аплидин  в обработанных лекарственным средством лейкозных клетках индуцирует арест в G1 и в G2. Кроме подавления рецептора VEGF, дополнительно о способе(ах) действия аплидина известно немного.
В фазе I клинических испытаний аплидина, для предотвращения миелотоксичности, назначали L-карнитин в виде предварительного введения за 24 часа или совместного введения, например, см. WO 02/30441. Доказано, что совместное введение L-карнитина способно улучшить восстановление от индуцированной лекарственным средством мышечной токсичности, и оно позволило увеличить дозу аплидина.
in vitro
in vivo
Ранее проведенные с аплидином в сочетании с другими противораковыми средствами анализы  и  показали, что сочетания с анализируемым лекарственным средством пригодны для комбинированного лечения лейкоза и лимфомы. В WO 2004/080421 аплидин для лечения лейкоза и лимфомы, в частности, оценивали в сочетании с метотрексатом, цитозинарабинозидом, митоксантроном, винбластином, метилпреднизолоном и доксорубицином.
Так как злокачественная опухоль является лидирующей причиной смертности животных и людей, прикладывались и все еще прикладываются значительные усилия для получения эффективного и безопасного для введения пациентам, страдающим от злокачественной опухоли, противоопухолевого лекарственного средства. Проблемой для разрешения посредством настоящего изобретения является предоставление противоопухолевых лекарственных средств, пригодных для лечения злокачественной опухоли.
РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Авторы изобретения установили, что аплидин и аналоги аплидина усиливают действие других противораковых средств и, таким образом, их можно успешно использовать в комбинированной терапии для лечения злокачественной опухоли. Изобретение относится к фармацевтическим композициям, фармацевтическим лекарственным формам, наборам, способам лечения злокачественных опухолей с использованием этих способов комбинированной терапии и к применению аплидина и аналогов аплидина для получения лекарственного средства для комбинированной терапии.
По одному из аспектов данного изобретения авторы изобретения предоставляют эффективные способы комбинированной терапии на основе аплидина и аналогов аплидина с применением других лекарственных средств, эффективных при лечении злокачественной опухоли. Предпочтительно другое лекарственное средство или другие лекарственные средства эффективны при лечении злокачественной опухоли, выбранной из рака легких, рака молочной железы, рака толстого кишечника, рака предстательной железы, злокачественной опухоли почки, меланомы, множественной миеломы, лейкоза и лимфомы. Наиболее предпочтительно другое лекарственное средство или другие лекарственные средства выбраны из группы, состоящей из паклитаксела (таксол), доксорубицина, цисплатина, триоксида мышьяка, 5-фторурацила (5-FU), цитозинарабинозида (AraC), карбоплатина, 7-этил-10-гидроксикамптотецина (SN38), этопозида (VP16), мелфалана, дексаметазона, циклофосфамида, бортезомиба, эрлотиниба, трастузумаба, леналидомида (ревлимид), интерлейкина-2 (IL-2), интерферона-α 2 (INF-α), дакарбазина (DTIC), бевацизумаба (авастин), идарубицина, талидомида и ритуксимаба.
В другом варианте осуществления данное изобретение относится к способу лечения злокачественной опухоли, включающему введение нуждающемуся в таком лечении пациенту терапевтически эффективного количества аплидина, или аналога аплидина, или его фармацевтически приемлемого пролекарственного средства, соли, сольвата или гидрата и терапевтически эффективного количества другого лекарственного средства, эффективного для лечения злокачественной опухоли, или его фармацевтически приемлемого пролекарственного средства, соли, сольвата или гидрата, вводимого до, в течение или после введения аплидина или аналога аплидина. В дополнительном варианте осуществления изобретения вводят терапевтически эффективное количество третьего лекарственного средства, и его вводят до, в течение или после введения аплидина или аналога аплидина и второго лекарственного средства.
Предпочтительно другое лекарственное средство или другие лекарственные средства эффективны для лечения злокачественной опухоли, выбранной из рака легких, рака молочной железы, рака толстого кишечника, рака предстательной железы, злокачественной опухоли почки, меланомы, множественной миеломы, лейкоза и лимфомы. Наиболее предпочтительно другое лекарственное средство или другие лекарственные средства выбраны из группы, состоящей из паклитаксела (таксол), доксорубицина, цисплатина, триоксида мышьяка, 5-фторурацила (5-FU), цитозинарабинозида (AraC), карбоплатина, 7-этил-10-гидроксикамптотецина (SN38), этопозида (VP16), мелфалана, дексаметазона, циклофосфамида, бортезомиба, эрлотиниба, трастузумаба, леналидомида (ревлимид), интерлейкина-2 (IL-2), интерферона-α 2 (INF-α), дакарбазина (DTIC), бевацизумаба (авастин), идарубицина, талидомида и ритуксимаба. Другое лекарственное средство или другие лекарственные средства могут составлять часть той же композиции, или их можно предоставлять в виде отдельной композиции для введения в то же время или в другое время.
В другом аспекте данное изобретение относится к способу увеличения терапевтической эффективности лекарственного средства, эффективного для лечения злокачественной опухоли, предпочтительно лекарственного средства, эффективного для лечения злокачественной опухоли, выбранной из рака легких, рака молочной железы, рака толстого кишечника, рака предстательной железы, злокачественной опухоли почки, меланомы, множественной миеломы, лейкоза и лимфомы, наиболее предпочтительно лекарственное средство выбрано из группы, состоящей из паклитаксела (таксол), доксорубицина, цисплатина, триоксида мышьяка, 5-фторурацила (5-FU), цитозинарабинозида (AraC), карбоплатина, 7-этил-10-гидроксикамптотецина (SN38), этопозида (VP16), мелфалана, дексаметазона, циклофосфамида, бортезомиба, эрлотиниба, трастузумаба, леналидомида (ревлимид), интерлейкина-2 (IL-2), интерферона-α 2 (INF-α), дакарбазина (DTIC), бевацизумаба (авастин), идарубицина, талидомида и ритуксимаба или их фармацевтически приемлемых пролекарственных средств, солей, сольватов или гидратов, где способ включает введение нуждающемуся в этом пациенту определенного количества аплидина, или аналога аплидина, или его фармацевтически приемлемого пролекарственного средства, соли, сольвата или гидрата. Аплидин или аналог аплидина вводят до, в течение или после введения другого лекарственного средства. В дополнительном варианте осуществления изобретения вводят терапевтически эффективное количество третьего лекарственного средства, и его вводят до, в течение или после введения аплидина или аналога аплидина и второго лекарственного средства. Предпочтительно третье лекарственное средство представляет собой лекарственное средство, эффективное для лечения злокачественной опухоли, выбранной из рака легких, рака молочной железы, рака толстого кишечника, рака предстательной железы, злокачественной опухоли почки, меланомы, множественной миеломы, лейкоза и лимфомы. Наиболее предпочтительно третье лекарственное средство выбрано из группы, состоящей из паклитаксела (таксол), доксорубицина, цисплатина, триоксида мышьяка, 5-фторурацила (5-FU), цитозинарабинозида (AraC), карбоплатина, 7-этил-10-гидроксикамптотецина (SN38), этопозида (VP16), мелфалана, дексаметазона, циклофосфамида, бортезомиба, эрлотиниба, трастузумаба, леналидомида (ревлимид), интерлейкина-2 (IL-2), интерферона-α 2 (INF-α), дакарбазина (DTIC), бевацизумаба (авастин), идарубицина, талидомида и ритуксимаба или их фармацевтически приемлемых пролекарственных средств, солей, сольватов или гидратов.
В дополнительном аспекте данное изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей аплидин, или аналог аплидина, или его фармацевтически приемлемое пролекарственное средство, соль, сольват или гидрат и другое лекарственное средство, эффективное для лечения злокачественной опухоли. В дополнительном варианте осуществления изобретения фармацевтическая композиция дополнительно содержит третье лекарственное средство, также эффективное для лечения злокачественной опухоли. Предпочтительно другое лекарственное средство или другие лекарственные средства эффективны для лечения злокачественной опухоли, выбранной из рака легких, рака молочной железы, рака толстого кишечника, рака предстательной железы, злокачественной опухоли почки, меланомы, множественной миеломы, лейкоза и лимфомы. Наиболее предпочтительно другое лекарственное средство или другие лекарственные средства выбраны из группы, состоящей из паклитаксела (таксол), доксорубицина, цисплатина, триоксида мышьяка, 5-фторурацила (5-FU), цитозинарабинозида (AraC), карбоплатина, 7-этил-10-гидроксикамптотецина (SN38), этопозида (VP16), мелфалана, дексаметазона, циклофосфамида, бортезомиба, эрлотиниба, трастузумаба, леналидомида (ревлимид), интерлейкина-2 (IL-2), интерферона-α 2 (INF-α), дакарбазина (DTIC), бевацизумаба (авастин), идарубицина, талидомида и ритуксимаба.
Изобретение также относится к набору для применения при лечении или профилактике злокачественной опухоли, содержащему лекарственную форму аплидина, или аналога аплидина, или его фармацевтически приемлемого пролекарственного средства, соли, сольвата или гидрата, лекарственную форму другого лекарственного средства, эффективного для лечения злокачественной опухоли, или его фармацевтически приемлемого пролекарственного средства, соли, сольвата или гидрата и инструкции по применению каждого действующего средства в комбинации для лечения или профилактики злокачественной опухоли. В дополнительном варианте осуществления изобретения набор дополнительно содержит лекарственную форму третьего лекарственного средства, также эффективного для лечения злокачественной опухоли, или его фармацевтически приемлемого пролекарственного средства, соли, сольвата или гидрата. Предпочтительно другое лекарственное средство или другие лекарственные средства эффективны для лечения злокачественной опухоли, выбранной из рака легких, рака молочной железы, рака толстого кишечника, рака предстательной железы, злокачественной опухоли почки, меланомы, множественной миеломы, лейкоза и лимфомы. Наиболее предпочтительно другое лекарственное средство или другие лекарственные средства выбраны из группы, состоящей из паклитаксела (таксол), доксорубицина, цисплатина, триоксида мышьяка, 5-фторурацила (5-FU), цитозинарабинозида (AraC), карбоплатина, 7-этил-10-гидроксикамптотецина (SN38), этопозида (VP16), мелфалана, дексаметазона, циклофосфамида, бортезомиба, эрлотиниба, трастузумаба, леналидомида (ревлимид), интерлейкина-2 (IL-2), интерферона-α 2 (INF-α), дакарбазина (DTIC), бевацизумаба (авастин), идарубицина, талидомида и ритуксимаба.
В настоящее изобретение также включены эффективные способы комбинированной терапии на основе применения трех лекарственных средств: аплидина и аналогов аплидина и двух дополнительных лекарственных средств (второе лекарственное средство и третье лекарственное средство).
В одном из предпочтительных аспектов настоящее изобретение относится к синергическим сочетаниям.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фиг.1. Пример линейного регрессионного анализа, который представляет собой способ выявления наличия синергии.
in vitro
Фиг.2. Данные активности аплидина (Aplidin) в сочетании с паклитакселом (Таксол) против клеток SKBR3 .
in vitro
Фиг.3. Данные активности аплидина (Aplidin) в сочетании с паклитакселом (Таксол) против клеток MOLT3 .
in vitro
Фиг.4. Данные активности аплидина (Aplidin) в сочетании с паклитакселом (Таксол) против клеток PC3 .
in vitro
Фиг.5. Данные активности аплидина (Aplidin) в сочетании с паклитакселом (Таксол) против клеток HL60 .
in vitro
Фиг.6. Данные активности аплидина (Aplidin) в сочетании с паклитакселом (Таксол) против клеток MX1 .
in vitro
Фиг.7. Данные активности аплидина (Aplidin) в сочетании с паклитакселом (Таксол) против клеток A549 .
in vitro
Фиг.8. Данные активности аплидина (Aplidin) в сочетании с доксорубицином (DOX) против клеток A549 .
in vitro
Фиг.9. Данные активности аплидина (Aplidin) в сочетании с доксорубицином (DOX) против клеток HT29 .
in vitro
Фиг.10. Данные активности аплидина (Aplidin) в сочетании с доксорубицином (DOX) против клеток PC3 .
in vitro
Фиг.11. Данные активности аплидина (Aplidin) в сочетании с доксорубицином (DOX) против клеток MOLT3 .
in vitro
Фиг.12. Данные активности аплидина (Aplidin) в сочетании с доксорубицином (DOX) против клеток MX1 .
in vitro
Фиг.13. Данные активности аплидина (Aplidin) в сочетании с доксорубицином (DOX) против клеток SKBR3 .
in vitro
Фиг.14. Данные активности аплидина (AP, Aplidin) в сочетании с цисплатином (DDP) против клеток MX1 .
in vitro
Фиг.15. Данные активности аплидина (Aplidin) в сочетании с цисплатином (цис-DDP) против клеток HT29 .
in vitro
Фиг.16. Данные активности аплидина (APL, Aplidin) в сочетании с цисплатином (цис-DDP, DDP) против клеток SKBR3 .
in vitro
Фиг.17. Данные активности аплидина (Aplidin) в сочетании с цисплатином (цис-DDP, DDP) против клеток MOLT3 .
in vitro
Фиг.18. Данные активности аплидина (Aplidin) в сочетании с цисплатином (цис-DDP, DDP) против клеток A549 .
in vitro
Фиг.19. Данные активности аплидина (Aplidin) в сочетании с триоксидом мышьяка (TRI) против клеток A549 .
in vitro
Фиг.20. Данные активности аплидина (Aplidin) в сочетании с триоксидом мышьяка (TRI) против клеток HT29 .
in vitro
Фиг.21. Данные активности аплидина (Aplidin) в сочетании с триоксидом мышьяка (TRI) против клеток PC3 .
in vitro
Фиг.22. Данные активности аплидина (Aplidin) в сочетании с триоксидом мышьяка (TRI) против клеток MOLT3 .
in vitro
Фиг.23. Данные активности аплидина (Aplidin) в сочетании с 5-фторурацилом (5FU) против клеток HL60 .
in vitro
Фиг.24. Данные активности аплидина (Aplidin) в сочетании с 5-фторурацилом (5FU) против клеток SKBR3 .
in vitro
Фиг.25. Данные активности аплидина (Aplidin) в сочетании с 5-фторурацилом (5FU) против клеток A549 .
in vitro
Фиг.26. Данные активности аплидина (Aplidin) в сочетании с 5-фторурацилом (5FU) против клеток PC3 .
in vitro
Фиг.27. Данные активности аплидина (Aplidin) в сочетании с 5-фторурацилом (5FU) против клеток HT29 .
in vitro
Фиг.28. Данные активности аплидина (Aplidin) в сочетании с цитозинарабинозидом (AraC) против клеток SKBR3 .
in vitro
Фиг.29. Данные активности аплидина (Aplidin) в сочетании с цитозинарабинозидом (AraC) против клеток A549 .
in vitro
Фиг.30. Данные активности аплидина (Aplidin) в сочетании с цитозинарабинозидом (AraC) против клеток PC3 .
