КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ НЕВРОЛОГИЧЕСКИХ НАРУШЕНИЙ
COMPOSITIONS AND METHODS OF TREATING NEUROLOGICAL DISTURBANCES

Декларация относительно прав на изобретения, выполненных при федеральном финансировании научно-исследовательских работ
Это изобретение было выполнено при правительственной поддержке в рамках гранта, предоставленного Министерством здравоохранения и социального обеспечения. Правительство имеет определенные права на это изобретение.
Ссылки на родственные заявки
Эта заявка имеет приоритет предварительной заявки на патент США 60/582999, поданной 25 июня 2004, которая включена сюда во всей своей полноте, как если бы она была полностью здесь изложена.
Область изобретения
Описаны композиции, применяемые для лечения неврологических нарушений, включающих нейродегенеративные нарушения, связанные с болезнетворной белковой агрегацией, аберрантной укладкой белка и/или нейродегенеративными аутоиммунными нарушениями, такими как амилогенные заболевания мозга. Также описаны способы применения указанных композиций.
Уровень техники
В общем случае неврологические заболевания характеризуются потерей нейронов в одной или нескольких областях центральной нервной системы. Примеры неврологических заболеваний включают болезнь Альцгеймера, нейрофиброматоз, болезнь Хантингтона, депрессию, амиотрофический латеральный склероз, рассеянный склероз, нарушение мозгового кровообращения, болезнь Паркинсона и мультиинфарктную деменцию. Они являются сложными как в начале, так и в развитии и, как подтверждается, являются одними из наиболее трудных заболеваний в лечении. Фактически для некоторых неврологических заболеваний нет препаратов, которые обеспечивают значительный терапевтический эффект. Трудность в обеспечении лечения еще более трагична на фоне разрушительного действия, которое оказывают эти заболевания на пациентов.
Болезнь Альцгеймера (AD) представляет собой дегенеративное заболевание мозга, клинически характеризующееся прогрессивной потерей памяти, восприятия, логического мышления, здравого смысла и эмоциональной стабильности, что постепенно приводит к глубокому умственному нарушению и в конечном итоге к смерти. AD является очень распространенной причиной прогрессирующего умственного расстройства (деменции) у пожилых людей и, как полагают, является четвертой из самых распространенных медицинских причин смерти в США. AD наблюдается у всех рас и этнических групп по всему миру и представляет главную настоящую и будущую проблему здравоохранения. Как оценивают, только в США заболевание охватывает приблизительно четыре миллиона индивидуумов. В настоящее время AD является неизлечимой. Для лечения симптомов AD у людей применяют некоторые лекарственные средства. Однако в настоящее время не известно ни одного лекарственного средства, которое эффективно предотвращает AD или полностью прекращает симптомы или течение болезни у людей.
В головном мозге индивидуумов с AD наблюдаются характерные поражения, которые называют сенильными бляшками и нейрофибриллярными клубками. Сенильные бляшки, характерные при AD, наиболее часто локализуются внеклеточно, тогда как нейрофибриллярные клубки наиболее часто локализуются внутриклеточно. В общем случае большое количество этих поражений (повреждений) обнаружено у больных с AD в нескольких областях человеческого мозга, отвечающих за память и когнитивную функцию. Меньшее количество этих повреждений в более ограниченном анатомическом распределении иногда обнаруживаются в головном мозге пожилых людей, у которых нет клинической AD. Основным химическим компонентом сенильных бляшек и сосудистых амилоидных отложений (амилоидная ангиопатия), характерная особенность AD, является белок, называемый амилоидный-β пептид (Aβ), который также может упоминаться как βAP, AβP или β/A4. Внеклеточные бляшки, содержащие Aβ, могут быть плотнорасположенными или рассеянными. Плотнорасположенные бляшки упоминаются часто как фибриллярные бляшки. О первом очищенном Aβ и о неполной аминокислотной последовательности сообщали Glenner и Wong (1984) Biochem. Biophys. Res. Commun. 120:885-890. Методика выделения и данные последовательности для первых 28 аминокислот описаны в Патенте США № 4666829. Впервые о формах Aβ, содержащих более 40 аминокислот, было сообщено Kang et al. (1987) Nature 325:733-736.
AD невропатологически характеризуется, в той или иной степени, четырьмя главными поражениями: a) внутринейронные, цитоплазматические отложения нейрофибриллярных клубков (NFT), b) паренхимальные амилоидные отложения, называемые нейритными бляшками (старческими бляшками), c) цереброваскулярный Aβ амилоидоз (например, амилоидная ангиопатия), и d) синаптическая и нейронная потеря. Одним из ключевых событий в AD является отложение амилоида (например, Aβ пептида) в виде нерастворимой фиброзной массы (амилоидогенез), что приводит к внеклеточным нейритным бляшкам и отложениям по стенкам церебральных кровеносных сосудов. Основным компонентом нейритных бляшек и церебральной амилоидной ангиопатии является Aβ, хотя эти отложения могут также содержать другие белки, такие как гликозаминогликаны и аполипопротеины. Solomon, B. et al. (1997) PNAS 94 (8):4 4109-1-2 показал, что моноклональное антитело против N-концов Aβ может связываться с ними и дезагрегировать существующие ранее отложения Aβ-пептида и/или предотвращать фибриллярную агрегацию in vitro и предотвращать токсичность в нейронных клеточных культурах. Schenk, D. et al., Nature 400 (6740): 173-177 (1999) показал, что иммунизация амилоидом-β уменьшила патологию, подобную болезни Альцгеймера у трансгенных мышей PDAPP, которые являются экспериментальной моделью на животных для отложений амилоида-β и невропатологий, подобных болезни Альцгеймера. Они сообщили, что иммунизация молодых животных до начала невропатологий типа болезни Альцгеймера по существу предотвратила развитие формирования β-амилоидных бляшек, невритической дистрофии и астроглиоза, тогда как при лечении взрослых животных после появления невропатологий типа болезни Альцгеймера наблюдали уменьшение степени и прогрессии этих невропатологий. Этот эффект опосредован антителами, так как при периферическом введении антител против Aβ наблюдали уменьшение мозговой паренхимальной амилоидной массы (Bard F. et al., (2000) Nat. Med. 6(8):916-9). Кроме того, интраназальная иммунизация свежеприготовленным солюбилизированным Aβ 1-40 уменьшает церебральную амилоидную массу (Weiner, H.L. et al., (2000) Ann. Neuro. 48(4):567-79). Два исследования, выполненные Morgan, D. et al., (2000) Nature 408(6815):982-5; и Janus, C. et al., (2000) Nature 408(6815):979-82, с использованием системы экспериментальных моделей на животных, показали, что сокращение амилоидных отложений в мозгу, вызванное вакцинацией, привело к улучшениям восприятия. Дополнительные исследования были направлены на различные аспекты этой же темы, включая Dodart et al., (2002) Nat. Neuroscience 5(5):452-7 и Kotilinek, L.A. et al., (2002) J. Neuroscience 22(15):6331-5. Хотя при вакцинации Aβ были показаны некоторые благоприятные исходы в различных исследованиях при использовании экспериментальных моделей AD на животных, клинические исследования иммунизации людей Aβ 1-40/42 пептидами, приготовленными с адъювантом (QS21), были остановлены из-за вредного и/или неприемлемо высокого числа случаев возникновения побочных эффектов, таких как менингоэнцефалит. Таким образом, существует потребность в терапевтически приемлемых методах лечения и/или профилактики AD и родственных нейродегенеративных нарушений, связанных с агрегацией белка.
Аутоиммунные заболевания характеризуются отклоняющимся от нормы иммунным ответом, направленным на самих себя или на аутогенные ткани. В зависимости от типа имеющего место иммунного ответа (или иммунной реакции), в общем случае, аутоиммунные заболевания у млекопитающих могут быть отнесены к одному из двух разных типов: нарушения, опосредованные клеткой (то есть опосредованные Т-клетками) или опосредованные антителом. Рассеянный склероз (MS) представляет собой аутоиммунное заболевание, опосредованное Т-клетками (Trapp et al. New Eng. J. Med. 338 (5):278 (1998)). Более чем 1000000 молодых людей по всему миру в возрасте от тридцати до сорока лет имеют MS. MS является самым распространенным заболеванием центральной нервной системы и представляет собой самую распространенную причину неврологической неспособности у молодых людей. Патофизиологически циркулирующие аутореактивные Т-клетки являются посредниками разрушения большой части центральной нервной системы, отмечающегося у пациентов с MS (Rudick et al. New Eng. J. Med. 337:1604 (1997)).
При MS Т-клетки реагируют с основным белком миелина (MBP), который является компонентом миелина в центральной нервной системе. Доказательство, что активированные Т-клетки, специфические к MBP, могут быть выделены у пациентов с MS, подтверждает предположение, что MS является аутоиммунным заболеванием, где Т-клетки уничтожают сами себя или аутогенную нейрональную ткань (Allegretta et al. Science: 247: 778 (1990)).
В настоящее время MS лечат некоторыми противовоспалительными и иммуносупрессорными агентами, такие агенты включают: (i) кортикостероиды, которые обладают как иммуномодуляторным, так и иммуносупрессорным действием; (ii) интерферон-β; (iii) глатирамер ацетат (GA); (iv) азатиоприн, аналог пурина, который подавляет как опосредованный клеткой, так и гуморальный иммунитет; (v) внутривенный иммунный глобулин; (vi) метотрексат, который ингибирует дигидрофолатредуктазу и подавляет опосредованный клеткой и гуморальный иммунитет; (vii) циклофосфамид, алкилирующий агент, который оказывает цитотоксическое и иммуносупрессорное действие; и (viii) циклоспорин, который обладает мощным иммуносупрессорным действием посредством ингибирования активации Т-клетки. Несмотря на лечение такими противовоспалительными или иммуносупрессорными препаратами, состояние более чем 50% пациентов с MS неуклонно ухудшается из-за фокального разрушения спинного мозга, мозжечка и церебральной коры.
Многие препараты, используемые в настоящее время для лечения MS, имеют ограничение эффективности длительного воздействия, частично, потому что они оказывают значительное цитотоксическое действие. Например, длительное лечение циклофосфамидом может вызвать облысение, тошноту, рвоту, геморрагический цистит, лейкопению, миокардит, бесплодие и легочный внутритканевый фиброз. Лечение иммуносупрессорами может в итоге вызвать "общую" иммуносупрессию у пациента, подвергаемого лечению, которая значительно увеличивает риск инфекции. Пациенты, подвергаемые воздействию длительной общей иммуносупрессии, имеют повышенный риск развития тяжелых медицинских осложнений при лечении, таких как злокачественные опухоли, почечные расстройства и диабет.
Альтернативный вариант лечения MS заключается в использовании внутривенного или перорального приема MBP для регулирования Т-клеточного иммунного ответа, который может быть с ним ассоциирован. Внутривенное введение MBP или его фрагментов, содержащих иммунодоминантные эпитопы MBP, подавляет иммунную систему, вызывая клональную анергию или Т-клеточную иммунологическую толерантность, которая дезактивирует Т-клетки, специфичные для MBP. Конечный результат заключается в том, что MBP-специфичные Т-клетки больше не пролиферируют в ответ на MBP. Неспособность Т-клеток пролиферировать приводит к уменьшению разрушения невральных тканей, опосредованных Т-клетками.
Иммунохимический аналог MBP, используемый для лечения MS, представляет собой глатирамер ацетат (GA) или сополимер 1 (COP-1) (Патент США № 3849550; Заявка PCT WO/95/31990). GA, в его коммерчески доступном виде, является смесью случайных синтетических полипептидов, состоящих из L-аланина, L-глутаминовой кислоты, L-лизина и L-тирозина в молярном соотношении 6,0:1,9:4,7:1,0. Изначально он был синтезирован как иммунохимический миметик MBP. Например, некоторые моноклональные антитела к GA дают перекрестную реакцию с MBP (Teitelbaum et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9258 (1991)). Как было также обнаружено, GA индуцирует T супрессорные клетки, специфичные к MBP (Lando et al. J. Immunol. 123:2156 (1979)). Эксперименты на мышах показывают, что GA также специфически ингибирует MBP-специфические Т-клетки, которые вызывают разрушение тканей центральной нервной системы при экспериментальном аллергическом энцефаломиелите (EAE) (Teitelbaum et al. Proc. Natl. Acad. USA 85:9724 (1995)).
Введение GA может: (i) увеличить процент NK клеток; (ii) уменьшить сывороточные рецепторы IL-2; (iii) подавить TNF-α; и (iv) увеличить TGF-β и IL-4 (Ariel et al. Multiple Sclerosis 3(5), S053 (1997)).
Хотя пациентов с MS относительно успешно лечили парентеральным введением GA (Bornstein et al. Transactions American Neurological Association, 348 (1987)), текущий режим лечения и эффекты в целом могут быть улучшены.
Цитирование приведенных выше документов не должно быть истолковано как признание того, что какой-либо из указанных документов представляет относящийся к делу предшествующий уровень техники. Все утверждения, касающиеся даты или изложения относительно содержания указанных документов, основаны на информации, доступной заявителям, и не предполагают какое-либо допущение относительно корректности дат или содержания указанных документов.
Краткое описание изобретения
Настоящее изобретение обеспечивает способы и композиции для лечения неврологических заболеваний или нарушений у млекопитающих, нуждающихся в таком лечении. Указанные неврологические заболевания или нарушения могут представлять собой ассоциируемые с системным или локализованным отложениями белка или белкового материала (например, амилоидоз), болезнетворными белковыми агрегациями (неправильная укладка белка) и/или нейродегенеративным аутоиммунитетом. Особый интерес представляют заболевания, формирующие амилоид, такие как болезнь Альцгеймера и/или другие амилогенные заболевания мозга, включающие заболевания, связанные с прионами, болезнь Хантингтона, болезнь Паркинсона и церебральную амилоидную ангиопатию (CAA) (Revesz, T. et al. (2003) J. Neuropathol. Exp.Neurol. 62 (9):885-98). Лечение указанных заболеваний, связанных с амилоидом, может включать предотвращение формирования новой амилоидной бляшки (отложения), поддержание текущих уровней амилоидных бляшек и/или уменьшение количества существующих амилоидных бляшек или общего количества амилоидного белка в мозге (включая Aβ, который не может быть отложен в бляшках), измеренного по определению общей амилоидной нагрузки (растворимого и нерастворимого Aβ) или количества фибриллярной Aβ-амилоидной нагрузки. Указанные неврологические заболевания или нарушения могут быть связаны с опосредованным клетками аутоиммунным заболеванием, таким как рассеянный склероз. Лечение указанных аутоиммунных нарушений может включать предотвращение формирования аутореактивных Т-клеток, поддержание текущих концентраций аутореактивных Т-клеток и/или уменьшение концентрации аутореактивных Т-клеток.
