СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЙ ОБСЕМЕНЕННОСТИ МОЧИ, СЕКРЕТА ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ И ЭЯКУЛЯТА
METHOD OF EVALUATING BACTERIAL LOAD OF URINE, PROSTATIC SECRETION, AND EJACULATE

Изобретение относится к бактериологии, а именно к способам определения обсемененности биологического материала (мочи, секрета предстательной железы, эякулята) микроорганизмами, и может быть использовано для установления диагностической значимости микроорганизмов при местных инфекционно-воспалительных заболеваниях и дисбиотических состояниях урогенитального тракта человека.
Отмеченный в последние годы рост иммунодефицитных состояний и изменение структуры инфекционной патологии, обусловленные неблагоприятными экологическими и социальными факторами способствует увеличению заболеваемости оппортунистическими инфекциями, передаваемыми половым путем, в том числе недостаточно изученными. Это связано с рядом особенностей урогенитальных инфекций и их возбудителей: их широким распространением и длительностью циркуляции антител после перенесенной инфекции (особенно IgG-антител, выявляемых в иммуноферментном анализе (ИФА)), наличием хронических и латентных форм, частыми микст-инфекциями, высокой серологической гетерогенностью и антигенной изменчивостью, широким спектром перекрестных серологических реакций, низкими титрами специфических иммуноглобулинов при локальных формах инфекций и др. Наибольшую диагностическую ценность имеют методы выявления возбудителей и их антигенов, в связи с чем бактериологическая диагностика приобретает решающую роль в распознавании урогенитальных инфекций. Появление большого числа новых диагностических препаратов и методов требует оптимизации лабораторной диагностики урогенитальных инфекций.
Описан способ оценки степени микробной обсемененности биологического материала, заключающийся в прижизненном окрашивании бактерий. В качестве красителя используется насыщенный спиртовый раствор метиленового синего в разведении 1:10000 [Кривошеина Ю.С. // Руководство к практическим занятиям по медицинской микробиологии и лабораторной диагностике инфекционных болезней. М., 1986. - С.14-15]. Для этого на предметном стекле смешивают каплю из центрифугата субстрата с раствором красителя и накрывают покровным стеклом. Микроскопируют объективом ×40.
Однако морфологические признаки бактерий при этом способе окрашивания трудно различимы, что позволяет использовать этот метод лишь для качественной оценки (подтверждения наличия или отсутствия) микробной флоры.
Известен способ диагностики урогенитальных инфекций, вызываемых Mycoplasma hominis (патент РФ №2261903, 10.10.2005), который включает введение питательной среды, способствующей обнаружению возбудителей заболеваний, в лунки культурального планшета, исследуемого материала, индикатора и вещества, создающего анаэробные условия и анализ изменения цвета питательной среды. В качестве питательной среды используют среду, содержащую питательную основу, стимуляторы роста, аргинин, лошадиную сыворотку и дистиллированную воду.
3
Недостатки данного метода в том, что не определяется количество микоплазм, что является важным, так как они относятся к факультативной микрофлоре различных биотопов, в частности урогенитального тракта и их количество в норме составляет 10 КОЕ/мл.
Известен способ выявления обсемененности объектов внешней среды (патент РФ №2372406, 10.11.2009) грамотрицательными бактериями рода Pseudomonas и Acinetobacter путем исследования смывов, отличающийся тем, что смывы фильтруют через бактериальные фильтры с диаметром пор 0,22 мкм, на которых концентрируются бактерии, содержащиеся в минимальных количествах, и/или покоящиеся формы, с последующим ПЦР-анализом элюстрированной тотальной ДНК с использованием родо- и видоспецифичных праймеров к данным бактериям.
Недостатки данного метода в том, что исследование является трудоемким, так как необходимо использовать специальные фильтры, которые отсутствуют в бактериологических лабораториях, а последующая ПЦР диагностика только регистрирует их наличие, но не количество, что является важным критерием для диагностики заболеваний, вызванных уропатогенной микрофлорой.
