КОНСОРЦИУМ БИФИДОБАКТЕРИЙ И ЛАКТОБАЦИЛЛ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ БАКТЕРИЙНЫХ ПРЕПАРАТОВ И БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ДОБАВОК, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫХ ДЛЯ КОРРЕКЦИИ МИКРОФЛОРЫ ЛЮДЕЙ СТАРШЕ 14 ЛЕТ, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ, БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНАЯ ДОБАВКА К ПИЩЕ ДЛЯ КОРРЕКЦИИ МИКРОФЛОРЫ ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНОГО ТРАКТА ЛЮДЕЙ СТАРШЕ 14 ЛЕТ И БАКТЕРИАЛЬНЫЙ ПРЕПАРАТ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ДИСБИОТИЧЕСКИХ СОСТОЯНИЙ ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНОГО ТРАКТА ЛЮДЕЙ СТАРШЕ 14 ЛЕТ
BIFIDOBACTERIAL AND LACTOBACILLARY CONSORTIUM FOR PREPARING BACTERIAL PREPARATIONS AND DIETARY SUPPLEMENTS FOR CORRECTING GASTROINTESTINAL MICROFLORA IN INDIVIDUALS OF FOURTEEN AND OLDER, AND METHOD FOR PREPARING IT, DIETARY SUPPLEMENT FOR CORRECTING GASTROINTESTINAL MICROFLORA IN INDIVIDUALS OF FOURTEEN AND OLDER AND BACTERIAL PREPARATION FOR TREATING DYSBIOTIC GASTROINTESTINAL CONDITIONS IN INDIVIDUALS OF FOURTEEN AND OLDER

Изобретение относится к медицине и биотехнологии и может быть использовано для приготовления лечебно-профилактических средств пробиотической направленности, предназначенных для коррекции дисбиотических нарушений микрофлоры желудочно-кишечного тракта и поддержания ее колонизационной резистентности у людей старше 14 лет. Средства для профилактики и лечения конструируются преимущественно на основе двух групп микроорганизмов - бифидобактерий и лактобацилл. Бифидобактерии являются одним из наиболее значимым представителем микрофлоры человеческого организма, выполняя многофункциональную роль в поддержании гомеостаза организма. Бифидобактерии обеспечивают колонизационную резистентность в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов; обладают иммуномодулирующим действием; синтезируют аминокислоты, витамины, летучие жирные кислоты, ферменты, участвующие в процессах пищеварения и обмена веществ; способствуют усвоению железа, кальция, поддержанию водно-солевого баланса.[1, 2, 3] Частичная или полная элиминация бифидобактерий приводит к угнетению иммунных сил организма, развитию дисбиоза.
Многофакторное позитивное воздействие на организм человека позволяет рассматривать бифидобактерии как эффективный биокорректор и основу для создания препаратов, обладающих регулирующим и стимулирующим воздействием на организм [4, 5].
В России традиционным подходом к бактериотерапии является назначение больным препаратов на основе культур штаммов бифидобактерий с доказанным пробиотическим действием преимущественно в виде монокультур штаммов Bifidobacterium bifidum 1, В.bifidum 791, В.bifidum ЛВА-3, B.longum В379М, B.adolescentis МС-42.
Это, прежде всего, широко применяющийся лечебный препарат "Бифидумбактерин" [6].
При этом следует отметить, что в микробиоценозе кишечника человека бифидобактерии представлены одновременно многими видами - как отдельными, так и в ассоциациях [7]. Это позволяет предположить, что введение в состав пробиотических препаратов сразу нескольких видов бифидобактерии будет способствовать повышению их лечебной и профилактической эффективности.
Подобный подход предлагается в Российском патенте [8], касающемся консорциума на основе 9 штаммов бифидобактерии B.bifidum 791, B.bifidum ЛВА-3, B.longum В379М, B.longum Я-3, В.breve 79-119, В.breve 79-88, B.infantis 73-15, B.infantis 79-43, B.adolescentis Г7513.
Вместе с тем, указанный консорциум не учитывает, что рациональный подход к конструированию и применению новых средств коррекции микрофлоры должен основываться на таком явлении, как аутогенная сукцессия - последовательность смены биоценозов в определенной экологической нише [9, 10]. В ходе этого процесса в видовом сообществе происходит последовательное вытеснение одних видов другими вследствие их биоэкологических преимуществ в определенных условиях. При этом образуется так называемый сукцессионный ряд с образованием конечного - устойчивого биоценоза. Все биоценозы в живой природе развиваются по законам сукцессии. Что касается микроэкологии человеческого организма, данная закономерность прослеживается в смене видового состава бифидофлоры в процессе онтогенеза, совпадающей с критическими периодами развития в детском и подростковом возрасте: становлением иммунной и ферментативной систем, изменением гормонального фона, сменой пищевого рациона. В то же время, видовой состав бифидофлоры взрослых людей относительно стабилен [11, 12].
Таким образом, препараты должны представлять собой ассоциации доминирующих микроорганизмов, которые максимально приближены по составу к естественному микробиоценозу желудочно-кишечного тракта человека в определенный возрастной период. Это является обоснованным подходом, обеспечивающим индивидуализацию бактериотерапии и повышение ее эффективности, способствуя устойчивой локализации или новому заселению биотопа теми видами бифидобактерий, которые преобладают в микробиоценозе конкретного человека.
