ГУМАНИЗИРОВАННЫЕ АНТИТЕЛА ПРОТИВ PSMA
HUMANIZED ANTI-PSMA ANTIBODIES

Область техники, к которой относится настоящее изобретение
Настоящая заявка относится к гуманизированным и/или деиммунизированным антителам, фрагментам антител или производным антител, которые связываются со специфическим мембранным антигеном предстательной железы (PSMA), и к способам применения указанных антител, фрагментов антител или производных антител в лечении рака предстательной железы и других неопластических опухолей, а также неврологических заболеваний.
Предшествующий уровень техники настоящего изобретения
Специфический мембранный антиген предстательной железы (PSMA), который также известен как глутаматкарбоксипептидаза II (GCPII), N-ацетил-L-аспартил-L-глутаматпептидаза I (NAALADase I) или N-ацетил-аспартилглутамат (NAAG) пептидаза, представляет собой фермент, кодируемый геном фолатгидролазы человека (FOLH1). PSMA представляет собой связанную с мембраной пептидазу клеточной поверхности, которая играет различные физиологические роли и экспрессируется в различных тканях, таких как предстательная железа, почка, тонкий кишечник, центральная и периферическая нервная система. Он в высокой степени экспрессируется злокачественными эпителиальными клетками предстательной железы и эндотелиальными клетками сосудов многочисленных солидных злокачественных новообразований, в том числе глиобластом, рака молочной железы и рака мочевого пузыря. Белок также участвует в различных неврологических заболеваниях, в том числе в шизофрении и ALS.
PSMA представляет собой трансмембранный гликопротеин II класса с коротким N-концевым цитоплазматическим хвостом из 18 аминокислот (аа 1-18), одной спиралью, пронизывающей мембрану (аа 19-43), и внеклеточным фрагментом, состоящим из аминокислот 44-750 с приблизительной молекулярной массой 84 кДа (Barinka et al., 2004). Короткий N-концевой цитоплазматический хвост, как было показано, взаимодействует с мембранными каркасными белками, которые регулируют эндоцитоз некоторых PSMA-связанных субстратов, такими как клатрин, клатриновый адаптерный белок 2, филамин А (FLNa) и кавеолин-1. Внеклеточная часть дополнительно делится на три домена: протеазу (аа 57-116 и аа 352-590), апикальную часть (аа 117-351) и С-концевой домен или домен димеризации (аа 591 750); эти фрагменты коллективно выполняют роль распознавания субстрата/лиганда (аа 57-116 и аа 352-590) (фиг. 1). Что касается аминокислотной последовательности и доменной организации, трехмерная внеклеточная структура PSMA напоминает рецептор трансферрина (Tfr). PSMA ферментативно активен только в димерной форме. Димеризация, а также гликозилирование необходимы для правильной конформации и ферментативной активности молекулы.
Экспрессия и локализация PSMA в нормальной предстательной железе человека связаны с цитоплазмой и апикальной стороной эпителия, окружающего протоки предстательной железы. Диспластическая и неопластическая трансформация ткани предстательной железы приводит к переносу PSMA с апикальной мембраны на просветную поверхность протоков. Хотя изначально считали, что PSMA специфичен для предстательной железы, более поздние исследования показали, что он также экспрессируется эпителиальными клетками тонкого кишечника (щеточной каймой), клетками проксимальных почечных канальцев и слюнными железами, а также в нервной системе.
В тонком кишечнике PSMA располагается в щеточной кайме проксимального отдела тощей кишки, где он действует как гидролаза на поли-γ-глутамированный фолат и активно транспортирует моноглутамилированные фолаты в кровоток ( et al., 2014). Таким образом, он проявляет как гидролизирующую, так и эндоцитарную функции, по меньшей мере у людей и свиней. Эндоцитарная интернализация происходит через ямки, окаймленные клатрином, посредством рецептор-опосредованного эндоцитоза. В нервной системе PSMA, также называемый NAAG-гидролазой, катализирует гидролиз NAAG, широко распространенного нейротрансмиттера в головном мозге млекопитающих, до глутамата и N-ацетиласпартата (NAA). Различные роли PSMA в разных тканях обусловили обширное исследование различных терапевтических подходов, направленных на доставку лекарственных средств и малых молекул специфически в клетки, экспрессирующие PSMA (Evans et al., 2016).
Уровни экспрессии PSMA выше в злокачественных тканях различного происхождения, чем в нормальных и здоровых тканях (Evans et al., 2016; Haffner et al., 2009). Этот паттерн экспрессии прямо указывает на роль PSMA в прогрессировании и инвазии рака и делает молекулу желательной мишенью для диагностики и лечения солидных опухолей.
По нескольким причинам PSMA является идеальной мишенью при раке предстательной железы. Во-первых, он в значительной степени надэкспрессируется почти на всех клетках рака предстательной железы. Уровень экспрессии в клетках рака предстательной железы в 100-1000 раз выше, чем в нормальной ткани. PSMA экспрессируется почти при всех раковых заболеваниях предстательной железы; только 5-10% случаев первичного рака предстательной железы или поражений рака предстательной железы имели отрицательные результаты PSMA на PET (Eiber et al., 2017).
Во-вторых, его экспрессия дополнительно увеличивается на поздних стадиях, при метастатическом заболевании высокой степени, при гормонально-рефрактерном раке предстательной железы и при метастатическом кастрационно-резистентном раке предстательной железы (mCRPC).
В-третьих, в отличие от других связанных с предстательной железой антигенов, таких как PSA, простатическая кислая фосфатаза и секреторный белок предстательной железы, PSMA как интегральный белок мембранной поверхности клетки типа II не секретируется и, следовательно, является отличной мишенью, например, для антитела или другой опосредованной лигандом терапии. После связывания с активным центром внеклеточного домена лиганды PSMA интернализируются. Последующая рециркуляция эндосом увеличивает отложение, что приводит к усиленному поглощению опухолью, удержанию и последующей высокой локальной дозе при терапевтических применениях.
В целом, метастазы рака предстательной железы часто поражают костный мозг и лимфатические узлы, которые являются местами, принимающими высокие уровни циркулирующих антител, и хорошо реагируют на терапевтические средства на основе моноклонального антитела при других типах опухолей, таких как лимфома и рак молочной железы (Nanus et al, 2003).