in vitro
Фиг.31. Данные активности аплидина (Aplidin) в сочетании с цитозинарабинозидом (AraC) против клеток HL60 .
in vitro
Фиг.32. Данные активности аплидина (Aplidin) в сочетании с цитозинарабинозидом (AraC) против клеток HT29 .
in vitro
Фиг.33. Данные активности аплидина (Aplidin) в сочетании с карбоплатином в клетках PC3 .
in vitro
Фиг.34. Данные активности аплидина (Aplidin) в сочетании с карбоплатином в клетках HT29 .
in vitro
Фиг.35. Данные активности аплидина (Aplidin) в сочетании с карбоплатином в клетках A549 .
in vitro
Фиг.36. Данные активности аплидина (Aplidin) в сочетании с карбоплатином в клетках MOLT3 .
in vitro
Фиг.37. Данные активности аплидина (Aplidin) в сочетании с карбоплатином в клетках MX1 .
in vitro
Фиг.38. Данные активности аплидина (Aplidin) в сочетании с SN-38 в клетках A549 .
in vitro
Фиг.39. Данные активности аплидина (Aplidin) в сочетании с SN-38 в клетках SKBR3 .
in vitro
Фиг.40. Данные активности аплидина (Aplidin) в сочетании с SN-38 в клетках HL60 .
in vitro
Фиг.41. Данные активности аплидина (Aplidin) в сочетании с SN-38 в клетках PC3 .
in vitro
Фиг.42A и 42B. Данные активности аплидина (A, Aplidin) в сочетании с VP16 (B) против клеток HL-60 .
in vitro
Фиг.43A и 43B. Данные активности аплидина (A, Aplidin) в сочетании с VP16 (B) против клеток K562 .
in vitro
Фиг.44A и 44B. Данные активности аплидина (A, Aplidin) в сочетании с VP16 (B) против клеток MOLT3 .
in vitro
Фиг.45A и 45B. Данные активности аплидина (A, Aplidin) в сочетании с VP16 (B) против клеток MC116 .
in vitro
Фиг.46A и 46B. Данные активности аплидина (A, Aplidin) в сочетании с VP16 (B) против клеток RAMOS .
in vitro
Фиг.47A и 47B. Данные активности аплидина (A, Aplidin) в сочетании с VP16 (B) против клеток U937 .
in vitro
Фиг.48A и 48B. Данные активности аплидина (A, Aplidin) в сочетании с VP16 (B) против клеток NCI-H929 .
in vitro
Фиг.49A и 49B. Данные активности аплидина (A, Aplidin) в сочетании с VP16 (B) против клеток HUNS-1 .
in vitro
Фиг.50A и 50B. Данные активности аплидина (A, Aplidin) в сочетании с VP16 (B) против клеток U266 B1 .
in vitro
Фиг.51A и 51B. Данные активности аплидина (A, Aplidin) в сочетании с VP16 (B) против клеток RPMI 8226 .
in vitro
Фиг.52. Данные активности аплидина (Aplidin) в сочетании с карбоплатином против клеток LOX-I-MVI .
in vitro
Фиг.53. Данные активности аплидина (Aplidin) в сочетании с карбоплатином против клеток UACC-257 .
Фиг.54. Ответ на дозу аплидина через 48 часов после обработки в клеточных линиях MM1S, MM1R, U266 и U266-LR7.
Фиг.55. Сравнение эффективности дозы аплидина (Aplidin) и других лекарственных средств в клеточной линии MM1S (48 часов обработки).
Фиг.56. Сочетание аплидина (Aplidin) и дексаметазона через 3 суток. A) Кривая "доза-эффект". B) Диаграмма Fa-CI.
Фиг.57. Сочетание аплидина (Aplidin) и дексаметазона через 6 суток. A) Кривая "доза-эффект". B) Диаграмма Fa-CI.
Фиг.58. Сочетание аплидина (Aplidin) и мелфалана через 3 суток. A) Кривая "доза-эффект". B) Диаграмма Fa-CI.
Фиг.59. Сочетание аплидина (Aplidin) и мелфалана через 6 суток. A) Кривая "доза-эффект". B) Диаграмма Fa-CI.
Фиг.60. Сочетание аплидина (Aplidin) и доксорубицина через 3 суток. A) Кривая "доза-эффект". B) Диаграмма Fa-CI.
Фиг.61. Сочетание аплидина (Aplidin) и доксорубицина через 6 суток. A) Кривая "доза-эффект". B) Диаграмма Fa-CI.
Фиг.62. Сочетание аплидина (Aplidin) и леналидомида (ревлимид) через 3 суток. A) Кривая "доза-эффект". B) Диаграмма Fa-CI.
Фиг.63. Сочетание аплидина (Aplidin) и леналидомида (ревлимид) через 6 суток. A) Кривая "доза-эффект". B) Диаграмма Fa-CI.
Фиг.64. Сочетание аплидина (Aplidin) и бортезомиба через 3 суток. A) Кривая "доза-эффект". B) Диаграмма Fa-CI.
Фиг.65. Сочетание аплидина (Aplidin) и бортезомиба через 6 суток. A) Кривая "доза-эффект". B) Диаграмма Fa-CI.
Фиг.66. Динамика общего объема опухоли после начала обработки аплидином (Aplidin) в качестве единственного средства или в сочетании с дакарбазином в опухолевых ксенотрансплантатах меланомы MRI-H-187.
Фиг.67. Динамика общего объема опухоли после начала обработки аплидином (Aplidin) в качестве единственного средства или в сочетании с карбоплатином в опухолевых ксенотрансплантатах меланомы MRI-H-187.
Фиг.68. Динамика общего объема опухоли после начала обработки аплидином (Aplidin) в качестве единственного средства или в сочетании с интерлейкином-2 (IL-2) в опухолевых ксенотрансплантатах меланомы MRI-H-187.
Фиг.69. Динамика общего объема опухоли после начала обработки аплидином (Aplidin) в качестве единственного средства или в сочетании с интерфероном-α 2a (INF-α) в опухолевых ксенотрансплантатах меланомы MRI-H-187.
Фиг.70. Динамика общего объема опухоли после начала обработки аплидином (APL) в качестве единственного средства или в сочетании с дакарбазином (DTIC) в опухолевых ксенотрансплантатах меланомы LOX-IMVI.
Фиг.71. Динамика общего объема опухоли после начала обработки аплидином (APL) в качестве единственного средства или в сочетании с карбоплатином в опухолевых ксенотрансплантатах меланомы LOX-IMVI.
Фиг.72. Динамика общего объема опухоли после начала обработки аплидином (APL, Aplidin) в качестве единственного средства или в сочетании с интерлейкином-2 (IL-2) в опухолевых ксенотрансплантатах меланомы LOX-IMVI.
Фиг.73. Динамика общего объема опухоли после начала обработки аплидином (APL, Aplidin) в качестве единственного средства или в сочетании с интерфероном-α 2a (INF-α) в опухолевых ксенотрансплантатах меланомы LOX-IMV1.
Фиг.74. Динамика общего объема опухоли после начала обработки аплидином (APL) в качестве единственного средства или в сочетании с бевацизумабом (авастин) в ксенотрансплантатах опухоли почки CaKi-1.
Фиг.75. Динамика общего объема опухоли после начала обработки аплидином (APL) в качестве единственного средства или в сочетании с интерлейкином-2 (IL-2) в ксенотрансплантатах опухоли почки CaKi-1.
Фиг.76. Динамика общего объема опухоли после начала обработки аплидином (APL) в качестве единственного средства или в сочетании с интерфероном-α 2a (INF-α 2a) в ксенотрансплантатах опухоли почки CaKi-1.
Фиг.77. Динамика общего объема опухоли после начала обработки аплидином (APL) в качестве единственного средства или в сочетании с бевацизумабом (Авастин) в ксенотрансплантатах опухоли почки MRI-H121.
Фиг.78. Динамика общего объема опухоли после начала обработки аплидином (APL) в качестве единственного средства или в сочетании с интерлейкином-2 (IL- 2) в ксенотрансплантатах опухоли почки MRI-H121.
Фиг.79. Динамика общего объема опухоли после начала обработки аплидином (APL) в качестве единственного средства или в сочетании с интерфероном-α 2a (INF-α) в ксенотрансплантатах опухоли почки MRI-H121.
Фиг.80. Сочетание аплидин (A) + леналидомид (ревлимид; R) + дексаметазон (D) в MM1S после 72 часов обработки. Дозы аплидина выражены в единицах нМ, дозы леналидомида выражены в единицах мкМ и дозы дексаметазона выражены в единицах нМ.
Фиг.81. Сочетание аплидин (A) + бортезомиб (B) + дексаметазон (D) в MM1S после 72 часов обработки. Дозы аплидина выражены в единицах нМ, дозы бортезомиба выражены в единицах нМ и дозы дексаметазона выражены в единицах нМ.
Фиг.82. Сочетание аплидин (A) + бортезомиб (B) + леналидомид (ревлимид; R) в MM1S после 72 часов обработки. Дозы аплидина выражены в единицах нМ, дозы бортезомиба выражены в единицах нМ и дозы леналидомида выражены в единицах мкМ.
Фиг.83. Сочетание аплидин (A) + талидомид (T) + дексаметазон (D) в MM1S после 72 часов обработки. Дозы аплидина выражены в единицах нМ, дозы талидомида выражены в единицах мкМ и дозы дексаметазона выражены в единицах нМ.
Фиг.84. Сочетание аплидин (A) + мелфалан (M) + дексаметазон (D) в MM1S после 72 часов обработки. Дозы аплидина выражены в единицах нМ, дозы мелфалана выражены в единицах мкМ и дозы дексаметазона выражены в единицах нМ.
Фиг.85. Сочетание аплидин (A) + мелфалан (M) + бортезомиб (B) в MM1S после 72 часов обработки. Дозы аплидина выражены в единицах нМ, дозы мелфалана выражены в единицах мкМ и дозы бортезомиба выражены в единицах нМ.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Подразумевают, что "злокачественная опухоль" включает опухоли, неоплазии и любые другие злокачественные ткани или клетки. Настоящее изобретение относится к применению аплидина или аналога аплидина в комбинации для лечения злокачественной опухоли вообще, но более предпочтительно для лечения рака легких, рака молочной железы, рака толстого кишечника, рака предстательной железы, злокачественной опухоли почки, меланомы, множественной миеломы, лейкоза и лимфомы.
in vitro
in vivo
in vitro
Для исследования возможного потенциирования других противораковых средств аплидином авторы изобретения проводили систематическое исследование сочетаний лекарственных средств на возможное применение для указанных выше типов злокачественных опухолей. Исследования комбинаций лекарственных средств проводили на различных типах клеточных линий. Исследования  проводили с использованием таких линий опухолевых клеток, как линия NSCL A549, линия карциномы молочной железы MX1, линия промиелоцитарного лейкоза HL60, линия аденокарциномы толстого кишечника HT29, линия аденокарциномы предстательной железы PC3, линия аденокарциномы молочной железы SKBR3 и линия острого лимфобластного лейкоза (MOLT3), которые обладают различной чувствительностью к аплидину (от низкой до высокой). Также проводили дополнительные исследования с клеточными линиями лейкозов, лимфом, множественной миеломы и меланомы. Кроме того, для определения действия аплидина в сочетании с другими стандартными средствами также проводили исследования  с использованием ксенотрансплантатов меланомы, опухоли почки, миеломы и лимфомы. Наконец, проводили исследования  в линиях клеток множественной миеломы с применением тройных комбинаций, т.е. сочетая аплидин с двумя дополнительными стандартными средствами (второе и третье лекарственное средство).
В качестве основного заключения авторы изобретения обнаружили, что цитотоксичность аплидина в опухолевых клетках сильно увеличена в сочетании со многими из стандартных средств, применяемых для этой оценки. Основной синергический эффект наблюдали для сочетания аплидина с паклитакселом (таксол), доксорубицином, цисплатином, триоксидом мышьяка, 5-фторурацилом (5-FU), цитозинарабинозидом (AraC), карбоплатином, 7-этил-10-гидроксикамптотецином (SN38), этопозидом (VP16), мелфаланом, дексаметазоном, циклофосфамидом, бортезомибом, эрлотинибом, трастузумабом, леналидомидом (ревлимид), интерлейкином-2 (IL-2), интерфероном-α 2 (INF-α), дакарбазином (DTIC), бевацизумабом (авастин), идарубицином, талидомидом и ритуксимабом. Дополнительно также обнаружено, что увеличение цитотоксичности также получали с применением тройных комбинаций аплидина с указанными выше средствами.
Особенно предпочтительным для лечения злокачественной опухоли, а более конкретно - для лечения злокачественной опухоли, выбранной из рака молочной железы, лейкоза и рака предстательной железы, является сочетание аплидина с паклитакселом.
Особенно предпочтительным для лечения злокачественной опухоли, а более конкретно - для лечения злокачественной опухоли, выбранной из рака легких, рака толстого кишечника, рака предстательной железы и множественной миеломы, является сочетание аплидина с доксорубицином.
Особенно предпочтительным для лечения злокачественной опухоли, а более конкретно - для лечения злокачественной опухоли, выбранной из рака молочной железы и рака толстого кишечника, является сочетание аплидина с цисплатином.
Особенно предпочтительным для лечения злокачественной опухоли, а более конкретно - для лечения злокачественной опухоли, выбранной из рака легких, рака толстого кишечника и рака предстательной железы, является сочетание аплидина с триоксидом мышьяка.
Особенно предпочтительным для лечения злокачественной опухоли, а более конкретно - для лечения злокачественной опухоли, выбранной из лейкоза, рака легких, рака молочной железы и рака предстательной железы, является сочетание аплидина с 5-фторурацилом.
Особенно предпочтительным для лечения злокачественной опухоли, а более конкретно - для лечения злокачественной опухоли, выбранной из рака легких, рака молочной железы и рака предстательной железы, является сочетание аплидина с цитозинарабинозидом.
Особенно предпочтительным для лечения злокачественной опухоли, а более конкретно - для лечения злокачественной опухоли, выбранной из рака толстого кишечника, рака предстательной железы и меланомы, является сочетание аплидина с карбоплатином.
Особенно предпочтительным для лечения злокачественной опухоли, а более конкретно - для лечения рака легких, является сочетание аплидина с SN38.
Особенно предпочтительным для лечения злокачественной опухоли, а более конкретно - для лечения злокачественной опухоли, выбранной из лимфомы и множественной миеломы, является сочетание аплидина с этопозидом.
Особенно предпочтительным для лечения злокачественной опухоли, а более конкретно - для лечения множественной миеломы, является сочетание аплидина с дексаметазоном.
Особенно предпочтительным для лечения злокачественной опухоли, а более конкретно - для лечения множественной миеломы, является сочетание аплидина с леналидомидом.
Особенно предпочтительным для лечения злокачественной опухоли, а более конкретно - для лечения множественной миеломы, является сочетание аплидина с бортезомибом.
Особенно предпочтительным для лечения злокачественной опухоли, а более конкретно - для лечения меланомы, является сочетание аплидина с дакарбазином.
Особенно предпочтительным для лечения злокачественной опухоли, а более конкретно - для лечения злокачественной опухоли почки, является сочетание аплидина с бевацизумабом.
