Композиция, ингибирующая рост и выживаемость опухолевых клеток
COMPOSITION INHIBITING TUMOR GROWTH AND SURVIVAL RATE

Изобретение относится к области молекулярной биологии, исследующей новые возможности для увеличения селективной гибели опухолевых клеток без повреждения нормальных.
Химиотерапия опухолей традиционно направлена на ингибирование пролиферации раковых клеток. Снижение пролиферативной активности сопровождается блокированием прогрессии по циклу и последующей гибелью опухолевой клетки. Уникальной метаболической особенностью опухолевых клеток является аэробный гликолиз, что приводит к повышенной зависимости их от глюкозы. Аналоги глюкозы глюкозамин D, и 2-дезокси-D-глюкоза (2-DG) являются ингибиторами гликолиза, а именно первой стадии гликолиза- ингибируя активность гексокиназы. В работах: Journal of Zhejiang University SCIENCE В 2006, 7, 608-614 [1]; Nature 1953, 171, 252-254 [2] показана токсичность D-глюкозамина для нескольких малигнантных клеточных линий и in vivo опухолей при концентрациях, имеющих малый эффект на нормальные клетки. Показана его антиоксидантная и антивоспалительная способность, что делает его привлекательным мультифунциональным терапевтическим агентом: Life Science, 2016, 152, 21-29 [3]. Известно, также, что 2-дезокси-D-глюкоза токсична для различных типов раковых клеток. Кроме того, она повышает эффективность лучевой терапии и химиотерапии. 2-дезокси-D-глюкоза широко используется в исследованиях в качестве метаболического ингибитора: Nat. Rev. Cancer 2014, 14 (4), 263-276 [4]. Показано, что на различных клеточных линиях раковых клеток способность 2-DG вызывать замедление пролиферации, остановку клеточного цикла, сопровождающуюся индукцией умеренного апоптоза, вплоть до полной остановки клеточного цикла и массивного апоптоза: Anticancer Research 2006, 26, 3561-3566 [5]. Показана селективная эффективность 2-дезокси-D-глюкозы в концентрациях от 20 до 80 мМ в отношении индукции апоптотической гибели опухолевых клеток и блокировании в G2/M фазах клеточного цикла, в том числе, в зависимости и от уровня глюкозы в питательной среде: Патологическая физиология и экспериментальная терапия: Патологическая физиология и экспериментальная терапия 2014, 58 (4), 78-85 [6]. Известно, что D-глюкозамин может как индуцировать, так и ингибировать апоптоз в зависимости от типа клеток и активности специфического биохимического пути.
Известно также применение производных глюкозамина в сочетании с др. веществами для повышения токсичности в отношении опухолевых клеток:
Известен патент RU 2138257, МПК А61К 31/375, А61К 31/19 "Фармацевтический состав для профилактики и лечения раковых заболеваний", где предложен D-глюкозамин в сочетании с другими веществами [7]. Композиция включает по меньшей мере три активных соединения: по меньшей мере одну аминокислоту, по меньшей мере один витамин и по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из аденина, 2-деокси-D-рибозы, D-маннозы, D-глюкозамина, яблочной кислоты, щавелево-уксусной кислоты, аденозинтрифосфата и/или их фармацевтически приемлемых солей, с учетом того, что если состав содержит, кроме аминокислоты, только яблочную кислоту и витамин, то витамин не может быть аскорбиновой кислотой. То есть, D-глюкозамин использовался как третий компонент и примерно в одном из 10 возможных составов. Использовалась концентрации, которые снижали клеточную пролиферацию именно при комбинированном воздействии.
В данной композиции селективностью в отношении опухолевых клеток обладает только D-глюкозамин, остальные составляющие могут менять метаболизм как нормальных, так и опухолевых клеток, что приводит к неопределенности ожидаемого результата.
Известен патент WO 2005025581, МПК А61К 31/375, А61К 31/19 "Use of n-acetyl-d-aminog lycosamine in preparation of drugs for the treatment of cacer and metastasis" [8], где предложено использовать производное D-глюкозамина -- N-ацетил-D-аминогликозамин для лечения рака и метастазов. Авторы предполагают, что N-ацетил-D-аминогликозамин может встраиваться в клеточную мембрану, включаться в процесс метаболизма раковых и останавливать передачу энергии в клетки, что приводит к их смерти. Авторы утверждают, что данный препарат показал весьма значительный эффект как в лабораторных экспериментах, так на животных моделях и в тестах на людях.