При раке предстательной железы экспрессия PSMA негативно регулируется андрогенами (Israel et al., 1993). Анализ транскрипции генов показал, что андроген может подавлять промотор гена PSMA. Следовательно, начало терапии депривацией андрогенов вызывает раннюю, но временную активацию экспрессии PSMA, подавление при длительной терапии депривацией андрогенов и, наконец, надэкспрессию PSMA в андроген-резистентных опухолях. Эти эффекты потенциально могут быть использованы для улучшения терапии и диагностики (Eiber et al., 2017). Хотя прямая роль PSMA в метастазировании рака предстательной железы до сих пор полностью не изучена, было показано, что гормональная терапия андрогенной абляции на андроген-чувствительных клетках повышает содержание PSMA, а повышенная экспрессия PSMA делает клетки менее инвазивными. С другой стороны, нокдаун PSMA приводил к пятикратному увеличению инвазивной активности.
Рак предстательной железы представляет собой наиболее часто диагностируемый рак у мужчин и вторую по частоте причину смерти в западных странах. Из-за высокой смертности и заболеваемости, связанных с прогрессированием заболевания, существует острая необходимость в новых целевых методах лечения. В настоящее время оценивают различные подходы к лечению рака предстательной железы. Малые молекулы, аптамеры или антитела используют в качестве специфических лигандов для использования PSMA при направленной доставке химиотерапевтических лекарственных средств (см. обзор Evans et al., 2016). Подходы к генной терапии, нацеленной на PSMA, основанные, например, на RNAi, антисмысловой РНК или аптамерах, а также на PSMA-опосредованной саморазрушающей генной терапии, в настоящее время находятся на стадии оценивания. При радиоиммунотерапии, которая в настоящее время используется у приблизительно 25% больных с локализованным заболеванием при раке предстательной железы (Cooperberg et al., 2010), добавление нацеливающего лиганда, такого как моноклональное антитело или аптамер, к радионуклиду позволяет нацеливаться на связанный с раком антиген клеточной поверхности, такой как PSMA, и тем самым снижать нежелательные побочные эффекты и повышение дозировки. Иммунотерапевтические средства, основанные на праймированных дендритных клетках (DC) или Т-клетках, несущих химерный антигенный рецептор (CAR) против PSMA, для индуцирования активности CTL против PSMA-позитивных опухолевых клеток, находятся на клинической стадии.
Антитела, связывающие PSMA, были описаны в предшествующем уровне техники. PSMA впервые был охарактеризован с помощью мышиного моноклонального антитела 7Е11, полученного от мышей, иммунизированных частично очищенными фракциями клеточной мембраны, выделенными из линии клеток аденокарциномы предстательной железы человека (LNCap) (Horoszewicz et al., 1986). Это первое опубликованное моноклональное антитело против PSMA распознает N-конец (MWNLLH) внутриклеточного домена PSMA (Troyer et al., 1995).
Были получены четыре моноклональных антитела IgG мыши (J591, J415, J533 и Е99) против внеклеточного домена PSMA, которые, в отличие от 7Е11, распознают два различных неконкурентных эпитопа, расположенных на внешней стороне клетки (Liu et al., 1997; Nanus et al., 2003).
Wolf et al. (2010a) получили три разных мышиных моноклональных антитела против PSMA 3/А12, 3/Е7 и 3/F11, демонстрирующих сильное связывание с PSMA-позитивной субклеточной линией LNCaP рака предстательной железы С4-2 со средними полумаксимальными концентрациями насыщения от 9 до 17 нМ (ЕР 1883698 В2). Антитела окрашивали эпителиальные клетки во всех тестируемых образцах нормальной и опухолевой ткани предстательной железы. Как показали исследования конкурентного связывания, три моноклональных антитела связываются с различными внеклеточными эпитопами PSMA. Было обнаружено, что эпитоп 3/А12 полностью или частично перекрывается с эпитопом антитела J591.
Фрагмент одноцепочечного антитела против PSMA (scFv), называемый D7, выделенный с помощью фагового дисплея из моноклонального антитела 3/F11, использовали для конструирования иммунотоксина путем лигирования С-конца экзотоксина А Pseudomonas с cDNA D7; этот иммунотоксин подавлял рост PSMA-положительных клеток рака предстательной железы in vitro, а также in vivo (Wolf et al, 2010b).
В отличие от результатов, полученных с моноклональными антителами 3/А12, 3/Е7 и 3/F11, которые были получены от мышей, иммунизированных неочищенным лизатом клеток LNCaP, те же исследователи получили три моноклональных антитела К7, К12 и D20 от мышей, иммунизированных очищенным PSMA, который был высокоактивен только с выделенным антигеном, но показал слабую реакцию или ее отсутствие с жизнеспособными клетками LNCaP (Elsasser-Beile et al., 2006).
Tykvart et al. (2014) охарактеризовали тринадцать различных PSMA-специфичных моноклональных антител мыши с точки зрения их активности связывания с нативным и денатурированным антигеном.
В WO 2001009192 (Medarex) описана разработка человеческих моноклональных антител против специфического мембранного антигена предстательной железы. Человеческие моноклональные антитела против PSMA создавали путем иммунизации мышей очищенным PSMA или обогащенными препаратами антигена PSMA. Такой очищенный антиген представляет собой денатурированный PSMA, поскольку он был очищен иммуноадсорбцией после лизиса клеток ионными детергентами.
В WO 1997035616 (Pacific Northwest Cancer Foundation) описываются моноклональные антитела, специфические в отношении внеклеточного домена специфического мембранного антигена предстательной железы. Иммунизацию проводили С-концевым пептидом или препаратом мембраны опухоли, экспрессирующей PSMA. Полученные моноклональные антитела не связывались специфически с клетками, экспрессирующими PSMA, и поэтому не могли быть использованы для диагностических или терапевтических целей.
Bander et al. (2003) раскрыли моноклональные антитела, направленные против специфического мембранного антигена предстательной железы. Поскольку иммунизацию проводили очищенным антигеном, моноклональные антитела не подходили для связывания с клетками, и scFv нельзя было получить ни из одного из этих моноклональных антител. В WO 1998/03873, описывающих те же самые антитела или их связывающие части, которые распознают внеклеточный домен специфического мембранного антигена предстательной железы, не могло быть показано, что связывающие части антител действительно связываются с антигеном.
