ИММУНОКОНЪЮГАТЫ АНТИТЕЛА К PD-1 С МУТАНТОМ IL-2 ИЛИ С IL-15
IMMUNOCONJUGATES OF ANTIBODY TO PD-1 WITH IL-2 OR IL-15 MUTANT

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится в целом к иммуноконъюгатам, в частности иммуноконъюгатам, которые содержат мутантный полипептид интерлейкина-2 и антитело, которое связывается с PD-1. Кроме того, изобретение относится к полинуклеотидым молекулам, которые кодируют иммуноконъюгаты, и векторам и клеткам-хозяевам, которые содержат указанные полинуклеотидные молекулы. Изобретение относится также к способам получения мутантных иммуноконъюгатов, фармацевтическим композициям, которые их содержат, и их применениям.
Предпосылки создания изобретения
Интерлейкин-2 (IL-2), известный также как фактор роста Т-клеток (TCGF), представляет собой глобулярный гликопротеин с молекулярной массой 15,5 кДа, играющий основную роль в образовании, выживании и гомеостазе лимфоцитов. Он имеет 133 аминокислоты в длину и состоит из четырех антипараллельных амфипатичских α-спиралей, которые формируют четвертичную структуру, необходимую для его функции (Smith, Science 240, 1988, сс. 1169-1176; Bazan, Science 257, 1992, сс. 410-413). Последовательности IL-2 различных видов депонированы под регистрационными номерами NCBI RefSeq NP000577 (человеческая), NP032392 (мышиная), NP446288 (крысиная) или NP517425 (шимпанзе).
с
reg
reg
+
+
IL-2 проявляет свое действие путем связывания с рецепторами для IL-2 (IL-2R), которые состоят из индивидуальных (числом вплоть до трех) субъединиц, различная ассоциация которых может приводить к образованию форм рецепторов, которые отличаются по их аффинности к IL-2. Ассоциация α-(CD25), β- (CD122) и γ- (γ, CD132) субъединиц приводит к образованию тримерного высокоаффинного рецептора для IL-2. Димерный рецептор IL-2 состоит из β - и γ-субъединиц и его называют IL-2R с промежуточной аффинностью, α-субъединица образует мономерный низкоаффинный рецептор для IL-2. Хотя димерный с промежуточной аффинностью рецептор для IL-2 связывается с IL-2 с более низкой примерно в 100 раз аффинностью по сравнению с тримерным высокоаффинным рецептором, как димерные, так и тримерые варианты рецептора IL-2 обладают способностью передавать сигнал при связывании с IL-2 (Minami и др., Annu Rev Immunol 11, 1993, сс. 245-268). В отличие от этого, α-субъединица, CD25, не имеет решающего значения для передачи сигналов IL-2. Она характеризуется высокоаффинным связыванием с ее рецептором, в то время как β-субъединица, CD122, и γ-субъединица имеют решающее значение для трансдукции сигналов (Krieg и др., Proc Natl Acad Sci 107, 2010, сс. 11906-11911). Тримерные рецепторы IL-2, включающие CD25, экспрессируются (покоящимися) регуляторными CD4 forkhead box Р3 (FoxP3) Т-клетками (T). Они также кратковременно индуцируются на канонических активированных Т-клетках, в то время как в покоящемся состоянии эти клетки экспрессируют только димерные рецепторы для IL-2. T-клетки постоянно экспрессируют наиболее высокий уровень CD25 in vivo (Fontenot и др., Nature Immunol 6, 2005, сс. 1142-1151).
+
IL-2 синтезируется главным образом активированными Т-клетками, в частности, CD4 Т-клетками-хелперами. Он стимулирует пролиферацию и дифференцировку Т-клеток, индуцирует образование цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL) и дифференцировку лимфоцитов периферической крови в цитотоксические клетки и лимфокин-актированные клетки-киллеры (LAK), усиливает экспрессию цинокинов и цитолических молекул Т-клетками, облегчает пролиферацию и дифференцировку В-клеток и синтез иммуноглобулинов В-клетками и стимулирует образование, пролиферацию и активацию естественных клеток-киллеров (NK) (см. обзор, например, у Waldmann, Nat Rev Immunol 6, 2009, сс. 595-601; Olejniczak и Kasprzak, Med Sci Monit 14, 2008, cc. RA179-89; Malek, Annu Rev Immunol 26, 2008, cc. 453-479).
Способность увеличивать популяции лимфоцитов in vivo и повышать эффекторные функции этих клеток обусловливают противоопухолевые действия IL-2, что делает иммунотерапию на основе IL-2 привлекательным вариантом лечения некоторых метастатических раков. Так, лечение высокими дозами IL-2 разрешено для применения на пациентах с метастатической почечноклеточной карциномой и злокачественной меланомой.
Однако IL-2 обладает двойной функцией с точки зрения иммунного ответа, поскольку он не только опосредует экспансию и активность эффекторных клеток, но также играет основную роль в поддержании периферической иммунной толерантности.
Основным механизмом, лежащим в основе периферической аутотолерантности, является индуцированная активацией, индуцированной IL-2, клеточная гибель (AICD) Т-клеток. AICD представляет собой процесс, с помощью которого полностью активированные Т-клетки подвергаются запрограммированной клеточной гибели путем контакта с экспрессируемыми на клеточной поверхности рецепторами смерти, такими как CD95 (известный также как Fas) или TNF-рецептор. Когда активированные антигеном Т-клетки, экспрессирующие высокоаффинный рецептор IL-2 (после предварительного воздействия IL-2) в процессе пролиферации, повторно стимулируются антигеном через комплекс Т-клеточный рецептор (TCR)/CD3, индуцируется экспрессия лиганда для Fas (FasL) и/или фактора некроза опухоли (TNF), делая клетки чувствительными к опосредуемому Fas апоптозу. Этот процесс зависит от IL-2 (Lenardo, Nature 353, 1991, сс. 858-861) и опосредуется через STAT5. С помощью процесса AICD в Т-лимфоцитах может создаваться толерантность не только к аутоантигенам, но также к персистентным антигенам, которые очевидно не являются частью структуры хозяина, таким как опухолевые антигены.
+
+
reg
reg
Кроме того, IL-2 участвует также в поддержании периферических CD4 CD25 регуляторных Т-клеток (T) (Fontenot и др., Nature Immunol 6, 2005, сс. 1142-1151; D'Cruz и Klein, Nature Immunol 6, 2005, сс. 1152-1159); Maloy и Powrie, Nature Immunol 6, 2005, cc. 1171-1172, которые известны также как супрессорные Т-клетки. Они подавляют разрушение эффекторными Т-клетками их (ауто)мишеней либо посредством контакта клетка-клетка путем ингибирования хелперной функции и активации Т-клеток, либо посредством высвобождения иммуносупрессорных цитокинов, таких как IL-10 или TGF-β. Установлено, что истощение T клеток повышает индуцированный IL-2 противоопухолевый иммунитет (Imai и др., Cancer Sci 98, 2007, сс. 416-423).
reg
Таким образом, IL-2 не является оптимальным агентом для ингибирования роста опухолей, поскольку в присутствии IL-2 либо созданные CTL могут распознавать опухоль как «свою» и подвергаться AICD, либо иммунный ответ может ингибироваться IL-2-зависимыми T-клетками.
Другой проблемой иммунотерапии с использованием IL-2 являются побочные действия, возникающие при обработке рекомбинантным человеческим IL-2. У пациентов, получающих высокодозное лечение IL-2, часто проявлялись серьезные сердечно-сосудистые, легочные, почечные, печеночные, желудочно-кишечные, неврологические, кожные, гематологические и системные нежелательные явления, требующие интенсивного мониторинга и стационарного лечения. Большинство указанных побочных действий можно объяснить развитием, так называемого васкулярного (или капиллярного) просачивания (VLS), т.е. патологического повышения проницаемости сосудов, приводящего к транссудации жидкости в нескольких органах (что вызывает, например, легочный или кожный отек и повреждение клеток печени) и к истощению внутрисосудистой жидкости (что вызывает снижение кровяного давления и компенсаторное повышение сердечного ритма). Не существует другого подхода к лечению VLS, кроме устранения IL-2. Во избежание VLS на пациентах изучены низкодозные режимы IL-2, однако полученные результаты оказались ниже субоптимальных. Предполагалось, что VLS вызывается высвобождением провоспалительных цитокинов, таких как фактор некроза опухоли (TNF)-α из активированных IL-2 NK-клеток, однако в настоящее время установлено, что индуцированный IL-2 отек легких является результатом непосредственного связывания IL-2 с эндотелиальными клетками легких, которые экспрессируют функциональные αβγ IL-2-рецепторы с уровнями от низких до умеренных (Krieg и др., Proc Nat Acad Sci USA 107, 2010, cc. 11906-11911).
reg
Разработано несколько подходов для решения указанных проблем, связанных с иммунотерапией IL-2. Например, было установлено, что комбинация IL-2 с некоторыми моноклональными антителами к IL-2 повышает эффективность лечения с помощью IL-2 in vivo (Kamimura и др., J Immunol 177, 2006, cc. 306-314; Boyman и др., Science 311, 2006, cc. 1924-1927). В качестве альтернативного подхода IL-2 подвергали различными путями мутациям для снижение его токсичности и/или повышения его эффективности. Hu с соавторами (Blood 101, 2003, cc. 4853-4861, публикация патента США №2003/0124678) осуществляли замену остатка аргинина в положении 38 IL-2 на триптофан для элиминации способности IL-2 проникать в сосуды. Shanafelt с соавторами (Nature Biotechnol 18, 2000, сс. 1197-1202) осуществляли замену путем мутации аспарагина в положении 88 на аргинин для повышения избирательности в отношении Т-клеток по сравнению с NK-клетками. Heaton с соавторами (Cancer Res 53, 1993, сс. 2597-2602; US №5229109) интродуцировали две мутации, Arg38Ala и Phe42Lys, для снижения секреции провоспалительных цитокинов из NK-клеток. Gillies с соавторами (публикация патента США №2007/0036752) осуществляли замену трех остатков в IL-2 (Asp20Thr, Asn88Arg и Gln126Asp), которая повышала аффинность к рецептору IL-2 с промежуточной аффинностью, для снижения VLS. Gillies с соавторами (WO 2008/0034473) изменяли также путем мутации поверхность раздела IL-2 с CD25, осуществляя аминокислотную замену Arg38Trp и Phe42Lys, для уменьшения взаимодействия с CD25 и активации T-клеток с целью повышения эффективности. Для этой же цели Wittrup с соавторами (WO 2009/061853) получали мутантов IL-2, которые обладали повышенной аффинностью к CD25, но не активировали рецептор, действуя тем самым в качестве антагонистов. Интродуцированные мутации способствовали нарушению взаимодействия с β- и/или γ-субъединицей рецептора.
reg
Конкретный мутантный полипептид IL-2, созданный для преодоления вышеуказанных проблем, связанных с иммунотерапией IL-2 (токсичность, вызываемая индукцией VLS, толерантность к опухолям, вызываемая AICD, и иммуносупрессия, вызываемая активацией T-клеток) описан в WO 2012/107417. Замена остатка фенилаланина в положении 42 на аланин, остатка тирозина в положении 45 на аланин и остатка лейцина в положении 72 IL-2 на глицин практически устраняла связывание указанного мутантного полипептида IL-2 с α-субъединицей рецептора IL-2 (CD25).
Помимо использования вышеуказанных подходов иммунотерапию IL-2 можно улучшать путем избирательного таргетинга IL-2 к опухолям, например, в форме иммуноконъюгатов, содержащих антитело, которое связывается с антигеном, экспрессируемым на опухолевых клетках. Несколько таких иммуноконъюгатов описаны (см., например, Ko и др.,, J Immunother 27, 2004, сс. 232-239; Klein и др., Oncoimmunology 6(3), 2017, е1277306).
Однако опухоли могут ускользать от указанного таргетинга путем сбрасывания, мутации или понижающей регуляции антигена-мишени для антитела. Кроме того, таргетированный на опухоль IL-2 может не иметь оптимального контакта с эффекторными клетками, такими как цитотоксические Т-лимфоциты (CTL), в микроокружениях опухолей, которые фактически не включают лимфоциты.
Таким образом, сохраняется необходимость в дополнительном совершенствовании иммунотерапии на основе IL-2. Подходом, который может преодолеть проблемы таргетинга опухолей, заключается в таргетинге IL-2 непосредственно к эффекторным клеткам, в частности CTL.
Ghasemi с соавторами описали слитый белок, включающий IL-2 и NKG2D-связывающий белок (Ghashemi и др., Nat Comm 7, 2016, с. 12878), для таргетинга IL-2 к несущим NKG2D клеткам, таким как естественные клетки-киллеры (NK).
Белок запрограммированной смерти клеток 1 (PD1 или CD279) является обладающим ингибирующей способностью членом CD28-семейства рецепторов, которое включает также CD28, CTLA-4, ICOS и BTLA. PD1 представляет собой рецептор клеточной поверхности, и он экспрессируется на активированных В-клетках, Т-клетках и миелоидных клетках (Okazaki и др., Curr. Opin. Immunol. 14, 2002, сс. 391779-391782; Bennett и др., J Immunol 170, 2003, сс. 711-718). Структура PD1 соответствует структуре мономерного трансмембранного белка типа 1, состоящей из одного внеклеточного домена, подобного вариабельному домену иммуноглобулина, и цитоплазматического домена, содержащего иммунорецепторный ингибиторный мотив на основе тирозина (ITIM) и иммунорецепторный переключающий мотив на основе тирозина (ITSM). Идентифицировано два лиганда для PD-1, PD-L1 и PD-L2, которые, как установлено, обеспечивают понижающую регуляцию Т-клеточной активации при связывании с PD-1 (Freeman и др., J Exp Med 192, 2000, сс. 1027-1034; Latchman и др., Nat Immunol 2, 2001, сс. 261-268; Carter и др., Eur J Immunol 32, 2002, сс. 634-643). И PD-L1, и PD-L2 оба являются гомологами В7, которые связываются с PD-1, но не связываются с другими членами семейства CD28. Один лиганд для PD-1, PD-L1, широко распространен при различных видах человеческого рака (Dong и др., Nat. Med 8, 2002, сс. 787-789). Взаимодействие между PD-1 и PD-L1 приводит к снижению количества инфильтрующих опухоль лимфоцитов, снижению опосредуемой Т-клеточным рецептором пролиферации и ускользанию канцерогенных клеток от иммунологического надзора (Dong и др., J. MoI. Med. 81, 2003, сс. 281-287; Blank и др., Cancer Immunol. Immunother. 54, 2005, сс. 307-314; Konishi и др., Clin. Cancer Res. 10, 2004, сс. 5094-5100). Иммунная супрессия может реверсироваться путем ингибирования местного взаимодействия PD-1 с PD-L1, и этот эффект является аддитивным, когда блокируется также взаимодействие PD-1 с PD-L2 (Iwai и др., Proc. Nat 7. Acad. ScL USA 99, 2002, сс. 12293-12297; Brown и др., J. Immunol. 170, 2003, сс. 1257-1266).
Антитела, которые связываются с PD-1, описаны, например, в публикации заявки на патент РСТ № РСТ/ЕР2016/073248.
Краткое изложение сущности изобретения
В настоящем изобретении предложен новый подход таргетинга мутантной формы IL-2 с характеристиками, обеспечивающими преимущества с позиции иммунотерапии, непосредственно к иммунным эффекторным клеткам, таким как цитотоксические Т-лимфоциты, а не к опухолевым клеткам. Таргетинг к иммунным эффекторным клеткам достигается путем конъюгации мутантной молекулы IL-2 с антителом, которое связывается с PD-1.
reg
reg
Мутант IL-2, применяемый в настоящем изобретении, был создан для преодоления проблем, связанных с иммунотерапией IL-2, в частности, токсичности, вызываемой индукцией VLS, опухолевой толерантности, вызываемой AICD, и иммуносупрессии, вызываемой активацией T-клеток. В дополнение к решению вопроса ускользания опухолей от описанного выше таргетинга опухолей, таргетинг мутанта IL-2 к иммунным эффекторным клеткам может повышать также преимущественную активацию CTL по сравнению с иммуносупрессорными T клетками. Путем применения антитела, которое связывается с PD-1, подавление Т-клеточной активности, индуцированной взаимодействием PD-1 с его лигандом PD-L1, можно дополнительно реверсировать, дополнительно усиливая тем самым иммунный ответ.
Слитый белок IL-2, содержащий антитело к PD-L1 атезолизумаб, описан у Chen с соавторами (Chen и др., Biochem Biophys Res Comm 480, 2016, сс. 160-165).
Следует отметить, что иммуноконъюгат, предлагаемый в изобретении, который содержит антитело, связывающееся с PD-1, характеризуется существенно более высокой противоопухолевой эффективностью in vivo по сравнению с аналогичным иммуноконъюгатом, таргетированным на PD-L1 (см. пример 3, ниже).
Основным объектом изобретения является иммуноконъюгат, содержащий антитело, которое связывается с PD-1, и полипептид, который передает сигналы через IL-2Rβγ. Полипептид, передающий сигналы через IL-2Rβγ, представляет собой, в частности, полипептид IL-2 или полипептид IL-15. Первым объектом изобретения является иммуноконъюгат, содержащий мутантный полипептид IL-2 и антитело, которое связывается с PD-1, в котором мутантный полипептид IL-2 представляет собой молекулу человеческого IL-2, содержащую аминокислотные замены F42A, Y45A и L72G (нумерация соответствует последовательности SEQ ID NO: 19 человеческого IL-2).
Следующим объектом изобретения является иммуноконъюгат, содержащий мутантный полипептид IL-2 и антитело, которое связывается с PD-1, в котором мутантный полипептид IL-2 представляет собой молекулу человеческого IL-2, содержащую аминокислотные замены F42A, Y45A и L72G (нумерация соответствует последовательности SEQ ID NO: 19 человеческого IL-2); и в котором антитело содержит (а) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, и FR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7 в положениях 71-73 согласно нумерации Кэбота, и (б) вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, или в котором антитело содержит (а) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, и HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, и (б) вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, и HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13.
Другим объектом изобретения является иммуноконъюгат, содержащий мутантный полипептид IL-2 и антитело, которое связывается с PD-1, в котором мутантный полипептид IL-2 представляет собой молекулу человеческого IL-2, содержащую аминокислотные замены F42A, Y45A и L72G (нумерация соответствует последовательности SEQ ID NO: 19 человеческого IL-2); и в котором антитело содержит (а) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 14, и (б) вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, которая состоит из SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 и SEQ ID NO: 18.
1
1
В некоторых вариантах осуществления изобретения в иммуноконъюгате, предлагаемом в изобретении, мутантный полипептид IL-2 дополнительно содержит аминокислотную замену Т3А и/или аминокислотную замену С125А. В некоторых вариантах осуществления изобретения мутантный полипептид IL-2 содержит последовательность SEQ ID NO: 20. В некоторых вариантах осуществления изобретения иммуноконъюгат содержит не более одного мутантного полипептида IL-2. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело содержит Fc-домен, состоящий из первой и второй субъединиц. В некоторых указанных вариантах осуществления изобретения Fc-домен представляет собой Fc-домен IgG-класса, в частности IgG-подкласса, и/или Fc-домен представляет собой человеческий Fc-домен. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело относится к IgG-классу, в частности к IgG-подклассу иммуноглобулинов.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, в которых иммуноконъюгат содержит Fc-домен, Fc-домен содержит модификацию, способствующую ассоциации первой и второй субъединиц Fc-домена. В некоторых вариантах осуществления изобретения в СН3-домене первой субъединицы Fc-домена аминокислотный остаток заменяют на аминокислотный остаток, имеющий больший объем боковой цепи, что приводит к образованию выпуклости в СН3-домене первой субъединицы, которая может помещаться в полость в СН3-домене второй субъединицы, а в СН3-домене второй субъединицы Fc-домена аминокислотный остаток заменяют на аминокислотный остаток, имеющий меньший объем боковой цепи, что приводит к образованию полости в СН3-домене второй субъединицы, в которую может помещаться выпуклость в СН3-домене первой субъединицы. В некоторых вариантах осуществления изобретения в первой субъединице Fc-домена остаток треонина в положении 366 заменяют на остаток триптофана (T366W), а во второй субъединице Fc-домена остаток тирозина в положении 407 заменяют на остаток валина (Y407V) и необязательно остаток треонина в положении 366 заменяют на остаток серина (T366S) и остаток лейцина в положении 368 заменяют на остаток аланина (L368A) (нумерация согласно EU-индексу Кэбота). В некоторых указанных вариантах осуществления изобретения в первой субъединице Fc-домена дополнительно остаток серина в положении 354 заменяют на остаток цистеина (S354C) или остаток глутаминовой кислоты в положении 356 заменяют на остаток цистеина (Е356С), а во второй субъединице Fc-домена дополнительно остаток тирозина в положении 349 заменяют на остаток цистеина (Y349C) (нумерация согласно EU-индексу Кэбота). В некоторый вариантах осуществления изобретения мутантный полипептид IL-2 сливают на его аминоконцевой аминокислоте с карбоксиконцевой аминокислотой одной из субъединиц Fc-домена, в частности первой субъединицы Fc-домена, необязательно через линкерный пептид. В некоторых указанных вариантах осуществления изобретения линкерный пептид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, в которых иммуноконъюгат содержит Fc-домен, Fc-домен содержит одну или несколько аминокислотных замен, которая(ые) снижает(ют) связывание с Fc-рецептором, в частности с Fcγ-рецептором, и/или эффекторную функцию, в частности антитело-обусловленную клеточнозависимую цитотоксичность (ADCC). В некоторых указанных вариантах осуществления изобретения указанная(ые) одна или несколько аминокислотная(ых) замена(н) находится(ятся) в одном или нескольких положениях, выбранных из группы L234, L235 и Р329 (нумерация согласно EU-индексу Кэбота). В некоторых вариантах осуществления изобретения каждая субъединица Fc-домена содержит аминокислотные замены L234A, L235A и P329G (нумерация согласно EU-индексу Кэбота).
1
В некоторых вариантах осуществления изобретения иммуноконъюгат, предлагаемый в изобретении, содержит полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 22, полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 23 или SEQ ID NO: 24, и полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 25. В некоторых вариантах осуществления изобретения иммуноконъюгат практически состоит из мутантного полипептида IL-2 и молекулы иммуноглобулина IgG-подкласса, которые сцеплены линкерной последовательностью.
В изобретении предложен также один или несколько выделенных полинуклеотидов, кодирующих иммуноконъюгат, предлагаемый в изобретении, один или несколько векторов (в частности экспрессионных векторов), содержащих указанный(е) полинуклеотиды или указанный(е) вектор(ы).
Предложен также способ получения иммуноконъюгата, содержащего мутантный полипептид IL-2 и антитело, которое связывается с PD-1, который включает (а) культивирование клетки-хозяина, предлагаемой в изобретении, в условиях, пригодных для экспрессии иммуноконъюгата, и необязательно (б) выделение иммуноконъюгата. Кроме того, в изобретении предложен иммуноконъюгат, содержащий мутантный полипептид IL-2 и антитело, которое связывается с PD-1, полученный с помощью указанного способа.
В изобретении предложена также фармацевтическая композиция, которая содержит иммуноконъюгат, предлагаемый в изобретении, и фармацевтически приемлемый носитель, и способы применения иммуноконъюгата, предлагаемого в изобретении.
В частности, в изобретении предложен иммуноконъюгат, предлагаемый в изобретении, предназначенный для применения в качестве лекарственного средства и для применения для лечения заболевания. В конкретном варианте осуществления изобретения указанное заболевание представляет собой рак.
Кроме того, в изобретении предложено применение иммуноконъюгата, предлагаемого в изобретении, для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения заболевания. В конкретном варианте осуществления изобретения указанное заболевание представляет собой рак.
Кроме того, предложен способ лечения заболевания у индивидуума, включающий введение указанному индивидууму в терапевтически эффективном количестве композиции, которая содержит иммуноконъюгат, предлагаемый в изобретении, в фармацевтически приемлемой форме. В конкретном варианте осуществления изобретения указанное заболевание представляет собой рак.
Предложен также способ стимуляции иммунной системы индивидуума, включающий введение указанному индивидууму в эффективном количестве композиции, которая содержит иммуноконъюгат, предлагаемый в изобретении, в фармацевтически приемлемой форме.
Подробное описание изобретения
Определения
Понятия, применяемые в настоящем описании, имеют значения, общепринятые в данной области, если ниже специально не указано иное.
В контексте настоящего описания понятие «интерлейкин-2» или «IL-2», если не указано иное, относится к любому нативному IL-2 из любого применяемого в качестве источника позвоночного животного, включая млекопитающих, таких как приматы (например, человек) и грызуны (например, мыши и крысы). Под понятие подпадает непроцессированный IL-2, а также любая форма IL-2, полученная в результате процессинга в клетке. Под понятие подпадают также встречающиеся в естественных условиях варианты IL-2, например, сплайсинговые варианты или аллельные варианты. В качестве примера аминокислотная последовательность человеческого IL-2 представлена в SEQ ID NO: 19. Непроцессированный человеческий IL-2 дополнительно содержит расположенный на N-конце состоящий из 20 аминокислот сигнальный пептид, имеющий последовательность SEQ ID NO: 26, который отсутствует в зрелой молекуле IL-2.
В контексте настоящего описания подразумевается, что понятие «мутант IL-2» или «мутантный полипептид IL-2» относится к любым мутантным формам различных форм молекулы IL-2, включая полноразмерный IL-2, укороченные формы IL-2 и формы, в которых IL-2 связан с другой молекулой, например, путем слияния или химической конъюгации. Подразумевается, что понятие «полноразмерный», применяемое касательно IL-2, означает зрелую молекулу IL-2, имеющую встречающуюся в естественных условиях длину. Например, полноразмерный человеческий IL-2 означает молекулу, которая имеет 133 аминокислоты (см., например, SEQ ID NO: 19). Различные формы мутантов IL-2 характеризуются наличием по меньшей мере одной аминокислотной мутации, влияющей на взаимодействие IL-2 с CD25. Указанная мутация может включать замену, делецию, укорочение или модификацию аминокислотного остатка дикого типа, локализованного в норме в указанном положении. Предпочтительными являются мутации, полученные путем аминокислотной замены. Если специально не указано иное, то понятие «мутант IL-2» может рассматриваться в настоящем описании как мутант пептидной последовательности IL-2, мутант полипептида IL-2, мутант белка IL-2 или мутант аналога IL-2.
42
В настоящем описании обозначение различных форм IL-2 осуществляют относительно последовательности, представленной в SEQ ID NO: 19. В настоящем контексте для описания одной и той же мутации можно применять различные обозначения. Например, мутацию, приводящую к замене фенилаланина в положении 42 на аланин, можно обозначать как 42А, А42, А, F42A или Phe42Ala.
В контексте настоящего описания понятие «молекула человеческого IL-2» означает молекулу IL-2, которая содержит аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере примерно на 90%, по меньшей мере примерно на 91%, по меньшей мере примерно на 92%, по меньшей мере примерно на 93%, по меньшей мере примерно на 94%, по меньшей мере примерно на 95% или по меньшей мере примерно на 96% последовательности человеческого IL-2 SEQ ID NO: 19. В частности, идентичность последовательности составляет по меньшей мере примерно 95%, более предпочтительно по меньшей мере примерно 96%. В конкретных вариантах осуществления изобретения молекула человеческого IL-2 представляет собой полноразмерную молекулу IL-2.
В контексте настоящего описания подразумевается, что понятие «аминокислотная мутация» включает аминокислотные замены, делеции, инсерции и модификации. Можно осуществлять любую комбинацию замены, делеции, инсерции и модификации для получения конечной конструкции, при условии, что конечная конструкция обладает требуемыми характеристиками, например, пониженным связыванием с CD25. Делеции и инсерции аминокислотной последовательности включают амино- и/или карбоксиконцевые делеции и инсерции аминокислот. Примером концевой делеции является делеция остатка аланина в положении 1 полноразмерного человеческого IL-2. Предпочтительными аминокислотными мутациями являются аминокислотные замены. Для изменения, например, характеристик связывания полипептида IL-2 неконсервативные аминокислотные замены, т.е. замена одной аминокислоты на другую аминокислоту, которая имеет другие структурные и/или химические свойства, являются особенно предпочтительными. Предпочтительные аминокислотные замены включают замену гидрофобной аминокислоты на гидрофильную. Аминокислотные замены включают замену на не встречающиеся в естественных условиях аминокислоты на встречающиеся в естественных условиях аминокислотные производные 20 стандартных аминокислот (например, 4-гидроксипролин, 3-метилгистидин, орнитин, гомосерин, 5-гидроксилизин). Аминокислотные мутации можно создавать с помощью генетических или химических методов, хорошо известных в данной области. Генетические методы могут включать сайтнаправленный мутагенез, ПЦР, синтез генов и т.п. Подразумевается, что можно применять также методы изменения группы боковой цепи аминокислоты с помощью методов, отличных от генетической инженерии, таких как химическая модификация.
В контексте настоящего описания форма «дикого типа» IL-2 представляет собой форму IL-2, которая в основном является такой же, что и у мутантного полипептида IL-2 за исключением того, что форма дикого типа имеет аминокислоту дикого типа в каждом аминокислотном положении мутантного полипептида IL-2. Например, если мутант IL-2 представляет собой полноразмерный IL-2 (т.е. IL-2, не слитый или не конъюгированный с какой-либо другой молекулой), то дикая форма указанного мутанта представляет собой полноразмерный нативый IL-2. Если мутант IL-2 представляет собой слияние между IL-2 и другим полипептидом, кодируемым в прямом направлении относительно IL-2 (например, цепью антитела), то дикая форма этого мутанта IL-2 представляет собой IL-2 с аминокислотной последовательностью дикого типа, слитой с таким же расположенным в прямом направлении полипептидом. Кроме того, если мутант IL-2 представляет собой укороченную форму IL-2 (мутантную или модифицированную последовательность в неукороченной части IL-2), то форма дикого типа указанного мутанта IL-2 представляет собой аналогично укороченный IL-2, который имеет последовательность дикого типа. Для сравнении аффинности связывания рецептора IL-2 или биологической активности различных форм мутантов IL-2 с соответствующей формой дикого типа IL-2, подразумевается, что под понятие «дикий тип» подпадают формы IL-2, которые содержат одну или несколько аминокислотную(ых) мутацию(й), которая(ые) не влияет(ют) на связывание с рецептором IL-2 по сравнению со встречающимся в естественных условиях нативным IL-2, такие, например, как замена цистеина в положении, соответствующем остатку 125 человеческого IL-2, на аланин. В некоторых вариантах осуществления изобретения IL-2 дикого типа для целей настоящего изобретения содержит аминокислотную замену С125А (см. SEQ ID NO: 29). В некоторых вариантах осуществления изобретения полипептид IL-2 дикого типа, с которым сравнивают мутантный полипептид IL-2, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19. В других вариантах осуществления изобретения полипептид IL-2 дикого типа, с которым сравнивают мутантный полипептид IL-2, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29.
В контексте настоящего описания понятие «CD25» или «α-субъединица рецептора IL-2», если не указано иное, относится к любой нативной CD25 из любого применяемого в качестве источника позвоночного животного, включая млекопитающих, таких как приматы (например, человек) и грызуны (например, мыши и крысы). Под это понятие подпадает «полноразмерная» непроцессированная форма CD25, а также любая форма CD25, полученная в результате процессинга в клетке. Под понятие подпадают также встречающиеся в естественных условиях варианты CD25, например, сплайсинговые варианты или аллельные варианты. В некоторых вариантах осуществления изобретения CD25 представляет собой человеческую CD25. Аминокислотная последовательность человеческой CD25 представлена в UniProt, код доступа № Р01589 (версия 185).
с
В контексте настоящего описания понятие «высокоаффинный рецептор IL-2» относится к гетеротримерной форме рецептора IL-2, состоящей из рецепторной γ-субъединицы (которая известна также как общая γ-субъединица цитокинового рецептора, γ, или CD132, см. UniProt, код доступа № Р14784 (версия 192)), рецепторной β-субъединицы (известной также как CD122 или р70, см. UniProt, код доступа Р31785 (версия 197)) и рецепторной α-субъединицы (известной также как CD25 или р55, см. UniProt, код доступа Р01589 (версия 185)). В противоположность этому, понятие «рецептор IL-2 с промежуточной аффинностью» относится к рецептору IL-2, который включает только γ-субъединицу и β-субъединицу, но не содержит α-субъединицы (см., например, обзор Olejniczak и Kasprzak, Med Sci Monit 14, 2008, RA179-189).
D
off
on
Понятие «аффинность» относится к суммарной силе всех нековалентных взаимодействий между индивидуальным сайтом связывания молекулы (например, рецептора) и его партнером по связыванию (например, лигандом). Если не указано иное, то в контексте настоящего описания понятие «аффинность связывания» относится к присущей компонентам связывающейся пары (например, антигенсвязывающим фрагментом и антителом или рецептором и его лигандом) аффинности связывания, отражающей взаимодействие по типу 1:1. Аффинность молекулы X к ее партнеру Y можно, как правило, характеризовать с помощью константы диссоциации (K), которая представляет собой отношение констант скорости реакции диссоциации и ассоциации (k и k соответственно). Так, эквивалентные аффинности могут соответствовать различным константам скорости, если соотношение констант скорости остается таким же. Аффинность можно оценивать общепринятыми методами, известными в данной области, включая представленные в настоящем описании. Конкретным методом измерения аффинности является поверхностный плазмонный резонанс (SPR).
Аффинность мутантного полипептида или полипептида дикого типа IL-2 к различным формам рецептора IL-2 можно определять с помощью метода поверхностного плазмонного резонанса (SPR), изложенного в WO 2012/107417, используя стандартный инструментарий, такой как устройство BIAcore (фирма GE Healthcare) и рецепторных субъединиц, таких как те, которые можно получать с помощью рекомбинантной экспрессии (см., например, Shanafelt и др., Nature Biotechnol 18, 2000, сс. 1197-1202). Альтернативно этому, аффинность связывания мутантов IL-2 с различными формами рецептора IL-2 можно оценивать с использованием клеточных линий, для которых известно, что они экспрессируют ту или иную указанную форму рецептора. Ниже описаны конкретные иллюстративные и приведенные в качестве примера варианты измерения аффинности связывания.
+
reg
Под «регуляторной Т-клеткой» или «Treg-клеткой» подразумевается специализированный тип CD4 Т-клетки, которая может подавлять ответы других Т-клеток. Treg-клетки отличаются способностью экспрессировать α-субъединицу рецептора IL-2 (CD25) и фактор транскрипции forkhead box Р3 (FOXP3) (Sakaguchi, Annu Rev Immunol 22, 2004, сс. 531-562), и они играют решающую роль в индукции и поддержании периферической аутотолерантности к антигенам, включая те антигены, которые экспрессируются опухолями. Для T-клеток требуется IL-2 для их индукции и развития и индукции их супрессорных характеристик.
+
В контексте настоящего описания понятие «эффекторные клетки» относится к популяции лимфоцитов, которые опосредуют цитотоксические действия IL-2. Эффекторные клетки включают эффекторные Т-клетки, такие как цитотоксические CD8 Т-клетки, NK-клетки, лимфокин-актированные клетки-киллеры (LAK), и макрофаги/моноциты.
D
-8
-8
-13
-9
-13
В контексте настоящего описания понятие «PD1», «человеческий PD1», «PD-1» или «человеческий PD-1» (который обозначают также как белок запрограммированной смерти клеток 1 или белок программируемой клеточной смерти 1) относится к человеческому белку PD1 (SEQ ID NO: 27, белок без сигнальной последовательности)/(SED ID NO: 28, белок с сигнальной последовательностью, см. также UniProt, код доступа № Q15116 (версия 156). В контексте настоящего описания антитело «связывающееся с PD-1», «специфически связывающееся с PD-1», «которое связывается с PD-1» или «антитело к PD-1» относится к антителу, которое обладает способностью связываться с PD-1, в частности с полипептидом PD-1, который экспрессируется на клеточной поверхности, с аффинностю, достаточной для того, чтобы антитело можно было применять в качестве диагностического и/или терапевтического агента, таргетирующего PD-1. В одном из вариантов осуществления изобретения уровень связывания антитела к PD-1 с неродственным, т.е. не представляющим собой PD-1, белком составляет менее чем примерно 10% от уровня связывания антитела с PD-1, при измерении, например, с помощью радиоиммунного анализа (РИА) или проточной цитометрии (FACS), поверхностного плазмонного резонанса с использованием для анализа биосенсорной системы, такой как система Biacore. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело, которое связывается с PD-1, характеризуется величиной K, составляющей ≤ 1 мкМ, ≤ 100 нМ, ≤ 10 нМ, ≤ 1 нМ, ≤ 0,1 нМ, ≤ 0,01 нМ или ≤ 0,001 нМ (например, 10 М или менее, например, от 10 М до 10 М, например, от 10 М до 10 М). В одном из вариантов осуществления изобретения величину KD, характеризующую аффинность связывания, определяют с помощью анализа поверхностного плазмонного резонанса, используя в качестве антигена внеклеточный домен (ECD) человеческого PD-1 (PD-1-ECD, см. SEQ ID NO: 43).
Понятие «специфически связывается» означает, что связывание является избирательным в отношении антигена и его можно отличать от нежелательных или неспецифических взаимодействий. Способность антигенсвязывающей молекулы связываться со специфическим антигеном (например, PD-1) можно определять с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) или других методик, известных специалисту в данной области, например, с помощью методики на основе поверхностного плазмонного резонанса (SPR) (осуществляя анализ с помощью устройства BIAcore) (Liljeblad и др., Glyco J 17, 2000, сс. 323-329), и традиционных анализов связывания (Heeley, Endocr Res 28, 2002, сс. 217-229). В одном из вариантов осуществления изобретения уровень связывания антигенсвязывающей молекулы с неродственным белком составляет менее чем примерно 10% от уровня связывания антитела с антигеном, при измерении, например, с помощью SPR. Антитело, содержащееся в иммуноконъюгате, представленном в настоящем описании, специфически связывается с PD-1.
В контексте настоящего описания понятие «полипептид» относится к молекуле, которая состоит из мономеров (аминокислот), линейно сцепленных с помощью амидных связей (которые обозначают также как пептидные связи). Понятие «полипептид» относится к любой цепи из двух или большего количества аминокислот и не относится к конкретной длине продукта. Так, пептиды, дипептиды, трипептиды, олигопептиды, «белок», «аминокислотная цепь» и любое другое понятие, применяемое для обозначения цепи из двух или большего количества аминокислот, подпадает под понятие «полипептид», и понятие «полипептид» можно применять вместо или взаимозаменяемое с любым из указанных понятий. Предполагается также, что понятие «полипептид» относится к продуктам пост-экспрессионных модификаций полипептида, включая (но, не ограничиваясь только ими) гликозилирование, ацетилирование, фосфорилирование, амидирование, дериватизацию с помощью известных защитных/блокирующих групп, протеолитическое расщепление или модификацию с использованием не встречающихся в естественных условиях аминокислот. Полипептид может иметь происхождение из естественного биологического источника или его можно получать с помощью технологии рекомбинации, но он не обязательно транслируется с созданной нуклеотидной последовательности. Его можно создавать любым методом, включая химический синтез. Полипептиды могут иметь определенную трехмерную структуру, хотя не является обязательным наличие у них указанной структуры. Полипептиды с определенной трехмерной структурой рассматриваются как уложенные (имеющие укладку), а полипептиды, не имеющие определенной трехмерной структуры, но для которых в большей степени характерно большое количество различных конформаций, рассматриваются как не уложенные.
Под «выделенным» полипептидом или его вариантом, или производным подразумевается полипептид, который не находится в его естественной среде. Не требуется какая-либо конкретная степень очистки. Например, выделенный полипептид может быть отделен от его нативного или естественного окружения. Рекомбинантно полученные полипептиды и белки, экспрессируемые в клетках-хозяевах, рассматриваются в качестве выделенных для целей изобретения, поскольку представляют собой нативные или рекомбинантные полипептиды, которые отделены, фракционированы или частично или полностью очищены с помощью любого приемлемого метода.
