Способ прогнозирования риска развития синдрома задержки роста плода у женщин без отягощенного семейного анамнеза с использованием молекулярно-генетических данных
METHOD FOR PREDICTION OF THE RISK OF DEVELOPING FETAL GROWTH RETARDATION SYNDROME IN WOMEN WITHOUT PRE-EXISTING FAMILY HISTORY USING MOLECULAR GENETIC DATA

Изобретение относится к области медицинской диагностики, может быть использовано для прогнозирования риска развития синдрома задержки роста плода у женщин без отягощенного семейного анамнеза по задержке роста плода.
Одним из наиболее распространенных осложнений беременности, связанных с метаболическими и гемодинамическими расстройствами в системе «мать-плацента-плод», является плацентарная недостаточность [Плацентарная недостаточность: Патогенез. Прогнозирование. Диагностика. Профилактика. Акушерская тактика [Текст]. Стрижаков А.М., Липатов И.С., Тезиков Ю.В., Самара: ООО «ОФОРТ». 2014. - 239 с.]. Плацентарная недостаточность, приводя к уменьшению поступления питательных веществ и кислорода, нередко может обусловливать развитие задержки роста плода (ЗРП) [Intrauterine Growth Restriction – A Review Article [Text]. Heshmat S. H. Anatomy Physiol Biochem Int J. 2017;1(5):555-572.]. Под ЗРП понимается недостаточное достижение плодом показателей массы и роста в соответствии с гестационным сроком с учетом пола и этнической принадлежности [Intrauterine Growth Restriction: Antenatal and Postnatal Aspects [Text]. Sharma D, Shastri S, Sharma P. Clinical Medicine Insights: Pediatrics. 2016;10:67-83.]. ЗРП имеет высокую распространенность и может затрагивать до 10% беременностей [Intrauterine Growth Restriction: Hungry for an Answer [Text]. Devaskar SU, Chu A. Physiology (Bethesda). 2016;31(2):131–146.]. ЗРП является известным фактором высокого риска перинатальной заболеваемости и смертности. Литературные данные свидетельствуют о важной роли ЗРП в развитии перинатальной асфиксии, респираторного дистресс-синдрома, мекониальной аспирации, некротизирующего энтероколита и др. [Neonatal Morbidities of Fetal Growth Restriction: Pathophysiology and Impact.  [Text]. Malhotra A, Allison BJ, Castillo-Melendez M, Jenkin G, Polglase GR, Miller SL. Front Endocrinol (Lausanne). 2019; 10:55.]. Имеются убедительные доказательства связи между задержкой роста плода и риском развития различных заболеваний (сердечно-сосудистых, ожирения, сахарного диабета 2 типа, дислипидемии, метаболического синдрома и др.) во взрослой жизни индивидуума [Молекулярно-генетические и эпигенетические аспекты нарушения рецептивности эндометрия у женщин с низкой массой тела при рождении [Текст]. Мелкозерова О.А., Башмакова Н.В., Третьякова Т.Б., Щедрина И.Д. Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии. 2019; 18(4): 35–43.].
Согласно современным представлениям ЗРП имеет многофакторную природу, в ее формирование вовлечены различные факторы: материнский (сосудистые заболевания, недостаток питания, токсические влияния, воздействие гипоксии и др.), плацентарный (морфо-функциональные нарушения, изменение метиллирования генов и профиля экспрессии микро-РНК в плаценте и др.), фетальный (генетические аномалии) [Материнские клинико-анамнестические факторы формирования задержки роста плода [Текст]. Яворская С.Д., Долгова Н.С., Фадеева Н.И., Ананьина Л.П. Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии. 2019; 18(5): 83–87].
