СПОСОБ НАНОСКОПИИ
METHOD OF NANOSCOPY

Область техники, к которой относится изобретение
Предлагаемое изобретение относится к способам оптической микроскопии, т.е. аппаратным методам исследования объектов, невидимых невооруженным глазом, выполняемых на основе исследования световых волн, взаимодействующих с микрообъектами. Взаимодействие световых волн с микрообъектами может происходить в различных вариантах (поглощение, отражение, интерференция, рассевание, эмиссия, поляризация, дифракция), которые в современной микроскопии по отдельности или в различных сочетаниях могут использоваться для получения изображения микрообъекта, имеющего размеры существенно меньшие, чем половина длины волны света, используемого для получения изображения. Способ предназначен для применения в производстве (технологический контроль), научно-исследовательской работе (биология, физика, химия, фармакология, материаловедение и др.), нанотехнологиях, медицине (диагностика заболеваний), образовании.
Предшествующий уровень техники
Инструменты для исследования микроскопических объектов необходимы для современных технологий, используемых в промышленности, биологии, медицине. Световая микроскопия относится к числу наиболее распространенных методов исследования микрообъектов. Однако разрешающая способность традиционных вариантов световой микроскопии ограничена волновыми свойствами света и не может превышать дифракционный предел Аббе, который составляет примерно половину от длины волны света, используемого в освещении объекта (Панов В.А., Андреев Л.Н. Оптика микроскопов. Расчет и проектирование. Л.: Машиностроение, 1976. - 432 с.). Это существенно ограничивает области применения традиционных методов световой микроскопии в областях науки и техники, где требуется исследовать объекты, имеющие значительно меньшие размеры, - наноразмерные объекты. Для исследования таких объектов применяются методы сканирующей электронной микросокпии (СЭМ), трансмиссивной электронной микроскопии (ТЭМ), зондовая микроскопия (Echlin P. Handbook of Sample preparation for Scanning Electron Microscopy and X-Ray Microanalysis. Springer Science+Business Media, LLC 2009. - P.330; сайт «NT-MTD», URL-адрес http://www.ntmdt.ru/spm-principles; http://ru.wikipedia.org). Методы электронной и зондовой микроскопии, которые позволяют достичь нанометрового и субнанометрового разрешения, требуют сложной, длительной и дорогостоящей пробоподготовки и осуществляются на очень сложных и дорогостоящих микроскопах; для выполнения таких методик требуется специальный персонал, что, безусловно, ограничивает применение электронно-микроскопических и зондово-микроскопических методов.
За последние десятилетия появились новые системы, основанные на световой микроскопии, которые позволяют достичь разрешения существенно меньшего, чем предел Аббе. Такая микроскопия получила название сверхразрешающей микроскопии (сайт http://en.wikipedia.org/wiki/Super_resolution_microscopy). Наиболее известны и применяемы несколько методов сверхразрешающей оптической микроскопии. Это методы, получившие названия SMI-микроскопия, локализационная микроскопия, STORM-микроскопия
SMI-микроскопия или пространственно-модулированная иллюминация (акроним SMI от англ. Spatially Modulated Illumination) основана на так называемом «инженеринге функции рассеяния точки» (Reymann J., Baddeley D., Lemmer P., Stadter W., Jegou Т., Rippe K., Cremer C., Birk U. High precision structural analysis of subnuclear complexes in fixed and live cells via Spatially Modulated Illumination (SMI) microscopy. Chromosome Research. 2008. - 16, p.367-382). Специальная система изменяет заданным образом функцию рассеяния точки. Например, для этого используется два лазерных луча, интерферирующих вдоль одной оптической оси. Изучаемую флуоресцирующую точку объекта при помощи специального устройства позиционирования перемещают вдоль указанной оптической оси посредством высокоточных наноразмерных шагов таким образом, чтобы она попадала в участки с различными фазовыми сдвигами. Одновременно регистрируется изменения картины рассеяния изучаемой точки объекта. Таким образом, объект сканируется по отдельным точкам. Полученные результаты обрабатываются с использованием сложного математического аппарата (например, применяют вейвлет-анализ), результатом является виртуально восстановленное изображение с высоким разрешением (до 10 нм). SMI-микроскопия предполагает использование прецизионных оптических и механических технологий, а следовательно, дорогостоящего оборудования и высококвалифицированного персонала.