Наиболее близким по совокупности признаков к заявляемому способу является способ дифференциации микрофлоры урогенитального тракта человека (патент РФ №2260054, 10.09.2005), который осуществляют путем забора исследуемого материала, его посева на селективные питательные среды (Columbia-agar, среда Эндо, желточно-солевой агар), выделения и идентификации чистых культур микроорганизмов, определения у выделенных микроорганизмов способности к инактивации антимикробного белка тромбоцитов. К нормальной микрофлоре урогенитального тракта человека относят микроорганизмы, не обладающие способностью к инактивации антимикробного белка тромбоцитов или обладающие способностью к инактивации антимикробного белка тромбоцитов 20% и менее. Исследуют отделяемое уретры и/или секрет простаты, семенную жидкость. Посевы инкубируют при 37°С в течение 24-48 часов.
Недостатком прототипа является то, что необходимо выделять у каждого вида микроорганизма антимикробный фактор тромбоцитов и по наличию его в определенной концентрации в каждом из микробов или отсутствии можно судить о том, агрессивен ли микроб или он относится к нормальной флоре. Методика сложная, трудоемкая и не применима в широкой практике клинических лабораторий, а только в научно-исследовательских целях. При этом изучаются, в основном, факультативно-анаэробные уропатогенные бактерии, а многочисленная группа неклостридиально-анаэробных бактерий практически не учитывается при первичном посеве материала, что сужает круг бактерий этиологически причастных к развитию заболеваний.
Основной задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является повышение точности метода, расширение спектра определяемых факультативно-анаэробных и неклостридиально-анаэробных бактерий.
-1
-10
-1
Поставленная задача решается тем, что определение бактериологической обсемененности мочи, секрета предстательной железы и эякулята факультативно-анаэробными и неклостридиально-анаэробными бактериями, включает забор материала, его посев на селективные питательные среды, выделение и идентификацию культур микроорганизмов, при этом производят посев мочи, секрета предстательной железы и эякулята на среду Блаурокка, бульон Шадлера, агар Шадлера, кровяной агар (КА) на основе среды Мюллер-Хинтон, желчно-эскулиновый агар для бактероидов - для культивирования неклостридиально-анаэробных бактерий; среду Эндо, хромогенный селективный агар для энтерококков, хромогенный селективный агар для кандид, хромогенный селективный агар для клебсиелл, хромогенный селективный агар для стафилококков, КА на основе среды Мюллер-Хинтон - для культивирования факультативно-анаэробных бактерий в последовательных разведениях от 10 до 10 и выявляют факультативно-анаэробные и некло-стридиально-анаэробные бактерии и их концентрацию с минимального уровня разведении 10.
Неожиданный технический результат, достигаемый при осуществлении заявленного способа, заключается:
- в повышении точности диагностики за счет расширения спектра определяемых микроорганизмов, в частности, обширной и превалирующей во всех биотопах человеческого организма группы неклостридиально-анаэробных бактерий, которые не учитываются при рутинном бактериологическом исследовании мочи, секрета предстательной железы и эякулята.
- в сокращении времени диагностики за счет использования нами хромогенных сред до 24 часов.
Так например, энтерококки стандартно культивируют на кровяном агаре и их идентификация проходит по биохимическим и антигенным свойствам.
Использование нами хромогенной среды позволяет быстро дифференцировать данные микроорганизмы в моче, секрете предстательной железы, эякуляте, так как они специфически расщепляют присутствующие в среде хромогенного субстрата углеводы и по цвету колоний достаточно быстро и просто определить наиболее значимые роды (Enterococcus faecium, E.faecalis, E.hirae).
Дрожжеподобные грибы рода Candida по стандарту культивируют на среде Сабуро, на которой не представляется возможности дифференцировать виды кандид.