Особенно предпочтительным для лечения злокачественной опухоли, а более конкретно - для лечения злокачественной опухоли почки, является сочетание аплидина с интерлейкином-2.
Особенно предпочтительным для лечения злокачественной опухоли, а более конкретно - для лечения множественной миеломы, является сочетание аплидина с мелфаланом.
Особенно предпочтительным для лечения злокачественной опухоли, а более конкретно - для лечения лейкоза, является сочетание аплидина с идарубицином.
Особенно предпочтительным для лечения злокачественной опухоли, а более конкретно - для лечения лимфомы, является сочетание аплидина с ритуксимабом.
Особенно предпочтительным для лечения злокачественной опухоли, а более конкретно - для лечения множественной миеломы, является сочетание аплидина с талидомидом.
Особенно предпочтительным для лечения злокачественной опухоли, а более конкретно - для лечения множественной миеломы, является тройное сочетание аплидина с леналидомидом и дексаметазоном.
Особенно предпочтительным для лечения злокачественной опухоли, а более конкретно - для лечения множественной миеломы, является тройное сочетание аплидина с бортезомибом и дексаметазоном.
Особенно предпочтительным для лечения злокачественной опухоли, а более конкретно - для лечения множественной миеломы, является тройное сочетание аплидина с бортезомибом и леналидомидом.
Особенно предпочтительным для лечения злокачественной опухоли, а более конкретно - для лечения множественной миеломы, является тройное сочетание аплидина с бортезомибом и талидомидом.
Особенно предпочтительным для лечения злокачественной опухоли, а более конкретно - для лечения множественной миеломы, является тройное сочетание аплидина с дексаметазоном и талидомидом.
Особенно предпочтительным для лечения злокачественной опухоли, а более конкретно - для лечения множественной миеломы, является тройное сочетание аплидина с дексаметазоном и мелфаланом.
Особенно предпочтительным для лечения злокачественной опухоли, а более конкретно - для лечения множественной миеломы, является тройное сочетание аплидина с мелфаланом и бортезомибом.
Композиции по настоящему изобретению могут содержать все компоненты (лекарственные средства) в одной фармацевтически приемлемой фармацевтической форме. Альтернативно компоненты можно составлять отдельно и вводить в сочетании друг с другом. В настоящем изобретении можно использовать различные фармацевтически приемлемые формы, хорошо известные специалистам в данной области. Выбор соответствующей фармацевтической формы для применения согласно настоящему изобретению могут обычным способом проводить специалисты в данной области в зависимости от способа введения и характеристик растворимости компонентов композиции.
Примеры фармацевтических композиций, содержащих аплидин или аналог аплидина, включают жидкие композиции (растворы, суспензии или эмульсии), подходящие для внутривенного введения, и они могут содержать чистое соединение или соединение в сочетании с любым носителем или другими фармакологически активными соединениями. Растворенный аплидин продемонстрировал значительное разрушение в тестовых условиях тепловой и световой нагрузки, и была разработана лиофилизированная лекарственная форма, см. WO 99/42125, включенную в настоящий документ в качестве ссылки.
Введение аплидина или композиций по настоящему изобретению основано на протоколе дозирования предпочтительно посредством внутривенного вливания. Авторы изобретения предпочитают, чтобы использовали продолжительность вливания вплоть до 72 часов, более предпочтительно - от 1 до 24 часов, наиболее предпочтительно - приблизительно 1, приблизительно 3 или приблизительно 24 часа. Особенно желательна короткая продолжительность вливания, которая позволяет проводить обработку без содержания в госпитале, в течение ночи. Однако если нужно, вливание можно проводить приблизительно 24 часа или даже более. Вливание можно проводить с подходящими интервалами с изменяющимися схемами, иллюстративно: раз в неделю, два раза в неделю или с большей частотой в неделю, с повторением на каждой неделе, необязательно с пропусками, как правило, одной или нескольких недель.
Точная дозировка соединений сочетания варьирует в зависимости от конкретной фармацевтической формы, способа применения и конкретных участка, пациента и опухоли, подвергаемых обработке. В расчет следует принимать и другие факторы, такие как возраст, масса тела, пол, диета, время введения, скорость выведения, состояние пациента, сочетания лекарственных средств, реакции гиперчувствительности и тяжесть заболевания. Введение можно проводить непрерывно или периодически в пределах максимально переносимой дозы. Дополнительное руководство по введению аплидина приведено в WO 01/35974, включенной в настоящий документ в качестве ссылки в полном объеме.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к синергическим сочетаниям с применением аплидина или аналога аплидина. Признаки синергии можно легко выявить посредством тестирования сочетаний и анализа результатов, например посредством линейного регрессионного анализа. Иллюстрацией этого пункта служит фигура 1. Для выявления синергизма доступны альтернативные способы, такие как анализ изоболограмм, и их можно применять для настоящих целей.
Подходящие аналоги аплидина включают соединения, определенные п.1 WO 02/02596, особенно соединения, определенные любым из пунктов, зависимых от п.1. Авторы изобретения включили посредством конкретной ссылки описание в WO 02/02596 соединений, которые являются аналогами аплидина, включая формулу изобретения.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
in vitro
. Исследования  для определения воздействия аплидина в сочетании с другим стандартным средством на линии опухолевых клеток.
Аплидин в виде одного средства или в сочетании с выбранными стандартными химиотерапевтическими средствами оценивали относительно нескольких линий опухолевых клеток для измерения различий в цитотоксичности.
В качестве единственного средства и для комбинации с аплидином выбраны следующие стандартные средства: паклитаксел (таксол), доксорубицин, цисплатин, триоксид мышьяка (тризонекс), 5-фторурацил (5-FU), цитозинарабинозид (AraC), карбоплатин и 7-этил-10-гидроксикамптотецин (SN38).
Аплидин в качестве единственного средства цитотоксичен для нескольких типов злокачественной опухоли с различной эффективностью. Поэтому выбраны репрезентативные линии опухолевых клеток с низкой, средней или высокой чувствительностью к аплидину. Используемые линии опухолевых клеток перечислены в таблице 1.
Таблица 1
<b>Тип злокачественной опухоли</b> (клеточная линия)
<b>Чувствительность к аплидину</b>
NSCL (A549)
Низкая
карцинома молочной железы (MX1)
Низкая
промиелоцитарный лейкоз (HL60)
Средняя
аденокарцинома толстого кишечника (HT29)
Средняя
аденокарцинома предстательной железы (PC3)
Средняя
аденокарцинома молочной железы (SKBR3)
Высокая
острый лимфобластный лейкоз (MOLT3)
Высокая
Скрининг проводили в двух частях:
50
a. В первом наборе анализов для каждого соединения определяли значения IC через 72 часа экспозиции лекарственного средства в каждой из линий опухолевых клеток.
2
Все клеточные линии поддерживали в соответствующих средах для выращивания при 37°C, 5% CO и влажности 98%. Ни один из препаратов сред не содержал антибиотиков. За сутки до высевания клеток все культуры помещали в свежие полные среды для выращивания. В день сбора (высевания) клетки подсчитывали способом исключения трипанового синего (основная клеточная культура). Клетки собирали и высевали в 96-луночные планшеты для микротитрования при 10000 клеток на лунку в 190 мкл сред и инкубировали в течение 24 часов для того, чтобы позволить клеткам прикрепиться перед добавлением лекарственного средства. Клетки обрабатывали лекарственными средствами и цитотоксический эффект измеряли посредством анализа MTS Assay (тетразол), который представляет собой колориметрический способ для определения количества живых клеток. Через 72 часа инкубации с лекарственным средством к каждой лунке для микротитрования добавляли 25 мкл раствора MTS+PMS и инкубировали в течение 4 часов при 37°C. Затем планшеты вынимали из инкубатора и помещали на качалку для планшетов на 5 минут (с покрытием алюминиевой фольгой для защиты от света). Оптическую плотность считывали при 490 нм на спектрофотометре для анализа планшетов. Данные анализировали с применением программы SoftMax версии 3.12.
50
50
50
50
Рассчитывали IC, которая приблизительно эквивалентна IG (концентрация, при которой измеряют 50% ингибирование роста). С применением программы SoftMax получали кривую регрессии, а затем вручную интерполировали концентрацию при 50% ингибировании и преобразовывали эту концентрацию в молярную (М), деля на молекулярную массу соединения. Индивидуальные значения IC (экспозиция лекарственного средства 72 часа) приведены в таблице 2. Значения IC представляют 100% концентрацию лекарственного средства.
Таблица 2
<b>Клеточная линия</b>
<b>Тип</b>
<b>Лекарственное средство</b>
<b>IC</b><sub>50</sub><b> (Молярная)</b>
A549
опухоль NSCL
аплидин
3,6E-04
паклитаксел
1,3E-08
доксорубицин
1,3E-06
цисплатин
6,0E-06
триоксид мышьяка
4,2E-04
5-FU
1,4E-03
AraC
>1,0E-04
карбоплатин
3,1E-04
SN38
1,3E-03
MX1
аденокарцинома молочной железы
аплидин
>1,0E-04
паклитаксел
9,4E-06
доксорубицин
>1,0E-04
цисплатин
1,7E-04
триоксид мышьяка
9,7E-05
5-FU
>1,0E-04
AraC
>1,0E-04
карбоплатин
>1,0E-04
SN38
1,5E-07
HL60
промиелоцитарный лейкоз
аплидин
3,0E-09
паклитаксел
1,6E-08
доксорубицин
>1,0E-04
цисплатин
1,2E-05
триоксид мышьяка
2,0E-05
5-FU
1,2E-03
AraC
1,0E-05
карбоплатин
5,6E-05
SN38
<1,0E-06
HT29
аденокарцинома толстого кишечника
аплидин
>1,0E-04
паклитаксел
5,0E-09
доксорубицин
>1,0E-04
цисплатин
7,2E-04
триоксид мышьяка
8,0E-05
5-FU
8,8E-04
AraC
>1,0E-04
карбоплатин
2,6E-04
SN38
1,2E-07
PC3
опухоль предстательной железы
аплидин
7,8E-08
паклитаксел
Не определено
доксорубицин
1,1E-05
цисплатин
8,7E-05
триоксид мышьяка
1,2E-03
5-FU
2,2E-04
AraC
>1,0E-04
карбоплатин
>1,0E-04
SN38
4,6E-05
SKBR3
аденокарцинома молочной железы
аплидин
2,0E-09
паклитаксел
>1,0E-04
доксорубицин
2,9E-07
цисплатин
7,0E-06
триоксид мышьяка
1,0E-04
5-FU
1,8E-05
AraC
>1,0E-04
карбоплатин
5,2E-05
SN38
<1,0E-11
MOLT3
острый лимфобластный лейкоз
аплидин
4,9E-14
паклитаксел
7,7E-05
доксорубицин
6,9E-09
цисплатин
5,7E-07
триоксид мышьяка
3,7E-06
5-FU
1,1E-05
AraC
2,2E-07
карбоплатин
4,0E-06
SN38
1,0E-06
50
b. Во втором наборе анализов каждую клеточную линию инкубировали с аплидином в сочетании с каждым из стандартных средств, указанных выше, в следующих сочетаниях от индивидуальной концентрации IC:
<b>IC</b><sub>50</sub><b> аплидина</b>
<b>IC</b><sub>50</sub><b> стандартного средства</b>
100%
0%
75%
25%
60%
40%
50%
50%
40%
60%
30%
70%
25%
75%
0%
100%
0%
0%
2
Планшеты для микротитрования инкубировали в течение 72 часов при 5% CO и 37°C. Цитотоксический эффект измеряли посредством анализа MTS Assay. Оптические плотности считывали при 490 нм. Нормализованные данные представляли и интерпретировали, как описано. Данные анализировали следующим образом.
1. Для данных, нормализованных по контрольным значениям (100% = рост клеток в отсутствие средства (лекарственного средства); 0% = только контроль).
50
2. Нормализованные данные представляли в виде диаграммы рассеяния. Рисовали линию, соединяющую значения 100% IC для каждого средства (лекарственного средства). Значения значимо выше линии указывали на антагонизм, ниже - на синергию, а на линии - на аддитивность.
50
Статистическая обработка данных соответствовала Laska E. et al. Biometrics (1994) 50:834-841 и Greco et al. Pharmacol Rev. (1995) 47:331-385. Сочетания тестируемых соотношений доз считали синергическими, когда ингибирование клеточной пролиферации превышало максимум величин ингибирования для каждого лекарственного средства в отдельности (при 100% IC). Наоборот, решение об антагонизме принимали, когда ингибирование меньше, чем оба максимума. Об аддитивности судят, когда эффекты сочетаний значимо не отличаются от максимумов обоих лекарственных средств. Статистическую значимость оценивали посредством t-критерия Стьюдента по отношению к ингибированию при каждом соотношении доз в сравнении с ингибированием при максимуме каждого лекарственного средства. Общая значимость сочетаний лекарственных средств для каждой клеточной линии зависела от наличия статистической значимости более чем для 50% отношений доз.
50
50
В качестве графического представления значения ответов наносили на диаграмму рассеяния с отношениями доз, нанесенными на оси x, и значениями % ответов на оси y. Между двумя конечными значениями ответов проводили прямую линию. (Например, между значениями ответов для 100% IC аплидина и 100% IC стандартного химиотерапевтического средства.) В случаях когда значения ответов в двух конечных точках были приблизительно равными, точки, лежащие выше или ниже этой расчетной линии аддитивности, можно интерпретировать как представляющие антагонистическое или синергическое взаимодействие лекарственных средств соответственно.
in vitro
Сочетания каждого лекарственного средства с аплидином  имеют возможность быть синергическими, аддитивными или антагонистическими. Синергическая цитотоксичность для опухолевых клеток представляет собой оптимальный эффект и подразумевает, что сочетание аплидина с другим лекарственным средством является более эффективным, чем каждое лекарственное средство в отдельности.
