Состояние секреторной функции нейтрофилов в условиях механической травмы

Медицинская Иммунология 2002, Т. 4, № 1, стр 93-97 О 2002, СПб РО РААКИ

Краткие сообщения

СОСТОЯНИЕ СЕКРЕТОРНОЙ ФУНКЦИИ НЕЙТРОФИЛОВ В УСЛОВИЯХ МЕХАНИЧЕСКОЙ ТРАВМЫ

Третьякова И.Е.

Кафедра микробиологии Челябинской государственной медицинской академии

Резюме. Работа посвящена экспериментальному исследованию секреторной функции нейтрофилов в условиях механической травмы. Установлено, что при множественной механической травме у мышей отмечается снижение иммунологической реактивности, а также нарушается секреторная функция нейтрофилов, что проявляется в уменьшении уровня секреции медиаторов с иммуностимулирующими свойствами.

Ключевые слова: нейтрофилокины, секреторная функция нейтрофилов, механическая травма, посттравматический иммунодефицит.

Tretyakova I.E.

SECRETORY FUNCTION OF NEUTROPHILS IN MECHANICAL TRAUMA

Abstract. The article is devoted to experimental research of secretory function of neutrophils in mechanical trauma. It has been revealed, that in mechanical multitrauma in mice the secretory function of neutrophils was suppressed. It led to lower levels of secretion of mediators with immunostimulating properties.

Введение

Состояние нейтрофилов при развитии травматического процесса изучено достаточно полно. При этом основное внимание иммунологов сосредоточено на исследовании фагоцитарной функции этих клеток [3, 6]. Практически неизученным является влияние травмы на секреторную функцию нейтрофилов (СФН). Вместе с тем, нейтро-филы секретируют широкий спектр биологически активных веществ, часть из которых обладает выраженной иммунотропной активностью [1, 4,

7, 9, 12]. Учитывая это можно предположить, что изменение СФН при травме оказывает определенное влияние на состояние иммунной системы и, следовательно, на течение самого травматического процесса.

В связи с этим нами была поставлена задача - изучить состояние СФН у животных с экспериментальной механической травмой.

Адрес для переписки:

Третьякова Ирина Евгеньевна, Челябинская государственная медицинская академия, кафедра микробиологии.

454092, г. Челябинск, ул. Воровского, 64.

Тел.: (3512) 34-04-14, факс (3512) 34-02-36 E-mail:postmaster @ vita. chel. su; www.vita.chel.su

Материалы и методы

В опытах использовали половозрелых мышей-гибридов Р^СВА х С ВЬ), которые были получены из питомника Рапполово.

Секреторную функцию нейтрофилов интактных и травмированных мышей оценивали с помощью метода, разработанного И. И. Долгушиным и др. [5]. Популяции мышиных нейтрофилов получали с помощью внут-рибрюшинного введения животным 4 мл 1,2 % раствора казеина в среде 199. Через 8 часов путем трехкратного промывания брюшной полости охлажденной до 0°С средой 199 получали клетки перитонеального экссудата. Процентное содержание нейтрофилов среди клеток перитонеального экссудата, выделенных таким способом, составляло 94 -96%. Выделенные и трижды отмытые в среде 199 нейтрофилы разводили средой 199 до концентрации 5 х 106 клеток/мл. Суспензию клеток подвергали одночасовой инкубации при температуре 37°С в присутствии микросфер монодисперсного полисти-рольного латекса диаметром 1,7 мкм из расчета 50 частиц на один нейтрофил. После инкубации забирали часть взвеси для определения жизнеспособности клеток (процент жизнеспособных клеток составлял не менее 97%). Затем с помощью центрифугирования при 3000 об/ мин в течение 10 минут и последующей фильтрации через мембранные фильтры с диаметром пор 0,24 мкм (“МПНрог”, США) клетки и частицы латекса уда-

ляли из надосадка. Полученные супернатанты активированных нейтрофилов (САН) расфасовывали по 3 мл в стерильные стеклянные флаконы и хранили при температуре - 40°С. Для получения продуктов активированных нейтрофилов травмированных животных у мышей воспроизводили механическую травму с помощью закрытого перелома обеих бедренных костей. Выбор множественной механической травмы обусловлен тем, что в предварительных опытах нами было установлено отсутствие иммуносупрессии при изолированной травме, в то время как множественная травма достоверно угнетала иммунные процессы в организме мышей.

