ВИРУСВАКЦИНА АССОЦИИРОВАННАЯ ПРОТИВ ОСПЫ ОВЕЦ И ОСПЫ КОЗ КУЛЬТУРАЛЬНАЯ СУХАЯ
VIRUS-VACCINE ASSOCIATED AGAINST SHEEP POX AND GOAT POX CULTURE DRY

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и может быть использовано при разработке и изготовлении средств специфической профилактики оспы овец и оспы коз.
Оспа овец и оспа коз - высококонтагиозные вирусные заболевания мелких жвачных, проявляющиеся интоксикацией организма, лихорадкой, папулезно-пустулезными поражениями кожи и слизистых оболочек, часто с летальным исходом, особенно среди молодняка. Они наносят животноводству огромный экономический ущерб, слагающийся из гибели и вынужденного убоя больных животных, снижения продуктивности, затрат на проведение ветеринарно-санитарных и охранно-карантинных мероприятий.
В соответствии с классификацией, установленной Международной комиссией по таксономии вирусов (International Committee on Taxonomy of Viruses - ICTV) вирус оспы относится к роду 00.058.1.04 Capripoxvirus, принадлежащему к подсемейству 00.058.1 Chordopoxvirinae семейства 00.058 Poxviridae (1).
Род Capripoxvirus включает вирус оспы овец (BOO), вирус оспы коз (ВОК) и вирус кожной бугорчатки КРС (вирус нодулярного дерматита (ВБ)). Представители рода близкородственны, что доказывается иммунологическим анализом и структурой генома. Так ВОК является близкородственным BOO, но таксономически самостоятельным видом. BOO и ВОК не обладают четко выраженной хозяйской специфичностью: несмотря на то что обычно вирусы вызывают наиболее выраженное заболевание либо у овец, либо у коз, некоторые штаммы патогенны для обоих видов животных-хозяев (2, 3).
В связи с этим на практике, как правило, не дифференцируют два этих заболевания, а обычно обозначают как единое заболевание - оспа овец и коз.
Именно под таким названием заболевание оспа овец и коз приводится в перечне Международной организации здравоохранения животных (МЭБ) болезней, обязательных к декларированию, хотя это и затрудняет анализ реальной распространенности оспы овец и оспы коз как отдельных заболеваний.
По данным МЭБ эти заболевания регистрируются на всех континентах, за исключением Австралии и Океании. В последние годы оспа получила широкое распространение и в тех странах, где раньше никогда не регистрировалась (Вьетнам, 2005; Монголия, 2006; Греция, 2007).
Напряженная ситуация остается в странах СНГ Среднеазиатского и Кавказского регионов (Казахстан, Таджикистан, Киргизия, Азербайджан, Грузия). В 1996-2003 гг. неблагополучными по этим заболеваниям были 55 стран, в том числе 7 стран СНГ. Так, в Таджикистане в 2000 г. оспу коз регистрировали в виде отдельных случаев, в 2001 г. - уже во всех зонах республики. Вначале заболевание выявлялось только у коз ангорской породы, а в 2002 г. - и у коз местных пород.
В течение длительного времени Россия оставалась благополучной по данным заболеваниям. Однако во время вспышки в 1993 г. на юге Российской Федерации (РФ) в Ставропольском крае и Дагестане в 5 очагах оспой заболело 1413 животных, из которых пало 628 голов. В дальнейшем в России отмечалось увеличение количества очагов и оспа мелкого рогатого скота в 1994-1999 гг. проявлялась ежегодно. За это время было зарегистрировано 85 очагов оспы преимущественно среди овец. В 2002 г. во время вспышки оспы овец на Дальнем Востоке отмечались единичные случаи заболевания коз, а в 2003 г. оспа коз проявила себя как самостоятельное заболевание.
В связи с тем что Россия имеет общую границу и тесные экономические связи со многими неблагополучными по оспе государствами, заболевание представляет большую угрозу для нашей страны в отношении возможности заноса возбудителей болезни.
Создавшаяся эпизоотическая ситуация по оспе овец и оспе коз свидетельствует о необходимости иметь высокоэффективные диагностические препараты и средства специфической профилактики как против оспы овец, так и против оспы коз, которые в короткие сроки позволили бы идентифицировать возбудителей этих заболеваний и быстро купировать распространение инфекций.
Это обстоятельство вынуждает вести постоянный поиск новых штаммов BOO и ВОК, пригодных для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики оспы овец и оспы коз.
В странах, где отмечены вспышки этих заболеваний, специфическая профилактика оспы овец и оспы коз проводится с помощью культуральных вирусвакцин из аттенуированных штаммов возбудителей заболеваний и инактивированных тканевых и культуральных вакцин, которые производят в виде монопрепаратов.
В результате многочисленных исследований установлено, что инактивированные вакцины уступают вирусвакцинам по иммуногенной активности.
Известно использование в ряде стран вирусвакцины из аттенуированного штамма RM/65 BOO, но она оказалась не эффективной против некоторых местных полевых изолятов BOO в Индии и Марокко (4, 5, 6). В связи с этим были получены аттенуированные варианты BOO из местных эпизоотических штаммов (7, 8).
В нашей стране получили культуральную вирусвакцину против оспы овец из вируса, адаптированного к культуре клеток почки крольчат, и проверили ее в производственных условиях (9).
50/
3
Известна вирусвакцина против оспы овец, содержащая активное вещество в виде антигенного материала из аттенуированного штамма Variola ovina ВГНКИ (НИСХИ) №77 BOO, полученного в культуре клеток почки ягнят с титром инфекционной активности 5,0÷6,0 lg ТЦДсм, и целевую добавку в виде стабилизатора, в соотношении, мас.%:
Антигенный материал
40,0÷60,0
Стабилизатор до
100,0 (10).
50/
3
Известна вирусвакцина против оспы овец, содержащая активное вещество в виде антигенного материала из аттенуированного штамма Sheep capripoxvirus ВГНКИ №6 BOO, полученного в подкожной клетчатке овец с титром инфекционной активности 4,0÷6,5 ИД0,2 см, и целевую добавку в виде стабилизатора в соотношении, мас.%:
Антигенный материал
40,0÷60,0
Стабилизатор
до 100,0 (11).
50/
3
Известна вирусвакцина против оспы овец, содержащая активное вещество в виде антигенного материала из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ» BOO, полученного в культуре клеток гонад козы Capra hircus L. (в культуре клеток Ch-91) с титром инфекционной активности 5,0÷6,5 ТЦДсм, и целевую добавку в виде стабилизатора в соотношении, мас.%:
Антигенный материал
80,0÷90,0
Стабилизатор
до 100,0 (12).
50/
3
Известна вирусвакцина против оспы овец, содержащая активное вещество в виде антигенного материала из аттенуированного штамма «НИСХИ» BOO, полученного в культуре клеток почки овцы ПО-ВНИИВВиМ с инфекционной активностью 5,5-6,0 ТЦДсм, и целевую добавку в виде стабилизатора в объемном соотношении 1:1 (13).
Известна вирусвакцина против оспы коз, содержащая активное вещество в виде антигенного материала из аттенуированного штамма «Durg» BOK, полученного в чувствительной биологической системе, и целевую добавку в виде стабилизатора в эффективном соотношении (14).
4
42
Известна вирусвакцина против оспы коз, содержащая активное вещество в виде антигенного материала из аттенуированного штамма «GT-STV» BOK, полученного в чувствительной биологической системе, и целевую добавку в виде стабилизатора в эффективном соотношении (15).
Известна вирусвакцина против оспы коз, содержащая активное вещество в виде антигенного материала из аттенуированного штамма «Mysore» BOK, полученного в чувствительной биологической системе, и целевую добавку в виде стабилизатора в эффективном соотношении (16).
Известна вирусвакцина против оспы коз, содержащая активное вещество в виде антигенного материала из аттенуированного штамма «Gorgan» BOK, полученного в чувствительной биологической системе, и целевую добавку в виде стабилизатора в эффективном соотношении (17).
50/
3
Известна вирусвакцина против оспы коз культуральная сухая, содержащая активное вещество в виде антигенного материала из аттенуированного штамма «ОК/А-04» BOK, полученного в культуре клеток почки овцы ПО-ВНИИВВиМ с титром инфекционной активности 5,5÷6,0 ТЦДсм, и целевую добавку в виде лактозо-пептонного стабилизатора в объемном соотношении 1:1 (18).
