Экспансия hk лимфоцитов in vitro для использования в терапии пациентов с острыми лейкозами

28

Новости клеточных технологий

ванными клинические испытания, представленные в данной работе. В то же время, в клинической части работы смущает маленькая выборка (всего 14 пациентов, из них только 7 инфицированы НСУ). В связи с этим получаются практически равные группы в случае определения вирусной РНК через 4 нед. после трансплантации печени (4 пациента не имеют РНК НСУ в достаточном для опре-

деления количестве, 3 имеют) и в случае оценки реакции на АИТ в отдаленной перспективе (2 пациента не отвечали на иммунотерапию, 3 отвечали умерено и 2 не имели определяемого уровня РНК НСУ в крови). Таким образом, работа смотрелась бы более целостно без раздела, посвященного клиническим испытаниям, которые, к тому же, в настоящий момент не завершены.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Welch C.S. A Note on transplantation of the whole liver in dogs. Transplant. Transplant Bull. 1955; 2: 54.

2. Starzl T.E., Marchioro T.L., Vonkaulla K.N. et al. Homotransplantation of the liver in humas. Surg. Gynecol. Obstet. 1963; 117: 659—76.

3. Starzl T.E., Klintmalm G.B., Porter K.A., Iwatsuki S., Schroeter G.P. Liver transplantation with use of cyclosporin a and prednisone. N. Engl. J. Med. 1981; 305(51: 266-9.

4. Ермолов A.C., Чжао A.B., Мусселиус С.Г. и др. Первый опыт трансплантации печени в НИИ скорой помощи им. Н.В. Склифосовского. Рос. журн. гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии 2DD2; 1: 38-46.

5. Андрейцева О.И.. Возможности ортотопической трансплантации печени при лечении больных с терминальными поражениями печени. Consilium medicum 2DD4; D6: 414—21.

6. Jain A., Reyes J., Kashyap R. et al. Long-term survival after liver transplantation in 4000 consecutive patients at a single center. Ann. Surg. 2000; 232; 490-500.

7. Borel J.F., Feurer C., Gubler H.U., Stahelin H. Biological effect of cyclosporine A: new antilymphocytic agent. Agents Actions 1976; 6: 468-75.

8. Brown R.S. Hepatitis С and liver transplantation. Nature 2005; 436: 973-8.

9. Mazzaferro V., Regalia E., Doci R. et al. Liver transplantation for the treatment of small hepatocellular carcinomas in patients with cirrhosis. N. Engl. J. Med. 1996; 334: 693-9.

10. Шерлок LU., Дули Дж. Заболевания печени и желчных путей: Практическое руководство; пер. с англ. Под ред. Апросиной З.Г., Мухина

Н.А. Москва: ГЗОТАР-МЕД; 2002.

11. First human gets new antibody aimed at hepatitis С virus Phase 1 clinical trial in healthy subjects designed to advance novel treatment to prevent. University of Massachusetts Medical School press release. August 6, 2009.

12. Garcia-Retortillo М., FornsX., Feliu A. et al. Hepatitis С virus kinetics during and immediately after liver transplantation. Hepatology 2002; 35: 680-7.

13. Doherty D. G., Norris S., Madrigal-Estebas L. et al. The human liver contains multiple populations of NK cells, T cells, and CD3 1 CD56 1 natural T cells with distinct cytotoxic activities and Th1, Th2, and ThO cytokine secretion patterns. J. Immunol. 2002; 163: 2314—21.

14. Ishiyama K., Ohdan H., Ohira M. et al. Difference in cytotoxicity against hepatocellular carcinoma between liver and periphery natural killer cells in humans. Hepatology 2006; 43: 362—72.

15. Tateno C., Yoshizane Y., Saito N. et al. Near completely humanized liver in mice shows human-type metabolic responses to drugs. Am. J. Pathol. 2004; 165: 901-12.

Подготовил MA, Реутин

По материалам: Ohira М„ Ishiyama КTanaka Y. Adoptive immunotherapy with liver allograft-derived lymphocytes induces anthHCV activity after liver transplantation in humans and humanized mice, J, Clin, Invest, 2009; 119: 3226-35

Экспансия НК лимфоцитов in vitro для использования в терапии пациентов с острыми лейкозами

Достижения клеточных технологий на сегодняшний день нашли свое клиническое применение главным образом в лечении пациентов со злокачественными гематологическими заболеваниями, где трансплантация красного костного мозга или гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) после протоколов химиотерапии и облучения является неотъемлемой частью терапии [1, 2]. Трансплантация НЬА-совместимого клеточного материала зачастую неосуществима из-за отсутствия подходящих доноров, в связи, с чем возникает проблема пожизненной иммуносупрессии для нивелирования реакции «трансплантат против хозяина», что ведет, в свою очередь, к возможности развития двух основных причин смерти пациентов: инфекционным осложнениям и рецидиву лейкоза [2]. Если профилактические мероприятия, направленные на снижение риска активации оппортунистических инфекций, многочисленны и разнообразны (ограничительные меры: диета, минимизация контактов с источниками инфекции; использование противомикроб-ных препаратов, введение лимфоцитов в различных вариантах), то предупреждение рецидивов лейкозов является наиболее проблемным вопросом. Подтверждением этого является высокая частота рецидивов — от 20 до 60% в зависимости от вида лейкоза и стадии процесса [3].