В соответствие с этим анализом выявлено, что:
a. Сочетание аплидина с паклитакселом продемонстрировало синергию в клетках аденокарциномы молочной железы SKBR3 (фигура 2), клетках острого лимфобластного лейкоза MOLT3 (фигура 3) и в клетках аденокарциномы предстательной железы PC3 (фигура 4). Тенденцию к аддитивности наблюдали в клетках промиелоцитарного лейкоза HL60 (фигура 5), клетках карциномы молочной железы MX1 (фигура 6) и в клетках NSCL A549 (фигура 7).
b. Сочетание аплидина с доксорубицином продемонстрировало синергию в клетках NSCL A549 (фигура 8), клетках аденокарциномы толстого кишечника HT29 (фигура 9) и в клетках аденокарциномы предстательной железы PC3 (фигура 10). Аддитивность наблюдали в клетках острого лимфобластного лейкоза MOLT3 (фигура 11), клетках карциномы молочной железы MX1 (фигура 12) и клетках аденокарциномы молочной железы SKBR3 (фигура 13).
c. Сочетание аплидина с цисплатином продемонстрировало синергию в клетках карциномы молочной железы MX1 (фигура 14) и в клетках аденокарциномы толстого кишечника HT29 (фигура 15). Аддитивность наблюдали в клетках аденокарциномы молочной железы SKBR3 (фигура 16) и в клетках острого лимфобластного лейкоза MOLT3 (фигура 17), а в клетках NSCL A549 (фигура 18) выявили тенденцию к синергии.
d. Сочетание аплидина с триоксидом мышьяка продемонстрировало синергию в клетках NSCL A549 (фигура 19), клетках аденокарциномы толстого кишечника HT29 (фигура 20) и в клетках аденокарциномы предстательной железы PC3 (фигура 21). Аддитивность наблюдали в клетках острого лимфобластного лейкоза MOLT3 (фигура 22).
e. Сочетание аплидина с 5-фторурацилом продемонстрировало синергию в клетках промиелоцитарного лейкоза HL60 (фигура 23), клетках аденокарциномы молочной железы SKBR3 (фигура 24), клетках NSCL A549 (фигура 25) и в клетках аденокарциномы предстательной железы PC3 (фигура 26). Аддитивность наблюдали в клетках аденокарциномы толстого кишечника HT29 (фигура 27).
f. Сочетание аплидина с цитозинарабинозидом продемонстрировало синергию в клетках аденокарциномы молочной железы SKBR3 (фигура 28), клетках NSCL молочной железы A549 (фигура 29) и в клетках аденокарциномы предстательной железы PC3 (фигура 30). Аддитивность обнаружили в клетках промиелоцитарного лейкоза HL60 (фигура 31) и в клетках аденокарциномы толстого кишечника HT29 (фигура 32).
g. Сочетание аплидина с карбоплатином продемонстрировало синергию в клетках аденокарциномы предстательной железы PC3 (фигура 33) и в клетках аденокарциномы толстого кишечника HT29 (фигура 34). Аддитивность наблюдали в клетках NSCL A549 (фигура 35), клетках острого лимфобластного лейкоза MOLT3 (фигура 36) и в клетках карциномы молочной железы MX1 (фигура 37).
h. Сочетание аплидина с SN38 продемонстрировало синергию в клетках NSCL A549 (фигура 38). Аддитивность наблюдали в клетках аденокарциномы молочной железы SKBR3 (фигура 39), клетках промиелоцитарного лейкоза HL60 (фигура 40) и в клетках аденокарциномы предстательной железы PC3 (фигура 41).
Пример 2
in vitro
. Исследования  для определения эффекта аплидина в сочетании с другим стандартным средством на линии опухолевых клеток лейкоза, лимфомы, множественной миеломы и меланомы.
После такой же процедуры, как описано в примере 1, аплидин в качестве единственного средства или в сочетании с выбранными стандартными химиотерапевтическими средствами оценивали относительно нескольких линий опухолевых клеток для измерения различий в цитотоксичности.
В качестве единственных средств и для комбинации с аплидином выбраны следующие стандартные средства: этопозид (VP16) и карбоплатин. Линии опухолевых клеток, выбранные для данного анализа, приведены в таблице 3.
Таблица 3
<b>Клеточная линия</b>
<b>Тип опухоли</b>
HL-60
Лейкоз
K562
Лейкоз
MOLT3
Лейкоз
H9
Лимфома
HUT78
Лимфома
MC116
Лимфома
RAMOS
Лимфома
U937
Лимфома
NCI-H929
Множественная миелома
HUNS-1
Множественная миелома
U266B-1
Множественная миелома
RPMI 8226
Множественная миелома
LOXIMVI
Меланома
UACC-257
Меланома
Способ культивирования клеток
2
Все клеточные линии поддерживали в соответствующих средах для выращивания при 37°C, 5% CO и влажности 98%. Ни один из препаратов сред не содержал антибиотиков. За сутки до высевания клеток все культуры помещали в свежие полные среды для выращивания. В день сбора (высевания) клетки подсчитывали способом исключения трипанового синего (основная клеточная культура).
Посев клеток
Клетки собирали и высевали в 96-луночные планшеты для микротитрования при 15000 клеток на лунку в 190 мкл сред и инкубировали в течение 24 часов для того, чтобы позволить клеткам прикрепиться перед добавлением лекарственного средства.
Обработка лекарственным средством
Исходный раствор аплидина получали в 100% DMSO при 5 мг/мл. Исходные растворы химиотерапевтических средств VP16 и карбоплатина получали в 100% DMSO при концентрации 2 мг/мл для обоих лекарственных средств.
50
Клетки обрабатывали аплидином и другим стандартным средством в диапазонах, как перечислено ниже, и в планшете в трех повторениях получали концентрацию индивидуального лекарственного средства. Используемую концентрацию тестируемых средств выражают в виде процента от IC отдельного средства, что определено так же, как в примере 1.
<b>IC</b><sub>50</sub><b> аплидина</b>
<b>IC</b><sub>50</sub><b> стандартного средства</b>
100%
0%
75%
25%
60%
40%
50%
50%
40%
60%
30%
70%
25%
75%
0%
100%
50
Индивидуальные значения IC для каждого средства для каждой клеточной линии приведены в таблице 4.
Таблица 4
<b>Лекарственное средство</b>
<b>Клеточная линия</b>
<b>IC</b><sub>50</sub><b> (молярная)</b>
Аплидин
HL-60
8,0E-12
K562
2,0E-10
MOLT3
3,2E-14
H9
4,8E-14
HUT78
10E-15
MC116
5,5E-10
RAMOS
5,0E-09
U937
4,4E-13
U266B-1
5,9E-12
RPMI 8226
1,4E-14
HUNS-1
3,4E-14
NCI-H929
5,2E-13
LOXIMVI
3,5E-09
UACC-257
4,8E-10
VP16
HL-60
2,0E-06
K562
7,6E-06
MOLT3
2,4E-08
H9
7,3E-07
HUT78
1,4E-06
MC116
2,3E-07
RAMOS
1,1E-07
U937
4,4E-07
U266B-1
5,9E-06
RPMI 8226
3,7E-07
HUNS-1
3,1E-06
NCI-H929
2,4E-06
Карбоплатин
LOXIMVI
1,2E-04
UACC-257
1,7E-04
Цитотоксический эффект измеряли посредством анализа MTS Assay (тетразол), который представляет собой колориметрический способ для определения количества живых клеток.
Через 72 часа инкубации с тестируемыми средствами к каждой лунке для микротитрования добавляли 25 мкл раствора MTS+PMS и инкубировали в течение 4 часов при 37°C. Затем планшеты вынимали из инкубатора и помещали на качалку для планшетов на 5 минут (с покрытием алюминиевой фольгой для защиты от света). Оптическую плотность считывали при 490 нм на спектрофотометре для анализа планшетов. Данные анализировали следующим образом.
1. Для данных, нормализованных по контрольным значениям (100% = рост клеток в отсутствие средства (лекарственного средства); 0% = только контроль).
50
2. Нормализованные данные представляли в виде диаграммы рассеяния. Рисовали линию, соединяющую значения 100% IC для каждого средства (лекарственного средства). Значения значимо выше линии указывали на антагонизм, ниже линии - на синергию, а на линии - на аддитивность.
50
Статистическая обработка данных соответствовала Laska E. et al. Biometrics (1994) 50:834-841 и Greco et al. Pharmacol Rev. (1995) 47:331-385. Сочетания тестируемых соотношений доз считали синергическими, когда ингибирование клеточной пролиферации превышало максимум величин ингибирования для каждого лекарственного средства в отдельности (при 100% IC). Наоборот, решение об антагонизме принимали, когда ингибирование меньше, чем оба максимума. Об аддитивности судят, когда эффекты сочетаний значимо не отличаются от максимумов для обоих лекарственных средств. Статистическую значимость оценивали посредством t-критерия Стьюдента по отношению к ингибированию при каждом соотношении доз в сравнении с ингибированием при максимуме каждого лекарственного средства. Общая значимость сочетаний лекарственных средств для каждой клеточной линии зависела от наличия статистической значимости более чем для 50% отношений доз.
50
50
В качестве графического представления значения ответов наносили на диаграмму рассеяния с отношениями доз, нанесенными на оси x, и значениями % ответов на оси y. Между двумя конечными значениями ответов проводили прямую линию. (Например, между значениями ответов для 100% IC аплидина и 100% IC стандартного химиотерапевтического средства.) В случаях когда значения ответов в двух конечных точках были приблизительно равными, точки, лежащие выше или ниже этой расчетной линии аддитивности, можно интерпретировать как представляющие антагонистическое или синергическое взаимодействие лекарственных средств соответственно.
in vitro
На фигурах 42A и 42B показаны данные активности аплидина в сочетании с VP16 против клеток HL-60 . В соответствии с этими данными получили аддитивный эффект.
in vitro
На фигурах 43A и 43B показаны данные активности аплидина в сочетании с VP16 против клеток K562 . В соответствии с этими данными получили аддитивность.
in vitro
На фигурах 44A и 44B показаны данные активности аплидина в сочетании с VP16 против клеток MOLT3 . В соответствии с этими данными получили аддитивность.
in vitro
На фигурах 45A и 45B показаны данные активности , наблюдаемые для аплидина в сочетании с VP16 против клеток MC116. В соответствии с этими данными в этой линии опухолевых клеток получили аддитивность.
in vitro
На фигурах 46A и 46B показаны данные активности , наблюдаемые для аплидина в сочетании с VP16 против клеток RAMOS. В соответствии с этими данными в этой линии опухолевых клеток получили синергию.
in vitro
На фигурах 47A и 47B показаны данные активности , наблюдаемые для аплидина в сочетании с VP16 против клеток U937. В соответствии с этими данными получили аддитивность.
in vitro
На фигурах 48A и 48B показаны данные активности , наблюдаемые для аплидина в сочетании с VP16 против клеток NCI-H929. В соответствии с этими данными получили синергию.
in vitro
На фигурах 49A и 49B показаны данные активности , наблюдаемые для аплидина в сочетании с VP16 против клеток HUNS-1. В соответствии с этими данными в этой линии опухолевых клеток получили аддитивность.
in vitro
На фигурах 50A и 50B показаны данные активности , наблюдаемые для аплидина в сочетании с VP16 против клеток U266B-1. В соответствии с этими данными в этой линии опухолевых клеток получили аддитивность.
in vitro
На фигурах 51A и 5 IB показаны данные активности , наблюдаемые для аплидина в сочетании с VP16 против клеток RPMI 8226. В соответствии с этими данными в этой линии опухолевых клеток получили аддитивность.
in vitro
На фигуре 52 показаны данные активности , наблюдаемые для аплидина в сочетании с карбоплатином против клеток LOX-I-MVI. В соответствии с этими данными в этой линии опухолевых клеток получили аддитивность.
in vitro
На фигуре 53 показаны данные активности , наблюдаемые для аплидина в сочетании с карбоплатином против клеток UACC-257. В соответствии с этими данными в этой линии опухолевых клеток получили синергию.
Пример 3
in vitro
. Исследования  для определения эффекта аплидина в сочетании с другими стандартными средствами на линии опухолевых клеток множественной миеломы.
Множественная миелома (MM) представляет собой злокачественное заболевание плазматических клеток, как правило, возникающее из клона плазматических клеток, пролиферирующего и накапливающегося в костном мозге. Клинико-паталогические характеристики пациентов с миеломой включают накопление моноклонального белка в крови или моче, литические очаги повреждения в костях, анемию и почечную дисфункцию (Sirohi B. et al. Lancet (2004) 363: 875-87).
Существующее в настоящее время лечение миеломы основано на высокодозовой терапии, поддерживаемой трансплантацией стволовых клеток. Несмотря на прогресс в последнем десятилетии, в настоящее время MM остается неизлечимым заболеванием с общей средней продолжительностью жизни пациентов от 2 до 5 лет (Sirohi B. et al. Lancet (2004) 363: 875-87). Для улучшения исхода для пациентов необходимы новые подходы к лечению, исходя из трех основных направлений исследований: a) увеличение эффективности химиотерапии посредством применения высокой дозы; b) усиление иммунного ответа хозяина против миеломных клеток; и c) разработка новых лекарственных средств с более специфичными мишенями, которые могут интерферировать не только с миеломными клетками, но также и с микроокружением костного мозга (San Miguel JF et al. Curr. Treat. Options Oncol. (2003) 4: 247-58). Есть надежда, что сочетание двух или более из этих терапевтических средств приведет к увеличению анти-MM эффективности и более длительной выживаемости.
В настоящем документе авторы изобретения сообщают о нескольких исследованиях эффекта аплидина в качестве нового лекарственного средства для лечения множественной миеломы. Эти исследования включают:
1) цитотоксическую эффективность аплидина (отдельно или в комбинации) в отношении нескольких клеточных линий MM с использованием анализов жизнеспособности клеток (анализ MTT) и апоптоза (окрашивание на аннексин V);
2) цитотоксическую эффективность сочетаний аплидина и других классических и недавно разработанных лекарственных средств для лечения этого заболевания.
Материалы и методы
Клеточные линии и реагенты для культивирования клеток
В данном исследовании использовали четыре полученные клеточные линии MM: чувствительный к дексаметазону (MM.1S) и устойчивый к дексаметазону (MM.1R) варианты клеточной линии множественной миеломы человека MM.1 (Greenstein S. et al. Exp. Hematol (2003) 31:.271-82), которые были предоставлены Dr. S Rudikoff, Bethesda MD; и клеточные линии U266 и ее устойчивый к мелфалану аналог U266 LR7, полученные от Dr. W. Dalton, Tampa, FL. Все клеточные линии MM растили в среде RPMI 1640, дополненной инактивированной нагреванием 10% эмбриональной телячьей сывороткой, 100 Ед/мл пенициллином, 100 мкг/мл стрептомицином и 2 мМ L-глутамином. Все среды и реагенты для культивирования клеток куплены в Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA).
Анализы жизнеспособности клеток
Анализ клеточной пролиферации MM проводили с использованием колориметрического анализа с метилтиотетразолом (MTT; Sigma, St. Louis MO). Клеточные линии MM высевали с плотностью 50000 клеток/200 мкл среды в лунке в 48-луночные планшеты и обрабатывали определенной дозой лекарственного средства и в течение определенного времени. За два часа до окончания обработки добавляли раствор MTT (5 мг/мл в PBS; как правило, 10% объема в каждой лунке), и метаболически активные клетки восстанавливали соль тетразола до окрашенных формазановых кристаллов. После растворения этих кристаллов в течение ночной инкубации в 10% растворе SDS-HCl измеряли поглощение при 570 нм с коррекцией при 630 нм. Для каждого состояния анализировали четыре лунки, а результаты представлены в виде среднего ± SD четырех экземпляров соответствующего эксперимента, который повторяли, по меньшей мере, три раза.