Помимо бифидобактерий, в биопрепаратах-пробиотиках широко используются лактобациллы. Эти микроорганизмы обладают высокой антагонистической активностью против широкого спектра патогенных и условно-патогенных микробов, стимулируют неспецифическую резистентность организма человека, обладают выраженным воздействием на ферментативную систему. Обладая бета-галактозидазной активностью, нивелируют лактазную недостаточность, которая в настоящее время широко распространена. Применение метода совместного культивирования требует анализа межштаммовых взаимодействий микроорганизмов в условиях in vitro [13]. Пригодными для совместного культивирования считают биосовместимые штаммы, т.е. штаммы, взаимоотношения которых расцениваются как симбиоз.
Совместное культивирование двух и более видов лактобацилл повышает их технологичность и расширяет спектр функциональной активности.
Проведенные эксперименты по изучению биосовместимости различных штаммов, позволили выделить группу лактобацилл, наиболее перспективных в отношении совместного культивирования. Наибольший интерес из этой группы лактобактерий представляют штаммы L. helvetucus К3ш24, L. helveticus NK-1 и L.casei КНМ-12. Они обладают выраженным антагонизмом по отношению к условно-патогенным микроорганизмам и устойчивостью к спектру антибактериальных средств. Кроме того, установлена высокая степень биосовместимости этих штаммов, что определило целесообразность их совместного культивирования.
Известен патент РФ №2180914 «Консорциум бифидобактерии и лактобацилл, используемый для приготовления бактериальных препаратов, заквасок для кисломолочных продуктов, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, биологически активных добавок, предназначенных для коррекции микрофлоры людей в возрасте от 12-ти лет и старше». Заявка №2001111551 от 28.04.2001. Опубл. 27.03.2002 г.[14]. В данном патенте предлагается консорциум бифидобактерии и лактобацилл следующего состава: штаммы Bifidobacterium bifidum 791, B.bifidum ЛВА-3, B.longum В379М, B.longum Я-3, B.adolescentis Г7513, B.adolescentis ГО-13, L.plantarum 8-PA-3, L.acidophilus K3ш24, L.acidophilus NK-1. Характеризуя Патент РФ №2180914 [14], следует отметить, что недостатком способа получения данного консорциума является то, что консорциум получается путем объединения инокулятов культур отдельных штаммов бифидобактерии в равных долях, последующим добавлением к нему инокулятов культур лактобацилл в соотношении 10:1 и совместному культивированию в питательной среде в течение 10-12 часов в ферментере или 18-20 часов в стационарных условиях при температуре 37-38°C.
В настоящее время для изучения таксономии представителей микробиоты, в том числе бифидобактерии и лактобацилл, разработаны и широко применяются различные молекулярно-генетические методы, включая секвенирование, мультилокусное генотипирование и другие, что существенно пополнило наши представления о видовом многообразии этих бактерий, позволило реклассифицировать известные и выявить новые виды (15, 16). Это тесным образом связано с разработкой новых пробиотических препаратов, обладающих иммуномодулирующим действием, широким набором свойств, определяющих метаболическую и антагонистическую активность.
Так, изучение вышеперечисленных штаммов молекулярно-генетическими методами - на основе амплификации и секвенирования фрагментов двух генов: 16S рибосомальной РНК (16S) и трансальдолазы (tal) - показало несоответствие в видовой принадлежности некоторых штаммов, идентифицированных ранее с помощью биохимических тестов. Штамм В. bifidum 1, широко используемый в производстве пробиотиков, оказался природным рекомбинантом, состоящим из двух клонов: В.bifidum и В.breve. Штаммы B.adolescentis Г7513 и В.bifidum ЛВА-3 также показали себя как рекомбинанты B.bifidum/B.breve. Штамм B.adolescentis Я-3 по одной мишени был идентифицирован, как B.longum, а по другой - как B.adolescentis. И только штамм B.adolescentis ГО-13 по обеим мишеням был идентифицирован как истинный B.adolescentis. Данная информация говорит о необходимости новых подходов к конструированию мультипробиотических препаратов.
Представленные данные убедительно показывают, что для эффективной коррекции дисбиотических нарушений микробиоценоза людей данной возрастной группы в состав препарата должны входить штаммы не только с доказанным пробиотическим эффектом, но и в видовом отношении комплементарные бифидофлоре биоценоза кишечника желудочно-кишечного тракта. Важное значение имеет включение в состав средства коррекции микрофлоры штаммов, выделенных от здоровых людей в настоящий период времени, т.к. большинство производственных штаммов имеют происхождение 50-ти и более лет.
Это относится к всесторонне изученным и запатентованным штаммам бифидобактерий: штамм В.bifidum OV-19 [17] и штамм В.longum OV-20 [18]. Штамм В. longum OV-20 отличается широким спектром антибиотикорезистентности. Штамм В.bifidum OV-19 обладает устойчивым генотипом, высокотехнологичен.