Иммуногенность является критическим фактором при разработке лекарственного средства на основе антитела (Almagro and Fransson, 2008). Все экзогенные белки, используемые в терапевтических целях, создают риск образования антител против лекарственного средства у реципиентов (Schellekens, 2002), а применение терапевтических белков и антител нечеловеческого происхождения обычно связано с образованием антител против лекарственного средства, что зачастую приводит к образованию вредных иммунных комплексов и/или к нейтрализации терапевтических средств. Было показано, что помимо происхождения и природы антитела на иммуногенность влияют и другие факторы, такие как тип заболевания, путь введения и генетический фон реципиентов.
Таким образом, по разным причинам описанные выше антитела против PSMA из предшествующего уровня техники не подходят для терапии человека, в частности, из-за их иммуногенного потенциала, отсутствия распознавания мишени или недостаточной аффинности связывания.
Краткое раскрытие настоящего изобретения
С учетом предшествующего уровня техники одной из целей настоящего изобретения является обеспечение гуманизированных антител, фрагментов антител или производных антител, которые связывают специфический мембранный антиген предстательной железы (PSMA) с высокой аффинностью, в частности, эпитоп внеклеточного домена PSMA, как описано в настоящей заявке.
Антитела, фрагменты антител или их производные, раскрываемые в настоящем документе, содержат гуманизированные последовательности, в частности, предпочтительной антигенсвязывающей области на основе VH и VL, которые поддерживают соответствующую аффинность лиганда. Модификации аминокислотной последовательности для получения указанных гуманизированных последовательностей могут происходить в областях CDR, и/или в каркасных областях исходного антитела, и/или в последовательностях константной области антитела.
Еще одна цель настоящего изобретения заключается в обеспечении антител, которые специфически связываются с PSMA поверхности нативной клетки и, следовательно, являются ценными для диагностических и терапевтических применений, фокусирующихся на PSMA в качестве целевого антигена для рака предстательной железы.
Еще одна цель настоящего изобретения заключается в обеспечении соединений для применения в способах лечения рака предстательной железы или неврологических нарушений.
Еще одна цель настоящего изобретения заключается в обеспечении соединений, разрушающих клетки рака предстательной железы, экспрессирующие PSMA.
Другая цель настоящего изобретения заключается в обеспечении антитела, фрагмента антитела или его производного антитела с низкой или отсутствующей иммуногенностью у людей. Предпочтительно такое антитело представляет собой моноклональное антитело, его фрагмент антитела или производное антитела.
Другая цель настоящего изобретения заключается в обеспечении конъюгатов антитело-лекарственное средство (ADC) для применения в способах лечения рака предстательной железы и других заболеваний, предпочтительно содержащих аматоксин.
Полной неожиданностью было то, что гуманизированные последовательности в соответствии с настоящим изобретением, в частности, последовательности CDR областей VH и VL, участвующие в связывании с целевой молекулой, демонстрируют специфическое и сильное связывание, как показано в примерах, а также сохраняют или даже превышают характеристики связывания исходного мышиного антитела 3F11 без какого-либо созревания аффинности, которое обычно требуется после гуманизации антител. Для специалиста было бы неожиданным, что характеристики связывания гуманизированных вариантов будут подобными, не говоря уже о даже лучших характеристиках связывания, чем у исходного мышиного антитела. Принимая во внимание изменения последовательностей в вариабельных доменах и, в частности, CDR, полезные характеристики связывания гуманизированных последовательностей, продемонстрированные в настоящем документе, следует рассматривать как неожиданный технический эффект.
Кроме того, было совершенно неожиданным, что с гуманизированными последовательностями в соответствии с настоящим изобретением при их экспрессии в эукариотических клетках-хозяевах, получали значительно лучшие выходы экспрессии, чем с последовательностями родительских антител. Таким образом, биотехнологическое получение гуманизированных антител или их фрагментов антител или производных антител в соответствии с настоящим изобретением может быть осуществлено со значительно более низкими затратами, чем с последовательностями родительских антител.
Эти и другие цели достигаются с помощью способов и средств согласно независимым пунктам формулы настоящего изобретения. Зависимые пункты формулы относятся к конкретным вариантам осуществления.
Настоящее изобретение и общие преимущества его признаков будут подробно рассмотрены ниже.
Краткое описание графических материалов
Фиг. 1. Схематическое представление трансмембранного белка PSMA в виде гомодимера (от Evans et al., 2016).
H
H
H
L
L
L
H
Фиг. 2. Схематическое представление антитела. Структура IgG, демонстрирующая две идентичных тяжелых (Н) цепи и две идентичных легких (L) цепи. Н цепи имеют четыре домена, три С домена (C1 - C3) и один V. L цепи имеют один C домен и один V домен. Fv-фрагмент (обозначен квадратом) представляет собой часть молекулы, которая взаимодействует с антигеном. Он образован нековалентным спариванием V и V. Fv-фрагмент показан на изображении антигена, указывающем размещение гипервариабельных петель (от Almagro and Fransson, 2008).
Фиг. 3. Выравнивание последовательностей вариабельных областей тяжелой цепи (VH) вариантов гуманизированного/деиммунизированного антитела 3F11. Аминокислотные замены по сравнению с мышиным 3F11 дикого типа выделены жирным шрифтом.
Фиг. 4. Выравнивание последовательностей вариабельных областей легкой цепи (VL) вариантов гуманизированного/деиммунизированного антитела 3F11. Аминокислотные замены по сравнению с мышиным 3F11 дикого типа выделены жирным шрифтом.
Фиг. 5. SDS-PAGE и окрашивание Кумасси для анализа вариантов 13-16 гуманизированного антитела 3F11 в восстанавливающих условиях. Загружали 1 мкг на лунку образца и контроля на гель.
2
Фиг. 6. Кривые зависимости связывания от дозы для вариантов гуманизированного антитела 3F11. Символы представляют собой среднее значение ± SEM для повторных образцов (n=2 для гуманизированных образцов и n=8 для химерного антитела 3F11 дикого типа) для нормализованных данных связывания для одного эксперимента. MFI по сравнению с преобразованными данными логарифма дозы нормализовали с использованием максимального и минимального значений MFI. R≥0,99 во всех случаях.
50
50
Фиг. 7. Связывание ЕС для вариантов гуманизированного антитела 3F11. Символы представляют собой среднее значение ЕС, а столбцы показывают 95% доверительный интервал (CI). Черные пунктирные линии показывают 95% CI для антитела 3F11 дикого типа (n=8), а красные пунктирные линии показывают 95% CI для 3F11-var7 (n=1) для одного эксперимента. Вариант с наивысшей активностью связывания (3F11-var7) и антитело дикого типа показаны закрашенным символом.