Недостаток аналога. Глюкозамин нестабилен, поэтому в терапии используются в основном его соли гидрохлорид или сульфат или N-ацетил.
N-ацетилглюкозамин не растворяется в воде, растворим в концентрированных органических и неорганических кислотах, что снижает эффективность и селективность воздействия на опухолевые клетки.
В качестве прототипа рассмотрен патент СА 26663398, МПК А61К 31/7028 "А caner sensitizer comprising glucosamine, glucosamine derivatives or salts thereof (приоритет от 2006-06-16) [9]. Композиция состоит из D-глюкозамина и его сульфатных солей, которые рассматриваются в качестве добавки для повышения чувствительности раковых клеток к противораковым агентам, не вызывая побочных эффектов. Вторым компонентом являются химиотерапевтические препараты: мехлорэтамин, хлорамбуцил, фенилаланин, горчица, циклофосфамид, ифосфамид, кармустин (BCNU), ломустин (CCNU), стрептозотоцин, бусульфан, тиоплатин, тиототеп, дактиномицин (актиномицин D), доксорубицин (адриамицин), даунорубицин, идарубицин, митоксантрон, пликамицин, митомицин, С-блеомицин, винкристин, винбластин, паклитаксел, доцетаксел, этопозид, тенипозекан, топототекан, топот.
Используемая концентрация D-глюкозамина либо его соли -10 мМ является нетоксичной по отношению к нормальным клеткам, т.е. селективна к опухолевым клеткам.
Недостатки прототипа в том, что второй компонент композиции - химиотерапевтические агенты, которые токсичны как для здоровых, так и для опухолевых клеток, т.е. не обладают селективностью по отношению к опухолевым клеткам. Кроме того, сульфатная форма глюкозамин недостаточно стабильна. Оценка жизнеспособности клеток оценивалась недостаточно корректно только с помощью МТТ, который основан на восстановлении формазана с помощью внутриклеточных NAD(Р)H-оксиредуктаз, т.е. по метаболическая активности (жизнеспособности). Несмотря на огромное число работ с использованием этого простого метода, выводы об ингибировании пролиферации, сделанные на основе анализов метаболической жизнеспособности, могут быть ошибочными, поскольку они могут не коррелировать с ингибированием роста и/или потерей клоногенной выживаемости, об этом сказано в работах: Sci Rep. 2018. v.8.n.1:1531 [10]; J Cell Mol Med. 2010 [11].
Технический эффект: создание стабильной композиции и обладающей более высокой селективностью по отношению к опухолевым клеткам.
Задача настоящего изобретения состоит в том, чтобы создать композицию, комбинированно воздействующей на опухолевые клетки путем повышения ингибирования пролиферации.
Технический эффект достигается тем, что в известной композиции, ингибирующей рост и выживаемость опухолевых клеток, включающей два компонента, одним из которых является производное глюкозамина в качестве ингибитора клеточного метаболизма, новым является то, что в качестве производного глюкозамина используют 2-амино-2дезокси-D-глюкозу, а вторым компонентом является второй ингибитор клеточного метаболизма 2-дезокси-D-глюкоза.
Концентрация заявленных компонентов 3-10 мМ для каждого компонента и соотношение их равно 1:1.
Заявленная совокупность признаков основана на экспериментальных данных, показывающих ингибирование пролиферации опухолевых клеток в различных фазах цикла: глюкозамин ингибирует прогрессию клеток из G1 в S-фазу, a 2-DG блокирует клетки в G2/M, что обеспечивает в данной композиции синергетический эффект от совместного действия компонентов композиции и приводит к апоптотической гибели опухолевых клеток.
Заявляемая совокупность признаков не известна из открытых источников информации.
Для пояснения сущности изобретения представлены следующие графические материалы.
