СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ ЗЕЛЕНЫХ МИКРОВОДОРОСЛЕЙ, ОБОГАЩЕННОЙ ЖИРНЫМИ КИСЛОТАМИ
METHOD FOR OBTAINING BIOMASS OF GREEN MICROALGAE, ENRICHED WITH FATTY ACIDS

Предлагаемое изобретение относится к фотобиотехнологии, микробиологии и отраслям, использующим возобновляемые энергоресурсы.
2
Производство энергоносителей с использованием микроводорослей-гиперпродуцентов липидов - новый перспективный подход к получению энергии из возобновляемых альтернативных источников (Singh A., P.S. Nigam, and J.D. Murphy. Renewable fuels from algae: An answer to debatable land based fuels. Bioresource Technology, 2011. 102(1): p.10-16; Lee D.H., Algal biodiesel economy and competition among bio-fuels. Bioresource Technology, 2011. 102(1): p.43-49; Scott E.L., A.M.J. Kootstra, and J.P.M. Sanders, Perspectives on Bioenergy and Biofuels, in Sustainable Biotechnology, 2010. p.179-194). В США, Израиле, Австралии и на Украине ведутся поисковые работы по созданию высокопродуктивных в этом отношении штаммов водорослей и разработке установок для их культивирования, число исследовательских работ по получению дизельного топлива из биомассы микроводорослей, обогащенной липидами, в последние годы увеличивается экспоненциально. Известны виды микроводорослей, содержащие в среднем более 20% жирных кислот (ЖК) в расчете на сухой вес биомассы (Lee D.H., Algal biodiesel economy and competition among bio-fuels. Bioresource Technology, 2011. 102(1): p.43-49; Gatenby С.М., et al., Biochemical composition of three algal species proposed as food for captive freshwater mussels. Journal of Applied Phycology, 2003. 15(1): p.1-11; Ge Y., J. Liu, et al. Growth characteristics of Botryococcus braunii 765 under high CO concentration in photobioreactor. Bioresource Technology, 2011. 102(1): p.130-134; Pan Y.Y., et al., Isolation of Thermo-Tolerant and High Lipid Content Green Microalgae: Oil Accumulation Is Predominantly Controlled by Photosystem Efficiency During Stress Treatments in Desmodesmus. Bioresource Technology, 2011. 102(22): p.10510-10517). Подобрав оптимальные условия (световой режим, состав среды, температура, состав перерабатываемого газа и др.) культивирования, можно дополнительно увеличить этот параметр.
В литературе упоминаются виды микроводорослей - потенциальные гиперпродуценты липидов, но для полной реализации их биосинтетического потенциала необходимо найти оптимальные условия их культивирования, обеспечивающие максимальный выход требуемых веществ. Определение условий, оптимальных для биосинтеза липидов водорослями, а также выбор новых продуцентов, позволят увеличить экономичность предлагаемых способов получения биомассы, обогащенной жирными кислотами. Поскольку сведения по этим вопросам редко встречаются в литературе и зачастую бывают противоречивыми, поиски среди микроводорослей эффективных продуцентов липидов и оптимального способа их культивирования являются весьма актуальными.
2
Среди известных в настоящее время способов получения обогащенных жирными кислотами биомассы следует отметить культивирование микроводорослей Neochloris oleoabundans и Bracteacoccus grandis как корма для содержащихся в неволе мидий. В данном аналоге при аэрации смесью атмосферного воздуха и СО (1,5%) удалось достичь накопления жирных кислот в количестве 22-25% от сухого веса биомассы, что было пределом накопления в данном аналоге (Gatenby, С.М., et al., Biochemical composition of three algal species proposed as food for captive freshwater mussels. Journal of Applied Phycology, 2003. 15(1): p.1-11).
2
2
При культивировании микроводоросли Botryococcus braunii шт 765 удается получить биомассу, содержащую до 12% общих липидов и 8% жирных кислот, при этом продуктивность по жирным кислотам составляет 0,08 г/л за 15 суток культивирования при барботировании газовой смесью с содержанием в ней 20% СО (Ge, Y., J. Liu, et al. Growth characteristics of Botryococcus braunii 765 under high CO concentration in photobioreactor. Bioresource Technology, 2011. 102(1): p.130-134).
Ранее разработанные способы культивирования микроводорослей рода Desmodesmus при высокой (28°C) температуре (Pan Y.Y., et al., Isolation of Thermo-Tolerant and High Lipid Content Green Microalgae: Oil Accumulation Is Predominantly Controlled by Photosystem Efficiency During Stress Treatments in Desmodesmus. Bioresource Technology, 2011. 102(22): p.10510-10517) обеспечивают получение биомассы, содержащей до 15-20% жирных кислот.
-2
-1
Наиболее близким аналогом предлагаемого изобретения (прототипом) является способ получения биомассы зеленой микроводоросли Parietochloris incisa, содержащей в составе внутриклеточных липидов жирные кислоты, продуктивность по которым достигает 0,25 г/л (что составляет 12-14% ЖК от веса сухой биомассы), путем ее выращивания на минеральной среде, не содержащей связанного азота, и освещенности порядка 400 мкЕ ФАР м с (Solovchenko A., et al., Effects of light intensity and nitrogen starvation on growth, total fatty acids and arachidonic acid in the green microalga Parietochloris incisa. Journal of Applied Phycology, 2008. 20(3): p.245-251).
К недостаткам прототипа относится невысокая продуктивность в отношении выхода жирных кислот в биомассе P. incisa и низкая экономичность способа, связанная с необходимостью использования для освещения люминесцентных ламп (суммарной потребляемой мощностью >400 Вт) и необходимость постоянного барботирования культуральной среды газовой смесью с повышенным содержанием углекислоты в ней в количестве не менее 1% по объему.