По настоящему изобретению заявляются и используются различные композиции на основе протеосомы и/или композиции GA, необязательно в форме субмикронной эмульсии или наноэмульсии, в качестве лекарственного средства для лечения неврологических заболеваний или нарушений у млекопитающих, включающих заболевания или нарушения, связанные с Aβ бляшками, и аутоиммунные заболевания или нарушения, опосредуемые клеткой.
Краткое описание фигур
Фиг.1: Действие подкожной иммунизации на уровни общего Aβ в мозге. Для количественного определения амилоидной нагрузки, правое полушарие экстрагировали в 5,0 М хлорида гуанидиния (pH 8) в течение 3 часов при комнатной температуре. Растворы использовали для измерения уровней Aβ40 и Aβ42 методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA).
Фиг.2: Действие назальной иммунизации на общие уровни общего Aβ в мозге. Концентрационные уровни общего Aβ по Aβ40 и Aβ42 из отдельных мышей после назальной обработки, измеренные методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA).
Фиг.3: Активация CD11b+ клеток приводит к клиренсу фибриллы Aβ у мышей, обработанных парентерально и назально. (A) Окрашивание фибриллы Aβ в гиппокампальной области тиофлавином-S (увеличение х10) или совместное окрашивание общего Aβ с анти-Aβ антителом (R1288) и анти-CD11b (микроглия/макрофаг) (увеличение x40) после подкожной иммунизации. (B) Совместное окрашивание анти-Aβ антитела (R1288) и анти-CD11b (микроглия/макрофаг) (в гиппокампальной области увеличение x40) после назальной иммунизации.
Фиг.4: Иммуногистология мозговых срезов после подкожной иммунизации MOG и назальной вакцинации глатирамер ацетатом. Серийные срезы области гиппокампа из необработанных или иммунизированных мышей спустя 50 дней после иммунизации были помечены с использованием анти-CD11b, CD3, IFN-γ и TGF-β антител (увеличение x20, увеличение на вкладках x60).
2
Фиг.5: Уменьшение астроцитоза после назального введения GA+IVX-908. Четкие гиппокампальные области (Брегма-1.44mm) отбирали для количественного анализа активированных астроцитов с использованием GFAP окрашивания. Уровень активации астроцита выражали как процент на мм гиппокампальной области; p=0,039 GA+IVX-908 по сравнению с контролем; p=0,02 по сравнению с EAE (MOG).
Фиг.6: Невропатология в мозговых средах после подкожной иммунизации MOG и назальной вакцинации глатирамер ацетатом. Серийные срезы коры из необработанных или обработанных мышей спустя 50 дней после иммунизации были помечены с использованием маркеров нейротоксичности: SMI32, TUNEL и iNOS (первоначальное увеличение x20). Стрелки показывают метки для изученных маркеров. Мечение для маркеров нейротоксичности наблюдали у EAE животных, но не у животных, обработанных GA-IVX-908.
Фиг.7: Целостность гематоэнцефалитического барьера на срезе гиппокампа после подкожной иммунизации MOG и назальной вакцинации глатирамер ацетатом. Серийные срезы коры от необработанных или обработанных мышей спустя 50 дней после иммунизации были помечены с использованием маркера окрашивания плазмы - фибриногена. Мечение для маркеров фибриногена наблюдали у EAE животных, но не у животных, обработанных GA-IVX-908. (Увеличение x20, увеличение на вкладке x40).
Фиг.8: Невропатология в обонятельных срезах после подкожной иммунизации MOG и назальной вакцинации глатирамер ацетата. Серийные срезы коры из необработанных или обработанных мышей спустя 50 дней после иммунизации были помечены с использованием маркеров фибриллярного амилоида: ThS, активация микроглии CD11b, BBB целостность, Фибриноген. (Увеличение x20)
Фиг.9: Окрашивание для CD68+клеток в ЦНС у необработанных мышей и мышей, иммунизированных MOG и обработанных GA+IVX-908. Стрелки указывают на CD68+клетки, которые проникают в ЦНС при EAE, но остаются локализованными у хороидного сплетения у мышей, обработанных GA+IVX-908. У необработанных мышей не наблюдали окрашивания. Срезы брали из мозжечка (Увеличение x20).
Осуществление изобретения
Термин "неврологическое заболевание" относится к заболеванию или нарушению, которое затрагивает нейронные клетки нервной системы. Особо включены: прионные заболевания (например, болезнь Крейтцфельда-Якоба); патологии развития мозга (например, врожденные дефекты в аминокислотном метаболизме, такие как аргининосукцинурия, цистатионурия, гистидинемия, гомоцистинурия, гипераммониемия, фенилкетонурия, тирозинемия и синдром ломкой X-хромосомы); патологии мозга у взрослых (например, нейрофиброматоз, болезнь Хантингтона, депрессии, амиотрофический латеральный склероз, рассеянный склероз); состояния, которые поражают в зрелом возрасте (например, болезнь Альцгеймера, болезнь Крейтцфельда-Якова, болезнь тела Леви, болезнь Паркинсона, синдром Пика); и другие патологии мозга (например, нарушение мозга, повреждения мозга, кома, инфекции различными агентами, недостаточность рациона, нарушение мозгового кровообращения, мультиинфарктная деменция и сердечно-сосудистые осложнения).
Предпочтительными заболеваниями или нарушениями по настоящему изобретению являются заболевания, повреждающие мозг у взрослых, такие как рассеянный склероз, и те, которые обычно поражают в зрелом возрасте, такие как болезнь Альцгеймера.
Термин "болезнь Альцгеймера", обозначенный здесь аббревиатурой "AD", относится к нейродегенеративному заболеванию центральной нервной системы. В общих чертах, заболевание относится к двум категориям: поздняя, которая встречается в престарелом возрасте (обычно после 65 лет) и ранняя, которая развивается задолго до старческого периода, например между 35 и 60 годами. При обоих типах заболевания патология сходна, но в случаях, начавшихся в более раннем возрасте, отклонения имеют тенденцию быть более тяжелыми и широко распространенными. AD характеризуется накоплением внеклеточно локализованного мозгового амилоида (например, пептид Aβ), амилоидными бляшками (которые можно дополнительно разделить на плотнорасположенные или рассеянные) и внутриклеточно локализованными нейрофибриллярными клубками, сконцентрированными в некоторых уязвимых областях мозга, таких как гиппокамп и кора. AD представляет собой прогрессирующее заболевание, приводящее к старческой деменции. Амилоидные бляшки представляют собой области дезорганизованных нейрофибриллярных волокон, которые могут быть объединены с нейтрофилами вплоть до 150 мм в ширину с внеклеточным бета-амилоидными (Aβ) отложениями в центре, видимые при микроскопическом анализе срезов мозговой ткани. Нейрофибриллярные клубки представляют собой внутриклеточные отложения тау-белка (часто гиперфосфорилированного), состоящие из двух парноскрученных филаментов. AD связан с патологическим накоплением Aβ пептида, являющегося следствием измененного протеолитического процессинга амилоидного белка-предшественника (APP). Патологическое накопление Aβ коррелирует с рядом мутаций, таких как аутосомные доминантные мутации APP и мутации в генах, кодирующих белки, называемые пресенилин 1 (PS1) и пресенилин 2 (PS2), которые влияют на протеолитическую активность, соответственно, γ (гамма) или β (бета) секретазы, вызывая повышенные уровни, например, Aβ 1-42; тогда как протеолитическая активность α (альфа) секретазы возможно связана с нормальным процессингом APP. При AD обнаружены различные типы бляшек, включающие без ограничения нейритные бляшки, связанные с патологическими дистрофическими невритами. Показателем заболевания также является наличие воспалительной реакции ЦНС, включая активированную микроглию и астроциты. Накопление отложений дисфункционального белка (например, Aβ и прионного белка), связанное с неврологическими нарушениями, как считают, является причиной, или способствует, или влияет иначе на развитие некоторых неврологических нарушений (Ingelsson, M. and Hyman B.T. (2002) Annals of Med. 34:259-271). Нейродегенеративные нарушения, связанные с болезнетворной белковой агрегацией, включают болезнь Альцгеймера, синдром Пика, болезнь Паркинсона, прионное заболевание нарушения Хантингтона и мотонейронные нарушения (Shastry, Neurochemistry International, 2002, 43: 1-7).
Термин "амилоид" относится к внеклеточному (например, Aβ, прионным заболеваниям и заболеванию множественной миеломы легкой цепи) или внутриклеточному (например, нейрофибриллярные клубки тау-белка при AD и альфа-синуклеина при болезни Паркинсона) отложению белковых агрегатов (Trojanowski J.Q. and Mathson M.P. (2003) Neuromolecular Medicine 4:1-5). Амилоидное отложение может быть обнаружено в мозге у пациентов с AD и синдромом Дауна, а также в артериях, артериолах, капиллярах и венах центральной нервной системы. Амилоидные отложения могут быть идентифицированы вследствие их способности связаться с красителями, такими как конго красный и тиофлавин-S, и образовывать фибриллы, включая перекрестную B-складчатую конформацию.
Термин "амилоидоз" относится к большой разнородной группе нарушений, характеризующихся абберантными нерастворимыми отложениями обычно растворимых белков, которые могут представлять собой белки с неправильной укладкой, включая белковые агрегации.
Кроме болезни Альцгеймера (AD), ранней болезни Альцгеймера, поздней болезни Альцгеймера и предсимптоматической болезни Альцгеймера, другие заболевания, характеризующиеся амилоидными отложениями, например сывороточный амилоид А(SAA) амилоидоз, наследственный исландский синдром, множественная миелома, прионные заболевания и т.п., или другие амилогенные заболевания мозга (Revesz, T. et al. (2003) J. Neuropathol. Exp.Neurol. 62 (9):885-98), могут лечиться композициями и способами, предложенными здесь. Самыми распространенными прионными заболеваниями у животных являются скрейпи овец и коз и губчатая энцефалопатия (BSE) крупного рогатого скота (Wilesmith и WeIIs (1991) Curr. Top.Microbiol. Immunol. 172:22-38). Четыре прионных заболевания были идентифицированы у людей: (i) куру, (ii) болезнь Крейтцфельда-Якоба (CJD), (iii) болезнь Герстманна-Штройсслера-Шейнкера (GSS) и (iv) фатальная семейная бессонница (FFI) (Gajdusek, округ Science 197(4307):943-60 и Medori, R. et al., (1992) N. Engl. J. Med. 326 (7):444-9).
Главным компонентом сенильных бляшек является пептид Aβ. Пептид Aβ представляет собой внутренний фрагмент из 39-43 аминокислот в белке-предшественнике APP. Несколько мутаций в белке APP коррелируют с наличием болезни Альцгеймера (см., например, Goate, A. et al., (1991) Nature 349(6311):704-6, Murrell, M. et al., (1991) Science 254(5028):97-9, Mullan, M. et al., (1992) Nat. Genet. l(5):345-7).
Термин "белок-предшественник β-амилоида" (APP), как здесь используется, определен как полипептид, который кодируется геном с таким же названием, который находится у людей в длинном плече хромосомы 21 и который включает Aβ в пределах трети у карбоксильного конца. APP является гликозилированным белком, пронизывающим мембрану один раз, который экспрессируется широким рядом клеток во многих тканях млекопитающих.
Мутации APP, как считают, влияют на развитие болезни Альцгеймера посредством усиленного или измененного протеолитического процессинга АPP в Aβ, в частности, процессинга APP, приводящего к повышенным количествам длинной формы Aβ (то есть Aβ 1-42 и Aβ 1-43). Мутации в других генах, таких как гены пресенилина, PS1 и PS2, как считают, косвенно воздействуют на протеолитический процессинг APP, приводящий к повышенным количествам длинной формы Aβ (см. Hardy, J. (1997) Trends Neurosci. 20 (4): 154-9). Эти наблюдения указывают, что Aβ, и особенно его длинная форма, является причиной болезни Альцгеймера.
Термин "фрагменты APP", как здесь используется, относится к фрагментам APP, отличным от тех, которые состоят исключительно из Aβ или фрагментов Aβ. То есть фрагменты APP включают аминокислотные последовательности APP в дополнение к тем, которые образовывают интактный Aβ или фрагмент Aβ.
Термин "бета-амилоидный пептид" является синонимом с терминами "β-амилоидный пептид", "βAP", "βA" и "Aβ". Все эти термины относятся к пептиду, формирующему бляшку, произведенному из фрагментов амилоидного белка-предшественника.
Как здесь используется, определение терминов фибриллярный Aβ и общий Aβ следующие. "Фибриллярный" Aβ представляет собой Aβ-пептид, содержащийся во внеклеточных амилоидных отложениях, которые также упоминаются как Aβ бляшки или «plagues»; в некоторых случаях Aβ бляшки можно дополнительно разделить на рассеянные или плотнорасположенные. "Общая" амилоидная нагрузка или общая Aβ нагрузка представляет собой сумму растворимого и нерастворимого (например, фибриллярного) пептида Aβ, большая часть которого, как предполагают, является внеклеточной. Как полагают, существует динамическая зависимость между растворимым и нерастворимым Aβ, где внеклеточный нефибриллярный Aβ может представлять собой источник Aβ, который может стать фибриллярным амилоидом.
+
Как здесь используется, термин экспериментальный аллергический энцефаломиелит (EAE) представляет собой основную экспериментальную модель на животных для MS. EAE может быть без труда вызван у малых млекопитающих иммунизацией MBP в подходящем адъюванте или пассивным переносом CD4, MBP-реактивных Т-клеток (Alvord Jr, E. C, et al. eds. in Experimental Allergic Encephalomyelitis a Useful Model for Multiple Sclerosis, A.R. Liss, N.Y., 1984; Makhtarian et al. Nature 309: 356 (1984); Ben-Nun et al. J. Immunol. 129:303 (1982)). Т-клетки, которые вызывают EAE как у мышей, так и у крыс, распознают пептиды, соответствующие областям антигенной детерминанты MBP, представленной антиген-представляющими клетками по классу II главного комплекса гистосовместимости (MHC) молекул.