На фиг. 1 представлены структурные формулы композиции: слева 2-амино-2-дезокси-D-глюкоза (D-глюкозамин), справа 2-дезокси-D-глюкоза (2-DG)
На фиг. 2 представлены результаты экспериментов по оценке влияния различных концентраций D-глюкозамина и 2-дезокси-D-глюкозой (2-DG) на жизнеспособность клеток двух линий, проведенная с помощью МТТ метода.
На фиг. 3 представлены результаты цитометрического анализа влияния 20 мМ D-глюкозамина на прогрессию по циклу и апоптотическую гибель HeLa G63 и ECV 304.
На фиг. 3(А) представлены результаты цитометрического анализа при обработке клеток HeLa G63 глюкозамином в концентрации 0.1 мМ и без обработки.
На фиг. 4 представлены данные по оценке изменения концентрации клеток в образцах после 48 часовой инкубации их D-глюкозамином при изначально одинаковой концентрации при рассеве их по флаконам (влияние на рост клеток).
На фиг. 5 в виде диаграмм отражающих уровень апоптотически гибнущих клеток (клеток с содержанием ДНК <2с) представлены результаты раздельной и комбинированной обработки клеток глюкозамином D и 2-дезокси-D-глюкозы в различных концентрациях с последующим культивированием их в среде с нормальным (полная среда: 4 гр/л) и низким содержанием глюкозы (голодная среда: 1 гр/л).
На фиг. 6 представлены результаты экспериментов по оценке влияние уровня глюкозы в питательной среде на прогрессию клеток по циклу в виде распределения клеток по содержанию ДНК (2с- G1, 3с -S, 4с- G2/M фазы клеточного цикла).
На фиг. 7 представлены результаты цитометрического анализа влияния ингибиторов гликолиза D-глюкозамина и 2-DG на распределение клеток линии ECV по содержанию ДНК при культивировании их в питательной среде с различным уровнем глюкозы. (<2с-апоптоз, 2с - G1, 3с -S, 4с- G2/M фазы клеточного цикла).
Примеры конкретной реализации способа.
Объекты исследования: клетки эпителиоидной карциномы шейки матки линия HeLa G 63, эндотелиальные клетки человека линия ECV 304. Эти линии клеток культивируются в среде Игла (фирма «Биолот») с дополнением 10% сыворотки крупного роготого скота (фирма «Биолот») и 100 ед./мл пенициллина-стрептомицина (Gibco BRL) при 37°С. Субкультивируют каждые три дня.
В качестве ингибитов пролиферации использованы, как представлено выше, 2-амино-2дезокси-D-глюкозу, а вторым компонентом является второй ингибитор гликолиза 2-дезокси-D-глюкоза. Оба компонента являются ингибиторами гексокиназы. В противоположность рассмотенным аналогам (где в качестве ингибитора гексокиназы используется только глюкозамин.)
Важно то, что в качестве соли глюкозамина предложен глюкозамин гидрохлорид, глюкозамин HCl нетоксичен, обладает высокой гидрофильностью и более стабилен, чем глюкозамина сульфат. Учитывая то, что глюкозамин гидрохлорид не требует стабилизации и применяется практически в чистом виде, ряд ученых считают, что в терапии лучше использовать глюкозамин гидрохлорид: Cartilage. 2016 Jan; 7(1):70-81 [12]
5
Далее проводен анализ цитотоксичности с помощью МТТ метода: Biotechnol Annu Rev 11 127-152 (2005) [13]. Колориметрический анализ при восстановлении желтой соли тетразолия до пурпурного формазана в митохондриях жизнеспособных клеток. Клетки высевают в концентрации 1×10 клеток/лунка в 24-луночных планшетах. После инкубирования в течение 24 часов в питательную среду либо глюкозамин D (Sigma), либо 2-дезокси-D-глюкозу, либо оба глюкозамин + 2-декозы-D-глюкозы(Sigma) в дозах от 3 - до 10 мм, в соотношении 1:1. Контроль без обработки. В день анализа через (24-48 часов) культурную среду в каждой лунке заменяют на свежую, содержащую МТТ (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий) (Sigma) при концентрации 0,5 мг на мл с последующим инкубированием в ней в течение дополнительных 4 часов. После удаления среды добавляют 500 мкл ДМСО в каждую лунку, и кристаллы формазана растворяют с использованием орбитального шейкера и анализируют на ридере «Thermoficher". Выживаемость клеток представлены как процент исследуемой группы по отношению к контролю. Эти эксперименты выполнены для трех образцов и повторялись, по меньшей мере, три раза. Для каждого эксперимента приводится среднее для трех независимых экспериментов и стандартные отклонения.