Задачей настоящего изобретения является создание консорциума бифидобактерий и лактобацилл, по составу максимально приближенных к микробиоценозу взрослых людей старше 14 лет, а также разработкой способа его получения, учитывающего биосовместимость штаммов в процессе культивирования и при дальнейшем хранении.
Предлагаемый консорциум имеют следующий видовой состав: Консорциум бифидобактерии и лактобацилл для препаратов и БАД, предназначенных для нормализации микрофлоры людей старше 14 лет:
1. Bifidobacterium bifidum OV-19 - ГКНМ МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского
№216, выделен из содержимого кишечника здорового ребенка. RU №2375444
2. Bifidobacterium B.bifidum 791- ВНИИгенетика в ЦМПМ №В-3300, ГКНМ МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского №80, выделен из содержимого кишечника здорового ребенка.
3. Bifidobacterium longum Я-3 - ВНИИгенетика в ЦМПМ №…, ГКНМ МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского №103, выделен из содержимого кишечника здорового человека.
4. Bifidobacterium longum OV-20 - ГКНМ МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского №214, выделен из содержимого кишечника здорового человеками 2375445
5 Bifidobacterium adolescentis ГО-13 - ГКНМ МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского №48, выделен из содержимого кишечника здорового человека.
6. Lactobacillus casei КНМ-12- ГКНМ МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского №12, выделен из молочного продукта.
7. Lactobacillus helveticus NK-1- ГКНМ МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского №54, выделен из содержимого кишечника здорового человека.
8. Lactobacillus helveticus К3 ш24 - ГКНМ МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского №42, выделен из содержимого кишечника здорового человека.
Задачей настоящего изобретения является также разработка определенной схемы совместного культивирования отдельных культур для получения консорциума.
Техническим результатом предлагаемой схемы культивирования отдельных штаммов для получения консорциума является отсутствие взаимного ингибирования штаммов и расширение спектра ферментативной и антагонистической активности.
Способ получения консорциума основан на предварительном изучении и подборе для совместного культивирования штаммов по принципу биосовместимости и с учетом кинетики роста каждого из них.
Алгоритмом к созданию консорциума бифидобактерий и лактобацилл является совместное культивирование определенных штаммов с учетом длительности экспоненциальной фазы роста каждого из них и численного соотношения в микробиоценозе кишечника бифидобактерий и лактобацилл, на основании чего определяется временная точка засева питательной среды при поэтапном внесении инокулятов монокультур.
По оптическому стандарту мутности устанавливают концентрацию ОЕ/мл, соответствующую 1 млрд клеток бифидобактерий. Лактобациллы, являясь микроаэрофиллами, поглощая остаточный кислород из среды, создают благоприятные условия для развития бифидобактерий. По оптическому стандарту мутности устанавливают концентрацию ОЕ/мл, соответствующую 1 млрд клеток. При подборе дозы инокулята необходимо учитывать также соотношение бифидобактерий и лактобацилл в микробиоценозе человека (100:1) и более высокую кинетику роста лактобацилл.
Посев каждой из культур бифидобактерий в ферментер, по 2% к объему среды культивирования, проводят поэтапно, с периодичностью в 30 минут, коррегируя рН культуральной жидкости 20% NaOH перед засевом нового штамма до 6,8. При засеве лактобацилл % инокулята составляет 0,1%; рН среды перед засевом должен быть более кислым - 6,0.
Очередность внесения инокулята для получения данного консорциума является следующей:
1) - В.bifidum OV-19-2%;
2) - В.bifidum 791- 2%;
3) - B.longum OV-20 -2%;
А) - В.longum Я-3- 2%;
5) - B.adolescentis ГО-13-2%;
6) - L.caseiKHM-12-0,1%;
7) - L.helveticus К3ш24-0,1%
8) - L.helveticus NK-1-0,1%
Процесс культивирования ведут 8 часов при при 37-38°C.
Консорциум культивируют при 37°C при периодическом перемешивании в течение 8-10 часов; рН культуральной жидкости после окончания процесса составляет 3,9-4,3.
Культурально-морфологические признаки консорциума.
Клетки представляют Грам+полиморфные палочки: бифидобактерии расположенны преимущественно в виде скоплений; в стационарной фазе роста часто отмечаются клетки с раздвоениями на концах или булавовидными утолщениями. Лактобациллы - цепочками из крупных клеток с закругленными концами.
При выращивании в ферментере в экспоненциальной фазе роста при микроскопии культура имеет вид ровных палочек разной величины, расположенных цепочками или скоплениями.
В полужидких питательных средах биомасса консорциума бифидобактерий и лактобацилл растет по всему объему питательной среды, кроме зоны аэробиоза. Морфология колоний неоднородна и зависит от входящих в консорциум штаммов, сохраняя признаки каждого из них в совокупной культуре.
Физиолого-биохимические признаки микроорганизмов, входящих в консорциум.
Бифидобактерии - облигатные анаэробы, лактобациллы микроаэрофиллы. На агаризованной поверхности образуют прозрачные колонии. Оптимальная температура выращивания составляет 37,0-38°C, рН питательных сред 7,2-7,4. Каталазу не образуют, желатин не разжижают, газообразование отсутствует. Сбраживают глюкозу с образованием кислоты без образования газа, закисляя среду выращивания до рН 4,3-5,1.