Вестерн-блоттинг
Клетки собирали и отмывали в PBS и получали общие клеточные лизаты после инкубации в охлажденном на льду буфере для лизиса (140 мМ NaCl, 10 мМ ЭДТА, 10% глицерин, 1% Nonidet P-40, 20 мМ Tris (pH 7,0), 1 мкМ пепстатин, 1 мкг/мл апротинин, 1 мкг/мл леупептин, 1 мМ ортованадат натрия). Затем образцы центрифугировали при 10000 g при 4°C в течение 10 мин, и посредством 6-12,5% SDS-PAGE были разделены равные количества белка в супернатантах. Затем белки переносили на нитроцеллюлозные или PVDF мембраны, блокировали посредством инкубации в 5% обезжиренном сухом молоке в буфере PBST (0,05%-Tween 20 в PBS), а затем инкубировали со специфическими первичными антителами [антитела к p-c-jun, к p-Erk1/2 и к Erk5 куплены в Santa Cruz Biotechnologies (Santa Cruz, CA), тогда как антитела к p-p38 получены из Cell Signaling (Danvers, MA), а антитела к PARP - из Becton Dickinson Biosciences (Bedford, MA)]. После второй инкубации с соответствующим вторичным антителом иммуноблоты обрабатывали посредством усиленной хемилюминесценции (ECL; Amersham, Arlington Heights, IL). Идентификация активированных JNK и Erk5 требовала предварительной иммунопреципитации белковых лизатов с применением соответствующих специфических антител и сефарозы с белком A.
Анализ изоболограмм
Взаимодействие между аплидином и другими средствами против MM анализировали с применением программного обеспечения Calcusyn (Biosoft, Ferguson, MO). Данные анализа жизнеспособности клеток (MTT) выражали как часть клеток, подвергнутых действию дозы (Fa), у обработанных лекарственным средством клеток по сравнению с необработанными клетками (контроль). Эта программа основана на способе Chou-Talalay (Chou TC et al. Adv. Enzyme Regul. (1984) 22: 27-55) в соответствии со следующим равенством CI=(D)1/(Dx)1 + (D)1(D)2/(Dx)1(Dx)2, где (D)1 и (D)2 представляют собой дозы лекарственного средства 1 и 2, которые имеют тот же эффект x при применении по отдельности. Значения CI менее чем 1,0 указывают на синергию, значения CI≅1,0 указывают на аддитивный эффект, тогда как значения, большие 1, соответствуют антагонистическому эффекту.
Результаты
Зависимость от дозы аплидина у полученных из MM клеточных линий
50
Сначала авторы изобретения с применением анализа MTT определили, воздействует ли аплидин на жизнеспособность клеток в полученных из MM клеточных линиях, чувствительных и устойчивых к традиционным лечебным лекарственным средствам. Как видно на фигуре 54, обработка аплидином в течение 48 часов индуцирует сходное уменьшение зависимым от дозы образом жизнеспособности клеток во всех тестируемых клеточных линиях. Для четырех тестированных клеточных линий концентрация пятидесятипроцентного уменьшения жизнеспособных клеток (IC) через 48 часов обработки находилась в диапазоне 1-10 нМ.
Эффективность аплидина также сравнивали с другими классическими (мелфалан, дексаметазон) и новыми лекарственными средствами (бортезомиб) для лечения MM. На фигуре 55 показана превосходная эффективность аплидина по сравнению с другими лекарственными средствами при тестировании в дозах 0,1-1 нМ в течение 48 часов на клеточной линии MM.1S; его эффект был аналогичен эффекту бортезомиба в максимальных дозах (10-100 нМ).
Оценка синергии в двойных сочетаниях аплидина
Так как длительное воздействие химиотерапии MM во многих случаях ассоциировано с увеличенной токсичностью и развитием устойчивости к новым лекарственным средствам, авторы изобретения тестировали, воздействуют ли сочетания минимально токсичных концентраций аплидина и других лекарственных средств на жизнеспособность клеток MM. В частности, аплидин комбинировали с классическими лекарственными средствами для лечения MM (такими, как дексаметазон или мелфалан), а также с недавно разработанными средствами против миеломы (бортезомиб) и с лекарственными средствами, специфической мишенью которых является микроокружение костного мозга (леналидомид (ревлимид)).
Также для указанных терапевтических средств проводили эксперименты по зависимости от времени на сутки 1, 2, 3 и 6 для определения подходящих для комбинаторных экспериментов субоптимальных доз (от 10% до 30% ингибирования роста), а также для изучения длительности лечения. Комбинаторные эксперименты для аплидина и остальных лекарственных средств проводили после инкубации в течение 3 суток или 6 суток. Рост клеток клеточной линии MM.1S определяли посредством анализа MTT, как описано выше, а степень ингибирования анализировали посредством программы CalcuSyn. Для оценки результатов сочетания использовали подсчитанный на компьютере комбинаторный индекс (CI): CI>1, CI=1 и CI<1, указывающие на антагонистический, аддитивный и синергический эффекты соответственно. Соответствие данных принципу средних воздействий можно легко выявить посредством коэффициента линейной корреляции (r) диаграммы среднее-эффект: log (fa/fu) = m log (D) - m log (Dm), где D представляет собой дозу, Dm представляет собой дозу, необходимую для 50% эффекта, fa представляет собой часть, на которую действовала доза, fu - часть, на которую воздействия не было, а m представляет собой коэффициент сигмовидности кривой доза-эффект. Для каждого двойного сочетания использовали сочетание с непостоянными соотношениями. Каждый эксперимент повторяли три раза и исследовали минимум три точки данных для каждого отдельного лекарственного средства и три сочетания.
Сочетание аплидина с дексаметазоном
На сутки 3 наблюдали синергию для сочетаний 0,5 нМ аплидина/1 нМ и 10 нМ дексаметазона (фигура 56).
Как показано на фигуре 57, сочетание на 6 сутки было более синергичным.
Сочетание аплидина с мелфаланом
Следующие сочетания показали практически аддитивные эффекты на 3 и 6 сутки (фигуры 58 и 59 соответственно).
Сочетание аплидина с доксорубицином
На 3 сутки только одно сочетание было умеренно синергичным (фигура 60, сочетание 1) и два сочетания были аддитивными (фигура 60, сочетания 3 и 4).
На 6 сутки аддитивными были только два сочетания (фигура 61, сочетания 7 и 8).
Сочетание аплидина с леналидомидом (ревлимид)
В настоящем исследовании сочетание аплидина и леналидомида (ревлимид) показало бóльшие степени синергии, чем все остальные тестируемые сочетания (фигура 62).
Примечательно, что синергия была более важной на 6 сутки (фигура 63).
Сочетание аплидина с бортезомибом
Это сочетание продемонстрировало антагонизм на 3 сутки (фигура 64); на 6 сутки для двух сочетаний выявили синергию (фигура 65, сочетания 4 и 6).
Пример 4
in vivo
: Исследования для определения воздействия аплидина в сочетании с другими стандартными средствами на ксенотрансплантаты меланомы и опухоли почки.
Целью этого исследования являлась оценка противоопухолевой активности аплидина при введении вместе со стандартным противоопухолевым средством, где оба вводили с применением режима нескольких доз, в различных типах опухолевых ксенотрансплантатов у самок бестимусных мышей.
in vitro
Самок бестимусных голых мышей получали из Harlan Sprague Dawley, Madison, Wisconsin в возрасте 4-5 недель. Перед имплантацией опухоли мышей акклиматизировали к лаборатории в течение, по меньшей мере, одной недели. Животных содержали в стационарных клетках с неограниченным количеством пищи и воды. Экспериментальным животным имплантировали фрагменты опухолей, полученные из приживающихся после трансплантации опухолей человека, или клетки, полученные непосредственно из культуры . Опухоли имплантировали подкожно в правый бок на сутки 0.
3
2
3
Измерения размера опухолей записывали дважды в неделю, начиная с суток 4 или 5, с применением штангенциркулей. Для оценки объема опухоли по 2-мерным измерениям опухоли использовали формулу для расчета объема сплющенного эллипсоида: объем опухоли (мм) = (длина×ширина) - 2. Предполагая плотность равной единице, объем преобразовывали в массу (т.е. 1 мм = 1 мг). Когда опухоли достигали приблизительного диапазона объема 100±15 мг, мышей случайным образом делили на обрабатываемую и контрольную группы. Лекарственные средства назначали и вводили, исходя из индивидуальной массы тела. Для определения соответствующего уровня дозы каждого используемого в исследованиях сочетаний соединения для каждой модели опухоли проводили исследования по поиску диапазона доз.
Для определения того, может ли комбинированная терапиия обеспечить большую противоопухолевую активность по сравнению с сочетанной активностью двух средств, вводимых в качестве монотерапии, с аплидином (APL) комбинировали следующие стандарты лечебных средств для различных типов злокачественных опухолей (показаний).
<b>Показание</b>
<b>Модель опухоли</b>
<b>Соединения</b>
<b>Меланома</b>
LOX-IMVI
APL + карбоплатин
APL + интерлейкин-2 (IL-2)
APL + интерферон-α 2a (INF-α)
APL + дакарбазин (DTIC)
MRI-H187
APL + карбоплатин
APL + интерлейкин-2 (IL-2)
APL + интерферон-α 2a (INF-α)
APL + дакарбазин (DTIC)
<b>Опухоль почки</b>
CaKi-1
APL + интерлейкин-2 (IL-2)
APL + интерферон-α 2a (INF-α)
APL + бевацизумаб (авастин)
MRI-H121
APL + интерлейкин-2 (IL-2)
APL + интерферон-α 2a (INF-α)
APL + бевацизумаб (авастин)
В таблицах 5-10 показана динамика общего объема опухоли (среднее ± S.E.M., мг) после начала обработки аплидином отдельно или в сочетании со стандартным лекарственным средством в ксенотрансплантатах меланомы и злокачественной опухоли почки.
В таблице 5 и на фигурах 66 и 67 показана динамика общего объема опухоли после начала обработки аплидином (Aplidin) в качестве единственного средства или в сочетании с DTIC и карбоплатином в ксенотрансплантатах опухоли меланомы MRI-H187. Аплидин вводили ежесуточно в течение 9 суток подряд посредством интраперитонеальной (и/п) инъекции, контроль в виде солевого раствора (стерильный солевой раствор) - ежесуточно в течение 9 суток подряд посредством и/п инъекции, DTIC - ежесуточно в течение 5 суток подряд посредством и/п инъекции и карбоплатин - одну дозу каждые 4 суток всего при 4 обработках посредством и/п инъекции.
Таблица 5
<b>Лекарственное средство</b>
<b>Доза/сутки</b>
<b>Общий объем опухоли ± S.E.M. (мг)</b>
СУТКИ 20
СУТКИ 24
СУТКИ 27
СУТКИ 31
СУТКИ 34
Контроль в виде солевого раствора
-
139±13
221±41
292±47
420±71
571±111
Аплидин
50 мкг/кг
141±12
265±72
317±64
442±81
601±116
DTIC
40 мг/кг
148±14
264±60
377±98
558±152
681±187
Карбоплатин
25 мг/кг
143±13
213±32
301±50
398±76
540±99
Аплидин + DTIC
50 мкг/кг + 40 мг/кг
145±11
257±51
311±52
476±114
632±150
Аплидин + карбоплатин
50 мкг/кг + 25 мг/кг
145±14
201±46
262±55
339±76
443±104
S.E.M. = Стандартная ошибка среднего
Таблица 5 (продолжение)
<b>Лекарственное средство</b>
<b>Общий объем опухоли ± S.B.M. (мг)</b>
СУТКИ 38
СУТКИ 41
СУТКИ 46
СУТКИ 49
СУТКИ 52
СУТКИ 55
Контроль в виде солевого раствора
702±110
820±141
1270±233
1499±247
1629±277
1848±313
Аплидин
813±121
934±156
1295±241
1445±211
1649±249
1767±239
DTIC
927±274
1182±324
1508±427
1804±507
2036±525
2123±558
Карбоплатин
793±132
917±138
1303±237
1447±261
1603±288
1989±373
Аплидин + DTIC
723±126
855±133
1028±193
1101±197
1358±300
1397±265
Аплидин + карбоплатин
608±129
617±146
622±105
720±148
796±145
867±164
Таблица 5 (продолжение)
<b>Лекарственное средство</b>
<b>Общий объем опухоли ± S.E.M.</b><b>(мг)</b>
СУТКИ 59
СУТКИ 62
СУТКИ 66
Контроль в виде солевого раствора
2049±357
2100±330
2263±375
Аплидин
2113±329
2423±408
2561±441
DTIC
2166±563
2333±433
2508±536
Карбоплатин
2292±487
2659±492
2723±519
Аплидин + DTIC
1585±251
1571±261
1879±311
Аплидин + карбоплатин
1070±250
1153±230
1430±237
Из этого исследования ксенотрансплантатов заключили, что в клетках меланомы MRI-H187 сочетание аплидина с DTIC и аплидина с карбоплатином демонстрирует четкое статистически значимое потенциирование противоопухолевой активности, которое более заметно в случае сочетания с карбоплатином.
В таблице 6 и на фигурах 68 и 69 показана динамика общего объема опухоли после начала обработки аплидином (Aplidin) в качестве единственного средства или в сочетании с интерлейкином-2 (IL-2) и интерфероном-α 2a (INF-α) в ксенотрансплантатах опухоли меланомы MRI-H-187. Аплидин вводили ежесуточно в течение 9 суток подряд посредством и/п инъекции, контроль в виде солевого раствора (стерильный солевой раствор) - ежесуточно в течение 9 суток подряд посредством и/п инъекции, IL-2 - ежесуточно в течение 5 суток в неделю (понедельник-пятница) в течение 3 недель посредством и/п инъекции и INF-α - ежесуточно в течение 5 суток в неделю (понедельник-пятница) в течение 3 недель посредством подкожной (п/к) инъекции.
Таблица 6
<b>Лекарственное средство</b>
<b>Доза/сутки</b>
<b>Общий объем опухоли ± S.E.M. (мг)</b>
СУТКИ 21
СУТКИ 23
СУТКИ 27
СУТКИ 30
СУТКИ 34
Контроль в виде солевого раствора
-
116±4
172±16
289±28
367±33
562±39
Аплидин
50 мкг/кг
114±7
156±15
262±32
353±34
573±70
IL-2
2 мкг/мышь
113±4
171±24
314±46
420±68
647±88
INF-α
200000 Ед/мышь
115±5
169±19
272±40
398±54
653±99
Аплидин + IL-2
50 мкг/кг + 2 мкг/мышь
113±4
206±19
307±42
399±51
673±80
Аплидин + INF-α
50 мкг/кг + 200000 Ед/мышь
113±7
152±12
272±32
328±48
506±56
S.E.M. = Стандартная ошибка среднего
Таблица 6 (продолжение)
<b>Лекарственное средство</b>
<b>Общий объем опухоли ± S.E.M. (мг)</b>
СУТКИ 37
СУТКИ 40
СУТКИ 42
СУТКИ 48
СУТКИ 51
Контроль в виде солевого раствора
669±52
863±84
953±94
1495±211
1840±280
Аплидин
743±81
837±108
1000±147
1500±236
1836±260
IL-2
843±90
1072±136
1215±158
1672±166
2005±202
INF-α
776±115
912±149
1104±202
1521±311
1978±450
Аплидин + IL-2
872±93
1083±98
1299±107
1592±110
1739±108
Аплидин + INF-α
664±61
783±86
938±89
1276±170
1541±221
Из этого исследования ксенотрансплантатов заключили, что в клетках меланомы MRI-H187 сочетание аплидина с IL-2 и аплидина с INF-α демонстрирует аддитивность.