Подробное раскрытие настоящего изобретения
Перед подробным раскрытием настоящего изобретения следует обратить внимание на то, что настоящее изобретение не ограничивается конкретными составными частями описанных устройств или стадиями процесса описанных способов, поскольку такие устройства и способы могут варьировать. Также следует учитывать, что используемая в настоящем документе терминология предназначена исключительно для целей описания конкретных вариантов осуществления и не предназначена для ограничения. Следует отметить, что при использовании в описании и прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа предусматривается единственное и/или множественное число, если контекст явно не диктует иное. Более того, следует учитывать, что в случае, если даны диапазоны параметров, которые ограничены числовыми значениями, считается, что диапазоны включают в себя эти ограничивающие значения.
Кроме того, следует учитывать, что варианты осуществления, раскрываемые в настоящем документе, не предназначены для понимания их как отдельных вариантов осуществления, которые не связаны друг с другом. Признаки, обсуждаемые в одном варианте осуществления, должны быть раскрыты также в связи с другими вариантами осуществления, показанными в настоящем документе. Если в одном случае конкретный признак не раскрывается не в одном варианте осуществления, а в другом, квалифицированному специалисту будет понятно, что это не обязательно означает, что указанный признак не предназначен для раскрытия в указанном другом варианте осуществления. Квалифицированному специалисту будет понятно, что суть настоящей заявки состоит в том, чтобы раскрыть упомянутый признак также для другого варианта осуществления, но это не было сделано исключительно для ясности и для сохранения настоящего раскрытия в доступном объеме.
Кроме того, содержание документов предшествующего уровня техники, упомянутых в настоящем документе, включено посредством ссылки. Это относится, в частности, к документам предшествующего уровня техники, которые раскрывают стандартные или рутинные способы. В этом случае включение посредством ссылки в основном имеет цель обеспечить достаточное раскрытие и избежать длинных повторений.
Используемый в настоящем документе термин «антитело» должен относиться к белку, состоящему из одной или нескольких полипептидных цепей, кодируемых генами иммуноглобулинов или фрагментами генов иммуноглобулинов или cDNA, происходящими от них. Указанные гены иммуноглобулинов включают в себя гены константной области легкой цепи каппа, лямбда и тяжелой цепи альфа, дельта, эпсилон, гамма и мю, а также любые из множества различных генов вариабельной области.
H
H
L
L
Основной структурной единицей иммуноглобулина (антитела) обычно является тетрамер, состоящий из двух идентичных пар полипептидных цепей, легких цепей (L, имеющих молекулярную массу приблизительно 25 кДа) и тяжелых цепей (Н, имеющих молекулярную массу приблизительно 50-70 кДа). Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (сокращенно VH или V) и константной области тяжелой цепи (сокращенно СН или C). Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов, а именно CH1, СН2 и СН3. Каждая легкая цепь включает в себя вариабельную область легкой цепи (сокращенно VL или V) и константную область легкой цепи (сокращенно CL или C). VH и VL области могут быть дополнительно разделены на области гипервариабельности, которые также называются определяющими комплементарность областями (CDR), чередующиеся с областями, которые являются более консервативными и называются каркасными областями (FR). Каждая VH и VL область состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от аминоконца до карбоксиконца в следующем порядке FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельные области тяжелых и легких цепей образуют связывающий домен, который взаимодействует с антигеном.
CDR наиболее важны для связывания антитела или его антигенсвязывающей части. FR могут быть заменены другими последовательностями при условии сохранения трехмерной структуры, необходимой для связывания антигена. Структурные изменения конструкции чаще всего приводят к потере достаточного связывания с антигеном.
Термин «антигенсвязывающая часть» (моноклонального) антитела относится к одному или нескольким фрагментам антитела, которые сохраняют способность специфического связывания со специфическим мембранным антигеном предстательной железы в его нативной форме. Примеры антигенсвязывающих частей антитела включают в себя Fab-фрагмент, одновалентный фрагмент, состоящий из VL, VH, CL и СН1 доменов, F(ab')2-фрагмент, двухвалентный фрагмент, состоящий из двух Fab-фрагментов, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области, Fd-фрагмент, состоящий из VH и СН1 доменов, Fv-фрагмент, состоящий из VL и VH доменов одного плеча антитела, и dAb-фрагмент, который состоит из VH домена и выделенной определяющей комплементарность области (CDR).
Используемый в настоящем документе термин «моноклональное антитело (mAb)» относится к композиции антитела, имеющей гомогенную популяцию антител, т.е. гомогенную популяцию, состоящую из целого иммуноглобулина или его фрагмента или производного. Особенно предпочтительным является то, что такое антитело выбрано из группы, состоящей из IgG, IgD, IgE, IgA и/или IgM, или его фрагмента или производного.
Используемый в настоящем документе термин «фрагмент» относится к фрагментам такого антитела, сохраняющим способности связывания с мишенью, например, CDR (определяющая комплементарность область), гипервариабельная область, вариабельный домен (Fv), тяжелая цепь IgG (состоящая из VH, СН1, шарнира, областей СН2 и СН3), легкая цепь IgG (состоящая из областей VL и CL) и/или Fab, и/или F (ab) 2.
2
Используемый в настоящем документе термин «производное» относится к белковым конструкциям, которые структурно отличаются от общей концепции антител, но все же имеют некоторое структурное отношение к ней, например, scFv, Fab и/или F(ab), а также конструкции антител с двойной, тройной или более высокой специфичностью. Все эти элементы описаны ниже.
Другими производными антител, известными специалисту в данной области, являются диатела, антитела верблюдовых, доменные антитела, двухвалентные гомодимеры с двумя цепями, состоящими из scFv, IgA (две структуры IgG, соединенные J-цепью и секреторным компонентом), антитела акулы, антитела, состоящие каркаса широконосых приматов плюс CDR приматов, отличных от широконосых, димеризированные конструкции, содержащие CH3+VL+VH, другие форматы каркасных белков, содержащие CDR, и конъюгаты антител (например, антитело или его фрагменты или производные, связанные с лекарственным средством, токсином, цитокином, аптамером, нуклеиновой кислотой, такой как дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) или рибонуклеиновая кислота (РНК), терапевтическим полипептидом, радиоизотопом или меткой). Указанные форматы каркасных белков могут включать в себя, например, белки анкирин, аффилин и другие.