В основе метода локализационной микроскопии лежит возможность определения положения объекта (локализации) по его изображению с субдифракционной точностью (сайт НИИ нанобиотехнологий, URL-адрес http://www.nanobio.spbstu.ru/napravlenia-issledovanij/lokalizacionnaa-mikroskopia). Этот метод также подразумевает использование флуорохромов для окраски изучаемых точек объекта (Hess S.Т., Girirajan Т.Р., Mason М.D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys J.2006. - 91, p.4258-4272). Суть метода заключается в создании условий, при которых молекулы красителя в образце флуоресцируют не одновременно, а по очереди. В таком случае их изображения в различных кадрах не перекрываются, что позволяет локализовать каждую молекулу с высокой точностью, ограниченной только соотношением «сигнал-шум» и количеством зарегистрированных фотонов. Таким образом, накопив достаточное количество кадров и определив координаты всех молекул в них, реконструируется карта распределения молекул флуорофора в образце (его изображение), которая будет иметь существенно лучшее разрешение по сравнению с обычным изображением образца.
Одним из вариантов локализационной микроскопии является STED-микроскопия (акроним STED от англ. «Stimulated Emission Depletion microscopy») или «микроскопия снижения стимулированной эмиссии» (Hell S.W. and Wichmann J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. OPTICS LETTERS. - 1994. - Vol.19, No. 11. - P.780-782). Этот тип микроскопии подразумевает использование флуоресцентной микроскопии при условии, что исследуемые точки объекта, обработанные флуорохромом, обеспечивают эмиссию света определенной частоты (при освещении от внешнего источника). Этот тип микроскопии одновременно использует два типа лазерных импульсов. Первый переводит флуорохром в обычное возбужденное состояние, обеспечивая его свечение (так получается изображение точки, которая имеет диаметр не меньше, чем диаметр диска Эйри). Второй тип импульса (STED-импульс) модифицирован таким образом, что в центре имеет пятно нулевой интенсивности (которое совпадает с зоной возбуждения, вызванного первым импульсом), а по краям после достаточно длительного воздействия вызывает «выключение» флуорохромов и гашение их свечения. После такой обработки определяют интенсивность свечения отдельной точки, соответствующей центру исследуемого пятна, который имеет диаметр значительно меньше, чем диск Эйри. Разрешение метода определяется законом
<mrow><mi>d</mi><mo>=</mo><mfrac><mi>λ</mi><mrow><mn>2</mn><mi>n</mi><mi>sin</mi><mi>α</mi><msup><mrow><mrow><mo>(</mo><mrow><mn>1</mn><mo>+</mo><mi>a</mi><msub><mi>I</mi><mrow><mi>max</mi></mrow></msub><mo>/</mo><msub><mi>I</mi><mi>s</mi></msub></mrow><mo>)</mo></mrow></mrow><mrow><mn>1</mn><mo>/</mo><mn>2</mn></mrow></msup></mrow></mfrac></mrow>
,
s
1
0
max
где I - мощность излучения, необходимая для обеспечения преимущественного перехода S→S; I - мощность излучения тушения
Таким образом, объект сканируют по отдельным точкам и при помощи сложного математического аппарата виртуально восстанавливают изображение. STED-микроскопия предполагает использование прецизионных оптических и механических технологий, а следовательно, дорогостоящего оборудования и высококвалифицированного персонала.
В качестве одного из вариантов локализационной микроскопии можно расценивать STORM-микроскопию (Rust J.M., Bates M., Zhuang X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 2006. - 3, p.793-795). STORM-микроскопия основана на стохастической оптической реконструкции изображения (акроним STORM происходит от англ. «stochastic optical reconstruction microscopy») при помощи объединения информации о точной локализации каждого флуорофора в образце. Этот тип микроскопии подразумевает использование последовательной активации (одновременно с определением локализации) фотопереключаемых флуорофоров, окрашивающих исследуемые точки препарата. Одновременно активируется некое множество флуорофоров с определенной длиной волны эмиссии так, что появляется возможность определить локализацию каждого флуорофора. Затем, «выключив» первое множество флуорофоров, производят активацию флуорофоров и оценку их локализации по другой длине волны эмиссии. Сложная математическая обработка полученных изображений позволяет восстановить исходное изображение объекта с разрешающей способностью 20 нм в горизонтальной плоскости и 50 нм по оси Z (по вертикали). Основной сложностью всех вариантов локализационной микроскопии является создание условий для разделения флуоресценции молекул во времени. Для этого существует несколько методик: 1) использование экзотических фотопереключаемых или фотоактивируемых красителей, переходами которых в активное состояние можно управлять при помощи света определенных длин волн; 2) создание условий для обратимого перехода стандартных флуоресцентных красителей в долгоживущее «темное» состояние и спонтанного возвращения оттуда («мигания» флуорофоров).
