ПОЛИВАЛЕНТНАЯ ИММУНИЗИРУЮЩАЯ И/ИЛИ ТЕРАПЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ ПРИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ИНФЕКЦИЯХ ИЛИ ПИЩЕВОМ ОТРАВЛЕНИИ, В ЧАСТНОСТИ САЛЬМОНЕЛЛЁЗЕ, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭТОЙ КОМПОЗИЦИИ, ЕЁ ПРИМЕНЕНИЕ И ВАКЦИНА, СОДЕРЖАЩАЯ ЭТУ КОМПОЗИЦИЮ
POLYVALENT COMBINED IMMUNIZING AND/OR THERAPEUTIC PREPARATION FOR USE IN BACTERIAL INFECTIONS OR FOOD POISONING, PARTICULARLY SALMONELLOSIS, METHOD FOR PRODUCTION OF THIS PREPARATION, ITS USE AND VACCINE COMPRISING THIS PREPARATION

Объектами настоящего изобретения является безопасная и эффективная иммунизирующая и/или терапевтическая композиция для применения при бактериальных инфекциях и пищевом отравлении, в частности, сальмонеллезе, способ ее получения и ее применение. Настоящее изобретение также относится к вакцине против бактериальных инфекций, содержащих указанную выше иммунизирующую и/или терапевтическую композицию.
Сальмонеллезы - это зоонозы, которые могут передаваться напрямую или опосредованно между животными и человеком. Бактерии рода Salmonella довольно широко распространены в кишечнике здоровых птиц и млекопитающих, в пище, причем наиболее часто они встречаются в яйцах и сырой свинине, мясе индеек и куриц. Человеку это заболевание может передаваться через зараженную пищу.
Растущая потребность в пище, быстрое развитие крупных птицеферм и производство пищи в промышленных масштабах были прямыми причинами пандемий сальмонеллеза в прошлом веке.
С сальмонеллезами чрезвычайно сложно бороться. С одной стороны, имеет место явление серологического разнообразия этих бактерий, а с другой стороны широкое распространение Salmonella в природе. Они устойчивы к большинству известных антибиотиков и попытки их уничтожения в условиях сельского хозяйства связаны с необходимостью разработки вакцины против каждого серовара "особенно важного для народного здравоохранения" (Barrow, Р.А. (2007) "Salmonella infections: immune and nonimmune protection with vaccines", Avian Pathology, 36: 1, 1-13).
Бактерии Salmonella принадлежат к семейству энтеробактерий (Enterobacteriaceae). На основании генетических признаков и биохимических свойств Salmonella была разделена на два вида: Salmonella enterica и Salmonella bongori. Salmonella enterica включает следующие подвиды: enterica, salamae, arizonae, diarizonae, houtenae и indica. (Grimont, P.A.D. & Weill F-X, Antigenic formulae of the Salmonella serovars, 2007, 9th edition, WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Salmonella (изд. Центра сотрудничества ВОЗ информации и исследований по сальмонелле, 9 издание, 2007 г.)).
К настоящему моменту описано 2579 серотипов Salmonella, входящих в род Salmonella. Эти серотипы классифицированы на основании присутствия на их поверхности соматических (О), капсульных (Vi) и жгутиковых антигенов (Н). Эта схема, называемая схемой Кауфмана-Уайта, представляет классификацию антигенной структуры сероваров Salmonella и состоит из 63 серогрупп. Только ограниченное число сероваров Salmonella являются широко распространенными.
Липополисахарид (антиген O, эндотоксин) играет важную роль в бактериальной клетке. Он является одной из детерминант патогенности для человека или животных. Липополисахарид представляет собой гетерополимер, состоящий из трех структурно различающихся областей: липида A, корового олигосахарида и O-специфической полисахаридной цепи. O-специфическая полисахаридная цепь (OPS) образует дистальную часть липополисахарида. Она является самым вариабельным фрагментом и той частью эндотоксина, которая стимулирует образование антител. Этот липополисахарид называют эндотоксином, поскольку он вызывает тяжелый осложнения в случае бактериальных инфекций, с такими симптомами как сепсис и септический шок. Исследования, проводимые в течение многих лет, позволили авторам изобретения получить очень важные сведения об основных иммуногенных свойствах некоторых структур этих антигенов. Это исследование стало основой для композиции поливалентной многокомпонентой вакцины для борьбы с сальмонеллезами. (Публикации: Kumirska J., Szafranek J., Czerwicka M., Golebiowski M., Paszkiewicz M., Dziadziuszko H., Kunikowska D., Stepnowski P., Smith degradation of the O-antigenic polysaccharide of Salmonella Dakar, structural studies of the products, Carbohydr Res. 2008, 343(6): 1 120-1 125; J. Gajdus, R. Gtośnicka, J. Szafranek. I-Rzedowa struktura antygenów О bakterii Salmonella (Первичная структура О-антигенов Salmonella spp.), Wiadomości Chemiczne, 2006, 6O: 9-10); Szafranek J., Kumirska J., Czerwicka M., Kunikowska D., Dziadziuszko H., R. Gtośnicka, Structure and heterogeneity of the O-antigen chain of Salmonella Agona lipopolysaccharide, FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2006, 48: 223-236; Szafranek J., Kaczyńka M., Kaczyńki J., Gajdus J., Czerwicka M., Dziadziuszko H., R. Gtośnicka, Structure of the polysaccharide O-Antigen of Salmonella Aberdeen (O:1 1), Polish J. Chem. 2003, 77:1 135-1 140; H. Dziadziuszko, D. Kunikowska, R. Gtośnicka, J. Gajdus, Z. Kaczyńki, J. Szafranek, Immunological and chemical studies of Salmonella haarlem somatic antigen epitopes. II. Serological investigation, FEMS Immunology and Medical Microbiology 1998, 21 (4): 253-259; J. Szafranek, J. Gajdus, Z. Kaczyńki, H. Dziadziuszko, D. Kunikowska, R. Gtośnicka, T. Yoshida, J. Vihanto and K. Pihlaja, Immunological and chemical studies of Salmonella haarlem somatic antigen epitopes. I. Structural studies of O-antigen., FEMS Immunology and Medical Microbiology 1998, 21 (4): 243-252).
Жгутиковый антиген - это поверхностный антиген, связанный с присутствием жгутика на поверхности Salmonella. Их особенно много в жидкой культуре и в агаре Свена Гарда. Жгутиковые антигены, Н, сальмонеллы обычно являются двухфазными. Большинство бактерий рода Salmonella перемещаются при помощи жгутиков.
Vi-антиген, наоборот, локализован в капсуле бактериальной клетки. Он состоит из полисахарида - поли-N-ацетиламиногалатуроновой кислоты. Vi-антиген продуцируется лишь некоторыми штаммами Salmonella.
Серовары Salmonella, принадлежавшие к кишечному подвиду (сальмонелла энтерика, enterica) представляют собой группу патогенов, различающихся по предпочтениям в отношении хозяина, у которого они могут вызвать заболевание. Диапазон предпочтительных хозяев может быть очень узким, как в случае S. Typhi, которая инфицирует только людей и приматов, или может быть более широк (включать людей и много видов животных), как в случае инфекций, вызываемых бактериями Salmonella Typhimurium и Salmonella Enteritidis.
Огромное большинство патогенных сероваров, связанных с инфекциями человека, принадлежат к подвиду enterica вида кишечная сальмонелла (Salmonella enterica). В 2006-2009 г. наиболее широко распространенные серовары в Европе включали: S. Entehtidis, S. Typhimurium, S. Infantis, S. Bovismorbificans, S. Hadar, S. Virchow, S. Derby, S. Newport, S. Stanley, S. Agona, S. Kentucky и S. Saintpaul. В последние годы появился монофазный вариант штамма S. Typhimurium, такой как (например, 1,4, [5], 12: i: -) у куриц, крупного рогатого скота, домашних животных и человека, что представляет новую угрозу для окружающей среды и, соответственно, опасность загрязнения компонентов корма, что увеличивает вероятность нарушения биологической безопасности. (EFSA Journal 2011; 9 (7): 2106).
Европейская система наблюдения (EFSA (Европейское ведомство безопасности продуктов питания) и ECDC (Европейский центр по предотвращению и контролю заболеваний), 2011 г) в 2009 г. сообщала о 108614 подтвержденных случаях сальмонеллеза у человека в 27 государствах Евросоюза. Заболеваемость составила 23.7 случаев на 100000 человек, (от 2.1 в Португалии, 22.3 в Польше до 100.1 в Чешской Республике), См. ежегодный эпидемиологический отчет Европейского центра по предотвращению и контролю заболеваний за 2011 г.
Как и в предшествующие годы, наиболее часто регистрируемыми сероварами были S. Entehtidis и S. (75.6% из всех зарегистрированных сероваров). По оценкам EFSA общее экономическое бремя, связанное с сальмонеллезами у людей может достигать 3 миллиарда евро в год.
Распространенность инфекции в поголовьях куриц в 26 странах составила в среднем 26%. Больше всего инфицированных поголовий было в Португалии - 79.5%. Польша была на втором месте с 76.2% инфицированных поголовий кур. Далее в списке стран следовали Испания, Чешская Республика и Греция; в этих странах распространенности инфекции среди кур составляла более 50% {EFSA Journal (2007) 98, 1-85). Защитная вакцинация единственный приемлемый путь для ограничения и/или устранения инфекций, вызываемых бактериями Salmonella, среди сельскохозяйственных птиц. Согласно директивам Европейского Союза обязательства по контролю заболеваний касаются пяти сероваров (Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium, Salmonella Hadar, Salmonella Virchow и Salmonella Infantis).
В настоящее время защитная вакцинация против сальмонелл крайне популярна. Для этот используют:
1. Вакцины, содержащие инактивированные (убитые) бактерии
В экспериментальных и полевых исследованиях используются различные типы инактивированных вакцин. Такие вакцины могут содержать бактерии, инактивированные формальдегидом, ацетоном, глютаральдегидом или нагреванием. В некоторых вакцинах для стимуляции иммунной системы используются масляные адъюванты, гидроксид алюминия и другие соединения. Вакцины, содержащие убитые бактерии, применяемые для подкожных или внутримышечных инъекций, обладают способностью вызывать сильный иммунный ответ, но дают слабую или узконаправленную защиту (Barrow, Р.А. 2007). Эти вакцины обычно содержат один или два серовара, например S. Entehtidis и S. Typhimurium, и их вводят на 4 и на 6 неделях жизни. Также рекомендуется вводить эти вакцины два раза.