«Процент (%) идентичности аминокислотной последовательности» относительно полипептидной референс-последовательности определяют как процент аминокислотных остатков в последовательности-кандидате, которые идентичны аминокислотным остаткам в полипептидной референс-последовательности, после выравнивания последовательностей и интродукции при необходимости брешей для достижения максимального процента идентичности последовательностей, и при этом какие-либо консервативные замены не учитываются при оценке идентичности последовательностей. Сравнительный анализ для определения процента идентичности аминокислотных последовательностей можно осуществлять различными путями, которые находятся в компетенции специалиста в данной области, например, с использованием публично доступных компьютерных программ, таких как программа BLAST, BLAST-2, Clustal W, Megalign (DNASTAR) или пакет программ FASTA. Специалисты в данной области могут определять соответствующие параметры для выравнивания последовательностей, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей. Однако для целей настоящего изобретения величину % идентичности аминокислотных последовательностей получают с использованием программы ggsearch из пакета программ FASTA, версия 36.3.8с или более поздняя версия, с использованием матрицы для сравнения BLOSUM50. Пакет программ FASTA был разработан W.R. Pearson и D.J. Lipman, "Improved Tools for Biological Sequence Analysis", PNAS 85, 1988, cc. 2444-2448; W.R. Pearson "Effective protein sequence comparison" Meth. Enzymol. 266, 1996, cc. 227-258; и Pearson и др. Genomics 46, 1997, cc. 24-36, и публично доступен на сайте http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_down.shtml. Альтернативно этому, для сравнения последовательностей можно использовать публичный сервер, доступный на сайте http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/index.cgi, с использованием программы ggsearch (global protein:protein) и задаваемых по умолчанию опций (BLOSUM50; open: -10; ext: -2; Ktup = 2) для обеспечения осуществления глобального, а не локального выравнивания. Процент идентичности аминокислот выдается в виде заголовка в качестве выходного результата выравнивания.
Понятие «полинуклеотид» относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты или конструкции, например, матричной РНК (мРНК), РНК вирусного происхождения или плазмидной ДНК (пДНК). Полинуклеотид может содержать обычную фосфодиэфирную связь или нетрадиционную связь (например, амидную связь, такую, которая присутствует в пептидных нуклеиновых кислотах (ПНК)). Понятие «молекула нуклеиновой кислоты» относится к любому одному или нескольким сегментам нуклеиновой кислоты, например, фрагментам ДНК или РНК, присутствующим в полинуклеотиде.
Под «выделенной» молекулой нуклеиновой кислоты или полинуклеотидом подразумевается молекула нуклеиновой кислоты, т.е. ДНК или РНК, которая отделена от ее нативного окружения. Например, рекомбинантный полинуклеотид, кодирующий входящий в вектор полипептид, рассматривается как выделенный для целей настоящего изобретения. Другими примерами выделенного полинуклеотида являются рекомбинантные полинуклеотиды, присутствующие в гетерологичных клетках-хозяевах, или очищенные (частично или полностью) полинуклеотиды, находящиеся в растворе. Выделенный полинуклеотид включает полинуклеотидную молекулу, входящую в клетки, которые в норме содержат полинуклеотида молекулу, но полинуклеотидная молекула присутствует вне хромосомы или имеет локализацию в хромосоме, отличную от ее локализации в хромосоме в естественных условиях. Выделенные молекулы РНК включают полученные in vivo или in vitro РНК-транскрипты, предлагаемые в настоящем изобретении, а также формы с позитивной и негативной цепью и двухцепочечные формы. Выделенные полинуклеотиды или нуклеиновые кислоты, предлагаемые в настоящем изобретении, включают также указанные молекулы, полученные с помощью синтеза. Кроме того, полинуклеотид или нуклеиновая кислота может представлять собой или может включать регуляторный элемент, такой как промотор, сайт связывания рибосом или терминатор транскрипции.
Понятие «выделенный полинуклеотид (или нуклеиновая кислота), кодирующий [например, иммуноконъюгат, предлагаемый в изобретении]» относится к одной или нескольким полинуклеотидным молекулам, которые кодируют тяжелые и легкие цепи антитела и/или полипептиды IL-2 (или их фрагменты), включая такую(ие) полинуклеотидную(ые) молекулу(ы) в одном и том же векторе или в различных векторах, и такая(ие) нуклеотидная(ые) молекула(ы) присутствует(ют) в одном или нескольких локализациях в клетке-хозяине.
Понятие «кассета экспрессии» относится к полинуклеотиду, полученному с помощью рекомбинации или синтеза, который содержит серии специфических нуклеотидных элементов, которые обеспечивают транскрипцию конкретной нуклеиновой кислоты в клетке-мишени. Рекомбинантную кассету экспрессии можно встраивать в плазмиду, хромосому, митохондриальную ДНК, пластидную ДНК, вирус или фрагмент нуклеиновой кислоты. Как правило, рекомбинантная кассета экспрессии, представляющая собой часть экспрессионного вектора, включает среди прочих последовательностей подлежащую транскрипции нуклеотидную последовательность и промотор. В некоторых вариантах осуществления изобретения кассета экспрессии содержит полинуклеотидные последовательности, которые кодируют иммуноконъюгаты, предлагаемые в изобретении, или их фрагменты.
Понятие «вектор» или «экспрессионный вектор» относится к молекуле ДНК, которую применяют для интродукции и обеспечения экспрессии конкретного гена, с которой он функционально связан в клетке. Понятие включает вектор, представляющий собой самореплицирующуюся структуру нуклеиновой кислоты, а также вектор, встроенный в геном клетки-хозяина, в которую он интродуцирован. Экспрессионный вектор, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит кассету экспрессии. Экспрессионные векторы позволяют осуществлять транскрипцию стабильной мРНК в больших количествах. Когда экспрессионный вектор находится внутри клетки-мишени, то молекула рибонуклеиновой кислоты или белок, который кодируется геном, продуцируется в результате клеточного механизма транскрипции и/или трансляции. В одном из вариантов осуществления изобретения экспрессионный вектор, предлагаемый в изобретении, содержит кассету экспрессии, которая включает полинуклеотидные последовательности, которые кодируют иммуноконъюгаты, предлагаемые в изобретении, или их фрагменты.
В контексте настоящего описания понятия «клетка-хозяин», «линия клеток-хозяев» и «культура клеток-хозяев» используются взаимозаменяемо, и они относятся к клеткам, в которые интродуцирована экзогенная нуклеиновая кислота, включая потомство указанных клеток. К клеткам-хозяевам относятся «трансформанты» и «трансформированные клетки», которые включают первичные трансформированные клетки, а также потомство, выведенное из них, независимо от количества пересевов. Потомство может не быть строго идентичным родительской клетке по составу нуклеиновых кислот, а может нести мутации. Под данное понятие подпадает мутантное потомство, которое обладает такой же функцией или биологической активностью, что и отобранная путем скрининга или селекции исходная трансформированная клетка. Клетка-хозяин представляет собой любой тип клеточной системы, которую можно применять для создания иммуноконъюгатов, предлагаемых в настоящем изобретении. Клетки-хозяева включают культивируемые клетки, например, культивируемые клетки млекопитающих, такие как (но, не ограничиваясь только ими) HEK-клетки, СНО-клетки, BHK-клетки, NS0-клетки, SP2/0-клетки, клетки миеломы линии YO, клетки мышиной миеломы линии Р3Х63, PER-клетки, PER.С6-клетки или клетки гибридомы, клетки дрожжей, клетки насекомых и клетки растений, но также клетки, находящиеся в трансгенном животном, трансгенном растении или в культивируемой растительной или животной ткани.
В контексте настоящего описания понятие «антитело» используется в его наиболее широком смысле, и оно относится к различным структурам антител, включая (но, не ограничиваясь только ими) моноклональные антитела, поликлональные антитела, моноспецифические и мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела) и фрагменты антител, при условии, что они обладают требуемой антигенсвязывающей активностью.
Понятие «моноклональное антитело» в контексте настоящего описания относится к антителу, полученному из популяции практически гомогенных антител, т.е. индивидуальные антитела, входящие в популяцию, идентичны и/или связываются с одним и тем же эпитопом, за исключением возможных вариантов антител, например, содержащих мутации, встречающиеся в естественных условиях или возникающие в процессе производства препарата моноклонального антитела, указанные варианты, как правило, присутствуют в минорных количествах. В отличие от препаратов поликлональных антител, которые, как правило, включают различные антитела к различным детерминантам (эпитопам), каждое моноклональное антитело из препарата моноклонального антитела направлено против одной детерминанты на антигене. Таким образом, прилагательное «моноклональный» относится к характеристике антитела, указывающей на получение из практически гомогенной популяции антител, и его не следует рассматривать как требование, ограничивающее получение антитела с помощью какого-либо конкретного метода. Например, моноклональные антитела, предназначенные для применения согласно настоящему изобретению, можно получать различными методиками, включая (но, не ограничиваясь только ими) метод гибридом, методы рекомбинантной ДНК, методы фагового дисплея и методы, включающие применение трансгенных животных, содержащих весь локус человеческого иммуноглобулина или его часть, указанные методы и другие приведенные в качестве примера методы создания моноклональных антител представлены в настоящем описании.
«Выделенное» антитело представляет собой антитело, отделенное от компонента его естественного окружения, т.е. которое не находится в естественной для него среде. Не требуется какая-либо конкретная степень очистки. Например, выделенное антитело может быть отделено от его нативного или естественного окружения. Рекомбинантно полученные антитела, экспрессируемые в клетках-хозяевах, рассматриваются в качестве выделенных для целей изобретения, поскольку представляют собой нативные или рекомбинантные антитела, которые отделены, фракционированы или частично или полностью очищены с помощью любого приемлемого метода. Так, иммуноконъюгаты, предлагаемые в настоящем изобретении, являются выделенными. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело очищают до чистоты, превышающей 95% или 99% по данным, например, электрофоретических анализов (таких, например, как ДСН-ПААГ, изоэлектрическое фокусирование (ИЭФ), капиллярный электрофорез) или хроматографических анализов (таких, например, как ионообменная хроматография или ЖХВР с обращенной фазой). Обзор методов оценки чистоты см., например, у Flatman S. и др., J. Chrom. В 848, 2007, сс. 79-87.
Понятия «полноразмерное антитело», «интактное антитело» и «цельное антитело» в контексте настоящего описания используют взаимозаменяемо для обозначения антитела, имеющего структуру, практически сходную со структурой нативного антитела.
2
2
Понятие «фрагмент антитела» относится к молекуле, отличной от интактного антитела, которая содержит часть интактного антитела, обладающую способностью связываться с антигеном, с которым связывается интактное антитело. Примерами фрагментов антител являются (но, не ограничиваясь только ими) Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab'), димерные антитела (диабоди), линейные антитела, одноцепочечные молекулы антител (например, scFv); и однодоменные антитела. Обзор некоторых фрагментов антител см., например, у Hudson и др., Nat Med 9, 2003, сс. 129-134. Обзор scFv-фрагментов см., например, у  в: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, т. 113, под ред. Rosenburg и Moore, изд-во Springer-Verlag, New York, 1994, cc. 269-315; см. также WO 93/16185; и US №№5571894 и 5587458. Обсуждение Fab- и F(ab')-фрагментов, содержащих остатки эпитопа, связывающегося с рецептором спасения, и обладающих удлиненным временем полужизни in vivo, см. в US №5869046. Димерные антитела представляют собой фрагменты антител с двумя антигенсвязывающими сайтами, которые могут быть двухвалентными или биспецифическими (см., например, ЕР 404097; WO 1993/01161; Hudson и др., Nat Med 9, 2003, сс. 129-134; и Hollinger и др., Proc Natl Acad Sci USA 90, 1993, сс. 6444-6448). Тримерные и тетрамерные антитела описаны также у Hudson и др., Nat Med 9, 2003, сс. 129-134. Однодоменные антитела представляют собой фрагменты антител, содержащие весь вариабельный домен тяжелой цепи или его часть или весь вариабельный домен легкой цепи антитела или его часть. В некоторых вариантах осуществления изобретения однодоменное антитело представляет собой человеческое однодоменное антитело (фирма Domantis, Inc., Валтам, шт. Массачусетс; см., например, US №6248516 В1). Фрагменты антител можно создавать с помощью различных методик, включая (но, не ограничиваясь только ими) протеолитическое расщепление интактного антитела, а также получать с использованием рекомбинантных клеток-хозяев (например, Е. coli или фага), как указано в настоящем описании.
Понятие «молекула иммуноглобулина» относится к белку, который имеет структуру встречающегося в естественных условиях антитела. Например, иммуноглобулины IgG-класса представляют собой гетеротетрамерные гликопротеины с молекулярной массой примерно 150000 Да, состоящие из двух идентичных легких цепей и двух идентичных тяжелых цепей, связанных дисульфидными мостиками. Начиная с N- конца к С-концу, каждая тяжелая цепь имеет вариабельную область (VH), которую называют также вариабельным тяжелым доменом или вариабельным доменом тяжелой цепи, за которой следует три константных домена (CH1, СН2 и СН3), которые называют также константной областью тяжелой цепи. Аналогично этому, начиная с N-конца к С-концу, каждая легкая цепь имеет вариабельную область (VL), которую называют также вариабельным легким доменом или вариабельным доменом легкой цепи, за которой следует константный домен легкой цепи (CL), который называют также константной областью легкой цепи. Тяжелая цепь антитела может относиться к одному из пяти типов, которые обозначают как α (IgA), δ (IgD), ε (IgE), γ (IgG) или μ (IgM), некоторые из которых можно дополнительно подразделять на подтипы, например, γ1 (IgG1), γ2 (IgG2), γ3 (IgG3), γ4 (IgG4), α1 (IgA1) и α2 (IgA2). Легкая цепь антитела может принадлежать к одному из двух типов, называемых каппа (κ) и лямбда (λ), в зависимости от аминокислотной последовательности ее константного домена. Иммуноглобулин практически состоит из двух Fab-молекул и Fc-домена, которые соединены через шарнирную область иммуноглобулина.
Понятие «антигенсвязывающий домен» относится к части антитела, которая содержит область, специфически связывающуюся и являющуюся комплементарной части антигена или полному антигену. Антигенсвязывающий домен может представлять собой, например, один или несколько вариабельных доменов антитела (которые называют также вариабельными областями). Предпочтительно антигенсвязывающий домен содержит вариабельную область легкой цепи (VL) антитела и вариабельную область тяжелой цепи антитела (VH).
Понятие «вариабельная область» или «вариабельный домен» относится к домену тяжелой или легкой цепи антитела, который участвует в связывании антитела с антигеном. Вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи (VH и VL соответственно) нативного антитела, как правило, имеют сходные структуры, при этом каждый домен содержит четыре консервативных каркасных участка (FR) и три гипервариабельных участка (HVR) (см., например, Kindt и др., Kuby Immunology, 6-ое изд., изд-во W.H. Freeman and Co., 2007, с. 91). Одного VH- или VL-домена может быть достаточно для обеспечения специфичности связывания антигена. В контексте настоящего описания касательно последовательностей вариабельных областей «нумерация по Кэботу» относится к системе нумерации, описанной у Kabat и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-ое изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.
В контексте настоящего описания аминокислотные положения всех константных областей и доменов тяжелой и легкой цепей нумеруют согласно системе нумерации по Кэботу, которая описана у Kabat и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-ое изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991 и которую обозначают в контексте настоящего описания как «нумерация по Кэботу». В частности, систему нумерации по Кэботу (см. сс. 647-660), описанную у Kabat и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-ое изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991, применяют для константного домена CL легкой цепи каппа- и лямбда-изотипа, а систему нумерации согласно EU-индексу Кэбота (см. сс. 661-723) применяют для константных доменов тяжелой цепи (СН1, шарнир, СН2 и СН3, что в этом случае в контексте настоящего описания дополнительно разъяснено ссылкой на «нумерацию согласно EU-индексу Кэбота»).
Понятие «гипервариабельный участок» или «HVR» в контексте настоящего описания относится к каждому из участков вариабельного домена антитела, фрагменты аминокислотных остатков которых являются гипервариабельными по их последовательности («определяющие комплементарность участки» или «CDR») и/или формируют петли определенной структуры («гипервариабельные петли»), и/или содержат контактирующие с антигеном остатки («контакты с антигеном»). Как правило, антитела содержат шесть HVR; три в VH (H1, Н2, Н3) и три в VL (L1, L2, L3).
HVR включают:
(а) гипервариабельные петли, включающие аминокислотные остатки 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (Н2) и 96-101 (Н3) (Chothia С. и Lesk A.M., J. Mol. Biol. 196, 1987, сс. 901-917);
(б) CDR, включающие аминокислотные остатки 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (Н2) и 95-102 (Н3) (Kabat Е.А. и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-ое изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991, публикация NIH 91-3242);
(в) области контакта с антигеном, включающие аминокислотные остатки 27 с-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (Н2) и 93-101 (Н3) (MacCallum и др., J. Mol. Biol. 262, 1996, сс. 732-745); и
(г) комбинации остатков, указанных в подпунктах (а), (б) и/или (в), включающие аминокислотные остатки HVR 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (Н2), 93-102 (Н3) и 94-102 (Н3).
Если не указано иное, то HVR-остатки и другие остатки в вариабельном домене (например, FR-остатки) нумеруют в настоящем описании согласно Kabat и др., выше.
«Каркасные участки» или «FR»-участки представляют собой участки вариабельных доменов, отличные от остатков гипервариабельных участков (HVR). FR вариабельного домена, как правило, представлены четырьмя FR-доменами: FR1, FR2, FR3 и FR4. Таким образом, последовательности HVR и FR, как правило, расположены в VH (или VL) в следующем порядке: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
Понятие «гуманизированное» антитело относится к химерному антителу, которое содержит аминокислотные остатки из нечеловеческих HVR и аминокислотные остатки из человеческих FR. В некоторых вариантах осуществления изобретения гуманизированное антитело может содержать практически все из по меньшей мере одного и, как правило, двух вариабельных доменов, в которых все или практически все HVR (например, CDR) соответствуют участкам нечеловеческого антитела, а все или практически все FR соответствуют участкам человеческого антитела. Указанные вариабельные домены обозначают как «гуманизированная вариабельная область». Гуманизированное антитело необязательно может содержать по меньшей мере часть константной области антитела, происходящей из человеческого антитела. В некоторых вариантах осуществления изобретения некоторые FR-остатки в гуманизированном антителе заменены соответствующими остатками из нечеловеческого (например, антитела, из которого получены HVR-остатки), например, для сохранения или повышения специфичности или аффинности антитела. Понятие «гуманизированная форма» антитела, например, нечеловеческого антитела, относится к антителу, которое подвергали гуманизации. Другие формы «гуманизированных антител», подпадающие под объем настоящего изобретения, представляют собой антитела, в которых константная область дополнительно модифицирована или изменена по сравнению с исходным антителом для создания свойств, которые требуются согласно изобретению, в частности касательно связывания C1q и/или связывания с Fc-рецептора (FcR).
«Человеческое антитело» представляет собой антитело, которое имеет аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности антитела, продуцируемого в организме человека или человеческой клеткой, или полученного из нечеловеческого источника, который использует спектры человеческих антител, или другим кодирующим человеческое антитело последовательностям. Из указанного определения человеческого антитела специально исключено гуманизированное антитело, содержащее нечеловеческие антигенсвязывающие остатки. В некоторых вариантах осуществления изобретения человеческое антитело получают из трансгенного млекопитающего кроме человека, например, мыши, крысы или кролика. В некоторых вариантах осуществления изобретения человеческое антитело получено из линии клеток гибридомы. Антитела или фрагменты антител, выделенные из библиотек человеческих антител, в настоящем описании также рассматриваются как человеческие антитела или фрагменты человеческих антител.
1
2
3
4
1
2
Понятие «класс» антитела относится к типу константного домена или константной области, входящего/входящей в тяжелую цепь. Существует пять основных классов антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, а некоторые из них можно дополнительно подразделять на подклассы (изотипы), например, IgG, IgG, IgG, IgG, IgA и IgA. Константные домены тяжелых цепей, соответствующие различным классам иммуноглобулинов, обозначают как α, δ, ε, γ и μ соответственно.
В контексте настоящего описания понятие «Fc-домен» или «Fc-область» применяют для определения С-концевой области тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит по меньшей мере часть константной области. Под понятие подпадают имеющие нативную последовательность Fc-области и варианты Fc-областей. Хотя пограничные последовательности Fc-области тяжелой цепи IgG могут слегка варьироваться, как правило, считается, что Fc-область тяжелой цепи человеческого IgG простирается от Cys226 или от Pro230 до карбоксильного конца тяжелой цепи. Однако антитела, продуцируемые клеткой-хозяином, могут подвергаться пост-трансляционному отщеплению одной или нескольких, в частности одной или двух, аминокислот из С-конца тяжелой цепи. Поэтому антитело, продуцируемое клеткой-хозяином в результате экспрессии специфической молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует полноразмерную тяжелую цепь, может включать полноразмерную тяжелую цепь или может включать расщепленный вариант полноразмерной тяжелой цепи (который обозначают также как «расщепленный вариант тяжелой цепи»). Это может приводить к ситуации, когда последние две С-концевые аминокислоты тяжелой цепи представляют собой глицин (G446) и лизин (K447, нумерация согласно EU-индексу Кэбота). Таким образом, С-концевой лизин (Lys447) или С-концевые глицин (Gly446) и лизин (K447) Fc-области могут присутствовать или отсутствовать. Аминокислотные последовательности тяжелых цепей, включающих Fc-домены (или субъединицу Fc-домена, указанную в настоящем описании), если не указано иное, в контексте настоящего описания рассматривают без С-концевого дипептида глицин-лизин. В одном из вариантов осуществления изобретения тяжелая цепь, которая включает субъединицу Fc-домена, указанную в настоящем описании, которая содержится в иммуноконъюгате, предлагаемом в изобретении, содержит дополнительно С-концевой дипептид глицин-лизин (G446 и K447, нумерация согласно EU-индексу Кэбота). В одном из вариантов осуществления изобретения тяжелая цепь, которая включает субъединицу Fc-домена, указанную в настоящем описании, которая содержится в иммуноконъюгате, предлагаемом в изобретении, содержит дополнительно С-концевой остаток глицина (G446, нумерация согласно EU-индексу Кэбота). Композиции, предлагаемые в изобретении, такие как фармацевтические композиции, указанные в настоящем описании, содержат популяцию иммуноконъюгатов, предлагаемых в изобретении. Популяция иммуноконъгатов может содержать молекулы, имеющие полноразмерную тяжелую цепь, и молекулы, имеющие расщепленный вариант тяжелой цепи. Популяция иммуноконъгатов может состоять из смеси молекул, имеющих полноразмерную тяжелую цепь, и молекул, имеющих расщепленный вариант тяжелой цепи, в которой по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80% или по меньшей мере 90% иммуноконъюгатов имеют расщепленный вариант тяжелой цепи. В одном из вариантов осуществления изобретения композиция, которая состоит из популяции иммунокоъюгатов, предлагаемых в изобретении, содержит иммуноконъюгат, который содержит тяжелую цепь, включающую субъединицу Fc-домена, указанную в настоящем описании, с дополнительным С-концевым дипептидом глицин-лизин (G446 и K447, нумерация согласно EU-индексу Кэбота). В одном из вариантов осуществления изобретения композиция, которая состоит из популяции иммуноконъюгатов, предлагаемых в изобретении, содержит иммуноконъюгат, который содержит тяжелую цепь, включающую субъединицу Fc-домена, указанную в настоящем описании, с дополнительным С-концевым остатком глицина (G446, нумерация согласно EU-индексу Кэбота). В одном из вариантов осуществления изобретения указанная композиция содержит популяцию иммуноконъюгатов, состоящую из молекул, которые содержат тяжелую цепь, включающую субъединицу Fc-домена, указанную в настоящем описании; молекул, которые содержат тяжелую цепь, включающую субъединицу Fc-домена с дополнительным С-концевым остатком глицина (G446, нумерация согласно EU-индексу Кэбота); и молекул, которые содержат тяжелую цепь, включающую субъединицу Fc-домена с дополнительным С-концевым дипептидом глицин-лизин (G446 и K447, нумерация согласно EU-индексу Кэбота). Если в настоящем описании специально не указано иное, то нумерация аминокислотных остатков в Fc-области или константном участке соответствует системе EU-нумерации, которую называют также EU-индексом, описанной у Kabat и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-ое изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991 (см. выше). В контексте настоящего описания понятие «субъединица» Fc-домена относится к одному из двух полипептидов, образующих димерный Fc-домен, т.е. полипептиду, который содержит С-концевые константные области тяжелой цепи иммуноглобулина, обладающему способностью к стабильной самоассоциации. Например, субъединица Fc-домена IgG содержит константные домены СН2 IgG и СН3 IgG.
«Модификация, способствующая ассоциации первой и второй субъединиц Fc-домена» означает манипуляцию с пептидным каркасом или посттрансляционные модификации субъединицы Fc-домена, которая снижает или препятствует ассоциации полипептида, содержащего субъединицу Fc-домена, с идентичным полипептидом с образованием гомодимера. В контексте настоящего описания модификация, способствующая ассоциации, в частности включает отдельные модификации, затрагивающие каждую из двух субъединиц Fc-домена, требуемых для ассоциации (т.е. и первую и вторую субъединицы Fc-домена), при этом модификации дополняют друг друга так, чтобы способствовать ассоциации двух субъединиц Fc-домена. Например, модификация, способствующая ассоциации, может изменять структуру или заряд одной или обеих субъединиц Fc-домена, так, чтобы сделать ассоциацию стерически или электростатически выгодной соответственно. Таким образом, (гетеро)димеризация имеет место между полипептидом, который содержит первую субъединицу Fc-домена, и полипептидом, который содержит вторую субъединицу Fc-домена, которые могут быть неидентичными в том плане, что дополнительные компоненты, слитые с каждой из субъединиц (например, антигенсвязывающие фрагменты), не являются одинаковыми. В некоторых вариантах осуществления изобретения модификация, способствующая ассоциации, включает аминокислотную мутацию в Fc-домене, в частности, аминокислотную замену. В конкретном варианте осуществления изобретения модификация, способствующая ассоциации, включает отдельную аминокислотную мутацию, в частности, аминокислотную замену, в каждой из двух субъединиц Fc-домена.
В контексте настоящего описания понятие «эффекторные функции» касательно антител относится к видам биологической активности, присущим Fc-области антитела, которые варьируются в зависимости от изотипа антитела. Примерами эффекторных функций антитела являются: способность связываться с C1q и комплементзависимая цитотоксичность (CDC), способность связываться с Fc-рецептором, антитело-обусловленная клеточнозависимая цитотоксичность (ADCC), антитело-обусловленный клеточнозависимый фагоцитоз (ADCP), секреция цитокинов, опосредованное иммунным комплексом поглощение антигена антигенпрезентирующими клетками, понижающая регуляция рецепторов клеточной поверхности (например, В-клеточного рецептора) и активация В-клеток.
Антитело-обусловленная клеточнозависимая цитотоксичность (ADCC) представляет собой иммунный механизм, приводящий в лизису сенсибилизированных антителом являющихся мишенями ADCC клеток с помощью иммунных эффекторных клеток. Клетки-мишени представляют собой клетки, с которыми антитела или их производные, содержащие Fc-область, специфически связываются, как правило, через белковую часть, которая является N-концевой относительно Fc-области. В контексте настоящего описания понятие «пониженная ADCC» относится или к снижению количества клеток-мишеней, подвергнутых лизису в данное время, при данной концентрации антитела в среде, окружающей клетки-мишени, с помощью описанного выше механизма ADCC, и/или к повышению концентрации антитела в среде, окружающей клетки-мишени, требуемой для достижения лизиса данного количества клеток-мишеней в данное время с помощью механизма ADCC. Снижение ADCC определяют относительно ADCC, опосредуемой тем же самым антителом, которое продуцируется тем же самым типом клеток-хозяев, с использованием тех же самым стандартных методов получения, очистки, приготовления форм и хранения (которые известны специалистам в данной области), но не сконструированным антителом. Например, снижение ADCC, опосредуемое антителом, содержащим в его Fc-домене аминокислотную замену, которая снижает ADCC, определяют относительно ADCC, опосредуемой тем же самым антителом без аминокислотной замены в Fc-домене. Приемлемые анализы измерения ADCC хорошо известны в данной области (см., например, публикацию РСТ WO 2006/082515 или публикацию РСТ WO 2012/130831).
«Активирующий Fc-рецептор» представляет собой Fc-рецептор, который после взаимодействия с Fc-областью антитела осуществляет процесс передачи сигналов, которые стимулируют осуществление несущей рецептор клеткой эффекторных функций. Человеческие активирующие Fc-рецепторы включают FcγRIIIa (CD16a), FcγRI (CD64), FcγRIIa (CD32) и FcαRI (CD89).
В контексте настоящего описания предполагается, что понятия «создание, конструирование, инженерия» включают любую манипуляцию с пептидным каркасом или пост-трансляционные модификации встречающего в естественных условиях или рекомбинантного полипептида или его фрагмента. Инженерия включает модификации аминокислотной последовательности, схемы гликозилирования или группы боковой цепи индивидуальных аминокислот, а также комбинации указанных подходов.
Понятие «пониженное связывание», например, пониженное связывание с Fc-рецептором или CD25, относится к снижению аффинности соответствующего взаимодействия, по данным, полученным, например, с помощью SPR. С целью дополнительного пояснения, понятие включает также снижения аффинности до нуля (или ниже предела определения аналитического метода), т.е. полное элиминирование взаимодействия. И, наоборот, «повышенное связывание» относится к повышению аффинности связывания соответствующего взаимодействия.
В контексте настоящего описания понятие «иммуноконъюгат» относится к полипептидной молекуле, которая включает по меньшей мере одну молекулу IL-2 и по меньшей мере одно антитело. Молекула IL-2 может быть сцеплена с антителом путем различных взаимодействий и в различных конфигурациях, которые указаны в настоящем описании. В конкретных вариантах осуществления изобретения молекула IL-2 слита с антителом через пептидный линкер. Конкретные иммуноконъюгаты, предлагаемые в изобретении, практически состоят из одной молекулы IL-2 и антитела, которые сцеплены с помощью одной или нескольких линкерных последовательностей.
Под «слитым» подразумевается, что компоненты (например, антитело и молекула IL-2) соединены с помощью пептидных связей, либо непосредственно, либо через один или несколько пептидных линкеров.
В контексте настоящего описания понятия «первая» и «вторая» касательно субъединиц Fc-домена и т.д. применяют для удобства отличия их друг от друга, когда присутствует более одного каждого типа фрагмента. Не предусматривается, что применение указанных понятий относится к конкретному порядку или ориентации в иммуноконъюгате, если специально не указано иное.
Понятие «эффективное количество» агента относится к количеству, необходимому для обеспечения физиологического изменения в клетке или ткани, в которую его вводят.
Понятие «терапевтически эффективное количество» агента, например, фармацевтической композиции, относится к количеству, эффективному при применении в дозах и в течение периодов времени, необходимых для достижения требуемого терапевтического или профилактического результата. Терапевтически эффективное количество агента, например, элиминирует, снижает, замедляет, минимизирует или предупреждает нежелательные явления заболевания.
«Индивидуум» или «субъект» представляет собой млекопитающее. Млекопитающие представляют собой (но, не ограничиваясь только ими) одомашненных животных (например, коровы, овцы, кошки, собаки и лошади), приматов (например, люди и приматы кроме человека, такие как обезьяны), кроликов и грызунов (например, мыши и крысы). Предпочтительно индивидуум или субъект представляет собой человека.
Понятие «фармацевтическая композиция» относится к препарату, который находится в такой форме, что он обеспечивает биологическую активность входящего в его состав действующего вещества, которое должно обладать эффективностью, и который не содержит дополнительных компонентов, которые обладают неприемлемой токсичностью для индивидуума, которому следует вводить композицию.
«Фармацевтически приемлемый носитель» относится к ингредиенту в фармацевтической композиции, отличному от действующего вещества, который является нетоксичным для индивидуума. Фармацевтически приемлемые носители включают (но, не ограничиваясь только ими) буфер, эксципиент, стабилизатор или консервант.
В контексте настоящего описания понятие «лечение» (и его грамматические вариации, такие как «лечить» или «процесс лечения») относится к клиническому вмешательству с целью изменения естественного течения болезни у индивидуума, подлежащего лечению, и его можно осуществлять либо для профилактики, либо в процессе развития клинической патологии. Требуемыми действиями лечения являются (но, не ограничиваясь только ими) предупреждение возникновения или рецидива болезни, облегчение симптомов, уменьшение любых прямых или косвенных патологических последствий болезни, предупреждение метастазов, снижение скорости развития болезни, облегчение или временное ослабление болезненного состояния и ремиссия или улучшение прогноза. В некоторых вариантах осуществления изобретения иммуноконъюгаты, предлагаемые в изобретении, применяют для задержки развития заболевания или замедления прогрессирования заболевания.
Подробное описание вариантов осуществления изобретения
Мутантный полипептид IL-2
reg
reg
Иммуноконъюгаты, предлагаемые в настоящем изобретении, содержат мутантный полипептид IL-2, обладающий улучшенными свойствами для иммунотерапии. В частности, у мутантного полипептида IL-2 элиминированы фармакологические свойства IL-2, которые участвуют в проявлении его токсичности, но не имеют решающего значения для эффективности IL-2. Указанные мутантные полипептиды IL-2 описаны подробно в WO 2012/107417, которая полностью включена в настоящее описание в качестве ссылки. Как указано выше, различные формы рецептора IL-2 состоят из различных субъединиц и характеризуются различной аффинностью к IL-2. Рецептор IL-2 с промежуточной аффинностью, состоящий из β- и γ-субъединиц рецептора, экспрессируется на покоящихся эффекторных клетках и его присутствия достаточно для обеспечения передачи сигналов IL-2. Высокоаффинный рецептор IL-2, который дополнительно содержит α-субъединицу рецептора, экспрессируется главным образом на регуляторных Т-клетках (T), а также на активированных эффекторных клетках, при этом их взаимодействие с IL-2 может усиливать опосредуемую T-клетками иммуносупрессию или индуцированную активацией смерть клеток (AICD) соответственно. Таким образом, не ограничиваясь какой-либо теорией, можно предположить, что снижение или аннулирование аффинности IL-2 к α-субъединице рецептора IL-2 может снижать индуцируемую IL-2 понижающую регуляцию функции эффекторных клеток посредством регуляторных Т-клеток и развитие толерантности опухолей с помощью процесса AICD. С другой стороны, сохранение аффинности рецептора IL-2 с промежуточной аффинностью должно поддерживать индукцию пролиферации и активацию эффекторных клеток типа NK и Т-клеток с помощью IL-2.
Мутантный полипептид интерлейкина-2 (IL-2), который содержится в иммуноконъюгате, предлагаемом в изобретении, содержит по меньшей мере одну аминокислотную мутацию, которая аннулирует или снижает аффинность мутантного полипептида IL-2 к α-субъединице рецептора IL-2 и сохраняет аффинность мутантного полипептида IL-2 к рецептору IL-2 с промежуточной аффинностью, в каждом случае по сравнению с полипептидом IL-2 дикого типа.
Мутанты человеческого IL-2 (hIL-2) с пониженной аффинностью к CD25 можно создавать, например, путем аминокислотной замены аминокислоты в положении 35, 38, 42, 43, 45 или 72 или их комбинации (нумерация относительно последовательности человеческого IL-2 SEQ ID NO: 19). Примеры аминокислотных замен включают K35E, K35A, R38A, R38E, R38N, R38F, R38S, R38L, R38G, R38Y, R38W, F42L, F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R, F42K, K43E, Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N, Y45D, Y45R, Y45K, L72G, L72A, L72S, L72T, L72Q, L72E, L72N, L72D, L72R и L72K. Конкретные мутанты IL-2, которые можно применять в иммуноконъюгатах, предлагаемых в изобретении, содержат аминокислотную мутацию в аминокислотном положении, соответствующем остатку 42, 45 или 72 человеческого IL-2, или их комбинацию. В одном из вариантов осуществления изобретения аминокислотная мутация представляет собой аминокислотную замену, выбранную из группы F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R, F42K, Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N, Y45D, Y45R, Y45K, L72G, L72A, L72S, L72T, L72Q, L72E, L72N, L72D, L72R и L72K, более конкретно аминокислотную замену, выбранную из группы F42A, Y45A и L72G. Эти мутанты характеризуются практически одинаковой аффинностью к рецептору IL-2 с промежуточной аффинностью и обладают пониженной в значительной степени аффинностью к α-субъединице рецептора IL-2 и высокоаффинному рецептору IL-2 по сравнению с формой дикого типа мутанта IL-2.
Другие характеристики перспективных мутантов могут представлять собой способность индуцировать пролиферацию несущих рецептор IL-2 Т-клеток и/или NK-клеток, способность индуцировать передачу сигналов IL-2 в несущих рецептор IL-2 Т-клетках и/или NK-клетках, способность воздействовать на образование интерферона (IFN)-γ в качестве вторичного цитокина NK-клетками, пониженную способность индуцировать выработку вторичных цитокинов, в частности IL-10 и TNF-α, мононуклеарными клетками периферической крови (РВМС), пониженную способность активировать регулярные Т-клетки, пониженную способность индуцировать апоптоз Т-клеток и пониженный профиль токсичности in vivo.
Конкретные мутантные полипептиды IL-2, которые можно применять согласно изобретению, содержат три аминокислотные мутации, которые аннулируют или снижают аффинность мутантного полипептида IL-2 к α-субъединице рецептора IL-2, но сохраняют аффинность мутантного полипептида IL-2 к рецептору IL-2 с промежуточной аффинностью. В одном из вариантов осуществления изобретения указанные три аминокислотные мутации находятся в положениях, соответствующих остаткам 42, 45 и 72 человеческого IL-2. В одном из вариантов осуществления изобретения указанные три аминокислотные мутации представляют собой аминокислотные замены. В одном из вариантов осуществления изобретения указанные три аминокислотные мутации представляют собой аминокислотные замены, выбранные из группы F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R, F42K, Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N, Y45D, Y45R, Y45K, L72G, L72A, L72S, L72T, L72Q, L72E, L72N, L72D, L72R и L72K. В конкретном варианте осуществления изобретения указанные три аминокислотные мутации представляют собой аминокислотные замены F42A, Y45A и L72G (нумерация относительно последовательности человеческого IL-2 SEQ ID NO: 19).
В некоторых вариантах осуществления изобретения указанная аминокислотная мутация снижает аффинность мутантного полипептида IL-2 к α-субъединице рецептора IL-2 по меньшей мере в 5 раз, в частности, по меньшей мере в 10 раз, более конкретном по меньшей мере в 25 раз. В вариантах осуществления изобретения, в которых присутствует несколько аминокислотных мутаций, которые снижают аффинность мутантного полипептида IL-2 к α-субъединице рецептора IL-2, комбинация указанных аминокислотных мутаций может снижать аффинность мутантного полипептида IL-2 к α-субъединице рецептора IL-2 по меньшей мере в 30 раз, по меньшей мере в 50 раз или даже по меньшей мере в 100 раз. В одном из вариантов осуществления изобретения указанная аминокислотная мутация или комбинация аминокислотных мутаций аннулирует аффинность мутантного полипептида IL-2 к α-субъединице рецептора IL-2, в результате чего никакое связывание не удается обнаружить с помощью метода поверхностного плазмонного резонанса.
Считается, что достигается практически сходное связывание с рецептором с промежуточной аффинностью, т.е. сохранение аффинности мутантного полипептида IL-2 к указанному рецептору, когда для мутанта IL-2 характерна аффинность, составляющая более чем примерно 70% от аффинности формы дикого типа мутанта IL-2 к рецептору IL-2 с промежуточной аффинностью. Мутанты IL-2, предлагаемые в изобретении, могут характеризоваться аффинностью, составляющей более чем примерно 80%, и даже более чем примерно 90% от указанной аффинности.
Снижение аффинности IL-2 к α-субъединице рецептора IL-2 в сочетании с элиминацией О-гликозилирования IL-2 позволяет получать белок IL-2 с улучшенными свойствами. Например, элиминация сайта О-гликозилирования позволяет получать более гомогенный продукт при экспрессии мутантного полипептида IL-2 в клетках млекопитающих, таких как СНО- или HEK-клетки.
Таким образом, в некоторых вариантах осуществления изобретения мутантный полипептид IL-2 содержит дополнительную аминокислотную мутацию, которая элиминирует сайт О-гликозилирования IL-2 в положении, соответствующем остатку 3 человеческого IL-2. В одном из вариантов осуществления изобретения указанная дополнительная аминокислотная мутация, которая элиминирует сайт О-гликозилирования IL-2 в положении, соответствующем остатку 3 человеческого IL-2, представляет собой аминокислотную замену. Примерами аминокислотных замен являются Т3А, T3G, T3Q, Т3Е, T3N, T3D, T3R, T3K и Т3Р. В конкретном варианте осуществления изобретения указанная дополнительная аминокислотная мутация представляет собой аминокислотную замену Т3А.