Результаты культивирования монокультур бифидобактерии и лактобацилл и их совместного культивирования представлены в таблице 1.
Таблица 1
Сравнительные данные культивирования монокультур и консорциума бифибактерий и лактобацилл
Наименование культуры
совместное культивирование
раздельное культивирование
Число КОЕ/ мл
°T
Число КОЕ/ мл
°T
В.bifidum OV-19
1,6±0,1×10<sup>9</sup>
-
1,7±0,2×10<sup>9</sup>
90°
В.bifidum 791
1,5±0,3×10<sup>9</sup>
-
1,8±0,1×10<sup>9</sup>
100°
В.longum Я-3
1,1±0,2×10<sup>9</sup>
-
1,5±0,3×10<sup>9</sup>
120°
B.longum OV-20
1,5±0,3×10<sup>9</sup>
-
1,8±0,4×10<sup>9</sup>
120°
В.adolescentis ГО-13
1,5±0,3×10<sup>9</sup>
-
1,8±0,4×10<sup>9</sup>
120°
L.casei КНМ-12
0,1±0,1×10<sup>9</sup>
-
0,1±0,1×10<sup>9</sup>
140°
L.helveticus К3ш24
1,0±0,1×10<sup>9</sup>
-
1,1±0,1×10<sup>9</sup>
170°
L.helveticus NK-1
0,3±0,2×10<sup>9</sup>
-
0,4±0,1×10<sup>9</sup>
180°
Консорциум
8,6±0,2×10<sup>9</sup>
210°
-
-
Консорциум возможно культивировать на различных питательных средах со стабильно высокими показателями КОЕ/мл пробиотических микроорганизмов и продуцируемых органических кислот (таблица 2).
Таблица 2
Результаты культивирования консорциума на разных питательных средах
Среда выращивания
Консорциум бифидобактерий и лактобацилл
Число КОЕ/мл
°T
Блаурокка
8,6±0,6×10<sup>9</sup>
200°
Гидролизатно-молочная
7,9±0,2×10<sup>9</sup>
220°
Среда для культивирования бифидобактерий и лактобацилл согласно изобретению
8,6±0,3×10<sup>9</sup>
210°
При предложенной схеме внесения посевного материала не происходит взаимного ингибирования культур.
Наиболее перспективной в производстве препаратов и БАД является гидролизатно-молочная среда, т.к. в настоящее время широко распространена непереносимость коровьего молока. Данная среда гипоаллергенна, так как ее основой является гидролизат молока, состоящий из низкомолекулярных пептидов и аминокислот, которые легко усваиваются, не вызывая аллергических реакций. Среда, изготовленная на основе гидролизата молока, имеет следующий состав (в расчете на 100 л):
Таблица 3
Состав гидролизатно-молочной среды
Гидролизат молока
50 л
Цистеин солянокислый
20 г
Лактоза
1000 г
Пептон ферментативный
200 г
Агар-агар микробиологический
100 г
Хлористый натрий
400 г
Вода водопроводная очищенная
до 100 л
Среда проста в приготовлении, экономически выгодна; вместе с тем, как видно из результатов, представленных в таблице 2, по ростовым свойствам уступает остальным средам.
Для устранения данного недостатка в нее были дополнительно включены добавки, стимулирующие рост пробиотических микроорганизмов - пребиотики инулин и олигофруктоза и дрожжевой аутолизат, содержащий витамины группы В, необходимые для их развития и аскорбиновая кислота, как антиоксидант.Состав усовершенствованной таким образом среды представлен в таблице 4.
Таблица 4
Состав заявляемой среды (в расчете на 100 л):
Гидролизат молока
50 л
Аутолизат дрожжей
500 г
Цистеин солянокислый
20 г
Лактоза
1000 г
Пептон ферментативный
200 г
Агар-агар микробиологический
100 г
Хлористый натрий
400 г
Аскорбиновая кислота
250 г
Инулин
500 г
Олигофруктоза
500 г
Вода водопроводная очищенная
до 100 л
При изучении ростовых свойств заявляемой среды было показано, что они превосходят ростовые свойства гидролизатно-молочной среды, т.е. желаемый результат был достигнут.Результаты представлены в таблице 5.
Таблица 5
Сравнительные результаты культивирования консорциума на гидролизатно-молочной и заявляемой средах
Среда выращивания
Консорциум бифидобактерии и лактобацилл
Число КОЕ/мл
°T
Гидролизатно-молочная
7,9±0,2×10<sup>9</sup>
180°
Заявляемая среда
8,8±0,3×10<sup>9</sup>
210°
Таким образом, заявляемая среда является перспективной в производстве препаратов и БАД для людей старше 14 лет.
Синергидный эффект, который был отмечен при культивировании консорциума, проявляется также при определении спектра биохимической активности.
В качестве иллюстрации в таблице 6 представлено, что расширяется спектр ферментативной активности штаммов при совместном культивировании - увеличивается число усвоенных субстратов.