Недостатки вышеприведенных вирусвакцин против оспы овец и оспы коз состоят в том, что они являются монопрепаратами и содержат в своем составе лишь один из двух вакцинных штаммов, и их последовательное независимое введение оказывает более сильное стрессовое воздействие на организм иммунизированных животных и требует удвоенного количества трудовых затрат при вакцинации.
Указанные недостатки могут быть устранены созданием ассоциированных вакцин. Уже известна первая попытка создания таких препаратов.
3
3
50/
Известна ассоциированная вакцина против сибирской язвы и оспы овец, содержащая смесь из суспензии жизнеспособных спор сибиреязвенного вакцинного штамма «55-ВНИИВВиМ» в исходной концентрации 180-360 млн спор/см и антигенного материала из аттенуированного штамма «НИСХИ» BOO, полученного в культуре клеток почки овцы ПО-ВНИИВВиМ с инфекционной активностью не менее 5,0 lg ТЦДсм, и лактозо-пептонный стабилизатор в эффективном соотношении (19).
Недостаток указанной вакцины состоит в том, что она обладает низкой иммуногенной активностью и не обеспечивает удовлетворительной защиты животных против эпизоотического BOO, циркулирующего на территории Российской Федерации.
50/
3
Наиболее близкой предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является вирусвакцина против оспы овец, содержащая активное вещество в виде антигенного материала из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ» BOO, полученного в культуре клеток Ch-91 с титром инфекционной активности 5,0÷6,0 lg ТЦДсм, и целевую добавку в виде стабилизатора в соотношении, мас.%:
Антигенный материал
80,0÷90,0
Стабилизатор
до 100,0 (12).
Существенный недостаток вирусвакцины-прототипа состоит в том, что она не создает защиты против оспы коз.
В связи с этим проблема создания ассоциированной вирусвакцины против оспы мелких жвачных животных, обладающей высокой иммуногенной активностью и безвредностью, продолжает оставаться актуальной и является основным направлением исследований.
Задача, на решение которой направлено настоящее изобретение, заключается в получении вирусвакцины ассоциированной против оспы овец и оспы коз культуральной сухой, создающей эффективную защиту мелких жвачных животных против возбудителей оспы.
Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в расширении арсенала высокоиммуногенных, безвредных и ареактогенных ассоциированных вирусвакцин против оспы овец и оспы коз культуральных сухих, способных защитить мелких жвачных животных от возбудителей оспы.
Указанный технический результат достигнут созданием ассоциированной вирусвакцины против оспы овец и оспы коз культуральной сухой, охарактеризованной следующей совокупностью признаков.
Согласно изобретению предлагаемая вирусвакцина содержит смесь активных веществ, состоящих из антигенного материала из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ» BOO (авторское наименование), из антигенного материала из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК (авторское наименование), полученных в культурах клеток животного происхождения, и целевую добавку стабилизатор; в объемном соотношении и в количествах, обеспечивающих протективную иммунную активность каждого антигена в организме животных после введения им целевого препарата.
BOO из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ» выращивают в культуре клеток Ch-91, которая является гетерологичной по отношению к овцам.
ВОК из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» выращивают в культуре клеток Ch-91, которая является гомологичной по отношению к козам.
50/
3
Для изготовления предлагаемой вирусвакцины используют вышеуказанные антигенные материалы с инфекционной активностью не менее 5,5 lg ТЦДсм, в равном объемном соотношении.
В качестве стабилизатора используют защитную среду, содержащую 5% сахарозы, 1% желатозы и 3% гидролизата лактальбумина (ГЛА).
В результате проведенных исследований авторами изобретения определен оптимальный состав предлагаемой вирусвакцины:
50/
3
1. Антигенный материал из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ» BOO, полученного в культуре клеток Ch-91 с инфекционной активностью не менее 5,5 lg ТЦДсм, в количестве 40,0÷45,0 мас.%.
50/
3
2. Антигенный материал из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК, полученного в культуре клеток Ch-91 с инфекционной активностью не менее 5,5 lg ТЦДсм, в количестве 40,0÷45,0 мас.%.
3. Стабилизатор в количестве 10,0÷20,0 мас.%.
50/
3
Штамм «ВНИИЗЖ» BOO получен путем адаптации исходного BOO ВГНКИ (НИСХИ) №77 к перевиваемой культуре клеток Ch-91. При стационарном способе культивирования в культуре клеток Ch-91 вирус накапливается в титрах 5,0-6,0 lg ТЦДсм.
Аттенуированный штамм «ВНИИЗЖ» BOO депонирован 27.06.1996 г. в качестве вакцинного во Всероссийскую государственную коллекцию штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, ФГУ ВГНКИ и ему присвоен регистрационный номер (шифр) - «ВНИИЗЖ».
Штамм «ВНИИЗЖ» BOO характеризуется следующими признаками и свойствами (12).
Морфологические свойства
Вирус штамма «ВНИИЗЖ» обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя оспы овец.
Антигенные свойства
При подкожном введении овцам вызывает образование вируснейтрализующих и комплементсвязывающих антител.
Биотехнологические характеристики
50/
3
Штамм «ВНИИЗЖ» BOO выращивают и поддерживают в перевиваемой культуре клеток Ch-91. Вирус адаптируют к указанной культуре клеток путем проведения 3-5 пассажей. Цитопатогенное действие вируса наступает через 48-96 часов на 98÷100% поверхности зараженного монослоя культуры клеток. При стационарном способе выращивания в культуре клеток Ch-91 вирус накапливается в титрах 5,0÷6,0 lg ТЦДсм.
Иммуногенные свойства
50
При подкожном введении BOO штамма «ВНИИЗЖ» в дозе 1000 ТЦД создает стойкий иммунитет у привитых овец на 4÷5 день после вакцинации продолжительностью 12 месяцев.
Безвредность
BOO штамма «ВНИИЗЖ» безвреден для овец при подкожном введении. Не передается контактным путем чувствительным животным. Для лабораторных животных (кроликов, морских свинок, мышей) не является патогенным. При введении вакцины в прививной дозе в разведении 1:25 кожной и температурной реакции не отмечается.
Реактогенность
3
BOO штамма «ВНИИЗЖ» ареактогенен для овец при подкожном введении. У овец может вызывать исчезающую через 5÷7 дней местную реакцию в виде воспалительного отека размером 2×3 см при введении вируса в нативном виде по 5,0 см подкожно в бесшерстный участок подмышечной области.
Реверсибельность и контагиозность
BOO штамма «ВНИИЗЖ» не восстанавливает вирулентных свойств после 5 последовательных пассажей на овцах (не реверсибелен) и не передается при совместном содержании привитых и интактных овец (не контагиозен).
Стабильность свойств при пассировании
Основные иммунобиоогические свойства штамма стабильно сохраняются на протяжении 10 пассажей в перевиваемой культуре клеток Ch-91 (срок наблюдения).
Сохраняемость
В нативном состоянии штамм «ВНИИЗЖ» BOO не снижает своей активности в течение 3 месяцев при плюс 4°С, в лиофилизированном виде в присутствии 3% пептона, 5% сахарозы и 1% желатина его активность остается на исходном уровне при плюс 4°С и минус 20°С в течение 2 лет (срок наблюдения). После восстановления из лиофилизированного состояния физиологическим раствором вирус не инактивируется при комнатной температуре в течение 24 часов, при минус 4°С - 7 суток.
Вирусный изолят, послуживший источником для получения аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003», ВОК был выделен в 2003 г. в Приморском крае Российской Федерации от больных оспой коз.
Для получения вируса, обладающего оптимальными биологическими свойствами, использовали различные системы культивирования, в том числе линии клеток: ПО, Ch-91, ПСГК, MDBK, СПЭВ, Vero, BHK-21 и Marc-145. В процессе адаптации было установлено, что гомологичная система культивирования перевиваемая линия клеток Ch-91 высокочувствительна к ВОК и оказалась оптимальной культурой для выращивания выделенного вируса. В результате проведения 35 последовательных пассажей изолята на культуре клеток Ch-91 был получен аттенуировнный штамм «ВНИИЗЖ 2003» ВОК, имеющий стабильные биотехнологические, антигенные и иммуногенные свойства.