В некоторых вариантах осуществления изобретения мутантный полипептид IL-2 представляет собой практически полноразмерную молекулу IL-2. В некоторых вариантах осуществления изобретения мутантный полипептид IL-2 представляет собой молекулу человеческого IL-2. В одном из вариантов осуществления изобретения мутантный полипептид IL-2 содержит последовательность SEQ ID NO: 19 по меньшей мере с одной аминокислотной мутацией, которая аннулирует или снижает аффинность мутантного полипептида IL-2 к α-субъединице рецептора IL-2, но сохраняет аффинность мутантного полипептида IL-2 к рецептору IL-2 с промежуточной аффинностью по сравнению с полипептидом IL-2, который содержит SEQ ID NO: 19 без указанной мутации. В другом варианте осуществления изобретения мутантный полипептид IL-2 содержит последовательность SEQ ID NO: 29 по меньшей мере с одной аминокислотной мутацией, которая аннулирует или снижает аффинность мутантного полипептида IL-2 к α-субъединице рецептора IL-2, но сохраняет аффинность мутантного полипептида IL-2 к рецептору IL-2 с промежуточной аффинностью по сравнению с полипептидом IL-2, который содержит SEQ ID NO: 29 без указанной мутации.
В конкретном варианте осуществления изобретения мутантный полипептид IL-2 может вызывать один или несколько клеточных ответов, выбранных из группы, включающей: пролиферацию активированного Т-лимфоцита, дифференцировку активированного Т-лимфоцита, активность цитотоксической Т-клетки (CTL), пролиферацию активированной В-клетки, дифференцировку активированной В-клетки, пролиферацию естественной клетки-киллера (NK), дифференцировку NK-клетки, секрецию цитокина активированной Т-клеткой или NK-клеткой и противоопухолевую цитотоксичность NK/лимфокин-активированной клетки-киллера (LAK).
В одном из вариантов осуществления изобретения мутантный полипептид IL-2 обладает пониженной способностью индуцировать передачу сигналов IL-2 в регуляторных Т-клетках по сравнению с полипептидом IL-2 дикого типа. В одном из вариантов осуществления изобретения мутантный полипептид IL-2 индуцирует пониженную индуцированную активацией клеточную гибель (AICD) Т-клеток по сравнению с полипептидом IL-2 дикого типа. В одном из вариантов осуществления изобретения мутантный полипептид IL-2 обладает пониженным профилем токсичности in vivo по сравнению с полипептидом IL-2 дикого типа. В одном из вариантов осуществления изобретения мутантный полипептид IL-2 обладает пролонгированным временем полужизни в кровотоке по сравнению с полипептидом IL-2 дикого типа.
reg
В частности, мутантный полипептид IL-2, который можно применять согласно изобретению, содержит четыре аминокислотные замены в положениях, соответствующих остаткам 3, 42, 45 и 72 человеческого IL-2. Конкретные аминокислотные замены представляют собой Т3А, F42A, Y45A и L72G. Как продемонстрировано в WO 2012/107417, указанный несущий четыре мутации (четырехмутантный) полипептид IL-2 характеризуется не выявляемым уровнем связывания с CD25, пониженной способностью индуцировать апоптоз Т-клеток, пониженной способностью индуцировать передачу сигналов IL-2 в T-клетках и пониженным профилем токсичности in vivo. Однако он сохраняет способность активировать передачу сигналов IL-2 в эффекторных клетках, индуцировать пролиферацию эффекторных клеток и создание NK-клетками IFN-γ в качестве вторичного цитокина.
Кроме того, указанный мутантный полипептид IL-2 обладает дополнительными предпочтительными свойствами, такими как пониженная гидрофобность поверхности, хорошая стабильность и высокий выход экспрессии, что описано в WO 2012/107417. Неожиданно было установлено, что указанный мутантный полипептид IL-2 обладает также пролонгированным временем полужизни в сыворотке по сравнению с IL-2 дикого типа.
Мутанты IL-2, которые можно применять согласно изобретению, помимо наличия мутаций в области IL-2, которая образует поверхность раздела между IL-2 и CD25, или в сайте гликозилирования, могут иметь также одну или несколько мутаций в аминокислотной последовательности, расположенной вне указанных областей. Такие дополнительные мутации в человеческом IL-2 могут обеспечивать дополнительные преимущества, такие как повышенный уровень экспрессии или стабильности. Например, цистеин в положении 125 можно заменять на нейтральную аминокислоту, такую как серин, аланин, треонин или валин, получая C125S IL-2, С125А IL-2, С125Т IL-2 или C125V IL-2 соответственно, что описано в US №4518584. Как описано в указанном документе, можно также изымать путем делеции N-концевой остаток аланина IL-2, получая такой мутант, как des-A1 C125S или des-A1 С125А. Альтернативно этому или в дополнение к этому, мутант IL-2 может включать мутацию, при которой метионин, присутствующий в норме в положении 104 человеческого IL-2 дикого типа, заменен на нейтральную аминокислоту, такую как аланин (см. US №5206344). Образовавшиеся мутанты, например, des-A1 М104А IL-2, des-A1 М104А C125S IL-2, М104А IL-2, M104A C125A IL-2, des-A1 M104A C125A IL-2 или M104A C125S IL-2 (эти и другие мутанты описаны в US №5116943 и у Weiger и др., Eur J Biochem 180, 1989, сс. 295-300), можно применять в сочетании с конкретными мутациями IL-2, предлагаемыми в изобретении.
Таким образом, в некоторых вариантах осуществления изобретения мутантный полипептид IL-2 содержит дополнительную аминокислотную мутацию в положении, соответствующем остатку 125 человеческого IL-2. В одном из вариантов осуществления изобретения указанная дополнительная аминокислотная мутация представляет собой аминокислотную замену С125А.
Специалисту в данной области очевидны пути определения дополнительных мутации, которые могут обеспечивать дополнительные преимущества для целей изобретения. Например, должно быть очевидно, что аминокислотные мутации в последовательности IL-2, которые снижают или аннулируют аффинность IL-2 к рецептору IL-2 с промежуточной аффинностью, такие как D20T, N88R или Q126D (см., например, US 2007/0036752), могут оказаться непригодными для включения в мутантный полипептид IL-2, предлагаемый в изобретении.
В одном из вариантов осуществления изобретения мутантный полипептид IL-2 содержит не более чем 12, не более чем 11, не более чем 10, не более чем 9, не более чем 8, не более чем 7, не более чем 6 или не более чем 5 аминокислотных мутаций по сравнению с соответствующей последовательностью IL-2 дикого типа, например, последовательностью SEQ ID NO: 19 человеческого IL-2. В конкретном варианте осуществления изобретения мутантный полипептид IL-2 содержит не более чем 5 аминокислотных мутаций по сравнению с соответствующей последовательностью IL-2 дикого типа, например, последовательностью SEQ ID NO: 19 человеческого IL-2.
В одном из вариантов осуществления изобретения мутантный полипептид IL-2 содержит последовательность SEQ ID NO: 20. В одном из вариантов осуществления изобретения мутантный полипептид IL-2 состоит из последовательности SEQ ID NO: 20.
Иммуноконъюгаты
Иммуноконъюгаты, указанные в настоящем описании, содержат молекулу IL и антитело. Указанные иммуноконъюгаты значительно повышают эффективность терапии на основе IL-2 в результате непосредственного таргетинга IL-2, например, в микроокружение опухоли. Согласно изобретению антитело, содержащееся в иммуноконъюгате, может представлять собой цельное антитело или иммуноглобулин или его фрагмент или вариант, который обладает биологической функцией, такой как аффинность антигенспецифического связывания.
В целом, преимущества иммуноконъюгата являются очевидными. Например, антитело, содержащееся в иммуноконъюгате, распознает опухольспецифический эпитоп и обеспечивает таргетинг молекулы иммуноконъюгата к месту опухоли. В результате высокие концентрации IL-2 могут доставляться в микроокружение опухоли, что приводит к активации и пролиферации различных упомянутых в настоящем описании иммунных эффекторных клеток с использованием существенно более низкой дозы иммуноконъюгата по сравнению с дозой, требуемой для неконъюгированного IL-2. Кроме того, поскольку применение IL-2 в форме иммуноконъюгата снижает дозы самого цитокина, то потенциальная возможность проявления нежелательных побочных действий IL-2 ограничивается, и таргетинг IL-2 к конкретной области организма с помощью иммуноконъюгата может приводить также к снижению системной экспозиции и, как следствие, к снижению побочных действий, которые имеют место при применении неконъюгированного IL-2. Кроме того, увеличенное время полужизни в кровотоке иммуноконъюгата по сравнению с неконъюгированным IL-2 вносит вклад в эффективность иммуноконъюгата. Однако эта характерная особенность иммуноконъюгатов IL-2 может вновь усугублять потенциальные побочные действия молекулы IL-2: поскольку из-за в значительной степени повышенного времени полужизни иммуноконъюгата IL-2 в кровотоке по сравнению с неконъюгированным IL-2, вероятность того, что IL-2 или другие составляющие молекулы слитого белка могут активировать компоненты, обычно присутствующие в сосудистой сети, повышается. Эти же соображения применимы и к другим слитым белкам, которые содержат IL-2, слитый с другим фрагментом, таким как Fc или альбумин, что приводит к удлиненному времени полужизни IL-2 в кровотоке. В связи с этим, иммуноконъюгат, содержащий мутантный полипептид IL-2, представленный в настоящем описании и описанный в WO 2012/107417, с пониженной токсичностью по сравнению с формами IL-2 дикого типа, является наиболее предпочтительным.
Как указано выше, таргетинг IL-2 непосредственно к иммунным эффекторным клеткам, а не к опухолевым клеткам может обладать преимуществом для иммунотерапии с использованием IL-2.
1
Таким образом, в изобретении предложены мутантный полипептид IL-2, указанный выше, и антитело, которое связывается с PD-1. В одном из вариантов осуществления изобретения мутантный полипептид IL-2 и антитело образуют слитый белок, т.е. мутантный полипептид IL-2 объединен пептидной связью с антителом. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело содержит Fc-домен, состоящий из первой и второй субъединиц. В конкретном варианте осуществления изобретения мутантный полипептид IL-2 слит на его аминоконцевой аминокислоте с карбоксиконцевой аминокислотой одной из субъединиц Fc-домена, необязательно через линкерный пептид. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело представляет собой полноразмерное антитело. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело представляет собой молекулу иммуноглобулина, в частности молекулу иммуноглобулина IgG-класса, более предпочтительно молекулу иммуноглобулина IgG-подкласса. В одном из указанных вариантов осуществления изобретения мутантный полипептид IL-2 объединен аминоконцевой пептидной связью с одной из тяжелых цепей иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело представляет собой фрагмент антитела. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело представляет собой молекулу Fab или молекулу scFv. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело представляет собой молекулу Fab. В другом варианте осуществления изобретения антитело представляет собой молекулу scFv. Иммуноконъюгат может содержать также более одного антитела. Если иммуноконъюгат содержит более одного антитела, например, первое и второе антитело, то каждое антитело можно независимо друг от друга выбирать из различных форм антител и фрагментов антител. Например, первое антитело может представлять собой молекулу Fab, а второе антитело может представлять собой молекулу scFv. В конкретном варианте осуществления изобретения каждое из указанного первого и указанного второго антитела представляет собой молекулу scFv или каждое из указанного первого и указанного второго антитела представляет собой молекулу Fab. В конкретном варианте осуществления изобретения каждое из указанного первого и указанного второго антитела представляет собой молекулу Fab. В одном из вариантов осуществления изобретения каждое из указанного первого и указанного второго антитела связывается с PD-1.
Форматы иммуноконъюгатов
Примеры форматов иммуноконъюгатов описаны в публикации РСТ WO 2011/020783, которая полностью включена в настоящее описание в качестве ссылки. Такие иммуноконъюгаты содержат по меньшей мере два антитела. Таким образом, согласно одному из вариантов осуществления изобретения иммуноконъюгат, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит мутантный полипептид IL-2, представленный в настоящем описании, и по меньшей мере первое и второе антитело. В конкретном варианте осуществления изобретения указанные первое и второе антитела независимо выбраны из группы, включающей молекулу Fv, в частности, молекулу scFv, и молекулу Fab. В конкретном варианте осуществления изобретения указанный мутантный полипептид IL-2 объединен амино- или карбоксиконцевой пептидной связью с указанным первым антителом, а второе антитело объединено амино- или карбоксиконцевой пептидной связью либо I) с мутантным полипептидом IL-2, либо II) с первым антителом. В конкретном варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат практически состоит из мутантного полипептида IL-2 и первого и второго антитела, в частности молекул Fab, соединенных друг с другом с помощью одной или нескольких линкерных последовательностей. Указанные форматы имеют преимущество, заключающееся в том, что они связываются с высокой аффинностью с антигеном-мишенью (PD-1), но характеризуются лишь мономерным связыванием с рецептором IL-2, что позволяет избегать таргетинга иммуноконъюгата к несущим рецептор IL-2 иммунным клеткам, расположенным в областях, отличных от сайта-мишени. В конкретном варианте осуществления изобретения мутантный полипептид IL-2 соединен карбоксиконцевой пептидной связью с первым антителом, в частности, первой молекулой Fab, и дополнительно соединена аминоконцевой пептидной связью со вторым антителом, в частности второй молекулой Fab. В другом варианте осуществления изобретения первое антитело, в частности первая молекула Fab, соединена карбоксиконцевой пептидной связью с мутантным полипептидом IL-2, и дополнительно соединена аминоконцевой пептидной связью со вторым антителом, в частности второй молекулой Fab. В другом варианте осуществления изобретения первое антитело, в частности первая молекула Fab, соединена аминоконцевой пептидной связью с первым мутантным полипептидом IL-2 и дополнительно соединена карбоксиконцевой пептидной связью со вторым антителом, в частности второй молекулой Fab. В конкретном варианте осуществления изобретения мутантный полипептид IL-2 соединен карбоксиконцевой пептидной связью с вариабельной областью первой тяжелой цепи и дополнительно соединен аминоконцевой пептидной связью с вариабельной областью второй тяжелой цепи. В другом варианте осуществления изобретения мутантный полипептид IL-2 соединен карбоксиконцевой пептидной связью с вариабельной областью первой легкой цепи и дополнительно соединен аминоконцевой пептидной связью с вариабельной область второй легкой цепи. В другом варианте осуществления изобретения вариабельная область первой тяжелой или легкой цепи соединена карбоксиконцевой пептидной связью с мутантным полипептидом IL-2 и дополнительно соединена аминоконцевой пептидной связью с вариабельной областью второй тяжелой или легкой цепи. В другом варианте осуществления изобретения вариабельная область первой тяжелой или легкой цепи соединена аминоконцевой пептидной связью с мутантным полипептидом IL-2 и дополнительно соединена карбоксиконцевой пептидной связью с вариабельной областью второй тяжелой или легкой цепи. В одном из вариантов осуществления изобретения мутантный полипептид IL-2 соединен карбоксиконцевой пептидной связью с тяжелой или легкой цепью первого Fab и дополнительно соединен аминоконцевой пептидной связью с тяжелой или легкой цепь второго Fab. В другом варианте осуществления изобретения тяжелая или легкая цепь первого Fab соединена карбоксиконцевой пептидной связью с мутантным полипептидом IL-2 и дополнительно соединена аминоконцевой пептидной связью с тяжелой или легкой цепь второго Fab. В другом варианте осуществления изобретения тяжелая или легкая цепь первого Fab соединена аминоконцевой пептидной связью с мутантным полипептидом IL-2 и дополнительно соединена карбоксиконцевой пептидной связью с тяжелой или легкой цепь второго Fab. В одном из вариантов осуществления изобретения иммуноконъюгат содержит мутантный полипептид IL-2, который соединен аминоконцевой пептидной связью с одной или несколькими молекулами scFv и дополнительно соединен карбоксиконцевой пептидной связью с одной или несколькими молекулами scFv.
Однако, наиболее приемлемые форматы иммуноконъюгатов, предлагаемых в настоящем изобретении, содержат молекулу иммуноглобулина в качестве антитела. Указанные форматы иммуноконъюгатов описаны в WO 2012/146628, которая полностью включена в настоящее описание в качестве ссылки.
1
1
1
Таким образом, в конкретных вариантах осуществления изобретения иммуноконъюгат содержит мутантный полипептид IL-2, представленный в настоящем описании, и молекулу иммуноглобулина, которая связывается с PD-1, в частности молекулу IgG, более предпочтительно молекулу IgG. В одном из вариантов осуществления изобретения иммуноконъюгат содержит не более одного мутантного полипептида IL-2. В одном из вариантов осуществления изобретения молекула иммуноглобулина представляет собой молекулу человеческого иммуноглобулина. В одном из вариантов осуществления изобретения молекула иммуноглобулина содержит человеческую константную область, например, человеческий домен CH1, СН2, СН3 и/или CL. В одном из вариантов осуществления изобретения иммуноглобулин содержит человеческий Fc-домен, в частности Fc-домен человеческого IgG. В одном из вариантов осуществления изобретения мутантный полипептид IL-2 объединен амино- или карбоксиконцевой пептидной связью с молекулой иммуноглобулина. В одном из вариантов осуществления изобретения иммуноконъюгат практически состоит из мутантного полипептида IL-2 и молекулы иммуноглобулина, в частности, молекулы IgG, более предпочтительно молекулы IgG, которые соединены с помощью одной или нескольких линкерных последовательностей. В конкретном варианте осуществления изобретения мутантный полипептид IL-2 слит на его аминоконцевой аминокислоте с карбоксиконцевой аминокислотой одной из тяжелых цепей иммуноглобулина, необязательно через линкерный пептид.
4
n
4
n
4
n
4
4
n
n
n
m
4
3
Мутантный полипептид IL-2 может быть слит с антителом непосредственно или через линкерный пептид, содержащий одну или несколько аминокислот, как правило, примерно 2-20 аминокислот. Линкерные пептиды известны в данной области и указаны в настоящем описании. Приемлемыми неиммуногенными линкерными пептидами являются, например, (GS), (SG), (GS) или G(SG), в которых «n», как правило, обозначает целое число от 1 до 10, как правило, от 2 до 4. В одном из вариантов осуществления изобретения линкерный пептид состоит по меньшей мере из 5 аминокислот, в одном из вариантов осуществления изобретения из 5-100, в следующем варианте осуществления изобретения из 10-50 аминокислот. В конкретном варианте осуществления изобретения линкерный пептид состоит из 15 аминокислот. В одном варианте осуществления изобретения линкерный пептид представляет собой (GxS) или (GxS)G, в котором G обозначает глицин, S обозначает серин и (х=3, n=3, 4, 5 или 6 и m=0, 1, 2 или 3) или (х=4, n=2, 3, 4 или 5 и m=0, 1, 2 или 3), в одном варианте осуществления изобретения х=4 и n=2 или 3, в другом варианте осуществления изобретения х=4 и n=3. В конкретном варианте осуществления изобретения линкерный пептид представляет собой (GS) (SEQ ID NO: 21). В одном варианте осуществления изобретения линкерный пептид имеет (или состоит из) аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21.
1
В конкретном варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат содержит молекулу IL-2 и молекулу иммуноглобулина, в частности молекулу иммуноглобулина IgG-подкласса, которая связывается с PD-1, в котором мутантная молекула IL-2 слита на аминоконцевой аминокислоте с карбоксиконцевой аминокислотой одной из тяжелых цепей иммуноглобулина через линкерный пептид, имеющий SEQ ID NO: 21.
1
В конкретном варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат содержит молекулу IL-2 и антитело, которое связывается PD-1, в котором антитело содержит Fc-домен, в частности Fc-домен человеческого IgG, состоящий из первой и второй субъединиц, и мутантная молекула IL-2 слита на ее аминоконцевой аминокислоте с карбоксиконцевой аминокислотой одной из субъединиц Fc-домена через линкерный пептид, имеющий SEQ ID NO: 21.
Антитела к PD-1
Антитело, содержащееся в имуноконъюгате, предлагаемом в изобретении, связывается с PD-1, в частности с человеческим PD-1, и обладает способностью направлять мутантный полипептид IL-2 к сайту-мишени, в котором экспрессируется PD-1, в частности к Т-клетке, которая экспрессирует PD-1, например, к ассоциированной с опухолью Т-клетке.
Приемлемые антитела к PD-1, которые можно применять в иммуноконъюгате, предлагаемом в изобретении, описаны в заявке на патент РСТ РСТ/ЕР 2016/073248, которая полностью включена в настоящее описание в качестве ссылки.
Иммуноконъюгат, предлагаемый в изобретении, может содержать два или большее количество антител, которые могут связываться с одним и тем же или разными антигенами. Однако в конкретных вариантах осуществления изобретения каждое из указанных антител связывается с PD-1. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело, содержащееся в иммуноконъюгате, предлагаемом в изобретении, является моноспецифическим. В конкретном варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат содержит одно моноспецифическое антитело, в частности моноспецифическую молекулу иммуноглобулина.
2
1
Антитело может представлять собой антитело любого типа или его фрагмент, который сохраняет способность специфически связываться с PD-1, в частности человеческим PD-1. Фрагменты антител включают (но, не ограничиваясь только ими) Fv-молекулы, scFv-молекулы, Fab-молекулы и F(ab')- молекулы. Однако в конкретных вариантах осуществления изобретения антитело представляет собой полноразмерное антитело. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело содержит Fc-домен, состоящий из первой и второй субъединиц. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело представляет собой иммуноглобулин, в частности иммуноглобулин IgG-класса, более конкретно IgG-подкласса.
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело представляет собой моноклональное антитело.
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело содержит HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, FR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7 в положениях 71-73 согласно нумерации Кэбота, HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6.
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело содержит (а) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, FR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7 в положениях 71-73 согласно нумерации Кэбота, HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6. В некоторых вариантах осуществления изобретения вариабельная область тяжелой и/или легкой цепи представляет собой гуманизированную вариабельную область. В некоторых вариантах осуществления изобретения вариабельная область тяжелой и/или легкой цепи содержит человеческие каркасные участки (FR).
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело содержит HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, и HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13.
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело содержит (а) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, и (б) вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, и HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13.
В некоторых вариантах осуществления изобретения вариабельная область тяжелой и/или легкой цепи представляет собой гуманизированную вариабельную область. В некоторых вариантах осуществления изобретения вариабельная область тяжелой и/или легкой цепи содержит человеческие каркасные участки (FR).
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), которая содержит аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 14. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело содержит вариабельную область легкой цепи (VL), которая содержит аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 и SEQ ID NO: 18. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело содержит (а) вариабельную область тяжелой цепи (VH), которая содержит аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 14, и (б) вариабельную область легкой цепи (VL), которая содержит аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 и SEQ ID NO: 18.
В конкретном варианте осуществления изобретения антитело содержит (а) вариабельную область тяжелой цепи (VH), которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, и (б) вариабельную область легкой цепи (VL), которая содержит SEQ ID NO: 15.
1
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело представляет собой гуманизированное антитело. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело представляет собой молекулу иммуноглобулина, которая содержит человеческую константную область, в частности молекулу иммуноглобулина IgG-класса, которая содержит человеческие СН1-, СН2-, СН3- и/или CL-домены. Примеры последовательностей человеческих константных доменов представлены в SEQ ID NO: 31 и 32 (CL-домены человеческой каппа- и лямбда цепи соответственно) и в SEQ ID NO: 33 (константные домены СН1-СН2-СН3 тяжелой цепи человеческого IgG). В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело содержит константную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31 или SEQ ID NO: 32, в частности аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело содержит константную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 33. В частности, константная область тяжелой цепи может содержать аминокислотные мутации в Fc-домене, указанные в настоящем описании.
Fc-домен
В конкретных вариантах осуществления изобретения антитело, содержащееся в иммунокоъюгатах, предлагаемых в изобретении, содержит Fc-домен, который состоит из первой и второй субъединиц. Fc-домен антитела состоит из пары полипептидных цепей, содержащих домены тяжелой цепи молекулы иммуноглобулина. Например, Fc-домен молекулы иммуноглобулина G (IgG) представляет собой димер, каждая субъединица которого содержит константные домены СН2 и СН3 тяжелой цепи IgG. Две субъединицы Fc-домена обладают способностью к стабильной ассоциации друг с другом. В одном из вариантов осуществления изобретения иммуноконъюгат, предлагаемый в изобретении, содержит не более одного Fc-домена.
1
4
4
4
1
1
В одном из вариантов осуществления изобретения Fc-домен антитела, содержащегося в иммуноконъюгате, предлагаемом в изобретении, представляет собой Fc-домен IgG. В конкретном варианте осуществления изобретения Fc-домен представляет собой Fc-домен IgG. В другом варианте осуществления изобретения Fc-домен представляет собой Fc-домен IgG. В более конкретном варианте осуществления изобретения Fc-домен представляет собой Fc-домен IgG, содержащий аминокислотную замену в положении S228 (нумерация согласно EU-индексу Кэбота), в частности аминокислотную замену S228P. Указанная аминокислотная замена снижает in vivo обмен в Fab-плече антител IgG-подкласса (см. Stubenrauch и др., Drug Metabolism and Disposition 38, 2010, cc. 84-91). В другом конкретном варианте осуществления изобретения Fc-домен представляет собой человеческий Fc-домен. В еще более конкретном варианте осуществления изобретения Fc-домен представляет собой Fc-домен человеческого IgG. Примером последовательности Fc-области человеческого IgG является SEQ ID NO: 30.
Модификации Fc-домена, способствующие гетеродимеризации
Иммуноконъюгаты, предлагаемые в изобретении, содержат мутантный полипептид IL-2, в частности единичный (не более одного) мутантный полипептид IL-2, слитый с одной или с другой из двух субъединиц Fc-домена, таким образом, две субъединицы Fc-домена, как правило, содержатся в двух неидентичных полипептидных цепях. Рекомбинантная совместная экспрессия этих полипептидов и последующая димеризация приводят к нескольким возможным комбинациям двух полипептидов. Для повышения выхода и чистоты иммуноконъюгата при рекомбинантном получении целесообразно интродуцировать в Fc-домен антитела модификацию, способствующую ассоциации требуемых полипептидов.
Таким образом, в конкретных вариантах осуществления изобретения Fc-домен антитела, содержащегося в иммуноконъюгате, предлагаемом в изобретении, содержит модификацию, которая способствует ассоциации первой и второй субъединиц Fc-домена. Сайт наиболее сильного белок-белкового взаимодействия двух субъединиц Fc-домена человеческого IgG находится в СН3-домене Fc-домена. Таким образом, в одном из вариантов осуществления изобретения указанная модификация находится в СН3-домене Fc-домена.
Существует несколько подходов к модификациям в СН3-домене Fc-домена для усиления гетеродимеризации, которые подробно описаны, например, в WO 96/27011, WO 98/050431, ЕР 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012058768, WO 2013157954, WO 2013096291. Как правило, во всех указанных подходах СН3-домен первой субъединицы Fc-домена и СН3-домен второй субъединицы Fc-домена оба конструируют комплементарным образом, в результате чего каждый СН3-домен (или тяжелая цепь, содержащая его), не может более образовывать гомодимер сам с собой, но у него усилена способность к гетеродимеризации со сконструированным комплементарным образом другим СН3-доменом (в результате имеет место гетеродимеризация первого и второго СН3-доменов и не образуются гомодимеры между двумя первыми или двумя вторыми СН3-доменами).
В конкретном варианте осуществления изобретения указанная модификация, способствующая ассоциации первой и второй субъединиц Fc-домена, представляет собой так называемую модификацию типа «knob-in-hole» (типа «выступ-во впадину»), которая включает модификацию, приводящую к образованию «выступа» на одной из двух субъединиц Fc-домена и модификацию, приводящую к образованию «впадины» в другой одной из двух субъединиц Fc-домена.
Технология «knob-into-hole» описана, например, в US №5731168; US №7695936; у Ridgway и др., Prot Eng 9, 1996, сс. 617-621 и Carter, J Immunol Meth 248, 2001, сс. 7-15. В целом, метод включает интродукцию выпуклости («выступ») на поверхности раздела первого полипептида и соответствующей полости («впадина») в поверхности раздела второго полипептида, в результате выпуклость может помещаться в полость, способствуя тем самым образованию гетеродимера и препятствуя образованию гомодимера. Выпуклости конструируют путем замены аминокислот с небольшими боковыми цепями на поверхности раздела первого полипептида на аминокислоты с более крупными боковыми цепями (например, на тирозин или триптофан). Компенсирующие полости идентичного или сходного с выпуклостями размера создают в поверхности раздела второго полипептида путем замены аминокислот с крупными боковыми цепями на аминокислоты с менее крупными боковыми цепями (например, аланин или треонин).
Таким образом, в конкретном варианте осуществления изобретения в СН3-домене первой субъединицы Fc-домена антитела, содержащегося в иммуноконъюгате, аминокислотный остаток заменен аминокислотным остатком, который имеет больший объем боковой цепи, что приводит к образованию выпуклости на СН3-домене первой субъединицы, которая может помещаться в полость в СН3-домене второй субъединицы, и в СН3-домене второй субъединицы Fc-домена аминокислотный остаток заменен аминокислотным остатком, который имеет меньший объем боковой цепи, что приводит к образованию полости в СН3-домене второй субъединицы, в которую может помещаться выпуклость на СН3-домене первой субъединицы.
Предпочтительно указанный аминокислотный остаток, который имеет больший объем боковой цепи, выбирают из группы, состоящей из аргинина (R), фенилаланина (F), тирозина (Y) и триптофана (W).
Предпочтительно указанный аминокислотный остаток, который имеет меньший объем боковой цепи, выбирают из группы, состоящей из аланина (А), серина (S), треонина (Т) и валина (V).
Выпуклость и полость можно создавать путем изменения нуклеиновых кислот, кодирующих полипептиды, например, с помощью сайтнаправленного мутагенеза или путем пептидного синтеза.
В конкретном варианте осуществления изобретения в СН3-домене первой субъединицы Fc-домена (субъединица с «выступом») остаток треонина в положении 366 заменен остатком триптофана (T366W), а в СН3-домене второй субъединицы Fc-домена (субъединица с «впадиной») остаток тирозина в положении 407 заменен на остаток валина (Y407V). В одном из вариантов осуществления изобретения во второй субъединице Fc-домена дополнительно остаток треонина в положении 366 заменен на остаток серина (T366S) и остаток лейцина в положении 368 заменен на остаток аланина (L368A) (нумерация согласно EU-индексу Кэбота).
В следующем варианте осуществления изобретения в первой субъединице Fc-домена дополнительно остаток серина в положении 354 заменен на остаток цистеина (S354C) или остаток глутаминовой кислоты в положении 356 заменен на остаток цистеина (Е356С) (в частности остаток серина в положении 354 заменен на остаток цистеина), а во второй субъединице Fc-домена дополнительно остаток тирозина в положении 349 заменен на остаток цистеина (Y349C) (нумерация согласно EU-индексу Кэбота). Интродукция указанных двух остатков цистеина приводит к образованию дисульфидного мостика между двумя субъединицами Fc-домена, тем самым дополнительно стабилизируя димер (Carter, J Immunol Methods 248, 2001, cc. 7-15).
В конкретном варианте осуществления изобретения первая субъединица Fc-домена содержит аминокислотные замены S354C и Т366 W, а вторая субъединица Fc-домена содержит аминокислотные замены Y349C, T366S, L368A и Y407V (нумерация согласно EU-индексу Кэбота).
В некоторых вариантах осуществления изобретения вторая субъединица Fc-домена дополнительно содержит аминокислотные замены H435R и Y436F (нумерация согласно EU-индексу Кэбота).
В конкретном варианте осуществления изобретения мутантный полипептид IL-2 слит (необязательно через линкерный пептид) с первой субъединицей Fc-домена (содержащей модификацию, приводящую к образованию «выступа»). Не вдаваясь в теорию, слияние мутантного полипептида IL-2 с содержащей «выступ» субъединицей Fc-домена может (дополнительно) минимизировать образование иммуноконъюгатов, которые содержат два мутантных полипептида IL-2 (стерический «конфликт» двух содержащих «выступ» полипептидов).
Другие методики СН3-модификации для усиления гетеродимеризации рассматриваются в качестве альтернатив согласно изобретению и описаны, например, в WO 96/27011, WO 98/050431, ЕР 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012/058768, WO 2013/157954, WO 2013/096291.
В одном из вариантов осуществления изобретения в качестве альтернативы применяют подход к гетеродимеризации, описанный в ЕР 1870459. Этот подход основан на интродукции заряженных аминокислот с противоположными зарядами в конкретные аминокислотные положения в поверхности раздела СН3/СН3 между двумя субъединицами Fc-домена. Одним из предпочтительных вариантов антитела, содержащегося в иммуноконъюгате, предлагаемом в изобретении, являются аминокислотные мутации R409D; K370E в одном из двух СН3-доменов (Fc-домена) и аминокислотные мутации D399K; E357K в другом одном из СН3-доменов Fc-домена (нумерация согласно EU-индексу Кэбота).
В другом варианте осуществления изобретения антитело, содержащееся в иммуноконъюгате, предлагаемом в изобретении, содержит аминокислотную мутацию T366W в СН3-домене первой субъединицы Fc-домена и аминокислотные мутации T366S, L368A, Y407V в СН3-домене второй субъединицы Fc-домена, и дополнительно аминокислотные мутации R409D; K370E в СН3-домене первой субъединицы Fc-домена и аминокислотные мутации D399K; E357K в СН3-домене второй субъединицы Fc-домена (нумерация согласно EU-индексу Кэбота).
В другом варианте осуществления изобретения антитело, содержащееся в иммуноконъюгате, предлагаемом в изобретении, содержит аминокислотные мутации S354C, T366W в СН3-домене первой субъединицы Fc-домена и аминокислотные мутации Y349C, T366S, L368A, Y407V в СН3-домене второй субъединицы Fc-домена, или указанное антитело содержит аминокислотные мутации Y349C, T366W в СН3-домене первой субъединицы Fc-домена и аминокислотные мутации S354C, T366S, L368A, Y407V в СН3-домене второй субъединицы Fc-домена и дополнительно аминокислотные мутации R409D; K370E в СН3-домене первой субъединицы Fc-домена и аминокислотные мутации D399K; E357K в СН3-домене второй субъединицы Fc-домена (во всех случаях нумерация согласно EU-индексу Кэбота).
В одном из вариантов осуществления изобретения в качестве альтернативы применяют подход к гетеродимеризации, описанный в WO 2013/157953. В одном из вариантов осуществления изобретения первый СН3-домен содержит аминокислотную мутацию T366K, а второй СН3-домен содержит аминокислотную мутацию L351D (нумерация согласно EU-индексу Кэбота). В другом варианте осуществления изобретения первый СН3-домен содержит дополнительно аминокислотную мутацию L351K. В другом варианте осуществления изобретения второй СН3-домен содержит дополнительно аминокислотную мутацию, выбранную из Y349E, Y349D и L368E (предпочтительно L368E) (нумерация согласно EU-индексу Кэбота).
В одном из вариантов осуществления изобретения в качестве альтернативы применяют подход к гетеродимеризации, описанный в WO 2012/058768. В одном из вариантов осуществления изобретения первый СН3-домен содержит аминокислотные мутации L351Y, Y407A, а второй СН3-домен содержит аминокислотные мутации Т366А, K409F. В другом варианте осуществления изобретения второй СН3-домен содержит дополнительную аминокислотную мутацию в положении Т411, D399, S400, F405, N390 или K392, например, выбранную из a) T411N, T411R, T411Q, T411K, T411D, Т411Е или T411W, б) D399R, D399W, D399Y или D399K, в) S400E, S400D, S400R или S400K, г) F405I, F405M, F405T, F405S, F405V или F405W, д) N390R, N390K или N390D, е) K392V, K392M, K392R, K392L, K392F или K392E (нумерация согласно EU-индексу Кэбота). В другом варианте осуществления изобретения первый СН3-домен содержит аминокислотные мутации L351Y, Y407A, а второй СН3-домен содержит аминокислотные мутации T366V, K409F. В следующем варианте осуществления изобретения первый СН3-домен содержит аминокислотную мутацию Y407A, а второй СН3-домен содержит аминокислотные мутации Т366А, K409F. В следующем варианте осуществления изобретения второй СН3-домен содержит дополнительно аминокислотные мутации K392E, Т411Е, D399R и S400R (нумерация согласно EU-индексу Кэбота).
В одном из вариантов осуществления изобретения в качестве альтернативы применяют подход к гетеродимеризации, описанный в WO 2011/143545, например, с использованием аминокислотной модификации в положении, выбранном из группы, состоящей из 368 и 409 (нумерация согласно EU-индексу Кэбота).
В одном из вариантов осуществления изобретения в качестве альтернативы применяют подход к гетеродимеризации, описанный в WO 2011/090762, в котором также используется описанная выше технология «knobs-into-holes». В одном из вариантов осуществления изобретения первый СН3-домен содержит аминокислотную мутацию T366W, а второй СН3-домен содержит аминокислотную мутацию Y407A. В одном из вариантов осуществления изобретения первый СН3-домен содержит аминокислотную мутацию T366Y, а второй СН3-домен содержит аминокислотную мутацию Y407T (нумерация согласно EU-индексу Кэбота).
2
В одном из вариантов осуществления изобретения в качестве альтернативы применяют антитело, содержащееся в иммуноконъюгате, которое относятся к IgG-подклассу, или его Fc-домен, и подход к гетеродимеризации, описанный в WO 2010/129304.
В альтернативном варианте осуществления изобретения модификация, способствующая ассоциации первой и второй субъединиц Fc-домена, содержит модификацию, обусловливающую явления электростатического корректора, например, описанные в публикации РСТ WO 2009/089004. Как правило, этот метод включает замену одного или нескольких аминокислотных остатков на поверхности раздела двух субъединиц Fc-домена на заряженные аминокислотные остатки, что приводит к тому, что образованием гомодимера становится электростатически невыгодным, а гетеродимеризация становится электростатически выгодной. В одном из указанных вариантов осуществления изобретения первый СН3-домен содержит аминокислотную замену K392 или N392 на отрицательно заряженную аминокислоту (например, глутаминовую кислоту (Е) или аспарагиновую кислоту (D), предпочтительно K392D или N392D), а второй СН3-домен содержит аминокислотную замену D399, Е356, D356 или Е357 на положительно заряженную аминокислоту (например, лизин (K) или аргинин (R), предпочтительно D399K, E356K, D356K или E357K, и более предпочтительно D399K и E356K). В следующем варианте осуществления изобретения первый СН3-домен дополнительно содержит аминокислотную замену K409 или R409 на отрицательно заряженную аминокислоту (например, глутаминовую кислоту (Е) или аспарагиновую кислоту (D), предпочтительно K409D или R409D). В другом варианте осуществления изобретения первый СН3-домен в дополнительном или альтернативном варианте содержит аминокислотную замену K439 и/или K370 на отрицательно заряженную аминокислоту (например, глутаминовую кислоту (Е) или аспарагиновую кислоту (D)) (во всех случаях нумерация согласно EU-индексу Кэбота).
Еще в одном варианте осуществления изобретения, в качестве альтернативы применяют подход к гетеродимеризации, описанный в WO 2007/147901. В одном из вариантов осуществления изобретения первый СН3-домен содержит аминокислотные мутации K253E, D282K и K322D, а второй СН3-домен содержит аминокислотные мутации D239K, E240K и K292D (нумерация согласно EU-индексу Кэбота).
Еще в одном варианте осуществления изобретения в качестве альтернативы можно применять подход к гетеродимеризации, описанный в WO 2007/110205.
В одном из вариантов осуществления изобретения первая субъединица Fc-домена содержит аминокислотные замены K392D и K409D, а вторая субъединица Fc-домена содержит аминокислотные замены D356K и D399K (нумерация согласно EU-индексу Кэбота).
Модификации Fc-домена, приводящие к снижению связывания с Fc-рецептором и/или эффекторной функции
Fc-домен придает иммуноконъюгату предпочтительные фармакокинетические свойства, включая продолжительное время полужизни в сыворотке, что обеспечивает хорошее накопление в ткани-мишени и предпочтительное соотношение распределения в ткани-крови. Однако в то же время он может приводить к нежелательной направленности иммуноконъюгата к клеткам, которые экспрессируют Fc-рецепторы, а не к предпочтительным несущим антиген клеткам. Кроме того, совместная активация путей передачи сигналов Fc-рецептора может приводить к высвобождению цитокинов, что в сочетании с полипептидом IL-2 и продолжительным временем полужизни иммуноконъюгата, приводит к избыточной активации цитокиновых рецепторов и серьезным побочным действиям при системном введении. В соответствии с этим для общепринятых иммуноконъюгатов IgG-IL-2 описано наличие ассоциированных с ними инфузионных реакций (см., например, King и др., J Clin Oncol 22, 2004, сс. 4463-4473).