Используемый в настоящем документе термин «Fab» относится к фрагменту IgG, содержащему антигенсвязывающую область, при этом указанный фрагмент состоит из одного константного и одного вариабельного домена от каждой тяжелой и легкой цепей антитела.
2
Используемый в настоящем документе термин «F(ab)» относится к фрагменту IgG, состоящему из двух фрагментов Fab, связанных друг с другом дисульфидными связями.
Используемый в настоящем документе термин «scFv» относится к одноцепочечному вариабельному фрагменту, представляющему собой слияние вариабельных областей тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов, связанных вместе коротким линкером, обычной содержащим сериновые (S) и/или глициновые (G) остатки. Такая химерная молекула сохраняет специфичность исходного иммуноглобулина, несмотря на удаление константных областей и введение линкерного пептида.
Модифицированными форматами антитела являются, например, би- или триспецифические конструкции антитела, белки слияния на основе антитела, иммуноконъюгаты и подобное.
2
IgG, scFv, Fab и/или F(ab) представляют собой форматы антитела, которые хорошо известны специалисту в данной области. Относящиеся к ним методики применения доступны из соответствующих учебников.
Моноклональные антитела (mAb), полученные от мыши, могут вызывать нежелательные иммунологические побочные эффекты из-за того, что они включают в себя белок другого вида, который может индуцировать антитела. Чтобы преодолеть эту проблему, разрабатывали способы гуманизации и созревания антител для создания молекул антител с минимальной иммуногенностью при применении у людей, при этом в идеале все еще сохраняющих специфичность и аффинность родительского антитела, не являющегося человеческим (для обзора см. Almagro and Fransson, 2008). С использованием этих способов, например, каркасные области мышиного mAb заменяют соответствующими каркасными областями человека (так называемая прививка CDR). В WO 200907861 раскрывается создание гуманизированных форм мышиных антител путем связывания областей CDR отличных от человеческих антител с человеческими константными областями с помощью технологии рекомбинантной ДНК. В патенте US 6548640 от Medical Research Council описаны методики прививки CDR, а в патенте US 5859205 от Celltech описано получение гуманизированных антител.
Однако гуманизация путем прививки CDR часто приводит к значительному снижению или даже потере аффинности связывания, поскольку набор поддерживающих каркасных остатков в так называемой зоне Вернье важен для поддержания конформации CDR (Foote and Winters, 1992). Эти остатки отвечают за стабилизацию гипервариабельной петлевой структуры и модификацию их положения; они точно настраивают аффинность антитела. Повторное введение мышиных остатков в человеческий каркас (Queen et al., 1989) может решить эту проблему. Такие замены обычно называют «обратными мутациями».
Иммуногенность представляет собой способность индуцировать ответ хелперных Т-клеток (Th), который запускается, когда уникальный рецептор Т-клеток распознает пептид, связанный с молекулами HLA (человеческого лейкоцитарного антигена) класса II, отображаемыми на антигенпрезентирующих клетках (АРС). Пептиды образуются из белков, интернализованных антигенпрезентирующими клетками, которые затем обрабатываются путем эндосомного расщепления. Только пептиды с достаточной аффинностью к молекулам HLA класса II будут представлены на клеточной поверхности АРС и, возможно, смогут вызвать ответ Th.
С использованием процесса, известного как деиммунизация, можно еще больше снизить иммуногенный потенциал путем удаления эпитопов Th (Chamberlain, 2002; Baker and Jones, 2007). Это достигается путем прогнозирования того, какие пептиды в соответствующем терапевтическом белке могут связываться с молекулами HLA класса II, и последующего введения замен, которые устраняют или снижают аффинность связывания пептида с молекулами HLA класса II.
Существует несколько генов HLA класса II, а молекулы HLA класса II состоят из альфа- и бета-цепей, каждая из которых экспрессируется из разных генов, что увеличивает вариабельность (DRA/DRB, DQA/DQB и DPA/DPB), и почти все они являются в высокой степени полиморфными, только DRA не является полиморфным. Во время деиммунизации основное внимание уделяется аллотипам DR, которые, как известно, экспрессируются на более высоких уровнях, чем DQ и DP. Оценка релевантности отдельных эпитопов основана на критериях неизбирательности, т.е. на количестве аллотипов HLA, с которыми связывается конкретный эпитоп, а также важности (частоте) аллотипов в популяции и качественной оценке прочности связывания комплекса HLA-пептид. Поскольку популяция Т-клеток индивидуума была выбрана так, чтобы не распознавать «собственные пептиды» эндогенных белков, таких как антитела, можно провести скрининг подлежащего деиммунизации белка на наличие пептидов, которые соответствуют (известным) собственным пептидам, которые не должны обычно индуцировать ответ Th.
Используемый в настоящем документе термин «гуманизированное антитело» относится к антителу, его фрагменту или производному, в котором по меньшей мере часть константных областей и/или каркасных областей и необязательно часть областей CDR антитела происходит из последовательностей иммуноглобулина человека или адаптирована к ним.
Также в объем настоящего изобретения включены варианты последовательностей нуклеиновой кислота или аминокислотных последовательностей, заявленных в настоящем документе, которые, например, определены заявленным % идентичности (гомологии) последовательностей и которые поддерживают указанные свойства антител, фрагментов или производных антител в соответствии с настоящим изобретением. Термин «идентичность последовательностей» относится к процентному содержанию идентичных нуклеотидов или аминокислот при выполнении выравнивания последовательностей.
Используемый в настоящем документе термин «аминокислотная замена» относится к модификациям аминокислотной последовательности белка, при которых одна или несколько аминокислот заменяются одинаковым количеством разных аминокислот, в результате чего получается белок, который содержит другую аминокислотную последовательность, чем исходный белок. Под консервативной аминокислотной заменой подразумевают замену, которая из-за сходного размера, заряда, полярности и/или конформации существенно не влияет на структуру и функцию белка. Группы консервативных аминокислот в этом смысле представляют собой, например, неполярные аминокислоты Gly, Ala, Val, Ile и Leu, ароматические аминокислоты Phe, Trp и Tyr, положительно заряженные аминокислоты Lys, Arg и His, а также отрицательно заряженные аминокислоты Asp и Glu.
