СПОСОБ УСТАНОВЛЕНИЯ ПОДЛИННОСТИ МОЛОЧНЫХ ПРОДУКТОВ
AUTHENTICATION METHOD OF DAIRY PRODUCTS

Область изобретения
Изобретение относится к новому способу установления подлинности и происхождения молочных продуктов, в частности, применению штаммов молочнокислых бактерий, имеющих уникально расположенный элемент инсерционной последовательности, в качестве инструмента для маркирования молочных продуктов (например, сыра) и их идентификации. Изобретение также распространяется на новые штаммы молочнокислых бактерий, их применение в производстве молочных продуктов, а также молочные продукты, содержащие такие штаммы бактерий.
Предпосылки создания изобретения
Охрана ценных товаров, продуктов и брендов всегда была ключевым требованием современного рынка. Учитывая постоянное увеличение числа подделок и несанкционированного распространения продуктов питания, существует потребность в эффективном решении задачи установления подлинности продуктов и товаров. Ингредиенты контрафактной продукции могут отличаться от подлинных продуктов, а также могут соответствовать им (но при этом в фальсифицированной форме или более низкого качества), что усложняет установление различий между такими продуктами.
Существующие попытки, направленные на проверку подлинности продукции, включают, например, добавление экзогенных низкомолекулярных маркеров, таких как витамины (например, патент США 2006/0035288), сахара (например, международная публикация WO 25 2008/002987), визуально обнаруживаемые маркеры, например, по флуоресценции при применении красителей (например, патенты США 6312958, США 2004/0029295, ЕП 0327163, США 4764290), маркеры на основании азот- и/или серосодержащих гетероциклов (например, WO 2009/040563) или нуклеиновых кислот (например, WO 96/17954). Другие подходы включают определение зависимых от географии индикаторов (например, распределение изотопов) и индикаторов, образующихся под влиянием процесса производства (например, медь) (Р Pillonel et al, Mitt. Lebensm. Hyg. 95, 503 (2004), включая процитированные источники), или идентификацию генетических маркеров с помощью методов ПЦР, таких как генетически мобильные элементы, включая инсерционные последовательности (или IS-элементы, от англ. insertion sequence).
Бактериальные IS-элементы были обнаружены в ходе ранних исследований экспрессии генов у Escherichia coli и бактериофага-лямбда. Длина IS-элементов варьирует от 800 до 2500 п.о., и их можно обнаружить в геноме множества различных бактерий в количестве от незначительного числа до нескольких сотен копий на геном.
Структура IS-элементов, как правило, характеризуется наличием последовательности инвертированных повторов по концам и гена, кодирующего транспозазу. Такие IS-элементы способны встраиваться во множество сайтов в геноме или в плазмиде (Mahillon et al. 1998). IS-элементы, как было показано, способствуют эволюционной адаптации хозяина (Nicoloffet al. 2003 et 2007, Papadopoulos et al. 1999, Schneider et al. 2004). Однако для различных IS-элементов показана различная транспозиционная активность (Papadopoulos et al. 1999, Polzin et al. 1993). Полиморфизм длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ), ассоциированный с наличием множества IS-элементов, оказался подходящим способом типирования штаммов молочнокислых бактерий на внутривидовом уровне (Petrovic et al. 2006, Ricci et al. 2006).
Заявители обнаружили, что высоко вариабельные IS-элементы, которые имеют уникальное расположение в отдельных штаммах молочнокислых бактерий, можно применять в качестве штаммоспецифичного маркера для маркирования молочных продуктов, быстрого и эффективного инструмента для их идентификации.
Краткое описание изобретения
Соответственно, настоящее изобретение относится в целом к новому способу установления подлинности и происхождения молочных продуктов и, в частности, к применению штаммов молочнокислых бактерий, имеющих уникальное расположение IS-элементов, в качестве инструмента для маркирования молочных продуктов для их идентификации.
Таким образом, настоящее изобретение в первом аспекте относится к способу определения наличия или отсутствия штамма молочнокислых бактерий, включающего уникально расположенные IS-элементы, в молочных продуктах, включающему определение наличия или отсутствия указанного IS-элемента в определенном локусе генома.
В частности, способ настоящего изобретения включает следующие стадии: (а) получение образцов нуклеиновых из молочных продуктов, (б) предоставление пары праймеров, специфичных для области, в которой локализован указанный IS-элемент, и области последовательности нуклеиновых кислот, прилежащей к указанному уникально расположенному IS-элементу, (в) проведения реакции амплификации методом ПЦР с парой праймеров, указанных на стадии (б) в условиях, подходящих для образования продукта амплификации, когда указанный уникально расположенный IS-элемент присутствует в указанном образце нуклеиновой кислоты, и (г) определение наличия или отсутствия штамма молочнокислых бактерий, определяемое по наличию или отсутствию указанного продукта амплификации.
В конкретных вариантах реализации штамм молочнокислых бактерий, включающий уникально расположенный IS-элемент, в дальнейшем также упоминаемый как маркерный штамм (настоящего изобретения), выбран из группы, включающей Pediococcus, Lactobacillus, Streptococcus thermophilus, предпочтительно Pediococcus, такой как депонированный 25 сентября 2009 в Немецком банке микроорганизмов и клеточных культур (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, DSMZ) под номером DSM 22981, и Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis, такой как депонированный 28 сентября 2010 в Немецком банке микроорганизмов и клеточных культур (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, DSMZ) под номером DSM 24025.
