Структура G-квадруплексного ДНК-аптамера к тромбину RA36

УДК 577.112; 577.18

СТРУКТУРА G-КВАДРУПЛЕКСНОГО ДНК-АПТАМЕРА К ТРОМБИНУ RA36

А.В. Юминова, И.Г. Смирнова, А.М. Арутюнян, А.М. Копылов. А.В. Головин, Г.В. Павлова

Изучена структура 31-звенного аптамерного олигонуклеотида (RA36), более эффективно ингибирующего коагулянтную активность тромбина по сравнению с широкоизвестным аптамером 15TGT (Thrombin binding aptamer). Аптамер RA36 имеет двухмодульную структуру, в состав которой входят две G-богатых области, способные формировать квадруплекс. Методом кругового дихроизма показано, что аптамер RA36 формирует G-квадруплекс, аналогичный G-квадруплексу 15XGT. Изучена термическая стабильность G-квадруплекса RA36. При физиологических условиях (концентрация стабилизирующего катиона 5 мМ) температура плавления G-квадруплексов RA36 значительно ниже, чем 15TGT. Спектры КД делеционных мутантов этого олигонуклеотида подтверждают двух-модульное строение RA36, т.е. образование G-квадруплекса в структуре аптамера RA36 как первым, так и вторым G-богатым участком.

Ключевые слова: G-квадруплекс, ДНК, аптамеры, круговой дихроизм, термостабильность.

Список сокращений: КД - круговой дихроизм, ПААГ - полиакриламидный гель, 15ТGT - 15-звенный олигонуклеотид, связывающий тромбин; RA36 - 31-звенный оли-гонуклеотид, связывающий тромбин; РСА - рентгеноструктурный анализ, НК - нуклеиновая кислота.

Способность однотяжевых НК копироваться, а также формировать сложные третичные структуры определила возникновение новой технологии SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment) [1-5]. C помощью метода SELEX отбирают небольшие молекулы НК - аптамеры, которые по специфичности и аффинности являются функциональными аналогами антител. Аптамеры способны образовывать стабильные комплексы с разными мишенями: клетками, белками, низкомолекулярными веществами. В случае ферментов, в частности протеиназ, аптамеры используют в качестве ингибиторов.

Тромбин - многофункциональная сериновая про-теиназа, участвующая в коагулянтном каскаде крови, первая протеиназа, для которой были получены апта-мерные ингибиторы [6-8].

С помощью ЯМР-спектроскопии и РСА было показано, что связывающий тромбин 15-звенный аптамер dGGTTGGTGTGGTTGG (15TBA) образует G-квадруплекс [7-10]. Восемь гуанинов образуют два плоских G-квартета с тремя петлями: петля TGT и две симметричные петли TT.

Спектры КД антипараллельных G-квадруплексов имеют характерные положительные максимумы при 294 и 248 нм и отрицательный экстремум при 265 нм [11-15].

G-квадруплексы стабилизируются посредством тесного взаимодействия катионов с остатками гуанина [16-17]. Катионы координируются атомами кислорода (О6) карбонильных групп гуанинов между плоскостями соседних G-квартетов, причем ион калия представляется наиболее подходящим для стабилизации подобных структур среди одновалентных ионов [13].

Проведено систематическое исследование 15ТВА и его производных, у которых варьировали длину петель [14]. Показано, что при длине петель менее 5 ну-клеотидов образуется параллельный G-квадруплекс, в остальных случаях - квадруплексы антипараллельного и смешанного типов. Введение в структуру 15ТВА химических модификаций по определенным положениям также может приводить к формированию параллельного G-квадруплекса [18].

В спектре КД 15ТВА, полученном в присутствии его комплементарной цепи ДНК, положения максимума (294 нм) и минимума (267 нм) смещаются в коротковолновую область (до 280 и 252 нм соответственно), что отвечает спектрам КД двутяжевой ДНК [11].

