СПОСОБЫ И КОМПОЗИЦИИ ПРИГОДНЫХ К ПОТРЕБЛЕНИЮ МАТЕРИАЛОВ
METHODS AND COMPOSITIONS OF CONSUMABLES

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
По настоящей заявке испрашивается приоритет патентной заявки США с серийным № 13/941211, поданной 12 июля 2013 года, патентной заявки США с серийным № 61/908634, поданной 25 ноября 2013 года, и патентной заявки США с серийным № 61/751816, поданной 11 января 2013 года; и настоящая заявка имеет отношение к указанным ниже одновременно рассматриваемым патентным заявкам: заявке c серийным номером PCT/US 12/46560; заявке с серийным № РСТ/US 12/46552, заявке с серийным № 61876676, поданной 11 сентября 2013 года, заявке с серийным № 61/751818, поданной 11 января 2013 года, и заявке с серийным номером 61/611999, поданной 16 марта 2012 года, и все из указанных заявок включены в настоящее изобретение в качестве ссылки.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к пищевым продуктам, и более конкретно к имеющим неживотную основу аналогам пищевых продуктов животного происхождения, которые могут быть получены, в некоторых вариантах осуществления, путем разделения неживотных материалов на их составные частицы и компоновки этих частиц в пригодные к потреблению материалы.
УРОВЕНЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Животноводство имеет глубокое негативное воздействие на окружающую среду. В настоящее время считается, что 30% поверхности суши Земли отдано под животноводство, и домашний скот занимает 20% от общей земной биомассы животных. Благодаря такому масштабу, животноводство является причиной более 18% от общего количества выбросов парниковых газов. Животноводство может быть крупным источником загрязнения воды человеком, и, безусловно, животноводство является крупнейшей в мире угрозой для биологического разнообразия. Было подсчитано, что 26% поверхности земной суши будет освобождено для других целей, если человеческое население в мире сможет отказаться от содержания мяса в рационе и перейти к рациону, не содержащему продуктов животного происхождения. Кроме того, при переходе на вегетарианскую диету можно значительно уменьшить потребление воды и электроэнергии.
Потребление мяса оказывает глубокое негативное воздействие на здоровье человека. Польза и преимущества для здоровья вегетарианской диеты являются общеизвестными. Если человеческое население сможет перейти к рациону с более выраженной вегетарианской направленностью, то произойдет снижение расходов на здравоохранение.
Голод представляет собой проблему мирового масштаба, вместе с тем, 4 основные мировые товарные зерновые культуры (соя, кукуруза, пшеница и рис) уже более чем на 100% удовлетворяют потребности человеческого населения в калориях и белках, в том числе потребности во всех незаменимых аминокислотах.
Заменители мяса на растительной основе в основном не смогли вызвать переход к вегетарианской диете. Современное состояние в области композиций заменителей мяса включает экструзию смеси сои/зерна, в результате чего получают материалы, которые в своей массе не могут практически воспроизвести приготовление и поедание мяса. Общими недостатками этих материалов является их текстура и вкус, которые, в отличие от эквивалентных мясных продуктов, представляются более однородными. Кроме того, поскольку упомянутые материалы в основном должны поступать в продажу после предварительной кулинарной обработки с введением в них искусственных вкусовых добавок и ароматизаторов, они не могут воспроизвести вкусы, ароматы и другие ключевые признаки, такие как текстура и вкусовые ощущения, характерные для мяса при его кулинарной обработке. В результате, эти материалы в основном привлекают ограниченный контингент потребителей, уже ставших приверженцами вегетарианства/веганства, но, вместе с тем, они могут обращать на себя внимание более широкого сегмента потребителей, привыкших к употреблению мяса.
Пищей является любое вещество, которое какое-либо животное, в том числе человек, или ест, или пьет в целях питания или для удовольствия. Пища обычно бывает растительного или животного происхождения и может содержать необходимые питательные вещества, такие как углеводы, жиры, белки, витамины или минералы. Вещество после проглатывания поступает в организм и усваивается клетками организма для выработки энергии, поддержания жизни или стимуляции роста.
Происхождением пищи обычно является фотосинтетический организм, как правило, растение. Некоторые виды пищи получают непосредственно из растений, но даже используемые в качестве пищевых источников животные выращиваются путем вскармливания их пищей, которая, как правило, получена из растений. Съедобные грибы и бактерии используют для трансформации материалов из растений или животных в другие пищевые продукты, грибы, хлеб, йогурт и тому подобное.
В большинстве случаев растение или животное разделяют на множество разных частей, в зависимости от пищевого назначения. Часто люди более высоко ценят конкретные части растения, такие как семена или плоды, которые, в отличие от других частей, выбираются для потребления человеком, тогда как менее желательные части, такие как стебли трав, обычно используются для кормления животных.
Туши животных перед употреблением обычно разделывают на небольшие куски мяса с конкретным вкусом и конкретными свойствами обработки.
Многие продукты можно есть в сыром виде, но вместе с тем множество продуктов подвергаются некоторым видам кулинарной обработки по соображениям безопасности, вкусовой привлекательности, текстуры или вкуса. На простейшем уровне вышеперечисленное может включать мойку, нарезание, обрезку или добавление других продуктов или ингредиентов. Также это может включать смешивание, нагревание или охлаждение или ферментацию, и отдельные продукты могут быть объединены с другими пищевыми продуктами с целью достижения желаемой комбинации свойств.
В последние годы предпринимаются попытки привнести строгий научный подход к способам приготовления пищи, в соответствии с областями науки о пище и молекулярной кулинарии. Наука о пище широко изучает сферы безопасности, микробиологии, сохранения, химии, физики и инженерного дела в области приготовления пищи, тогда как молекулярная кулинария сфокусирована на применении научных подходов для трансформации пищевых продуктов в неожиданные формы, например, на использовании жидкого азота, эмульгаторов, таких как соевый лецитин, и гелеобразующих веществ, таких как альгинаты кальция.
Вместе с тем, сырьем обычно является организм в целом (растение или животное) или выделенная ткань, например, стейк, плодовое тело гриба или семена растений. В некоторых случаях выделенная ткань подвергается модификации перед приготовлением пищи, например, из семян делают муку или выделяют масла и белковую массу.
Несмотря на тот факт, что все эти материалы содержат смесь белков, углеводов, жиров, витаминов и минералов, предназначенное для этой растительной или животной ткани использование определяется физическим расположением этих материалов в исходном растении или животном. Изобретение относится к композиции и улучшенным способам и для производства пригодных к потреблению материалов.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к пригодным к потреблению материалам и способам их изготовления. Пригодные к потреблению материалы могут представлять собой пригодные к потреблению изделия на неживотной основе, например, содержащие в основном растительные белки и/или жиры или полностью состоящие из растительных белков и/или жиров, и могут представлять собой напиток (например, алкогольный напиток, такой как кремовый ликер или белковый напиток), белковую добавку, печеные изделия (например, хлеб или печенье), приправы (например, майонез, горчица), мясной продукт или продукт - заменитель мяса (например, продукт из говяжьего фарша). Например, белковый напиток может представлять собой напиток - заменитель пищи, пиво с добавлением белка или полученный перегонкой алкогольный напиток (например, водка или ром) с добавлением белка. Приправой может быть майонез. Мясной продукт может представлять собой паштет, колбасу или заменитель мяса, который может включать аналог мышечной ткани, жировую и/или соединительную ткань на растительной основе. Можно использовать коацерваты, которые включают один или несколько белков, чтобы способствовать связыванию ингредиентов друг с другом в пригодных к потреблению материалах (например, в продукте из говяжьего фарша).
Соответственно, изобретение относится к пригодному к потреблению материалу, содержащему выделенный и очищенный растительный белок, при этом выделенный и очищенный растительный белок обладает (i) растворимостью в растворе по меньшей мере 25 г/л при температуре от приблизительно 2°С до приблизительно 32°С, при этом уровень рН раствора составляет от 3 до 8, и содержание хлорида натрия составляет от 0 до 300 мМ, или (ii) растворимостью в растворе по меньшей мере 1 мг/мл при температуре в диапазоне от 90°С до 110°С, при этом уровень рН раствора составляет от 5 до 8, и содержание хлорида натрия составляет от 0 до 300 мМ. В некоторых вариантах осуществления пригодный к потреблению материал представляет собой напиток, белковую добавку, печеные изделия, приправы, мясной продукт или продукт - заменитель мяса. В некоторых вариантах осуществления напиток представляет собой алкогольный напиток или белковый напиток. В некоторых вариантах осуществления алкогольным напитком является кремовый ликер. Кремовый ликер может дополнительно включать немолочного липидную эмульсию, при этом кремовый ликер не содержит продуктов животного происхождения. В некоторых вариантах осуществления белковый напиток может представлять собой напиток – заменитель пищи, пиво с добавлением указанного белка или полученный перегонкой алкогольный напиток с добавлением указанного белка. Приправой может быть аналог майонеза. В некоторых вариантах осуществления мясной продукт может представлять собой паштет, аналог колбасы или заменитель мяса. В некоторых вариантах осуществления размер выделенного и очищенного растительного белка составляет по меньшей мере 10 кДа. В некоторых вариантах осуществления выделенный и очищенный растительный белок является не полностью денатурированным. В некоторых случаях выделенный и очищенный растительный белок не является производным сои. В некоторых вариантах осуществления выделенный и очищенный растительный белок содержит одно или несколько из следующего: RuBisCo, 8S глобулин бобов мунг, глобулин гороха, альбумин гороха, белок чечевицы, зеин или олеозин.
В некоторых вариантах осуществления выделенный и очищенный растительный белок содержит дегидрин, гидрофилин, внутренне неупорядоченный белок или белок, идентифицированный на основании его способности оставаться после кипячения растворимым при уровне рН и концентрации соли, сравнимых с пищей. В некоторых вариантах осуществления пригодный к потреблению материал дополнительно содержит липид растительного происхождения или липид микробного происхождения. В некоторых вариантах осуществления пригодный к потреблению материал дополнительно содержит второй выделенный и очищенный белок и/или вещество приправы, вкусовое вещество, эмульгатор, желирующее вещество, сахар или волокна.
Изобретение также относится к пригодному к потреблению материалу, содержащему коацерват, который содержит один или несколько выделенных и очищенных белков. В некоторых вариантах осуществления пригодный к потреблению материал является аналогом мяса. В некоторых вариантах осуществления пригодный к потреблению материал дополнительно включает липид растительного происхождения или липид микробного происхождения. Липид растительного происхождения или липид микробного происхождения может содержать лецитин и/или масло. Упомянутый продукт может включать лецитин приблизительно до 1% по массе. Этот продукт может включать лецитин и масло. В некоторых вариантах осуществления маслом является рапсовое масло, пальмовое масло или масло какао. Продукт может включать от приблизительно 1% до приблизительно 9% масла. Один или несколько выделенных и очищенных белков могут содержать растительные белки. Один или несколько растительных белков могут содержать один или несколько белков гороха, белков нута, белков чечевицы, белков люпина, белков других бобовых или их смеси. В некоторых вариантах осуществления один или несколько белков гороха представляют собой легумины, вицилин, конвицилин или их смесь.
Изобретение также относится к аналогу мяса, содержащему аналог мышечной ткани, аналог соединительной ткани, аналог жировой ткани, и к коацервату, содержащему один или несколько выделенных и очищенных белков. Коацерват дополнительно может содержать липиды растительного происхождения или липиды микробного происхождения. Липиды растительного происхождения или липиды микробного происхождения могут представлять собой лецитин и/или масло. Аналог мяса может быть аналогом говяжьего фарша.
Также изобретение относится к пригодному к потреблению материалу, содержащему отверждаемый на холоде гель, в котором содержится соль и один или несколько выделенных и очищенных белков от неживотного источника. В некоторых вариантах осуществления выделенный и очищенный растительный белок содержит одно или несколько из следующего: RuBisCo, глобулин Мунг 8S, глобулин гороха, альбумин гороха, белок чечевицы, зеин или олеозин. В некоторых вариантах осуществления выделенный и очищенный растительный белок содержит дегидрин, гидрофилин или внутренне неупорядоченный белок. В некоторых вариантах осуществления отверждаемый на холоде гель дополнительно содержит липид растительного происхождения или липид микробного происхождения. В некоторых вариантах осуществления липид растительного происхождения или липид микробного происхождения представляет собой лецитин и/или масло.
Изобретение дополнительно относится к аналогу жировой ткани, содержащему один или несколько выделенных растительных белков, одно или несколько масел, полученных из растений или водорослей, и необязательно фосфолипид. В некоторых вариантах осуществления фосфолипидом является лецитин. В некоторых вариантах осуществления масла на растительной основе выбраны из группы, состоящей из кукурузного масла, оливкового масла, соевого масла, арахисового масла, орехового масла, миндального масла, кунжутного масла, хлопкового масла, рапсового масла, масла канолы, сафлорового масла, подсолнечного масла, льняного масла, пальмового масла, пальмоядрового масла, кокосового масла, масла бабассу, масла ши, масла манго, масла какао, масла зародышей пшеницы, масла из рисовых отрубей и из их комбинаций. В некоторых вариантах осуществления температура выделения жира из аналога жировой ткани находится в диапазоне от 23°С до 33°С, от 34°С до 44°С, от 45°С до 55°С, от 56°С до 66°С, от 67°С до 77°С, от 78°С до 88°С, от 89°С до 99°С, от 100°С до 110°С, от 111°С до 121°С, от 122°С до 132°С, от 133°С до 143°С, от 144°С до 154°С, от 155°С до 165°С, от 166°С до 167°С, от 168°С до 169°С, от 170°С до 180°С, от 181°С до 191°С, от 192°С до 202°С, от 203°С до 213°С, от 214°С до 224°С, от 225°С до 235°С, от 236°С до 246°С, от 247°С до 257°С, от 258°С до 268°С, от 269°С до 279°С, от 280°С до 290°С или от 291°С до 301°С. В некоторых вариантах осуществления процент выделения жира из аналога жировой ткани при кулинарной обработке составляет от 0 до 10%, от 10% до 20%, от 20% до 30%, от 30% до 40%, от 40% до 50%, от 50% до 60%, от 60 % до 70%, от 70% до 80%, от 80% до 90% или от 90% до 100%. В некоторых вариантах осуществления выделенный и очищенный растительный белок содержит одно или несколько из следующего: RuBisCo, 8S глобулин бобов мунг, глобулин гороха, альбумин гороха, белок чечевицы, зеин или олеозин.
В некоторых вариантах осуществления аналог жировой ткани содержит от приблизительно 40% до приблизительно 90% масла. В некоторых вариантах осуществления аналог жировой ткани содержит от приблизительно 1% до приблизительно 6% выделенного и очищенного растительного белка. В некоторых вариантах осуществления аналог жировой ткани содержит от приблизительно 0,05 до приблизительно 2% фосфолипида. В некоторых вариантах осуществления твердость аналога жировой ткани сходна с твердостью жировой ткани в говядине.
Изобретение также относится к пригодному к потреблению материалу, содержащему гем-содержащий белок и (i) окись углерода и/или (ii) нитрит, при этом пригодный к потреблению материал не содержит мяса. В некоторых вариантах осуществления масса гем-содержащего белка составляет по меньшей мере 0,01% от массы композиции. В некоторых вариантах осуществления пригодный к потреблению материал дополнительно содержит одну соль или несколько солей аммония, натрия, калия или кальция. В некоторых вариантах осуществления выделенные и очищенные белки являются сшитыми.
Дополнительно, изобретение относится к пригодному к потреблению материалу, содержащему гелеобразную эмульсию, при этом гелеобразная эмульсия содержит:
a) выделенный и очищенный белок;
b) первый липид, который является твердым при выбранном температурном диапазоне, если он не находится в пригодном к потреблению материале; и
c) второй липид, который является жидким при выбранном температурном диапазоне, если он не находится в пригодном к потреблению материале; при этом температура плавления смеси первого и второго липидов аналогична температуре плавления липидов, находящихся в мясе, и при этом первый и второй липиды являются липидами растительного происхождения или липидами микробного происхождения.
Изобретение также относится к способу изготовления пригодного к потреблению материала, и указанный способ содержит:
a) приготовление раствора, содержащего выделенный и очищенный растительный белок, при этом выделенный и очищенный растительный белок (i) обладает растворимостью в растворе по меньшей мере 25, при температуре от приблизительно 2°С до 32°С, при этом уровень рН раствора составляет от 3 до 8, и содержание хлорида натрия составляет от 0 до 300 мМ, или (ii) обладает растворимостью в растворе по меньшей мере 1 мг/мл при температуре в диапазоне от 90°С до 110°С, при этом уровень рН раствора составляет от 5 до 8, и содержание хлорида натрия составляет от 0 до 300 мМ; и
b) добавление этого раствора к напитку.
В некоторых вариантах осуществления раствор содержит два или несколько выделенных и очищенных растительных белков. В некоторых вариантах осуществления напиток является прозрачным. В некоторых вариантах осуществления выделенный и очищенный растительный белок присутствует в растворе в концентрации по меньшей мере 1% по массе. В некоторых вариантах осуществления выделенный и очищенный растительный белок выбран из группы, состоящей из следующего: RuBisCo, глобулин бобов мунг, глобулин сои, глобулин гороха, альбумин гороха, проламин, белок чечевицы, дегидрин, гидрофилин и внутренне неупорядоченный белок. В некоторых вариантах осуществления перед изготовлением указанного раствора выделенный и очищенный растительный белок подвергается лиофилизации. В некоторых вариантах осуществления напиток создает улучшенные вкусовые ощущения по сравнению с соответствующим напитком без выделенного и очищенного белка.
Изобретение также относится к способу продления срока годности не содержащего мясо пригодного к потреблению материала, при этом способ содержит добавление гем-содержащего белка к пригодному к потреблению материалу, при этом при эквивалентных условиях хранения гем-содержащий белок окисляется медленнее, чем миоглобин. В некоторых вариантах осуществления гем-содержащий белок содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70% гомологична любой из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:1-27.
Дополнительно изобретение относится к способу изготовления аналога мяса, содержащего отверждаемый на холоде гель, при этом указанный способ включает:
a) денатурацию раствора, содержащего по меньшей мере один выделенный и очищенный белок из неживотного источника при условиях отсутствия преципитации выделенного и очищенного белка из этого раствора;
b) необязательно, добавление любых термолабильных компонентов к раствору денатурированного белка;
c) образование геля из раствора денатурированного белка при температуре от приблизительно 4°С до приблизительно 25°С путем повышения отверждаемого на холоде геля; и
d) введение отверждаемого на холоде геля в аналог мяса.
В некоторых вариантах осуществления желирование индуцируется с помощью хлорида натрия или хлорида кальция в количестве от 5 до 100 мМ. В некоторых вариантах осуществления термолабильными компонентами являются белки или липиды, или их смеси. В некоторых вариантах осуществления белок представляет собой гем-содержащий белок. В некоторых вариантах осуществления отверждаемый на холоде гель делают в матрице, содержащей упорядоченный лиофилизацией растительный белок.
В некоторых вариантах осуществления выделенный и очищенный белок из неживотного источника представляет собой растительный белок. В некоторых вариантах осуществления растительный белок выбран из группы, состоящей из следующего: RuBisCo, глобулин бобов мунг, глобулин сои, глобулин гороха, альбумин гороха, проламин, белок чечевицы, дегидрин, гидрофилин и внутренне неупорядоченный белок.
Дополнительно изобретение относится к аналогу жировой ткани, содержащему:
a) выделенный и очищенный неживотный белок;
b) неживотный липид; и
с) трехмерную матрицу, содержащую волокна, полученные из неживотных источников, при этом липид и белок диспергированы в трехмерной матрице, и при этом трехмерная матрица стабилизирует структуру аналога жировой ткани.
Изобретение также относится к аналогу соединительной ткани, который содержит один или несколько выделенных и очищенных белков, собранных в волокнистые структуры посредством способа формования из раствора. В некоторых вариантах осуществления волокнистые структуры стабилизированы с помощью сшивающего агента.
Изобретение относится к способу придания вкуса говядины пригодному к потреблению материалу, и указанный способ содержит добавление к пригодной к потреблению композиции гем-содержащего белка, при этом после кулинарной обработки этой пригодной к потреблению композиции передается вкус говядины.
Также изобретение относится к способу изготовления вкусовой композиции из домашней птицы или рыбы, имеющей вкус говядины, и указанный способ содержит добавление гем-белка в композицию из домашней птицы или рыбы соответственно.
В некоторых вариантах осуществления гем-содержащий белок имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70% гомологична любой из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:1-27.
Дополнительно изобретение относится к способу изготовления коацервата, и указанный способ содержит:
а) подкисление раствора одного или несколько растительных белков до уровня рН от 3,5 и 5,5, при этом раствор содержит хлорид натрия в количестве 100 мМ или меньше; и
b) выделение коацервата из раствора. В некоторых вариантах осуществления уровень рН составляет от 4 и 5. В некоторых вариантах осуществления растительные белки содержат один или несколько из белков гороха, белков нута, белков чечевицы, белков люпина, белков других бобовых или их смеси. В некоторых вариантах осуществления белки гороха содержат выделенные и очищенные легумины, выделенные и очищенные вицилины, выделенные и очищенные конвицилины или их комбинации. В некоторых вариантах осуществления выделенные и очищенные белки гороха содержат выделенные и очищенные вицилины и выделенные и очищенные конвицилины. В некоторых вариантах осуществления этап подкисления проводят в присутствии липида растительного происхождения или липида микробного происхождения. В некоторых вариантах осуществления липид растительного происхождения или липид микробного происхождения содержит масла и/или фосфолипиды.
Изобретение относится к способу изготовления аналога жировой ткани, и указанный способ содержит образование эмульсии, содержащей один или несколько выделенных растительных белков, одно или несколько масел, полученных из растений или водорослей, и необязательно фосфолипид. В некоторых вариантах осуществления фосфолипид, при его наличии, представляет собой лецитин. В некоторых вариантах осуществления растительные масла выбраны из группы, состоящей из кукурузного масла, оливкового масла, соевого масла, арахисового масла, орехового масла, миндального масла, кунжутного масла, хлопкового масла, рапсового масла, масла канолы, сафлорового масла, подсолнечного масла, льняного масла, пальмового масла, пальмоядрового масла, кокосового масла, масла бабассу, масла ши, манго, масла какао, масла зародышей пшеницы, масла из рисовых отрубей и их комбинаций. В некоторых вариантах осуществления температура выделения жира из аналога жировой ткани находится в диапазоне от 23°С до 33°С, от 34°С до 44°С, от 45°С до 55°С, от 56°С до 66°С, от 67°С до 77°С, от 78°С до 88°С, от 89°С до 99°С, от 100°С до 110°С, от 111°С до 121°С, от 122°С до 132°С, от 133°С до 143°С, от 144°С до 154°С, от 155°С до 165°С, от 166°С до 167°С, от 168°С до 169°С, от 170°С до 180°С, от 181°С до 191°С, от 192°С до 202°С, от 203°С до 213°С, от 214°С до 224°С, от 225°С до 235°С, от 236°С до 246°С, от 247°С до 257°С, от 258°С до 268°С, от 269°С до 279°С, от 280°С до 290°С или от 291°С до 301°С. В некоторых вариантах осуществления процент выделения жира из аналога жировой ткани при кулинарной обработке составляет от 0 до 10%, от 10% до 20%, от 20% до 30%, от 30% до 40%, от 40% до 50%, от 50% до 60%, 60 % до 70%, 70% до 80%, 80% до 90% или 90% до 100%. В некоторых вариантах осуществления выделенный и очищенный растительный белок содержит одно или несколько из следующего: RuBisCo, 8S глобулин бобов мунг, глобулин гороха, альбумин гороха, белок чечевицы, зеин или олеозин. В некоторых вариантах осуществления эмульсия содержит от приблизительно 40% до приблизительно 90% масла. В некоторых вариантах осуществления эмульсия содержит выделенный и очищенный растительный белок в количестве от приблизительно 1% до приблизительно 4%. В некоторых вариантах осуществления аналог жировой ткани содержит фосфолипид в количестве от приблизительно 0,05 до приблизительно 1%. В некоторых вариантах осуществления эмульсию получают путем гомогенизации под высоким давлением, обработки ультразвуком или путем ручной гомогенизации.
Дополнительно, изобретение относится к способу минимизации нежелательных запахов или вкусов в композиции, которая содержит растительные белки, и указанный способ содержит контактирование композиции с лигандом, обладающим аффинностью к одной или нескольким липоксигеназам.
Также изобретение относится к способу минимизации нежелательных запахов или вкусов в композиции, которая содержит растительные белки, и указанный способ содержит контактирование композиции с активированным углем с последующим удалением активированного угля из композиции.
Также изобретение относится к способу минимизации нежелательных запахов или вкусов в композиции, которая содержит растительные белки, и указанный способ содержит добавление в композицию ингибитора липоксигеназы и/или антиоксиданта.
Изобретение дополнительно относится к спреду с шоколадным вкусом, который содержит:
a) сахар,
b) вещество со вкусом шоколада и
c) фракцию сливок из молока на растительной основе.
Изобретение относится к способу изменения текстуры пригодного к потреблению материала во время или после кулинарной обработки, и указанный способ содержит введение в пригодный к потреблению материал одного или нескольких растительных белков с низкой температурой денатурации. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один из одного или нескольких растительных белков является выделенным и очищенным. В некоторых вариантах осуществления один или несколько растительных белков выбраны из группы, состоящей из следующего: RuBisCo, белок гороха, белок чечевицы или белки других бобовых. В некоторых вариантах осуществления эти белки гороха содержат гороховый белок альбумин. В некоторых вариантах осуществления пригодный к потреблению материал становится тверже во время или после кулинарной обработки.
Также изобретение относится к аналогу ткани, который содержит упорядоченный лиофилизацией неживотный белок. В некоторых вариантах осуществления неживотный белок представляет собой растительный белок. В некоторых вариантах осуществления неживотный белок является выделенным и очищенным. В некоторых вариантах осуществления аналогом ткани является аналог мышечной ткани.
Изобретение также относится к аналогу мяса, который включает аналог ткани, содержащий упорядоченный лиофилизацией неживотный белок.
Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в изобретении, имеют такое же значение, что и обычно подразумевают рядовые специалисты в области, к которой относится настоящее изобретение. Для осуществления настоящего изобретения можно использовать способы и материалы, которые аналогичны или эквивалентны описанным, вместе с тем, подходящие способы и материалы описаны ниже. Все публикации, патентные заявки, патенты и другие ссылки, упомянутые в изобретении, включены в качестве ссылки в полном объеме. В случае противоречий настоящее описание, в том числе и определения, имеет приоритет. Дополнительно, материалы, способы и примеры являются только иллюстративными и не предназначены для ограничения объема изобретения.
Подробности одного или нескольких вариантов осуществления изобретения изложены в прилагаемых чертежах и в приведенном ниже описании. Другие признаки, задачи и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из описания и чертежей и из формулы изобретения. Слово "содержащий" в формуле изобретения может быть заменено на "состоящий по существу из" или "состоящий из", в соответствии со стандартной практикой в патентном законодательстве.
ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фиг. 1 содержит аминокислотные последовательности иллюстративных гем-содержащих белков.
Фиг. 2А представляет собой гистограмму, показывающую процент выделения жира в зависимости от количества лецитина.
Фиг. 2B представляет собой гистограмму, показывающую температуру выделения жира в зависимости от количества лецитина.
Фиг. 2C представляет собой гистограмму, показывающую твердость аналога жира в зависимости от количества лецитина.
Фиг. 3 представляет собой гистограмму, показывающую процент выделения жира из аналога жира, который содержит различные масла (масло канолы, масло какао, кокосовое масло или масло из рисовых отрубей).
Фиг. 4 представляет собой гистограмму, показывающую температуру выделения жира из аналога жира, который содержит различные масла (масло канолы, масло какао, кокосовое масло или масло из рисовых отрубей).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
I. Пригодные к потреблению материалы
В изобретении описаны способы и композиции для изготовления пригодных к потреблению материалов. В некоторых случаях пригодные к потреблению материалы представляют собой неживотные аналоги продуктов питания животного происхождения, которые могут быть получены путем расщепления неживотных материалов на их составные частицы, и путем компоновки этих частиц в пригодные к потреблению материалы. В некоторых случаях пригодные к потреблению материалы не предназначены быть аналогами пищи животного происхождения, а напротив, имеют свои собственные уникальные характеристики желательные в качестве пищи. Дополнительно, пригодные к потреблению материалы, в некоторых случаях, могут действовать в качестве нутрицевтиков или носителей для фармацевтических композиций, а не играть основной роли в качестве пищи.
Преимущества описанных в изобретении пригодных к потреблению материалов могут включать, например, использование меньшего количества энергии или воды в производстве пригодных к потреблению материалов по сравнению с производством аналогичных пищевых продуктов, отсутствие использования животных в производстве пригодных к потреблению материалов, что дает более здоровый продукт, позволяет использовать сырье, которое в ином случае будет отбраковано, или дает возможность устранения некоторых компонентов (например, аллергенов) из пригодных к потреблению материалов (или отсутствует введение таких компонентов). Пригодные к потреблению материалы также могут иметь более высокую степень соответствия продукта, что позволяет улучшить контроль качества продукции. Еще одним преимуществом является то, что можно специально разрабатывать пригодные к потреблению материалы с желательными характеристиками для кулинарной обработки, которые превосходят характеристики общепринятых пищевых продуктов.
Пригодные к потреблению материалы могут быть предназначены для потребления животными, в том числе для человеческого потребления. Пригодные к потреблению материалы могут служить кормом для домашних животных (например, в соответствии с настоящим изобретением можно производить корм для собак) или для диких животных (например, быть кормом для неодомашненных хищников).
Пригодные к потреблению материалы можно продавать в продуктовых магазинах, ночных магазинах, торговых центрах и клубных магазинах, или готовить в ресторанах, в том числе в ресторанах быстрого питания, в местах проведения мероприятий, в школах, больницах, лечебных учреждениях для хронических больных, приютах, тюрьмах, на военных объектах или аналогично уже используемым людьми существующим продуктам.
Пригодные к потреблению материалы могут быть одобрены соответствующими регулирующими органами. Например, можно подготовить пригодные к потреблению материалы, чтобы они соответствовали требованиям Администрации по контролю продуктов питания и лекарств США. Способы по изобретению могут включать этапы, необходимые для удовлетворения регулирующих органов.
Пригодные к потреблению материалы по настоящему изобретению могут быть аналогами, конкурировать, дополнять или заменять общепринятые пищевые продукты (далее называемые "пищевыми продуктами"). Пищевыми продуктами могут являться любые продукты, которые существуют в настоящее время. Пригодные к потреблению материалы по изобретению могут быть сделаны как аналоги пищевых продуктов, например, как эквиваленты мясного продукта. Эквивалентный мясной продукт может представлять собой белое мясо или темное мясо. Эквивалентный мясной продукт может быть получен из любого животного. Неограничивающие примеры животных, используемых для получения эквивалентного мясного продукта, включают сельскохозяйственных животных, таких, например, как крупный рогатый скот, овцы, свиньи, курицы, индейки, гуси, утки, лошади, собаки, или охотничьих животных (диких или выращиваемых), таких как, например, кролик, олень, бизон, буйвол, кабан, змея, фазан, перепел, медведь, лось, антилопа, голубь, горлица, куропатка, лиса, дикая свинья, козел, кенгуру, эму, аллигатор, крокодил, черепаха, лесной сурок, сурок, опоссум, куропатка, белка, енот, кит, тюлень, страус, капибара, нутрия, морская свинка, крыса, мышь, полевка, любые разнообразные насекомые или другие членистоногие или морепродукты, такие как, например, рыбы, крабы, омары, устрицы, моллюски, гребешки, морское ушко, кальмары, осьминоги, морские ежи, оболочники и другие.
Многие мясные продукты обычно получают из скелетных мышц животного, но следует понимать, что мясо может также быть от других мышц или органов животных. В некоторых вариантах осуществления эквивалентный мясной продукт представляет собой кусок мяса, полученный из скелетных мышц. В других вариантах осуществления эквивалентный мясной продукт является органом, таким как, например, почка, сердце, печень, желчный пузырь, кишечник, желудок, костный мозг, головной мозг, тимус, легкое или язык. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления композиции по настоящему изобретению представляют собой пригодные к потреблению материалы, подобно скелетным мышцам или органам.
Пригодный к потреблению материал (например, заменитель мяса) может содержать одну или несколько первых композиций, содержащих аналог мышечной ткани, вторую композицию, содержащую аналог жировой ткани, и/или третью композицию, содержащую аналог соединительной ткани, при этом одна или несколько композиций скомбинированы таким образом, чтобы копировать физическую структуру мяса. Настоящее изобретение также относится к различным композициям аналогов мышечной ткани (далее в изобретении называемых "мышечными аналогами"), аналогов жировой ткани (далее в изобретении называемых "аналогами жировой ткани" или "жировыми аналогами"), и аналогов соединительной ткани (далее в изобретении называемых "аналогами соединительной ткани"). В некоторых вариантах осуществления эти композиции преимущественно или полностью состоят из ингредиентов, полученных из неживотных источников (например, 10% или меньше из ингредиентов имеют животное происхождение). В альтернативных вариантах осуществления аналоги мышечной, жировой и/или соединительной ткани или продукты - заменители мяса, в которых содержится один или несколько из упомянутых аналогов, частично получены из источников животного происхождения, но с добавлением ингредиентов, полученных из неживотных источников. В некоторых вариантах осуществления пищевой продукт получен из источников животного происхождения на все 90%. В некоторых вариантах осуществления приблизительно 75% пищевого продукта получено из источников животного происхождения. В некоторых вариантах осуществления приблизительно 50% пищевого продукта получено из источников животного происхождения. В некоторых вариантах осуществления приблизительно 10% пищевого продукта получены из источников животного происхождения. В других альтернативных вариантах осуществления изобретение относится к мясной продукции, по существу полученной из источников животного происхождения (например, продукция из говядины, курицы, индейки или свинины), которая дополнена одним или несколькими аналогами мышечной ткани, аналогами жировой ткани и/или аналогами соединительной ткани, при этом аналоги получены в основном или полностью из неживотных источников. Неограничивающий пример такого мясного продукта представляет собой ультрапостный продукт из говяжьего фарша с добавлением жирового аналога неживотного происхождения, который улучшает текстуру и вкусовые ощущения, и при этом сохраняет полезность для здоровья пригодного к потреблению материала с низким содержанием животных жиров. С помощью этих альтернативных вариантов осуществления можно создавать продукты со свойствами, которые в большей степени повторяют ключевые признаки, связанные с приготовлением и поеданием мяса, но которые являются менее дорогостоящими и связаны с меньшим воздействием на окружающую среду, меньшим воздействием на благополучие животных, или с большей пользой для здоровья потребителей.
Примеры других пищевых продуктов, которые пригодный к потреблению материал может имитировать или заменять, включают: напитки (например, кремовый ликер или молоко), белковые напитки (например, RuBisCo, который может быть использован в качестве белковой добавки для пива, для полученных дистилляцией алкогольных напитков, таких как водка, для фруктовых соков, напитков - заменителей питания или для воды), в пастах (например, Нутелла™, сливках, в сыре Начо или в аналогах майонеза), в паштетах, кровяных колбасах, добавках для увеличения срока годности мяса, яйцах, рыбе, колбасе, продуктах с нежной консистенцией, в консервированных или охлажденных продуктах (например, в аналогах мороженого, йогурта, кефира, сметаны или сливочного масла).
Пригодный к потреблению материал может быть аналогом мяса. Пригодный к потреблению материал может быть сделан таким образом, чтобы имитировать внешний вид или срез мяса. Например, пригодный к потреблению материал может быть визуально похожим или неотличимым от говяжьего фарша или от конкретного куска говядины. В качестве примера варианта осуществления, аналоги комбинируют таким образом, чтобы они приблизительно соответствовали физической структуре натурального измельченного мяса (например, говяжьего фарша, куриного фарша или фарша индейки). В других вариантах осуществления аналоги комбинируют таким образом, чтобы они были похожи на различные куски говядины, такие, например, как антрекот, филе миньон, лондонское жаркое и другие. Альтернативно, можно делать пригодные к потреблению материалы с уникальным обликом или внешним видом. Например, пригодный к потреблению материал может содержать узоры (например, надписи или картинки), которые образованы структурой этого продукта. В некоторых случаях пригодные к потреблению материалы похожи на общепринятые пищевые продукты после их приготовления. Например, можно производить пригодные к потреблению материалы, размер которых больше, чем размер обычных кусков говядины, но после нарезки и приготовления этот пригодный к потреблению материал будет иметь такой же внешний вид, как и обычное приготовленное мясо. В некоторых вариантах осуществления пригодный к потреблению материал может в двух измерениях быть похожим на общепринятую форму пищевого продукта, а в третьем измерении отличаться. Например, пригодный к потреблению материал может напоминать кусок мяса в двух измерениях (например, при взгляде сверху), но может быть гораздо длиннее (или толще), чем обычный кусок. В этом примере композицию можно многократно разрезать для придания общепринятой формы мясных продуктов.
Пригодные к потреблению материалы могут быть сделаны из местных продуктов. Например, пригодные к потреблению материалы могут быть изготовлены из растений, выращенных в определенном радиусе от возможного потребителя. Например, этот радиус может составлять 1 милю, 10, 100 или 1000 миль. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способу получения пригодного к потреблению материала, не содержащего веществ, которые были отправлены из местности далее 1 мили, 10, 100 или 1000 миль.
Настоящее изобретение относится к способам получения свойств совместимости пригодных к потреблению материалов, если они изготовлены из разных источников. Например, аналоги мяса на растительной основе, изготовленные из местных растений в штате Айова, США, будут иметь по существу сходный вкус, запах и текстуру, что и аналоги мяса на растительной основе, изготовленные из местных растений в Лотарингии, Франция. Эта совместимость позволяет проводить рекламу выращенных пищевых продуктов с совместимыми свойствами. Совместимость может быть обусловлена концентрацией или очисткой сходных компонентов в разных местах. Для обеспечения совместимости эти компоненты можно объединять в заранее определенном соотношении. В некоторых вариантах осуществления можно достичь высокой степени свойства совместимости при использовании компонентов (например, выделенных или концентрированных белков и жиров), которые получены от одинаковых видов растений. В некоторых вариантах осуществления можно достичь высокой степени свойства совместимости при использовании компонентов (например, выделенных или концентрированных белков и жиров), которые получены из разных видов растений. В некоторых вариантах осуществления одни и те же белки могут быть выделены из разных видов растений (например, гомологичные белки). В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу, содержащему выделение одинаковых ингредиентов из растительных источников в разных месторасположениях, составление в обоих месторасположениях описанных в изобретении композиций, и продажу этих композиций, при этом композиции, составленные и продаваемые в разных географических месторасположениях, имеют совместимые физические и химические свойства. В некоторых вариантах осуществления выделенные компоненты происходят из разных популяций растений в разных месторасположениях. В некоторых вариантах осуществления один или несколько из выделенных компонентов поставляются в разные географические точки.
Для производства пригодных к потреблению материалов может требоваться меньше ресурсов, чем для производства потребительских продуктов из домашних животных. Таким образом, настоящее изобретение относится к аналогам мяса, для производства которых требуется меньше воды или энергии, чем для производства мяса. Например, для пригодного к потреблению материала, описанного в изобретении, может потребоваться меньше, чем приблизительно 10, 50, 100, 200, 300, 500 или 1000 галлонов воды на фунт такого продукта. Для сравнения, для производства говядины может требоваться более 2000 галлонов воды на фунт мяса.
Для производства пригодного к потреблению материала может потребоваться меньшая площадь земли, чем для производства мясного продукта со сходным содержанием белка. Например, для производства пригодного к потреблению материала, описанного в изобретении, может потребоваться 30% или меньше от площади, необходимой для получения мясного продукта с аналогичным содержанием белка.
Пригодный к потреблению материал может быть более полезным для здоровья по сравнению с продуктами животного происхождения, которые он заменяет в рационе. Например, такой материал может обладать более низким содержанием холестерина или более низким содержанием насыщенных жиров, по сравнению с мясными продуктами. Существуют рекомендации Американской кардиологической ассоциации и Национальной образовательной программы по контролю холестерина (the American Heart Association; the National Cholesterol Education Program) по ограничению потребления холестерина с пищей до 300 мг в день, что эквивалентно потреблению 12 унций говядины или двух яичных желтков. Описанные в изобретении пригодные к потреблению материалы, которые неотличимы от продуктов животного происхождения, таких как говяжий фарш, и не содержащие холестерин, или имеющие пониженное содержание холестерина, могут способствовать поддержанию низкого уровня холестерина. В другом примере, описанный в изобретении пригодный к потреблению материал может не содержать холестерина или иметь более высокое содержание полиненасыщенных жирных кислот по сравнению с продуктом животного происхождения, который заменяется материалом по изобретению.
Пригодный к потреблению материал может иметь преимущества в отношении защиты животных по сравнению с продуктом животного происхождения, который заменяется продуктом по изобретению. Например, такой продукт может быть получен без необходимости содержания животных в неволе, без принудительного кормления, преждевременного отлучения от естественного вскармливания, нарушения взаимодействия матери и потомства или без необходимости убоя животных ради мяса.
Пригодный к потреблению материал может иметь меньший "углеродный след", чем мясные продукты, которые заменяются продуктом по изобретению. Например, пригодный к потреблению материал может давать чистый выброс парниковых газов, количество которых составляет 1%, 5%, 10%, 25%, 50% или 75% от выброса парниковых газов, обусловленного производством продуктов животного происхождения, которые заменяются продуктом по изобретению. В качестве примера, согласно данным Рабочей группы по проблемам окружающей среды (Environmental Working Group), 2011) "мясоеды ведут к изменению климата и здоровья", производство говядины приводит к выбросу 27 кг эквивалента двуокиси углерода на килограмм потребляемой говядины, и производство баранины приводит к выбросу 39 кг эквивалента двуокиси углерода на килограмм потребляемой говядины.
Пригодный к потреблению материал, описанный в изобретении, может использоваться в качестве альтернативы продуктам животного происхождения или комбинациям продуктов животного происхождения, потребление которых запрещено по религиозным убеждениям. Например, пригодный к потреблению материал может представлять собой кошерный аналог свиной отбивной.
Пригодный к потреблению материал также можно поставлять в виде компонентов, и производить или собирать его в другом месте. Для производства пригодного к потреблению материала могут быть использованы местные компоненты, при их наличии. Местные компоненты могут быть дополнены компонентами, которые не доступны в этой местности. Это позволяет осуществлять способы получения пригодных к потреблению материалов, например, аналогов мяса, при меньших затратах энергии на транспортировку, чем это требуется для производства мяса. Например, можно использовать местную воду в комбинации с набором, в котором имеются другие компоненты пригодного к потреблению материала. Использование местной воды снижает вес доставки, тем самым снижаются затраты и воздействие на окружающую среду.
Пригодные к потреблению материалы, описанные в изобретении, могут быть произведены или скомплектованы полностью или частично в районах, где животноводство не целесообразно или не допускается. Пригодный к потреблению материал можно производить или комплектовать в городской среде. Например, пользователю может быть предоставлен набор, позволяющий пользователю получать пригодный к потреблению материал. Пользователь может использовать местную воду или растения, выращиваемые на крыше, как, например, в Шанхае. В другом примере пригодные к потреблению материалы могут быть произведены на борту космического аппарата, космической станции или на лунной базе. Соответственно, настоящее изобретение относится к способам и системам для производства аналогов мяса для использования их в космических путешествиях или при подготовке к ним. Например, настоящее изобретение может быть использовано при наземной подготовке для космических путешествий. Пригодные к потреблению материалы также можно производить на острове или на искусственной платформе в море, где ведение животноводства затруднительно или запрещено.
II. Свойства пригодного к потреблению материала
Пригодные к потреблению материалы, описанные в изобретении, обычно предназначены для имитации практического поедания пищевого продукта, например, мяса. Вид, текстура и вкус пригодного к потреблению материала могут быть такими, что он будет похожим или неотличимым от пищевого продукта, например, от мяса. Также можно производить пригодный к потреблению материал, чтобы он обладал желаемыми характеристиками пищевых продуктов и не имел других нежелательных свойств. Например, пригодный к потреблению материал может быть аналогом бифштекса, не имеющим хрящей или других компонентов, которые обычно не употребляются в общепринятом пищевом продукте.
В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способам определения соответствия пригодного к потреблению материала характеристикам, позволяющим считать его аналогом пищевого продукта, например, путем установления возможности животного или человека отличать пригодный к потреблению материал от общепринятого пищевого продукта, например, конкретно от мяса. Один из способов, чтобы определить, является ли пригодный к потреблению материал сравнимым с пищевым продуктом (например, с мясом), состоит в следующем: a) определение свойств мяса и b) определение наличия аналогичных свойств у пригодного к потреблению материала.