По одному аспекту настоящего изобретения обеспечивается способ лечения неврологического заболевания или нарушения у млекопитающего. Способ по этому аспекту настоящего изобретения является эффективным посредством введения терапевтически эффективного количества GA и композиции на основе протеосомы субъекту, нуждающемуся в этом. Дополнительным аспектом по настоящему изобретению является то, что указанное неврологическое заболевание или нарушение представляет собой заболевание или нарушение с формированием амилоидных бляшек. Самые известные неврологические заболевания или нарушения, для лечения GA и композицией на основе протеосомы, по одному аспекту настоящего изобретения, представляют собой болезнь Альцгеймера и рассеянный склероз. В дополнение к терапевтической композиции GA, объединенной с протеосомой, для лечения вышеупомянутых неврологических заболеваний или нарушений дополнительные воплощения без ограничения включают применение следующих терапевтических композиций для лечения: композиция на основе протеосомы без композиции GA, GA в виде субмикронной эмульсионной композиции, или GA в виде наноэмульсионной композиции. Предыдущие воплощения также могут включать любой фармацевтически приемлемый разбавитель, наполнитель, стабилизатор или носитель.
Еще одним дополнительным аспектом по настоящему изобретению является то, что лечение указанного неврологического заболевания или нарушения у млекопитающего включает введение терапевтически эффективного количества GA и композиции на основе протеосомы, которая вызывает независящий от антитела ответ у указанного млекопитающего.
Дополнительное воплощение настоящего изобретения заключается в способе лечения амилоидного заболевания, которое может представлять собой болезнь Альцгеймера. Лечение амилоидного заболевания может осуществляться посредством, например, предотвращения увеличения фибриллярной амилоидной нагрузки, предотвращения увеличения общей амилоидной нагрузки, поддерживания текущей фибриллярной и/или общей амилоидной нагрузки или уменьшения фибриллярной и/или общей амилоидной нагрузки в мозге. Поскольку известно, что амилоидные белки могут быть обнаружены по всему телу, воплощения настоящего изобретения не ограничены мозговым амилоидом. Кроме того, хотя настоящее изобретение конкретно касается β-амилоида, настоящее изобретение охватывает также другие амилоидные классы, такие как сывороточный амилоид А (SAA), прионное заболевание, наследственный исландский синдром, болезнь Хантингтона, паркинсонизм, синдром Дауна и церебральную амилоидную ангиопатию. Лечение вышеупомянутых амилоидных заболеваний может сопровождаться введением одной из следующих терапевтических композиций: терапевтически эффективное количество GA и композиции на основе протеосомы, композиция на основе протеосомы без композиции GA, GA в форме субмикронной эмульсии и/или GA в форме наноэмульсии. Предыдущие воплощения также могут включать любой фармацевтически приемлемый разбавитель, наполнитель, стабилизатор или носитель.
Глатирамера ацетат
Глатирамера ацетат (GA), или сополимер-1 (СОР-1) (Патент США № 3849550; заявка PCT WO/95/31990), представляет собой иммунохимический аналог MBP, эффективный при лечении рассеянного склероза (MS). GA, в его коммерчески доступном виде, является смесью случайных синтетических полипептидов, состоящих из L-аланина, L-глутаминовой кислоты, L-лизина и L-тирозина в молярном соотношении 6,0:1,9:4.7:1,0. Впервые он был синтезирован как иммунохимический миметик MBP. Например, некоторые моноклональные антитела к GA дают перекрестную реакцию с MBP (Teitelbaum et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9258 (1991)). Также было установлено, что GA индуцирует T-супрессорные клетки, специфичные к MBP (Lando et al. J. Immunol. 123:2156 (1979)). Эксперименты на мышах показывают, что GA также специфически ингибирует MBP-специфические Т-клетки, которые участвуют в разрушении ткани центральной нервной системы при EAE (Teitelbaum et al. Proc. Natl. Acad. USA 85:9724 (1995); и Angelov, D.N. et al. PNAS 100 (8):4790-4795 (2003)), показывают, что GA может быть использован для лечения амиотрофического латерального склероза, где индукция хорошо отрегулированной аутоиммунной реакции, как оказывается, влияет на выживаемость при наличии Т-клеточной реакции против себя, которая может быть усилена введением GA.
GA по настоящему изобретению может быть приготовлен способами, известными в данной области. Например, GA может быть приготовлен способом, раскрытым в патенте США № 3849550, где N-карбоксиангидриды тирозина, аланина, γ-бензилглутамата и є-N-трифторацетиллизина полимеризуются при температуре среды в безводном диоксане с диэтиламином в качестве ингибитора. Разблокирование γ-карбоксильной группы глутаминовых кислот выполняют бромводородом в ледяной уксусной кислоте и с последующим удалением трифторацетильных групп от остатков лизина посредством 1M пиперидина. Полученная смесь полипептидов состоит, по существу, из полимеров аланина, глутаминовой кислоты, лизина и тирозина в молярном соотношении приблизительно 6:2:5:1.
GA также коммерчески доступен от Teva Pharmaceuticals, Kfar-Saba, Israel.
GA может быть приготовлен для применения по настоящему изобретению в любой из форм, которые обеспечивают его терапевтическую полезность. Они включают смеси пептидов с различными молекулярными массами. GA, имеющий желательный диапазон молекулярных масс, может быть получен способами, известными в данной области. Такие способы включают гель-фильтрацию высокоэффективной жидкостной хроматографией GA для удаления высокомолекулярных форм, как раскрыто в WO 95/311990. В одном воплощении GA имеет приблизительно 75% его полимерной формы в диапазоне молекулярных масс от приблизительно 2 кДа до приблизительно 20 кДа. В другом воплощении GA имеет среднюю молекулярную массу приблизительно от 4 кДа до 9 кДа. Должно быть понятно, что GA может быть подвергнут ферментативному или другому разложению для включения полимерных форм, имеющих длину, отличную от, или иначе модифицированных по сравнению с обычным GA, полученным известными способами.
GА и протеосомы
GA, приготовленный с протеосомами (например, IVX-908 или Protollin), может вводиться, например, инъекционно или интраназально. При инъекционной доставке, такая доставка может представлять собой одну инъекцию (комбинированное одновременное введение). Альтернативно доставка GA композиции и композиции на основе протеосомы может обеспечиваться по отдельности, выполнением инъекций в несколько участков, которые могут проводиться одновременно или через определенные промежутки времени и где в один участок вводят только GA композицию (то есть без протеосомы) и во второй участок вводят только композицию на основе протеосомы (то есть без GA). Также рассматривается, что GA может вводиться инъекционно, тогда как композиция на основе протеосомы вводится, например, интраназально в это же или в другое время. Таким образом, в одном воплощении по настоящему изобретению композиция GA доставляется инъекционно и отдельно от композиции на основе протеосомы, которая вводится интраназально.
Пептиды GA по настоящему изобретению также могут быть приготовлены содержащими гидрофобную якорную часть последовательности, которая, как ожидается, усилит нековалентную ассоциацию с протеосомами. В патенте США № 6476201 описывается изготовление и получение протеосомо-амфифильных детерминантных вакцин, предназначенных как для парентерального, так и особенно для введения через слизистую оболочку, включая желудочно-кишечное введение, чтобы вызвать образование антител как системно, так и в слизистой оболочке. Амфифильная детерминанта представляет собой молекулу, имеющую гидрофобные и гидрофильные области, которые при соответствующем приготовлении с протеосомами связываются с протеосомами, чтобы образовать комплекс, который вызывает иммунную реакцию у субъекта. Обычные амфифильные детерминанты включают гликолипиды, липосахариды (включая детоксифицированные липополисахариды), липопептиды, трансмембранные домены, внешние или токсоидные белки или белки или пептиды с внутренними гидрофобными аминокислотными якорями.
Эмульсионные композиции
GA может вводиться или быть приготовленным в форме субмикронной эмульсии или наноэмульсии, как описано в патентах США № 5961970 или 5716637 соответственно. Композиция включает субмикронную эмульсию типа «масло-в-воде», содержащую от приблизительно 0,5 до приблизительно 50% масла, от приблизительно 0,1 до приблизительно 10% эмульгатора, от приблизительно 0,05 до приблизительно 5% неионогенного поверхностно-активного вещества и от приблизительно 0,00001 до приблизительно 1,0% GA, в качестве водной дисперсионной фазы. Средний размер капель субмикронной эмульсии находится в диапазоне от приблизительно 0,03 до приблизительно 0,5 мкм и предпочтительно от 0,05 и до 0,2 мкм.
Наноэмульсионный подход обеспечивает вакцинные композиции, содержащие наноэмульсионные частицы, имеющие липидное ядро, окруженное по меньшей мере одним фосфолипидным бислоем. Средний диаметр частиц находится в диапазоне от приблизительно 10 до приблизительно 250 нм, как определено по весу, и GA включается в них или, в основном, до процесса гомогенизации или, реже, после него. Обычно частицы суспендированы в водной дисперсионной среде, и каждая липидная частица включает липидное ядро, где липид представляет собой в целом твердый или жидкий кристалл при температуре приблизительно 25°C или выше. Обычно количество захваченного GA составляет от приблизительно 0,001 до приблизительно 5%. Альтернативно GA может быть объединен с протеосомой и/или наноэмульсия может дополнительно включать биоадгезивные или мукоадгезивные макромолекулы.
Предполагаемый механизм
Изобретение также включает, например, способ ингибирования или уменьшения уровня β-амилоидного пептида (растворимого и/или нерастворимого), его фрагмента или производного, который включает иммунизацию млекопитающего GA, приготовленным с композицией на основе протеосомы, или композицией на основе протеосомы без GA, где понижение или ингибирование пептида, его фрагмента или производного происходит без образования антител, как здесь показано при использовании мышей с недостатком В-клеток (µМT), которые являются неспособными к образованию антител. Не основываясь на какой-либо определенной теории, предпочтительно ингибирование или уменьшение амилоида (например, пептида Aβ) происходит посредством активации иммунных клеток, таких как микроглия, локализованной в мозге, или нейтрофилов и/или макрофагов, которые могут быть обнаружены в мозге или периферически, где активация этих клеток происходит независимо от любого антитела или антиген-специфического механизма. Наиболее предпочтительно, что снижение или ингибирование происходит, не вызывая экспериментальный аллергический энцефаломиелит (EAE) у млекопитающего (включая менингоэнцефалит).
Снижение амилоидной нагрузки (например, Aβ, включая фибриллярные бляшки и нефибриллярный Aβ, который не может быть отложен в бляшках) относится к уменьшению амилоидного отложения и/или формирования бляшек Aβ, и, таким образом, происходит лечение AD и связанных заболеваний или амилоидогенных заболеваний или нарушений. Хотя различные аспекты изобретения не должны ограничиваться конкретной теорией или механизмом, предполагается, что активированная микроглия локализуется вместе с амилоидными бляшками и активация микроглиальных клеток зависит от наличия амилоидного отложения, и это отложение является активатором эндогенных микроглиальных клеток. Таким образом, активированные микроглиальные клетки участвуют в удалении амилоидных отложений (например, бляшек Aβ). Дополнительная информация относительно возможных механизмов для AD может быть найдена в Schenk, D. (2002) Nature 3:824-828. Отложение Aβ и формирование амилоидных бляшек, по-видимому, сопровождается комплексными воспалительным и нейротоксичным каскадами. Поэтому считается, что может быть применен противовоспалительный механизм лечения. Такие противовоспалительные процессы часто согласуются с экспрессией противовоспалительных IL-4/IL-10 (Th2) и TGF-β (Th3) иммунных ответов. Следовательно, удивительным и неожиданным является то, что настоящие составы, включающие композиции на основе протеосомы и GA, стимулируют иммунный ответ, вызванный не антителом, который вызывает уменьшение бляшек, содержащих Aβ-амилоид, поскольку было предварительно предложено, что протеосомы чаще связаны со стимуляцией иммунного (цитокинного) ответа типа Th1, связанного с про-воспалительным иммунным ответом, и являлись бы противоположностью и отличаются от Th2 иммунного ответа. Однако при увеличении микроглиального фагоцитоза цитокином INF-гамма Th1-типа (более 75% необработанных) можно также предложить наличие механизма обратной связи для ускоренного клиренса воспалительного инфильтрата в CNS (Cha, A. et. al. (2001) GLIA (1):87-1,0 95). Кроме того, INF-гамма, сам по себе, может также привести к ингибированию транскрипции бета-амилоидного белка-предшественника (Ringheeim G.E. et al. Biochem Biophys Res Commun (1996) 224 (1):246-51).
Композиции на основе протеосомы
В патентах США № 6476201 и 5961970 описываются поливалентные субъединичные вакцины для стимуляции оптимальных иммунных ответов к каждому из компонентов, при этом подходящие компоненты должны быть соответствующим образом связанными и каждый должен быть доступным для иммунной системы таким образом, чтобы они могли быть эффективно распознаны и процессированы клетками иммунной системы. Такое узнавание и процессирование могут включать захват мембранными клетками (М-клетками), расположенными, например, в носовом эпителии, с последующей доставкой к основным клеткам иммунной системы хозяина. Основными примерами таких нековалентно образующих комплекс вакцин являются вакцины на основе протеосом, которые могут состоять из белков внешней мембраны Neisserial, нековалентно образующих комплекс с широким рядом антигенов, включающих пептиды, липопептиды, трансмембранные или токсоидные белки, полисахариды или липополисахариды (LPS) (для дополнительного обзора смотри ссылки: патент США № 5,726,292, Immunogenicity and Efficacy of Oral or Intranasal Shigella flexneri 2a and Shigella sonnei Proteosome-Lipopolysaccharide Vaccines in Animal Models; Infect. Immun. 61:2390; Mallett, C.P., T.L. Hale, R. Kaminski, T. Larsen, N. Orr, D. Cohen, and G.H. Lowell. (1995)); Интраназальная или внутрижелудочная иммунизация протеосомно-Shigella липополисахаридными вакцинами предохраняет против смертельной пневмонии на мышиной модели шигеллеза; (Infect. Immun. 63:2382-2386; Lowell G H, Kaminski R W, Grate S et al. (1996)); Интраназальная и внутримышечная протеосомно-стафилококковый энтеротоксин B (SEB) токсоидная вакцина: иммуногенность и эффективность против летальной интоксикации SEB у мышей (Infec. Immun. 64:1706-1713; Lowell, G.H. (1990)); Proteosomes, Hydrophobic Anchors, Iscoms and Liposomes for Improved Presentation of Peptide and Protein Vaccines, (in New Generation Vaccines: G.C. Woodrow and M.M. Levine, eds. (Marcel Dekker, NY) Chapter 12 (pp.141-160)); и Proteosome-lipopeptide vaccines: enhancement of immunogenicity for malaria CS peptides; (Lowell, G.H., W.R. Ballou, L.F. Smith, R.A. Wirtz, W.D. Zollinger and W.T. Hockmeyer (1988) Science 240:800)).