Обнаружено (фиг. 2), что обработка клеток глюкозамином и 2-дезокси-D-глюкозой приводит к дозо-зависимому снижению метаболической активности в исследуемых клеточных линиях. При этом, опухолевые клетки (HeLa G63) были примерно в 3 раза чувствительнее к глюкозамину, чем неопухолевых (ECV 304). Примерно равный эффект регистрировался при дозах глюкозамина для HeLa G63 - 3 мМ и для ECV 304 - 10 мМ. При обработке клеток 2-дезокси-D-глюкозой равный эффект регистрировался для HeLa G63 10 мМ, для ECV 304 - 20 мМ, т.е. клетки HeLa G 63 были вдвое, чувствительнее к действию 2-дезокси-D-глюкозы, чем клетки ECV 304. Полученные данные подтверждают наличие селективных цитотоксических дозозависимых эффектов у каждого из препаратов. С увеличением концентрации сильнее проявляются различия между клеточными линиями.
1
В отличие от прототипа исследование влияния данной композиции на рост и выживаемость клеток проводилось еще и с помощью цитометрического анализа состава клеточной популяции (фиг. 3). Для этого клетки инкубировали с препаратами в указанном концентрационном диапазоне, отмывали и инкубировали с флюоресцентным зондом этидиум бромидом. За 1 час до анализа на проточном цитометре клетки инкубировали в течение 10 минут в гипотоническом растворе этидиум бромида, который количественно связывается с ДНК клеток, поэтому распределение клеток по содержанию ДНК позволяет проследить за прогрессией клеток по циклу: 2с- G1-фаза; 3с- S-фаза; 4с- G2/М-фазы. Цитотоксичность композиции оценивалась по уровню клеток с содержанием ДНК меньше диплоидного (<2 с или sub-G1-популяцию), которые появляются в результате фрагментации ядра в процессе апоптотической гибели клеток: Flow Cytometry Data Analysis: Basic Concepts and Statistics [14] и параллельно проводили морфологический анализ популяции на клетках при микроскопировании препаратов. Обнаружено, что после 48 часовой обработки клеток обеих линий D-глюкозамином в концентрации 20 мМ (для некоторых клеточных линий концентрация 20 мМ D-глюкозамина считается токсичной) регистрируется увеличение доли клеток в G, что свидетельствует о нарушении прогрессии клеток по циклу. Снижение концентрации D-глюкозамина в 20 раз до 0.1 мМ (фиг. 3А) также приводит к аккумуляции клеток в фазе G1, но без видимого цитотоксического эффекта. Для опухолевых клеток регистрируется появление клеток содержанием клеток ДНК <2с (апоптотически гибнущих клеток). По сравнению с необработанным контролем (2%) уровень клеток с содержанием <2с увеличился почти в 8 раз (15%). Клетки линии ECV 304 только замедлили прогрессию по клеточному циклу, доля клеток в фазе G1 увеличилась с 46% в контроле до 60% после обработки D-глюкозамином в концентрации 20 мМ. Доля клеток с содержанием ДНК <2с не изменилась, что позволяет предположить отсутствие гибели клеток линии ECV 304. При морфологическом анализе клетки с фрагментированными ядрами (апоптотически гибнущие клетки) также не регистрировались.
Обнаружено, (фиг. 4) что после 48-часовой инкубации клеток с D-глюкозамином в концентрациях 3 мМ и 10 мМ резко снижается рост клеток HeLa до 55 и 40% от контроля. При этом концентрация клеток ECV после аналогичной обработки составляет 95-85% от контроля, что свидетельствует о селективной токсичности D-глюкозамина в отношении опухолевых клеток. Эти результаты коррелировали с результатами цитометрического и морфологического анализа состава клеточной популяции и не корреляции с данными, полученными с помощью МТТ метода.
