Микросателлитные последовательности хпДНК ячменя: снижение спектра изменчивости у культурных форм

© Н.В. Луханина,

М.Г. Синявская, И.М. Голоенко, О.Г. Давыденко

Институт генетики и цитологии АН Беларуси, Минск

Ш Проведено исследование хлоропластной ДНК у 67 образцов Hordeum vulgare L. с целью оценки полиморфизма микроса-теллитных последовательностей. Из семи изученных микросател-литных повторяющихся последовательностей хлоропластной ДНК полиморфными оказались 4 меж-генные района: trnL-trnF, psbl-trnS, 2 района гена trnS (3’ область). Найдены редкие варианты указанных районов хпДНК, выделено 5 образцов, несущих эти аллели. Результаты проведенного исследования указывают на крайне низкий уровень полиморфизма хпДНК культурного ячменя.

Ш Ключевые слова: хлоропластная ДНК; микросателлиты; полиморфизм; Hordeum vulgare L.; сорт; окультуривание

МИКРОСАТЕЛЛИТНЫЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ хпДНК ЯЧМЕНЯ: СНИЖЕНИЕ СПЕКТРА ИЗМЕНЧИВОСТИ У КУЛЬТУРНЫХ ФОРМ

ВВЕДЕНИЕ

Ядерный геном, несомненно, играет определяющую роль в процессах роста и развития растений, однако доказаны и эффекты цитоплазматических генов на экспрессию количественных признаков, трансмиссию и частоту рекомбинаций отдельных локусов хромосом [1, 2, 8, 19]. Тесное взаимодействие геномов ядра и органелл в процессах эволюции и селекции подтверждается исследованиями изменчивости одновременно органельной и ядерной ДНК. Выявлено существование неслучайных комбинаций различных полиморфных типов ядерной и хлоропластной ДНК ячменя [13, 18]. ДНК органельных геномов растений обладают гораздо меньшим уровнем изменчивости по сравнению с ядерным, однако полиморфизм ДНК цитоплазматических органелл показан у эукариот как на межвидовом, так и внутривидовом уровне [4, 6, 17].

Применение ПЦР-методов для изучения геномов органелл в популяционной генетике позволило выявить дополнительный резерв генетической изменчивости растений, одновременно продемонстрировав ее сокращение в процессе окультуривания и дальнейшей селекции. В процессе одомашнивания и селекции изменения частот генов в популяциях культурных растений по сравнению с дикими могут быть весьма значительными вследствие эффекта «бутылочного горлышка» в том случае, если предками сортов какого-либо вида была одна или небольшое количество групп. Подобное явление отмечают для многих видов культурных растений [3, 6, 12, 16].

В связи с этим, оценка уровня полиморфизма хлоропластной ДНК культурных форм, выявление уникальных и редких образцов очень важны для того, чтобы расширить или, по меньшей мере, сохранить спектр изменчивости, не утратив при окультуривании потенциально важные плазматипы. В данной работе мы изучали изменчивость микросателлитных последовательностей хлоропластной ДНК у культурных представителей рода Hordeum, а также выделили редкие плазматипы среди образцов данного вида.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследовано 67 образцов Hordeum vulgare L. (табл. 1), представляющих 19 стран — Беларусь, Россия, Украина, Канада, Швеция, Эфиопия и др. Тотальная ДНК выделялась по стандартной методике [7] из 6—7-дневных проростков.

Для анализа микросателлитных последовательностей хлоропластной ДНК были отобраны SSR-маркеры, выявляющие, по данным ряда исследователей [9, 15, 17], высокий уровень полиморфизма хпДНК в семействе Gramineae (табл. 2).

Полимеразную цепную реакцию проводили в реакционной смеси объемом 10 |jL, содержащим 1х ПЦР-буфер (60 mM Tris-HCl, 25 mM KCl,

Таблица 1

Исследованные образцы Hordeum vulgare L.