В таблице 7 и на фигурах 70 и 71 показана динамика общего объема опухоли после начала обработки аплидином (APL) в качестве единственного средства или в сочетании с DTIC и карбоплатином в ксенотрансплантатах опухоли меланомы LOX-IMVI. Аплидин вводили ежесуточно в течение 9 суток подряд посредством и/п инъекции, контроль в виде солевого раствора (стерильный солевой раствор) - ежесуточно в течение 9 суток подряд посредством и/п инъекции, DTIC - ежесуточно в течение 5 суток подряд посредством и/п инъекции и карбоплатин - одна доза каждые 4 суток всего при 4 обработках посредством и/п инъекции.
Таблица 7
<b>Лекарствен-</b><b>ное</b><b>средство</b>
<b>Доза/</b><b>сутки</b>
<b>Общий объем опухоли ± S.E.M. (мг)</b>
СУТКИ 6
СУТКИ 8
СУТКИ 12
СУТКИ 14
СУТКИ 19
Контроль в виде солевого раствора
-
107±4
292±45
1356±174
3085±346
9364±1702
Аплидин
50 мкг/кг
107±5
288±21
863±87
2261±459
8980±1085
DTIC
30 мг/кг
105±5
208±25
699±57
950±57
2695±560
Карбоплатин
25 мг/кг
107±3
347±43
1167±117
2936±543
4598±1182
Аплидин + DTIC
50 мкг/кг + 30 мг/кг
107±4
302±16
819±57
1174±129
3397±745
Аплидин + Карбоплатин
50 мкг/кг + 25 мг/кг
107±5
253±30
909±152
1911±374
4000±1610
S.E.M. = Стандартная ошибка среднего
Из этого исследования ксенотрансплантатов заключили, что в клетках меланомы LOX-IMVI сочетание аплидина с DTIC демонстрирует профиль аддитивности, а сочетание аплидина с карбоплатином демонстрирует тенденцию к синергии.
В таблице 8 и на фигурах 72 и 73 показана динамика общего объема опухоли после начала обработки аплидином (APL) в качестве единственного средства или в сочетании с интерлейкином-2 (IL-2) и интерфероном-α 2a (INF-α) в ксенотрансплантатах опухоли меланомы LOX-IMVI. Аплидин вводили ежесуточно в течение 9 суток подряд посредством и/п инъекции, контроль в виде солевого раствора (стерильный солевой раствор) - ежесуточно в течение 9 суток подряд посредством и/п инъекции, IL-2 - ежесуточно в течение 5 суток в неделю (понедельник-пятница) в течение 3 недель посредством и/п инъекции, а INF-α - ежесуточно в течение 5 суток в неделю (понедельник-пятница) в течение 3 недель посредством п/к инъекции.
Таблица 8
<b>Лекарственное средство</b>
<b>Доза/сутки</b>
<b>Общий объем опухоли </b>±<b> S.E.M. (мг)</b>
СУТКИ 6
СУТКИ 9
СУТКИ 13
СУТКИ 16
Контроль в виде солевого раствора
-
111±4
532±63
1666±152
2684±303
Аплидин
50 мкг/кг
113±4
300±15
1258±131
2436±256
IL-2
2 мкг/ мышь
111±5
357±51
1541±247
3315±614
INF-α
200000 Ед/мышь
110±4
329±39
1452±252
2188±465
Аплидин + IL-2
50 мкг/кг + 2 мкг/мышь
111±3
358±50
1485±274
3097±826
Аплидин + INF-α
50 мкг/кг + 200000 Ед/мышь
112±4
260±18
1152±110
2607±472
S.E.M. = Стандартная ошибка среднего
Из этого исследования ксенотрансплантатов заключили, что в клетках меланомы LOX-IMVI сочетание аплидина с IL-2 и аплидина с INF-α демонстрирует аддитивность.
В таблице 9 и на фигурах 74, 75 и 76 показана динамика общего объема опухоли после начала обработки аплидином (APL) в качестве единственного средства или в сочетании с бевацизумабом (авастин), интерлейкином-2 (IL-2) и интерфероном-α 2a (INF-α) в ксенотрансплантатах опухоли почки CaKi-1. Аплидин вводили ежесуточно в течение 9 суток подряд посредством и/п инъекции, контроль в виде солевого раствора (стерильный солевой раствор) - ежесуточно в течение 9 суток подряд посредством и/п инъекции, бевацизумаб (авастин) - каждые 3 суток всего при 4 обработках посредством и/п инъекции, IL-2 - ежесуточно в течение 5 суток в неделю (понедельник-пятница) в течение 3 недель посредством и/п инъекции и INF-α - ежесуточно в течение 5 суток в неделю (понедельник-пятница) в течение 3 недель посредством п/к инъекции.
Таблица 9
<b>Лекарственное средство</b>
<b>Доза/сутки</b>
<b>Общий объем опухоли </b>±<b> S.E.M. (мг)</b>
СУТКИ 13
СУТКИ 15
СУТКИ 19
СУТКИ 22
СУТКИ 26
Контроль в виде солевого раствора
-
105±3
157±11
226±18
305±29
500±69
Аплидин
50 мкг/кг
103±3
164±12
208±12
282±26
406±46
Авастин
5,0 мг/кг
105±3
162±14
286±49
398±53
632±79
IL-2
2 мкг/мышь
103±3
143±15
224±21
324±25
484±49
INF-α
200000 Ед/мышь
105±3
162±14
239±28
312±43
496±60
Аплидин + Авастин
50 мкг/кг + 5,0 мг/кг
106±3
169±15
238±21
283±25
383±48
Аплидин + IL-2
50 мкг/кг + 2 мкг/мышь
105±3
147±21
175±16
208±34
320±57
Аплидин +INF-α
50 мкг/кг + 200000 Ед/мышь
105±4
141±12
213±27
267±29
391±39
S.E.M. = Стандартная ошибка среднего
Таблица 9 (продолжение)
<b>Лекарственное средство</b>
<b>Общий объем опухоли </b>±<b> S.E.M. (мг)</b>
СУТКИ 29
СУТКИ 33
СУТКИ 36
СУТКИ 41
СУТКИ 47
СУТКИ 50
Контроль в виде солевого раствора
639±64
741±69
897±75
1149±76
1595±74
1939±110
Аплидин
637±68
800±86
1035±117
1371±125
1855±202
2173±213
Авастин
811±90
985±111
1251±109
1654±189
2170±253
2842±379
IL-2
623±59
746±77
956±102
1206±116
1684±120
2403±218
INF-α
613±92
734±99
867±86
1125±111
1473±149
1777±197
Аплидин + Авастин
451±42
579±51
825±86
1014±77
1409±122
1834±174
Аплидин + IL-2
398±49
495±64
680±75
859±88
1138±106
1404±122
Аплидин +INF-α
470±39
591±56
821±115
1117±148
1699±240
2356±354
Из этого исследования ксенотрансплантатов заключили, что в клетках опухоли почки CaKi-1 сочетание аплидина с авастином и аплидина с IL-2 демонстрирует синергию, являющуюся более заметной в случае сочетания с IL-2. С другой стороны, сочетание аплидина с INF-α демонстрирует профиль аддитивности.
В таблице 10 и на фигурах 77, 78 и 79 показана динамика общего объема опухоли после начала обработки аплидином (APL) в качестве единственного средства или в сочетании с бевацизумабом (авастином), интерлейкином-2 (IL-2) и интерфероном-α 2a (INF-α) в ксенотрансплантатах опухоли почки MRI-H121. Аплидин вводили ежесуточно в течение 9 суток подряд посредством и/п инъекции, контроль в виде солевого раствора (стерильный солевой раствор) - ежесуточно в течение 9 суток подряд посредством и/п инъекции, бевацизумаб (авастин) - каждые 3 суток всего при 4 обработках посредством и/п инъекции, IL-2 - ежесуточно в течение 5 суток в неделю (понедельник-пятница) в течение 3 недель посредством и/п инъекции и INF-α - ежесуточно в течение 5 суток в неделю (понедельник-пятница) в течение 3 недель посредством п/к инъекции.
Таблица 10
<b>Лекарственное средство</b>
<b>Доза/сутки</b>
<b>Общий объем опухоли </b>±<b> S.E.M. (мг)</b>
СУТКИ 11
СУТКИ 14
СУТКИ 18
СУТКИ 19
СУТКИ 21
Контроль в виде солевого раствора
-
112±6
180±15
253±27
266±33
384±52
Аплидин
25 мкг/кг
108±6
182±15
357±44
345±42
467±68
Авастин
2,5 мг/кг
106±7
171±16
306±27
299±39
365±39
IL-2
1 мкг/мышь
108±5
201±29
402±60
366±56
475±87
INF-α
200000 Ед/мышь
110±6
166±15
331±32
341±32
371±37
Аплидин + Авастин
25 мкг/кг + 2,5 мг/кг
106±7
140±20
247±39
241±30
295±39
Аплидин + IL-2
25 мкг/кг + 1 мкг/мышь
109±5
149±16
286±33
336±51
381±79
Аплидин + INF-α
25 мкг/кг + 200000 Ед/мышь
111±7
152±23
254±45
301±42
343±52
S.E.M. = Стандартная ошибка среднего
Таблица 10 (продолжение)
<b>Лекарственное средство</b>
<b>Общий объем опухоли </b>±<b> S.E.M. (мг)</b>
СУТКИ 26
СУТКИ 29
СУТКИ 32
СУТКИ 35
СУТКИ 39
СУТКИ 42
Контроль в виде солевого раствора
628±106
789±105
880±126
1104±166
1512±188
1549±204
Аплидин
688±108
898±106
1161±141
1206±157
1622±195
1660±169
Авастин
503±57
678±77
899±93
898±69
1240±124
1383±148
IL-2
737±121
922±163
1138±205
1175±192
1615±273
1873±310
INF-α
591±69
704±91
809±96
898±108
1457±165
1747±210
Аплидин + Авастин
501±53
-
784±93
848±110
1166±145
1430±155
Аплидин + IL-2
662±136
817±136
951±167
1052±161
1447±199
1791±272
Аплидин + INF-α
635±83
868±104
937±125
1081±155
1739±181
1996±167
Из этого исследования ксенотрансплантатов заключили, что в клетках опухоли почки MRI-H121 три сочетания демонстрируют профиль аддитивности.
Пример 5
in vitro
. В клеточных линиях множественной миеломы (RPMI-8226 и U266B1) проводили дополнительные анализы  для определения воздействия аплидина в сочетании с двумя стандартными лечебными химиотерапевтическими средствами (бортезомиб и мелфалан).
Аплидин в качестве единственного средства или в сочетании с бортезомибом или мелфаланом оценивали относительно клеточных линий множественной миеломы, конкретно, в клеточных линиях RPMI-8226 и U266B1.
Эти клеточные линии культивировали в среде RPMI-1640 с 10% ЭТС и 1% L-глутамином. Каждую клеточную линию высевали в 96-луночные планшеты при 20000 клеток на лунку.
50
50
50
Сначала аплидин, бортезомиб и мелфалан тестировали отдельно для определения значения IC для каждого из них индивидуально. Для определения значения IC каждое лекарственное средство проверяли при различном диапазоне концентрации лекарственного средства в соответствии с процедурой, описанной в примере 1. В таблице 11 приведены индивидуальные IC, полученные с каждым из трех лекарственных средств относительно двух линий клеток множественной миеломы.
Таблица 11
<b>IC</b><sub>50</sub><b> (молярная)</b>
<b>RPMI-8226</b>
<b>U2661</b>
Аплидин
2,93E-08
1,39E-09
Бортезомиб
2,29E-09
1,66E-05
Мелфалан
1,61E-05
3,16E-09
На следующем этапе с аплидином сочетали бортезомиб или мелфалан. В этих экспериментах использовали концентрации аплидина с серийным разведением 1:10. Каждое серийное разведение объединяли с 4 различными концентрациями бортезомиба или мелфалана.
2
50
50
50
Планшеты инкубировали в течение 3 суток при 37°C и 5% CO. Планшеты читали с применением системы анализа Promega MTS с применением MTS, метаболизируемого жизнеспособными клетками, превращающими его в формазан, флуоресцирующий при длине волны 490 нм. Это является непрямым измерением жизнеспособности клеток. Их анализировали с применением программы Softmax Pro, которая определяет жизнеспособность клеток на основе процента от контрольных лунок. Эти данные IC переносили в программу CalcuSyn для анализа комбинаторного индекса. CalcuSyn сравнивает значения IC лекарственных средств отдельно с IC лекарственных средств в сочетании с использованием алгоритма для определения комбинаторного индекса. Важно отметить, что комбинаторный индекс (CI) представляет собой отражение эффекта сочетания двух лекарственных средств: CI=1 указывает на аддитивный эффект; CI<1 указывает на синергический эффект; и CI>1 указывает на антагонистический эффект.
В таблице 12 приведены те дозы, где наблюдали синергический эффект для сочетания аплидина с бортезомибом относительно клеточной линии RMPI-8226:
Таблица 12
<b>Концентрация аплидина</b>
<b>Концентрация бортезомиба</b>
<b>CI</b>
0,2 мкг/мл
1,0 нг/мл
0,402
3,5 нг/мл
0,911
6,0 нг/мл
0,013
8,5 нг/мл
0,014
2 мкг/мл
1,0 нг/мл
0,103
3,5 нг/мл
0,104
6,0 нг/мл
0,106
8,5 нг/мл
0,107
В таблице 13 приведены те дозы, где наблюдали синергический эффект для сочетания аплидина с мелфаланом относительно клеточной линии RMPI-8226:
В таблице 14 приведены те дозы, где наблюдали синергический эффект для сочетания аплидина с бортезомибом относительно клеточной линии U266B1:
Таблица 14
<b>Концентрация аплидина</b>
<b>Концентрация бортезомиба</b>
<b>CI</b>
0,2 пг/мл
3,5 нг/мл
0,602
8,5 нг/мл
0,919
20 пг/мл
6,0 нг/мл
0,758
0,2 нг/мл
6,0 нг/мл
0,852
2 нг/мл
3,5 нг/мл
0,588
6,0 нг/мл
0,776
8,5 нг/мл
0,553
20 нг/мл
3,5 нг/мл
0,892
8,5 нг/мл
0,79
0,2 мкг/мл
1,0 нг/мл
0,317
3,5 нг/мл
0,193
6,0 нг/мл
0,251
8,5 нг/мл
0,112
В таблице 15 приведены те дозы, где наблюдали синергический эффект для сочетания аплидина с мелфаланом относительно клеточной линии U266B1:
Таблица 15
<b>Концентрация аплидина</b>
<b>Концентрация мелфалана</b>
<b>CI</b>
0,2 пг/мл
30 нг/мл
0,922
10 нг/мл
0,064
8 нг/мл
0,047
2,0 пг/мл
50 нг/мл
0,525
30 нг/мл
0,709
10 нг/мл
0,164
8 нг/мл
0,127
20 пг/мл
50 нг/мл
0,793
10 нг/мл
0,467
8 нг/мл
0,845
0,2 нг/мл
10 нг/мл
0,472
8 нг/мл
0,974
2 нг/мл
50 нг/мл
0,744
30 нг/мл
0,504
10 нг/мл
0,498
8 нг/мл
0,438
20 нг/мл
50 нг/мл
0,888
30 нг/мл
0,688
10 нг/мл
0,573
8 нг/мл
0,573
0,2 мкг/мл
50 нг/мл
0,249
30 нг/мл
0,109
10 нг/мл
0,145
8 нг/мл
0,108
Пример 6
in vitro
. В клеточных линиях лейкоза (MOLT4 и K-562) проводили дополнительные анализы  для определения воздействия аплидина в сочетании со стандартным лечебным химиотерапевтическим средством, таким как идарубицин.