Тестирование секреторной функции нейтрофилов проводили in vivo путем внутривенного трехкратного с интервалом 24 часа введения в организм интактных животных строго определенного количества супернатантов активированных нейтрофилов (50 мкл/ мышь) интактных и травмированных мышей с последующим изучением способности животных к иммунному ответу с использованием метода локального гемолиза в геле [10] и функций резидентных перитонеальных макрофагов (фагоцитарной [8] и НСТ - восстанавливающей [11] активностей этих клеток). Доза и кратность введения супернатантов активированных нейтрофилов были раз-

Г" Введение САН травмированных,"]

^ интактных мышей и среды 199 J

работаны ранее сотрудниками нашей лаборатории [2]. В качестве контроля использовали 2 группы мышей. Животным первой группы внутривенно трижды вводили среду 199. Во второй группе мыши получали внутривенные инъекции САН интактных животных. Для того, чтобы лучше оценить СФН травмированных мышей, мы сравнивали ее со способностью нейтрофилов интактных животных секретировать иммуностимулирующие вещества. Для оценки влияния секреторных продуктов нейтрофилов интактных и травмированных мышей на иммунный ответ интактных реципиентов на 3 сутки после первого введения супернатантов нейтрофилов и среды 199 животных внутрибрюшинно иммунизировали эритроцитами барана (ЭБ) в концентрации

2 х 108 / мышь с последующим определением количества антителообразующих клеток к эритроцитам барана (АОК - ЭБ) в селезенках мышей (рис. 1). Для определения функциональной активности мышиных перитонеальных макрофагов на 3 сутки после первого введения нейтрофилокинов интактных и травмированных животных, а также среды 199 производили забор резидентных перитонеальных макрофагов путем промывания брюшной полости охлажденной до 0° С средой 199 с гепарином в концентрации 10 ЕД/ мл (рис. 1).

а)

' г

—I—

-и

—I-------

9 10 сутки

i---------------------------1

Иммунизация ЭБ i___________________________i

Г" Введение САН травмированных,"! интактных мышей и среды 199 J

Определение АОК-ЭБ

б)

' г

3

11

-1-----------(*

9 10

сутки

I----------------------------1

Оценка функций Мф I____________________________I

Рис.1. Схемы тестирования секреторной функции нейтрофилов травмированных и интактных мышей в организме интактных реципиентов: а) по иммунному ответу; б) по функциям перитонеальных макрофагов.

интактных реципиентов, тогда как САН интактных мышей стимулируют иммунореактивность интактных животных (табл. 1).

Аналогичные исследования были проведены по изучению влияния секреторных продуктов нейтрофилов интактных и травмированных мышей на функциональную активность клеток системы мо-нонуклеарных фагоцитов (СМФ) интактных реципиентов. Полученные результаты свидетельствовали о том, что характер влияния нейтрофи-локинов травмированных животных на функции клеток СМФ примерно совпадал с изменениями иммунного ответа, которые возникали от действия супернатантов гранулоцитов мышей после травмы. Продукты секреции, выделенные из нейтрофилов мышей на 3, 7, 14 сутки после травмы, угнетали показатели спонтанного НСТ - теста, активности и интенсивности фагоцитоза. Исключение составляли значения индуцированной частицами латекса реакции восстановления НСТ в диформазан, которые примерно сохранялись на одном уровне с нормой под влиянием САН, полученных на 3 сутки после травмы. Нейтрофилокины, выделенные на 7 и 14 сутки после травмы, снижали показатели индуцированного НСТ - теста. САН интактных мышей стимулировали функциональную актив-

Табл. 1. ВЛИЯНИЕ СЕКРЕТОРНЫХ ПРОДУКТОВ АКТИВИРОВАННЫХ НЕЙТРОФИЛОВ ИНТАКТНЫХ И ТРАВМИРОВАННЫХ МЫШЕЙ - ГИБРИДОВ ^ (СВА X С57ВЦ, ВЫДЕЛЕННЫХ НА 3, 7, 14 СУТКИ ПОСЛЕ ТРАВМЫ, НА ИММУННЫЙ ОТВЕТ ИНТАКТНЫХ РЕЦИПИЕНТОВ - ГИБРИДОВ Р, (СВА X СЯВЦ (НА 3 СУТКИ ПОСЛЕ ПЕРВОГО ВВЕДЕНИЯ САН

Вид воздействия Статистические показатели Количество ЯСК в селезенке х 108 Число АОК-ЭБ в селезенке