50/
3
В зависимости от дозы заражения и количества пассажей в условиях стационарного культивирования накопление ВОК штамма «ВНИИЗЖ 2003» в культуре клеток Ch-91 обеспечивалось на уровне от 6,0 до 7,5 lg ТЦДсм.
По сравнению с исходным изолятом штамм «ВНИИЗЖ 2003» имеет генетические и фенотипические отличия. По результатам сравнительного изучения иммунобиологических характеристик различных штаммов ВОК установлено, что штамм «ВНИИЗЖ 2003» является авирулентным, обладает хорошей антигенной и иммуногенной активностью и защищает от контрольного заражения гомологичным эпизоотическим вирусом.
Преимущество штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК по сравнению с аналогичными штаммами заключается в стабильно высоком накоплении вируса в культуре клеток Ch-91 и его высокой биологической, антигенной иммуногенной активности.
Штамм «ВНИИЗЖ 2003» ВОК депонирован 6 июня 2006 г. во Всероссийскую государственную коллекцию штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве. Федерального государственного учреждения «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ ВГНКИ) под регистрационным номером (ссылкой) - производственный вакцинный штамм «ВНИИЗЖ 2003» - ДЕП ВОК.
Штамм «ВНИИЗЖ 2003» ВОК характеризуется следующими признаками и свойствами.
Морфологические признаки
Штамм «ВНИИЗЖ 2003» ВОК относится к роду Capripoxvirus, семейства Poxviridae и обладает морфологическими признаками, характерными для ВОК.
Вирион ВОК состоит из вирусной сердцевины (нуклеоида), овальных латеральных тел и наружной оболочки. Нуклеоид окружен гладкой мембраной толщиной 5 нм. Внутри него находится нуклеопротеин (ДНК, связанная с белком), имеющий S-образную или более сложную форму. Чувствительные к трипсину структуры, называемые боковыми телами, сдавливают нуклеоид, придавая ему форму двояковогнутого диска, имеющего на срезе вид гантели. Нуклеоид и боковые тела окружены наружной оболочкой, состоящей из липидов и трубчатых белковых структур (10×5 нм).
Геном представлен двухцепочечной ДНК. Две цепи ДНК соединены шпилькообразными петлями, в результате чего образуется одна непрерывная, ковалентно связанная полинуклеотидная цепь. Флип-флоп формы ДНК (т.н. «шпильки») образованы инвертированными концевыми повторами: идентичными, но противоположно ориентированными последовательностями ДНК, длина которых варьирует даже в пределах одного рода (Классификация и номенклатура вирусов позвоночных, 2002).
Антигенные свойства
По своим антигенным свойствам штамм «ВНИИЗЖ 2003» относится к ВОК.
Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой в реакции нейтрализации (РН) на культуре клеток Ch-91, в реакции диффузионной преципитации (РДП) и в реакции длительного связывания комплемента (РДСК). Штамм проявляет антигенную активность в РДП 1:16÷1:32, в РДСК 1:120÷1:160 и в иммуноферментном анализе (ИФА) 1:1000÷1:4000.
2
Испытания вирусвакцины против оспы коз из штамма «ВНИИЗЖ 2003» в лабораторных условиях показали, что иммунизация коз сопровождается образованием вируснейтрализующих антител в крови животных в титре не менее 2,0 log.
Биотехнологические характеристики
50/
3
Штамм «ВНИИЗЖ 2003» ВОК проявляет высокую биологическую, антигенную иммунологическую активность в лиофилизированном виде и в виде культуральной вируссодержащей суспензии. Штамм предназначен для изготовления вакцинных и диагностических препаратов. Вирус штамма «ВНИИЗЖ 2003» репродуцируется в монослойных культурах клеток: первичнотрипсинизированной культуре клеток почки овцы и перевиваемой культуре клеток Ch-91, - и в течение 5-7 суток инкубирования накапливается в титре не менее 5,5 lg ТЦДсм. Сохраняет исходные характеристики при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 35 пассажей.
Генотаксономическая характеристика
Геном ВОК не обладает инфекционностью и представлен молекулой линейной двухцепочечной ДНК с центральным менее вариабельным участком длиной около 145 нв и более вариабельными концами.
Физические свойства
При электронной микроскопии штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК были выявлены вирусные частицы, структура и размеры которых характерны для каприпоксвирусов.
3
Вирионы оспы имеют линейную двухслойную ДНК длиной 45÷60 мкм, молекулярной массой 80÷240 МДа. Плавучая плотность ДНК вирусов оспы в хлористом цезии и сахарозе равна 1,676÷1,723 г/см. Важной особенностью ДНК вируса оспы является необычно прочная структура двухспиральной молекулы. Обе нити молекулы ДНК связаны между собой ковалентно.
Устойчивость к внешним факторам
ВОК штамма «ВНИИЗЖ 2003» устойчив к высушиванию эфиром, не стоек к воздействию высокой температуры, различных химических веществ, например формалину (0,5÷1%), слабым растворам йода (1:10000), соляной, серной кислот (2,5%), спирту, его инфекционная активность сохраняется при pH 6,0÷7,4.
Дополнительные признаки и свойства
Иммуногенная активность - иммуногенен в составе живой лиофилизированной вакцины.
3
Реактогенность - в месте подкожного введения нативного вируса в объеме 5 см образуется кожный тяж длиной до 4 см.
3
Патогенность - при внутримышечном введении животным заболевания не вызывает. При испытании вирусвакцины против оспы коз из штамма «ВНИИЗЖ 2003» на козах было установлено, что она не вызывала ответной местной реакции на подкожное введение в объеме 5 см (125 прививных доз), была безвредна и ареактогенна для коз.
Вирулентность - авирулентен для мелких жвачных животных при контрольном, аэрозольном и парентеральном заражении.
Антигенные свойства - вирус индуцирует у коз и овец образование вируснейтрализующих антител.
Стабильность биологических свойств - сохраняет исходные характеристики при пассировании на культуре клеток Ch-91 в течение 35 пассажей. Штамм нереверсибелен в течение 5 пассажей на козах.
50/
3
При изготовлении вирусвакцины ассоциированной против оспы овец и оспы коз антигенный материал из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ» BOO и антигенный материал из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК, полученных в культуре клеток Ch-91 с инфекционной активностью не менее 5,5 lg ТЦДсм, смешивают в равном объемном соотношении, а затем к полученной смеси добавляют стабилизатор в соотношении, мас.%:
Антигенный материал из аттенуированного
штамма «ВНИИЗЖ» BOO
40,0÷45,0
Антигенный материал из аттенуированного
штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК
40,0÷45,0
Стабилизатор
до 100,0.
Содержание антигенных материалов и стабилизатора в прививной дозе предлагаемой вирусвакцины в вышеуказанном соотношении является оптимальным, так как обеспечивает толерантную презентацию каждого антигена в организме иммунизированных животных.
3
3
Полученную смесь расфасовывают в ампулы по 2,0 см или во флаконы по 4,0 см, замораживают при температуре минус 50°С и подвергают лиофильному высушиванию. После сублимации ампулы (флаконы) заполняют сухим стерильным воздухом или инертным газом, ампулы запаивают, а флаконы закрывают резиновыми пробками и закатывают металлическими колпачками. Контроль качества полученного препарата проводят на стерильность, безвредность, специфичность и иммуногенную активность в соответствии с показателями, установленными стандартом организации-изготовителя.
Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые испрашивается правовая охрана:
1. Вирусвакцина ассоциированная против оспы овец и оспы коз культуральная сухая.
2. Смесь активных веществ.
3. Активное вещество в виде антигенного материала из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ» BOO, полученного в культуре клеток животного происхождения, в эффективном количестве.
4. Активное вещество в виде антигенного материала из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК, полученного в культуре клеток животного происхождения, в эффективном количестве.
5. Стабилизатор.
Признаками изобретения, характеризующими предлагаемую вирусвакцину и совпадающими с признаками прототипа, в том числе родовое понятие, отражающее назначение, являются:
1. Вирусвакцина ассоциированная против оспы овец и оспы коз культуральная сухая.
2. Антигенный материал из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ» BOO, полученного в культуре клеток животного происхождения и депонированного в коллекцию ФГУ «ВГНКИ» под регистрационным номером (ссылкой) «ВНИИЗЖ».
3. Стабилизатор.
