Моделирование острого панкреатита у свиней и цитохимическая характеристика лейкоцитов

УДК 619:616.4-085:612.128

Ключевые слова: панкреатит, лейкоциты, свиньи

Key words: pancreatitis, leukocytes, pigs

Андреева С. Д.

МОДЕЛИРОВАНИЕ ОСТРОГО ПАНКРЕАТИТА У СВИНЕЙ И ЦИТОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЛЕЙКОЦИТОВ

modeling of acute pancreatitis in pigs and cytochemical characteristic of leukocytes

ФГБОУ ВПО «Вятская государственная сельскохозяйственная академия» Адрес: 610017, Россия, г. Киров, Октябрьский пр., 133

vyatka state Agricultural Academy Address: 610017, Russia, Kirov, oktyabr 'sky prospect, 133

Андреева Светлана Дмитриевна, к. в. н., проф. Российской академии естествознания, доцент каф. морфологии и микробиологии. Тел. (8332) 57-43-29 Andreeva svetlana D., Ph.D. in veterinary science, Professor of the Russian Academy of Natural sciences, Associated Professor of the Dept. of Morphology and Microbiology. Tel. +7 (8332) 57-43-29

Аннотация. Работа посвящена изучению цитохимических свойств лейкоцитов свиней при создании модели острого панкреатита. Установлено, что наибольшие изменения наблюдаются в химическом составе нейтрофилов и лимфоцитов на 7 сутки эксперимента, что вызвано нарастанием деструктивных поражений в поджелудочной железе животных.

Summary. This is the study of cytochemical properties of leukocytes of pigs in the process of modeling the acute pancreatitis. The most significant changes are observed in the chemical composition of neutrophils and lymphocytes on the 7th day of the experiment which is caused by the rise of aggressive lesions in the pancreas of animals.

Введение

Актуальность проблемы острого деструктивного панкреатита (ОДП) обусловлена отсутствием комплексной диагностики указанной патологии у свиней, что вызвано ана-томо-топографическими особенностями поджелудочной железы у всеядных животных.

При воспалительных процессах в поджелудочной железе продукты распада тканей усиливают проницаемость клеточных мембран ациноцитов. У животных с выраженными формами панкреатита в крови существенно возрастает содержание гликогена, сукцинатдегидрогеназы (СДГ) и кислой фосфатазы (маркеров митохондриальных и лизосомальных ферментов), показывающих более выраженную и глубокую степень деструктивных изменений в паренхиме поджелудочной железы.

При воспалительных состояниях в ней-трофилах наблюдается высокая активность ферментов, что не связано с появлением молодых палочкоядерных клеток, т. к. последним свойственны более низкие показатели

активности ферментов по сравнению со зрелыми нейтрофилами. Хейхоу Ф. Г. Дж., Ква-глино Д. [2] полагали, что это является результатом поступления зрелых нейтрофилов, которые продуцируются преимущественно в селезенке, а не в костном мозге. Цитохимические исследования Wulff H. R. [6] указали на небольшое увеличение активности КФ и гликогена в клетках крови при инфекциях и некоторых видах лейкоза у человека. При этом было отмечено, что эритробласты и ре-тикулоциты обычно реагируют положительно, но эритроциты в норме - отрицательно.

Целью настоящего исследования было выявление зависимости между метаболическими сдвигами, происходящими в лейкоцитах, и интенсивностью проявления экспериментального панкреатита.

Задача: изучить изменения содержания кислой фосфатазы (КФ), сукцинатдегидрогеназы (СДГ) и гликогена в нейтрофильных гранулоцитах и лимфоцитах экспериментальных животных при остром деструктивном панкреатите (ОДП) у свиней.