1. Контроль - 1 М±ш 1,67±0,097 37267±2064

(введение среды 199) п 6 6

2. Контроль - 2 М±т 1,8±0,091 49600±2514‘

(введение САН интактных % к контролю 1 108,0 133,0

мышей) п 7 7

3. Введение САН М±т 1,31 ±0,096*'* 30960±4154**

травмированных мышей % к контролям 1 и 2 78,0 и 73,0 83,0 и 62,0

(получены на 3 сутки после травмы) п 5 5

4. Введение САН М±т 1,67±0,202 28000+2681***

травмированных мышей % к контролям 1 и 2 100,0 и 93,0 75,0 и 56,0

(получены на 7 сутки после травмы) п 6 6

5. Введение САН М±т 2,17+0,115* 14720±2154* **

травмированных мышей % к контролям 1 и 2 130,0 и 120,0 39,0 и 30,0

(получены на 14 сутки после травмы) п 5 5

Примечание: *, ** - показатели достоверности различий по отношению к 1 и 2 контролям

Результаты и обсуждение

В предварительных опытах нами было установлено, что при множественной механической травме имеет место нарушение иммунных процессов. В изменении иммунологической реактивности при травматической болезни у мышей четко прослеживалось

3 стадии: период ранней иммунодепрессии (3 сутки после травмы); период компенсации (7 сутки), в течение которого увеличивалась иммунореактивность; период нормализации функции иммунной системы (14 сутки).

Для изучения СФН животных с множественной механической травмой мы получали секреторные продукты гранулоцитов на 3, 7, 14 сутки после травмы. Выбор этих сроков получения ней-трофилокинов обусловлен сроками изменения иммунологической реактивности мышей после травмы. Иными словами, получение продуктов секреции нейтрофилов осуществляли в период ранней иммунодепрессии, в момент компенсации и в период нормализации функции иммунной системы.

Результаты исследования показали, что секреторные продукты активированных гранулоцитов травмированных животных, выделенные на 3, 7, 14 сутки после травмы, стойко снижают иммунный ответ

ность перитонеальных макрофагов интактных животных (табл. 2).

Таким образом, под влиянием секреторных продуктов активированных гранулоцитов, выделенных у мышей на 3, 7, 14 сутки после травмы, отмечалось стойкое угнетение функций иммунокомпетентных клеток у интактных животных. Это может быть связано со снижением способности нейтрофилов травмированных животных секретировать иммуностимулирующие факторы. Вместе с тем, нельзя исключить, что изменение иммунопотенцирующих свойств продуктов активированных гранулоцитов происходит не только за счет уменьшения в супернатантах иммуностимулирующих факторов, но и с повышением в них содержания медиаторов с иммуносупрес-сорным действием. При анализе иммунотропной активности супернатантов нейтрофилов снижение их иммуностимулирующих свойств условно обозначалось нами как нарушение (снижение) секреторной функции (активности) нейтрофилов.

При сравнении с СФН интактных животных отмечено, что СФН травмированных мышей отличается от таковой интактных животных. Следовательно, после множественной механической травмы происходит нарушение СФН у мышей. Травматическая болезнь приводит к стойкому угнетению секреторной функции гранулоцитов.

Сопоставляя изменения СФН травмированных мышей с иммунореактивностью животных после травмы, мы обнаружили следующую закономерность. После множественной механической травмы наступал период ранней иммунодепрессии. В это же время отмечалось снижение СФН травмированных мышей, которое держалось в течение двух недель, тогда как изменение иммунореактивности животных с травмой имело волнообразный характер. Вероятно, в развитии раннего посттравматического иммунодефицита не последнюю роль играет угнетение СФН.

Табл. 2. ВЛИЯНИЕ СЕКРЕТОРНЫХ ПРОДУКТОВ АКТИВИРОВАННЫХ НЕЙТРОФИЛОВ ИНТАКТНЫХ И ТРАВМИРОВАННЫХ МЫШЕЙ-ГИБРИДОВ Р,

Вид воздействия Статисти- ческие показатели НСТ-тест спонтанный НСТ-тест индуцированный Фагоцитоз

Активность Интенсивность Активность Интенсивность Активность Интенсивность

1 .Контроль - 1 М±т 65,8+6,15 0,7±0,069 76,4+4,6 0,77+0,046 53,0±6,9 321,2±51,15

(введение среды 199) п 5 5 5 5 5 5

2. Контроль - 2 М±т 83,2±2,7* 0,86±0,027 86,0±3,8 0,88±0,05 79,6±7,3* 460,0±87,7

(введение САН % к

интактных мышей) контролю 1 126,0 123,0 113,0 114,0 150,0 143,0

п 5 5 5 5 5 5

3. Введение САН М±т 53,6±4,2** 0,64±0,085 83,6±2,5 0,86±0,03 22,2±2,1*,** 27,6±1,5 *"