Свойства, которые могут быть проверены или использованы для сравнения или описания пищевого продукта или пригодного к потреблению материала, включают механические свойства, такие как твердость, хрупкость, плотность, разжевываемость, липкость, вязкость, эластичность и адгезивность. Свойства пищевых продуктов, которые могут быть проверены, также включают геометрические параметры, такие как размер частиц, форма частиц и ориентация. Также можно подвергать проверке трехмерную организацию частиц. Дополнительные свойства могут включать содержание влаги и содержание жира. Эти свойства могут быть описаны с помощью таких понятий, как "мягкий", "твердый" или "жесткий" при описании твердости; "рассыпчатый", "хрустящий", "хрупкий", "разжевываемый", "нежный", "жесткий", "сухой", "мучнистый", "пастообразный" или "липкий" при описании когезионных свойств; "водянистый" или "вязкий" при описании вязкости; "пластичный" или "упругий" при описании эластичности; "липкий", "клейкий" или "тягучий" при описании адгезионных свойств; "шероховатый", "зернистый" или "текучий" при описании формы и размера частиц; "волокнистый", "подобный сотам" или "кристаллический" при описании формы частиц и их ориентации; "сухой", "сырой", "мокрый" или "жидкий" при описании содержания влаги; или "маслянистый" или "жирный" при описании содержания жира. Соответственно, в одном варианте осуществления можно предложить группе людей провести оценку конкретного пищевого продукта, например, говяжьего фарша, в соответствии со свойствами, которые описывают этот пищевой продукт. Для установления эквивалентности те же люди могут провести оценку пригодного к потреблению материала, описанного в изобретении.
Также может быть оценен вкус пищевого продукта. Вкусовые свойства могут быть оценены в плане сходства с пищевыми продуктами, например, как "яичный", "рыбный", "маслянистый", "шоколадный", "фруктовый", "острый", "вкус бекона", "сливочный", "молочный" или "мясной" вкус. Вкусовые свойства могут быть оценены в соответствии с семью основными вкусами, а именно, как сладкий, кислый, горький, соленый, умами (пряный), острый (или пикантный) и металлический вкус. Вкусовые свойства могут быть описаны по сходству с ощущением, вызванным химическим продуктом, таким как диацетил (маслянистый), 3-гидрокси-2-бутанон (маслянистый), нона-2Е-еналь (жирный), 1-октен-3-ол (грибной), гексановая кислота (запах пота), 4-гидрокси-5-метилфуранон (HMF, мясной), пиразины (ореховый), бис(2-метил-3-фурил) дисульфид (жареное мясо), деканон (запах плесени/фруктовый), изоамилацетат (банан), бензальдегид (горький миндаль), коричный альдегид (корица), этилпропионат (фруктовый), метилантранилат (виноград), лимонен (апельсин), этилдекадиеноат (груша), аллилгексаноат (ананас), этилмальтол (сахар, сахарная вата), этилванилин (ваниль), бутановая кислота (прогорклый), 12-метилтридеканаль (крепкий) или метилсалицилат (грушанка). Эти оценки могут быть использованы как показатели свойств пищевого продукта. Затем пригодные к потреблению материалы по настоящему изобретению можно сравнивать с пищевым продуктом, чтобы определить степень сходства пригодного к потреблению материала и пищевого продукта. В некоторых случаях после этого изменяют свойства пригодных к потреблению материалов, чтобы сделать пригодный к потреблению материал более похожим на пищевой продукт. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления пригодный к потреблению материал считается похожим на пищевой продукт в соответствии с человеческой оценкой. В некоторых вариантах осуществления пригодный к потреблению продукт с точки зрения человека неотличим от настоящего мяса.
Можно производить пригодный к потреблению материал с устранением свойств, связанных с источником компонентов пригодного к потреблению материала. Например, пригодный к потреблению материал может быть изготовлен из компонентов, полученных из бобов, но с устранением "бобового" вкуса или текстуры. Один из способов, с помощью которого можно получать такие результаты, заключается в том, что составляющие в исходных материалах расщепляются на выделенные и очищенные компоненты, и не используются компоненты, которые вызывают нежелательные характерные свойства исходного сырья. Дополнительно, согласно изобретению, посторонние вкусы или ароматы (например, нежелательные вкусы или ароматы) в выделенных и/или очищенных компонентах могут быть минимизированы путем дезодорации активированным углем или путем удаления ферментов, таких как липоксигеназы (LOX), которые могут присутствовать в следовых количествах и которые способны превращать ненасыщенные триацилглицериды (например, линолевую кислоту или линоленовую кислоту) в более мелкие и более летучие молекулы. В природном состоянии LOX присутствует в бобовых, таких как горох, соя и арахис, а также в рисе, картофеле и оливках. При разделении муки из бобовых на отдельные белковые фракции LOX может выступать в качестве нежелательной "бомбы замедленного действия", которая со временем или при хранении может приводить к появлению нежелательных вкусов или ароматов. Как показано в примере 34, композиции, содержащие растительные белки (например, из измельченных семян растений), могут подвергаться очистке для удаления LOX, например, с использованием аффинной смолы, которая связывается с LOX и выводит ее из белкового образца. Аффинная смола может представлять собой линолевую кислоту, линоленовую кислоту, стеариновую кислоту, олеиновую кислоту, пропилгаллат или эпигаллокатехин-галлат, присоединенную к твердой матрице, такой как шарик или смола. См., например, патент WO2013138793. Дополнительно, в зависимости от белкового компонента пищевого продукта, можно использовать определенные комбинации антиоксидантов и/или ингибиторов LOX в качестве эффективных агентов для минимизации образования постороннего вкуса или постороннего запаха в белковых растворах, особенно в присутствии жиров и масел. Такие соединения могут включать, например, одно или несколько соединений из β-каротина, α-токоферола, кофейной кислоты, пропилгаллата или эпигаллокатехин-галлата. Включение указанных соединений можно осуществлять во время очистки белков или во время последующих этапов обработки пищи, с целью уменьшения образования посторонних вкусов или посторонних запахов в пище на белковой основе.
Для некоторых композиций людям было предложено проверить пригодный к потреблению материал в качестве пищевого продукта или в качестве конкретного пищевого продукта, например, человек будет определять пригодный к потреблению материал в качестве мяса. Например, в некоторых композициях человек сможет определить, что пригодный к потреблению материал имеет свойства, эквивалентные свойствам мяса. В некоторых вариантах одно или несколько свойств пригодного к потреблению материала эквивалентны соответствующим свойствам мяса в соответствии с восприятием человека. В число таких свойств входят свойства, которые могут быть проверены. В некоторых вариантах осуществления человек идентифицирует пригодный к потреблению материал по настоящему изобретению, как более похожий на мясо, чем любые заменители мяса, существующие в данной области.
Можно экспериментально показать, что пригодный к потреблению материал является приемлемым для потребителей. Для скрининга различных пригодных к потреблению материалов, описанных в изобретении, можно задействовать группу экспертов. Группа экспертов-людей может протестировать множество образцов пригодных к потреблению материалов, а именно, сравнить натуральное мясо с композициями пригодных к потреблению материалов, описанных в изобретении, или сравнить заменители мяса с композициями пригодных к потреблению материалов, описанных в изобретении. Вариабельные свойства, такие как содержание жира, могут быть стандартизированы путем использования смесей постного мяса и жирного мяса, например, содержащего до 20% жира. Содержание жира можно определять с помощью способа Babcock для мяса (S.S. Nielson, Introduction to the Chemical Analysis of Foods (Jones & Bartlett Publishers, Boston, 1994)). Можно составлять рецептуру смесей говяжьего фарша и пригодных к потреблению материалов по изобретению, приготовленных в соответствии с описанным в изобретении способом.
Участникам экспертизы образцы могут быть поданы (например, в кабинках) под красным или под белым светом. Образцам могут быть присвоены случайные трехзначные цифры, и они могут чередоваться в положении для голосования, чтобы предотвратить искажение. Участников экспертизы просили оценить образцы в отношении их нежности, сочности, текстуры, вкуса и общей приемлемости, используя гедонистическую шкалу от 1, означавшей "чрезвычайно не нравится", до 9, означавшей "чрезвычайно нравится", при срединной оценке 5 - "не нравится и не отвергается". Участникам оценки следовало ополаскивать рот водой между образцами, также они имели возможность комментировать каждый образец.
Результаты этого эксперимента могут показать значительные различия или сходства между обычными мясными продуктами и композициями по изобретению.
Эти результаты могут продемонстрировать, что композиции, описанные в изобретении, оценивались как приемлемо эквивалентные настоящим мясным продуктам. Дополнительно, эти результаты могут продемонстрировать, что участники оценки отдали предпочтение описанным в изобретении композициям по сравнению с другими коммерчески доступными заменителями мяса. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к пригодным к потреблению материалам, которые похожи на обычные мясные продукты и имеют большее сходство с мясом, чем ранее известные заменители мяса.
2
2
Пригодные к потреблению материалы по изобретению также могут иметь физические свойства, аналогичные свойствам пищевых продуктов, например, обычного мяса. В одном варианте осуществления усилие, необходимое для прокалывания структуры толщиной 1 дюйм (например, котлета), изготовленной из пригодного к потреблению материала по изобретению, с помощью стального стержня с фиксированным диаметром, существенно не отличается от усилия, которое необходимо, чтобы проколоть аналогичную структуру пищевого продукта толщиной 1 дюйм (например, котлета из говяжьего фарша) с помощью стального стержня с аналогичным фиксированным диаметром. Таким образом, изобретение относится к пригодным к потреблению материалам, имеющим характеристики, аналогичные характеристикам физических усилий для мяса. В другом варианте осуществления усилие, необходимое, чтобы разорвать образец по изобретению с площадью сечения 100 мм, по существу не отличается от усилия, необходимого для разрыва образца ткани животного (мышцы, жира или соединительной ткани) с площадью сечения 100 мм, которое измерено аналогичным образом. Усилие может быть измерено с помощью анализатора текстуры, такого как TA.XT Plus Texture Analyzer (Textrue Technologies Corp.). Таким образом, изобретение относится к пригодным к потреблению материалам с характеристиками, аналогичными характеристикам физических усилий для мяса.
Пригодные к потреблению материалы, описанные в изобретении, могут иметь характеристики кулинарных потерь, аналогичные характеристикам пищевого продукта, например, мяса. Например, пригодный к потреблению материал может иметь аналогичное говяжьему фаршу содержание жира и белка, и может точно так же уменьшаться в размере при кулинарной обработке, как и настоящий говяжий фарш. Сходство профилей потерь в размерах, соответствующих разным видам мяса, может быть получено для разных композиций пригодных к потреблению материалов, описанных в изобретении. Также можно разрабатывать характеристики кулинарных потерь пригодного к потреблению материала с тем, чтобы они превосходили характеристики пищевых продуктов. Например, можно производить пригодный к потреблению материал, имеющий меньшие потери во время кулинарной обработки, но достигающий сходных вкусовых свойств и качества текстуры, как и приготовленные продукты. Одним из способов достижения этого является изменение соотношений липидов в зависимости от температуры плавления пригодной к потреблению композиции. Другой способ достижения упомянутых результатов состоит в изменении белковой композиции пригодного к потреблению материала путем регулирования концентрации белка, или с помощью механизма, посредством которого образуется аналог ткани.
В некоторых вариантах осуществления пригодный к потреблению материал сравнивают с другим пищевым продуктом на животной основе (например, с мясом) на основе показаний ольфактометра. В различных вариантах осуществления можно использовать ольфактометр для оценки концентрации запаха и порогов восприятия запаха, сверхпорогов восприятия запаха по сравнению с эталонным газом, и для оценки по гедонической шкале, чтобы определить степень привлекательности или относительную интенсивность запахов. В некоторых вариантах ольфактометр позволяет проводить обучение участников экспертизы и автоматическую оценку. В некоторых вариантах осуществления пригодный к потреблению материал представляет собой материал, дающий сходные или идентичные показания ольфактометра. В некоторых вариантах осуществления различия настолько малы, что они ниже порога обнаружения человеческого восприятия.
Газовая хроматография-масс-спектрометрия (ГХ-МС) представляет собой способ, который сочетает в себе признаки газожидкостной хроматографии и масс-спектрометрии для разделения и идентификации различных продуктов в образце. В некоторых вариантах осуществления ГХ-МС можно применять для оценки свойств пригодного к потреблению материала. Например, летучие вещества могут быть выделены из свободного пространства вокруг мяса. Идентификацию этих химических веществ можно осуществлять с помощью ГХ-МС. Таким образом, получают профиль летучих химических веществ в свободном пространстве вокруг мяса. В некоторых случаях каждый пик ГХ-МС можно подвергать дополнительной оценке. Например, человек может оценивать обонятельные ощущения от химического вещества, отвечающего за конкретный пик. Эту информацию можно использовать для улучшения результативности профиля. Затем ГХ-МС можно применять для оценки свойств пригодного к потреблению материала. Профиль ГХ-МС может быть использован для рафинирования пригодного к потреблению материала.
Характерные вкусовые и ароматические компоненты в основном создаются во время кулинарной обработки посредством химических реакций молекул, в том числе аминокислот, жиров и сахаров, которые находятся в растениях, а также в мясе. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления проводится тестирование пригодного к потреблению материала на сходство с мясом во время или после кулинарной обработки. В некоторых вариантах осуществления для создания обонятельной карты приготовленного мяса используются составляемые людьми рейтинги, проводимые людьми оценки, показания ольфактометра или измерения ГХ-МС, или их комбинации. Таким же образом может быть создана обонятельная карта пригодного к потреблению материала, например, аналога мяса. Эти карты можно сравнивать для оценки степени сходства приготовленного пригодного к потреблению материала и приготовленного мяса. В некоторых вариантах осуществления обонятельная карта пригодного к потреблению материала во время или после его кулинарной обработки аналогична или неотличима от обонятельной карты приготовленного мяса или мяса во время приготовления. В некоторых вариантах осуществления сходство является достаточным, чтобы быть за пределами порога обнаружения человеческого восприятия. Пригодный к потреблению материал может быть изготовлен таким образом, что его свойства аналогичны свойствам пищевого продукта после кулинарной обработки, при этом сырой пригодный к потреблению материал может обладать свойствами, которые отличаются от заявленных свойств пищевого продукта перед кулинарной обработкой.
Сроком годности является продолжительность времени, которое отведено пригодному к потреблению материалу, прежде чем он станет считаться непригодным для продажи, использования или потребления. Обычно, важно сохранять мясной продукт при температуре приблизительно 2°С, поскольку при воздействии более высокой температуры срок годности уменьшается.
Срок годности мяса определяется путем исследований сенсорных сигналов от мясных продуктов на протяжении времени (запах, внешний вид упаковки, цвет, вкус и текстура), и с помощью лабораторного анализа в регулируемых условиях, с целью определения, насколько долго продукт остается безопасным, полезным и приятным. В качестве примера используется говяжий фарш, но подобные условия можно применять к стейкам, отбивным и ростбифам из других видов мяса. Говядина в своем естественном состоянии имеет темный голубовато-фиолетовый цвет. Вместе с тем, в мясо может проникать кислород и вызывать химическую реакцию с миоглобином мяса, что приводит к появлению красного цвета. Продолжающееся воздействие кислорода вызывает окисление миоглобина, и в результате красное мясо становится коричневым и появляются "посторонние" вкусы. Для контроля такого окисления проведено обширное исследование различных способов хранения и выставления на магазинных полках мясных продуктов, направленное на увеличение срока хранения мясных продуктов. Эти способы включают использование вакуумной упаковки, упаковки в модифицированной газовой среде (с высоким содержанием кислорода), упаковки в модифицированной атмосфере (низкое содержание кислорода с одноокисью углерода) и/или пастеризацию под высоким давлением (HPP).
2+
2+
3+
Основным фактором, определяющим цвет мяса, является концентрация железосодержащих белков в мясе. В скелетных мышцах, представляющих собой компонент мясных продуктов, одним из основных железосодержащих белков является миоглобин. Установлено, что в белом курином мясе содержится до 0,05% миоглобина, в свинине и телятине содержится от 0,1 до 0,3% миоглобина, в молодой говядине содержится от 0,4 до 1,0% миоглобина и в старой говядине содержится от 1,5 до 2,0% миоглобина. Обычно миоглобин в мясе существует в трех состояниях: оксимиоглобин (Fe) (окисленный = ярко-красный), миоглобин (Fe) (неокисленный = пурпурный/маджента) и метмиоглобин (Fe) (окисленный = коричневый). Считается, что переход оксимиоглобина в метмиоглобин в присутствии кислорода является причиной изменения цвета фарша от красного до коричневого цвета. Были разработаны добавки для мяса для увеличения срока годности мясных продуктов красного цвета, включающие без ограничения одноокись углерода, нитриты, метабисульфит натрия, Бомбаль, витамин Е, экстракт розмарина, экстракт зеленого чая, катехины и другие антиоксиданты.
2+
Вместе с тем, более стабильный по своей природе гем-белок, такой как гемоглобин, выделенный из Aquifex aeolicus (SEQ ID NO:3) или Methylacidiphilum infernorum (SEQ ID NO:2), окисляется медленнее, чем мезофильный гемоглобин, такой как миоглобин. Гем-белки, описанные в изобретении, (см., например, фиг. 1) также могут иметь срок годности в состоянии восстановленного гема-Fe, продленный с помощью добавок для увеличения срока годности мяса, таких как одноокись углерода и нитрит натрия. Гем-белки можно выбирать, исходя из желаемых свойств сохранения цвета. Например, при низкотемпературном приготовлении пищи по технологии су-вид (sous-vide) относительно нестабильный гем-белок, такой как белок из Hordeum vulgare, может в условиях, при которых миоглобин будет сохранять свой красный цвет и сырой вид, дать в результате коричневый продукт, вид которого соответствует продукту после кулинарной обработки. В некоторых вариантах осуществления может быть выбран гем-белок, имеющий повышенную стабильность, при этом, например, аналоги мяса могут сохранять привлекательный внешний вид средней степени прожарки, несмотря на их тщательную кулинарную обработку для безопасности пищевых продуктов.
Основным фактором, определяющим прогорклость и появление посторонних вкусов или посторонних запахов, является окисление компонентов пригодного к потреблению материала, включая без ограничения жиры. Например, окисление ненасыщенных жирных кислот является известной причиной прогорклого запаха. В некоторых вариантах осуществления аналоги мяса имеют увеличенный срок годности, потому что состав химических свойств аналога мяса контролируется таким образом, что вкус, текстура, запах и химические свойства не вступают в реакцию с кислородом, при которой возникают посторонние вкусы или посторонние запахи. В некоторых вариантах осуществления аналоги мяса менее чувствительны к окислению благодаря наличию более высокого уровня ненасыщенных жирных кислот, чем содержится в говядине. В некоторых вариантах осуществления аналог мяса не содержит ненасыщенные жирные кислоты. В других вариантах осуществления аналог мяса имеет более высокое содержание антиоксидантов, таких как глутатион, витамин С, витамин А и витамин Е, а также ферментов, таких как каталаза, супероксиддисмутаза и различные пероксидазы, чем содержание упомянутых веществ в мясе. В других вариантах осуществления отсутствуют компоненты, генерирующие посторонние вкус или посторонний запах, такие как липоксигеназы.
В некоторых вариантах осуществления пригодный к потреблению материал, описанный в изобретении, проявляет повышенную стабильность при условиях коммерческой упаковки. В некоторых вариантах осуществления увеличенный срок годности при хранении улучшается при использовании компонентов с повышенной устойчивостью к окислению, таких как липиды с пониженным содержанием ненасыщенных жирных кислот, и/или при использовании более стабильного гем-белка, например, гемоглобина, выделенного из Aquifex aeolicus (SEQ ID NO:3) или Methylacidiphilum infernorum (SEQ ID NO:2). В некоторых вариантах осуществления увеличенный срок годности обусловлен комбинацией компонентов, используемых в пригодном к потреблению материале. В некоторых вариантах осуществления пригодный к потреблению материал конкретно предназначен для желательного способа упаковки.
III. Композиция пригодных к потреблению материалов
Пригодный к потреблению материал, описанный в изобретении, включает один или несколько выделенных и очищенных белков. "Выделенный и очищенный белок" относится к препарату, в котором совокупная масса большинства белковых компонентов, отличных от указанного белка, который может представлять собой единственный мономерный белок или мультимерные виды белка, уменьшена с коэффициентом 2 или больше, 3 или больше, 5 или больше, 10 или больше, 20 или больше, 50 или больше, 100 или больше, или 1000 или больше, по отношению к исходному материалу, из которого был выделен указанный белок. Для ясности, выделенный и очищенный белок, согласно описанию, считается выделенным и очищенным по отношению к его исходному материалу (например, к растительному или другому источнику неживотного происхождения). В некоторых вариантах осуществления понятие "выделенный и очищенный" может указывать, что чистота белкового препарата составляет по меньшей мере 60%, например, больше чем 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99%. Тот факт, что пригодный к потреблению материал в дополнение к выделенному и очищенному белку может содержать материалы, не изменяет свойства белка, относящиеся к его выделению и очистке, поскольку обычно это определение относится к белку перед добавлением в композицию.
В некоторых вариантах осуществления один или несколько выделенных и очищенных белков составляют в пригодном к потреблению материале по массе по меньшей мере 1%, по меньшей мере 5%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40% или по меньшей мере 50% содержания белка. В некоторых вариантах осуществления каждый из одного или нескольких выделенных белков подвергается выделению и очистке по отдельности.
Пригодный к потреблению материал, описанный в изобретении, может состоять по существу или полностью из ингредиентов, полученных из неживотных источников, например, из источников на основе растений, грибов или микроорганизмов. Растительные источники могут представлять собой органически выращенные источники. Белки могут быть экстрагированы из исходного материала (например, экстрагированы из тканей животных или из биомассы растений, грибов, водорослей или бактериальной биомассы, или из культурального супернатанта для секретируемых белков) или из комбинации исходных материалов (например, из нескольких видов растений). Пригодные к потреблению материалы также могут быть изготовлены из комбинированных источников на растительной основе и животной основе. Например, пригодный к потреблению материал может представлять собой продукт из говяжьего фарша с добавлением продуктов по изобретению на растительной основе.
A. ИСТОЧНИКИ КОМПОНЕНТОВ ПРИГОДНОГО К ПОТРЕБЛЕНИЮ МАТЕРИАЛА
Как описано выше, выделенные и очищенные белки могут быть получены из неживотных источников, таких как растения, водоросли, грибы (например, дрожжи или мицелиальные грибы), бактерии или Archaea. В некоторых вариантах осуществления, выделенные и очищенные белки могут быть получены из генетически модифицированных организмов, таких как генетически модифицированные бактерии или дрожжи. В некоторых вариантах осуществления выделенные и очищенные белки синтезированы химическим путем или получены путем синтеза in vitro.
4
В некоторых вариантах осуществления один или несколько выделенных и очищенных белков получены из растительных источников. Выделенные и очищенные белки могут быть выделены из единственного растительного источника, или, альтернативно, множество растительных источников могут служить в качестве исходного материала для выделения и очистки белков. Согласно изобретению выделенные и очищенные растительные белки растворимы в растворе. Раствор может содержать ЭДТА (0-0,1 М), NaCl (0-1 М), KCl (0-1М), NaSO (0-0,2 М), фосфат калия (0-1М), цитрат натрия (0-1 М), карбонат натрия (0–1 М), сахарозу (0-50%), мочевину (0–2 M) или любую их комбинацию. Уровень рН раствора может составлять от 3 до 11. В некоторых вариантах осуществления растворимость растительных белков в растворе может составлять более 25 г/л (например, по меньшей мере 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200 или 225 г/л) при температуре от приблизительно 2°С до приблизительно 32°С (например, в диапазонах от 3°С до 8°С, от 10°С до 25°С или от 18°С до 25°С), при этом уровень рН раствора составляет от 3 до 8 (например, рН от 3 до 6, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5 или 8), и содержание хлорида натрия в растворе составляет от 0 до 300 мМ (например, 50, 100, 150, 200, 250, или 300 мМ). В некоторых вариантах осуществления выделенные и очищенные белки растворимы в растворе в концентрации более чем 10, 15, 20, 25, 50, 100, 150, 200 или 250 г/л.
Специалисту в данной области будет понятно, что для изготовления пригодного к потреблению материала, описанного в изобретении, могут быть использованы белки, которые могут быть выделены из любого организма из царства растений. Неограничивающие примеры растительных источников включают зерновые культуры, такие как, например, кукуруза, овес, рис, пшеница, ячмень, рожь, просо, сорго, гречиха, амарант, лебеда, тритикале (гибрид пшеницы и ржи), тефф (Eragrostis tef); масличные культуры, включающие хлопковое семя, семя подсолнечника, сафлоровое семя, Crambe, Camelina, горчицу, рапс (Brassica napus); Acacia, или растения из семейства бобовых, такие как, например, клевер, Stylosanthes, Sesbania, вика (Vicia), Arachis, Indigofera, Leucaena, Cyamopsis, виды гороха, такие как коровий горох, английский горох, желтый горох или зеленый горох, или бобы такие, как, например, соевые бобы, конские бобы, лимская фасоль, фасоль, бобы, нут, бобы мунг, фасоль пинто, чечевица, люпин, мескит, рожковое дерево, соя и арахис (Arachis hypogaea); листовую зелень, такую как, например, салат, шпинат, капуста листовая, листья брюквы, мангольд, горчица листовая, зелень одуванчика, брокколи или капуста; или зеленую массу, обычно не потребляемую людьми, в том числе биомассу сельскохозяйственных культур, таких как просо (Panicum virgatum), мискантус, Arundo Donax, энергетический тростник, сорго или другие травы, люцерна, кукурузная солома, ламинария или другие водоросли, зеленая масса, обычно удаляемая при сборе растений, листья сахарного тростника, листья деревьев, корнеплоды, такие как маниока, батат, картофель, морковь, свекла или брюква; или кокосовый орех.
Белки могут быть выделены из любой части растения, включая корни, стебли, листья, цветы или семена. Например, рибулозо-1,5-бисфосфат карбоксилазу/оксигену (RuBisCo) можно выделять, например, из люцерны, морковной ботвы, кукурузной соломы, листьев сахарного тростника, листьев сои, из проса, мискантуса, энергетического тростника, Arundo Donax, морской травы, ламинарии, водорослей или листьев горчицы.
Белки, которые в изобилии присутствуют в растениях, могут быть выделены в больших количествах из одного или нескольких исходных растений и, таким образом, являются экономичным выбором для использования в любых композициях по изобретению (например, в аналогах мышечной, жировой или соединительной ткани, в продуктах-заменителях мяса или в других). Соответственно, в некоторых вариантах осуществления один или несколько выделенных и очищенных белков содержат имеющийся в изобилии белок, в больших количествах присутствующий в растении, который может быть выделен и очищен в больших количествах. В некоторых вариантах осуществления имеющийся в изобилии белок составляет приблизительно 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65% или 70% от общего содержания белка в исходном растительном материале. В некоторых вариантах осуществления имеющийся в изобилии белок составляет от приблизительно 0,5 до 10%, от приблизительно 5 до 40%, от приблизительно 10 до 50%, от приблизительно 20 до 60% или от приблизительно 30 до 70% от общего содержания белка в исходном растительном материале. В некоторых вариантах осуществления имеющийся в изобилии белок составляет приблизительно 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% или 50% от общей массы сухого продукта в исходном растительном материале. В некоторых вариантах осуществления имеющийся в изобилии белок составляет от приблизительно 0,5 до 5%, от приблизительно 1 до 10%, от приблизительно 5 до 20%, от приблизительно 10 до 30%, от приблизительно 15 до 40% или от приблизительно 20 до 50% от общей массы сухого продукта в исходном растительном материале.
Один или несколько выделенных и очищенных белков могут содержать имеющийся в изобилии белок, высокое содержание которого обнаруживают в листьях растений. В некоторых вариантах осуществления имеющийся в изобилии белок составляет приблизительно 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% или 80% от общего содержания белка в листьях исходного растения. В некоторых вариантах осуществления имеющийся в изобилии белок составляет от приблизительно 0,5 до 10%, от приблизительно 5% до 40%, от приблизительно 10% до 60%, от приблизительно 20% до 60%, или от приблизительно 30 до 70% от общего содержания белка в листьях исходного растения. В некоторых вариантах осуществления один или несколько выделенных белков содержат RuBisCo, который является особенно полезным белком для аналогов мяса по причине его высокой растворимости и аминокислотной композиции, близкой к оптимальным соотношениям незаменимых аминокислот для питания человека. В конкретных вариантах осуществления один или несколько выделенных белков содержат активазу рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы (RuBisCo активаза). В некоторых вариантах осуществления один или несколько выделенных и очищенных белков содержат растительный запасной белок (VSP).
Один или несколько выделенных белков может содержать имеющийся в изобилии белок, высокое содержание которого обнаруживают в семенах растений. В некоторых вариантах осуществления имеющийся в изобилии белок составляет приблизительно 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% или 90% или больше от общего содержания белка в семенах исходного растения. В некоторых вариантах осуществления имеющийся в изобилии белок составляет от приблизительно 0,5 до 10%, от приблизительно 5% до 40%, от приблизительно 10% до 60%, от приблизительно 20% до 60% или от приблизительно 30 до 70% или больше 70% от общего содержания белка в семенах исходного растения. Неограничивающие примеры белков, высокий уровень которых обнаружен в семенах растений, включают запасные белки семян, например, альбумины, глицинины, конглицинины, легумины, глобулины, вицилины, кональбумин, глиадин, глютелин, клейковину, глютенин, гордеин, проламины, фазеолин (белок), протеинопласт, секалин, глютен Triticeae или зеин, или белки масляного тельца, такие как олеозины, калолеозины или стеролеозины.
Один или несколько выделенных и очищенных белков могут включать белки с высокой растворимостью, такие как дегидрины, гидрофилины, нативно-развернутые белки (также называемые внутренне неупорядоченными белками) или другие белки семейства позднего эмбриогенеза (LEA). Белки LEA были обнаружены у животных, растений и микроорганизмов, и предполагается, что они действуют как осмопротекторы и белки стрессорной реакции. См., например, Battaglia, et al., Plant Physiol., 148:6-24 (2008). Такие белки также являются термостабильными. Растворимость упомянутых белков LEA в растворе может составлять по меньшей мере 1 г/л (например, 2, 4, 6, 8, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 150, 200 или 250 г/л) при температуре в диапазоне от 90°С до 110°С (например, в диапазоне от 95°С до 105°С, или от 95°С до 100°С), при этом уровень рН раствора составляет от 5 и 8 (например, рН 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5 или 8), и содержание хлорида натрия составляет от 0 до 300 мМ (например, 50, 100, 150, 200, 250, или 300 мМ). В некоторых случаях белки LEA могут быть выделены путем нагревания белкового экстракта при температуре от 90°С до 110°С (например, 95°С или 100°С), и после центрифугирования или фильтрации нерастворимого материала осуществляют концентрирование фракции белка LEA, например, путем ультрафильтрации. В некоторых случаях можно проводить этапы изоионной рН преципитации, преципитации трихлоруксусной кислотой и/или преципитации сульфатом аммония до или после этапа нагревания, в целях дополнительного удаления белков, не являющихся белками LEA. При нагревании раствора до температуры от 90°С до 110°С большинство белков подвергается денатурации, что позволяет удалить из раствора большинство белков.
B. БЕЛКИ
Без связи с какой-либо теорией, предполагается, что путем выделения и очистки белков неживотного происхождения (например, растительных белков) можно производить пригодный к потреблению материал с высокой степенью соответствия и более строгим контролем свойств пригодного к потреблению материала. В некоторых вариантах осуществления белковый компонент пригодного к потреблению материала приблизительно на 0,1%, 0,2%, 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, на 99% или больше состоит из одного или нескольких выделенных и очищенных белков. Степень чистоты выделенного и очищенного белка может составлять больше, чем 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100%.
Выделенные и очищенные белки могут быть выделены из одного или нескольких других компонентов из источника неживотного происхождения. Например, белковая фракция может быть выделена из растительного изолята. В некоторых случаях выделенные белки могут быть очищены, при этом определенный вид белка отделяют от других компонентов, выявленных в неживотном источнике. Белки можно подвергать разделению, исходя из их молекулярной массы, например, с помощью эксклюзионной хроматографии, ультрафильтрации через мембраны или центрифугирования в градиенте плотности. В некоторых вариантах осуществления эти белки могут быть разделены на основе их поверхностного заряда, например, путем изоэлектрической преципитации, анионообменной хроматографии или катионообменной хроматографии. Белки также могут быть разделены на основе их растворимости, например, путем преципитации сульфатом аммония, изоэлектрической преципитации, экстракции поверхностно-активными веществами, детергентами или растворителями. Белки также могут быть разделены на основе их аффинности к другой молекуле, с использованием, например, хроматографии гидрофобного взаимодействия, реактивных красителей или гидроксиапатита. Аффинная хроматография может также включать в себя использование антител, обладающих аффинностью специфичного связывания с представляющим интерес белком, никель-нитрилотриуксусную кислоту (никель-NTA) для His-меченных рекомбинантных белков, лектины для связывания с сахарными функциональными группами на гликопротеине, или другие молекулы, которые специфично связываются с представляющим интерес белком.
Выделение белков позволяет устранить нежелательный материал. В некоторых вариантах осуществления выделенный и очищенный белок представляет собой белок, который по существу отсепарирован от нежелательного материала (такого как нуклеиновые кислоты, такие как ДНК и РНК, липидные мембраны, фосфолипиды, жиры, масла, углеводы, такие как крахмал, целлюлоза и глюканы, фенольные соединения, полифенольные соединения, ароматические соединения или пигменты) в семенах, листьях, стеблях или в других частях растения.
Выделенные и очищенные белки также могут быть получены с помощью рекомбинантной технологии с использованием способов полипептидной экспрессии (например, технологии гетерологичной экспрессии с использованием бактериальных клеток, клеток насекомых, клеток грибов, например, дрожжей, клеток растений или клеток млекопитающих). В некоторых случаях можно применять стандартные технологии синтеза полипептидов (например, технологии полипептидного синтеза в жидкой фазе или технологии полипептидного синтеза в твердой фазе) для получения белков синтетическим путем. В некоторых случаях для получения белков синтетическим путем можно применять технологии бесклеточной трансляции.
Белок или белки, входящие в пригодный к потреблению материал, могут иметь питательную функцию. В некоторых случаях белок также предназначен для изменения свойств пригодного к потреблению материала, например, вкуса, цвета, запаха и/или текстуры пригодного к потреблению материала. Например, продукт - заменитель мяса - может содержать белок-индикатор, который при кулинарной обработке указывает на переход из сырого состояния в состояние готовности, при этом продукт-заменитель мяса получен из неживотных источников.
Примеры белков, которые могут быть выделены и очищены, и использоваться в пригодных к потреблению материалах, описанных в изобретении, включают рибосомные белки, актин, гексокиназу, лактатдегидрогеназу, фруктозо-бисфосфат альдолазу, фосфофруктокиназы, триозофосфат-изомеразы, фосфоглицерат-киназы, фосфоглицерат-мутазы, энолазы, пируваткиназы, протеазы, липазы, амилазы, гликопротеины, лектины, муцины, глицеральдегид-3 фосфат-дегидрогеназы, пируват-декарбоксилазы, актины, факторы элонгации трансляции, гистоны, риболозо-1,5-бифосфат-карбоксилазу/оксигеназу (RuBisCo), активазу рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы (активаза RuBisCo), альбумины, глицинины, конглицинины, глобулины, вицилины, кональбумин, глиадин, глютелин, глютен, глютенин, гордеин, проламин, фазеолин (белок), протеинопласт, секалин, экстензины, глютен Triticeae, коллагены, зеин, кафирин, авенин, дегидрины, гидрофилины, белки позднего эмбриогенеза, нативно развернутые белки, любой запасной белок семян, олеозины, калолеозины, стеролеозины или другие белки масляных телец, растительный запасной белок A, растительный запасной белок B, запасной глобулин семян, 8S глобулин бобов мунг, глобулины гороха и альбумины гороха.
В некоторых вариантах осуществления выделенный и очищенный белок может представлять собой белок, который взаимодействует с липидами и способствует стабилизации липидов в структуре; белок, который связывается с липидами и способствует сшиванию липидных структур; или белок, который связывается с липидами и способствует сшиванию липидных структур и белков, взаимодействующих с не-липидами. Без связи с конкретной теорией, использование таких белков в пригодном к потреблению материале, описанном в изобретении, может улучшать интеграцию липидов и/или аналогов жира с другими компонентами продукта-заменителя мяса, что приводит к улучшению вкусовых ощущений и текстуры конечного продукта. Неограничивающий пример растительных белков, взаимодействующих с липидами, включает белки семейства олеозинов. Олеозины представляют собой взаимодействующие с липидами белки, которые расположены в масляных тельцах растений. Другие неограничивающие примеры растительных белков, которые могут взаимодействовать с липидами и стабилизировать эмульсии, включают запасные белки семян из фасоли великой северной, альбумины из гороха, глобулины из гороха, 8S глобулины из бобов мунг, 8S глобулины из фасоли, проламин и белки переноса липидов.
2+
+
В некоторых вариантах осуществления один или несколько выделенных и очищенных белков могут представлять собой железосодержащий белок, такой как гем-содержащий белок. Используемое в изобретении понятие "гем-содержащий белок" можно использовать взаимозаменяемо с понятиями "гем-содержащий полипептид" или "гем-белок" или "гем-полипептид", и включает любой полипептид, который может ковалентно или нековалентно связываться с функциональной группой гема. В некоторых вариантах осуществления гем-содержащий полипептид представляет собой глобин и может включать в себя конформационную структуру глобина, которая содержит ряд от семи до девяти альфа-спиралей. Белки глобинового типа могут относиться к любому классу (например, к классу I, классу II или классу III), и в некоторых вариантах осуществления эти белки могут переносить или накапливать кислород. Например, гем-содержащий белок может представлять собой легоглобин или гемоглобин не-симбиотического типа. Гем-содержащий полипептид может представлять собой мономер, т.е. одиночную полипептидную цепь, или может представлять собой димер, тример, тетрамер и/или олигомеры высшего порядка. Время жизни гем-содержащего белка в окисленном Feсостоянии может быть аналогичен времени жизни миоглобина, или может превышать его на 10%, 20%, 30%, 50%, 100% или больше, при условиях, в которых пригодный к потреблению материал с содержанием гем-белка производится, хранится, обрабатывается или подготавливается к потреблению. Время жизни гем-содержащего белка в неокисленном Fe2 состоянии может быть аналогично времени жизни миоглобина или может превышать его на 10%, 20%, 30%, 50%, 100% или больше, при условиях, в которых пригодный к потреблению материал, содержащий гем-белок, производится, хранится, обрабатывается или подготавливается к потреблению.
Неограничивающие примеры гем-содержащих полипептидов могут включать андроглобин, цитоглобин, глобин Е, глобин Х, глобин Y, гемоглобин, миоглобин, эритрокруорин, бета гемоглобин, альфа гемоглобин, легемоглобин, флавогемоглобин, глобин I Hell`s gate, миоглобин, эритрокруорин, бета-гемоглобин, альфа-гемоглобин, протоглобин, цианоглобин, цитоглобин, гистоглобин, нейроглобины, хлорокруорин, процессированный гемоглобин (например, HbN или HbO), процессированный 2/2 глобин, гемоглобин 3 (например, Glb3), цитохром или пероксидазу.
Гем-содержащие белки, которые могут быть использованы в описанных в изобретении пригодных к потреблению материалах, можно получать из млекопитающих (например, от сельскохозяйственных животных, таких как коровы, козы, овцы, свиньи, быки или кролики), из птиц, растений, водорослей, грибов (например, из дрожжей или мицелиальных грибов), из инфузорий или бактерий. Например, гем-содержащий белок может быть получен от млекопитающих, таких как сельскохозяйственные животные (например, коровы, козы, овцы, свиньи, быки или кролики), или от птиц, таких как индейка или курица. Гем-содержащие белки могут быть получены из растений, таких как Nicotiana tabacum или Nicotiana sylvestris (табак); Zea mays (кукуруза), Arabidopsis thaliana, бобовая культура, например, Glycine max (соя), Cicer arietinum (нут обыкновенный или горох бараний), сорта Pisum sativum (горох посевной), такие как садовый горох или сахарный горох, сорта Phaseolus vulgaris, такие как зеленые бобы, черные бобы, турецкие бобы, северные бобы или фасоль пинто, сорта Vigna unguiculata (вигна), Vigna radiata (фасоль маш), Lupinus albus (люпин) или Medicago sativa (люцерна); Brassica napus (канола); виды Triticum (пшеница, в том числе ядра пшеничных зерен и полба); Gossypium hirsutum (хлопчатник); Oryza sativa (рис); виды Zizania (дикий рис); Helianthus annuus (подсолнечник); Beta vulgaris (сахарная свекла); Pennisetum glaucum (просо); виды Chenopodium (лебеда); виды Sesamum (кунжут); Linum usitatissimum (лен); или Hordeum vulgare (ячмень). Гем-содержащие белки могут быть выделены из грибов, таких как Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Magnaporthe oryzae, Fusarium graminearum, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Myceliopthera thermophile, Kluyvera lacti или Fusarium oxysporum. Гем-содержащие белки могут быть выделены из бактерий, таких как Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Synechocistis sp., Aquifex aeolicus, Methylacidiphilum infernorum или термофильных бактерий, (например, растущих при температуре свыше 45°С), таких как Thermophilus. Гем-содержащих белки могут быть выделены из водорослей, такие как Chlamydomonas eugametos. Гем-содержащие белки могут быть выделены из простейших, таких как Paramecium caudatum или Tetrahymena pyriformis. В некоторых вариантах осуществления бактериальные гемоглобины выбраны из группы, состоящей из Aquifex aeolicus, Thermobifida fusca, Methylacidiphilum infernorum (Hells Gate), Synechocystis SP. или Bacillus subtilis. Последовательности и структура многочисленных гем-содержащих белков являются известными. См., например, Reedy, et al., Nucleic Acids Research, 2008, Vol. 36, база данных, выпуск D307–D313, и база данных по гем-белкам (Heme Protein Database), доступная в сети Интернет по адресу: http://hemeprotein.info/heme.php.
Например, не-симбиотический гемоглобин может быть получен из растения, выбранного из группы, состоящей из соевых бобов, проросших соевых бобов, люцерны, льна золотого, черных бобов, черноглазого гороха, северных бобов, нута обыкновенного, маша, вигны, фасоли пинто, стручкового гороха, лебеды, кунжута, подсолнечника, ядер пшеничных зерен, полбы, ячменя, дикого риса или риса.
Любой из гем-содержащих белков, описанных в изобретении, которые могут быть использованы для изготовления пригодных к потреблению материалов, может иметь идентичность последовательности по меньшей мере 70% (например, по меньшей мере, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% или 100% по отношению к аминокислотной последовательности соответствующего дикого типа гем-содержащего белка или его фрагментов, которые содержат гем-связывающий мотив. Например, гем-содержащий белок может иметь идентичность последовательности по меньшей мере 70% по отношению к аминокислотной последовательности, представленной на фиг. 1, в том числе не-симбиотический гемоглобин, например, из Vigna radiata (SEQ ID NO:1), Hordeum vulgare (SEQ ID NO:5), Zea mays (SEQ ID NO:13), Oryza sativa subsp. japonica (рис) (SEQ ID NO:14) или Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO:15), глобин I Hell's gate, например, белок из Methylacidiphilum infernorum (SEQ ID NO:2), флавогемопротеин, например, из Aquifex aeolicus (SEQ ID NO:3), легоглобин, например, из Glycine max (SEQ ID NO:4), Pisum sativum (SEQ ID NO:16) или Vigna unguiculata (SEQ ID NO:17), гем-зависимая пероксидаза, например, из Magnaporthe oryzae (SEQ ID NO:6) или Fusarium oxysporum (SEQ ID NO:7), цитохром С пероксидаза из Fusarium graminearum (SEQ ID NO:8), процессированный гемоглобин из Chlamydomonas moewusii (SEQ ID NO:9), Tetrahymena pyriformis (SEQ ID NO:10, группа I процессирована), Paramecium caudatum (SEQ ID NO:11, группа I процессирована), гемоглобин из Aspergillus niger (SEQ ID NO:12) или миоглобиновый белок млекопитающих, такой как миоглобин Bos taurus (SEQ ID NO:18), миоглобин Sus scrofa (SEQ ID NO:19), миоглобин Equus Caballus (SEQ ID NO:20), гем-белок из Nicotiana benthamiana (SEQ ID NO:21), Bacillus subtilis (SEQ ID NO:22), Corynebacterium glutamicum (SEQ ID NO:23), Synechocystis PCC6803 (SEQ ID NO:24), из видов Synechococcus PCC 7335 (SEQ ID NO:25), Nostoc commune (SEQ ID NO:26) или Bacillus megaterium (SEQ ID NO:27). См. фиг. 1.