Материалы и методы

Эксперимент поставлен в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ № 755 от 12.08.1977 г. МЗ СССР). Работа выполнена на кафедре хирургии и акушерства Вятской ГСХА. Опыты проведены на 5 контрольных и 5 подопытных клинически здоровых поросятах крупной белой породы в возрасте 30 суток живой массой 5-5,5 кг. Премедикацию осуществляли препаратом ветранквил 1 % в дозе 1 мл на 100 кг массы тела животного внутримышечно. В качестве базового наркоза использовали препарат золетил 50 в дозе 5, 10 и 15 мг на 1 кг внутримышечно. Перед рассечением тканей проводили местную инфильтрацион-ную анестезию 0,5%-м раствором новокаина. Показатели температуры тела, пульса, дыхания, характеризующие общий клинический статус, определяли до введения, затем через 10 минут после инъекции Золетила 50, а также через 1, 3, 7, 13 и 21 суток после воспроизведения острого панкреатита. Для создания криогенной модели острого панкреатита нами был предложен препарат «КриоФар-ма», который представляет аэрозоль, состоящую из смеси диметилэфира и пропана. При лапаротомии по срединной линии выводили в операционное поле двенадцатиперстную кишку и правую долю поджелудочной железы. На выбранный участок органа наносили аэрозоль «КриоФарма» методом аппликации и выдерживали 20 секунд. После криогенного воздействия вправляли органы в брюшную полость. Поросятам обеих групп после проведения лапаротомии на брюшную стенку последовательно наложены трехэтажные швы. Животным контрольной группы крио-обработка поджелудочной железы не проводилась.

Кровь для исследования морфологического состава брали из краевой вены уха в пробирки с гепарином (100 ЕД на 1 мл крови) до введения анестетиков, а также перед проведением эвтаназии на определенных ранее этапах эксперимента. Определяли уровень гемоглобина колориметрическим методом по Сали, проводили подсчет количества эритроцитов, лейкоцитов в камере Горяева. Мазки крови

окрашивали на СДГ по Р. П. Нарциссову [1], на кислую фосфатазу по М. Г. Шубичу [3], на гликоген по Шиффу [1] в лаборатории па-томорфологии крови Кировского научно-исследовательского института гематологии и переливания крови. В клинических и гематологических исследованиях использовали утвержденные Департаментом ветеринарии МСХ РФ методы и методики исследования.

С помощью бинокулярного микроскопа БИОЛАМ (ув. 10^100) изучали препараты, подсчитывали лейкоцитарную формулу, результаты цитохимического исследования оценивали по методу G. Astaldi и L. Verga [4]. Результаты представляли в виде среднего цитохимического коэффициента (СЦК) по Kaplow L. [5]. Интенсивность КФ, СДГ и гликогена в нейтрофилах и лимфоцитах оценивали путем полуколичественного анализа, учитывали дифференциальную окраску специфических гранул, их расположение и концентрации в клетках крови, используя следующие градации характера реакции в клетках: 0 -в цитоплазме нет положительного материала; + - в цитоплазме выявляются отдельные гранулы или «венчик» из одного ряда окрашенных зерен; ++ - в цитоплазме клеток выявляется венчик из 2 рядов окрашенных гранул или интенсивно окрашенная цитоплазма в нейтрофильных гранулоцитах; +++ - в цитоплазме лимфоцитов выявляются три венчика из окрашенных гранул, цитоплазма нейтрофилов ярко-красного цвета с четкой зернистостью. Статистическую обработку результатов проводили с использованием компьютерной программы Primer of Biostatistics 4.03. (p < 0,05).

Результаты исследования

Клиническое обследование животных свидетельствовало о выявлении ярко выраженной болезненности брюшной стенки при пальпации у животных опытной группы, в то время как аналогичный симптом у животных контрольной группы не обнаружен. Животное № 1 погибло через 20 минут после завершения операции по моделированию ОДП, животное № 2 пало на 3 сутки эксперимента.