Используемый нами хромогенный агар для дрожжеподобных грибов рода Candida является селективной и дифференциальной средой, которая способствует быстрому выделению грибов из смешанных культур и позволяет дифференцировать по цвету и морфологии колоний дрожжеподобные грибы рода Candida: C.albicans, C.krusei, C.glabrata, C.tropicalis, что удобно для быстрой идентификации дрожжеподобных грибов рода Candida в моче, секрете предстательной железы и эякуляте.
Аналогичные ситуации наблюдаются и при использовании хромогенных сред для стафилококков. В обычной лаборатории по стандарту стафилококки культивируют на желточно-солевом агаре и кровяном агаре, затем проводят их биохимическую идентификацию («Медицинская микробиология, вирусология и иммунология». /Под редакцией А.А.Воробьева. - М.: «МИА», 2004. - С.329).
Использование нами хромогенного агара для стафилококков позволяет быстро выявить различные виды стафилококков по изменению цвета колонии.
Использование нами хромогенной среды для клебсиелл, также позволяет уже через 24 часа идентифицировать их в моче, секрете предстательной железы и эякуляте. Тогда как использование обычных питательных сред (МПА, Эндо) требует их окончательной идентификации, что удлиняет время бактериологического исследования («Медицинская микробиология, вирусология и иммунология». /Под редакцией А.А.Воробьева. - М.: «МИА», 2004. - С.359).
1
Агар Шадлера для культивирования неклостридиально-анаэробных бактерий («Медицинская микробиология». Учебное пособие, СПб, 1999. - С.155-159), по-нашему мнению, обладает преимуществом по сравнению с обычным анаэробным кровяным агаром, так как витамин K и 5% баранья кровь (а не человеческая, используемая для приготовления обычного кровяного агара) способствуют эффективному выделению бактероидов. Колистин и налидиксовая кислота, содержащиеся в агаре Шадлера, способствуют выделению грамположительных неклостридиально-анаэробных кокков - пепто-кокков и пептострептококков. Входящая в состав данной среды глюкоза является источником энергии, а гемин и витамин К позволяют культивировать превотеллы и другие бактерии. За счет широкого состава ингредиентов, входящих в данную среду, она, как показано нашими исследованиями, является более эффективной, чем обычный анаэробный кровяной агар.
Предлагаемая нами для использования среда желчно-эскулиновый агар для бактероидов является исключительной средой только для этих микроорганизмов, так как она содержит гидролизат казеина, пептический перевар соевой муки и гемин, которые поддерживают рост бактероидов. Компонент Oxgall подавляет рост всех неклостридиально-анаэробных бактерий кроме бактероидов.
Таким образом, предлагаемые нами среды для культивирования мочи, секрета предстательной железы и эякулята не только расширяют спектр выделяемых микробов, но и значительно сокращают время на проведение бактериологического исследования, что крайне важно для врача-клинициста.
Заявляемый способ позволяет более быстро и качественно контролировать бактериальную обсемененность субстрата (мочи, секрета предстательной железы и эякулята) и адекватно корректировать тактику ведения больного.
-1
-10
При контроле общей бактериальной обсемененности принято определять наиболее значимую и многочисленную группу микроорганизмов, а именно, количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ). Поэтому питательные среды должны обеспечивать оптимальный рост и развитие именно этой группы микроорганизмов. Однако обычно используемые среды являются питательными средами общего назначения. При изменении техники посева, условий культивирования и использования расширенного набора питательных сред могут быть выявлены иные группы микроорганизмов, в частности многочисленная группа неклостридиально-анаэробных бактерий, превалирующих во всех биотопах человеческого организма. Использование широкого набора питательных сред связано с тем, что эффективность и точность бактериологического метода диагностики в большей степени зависит от состава и качества используемых питательных сред. Разведение исследуемого материала от 10 до 10 позволяет точно определить количество микроорганизмов, что особенно важно при выделение бактерий в формально допустимых количествах или на границе нормы, но при наличии клинических симптомов у больного.
Подробное описание способа и примеры его клинического выполнения.