Настоящее изобретение относится к гуманизированному антителу или его фрагменту антитела или производному антитела, которые связываются с внеклеточным доменом специфического мембранного антигена предстательной железы (PSMA).
Далее будут обсуждаться предпочтительные последовательности CDR. Важно понимать, что CDR содержатся в подходящем белковом каркасе, чтобы быть способными связываться с внеклеточным доменом специфического мембранного антигена предстательной железы (PSMA).
Настоящее изобретение также обеспечивает гуманизированное антитело или его фрагмент антитела или производное антитела, которые связываются с внеклеточным доменом PSMA, включающим в себя VH домен, который включает в себя последовательности CDR
1
2
3
4
1
2
3
4
- GXTXTXX (CDR H1), в которой каждый X, Х, Х и Х представляет собой Y, F, W;
5
6
7
8
9
10
5
6
7
8
9
10
- GISPGDXNXNYXXXFXG (CDR H2), в которой X представляет собой G, S; X представляет собой Т, V; Х представляет собой N, A; X представляет собой Е, Q; Х представляет собой N, К; Х представляет собой К, Q; и
11
12
13
11
12
13
- DGNXPXXAMDS (CDR Н3), в которой каждый Х, Х, Х представляет собой Y, F, W.
Настоящее изобретение также относится к указанному гуманизированному антителу или его фрагменту антитела или производному антитела, в котором VH домен содержит последовательность HI CDR GYTFTYF (SEQ ID №1).
Настоящее изобретение, кроме того, относится к указанному гуманизированному антителу или его фрагменту антитела или производному антитела, связывающемуся с внеклеточным доменом PSMA, в котором VH домен содержит последовательность Н2 CDR SEQ ID №2, или SEQ ID №7, или SEQ ID №9, или SEQ ID №11.
Настоящее изобретение, кроме того, относится к указанному гуманизированному антителу или его фрагменту антитела или производному антитела, связывающемуся с внеклеточным доменом PSMA, в котором VH домен содержит последовательность НЗ CDR DGNFPYYAMDS (SEQ ID №3).
Согласно предпочтительному варианту осуществления антитело или его фрагмент антитела или производное антитела, связывающиеся с внеклеточным доменом PSMA, содержат VH домен, включающий в себя
SEQ ID №1 и
SEQ ID №2, или SEQ ID №7, или SEQ ID №9, или SEQ ID №11
и SEQ ID №3.
Согласно дополнительному предпочтительному варианту осуществления антитело или его фрагмент антитела или производное антитела, связывающиеся с внеклеточным доменом PSMA, содержат VH домен, содержащий любую из последовательностей согласно SEQ ID №№13, 15, 17 или 19.
Настоящее изобретение также относится к гуманизированному антителу или его фрагменту антитела или производному антитела, которые связываются с внеклеточным доменом PSMA, содержат VL домен, который включает в себя последовательности CDR
1
2
3
1
2
3
- RSSQSLVHSXGXTXLH (CDR L1), в которой X представляет собой N, S; Х представляет собой N, Q; Х представляет собой Y, F, W,
4
4
- TVSNRXS (CDR L2), в которой Х представляет собой A, Y, F, W, и
- SQSTHVPT (CDR L3).
Согласно предпочтительному варианту осуществления указанные антитело или его фрагмент антитела или производное антитела содержат VL домен, который включает в себя последовательность L1 CDR SEQ ID №4, или SEQ ID №8, или SEQ ID №10.
Согласно дополнительному предпочтительному варианту осуществления указанные антитело или его фрагмент антитела или производное антитела содержат VL домен, который включает в себя последовательность L2 CDR SEQ ID №5 или SEQ ID №12.
Согласно дополнительному предпочтительному варианту осуществления указанные антитело или его фрагмент антитела или производное антитела содержат VL домен, который включает в себя комбинацию
SEQ ID №, 4 или SEQ ID №8, или SEQ ID №10, и
SEQ ID №5 или SEQ ID №12, и
SEQ ID №6.
Настоящее изобретение, в частности, относится к антителу или его фрагменту антитела или производному антитела, содержащему VL домен, который включает в себя любую из последовательностей согласно SEQ ID №№14, 16, 18 или 20.
Настоящее изобретение также относится к антителу или его фрагменту антитела или производному антитела, содержащему комбинацию по меньшей мере одной из последовательностей CDR VH, упомянутых выше и по меньшей мере одной из последовательностей VL CDR, упомянутых выше.
Настоящее изобретение также относится к указанному антителу или его фрагменту антитела или производному антитела, содержащему комбинацию по меньшей мере одной из последовательностей VH домена, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID №13, 15, 17 и 19, и по меньшей мере одной из последовательностей VL домена, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID №14, 16, 18 и 20.
50
50
50
Настоящее изобретение также относится к любому такому антителу или его фрагменту антитела или производному антитела, описанному выше, при этом они связываются с внеклеточным доменом PSMA с аффинностью ЕС<0,4 мкг/мл, предпочтительно аффинностью ЕС<0,3 мкг/мл, наиболее предпочтительно аффинностью ЕС<0,4 мкг/мл.
Указанные гуманизированное антитело против PSMA или его фрагмент антитела или производное антитела могут быть гликозилированными. Гликан может представлять собой N-связанную олигосахаридную цепь по аспарагину 297 тяжелой цепи.
Указанный специфический мембранный антиген предстательной железы может быть специфическим мембранным антигеном предстательной железы млекопитающего, отличного от примата животного, примата и, в частности, человека.
Антитело или его фрагмент антитела или производное антитела в соответствии с настоящим изобретением может представлять собой моноклональное антитело. Антитело может принадлежать изотипу IgA, IgD, IgE, IgG или IgM.
2
Настоящее изобретение относится к фрагменту антитела, который выбран из группы, состоящей из вариабельного домена (Fv), Fab-фрагмента и Р(аb)-фрагмента. Настоящее изобретение также относится к производному антитела, которое предпочтительно представляет собой одноцепочечный Fv (scFv).
