СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СРЕДСТВА, ОБЛАДАЮЩЕГО ЛИПИДКОРРИГИРУЮЩИМ ДЕЙСТВИЕМ
METHOD FOR PREPARING AGENT POSSESSING LIPID-CORRECTING ACTION

Предлагаемое изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной фармакологии, и может быть использовано в химико-фармацевтической промышленности в качестве биологически активного средства.
По данным Всемирной Организации Здравоохранения сердечно-сосудистые заболевания являются одними из самых распространенных заболеваний населения Земли и служат основной причиной смертности в большинстве стран мира. В связи с чем для фармакотерапии, направленной на профилактику рецидивов заболеваний сердца и их прогрессирование, актуальным является поиск природных препаратов и биологически активных добавок (БАД) к пище, обладающих липидкорригирующими эффектами. Перспективными в этом отношении являются БАД к пище, полученные из сырья морского происхождения. К ним относятся в первую очередь жиры морских гидробионтов, содержащие ω-3 полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК).
Байкальский тюлень (нерпа) (Pusa (Phoca) sibirica Gmel.) - млекопитающее озера Байкал, находящееся на вершине пищевой цепи водоема, оказывает существенное влияние на всю экосистему озера. Для сохранения биоразнообразия и биоравновесия экосистемы популяция байкальской нерпы поддерживается в строго определенных пределах путем санитарного отлова ограниченного количества животных - в пределах до 4 тысяч особей в год. Животное добывается с целью получения меха, а остальная часть (жир и внутренние органы) направляется на зверофермы [В.Д. Пастухов. Нерпа Байкала. - Новосиб.: ВО Наука. 1993, 271 с.].
Согласно современным данным жир байкальской нерпы не обладает токсическим эффектом, содержит невысокое содержание насыщенных жирных кислот, отрицательно влияющих на обмен веществ. Исследования химического состава жира байкальской нерпы показали, что в состав жира входит порядка 60 жирных кислот, содержащих от 8 до 22 углеродных атомов. Из них на долю насыщенных кислот приходится 17-19%, мононенасыщенных 59-60%, полиненасыщенных 22-23%). Жир богат полиненасыщенными жирными кислотами - содержание эйкозапентаеновой кислоты (ЭПК) составляет 2,65%, докозагексаеновой (ДГК) - 6,28%, что обусловливает перспективность его использования как источника при изготовлении биологически активных добавок.
Известно средство, обладающее липидкорригирующими и иммуномодулирующими свойствами (см. RU №2259824, МПК А61К 31/20, 35/56, А61Р 3/06, 9/10, 37/02, опубл. 10.09.2005). В жире командорского кальмара Berryteuthis magister содержится 50% алкил-диацилглицеридов (АДГ) и 10% полиненасыщенных жирных кислот. Назначение жира вызывало у животных (крысы) при экспериментальной кардиовазопатии выраженные липидкорригирующий и иммуномодулирующий эффекты. Они проявлялись в значительном снижении в крови крыс холестерина, триглицеридов, липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) и липопротеинов очень низкой плотности (ЛПОНП).
К недостаткам данного лечебного средства можно отнести то, что высокое содержание в нем АДГ (50%), как показал анализ проведенных исследований, не позволяет в полной мере использовать потенциал содержащихся в средстве ПНЖК ввиду необходимости увеличения потребляемой дозы средства, что нежелательно из-за избыточной нагрузки АДГ на сердце.
Известно средство, обладающее липидкорригирующим гипокоагуляционными и антиоксидантными свойствами (см. RU №2302248, МПК А61К 35/407, 35/56, А61Р 39/06, 3/06, 7/02, опубл. 10.03.2007). Данное средство представляет собой липидную фракцию, выделенную из печени камчатского краба Paralithodes comtschatica, содержащую 10% полиненасыщенных жирных кислот, 10% алкил-диацилглицеридов и комплекс природных биоантиоксидантов. Средство обладает выраженными липидкорригирующим, гипокоагуляционным и антиоксидантным свойствами.
К недостаткам данного средства можно отнести то, что в нем содержится 10% ПНЖК, что недостаточно для рекомендованного суточного потребления, поэтому возникает потребность в увеличении дозы употребления данной добавки.
Известно средство, обладающее липидкорригирующими и антиоксидантными свойствами (см. RU 2309763, МПК А61К 36/03, А61Р 9/00, опубл. 10.11.2007). Средство представляет собой сконцентрированный комплекс биологически активных веществ из бурых водорослей, содержащий 80-90% липидов, в том числе 26,7-38,7% ПНЖК от суммы жирных кислот, 3-6% маннита, 1-2% азотсодержащих веществ, 5-12% биогенных микро- и макроэлементов.
