Композиция, содержащая биосовместимый матрикс, способ получения композиции
COMPOSITION CONTAINING A BIOCOMPATIBLE MATRIX, A METHOD FOR PRODUCING THE COMPOSITION

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к биомедицинскому продукту и его применению для лечения повреждений мягких тканей. В частности, настоящее изобретение относится к композициям, содержащим популяцию мезенхимальных стволовых клеток и биосовместимый матрикс.
Предшествующий уровень техники
Ежегодно миллионам людей требуется медицинская помощь в связи с острыми или вызванными перенапряжением повреждениями мягких тканей, например, повреждениями кожи (такими как незаживающие раны кожи) или мышц (такими как травматические или хирургические раны). Процесс заживления ран имеет определенный характер и включает три фазы: воспалительную фазу, в ходе которой происходит высвобождение цитокинов с целью улучшения воспалительных реакций; фазу восстановления или пролиферации, характеризующуюся активацией и пролиферацией клеток-предшественников под влиянием факторов роста и цитокинов и ангиогенезом; и фазу ремоделирования или созревания, характеризующуюся формированием рубцовой тканью и перекрестных связей коллагена с другим коллагеном и с белковыми молекулами с повышением прочности рубца на разрыв.
В прошлом предложено несколько подходов к решению задач регенеративной медицины, но их клиническое применение остается ограниченным, поскольку локальному введению факторов роста по-прежнему сопутствует быстрое снижение их локальной концентрации, неприемлемый градиент и потеря биологической  активности (Borselli и др., Proc Natl Acad Sci USA. 2010, 107:3287-3292); прямая имплантация децеллюляризованного внеклеточного матрикса (содержащего нативные фактор роста сосудистого эндотелия (ФРСЭ) и основной фактор роста фибробластов (оФРФ) связана с неконтролируемым высвобождением факторов роста и отсутствием биосовместимости в основном из-за его ксеногенного происхождения (Keane и др., Biomaterials., 2012, 33: 1771-1781); и трансплантация дифференцированных клеток мышц, например, ограничена низким приживлением клеток на ранней стадии после имплантации из-за гипоксического стресса (Turner and Badylak, Cell Tissue Res. 2012, 347:759-774).
Затем были предложены стволовые клетки с целью улучшения ремоделирования ишемической мышечной ткани за счет высокой скорости пролиферации и самообновления, резистентности к окислительному или гипоксическому стрессу (Camassola и др., Methods Mol Biol Clifton NJ., 2012, 879: 491-504), миогенеза, ангиогенеза и локальной клеточной иммуномодуляции (Hong и др., Curr Opin Organ Transplant. 2010, 15:86-91).
Кроме того, ранее было продемонстрировано, что стволовые клетки, высеваемые на тканевый продукт, содержащий коллагеновый матрикс, усиливают заживление ран по сравнению с нестволовыми клетками, высеваемыми на тот же тканевый продукт, содержащий коллагеновый матрикс (Lafosse и др., Plastic and Reconstructive Surgery 2015, 136 (2):279-95).
В недавних исследованиях описан трехмерный клеточный каркас, засеянный мезенхимальными стволовыми клетками, как описано в европейской патентной заявке ЕР 2374485 и в патентной заявке US 2013/0121973. Однако эти патентные заявки относятся к дифференцированным мезенхимальным стволовым клеткам, в частности в фибробласты. Аналогичным образом, в международной патентной заявке WO 2014/150784 описана композиция для лечения повреждения мягких тканей, содержащая коллагеновый матрикс и клеточную суспензию, содержащую мезенхимальные стволовые клетки и немезенхимальные стволовые клетки.
Однако эти заменители или композиции не тестировались in vivo, в частности, на человеке.
Соответственно, сохраняется потребность повысить эффективность современных методов лечения повреждений мягких тканей. Заявителями неожиданно продемонстрировано, что преимущественно чистая популяция мезенхимальных стволовых клеток может улучшать восстановление и регенерацию в месте повреждения по сравнению с популяцией мезенхимальных стволовых клеток, которая не является преимущественно чистой.
Следовательно, настоящее изобретение относится к композиции, содержащей преимущественно чистую популяцию мезенхимных стволовых клеток и биосовместимый матрикс, и к ее применению для лечения повреждений мягких тканей.
Краткое изложение сущности изобретения
Настоящее изобретение относится к композиции, содержащей биосовместимый матрикс и популяцию мезенхимальных стволовых клеток (МСК), при этом популяция мезенхимальных стволовых клеток является преимущественно чистой.
В одном из вариантов осуществления популяция мезенхимальных стволовых клеток согласно изобретению содержит менее 25% фибробластов.
В одном из вариантов осуществления мезенхимальные стволовые клетки согласно изобретению являются недифференцированными.
В одном из вариантов осуществления мезенхимальные стволовые клетки согласно изобретению получают из жировой ткани, костного мозга, ткани пуповины, вартонова студня, околоплодных вод, плаценты, периферической крови, фаллопиевой трубы, роговичной стромы, легких, мышц, кожи, костей, дентина или плодной печени. Мезенхимальные стволовые клетки композиции предпочтительно получают из жировой ткани, более предпочтительно из подкожной жировой ткани.
В одном из вариантов осуществления биосовместимый матрикс согласно изобретению является ацеллюлярным.
В одном из вариантов осуществления биосовместимый матрикс согласно изобретению содержит коллаген.
В одном из вариантов осуществления источником биосовместимого матрикса согласно изобретению является человек, свинья, крупный рогатый скот или лошадь.
В одном из вариантов осуществления источником мезенхимальным стволовых клеток согласно изобретению является субъект, подлежащий лечению.
Изобретение также относится к описанной выше композиции, содержащей биосовместимый матрикс и популяцию мезенхимных стволовых клеток, для применения при лечении повреждения мягких тканей у нуждающегося в этом субъекта.
В одном из вариантов осуществления подлежащая лечению мягкая ткань выбрана из группы, включающей кожную ткань, мышечную ткань, дермальную ткань, ткань сухожилия, ткань связки, ткань мениска и ткань мочевого пузыря.
В одном из вариантов осуществления повреждением мягких тканей является острая или хроническая рана.
В одном из вариантов осуществления подлежащее лечению повреждение мягких тканей выбрано из группы, включающей разрывы мягких тканей, кожные раны, кожные ожоги, кожные язвы, хирургические раны, сосудистые заболевания, мышечные заболевания, грыжи и радиационные раны. В одном из конкретных вариантов осуществления кожной раной является диабетическая рана.
В одном из вариантов осуществления композицию для применения согласно изобретению вводят местно или путем хирургической имплантации.
Изобретение также относится к способу получения композиции, содержащей биосовместимый матрикс и популяцию мезенхимальных стволовых клеток, включающий инкубацию преимущественно чистой популяции мезенхимальных стволовых клеток с биосовместимым матриксом.
Определения
В настоящем изобретении следующие термины имеют следующие значения.
"Мезенхимальные стволовые клетки" или МСК являются высокоэффективными стволовыми клетками, способными к дифференцировке в мезенхимальные или соединительные ткани нескольких специфических типов, включая остеобласты, хондроциты, адипоциты, миелоидные стромальные клетки, последовательности миогенных или нейрогенных клеточных поколений. Мезенхимальные стволовые клетки могут выделяться из тканей, включающих без ограничения жировую ткань, костный мозг, ткань пуповины, вартонов студень, околоплодные воды, плаценту, периферическую кровь, фаллопиевую трубу, роговичную строму, легкие, мышцы, кожу, кости, дентин, предменструальную жидкость, крайнюю плоть, плодную печень и т.п.
"Мезенхимальная стволовая клетка позднего пассажа" означает клетку с меньшей иммуногенностью, чем у клетки более раннего пассажа. Иммуногенность мезенхимальной стволовой клетки соответствует числу пассажей. Клетку предпочтительно пассируют, по меньшей мере, четыре раза, более предпочтительно, по меньшей мере, шесть раз, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, восемь раз.
"Нормоксия" означает нормальные тканевые или физиологические уровни содержания кислорода. В одном из вариантов осуществления изобретения клеточная культура в условиях нормоксии или содержания кислорода на физиологическом уровне означает уровень содержания кислорода от около 3% до около 6%, предпочтительно около 5%.
"Гипоксия" означает сниженный уровень содержания кислорода. В одном из вариантов осуществления изобретения клеточная культура в условиях гипоксии означает уровень содержания кислорода от около 0% до около 1%, предпочтительно около 0,1%.
"Нормогликемия" означает нормальные уровни концентрации глюкозы. В одном из вариантов осуществления изобретения клеточная культура в условиях нормогликемии означает концентрацию глюкозы от около 0,5 г/л до около 1,5 г/л, предпочтительно около 1 г/л.
"Гипергликемия" означает повышенные уровни концентрации глюкозы. В одном из вариантов осуществления изобретения клеточная культура в условиях гипергликемии означает концентрацию глюкозы от около 2 г/л до около 10 г/л, предпочтительно от около 3 г/л до около 6 г/л, более предпочтительно около 4,5 г/л.
"Биосовместимый" означает отсутствие токсичных или вредных воздействий на организм, в частности на мягкие ткани. В одном из вариантов осуществления биосовместимость материала означает его способность выполнять свою желаемую функцию, не вызывая нежелательных локальных или системных эффектов у субъекта, но с достижением наиболее приемлемой полезной клеточной или тканевой реакции.
"Биосовместимый матрикс", также называемый матриксом или клеточным каркасом, означает трехмерный каркас, образованный биосовместимым материалом.
"Ацеллюлярный" или "децеллюляризованный" применительно к биосовместимому матриксу означает матрикс, из которого удалены практически все эндогенные клетки, например, по меньшей мере, около 60% эндогенных клеток, предпочтительно около 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% эндогенных клеток или более. Децеллюляризация матрикса может оцениваться путем подсчета жизнеспособных клеток, например, методом окрашивания DAPI.
"Мягкая ткань" означает не являющиеся костями ткани, которые соединяют, поддерживают или окружают другие структуры и органы тела. В одном из вариантов осуществления мягкая ткань включает, без ограничения, сухожилия, связки, фасции, кожу, волокнистые ткани, жировые и синовиальные мембраны (которые являются соединительной тканью), мышцы, нервы и кровеносные сосуды (которые не являются соединительной тканью). В другом варианте мягкими тканями являются ткани тела за исключением костей, зубов, ногтей, волос и хрящей.
"Субъект" означает млекопитающего, предпочтительно человека. В одном из вариантов осуществления субъектом может являться "пациент", то есть теплокровное животное, более предпочтительно человек, который ожидает получения или получает медицинскую помощь или был/является/станет объектом медицинской процедуры или у которого контролируется развитие или заживление повреждения мягких тканей. В одном из вариантов осуществления субъектом является взрослый (например, старше 18 лет). В другом варианте осуществления субъектом является ребенок (например, в возрасте до 18 лет). В одном из вариантов осуществления субъектом является субъект мужского пола. В другом варианте осуществления субъектом является субъект женского пола.
"Лечение" или "облегчение" означает терапевтическое воздействие, которое было предпринято и которое не было предпринято, с целью улучшения состояния пациента, при этом у объекта должно замедляться (уменьшаться) или прекращаться развитие или облегчаться один или нескольких симптомов повреждения мягких тканей, таких как, например, незакрытая рана, развитие фиброза, отсутствие васкуляризации и воспаление. У субъекта или млекопитающего успешно "лечат" повреждение мягких тканей, если после введения ему композиции согласно настоящему изобретению у него обнаруживается наблюдаемое и/или измеряемое уменьшение или отсутствие одного или нескольких из следующего: облегчение до определенной степени одного или нескольких из симптомов, связанных с повреждением мягких тканей; снижение заболеваемости; снижение смертности или улучшение качества жизни. Перечисленные параметры оценки успешного лечения и положительной динамики при повреждении легко поддаются измерению стандартными методами, известными врачам.
"Пассирование", также известное как субкультивирование или деление клеток, означает перенос небольшого числа клеток в новый сосуд, когда клетки находятся или почти находятся в условиях конфлюэнтности, чтобы продлить жизнь и/или увеличить число клеток в культуре. В одном из вариантов осуществления нулевым пассажем (Р0) является состояние, в котором клетки были первоначально помещены в культуру.
Подразумевается, что термины "около" и "приблизительно", используемые применительно к измеряемой величине, такой как количество соединения, доза, время, температура и т.п., означают отклонения в пределах 20%, 10%, 5%, 1%, 0,5% или даже 0,1% от указанного количества.
"И/или" означает любые и все возможные сочетания одного или нескольких соответствующих перечисленных наименований, а также отсутствие сочетаний при интерпретации в альтернативном смысле ("или").
Используемый термин "производное" означает любую долю вещества, его производного, подсемейства и т.д. отдельно или в сочетании с другими производными или другими ингредиентами.
Используемый термин "выделенный" означает, что клетки помещены в условия, отличные от их естественной среды.
Подробное описание изобретения
Ранее описанные популяции мезенхимальных стволовых клеток (МСК) включают клетки других типов помимо мезенхимальных стволовых клеток, в частности могут включать фибробласты или могут быть частично дифференцированы в фибробласты. Заявителем продемонстрировано, что мезенхимальные стволовые клетки обладают способностью лучше выживать и размножаться в условиях гипоксии и/или гипергликемии, чем фибробласты. Более того, мезенхимальные стволовые клетки обладают способностью секретировать больше ФРСЭ, чем фибробласты, в частности мезенхимальные стволовые клетки секретируют больше ФРСЭ в условиях гипоксии и гипергликемии (то есть в условиях диабетических ран), чем в условиях нормоксии и нормогликемии (Пример 2).
Заявителями также продемонстрировано, что мезенхимальные стволовые клетки, высеянные на биосовместимый матрикс, могут восстанавливать дермальную ткань (Пример 3) и могут использоваться для лечения поврежденной мышцы (Пример 4).
Более того, популяция МСК, высеянная на биосовместимый матрикс, продемонстрировала способность выживать в условиях гипоксии и/или гипергликемии, улучшая высвобождение проангиогенных факторов посредством чувствительного к кислороду механизма и уменьшая фиброзный рубец. Эти свойства могут способствовать восстановлению мягких тканей, например, в условиях диабета.
Таким образом, настоящее изобретение относится к композиции, содержащей биосовместимый матрикс и популяцию мезенхимальных стволовых клеток (МСК).
Композиция согласно изобретению применяются в инженерии и регенерации тканей у животных. Точная композиция согласно изобретению может варьировать в зависимости от желаемого применения. Модификации и другие варианты осуществления изобретения станут очевидными для специалиста в области техники, к которой относится настоящее изобретение, который ознакомился с идеями, изложенными выше в описании и представленными на сопровождающих его чертежах. Подразумевается, что изобретение не ограничено раскрытыми конкретными вариантами осуществления, и предполагается, что в объем прилагаемой формулы изобретения входят модификации и другие варианты осуществления.
В одном из вариантов осуществления композицией согласно изобретению является биомедицинский продукт.
В одном из вариантов осуществления популяция МСК может содержать клетки других типов помимо МСК, такие как, например, фибробласты, макрофаги, эндотелиальные клетки, дендритные клетки, остеобласты, гемопоэтические стволовые клетки, стволовые клетки пуповинной крови, лимфоциты или природные клетки-киллеры.
Клетки могут быть получены от донора (живого или умершего) или выделены из установленного клеточного штамма или клеточной линии. Например, клетки могут собираться у донора с использованием стандартных методов биопсии, известных из техники.
В одном из вариантов осуществления МСК получают от донора-человека.
В одном из вариантов осуществления МСК получают от донора-человека при условии, что они не являются эмбриональными стволовыми клетками.
В одном из вариантов осуществления изобретения популяцией МСК является популяция выделенных МСК.
В одном из вариантов осуществления изобретения популяция МСК является преимущественно чистой. Используемый термин "преимущественно чистая популяция МСК" означает, что популяция МСК содержит менее 25% живых клеток других типов, в частности фибробластов. В одном из вариантов осуществления преимущественно чистая популяция МСК согласно изобретению содержит, по меньшей мере, около 75%, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% МСК от общего числа живых клеток.
В другом варианте осуществления преимущественно чистая популяция МСК согласно изобретению содержит менее около 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1% фибробластов от общего числа живых клеток.
В одном из вариантов осуществления преимущественно чистая популяция МСК согласно изобретению секретирует не более 100 пг/мл фактора стромальных клеток 1 альфа (ФСК-1α), предпочтительно не более 50, 40, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 пг/мл.
2
В одном из вариантов осуществления, преимущественно чистая популяция МСК согласно изобретению секретирует не более 50 пг/мл ФСК-1α, предпочтительно не более 40, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 пг/мл, при этом культивируют популяцию МСК, по меньшей мере, 24 часа при содержании О около 21%.
Согласно другому варианту осуществления преимущественно чистая популяция МСК согласно изобретению секретирует не более 50 пг/мл ФСК-1α, предпочтительно не более 40, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 пг/мл, при этом культивируют популяцию МСК, по меньшей мере, 24 часа в условиях содержания кислорода на физиологическом уровне, предпочтительно около 5%.