2. Живые вакцины
Современные вакцины могут содержать живые аттенуированные (ослабленные), генетически модифицированные бактерии. Применение оральных вакцин, содержащих живые генетически модифицированные бактерии, против сальмонеллезов стимулирует местный иммунитет в кишечнике, а также помогает снизить экскрецию бактерий у обработанных животных. Применение этих вакцин имеет ряд ограничений (COMMISSION REGULATION (ЕС) No. 1 177/2006 (директива еврокомиссии), см. ниже). Введение животным живых бактерий в вакцине связано с сильным ответом на эндотоксин; имели случаи заболевания и смерти животных. Такие вакцины на могут использоваться в случае острой инфекции в поголовье, и они не вызывают иммунитет у очень молодых животных. Применение генетически модифицированных вакцин в первый день жизни не защищало цыплят от колонизации печени и селезенки инфекционным штаммом (Van Immerseel 2002. Early protection against Salmonella infection in chickens by modification of the initial interactions host-pathogen - диссертация на соискание докторской степени). Это явление объясняется незрелостью иммунной системы у птиц. Созревание иммунной системы у птиц после вылупления занимает 3 недели. Все известные вакцины применяются у животных в возрасте 3-4 недель. Производители также рекомендуют вводить эти вакцины два или три раза.
Уже много лет известны бактерицидные и защитные свойства антисывороток и антител, полученных из желтка птичьих яиц (кур и уток), иммунизированных бактериями или вирусам. (Peltra, С. et al. 1994, Taylor P.W., 1998, Yokoyama, Н. et al., 1998, Raja Chalghoumi, R., Beckers, Y., Portetelle, D., Thewis, A. Biotechnol. Agron. Soc. Environ. 2009 13 (2), 295-308, Meenatchisundaram. S, Michael, A., Subbraj, Т., Diraviam, Т., Shanmugam, V. International Journal of Drug Development & Research 201 1 (vol. 3), Jann Hau and Coenraad F.M. Hendriksen, Refinement of Polyclonal Antibody Production by Combining Oral Immunization of Chickens with Harvest of Antibodies from the Egg Yolk, ILAR Journal, vol. 46, no. 3, 2005).
К сожалению, согласно результатам эпизоотологических и эпидемиологических исследований, проведенных между 2010 и 2011 годами, целевые результаты по снижению числа инфекций сероварами Salmonella Enteritidis и Salmonella Typhimurium, на птицефермах не были достигнуты.
Соответственно, было проведено несколько исследований, направленных на разработку вакцин против сальмонеллезов. Так, в международной заявке на патент WO 2011092185 A1 описаны новые мутанты Salmonella, способ их получения и вакцины, содержащие эти мутанты, причем указанные мутанты Salmonella характеризуются тем, что они вызывают антительный ответ, который можно отличить от антительного ответа, вызываемого штаммами дикого типа. Изобретение относится к применению этих мутантных штаммов в качестве серологического маркера для вакцинации животных, в частности, млекопитающих и птиц. Вакцина, являющаяся серологическим маркером, вызывает продолжительную иммунизацию животных против широкого диапазона штаммов Salmonella. В международной заявке на патент WO 2007112518 A1 раскрыты ослабленные в два или три раза штаммы бактерий, вызывающих инфекции у животных, таких как Salmonella enterica и/или Escherichia coli. Мутанты согласно этому изобретению содержат по меньшей мере одну генетическую модификацию первого типа и по меньшей мере одну генетическую модификацию второго типа. Изобретение также относится к живым аттенуированным вакцинам на основе этих мутантов для приведения в предотвращении сальмонеллез и инфекций, вызываемых патогенной Е. coli у животных. Другая вакцина, содержащая по меньшей мере один аттенуированный штамм Salmonella, раскрыта в международной заявке на патент WO 2008073891 A2.
В патенте РФ RU 2377015 C1 раскрыта инактивированная вакцина против сальмонеллеза у голубей, которая включает штаммы Salmonella Typhimurium M-5v t-DEP, Salmonella Typhimurium D-1 v t-DEP и Salmonella Enteritidis 25 Yav e-DEP, инактивированные формалином и осажденные полиэтиленгликолем, для внутримышечного применения.
В Патенте Украины № UA 12945 U раскрыта инактивированная, концентрированная вакцина типа «Полиависан» для домашней птицы, против, среди прочего, сальмонеллеза, которая содержит растворимые антигены клеточной стенки Escherichia coli, Salmonella Enteritidis, Salmonella typhimurium, Salmonella Gallinarum, Clostridium perfringens типа A и C в оптимальном соотношении с иммуностимулирующим компонентом, который представляет собой медицинский растительный экстракт, который стимулирует синтез антител, и другие стандартные ингредиенты. Эту вакцину можно вводить молодым птицам, даже в возрасте одного дня.
А в патенте Украины №UA 12941 раскрыта комбинированная, инактивированная вакцина типа «Вельшиколисальм» для животных против, среди прочего, сальмонеллеза, содержащая растворимые антигены клеточной стенки Escherichia coli (6 штаммов), Salmonella enteritidis, Salmonella dublin, Salmonella typhi suis, Salmonella typhi murium, Salmonella cholerae suis, Clostridium perfringens типа A и C, в оптимальном соотношении с иммуностимулирующим компонентом, который представляет собой медицинский растительный экстракт, который стимулирует синтез антител, и другие стандартные ингредиенты.
В патенте Польши PL 206377 B1 описано применение бактерий рода Salmonella, дикий тип которых образует жгутики (эти бактерии не способны индуцировать выработку антител против по меньшей мере одной антигенной детерминанты флагеллина или жгутика) и адъюванта для получения инактивированной вакцины для защиты людей и животных от инфекции сальмонеллой или патологических эффектов такой инфекции. Вакцину согласно указанному выше изобретению можно вводить животным или людям, в частности, интраназально, путем распыления, внутрикожно, подкожно, перорально, в форме аэрозоля или внутримышечно. В случае домашней птицы, вакцину вводят в крылья или в форме глазных капель.
Однако в патенте Польши PL 186873 B1 раскрыт способ получения трехвалентной вакцины для птиц против сальмонеллеза, парамиксовирусной инфекции и миксоплазмоза, особенно для кур и голубей, в котором термоинактивированные палочки Salmonella смешивают с инактивированными формалином антигенами штамма La-Sota парамиксовируса PMV-1 и инактивированными формалином клетками Mycoplasma gallisepticum, а затем добавляют Tween 80 и эмульгируют с масляным адъювантом.
3
11
11
11
11
11
1
2-3
1
В: Medycyna Wet. 2005, 61 (10), 1 105-1 109, Gtośnicka R., Dziadziuszko H., Kunikowska D., Lis M., Wicha M. Heleski M., Tokarska-Pietrzak E., Strzatkowski L. Bugajak P. "Immunovac - polyvalent vaccine against salmonellosis in hens" описана новая комбинированная поливалентная вакцина для борьбы с сальмонеллезом у кур. Immunovac (Иммуновак) содержала 8 штаммов Salmonella, связанных с антителами кролика. Вакцина Иммуновак была разработана в 1989 г. Эта вакцина представляла собой суспензию инактивированных штаммов Salmonella и антител кролика, предназначенную для предотвращения сальмонеллеза у кур-несушек и в племенных поголовьях. Этот препарат в форме суспензии состоял из комплекса 8 штаммов Salmonella, связанных со специфическими к ним антителами. Бактерии инактивировали формальдегидом и суспендировали в хлориде натрия (8.5 г/см), содержащем 0.02% формальдегида. Один миллилитр суспензии содержал приблизительно 3.5×10 бактерий: S. Gallinarum - 0.4×10, S. Enteritidis - 1.5×10, S. Dublin - 0.4×1011, S. Typhimurium - 0.8×1011, S. Heidelberg - 0.1×10, S. Choleraesuis - 0.1×1011, S. Kentucky - 0.1×10 и S. Senftenberg - 0.1×1011. Бактерии связывали с поликлональными антителами, полученными из сыворотки кроликов, иммунизированных соматическими антигенами Salmonella из групп B, C, С и D. Подробно описанный способ получения вакцины Иммуновак запатентован (PL 196172).
Для изучения микробиологической активности, способности вызывать устойчивость к инфекции у мышей, иммунизацию кроликов и стимулировать клеточную и гуморальную активность, использовали вакцину, полученную в лабораторном масштабе.
Эти исследования включали:
- Исследование противомикробной активности вакцины in vitro;
- Исследование способности стимулировать клеточную активность на спленоцитах мышей, вакцинированных пероральным путем.
Для определения защитных свойств вакцины в отношении куриц использовали вакцину Иммуновак, произведенную в большом количестве (компанией Biowet-Putawy). Курицам, полученным из поголовий, разводимых на фермах, вводили вакцину четыре раза с питьевой водой.
Оценивая результаты исследований в совокупности обнаружили, что вакцина Иммуновак продемонстрировала способность активировать иммунную систему. Она стимулировала гуморальный и клеточный иммунитет. Она обеспечивала 100% защиту мышей против инфекции при пероральном введении штамма S. Enteritidis и 80% защиту куриц против бактерий S. Gallinarum, вводимых внутримышечно. Она оказывала бактериостатическое действие в отношении S. Enteritidis и S. Typhimurium в тестах in vitro. Она продемонстрировала способность стимулировать пролиферацию лимфоцитов, а также высокую активность в отношении стимуляции образования специфических рецепторов на лимфоцитах вакцинированных мышей.
Исследования выявили присутствие у кроликов антител к конкретным штаммам, содержащимся в вакцине. Коммерческий тест Idexx (коммерческий тест для серологической идентификации инфекций Salmonella у птиц, не используемый в настоящее время) не выявил какого-либо повышения уровня антител у вакцинированных куриц. Поливалентная комбинированная вакцина Иммуновак представляет собой безопасное, легкое в использовании и эффективное средство для борьбы с сальмонеллезом у куриц.
Способ получения вакцины Иммуновак был разработан в 1989 г.
Бактерии: каждый штамм собирали отдельно, по одной копии каждого, из музейной коллекции и размножали на агаровой среде.
13
Обновленную исходную основную массу переносили в жидкую среду и инкубировали в течение 20 часов при 37°C. Суспензию бактерий в бульоне высевали в стеклянные планшеты, содержащие обогащенную агаровую среду. Бактерии культивировали в течение 20 часов при 37°C, затем смывали и переносили в стерильную колбу. Перед тем как перейти к следующему этапу необходимо центрифугировать бактериальную суспензию и определить число бактерий путем серийных разведений и подсчета колоний. Один грамм бактерий содержит приблизительно 3.5×10 колониеобразующих единиц (КОЕ). К колонии бактерий добавляют формальдегид до концентрации 0.4% и оставляют ее при 37°C на 24 часа, чтобы убить бактерии.
1
2-3
1
Поликлональные антитела, полученные из сыворотки кроликов, иммунизированных соматическими антигенами Salmonella из групп B, C, С и D, связывали с бактериями. Процедуру связывания осуществляли следующим образом: После проверки инактивированных бактерий на стерильность добавляют сыворотку кролика к центрифугированной массе на каждый 1 грамм содержащего бактерии осадка (15 мл соответствующей сыворотки, разбавленной хлоридом натрия 1:3). Смесь инкубировали в течение 20 часов при 37 C, центрифугировали и после ресуспендирования осадка в хлориде натрия хранили при 4°C.