Способ обнаружения неклостридиально-анаэробных бактерий (НАБ) осуществляется следующим путем. На исследование забирают 10 мл средней порции утренней мочи или 0,5 мл эякулята или секрета предстательной железы. Готовят десятикратные разведения следующим образом. Расставляют 9 пробирок в штатив. В пробирку №1 стерильной пипеткой объемом, например, 1 мл с неповрежденным концом вносят 9 мл тиогликолевого буфера и 1 мл исследуемой мочи. Пробирку аккуратно встряхивают.Это первое десятикратное разведение. Далее, в расставленные в штативе пробирки (№№2-9) стерильной пипеткой вносят по 4,5 мл тиогликолевого буфера. Из первого разведения стерильной пипеткой объемом, например, 1 мл с неповрежденным концом переносят 0,5 мл материала в пробирку №2. При этом кончик пипетки прислоняют к внутренней стенке пробирки, не касаясь содержащейся в ней жидкости. Пробирку №2 аккуратно встряхивают. После этого пипетку помещают в дезинфицирующий раствор. Берут другую такую же пипетку и из пробирки №2 переносят 0,5 мл в следующую пробирку, соблюдая те же правила, пока не закончат подготовку всех разведений.
Из каждого разведения стерильной пипеткой с неповрежденным концом объемом 1 мл делают посевы по 1,0 мл на бульон Шадлера (HIMEDIA, Индия) и среду Блаурокка (Ростовский НИПЧИ) и по 0,1 мл на желчно-эскулиновый агар для бактероидов (HIMEDIA, Индия), агар Шадлера (HIMEDIA, Индия), кровяной агар (КА) на основе среды Мюллер-Хинтон (HIMEDIA, Индия) для неклостридиально-анаэробных бактерий. Для культивирования факультативно-анаэробной микрофлоры делается посев по 0,1 мл на среду Эндо (HIMEDIA, Индия), хромогенный селективный агар для энтерококков (HIMEDIA, Индия), хромогенный селективный агар для дрожжеподобных грибов рода Candida (HIMEDIA, Индия), хромогенный селективный агар для клебсиелл (HIMEDIA, Индия), хромогенный селективный агар для стафилококков (HIMEDIA, Индия), КА на основе среды Мюллер-Хинтон (HIMEDIA, Индия) /см. таблицу 1/.
Таблица 1
Питательные среды
Разведения
Количество материала
среда Блаурокка (Ростовский НИПЧИ)
10<sup>-1</sup>-10<sup>-10</sup>
1,0 мл
бульон Шадлера (HIMEDIA, Индия)
10<sup>-1</sup>-10<sup>-10</sup>
1,0 мл
агар Шадлера (HIMEDIA, Индия)
10<sup>-1</sup>-10<sup>-10</sup>
0,1 мл
КА на основе среды Мюллер-Хинтон - для неклостридиально-анаэробных бактерий (HIMEDIA, Индия)
10<sup>-1</sup>-10<sup>-10</sup>
0,1 мл
желчно-эскулиновый агар для бактероидов (HIMEDIA, Индия)
10<sup>-1</sup>-10<sup>-10</sup>
0,1 мл
среда Эндо (HIMEDIA, Индия)
10<sup>-1</sup>-10<sup>-10</sup>
0,1 мл
хромогенный селективный агар для энтерококков (HIMEDIA, Индия)
10<sup>-1</sup>-10<sup>-10</sup>
0,1 мл
хромогенный селективный агар для грибов (HIMEDIA, Индия)
10<sup>-1</sup>-10<sup>-10</sup>
0,1 мл
хромогенный селективный агар для клебсиелл (HIMEDIA, Индия)
10<sup>-1</sup>-10<sup>-10</sup>
0,1 мл
хромогенный селективный агар для стафилококков (HIMEDIA, Индия)
10<sup>-1</sup>-10<sup>-10</sup>
0,1 мл
КА на основе среды-Мюллер-Хинтона - для факультативно-анаэробных бактерий (HIMEDIA, Индия)
10<sup>-1</sup>-10<sup>-10</sup>
0,1 мл