2
Согласно другому варианту осуществления преимущественно чистая популяция МСК согласно изобретению секретирует не более 50 пг/мл ФСК-1α, предпочтительно не более 40, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 пг/мл, при этом культивируют популяцию МСК, по меньшей мере, в течение 24 часов в условиях гипоксии, предпочтительно при содержании О около 0,1%.
Согласно другому варианту осуществления преимущественно чистая популяция МСК согласно изобретению секретирует не более 100 пг/мл ФСК-1α, предпочтительно не более 50, 40, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 пг/мл ФСК-1α, при этом культивируют популяцию МСК, по меньшей мере, 24 часа в условиях нормогликемии, предпочтительно при концентрации глюкозы около 1 г/л.
Согласно другому варианту осуществления преимущественно чистая популяция МСК согласно изобретению секретирует не более 50 пг/мл ФСК-1α, предпочтительно не более 40, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 пг/мл ФСК-1α, при этом культивируют популяцию МСК, по меньшей мере, в течение 24 часов в условиях гипергликемии, предпочтительно при концентрации глюкозы около 4,5 г/л.
2
В одном из вариантов осуществления преимущественно чистая популяция МСК согласно изобретению секретирует не более 100 пг/мл, предпочтительно не более 50, 40, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 пг/мл ФСК-1α, при этом культивируют популяцию МСК, по меньшей мере, в течение 24 часов при содержании О около 21% и при низкой концентрации глюкозы, предпочтительно около 1 г/л.
2
В другом варианте осуществления преимущественно чистая популяция МСК согласно изобретению секретирует не более 50 пг/мл, предпочтительно не более 40, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 пг/мл ФСК-1α, при этом культивируют популяцию МСК, по меньшей мере, в течение 24 часов при содержании О около 21% и при высокой концентрации глюкозы, предпочтительно около 4,5 г/л.
В другом варианте осуществления преимущественно чистая популяция МСК согласно изобретению секретирует не более 100 пг/мл, предпочтительно не более 50, 40, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 пг/мл ФСК-1α, при этом культивируют популяцию МСК, по меньшей мере, в течение 24 часов в условиях содержания кислорода на физиологическом уровне, предпочтительно около 5% и при низкой концентрации глюкозы, предпочтительно около 1 г/л.
В другом варианте осуществления преимущественно чистая популяция МСК согласно изобретению секретирует не более 50 пг/мл, предпочтительно не более 40, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 пг/мл ФСК-1α, при этом культивируют популяцию МСК, по меньшей мере, в течение 24 часов в условиях содержания кислорода на физиологическом уровне, предпочтительно около 5%, и при высокой концентрации глюкозы, предпочтительно около 4,5 г/л.
2
В другом варианте осуществления преимущественно чистая популяция МСК согласно изобретению секретирует не более 100 пг/мл, предпочтительно не более 50, 40, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 пг/мл ФСК-1α, при этом культивируют популяцию МСК, по меньшей мере, в течение 24 часов в условиях гипоксии, предпочтительно при содержании O около 0,1%, и при низкой концентрации глюкозы, предпочтительно около 1 г/л.
2
В другом варианте осуществления преимущественно чистая популяция МСК согласно изобретению секретирует не более 50 пг/мл, предпочтительно не более 40, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 пг/мл ФСК-1α, при этом культивируют популяцию МСК, по меньшей мере, в течение 24 часов в условиях гипоксии, предпочтительно при содержании O около 0,1%, и при высокой концентрации глюкозы, предпочтительно около 4,5 г/л.
2
В одном из вариантов осуществления преимущественно чистая популяция МСК согласно изобретению секретирует, по меньшей мере, 200 пг/мл ФРСЭ, предпочтительно, по меньшей мере, 250, 260, 270, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289 или 290 пг/мл ФРСЭ, при этом культивируют популяцию МСК, по меньшей мере, в течение 24 часов в условиях гипоксии, предпочтительно при содержании O около 0,1%, и в условиях гипергликемии, предпочтительно при концентрации глюкозы около 4,5 г/л.
В другом варианте осуществления преимущественно чистая популяция МСК согласно изобретению секретирует, по меньшей мере, около 90 пг/мл ФРСЭ, предпочтительно, по меньшей мере, около 95, 100, 105, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 188, 119 или 120 пг/мл ФРСЭ, при этом культивируют популяцию МСК, по меньшей мере, 24 часа в условиях содержания кислорода на физиологическом уровне, предпочтительно около 5%, и в услових гипергликемии, предпочтительно при концентрации глюкозы около 4,5 г/л.
В другом варианте осуществления преимущественно чистая популяция МСК согласно изобретению секретирует, по меньшей мере, около 160 пг/мл ФРСЭ, предпочтительно, по меньшей мере, около 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169 или 170 пг/мл ФРСЭ, при этом культивируют популяцию МСК, по меньшей мере, 24 часа в условиях содержания кислорода на физиологическом уровне, предпочтительно около 5%, и в условиях нормогликемии, предпочтительно при концентрации глюкозы около 1 г/л.
2
В одном из вариантов осуществления преимущественно чистая популяция МСК согласно изобретению секретирует не более 50 мг/мл ФСК-1α, предпочтительно не более 40, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 пг/мл ФСК-1α; и, по меньшей мере, около 200 пг/мл ФРСЭ, предпочтительно, по меньшей мере, 250, 260, 270, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289 или 290 пг/мл ФРСЭ, при этом культивируют популяцию МСК, по меньшей мере, 24 часа в условиях гипоксии, предпочтительно при содержании O около 0,1% и в условиях гипергликемии, предпочтительно при концентрации глюкозы около 4,5 г/л.
В другом варианте осуществления преимущественно чистая популяция МСК согласно изобретению секретирует не более 50 пг/мл ФСК-1α, предпочтительно не более 40, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 пг/мл ФСК-1α; и, по меньшей мере, около 90 пг/мл ФРСЭ, предпочтительно, по меньшей мере, около 95, 100, 105, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 188, 119 или 120 пг/мл ФРСЭ, при этом культивируют популяцию МСК, по меньшей мере, 24 часа в условиях содержания кислорода на физиологическом уровне, предпочтительно около 5%, и в условиях гипергликемии, предпочтительно при концентрации глюкозы около 4,5 г/л.
В другом варианте осуществления преимущественно чистая популяция МСК согласно изобретению секретирует не более 100 пг/мл ФСК-1α, предпочтительно не более 50, 40, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 пг/мл ФСК-1α; и, по меньшей мере, около 160 пг/мл ФРСЭ, предпочтительно, по меньшей мере, около 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169 или 170 пг/мл ФРСЭ, при этом культивируют популяцию МСК, по меньшей мере, 24 часа в условиях содержания кислорода на физиологическом уровне, предпочтительно около 5%, и в условиях нормогликемии, предпочтительно при концентрации глюкозы около 1 г/л глюкозы.
2
В одном из вариантов осуществления культивируют популяцию МСК в условиях нормоксии, предпочтительно при содержании O около 21%, и в условиях нормогликемии, предпочтительно при концентрации глюкозы около 1 г/л вплоть, по меньшей мере, до 1-го, 2-го, 3-го или 4-го пассажа перед измерением уровня экспрессии ФСК-1α и/или ФРСЭ. В одном из вариантов осуществления культивируют популяцию МСК до конфлюэнтности перед измерением уровня экспрессии ФСК-1α и/или ФРСЭ. В другом варианте осуществления культивируют популяцию МСК вплоть, по меньшей мере, до конфлюэнтности около 80, 85, 90, 95, 99 или 100% перед измерением уровня экспрессии ФСК-1α и/или ФРСЭ.
В одном из вариантов осуществления мезенхимальные стволовые клетки являются недифференцированными, т.е. МСК не дифференцированы в клетки определенных типов, в частности, в фибробласты.
В одном из вариантов осуществления выделяют МСК из тканей, выбранных из группы, включающей жировую ткань, костный мозг, пуповинную кровь, вартонов студень (например, вартонов студень из пуповины), околоплодные воды, плаценту, периферическая кровь, фаллопиеву трубу, роговичную строму, легкие, мышцы, кожу, кости, дентин и плодную печень и т.п. В одном из частных вариантов осуществления выделяют МСК из жировой ткани. В одном из предпочтительных вариантов осуществления МСК представляют собой стволовые клетки жировой ткани (называемые СКЖТ или МСКЖТ).
В одном из вариантов осуществления МСК выделяют из любых тканей теплокровных животных, предпочтительно из тканей человека, свиньи, крупного рогатого скота или лошади, более предпочтительно из тканей человека. В одном из частных вариантов осуществления МСК представляют собой СКЖТ человека.
В одном из вариантов осуществления клетками являются клетки в культуре, предпочтительно линии клеток и/или производные эмбриональных клеток, т.е. клетки, выделенными непосредственно из ткани. В одном из вариантов осуществления клетки извлекают из взятого у индивида образца, полученного, например, путем биопсии. Стадия взятия образца у индивидуума предпочтительно не является частью способа согласно настоящему изобретению.
Выделение мезенхимальных стволовых клеток может осуществляться любым приемлемым способом, известным специалисту в данной области техники. Примеры способов выделения МСК включают без ограничения расщепление коллагеназой, трипсинизацию или культивирование в искусственной среде.
В одном из частных вариантов осуществления выделяют мезенхимальные стволовые клетки из жировой ткани путем расщепления ткани, например, коллагеназой.
В одном из вариантов осуществления МСК согласно изобретению могут постоянно или временно трансфицироваться или трансдуцироваться представляющей интерес нуклеиновой кислотой с использованием применимой плазмидной, вирусной или альтернативной векторной стратегии. Представляющие интерес нуклеиновые кислоты включают без ограничения кодирующие генные продукты, которые усиливают продуцирование компонентов внеклеточного матрикса, обнаруженных в ткани, подлежащего восстановлению типа.
В одном из вариантов осуществления изобретения после выделения культивируют популяцию МСК в любой известной специалистам культуральной среде, способной поддерживать рост клеток. В настоящем изобретении такая культуральная среда называется "пролиферативной средой" или "средой для выращивания". Примеры среды для выращивания включают без ограничения среды MEM, DMEM, CMRL, EVIDM, RPMI 1640, FGM или FGM-2, 199/109, HamF10/HamF12 или 5A McCoy, предпочтительно DMEM или RPMI.
В одном из вариантов осуществления культуральная среда также может содержать любые дополнительные факторы. Примеры дополнительных факторов включают без ограничения ФБС; лизат тромбоцитов; глицин; аминокислоты, такие как глутамин, аспарагин, глутаминовая кислота, аспарагиновая кислота, серии, пролин или аланин, предпочтительно аминокислоты, имеющие L-конфигурацию; и антибиотики, такие как стрептомицин или пенициллин.
2
В одном из вариантов осуществления культивируют популяцию МСК в стандартных условиях культивирования. Используемый термин "стандартные условия культивирования" означает культивирование при температуре 37°C и содержании CO 5%.
В одном из вариантов осуществления популяция МСК согласно изобретению не дифференцирована в определенную ткань. Соответственно, в одном из вариантов осуществления не культивируют популяцию МСК согласно изобретению в условиях, имеющих целью индуцировать дифференцировку, таких как, например, среда для дифференцировки. В одном из частных вариантов осуществления не культивируют популяцию МСК согласно изобретению в среде для дифференцировки в остеобласты, среде для дифференцировки в мышечные клетки или среде для дифференцировки в кожные клетки.
В одном из вариантов осуществления получают преимущественно чистую популяцию МСК путем культивирования популяции МСК вплоть, по меньшей мере, до 3-го пассажа, предпочтительно в условиях нормоксии и нормогликемии.
В одном из вариантов осуществления популяция МСК может быть заморожена, предпочтительно, по меньшей мере, после 3-го пассажа. В качестве примера, популяция клеток может быть заморожена и храниться в жидком азоте или при любой температуре, предпочтительно от около -0°C до -196°C до тех пор, пока клетки могут использоваться в качестве стволовых клеток после их оттаивания. В одном из вариантов осуществления популяция МСК может быть оттаиваться и дополнительно увеличиваться с целью получения свежих клеток.
В одном из вариантов осуществления биосовместимый матрикс образован биорассасывающимся биологическим материалом. Используемый термин "биорассасывающийся" означает, что биологический материал может ассимилироваться, растворяться или поглощаться в организме и не требует удаления механическим путем или вручную.
В одном из вариантов осуществления биосовместимый матрикс согласно изобретению образован материалом, который обеспечивает структурную поддержку роста и распространения клеток. В одном из вариантов осуществления биосовместимый матрикс содержит природный или синтетический материал или его химическое производное, выбранное из группы, включающей агар/агарозу, альгинат-хитозан, хондроитинсульфат, коллаген, эластин или эластин-подобные пептиды (ELP), фибриноген, фибрин, фибронектин, желатин, протеогликаны гепарансульфата, гиалуроновую кислоту, полиангидриды, полимолочную кислоту (PLA), сополимер молочной и гликолевой кислот (PLGA), полиэтиленоксид/полиэтиленгликоль (PEO/PEG), поливиниловый спирт (PVA), полимеры на основе фумарата, такие как, например, поли(пропиленфумарат) (PPF) или сополимер пропиленфумарата и этиленгликоля (P(PF-co-EG)), олиго(поли(этиленгликоль)фумарат) (OPF), поли(n-изопропилакриламид) (PNIPPAAm), поли(альдегидный гулуронат) (PAG), полиангидриды, поли(n-винилпирролидон) (PNVP), самоорганизующиеся олигопептидные гели и/или любой другой применимый гидрогелевый материал в качестве носителя клеток для дополнения роста ткани. В одном из частных вариантов осуществления биосовместимый матрикс согласно изобретению содержит коллаген, такой как, например, коллаген типа I.
В одном из вариантов осуществления биосовместимый матрикс согласно изобретению получен из любых коллагеновых тканей. Примеры коллагеновых тканей включают без ограничения кожу, дерму, сухожилия, связки, мышцы, амнион, мениск, подслизистую оболочку тонкой кишки, сердечный клапан, сосуды и мочевой пузырь. В одном из частных вариантов осуществления биосовместимый матрикс согласно изобретению получен из сухожилия, предпочтительно из широкой фасции.
В одном из вариантов осуществления биосовместимый матрикс взят у индивида. В одном из вариантов осуществления биосовместимый матрикс взят у человека. В другом варианте осуществления биосовместимый матрикс взят у животного, не являющегося человеком. Такие биосовместимые матриксы предлагаются на рынке. Примеры предлагаемых на рынке биосовместимых матриксов включают без ограничения, Integra (Integra LifeSciences Corporation), Matriderm (Skin & Health Care), Alloderm (Life Cell) и Puramatrix (3-D Matrix Medical Technology). Стадия получения биосовместимого матрикса у индивида предпочтительно не является частью способа согласно настоящему изобретению.
В одном из частных вариантов осуществления изобретения биосовместимый матрикс получен из широкой фасции человека.
В одном из вариантов осуществления биосовместимый матрикс согласно изобретению обладает низкой иммуногенностью или не обладает иммуногенностью. В одном из вариантов осуществления биосовместимый матрикс обрабатывают любыми биологическими, химическими и/или физическими средствами с целью снижения его иммуногенности. После снижения иммуногенности биосовместимый матрикс согласно изобретению является менее иммуногенным, чем необработанный биосовместимый матрикс того же типа.
В одном из вариантов осуществления с целью снижения иммуногенности обрабатывают биосовместимый матрикс, чтобы удалить клеточные мембраны, нуклеиновые кислоты, липиды и цитоплазматические компоненты. После снижения иммуногенности биосовместимый матрикс содержит в исходном состоянии компоненты, обычно связанные с матриксом, такие как, например, коллаген, эластины, гликозаминогликаны и протеогликаны.
В одном из вариантов осуществления обрабатывают биосовместимый матрикс с целью снижения иммуногенности. В одном из вариантов осуществления биосовместимый матрикс согласно настоящему изобретению является, по меньшей мере, на 50, 60, 70, 80 или 90% менее иммуногенным, чем необработанный биосовместимый матрикс того же типа. Параметры оценки иммуногенности матрикса легко поддаются измерению стандартными методами, известными врачам.
Примеры способов снижения иммуногенности включают без ограничения децеллюляризацию биосовместимого матрикса и разрушение клеток биосовместимого матрикса.
В одном из вариантов осуществления биосовместимый матрикс изобретения обработан методом разрушения клеток. Примеры методов разрушения клеток включают без ограничения криоконсервацию, циклическое замораживание/оттаивание и облучение.
В другом варианте осуществления биосовместимый матрикс согласно изобретению обработан методом децеллюляризации. Используемый термин "метод децеллюляризации" означает способ удаления эндогенных клеток из биосовместимого матрикса путем использования физических, химических или биохимических средств. Примеры средств включают без ограничения ферменты, такие как протеазы и/или нуклеазы; химические вещества, такие как кислоты, основания, ионные детергенты, неионные детергенты, поверхностно-активные вещества и/или цвиттер-ионные детергенты; обезжиривающие агенты, такие как ацетон; и/или лиофилизацию.