Онкологическая настороженность в посттрансплан-тационном периоде побуждает к активному поиску и совершенствованию методов предупреждения рецидивов злокачественных гематологических заболеваний. Предложены протоколы профилактического использования химиопрепаратов, однако ни один из них не является оптимальным.

Одним из перспективных направлений является использование противоопухолевых потенций натуральных киллеров (НК-лимфоцитов), реализующихся без предшествующей сенситизации организма через идентификацию и устранение клеток-мишеней с измененной или отсутствующей экспрессией молекул главного комплекса гистосовместимости I, к которым относятся трансформированные клетки [4].Теоретически, необходимый клеточный материал может быть получен непосредственно от донора или «наработан» in vivo из ГСК. Рядом авторов уже опубликованы положительные результаты экспериментов на мышиных моделях, отмечающие снижение частоты рецидивов лейкозов без увеличения риска развития реакции «трансплантат против хозяина» [5, 6], однако прецедентов клинических исследований с применением культивированных in vitro НК-лимфоцитов для предупреждения рецидивов лейкозов до настоящего времени не было.

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, ІУ» 1, 2010

Новости клеточных технологий

29

В этой связи представляют интерес результаты работы S.R. Yoon и соавт., впервые определяющей выполнимость экспансии НК-лимфоцитов в условиях in vitro из CD34+ предшественников с целью дальнейшего использования для достижения устойчивой ремиссии лейкозов у пациентов, перенесших трансплантацию HLA-несовместимых ГСК.

Для работы были отобраны 18 пациентов (16 с острым лейкозом и 2 с миелодиспластическим синдромом), для которых оказалось невозможным найти HLA-co-вместимых доноров, однако по ряду причин (смерть одного пациента из-за быстрой прогрессии заболевания, сложности в процессе получения культуры НК-лимфоцитов in vitro) четыре пациента не приняли участие в исследовании. Всем пациентам (возраст от 23 до 65 лет) была выполнена трансплантация ГСК с осуществлением в предоперационном периоде протоколов химиотерапии, рассчитанных специально для случаев введения HLA-несовместимого клеточного материала. В раннем посттрансплантационном периоде пациентам для профилактики реакции «трансплантат против хозяина» назначались циклоспорин и короткий курс метотрексата.

Получение НК-лимфоцитов осуществлялось из CD34+ предшественников, выделенных из крови доноров и культивированных первые три недели в среде, содержащей фактор стволовых клеток человека (human stem cell factor), лиганд fms-связанной тирозинкиназы-3 человека (human fms-related tyrosine kinase 3 ligand), человеческий интерлейкин-7 и гидрокортизон, а в последующие 21 сут. в среде с человеческими интерлейкинами-15 и 21 и гидрокортизоном. Иммунофенотипическое обоснование принадлежности полученной культуры к НК-лим-фоцитам выполнялось на основе определения основных маркеров — CD122, CD56, KIR (иммуноглобулиноподобный рецептор киллеров (killer immunoglobulin-like receptor)) в сочетании с отрицательной экспрессией CD3. Кроме того, авторы доказали цитотоксичность культуры НК-лимфоци-тов в опыте с коинкубированием их с трансформированными клетками линии К562, мечеными радиоизотопом хрома (Сг51). Также была установлена экспрессия генов перфорина и гранзима, характерных для НК-лимфоцитов.

Введение клеточной культуры осуществлялось при отсутствии острой реакции «трансплантат против хозяина», активных инфекционных процессов, нарушений функции печени, почек и сердца между 43 и 50 сут. после

6-7

Дни Д-V Д-6 Д-ь Д-4 д-3 А-'2 Д-1 ДО Д1 Д^ ДЗ Д4 Д / ” Д12 ” неделя -

Схема протокола лечения больных с онкогематологическими заболеваниями, использованного в исследовании:

BU - бусульфан; FLU - флюдарабин; ATG - антитимоцитарный иммуноглобулин; CSA - циклоспорин; МТХ - метотрексат; MNCs - мононуклеарная фракция клеток крови; G-CSF - гранулоцитарный колониестимулирующий фактор

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, 1У< 1, 2010

30

Новости клеточных технологий

трансплантации ГСК в 5% растворе альбумина, и не вызывало острых побочных эффектов в виде лихорадки, головной боли, тошноты, рвоты, гипотензии. В двух случаях исследователи были вынуждены вводить НК-лимфоциты пациентам с рецидивом острого лейкоза, остальным — в фазе ремиссии.