Процент идентичности между двумя аминокислотными последовательностями может быть определен следующим образом. Вначале аминокислотные последовательности выравнивают с помощью программы выравнивания последовательностей BLAST 2 (B12seq) из автономной версии BLASTZ, содержащей версию BLASTP 2.0.14. Эту автономную версию BLASTZ можно получить на веб-сайте Fish & Richardson (например, www.fr.com/blast/) или на веб-сайте Национального центра правительства США по биотехнологической информации (U.S. government’s National Center for Biotechnology Information, www.ncbi.nlm.nih.gov). Инструкции, объясняющие порядок использования программы B12seq, можно найти в файле readme, прилагаемом к программе BLASTZ. С помощью B12seq выполняется сравнение между двумя аминокислотными последовательностями, с использованием алгоритма BLASTP. Для сравнения двух аминокислотных последовательностей опции программы B12seq устанавливаются следующим образом: обозначение -i устанавливают для файла, содержащего первую аминокислотную последовательность, предназначенную для сравнения (например, С:\seq1.txt); -j устанавливают для файла, содержащего вторую аминокислотную последовательность, предназначенную для сравнения (например, С:\seq2.txt); -p устанавливают на blastp; -о устанавливают на любое желаемое имя файла (например, C:\ output.txt); и все другие опции оставляют с их установками по умолчанию. Например, можно использовать следующую команду для создания выходного файла, содержащего сравнение между двумя аминокислотными последовательностями: C:\B12seq -i c:\seq1.txt -j c:\seq2.txt -p blastp-o c:\output.txt. Если две сравниваемые последовательности являются гомологичными по отношению друг к другу, то обозначенный выходной файл будет отображать эти участки гомологии как выровненные последовательности. Если обе сравниваемые последовательности не имеют гомологии, то обозначенный выходной файл не будет отображать выровненных последовательностей. Аналогичные методики могут применяться для последовательностей нуклеиновых кислот, за исключением использования программы blastn.
После выравнивания количество совпадений определяется путем подсчета числа положений, где аналогичные аминокислотные остатки представлены в обеих последовательностях. Процент идентичности определяется путем деления числа совпадений на длину полноразмерной полипептидной последовательности аминокислот, с последующим умножением полученного значения на 100. Следует отметить, что значение процента идентичности округляется до ближайшей десятой. Например, 78,11, 78,12, 78,13 и 78,14 округляется до 78,1, тогда как 78,15, 78,16, 78,17, 78,18 и 78,19 округляется до 78,2. Также необходимо отметить, что значение длины всегда будет целым числом.
Следует понимать, что ряд нуклеиновых кислот может кодировать полипептид, имеющий определенную аминокислотную последовательность. Вырожденность генетического кода хорошо известна специалистам в данной области; т.е. для многих аминокислот существует более одного триплета нуклеотидов, который служит кодоном для этой аминокислоты. Например, можно модифицировать кодоны в кодирующей последовательности для заданного фермента, таким образом, что оптимальная экспрессия достигается в конкретных видах (например, в бактериях или грибах), с помощью соответствующих таблиц смещения кодонов для этих видов.
Гем-содержащие белки можно экстрагировать из исходного материала (например, экстрагировать из тканей животных или растений, грибов, водорослей, или из бактериальной биомассы, или из культурального супернатанта для секретируемых белков), или из комбинации исходных материалов (например, из многих видов растений). Легоглобин широко доступен в виде неиспользуемого побочного продукта товарных бобовых культур (например, сои, люцерны или гороха. Количество легоглобина в корнях этих культур в США превышает содержание миоглобина во всем красном мясе, потребляемом в Соединенных Штатах Америки.
В некоторых вариантах осуществления экстракты гем-содержащих белков включают один или несколько белков из исходного материала, которые не содержат гем (например, из других животных, растений, грибов, водорослей или бактериальных белков), или из комбинации исходных материалов (например, из разных животных, растений, грибов, водорослей или бактерий).
В некоторых вариантах осуществления гем-содержащие белки выделяют и очищают из других компонентов исходного материала (например, из другого животного, растения, грибов, водорослей или бактериальных белков) с помощью вышеописанных способов. Используемый в изобретении термин "выделенный и очищенный" означает, что препарат гем-содержащего белка имеет степень чистоты по меньшей мере 60%, например, степень чистоты, превышающую 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99%.
Гем-содержащие белки также могут быть получены рекомбинантным способом с использованием технологий экспрессии полипептидов (например, технологий гетерологичной экспрессии с использованием бактериальных клеток, клеток насекомых, клеток водорослей, клеток грибов, таких как дрожжи, клеток растений или клеток млекопитающих). Например, гем-содержащий белок может быть экспрессирован в клетках E. coli. Гем-содержащие белки могут быть мечены гетерологичной аминокислотной последовательностью, такой как FLAG, полигистидин (например, гексагистидин, HIS-метка), гемагглютинин (HA), глутатион-S-трансфераза (GST) или мальтоза-связывающий белок (МВР), что способствует очистке белка. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный гем-содержащий белок с включением His-метки и сайта протеазы (например, TEV), позволяющей расщеплять His-метку, может быть экспрессирован в E. coli и очищен с помощью аффинной хроматографии с His-меткой (смола Talon, Clonetech). В некоторых случаях можно использовать стандартные способы синтеза полипептидов (например, технологии полипептидного синтеза в жидкой фазе или технологии твердофазного полипептидного синтеза) для получения гем-содержащих белков путем синтеза. В некоторых случаях, для получения гем-содержащих белков путем синтеза, можно использовать технологии бесклеточной трансляции.
В некоторых вариантах осуществления выделенный и очищенный белок находится по существу в своей нативной конформации и растворим в воде. В некоторых вариантах осуществления более чем 50, 60, 70, 80 или 90% выделенного и очищенного белка находится в его нативной конформации. В некоторых вариантах осуществления растворимость в воде выделенного и очищенного белка превышает 50, 60, 70, 80 или 90%.
Белки, используемые в пригодном к потреблению материале, могут подвергаться изменению (например, подвергаться гидролизу, расщеплению, присоединению, денатурации, полимеризации, экструдированию, электроформованию, сушке путем распыления или лиофилизации, или быть дериватизированными или химически модифицированными). Например, белки могут быть модифицированы путем ковалентного присоединения сахаров, липидов, кофакторов, пептидов или других химических групп, включающих фосфат, ацетат, метил и другие природные или неприродные молекулы. Например, пептидные каркасы белков можно расщеплять воздействием кислоты или протеаз или другими способами. Например, белки могут подвергаться денатурации, т.е. может быть изменена их вторичная, третичная или четвертичная структура в результате воздействия нагревания или охлаждения, изменения уровня рН, воздействия денатурирующих веществ, таких как детергенты, мочевина, или воздействия других хаотропных веществ, или в результате механического стресса, в том числе сдвига. Выравнивание белков в растворе, коллоиде или в твердой массе можно регулировать, чтобы влиять на механические свойства, включающие прочность на разрыв, упругость, деформируемость, твердость или гидрофобность.
Белки также могут быть собраны в волокна, которые могут образовывать матрицу в структуре для композиций. Например, трехмерная матрица из белковых волокон может содержать химические вещества, которые способствуют образованию межмолекулярных дисульфидных связей (смеси глутатиона, дитиотреитола (DTT), бета-меркаптоэтанола (BME)). В некоторых вариантах осуществления химические вещества представляют собой белки (тиоредоксин, глутаредоксин). В некоторых вариантах осуществления белки являются ферментами (дисульфид-изомераза). В некоторых вариантах осуществления волокна сшиваются с помощью химических сшивающих линкеров с двумя реакционноспособными группами, выбранными из группы, состоящей из сложных эфиров N-гидроксисукцинимида (NHS), имидоэфиров, арилфторидов, альдегидов, малеимидов, пиридилдитиолов, галоацетилов, арилазидов, диазиринов, карбодиимидов, гидразидов и изоцианатов.
В некоторых вариантах осуществления могут быть созданы и использованы коацерваты, содержащие один или несколько растительных белков, например, в качестве связующих веществ в аналогах мяса или в других аналогах. Коацервация представляет собой способ, при котором гомогенный раствор заряженных полимеров подвергается разделению фаз, в результате чего получают богатую полимерами плотную фазу ("коацерват") и богатую растворителем фазу (супернатант). Белок-полисахаридные коацерваты были использованы в разработке биоматериалов. См., например, публикации Boral and Bohidar (2010) Journal of Physical Chemistry B. Vol 114 (37): 12027-35; и Liu et al., (2010) Journal of Agricultural and Food Chemistry, Vol 58:552-556. Образование таких коацерватов запускается ассоциативными взаимодействиями между противоположно заряженными полимерами. Вместе с тем, согласно изобретению, можно получать коацерваты с использованием белков (например, растительных белков, содержащих один или несколько из белков гороха, белков нута, белков чечевицы, белков люпина, белков других бобовых или из их смеси). В общем, коацерват может быть образован путем подкисления раствора с низкой ионной силой (например, буферного раствора с содержанием хлорида натрия ниже 100 мМ), содержащего один или несколько выделенных и очищенных растительных белков, таких как легумины или вицилины гороха (например, фракцию вицилина, содержащую конвицилины), комбинацию и вицилинов и легуминов, или нефракционированных белков гороха, до уровня рН от 3,5 до 5,5, (например, до уровня рН от 4 до 5). В этих условиях происходит сепарация белков из раствора, и смесь можно центрифугировать до чистого отделения коацервата. Такой коацерват, в отличие от осадка, представляет собой вязкий материал, который можно растянуть натяжением и который плавится при нагревании. Этот способ можно осуществлять в присутствии масел (до 70%, например, пальмового масла или другого масла) для образования кремообразного материала. Можно подбирать желаемые связывающие свойства коацервата путем изменения композиции раствора (соотношения вицилин:легумин, типа и количества используемого масла). В некоторых вариантах осуществления для образования коацервата может быть использована одна или несколько камедей (например, гуммиарабик или ксантановая смола). Коацерваты можно использовать в качестве связующих веществ в аналогах говяжьих котлет, чтобы связывать и удерживать вместе аналоги жировой ткани, мышечной и соединительной ткани.
Связывающие материалы с различными адгезионными свойствами и характеристиками кулинарной обработки могут быть получены путем комбинирования фракций глютена пшеницы (0-20%) и фракций белка гороха (0-50%) в присутствии пластификатора, такого как глицерин (0-30%) или полиэтиленгликоль. К этой смеси могут быть добавлены легоглобин или другой гем-содержащий белок, если это необходимо. Материал смешивают для удаления всех сгустков, и после этого материал может быть включен в состав аналога говяжьей котлетки.
В некоторых вариантах осуществления белки можно подвергать сублимационному выравниванию для текстурирования белков, без экструзии. Способ состоит в том, что содержащие белок материалы подвергаются медленному замораживанию, что позволяет образоваться кристаллам льда. При охлаждении с одной стороны образование кристаллов льда происходит преимущественно в направлении, перпендикулярном к охлаждаемой стороне. После замораживания лед может быть удален из материала в аппарате для лиофильной сушки, в результате получают материал с несколькими слоями. Такая структура может быть стабилизирована путем нагревания под давлением в условиях влажности, чтобы получить материал, который можно использовать в аналогах мяса. Сублимационное выравнивание соевых белков было описано авторами Lugay и Kim (1981) (см. Freeze alignment: A novel method for protein texturization. стр. 177-187, глава 8 в издании: D.W. Stanley, E.D. Murray and D.H. Lees eds. 1981. Utilization of Protein Resources. Westport, CT: Food & Nutrition Press, Inc). Сублимационно выровненные белки можно подвергать дальнейшей обработке (путем замачивания в растворах, содержащих вкусовые добавки с ароматом говядины и/или легоглобин) и использовать в комбинации с аналогами жировой ткани и соединительной ткани для получения аналогов мяса. Аналоги могут быть также использованы в качестве структур, вокруг которых могут быть сформованы отверждаемые на холоде гели (содержащие, например, белки гороха и миоглобин) или сшитые гели (содержащие, например, белки гороха и легоглобин) перед их объединением с жировой тканью и соединительной тканью.
C. ЛИПИДЫ
Пригодные к потреблению материалы, описанные в изобретении, могут включать липидный компонент. Липиды могут быть выделенными и/или очищенными и могут быть в виде триглицеридов, моноглицеридов, диглицеридов, свободных жирных кислот, сфингозидов, гликолипидов, фосфолипидов или масел, или представлять собой совокупность таких липидов (например, мембраны, лецитин, лизолецитин или капли жира, содержащие небольшое количество липидов в объемной водной фазе). В некоторых вариантах осуществления источниками липидов являются масла, полученные из неживотных источников (например, масла, полученные из растений, водорослей, грибов, таких как дрожжи или мицелиальные грибы, из морской травы, бактерий или Archaea), включающие генетически модифицированные бактерии, водоросли, археи или грибы. Неограничивающие примеры растительных масел включают кукурузное масло, оливковое масло, соевое масло, арахисовое масло, масло грецкого ореха, миндальное масло, кунжутное масло, хлопковое масло, рапсовое масло, масло канолы, сафлоровое масло, подсолнечное масло, льняное масло, пальмовое масло, пальмоядровое масло, кокосовое масло, масло бабассу, масло ши, масло манго, масло какао, масло из зародышей пшеницы или масло из рисовых отрубей; или маргарин. Масла могут быть гидрогенизированными (например, гидрогенизированное растительное масло) или негидрированными.
В некоторых вариантах осуществления липид может представлять собой триглицериды, моноглицериды, диглицериды, свободные жирные кислоты, сфингозиды, гликолипиды, лецитин, лизолецитин, фосфолипиды, такие как фосфатидные кислоты, лизофосфатидные кислоты, фосфатидилхолины, фосфатидил-инозитолы, фосфатидил-этаноламины, фосфатидил-серины; сфинголипиды, такие как сфингомиелины или керамиды; стерины, такие как стигмастерин, ситостерин, кампестерол, брассикастерин, ситостанол, кампестанол, эргостерин, зимостерин, фекостерин, диностерин, ланостерин, холестерин или эпистерин; липидамиды, такие как N-пальмитоил пролин, N-стеароил глицин, N-пальмитоил глицин, N-арахидоноил глицин, N-пальмитоил таурин, N-арахидоноил гистидин или анандамид; свободные жирные кислоты, такие как пальмитолеиновая кислота, пальмитиновая кислота, миристиновая кислота, лауриновая кислота, миристолеиновая кислота, капроновая кислота, каприновая кислота, каприловая кислота, пеларгоновая кислота, ундекановая кислота, линолевая кислоты (C18:2), эйкозановая кислота (С22:0), арахидоновая кислота (С20:4), эйкозапентановая кислота (С20:5), докозапентаеновая кислота (С22:5), докозагексановая кислота (С22:6), эруковая кислота (С22:1), конъюгированная линолевая кислота, линоленовая кислота (С18:3), олеиновая кислота (С18:1), элаидиновая кислота (транс-изомер олеиновой кислоты), транс-вакценовая кислота (C18:1 транс 11), или конъюгированная олеиновая кислота; или сложные эфиры упомянутых жирных кислот, в том числе сложные эфиры моноацилглицерида, сложные эфиры диацилглицерида и сложные эфиры триацилглицерида упомянутых жирных кислот.
Липиды могут содержать фосфолипиды, амиды липидов, стерины или нейтральные липиды. Фосфолипиды могут содержать множество амфипатических молекул, содержащих жирные кислоты (например, см. выше), глицерин и полярные группы. В некоторых вариантах осуществления полярные группы представляют собой, например, холин, этаноламин, серин, фосфат, глицерин-3-фосфат, инозитол или инозитолфосфат. В некоторых вариантах осуществления липиды представляют собой, например, сфинголипиды, керамиды, сфингомиелины, цереброзиды, ганглиозиды, эфирные липиды, плазмалогены или пегилированные липиды.
В некоторых вариантах осуществления липиды, используемые в пригодном к потреблению материале, представляют собой кремовую фракцию, изготовленную из семян, орехов или бобовых, включающих без ограничения семена подсолнечника, семена сафлора, семена кунжута, семена рапса, миндаль, макадамию, семена грейпфрута, лимона, апельсина, арбуза, тыквы, какао-бобы, кокос, манго, орех сквош, кешью, бразильские орехи, каштаны, фундук, арахис, орехи пекан, грецкие орехи и фисташки. Используемое в изобретении понятие "кремовая фракция" может относиться к выделенной эмульсии, содержащей липиды, белки и воду.
4
Для получения кремовой фракции из семян, орехов или бобовых можно осуществлять один или несколько из следующих этапов. Семена, орехи или бобовые можно смешивать в течение от 1 минуты до 30 минут. Например, семена, орехи или бобовые можно смешивать в режиме постепенного увеличения скорости до максимальной скорости в течение 4 минут, после чего продолжают смешивание с максимальной скоростью в течение 1 минуты. Семена, орехи или бобовые могут быть смешаны с получением суспензии в воде или растворах, которые имеют уровень рН от 3 до 11 и содержат все или некоторые из следующих веществ: ЭДТА (0-0,1 М), NaCl (0-1 M), KCl (0-1 M), NaSO (0-0,2 М), фосфат калия (0-1 М), цитрат натрия (0–1 М), карбонат натрия (0–1 М) и/или сахарозу (0-50%). Суспензию можно нагревать до температуры от 20°С до 50°С и центрифугировать для получения кремовой фракции (верхний слой, также называемый "кремом"). Можно проводить дополнительную очистку кремовой фракции путем промывания кремовой фракции раствором мочевины от 0,1 М до 2 М перед повторным выделением кремовой фракции путем центрифугирования. Также может быть использована остаточная жидкость (называемая "обезжиренным" слоем), которая представляет собой раствор, содержащий белки в воде.
"Крем" может быть использован как есть, или подвергаться дополнительным этапам очистки. Например, путем промывания и нагревания можно удалять молекулы, придающие цвет и вкус (например, нежелательные молекулы), или нежелательные зернистые частицы, чтобы улучшить вкусовые ощущения и кремообразную текстуру. В частности, путем промывания буфером с высоким уровнем рН (рН>9) можно удалять соединения с горьким вкусом и улучшать ощущение во рту, путем промывания мочевиной можно удалять запасные белки, путем промывания раствором с уровнем рН ниже 9 и последующим промыванием с уровнем рН выше 9 можно удалять молекулы, придающие нежелательный цвет, и/или путем промывания солями можно снизить содержание вкусовых соединений. Нагревание может повышать степень удаления зернистых частиц и соединений, придающих цвет и вкус. Например, кремовую фракцию можно нагревать в течение от 0 до 24 часов до температуры от 25°С до 80°С. В некоторых вариантах осуществления в полученной кремовой фракции содержатся запасные белки семян. В некоторых вариантах осуществления запасные белки семян по существу удалены из полученной сливочной фракции.
D. ВОЛОКНА
Волокна могут быть выделенными и/или очищенными для включения в пригодный к потреблению материал, описанный в изобретении. Волокно может относиться к некрахмальным полисахаридам, таким как арабиноксиланы, целлюлоза и другие растительные компоненты, такие как резистентный крахмал, резистентные декстрины, инулин, лигнин, воски, хитины, пектины, бета-глюканы и олигосахариды из любого растительного источника.
Волокна могут относиться к экструдированным и сформованным в растворе белкам, согласно изобретению.
Е. САХАРА
В некоторых вариантах осуществления пригодный к потреблению материал может также содержать сахара. Например, пригодный к потреблению материал может содержать: моносахариды, включающие без ограничения глюкозу (декстрозу), фруктозу (левулозу), галактозу, маннозу, ксилозу, арабинозу (D- или L-ксилозу), и рибозу; дисахариды, включающие без ограничения сахарозу, лактозу, мелибиозу, трегалозу, целлобиозу или мальтозу; сахарные спирты, такие как арабит, маннит, дульцит или сорбит; сахарные кислоты, такие как галактуронат, глюкуронат или глюконат, олигосахариды и полисахариды, такие как глюканы, крахмалы, такие как кукурузный крахмал, картофельный крахмал, пектины, такие как яблочный пектин или апельсиновый пектин, раффинозу, стахиозу или декстраны; продукты расщепления клеточной стенки растений, такие как салицин, и/или производные сахаров, такие как N-ацетилглюкозамин.
F. ЖЕЛИРОВАНИЕ
Компоненты композиции могут быть изготовлены в виде геля. В некоторых вариантах осуществления гели содержат белок, при этом белок получен из неживотного источника (например, из растительного источника или другого неживотного источника, такого как генетически модифицированные дрожжи или бактерии). Гели могут быть изготовлены с помощью различных способов. Концентрация белка, концентрация фермента, уровень рН и/или температура при изготовлении могут влиять на скорость образования геля и качество конечного аналога ткани.
Гели могут быть полностью стабилизированными с помощью физических сшивок между компонентами. В некоторых вариантах осуществления гели могут быть получены с помощью циклов нагревания/охлаждения, и в этом случае стабилизацию геля осуществляют путем физических взаимодействий (переплетений, гидрофобных взаимодействий) между белковыми молекулами. Например, гель может быть образован путем нагревания белкового раствора до температуры по меньшей мере 40°С, 45°С, 50°С, 60°С, 70°С, 80°С, 90°С или 100°С, и последующего охлаждения до комнатной температуры или до температуры ниже 40°С.
В некоторых вариантах осуществления гель может быть образован путем воздействия обработкой высоким давлением на композицию, содержащую белок и любые другие компоненты (например, липиды).
В некоторых вариантах осуществления гели могут быть получены путем подбора уровня рН раствора. Например, можно регулировать уровень рН концентрированного раствора белка, чтобы он был близок к изоэлектрическому уровню рН основного белкового компонента, путем добавления соляной кислоты или другой кислоты, или гидроксида натрия, или другого основания.
В некоторых вариантах осуществления гели могут быть получены путем пропитки белковых порошков растворами. Например, протеин может быть пропитан концентрированным раствором гидроксида натрия в количестве по меньшей мере 1%, 5%, 10%, 20% (вес./об.) или больше. В других примерах белковый порошок может быть пропитан смешанными растворами воды / этанола.
В некоторых вариантах осуществления получают отверждаемый на холоде гель, чтобы избежать денатурации или распада каких-либо термолабильных компонентов (например, окисления железа в геме или возникновения нежелательных запахов). См. публикации Ju and Kilara A. (1998) J. Food Science, Vol 63(2): 288-292; и Maltais et al., (2005) J. Food Science, Vol 70(1): C67-C73) в отношении общих методик изготовления отверждаемых на холоде гелей. В общем, изготовление отверждаемых на холоде гелей осуществляют путем первой термической денатурации белкового раствора ниже его минимальной гелеобразующей концентрации (в зависимости от уровня рН и типа белка, обычно <8% (вес./об.) при уровне рН от 6 до 9 для глобулярных растительных белков, таких как белки гороха). Раствор белка можно нагревать до температуры выше температуры денатурации белка при условиях, когда белок не выпадает в осадок из раствора (например, при содержании хлорида натрия от 0 до 500 мМ и при уровне рН от 6 до 9). Затем раствор можно охлаждать до комнатной температуры или ниже, и можно смешивать его с любыми термолабильными компонентами (например, гем-содержащими белками и/или маслами), когда раствор становится достаточно густым, но перед желированием. Желирование может быть индуцировано добавлением хлорида натрия или хлорида кальция (например, от 5 до 100 мМ), и полученный раствор можно инкубировать при комнатной температуре или ниже, чтобы дать возможность образования геля (обычно в течение минут-часов). Полученный гель может быть использован как есть в аналогах мяса или подвергаться дополнительной обработке (например, стабилизации) перед его введением в аналоги мяса.
В некоторых вариантах осуществления гели могут содержать сшивающий фермент или быть получены (например, стабилизированы), по меньшей мере, частично посредством сшивающего фермента. Сшивающий фермент может представлять собой, например, трансглутаминазу, тирозиназу, липоксигеназу, дисульфид-редуктазу белка, дисульфид-изомеразу белка, сульфгидрил-оксидазу, пероксидазу, гексозооксидазу, лизилоксидазу или аминоксидазу.
В некоторых случаях, гели могут содержать химические вещества, которые способствуют образованию межмолекулярных дисульфидных связей между белками. В некоторых вариантах осуществления эти химические вещества представляют собой белки (например, тиоредоксин, глутаредоксин). В некоторых вариантах осуществления белки представляют собой ферменты (дисульфид-изомераза).
Гели могут быть стабилизированы путем химического сшивания с помощью химических сшивающих линкеров с двумя реакционноспособными группами, выбранными из группы, состоящей из сложных эфиров N-гидроксисукцинимида (NHS), имидоэфиров, арилфторидов, альдегидов, малеимидов, пиридилдитиолов, галоацетилов, арилазидов, диазиринов, карбодиимидов, гидразидов и изоцианатов.
В некоторых вариантах осуществления гели могут быть стабилизированы путем добавления крахмалов и камедей.
В некоторых вариантах осуществления применяется более чем один из упомянутых способов, в комбинации. Например, гель, сшитый посредством трансглутаминазы, может быть дополнительно стабилизирован обработкой нагреванием/охлаждением.
G. АНАЛОГИ МЫШЕЧНОЙ ТКАНИ
Большое количество мясных продуктов имеют высокое относительное содержание скелетных мышц. Таким образом, настоящее изобретение относится к композиции, имитирующей или имеющей близкое сходство с ключевыми свойствами скелетных мышц животного, и указанная композиция может быть получена из неживотных источников. Композиция, полученная из животных источников, которая имитирует или имеет близкое сходство со скелетными мышцами животных, может быть использована в качестве компонента пригодного к потреблению материала, например, аналога мясо. Такая композиция называется в изобретении "аналогом мышечной ткани". В некоторых вариантах осуществления аналог мышечной ткани и/или продукт-заменитель мяса, содержащий аналог мышечной ткани частично получен из животных источников. В некоторых вариантах осуществления аналог мышечной ткани и/или продукт-заменитель мяса, содержащий аналог мышечной ткани, полностью получен из неживотных источников.
Аналог мышечной ткани может содержать белковый компонент, при этом белковый компонент содержит один или несколько выделенных и очищенных белков, и при этом аналог мышечной ткани имеет близкое сходство со вкусом, консистенцией или цветом эквивалентной мышечной ткани, полученной из животного источника.
Многие мясные продукты имеют высокое относительное содержание поперечнополосатых скелетных мышц, в которых отдельные мышечные волокна в основном имеют анизотропную структуру. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления аналоги мышечной ткани содержат волокна, которые до некоторой степени организованы анизотропно. Волокна могут содержать белковый компонент. В некоторых вариантах осуществления волокна содержат белковый компонент в количестве приблизительно 1% (вес./вес.), приблизительно 2%, приблизительно 5%, приблизительно 10%, приблизительно 15%, приблизительно 20%, приблизительно 30%, приблизительно 40%, приблизительно 50%, приблизительно 60 %, приблизительно 70%, приблизительно 80%, приблизительно 90%, приблизительно 95%, приблизительно 99% (вес./вес.) или больше.
Компонент соединительной ткани в скелетных мышцах вносит существенный вклад в текстуру, вкусовые ощущения и характер мясных продуктов во время кулинарной обработки. Соединительная ткань состоит из белковых волокон (коллаген, эластин), имеющих диаметр в диапазоне от 0,1 до 20 микронов. В некоторых вариантах осуществления делают смесь волокон диаметром от 1 до 10 мкм и от 10 до 300 мкм, чтобы имитировать волокнистую композицию животной соединительной ткани. В некоторых вариантах осуществления трехмерную матрицу из волокон стабилизируют посредством белковых сшивок, чтобы воспроизвести прочность на разрыв животной соединительной ткани. В некоторых вариантах осуществления трехмерная матрица из волокон содержит выделенный, очищенный сшивающий фермент. Сшивающий фермент может представлять собой, например, трансглутаминазу, тирозиназу, липоксигеназу, дисульфид-редуктазу белка, дисульфид-изомеразу белка, сульфгидрил-оксидазу, пероксидазу, гексозооксидазу, лизилоксидазу или аминоксидазу.
Некоторые белки (например, 8S глобулин из семян бобов мунг, или альбумин, или глобулиновая фракция семян гороха) имеют полезные свойства для создания аналогов мяса, благодаря их способности образовывать гели с текстурой, аналогичных животной мышечной или жировой ткани. См. также белки, указанные в разделе III А и В. Эти белки могут быть специально разработаны для воспроизведения физических свойств животной мышечной ткани.
В некоторых вариантах осуществления белковый компонент в аналоге мяса состоит по массе из одного или нескольких выделенных и очищенных белков приблизительно на 0,1%, 0,2%, 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, на 99% или больше. В некоторых вариантах осуществления один или несколько выделенных и очищенных белков составляют приблизительно 0,1%, 0,2%, 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9 %, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, на 99% или больше от содержания белка в пригодном к потреблению материале.
Скелетные мышцы животных, например, крупного рогатого скота, обычно содержат значительное количество гликогена, который может составлять порядка 1% от массы мышечной ткани в момент забоя. После забоя во фракции этого гликогена продолжается метаболизм с получением продуктов, включающих молочную кислоту, и это способствует снижению уровня рН мышечной ткани и желаемого качества мяса. Гликоген представляет собой разветвленный полимер глюкозы, связанной друг с другом альфа(1->4)-гликозидными связями в линейных цепях, с точками ветвления, содержащими альфа(1->6)-гликозидные связи. Крахмалы из растений, в частности, амилопектины, также являются разветвленными полимерами глюкозы, связанной друг с другом посредством альфа(1->4) гликозидных связей в линейных цепях, с точками ветвления, содержащими альфа(1->6)гликозидные связи, и, следовательно, могут быть использованы в качестве аналога гликогена при изготовлении аналога мяса. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления аналоги мышечной ткани или аналоги мяса включают крахмал или пектин.
Дополнительные компоненты животной мышечной ткани включают натрий, калий, кальций, магний и другие ионы металлов, молочную кислоту и другие органические кислоты, свободные аминокислоты, пептиды, нуклеотиды и соединения серы. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления аналог мышечной ткани может включать натрий, калий, кальций, магний, другие ионы металлов, таких как железо, цинк, медь, никель, литий или селен, молочную кислоту и другие органические кислоты, такие как жирные кислоты, свободные аминокислоты, пептиды, нуклеотиды и соединения серы глутатион, бета-меркаптоэтанол или дитиотреитол. В некоторых вариантах осуществления концентрации натрия, калия, кальция, магния, других ионов металлов, молочной кислоты, других органических кислот, свободных аминокислот, пептидов, нуклеотидов и/или соединений серы в аналоге мышечной ткани или в пригодном к потреблению материале находятся в пределах 10% от концентрации, выявленной в мышечной ткани или в мясе, для которых создаются аналоги.
Изобретение также относится к способам получения аналога мышечной ткани. В некоторых вариантах осуществления способ включает формование композиции в асимметричные волокна перед введением в пригодный к потреблению материал. В некоторых вариантах осуществления эти волокна имитируют мышечные волокна. В некоторых вариантах осуществления эти волокна являются сформованными волокнами. В других вариантах осуществления волокна представляют собой экструдированные волокна. Таким образом, настоящее изобретение относится к способам получения асимметричных или сформованных белковых волокон. В некоторых вариантах осуществления волокна изготовлены путем экструзии белкового компонента через экструдер. Способы экструзии хорошо известны в данной области и описаны, например, в патенте США № 6379738, патенте США № 3693533 и в патентной публикации США 20120093994, которые включены в изобретение в качестве ссылки. Эти способы могут быть применимы к изготовлению композиций по настоящему изобретению.
Экструзию можно осуществлять с использованием, например, двухшнекового экструдера с одновременным вращением Leistritz Nano-16 (American Leistritz Extruder Corp. USA, Sommerville, NJ). Для ограничения денатурации белков можно применять активное охлаждение секции корпуса. Для ограничения расширения экструдированного продукта и чрезмерной потери влаги можно применять активное охлаждение секции головки. Подачу белков и жидкости осуществляют по отдельности: белок поступает из волюметрического поршневого фидера или из фидера шнекового типа с непрерывной подачей, а жидкость можно добавлять в корпус через систему впрыска жидкости под высоким давлением. Можно использовать насадки головки с различными значениями внутреннего диаметра и длины канала для точной регуляции давления, скорости охлаждения и расширения продукта при экструзии. В некоторых примерах использовали следующие параметры экструзии: скорость вращения шнека от 100 до 200 оборотов в минуту, диаметр головки 3 мм, длина головки 15 см, температура продукта в конце головки 50°С, скорость подачи 2 г/мин, и скорость расхода воды 3 г/мин. Температура продукта в головке во время экструзии измеряется с помощью термопары.
Формованные волокна могут быть изготовлены путем приготовления из белка "пасты" с высокой вязкостью путем добавления гидроксида натрия в концентрированные растворы белков или в преципитаты белков, и выдавливания этого раствора через устройство поршневого типа (в некоторых примерах, с помощью шприца со шприцевым насосом) через маленький стальной капилляр (в некоторых примерах, через иглу 27 калибра для подкожных инъекций) в коагуляционную ванну. В некоторых примерах ванна была заполнена раствором концентрированной кислоты (например, 3 М соляной кислоты). В некоторых примерах ванна была заполнена буферным раствором с уровнем рН, приблизительно равным изоионной точке белка. Коагулирующая струя белкового раствора образует волокна, которые собираются на дне ванны.
2
Пучки формованных волокон могут быть получены путем выдавливания белковой "пасты" через фильеры с множеством маленьких отверстий. В некоторых примерах фильеры представляют собой пластины из нержавеющей стали, имеющие приблизительно 25000 отверстий на см, с диаметром каждого отверстия приблизительно 200 мкм. В некоторых вариантах осуществления аналог мышечной ткани производится путем погружения трехмерной матрицы из волокон (аналог соединительной ткани) в растворы белков, и изготовления белковых гелей, в которые включена трехмерная матрица из волокон.
Н. АНАЛОГИ ЖИРА
Животный жир имеет значение для ощущения поедания приготовленного мяса и значение для питательной ценности мяса. Таким образом, настоящее изобретение относится к композициям, полученным из неживотных источников, которые воспроизводят ключевые свойства животного жира, включающие текстуру и/или вкус, с помощью компонентов, которые имитируют химическую композицию и физические свойства, например, говяжьего фарша. В другом аспекте настоящее изобретение относится к продукту-заменителю мяса, который содержит композицию, имитирующую животный жир, полученную из неживотных источников. Такая композиция называется в настоящем изобретении "жировым аналогом" или "аналогом жира". В некоторых вариантах осуществления аналог жира и/или продукт-заменитель мяса, содержащий аналог жира, частично получены из животных источников. Пригодный к потреблению материал может также включать жировые аналоги, которые воспроизводят ключевые свойства неживотных жиров, включающие текстуру, вкус, твердость, процент выделения жира и/или температуру выделения жира. Содержание жира в пригодном к потреблению материале может составлять по меньшей мере 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, 80%, 90% или 95% жира.
Фарш из говядины обычно получают путем смешивания постного мяса с жировой тканью (жиром), который вырезают из стейков, при этом жировую ткань добавляют в количестве от 16 до 30% (Cox, 1993). Мясо без жира, пропущенное через мясорубку, является жестким, рассыпчатым и быстро высыхает. К постной говядине добавляется жир, таким образом, жир, выделяющийся во время кулинарной обработки, обеспечивает смачивание поверхности, что способствует приготовлению и создает ключевые вкусы и ароматы говядины, которые в значительной степени обусловлены продуктами жирных кислот.
Создание аналога жировой ткани, который играет такую же ключевую роль для текстуры и вкуса мясного фарша на растительной основе, является важным фактором для текстуры и вкуса.
Аналоги жировой ткани, описанные в изобретении, имеют большое преимущество для здоровья по сравнению с говяжьей жировой тканью, поскольку композицию жирных кислот можно регулировать таким образом, чтобы количество насыщенных жиров поддавалось снижению. Дополнительно, аналоги жировой ткани на растительной основе не содержат холестерина. Аналоги жировой ткани на растительной основе могут иметь более низкий процент содержания общего жира и, тем не менее, иметь такое же количество выделенного или оставшегося жира для желаемых кулинарных свойств, для вкуса и текстуры.
Согласно изобретению, можно производить аналоги жира, содержащие эмульсии липидов растительного происхождения и один или несколько выделенных и очищенных белков, при этом можно регулировать композицию (например, композицию жирных кислот), кулинарные характеристики (например, температуру выделения жира или процент выделения жира) и физические свойства (например, твердость), что позволяет композиции на растительной основе имитировать жир на животной основе. Аналог жировой ткани включает: (1) растительное масло, содержащее триацилглицериды жирных кислот; (2) один или несколько выделенных и очищенных белков из источников неживотного происхождения (например, растительный белок); и (3) фосфолипид, такой как лецитин. Белки могут представлять собой белки из растений или микроорганизмов, как описано выше (например, RuBisCo, олеозин, альбумин, глобулин или другой запасной белок семян). См. также белки, описанные в разделах III A и B. Растительные масла могут представлять собой любое из масел, описанных в настоящем изобретении. См., например, раздел III С.
Аналог жира может представлять собой гелевую эмульсию. В некоторых вариантах осуществления гель является мягким, эластичным гелем, содержащим белки и, необязательно, углеводы. Гелевая эмульсия может содержать раствор белка, содержащего несколько белков, например, от 1 до 5 или от 1 до 3 выделенных и очищенных белков, при этом раствор белка составляет от 1 до 30% от объема эмульсии. Гелевая эмульсия может содержать капли жира, при этом капли жира составляют от 70 до 99% от объема эмульсии. Гелевая эмульсия может содержать выделенный, очищенный сшивающий фермент, при этом количество сшивающего фермента составляет от 0,0005% до 0,5% от массы эмульсии по объему, от 0,5 до 2,5% от массы эмульсии по объему, или 0,001% или меньше от массы эмульсии по объему. Эмульсию жировых капель в растворе белка можно стабилизировать, создавая из эмульсии гель посредством сшивающего фермента, например, трансглутаминазы, посредством гелеобразующих белков с помощью нагревания и охлаждения белковых растворов, путем создания отверждаемого на холоде геля, путем образования коацервата, или с помощью комбинации этих способов, как описано относительно коацерватов в разделе С и относительно образования геля в разделе F.
В некоторых вариантах осуществления жировой аналог содержит сшивающие ферменты, которые катализируют реакции, приводящие к образованию ковалентных сшивок между белками. Сшивающие ферменты могут быть использованы для создания или стабилизации желаемой структуры и текстуры аналога жировой ткани, чтобы имитировать желаемую текстуру эквивалентного желаемого животного жира. В некоторых вариантах осуществления сшивающие ферменты выделены и очищены из неживотного источника, и примеры и варианты осуществления таких источников описаны в изобретении. В некоторых вариантах осуществления жировой аналог содержит сшивающий фермент в количестве по меньшей мере 0,0001%, по меньшей мере 0,001%, по меньшей мере 0,01%, по меньшей мере 0,1% или по меньшей мере 1% (вес./об.). Сшивающий фермент может быть выбран, например, из трансглутаминазы, тирозиназы, липоксигеназы белка, дисульфид-редуктазы, дисульфид-изомеразы белка, сульфгидрил-оксидазы, пероксидазы, гексозооксидазы, лизилоксидазы и аминоксидазы. В некоторых вариантах осуществления сшивающий фермент представляет собой трансглутаминазу, лизилоксидазу (например, лизилоксидазу Pichia pastoris) или другую аминоксидазу.
Аналог жира может содержать гель с капельками жира, суспендированного в этом геле. Жировые капли, используемые в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, могут происходить из различных источников. В некоторых вариантах осуществления источниками являются источники неживотного происхождения (например, растительные источники). См., например, примеры, приведенные в разделе III C. В некоторых вариантах осуществления источником капель жира являются продукты животного происхождения (например, сливочное масло, сливки, смалец и/или сало). В некоторых вариантах осуществления капли жира получают из целлюлозы или масла. В других вариантах осуществления источником могут быть водоросли, дрожжи, маслянистые дрожжи, такие как Yarrowia lipolytica, или плесневые грибы. Например, в одном варианте осуществления могут быть использованы триглицериды, полученные из Mortierella isabellina. В некоторых вариантах осуществления жировые капли содержат синтетические или частично синтетические липиды.
В некоторых вариантах осуществления жировые капли стабилизированы путем добавления поверхностно-активных веществ, включающих без ограничения фосфолипиды, лецитины и липидные мембраны. Липидные мембраны могут быть получены из водорослей, грибов и растений. В некоторых вариантах осуществления поверхностно-активные вещества содержат менее 5% аналогов жира. Размер жировых капель в некоторых примерах варьируется в диапазоне от 100 нм до 150 мкм в диаметре. Стабилизированные капли с указанным диаметром могут быть получены путем гомогенизации, гомогенизации под высоким давлением, экструзии или обработки ультразвуком.
В некоторых вариантах осуществления растительные масла подвергают модификации, чтобы они стали похожими на животные жиры. Растительные масла можно модифицировать с помощью вкусовых добавок или других веществ, таких как гем-белки, аминокислоты, органические кислоты, липиды, спирты, альдегиды, кетоны, лактоны, фураны, сахара или другие вкусовые прекурсори, для воспроизведения вкуса и запаха мяса во время приготовления и после приготовления. Соответственно, некоторые аспекты изобретения охватывают способы тестирования качественного сходства между кулинарными свойствами животного жира и кулинарными свойствами растительных масел в пригодном к потреблению материале.
В некоторых вариантах осуществления к аналогу жира могут быть добавлены дополнительные полисахариды, включающие полисахариды льняного семени и ксантановую камедь.
Для создания жирового аналога на растительной основе необходимо стабилизировать эмульсии масло-в-воде. Обычно животная жировая ткань содержит приблизительно 95% жир, и стабилизируется с помощью фосфолипидного бислоя и ассоциированных белков. Аналоги жира, описанные в изобретении, могут быть созданы с содержанием жира до 95% в некоторых случаях, с содержанием 80% жира при различных условиях, или с более низким содержанием жира (например, 50% или менее), и при этом имитировать свойства животного жира. Путем стабилизации эмульсии регулируют достижение высокого процента жира.
Можно подбирать композицию (например, композицию жирных кислот), кулинарные характеристики (например, температуру выделения жира или процент выделения жира) и физические свойства (например, твердость) путем регуляции типа и количества жира, количество белка, типа и количества лецитина, наличия добавок и способа желирования.
В некоторых вариантах осуществления белковый компонент содержит аналог жира в количестве приблизительно 0,1%, 0,5%, 1%, 2%, 5%, 10%, 15% или 20%, 25% или больше в пересчете на сухую массу или общую массу. В некоторых вариантах осуществления белковый компонент содержит аналог жира в количестве от приблизительно 0,1 до 5% или от приблизительно 0,5 до 10% и больше в пересчете на сухую массу или общую массу. В некоторых вариантах осуществления белковый компонент составляет от 0,5 до 3,5% или от 1 до 3% от сухой массы или общей массы аналога жира. В некоторых вариантах осуществления белковый компонент содержит раствор, содержащий один или несколько выделенных, очищенных белков. Тип белка может влиять на стабильность эмульсии. RuBisCo и альбумины гороха позволяют делать аналог жира с содержанием жира более 90%. Добавление полисахаридов, включающих семена льна и ксантановую камедь, способствует эмульгированию смеси, что позволяет увеличить содержание жира.
Тип и количество жира можно регулировать путем выбора источника жира и его липидной композиции. В общем, масла с более высоким содержанием насыщенных жирных кислот в большей степени способны к эмульгированию при более низкой концентрации белка, тогда как для масел с более высоким содержанием ненасыщенных жирных кислот необходима более высокая концентрация белка для эмульгирования. Белок необходим для стабилизации эмульсии, и повышение содержания белка увеличивает стабильность. Если количество добавленного белка слишком мало для эмульгирования такого количества жира, смесь будет разделяться на слои.
Лецитин также является модулятором эмульсии и, в зависимости от количества присутствующего белка и типа используемого масла, может или стабилизировать или разрушать эмульсию. Например, лецитин может разрушать белково-жировую матрицу, что делает эмульсию менее стабильной, но его можно добавлять в более низкой концентрации, чтобы модулировать другие физические свойства. Эмульсии, изготовленные из масел с более высоким количеством ненасыщенных жиров, могут дестабилизироваться при высоком содержании лецитина (1%), при этом эмульсия не затвердевает. Эмульсии, изготовленные из масел с более высоким количеством насыщенных жиров, могут затвердевать при высоком количестве лецитина (1%), но оставаться очень мягкими.
Согласно изобретению, можно изготовлять аналоги жира с различной консистенцией, от очень мягких до очень твердых. Твердость аналога можно регулировать с помощью композиции и количества жира. Более твердые гели получают с использованием более твердых масел, которые содержат больше длинноцепочечных насыщенных жиров. Масла, с использованием которых производят более мягкие гели, обычно содержат больше ненасыщенных жирных кислот или короткоцепочечных насыщенных жирных кислот. В общем, твердость геля возрастает по мере увеличения общего процента содержания жира, до тех пор, пока эмульсия остается стабильной и не разделяется. Количество белка также влияет на твердость аналога. В общем, увеличение концентрации белка повышает твердость аналога. Количество лецитина является модулятором твердости аналога. При образовании гелей с высоким процентом белка (3%) более высокое количество лецитина (1%) дает значительно более выраженную мягкость, чем более низкое количество лецитина (0,05%). При снижении содержания белка (1,8%) все гели становятся мягче, и если эмульсия стабилизирована, имеется небольшое различие в твердости при низком уровне лецитина (0,05%) и при высоком уровне лецитина (1%).
Твердость гелевых аналогов жира может быть повышена путем добавления полисахаридов, включающих без ограничения ксантановую камедь и пасту из льняного семени, к упомянутым аналогам.