По сравнению с вирусвакциной-прототипом существенным отличительным признаком предлагаемой вирусвакцины является то, что она содержит дополнительно антигенный материал из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК Variola virus caprinum, сем. Poxviridae, подсем. Chordopoxvirinae, рода Capripoxvirus, полученного в культуре клеток животного происхождения и депонированного в коллекцию ФГУ «ВГНКИ» под регистрационным номером (ссылкой) «ВНИИЗЖ 2003» - ДЕП, в эффективном количестве.
Предлагаемое изобретение характеризуется другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:
1. Антигенный материал из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ» BOO, полученного в культуре клеток Ch-91, в эффективном количестве.
50/
50/
3
3
2. Антигенный материал из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ» BOO, полученного в культуре клеток Ch-91 с инфекционной активностью не менее 5,5 lg ТЦДсм, в количестве 40,0÷45,0 ТЦДсм.
3. Антигенный материал из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК, полученного в культуре клеток Ch-91, в эффективном количестве.
50/
3
4. Антигенный материал из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК, полученного в культуре клеток Ch-91 с инфекционной активностью не менее 5,5 lg ТЦДсм, в количестве 40,0÷45,5 мас.%.
5. Стабилизатор в эффективном количестве.
6. Стабилизатор в количестве 10,0÷20,0 мас.%.
50/
3
7. Смесь из антигенного материала из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ» BOO, из антигенного материала из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК, полученных в культуре клеток Ch-91 с инфекционной активностью не менее 5,5 lg ТЦДсм, и стабилизатора, взятых в соотношении, мас.%:
Антигенный материал из аттенуированного
штамма «ВНИИЗЖ» BOO
40,0÷45,0
Антигенный материал из аттенуированного
штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК
40,0÷45,0
Стабилизатор
до 100,0.
Предлагаемое изобретение расширяет арсенал вирусвакцин ассоциированных против оспы овец и оспы коз культуральных сухих, обладающих высокой антигенной и иммуногенной активностью и обеспечивающих эффективную защиту мелких жвачных животных от возбудителей оспы.
В результате проведенных исследований авторами предлагаемого изобретения установлено, что между антигенами, входящими в состав предлагаемой вирусвакцины, отсутствует конкуренция.
Авторами предлагаемого изобретения обнаружено также явление синергизма при соединении указанных антигенов в предлагаемой вакцине, что позволило снизить их количественное содержание в препарате при сохранении такой же напряженности и длительности иммунитета у вакцинированных животных, как и при использовании для иммунизации соответствующих монопрепаратов.
Сущность изобретения пояснена на графических материалах, на которых на:
50/
фиг.1 представлено графическое изображение изменения титра ВОК штамма «ВНИИЗЖ 2003» при его пассировании в культуре клеток Ch-91 (доза заражения 0,01÷0,05 ТЦДкл.);
фиг.2 - фотографическое изображение под электронным микроскопом характерной морфологии ВОК штамма «ВНИИЗЖ 2003» (фото получено д.б.н. А.П.Пономаревым), увеличение ×76000;
фиг.3 - хроматограмма результатов видовой дифференциации каприпоксвирусов, полученных методом мультиплексной ПЦР с видоспецифическими праймерами, на которой:
1 - отрицательный контроль;
2 - маркер (снизу вверх - 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 п.н. и т.д.);
3 - BOO, вакцинный штамм «ВНИИЗЖ»;
4 - BOO, эпизоотический штамм «Афганский»;
5 - BOO, эпизоотический штамм «Приморский»;
6 - BOO, эпизоотический штамм «ЕАО»;
7 - BOO, эпизоотический штамм «Таджикский»;
8 - ВОК, вакцинный штамм «ВНИИЗЖ 2003»;
9 - ВОК, эпизоотический штамм «Приморский 2003»;
10 - ВОК, эпизоотический штамм «Pellor»;
11 - ВБ;
12 - смесь BOO и ВОК;
13 - смесь BOO, ВОК и ВБ;
фиг.4 - хроматограмма результатов видовой дифференциации BOO и ВОК, полученных методом рестрикции гена «ankyrin-repeat», на которой:
1 - маркер (снизу вверх - 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 п.н. и т.д.);
2 - BOO, вакцинный штамм «ВНИИЗЖ»;
3 - BOO, эпизоотический штамм «Афганский»;
4 - BOO, эпизоотический штамм «Приморский»;
5 - BOO, эпизоотический штамм «ЕАО»;
6 - ВОК, вакцинный штамм «ВНИИЗЖ 2003»;
7 - ВОК, эпизоотический штамм «Приморский 2003»;
8 - ВОК, эпизоотический штамм «Таджикский»;
9 - ВОК, эпизоотический штамм «Pellor».
Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его исполнения, которые не ограничивают объем изобретения.
Пример 1
Технологический процесс изготовления вирусвакцины ассоциированной против оспы овец и оспы коз культуральной сухой состоит из двух этапов: получения посевного BOO штамма «ВНИИЗЖ» и посевного ВОК штамма «ВНИИЗЖ 2003» и производственной серии предлагаемого препарата.
50/
50
50/
3
3
3
Посевной BOO штамма «ВНИИЗЖ» выращивают в культуре клеток Ch-91. Для этого клетки штамма Ch-91, хранящиеся в жидком азоте, размораживают путем оттаивания в водяной бане при (+37)÷(+38)°C и проводят 1÷2 пассажа для восстановления исходной скорости роста в монослое. Из культурального сосуда с монослоем клеток удаляют среду культивирования. Монослой клеток дважды обрабатывают диспергирующим раствором, содержащим 0,25%-ный раствор трипсина и 0,02%-ный раствор версена, взятые в соотношении 1:3, с добавлением 0,5% декстрозы, до начала отслаивания клеток. Диспергирующий раствор сливают, вносят среду Игла с 10% сыворотки КРС и 0,03% глутамина и суспензию клеток разливают в клинские матрасы. Культуру клеток инкубируют при 37°С в течение 48÷72 часов до момента формирования плотного монослоя. Для получения антигенного материала используют суспензию лиофилизированного или нативного BOO штамма «ВНИИЗЖ» с титром инфекционной активности от 5,0 до 6,0 lg ТЦДсм. Средняя инфицирующая доза вируса должна составлять 0,1 ТЦД/кл. Внесенную вирусную суспензию экспонируют на предварительно отмытый от остатков ростовой среды раствором Хенкса монослой в течение 1 часа при (37±0,5)°С, после чего в необходимом объеме вносят поддерживающую питательную среду ПСП. Культивирование BOO проводят в течение 12 суток при указанной температуре. При поражении вирусом площади монослоя не менее 80% (округление и появления светопреломляющего эффекта) проводят сбор вируса. Для этого содержимое клинских матрасов замораживают при температуре минус 40°С и проводят оттаивание при комнатной температуре, энергично встряхивая для отделения монослоя. Из каждого матраса берут пробу по 3 см для определения контаминирующих примесей и цитопатической активности. Полученный материал хранят при минус 20°С не более 6 месяцев. При активности BOO не ниже 5,5 lg ТЦДсм стерильный вируссодержащий материал используют для составления производственной серии ассоциированной вирусвакцины против оспы овец и оспы коз культуральной сухой.
Пример 2
Вирусный изолят, послуживший источником для получения штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК, был выделен в 2003 г. от больных оспой коз в Приморском крае Российской Федерации. Подготовку материала проводили общепринятым методом.
Биологические и вирусологические методы включали адаптацию вируса, выделенного от больных коз, к культурам первичнотрипсинизированных и перевиваемых линий клеток и его аттенуацию. Для выращивания ВОК были испытаны различные линии культур клеток: ПО, Ch-91, ПСГК, MDBK, СПЭВ, Vero, ВПК-21, Marc-145. В процессе адаптации было установлено, что перевиваемая линия клеток Ch-91 высокочувствительна к ВОК и оказалась оптимальной культурой для получения расплодки штамма для изготовления предлагаемой вирусвакцины.
В дальнейшем для получения расплодки вирусную суспензию вносили на освобожденный от ростовой среды монослой культуры клеток и экспонировали в течение часа в термостате при температуре (37±0,5)°С. После этого вносили поддерживающую среду ПСП или Игла с добавлением 1÷2% сыворотки крови КРС. Инфицированную культуру инкубировали при (37±0,5)°С до появления ЦПД вируса, которое характеризовалось округлением клеток, скоплением их в виде групп по 10÷20 клеток и в дальнейшем тотальной деструкцией монослоя клеток. При поражении площади монослоя не менее 70÷80% (округление и появление светопреломляющего эффекта, отслоение от стекла) 3-кратным промораживанием культуральных матрасов проводили сбор вируса с последующим отбором проб для исключения микробной контаминации и определения инфекционной активности вируса титрованием его в культуре клеток Ch-91.