Компоненты вакцины - инактивированные бактерии, смешанные с антителами, после проведения соответствующих контрольных тестов смешивали в следующих пропорциях:
- S. Enteritidis - 15 г
- S. Gallinarum - 4 г;
- S. Dublin - 4 г;
- S. Typhimurium - 8 г;
- S. Heidelberg - 1 г;
- S. Choleraesuis - 1 г;
- S. Kentucky - 1 г
- S. Senftenberg - 1 г
Полученную суспензию бактерий доводят до нужного объема хлоридом натрия, в который добавлен формальдегид до концентрации 0.02%, разливают в бутылки объемом 100 мл и хранят при температуре от 2 до 8°C. Конечный продукт, в дополнение к другим требуемым характеристикам, должен быть стерильным и содержать определенное количество антител (измеренное методом твердофазного ИФА (ELISA)).
Помимо оценок, описанных в этой публикации, авторы изобретения провели:
Оценку имуногенной активности вакцины Иммуновак у куриц
Были проведены эксперименты по определению иммунного ответа после введения вакцины Иммуновак. Определяли уровень антител IgG к Salmonella в крови цыплят до и после полного цикла 4-кратной вакцинации. Цыплят иммунизировали, вводя им перорально вакцину первый раз на второй неделе жизни. Последующие дозы давали птицам перорально с недельными интервалами. Численность племенного поголовья составляла 14.000, птиц для исследования крови отбирали случайным образом. Группа 1 состояла из 15 животных, группа 2 - из 8 животных, а контрольная группа невакцинированных цыплят состояла из 10 животных.
Уровни антител IgG к Salmonella определяли методом твердофазного ИФА (ELISA). Суспензию лизатов из всех штаммов, входящих в вакцину, использовали в качестве антигена. Кровь брали на 11 и на 16 неделе жизни. Средние значения, полученные для отдельных исследованных групп, показаны на Фиг. 1.
Как видно из графика, приведенного на Фиг. 1, гуморальный иммунный ответ, полученный у цыплят, вакцинированных Иммуноваком, был сравнительно довольно низким. Иммуногенная активность вакцины на 11 неделе жизни составила 0.665 ОП492, а на 16 неделе жизни (8 неделя после вакцинации) была несколько выше и соответствовала оптической плотности ОП492, равной 0.729 в тесте методом твердофазного ИФА (ELISA).
Это значение почти в три раза ниже значения иммуногенной активности композиции согласно настоящему изобретению.
Недостатки вакцины Иммуновак
1. Иммуновак состоял из 8 штаммов серотипов Salmonella, которые были важны с точки зрения эпидемиологических исследований в популяциях людей и животных в 1988 г. Эти штаммы были получены из коллекции KOS (Национального центра сальмонеллы), их источниками были штаммы, выделенные в 1950х годах, которые постоянно пассировали в искусственных средах.
2. Штаммы смешивали с нативной сывороткой кроликов, которую добавляли в избытке, поскольку не было разработанных методов дозирования сыворотки для инактиврованных штаммов, что приводило к неконтролирумому связыванию с бактериями, и, соответственно, блокированию эпитопов - фракций LPS, определяющих распознавание серотипа Salmonella, в организме животного после вакцинации.
3. Число бактерий, определенное на основании массы полученной суспензии бактерий, оказалось неправильным. При производстве в промышленном масштабе центрифугирование не позволяло получить требуемую концентрацию бактерий. Наконец, в случае применения продукта в племенных поголовьях птицы (курицы), получали значительно менее инактивированные бактерии. В результате получали только 80% защиту против инфекции куриц. В исследованиях сыворотки вакцинированных куриц, не описанных в данной публикации, измерения методом твердофазного ИФА (ELISA) показали низкие уровни антител (Фиг. 1).
4. Получение в лабораторном масштабе не соответствовало методике, которую использовали для крупного/промышленного масштаба.
По этой причине в данной области сохраняется настоятельная потребность в эффективном поливалентом средстве для лечения и/или предотвращения сальмонеллеза у животных, в частности, птиц.
Соответственно, задачей настоящего изобретения было разработать безопасную и эффективную композицию для лечения и/или предотвращения сальмонеллеза, вызываемого серотипами различных штаммов Salmonella, особенно сальмонеллеза у животных, в частности, птиц, которая была бы легкой для производства, не содержала живых бактерий и не требовала особенным образом мутированных штаммов бактерий, а также никаких дополнительный активных компонентов, таких как антибиотики и иммуномодулирующие вещества, для достижения желаемого эффекта, и соответственно, производство которой не было бы сложным, дорогим или времязатратным.
Задачей настоящего изобретения было разработать вакцину, свободную от недостатков вакцин, известных из уровня техники, в частности, от недостатков вакцины Иммуновак.
Задачей настоящего изобретения было разработать вакцину, демонстрирующую более высокую эффективность, чем известные вакцины, которые при введении не блокируют эпитопы на фракциях LPS, отвечающих за распознавание конкретных серотипов Salmonella.
Задачей настоящего изобретения было разработать вакцину, которую можно было бы легко вводить животным, в частности, птицам, в частности, такую, которую можно было бы вводить в питьевой воде. Другой задачей настоящего изобретения было разработать вакцину против сальмонеллеза, которую можно было бы вводить молодым особям, прямо с первого дня их жизни.
Неожиданно было обнаружено, что композиция, состоящая из инактивированных штаммов Salmonella различных серотипов, вместе со связанными с ними антителами, представляет собой безопасную и эффективную композицию для лечения и/или предотвращения сальмонеллеза, вызываемого штаммами Salmonella, принадлежащими к различным серотипам, в частности, у животных. Эта композиция решает все задачи настоящего изобретения и пригодна для изготовления вакцины против сальмонеллеза, пригодной для перорального введения, например, в питьевой воде, а также парентеральным путем, и при таком введении обладает эффективностью, близкой к эффективности вакцин, полученных обычными методами получения антисывороток, в частности, пригодных для парентерального введения, или даже более высокой эффективностью. Назначением разработанных композиции и вакцины является индукция пассивного и активного иммунитета против инфекционных зоонозов, особенно сальмонеллезов у животных, в частности, птиц.
Соответственно, объектом настоящего изобретения является поливалентная, комбинированная иммунизирующая и/или терапевтическая композиция против сальмонеллеза, содержащая инактивированный штамм Salmonella sp. с которым связаны антитела, характеризующаяся тем, что антитела выбраны таким образом, чтобы связывать антигенные эпитопы в структурах повторяющихся O-специфических звеньев в основных группах бактерий Salmonella, которые определяют принцип взаимодействия с иммунной системой хозяина, без блокирования эпитопов, определяющих распознавание серотипа Salmonella.
В предпочтительном варианте композиция настоящего изобретения содержит инактивированные бактерии и представляет собой смесь нескольких штаммов Salmonella, выбранных из подгрупп, охарактеризованных схемой Кауфмана-Уайта (Grimont, P.A.D. & Weill F-X, Antigenic formulae of the Salmonella serovars, 2007, 9th edition, WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Salmonella (Центр сотрудничества ВОЗ информации и исследований по сальмонелле)).
В предпочтительном варианте композиция настоящего изобретения содержит инактивированные бактерии подвидов: enterica, salamae, arizonae и/или diarizonae, houtenae, Indica вила enterica рода Salmonella.
В предпочтительном варианте композиция согласно настоящему изобретению характеризуется тем, что инактивированные бактерии рода Salmonella принадлежат к следующим подгруппам:
из группы 4 (В), в частности, серовары: Salmonella Typhimurium, Salmonella Typhimurium (например, 1,4, [5], 12: i: -), Salmonella Agona, Salmonella Bredeney, Salmonella Heidelberg, Salmonella Indiana, Salmonella Saintpaul, Salmonella Brandenburg, Salmonella Agama, Salmonella Derby, Salmonella Stanley, Salmonella Paratyphi B, Salmonella Schleissheim, Salmonella Chester;
20
из групп 6,7 и 8, (C1-С3), в частности, серовары: Salmonella Paratyphi С, Salmonella Infantis, Salmonella Hadar, Salmonella Mbandaka, Salmonella Livingstone, Salmonella Virchow, Salmonella Ohio, Salmonella Montevideo, Salmonella Tennessee, Salmonella Rissen, Salmonella Bareilly, Salmonella Oranienburg, Salmonella Thompson, Salmonella Newport, Salmonella Kottbus, Salmonella Kentucky, Salmonella Albany, Salmonella Bovismorbificans, Salmonella Djugu, Salmonella Breanderup, Salmonella Jeruzalem, Salmonella Chester, Salmonella Goldcoast, Salmonella Braenderup;
из групп 9 и 9,46 (D1-D2), в частности, серовары: Salmonella Enteritidis, Salmonella Panama, Salmonella Dublin, Salmonella Gallinarum, Salmonella Miami, Salmonella Sendai, Salmonella Wernigerode, Salmonella Typhi;
15
34
из группы 3,10 [,] и 1,3,19 (E1-E4), в частности, серовары: Salmonella Give, Salmonella Anatum, Salmonella London, Salmonella Meleagridis, Salmonella Cambridge, Salmonella Minneapolis, Salmonella Simsbury, Salmonella Senftenberg, Salmonella Westerstede;
из группы 11 (F), в частности Salmonella Aberdeen;
из группы 13 (G1-G2), в частности, серовары: Salmonella Cubana, Salmonella Poona;
из группы 6,14 (Н), в частности, серовары: Salmonella Heves, Salmonella Onderstepoort;
из группы 16 (I), в частности, серовары: Salmonella Brazil, Salmonella Hvittingfoss;
из группы 17 (J), в частности, серовар Salmonella Berlin;
из группы 18 (К), в частности, серовар Salmonella Ilia (O:18);
и из дополнительных подгрупп под номерами 21, 28, 30, 35, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 47, 48 и 50.
В предпочтительном варианте композиция согласно настоящему изобретению характеризуется тем, что антитела адсорбированы на бактериях Salmonella.
В предпочтительном варианте композиция согласно настоящему изобретению характеризуется тем, что указанные антитела выделены из сыворотки кролика, иммунизированного антигенами Salmonella.
В предпочтительном варианте композиция согласно настоящему изобретению характеризуется тем, что указанные антитела выделены из желтка яиц птицы, в частности, курицы, иммунизированной антигенами Salmonella.
В предпочтительном варианте композиция согласно настоящему изобретению содержит антитела, выделенные из сыворотки кролика, иммунизированного антигенами Salmonella, и антитела, выделенные из желтка яиц птицы, в частности, курицы, иммунизированной антигенами Salmonella.
13
13
В предпочтительном варианте композиция согласно настоящему изобретению характеризуется тем, что содержит антитела в количестве 25-100 мг на массу бактерий Salmonella в концентрации 2-5×10 (НВЧ), предпочтительно 50 мг/2-5×10 бактерий.
В предпочтительном варианте композиция согласно настоящему изобретению характеризуется тем, что она содержит инактивированные бактерии группы O:4, связанные с анти-O:9 иммуноглобулинами, полученными путем иммунизации хозяина с использованием Salmonella из группы O:9, и/или
инактивированные бактерии группы O:9, связанные с анти-O:4 иммуноглобулинами, полученными путем иммунизации хозяина с использованием Salmonella из группы O:4, и/или
инактивированные бактерии группы O:6,7, связанные с анти-O:6,8 иммуноглобулинами, полученными путем иммунизации хозяина с использованием Salmonella из группы O:6,8, и/или
инактивированные бактерии из группы O:6,8, связанные с анти-O:6,7 иммуноглобулинами, полученными путем иммунизации хозяина с использованием Salmonella из группы O:6,7.