В одном из вариантов осуществления биосовместимый матрикс согласно изобретению является ацеллюлярным. В одном из вариантов осуществления биосовместимый матрикс содержит не более 40, 35, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% или менее эндогенных клеток по сравнению с биосовместимым матриксом того же типа, из которого не удалены эндогенные клетки.
Децеллюляризация может представляться в количественной форме любым способом, известным специалистам в данной области. Примеры способов представления децеллюляризации в количественной форме включают без ограничения окрашивание 40,6-диамидинофенилиндолом (DAPI) или измерение концентрации ДНК в обработанном биосовместимом матриксе по сравнению с биосовместимым матриксом до обработки или с биосовместимым матриксом того же типа, который не был обработан.
В одном из предпочтительных вариантов осуществления биосовместимым матриксом является ацеллюлярный коллагеновый матрикс, предпочтительно ацеллюлярный коллагеновый матрикс человека (АКМЧ или НАСМ, от английского - human acellular collagen matrix).
2
2
2
2
В одном из вариантов осуществления получают биосовместимый матрикс, не содержащий поддающихся обнаружению химических остатков, таких как, например, ацетон или НО, и содержащий менее около 10% остаточной влаги, предпочтительно менее 8%. Такое получение биосовместимого матрикса может осуществляться любым приемлемым способом, известным специалистам в данной области техники. Так, в одном из вариантов осуществления изобретения биосовместимый матрикс не содержит химических остатков, таких как, например, ацетон или НО, и содержит менее около 10% остаточной влаги, предпочтительно менее 8%.
В другом варианте осуществления стерилизуют биосовместимый матрикс во избежание передачи инфекционных заболеваний, таких как, например, ВИЧ, вирусы гепатита С и В (ВГС и ВГВ) и бактериальные инфекции. Примеры способов стерилизации включают без ограничения стерилизацию химическими веществами, тепловую стерилизацию, стерилизацию ультрафиолетовым и ионизирующим излучением, такую как облучение гамма-лучами.
В одном из вариантов осуществления биосовместимый матрикс и популяция МСК согласно изобретению принадлежат к одному и тому же виду. В другом варианте осуществления биосовместимый матрикс и популяция МСК изобретения принадлежат к различным видам. В другом варианте осуществления биосовместимый матрикс и популяция МСК изобретения взяты у одного и того же субъекта-донора, который необязательно может являться субъектом-реципиентом. В другом варианте осуществления биосовместимый матрикс и популяция МСК согласно изобретению взяты у различных субъектов, один которых может являться субъектом-реципиентом или ни один из которых может не являться субъектом-реципиентом.
В одном из вариантов осуществления инкубируют популяцию мезенхимальных стволовых клеток с биосовместимым матриксом. Используемый термин "инкубированный" означает, что популяция мезенхимальных стволовых клеток контактирует с биосовместимым матриксом.
В одном из вариантов осуществления высевают популяцию мезенхимных стволовых клеток на биосовместимый матрикс. В другом варианте осуществления высевают популяцию мезенхимальных стволовых клеток в биосовместимый матрикс. В другом варианте осуществления высевают популяцию мезенхимных стволовых клеток на биосовместимый матрикс и в биосовместимый матрикс.
В одном из вариантов осуществления высевают клетки композиции в любом порядке. Например, клетки могут однородно распределяться по всему биосовместимому матриксу или распределяться в заданных зонах, областях или слоях внутри биосовместимого матрикса.
Посев клеток предпочтительно проводят в применимых условиях температуры, рН, ионной силы и чистоты для поддержания жизнеспособности клеток.
В одном из вариантов осуществления культивируют популяцию МСК вплоть, по меньшей мере, до 2-го, 3-го, 4-го или 5-го пассажа перед инкубацией с биосовместимым матриксом. Используемый термин "культивированный вплоть, по меньшей мере, до 4-го пассажа" означает, что, по меньшей мере, 4 раза отделяют популяцию клеток и переносят ее в новый сосуд. В одном из частных вариантов осуществления культивируют популяцию МСК вплоть до 4-го пассажа перед инкубацией с биосовместимым матриксом.
В одном из вариантов осуществления мезенхимальные стволовые клетки, инкубированные с биосовместимым матриксом, представляют собой мезенхимальные стволовые клетки позднего пассажа.
В одном из вариантов осуществления пассируют популяцию МСК, когда популяция МСК достигает 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 или 100% конфлюэнтности.
В другом варианте осуществления культивируют популяцию МСК в течение, по меньшей мере, 24 часов, предпочтительно, по меньшей мере, 36, 48, 60 или 72 часов до инкубации с биосовместимым матриксом.
В другом варианте осуществления культивируют популяцию МСК в течение, по меньшей мере, 1 дня, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 дней до инкубации с биосовместимым матриксом.
2
2
2
В некоторых вариантах осуществления инкубируют биосовместимый матрикс с популяцией МСК в 12-луночных или 24-луночных планшетах или в колбах для культур клеток размером 25 см, 75 см или 150 см.
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
В одном из вариантов осуществления подсчитывают популяцию МСК и первоначально инкубируют с биосовместимым матриксом при плотности, по меньшей мере, 0,5×10, 1×10, 2×10 или 3×10 клеток на лунку. В другом варианте осуществления первоначально инкубируют популяцию МСК с биосовместимым матриксом при плотности от около 0,5×10 до около 5×10 клеток на лунку, предпочтительно от около 1×10 до около 4×10 клеток на лунку, более предпочтительно от около 2×10 до около 3×10 клеток на лунку. В одном из предпочтительных вариантов осуществления первоначально инкубируют популяцию МСК с биосовместимым матриксом при плотности около 2×10 клеток на лунку.
4
4
4
4
2
4
4
2
4
4
2
4
4
2
4
2
В одном из вариантов подсчитывают популяцию МСК и первоначально инкубируют с биосовместимым матриксом при плотности, по меньшей мере, 1×10, 2,5×10, 5×10 или 8×10 клеток/см чашек или планшетов для культивирования. В другом варианте осуществления первоначально инкубируют популяцию МСК с биосовместимым матриксом при плотности от около 1×10 до около 15×10 клеток/см чашек или планшетов для культивирования, предпочтительно от около 2,5×10 до около 12,5×10 клеток/см, более предпочтительно от около 5×10 до около 8×10 клеток/см. В одном из предпочтительных вариантов осуществления первоначально инкубируют популяцию МСК с биосовместимым матриксом при плотности около 5×10 клеток/см чашек или планшетов для культивирования.
5
5
5
5
2
5
5
2
5
5
2
5
5
2
5
5
2
В одном из вариантов осуществления подсчитывают популяцию МСК и первоначально инкубируют с биосовместимым матриксом при плотности, по меньшей мере, 0,25×10, 0,5×10, 1×10 или 1,5×10 клеток/см чашек или планшетов для культивирования. В другом варианте осуществления первоначально инкубируют популяцию МСК с биосовместимым матриксом при плотности от около 0,25×10 до около 2,5×10 клеток/см чашек или планшетов для культивирования, предпочтительно от около 0,5×10 до около 2×10 клеток/см, более предпочтительно от около 1×10 до около 1,5×10 клеток/см. В одном из предпочтительных вариантов осуществления первоначально инкубируют популяцию МСК с биосовместимым матриксом при плотности около 1×10 до около 1,5×10 клеток/см чашек или планшетов для культивирования.
2
В одном из вариантов осуществления инкубация биосовместимого матрикса с популяцией мезенхимальных стволовых клеток согласно изобретению происходит в описанной выше культуральной среде. В некоторых вариантах осуществления инкубация происходит при температуре 37°C в 5% CO.
В одном из вариантов осуществления культивируют композицию после того, как популяция МСК контактирует с биологическим матриксом. В одном из вариантов осуществления культивируют композицию согласно изобретению до достижения конфлюэнтности МСК. В другом варианте осуществления культивируют композицию согласно изобретению до достижения, по меньшей мере, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 или 100% конфлюэнтности МСК.
В другом варианте осуществления культивируют композицию согласно изобретению в течение, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 дней после контакта с популяцией МСК и биологическим матриксом. В другом варианте осуществления культивируют композицию согласно изобретению в течение более 30 дней. В другом варианте осуществления культивируют композицию согласно изобретению течение от 3 до 30 дней, от 5 до 25 дней, от 5 до 20 дней, от 5 до 15 дней или от 5 до 10 дней.
В одном из вариантов осуществления изобретения после культивирования промывают композицию согласно изобретению с целью удаления культуральной среды. В одном из частных вариантов осуществления промывают композицию забуференным фосфатом физиологическим раствором (PBS).
2
В одном из вариантов осуществления композиция согласно изобретению секретируют не более 100 пг/мл ФСК-1α, предпочтительно не более 50, 40, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 пг/мл при культивировании композиции в течение, по меньшей мере, 24 часов в условиях гипоксии, предпочтительно при содержании О около 0,1%.
В соответствии с другим вариантом осуществления композиция согласно изобретению секретируют не более 100 пг/мл ФСК-1α, предпочтительно не более 50, 40, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 пг/мл ФСК-1α при культивировании композиции в течение, по меньшей мере, 24 часов в условиях нормогликемии, предпочтительно при концентрации глюкозы около 1 г/л.
В соответствии с другим вариантом осуществления композиция согласно изобретению секретируют не более 50 пг/мл ФСК-1α, предпочтительно не более 40, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 пг/мл ФСК-1α при культивировании композиции в течение, по меньшей мере, 24 часов в условиях гипергликемии, предпочтительно при концентрации глюкозы около 4,5 г/л.
2
В одном из вариантов осуществления композиция согласно изобретению секретируют, по меньшей мере, 200 пг/мл ФРСЭ, предпочтительно, по меньшей мере, около 250, 260, 270, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 299 или 290 пг/мл ФРСЭ при культивировании композиции в течение, по меньшей мере, 24 часов в условиях гипоксии, предпочтительно при содержании О около 0,1%, и в условиях гипергликемии, предпочтительно при концентрации глюкозы около 4,5 г/л.
В другом варианте осуществления композиция согласно изобретению секретируют, по меньшей мере, около 90 пг/мл ФРСЭ, предпочтительно, по меньшей мере, около 95, 100, 105, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119 или 120 пг/мл ФРСЭ при культивировании композиции в течение, по меньшей мере, 24 часов в условиях содержания кислорода на физиологическом уровне, предпочтительно около 5%, и в условиях гипергликемии, предпочтительно при концентрации глюкозы около 4,5 г/л.
В другом варианте осуществления композиция согласно изобретению секретируют, по меньшей мере, около 160 пг/мл ФРСЭ, предпочтительно, по меньшей мере, около 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169 или 170 пг/мл ФРСЭ при культивировании композиции в течение, по меньшей мере, 24 часов в условиях содержания кислорода на физиологическом уровне, предпочтительно около при 5%, и в условиях нормогликемии, предпочтительно при концентрации глюкозы около 1 г/л.
2
В одном из вариантов осуществления согласно изобретению секретируют не более 50 пг/мл ФСК-1α, предпочтительно не более 40, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 пг/мл ФСК-1α; и, по меньшей мере, около 200 пг/мл ФРСЭ, предпочтительно, по меньшей мере, 250, 260, 270, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 299 или 290 пг/мл ФРСЭ при культивировании композиции в течение, по меньшей мере, 6 часов в условиях гипоксии, предпочтительно при содержании O около 0,1%, и в условиях гипергликемии, предпочтительно при концентрации глюкозы около 4,5 г/л.
В другом варианте осуществления композиция согласно изобретению секретируют не более 50 пг/мл ФСК-1α, предпочтительно не более 40, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 пг/мл ФСК-1α; и, по меньшей мере, около 90 пг/мл ФРСЭ, предпочтительно, по меньшей мере, около 95, 100, 105, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119 или 120 пг/мл ФРСЭ при культивировании композиции в течение, по меньшей мере, 6 часов в условиях содержания кислорода на физиологическом уровне, предпочтительно около 5%, и в условиях гипергликемии, предпочтительно при концентрации глюкозы около 4,5 г/л.
В другом варианте осуществления композиция согласно изобретению секретируют не более 100 пг/мл ФСК-1α, предпочтительно не более 50, 40, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 пг/мл ФСК-1α; и, по меньшей мере, около 160 пг/мл ФРСЭ, предпочтительно, по меньшей мере, около 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169 или 170 пг/мл ФРСЭ при культивировании композиции в течение, по меньшей мере, 24 часов в условиях содержания кислорода на физиологическом уровне, предпочтительно около 5%, и в условиях нормогликемии, предпочтительно при концентрации глюкозы около 1 г/л.
В одном из вариантов осуществления культивируют композицию согласно изобретению до достижения конфлюэнтности популяции МСК перед измерением уровня экспрессии ФСК-1α и/или ФРСЭ. В другом варианте осуществления культивируют композицию до достижения, по меньшей мере, около 80, 85, 90, 95, 99 или 100% конфлюэнтности популяции МСК перед измерением уровня экспрессии ФСК-1α и/или ФРСЭ.
В одном из вариантов осуществления композицией согласно изобретению является устройство (такое как, например, медицинское устройство), пленка, трехмерная структура, повязка, композитный трансплантат, заменитель мягкой ткани, фармацевтическая композиция и т.п.
В одном из вариантов осуществления в композицию согласно изобретению могут добавляться дополнительные компоненты, являющиеся по своей природе гормоном, белком, нуклеиновой кислотой, липидом и/или углеводом, в любом количестве, которое позволит добавленному компоненту являться положительным или отрицательным эффектором адгезии, роста, дифференцировки, пролиферации, васкуляризации, приживления и трехмерного моделирования популяции МСК в композиции согласно изобретению. Примеры таких компонентов, применимых для использования в композиции, включают без ограничения естественные варианты или фрагменты иммуностимуляторов, иммуносупрессоров и/или иммуноадъювантов, таких как цитокины, лимфокины, монокины, факторы роста стволовых клеток, лимфотоксины, гемопоэтические факторы, колониестимулирующие факторы (КСФ), интерфероны (ИФ), паратиреоидный гормон, тироксин, инсулин, проинсулин, релаксин, прорелаксин, фолликулостимулирующий гормон (ФСГ), тиреотропный гормон (ТТГ), лютеинизирующий гормон (ЛГ), фактор роста печени, простагландин, фактор роста фибробластов, пролактин, плацентарный лактоген, лептин, трансформирующий фактор роста (ТФР), ТФР-α, ТФР-β, инсулиноподобный фактор роста (ИФР), эритропоэтин, тромбопоэтин, фактор некроза опухоли (ФНО), ФНО-α, ФНО-β, антимюллеров гормон, связанный с гонадотропином мыши пептид, ингибин, активин, фактор роста эндотелия сосудов, интегрин, интерлейкин (ИЛ), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (Г-КСФ), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ), интерферон-α, интерферон-β, интерферон-γ, SI-фактор, ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-5, IL-6, ИЛ-7, ИЛ-8, ИЛ-9, ИЛ-10, ИЛ-11, ИЛ-12, ИЛ-13, ИЛ-14, ИЛ-15, ИЛ-16, ИЛ-17, ИЛ-18 ИЛ-21, ИЛ-25, LIF, kit-лиганд, FLT-3, ангиостатин, тромбоспондин, эндостатин, LT, кортикостероиды, циклоспорин, метотрексат и т.п. независимо от того, являются ли какие-либо из указанных компонентов специфическими или неспецифическими. Способы получения вариантов хорошо известны из техники и могут включать, например, консервативные замены аминокислот или мутагенез и анализ полученного варианта на наличие требуемых функциональных возможностей.
В одном из вариантов осуществления дополнительные компоненты могут присутствовать в композиции согласно изобретению в любом количестве, которое позволяет добавленному компоненту обеспечивать большее удобство и простоту применения композиции или обращения с ней без существенного изменения стабильности или формы композиции согласно изобретению. Примеры таких компонентов, применимых для использования в композиции, включают без ограничения антисептики, антибиотики, противовирусные средства, антиоксиданты, анестетики, пластификаторы, консерванты, среду для выращивания клеток и/или криопротекторы.
Настоящее изобретение также относится к способу получения композиции, содержащей биосовместимый матрикс и популяцию мезенхимальных стволовых клеток, включающему:
а - выделение мезенхимальных стволовых клеток (МСК), предпочтительно стволовых клеток жировой ткани,
б - получение преимущественно чистой популяции МСК и
в -  инкубацию популяции МСК с биосовместимым матриксом.
В одном из вариантов осуществления способ получения композиции, содержащей биосовместимый матрикс и популяцию мезенхимальных стволовых клеток, включает инкубацию преимущественно чистой популяции МСК с биосовместимым матриксом.
В одном из вариантов осуществления способ получения композиции, содержащей биосовместимый матрикс и популяцию мезенхимальных стволовых клеток, включает:
а - выделение мезенхимальных стволовых клеток (МСК),
б - получение популяции МСК, содержащей менее 25% фибробластов, и
в -  инкубацию популяции МСК с биосовместимым матриксом.
В другом варианте осуществления способ получения композиции, содержащей биосовместимый матрикс и популяцию мезенхимных стволовых клеток, включает инкубацию популяции МСК, содержащей менее 25% фибробластов с биосовместимым матриксом.