1
1
1
1
1
1
1
1
Таким образом, в конкретных вариантах осуществления изобретения Fc-домен антитела, содержащегося в иммуноконъюгате, предлагаемом в изобретении, обладает пониженной аффинностью связывания с Fc-рецептором и/или пониженной эффекторной функцией по сравнению с нативным Fc-доменом IgG. В одном указанном варианте осуществления изобретения Fc-домен (или антитело, содержащее указанный Fc-домен) характеризуется аффинностью связывания, составляющей менее чем 50%, предпочтительно менее чем 20%, более предпочтительно менее чем 10% и наиболее предпочтительно менее чем 5% от аффинности связывания с Fc-рецептором нативного Fc-домена IgG (или антитела, содержащего нативный Fc-домен IgG), и/или эффекторной функцией, составляющей менее чем 50%, предпочтительно менее чем 20%, более предпочтительно менее чем 10% и наиболее предпочтительно менее чем 5% от эффекторной функции нативного Fc-домена IgG (или антитела, содержащего нативный Fc-домен IgG). В одном из вариантов осуществления изобретения Fc-домен (или антитело, содержащее указанный Fc-домен) практически не связывается с Fc-рецептором и/или не индуцирует эффекторную функцию. В конкретном варианте осуществления изобретения Fc-рецептор представляет собой Fcy-рецептор. В одном из вариантов осуществления изобретения Fc-рецептор представляет собой человеческий Fc-рецептор. В одном из вариантов осуществления изобретения Fc-рецептор представляет собой активирующий Fc-рецептор. В конкретном варианте осуществления изобретения Fc-рецептор представляет собой активирующий человеческий Fcγ-рецептор, более конкретно человеческий FcγRIIIa, FcγRI или FcγRIIa, наиболее предпочтительно человеческий FcγRIIIa. В одном из вариантов осуществления изобретения эффекторная функция представляет собой одну или несколько функций, выбранных из группы, включающей CDC, ADCC, ADCP и секрецию цитокинов. В конкретном варианте осуществления изобретения эффекторная функция представляет собой ADCC. В одном из вариантов осуществления изобретения Fc-домен характеризуется практической такой же аффинностью связывания с неонатальным Fc-рецептором (FcRn), что и нативный Fc-домен IgG. Практически такое же связывание с FcRn достигается в том случае, когда Fc-домен (или антитело, содержащее указанный Fc-домен), характеризуется аффинностью связывания, составляющей более чем примерно 70%, предпочтительно более чем примерно 80%, более предпочтительно более чем примерно 90%, от аффинности связывания нативного Fc-домена IgG (или антитела, содержащего нативный Fc-домен IgG) с FcRn.
Согласно некоторым вариантам осуществления изобретения Fc-домен конструируют так, чтобы он обладал пониженной аффинностью связывания с Fc-рецептором и/или пониженной эффекторной функцией по сравнению с не подвергнутым инженерии Fc-доменом. В конкретных вариантах осуществления изобретения Fc-домен антитела, содержащегося в иммуноконъюгате, содержит одну или несколько аминокислотных мутаций, которые снижают аффинность связывания Fc-домена с Fc-рецептором и/или эффекторную функцию. Как правило, в каждой из двух субъединиц Fc-домена присутствует(ют) одна или несколько одинаковых аминокислотных мутаций. В одном из вариантов осуществления изобретения аминокислотная мутация снижает аффинность связывания Fc-домена с Fc-рецептором. В одном из вариантов осуществления изобретения аминокислотная мутация снижает аффинность связывания Fc-домена с Fc-рецептором по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 5 раз или по меньшей мере в 10 раз. Согласно вариантам осуществления изобретения, в которых имеет место более одной аминокислотной мутации, которые снижают аффинность связывания Fc-домена с Fc-рецептором, комбинация указанных аминокислотных мутаций может снижать аффинность связывания Fc-домена с Fc-рецептором по меньшей мере в 10 раз, по меньшей мере в 20 раз или по меньшей мере в 50 раз. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело, содержащее сконструированный Fc-домен, характеризуется аффинностью связывания, составляющей менее чем 20%, в частности, менее чем 10%, более предпочтительно менее чем 5% от аффинности связывания с Fc-рецептором, характерной для антитела, содержащего не подвергнутый инженерии Fc-домен. В конкретном варианте осуществления изобретения Fc-рецептор представляет собой Fcγ-рецептор. В некоторых вариантах осуществления изобретения Fc-рецептор представляет собой человеческий Fc-рецептор. В некоторых вариантах осуществления изобретения Fc-рецептор представляет собой активирующий Fc-рецептор. В конкретном варианте осуществления изобретения Fc-рецептор представляет собой активирующий человеческий Fc-рецептор, более конкретно человеческий FcγRIIIa, FcγRI или FcγRIIa, наиболее предпочтительно человеческий FcγRIIIa. Предпочтительно уменьшается связывание с каждым из этих рецепторов. Согласно некоторым вариантам осуществления изобретения снижается также аффинность связывания с компонентом системы комплемента, в частности, аффинность связывания с C1q. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения не снижается аффинность связывания с неонатальным Fc-рецептором (FcRn). Практически такое же связывание с FcRn, т.е. сохранение аффинности связывания Fc-домена с указанным рецептором, достигается, когда Fc-домен (или антитело, содержащее указанный Fc-домен) характеризуется аффинностью связывания с FcRn, составляющей более чем примерно 70% от аффинности связывания с FcRn не подвергнутой инженерии формы Fc-домена (или антитела, содержащего не подвергнутую инженерии форму Fc-домена). Fc-домен или антитело, содержащееся в иммуноконъюгате, предлагаемом в изобретении, которое содержит указанный Fc-домен, может характеризоваться аффинностью, составляющей более чем примерно 80% и даже более чем примерно 90% от указанной выше аффинности. В некоторых вариантах осуществления изобретения Fc-домен антитела, содержащегося в иммуноконъюгате, создают так, чтобы он обладал пониженной эффекторной функцией по сравнению с не подвергнутым инженерии Fc-доменом. Пониженная эффекторная функция может представлять собой (но, не ограничиваясь только ими) пониженную(ые) одну или несколько из следующих функций: пониженная комплементзависимая цитотоксичность (CDC), пониженная антитело-обусловленная клеточнозависимая цитотоксичность (ADCC), пониженный антитело-обусловленный клеточнозависимый фагоцитоз (ADCP), пониженная секреция цитокинов, пониженное опосредованное иммунным комплексом поглощение антигена антигенпрезентирующими клетками, пониженное связывание с NK-клетками, пониженное связывание с макрофагами, пониженное связывание с моноцитами, пониженное связывание с полиморфоядерными клетками, пониженная непосредственная передача сигнала, индуцирующего апоптоз, пониженное перекрестное сшивание связанных с мишенью антител, пониженное созревание дендритных клеток или пониженное Т-клеточное примирование. В одном из вариантов осуществления изобретения пониженная эффекторная функция представляет собой одну или несколько функций, выбранных из группы, включающей пониженную CDC, пониженную ADCC, пониженный ADCP и пониженную секрецию цитокинов. В конкретном варианте осуществления изобретения пониженная эффекторная функция представляет собой пониженную ADCC. В одном из вариантов осуществления изобретения пониженная ADCC составляет меньше 20% от ADCC, индуцируемой не подвергнутым инженерии Fc-доменом (или антителом, содержащим не подвергнутый инженерии Fc-домен).
1
1
1
1
1
В одном из вариантов осуществления изобретения аминокислотная мутация, которая снижает аффинность связывания Fc-домена с Fc-рецептором и/или эффекторную функцию, представляет собой аминокислотную замену. В одном из вариантов осуществления изобретения Fc-домен содержит аминокислотную замену в положении, выбранном из Е233, L234, L235, N297, Р331 и Р329 (нумерация согласно EU-индексу Кэбота). В более конкретном варианте осуществления изобретения Fc-домен содержит аминокислотную замену в положении, выбранном из L234, L235 и Р329 (нумерация согласно EU-индексу Кэбота). В некоторых вариантах осуществления изобретения Fc-домен содержит аминокислотные замены L234A и L235A (нумерация согласно EU-индексу Кэбота). В одном из указанных вариантов осуществления изобретения Fc-домен представляет собой Fc-домен IgG, в частности, Fc-домен человеческого IgG. В одном из вариантов осуществления изобретения Fc-домен содержит аминокислотную замену в положении Р329. В более конкретном варианте осуществления изобретения аминокислотная замена представляет собой Р329А или P329G, в частности P329G (нумерация согласно EU-индексу Кэбота). В одном из вариантов осуществления изобретения Fc-домен содержит аминокислотную замену в положении Р329 и, кроме того, аминокислотную замену в положении, выбранном из Е233, L234, L235, N297 и Р331 (нумерация согласно EU-индексу Кэбота). В более конкретных вариантах осуществления изобретения дополнительная аминокислотная замена представляет собой Е233Р, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D или P331S. В конкретном варианте осуществления изобретения Fc-домен содержит аминокислотные замены в положениях Р329, L234 и L235 (нумерация согласно EU-индексу Кэбота). В более конкретных вариантах осуществления изобретения Fc-домен содержит аминокислотные мутации L234A, L235A и P329G («P329G LALA», «PGLALA» или «LALAPG). В частности, в конкретном варианте осуществления изобретения каждая из субъединиц Fc-домена содержит аминокислотные замены L234A, L235A и P329G (нумерация согласно EU-индексу Кэбота), т.е. в каждой из первой и второй субъединиц Fc-домена остаток лейцина в положении 234 заменен на остаток аланина (L234A), остаток лейцина в положении 235 заменен на остаток аланина (L235A) и остаток пролина в положении 329 заменен на остаток глицина (P329G) (нумерация согласно EU-индексу Кэбота). В одном из указанных вариантов осуществления изобретения Fc-домен представляет собой Fc-домен IgG, в частности Fc-домен человеческого IgG. Комбинация аминокислотных замен «P329G LALA» практически полностью элиминирует связывание с Fcγ-рецептором Fc-домена человеческого IgG (а также комплементом), что описано в публикации РСТ WO 2012/130831, которая полностью включена в настоящее описание в качестве ссылки. В WO 2012/130831 описаны также методы получения указанных мутантных Fc-доменов, методы изучения их свойств, таких как связывание с Fc-рецептором или эффекторные функции.
4
1
4
4
4
4
4
4
4
Антитела IgG-подкласса обладают пониженной аффинностью к связыванию с Fc-рецепторами и пониженными эффекторными функциями по сравнению с антителами IgG-подкласса. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления изобретения Fc-домен антитела, содержащегося в иммуноконъюгате, предлагаемом в изобретении, представляет собой Fc-домен IgG, в частности Fc-домен человеческого IgG. В одном из вариантов осуществления изобретения Fc-домен IgG содержит аминокислотные замены в положении S228, конкретно аминокислотную замену S228P (нумерация согласно EU-индексу Кэбота). Для дополнительного снижения аффинности связывания с Fc-рецептором и/или его эффекторной функции в одном из вариантов осуществления изобретения Fc-домен IgG содержит аминокислотную замену в положении L235, в частности, аминокислотную замену L235E (нумерация согласно EU-индексу Кэбота). В другом варианте осуществления изобретения Fc-домен IgG содержит аминокислотную замену в положении Р329, в частности, аминокислотную замену P329G (нумерация согласно EU-индексу Кэбота). В конкретном варианте осуществления изобретения Fc-домен IgG содержит аминокислотные замены в положениях S228, L235 и Р329, в частности, аминокислотные замены S228P, L235E и P329G (нумерация согласно EU-индексу Кэбота). Указанные мутанты Fc-домена IgG и их особенности связывания с Fcγ-рецептором описаны в публикации РСТ WO 2012/130831, которая полностью включена в настоящее описание в качестве ссылки.
1
1
4
В конкретном варианте осуществления изобретения Fc-домен, характеризующийся пониженной аффинностью связывания с Fc-рецептором и/или пониженной эффекторной функцией по сравнению с нативным Fc-доменом IgG, представляет собой Fc-домен человеческого IgG, содержащий аминокислотные замены L234A, L235A и необязательно P329G, или Fc-домен человеческого IgG, содержащий аминокислотные замены S228P, L235E и необязательно P329G (нумерация согласно EU-индексу Кэбота).
В некоторых вариантах осуществления изобретения элиминировали N-гликозилирование Fc-домена. В одном из указанных вариантов осуществления изобретения Fc-домен содержит аминокислотную мутацию в положении N297, в частности, аминокислотную замену аспарагина на аланин (N297A) или аспарагиновую кислоту (N297D) (нумерация согласно EU-индексу Кэбота).
Помимо Fc-доменов, описанных выше и в публикации РСТ WO 2012/130831, Fc-домены с пониженной способностью связываться с Fc-рецептором и/или эффекторной функцией включают также Fc-домены с заменой одного или нескольких остатков 238, 265, 269, 270, 297, 327 и 329 (US №637056) (нумерация согласно EU-индексу Кэбота). К указанным мутантам Fc относятся мутанты Fc с заменами в двух или большем количестве из аминокислотных положений 265, 269, 270, 297 и 327, включая так называемый мутант Fc-домена «DANA» с заменой остатков 265 и 297 на аланин (US №7332581).
Мутантные Fc-домены можно получать путем аминокислотной делеции, замены, инсерции или модификации с использованием генетических или химических методов, хорошо известных в данной области. Генетические методы могут включать сайтнаправленный мутагенез кодирующей ДНК последовательности, ПЦР, синтез генов и т.п. Правильность нуклеотидных замен можно подтверждать, например, секвенированием.
Связывание с Fc-рецепторами можно легко определять, например, с помощью ELISA или поверхностного плазмонного резонанса (SPR) с использованием стандартного оборудования, такого как устройство BIAcore (фирма GE Healthcare), и с применением таких Fc-рецепторов, которые можно получать методом рекомбинантной экспрессии. Альтернативно этому, аффинность связывания Fc-доменов или антител, содержащих Fc-домен, с Fc-рецепторами можно оценивать с использованием клеточных линий, для которых известно, что они экспрессируют конкретные Fc-рецепторы, такие как человеческие NK-клетки, экспрессирующие FcγIIIa-рецептор.

Эффекторную функцию Fc-домена или антитела, содержащего Fc-домен, можно оценивать методами, известными в данной области. Примеры анализов in vitro, предназначенных для оценки ADCC-активности представляющей интерес молекулы, описаны в US №5500362; у Hellstrom и др., Proc Natl Acad Sci USA 83, 1986, сс. 7059-7063 и Hellstrom и др., Proc Natl Acad Sci USA 82, 1985, cc. 1499-1502; US №5821337; у Bruggemann и др., J Exp Med 166, 1987, cc. 1351-1361. Альтернативно этому, можно применять методы, основанные на нерадиоактивном анализе (см., например, ACTI™ - нерадиоактивный анализ цитотоксичности с помощью проточной цитометрии (фирма CellTechnology, Inc. Маунтин-Вью, шт. Калифорния); и CytoTox 96 - нерадиоактивный анализ цитотоксичности (фирма Promega, Мэдисон, шт. Висконсин)). Приемлемыми эффекторными клетками для таких анализов являются мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) и естественные клетки-киллеры (NK). В альтернативном или дополнительном варианте ADCC-активность представляющей интерес молекулы можно оценивать in vivo, например, с использованием созданных на животных моделей, описанных у Clynes и др., Proc Natl Acad Sci USA 95, 1998, cc. 652-656.
В некоторых вариантах осуществления изобретения снижают связывание Fc-домена с компонентом системы комплемента, в частности с C1q. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления изобретения, в которых Fc-домен конструируют так, чтобы он обладал пониженной эффекторной функцией, указанная пониженная эффекторная функция включает пониженную CDC. Можно осуществлять анализы связывания C1q для решения вопроса о том, может ли Fc-домен или антитело, содержащее Fc-домен, связываться с C1q и, как следствие, обладает ли он CDC-активностью (см., например, анализы связывания с C1q и С3с с помощью ELISA, описанные в WO 2006/029879 и WO 2005/100402). Для оценки активации комплемента можно осуществлять анализ CDC (см., например, Gazzano-Santoro и др., J Immunol Methods 202, 1996, с. 163; Cragg и др., Blood 101, 2003, cc. 1045-1052 и Cragg и Glennie, Blood 103, 2004, cc. 2738-2743).
Анализ FcRn-связывания и определение клиренса/времени полужизни in vivo можно осуществлять также с использованием методов, известных в данной области (см., например, Petkova S.B. и др., Int'l. Immunol. 18(12), 2006, cc. 1759-1769; WO 2013/120929).
Конкретные объекты изобретения
Одним из объектов изобретения является иммуноконъюгат, содержащий мутантный полипептид IL-2 и антитело, которое связывается с PD-1,
в котором мутантный полипептид IL-2 представляет собой молекулу человеческого IL-2, которая содержит аминокислотные замены F42A, Y45A и L72G (нумерация относительно последовательности человеческого IL-2 SEQ ID NO: 19); и
в котором антитело содержит (а) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, и (б) вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15.
Одним из объектов изобретения является иммуноконъюгат, содержащий мутантный полипептид IL-2 и антитело, которое связывается с PD-1,
в котором мутантный полипептид IL-2 представляет собой молекулу человеческого IL-2, которая содержит аминокислотные замены Т3А, F42A, Y45A, L72G и С125А (нумерация относительно последовательности человеческого IL-2 SEQ ID NO: 19); и
в котором антитело содержит (а) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, и (б) вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15.
Одним из объектов изобретения является иммуноконъюгат, содержащий мутантный полипептид IL-2 и антитело, которое связывается с PD-1,
в котором мутантный полипептид IL-2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20; и
в котором антитело содержит (а) (а) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, и (б) вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15.
1
В одном из вариантов осуществления любого из указанных выше объектов изобретения антитело представляет собой иммуноглобулин IgG-класса, содержащий Fc-домен человеческого IgG, который состоит из первой и второй субъединиц,
в котором в первой субъединице Fc-домена остаток треонина в положении 366 заменен на остаток триптофана (T366W), а во второй субъединице Fc-домена остаток тирозина в положении 407 заменен на остаток валина (Y407V) и необязательно остаток треонина в положении 366 заменен на остаток серина (T366S) и остаток лейцина в положении 368 заменен на остаток аланина (L368A) (нумерация согласно EU-индексу Кэбота),
и в котором также каждая субъединица Fc-домена содержит аминокислотные замены L234A, L235A и P329G (нумерация согласно EU-индексу Кэбота).
В указанном варианте осуществления изобретения мутантный полипептид IL-2 может быть слит на его аминоконцевой аминокислоте с карбоксиконцевой аминокислотой первой субъединицы Fc-домена через линкерный пептид, имеющий SEQ ID NO: 21.
Одним из объектов изобретения является иммуноконъюгат, содержащий полипептид, который содержит аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% последовательности SEQ ID NO: 22, полипептид, который содержит аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% последовательности SEQ ID NO: 23 или SEQ ID NO: 24, и полипептид, который содержит аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% последовательности SEQ ID NO: 25.
Полинуклеотиды
Изобретение относится также к выделенным полинуклеотидам, которые кодируют иммуноконъюгат, указанный в настоящем описании, или его фрагмент. В некоторых вариантах осуществления изобретения указанный фрагмент представляет собой антигенсвязывающий фрагмент.
Полинуклеотиды, кодирующие иммуноконъюгаты, предлагаемые в изобретении, можно экспрессировать в виде индивидуального полинуклеотида, который кодирует полный иммуноконъюгат, или в виде нескольких (например, двух или большего количества) совместно экспрессируемых полинуклеотидов. Полипептиды, кодируемые совместно экспрессируемыми полинуклеотидами, можно объединять путем ассоциации, например, через дисульфидные связи или другими путями с получением функционального иммуноконъюгата. Например, часть антитела, представляющая собой легкую цепь, может кодироваться полинуклеотидом, отличным от полинуклеотида, который кодирует часть иммуноконъюгата, представляющую собой тяжелую цепь антитела и мутантный полипептид IL-2. При совместной экспрессии полипептиды тяжелой цепи должны связываться с полипептидами легкой цепи с образованием иммуноконъюгата. В другом примере часть иммуноконъюгата, содержащую одну из двух субъединиц Fc-домена и мутантный полипептид IL-2, может кодироваться полинуклеотидом, отличным от того, который кодирует часть иммуноконъюгата, содержащую вторую из двух субъединиц Fc-домена. При совместной экспрессии субъединицы Fc-домена должны в результате ассоциации образовывать Fc-домен.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный полинуклеотид кодирует полный иммуноконъюгат, предлагаемый в изобретении, который указан в настоящем описании. В других вариантах осуществления изобретения выделенный полинуклеотид кодирует полипептид, содержащийся в иммуноконъюгате, предлагаемом в изобретении, который указан в настоящем описании.
В одном из вариантов осуществления изобретения выделенный полинуклеотид, предлагаемый в изобретении, кодирует тяжелую цепь антитела, содержащегося в иммуноконъюгате (например, тяжелую цепь иммуноглобулина), и мутантный полипептид IL-2. В другом варианте осуществления изобретения выделенный полинуклеотид, предлагаемый в изобретении, кодирует легкую цепь антитела, содержащегося в иммуноконъюгате.
В некоторых вариантах осуществления изобретения полинуклеотид или нуклеиновая кислота представляет собой ДНК. В других вариантах осуществления изобретения полинуклеотид, предлагаемый в настоящем изобретении, представляет собой РНК, например, в форме матричной РНК (мРНК). РНК, предлагаемая в настоящем изобретении, может быть одноцепочечной или двухцепочечной.
Методы рекомбинации
Мутантные полипептиды IL-2, применяемые в изобретении, можно получать с помощью делеции, замены, инсерции или модификации, используя генетические или химические методы, известные в данной области. Генетические методы могут включать сайтнаправленный мутагенез кодирующей ДНК последовательности, ПЦР, синтез генов и т.п. Правильность нуклеотидных замен можно подтверждать, например, секвенированием. Следует отметить, что нуклеотидная последовательность нативного IL-2 описана у Taniguchi с соавторами (Nature 302, 1983, cc. 305-310), а нуклеиновая кислота, кодирующая человеческий IL-2, доступна из публичных депозитариев, таких как Американская коллекция типовых культур (Роквилл, шт. Мэриленд). Последовательность нативного человеческого IL-2 представлена в SEQ ID NO: 19. Замена или инсерция может включать встречающиеся в естественных условиях или не встречающееся в естественных условиях аминокислотные остатки. Аминокислотная модификация включает хорошо известные методы химической модификации, такие как добавление сайтов гликозилирования или присоединения углеводов и т.п.
Иммуноконъюгаты, предлагаемые в изобретении, можно получать с помощью твердофазного пептидного синтеза (например, твердофазный синтез Меррифилда) или методом рекомбинации. Для рекомбинантного получения один или несколько полинуклеотидов, кодирующих иммуноконъюгат (фрагмент), например, описанный выше, выделяют и встраивают в один или несколько векторов для дальнейшего клонирования и/или экспрессии в клетке-хозяине. Указанный полинуклеотид можно легко выделять и секвенировать с помощью общепринятых процедур. Одним из объектов изобретения является вектор, предпочтительно экспрессионный вектор, содержащий один или несколько полинуклеотидов, предлагаемых в изобретении. Методы, хорошо известные специалистам в данной области, можно применять для конструирования экспрессионных векторов, содержащих кодирующую последовательность иммуноконъюгата (фрагмента), наряду с приемлемыми контролирующими транскрипцию/трансляцию сигналами. Эти методы включают технологии рекомбинантной ДНК in vitro, методы синтеза и рекомбинации/генетической рекомбинации in vivo (см., например, методы, описанные у Maniatis и др., Maniatis и др., Molecular Cloning A Laboratory Manual, изд-во Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., 1989; и Ausubel и др., Current Protocols in Molecular Biology, изд-во Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y., 1989). Экспрессионный вектор может представлять собой часть плазмиды, вируса или может представлять собой фрагмент нуклеиновой кислоты. Экспрессионный вектор включает кассету экспрессии, в которой полинуклеотид, кодирующий иммуноконъюгат (фрагмент) (т.е. кодирующую область), клонируют с обеспечением функциональной связи с промотором и/или другими элементами, контролирующими транскрипцию или трансляцию. В контексте настоящего описания «кодирующая область» представляет собой часть нуклеиновой кислоты, которая состоит из кодонов, транслируемых в аминокислоты. Хотя «стоп-кодон» (TAG, TGA или ТАА) не транслируется в аминокислоту, он, в случае его присутствия, может рассматриваться как часть кодирующей области, однако любые фланкирующие последовательности, например, промоторы, сайты связывания рибосом, терминаторы транскрипции, интроны, 5'- и 3'-нетранслируемые области и т.п., не являются частью кодирующей области. Две или большее количество кодирующих областей может присутствовать в индивидуальной полинуклеотидной конструкции, например, индивидуальном векторе, или в отдельных полинуклеотидных конструкциях, например, отдельных (различных) векторах. Кроме того, любой вектор может содержать одну кодирующую область или может содержать две или большее количество кодирующих областей, например, вектор, предлагаемый в настоящем изобретении, может кодировать один или несколько полипептидов, которые пост- или котранляционно разделяются на конечные белки посредством протеолитического расщепления. Кроме того, вектор, полинуклеотид или нуклеиновая кислота, предлагаемый/предлагаемая в изобретении, может кодировать гетерологичные кодирующие области, либо слитые, либо не слитые с полинуклеотидом, который кодирует иммуноконъюгат, предлагаемый в изобретении, или его варианты или производные. Гетерологичные кодирующие области включают (но не ограничиваясь только ими) специализированные элементы или мотивы, такие как секреторный сигнальный пептид или гетерологичный функциональный домен. Функциональная связь имеет место, когда кодирующая область генного продукта, например полипептида, ассоциирована с одной или несколькими регуляторными последовательностями таким образом, чтобы экспрессия генного продукта находилась под воздействием или контролем регуляторной(ых) последовательности(ей). Два ДНК-фрагмента (таких как кодирующая область полипептида и ассоциированный с ней промотор) являются «функционально связанными», если индукция промоторной функции приводит к транскрипции мРНК, кодирующей требуемый генный продукт, и если природа связи между двумя ДНК-фрагментами не оказывает воздействия на способность регулирующих экспрессию последовательностей направлять экспрессию генного продукта, или не оказывает воздействия на способность ДНК-матрицы к транскрипции. Таким образом, промоторная область должна быть функционально связана с нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид, если промотор обладает способностью осуществлять транскрипцию нуклеиновой кислоты. Промотор может представлять собой специфический для клетки промотор, который обеспечивает значительную транскрипцию ДНК только в предварительно отобранных клетках. Другие контролирующие транскрипцию элементы, помимо промотора, например, энхансеры, операторы, репрессоры и сигналы терминации транскрипции, можно функционально связывать с полинуклеотидом для обеспечения специфической для клетки транскрипции. Приемлемые промоторы и другие контролирующие транскрипцию области представлены в настоящем описании. Специалистам в данной области известно широкое разнообразие контролирующих транскрипцию областей. Они включают (но не ограничиваясь только ими) контролирующие транскрипцию области, которые функционируют в клетках позвоночных животных, такие как (но не ограничиваясь только ими) сегменты промоторов и энхансеров из цитомегаловирусов (например, немедленно-ранний промотор в сочетании с интроном-А), обезьяньего вируса 40 (например, ранний промотор) и ретровирусов (таких как вирус саркомы Рауса). Другие контролирующие транскрипцию области включают области, происходящие из генов позвоночных животных, таких как ген актина, белка теплового шока, бычьего гормона роста и кроличьего β-глобина, а также другие последовательности, которые могут контролировать экспрессию генов в эукариотических клетках. Дополнительные приемлемые контролирующие транскрипцию области включают тканеспецифические промоторы и энхансеры, а также индуцибельные промоторы (например, промоторы, индуцируемые тетрациклинами). Аналогично этому, обычным специалистам в данной области известно широкое разнообразие контролирующих трансляцию элементов. Они включают (но не ограничиваясь только ими) сайты связывания рибосом, кодоны инициации трансляции и терминирующие кодоны и элементы, происходящие из вирусных систем (в частности внутренний сайт посадки рибосом или IRES, который обозначают также как CITE-последовательность). Кассета экспрессии может включать также другие характерные структуры, такие как сайт инициации репликации и/или интегрированные в хромосому элементы, такие как длинные концевые повторы (LTR) ретровирусов, или инвертированные концевые повторы (ITR) аденоассоциированного вируса (AAV).
Кодирующие области полинуклеотида и нуклеиновой кислоты, предлагаемые в настоящем изобретении, могут быть ассоциированы с дополнительными кодирующими областями, которые кодируют секреторные или сигнальные пептиды, направляющие секрецию полипептида, который кодируется полинуклеотидом, предлагаемым в настоящем изобретении. Согласно гипотезе, касающейся сигналов, белки, секретируемые клетками млекопитающих, имеют сигнальный пептид или секреторную лидерную последовательность, который/которая отщепляется от зрелого белка после инициации экспорта растущей белковой цепи через шероховатый эндоплазматический ретикулум. Обычным специалистам в данной области должно быть очевидно, что полипептиды, секретируемые клетками позвоночных животных, как правило, имеют сигнальный пептид, слитый с N-концом полипептида, который отщепляется от транслируемого полипептида с образованием секретируемой или «зрелой» формы полипептида.
Например, человеческий IL-2 транслируется с состоящей из 20 аминокислот сигнальной последовательностью на N-конце полипептида, которая затем отщепляется с образованием зрелого, состоящего из 133 аминокислот человеческого IL-2. В некоторых вариантах осуществления изобретения применяют нативный сигнальный пептид, например, сигнальный пептид IL-2 или сигнальный пептид тяжелой цепи или легкой цепи иммуноглобулина или функциональное производное указанной последовательности, которое сохраняет способность направлять секрецию полипептида, функционального связанного с ним. Альтернативно этому, можно применять гетерологичный сигнальный пептид млекопитающих или его функциональное производное. Например, лидерную последовательность дикого типа можно заменять на лидерную последовательность человеческого тканевого активатора плазминогена (ТРА) или мышиной β-глюкуронидазы.
ДНК, кодирующую короткую белковую последовательность, которую можно применять для облегчения дальнейшей очистки (например, гистидиновую метку), или предназначенную для мечения слитого белка, можно включать внутрь или на концы полинуклеотида, кодирующего иммуноконъюгат (фрагмент).
-
Другим объектом изобретения является клетка-хозяин, содержащая один или несколько полинуклеотидов, предлагаемых в изобретении. Некоторыми объектами изобретения является клетка-хозяин, содержащая один или несколько векторов, предлагаемых в изобретении. Полинуклеотиды и векторы могут обладать любыми особенностями, индивидуально или в сочетании, указанными в настоящем описании касательно полинуклеотидов и векторов соответственно. В одном из объектов изобретения клетка-хозяин содержит вектор (например, трансформирована или трансфектирована вектором), содержащий полинуклеотид, который кодирует иммуноконъюгат, предлагаемый в изобретении. В контексте настоящего описания понятие «клетка-хозяин» относится к любому типу клеточной системы, которую можно конструировать для получения иммуноконъюгатов, предлагаемых в изобретении, или их фрагментов. Клетки-хозяева, пригодные для репликации и для поддержания экспрессии иммуноконъюгатов, хорошо известны в данной области. Такие клетки можно трансфектировать или трансдуцировать соответствующим образом конкретным экспрессионным вектором и можно выращивать большее количество содержащих вектор клеток с целью внесения в ферментеры для крупномасштабных процессов получения иммуноконъюгата в достаточных для клинических применений количествах. Приемлемыми клетками-хозяевами являются прокариотические микроорганизмы, такие как Е. coli, или различные эукариотические клетки, такие как клетки яичника китайского хомячка (СНО), клетки насекомых или т.п. Например, полипептиды можно получать в бактериях, в частности, когда отсутствует потребность в гликозилировании. После экспрессии полипептид можно выделять из пасты бактериальных клеток в растворимую фракцию и можно дополнительно очищать. Помимо прокариот, в качестве хозяев для клонирования или экспрессии векторов, которые кодируют полипептид, можно использовать эукариотические микроорганизмы, такие как нитчатые грибы или дрожжи, включая штаммы грибов и дрожжей, пути гликозилирования которых были «гуманизированы», что позволяет получать полипептид с частично или полностью человеческой схемой гликозилирования (см. Gerngross, Nat. Biotech. 22, 2004, cc. 1409-1414 и Li и др., Nat. Biotech. 24, 2006, cc. 210-215). Клетки-хозяева, которые можно использовать для экспрессии (гликозилированных) полипептидов, получают также из многоклеточных организмов (беспозвоночных и позвоночных животных). Примерами клеток беспозвоночных являются клетки насекомых, а также можно применять клетки растений. Были выявлены многочисленные бакуловирусные штаммы и соответствующие пригодные для них в качестве хозяев клетки насекомых, в частности для трансфекции клеток Spodoptera frugiperda. В качестве хозяев можно применять также культуры растительных клеток (см., например, US №№5959177, 6040498, 6420548, 7125978 и 6417429 (описание технологии PLANTIBODIES™ для получения антител в трансгенных растениях). В качестве хозяев можно применять также клетки позвоночных животных. Например, можно использовать клеточные линии млекопитающих, которые адаптированы к росту в суспензии. Другими примерами приемлемых линий клеток-хозяев млекопитающих являются линия клеток почки обезьяны CV1, трансформированная с помощью SV40 (COS-7); линия клеток почки эмбриона человека (293 или клетки линии 293, субклонированные с целью выращивания в суспензионной культуре, Graham и др., J. Gen. Virol., 36, 1977, с. 59); клетки почки детеныша хомяка (ВНК); клетки Сертоли мыши (ТМ4-клетки, описанные, например, у Mather, Biol. Reprod., 23, 1980, сс. 243-251); клетки почки обезьяны (CV1); клетки почки африканской зеленой мартышки (VERO-76,); клетки карциномы шейки матки человека (HELA); клетки почки собаки (MDCK); клетки печени бычьей крысы (BRL 3А); клетки легкого человека (W138); клетки печени человека (Hep G2); клетки опухоли молочной железы мыши (ММТ 060562); клетки TRI, описанные, например, у Mather и др., Annals N.Y. Acad. Sci., 383, 1982, сс. 44-68); клетки MRC 5 и клетки FS4. Другими ценными линиями клеток-хозяев млекопитающих являются клетки яичника китайского хомячка (СНО), включая dhfr-CHO-клетки (Urlaub и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 1980, с. 4216); и клеточные линии миеломы, такие как Y0, NS0, Р3Х63 и Sp2/0. Обзор конкретных линий клеток-хозяев млекопитающих, которые можно применять для производства белка, см., например, у Yazaki и Wu, в: Methods in Molecular Biology под ред. В.K.С. Lo, изд-во Humana Press, Totowa, NJ, т. 248, 2003, cc. 255-268. Клетки-хозяева включают культивируемые клетки, например, культивируемые клетки млекопитающих, клетки дрожжей, клетки насекомых, клетки бактерий и клетки растений (но не ограничиваясь только ими), а также клетки, находящиеся в организме трансгенного животного, трансгенного растения или культивируемой растительной или животной ткани. В одном из вариантов осуществления изобретения клетка-хозяин представляет собой эукариотическую клетку, предпочтительно клетку млекопитающего, такую как клетка яичника китайского хомячка (СНО), клетка почки человеческого эмбриона (HEK) или лимфоидная клетка (например, клетка Y0, NS0, Sp20).
В данной области известны стандартные технологии для экспрессии чужеродных генов в этих системах. Клетки, экспрессирующие мутантный полипептид IL-2, слитый либо с тяжелой, либо с легкой цепью антитела, можно конструировать таким образом, чтобы в них происходила также экспрессия и других цепей антитела, например, в результате чего экспрессируемый слитый продукт мутанта IL-2 включал антитело, которое имеет как тяжелую, так и легкую цепи.
Одним из объектов изобретения является способ получения иммуноконъюгата, предлагаемого в изобретении, где способ включает культивирование клетки-хозяина, содержащей один или несколько полинуклеотидов, кодирующих иммуноконъюгат, предлагаемый в изобретении, и необязательно выделение иммуноконъюгата из клетки-хозяина (или культуральной среды клетки-хозяина).
В иммуноконъюгате, предлагаемом в изобретении, мутантный полипептид IL-2 можно генетически сливать с антителом или можно химически конъюгировать с антителом. Генетическое слияние полипептида IL-2 с антителом можно создавать так, чтобы сливать последовательность IL-2 с полипептидом непосредственно или опосредованного через линкерную последовательность. Состав и длину линкера можно определять с помощью методов, хорошо известных в данной области и можно оценивать их эффективность. Конкретные линкерные пептиды представлены в настоящем описании. При необходимости можно включать также дополнительные последовательности в сайт расщепления для разделения индивидуальных компонентов слияния, например, распознаваемую эндопептидазой последовательность. Кроме того, слитый белок IL-2 можно синтезировать химически, используя методы синтеза полипептидов, хорошо известные в данной области (например, твердофазный синтез Меррифилда). Мутантные полипептиды IL-2 можно химически конъюгировать с другими молекулами, например антителами, используя хорошо известные методы химической конъюгации. Для этой цели можно применять бифункциональные перекрестносшивающие реагенты, такие как гомофункциональные или гетерофункциональные перекрестносшивающие реагенты, хорошо известные в данной области. Тип предназначенного для применения перекрестносшивающего реагента зависит от природы молекулы, подлежащей слиянию с IL-2, его легко могут определять специалисты в данной области. В альтернативном или дополнительном варианте мутант IL-2 и/или молекулу, предназначенную для конъюгации с ним, можно химически дериватизировать так, чтобы их обоих можно было конъюгироваться с использованием отдельной реакции, что также хорошо известно в данной области.
Иммуноконъюгаты, предлагаемые в изобретении, содержат антитело. Методы получения антител хорошо известны в данной области (см., например, Harlow и Lane, «Antibodies: a Laboratory Manual», изд-во Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). He встречающиеся в естественных условиях антитела можно создавать с помощью твердофазного пептидного синтеза, можно получать с помощью методов рекомбинации (например, описанных в US №4186567) или можно получать, например, путем скрининга комбинаторных библиотек, содержащих вариабельные области тяжелых цепей и вариабельные области легких цепей (см., например, US №5969108 на имя McCafferty). Иммуноконъюгаты, антитела и методы их получения подробно описаны также в публикациях РСТ WO 2011/020783, WO 2012/107417 и WO 2012/146628, каждая из которых полностью включена в настоящее описание в качестве ссылки.
В иммуноконъюгатах, предлагаемых в изобретении можно применять антитело любых видов животных. Примерами антител, которые можно применять согласно настоящему изобретению, являются (но не ограничиваясь только ими) конструкции, полученные из организма мышей, приматов или человека. Если иммуноконъюгат предназначен для применения на человеке, то можно использовать химерную форму антитела, в которой константные области антитела получают из человеческого антитела. Гуманизированную или полностью человеческую форму антитела можно получать также с помощью методов, хорошо известных в данной области (см., например, US №5565332 на имя Winter). Для осуществления гуманизации можно применять различные методы, такие как (но не ограничиваясь только ими) (а) трансплантация нечеловеческих (например, из антитела-донора) CDR в человеческий (например, антитело-реципиент) каркасный участок и константные области, сохраняющие или не сохраняющие имеющие решающее значение остатки каркасного участка (например, остатки, важные для сохранения хорошей антигенсвязывающей аффинности или функций антитела), (б) трансплантация только нечеловеческих определяющих специфичность участков (SDR или a-CDR; остатки имеют решающее значение для взаимодействия антитело-антиген) в человеческие каркасные и константные области, или (в) трансплантация полных нечеловеческих вариабельных доменов, но их «маскировка» напоминающим человеческий сегментом путем замены поверхностных остатков. Обзор гуманизированных антител и методов их получения см., например, у Almagro и Fransson, Front Biosci 13, 12008, сс. 1619-1633, и они описаны также, например, у Riechmann и др., Nature 332, 1988, сс. 323-329; Queen и др., Proc Natl Acad Sci USA 86, 1989, cc. 10029-10033; US, №№5821337, 7527791, 6982321 и 7087409; Kashmiri и др., Methods 36, 2005, cc. 25-34) (описание трансплантации SDR (a-CDR)); Padlan, Mol Immunol 28, 1991, cc. 489-498 (описание метода изменения поверхности («повторное покрытие»)); Dall'Acqua и др., Methods 36, 2005, сс. 43-60 (описание «перестановки FR») и Osbourn и др., Methods 36, 2005, сс. 61-68, и Klimka и др., Br J Cancer 83, 2000, сс. 252-260 (описание подхода на основе «целенаправленной селекции» для перестановки FR). Человеческие каркасные участки, которые можно применять для гуманизации, включают (но не ограничиваясь только ими): каркасные участки, выбранные на основе метода «наилучшего подбора» (см., например, Sims и др., J. Immunol. 151, 1993, с. 2296); каркасные участки, выведенные из консенсусной последовательности человеческих антител конкретной подгруппы вариабельных областей легких или тяжелых цепей (см., например, Carter и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 1992, с. 4285; и Presta и др., J. Immunol., 151, 1993, с. 2623); человеческие зрелые (подвергнутые соматической мутации) каркасные участки или каркасные участки человеческой зародышевой линии (см., например, Almagro и Fransson, Front. Biosci. 13, 2008, cc. 1619-1633); и каркасные участки, полученные в результате скрининга FR-библиотек (см., например, Васа и др., J. Biol. Chem. 272, 1997, cc. 10678-10684) и Rosok и др., J. Biol. Chem. 271, 1996, cc. 22611-22618).