При кулинарной обработке жирового аналога жир вытекает из структурированного аналога по мере его приготовления. Часто жир остается в приготовленном продукте; важно достичь баланса между жиром, который выделяется и способствует кулинарной обработке, и жиром, который остается для текстуры и вкуса. Процент выделения жира (от общего содержания жира) может быть определен путем измерения количества жира, выделенного при кулинарной обработке до ее завершения. Процент выделения жира рассчитывается как вес выделенного жира от общего содержания жира в аналоге. Например, при кулинарной обработке процент выделения жира из аналога жировой ткани, описанного в изобретении, может составлять от 0 до 10%, от 10% до 20%, от 20% до 30%, от 30% до 40%, от 40% до 50%, от 50% до 60%, от 60% до 70%, от 70% до 80%, от 80% до 90% или от 90% до 100%. Из жировых аналогов обычно выделяется от 0 до 90% жира при стандартных условиях приготовления. Для сравнения, выделение жира из говяжьей жировой ткани в эквивалентных условиях обычно составляет от 40 до 55% жира.
Поскольку растительные масла имеют установленную температуру плавления, существует широкий диапазон температур, при которых можно изготовлять жировые аналоги, с тем, чтобы происходило выделение жира. Температурой выделения жира является температура, при которой на поверхности приготовляемого аналога визуально заметно выделение жира из аналога. Согласно изобретению, можно подбирать температуру выделения жира из жирового аналога в зависимости от типа и количества жира, количества белка, типа и количества лецитина, присутствия добавок, от способа эмульгирования и способа желирования. Полученные аналоги жировой ткани могут иметь температуру выделения жира от 23°С до 33°С, от 34°С до 44°С, от 45°С до 55°С, от 56°С до 66°С, от 67°С до 77°С, от 78°С до 88°С, от 89°С до 99°С, от 100°С до 110°С, от 111°С до 121°С, от 122°С до 132°С, от 133°С до 143°С, от 144°С до 154°С, от 155°С до 165°С, от 166°С до 167°С, от 168°С до 169°С, от 170°С до 180°С, от 181°С до 191°С, от 192°С до 202°С, от 203°С до 213°С, от 214°С до 224°С, от 225°С до 235°С, от 236°С до 246°С, от 247°С до 257°С, от 258°С до 268°С, от 269°С до 279°С, от 280°С до 290°С или от 291°С до 301°С. Было установлено, что из говяжьей жировой ткани выделение жира происходит при температуре от 100 до 150°С.
Эмульгирование также является фактором регулирования температуры выделения: после того, как жиры вводятся в аналог совместно с белком или с белком и лецитином, значительно возрастает температура, при которой происходит выделение жира, по сравнению с температурой, при которой происходит плавление жира единственного.
Композиция жирных кислот также имеет значение для температуры выделения жира и процента выделения жира. Растительные масла с высоким относительным содержанием ненасыщенных жирных кислот имеют низкие температуры плавления, и многие из них являются жидкими при комнатной температуре. Растительные масла с более высоким относительным содержанием насыщенных жирных кислот имеют более высокую температуру плавления, и являются твердыми при комнатной температуре. Аналоги с более высоким количеством ненасыщенных жиров имеют более высокую температуру выделения жира, чем такие же аналоги, изготовленные с более насыщенными жирными кислотами. Гели, сделанные из 75% масла с более высоким содержанием ненасыщенных жирных кислот, с высоким содержанием белка (3%) и с минимальным содержанием лецитина (0,05%), при эмульгировании смеси с помощью ручного гомогенизатора и образовании геля с использованием технологии нагревания-охлаждения, могут подвергаться нагреванию до 200°С практически без выделения жира. Аналоги, содержащие масла с насыщенными жирами с более длинной цепочкой, обычно выделяют жир в большей степени при высоком содержании белка, но в процентном отношении к общему количеству жира эти аналоги выделяют меньше жиров по сравнению с аналогами, содержащими масла с более короткими цепочками жиров и с более низким процентным содержанием белка. Гели, изготовленные из масел с более высокой долей короткоцепочечных насыщенных жирных кислот, с высоким содержанием белка (3%) и с минимальным содержанием лецитина (0,05%), могут подвергаться нагреванию до 200°С с небольшим выделением жира.
Процент выделения жира при кулинарной обработке жирового аналога также зависит от количества белка и количества лецитина. Обычно жировые аналоги содержат белок в количестве от 1 до 3% в пересчете на массу. Увеличение содержания белка приводит к повышению температуры выделения жира и уменьшает долю выделяемого жира. Увеличение содержания лецитина до 1% может уменьшать температуру выделения жира до 60-115°С и увеличивать долю выделяемых жиров (например, от 25 до 30%). С помощью источника или композиции используемого лецитина можно модулировать количество выделяемого жира и температурный порог для выделения жира. Без связи с конкретным механизмом, считается, что лецитин дестабилизирует эмульсию, нарушая взаимодействия белок-белок. В одном варианте осуществления при высокой концентрации белка, составляющей 3%, повышение содержания лецитина до 1% приводило к снижению температуры выделения жира до 55-60°С и увеличению процента выделяемого жира до 60-65%.
Способ приготовления эмульсии также является фактором, определяющим количество выделяемого жира. При эмульгировании образуется гомогенная смесь жира, который удерживается в матрице из белков и лецитина. Способы эмульгирования могут включать гомогенизацию под высоким давлением, обработку ультразвуком или ручную гомогенизацию. Альтернативные способы дают характерные различия в размере капель масла в эмульсии, что влияет на стабильность получаемых эмульсий и максимальную концентрацию жира, при которой можно получить стабильные эмульсии.
Способ желирования аналога также является фактором, определяющим количество выделяемого жира. Хотя жировые аналоги могут быть изготовлены без образования гелей, желирование приводит к получению более густой и более стабильной эмульсии. Способы желирования описаны выше и могут включать, например, добавление сшивающего фермента, такого как трансглутаминаза (ТГ), или обработку эмульсии в циклах нагревания/охлаждения. Например, преобразовать эмульсию, как описано выше, в гель, можно или обработкой ТГ или способом с нагреванием/охлаждением. Кроме того, гелеобразные эмульсии, образованные в результате сшивания, которое катализируется ТГ, обычно выделяют жир при более высокой температуре, чем в случае, если желирование эмульсий проводится по технологии нагревания/охлаждения. Гели, образованные путем сшивания с ТГ, также обычно выделяют меньше жира, чем гели, образованные с помощью технологии нагревания/охлаждения.
В некоторых вариантах осуществления могут быть изготовлены аналоги жира с содержанием белка <1,5% и с минимальным содержанием лецитина (0,05%), которые имеют температуру выделения жира от 45 до 65°С и большое количество выделяемого жира (например, от 70 до 90%). Эти гели имеют более высокий предел процентного выделения жира.
В некоторых вариантах осуществления аналоги жира могут быть изготовлены с более низким содержанием белка (<1,5%) и высоким содержанием лецитина (>1%) и иметь более низкую температуру выделения жира (например, от 30 до 50°С, например, от 30 до 45°С) и промежуточное процентное количество выделения жира (от 45 до 65%). Таким образом, в гелях, образованных из масел с короткоцепочечными жирными кислотами или длинноцепочечными жирными кислотами, при низких концентрациях белка, лецитин может играть роль в стабилизации эмульсии.
В некоторых вариантах осуществления можно использовать RuBisCo или альбумина гороха в количестве более 2% для получения жирового аналога с содержанием жира более 70%. В некоторых вариантах осуществления можно получать жировой аналог с содержанием жира более 70% при использовании гелей, образованных с выделенным и очищенным белком в количестве более 3%.
В некоторых вариантах осуществления аналоги жира, сделанные из масел с более высоким относительным содержанием длинноцепочечных насыщенных жирных кислот, с содержанием белка 3% и с минимальным содержанием лецитина (0,05%), могут выделять жир при температуре, аналогичной температуре выделения жира из говяжьей жировой ткани (от 50 до 100°С), и могут выделять жир на уровне от низкого до среднего (от 15 до 45%).
В некоторых вариантах осуществления аналог жира с более высокой концентрацией белка (>3%) и с содержанием лецитина >1% может иметь температуру выделения жира от 50 до 70°С и более высокое количество выделяемого жира (от 50 до 80%). При высокой концентрации белка и низкой концентрации лецитина гели с более насыщенными жирными кислотами обычно выделяют приблизительно на 10% больше жира, чем соответствующие гели, изготовленные с ненасыщенными жирами.
В некоторых вариантах осуществления обработка белковых компонентов протеазой перед образованием геля может приводить к увеличению выделения жира.
В некоторых вариантах осуществления матрица аналога жировой ткани, стабилизированная посредством сшивающих ферментов, выделяет больше жира, чем матрица аналога жировой ткани, стабилизированная денатурацией белка путем нагревания/охлаждения. В одном варианте осуществления матрица жировой ткани, состоящая из 8S белка бобов мунг и масла канолы, или из смеси масел кокосового ореха, какао, оливкового и пальмового масла в равных пропорциях, сохраняет больше массы при изготовлении способом денатурации нагреванием/охлаждением, чем при изготовлении путем сшивания с ферментом. В одном варианте осуществления матрица жировой ткани, изготовленная способом денатурации нагреванием/охлаждением предварительно изготовленной белково-масляной эмульсии, содержащей RuBisCo и масло какао, имеет более высокую температуру плавления, чем аналог жира с аналогичной композицией, которая стабилизирована сшивающим ферментом.
6
В некоторых вариантах осуществления аналоги жировой ткани, состоящие из 8S белка бобов мунг в количестве 1,4% вес./об. с маслом канолы 90% об./об. и соевым лецитином в количестве 0,45% вес./об., могут быть гомогенизированы в присутствии олеозинов подсолнечника в различной концентрации. Концентрация олеозинов может варьироваться от 1:10 до 1:10мольного соотношения олеозин:триглицерид. Наблюдается увеличение сохранения массы после кулинарной обработки при повышении концентрации олеозинов в аналогах жировой ткани.
Твердость аналога жировой ткани, изготовленного в виде стабилизированной белково-жировой эмульсии, может быть модифицирована путем изменения концентрации белка в матрице аналога жировой ткани. Например, ряд аналогов жировой ткани, изготовленных с вариабельной концентрацией RuBisCo, с подсолнечным маслом в количестве 70-80% об./об., имели разную твердость. Аналоги жировой ткани с содержанием RuBisCo 0% и 0,18% (вес./об.) были очень мягкими, тогда как аналоги, сделанные с 1,6% (вес./об.) RuBisCo, были мягкими, и аналоги, сделанные RuBisCo в количестве 1,9% (вес./об.), имели среднюю твердость.
В одном варианте осуществления твердость жирового аналога, изготовленного путем стабилизации белково-масляной эмульсии, может быть модифицирована путем изменения количества белка в жировом аналоге. В одном варианте осуществления аналоги жировой ткани, изготовленные из RuBisCo и 70% подсолнечного масла, были более мягкими при более низких концентрациях RuBisCo в аналогах жировой ткани, например, 1%, чем при более высоких концентрациях RuBisCo, например, 3%.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способам получения аналога жира. Жир может быть выделен и гомогенизирован. Например, можно использовать смесь органических растворителей, чтобы облегчить растворение липида в гель, и затем удалить эти растворители для получения конечного геля. В этот момент липид может быть заморожен, лиофилизирован или оставлен для хранения. Таким образом, в одном аспекте изобретение относится к способу выделения и хранения липид, который был выбран с наличием свойств, аналогичных свойствам животного жира. После этого липидный пирог или пленку можно подвергать гидратации. При гидратации можно применять взбалтывание или изменения температуры. Гидратация может происходить в растворе - прекурсоре геля. После гидратации суспензию липидов можно обрабатывать ультразвуком, гомогенизировать, гомогенизировать под высоким давлением или экструдировать для дополнительного изменения свойств липида в растворе.
В некоторых вариантах осуществления жировой аналог сформирован таким образом, чтобы он имел близкое сходство со структурой жировой ткани в мясе. В некоторых вариантах осуществления некоторые или все из компонентов жирового аналога суспендированы в геле (например, в белковом геле). В других вариантах осуществления гель может представлять собой гидрогель, органогель или ксерогель. В некоторых вариантах осуществления гель может быть загущен до желаемой консистенции с помощью вещества на основе полисахаридов или белков. Например, могут быть использованы крахмал fecula, маранта, кукурузный крахмал, катакури-крахмал, картофельный крахмал, саго, тапиока, альгинин, гуаровая камедь, камедь рожкового дерева, ксантановая камедь, коллаген, яичные белки, фурцелларан, желатин, агар, каррагинан, целлюлоза, метилцеллюлоза, гидроксиметилцеллюлоза, гуммиарабик, конжек, крахмал, пектин, амилопектин или белки, полученные из бобов, зерна, орехов, других семян, из листьев, водорослей, бактерий, грибов, и использованы по отдельности или в комбинации для загущения геля, образуя форму или структуру пригодного к потреблению материала.
В некоторых вариантах осуществления прочность на разрыв жирового аналога имитирует предел прочности жировой ткани. Предел прочности на разрыв гелеобразных эмульсий может быть увеличен путем включения волокон. Волокна могут быть получены из неживотных источников, включающих без ограничения арбуз, джекфрут, сквош, кокос, зеленые нитчатые водоросли, кукурузу и/или хлопок. В некоторых вариантах осуществления волокна получают путем ауто-полимеризации белков, например, олеозинов и проламинов. В некоторых вариантах осуществления волокна получены из электроформованных или экструдированных белков. Волокна могут образовывать трехмерную сеть или нити, при этом каждое волокно может иметь диаметр меньше 1 мм.
Жировой аналог может представлять собой эмульсию, содержащую раствор одного или нескольких белков и одного или нескольких жиров, суспендированных в ней в виде капелек. При медленном добавлении масляной фазы к водной фазе можно достичь более надежного эмульгирования и предотвратить случайные сбои при эмульгировании. В некоторых случаях добавление лецитина может дестабилизировать эмульсию, стабилизированную белком, что позволяет повысить выход жира при кулинарной обработке аналога. В некоторых вариантах осуществления эмульсию в геле стабилизируют с помощью одного или несколько сшивающих ферментов. В некоторых вариантах осуществления эмульсию стабилизируют с помощью матрицы, образованной белками, которые были доведены до состояния геля с помощью технологии нагревания/охлаждения или технологии отверждения геля на холоде. Нагревание стабилизированной белками эмульсии может вызвать термическую денатурацию белков, приводящую к увеличению твердости жирового аналога. Нагревание до достаточной температуры также может снизить жизнеспособность естественной микрофлоры по меньшей мере в 100 раз. В некоторых вариантах осуществления эмульсию стабилизируют с помощью гелеобразной белковой матрицы, образованной комбинацией одного или нескольких белковых сшивающих ферментов и технологии нагревания/охлаждения или технологии отверждения геля на холоде. После достаточного охлаждения эмульсии, но перед завершением желирования можно добавлять один или несколько дополнительных ингредиентов, например, гем-содержащий белок (например, в количестве приблизительно до 0,4%, например, 0,15, 0,2, 0,25, 0,3 или 0,4%), с получением жира розового цвета с более естественным внешним видом, и/или одно или несколько вкусовых соединений, таких как аминокислоты, сахара, тиамин или фосфолипиды, чтобы обеспечить улучшенный вкус конечного продукта.
Один или несколько белков в растворе могут содержать выделенные и очищенные белки, например, обогащенную фракцию очищенного альбумина гороха, обогащенную фракцию очищенного глобулина гороха, обогащенную фракцию очищенного 8S глобулина бобов мунг и/или обогащенную фракцию RuBisCo. В других вариантах осуществления один или несколько жиров получают из масел растительного происхождения (масло из рисовых отрубей или масло канолы). См., например, раздел III C. В некоторых случаях композиция содержит сшивающий фермент, такой как трансглутаминаза, лизилоксидаза или другая аминоксидаза. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления аналоги жировой ткани могут быть изготовлены путем выделения и очистки одного или несколько белков; приготовления раствора, содержащего один или несколько белков; эмульгирования одного или нескольких жиров в растворе; и стабилизации раствора в гелеобразной эмульсии с одним или несколькими сшивающими реагентами.
В некоторых вариантах осуществления жировой аналог представляет собой эмульсию с высоким содержанием жиров, содержащую белковый раствор очищенного альбумина гороха, которая эмульгирована с маслом из рисовых отрубей в количестве от 40 до 80%, и в геле стабилизирована трансглутаминазой в количестве от 0,5 до 5% (вес./об.).
В некоторых вариантах осуществления жировой аналог представляет собой эмульсию с высоким содержанием жиров, содержащую белковый раствор выделенного 8S глобулина бобов мунг, которая эмульгирована с маслом из рисовых отрубей в количестве от 40 до 80%, или с маслом канолы в количестве от 40 до 80%, и в геле стабилизирована трансглутаминазой в количестве от 0,5 до 5% (вес./об.).
Жир может быть выделен из растительных тканей и эмульгирован. При эмульгировании могут применяться высокоскоростное смешивание, гомогенизация, гомогенизация под высоким давлением, обработка ультразвуком, деформация сдвигом, взбалтывание или изменения температуры. Липидную суспензию можно обрабатывать ультразвуком или экструдировать для дополнительного изменения свойств липида в растворе. При этом в некоторых вариантах осуществления к раствору добавляют другие компоненты пригодного к потреблению материала с последующим добавлением гелеобразующего вещества. В некоторых вариантах осуществления добавляют сшивающие вещества (например, трансглутаминазы или лизилоксидазы) для связывания компонентов в пригодном к потреблению материале. В других вариантах осуществления добавляют гелеобразующее вещество и после этого липидно-гелевую суспензию объединяют с дополнительными компонентами пригодного к потреблению материала.
РЕГУЛЯЦИЯ ТЕМПЕРАТУРЫ ПЛАВЛЕНИЯ ПУТЕМ РЕГУЛЯЦИИ ЖИРОВОЙ КОМПОЗИЦИИ
Кулинарная обработка мяса является неотъемлемой частью практического использования и наслаждения мясом. Важным свойством мяса является то, что по мере нагревания из мяса выделяются жиры, которые смазывают приготовляемую поверхность и увеличивают теплоотдачу, и эти жиры представляют собой компонент визуальных, слуховых и обонятельных ощущений приготовления мяса. Количество жира, который выделяется при кулинарной обработке, в отличие от количества сохраняющегося в это время жира, зависит от температуры приготовления и способствует появлению визуальных, слуховых и обонятельных ощущений приготовляемого мяса.
Композиция и соотношение жирных кислот в триглицеридах и фосфолипидах, а также соотношения полярных головных групп фосфолипидов способствуют созданию различных вкусовых профилей приготовленного мяса. Например, повышенное содержание фосфатидилхолина и фосфатидилэтаноламина в жире обеспечивает более интенсивный аромат говядины. Как описано выше, вкус аналога мяса может быть модифицирован путем изменения соотношений и типа различных масел и фосфолипидов, которые входят в состав аналога мяса. Например, вкус приготовленного аналога мяса можно регулировать путем изменения количества фосфолипидов, стеринов и липидов (например, от 0,2 до 1% вес./вес.). В одном варианте осуществления вкус приготовленного аналога мяса можно регулировать путем изменения соотношения различных полярных головных групп фосфолипидов.
В некоторых вариантах осуществления фосфолипиды содержат множество амфипатических молекул, содержащих жирные кислоты, глицерин и полярные группы. См., например, в разделе III C примеры жирных кислот, фосфолипидов, полярных групп и стеринов, связанных с фосфолипидами. См. также в разделе III C примеры полезных растительных масел.
В разных кусках мяса жир имеет различные свойства, начиная от структурно значимого характера жира в беконе до характера мягкого плавления мраморного жира в говядине Вагю.
Контролируя температуру плавления аналогов жировой ткани в пригодных к потреблению материалах, можно на практике имитировать кулинарную обработку различных типов мяса. Например, аналоги жировой ткани, созданные из жиров с температурой плавления от 23°С до 27°С, могут иметь температуру плавления, аналогичную жировой ткани в говядине Вагю; аналоги жировой ткани, созданные из жиров с температурой плавления от 35°С до 40°С, могут иметь температуру плавления, аналогичную жировой ткани из стандартного говяжьего фарша; и аналоги жировой ткани, созданные из жиров с температурой плавления от 36°С до 45°С, могут иметь температуру плавления, аналогичную жировой ткани из бекона. Аналоги жировой ткани могут быть изготовлены и включены в состав пригодных к потреблению материалов, таким образом, что относительное количество выделенного жира и относительное количество жира, который остается в аналоге жировой ткани при его кулинарной обработке, будет аналогично свойствам жира в мясе, например, в говяжьем фарше.
В некоторых вариантах осуществления температура выделения жирового аналога может регулироваться путем смешивания в различных соотношениях растительных масел, содержащих триацилглицериды и фосфолипиды (например, лецитин). Температура плавления жиров регулируется химической композицией жирных кислот. В целом, жиры, содержащие насыщенные жирные кислоты (например, C10:0, C12:0, C14:0, C16:0, C18:0, C20:0, C22:0), являются твердыми при температуре холодильника (например, от приблизительно 1°С до приблизительно 5°С) и при комнатной температуре (например, от приблизительно 20°С до 25°С). Путем регулирования температуры выделения жира при кулинарной обработке аналога жировой ткани можно регулировать твердость аналога жировой ткани при его хранении в холодильнике (например, от приблизительно 1,5°С до приблизительно 4°С) и при комнатной температуре (например, от приблизительно 20°С до 25°С). Жиры, содержащие мононенасыщенные жирные кислоты (например, С16:1 или C18:1), обычно являются твердыми при температуре холодильника, и жидкими при комнатной температуре. Жиры, содержащие полиненасыщенные жирные кислоты (например, С18:2, С18:3, С20:5 или С22:6), обычно являются жидкими при температуре холодильника и при комнатной температуре. Например, кокосовое масло плавится приблизительно при 24°С, а гидрогенизированное кокосовое масло плавится при температуре от 36 до 40°С.
Например, содержащие триглицериды и фосфолипиды аналоги жировой ткани, которые являются жидкими при комнатной температуре (от приблизительно 20°С до 25°С), будут более мягкими, чем аналоги жировой ткани, содержащие триглицериды и фосфолипиды, которые являются твердыми при температуре холодильника.
Аналоги жировой ткани могут содержать масла из одного или нескольких источников, которые являются жидкими и при температуре холодильника и при нормальной комнатной температуре (например, масло канолы, подсолнечное масло и/или масло фундука). В одном варианте осуществления аналог жировой ткани содержит масла из одного или нескольких источников, и эти масла являются твердыми при температуре холодильника, но жидкими при комнатной температуре (например, оливковое масло, пальмовое масло и/или масло из рисовых отрубей). В одном варианте осуществления аналог жировой ткани содержит масла из одного или нескольких источников, и эти масла являются твердыми при комнатной температуре, но жидкими при температуре ротовой полости (приблизительно 37°С) (например, пальмовое масло, кокосовое масло и/или масло какао). В одном варианте осуществления аналог жировой ткани содержит масла из одного или нескольких источников, и эти масла являются твердыми при температуре ротовой полости (приблизительно 37°С) (например, масло из манго).
В одном варианте осуществления аналог жировой ткани включает триглицериды и фосфолипиды с высоким соотношением насыщенных жирных кислот, и является более твердым, чем аналог жировой ткани, имеющий большее относительное содержание мононенасыщенных и полиненасыщенных триглицеридов и липидов. Например, аналог жировой ткани, содержащий подсолнечное масло, является более мягким, чем аналог жировой ткани, содержащий масло какао. Можно делать аналоги жировой ткани, содержащие 0%, 0,18%, 1,6% или 2,4% вес./об. RuBisCo, с подсолнечным маслом или маслом какао в количестве 70%, 80% или 90% об./об.. Каждый из аналогов жировой ткани, который содержит масло какао, является более твердым, чем аналоги, изготовленные с подсолнечным маслом.
В одном варианте осуществления аналог жировой ткани, изготовленный в виде стабильной эмульсии 8S белка бобов мунг с подсолнечным маслом, является более мягким, чем аналог жировой ткани, изготовленный в виде стабильной эмульсии 8S белка бобов мунг и масло какао. Аналоги жировой ткани, сделанные с 8S белком бобов мунг в количестве 2%, 1% или 0,5% вес./об., содержат 70%, 80% или 90% об./об. подсолнечного масла или масла какао. Каждый из аналогов жировой ткани, который содержит масло какао, является более твердым, чем аналоги, изготовленные с подсолнечным маслом.
В одном варианте осуществления аналог жировой ткани, изготовленный в виде стабильной эмульсии 8S белка бобов мунг с маслом канолы, является более мягким, чем аналог жировой ткани, изготовленный в виде стабильной эмульсии 8S белка бобов мунг со смесью масел кокосового ореха, какао, оливкового масла и пальмового масла в равных пропорциях. Аналог жировой ткани может быть сделан с 1,4% вес./об. 8S белка бобов мунг, с содержанием 50%, 70% или 90% об./об. подсолнечного масла или смеси масел. Каждый из аналогов жировой ткани, содержащий смесь масел, является более твердым, чем аналоги, изготовленные с подсолнечным маслом.
В одном варианте осуществления аналог жировой ткани, изготовленный в виде стабильной эмульсии соевых белков с подсолнечным маслом, является более мягким, чем аналог жировой ткани, изготовленный в виде стабильной эмульсии соевых белков и масла какао. Аналоги жировой ткани, сделанные с 0,6%, 1,6% или 2,6% вес./об. сои, содержали 50%, 70%, 80% или 90% об./об. подсолнечного масла или смеси масел. Каждый из аналогов жировой ткани, содержащий смесь масел, является более твердым, чем аналог, сделанный с подсолнечным маслом.
В некоторых вариантах осуществления аналоги жировой ткани, содержащие 0%, 0,18%, 1,6% и 2,4% вес./об. RuBisCo с какао-маслом в количестве 70%, 80% и 90% об./об., являются твердыми при комнатной температуре, но плавятся приблизительно при температуре ротовой полости. В некоторых вариантах осуществления аналоги жировой ткани, содержащие сою в количестве 0,6%, 1,6% и 2,6% вес./об. и 50%, 70%, 80% и 90% об./об. какао-масла, являются твердыми при комнатной температуре, но плавятся приблизительно при температуре ротовой полости. В некоторых вариантах осуществления аналоги жировой ткани, содержащие 1,4% вес./об. 8S белка бобов мунг и 50%, 70% и 90% об./об. смеси масел кокосового ореха, какао, оливкового и пальмового масла, в равных пропорциях являются твердым при комнатной температуре, но плавятся приблизительно при температуре ротовой полости. В одном варианте осуществления температура плавления аналогов жировой ткани будет такой же, как у говяжьего жира. В некоторых вариантах осуществления аналоги жира содержат масла с соотношением насыщенных и ненасыщенных жирных кислот 1:1. В некоторых вариантах осуществления аналог жировой ткани содержит равные количества масла какао и масла манго. В некоторых вариантах осуществления аналог жировой ткани содержит равные количества кокосового масла, масло какао, оливкового масла и пальмового масла.
В одном варианте осуществления аналог жировой ткани, содержащий триглицериды и фосфолипиды, имеет соотношение жирных кислот, аналогичное этим пропорциям в говядине (С14:0 от 0 до 5% вес./вес., С16:0 от 0 до 25%, С18:0 от 0 до 20%, С18:1 от 0 до 60%, С18:2 от 0 до 25%, С18:3 от 0 до 5%, С20:4 от 0 до 2% и С20:6 от 0 до 2%). Например, аналог жировой ткани может содержать оливковое масло, масло какао, кокосовое масло и масло манго в равных пропорциях. В другом примере аналог жировой ткани может содержать оливковое масло и масло из рисовых отрубей в равных пропорциях.
В одном варианте осуществления температура плавления аналогов жировой ткани будет такой же, как у жира из говядины Вагю. В некоторых вариантах осуществления аналоги жира содержат масла с соотношением насыщенных и ненасыщенных жирных кислот 1:2 (например, 1 часть кокосового масла на 2 части подсолнечного масла). В некоторых вариантах осуществления аналог жировой ткани содержит равные количества оливкового масла, масла из рисовых отрубей, масла какао и масла манго.
I. АНАЛОГИ СОЕДИНИТЕЛЬНОЙ ТКАНИ
Животная соединительная ткань обладает ключевыми структурными свойствами, которые являются важным компонентом ощущений при поедании мяса. Таким образом, настоящее изобретение относится к композиции, полученной из неживотных источников, которая воспроизводит основные свойства животной соединительной ткани. Настоящее изобретение дополнительно относится к продукту-заменителю мяса, который содержит композицию, полученную из неживотных источников, имитирующую важные структурные и визуальные свойства животной соединительной ткани. Такие композиции называются в настоящем изобретении "аналогами соединительной ткани". В некоторых вариантах осуществления аналоги соединительной ткани и/или продукт-заменитель мяса, содержащий аналог соединительной ткани, частично получены из животных источников.
В животной соединительной ткани в целом можно выделить ткани фасциального типа и ткани хрящевого типа. Ткани фасциального типа являются очень волокнистыми, устойчивыми к растяжению (имеют высокий модуль упругости), и имеют высокое содержание белка, умеренное содержание воды (приблизительно 50%) и содержание жира и полисахарида от низкого до отсутствия. Таким образом, настоящее изобретение относится к аналогу соединительной ткани, который имитирует основные свойства ткани фасциального типа. В некоторых вариантах осуществления аналог соединительной ткани содержит приблизительно 50% белка от общей массы, приблизительно 50% жидкости по массе, и имеет низкое содержание жирового и полисахаридного компонента.
Фиброзная структура соединительной ткани фасциального типа в значительной степени состоит из коллагеновых волокон. Выявлено, что коллагеновые волокна представляют собой структуры в форме тяжей или лент от 1 до 20 мкм в ширину. Эти волокна состоят из плотно упакованных тонких коллагеновых фибрилл от 30 до 100 нанометров. Эти фибриллы также собраны в упругие ретикулярные фиброзные сети с отдельными волокнами, которые могут иметь толщину 200 нанометров.
В одном варианте осуществления аналог соединительной ткани фасциального типа состоит из фиброзной или фиброзо-подобной структуры, которая может состоять из белков. В некоторых вариантах осуществления белковое содержимое получено из неживотного источника (например, из растительного источника, водорослей, бактерий или грибов, см., например, разделы III A и В). В некоторых вариантах осуществления выделенные белки составляют 50%, 60%, 70%, 80%, или 90% или больше от веса белкового содержимого. В некоторых вариантах осуществления несколько выделенных белков выделены и очищены по отдельности и входят в состав общего белкового содержимого.
В соединительной ткани фасциального типа белки семейства проламинов, по отдельности или в комбинации, проявляют пригодность в качестве белкового компонента, поскольку эти белки очень многочисленны, обладают сходством с коллагеном по общей аминокислотной композиции (имеют большие фракции пролина и аланина) и поддаются обработке с получением пленки. В некоторых вариантах осуществления белки семейства проламинов выбраны из группы, состоящей из зеина (содержится в кукурузе), гордеина из ячменя, глиадина из пшеницы, секалина, экстензинов из ржи, кафирина из сорго или авенина из овса. В некоторых вариантах осуществления один или несколько выделенных и очищенных белков представляют собой зеин. В некоторых вариантах осуществления для достижения целевых требований к физико-химическим и питательным свойствам в дополнение к проламинам могут быть использованы другие белки. См. перечень в разделах III A и В, включающий основные запасные белки семян, коллаген животного или рекомбинантного происхождения, или экстензины (богатые гидроксипролином гликопротеины, в большом количестве присутствующие в клеточных стенках, например, Arabidopsis thaliana, мономеры которых представляют собой "коллагено-подобные" стержне-подобные гибкие молекулы).
Белки можно подвергать сублимационной сушке и измельчению и объединять с одним или несколькими другими ингредиентами (например, с глютеном пшеницы, волокном, таким как бамбуковое волокно, или соевым белковым изолятом).
Фиброзные или фиброзо-подобные структуры могут быть образованы путем экструзии. В некоторых вариантах осуществления экструзию можно осуществлять с использованием двухшнекового экструдера с одновременным вращением Leistritz Nano-16 (American Leistritz Extruder Corp. USA, Sommerville, NJ). Для оптимизации механических свойств, степени набухания и содержания воды в волокнах применяется активный подогрев и охлаждение секции корпуса. Например, содержание воды может быть отрегулировано приблизительно до 50% для получения жесткого аналога соединительной ткани. Подачу белков и жидкости осуществляют путем раздельного добавления: белок поступает из волюметрического поршневого фидера, и жидкость добавляют в корпус через систему впрыска жидкости под высоким давлением. В некоторых примерах использовались следующие параметры экструзии: скорость вращения шнека от 100 до 200 оборотов в минуту, температура продукта в головки 120°С, скорость подачи 2,3 г/мин и скорость расхода воды 0,7 г/мин. Температура продукта в головке во время экструзии измеряется с помощью термопары.
Фиброзные или фиброзо-подобные структуры могут быть образованы путем экструзии через нитевидные и мульти-нитевидные головки для производства волокнистых структур. В некоторых вариантах осуществления можно использовать головки, включающие множество штампов с различными размерами отверстий в диапазоне от 10 до 300 мкм, для создания аналогов в виде смешанных волокнистых тканей при строгом контроле размеров и композиции волокон. Волокна разных размеров могут быть включены в композиции для регуляции свойств композиций.
Электроформование можно применять для создания волокон с диаметром в диапазоне от 1 до 10 микронов. В некоторых вариантах осуществления электроформование применяется для создания волокон с диаметром в диапазоне от 1 до 10 мкм. Например, концентрированный раствор глобулина бобов мунг (140 мг/мл), содержащий 400 мМ хлорида натрия, может быть смешан с раствором поливинилового спирта или полиэтиленоксида (9% вес./об.) для получения смешанных растворов с 22,5 мг/мл глобулина бобов мунг и соответствующего полимера в количестве 6,75% вес./об.. Полученный раствор медленно нагнетают (например, со скоростью 3 мкл/мин) с помощью шприцевого насоса, шприцем 5 мл через тефлоновую трубку и затупленную иглу 21 калибра. Игла соединена с положительным полюсом источника высокого напряжения (например, Spellman CZE, 30 кВ) и фиксирована на 20-30 см от коллекторного электрода. Коллекторный электрод представляет собой алюминиевый барабан (приблизительно 12 см в длину, диаметр 5 см), который обернут алюминиевой фольгой. Барабан прикреплен к шпинделю, который вращается посредством мотора IKA RW20 со скоростью приблизительно 600 оборотов в минуту. Шпиндель соединен с выводом заземления источника высокого напряжения. Белково-полимерное волокно собирается на фольге и после завершения электроформования удаляется с фольги и добавляется к аналогу ткани.
Размер и композиция волокон, полученных с помощью способов по изобретению, оказывают влияние на вкус, текстуру и механические свойства аналога ткани. Ткани, содержащие от 1 до 50% волокон в диапазоне от 1 до 10 мкм и от 10 до 50% волокон в диапазоне от 10 до 300 мкм, являются наиболее близкими к животной соединительной ткани с точки зрения вкуса, вкусовых ощущений и механических свойств.
Ткани хрящевого типа являются макроскопически однородными, устойчивыми к сжатию, имеют высокое содержание воды (до 80%), низкое содержание белка (коллагена) и высокое содержание полисахаридов (протеогликанов) (приблизительно по 10% каждого). Композиционно аналоги соединительной ткани хрящевого типа похожи на аналоги ткани фасциального типа, и можно подбирать относительные соотношения каждого аналога для более точной имитации "мясной" соединительной ткани. Во время экструзии можно регулировать содержание воды приблизительно до 60% для получения аналога мягкой соединительной ткани.
Способы изготовления соединительной ткани хрящевого типа, аналогичны для соединительной ткани фасциального типа, но предпочтительными являются способы, с помощью которых производят изотропные неволокнистые гели.
Аналоги соединительной ткани могут быть изготовлены путем выделения и очистки одного или несколько белков; и преципитации одного или нескольких белков, при этом преципитация приводит к получению одного или нескольких белков, образующих физическую структуру, близкую к физической структуре соединительной ткани. Преципитация может содержать солюбилизацию одного или нескольких белков в первом растворе; и экструдирование первого раствора во второй раствор, при этом один или несколько белков нерастворимы во втором растворе, и при этом экструдирование вызывает преципитацию одного или нескольких белков.
В некоторых вариантах осуществления некоторые или все из компонентов пригодного к потреблению материала суспендированы в геле (например, в белковоподобном геле). В различных вариантах осуществления гель может представлять собой гидрогель, органогель или ксерогель. Гель может быть загущен с помощью вещества на основе полисахаридов или белков. Например, могут быть использованы крахмал fecula, маранта, кукурузный крахмал, крахмал катакури, картофельный крахмал, саго, тапиока, альгинин, гуаровая камедь, камедь рожкового дерева, ксантановая камедь, коллаген, яичные белки, фурцелларан, желатин, агар, каррагинан, целлюлоза, метилцеллюлоза, гидроксиметилцеллюлоза, гуммиарабик, конжек, крахмал, пектин, амилопектин или белки, полученные из бобов, зерна, орехов и других семян, из листьев, водорослей, бактерий, грибов, по отдельности или в комбинации, для загущения геля, образования формы или структуры пригодного к потреблению материала. Также могут быть использованы ферменты, которые катализируют реакции, приводящие к ковалентной сшивке между белками, по отдельности или в комбинации, чтобы создать форму или структуру пригодного к потреблению материала. Например, могут быть использованы трансглютаминазы, тирозиназы, лизилоксидазы или другие аминоксидазы (например, лизилоксидазы Pichia pastoris (PPLO)) по отдельности или в комбинации, чтобы создать форму или структуру пригодного к потреблению материала путем сшивания белковых компонентов. В некоторых вариантах осуществления комбинируют несколько гелей с различными компонентами с образованием пригодного к потреблению материала. Например, гель, содержащий белок растительного происхождения, можно соединять с гелем, содержащим жир растительного происхождения. В некоторых вариантах осуществления волокна или полоски белков ориентированы параллельно друг другу, и затем зафиксированы путем применения геля, содержащего жиры на растительной основе.
Композиции по изобретению можно делать воздушными или расширять их путем нагревания, например, с помощью жарки, выпечки, СВЧ-нагревания, нагревания в принудительной воздушной системе, нагревания в аэродинамической трубе и т.п., в соответствии со способами, хорошо известными в данной области.
В некоторых вариантах осуществления соединяют несколько гелей с различными компонентами для образования пригодного к потреблению материала. Например, гель, содержащий белок растительного происхождения, может быть связан с гелем, содержащим жир растительного происхождения. В некоторых вариантах осуществления волокна или полоски белков ориентированы параллельно друг другу, а затем зафиксированы путем применения геля, содержащего жиры на растительной основе.
J. ИСКЛЮЧЕНИЯ ИЗ КОМПОЗИЦИЙ
Поскольку пригодный к потреблению материал можно собрать из определенных ингредиентов, которые сами по себе могут быть выделенными и очищенными, можно производить пригодный к потреблению материал, который не содержит определенных компонентов. В некоторых случаях это позволяет получать пригодный к потреблению материал с отсутствием ингредиентов, которые могут быть нежелательными для потребителей (например, можно исключать белки, на которые у некоторых людей существует аллергия, или добавки). В некоторых вариантах осуществления пригодный к потреблению материал не содержит продуктов животного происхождения. В некоторых вариантах осуществления пригодный к потреблению материал не содержит или содержит менее 1% глютена пшеницы. В некоторых вариантах осуществления пригодный к потреблению материал не содержит метилцеллюлозу. В некоторых вариантах осуществления пригодный к потреблению материал не содержит каррагинана. В некоторых вариантах осуществления пригодный к потреблению материал не содержит карамельного красителя. В некоторых вариантах осуществления пригодный к потреблению материал не содержит конжековой муки. В некоторых вариантах осуществления пригодный к потреблению материал не содержит гуммиарабика (также называемого аравийской камедью). В некоторых вариантах осуществления пригодный к потреблению материал не содержит глютена пшеницы. В некоторых вариантах осуществления пригодный к потреблению материал не содержит соевого белкового изолята. В некоторых вариантах осуществления пригодный к потреблению материал не содержит тофу. В некоторых вариантах осуществления пригодный к потреблению материал содержит менее 5% углеводов. В некоторых вариантах осуществления пригодный к потреблению материал содержит менее 1% целлюлозы. В некоторых вариантах осуществления пригодный к потреблению материал содержит менее 5% целлюлозы. В некоторых вариантах осуществления пригодный к потреблению материал содержит менее 5% нерастворимых углеводов. В некоторых вариантах осуществления пригодный к потреблению материал содержит менее 1% нерастворимых углеводов. В некоторых вариантах осуществления пригодный к потреблению материал не содержит искусственных красителей. В некоторых вариантах осуществления пригодный к потреблению материал не содержит искусственных вкусовых добавок.
В некоторых вариантах осуществления пригодный к потреблению материал имеет одно или несколько из следующих свойств: отсутствие продуктов животного происхождения, отсутствие метилцеллюлозы, отсутствие каррагинана, отсутствие конжековой муки, отсутствие гуммиарабика, менее 1% глютена пшеницы, отсутствие глютена пшеницы, отсутствие тофу, приблизительно 5% углеводов, менее 5% целлюлозы, менее 5% нерастворимых углеводов, менее 1% нерастворимых углеводов, отсутствие пищевых красителей, таких как карамельный краситель, паприка, корица, свекольный краситель, масло моркови, экстракт томатного ликопина, порошок малины, кармин, экстракт кошенили, аннато, куркума, шафран, FD&C Red № 3, желтый № 5, желтый № 6, зеленый № 3, голубой № 2, синий № 1, фиолетовый № 1, FD&C Red № 40 - Allura Red AC и/или E129 (красный оттенок), и/или отсутствие искусственных вкусовых добавок. В некоторых вариантах осуществления пригодный к потреблению материал не содержит соевого белкового изолята. В других вариантах осуществления пригодный к потреблению материал не содержит соевого белка или белкового концентрата.
В некоторых вариантах осуществления аналог мышечной ткани дополнительно содержит глютен пшеницы в количестве менее 10%, менее 5%, менее 1% или менее 0,1%. В некоторых вариантах осуществления аналог мышечной ткани не содержит глютена пшеницы.
IV. Комбинации компонентов
A. АНАЛОГИ МЯСА
Продукт-заменитель мяса (по другому называемый аналогом мяса) может содержать описанные в изобретении композиции. Например, аналог мяса может содержать аналог мышечной ткани, аналог жировой ткани и аналог соединительной ткани (или их субкомбинации). Аналог мышечной ткани, аналог жировой ткани и/или аналог соединительной ткани могут быть собраны таким образом, чтобы приблизительно соответствовать физической структуре мяса. В некоторых вариантах осуществления используется связывающее вещество, такое как коацерват, которое способствует связыванию аналогов друг с другом.
Можно также регулировать процент различных компонентов. Например, можно комбинировать заменители мышечной ткани, жировой ткани, соединительной ткани и заменители компонентов крови на неживотной основе, имеющие различную физическую структуру и в различных соотношениях, для максимального сходства с внешним видом и ощущением мяса. Разные компоненты могут быть сделаны со структурой, обеспечивающей плотность при разжевывании пригодного к потреблению материала. Структура компонентов может быть сделана с гарантией отсутствия каких-либо отходов из пригодного к потреблению материала. Например, обычный кусок мяса может иметь части, которые обычно не употребляются в пищу, поэтому аналоги мяса могут иметь улучшенные свойства по сравнению с мясом, так как в них не включены несъедобные части (например, кости, хрящи, соединительная ткань или другие материалы, обычно называемые хрящами). Такое улучшение позволяет употребить весь изготовленный или поставляемый продукт, что сокращает количество отходов и расходы по доставке. Альтернативно, аналоги мяса могут включать несъедобные части, чтобы имитировать ощущение поедания мяса. Такие части могут включать кости, хрящи, соединительные ткани или другие материалы, обычно называемые хрящами, или материалы, включенные для имитации этих компонентов. В некоторых вариантах осуществления пригодный к потреблению материал может содержать предназначенные для второстепенных функций имитации несъедобных частей мясных продуктов. Например, имитация кости может быть предназначена для распределения тепла во время кулинарной обработки, что ускоряет приготовление пригодного к потреблению материала или делает приготовление более равномерным, чем приготовление мяса. В других вариантах осуществления имитация кости может также служить для поддержания постоянной температуры в пригодном к потреблению материале во время транспортировки. В других вариантах осуществления имитации несъедобных частей могут быть биоразлагаемыми (например, представлять собой биоразлагаемый пластик).
В некоторых вариантах осуществления композиция заменителя мяса содержит от 10 до 30% белка, от 5 до 80% воды и от 5 от 70% жира, при этом композиция включает один или несколько выделенных и очищенных белков. Такой заменитель мяса может не включать животный белок. В некоторых вариантах осуществления композиции заменителей мяса содержат трансглутаминазу.
В некоторых вариантах осуществления продукт-заменитель мяса включает аналог мышечной ткани, аналог жировой ткани и аналог соединительной ткани, при этом аналог мышечной ткани составляет от 40 до 90% веса продукта, аналог жировой ткани составляет от 1 до 60% веса продукта, и аналог соединительной ткани составляет от 1 до 30% веса продукта.
В некоторых вариантах осуществления продукт-заменитель мяса содержит от 60 до 90% воды, от 5 до 30% белкового компонента и от 1 до 20% жира, при этом белковый компонент содержит один или несколько выделенных и очищенных растительных белков.