В одном из вариантов осуществления способ получения композиции, содержащей биосовместимый матрикс и популяцию стволовых клеток жировой ткани, включает:
а - выделение стволовых клеток жировой ткани (СКЖТ),
б - получение преимущественно чистой популяции СКЖТ и
в - инкубацию популяцию СКЖТ с коллагенсодержащим биосовместимым матриксом.
В другом варианте осуществления способ получения композиции, содержащей биосовместимый матрикс и популяцию стволовых клеток жировой ткани, включает инкубацию преимущественно чистой популяции СКЖТ с коллагенсодержащим биосовместимым матриксом.
В одном из вариантов осуществления способ получения композиции, содержащей биосовместимый матрикс и популяцию стволовых клеток жировой ткани, включает:
а - выделение стволовых клеток жировой ткани (СКЖТ),
б - получение популяции СКЖТ, содержащей менее 25% фибробластов, и
в - инкубацию популяции СКЖТ с коллагенсодержащим биосовместимым матриксом.
В другом варианте осуществления способ получения композиции, содержащей биосовместимый матрикс и популяцию стволовых клеток жировой ткани, включает инкубацию популяции СКЖТ, содержащей менее 25% фибробластов, с коллагенсодержащим биосовместимым матриксом.
Согласно еще одному варианту настоящего изобретения предложена описанная выше композиция согласно изобретению для лечения или применения при лечении повреждения мягких тканей у нуждающегося в этом субъекта.
В одном из вариантов осуществления повреждение мягкой ткани может являться результатом, например, заболевания, травмы или неспособности ткани нормально развиваться.
В одном из вариантов осуществления мягкая ткань, которую можно лечить композицией согласно изобретению, выбрана из группы, включающей кожную ткань, мышечную ткань, дермальную ткань, ткань сухожилий, ткань связок, ткань мениска, ткань сердечного клапана, сосудистую ткань, слизистую оболочку желудка, ткань барабанной перепонки, амнион и ткань мочевого пузыря.
В одном из вариантов осуществления композиция согласно изобретению предназначена для лечения или применения при лечении повреждения кожи. В другом варианте осуществления композиция согласно изобретению предназначена для лечения или применения при лечении повреждения мышц.
В одном из вариантов осуществления повреждение мягких тканей, которое можно лечить композицией, выбрано из группы, включающей кожные раны, ожоги кожи, язвы кожи, заболевания мышц (такие как, например, воспалительные заболевания мышц, нейрогенные заболевания мышц, миогенные заболевания мышц, мышечные дистрофии, врожденные миопатии или миастению), грыжи, хирургические раны (такие как, например, послеоперационные раны) или сосудистые заболевания (такие как, например, заболевания периферических артерий, аневризмы брюшной аорты, заболевания сонной артерии, венозные заболевания или сосудистые повреждения).
В одном из вариантов осуществления композиция согласно изобретению предназначена для лечения или применения при лечении кожной раны, ожога кожи или язвы кожи. В одном из частных вариантов осуществления композиция предназначена для лечения или применения при лечении язвы кожи вследствие дрепаноцитоза. В другом варианте осуществления композиция предназначена для лечения или применения при лечении язвы кожи вследствие васкулита. В другом варианте осуществления композиция предназначена для лечения или применения при лечении диабетической раны, такой как, например, диабетическая язва. В другом варианте осуществления композиция предназначена для лечения или применения при лечении радионекроза. В другом варианте осуществления композиция согласно изобретению предназначена для лечения или применения при лечении заболевания мышц.
В одном из вариантов осуществления повреждением мягкой ткани является острая рана (т.е. менее, чем спустя около 2-4 дней после повреждения). В другом варианте осуществления повреждением мягкой ткани является подострая рана (т.е. спустя от около 2-4 дней до 6 недель после повреждения). В другом варианте осуществления повреждением мягкой ткани является рана на поздней стадии (т.е. спустя около 6 недель после повреждения). В другом варианте осуществления повреждением мягкой ткани является хроническая рана. В одном из вариантов осуществления хроническая рана определяется по отсутствию полного заживления через 3 месяца. В другом варианте осуществления повреждением мягкой ткани является незаживающая рана.
В другом варианте осуществления композиция согласно изобретению обеспечивает модель ex vivo для исследования повреждения мягких тканей в соответствии с предыдущими особенностями.
В одном из вариантов осуществления у субъекта имеется, по меньшей мере, одно описанное выше повреждение мягких тканей. В одном из вариантов осуществления субъект является диабетиком. В одном из вариантов осуществления у субъекта диагностирован сахарный диабет, такой как, например, сахарный диабет типа I, сахарный диабет типа II, гестационный диабет, латентный аутоиммунный диабет, сахарный диабет типа 1,5, липоатрофический сахарный диабет, сахарный диабет взрослого типа у молодых, неонатальный сахарный диабет (например, перманентный неонатальный сахарный диабет или транзиторный неонатальный сахарный диабет), преддиабет, стероид-индуцированный сахарный диабет. В одном из вариантов осуществления субъект, которому вводят композицию, страдает сахарным диабетом типа I или сахарным диабетом типа II.
В одном из вариантов осуществления повреждение мягких тканей у субъекта ранее не лечили другим средством. В другом варианте осуществления субъект ранее получал, по меньшей мере, одно средство для лечения повреждения мягких тканей. Примеры других средств для лечения повреждения мягких тканей включают без ограничения закрытие ран швами, скобкой или клейкой лентой или клеем, противовоспалительные лекарственные средства, дренаж инфекции, хирургическое вмешательство, аутотрансплантацию кожи, ультразвуковую терапию, гипербарическую кислородную терапию, уход за больными, местное применение факторов роста и клеточный спрей из кератиноцитов.
В одном из вариантов осуществления биосовместимый матрикс согласно изобретению является ксеногенным для субъекта, которому вводится композиция. Одним из неограничивающих примеров является биосовместимый матрикс свиньи и субъект-человек.
В другом варианте осуществления биосовместимый матрикс согласно изобретению является аллогенным для субъекта, которому вводится композиция. Одним из неограничивающих примеров является биосовместимый матрикс человека и субъект-человек.
В одном из вариантов осуществления популяция МСК согласно изобретению является ксеногенной для субъекта, которому вводится композиция, т.е. ее источником является субъект другого вида. В другом варианте осуществления популяция МСК согласно изобретению является аллогенной для субъекта, которому вводится композиция, т.е. ее источником является генетически неидентичный субъект того же вида. В другом варианте осуществления популяция МСК согласно изобретению является сингенной для субъекта, которому вводится композиция, т.е. генетически идентичной или близкой ему с тем, чтобы минимизировать отторжение тканевого трансплантата. Сингенная популяция МСК включает аутогенную популяцию (т.е. источником которой является субъект, подлежащий лечению) и изогенную популяцию (т.е. источником которой является генетически идентичный, но другой субъект, например, идентичный близнец).
В одном из вариантов осуществления как биосовместимый матрикс, так и популяция МСК согласно изобретению являются ксеногенными для субъекта, которому вводится композиция. В другом варианте осуществления, по меньшей мере, биосовместимый матрикс или популяции МСК согласно изобретению является аллогенной для субъекта, которому вводится композиция. В другом варианте осуществления как биосовместимый матрикс, так и популяция МСК согласно изобретению являются аллогенными для субъекта, которому вводится композиция.
В одном из вариантов осуществления композиция согласно изобретению может вводиться субъекту любым способом, известным из техники. Примеры способов введения включают без ограничения имплантацию (такую как, например, хирургическая имплантация), местное применение, инъекция и трансплантация с другой тканью.
В одном из вариантов осуществления композиция согласно изобретению вводится субъекту местно. В другом варианте осуществления композиция согласно изобретению вводится субъекту путем хирургической имплантации. В другом варианте осуществления композиция согласно изобретению вводится субъекту путем инъекции.
В одном из вариантов осуществления композиция согласно изобретению вводится субъекту в месте повреждения мягких тканей. В некоторых вариантах осуществления композиция согласно изобретению сконфигурирована с учетом формы и/или размера ткани, подлежащей лечению. В некоторых вариантах осуществления до введения композиции согласно изобретению субъекту изменяют размер композиция по форме и/или размеру ткани, подлежащей лечению.
Изобретение также относится к способу лечения повреждения мягких тканей, включающему введение описанной выше композиции. В одном из вариантов осуществления композицию вводят местно или путем хирургической имплантации. В одном из вариантов осуществления композицию вводят в месте повреждения мягкой ткани.
В одном из вариантов осуществления способ лечения повреждения мягких тканей включает введение композиции согласно изобретению нуждающегося в этом субъекту. В одном из частных вариантов осуществления способ лечения повреждения мягких тканей включает введение композиции согласно изобретению пациенту, страдающему диабетом.
Другой задачей настоящего изобретения является создание способа усиления или улучшения закрытия раны, такой как, например, незаживающая кожная рана. Изобретение также относится к способу стимулирования регенерации мягких тканей, такой как, например, регенерация кожи или регенерация мышц.
Согласно другой особенности изобретения предложен способ стимулирования или усиления развития кровеносных сосудов, предпочтительно в месте повреждения мягких тканей. Согласно другой особенности изобретения предложен способ стимулирования или усиления синтеза грануляционной ткани, предпочтительно в месте повреждения мягких тканей. Согласно еще одной особенности изобретения предложен способ уменьшения фиброзного рубца, предпочтительно в месте повреждения мягких тканей.
Изобретение также относится к способу уменьшения некроза мягких тканей, такого как, например, некроз скелетных мышц.
Другой задачей настоящего изобретения является создание способа повышения эффективности аутотрансплантации, такой как, например, аутотрансплантация кожи, включающего введение композиции согласно изобретению до аутотрансплантации. В одном из вариантов осуществления повышение эффективности аутотрансплантации связано с уменьшением изъязвлений (частоты и размера).
Другой задачей настоящего изобретения является создание способа тестирования воздействия определенного соединения на композицию согласно изобретению, при этом способ включает введение соединения в контакт с композицией согласно изобретению и определение его воздействия на клетки, присутствующие в композиции.
Примеры определения воздействия соединения на клетки, присутствующие в композиции, включают без ограничения, секрецию фактора роста кератиноцитов (ФРК) для ремоделирования эпидермиса и ФРСЭ для развития кровеносных сосудов в дерме в обоих случаях для регенерации кожи; секрецию ФРСЭ, ИФР-1, фактора роста гепатоцитов (ФРГ), ФРФ и ТФР-β, связанных с активацией, пролиферацией и дифференцировкой клеток-предшественников, для регенерации скелетных мышц; и секрецию ФРСЭ в зависимости от оксигенации тканей.
Другой задачей настоящего изобретения является создание способа тестирования воздействия определенного соединения на пленкообразование, трехмерную структуру, перевязочный материал, композитный трансплантат или заменитель мягких тканей согласно изобретению, при этом способ включает введение соединения в контакт с композицией согласно настоящему изобретению и определение воздействия соединения на пленкообразование, трехмерную структуру, перевязочный материал, композитный трансплантат или заменитель мягких тканей согласно изобретению.
Примеры определения воздействия соединения на пленкообразование, трехмерную структуру, перевязочный материал, композитный трансплантат или заменитель мягких тканей согласно изобретению включают без ограничения повторную колонизацию трехмерного клеточного каркаса in vitro чистыми стволовыми клетками; и распластывание стволовых клеток in vitro с целью восстановления поверхности клеточного каркаса.
Другой задачей настоящего изобретения является создание способа тестирования терапевтического воздействия определенного соединения на описанное повреждение мягких тканей, при этом способ включает:
введение соединения в контакт с композицией согласно изобретению, содержащей МСК, полученные от субъекта, подлежащего лечению, или субъекта, страдающего патологией или состоянием, подлежащим лечению, и
определение терапевтического воздействия соединения на композицию согласно изобретению, чтобы определить, может ли соединение использоваться для лечения повреждения мягких тканей у нуждающегося в этом пациента.
Примеры определения терапевтического воздействия соединения на композицию согласно изобретению включают без ограничения секрецию профиля избирательного высвобождения факторов роста в зависимости от тканевой раны, таких как ФРК для регенерации эпидермиса; и способность чистых стволовых клеток (полученных от субъектов, страдающих и не страдающих диабетом) лечить диабетическую кожную раны.
Другой задачей изобретения является тестирование или тестирование эффективности, чтобы определить, применима ли композиция согласно изобретению для использования при лечении повреждения мягких тканей, при этом:
получают композицию согласно изобретению, как описано выше,
анализируют композицию или пленку, трехмерную структуру, перевязочный материал, композитный трансплантат или заменитель мягких тканей согласно изобретению, чтобы определить, имеет ли он, по меньшей мере, одну характеристику мягкой ткани, подлежащей лечению.
Примеры определения, по меньшей мере, одной характеристики мягкой ткани, подлежащей лечению, включают без ограничения повышенную секрецию ФРСЭ чистыми стволовыми клетками в трехмерной композиции в условиях гипоксии.
Краткое описание Фигур
На Фиг. 1 показан график, иллюстрирующий определение общего количества белка, выделенного из широкой фасции на различных стадиях способа децеллюляризации.
На Фиг. 2 показан набор графиков, иллюстрирующих определение количества ФСК-1α (А), ФРСЭ (В), оФРФ (С) и ИФР (D), выделенных из широкой фасции на различных стадиях способа децеллюляризации.
На Фиг. 3 показан график, иллюстрирующий определение общего количества ДНК, выделенной из широкой фасции до и после способа децеллюляризации.
На Фиг. 4 показан график, иллюстрирующий определение общего количества белка, выделенного из дермальных тканей на различных стадиях способа децеллюляризации.
На Фиг. 5 показан набор графиков, иллюстрирующих определение количества ФСК-1α (А), ФРСЭ (В) и оФРФ (С), выделенных из дермальных тканей на различных стадиях способа децеллюляризации.
На Фиг. 6 показан график, иллюстрирующий определение общего количества ДНК, выделенной из дермальных тканей до и после способа децеллюляризации.
На Фиг. 7 показан график, иллюстрирующий определение общего количества белка, выделенного из губчатой кости на различных стадиях способа децеллюляризации.
На Фиг. 8 показан набор графиков, иллюстрирующих определение количества ФСК-1α (А), ФРСЭ (В), оФРФ (С) и ИФР (D), выделенных из губчатого вещества костей на различных стадиях способа децеллюляризации.
На Фиг. 9 показан график, иллюстрирующий определение общего количества ДНК, выделенной из губчатого вещества костей до и после способа децеллюляризации.
На Фиг. 10 показан график, иллюстрирующий определение общего количества белка, выделенного из кортикального слоя костей на различных стадиях способа децеллюляризации.
На Фиг. 11 показан набор графиков, иллюстрирующих определение количества ФСК-1α (А), ФРСЭ (В) и оФРФ (С), выделенных из кортикального слоя костей на различных стадиях способа децеллюляризации.
На Фиг. 12 показан график, иллюстрирующий определение общего количества ДНК, выделенной из кортикального слоя костей до и после способа децеллюляризации.
На Фиг. 13 показана фотография, иллюстрирующая СКЖТ и КФ в пролиферативной среде (А) и в среде остеогенной дифференцировки (В).
На Фиг. 14 показан график, иллюстрирующий пролиферацию клеток СКЖТ и КФ в соответствии с количеством пассажей.
2
На Фиг. 15 показана гистограмма, иллюстрирующая выживаемость клеток СКЖТ и КФ в пролиферативной среде без ФБС при содержании O 0,1% или 5%.
2
На Фиг. 16 показан набор гистограмм, иллюстрирующих секрецию ФРК (А), оФРФ (В), ИФР-1 (С) и ФРГ (D) при пяти различных разведениях СКЖТ/КФ в пролиферативной среде при концентрации глюкозы 4,5 г/л и содержании O 0,1% или 5%.
2
На Фиг. 17 показан набор гистограмм, иллюстрирующих секрецию ФРСЭ (А) и ФСК-1α (В) при пяти различных разведениях СКЖТ/КФ в пролиферативной среде при концентрации глюкозы 4,5 г/л и содержании O 0,1%.
2
На Фиг. 18 показан набор гистограмм, иллюстрирующих секрецию ФРСЭ (А) и ФСК-1α (В) при пяти различных разведениях СКЖТ/КФ в пролиферативной среде при концентрации глюкозы 4,5 г/л и содержании O 5%.
2
На Фиг. 19 показана гистограмма, иллюстрирующая секрецию ФСК-1α при пяти различных разведениях СКЖТ/КФ в пролиферативной среде при концентрации глюкозы 4,5 г/л и содержании O 21%.
2
На Фиг. 20 показан набор гистограмм, иллюстрирующих секрецию ФРСЭ (А) и ФСК-1α (В) при пяти различных разведениях СКЖТ/КФ в среде для пролиферации при концентрации глюкозы 1 г/л и содержании O 0,1%.
2
На Фиг. 21 показан набор гистограмм, иллюстрирующих секрецию секреции ФРСЭ (А) и ФСК-1α (В) при пяти различных разведениях СКЖТ/КФ в пролиферативной среде при концентрации глюкозы 1 г/л и содержании O 5%.