В еще одном аспекте изобретение также относится к паре специфичных праймеров, подходящих для применения в способах настоящего изобретения, каждый из которых состоит из первого и второго праймера, длиной от 10 до 100, предпочтительно от 18 до 35 нуклеотидов, которые являются достаточно специфичными по отношению к фрагменту IS-элемента, присутствующего в конкретном штамме молочнокислых бактерий, как это определено выше, и фрагменту последовательности, прилежащей к указанному IS-элементу, соответственно, для проведения ПЦР-амплификации.
В еще одном аспекте изобретение также относится к применению таких праймеров или пар праймеров настоящего изобретения.
И еще в одном аспекте настоящее изобретение также относится к новым штаммам молочнокислых бактерий, таким как Pediococcus acidilactici, представленным изолятом, депонированным в Немецком банке микроорганизмов и клеточных культур (DSMZ) под номером DSM 22981, и изолятом Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis, депонированным 28 сентября 2010 в Немецком банке микроорганизмов и клеточных культур (DSMZ) под номером DSM 24025. Также изобретение охватывает мутантные формы или варианты штаммов или бактерий, имеющие по меньшей мере 93 процента сходства по последовательности 16S рРНК с каждым из вышеперечисленных штаммов (далее называемые в настоящей заявке штаммами (молочнокислых) бактерий/(бактериальными штаммами) настоящего изобретения). В еще одном аспекте изобретение также относится к молочным продуктам, предпочтительно сыру, включающим штамм молочнокислых бактерий настоящего изобретения или комбинацию штаммов молочнокислых бактерий настоящего изобретения.
В еще одном аспекте изобретение относится также к применению штамма молочнокислых бактерий, включающего уникально расположенные IS-элементы, для идентификации и установления подлинности происхождения молочных продуктов, при этом на подлинность происхождения указывает наличие указанного штамма молочнокислых бактерий.
В еще одном аспекте настоящее изобретение также относится к набору для специфичной детекции штамма молочнокислых бактерий, включающего уникально расположенные IS-элементы, который включает пару праймеров, как это определено выше, для выявления и установления подлинности происхождения молочного продукта, при этом на подлинность происхождения указывает наличие указанного штамма молочнокислых бактерий.
Подробное описание изобретения
Следует понимать, что употребление формы слова в единственном числе в отношении штаммов и IS-элементов охватывает один или более штамм или один или более IS-элемент. Таким образом, также охвачены комбинации одного штамма молочнокислых бактерий, имеющего одну или более маркерную последовательность, двух или более штаммов молочнокислых бактерий, каждый из которых имеет одну маркерную последовательность, и двух или более штаммов молочнокислых бактерий, каждый из которых включает две или более маркерные последовательности. Конкретные комбинации обсуждаются в тексте.
Выражение «вариант» или «производное» штамма, используемое в настоящей заявке, обозначает штамм, который отличается от другого (родственного) штамма настоящего изобретения определенным или неопределенным образом, но имеет такую же маркерную последовательность. Такие варианты могут образовываться либо в результате спонтанных мутаций или же могут быть получены целенаправленно посредством генетических манипуляций или стандартными способами, включающими получение мутаций при действии источников ультрафиолетового света, с помощью химических веществ, таких как нитрозогуанидин, и т.п.
Выражение «вариант» или «производная» по отношению к маркерной нуклеотидной последовательности включает все нуклеотидные последовательности, которые отличаются заменой, делецией, добавлением некоторых нуклеотидов, но которые дают продукт ПЦР такого же размера (менее 15% разницы по п.о.) с праймерами настоящего изобретения.
Термин «праймер» относится к одноцепочечному олигонуклеотиду, способному выступать в качестве сайта инициации матричного синтеза ДНК при соответствующих условиях (например, в присутствии четырех нуклеозидтрифосфатов и ДНК-полимеразы) в соответствующем буфере и при соответствующей температуре. Соответствующая длина праймера зависит от предполагаемого применения такого праймера, но, как правило, длина от 18 до 35 нуклеотидов является достаточной для обеспечения гибридизации при заданных условиях. Короткие молекулы праймеров обычно требуют более низких температур для образования достаточно стабильных гибридных комплексов с матрицей. Праймер не обязательно точно соответствует последовательности матрицы, но он должен обладать достаточной степенью комплементарности для гибридизации с матрицей. Термин «сайт праймера» относится к области ДНК-мишени, с которым гибридизуется праймер. Термин «пара праймеров» обозначает набор праймеров, в том числе 5'-«верхний» праймер, который гибридизуется с 5'-концом амплифицируемой последовательности ДНК, 3'-«нижний» праймер, который гибридизуется последовательностью, комплементарной 3'-концу амплифицируемой последовательности ДНК. Пары праймеров, подходящие для настоящего изобретения, специально сконструированы для выявления уникально расположенного IS-элемента, и включают праймер, гибридизующийся с фрагментом в пределах IS-элемента и второй праймер, гибридизующийся с фрагментом, фланкирующим IS-элемент. В контексте настоящего изобретения, последовательность, ограниченная первым и вторым праймером, также упоминается как маркерная последовательность.