К недостаткам данного средства можно отнести то, что помимо полиненасыщенных кислот в данном средстве присутствуют азотсодержащие вещества, биогенные микро- и макроэлементы (К, Са, Mg, Mn, Со, Cu, Se, Ag, I в минеральном и органически связанном виде), о липидкорригирующем действии которых не уточнено.
Наиболее близким по технической сущности к заявленному изобретению является способ получения липосом, предусматривающий экстракцию фосфолипидов из печени байкальской нерпы (см. RU№2308940, МПК А61К 9/127, 39/10, 35/12, опубл. 27.10.2007). Смесь полученных фосфолипидов и жир байкальской нерпы растворяют в органическом растворителе в соотношении 4:6 с антиоксидантом α-токоферолом, высушивают тонкий слой липидов на роторном испарителе. Затем добавляют буферный раствор, встряхивают смесь до получения однородной суспензии. Проводят обработку липидной смеси ультразвуком при водяном охлаждении, далее центрифугируют смесь и отделяют верхние три четверти надосадочной жидкости. Способ позволяет получить липосомальное средство, обладающее самостоятельным лечебным - иммунокорригирующим и гепатопротекторным действием.
Однако в известном способе не рассматривается липидкорригирующее действие липосомального средства.
Задача, решаемая изобретением, - расширение арсенала БАД к пище природного происхождения липидкорригирующего действия.
Технический результат, достигаемый при осуществлении заявленного способа, - это создание липосомального средства, полученного из жира байкальской нерпы, обладающего выраженным липидкорригирующим и антиоксидантным действиями.
Указанный технический результат достигается тем, что в способе получения средства, обладающего липидкорригирующим действием, предусматривающем экстракцию фосфолипидов из печени байкальской нерпы, растворение смеси полученных фосфолипидов и липидной фракции, выделенной из байкальской нерпы, в органическом растворителе с антиоксидантом α-токоферолом, высушивание тонкого слоя липидов на роторном испарителе, введение буферного раствора, встряхивание смеси до получения однородной суспензии, обработку липидной смеси с получением липосомального средства, согласно изобретению в качестве липидной фракции используют концентрат полиненасыщенных жирных кислот, полученный из жира байкальской нерпы путем комплексообразования свободных жирных кислот с мочевиной, при растворении в органическом растворителе смесь фосфолипидов и концентрат полиненасыщенных жирных кислот берут в соотношении 2:1, высушивание смеси проводят под вакуумом, при этом обработку липидной смеси с получением липосомального средства проводят путем экструдирования смеси через поликарбонатные мембраны с диаметром пор 100 нм.
Отличительными признаками заявленного способа является использование в качестве липидной фракции концентрата ПНЖК, полученного из жира байкальской нерпы путем комплексообразования свободных жирных кислот с мочевиной, оптимальное соотношение фосфолипидов и концентрата ПНЖК 2:1.
Среди различных способов получения концентратов ПНЖК метод комплексообразования с мочевиной считается самым быстрым, недорогим, надежным, наиболее эффективным и экологически чистым приемом для получения концентратов ПНЖК [Hayes, D.G., Bengtsson, J.M. Van Alstineand F. Setterwall, 1998. Urea complication for the rapid, ecologically responsible fractionation of ffatty acids from seed oil. Journal of the American Oil Chemists' Society, 75: 1403-1409. Wanasundara, U.N. and F. Shahidi, 1999. Concentration of omega-3 polyunsaturated fatty acids of blubber oil by urea complication: optimization of reaction conditions. Food Chemistry, 65(1): 41-49].
Методом комплексообразования с мочевиной из жира байкальской нерпы был получен концентрат полиненасыщенных жирных кислот. Сравнительные данные показателей суммарного содержания жирных кислот жира и концентрата ПНЖК приведены в таблице 1.
При исследовании жирнокислотного состава жира нерпы и концентрата ПНЖК было установлено, что полученный концентрат характеризуется высоким содержанием ПНЖК (28,11%), мононенасыщенных жирных кислот (64,56%), а также низким содержанием насыщенных жирных кислот (7,33%), соотношение ω-6/ω-3 ПНЖК 0,94:1 и 1,3:1 соответственно.
Оптимальное соотношение фосфолипидов и концентрата ПНЖК в заявленном способе было установлено экспериментальным путем. Была изучена стабильность липосом с различными соотношениями концентрата и фосфолипидов. Брали следующие соотношения фосфолипиды : концентрат 1:2, 1:1, 2:1, 4:1 при температуре хранения 4±2°С в течение 6 месяцев. Результат исследований представлен в таблице 2.