В предпочтительном варианте композиция согласно настоящему изобретению содержит инактивированные бактерии S. Enteritidis, связанные с иммуноглобулинами, полученными путем иммунизации хозяина с использованием S. Paratyphi B, и/или
инактивированные бактерии S. Typhimurium, связанные с иммуноглобулинами, полученными путем иммунизации хозяина с использованием S. Kapemba, и/или
инактивированные бактерии S. Hadar, связанные с иммуноглобулинами, полученными путем иммунизации хозяина с использованием S. Choleraesuis, и/или
инактивированные бактерии S. Virchow, связанные с иммуноглобулинами, полученными путем иммунизации хозяина с использованием S. Newport O:6,8, и/или
инактивированные бактерии S. Infantis, связанные с иммуноглобулинами, полученными путем иммунизации хозяина с использованием S. Newport O:6,8.
В предпочтительном варианте композиция согласно настоящему изобретению предназначена для применения в качестве фармацевтической композиции, в частности, в качестве вакцины.
В предпочтительном варианте композиция согласно настоящему изобретению предназначена для применения в иммунизации и/или лечении сальмонеллеза у животных, в частности, птиц.
Настоящее изобретение также относится к способу получения поливалентной, комбинированной иммунизирующей и/или терапевтической композиции, который включает этапы, на которых:
- отдельно получают антитела путем иммунизации хозяина выбранным антигеном Salmonella;
- отдельно готовят стерильную суспензию бактерий из выбранного бактериального штамма Salmonella;
- в каждую приготовленную суспензию бактерий добавляют антитела, что обеспечивает спонтанное связывание антител с неспецифическими фракциями O-полисахаридов;
- смешивают вместе инактивированные бактерии с адсорбированными на них антителами;
- центрифугируют полученную суспензию и образующийся осадок ресуспендируют в физиологическом растворе, в который может быть добавлен консервант, предпочтительно формальдегид или фенол, или их смесь, в концентрации не больше 0.05%;
- полученную композицию, содержащую антитела, адсорбированные на бактериях Salmonella, выделяют из реакционной среды путем центрифугирования.
В предпочтительном варианте способ согласно настоящему изобретению характеризуется тем, что стерильную бактериальную массу смешивают с антителами, полученными из сыворотки кроликов, иммунизированных антигенами, происходящими из Salmonella.
В предпочтительном варианте способ согласно настоящему изобретению характеризуется тем, что стерильную бактериальную массу смешивают с антителами, полученными из желтков яиц птиц, иммунизированных антигенами, происходящими из Salmonella.
В предпочтительном варианте способ согласно настоящему изобретению характеризуется тем, что стерильную бактериальную массу смешивают с антителами, полученными из сыворотки кроликов и желтка яиц птиц, иммунизированных антигенами, происходящими из Salmonella.
12
14
В предпочтительном варианте способ согласно настоящему изобретению характеризуется тем, что концентрация бактерий в композиции не меньше 10 бактерий/мл и не больше 10 бактерий/мл.
Настоящее изобретение относится к применению композиции согласно настоящему изобретению для получения вакцины против сальмонеллеза у животных, в частности, птиц.
Другим объектом настоящего изобретения является вакцина против сальмонеллеза, которая содержит композицию согласно настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель.
В предпочтительном варианте вакцина согласно настоящему изобретению характеризуется тем, что указанная композиция суспендирована в физиологическом растворе.
В предпочтительном варианте вакцина согласно настоящему изобретению дополнительно содержит консервант, выбранный из фенола и формальдегида.
В предпочтительном варианте вакцина согласно настоящему изобретению предназначена для перорального введения в питьевой воде, а также парентерального введения.
В предпочтительном варианте вакцина согласно настоящему изобретению предназначена для введения молодым особям с первого дня их жизни.
В предпочтительном варианте вакцина согласно настоящему изобретению характеризуется тем, что ее введение повторяют 3 или 4 раза, предпочтительно с интервалами по 7-10 дней.
Описание графических материалов
Фиг. 1 Уровень антител к Salmonella в сыворотке куриц, вакцинированных вакциной Иммуновак, известной из уровня техники;
Фиг. 2 Уровень антител к Salmonella: Enteritidis, Typhimurium, Hadar, Virchow и Infantis в сыворотке куриц, которых вакцинировали 4 раза композицией из Примера IIa;
Фиг. 3 Уровень антител к Salmonella: Enteritidis, Typhimurium, Hadar, Virchow и Infantis в яйцах куриц, которых вакцинировали 4 раза композицией из Примера IIa;
Фиг. 4 Уровень антител против SE в яйцах куриц, вакцинированных живым аттеньюированным штаммом Salmonella путем перорального введения и вакциной Селенвак Т, которую вводили путем инъекции.
В последующие годы авторы изобретения проводили интенсивные исследования, чтобы выяснить причины недостатков вакцины Иммуновак. Кроме того, было решено исследовать научные основы и новые возможности для препарата, который обладал бы защитными и терапевтическими свойствами в отношении сальмонеллезов.
Вакцины согласно настоящему изобретению содержат несколько штаммов (в частности, от 1 до 7) различных серотипов. Бактерии выращивают в обогащенной среде, содержащей агар (1.5-2%), и инактивируют (убивают) формальдегидом.
Крайне важным свойством вакцины согласно настоящему изобретению является то, что она разработана на основании сложной химической структуры соматического антигена-липополисахарида (LPS)-эндотоксина, в результате проверенных исследований химической структуры выбранных фракций O-специфичных полисахаридов (OPS).
LPS расположен во внешней части клеточной стенки грамотрицательных бактерий. Он состоит из липида A, KDO (кетодезоксиоктулозоната) - корового олигосахарида и O-специфичных полисахаридов (OPS). Липид A - важный патогенный фактор, который в основном определяет пирогенные реакции высших организмов на инфекцию. Химическая структура липида A и KDO аналогична во всех грамотрицательных штаммах. OPS, демонстрирующий выраженные антигенные свойства, составляет наиболее периферическую часть молекулы LPS. Он состоит из повторяющихся олигосахаридных звеньев, причем каждая цепь может содержать до нескольких дюжин звеньев, которые образуют линейную структуру. Каждое повторяющееся звено состоит в основном из 2-8 остатков сахаров. OPS характеризуется очень высокой вариабельностью в составе сахаров, типах связей и несахаридных заместителей, в пределах рода, так и в пределах одного вида бактерий. Эти характеристики составляют основу серологического разнообразия бактерий Salmonella.
Самыми распространенными моносахаридами в OPS являются глюкоза (Glc) и галактоза (Gal), часто встречается манноза (Man), рибоза, арибиноза и ксилоза, 6-дезоксисахариды (рамноза (Rha) и фукоза), 3,6-дидезоксисахариды (абеквоза (Abe), тивелоза (Tyv) - 3,6-дидезокси-D-ксилогексоза).
Для определения первичных структур O-специфических полисахаридов выбранных бактерий Salmonella было проведено несколько тестов с использованием химических, спектроскопических, ферментативных и иммунологических методов. Химические тесты включали:
- Определение состава сахаридов;
- Определение, находятся ли сахариды в D- или L-конфигурации;
- Определение характера связывания остатков сахаров;
- Определение размеров колец сахаридных компонентов;
- Определение последовательности остатков сахаров;
- Определении конфигурации аномерных атомов углерода;
- Определение сахаридных компонентов, сайтов их прикрепления и стереохимических характеристик.
Ниже приведены примеры структур повторяющихся O-специфических звеньев в основных группах Salmonella, которые стали основой для разработке теоретических предпосылок, и затем были использованы в составлении вакцины.
Иммуноглобулины - антитела
Для специфической идентификации и уничтожения широчайшего диапазона антигенов необходим широкий диапазон факторов, участвующих в борьбе с патогенами. Распознавание эпитопов обеспечивается отбором клонов и пролиферацией клеток, на поверхности которых экспрессируются рецепторы: иммуноглобулины на В-клетках и рецепторы TCR (рецепторы Т-клеток) на Т-клетках. Антитела непосредственно распознают эпитопы: T-клетки взаимодействуют с эпитопами, связанными с антигенами гистосовместимости на поверхности клеток. Характеристическим свойством эффекторных В-клеток является образование специфических антител. Типичная молекула антитела представляет собой тетрамер, состоящий из двух легких цепей, каждая из которых состоит из 220 аминокислот, и двух тяжелых цепей, из 440 аминокислот каждая.
В каждой из цепей есть внутренние дисульфидные мостики, определяющие ее пространственную конфигурацию. Фрагменты сахаров присоединены к тяжелым цепями: молекула антитела представляет собой гликопротеин. Фрагменты сахаров, связанные с молекулой иммуноглобулина, оказывают влияние на физико-химические свойства этих молекул: обуславливают более высокую растворимость в полярной среде (например, воде), повышают термостабильность, защищают от расщепления под действием протеаз и поддерживают правильную конформацию молекулы иммуноглобулина. Для того чтобы В-клетки могли трансформироваться в плазматические клетки и продуцировать антитела, необходим общий ответ иммунной системы.
Решающим моментом для начала последовательности реакций является появление антитела в организме.
Антитела, образующиеся в ходе первичного ответа, принадлежат в основном к классу IgM, и их уровень достигает наиболее высокого значения через 7-10 дней после иммунизации. В случае отсутствия повторной иммунизации уровень антител снижается, но B- и Т-клетки памяти сохраняются в циркулирующей крови. В случае повторного попадания антигена в организм, реакция организма будет более быстрой и эффективной, что составляет часть вторичного иммунного ответа. Этот важный принцип был учтен в нашем исследовании. Авторы исследования предлагают вводить вакцину от 3 и предпочтительно до 4 раз. Количество образующихся антител во много раз выше, чем при первичном ответе, и они обладают более высокой аффинностью к антигену. Вторичный ответ может сохраняться годами (D. Kunikowska, Natural and synthetic antigens of bacteria and viruses, Ann. Acad. Med. Gedan, vol. 36, suppl. 4, 9-141). Преобладающим классом антител при вторичном ответе являются антитела класса IgG. Они проявляют более высокую аффинность связывания с антигенами, чем антитела первичного ответа. Антитела желтка яиц в основном принадлежат к классу Igy. Антитела являются чрезвычайно чувствительным и превосходным инструментом, они распознают каждую особенность в структуре полисахаридных антигенов: состав сахаров, D- или L-конфигурацию, характер связывания остатков сахаров, размер кольца сахаров в составе антигенов, конфигурацию моносахаридного аномерного атома углерода и сайт присоединения сахаридных компонентов.