Таблица 6
Ферментативная активность штаммов при раздельном и совместном культивировании по данным ANAEROtest-23
Активный ингредиент
В.bifdum 791
В.bifdum OV-19
B.longum Я-3
B.longumOV-20
B.adolescentis ГО-13
L.casei KHM-12
Lactobacillus Helveticus NK1
Lactobacillus helveticus КЗШ24
Консорциум
L-рамноза
0
±
0
0
0
±
0
0
+
Дульцитол
0
0
0
0
0
0
±
0
+
Эритрол
0
0
0
0
0
0
±
0
±
D-галактоза
+
+
+
+
+
+
+
+
+
D-глюкоза
+
+
0
+
+
+
+
+
+
D-фруктоза
+
0
+
+
0
+
+
+
+
D-лактоза
+
0
+
+
0
+
+
+
+
D-сахароза
0
0
+
0
0
+
+
+
+
D-мальтоза
0
0
+
0
0
+
0
+
+
D-раффиноза
±
0
0
+
0
±
±
±
+
L-арабиноза
±
0
+
±
+
+
±
±
+
D-ксилоза
±
0
±
±
+
±
±
±
±
Салицин
0
0
0
0
+
0
0
+
+
D-целлобиоза
0
0
±
0
+
+
0
±
+
D-манноза
0
0
0
0
±
+
+
±
+
D-трегалоза
±
0
0
0
0
+
+
+
+
D-мелецитоза
0
0
0
0
0
+
+
+
+
Инулин
0
0
0
0
0
0
0
0
0
D-манит
0
0
0
0
+
0
0
+
0
D-сорбитол
0
0
0
+
±
+
0
±
+
Инозит
0
0
0
0
0
0
0
+
Синергидный эффект консорциума проявляется также в большей антагонистической активности консорциума по сравнению с монокультурами, что повышает пробиотическую значимость препарата. Данный эффект можно наблюдать по зонам задержки роста тест-культур (табл.7).
Таблица 7
Зоны задержки роста тест-культур (в мм) в присутствии консорциума и отдельных штаммов бифидо - и лактобактерий
Объект
Sh.
Sh.
Staph.
Proteus
исследования
sonnei 5063
flexneri 170
E..coli 157
aureus 209
vulgaris 177
В.bifidum OV-19
19±2
16±1
17±3
14±2
18±2
В.bifidum 791
17±3
15±2
15±3
15±1
17±2
В.longum Я-3
24±2
20±2
23±2
18±3
26±3
В.longum OV-20
25±2
23±1
25±2
24±3
25±2
B.adolescentis ГО-13
29±2
25±2
27±3
25±3
31±1
L.helveticus К3ш24
28±1
29+3
30±1
27±2
31±2
L.helveticus NK-1
27±4
29±1
29±3
22±1
30±2
L.casei KHM-12
28±2
25±4
31±3
30±3
31±1
Консорциум бифидо - и лактобактерий
34±2
31±2
33±3
31±2
35±1
Как показывают данные, представленные в таблице 7, по антагонистической активности в отношении тест-штаммов патогенных микроорганизмов консорциум превосходит отдельные штаммы, входящие в его состав.
Таким образом, полученные результаты говорят не только о
возможности совместного культивирования различных видов бифидобактерий и лактобацилл, но и синергидном эффекте консорциума штаммов, что позволяет решить сложную биотехнологическую задачу получения многокомпонентных пробиотических препаратов, имеющих определенный состав и назначение.
В предлагаемом консорциуме помимо определенного видового состава бифидобактерий и лактобацилл, отмечается определенное количественное соотношение микробных культур после культивирования. Количественный учет долевого участия отдельных штаммов производится путем подсчета числа колоний, выросших в полужидкой среде. Культура каждого штамма имеет колонии определенной морфологии и размера, что позволяет их различать. Соотношение отдельных видов бифидобактерий и лактобацилл в консорциуме представлено в таблице 8.
Таблица 8
Соотношение отдельных видов бифидобактрий и лактобацилл в консорциуме
№п/п
Штамм микроорганизма
Число КОЕ/г
Массовая доля микроорганизмов, %
1.
В. bifidum OV-19
10<sup>9</sup>-10<sup>10</sup>
18,0-20,0
2.
В. bifidum 791
10<sup>9</sup>-10<sup>10</sup>
20,0-18,0
3.
В. longum Я3
10<sup>9</sup>-10<sup>10</sup>
14,5-12,0
4.
В. аdolescentis ГО-13
10<sup>9</sup>-10<sup>10</sup>
23,5-23,0
5.
В. breve OV-12
10<sup>9</sup>-10<sup>10</sup>
24,0-27,0
6.
L. helveticus К3ш24
10<sup>8</sup>-10<sup>9</sup>
3,0-3,5
7.
L. helveticus NK-1
10<sup>8</sup>-10<sup>9</sup>
3,0-3,5
8.