Как видно из таблицы 2, оптимальным соотношением фосфолипидов и концентрата ПНЖК является 2:1 и 4:1, при котором наблюдается стабильность липосом при хранении в течение 6 месяцев при температуре 4±2°С.
Действие средства, полученного заявленным способом, было изучено в эксперименте на животных.
Опыты проведены на белых половозрелых крысах-самцах линии Wistar, полученных из питомника НИИ Биофизики ФГБОУ ВПО «Ангарская государственная техническая академия». Животные содержались в виварии в соответствии с санитарными правилами по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник, в пластмассовых клетках по 4-5 голов в каждой, на подстилке из лиственных пород дерева при естественном освещении при температуре 19±2°С. Исследования проводились в соответствии с требования нормативно-правовых актов о порядке экспериментальной работы с использованием животных. Эвтаназию животных осуществляли путем декапитации под эфирным наркозом.
Экспериментальные животные были разделены на 4 группы (по 10 особей в группе):
I группа - интактная (животные получали стандартный корм и воду);
II группа - контрольная (животные находились на атерогенной диете в течение 21 дня);
III группа - опытная 1 (животные после атерогенной диеты (продолжительностью 21 день) получали перорально липосомальное средство с соотношением фосфолипиды: концентрат (2:1) в виде суспензии, полученной заявленным способом, в дозе 20 мг/кг массы тела в течение 14 дней);
IV группа - опытная 2 (животные после атерогенной диеты (продолжительностью 21 день) получали перорально липосомальное средство с соотношением фосфолипиды: концентрат (4:1) в виде суспензии, полученной заявленным способом, в дозе 20 мг/кг массы тела в течение 14 дней).
Модель экспериментальной гиперлипидемии у крыс вызывали согласно МУК 2.3.2.721-98.2.3.2, разработанным Институтом питания РАМН, используя модель атерогенной гиперлипидемии введением в обычный рацион: 3-5% холестерина (BioChemica, Applichem), 0,3% 6-метилтиоурацила, 1% холиевой кислоты и 5% свиного сала - в течение 21 дня. Животные ежедневно осматривались, учитывалась поедаемость корма. За время опыта не было случаев падежа и заболеваний животных.
Липидный спектр сыворотки крови крыс исследовали на биохимическом анализаторе, определяя уровень общего холестерина (ОХС), триацилглицеридов (ТГ), липопротеинов высокой плотности (ЛПВП), липопротеинов низкой плотности (ЛПНП), липопротеинов очень низкой плотности (ЛПОНП). Для характеристики атерогенных свойств крови рассчитывали индекс атерогенности (ИА).
Полученные результаты представлены в таблице 3.
Результаты оценки гиполипидимеческого действия средства, полученного заявленным способом, свидетельствуют о достоверном снижении биохимических показателей сыворотки крови исследуемых животных. При введении средства с концентратом ПНЖК у животных опытной группы 1 ОХС сыворотки крови снизился на 48%, у опытной группы 2 ОХС крови снизился на 34% по сравнению с контролем. Содержание ЛПВП у опытной группы 1 повысилось на 42,7%, у опытной группы 2 на 26,7% по сравнению с контролем. У опытной группы 1 ЛПНП снизились на 58%, у опытной группы 2 снизился на 20,7% по сравнению с контролем. Уровень ТГ в крови опытной группы 1 снизился на 36%, опытной группы 2 на 20,9%. ЛПОНП у опытной группы 1 уменьшились на70,3%, у опытной группы 2 уменьшились на 48,6% по сравнению с контрольной группой. У животных опытной группы 1 ИА снизился в 11,3 раза, у опытной группы 2 снизился в 3 раза по сравнению с контролем.
В результате проведенных экспериментальных исследований выявлено, что введение полученного заявляемым способом липосомального средства животным на фоне экспериментальной гиперлипидемии, вызванной атерогенной диетой, снижает ОХС, ЛПНП, ЛПОНП, ТГ и ИА, но одновременно повышает ЛПВП.
Полученные результаты свидетельствуют о гиполипидемическом действии исследуемого средства, при этом липосомальное средство с соотношением фосфолипиды: концентрат (2:1) является достоверно более эффективным, чем соотношение 4:1 для снижения липидного профиля сыворотки крови экспериментальных животных.
Концентрацию малонового диальдегида (МДА) в печени и в сыворотке крови определяли методом, в основе которого лежит свойство МДА реагировать с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК). Измерение концентрации ТБК-активных продуктов в образцах проб осуществляли при длине волны 532 нм по степени образования окрашенного комплекса с ТБК.