Обнаружено (фиг. 5), что обработка клеток композицией глюкозамина D + 2-дезокси-D-глюкозы в различных концентрациях с последующим культивированием их в среде с нормальным (полная среда)(4 гр/л) и низким содержанием глюкозы (голодная среда - 1 гр/л) приводила к увеличению гибели опухолевых клеток по сравнению с раздельной обработкой каждым из агентов композиции. Так например, 5 мМ глюкозамина D+5 мМ 2-дезокси-D-глюкозы индуцировали большую гибель клеток, чем 10 мМ глюкозамина D или 10 мМ 2-дезокси-D-глюкозы, данные раздельно, при том что суммарная концентрация ингибиторов в среде была одинаковой (10 мМ). При культивировании клеток в среде с низким содержанием глюкозы (1 гр/л) эффективность комбинированной обработки возрастает. Так например, сочетанная обработка 5 мМ глюкозамина D+ 5 мМ 2-дезокси-D-глюкозы на полной среде и 3 мМ глюкозамина + 3 мМ 2-дезокси-D-глюкозы на голодной среде индуцировала примерно одинаковое количество апоптотически гибнущих клеток (20%), а 10 мМ глюкозамина + 10 мМ 2-дезокси-D-глюкозы на полной среде, как 5 мМ глюкозамина + 5 мМ 2-дезокси-D-глюкозы на голодной среде, т.е. уровень глюкозы в питательной среде менял цитотоксический эффект вдвое и даже больше. Таким образом, доказан синергетический эффект заявляемой композиции и его усиление при понижении уровня глюкозы в среде.
Обнаружено (фиг. 6), что обработка клеток HeLa G63 глюкозамином приводит к увеличению уровня клеток с содержанием ДНК 2с по сравнению с необработанным контролем, т.е. глюкозамин ингибирует прогрессию клеток из G1 в S-фазу дозозависимым образом, снижение уровня глюкозы в питательной среде несколько нивелирует дозовую зависимость. Обработка клеток 2-DG в тех же концентрациях и при том же режиме обработки приводит к увеличению уровня клеток с содержанием ДНК 4с (G2/M фазы), особенно наглядно это проявляется при инкубировании клеток в среде с низким содержанием глюкозы и при сочетанном воздействии композицией. Ингибирование прогрессии клеток в двух точках клеточного цикла при сочетанном воздействии приводит к увеличению цитотоксичности даже низких концентраций D-глюкозамина и 2-DG Используя эту композицию можно значительно уменьшить терапевтические дозы, повысить селективность действия препаратов и избежать возможных побочных эффектов.
Обнаружено (фиг. 7), что обработка клеток линии ECV 304 D-глюкозамин, 2-DG в концентрации 3 мМ не нарушала прогрессию по циклу, т.к. уровень клеток в содержанием 2с (G1- фаза) и 4с (G2/М-фазы) существенно не отличались от контроля. Уровень клеток с содержанием ДНК <2с (апоптотически гибнущие клетки) очень низкий (5-7%) и практически не отличается от контроля. При концентрации 10 мМ регистрируется незначительное увеличение доли 2с клеток после обработки глюкозамином и увеличение доли 4с после обработки 2-DG, при культивировании в питательной среде как с нормальным (4 гр/л), так и с низким(1 гр/л) содержанием глюкозы. Таким образом, мы доказываем селективность данной композиции в отношении только опухолевых клеток.
Таким образом, фиг. 2, фиг 2а, фиг. 4, фиг. 5 и фиг. 6, что заявленная композиция комбинированно воздействуют на опухолевые клетки путем повышения ингибирования пролиферации за счет блокирования клеток в G1/S-фазах, и в G2/M, фазах клеточного цикла, что приводит к апоптотической гибели опухолевых клеток.
Таким образом, предложена композиция, которая содержит два ингибитора гексокиназы, а именно 2-амино-2-дезокси-D-глюкозой (D-глюкозамином) и 2-дезокси-D-глюкозой (2-DG) (структурные формулы которых представлены на фиг. 1), комбинированно воздействующая на опухолевые клетки: глюкозамин D в исследованных концентрациях, ингибирует прогрессию клеток из G1 в S-фазу, a 2-DG блокирует клетки в G2/M. Нарушение контроля за прогрессией клеток по циклу сразу в двух точках клеточного цикла приводит к увеличению цитотоксичности даже низких концентрациях D-глюкозамина и 2-DG, что позволяет существенно снизить терапевтическую концентрацию препаратов до уровня, не оказывающего сколько-нибудь заметного негативного влияния на нормальные клетки.