Целью предлагаемого изобретения является повышение содержания жирных кислот (ЖК) в биомассе микроводорослей и увеличение экономичности способа.
-2
-1
Сущность изобретения заключается в том, что для достижения цели используют зеленую микроводоросль Desmodesmus sp.шт 2С166Е, выделенный и идентифицированный авторами заявки, сиквенс которого зарегистрирован в международной базе данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) под номером JQ313131, инокулят вносят в среду при конечной концентрации хлорофилла в смеси 4-6 мкг/мл, культивирование проводят в фотобиореакторе на минеральной среде BG-11 при постоянном освещении с интенсивностью 100-120 мкЕ ФАР м с с помощью светодиодов при постоянном барботировании среды атмосферным воздухом при расходе воздуха на барботирование - 0,6-1,0 л/мин в течение 12-16 суток при температуре 25-27°C. После этого отделяют биомассу от среды центрифугированием. В результате получают согласно предлагаемому способу биомассу микроводоросли Desmodesmus sp. шт 2С166Е с содержанием ЖК 33-35% сух. веса, что при количестве биомассы в 2,0-2,1 г/л составляет 0,68 - 0,74 г/л ЖК.
Следующие материалы иллюстрируют достижение цели.
Из фиг.1 видно, что продуктивность (количество жирных кислот в накопленной за время культивирования биомассе в расчете на литр суспензии) после 14-16 сут культивирования превышает аналогичный показатель в прототипе примерно в 3 раза (0,70 г/л в предлагаемом способе и 0,25 г/л в прототипе).
Экономичность способа по сравнению с прототипом заключается в том, что при культивировании микроводорослей расходуется в 4 раза меньше электроэнергии на освещение и отсутствуют затраты на оборудование, обеспечивающее барботирование газовой смесью с 1% углекислотой.
Пример №1.
2
4
3
4
2
2
2
4
2
2
3
4
2
3
3
2
2
4
2
4
2
2
4
2
3
2
2
-2
-1
Берут среду BG-11 следующего состава: KHPO - 0,04 г/л, NaNO - 1,5 г/л, MgSO·7HO - 0,075 г/л, CaCl·2HO - 0,037 г/л, лимонная кислота - 0,006 г/л, FeSO·7HO - 0,006 г/л, NaCO - 0,2 г/л, ЭДТА - 0,001 г/л, раствор FeSO·7HO (7,45 г/л)+ЭДТА (5,57 г/л) - 1 мл/л, раствор микроэлементов (HBO - 2,86 г/л, MnCl·4HO - 1,86 г/л, ZnSO·7HO - 0,22 г/л, CuSO·5HO - 0,08 г/л, NaMoO·7HO - 0,39 г/л, Co(NO)·6HO -0,05 г/л) - 1 мл/л, pH - 7,1 -7,2 в количестве 750 мл, куда вносят инокулят микроводоросли Desmodesmus sp.шт.2С166Е до конечной концентрации хлорофилла 4 мкг/мл в смеси, после чего культуру инкубируют в фотобиореакторе в течение 16 суток при барботировании атмосферным воздухом 0,6 л/мин, постоянной освещенности 100 мкЕ ФАР м с и температуре 25°C. После этого отделяют биомассу от среды центрифугированием при 5000 g в течение 5 мин. Количество ЖК определяют общепринятым методом газовой хроматографии (Ackman R., Gas-liquid chromatography of fatty acids and esters. Methods Enzymol, ed. J. Lowenstein. Vol.14. 1969, New York: Academic Press. 329-381).
В результате количество ЖК в биомассе составило 35% сух. веса, что при содержании биомассы 2,1 г/л дает 0,74 г/л ЖК.
Пример №2.
-2
-1
Берут среду согласно примеру №1, куда вносят инокулят микроводоросли Desmodesmus sp.шт.2С166Е до конечной концентрации хлорофилла 6 мкг/мл в смеси, после чего культуру инкубируют в фотобиореакторе в течение 12 суток при барботировании атмосферным воздухом 1,0 л/мин, постоянной освещенности 120 мкЕ ФАР м с и температуре 27°C. После отделяют биомассу и определяют количество ЖК согласно примеру №1.
В результате количество ЖК в биомассе составляет 33% сух. веса, что при содержании биомассы 2,0 г/л дает 0,68 г/л ЖК.
Пример №3.
-2
-1
Берут среду согласно примеру №1, куда вносят инокулят микроводоросли Desmodesmus sp.шт.2С166Е до конечной концентрации хлорофилла 5 мкг/мл в смеси, после чего культуру инкубируют в фотобиореакторе в течение 12 суток при барботировании атмосферным воздухом 0,6 л/мин, постоянной освещенности ПО мкЕ ФАР м с и температуре 27°C. Затем отделяют биомассу и определяют количество ЖК согласно примеру №1.
В результате количество ЖК в биомассе составляет 34% сух. веса, что при содержании биомассы 2,05 г/л дает 0,7 г/л ЖК.
Пример №4.
-2
-1
Берут среду согласно примеру №1, куда вносят инокулят микроводоросли Desmodesmus sp.шт.2С166Е до конечной концентрации хлорофилла 6 мкг/мл в смеси, после чего культуру инкубируют в фотобиореакторе в течение 16 суток при барботировании атмосферным воздухом 1,0 л/мин, постоянной освещенности 120 мкЕ ФАР м с и температуре 25°C. После отделяют биомассу и определяют количество ЖК согласно примеру №1.
В результате количество ЖК в биомассе составляет 35% сух. веса, что при содержании биомассы 2,1 г/л дает 0,74 г/л ЖК.