В некоторых вариантах осуществления пригодный к потреблению материал содержит компоненты, имитирующие компоненты мяса. Основным компонентом мяса обычно являются скелетные мышцы. Приблизительный состав скелетных мышц обычно представляет собой 75 процентов воды, 19 процентов белка, 2,5 процента внутримышечного жира, 1,2 процентов углеводов и 2,3 процента других растворимых небелковых веществ. Они включают органические кислоты, соединения серы, азотистые соединения, такие как аминокислоты и нуклеотиды, и неорганические вещества, такие как минералы. Таким образом, некоторые варианты осуществления настоящего изобретения относятся к созданию близких аналогов этой композиции для пригодного к потреблению материала. Например, в некоторых вариантах осуществления пригодный к потреблению материал представляет собой аналог мяса на растительной основе, содержащий приблизительно 75% воды, 19% белка, 2,5% жира, 1,2% углеводов и 2,3 процента других растворимых небелковых веществ. В некоторых вариантах осуществления пригодный к потреблению материал представляет собой аналог мяса на растительной основе, содержащий от приблизительно 60 до 90% воды, от 10 до 30% белка, от 1 до 20% жира, от 0,1 до 5% углеводов и от 1 до 10 процентов других растворимых небелковых веществ. В некоторых вариантах осуществления пригодный к потреблению материал представляет собой аналог мяса на растительной основе, содержащий от приблизительно 60 до 90% воды, от 5 до 10% белка, от 1 до 20% жира, от 0,1 до 5% углеводов и от 1 до 10 процентов других растворимых небелковых веществ. В некоторых вариантах осуществления пригодный к потреблению материал представляет собой аналог мяса на растительной основе, содержащий от приблизительно 0 до 50% воды, от 5 до 30% белка, от 20 до 80% жира, от 0,1 до 5% углеводов и от 1 до 10 процентов других растворимых небелковых веществ.
В некоторых вариантах осуществления аналог мяса содержит гем-содержащий белок в количестве от 0,01% до 5% веса. В некоторых вариантах осуществления аналог содержит легоглобин в количестве от 0,01% до 5% веса. Некоторые виды мяса также содержат миоглобин и гем-содержащий белок, которыми в основном обусловлены красный цвет и содержание железа в некоторых видах мяса. Следует понимать, что указанное процентное содержание в мясе может варьироваться, и можно производить аналоги мяса, близкие к естественным вариантам мяса. В вариантах осуществления, которые включают гем-содержащий белок и, необязательно, вкусовые добавки, можно использовать k-каррагинан для абсорбции части жидкости из вкусовой добавки и раствора гема, с тем, чтобы измельченная ткань не имела избыточной влаги. Во время добавления раствора смеси вкусовой добавки и гема равномерно распределяют порошок k-каррагинана по тканевой смеси, чтобы обеспечить однородность конечного измельченного продукта.
Следует понимать, что при поставке белков в виде раствора для концентрирования белка могут необязательно применяться способы удаления воды, такие как сублимационная сушка или распылительная сушка. Затем количество жидкости в белках можно восстанавливать, и это предотвращает наличие избыточной влаги в измельченной ткани.
Дополнительно, в некоторых случаях, настоящее изобретение относится к улучшенным аналогам мяса, которые имеют неестественное процентное содержание упомянутых компонентов. Концентрация гем-содержащего белка является важным фактором, определяющим мясной вкус и аромат. Так, например, аналог мяса может иметь более высокое содержание гем-белка, чем обычная говядина. Например, аналог мяса может быть изготовлен с более высоким содержанием жира, чем обычная средняя жирность. Процентное содержание упомянутых компонентов также может быть изменено для усиления других желаемых свойств.
В некоторых случаях аналог мяса разработан таким образом, что после кулинарной обработки процентное содержание компонентов аналогично их содержанию в приготовленном мясе. Так, в некоторых вариантах осуществления сырой пригодный к потреблению материал имеет отличное от сырого мяса процентное содержание компонентов, но после кулинарной обработки пригодный к потреблению материал становится похожим на приготовленное мясо. Например, можно делать аналог мяса с более высоким, чем обычно в сыром мясе, содержанием воды, при этом после приготовления в микроволновой печи в полученном продукте имеются некрахмальные полисахариды, такие как целлюлоза, арабиноксиланы и многие другие растительные компоненты, такие как резистентный крахмал, устойчивые декстрины, инулин, лигнин, воски, хитины, пектины, бета-глюканы и олигосахариды, с процентным содержанием этих компонентов, аналогичным для приготовленного на огне мяса.
В некоторых вариантах осуществления пригодный к потреблению материал является аналогом мяса с более низким содержанием воды, чем обычное содержание воды в мясе. В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способам гидратации аналога мяса, предназначенных для достижения сходства аналога мяса с мясом по содержанию воды. Например, аналоги мяса с содержанием воды, которое является низким для мяса, например, 1%, 10%, 20%, 30%, 40% или 50% воды, может подвергаться гидратации приблизительно до 75%-го содержания воды. После гидратации, в некоторых вариантах осуществления, аналог мяса затем подвергается кулинарной обработке для потребления человеком.
Пригодный к потреблению материал может иметь белковый компонент. В некоторых вариантах осуществления содержание белка в пригодном к потреблению материал составляет 10%, 20%, 30% или 40%. В некоторых вариантах осуществления содержание белка в пригодном к потреблению материале аналогично содержанию его в мясе. В некоторых вариантах осуществления в пригодном к потреблению материале содержится больше белка, чем в мясе. В некоторых вариантах осуществления в пригодном к потреблению материале содержится меньше белка, чем в мясе.
В пригодный к потреблению материал можно вводить белок из разных источников или из комбинации источников. Источники неживотного происхождения могут обеспечить часть белка или весь белок в пригодном к потреблению материале. Источники неживотного происхождения могут включать овощи, непищевую биомассу, например, морковную ботву и Miscanthus, морскую траву, фрукты, орехи, зерно, водоросли, бактерии и грибы. См., например, разделы III A и B. Белок может быть выделен или получен путем концентрации из одного или нескольких таких источников. В некоторых вариантах осуществления пригодный к потреблению материал представляет собой аналог мяса, который содержит белок, полученный только из неживотных источников.
В некоторых вариантах белок, предназначенный для включения в пригодный к потреблению материал, сформирован в асимметричные волокна. В некоторых вариантах осуществления эти волокна имитируют мышечные волокна. В некоторых вариантах осуществления белок представляет собой формованные волокна. Таким образом, настоящее изобретение относится к способам получения асимметричных или формованных белковых волокон. В некоторых вариантах осуществления пригодный к потреблению материал содержит белок или белки, которые имеют все выявленные в белках аминокислоты, которые необходимы для питания человека. В некоторых вариантах осуществления эти белки, добавленные в пригодный к потреблению материал, дополнены аминокислотами.
Реакции заменителя мяса на кулинарную обработку могут определяться таким фактором, как физическая структура. Например, вкус мяса модифицируется размером частиц. Мясной фарш, который был уварен до состояния пасты, создает другие вкусы при кулинарной обработке, чем более грубо измельченное мясо. Способность регулировать относительный размер и ориентацию отдельных аналогов ткани позволяет модифицировать профиль вкуса и аромата пригодных к потреблению материалов во время кулинарной обработки. Например, аналоги мышечной ткани и аналоги жировой ткани дают разные вкусы при раздельной кулинарной обработке или при их смешивании. Можно отметить дополнительные изменения вкусового профиля, в зависимости от способа, с помощью которого готовят смесь различных аналогов тканей.
Можно манипулировать с физической структурой продукта-заменителя мяса, регулируя локализацию, структуру, компоновку или ориентацию аналогов мышечной, жировой и/или соединительной ткани, описанных в изобретении. В некоторых вариантах осуществления продукт изготовлен таким образом, что описанные в изобретении аналоги связаны друг с другом, как в мясе. В некоторых вариантах осуществления пригодный к потреблению материал изготовлен таким образом, что после кулинарной обработки описанные в изобретении аналоги связаны друг с другом, как в приготовленном мясе.
Характерные вкусовые и ароматические компоненты мяса в основном создаются в ходе кулинарной обработки посредством химических реакций, субстратами для которых являются аминокислоты, жиры и сахара, содержащиеся в растениях, а также в мясе. Поэтому в некоторых вариантах осуществления пригодный к потреблению материал тестируют на сходство с мясом во время или после кулинарной обработки. В некоторых вариантах осуществления используются рейтинги людей, оценки людей, оценки по показаниям ольфактометра или по измерениям с помощью газовой хроматографии-масс-спектрометрии (ГХ-МС), или их комбинации, для создания обонятельной карты приготовленного мяса. Аналогичным образом можно создавать обонятельную карту пригодного к потреблению материала, например, аналогов мяса. Можно проводить сравнение этих карт на степень сходства с мясом пригодного к потреблению материала после его кулинарной обработки. В некоторых вариантах осуществления обонятельная карта пригодного к потреблению материала во время или после его кулинарной обработки аналогична или неотличима от обонятельной карты приготовленного мяса или мяса во время кулинарной обработки. В некоторых вариантах осуществления эти различия достаточно малы, чтобы быть ниже порога обнаружения человеческого восприятия.
В некоторых вариантах осуществления отдельные аналоги тканей собраны в слои, листы, блоки и полоски в определенных положениях и ориентациях.
В некоторых вариантах осуществления аналоги объединяются друг с другом при их пропускании через пластины измельчителя с установленным размером отверстий менее 1/2 дюйма (например, 1/4 дюйма). Измельчитель имеет несколько функций, которые состоят в уменьшении размера частиц, обеспечении дополнительного перемешивания или переработки и в формовании материала в виде цилиндрических порций, подобно обычному изготовлению мясного фарша. Во время объединения компонентов, их измельчения и формования важно поддерживать холодную температуру в аналогах ткани (например, 4-15°С), для контроля роста микробов, ограничения реакций вкусовых веществ, а также для поддержания жира в твердом состоянии, чтобы отдельные кусочки жира сохранялись в ходе измельчения.
Перед измельчением аналоги тканей обычно разделяются каким-либо образом на части с определенным размером частиц. Например, в некоторых вариантах осуществления отдельные аналоги тканей, перед их объединением с другими аналогами тканей, могут быть сформированы в мелкие кусочки менее 1 см в диаметре или менее 5 мм в диаметре. Жировую ткань можно измельчить на частицы размером от приблизительно 3 до 7 мм. Это имеет значение как для внешнего вида конечного материала, так и для характера вытекания жира во время кулинарной обработки. С помощью размеров в указанном диапазоне создается естественный внешний вид жировых вкраплений в конечном сыром продукте. Если частицы жировой ткани слишком маленькие (например, менее 2 мм), то при кулинарной обработке будет вытекать недостаточное количество жира из такого продукта.
Аналоги мягкой соединительной ткани могут быть разделены на кусочки приблизительно 1-3 мм в длину с неровными краями. Если частицы являются слишком большими (например, больше чем приблизительно 4 мм), текстура конечного продукта может быть излишне зернистой.
Аналоги липкой ткани или лентовидной ткани, состоящие из аморфных или длинных лентовидных фрагментов аналога ткани соответственно, и сырые аналоги ткани можно вручную разделять на кусочки от приблизительно 1 до 3 см в диаметре. Получение частиц с размерами в этом диапазоне позволяет выполнять надлежащее перемешивание и достигать приемлемой гомогенности в конечном измельченном материале.
В некоторых вариантах осуществления измельчение твердых аналогов соединительной ткани можно выполнять на трех уровнях (например, грубое, промежуточное и тонкое измельчение). Трехуровневое измельчение обеспечивает более высокую степень гетерогенности, чем способ одноэтапного измельчения, и создает вкусовые ощущения от конечного продукта, более похожие на ощущения от говяжьего фарша.
В композициях, содержащих глютен, дополнительной функцией пищевого измельчителя является переработка глютена и создание глютеновой сети из выровненных молекул глютена. Для глютен-содержащих композиций является важным минимизировать взаимодействие жира с глютеновой сетью. Это делается путем предварительного измельчения жировых аналогов и аналогов измельченной ткани перед их объединением, а также путем минимизации количества манипуляций после добавления жира. Излишняя переработка жировых аналогов в глютен будет разрушать или "укорачивать" глютеновую сеть.
Наконец, для глютен-содержащих композиций допускается их использование в котлетах, которые выстаиваются перед приготовлением при комнатной температуре в течение 30 минут или в течение ночи при 4°С. Это дает время для "отдыха" глютеновой сети, создавая в целом более приятную текстуру.
В некоторых вариантах осуществления аналог соединительной ткани вводится в белковый раствор перед образованием аналога мышечной ткани.
В некоторых вариантах осуществления аналог соединительной ткани вводится непосредственно в эмульсию перед образованием аналога жировой ткани.
В некоторых вариантах осуществления аналог жировой ткани добавляется к аналогу мышечной ткани в виде нитей и слоев для воспроизведения эффекта "мраморности" или полосатости бекона.
Смешанные аналоги мяса ткани могут усиливать ощущения от вкусовых веществ, и такие вкусовые вещества включают без ограничения множество ароматических соединений, связанных с ароматами фруктов/зеленых бобов/металлического привкуса, орехов/зелени, арахисового масла/плесени, сырого картофеля/жареного/землистого привкуса, уксуса, пряностей/карамели/миндаля, со сливочным, сладким, фруктовым ароматом/ароматом несвежего пива, затхлости/орехов/кумарина/солодки/фундука/хлеба, кокосовым/древесным/сладким, проникающим/тошнотворным, мятным ароматом или ароматом подрумяненной карамели.
В некоторых вариантах осуществления смешанные аналоги мяса увеличивают присутствие летучих ароматических веществ, таких как 2-пентил-фуран, 4-метилтиазол, этилпиразин, 2,3-диметилпиразин, уксусная кислота, 5-метил-2-фуранкарбоксальдегид, бутиролактон, 2,5-диметил-3-(3-метил-бутил)пиразин, 2-циклопентен-1-он, 2-гидрокси-3-метил, 3-ацетил-1H-пирролин, пантолактон, 1-метил-1(Н)-пиррол-2-2-карбоксальдегид, капролактам, 2,3-дигидро-3,5-дигидрокси-6-метил-4(Н)-пиран-4-он. В некоторых вариантах осуществления нежелательные вкусовые вещества включают без ограничения ароматы, напоминающие керосин, бензин, напоминающие прокисшую/гнилую рыбу, пресный аромат/деревянистый аромат/ароматы йогурта, жира/меда/цитрусовых, зелени и острый/сладкий/карамельный и ореховый/подгорелый ароматы, которые возникают только в отдельных аналогах тканей, но не накапливаются в смешанных аналогах мяса. В некоторых вариантах осуществления отдельные аналоги тканей увеличивают присутствие летучих ароматических веществ, включающих без ограничения нонан, 2,6-диметил-3-метил-3-гексен, пиридин, ацетоин, октаналь, 1-гидрокси-2-пропанон и/или этенилпиразин. В некоторых вариантах осуществления уровни содержания, в пределах которых во время кулинарной обработки накапливаются все из вышеуказанных соединений, зависят от размеров составных частиц в аналогах ткани и от способа их смешивания (грубая смесь, тонкая смесь или блендерная смесь).
В некоторых вариантах осуществления смешанные аналоги мясных тканей усиливают ощущение вкусов и ароматов, включающих без ограничения множество ароматических соединений, связанных с ароматами фруктов/зеленых бобов/металлического привкуса, орехов/зелени, арахисового масла/плесени, сырого картофеля/жареного/землистого привкуса, уксуса, пряностей/карамели/миндаля, со сливочным, сладким, фруктовым ароматом/ароматом несвежего пива, затхлости/орехов/кумарина/солодки/фундука/хлеба, кокосовым/древесным/сладким, проникающим/тошнотворным, мятным ароматом или ароматом подрумяненной карамели. В некоторых вариантах осуществления смешанные аналоги мяса увеличивают присутствие летучих ароматических веществ, включающих без ограничения фенилацетальдегид, 1-октен-3-он, 2-н-гептилфуран, 2-тиофенкарбоксальдегид, 3-тиофенкарбоксальдегид, бутиролактон, 2-ундеканаль, метилпиразин, фурфурол, 2-деканон, пиррол, 1-октен-3-ол, 2-ацетилтиазол, (Е)-2-октеналь, деканаль, бензальдегид, (Е)-2-ноненаль, пиразин, 1-гексанол, 1-гептанол, диметилтрисульфид, 2-нонанон, 2-пентанон, 2-гептанон, 2,3-бутандион, гептаналь, нонаналь, 2-октанон, 1-октанол, 3-этилциклопентанон, 3-октен-2-он, (E,Е)-2,4-гептадиеналь, (Z)-2-гептеналь, 2-гептанон, 6-метил-(Z)-4-гептеналь, (E,Z)-2,6-нонадиеналь, 3-метил-2-бутеналь, 2-пентил-фуран, тиазол, (Е,Е)-2,4-декадиеналь, гексановую кислоту, 1-этил-5-метилциклопентен, (Е,Е)-2,4-нонадиеналь, (Z)-2-деценаль, дигидро-5-пентил-2(3Н)-фуранон, транс-3-нонен-2-он, (Е,Е)-3,5-октадиен-2-он, (Z)-2-октен-1-ол, 5-этилдигидро-2(3Н)-фуранон, 2-бутеналь, 1-пентен-3-ол, (Е)-2-гексеналь, муравьиную кислоту, гептиловый эфир, 2-пентил-тиофен, (Z)-2-ноненаль, 2-гексил-тиофен, (Е)-2-деценаль, 2-этил-5-метил-пиразин, 3-этил-2,5-диметил-пиразин, 2-этил-1-гексанол, тиофен, 2-метил-фуран, пиридин, бутаналь, 2-этил-фуран, 3-метил-бутаналь, трихлорметан, 2-метил-бутаналь, метакролеин, 2-метил-пропаналь, пропаналь, ацетальдегид, 2-пропил-фуран, дигидро-5-пропил-2(3Н)-фуранон, 1,3-гексадиен, 4-децин, пентаналь, 1-пропанол, гептановую кислоту, триметил-этантиол, 1-бутанол, 1-пентен-3-он, диметилсульфид, 2-этилфуран, 2-пентил-тиофен, 2-акролеин, 2-тридецен-1-ол, 4-октен, 2-метилтиазол, метилпиразин, 2-бутанон, 2-пентил-фуран, 2-метил-пропаналь, бутиролактон, 3-метил-бутаналь, метил-тииран, 2-гексил-фуран, бутаналь, 2-метил-бутаналь, 2-метил-фуран, фуран, октаналь, 2-гептеналь, 1-октен, гептиловый эфир муравьиной кислоты, 3-пентил-фуран и 4-пентен-2-он. В некоторых вариантах осуществления уровни содержания, в пределах которых во время кулинарной обработки накапливаются все из вышеуказанных соединений, зависят от размеров составных частиц тканей и от способа их смешивания (грубая смесь, тонкая смесь или блендерная смесь).
Выработка летучих ароматических веществ может быть повышена, если аналоги жировой, мышечной и соединительной ткани будут контактировать друг с другом. В некоторых вариантах осуществления выработка летучих ароматических веществ усиливается при тщательном смешивании аналогов жировой, мышечной и соединительной ткани, при среднем размере отдельного тканевого аналога 5 мм. В некоторых вариантах осуществления выработка летучих ароматических веществ усиливается, когда аналоги жировой, мышечной и соединительной ткани тщательно смешивают, при среднем размере отдельного тканевого аналога 2 мм. В некоторых вариантах осуществления указанная выработка летучих ароматических веществ усиливается, когда аналоги жировой, мышечной и соединительной ткани тщательно смешивают, при среднем размере отдельного тканевого аналога 1 мм.
В некоторых вариантах осуществления заменитель мяса оптимизирован для конкретных способов кулинарной обработки (оптимизирован для приготовления в микроволновой печи, или оптимизирован для приготовления способом тушения).
В некоторых вариантах осуществления заменитель мяса оптимизирован для дегидратации.
В некоторых вариантах осуществления указанный заменитель мяса оптимизирован для быстрой регидратации при воздействии воды на обезвоженный аналог мяса.
В некоторых вариантах осуществления указанный заменитель мяса оптимизирован для использования в качестве питания при чрезвычайных ситуациях, для туристического или космического питания.
Описанные в изобретении способы могут быть использованы для получения аналога мяса с определенными кулинарными характеристиками, позволяющими производить аналог мяса, оптимизированный для конкретных способов приготовления. Например, для тушения требуется медленное приготовление в целях желирования соединительной ткани в мясе, то есть могут быть разработаны аналоги мяса, в которых аналог соединительной ткани легче поддается желированию, что позволяет быстро приготовить тушеное блюдо.
B. ИНДИКАТОРЫ КУЛИНАРНОЙ ГОТОВНОСТИ МЯСА
Пригодный к потреблению материал может включать композиции, которые могут указывать, что пригодный к потреблению материал является уже готовым или находится в стадии приготовления. Выделение ароматических веществ при кулинарной обработке является важным аспектом потребления мяса. В некоторых вариантах осуществления пригодный к потреблению материал представляет собой аналог мяса, полностью состоящий из продуктов неживотного происхождения, и при его кулинарной обработке создается аромат, который воспринимается людьми как обычный аромат во время приготовления говядины. В некоторых вариантах осуществления пригодный к потреблению материал при кулинарной обработке создает аромат, воспринимаемый людьми как обычный аромат во время приготовления свинины, бекона, курицы, баранины, рыбы или индейки. В некоторых вариантах осуществления пригодный к потреблению материал представляет собой аналог мяса, который в основном или полностью состоит из ингредиентов, полученных из источников неживотного происхождения, и ароматное вещество из такого материала выделяется при кулинарной обработке или вырабатывается посредством химических реакций, которые происходят при кулинарной обработке. В некоторых вариантах осуществления пригодный к потреблению материал представляет собой аналог мяса, в основном или полностью состоящий из ингредиентов, полученных из неживотных источников, которые содержат смеси белков, пептидов, аминокислот, нуклеотидов, сахаров и полисахаридов и жиров в комбинации, и пространственные структуры, которые позволяют этим соединениям вступать в химические реакции во время кулинарной обработки для выработки ароматических веществ и соединений, создающих вкус.
В некоторых вариантах осуществления пригодный к потреблению материал представляет собой аналог мяса, который в основном или полностью состоит из ингредиентов, полученных из неживотных источников, с летучим или лабильным ароматическим веществом, которое выделяется при кулинарной обработке.
В некоторых вариантах осуществления индикатор представляет собой визуальный индикатор, который точно имитирует изменение цвета мясного продукта в ходе кулинарной обработки. Может происходить изменение цвета, например, от красного до коричневого цвета, от розового до белого цвета или до состояния подрумяненности, или от полупрозрачного до непрозрачного состояния в ходе кулинарной обработки.
В некоторых вариантах осуществления индикатор представляет собой обонятельный индикатор, который указывает на изменения в ходе кулинарной обработки. В одном варианте осуществления обонятельным индикатором является одно или несколько летучих ароматических веществ, выделяемых в ходе кулинарной обработки.
В некоторых вариантах осуществления индикатор содержит один или несколько выделенных, очищенных железосодержащих белков. В некоторых вариантах осуществления один или несколько выделенных, очищенных железосодержащих белков (например, гем-содержащий белок, см. раздел III B) находятся в восстановленном состоянии перед кулинарной обработкой. В некоторых вариантах осуществления один или несколько выделенных и очищенных железосодержащих белков в восстановленной или окисленной форме имеют ультрафиолетовый/видимый UV-VIS профиль, аналогичный профилю белка миоглобина, полученного из животного источника, когда этот белок находится в эквивалентном восстановленном или окисленном состоянии. Гемоглобин из Aquifex aeolicus имеет длину волны пика поглощения 13 нм; гемоглобин из Methylacidiphilum infernorum имеет длину волны пика поглощения 412 нм; легоглобин Glycine max имеет длину волны пика поглощения 415 нм; несимбиотические гемоглобины из Hordeum vulgare и Vigna radiata имеют длину волны пика поглощения 412 нм. Миоглобин Bos tauros имеет длину волны пика поглощения 415 нм.
В некоторых вариантах осуществления различие между длиной волны пика поглощения одного или нескольких выделенных и очищенных железосодержащих белков и длиной волны пика поглощения миоглобина, полученного из животного источника, составляет менее 5%.
Ароматические вещества, выделяемые в ходе приготовления мяса, образуются в реакциях, которые в качестве реагентов могут включать жиры, белки, аминокислоты, пептиды, нуклеотиды, органические кислоты, соединения серы, сахара и другие углеводы. В некоторых вариантах осуществления ароматические вещества, которые объединяются во время приготовления мяса, идентифицированы и расположены рядом друг с другом в пригодном к потреблению материале, таким образом, что при кулинарной обработке пригодного к потреблению материала происходит объединение этих ароматических веществ. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления характерные вкусовые и ароматические компоненты создаются в ходе кулинарной обработки посредством химических реакций с участием аминокислот, жиров и сахаров, содержащихся в растениях, а также в мясе. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления характерные вкусовые и ароматические компоненты в основном создаются в ходе кулинарной обработки посредством химических реакций с участием одного или нескольких жиров, пептидов, аминокислот, нуклеотидов, органических кислот, соединений серы, сахаров и других углеводов, которые содержатся в растениях, а также в мясе.
Некоторые реакции, в которых образуются ароматические вещества, выделяющиеся во время приготовления мяса, могут катализироваться железом, в частности железом из гема миоглобина. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления некоторые из характерных вкусовых и ароматических компонентов создаются в ходе кулинарной обработки посредством химических реакций, катализируемых железом. В некоторых вариантах осуществления некоторые из характерных вкусовых и ароматических компонентов создаются в ходе кулинарной обработки посредством химических реакций, катализируемых гемом. В некоторых вариантах осуществления некоторые из характерных вкусовых и ароматических компонентов создаются в ходе кулинарной обработки посредством химических реакций, которые катализируются железом гема из легоглобина. В некоторых вариантах осуществления некоторые из характерных вкусовых и ароматических компонентов создаются в ходе кулинарной обработки посредством химических реакций, которые катализируются железом гема из гем-белка. Например, гем-белки (например, из Aquifex aeolicusm, Methylacidiphilum infernorum, Glycine max, Hordeum vulgare или Vigna radiata) при их нагревании в присутствии цистеина и глюкозы создают профиль летучих ароматических веществ, который в значительной степени отличается от профиля, создаваемого подмножеством из любых трех компонентов, что выявляют с помощью анализа ГХ-МС. Летучие ароматические компоненты, выделение которых в таких условиях усиливается, включают без ограничения фуран, ацетон, тиазол, фурфурол, бензальдегид, 2-пиридинкарбоксальдегид, 5-метил-2-тиофенкарбоксальдегид, 3-метил-2-тиофенкарбоксальдегид, 3-тиофенметанол и деканол. В этих условиях цистеин и глюкоза в качестве единственных компонентов, или в присутствии солей железа, таких как железистый глюконат, производят сернистый запах, но при добавлении гем-содержащих белков сернистый запах уменьшается и меняется на ароматы, включающие без ограничения аромат куриного бульона, подрумяненных грибов, патоки и хлеба.
Дополнительно, гем-белок (например, Aquifex aeolicusm, Methylacidiphilum infernorum, Glycine max, Hordeum vulgare или Vigna radiata) при нагревании в присутствии куриного фарша усиливает выделение конкретных летучих ароматических веществ, которые повышены в говядине по сравнению с куриным мясом, что выявляют с помощью анализа ГХ-МС. Летучие ароматические компоненты, выделение которых усиливается в таких условиях, включают без ограничения пропаналь, бутаналь, 2-этилфуран, гептаналь, октаналь, транс-2-(2-пентенил)-фуран, (Z)-2-гептеналь (Е)-2-октеналь пиррол, 2,4-додекадиеналь, 1-октаналь или (Z)-2-деценаль 2-ундеценаль.
C. ЦВЕТОВЫЕ ИНДИКАТОРЫ
Цвет мяса является важной составляющей практического приготовления и поедания мяса. Например, куски говядины имеют характерный красный цвет в сыром виде, и постепенно во время приготовления цвет меняется на коричневый цвет. В качестве другого примера, белые виды мяса, такие как куриное мясо или свинина, имеют характерный розовый цвет в сыром состоянии, и постепенно во время приготовления цвет меняется на белый или коричневатый цвет. Количественные параметры изменения цвета используются для определения степени кулинарной обработки говядины и определения времени приготовления и температуры для получения желаемого состояния готовности. В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к немясному продукту-заменителю мяса, в котором имеется визуальный индикатор изменений в ходе кулинарной обработки. В некоторых вариантах осуществления визуальный индикатор представляет собой цветовой индикатор, который показывает изменение цвета во время приготовления. В некоторых вариантах осуществления цветовой индикатор воспроизводит изменение цвета в куске мяса, по мере изменения состояния мяса от сырого до приготовленного. В других вариантах осуществления цветовой индикатор подкрашивает продукт-заменитель мяса в красный цвет перед приготовлением для обозначения сырого состояния и вызывает изменение цвета продукта-заменителя мяса на коричневый цвет по мере приготовления. В других вариантах осуществления цветовой индикатор подкрашивает продукт-заменитель мяса в розовый цвет перед приготовлением, обозначая сырое состояние, и вызывает изменение цвета продукта-заменителя мяса на белый или коричневый цвет по мере приготовления.
Основным фактором, определяющим питательное значение цвета мяса, является концентрация железосодержащих белков в мясе. Миоглобин является одним из основных железосодержащих белков в таком компоненте мясных продуктов, как скелетные мышцы. Как описано выше, содержание миоглобина варьируется от 0,05% в белом курином мясе до 1,5-2,0% в старой говядине. Так, в некоторых вариантах осуществления пригодный к потреблению материал является аналогом мяса, который включает железосодержащий белок (например, гем-содержащий белок). В некоторых вариантах осуществления аналог мяса содержит железосодержащий белок (например, гем-содержащий белок) в количестве приблизительно 0,05%, приблизительно 0,1%, приблизительно 0,2%, приблизительно 0,3%, приблизительно 0,4%, приблизительно 0,5%, приблизительно 0,6%, приблизительно 0,7%, приблизительно 0,8%, приблизительно 0,9%, приблизительно 1%, приблизительно 1,1%, приблизительно 1,2%, приблизительно 1,3%, приблизительно 1,4%, приблизительно 1,5%, приблизительно 1,6%, приблизительно 1,7%, приблизительно 1,8%, приблизительно 1,9%, приблизительно 2% или более чем приблизительно 2% в пересчете на сухую массу или на общую массу. В некоторых вариантах осуществления железосодержащий белок был выделен и очищен из источника. В других случаях железосодержащий белок не подвергался выделению и очистке. В некоторых случаях источником железосодержащего белка является источник животного происхождения или неживотный источник, такой как растения, грибы или генетически модифицированные организмы, такие как, например, растения, водоросли, бактерии или грибы. В некоторых случаях железосодержащим белком является миоглобин. В некоторых вариантах осуществления пригодный к потреблению материал представляет собой аналог мяса на растительной основе, в который добавлен миоглобин животного происхождения. Так, например, в аналоге молодой говядины может содержаться от приблизительно 0,4 до 1% миоглобина. В некоторых вариантах осуществления пригодный к потреблению материал представляет собой аналог мяса на растительной основе, в который добавлен легоглобин или цитохром. Так, например, в аналоге молодой говядины может содержаться от приблизительно 0,4 до 1% легоглобина или цитохрома.
Другим примером железосодержащих белков является гемоглобин, представляющий собой связывающий кислород железосодержащий белок в красных кровяных клетках позвоночных. Гемоглобин и миоглобин имеют сходный цвет. В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способам сохранения и переработки крови от сельскохозяйственных животных для цветовой добавки к пригодному к потреблению материалу. Например, на бойне собирают кровь, и гемоглобин из этой крови используется для улучшения цвета пригодного к потреблению материала. В некоторых аспектах пригодный к потреблению материал представляет собой аналог мяса на растительной основе, содержащий гемоглобин.
В природе существуют дополнительные железосодержащие белки. В некоторых вариантах осуществления пригодный к потреблению материал содержит железосодержащий белок, который не является миоглобином. В некоторых вариантах осуществления пригодный к потреблению материал не содержит миоглобин. В некоторых вариантах осуществления пригодный к потреблению материал не содержат гемоглобин. В некоторых вариантах осуществления пригодный к потреблению материал представляет собой аналог мяса, который содержит железосодержащий белок, отличный от миоглобина или гемоглобина. Примеры гем-содержащих белков приведены, например, в разделе III B, а также на фиг. 3. Например, в некоторых вариантах осуществления пригодный к потреблению материал содержит гемопротеин (например, гемоглобин, миоглобин, нейроглобин, цитоглобин, легоглобин, не симбиотический гемоглобин, глобин I Hell`s gate, бактериальный гемоглобин, миоглобин инфузорий или флавогемоглобин).
Легоглобин является близким к миоглобину по структуре и физическим свойствам и широко доступен в виде неиспользуемого побочного продукта товарных бобовых культур (например, сои или гороха. Количество легоглобина в корнях этих культур в США превышает содержание миоглобина во всем красном мясе, потребляемом в США.
В некоторых вариантах осуществления пригодный к потреблению материал представляет собой аналог мяса, который в основном или полностью состоит из ингредиентов, полученных из неживотных источников, и содержит гем-белок (например, легоглобин или член семейства глобиновых белков). Например, аналог мясо может в основном или полностью состоять из ингредиентов, полученных из неживотных источников, в том числе из аналогов мышечной ткани, аналогов жировой ткани, аналогов соединительной ткани и гем-белка. В некоторых вариантах осуществления пригодный к потреблению материал представляет собой аналог мяса, который в основном или полностью состоит из ингредиентов, полученных из неживотных источников с высоким содержанием железа из гем-белка. В некоторых вариантах осуществления содержание железа аналогично мясу. В некоторых вариантах осуществления пригодный к потреблению материал имеет отчетливый красный мясной цвет, и такой цвет обусловлен легоглобином.
Гем-белок (например, гем-содержащий белок, описанный в разделе III B) может быть использован в качестве индикатора окончательной готовности пригодного к потреблению материала. Таким образом, одним из вариантов осуществления настоящего изобретения является способ кулинарной обработки пригодного к потреблению материала, и этот способ содержит детекцию легоглобина, который перемещается из внутренней части пригодного к потреблению материала на поверхность при кулинарной обработке этого материала. Другой вариант осуществления изобретения относится к способу кулинарной обработки пригодного к потреблению материала, и указанный способ содержит детекцию изменения цвета с красного на коричневый при кулинарной обработке этого материала.
В некоторых вариантах осуществления увеличенный срок годности обеспечивается с помощью продления срока годности пищевых продуктов с желаемым красным цветом (например, заменителя мяса на немясной основе).
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к гемопротеинам, которые придают желаемый цвет немясным заменителям мяса. В некоторых вариантах осуществления гемопротеины получены из неживотного источника, такого как растения, грибы или генетически модифицированные организмы, такие как, например, растения, водоросли, бактерии или грибы. См., например, раздел III В. В некоторых вариантах осуществления срок годности гемопротеинов продлевается путем обработки мяса добавками для продления срока годности.
В некоторых вариантах осуществления добавки для продления срока годности мяса выбраны из группы, состоящей из окиси углерода, нитритов, метабисульфита натрия, Бомбаля, экстракта розмарина, экстракта зеленого чая, катехинов и других антиоксидантов.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к гемопротеинам, которые создают желаемые вкусовые профили в пищевых продуктах (например, в немясных заменителях мяса). В некоторых вариантах осуществления гемопротеины обладают аналогичной миоглобину способностью создавать желаемый вкусовой профиль.
В некоторых вариантах осуществления период действия упомянутой способности гемопротеинов создавать желаемый вкусовой профиль составляет 10%, 20%, 30%, 50% или 100% от такого периода у миоглобина или превышает его.
D. ПИЩЕВЫЕ ПРОДУКТЫ, СОДЕРЖАЩИЕ ВЫДЕЛЕННЫЕ, ОЧИЩЕННЫЕ ГЕМ-БЕЛКИ
В некоторых вариантах осуществления гем-белки, описанные в изобретении, добавляются к мясу или пригодному к потреблению материалу, описанному в изобретении, для улучшения свойств мяса или пригодного к потреблению материала. Например, раствор, содержащий гем-белок, может быть введен в сырое мясо (например, сырое белое мясо) или в приготовленное мясо, в целях улучшения органолептических свойств мяса во время приготовления путем добавления "мясного" вкуса (например, для белого мяса, такого как куриное мясо).
В другом примере, раствор гем-белка можно добавлять по каплям на поверхность мяса или пригодного к потреблению материала по изобретению для улучшения внешнего вида. В одном варианте осуществления использование гем-белка может улучшать рекламу, фотографию или видеосъемку пищевых продуктов, таких как мясо или заменитель мяса.
В другом варианте осуществления гем-белок добавляется к пригодному к потреблению материалу в качестве добавки железа.
В одном применении настоящего изобретения гем-белки могут быть использованы в качестве пищевых красителей. В одном варианте осуществления гем-белки могут быть использованы в качестве безопасного съедобного заменителя FD&C Red No. 40 - Allura Red AC, E129 (красный оттенок) для множества применений. Неограничивающий перечень таких потенциальных применений будет включать нанесение изображений, особенно в таких случаях, как рисунки на теле, или применение в качестве театральной крови.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам получения гем-белков (например, легоглобина) из растения. Легоглобин может быть получен из различных растений. Различные виды бобовых и их разновидности (например, соя, стручковая фасоль, лимская фасоль, коровий горох, английский горох, желтый горох, люпин, фасоль, нут, арахис, люцерна, сушеная вика, клевер, леспедеца или фасоль пинто) имеют на корнях азот-фиксирующие клубеньки, в которых легоглобин играет ключевую роль в регуляции концентрации кислорода (например, корневые клубеньки гороха). В одном варианте осуществления для очистки белка легоглобина из корневых клубеньков бобовых растений (например, из соевых бобов, стручковой фасоли или гороха) используют ионообменную хроматографию. В одном варианте осуществления легоглобин очищен из корневых клубеньков сои, стручковой фасоли или душистого горошка.
Растения могут быть выращены с использованием стандартных сельскохозяйственных способов, с тем исключением, что в некоторых случаях не применяются удобрения, и почву обогащают природными азотфиксирующими бактериями из рода Rhizobium. Можно собирать и корни целиком, и корневые узелки и лизировать их, например, в 20 мМ фосфата калия с уровнем рН 7,4, 100 мМ хлорида калия и 5 мМ ЭДТА, используя блендер-измельчитель. Во время этого лизирования легоглобин поступает в буферный раствор. Клубеньковый лизат, содержащий легоглобин, может быть очищен от клеточного дебриса путем фильтрации через 5-мкм фильтр. В некоторых вариантах осуществления после фильтрации выполняют центрифугирование (7000 g, 20 минут). После этого очищенный лизат, содержащий легоглобин, фильтруют через фильтр 200 нм и вносят в колонку для анионообменной хроматографии (High Prep Q; High Prep DEAE, GE Healthtcare) на устройстве для быстрой жидкостной хроматографии белков (GE Healthcare). Легоглобин собирают из проточной фракции и концентрируют над фильтрующей мембраной 3 кДа до требуемой концентрации. Анализ чистоты (частичного содержания) очищенного легоглобина проводят с помощью геля для электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE): содержание легоглобина в лизате составляет от 20 до 40%, а после анионообменной очистки его содержание составляет от 70 до 80%. В другом варианте осуществления проточную фракцию соевого легоглобина после анионообменной хроматографии переносят для гель-хроматографии (сефакрил S-100 HR, GE Healthcare). Соевый легоглобин элюируют в виде двух фракций, соответствующих димерному и мономерному типам. Анализ чистоты (частичного содержания) легоглобина проводят с помощью SDS-PAGE, и определяют степень чистоты, составляющую приблизительно 90-100%.
Белки из лизата клубеньков бобовых культур могут быть перенесены в буфер из 10 мМ карбоната натрия с уровнем рН 9,5, 50 мМ хлорида натрия, затем пропущены через фильтр 200 нм и внесены на колонку для анионообменной хроматографии на устройстве для быстрой жидкостной хроматографии белков (GE Healthcare). Легоглобин можно присоединять к матрице анионообменной хроматографии и элюировать с использованием градиента хлорида натрия. Анализ чистоты (частичного содержания) легоглобина проводят с помощью электрофореза SDS-PAGE, и определяют степень чистоты, составляющую приблизительно от 60 до 80%.
Нежелательные малые молекулы из корней бобовых культур можно удалять из очищенного легоглобина путем пропускания легоглобина в растворе над анионообменной смолой. Эти малые молекулы придают различные оттенки коричневого цвета лизатам корневых клубеньков, тем самым снижая качество цвета раствора легоглобина. В одном варианте осуществления используют анионообменные смолы FFQ, DEAE, Amberlite IRA900, Dowex 22 или Dowex 1x4. Легоглобин, очищенный или путем фракционирования сульфатом аммония (сульфат аммония 60% вес./об. и 90% вес./об.) или путем анионообменной хроматографии, подвергался замене буфера на 20 мМ фосфата калия с уровнем рН 7,4, 100 мМ хлорида натрия, и этот раствор пропускали через одну из вышеупомянутых анион-обменных смол. Можно собирать проточную фракцию и сравнивать ее цвет с цветом раствора перед пропусканием через анионообменные смолы. Можно наблюдать улучшение цвета в растворе очищенного легоглобина, что определяли путем визуального осмотра (от желто-коричневого до более заметного красного цвета), вместе с тем желто-бурый оттенок устранялся в разной степени.
Альтернативно, гем-содержащий белок может быть получен с помощью рекомбинантной технологии, как описано в разделе III B. Например, несимбиотический гемоглобин из бобов мунг может быть рекомбинантно экспрессирован в E. coli и очищен с помощью анионообменной хроматографии или катионообменной хроматографии. Клеточный лизат можно загружать на смолу FF-Q в устройстве для быстрой жидкостной хроматографии белков (GE Healthcare). Несимбиотический гемоглобин бобов мунг элюировали в проточных фракциях. Анализ чистоты (частичное содержание) несимбиотического гемоглобина из бобов мунг проводили с использованием SDS-PAGE, и было установлено, что степень чистоты, как фракция общего белка, составляет: 12% в лизате E. coli и 31% после очистки на FF-Q. С помощью UV-Vis анализа очищенного белка были установлены спектральные характеристики гем-белка.
Альтернативно, клеточный лизат может быть загружен над смолой FF-S в устройство для быстрой жидкостной хроматографии белков (GE Healthcare). Несимбиотический гемоглобин бобов мунг можно присоединять на FF-S колонку и элюировать с градиентом хлорида натрия (50 мМ–1000 мМ). Чистоту (частичное содержание) несимбиотического гемоглобина из бобов мунг можно проанализировать с помощью электрофореза SDS-PAGE, и было установлено, что степень чистоты составляет в лизате E. coli 13%, после очистки на FFQ 35%. С помощью UV-Vis анализа очищенного белка были установлены спектральные характеристики гем-связанного белка.
В некоторых вариантах осуществления гем-белки используются в качестве ингредиентов в пищевых продуктах, для которых желательно наличие вкуса крови. Гем-содержащие белки по изобретению были протестированы группой добровольцев, и во всех случаях было отмечено, что вкус напоминает кровь.
Гем-белки, например легоглобин, можно объединять с другими компонентами аналога мяса на растительной основе. В некоторых вариантах осуществления гем-белки захватываются в гель, который содержит другие компоненты, например, липиды и/или другие белки. В некоторых аспектах, несколько гелей объединяют с гем-белками на негелевой основе. В некоторых вариантах осуществления объединяют гем-белки и другие соединения пригодного к потреблению материала, для гарантии того, что гем-белки смогут диффундировать через пригодный к потреблению материал. В некоторых вариантах осуществления пригодный к потреблению материал пропитывают раствором, содержащим гем-белок, например, раствором легоглобина, например, на 1, 5, 10, 15, 30 или 45 минут или на 1, 5, 10, 15, 20 или 30 часов.
Учитывая полезность гем-белков для окрашивания пригодных к потреблению материалов, полезно проводить детекцию содержания конкретного гем-белка в продукте. Соответственно, настоящее изобретение в некоторых вариантах осуществления включает способы, позволяющие определить, содержится ли в продукте гем-белок. Например, можно проводить анализы ELISA, анализ близости-лигирования, анализ Luminex или вестерн-блот анализ, чтобы определить присутствие легоглобина или другого гем-содержащего белка в пищевом продукте, таком как мясо или аналог мяса. В одном варианте осуществления используют способы обнаружения, чтобы определить, подвергалось ли мясо изменению с легоглобином или другим гем-содержащим белком.
Е. АНАЛОГИ МАЙОНЕЗНОГО СПРЕДА
Майонез представляет собой густой кремообразный соус. Традиционный майонез представляет собой стабильную эмульсию масла и яичного желтка. Считается, что лецитин и белки из яичного желтка стабилизируют эмульсии. Традиционный коммерческий майонез обычно содержит от 70 до 80% жира (вес./вес.) и 5% яичного желтка (вес./вес.). Коммерческие продукты с пониженным содержанием жира могут содержать приблизительно 20% жира (вес./вес.). Пригодный к потреблению материал может содержать композицию, которая имеет свойства, сопоставимые с майонезом.