Учет результатов посева на плотных питательных средах (желчно-эскулиновый агар для бактероидов (HIMEDIA, Индия), КА на основе среды Мюллер-Хинтон (HIMEDIA, Индия), агар Шадлера (HIMEDIA, Индия) для неклостридиально-анаэробных бактерий, среда Эндо (HIMEDIA, Индия), хромогенный селективный агар для энтерококков (HIMEDIA, Индия), хромогенный селективный агар для грибов (HIMEDIA, Индия), хромогенный селективный агар для клебсиелл (HIMEDIA, Индия), хромогенный селективный агар для стафилококков (HIMEDIA, Индия), КА на основе среды Мюллер-Хинтон (HIMEDIA, Индия)) для культивирования факультативно-анаэробных и неклостридиально-анаэробных бактерий проводили согласно методике, описанной в работе Меньшиков В.В. Методики клинических лабораторных исследований. - М.: Лабора, 2009. - С.68. Учет результатов посева на полужидких (среда Блаурокка (Ростовский НИПЧИ) и бульон Шадлера (HIMEDIA, Индия)) питательных средах для культивирования неклостридиально-анаэробных бактерий осуществляли согласно методике, описанной в работе Меньшиков В.В. Методики клинических лабораторных исследований. - М.: Лабора, 2009. - С.80. Работоспособность заявляемого способа подтверждается приводимыми клиническими примерами его использования.
Клинический пример 1.
2
7
6
3
3
Больная Д-ева, 28 лет, история болезни №006000/504 от 21.05.2010. Страдает хроническим рецидивирующем пиелонефритом в течение 8 лет. В анамнезе 6 эпизодов двухстороннего необструктивного пиелонефрита. При неоднократных УЗИ почек и дважды внутривенной урографии обструкции верхних мочевых путей не выявлено. Пузырно-мочеточниковые рефлюксы - исключены. При стандартном бактериологическом исследовании средней порции мочи выделена культура Staphylococcus hominis 10 КОЕ/мл. При общем исследовании мочи: признаки воспалительного процесса, что не подтверждалось результатом бактериологического исследования, проведенного по стандартной методике 7 раз в течение 8 лет. При поступлении в урологическое отделение РостГМУ с очередным эпизодом острого пиелонефрита обструкции мочевых путей нет (УЗИ+СКТ почек). Выполнено бактериологическое исследование средней порции мочи с использованием расширенного набора питательных сред (11 сред): среда Блаурокка, бульон Шадлера, желчно-эскулиновый агар для бактероидов, агар Шадрера, КА на основе среды Мюллер-Хинтон - для неклостридиально-анаэробных бактерий; среда Эндо, хромогенный селективный агар для энтерококков, хромогенный селективный агар для грибов, хромогенный селективный агар для клебсиелл, хромогенный селективный агар для стафилококков, КА на основе среды Мюллер-Хинтон - для факультативно-анаэробных бактерий. В исследуемом материале регистрировалась ассоциация факультативно-анаэробных и неклостридиально-анаэробных микроорганизмов с превалированием неклостридиально-анаэробных бактерий с высокой концентрацией Propionibacterium sp.10 КОЕ/мл, Bacteroides sp.10 КОЕ/мл, Eubacterium sp.10 КОЕ/мл. Из аэробных бактерий выделена Klebsiella pneumoniae 10 КОЕ/мл. Пациентке проводилась комбинированная антибиотикотерапия с учетом чувствительности всех выделенных из мочи ассоциантов. При динамическом мониторинге у пациентки нормализовались показатели общего анализа мочи на 7 сутки. Через 14 дней после окончательной антибиотикотерапии бактериологическое исследование мочи соответствовало норме. При диспансерном наблюдении за пациенткой в течение 1 года активация мочевой инфекции не регистрировалась.
Клинический пример 2.