Термин «комплементарный», «комплементарность», используемый в настоящей заявке в отношении полинуклеотидов (например, последовательности нуклеотидов, такой как олигонуклеотид или целевая нуклеиновая кислота), относится к стандартным уотсон-криковским правилам образования пар. Последовательность комплементарна некоторой последовательности нуклеиновых кислот таким образом, что 5'-конец одной последовательности спаривается с 3'-концом другой последовательности, находясь в «антипараллельной ассоциации».
Термин «существенная комплементарность» означает, что последовательность, в контексте настоящей заявки, праймер или зонд не обязательно должен быть в точности комплементарен своей последовательности-мишени и необходимо, чтобы праймер или зонд был только существенно комплементарен для селективной гибридизации с соответствующей цепью в сайте своего отжига. Как понятно специалисту в данной области, существенно комплементарные последовательности не обязательно должны гибридизоваться по всей своей длине. В праймер или зонд может быть включено некомплементарное основание или несколько оснований при условии, что праймер или зонд сохраняет достаточную комплементарность с полинуклеотидным сайтом связывания для формирования с ним стабильного дуплекса.
«Специфичная гибридизация» праймеров представляет собой отжиг на комплементарную последовательность с формированием двухцепочечного полинуклеотида, что обеспечивает сайт инициации элонгации (удлинения) праймера и синтеза ДНК.
2+
Термин «ампликон» или «продукт амплификации» относится к продукту реакции амплификации, полученному в результате удлинения пары праймеров настоящего изобретения. Ампликон может содержать экспоненциально амплифицируемые нуклеиновые кислоты, если оба применяемых праймера гибридизуются с целевой последовательностью. Кроме того, ампликон может образовываться в результате линейной амплификации, если один из применяемых праймеров не гибридизуется с целевой последовательностью. В предпочтительном способе амлификации используется ПЦР (см see Saiki et al. (1988) Science 239:487-4391). В данном способе применяется пара праймеров, как описано выше. При стандартной ПЦР праймеры смешивают с соответствующим буфером, содержащим Mg, все четыре дезоксинуклеотида (дНТФ), термостабильной ДНК-полимеразой и ДНК-мишенью (матрицей). Смесь нагревают до температуры, достаточной для разделения двух комплементарных нитей ДНК. После этого смесь охлаждают до температуры, достаточной для специфичного отжига праймеров на комплементарных последовательностях. Температуру реакционной смеси можно довести до оптимального значения для термостабильной ДНК-полимеразы для осуществления синтеза ДНК (элонгации). Такой температурный режим повторяется при каждом цикле амплификации. Таким образом, ПЦР включает множество циклов плавления ДНК, отжига и элонгации. Методы ПЦР, применяемые в способах настоящего изобретения, осуществляются с помощью стандартных методик (см., например, McPherson et al., PCR (Basics: From Background to Bench) (2000) Springer Verlag; Dieffenbach and Dveksler (eds) PCR Primer: A Laboratory Manual (1995) Cold Spring Harbor Laboratory Press; Erlich, PCR Technology, Stockton Press, New York, 1989; Innis et 10 al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Harcourt Brace Javanovich, New York, 1990; Barnes, W. M. (1994) Proc Natl Acad Sci USA, 91, 2216-2220). Праймеры или олигонуклеотиды, применяемые в способах согласно настоящему изобретению, предпочтительно представляют собой ДНК. В контексте настоящего изобретения продукт амплификации или ампликон получают путем проведения реакции ПЦР-амплификации с применением пары праймеров настоящего изобретения, таким образом, амплифицируя маркерную последовательность (то есть последовательность, ограниченную первым и вторым праймерами) и получая соответствующий продукт амплификации или ампликон. Используемый в настоящей заявке термин «выявление/детекция» в отношении обнаружения присутствия целевой последовательности нуклеиновой кислоты, свидетельствующего о наличии конкретного штамма в образце, и т.д., не требует от метода 100% чувствительности и/или 100% специфичности. Как известно, «чувствительность» представляет собой вероятность того, что анализ является положительным при условии, что образец содержит целевую последовательность нуклеиновых кислот, тогда как «специфичность» представляет собой вероятность того, что анализ является отрицательным при условии, что образец не содержит целевой последовательности нуклеиновых кислот. Чувствительность по меньшей мере 50% является предпочтительной, хотя чувствительность по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, и по меньшей мере 99% является, несомненно, более предпочтительной. Специфичность по меньшей мере 50% является предпочтительной, хотя специфичность, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, и по меньшей мере 99%, несомненно, более предпочтительна. Детектирование также включает в себя анализ с ложноположительными и ложноотрицательными ответами. Доля ложноотрицательных ответов может составлять 1%, 5%, 10%, 15%, 20% или даже больше. Доля ложноположительных ответов может составлять 1%, 5%, 10%, 15%, 20% или даже больше.
«Фрагмент» по отношению к последовательности нуклеиновой кислоты (например, фрагмент в пределах IS-элемента или фрагментов в пределах последовательности нуклеиновой кислоты, фланкирующей IS-элемент, который служит сайтом гибридизации для пары праймеров настоящего изобретения) относится к последовательности нуклеотидных остатков длиной от 15 до 2000 п.о., предпочтительно от 15 до 500, более предпочтительно от 50 до 400, наиболее предпочтительно от 100 до 300 нуклеотидов.