Важное значение в развитии ЗРП отводиться генетическим факторам [Genetic markers for inherited thrombophilia are associated with fetal growth retardation in the population of Central Russia. [Text]. Reshetnikov E, Zarudskaya O, Polonikov A, Bushueva O, Orlova V, Krikun E, Dvornyk V, Churnosov M. J Obstet Gynaecol Res. 2017;43(7):1139-1144]. Считается, что формирование веса новорожденного на 40% определяется наследственностью, а 60% связано с внешне-средовыми воздействиями [Intrauterine Growth Restriction: Hungry for an Answer [Text]. Devaskar SU, Chu A. Physiology (Bethesda). 2016;31(2):131–146.]. Следует отметить, что проведенные к настоящему времени молекулярно-генетические  исследования ЗРП не дали однозначного ответа о роли рассматриваемых полиморфных локусов различных групп генов-кандидатов в формировании ЗРП. Это диктует  необходимость продолжения исследований молекулярно-генетических детерминант ЗРП.
Из области техники известен патент № 2626316 «Способ прогнозирования развития синдрома задержки развития плода на фоне табакокурения» по заявке № 2016117077 от. 28.04.2016. Способ включает проведение ультразвукового исследования в сроки беременности 11-14 недель и определение показателя кожной микроциркуляции а именно: параметр, характеризующий временную изменчивость перфузии, методом лазерной допплеровской флоуметрии.  По формуле рассчитывают коэффициент прогноза развития синдрома задержки развития плода:    R=1/(1+e-z),  где R - коэффициент прогноза развития синдрома задержки развития плода; е - константа, основание натурального логарифма, равная 2,72; z - степень обратного логарифма, рассчитывают по формуле z=b1⋅x1+а, где b1- коэффициент регрессии, расчет которого является задачей бинарной логистической регрессии, который при синдроме задержки развития плода равен 5,121; x1- значение независимой переменной, а именно параметра, характеризующего временную изменчивость перфузии; а - константа, равная при синдроме задержки развития плода -4,477; и при R больше 0,5 прогнозируют развитие синдром задержки развития плода. Однако данный способ не является достаточно информативным, так как не включает данные о генетических маркерах и применим только на клиническом этапе, что исключает раннюю диагностику и проведение профилактических мероприятий по предотвращению развития синдрома задержки развития плода.
За прототип взят патент № 2646505 «Способ выявления наследственной предрасположенности к развитию задержки роста плода у курящих женщин» по заявке № 2017115003 от 27.04. 2017. Способ представляет собой исследование периферической венозной крови, включающий выделение ДНК, проведение полимеразной цепной реакции и анализ полиморфизма генов женщин, отличающийся тем, что проводят анализ полиморфизма гена IL-10 G-1082A и при выявлении генотипов IL-10-1082А/А или IL-70-1082G/A делают вывод о наличии наследственной предрасположенности к задержке роста плода у курящих женщин. Недостатками указанного способа являются: 1. Использование в качестве маркера только одного генетического полиморфизма, что снижает статистическую мощность проведенного исследования; 2. Способа прогнозирования риска развития задержки роста плода может быть использован только у ограниченной группе, а именно, у курящих женщин.
В изученной научно-медицинской и доступной патентной литературе не было обнаружено способа прогнозирования риска развития синдрома задержки роста плода у женщин без отягощенного семейного анамнеза по задержке роста плода на основе данных о гаплотипе TG полиморфных локусов rs2234693-rs9340799 гена рецептора эстрогенов ESR1.
Задачей настоящего исследования является расширение арсенала способов диагностики, а именно создание способа прогнозирования риска развития синдрома задержки роста плода на основе данных о гаплотипе TG полиморфных локусов rs2234693-rs9340799 гена рецептора эстрогенов ESR1.