3
4
3
Больной А-ев, 32 года, история болезни №4657/396 от 19.05.2009. Неоднократно лечился по поводу мужского бесплодия в течение 5 лет. По данным сонографических, гормональных, лабораторных (ПЦР и культуральные методы диагностики на ЗППП) исследований причины бесплодия не выявлены. Однако в неоднократных результатах спермограммы выявлена пиоспермия. При проведении стандартного бактериологического исследования эякулята микроорганизмы не выявлены. При поступлении в урологическое отделение РостГМУ проведено бактериологическое исследование эякулята с использованием расширенного набора питательных сред: среда Блаурокка, бульон Шадлера, желчно-эскулиновый агар для бактероидов, агар Шадлера, КА на основе среды Мюллер-Хинтон для неклостридиально-анаэробных бактерий; среда Эндо, хромогенный селективный агар для энтерококков, хромогенный селективный агар для грибов, хромогенный селективный агар для клебсиелл, хромогенный селективный агар для стафилококков, КА на основе среды Мюллер-Хинтон - для факультативно-анаэробных бактерий. В эякуляте обнаружена микст-инфекция, представленная неклостридиально-анаэробными бактериями: Bacteroides sp.10 КОЕ/мл, Peptostreptococcus sp.10 КОЕ/мл, дрожжеподобные грибы Candida albicans 10 КОЕ/мл. Пациенту проводилась антибиотикотерапия, соответствующая результатам индивидуальных антибиотикограмм. При контрольном бактериологическом исследовании эякулята пиоспермия и бактериальная обсемененность отсутствовали. В связи с беременностью супруги, наступившей в короткие сроки после проведенного лечения, диагноз мужское бесплодие пациенту был автоматически снят.
По заявляемой методике нами обследованы 78 больных по поводу инфекции верхних и нижних мочевых путей, а также половых органов:
Острый пиелонефрит: 10 больных,
Хронический пиелонефрит: 7 больных,
Хронический цистит: 31 больных,
Хронический простатит: 23 больных,
Хронический везикулит: 3 больных,
Хронический эпидидимит: 4 больных.
При стандартном и расширенном бактериологическом исследовании были получены следующие результаты, представленные в таблице 2.
Во всех случаях имела место микс-инфекция факультативно-анаэробных и неклостридиально-анаэробных бактерий. Лечение антибиотиками проводили в соответствии с чувствительностью как факультативно-анаэробных бактерий, так и неклостридиально-анаэробных бактерий. Чувствительность факультативно-анаэробных и неклостридиально-анаэробных бактерий не совпадала в 60% случаев. В этих ситуациях проводили лечение антибиотиками на основании индивидуальных антибиотикограмм препаратами, к которым была чувствительна анаэробная флора. Окончательные результаты лечения:
Клиническое выздоровление - 90% случаев, бактериологическое 85% случаев.
В результате использования предлагаемой методики был выявлен широкий спектр факультативно-анаэробных бактерий: представители семейства Enterobactaeriacae (E.coli, Klebsiella sp., Proteus sp., Enterobacter sp., Citrobacter sp.), коагулазоотрицательные стафилококки, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis и другие виды энтерококков, Corynebacterium sp., дрожжеподобные грибы рода Candida и другие. Streptococcus sp. И неклостридиально -анаэробные бактерии: Prevotella sp., Peptococcus sp., Peptostreptococcus sp., Propionibacterium sp., Bacteroides sp., Eubacterium sp., Fusobacterium sp., которые не выявляются при стандартной методике посева.
Таким образом, заявляемый способ определения бактериологической обсемененности субстрата обладает следующими преимуществами по сравнению с известными: количественное определение широкого спектра не только наиболее изученных и легко культивируемых факультативно-анаэробных бактерий, но и определение количества неклостридиально-анаэробных бактерий, выделенных в различных субстратах.
Способ может применяться как для диагностики, так и для контроля лечения. Способ доступен в применении и может быть использован в условиях любой практической лаборатории.