Страна происхождения Сорт Тип хлоропластной ДНК*

Беларусь Криничный, Зазерский 85, Талер, Сталы, Сябра, Гонар, Атаман, Маентак, Дивосны, Виват, Якуб, Гастинец, Прима Беларуси, Визит 1

Украина Харьковский 74, Харьковский 84, Одесский 100, Вестник, Романтик, Днепровский 16, Агант, Гетмань, Пивденный, Чаривний, Галактик, Орфей 1

Оболонь

Россия Новосибирский 80, Московский 3, Нарымчанин, Омский 85, Рассвет, Омский 86 1

Ранний 1

Эфиопия Abyssinian 1124, Местный образец (4 формы) 1

Wollamo Sadado

Мексика Местный образец (2 формы) 1

Нидерланды Effendi, Cebeco 6723, Cebeco 6727 1

Швеция Bente, Вежа 1

Роланд

США Hembar, C.I.15532 1

Канада Конквист 1

Brock

Дания Sigurd Sejet, Sewa 1

Камерун Ethiopia 13 1

Франция Grindor, Leila 1

Финляндия Jo 1389, Инари 1

Германия Баронесса, Тюрингия 1

Польша Атол, Стратус 1

Казахстан Медикум 85 1

Латвия Имула 1

Чехословакия CE 334 1

Австрия Антьяго 1

Примечание: * — тип хлоропластной ДНК расшифровывается в табл. 3.

10 mM 2-меркаптоэтанол, 0,1 % тритон Х-100) (Сиб-Энзим), 1,5 mM MgCl2, 200 мМ dNTPs, 4 pmol Су5 меченого прямого праймера, 4 pmol обратного праймера, 0,5 U Taq полимеразы (СибЭнзим), 50—100 ng геномной ДНК в амплификаторе Gene Amp PCR System 2700 (Applied Biosystems). Амплификация с праймерами hvcptrnS1, hvcptrnS2, hvcprpoA, hvcptrnL/F проводилась согласно Provan et al.,1999b; atpB/rbcL — Provan et al., 2004; WCt2, WCt3 — Ishii et al., 2001. Продукты реакции разделялись в 6—8 %-ном полиакриламидном денатурирующем геле в секвенаторе ALFwin Sequence Analyser (Amersham, Pharmacia Biotech).

Для оценки информативности праймерных комбинаций был использован коэффициент: H = (n/(n—1)) х (1— Zp¡2),

где рг- — частота i-го аллельного варианта, n — число образцов в анализируемой выборке [11].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Изучена изменчивость семи микросателлитных повторяющихся последовательностей хлоропластной ДНК у вида Hordeum vulgare. Полиморфизм был выявлен для межгенных районов trnL-trnF и psbl-trnS, 2 районов гена trnS (3’ область) (табл. 2 и 3). Среди исследуемых образцов формы Wollamo Sadado, Brock и Ранний 1 оказались полиморфными сразу по всем четырем локусам. Относительный размер амплифицированных фрагментов локусов 3' trnSl, 3' trnS2, межгенных районов trnL-trnF и psbl-trnS у данных форм составил 124, 112, 100 и 133 п.н. соответственно (обычные типы — 129, 113,

Таблица 2

Микросателлитные праймеры, использованные в работе

Праймер Локализация Амплифицируется на видах Тип повтора Tm, °С Размер у ячменя

HvcptrnS1 (Provan et al., 1999b) ЗЧгпБ район Ячмень, рожь (A)7CGC (T)!3 60 130

HvcptrnS2 (Provan et al., 1999b) 3' іїпБ район Ячмень, рожь (Т)ю 60 113

HvcprpoA (Provan et al., 1999b) З'гроА район Ячмень, рожь (T)8 (CTT)3 60 122

HvcptrnL/F (Provan et al., 1999b) 1гпЬ4тР межгенный район Ячмень, рожь (C)9 60 101

WCt2 (Ishii et al., 2001) межгенный район рвЬНтБ Ячмень, рожь, пшеница (T)16 55 134