Ген ESR1 располагается на длинном плече 6 хромосомы  (локус q24–27) и является белок-кодирующим геном. Он кодирует alpha-рецепторы эстрогенов, которые являются мощным регулятором транскрипционной активности различных генов (http://www.genecards.org/). Рецепторы эстрогенов (ESR1) определяют биологические эффекты эстрогенов в тканях-мишенях и в том числе потенциируют вовлеченность эстрогенов  в преобразование эндометрия матки на ранних сроках гестации: управляют волнами пролиферации, дифференцировки и ремоделирования клеток маточной ткани, чтобы подготовить ее к имплантации эмбриона и становлению беременности. Рецепторы эстрогенов находятся и в плаценте. ESR1 играет важную роль как в стимуляции терминальной дифференцировки мононуклеарных клеток трофобласта в синцитиотрофобласт, так и в стимулировании функции плаценты [Рецепторы эстрогенов (Обзор литературы).Часть 2 [Текст].  Довжикова И.В., Андриевская И.А. Бюллетень физиологии и патологии дыхания. 2018. № 73. С. 125-133.].  В работе Akram S.K. et al. [Placental IGF-I, estrogen receptor, and progesterone receptor expression, and maternal anthropometry in growth-restricted pregnancies in the Swedish population  [Text]/Akram S.K., Sahlin L., Ostlund E., Hagenäs L., Fried G., Söder O. // Horm. Res. Paediatr. 2011. Vol.75, №2. Р.131−137.]  показаны значимые взаимосвязи между уровнем экспрессии  ESR1, прогестерона, инсулиноподобного фактора роста 1  в плаценте  и их связь со сроком гестации и задержкой внутриутробного роста плода. Но информация о роли гаплотипа TG полиморфных локусов rs2234693-rs9340799 гена ESR1 в развитии задержки роста плода в зарубежной и отечественной литературе отсутствует.
Задачей настоящего исследования является расширение арсенала способов диагностики, а именно создание способа прогнозирования оценки риска развития синдрома задержки роста плода у женщин русской национальности, являющихся уроженками Центрального Черноземья, не имеющих отягощенного семейного анамнеза по задержке роста плода.
Технический результат использования изобретения – получение критериев оценки риска развития синдрома задержки роста плода у женщин русской национальности, являющихся уроженками Центрального Черноземья, не имеющих отягощенного семейного анамнеза по задержке роста плода, на основе данных о гаплотипе TG полиморфных локусов rs2234693-rs9340799 гена рецептора эстрогенов ESR1, включающий:
- выделение ДНК из периферической венозной крови;
- анализ полиморфных локусов rs2234693 и rs9340799 гена рецептора эстрогенов ESR1;
- прогнозирование высокого риска развития синдрома задержки роста плода у женщин без отягощенного семейного анамнеза по задержке роста плода при выявлении гаплотипа TG полиморфных локусов rs2234693-rs9340799 гена рецептора эстрогенов ESR1.
Новизна и изобретательский уровень заключаются в том, что из уровня техники не известна возможность прогноза риска развития синдрома задержки роста плода у женщин без отягощенного семейного анамнеза по задержке роста плода при наличии гаплотипа TG полиморфных локусов rs2234693-rs9340799 гена рецептора эстрогенов ESR1.
Выделение геномной ДНК из периферической крови осуществляют методом фенольно-хлороформной экстракции (Mathew, 1984) в два этапа. На первом этапе к 4 мл крови с ЭДТА добавляют 25 мл лизирующего буфера, содержащего 320мМ сахарозы, 1% тритон Х-100, 5мМ MgCl2, 10мМ трис-HCl с pH=7,6. Полученную смесь перемешивают и центрифугируют при 4ºС, 4000 об./мин. в течение 20 минут. После центрифугирования надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 4 мл раствора, содержащего 25 мМ ЭДТА с рН=8,0 и 75 мМ NaCl, ресуспензируют. Затем прибавляют 0,4 мл 10% SDS, 35 мкл протеиназы К, 10мг/мл,  и инкубируют образец при 37ºС в течение 16 часов.