Для работы мы выбрали 15- и 31-звенный аптамеры. Ранее ингибирующее действие ЯА36 было охарактеризовано по его влиянию на продолжительность тромбинового времени, которое используется в клиниках для контроля терапии ингибиторами тромбина [19, 20]. ЯА36 можно

рассматривать как двухмодульную молекулу, в которой оба G-богатых участка могут формировать G-квадруплекс. Однако в настоящее время данные о структуре аптамера RA36 отсутствуют, поэтому цель настоящей работы состояла в изучении информационной стабильности RA36 методом кругового дихроизма.

Экспериментальная часть

Материалы и методы. Для работы использовали олигодезоксирибонуклеотиды, синтезированные и очищенные в ПААГ («Синтол», Россия), структуры приведены в таблице.

Спектры КД измеряли на CD-спектрометре «CHIRASCAN» («Applied Photophysics Ltd.», Великобритания) и модифицированном дихрографе «MARK-5» («Jobin-Yvon», Франция). Регистрацию проводили в интервале длин волн от 220 до 350 нм (в кювете с длиной оптического пути 1 см) и в интервале температур от 4 до 80°С. Обработку изображений и математических данных проводили с помощью программ «JImage», «Gimp», «GraphWork» и «Origin 8.0».

Результаты и обсуждение

Спектр КД 15TGT показан на рис. 1, Б, который совпадает с типичным спектром КД мономолекулярного антипараллельного G-квадруплекса [8-12]. В спектре КД RA36 (рис. 1, А) наблюдаются максимумы при 294 и 247 нм и минимумы при 267 и 230 нм, что полностью соответствует спектру КД 15TGT (рис. 1, Б). Но в отличие от 15TGT амплитуда максимума при 294 нм в спектре КД RA36 больше на 25-35%. Этот эффект можно объяснить формирова-

нием двух квадруплексов. Исследована структура ряда аналогов ЯЛ36, полученных путем укорочения последовательности ЯЛ36 по 3 - или 5 -концу. Аптамеры ЯЛ36_51, ЯЛ36_52 и ЯЛ36_53, полученные делецией 1-, 2- и 3-нуклеотидов с 5 -конца последовательности ЯЛ36, также имеют спектры КД с экстремумами, характерными для антипараллельного в-квадруплекса. Таким образом, при наличии вырожденного паттерна на 5 -конце второй в-квадрулпексный паттерн образует в-квадруплекс (рис. 2). Как показано на рис. 3, температура плавления в-квадруплекса при уменьшении длины вырожденного паттерна изменяется незначительно: 23,5±0,3°С, 24,9±0,2°С и 24,0±0,9°С для аптамеров ЯЛ36_51, ЯЛ36_52 и ЯЛ36_53 соответственно.

Аптамеры ЯЛ36_31, ЯЛ36_32 и ЯЛ36_33, полученные делецией соответственно 1-, 2- и 3-нуклеотидов с 3 -конца последовательности ЯЛ36, также имеют спектры КД с экстремумами, характерными для антипараллельного в-квадруплекса. Таким образом, при наличии вырожденного паттерна на 3'-конце второй в-квадруплексный паттерн также образует в-квадруплекс (рис. 4). Температура плавления в-квадруплекса при уменьшении длины вырожденного паттерна изменяется незначительно (рис. 3): 18,1±0,3°С, 18,0±1,0°С и 17,8±0,5°С для аптамеров ЯЛ36_31, ЯЛ36_32 и ЯЛ36_33 соответственно. При одновременной делеции по 1 нуклеотиду с 3 - и 5 -концов (ЯЛ36_31_51), когда оба паттерна являются вырожденными, полностью исчезает максимум КД при 294 нм (рис. 5), характеризующий квадруплексную структуру, а значит в-квадруплекс не образуется, что коррелирует с полученными ранее данными об отсут-

Исследуемые аптамерные олигодезоксирибонуклеотиды

Название Первичная структура, 5'-3'