L. casei КЕМ-12
10<sup>8</sup>-10<sup>9</sup>
3,0-3,5
При составлении рецептуры препаратов для коррекции микрофлоры необходимо учитывался тот факт, что наиболее целесообразным является сочетанное использование консорциума пробиотических микроорганизмов совместно с пребиотиками инулином и олигофруктозой, стимулирующими рост как индигенной, так и микрофлоры, входящей в состав препарата. Кроме того, пребиотики, инкапсулируя микробные клетки, защищают их при прохождении желудочно-кишечного тракта от агрессивного действия окружающей среды. Техническим результатом данного изобретения является использование консорциума в качестве активного вещества в сочетании с пребиотиками - инулином и олигофруктозой. Присутствие питательных субстратов способствует эффективной колонизации биотопа. Сахаролитические микроорганизмы, увеличивая при этом продукцию органических кислот, способствуют лучшему усвоению кальция, железа, магния. Помимо этого, инулин ускоряется очищение организма от шлаков и непереваренной пищи вследствие стимулирования сократительной способности кишечной стенки, отмечается хороший слабительный эффект, он оказывает антитоксическое и защитное действие. Инулин обладает «обволакивающим действием», защищая слизистые оболочки желудка и частично кишечника от механического раздражения пищей. Использование диеты с добавлением инулина ингибирует развитие опухолей и уменьшает в кишечнике количество аммиака, повышенная концентрация которого способствует росту опухолей. Инулин улучшает углеводный и липидный метаболизм и нормализует уровень сахара в крови у больных сахарным диабетом. Олигофруктоза обладает выраженным желчегонным действием, которое усиливается в связи с облегчением оттока желчи из печени и желчного пузыря в двенадцатиперстную кишку, обусловленным улучшением опорожнения кишечника.
Помимо описанных эффектов, данные ингредиенты обладают высокой сорбционной емкостью.
Еще одним вариантом рационального подхода к коррекции дисбиотических состояний является сочетанное применение микронутриентов и пробиотических микроорганизмы. При введении в организм человека такого комплекса происходит восполнение нарушенной индигенной микрофлоры. Пробиотическая микрофлора повышает биодоступность микронутриентов и снижает дефицит витаминов и минералов. Это, в свою очередь, должно способствовать более эффективному восстановлению индигенной микрофлоры и метаболитного баланса в организме.
Примеры
I. Консорциум бифидобактерий и лактобацилл для нормализации микрофлоры желудочно-кишечного тракта людей старше 14 лет и способ его получения.
1-й пассаж - лиофилизированный материал штаммов В.bifidum OV-19, В.bifidum 791, В.longum Я-3, В.longum OV-20, В. B.adolescentis ГО-13 L.helveticus К3 ш24, L.casei КНМ-12, L. helveticus NK-1 по отдельности регидратируют физиологическим раствором в объеме 1 мл и титруют методом десятикратных разведений в питательной среде до 107"8. Инкубируют при температуре 37,5-38°C в течение 36 ч.
6-8
2-й пассаж.- каждую из выросших культур из разведения 10 в объеме 5% засевают в питательную полужидкую среду (30 мл) и культивируют 7 ч при 37,0-38°C.
3-й пассаж - каждую из выросших культур засевают в заявленную полужидкую среду и выращивают в течение 17 ч при 37-38°C.
Выращивание консорциума.
Консорциум бифидобактерии получается путем совместного культивирова-ния вышеперечисленных штаммов на питательной среде следующего состава (в расчете на 100 л):
Гидролизат молока
50 л
Аутолизат дрожжей
500 г
Цистеин солянокислый
20 г
Лактоза
1000 г
Пептон ферментативный
200 г
Агар-агар микробиологический
100 г
Хлористый натрий
400 г
Аскорбиновая кислота
250 г
Инулин
500 г
Олигофруктоза
500 г
Вода водопроводная очищенная
до 100 л
Для этого подбирают строго количественное соотношение посевного материала каждого из штаммов. По оптическому стандарту мутности устанавливают концентрацию ОЕ/мл, соответствующую 1 млрд клеток бифидобактерии.
Посев культур в ферментер по 2% каждой к объему засеваемой среды проводят поэтапно, с периодичностью в 30 минут, коррегируя рН культуральной жидкости 20% NaOH перед засевом нового штамма до 6,8:1)
В.bifidum OV-19 - 2%, 2) В.bifidum 791 - 2%, 3) В.longum OV-20 - 2%, 4) В.longum Я-3 2%, 5) В.adolescentis ГО-13 - 2%.
Процесс культивирования ведут 10 ч при 37-38°C. до достижения рН конечного продукта 5,1.
2. Биологически активная добавка к пище на основе консорциума из бифидо- и лактобактери для людей старше 14 лет и способ ее получения БАД изготавливают на основе консорциума сухой биомассы бифидобактерий и лактобацилл с добавлением функционально значимых ингредиентов.
Выращивание консорциума.
7-8
1-й пассаж - лиофилизированный материал штаммов В.bifidum OV-19, В.bifidum 791, В.longum OV-20, В.longum Я-3, В. B.adolescentis ГО-13, L.helveticus К3ш24, L.casei КНМ-12, L.helveticus NK-1 по отдельности регидратируют физиологическим раствором в объеме 1 мл и титруют методом десятикратных разведений в питательной среде до 10. Инкубируют при температуре 37-38°C в течение 36 ч.