На втором этапе из полученного лизата последовательно проводят экстракцию ДНК равными объемами фенола, фенол-хлороформа (1:1) и хлороформа с центрифугированием при 4000 об./мин. в течение 10 минут. После каждого центрифугирования производят отбор водной фазы. ДНК осаждают из раствора двумя объемами охлажденного 96% этанола. После лиофилизации полученную ДНК растворяют в бидистиллированной, деионизованной воде и хранят при минус 200С. Выделенную ДНК используют для проведения полимеразной цепной реакции синтеза ДНК.
Анализ полиморфизма rs2234693 ESR1 проводят методом ПЦР-синтеза ДНК на амплификаторе СFX96 с использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров и зондов с последующим анализом полиморфизма методом дискриминации аллелей. Реакционная смесь объемом 25 мкл включает: 67 мМ трис-HCl с pH=8,8, 2,5мМ MgCl2, 0,1 мкг геномной ДНК, по 10 пМ каждого праймера, по 5 пкмоль каждого зонда, по 200 мкМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP и 1 единицу активной Taq-полимеразы. После денатурации в течение 5 мин. при 95°С выполняют 40 циклов амплификации по схеме: отжиг праймеров – 1 мин. при t=54°С; денатурация – 15 сек при t=95°С. При проведении ПЦР в амплификаторе CFX96 с флюоресцентной детекцией генотипирование осуществляют методом Tag Man зондов по данным величин ОЕФ (относительные единицы флуоресценции). Для rs2234693 ESR1 зонд с флуоресцентным красителем ROX соответствует аллелю G, зонд с красителем FAM – аллелю Т (фиг.1).
Для исследования полиморфизма rs9340799 ESR1 методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК на амплификаторе IQ5 (Bio-Rad)  использовались соответствующие олигонуклеотидные праймеры и зонды  с последующим анализом полиморфизма методом дискриминации аллелей. Реакционная смесь объемом 25 мкл включает: 67 мМ трис-HCl с pH=8,8, 2,5 мМ MgCl2, 0,1 мкг геномной ДНК, по 10 пМ каждого праймера, по 5 пкмоль каждого зонда, по 200 мкМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP и 1 единицу активной Taq-полимеразы. После денатурации, 5 мин. при 95°C, выполняли 40 циклов амплификации по схеме: отжиг праймеров - 1 мин при 52°C; денатурация - 15 сек при 95°C. При проведении ПЦР в амплификаторе IQ5 с флюоресцентной детекцией  генотипирование осуществлялось методом Tag Man зондов по данным величин RFU (уровень относительной флуоресценции) каждого зонда, представленны: зонд с флуоресцентным красителем ROX соответствует аллелю G, зонд с красителем FAM - аллелю А.
Изобретение характеризуется фигурами.
Фиг. 1. Дискриминации аллелей методом детекции TaqMan зондов по данным величин ОЕФ (относительные единицы флуоресценции) каждого зонда на амплификаторе CFX96 c детектирующей системой в режиме реального времени полиморфизма ESR1 (rs2234693):  -GG,   -ТТ,  -GТ,                          •-отрицательный контроль
Фиг. 2. Дискриминации аллелей методом детекции TaqMan зондов по данным величин ОЕФ (относительные единицы флуоресценции) каждого зонда на амплификаторе CFX96 c детектирующей системой в режиме реального времени полиморфизма ESR1 (rs9340799):   - АА,    - GG,   - АG,                    •- отрицательный контроль.
Для анализа ассоциаций гаплотипов изучаемых полиморфных локусов  с риском развития синдрома задержки роста плода использовался логистический регрессионный анализ.  Коррекция на множественные сравнения проводилась с использованием пермутационного теста (выполнялось 1000 пермутаций), за статистически значимый принимали уровень pperm<0,05. Расчеты выполнялись в программном обеспечении PLINK v. 2.050 (http://zzz.bwh.harvard.edu/plink/).