Человеческие антитела можно получать различными методами, известными в данной области. Человечески антитела описаны в целом у van Dijk и van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5, 2001, cc. 368-374 и Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20, 2008, cc. 450-459. Человеческие антитела можно получать путем введения иммуногена трансгенному животному, которое модифицировано таким образом, что продуцирует интактные человеческие антитела или интактные антитела с человеческими вариабельными областями в ответ на контрольное заражение антигеном. Указанные животные, как правило, содержат все или часть локусов человеческого иммуноглобулина, которыми заменены эндогенные локусы иммуноглобулина, или которые присутствуют вне хромосом или интегрированы произвольно в хромосомы животного. У таких трансгенных мышей эндогенные локусы иммуноглобулина, как правило, инактивированы. Обзор методов получения человеческих антител в трансгенных животных см. у Lonberg, Nat. Biotech. 23, 2005, cc. 1117-1125. Они описаны также, например, в US №№6075181 и 6150584 в которых описана технология XENOMOUSE™; US №5770429, в котором описана технология HUMAB; US 7041870, в котором описана технология K-М MOUSE и в публикации заявки на патент США №2007/0061900, в котором описана технология VELOCIMOUSE. Человеческие вариабельные области интактных антител, полученные в таких животных, можно дополнительно модифицировать, например, объединяя с человеческой константной областью из другого антитела.
Человеческие антитела можно получать также с помощью методов, основанных на применении гибридом. Описаны клеточные линии человеческой миеломы и мышиной-человеческой гетеромиеломы, предназначенные для получения человеческих моноклональных антител (см., например, Kozbor, J. Immunol., 133, 1984, с. 3001; Brodeur и др., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, 1987, cc. 51-63 (изд-во Marcel Dekker, Inc., New York); и Boerner и др., J. Immunol., 147, 1991, c. 86). Человеческие антитела, созданные с помощью технологии, основанной на применении человеческих В-клеточных гибридом, описаны также у Li и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103, 2006, cc. 3557-3562. Дополнительные методы представляют методы, описанные, например, в US №7189826 (описание получения моноклональных человеческих антител типа IgM из клеточных линий гибридом) и у Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4), 2006, cc. 265-268 (описание человеческих-человеческих гибридом). Технология, основанная на применении человеческих гибридом (Trioma-технология), описана также у Vollmers и Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3), 2005, cc. 927-937 и Vollmers и Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3), 2005, cc. 185-191.
Человеческие антитела можно создавать также путем выделения из библиотек человеческих антител, представленных в настоящем описании.
Антитела, применяемые согласно изобретению, можно выделять путем скрининга комбинаторных библиотек в отношении антител с требуемой(ыми) активностью или видами активности. Обзор методов скрининга комбинаторных библиотек представлен, например, у Lerner и др. в Nature Reviews 16, 2016, cc. 498-508. Например, в данной области известны различные методы создания фаговых дисплейных библиотек и скрининга указанных библиотек в отношении антител, обладающих требуемыми характеристиками связывания. Обзор таких методов представлен, например, у Frenzel и др. в mAbs 8, 2016, cc. 1177-1194; Bazan и др. в Human Vaccines and Immunotherapeutics 8, 2012, cc. 1817-1828 и Zhao и др., в Critical Reviews in Biotechnology 36, 2016, cc. 276-289, а также у Hoogenboom и др. в Methods in Molecular Biology 178, 2001, cc. 1-37 (под ред.  и др., изд-во Human Press, Totowa) и у Marks и Bradbury в Methods in Molecular Biology 248, 2003, cc. 161-175, (под ред. Lo, изд-во Human Press). При осуществлении некоторых методов фагового дисплея популяции VH- и VL-генов клонируют по отдельности с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и рекомбинируют произвольно в фаговых библиотеках, которые затем подвергают скринингу в отношении антигенсвязывающего фага согласно методу, описанному у Winter и др., Ann. Rev. Immunol., 12, 1994, cc. 433-455. Фаг, как правило, экспонирует фрагменты антител либо в виде одноцепочечных Fv-фрагментов (scFv), либо в виде Fab-фрагментов. Библиотеки, полученные из иммунизированных источников, включают антитела, обладающие высокой аффинностью к иммуногену, при этом отсутствует необходимость в создании гибридом. Альтернативно этому, можно клонировать необработанную («наивную») популяцию (например, из организма человека), получая один источник антител к широкому спектру чужих, а также своих антигенов без какой-либо иммунизации, что описано у Griffiths и др., EMBO J, 12, 1993, сс. 725-734. И, наконец, «наивные» библиотеки можно получать также методами синтеза путем клонирования неперегруппированных сегментов V-гена из стволовых клеток и с помощью ПЦР-праймеров, содержащих случайную последовательность, для кодирования гипервариабельных CDR3-участков и для осуществления перегруппировки in vitro согласно методу, описанному у Hoogenboom и Winter, J. Mol. Biol., 227, 1992, сс. 381-388. Фаговые библиотеки человеческих антител описаны, например, в следующих патентных публикациях: US №№5750373; 7985840; 7785903 и 8679490, а также в публикациях патентов США №№.2005/0079574, 2007/0117126, 2007/0237764 и 2007/0292936. Кроме того, примеры известных в данной области методов скрининга комбинаторных библиотек в отношении антител с требуемой(ыми) активностью или видами активности включают рибосомный и мРНК-дисплей, а также методы дисплея и селекции антител на бактериях, клетках млекопитающих, клетках насекомых или клетках дрожжей. Обзор методов дисплея на поверхности дрожжей представлен, например, у Scholler и др. в Methods in Molecular Biology 503, 2012, сс. 135-156 и у Cherf и др. в Methods in Molecular biology 1319, 2015, сс. 155-175, а также у Zhao и др., в Methods in Molecular Biology 889, 2012, сс. 73-84. Методы рибосомного дисплея описаны, например, у Не и др., в Nucleic Acids Research 25, 1997, сс. 5132-5134 и у Hanes и др., в PNAS 94, 1997, сс. 4937-4942.
Может потребоваться дополнительная химическая модификация иммуноконъюгата, предлагаемого в изобретении. Например, можно решать проблемы, связанные с иммуногенностью и коротким временем полужизни путем конъюгации с практически прямоцепочечными полимерами, такими как полиэтиленгликоль (ПЭГ) или полипропилегликоль (ППГ) (см., например, WO 87/00056).
Иммуноконъюгаты, полученные согласно настоящему описанию, можно очищать с использованием известных в данной области методик, таких как жидкостная хроматография высокого разрешения, ионообменная хроматография, гель-электрофорез, аффинная хроматография, гель-фильтрация и т.п.
Фактические условия, применяемые для очистки конкретного белка, зависят, в частности, от таких факторов, как чистый заряд, гидрофобность, гидрофильность и т.д., и они должны быть очевидны специалисту в данной области. Для очистки антитела с помощью аффинной хроматографии можно использовать лиганд, рецептор или антиген, с которым связывается иммуноконъюгат. Например, можно применять антитело, которое специфически связывается с мутантным полипептидом IL-2. Для очистки с помощью аффинной хроматографии иммуноконъюгатов, предлагаемых в изобретении, можно использовать матрикс с белком А или белком G. Например, последовательное применение аффинной хроматографии на белке А или G и гель-фильтрации можно использовать для выделения иммуноконъюгата, практически согласно методу, описанному в разделе «Примеры». Чистоту иммуноконъюгата можно определять с помощью любого из широкого разнообразия хорошо известных аналитических методов, включая гель-электрофорез, жидкостную хроматографию высокого давления и т.п.
Композиции, препаративные формы и пути введения
Следующим объектом изобретения являются фармацевтические композиции, содержащие иммуноконъюгат, представленный в настоящем описании, например, предназначенные для применения в любом из указанных ниже терапевтических способов. В одном из вариантов осуществления изобретения фармацевтическая композиция содержит любой из иммуноконъюгатов, представленных в настоящем описании, и фармацевтически приемлемый носитель. В другом варианте осуществления изобретения фармацевтическая композиция содержит любой из иммуноконъюгатов, представленных в настоящем описании, и по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое средство, например, указанное ниже.
Кроме того, предложен способ получения иммуноконъюгата, предлагаемого в изобретении, в форме, пригодной для введения in vivo, где способ включает (а) получение иммуноконъюгата, предлагаемого в изобретении, и (б) приготовление препаративной формы иммуноконъюгата в сочетании по меньшей мере с одним фармацевтически приемлемым носителем, с получением иммуноконъюгата в форме, предназначенной для введения in vivo.
Фармацевтические композиции, предлагаемые в настоящем изобретении, содержат в терапевтически эффективном количестве иммуноконъюгат, который растворен или диспергирован в фармацевтически приемлемом носителе. Понятия «фармацевтически или фармакологически приемлемый» относятся к молекулярным субстанциям и композициям, которые, в целом, нетоксичны для реципиентов в применяемых дозах и концентрациях, т.е. не вызывают вредные, аллергические или другие нежелательные реакции при введении при необходимости животному, такому, например, как человек. Приготовление фармацевтической композиции, которая содержит иммуноконъюгат и необязательно дополнительное действующее вещество, должно быть очевидно специалистам в данной области в свете настоящего описания, например, из справочника Remington's Pharmaceutical Sciences, 18-ое изд., изд-во Mack Printing Company, 1990, включенного в настоящее описание в качестве ссылки. Кроме того, как должно быть очевидно, для введения животному (например, человеку) препараты должны удовлетворять стандартам стерильности, пирогенности, общей безопасности и чистоты в соответствиями с требованиями отдела биологических стандартов FDA или соответствующих руководящих органов в других странах. Предпочтительные композиции представляют собой лиофилизированные препаративные формы или водные растворы. В контексте настоящего описания «фармацевтически приемлемый носитель» включает любые и все растворители, буферы, дисперсионные среды, покрытия, поверхностно-активные вещества, антиоксиданты, консерванты (например, антибактериальные агенты, противогрибковые агенты), агенты для придания изотоничности, замедляющие абсорбцию агенты, соли, консерванты, антиоксиданты, белки, лекарственные средства, стабилизаторы лекарственных средств, полимеры, гели, связывающие вещества, эксципиенты, разрыхлители, замасливатели, подслащивающие вещества, корригенты, красители, материалы, подобные указанным, и их комбинации, которые должны быть известны обычному специалисту в данной области (см., например, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18-ое изд., изд-во Mack Printing Company, 1990, сс. 1289-1329, включенный в настоящее описание в качестве ссылки). Предполагается, что в терапевтических или фармацевтических композициях можно применять любой из общепринятых носителей, за исключением тех случаев, когда он является несовместимым с действующим веществом.
Иммуноконъюгат, предлагаемый в изобретении (и любое дополнительное терапевтические средство), можно вводить любыми приемлемыми путями, включая парентеральную, внутрилегочную и внутриназальную и при необходимости местную обработку, введение в повреждение. Парентеральные инфузии включают внутримышечное, внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное или подкожное введение. Введение доз можно осуществлять с помощью любого приемлемого пути, например, с помощью инъекций, таких как внутривенные или подкожные инъекции, в зависимости, в том числе от того, является ли введение кратковременным или хроническим.
Парентеральные композиции включают композиции, созданные для введения путем инъекции, например, подкожной, внутрикожной, внутрь повреждения, внутривенной, внутриартериальной, внутримышечной, подоболочечной или внутрибрюшинной инъекции. Для инъекции иммуноконъюгаты, предлагаемые в изобретении, можно включать в препаративные формы в виде водных растворов, предпочтительно в физиологически совместимых буферах, таких как раствор Хэнкса, раствор Рингера или физиологический соляной буфер. Раствор может содержать предназначенные для получения препаративной формы агенты, такие как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие агенты. Альтернативно этому, иммуноконъюгаты могут находиться в порошкообразной форме, предназначенной для восстановления перед применением приемлемым наполнителем, например, стерильной не содержащей пирогенов водой. Стерильные инъецируемые растворы приготавливают путем включения иммуноконъюгатов, предлагаемых в изобретении, в требуемом количестве в соответствующий растворитель при необходимости в сочетании с различными другими ингредиентами, перечисленными ниже. Стерильность можно легко обеспечивать, например, путем фильтрации через стерильные фильтрующие мембраны. Как правило, дисперсии получают путем включения различных стерилизованных действующих веществ в стерильный наполнитель, который содержит основную дисперсионную среду и/или другие ингредиенты. В случае стерильных порошков для получения стерильных инъецируемых растворов, суспензий или эмульсий предпочтительными методами получения являются вакуумная сушка или сушка вымораживанием, которые позволяют получать порошок действующего вещества в сочетании с любым дополнительным требуемым ингредиентом из предварительно стерилизованной фильтрацией жидкой среды. При необходимости жидкая среда перед осуществлением инъекции может быть соответствующим образом забуферена и жидкому разбавителю сначала придана изотоничность с помощью достаточного количества соляного раствора или глюкозы. Композиция должна быть стабильной в условиях приготовления и хранения и защищена от загрязняющего действия микроорганизмов, таких как бактерии и грибы. Принято поддерживать загрязнение эндотоксинами на минимальном безопасном уровне, например, менее 0,5 нг/мг белка. Пригодные фармацевтически приемлемые носители включают (но не ограничиваясь только ими): буферы, такие как фосфатный, цитратный и буферы на основе других органических кислот; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты(такие как октадецилдиметилбензиламмонийхлорид; гексаметонийхлорид; бензалконийхлорид; бензетонийхлорид; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; катехол, резорцинол; циклогексанол; 3-пентанол и мета-крезол); низкомолекулярные (содержащие менее примерно 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, такие как ЭДТА; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексы с металлами (например, комплексы Zn-белок); и/или неионогенные поверхностно-активные вещества, такие как полиэтиленгликоль (ПЭГ). Водные суспензии для инъекций могут содержать соединения, которые повышают вязкость суспензии, такие как натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы, сорбит, декстран или т.п. Необязательно суспензия может содержать также стабилизаторы или агенты, которые повышают растворимость соединений, что позволяет получать высококонцентрированные растворы. Кроме того, суспензии действующих веществ можно получать в виде соответствующих масляных предназначенных для инъекции суспензий. Приемлемые липофильные растворители или наполнители включают жирные нелетучие масла, такие как кунжутное масло, или синтетические эфиры жирных кислот, такие как этилолеаты или триглицериды, или липосомы.
Действующие вещества можно заключать в микрокапсулы, например, полученные с помощью методов коацервации или межфазной полимеризации, например в гидроксипропилметилцеллюлозные или желатиновые микрокапсулы и поли(метилметакрилатные) микрокапсулы соответственно, в коллоидные системы введения лекарственного средства (например, в липосомы, альбуминовые микросферы, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в макроэмульсии. Такие методы описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences (18-ое изд., изд-во Mack Printing Company, 1990). Приемлемыми примерами препаратов с замедленным высвобождением являются полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобных полимеров, включающие полипептид, такие матрицы представляют собой изделия определенной формы, например, пленки или микрокапсулы. В конкретных вариантах осуществления изобретения для достижения пролонгированной абсорбции инъецируемой композиции можно применять в композиции агенты, замедляющие абсорбцию, такие, например, как моностеарат алюминия, желатин или их комбинации.
Помимо описанных выше композиций, иммуноконъюгаты можно приготавливать также в виде препарата в форме депо. Указанные препаративные формы длительного действия можно применять путем имплантации (например, подкожной или внутримышечной) или внутримышечной инъекции. Так, например, иммуноконъюгат можно включать в препаративные формы в сочетании с приемлемыми полимерными или гидрофобными материалами (например, в виде эмульсии в приемлемом масле) или ионообменными смолами, или в виде умеренно растворимых производных, например, умеренно растворимой соли.
Фармацевтические композиции, содержащие иммуноконъюгаты, предлагаемые в изобретении, можно приготавливать с помощью общепринятых процессов смешения, растворения, эмульгирования, капсулирования, захвата или лиофилизации. Фармацевтические композиции можно включать в препаративные формы с помощью общепринятого метода с использованием одного или нескольких физиологически приемлемых носителей, разбавителей, эксципиентов или вспомогательных веществ, которые облегчают обработку белков, с получением препаратов, которые можно применять в фармацевтических целях. Соответствующая форма зависит от выбранного пути введения.
Иммуноконъюгаты можно включать в композицию в виде свободной кислоты или свободного основания, в нейтральной форме или в форме соли. Фармацевтически приемлемые соли представляют собой соли, которые практически сохраняют биологическую активность свободной кислоты или свободного основания. Они включают кислотно-аддитивные соли, например, соли, образованные со свободными аминогруппами белковой композиции, или образованные с неорганическими кислотами, такими, например, как соляная или фосфорная кислота, или такими органическими кислотами, как уксусная, щавелевая, винная или миндальная кислота. Соли, образованные со свободными карбоксильными группами, можно получать также из неорганических оснований, таких, например, как гидроксиды натрия, калия, аммония, кальция или железа; или таких органических оснований как изопропиламин, триметиламин, гистидин или прокаин. Фармацевтические соли имеют тенденцию к более высокой растворимости в водных и других протонных растворителях по сравнению с соответствующими формами в виде свободных оснований.
Способы и композиции для терапевтического применения
Любой из иммуноконъюгатов, представленных в настоящем описании, можно применять в терапевтических способах. Иммуноконъюгаты, предлагаемые в изобретении, можно применять в качестве иммунотерапевтических агентов, например, при лечении раков.
Для применения в терапевтических способах иммуноконъюгаты, предлагаемые в изобретении, можно включать в состав препаративных форм, дозировать и вводить в соответствии с надлежащей клинической практикой. Рассматриваемые в этом контексте факторы включают конкретное нарушение, подлежащее лечению, конкретное млекопитающее, подлежащее лечению, клиническое состояние индивидуального пациента, причину заболевания, область введения агента, метод введения, схему введения и другие факторы, известные практикующим медикам.
Иммуноконъюгаты, предлагаемые в изобретении, наиболее целесообразно применять для лечения болезненных состояний, при которых благоприятное действие оказывает стимуляция иммунной системы хозяина, в частности состояний, при которых требуется повышенный клеточный иммунный ответ. Они могут включать болезненные состояния, при которых иммунный ответ хозяина является недостаточным или несовершенным. Болезненные состояния, при которых можно применять иммуноконъюгаты, предлагаемые в изобретении, включают, например, опухоль или инфекцию, при которой клеточный иммунный ответ является имеющим решающее значение механизмом специфического иммунитета. Иммуноконъюгаты, предлагаемые в изобретении, можно вводить per se или в любой приемлемой фармацевтической композиции.
Одним из объектов изобретения являются иммуноконъюгаты, предлагаемые в изобретении, предназначенные для применения в качестве лекарственного средства. Другими объектами изобретения являются иммуноконъюгаты, предназначенные для лечения заболевания. В некоторых объектах изобретения иммуноконъюгаты, предлагаемые в изобретении, предназначены для применения в способе лечения. Одним из вариантов осуществления изобретения является иммуноконъюгат, представленный в настоящем описании, предназначенный для применения для лечения заболевания у индивидуума, который нуждается в этом. Некоторыми вариантами осуществления изобретения является иммуноконъюгат, предназначенный для применения в способе лечения индивидуума, имеющего заболевание, который включает введение индивидууму иммуноконъюгата в терапевтически эффективном количестве. В некоторых вариантах осуществления изобретения заболевание, подлежащее лечению, представляет собой пролиферативное нарушение. В предпочтительном варианте осуществления изобретения заболевание представляет собой рак. В некоторых вариантах осуществления изобретения способ включает также введение индивидууму в терапевтически эффективном количестве по меньшей мере одного дополнительного терапевтического средства, например, противоракового средства, если заболевание, подлежащее лечению, представляет собой рак. Другими вариантами осуществления изобретения является иммуноконъюгат, предназначенный для применения для стимуляции иммунной системы. Некоторыми вариантами осуществления изобретения является иммуноконъюгат, предназначенный для применения в способе стимуляции иммунной системы у индивидуума, включающем введение индивидууму в эффективном количестве иммуноконъюгата для стимуляции иммунной системы. «Индивидуум» в контексте любого из указанных выше вариантов осуществления изобретения представляет собой млекопитающее, предпочтительно человека. «Стимуляция иммунной системы» в контексте любого из указанных выше вариантов осуществления изобретения может включать один или несколько показателей, таких как общее повышение иммунной функции, повышение Т-клеточной функции, повышение В-клеточной функции, восстановление лимфоцитарной функции, повышение экспрессии рецепторов IL-2, повышение Т-клеточной реактивности, повышение активности естественных клеток-киллеров или активности лимфокин-активированной клетки-киллера (LAK) и т.п.
Следующим объектом изобретения является применение иммуноконъюгата, предлагаемого в изобретении, для производства или приготовления лекарственного средства. В одном из вариантов осуществления изобретения лекарственное средство предназначено для лечения заболевания у индивидуума, нуждающегося в этом. В одном из вариантов осуществления изобретения лекарственное средство предназначено для применения в способе лечения заболевания, включающем введение индивидууму, который имеет заболевание, в терапевтически эффективном количестве лекарственного средства. В некоторых вариантах осуществления изобретения заболевание, подлежащее лечению, представляет собой пролиферативное нарушение. В предпочтительном варианте осуществления изобретения заболевание представляет собой рак. В одном из указанных вариантов осуществления изобретения способ включает также введение индивидууму в терапевтически эффективном количестве по меньшей мере одного дополнительного терапевтического средства, например, противоракового средства, если заболевание, подлежащее лечению, представляет собой рак. В следующем варианте осуществления изобретения лекарственное средство предназначено для стимуляции иммунной системы. В другом варианте осуществления изобретения лекарственное средство предназначено для применения в способе стимуляции иммунной системы у индивидуума, включающем введение индивидууму в эффективном количестве лекарственного средства для стимуляции иммунной системы. «Индивидуум» в контексте любого из указанных выше вариантов осуществления изобретения представляет собой млекопитающее, предпочтительно человека. «Стимуляция иммунной системы» в контексте любого из указанных выше вариантов осуществления изобретения может включать один или несколько показателей, таких как общее повышение иммунной функции, повышение Т-клеточной функции, повышение В-клеточной функции, восстановление лимфоцитарной функции, повышение экспрессии рецепторов IL-2, повышение Т-клеточной реактивности, повышение активности естественных клеток-киллеров или активности лимфокин-активированной клетки-киллера (LAK) и т.п.
Следующим объектом изобретения является способ лечения заболевания у индивидуума. В одном из вариантов осуществления изобретения способ включает введение индивидууму, имеющему такое заболевание, в терапевтически эффективном количестве иммуноконъюгата, предлагаемого в изобретении. В одном из вариантов осуществления изобретения указанному индивидууму вводят композицию, которая содержит иммуноконъюгат, предлагаемый в изобретении, в фармацевтически приемлемой форме. В некоторых вариантах осуществления изобретения заболевание, подлежащее лечению, представляет собой пролиферативное нарушение. В предпочтительном варианте осуществления изобретения заболевание представляет собой рак. В некоторых вариантах осуществления изобретения способ включает также введение индивидууму в терапевтически эффективном количестве по меньшей мере одного дополнительного терапевтического средства, например, противоракового средства, если заболевание, подлежащее лечению, представляет собой рак. Следующим объектом изобретения является способ стимуляции иммунной системы у индивидуума, включающий введение индивидууму в эффективном количестве мутантного полипептида IL-2 или иммуноконъюгата для стимуляции иммунной системы. «Индивидуум» в контексте любого из указанных выше вариантов осуществления изобретения представляет собой млекопитающее, предпочтительно человека. «Стимуляция иммунной системы» в контексте любого из указанных выше вариантов осуществления изобретения может включать один или несколько показателей, таких как общее повышение иммунной функции, повышение Т-клеточной функции, повышение В-клеточной функции, восстановление лимфоцитарной функции, повышение экспрессии рецепторов IL-2, повышение Т-клеточной реактивности, повышение активности естественных клеток-киллеров или активности лимфокин-активированной клетки-киллера (LAK) и т.п.
В некоторых вариантах осуществления изобретения заболевание, подлежащее лечению, представляет собой пролиферативное нарушение, предпочтительно рак. Примерами рака являются (но не ограничиваясь только ими) рак мочевого пузыря, рак головного мозга, рак головы и шеи, рак поджелудочной железы, рак легкого, рак молочной железы, рак яичника, рак матки, рак шейки матки, рак эндометрия, рак пищевода, рак ободочной кишки, колоректальный рак, ректальный рак, рак желудка, рак предстательной железы, рак крови, рак кожи, плоскоклеточная карцинома, рак кости и рак почки. Другие нарушения клеточной пролиферации, которые можно лечить с использованием иммуноконъюгата, предлагаемого в настоящем изобретении, включают (но не ограничиваясь только ими) неоплазмы, локализованные в: животе, кости, молочной железе, пищеварительной системе, печени, поджелудочной железе, брюшине, эндокринных железах (надпочечник, паращитовидная, гипофиз, яички, яичник, тимус, щитовидная), глазу, голове и шеи, нервной системе (центральной и периферической), лимфатической системе, тазовой области, коже, мягкой ткани, селезенке, грудном отделе и мочеполовой системе. Также под объем изобретения подпадают предраковые состояния или повреждения и метастазы рака. В некоторых вариантах осуществления изобретения рак выбирают из группы, включающей рак почки, рак кожи, рак легкого, колоректальный рак, рак молочной железы, рак головного мозга, рак головы и шеи, рак предстательной железы и рак мочевого пузыря. Специалисту в данной области должно быть очевидно, что во многих случаях иммуноконъюгаты не могут обеспечивать исцеление, а могут только оказывать частичное благоприятное воздействие. В некоторых вариантах осуществления изобретения физиологические изменения, обладающие некоторым благоприятным действием, рассматриваются также как терапевтически ценные. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления изобретения количество иммуноконъюгата, которое обеспечивает физиологическое изменение, рассматривается как «эффективное количество» или «терапевтически эффективное количество». Субъект, пациент или индивидуум, нуждающийся в лечении, представляет собой, как правило, млекопитающее, более конкретно человека.
В некоторых вариантах осуществления изобретения иммуноконъюгаты, предлагаемые в изобретении, в эффективном количестве вводят в клетку. В других вариантах осуществления изобретения иммуноконъюгаты, предлагаемые в изобретении, вводят в терапевтически эффективном количестве индивидууму для лечения заболевания.
Для предупреждения или лечения заболевания соответствующая доза иммуноконъюгата, предлагаемого в изобретении (при его применении индивидуально или в сочетании с один или несколькими другими дополнительными терапевтическими средствами), должна зависеть от типа заболевания, подлежащего лечению, пути введения, веса тела пациента, типа молекулы (например, от наличия или отсутствия Fc-домена), серьезности и течения заболевания, от того, вводят ли иммуноконъюгат в превентивных или терапевтических целях, предшествующих или осуществляемых одновременно терапевтических вмешательств, истории болезни пациента и ответа на иммуноконъюгат и предписания лечащего врача. Практикующий специалист, ответственный за введение, в любом случае, должен определять концентрацию действующего(их) вещества(в) в композиции и соответствующую(ие) дозу(ы) для индивидуального пациента. Различные схемы введения доз включают (но не ограничиваясь только ими) однократное введение или несколько введений в различные моменты времени, болюсное введение и пульсирующую инфузию.
Иммуноконъюгат можно вводить пациенту в виде одной обработки или серий обработок. В зависимости от типа и серьезности заболевания примерно от 1 мкг/кг до 15 мг/кг (например, 0,1-10 мг/кг) иммуноконъюгата может представлять собой начальную возможную дозу для введения пациенту, например, с использованием одного или нескольких индивидуальных введений или с помощью непрерывной инфузии. Типичная суточная доза может составлять от примерно 1 мкг/кг до 100 мг/кг или более в зависимости от отмеченных выше факторов. Для повторных введений в течение нескольких дней или более продолжительного периода в зависимости от состояния лечение, как правило, должно продолжаться до достижения требуемого подавления имеющихся симптомов заболевания. В качестве примера, доза иммуноконъюгата может составлять от примерно 0,005 до примерно 10 мг/кг. В другом примере (но не ограничиваясь только указанным) доза на одно введение может составлять от примерно 1, примерно 5, примерно 10, примерно 50, примерно 100, примерно 200, примерно 350, примерно 500 мкг/кг веса тела, примерно 1, примерно 5, примерно 10, примерно 50, примерно 100, примерно 200, примерно 350, примерно 500 до примерно 1000 мг/кг/веса тела или более, и находиться в любом указанном диапазоне. В качестве примеров (но не ограничиваясь только ими) указанного диапазона значений, можно вводить от примерно 5 до примерно 100 мг/кг веса тела, от примерно 5 мкг/кг веса тела до примерно 500 мг/кг веса тела и т.д. с учетом указанных выше уровней доз. Так, пациенту можно вводить одну или несколько доз, составляющих примерно 0,5, 2,0, 5,0 или 10 мг/кг (или любую их комбинацию). Указанные дозы можно вводить прерывисто, например, каждую неделю или каждые три недели (например, таким образом, чтобы пациент получал от примерно двух до примерно двадцати или, например, примерно шесть доз иммуноконъюгата). Можно вводить начальную более высокую ударную дозу, после которой применять одну или несколько более низких доз. Однако можно использовать другие схемы введения доз. Успех такой терапии легко оценивать с помощью общепринятых методик и анализов.
Иммуноконъюгаты, предлагаемые в изобретении, как правило, следует применять в количестве, эффективном для достижения поставленной цели. При применении для лечения или предупреждения болезненного состояния иммуноконъюгаты, предлагаемые в изобретении, или их фармацевтические композиции, вводят или применяют в терапевтически эффективном количестве. Определение терапевтически эффективного количества находится в компетенции специалистов в данной области, в частности в свете представленного подробного описания изобретения.
50
Для системного введения терапевтически эффективную дозу можно сначала определять с помощью анализов in vitro, например, анализов с использованием клеточных культур. Затем дозу можно включать в форму для изучения на животных моделях для достижения концентрации в кровотоке, находящейся в диапазоне, включающем значение IC, определенное на клеточной культуре. Указанную информацию можно использовать для более точного определения доз, которые можно применять на людях.
Начальные дозы можно оценивать также, исходя из данных, полученных in vivo, например, на животных моделях, используя методики, хорошо известные в данной области. Обычный специалист в данной области легко может оптимизировать применение на людях на основе данных, полученных на животных.
Уровень доз и интервал можно регулировать индивидуально для получения уровней в плазме иммуноконъюгатов, которые являются достаточными для поддержания терапевтического действия. Обычные дозы, предназначенные для введения пациенту путем инъекции, составляют от примерно 0,1 до 50 мг/кг/день, как правило, от примерно 0,5 до 1 мг/кг/день. Для достижения терапевтически эффективных уровней в плазме можно вводить несколько доз каждый день. Уровни в плазме можно оценивать, например, с помощью ЖХВР.
В случаях местного применения или избирательного поглощения эффективная местная концентрация иммуноконъюгатов может не соответствовать концентрации в плазме. Специалист в данной области может оптимизировать терапевтически эффективные местные дозы без чрезмерных экспериментов.
50
50
50
50
50
Применение в терапевтически эффективной дозе иммуноконъюгатов, представленных в настоящем описании, должно, как правило, обеспечивать терапевтическую пользу, не вызывая существенной токсичности. Токсичность и терапевтическую эффективность иммуноконъюгата можно определять с помощью стандартных фармацевтических процедур на культурах клеток или экспериментальных животных. Анализы на клеточных культурах или опыты на животных можно применять для определения значений LD (доза, смертельная для 50% популяции) и ED (доза, терапевтически эффективная для 50% популяции). Соотношение доз, характеризующих токсические и терапевтические действия, обозначают как терапевтический индекс, который можно выражать в виде соотношения LD/ED. Иммуноконъюгаты, имеющие высокие терапевтические индексы, являются предпочтительными. В одном из вариантов осуществления изобретения иммуноконъюгат, предлагаемый в настоящем изобретении, характеризуется высоким терапевтическим индексом. Данные, полученные в анализах с использованием клеточных культур и в опытах на животных, можно применять для определения диапазона доз, которые можно применять на людях. Доза лежит предпочтительно в диапазоне концентраций в кровотоке, которые включают ED, обладающих невысокой токсичностью или не обладающих токсичностью. Доза может варьироваться в зависимости от различных факторов, например, от применяемой лекарственной формы, применяемого пути введения, состояния индивидуума и т.п. Точную препаративную форму, путь введения и дозу может выбирать индивидуально врач в зависимости от состояния пациента (см., например, Fingl и др., в: The Pharmacological Basis of Therapeutics, гл. 1, 1975, с. 1, публикация полностью включена в настоящее описание в качестве ссылки).
Лечащему врачу пациентов, которым вводят иммуноконъюгаты, предлагаемые в изобретении, должно быть очевидно, как и когда заканчивать, прерывать или регулировать введение из-за токсичности, дисфункции органов и т.п. И, наоборот, лечащему врачу должно быть очевидно, как регулировать лечение в сторону применения более высоких доз, если клинический ответ является неадекватным (предотвращая токсичность). Величина вводимой дозы при лечении представляющего интерес нарушения должна варьироваться в зависимости от серьезности состояния, подлежащего лечению, пути введения и т.п. Серьезность состояния можно, например, оценивать среди прочего с помощью стандартных прогностических методов оценки. Кроме того, доза и предполагаемая частота введения дозы должны также варьироваться в зависимости от возраста, веса тела и ответа индивидуального пациента.
Максимальную терапевтическую дозу иммуноконъюгата, содержащего мутантный полипептид IL-2, можно повышать по сравнению с дозами, в которых применяют иммуноконъюгат, содержащий IL-2 дикого типа
Другие агенты и варианты лечения
Иммуноконъюгаты, предлагаемые в изобретении, при лечении можно вводить в сочетании с одним или несколькими другими агентами. Например, иммуноконъюгат, предлагаемый в изобретении, можно вводить совместно по меньшей мере с одним дополнительным терапевтическим средством. Понятие «терапевтическое средство» включает любое средство, которое вводят для лечения симптома или заболевания у индивидуума, который нуждается в таком лечении. Указанное дополнительное терапевтическое средство может представлять собой любое действующее вещество, которое можно применять при конкретном показании, подлежащем лечению, предпочтительно с дополнительными видами активности, которые не оказывают отрицательное действие друг на друга. В некоторых вариантах осуществления изобретения дополнительное терапевтическое средство представляет собой иммуномодулятор, цитостатическое средство, ингибитор клеточной адгезии, цитотоксическое средство, активатор клеточного апоптоза или средство, повышающее чувствительность клеток к индукторам апоптоза. В конкретном варианте осуществления изобретения дополнительное терапевтическое средство представляет собой противораковое средство, например, агент, разрушающий микротрубочки, антиметаболит, ингибитор топоизомеразы, интеркалятор ДНК, алкилирующий агент, средство гормональной терапии, ингибитор киназ, антагонист рецептора, активатор апоптоза опухолевых клеток или антиангиогенное средство.
Указанные другие средства могут присутствовать в комбинации в количествах, эффективных для указанных целей. Эффективное количество указанных других средств зависит от количества применяемого иммуноконъюгата, типа нарушения, подлежащего лечению, и других указанных выше факторов. Иммуноконъюгаты, как правило, применяют в таких же дозах и с использованием указанных в настоящем описании путей введения, или в дозах, составляющих примерно от 1 до 99% от указанных в настоящем описании доз, или в любой дозе и с использованием любого пути введения, которые согласно эмпирическим/клиническим данным рассматриваются как приемлемые.
Отмеченные выше комбинированные терапии предусматривают совместное введение (когда два или большее количество терапевтических средств включают в одну и ту же или в отдельные композиции) и раздельное введение, в этом случае введение иммуноконъюгата, предлагаемого в изобретении, можно осуществлять до, одновременно и/или после введения дополнительного терапевтического средства и/или адъюванта. Иммуноконъюгаты, предлагаемые в изобретении, можно применять также в сочетании с лучевой терапией.
Изделия
Другим объектом изобретения является изделие, которое содержит продукты, применяемые для лечения, предупреждения и/или диагностирования указанных выше нарушений. Изделие представляет собой контейнер и этикетку или листовку-вкладыш в упаковку, которые размещены на контейнере или прилагаются к нему. Приемлемыми контейнерами являются, например банки, пузырьки, шприцы, пакеты для внутривенного (IV) раствора и т.д. Контейнеры можно изготавливать из различных материалов, таких как стекло или пластмасса. Контейнер содержит композицию, которая сама по себе или в сочетании с другой композицией является эффективной для лечения, предупреждения и/или диагностирования состояния, и может иметь стерильный порт доступа (например, контейнер может представлять собой пакет для внутривенного раствора или пузырек, снабженный пробкой, которую можно прокалывать с помощью иглы для подкожных инъекций). По меньшей мере одно действующее вещество в композиции представляет собой иммуноконъюгат, предлагаемый в изобретении. На этикетке или листовке-вкладыше в упаковке указано, что композицию применяют для лечения выбранного состояния. Кроме того, изделие может включать (а) первый контейнер с находящейся в нем композицией, где композиция содержит иммуноконъюгат, предлагаемый в изобретении; и (б) второй контейнер с находящейся в нем композицией, где композиция содержит дополнительное цитотоксическое или иное терапевтическое средство. Согласно этому варианту осуществления изобретения изделие может содержать листовку-вкладыш в упаковке, которая содержит информацию о том, что композиции можно использовать для лечения конкретного состояния. В альтернативном или дополнительном варианте изделие может дополнительно включать второй (или третий) контейнер с фармацевтически приемлемым буфером, таким как бактериостатическая вода для инъекций (БСВИ), забуференный фосфатом физиологический раствор, раствор Рингера и раствор декстрозы. Кроме того, оно может включать другие продукты, необходимые с коммерческой точки зрения и с точки зрения потребителя, в частности, другие буферы, разбавители, фильтры, иглы и шприцы.