Согласно предпочтительному варианту осуществления гуманизированное антитело или его фрагмент или производное, например, scFv, описанный в настоящей заявке, специфически связываются с нативным PSMA на клеточной поверхности и поэтому будут обладать ценностью в диагностических и терапевтических применениях, нацеливающихся на PSMA в качестве целевого антигена, например, при раке предстательной железы. Поскольку PSMA экспрессируется на клетках рака предстательной железы со специфической третичной и четвертичной структурой, особенно антитела против этой клеточной конформации могут распознавать жизнеспособные клетки рака предстательной железы и ткани, экспрессирующие PSMA, и прочно связываться с таковыми. Следовательно, одна из целей настоящего исследования заключалась в создании таких антител или их фрагментов или производных, которые можно использовать для терапевтического и диагностического нацеливания на рак предстательной железы.
Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящее изобретение, кроме того, относится к конъюгату антитело-лекарственное средство (ADC, также называемому иммуноконъюгатом), содержащему гуманизированное антитело или его фрагмент или производное, как описано выше, конъюгированные с терапевтическим средством, необязательно через линкерный фрагмент.
Указанное терапевтическое средство может представлять собой, например, лекарственное средство, химиотерапевтическое средство, цитотоксическое средство, такое как, например, таксол, цитохалазин В, грамицидин D, токсин, подавляющее рост средство, аптамер, нуклеиновая кислота, такая как дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) или рибонуклеиновая кислота (РНК), терапевтический полипептид или радиоактивное вещество.
ADC может включать в себя линкерную область между терапевтическим средством и антителом против PSMA или его фрагментом антитела или производным антитела. Линкер может быть расщепляемым, например, без ограничения с помощью расщепляющего средства или условий кислотного рН.
Согласно другому аспекту настоящего изобретения представлены гуманизированное антитело против PSMA или его фрагмент или производное, при этом указанное антитело составляют в фармацевтическом составе.
В водной форме указанный фармацевтический состав может быть готов для введения, тогда как в лиофилизированной форме указанный состав может быть переведен в жидкую форму перед введением, например, путем добавления воды для инъекций, которая может содержать или не содержать консервант, такой как, например, без ограничения бензиловый спирт, антиоксиданты, такие как витамин А, витамин Е, витамин С, ретинилпальмитат и селен, аминокислоты цистеин и метионин, лимонная кислота и цитрат натрия, синтетические консерванты, такие как парабены метилпарабен и пропилпарабен.
Указанный фармацевтический состав может дополнительно содержать один или несколько стабилизаторов, которые могут представлять собой, например, аминокислоту, сахарный многоатомный спирт, дисахарид и/или полисахарид. Указанный фармацевтический состав может дополнительно содержать одно или несколько поверхностно-активных веществ, одно или несколько изотонизирующих средств, и/или один или несколько хелаторов ионов металлов, и/или один или несколько консервантов.
Фармацевтический состав, описываемый в настоящем документе, может подходить по меньшей мере для внутривенного, внутримышечного или подкожного введения. В качестве альтернативы, антитело в соответствии с настоящим изобретением может быть обеспечено в форме депо, которая обеспечивает замедленное высвобождение биологически активного средства в течение определенного периода времени.
Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения представлена первичная упаковка, такая как предварительно заполненный шприц или шприц-ручка, флакон или инфузионный пакет, которые содержат указанный состав согласно предыдущему аспекту настоящего изобретения и/или указанное гуманизированное антитело против PSMA или его фрагмент или производное.
Предварительно заполненный шприц или шприц-ручка может содержать состав либо в лиофилизированной форме (которая затем должна быть солюбилизирована, например, водой для инъекций, перед введением), либо в водной форме. Указанный шприц или шприц-ручка часто представляет собой одноразовое изделие только для одноразового использования и может иметь объем от 0,1 до 20 мл. Однако шприц или шприц-ручка также могут быть многоразовыми или многодозовыми шприцем или шприцем-ручкой.
Указанный флакон может также содержать состав в лиофилизированной форме или в водной форме и может служить устройством для одноразового или многократного использования. Как устройство многоразового использования, указанный флакон может иметь больший объем. Указанный инфузионный пакет обычно содержит состав в водной форме и может иметь объем от 20 до 5000 мл.
Указанный фармацевтический состав предназначен для лечения медицинского нарушения, связанного со надэкспрессией PSMA, и содержит гуманизированное антитело или его фрагмент антитела или производное антитела, описываемые в настоящем документе, вместе по меньшей мере с фармацевтически приемлемым носителем.
Указанное медицинское нарушение, связанное с надэкспрессией PSMA, может представлять собой, например, рак, описываемый в настоящем документе или неврологическое нарушение. Гуманизированные антитела против PSMA или их фрагменты или производные могут опосредовать противоопухолевые эффекты, активируя гуморальные или клеточные иммунные функции или нацеливаясь на опухоли конъюгированными цитотоксинами или радиоактивностью, как описано выше.
Настоящее изобретение относится к антителу или его фрагменту антитела или производному антитела, описываемым в настоящем документе, для применения в лечении рака предстательной железы.
Настоящее изобретение также относится к способу лечения больного, страдающего раком предстательной железы, предусматривающему введение эффективного количества антитела или его фрагмента антитела или производного антитела, описываемого в настоящем документе.
Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к диагностическому набору для выявления опухолевых клеток, содержащему выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент или производное, что позволяет выявлять его после связывания с подходящими реагентами и устройствами для выявления. Настоящее изобретение также относится к способу идентификации опухолевых клеток in vitro, с помощью которого идентифицируемые опухолевые клетки контактируют с выделенным моноклональным антителом или его антигенсвязывающим фрагментом или производным, несущим метку, которая может быть выявлена подходящими аналитическими устройствами. Метка позволяет диагностическую идентификацию опухолевых клеток, например, в срезах тканей человека, полученных после хирургической операции или биопсии.
Настоящее изобретение также относится к клетке-хозяину, способной продуцировать указанные гуманизированные антитела против PSMA или их фрагменты или производные, и к линии клеток, трансфицированных рекомбинантной плазмидой, включающей в себя кодирующие последовательности указанных антител в соответствии с настоящим изобретением.
Согласно другому предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения указанная клетка-хозяин представляет собой клетку млекопитающего. Согласно еще одному предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения указанная клетка-хозяин представляет собой по меньшей мере клетку, выбранную из группы, состоящей из, например, клеток почки новорожденного хомяка (например, ВНК21), клеток яичника китайского хомячка (СНО), клеток миеломы мыши (например, SP2/0 или NS0), клеток почки эмбриона человека (например, НЕК-293), клеток сетчатки глаза человека (например, PER-C6) и клеток-амниоцитов (например, САР).