При проведении гематологических исследований у экспериментальных животных

на 7 сутки развития острого деструктивного панкреатита отмечается ярко выраженный лейкоцитоз (23,7 тыс.), лимфоцитоз (13,9 тыс., 51 %), эритропения (3,0 млн.) и ускорение СОЭ до 6 мм/час. На 14 сутки после проведения экспериментального ОДП выявлены лейкопения (12,2 тыс.), моноцитоз (2,19 тыс., 18 %) и лимфоцитоз (6,22 тыс., 51 %), СОЭ - 5 мм/час. У контрольных животных гематологические показатели были в пределах физиологической нормы: количество эритроцитов - 6,5±0,8 млн., лейкоцитов -15,0±0,1 тыс., лимфоцитов - 5,1±0,5 тыс. (34,0±0,2 %), моноцитов 300±5 (2,0±0,01 %), СОЭ - 2 мм/час.

Ультразвуковое исследование органов брюшной полости у животных опытной группы выявило острый гепатит и диффузный панкреатит. У животных контрольной группы указанные патологии не выявлены.

При патологоанатомическом исследовании животных опытной группы были диагностированы острый панкреатит, острый гепатит, фибринозный перитонит, острый пиелонефрит, асцит, острый серозный дуоденит, экссу-дативный плеврит. У животных контрольной группы патологоанатомические изменения во внутренних органах отсутствовали.

Цитохимические изменения в нейтрофилах

Гранулы гликогена одиночные, изредка образуют замкнутое кольцо вокруг ядра. При среднем значении СЦК 0,85 у. е. у контрольных животных показатели гликогена в нейтрофилах до операции были выше у животного № 2 и № 5. На 7 сутки ОДП СЦК содержания гликогена значительно вырос (2,58) в 2,3 раза. На 14 сутки эксперимента данный показатель был также высоким (2,64). У животного с лапаротомией хотя и снизился СЦК по сравнению с дооперацион-ным периодом, но остался на 21 день эксперимента высоким (2,04).

СЦК кислой фосфатазы в нейтрофилах у здоровых животных контрольной группы составил 0,49, а у животных опытной группы в среднем он равен 0,96. Наибольший подъем этого показателя наблюдается на 7 сутки эксперимента (в 2,47 раз выше по сравнению с началом эксперимента). На 14 сутки спад

значения СЦК объясняется истощением резервных возможностей нейтрофилов и появлением молодых палочкоядерных нейтро-филов. Однако у животных с лапаротомией первоначально высокий показатель незначительно повысился.

Средний показатель СЦК СДГ в нейтро-филах у животных контрольной группы составил 0,57. У экспериментальных животных в первые сутки эксперимента он был 0,33. На 7 сутки уровень содержания СДГ повысился в 10 раз по сравнению с дооперацион-ным периодом, что вызвано активизацией и пролиферацией нейтрофилов в очаге воспаления.

Цитохимические изменения в лимфоцитах

У здоровых поросят в месячном возрасте СЦК КФ в лимфоцитах составляет 0,26. У животных при моделировании ОДП он составил 0,51-0,73 (ср. показатель 0,63). В первый час эксперимента у животного № 1 наблюдался анафилактический шок, показатель остался неизменным. У животного № 2 в течение трех суток СЦК КФ снизился почти в 7 раз с первоначальным значением до операции. Однако у опытного животного, выведенного из эксперимента с выраженной формой острого панкреатита, СЦК КФ повысился на 60 %, что свидетельствует об активных обменных процессах, происходящих в лимфоцитах. У животного № 4 на 14 сутки ОДП СЦК КФ незначительно снизился на 18 % (до 0,56), а на 21 сутки эксперимента СЦК КФ вновь возрастает до 1,11, что выше дооперационного периода в 2,1 раза.

СЦК содержания СДГ в лимфоцитах здоровых месячных поросят составил 0,06 у. е. При использовании в реакционной смеси в качестве красителя нитро-тетразолия синего наблюдается окрашивание в виде дифференциальных отложений и отдельных гранул. У животных, погибших в 1 и 3 сутки, СДГ не определялась. Но характерное повышение фермента отмечено на 7, 14 и 21 сутки эксперимента. Это вызвано активизацией мито-хондриального комплекса ферментов, в т. ч. и СДГ при воспалительном процессе.