Как здесь используется, композиция на основе протеосомы относится к препаратам белков наружной мембраны (OMP, также известные как порины) из грамотрицательных бактерий, таких как из рода Neisseria (см., например, Lowell et al., J. Exp.Med. 167:658, 1988; Lowell et al., Science 240:800, 1988; Lynch et al., Biophys. J. 45:104, 1984; Lowell, in "New Generation Vaccines" 2nd ed., Marcel Dekker, Inc., New York, Basil, Hong Kong, pages 193, 1997; патент США № 5726292; патент США № 4707543), которые могут использоваться как носители или адъюванты для иммуногенов, таких как бактериальные или вирусные антигены. Протеосомы, приготовленные, как описано выше, также содержат эндогенный липополисахарид (LPS), полученный из бактерий, использованных для получения OMP поринов (например, из рода Neisseria). Определение протеосомы охватывает любой способ приготовления, который приводит к компоненту белка наружной мембраны в везикулярном или везикулоподобном виде, включая многомолекулярные мембранные структуры или жидкие глобулярно-подобные OMP композиции одного или более OMP.
Как здесь используется, "липосахарид" относится к нативному или модифицированному липополисахариду или липоолигосахариду (в совокупности также называемые "LPS"), полученному из грамотрицательных бактерий, таких как Shigella flexneri или Plesiomonas shigelloides, или других грамотрицательных бактерий (включая роды Alcaligenes, Bacteroides, Bordetella, Brucella, Campylobacter, Chlamydia, Citrobacter, Edwardsiella, Ehrlicha, Enterobacter, Escherichia, Francisella, Fusobacterium, Gardnerella, Hemophillus, Helicobacter, Klebsiella, Legionella, Moraxella, Morganella, Neiserria, Pasteurella, Proteus, Providencia, другие Plesiomonas, Porphyromonas, Prevotella, Pseudomonas, Rickettsia, Salmonella, Serratia, другие Shigella, Spirillum, Veillonella, Vibrio или Yersinia). Следует отметить, что как здесь используется, LPS может быть недетоксифицирован или детоксифицирован.
В других воплощениях экзогенный LPS, выделенный из одной или различных бактерий, из которых была приготовлена протеосома, может быть смешан с ней; одна такая композиция на основе протеосомы упомянута здесь как IVX-908 (может также упоминаться как Protollin). Другими словами, протеосомы типа IVX-908 представляют собой препараты OMP, смешанные с по меньшей мере одним видом липосахарида, чтобы обеспечить OMP-LPS композицию (которая может функционировать как иммуностимулирующая композиция). Таким образом, OMP-LPS (IVX-908) адъювант может состоять из двух основных компонентов (1) протеосомный препарат белка наружной мембраны, приготовленный из грамотрицательных бактерий, таких как Neisseria meningitides, и (2) препарат одного или нескольких липосахаридов. Также рассматривается, что компоненты IVX-908 могут представлять собой или включать липиды, гликолипиды, гликопротеины, малые молекулы или т.п.
Композиции на основе протеосомы, как здесь раскрыто, могут включать один или несколько компонентов, которые по меньшей мере частично имеют функцию адъюванта, обладающего способностью стимулировать иммунную систему хозяина. Следует понимать, что такие протеосомные компоненты могут включать компонент белка наружной мембраны (OMP) (слитый белок или его фрагмент) грамотрицательных бактерий, а также компонент липополисахарида (LPS) из той же или отличной грамотрицательной бактерии. Такие компоненты могут иметь функцию, например, лигандов, которые стимулируют иммунный ответ хозяина, взаимодействуя с некоторыми рецепторами (например, Toll-подобные рецепторы), продуцированными одной или несколькими клетками-хозяевами реципиента вакцины.
Не основываясь на какой-либо определенной теории, один или несколько компонентов вакцинных препаратов, раскрытых здесь, могут взаимодействовать с Toll-подобными рецепторами (TLRs), ассоциированными с врожденным и/или адаптивным иммунным ответом хозяина вакцины. Существует по меньшей мере 10 TLR (см. Takeda et. al., Annu Rev Immunology (2003) 21:335-76). Были идентифицированы один или несколько лигандов, которые взаимодействуют с и впоследствии активируют некоторые TLR, за исключением TLR8 и TLRl0. Белки наружной мембраны Neisseria meningitides, например OMP 2 (также упомянутый как Por B), взаимодействуют с TLR2, тогда как LPS из большинства, но не всех грамотрицательных бактерий, взаимодействуют с TLR4. Соответственно, один механизм, посредством которого вакцинные препараты, описанные здесь, вносят вклад в биологическое воздействие, включает активацию одного или обоих TLR2 и TLR4. Однако в другом аспекте настоящего изобретения в равной степени возможно, что активация других TLR (отличных от TLR2 и TLR4) может иметь сходную функцию или дополнительно усиливать качественный и/или количественный профиль экспрессируемых цитокинов, и которая может быть ассоциируемой с Th1/Th2 иммунным ответом хозяина.
Качественная и/или количественная активация одного или нескольких TLR, как ожидается, будет вызывать или влиять на относительную стимуляцию (сбалансированную или несбалансированную) Th1 и/или Th2 иммунного ответа, с или без сопутствующего образования гуморального антитела.
Лиганды, взаимодействующие с TLR, отличными от TLR2 и TLR4, также могут быть использованы в вакцинных композициях, описанных здесь. Такие вакцинные компоненты могут, отдельно или в комбинации, быть использованы для воздействия на развитие иммунного ответа хозяина, достаточного для лечения или предотвращения амилогенного заболевания, как здесь заявлено. Такие TLR и ассоциируемые лиганды без ограничения включают таковые, представленные в Списке 1.
Список 1
Семейство TRL
Лиганды (примеры возможных источников)
TRL1
Растворимый фактор (Neisseria meningitides)
Триациллипопептиды (бактерии, микобактерии)
TRL2
Липопротеины и липопептидыПорины (Neisseria)
Атипичные LPS (Leptospira interrogans)
Атипичные LPS (Porphyromonas gingivalis)
Пептидогликан (Грамположительные бактерии)
Липотейхоевая кислота (Грамположительные бактерии)
HSP70 (хозяин)
Гликолепиды (Treponema maltophilium)
TRL3
Двуспиральная РНК (например, вирусная)
TRL4
LPS (Грамотрицательные бактерии)
Таксол (растение)
HSP60 (хозяин)
HSP70 (хозяин)
HSP60 (Chlamydia pnemoniae)
Фибриноген (хозяин)
TRL5
Флагеллин (бактерия)
TRL6
Диациллипопетиды (микоплазма)
TRL7
Имидазохинолин (синтетические соединения)
Локсорибин (синтетические соединения)
Бропиримин (синтетические соединения)
TRL8
Лиганд еще не идентифицирован
TRL9
CpG ДНК (бактерии)
TRL10
Лиганд еще не идентифицирован
Любой из или комбинация идентифицированных TLR (список 1), может быть активирован любым из TLR лигандных компонентов вакцинного препарата, рассмотренного здесь или их комбинацией. Дополнительно должно быть понятно, что стимуляция любого из или нескольких TLR может быть достигнута при использовании любого из или нескольких лигандов TLR в концентрациях, соответствующих пути введения (например, интраназальный, инъекционный и т.д.).
Следовательно, по настоящему изобретению должно быть ясно, что вакцинный препарат может включать любой один или несколько лиганд(ов) TLR, включая рекомбинантные лиганды (химерные белки или их фрагменты), в комбинации с антигенным вакцинным компонентом, или необязательно включающим CD14 рецептор, с или без экзогенного добавления липополисахаридного компонента.
По одному аспекту настоящего изобретения только TLR связывающая часть любого одного или нескольких лигандов TLR может быть выделена посредством, например, технологии рекомбинантных ДНК и приготовлена с или без GA, в качестве терапевтического средства и/или профилактического средства в отношении болезни Альцгеймера или подобного заболевания или нарушения. Такой полипептид также может быть получен тем или иным синтетическим методом, известным специалистам в данной области. Не основываясь на какой-либо определенной теории, один такой выделенный связывающий домен может быть выделен из части белка наружной мембраны Neisseria meningitidis, называемого Porin B, который, как предполагают, связывается с TLR2. Другой такой полипептидный лиганд связывающий TLR домен также может быть использован подобным образом отдельно или в той или иной комбинации. Такой препарат может быть использован с или без потребности введения препарата протеосома-GA или может быть использован последовательно после введения препарата протеосома-GA. Кроме того, должно быть понятно, что вариант (например, консервативная аминокислотная замена) такой связывающей TLR части лиганда TLR, может быть использован для активации TLR, при условии, что вариант обеспечивает способность связывать (и активизировать) TLR. В еще одном дополнительном аспекте по настоящему изобретению такая связывающая TLR часть лиганда TLR может быть повторена один или более раз, используя технологию рекомбинантных ДНК для получения полипептида, содержащего многократные копии такой связывающей части, или даже мультивалентные (то есть гибридные) полипептиды, включающие многократные связывающие домены того же или различных лигандов TLR.
В некоторых композициях на основе протеосомы один или несколько составляющих частей вакцинной композиции не должны образовывать нековалентный комплекс, а скорее могут быть смешаны с протеосомной композицией (например, IVX-908, Protollin). Композиции на основе протеосомы, названые Projuvant, содержат только малые количества эндогенного LPS (или липоолигосахарида (LOS)), тогда как IVX-908/protollin композиции на основе протеосомы содержат дополнительные экзогенные LPS, которые могут быть из того же или из другого рода грамотрицательных бактерий, в качестве OMP компонентов, или может быть смесью LPS, полученных из более чем одной грамотрицательной бактерии.
В одном воплощении конечное содержание липосахарида по массе как процент от общего протеосомного белка может находиться в диапазоне от приблизительно 1% до приблизительно 500%, более предпочтительно в диапазоне от приблизительно 20% до приблизительно 200%, или в диапазоне от приблизительно 30% до приблизительно 150%, или в диапазоне от приблизительно 10% до приблизительно 100%. Предпочтительное воплощение настоящего изобретения представляет собой иммуностимулирующую композицию, где компонент на основе протеосомы приготовлен из Neisseria meningitides, и конечное содержание липосахарида составляет от 50% до 150% от общего содержания протеосомного белка по массе. Конечное содержание LPS может представлять комбинацию эндогенного LPS (например, LOS) и экзогенно добавленного LPS (или LOS). В другом воплощении композиции на основе протеосомы (например, Projuvant) выполнены с эндогенным липоолигосахаридом (LOS) из Neiserria, где его содержание находится в пределах от приблизительно 0,5% до приблизительно 5% от общего содержания OMP. Другое воплощение настоящего изобретения обеспечивает протеосомы с содержанием эндогенного липосахарида, находящимся в диапазоне от приблизительно 12% до приблизительно 25% и в предпочтительном воплощении приблизительно между 15% и приблизительно 20% от общего количества OMP. Настоящее изобретение также обеспечивает композицию, содержащую липосахарид, полученный из любого рода грамотрицательных бактерий, который может быть из того же рода грамотрицательной бактерии, который является источником протеосом, или из другого рода бактерий.
Патент США № 6476201 относится к приготовлению и получению протеосомно- амфифильных детерминантных вакцин, предназначенных как для парентерального введения, так и введения через слизистую оболочку, индуцирующую образование антител как системно (сывороточное), так и в слизистой оболочке (включая респираторное и кишечное). Предпочтительным является введение через слизистую и без ограничения включает респираторное (включая, например, интраназальное, внутрифарингеальное и внутрилегочное), желудочно-кишечное (включая, например, пероральное или ректальное) или местное (например, конъюнктивальное или ушное) введение. Амфифильная детерминанта представляет собой молекулу, имеющую гидрофобные и гидрофильные области, которые при соответствующем приготовлении с протеосомами связываются с протеосомами для образования комплекса, который вызывает иммунологический ответ у индивидуума. Обычные амфифильные детерминанты включают гликолипиды, липосахариды (включая детоксифицированные липополисахариды), липопептиды, трансмембранные, внешние или токсоидные белки или белки или пептиды с внутренними гидрофобными аминокислотными якорями. Такой детерминантый материал может быть получен из грамотрицательных бактерий, включающих Escherichia, Klebsiella, Pseudomonas, Hemophilus, Brucella, Shigella и Neisseria. Более конкретно, протеосомные вакцины, в которых менингококковые препараты протеосомы белка наружной мембраны (препараты из любого штамма N. meningitides, или N. gonorrhea, или из других видов Neisserial) образуют нековалентный комплекс с нативным или детоксифицированным липополисахаридами или липоолигосахаридами из Shigella или Neisserial, для формирования вакцины, предназначенной для предотвращения заболеваний, вызванных грамотрицательными организмами, которые содержат любую из составляющих частей комплекса, включающего Meningococci или Shigellae. Более конкретно, протеосомные вакцины содержат LPS, которые индуцируют образование антител, которые распознают типоспецифические соматические полисахаридные O-антигены липополисахаридов из Shigella и, таким образом, обеспечивают гомологичную защиту против шигеллиоза. Липополисахариды при образовании комплекса с протеосомами вызывают анти-Shigella защитный иммунный ответ. Протеосомные вакцины приготовляют и выделяют или из Shigella sonnei или из Plesiomonas shigelloides для формирования иммунитета против Shigella sonnei заболевания, из Shigella flexneri 2a для формирования иммунитета против Shigella flexneri 2a заболевания, и т.д, используя LPS, полученные из гомологичных или антиген-перекрестнореагирующих организмов для формирования гомологичного иммунитета против шигеллиоза, вызванного S. flexneri 2a (или 3a и т.д.), S. boydii, S. sonnei и т.д. Дополнительно патент США № 6476201 описывают введение протеосомно-Shigella вакцин, которые являются мультивалентными в тех двух независимо выполненных протеосомных вакцинах с использованием shigella LPS антигенов, полученных из S. flexneri 2a (для S. flexneri 2a заболевания) и от P. shigelloides или S. sonnei (для S. sonnei заболевания), вводимых вместе, таким образом, индуцирующих антитела, которые распознают эти два организма и таким образом обеспечивают защиту против двух типов заболеваний. Кроме того, протеосома-Shigella LPS вакцина, в которой протеосомы из группы В типа 2b meningococci образуют комплекс с LPS из P. shigelloides, с использованием технологии мембранной диафильтрации для получения вакцины для введения через слизистую оболочку респираторным и/или желудочно-кишечным путем и индуцирования антител, которые распознают соматический O-антиген LPS из S. sonnei, таким образом, используемой для защиты от шигеллиоза.