В одном варианте осуществления в качестве заменителя яичных белков можно использовать очищенные растительные белки для изготовления стабильной, кремообразной белково-жировой эмульсии, которая визуально и по вкусовым ощущениям напоминает традиционный майонез. Согласно изобретению, жир (от приблизительно 20 до 80% вес./вес.) может быть из одного источника или из нескольких источников. Для всех кулинарных применений, в которых используется традиционный майонез, можно использовать нетрадиционную майонезную продукцию. В одном варианте осуществления в качестве вкусовых добавок добавляют уксус и/или лимон и/или лайм. В одном варианте осуществления очищенные растительные белки не являются соевыми белками. В одном варианте осуществления вкус может быть модифицирован путем добавления горчицы, специй, трав и/или солений.
Аналог майонеза может содержать смесь белков неживотного происхождения. В одном варианте осуществления аналог майонеза представляет собой смесь из 50% (вес./об.) масла из рисовых отрубей и 7% (вес./об.) 8S белка бобов мунг. В одном варианте осуществления аналог майонеза представляет собой смесь из 70% (вес./об.) подсолнечного масла или масло какао, 2,4% (вес./об.) RuBisCo, 0,29% (вес./вес.) соевого лецитина и, необязательно, 8 мкΜ олеозина.
Эту смесь можно эмульгировать, и стабильность эмульсии можно регулировать путем изменения размера частиц масло-вода-белок путем гомогенизации под высоким давлением или посредством ультразвука. Масло может быть добавлено в жидком виде. Белок может быть добавлен в виде раствора в буфере. Соевый лецитин можно ресуспендировать в воде и обрабатывать ультразвуком перед смешиванием с раствором масла и белка. Полученный раствор масла, белка и лецитина можно гомогенизировать, например, сначала при 5000 фунтов на кв. дюйм и затем при 8000 фунтов на кв. дюйм, или можно обрабатывать ультразвуком при 40% рабочего цикла в течение 2 минут с максимальными установками. По густоте, текстуре, бархатистости и внешнему виду полученные продукты похожи на один из традиционных майонезов. В некоторых случаях (например, при использовании 8S белка бобов мунг и масла из рисовых отрубей) получают светлый продукт беловатого цвета.
F. АНАЛОГ КРЕМОВОГО ЛИКЕРА
Обычно кремовые ликеры в своей основе содержат молочные сливки и ликер. Примеры ликера включают виски, ирландский виски, шотландский виски, ром, водку, граппу или ферментированные фрукты (например, вишневый ликер), сливовый бренди, текилу или травяные настойки. Аналог кремового ликера может быть изготовлен путем замены молочных сливок в кремовом ликере на немолочные сливочные фракции из растительных источников. В одном варианте осуществления молочные сливки в сливочном ликере могут быть заменены на стабильную эмульсию растительных жиров и выделенных или очищенных белков, которая имеет консистенцию, аналогичную молочным сливкам. В одном варианте осуществления очищенные растительные белки и/или растительные жиры могут происходить из одного или нескольких источников, как описано в изобретении. Например, кремовый ликер может включать сливочную фракцию из подсолнечного масла, RuBsiCo и виски и одну или несколько необязательных вкусовых добавок (например, ванильную, шоколадную и/или кофейную добавки).
G. ОБОГАЩЕННЫЙ БЕЛКАМИ АЛКОГОЛЬНЫЙ НАПИТОК
Обычно алкогольные напитки содержат белок в количестве от незначительного до низкого. Добавление растительных белков в различные алкогольные напитки положительно модифицирует их вкус, вкусовые ощущения, физическое состояние и повышает питательную ценность по содержанию белка. Дополнительно, присутствие белка в различных алкогольных напитках, используемых в коктейлях, положительно модифицирует вкус, вкусовые ощущения, физическое состояние коктейля и повышает его питательную ценность по содержанию белка. Разные классы алкогольных напитков содержат разное количество спиртов. Например, винные прохладительные напитки содержат приблизительно 4-7% спирта, пиво содержит приблизительно 3-10% спирта, вино содержит приблизительно 8-14% спирта (об./об.), десертные вина содержат приблизительно 17-20% спирта, виски содержит приблизительно 40% спирта, водка содержит от приблизительно 35 до 50% спирта. Дополнительно, некоторые традиционные алкогольные напитки включают сахара (например, Bacardi Razz на уровне 10% вес./об.).
Таким образом, содержащие спирт напитки могут быть дополнены путем добавления очищенных растительных белков, например, в количестве от 0,1 до 5% вес./об. и, необязательно, сахара (1-15% вес./об.). Сахар может представлять собой, например, тростниковый сахар, коричневый сахар, сахарозу или глюкозу. Например, к виски можно добавить очищенный RuBisCo в количестве 180 мг/мл в 20 мМ К-фосфата с уровнем рН 7,0, 150 мМ NaCl. Виски Jameson при добавлении 5% вес./об. Rubsico образует пластичный гель, с консистенцией, подобной традиционным шотам Джелло.
Например, алкогольные напитки, обогащенные RuBisCo, 8S белком бобов мунг и глобулином гороха, были изготовлены путем добавления очищенных RuBisCo, 8S белков бобов мунг и глобулина гороха в конечных концентрациях белка 0,5%, 1% и 5% (вес./об.) соответственно, в пиво Corona, вино Pinot Grigio и виски Jameson. К 60% этанола, 5% раствора сахарозы в воде добавляли зеин в количестве 0,5%, 1% и 5% (вес./об.).
Белки гороха экстрагировали из гороховой муки путем ресуспендирования муки в 5%, 20% или 40% этаноле, 5% растворе сахарозы в воде, с последующей инкубацией в течение 1 часа при комнатной температуре. Любые нерастворенные твердые вещества удаляли центрифугированием при 5000 g в течение 10 минут. Полученный раствор супернатанта по внешнему виду был прозрачным. Особенно полезным являлся 5%-ый раствор этанола.
По оценке группы дегустаторов, все обогащенные белком алкогольные напитки имели ароматы и вкусы, отличающиеся от ароматов и вкусов напитков, не обогащенных белком. В некоторых случаях созданные ароматы и вкусы были оценены как нейтральные, в некоторых случаях как более привлекательные, а в некоторых случаях как менее привлекательные, по сравнению с контрольной группой. В конкретном примере добавление 8S белка бобов мунг в количестве 0,5% вес./об. и 1% вес./об. в виски Jameson смягчает аромат и вкус виски Jameson. Добавление белка бобов мунг в количестве 0,5% вес./об. в виски Jameson придает слегка сливочный вкус виски Jameson и аромат, напоминающий традиционный Белый русский коктейль. При добавлении 5% вес./об. зеина в виски Jameson возникают ароматы и вкусы, характеризуемые как ароматы и вкусы заплесневелых бобов и сырого картофеля.
В другом примере пиво Corona было обогащено глобулином гороха в количестве 0,5% вес./об., при этом аромат менялся на хмелевый и напоминал индийский светлый эль, а изменение вкуса заключалось в появлении ноток гороха. При добавлении 8S белка бобов мунг в количестве 0,5% вес./об. и 5% вес./об. аромат пива Corona изменялся к сладкому аромату цветущего пиона с сильным хмелевым ароматом. Аромат был нейтральным в случае добавления 8S бобов мунг в количестве 0,5% вес./об. и приобретал растительно-ореховые ноты при добавлении 8S белка бобов мунг, 5% вес./об..
В другом примере вино Pinot Grigio обогащали 8S белком бобов мунг в количестве 1% вес./об., при этом ощущалось присутствие в аромате дополнительных ноток сладостей и цитрусовых и изменение вкуса с присутствием ноток арахисового масла. При добавлении глобулинов гороха в количестве 1% вес./об. изменялся аромат с появлением сильного аромата заплесневелого дуба и мокрых листьев. Изменение вкуса заключалось в присутствии ноток ила. При добавлении RuBisCo в количестве 5% вес./об. возникал аромат и вкус влажного сена.
Обогащенный зеином раствор 60% этанола и 5% сахарозы имел аромат с нотами чипсов тортилья по сравнению с соответствующим раствором без зеина. Какие-либо различия в аромате отсутствовали.
Все обогащенные белком гороха растворы 5%, 20% и 40% этанола с 5% сахарозой имели землистый аромат и вкус по сравнению с контрольными растворами без белков. Дополнительно, ощущался вкус гороха, и горький вкус усиливался при увеличении содержания алкоголя.
H. ШОКОЛАДНАЯ ПАСТА
Шоколадная паста представляет собой спред с ароматом шоколада, в котором традиционными основными ингредиентами являются какао-порошок, коровье молоко, растительное масло и сахар. Традиционные шоколадные пасты при нормальной комнатной температуре являются или твердыми или твердыми с мягкой консистенцией и плавятся при температуре ниже температуры плавления какао-масла. Этот продукт можно употреблять для намазывания на хлеб, лепешки, блины, в глазури для тортов и печенья, в начинке для кондитерских шоколадных изделий или в немолочных начинках для шоколадных тортов и пирожных.
В одном варианте осуществления коровье молоко и молочные продукты, такие как мороженое, сыворотка, сливки, йогурт, сметана или молочный жир, заменяются немолочной сливочной фракцией согласно изобретению. В одном варианте осуществления немолочная сливочная фракция происходит из одного источника или из нескольких источников, описанных в изобретении. В одном варианте осуществления коровье молоко и молочные продукты заменяются на любое не коровье молоко, описанное в изобретении. В одном варианте осуществления коровье молоко и молочные продукты заменяются очищенными растительными белками, описанными в изобретении. В одном варианте осуществления коровье молоко и молочные продукты заменяются твердыми стабильными эмульсиями с мягкой консистенцией, изготовленными из одного или нескольких растительных масел и одного или нескольких очищенных растительных белков.
I. ДРУГИЕ ПРИМЕНЕНИЯ:
В одном варианте осуществления фракция немолочных растительных сливок может быть использована в качестве заменителя коровьего молока и молочных продуктов, для изготовления плиток немолочного шоколада или кондитерских изделий из немолочного шоколада.
В одном варианте осуществления фракция немолочных растительных сливок и очищенные растительные белки могут быть использованы в качестве заменителя коровьего молока и молочных продуктов, для изготовления плиток немолочного шоколада или кондитерских изделий из немолочного шоколада.
В одном варианте осуществления фракцию немолочных растительных сливок и растительные белки можно использовать для изготовления шоколадного мусса. Традиционными основными ингредиентами шоколадного мусса являются горький или полусладкий шоколад, сливочное масло и яйца. В одном варианте осуществления сливочное масло может быть заменено на фракцию немолочных растительных сливок. В одном варианте осуществления сливочное масло и яйца могут быть заменены на фракцию немолочных растительных сливок и стабилизирующие пену запасные белки семян растений, такие как альбумин гороха.
В одном варианте осуществления можно приготовить веганский пригодный к потреблению продукт, такой как аналог паштета. Веганский аналог паштета можно приготовить следующим образом: мелко измельчают 10 г аналога жира и нагревают его на сковороде с мелко нарезанным луком-шалотом в течение 2-3 минут. Аналог мышечной ткани (20 г), сделанный без волокон аналога соединительной ткани, можно нарезать на кубики размером  дюйма и обжарить в смеси жира и шалота в течение еще 3-5 минут. Смесь можно пропустить через сито до гомогенного состояния. Сковороду, пока она остается теплой, можно ополоснуть столовой ложкой мадеры, не позволяя вину полностью испариться. Жидкость со сковороды добавляют в гомогенизированную смесь, по вкусу добавляют специи (соль, перец), и смесь вторично пропускают через сито. После охлаждения в холодильнике (например, в течение 15 минут) паштет готов для подачи.
В некоторых вариантах осуществления для приготовления более постных или более жирных паштетов используются другие соотношения аналогов жировой ткани и мышечной ткани. Например, паштет может содержать аналог жировой ткани в количестве от 0,5 до 10%, приблизительно от 5% до 40%, приблизительно от 10% до 60%, или приблизительно от 30 до 70% или более 70%.
В некоторых вариантах осуществления для паштета можно использовать аналог мышечной ткани с более высоким содержанием железа, чтобы изготовить более близкую имитацию свиного или птичьего печеночного паштета. Например, аналог мышечной ткани может содержать приблизительно 1%, приблизительно 1,5%, приблизительно 2% или более 2% гем-белка.
В некоторых вариантах осуществления для паштета можно использовать аналог мышечной ткани с меньшим содержанием железа, чтобы изготовить более близкую имитацию паштета из мяса птицы или рыбы. Например, аналог мышечной ткани может содержать гем-белок в количестве приблизительно 1%, приблизительно 0,5%, приблизительно 0,2% или менее 0,2%.
В одном варианте осуществления можно делать веганский пригодный к потреблению продукт, такой как аналог кровяной колбасы. Веганскую кровяную колбасу делают из аналога крови, созданного путем смешивания растворов гем-белка и очищенного растительного белка. Например, 35 мл смешанного раствора легоглобина (120 мг/мл) и альбумина гороха (100 мг/мл), который близок к составу крови, можно тщательно смешать с суспензией кукурузной муки в соленой воде (соотношение муки к воде 6:5 вес./об.). Столовую ложку измельченного лука можно обжарить с 10 г измельченного аналога жировой ткани, смешанного с несколькими ягодами изюма и охладить до комнатной температуры перед смешиванием со смесью крови/муки. Смесь можно приправить по вкусу (например, с использованием соли, перца, петрушки и/или корицы), заполнить смесью вегетарианские колбасные оболочки и варить в почти кипящей воде в течение приблизительно 45 минут. После охлаждения колбасу можно употреблять как есть или подвергать дополнительной кулинарной обработке, например, коптить, делать хрустящей в духовке или жарить.
В некоторых вариантах осуществления аналог мышечной ткани может быть включен в рецептуры для имитации мясных/кровяных колбас. В некоторых вариантах осуществления в кровяной колбасе могут быть использованы ячмень, гречиха, овес, рис, рожь, сорго, пшеница и другие зерновые культуры. В некоторых вариантах осуществления в кровяную колбасу могут быть добавлены хлеб, каштаны, картофель, сладкий картофель, крахмал или другие наполнители, или заменители зерна.
ПРИМЕРЫ
ПРИМЕР 1: ВЫДЕЛЕНИЕ БЕЛКА.
Все этапы проводили при 4°С или при комнатной температуре. Этапы центрифугирования выполняли при 8000 g в течение 20 минут при 4°С или при комнатной температуре. Муку суспендировали в специальном буфере, суспензию центрифугировали, затем супернатант подвергали микрофильтрованию через полиэтилсульфуроновые (PES) мембраны 0,2 мкм, и после этого концентрировали путем ультрафильтрации на PES мембранах с отсечкой по молекулярной массе 3 кДа, 5 кДа или 10 кДа с использованием системы фильтрации с тангенциальным потоком и полыми волокнами Spectrum Labs KrosFlo.
После фракционирования все представляющие интерес фракции преципитата, полученного с сульфатом аммония, хранили при -20°С до дальнейшего использования. Перед использованием преципитатов в экспериментах их ресуспендировали в 10 объемах калий-фосфатного буфера 50 мМ, рН 7,4 + 0,5 М NaCl. Суспензии центрифугировали, затем супернатанты подвергали микрофильтрованию через PES мембраны 0,2 мкм, после чего концентрировали путем ультрафильтрации на PES мембранах с отсечкой по молекулярной массе 3 кДа, 5 кДа или 10 кДа с использованием системы фильтрации с тангенциальным потоком и полыми волокнами Spectrum Labs KrosFlo. Контроль белковой композиции на отдельных этапах фракционирования осуществляли с помощью анализа SDS-PAGE, и концентрацию белка измеряли с помощью стандартных способов UV-VIS.
(i) Альбумины гороха: в качестве источника альбуминов гороха была использована сухая мука из зеленого или желтого гороха. Муку суспендировали в 10 объемах 50 мМ натрий-ацетатного буфера с уровнем рН 5 и перемешивали в течение 1 часа. Растворимый белок отделяли от неэкстрагированного белка и дебриса горохового семени с помощью или центрифугирования (8000 g, 20 минут), или фильтрования через 5-микронный фильтр. Собирали супернатант или фильтрат соответственно. К полученному неочищенному экстракту белка добавляли твердый сульфат аммония до 50% насыщения (вес./об.). Раствор перемешивали в течение 1 часа, а затем центрифугировали. К полученному на этом этапе супернатанту добавляли сульфат аммония, доводя насыщение до 90% вес./об.. Раствор перемешивали в течение 1 часа, а затем центрифугировали для сбора альбуминовых белков гороха в осадке. Осадок хранили при -20°С до дальнейшего использования. Белок выделяли из гранул и подготавливали к использованию, как описано выше, с тем исключением, что конечный буфер может содержать хлорид натрия в количестве от 0 до 500 мМ.
В некоторых вариантах осуществления муку суспендировали в 10 объемах 50 мМ NaCl, рН 3,8 и перемешивали в течение 1 часа. Растворимый белок отделяли от неэкстрагированного белка гороха и дебриса горохового семени путем центрифугирования (8000 g, 20 минут). Супернатант собирали и фильтровали через мембраны 0,2 мкм, после чего концентрировали с использованием отсечки 10 кДа через PES мембраны.
(ii) Глобулины гороха: для экстрагирования глобулиновых белков гороха использовали сухую муку из зеленого гороха. Муку суспендировали в 10 объемах 50 мМ калий-фосфатного буфера с уровнем рН 8 и 0,4 М хлорида натрия и перемешивали в течение 1 часа. Растворимый белок отделяли от дебриса горохового семени путем центрифугирования. Супернатант подвергали фракционированию сульфатом аммония в два этапа при 50% и 80% насыщении. 80%-осадок, содержащий представляющие интерес глобулины, хранили при -20°С до дальнейшего использования. Белок выделяли из гранул и подготавливали к использованию, как описано выше.
(iii) 7S и 11S глобулины сои: глобулины из соевой муки выделяли путем первичного суспендирования соевой муки с пониженным содержанием жира/обезжиренной муки в 4-15 объемах 10 мМ (или 20 мМ) фосфата калия с рН 7,4. Суспензию центрифугировали при относительной силе центрифугирования 8000 rcf в течение 20 минут или осветляли с помощью 5-микронной фильтрации, затем супернатант собирали. Неочищенный белковый экстракт содержал и 7S и 11S-глобулины. Затем раствор фильтровали (0,2 мкм) и концентрировали с использованием PES мембран с отсечкой по молекулярной массе 10 кДа в системе фильтрации с тангенциальным потоком и полыми волокнами Spectrum Labs KrosFlo, или путем пропускания над анионообменной смолой, перед использованием этого раствора в экспериментах. С помощью изоэлектрической преципитации отделяли 11S глобулины от белков 7S. Уровень рН неочищенного белкового экстракта доводили до 6,4 с помощью разбавленной HCl, перемешивали в течение от 30 минут до 1 часа и затем центрифугировали, чтобы собрать преципитат 11S глобулина и 7S белки в супернатанте. Фракцию 11S ресуспендировали с 10 мМ калия фосфата, рН 7,4, и белковые фракции микрофильтровали и концентрировали до их использования.
Соевые белки также могут быть экстрагированы путем суспендирования обезжиренной соевой муки в 4-15 объемах (например, в 5 объемах) 20 мМ карбоната натрия, рН 9 (или воды, при этом уровень рН доводили до 9 после добавления муки) или 20 мМ калий-фосфатного буфера с уровнем рН 7,4, и 100 мМ хлорида натрия для уменьшения посторонних вкусов в очищенном белке. Суспензию перемешивали в течение одного часа и центрифугировали при 8000 g в течение 20 минут. Экстрагированные белки подвергали ультрафильтрации и затем обрабатывали, как указано выше, или, альтернативно, супернатант собирали, фильтровали через мембраны 0,2 мкм и концентрировали с использованием PES мембран с отсечкой 10 кДа.
(iv) 8S глобулины бобов мунг: использовали муку из бобов мунг для экстрагирования 8S глобулинов путем первичного суспендирования муки в 4-х объемах 50 мМ калий-фосфатного буфера с уровнем рН 7 (+ 0,5 М NaCl, для очистки на уровне лабораторного качества). После центрифугирования белки в супернатанте фракционировали путем добавления сульфата аммония в два этапа до 50% и 90% насыщения соответственно. Преципитат от 90% фракции содержал 8S глобулины и хранился при -20°С до дальнейшего использования. Белок выделяли из гранул и подготавливали к использованию, как описано выше.
Глобулины бобов мунг также можно экстрагировать путем суспендирования муки в 4 объемах 20 мМ натриево-карбонатного буфера, рН 9 (или воды, с доведением уровня рН до 9 после добавления муки из бобов мунг), чтобы уменьшить посторонние вкусы в очищенных белковых фракциях. Суспензию центрифугировали (или фильтровали) для удаления твердых веществ, ультрафильтровали, а затем обрабатывали, как описано выше.
(v) Многочисленные белки позднего эмбриогенеза: муку (включающую без ограничения муку из бобов мунг и соевую муку) суспендировали в 20 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 10 мМ NaCl и перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа, затем центрифугировали. К супернатанту добавляли кислоту (HCl или уксусную кислоту) в концентрации 5% (об./об.), перемешивали при комнатной температуре, затем центрифугировали. Супернатант нагревали до 95°С в течение 15 минут, после чего центрифугировали. Преципитацию супернатанта выполняли путем добавления трихлоруксусной кислоты до 25%, центрифугировали, затем промывали ацетоном. Этапы нагревания и промывки кислотой могут быть проведены в обратном порядке.
(vi) Проламины гороха: сухую муку из зеленого гороха суспендировали в 5х (вес./об.) 60%-го этанола, перемешивали при комнатной температуре в течение одного часа, затем центрифугировали (7000 g, 20 минут), и после этого собирали супернатант. Этанол в супернатанте выпаривали путем нагревания раствора до 85°С и затем охлаждали до комнатной температуры. Для преципитации белков добавляли ледяной ацетон (1:4 об./об.). Затем раствор центрифугировали (4000 g, 20 минут), и экстрагировали белок в виде гранул светло-бежевого цвета.
(vii) Зеины-проламины: концентрированный кукурузный белок или муку суспендировали в 5х (вес./об.) 60%-го этанола, перемешивали при комнатной температуре в течение одного часа и затем центрифугировали. Этанол в супернатанте выпаривали путем нагревания, затем раствор центрифугировали, и экстрагировали белок в виде гранул.
(viii) Фракцию RuBisCo выделяли из зелени люцерны сначала путем измельчения листьев в блендере с 4 объемами холодного калий-фосфатного буфера 50 мМ, рН 7,4 (0,5 М NaCl + 2 мМ DTT + 1 мМ ЭДТА). Полученную суспензию центрифугировали для удаления дебриса, и на дальнейших этапах очистки использовали супернатант (неочищенный лизат). Белки в неочищенном лизате подвергали фракционированию путем добавления сульфата аммония до 30% насыщения (вес./об.). Раствор перемешивали в течение 1 часа и затем центрифугировали. На этом этапе удаляли осадок, и к супернатанту добавляли дополнительный сульфат аммония до 50% насыщения (вес./об.) сульфатом аммония. Раствор повторно центрифугировали после перемешивания в течение 1 часа. На этом этапе осадок содержал RuBisCo, и его сохраняли при -20°С до использования. Белок выделяли из гранул и подготавливали к использованию, как описано выше.
RuBisCo также можно очищать путем доведения неочищенного лизата с помощью 0,1 М NaCl и использования анионообменной смолы. Слабосвязанные белковые примеси промывали 50 мМ калий-фосфатного буфера рН 7,4 + 0,1 М NaCl + RuBisCo, затем элюировали буфером с высокой ионной силой (0,5 М NaCl).
Растворы RuBisCo обесцвечивали (уровень рН от 7 до 9) путем пропускания через колонку с активированным углем. Красители оставались на колонке, тогда как RuBisCo был выделен в фильтрате.
Растворы RuBisCo также обесцвечивают альтернативным способом инкубации раствора со смолой FPX66 (Dow Chemicals), загруженной в колонку (или в режиме порций). Суспензию инкубировали в течение 30 минут, а затем жидкость отделяли от смолы. Красители присоединялись к смоле, и RuBisCO собирали из проточных фракций колонки.
В некоторых вариантах осуществления RuBisCO выделяли из листьев шпината, сначала путем измельчения листьев в блендере с 4 объемами 20 мМ калий-фосфатного буфера с уровнем рН 7,4 + 150 мМ NaCl + 0,5 мМ ЭДТА). Полученную суспензию центрифугировали для удаления дебриса, затем супернатант (неочищенный лизат) фильтровали через мембраны 0,2 мкм и концентрировали с использованием PES мембран с отсечкой 10 кДа.
В некоторых вариантах осуществления RuBisCo экстрагировали из порошка из сока люцерны или пырея путем смешивания в блендере этого порошка с 4 объемами 20 мМ калий-фосфатного буфера с уровнем рН 7,4 + 150 мМ NaCl + 0,5 мМ ЭДТА). Полученную суспензию центрифугировали для удаления дебриса, затем супернатант (неочищенный лизат) фильтровали через мембраны 0,2 мкм и концентрировали с использованием PES мембран с отсечкой 10 кДа.
(ix) Легоглобин. Корневые клубеньки сои суспендировали с помощью измельчителя-блендера и лизировали в 20 мМ фосфата калия, рН 7,4, 100 мМ хлорида калия и 5 мМ ЭДТА. Во время лизирования легоглобин выделялся в буферный раствор. Клубеньковый лизат, содержащий легоглобин, очищали от клеточного дебриса путем фильтрации через фильтр 5 мкм. В некоторых вариантах осуществления после фильтрования выполняли центрифугирование (7000 g, 20 минут). После этого осветленный лизат, содержащий легоглобин, фильтровали через 0,2-микронный фильтр и наносили на анионообменную хроматографическую колонку (High Prep Q; High Prep DEAE, GE Healthtcare) в устройстве для быстрой жидкостной хроматографии белков (GE Healthtcare). Легоглобин собирали в проточной фракции и концентрировали до требуемой концентрации над PES мембраной с отсечкой по молекулярной массе 3 кДа в системе фильтрации с тангенциальным потоком и полыми волокнами Spectrum Labs KrosFlo. Анализ чистоты (частичное содержание) очищенного легоглобина проводили с помощью электрофореза в геле SDS-PAGE: содержание легоглобина в лизате составляло от 20 до 40%, а после анионообменной очистки его содержание составляло от 70 до 80%. В другом варианте осуществления проточную фракцию соевого легоглобина после анионообменной хроматографии вносили на колонку для эксклюзионной хроматографии (сефакрил S-100 HR, GE Healthcare). Соевый легоглобин элюировали в виде двух фракций, соответствующих димерному и мономерному типам. Анализ чистоты (частичное содержание) легоглобина проводили с помощью SDS-PAGE, и было установлено приблизительное содержание от 90 до 100%. В анализе UV-VIS (250–700 нм) была выявлена спектральная подпись, соответствующая гем-содержащему легоглобину.
2
2
(x) Несимбиотический гемоглобин из бобов мунг был клонирован в вектор pJexpress401 (DNA2.0) и трансформирован в клетки E. coli BL21. Клетки выращивали в среде LB, содержащей сойтон вместо триптона, канамицин, 0,1 мМ трихлорид железа и 10 мкг/мл 5-аминолевулиновой кислоты. Экспрессию индуцировали посредством 0,2 мМ изопропилтиогалактозида (IPTG), и клетки выращивали при 30°С в течение 20 часов. Собирали E. coli, экспрессирующие не-симбиотический гемоглобин бобов мунг, и ресуспендировали их в 20 мМ MES-буфера, рН 6,5, 50 мМ NaCl, 1 мМ MgCl, 1 мМ CaCl. Добавляли небольшое количество ДНК-азы l и ингибиторов протеазы. Клетки лизировали обработкой ультразвуком. Лизат очищали от клеточного дебриса путем центрифугирования при 16000 g в течение 20 минут с последующим фильтрованием через фильтр 200 нм. После этого клеточный лизат загружали на FF-S смолу в устройстве для быстрой жидкостной хроматографии белков (GE Healthcare). Не-симбиотический гемоглобин бобов мунг связывался с FF-S колонкой и элюировался с использованием градиента хлорида натрия (50 мМ–1000 мМ). Анализ чистоты (частичное содержание) не-симбиотического гемоглобина бобов мунг проводили с помощью SDS-PAGE, и было установлено, что содержание в лизате E. coli - 13%, содержание после очистки на FFQ - 35%. UV-VIS анализ очищенного белка показывал спектральные характеристики гем-связанного белка.
(xi) Были синтезированы гем-белки с меткой N-концевого эпитопа His6 и сайта расщепления TEV, клонированы в вектор pJexpress401 (DNA2.0) и трансформированы в E. coli BL21. Трансформированные клетки выращивали в среде LB, содержащей сойтон вместо триптона, канамицин, 0,1 мМ трихлорид железа и 10 мкг/мл 5-аминолевулиновой кислоты.
2
2
Экспрессию индуцировали посредством 0,2 мМ IPTG, и клетки выращивали при 30°С в течение 20 часов. Клетки E. coli, экспрессирующие гем-белки, собирали и ресуспендировали в 50 мМ фосфата калия рН 8, 150 мМ NaCl, 10 мМ имидазола, 1 мМ MgCl, 1 мМ CaCl, в присутствии ДНКазы I и ингибиторов протеазы. Клетки лизировали обработкой ультразвуком и очищали путем центрифугирования при 9000×g. Лизат инкубировали со смолой NiNTA (MCLAB), промывали 50 мМ фосфата калия рН 8, 150 мМ NaCl, 10 мМ имидазола в количестве 5 объемов колонки (ОК), и элюировали 50 мМ фосфата калия рН 8, 150 мМ NaCl, 500 мМ имидазола. Анализ SDS-PAGE и спектры UV-VIS подтверждали ожидаемую молекулярную массы и полную загрузку гема соответственно.
3
3
В некоторых вариантах осуществления трансформированные клетки выращивали в среде для семян, состоящей из 10 г/л моногидрата глюкозы, 8 г/л монокалия фосфата, 2,5 г/л Sensient Amberferm 6400, 2,5 г/л Sensient Tastone 154, 2 г/л диаммонийфосфата, 1 мл/л смеси следовых металлов (Teknova 1000x Trace Metals Mixture, № в каталоге T1001), 1 г/л сульфата магния, 0,25 мл 0,1 М раствора хлорного железа, 0,5 мл/л антивспенивателя 204 Sigma, раствор 1000×1 мл/л канамицина сульфата. Использовали 250 мл среды во встряхиваемых колбах с отбойными перегородками объемом (4) - 1л, в каждую из которых инокулировали 0,25 мл глицериновой маточной культуры из одного флакона. Встряхиваемые колбы выращивали в течение 5,5 часов с перемешиванием 250 об./минуту при 37°С. Среду для семян в объеме 40 л стерилизовали паром в 100-литровом биореакторе, охлаждали до 37°С, доводили уровень рН до 7,0 и инокулировали культурой из встряхиваемой колбы в объеме 800 мл после достижения показателя оптической плотности (ОП) 2,5 во встряхиваемой колбе. В биореактор подавался воздух со скоростью 40 л/м и его перемешивали при 250 об./мин. Через 2,2 часа выращивания был достигнут показатель ОП 2,20, затем 22 л культуры переносили в заключительный биореактор объемом 4 м. Исходная среда в заключительном биореакторе состояла из следующих компонентов пара на месте: 1775 л деионизированной воды, 21,75 кг монокалия фосфата, 2,175 кг диаммонийфосфата, 4,35 кг аммония цитрата трехвалентного железа, 8,7 кг сульфата аммония, 10,875 кг Sensient Amberferm 6400, 10,875 кг Sensient Tastone 154. После пропаривания в течение 30 минут компоненты среды охлаждали до 37°С, и после стерилизации вносили добавки: 2,145 л 0,1 М раствора треххлорида железа, 59,32 кг 55% вес./вес. глюкозы моногидрата, 3,9 л смеси следовых металлов (Teknova 1000x Trace Metals Mixture, № в каталоге T1001), 10,88 л диаммонийфосфата 200 г/л, 36,14 л 1М сульфата магния и 2,175 л антивспенивателя 204 Sigma, 2,175 л раствора канамицина сульфат 1000x. Уровень рН поддерживали на уровне 7,0 путем добавления 30% гидроксида аммония. Аэрацию осуществляли при 2,175 м/мин, содержание растворенного кислорода поддерживали на уровне 25%, варьируя скорость перемешивания в диапазоне от 60 до 150 об./минуту. Дополнительные питательные вещества вводили в виде болюсных добавок в двух точках времени (EFT=4 и EFT=8). При каждом добавлении в автоклавированные растворы вносили 5,5 кг Sensient Amberferm 6400, 5,5 кг Sensient Tastone 154 и 4,4 кг диаммонийфосфата (10 г/л раствора Amberferm и Tastetone, 200 г/л диаммонийфосфата). Для поддержания остаточного уровня глюкозы от 2 до 5 г/л в биореактор подавали стерильный раствор глюкозы 55% вес./вес. глюкозы моногидрата. После достижения оптической плотности 25 температуру снижали до 25°С, и культуру индуцировали 1 М изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозидом в количестве 0,648 л. Культуру оставляли для роста в течение общего времени 25 часов, после чего разводили 1:1 деионизированной водой, затем центрифугировали и концентрировали фильтрат до 50%-го содержания твердых частиц об./об.. Клеточный фильтрат замораживали до -20°С. Фильтрат оттаивали при 4°С, разводили в 20 мМ калий-фосфатного буфера рН 7,8, 100 мМ NaCl, 10 мМ имидазола и гомогенизировали при 15000 фунтов на кв.дюйм. Гомогенизированные клетки подвергали фильтрованию через фильтр 0,2 мкм с тангенциальным потоком (TFF), и фильтрованный лизат загружали непосредственно на цинк-содержащую колонку IMAC (GE). Связанные белки промывали 20 мМ фосфата калия, рН 7,4, 100 мМ NaCl, 5 мМ гистидина в количестве 10 объемов колонки (ОК) и элюировали 500 мМ одноосновного фосфата калия, 100 мМ NaCl в количестве 10 ОК. Элюированный легоглобин подвергали концентрированию и диафильтрации с использованием PES мембран с отсечкой по молекулярной массе 3 кДа и TFF. Концентрированный образец восстанавливали посредством дитионита натрия 20 мМ и обессоливали с использованием смолы G-20 (GE). Обессоленные образцы легоглобина замораживали в жидком азоте и хранили при -20°С. Чистоту и концентрацию легоглобина определяли с помощью анализов SDS-PAGE и UV-VIS.
(xii) Олеозин. Масляные тельца подсолнечника очищали из семян подсолнечника. Семена подсолнечника смешивали в 100 мМ натрий-фосфатного буфера, рН 7,4, 50 мМ хлорида натрия, 1 мМ ЭДТА в соотношении 1:3 вес./об.. Масляные тельца собирали центрифугированием (5000 g, 20 минут) и ресуспендировали в соотношении 1:5 (вес./об.) в 50 мМ хлорида натрия, 2М мочевины, затем перемешивали в течение 30 минут при 4°С. Этапы промывания 2М мочевиной и центрифугирования повторяли. Масляные тельца, собранные центрифугированием, ресуспендировали в 100 мМ натрий-фосфатного буфера, рН 7,4, 50 мМ хлорида натрия. Этапы центрифугирования и промывания повторяли еще раз, и окончательное промывание проводили с фракцией масляных телец из последнего этапа центрифугирования. Масляные тельца ресуспендировали в 10% вес./вес. в 100 мМ натрий-фосфатного буфера, рН 7,4, 50 мМ хлорида натрия, 2% вес./об. солей жирных кислот из растительного масла, гомогенизировали при 5000 фунтов на кв.дюйм, и инкубировали при 4°С в течение 12 часов. Раствор центрифугировали (8000 g, 30 минут), верхний слой удаляли и собирали растворимую фракцию. Исходя из анализа SDS-PAGE, предполагается, что олеозины являются основным белком, присутствующим в растворимой фракции. Концентрация олеозина составляла 2,8 мг/мл.
(xiii) Общий белок гороха: для экстракции общего белка гороха использовали сухую муку зеленого или желтого гороха. Муку суспендировали в 10 объемах 20 мМ калий-фосфатного буфера, рН 8, и 100 мМ хлорида натрия, затем перемешивали в течение 1 часа. Растворимый белок отделяли от дебриса горохового семени путем центрифугирования. Супернатант собирали и фильтровали через мембраны 0,2 мкм, затем концентрировали с использованием PES мембран с отсечкой 10 кДа.
(xiv) Вицилин гороха и легумин гороха: сухую муку из зеленого или желтого гороха использовали для экстракции общего белка гороха, как описано выше. Полученную неочищенную смесь гороховых белков фракционировали на вицилин гороха и легумин гороха с помощью ионообменной хроматографии. Материал загружали на сефарозную смолу Q-Sepharose FastFlow и собирали фракции, при этом концентрация соли NaCl варьировалась от 100 мМ до 500 мМ. Вицилин гороха собирали при 350 мМ хлорида натрия, и легумин гороха собирали при 460 мМ хлорида натрия. Собранные фракции концентрировали с использованием PES мембран с отсечкой 10 кДа.
(xv) Общий белок чечевицы: для экстракции неочищенной смеси белков чечевицы использовали чечевичную муку, прошедшую тепловую обработку горячим воздухом. Муку суспендировали в 5 объемах 20 мМ калий-фосфатного буфера, рН 7,4 и 0,5 М хлорида натрия, затем перемешивали в течение 1 часа. Растворимый белок отделяли от неэкстрагированного белка, и дебрис семян чечевицы удаляли путем центрифугирования (8000 g, 20 минут). Супернатант собирали, фильтровали через мембраны 0,2 мкм и концентрировали с использованием PES мембран с отсечкой 10 кДа.
(xvi) Альбумины чечевицы: чечевичную муку, прошедшую тепловую обработку горячим воздухом, суспендировали в 5 объемах 50 мМ хлорида натрия, рН 3,8, и перемешивали в течение 1 часа. Растворимый белок отделяли от неэкстрагированного белка, и дебрис семян чечевицы удаляли путем центрифугирования (8000 g, 20 минут). Супернатант собирали и фильтровали через мембраны 0,2 мкм, затем его концентрировали с использованием PES мембран с отсечкой 10 кДа.
(xvii) Общий белок нута/бобов гарбанзо: муку из бобов гарбанзо суспендировали в 5 объемах 20 мМ калий-фосфатного буфера, рН 7,4, и 0,5 М хлорида натрия, затем перемешивали в течение 1 часа. Растворимый белок отделяли от неэкстрагированного белка, и дебрис семян нута удаляли путем центрифугирования (8000 g, 20 минут). Супернатант собирали и фильтровали через мембраны 0,2 мкм, затем его концентрировали с использованием PES мембран с отсечкой 10 кДа.
(xviii) Альбумины нута/бобов гарбанзо: муку из бобов гарбанзо суспендировали в 5 объемах 50 мМ хлорида натрия, рН 3,8, и 0,5 М хлорида натрия, затем перемешивали в течение 1 часа. Растворимый белок отделяли от неэкстрагированного белка, и дебрис семян нута удаляли путем центрифугирования (8000 g, 20 минут). Супернатант собирали, фильтровали через мембраны 0,2 мкм и затем концентрировали с использованием PES мембран с отсечкой 10 кДа.
(xix) Дегидрины из муки амаранта: муку из амаранта суспендировали в 5 объемах 0,5 М хлорида натрия, рН 4,0, и перемешивали в течение 1 часа. Растворимый белок отделяли от неэкстрагированного белка, и дебрис амаранта удаляли путем центрифугирования (8000 g, 20 минут). Супернатант собирали, фильтровали через мембраны 0,2 мкм и затем концентрировали с использованием PES мембран с отсечкой 3 кДа. Дополнительное обогащение дегидринов из этой фракции достигалось путем кипячения концентрированного белкового материала, центрифугирования со скоростью 8000 g в течение 10 минут, после чего собирали супернатант.
ПРИМЕР 2: СОЗДАНИЕ АНАЛОГА МЫШЕЧНОЙ ТКАНИ
Для изготовления аналога мышечной ткани 8 мл раствора белка бобов мунг (114 мг/мл в 20 мМ фосфатного буфера (рН 7,4) и 400 мМ хлорида натрия) смешивали с 16 мл раствора легоглобина (6 мг/мл легоглобина в 20 мМ фосфата калия, 400 мМ NaCl, уровень рН 7,3). Полученную смесь концентрировали с помощью концентраторов-центрифуг Amicon (отсечка 10 кДа) до конечной концентрации 61 мг/мл 8S глобулина бобов мунг и 6,5 мг/мл легоглобина. К раствору добавляли приблизительно 400 мг порошка трансглутаминазы, который был тщательно перемешен и разделен на два флакона Falcon объемом 50 мл, затем проводили инкубацию в течение ночи при комнатной температуре. Конечная концентрация общего белка составляла 67,5 мг/мл общего белка. Был получен аналог мышечной ткани в виде непрозрачного геля красновато-коричневого цвета, с небольшим количеством (менее 1 мл) включений темно-красной жидкости цвета венозной крови.
ПРИМЕР 3: ПОВЫШЕНИЕ ПРОЧНОСТИ НА РАЗРЫВ АНАЛОГА ЖИРОВОЙ ТКАНИ
40 мл аликвоты из масла рисовых отрубей и 40 мл аликвоты белка бобов мунг (114 мг/мл) объединяли в химическом стакане из пирекса объемом 250 мл. Химический стакан помещали в водяную баню и проводили эмульгирование с использованием ультразвукового аппарата Branson Sonifer 450 с наконечником 12 мм в течение 6 минут, при 60% рабочего цикла, уровень мощности 5.
В пластиковый лоток для льда из синтетического каучука (Ikea) размером 18 см × 18 см × 2,5 см, укладывали 48 мг электроформованных волокон (из соединительной ткани, пример 14) в продольном направлении и максимально равномерно, насколько это возможно, поперек дна одной треугольной формы 13,97 см × 1,27 см × 1,5875 см. Затем на волокна выливали приблизительно 20 мл эмульсии масла из рисовых отрубей/белка бобов мунг. Затем еще 20 мл эмульсии выливали в пустую форму тех же размеров в том же лотке, которую использовали в качестве контроля.
Лоток для льда помещали в кипящую воду на 15 минут, вынимали и охлаждали до комнатной температуры.
2
С помощью лезвия бритвы каждый из полученных гелей был разрезан на 3 сегмента, каждый сегмент имел длину 4,66 см и площадь поперечного сечения 1 см. Для оценки прочности на разрыв использовали улучшенный анализатор текстуры Stable Micro Systems TA XTExpress Enhanced, снабженный зондом TA-96B. Слой, содержащий аналог жира, имел прочность на разрыв 23 кПа, в то время как аналог жира без волокон имел прочность на разрыв 20 кПа.
ПРИМЕР 4. АНАЛОГ ЖИРА С ВЫСОКИМ ПРОЦЕНТОМ ЖИРА
Аналог жировой ткани, содержащий белково-масляную эмульсию, изготовленную из 3,3% вес./об. глобулина гороха, 70% вес./вес. масла, состоящего из смеси кокосового масла, какао-масла, оливкового и пальмового масел в равных пропорциях, и 0,5% вес./об. лецитина, сшивали с 2% трансглутаминазой (Ajinomoto Activa TI). После удаления жидкости и дегидратации получали гель средней мягкости, в котором подтвержденное содержание жира составляло 75% (вес./вес.).
Матрица жировой ткани, содержащая белково-масляную эмульсию, была изготовлена с 1,6% вес./об. RuBisCo и 80% об./об. масла какао. Полученный гель был мягким.
ПРИМЕР 5: СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНАЛОГА ЖИРОВОЙ ТКАНИ
При необходимости масла растапливали путем нагревания до комнатной температуры или аккуратного разогревания. Если масла являются твердыми при комнатной температуре, в течение остальной части процедуры в них поддерживалась температура, близкая к точке плавления. Белки получали в соответствии с установленными протоколами (см. пример 1). Лецитин взвешивали и ресуспендировали в воде, а затем обрабатывали ультразвуком для создания гомогенного раствора. Компоненты объединяли друг с другом в определенных соотношениях и доводили объем с использованием буфера при необходимости (20 мМ фосфата натрия, рН 7,4, 50 мМ хлорида натрия), а затем подвергали гомогенизации или ультразвуковой обработке для контроля размера частиц в эмульсии. После этого эмульсии подвергали желированию путем: (а) нагревания/охлаждения, (b) сшивания с ферментом трансглутаминазой или (b) нагревания/охлаждения с последующим добавлением фермента трансглутаминазы. Для сравнения были изготовлены контрольные образцы (без обработок нагреванием/охлаждением и трансглутаминазным сшиванием). Эмульсии, стабилизированные обработкой нагреванием/охлаждением, были изготовлены путем помещения эмульсии в водяную баню при 90-100°С на пять минут, затем образцы оставляли для медленного охлаждения до комнатной температуры. Эмульсии, стабилизированные трансглутаминазным сшиванием, были изготовлены путем добавления трансглутаминазы до 2% вес./об. и подвергались инкубации при 37°С в течение 12-18 часов. Эмульсии, стабилизированные нагреванием/охлаждением с последующим добавлением фермента трансглутаминазы, были изготовлены следующим образом: сначала они подвергались нагреванию/охлаждению в соответствии с протоколом, с последующим добавлением фермента после охлаждения образцов до комнатной температуры. Все эмульсии были инкубированы в течение от 8 до 12 часов при температуре 37°С.