На основе вышеупомянутых научно-технических документов можно утверждать, что осуществление известных способов оптической сверхразрешающей микроскопии включает следующие варианты:
1) Восстановление изображения по данным, полученным на основании исследований функции рассеяния света точек объекта.
2) Восстановление изображения по данным, полученным при помощи «управляемой» флуоресценции точек объекта, окрашенных флуорофорами.
Главная положительная сторона описанных способов заключаются в возможности получения разрешающей способности значительно меньше предела Аббе; это позволяет изучать объекты, размеры которых измеряются десятками нанометров.
Но у указанных способов существуют и значительные недостатки. Главным принципиальным недостатком является невозможность изучения нефлуоресцирующих объектов. К другим недостаткам можно отнести: 1) сложность и дороговизну используемого оборудования; 2) необходимость применения дорогостоящих флуорохромных красителей; 3) необходимость дополнительного этапа окраски флуорохромами в ходе пробоподготовки препаратов для микроскопии, что удлиняет, осложняет и удорожает проведение процедуры микроскопии; 4) необходимость специально подготовленного высококвалифицированного персонала для выполнения микроскопии при помощи описанных способов.
Наиболее близким к предлагаемому решению и выбранным автором в качестве прототипа является вариант сверхразрешающей микроскопии, который получил название «Способ флуоресцентной наноскопии (варианты)» (патент Российской Федерации на изобретение №2305270, кл. G01N 21/00, G01N 21/64, опубл. 27.11.2006 г.). Этот тип микроскопии подразумевает использование флуоресцентной микроскопии при условии, что исследуемые точки объекта, обработанные флуорохромом или несколькими флуорохромами, обеспечивают эмиссию света (при освещении от внешнего источника). При освещении объекта с помощью УФ-вспышки часть нефлуоресцирующих молекул красителя превращается во флуоресцирующие. Это может происходить за счет того, что часть нефлуоресцирующих молекул красителя превращается во флуоресцирующие за счет отрыва от них блокирующих флуоресценцию химических групп. Свечение от точек, соответствующих светящимся молекулам флуорохрома, регистрируется в виде раздельных пятен на кадрах видеокамеры или двух видеокамер, информация от которых передается в компьютер. Флуоресцирующие молекулы обесцвечиваются в процессе или после регистрации. Кадры с остаточным флуоресцентным излучением передаются в компьютер. По разностным кадрам осуществляют поиск центров пятен, представляющих координаты молекул флуоресцирующего красителя. Процесс повторяется до вычисления координат молекул красителя в освещаемой части объекта. Осуществляют компьютерную реконструкцию изображения объекта или его среза. Объекты могут быть прокрашены флуоресцентными наночастицами одного или разных видов. Технический результат - получение двух- и трехмерного изображения с разрешением лучше 20 нм, возможность регистрации цветного изображения при прокраске различными красителями белков, нуклеиновых кислот, липидов и пр.
Несомненным достоинством способа, описанного в прототипе, является возможность получения разрешающей способности значительно меньше предела Аббе - порядка 20 нм. Это позволяет получать качественные изображения объектов, размеры которых измеряются десятками нанометров.
Однако известный способ имеет существенные недостатки.
Во-первых, в прототипе возможно исследование только объектов, содержащих специальные флуоресцирующие молекулы. Поэтому препараты для этого типа микроскопии требуют дорогостоящей пробоподготовки, которая заключается в окраске препарата специальными флуоресцирующими красителями - флуорохромами.
Во-вторых, объекты, однократно подвергнутые описанному в прототипе способу наноскопии, теряют свое качество из-за «выжигания» молекул флуорохромов, из-за чего их повторное исследование становится невозможным.
В-третьих, авторы способа-прототипа позиционируют свой вариант наноскопии в качестве способа, применяющегося только в медико-биологических науках для исследования «белков, нуклеиновых кислот, липидов и пр.». Это также сужает область применения способа, не позволяя использовать его для исследования неживых объектов в физике, химии, промышленных технологиях.
Все перечисленные недостатки не только количественно снижают эффективность способа, но и качественно ограничивают область его применения, не позволяя использовать его для исследования объектов, не содержащих специальные флуоресцирующие молекулы.
Сущность изобретения
Задачей предлагаемого изобретения является создание нового эффективного способа наноскопии, позволяющего исследовать окрашенные и неокрашенные препараты.