Неограничивающим примером композиции на основе протеосомы по настоящему изобретению является адъювант, подходящий для применения на слизистых оболочках, на основе протеосомы IVX-908 (Protollin), который является нековалентносвязанным препаратом из белков наружной мембраны (протеосом) из Neisseria meningitides и экзогенно добавленных LPS, полученных из Shigella flexneri.
Препараты и введение
В дальнейшем фразы "физиологически приемлемый носитель" и "фармацевтически приемлемый носитель", используемые попеременно, относятся к носителю или разбавителю, который не вызывает значительное раздражение организма и не подавляет биологическую активность и свойства применяемого соединения.
Здесь термин "эксципиент" относится к инертному веществу, добавленному к фармацевтической композиции для дополнительного облегчения введения активного ингредиента. Неограничивающие примеры наполнителей включают карбонат кальция, фосфат кальция, различные сахара и типы крахмала, производные целлюлозы, желатина, растительные масла и полиэтиленгликоли.
Методы приготовления и введения препаратов могут быть найдены в "Remington's Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Easton, Pa., последнее издание.
Подходящие пути введения могут включать, например, пероральную, ректальную, чресслизистую, назальную, кишечную или парентеральную доставку, включая внутримышечную, подкожную и костномозговую инъекции, а также интратекальную, непосредственную интравентрикулярную, внутривенную, интраперитонеальную, интраназальную или внутриглазную инъекцию, но предпочтительным путем введения для протеосомы является интраназальное введение.
GA препараты, включающие композиции на основе протеосомы, как в форме субмикронной эмульсии, так и в форме наноэмульсии, могут применяться парентерально, перорально, интраназально, или местно, или, как здесь обозначено, в любой их комбинации. Хотя в некоторых воплощениях предпочтительно их парентеральное введение или через слизистую оболочку. Также здесь включены двойные или множественные пути введения. Двойные пути введения могут включать, например, препараты на основе протеосомы, приготовленные и вводимые интраназально, но отдельно от GA, который может вводиться инъекционно одновременно с или отдельно от интраназального введения протеосом. Протеосомные (Projuvant) или протеосома:LPS (то есть IVX-908) композиции (при отсутствии GA) могут вводиться инъекционно одновременно с или отдельно от GA. Для инъекционного введения активные ингредиенты по изобретению могут быть приготовлены в физиологически приемлемом носителе, предпочтительно в физиологически совместимых буферах, таких как раствор Ханка, раствор Рингера или физиологический солевой буфер. Для трансдермального введения и введения через слизистую в препарате могут быть использованы пенетранты, подходящие для барьера, который должен быть преодолен. Такие смачивающие реагенты, в общем случае, известны в данной области.
Для перорального введения соединения могут быть без труда приготовлены объединением активных соединений с фармацевтически приемлемыми носителями, известными в данной области. Такие носители позволяют приготовить соединения по изобретению в форме таблеток, пилюль, драже, капсул, жидкостей, гелей, сиропов, жидких растворов, суспензий и т.п. для перорального приема пациентом. Фармакологические препараты для перорального применения могут быть приготовлены с использованием твердых эксципиентов, при необходимости размалыванием полученной смеси и технологической обработки смеси гранул, после добавления подходящих вспомогательных веществ, если требуется, получают ядра драже или таблетки. Подходящие наполнители, в частности наполнители, такие как сахара, включая лактозу, сахарозу, маннит или сорбит; препараты целлюлозы, такие как, например, маисовый крахмал, пшеничный крахмал, рисовый крахмал, картофельный крахмал, желатин, трагантовая камедь, метилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, натрий карбоксиметилцеллюлоза; и/или физиологически приемлемые полимеры, такие как поливинилпирролидон (PVP). Если требуется, возможно добавление дезинтегрантов, таких как сшитый поливинилпирролидон, агар-агар, или альгиновая кислота, или ее соли, такие как альгинат натрия.
Для интраназального введения активные ингредиенты для применения по настоящему изобретению могут быть удобно доставлены, например, в виде аэрозольной струи из баллона под давлением или распылителя с использованием подходящего пропеллента, например дихлордифторметана, трихлорфторметана, двухлортетрафторметана или углекислого газа. В случае аэрозоля под давлением доза может быть определена посредством обеспечения клапана для измерения доставленного количества. Капсулы и кассеты, выполненные, например, из желатина, для применения в диспенсере могут быть приготовлены содержащими измельченную смесь соединений и соответствующую порошковую основу, такую как лактоза или крахмал.
Препараты, описанные здесь, могут быть приготовлены для парентерального введения, например болюсной инъекцией или продолжительной инфузией. Препараты для инъекционного введения могут быть представлены в форме дозированной единицы, например в ампулах или в мультидозовых контейнерах, при необходимости с добавлением консерванта. Композиции могут представлять собой суспензии, растворы или эмульсии в масляных или водных носителях и могут содержать вспомогательные агенты, такие как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие агенты.
Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут вводиться как профилактическое средство и/или терапевтическое средство для лечения заболеваний, связанных с выработкой и/или отложениями амилоида (например, Aβ) по всему телу индивидуума, но особенно в мозге. При терапевтическом применении фармацевтические композиции вводятся млекопитающему, уже имеющему заболевание и нуждающемуся в лечении. Фармацевтические композиции могут применяться в количестве, достаточном, чтобы ингибировать или уменьшать дальнейшее отложение Aβ в бляшку и/или для удаления уже образованных бляшек и/или стимулировать уменьшение уже существующих Aβ агрегации, и/или стимулировать снижение Aβ, который не содержится в бляшках. Количество, соответствующее для достижения этого, является "терапевтически эффективной дозой или количеством".
Для профилактического применения фармацевтические композиции по настоящему изобретению вводятся млекопитающему индивидууму, склонному к заболеванию, связанному с амилоидом (например, болезнь Альцгеймера, связанная с Aβ), но еще не имеющему такое заболевание. Такие млекопитающие индивидуумы могут быть идентифицированы генетическим скринингом и клиническими анализами, как описано в медицинской литературе (например, Goate (1991) Nature 349:704-706). Фармацевтические композиции способны ингибировать, предотвращать или уменьшать амилоидное отложение, например, Aβ в бляшку при симптоматической ранней стадии, предпочтительно предотвращая даже начальные стадии заболевания, связанного с β-амилоидом. Количество соединения, необходимое для такого профилактического воздействия, называемое профилактически-эффективная доза, может cоставлять, но не обязательно, в общем случае то же количество, как описано выше, для терапевтического лечения.
Для целей этого описания и приложенной формулы изобретения термины "пациент", "индивидуум" и "реципиент" используются взаимозаменяемо. Они включают людей и других млекопитающих (например, корову и другой рогатый скот), которые являются объектами профилактического, экспериментального или терапевтического воздействия.
Как здесь используется, термин "лечение" включает по существу ингибирование, замедление или обращение прогрессии заболевания, по существу улучшение клинических симптомов заболевания или по существу предотвращение появления клинических симптомов заболевания, статистически достоверным способом.
В зависимости от серьезности и ответной реакции состояний для лечения доза может быть введена однократно или несколько раз в одно или несколько мест или различными способами доставки, курсом лечения, продолжительностью от нескольких дней до нескольких недель или до полного излечения, или до достижения статистически достоверного уменьшения состояния заболевания. Количество вводимого лекарственного средства, конечно, будет зависеть от индивидуума, подвергающегося лечению, серьезности болезни, способа введения, мнения врача и т.д. Методы для вычисления статистической значимости известны в данной области.
"Лечение" MS включает оба воздействия: предотвращение или задержку начала любого проявления, клинического или доклинического, например гистологического, симптомов этого рассеянного склероза, а также терапевтическое подавление или облегчение симптомов после их проявления, посредством уменьшения аутоиммунного всплеска и предотвращения или замедления аутоиммунного разрушения ткани. "Уменьшение", «подавление» или «понижение» аутоиммунного всплеска или реакции охватывают частичное уменьшение или улучшение одного или более симптомов всплеска или реакции. "По существу" увеличенное подавляющее воздействие (как уменьшение, так и снижение) "аутоиммунной реакции" означает значительное уменьшение одного или более маркеров или гистологических или клинических показателей MS. Неограничивающие примеры представляют собой снижение по меньшей мере на 1 единицу количественного показателя для паралича конечности.
GA, в общем случае, вводится для лечения MS в дозе от 0,01 мг к 1000 мг/день. В одном воплощении применяемая доза находится в диапазоне 0,5-50 мг. Однако по одному аспекту настоящего изобретения ожидается, что применение одного или более адъювантнов, предложенных здесь (или их комбинации) для приготовления композиции, включающей GA, допускает снижение или повышение дозы или частоты введения GA и при этом нет необходимости, чтобы доза GA была эффективна сама по себе.
+
+
Установить эффективный диапазон доз, а также оптимальное количество может любой специалист в этой области в свете информации, представленной в этом разделе. Например, дозы для млекопитающего и человека, в частности, оптимизированы, начиная с относительно низкой дозы GA (например, 1 мг/день), постепенно ее увеличивая (например, логарифмически), и измеряют биологическую реакцию на лечение; например, (i) измерением индукции регуляторных клеток (CD4и/или CD8) (Chen, Y. et al., Science, 255: 1237 (1994)); (ii) измерением уменьшения в классе II поверхностных маркеров на циркулирующих Т-клетках; (iii) измерением количества TGF-β экспрессирующих клеток или относительного количества поддающегося обнаружению TGF-β; (iv) оценкой количества и активации иммунного всплеска Т-клеток в крови (например, методом анализа ограниченного разбавления и способности пролиферировать); или (v) оценкой серьезности заболевания в соответствии с известными методами количественного определения (например, измерением количества приступов, опухание сустава, сила схвата, подвижности, визуальной остроты, возможности уменьшить или прекратить лечение). Эффективной дозой является любая доза, которая вызывает по меньшей мере статистически или клинически значимое уменьшение одного из этих показателей и предпочтительно того, который ослабляет по меньшей мере одну симптоматическую характеристику MS во время исследования дозирования.
Исследование серьезности заболевания в MS может быть выполнено известными методами в зависимости от типа заболевания. Такие методы включают без ограничения: серьезность и количество приступов за некоторый промежуток времени; прогрессирующее нарастание неспособности (которое может быть измерено, например, по расширенной шкале неспособности); количество и объем повреждений в мозге (как выявляется, например, магнитно-резонансным исследованием) и частота автореактивных Т-клеток.
Описанное выше в общих чертах изобретение теперь будет более конкретно пояснено ссылками на следующие примеры, которые представлены в качестве иллюстрации и не предназначены для ограничения настоящего изобретения, если не оговорено иначе.
ПРИМЕРЫ
Амилоидный белок-предшественник (APP) трансгенные мыши иммунизировали миелин-олигодендроцитарным гликопротеин (MOG) пептидом (аминокислоты 35-55) в полном адъюванте Фрейнда (CFA) с последующим введением (инъекцией) коклюшного токсина (РТ) для определения их восприимчивости к экспериментальному аллергическому энцефаломиелиту (EAE) по сравнению с нетрансгенными однопометными особями. В качестве контрольной группы животных иммунизировали бычьим сывороточным альбумином (BSA) или человеческим β-амилоидным пептидом (Aβ аминокислоты 1-40). EAE развивался до идентичной степени как у APP трансгенных животных (Mucke et al., Ann NY Acad Sci (777) 82-88 (1996)), так и у нетрансгенных однопометных особей, и при этом EAE не наблюдали у животных, иммунизированных Aβ 1-40 или с BSA. Однако при невропатологическом исследовании головного мозга наблюдали меньшее окрашивание Aβ у животных с развитым EAE. По количественному определению окрашивания фибрилл Aβ в гиппокампе при использовании тиофлавина С, обнаружили 92% снижение у MOG-иммунизированных мышей по сравнению с контролем (p=0,001) и 73% снижение по сравнению с мышами, иммунизированными Aβ 1-40 (p=0,03) (см. таблицу 1, Фиг.1). По количественному определению общего содержания Aβ в мозгу методом ELISA, установили 94% снижение Aβ у MOG-иммунизированных животных по сравнению с контролем (p<0,001) и 86% снижение при сравнении с иммунизированными Aβ 1-40 мышами (p=0,03) (см. таблицу 1, фиг.1).
Для определения того, был ли эффект уникален при MOG-индуцированном EAE, EAE индуцировали протеолипидным белок (PLP) пептидом (аминокислоты 139-151) в CFA. Наблюдали 76% снижение окрашивания для фибрилл Aβ и 70% снижение уровней Aβ у животных с EAE, индуцированным PLP (p<0,02) (см. таблицу 2, фиг.3A). Чтобы индуцировать EAE посредством PLP, использовали мышей Tg2576, с B6/SJL фоном, как описано у Hsiao, K. et al, Science 274 (5284):99-102 (1996). Сходные результаты были получены при индуцировании MOG-EAE у мышей Tg2576 и иммунизированных мышей J20, описанных у Mucke et al., Ann NY Acad Sci (777) 82-88 (1996) (см. Таблицу 1). Эти результаты демонстрируют, что полученные данные исследований не связаны ни с антигеном, использованным для индуцирования EAE, или исследуемой экспериментальной моделью AD на животных, ни с генетическим фоном животного, ни с полом (50% мужской/женский). У животных, иммунизированных BSA в CFA, не наблюдали никаких изменений. К сведению, общая Aβ (амилоидная) нагрузка у мышей J20 в возрасте старше 13 месяцев и у мышей Tg2576 в возрасте старше 16 месяцев не отличалась.