Для создания новой вакцины использовали иммуноглобулины из сыворотки, полученной из кроликов, иммунизированных подготовленными соответствующим образом антигенами Salmonella. Их выделяли и очищали колоночной хроматографией с использованием адсорбента T-Gel и повторной хроматографией на носителе Sephadex G-25. Полученная суспензия иммуноглобулинов содержала смесь антител классов IgG и IgM. Содержащие белка в каждой партии проверяли методом спектрофотометрии, содержание антител проверяли методом ELISA (иммуноферментный анализ), а также проводили количественное исследование специфических антител с методом реакции агглютинации в пробирке. Кроме того, использовали выделенные антитела Igy, полученные из желтков яиц куриц, вакцинированных соответствующими антигенами Salmonella. Использовали тот же метод очистки, что и для иммуноглобулинов кролика. В контрольных испытаниях уровень белка определяли методом спектрофотометрии, а уровень специфических антител определяли с использованием реакции агглютинации в пробирке.
Для выяснения основы практических предпосылок для создания вакцины были проведены комплексные исследования выбранных OPS, которые предварительно подвергли фракционированию, в результате которого были получены фрагменты остатков отдельных сахаров.
Проведенные тесты:
- Создание набора сывороток кроликов более чем 30 видов, которые использовали для определения соматических антигенов LPS и идентификации индивидуальных фракций O-специфических полисахаридных эпитопов;
- Разработка нескольких гибридных линий для продуцирования моноклональных антител;
- Идентификация антигенных эпитопов индивидуальных компонентов остатков сахаров с использованием ИФА-анализов (ELISA), гемагглютинации, ингибирования гемагглютинации и реакции агглютинации в пробирке.
Результаты этих тестов привели к следующим выводам:
В случае остатков сахаридов OPS групп O:4 и O:9, как анти-O:4, так и анти-O:9антитела реагировали с сахаридами в полных основных цепях:
и с сахаридами в боковой цепи:
Символы  и  обозначают сайты связывания антител.
Для идентификации фрагментов, определяющих иммунологическую специфичность, окисляли рамнозу и в результате получали эпитопы групп O:4 и O:9, которые оставались свободными, несвязанными с анти-O:4 и/или анти-O:9 антителами:
В группе O:4
В группе O:9
В случае сахаридных остатков OPS группы O:6 анти-O:6 антитела связывались в следующих сайтах:
Последовательность остатков сахаров в основной цепи этих бактерий состоит в основном из маннозы, связанной в (1→2). Она главным образом отвечает за индукцию образования анти-O:6 антител. Антигенную специфичность определяет фрагмент:
, эпитоп оставался свободным, не связанным с антителами.
В случае остатков сахаров OPS групп O:8 анти-O:8 антитела связывались в следующих сайтах:
Основным сахаридным фрагментом, связывающим эти две группы, является фрагмент:
Антигенную специфичность определяет следующий эпитоп, который оставался свободным, не связанным с антителами:
Между тем существует очевидная разница между химической структурой этой группы и группы O:4, в которой также присутствует абеквоза,
Группа О:3,10
В группах O:9,46 и O:3:10 идентичные серологические реакции выявили одинаковые сахара, расположенные в основной цепи:
Аномерная конфигурация β-D-Manp и связь 1→6 с галактозой обуславливали то, что антитела, приготовленные для групп O:4 и O:9, не взаимодействовали с этими антигенными фракциями O:9,46 и O:3,10.
O-специфическая фракция (эпитоп) для группы O:9,46 состоит из:
Этот эпитоп оставался свободным, несвязанным с антителами:
а для группы O:10
O-ацетил является необходимым компонентом антигенной детерминанты фактора 10.
Представленные выше иммунохимические схемы представляют собой основу для разработки вакцин согласно настоящему изобретению.
Разработка новой вакцины /препарата/
Описанное выше исследование привело к разработке теоретических основ для получения новой вакцины. В соответствии с описанными теоретическими предпосылками была разработана композиция, обеспечивающая иммунизацию против сальмонеллеза.
Несмотря на идентичность состава LPS не все серотипы, принадлежащие к описанным серогруппам, обладают одинаковой вирулентностью. Их патогенная активность зависит от бактерий целиком. Однако распознавание и иммунный ответ зависят от присутствия наиболее важных эпитопов, факторов, содержащихся в цепи O-полисахарида. Это особенно важно в случае повторной иммунизации в ходе инфекции.
Описанные свойства иммуноглобулинов, которые использованы в новой вакцине, обеспечили возможность использовать антитела в вакцине путем связывания из с определенными антигенными эпитопами (факторами) в структурах повторяющихся O-специфических звеньев в основных группах бактерий Salmonella, которые определяют природу взаимодействия с иммунной системой хозяина, не блокируя при этом эпитопы, отвечающие за распознавание серотипа Salmonella. Этот признак особенно важен ввиду особых свойств этих бактерий: "Вакцины, содержащие один серотипа Salmonella, не вызывают перекрестный иммунитет с другими серотипами" (Meyer Н. et al. - Симпозиум «Сальмонелла и Сальмонеллез» во Франции, 1992 г., "Salmonella and Salmonellosis" (Symposium Ploufragan/Saint-Brieuc, France, 1992, p. 345. Segall, T. & Lindberg, A.A. (1993)); пероральная вакцинация крупного рогатого скота зависимым от ароматических соединений гибридом Salmonella dublin (09, 12), экспрессирующим 04, 12, защищает против S. dublin (09, 12) но не против Salmonella typhimurium (04, 5, 12): "Oral vaccination of calves with an aromatic-dependent Salmonella dublin (09, 12) hybrid expressing 04, 12 protects against S. dublin (09, 12) but not against Salmonella typhimurium (04, 5, 12). Infect Immun 61, 1222-1231)."
Проведенные исследования привели к разработке новой основы для методики получения вакцины против сальмонеллеза. Процедуры были разработаны в соответствии с руководством Польской Фармакопеи IX, том I, 2011 г.: (Ph. Eu. VII).
2,3
1
1
Основу составили штаммы Salmonella. Были получены штаммы из коллекции KOS (Национальный центр по сальмонелле), которые были выделены из организма людей и птиц, инфицированный сальмонеллой, в последние годы. Наиболее важными бактериями считались Salmonella. Наиболее важными бактериями считались: Salmonella Enteritidis (O:9, группа D), Salmonella Typhimurium (O:4, группа В), Salmonella Hadar (O:6,8, группа С), Salmonella Virchow (O:7, группа C) и Salmonella Infantis (O:7, С group). Предмет исследований также включал штаммы других подгрупп. Были исследованы и описаны основные серологические и биохимические характеристики этих штаммов. Из этих штаммов получали исходные партии для посева, а также использовали для создания рабочих запасов. Очень важно применять штаммы, пассируемые в животных (в данном случае, в курицах), поскольку после многократного пассирования на искусственных средах наблюдается потеря некоторых свойств.
Для получения соматических антигенов - O для вакцинации животных использовали суспензию бактерий, инактивированных путем кипячения. Эта обработка позволяла удалить жгутиковые антигены, и не вызывала изменений в соматических антигенах.
Для создания "новой" вакцины использовали иммуноглобулины из сывороток, полученных из кроликов или желтков яиц куриц, иммунизированных такими антигенами. Выделенные иммуноглобулины включали антитела ко всем компонентам липополисахаридных антигенов, а также ко всем O-полисахаридным фракциям. Для обеспечения терапевтической активности (пассивная защита молодых птиц) антитела связывали с бактериями, которые использовали для активной иммунизации. Для достижения этой цели антитела связывали с сахарами в полных основных цепях или фрагментов, общих для нескольких «соматических» групп, описанных в схеме Кауфмана-Уайта. С другой стороны, эпитопы, антигены, определяющие основные механизмы распознавания бактерий иммунной системой, оставались несвязанными. Можно назвать это альтернативным связыванием антигена и антитела.
Таким образом: бактерии из группы O:4 (например, S. Typhimurium 1,4,12, S. Typhimurium (например, 1,4, [5], 12: i: -), S. Agona, S. Bredeney, S. Heidelberg, S. Indiana, S. Saintpaul, S. Brandenburg, S. Derby, S. Stanley, S. Paratyphi В) связывали с анти-O:9-иммуноглобулинами, т.е. с иммуноглобулинами, полученными в результате иммунизации хозяина бактериями Salmonella из группы O:9.
Бактерии из группы O:9 group (например, S. Enteritidis 1,9,12, S. Panama, S. Dublin, S. Gallinarum) связывали с анти-O:4-иммуноглобулинами, т.е. с иммуноглобулинами, полученными в результате иммунизации хозяина бактериями Salmonella из группы O:4.
Бактерии из группы O:6,7 (например, S. Infantis 6,7, S. Virchow 6,7, and S. Mbandaka, S. Livingstone, S. Tennessee, S. Bareilly, S. Oranienburg, S. Thompson) связывали с анти-O:6,8-иммуноглобулинами, т.е. с иммуноглобулинами, полученными в результате иммунизации хозяина бактериями Salmonella из группы O:6,8.
Бактерии из группы O:6,8 (например, S. Hadar 6,8, S. Newport, S. Kottbus, S. Kentucky, S. Albany, S. Bovismorbificans, S. Breanderup, S. Jeruzalem, S. Chester, S. Goldcoast) связывали с анти-O:6,7-иммуноглобулинами, т.е. с иммуноглобулинами, полученными в результате иммунизации хозяина бактериями Salmonella из группы O:6,7 group.
Приведенные выше иммунохимические схемы описывают основание для этого подхода.
В исследованиях был также выявлено, что другим ключевым элементом, помимо связывания инактивированных бактерий со специфическими антителами, связывающими антигенные эпитопы (факторы) в структурах повторяющихся O-специфических звеньев в основных группах Salmonella, которые определят характер взаимодействия с иммунной системой хозяина, без блокирования эпитопов, определяющих распознавание серотипа Salmonella, является отбор и количество этих антител. Оказалось, что применение этих антител в избытке также может привести к блокированию эпитопов, которые, как указывалось ранее, должны оставаться свободными, что снижает эффективность вакцины, как в случае с вакциной Иммуновак, в которой использовались антитела в количестве, в 10 раз большем.
Основанием для разработки поливалентной комбинированной иммунизирующей и/или терапевтической композиции и вакцины против сальмонеллеза согласно настоящему изобретению для перорального введения в питьевой воде и парентерально с первых дней жизни животных, является особенная чувствительность молодых животных к инфекциям. До третьей недели жизни у птиц нет полностью развитой иммунной системы. Вакцина на основе композиции согласно настоящему изобретению безопасна для людей и окружающей среды. Ее легко вводить и она позволяет обеспечивать молодых особей антителами в первые дни их жизни, а затем вызывает развитие активного иммунитета. Кроме того, необходимость защиты против Salmonella обусловлена требованиями правил Европейского Союза.
Возможность введения иммунизирующей и/или терапевтической композиции и вакцины согласно настоящему изобретению в питьевой воде является очень важным преимуществом, поскольку она значительно упрощает процесс профилактической/терапевтической вакцинации животных, особенно птиц. Известно, что вакцины обычно вводят в форме препаратов для парентерального введения, в частности, для инъекций, особенно для внутримышечных и подкожных инъекций, поскольку парентеральное введение обеспечивает существенно более высокую эффективность, чем пероральное введение. Неожиданно оказалось, что иммунизирующие и/или терапевтические композиция и вакцина согласно настоящему изобретению чрезвычайно эффективны при введении в питьевой воде. Как показано ниже в Примере 3 в описании, было проведено исследование эффективности вводимой пероральным путем вакцины согласно настоящему изобретению, и результаты сравнивали с парентеральным и внутривенным введением. Неожиданным результатом было то, что перорально вводимые вакцины обладали эффективностью, в целом сравнимой с внутривенным введением, и при этом пероральные вакцины обладали значительно более высокой эффективностью против некоторых штаммов Salmonella.