Изобретение обеспечивает высокую противоопухолевую активность и селективность действия D-глюкозамином и 2-дезокси-D-глюкозой (2-DG) при одновременном существенном снижении возможного токсического влияния на нормальные клетки.
Заявляемый композиция может быть применена в биологических исследованиях и в доклиничеких испытаниях. D-глюкозамин является фармакопейным препаратом и широко применяется в медицине в качестве лекарственной субстанции для торможения развитие дегенеративных процессов в суставах, восстановления их функции и уменьшения суставных болей. Тот факт, что он является широко известным фармакопейным препаратом с достаточно долгой историей его применения в медицинской практике, существенно облегчает возможное использование его в том числе и для лечения раковых заболеваний, поскольку данный препарат не только не требует каких-либо доклинических исследований на предмет его токсичности, безопасности и возможных побочных эффектов, но также широко доступен в виде лекарственных форм в аптечной сети, а также пищевых добавок.
Список литературы
1. Zhang L, Liu W-S, Han B-Q, et. al. Antitumor activities of D-glucosamine and its derivatives. Journal of Zhejiang University SCIENCE В 2006, 7, 608-614;
2. J.H. Quastel, A. Cantero, Inhibition of tumour growth by D-glucosamine, Nature 1953, 171, 252-254;
3. Dalirfardouei R., Rfrimi G, Jamialahmadi K. Molecular mechanisms and biomedical applications of glucosamine as a potential multifunctional therapeutic agent. Life Science, 2016, 152, 21-29.
4. Lee A.M. Glucose regulated proteins in cancer: molecular mechanisms and therapeutic potential. Nat. Rev. Cancer 2014, 14 (4), 263-276.
5. Zhang X.D., Deslandes E., Villedieu M., Poulain L., Duval M., Gauduchon P., Schwartz L., Card P. Effect of 2-Deoxy-D-glucose on Various Malignant Cell Lines In Vitro. Anticancer Research 2006, 26, 3561-3566
6. Гильяно Н.Я., Бондарев Г.Н., Коневега Л.В., и др. Возможные механизмы селективного действия ингибиторов гликолиза на эндотелиоциты и клетки карциномы человека в культуре. Патологическая физиология и экспериментальная терапия. 2014, 58 (4), 78-85.
7. RU 2138257 C1 "Фармацевтический состав для профилактики и лечения раковых заболеваний" приоритет 08.11.1994, МПК А61К 31/375, А61К 31/19
8. WO 2005025581 A1 "Use of n-acetyl-d-aminog lycosamine in preparation of drugs for the treatment of cacer and metastasis" приоритет 2003.09.17, МПК A61K 31/7008
9. CA 2663398 C "A cancer sensitizer comprising glucosamine, glucosamine derivatives or salts thereof 2012-01-31, приоритет 2006.06.16, МПК A61K 31/7028, МПК прототип.
10. Rai Y., Pathak R., Kumari N. et. al. Mitochondrial biogenesis and metabolic hyperactivation limits the application of MTT assay in the estimation of radiation induced growth inhibition. Sci Rep. 2018. v.8.n.1:1531
11. Quent VM, Loessner D, Friis T, et. al. DW. Discrepancies between metabolic activity and DNA content as tool to assess cell proliferation in cancer research. J Cell Mol Med. 2010
12. Bascoul-Colombo C, Garaiova I, Plummer SF, Harwood JL, Caterson B, Hughes CE. Glucosamine Hydrochloride but Not Chondroitin Sulfate Prevents Cartilage Degradation and Inflammation Induced by Interleukin-la in Bovine Cartilage Explants. Cartilage. 2016 Jan; 7(1):70-81.
13. Berridge, M.V, Tan, A.S., Herst, P.M.. Tetrazolium dyes as tools in cell biology: New insights into their cellular reduction. Biotechnol Annu Rev 11 127-152 (2005).
14. Watson J V 2005. Flow Cytometry Data Analysis: Basic Concepts and Statistics).