В предыдущих исследованиях иммунного подхода к лечению мышиной модели AD, в которой животные были иммунизированы пептидом Aβ, приготовленным в CFA, как было показано, анти-агрегирующие β-амилоидные антитела играют роль как in vitro Solomon, B. et al, Proc Natl Acad Sci 94:4109-12 (1997), так и in vivo Weiner, H.L. et al., Ann Neurol 48, 567-79 (2000), и Schenk, D. et al., Nature 400, 173-7 (1999), при уменьшении амилоидной нагрузки, и их активность была связана со специфическим эпитопом в области N-конца Aβ (Frenkel, D. et al., Neuroimmunol 88, 85-90 (1998), и Frenkel, D. et al., Proc Natl Acad Sci U S A У 97, 11455-9 (2000)). Измеряли уровни антител против Aβ у животных, иммунизированных MOG или PLP, чтобы определить наличие перекрестной реакции Aβ, и титры Aβ антител сравнивали с таковыми от животных, иммунизированных Aβ. Как показано в таблицах 1 и 2, анти-Aβ антитела у животных, иммунизированных MOG или PLP, не обнаружены. Чтобы окончательно доказать, что антитела не играют роль, от 16 месячных мышей J20 получали потомство µМТ мышей с дефицитом В-клеток иммунизировали MOG 35-55 в CFA с последующим введением коклюшного токсина. Как показано в таблице 1 и на фиг.1, µМТ APP+мыши с дефицитом В-клеток имели 90% уменьшение амилоида по сравнению с контролем, как измерено как по окрашиванию ThS (p<0,001), так и посредством ELISA для общего количества амилоида в мозге (p<0,001). Эти результаты показывают, что снижение Aβ после MOG иммунизации произошло по механизму, не зависимому от антитела.
Из предыдущих исследований было предположено, что активированная микроглия может играть важную роль при удалении Aβ in vivo (Schenk, D. et al., Nature 400, 173-7 (1999), Rogers, J. et al., Glia 40, 260-9 (2002), Mitrasinovic, O.M. et al., Neurobiol Aging 24, 807-15 (2003), Webster, S.D. et al., Exp Neurol 161, 127-38 (2000), Bacskai, BJ. et al., J Neurosci 22, 7873-8 (2002), Nicoll, J.A. et al., Nat Med 9, 448-52 (2003), Akiyama, H. & McGeer, P.L., Nat Med 10, 117-8; author reply 118-9 (2004)). Активированную микроглию (или подобные микроглии клетки) можно дополнительно разделить на происходящую из головного мозга или возникающую вне головного мозга, то есть периферически, такие как нейтрофилы и макрофаги. Методики для отделения мозговой микроглии от периферических нейтрофилов и макрофагов являются широко известными в данной области. Для исследования потенциального влияния активации микроглии на клиренс Aβ, мозг APP трансгенных мышей, иммунизированных MOG/CFA (посредством инъекции в стопу или интраназально), окрашивали CD11b, маркером активированной микроглии. Как показано на фиг.3 и 4 и в таблице 4, иммуноокрашивание гиппокампа APP трансгенных MOG-иммунизированных мышей выявляет увеличенные количества активированной микроглии (349±34,3 клеток/область гиппокампа), которая со-локализуется с амилоидными бляшками (таблица 4). Только минимальное окрашивание наблюдалось у контрольных животных, иммунизированных BSA/CFA (76±17 клеток/область гиппокампа) (таблица 4). Промежуточные уровни активации микроглии наблюдались у животных, иммунизированных Aβ/CFA (106±27 клеток/область гиппокампа). Кроме того, увеличенные уровни активации микроглии также наблюдались у µМТ мышей с дефицитом В-клеток (p<0,001) и животных, иммунизированных PLP (p<0,001) (фиг.3A, Таблица 4).
В соответствии с первой серией экспериментов, описанных выше, введение MOG/PLP вместе с CFA (с последующим введением коклюшного токсина) ассоциируется cо снижением Aβ, но вызывало нежелательный EAE. В этих экспериментах коклюшный токсин использовали, чтобы открыть гематоэнцефалический барьер для доставки соединений приготовленных в CFA в мозг. Поэтому, чтобы оценить, было ли снижение в Aβ прямо связано с индукцированием EAE, и после того, как исследовали MOG, PLP и GA в отношении MS, связанного с EAE, оценивали эффекты иммунизации APP мышей глатирамер ацетатом (GA), который представляет собой случайный аминокислотный сополимер аланина, лизина, глутаминовой кислоты и тирозина, который является эффективным при подавлении EAE и одобренным и широко используемым для лечения рецидивирующей формы MS (Teitelbaum, D. et al., J. Neural Transm Suppl 49, 85-91 (1997)).
Хотя исходное осуществление проводили введением некоторых, обеспеченных здесь, смесей антиген/адъювант с последующим введением (инъекцией) коклюшного токсина; должно быть понятно, что некоторые другие композиции, описанные здесь, могут применяться без введения коклюшного токсина. Действительно, композиции на основе протеосомы, такие как IVX-908 с или без GA могут применяться без введения коклюшного токсина. Фактически коклюшный токсин не использовали для интраназальной доставки никакой из композиции на основе протеосомы, описанной здесь.
Таким образом, мыши были иммунизированы (инъекцией в стопу) 100 мкг GA в CFA и сразу же после этого и через 48 часов получили интраперетонеальную инъекцию 150 нг коклюшного токсина. Через пятьдесят дней после иммунизации мышей умерщвили. Иммунизация глатирамер ацетатом привела к 92% снижению амилоидных фибрилл в области гиппокампа по сравнению с необработанным контролем (p<0,01) и 70% снижению общей амилоидной нагрузки (p<0,01) (см. таблицу 1, фиг.1). У животных, иммунизированных GA/CFA положительным токсином коклюша, не наблюдали клинический EAE.
Поскольку CFA не может вводиться человеку, эффект назальной вакцинации глатирамер ацетатом на мышиной модели AD исследовали с другим адъювантом, отличным от CFA; животных обрабатывали назально вводимым глатирамер ацетатом отдельно или вместе с адъювантом, подходящим для слизистой оболочки. Был приготовлен адъювант на основе протеосомы, подходящий для слизистой оболочки, IVX-908 (Protollin), включающий нековалентный препарат белка наружной мембраны (протеосомы) Neisseria meningitides и LPS из Shigella flexneri, который был использован как на людях (Fries, L.F., et al., Infect Immun (2001)), так и на мышах (Plante, M. et al., Vaccine 20, 218-25 (2001)). Мышей обрабатывали несколько раз протеосомным адъювантом в первую неделю и затем поддерживали еженедельно в течение последующих пяти недель, после которых проводили невропатологический анализ. В качестве контрольных групп животных обрабатывали назально IVX-908+BSA, только IVX-908 или только GA. Неожиданно назальное введение GA, приготовленного с IVX-908, привело к 84% снижению тиофлавин-положительного фибриллярного амилоида в гиппокампе (p<0,001 по сравнению с контролем) и 70% снижению по сравнению с только IVX-908 (p<0,01) (таблица 3). В терминах общего количества Aβ в мозге наблюдали 73% снижение после назального введения глатирамера ацетата в IVX-908 (p<0,001 по сравнению с контролем) и 45% снижение при применении только IVX-908 (p<0,002) (таблица 3, фиг.2).
Кроме того, определили, что активированная микроглия окружала амилоидные бляшки у обработанных животных. Назальное введение только GA не повлияло на фибриллы Aβ, хотя было небольшое снижение общего количества Aβ в мозге (p=0,044 по сравнению с контролем). Назальное введение BSA+IVX-908 или только IVX-908 привело к 50% снижению общей амилоидной нагрузки (p=0,02 по сравнению с контролем), хотя не наблюдали влияния на фибриллярное окрашивание Aβ. В противоположность инъекции CFA назальное введение только IVX-908 или как препарата с GA или BSA не индуцировали EAE ни в каком животном в этих экспериментах.
У APP нетрансгенных мышей не наблюдали микроглиальную активацию при ни одном из протоколов иммунизации: парентерально CFA/PT вместе с GA, назально IVX-908 вместе с GA (см. фиг.3B), или назально только IVX-908. Эти результаты подтверждают, что активация микроглии после введения (иммунизации) GA, приготовленным с IVX-908, или только IVX-908 может зависеть от наличия амилоидного отложения, которое может служить началом активации эндогенной микроглии.
Хотя не существует никакой известной перекрестной реакции между GA и Aβ, и авторы не наблюдали анти-Aβ антитела у животных, обработанных как GA, так и у EAE животных, возможно, что иммунизация GA+IVX-908 могла привести к праймингу Aβ реактивных Т-клеток. Авторы измерили Т-клеточные пролиферативные реакции и выработку цитокинов (IL-2, IFN-γ, IL-6) после 7 недель еженедельного лечения GA+IVX-908 (к тому времени, когда эксперимент был завершен) посредством стимулирования селезеночных Т-клеток Aβ (l-40). Не было обнаружено прайминга Aβ реактивными Т-клетками, как было измерено пролиферацией: Число импульсов в минуту Aβ, для необработанных=3315±1682 имп/мин; для GA+IVX-908=4516±1412 имп/мин (фоновые импульсы составляли 100-300). Индекс стимуляции (GA+IVX-908/необработанные)=1,37; минимальный индекс стимуляции более чем 2,5 считали положительным. Кроме того, в этих культурах не было обнаружено секреции IL-2, IFN-γ, IL-6, выше фонового. Это отсутствие Т-клеточного ответа на Aβ сопоставимо с не обнаружением анти-Aβ антитела, поскольку для выработки антител требуется помощь Т-клеток. Точно так же не было обнаружено прайминга Aβ у EAE животных.
Для исследования воздействия обработки GA+IVX-908 на другие участки мозга, кроме гиппокампа, были исследованы обонятельная луковица и мозжечок. Окрашивали CD11b и фибриногеном обонятельную луковицу на Aβ и получали результаты, сходные с наблюдаемыми в гиппокампе (фиг.8). После назального введения GA+IVX-908 было обнаружено увеличенное количество активированной микроглии по сравнению с контролем. Также наблюдали активацию у животных с EAE, но она ассоциировалась с утечкой крови через барьер мозга (BBB), как было измерено окрашиванием фибриногена.
При исследовании мозжечка не было обнаружено увеличенной активации микроглиального окрашивания у животных, обработанных GA+IVX-908, было предположено, что увеличенная активация ограничена областями с отложениями Aβ. Кроме того, не наблюдали активацию микроглии где-либо в головном мозге нетрансгенных однопометных особей после GA+IVX-908, что дополнительно демонстрирует, что увеличенная активация ограничена областями с отложением Aβ (см. фиг.3b).
Для лучшего понимания механизма наблюдаемого клиренса окрашивали экспрессию CD68, которая высоко выражена у активированных макрофагов из периферии в противоположность мозговой микроглии. Как показано на фиг.9, были получены хорошо окрашенные CD68 у животных с EAE по сравнению с обработанными GA+IVX-908. Такая картина окрашивания показывает перемещение макрофагов от хлоридного сплетения к окружающей мозговой паренхиме, включая мозжечок и кору. При обработке GA+IVX-908 наблюдается увеличенная экспрессия CD68 прежде всего в пределах хлоридного сплетения. Это предлагает, что CD11b+клетки, отвечающие за клиренс Aβ у животных с EAE, мигрируют от ЦНС к периферии и ассоциируются с нейронной токсичностью, тогда как CD11b + клетки у животных, обработанных GA+IVX-908, представляют собой прежде всего эндогенные микроглиальные клетки и ассоциируются с клиренсом Aβ без факта прямой токсичности. Как дополнительное подтверждение для такой интерпретации, было обнаружено, что имеет место увеличенная экспрессия CD68+ клеток в мозжечке у животных с EAE, но не у животных, обработанных GA+IVX-908, или необработанных животных (не показано). Кроме того, активированные CD11b+ клетки после обработки GA+IVX-908 были обнаружены только в областях, где было накопление амилоида.
Как показано в таблице 4 и на фиг.4, уменьшение фибрилл Aβ в гиппокампе значительно коррелирует с увеличенным количеством активированных микроглиальных клеток обоих типов, как показано окрашиванием CD11b (r=-0,7 CD11b по сравнению с фибриллами Aβ), и IFN-γ по сравнению с фибриллами Aβ. Наблюдали значительную корреляцию между CD11b клетками и клетками IFN-γ, наблюдали увеличенные количества микроглии, иммунореактивной для макрофагального рецептора колониестимулирующего фактора (М-CSFR) у обработанных животных по сравнению с контролем (p<0,02) (таблица 4). Наблюдали снижение TGF-β и процента фибрилл Aβ в области гиппокампа (r=0,91). Никаких значительных изменений не наблюдали в IL-10 иммунореактивных клетках между контролем и животными, обработанными GA+IVX-908, хотя животные с EAE имели меньше IL-10, чем контроль.
Проводили следующие эксперименты, чтобы оценить, индуцирует ли лечение GA с IVX-908 нейронную клеточную токсичность или другие потенциальные отрицательные эффекты: i) определяют уровень GFAP, как показатель астроцитоза (токсичности), соответствующего нейронному повреждению клетки; ii) измеряют уровень экспрессии SMI32, маркера фосфорилирования нейрофиламентов, и который, как известно, увеличивается при нейронном клеточном повреждении; iii) проводят TUNEL анализ для измерения апоптической гибели клетки; iv) и определяют уровень iNOS, как фермента, который, как показано, активируется в условиях нейронного стресса клетки.
Результаты GFAP исследования показывают, что астроцитоз происходит у контрольных необработанных животных (область активированных астроцитов в гиппокампе, как измерено посредством GFAP+клетки) (фиг.5). Астроцитоз уменьшался при назальном введении GA+IVX-908 (3,1%; p=0,039 по сравнению с контролем). В противоположность уменьшения астроцитоза у EAE животных не происходило. Эти результаты показывают, что клиренс Aβ как следствие обработки GA+IVX-908 является менее токсическим (ассоциированным с меньшим астроцитозом), чем таковой, наблюдаемый у животных с EAE, даже при том, что EAE также ассоциируется с уменьшением отложений Aβ.
Результаты экспериментов по измерению SMI32 (фиг.6) показывают, что SMI32 положительные клетки, имеющие патологическую овоидную морфологию, являются ассоциируемыми с нейритными бляшками у необработанных контрольных животных. У животных с EAE наблюдали увеличение количества SMI32 положительных клеток с патологической овоидной морфологией во всем мозге (совместно с воспалением), включая мозжечок (хотя нейритные бляшки не наблюдались). Напротив, у животных, обработанных GA+IVX-908, наблюдали снижение количества SMI32 положительных клеток (с патологической овоидной морфологией), ассоциируемых с нейритными бляшками. Эти эксперименты дают возможность предположить, что обработка GA+IVX-908 не является ассоциируемой с токсичностью, как измерено по SMI32.
Результаты измерений апоптической гибели клеток с использованием стандартного исследования TUNEL (фиг.6) показывают отсутствие TUNEL окрашивания у контрольных животных, и наблюдали увеличение TUNEL окрашивания в коре у животных с EAE. У животных, обработанных GA+IVX-908, не наблюдали TUNEL окрашивания. Кроме того, исследования по измерению iNOS показывают, что iNOS активируется у мышей с EAE, но не у животных, обработанных GA+IVX-908. Повреждение сосудистых структур не наблюдали как у животных, обработанных как GА+IVX-908, так и у животных с EAE.