50/
50/
50/
3
3
3
Выделенный вирус обладал цитопатическим действием на культуре клеток Ch-91 с первоначальным титром 3,0÷4,0 lg ТЦДсм. В последующих пассажах на этой же культуре клеток титр вируса повышался в 6÷7-м пассажах до 5,0÷5,5 lg ТЦДсм, в 9÷10-м пассажах до 6,0 lg ТЦДсм.
50/
50/
50/
50/
50/
3
3
В зависимости от дозы заражения, составляющей 0,01÷1,0 ТЦДкл., накопление аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК в культуре клеток Ch-91 обеспечивалось на уровне 5,33÷7,17 lg ТЦДсм за 4÷7 суток при 50÷90% поражении клеточного монослоя. Оптимальной инфицирующей дозой вируса считали 0,01÷0,05 ТЦДкл., вызывающей при стационарном культивировании в течение 5÷7 суток накопление вируса в титре от 6,67±0,08 до 7,17±0,10 lg ТЦДсм при 80÷90% поражении клеточного монослоя. Результаты исследований представлены в таблице 1. Стабильность культуральных свойств лиофилизированного вируса при определении степени его накопления в течение 35 пассажей в культуре клеток Ch-91 при заражающей дозе 0,01÷0,05 ТЦДкл. представлена на фиг.1.
50/
50/
3
Из данных, представленных на фиг.1, следует, что в процессе пассирования в условиях стационарного культивирования ВОК с дозой заражения 0,01÷0,05 ТЦДкл. его инфекционная активность 6,0÷7,5 lg ТЦДсм отмечалась в течение первых 13 пассажей. При увеличении количества пассажей инфекционная активность вируса постепенно снижалась. Результаты исследования сроков культивирования ВОК в культуре клеток Ch-91 представлены в таблице 2.
50/
Инфекционная активность штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК при дозе заражения 0,01÷0,05 ТЦДкл зависела от количества пассажей. На уровне 8÷13 пассажей продолжительность культивирования ВОК не превышала 7 дней. За это время достигалось наиболее выраженное 80÷90% ЦПД вируса и его максимальное накопление в культуре клеток Ch-91. В дальнейшем накопление вируса установлено на более низком уровне, и инфекционная активность вируса следующих пассажей характеризовалась меньшими значениями с увеличением продолжительности культивирования.
В результате осуществления 35 последовательных пассажей выделенного ВОК на культуре клеток Ch-91 был получен аттенуированный штамм «ВНИИЗЖ 2003», имеющий стабильные биотехнологические, антигенные и иммуногенные свойства, которые позволяют использовать его для получения антигенного материала при изготовлении диагностикумов и вирусвакцины против оспы коз.
В дальнейшем культуру клеток Ch-91 использовали для получения расплодки ВОК для изготовления вирусвакцины.
Полученный штамм ВОК был испытан сначала в лабораторных, а затем и в эпизоотических условиях. В результате проведенных исследований установлено следующее:
1. Проверку на стерильность осуществляли путем высева проб вируссодержащей жидкости на бактериальные питательные среды МПБ, МПА, МППБ, агар Сабуро (жидкий) и тиогликолевую среду, а также среды Эдварда или Мартена для выявления микоплазм. Бактериальные или грибковые загрязнения штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК отсутствовали, как и контаминация другими вирусами.
2. При электронной микроскопии штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК были выявлены вирусные частицы, структура и размеры которых характерны для каприпоксвирусов (фиг.2).
3. Видовая принадлежность штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК подтверждена двумя молекулярно-генетическими методами: мультиплексной ПНР с видоспецифичными праймерами (фиг.3) и рестрикционным анализом фрагмента гена «ankyrin-repeat» белка (фиг.4).
4. Специфичность штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК была подтверждена в РДП, РДСК и ИФА.
Полученный штамм депонирован в июне 2006 г. во Всероссийскую государственную коллекцию штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, ФГУ «ВГНКИ» под регистрационным номером (ссылкой) - производственный вакцинный штамм «ВНИИЗЖ 2003» - ДЕП ВОК.
Пример 3
В ходе разработки мультиплексной ПЦР для индикации и видовой дифференциации каприпоксвирусов в результате анализа полных нуклеотидных последовательностей генома каприпоксвирусов, представленных в базе данных GenBank, были установлены видоспецифичные участки для BOO, ВОК и ВБ. На основе этих данных были сконструированы видоспецифичные праймеры S1 и S2 - для BOO, G1 и G2 - для ВОК, L1 и L2 - для ВБ. Видоспецифичные праймеры были рассчитаны таким образом, чтобы синтезируемые с их участием ампликоны имели разную длину: 415 п.н. для ВОК, 311 п.н. для BOO и 254 п.н. для ВБ. Это позволило использовать все три пары праймеров в одной реакции и различать продукты мПЦР по размеру с помощью электрофореза в агарозном геле.
В ходе видовой дифференциации каприпоксвирусов было исследовано 11 проб вируссодержащих клеточных культур с вакцинным штаммом «ВНИИЗЖ» и с эпизоотическими штаммами «Афганский», «Приморский», «ЕАО» BOO, с вакцинным штаммом «ВНИИЗЖ 2003» и с эпизоотическими штаммами «Приморский 2003», «Pellor» ВОК, с ВБ, а также с изолятами «ЕАО» и «Таджикский» в виде суспензии кожи больных животных.
На фиг.3 отражены результаты ПЦР с видоспецифичными праймерами. В пробах, содержащих ДНК штамма «ВНИИЗЖ 2003», синтезировался фрагмент длиной 415 п.н., в амплификации которого участвуют видоспецифичные для ВОК праймеры.
С помощью метода рестрикционного анализа можно также дифференцировать BOO и ВОК и определять штаммовую принадлежность BOO. С использованием родоспецифических праймеров проводится амплификация участка гена «ankyrin-repeat» белка длиной 564 п.н. Затем проводится обработка амплификонов рестриктазой Dra I. В пределах амплифицируемого фрагмента генома у эпизоотических изолятов BOO расположен один сайт рестрикции Dra I, у вакцинных штаммов BOO - два сайта, у ВОК - таких сайтов нет. Анализ продуктов рестрикции в агарозном или полиакриламидном геле позволяет легко отличать BOO от ВОК и вакцинные штаммы BOO от эпизоотических изолятов по характерному набору фрагментов ДНК.
При проведении данного метода у вакцинного штамма «ВНИИЗЖ» BOO ампликон в результате обработки рестриктазой Dra I расщеплялся на три фрагмента, у всех эпизоотических изолятов BOO - на два фрагмента, а у вакцинного штамма «ВНИИЗЖ 2003» и двух эпизоотических изолятов ВОК расщепления ампликона не происходило (фиг.4).
Таким образом, при обработке эндонуклеазой Dra I фрагмента гена «akrylin-repeat» белка штамма «ВНИИЗЖ 2003» расщепления ДНК не наблюдалось, что указывает на принадлежность штамма к ВОК.
Дополнительно специфичность штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК была подтверждена и серологическими методами в РДП и РДСК. РДП и РДСК были положительными только между специфическим вирусом с гомологичной сывороткой (табл.3, табл.4).
Пример 4
50
50
3
Для получения посевного ВОК штамма «ВНИИЗЖ 2003» используют культуру клеток Ch-91 с хорошо сформировавшимся монослоем 2-3 суточного возраста в клинских матрасах и суспензию лиофилизированного или нативного ВОК штамма «ВНИИЗЖ 2003» с инфекционным титром от 5,0 до 6,0 lg ТЦД/см. Средняя инфицирующая доза вируса составляет 0,1 ТЦД/кл. Внесенную вирусную суспензию экспонируют на предварительно отмытый от остатков ростовой среды раствором Хенкса монослой в термостате в течение часа при (37±0,5)°С, затем в необходимом объеме вносят поддерживающую питательную среду ПСП. Культивирование вируса проводят в течение 12 суток при указанной температуре.