Wct3 (Ishii et al., 2001) межгенный район рзЬСМтБ Ячмень, рожь, пшеница (A)14 55 148

atpB/rbcL (Provan et al., 2004) межгенный район аірВ-гЬсЬ Ячмень, рожь, пшеница (T)7 и (A)8 56 134

Таблица 3

Дифференциация сортообразцов ячменя по плазматипам

Образец Праймер Тип хлоропластной ДНК

HvcptrnLF

Гастинец и др. (обычный тип) 101 113 129 134 1

Brock, Ранний 1, Wollamo Sadado 100 112 124 133 2

Роланд, Оболонь 100 113 129 133 3

Примечание: редкие варианты выделены шрифтом.

101 и 134 п.н) (табл. 3). Отличия в локусе trnL-trnF были подтверждены секвенированием — мутация затрагивала ядро повтора С9 ^С5.

Редкие варианты trnL-trnF и psbl-trnS районов хпДНК были найдены у сортов Роланд (Швеция) и Оболонь (Украина). Размеры амплифицированных локусов составили для trnL-trnF (праймер hvcptrnL/F) и psbl-trnS (праймер WCt2) 100 и 133 п.н. соответственно (обычный тип — 101 и 134 п.н.).

Наиболее информативными оказались микросател-литные праймеры hvcptrnL/F и WCt2, индекс полиморфизма для них составил 0,14, а также праймеры hvcptrnS1 и hvcptrnS2, индекс полиморфизма — 0,08. Применение праймерных комбинаций hvcprpoA, WCt3 и atpB/rbcL в случае Hordeum vulgare L. неэффективно, поскольку данный район, по крайней мере у исследуемых форм, оказался мономорфен (табл. 4).

Пластом Gramineae отличается высокой степенью консервативности, однако известно несколько районов хлоропластного генома, где мутации происходят наиболее часто — т. н. горячие точки мутаций (hotspot region). Накопление мутаций в этих районах в ходе процессов дивергенции и видообразования происходит особенно активно. Относительное сравнение секвенированных последовательностей этих районов у растений разных видов (пшеница, рис, кукуруза) [14] обнаруживает большое количество инсерций и/ или делеций в районе примерно 16kb от начала большого одокопийного района. Этот район содержит гены транспортных РНК от trnS (tRNA — Ser^ trn C (tRNA — Cys).

Среди анализируемых нами локусов полиморфизм был обнаружен с использованием праймеров hvcptrnS1 и hvcptrnS2, фланкирующих микросателлитные после-

Таблица 4

Характеристика микросателлитных праймеров

Праймер Информативность, H Число детектируемых аллельных вариантов

HvcptrnS1 0,08 2

HvcptrnS2 0,08 2

HvcptrnL/F 0,14 2

WCt2 0,14 2

HvcprpoA - 1

WCt3 - 1

atpB/rbcL - 1

довательности 3' trnS (расположенные в вышеописанном регионе). Межгенная область psbl-trnS, примыкающая к указанному району, тоже оказалась высокополиморфной (см. табл. 3 и 4).

Межгенная область trnL-trnF не расположена в известных hot-spot областях, однако, согласно данным, полученным в последние годы [4, 5, 10], она обладает значительной изменчивостью. Вследствие выявленной вариабельности, trnL-trnF район является хорошим маркером для анализа наследования хлоропластных геномов и популяционных генетических исследований у многих видов растений. В нашей работе изучение trnL-trnF области также позволило выявить полиморфизм и выделить редкие формы. (см. табл. 3 и 4) Это свидетельствует об изменчивости данного локуса и, возможно, его также следует включить в перечень «горячих точек» хлоропластного генома.