ПРИМЕР 6: СПОСОБ АНАЛИЗА АНАЛОГОВ ЖИРОВОЙ ТКАНИ
После различных желирующих обработок гелеобразные эмульсии перемещали для анализов в условия с комнатной температурой. Регистрировали общий объем гелеобразных эмульсий и объемы фазово-разделенной воды и/или объемы масла (если гелеобразные эмульсии были не однофазными). Твердость аналога жировой ткани оценивали путем аккуратного протыкания гелеобразных эмульсий. Затем проводили кулинарные эксперименты, для чего полученную массу переносили на нагретую поверхность и измеряли температуры жидкости сразу после приготовления.
ПРИМЕР 7: ЖИРОВОЙ АНАЛОГ ГОВЯЖЬЕГО ЖИРА
Аналог жировой ткани было изготовлен путем желирования раствора очищенного 8S белка бобов мунг, эмульгированного с равным количеством какао-масла, кокосового масла, оливкового масла и пальмового масла. Очистку 8S белков бобов мунг проводили, как описано в примере 1, и они имели концентрацию 140 мг/мл в 20 мМ фосфата калия, рН 7,4, 400 мМ NaCl. Смесь жиров была приготовлена путем расплавления отдельных жиров из твердого состояния в жидкое состояние при 45°С в течение 30 минут. Затем отдельные жиры (масло какао, кокосовое масло, оливковое масло и пальмовое масло) в жидком состоянии смешивали в соотношении 1:1:1:1 (об./об.). Белково-жировую эмульсию получали путем смешивания смеси жидкого жира в количестве 70% об./об. с 8S белком бобов мунг 4,2% вес./об. и лецитином сои 0,4% вес./об., и затем эмульгировали путем встряхивания на вортексе в течение 30 секунд с последующей обработкой ультразвуком в течение 1 минуты. После гомогенизации получали белково-жировую эмульсию в единственной жидкой фазе, что устанавливали путем визуального наблюдения.
Одну из эмульсий аналога жировой ткани стабилизировали сшиванием с ферментом трансглутаминазой 0,2% вес./об. при 37°С в течение 12 часов. Другой аналог жировой ткани стабилизировали путем желирования белков при нагревании до 100°С на водяной бане с последующим охлаждением до комнатной температуры. Полученные аналоги жировой ткани были однофазными. Матрица аналога жировой ткани, изготовленная посредством трансглютаминазы, была твердой с более мягкой консистенцией, чем матрица аналога жировой ткани, которая была изготовлена путем желирования, индуцированного нагреванием/охлаждением.
ПРИМЕР 8. ЖИРОВОЙ АНАЛОГ ЖИРА ГОВЯДИНЫ ВАГЮ
Аналог жировой ткани был изготовлен путем желирования эмульсии очищенных белков-глобулинов гороха и равных количеств масла какао, кокосового масла, оливкового масла и пальмового масла. Глобулиновые белки гороха были очищены, как описано в примере 1, и имели концентрации 100 мг/мл, в 20 мМ фосфата калия, рН 8, 400 мМ NaCl. Жировую смесь получали путем расплавления отдельных жиров из твердого состояния в жидкое состояние при 45°С в течение 30 минут. Затем отдельные жиры (масло какао, масло манго, оливковое масло) в жидком состоянии смешивали в соотношении 2:1:1 об./об. (оливковое масло:масло какао:масло манго). Белково-жировую эмульсию получали путем смешивания жидкой жировой смеси с 5% вес./об. раствора глобулинов гороха в соотношении 1:1, с последующим эмульгированием с помощью ручного гомогенизатора при максимальных установках в течение 30 секунд. После гомогенизации получали белково-жировую эмульсию в единственной жидкой фазе, что устанавливали путем визуального наблюдения. Эмульсия была стабилизирована сшиванием с ферментом трансглутаминазой в количестве 0,2% вес./об. при 37°С в течение 12 часов. Полученный аналог жировой ткани был однофазным, твердым с мягкой консистенцией и имел солоноватый вкус.
ПРИМЕР 9: АНАЛОГ ЖИРОВОЙ ТКАНИ С ВНЕСЕНИЕМ ЖИРНЫХ КИСЛОТ ГОВЯДИНЫ
Аналог жировой ткани был изготовлен путем желирования эмульсии очищенных белков-глобулинов гороха и равных количеств масла какао, масла манго, оливкового масла и масла из рисовых отрубей. Глобулиновые белки гороха были очищены, как описано в примере 1, и имели концентрации 100 мг/мл, в 20 мМ фосфата калия, рН 8, 400 мМ NaCl. Жировую смесь получали путем расплавления отдельных жиров из твердого состояния в жидкое состояние при 45°С в течение 30 минут. Затем отдельные жиры (масло какао, масло манго, оливковое масло и масло из рисовых отрубей) в жидком состоянии смешивали в соотношении 1:1:1:1 об./об.. Белково-жировую эмульсию получали путем смешивания 50% об./об. жидкой жировой смеси с 5% вес./об. глобулинов гороха, с последующим эмульгированием с помощью ручного гомогенизатора при максимальных установках в течение 30 секунд. После гомогенизации получали белково-жировую эмульсию в единственной жидкой фазе, что устанавливали путем визуального наблюдения. Эмульсия была стабилизирована сшиванием с ферментом трансглутаминазой в количестве 0,2% вес./об. при 37°С в течение 12 часов. Полученный аналог жировой ткани был однофазным, твердым с мягкой консистенцией и имел солоноватый вкус.
ПРИМЕР 10: АНАЛОГ ЖИРОВОЙ ТКАНИ, В КОТОРОМ ТВЕРДОСТЬ ЖИРОВОЙ ТКАНИ ПРИ ОХЛАЖДЕНИИ И ТЕМПЕРАТУРЕ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ РЕГУЛИРУЕТСЯ ТЕМПЕРАТУРОЙ ПЛАВЛЕНИЯ ЖИРА В АНАЛОГЕ ЖИРОВОЙ ТКАНИ
Аналоги жировой ткани, сделанные в виде стабильной эмульсии RuBisCo с подсолнечным маслом, имели более мягкую консистенцию, чем аналоги жировой ткани, сделанные в виде стабильной эмульсии RuBisCo и масло какао. Аналоги жировой ткани были изготовлены с 0,18%, 1,6% и 2,4% (вес./об.) Rubisco и с 70%, 80% и 90% (об./об.) подсолнечного масла или масла какао. Каждый из аналогов жировой ткани, который содержал масло какао, был более твердым, чем соответствующий аналог, изготовленный с подсолнечным маслом. Аналоги жировой ткани, содержащие 0,18%, 1,6% и 2,4% (вес./об.) RuBisCo с 70%, 80% и 90% какао-масла (об./об.), были твердыми при комнатной температуре, но плавились примерно при температуре ротовой полости. Аналоги жировой ткани, изготовленные с различными концентрациями RuBisCo (0,18, 1,6 1,9% вес./об.) и с подсолнечным маслом в количестве от 70 до 80% (об./об.), были более твердыми, поскольку увеличивалось количество белка в матрице аналога жировой ткани. Аналоги жировой ткани с 0,18% вес./об. RuBisCo были очень мягкими; аналоги жировой ткани с 1,6% вес./об. RuBisCo были мягкими; и аналоги жировой ткани с 1,9% вес./об. RuBisCo имели среднюю твердость.
Аналоги жировой ткани, изготовленные в виде стабильной эмульсии 8S белков бобов мунг с подсолнечным маслом, имели более мягкую консистенцию, чем аналоги жировой ткани, изготовленные в виде стабильной эмульсии 8S белка бобов мунг и масло какао. Аналоги жировой ткани были изготовлены с 2%, 1% и 0,5% (вес./об.) 8S белков бобов мунг и подсолнечным маслом или маслом какао в количестве 70%, 80% и 90% (об./об.). Каждый из аналогов жировой ткани, который содержал масло какао, был более твердым, чем соответствующий аналог, изготовленный с подсолнечным маслом.
Аналоги жировой ткани, изготовленные в виде стабильных эмульсий 8S белка бобов мунг с маслом канолы, имели более мягкую консистенцию, чем соответствующие аналоги жировой ткани, изготовленные в виде стабильных эмульсий 8S белков бобов мунг со смесью кокосового масла, масла какао, оливкового и пальмового масел в равных пропорциях. Аналоги жировой ткани были изготовлены с 1,4% (вес./об.) 8S белков бобов мунг с подсолнечным маслом или маслом какао, или со смесью масел в количестве 50%, 70% и 90% (об./об.). Каждый из аналогов жировой ткани, который содержал смесь масел, был более твердым, чем соответствующий аналог, изготовленный с подсолнечным маслом. Аналог жировой ткани, содержащий 1,4% (вес./об.) 8S белков бобов мунг и 50%, 70% и 90% (об./об.) кокосового масла, масла какао, оливкового и пальмового масла в равной смеси, был твердым при комнатной температуре, но плавился примерно при температуре ротовой полости.
Аналог жировой ткани, изготовленный в виде стабильной эмульсии соевых белков и подсолнечного масла, имел более мягкую консистенцию, чем соответствующий аналог жировой ткани, изготовленный в виде стабильной эмульсии соевых белков и масла какао. Аналоги жировой ткани были изготовлены с 0,6%, 1,6% и 2,6% (вес./об.) соевых белков и с подсолнечным маслом или смесью масел в количестве 50%, 70%, 80% и 90% (об./об.). Каждый из аналогов жировой ткани, который содержал смесь масел, был более твердым, чем соответствующий аналог, изготовленный с подсолнечным маслом. Аналоги жировой ткани, содержащие 0,6%, 1,6% и 2,6% (вес./об.) соевых белков с 50%, 70%, 80% и 90% (об./об.) какао-масла, были твердыми при комнатной температуре, но плавились примерно при температуре ротовой полости.
ПРИМЕР 11: ПРИГОТОВЛЕНИЕ АНАЛОГА ЖИРОВОЙ ТКАНИ: СТРУКТУРА МАТРИЦЫ ЖИРОВОЙ ТКАНИ РЕГУЛИРУЕТ ТЕМПЕРАТУРУ ПЛАВЛЕНИЯ ВО ВРЕМЯ КУЛИНАРНОЙ ОБРАБОТКИ
Аналог жировой ткани, содержащий стабилизированную эмульсию белок-в масле, созданную, как описано в примере 5 и в примере 6 выше, был изготовлен с 2% (вес./об.) RuBisCo и 50%, 70% и 90% (об./об.) масла какао, имел более высокую температуру плавления, чем аналог жировой ткани, изготовленный путем денатурации нагреванием/охлаждением, и более низкую температуру плавления, чем при изготовлении путем сшивки с трансглутаминазой.
ПРИМЕР 12: КУЛИНАРНАЯ ОБРАБОТКА ЖИРОВОЙ ТКАНИ: РАСПОЛОЖЕНИЕ И СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ БЕЛКОВ И ЖИРА В МАТРИЦЕ ЖИРОВОЙ ТКАНИ РЕГУЛИРУЕТ КОЛИЧЕСТВО ВЫДЕЛЯЕМОГО ЖИРА И ЖИРА, ОСТАЮЩЕГОСЯ В АНАЛОГЕ ЖИРОВОЙ ТКАНИ ВО ВРЕМЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ
Во время кулинарной обработки матрицы аналога жировой ткани, содержащей эмульсию белок–в масле, изготовленную с 2% вес./об. RuBisCo и 50%, 70% или 90% об./об. какао-масла, аналог жировой ткани лучше сохранял свою массу после приготовления, если этот аналог жировой ткани был изготовлен путем денатурации нагреванием/охлаждением, и меньшее количество его массы сохранялось в случае изготовления путем сшивки с трансглутаминазой. Выделяемая масса была жидкой и имела маслянистый вид.
Во время кулинарной обработки матрицы аналога жировой ткани, содержащей эмульсию белок–в масле, образованную с 2,6 и 0,6% вес./об. соевого белка и 50%, 70% или 90% об./об. какао-масла, аналог жировой ткани лучше сохранял свою массу, если этот аналог жировой ткани был изготовлен путем денатурации нагреванием/охлаждением, и меньшее количество его массы сохранялось в случае изготовления путем сшивки с трансглутаминазой. Выделяемая масса была жидкой и имела маслянистый вид.
ПРИМЕР 13: КУЛИНАРНАЯ ОБРАБОТКА АНАЛОГА ЖИРОВОЙ ТКАНИ: КОНЦЕНТРАЦИЯ КОНКРЕТНЫХ БЕЛКОВ В МАТРИЦЕ ЖИРОВОЙ ТКАНИ РЕГУЛИРУЕТ МАССУ АНАЛОГА ЖИРОВОЙ ТКАНИ, КОТОРАЯ ОСТАЕТСЯ ПОСЛЕ ПРИГОТОВЛЕНИЯ
6
Серию аналогов жировой ткани, изготовленных с 1,4% вес./об. 8S белок бобов мунг, 90% об./об. рапсового масла и 0,45% вес./об. соевого лецитина, гомогенизировали, и к этой эмульсии добавляли олеозины подсолнечника в возрастающих концентрациях при различных концентрациях. Концентрация олеозина варьировалась от 1:10 до 1:10в молярном соотношении олеозина и триглицерида. При более высоком содержании олеозинов по отношению к маслу в аналоге жировой ткани наблюдалось увеличение массы, остающейся после приготовления.
В серии аналогов жировой ткани, изготовленных с различными концентрациями RuBisCo и 70% об./об. подсолнечного масла, сохранялось больше массы при кулинарной обработке по мере возрастания концентрации RuBisCo. Аналоги жировой ткани, содержащие RuBisCo при 0% вес./об., расплавлялись полностью, тогда как при 1,9% вес./об. RuBisCo сохранялось 10% массы, а в аналоге жировой ткани, содержащей 2,4% вес./об. RuBisCo, сохранялось 20% массы при кулинарной обработке.
ПРИМЕР 14: АНАЛОГ СОЕДИНИТЕЛЬНОЙ ТКАНИ
Аналоги волокон соединительной ткани были изготовлены путем электроформования раствора глобулина бобов мунг (22,5 мг/мл), содержащего 400 мМ хлорида натрия, 6,75% вес./об. поливинилового спирта и следовые количества азида натрия (0,007%) вес./об.). Полученный раствор нагнетали со скоростью 3 мкл/мин с помощью шприцевого насоса, шприцем 5 мл через тефлоновую трубку и затупленную иглу 21 калибра. Игла была соединена с положительным полюсом источника высокого напряжения Spellman CZE, 30 кВ, и фиксирована на расстоянии 12 см от алюминиевого барабана (приблизительно 12 см в длину, диаметр 5 см), который обернут алюминиевой фольгой. Барабан был прикреплен к шпинделю, который вращается посредством мотора IKA RW20 со скоростью приблизительно 220 оборотов в минуту. Шпиндель был соединен с выводом заземления источника высокого напряжения. Белково-полимерное волокно, собранное на фольге, соскребали и использовали в качестве аналога соединительной ткани.
2+
ПРИМЕР 15: ПРОДЛЕНИЕ ВРЕМЕНИ ЖИЗНИ ВОССТАНОВЛЕННОГО ЛЕГОГЛОБИНА (ГЕМ-FE)
Лошадиный миоглобин был приобретен в компании Sigma. Миоглобин ресуспендировали в 10 мг/мл в 20 мМ фосфата калия, рН 8,0, 100 мМ NaCl. Исходя из анализа SDS-PAGE, предполагается, что чистота белка составляет приблизительно 90%.
Соевый легоглобин очищали из корневых клубеньков Glycine max посредством преципитации сульфатом аммония (фракционирование 60%/90%), как подробно описано в примере 1. Ресуспендированный посредством 90% сульфата аммония легоглобин дополнительно очищали с помощью анионообменной хроматографии (колонка HiTrap Q FF 5 мл FPLC) в 20 мМ фосфата калия, рН 8,0, 100 мМ NaCl. Легоглобин элюировали в проточных фракциях. Исходя из анализа SDS-PAGE, предполагается, что чистота белка составляет приблизительно 70%. Легоглобин подвергали замене буфера на 20 мМ фосфата калия, рН 7,4, 100 мМ NaCl, и концентрировали до 10 мг/мл на мембранных концентраторах 3,5 кДа.
3+
2+
2+
Обработка окисью углерода: миоглобин в количестве 10 мг/мл в 20 мМ фосфата калия, рН 8,0, 100 мМ NaCl и легоглобин в количестве 10 мг/мл в 20 мМ фосфата калия, рН 7,4, 100 мМ NaCl сначала дегазировали в вакууме в течение 1 часа при 4°С, затем подвергали перфузии газообразным монооксидом углерода в течение 2 минут. После этого глобины восстанавливали из состояния гем-Fe до гем-Fe путем добавления 10 мм дитионита натрия, 0,1 мМ гидроксида натрия на 2 минуты. Затем дитионит натрия и гидроксид натрия удаляли из раствора белка с помощью эксклюзионной хроматографии (колонка PD-10 для обессоливания) в 20 мМ фосфата калия, рН 8,0, 100 мМ NaCl и 20 мМ фосфата калия, рН 7,4, 100 мМ NaCl соответственно. Фракции глобинов собирали в виде фракций максимально красного цвета, что оценивали визуально. UV-VIS спектры подтверждали присутствие обоих белков в состоянии гема-Fe. После обессоливания раствор снова подвергали газовой перфузии в течение еще 2 минут. Цвет растворов оценивали путем регистрации UV-VIS спектров (от 250 нм до 700 нм) каждые 20 минут с использованием спектрофотометра NanoDrop. Контрольные образцы не обрабатывали окисью углерода.
3+
2+
2+
2+
Обработка нитритом натрия: миоглобин в количестве 10 мг/мл в 20 мМ фосфата калия, рН 8,0, 100 мМ NaCl и легоглобин в количестве 10 мг/мл в 20 мМ фосфата калия, рН 7,4, 100 мМ NaCl были восстановлены из состояния гем-Feдо гем-Fe путем добавления 10 мМ дитионита натрия, 0,1 мМ гидроксида натрия на 2 минуты. Дитионит натрия и гидроксид натрия удаляли из раствора белка с помощью эксклюзионной хроматографии (колонка PD-10 для обессоливания) в 20 мМ фосфата калия, рН 8,0, 100 мМ NaCl и 20 мМ фосфата калия, рН 7,4, 100 мМ NaCl соответственно. Фракции глобинов собирали в виде фракций максимально красного цвета, что оценивали визуально. UV-VIS спектры подтверждали присутствие обоих белков в состоянии гема-Fe. Затем добавляли нитрит натрия до конечной концентрации 1 мМ из 100 мМ нитрита в фосфатном буфере рН 7,4. Время жизни в состоянии гема-Fe отслеживали путем регистрации UV-VIS спектров (от 250 до 700 нм), используя спектрофотометр, в зависимости от времени. Контрольные образцы не обрабатывали нитритом натрия.
2+
Анализ данных по времени жизни гема-Feдля образцов миоглобина и легоглобина, обработанных окисью углерода и нитритом натрия, проводили в Microsoft Excel путем построения амплитуды пика поглощения при длине волны 540 нм. Был определен "исходный уровень" поглощения при 540 нм по состоянию UV-VIS спектра растворов глобина перед добавлением каких-либо добавок, восстановлением посредством дитионита или перед обессоливанием. Использовали встроенную функцию подбора по кривым для получения экспоненциальной линии наибольшего соответствия, показатель которой непосредственно относится к периоду полужизни пиковой амплитуды.
2+
2+
2+
Время жизни в состоянии гема-Fe и время сопутствующего красного цвета растворов миоглобина и легоглобина в отсутствие окиси углерода и нитрита натрия составляло проиблизительно 6 часов и 4 часа соответственно. Добавление нитрита натрия продлевает время жизни в состоянии гема-Fe и сохранение сопутствующего красного цвета больше, чем на семь дней. Добавление окиси углерода продлевает время жизни в состоянии гем-Fe и сохранение сопутствующего красного цвета больше, чем на две недели.
ПРИМЕР 16: ИЗГОТОВЛЕНИЕ АНАЛОГОВ МЯСА, В КОТОРЫХ ВАРЬИРУЕТСЯ РАЗМЕР ЧАСТИЦ ОТДЕЛЬНЫХ КОМПОНЕНТОВ АНАЛОГОВ ТКАНЕЙ ДЛЯ РЕГУЛЯЦИИ ОБРАЗОВАНИЯ АРОМАТА ВО ВРЕМЯ КУЛИНАРНОЙ ОБРАБОТКИ
Аналоги мышечной ткани и аналоги жировой ткани были изготовлены по отдельности, а затем объединены в аналог мясных тканей, при этом варьировался размер отдельных компонентов тканевого аналога в целях регуляции образования аромата во время кулинарной обработки. Отдельные аналоги жировой, мышечной и соединительной ткани были изготовлены следующим образом.
Аналог мышечной ткани был получен, как описано в примере 2. Аналоги мышечной ткани были изготовлены в виде непрозрачного геля красновато-коричневого цвета, с небольшим количеством (меньше 1 мл) включений темно-красной жидкости цвета венозной крови. Аналог соединительной ткани был получен, как описано в примере 14. Аналог жировой ткани был получен, как описано в примере 7.
Аналоги мяса с соотношением постной ткани и жира 85/15 были получены путем комбинирования отдельных аналогов мышечной, соединительной и жировой ткани таким образом, что размер частиц отдельных аналогов тканей варьировался: (a) 2,1 г аналога мышечной ткани с кускочками 0,9 г жирового аналога размером от 5 до 10 мм ("грубая смесь"); (b) 2,1 г аналога мышечной ткани с кусочками жирового аналога 0,9 г, нарезанными с размером 2-3 мм ("тонкая смесь"); и (c) 2,1 г аналога мышечной ткани с кусочками жирового аналога 0,9 г, тщательно измельченного в блендере до размера кусочков менее 1 мм ("блендерная смесь"). Контрольный образец "только мышцы" содержал 3 г аналога мышечной ткани единственного. Контрольный образец "только жир" содержал 3 г жирового аналога единственного с частицами размером от 5 до 10 мм. Образцы мяса, мышечной и жировой тканей были подвергнуты кулинарной обработке в герметичных стеклянных флаконах при 150°С в течение 10 минут. Ароматические профили образцов были проанализированы группой дегустаторов и с помощью анализа ГХ-МС.
Исходя из сенсорного ольфакторного анализа образцов аналогов мяса, проведенного группой дегустаторов, предполагается, что размер отдельных составных частиц тканей и степень их смешивания в аналогах мясных тканей коррелирует с созданием различных ароматов. Аналог мышечной ткани, приготовленный единственным, создавал ароматы, которые ассоциировались с магазинным соусом, слабым цитрусовым и анисовым ароматом. Аналог жировой ткани, приготовленный единственным, создавал ароматы, которые ассоциировались с плесневелым, прогорклым и сладким ароматами. Аналог мясной ткани после кулинарной обработки (с "грубым" размером частиц) создавал ароматы, которые ассоциировались с магазинным соусом, сладким, слегка плесневелым и анисовым ароматом. Аналог мясной ткани после кулинарной обработки (с мелкими частицами) создавал ароматы, которые ассоциировались с соевым соусом, говяжьим бульоном, плесневелым, слегка прогорклым ароматом. Аналог мясной ткани после кулинарной обработки (с очень мелким размером частиц) создавал ароматы, которые ассоциировались со сладким, плесневелым ароматом и соевым соусом. Все образцы, за исключением аналога жировой ткани, создавали ароматы, которые ассоциировались с запахом горелого мяса, однако в разной интенсивности.
Анализ данных ГХ-МС показал, что размер отдельных составных частиц тканей и степень их смешения в аналогах мясных тканей имеют глубокое влияние на возникновение ароматических соединений при кулинарной обработке. В частности, ряд ароматических соединений, связанных с такими ароматами, как фруктовый/зеленая фасоль/привкус металла (2-пентил-фуран); ореховый/зелень (4-метилтиазол); арахисовое масло/плесень (пиразин, этил); неочищенный картофель/жареный/землистый (пиразин, 2,3-диметил); уксусный (уксусная кислота); пряный/карамельный/миндальный (5-метил-2-фуранкарбоксальдегид); сливочный (бутиролактон); сладкий (2,5-диметил-3-(3-метил-бутил)пиразин); фруктовый/несвежее пиво (2-циклопентен-1-он, 2-гидрокси-3-метил); плесневелый/ореховый/кумарин/солодка/фундук/хлеб (3-ацетил-1H-пироллин); кокосовый/древесный/сладкий (пантолактон); проникающий (1H-пиррол-2-2-карбоксальдегид, 1-метил); мятный (капролактам); подрумяненной карамели (4H-пиран-4-он, 2,3-дигидро-3,5-дигидрокси-6-метил), возникают только в смешанных аналогах мяса, но не в отдельных аналогах тканей. Некоторые другие ароматические соединения, например, напоминающие керосин (нонан, 2,6-диметил), напоминающие бензин (3-гексен, 3-метил), напоминающие прокисшую/гнилую рыбу (пиридин), пресный аромат/деревянистый аромат/ароматы йогурта (ацетоин), ароматы жира/меда/цитрусовых (октаналь), острый/сладкий/карамельный (2-пропанон, 1-гидрокси) и ореховый/подгорелой зелени (этенил пиразин), возникают только в отдельных аналогах тканей, но не накапливаются в смешанных аналогах мяса. Кроме того, уровни содержания, в пределах которых во время кулинарной обработки накапливаются все из вышеуказанных соединений, зависят от размеров составных частиц в аналогах ткани и от способа их смешивания (грубый размер частиц, мелкий размер частиц или очень мелкий размер частиц (блендерная смесь).
Было установлено, что, подобно аналогам мясных тканей, структурное расположение и размер частиц в тканях говядины изменяет реакцию тканей говядины на кулинарную обработку. Например, вкус мяса можно модифицировать с помощью размера частиц. Образцы говядины были подготовлены следующим образом: образцы говяжьих мышц и говяжьего жира нарезались ножом по отдельности и: (а) "измельчались", при этом нарезанные ножом кубики тканей пропускали через стандартную мясорубку. Образец говяжьего фарша из постного мяса/жира 80/20 (вес./вес.) готовили путем смешивания кубиков мышечной и жировой ткани в соответствующем соотношении перед измельчением. Этот приготовленный образец называют "смесью с мелким размером частиц". (b) Размер частиц измельченной ткани был дополнительно уменьшен путем замораживания измельченной ткани в жидком азоте и дробления этой ткани с помощью ступки и пестика до очень тонкого порошка (с размером частиц <1 мм). Такой подготовленный образец называют "смесью с очень мелким размером частиц". Все образцы подвергались кулинарной обработке в герметичных стеклянных флаконах при 150°С в течение 10 минут.
Ароматические профили образцов были проанализированы группой дегустаторов и ГХ-МС, как описано в примере 1. Контрольный образец "только мышцы" содержал 3 г аналога мышечной ткани единственного. Контрольный образец "только жир" содержал 3 г жирового аналога единственного. Образец говяжьего фарша содержал 3 г смеси мышц/жира 80/20 (вес./вес.).
Исходя из сенсорного ольфакторного анализа образцов говядины, проведенного группой дегустаторов, предполагается, что размер отдельных составных частиц тканей и степень их смешивания в образцах коррелирует с созданием различных ароматов. Приготовленная отдельно говяжья мышечная ткань создавала обычные ароматы, связанные с приготовленным говяжьим фаршем. Аналог жировой ткани, приготовленный единственным, создавал слегка сладкие ароматы и ароматы, которые ассоциировались с подгорелыми грибами. После кулинарной обработки говяжий фарш "со смесью частиц мелкого размера" создавал обычные ароматы, которые ассоциировались с приготовленным говяжьим фаршем, с присутствием слегка сладких ароматов, характерных для приготовленного жира. После кулинарной обработки говяжий фарш "со смесью частиц очень мелкого размера" создавал ароматы, которые ассоциировались с приготовленным говяжьим фаршем, при этом не был выявлен слегка сладкий аромат, характерный для приготовленного жира.
Анализ данных ГХ-МС показал, что размер отдельных составных частиц тканей влияет на возникновение ароматических соединений при кулинарной обработке. В частности, возникновение и/или количество многих ароматических соединений, обусловленные отдельными образцами тканей или образцами говяжьего фарша, варьировались в зависимости от размера частиц в ткани. Некоторые из ароматических соединений, которые были разными в мышечных тканях с мелким и очень мелким размером частиц, представляли собой: 4H-пиран-4-он, 2,3-дигидро-3,5-дигидрокси-6-метил, 3-ацетил-1H-пироллин, 1-(6-метил-2-пиразинил)-1-этанон, 2,5-диметил-3-(3-метил-бутил)-пиразин, 2-фуранкарбоксальдегид, 5-метил, уксусную кислоту, этенил-пиразин, пиразин, 2,3-диметил, 2-пропанон, 1-гидрокси, октаналь, ацетоин, 4-метилтиазол, псевдо-2-пентил-фуран, 2-пентил-фуран. Некоторые из ароматических соединений, которые были разными в жировых тканях с мелким и очень мелким размером частиц, представляли собой: триэтиленгликоль, 4H-пиран-4-он, 2,3-дигидро-3,5-дигидрокси-6-метил, капролактам, 1-(6-метил-2-пиразинил)-1-этанон, 2-циклопентен-1-он, 2-гидрокси-3-метил, бутиролактон, 2-фуранкарбоксальдегид, 5-метил, этанон, 1-(2-фуранил), уксусную кислоту, 2-этил-5-метил пиразин, пиразин, 2,3-диметил, пиразин, этил, октаналь, ацетоин, 4-метилтиазол, псевдо-2-пентил-фуран, пиридин, нонан, 2,6-диметил. Некоторые из ароматических соединений, которые были разными в образцах смеси мышечной/жировой ткани 80/20 с мелким и очень мелким размером частиц, представляли собой: 4H-пиран-4-он, 2,3-дигидро-3,5-дигидрокси-6-метил, капролактам, 1H-1-пиридин, 3-карбонитрил, 4-этил-2-оксо-2,5,1-H-пиррол-2-2-карбоксальдегид, 1-метил, 2-циклопентен-1-он, 2-гидрокси-3-метил, 2,5-диметил-3-(3-метил-бутил)-пиразин, бутиролактон, 2-фуранкарбоксальдегид, 5-метил, этанон, 1-(2-фуранил), уксусную кислоту, этенил пиразин, 2-этил-5-метил пиразин, пиразин, 2,3-диметил, 2-пропанон, 1-гидрокси, октаналь, ацетоин, 2-пентил-фуран.
ПРИМЕР 17: ЗНАЧИМОСТЬ ЛЕГОГЛОБИНА ДЛЯ ВКУСА
Вкусы и ароматы говядины могут быть созданы в немясных пригодных к потреблению материалах путем добавления гем-белков. Куриный фарш (90% мяса, 10% жира) отжимали марлей и смешивали с соевым рекомбинантным легоглобином или с бычьим рекомбинантным миоглобином до конечной концентрации от 0,5 до 1,0% вес./вес.. Рекомбинантные гем-белки экспрессировали в E. coli и очищали с помощью никель-аффинной хроматографии, как описано в примере 1. Перед смешиванием с куриным фаршем гем-белки восстанавливали дитионитом натрия 20 мМ. Затем дитионит натрия удаляли из образца с помощью колонки для обессоливания Zeba (Thermo Scientific). Легоглобин обессоливали в 20 мМ фосфата калия рН 7,4, 100 мМ NaCl. Миоглобин обессоливали или в 20 мМ фосфата калия рН 7,4, 100 мМ NaCl или в 20 мМ цитрата натрия, рН 6,0, 100 мМ NaCl. Восстановленные образцы гем-белка были разделены на две части, и половину из образцов продували монооксидом углерода (CO) в течение 2 минут. После смешивания образцов гем-белка с куриным фаршем эту смесь выливали в формы для наггетсов и инкубировали в течение ночи при 4°С. Наггетсы запекали в духовке или жарили на сковороде при температуре 165°С до достижения внутренней температуры 165°С в каждом наггетсе. Группа экспертов провела дегустацию наггетсов, содержащих только курятину, курятину, смешанную с буфером, курятину, смешанную или с легоглобином или с миоглобином +/-СО, или говядину (90% постного мяса, 10% жира). Эксперты заполняли анкеты по оценке вкуса и аромата каждого наггетса. Эксперты оценивали аромат и вкус каждого наггетса следующим образом: 1 = куриный, 2 = куриный + слегка говяжий, 3 = 50/50 куриный + говяжий, 4 = говяжий + слегка куриный, 5 = говяжий. В таблице 2 представлены средние баллы, присвоенные каждому наггетсу. В процентах показана конечная концентрация (вес./вес.) гем-белка (сокращения: KP = буфер 20 мМ фосфата калия, рН 7,4, 100 мМ NaCl; NC = буфер 20 мМ цитрата натрия рН 6,0, 100 мМ NaCl; н/о = не определено). Добавление рекомбинантного легоглобина или миоглобина к куриному фаршу приводило к усилению аромата и вкуса говядины. Уровень ощущения вкуса и аромата говядины повышался в присутствии миоглобина и легоглобина. Легоглобин (legH) и миоглобин (Myo) дает такой же полезный эффект для вкуса и аромата.
Таблица 2
Запекание в духовке
Поджаривание на сковороде
Аромат
Вкус
Аромат
Вкус
Курица
1
1
1
1
Курица KP
1
1
2,5
1,2
Курица NC
1,5
1,5
1,5
1
Курица 0,5% legH KP
1,5
2,5
3,67
3,2
Курица 0,5% legH + CO KP
2,5
2,5
2,67
2,2
Курица 0,5% Myo NC
2
2
1,5
2,4
Курица 0,5% Myo + CO NC
2
2
2,5
3
Курица 0,5% Myo + CO KP
2,5
2,5
2,33
2
Курица 0,8% Myo + CO NC
2
3
4
2,6
Курица 1% Myo NC
4,5
4
н/о
н/о
Курица 1% legH NC
4
4
н/о
н/о
Говядина
5
5
5
5
ПРИМЕР 18: ПРИГОТОВЛЕНИЕ ЛИКЕРА ИЗ НЕМОЛОЧНЫХ СЛИВОК
Кремовый ликер готовили из фракции сливок из подсолнечника, RuBisCo и виски (Jameson). Фракция сливок из подсолнечника была получена путем блендерного смешивания семян подсолнечника с буфером 40 мМ фосфата натрия, рН 8,0, и 400 мМ хлорида натрия. Дебрис из семян осаждали центрифугированием при 5000 g в течение 20 минут и собирали фракцию сливок. Затем фракцию сливок ресуспендировали в 10 мМ калий-фосфатного буфера, рН 7,4 и собирали центрифугированием при 5000 g в течение 20 минут. RuBisCo очищали, как описано в примере 1, и использовали в качестве маточного раствора 25 мг/мл в 20 мМ фосфата калия, рН 7,0, 150 мМ NaCl.
В одном примере кремовый ликер готовили из следующих ингредиентов: фракция сливок из подсолнечника 11,4% (вес./об.), виски Jameson 40% (об./об.), RuBisCo 0,4-1,6% (вес./об.), экстракт ванили 0,5% (вес/об.), кофе эспрессо 0,5% (об./об.) и шоколадный порошок 1,5% (вес/об.). Полученную смесь гомогенизировали при 5000 фунтов на квадратный дюйм.
В другом примере кремовый ликер готовили из фракции сливок из подсолнечника, виски (Jameson) и сахара: фракция сливок из подсолнечника 11,4% (вес/объем), виски Jameson 40% (об./об.), экстракт ванили 0,5% (об./об.), кофе эспрессо 0,5% (об./об.), шоколадный порошок 1,5% (вес./об.) и сахар 8% (вес./об.).
Напитки подавались как охлажденными, так и с нормальной комнатной температурой. Полученные напитки имели цвет от бежевого до слегка шоколадного. Результаты дегустации показали, что напиток имел выраженный сливочный алкогольный вкус, похожий на ликер из молочных сливок. Предпочтительным был охлажденный продукт. Эмульсия была стабильной при комнатной температуре в течение по меньшей мере 1 недели (максимальное время тестирования).
ПРИМЕР 19. ШОКОЛАДНАЯ ПАСТА
Шоколадную пасту готовили из 34% (вес./вес.) тростникового сахара, 22% (вес./вес.) какао-порошка, 19% (вес./об.) фракции фисташковых сливок и 12% (об./об.) миндального молока. Тростниковый сахар и какао-порошок (Ghirardelli) были приобретены у коммерческих поставщиков. Обезжиренное миндальное молоко готовили следующим образом: миндаль бланшировали погружением в воду с температурой 100°С на 30 секунд. Бланшированные орехи извлекали и охлаждали путем погружения в ледяную воду. Миндаль сушили на воздухе. Затем миндаль регидратировали путем погружения в воду при 2°С в течение 16 часов. Регидратированный миндаль высушивали, смешивали с водой в соотношении 1:2 вес./об. и смешивали в блендере Vitamix в течение 5 минут. Смешанную суспензию собирали в охлажденный контейнер и перемешивали с замороженными охлаждающими палочками для охлаждения. После охлаждения суспензии до 10°С эту суспензию сохраняли при 2°С в течение 12 часов. Обезжиренный миндаль и сливки были разделены путем центрифугирования при 7480 g в течение 30 минут при 4°С. Миндальное молоко разделялось на 3 слоя: плотный осадок из нерастворимого твердого материала, водный слой от прозрачного до полупрозрачного (который называется "миндальным обезжиренным молоком"), и более светлый, кремовый непрозрачный слой (который называется "миндальными сливками"). После этого миндальное молоко подвергали пастеризации при 75°С в течение 16 секунд, охлаждали и сохраняли при 2°С.
Фракцию фисташковых сливок готовили путем блендерного смешивания фисташек в буфере 100 мМ карбоната натрия, рН 9,5 с 400 мМ хлорида натрия и 1 мМ ЭДТА, затем центрифугировали при 5000 g в течение 20 минут. Фракцию сливок собирали и повторно промывали в том же самом буфере. После центрифугирования при 5000 g в течение 20 минут фракцию сливок собирали и промывали в 20 мМ натрий-фосфатного буфера, рН 7,4, с 50 мМ хлорида натрия и 1 мМ ЭДТА. После центрифугирования при 5000 g в течение 20 минут фракцию сливок собирали, промывали еще один раз в нейтральном буфере (рН 7,4) и центрифугировали при 5000 g в течение 20 минут. Фракцию фисташковых сливок собирали и хранили при 4°С.
Шоколадную пасту готовили следующим образом. Тростниковый сахар расплавляли в миндальном молоке, в сахарно-молочную смесь добавляли какао-порошок при перемешивании и расплавляли. Затем к фракции фисташковых сливок добавляли сахар, молоко и какао и вместе взбивали. Полученную смесь затем разливали в формы и оставляли на 24 часа при температурах холодильника и морозильника.
В другом примере шоколадную пасту готовили из 42% (вес./вес.) тростникового сахара, 27% (вес./вес.) какао-порошка, 31% (вес./об.) фракции подсолнечных сливок и 23% (об./об.) миндального обезжиренного молока. Все ингредиенты и способы, кроме фракции подсолнечных сливок, соответствуют вышеприведенному описанию.
Фракцию сливок из подсолнечника готовили путем смешивания в блендере семян подсолнечника в весовом количестве, в 5 раз превышающем объем раствора 40 мМ фосфата калия, рН 8, 400 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, после чего суспензию охлаждали до 20°С и затем центрифугировали. Верхний слой сливок собирали и смешивали в блендере в том же буфере, с последующим нагреванием в течение 1 часа при 40°С. Суспензию охлаждали до 20°С, затем центрифугировали; слой сливок собирали и смешивали при 5-кратном превышении веса к объему 100 мМ карбоната натрия, рН 10, и 400 мМ NaCl, затем центрифугировали. После этого верхний слой смешивали с водой при 5-кратном превышении веса к объему воды и повторно центрифугировали, в результате полученная фракция сливок имела очень сливочный, белый вид и нейтральный вкус.
В другом примере шоколадную пасту готовили из 37% (вес./вес.) тростникового сахара, 23% (вес./вес.) какао-порошка, 13% (вес./об.) фракции сливок из подсолнечника, 7% (вес./вес.) масла какао и 20% (об./об.) миндального обезжиренного молока.
В другом примере шоколадную пасту готовили из 37% (вес./вес.) тростникового сахара, 23% (вес./вес.) какао-порошка, 13% (вес./об.) фракции сливок из подсолнечника, 7% (вес./вес.) кокосового масло и 20% (об./об.) миндального обезжиренного молока.
В другом примере шоколадную пасту готовили из 37% (вес./вес.) тростникового сахара, 23% (вес./вес.) какао-порошка, 13% (вес./об.) фракции сливок из подсолнечника, 7% (вес./вес.) пальмового масла и 20% (об./об.) миндального обезжиренного молока.
В другом примере шоколадную пасту готовили из 1,8% (вес./вес.) тростникового сахара, 1,13% (вес./вес.) какао-порошка, 88% (вес./об.) фракции фисташковых сливок и 9% миндального обезжиренного молока, путем взбивания равного количества описанных выше паст и фисташковых масляных телец.
В другом примере шоколадную пасту готовили из 8,5% (вес./вес.) тростникового сахара, 5,4% (вес./вес.) какао-порошка, 81% (вес./об.) фракции сливок из подсолнечника и 4,6% (об./об.) миндального обезжиренного молока, путем смешивания описанной выше шоколадной пасты с подсолнечными сливками в соотношении 2:1.
Исходя из визуальной оценки внешнего вида и текстуры всех продуктов, предполагается, что они образуют стабильные, твердые сливочные спреды при комнатной температуре. Все материалы были плотными и твердыми при температурах холодильника и морозильника. По результатам дегустации всех продуктов был предложен очень приятный продукт с богатой сливочной текстурой, тающий во рту, который получил положительную оценку дегустаторов. Отдельные предпочтения дегустаторов варьировались как «нравится» или «не нравится» в отношении фисташкового вкуса, кокосового вкуса, предпочтений более сладкого или менее сладкого продукта, и более интенсивного или менее интенсивного вкуса какао. Был описан один конкретный пример в плане сходства с пастой из молочного шоколада, поскольку фракция сливок из подсолнечника придавала нейтральный вкус.
ПРИМЕР 20. ПОЛУЧЕНИЕ АНАЛОГА ЖИРОВОЙ ТКАНИ
Аналоги жировой ткани были созданы с использованием ингредиентов, перечисленных в таблице 3.
Таблица 3
Аналог жировой ткани
Ингредиент
%
Кокосовое масло
65
Белок вицилин гороха в буфере
21,3
Какао масло
10
Буфер
2,7
Суспензия лецитина, 50 мг/мл
1
Всего
100
Был подготовлен лецитин (обезжиренный соевый лецитин SOLEC™ F, The Solae Company, St. Louis, MO) в концентрации 50 мг/мл в буфере 20 мМ фосфата калия, 100 мМ NaCl, рН 8,0, который в течение 30 секунд обрабатывали ультразвуком (ультразвуковой аналоговый клеточный дезинтегратор Sonifier Analog Cell Disruptor, модель 102C, BRANSON Ultrasonics Corporation, Danbury, Connecticut).
Белок вицилин гороха был прибретен в виде жидкости, содержащей приблизительно 140 мг/г вицилина гороха в буфере 20 мМ фосфата калия, 100 мМ NaCl, рН 8,0.
Кокосовое масло (Shay and Company, Milwaukie, OR) и масло какао (Cocoa Family, Duarte, CA) растапливали путем нагревания до температуры от 50 до 70°С, затем объединяли и сохраняли теплыми до использования.
Забуференный раствор белка, дополнительный буфер и суспензию лецитина перемешивали в металлическом стакане объемом 32 унции и доводили до комнатной температуры. Эмульсию создавали с помощью ручного гомогенизатора (модель OMNI GLH, оснащенная 20 мм датчиком генератора G20-195ST, OMNI International, Kennesaw, GA). Датчик гомогенизатора вводили в смесь белка и лецитина и включали на скорость 4. Затем подогретое масло медленно добавляли в течение приблизительно 2 минут при непрерывном круговом движении датчика в смеси.
Затем эмульсию подвергали термостабилизации, помещая металлический стакан на водяную баню с температурой 95°С. Используя чистую лопаточку, эмульсию перемешивали каждые 20 секунд всего в течение 3 минут. После этого стакан извлекали из водяной бани и оставляли при 4°С на несколько часов до полного охлаждения.
ПРИМЕР 21. ИЗГОТОВЛЕНИЕ АНАЛОГА СЫРОЙ ТКАНИ
Аналог сырой ткани был создан с использованием ингредиентов, перечисленных в таблице 4.
Таблица 4
Аналог сырой ткани
Ингредиент
%
Буфер
41,6
Гем-белок в буфере
26,7
Легумин гороха в буфере, обжаренный
12,1
Вицилин гороха в буфере, обжаренный
9,4
Смесь вкусовых прекурсоров, 17x
6,2
Препарат трансглутаминазы
4
Всего
100
Буфер состоял из 20 мМ фосфата калия, 100 мМ NaCl с уровнем рН 7,4. Был подготовлен гем-белок в концентрации 55 мг/г в буфере из 20 мМ фосфата калия, 100 мМ NaCl, рН 7,4. Смесь вкусовых прекурсоров 17x описана в примере 27. Был подготовлен легумин гороха в буфере из 20 мМ фосфата калия, 500 мМ NaCl, рН 8, затем легумин гороха высушивали лиофилизацией до использования. Конечная концентрация белка в высушенном материале составляла 746 мг/г. Вицилин гороха готовили в буфере 20 мМ фосфата калия, 200 мМ NaCl, рН 8, и затем высушивали лиофилизацией до использования. Конечная концентрация белка в высушенном материале составляла 497 мг/г.