3
3
50/
При поражении вирусом площади монослоя не менее 80% (округление и появление светопреломляющего эффекта) проводят сбор вируса. Для этого содержимое клинских матрасов замораживают при температуре минус 40°С и проводят оттаивание при комнатной температуре, энергично встряхивая для отделения монослоя. Из каждого матраса берут пробу по 3 см для определения контаминирующих примесей и цитопатической активности. Полученный материал хранят при -20°С не более 6 месяцев. При активности ВОК не ниже 5,5 lg ТЦДсм стерильный вируссодержащий материал используют для составления производственной серии вирусвакцины ассоциированной против оспы овец и оспы коз культуральной сухой.
Пример 5
Для изготовления целевого препарата предварительно объединяют равные объемы антигенного материала из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ» BOO, полученного так, как описано в примере 1, и антигенного материала из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК, полученного так, как описано в примере 4. Полученную смесь тщательно перемешивают, а затем в нее вносят стабилизатор при постоянном перемешивании. В качестве стабилизатора используют защитную среду, содержащую 5% сахарозы, 1% желатозы и 3% ГЛА.
Для получения одного миллиона доз ассоциированной вирусвакцины необходимо получить 20 литров суспензии BOO и 20 литров суспензии ВОК.
Из полученного антигенного материала готовят 2 серии вирусвакцины ассоциированной против оспы овец и оспы коз культуральной сухой, отличающихся содержанием стабилизатора в препарате.
Серия №1 предлагаемой вирусвакцины содержит, мас.%:
Антигенный материал из аттенуированного штамма
«ВНИИЗЖ» BOO, полученного в культуре клеток Ch-91
с инфекционной активностью 6,0 lg ТЦД<sub>50/</sub>см<sup>3</sup>
40,0
Антигенный материал из аттенуированного штамма
«ВНИИЗЖ 2003» ВОК, полученного в культуре клеток Ch-91
с инфекционной активностью 5,5 lg ТЦД<sub>50/</sub>см<sup>3</sup>
40,0
Стабилизатор
до 100,0.
Серия №2 предлагаемой вирусвакцины содержит, мас.%:
Антигенный материал из аттенуированного штамма
«ВНИИЗЖ» BOO, полученного в культуре клеток Ch-91
с инфекционной активностью 6,0 lg ТЦД<sub>50/</sub>см<sup>3</sup>
45,0
Антигенный материал из аттенуированного штамма
«ВНИИЗЖ 2003» ВОК, полученного в культуре клеток Ch-91
с инфекционной активностью 5,5 lg ТЦД<sub>50/</sub>см<sup>3</sup>
45,0
Стабилизатор
до 100,0.
3
3
Полученную вирусвакцину фасуют в ампулы по 2,0 см или во флаконы по 2,0 или 4,0 см, замораживают при температуре минус 50°С и подвергают лиофильному высушиванию. После сублимации флаконы (ампулы) заполняют сухим стерильным воздухом или инертным газом, закрывают резиновыми пробками и закатывают металлическими колпачками, ампулы запаивают.
3
3
Вирусвакцина ассоциированная против оспы овец и оспы коз культуральная сухая, расфасованная во флаконы или ампулы, представляет собой однородную пористую массу цилиндрической формы светло-желтого цвета, растворяющуюся в течение 1÷1,5 минут в физрастворе. В одной ампуле содержится 2,0 см, а во флаконе 2,0 или 4,0 см сухой вирусвакцины, содержащей соответственно в ампуле 50 и во флаконе 50 или 100 прививных доз препарата для овец и коз.
Полученный препарат подвергают контролю на стерильность, безвредность, специфичность и иммуногенную активность в соответствии с показателями, установленными стандартом организации-изготовителя.
Пример 6
Проведены испытания инфекционной активности вирусвакцины ассоциированной против оспы овец и оспы коз культуральной сухой, изготовленной так, как описано в примере 5.
Инфекционную активность аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ» BOO и аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК в полученной вирусвакцине после лиофилизации определяют титрованием десятикратных разведении вирусной суспензии каждого штамма в культуре клеток Ch-91 во флаконах. Учет результатов проводят в течение 12 суток по наличию ЦПД. Результаты титрования 2-х серий вирусвакцины представлены в таблице 5.
50
3
Инфекционная активность вирусвакцины ассоциированной против оспы овец и оспы коз составила 5,23±0,15 lg ТЦД/см.
Результаты исследования инфекционной активности ассоциированной вирусвакцины в процессе длительного хранения представлены также в таблице 5.
50
50
3
3
При хранении в течение 36 месяцев титр вирусов оспы снижался не более чем на 0,5 lg ТЦД/см. Однако следует отметить, что хранение вирусвакцины ассоциированной в течение 2÷3 недель при комнатной температуре снижало инфекционную активность вирусов на 1,0÷1,5 lg ТЦД/см. По этой причине транспортировка вирусвакцины ассоциированной против оспы овец и оспы коз должна осуществляться при низких температурах.
Пример 7
Проведены испытания безвредности и реактогенности вирусвакцины ассоциированной против оспы овец и оспы коз культуральной сухой, изготовленной так, как описано в примере 5, и содержащей, мас.%:
Антигенный материал из аттенуированного штамма
«ВНИИЗЖ» BOO, полученного в культуре клеток Ch-91
с инфекционной активностью 6,0 lg ТЦД<sub>50/</sub>см<sup>3</sup>
40,0
Антигенный материал из аттенуированного штамма
«ВНИИЗЖ 2003» ВОК, полученного в культуре клеток Ch-91
с инфекционной активностью 5,5 lg ТЦД<sub>50/</sub>см<sup>3</sup>
40,0
Стабилизатор
до 100,0.
3
Для определения безвредности и реактогенности вирусвакцину вводили козам и овцам по 5,0 см в исходном разведении (125 прививных доз) подкожно в область бесшерстного участка внутренней поверхности передней конечности. За животными вели наблюдение в течение 21 суток.
При исследовании вирусвакцины на безвредность и реактогенность в единичных случаях у животных на месте введения вакцины в исходном разведении установлено образование на 4÷6 сутки воспалительного отека в виде небольшого тяжа размером от 1 до 3 см, который исчезал на 3÷14 сутки после появления и никак не отражался на клиническом состоянии животных. На протяжении всего срока наблюдения (21 сутки) температура тела овец и коз оставалась в пределах физиологической нормы. Это позволило заключить, что вирусвакцина ассоциированная против оспы овец и оспы коз культуральная сухая является безвредным и нереактогенным препаратом.
Пример 8
Проведены испытания антигенной активности вирусвакцины ассоциированной против оспы овец и оспы коз культуральной сухой, изготовленной так, как описано в примере 5, и содержащей, мас.%:
Антигенный материал из аттенуированного штамма
«ВНИИЗЖ» BOO, полученного в культуре клеток Ch-91
с инфекционной активностью 6,0 lg ТЦД<sub>50/</sub>см<sup>3</sup>
45,0
Антигенный материал из аттенуированного штамма
«ВНИИЗЖ 2003» ВОК, полученного в культуре клеток Ch-91
с инфекционной активностью 5,5 lg ТЦД<sub>50/</sub>см<sup>3</sup>
45,0
Стабилизатор
до 100,0.
Антигенную и иммуногенную активность вирусвакцины ассоциированной против оспы овец и оспы коз культуральной сухой определяли на овцах и козах.
3
Вирусвакцину во флаконах разводили питательной средой в исходном объеме, из которого затем готовили разведения 1:25, 1:1000 и 1:10000 и вводили животным в объеме по 1,0 см подкожно в подмышечной области. Использовали по 6 голов каждого вида животных на разведение 1:25 и по 2 головы на разведения 1:1000 и 1:10000. Для контроля использовали по 6 голов каждого вида животных.
Через 7, 14 и 21 сутки после вакцинации у животных отбирали пробы крови с целью получения сыворотки.
50/
3
Сыворотки крови животных исследовали на наличие антител против оспы в РН с BOO и ВОК с постоянной дозой каждого вируса 100 ТЦДсм против ряда последовательных двукратных разведении сывороток от 1:2 до 1:32.
При наблюдении за животными после вакцинации установлено, что все овцы и козы были клинически здоровы, температура тела оставалась в норме, местной реакции не выявлено.