Краткое описание чертежей
На чертежах показано:
на фиг. 1 схематическое изображение формата иммуноконъюгата IgG-IL-2, содержащего мутантный полипептид IL-2;
на фиг. 2 данные, демонстрирующие связывание PD1-IL2v с CD4 Т-клетками (А) и CD8 Т-клетками (Б) в активированных ФГА РВМС в сравнении с PD1 IgG и CEA-IL2v;
на фиг. 3 - данные о пролиферации NK-клеток (A), CD8 Т-клеток (Б) и CD4 Т-клеток (В) в РВМС при использовании PD1-IL2v, CEA-IL2v и комбинации PD1 IgG плюс CEA-IL2v. PD1 IgG включали в качестве контроля;
на фиг. 4 данные об активации NK-клеток (A), CD8 Т-клеток (Б) и CD4 Т-клеток (В) в РВМС при использовании PD1-IL2v, CEA-IL2v и комбинации PD1 IgG плюс CEA-IL2v. PD1 IgG включали в качестве контроля. Уровень экспрессии CD25 на NK-клетках, CD4 Т-клетках и CD8 Т-клетках применяли в качестве маркера активации;
на фиг. 5 - данные о пролиферации предварительно активированных ФГА CD8 Т-клеток (А) и CD4 Т-клеток (Б) в РВМС при использовании PD1-IL2v, CEA-IL2v и комбинации PD1 IgG плюс CEA-IL2. PD1 IgG PD1 IgG включали в качестве контроля;
на фиг. 6 - данные об активации предварительно активированных ФГА CD8 Т-клеток (А) и CD4 Т-клеток (Б) в РВМС при использовании PD1-IL2v, СЕА-IL2v и комбинации PD1 IgG плюс CEA-IL2. PD1 IgG PD1 IgG включали в качестве контроля. Уровень экспрессии CD25 на NK-клетках, CD4 Т-клетках и CD8 Т-клетках применяли в качестве маркера активации;
на фиг. 7 - данные о пролиферации линии человеческих NK-клеток NK92, индуцированной PD-L1-IL2v, в сравнении с CEA-IL2v (А) или индуцированной PD-L1-IL2v в сравнении с PD1-IL2v (Б), полученные через 2 дня;
на фиг. 8 данные о связывании PD-L1-muIL2v и PD-L1 muIgG1 с позитивной по PD-L1 мышиной линии Т-клеток CTLL2;
на фиг. 9 - данные о пролиферации позитивной по PD-L1 мышиной линии Т-клеток CTLL2, индуцированной PD1-muIL2v в сравнении с CEA-muIL2v (А), или индуцированной PD1-muIL2v в сравнении с PD-L1-muIL2v (Б), полученные через 3 дня;
на фиг. 10 - результаты эксперимента по оценке эффективности с использованием конъюгатов PD1-IL2v, PD-L1-IL2v или антител к PD1 и PD-L1 в качестве индивидуальных агентов. Применяемую для трансфекции линию клеток карциномы поджелудочной железы Panc02-H7-Fluc инъецировали в поджелудочные железы мышей линии Black 6 для оценки выживаемости с использованием ортотопической сингенной модели опухоли поджелудочной железы;
на фиг. 11 - результаты эксперимента по оценке эффективности с использованием конъюгатов PD1-IL2v, PD-L1-IL2v или антител к PD1 и PD-L1 в качестве индивидуальных агентов. Применяемую для трансфекции линию клеток карциномы поджелудочной железы Panc02-H7-Fluc инъецировали в поджелудочные железы мышей линии Black 6 для оценки выживаемости с использованием ортотопической сингенной модели опухоли поджелудочной железы с помощью биолюминесценции;
на фиг. 12 - данные о способности CD4 Т-клеток секретировать IL-2 (А), IL-2 и IFN-γ (Б) или IFN-γ (В) после 48 ч бустер-обработки иммуногенным белком рр65 CMV в присутствии либо только антитела к PD-1 или к PD-L1 в комбинации с IL-2v, либо в виде слитых белков;
на фиг. 13 данные о статусе дифференцировки вирусоспецифических CD4 Т-клеток, секретирующих только IL-2 (А), и IL-2, и IFN-γ (Б) или только IFN-γ (В и Г) после 48 ч бустер-обработки иммуногенным белком рр65 CMV в присутствии либо только антитела к PD-1 или к PD-L1, либо в комбинации с IL-2v, либо в виде слитых белков;
conv
reg
conv
reg
на фиг. 14 - результаты конкурентного анализа связывания антител к PD1 и PD1-IL2v с активированными каноническими и регуляторными Т-клетками. Представлены данные об изменении частоты связывания на T-клетках в сравнении с T-клетками (фиг. 14А) и связывания с T- и T-клетками (фиг. 14Б);
reg
conv
reg
conv
на фиг. 15 данные о реверсии подавления T-клетками T-клеток с помощью PD1-IL2v. Представлены данные о проценте подавления T-клетками гранзима В (фиг 15А) и интерферона-γ (фиг. 15Б), секретируемых T, после совместного культивирования в течение 5 дней;
на фиг. 16 - результаты эксперимента по оценке эффективности, позволяющие сравнивать действие антител muPD1-IL2v с muFAP-IL2v и muPD-1 при их применении в качестве индивидуальных агентов и в комбинации;
на фиг. 17 - результаты эксперимента по оценке эффективности, позволяющие сравнивать действие muPD1-IL2v с FAP-IL2v, muPD1 и их комбинаций;
на фиг. 18А и 18Б - иммуногистохимические изображения опухолей поджелудочных желез, окрашенных антителом к мышиному CD3 (фиг. 18А), и результаты количественного анализа Т-клеток (фиг. 18Б);
на фиг. 19 - иммуногистохимические изображения опухолей поджелудочных желез, окрашенных антителом к мышиному PD1;
на фиг. 20 - иммуногистохимические изображения опухолей поджелудочных желез, окрашенных антителом к мышиному ICOS;
на фиг. 21 - результаты эксперимента по оценке эффективности, позволяющие сравнивать действие muPD1-IL2v с FAP-IL2v и muPD1 в качестве индивидуальных агентов и их комбинаций;
на фиг. 22 - результаты эксперимента по оценке эффективности, позволяющие сравнивать действие muPD1-IL2v с FAP-IL2v, muPD1 и их комбинаций с использованием двух различных доз;
на фиг. 23 - иммуногистохимические изображения опухолей поджелудочных желез, окрашенных антителом к мышиному CD3;
на фиг. 24А и 24Б - иммуногистохимические изображения опухолей поджелудочных желез, окрашенных антителом к мышиному CD8 (фиг. 24А), и результаты количественного анализа Т-клеток (фиг. 24Б);
на фиг. 25А и 25Б - иммуногистохимические изображения опухолей поджелудочных желез, окрашенных антителом к гранзиму В (фиг. 25А), и результаты количественного анализа площади маркера гранзима В (фиг. 25Б);
на фиг. 26А и 26Б - иммуногистохимические изображения опухолей поджелудочных желез, окрашенных антителом к мышиному PD1 (фиг. 26А), и результаты количественного анализа PD1-позитивных клеток (фиг. 26Б);
на фиг. 27 А-Г данные о способности CD4 Т-клеток секретировать IL-2 (A), IL-2 и IFN-γ (Б) или IFN-γ (В) и способности к пролиферации (Г) после 48 ч бустер-обработки иммуногенным белком рр65 CMV в присутствии либо только антитела к PD-1, либо в комбинации с IL-2v, либо в виде слитого белка;
на фиг. 28 данные о статусе дифференцировки на основе экспрессии CD45RO и CD62L вирусоспецифических CD4 Т-клеток, секретирующих IFN-γ, после 48 ч бустер-обработки иммуногенным белком рр65 CMV в присутствии либо только антитела к PD-1, либо в комбинации с IL-2v, либо в виде слитого белка;
на фиг. 29А-Г - результаты 8ТАТ5-анализа на покоящихся РВМС первого донора (CD8 Т-клетки (А), NK-клетки (Б), CD4 Т-клетки (В) и регуляторные Т-клетки (Г));
на фиг. 30А-Г результаты анализа STAT5 на покоящихся РВМС второго донора (CD4 Т-клетки (A), CD8 Т-клетки (Б), регуляторные Т-клетки (В) и NK-клетки (Г));
на фиг. 31А-Г - результаты анализа STAT5 на покоящихся РВМС третьего донора (CD8 Т-клетки (А), NK-клетки (Б), CD4 Т-клетки (В) и регуляторные Т-клетки (Г));
на фиг. 32А-Г результаты анализа STAT5 на покоящихся РВМС четвертого донора (CD8 Т-клетки (А), NK-клетки (Б), CD4 Т-клетки (В) и регуляторные Т-клетки (Г)).
Аминокислотные последовательности
Примеры
Ниже представлены примеры способов и композиций, предлагаемых в изобретении. Как должно быть очевидно, можно осуществлять на практике различные другие варианты осуществления изобретения с учетом представленного выше описания изобретения в целом.
Пример 1
Пример 1А. Получение слитых белков PD1-IL2v
1
4
3
1
каппа
Кассету экспрессии для слитого белка тяжелая цепь антитела - интерлейкин-2 (IL-2) [вариабельная область тяжелой цепи антитела к человеческому PD-1, тяжелая цепь человеческого IgG (несущая мутации L234A, L235A и P329G (EU-нумерация) для элиминации эффекторных функций и мутации S354C и T366W (EU-нумерация) для гетеродимеризации («выступ»)), линкер (GS) и человеческий IL-2v (несущий мутации Т3А, F42A, Y45A, L72G и С125А)], кассету экспрессии для тяжелой цепи антитела [вариабельная область тяжелой цепи антитела к человеческому PD-1 и тяжелая цепь человеческого IgG (несущая мутации L234A, L235A и P329G (EU-нумерация) для элиминации эффекторных функций, мутации Y349C, T366S, L368A и Y410V (EU-нумерация) для гетеродимеризации («впадина») и необязательно мутации H435R и Y436F (EU-нумерация)] и кассету экспрессии для легкой цепи антитела [вариабельная область легкой цепи антитела к человеческому PD-1 и константная область человеческой С] получали с помощью синтеза генов.
Каждую из них клонировали путем расщепления HindIII и NheI в экспрессионном векторе под контролем CMV-промотора, за которым располагался интронА, и, в завершении, поли(А)-сигнал BGH. Вектор дополнительно содержал ген, обусловливающий устойчивость бактерий к ампициллину, и сайт инициации репликации из E. coli.
Слитый белок человеческий PD1-IL-2v (SEQ ID NO: 22, 24 и 25) создавали путем совместной трансфекции HEK293E-клеток (фирма Invitrogen) описанными выше векторами в соотношении 1:1:1 во встряхиваемых колбах. Через 1 неделю супернатант собирали и фильтровали через стерильные фильтры.
Слитый белок очищали из супернатанта путем объединения аффинной хроматографии на белке А и гель-фильтрации. Полученный продукт характеризовали в отношении идентичности с помощью масс-спектрометрии и в отношении свойств, таких как чистота, с помощью капиллярного электрофореза (КЭ-ДСН), содержание мономера и стабильность.
Аналогичным образом получали слитый белок мышиный аналог PD1-IL2v (SEQ ID NO: 34-36). Молекула-аналог содержала антитело к мышиному PD-1 в виде мышиного IgG1 (несущего мутации Fc для элиминации эффекторной функции и гетеродимеризации) и мышиный интерлейкин-2 с мутациями, аналогичными человеческой молекуле.
Оба слитых белка удалось получать с высокими выходами, и они были стабильными.
Пример 1Б. Получение слитых белков PD-L1-IL2v
1
4
3
1
каппа
Кассету экспрессии для слитого белка: тяжелая цепь антитела - интерлейкин-2 (IL-2) [вариабельная область тяжелой цепи антитела к человеческому PD-1, тяжелая цепь человеческого IgG (несущая мутации L234A, L235A и P329G (EU-нумерация) для элиминации эффекторных функций и мутации S354C и T366W (EU-нумерация) для гетеродимеризации («выступ»)), линкер (GS) и человеческий IL-2v (несущий мутации Т3А, F42A, Y45A, L72G и С125А)], кассету экспрессии для тяжелой цепи антитела [вариабельная область тяжелой цепи антитела к человеческому PD-L1 и тяжелая цепь человеческого IgG (несущая мутации L234A, L235A и P329G (EU-нумерация) для элиминации эффекторных функций, мутации Y349C, T366S, L368A и Y410V (EU-нумерация) для гетеродимеризации («впадина») и необязательно мутации H435R и Y436F (EU-нумерация)] и кассету экспрессии для легкой цепи антитела [вариабельная область легкой цепи антитела к человеческому PD-L1 и константная область человеческой С] получали с помощью синтеза генов. Экспрессия антитела находилась под контролем химерного промотора MPSV и синтетическая сигнальная поли(А)-последовательность была локализована на 3'-конце CDS. Кроме того, каждый вектор включал OriP-последовательность EBV.
Молекулы получали путем совместной трансфекции клеток HEK293-EBNA, растущих в суспензии, с экспрессионными векторами для клеток млекопитающих с использованием полиэтиленимина. Клетки трансфектировали соответствующими экспрессионными векторами в соотношении 1:1:2 («вектор тяжелой цепи (VH-CH1-CH2-CH3-IL2v)»: «вектор тяжелой цепи (VH-CH1-CH2-СН3)»: «вектор легкой цепи (VL-CL)»).
2
Для трансфекции клетки HEK293 EBNA культивировали в суспензии в бессывороточной культуральной среде Excell, содержащей 6 мМ L-глутамин, и в культуральной среде, содержащей 250 мг/л G418. Для получения в 600-миллилитровые колбы TubeSpin (максимальный рабочий объем 400 мл) засевали 600 млн клеток HEK293-EBNA за 24 ч до трансфекции. Для трансфекции клетки центрифугировали в течение 5 мин при 210 × g и супернатант заменяли 20 мл предварительно нагретой среды CD СНО. Экспрессионные векторы смешивали в 20 мл среды CD СНО до достижения конечного количества ДНК 400 мкг. После добавления 1080 мкл раствора ПЭИ (2,7 мкг/мл) смесь интенсивно перемешивали в течение 15 с и затем инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре. Затем клетки смешивали с раствором ДНК/ПЭИ, переносили в 600-миллилитровую колбу TubeSpin и инкубировали в течение 3 ч при 37°C в инкубаторе в атмосфере с 5% СО. После инкубации добавляли 360 мл среды Excell, дополненной 6 мМ L-глутамином, 5 г/л соевого пептида (PEPSOY) и 1,0 мМ VPA (вальпроевая кислота), и клетки культивировали в течение 24 ч. Через 1 день после трансфекции добавляли 7% Feed 7. После культивирования в течение 7 дней супернатант собирали для очистки центрифугированием в течение 20-30 мин при 3600 × g (центрифуга Sigma 8K), раствор стерилизовали фильтрацией (0,22 мкм-фильтр) и добавляли и азид натрия в конечной концентрации 0,01% (мас./об.). Раствор выдерживали при 4°C.
Конструкцию человеческий PD-L1-IL2v (SEQ ID NO: 37-39) очищали с помощью одной стадии аффинной хроматографии с использованием белка А (MabSelectSure, фирма GE Healthcare) с последующей гель-фильтрацией (HiLoad 16/60 Супердекс 200, фирма GE Healthcare). Для осуществления аффинной хроматографии супернатант вносили в колонку HiTrap ProteinA HP (CV = 5 мл, фирма GE Healthcare), уравновешенную 25 мл буфера, содержащего 20 мМ фосфат натрия, 20 мМ цитрат натрия, рН 7,5. Несвязанный белок удаляли путем промывки буфером, содержащим 20 мМ фосфат натрия, 20 мМ цитрат натрия, рН 7,5, используя его в объеме, кратном по меньшей 10 объемам колонки, а требуемый белок элюировали с использованием буфера, содержащего 20 мМ цитрат натрия, 100 мМ хлорид натрия, 100 мМ глицин, 0,01% Твин20, рН 3, используя его в объеме, кратном 6 объемам колонки. Белковый раствор нейтрализовали путем добавления 1/10 0,5М раствора фосфата натрия, рН 8,0. Требуемый белок концентрировали и фильтровали перед внесением в колонку HiLoad Супердекс 200 (фирма GE Healthcare), уравновешенную буфером, содержащим 20 мМ гистидин, 140 мМ хлорид натрия, рН 6,0, 0,01% Твин20.
Конструкцию мышиный PD-L1-IL2v (SEQ ID NO: 40-42) очищали аналогичным образом с помощью одной стадии аффинной хроматографии с использованием белка A (MabSelectSure, фирма GE Healthcare) с последующей гель-фильтрацией (HiLoad 16/60 Супердекс 200, фирма GE Healthcare). Для осуществления аффинной хроматографии супернатант смешивали в соотношении 1:1 с 2М глицином, 0,6М NaCl, рН 8,6 и вносили в колонку HiTrap ProteinA HP (CV=5 мл, фирма GE Healthcare), уравновешенную 25 мл буфера, содержащего 1М глицин, 0,3M NaCl, рН 8,6. Несвязанный белок удаляли путем промывки буфером, содержащим 1М глицин, 0,3M NaCl, рН 8,6, используя его в объеме, кратном по меньшей 10 объемам колонки, а требуемый белок элюировали с использованием буфера, содержащего 1М глицин, 0,3M NaCl, рН 4,0 используя его в объеме, кратном 6 объемам колонки. Белковый раствор нейтрализовали путем добавления 1/10 0,5М раствора фосфата натрия, рН 8,0. Требуемый белок концентрировали и фильтровали перед внесением в колонку HiLoad Супердекс 200 (фирма GE Healthcare), уравновешенную буфером, содержащим 20 мМ гистидин, 140 мМ хлорид натрия, рН 6,0, 0,01% Твин20.
2
4
3
Полученный в результате препарат человеческий PD-L1-IL2v содержал 99% мономера (по данным, полученным с использованием колонки для аналитической гель-фильтрации TSKgel G3000 SW XL (фирма Tosoh) в подвижном буфере, содержащем 25 мМ KHPO, 125 мМ NaCl, 200 мМ моногидрохлорид L-аргинина, 0,02% (мас./об.) NaN, рН 6,7 при 25°C) и имел 100%-ную чистоту (по данным, полученным с помощью капиллярного электрофореза в присутствии ДСН в невосстанавливающих условиях с использованием системы Caliper LabChip GXII (фирма Caliper lifescience), которую применяли согласно инструкции производителя). Выход продукта составлял 23 мг/л. Анализ методом масс-спектрометрии подтвердил получение в основном правильно собранной молекулы со следовыми количествами (<5%) молекул без интерлейкина-2 (масс-спектрометрию осуществляли с использованием системы Agilent LC-MS (фирма Agilent Technologies) с колонкой NUCLEOGEL RP1000-8, 250 мм × 4,6 мм (фирма MACHEREY-NAGEL GmbH) и градиента ацетонитрил-муравьиная кислота).
Содержание мономера в конструкции мышиный аналог PD-L1-IL2v составляло 96%, чистота была равна 100%, а выход продукта составлял 3,8 мг/л.
Пример 1 В. Получение конструкций: мышиный аналог CEA-IL2v и мышиный аналог FAP-IL2v
Создавали муринизированную суррогатную (являющуюся аналогом) молекулу таргетированного на СЕА варианта иммуноцитокина IL-2, CEA-IL2v, обозначенную как muCEA-muIL2v (обозначенную также как muCEA-IL2v), для применения на моделях опухолей in vivo, созданных в полностью иммунокомпетентных мышах, для того, чтобы снижать образование антител к лекарственным средствам (ADA). Кроме того, создавали соответственно муринизированную химерную версию таргетированного на FAP варианта иммуноцитокина IL-2, FAP-IL2v, обозначенную как muFAP-muIL2v (обозначенную также как muFAP-IL2v), для применения на моделях опухолей in vivo, созданных в полностью иммунокомпетентных мышах, для того, чтобы снижать образование антител к лекарственным средствам (ADA). В муринизированных суррогатных молекулах мутации «выступ-во-впадины» в Fc-домене заменяли DDKK-мутациями в muIgG1, а мутации LALA P329G заменяли мутациями DAPG в muIgG1 (согласно описанному в заявке РСТ WO 2016/0330350 А1, которая полностью включена в настоящее описание в качестве ссылки).
1
4
2
Например, конструкция muCEA-muIL2v характеризовалась следующими особенностями. В качестве родительского антитела применяли человеческое-мышиное химерное антитело IgG-подкласса с человеческими (гуманизированными) вариабельными областями, но с мышиными константными областями. Во избежание потенциальной иммуногенности применяли соответствующий аллотип Black 6 (последовательность, опубликованная в рамках проекта по исследованию мышиного генома (Mouse Genomes Project)). Связывание с muIL2Rα аннулировали с помощью трех мутаций, гомологичных мутациям, идентифицированным в человеческом IL-2v, и удаляли соответствующий сайт О-гликозилирования: Т23А (O-Glyco), F76A, Y79A, L106G. Кроме того, аналогично альдеслейкину, остаток цистеина подвергали мутации во избежание агрегации с помощью мутации С160А (нумерация на основе UniProt ID Р04351, включая сигнальный пептид). Хотя muIgG1 уже обладал пониженной способностью связываться с FcγR, связывание с мышиными FcγR полностью аннулировали путем интродукции мутаций DAPG (D265A, P329G), при этом сохраняли связывание с muFcRn. muIL-2v сливали через неиммуногенный (GS)-коннектор только с С-концом одной тяжелой цепи антитела muIgG1. Для достижения этого конструировали иммуноцитокин с использованием эффекта электростатического взаимодействия, обеспечиваемого посредством мутаций DDKK в Fc-домене, для обеспечения гетеродимеризации в мышином каркасе.
Ниже представлены полипептидные последовательности muCEA-muIL2v:
Тяжелая цепь с мутацией DD и слитая с muIL2v (SEQ ID NO: 44):
Тяжелая цепь с мутацией КК (SEQ ID NO: 45):
Легкая цепь (SEQ ID NO: 46):
Ниже представлены полипептидные последовательности muFAP-muIL2v:
Тяжелая цепь с мутацией DD и слитая с muIL2v (SEQ ID NO: 47):
Тяжелая цепь с мутацией KK (SEQ ID NO: 48):
Легкая цепь (SEQ ID NO: 49):
Ниже представлены полипептидные последовательности muPD1:
Тяжелая цепь (SEQ ID NO: 50):
Легкая цепь (SEQ ID NO: 51):
Полученные в этом примере иммуноконъюгаты применяли также в приведенных ниже примерах.
Пример 2
Пример 2А. Связывание PD1-IL2v с активированными CD8- и CD4-T-клетками
3
+
+
+
+
Свежевыделенные РВМС из здоровых доноров стимулировали в течение ночи с помощью CD3 и CD28 для индукции повышающей регуляции PD1 на Т-клетках. РВМС высевали в среду (RPMI1640, 10% FCS, 2 мМ глутамин) в колбы для культуры клеток, которые сенсибилизировали в течение 1 ч при 37°C 1 мкг/мл (антитела к) CD3 (клон OKT3, №317304, фирма BioLegend). (Антитело к) CD28 добавляли в раствор к РВМС в концентрации 2 мкг/мл (клон CD28.2, №302914, фирма BioLegend). На следующий день РВМС собирали и переносили в 96-луночный круглодонный планшет (200000 клеток на лунку). Клетки промывали FACS-буфером (ЗФР, 2% FBS, 5 мМ ЭДТА, 0,025% NaN) и окрашивали, используя по 40 мкл указанных молекула (PD1 IgG, PD1-IL2v и CEA-IL2v) в FACS-буфере в течение 30 мин при 4°C. Клетки промывали дважды FACS-буфером для удаления несвязанных молекул. Затем к клеткам добавляли 40 мкл разведенного меченного РЕ античеловеческого Fc-специфического вторичного антитела (№109-116-170, фирма Jackson ImmunoResearch). После инкубации в течение 30 мин при 4°C клетки промывали дважды FACS-буфером. Для детекции Т-клеток РВМС окрашивали с использованием 40 мкл смеси CD3, конъюгированного с ФИТЦ (клон UCHT1, №300406, фирма BioLegend), CD4, конъюгированного с АРС (клон RPA-T4, №300514, фирма BioLegend), и CD8, конъюгированного с BV421 (клон RPA-T8, №301036, фирма BioLegend), в течение 30 мин при 4°C. Несвязанные антитела удаляли путем промывки дважды FACS-буфером. И, наконец, клетки фиксировали с помощью 1% PFA в FACS-буфере и оценивали с использованием устройства BD Fortessa с установкой дискриминационного окна на CD3CD4 -клетки (CD4 Т-клетки) и CD3CD8 -клетки (CD8 Т-клетки).
Как продемонстрировано на фиг. 2, PD1-IL2v и соответствующий PD1 IgG связывались аналогичным образом с CD4- и CD8- Т-клетками. Аналогичный иммуноцитокин: CEA-IL2v, таргетированный на СЕА на опухолевых клетках вместо PD1, служил в качестве «ненацеленного» (нетаргетированного) контроля для сравнения воздействия конструкции на основе только иммуноцитокина IL2v, нетаргетированной на PD1.
Пример 2Б. Активация и пролиферация Т-клеток и NK-клеток с помощью PD1-IL2v
Свежевыделенные РВМС из здоровых доноров инкубировали в течение ночи и затем метили с помощью CFSE (сложный N-сукцинимидиловый эфир 5(6)-карбоксифлуоресцеиндиацетата, №21888, фирма Sigma-Aldrich). В целом, метод состоял в следующем: 30 млн РВМС промывали однократно ЗФР. Параллельно маточный раствор CSFE (2 мМ в ДМСО) разводили в соотношении 1:20 в ЗФР. РВМС ресуспендировали в 30 мл предварительно нагретого ЗФР, добавляли 30 мкл раствора CFSE и клетки немедленно перемешивали. Для оптимального мечения клетки инкубировали в течение 15 мин при 37°C. Затем добавляли 10 мл предварительно нагретой среды (RPMI1640, 10% FCS, 1% глутамина) для прекращения реакции мечения. Клетки перемешивали в течение 10 мин при 400 × g и ресуспендировали в 20 мл свежей среды, и инкубировали в течение еще 30 мин при 37°C. И, наконец, клетки однократно промывали средой и ресуспендировали в свежей среде из расчета 1 млн клеток на мл. Меченые РВМС высевали в 96-луночный круглодонный планшет (200000 клеток на лунку) и обрабатывали в течение 5 дней указанными молекулами (PD1-IL2v, CEA-IL2v, PD1 IgG и комбинацией PD1 IgG плюс CEA-IL2v). После инкубации клетки однократно промывали FACS-буфером и окрашивали с использованием 20 мкл смеси CD3 АРС/Су7 (клон UCHT1, №300426, фирма BioLegend), CD56 АРС (клон НСН56, №318310, фирма BioLegend), CD4 РЕ (клон RPA-T4, №300508, фирма BioLegend) и CD25 BV421 (клон М-А251, фирма BioLegend) в FACS-буфере в течение 30 мин при 4°C. Затем РВМС промывали дважды FACS-буфером, после чего их фиксировали с использованием 1% PFA в FACS-буфере и количественно оценивали флуоресценцию с помощью устройства BD Fortessa. Пролиферацию определяли, измеряя разведение CFSE для CD8 Т-клеток (CD3+CD4-), CD4 Т-клеток (CD3+CD4+) и NK-клеток (CD3-CD56+).
Как продемонстрировано на фиг. 3, активность PD1-IL2v оказалась сопоставимой с активностью CEA-IL2v и CEA-IL2v в комбинации с PD1 IgG. PD1 IgG при его индивидуальном применении не обладал активностью в этом эксперименте.
На фиг. 4 продемонстрировано, что PD1-IL2v индуцирует активацию (измеренную по повышающей регуляции CD25) NK-клеток, CD8 Т-клеток и CD4 Т-клеток. Активация, индуцированная CEA-IL2v и комбинацией CEA-IL2v с PD1 IgG, оказалась схожей. PD1 IgG при его индивидуальном применении не индуцировал активацию в этом эксперименте.
Пример 2В. Активация и пролиферация предварительно активированных CD8- и CD4-Т-клеток с помощью PD1-IL2v
Свежевыделенные РВМС из здоровых доноров метили с помощью CFSE (сложный N-сукцинимидиловый эфир 5(6)-карбоксифлуоресцеиндиацетата, №21888, фирма Sigma-Aldrich). В целом, метод состоял в следующем: 30 млн РВМС промывали однократно ЗФР. Параллельно маточный раствор CSFE (2 мМ в ДМСО) разводили в соотношении 1:20 в ЗФР. РВМС ресуспендировали в 30 мл предварительно нагретого ЗФР, добавляли 30 мкл раствора CFSE и клетки немедленно перемешивали. Для оптимального мечения клетки инкубировали в течение 15 мин при 37°C. Затем добавляли 10 мл предварительно нагретой среды (RPMI1640, 10% FCS, 1% глутамина) для прекращения реакции мечения. Клетки перемешивали в течение 10 мин при 400 × g и ресуспендировали в 20 мл свежей среды, и инкубировали в течение еще 30 мин при 37°C. И, наконец, клетки однократно промывали средой и ресуспендировали в свежей среде из расчета 1 млн клеток на мл. Меченные CFSE РВМС предварительно активировали в течение ночи с помощью 1 мкг/мл ФГА (№L8902, фирма Sigma-Aldrich) для индукции повышающей регуляции PD-1 на Т-клетках. На следующий день собирали предварительно активированные РВМС и подсчитывали. Затем РВМС высевали в 96-луночный круглодонный планшет (200000 клеток на лунку) и обрабатывали в течение 4 дней указанными молекулами (PD1-IL2v, CEA-IL2v, PD1 IgG и комбинацией PD1 IgG плюс CEA-IL2v). После инкубации клетки однократно промывали FACS-буфером и окрашивали 20 мкл смеси CD3 АРС/Су7 (клон UCHT1, №300426, фирма BioLegend), CD8 АРС (клон SK1, фирма BioLegend) и CD25 BV421 (клон М-А251, фирма BioLegend) в FACS-буфере в течение 30 мин при 4°C. Затем РВМС промывали дважды FACS-буфером, после чего фиксировали их с использованием 1% PFA в FACS-буфере и количественно оценивали флуоресцентность с помощью устройства BD Fortessa. Пролиферацию CD8 Т-клеток (CD3+CD8+) и CD4 Т-клеток (CD3+CD8-) определяли, измеряя разведение CFSE.
На фиг. 5 продемонстрировано, что PD1-IL2v индуцирует пролиферацию активированных ФГА CD8- и CD4-Т-клеток, которые экспрессируют PD-1. Активность оказалась сопоставимой с активностью CEA-IL2v и комбинации CEA-IL2v с PD1 IgG. PD1 IgG при его индивидуальном применении не обладал активностью в этом эксперименте. Никакого дополнительного действия блокирования PD-1 не удалось обнаружить в этом эксперименте, вероятно, из-за отсутствия PD-L1-позитивных опухолевых клеток.
Как продемонстрировано на фиг. 6, PD1-IL2v индуцирует активацию активированных ФГА CD8- и CD4-Т-клеток, которые экспрессируют PD-1 (с использованием экспрессии CD25 в качестве маркера активации). CEA-IL2v и комбинация CEA-IL2v с PD1 IgG индуцировали сопоставимый уровень активации Т-клеток. PD1 IgG при его индивидуальном применении не обладал активностью в этом эксперименте. Никакого дополнительного воздействия блокады PD-1 не удалось обнаружить в этом эксперименте, вероятно, из-за отсутствия PD-L1-позитивных опухолевых клеток.
Пример 2Г. Пролиферация NK92 под воздействием PD1-IL2v и PD-L1-IL2v
NK92-клетки собирали, подсчитывали и оценивали жизнеспособность. Клетки промывали три раза ЗФР для удаления остаточных количеств IL-2 и ресуспендировали в среде (RPMI1640, 10% FCS, 1% глутамина) без IL-2. Промытые NK92-клетки инкубировали в течение 2 ч в инкубаторе для клеток (IL-2-«голодание»). После периода «голодания» клетки ресуспендировали в свежей среде без IL2 до достижения концентрации клеток 200000 на мл и 50 мкл клеточной суспензии переносили в 96-луночный обработанный плоскодонный планшет для культуры клеток и дополняли 50 мкл разведенных антител (в среде без IL-2), пролейкина (конечная концентрация 1,5 мкг/мл) или среды (контрольные лунки) до достижения конечного объема 100 мкл на лунку. Планшет инкубировали в течение 2 дней в инкубаторе. Через 2 дня реагенты CellTiter-Glo (фирма Promega) и планшет для культуры клеток уравновешивали до комнатной температура. Раствор CellTiter-Glo приготавливали согласно инструкциям производителя и 100 мкл раствора добавляли в каждую лунку. После 10-минутной инкубации оставшиеся агрегаты ресуспендировали путем пипетирования и 150 мкл смеси переносили в белый плоскодонный планшет. Люминесценцию измеряли с помощью мульмодального ридера Tecan Spark 10М.
На фиг. 7А продемонстрировано, что PD-L1-IL2v индуцирует пролиферацию NK92-клеток столь же эффективно, что и CEA-IL2v. На фиг. 7Б продемонстрировано, что PD-L1-IL2v и PD1-IL2v обладают одинаковой активностью в отношении индукции пролиферации NK92-клеток. NK92-клетки являются PD1-негативными.
Пример 2Д. Связывание PD-L1-IL2v с CTLL2-клетками
3
Мышиная Т-клеточная линия CTLL2 экспрессирует PD-L1. Эти клетки применяли для тестирования связывания PD-L1-IL2v (мышиный аналог) с PD-L1. Клетки собирали, оценивали жизнеспособность и переносили их в 96-луночный круглодонный планшет (200000 клеток на лунку). Клетки промывали FACS-буфером (ЗФР, 2% FBS, 5 мМ ЭДТА, 0,025% NaN) и окрашивали с помощью 40 мкл указанных молекул в FACS-буфере в течение 30 мин при 4°C. Клетки промывали дважды FACS-буфером для удаления несвязанных молекул. Затем к клеткам добавляли 40 мкл разведенного конъюгированного с АРС антимышиного Fc-специфического вторичного антитела (№115-136-071, фирма Jackson ImmunoResearch). После 30-минутной инкубации при 4°C клетки промывали дважды FACS-буфером. Клетки анализировали с использованием устройства BD LSR Fortessa.
На фиг. 8 продемонстрировано, что PD-L1-IL2v связывается с CTLL2-клетками столь же эффективно, что и соответствующий PD-L1 muIgG1. Эти клетки являются PD1-негативными.
Пример 2Е. Пролиферация СТЬЬ2-клеток под воздействием PD1-IL2v и PD-L1-IL2V
CTLL2-клетки собирали, подсчитывали и оценивали их жизнеспособность. Клетки промывали три раза ЗФР (для удаления остаточных количеств IL-2), ресуспендировали в среде (RPMI1640, 10% FCS, 1% глутамина) без IL-2. и инкубировали в течение 2 ч в инкубаторе для клеток (IL-2-«голодание»). После периода «голодания» клетки ресуспендировали в свежей среде без IL2 до достижения концентрации клеток 200000 на мл и 50 мкл клеточной суспензии переносили в 96-луночный обработанный плоскодонный планшет для культуры клеток. 50 мкл разведенной конструкции мышиный аналог PD1-IL2v, мышиный аналог PD-L1-IL2v, мышиный аналог CEA-IL2v, разведенного пролейкина (конечная концентрация 1,5 мкг/мл) или только среды (все с использованием не содержащей IL-2 среды) добавляли в лунки до достижения конечного объема 100 мкл/лунку. Образцы инкубировали в течение 3 дней в инкубаторе для клеток и пролиферацию оценивали с помощью системы CellTiter-Glo согласно инструкциям производителя. В целом, метод состоял в следующем: 100 мкл реагентов добавляли в каждую лунку и инкубировали в течение 10 мин. Оставшиеся агрегаты ресуспендировали путем пипетирования и 150 мкл смеси переносили в белый плоскодонный планшет. Люминесценцию измеряли с помощью мульмодального ридера Tecan Spark 10М.
На фиг. 9А продемонстрировано, что PD-L1-IL2v индуцирует пролиферацию CTLL2-клеток. Активность оказалась более высокой по сравнению с CEA-IL2v, вероятно, из-за экспрессии PD-L1 на CTLL2-клетках. На фиг. 9Б продемонстрировано также, что PD1-IL2v индуцирует пролиферацию CTLL2-клеток. Активность оказалась более низкой по сравнению с PD-L1-IL2v, вероятно, из-за того, что эти клетки экпрессируют только PD-L1, но не экспрессируют PD1.
Пример 3
In vivo эффективность PD1-IL2v и PD-L1-IL2v на сингенной мышиной модели опухоли
Иммуноконъюгаты (мышиные аналоги) PD1-IL2v и PD-L1-IL2v тестировали индивидуально и в сравнении с соответствующими антителами к PD1 и PD-L1 в отношении их противоопухолевой эффективности на сингенной модели Panc02-Fluc.
2
5
5
Клетки Panc02-Н7 (мышиная карцинома поджелудочной железы) исходно были получены из центра рака MD Anderson (шт. Техас, США) и после размножения депонированы во внутреннем банке клеток фирмы Roche-Glycart. Линию клеток Panc02-H7-Fluc получали в лаборатории заявителей путем трансфекции кальцием и с помощью методов субклонирования. Клетки Panc02-H7-Fluc культивировали в среде RPMI, содержащей 10% FCS (фирма Sigma), 500 мкг/мл гигромицина и 1% Glutamax. Клетки культивировали при 37°С в насыщенной водяным паром атмосфере с 5% СО. Для трансплантации применяли пассаж 23. Жизнеспособность клеток составляла 90,4%. Инъецировали 1×10 клеток на животное в поджелудочные железы мышей линии Black 6, используя 0,3-миллилитровый туберкулиновый шприц (фирма BD Biosciences, Германия). Для этой цели делали небольшой разрез в левой части брюшной области анестезированных мышей. Брюшную стенку открывали, и поджелудочные железы осторожно изымали с помощью пинцета. 10 мкл (1×10 клеток Panc02-H7-Fluc в среде RPMI) клеточной суспензии инъецировали в хвост поджелудочных желез. На брюшную стенку и кожные раны накладывали швы, используя рассасывающийся шовный материал 5/0.
Самок мышей линии Black 6, возраст которых в начале эксперимента составлял 10-12 недель (фирма Charles Rivers, Лион, Франция) содержали в свободных от специфических патогенов условиях с суточным циклом 12 ч света/12 ч темноты согласно принятым руководствам (GV-Solas; Felasa; TierschG). Протокол экспериментального исследования был рассмотрен и одобрен местными органами управления (ZH193/2014). После доставки животных выдерживали одну неделю для акклиматизации к новому окружению и для обследования. Регулярно осуществляли мониторинг состояния здоровья.
5
Мышам инъецировали внутрь поджелудочных желез в день 0 опыта 1×10 клеток Panc02-Fluc, произвольно разделяли на группы и взвешивали. Через 1 неделю после инъекции опухолевых клеток мышам инъецировали i.v. PD1-IL2v, PD-L1-IL2v или антитела к PD1 и PD-L1, один раз в неделю в течение 4 недель.
Всем мышам инъецировали i.v. 200 мкл соответствующего раствора. Мышам в обработанной наполнителем группе инъецировали гистидиновый буфер, а мышам из групп обработки (тестируемыми агентами) инъецировали конъюгаты: мышиный аналог PD1-IL2v и мышиный аналог PD-L1-IL2v или соответствующие антитела к PD1 и PD-L1, разведенные по мере необходимости гистидиновым буфером. Количество антител, инъецированных каждой мыши, в мг /кг, составляло: 1,5 мг/кг PD1-IL2v и PD-L1-IL2v, 10 мг/кг антител к PD1 и PD-L1.
На фиг. 10 и в таблице 1 продемонстрировано, что конъюгат PD1-IL2v опосредовал существенно более высокую эффективность с позиции повышенной медианной и общей выживаемости по сравнению со всеми другими тестируемыми индивидуально агентами, включая, что важно отметить, и PD-L1-IL2v.
2
Для получения биолюминисцентных изображений с помощью системы IVIS SPECTRUM мышам инъецировали внутрибрюшинно 150 мг/кг D-люциферина за 10 мин до регистрации биолюминесцентных изображений (изображений в режиме биолюминесценции) (BLI) и последующей анестезии с помощью 4% изофлурана. Затем мышей переносили в изолированную камеру, которую помещали в устройство IVIS Spectrum. In vivo регистрацию BLI осуществляли путем регистрации люминесцентного сигнала в течение 10-50 с. Данные запасали в виде излучения (фотоны)/с/см/стерадиан (sr). In vivo анализ BLI-данных осуществляли с помощью программного обеспечения Living Image 4.4 и описывали с помощью кривой ингибирования опухоли.
На фиг. 11 продемонстрировано, что PD1-IL2v обладал более высокой эффективностью с позиции снижения биолюминесцентного сигнала (фотоны/с) по сравнению со всеми другими группами, включая, что важно отметить, PD-L1-IL2v. Уже после первой терапевтической обработки в день 7 обнаружено с использованием IVIS Spectrum снижение биолюминесцентного сигнала в Panc02-Fluc в нескольких группах обработки, но только для PD1-IL2v обнаружено полное отсутствие BLI-сигнала у большинства мышей, и оно сохранялось в течение всего эксперимента, свидетельствуя о полном ответе у 7 из 8 мышей.
Пример 4
Воздействие доставки IL-2v к истощенным вирусспецифическим Т-клетками посредством блокады либо PD-1 или PD-L1
Экспрессия PD-1 впервые описана на истощенных вирусоспецифических Т-клетках как результат хронического воздействия вирусных антигенов, и это ассоциировано с неспособностью Т-клеток поддерживать эффективный антивирусный ответ. Вирусоспецифические CD4 Т-клетки обладают способностью одновременно секретировать IL-2 и IFN-γ, обеспечивая защиту от вирусной реактивации при хронических инфекциях. Так, полифункциональная сигнатура CD4 Т-клеток ассоциирована с контролем вирусов у здоровых индивидуумов, зараженных цитомегаловирусом (CMV), вирусом Эепштейна-Барра (EBV) и вирусом герпеса простого (HSV), а также у тех индивидуумов, зараженных вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), у которых в течение нескольких лет отсутствуют симптомы.