Аплидин в качестве единственного средства или в сочетании с идарубицином оценивали относительно клеточных линий лейкоза, а конкретно в клеточных линиях MOLT4 и K562.
Эти клеточные линии культивировали в среде RPMI-1640 с 10% ЭТС и 1% L-глутамином. Каждую клеточную линию высевали в 96-луночные планшеты при 20000 клеток на лунку.
50
50
50
Сначала аплидин и идарубицин тестировали отдельно для определения значения IC для каждого из них индивидуально. Для определения значения IC каждое лекарственное средство проверяли при различном диапазоне концентрации лекарственного средства в соответствии с процедурой, описанной в примере 1. В таблице 16 приведены индивидуальные IC, полученные с каждым из трех лекарственных средств относительно двух клеточных линий лейкоза.
Таблица 16
<b>IC</b><sub>50</sub><b> (молярная)</b>
<b>MOLT4</b>
<b>K562</b>
Аплидин
1,43E-08
2,35E-09
Идарубицин
5,0E-11
6,33E-08
На следующем этапе с аплидином сочетали идарубицин. В эксперименте, связанном с клеточной линией MOLT4, использовали концентрации аплидина с серийным разведением 1:10. Каждое серийное разведение объединяли с 4 различными концентрациями идарубицина. В эксперименте, связанном с клеточной линией K562, использовали концентрации аплидина с серийным разведением 1:5, и концентрация добавленного в каждое сочетание идарубицина основывалась на соотношении. Таким образом, сочетание A составляло 1:1, сочетание B составляло 0,008:1, сочетание C составляло 6,4E-05:1 и сочетание D составляло 5,12E-07:1.
2
50
50
50
Планшеты инкубировали в течение 3 суток при 37°C и 5% CO. Планшеты читали с применением системы анализа Promega MTS с применением MTS, метаболизируемого жизнеспособными клетками, превращающими его в формазан, флуоресцирующий при длине волны 490 нм. Это является непрямым измерением жизнеспособности клеток. Их анализировали с применением программы Softmax Pro, которая определяет жизнеспособность клеток на основе процента от контрольных лунок. Эти данные IC переносили в программу CalcuSyn для анализа комбинаторного индекса. CalcuSyn сравнивает значения IC лекарственных средств отдельно с IC лекарственных средств в сочетании с использованием алгоритма для определения комбинаторного индекса. Важно отметить, что комбинаторный индекс (CI) представляет собой отражение эффекта сочетания двух лекарственных средств: CI=1 указывает на аддитивный эффект; CI<1 указывает на синергический эффект; и CI>1 указывает на антагонистический эффект.
В таблице 17 приведены те дозы, где наблюдали синергический эффект для сочетания аплидина с идарубицином относительно клеточной линии MOLT4.
Таблица 17
<b>Концентрация аплидина</b>
<b>Концентрация идарубицина</b>
<b>CI</b>
0,2 мкг/мл
3,0 нг/мл
0,28
0,7 нг/мл
0,052
8,0 пг/мл
0,053
2 мкг/мл
3,0 нг/мл
0,669
0,7 нг/мл
0,269
8,0 пг/мл
0,337
В таблице 18 приведены те дозы, где наблюдали синергический эффект для сочетания аплидина с идарубицином относительно клеточной линии K562.
Таблица 18
<b>Концентрация аплидина</b>
<b>Концентрация идарубицина</b>
<b>CI</b>
Сочетание с соотношением 1:1
6,4 нг/мл
6,4 нг/мл
0,054
32 нг/мл
32 нг/мл
0,051
160 нг/мл
160 нг/мл
0,003
0,8 мкг/мл
0,8 мкг/мл
0,014
4 мкг/мл
4 мкг/мл
0,222
Сочетание с соотношением 0,008:1
256 пг/мл
32 нг/мл
0,687
1,28 нг/мл
160 нг/мл
0,025
6,4 нг/мл
0,8 мкг/мл
0,026
32 нг/мл
4 мкг/мл
0,209
Сочетание с соотношением 6,4E-05:1
10,2 пг/мл
160 нг/мл
0,194
51,2 пг/мл
0,8 мкг/мл
0,677
256 пг/мл
4 мкг/мл
0,459
Сочетание с соотношением 5,12E-07:1
81,9 фг/мл
160 нг/мл
0,091
0,41 пг/мл
0,8 мкг/мл
0,365
2,05 пг/мл
4 мкг/мл
0,459
Пример 7
in vivo
: Исследования для определения воздействия аплидина в сочетании с другим стандартным средством в ксенотрансплантатах меланомы.
nu
nu
Целью этого исследования являлась оценка противоопухолевой активности аплидина при введении в сочетании с карбоплатином против имплантированных подкожно самкам бестимусных мышей NCr-/ клеток меланомы человека UACC-257.
nu
nu
Животных содержали в микроизолирующих клетках, до пяти на клетку с 12-часовым циклом свет/темнота. В течение одной недели до эксперимента самок бестимусных мышей NCr-/ в возрасте шести недель акклиматизировали в лабораториях.
in vitro
7
8
2
Каждой мыши подкожно рядом с правым боком инокулировали клетки меланомы человека UACC-257 из клеточной культуры  с применением иглы калибра 23. Каждая мышь получала 2×10 клеток, ресуспендированных 0,2 мл Matrigel. Пробирку с замороженными клетками меланомы человека UACC-257 оттаивали и культивировали в среде RPMI 1640, содержащей низкую концентрацию глюкозы (2000 мг/л), бикарбонат натрия (1500 мг/мл), 2 мМ L-глутамин, 10% эмбриональную телячью сыворотку (полная среда) и растили в инкубаторе с +37°C во влажной атмосфере с 5% CO до получения необходимого для инокуляции мышам количества клеток. Клетки собирали через четыре пассажа в культуре. Клетки забирали из матрасов, помещали в 50-мл центрифужные пробирки и центрифугировали при 1000 об/мин в течение 10 минут в центрифуге с охлаждением. Клеточный осадок ресуспендировали в свежей полной среде. Количество и жизнеспособность клеток определяли с применением счетчика и анализатора жизнеспособности клеток Beckman Coulter VI CELL XR. Клеточную суспензию центрифугировали и клеточный осадок ресуспендировали в Matrigel при клеточной плотности 1,0×10 клеток/мл и помещали на сухой лед. Конечная концентрация Matrigel в клеточной суспензии составляла 56,9%. На сутки сбора клеток жизнеспособность клеток составляла 98,9%.
3
Сутки инокуляции опухолевых клеток обозначили как сутки 0. Отдельные опухоли росли до массы 150-245 мг (с размером 150-245 мм) на сутки начала обработки, сутки 13 после инокуляции опухолевых клеток. Сорок животных с опухолями с размером в надлежащем диапазоне распределили на четыре группы обработки так, чтобы средние массы опухолей на первые сутки обработки были как можно ближе друг к другу.
Эксперимент состоял из обработанной носителем контрольной группы из 10 мышей и трех обработанных лекарственным средством групп из 10 мышей на группу всего из 40 мышей на первые сутки обработки, сутки 13 после инокуляции опухолевых клеток. Животных в группе 1 обрабатывали и.п. ежесуточно в течение 9 суток подряд (сутки 13-21) носителем аплидина, разбавленным солевым раствором. Аплидин вводили и.п. ежесуточно в течение 9 суток (сутки 13-21) при дозе 60 мкг/кг/доза отдельно (группа 2) или в сочетании с карбоплатином (группа 4). Карбоплатин вводили в/в каждые 4 суток всего при трех обработках (сутки 13, 17 и 21) при дозе 50 мг/кг/доза отдельно (группа 3) или в сочетании с аплидином (группа 4). В сутки, когда вводили оба соединения в группе 4, сначала всем десяти животным в группе инъецировали аплидин с последующим немедленным введением карбоплатина (группа 4).
Группу 1 обрабатывали и.п. 0,18% кремофора EL/0,18% этанола/0,84% WFI/98,8% солевого раствора (объем инъекции: 0,1 мл/10 г массы тела). Аплидин восстанавливали носителем, содержащим 15% кремофора EL/15% этанола/70% WFI, и разбавляли солевым раствором (объем инъекции: 0,1 мл/10 г массы тела). Карбоплатин получали в WFI (объем инъекции: 0,1 мл/10 г массы тела).
Животных наблюдали ежесуточно и отмечали клинические признаки. Измеряли п/к опухоли и животных взвешивали дважды в неделю, начиная с первых суток обработки, суток 13. Объем опухоли определяли посредством измерений штангенциркулем (мм) и с применением формулы для эллипсоидной сферы:
Д × Ш
/2 = мм
2
3
,
3
где Д и Ш относятся к большему и меньшему перпендикулярным размерам, полученным в каждом измерении. Эту формулу также использовали для расчета массы опухоли, предполагая плотность равной единице (1 мм = 1 мг).
Для оценки противоопухолевой эффективности использовали сравнение средней массы опухоли в обрабатываемых группах (T) со средней массой опухоли в контрольной группе (T/C×100%) на сутки 23 (двое суток после окончания обработки) и сутки 70 (сутки окончания исследования). % T/C для каждой обработки приведен в таблице 19.
Таблица 19
<b>№ группы</b>
<b>Средство</b>
<b>Дозировка и единица</b>
<b>Способ введения</b>
<b>Протокол</b>
<b>% T/C на сутки</b>
<b>23</b>
<b>70</b>
1
Носитель
0 мкг/кг/доза
и.п.
q1d×9
2
Аплидин
60 мкг/кг/доза
и.п.
q1d×9
90
91
3
Карбоплатин
50 мг/кг/доза
в/в
q4d×3
95
60
4
Аплидин/
60 мкг/кг/доза
и.п.
q1d×9
95
53
Карбоплатин
50 мг/кг/доза
в/в
q4d×3
Протокол носителя: q1d×9 сутки 13Протокол аплидина: q1d×9 сутки 13Протокол карбоплатина: q4d×3 сутки 13Протокол аплидина/карбоплатина: q1d×9 сутки 13/q4d×3 сутки 13
Обработка сочетанием аплидина и карбоплатина переносилась без летальных исходов. Обработка сочетанием приводила к значениям T/C 95% и 53% на сутки 23 и 70 соответственно.
Пример 8
in vivo
: Исследования для определения воздействия аплидина в сочетании с другим стандартным средством в ксенотрансплантатах миеломы.
Целью этого исследования являлась оценка противоопухолевой активности аплидина при введении в сочетании с бортезомибом против имплантированных подкожно самцам мышей SCID клеток миеломы человека RPMI 8226.
Животных содержали в микроизолирующих клетках, до пяти на клетку с 12-часовым циклом свет/темнота. В течение одной недели до эксперимента самцов мышей SCID в возрасте шести недель акклиматизировали в лабораториях.
in vitro
7
8
2
Каждой мыши п/к рядом с правым боком инокулировали клетки миеломы человека RPMI 8226 из клеточной культуры  с применением иглы калибра 23. Каждая мышь получала 2×10 клеток, ресуспендированных 0,2 мл Matrigel. Клетки миеломы человека RPMI 8226 исходно приобретали в ATCC (номер ATCC: CCL-155). Пробирку с замороженными клетками миеломы человека RPMI 8226 оттаивали и культивировали в среде RPMI 1640, содержащей высокую концентрацию глюкозы (4500 мг/л), бикарбонат натрия (1500 мг/мл), 2 мМ L-глутамин, 10 мМ Hepes, 1 мМ пируват натрия и 10% эмбриональную телячью сыворотку (полная среда) и растили в инкубаторе с +37°C во влажной атмосфере с 5% CO до получения необходимого для инокуляции мышам количества клеток. Клетки собирали через четыре пассажа в культуре. Клетки забирали из матрасов, помещали в 50-мл центрифужные пробирки и центрифугировали при 1000 об/мин в течение 10 минут в центрифуге с охлаждением. Клеточный осадок ресуспендировали в свежей полной среде. Количество и жизнеспособность клеток определяли с применением счетчика и анализатора жизнеспособности клеток Beckman Coulter VI CELL XR. Клеточную суспензию центрифугировали и клеточный осадок ресуспендировали в Matrigel при клеточной плотности 1,0×10 клеток/мл и помещали на сухой лед. Конечная концентрация Matrigel в клеточной суспензии составляла 78,3%. На сутки сбора клеток жизнеспособность клеток составляла 89,3%.
3
Сутки инокуляции опухолевых клеток обозначили как сутки 0. Отдельные опухоли росли до массы 75-188 мг (с размером 75-188 мм) на сутки начала обработки, сутки 18 после инокуляции опухолевых клеток. Животных, отобранных с опухолями с размером в надлежащем диапазоне, распределили на четыре группы обработки так, чтобы средние массы опухолей на первые сутки обработки были как можно ближе друг к другу.
Эксперимент состоял из обработанной носителем контрольной группы из 10 мышей и трех обработанных лекарственным средством групп из 10 мышей на группу всего из 40 мышей на первые сутки обработки, сутки 18 после инокуляции опухолевых клеток. Животных в группе 1 обрабатывали и.п. ежесуточно в двух раундах каждые сутки в течение 9 суток подряд (сутки 18-26 и сутки 38-46) носителем аплидина, разбавленным солевым раствором. Аплидин вводили и.п. ежесуточно в двух раундах каждые сутки в течение 9 суток подряд (сутки 18-26 и сутки 38-46) при дозе 60 мкг/кг/доза отдельно (группа 2) или в сочетании с бортезомибом (группа 4). Бортезомиб вводили в/в при дозе 0,35 мг/кг/доза в течение четырех недель каждые 3 суток всего при 2 обработках, начиная с суток 18 с последующей дополнительной в/в инъекцией, вводимой на сутки 46 отдельно (группа 3) или в сочетании с аплидином (группа 4). В сутки, когда вводили оба соединения в группе 4, сначала всем десяти животным в группе инъецировали аплидин с последующим немедленным введением бортезомиба (группа 4).
Группу 1 обрабатывали и.п. 0,18% кремофора EL/0,18% этанола/0,84% WFI/98,8% солевого раствора (объем инъекции: 0,1 мл/10 г массы тела). Аплидин восстанавливали носителем, содержащим 15% кремофора EL/15% этанола/70% WFI, и разбавляли солевым раствором (объем инъекции: 0,1 мл/10 г массы тела). Велкейд (бортезомиб) получали в солевом растворе (объем инъекции: 0,1 мл/10 г массы тела).