олигодезоксирибонуклеотида

15TGT dGGTTGGTGTGGTTGG

RA36 dGGTTGGTGTGGTTGGTGGTTGGTGTGGTTGG

RA36_51 dGTTGGTGTGGTTGGTGGTTGGTGTGGTTGG

RA36_52 dTTGGTGTGGTTGGTGGTTGGTGTGGTTGG

RA36_53 dTGGTGTGGTTGGTGGTTGGTGTGGTTGG

RA36_31 dGGTTGGTGTGGTTGGTGGTTGGTGTGGTTG

RA36_32 dGGTTGGTGTGGTTGGTGGTTGGTGTGGTT

RA36_33 dGGTTGGTGTGGTTGGTGGTTGGTGTGGT

RA36 51 31 dGTTGGTGTGGTTGGTGGTTGGTGTGGTTG

— —

Рис. 1. А - спектры КД аптамера RA36 в диапазоне температур от 5 до 50°С с шагом 5°С

—I---1—--1—--1--1---1——I—'—г

220 260 300 340

Длима волны, нм

Рис. 2. Спектры КД аптамера RA36_31 в диапазоне температур от 5 до 50°С с шагом 5°С

ствии физиологической активности этого ДНК-олигонуклеотида [21].

Температура плавления, рассчитанная по изменению амплитуды при 294 нм, аптамера ЯЛ36 значительно ниже, чем 15TGT (30,0 и 39,0°С соответственно), что указывает на дестабилизирующее влияния дополнительного G-богатого квадру-плексного участка у ЯЛ36 на стабильность квадру-плексной структуры. Очевидно, что один из двух квадруплексных модулей становится менее стабилен, чем 15TGT. Делеции дезоксирибонуклеоти-дов по 3 -концу обладают большим дестабилизирующим действием, чем делеции по 5 -концу, что выражается в снижении температуры плавления G-квадруплексных структур (рис. 5). Делеционный анализ позволяет предположить, что квадруплекс находящийся на 3 -части ЯЛ-36 более стабилен, чем квадруплекс расположенный на 5 -конце. Ин-

Рис. 3. Термостабильность G-квадруплексной структуры аптамеров: 1 - RA36_31 (Tm = 23,5±0,3°С) и 2 - RA36_51 (T = 18,1±0,3оС), длина волны 295 нм

Рис. 4. Спектры КД аптамера RA36_51 в диапазоне температур от 5 до 50оС с шагом 5оС

Рис. 5. Спектры КД аптамера RA36_31_51 в диапазоне температуры от 5°С до 50°С с шагом 5°С, в буфере 20 мМ Трис-HCl (pH 7,5), 140 мМ NaCl, 5 мМ KCl

тересно отметить, что структурная стабильность прямо коррелирует с ингибирующей активностью делеционных мутантов описанных ранее [21].

Аптамер ЯЛ36 образует антипараллельный в-квадруплекс, менее стабильный, чем в-квадру-плекс широкоизвестного аптамера 15ТвТ (15ТВЛ). в-квадруплекс может быть образован как первым, так и вторым в-квадруплексным паттерном последовательности

Влияние дополнительных дезоксирибонуклеоти-дов на G-квадруплекс не равнозначно относительно хода цепи: наличие дополнительной G-богатой последовательности на 5-конце последоватеельности в меньшей степени дестабилизирует G-квадруплекс аптамера, чем аналогичная дополнительная последовательность на 3 -конце. Для эффективной разработки антикоагулянтных препаратов необходимо понимание причин, определяющих структуру и свойства аптамеров к тромбину.

GTTGGTGTGGTTGGTGGTTGGTGTGGTTGG.

Работа была поддержана грантом РФФИ (проект № 14-04-01757 а).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Burke J.M., Bezzal-HerranzA. // FASEB J. 1993. 7. P. 106.

2. Breaker R.R., Joyce G.F. // TIBTECH. 1994. 12. P. 268.

3. Gold L., Polisky B., Uhlenbeck O., Yarus M. // Annu. Rev. Biochem. 1995. 64. P. 763.

4. Osborne S. E., Matsumura I., Ellington A. D. // Curr. Opin. Chem. Biol. 1997. 1. P. 5.

5. Копылов А.М., Спиридонова В.А. // Молекулярная биология. 2000. 34. С. 1097.

6. Bock L.C., Griffin L.C., Latham J.A., Vermaas E.H., Toole J.J. // Nature. 1992. 355. P. 564.

7. Tasset D.M., KubikM.F., Steiner W. // J. Mol. Biol. 1997. 272. P. 688.

8. Macaya R.F., Schultze P., Smith F.W., Roe J. A., Feiqon J. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1993. 90. P. 3745.