Настоящее изобретение относится в целом к способу установления подлинности и подтверждения происхождения молочных продуктов путем маркирования молочных продуктов в процессе производства с помощью штаммов молочнокислых бактерий, имеющих уникальное расположение IS-элементов, в дальнейшем также упоминаемых в настоящей заявке как маркерные штаммы (настоящего изобретения). Скрининг таких штаммов, имеющих уникально расположенные IS-элементы, позволит установить происхождение молочных продуктов.
Таким образом, настоящее изобретение относится к способу определения наличия или отсутствия штамма молочнокислых бактерий, включающего уникально расположенный IS-элемент, в молочных продуктах, включающего выявление наличия или отсутствия указанного IS-элемента в определенном локусе, при этом его присутствие указывает на наличие такого штамма молочнокислых бактерий в указанном молочном продукте. В частности, способ включает стадии
(а) получение образца нуклеиновой кислоты из молочных продуктов,
(б) предоставление пары праймеров, специфичных для области указанного уникально расположенного IS-элемента и области последовательности нуклеиновых кислот, прилегающей к указанному уникально расположенному IS-элементу,
(в) проведение реакции ПЦР-амплификации с парой праймеров, указанных на стадии (б), в условиях, подходящих для образования продукта амплификации, при этом указанный уникально расположенный IS-элемент присутствует в образце указанной нуклеиновой кислоты и
(г) определение наличия или отсутствия штамма молочнокислых бактерий по детекции наличия или отсутствия указанного продукта амплификации.
В конкретных вариантах реализации штамм молочнокислых бактерий, применяемый в способах настоящего изобретения, может представлять собой любой вид молочнокислых бактерий, присутствующих в молочных продуктах или применяемый в молочной промышленности, например такой как Lactococci, такой как Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris и Lactococcus lactis subsp. lactic biovar diacetylactis; Pediococci, такой как Pediococcus pentosaceus, Pediococcus acidilactici; Streptococci, такой как Streptococcus thermophilus; Lactobacilli, такой как Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus casei, Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis, Lactobacillus rhamnosus.
Предпочтительный штамм представляет собой штамм, депонированный 25 сентября 2009 в Немецком банке микроорганизмов и клеточных культур(DSMZ) под номером DSM 22981.
Другой предпочтительный штамм представляет собой штамм, депонированный 28 сентября 2010 в Немецком банке микроорганизмов и клеточных культур(DSMZ) под номером DSM 24025.
В других конкретных вариантах реализации указанный уникально расположенный IS-элемент по меньшей мере 75% идентичен IS-элементу, выбранному из группы, включающей легкодоступные IS-элементы из молочнокислых бактерий Streptococcus thermophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus delbrueckii Lactis, lactobacillus helveticus, Lactococcus lactis, Leuconostoc lactis, Pediococcus pentosaceus, Pediococcus damnosus и Lactobacillus rhamnosus, включающие, но не ограниченные перечисленными, последовательности IS30, IS153, ISS1, IS981, IS1076, ISL1, ISLpI1, IS904, IS946 и или их части.
В других вариантах реализации образцы нуклеиновых кислот молочных продуктов (в соответствии со стадией (а) вышеуказанного способа) могут быть получены способами, известными в данной области.
Способы изобретения включают скрининг одного или более штамма молочнокислых бактерий, каждый из которых включает уникально расположенный IS-элемент. Скрининг включает гибридизацию образца нуклеиновых кислот с одной парой праймеров настоящего изобретения для каждого штамма, делающую возможной амплификацию и получение продукта амплификации для каждого штамма. В отдельных вариантах реализации способ настоящего изобретения включает скрининг одного штамма или комбинации из 2 или 3 штаммов.
Кроме того, способы настоящего изобретения включают скрининг одного штамма молочнокислых бактерий, включающего один или более уникально расположенный IS-элемент, который может быть осуществлен путем гибридизации образца нуклеиновой кислоты с одной парой праймеров настоящего изобретения для каждого IS-элемента, что делает возможной амплификацию и получения продукта амплификации для каждого IS-элемента. В отдельных вариантах реализации способ изобретения включает скрининг 1, 2 или 3 IS-элементов.
Определение одного или более уникально расположенного IS-элемента в конкретном штамме осуществляется путем (I) первого этапа скрининга одного или более IS-элемента в конкретном штамме с помощью соответствующих праймеров, (II) последующей амплификации ДНК между одним или более различными выявленными IS-элементами в конкретном штамме, а также в других штаммах того же вида с использованием специально разработанных праймеров по отдельности или в различных сочетаниях, и (III) обнаружения продуктов ПЦР, уникальных для конкретного штамма. Выявленные уникальные продукты ПЦР секвенируют, конструируют праймеры и оценивают штаммоспецифичность сконструированных праймеров.
Образцы нуклеиновых кислот из молочных продуктов можно амплифицировать с применением пары праймеров настоящего изобретения, используя различные способы, известные в данной области. Предпочтительно, для амплификации нуклеиновых кислот применяют ПЦР. Кратко, приобретают две последовательности праймеров, которые комплементарны областям на противоположных комплементарных нитях, как описано выше, то есть первый праймер гибридизуется с фрагментом уникально расположенного IS-элемента, а второй праймер гибридизуется с фрагментом последовательности нуклеиновой кислоты, прилежащей к указанному IS-элементу. К реакционной смеси добавляют избыточное количество олигонуклеотидов, а также ДНК-полимеразу, например, Taq-полимеразу, и дезоксинукпеотидтрифосфаты.