Животных наблюдали ежесуточно и отмечали клинические признаки. Измеряли п/к опухоли и животных взвешивали дважды в неделю, начиная с первых суток обработки, суток 18 после инокуляции опухолевых клеток. Объем опухоли определяли посредством измерений штангенциркулем (мм) и с применением формулы для эллипсоидной сферы, как описано в примере 7.
Для оценки противоопухолевой эффективности использовали сравнение средней массы опухоли в обрабатываемых группах (T) со средней массой опухоли в контрольной группе (T/C×100%) на сутки 27 (одни сутки после окончания первого раунда обработки аплидином) и сутки 48 (двое суток после окончания обработки аплидином и бортезомибом). % T/C для каждой обработки приведен в таблице 20.
Таблица 20
<b>№ группы</b>
<b>Средство</b>
<b>Дозировка и единица</b>
<b>Способ введения</b>
<b>% T/C на сутки</b>
<b>27</b>
<b>48</b>
1
Носитель
0 мкг/кг/доза
и.п.
2
Аплидин
60 мкг/кг/доза
и.п.
76
63
3
Бортезомиб
0,35 мг/кг/доза
в/в
70
67
4
Аплидин/
60 мкг/кг/доза
и.п.
49
31
бортезомиб
0,35 мг/кг/доза
в/в
Протокол носителя: q1d×9 сутки 18, 38Протокол аплидина: q1d×9 сутки 18, 38Протокол бортезомиба: q3d×2 сутки 18, 25, 32, 39; q1d×1 сутки 46Протокол аплидина/бортезомиба: q1d×9 сутки 18, 38/q3d×2 сутки 18, 25, 32, 39; q1d×1 сутки 46
Обработка сочетанием аплидина и бортезомиба переносилась без летальных исходов. Обработка сочетанием эффективна для ингибирования роста миеломных клеток RPMI 8226, приводя к значениям T/C 49% и 31% на сутки 27 и 48 соответственно. Противоопухолевая активность при обработке сочетанием была выше, чем аддитивная, по сравнению с противоопухолевой активностью, получаемой при введении каждого соединения отдельно.
Пример 9
in vivo
: Исследования для определения воздействия аплидина в сочетании с другим стандартным средством в ксенотрансплантатах лимфомы.
Целью этого исследования являлась оценка противоопухолевой активности аплидина при введении в сочетании с ритуксимабом против имплантированных подкожно самкам мышей SCID клеток лимфомы человека RL.
Животных содержали в микроизолирующих клетках, до пяти на клетку с 12-часовым циклом свет/темнота. В течение одной недели до эксперимента самцов мышей SCID в возрасте шести недель акклиматизировали в лабораториях.
in vitro
7
7
2
Каждой мыши п/к рядом с правым боком инокулировали клетки лимфомы человека RL из клеточной культуры  с применением иглы калибра 23. Каждая мышь получала 2×10 клеток, ресуспендированных 0,2 мл Matrigel. Пробирку с замороженными клетками лимфомы человека RL оттаивали и культивировали в среде RPMI 1640, содержащей высокую концентрацию глюкозы (4500 мг/л), бикарбонат натрия (1500 мг/мл), 2 мМ L-глутамин, 10 мМ Hepes, 1 мМ пируват натрия и 10% эмбриональную телячью сыворотку (полная среда) и растили в инкубаторе с +37°C во влажной атмосфере с 5% CO до получения необходимого для инокуляции мышам количества клеток. Клетки собирали через шесть пассажей в культуре. Клетки забирали из матрасов, помещали в 50-мл центрифужные пробирки и центрифугировали при 1000 об/мин в течение 10 минут в центрифуге с охлаждением. Клеточный осадок ресуспендировали в свежей полной среде. Количество клеток определяли с применением счетчика клеток Coulter Model Z1, а жизнеспособность измеряли с применением окрашивания йодидом пропидия и анализировали с применением проточного цитометра Beckman Coulter EPICS XL. Клеточную суспензию повторно центрифугировали и клеточный осадок ресуспендировали в Matrigel при клеточной плотности 5,0×10 клеток/мл и помещали на сухой лед. Конечная концентрация Matrigel в клеточной суспензии составляла 73,0%. На сутки сбора клеток жизнеспособность клеток составляла 98,9%.
3
Сутки инокуляции опухолевых клеток обозначили как сутки 0. Отдельные опухоли росли до массы 100-196 мг (с размером 100-196 мм) на сутки начала обработки, сутки 15 после инокуляции опухолевых клеток. Сорок животных с опухолями с размером в надлежащем диапазоне распределили на четыре группы обработки так, чтобы средние массы опухолей на первые сутки обработки были как можно ближе друг к другу.
Эксперимент состоял из обработанной носителем контрольной группы из 10 мышей и трех обработанных лекарственным средством групп из 10 мышей на группу, всего из 40 мышей на первые сутки обработки, сутки 15 после инокуляции опухолевых клеток. Животных в группе 1 обрабатывали и.п. ежесуточно в двух раундах каждые сутки в течение 9 суток подряд (сутки 15-23 и сутки 28-36) носителем аплидина, разбавленным солевым раствором. Аплидин вводили и.п. ежесуточно в двух раундах каждые сутки в течение 9 суток подряд (сутки 15-23 и сутки 28-36) при дозе 60 мкг/кг/доза отдельно (группа 2) или в сочетании с ритуксимабом (группа 4). Ритуксимаб вводили в/в при дозе 20 мг/кг/доза в течение четырех недельных циклов каждые 3 суток всего при 2 обработках (протокол q3d×2), начиная с суток 15 отдельно (группа 3) или в сочетании с аплидином (группа 4). В сутки, когда вводили оба соединения в группе 4, сначала всем десяти животным в группе инъецировали аплидин с последующим немедленным введением ритуксимаба (группа 4).
Группу 1 обрабатывали и.п. 0,18% кремофора EL/0,18% этанола/0,84% WFI/98,8% солевого раствора (объем инъекции: 0,1 мл/10 г массы тела). Аплидин восстанавливали носителем, содержащим 15% кремофора EL/15% этанола/70% WFI, и разбавляли солевым раствором (объем инъекции: 0,1 мл/10 г массы тела). Ритуксан (ритуксимаб) получали в солевом растворе (объем инъекции: 0,1 мл/10 г массы тела).
Животных наблюдали ежесуточно и отмечали клинические признаки. Измеряли п/к опухоли и животных взвешивали дважды в неделю, начиная с первых суток обработки, суток 15. Объем опухоли определяли посредством измерений штангенциркулем (мм) и с применением формулы для эллипсоидной сферы, как описано в примере 7.
Для оценки противоопухолевой эффективности использовали сравнение средней массы опухоли в обрабатываемых группах (T) со средней массой опухоли в контрольной группе (T/C×100%) на сутки 24 (одни сутки после окончания первого 9-суточного раунда обработки аплидином) и сутки 38 (двое суток после окончания второго 9-суточного раунда обработки аплидином). % T/C для каждой обработки приведен в таблице 21.
Таблица 21
<b>№ группы</b>
<b>Средство</b>
<b>Дозировка и единица</b>
<b>Способ введения</b>
<b>% T/C на сутки</b>
<b>24</b>
<b>38</b>
1
Носитель
0 мкг/кг/доза
и.п.
2
Аплидин
60 мкг/кг/доза
и.п.
84
84
3
Ритуксимаб
20 мг/кг/доза
и.п.
95
102
4
Аплидин/
60 мкг/кг/доза
и.п.
69
74
ритуксимаб
20 мг/кг/доза
и.п.
Протокол носителя: q1d×9 сутки 15, 28Протокол аплидина: q1d×9 сутки 15, 28Протокол ритуксимаба: q3d×2 сутки 15, 22, 29, 36Протокол аплидина/ритуксимаба: q1d×9 сутки 15, 28/q3d×2 сутки 15, 22, 29, 36
Обработка сочетанием аплидина и ритуксимаба переносилась без летальных исходов. Обработка сочетанием эффективна для ингибирования роста лимфомных клеток RL и приводит к значениям T/C 69% и 74% на сутки 24 и 38 соответственно. Таким образом, когда аплидин сочетают с ритуксимабом, наблюдают потенциирование противоопухолевой активности.
Пример 10
in vivo
: Исследования для определения воздействия аплидина в сочетании с другими стандартными средствами (тройные сочетания) на линии опухолевых клеток множественной миеломы.
В настоящем исследовании анализировали тройные сочетания противоопухолевых средств. Все сочетания тестировали с применением анализа жизнеспособности клеток (MMT) на клеточной линии MM.1S, очень чувствительной клеточной линии MM. Результаты анализировали с применением программного обеспечения Calcusyn.
Клеточные линии и реагенты для культивирования клеток
Чувствительная к дексаметазону клеточная линия MM, MM.1S, была предоставлена Dr. S Rudikoff, Bethesda MD. Клеточную линию растили в среде RPMI 1640, дополненной инактивированной нагреванием 10% эмбриональной телячьей сывороткой, 100 Ед/мл пенициллином, 100 мкг/мл стрептомицином и 2 мМ L-глутамином. Все среды и реагенты для культивирования клеток куплены в Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA).
Анализы жизнеспособности клеток
Анализ клеточной пролиферации MM проводили с использованием колориметрического анализа с метилтиотетразолом (MTT; Sigma, St. Louis MO). Клеточные линии MM высевали с плотностью 50000 клеток/200 мкл среды в лунке в 48-луночные планшеты и обрабатывали определенной дозой лекарственного средства и в течение определенного времени. За два часа до окончания обработки добавляли раствор MTT (5 мг/мл в PBS; как правило, 10% объема в каждой лунке), и метаболически активные клетки восстанавливали соль тетразола до окрашенных формазановых кристаллов. После растворения этих кристаллов в течение ночной инкубации в 10% растворе SDS-HCl измеряли поглощение при 570 нм с коррекцией при 630 нм. Для каждого состояния анализировали четыре лунки, а результаты представлены в виде среднего ± SD четырех экземпляров соответствующего эксперимента, который повторяли, по меньшей мере, три раза.
Анализ изоболограмм
Взаимодействие между аплидином и другими средствами против MM анализировали с применением программного обеспечения Calcusyn (Biosoft, Ferguson, MO). Данные анализа жизнеспособности клеток (MTT) выражали как часть клеток, подвергнутых действию дозы (Fa), у обработанных лекарственным средством клеток по сравнению с необработанными клетками (контроль). Эта программа основана на способе Chou-Talalay в соответствие со следующим равенством CI=(D)1/(Dx)1+(D)1(D)2/(Dx)1(Dx)2, где (D)1 и (D)2 представляют собой дозы лекарственного средства 1 и 2, которые имеют тот же эффект x при применении по отдельности.
Для оценки результатов сочетания использовали подсчитанный на компьютере комбинаторный индекс (CI): CI>1, CI=1 и CI<1, указывающий на антагонистический, аддитивный и синергический эффекты соответственно. Соответствие данных принципу средних воздействий можно легко выявить посредством коэффициента линейной корреляции (r) диаграммы среднее-эффект: log (fa/fu) = m log (D)- m log (Dm), где D представляет собой дозу, Dm представляет собой дозу, необходимую для 50% эффекта, fa представляет собой часть, на которую действовала доза, fu - часть, на которую воздействия не было, а m представляет собой коэффициент сигмовидности кривой доза-эффект. Для каждого двойного сочетания использовали сочетание с непостоянными соотношениями.
Результаты
Сочетание аплидина + леналидомида (ревлимид) + дексаметазона
Добавление дексаметазона к сочетанию аплидин + леналидомид показало значительную синергию во всех сочетаниях, тестируемых в чувствительной клеточной линии (MM1S) (фигура 80). На фигуре 80 дозы аплидина выражены в единицах нМ, дозы леналидомида выражены в единицах мкМ и дозы дексаметазона выражены в единицах нМ.
Сочетание аплидина + бортезомиба + дексаметазона
Добавление дексаметазона к сочетанию аплидина с бортезомибом приводило к нескольким дозам с явной тенденцией к синергии (фигура 81). На фигуре 81 дозы аплидина выражены в единицах нМ, дозы бортезомиба выражены в единицах нМ и дозы дексаметазона выражены в единицах нМ.
Сочетание аплидина + бортезомиба + леналидомида (ревлимид)
Добавление бортезомиба к сочетанию аплидина с иммуномодулирующим средством, таким как леналидомид, отчетливо увеличивает его противоопухолевый эффект с CI в синергическом диапазоне для MM1S (фигура 82). На фигуре 82 дозы аплидина выражены в единицах нМ, дозы бортезомиба выражены в единицах нМ и дозы леналидомида выражены в единицах мкМ.
Сочетание аплидина + талидомида + дексаметазона
Данное сочетание продемонстрировало явную синергию в тройных сочетаниях, как можно видеть на фигуре 83. На фигуре 83 дозы аплидина выражены в единицах нМ, дозы талидомида выражены в единицах мкМ и дозы дексаметазона выражены в единицах нМ.
Сочетание аплидина + мелфалана + дексаметазона
Данное сочетание также продемонстрировало четкий синергический диапазон в основном при высоких дозах лекарственных средств (фигура 84). На фигуре 84 дозы аплидина выражены в единицах нМ, дозы мелфалана выражены в единицах мкМ и дозы дексаметазона выражены в единицах нМ.
Сочетание аплидина + мелфалана + бортезомиба
Данное сочетание приводило к CI в синергическом диапазоне при использовании высоких доз (фигура 85). На фигуре 85 дозы аплидина выражены в единицах нМ, дозы мелфалана выражены в единицах мкМ и дозы бортезомиба выражены в единицах нМ.
Эти полученные в отношении аплидина результаты можно расширить на аналоги, производные и родственные соединения аплидина. Например, настоящее изобретение относится к сочетанию соединения, такого как соединение из WO 02/02596, с противораковым лекарственным средством, предпочтительно паклитакселом (Таксол), доксорубицином, цисплатином, триоксидом мышьяка, 5-фторурацилом (5-FU), цитозинарабинозидом (AraC), карбоплатином, 7-этил-10-гидроксикамптотецином (SN38), этопозидом (VP16), мелфаланом, дексаметазоном, циклофосфамидом, бортезомибом, эрлотинибом, трастузумабом, леналидомидом (ревлимид), интерлейкином-2 (IL-2), интерфероном-α 2 (INF-α), дакарбазином (DTIC), бевацизумабом (авастин), идарубицином, талидомидом и ритуксимабом.
Примеры аналогов аплидина, которые можно использовать вместо самого аплидина, включают предпочтительные соединения, приведенные в WO 02/02596, и, в частности, авторы изобретения вводят в этот патент описание обсуждения предпочтительных соединений и связанных аспектов, приведенное в WO 02/02596. Более предпочтительно аналоги структурно близки аплидину и, как правило, отличаются от аплидина по одной аминокислоте или концевой боковой цепи. В циклической части или в боковой цепи молекулы могут находиться различные аминокислоты. Многие примеры таких соединений даны в WO 02/02596, и они являются кандидатами на использование в настоящем изобретении.