В лимфоцитах контрольной группы СЦК гликогена равен 0,61. Снижение уровня гли-

когена отмечено на 7 сутки. Его восстановление и увеличение запасов в клетке происходит на 14 сутки эксперимента. Однако у животных с лапаротомией происходит понижение СЦК гликогена, что, по-видимому, вызвано реставрацией пораженных участков оперативного доступа и энергетических затрат лимфоцитов на миграцию в место регенерации.

Заключение

Описанные цитохимические исследования проводились с помощью полуколичественного подсчета и дали возможность выявить изменения содержания гликогена, СДГ и кислой фосфатазы в патологически измененных клетках крови экспериментальных животных при ОДП.

Одной из основных причин повышения проницаемости клеточных мембран аци-нарных структур поджелудочной железы является гиперактивация в ней процессов перекисного окисления липидов, поэтому продукты его обмена - шиффовые основания и диеновые конъюгаты - могут отражать степень активности воспалительного процесса в железе. Комплексное цитохимическое исследование клеток крови экспериментальных животных при остром деструктивном панкреатите на гликоген, сукцинатдегидро-геназу и кислую фосфатазу поможет составить морфологические и цитохимические критерии патологических изменений при нарушении метаболизма ациноцитов на различных стадиях развития патологического процесса. Выявленные особенности состава лейкоцитов по цитохимическим признакам можно будет использовать для контроля течения воспалительного процесса в поджелудочной железе и его коррекции препаратами, влияющими на функции и метаболизм клеток крови.

Исходя из полученных данных, можно будет прогнозировать течение панкреатита. Гематологические исследования необходимо

подтверждать клиническим осмотром больных животных, результатами патологического вскрытия и изучением цитологических повреждений паренхимы органа.

Выводы

1. Изменения цитохимических признаков лейкоцитов при экспериментальном остром панкреатите у свиней отличаются гетерогенностью, что можно рассматривать как проявление метаболических различий между популяциями клеток крови с различными иммунологическими функциями.

2. Наиболее значительные изменения в нейтрофилах наблюдаются на 7 сутки эксперимента: происходит повышение значения СЦК гликогена (в 2,1 раза), СДГ в 10 раз, кислой фосфатазы в 1,6 раза.

3. В лимфоцитах свиней при остром панкреатите повышение уровня СДГ отмечено на 7 сутки в 4,1 раза, на 14 сутки в 4, 2 раза, на 21 сутки почти в 20 раз.

4. На 14 сутки при моделировании ОДП наиболее характерным признаком является повышение уровня гликогена в лимфоцитах в 2,5 раза.

Список литературы

1. Нарциссов, Р. П. Цитохимические исследования крови / Р. П. Нарциссов. - М. : Медицина, 1996. -325 с.

2. Хейхоу, Ф. Г. Дж. Гематологическая цитохимия / Ф. Г. Дж. Хейхоу, Д. Кваглино. - М. : Медицина, 1983. - 320 с.

3. Шубич, М. Г. Цитохимическая характеристика лейкоцитов / М. Г. Шубич, И. В. Нестерова // Лабораторное дело. - 1980. - № 3. - С. 150-154.

4. Astaldi, Q. Glycogen content of the cells of lymphatic leukaemia / Q. Astaldi, L. Verqa // Acta Haematology. - 1957. - 17. - Р. 129.

5. Kaplow, L. Assessment of monocyte esterase activity by flow cytophotometry / L. Kaplow, H. Dauber, E. Lerner // J. Histochemistry Cytochem. - 1976. - 24. -P. 363.

6. Wulff, H. R. Histochemical studes of leucocytes from an inflammatory exudates clycogen and phosphorylase / H. R. Wulff // Acta Haematology. -1962. - 28. - P. 86.

Ф

Архивы номеров журнала: www.invetbio.spb.ru/journal/vp_main.htm