Если уникально расположенный IS-элемент присутствует в образце, праймеры будут связываться с комплементарной им последовательностью в IS-элементе и фланкирующей его последовательностью, а полимераза будет обеспечивать элонгацию праймеров вдоль маркерной последовательности, добавляя нуклеотиды. При повышении и снижении температуры реакционной смеси удлиненные праймеры диссоциируют от маркерной последовательности с формированием продуктов реакции, оставшиеся избыточные праймеры связываются с целевой последовательностью и с продуктами реакции, и процесс повторяется, таким образом, с экспоненциальным образованием продуктов амплификации. Параметры циклирования можно изменять в зависимости от длины продуктов амплификации. Внутренний положительный контроль амплификации (ВПК) может быть включен в образец, включающий специфичный праймер, например, для контроля как выделения ДНК, так и любой последующей реакции амплификации.
В подходящем варианте реализации ПЦР в реальном времени осуществляют с помощью любого подходящего прибора, способного выявить накопление продукта амплификации. Чаще всего, такой прибор способен выявить флуоресценцию одной или более флуоресцентной метки. Например, детекция в реальном времени на приборе (например, Rotorgene) позволяет наблюдать флуоресценцию в течение каждого цикла ПЦР. Пороговый цикл, или значение Ct (от англ. threshold cycle), представляет собой цикл, на котором флуоресценция достигает порогового значения. Пороговое значение определяется программным обеспечением или вручную.
Амплификация последовательности нуклеиновой кислоты может быть обнаружена с помощью любых способов, хорошо известных в данной области, таких как гель-электрофорез, капиллярный электрофорез или детекция «в реальном времени».
В одном из вариантов реализации последовательности двух или более фрагментов амплифицируют в одной и той же реакционной пробирке (например, «мультиплексная ПЦР»). Детекция может происходить путем измерения конечной точки реакции или в режиме «реального времени».
Для детекции в реальном времени праймеры и/или зонды могут быть мечены для возможности детекции для того, чтобы можно было по разнице в значении флуоресценции определить, когда происходит включение праймеров или когда происходит гибридизация зондов, например, и когда происходит амплификация, с помощью прибора, способного отслеживать изменения флуоресценции в ходе реакции. Методы амплификации нуклеиновых кислот с детекцией в режиме реального времени хорошо известны, и включают, например, систему TaqMan, систему праймеров Scorpion™ и применение интеркалирующих красителей для двухцепочечной нуклеиновой кислоты. К меткам, которые можно применять, относятся, например, флуоресцентные красители (например, Texas red, FAM, JOE, HEX).
При детекции по конечной точке реакции ампликон (ампликоны) можно выявить путем первоначального разделения ампликонов по размеру с последующей детекцией разделенных фрагментов. Разделение ампликонов разного размера можно осуществить, например, с помощью гель-электрофореза и капиллярного электрофореза. Эти и другие методы разделения хорошо известны специалистам в данной области. В одном из примеров ампликоны размером от 10 до 150 пар оснований, размеры которых отличаются на 10 и более пар оснований, можно разделить, например, в 4-5% агарозном геле (от 2% до 3% агарозном геле для ампликонов от примерно 150 до примерно 300 пар оснований) или 6-11% полиакриламидном геле. Разделенные нуклеиновые кислоты можно окрасить с помощью красителя, такого как GelRed, и размер полученной окрашенной полосы или полос можно сравнить со стандартным маркером молекулярного веса ДНК.
Таким образом, в конкретном варианте реализации способа настоящего изобретения наличие продукта амплификации определяют по размеру (длине ДНК) амплифицированной последовательности с помощью гель-электрофореза, с помощью меченых праймеров, применяемых для указанной полимеразной цепной реакции, которые включаются в амплифицированную последовательность, или с помощью меченого ДНК-зонда, гибридизующегося с уникальной областью амплифицированной последовательности при помощи Саузерн-блот анализа.
В еще одном аспекте изобретение также относится к паре (парам) праймеров, применяемых для гибридизации и амплификации в соответствии со способами настоящего изобретения, а точнее пары праймеров, содержащей первый праймер и второй праймер, каждый из которых содержит по меньшей мере 15 последовательных нуклеотидов, при этом первый праймер достаточно специфичен по отношению к последовательности в пределах уникально расположенного инсерционного элемента, а второй праймер является достаточно специфичным по отношению к последовательности в области, фланкирующей инсерционный элемент. Наиболее предпочтительно, пара праймеров включает первый праймер SEQ ID NO:1 и второй праймер SEQ ID NO:2 для определения наличия или отсутствия штамма Pediococcus в молочном продукте, или шестой праймер SEQ ID NO 6 и седьмой праймер SEQ ID NO:7 для определения наличия или отсутствия штамма Lactobacillus в молочном продукте или их комбинацию.