2
На Фиг. 22 показана гистограмма, иллюстрирующая секрецию ФСК-1α 5 при пяти различных разведениях СКЖТ/КФ в пролиферативной среде при концентрации глюкозы 1 г/л и содержании O 21%.
2
На Фиг. 23 показан набор графиков, иллюстрирующих секреции ФРСЭ (А), ФСК-1α (В) и ФРК (С) МСКЖТ, кожными фибробластами (КФ) и кератиноцитами (Кц) при концентрации 1 г/л глюкозы и содержании O 5% (светло-серый) или 0,1% (темно-серый).
2
На Фиг. 24 показан набор графиков, иллюстрирующих секреции ФРСЭ (А), ФСК-1α (В) и ФРК (С) МСКЖТ, кожными фибробластами (КФ) и кератиноцитами (Кц) при содержании O 5% и концентрации глюкозы 1 г/л (светло-серый) или 4,5 г/л (темно-серый).
2
2
На Фиг. 25 показан набор графиков, иллюстрирующих секреции ФРСЭ (А), ФСК-1α (В) и ФРК (С) МСКЖТ, кожными фибробластами (КФ) и кератиноцитами (Кц) в физических условиях (при содержании O 5% и концентрации глюкозы 1 г/л, светло-серый) и в условиях диабетических ран (при содержании O 0,1% и концентрации глюкозы 4,5 г/л, темно-серый).
2
2
2
2
На Фиг. 26 показан набор графиков, иллюстрирующих секрецию ФРСЭ МСКЖТ (А) и кожными фибробластами (В) доноров-людей, страдающих и не страдающих диабетом, при содержании O 0,1% и концентрации глюкозы 1 г/л (0,1% nmglc), при содержании O 0,1% и концентрации глюкозы 4,5 г/л (0,1% Hglc), при содержании O 5% и концентрации глюкозы 1 г/л (5% nmglc) и при содержании O 5% и концентрации глюкозы 4,5 г/л глюкозы (5% Hglc).
2
2
2
2
На Фиг. 27 показан набор графиков, иллюстрирующих секрецию ФРК МСКЖТ (А) и кожными фибробластами (В) доноров-людей, страдающих и не страдающих диабетом, при содержании O 0,1% и концентрации глюкозы 1 г/л (0,1% nmglc), при содержании O 0,1% и концентрации глюкозы 4,5 г/л глюкозы (0,1% Hglc), при содержании O 5% и концентрации глюкозы 1 г/л (5% nmglc) и при содержании O 5% и концентрации глюкозы 4,5 г/л (5% Hglc).
На Фиг. 28 показана фотография, иллюстрирующая линиеспецифическую дифференцировку мезенхимальных СКЖТ: способность к дифференцировке в хондрогенном и адипогенном направлениях продемонстрирована окрашиванием ализариновым красным (осаждение кальция) (А), альциановым синим (осаждение гликозаминогликанов) (В) и масляным красным (внутриклеточные липидные капли) (С), соответственно (при 20-кратном увеличении).
На Фиг. 29 показан график, иллюстрирующий распластывание (А) и адгезию (В) СКЖТ на АКМЧ по сравнению с СКЖТ на лунках пластмассового планшета.
На Фиг. 30 показана фотография, иллюстрирующая гистологический и макроскопический анализ через 1 месяц и 3 месяца после имплантации композитного трансплантата (АКМЧ + СКЖТ) и только клеточного каркаса (АКМЧ, контроль) бестимусным крысам.
2
2
На Фиг. 31 показан график, иллюстрирующий секрецию ФРСЭ СКЖТ в условиях нормоксии (при содержании O 21%) или гипоксии (при содержании O 0,1%).
2
На Фиг. 32 показан график, иллюстрирующий плотность сосудов (число сосудов/2,56 см) в дерме бестимусных крыс через 1 месяц после подкожной имплантации АКМЧ + СКЖТ по сравнению только с АКМЧ (р=0,002; было проанализировано по пять представляющих интерес областей на микропрепарат).
На Фиг. 33 показана фотография, иллюстрирующая изменение клинического состояния пациента 1, страдающего радионекрозом.
На Фиг. 34 показана фотография, иллюстрирующая изменение клинического состояния пациентов 1 (А), 2 (В) и 3 (С) до имплантации (1), в момент имплантации (2) и через 22, 4 и 2 месяца (пациентов 1, 2 и 3 соответственно) (3).
На Фиг. 35 показан график, иллюстрирующий концентрации С-реактивного белка (СРБ) и фибриногена в момент имплантации и через 3, 13 и 28 дней.
На Фиг. 36 показана фотография, иллюстрирующая макрогистологию ткани раневого слоя по данным трехцветного окрашивания по Массону в день 0 (А) и день 56 (В) после имплантации у пациента 1.
На Фиг. 37 показан график, иллюстрирующий гистоморфометрический полуколичественный анализ ФРСЭ и фактора VIII (А) и CD3 и CD68 (В) до (светло-серый) и после имплантации (темно-серый) у пациента 1.
На Фиг. 38 показан набор фотографий, иллюстрирующих процесс закрытия раны при использовании только кожного аутотрансплантата (А), кожного аутотрансплантата после имплантации композитного трансплантата АКМЧ + СКЖТ (В) и кожного аутотрансплантата после имплантации только АКМЧ (С) у пациента 2 в день 0 при исследовании невооруженным глазом (1) и на уровне кожной ткани (2) и при максимальной продолжительности закрытия раны (28 дней, 65 дней и 16 дней, соответственно) (3).
2
2
На Фиг. 39 показан график, иллюстрирующий выживаемость МСК костного мозга и СКЖТ в условиях гипоксии (при содержании О 0,1%) относительно нормоксии (при содержании O 21%).
2
2
На Фиг. 40 показан набор графиков, иллюстрирующих секрецию ФРСЭ (А), ФРФ-бета (В), ИФР-1 (С), ТФР-бета (D) и ФРГ (Е) МСК костного мозга и СКЖТ в условиях нормоксии (при содержании O 21%) и гипоксии (при содержании О 0,1%). Результаты представлены как средняя величина ±SEM.
На Фиг. 41 показан график, иллюстрирующий распластывание МСК костного мозга и СКЖТ на АКМЧ (треугольники и квадраты соответственно) по сравнению с распластыванием клеток на пластмассовой лунке (прямая линия) (*р<0,05).
На Фиг. 42 показан график, иллюстрирующий рост МСК костного мозга и СКЖТ на АКМЧ (треугольники и квадраты соответственно) по сравнению с ростом клеток на пластмассовой лунке (прямая линия) (*§р<0,05).
На Фиг. 43 показан набор графиков, иллюстрирующих ангиогенез (А) и толщину фиброзной ткани (В) при некрозе мышц в результате лечения АКМЧ, рецеллюляризованным СКЖТ или МСК костного мозга, или только АКМЧ. Результаты представлены в сравнении с нелеченным некрозом мышц (имитация).
На Фиг. 44 показан график, иллюстрирующий ангиогенез эксплантированного трансплантата на основе АКМЧ, рецеллюляризованного с использованием СКЖТ или МСК костного мозга, или только АКМЧ через 30 дней после имплантации (р<0,05).
Примеры
Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано следующими примерами.
Пример 1. Биоактивность децеллюляризованных матриксов
Материал и методы
Децеллюляризация тканей человека
Приобрели ткань широкой фасции и кожную ткань человека в соответствии с общепринятыми стандартами Европейской Ассоциации скелетно-мышечной трансплантации (EAMST, Вена, 1997).
2
2
Выдержали ткань широкой фасции человека в чистом ацетоне в течение 24 часов, в простом эфире в течение 15 часов, а затем в 70-градусном этаноле в течение до 8 часов. Между каждой операцией интенсивно промывали ткань непрерывным потоком деминерализованной воды. Затем обработали ткань широкой фасции человека сочетанием NaOH 1N и NaCl в течение 1 часа и 15% НО в течение до 8 часов. После этого интенсивно промыли ткань деминерализованной водой в течение до 68 часов.
2
2
Выдержали кожную ткань человека в простом эфире в течение 8 часов, затем в 70-градусном этаноле в течение до 16 часов и промыли деминерализованной водой в течение 7 часов. Затем обработали кожную ткань человека сочетанием NaOH 1N и NaCl в течение 1 часа, затем промыли деминерализованной водой в течение 16 часов, и обработали 15% НО в течение до 15 часов. Дополнительно интенсивно промыли ткань деминерализованной водой в течение до 16 часов.
Получили губчатое вещество большой берцовой кости человека и кортикального слоя пяточной кости человека.
2
2
Начали обработку костных тканей (губчатого вещества и кортикального слоя) с центрифугирования с целью удаления костного мозга и крови. После центрифугирования разрезали трансплантаты и очистили деминерализованной водой. Затем обработали костные ткани в ацетоне в течение до 68 часов с последующей промывкой в течение 5 часов. Затем обработали костные ткани сочетанием 1N NaOH и NaCl в течение 1 часа с последующей промывкой деминерализованной водой в течение 3 часов, а затем обработали 15% НО в течение до 15 часов. Затем интенсивно промыли ткань деминерализованной водой в течение до 72 часов.
На каждой стадии децеллюляризации отбирали образец для выделения белков. Кроме того, определяли общее количество ДНК в нативных тканях, т.е. до децеллюляризации и в децеллюляризованных тканях, т.е. по окончании децеллюляризации.
Выделение и очистка белков
Выделили белки из широкой фасции и кожных тканей человека в соответствии с протоколом Wolf и др. (Biomaterials. 2012, 33(10): 2916-2925). Вкратце, инкубировали 300 мг ткани с 5 мл мочевинно-гепаринового буфера при рН 7,4 (2М мочевины, 50 мМ трис, 5 мг/мл гепарина, 10 мМ N-этилмалеимидов, 5 мМ бензамидина и 1 мМ фенилметилсульфонилфторида) в условиях перемешивания в течение до 24 часов при температуре 4°C. После центрифугирования с центробежным ускорением 3000 g в течение 30 мин удалили супернатант и обработали согласно такому же протоколу. Затем очистили второй супернатант методом эксклюзионной хроматографии и определили его количество методом ELISA.
Извлекли белки из костных тканей человека в соответствии с протоколом Pietrzal и др. (Radiat Oncol. 2007, 2(1):5). Вкратце, механически измельчили губчатое вещество и кортикальный слой костей с целью получения костного порошка. Инкубировали 300 мг костного порошка во влажном состоянии с 5 мл раствора, содержащего 4М гуанидина и 5 мМ бензамидина, в течение до 24 часов при температуре 4°C. Затем добавили 5 мл буфера трис-HCl, и инкубировали в течение до 5 часов при 4°C. После центрифугирования в течение 10 мин удалили супернатант, очистили методом эксклюзионной хроматографии, и определили его количество методом ELISA.
Определили общее количество белка с помощью набора для анализа ВСА в соответствии с инструкциями поставщика.
Определили уровни факторов роста для каждого образца с помощью наборов для анализа ELISA.
Результаты
Определение общего количества белка для широкой фасции и кожных тканей человека показывает снижение уровней белка вследствие децеллюляризации (фиг. 1 и 4). В случае как губчатого вещества, так и кортикального слоя костных тканей общее количество белка уменьшается на каждой стадии лечения вплоть до увеличения на последней стадии (фиг. 7 и 10). Это может быть связано с облучением гамма-лучами, которое способствует взаимодействиям с водородом и/или образованию дисульфидных связей между фрагментами деградированных белков.
Результаты определения количества цитокинов также указывают на сильное снижение уровней факторов роста вследствие обработки (фиг. 2, 5, 8 и 11). В частности, уровни ФРСЭ и ИФР сильно снижались на каждой стадии децеллюляризации (фиг. 2В и 2D, 5В, 8В и 8D и 11В). В тканях не были обнаружены ФРТ-ВВ и КМБ-2.
Определение количества ДНК для всех тестируемых тканей также демонстрирует серьезное снижение ДНК, присутствующей в децеллюляризованном матриксе, по сравнению с ДНК в нативных тканях (фиг. 3, 6, 9 и 12). Результаты указывают на элиминацию 82% содержащейся ДНК в случае широкой фасции, 35% в случае кожной ткани, 69% в случае губчатого вещества костных тканей и 65% в случае кортикального слоя костных тканей.
В совокупности эти результаты показывают сильную деградацию белков, в частности, деградацию цитокинов и элиминацию ДНК. Следовательно, децеллюляризованные матриксы, полученные способом согласно изобретению, являются инертным материалом, который можно вводить пациентам, не опасаясь отторжения или появления новой патологии.
Пример 2. Секреция факторов роста СКЖТ
Материалы и методы
Это исследование проводилось в соответствии с рекомендациями министерства здравоохранения Бельгии. Все процедуры закупок тканей и клинического исследования (В40320108280) были одобрены Комитетом по этике медицинского факультета Католического университета Лувена. Все материалы были получены от компаний Lonza (Вервье, Швейцария), Sigma-Aldrich (Сент-Луис, штат Миссури, США) или Invitrogen (Карлсбад, штат Калифорния, США), если не указано иное.
Выделение и культивирование СКЖТ и КФ
2
Осуществили комбинированный сбор жировых (в среднем: 7,4 г) и кожных (в среднем 1,5 см) тканей у 8 пациентов (Таблица 1), подвергающихся рекомендуемой пластической хирургии, после информированного согласия и серологического скрининга, путем липоаспирации методом Коулмана и биопсии кожи, соответственно. Выдержали образцы жировой ткани и кожи в стерильных условиях в течение максимум 60 минут при 4°C перед выделением стволовых клеток жировой ткани (СКЖТ) и кожных фибробластов (КФ).
2
Расщепили жировую ткань коллагеназой (1/2 в отношении веса к объему) на водяной бане при 37°C в течение 60 минут. Инактивировали коллагеназу в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (DMEM), дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой. Центрифугировали собранную ткань со скоростью 1500 об/мин в течение 10 минут при комнатной температуре. Суспендировали капли осадка в пролиферативной среде, состоящей из DMEM, дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой, L-глутамином (2 мМ) и антибиотиками (100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 1 мкл/мл амфотерицина В), и отфильтровали через сито с размером ячеек 500 мкм. Затем высеяли собранную суспензию в колбы размером 25 см с пролиферативной средой.
Выделили КФ путем экстрагирования из лишенных эпидермиса биопсий кожи, измельчили на фрагменты 2 мм×2 мм и поместили в пластмассовую лунку. Добавили небольшой объем пролиферативной среды во избежание отсоединения от поверхности пластмассы.
2
2
2
После 24-х часовой инкубации при 37°C и содержании CO 5% заменили пролиферативную среду. Этот первичный пассаж исходных клеток называется нулевым пассажем. Извлекли куски кожи из чашки для культивирования, когда на поверхности пластмассы, окружавшей фрагменты ткани, были видны сцепленные клетки. Сохраняли клетки в пролиферативной среде (которую заменяли 2 раза в неделю) вплоть до 4-го пассажа после последовательных трипсинизаций. Культивировали клетки от 3 доноров вплоть до 15-го пассажа с целью изучения профиля пролиферации в стандартных условиях культивирования (37°C, 21% O, 5% CO, 4,5 г/л глюкозы).
Характеристика профилей мембранных маркеров
В 4-м пассаже определили характеристики стандартных маркеров клеточной поверхности для СКЖТ и КФ (CD44, CD45, CD73, CD90, CD105, stro-1, CD106, CD146, CD166, CD19, CD31, CD1, CD79α, CD13, HLA-DR, CD14, CD34) [Dominici и др., Cytotherapy. 2006; 8 (4): 315-331; Bourin и др. Cytotherapy. 2013; 15: 641-648] путем клеточной сортировки с возбуждением флуоресценции (FACScan, BD Biosciences, Сан-Хосе, штат Калифорния).
Окрасили СКЖТ насыщающими количествами моноклональных антител: к Stro-1, к CD90, к CD106, к CD105, к CD146, к CD166, к CD44, к CD 19, к CD45 (Human Mesenchymal Stem Cell panel, R&D System, Миннеаполис, штат Миннесота, США), к CD44 (окрашенных РЕ моноклональных мышиных антител к CD44 человека, BD Bioscience, Франклин-Лейкс, штат Нью-Джерси, США), к CD73 (окрашенных FITC моноклональных мышиных антител к CD73 человека, BD Bioscience), к CD31 (окрашенных FITC моноклональных мышиных антител к CD31 человека, Abcam, Кембридж, Великобритания), к CD11b (окрашенных FITC моноклональных мышиных антител к CD11b человека, Abcam, Кембридж, Великобритания), к CD79α (окрашенных РЕ моноклональных мышиных антител к CD79α человека, Abcam, Кембридж, Великобритания), к CD13 (окрашенных FITC моноклональных мышиных антител к человека, Abcam, Кембридж, Великобритания), к HLA-DR (окрашенных FITC моноклональных мышиных антител к HLA-DR человека, Abcam, Кембридж, Великобритания), к CD14 (окрашенных FITC моноклональных мышиных антител к CD14 человека, Abcam, Кембридж, Великобритания), к CD34 (окрашенных РЕ моноклональных мышиных антител к CD34 человека, Abcam, Кембридж, Великобритания). Проанализировали, по меньшей мере, 10000 отобранных событий методом проточной цитометрии с помощью программного обеспечения CellquestPro. Результаты отображены как средняя интенсивность флуоресценции (MFI) в процентах клеток с положительной реакцией (порог: 95% изотипа).