Вакцина согласно настоящему изобретению представляет собой суспензию бактерий, покрытых антителами, в физиологическом растворе, т.е. в растворе NaCl 8.5 в количестве г/л. Это связано с тем, что для связывания антител и стабилизации препарата необходимы электролиты. Вакцина может дополнительно содержать консервант, который может быть выбран из формальдегида и фенола.
12
14
В целом, иммунизирующие и/или терапевтические композиции для применения при бактериальных инфекциях и пищевом отравлении, в частности, при сальмонеллезах, в которых используется стерильная бактериальная масса, получают следующим образом. Стерильную бактериальную массу Salmonella смешивают с антителами, полученными из сыворотки кроликов и/или желтка яиц птиц, иммунизированных антигенами Salmonella, полученную смесь оставляют на несколько часов при температуре предпочтительно 37°C, затем центрифугируют и полученный осадок ресуспендируют в физиологическом солевом растворе, в который может быть добавлен консервант, предпочтительно формальдегид или фенол, или их смесь, концентрация которого не превышает 0.02%. Полученную композицию антител, адсорбированных на Salmonella, выделяют из реакционной смеси путем центрифугирования, при этом концентрация бактерий в композиции не меньше 10 бактерий/мл и не больше 10 бактерий/мл.
13
13
В способе согласно настоящему изобретению антитела в предпочтительном варианте выделяют из сыворотки кроликов, иммунизированных антигенами Salmonella enterica, подвида enterica, причем для этой цели могут быть использованы антигены, полученные из: Salmonella Paratyphi В, Salmonella Typhimurium, Salmonella Heidelberg, Salmonella Thompson, Salmonella Virchow, Salmonella Newport, Salmonella Hadar, Salmonella Kentucky, Salmonella Bovismorbificans, Salmonella Kapemba, Salmonella Enteritidis, Salmonella London, Salmonella и Salmonella Anatum, и/или используют антитела, полученные из желтков яиц куриц, иммунизированных антигенами в количестве 25-100 мг на массу бактерий Salmonella в концентрации 2-5×10 НВЧ, предпочтительно 50 мг/2-5×10 бактерий.
Способ получения иммунизирующей и/или терапевтической композиции против бактериальных инфекций и пищевого отравления, в частности, при сальмонеллезах, описан в приведенных ниже примерах.
Для каждого этапа производства вакцины были разработаны стандартные технологически процедуры.
Получение антител
Способы получения сывороток с Salmonella для применения в вакцине согласно настоящему изобретению, содержащей антитела к группам и отдельным факторам соматических антигенов, соответствовали рекомендациям Центра сотрудничества ВОЗ информации и исследований по сальмонелле (M.Y. Popoff, Guidelines for the preparation of Salmonella antisera, 2001, 6th edition, Institut Pasteur, France (Изд. Института Пастера во Франции, 2001 г)).
Штаммы получали из коллекции Национального центра по сальмонелле (KOS). Каждый из них характеризуется обозначением, номером и специфическим антигенным паттерном. Из размноженных штаммов была создана собственная музейная коллекция.
Получение антигенов для вакцинации
Бактерии: каждый штамм отбирают отдельно, по одной копии каждого штамма, из собственной музейной коллекции, высевают в обогащенную жидкую среду, инкубируют при 37°C в течение 18 ч. и культивируют, в результате чего получают отдельные колонии. Тщательно отобранные гладкие колонии пассируют в среде с 1.5% агара и а чашках с агаром Свена Гарда. После 18-часовой инкубации проводят серологическую идентификацию с набором стекол с сыворотками для реакции агглютинации с бактериями Salmonella. В случае, когда замечали контаминацию штамма, формировали отдельную культуру на дифференциальной среде и проводили дополнительные тесты с использованием биохимической реакции. Биохимические и сереологические реакции должны соответствовать требованиям Информационного центра ВОЗ.
Получение соматических антигенов O для вакцинации животных
Одну гладкую колонию инкубируют в жидкой среде в течение 4 часов при 37°C, а затем переносят на чашки с 1.5% агара и культивируют при 37°C в течение 18 часов. Бактерии смывают 0.85% NaCl и кипятят при 100°C в течение 2.0 часов чтобы разрушить жгутики. После охлаждения проверяют суспензию на стерильность: 0.1 суспензии добавляли к 10 мл жидкой среды и инкубировали в течение 18 часов при 37°C. Отсутствие замутнения указывает на стерильность антигена. В случае, если замечена мутность, суспензию повторно кипятят в течение 1 часа при 100°C и повторяют тест на стерильность.
8
Затем проводят проверку идентичности антигенов с использованием реакции агглютинации в пробирке со стандартной сывороткой с известным титром антител. Тесты проводят следующим образом: готовят серийные разведения стандартной сыворотки от 1:10 до 1:1280 и добавляют 1-2 капли исследуемого антигена для получения концентрации бактерий 1.5×10 КОЕ (шкала Макфарланда). Суспензию выдерживают при комнатной температуре в течение ночи и оценивают агглютинацию по шкале от 1 до 5. Для вакцинации выбирают антиген, который демонстрирует агглютинацию 5 при разведении сыворотки по меньшей мере 1:640. В этой форме суспензия стабильна и может храниться до 1 года при температуре от 2 до 8°C.
Шкала для реакции агглютинации в пробирке:
5 - Полная агглютинация бактерий в полностью прозрачной жидкости. При легком встряхивании пробирки поднимается облако агглютинированных бактерий.
4 - Явная агглютинация бактерий в слегка опалесцентной жидкости.
3 - Агломераты бактерий в опалесцентной жидкости.
2 - Слабо видимые агломераты бактерий в опалесцентной жидкости.
1 - Следовая агглютинация в опалесцентной жидкости указывает на отсутствие агглютинации.
Контроль представляет собой суспензию бактерий в NaCl.
Получение антител кролика
9
Для вакцинации антиген разбавляли в 0.85% NaCl до концентрации 2×10 КОЕ бактерий (по шкале Макфарланда). Вакцинировали непородистых кроликов массой приблизительно 2,5. Сначала кроликов вакцинировали подкожно, вводя 0.5 мл суспензии, а затем внутривенно с использованием доз 0.5, 1.0, 2.0 и 4.0 мл каждые 5 дней. Через 9 дней после последней вакцинации проводили аспетический забор крови и выдерживали ее в течение 0.5 часа в инкубаторе при температуре 37°C, а затем переносили в холодильник (при ±4°C) на 18 часов. После центрифугирования до образования сгустка (3500 об./мин.) переносили сыворотку с стерильную бутыль.
Первичный контроль сыворотки осуществляют с использованием реакции агглютинации в пробирке. Готовят серийные разведения стандартной сыворотки от 1:10 до 1:2560 и проводят реакцию как описано выше (см. описание проверки идентичности антигена).
Реакцию следует проводить с использованием широкого спектра антигенов. Выбор антигенов зависит от ожидаемой совместной агглютинации и известных антигенных факторов, использованных для вакцинации кроликов.
Иммуноглобулины выделяют из сыворотки хроматографией на колонке с адсорбентом T-Gel с последующей хроматографией на колонке с наполнителем Sephadex G-25. После пропускания через колонку иммуноглобулины содержат антитела IgG и IgM. Их суспендируют в 0.85% NaCl, степень очистки составляет 96%, а их количество составляет от 13.5 до 20.0 мг/мл.
Получение антител из яичных желтков
Получение антител к Salmonella, выделенных из желтков яиц куриц, для вакцинации с целью борьбы с сальмонеллезом у куриц, осуществляют на основании рекомендаций по получению кроличьих сывороток против Salmonella Центра сотрудничества ВОЗ информации и исследований по сальмонелле (WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Salmonella, M.Y. Popoff, Guidelines for the preparation of Salmonella antisera, 2001, 6th edition, Institut Pasteur, France (Изд. Института Пастера во Франции)).
Описания получения антигенов для вакцинации и соответствующих контролей совпадают с описаниями для сывороток кролика.
9
Для вакцинации антиген разбавляли в 0.85% NaCl до концентрации 2×10 КОЕ бактерий (шкала Макфарланда). Для вакцинации использовали куриц, приобретенных на сертифицированных племенных фермах, которых выращивали по меньшей мере 5 недель до начала периода откладывания яиц. Куриц вакцинировали сначала подкожно - вводили 0.5 мл суспензии, а затем внутримышечно с использованием дох 0.5, 1.0, 2.0 и 4.0 мл через каждые пять дней. Яйца собирали в течение 3-4 недель от начала периода откладывания яиц. Из всего пула собранных яиц извлекали желтки и экстрагировали из ни антитела путем осаждения сульфатом аммония и с использованием полиэтиленгликоля. После диализа неочищенный экстракт антител Igγ очищали хроматографией с использованием адсорбента T-Gel, а затем подвергали хроматографии на колонке с носителем Sephadex G-25. Антитела Igγ, полученные в результате пропускания через колонку, суспендируют в 0.85% NaCl; степень их очистки составляет 96%, а их уровень лежал в диапазоне от 200 до 400 мг/мл.
В соответствии с рекомендациями Центра сотрудничества ВОЗ информации и исследований по сальмонелле, получали следующие представительные сыворотки:
анти-O:4 получали путем вакцинации антигеном S. Paratyphi В-4,12;
анти-O:9 получали путем вакцинации антигеном S. Kapemba 9,12;
анти-O:6.7 получали путем вакцинации антигеном S. Choleraesuis 6,7;
анти-O:6.8 получали путем вакцинации антигеном S. Newport 6,8;
Основные этапы получения вакцины
1. Получение исходных штаммов
Культивировали каждый штамм, собранный из маточной партии, и для дальнейшей работы выбирали только гладкие колонии. Такие колонии гарантируют полное развитие соматического антигена "О", а этот признак чрезвычайно важен для эффективности композиции. Проводили серологическое исследование выбранных колоний с использованием реакции агглютинации на стеклах с набором сывороток для серологической диагностики Salmonella, а также проводили их биохимическое исследование с использованием тест-систем Bio Marieu.
2. Приготовление бульона для культивирования
Полученный таким образом штамм высевали в обогащенную жидкую среду (бульон), состоящую из: 1000 мл дистиллированной воды, 0.4 г мясного экстракта, 5.4 г кислотного гидролизата казеина, 1.7 г дрожжевого экстракта, 3.5 г гидрохлорида натрия и инкубировали в течение 20-24 часов при 37°C.