2
В сыворотках крови овец и коз, иммунизированных вирусвакциной ассоциированной против оспы овец и оспы коз, через 21 сутки после вакцинации специфические вируснейтрализующие антитела (ВНА) выявляли на уровне от 0,25 до 3,17 log.
4
50
2
2
2
50
2
50
2
У всех животных, которым вводили вирусвакцину ассоциированную против оспы овец и оспы коз в разведении 1:25 (10 ТЦД), отмечали появление ВНА уже на 7-е сутки после вакцинации на уровне от 0,5 до 1,83 log, на 14-е сутки титры антител у этих животных составляли 1,0÷2,23 log, на 21-е сутки - 1,0÷3,17 log. У животных, привитых в дозе 10 ТЦД, антитела на 7-е сутки не выявляли, а на 21-е сутки титры антител составляли 0,25÷1,16 log, у животных, привитых в дозе 100 ТЦД, уровень антител на 21-е сутки после вакцинации составил 0,5÷1,66 log. Результаты исследований представлены в таблицах 6 и 7.
Следует отметить, что при постановке РН с BOO титр антител у овец был выше, чем с ВОК. А у коз при постановке РН с ВОК титры антител были выше, чем с BOO.
50
50
Через 21 сутки после иммунизации вакцинированных и контрольных овец заражали внутрикожно в области подхвостовой складки вирулентным BOO, штамм «Афганский», в дозе по 1000 ИД. Вакцинированных и контрольных коз заражали аналогично вирулентным ВОК, штамм «Приморский 2003», в дозе по 1000 ИД. В течение 14 суток после заражения за вакцинированными и контрольными животными вели наблюдение, измеряли температуру тела. При осмотре животных после заражения было установлено, что овцы и козы, иммунизированные вирусвакциной ассоциированной в разведении 1:25, оставались клинически здоровыми, повышения температуры тела и местной реакции на введение вируса не отмечали.
Козы, которым вводили вирусвакцину ассоциированную в разведении 1:1000 и 1:10000, также оставались устойчивыми к контрольному заражению вирулентным вирусом без проявления местной реакции и повышения температуры тела. У овец №8 и №10, вакцинированных разведениями 1:1000 и 1:10000 соответственно, после заражения отмечали повышение температуры тела до 40,7°С и появление гиперемии и отека на месте введения вирулентного вируса в течение всего срока наблюдения. У овцы №7, вакцинированной разведением 1:1000, температура тела повышалась до 40,5°С, которая затем приходила в норму к концу срока наблюдения. Появление характерных поражений кожи на других участках тела у этих животных не выявлено. Результаты исследований представлены в таблицах 8 и 9.
Все контрольные овцы и козы болели с характерными признаками оспы. Проявление местной реакции (гипертермии и отека) отмечали на 3÷4 сутки после заражения, появление папул на бесшерстных участках тела - на 5÷10 сутки, опухание головы и суставов у некоторых животных - на 11÷14 сутки. Болезнь всегда заканчивалась летально в период с 7-х по 14-е сутки после введения вирулентного ВОК или BOO.
Таким образом, проведенные испытания вирусвакцины ассоциированной против оспы овец и оспы коз культуральной сухой показали, что данная вирусвакцина стерильна, специфична, обладает высокой иммуногенной активностью, безвредна для овец и коз, предохраняет всех привитых животных от заболевания оспой, а также не реверсибельна. Предлагаемая вирусвакцина может быть рекомендована для профилактической иммунизации овец и коз против оспы.
Источники информации
1. http://www.virustaxonomyonline.com
2. Kitching R.P. The control of sheep and goats pox // Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz. - 1986. - V.5, №2. - P.503-511.
3. Gershon P.O., Black D.N. A comparison of the genomes of capripoxvirus isolates of sheeps, goats and cattle // Virology. - 1988. - V.164. - P.341-349.
4. Fassi-Fehri M. et al. Etnde experimentale de l'immunite anticlaveleuse post-vaccinale // M.Fassi-Fehri, M.El-Harrak, D.Johnson // Ann. Rech. Vet. - 1984. - Vol.15. №1. - Р.59-64.
5. Sharma P.C. et al. Immunological response of RM/65 sheep-pox vaccine in lambs // P.C.Sharma, S.Prasad, S.K.Karla // Indian J. Anim. Sci. - 1987. - Vol.57. №9. - P.923-928.
6. Singh J.P. et al. Comparative evaluation of sheep-pox vaccines // Indian J. Anim. Sci. - 1984. - Vol.54. №7. - P.650-653.
7. Das S.K. et al. Indian J. Exp. Biol., 1986, 24, 6.
8. Karla S.K. et al. Indian J. Anim. Sci., 1984, 54, 5.
9. Лихачев Н.В. Аттенуированный штамм вируса оспы овец // Тез. докл. научн. конф. / ВГНКИ. - M., 1974. - C.1-2.
10. Иванющенков В.Н. и соавт. Реактогенные и иммуногенные свойства вирусвакцины против оспы овец // Ветеринария. - 1990, №7. - С.28-30.
11. Пат. РФ №1614201; A61K 39/275, 20.03.1995 г.
12. Пат. РФ №2121366; A61K 39/275, C12N 7/00, 5/00, 5/02; 10.11.1998 г.
13. Пат. РФ №2138291; A61K 39/275, C12N 5/00, 7/00; 27.09.1999 г.
14. Joshi R.K. Physico-chemical characterization of «Durg» isolate of goat pox virus // Indian Vet. J. - 2001. - Vol.78. №5. - P.369-370.
15. Wang Shaohua et al. The pathomorphological studies on immunological effect of attenuated goat pox cellular virus // Acta Vet. Zootechn. Sinica. - 1988. - Vol.19. №2. - P.111-116.
th
16. Kitching R.P., Carn V.M. Sheep pox and goat pox // OIE Manual of standarts for diagnostic test and vaccines; 4 edn. - Paris: World organization for animal health.2000. - P.168-177.
17. Tulman E.R. et al. The genomes of pox and goat pox viruses // J. of Virol. - 2000. - V.76. №12. - Р.6054-6061.
18. Грачев Д.В. Иммунобиологические свойства вируса оспы коз, выделенного в Республике Таджикистан // Автореф. дисс. на соискание уч. степ. канд. вет. наук. - Покров, 2006. - 26 с.
19. Пат. РФ №2181296; А61К 39/07, А61К 39/275; 20.04.2002 г.
Таблица 1
Влияние дозы заражения на репродукцию вируса оспы коз штамма «ВНИИЗЖ 2003» в культуре клеток Ch-91
Доза (ТЦД<sub>50</sub>/кл)
Период культивирования (сут.)
Площадь поражения монослоя клеток (%)
Титр вируса (lg ТЦД<sub>50/</sub>см<sup>3</sup>)
0,01
6÷7
80÷90
7,17±0,10
0,05
5÷6
80÷90
6,67±0,08
0,1
5÷6
60÷70
6,17±0,72
1
4÷5
50÷60
5,33±0,17
Таблица 2
Биологическая активность штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК в культуре клеток Ch-91 в зависимости от количества пассажей и сроков культивирования в стационарных условиях
№ пассажа
Титр вируса (lg ТЦД<sub>50</sub>/см<sup>3</sup>) при дозе заражения 0,01-0,05 ТЦД<sub>50</sub>/кл/
Дни культивирования
1
2
4
5
6
8
8
2,50±0,25
3,25±0,23
4,75±0,25
5,25±0,13
6,75±0,16
6,33±0,23
9
3,00±0,11
4,00±0,22
5,50±0,25
6,00±0,28
6,66±0,15
6,25±0,61
10
2,33±0,13
2,59±0,18
3,50±0,40
5,55±0,34
6,55±0,25
6,00±0,23
13
2,00±0,31
2,33±0,13
3,75±0,41
4,25±0,28
6,00±0,31
5,50±0,25
14
1,50±0,31
2,03±0,28
3,03±0,30
4,25±0,43
5,33±0,14
5,77±0,20
19
1,00±0,12
1,51±0,35
2,50±0,24
3,51±0,45
4,50±0,26
5,00±0,25
Таблица 4
Дифференцирование вирусов оспы овец и оспы коз в РДСК
Наименование материала
Активность в РДСК
SS ВОК
SS BOO
органо-тканевая суспензия ВОК, штамм «ВНИИЗЖ 2003»
1:30÷1:240
1:10
концентрированный антиген ВОК
1:60÷1:320
1:10
органо-тканевая суспензия BOO, штамм «ВНИИЗЖ»
не специф.