Возможность использования предложенного способа для оценки риска развития синдрома задержки роста плода подтверждает анализ результатов наблюдений 520 женщин русской национальности, родившихся в Центрально-Черноземном регионе РФ, не имеющих родственных связей между собой и без отягощенного семейного анамнеза по задержке роста плода: 196 беременных с задержкой роста плода (средний возраст 26,63±4,41 лет) и 324 с физиологическим течением беременности (средний возраст 26,17±4,98, р>0,05). Из исследуемой группы исключались женщины с заболеваниями матки (фибромиома матки, аномалии развития внутренних половых органов), другой патологией беременности (аномалии прикрепления и расположения  плаценты, преэклампсия, резус-конфликт), патологией плода (ВПР), многоплодной беременностью. Все клинические и клинико-лабораторные исследования проводили на базе Перинатального  центра областной клинической больницы Святителя Иоасафа г. Белгорода в 2008 - 2015гг.  Клиническое и клинико-лабораторное обследование беременных проводилось на сроке родоразрешения. Информированное согласие было получено от каждой женщины, включенной в исследование.  Полученные материалы протоколировали по стандартам этического комитета Российской Федерации.
Выявлено, что гаплотип TG полиморфных локусов rs2234693-rs9340799 гена ESR1 среди беременных с задержкой роста плода (14,30%) встречается значительно чаще (в 1,78 раза), чем у женщин с физиологически протекающей беременностью (8,00%, p=0,002, pperm=0,008) (Таблица).
Таблица. Частоты гаплотипов полиморфных локусов rs2234693 и rs9340799 гена ESR1 у беременных с ЗРП и в контрольной группе.
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что наличие гаплотипа TG полиморфных локусов rs2234693-rs9340799 гена ESR1 является фактором риска ЗРП (OR=1,86) .
Примеры конкретного выполнения.
1. У женщины В.,  русской национальности, уроженки Центрального Черноземья, не имеющей отягощенного семейного анамнеза, на ранних сроках беременности была взята венозная кровь, при генотипировании ДНК-маркеров был выявлен гаплотип CG rs2234693-rs9340799 ESR1, что позволило отнести ее в группу беременных с пониженным риском развития СЗРП. Это подтвердило дальнейшее наблюдение: в течение беременности и после родов не было выявлено признаков СЗРП.
2. У женщины Л., при прегравидарной подготовке, не имеющей отягощенного семейного анамнеза, была взята венозная кровь, при генотипировании ДНК-маркеров был определен гаплотип ТG rs2234693-rs9340799 ESR1, что позволило отнести ее в группу беременных с повышенным риском развития СЗРП. Это подтвердило дальнейшее наблюдение. При возникновении беременности у нее на сроке 26 недель был диагностирован  синдром задержки роста плода I степени.
3. У беременной Е., русской национальности, уроженки Центрального Черноземья, не имеющей отягощенного семейного анамнеза, на ранних сроках беременности  была взята венозная кровь, при генотипировании ДНК-маркеров был выявлен гаплотип TA rs2234693-rs9340799 ESR1, что позволило отнести ее в группу беременных с пониженным риском развития СЗРП. Это подтвердило дальнейшее наблюдение: в течение беременности и после родов не было выявлено признаков СЗРП.
4. У женщины И., русской национальности, уроженки Центрального Черноземья, не имеющей отягощенного семейного анамнеза, при прегравидарной подготовке была взята венозная кровь. При генотипировании ДНК-маркеров  был установлен гаплотип CA rs2234693-rs9340799 ESR1, что позволило отнести ее в группу беременных с пониженным риском развития СЗРП. Это подтвердило дальнейшее наблюдение: в течение беременности и после родов не было выявлено признаков СЗРП.
Применение данного способа позволит формировать среди женщин, не имеющих отягощенного семейного анамнеза по задержке роста плода, при прегравидарной подготовке и на ранних сроках беременности группы риска и своевременно реализовывать в этих группах необходимые лечебно-профилактические мероприятия по предупреждению развития задержки роста плода.