2-й пассаж. - каждую из выросших культур из разведения 10 в объеме 3% вводят в среду накопления (300 мл) и культивируют 7 ч при 37,0-38°C.
3-й пассаж - каждую из выросших культур засевают в заявляемую питательную среду и выращивают в течение 17 ч при 37-38°C.
Консорциум бифидобактерий и лактобацилл получают путем совместного культивирования вышеперечисленных штаммов. Для этого подбирают строго количественное соотношение посевного материала каждого из штаммов. По оптическому стандарту мутности устанавливают концентрацию ОЕ/мл, соответствующую 1 млрд клеток бифидобактерий.
Посев культур в ферментер проводят поэтапно, с периодичностью в 30 минут, коррегируя рН культуральной жидкости 20% NaOH перед засевом нового штамма до 6,8. Очередность засева зависит от длительности экспоненциальной фазы роста каждого из штаммов и в данном консорциуме является следующей:
1) - В.bifidum OV-19 - 2%;
2) - В.bifidum 791 - 2%;
3) - B.longum OV-20 - 2%;
4) - B.longum Я-3 - 2%;
5) - B.adolescentis ГО-13 - 2%;
6) - - L.casei KHM-12 - 0,1%;
7) L. helveticus К3ш24 - 0,1%;
8) - L.helveticus NK-1 - 0,1%.
Процесс культивирования ведут 8 ч при 37-38°C. К выращенной биомассе пробиотических микроорганизмов добавляют защитную сахарозо-желатиновую среду и обезжиренное 10%-ное молоко по 10% к общему объему биомассы и лиофильно высушивают.
Техническиским результатом, достигаемым при получении биологически активной добавки с использованием заявляемого консорциума, является более эффективная и быстрая коррекция микрофлоры ЖКТ людей старше 14 лет.
После помола биомассу смешивают с витаминно-минеральным премиксом, инулином, олигофруктозой и фасуют в желатиновые или целлюлозные капсулы, которые укладываются по 20-60 штук в стерильные пластиковые баночки с герметично закрывающимися крышками. Рецептура биологически активной добавки представлена в таблице 9 (а,б).
Таблица 9а
Соотношение частей сырья на 100 кг
№п/п
Наименование сырья (материала)
Масса, кг (кол-во, шт.)
%Соотношение
1.
Сухая биомасса бифидобактерии и лактобацилл
30,0
30
3.
Витаминно-минеральный премикс
20,0
20
4.
Инулин
20,0
20
5.
Олигофруктоза
30,0
30
Итого:
100,0
100
б) Соотношение частей сырья по массе в одной капсуле (0,5 г)
Наименование сырья
Масса в г
% соотношение
Сухая биомасса бифидобактерий и лактобацилл
0,15
30
Инулин
0,1
20
Олигофруктоза
0,15
30
Витаминно-минеральный премикс**
0,1
20
Итого:
0,5
100
Таблица 10
Состав витаминно-минерального премикса в пересчете на одну дозу (0,5 г) БАД:
компонент
Содержание витаминов и минералов в готовом БАД (мг в 1 ложке-дозе)
Суточное поступление (мг, в 2-х ложках-дозах)
% от рекомендуемого суточного уровня поступления детей 1-3 лет
Витамин Е
1.65
3.3
66
Витамин В1
275 мкг
550 мкг
69
Рибофлавин
0,31
0,62
69
Витамин В6
0,36
0,72
80
Витамин В12
195 мкг
390 мкг
39
Фолиевая кислота
51.5 мкг
130 мкг
130
Пантотеновая кислота
1,71
3.42
171
Ниацинамид
2.97
5,94
59
Биотин
25 мкг
50 мкг
625
Витамин С
11.7
23.4
52
Цинк
2.25
4.5
45
Селен
8,5 мкг
17 мкг
31
Витаминно-минеральный премикс "CustoMix IMMUNITY" изготавливается компанией "DSM Nutritional Products Europe Ltd"(CH - 4002 Basel),для использования в пищевой промышленности для обогащения пищевых прдуктов. Свидетельство о государственной регистрации №77.99.11.9.У.2471.9.04 от 07.09.2004 года
3. Бактериальный препарат для лечения дисбиотических нарушений ЖКТ у людей старше 14 лет и способ его производства
7-8
1-й пассаж - лиофилизированный материал штаммов В.bifidum OV-19, В.bifidum 791, В.longum Я-3, В.longum OV-20, В.B.adolescentis ГО-13 L.helveticus К3ш24, L.casei КНМ-12, L.helveticus NK-1 по отдельности регидратируют физиологическим раствором в объеме 1 мл и титруют методом десятикратных разведений в питательной среде до 10. Инкубируют при температуре 37,5-38°C в течение 24 ч.
6-8
2-й пассаж. - каждую из выросших культур из разведения 10 в объеме 5% засевают в питательную полужидкую среду (30 мл) и культивируют 7 ч при 37,0-38°C.(маточные культуры).
3-й пассаж - каждую из выросших культур засевают в питательную полужидкую среду и выращивают в течение 17 ч при 37,0-38°C. Выращивание консорциума. Консорциум бифидобактерии получается путем совместного культивирова-ния вышеперечисленных штаммов. Для этого подбирают строго количественное соотношение посевного материала каждого из штаммов согласно разработанной схеме. По оптическому стандарту мутности устанавливают концентрацию КОЕ/мл, соответствующую 1 млрд клеток бифидобактерии.