Результаты представлены в таблице 4.
После введения липосомального средства с концентратом ПНЖК содержание МДА в сыворотке крови опытной группы 1 снизилось на 15,6%, у опытной группы 2 снизилось на 10,7% по сравнению с контрольной группой. При введении липосомального средства, полученного заявленным способом, наблюдалось снижение уровня МДА в печени животных опытной группы 1 на 11,4%), опытной группы 2 на 7,8% по сравнению с соответствующими показателями в контроле.
Антиоксидантный потенциал организма оценивали по активности глутатионредуктазы (GR), количества восстановленного глутатиона (GSH) и суммарного содержания антиоксидантов (ССА) в сыворотке крови исследуемых животных.
Определение активности глутатионредуктазы основано на изменении скорости окисления NADPH, которая регистрируется спектрофотометрически по уменьшению оптической плотности при длине волны 340 нм.
Определение количества восстановленного глутатиона основано на взаимодействии GSH с ДТНБК (5,5'-дитио-бис-2-нитробензойной кислотой) с образованием окрашенного в желтый цвет аниона 2-нитро-5-тиобензоата. Увеличение концентрации желтого аниона в ходе данной реакции регистрировали спектрофотометрическим методом при длине волны 412 нм.
Определение суммарного содержания антиоксидантов проводилось на проточно-инжекторной системе «Цвет Яуза-01-AA» с плунжерным насосом. Подготовка проб проводилась согласно «Методике выполнения измерений суммарного содержания жирорастворимых антиоксидантов в пищевых продуктах амперометрическим методом» аттестована в соответствии с ГОСТ Р 8.563-96, ГОСТ Р ИСО 5725-2002. В качестве стандарта использовалась галловая кислота.
Результаты исследований представлены в таблице 5.
Как видно из таблицы 5, после получения средства, производимого заявленным способом, содержание восстановленного глутатиона в эритроцитах крови экспериментальных животных повысилось на 19,5% у опытной группы 1, у животных опытной группы 2 повысилось на 9,4% по сравнению с контрольной. Активность глутатионредуктазы у опытной группы 1 снизилась на 36,8%, у опытной группы 2 на 26,3% по сравнению с контрольной группой. В опытной группе 1 ССА повысилось на 27%, в опытной группе 2 на 13,6% по сравнению с контрольной группой. Данные таблицы 5 свидетельствуют об антиоксидантном действии исследуемого средства.
Таким образом, изложенные сведения свидетельствуют о том, что заявленное липосомальное средство с концентратом ПНЖК в соотношении фосфолипиды: концентрат (2:1) обладает выраженным липидкорригирующим, антиоксидантным действием, что позволяет расширить сырьевую базу для получения липосом, используя природное сырье.
Заявляемый способ осуществляется следующим образом.
Фосфолипиды по известному способу экстрагируют из печени байкальской нерпы [см. М. Кейтс. Техника липидологии. М.: «Мир», 1975. - 236 с.]. К 6-7 г свежей печени прибавляют 3 мл воды и 30 мл смеси хлороформ-метанол (1:2) и ткань гомогенизируют в гомогенизаторе с ножами [Foss Tecato-2094] в течение 2 мин при комнатной температуре. Гомогенат центрифугируют в течение 10 минут при 3000 об/мин, супернатант декантируют и остаток реэкстрагируют 38 мл смеси хлороформ-метанол-вода (1:2:0.8) в гомогенизаторе [Foss Tecato-2094] в течение 2 мин. Ткань отделяют центрифугированием в течение 10 минут при 3000 об/мин. Объединенные супернатанты разбавляют 20 мл хлороформа и 20 мл воды, водно-метанольную и хлороформную фазу разделяют отстаиванием в делительной воронке. Нижний хлороформный слой концентрируют на роторном испарителе [испаритель роторный IKA HV 10 digital с вакуумным насосом Diaphragm Vacuum Pump] при 35°С. Остаток растворяют в 10 мл хлороформа. Далее к раствору суммарных липидов в хлороформе приливают пятикратный объем ацетона и смесь выдерживают 2-3 ч при 0°С, выпавший осадок отделяют центрифугированием в течение 10 минут при 3000 об/мин. Полученные фосфолипиды оставляют для дальнейшего использования.