Средняя выживаемость после трансплантации ГСК составила 18,7 мес. У одного пациента развилась острая (на седьмой день после введения НК-лимфоцитов), у четырех — хроническая реакция «трансплантат против хозяина» (в среднем между 14 и 68 днем после инфузии НК-лимфоцитов), однако авторы отмечают невозможность установления однозначной причины — введение ГСК или НК-лимфоцитов от НЬА-несовместимых доноров. Важно, что в двух случаях, когда исследователи были вынуждены трансплантировать НК-лимфоциты в активной стадии лейкоза, антиопухолевого эффекта не наблюдалось, что, возможно, связано со значительным преобладанием трансформированных клеток по отношению к введенным.

Авторы в своей работе не указали причины смерти пациентов, тем самым оставив без оценки эффективность введения НК-лимфоцитов для предупреждения рецидивов лейкозов, что, на первый взгляд, было бы вполне реализуемо в условиях данного клинического исследования. Основной акцент был сделан на доказательстве выполнимости экспансии НК-лимфоцитов in vitro из CD34+ предшественников и возможности их дальнейшего использования в терапии пациентов, перенесших трансплантацию HLA-несовместимых ГСК, без индукции острой реакции «трансплантат против хозяина». Положительные результаты работы позволили авторам сформулировать направления дальнейших исследований, касающихся определения максимально возможной «дозы» НК-лимфоцитов, которую можно трансплантировать в организм реципиентов без серьезных побочных эффектов, а также определения эффективности их применения для предупреждения рецидивов лейкозов.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Carella М.А., Lerma Е., Dejana A. Engraftment of HLA-matched sibling hematopoietic stem cells after immunosuppressive conditioning regimen in patients with hematologic neoplasias. Haematologica 1998; 83: 904—9.

2. Ljungman P., Urbano-lspizua A., Cavazzana-Calvo M. et al. Allogeneic and autologous transplantation for haematological diseases, solid tumours and immune disorders: definitions and current practice in Europe. Bone Marrow Transplantation 2006; 37: 439—49.

3. Kumar L. Leukemia: management of relapse after allogeneic bone marrow transplantation. J. Clin. Oncol. 1994; 12C8]: 1710—7.

4. Verheyden S., Demanet C. NK cell receptors and their ligands in leukemia. Leukemia 2008; 22: 249-57.

5. Ruggeri L., Capanni M., Urbani E. et al. Effectiveness of donor natural killer cell alloreactivity in mismatched hematopoietic transplants. Science 2002; 295: 2097-100.

6. Lundqvist A., Philip McCoy J., Samsel L., Childs R. Reduction of GVHD and enhanced antitumor effects after adoptive infusion of alloreactive Ly49-mismatched NK cells from MHC-matched donors. Blood 2007; 109: 3603-6.

Подготовил И.Я. Базо

По материалам: Yoon S.R., Lee Y.S., Yang S.H, et al. Generation of donor natural killer cells from С034ю progenitor cells and

subsequent infusion after HLA-mismatched allogeneic hematopoietic cell transplantation: a feasibility study. Bone Marrow Transplant, Published online 2 November 2009

Успешное применение генной терапии для лечения Х-сцепленной формы адренолейкодистрофии

Наследственная Х-сцепленная форма адренолейкодистрофии (АЛД) представляет собой фатальное де-миелинизирующее заболевание центральной нервной системы (ЦНС), причиной которого являются мутации в гене АВС01, кодирующем белок-транспортер АШР, локализованный в мембранах пероксисом [1 ]. В пероксисо-мах олигодендроцитов и клеток микроглии этот белок участвует в транспорте эфиров длинноцепочечных жирных кислот (ДЦЖК; более 22 атомов углерода в алифатическом «хвосте»), что необходимо для миелинизации нервных волокон [2]. В результате мутации развивается мультифокальный демиелинизирующий процесс, который приводит к гибели больного, как правило, еще в подростковом возрасте.

Единственным способом излечить это врожденное заболевание является аллогенная трансплантация ге-мопоэтических клеток. Успех подобной терапии может быть достигнут только на ранних стадиях болезни и при наличии подходящего донора [3]. Поскольку микрогли-альные клетки имеют миелоидное происхождение, полагают, что замещение мутантных гемопоэтических

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, 1У» 1, 2010

стволовых клеток и клеток-предшественников реципиента «здоровыми» клетками донора позволяет в итоге восстановить процесс миелинизации нервных волокон в ЦНС. Действительно, было показано, что костномозговые клетки человека, трансплантированные мышам, мигрируют в головной мозг и дифференцируются в мик-роглиальные клетки, экспрессирующие ALDP [4].

Долгосрочные результаты клинического испытания по применению трансплантации генетически «исправленных» аутологичных гемопоэтических стволовых клеток (ГСК), проведенной двум пациентам с АЛД, были опубликованы в журнале «Science». Несомненно, эта работа стала кульминацией продолжительных исследований д-ра Натали Картье (Nathalie Cartier; INSERM) и проф. педиатрии Патрика Збера (Patrick Aubourg; INSERM и госпиталь Сент-Винсент де Поля) [5]. У обоих пациентов (возраст 7,5 и 7 лет) были обнаружены мутации в гене ABCD1. Несмотря на прогрессирующую демиелинизацию и недостаточность функции надпочечников, отсутствие совместимого донора не давало возможности провести аллогенную трансплантацию.