Проведенный нами анализ районов межгенных областей trnL-trnF и psbl-trnS позволил выделить из изученной коллекции 5 редких образцов ячменя. Отмечено, что все формы, имеющие редкий аллель trnL-trnF (100 п.н.), несут также и редкий тип psbl-trnS локуса (133 п.н.). У трех из пяти образцов изменениям в данных районах сопутствуют и изменения в районе 3' trnS гена (праймеры hvcptrnS1, hvcptrnS2).

Результаты нашего исследования указывают на крайне низкий уровень полиморфизма хлоропластно-го генома культурного ячменя. Из 67 образцов, исследованных по семи микросателлитным локусам, выделены только три гаплотипа, два редких типа представлены пятью образцами (см. табл 3). Распределение редких гаплотипов не связано с какой-либо географической локализацией, гаплотип 2 найден в сортах из России, Канады и Эфиопии, гаплотип 3 — Украины, Швеции. Аналогичные данные получены другими исследователями. Так, Provan et al.,1999 [17], исследуя микросателлитные повторяющиеся последовательности хлоропластной ДНК, обнаружили 25 гаплотипов среди 31 вида рода Hordeum. Причем 11 гаплотипов

было выявлено внутри подвида H. vulgare ssp. spontaneum при исследовании 51 популяции. Однако 101 европейский сорт, представляющий подвид H. vulgare ssp. vulgare, принадлежал к одному общему гаплотипу, обнаруженному также среди линий из диких популяций (landraces) культурного ячменя

H. vulgare ssp. vulgare, что указывает на крайне низкий уровень генетического разнообразия культурного ячменя. Снижение уровня полиморфизма органельных геномов отмечается как для двудольных — картофель, томаты, соя, тыквенные [3, 6, 12, 16], так и для немногих видов однодольных растений [9].

Изменения в структуре ДНК органелл, сопровождающие процессы доместикации, практически не исследованы. По-вцдимому, изучение полиморфных микро-сателлитных последовательностей хлоропластной ДНК поможет в решении данной проблемы.

Снижение цитоплазматического генетического разнообразия в процессе окультуривания и дальнейшей строгой селекции агрономически важных признаков предполагает введение в культуру новых или редких плазматипов. Их поиск можно проводить с использованием хлоропластных микросателлитных маркеров. Обнаруженные нами редкие плазматипы представляют интерес для селекции, так как не исключено, что уникальные по хпДНК формы будут также уникальными и по ядерным генам или будут способны давать практически важные эффекты взаимодействия хлоропластных и ядерных генов.

Авторы выражают благодарность Н.Г. Даниленко за плодотворное обсуждение и ценные замечания, а также Г. Пендинен и В. Чернову (ВИР) за предоставленную информацию о сортообразцах ячменя.

Работа поддержана Государственной научной программой «Генетическая инженерия», а также Белорусским республиканским ФФИ (грант Б04М -166).

Литература

I. Давыденко О.Г Роль цитоплазматической изменчивости в эволюции и селекции растений. // Цитология и генетика. — 1989. — Т. 24. — С. 66-76.

2. Даниленко Н.Г., Давыденко О.Г Миры геномов органелл. — Минск: Технология, 2003. — 494 с.

3. Рыжова Н.Н., Кочиева Е.З. Анализ микросателлитных локусов хлоропластного генома перца (род Capsicum).// Генетика. — 2004. — T. 40, № 8. — C. 1093-1098.

4. Aoki K., Suzuki T., Murakami N. Intraspecific sequence variation of chloroplast DNA among the component species of evergreen broad-leaved forests in Japan. // J. Plant Res. — 2003. — Vol. 116. — P. 337-344.

5. Chen J., Tauer C.G., Huang Y. Paternal chloroplast inheritance patterns in pine hybrids detected with trnL-trnF intergenic region polymorphism. // Theoretical and Applied Genetics. — 2002. — Vol. 104. — P. 1307-1311.

6. Dane F., Lang P., Bakhtiyarova R. Comparative analysis of chloroplast DNA variability in wild and cultivated Citrullus speciaes. // Theoretical and Applied Genetics. — 2003. — Vol. 108. — P. 958-966.