В контексте хронических вирусных инфекций при создании изобретения разработан анализ in vitro для оценки воздействия таргетинга PD-1 и PD-L1 на доставку мутантной версии IL-2 (IL-2v) к антигенспецифическим Т-клеткам с нарушенной функцией. Во избежание ограничений, связанных с количеством приемлемых для осуществления данного исследования доноров, при создании изобретения был выбран иммуногенный вирусный белок CMV (рр65) в качестве «воскресшего» антигена для Т-клеток, принимая грубо, что 80% популяции является CMV-серопозитивной. Таким образом, при создании изобретения осуществляли стимуляцию мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) здорового донора с использованием CMV-pp65 в течение нескольких часов до добавления предлагаемых в изобретении конструкций в концентрации 10 мкг/мл. Через 43 ч блокировали белковый транспорт из аппарата Гольджи, добавляя Golgi Plug (брефелдин А) и Golgi Stop (монензин), и инкубировали клетки при 37°С в течение еще 5 ч. Затем клетки промывали, окрашивали поверхность с помощью антител к человеческим CD3, CD4, CD8, CD62L и CD45RO, после чего фиксировали/пермеабилизировали с помощью Fix/Perm-буфера (фирма BD Bioscience). В завершение осуществляли внутриклеточное окрашивание в отношение IL-2, IFN-γ и Ki67 (обе фирмы eBioscience).
+
-
-
-
+
-
Было установлено, что как PD1-IL2v, так и PD-L1-IL2v, а также комбинация соответствующих антител IgG-типа с IL-2v, повышали до сопоставимых уровней встречаемость полифункциональных (фиг. 12Б) и монофункциональных (IL-2 и IFN-γ) (фиг. 12А и 12В соответственно) CD4 Т-клеток, обеспечивая более высокое действие по сравнению с блокадой антителом к PD-1 и антителом к PD-L1 соответственно. Для размноженных популяций полифункциональных (фиг. 13Б) и монофункциональных по IFN-γ CD4 Т-клеток (фиг. 13В и 13Г) характерен профиль эффекторных клеток-клеток памяти (CD45RO CD62L) и полностью дифференцированных эффекторных клеток (CD45RO CD62L). Наоборот, для IL-2-монофункциональных CD4 Т-клеток, индуцированных антагонизмом PD-L1 и дополнительно размноженных путем совместной доставки IL-2v, характерна наивная сигнатура (CD62L CD45RO) (фиг. 13А).
Было сделано заключение о том, что доставка IL-2v к истощенным CMV-специфическим CD4 Т-клеткам посредством слитого белка PD1-IL-2v приводила к размножению долгоживущей защитной вирусоспецифической популяции, характеризующейся способностью секретировать совместно IL-2 и IFN-γ.
Пример 5
Пример 5А. Преимущественное связывание PD1-IL2v с активированными каноническими Т-клетками по сравнению с активированными регуляторными Т-клетками
+
+
dim
+
-
+
reg
conv
conv
conv
reg
Особенности связывания PD1-IL2v с активированными каноническими и регуляторными Т-клетками оценивали с помощью конкурентного анализа связывания. CD4CD25CD127 регуляторные Т-клетки (T) выделяли с помощью набора для двухступенчатого выделения регуляторных Т-клеток (фирма Miltenyi, №130-094-775). Параллельно выделяли канонические CD4CD25 Т-клетки (T), собирая негативную фракцию, полученную при CD25-позитивной селекции (фирма Miltenyi, №130-092-983) с последующим обогащением CD4 (фирма Miltenyi, №130-045-101). T метили с помощью CFSE (фирма eBioscience, №65-0850-84), а Treg метили с помощью Cell Trace Violet (фирма ThermoFisher scientific, C34557) для отслеживания пролиферации обеих популяций. T и T совместно высевали в культуральный планшет, который сенсибилизировали в течение ночи при 4°С 1 мкг/мл CD3 (клон OKT3, №317315, фирма BioLegend). CD28 добавляли в раствор в концентрации 1 мкг/мл CD28 (клон CD28.2, №302923, фирма BioLegend). После стимуляции в течение 5 дней осуществляли анализ связывания с антителами к PD1 (0376) и PD1-IL2v (0590), которые оба метили в лаборатории заявителей с помощью AF647.
conv
reg
conv
reg
conv
reg
reg
Для биспецифического антитела PD1-IL2v обнаружен профиль связывания, сопоставимый с профилем связывания для PD1 (фиг. 14А и 14Б). На фиг. 14А продемонстрирована разница частоты встречаемости данного антитела, связанного с T, по сравнению с T, в одном и том же образце. Каждый символ обозначает отдельного донора, горизонтальными линиями обозначены медианы при N=4. Для обеих молекул установлена более высокая способность к связыванию с T по сравнению с T из-за более высоких уровней экспрессии PD-1 на T, чем на T (фиг. 14Б; представлены данные, полученные для одного репрезентативного донора, демонстрирующие связывание с Tconv (черная линия) и T (серая линия)). Таким образом, биспецифическое антитело PD1-IL2v сохраняет способность к связыванию с PD1, несмотря на то, что с антителом сшит IL2v.
conv
reg
Пример 5Б. «Спасение» эффекторной функции T после обработки PD1-IL2v в анализе T-супрессии
conv
reg
conv
reg
conv
reg
-
-
На следующей стадии тестировали, может ли PD1-IL2v реверсировать супрессию T, обусловленную T. Для этой цели разработали анализ для оценки супрессорной функции, при осуществлении которого T и T культивировали совместно в течение 5 дней с блокирующими антителами или без них в присутствии CD4 CD25 клеток из неродственного донора для аллоспецифической стимуляции. Для этой цели T и T выделяли и метили согласно описанному выше методу. Накопление цитокинов в комплексе Гольджи повышали путем применения ингибиторов белкового транспорта (Protein Transport Inhibitors) (GolgiPlug, №555029, фирма BD и GolgiStop, №554724, фирма BD) в течение 5 ч до осуществления FACS-окрашивания.
conv
reg
reg
Оценивали способность пролиферирующих T секретировать гранзим В (GrzB; фиг. 15А) и интерферон гамма (IFNγ; фиг. 15Б) в присутствии T и без них. T-супрессию рассчитывали помощью следующей формулы:
Tconv+Treg±блокирующее
антитело
conv
reg
Tсоnv необработанные
conv
reg
в которой % цитoкинa обозначает уровень цитокина, секретированного T в присутствии T ± блокирующее антитело, % цитокина обозначает уровень цитокина, секретированного T, в отсутствии Treg. На фиг. 15А и 15Б каждый символ обозначает отдельного донора, горизонтальными линиями обозначены медианы при N=5, а пунктирными линиями при 0% обозначено отсутствие супрессии T-клетками. Р рассчитывали с помощью одностороннего регрессионного анализа (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, ****p<0,0001).
conv
conv
reg
На фиг. 15А продемонстрировано, что обработка антителом к PD1 (0376) приводит к получению медианного значения супрессии функции T, составляющего 47,7%, по сравнению с медианным значением супрессии в необработанной группе (статически незначимое различие), составляющим 68,6%. Аналогично этому, блокада взаимодействия PD-1/PD-L1 с помощью атезолизумаба, ниволумаба и пембролизумаба характеризуется такой же тенденцией, что и в случае антитела к PD1. Важно отметить, что DP47-IL2v (медианное значение = -11,3%, р=0,0011) и PD1-IL2v (медианное значение = -43,6%, p<0,0001) «спасали» эффекторную функцию T GrzB от T-супрессии. Кроме того, конструкция PD1-IL2v даже с большей достоверностью (р=0,0026) обладала более высокой эффективностью, чем антитело к PD1 при его индивидуальном применении.
conv
conv
reg
Параллельно осуществляли такой же анализ для оценки обусловленной Treg супрессии секреции INFγ T (фиг. 15Б). DP47-IL2v (медианное значение = 51,77%, р=0,0251) и PD1-IL2v (медианное значение = 31,23%, p=<0,0001) «спасали» эффекторную функцию T INFγ от T-супрессии.
Пример 6
In vivo эффективность иммуноконъюгатов PD1-IL2v на сингенной модели, созданной с помощью линий мышиных опухолевых клеток, в сравнении с антителами к PD1 и FAP-IL2v. применяемыми в качестве индивидуальных агентов и в комбинации
Иммуноконъюгат мышиный аналог PD1-IL2v (muPD1-IL2v) тестировали в сравнении с комбинацией мышиного аналога PD1 и мышиного аналога FAP-IL2v (muFAP-IL2v) в отношении их противоопухолевой эффективности на сингенной модели. Применяемая сингенная модель представляла собой сингенную модель Panc02-Fluc, созданную на поджелудочных железах.
2
5
5
Иммуноконъюгат мышиный аналог PD1-IL2v тестировали на мышах линии Black 6, внутрь поджелудочных желез которых инъецировали применяемую для трансфекции мышиную клеточную линию Panc02-Fluc. Клетки Panc02-Н7 (мышиная карцинома поджелудочной железы) исходно были получены из центра рака MD Anderson (шт. Техас, США) и после размножения депонированы во внутреннем банке клеток фирмы Roche-Glycart. Линию клеток Panc02-H7-Fluc получали в лаборатории заявителей путем трансфекции кальцием и с помощью методов субклонирования. Клетки Panc02-H7-Fluc культивировали в среде RPMI, содержащей 10% FCS (фирма Sigma), 500 мкг/мл гигромицина и 1% Glutamax. Клетки культивировали при 37°С в насыщенной водяным паром атмосфере с 5% СО. Для трансплантации применяли пассаж 23. Жизнеспособность клеток составляла 87,5%. Инъецировали 1×10 клеток на животное в поджелудочные железы мышей линии Black 6, используя 0,3-миллилитровый туберкулиновый шприц (фирма BD Biosciences, Германия). Для этой цели делали небольшой разрез в левой части брюшной области анестезированных мышей Black 6. Брюшную стенку открывали и поджелудочные железы осторожно изымали с помощью пинцета. 10 мкл (1×10 клеток Panc02-H7-Fluc в среде RPMI) клеточной суспензии инъецировали в хвост поджелудочных желез. На брюшную стенку и кожные раны накладывали швы, используя рассасывающийся шовный материал 5/0.
Самок мышей линии Black 6, возраст которых в начале эксперимента составлял 10-12 недель (фирма Charles Rivers, Лион, Франция) выдерживали в свободных от специфических патогенов условиях с суточным циклом 12 ч света/12 ч темноты согласно принятым руководствам (GV-Solas; Felasa; TierschG). Протокол экспериментального исследования был рассмотрен и одобрен местными органами управления (ZH193/2014). После доставки животных выдерживали одну неделю для акклиматизации к новому окружению и для обследования. Регулярно осуществляли мониторинг состояния здоровья.
5
Мышам инъецировали внутрь поджелудочных желез в день 0 опыта 1×10 клеток Panc02-Fluc, животных произвольно разделяли на группы и взвешивали. Через 1 неделю после инъекции опухолевых клеток мышам инъецировали внутривенно в двух различных дозах PD1-IL2v и сравнивали с комбинацией антител к PD1 и FAP-IL2v один раз в неделю в течение 4 недель.
Всем мышам инъецировали внутривенно 200 мкл соответствующего раствора. Мышам в обработанной наполнителем группе инъецировали гистидиновый буфер, а мышам из групп обработки инъецировали антитела PD1-IL2v (0,5 мг/кг или 1 мг/кг), PD1 (10 мг/кг) и FAP-IL2v (2,5 мг/кг) или комбинацию антител PD1 и FAP-IL2v (10 мг/кг PD1 и 2,5 мг/кг FAP-IL2v). Для получения соответствующего количества иммуноконъюгатов на 200 мкл маточные растворы при необходимости разводили гистидиновым буфером, что продемонстрировано в таблице 2.
2
Для получения биолюминисцентных изображений с помощью системы IVIS SPECTRUM мышам инъецировали внутрибрюшинно 150 мг/кг D-люциферина за 10 мин до регистрации биолюминесцентных изображений (BLI) и последующей анестезии с помощью 4% изофлурана. Затем мышей переносили в изолированную камеру, которую помещали в устройство IVIS Spectrum. In vivo регистрацию BLI осуществляли путем регистрации люминесцентного сигнала в течение 10-50 с. Данные запасали в виде излучения (фотоны)/с/см/sr. In vivo анализ BLI-данных осуществляли с помощью программного обеспеченш Living Image 4.4 и описывали с помощью кривой ингибирования опухоли.
Для изучения иммуннофармакодинамики с помощью гистологии 3 мышей из каждой группы умерщвляли через 4 дня после первой обработки путем скручивания шеи. Опухоли поджелудочных желез изымали и немедленно фиксировали в 10% формалина. Ткань выдерживали в растворе формалина в течение ночи и затем обрабатывали для FFPET-анализа (устройство Leica 1020, Германия). Затем 4-микрометровые парафиновые срезы нарезали с помощью микротома (устройство Leica RM2235, Германия). Иммуногистохимию для выявления мышиных CD3, PD1 и ICOS осуществляли с помощью автоматической системы окрашивания (автостейнер) Leica (устройство Leica ST5010, Германия) согласно протоколам производителя. Изображения сканировали с помощью сканера фирмы Olympus.
На фиг. 16 продемонстрированы результаты эксперимента по оценке эффективности, позволяющие сравнивать действие антитела, содержащего мышиный аналог PD1-IL2v, с антителом, содержащим мышиный аналог FAP-IL2v, и антителом к мышиному аналогу PD-1, при их применении в качестве индивидуальных агентов и в комбинации. Применяемые для трансфекции клетки карциномы поджелудочной железы линии Panc02-H7-Fluc инъецировали в поджелудочные железы мышей Black 6 для изучения выживаемости на ортотопической сингенной модели опухолей поджелудочной железы. Количество антител, инъецированных каждой мыши, в мг/кг составляло: 0,5 и 1 мг/кг антитела, содержащего мышиный аналог PD1-IL2v, 10 мг/кг антитела к мышиному аналогу PD1 и 2,5 мг/кг антитела, содержащего мышиный аналог FAP-IL2v. Антитела инъецировали внутривенно один раз в неделю в течение 4 недель. Значимо увеличенные медианная и общая выживаемость обнаружены при применении в дозе 0,5 и 1 мг/кг конструкции мышиный аналог PD1-IL2v по сравнению с индивидуальными применением всех других агентов и применением комбинации антитела к мышиному аналогу PD-1 и конструкции мышиный аналог FAP-IL2v. На фиг. 16 и в таблице 3 продемонстрировано, что при применении в обеих доза конструкция PD1-IL2v опосредовала существенно более высокую эффективность касательно повышенной медианной и общей выживаемости по сравнению с индивидуальными применением всех других агентов и применением комбинации PD1 и FAP-IL2v.
На фиг. 17 продемонстрированы результаты эксперимента по оценке эффективности, в котором сравнивали мышиный аналог PD1-IL2v с FAP-IL2v, с мышиным аналогом PD1 и их комбинацией. Применяемые для трансфекции клетки карциномы поджелудочной железы линии Panc02-H7-Fluc инъецировали в поджелудочные железы мышей Black 6 для изучения выживаемости на ортотопической сингенной модели опухолей поджелудочной железы с помощью биолюминесценции. Уже на 7-й день после первой обработки было обнаружено с помощью IVIS Spectrum снижение биолюминесцентного сигнала Panc02-Fluc в нескольких группах обработки, но только при применении PD1-IL2v было обнаружено полное исчезновение BLI-сигнала у большинства мышей, которое сохранялось на протяжении всего эксперимента, свидетельствуя о полном ответе у 4 из 7 мышей из группы, обработанной дозой 0,5 мг/кг, и у 7 из 7 мышей из группы, обработанной дозой 1 мг/кг. На фиг. 17 продемонстрировано, что при использовании в обеих дозах конструкция PD1-IL2v опосредовала наивысшую эффективность с точки зрения снижения биолюминесцентного сигнала (количество фотонов/с) по сравнению с группами, обработанными всеми другими агентами при их индивидуальном применении и в комбинации.
На фиг. 18А и 18Б представлены результаты иммуногистохимической визуализации опухолей поджелудочных желез, окрашенных антителом к мышиному CD3 (фиг. 18А), и результаты количественного анализа Т-клеток (фиг. 18Б). Иммуногистохимическое окрашивание CD3 Т-клеток осуществляли на опухолях поджелудочных желез мышей Black 6, отобранных из указанных групп обработки. Образцы ткани подготавливали для иммуногистохимического окрашивания: опухоли изымали из животных после обработки, фиксировали в 10% формалина (фирма Sigma, Германия) и затем обрабатывали для FFPET-анализа (устройство Leica 1020, Германия). Затем 4-микрометровые парафиновые срезы нарезали с помощью микротома (устройство Leica RM2235, Германия). Иммуногистохимию для выявления мышиного CD3 осуществляли с использованием антитела к мышиному CD3 (фирма Diagnostic Biosystem, Германия) с помощью автостейнера Leica (устройство Leica ST5010, Германия) согласно протоколам производителя. Изображения сканировали с помощью сканера фирмы Olympus. Количественную оценку muCD3-позитивных Т-клеток проводили с помощью программного обеспечения Definiens (фирма Definiens, Германия). Статистический анализ осуществляли с помощью одностороннего регрессионного анализа для множественных сравнений. Уже в день 4 дня после первой терапевтической обработки обнаружено значимое увеличение количества CD3-позитивных Т-клеток в обработанных PD1-IL2v группах по сравнению с обработанной наполнителем группой. Тенденция к увеличению количества CD3-позитивных клеток обнаружена также в группе, обработанной комбинацией мышиного аналога PD1 и конструкции мышиный аналог FAP-IL2v, по сравнению с обработанной наполнителем группой, но это различие не было достоверным. На фиг. 18А и 18Б продемонстрировано, что конструкция PD1-IL2v вызывала увеличение инфильтрации CD3 в опухоль поджелудочной железы через 4 дня после первой обработки по сравнению со всеми другими группами.
На фиг. 19 представлены результаты иммуногистохимической визуализации опухолей поджелудочных желез, окрашенных антителом к мышиному PD1. Иммуногистохимическое окрашивание PD1-позитивных Т-клеток осуществляли на опухолях поджелудочных желез мышей Black 6, отобранных из указанных групп обработки. Образцы ткани подготавливали для иммуногистохимического окрашивания: опухоли изымали из животных после обработки, фиксировали в 10% формалина (фирма Sigma, Германия) и затем обрабатывали для FFPET-анализа (устройство Leica 1020, Германия). Затем 4-микрометровые парафиновые срезы нарезали с помощью микротома (устройство Leica RM2235, Германия). Иммуногистохимию для выявления мышиного PD1 осуществляли с использованием антитела к мышиному PD1 (фирма R&D System, Германия) с помощью автостейнера Leica (устройство Leica ST5010, Германия) согласно протоколам производителя. Изображения сканировали с помощью сканера фирмы Olympus. Уже в день 4 после первой терапевтической обработки обнаружено очень существенное увеличение количества PD1-позитивных Т-клеток в обработанных PD1-IL2v группах по сравнению с обработанной наполнителем группой. Кроме того, умеренное увеличение количества PD1-позитивных клеток обнаружено в группе, обработанной комбинацией мышиного аналога PD1 и мышиного аналога FAP-IL2v, по сравнению с обработанной наполнителем группой. На фиг. 19 продемонстрировано, что конструкция PD1-IL2v вызывала увеличение инфильтрации PD1-позитивных Т-клеток в опухоль поджелудочной железы через 4 дня после первой обработки по сравнению со всеми другими группами.
На фиг. 20 представлены результаты иммуногистохимической визуализации опухолей поджелудочных желез, окрашенных антителом к мышиному ICOS. Иммуногистохимическое окрашивание ICOS-позитивных Т-клеток осуществляли на опухолях поджелудочных желез мышей Black 6, отобранных из указанных групп обработки. Образцы ткани подготавливали для иммуногистохимического окрашивания: опухоли изымали из животных после обработки, фиксировали в 10% формалина (фирма Sigma, Германия) и затем обрабатывали для FFPET-анализа (устройство Leica 1020, Германия). Затем 4-микрометровые парафиновые срезы нарезали с помощью микротома (устройство Leica RM2235, Германия). Иммуногистохимию для выявления мышиного ICOS осуществляли с использованием антитела к мышиному ICOS (фирма (My Biosource, Германия) с помощью автостейнера Leica (устройство Leica ST5010, Германия) согласно протоколам производителя. Изображения сканировали с помощью сканера фирмы Olympus. Уже в день 4 дня после первой терапевтической обработки было обнаружено снижение количества ICOS-позитивных Т-клеток в обработанных PD1-IL2v группах по сравнению с обработанной наполнителем группой. На фиг. 20 продемонстрировано, что конструкция PD1-IL2v вызывала пониженную инфильтрации ICOS-позитивных Т-клеток в опухоль поджелудочной железы через 4 дня после первой обработки по сравнению со всеми другими группами.
Пример 7
In vivo эффективность иммуноконъюгатов PD1-IL2v на сингенной модели, созданной с помощью линий мышиных опухолевых клеток, в сравнении с антителами к PD1 и FAP-IL2v (две различные дозы), применяемыми индивидуально и в комбинации
2
5
5
Иммуноконъюгат PD1-IL2v (muPD1-IL2v) тестировали в сравнении с комбинацией мышиного аналога PD1 и мышиного аналога FAP-IL2v (muFAP-IL2v) в двух различных дозах в отношении их противоопухолевой эффективности на одной сингенной модели. Применяемая сингенная модель представляла собой сингенную модель Panc02-Fluc, созданную на поджелудочных железах. Иммуноконъюгат мышиный аналог PD1-IL2v тестировали на мышах линии Black 6, внутрь поджелудочных желез которых инъецировали применяемую для трансфекции мышиную клеточную линию Panc02-Fluc. Клетки Panc02-Н7 (мышиная карцинома поджелудочной железы) исходно были получены из центра рака MD Anderson (шт. Техас, США) и после размножения депонированы во внутреннем банке клеток фирмы Roche-Glycart. Линию клеток Panc02-H7-Fluc получали в лаборатории заявителей путем трансфекции кальцием и с помощью методов субклонирования. Клетки Panc02-H7-Fluc культивировали в среде RPMI, содержащей 10% FCS (фирма Sigma), 500 мкг/мл гигромицина и 1% Glutamax. Клетки культивировали при 37°С в насыщенной водяным паром атмосфере с 5% СО. Для трансплантации применяли пассаж 16. Жизнеспособность клеток составляла 83,3%. Инъецировали 1×10 клеток на животное в поджелудочные железы мышей линии Black 6, используя 0,3-миллилитровый туберкулиновый шприц (фирма BD Biosciences, Германия). Для этой цели делали небольшой разрез в левой части брюшной области анестезированных мышей Black 6. Брюшную стенку открывали и поджелудочные железы осторожно изымали с помощью пинцета. 10 мкл (1×10 клеток Panc02-H7-Fluc в среде RPMI) клеточной суспензии инъецировали в хвост поджелудочных желез. На брюшную стенку и кожные раны накладывали швы, используя рассасывающийся шовный материал 5/0.
Самок мышей линии Black 6, возраст которых в начале эксперимента составлял 10-12 недель (фирма Charles Rivers, Лион, Франция) содержали в свободных от специфических патогенов условиях с суточным циклом 12 ч света/12 ч темноты согласно принятым руководствам (GV-Solas; Felasa; TierschG). Протокол экспериментального исследования был рассмотрен и одобрен местными органами управления (ZH193/2014). После доставки животных выдерживали одну неделю для акклиматизации к новому окружению и для обследования. Регулярно осуществляли мониторинг состояния здоровья.
5
Мышам инъецировали внутрь поджелудочных желез в день 0 опыта 1×10 клеток Panc02-Fluc, произвольно разделяли на группы и взвешивали. Через 1 неделю после инъекции опухолевых клеток мышам инъецировали внутривенно PD1-IL2v и сравнивали с комбинацией МАт PD1+FAP-IL2v в двух различных дозах один раз в неделю в течение 4 недель.
Всем мышам инъецировали внутривенно 200 мкл соответствующего раствора. Мышам в обработанной наполнителем группе инъецировали гистидиновый буфер, а мышам из групп обработки (тестируемыми агентами) инъецировали антитела PD1-IL2v (1 мг/кг), PD1 (10 мг/кг) и FAP-IL2v (0,625 мг/кг или 1, 25 мг/кг) или комбинацию антител PD1+FAP-IL2v (10 мг/кг + 1,25 мг/кг или 10 мг/кг + 0,625 мг/кг). Для получения соответствующего количества иммуноконъюгатов на 200 мкл маточные растворы при необходимости разводили гистидиновым буфером, что продемонстрировано в таблице 4.
2
Для получения биолюминисцентных изображений с помощью системы IVIS SPECTRUM мышам инъецировали внутрибрюшинно 150 мг/кг D-люциферина за 10 мин до регистрации биолюминесцентных изображений (изображений в режиме биолюминесценции) (BLI) и последующей анестезии с помощью 4% изофлурана. Затем мышей переносили в изолированную камеру, которую помещали в устройство IVIS Spectrum. In vivo регистрацию BLI осуществляли путем регистрации люминесцентного сигнала в течение 10-50 с. Данные запасали в виде излучения (фотоны)/с/см/sr. In vivo анализ BLI-данных осуществляли с помощью программного обеспечения Living Image 4.4 и описывали с помощью кривой ингибирования опухоли.
Для изучения иммуннофармакодинамики с помощью гистологии 3 мышей из каждой группы умерщвляли через 4 дня после первой обработки путем скручивания шеи. Опухоли поджелудочных желез изымали и немедленно фиксировали в 10% формалина. Ткань выдерживали в растворе формалина в течение ночи и затем обрабатывали для FFPET-анализа (устройство Leica 1020, Германия). Затем 4-микрометровые парафиновые срезы нарезали с помощью микротома (устройство Leica RM2235, Германия). Иммуногистохимию для выявления мышиных CD3, CD8, PD1 и гранзима В осуществляли с помощью автоматической системы окрашивания (автостейнер) Leica (устройство Leica ST5010, Германия) согласно протоколам производителя. Изображения сканировали с помощью сканера фирмы Olympus.
На фиг. 21 и в таблице 5 продемонстрированы результаты эксперимента по оценке эффективности, позволяющие сравнивать действие антител muPD1-IL2v с muFAP-IL2v и muPD-1 при их применении индивидуально и в комбинации. Применяемые для трансфекции клетки карциномы поджелудочной железы линии Panc02-H7-Fluc инъецировали в поджелудочные железы мышей Black 6 для изучения выживаемости на ортотопической сингенной модели опухолей поджелудочной железы. Количество антител, инъецированных каждой мыши, в мг/кг составляло: 1 мг/кг muPD1-IL2v, 10 мг/кг muPD1 и 0,625 или 1,25 мг/кг muFAP-IL2v. Антитела инъецировали внутривенно один раз в неделю в течение 4 недель. Значимо самые высокие медианная и общая выживаемость обнаружены при применении в дозе 1 мг/кг muPD1-IL2v по сравнению с индивидуальными применением всех других агентов и применением комбинации muPD-1 + muFAP-IL2v в обеих изученных дозах. Таким образом, можно сделать заключение о том, что конструкция PD1-IL2v опосредовала наиболее высокую эффективность с точки зрения повышенной медианной и общей выживаемости по сравнению с индивидуальным применением всех других агентов и применением комбинаций PD1 + FAP-IL2v в обеих изученных дозах.
На фиг. 22 представлены результаты эксперимента по оценке эффективности, в котором сравнивали muPD1-IL2v с FAP-IL2v, muPD1 и их комбинации, применяемые в двух различных дозах. Применяемые для трансфекции клетки карциномы поджелудочной железы линии Panc02-H7-Fluc инъецировали в поджелудочные железы мышей Black 6 для изучения выживаемости на ортотопической сингенной модели опухолей поджелудочной железы с помощью биолюминесценции. В процессе всего опыта снижение биолюминесцентного сигнала определяли с помощью IVIS Spectrum в нескольких группах обработки, но только при лечении с помощью muPD1-IL2v обнаружено полное исчезновение BLI-сигнала у всех мышей, что сохранялось на протяжении всего эксперимента, свидетельствуя о полном ответе у всех 6 мышей. На фиг. 22 продемонстрировано, что конструкция PD1-IL2v опосредовала наивысшую эффективность с точки зрения снижения биолюминесцентного сигнала (количество фотонов/с) по сравнению с группами, обработанными всеми другими агентами индивидуально и в комбинации.
На фиг. 23 представлены результаты иммуногистохимической визуализации опухолей поджелудочных желез, окрашенных антителом к мышиному CD3. Иммуногистохимическое окрашивание CD3 Т-клеток осуществляли на опухолях поджелудочных желез мышей Black 6, отобранных из указанных групп обработки. Образцы ткани подготавливали для иммуногистохимического окрашивания следующим образом: опухоли изымали из животных после обработки, фиксировали в 10% формалина (фирма Sigma, Германия) и затем обрабатывали для FFPET-анализа (устройство Leica 1020, Германия). Затем 4-микрометровые парафиновые срезы нарезали с помощью микротома (устройство Leica RM2235, Германия). Иммуногистохимию для выявления мышиного CD3 осуществляли с использованием антитела к мышиному CD3 (фирма Diagnostic Biosystem, Германия) с помощью автостейнера Leica (устройство Leica ST5010, Германия) согласно протоколам производителя. Изображения сканировали с помощью сканера фирмы Olympus. Уже в день 4 дня после первой терапевтической обработки обнаружено очень большое увеличение количества CD3-позитивных Т-клеток в обработанных muPD1-IL2v группах по сравнению с обработанной наполнителем группой. Кроме того, умеренное увеличение количества CD3-позитивных клеток обнаружено во всех других повергнутых терапевтической обработке группах, по сравнению с обработанной наполнителем группой. На фиг. 23 продемонстрировано, что конструкция PD1-IL2v вызывала повышение инфильтрации CD3-позитивных Т-клеток в опухоль поджелудочной железы через 4 дня после первой терапевтической обработки по сравнению со всеми другими группами.
На фиг. 24А и 24Б и в таблице 6 представлены результаты иммуногистохимической визуализации опухолей поджелудочных желез, окрашенных антителом к мышиному CD8 (фиг. 24А), и результаты количественного анализа Т-клеток (фиг. 24Б). Иммуногистохимическое окрашивание CD8 Т-клеток осуществляли на опухолях поджелудочных желез мышей Black 6, отобранных из указанных групп обработки. Образцы ткани подготавливали для иммуногистохимического окрашивания: опухоли изымали из животных после обработки, фиксировали в 10% формалина (фирма Sigma, Германия) и затем обрабатывали для FFPET-анализа (устройство Leica 1020, Германия). Затем 4-микрометровые парафиновые срезы нарезали с помощью микротома (устройство Leica RM2235, Германия). Иммуногистохимию для выявления мышиного CD8 осуществляли с использованием антитела к мышиному CD8 (фирма Serotec, Германия) с помощью автостейнера Leica (устройство Leica ST5010, Германия) согласно протоколам производителя. Изображения сканировали с помощью сканера фирмы Olympus. Количественную оценку muCD8-позитивных Т-клеток проводили с помощью программного обеспечения Definiens (фирма Definiens, Германия). Статистические характеристики анализировали с помощью одностороннего регрессионного анализа для множественных сравнений. Уже в день 4 дня после первой терапевтической обработки обнаружено значимое увеличение количества CD8-позитивных Т-клеток в обработанных muPD1-IL2v группах по сравнению со всеми другими группами. Тенденция к увеличению количества CD8-позитивных клеток обнаружено также во всех обработанных терапевтическими агентами изученных группах, но это различие не было достоверным. Так, на фиг. 24А и 24Б продемонстрировано, что конструкция PD1-IL2v вызывала повышенную инфильтрацию CD8 в опухоль поджелудочной железы через 4 дня после первой обработки по сравнению со всеми другими группами.
На фиг. 25А и 25Б и в таблице 7 представлены результаты иммуногистохимической визуализации опухолей поджелудочных желез, окрашенных антителом к гранзиму В (25А), данные количественного анализа площади, окрашенной маркером гранзима В (25Б). Иммуногистохимическое окрашивание гранзима В осуществляли на опухолях поджелудочных желез мышей Black 6, отобранных из указанных групп обработки. Образцы ткани подготавливали для иммуногистохимического окрашивания: опухоли изымали из животных после обработки, фиксировали в 10% формалина (фирма Sigma, Германия) и затем обрабатывали для FFPET-анализа (устройство Leica 1020, Германия). Затем 4-микрометровые парафиновые срезы нарезали с помощью микротома (устройство Leica RM2235, Германия). Иммуногистохимию для выявления мышиного гранзима В осуществляли с использованием антитела к мышиному гранзиму В (фирма Abcam, Германия) с помощью автостейнера Leica (устройство Leica ST5010, Германия) согласно протоколам производителя. Изображения сканировали с помощью сканера фирмы Olympus. Количественную оценку площади маркера гранзима В проводили с помощью программного обеспечения Definiens (фирма Definiens, Германия). Статистические характеристики анализировали с помощью одностороннего регрессионного анализа для множественных сравнений. Уже в день 4 дня после первой терапевтической обработки обнаружено значимое увеличение количества гранзима B в обработанных muPD1-IL2v группах по сравнению со всеми другими группами. Тенденция к увеличению площади маркера гранзима была обнаружена также во всех обработанных терапевтическими агентами изученных группах, но это различие не было достоверным. Так, на фиг. 25А и 25Б продемонстрировано, что конструкция PD1-IL2v вызывала увеличенную позитивную по гранзиму В площадь в опухоли поджелудочной железы через 4 дня после первой обработки по сравнению со всеми другими группами.
На фиг. 26А и 26Б и в таблице 8 представлены результаты иммуногистохимической визуализации опухолей поджелудочных желез, окрашенных антителом к мышиному PD1 (фиг. 26А), и результаты количественного анализа PD1-позитивных клеток (фиг. 26Б).
Иммуногистохимическое окрашивание позитивных по PD1 клеток осуществляли на опухолях поджелудочных желез мышей Black 6, отобранных из указанных групп обработки. Образцы ткани подготавливали для иммуногистохимического окрашивания: опухоли изымали из животных после обработки, фиксировали в 10% формалина (фирма Sigma, Германия) и затем обрабатывали для FFPET-анализа (устройство Leica 1020, Германия). Затем 4-микрометровые парафиновые срезы нарезали с помощью микротома (устройство Leica RM2235, Германия). Иммуногистохимию для выявления мышиного PD1 осуществляли с использованием антитела к мышиному PD1 (фирма Serotec, Германия) с помощью автостейнера Leica (устройство Leica ST5010, Германия) согласно протоколам производителя. Изображения сканировали с помощью сканера фирмы Olympus. Количественную оценку muPD1-позитивных Т-клеток проводили с помощью программного обеспечения Definiens (фирма Definiens, Германия). Статистические характеристики анализировали с помощью одностороннего регрессионного анализа для множественных сравнений. Уже в день 4 дня после первой терапевтической обработки обнаружено значимое увеличение количества PD1-позитивных клеток в обработанных muPD1-IL2v группах по сравнению со всеми другими группами. Тенденция к увеличению количества PD1-позитивных клеток была обнаружена также во всех других обработанных терапевтическими агентами изученных группах, но это различие не было достоверным. Так, на фиг. 26А и 26Б продемонстрировано, что конструкция PD1-IL2v вызывала повышение количества PD1-позитивных клеток в опухоли поджелудочной железы через 4 дня после первой обработки по сравнению со всеми другими группами.
Пример 7
Воздействие доставки IL-2v к истощенным вирусспецифическим Т-клетками посредством блокады PD-1
Экспрессия PD-1 впервые описана на истощенных вирусоспецифических Т-клетках как результат хронического воздействия вирусных антигенов, и это ассоциировано с неспособностью Т-клеток поддерживать эффективный антивирусный ответ. Вирусоспецифические CD4 Т-клетки обладают способностью одновременно секретировать IL-2 и IFN-γ, обеспечивая защиту от вирусной реактивации при хронических инфекциях. Так, полифункциональная сигнатура CD4 Т-клеток ассоциирована с контролем вирусов у здоровых индивидуумов, зараженных цитомегаловирусом (CMV), вирусом Эепштейна-Барра (EBV) и вирусом герпеса простого (HSV), а также у тех индивидуумов, зараженных вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), у которых в течение нескольких лет отсутствуют симптомы.
В контексте хронических вирусных инфекций при создании изобретения разработан анализ in vitro для оценки воздействия таргетинга PD-1 на доставку мутантной версии IL-2 (IL-2v) к антигенспецифическим Т-клеткам с нарушенной функцией. Во избежание ограничений, связанных с количеством приемлемых для осуществления данного исследования доноров, при создании изобретения был выбран иммуногенный вирусный белок CMV (рр65) в качестве «воскресшего» антигена для Т-клеток, принимая грубо, что 80% популяции является CMV-серопозитивной. Таким образом, при создании изобретения осуществляли стимуляцию мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) здорового донора с использованием CMV-pp65 (фирма Miltonic) в присутствии предлагаемых в изобретении конструкций в концентрации 10 мкг/мл. Через 43 ч блокировали белковый транспорт из аппарата Гольджи, добавляя Golgi Plug (фирма BD Bioscience, брефелдин А) и Golgi Stop (фирма BD Bioscience, монензин), и инкубировали клетки при 37°С в течение еще 5 ч. Затем клетки промывали, окрашивали поверхность с помощью антител к человеческим CD3, CD4, CD8, CD62L и CD45RO, после чего фиксировали/пермеабилизировали с помощью буфера из набора для окрашивания фактора транскрипции FoxP3 (фирма eBioscience). В конце осуществляли внутриклеточное окрашивание в отношение IL-2, IFN-γ и Ki67 (все фирмы eBioscience) для оценки клеточной пролиферации.
На фиг. 27 продемонстрирована способность CD4 Т-клеток секретировать IL-2 (A), IL-2 и IFN-γ (Б) или IFN-γ (В) и способность к пролиферации (Г) при бустер-обработке в течение 48 ч иммуногенным белком CMV рр65 в присутствии либо антитела к PD-1 индивидуально, либо в комбинации с IL-2v, либо в виде слитого белка. Обнаружена тенденция способности PD1-IL2v к повышению частоты встречаемости полифункциональных CD4 Т-клеток, которые могут совместно секретировать IL-2 и IFN-γ (фиг. 27Б), и значимому увеличению популяции, секретирующей только IFN-γ (фиг. 27В), по сравнению с образцами, обработанными рр65 и антителом к PD1. И, наоборот, комбинация рр65 и нетаргетированной конструкции IL-2v (DP47-IL2v) повышала частоту встречаемости секретирующих только IL-2 монофункциональных CD4 Т-клеток (фиг. 27А). Как и ожидалось, все клетки, обработанные таргетированными или нетаргетированнными IL-2v, пролиферировали, что установлено по позитивному Ki67-окрашиванию.
На фиг. 28 представлены данные о статусе дифференцировки в виде экспрессия CD45RO и CD62L вирусоспецифическими CD4 Т-клетками, секретирующими IFN-γ при бустер-обработке в течение 48 ч иммуногенным белком CMV рр65 в присутствии либо антитела к PD-1 индивидуально, либо в комбинации с IL-2v, либо в виде слитого белка. Фенотипическая характеризация размножившихся секретирующих IFN-γ вирусоспецифических CD4 Т-клеток (фиг. 28) подтвердила профиль, соответствующий эффекторным клеткам памяти (CD45RO+CD62L-). Было сделано заключение о том, что доставка IL-2v к истощенным CMV-специфическим CD4 Т-клеткам посредством слитого белка PD1-IL-2v приводила к размножению долгоживущей защитной вирусоспецифической популяции, характеризующейся дифференцированным профилем памяти и способностью секретировать совместно IL-2 и IFN-γ.
Пример 8
Пример 8А. Активация клеток доноров 1 и 2 (pSTAT5-анализ)
Свежевыделенные из здоровых доноров РВМС высевали в теплую среду (RPMI1640, 10% FCS, 2 мМ глутамин) в 96-луночный круглодонный планшет (200000 клеток/лунку). Планшеты центрифугировали при 300 g в течение 10 мин и супернатант удаляли. Клетки ресуспендировали в 50 мкл среды, содержащей молекулы IL2, и стимулировали в течение 20 мин при 37°С. Для сохранения статуса фосфорилирования клетки немедленно после стимуляции фиксировали в равном количестве предварительно нагретого Cytofix-буфера (554655, фирма BD Bioscience) в течение 10 мин при 37°С. Затем планшеты центрифугировали в течение 10 мин при 300 g и супернатант удаляли. Для обеспечения внутриклеточного окрашивания клетки пермеабилизировали в 200 мкл Phosflow Perm буфера III (558050, фирма BD Bioscience) в течение 30 мин при 4°С. Затем клетки промывали дважды 150 мкл холодного FACS-буфера и разделяли на два 96-луночных круглодонных планшета и окрашивали каждый с помощью 20 мкл смеси I или II антител в течение 60 мин в холодильнике. Смесь I антител применяли для окрашивания pSTAT5 в CD4 Т-клетках и регуляторных Т-клетках, а смесь II антител применяли для окрашивания pSTAT5 в CD8 Т-клетках и NK-клетках. Затем клетки промывали дважды FACS-буфером и ресуспендировали, используя 200 мкл FACS-буфера, содержащего 2% PFA, на лунку. Анализ осуществляли с использованием проточного цитометра BD Fortessa.