Технический результат от использования изобретения заключается в достижении сверхразрешающей способности - возможности исследовать объекты с разрешением от 1 нм и более; возможности исследования препаратов, не содержащих в своей структуре флуоресцирующих молекул, возможности повторного и многократного исследования изучаемых объектов.
Указанный технический результат достигается тем, что в способе наноскопии, включающем получение увеличенного изображения точек исследуемого объекта, регистрацию увеличенного изображения и оптических характеристик точек исследуемого объекта, сохранение и обработку информации об оптических характеристиках точек исследуемого объекта, восстановление изображения исследуемого объекта, на исследуемом объекте выбирают область сканирования, внутри которой формируют область со стандартными однородными оптическими свойствами, многократно сканируют точки выбранной области сканирования лазерным лучом, каждый раз перемещая начало сканирования на расстояние не более требуемой разрешающей способности, с одновременной регистрацией и сохранением информации об оптических характеристиках увеличенного изображения точек области сканирования и координатах точек области сканирования, восстанавливают изображение исследуемого объекта на основе использования информации об оптических характеристиках точек области со стандартными однородными оптическими свойствами и информации об оптических свойствах других точек области сканирования. Перемещение начала сканирования осуществляют на расстояние от 0,5 нм до 1000 нм.
Перечень фигур чертежей
0
0
0
0
0
Вышеуказанные и иные аспекты и преимущества настоящего изобретения раскрыты в нижеследующем подробном его описании, приводимом со ссылками на фигуры чертежей, на которых на Фиг.1 изображена схема сканирования объекта по оси Х с началом сканирования от линии, проходящей через Х; на Фиг.2 изображена схема сканирования объекта по оси Х с началом сканирования точки Х+∆; на Фиг.3 изображена схема сканирования объекта по оси Х с началом сканирования от линии, проходящей Х+2∆; на Фиг.4 изображена схема сканирования объекта по оси Y с началом сканирования от линии, проходящей через Y+∆; на Фиг.5 изображена схема сканирования объекта по оси Y с началом сканирования от линии, проходящей Y+2∆; на Фиг.6 приведено восстановленное изображение поверхности металлической пластины с зернистостью, имеющей диаметр «зерна» порядка 100 нм, полученное: А - при помощи известного способа лазерной сканирующей (конфокальной) микроскопии, Б - при помощи предлагаемого способа.
Подробное описание изобретения
Предлагаемый способ осуществляется следующим образом.
1. Исследуемый объект помещают на предметный столик микроскопа, оборудованный автоматически управляемым устройством позиционирования с управляемым шагом перемещения, который составляет от 0,5 нм до 1000 нм и более. Техническая возможность таких перемещений существует, примерами таких устройств являются нанопозиционирующие устройства с шагом менее 1 нм производства компании Piezosystem Jena GmbH (сайт: http://www.piezosystem.com, устройство nanoSXY 400) и PI Engineer (сайт: http://www.nanopositioning.net).
0
n
0
n
n-2
n-2
2. Затем на препарате выбирают область сканирования, ее координаты по осям «X» и «Y» фиксируют запоминающим устройством, сопряженным с устройством позиционирования препарата. Схема исследования препарата отражена на Фиг.1, Фиг.2, Фиг.3, Фиг.4, Фиг.5. Координаты области сканирования составляют по оси «X» от Х до X, по оси «Y» - от Y до Y (шкала деления соответствует 1 диску Эйри). Далее в определенной области сканирования формируют область со стандартными однородными оптическими свойствами. Для этого можно использовать непрозрачные для лазерного луча и полностью поглощающие лазерный луч «маски», которые накладывают на две взаимно перпендикулярные полосы с внутренними границами по линиям X и Y, ширина маски составляет не менее 2-х диаметров диска Эйри. На Фиг.1, Фиг.2, Фиг.3, Фиг.4, Фиг.5 область со стандартными однородными оптическими свойствами схематически изображена в виде области фигуры, окрашенной в серый цвет.
n
3. Производят микроскопию в отраженном свете. Луч лазерного света, сфокусированного системой линз до диаметра диска Эйри, наводят на точку с координатами Х=0 и Y=0. Препарат сканируют этим лучом, сфокусированным до диаметра диска Эйри, по отдельным точкам линий по оси Х до точек, расположенных на линии X; при этом расстояние между центрами этих точек равно диаметру диска Эйри. Таким образом сканируют все точки выбранной области сканирования, область сканирования и направления сканирования отражены на Фигурах горизонтальными линиями-стрелками.