3. Приготовление стерильной суспензии бактерий
13
Бактериальную массу из выбранного штамма Salmonella готовили следующим образом: на чашки Петри и/или во флаконах Py (Roux) со средой, состоящей из: 1000 мл дистиллированной воды, 0.4 г мясного экстракта, 5.4 г кислотного гидролизата казеина, 1.7 г дрожжевого экстракта. 3.5 г хлорида натрия и 15 г агара, здесь и далее называемой обогащенным агаром, выращивали бактерии Salmonella в течение 24 часов при 37°C. Бактерии смывали физиологическим раствором, добавляли формальдегид до концентрации от 0.4% до 0.5%, а затем оставляли при 37°C на ночь, чтобы убить бактерии. Контроль стерильности суспензии осуществляли в соответствии с руководством Польской фармакопеи IX, том. I, 2011 г., (Ph. Eu. VII). Бактерии центрифугировали в течение 60 минут при скорости 8000-10.000 об./мин. и удаляли надосадочную жидкость. Время центрифугирование зависит от объема полученной бактериальной суспензии. Осадок разбавляли физиологическим раствором (NaCl 8.5 г/л, pH приблизительно 7.0). Концентрацию бактерий определяли с использованием спектрофотометра на длине волны 650 нм. В качестве стандарта использовали шкалу Макфарданда. Полученное значение НВЧ (НВЧ - наиболее вероятное число) составило 4-8×10.
4. Приготовление композиции согласно изобретению
13
11
Для каждого штамма отдельно готовили стерильную бактериальную массу как в этапе 3, содержащую примерно 10 НВЧ, суспендировали в 0.85% растворе NaCl, добавляли несколько миллилитров очищенных антител к соответствующему штамму и выдерживали в водяной ванне при аккуратном встряхивании в течение приблизительно 20 часов при температуре приблизительно 37°C. В этих условиях происходит спонтанное связывание антител с неспецифическими фракциями O-полисахаридов. Затем суспензию центрифугировали на скорости 8000-10000 об./мин., надосадочную жидкость удаляли, а осадок ресуспендировали в солевом растворе с pH приблизительно 7, содержащем приблизительно 0.02% формальдегида, в результате чего получали 1000 мл суспензии, содержащей в 1 мл приблизительно 10 бактерий. Число бактерий определяли методом спектрофотометрии по шкале Макфарланда (McFarland), а уровень антител определяли методом твердофазного ИФА (ELISA).
Затем для изготовления вакцины объединяли от 2 до 7 отдельно приготовленных таким образом суспензий с адсорбированными на них антителами, в необходимом соотношении, с учетом стабильности вакцины в конкретной среде.
Примеры
Пример Ia
13
Бактериальную массу S. Enteritidis, полученную как в этапе 3, содержащую НВЧ 2×10, суспендировали суспендировали в 10 мл 0.85% NaCl, а затем добавляли 3 мл очищенных анти-O:9 антител (25 мг), выделенных из желтка куриных яиц, и выдерживали в водяной ванне при аккуратном встряхивании в течение 20 часов при 37°C. В этих условиях происходит спонтанное связывание антитела с неспецифическими фракциями O-полисахаридов. В этом случае основная полисахаридная цепь представляет собой:
,
а сахариды в боковой цепи:
. Символы  и  обозначают сайты связывания антител.
Антигенный эпитоп, определяющий антигенную специфичность бактерий:
оставался свободным - не связанным с антителами.
11
Суспензию центрифугировали в течение 60 минут при скорости 8000-10000 об./мин., надосадочную жидкость удаляли, а осадок ресуспендировали в солевом растворе, при pH приблизительно 7, содержащем 0.02% формальдегида, в результате чего получали 1000 мл суспензии, содержащей в 1 мл 2×10 бактерий. Число бактерий определяли методом спектрофотометрии по шкале Макфарланда (McFarland), определенное количество составляло 95% теоретического выхода. Уровень антител, определенный методом твердофазного ИФА (ELISA) составил приблизительно 1.600 для ОП492.
Пример Ib
13
Бактериальную массу S. Typhimurium, приготовленную как в Примере Ia, содержащую НВЧ 1×10, суспендировали в 10 мл 0.85% NaCl, добавляли 1.5 мл очищенных анти-O:9 антител (25 мг) и выдерживали в водяной ванне при аккуратном встряхивании в течение 20 часов при 37°C. Антитела связывались с неспецифическими фракциями O-полисахаридов. В этом случае основная полисахаридная цепь - такая же как у S. Enteritidis:
,
а сахариды в боковой цепи:
Эпитоп, определяющий антигенную специфичность бактерий:
оставался свободным - не связанным с антителами.
11
Затем суспензию центрифугировали в течение 60 минут на скорости 8000-10000 об./мин., надосадочную жидкость удаляли, а осадок ресуспендировали в солевом растворе с pH приблизительно 7, содержащем 0.02% формальдегида, в результате чего получали 1000 мл суспензии, содержащей в 1 мл 1×10 бактерий. Число бактерий определяли методом спектрофотометрии по шкале Макфарланда (McFarland), полученное количество составляло 98% теоретического выхода. Уровень антител, определенный методом твердофазного ИФА (ELISA) составил приблизительно 1.600 для ОП492.
Пример Ic
13
Бактериальную массу S. Hadar, приготовленную как в Примере Ia, содержащую НВЧ 1×10, суспендировали в 10 мл 0.85% NaCl, добавляли 1.5 мл очищенных анти-O:6.7 антител (25 мг) и выдерживали в водяной ванне при аккуратном встряхивании в течение 20 часов при 37°C. Антитела связывались с неспецифическими фракциями O-полисахаридов.
Эпитоп, определяющий антигенную специфичность бактерий:
оставался свободным - не связанным с антителами.
11
Суспензию центрифугировали в течение 60 минут при скорости 8000-10000 об./мин., надосадочную жидкость удаляли, а осадок ресуспендировали в солевом растворе с pH приблизительно 7, содержащем 0.02% формальдегида, в результате чего получали 1000 мл суспензии, содержащей в 1 мл 1×10 бактерий. Число бактерий определяли методом спектрофотометрии по шкале Макфарланда (McFarland), определенное количество составляло 96% теоретического выхода. Уровень антител, определенный методом твердофазного ИФА (ELISA) составил приблизительно 1.600 для ОП492.
Пример Id
13
Бактериальную массу S. Infantis, приготовленную как в Примере Ia, содержащую НВЧ 0.5×10 суспендировали в 10 мл 0.85% NaCl, добавляли 0.75 мл очищенных анти-O:6.8 антител (15 мг) и выдерживали в водяной ванне при аккуратном встряхивании в течение 20 часов при 37°C. Антитела связывались с неспецифическими фракциями O-полисахаридов.
Антигенную специфичность бактерий S. Infantis определяет фрагмент:
. Эпитоп оставался свободным, не связанным с антителами.
11
Суспензию центрифугировали в течение 60 минут при скорости 8000-10000 об./мин., надосадочную жидкость удаляли, а осадок ресуспендировали в солевом растворе с pH приблизительно 7, содержащем 0.02% формальдегида, в результате чего получали 1000 мл суспензии, содержащей в 1 мл 0.5×10 бактерий. Число бактерий определяли методом спектрофотометрии по шкале Макфарланда (McFarland), определенное количество составляло 95% теоретического выхода. Уровень антител, определенный методом твердофазного ИФА (ELISA) составил приблизительно 1.600 для ОП492.
Пример Ie
13
Бактериальную массу S. Enteritidis, полученную как в этапе 3, содержащую 2×10 НВЧ, суспендировали в 10 мл 0.85% NaCl, а затем добавляли 3 мл очищенных анти-O:4 антител (55 мг), выделенных из желтка куриных яиц, и выдерживали в водяной ванне при аккуратном встряхивании в течение приблизительно 20 часов при приблизительно 37°C. В этих условиях происходит спонтанное связывание антител с неспецифическими фракциями O-полисахаридов. В этом случае основная полисахаридная цепь представляет собой:
,
а сахариды в боковой цепи:
, Символы  и  обозначают сайты связывания антител.
Антигенный эпитоп, определяющий антигенную специфичность бактерий:
оставался свободным - не связанным с антителами.
11
Суспензию центрифугировали в течение 60 минут при скорости 8000-10000 об./мин., надосадочную жидкость удаляли, а осадок ресуспендировали в солевом растворе с pH приблизительно 7, содержащем 0.02% формальдегида, в результате чего получали 1000 мл суспензии, содержащей в 1 мл 2×10 бактерий. Число бактерий определяли методом спектрофотометрии по шкале Макфарланда (McFarland), определенное количество составляло 95% теоретического выхода. Уровень антител, определенный методом твердофазного ИФА (ELISA) составил приблизительно 1.600 для ОП492.
Пример If
13
Бактериальную массу S. Typhimurium, приготовленную как в Примере Ia, содержащую НВЧ 1×10. суспендировали в 10 мл 0.85% NaCl, а затем добавляли 1.5 мл очищенных анти-O:9 антител (25 мг), выделенных из желтка куриных яиц, и выдерживали в водяной ванне при аккуратном встряхивании в течение 20 часов при 37°C. Антител связывались с неспецифическими фракциями O-полисахаридов. В этом случае основная полисахаридная цепь идентична цепи S. Enteritidis:
,
а сахариды в боковой цепи представляют собой:
Антигенный эпитоп, определяющий антигенную специфичность бактерий:
оставался свободным - не связанным с антителами.
11
Суспензию центрифугировали в течение 60 минут при скорости 8000-10000 об./мин., надосадочную жидкость удаляли, а осадок ресуспендировали в солевом растворе с pH приблизительно 7, содержащем 0.02% формальдегида, в результате чего получали 1000 мл суспензии, содержащей в 1 мл 1×10 бактерий. Число бактерий определяли методом спектрофотометрии по шкале Макфарланда (McFarland), определенное количество составляло 98% теоретического выхода. Уровень антител, определенный методом твердофазного ИФА (ELISA) составил приблизительно 1.600 для ОП492.
Пример Iq
13
Бактериальную массу S. Hadar, приготовленную как в Примере Ia, содержащую НВЧ 1×10, суспендировали в 10 мл 0.85% NaCl, а затем добавляли 1.5 мл очищенных анти-O:6.7 антител (25 мг), выделенных из желтка куриных яиц, и выдерживали в водяной ванне при аккуратном встряхивании в течение 20 часов при 37°C. Антитела связывались с неспецифическими фракциями O-полисахаридов.
Антигенный эпитоп, определяющий антигенную специфичность бактерий:
оставался свободным - не связанным с антителами.
11
Суспензию центрифугировали в течение 60 минут при скорости 8000-10000 об./мин., надосадочную жидкость удаляли, а осадок ресуспендировали в солевом растворе с pH приблизительно 7, содержащем 0.02% формальдегида, в результате чего получали 1000 мл суспензии, содержащей в 1 мл 1×10 бактерий. Число бактерий определяли методом спектрофотометрии по шкале Макфарланда (McFarland), определенное количество составляло 96% теоретического выхода. Уровень антител, определенный методом твердофазного ИФА (ELISA) составил приблизительно 1.600 для ОП492.