Способность к дифференцировке
Испытали 4-й пассаж СКЖТ и КФ в определенных средах, чтобы оценить способность к дифференцировке в остеогенном направлении. Оценили дифференцировку по окрашиванию ализариновым красным после культивирования клеток в течение 3 недель в среде для специфической дифференцировки (пролиферативной среде, дополненной дексаметазоном (1 мкМ), аскорбатом натрия (50 мкг/мл) и дигидрофосфатом натрия (36 мг/мл) [Qu и др., In Vitro Cell Dev Biol Anim. 2007; 43:95-100]. Подтвердили остеогенную дифференцировку окрашиванием фосфата кальция ализариновым красным после фиксации в формалине. Кроме того, для подтверждения костного фенотипа провели иммуногистохимическое исследование на остеокальцин.
Влияние кислородного потенциала и фетальной бычьей сыворотки (ФБС) на пролиферацию клеток: анализ EdU
2
2
2
2
Испытали способность клеток к пролиферации методом измерения прямого синтеза ДНК путем включения 5-этинил-2'-дезоксиуридина с использованием набора для проточного цитометрического анализа Click-iT EdU Alexa Fluor 488 (Life Technology, Уолтем, штат Массачусетс, США). Высеяли СКЖТ (n=3) и КФ (n=3) в чашки для культивирования размером 21,5 см с плотностью 5000 клеток/см и культивировали в течение 24 часов в 10% ФБС при содержании О 21%. Затем прекратили пролиферацию клеток, заменив пролиферативную среду такой же средой ФБС в течение 24 часов. Наконец поместили клетки на 48 часов в специфические условия с содержанием O 0,1%, 5% и 21% и добавили пролиферативную среду, дополненную 1% ФБС или 5% ФБС и EdU (5-этинил-2'-дезоксиуридином, нуклеозидным аналогом тимидина, включенным в ДНК при активном синтезе ДНК). После проявления с помощью Alexa Fluor 488 подсчитали клетки с положительной реакцией методом проточной цитометрии (FACScan, BD Biosciences, Сан-Хосе, штат Калифорния).
Профиль секреции факторов роста
2
Подсчитали клетки (3-го пассажа) после трипсинизации и получили 5 последовательных разведений: 100% СКЖТ + 0% КФ; 75% СКЖТ + 25% КФ; 50% СКЖТ + 50% КФ; 25% СКЖТ + 75% КФ; и 0% СКЖТ + 100% КФ, которые трижды высеяли на 12-луночные культуральные планшеты при плотности клеток, приводящей к конфлюэнтности от около 80% до 95%, для инкубации в гипоксических камерах (Modular Incubator Chamber MIC-101, Billups-Rothenberg, Дель-Мар, штат Калифорния, США) с содержанием О 0,1% и 5%, что соответствует среде с высокой степенью гипоксии и тканевому кислородному потенциалу, соответственно. Подвергли клетки (в каждом разведении и при каждом кислородном потенциале) воздействию нормогликемической (1 г/л) или гипергликемической (4,5 г/л) пролиферативной среды. После инкубации в течение 24 часов в этих контролируемых условиях по отдельности собрали супернатанты клеточных культур и хранили при -20°C для дальнейшего определения количества факторов роста (ФРСЭ, ФРГ, ИФР-1, ФСК-1α и основного ФРФ) методом иммуноферментного анализа с ферментной меткой с помощью комплекта Quantikine ELISA, R&D System, Миннеаполис, штат Миннесота, США). Оценили жизнеспособность клеток сразу после гипоксического стресса путем анализа с помощью раствора 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-5-(3-карбоксиметоксифенил)-2-(4-сульфофенил)-2Н-тетразолия (МТС, Промега, Лейден, Нидерланды). Осуществили испытания на гипоксический/гликемический стресс и определение количества факторов роста трижды и дважды, соответственно. Результаты представлены в пикограммах на миллиметр.
Статистический анализ
Для оценки нормального распределения значений использовали одновыборочный критерий Колмогорова и графики КК. Проверили статистически значимые различия между группами (с нормальным распределением) парным t-критерием и односторонним дисперсионным анализом с поправкой Бонферрони. Осуществили статистические испытания с помощью программного обеспечения PASW 18 (SPSS, IBM, Нью-Йорк, штат Нью-Йорк, США); значение р<0,05 считалось значимым.
Результаты
Профили поверхностных маркеров не позволяют различать две популяции клеток (Таблица 2).
СКЖТ и КФ имели положительную реакцию (>90 клеток) на маркеры мезенхимальных клеток (CD13, CD44, CD73, CD90, CD105, CD166) и отрицательную реакцию на маркеры эндотелиальных клеток (CD31), маркеры стромальных клеток, полученных из костного мозга (CD106, Stro-1, CD146), маркеры гемопоэтической дифференцировки (CD14, CD45, CD1b, CD34) и HLA-DR, CD79a и CD19. После культивирования в специфических средах дифференцировки (Фиг. 13) была продемонстрирована способность к дифференцировке как СКЖТ, так и КФ окрашиванием ализариновым красным и путем иммуногистохимического исследования на остеокальцин.
СКЖТ и КФ имели сходные профили пролиферации до 15-го пассажа (NS на Фиг. 14).
2
2
Жизнеспособность СКЖТ и КФ существенно не изменилась после 24 часов культивирования при содержании O 0,1% и 5% без ФБС (Фиг. 15). При содержании O 5% КФ снизалась по сравнению с СКЖТ (выживаемость СКЖТ 87,04%, р<0,05).
2
Изучение секреции ФРГ, ИФР-1, оФРФ и ФРК (при содержании O 0,1% и 5% и концентрации глюкозы 4,5 г/л) из последовательных разведений СКЖТ и КФ не продемонстрировало какой-либо значимой кривой (Фиг. 16).
2
2
Однако в случае ФРСЭ и ФСК-1α наблюдались линейные регрессии после того, как СКЖТ были "загрязнены" КФ. Действительно, уровень секреции ФСК-1α снижается с увеличением доли СКЖТ. Этот результат обнаружен в различных условиях кислородного потенциала (21%, 5% или 0,1%) или концентрации глюкозы (1 г/л или 4,5 г/л) (Фиг. 17-22). Кроме того, в условиях культивирования при высокой концентрации глюкозы и содержании О 0,1% и 5% уровень секреции ФРСЭ повышается с увеличением доли СКЖТ (Фиг. 17А и 18А). Такие измерения в условиях низкой концентрации глюкозы продемонстрировали значительные линейные регрессии секреции ФРСЭ при содержании O 5% (Фиг. 20А).
Инвертировали отношения, поскольку более высокие уровни высвобождения ФСК-1α и ФРСЭ КФ с более высокими скоростями достигались у СКЖТ, что позволяло измерять долю клеток (чистоту СКЖТ).
Пример 3. Поведение СКЖТ в условиях гипоксии и гипергликемии
Материалы и методы
Это исследование проводилось в соответствии с рекомендациями министерства здравоохранения Бельгии. Все процедуры были одобрены Комитетом по этике медицинского факультета Католического университета Лувена.
Выделение и культивирование СКЖТ, КФ и кератиноцитов
2
Осуществили комбинированный сбор жировых (в среднем: 7,4 г) и кожных (в среднем 1,5 см) тканей у 8 пациентов (Таблица 1), подвергающихся рекомендуемой пластической хирургии, после информированного согласия и серологического скрининга, путем липоаспирации методом Коулмана и биопсии кожи, соответственно. Выдержали образцы жировой ткани и кожи в стерильных условиях в течение максимум 60 минут при 4°C перед выделением стволовых клеток жировой ткани (СКЖТ) и кожных фибробластов (КФ).
2
Расщепили жировую ткань коллагеназой (1/2 в отношении веса к объему) на водяной бане при 37°C в течение 60 минут. Инактивировали коллагеназу в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (DMEM), дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой. Центрифугировали собранную ткань со скоростью 1500 об/мин в течение 10 минут при комнатной температуре. Суспендировали капли осадка в пролиферативной среде, состоящей из DMEM, дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой, L-глутамином (2 мМ) и антибиотиками (100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 1 мкл/мл амфотерицина В), и отфильтровали через сито с размером ячеек 500 мкм. Затем высеяли собранную суспензию в колбы размером 25 см с пролиферативной средой.
Выделили КФ путем экстрагирования из лишенных эпидермиса биопсий кожи, измельчили на фрагменты 2 мм×2 мм и поместили в пластмассовую лунку. Добавили небольшой объем пролиферативной среды во избежание отсоединения от поверхности пластмассы.
Приобрели кератиноциты у АТСС (PCS-200-011) и культивировали с помощью комплекта для выращивания кератиноцитов (АТСС, PCS-200-040™) в соответствии с инструкциями поставщика.
2
После 24-х часовой инкубации при 37°C и содержании CO 5% заменили пролиферативную среду. Этот первичный пассаж исходных клеток называется нулевым пассажем. Извлекли куски кожи из чашки для культивирования, когда на поверхности пластмассы, окружавшей фрагменты ткани, были видны сцепленные клетки. Сохраняли клетки в пролиферативной среде (которую заменяли 2 раза в неделю) вплоть до 4-го пассажа после последовательных трипсинизаций.
Профиль секреции факторов роста
2
Трижды высеяли клетки (4-го пассажа) после трипсинизации на 12-луночные культуральные планшеты при плотности клеток, приводящей к конфлюэнтности от около 80% до 95%, для инкубации в гипоксических камерах (Modular Incubator Chamber MIC-101, Billups-Rothenberg, Дель-Мар, штат Калифорния, США) с содержанием O 0,1% и 5%, что соответствует среде с высокой степенью гипоксии и тканевому кислородному потенциалу, соответственно. Подвергли клетки (в каждом разведении и при каждом кислородном потенциале) воздействию нормогликемической (1 г/л) или гипергликемической (4,5 г/л) пролиферативной среды. После инкубации в течение 24 часов в этих контролируемых условиях по отдельности собрали супернатанты клеточных культур и хранили при -20°C для дальнейшего определения количества факторов роста (ФРСЭ, ФСК-1α и ФРК) методом иммуноферментного анализа с ферментной меткой с помощью комплекта Quantikine ELISA, R&D System, Миннеаполис, штат Миннесота, США). Осуществили испытания на гипоксический/гликемический стресс и определение количества факторов роста трижды и дважды, соответственно. Результаты представлены в пикограммах на миллиметр.
Статистический анализ
Для оценки нормального распределения значений использовали одновыборочный критерий Колмогорова и графики КК. Проверили статистически значимые различия между группами (с нормальным распределением) парным t-критерием и односторонним дисперсионным анализом с поправкой Бонферрони. Осуществили статистические испытания с помощью программного обеспечения PASW 18 (SPSS, IBM, Нью-Йорк, штат Нью-Йорк, США); значение р<0,05 считалось значимым.
Результаты
2
2
В условия гипоксии клетки, т.е. при содержании О 0,1% клетки выделяют более высокие уровни ФРСЭ, чем при физиологическом содержании О, т.е. 5% (Фиг. 23А). Только кератиноциты демонстрируют значительное увеличение экспрессии ФСК-1α и ФРК в условиях гипоксии по сравнению с нормоксией, однако ее уровни остаются очень низкими (Фиг. 23В и 23С).
СКЖТ, культивируемые в условиях гипергликемии, т.е. при концентрации глюкозы 4,5 г/л, демонстрируют незначительное снижение секреции ФРСЭ по сравнению с нормогликемией (1 г/л), тогда как секреция ФРСЭ фибробластами снижается более, чем на 70% (Фиг. 24А). Уровни экспрессии ФСК-1α снижаются как у СКЖТ, так и у фибробластов, а секреция ФРК является преимущественно сходной у клеток всех типов (Фиг. 24В и 24С).
2
2
В условиях гипоксии и гипергликемии, которые соответствует условиям диабетических ран, СКЖТ выделяет значительно больше ФРСЭ, чем в условиях нормоксии и нормогликемии (283,94 пг/мл при содержании O 0,1% и концентрации глюкозы 4,5 г/л по сравнению с 171,13 пг/мл при содержании O 5% O2 и концентрации глюкозы 1 г/л, Фиг. 25А). Для сравнения, фибробласты выделяют более низкие уровни ФРСЭ в условиях гипоксии и гипергликемии, чем в условиях нормоксии и нормогликемии.
Эти результаты показывают, что СКЖТ выделяет больше фактора роста ФРСЭ, чем фибробласты в условиях гипоксии, гипергликемии и в условиях гипоксии и гипергликемии. Более того, в условиях диабетических ран происходит увеличение секреции ФРСЭ в СКЖТ по сравнению с физиологическими условиями. Соответственно, СКЖТ могут высвобождать ФРСЭ для содействия неоангиогенеза в условиях диабета и, следовательно, могут способствовать заживлению диабетических ран.
Кроме того, СКЖТ, полученные от доноров-людей, страдающих диабетом или не страдающих диабетом, имеют сходный профиль секреции ФРСЭ (Фиг. 26А). В частности, СКЖТ, полученные от доноров-людей, страдающих диабетом, выделяют столько же или больше ФРСЭ, чем СКЖТ, полученные от доноров-людей, не страдающих диабетом. Для сравнения, фибробласты, полученные от доноров-людей, страдающих диабетом, выделяют меньше ФРСЭ, чем фибробласты, полученные от доноров-людей, не страдающих диабетом (Фиг. 26В).
В отличие от секреции ФРСЭ секреция ФРК у СКЖТ, полученных от доноров-людей, не страдающих диабетом, отличается от секреции ФРК у СКЖТ, полученных от доноров-людей, страдающих диабетом (Фиг. 27А). Кроме того, обнаружено, что СКЖТ и фибробласты независимо от того, являются ли их источником доноры-люди, не страдающие или страдающие диабетом, имеют сходные профили секреции ФРК (фиг. 27).
Вместе эти результаты показывают, что МСК, взятые от субъекта, страдающего диабетом, также могут высвобождать ФРСЭ для содействия неоангиогенезу и, следовательно, могут способствовать заживлению раны, такой как диабетическая рана.
Следовательно, популяция МСК согласно изобретению может быть выделена из ткани подлежащего лечению субъекта.
Пример 4. Регенерация костей
Материалы и методы
Все процедуры закупок тканей и клинического исследования (В40320108280) были одобрены Комитетом по этике медицинского факультета Католического университета Лувена и местным Комитетом по этике ухода за животными для исследований человека и доклинических исследований.
СКЖТ человека
Выделение и характеристика
Осуществили комбинированный сбор СКЖТ человека методом Коулмана (Coleman, Clin Plast Surg, 2001; 28: 111-119) у восьми пациентов во время рекомендуемой пластической хирургии (абдоминальной дермолипэктомии (n=3) или маммопластики (n=5), в среднем 6,2 г жировой ткани (1,4-14,6 г)) после информированного согласия и серологического скрининга.
Расщепили жировую ткань коллагеназой GMP (0,075 г, Serva Electrophoresis GmbH, Гейдельберг, Германия) на водяной бане при 37°C в течение 60 минут. После расщепления ткани собрали клетки после центрифугирования и выдержали в пролиферативной среде вплоть до 4-го пассажа (или далее для генетического исследования) после последовательных трипсинизаций, чтобы получить чистую популяцию СКЖТ (>90% СКЖТ после четырех пассажей). Охарактеризовали клетки по профилям мембранных маркеров (CD44, CD45, CD73, CD90, CD105, CD34, CD14, CD1b, CD79a, CD19, HLA-DR) (Dominici и др., Cytotherapy 2006, 8 (4): 315-317) путем клеточной сортировки с возбуждением флуоресценции (FACScan, BD Biosciences, Сан-Хосе, штат Калифорния) и испытали в специфических средах, чтобы оценить способность к мезенхимальной дифференцировке (адипогенезу, хондрогенезу, остеогенезу) (Schubert и др., Biomaterials. 2011; 32: 8880-8891; Cui и др., Biomaterials. 2009; 30:2683-2693).
2
Также высеяли СКЖТ на 12-луночные культуральные планшеты для инкубации в гипоксических камерах (Modular Incubator Chamber MIC-101, Billups-Rothenberg, Дель-Мар, штат Калифорния, США) в течение 72 часов с содержанием О 0,1% (среда с высокой степенью гипоксии, наблюдаемая в некротических тканях) или 21% (атмосферная нормоксия, нормальные условия культивирования) соответственно. После инкубации по отдельности собрали супернатанты клеточных культур и хранили при -20°C для определения количества ФРСЭ (Quantikine ELISA, R&D System, Миннеаполис, штат Миннесота, США).
Оценили жизнеспособность клеток с помощью раствора 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-5-(3-карбоксиметоксифенил)-2-(4-сульфофенил)-2Н-тетразолия (МТС, Промега, Лейден, Нидерланды) ( и др., Biomaterials 2011; 32:5945-5956).