Концентрат ПНЖК получают из жира байкальской нерпы путем комплексообразования свободных жирных кислот с мочевиной. На первом этапе для получения свободных жирных кислот из жира байкальской нерпы использовали алкоголиз, в качестве катализатора использовали гидроксид калия. После щелочного гидролиза жира байкальской нерпы к остатку добавляют равный объем воды, к смеси добавляют гексан, перемешивают и после отстаивания сливают нижний слой. Извлечение неомыляемых веществ повторяют дважды. Водный раствор мыла подкисляют разбавленной серной кислотой. Затем выделившиеся жирные кислоты экстрагируют гексаном. Гексановый слой в делительной воронке несколько раз промывают водой и сушат прокаленным сульфатом натрия. Затем раствор фильтруют, после чего растворитель отгоняют на роторном испарителе.
На следующем этапе проводят кристаллизацию с мочевиной для выделения концентрата ПНЖК. Для этого полученные жирные кислоты на первом этапе подвергают кристаллизации в этаноле в присутствии мочевины, вначале в течение 1 часа при комнатной температуре, а затем в течение 12 часов при температуре 2±4°С при соотношении продукты реакции: мочевина: этиловый спирт 1:5:10. Смесь кислот и мочевины растворяют в таком количестве спирта, чтобы получился раствор, насыщенный при 50°С.После интенсивного перемешивания раствор оставляют на кристаллизацию. Выпавшие после охлаждения кристаллы отсасывают на воронке Бюхнера. Спирт из фильтрата отгоняют и к остатку добавляют гексан. Все переносят в делительную воронку, промывают водой. Гексановый слой отделяют и сушат безводным сульфатом натрия, после чего растворитель отгоняют. Полученный концентрат ПНЖК представляет собой густую маслянистую жидкость светло-желтого цвета без запаха.
С помощью микродозатора вносят раствор фосфолипидов печени нерпы, концентрат ПНЖК и антиоксидант α-токоферол [см. М.Д. Машковский. Лекарственные средства: в 2-х томах. Т.2. - 11-е изд. Стер. - М.: Медицина, 1988. - с. 37-39] в соотношении 2:1:0,05 (0,1 г смеси), растворяют в органическом растворителе (1 мл хлороформа) и вносят в круглодонную колбу. Испаряют растворитель на роторном испарителе под вакуумом [IKA HV 10 digital с вакуумным насосом Diaphragm Vacuum Pump] при температуре водяной бани 35°С до образования тонкой пленки липида на стенках колбы. Роторный испаритель работает за счет понижения температуры кипения растворителя путем понижения давления при помощи вакуумного насоса. Данный подход позволяет удалять растворитель при низкой температуре, избегая побочных реакций, которые могут протекать при нагревании смеси выше определенной температуры. Испарение растворителя происходит из тонкой пленки на внутренней поверхности колбы. За счет вращения колбы эта поверхность постоянно обновляется, что значительно увеличивает скорость упаривания, так чтобы дать возможность полученной смеси распределиться в виде тонкой пленки по стенке колбы. Затем к липидной пленке добавляют 20 мл раствора, содержащего 0.25 М сахарозу, 0.01 М трис-буфер, 0.001 М ЭДТА, рН 7.4. Встряхивают смесь на механической качалке [Установка выращивания микроорганизмов, термостатированная УВМ-12-250] в течение 30 минут до получения однородной суспензии. Полученную липосомальную суспензию экструдируют через поликарбонатные мембраны с диаметром пор 100 нм на мини-экструдере [Liposomal Fast-Basic (AVESTIN, Canada)]. Приспособление Liposomal Fast-Basic (AVESTIN, Canada) представляет собой разборный металлический блок, в котором закрепляется поликарбонатный фильтр и два микрошприца Hamilton на 1 мл. Продавливают содержимое шприца №1 через фильтр, и дисперсия липосом оказывается в другом шприце. Продавливание повторяют нечетное количество раз, чтобы липосомальная дисперсия оказалась в шприце №2, это предотвращает присутствие в конечном образце частиц, не способных пройти через фильтр. Рекомендуют 19 продавливаний [MacDonald R.C., MacDonald R.I., Menco B.Takeshita К., Subbarao N.K., Lan-rong Hu. Biochim. Biophys. Asta. 1991. V. 1061. P.297-303], при этом получаются липосомы с довольно узким распределением по размерам [Сорокоумова Г.М. //Фосфолипиды. Методы их выделения, обнаружения и изучения физико-химических свойств липидных дисперсий в воде //Сорокоумова Г.М., Селищева А.А., Каплун А.П. М.: МИТХТ, 2000].
Таким образом, изложенные сведения свидетельствуют о том, что заявляемый способ позволяет получить липосомальное средство, обладающее самостоятельным лечебным - липидкорригирующим и антиоксидантным - действием, и расширить сырьевую базу для получения липосом, используя природное сырье.