травмированных мышей % к конт-

(получены на 3 сутки ролям

после травмы) 1 и 2 81,0 и 64,0 91,0 и 74,0 109,0 и 97,0 112,0 и 98,0 42,0 и 28,0 8,5 и 6,0

п 5 5 5 5 5 5

4. Введение САН М±т 26,4+5,77*,** 0,27+0,058*,** 69,6+13,46 0,7±0,14 19,2±4,2*,** 27,2±7,3*‘‘

травмированных мышей % к конт-

(получены на 7 сутки ролям

после травмы) 1 и 2 40,0 и 32,0 38,0 и 31,0 91,0 и 81,0 91,0 и 79,0 36,0 и 24,0 9,0 и 6,0

п 5 5 5 5 5 5

5. Введение САН М±т 59,2+6,15** 0,68±0,12 48,4+8,85*,** 0,49±0,09*,** 16,0±3,46*,** 21,6±6,15*”

травмированных мышей % к конт-

(получены на 14 сутки ролям

после травмы) 1 и 2 90,0 и 71,0 97,0 и 79,0 63,0 и 56,0 64,0 и 56,0 30,0 и 20,0 7,0 и 5,0

п 5 5 5 5 5 5

Примечание: *, **- показатели достоверности различий по отношению к 1 и 2 контролям

Выводы

1. Секреторная функция нейтрофилов травмированных животных отличается от секреторной функции нейтрофилов интактных животных.

2. У мышей с множественной механической травмой нарушается секреторная функция нейтрофилов, что проявляется в снижении уровня секреции медиаторов с иммуностимулирующими свойствами.

3. Развитие раннего посттравматического иммунодефицита может быть связано с угнетением секреторной функции нейтрофилов.

Список литературы

1. Васильева Г.И., ИвановаИ.А.,ТюкавкинаС.Ю. Кооперативное взаимодействие моно- и полинукле-арных фагоцитов, опосредованное моно - и нейтро-филокинами // Иммунология. - 2000. - № 5. - С. 11

- 17.

2. Власов A.B. Секреторная функция нейтрофилов при гнойной инфекции: Дис... канд. мед. наук. -Челябинск, 1989. - 220 с.

3. Горизонтов П.Д., Белоусова О.И., Федотова М.И. Стресс и система крови - М.; Медицина, 1983.

- 240 с.

4. Долгушин И.И., Зурочка A.B., Чукичев A.B. Регуляторные пептиды нейтрофилов (нейтрофило-кины) // Иммунология. - 1995. - № 4. - С. 40 - 44.

5. Долгушин И.И., Зурочка A.B., Крашенинникова Е.А. Способ исследования секреторной функции

нейтрофилов //Лабораторное дело. - 1988. - № 7. -С. 7-9.

6. Земсков В.М. Фагоцитоз: физиологические и молекулярные аспекты // Успехи современной биологии. - 1984. - Т. 98, Вып. 2 - С. 219 - 234.

7. Маянский А.Н., Маянский Д.Н. Очерки о ней-трофиле и макрофаге. -2-е изд., перераб. и доп. Новосибирск: Наука, 1989. - 344 с.

8. Фрейдлин И.С., Немировский С.В., Рудакова Т.А. Некоторые морфологические и функциональные характеристики моноцитов периферической крови человека, культивируемых in vitro // Факторы естественного иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях. - Омск, 1976.-Вып. 4-С. 13- 14.

9. Burd G., Sheng Y., Giroud J. Effects of supernatants and lysates of polymorphonuclear leucocytes: macrophage stimulatory factors // Brit. J. Exp. Pathol. - 1984. - Vol. 65, № 2. - P. 243 - 250.

10. JerneN.K., Nordin A. A. Plague formation in agar single antibody - producing cells //Science. - 1963. -Vol. 140 - 405.

11. Park B.H., Fikrig S.M., Smithwich E.M. Infection and nitroblus -tetrazolium reduction by neutrophils: 3 diagnostic act//Lancet. - 1968.-Vol. 11.-P. 532-534.

12. Zurochka A.V., Dolqushin 1.1., Chukichev A.V., Marachev S.I., Majorov V.A. Neutrophilokines is a new family of the regulating cytokynes // International Journal of Immunorehabilitation. - 1994. - № 1. - P. 399 - 400.

поступила в редакцию 13.06.2001 принята к печати 05.07.2001