Таким образом, в другом варианте способ определения наличия или отсутствия штамма Pediococcus acidilactii в молочном продукте включает следующие стадии:
(A) получение образца нуклеиновых из молочных продуктов,
(Б) предоставление пары праймеров, специфичных для области ISS1SC (номер доступа в GenBank X94934) и области последовательности нуклеиновых кислот, прилежащей к указанному уникально расположенному IS-элементу, предпочтительно пары праймеров, включающей первый праймер из пары праймеров, включающий последовательность SEQ ID NO:1, и второй праймер из пары праймеров, включающий последовательность SEQ ID NO:2.
(B) проведение реакции ПЦР-амплификации с парой праймеров, указанных на стадии (Б) в условиях, подходящих для обеспечения гибридизации первого и второго праймера, и
(Г) выявление наличия или отсутствия продукта амплификации, свидетельствующего о наличии или отсутствии указанного штамма Pediococcus.
Еще в одном варианте способ определения наличия или отсутствия штамма Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis в молочном продукте включает стадии:
(A) получение образца нуклеиновых из молочных продуктов,
(Б) предоставление пары праймеров, специфичных для области IS30 (номер доступа в GenBank NC_008529) и области последовательности нуклеиновых кислот, прилегающей к указанному уникально расположенному IS-элементу, предпочтительно пары праймеров, в которой шестой праймер из пары праймеров включает последовательность SEQ ID NO:6 и седьмой праймер из пары праймеров включает последовательность SEQ ID NO:7,
(B) проведение реакции ПЦР-амплификации с парой праймеров, указанных на стадии (Б), в условиях, подходящих для обеспечения гибридизации шестого и седьмого праймера, и
(Г) выявление наличия или отсутствия продукта амплификации, свидетельствующего о наличии или отсутствии указанного штамма Lactobacillus.
При этом в еще одном варианте реализации указанные способы можно объединять для определения наличия или отсутствия штаммов Pediococcus и Lactobacillus в молочных продуктах.
Еще в одном аспекте настоящее изобретение относится к изолированным штаммам молочнокислых бактерий, предпочтительно к изолированному штамму молочнокислых бактерий Pediococcus acidilactici представленному изолятом, депонированным в Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур (DSMZ) 25 сентября 2009 года под номером DSM 22981, или его мутантной форме или варианту, или бактерии, имеющей такую же маркерную последовательность, как и указанный маркерный штамм, или к изолированному штамму молочнокислых бактерий Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis, представленному изолятом, депонированным в Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур (DSMZ) 28 сентября 2010 года под номером DSM 24025, или его мутантной форме или варианту, или бактерии, имеющей такую же маркерную последовательность, как и указанный маркерный штамм.
В настоящем изобретении также раскрыты изолированные чистые культуры штаммов молочнокислых бактерий, имеющие вышеуказанные характеристики. Используемый в настоящей заявке термин «чистая культура» обозначает, что культура содержит биомассу одного изолята штамма молочнокислых бактерий в соответствии с изобретением, т.е. клон, происходящий по сути из одной клетки.
Такие чистые культуры могут быть предоставлены в виде жидкой клеточной суспензии или в виде замороженных, высушенных распылением или высушенных сублимацией препаратов. Предпочтительно, чистая культура представляет собой концентрат клеток, полученный путем отделения клеток, например, путем центрифугирования или фильтрации с помощью стандартных способов.
И еще в одном аспекте настоящее изобретение относится к содержащей культуру композиции, включающей один из указанных выше штаммов чистых культур молочнокислых бактерий, а также микробиологически приемлемый носитель.
Композиция может, в соответствии с настоящим изобретением, включать два или более указанных выше штамма чистых культур молочнокислых бактерий, и возможно, дополнительно включает еще виды молочнокислых бактерий, такие как выбранные из группы, включающей виды Lactococcus sp., Lactobacillus sp., Leuconostoc sp., Weissella sp., Oenococcus sp., Streptococcus spp., виды Bifidobacterium, виды Propionibacterium или виды Pediococcus, помимо тех, которые указаны выше.
Предпочтительные комбинации штаммов включают комбинации видов Lactobacillus и/или Pediococcus и/или Streprococcus. В соответствующих вариантах реализации культура композиции настоящего изобретения может представлять собой заквасочную культуру, или вспомогательную не заквасочную культуру, предпочтительно вспомогательную не заквасочную культуру.
Может быть предпочтительно, что такая содержащая культуру композиция содержит по меньшей мере один маркерный штамм настоящего изобретения в концентрации 100-1000 КОЕ/мл молока (для производства сыра). Подходящие вещества-носители включают питательные вещества, такие как источники усваиваемого углевода или азота, которые могут с легкость потребляются штаммом молочнокислых бактерий. Как правило, такая композиция представлена в виде замороженной или высушенной сублимацией композиции. В последнем случае композиция также может содержать криозащитные соединения.
Таким образом, в еще одном аспекте настоящее изобретение относится к применению упомянутых выше штаммов молочнокислых бактерий или чистой культуры в качестве заквасочной культуры или вспомогательной не заквасочной культуры, или инактивированной культуры в производстве молочных продуктов, предпочтительно сыра. Таким образом, настоящее изобретение также относится к способу получения молочных продуктов, таких как сыр, путем добавления эффективного количества штамма молочнокислых бактерий изобретения или композиции в молоко.