Для FACS-анализа применяли смеси антител, указанные в таблице 9 и таблице 10.
На фиг. 29 представлены данные о фосфорилировании STAT5 в CD8 Т-клетках (А), NK-клетках (Б), CD4 Т-клетках (В) и регуляторных Т-клетках (Г) после обработки покоящихся РВМС донора 1 с использованием PD1-IL2v, FAP-IL2v и FAP-IL2wt. Все три протестированные молекулы обладали одинаковой активностью в отношении CD8 Т-клеток, NK-клеток и CD4 Т-клеток (за исключением Treg). Конструкция FAP-IL2wt обладала более высокой активностью в отношении индукции фосфорилирования STAT5 в Treg, за ней в порядке снижения активности следовала конструкция PD1-IL2v. Конструкция FAP-IL2v обладала наименьшей активностью в отношении Treg.
На фиг. 30 представлены данные о фосфорилировании STAT5 в CD4 Т-клетках (A), CD8 Т-клетках (Б), регуляторных Т-клетках (В) и NK-клетках (Г) после обработки покоящихся РВМС донора 2 с использованием FAP-IL2v, PD1-IL2c, FAP-IL2wt и PD1-TIM3-IL2v. Все четыре протестированные молекулы обладали сопоставимой активностью в отношении CD8 Т-клеток, NK-клеток и CD4 Т-клеток (за исключением Treg). Конструкция FAP-IL2wt обладала более высокой активностью в отношении индукции фосфорилирования STAT5 в Treg за ней в порядке снижения активности следовала конструкция PD1-IL2v. Конструкция FAP-IL2v обладала наименьшей активностью в отношении Treg.
Пример 8Б. Активация клеток доноров 3 и 4 (pSTAT5-анализ)
Замороженные выделенные из здоровых доноров РВМС подвергали оттаиванию и культивировали в течение ночи при 37°С. На следующий день клетки высевали в теплую среду (RPMI1640, 10% FCS, 2 мМ глутамин) в 96-луночный круглодонный планшет (200000 клеток/лунку). Планшеты центрифугировали при 300 g в течение 10 мин и супернатант удаляли. Клетки ресуспендировали в 50 мкл среды, содержащей молекулы IL2, и стимулировали в течение 20 мин при 37°С. Для сохранения статуса фосфорилирования клетки немедленно после стимуляции фиксировали в равном количестве предварительно нагретого Cytofix-буфера (554655, фирма BD Bioscience) в течение 10 мин при 37°С. Затем планшеты центрифугировали в течение 10 мин при 300 g и супернатант удаляли. Для обеспечения внутриклеточного окрашивания клетки пермеабилизировали в 200 мкл Phosflow Perm буфера III (558050, фирма BD Bioscience) в течение 30 мин при 4°С. Затем клетки промывали дважды 150 мкл холодного FACS-буфера и разделяли на два 96-луночных круглодонных планшета и окрашивали каждый с помощью 20 мкл смеси I или II антител в течение 60 мин в холодильнике. Смесь I антител применяли для окрашивания pSTAT5 в CD4 Т-клетках и регуляторных Т-клетках, а смесь II антител применяли для окрашивания pSTAT5 в CD8 Т-клетках и NK-клетках. Затем клетки промывали дважды FACS-буфером и ресуспендировали, используя 200 мкл FACS-буфера, содержащего 2% PFA, на лунку. Анализ осуществляли с использованием проточного цитометра BD Fortessa.
Для FACS-анализа применяли смеси антител, указанные в таблице 11 и таблице 12.
На фиг. 31 представлены данные о фосфорилировании STAT5 в CD8 Т-клетках (А), NK-клетках (Б), CD4 Т-клетках (В) и регуляторных Т-клетках (Г) после обработки покоящихся РВМС донора 3 с использованием FAP-IL2v, PD1-IL2v, FAP-IL2wt, PD1-TIM3-IL2v. Все четыре протестированные молекулы обладали сопоставимой активностью в отношении CD8 Т-клеток, NK-клеток и CD4 Т-клеток (за исключением Treg). Конструкция FAP-IL2wt обладала более высокой активностью в отношении индукции фосфорилирования STAT5 в Treg. за ней в порядке снижения активности следовала конструкция PD1-IL2v. Конструкция FAP-IL2v обладала наименьшей активностью в отношении Treg.
На фиг. 32 представлены данные о фосфорилировании STAT5 в CD8 Т-клетках (А), NK-клетках (Б), CD4 Т-клетках (В) и регуляторных Т-клетках (Г) после обработки покоящихся РВМС донора 4 FAP-IL2v, PD1-IL2v, FAP-IL2wt, PD1-TIM3-IL2v. Все четыре протестированные молекулы обладали сопоставимой активностью в отношении CD8 Т-клеток, NK-клеток и CD4 Т-клеток (за исключением Treg). Конструкция FAP-IL2wt обладала более высокой активностью в отношении индукции фосфорилирования STAT5 в Treg за ней в порядке снижения активности следовала конструкция PD1-IL2v. Конструкция FAP-IL2v обладала наименьшей активностью в отношении Treg.
Дополнительные объекты изобретения
1. Иммуноконъюгат, содержащий мутантный полипептид IL-2 и антитело, которое связывается с PD-1,
в котором мутантный полипептид IL-2 представляет собой молекулу человеческого IL-2, содержащую аминокислотные замены F42A, Y45A и L72G (нумерация относительно последовательности SEQ ID NO: 19) человеческого IL-2.
2. Иммуноконъюгат, содержащий мутантный полипептид IL-2 и антитело, которое связывается с PD-1,
в котором мутантный полипептид IL-2 представляет собой молекулу человеческого IL-2, содержащую аминокислотные замены F42A, Y45A и L72G (нумерация относительно последовательности человеческого IL-2 SEQ ID NO: 19); и
в котором антитело содержит (а) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, FR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7 в положениях 71-73 согласно нумерации Кэбота, и (б) вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6.
3. Иммуноконъюгат, содержащий мутантный полипептид IL-2 и антитело, которое связывается с PD-1,
в котором мутантный полипептид IL-2 представляет собой молекулу человеческого IL-2, содержащую аминокислотные замены F42A, Y45A и L72G (нумерация относительно последовательности человеческого IL-2 SEQ ID NO: 19); и
в котором антитело содержит (а) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, и (б) вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, и HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13.
4. Иммуноконъюгат, содержащий мутантный полипептид IL-2 и антитело, которое связывается с PD-1,
в котором мутантный полипептид IL-2 представляет собой молекулу человеческого IL-2, содержащую аминокислотные замены F42A, Y45A и L72G (нумерация относительно последовательности человеческого IL-2 SEQ ID NO: 19); и
в котором антитело содержит (а) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 14, и (б) вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 и SEQ ID NO: 18.
5. Иммуноконъюгат по одному из объектов изобретения 1-4, в котором мутантный полипептид IL-2 содержит дополнительно аминокислотную замену Т3А и/или аминокислотную замену С125 А.
6. Иммуноконъюгат по одному из объектов изобретения 1-5, в котором мутантный полипептид IL-2 содержит последовательность SEQ ID NO: 20.
7. Иммуноконъюгат по одному из объектов изобретения 1-6, где иммуноконъюгат содержит не более одного мутантного полипептида IL-2.
8. Иммуноконъюгат по одному из объектов изобретения 1-7, в котором антитело содержит Fc-домен, состоящий из первой и второй субъединиц.
1
9. Иммуноконъюгат по объекту изобретения 8, в котором Fc-домен представляет собой Fc-домен IgG-класса, в частности Fc-домен IgG-подкласса.
10. Иммуноконъюгат по объекту изобретения 8 или 9, в котором Fc-домен представляет собой человеческий Fc-домен.
1
11. Иммуноконъюгат по одному из объектов изобретения 1-10, в котором антитело представляет собой иммуноглобулин IgG-класса, в частности IgG-подкласса.
12. Иммуноконъюгат по одному из объектов изобретения 8-11, в котором Fc-домен содержит модификацию, способствующую ассоциации первой и второй субъединиц Fc-домена.
13. Иммуноконъюгат по одному из объектов изобретения 8-12, в котором в СН3-домене первой субъединицы Fc-домена аминокислотный остаток заменен аминокислотным остатком, который имеет больший объем боковой цепи, что приводит к образованию выпуклости на СН3-домене первой субъединицы, которая может помещаться в полость в СН3-домене второй субъединицы, и в СН3-домене второй субъединицы Fc-домена аминокислотный остаток заменен аминокислотным остатком, который имеет меньший объем боковой цепи, что приводит к образованию полости в СН3-домене второй субъединицы, в которую может помещаться выпуклость на СН3-домене первой субъединицы.
14. Иммуноконъюгат по одному из объектов изобретения 8-13, в котором в первой субъединице Fc-домена остаток треонина в положении 366 замен на остаток триптофана (T366W), а во второй субъединице Fc-домена остаток тирозина в положении 407 заменен на остаток валина (Y407V) и необязательно остаток треонина в положении 366 заменен на остаток серина (T366S) и остаток лейцина в положении 368 заменен на остаток аланина (L368A) (нумерация согласно EU-индексу Кэбота).
15. Иммуноконъюгат по объекту изобретения 14, в котором в первой субъединице Fc-домена дополнительно остаток серина в положении 354 заменен на остаток цистеина (S354C) или остаток глутаминовой кислоты в положении 356 заменен на остаток цистеина (Е356С), и во второй субъединице Fc-домена дополнительно остаток тирозина в положении 349 замене на остаток цистеина (Y349C) (нумерация согласно EU-индексу Кэбота).
16. Иммуноконъюгат по одному из объектов изобретения 8-15, в котором мутантный полипептид IL-2 слит на его аминоконцевой аминокислоте с карбоксиконцевой аминокислотой одной из субъединиц Fc-домена, в частности первой субъединицы Fc-домена, необязательно через линкерный пептид.
17. Иммуноконъюгат по объекту изобретения 16, в котором линкерный пептид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21.
18. Иммуноконъюгат по одному из объектов изобретения 8-16, в котором Fc-домен содержит одну или несколько аминокислотную(ых) замену(н), которая(ые) снижает(ют) связывание с Fc-рецептором, в частности Fcγ-рецептором, и/или эффекторную функцию, в частности антитело-обусловленную клеточнозависимую цитотоксичность (ADCC).
19. Иммуноконъюгат по объекту изобретения 18, в котором указанная(ые) одна или несколько аминокислотная(ых) замена(н) находится(ятся) в одном или нескольких положении(ях), выбранном(ых) из группы L234, L235 и Р329 (нумерация согласно EU-индексу Кэбота).
20. Иммуноконъюгат по одному из объектов изобретения 8-19, в котором каждая субъединица Fc-домена содержит аминокислотные замены L234A, L235A и P329G (нумерация согласно EU-индексу Кэбота).
21. Иммуноконъюгат по одному из п.п. 1-20, содержащий полипептид, который содержит аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% последовательности SEQ ID NO: 22, полипептид, который содержит аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% последовательности SEQ ID NO: 23 или SEQ ID NO: 24, и полипептид, который содержит аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% последовательности SEQ ID NO: 25.
1
22. Иммуноконъюгат по одному из объектов изобретения 1-21, который практически состоит из мутантного полипептида IL-2 и молекулы иммуноглобулина IgG, соединенных линкерной последовательностью.
23. Один или несколько выделенных полинуклеотидов, который(ые) кодирует(ют) иммуноконъюгат по одному из объектов изобретения 1-22.
24. Один или несколько векторов, в частности экспрессионных векторов, содержащих полинуклеотид(ы) по объекту изобретения 23.
25. Клетка-хозяин, содержащая полинуклеотид(ы) по объекту изобретения 23 или вектор(ы) по объекту изобретения 24.
26. Способ получения иммуноконъюгата, который содержит мутантный полипептид IL-2 и антитело, которое связывается с PD-1, включающий (а) культивирование клетки-хозяина по объекту изобретения 25 в условиях, пригодных для экспрессии иммуноконъюгата, и необязательно (б) выделение иммуноконъюгата.
27. Иммуноконъюгат, который содержит мутантный полипептид IL-2 и антитело, которое связывается с PD-1, полученный способом по объекту изобретения 26.
28. Фармацевтическая композиция, содержащая иммуноконъюгат по одному из объектов изобретения 1-22 или 27 и фармацевтически приемлемый носитель.
29.Иммуноконъюгат по одному из объектов изобретения 1-22 или 27, предназначенный для применения в качестве лекарственного средства.
30. Иммуноконъюгат по одному из объектов изобретения 1-22 или 27, предназначенный для применения для лечения заболевания.
31. Иммуноконъюгат, предназначенный для лечения заболевания по объекту изобретения 30, где указанное заболевание представляет собой рак.
32. Применение иммуноконъюгата по одному из объектов изобретения 1-22 или 27 для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения заболевания.
33. Применение по объекту изобретения 32, в котором указанное заболевание представляет собой рак.
34. Способ лечения заболевания у индивидуума, включающий введение указанному индивидууму в терапевтически эффективном количестве композиции, которая содержит иммуноконъюгат по одному из объектов изобретения 1-22 или 27 в фармацевтически приемлемой форме.
35. Способ по объекту изобретения 34, в котором указанное заболевание представляет собой рак.
36. Способ стимуляции иммунной системы индивидуума, включающий введение указанному индивидууму в эффективном количестве композиции, которая содержит иммуноконъюгат по одному из объектов изобретения 1-22 или 27 в фармацевтически приемлемой форме.
37. Изобретение, как оно описано выше.
Хотя изобретение описано выше достаточно подробно с помощью иллюстраций и примеров, приведенных для целей лучшего понимания, описание и примеры не должны рассматриваться как ограничивающие объем изобретения. Все процитированные в настоящем описании патентные и научные публикации специально полностью включены в него в качестве ссылки.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  Ф. Хоффманн-Ля Рош АГ
<120>  Иммуноконъюгаты антитела к PD-1 с мутантом IL-2 или IL-15
<130>  P34189
<160>  51
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  4
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic construct
<400>  1
Ser Ser Tyr Thr
1
<210>  2
<211>  8
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic construct
<400>  2
Ser Gly Gly Gly Arg Asp Ile Tyr
1               5
<210>  3
<211>  5
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  3
Gly Arg Val Tyr Phe
1               5
<210>  4
<211>  6
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  4
Thr Ser Asp Asn Ser Phe
1               5
<210>  5
<211>  7
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  5
Arg Ser Ser Thr Leu Glu Ser
1               5
<210>  6
<211>  6
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  6
Asn Tyr Asp Val Pro Trp
1               5
<210>  7
<211>  3
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  7
Arg Asp Asn
1
<210>  8
<211>  7
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  8
Gly Phe Ser Phe Ser Ser Tyr
1               5
<210>  9
<211>  3
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  9
Gly Gly Arg
1
<210>  10
<211>  9
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  10
Thr Gly Arg Val Tyr Phe Ala Leu Asp
1               5
<210>  11
<211>  11
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  11
Ser Glu Ser Val Asp Thr Ser Asp Asn Ser Phe
1               5                   10
<210>  12
<211>  3
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  12
Arg Ser Ser
1
<210>  13
<211>  6
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  13
Asn Tyr Asp Val Pro Trp
1               5
<210>  14
<211>  120
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  14
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Arg Asp Ile Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Val Leu Leu Thr Gly Arg Val Tyr Phe Ala Leu Asp Ser Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  15
<211>  111
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  15
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Ser
20                  25                  30
Asp Asn Ser Phe Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro
35                  40                  45
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ser Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp
50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65                  70                  75                  80
Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Tyr
85                  90                  95
Asp Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105                 110
<210>  16
<211>  111
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  16
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1               5                   10                  15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Ser
20                  25                  30
Asp Asn Ser Phe Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro
35                  40                  45
Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ser Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp
50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser
65                  70                  75                  80
Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Tyr
85                  90                  95
Asp Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105                 110
<210>  17
<211>  111
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  17
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Ser
20                  25                  30
Asp Asn Ser Phe Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro
35                  40                  45
Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ser Ser Thr Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala
50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65                  70                  75                  80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Tyr
85                  90                  95
Asp Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105                 110
<210>  18
<211>  111
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  18
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Ser
20                  25                  30
Asp Asn Ser Phe Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro
35                  40                  45
Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ser Ser Thr Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala
50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65                  70                  75                  80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Tyr
85                  90                  95
Asp Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105                 110
<210>  19
<211>  133
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  19
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1               5                   10                  15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20                  25                  30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35                  40                  45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50                  55                  60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65                  70                  75                  80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85                  90                  95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100                 105                 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115                 120                 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210>  20
<211>  133
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  20
Ala Pro Ala Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1               5                   10                  15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20                  25                  30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Ala Met Pro Lys
35                  40                  45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50                  55                  60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Gly Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65                  70                  75                  80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85                  90                  95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100                 105                 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile
115                 120                 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210>  21
<211>  15
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  21
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1               5                   10                  15
<210>  22
<211>  597
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  22
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Arg Asp Ile Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Val Leu Leu Thr Gly Arg Val Tyr Phe Ala Leu Asp Ser Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115                 120                 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130                 135                 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145                 150                 155                 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165                 170                 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180                 185                 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195                 200                 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210                 215                 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
225                 230                 235                 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245                 250                 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260                 265                 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275                 280                 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290                 295                 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305                 310                 315                 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu
325                 330                 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340                 345                 350
Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355                 360                 365
Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370                 375                 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385                 390                 395                 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405                 410                 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420                 425                 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435                 440                 445
Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
450                 455                 460
Ala Pro Ala Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
465                 470                 475                 480
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
485                 490                 495
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Ala Met Pro Lys
500                 505                 510
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
515                 520                 525
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Gly Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
530                 535                 540
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
545                 550                 555                 560
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
565                 570                 575
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile
580                 585                 590
Ile Ser Thr Leu Thr
595
<210>  23
<211>  448
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  23
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Arg Asp Ile Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Val Leu Leu Thr Gly Arg Val Tyr Phe Ala Leu Asp Ser Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115                 120                 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130                 135                 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145                 150                 155                 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165                 170                 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180                 185                 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195                 200                 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210                 215                 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
225                 230                 235                 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245                 250                 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260                 265                 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275                 280                 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290                 295                 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305                 310                 315                 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu
325                 330                 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys
340                 345                 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355                 360                 365
Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370                 375                 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385                 390                 395                 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp
405                 410                 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420                 425                 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435                 440                 445
<210>  24
<211>  448
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  24
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Arg Asp Ile Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Val Leu Leu Thr Gly Arg Val Tyr Phe Ala Leu Asp Ser Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115                 120                 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130                 135                 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145                 150                 155                 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165                 170                 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180                 185                 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195                 200                 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210                 215                 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
225                 230                 235                 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245                 250                 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260                 265                 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275                 280                 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290                 295                 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305                 310                 315                 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu
325                 330                 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys
340                 345                 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355                 360                 365
Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370                 375                 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385                 390                 395                 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp
405                 410                 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420                 425                 430
Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435                 440                 445
<210>  25
<211>  218
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  25
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Ser
20                  25                  30
Asp Asn Ser Phe Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro
35                  40                  45
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ser Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp
50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65                  70                  75                  80
Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Tyr
85                  90                  95
Asp Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100                 105                 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115                 120                 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130                 135                 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145                 150                 155                 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165                 170                 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180                 185                 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195                 200                 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210                 215
<210>  26
<211>  20
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  26
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
1               5                   10                  15
Val Thr Asn Ser
20
<210>  27
<211>  268
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  27
Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr
1               5                   10                  15
Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe
20                  25                  30
Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr
35                  40                  45
Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu
50                  55                  60
Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu
65                  70                  75                  80
Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn
85                  90                  95
Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala
100                 105                 110
Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg
115                 120                 125
Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly
130                 135                 140
Gln Phe Gln Thr Leu Val Val Gly Val Val Gly Gly Leu Leu Gly Ser
145                 150                 155                 160
Leu Val Leu Leu Val Trp Val Leu Ala Val Ile Cys Ser Arg Ala Ala
165                 170                 175
Arg Gly Thr Ile Gly Ala Arg Arg Thr Gly Gln Pro Leu Lys Glu Asp
180                 185                 190
Pro Ser Ala Val Pro Val Phe Ser Val Asp Tyr Gly Glu Leu Asp Phe
195                 200                 205
Gln Trp Arg Glu Lys Thr Pro Glu Pro Pro Val Pro Cys Val Pro Glu
210                 215                 220
Gln Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Pro Ser Gly Met Gly Thr Ser
225                 230                 235                 240
Ser Pro Ala Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Pro Arg Ser Ala Gln Pro
245                 250                 255
Leu Arg Pro Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro Leu
260                 265
<210>  28
<211>  288
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  28
Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln
1               5                   10                  15
Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp
20                  25                  30
Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp
35                  40                  45
Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val
50                  55                  60
Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala
65                  70                  75                  80
Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg
85                  90                  95
Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg
100                 105                 110
Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu
115                 120                 125
Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val
130                 135                 140
Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro
145                 150                 155                 160
Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr Leu Val Val Gly Val Val Gly Gly
165                 170                 175
Leu Leu Gly Ser Leu Val Leu Leu Val Trp Val Leu Ala Val Ile Cys
180                 185                 190
Ser Arg Ala Ala Arg Gly Thr Ile Gly Ala Arg Arg Thr Gly Gln Pro
195                 200                 205
Leu Lys Glu Asp Pro Ser Ala Val Pro Val Phe Ser Val Asp Tyr Gly
210                 215                 220
Glu Leu Asp Phe Gln Trp Arg Glu Lys Thr Pro Glu Pro Pro Val Pro
225                 230                 235                 240
Cys Val Pro Glu Gln Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Pro Ser Gly
245                 250                 255
Met Gly Thr Ser Ser Pro Ala Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Pro Arg
260                 265                 270
Ser Ala Gln Pro Leu Arg Pro Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro Leu
275                 280                 285
<210>  29
<211>  133
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  29
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1               5                   10                  15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20                  25                  30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35                  40                  45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50                  55                  60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65                  70                  75                  80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85                  90                  95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100                 105                 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile
115                 120                 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210>  30
<211>  225
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  30
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1               5                   10                  15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20                  25                  30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35                  40                  45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50                  55                  60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65                  70                  75                  80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85                  90                  95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100                 105                 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115                 120                 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130                 135                 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145                 150                 155                 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165                 170                 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180                 185                 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195                 200                 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210                 215                 220
Pro
225
<210>  31
<211>  107
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  31
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1               5                   10                  15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20                  25                  30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35                  40                  45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50                  55                  60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65                  70                  75                  80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85                  90                  95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100                 105
<210>  32
<211>  105
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  32
Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu
1               5                   10                  15
Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe
20                  25                  30
Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val
35                  40                  45
Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys
50                  55                  60
Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser
65                  70                  75                  80
His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu
85                  90                  95
Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
100                 105
<210>  33
<211>  328
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  33
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85                  90                  95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100                 105                 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115                 120                 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130                 135                 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145                 150                 155                 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165                 170                 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180                 185                 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195                 200                 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210                 215                 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225                 230                 235                 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245                 250                 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260                 265                 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275                 280                 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290                 295                 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305                 310                 315                 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210>  34
<211>  607
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  34
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Ser
20                  25                  30
Tyr Arg Trp Asn Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn Arg Leu Glu Trp
35                  40                  45
Met Gly Tyr Ile Asn Ser Ala Gly Ile Ser Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50                  55                  60
Lys Arg Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65                  70                  75                  80
Leu Gln Val Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Ser Asp Asn Met Gly Thr Thr Pro Phe Thr Tyr Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val
115                 120                 125
Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr
130                 135                 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr
145                 150                 155                 160
Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165                 170                 175
Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser
180                 185                 190
Ser Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala
195                 200                 205
Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys
210                 215                 220
Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe
225                 230                 235                 240
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val
245                 250                 255
Thr Cys Val Val Val Ala Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe
260                 265                 270
Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Lys Pro
275                 280                 285
Arg Glu Glu Gln Ile Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro
290                 295                 300
Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val
305                 310                 315                 320
Asn Ser Ala Ala Phe Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr
325                 330                 335
Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys
340                 345                 350
Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asn
355                 360                 365
Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro
370                 375                 380
Ala Glu Asn Tyr Asp Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser
385                 390                 395                 400
Tyr Phe Val Tyr Ser Asp Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala
405                 410                 415
Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His
420                 425                 430
His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser
435                 440                 445
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Ala Ser Ser Ser
450                 455                 460
Thr Ser Ser Ser Thr Ala Glu Ala Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln
465                 470                 475                 480
Gln Gln Gln Gln His Leu Glu Gln Leu Leu Met Asp Leu Gln Glu Leu
485                 490                 495
Leu Ser Arg Met Glu Asn Tyr Arg Asn Leu Lys Leu Pro Arg Met Leu
500                 505                 510
Thr Ala Lys Phe Ala Leu Pro Lys Gln Ala Thr Glu Leu Lys Asp Leu
515                 520                 525
Gln Cys Leu Glu Asp Glu Leu Gly Pro Leu Arg His Val Leu Asp Gly
530                 535                 540
Thr Gln Ser Lys Ser Phe Gln Leu Glu Asp Ala Glu Asn Phe Ile Ser
545                 550                 555                 560
Asn Ile Arg Val Thr Val Val Lys Leu Lys Gly Ser Asp Asn Thr Phe
565                 570                 575
Glu Cys Gln Phe Asp Asp Glu Ser Ala Thr Val Val Asp Phe Leu Arg
580                 585                 590
Arg Trp Ile Ala Phe Ala Gln Ser Ile Ile Ser Thr Ser Pro Gln
595                 600                 605
<210>  35
<211>  442
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  35
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Ser
20                  25                  30
Tyr Arg Trp Asn Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn Arg Leu Glu Trp
35                  40                  45
Met Gly Tyr Ile Asn Ser Ala Gly Ile Ser Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50                  55                  60
Lys Arg Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65                  70                  75                  80
Leu Gln Val Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Ser Asp Asn Met Gly Thr Thr Pro Phe Thr Tyr Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val
115                 120                 125
Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr
130                 135                 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr
145                 150                 155                 160
Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165                 170                 175
Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser
180                 185                 190
Ser Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala
195                 200                 205
Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys
210                 215                 220
Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe
225                 230                 235                 240
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val
245                 250                 255
Thr Cys Val Val Val Ala Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe
260                 265                 270
Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Lys Pro
275                 280                 285
Arg Glu Glu Gln Ile Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro
290                 295                 300
Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val
305                 310                 315                 320
Asn Ser Ala Ala Phe Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr
325                 330                 335
Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys
340                 345                 350
Lys Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asn
355                 360                 365
Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro
370                 375                 380
Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Lys Thr Asp Gly Ser
385                 390                 395                 400
Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala
405                 410                 415
Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His
420                 425                 430
His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro
435                 440
<210>  36
<211>  218
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  36
Asp Ile Val Met Thr Gln Gly Thr Leu Pro Asn Pro Val Pro Ser Gly
1               5                   10                  15
Glu Ser Val Ser Ile Thr Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Tyr Ser
20                  25                  30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Trp Met Ser Thr Arg Ala Ser Gly Val Ser
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Gly Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly
85                  90                  95
Leu Glu Phe Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg
100                 105                 110
Thr Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln
115                 120                 125
Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr
130                 135                 140
Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln
145                 150                 155                 160
Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165                 170                 175
Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg
180                 185                 190
His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro
195                 200                 205
Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210                 215
<210>  37
<211>  595
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  37
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser
20                  25                  30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115                 120                 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130                 135                 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145                 150                 155                 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165                 170                 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180                 185                 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195                 200                 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210                 215                 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser
225                 230                 235                 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245                 250                 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260                 265                 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275                 280                 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290                 295                 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305                 310                 315                 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325                 330                 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340                 345                 350
Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys
355                 360                 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370                 375                 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385                 390                 395                 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405                 410                 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420                 425                 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly
435                 440                 445
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro
450                 455                 460
Ala Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu
465                 470                 475                 480
Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro
485                 490                 495
Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Ala Met Pro Lys Lys Ala
500                 505                 510
Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu
515                 520                 525
Glu Glu Val Leu Asn Gly Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro
530                 535                 540
Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly
545                 550                 555                 560
Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile
565                 570                 575
Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile Ile Ser
580                 585                 590
Thr Leu Thr
595
<210>  38
<211>  446
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  38
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser
20                  25                  30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115                 120                 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130                 135                 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145                 150                 155                 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165                 170                 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180                 185                 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195                 200                 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210                 215                 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser
225                 230                 235                 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245                 250                 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260                 265                 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275                 280                 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290                 295                 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305                 310                 315                 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325                 330                 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu
340                 345                 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys
355                 360                 365
Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370                 375                 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385                 390                 395                 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405                 410                 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420                 425                 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435                 440                 445
<210>  39
<211>  214
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  39
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20                  25                  30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210>  40
<211>  605
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  40
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser
20                  25                  30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro
115                 120                 125
Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly
130                 135                 140
Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn
145                 150                 155                 160
Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165                 170                 175
Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr
180                 185                 190
Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser
195                 200                 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro
210                 215                 220
Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
225                 230                 235                 240
Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys
245                 250                 255
Val Val Val Ala Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp
260                 265                 270
Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu
275                 280                 285
Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met
290                 295                 300
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser
305                 310                 315                 320
Ala Ala Phe Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly
325                 330                 335
Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln
340                 345                 350
Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe
355                 360                 365
Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu
370                 375                 380
Asn Tyr Asp Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe
385                 390                 395                 400
Val Tyr Ser Asp Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn
405                 410                 415
Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr
420                 425                 430
Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
435                 440                 445
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Ala Ser Ser Ser Thr Ser
450                 455                 460
Ser Ser Thr Ala Glu Ala Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln
465                 470                 475                 480
Gln Gln His Leu Glu Gln Leu Leu Met Asp Leu Gln Glu Leu Leu Ser
485                 490                 495
Arg Met Glu Asn Tyr Arg Asn Leu Lys Leu Pro Arg Met Leu Thr Ala
500                 505                 510
Lys Phe Ala Leu Pro Lys Gln Ala Thr Glu Leu Lys Asp Leu Gln Cys
515                 520                 525
Leu Glu Asp Glu Leu Gly Pro Leu Arg His Val Leu Asp Gly Thr Gln
530                 535                 540
Ser Lys Ser Phe Gln Leu Glu Asp Ala Glu Asn Phe Ile Ser Asn Ile
545                 550                 555                 560
Arg Val Thr Val Val Lys Leu Lys Gly Ser Asp Asn Thr Phe Glu Cys
565                 570                 575
Gln Phe Asp Asp Glu Ser Ala Thr Val Val Asp Phe Leu Arg Arg Trp
580                 585                 590
Ile Ala Phe Ala Gln Ser Ile Ile Ser Thr Ser Pro Gln
595                 600                 605
<210>  41
<211>  440
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  41
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser
20                  25                  30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro
115                 120                 125
Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly
130                 135                 140
Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn
145                 150                 155                 160
Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165                 170                 175
Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr
180                 185                 190
Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser
195                 200                 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro
210                 215                 220
Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
225                 230                 235                 240
Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys
245                 250                 255
Val Val Val Ala Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp
260                 265                 270
Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu
275                 280                 285
Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met
290                 295                 300
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser
305                 310                 315                 320
Ala Ala Phe Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly
325                 330                 335
Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Lys Gln
340                 345                 350
Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe
355                 360                 365
Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu
370                 375                 380
Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Lys Thr Asp Gly Ser Tyr Phe
385                 390                 395                 400
Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn
405                 410                 415
Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr
420                 425                 430
Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro
435                 440
<210>  42
<211>  214
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  42
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20                  25                  30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala
100                 105                 110
Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly
115                 120                 125
Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile
130                 135                 140
Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu
145                 150                 155                 160
Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser
165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr
180                 185                 190
Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser
195                 200                 205
Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210
<210>  43
<211>  150
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  43
Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr
1               5                   10                  15
Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe
20                  25                  30
Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr
35                  40                  45
Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu
50                  55                  60
Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu
65                  70                  75                  80
Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn
85                  90                  95
Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala
100                 105                 110
Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg
115                 120                 125
Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly
130                 135                 140
Gln Phe Gln Thr Leu Val
145                 150
<210>  44
<211>  608
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  44
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe
20                  25                  30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe
50                  55                  60
Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100                 105                 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser
115                 120                 125
Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val
130                 135                 140
Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145                 150                 155                 160
Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165                 170                 175
Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro
180                 185                 190
Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro
195                 200                 205
Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly
210                 215                 220
Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile
225                 230                 235                 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys
245                 250                 255
Val Thr Cys Val Val Val Ala Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln
260                 265                 270
Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Lys
275                 280                 285
Pro Arg Glu Glu Gln Ile Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu
290                 295                 300
Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg
305                 310                 315                 320
Val Asn Ser Ala Ala Phe Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325                 330                 335
Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro
340                 345                 350
Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr
355                 360                 365
Asn Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln
370                 375                 380
Pro Ala Glu Asn Tyr Asp Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly
385                 390                 395                 400
Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Asp Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu
405                 410                 415
Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn
420                 425                 430
His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly
435                 440                 445
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Ala Ser Ser
450                 455                 460
Ser Thr Ser Ser Ser Thr Ala Glu Ala Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln
465                 470                 475                 480
Gln Gln Gln Gln Gln His Leu Glu Gln Leu Leu Met Asp Leu Gln Glu
485                 490                 495
Leu Leu Ser Arg Met Glu Asn Tyr Arg Asn Leu Lys Leu Pro Arg Met
500                 505                 510
Leu Thr Ala Lys Phe Ala Leu Pro Lys Gln Ala Thr Glu Leu Lys Asp
515                 520                 525
Leu Gln Cys Leu Glu Asp Glu Leu Gly Pro Leu Arg His Val Leu Asp
530                 535                 540
Gly Thr Gln Ser Lys Ser Phe Gln Leu Glu Asp Ala Glu Asn Phe Ile
545                 550                 555                 560
Ser Asn Ile Arg Val Thr Val Val Lys Leu Lys Gly Ser Asp Asn Thr
565                 570                 575
Phe Glu Cys Gln Phe Asp Asp Glu Ser Ala Thr Val Val Asp Phe Leu
580                 585                 590
Arg Arg Trp Ile Ala Phe Ala Gln Ser Ile Ile Ser Thr Ser Pro Gln
595                 600                 605
<210>  45
<211>  445
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  45
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe
20                  25                  30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe
50                  55                  60
Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100                 105                 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser
115                 120                 125
Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val
130                 135                 140
Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145                 150                 155                 160
Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165                 170                 175
Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro
180                 185                 190
Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro
195                 200                 205
Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly
210                 215                 220
Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile
225                 230                 235                 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys
245                 250                 255
Val Thr Cys Val Val Val Ala Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln
260                 265                 270
Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Lys
275                 280                 285
Pro Arg Glu Glu Gln Ile Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu
290                 295                 300
Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg
305                 310                 315                 320
Val Asn Ser Ala Ala Phe Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325                 330                 335
Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro
340                 345                 350
Lys Lys Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr
355                 360                 365
Asn Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln
370                 375                 380
Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Lys Thr Asp Gly
385                 390                 395                 400
Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu
405                 410                 415
Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn
420                 425                 430
His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
435                 440                 445
<210>  46
<211>  215
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  46
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Ala Ala Val Gly Thr Tyr
20                  25                  30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Lys Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Leu
85                  90                  95
Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala
100                 105                 110
Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser
115                 120                 125
Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp
130                 135                 140
Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val
145                 150                 155                 160
Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met
165                 170                 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser
180                 185                 190
Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys
195                 200                 205
Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210                 215
<210>  47
<211>  604
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  47
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Ala Ile Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu
115                 120                 125
Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys
130                 135                 140
Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser
145                 150                 155                 160
Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165                 170                 175
Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp
180                 185                 190
Pro Ser Gln Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr
195                 200                 205
Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys
210                 215                 220
Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys
225                 230                 235                 240
Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val
245                 250                 255
Val Val Ala Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe
260                 265                 270
Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Lys Pro Arg Glu Glu
275                 280                 285
Gln Ile Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His
290                 295                 300
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala
305                 310                 315                 320
Ala Phe Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg
325                 330                 335
Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met
340                 345                 350
Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asn Phe Phe Pro
355                 360                 365
Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn
370                 375                 380
Tyr Asp Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val
385                 390                 395                 400
Tyr Ser Asp Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr
405                 410                 415
Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu
420                 425                 430
Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
435                 440                 445
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Ala Ser Ser Ser Thr Ser Ser
450                 455                 460
Ser Thr Ala Glu Ala Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln
465                 470                 475                 480
Gln His Leu Glu Gln Leu Leu Met Asp Leu Gln Glu Leu Leu Ser Arg
485                 490                 495
Met Glu Asn Tyr Arg Asn Leu Lys Leu Pro Arg Met Leu Thr Ala Lys
500                 505                 510
Phe Ala Leu Pro Lys Gln Ala Thr Glu Leu Lys Asp Leu Gln Cys Leu
515                 520                 525
Glu Asp Glu Leu Gly Pro Leu Arg His Val Leu Asp Gly Thr Gln Ser
530                 535                 540
Lys Ser Phe Gln Leu Glu Asp Ala Glu Asn Phe Ile Ser Asn Ile Arg
545                 550                 555                 560
Val Thr Val Val Lys Leu Lys Gly Ser Asp Asn Thr Phe Glu Cys Gln
565                 570                 575
Phe Asp Asp Glu Ser Ala Thr Val Val Asp Phe Leu Arg Arg Trp Ile
580                 585                 590
Ala Phe Ala Gln Ser Ile Ile Ser Thr Ser Pro Gln
595                 600
<210>  48
<211>  441
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  48
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Ala Ile Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu
115                 120                 125
Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys
130                 135                 140
Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser
145                 150                 155                 160
Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165                 170                 175
Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp
180                 185                 190
Pro Ser Gln Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr
195                 200                 205
Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys
210                 215                 220
Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys
225                 230                 235                 240
Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val
245                 250                 255
Val Val Ala Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe
260                 265                 270
Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Lys Pro Arg Glu Glu
275                 280                 285
Gln Ile Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His
290                 295                 300
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala
305                 310                 315                 320
Ala Phe Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg
325                 330                 335
Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Lys Gln Met
340                 345                 350
Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asn Phe Phe Pro
355                 360                 365
Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn
370                 375                 380
Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Lys Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val
385                 390                 395                 400
Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr
405                 410                 415
Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu
420                 425                 430
Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
435                 440
<210>  49
<211>  215
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  49
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser
20                  25                  30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35                  40                  45
Ile Asn Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ile Met Leu Pro
85                  90                  95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala
100                 105                 110
Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser
115                 120                 125
Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp
130                 135                 140
Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val
145                 150                 155                 160
Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met
165                 170                 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser
180                 185                 190
Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys
195                 200                 205
Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210                 215
<210>  50
<211>  450
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  50
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Ser
20                  25                  30
Tyr Arg Trp Asn Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn Arg Leu Glu Trp
35                  40                  45
Met Gly Tyr Ile Asn Ser Ala Gly Ile Ser Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50                  55                  60
Lys Arg Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65                  70                  75                  80
Leu Gln Val Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Ser Asp Asn Met Gly Thr Thr Pro Phe Thr Tyr Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Thr Ala Pro Ser Val
115                 120                 125
Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr
130                 135                 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr
145                 150                 155                 160
Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165                 170                 175
Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser
180                 185                 190
Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala
195                 200                 205
Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile
210                 215                 220
Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Ala Ala Gly Gly
225                 230                 235                 240
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile
245                 250                 255
Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp
260                 265                 270
Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His
275                 280                 285
Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg
290                 295                 300
Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys
305                 310                 315                 320
Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Gly Ala Pro Ile Glu
325                 330                 335
Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr
340                 345                 350
Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu
355                 360                 365
Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp
370                 375                 380
Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val
385                 390                 395                 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu
405                 410                 415
Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His
420                 425                 430
Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro
435                 440                 445
Gly Lys
450
<210>  51
<211>  218
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  51
Asp Ile Val Met Thr Gln Gly Thr Leu Pro Asn Pro Val Pro Ser Gly
1               5                   10                  15
Glu Ser Val Ser Ile Thr Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Tyr Ser
20                  25                  30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Trp Met Ser Thr Arg Ala Ser Gly Val Ser
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Gly Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly
85                  90                  95
Leu Glu Phe Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg
100                 105                 110
Thr Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln
115                 120                 125
Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr
130                 135                 140
Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln
145                 150                 155                 160
Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165                 170                 175
Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg
180                 185                 190
His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro
195                 200                 205
Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210                 215
<---