Генетическая стабильность ex vivo СКЖТ
Путем кариотипического анализа и флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) после различных пассажей изучили цитогенетическую стабильность с целью оценки онкогенной безопасности клеточного компонента биологического перевязочного материала. В соответствии со стандартными протоколами выделили метафазные хромосомы из СКЖТ, полученных от пяти доноров. Вкратце, в течение 4 часов обработали культивируемые клетки в фазе экспоненциального роста после 1-го, 4-го, 10-го, 12-го и 16-го пассажей 0,02 мкг/мл колцемида (Invitrogen, Карлсбад, штат Калифорния, США). В течение 30 минут инкубировали клетки, собранные из колб после трипсинизации, при 37°C в гипотоническом растворе 0,055 М КЦl и зафиксировали в смеси метанола и ледяной уксусной кислоты в соотношении 3:1. Сбор хромосом и получение микропрепаратов метафазных хромосом осуществлялся в соответствии со стандартными процедурами (Duhoux и др., PLoS ONE., 2011; 6:е26311). Проанализировали от 11 до 20 метафаз, обработанных трипсином и окрашенных методом нагревания в фосфатном буфере с последующим окрашиванием по Райту-Гимзе (GTW), и описали кариотипы согласно Международной системе цитогенетической номенклатуры человека (ISCN 2013). Осуществили анализ FISH в соответствии со стандартными протоколами (Veriter и др., Biomaterials, 2011; 32: 5945-5956) с целью обнаружения анеуплоидии хромосом 5, 7, 8 и 18 с использованием TelVysion 5q (SpectrumOrange), CEP7/D7Z1 (SpectrumGreen или SpectrumOrange), CEP8/D8Z2 (SpectrumOrange или SpectrumGreen) и зондов CEP18/D18Z1 (SpectrumGreen) (Abbot Molecular,  Бельгия). В 1-м, 4-м и 16-м пассажах насчитали двести ядер, в 10-м пассаже насчитали 120 ядер, а 12-м пассаже насчитали 73 ядра (пороговые значения рассчитывались согласно закону бета-распределения при доверительном интервале 99,9%).
Разработка биологического перевязочного материала
Сравнили способность СКЖТ 4-го пассажа к адгезии и распластыванию на ацеллюлярном коллагеновом матриксе человека (Dufrane и др., Biomaterials, 2008; 29: 2237-2248) (АКМЧ: лиофилизированная децеллюларизованная аллогенная широка фасция человека Банка тканей, Университетская больница Сент-Люк, Брюссель, Бельгия) и на пластмассовых лунках в качестве контроля. Оценили клеточную адгезию методом конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM), как описано у Bacallao и Stelzer, Methods Cell Biol. 1989; 31:437-452.
5
2
Высеяли СКЖТ человека на обработанную широкую фасцию в 24-луночном планшете с плотностью 2×10 клеток на лунку. Каждые 2 дня вплоть до 15-го дня и каждые 3 дня вплоть до 30-го дня после посева промывали АКМЧ в забуференном фосфатом физиологическом растворе с целью удаления среды, а затем примерно на 3 часа погрузили в 2 мкМ ацетоксиметиловых сложных эфиров кальцеина (AM, Molecular Probes Europe BV, Лейден, Нидерланды) с целью изучения методом CLSM. Определили общую покрытую площадь клеток, периметр клеток и форм-фактор [(площадь/периметр)×4π] с использованием программного обеспечения Scion Image Beta 4.02n для сбора и анализа данных (Scion Corporation, Торранс, штат Калифорния, США).
Для оценки онкологической безопасности и эффективности in vivo биологического перевязочного материала подкожно имплантировали куски (10 мм×10 мм) биологического перевязочного материала и только клеточного каркаса бестимусным крысам (n=10; Charles River Laboratories International, Уилмингтон, штат Массачусетс, США).
Под общей анестезии (3% изофлуран) сформировали треугольный лоскут в каждой паравертебральной области, чтобы создать два подкожных кармана для размещения трансплантатов (АКМЧ + СКЖТ с правой стороны и только АКМЧ с левой стороны). Вызвали тепловое поражение (кожный некроз) с внутренней стороны каждого лоскута с целью воспроизведения среды гипоксической раны. Имплантировали биологический перевязочный материал (АКМЧ + СКЖТ) таким образом, чтобы клетки контактировали с обожженной кожей с правой стороны, а в левую область паравертебральной области имплантировали только АКМЧ. Закрыли лоскуты нерассасывающимися швами после размещения от пяти до восьми кристаллов фталоцианина лития (LiPC), чтобы обеспечить дальнейшее измерение процесса послеимплантационной внутритканевой оксигенации.
Для наблюдения за процессом послеимплантационной внутритканевой оксигенации и оценки способности композитного трансплантата улучшать оксигенацию тканей у бестимусных крыс использовали электронную парамагнитную резонансная оксиметрию (спектрометр ЭПР, Magnettech, Берлин, Германия). Еженедельно изучали послеимплантационную оксигенацию в течение до 4 недель после имплантации под газовой анестезией (изофлуран). Результаты представлены в процентах оксигенации тканей на 6-й день после имплантации.
Через 1 месяц (n=5) или 3 месяца (n=5) после имплантации полностью иссекли трансплантата плюс окружающие ткани для макроскопического и гистологического анализа (методом окрашивания гематоксилином-эозином и трехцветного окрашивания по Массону для обнаружения развития локальной опухоли и ангиогенеза).
Клиническое применение для восстановления кожи
Предложили биологический перевязочный материал трем пациентам с незаживающими ранами (Таблица 3). Собрали околопупочную жировую ткань (22 г, 8 г и 21 г соответственно) (методом Коулмана под местной анестезией) с целью выделения и культивирования СКЖТ в соответствии с рекомендациями по эффективной производственной практике.
Трипсинизировали СКЖТ 3-го пассажа, ресуспендировали в DMEM и поместили на лиофилизированный АКМЧ (соответствующий 4-му пассажу). Получили биологический перевязочный материал, когда СКЖТ покрыли более 90% АКМЧ. Наконец, промывали композитный трансплантат CMRL (Mediatec, Манассас, штат Вирджиния, США) и перенесли в операционную с целью имплантации (при СКЖТ поверх АКМЧ).
Осуществили гидрохирургическую санацию раневой полости у этих трех пациентов перед имплантацией, чтобы обеспечить минимальное загрязнение раневого ложа. Обрезали композитный трансплантат до идеального размера и ориентировали таким образом, чтобы клеточный слой соприкасался непосредственно с поверхностью раны, и зафиксировали нерассасывающимися швами. Наблюдали параметры воспаления (С-реактивный белок, фибриноген), а также течение клинических и гистологических процессов. Ежедневно накладывали и меняли пропитанные вазелином повязки. Осуществили биопсию до и после имплантации с целью иммуногистохимического исследования и гистоморфометрии для изучения воспалительной реакции, ангиогенеза и ремоделирования тканей (CD3/CD68, ФРСЭ/фактор VIII и трехцветное окрашивание по Массону, соответственно).
Статистический анализ
Для оценки нормального распределения значений использовали одновыборочный критерий Колмогорова-Смирнова и графики КК. Проверили статистически значимые различия между группами (с нормальным распределением) парным t-критерием и односторонним дисперсионным анализом с поправкой Бонферрони. Осуществили статистические испытания с помощью программного обеспечения Systat, версия 8.0 (Cranes Software International, Бангалор, Индия) или PASW 18 (SPSS, IBM, Нью-Йорк, штат Нью-Йорк, США); значение р<0,05 считалось значимым.
Результаты
Безопасность ex vivo и in vivo СКЖТ + АКМЧ
Охарактеризовали СКЖТ 4-го пассажа по профилю поверхностных маркеров мезенхимальных стромальных клеток: CD44+ (>95% клеток), CD73+ (>90%), CD90+ (>95%), CD105+ (>95%), CD45- (<5%), CD34- (<7%), CD14- (<7%), CD11b- (<7%), CD79α- (<7%), CD19- (<5%) и HLA-DR- (<7%) (Таблица 4) и по положительной маркировке минерализации, осаждения гиалина и липидных вакуолей.
Также охарактеризовали СКЖТ в специфических средах, чтобы оценить способность к мезенхимальной дифференцировке (адипогенезу, хондрогенезу, остеогенезу) (Фиг. 28).
Спустя один день после посева большинство СКЖТ выглядели круглыми (средний форм-фактор: 0,93+0,13) на обоих клеточных носителях при среднем показателе покрытия поверхности 4,8% (незначимая величина).
В период между 3-м и 18-м днями после посева было обнаружено, что клетками покрыта значительно большая площадь пластмассовых лунок, чем АКМЧ (р<0,005). Было обнаружено, что клетки полностью покрыли поверхность АКМЧ на 1 неделю позже, чем поверхность пластмассовых лунок. Аналогичная задержка была обнаружена при распластывании СКЖТ (форм-фактор) по поверхности АКМЧ в сравнении с пластмассовыми лунками (р<0,005) (фиг. 29). Хотя клетки покрыли поверхность позже, был достигнут такой же их рост на АКМЧ, как и на пластмассовых лунках.
При исследовании безопасности ex vivo не было обнаружено каких-либо клональных структурных хромосомных аберраций в кариотипах СКЖТ 1-го пассажа, 4-го пассажа 4 и более поздних пассажей (10-го, 12-го или 16-го). По меньшей мере, у двух испытуемых хромосом во всех пассажах были обнаружены пограничные тетразомии (1,5-5,5%) путем анализа FISH межфазных клеток (отсечение: 4,5%). Этим методом также выявили клон с предполагаемой моносомией 7 у 15% межфазных клеток пассажа 16. Эти анеуплоидные клетки, по-видимому, не применимы для пролиферации, поскольку они не обнаруживаются в метафазных клетках.
В результате макроскопического и микроскопического анализа не обнаружено локального развития опухоли в эксплантированной ткани крыс с ослабленным иммунитетом (через 1 и 3 месяца после имплантации) (Фиг. 30).
Эффективность ex vivo и in vivo СКЖТ + АКМЧ (биологический перевязочный материал).
Сравнили жизнеспособность клеток после 72 часов инкубации при кислородном потенциале 0,1% и 21% (р=0,034). Гипоксия не оказывала пагубного влияния на жизнеспособность СКЖТ, и в условиях гипоксии (при кислородном потенциале 0,1%) была обнаружена значительно более высокая секреция ФРСЭ, чем при кислородном потенциале 21% (р<0,001; n=8) (Фиг. 31).
Кожная оксигенация на 6-й день (для каждого индивидуального реципиента) считалась исходной после повреждения кожи. Соотношение кислородного потенциала в глубокой дерме (после теплового поражения) было значительно выше в случае АКМЧ плюс СКЖТ, чем в случае только АКМЧ (р<0,05 через 13, 21 и 27 дней после имплантации). В дерме, восстановленной с помощью АКМЧ плюс СКЖТ, была обнаружена последовательно значительно более высокая плотность сосудов, чем в дерме, контактировавшей только с АКМЧ (р=0,002) (фиг. 32).
Клиническое применение
5
2
Трипсинизировали СКЖТ по окончании 3-го пассажа, и затем высеяли на АКМЧ, чтобы получить 4-й пассаж на коллагеновом каркасе. Получили имплант, когда 90% поверхности АКМЧ было покрыто СКЖТ (5,8×10 клеток/см). Полное изготовление перевязочного материала от выделения клеток до поставки занимало в среднем за 133 дня (Таблица 5).
Начальная ассимиляция трансплантата произошла на 3-й день после имплантации с последующей прогрессирующей резорбцией коллагенового матрикса, которая завершилась примерно через 28 дней после имплантации, в результате чего на поверхности раневого ложа осталась грануляционная ткань с хорошей васкуляризацией (Фиг. 33).
На 60-й день после имплантации у пациента 1 было достигнуто полное закрытие раны, которое сохранялось (более 22 месяцев). Пациентам 2 и 3 осуществили аутотрансплантацию кожи на васкуляризованную грануляционную ткань через 6 недель после имплантации СКЖТ. Кожные аутотрансплантаты полностью интегрировались через 3 дня (первое раскрытие повязки), что сопровождалось облегчением боли; ежедневный медицинский уход был прекращена через 6 месяцев и через 3 месяца после имплантации у пациентов 2 и 3, соответственно (Фиг. 34). У этих двух пациентов произошел рецидив язв, вероятно, из-за системной этиологии ран (дрепаноцитоза и васкулита).
Несмотря на значительное увеличение С-реактивного белка и фибриногена, произошедшее через 1 неделю после имплантации, не наблюдалось хронического воспаления; через 1 месяц после операции произошло снижение до базовых уровней (Фиг. 35).
Результаты биопсии после имплантации выявили хорошо организованную, васкуляризированную ткань по сравнению с сильным фиброзом перед имплантацией повязки (Фиг. 36). Было обнаружено значительное увеличение ФРСЭ (р<0,001) и фактора VIII (р<0,05) в тканях после имплантации (Фиг. 37А). Было обнаружено значительное пополнение макрофагов (р<0,05) после имплантации без изменения инфильтрации лимфоцитов (Фиг. 37В). Только АКМЧ (без клеток) не обеспечивал положительного эффекта у пациента 2 (Фиг. 38).
Вместе эти результаты показывают, что СКЖТ на АКМЧ могут поддерживать восстановление физиологии при заживлении кожных покровов; СКЖТ могут выживать в условиях сильной гипоксии и высвобождать ФРСЭ, содействуя неоангиогенезу, синтезу грануляционной ткани и, следовательно, процессу заживления.
Пример 5. Регенерация скелетных мышц
Материалы и методы
Все материалы были получены от компаний Lonza (Базель, Швейцария), Sigma-Aldrich (Сент-Луис, штат Миссури, США) или Invitrogen (Карлсбад, штат Калифорния, США), если не указано иное. Все процедуры были одобрены местным Комитетом по этике ухода за животными Католического университета Лувена (2013/UCL/MD/022).
Выделение и определение характеристик МСК костного мозга и СКЖТ
В качестве доноров МСК костного мозга и СКЖТ использовали бельгийских свиней породы ландрас (самок весом менее 100 кг, моложе 6 месяцев, Rattlerow Seghers Ltd., Локерен, Бельгия) использовались.
7
Собрали гепаринизированный костный мозг и смешали с двойным объемом забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS). После центрифугирования с центробежным ускорением 450 g в течение 10 минут повторно суспендировали клетки при плотности 10 клеток/мл, наслоили клеточную суспензию на колонку Ficoll-Hypaque (плотность 1,077, Lymphoprep, Nycomed, Осло, Норвегия) и центрифугировали в течение 30 минут с центробежным ускорением 1250 g. Собрали мононуклеарные клетки на границе раздела и в течение 10 минут промыли в PBS с центробежным ускорением 450 g. Поместили клетки в культуральные колбы с модифицированной по способу Дульбекко средой Игла (DMEM), дополненной инактивированной нагреванием 10% фетальной бычьей сывороткой (ФБС) и антибиотиками (Veriter и др., Biomaterials. 2011; 32:5945-5956).
2
Трижды промыли жировые ткани (в среднем 15 г) 9% NaCl, разрезали на чашке Петри, чтобы удалить сосуды и волокнистую соединительную ткань, и на 60 минут поместили в коллагеназу (0,075 г, Sigma-Aldrich), восстановленную в сбалансированном солевом растворе Хэнкса (с ионами кальция и магния), в вибрационной водяной бане при 37°C с непрерывным перемешиванием. После расщепления инактивировали коллагеназу в DMEM, дополненной инактивированной нагреванием 10% ФБС, L-глутамином (2 мМ) и антибиотиками (100 ед/мл пенициллина, 100 мг/мл стрептомицина). Центрифугировали собранную ткань в течение 10 мин с центробежным ускорением 450 g при комнатной температуре. Затем повторно суспендировали осадок в пролиферативной среде (MP) из DMEM, дополненной 10% ФБС и антибиотиками (100 ед/мл пенициллин и 100 мг/мл стрептомицина). После фильтрации через сито с размером ячеек 500 мкм в течение 10 минут центрифугировали ткань с центробежным ускорением 450 g при комнатной температуре и затем повторно суспендировали в среде MP. Этот первичный пассаж исходных клеток был назван нулевым пассажем (Р0). После 24-48 часов инкубации при 37°C в 5% CO промыли культуры PBS и выдержали в среде MP вплоть до 4-го пассажа (Р4), а затем дифференцировали в специфических средах (Schubert и др., Biomaterials. 2011; 32:8880-8891).
Клеточная сортировка с возбуждением флуоресценции (проанализировали, по меньшей мере, 10000 событий методом проточной цитометрии с помощью программного обеспечения CellquestPro, FACScan, BD Biosciences, Франклин-Лейкс, штат Нью-Джерси, США) подтвердила последовательность поколений мезенхимальных стволовых клеток, выявив положительный сдвиг средней интенсивности флуоресценции в случае антител CD44, CD73, CD90 и CD105 (BD Pharmigen, BD Biosciences), конъюгированных с фикоэритрином (РЕ), тогда как экспрессия антигена CD45 была отрицательной. В отличие от этого, одноядерные клетки периферической крови (отрицательный контроль) демонстрировали положительное окрашивание на CD45 и отрицательное окрашивание на CD44, CD73, CD90 и CD 105. В 4-м пассаже была подтверждена дифференцировка клеток в направлении адипогенных, остеогенных и хондрогенных фенотипов окрашиванием масляным красным, ализариновым красным и альциановым синим, соответственно.