1:40
Концентрированный антиген BOO
не специф.
1:40
Таблица 5
Инфекционная активность вирусвакцины ассоциированной против оспы овец и оспы коз культуральной сухой в процессе хранения
Номер серии вакцины
Титр вируса, lg ТЦД<sub>50/</sub>см<sup>3</sup>
исходный
через
12 мес
24 мес
36 мес
1
5,41±0,09
5,26±0,16
5,12±0,17
4,92±0,14
2
5,23±0,15
5,11±0,09
5,00±0,21
4,83±0,14
Таблица 6
Антигенная и иммуногенная активность вирусвакцины ассоциированной против оспы овец и оспы коз культуральной сухой у овец
№№ жив-ных
Разведение вакцины
Титр антител в РН, (log<sub>2</sub>, сут)
Результат заражения вирусом оспы овец
7
14
21
BOO
BOK
BOO
BOK
BOO
BOK
заболело
пало
1
1:25
1,83
1,0
1,5
1,5
1,66
1,66
-
-
2
1:25
1,5
1,0
1,66
1,66
1,83
1,66
-
-
3
1:25
1,66
1,33
1,83
1,83
1,5
1,66
-
-
4
1:25
1,5
1,0
1,83
1,83
2,0
1,83
-
-
5
1:25
1,0
1,0
1,5
1,5
2,0
1,83
-
-
6
1:25
1,83
1,83
2,0
1,83
2,48
2,0
-
-
7
1:1000
0
0
0,5
0,25
1,25
0,5
+
-
8
1:1000
0
0
0,5
0,25
0,75
0,5
+
-
9
1:10000
0
0
0,5
0
1,0
0,5
-
-
10
1:10000
0
0
0,25
0
0,5
0,25
+
-
11
контроль
0
+
+
12
0
+
+
13
0
+
+
14
0
+
+
15
0
+
+
16
0
+
+
Таблица 7
Антигенная и иммуногенная активность вирусвакцины ассоциированной против оспы овец и оспы коз культуральной сухой у коз
№№ жив-ных
Разведение вакцины
Титр антител в РН, (log<sub>2</sub>, сут)
Результат заражения вирусом оспы овец
7
14
21
BOO
BOK
BOO
BOK
BOO
BOK
заболело
пало
1
1:25
0,5
0,75
1,0
1,33
1,0
1,83
-
-
2
1:25
0,75
1,0
1,25
1,75
1,5
2,25
-
-
3
1:25
0,5
1,0
1,0
1,25
1,25
2,0
-
-
4
1:25
0,5
0,75
1,0
1,66
1,33
2,0
-
-
5
1:25
1,0
1,66
1,5
2,23
1,66
3,17
-
-
6
1:25
1,5
1,5
1,66
2,23
1,83
2,76
-
-
7
1:1000
0,25
0,5
0,25
1,0
0,5
1,5
-
-
8
1:1000
0,25
0,5
0,5
1,0
0,75
1,66
-
-
9
1:10000
0
0,25
0,25
0,5
0,25
1,0
-
-
10
1:10000
0
0,25
0,25
0,75
0,25
1,16
+
-
11
контроль
0
+
+
12
0
+
+
13
0
+
+
14
0
+
+
15
0
+
+
16
0
+
+
Таблица 8
Температурная реакция у вакцинированных и контрольных овец на введение вирулентного вируса оспы
№№ животных
Доза вакцины
Сут наблюдения
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
1
1:25
39,1
39,0
39,2
39,3
39,5
39,2
39,5
39,1
39,0
39,0
38,8
39,5
39,4
39,0
2
1:25
39,0
38,5
39,1
40,0
40,0
39,8
39,5
39,4
39,6
38,7
38,6
38,9
39,1
39,2
3
1:25
38,5
38,4
38,7
39,5
39,5
39,6
39,5
39,4
38,7
38,6
39,0
39,1
38,9
39,1
4
1:25
39,5
39,5
39,4
39,5
39,3
39,5
39,0
39,1
38,9
39,5
39,1
39,4
39,5
39,0
5
1:25
39,4
39,8
39,6
39,5
38,9
40,0
39,3
39,0
39,2
39,7
39,5
39,8
40,0
40,0
6
1:25
38,9
39,4
39,0
39,1
39,2
39,3
39,5
39,5
39,3
39,4
39,4
39,5
39,6
39,6
7
1:1000
39,4
38,8
40,5
39,7
40,0
40,0
40,2
40,0
39,9
39,9
39,8
39,5
39,0
39,1
8
1:1000
39,0
39,4
39,0
40,7
40,6
40,4
40,6
40,5
40,5
40,4
40,5
40,5
40,6
40,0
9
1:10000
39,1
39,0
39,5
39,5
39,6
39,8
39,7
39,4
39,1
39,3
39,0
39,0
39,5
39,4
10
1:10000
38,7
39,1
38,9
40,2
40,5
40,7
40,5
40,4
40,3
40,2
40,1
40,3
40,5
40,0
11
контроль
39,7
39,5
39,6
40,2
40,6
40,7
40,5
40,4
40,0
39,3
39,0
пала
-
-
12
контроль
39,8
39,3
39,8
40,7
41,8
41,6
41,0
41,0
40,8
39,5
пала
-
-
-
13
контроль
39,6
39,2
39,0
39,0
39,0
41,0
40,7
40,4
40,4
40,4
40,2
37,5
пала
-
14
контроль
39,8
39,8
39,6
39,8
39,8
41,1
41,2
41,4
40,7
40,6
пала
-
-
-
15
контроль
38,9
38,7
40,2
40,5
40,7
40,8
41,0
40,4
39,5
пала
-
-
-
-
16
контроль
39,5
39,3
40,0
40,8
41,0
40,5
39,7
пала
-
-
-
-
-
-
Таблица 9
Температурная реакция у вакцинированных и контрольных коз на введение вирулентного вируса оспы
№№ животных
Доза вакцины
Сут наблюдения
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
1
1:25
39,3
39,0
38,9
39,1
39,0
39,3
39,5
39,2
39,0
38,7
38,9
39,4
39,0
39,4
2
1:25
39,5
39,3
39,1
39,5
39,0
39,4
39,2
39,6
39,4
39,1
39,0
39,2
38,9
39,0
3
1:25
39,1
39,5
39,4
39,0
38,5
39,1
39,4
39,0
39,0
39,3
39,5
38,9
39,3
39,0
4
1:25
39,0
38,9
39,0
39,3
39,7
39,5
39,0
38,9
39,2
38,7
39,3
38,5
39,0
39,1
5
1:25
39,4
39,2
39,2
39,2
39,3
39,2
39,0
39,0
39,1
39,0
39,3
39,1
38,7
39,0
6
1:25
39,2
39,0
39,1
39,0
39,5
38,9
39,2
39,1
39,3
38,5
39,6
39,5
39,1
38,9
7
1:1000
39,2
39,6
39,0
38,8
39,2
39,0
39,5
39,4
38,9
38,5
38,5
38,9
39,4
39,2
8
1:1000
39,4
39,4
38,7
39,4
39,1
38,9
39,3
38,8
38,7
39,0
38,6
38,9
39,0
39,5
9
1:10000
39,6
38,9
39,1
39,0
38,9
38,5
38,8
39,0
38,9
39,4
38,9
39,0
38,6
39,1
10
1:10000
38,8
39,2
38,6
39,1
39,0
38,9
39,5
39,3
38,9
39,3
39,5
39,2
38,7
39,2
11
контроль
38,7
39,0
39,4
39,3
39,5
39,9
39,9
39,4
пала
-
-
-
-
-
12
контроль
39,8
39,9
40,8
41,6
41,5
40,3
пала
-
-
-
-
-
-
-
13
контроль
39,7
39,6
39,1
39,6
39,5
39,3
40,0
40,6
38,5
пала
-
-
-
-
14
контроль
39,5
39,0
39,1
39,0
39,2
39,0
40,5
40,8
40,4
39,5
пала
-
-
-
15
контроль
39,0
39,2
38,5
39,0
40,6
40,0
39,4
38,8
пала
-
-
-
-
-
16
контроль
39,1
39,8
39,2
39,9
40,2
40,6
41,2
41,0
40,9
41,0
40,6
40,3
40,5
пала