4. Лучи, отраженные от каждой точки, проходят через объектив, увеличенное изображение каждой точки попадает на фоторегистрирующее устройство, которое регистрирует оптические характеристики изображения точек (яркость или/и спектральные характеристики, или/и характеристики поляризации и др.). Фоторегистрирующее устройство сопряжено с запоминающим устройством, которое обеспечивает сохранение информации об изображении каждой точки, полученной в результате сканирования.
0
0
0
n
5. Второе (Фиг.2) и последующие сканирования (Фиг.3) каждой линии области сканирования препарата по оси Х производится с перемещением по оси «X» на величину «∆» относительно предыдущего сканирования, величина «∆» должна быть равна разрешению d, которое планируется получить при реализации данного способа. Таким образом, второе сканирование начинается с точки «Х+∆», третье сканирование начинается с точки «Х+2∆», четвертое сканирование начинается с точки «Х+3∆» и так далее, процесс повторяется многократно каждый раз со сдвигом +∆ по оси «X» до тех пор, пока в качестве начальной точки сканирования не будет достигнута точка X. Подобным образом сканируются все линии выбранной области сканирования по оси X.
0
0
6. Затем производится аналогичная серия сканирований с перемещением на величину +∆ по оси Y, начиная с точки «Х+∆; Y+∆»; схема двух первых сканирований из этой серии отражена на Фиг.4 и Фиг.5.
7. Затем производят математическую обработку полученных результатов. При помощи специального алгоритма восстанавливается изображение с разрешающей способностью, равной величине ∆. Суть алгоритма в том, что он предполагает сравнение светосумм в каждой из линий сканирования, полученных до каждого перемещения и после каждого перемещения. После этого сравнения делается вывод об оптических характеристиках области, геометрически соответствующей каждому сдвигу ∆. Напомним, что каждый сдвиг ∆ может иметь размеры от 0,5 нм до 1000 нм и более. На основании полученной информации об оптических свойствах каждой области ∆ восстанавливают изображение обо всем исследуемом объекте. Разрешающая способность d определяется согласно следующей закономерности:
0
0
0
d=1,22λ/A-([1,22λ/A/∆]-1)1,22λ/A∆,
0
где d - разрешающая способность, λ - длина волны используемого лазерного света, A -апертура осевого пучка, ∆ - длина шага перемещения исследуемого объекта относительно светового луча или луча относительно объекта.
Пример.
Предлагаемый способ применяли для получения изображения поверхности нативной (неокрашенной) металлической пластины, на поверхности которой присутствовала зернистость с диаметром «зерна» примерно 100 нм. На Фиг.6 показаны изображения, полученные методом традиционной лазерно-сканирующей (конфокальной) микроскопии (А) и реконструирования при помощи предлагаемого способа (Б). С использованием указанных методов было произведено сканирование по оси X. Исследование объекта при помощи метода, рассматриваемого авторами в качестве прототипа - наноскопии, - было принципиально невозможным, так как объект не поддавался окраске флуорохромными красителями. Результат реконструкции изображения показал, что при помощи лазерно-сканирующей (конфокальной) микроскопии невозможно выявить поверхностную структуру объекта, тогда как предлагаемый способ демонстрирует исчерченность, соответствующую естественной поверхности исследуемого объекта.
Приведенный пример доказывает, что предлагаемый способ может успешно использоваться в практике.
Пример показывает только один из возможных вариантов осуществления способа. Способ может осуществляться не только за счет отражения лазерного луча, освещающего объект под углом 90º, но и в проходящем свете, и при освещении объекта под углами в диапазоне от 0 до 360º. Способ может быть использован при изучении неокрашенных объектов и объектов, окрашенных флуоресцирующими и нефлуоресцирующими красителями. Способ позволяет проводить исследование объектов не только по осям Х и Y, но и Z, а также исследовать изменения геометрических размеров исследуемого объекта во времени (Т).
Достоинствами и преимуществами предлагаемого способа являются:
1) Достижение сверхразрешающей способности - возможность исследовать объекты с разрешением от 1 нм и более.
2) Возможность исследования препаратов, не содержащих в своей структуре флуоресцирующих молекул, что существенно расширяет область использования предлагаемого способа по сравнению с прототипом и другими известными способами сверхразрешающей микроскопии.
3) Возможность повторного и многократного исследования изучаемых объектов.
4) Упрощение и удешевление пробоподготовки объектов для исследования при помощи предлагаемого способа за счет возможности не использовать флуорохромные красители.