Подходящий штамм выбирают таким образом, что он не влияет на процесс производства сыра и/или что он не влияет на качество сыра, и/или что он выживает в условиях процесса производства сыра, и/или его детекцию можно осуществить в целом сыре, тертом сыре и/или в корке сыра, для того, чтобы установить подлинность происхождения сыра, содержащего указанный бактериальный штамм.
Используемый в настоящей заявке термин «молоко» обозначает любой вид свежего или восстановленного, обезжиренного, полужирного или цельного, пастеризованного молока или компонента молока, включающего, например, коровье молоко, буйволиное молоко, козье молоко, овечье молоко с содержанием сухих веществ от 10 до 20% по весу. Переработка молока для получения молочных продуктов, таких как сыр, осуществляется с помощью стандартных процедур.
3
3
13
5
9
6
8
Как правило, штамм молочнокислых бактерий добавляют в молоко в концентрации жизнеспособных клеток, которая составляет по меньшей мере 10КОЕ/г, предпочтительно в диапазоне от 10 до 10 КОЕ/г, например в диапазоне от 10 до 10 КОЕ/г, например, в диапазоне от 10 до 10 КОЕ/г молока.
В еще одном аспекте настоящее изобретение также относится к молочному продукту, предпочтительно сыру, содержащему штамм молочнокислых бактерий настоящего изобретения, или чистую культуру, или содержащую такую культуру композицию.
Таким образом, изобретение также относится к применению штамма молочнокислых бактерий настоящего изобретения, или его чистой культуры, или содержащей такую культуру композицию, для идентификации молочного продукта, предпочтительно сыра, и, таким образом, способа маркирования молочных продуктов для идентификации и установления подлинности происхождения, включающего добавление штамма молочнокислых бактерий настоящего изобретения, или чистой культуры, или содержащего такую культуру соединения в сырную закваску.
В еще одном аспекте изобретение также относится к набору для специфичной детекции штамма молочнокислых бактерий настоящего изобретенияю. или его чистой культуры, или содержащей культуру композиции, включающему пару праймеров, специфичных для области уникально расположенного IS-элемента в указанном штамме молочнокислых бактерий или чистой культуре или содержащей такую культуру композиции, и области последовательности нуклеиновых кислот, прилегающей к указанному уникально расположенному IS-элементу. Такой набор можно применять для идентификации и установления подлинности происхождения молочных продуктов, при этом подтверждением происхождения является наличие штамма молочнокислых бактерий, как это определено выше, с применением пары праймеров в соответствии с настоящим изобретением.
Другие преимущества и характеристики настоящего изобретения станут ясны при прочтении следующего описания и не ограничивающих примеров, приведенных исключительно в качестве иллюстрации. Различные модификации изобретения в дополнение к тем, которые были описаны в настоящей заявке, станут ясны специалисту в данной области из предшествующего описания, и они входят в объем охвата формулы настоящего изобретения. Различные публикации, процитированные в настоящем документе, включены посредством ссылки в полном объеме, необходимом для понимания настоящего изобретения.
Примеры
Материалы: Использованы бактериальные штаммы/культуры, включающие коммерчески доступные штаммы, а также штамм Pediococcus acidilactici, депонированный 25 сентября 2009 года, и штамм Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis, депонированный 28 сентября 2010 года в соответствии сие полным удовлетворением требований Будапештского договора о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры с Немецком банком микроорганизмов и клеточных культур (DSMZ) под номерами доступа DSM 22981 и DSM 24025, соответственно.
Методы: ДНК выделяли из сыра, ресуспендируя 10 г тертого сыра в Peptonwater (1% пептона, 0,5% NaCl и 2% цитрат натрия) и перемешивая в гомогенизаторе при комнатной температуре в течение 3 мин. Десять мл экстракта сыра смешивали с 50 мл 10% ДСН и центрифугировали 30 минут при 4000×g. Супернатант удаляли, оставляя примерно 1 мл, который переносили вместе с осадком в 1,5 мл пробирку. После центрифугирования (5 мин 10000×g), супернатант удаляли, а осадок песуспендировали в 950 мл буфера ТЭС (0,1 моль л^-1 Трис-HCl, 10 ммоль л^-1 ЭДТА, 25% в./об. сахарозы, рН 8,0) слизоцимом. ДНК выделяли с помощью набора EZ DNA Tissue Kit (Qiagen) после инкубации с протеиназой К, как описано в инструкции производителя.
-1
-1
-1
-1
2
Амплификацию проводили в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 2,5 мкл 10Х буфера с 15 ммоль л MgCl (Applied Biosystems, Foster City, CA), 0,5 мкл 10 ммоль л дНТФ (Promega Corp., Madison, WN), 0,2-25 мкл каждого праймера (100 ммоль л) (Operon Technologies, Alameda, CA or Microsynth Laboratory, Balgach, CH) и 0,2-0,25 мкл Taq ДНК-полимеразы (5 ед. мкл AmpliTaq Gold) (Applied Biosystems). Амплификацию проводилось с помощью системы для ПЦР GeneAmp PCR System (Applied Biosystems). Продукты амплификации разделяли с помощью чипа DNA 7500 или DNA 1000 LabChip в анализаторе Agilent 2100 Bioanalyser в соответствии с инструкциями производителя (Agilent Technologies, Palo Alto, CA).