Жидкие ингредиенты (буфер, гем и смесь вкусовых прекурсоров) смешивали в пластиковом химическом стакане. Затем добавляли высушенные легумин гороха и вицилин гороха и оставляли до полной регидратации при осторожном перемешивании в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем добавляли сухой препарат трансглутаминазы (ACTIVA TI, Ajinomoto, Fort Lee, NJ) и перемешивали в течение 5 минут до полного растворения. После этого прекращали перемешивание, и смесь оставляли для гелеобразования при комнатной температуре, до отверждения. После образования геля аналог сырой ткани сохраняли в холодильнике до использования.
ПРИМЕР 22. АНАЛОГ ЖЕСТКОЙ СОЕДИНИТЕЛЬНОЙ ТКАНИ
Аналог жесткой соединительной ткани был изготовлен описанным ниже способом с использованием соевого белкового изолята (Supro Ex38, Solae), глютена пшеницы (Cargill) и бамбуковых волокон (Alpha-Fiber B-200, The Ingredient House). Очищенные белки высушивали лиофилизацией и измельчали с помощью стандартной кофемолки. Коммерчески доступные порошки изолята соевого белка и глютена пшеницы использовались в состоянии поставки.
Аналог соединительной ткани содержал 49% изолята соевого белка, 49% пшеничного глютена и 2% бамбуковых волокон. Ингредиенты тщательно смешивали и загружали в экструдер, в питатель периодического действия загрузочного цилиндра. Использовали двухшнековый экструдер (Nano 16, Leistritz Extrusion Corp.) с насосом высокого давления для впрыска воды (Eldex) и изготовленными на заказ головками с насадками (трубки из нержавеющей стали, внутренний диаметр 3 мм, длина 15 см, давление в диапазоне 3000+ фунтов на кв.дюйм), прикрепленными при помощи трубчатого фитинга Hy-Lok с двумя ферулами, и с изготовленной на заказ головкой с резьбовой насадкой, с внутренним диаметром 10 мм, длиной проточного канала 20 мм.
Сухую смесь подавали в экструдер со скоростью 1 г/мин. Воду подавали насосом во вторую зону ствола экструдера. Скорость подачи воды регулировали по скорости подачи сухой смеси таким образом, чтобы в конечном экструдате содержание влаги достигало 55%. Вдоль цилиндра экструдера поддерживался следующий градиент температуры: в зоне подачи было 25°С, в зоне 1 было 30°С, в зоне 2 было 60°С, в зоне 3 было 130°С, в зоне 4 было 130°С. Матрица с головкой не подвергалась ни активному нагреванию, ни охлаждению. Насадку головки подвергали активному охлаждению (с применением влажного аналога ткани) для поддержания температуры экструдата ниже 100°С.
Аналог жесткой соединительной ткани, полученный этим способом, представлял собой темный желтовато-белый ("капучино") цветной материал, сформованный в волокна толщиной 3 мм, которые имели показатель прочности на разрыв, сходный с соединительной тканью животного происхождения (3 МПа).
ПРИМЕР 23. АНАЛОГ МЯГКОЙ СОЕДИНИТЕЛЬНОЙ ТКАНИ
Аналог мягкой соединительной ткани создавали, как указано в примере 22, за исключением того, что скорость подачи воды регулировали по скорости подачи сухой смеси, обеспечивая в конечном экструдате содержание влаги 60%. Температурный градиент поддерживался вдоль цилиндра экструдера следующим образом: в зоне подачи было 25°С, в зоне 1 было 30°С, в зоне 2 было 60°С, в зоне 3 было 115°С, в зоне 4 было 115°С. Матрица с головкой не подвергалась ни активному нагреванию, ни охлаждению. Насадку головки подвергали активному охлаждению (с применением влажного аналога ткани) для поддержания температуры экструдата ниже 100°С.
Аналог мягкой соединительной ткани, полученный этим способом, представлял собой темный желтовато-белый ("капучино") цветной материал, сформованный в волокна толщиной 3 мм, которые имели низкую прочность на разрыв (<0,1 МПа) и имели значительную склонность к расщеплению в продольном направлении на полоски и тонкие волокна.
ПРИМЕР 24. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНАЛОГА ТОНКОЙ СОЕДИНИТЕЛЬНОЙ ТКАНИ (ЗЕИНОВЫХ ВОЛОКОН)
Аналог тонкой соединительной ткани получали с использованием порошка зеинового белка, глицерина (качество согласно Пищевому химическому кодексу FCC), полиэтиленгликоля (ПЭГ 400 или ПЭГ 3350), этанола, гидроксида натрия (качество FCC) и воды. Порошок зеина и ПЭГ 3350 в соотношении 35% вес./вес. к зеину растворяли в 85% водном этаноле до конечной концентрации зеина 57% вес./вес.. Уровень рН раствора доводили до 7,0 с помощью 1 М раствора гидроксида натрия в этаноле. Использовали шприцевой насос со шприцем 1-12 мл, фильеры (подкожные иглы 18-27 калибра или пластиковые формунки 18-24 калибра), кремниевый ленточный нагреватель и вентиляторный нагреватель, с коллектором в сборке с двигателем с компьютерным управлением, вращающим делриновый стержень, который служит в качестве коллектора.
Полученный раствор загружали в шприц, который был установлен на шприцевой насос, снабженный пластиковым наконечником 18 калибра. Кремниевый ленточный нагреватель оборачивали вокруг наконечника, чтобы поддерживать в нем повышенную температуру. После экструзии раствора из наконечника и формирования капли эту каплю подхватывали с помощью шпателя и осторожно переносили на стержень коллектора для формирования нити между наконечником и коллектором. Скорость экструзии оптимизировали для получения равномерного потока материала от наконечника (5 мл/ч для шприца 12 мл и наконечника 18 калибра). Скорость вращения коллектора составляла 3 оборота в минуту. Вентиляторный нагреватель был расположен таким образом, чтобы обдувать горячим воздухом наматывающееся волокно. После намотки волокна помещали в печь при 120°С на 24 часа.
Аналог тонкой соединительной ткани, полученный таким способом, представлял собой материал полупрозрачного желтого цвета, сформированный в виде волокон толщиной 300 микрон, которые были частично гибкими на воздухе и становились очень гибкими и эластичными в присутствии воды, сохраняя высокую прочность на разрыв, которая аналогична прочности соединительных тканей животного происхождения (6 МПа).
ПРИМЕР 25. ЛАПША
Лапша была изготовлена с использованием очищенного вицилина гороха (лиофилизированного) и соевого белкового изолята (Supro EX38, компания Solae, Solbar Q842 (CHS)) или соевого белкового концентрата (Hisolate, Harvest Innovations). Для изготовления лапши 67% соевый белковый концентрат или изолят и 33% вицилина гороха, измельченного в порошок, тщательно смешивали и загружали в загрузочный цилиндр экструдера, в питатель периодического действия. Сухую смесь подавали в экструдер со скоростью в диапазоне 1-2 г/мин. Воду подавали насосом во вторую зону цилиндра экструдера со скоростью от 3,6 до 5,3 мл/мин таким образом, чтобы конечное содержание влаги в экструдате составляло 72,5%. Температурный градиент вдоль цилиндра экструдера поддерживался следующим образом: в зоне подачи было 25°С, в зоне 1 было 30°С, в зоне 2 было 60°С, в зоне 3 было 100°С, в зоне 4 было 100°С. Температура в зоне 1 может варьироваться в диапазоне от 25 до 45°С. Температура в зоне 2 может варьироваться в диапазоне от 45 до 65°С. Температура в зонах 3 и 4 может варьироваться в диапазоне от 95 до 100°С. Матрица с головкой не подвергалась ни активному нагреванию, ни охлаждению. Насадку головки пассивно охлаждали окружающим воздухом для поддержания температуры экструдата ниже 100°С.
Лапша, полученная этим способом, представляла собой материал светло-желтого цвета в форме нитей толщиной 1,5 мм, которые имели низкую прочность на разрыв (<0,1 МПа) и умеренно липкую текстуру.
ПРИМЕР 26. ИЗГОТОВЛЕНИЕ АНАЛОГА ЛИПКОЙ ТКАНИ
Аналог липкой ткани был изготовлен с использованием очищенного вицилина гороха (лиофилизированного) и очищенного легумина гороха (лиофилизированного). Для изготовления аналога липкой ткани 50% измельченного в порошок вицилина гороха и 50% измельченного в порошок легумина гороха тщательно смешивали и загружали в загрузочный цилиндр экструдера, в питатель периодического действия. Сухую смесь подавали в экструдер со скоростью в диапазоне 0,4–0,8 г/мин. Воду подавали насосом во вторую зону цилиндра экструдера со скоростью от 1,6 до 3,2 мл/мин таким образом, чтобы конечное содержание влаги в экструдате составляло 80%. Поскольку общая пропускная способность повышалась от 2 г/мин до 4 г/ мин, скорость шнека возрастала от 100 до 200 оборотов в минуту. Увеличение диаметра головки (4 мм и больше) также является полезным для предотвращения обратного тока при более высокой производительности. Температурный градиент вдоль цилиндра экструдера поддерживался следующим образом: в зоне подачи было 25°С, в зоне 1 было 30°С, в зоне 2 было 60°С, в зоне 3 было 90°С, в зоне 4 было 100°С. Температура в зоне 1 может варьироваться в диапазоне от 25 до 45°С. Матрица с головкой не подвергалась ни активному нагреванию, ни охлаждению. Насадку головки пассивно охлаждали окружающим воздухом. Насадку головки предохраняли от какой-либо закупорки отверждающимся гелевым материалом.
Аналог липкой ткани, полученный этим способом, представлял собой полупрозрачный материал водянисто-белого цвета, сформированный в виде неравномерных шариков размером от 1 до 5 см, которые имели липкую пастообразную консистенцию.
ПРИМЕР 27. ПРИГОТОВЛЕНИЕ СМЕСИ ВКУСОВЫХ ПРЕКУРСОРОВ
Смесь вкусовых прекурсоров была получена путем смешивания концентрированных стоковых растворов каждой добавки для получения 17х раствора. В таблице 5 приведена химическая композиция смеси и концентрация в мМ каждого компонента в конечном продукте - бургере. Концентрированную смесь вкусовых прекурсоров в стерильных условиях фильтровали и доводили до уровня рН 5,5-6,0 посредством NaOH, и использовали в бургерах в концентрации 1 х.
Таблица 5Химическая композиция смеси вкусовых прекурсоров
Химическое вещество
мМ
Аланин
5,6
Аргинин
0,6
Аспарагин
0,8
Аспартат
0,8
Цистеин
0,8
Глутаминовая кислота
3,4
Глутамин
0,7
Глицин
1,3
Гистидин
0,6
Изолейцин
0,8
Лейцин
0,8
Лизин
0,7
Метионин
0,7
Фенилаланин
0,6
Пролин
0,9
Треонин
0,8
Триптофан
0,5
Тирозин
0,6
Валин
0,9
Глюкоза
5,6
Рибоза
6,7
Мальтодекстрин
5,0
Тиамин
0,5
Гуанозинмонофосфат (ГМФ)
0,2
Инозинмонофосфат (ИМФ)
0,6
Молочная кислота
1,0
Креатин
1,0
NaCl
10
KCl
10
Калия фосфат pH 6,0
10
ПРИМЕР 28. ЛИОФИЛИЗАЦИОННОЕ ВЫРАВНИВАНИЕ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ТЕКСТУРИРОВАННОГО БЕЛКА, ИСПОЛЬЗУЕМОГО В КАЧЕСТВЕ АНАЛОГОВ МЫШЕЧНОЙ ТКАНИ
В этом примере описан неэкструзионный способ получения текстурированных белковых материалов, которые могут быть использованы в аналогах мяса.
Аналог мышечной ткани был изготовлен таким образом: сначала был изготовлен гель из белков чечевицы путем смешивания 4,5% (вес./об.) раствора белков чечевицы в буфере 20 мМ фосфата калия, рН 7,4 + 100 мМ хлорида натрия, с 20% (об./об.) масла канолы (от Jedwards International). Смесь желировали с помощью нагревания при 95°С в течение 15 минут и медленного охлаждения до комнатной температуры (со скоростью 1°С/в минуту). Гель выливали в сосуд и замораживали при -40°С, устанавливая сосуд над ванной с жидким азотом до полного замораживания. Затем замороженный материал высушивали в устройстве для лиофильной сушки. Когда материал был полностью высушен, его стабилизировали путем автоклавирования (121°С, 15 минут). Полученный материал представлял собой текстурированный аналог мышечной ткани, изготовленный с растительными белками.
Выровненный аналог мышечной ткани затем замачивали в воде в течение 5 минут, нарезали на кусочки длиной 3-4 мм, и после этого объединяли с 10 г аналога жировой ткани, 10 г аналога соединительной ткани и 5 г отверждаемого на холоде геля для образования аналогов говяжьей котлетки весом 50 г. Группа штатных экспертов отметила, что включение лиофилизационно выровненных тканей создает в котлете улучшенную волокнистую текстуру.
Аналоги мышечной ткани также были получены следующим образом: сначала был изготовлен лиофилизационно выровненный материал, как описано выше. После приготовления на пару аналога ткани при 121°С в течение 10 минут этот материал вымачивали в растворе термически денатурированных вицилинов гороха (6% вес./об. в 20 мМ калий-фосфатного буфера, рН 7,4 + 100 мМ хлорида натрия, термически денатурированного при 95°С в течение 30 минут), 1% (вес./об.) лошадиного миоглобина (Sigma), 40% (об./об.) масло канолы (от Jedwards International). Желирование среды индуцировали добавлением хлорида кальция при 20 мМ. Образец выдерживали в течение 5 минут при комнатной температуре, чтобы гель мог сформироваться. Полученный аналог мышечной ткани содержал выровненный материал в виде отверждаемого на холоде геля, напоминающего мышечную ткань говядины в стейке.
ПРИМЕР 29. ХОЛОДНОЕ ЖЕЛИРОВАНИЕ БЕЛКОВ ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЙ В МЯСНЫХ ПРОДУКТАХ
В одном примере отверждаемый на холоде гель, содержащий миоглобин, был получен следующим образом: сначала подвергали термической денатурации раствор 6% (вес./об.) вицилинов гороха в 20 мМ калий-фосфатного буфера, рН 7,4, со 100 мМ хлорида натрия при 100°С в течение 30 минут. Раствор оставляли для охлаждения до комнатной температуры. Добавляли масло канолы (от Jedwards International) и лошадиный миоглобин (Sigma) до конечной концентрации 20% (об./об.) и 1% (вес./об.) соответственно. Желирование индуцировали добавлением 20 мМ хлорида кальция. Формировали аналог говяжьей котлетки весом 50 г путем объединения 5 г отверждаемого на холоде геля с 10 г аналога жировой ткани, 10 г аналога соединительной ткани и 25 г аналога мышечной ткани. К смеси добавляли пять мл 7% (вес./вес.) раствора сырого белка чечевицы и формировали котлеты.
ПРИМЕР 30. СВЯЗУЮЩИЕ МАТЕРИАЛЫ В АНАЛОГАХ МЯСА
В одном примере аналоги говядины были изготовлены следующим образом: сначала был изготовлен коацерват из 3% (вес./об.) раствора вицилинов и легуминов гороха (соотношение вицилин:легумин составляло 3:1) в 20 мМ фосфата калия, рН 7,4 + 100 мМ хлорида натрия. К раствору добавляли растопленное пальмовое масло (от Jedwards International) до конечной концентрации 5% и смешивали на вортексе. Затем эмульсию подкисляли до уровня рН 5 путем добавления соляной кислоты с перемешиванием. Затем суспензию центрифугировали при 5000×g в течение 10 минут, и жидкий верхний слой декантировали от коацерват.
Аналог говяжьей котлетки весом 50 г был изготовлен путем объединения коацервата в количестве 10% с аналогом жировой ткани (20%), аналогом соединительной ткани (20%) и аналогом мышечной ткани (50%). К смеси добавляли пять мл 7%-го раствора сырого белка чечевицы и формировали котлеты. Было отмечено, что котлеты, которые включали коацерват в качестве связующего материала, были более плотными, чем котлеты без коацервата.
ПРИМЕР 31. ОБЪЕДИНЕНИЕ АНАЛОГОВ ИЗМЕЛЬЧЕННОЙ ТКАНИ ЛИПКОГО ТИПА И ТИПА ЛАПШИ И АНАЛОГА БУРГЕРА
Аналоги измельченной ткани и аналоги бургера были изготовлены с использованием ингредиентов, указанных в таблице 6. На всех этапах предварительной обработки в материалах поддерживалась холодная температура (от 4 до 15°С).
Таблица 6
Композиция рецептуры липкого типа и типа лапши
Ингредиент
%
Жир
26
Мягкая соединительная ткань
20,6
Липкого типа
12
Сырого типа
10
Лапша
10
Жесткая соединительная ткань
10
Раствор вкусового вещества и гема
10
k-каррагинан
1,4
Всего
100
Аналог жировой ткани из примера 6 был охлажден в виде твердого блока после окончательного этапа нагревания/охлаждения. Необязательно, можно добавлять 0,2% веса гем-белка в виде жидкого раствора 20 мг/мл и вручную вводить его в жир. Затем жир крошили на маленькие кусочки от 3 до 7 мм в диаметре, поддерживая в холодном состоянии.
Аналог мягкой соединительной ткани из примера 23 был получен путем экструзии в виде длинных струноподобных кусочков. Мягкую соединительную ткань крошили в мини-измельчителе (процессорная модель Mini-Prep Plus Processor model DLC-2L Cuisinart, Stamford, CT) одноэтапным способом. Приблизительно 200 г мягкой соединительной ткани помещали в мини-измельчитель и обрабатывали в режиме измельчения в течение 60 секунд для получения кусочков от 1 до 3 мм в длину с рваными краями.
Аналог лапши и аналог липкой ткани (см. примеры 25 и 26) были изготовлены способом экструзии в виде длинных лапшевидных кусочков или аморфных кусочков соответственно. Аналог сырой ткани из примера 21 был получен способом ферментативного сшивания в виде твердого блока. Все эти три аналога тканей были вручную раскрошены на кусочки диаметром от 1 до 3 см.
Аналог жесткой соединительной ткани из примера 22 был изготовлен способом экструзии в виде струноподобных кусочков. Аналог жесткой соединительной ткани измельчали на трех уровнях, а именно, в грубой, промежуточной и тонкой степени, в мини-измельчителе (процессорная модель Mini-Prep Plus Processor model DLC-2L Cuisinart, Stamford, CT). 160–200 г жесткой соединительной ткани помещали в мини-измельчитель и обрабатывали в режиме измельчения в течение 90 секунд. Третью часть материала извлекали в качестве грубо измельченной фракции. После этого материал, оставшийся в измельчителе, обрабатывали в течение дополнительных 60 секунд, и затем извлекали одну треть первоначального веса в качестве фракции с промежуточной степенью измельчения. Затем материал, оставшийся в измельчителе, обрабатывали в течение дополнительных 30 секунд для получения тонкоизмельченной фракции.
Легоглобин высушивали лиофилизацией и затем восстанавливали в 17x смеси вкусовых прекурсоров (см. пример 27), доводили уровень рН до 6,0 посредством 10 н. NaOH для получения раствора вкусового вещества и гем-белка.
После описанной выше предварительной обработки мягкую соединительную ткань, липкую ткань, сырую ткань, лапшу, жесткую соединительную ткань и 2/3 жира смешивали вручную в миске. Обычное это количество составляет от 100 г до 2000 г. Затем раствор вкусового вещества и гем-белка тонкой струйкой наливали на смесь аналогов тканей и осторожно перемешивали вручную, после чего эту смесь присыпали порошком k-каррагинана и перемешивали вручную. Во время объединения компонентов, измельчения и формования все материалы поддерживались в холодном состоянии (от 4 до 15°С). Смесь измельчали с помощью профессиональной модели стационарного миксера, оснащенного приложением в виде бытовой мясорубки ((KitchenAid Professional 600 Series 6 Quart Bowl-Lift, модель KP26M1XER и бытовая мясорубка KitchenAid, модель FGA, St. Joseph, MI) с установкой на первой скорости. Подача материала в пищевой измельчитель осуществлялась с помощью шнекового конвейера с вращающимся ножом, установленным спереди от фиксированной пластины с отверстиями.
Смесь аналогов измельченных тканей собирали в миску, затем добавляли остальную 1/3 раскрошенного жира к смеси аналогов измельченных тканей и перемешивали вручную. После этого порции приблизительно 30 г или 90 г аналога измельченной ткани формировали вручную в котлетки круглой формы. Обычные размеры для котлетки весом 30 г составляли 50 мм × 12 мм. Обычные размеры для котлетки весом 90 г составляли 70 мм × 18 мм. Котлетки сохраняли в холодильнике до кулинарной обработки. По оценке группы подготовленных экспертов, приготовленные котлетки имели внешний вид, текстуру и вкус, похожий на говяжий фарш. В дополнение к приготовлению в форме котлетки, аналог измельченной ткани также можно использовать в различных блюдах, таких как начинка для тако, запеканки, соусы, топпинги, супы, рагу или булки.
ПРИМЕР 32. ОБЪЕДИНЕНИЕ АНАЛОГА ИЗМЕЛЬЧЕННОЙ ТКАНИ, СОДЕРЖАЩЕЙ ГЛЮТЕН ПШЕНИЦЫ, И АНАЛОГОВ БУРГЕРА
Аналог измельченной ткани и бургеры были приготовлены с использованием ингредиентов, указанных в таблице 7.
Таблица 7
Композиция рецептуры, содержащей глютен пшеницы
Ингредиент
%
Жир
25
Мягкая соединительная ткань
30
Аналог сырой ткани с гемом и вкусовым веществом
35
Глютен пшеницы
5
Жесткая соединительная ткань
5
Всего
100
Жир, мягкую соединительную ткань и жесткую соединительную ткань подвергали предварительной обработке, как описано в примере 31. На всех этапах предварительной обработки материалы поддерживались в холодном состоянии при температуре от 4 до 15°С

Сырая мышечная ткань с гем-белком и вкусовое вещество были подготовлены следующим образом: лиофилизированные вицилин гороха и легумин гороха растворяли в воде и 16x стоковом растворе вкусового вещества. Лиофилизированный гем-белок растворяли в этой смеси, и доводили уровень рН до 5,8 посредством лимонной кислоты. Затем добавляли сухой препарат трансглутаминазы (TI ACTIVA Ajinomoto Fort Lee, NJ) и перемешивали в течение приблизительно 5 минут до полного растворения. Затем смесь перемешивали в течение дополнительных 10 минут до некоторого визуального увеличения вязкости. Затем добавляли мягкую соединительную ткань и жесткую соединительную ткань, и смесь выдерживали в течение 1 часа при комнатной температуре для отстойки и формирования твердой массы.
Затем в гелеобразную сырую мышечную ткань добавляли порошок из глютена пшеницы (vital wheat gluten, Great Northern, артикул 131100, Giusto’s Vita-Grain, South San Francisco, CA) и смешивали для распределения этого порошка. Затем полученную смесь немедленно измельчали с помощью стационарного миксера, оснащенного приложением в виде бытовой мясорубки, как описано в предыдущем примере. После этого аналог измельченной ткани охлаждали в течение 5 минут при -20°С. В конце к охлажденному аналогу измельченной ткани добавляли нарезанный жир, предварительно охлажденный до 4°С.
После этого добавленную смесь аналога измельченной ткани и аналога жировой ткани формировали вручную в две круглые котлеты весом 90 г. Обычно котлеты весом 90 г имели размеры 70 мм × 18 мм. Обычный размер порции составляет 180-200 г, и порция состояла из двух котлет. Котлеты затем выдерживали при комнатной температуре в течение 30 минут. После «отдыха» котлеты можно подвергать кулинарной обработке или хранить в холодильнике до момента приготовления.
ПРИМЕР 33: СОЗДАНИЕ ВКУСА ГОВЯДИНЫ В АНАЛОГЕ БУРГЕРА ПУТЕМ ДОБАВЛЕНИЯ ГЕМА И ВКУСОВЫХ ПРЕКУРСОРОВ
Характерные вкусовые и ароматические компоненты мяса в основном создаются во время кулинарной обработки посредством химических реакций молекул (прекурсоров), включающих аминокислоты, жиры и сахара, которые находятся в растениях, а также в мясе. К мышечному компоненту аналога бургера были добавлены вкусовые прекурсоры вместе с 1% легоглобином, как показано в таблице 8. Три аналога, один из которых не содержал прекурсоров, и два аналога с разными смесями прекурсоров были приготовлены вместе с говядиной в соотношении 80:20 и затем были представлены группе подготовленных экспертов, чтобы они описали атрибуты вкуса, показанные в таблице 9. При добавлении прекурсоров усиливался мясной вкус, ноты крови, общее качество вкуса и уменьшались посторонние привкусы в аналоге. Аналоги и образец говядины также анализировали с помощью ГХ-МС путем добавления 3 г сырого аналога или говядины в пробирку для ГХ-МС. Все образцы готовились при температуре 150°С в течение 3 минут, затем их охлаждали до 50°С для экстракции в течение 12 минут с помощью ГХ-МС (образцы волокна после твердофазной микроэкстракции (SPME) из свободного пространства над продуктом). Алгоритм поиска анализировал время удерживания и информацию по отпечаткам пальцев этой массы, для присвоения пикам химических названий. В аналоге бургера с 1% для легоглобином и смесью 2 прекурсоров были созданы 136 соединений говядины. В таблице 10 указаны все соединения, созданные в аналоге бургера, которые также были выявлены с помощью ГХ-МС в образцах говядины.
Таблица 8Вкусовые прекурсоры, добавленные к аналогу мяса перед кулинарной обработкой
Образцы
767
804
929
Добавка (мМ)
Смесь прекурсоров 1
Без прекурсоров
Смесь прекурсоров 2
Аланин
5,61
5,61
Цистеин
0,83
0,83
Глутаминовая кислота
3,40
3,40
Лейцин
0,76
0,76
Лизин
0,68
0,68
Метиониин
0,67
0,67
Триптофан
0,49
0,49
Тирозин
0,55
0,55
Валин
0,85
0,85
Глюкоза
5,55
5,55
Рибоза
6,66
6,66
Молочная кислота
1,00
1,00
креатин
1,00
1,00
Тиамин
0,50
0,50
ИМФ + ГМФ
0,40
0,40
Сахароза
2,00
Фруктоза
2,00
Ксилоза
2,00
Мальтодекстрин
0,50%
0,50%
Таблица 9Сенсорная оценка аналога бургеров и образца говядины 80:20, определяемая групой экспертов
№ образца
говядина
767
804
929
Качество вкуса
СЗ
7,0
3,8
3,2
4,3
СО
0,0
1,3
1,0
1,2
Интенсивность вкуса
СЗ
4,3
4,2
4,3
4,3
СО
0,8
1,2
1,4
1,2
Вкус: говяжий
СЗ
5,0
3,3
2,3
4,2
СО
1,0
1,2
0,8
1,2
Вкус: кровяной/металический
СЗ
4,5
2,0
2,2
3,2
СО
1,2
1,0
0,9
1,4
Вкус: пряный
СЗ
3,3
3,8
3,7
4,2
СО
1,2
1,2
1,2
1,8
Посторонние вкусы: химический/окисленный/бобовый
СЗ
1,5
2,3
3,5
2,7
СО
0,8
1,2
1,8
1,0
СЗ = среднее значениеСО = стандартное отклонение
Таблица 10Соединения со вкусом говядины, созданные в аналоге бургера с 1% легоглобином (Legh) и смесью 2 прекурсоров, выявленные с помощью ГХ-МС
3-октен-2-он
октановая кислота
(Z)-2-деценаль,
1-пентен-3-ol
октан
дисульфид углерода
виниловый эфир n- капроновой кислоты
октаналь
бутиролактон
2-ацетилтиазол
нонаналь
бутановая кислота
тиофен
4,7-диметил-ундекан
3-метил-бутаналь
метил-тииран
метил этаноат
2-метил-бутаналь
тиазол
метиональ
бутаналь
стирол
метакролеин
3,6,6-триметил-бицикло[3.1.1]гепт-2-ен
изовалериановая кислота
бензиловый спирт
пиррол
изопропиловый спирт
1,3-диметил-бензол
пиридин
гексановая кислота
бензол
триметил-пиразин
2,2,4,6,6-пентаметил-гептан
бензальдегид
тетраметил-пиразин
2-метил-гептан
ацетофенон
метил-пиразин
гептан
ацетонитрил
этил-пиразин
гептаналь
ацетон
3-этил-2,5-диметил-пиразин
фурфураль
ацетоин
2,5-диметил-пиразин
фуранол
этиниловый эфир уксусной кислоты
2,3-диметил-пиразин
3-метил-фуран
уксусная кислота
2-этил-5-метил-пиразин
2-пропил-фуран
ацетамид
2-этинил-6-метил-пиразин
2-пентил-фуран
ацетальдегид
пиразин
2-метил-фуран
4-метил-5-тиазол-этанол
2-метил-пропаналь
2-этил-фуран
6-метил-5-гептен-2-он
пропаналь
фуран
транс-2-(2-пентенил)фуран
фенилацетальдегид
формамид
(E)-4-октен
фенол
этилацетат
4-циклопентен-1,3-дион
пентановая кислота
1-(2-фуранил)-этанон
4-цианоциклогексен
3-этил-2,2-диметил-пентан
1-(1H-пиррол-2-ил)-этанон
дигидро-2-метил-3(2H)-фуранон
пентаналь
диметил трисульфид
(E,E)-3,5-октадиен-2-он
п-крезол
диметилсульфид
3,5-октадиен-2-он
бутилпропиловый эфир щавелевой кислоты
d-лимонен
2,2-диметил-ундекан
1-гептен
1-октен-3-ол
толуол
1-этил-5-метилциклопентен
1-аоктанол
1-пентанол
1-бутанол
1-гексанол
1-октен-3-он
1H-пиррол-2-карбоксальдегид
2-метил-1H-пиррол
2-бутанон
2-нонанон
3-метил-2-бутеналь
2-тиофен-карбоксальдегид
2-н-бутилакролеин
3-этилциклопентанон
2-пирролидинон
2-метил-2-гептен
2(5H)-фуранон
2-пропеналь
(E)-2-гексеналь
дигидро-5-пентил-2(3H)-фуранон
1-гидрокси-2-пропанон
(E)-2-гептеналь
5-этилдигидро-2(3H)-фуранон
1-(ацетилокси)-2-пропанон
6-метил-2-гептанон
5-ацетилдигидро-2(3H)-фуранон
2-пентанон
2-гептанон
2,6-диметилпиразин
(E)-2-октеналь
2-фураметанол
(E,E)-2,4-нонадиеналь
2-октанон
3-этил-2-1,4-диоксин
(E,E)-2,4-гептадиеналь
(E)-2-нонаналь
3-этил-2-метил-1,3-гексадиен
(E,E)-2,4-декадиеналь
8-метил-1-ундецен
2-бутеналь
2,3-диметил-5-этилпиразин
1-пропанол
1-пентен-3-он
ПРИМЕР 34. УДАЛЕНИЕ ПОСТОРОННИХ ЗАПАХОВ ИЗ РАСТВОРОВ РАСТИТЕЛЬНЫХ БЕЛКОВ
i) Синтез лиганд-модифицированной смолы для удаления липоксигеназы (LOX)
Расчетный объем сефарозной смолы CM 1 мл (CM Sepharose, Sigma Aldrich, № в каталоге CCF100), загруженный в миниколонку BioRad. Буфер в количестве 3 мл 50 мМ MES (2-морфолиноэтансульфоновой кислоты), с заданным диапазоном рН от 5,5 до 6, пропускали через слой смолы. Отдельно к 1 мл того же буфера последовательно добавляли 0,044 мл 4,7,10-триокса-1,13-тридекандиамина, 0,030 мл 12 N HCl, 23 мг NHS (N-гидроксисукцинимида) и 38 мг EDC (1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид) гидрохлорида с растворением после каждого добавления. Полученный раствор добавляли в верхний слой колонки и позволяли ему протекать самотеком, затем собирали эффлюент. Полученный эффлюент возвращали в верхний слой колонки. Циклы добавления, элюирования и возвращения раствора выполняли четыре раза. После завершения последнего элюирования самотеком через колонку пропускали 3 мл 50 мМ MES буфера с заданным диапазоном рН от 5,5 до 6. Линолевую кислоту (0,03 мл) растворяли в 0,5 мл ДМФ (Ν,Ν-диметилформамид), а затем последовательно в 12 мг NHS, 19 мг EDC и 0,5 мл 50 мМ буфера MES с заданным диапазоном рН от 5,5 до 6. Смесь NHS/EDC встряхивали для смешивания, в результате получали двухфазную жидкость, которую вносили в верхнюю часть колонки и элюировали через слой смолы, позволяя протекать самотеком через колонку, затем собирали эффлюент. Полученный эффлюент возвращали в верхний слой колонки. Циклы добавления, элюирования и возвращения раствора выполняли четыре раза. После завершения последнего сбора в верхнюю часть колонки добавляли раствор 70% этанола в воде (5 мл), а затем 3 мл 0,1 М гидроксида натрия. После этого добавляли буфер 0,1 М фосфата калия, предварительно доведенного до уровня рН от 7 до 8.
ii) Удаление посторонних вкусов из белков гороха с помощью лиганд-модифицированной смолы для удаления LOX
Раствор белков гороха (30 мл при концентрации белка 20 мг/мл в 20 мМ калий-фосфатного буфера, рН 7,4, 100 мМ хлорида натрия) пропускали через слой смолы 100 мл по вышеописанной методике. Весь несвязанный материал собирали, и смолу дополнительно промывали 200 мл буфера. Обе фракции объединяли, и из смолы извлекали связанный белок путем промывки 20 мМ фосфата калия, 1М хлорида натрия в количестве 2 объема слоя. Слой смолы регенерировали промывкой 0,1 М NaOH в количестве 2 объема слоя с последующей промывкой 3 объемами слоя воды и повторного уравновешивали с помощью буфера.
Истощение активности LOX в объединенной несвязанной фракции было подтверждено с помощью анализа на ферментную активность. В качестве субстрата для LOX использовали линолеат натрия, и образование промежуточных гидропероксидов отслеживали по поглощению при 234 нм. Анализы проводили при уровне рН 9 в буфере 50 мМ бората натрия. Анализы подтвердили истощение активности LOX в объединенной несвязанной фракции. LOX удаляли из смолы промывкой 0,5 М и 1 М хлорида натрия.
Улучшение вкуса LOX-истощенных белковых растворов (и «как есть», и инкубированных с маслом канолы 10%) было подтверждено группой из 4 дегустаторов. В качестве контроля использовали образцы белков гороха в той же концентрации, но не истощенные по LOX. Дегустаторы описывали мягкий вкус LOX-истощенных образцов и наличие бобового, растительного вкуса у контрольных образцов. Дополнительно, ГХ-МС анализ образцов показал 5-кратное снижение содержания летучих веществ в LOX-истощенных образцах.
Уменьшение посторонних вкусов с помощью диализа и активированного угля
Раствор альбуминов гороха (30 мл при концентрации 40 мг/мл в 20 мМ калий-фосфатного буфера, рН 7,4, 100 мМ хлорида натрия) подвергали диализу против 100 объемов буфера в течение ночи при 4°С. Затем раствор выливали на слой активированного угля (меш 100, Sigma-Aldrich), предварительно увлажненного буфером. Суспензию центрифугировали при 5000×g в течение 10 минут, и супернатант, содержащий белок, декантировали. Полученный раствор тестировали на улучшение вкуса и путем дегустации, и с помощью ГХ-МС. Дегустаторы отметили улучшение вкуса (менее горький, менее мыльный вкус), и анализ ГХ-МС подтвердил двух-кратное снижение содержания летучих соединений; в частности, в анализе образцов, обработанных активированным углем, было показано снижение содержания С6 и С7 соединений (например, 1-гептаналь, 2-гептеналь или 2-гептанон), которые ассоциируются со вкусом зелени/травянистым/растительным вкусом.
Уменьшение посторонних вкусов с помощью антиоксидантов и/или ингибиторов LOX
7%-ый раствор вицилинов гороха нагревали с кокосовым маслом (20%) до 95°С в течение 15 минут в присутствии антиоксидантов или ингибиторов LOX, и сравнивали посторонние вкусы образца с контрольным образцом без каких-либо антиоксидантов или ингибиторов LOX. В аналогичном эксперименте соевое молоко нагревали в присутствии антиоксидантов или ингибиторов LOX, и штатные эксперты дегустировали этот образец на наличие посторонних вкусов. Таблица 11 суммирует посторонние вкусы, отмеченные дегустаторами. И эпигаллокатехин-галлат и пропил-галлат обладают эффектом минимизации посторонних вкусов в образцах белков гороха. Тем не менее, в случае соевого молока, не выявлено уменьшение бобового привкуса при использовании эпигаллокатехин-галлата, и выявлено, что пропилгаллат и токоферол слегка улучшают вкус соевого молока.
Таблица 11
соединение
соевое молоко
горох
α-токоферол
слегка улучшенный вкус
окисленное масло
каффеиновая кислота (0,02%)
бобовый вкус
окисленное масло
эпигаллокатехин-галлат
бобовый вкус
улучшенный вкус
пропил-галлат (0,02%)
слегка улучшенный вкус
улучшенный вкус
β-каротин
бобовый вкус
окисленное масло
ПРИМЕР 35. ЖИРОВОЙ АНАЛОГ С ГРАДИЕНТОМ ЛЕЦИТИНА
TM
Был подготовлен лецитин (обезжиренный соевый лецитин SOLEC F, The Solae Company, St. Louis, MO) в концентрации 50 мг/мл в буфере 20 мМ фосфата калия, 100 мМ NaCl, рН 8,0, который в течение 30 секунд обрабатывали ультразвуком (ультразвуковой аналоговый клеточный дезинтегратор Sonifier Analog Cell Disruptor, модель 102C, BRANSON Ultrasonics Corporation, Danbury, Connecticut). Белок бобов мунг был прибретен в жидком виде в буфере 20 мМ фосфата калия, 100 мМ NaCl, рН 8,0. Кокосовое масло растапливали путем нагревания до температуры от 50 до 70°С и сохраняли теплым до использования. Кокосовое масло, забуференный раствор белка, дополнительный буфер и суспензию лецитина перемешивали при температуре 70°С и получали эмульсию с помощью ручного гомогенизатора. Затем эмульсию подвергали термостабилизации, помещая стакан на водяную баню с температурой 95°С всего на 5 минут. После этого стакан извлекали из водяной бани и оставляли при 4°С на двенадцать часов или более перед анализом.
Для наблюдения эффекта лецитина на аналог жировой ткани была изготовлена композиция, которая содержала 1% вес./об. белка бобов мунг и 75% об./об. кокосового масла, с лецитином в количестве, возрастающем от 0%, 0,05%, 0,25%, 0,5% и до 1,0% (вес./об.).
Свойства аналога жировой ткани измеряли путем взвешивания небольших порций материала и формирования одинаковых круглых шариков, которые затем готовились на сковороде с антипригарным покрытием при температуре, медленно повышающейся до 150°С. Регистрировали температуру сковороды, при которой было заметно выделение жира из шариков, как температуру выделения жира. После завершения кулинарной обработки измеряли температуру, при которой жир больше не выделялся, и измеряли общее количество выделенного жира.
Увеличение количества лецитина в жировом аналоге коррелирует с увеличением процента выделяемого жира, и с понижением температуры выделения жира (см. Фиг. 2А и 2В). При 0% содержании лецитина в среднем выделяется 40% жира, при повышении содержания лецитина до 0,05% в среднем выделяется 82% жира, и далее этот показатель увеличивается до 88% при 0,25% лецитина и выравнивается в среднем до 60% при дальнейшем увеличении содержания лецитина. При 0% содержании лецитина требовалась высокая температура 217°С, чтобы началось выделение жира. При 0,25% содержании лецитина температура выделения жира снижалась до 122°С, затем выравнивалась в среднем до 62°С при дальнейшем увеличении содержания лецитина.
Твердость жирового аналога измерялась анализатором текстуры (ТА XT plus). Датчик вводят внутрь жирового аналога через плоскую поверхность и регистрируют усилие при проникновении на глубину 2 мм. При небольшом количестве лецитина (0,05%) твердость увеличивалась, и при количестве лецитина 0,25% и выше твердость жирового аналога уменьшалась. См. фиг. 2C.
ПРИМЕР 36. АНАЛОГ ЖИРА С РАЗЛИЧНЫМИ ТИПАМИ РАСТИТЕЛЬНЫХ МАСЕЛ
Чтобы выявить влияние типа растительного масла на аналог жира, была получена композиция, содержащая белок бобов мунг 1,5% вес./об., лецитин 0,05% вес./об. и 75% (об./об.) различных растительных масел (масло канолы, масло какао, кокосовое масло и оливковое масло), и для исследования использовали ту же методику, что и в примере 35. Свойства жирового аналога были измерены путем взвешивания небольших порций материала и формирования одинаковых круглых шариков, которые затем жарились на сковороде с антипригарным покрытием при температуре, медленно повышающейся до 250°С. Регистрировали температуру сковороды, при которой было заметно выделение жира из шариков, как температуру выделения жира. После завершения кулинарной обработки измеряли температуру, при которой жир больше не выделялся, и измеряли общее количество выделенного жира.
Использование растительных масел разного типа имеет большое влияние на жировой аналог. Масла с более высоким количеством ненасыщенных жиров, включающие масло канолы и масло из рисовых отрубей, выделяют очень мало жира (выделяется 1 и 2% жира, см. фиг. 3), тогда как масла с более высоким содержанием насыщенных жиров, включающие масло какао и кокосовое масло, выделяют значительно больше жира (выделяется 30% и 50% жира, см. фиг. 4). В случае жировых аналогов с маслом канолы и маслом из рисовых отрубей для их расплавления требуется температура выше 250°С (не измерено), в то время как жировые аналоги с какао-маслом и кокосовым маслом выделяют жир при более низкой температуре (82°С и 137°С).
ПРИМЕР 37. АНАЛОГ ЖИРА, СДЕЛАННЫЙ С КОАЦЕРВАТОМ
TM
Был подготовлен лецитин (обезжиренный соевый лецитин SOLEC F, The Solae Company, St. Louis, MO) в концентрации 50 мг/мл в буфере 20 мМ фосфата калия, 100 мМ NaCl, рН 8,0, который в течение 30 секунд обрабатывали ультразвуком (ультразвуковой аналоговый клеточный дезинтегратор Sonifier Analog Cell Disruptor, модель 102C, BRANSON Ultrasonics Corporation, Danbury, Connecticut). Белки легумин гороха и вицилин гороха в буфере 20 мМ фосфата калия, 100 мМ NaCl, рН 8,0, смешивали в соотношении 1:1. Какао-масло растапливали путем нагревания до температуры 70°С и сохраняли теплым до использования. Какао-масло добавляли в количестве 2% и 10% (вес./об.) к белковым смесям, при температуре добавления 60°С для сохранения жидкого состояния какао-масла. Поскольку растворы еще оставались теплыми, смеси обрабатывали ультразвуком в течение 1-3 минут, до момента визуально определяемого эмульгирования частиц какао-масла. Уровень рН образцов доводили до 5,5 с помощью HCl, и смесь меняла цвет на молочно-белый цвет, после чего ее центрифугировали при 5,000×g в течение десяти минут. После центрифугирования собирали осадок, содержащий коацерват белка и какао-масло. При 2% жира коацерваты были липкими и эластичными, тогда как при 10% жира коацерваты были жирными и мягкими. Коацерваты запечатывали в пластик и подвергали обработке под высоким давлением (HPP). Образец был запечатан в термосвариваемый пластиковый пакет для хранения пищи, и затем подвергался обработке под высоким давлением (85 K фунтов на кв.дюйм в течение 5 минут в изостатическом пищевом прессе Avure 2L). После HPP образцов коацервата с 2% жира был получен полутвердый, плотный материал. Образцы коацервата с 10% жира были рассыпчатыми, мягкими и жирными.
Свойства полученных образцов коацервата были измерены путем отрыва небольших порций материала, которые жарили на антипригарной сковороде при температуре, медленно возрастающей до 250°С. Из образцов коацервата не выделялось никакого жира при жарке при этой температуре.
ДРУГИЕ ВАРИАНТЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
Предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения были показаны и описаны в изобретении, но, вместе с тем, специалистам в данной области будет очевидно, что такие варианты осуществления приведены только в качестве примера. Многочисленные вариации, изменения и замены будут очевидны специалистам в данной области без отступления от сущности изобретения. Следует понимать, что для практической реализации изобретения можно использовать различные альтернативы вариантам осуществления, описанным в изобретении. Предполагается, что объем настоящего изобретения определяется приведенной ниже формулой изобретения, и что способы и структуры входят в объем этой формулы изобретения, которая распространяется на их эквиваленты.