Эти данные в совокупности указывают, что даже при том, что наблюдался клиренс Aβ у животных с EAE, а также у животных, обработанных GA+IVX-908, последний не являлся ассоциируемым с нейронной клеточной токсичностью (таблица 4 и фиг.6).
Однако, хотя активация микроглии после иммунизации только IVX-908, как оказывается, требует наличия Aβ отложений, то такая иммунизация не приводила к удалению таких отложений Aβ (посредством активированной микроглии), а скорее имело место избирательное снижение количества общей амилоидной нагрузки. Такие результаты дают возможность предположить, что существуют две популяции микроглии, которые могут быть активированы, или как альтернативное предположение эта микроглия может быть активирована в различной степени, частично или полностью, где полностью активированная микроглия способна к удалению существующих ранее Aβ бляшек, а частично активированная микроглия участвует в секвестрации растворимого Aβ пептида. Если учесть, что растворимые Aβ агрегируются в нерастворимые Aβ бляшки, то такая обработка только IVX-908 может замедлить или предотвратить длительное формирование Aβ бляшек, оказывая положительное воздействие на индивидуума, подверженного заболеванию.
В таблице 4 и фиг.3B показано, что уменьшение Aβ фибрилл в гиппокампе коррелировало с увеличенным количеством двух типов активированных микроглиальных клеток (как показано CD11b+иммуногистохимическим окрашиванием) и секретирующих клеток IFN-γ. Кроме того, имело место увеличенное количество рецептора макрофагального колониестимулирующего фактора (М-CSFR) положительной микроглии. Сообщалось, что увеличенная экспрессия М-CSFR на мышиной и человеческой микроглии ускоряет фагоцитоз агрегированного амилоида как по макрофагальным фагоцитарным рецепторам, так и посредством увеличения микроглиальной экспрессии гамма рецепторов FcR (Mitrasinovic, O.M. & Murphy, G.M., Jr., Neurobiol Aging 24, 807-15 (2003)). Однако клиренс амилоида у μМT мышей с дефицитом В-клеток также увеличивал окрашивание М-CSFR, и, следовательно, наблюдаемые эффекты вызваны посредством не-Fc-опосредованного механизма (Bacskai, BJ. et al, J Neurosci 22, 7873-8 (2002)). Отмечали связь увеличения IFN-γ с понижением экспрессии TGF-β, что позволяло предположить, что TGF-β так или иначе регулирует возможность агрегирования растворимого Aβ в бляшки, и дополнительно предполагается, что TGF-β ассоциируется с увеличением амилоидного отложения (Wyss-Coray, T. et al., Nature 389, 603-6 (1997)). Уменьшение TGF-β также может способствовать амилоидному клиренсу. Для экспрессии IL-10 не наблюдали никаких значительных изменений. Микроглиальная активация может быть ассоциируемой с увеличенным количеством Т-клеток, которые, возможно, играют роль при стимуляции микроглиальной активации, тогда как присутствовала корреляция между количествами Т-клеток и количеством клеток, секретирующих IFN-γ.
Для подтверждения того, что CD11b+ клетки, определяемые в этих экспериментах, представляли собой активированные макрофаги или микроглию, а не нейтрофилы, образцы инкубировали с моноклональным антителом, распознающим F4/80, структуру поверхности клетки, которая может быть определена на поверхности активированных макрофагов и микроглии, но не на нейтрофилах (полиморфно-ядерные лейкоциты). Экспрессия F4/80 увеличивается с созреванием макрофагов и микроглии. Результаты этих экспериментов указывают, что все CD11b+ клетки, определенные в этих экспериментах, также имели положительную окраску для F4/80 (не показано), и таким образом показано, что эти CD11b+ клетки являлись активированными макрофагами или микроглией, а не нейтрофилами. Кроме того, CD11b+ клетки, которые со-локализуются с Aβ бляшками посредством H&E окрашивания (фиг.4), имеют мононуклеарную морфологию, а не полиморфнонуклеарную морфологию, характерную для нейтрофилов.
В еще одной серии экспериментов показано, что активация микроглиальных клеток после назального введения GA+IVX-908 коррелировала с увеличением количества Т-клеток, как определено окрашиванием CD3. Эти результаты дают возможность предположить, что роль Т-клеток заключается в инициации активации микроглиальных клеток, поскольку имела место корреляция между количеством Т-клеток и количеством клеток, секретирующих IFN-γ, при значении r=0,88 (таблица 4). Дополнительно, как сообщалось, TGF-β может или увеличить, или уменьшить формирование фибриллы Aβ у APP трансгенных мышей (Wyss-Coray, T. et al Nature 389, 603-6 (1997); Wyss-Coray et al. Nat. Med 7:612-8 (2001)). В экспериментах, показанных здесь, снижение экспрессии TGF-β наблюдалось у мышей, обработанных MOG (p<0,001) и GA+IVX-908 (p<0,001), по сравнению с контролем (таблица 4); присутствовала значительная корреляция между снижением TGF-β и долей Aβ фибрилл в области гиппокампа (r=0,95). В IL-10-иммунореактивных клетках значительных изменений не наблюдалось (не показано).
Уменьшение уровня общего Aβ в мозге было установлено при назальном введении только IVX-908 (таблица 3) (p=0,02 по сравнению с необработанными), но в отличие от IVX-908, приготовленного с GA, не наблюдалось воздействия только IVX-908 на клиренс тиофлавин-положительных Aβ фибрилл. IVX-908 представляет собой адъювант на основе протеосомы, состоящий из белка наружной мембраны (OMP) N. meningitides и экзогенно добавленного липополисахарида (LPS). Neisseria meningitidis OMP 2 (порин B) и LPS/LOS, как известно, взаимодействуют с TLR, обнаруженных на поверхности некоторых типов клеток, имеющих отношение к врожденной и/или приобретенной иммунной системе. Возможно, что такие взаимодействия требуются, по меньшей мере частично, для наблюдаемой активности IVX-908 и/или GA, приготовленного с IVX-908, как здесь заявлено. Эффект, наблюдаемый с IVX-908, может быть связан с сообщениями о том, что непосредственная инъекция LPS в гиппокамп может вызвать снижение нефибриллярной Aβ нагрузки, но не Aβ фибриллярных отложений (DiCarlo, G. et al., Neurobiol Aging 22, 1007-12 (2001)). Однако должно быть отмечено, что путь введения в этих экспериментах непосредственной инъекцией в мозг значительно отличается от назального пути введения для доставки препаратов на основе протеосомы, описанных здесь. В противоположность этому другие сообщения указывают, что, хотя LPS (воспаление), вводимые интраперитонально, могут стимулировать активацию микроглиальных клеток, также наблюдалось увеличение общего амилоида, LPS-индуцированное нейровоспаление увеличивает внутриклеточное накопление белка-предшественника амилоида и Aβ пептида (Sheng et al., Neurobiology of Disease 14:133-145 (2003), и ссылки, процитированные там). Кроме того, следует понимать, что непосредственная инъекция LPS, как ожидается, будет токсической.
В экспериментах, рассмотренных выше, было показано, что CD11b+ клетки являются активированной микроглией или макрофагами, а не нейтрофилами, из-за отсутствия сигнала F4/80. Однако, для чтобы определить, можно ли эти CD11b+ клетки дополнительно разделить на активированную микроглию и активированный макрофаг, проводили определение образцов на наличие CD68, клеточного маркера, который значительно экспрессируется на активированных макрофагах из периферии, но незначительно экспрессируется на поверхности микроглиальных клеток мозга. Как показано на фиг.8 и 9, было получено более интенсивное окрашивание для CD68 (макрофаг представляет собой CD11b+ и CD68+) у животных с EAE по сравнению с образцами, полученными от животных, обработанных GA+IVX-908; показано, что эти CD11b+ CD68+ клетки являются макрофагами, которые мигрировали в мозговую паренхиму, включая мозжечок и кору периферии (субарахноидальное пространство). Напротив, после обработки GA-IVX-908 происходило увеличение CD68, экспрессирующих макрофаг, но эти клетки остаются главным образом локализованными в субарахноидальном пространстве. Результаты этих экспериментов дают возможность предположить, что CD11b+ клетки, вовлеченные в клиренс Aβ у EAE животных, мигрировали в ЦНС от периферии и ассоциируются с нейронной токсичностью; тогда как CD11b+ клетки, обнаруженные после GA-IVX-908 обработки, представляют собой, главным образом, эндогенные микроглиальные клетки и ассоциируются с клиренсом Aβ, без признаков направленной токсичности. Для дополнительной поддержки этой интерпретации было установлено наличие увеличенной экспрессии CD68+ клеток в мозжечке у EAE животных, но не у животных, обработанных GA-IVX-908, или необработанных животных (данные не показаны). Кроме того, активированные CD11b+ клетки после обработки GA-IVX-908 были обнаружены только в областях, где было накопление амилоида.
Также были обнаружены увеличенные уровни Aβ в сыворотке животных, которым вводили GA+IVX-908, по сравнению с необработанными животными, что предполагает, что GA+IVX-908 приводит к клиренсу Aβ из областей мозга и что этот Aβ может тогда быть найден в периферии. Однако такое перераспределение Aβ не наблюдалось у животных с EAE, которое, как описано выше, может быть связано с источником активированных CD11b+ клеток. Кроме того, количество CD11b+ CD68+ активированных макрофагов, выстилающих мозговые капилляры и хороидное сплетение, было увеличено у животных, которым водили GA-IVX-908, по сравнению с необработанными животными (фиг.9). Эти результаты согласуются с повышенными уровнями Aβ, определенными в серологических образцах, полученных из животных, обработанных GA-IVX-908, и с сопутствующим уменьшением амилоидной ангиопатии у животных, обработанных GA-IVX-908, совместно с CD11b+ клетками (фиг.8).
Неожиданно, как оказывается, конечный общий путь амилоидного (например, Aβ бляшки) клиренса может происходить через активированную микроглию. В EAE, IFN-γ миелиновые реактивные Т-клетки типа Th1, вероятно, активируются в периферии иммунизацией MOG или PLP с CFA, и эти Т-клетки мигрируют в мозг, где они высвобождают IFN-γ (Th1 цитокин) и активируют микроглию. И, как следствие, энцефаломиелит и паралич животных вызывается повреждением миелина и основных аксонов. Иммунизация BSA/CFA в периферии не приводит к клиренсу Aβ, поскольку BSA специфические клетки типа Th1 не накапливаются в мозге. Периферическая иммунизация глатирамер ацетатом в CFA индуцирует GA специфичные Т-клетки, которые накапливаются в мозге, вследствие перекрестной реакции GA с MBP. Клетки способны секретировать IFN-γ и, таким образом, активировать микроглию, но не способны вызвать EAE из-за измененного сродства к MBP и сопутствующей секреции противовоспалительных цитокинов.
Был показан клиренс Aβ в ассоциации с активацией микроглии. Должно быть подчеркнуто, что микроглиальная активация может оказывать как положительное, так и отрицательное воздействие (Monsonego, A., and Weiner, H.L., Immunotherapeutic approaches to Alzheimer's disease, Science 302:834-838 (2003)). Микроглия представляет естественный механизм, посредством которого агрегируется белок, и отложения могут быть удалены из мозга, и существуют сообщения о том, что микроглиальная активация после иммунизации Aβ или нарушения кровообращения в мозге могут привести к клиренсу Aβ (см. Nicoll, J.A., et al., Neuropathology of human Alzheimer disease after immunization with amyloid-beta peptide: a case report, Nat Med., 9:448-452 (2003); Akiyama, H., and McGeer, P.L., Specificity of mechanisms for plaque removal after A beta immunotherapy for Alzheimer Disease, Nat Med., 10:117-118; author reply 118-119 (2004); и Wyss-Coray, T., et al., Prominent neurodegeneration and increased plaque formation in complement-inhibited Alzheimer's mice., Proc Natl Acad ScL, 99:10837-10842 (2002)). При исследованиях на животных Wyss-Coray и его коллеги продемонстрировали, что присутствует значительная нейродегенерация и увеличенное формирование бляшек в комплемент-ингибированной экспериментальной модели мыши с AD, у которой микроглия была значительно менее активирована, чем у мышей дикого типа с AD в том же возрасте. Это подтверждает концепцию, что активированная микроглия имеет полезную роль при уменьшении амилоидной нагрузки без значительной нейротоксичности на мышиной модели AD.
Назальное введение только IVX-908 приводит к снижению амилоида, поскольку этим возможно активировать микроглию, хотя не так эффективно, как в случае композиции IVX-908, приготовленной с GA, которая, кроме того, может активировать Т-клетки. У нетрансгенных животных не наблюдали активацию микроглии при периферическом введении GA с CFA или при интраназальном введении с IVX-908. Как сообщалось, отложение Aβ приводит к небольшой активации микроглии, окружающей бляшку Aβ, и, как оказывается, такая активация требуется для микроглии, которая будет дополнительно активирована посредством IVX-908 с GA. Возможно, что небольшая активация микроглии ассоциируется с экспрессией IFN-γ или toll-подобных рецепторов, которые отвечают за дополнительную активацию микроглии (Sasaki, A. et al., Virchows Arch., 441 (4):358-67 (2002)).
Эти результаты имеют отношение к потенциальным механизмам удаления бляшек, наблюдаемых у людей после иммунизации Aβl-42 в адъюванте (QS21) типа Th1, Nicoll, J.A. et al., Nat Med 9, 448-52 (2003) сообщали о результатах аутопсии пациентов с AD, вакцинированных Aβl-42, вводимым парентерально с адъювантом QS21, которая привела к системному менингоэнцефалиту, инфильтрации мозга макрофагами и снижению амилоидных отложений в коре головного мозга. Akiyama и McGeer сообщали о подобном уменьшении сенильных бляшек в поле коры головного мозга, поврежденной неполной ишемией в случае AD, и предлагали, что их результаты и те, о которых сообщает Nicoll, et al, могут быть связаны с фагоцитозом амилоида посредством высоко реактивной микроглии, по механизму, зависимому от антитела. Кроме того, при использовании TUNEL окрашивания (маркер для апоптотической клетки) или иммунизации NeUN (маркер для жизнеспособности нейронов) не наблюдали признаков токсичности при иммунизации GA с IVX-908 или только IVX-908 отдельно по сравнению с необработанными мышами.