Пример Ih
13
Бактериальную массу S. Infantis, приготовленную как в Примере Iа, содержащую 0.5×10 НВЧ, суспендировали в 10 мл 0.85% NaCl, а затем добавляли 0.75 мл очищенных анти-O:6.8 антител (15 мг), выделенных из желтка куриных яиц, и выдерживали в водяной ванне при аккуратном встряхивании в течение 20 часов при 37°C. Антитела связывались с неспецифическими фракциями O-полисахаридов.
Антигенную специфичность S. Infantis определяет фрагмент:
, эпитоп оставался свободным, не связанным с антителами.
11
Суспензию центрифугировали в течение 60 минут при скорости 8000-10000 об./мин., надосадочную жидкость удаляли, а осадок ресуспендировали в солевом растворе с pH приблизительно 7, содержащем 0.02% формальдегида, в результате чего получали 1000 мл суспензии, содержащей в 1 мл 0.5×10 бактерий. Число бактерий определяли методом спектрофотометрии по шкале Макфарланда (McFarland), определенное количество составляло 95% теоретического выхода. Уровень антител, определенный методом твердофазного ИФА (ELISA), составил приблизительно 1.600 для ОП492.
Пример IIa
Способом, описанным в Ia-Id, получали бактериальные массы отдельно для каждого штамма из S. Enteritidis, S. Typhimurium, S. Hadar, S. Virchow и S. Infantis, которые по отдельности смешивали с антителами, выделенными из сыворотки кроликов, вакцинированных суспензиями бактерий: S. Paratyphi В O:4, S. Kapemba O:9, S. Choleraesuis O:6,7 и S. Newport O:6,8, соответственно, как показано в таблице ниже.
13
11
Затем инактивированные бактерии с адсорбированными антителами, смешивали в соотношении 2:1:1:0.5:0.5 (по количеству бактерий), и полученную бактериальную массу, содержащую НВЧ 5×10, суспендировали в солевом растворе с pH 7, содержащем 0.02% формальдегида, в результате чего получали 1000 мл суспензию, содержащую 5×10 бактерий на 1 мл, что составило 96% теоретического выхода. Уровень антител, определенный методом твердофазного ИФА (ELISA) составил приблизительно 1.600 для ОП492.
Пример IIb
13
11
Способом из Примеров Ie-Ih получали раздельно бактериальные массы из S. Enteritidis, S. Typhimurium, S. Hadar, S. Virchow и S. Infantis, связанных с антителами, выделенными из желтков яиц от куриц, вакцинированных отдельно суспензиями бактерий: S. Paratyphi В O:4, S. Kapemba O:9, S. Choleraesuis O:6,7 и S. Newport O:6,8, соответственно (для составления комбинаций использовали метод, аналогичный показанном в Таблице выше), при этом суспензию антител для объединения с бактериями, описанную выше, разбавляли таким образом, чтобы получить концентрацию, соответствующую концентрацию антител кролика. Затем инактивированные бактерии с адсорбированными на них антителами смешивали с соотношении 2:1:1:0.5:0.5 (по количеству бактерий), и полученную бактериальную массу, содержащую НВЧ 5×10, суспендировали в солевом растворе при pH 7, содержащем 0.02% формальдегида, в результате чего получали 1000 мл суспензии, содержащей 5×10 бактерий на 1 мл, что составило 96% теоретического выхода. Уровень антител, определенный методом твердофазного ИФА (ELISA) составил приблизительно 1.600 для OП492.
Пример III
Исследование антител к Salmonella на курицах, вакцинированных композицией согласно Примеру IIа
7
8
8
8
Провели эксперименты для определения специфического иммунного ответа у куриц после введения композиции, содержащей 5 инактивированных штаммов Salmonella: Enteritidis, Typhimurium, Hadar, Virchow и Infantis (смешанных в следующих соотношениях 2:1:1:0,5:0,5), связанных с антителами, указанными в Примере IIа. Исследование проводили на половозрелых группах (курицы-несушки (15000 животных) и бройлеры (14000 животных)). Кур вакцинировали 4 раза, начиная первой недели жизни, с недельными перерывами. Композицию вводили в питьевой воде: 5.0×10; 1×10; 2×10 и 4×10/мл. У выбранных случайным образом животных - по 25 птиц в каждом поголовье (группе) - брали образцы крови на 7 и на 17 неделе жизни в случае кур-несушек т.е. на 3 и 13 неделе после вакцинации) и на 7 и 13 неделе в случае бройлеров (т.е. в 3 и 9 недели после вакцинации). Уровень антител исследовали методом твердофазного ИФА (ELISA) в сыворотках, разбавленных 1:10; результаты показаны на Фиг. 2.
Результаты и сравнение
Уровень антител:
Графики, приведенные на Фиг. 1 и Фиг. 2, и Таблица 1 демонстрируют, что уровень антител в сыворотке птиц, вакцинированных экспериментальной композицией, полученной согласно Примеру IIа, был очень высоким для всех 5 штаммов. График демонстрирует тенденцию к повышению уровня антител после 14 недели жизни кур-несушек. Самым низким значением ОП492 было 1.500, а самое высокое составило 3.000.
Для оценки качества полученных результатов, необходимо сравнить их с результатами исследования иммунного ответа у кур-несушек, вакцинированных 4 раза вакциной Иммуновак, которые продемонстрировали крайне низкие уровни антител при измерении ОП492, которые для кур-несушек на 11 неделе жизни были равны 0.665, а на 16 неделе жизни - 0.729.
Пример IV
Исследование уровней антител в яйцах вакцинированных куриц
Исследование уровней антител в яйцах куриц-несушек, вакцинированных композиций, содержащей 5 инактивированных штаммов Salmonella; Enteritidis, Typhimurium, Hadar, Virchow и Infantis (смешанные в следующих соотношениях 2:1:1:0,5:0,5), которые были связаны с антителами, указанными в IIа.
7
8
8
8
Исследование проводили на коммерческом репродуктивном поголовье из 15000 животных. Цыплят вакцинировали 4 раза, начиная с первой недели жизни с недельными интервалами. Композицию вводили в питьевой воде: 5,0×10; 1×10; 2×10 и 4×10/мл. Для этого исследования авторы изобретения случайным образом отобрали 60 яиц от куриц на 28 неделе жизни.
Уровень антител в смеси, содержащей белок и желток яиц, разбавленные 1:50 исследовали методом твердофазного ИФА (ELISA). Результаты показаны на Фиг. 3.
Уровни антител в яйцах вакцинированных куриц были значительно выше, чем в сыворотке. Значения оптической плотности ОП492 составили: для S. Enteritidis - 1.37; S. Typhimurium - 1.10; S. Hadar - 0.44; S. Virchow - 0.58; S. Infantis - 0.72. Показанные результаты были значительно ниже значений ОП, показанных на Фиг. 2 (в сыворотке куриц), что связано с тем, что степень разбавления содержимого яиц было в 40 раз выше, чем степень разбавления сыворотки куриц.
Пример V
Сравнение уровней антител после введения коммерческой вакцины и композиции согласно настоящему изобретению.
Было очень интересно сравнить результаты исследования антител, содержащихся в яйцах куриц, вакцинированных поливалентной композицией согласно настоящему изобретению, с результатами исследований, проведенных Брайаном Шиеном (Brian Sheehan) и Риком ван Оортом (Rick van Oort). Они провели исследование уровней антител в яйцах куриц, перорально вакцинированных живым аттенуированным штаммом (в публикации не упоминалось название вакцины) и вакциной Саленвак Т (Salenvac Т), которую вводили путем инъекции. Результаты выявили отсутствие антител в яйцах куриц, вакцинированных живыми бактериями, в то время как вакцина, которую вводили инъекционным путем, вызэвала присутствие анти-Se {антител к Salmonella enteritidis) на 27 и 63 неделях (График на Фиг. 4 из статьи Salmonella control: protecting eggs and people. Brian Sheehan and Rick van Oort, World Poultry - vol. 22, no 9. 2006. WP www.World/Poultry.Net 42).
Исследования поливалентной вакцины ('экспериментальная композиция из Примера IIа), После 4 пероральных введений композиции, содержащей инактивированные бактерии и антитела, авторы изобретения обнаружили в яйцах значительно более высокие уровни антител к 5 штаммам, содержащимся в вакцине (Фиг. 3), что указывает на то, что вакцина обладает способностью защищать потомство вакцинированных куриц. Это наблюдение чрезвычайно важно, поскольку не найдено письменных сообщений, которые подтверждали бы возможность получения значительного иммунного ответа после перорального применения инактивированных бактерий для иммунизации. Особенно стоит отметить факт обнаружения антител в яйцах куриц, вакцинированных новой композицией. Это явление возможно объясняется реакцией иммунной системы на многократное введение вакцины
Пример VI
Расщепление антител
Были проведены исследования, очень важные с точки зрения полезности комплекса бактерий, содержащего антитела, для функциональности композиции после введения через желудочно-кишечный тракт.
1
1
Выделяли антитела из сыворотки кроликов, иммунизированных бактериями Salmonella: O:4 (В), O:6,7 (C) и O:9 (D), с использованием осаждения сульфатом аммония. Осадок растворяли в воде и диализировали против 0.1 М ацетата натрия, pH 4.0. Содержание белка, определенное спектрофотометрическим методом (λ=280 нм), составило 100 мг/мл.
Расщепление осуществляли в два этапа:
Этап I
Расщепление пепсином (при концентрации фермента 1 мг/33 мг белка) при 37°C и pH 4.0 осуществляли в течение 30 минут. Образцы для исследования собирали перед расщеплением (образец 0), через 15 минут (образец 1) и через 30 минут (образец 2). Реакцию расщепления гасили путем добавления 0.1 М Tris-HCl/0.02 М CaCl2 к объему 1/40, после чего pH доводили до 7.8.
Этап II
Расщепление трипсином (1 мг/40 мг белка). Антитела после расщепления пепсином (как описано выше) подвергали расщеплению трипсином в течение 19 часов при 37°C и pH 7.8. Брали образцы для исследования: через 1 час (образец 3), 2 часа (образец 4), 3 часа (образец 5), 4 часа (образец 6) и через 19 часов (образец 7). Все образцы хранили при - 20°C.
Эффекты расщепления исследовали в тесте на основе реакции агглютинации в пробирке.
Из данных, представленных в Таблице 2, видно, что расщепление пепсином в кислой среде вызывало снижение титра антител от 1 до 2 разведений, а расщепление трипсином в течение 19 часов не привело к потере серологической активности в исследованных.
В процессе расщепления пепсином в кислой среде значения серологической активности антител снизилась на два порядка разведения. Антитела, расщепленные ферментами в условиях, близких к условиям с желудочно-кишечном тракте, не теряли своих свойств связывания бактериальных антигенов. Проведенное исследование показало, что вакцину, содержащую композицию их бактерий и антител можно вводить перорально, не опасаясь полного разрушения антител в желудочно-кишечном тракте. Вакцины такого состава можно также применять для борьбы с другими инфекциями в желудочно-кишечном тракте.
Заключения: 4-кратная пероральная вакцинация продемонстрировала способность вызывать мощный гуморальный ответ, определяемый в сыворотке вакцинированных куриц и образование значительного количества антител в яйцах.