9. Padmanabhang К., Padmanabhang K.P., Ferrarag J.D., Sadled J.E., Tulinsky A. // J.B.C. 1993. 268. P. 17651.

10. Padmanabhang К., Tulinsky A. // Acta Crystallogr., Sect. D. 1996. 52. P. 272.

11. Berova N., Nakanishi K., Woody R.W. // Circular Dichro-ism: Principles and Applications. Weinheim, 2000. P. 724.

12. Kumar N., Maiti S. // BBRC. 2004. 319. P. 759.

13. Kankia B.I., Marky L.A. // J. Am. Chem. Soc. 2001. 123. P. 10799.

14. SmirnovI.V., ShaferR.H. // J Mol Biol. 2000. 296. P. 1.

15. Smirnov I.V., Shafer R.H. // Biochemistry. 2000. 39. P. 1462.

16. Chen F.-M. // Biochemistry. 1992. 31. Р. 3769.

17. Basu S., Szewczak A.A., Cocco M., Strobel S.A. // J. Am. Chem. Soc. 2000. 122. Р. 3240.

18. Peng C.G., DamhaM.J. // Nucleic Acids Res. 2007. 35. N 15. P. 4977.

19. Savchik E.Y., Kalinina T.B., Drozd N.N., Makarov V.A., Zav'yalova E.G., Lapsheva E.N., Mudrik N.N., Babij A.V., Pavlova G.V., Golovin A.V., Kopylov A.M. // Bull. Exp. Biol. Med. 2013. 156. N 1. P. 44.

20. Головин А., Решетников Р., Завьялова Е., М. Копылов А., Павлова Г., Бабий В. Пат. РФ. № 2429293. М., 2009.

21. Zavyalova E., Golovin A., Pavlova G., Kopylov A. Module-Activity Relationship of G-quadruplex Based DNA Aptamers for Human Thrombin // Current MedicinalChe-mistry. 2013. 20. N 38. P. 4836.

Поступила в редакцию 10.10.14

THE STRUCTURE OF G-QUADRUPLEX THROMBIN BINDING DNA-APTAMER RA36

A.V. Yuminova, I.G. Smirnova, A.M. Arutyunyan, A.M. Kopylov, A.V. Golovin, G.V. Pavlova

The structure of 31-mer aptameric DNA-oligonucleotide RA36 has been studied. This aptamer more effectively inhibits coagulant activity of thrombin compared with widely known aptamer 15TGT (Thrombin binding aptamer). RA36 aptamer has two-pattern structure, which includes two G-rich regions capable of forming G-quadruplex. We showed by Circular dichroism that the aptamer RA36 forms a antyparallel G-quadruplex similar the G-quadruplex of 15TGT. Under physiological conditions (concentration of the stabilizing cation 5 mM) the thermal stability of G-quadruplex RA36 significantly lower than 15TGT. Double-quadruplex structure of RA36 is confirmed by CD spectra of deletion mutants, ie G-quadruplex formation could be both the first and second G-rich site of the aptamer RA36.

Key words: G-quadruplex, DNA, aptamers, circular dichroism, thermal stability

Сведения об авторах: Юминова Алина Валерьевна - мл. науч. сотр. ООО «АПТО-ФАРМ», канд. хим. наук (yumalina@gmail.com); Смирнова Инна Григорьевна - доцент кафедры химии природных соединений химического факультета МГУ, канд. хим. наук (sig@genebee.msu.ru); Арутюнян Александр Мигранович - вед. науч.сотр. НИИ физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского МГУ, канд. физ.-матем. наук (alarut@genebee.msu.ru), Копылов Алексей Михайлович - профессор кафедры химии природных соединений химического факультета МГУ, докт. хим. наук (kopylovalex@gmail.com); Головин Андрей Викторович - ст. препод. факультета биоинженерии и биоинформатики МГУ, канд. хим. наук (golovin@belozersky.msu.ru); Павлова Галина Валерьевна - вед. науч. сотр. ООО "APTO-PHARM", докт. биол. наук (lkorochkin@mail.ru).