Здесь обеспечивается новый иммунный терапевтический подход для лечения болезни Альцгеймера, который является не зависимым от антитела и опосредован активированной микроглией. Посредством комбинирования лекарственного средства, применяемого для лечения рассеянного склероза, с назальным адъювантом (IVX-908); как показано, активируется микроглия для удаления Aβ-фибриллярных бляшек и уменьшения общей амилоидной нагрузки, с использованием двух композиций (GA и адъювантов на основе протеосомы), которые ранее применялись у людей для других целей без токсичности. Приведенные исследования на животных показали, что уменьшение Aβ бляшек ассоциировано с когнитивным улучшением, назальная вакцинация IVX-908, приготовленного с GA, является эффективной терапией для пациентов с болезнью Альцгеймера.
Таблица 1
Действие подкожной иммунизации на общий и фибриллярный Aβ в головном мозге у трансгенных мышей J20 APP
Мышей в группе
Оценка EAE
Анти-Аβ антитело*
Общий Аβ в мозге (нг/мл)
% Области тиофлавин-положительных Аβ бляшек (гиппокамп)
Контроль**
8
0
0
125,6±15,9
2,6±0,4
Аβ
8
0
0,75
60,8±16<sup>a</sup>
0,83±0,3<sup>a</sup>
MOG
10
2,5±0,8
0
8,4±2,1<sup>b</sup>
0,22±0,1<sup>b</sup>
MOG B-дефицитные
6
2,7±0,4
0
11,4±2,7<sup>b</sup>
0,27±0,04<sup>b</sup>
GA
5
0
0
39,1±12,8<sup>c</sup>
0,26±0,1<sup>d</sup>
* Результаты представлены как уровень OD в титре 1:500 IgG.
** Контроль объединяет необработанные (n=5), и BSA/CFA обработанные (n=3) животные, поскольку эти группы не отличались. Для общего Aβ в мозге: необработанные = 126,7±19,5; BSA/CFA 123,7±33,2. Для % области тиофлавин-положительных Aβ бляшек: необработанные: 2,8±0,5; BSA/CFA=2,2±0,9. p<0,05 по сравнению с контролем.
<sup>а</sup>р<0,001 по сравнению с контролем.
<sup>b</sup>р<0,001 по сравнению с контролем; р<0,05 по сравнению с Aβ.
<sup>с</sup>р<0,01 по сравнению с контролем.
<sup>d</sup>р<0,01 по сравнению с контролем; p=0,05 по сравнению с Aβ
Таблица 2
Действие PLP иммунизации на общие и фибриллярный Aβ в головном мозге у трансгенных мышей Tg2576 APP
Мышей в группе
Оценка EAE
Анти-Аβ антитело*
Общий Аβ в мозге (нг/мл)
% Области тиофлавин-положительных Аβ бляшек (гиппокамп)
Контроль
5
0
0
133,1±32,7
2,67±0,4
PLP
5
1,7±0,7
0
47,7±18,4<sup>a</sup>
0,68±0,2<sup>b</sup>
* Результаты представлены как уровень OD 450 в титре 1:500 IgG.
<sup>а</sup>р<0,002 по сравнению с контролем (необработанные мыши).
<sup>b</sup>р<0,002 по сравнению с контролем.
Таблица 3
Влияние назальной иммунизации на общий и фибриллярный Aβ в головном мозге у трансгенных мышей J20 APP
Мышей в группе
Оценка EAE
Анти-Аβ анти-тело*
Общий Аβ в мозге (нг/мл)
% Области тиофлавин-положительных Аβ бляшек (гиппокамп)
Контроль**
8
0
0
125,6±15,9
2,6±0,4
GA
4
0
0
97,6±15,5
2,06±0,8
IVX-908
7
0
0
63,5±7,7<sup>a</sup>
1,5±0,2
GA+IVX-908
8
0
0
38,7±6,8<sup>b</sup>
0,48±0,09<sup>c</sup>
* Результаты представлены как уровень OD 450 в титре 1:50 IgG.
<sup>а</sup>р<0,02 по сравнению с контролем, р<0,02 по сравнению с GA.
<sup>b</sup>р<0,001 по сравнению с контролем и GA р<0,04 по сравнению с IVX-908
<sup>с</sup>р<0,001 по сравнению с контролем; р<0,002 по сравнению с GA, р<0,002 по сравнению с IVX-908
Таблица 4
Иммуногистохимия гиппокампа у иммунизированных мышей*
Число клеток на гиппокампальную область *
CD11b<sup>a</sup>
CD3<sup>b</sup>
M-CSFR<sup>c</sup>
INF-γ<sup>d</sup>
TGF-β<sup>e</sup>
Контроль
76±17
5±3
11±4
7±3
73±12
Подкожно (CFA/P.T.)
Aβ
106±27
10±2
34±11
9±2
41±5
MOG
349±34,3<sup>iv</sup>
142±19<sup>iv</sup>
79±5<sup>i</sup>
109±7<sup>iv</sup>
20±5<sup>iii</sup>
MOG B-дефицитный
462±23<sup>iv</sup>
195±12<sup>iv</sup>
77±6<sup>i</sup>
119±18<sup>iv</sup>
22±8<sup>ii</sup>
GA
227±61<sup>i</sup>
61±12<sup>i</sup>
57±8
85±11<sup>iv</sup>
31±7
Назально
GA
136±12
35±19
30±9
53±3<sup>i</sup>
77±10
IVX-908
406±16<sup>iv</sup>
55±9<sup>i</sup>
81±16<sup>i</sup>
92±4<sup>iv</sup>
40±11
GA+
451±48<sup>iv</sup>
67±9<sup>ii</sup>
119±30<sup>iv</sup>
81±10<sup>iii</sup>
14±2<sup>iv</sup>
IVX-908<sup>g</sup>
Сноски к таблице 4:
*Данные представляют количественный анализ трех срезов для каждой обработки и шести срезов для контроля (3 необработанный+3 BSA/CFA, обработанные, как в таблице 1).
<sup>а</sup>r=- 0,7 CD11b по сравнению с % области Aβ фибриллы.
<sup>b</sup>r=- 0,65 CD3 по сравнению с % области Aβ фибриллы; r=0,74 CD3 по сравнению с CD11b.
<sup>с</sup>r=- 0,7 М-CSFR по сравнению с % области Aβ фибриллы; r=0,92 М-CSFR по сравнению с CD11b.
<sup>d</sup>r=- 0,8 IFN-γ по сравнению с % области Aβ фибриллы; r=0,9 IFN-γ по сравнению с CD11b; r=0,85 IFN-γ по сравнению с CD3.
<sup>е</sup>r=0,91 TGF-β по сравнению с % области Aβ фибриллы; r=-0,77 TGF-β по сравнению с CD11b; r=-0,6 TGF-β по сравнению с CD3.
<sup>f</sup>r=0,67 IL-10 по сравнению с % области Aβ фибриллы; r=-0,4 IL-10 по сравнению с CD11b.
<sup>g</sup>p=0,0007 CD11b по сравнению с GA; p<0,05 IFN-γ по сравнению с GA; p=0,0011 TGF-β по сравнению с GA.
<sup>i</sup>p<0,05 по сравнению с контролем.
<sup>ii</sup>p<0,02 по сравнению с контролем.
<sup>iii</sup>p<0,001 по сравнению с контролем.
<sup>iv</sup>p<0,001 по сравнению с контролем.
Материалы и методы
Мыши. APP трансгенные мыши (B6XD2) F1 (средний возраст 14 месяцев) или (B6XSJL) F1 APP+(WT или µМТ) (средний возраст 16 месяцев) содержали и использовали в среде без патогенных микроорганизмов в Brigham and Woman's Hospital в соответствии со всеми действующими руководствами.
Материалы. IVX-908 (Protollin) представляет собой нековалентный препарат белков наружной мембраны (протеосомы) Neisseria meningitides и LPS из Shigella flexneri, который был безопасно проверен на людях, и был получен от ID Biomedical, Montreal, Canada. Глатирамера ацетат (Copaxone) представляет собой случайный аминокислотный сополимер аланина, лизина, глутаминовой кислоты и тирозина, который одобрен и широко используется для лечения рецидивирующих форм MS, и был получен из аптеки Brigham and Women's Hospital. MOG (35-55) и PLP (139-151) были синтезированы в Центре Неврологических Заболеваний, Brigham and Women's Hospital.
Индуцирование и клиническое исследование EAE у APP+ мышей. Мыши (B6D2) F1 или (B6XSJL)F1 APP+ (WT или c дефицитом В-клеток µMT) и нетрансгенные однопометные мыши были иммунизированы в задние подушечки лап 100 µg MOG (35-55), PLP 139-151 или 100 µg β-амилоидным пептидом (1-40) в CFA. Сразу же после того и снова через 48 часов мышам вводили внутрибрюшинную инъекцию, содержащую 150 нг коклюшного токсина в 0,2 мл PBS. Животных наблюдали на наличие симптомов EAE через 7 дней после иммунизации и оценивали следующим образом: 0 - отсутствие болезни; 1 - паралич задней части; 2 - слабость задних конечностей; 3 - паралич задних конечностей; 4 - паралич передних и задних конечностей; 5 - агония.
Назальная вакцинация. Глатирамера ацетат: 25 мкг вводили в дни 1, 2, 4 и 5 первой недели с последующим поддерживающим еженедельным введением в течение шести недель. IVX-908: 1 мкг/мышь вводили в дни 1 и 5 первой недели с последующим поддерживающим еженедельным введением в течение шести недель. BSA+IVX-908: 25 мкг BSA с 1 мкг IVX-908 вводили в дни 1 и 5 первой недели и 25 мкг только BSA вводили в дни 2 и 4, с последующим поддерживающим еженедельным введением в течение шести недель комбинации BSA+IVX-908. GA+IVX-908: 25 мкг GA с 1 мкг IVX-908 вводили в дни 1 и 5 первой недели и 25 мкг только GA вводили в дни 2 и 4, с последующим еженедельным поддерживающим введением в течение шести недель комбинации GA+IVX-908.
2
Количественный анализ амилоида. Для количественного определения амилоидной нагрузки правое полушарие экстрагировали в 5,0 М хлорида гуанидиния (pH 8) в течение 3 часов при комнатной температуре. Разбавления были использованы для измерения уровней нерастворимого (амилоидно-ассоциируемого) Aβ40 и Aβ42 методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). Для измерения Aβ фибрилл левостороннее полушарие было зафиксировано в 4% Brain O/N с последующим 4,5% сахарозы в течение 4 часов, затем в 20% сахарозе для O/N при 4°C. Головной мозг замораживали в присутствии OCT параформальдегида, резали на 14-мкм продольные срезы, используемые для иммуногистологического окрашивания и количественного анализа амилоидных фибрилл. Хорошо различимые гиппокампальные области (Брегма-1,34) были отобраны для количественного анализа количества амилоидных фибрилл в бляшках с использованием окрашивания тиофлавином-S. Изображения (увеличение x20) этих секций были получены 3CCD цветной видеокамерой и были проанализированы соответствующим программным обеспечением (NIH; Imaging Research). Количество амилоидных фибрилл выражали как процент в мм гиппокампальной области, как измерено программным обеспечением.
Иммуногистология. Окрашивание проводили с использованием следующих маркеров: T-клетки (CD3; BD Biosciences:553057), микроглия/макрофаги (CD11b; Serotec:MCA74G), (C-MFR; Cymbus Biotech:21080096), IFN-γ (Pharmingen: 559065), IL-10 (Pharmingen:559063) и TGF-β (RD:Aβ-20-PB). Антиамилоидные антитела (R1282) были подарком от Dennis Seloke. Мозговые срезы были дополнительно подвергнуты окрашиванию гематоксилином. Срезы оценивались слепым методом, и контроль включал применение изотопически сходного mAbs, как было предварительно описано. Для каждой обработки выполняли количественный анализ трех различных мозговых секций от гиппокампальной области (та же самая область, Брегма-1,34, которую использовали для ThS окрашивания). Результаты выражали как среднее значение меченых клеток для каждого маркера.
о
2
Невропатология. Для исследования на нейротоксичность левостороннее полушарие фиксировали в 4% параформальдегиде на ночь, с последующим 4,5% сахарозы в течение 4 часов, затем 20% сахарозы на ночь при 4C. Головной мозг замораживали в присутствии ОСТ параформальдегида, делали 14 мкм продольные срезы и использовали для иммуногистологического окрашивания. Проводили окрашивание четырьмя маркерами, используемыми для нейронного стресса и целостности гематоэнцефалитического барьера: GFAP (Sigma; G9269), SMI32 (Serotec), TUNEL (Roche 1 684 817), iNOS (CHEMICON:AB5382) и Фибриноген (Dako: A0080). Астроцитоз выражали как процент в мм гиппокампальной области, охваченной астроцитами. Окрашивание для iNOS, SMI32 и Фибриногена выполняли, как предварительно описано (29). Окрашивание терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазой опосредованным методом ник-мечения концов dUTP (TUNEL) выполняли в соответствии с рекомендациями производителя (Roche 1684817). Проводили H&E окрашивание для идентификации морфологии клеток, которые подсчитывают. Окрашивание выполняли на двух последовательных срезах на животного и четырех животных на группу слепым методом, используя программное обеспечение Imaging Research от NIH с объективным стереологическим подходом. Окрашивания групп из основной двигательной области коры головного мозга (Брегма латеральная 1,44 мм) показаны на фиг.6.
Анализ данных. Все текущие и порядковые данные выражены как среднее значение±SEM (стандартная ошибка средней). Выполняли сравнение данных с использованием t-критерия Стьюдента при сравнении двух групп или односторонний ANOVA анализ при анализе трех или более групп. Значения p менее чем 0,05 считали статистически значимыми; r значения рассчитывали с использованием статистической программы Excel.
Все ссылки, цитированные здесь, включая патенты, патентные заявки и публикации, включены сюда во всей их полноте, независимо от того, были ли они ранее включены как частный случай или нет.
Описав полностью это изобретение, должно быть понятно для специалиста в данной области, что это изобретение может быть выполнено в широком диапазоне эквивалентных параметров, концентраций и условий, не отходя от сути и охвата изобретения и без проведения лишних экспериментов.
Хотя изобретение описано в конкретных воплощениях, должно быть понятно, что возможны дальнейшие модификации. Эта заявка охватывает любые варианты, применения или адаптации изобретения в общем случае, следуя сути изобретения и включая такие отклонения от настоящего раскрытия, которые в пределах известной или общепринятой практики в области, к которой относится изобретение, и которые могут быть применены к существенным признакам, сформулированным выше.