7. Edwards K., Johnstone C., Thompson C. A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis. // Nucleic Acids Res. — 1991. — Vol. 19. — P. 1349.

8. Goloenko I.M., Teljatnicova A.A., Lukhanina N.V, Davydenko O.G. Some nuclei-cytoplasmic combinations of barley substituted lines collection change the productivity characteristics. // In Genetic Collection, Isogenic and Alloplasmic Lines: Proc. Intern. Conf. Jul 30-Aug 3, 2001. — Novosibirsk, 2001 — P. 70-74.

9. Ishii T., Mori N., Ogihara Y. Evaluation of allelic diversity at chloroplast microsatellite loci among common wheat and its ancestral species.// Theoretical and Applied Genetics. — 2001. — Vol. 103. — P. 896-904.

10. Molina-Cano J.-L., Russell J.R., Moralejo M.A. et al. Cloroplast DNA microsatellite analysis supports a polyphyletic origin for barley. // Theoretical and Applied Genetics. — 2005. — Vol. 110. — P. 613-619.

11. Nei M. Definition and estimation of fixation indices. // Evolution — 1986. — Vol. 40. — P 643-645.

12. Nesbitt T.C., Tanksley S.D. Comparative sequencing in the genus Lycopersicon: Implications for the evolution of fruit size in the domestication of cultivated tomatoes. // Genetics. — 2002. — Vol. 162. — P. 365-379.

13. Nevo E., Beharav A., Meyer R.C. et al. Genomic microsatellite adaptive divergence of wild barley by microclimatic stress in Evolution Canyon, Israel. // Biological Journal of the Linnean Society. — 2005. — Vol. 84. — P. 205-224.

14. Ogihara Y., Isono K., Kojima T. et al. Structural features of a wheat plastome as reveald by complete sequencing of chloroplast DNA. // Mol. Genet. Genomics. — 2002. — Vol. 266. — P. 740-746.

15. Provan J., Pamela M. Biss, Darragh Mc Meel et al. Universal primers for the amplification of chloroplast microsatellites in grasses (Poaceae). // Molecular Ecology Notes. — 2004. — Vol.4. — P. 262-264.

16. Provan J., Powell W., Dewar H. et al. An extreme cytoplasmic bottleneck in the modern European cultivated potato (Solanum tuberosum) is not reflected in decreased levels of nuclear diversity. // Genetics. — 1999a. — Vol. 266. — P. 633-639.

17. Provan J., Russell J.R., Booth A., Powell W Polymorphic chloroplast simple sequence repeat primers for systematic and population studies in the genus Hordeum.// Molecular Ecology. — 1999b. — Vol. 8. — P. 505-511.

18. Russell J.R., Booth A., Fuller J.D. et al. Patterns of polymorphism detected in the chloroplast and nuclear genomes of barley landraces sampled from Syria and Iordan. // Theoretical and Applied Genetics. — 2003. — Vol. 107, N 3. — P. 413-421.

19. Tsunewaki K. Genetic diversity of the cytoplasm in Triticum and Aegilops. — Tokyo: Japan. Soc. Prom. Sci., 1980. — 190 p.

Chloroplast microsatellites in barley: the reduction of variability spectrum in cultivated forms

Lukhanina N.V., Siniauskaya M.G., Goloenko I.M., Davydenko O.G.

Institute of genetics and cytology NAS Belarus, Minsk, Belarus

^ SUMMARY: The chloroplast genomes of 67 accessions of Hordeum vulgare L were surveyed for simple sequence repeat polymorphism. Seven SSR loci were investigated, trnL/trnF and psbI-trnS intergenic regions, as well as two regions 3’ trnS genes were polymorphic. The rare variants of these loci were revealed and five rare accessions were found. Our results show an extremely low level of cpDNA polymorphism of cultivated barley.

^ KEY WORDS: chloroplast DNA; microsatellites; Hordeum vulgare L.; polymorphism; variety; domestication