Состав среды выращивания (в расчете на 100 л):
Гидролизат молока
50 л
Аутолизат дрожжей
500 г
Цистеин солянокислый
20 г
Лактоза
1000 г
Пептон ферментативный
200 г
Агар-агар микробиологический
100 г
Хлористый натрий
400 г
Аскорбиновая кислота
250 г
Инулин
500 г
Олигофруктоза
500 г
Вода водопроводная очищенная
до 100 л
Процесс культивирования ведут 10 ч при 37-38°C. К выращенной биомассе добавляют защитную сахарозо-желатиновую среду и обезжиренное 10%-ное молоко по 10% к объему биомассы бифидобактерий и лактобацилл, разливают в асептических условиях по 5 мл в стеклянные пенициллиновые флаконы и лиофильно высушивают.
Техническим результатом, достигаемым при получении бактериального препарата с использованием заявляемого консорциума, является более эффективная и быстрая коррекция дисбиотических нарушений ЖКТ людей старше 14 лет.
* Содержание КОЕ/г бифидобактерий и лактобацилл в готовом препарате не менее 108.
Список цитируемой литературы
L.Mitsuoka Т. Intestinal Flora and Host. // Asian.Med.J. - 1989 - V.31. - N7. - P.400-409.
2. Гончарова Г.И., Лянная A.M., Козлова Э.П., Семенова Л.П. Роль бифидофлоры в повышении устойчивости организма к инфекции. // В сб. материалов международной конференции «Гнотобиология в теоретической и практической медицине». - М. - 1987. - С.62.
3. Шендеров Б.А. Микрофлора пищеварительного тракта - важнейший фактор поддержания микроэкологического гомеостаза хозяина. // Клиническое питание. - 2005. - №2. - С.2-5.
4. Гончарова Г.И. Бифидофлора человека, ее защитная роль в организме и обоснование сфер применения препарата бифидумбактерин // Автореф.дис…д-ра биол. наук. - М. - 1982. - 48 С.
5. Шендеров Б.А. Функциональное питание и его роль в профилактике метаболического синдрома // Москва: Дели принт. - 2008. - С.317.
6. Гончарова В.В. Изучение бифидобактерий, разработка препарата «сухой бифидумбактерин» и его эффективность при кишечных заболеваниях детей первого года жизни. // Автореф.дисс… канд. биол. наук. - Москва. 1970. - С.15.
7. Mitsuoka Т., Hayakawa К., Kimura N.. The fecal flora of man. II. Communication: the composition of bifidobacterium flora of different age groups. // Zentralbl. Bakteriol. Mikrobiol. Hyg. 1 Abt. Orig. - A 1974.-V.226/ - P.469-478.
8. Патент РФ №2196174
9. Сукачев B.H., Дылиса Н.В. Лесной биогеоценоз // М.:Наука. - 1964. - С.574.
10. Рыбальченко О.В., В.М.Бондаренко, Добрица В.П. Атлас ультраструктуры микробиоты кишечника человека. // С-Петербург. - 2008. - С.109.
11. Бифидобактерии и их использование в клинике, медицинской промышленности и сельском хозяйстве. // Сб. научных трудов. - М. - 1986. - С.208.
12. Леванова Л.Л., Алешкин В.А., Воробьев А.Л., и др. Возрастные особенности микробиоценоза кишечника у жителей г. Кемерово. // Журн. Микробиол. - 2001. - №3. - С.72-75.
13. Глушанова Н.А., Шендеров Б.А. Взаимоотношения пробиотических и индигенных лактобацилл в условиях совместного культививрования in vitro. // Журнал микроб., эпидемиол., и иммунобиол. - 2005. - №2. - С.56-61.
14. Патент РФ №2180914 «Консорциум бифидобактерий и лактобацилл, используемый для приготовления бактериальных препаратов, заквасок для кисломолочных продуктов, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, биологически активных добавок, предназначенных для коррекции микрофлоры людей в возрасте от 12-ти лет и старше». Заявка №2001111551 от 28.04.2001. Опубл. 27.03.2002 г. [16].
15. Карзанова М.В., Воронина О.Л., Лунин В.Г., Жиленкова О.Г., Амерханова A.M. Определение видовой принадлежности штаммов бифидобактерии на основе секвенирования фрагментов генов 16S рРНК и трансальдолазы. // Сборник докладов Россельхозакадемии. - М. - 2006. - №5. - С.9-12.
16. Namba К., Hatano М. at all. Method of detecting Bifidobacterium infantis // United States Patent. - Prior Publication data 14.12.2006. - 22 P.
17. Патент РФ №2375444 от 10.12.2009 Штамм Bifidobacterium bifidum OV-19, используемый для получения бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств. Заявка №2008128540 от 15.07.2008.
18. Патент РФ №2375445 от 10.12.2009 Штамм Bifidobacterium longum OV-20, используемый для получения бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств. Заявка №2008128542 от 15.07.2008.