Пример 1: Разработка штаммоспецифичной ПЦР
Для поиска уникально расположенных инсерционных последовательностей, участки ДНК между IS-элементами амплифицировали с помощью комбинации «верхнего» и «нижнего» праймеров. Праймеры были сконструированы для нескольких различных IS из молочнокислых бактерий.
(а) Pediococcus acidilactici:
Программа амплификации включала первый этап денатурации при 95°С 10 мин, 35 циклов 95°С в течение 30 сек, 54°С в течение 30 сек и 72°С в течение 8 мин, и заключительный этап элонгации 10 мин при 72°С.
В качестве примера, с парой праймеров Z32771FOUT (5'-CGTTCGGAATAGGTTATACT; SEQ ID NO:3), сконструированного для области 9519-10424 сахарозного и раффинозного оперонов из Pediococcus pentosaceus (номер доступа Z32771) и ISSIPpROUT (5'-AGGCTGCTTGCGTATC; SEQ ID NO:1), сконструированного для гена транспозазы ISS1SC из Streptococcus thermophilus (номер доступа Х94934) был получен продукт ПЦР 1700 только для штамма Pediococcus acidilactici настоящего изобретения (номер доступа DSM 22981).
Полученный ампликон секвенировали с вышеуказанным праймерами IS, отжигающимися вне IS-элемента, и конструировали новые праймеры для последовательности гена, прилежащего к IS-элементу. В результате ПЦР с использованием праймера ISSIPpROUT (SEQ ID NO:1) и нового сконструированного праймера G27 (5'-ATCGTCGAACGCCGCAAGAAAC; SEQ ID NO:2) был получен продукт ПЦР 220 п.о. только для штамма Pediococcus acidilactici настоящего изобретения (номер доступа DSM 22981).
(б) Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis
Программа амплификации включала первый этап денатурации при 95°С 10 мин, 35 циклов 95°С в течение 30 сек, 59°С в течение 1 мин и 72°С в течение 3 мин, и заключительный этап элонгации 7 мин при 72°С.
В качестве примера, с парой праймеров с355а-3 (5'-GGTGCAACTCTCTTCCTCGAA; SEQ ID NO:4), сконструированного для транспозазы семейства IS30 Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (номер доступа NC_008529) и с370-3 (S'-GGAAGGGCAAGCAGGATT; SEQ ID NO:5), сконструированного для гена транспозазы Lactobacillus helveticus (номер доступа МС_010080) был получен продукт ПЦР 1210 п.о. только для штамма Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis настоящего изобретения (номер доступа DSM 24025).
Полученый ампликон секвенировали с вышеуказанным праймерами IS, отжигающимися вне IS-элемента, и конструировали новые праймеры для последовательности гена, прилежащего к IS-элементу. В результате ПЦР с использованием нового сконструированного праймера Lb102-F (5'-CTTAAACTACAAGACTCCAGAAGAA; SEQ ID NO:6) для семейства IS30 транспозазы Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (номер доступа NC_008529), и нового сконструированного 19108/2010-17 праймера (5'-GGCATCAATTTATAGACGCCAAT; SEQ ID NO:7) был получен продукт ПЦР 136 п.о. только для штамма Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis настоящего изобретения (номер доступа DSM 24025).
Пример 2: Тестирование штаммоспецифичности
(а) Pediococcus acidilactici:
С помощью внешних праймеров для ISS1SC из Streptococcus thermophilus вместе с праймером G27 амплифицировали маркерную последовательность штамма Pediococcus acidilactici настоящего изобретения (номер доступа DSM 22981).
Для проверки наличия маркерной последовательности исключительно в маркерном штамме проводили детектирование маркерной последовательности в 50 родственных штаммах и 36 сырах, произведенных без маркерной культуры, и 20 сырах, произведенных с помощью маркерной культуры. Результаты показали, что все штаммы и все сыры, произведенные без маркерной последовательности, были отрицательными, а все сыры, произведенные с применением маркерной культуры, были положительными.
(б) Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis
Аналогичным образом было протестировано более 50 различных штаммов Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis. Результаты показали, что, как и ожидалось, все протестированные штаммов были отрицательными. Только сыры, произведенные с применением маркерной культуры, показали положительный ответ при тестировании.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  Agroscope Liebefeld-Posieux ALP
<120>  Authentication method
<130>  P158406
<160>  7
<170>  PatentIn version 3.3
<210>  1
<211>  16
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  synthetic oligonucleotide
<400>  1
aggctgcttg cgtatc                                                     16
<210>  2
<211>  22
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  synthetic oligonucleotide
<400>  2
atcgtcgaac gccgcaagaa ac                                              22
<210>  3
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  synthetic oligonucleotide
<400>  3
cgttcggaat aggttatact                                                 20
<210>  4
<211>  21
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  synthetic oligonucleotide
<400>  4
ggtgcaactc tcttcctcga a                                               21
<210>  5
<211>  18
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  synthetic oligonucleotide
<400>  5
ggaagggcaa gcaggatt                                                   18
<210>  6
<211>  25
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  synthetic oligonucleotide
<400>  6
cttaaactac aagactccag aagaa                                           25
<210>  7
<211>  23
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  synthetic oligonucleotide
<400>  7
ggcatcaatt tatagacgcc aat                                             23