Влияние гипоксии ex vivo на МСК костного мозга и СКЖТ
2
Высеяли СКЖТ и МСК костного мозга на 12-луночные культуральные планшеты и инкубировали в гипоксических камерах (Modular Incubator Chamber MIC-101, Billups-Rothenberg, Дель-Мар, штат Калифорния, США) согласно описанному ранее протоколу (Schubert и др., Biomaterials. 2011; 32:8880-8891). Инкубировали клетки в течение 72 часов при содержании O 0,1% и 21%, что соответствует условиям сильной гипоксии и атмосферной нормоксии, соответственно. Через 72 часа инкубации в каждой среде по отдельности собрали супернатанты клеточных культур, центрифугировали и хранили при -20°C для последующего определения количества факторов роста.
Определили количество ФРСЭ, ИФР-1, ФРФ, ФРГ и ТФР-β методом иммуносорбентного анализа с ферментной меткой (ELISA Quantikine Kit, R&D System, Миннеаполис, штат Миннесота, США). Образцы не разбавляли, и следовали указаниям производителя. Измерили оптическую плотность каждой лунки спектрофотометром Multiskan EX Labsystems (Thermo Scientific, Бреда, Нидерланды), настроенным на волну 450 нм с поправочной волной 690 нм. Высвобождение факторов роста представлены соотношением между гипоксией и нормоксией.
Также оценили жизнеспособность клеток в условиях нормоксии и гипоксии методом MTS анализа пролиферации клеток (MTS, Promega, Лейден, Нидерланды), как описано ранее (Schubert и др., Biomaterials. 2011; 32:8880-8891). Измерили оптическую плотность каждой лунки после инкубации спектрофотометром Multiskan EX Labsystems (Thermo Scientific), настроенным на волну 450 нм с поправочной волной 690 нм.
Ацеллюлярный коллагеновый матрикс человека (АКМЧ)
2
2
Приобрели широкие фасции выбранных доноров в соответствии с европейским и бельгийским законодательством, касающимся материалов человеческого тела, после скрининга донорских тканей на основании истории болезни, серологических тестов и микробиологических испытаний. Подготовили широкие фасции, как описано, методом, разработанным Банком Тканей университетской клиники Сен-Люк (Брюссель, Бельгия), с целью получения АКМЧ, не содержащего химических остатков (ацетона/НО) и содержащего менее 5% остаточной влаги. Стерилизовали АКМЧ путем облучения дозой 25000 Гр гамма-лучей (Sterigenics,  Бельгия). Затем хранили аллотрансплантаты при комнатной температуре (Dufrane и др., Biomaterials. 2008, 29: 2237-2248).
Сначала оценили процесс децеллюляризации (АКМЧ) путем окрашивания зафиксированных в параформальдегиде (4%) срезов нативного (n=4) и обработанного АКМЧ (n=4) отдельных доноров 40,6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI, 1 мкг/мл) (Abbot Molecular Inc., США). Наблюдали срезы тканей с использованием флуоресцентного микроскопа (Zeiss, Завентем, Бельгия) с камерой Infinity и программой просмотра Delta Pix. Затем с помощью QIAamp kit DNA Mini Kit (Qiagen, Хильден, Германия) выделили ДНК из залитых парафином образцов равного объема замороженного нативного матрикса (n=4) и подвергнутого последующей обработке матрикса (n=4). Измерили концентрацию ДНК путем флуорометрии с помощью флуориметра Qubit™ (Invitrogen), настроенным на волну 260 нм. Результаты выражены в мкг/мл раствора для выделения ДНК.
Ex vivo адгезия и распластывание МСК на АКМЧ
В конце 3-го пассажа (Р3) сравнили способность МСК к распластыванию на АКМЧ со способностью клеток, культивированных на пластмассовых лунках (в качестве контроля). Оценили адгезию клеток на каркасе путем конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM), как уже описано (Dufrane и др., Biomaterials. 2002, 23: 2979-2988).
5
Изучили адгезию и распластывание клеток (на пластмассовой лунке и АКМЧ) путем CLSM в период между 1-ми 30-м днями после посева. Высеяли МСК на АКМЧ и на 24-луночные планшеты с плотностью 2×10 клеток/лунку. В период между 1-ми 30-м днями после посева извлекли композитные трансплантаты из культуральной среды, промыли в PBS с целью удаления среды и примерно на 3 часа погрузили в 2 мкМ ацетоксиметиловых сложных эфиров кальцеина (Molecular Probes Europe BV, Лейден, Нидерланды). Затем прикрепили трансплантаты (клетки плюс АКМЧ) к микропрепарату с использованием цианоакрилатного клея и исследовали путем CLSM (Bio-Rad MRC 1024) с использованием рентгеновской линзы с 10-кратным увеличением и возбуждением от аргонового ионного лазера на волне 488 нм. Обнаружили живые клетки по присутствию повсеместной активности внутриклеточной эстеразы, определяемой путем ферментативного преобразования практически не флуоресцирующего проницаемого для клеток кальцеина AM в интенсивно флуоресцирующий кальцеин. На нем наблюдалась пролиферация клеток в пластмассовой лунке.
2
За один день до 30-го дня извлекли среды. Промыли лунки PBS и погрузили в кальцеин AM. Определяли общую площадь и периметр клеток с использованием программного обеспечения Scion Image Beta 4.02 для сбора и анализа данных. Поскольку распластывание клеток вызвало изменения их формы, также вычислили форм-фактор [(площадь/периметр)×4π] как функцию субстрата и времени.
Механические свойства композитных трансплантатов (АКМЧ плюс МСК)
-1
-1
Механическим путем оценили влияние ex vivo рецеллюляризации АКМЧ посредством МСК. Измерили одноосное механическое сопротивление на трех экземплярах образцов нативной широкой фасции человека (n=5), регидратированного лиофилизированного АКМЧ (n=4), только АКМЧ (без МСК), инкубированного в течение 4 недель в культуральной среде (n=4), и рецеллюляризованного АКМЧ с МСК (после 4 недель инкубации, n=4). Механические испытания проводились с использованием системы тяги Instron с программным обеспечением Instron bluehill (Model 5600, Instron, Кантон, штат, Массачусетс, США) путем испытания нагрузкой до разрушения со скоростью удлинения 4 мм×мин. Расстояние между двумя захватами составляло 26,5 мм для каждого испытания. Обрезали образцы до постоянной длины 45 мм и ширины 15 мм. Зарегистрировали толщину каждого образца. Зарегистрировали зависимость удлинения матриксов от нагрузки и виды отказов. Отобразили структурные свойства матриксов жесткостью (Нм×мин) и предельной нагрузкой (N).
Рассчитали жесткость (k) как k=AF/AL, где F означает силу, приложенную к телу, a L означает смещение, создаваемое силой, действующей в направлении той же степени свободы (например, изменение длины растянутой пружины). Сравнили эти параметры в каждой экспериментальной группе.
Эффективность in vivo композитного трансплантата АКМЧ плюс МСК
Разработали две экспериментальные модели дефекта скелетных мышц для бестимусных крыс (n=20, Charles River Laboratories International, Уилмингтон, Массачусетс, США) весом 200-300 г (в возрасте 5-8 недель). Применили анестезию путем ингаляции изофлурана (Abbvie, Вавр, Бельгия), чтобы выполнить продольный разрез брюшной стенки и обнажить скелетную мускулатуру брюшной стенки.
1. Вызванный электрокоагуляцией дефект мышц
2
Путем электрокоагуляции создали у каждого животного (n=6) по четыре области некроза размером 16 мм на париетальной брюшной мышце. Покрыли дефекты: МСК плюс АКМЧ (две области, клетки в непосредственном контакте с областью некроза); только АКМЧ (одна область); и имитация (без трансплантата, одна область). Непосредственно ввели имплантаты в тесный контакт с дефектом с помощью четырех стежков шовного материала 5.0 Prolene. Животным имплантировали композитные трансплантаты из АКМЧ плюс СКЖТ (n=3) или МСК костного мозга (n=3). Имплантировали композитные трансплантаты после 21-28 дней инкубации МСК на АКМЧ.
2. Полнослойный дефект мышц брюшной стенки
2
Создали полнослойный дефект (1,5×2,5 см) мышц брюшной стенки (n=14 бестимусных крыс), приводящий к обнажению внутренних органов. Имплантировали на дефекты композитный трансплантат (АКМЧ плюс СКЖТ, n=4, АКМЧ плюс МСК костного мозга, n=4) или только АКМЧ (n=6).
В обеих моделях использовали нерассасывающийся шовный материал, чтобы закрыть кожу в месте имплантации. Умертвили бестимусных крыс на 30-й день после операции путем внутрисердечной инъекции Т61 (Intervet, Боксмер, Нидерланды) под общей анестезией. Затем произвели эксплантацию трансплантатов, и подвергли имплантаты обработке в целях гистоморфометрии.
Невооруженным глазом оценили интеграцию трансплантатов на предмет воспалительной реакции, интеграции, ремоделирования тканей, адгезии с внутренними органами и возникновения грыж в модели полнослойного дефекта.
Через 4 недели после имплантации провели гистоморфометрический анализ, чтобы оценить ангиогенез и ремоделирование тканей. Имплантаты немедленно зафиксировали на ночь в 4% формальдегиде и залили парафином. Поместили последовательные сечения (толщиной 5 мкм) на стекло и высушили в течение 12 часов при 37°C. С целью оценки процесса пролиферации и ремоделирования сосудов осуществили окрашивание гематоксилином и эозином и трехцветное окрашивание по Массону. Кроме того, изучили реколонизацию мышц путем иммуноокрашивания на дистрофии (разведенный в соотношении 1:450 и выявляемый моноклональным кроличьим антителом En Vision, Abcam, Кембридж, Великобритания).
Оценили ремоделирование тканей путем гистоморфологического исследования (на модели электрокоагуляции) путем измерения расстояния между нативной неповрежденной мышцей и имплантатом (АКМЧ или кожей в случае АКМЧ без МСК или с МСК и имитацией, соответственно) после окрашивания по Массону с 12,5-кратным увеличением в пределах стандартной микрометрической шкалы. Проанализированы как минимум пять представляющих интерес областей (ROI) на каждом микропрепарате. Вычислили ремоделирование ткани по соотношению между толщиной, обнаруженной в случае АКМЧ (отдельно или с МСК), и имитацией. В случае модели дефекта мышц брюшной стенки осуществили окрашивание дистрофином, чтобы изучить реколонизацию мышц имплантата.
2
Изучили плотность сосудов путем подсчета сосудов с 25-кратным увеличением в пределах стандартной сетки, отображающей поверхность 0,16 мм на трехцветных микропрепаратах Массона. Проанализировали не менее пяти ROI на каждом микропрепарате.
Статистический анализ
Для обеспечения нормального распределения значений использовали одновыборочный критерий Колмогорова-Смирнова и графики КК. Результаты представлены как средние величины ± стандартное отклонение, если не указано иное. Проверили статистически значимые различия между экспериментальными группами с использованием критерия Стьюдента или одностороннего дисперсионного анализа с поправкой Бонферрони. Осуществили статистические испытания с помощью программного обеспечения PASW 18 (SPSS, Westlands Center, Куорри-Бэй, Гонконг). Различия считались значимыми при р<0,05.
Результаты
Влияние гипоксии на высвобождение фактора роста МСК для регенерации мышц
2
В условиях гипоксии (по сравнению с нормоксией) была обнаружена значительно более высокая выживаемость СКЖТ по сравнению с МСК костного мозга: жизнеспособность клеток 119,5±6,1% и 86,8+1,5%, соответственно (р<0,05, Фиг. 39). Были достигнуты значительно более высокие уровни высвобождения ФРФ и ФРСЭ из МСКЖТ по сравнению с МСК костного мозга при содержании O 0,1% и 21% (р<0,05) (фиг. 40А и 40В). Кроме того, гипоксия улучшала высвобождение ФРСЭ из СКЖТ (+37%, р<0,05) без какого-либо влияния на МСК костного мозга.
СКЖТ секретировали значительно меньшее количество ИФР по сравнению с МСК костного мозга в условиях гипоксии, а также нормоксии (р<0,005). Не было обнаружено значительного влияния кислородного потенциала на высвобождение ТФР и ФРГ из МСК обоих типов (Фиг. 40D и 40Е).
Адгезия и распластывание МСК на АКМЧ
Децеллюляризация АКМЧ была впервые подтверждена путем обнаружения редких флуоресцентных ядер после окрашивания DAPI на обработанных матриксах по сравнению с нативными матриксами (данные не показаны). Флуориметром Qubit не определено обнаружение ДНК (<0,01 мкг/мл по сравнению со средним значением 1,45 мкг/мл, обнаруженным в четырех независимых нативных широких фасциях).
На 13-й день наблюдалось оптимальное распластывание (с удлинением клеток на форм-фактор около 0) на пластмассовой лунке как для СКЖТ, так и для МСК костного мозга (0,22+0,001). Через 27 и 30 дней наблюдалась значительная задержка в достижении максимального распластывания клеток на АКМЧ для СКЖТ (0,31+0,03) и МСК костного мозга (0,48+0,02) соответственно. В период между 5-м и 18-м днями (по сравнению с пластмассовой лункой, р<0,05, Фиг. 41) обнаружено значительно меньшее распластывание МСК. Кроме того, в период между 11-ми 30-м днями после посева на АКМЧ (р<0,05; фиг. 41) обнаружено значительное различие в распластывании МСК (СКЖТ и МСК костного мозга).
Общее восстановление пластмассовой лунки достигнуто в течение 2 недель после инкубации МСК обоих типов с задержкой на АКМЧ до 21-го и 30-го дней для СКЖТ и МСК костного мозга, соответственно (р<0,05). Доля восстановленной площади АКМЧ была значительно ниже, чем у пластмассовой лунки в период между 3-м и 18-м днями и между 3-м и 27-м днями, соответственно, для СКЖТ и МСК костного мозга (р<0,05). В период между 13-м и 28-м днями после инкубации (р<0,05) (Фиг. 42) наблюдалась значительная задержка восстановления АКМЧ с МСК костного мозга по сравнению с СКЖТ.
Эффективность in vivo композитного трансплантата АКМЧ плюс МСК
1. Вызванный электрокоагуляцией дефект мышц
Через 4 недели после имплантации ангиогенез был значительно сильнее в областях, обработанных СКЖТ и АКМЧ, по сравнению с МСК костного мозга плюс АКМЧ и только АКМЧ (434±108% против 215+13% против 144+57% относительно имитации, р<0,001) (Фиг. 43А).
Через 4 недели была невооруженным глазом обнаружена лучшая интеграция скелетных мышц с композитным трансплантатом (АКМЧ плюс МСК), чем только с АКМЧ, что было подтверждено окрашиванием гематоксилином и эозином и трехцветным окрашиванием по Массону, со значительно меньшим остаточным фиброзом (относительно имитации) в случае СКЖТ или МСК костного мозга плюс АКМЧ, чем только АКМЧ (23+9% и 24+10% против 49+17% соответственно, р<0,05). Не было обнаружено различий между СКЖТ и МСК костного мозга (фиг. 43В).
2. Полнослойный дефект мышц брюшной стенки
В случае только АКМЧ или АКМЧ с добавлением МСК не наблюдалось возникновение грыжи брюшной стенки без каких-либо внутрибрюшных сцеплений с органами брюшной полости. Несмотря на обнаружение некоторых клеток с положительной реакцией на дистрофии вблизи края шва у каждого реципиента АКМЧ и МСК, в ядре брюшного имплантата не было обнаружено клеток с положительной реакцией. Через 4 недели после имплантации значительно улучшился ангиогенез в имплантате, изготовленном из СКЖТ и АКМЧ, по сравнению с МСК костного мозга плюс АКМЧ и только АКМЧ (21,4±1,0 против. 11,2+2,3 против 11,8+3,1 сосудов на сетку; р<0,05) (Фиг. 44).
Композитный трансплантат, изготовленный из СКЖТ, продемонстрировал способность стволовых клеток жировой ткани выживать в условиях гипоксии ех vivo, способность обеспечивать оптимальную доставку клеток каркасом из децеллюляризованного коллагенового матрикса, способность улучшать высвобождение проангиогенных факторов кислородочувствительным механизмом, способность восстановления сосудов in vivo во время ранней фазы стресса после трансплантации и, наконец, способность уменьшать фиброзный шрам по сравнению с бесклеточным каркасом. Все эти свойства могут способствовать регенерации скелетных мышц.
Кроме того, эти результаты продемонстрировали, что СКЖТ проявляют лучшее проангиогенное действие ex vivo и in vivo с точным контролем в условиях гипоксии, когда МСК костного мозга проявляют специфическое антифибротическое действие. АКМЧ является идеальным каркасом для адгезии, распластывания и доставки МСК, что остается механическими требованиями в случае скелетного мышечного некроза и дефектов критического размера.