-
Согласно одному варианту осуществления клетка млекопитающего представляет собой линию клеток СНО (например, СНО-К1, CHO-DG44, CHO-DXB или CHO-dhfr).
Настоящее изобретение также относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей гуманизированное антитело, его фрагмент антитела или производное антитела, связывающееся с PSMA, как описывается в настоящей заявке.
Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к гуманизированному антителу или его фрагменту антитела или производному антитела, содержащим вариабельный тяжелый (VH) домен, включающий в себя
последовательность H1 CDR согласно SEQ ID №1,
последовательность Н2 CDR, выбранную из любой из последовательностей согласно SEQ ID №2, SEQ ID №7, SEQ ID №9 и SEQ ID №11,
последовательность Н3 CDR согласно SEQ ID №3,
и вариабельный легкий (VL) домен, включающий в себя
последовательность L1 CDR, выбранную из любой из последовательностей согласно SEQ ID №4, SEQ ID №8 и SEQ ID №10,
последовательность L2 CDR, выбранную из любой из последовательностей согласно SEQ ID №5 и SEQ ID №12, и
последовательность L3 CDR согласно SEQ ID №6,
но не содержащим комбинацию последовательности H1 CDR согласно SEQ ID №1, последовательности Н2 CDR согласно SEQ ID №2, последовательности Н3 CDR согласно SEQ ID №3, последовательности L1 CDR согласно SEQ ID №4, последовательности L2 CDR согласно SEQ ID №5 и последовательности L3 CDR согласно SEQ ID 6,
которые связываются с внеклеточным доменом специфического мембранного антигена предстательной железы (PSMA).
Во избежание неоднозначности, все возможные 24 комбинации указанных CDR (т.е. комбинации одной H1 CDR, одной Н2 CDR, одной Н3 CDR, одной L1 CDR, одной L2 CDR и одной L3 CDR) считаются индивидуально раскрытыми в настоящем документе настоящего описания.
Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к гуманизированному антителу или его фрагменту антитела или производному антитела, содержащему VH домен, характеризующийся по меньшей мере 90%, предпочтительно 95%, гомологией последовательности по отношению к последовательности, выбранной из любой из последовательностей согласно SEQ ID №13, SEQ ID №15, SEQ ID №17 и SEQ ID №19.
Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к гуманизированному антителу или его фрагменту антитела или производному антитела, содержащему последовательность VH домена, выбранную из любой из последовательностей согласно SEQ ID №13, SEQ ID №15, SEQ ID №17 и SEQ ID №19.
Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к гуманизированному антителу или его фрагменту антитела или производному антитела, содержащему последовательность VL домена, характеризующуюся по меньшей мере 90%, предпочтительно 95%, гомологией последовательности по отношению к последовательности, выбранной из любой из последовательностей согласно SEQ ID №14, SEQ ID №16, SEQ ID №18 и SEQ ID №20.
Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к гуманизированному антителу или его фрагменту антитела или производному антитела, содержащему последовательность VL домена, выбранную из любой из последовательностей согласно SEQ ID №14, SEQ ID №16, SEQ ID №18 и SEQ ID №20.
Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к гуманизированному антителу или его фрагменту антитела или производному антитела, содержащему последовательность VH домена согласно SEQ ID №13 и последовательность VL домена, выбранную из любой из последовательностей согласно SEQ ID №14, SEQ ID №16, SEQ ID №18 и SEQ ID №20, или последовательность VH домена согласно SEQ ID №15 и последовательность VL домена, выбранную из любой из последовательностей согласно SEQ ID №14, SEQ ID №16, SEQ ID №18 и SEQ ID №20, или последовательность VH домена согласно SEQ ID №17 и последовательность VL домена, выбранную из любой из последовательностей согласно SEQ ID №14, SEQ ID №16, SEQ ID №18 и SEQ ID №20, или последовательность VH домена согласно SEQ ID №19 и последовательность VL домена, выбранную из любой из последовательностей согласно SEQ ID №14, SEQ ID №16, SEQ ID №18 и SEQ ID №20.
Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к гуманизированному антителу или его фрагменту антитела или производному антитела, в котором тяжелая цепь содержит любую из последовательностей согласно SEQ ID №21, SEQ ID №23, SEQ ID №25 или SEQ ID №27.
Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к гуманизированному антителу или его фрагменту антитела или производному антитела, в котором легкая цепь содержит любую из последовательностей согласно SEQ ID №22, SEQ ID №24, SEQ ID №26 или SEQ ID №28.
Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к гуманизированному антителу или его фрагменту антитела или производному антитела, содержащему по меньшей мере одну тяжелую цепь, содержащую любую из последовательностей согласно SEQ ID №№21, 23, 25 или 27, и по меньшей мере одну легкую цепь, содержащую любую из последовательностей согласно SEQ ID №№22, 24, 26 или 28.
Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящее изобретение относится к гуманизированному антителу или его фрагменту антитела или производному антитела, содержащему по меньшей мере одну тяжелую цепь, содержащую SEQ ID №27, и по меньшей мере одну легкую цепь, содержащую SEQ ID №28.
50
Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к гуманизированному антителу или его фрагменту антитела или производному антитела в соответствии с настоящим изобретением, связывающемуся с внеклеточным доменом PSMA с аффинностью ЕС<0,4 мкг/мл.
Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к гуманизированному антителу или его фрагменту антитела или производному антитела в соответствии с настоящим изобретением, при этом антитело является гликозилированным. Указанное гликозилирование может относиться к гликану, который представляет собой N-связанную олигосахаридную цепь по аспарагину 297 тяжелой цепи.
Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к гуманизированному антителу или его фрагменту антитела или производному антитела в соответствии с настоящим изобретением, при этом указанный специфический мембранный антиген предстательной железы представляет собой специфический мембранный антиген предстательной железы человека.
Гуманизированное антитело или его фрагмент антитела или производное антитела в соответствии с настоящим изобретением может представлять собой моноклональное антитело или его фрагмент антитела или производное антитела. Указанное моноклональное антитело предпочтительно может принадлежать изотипу IgG.
2
Фрагмент гуманизированного антитела в соответствии с настоящим изобретением может быть выбран из группы, состоящей из вариабельного домена (Fv), Fab-фрагмента и F(ab)-фрагмента.
Производное гуманизированного антитела в соответствии с настоящим изобретением может представлять собой одноцепочечный Fv (scFv).
Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к конъюгату антитело-лекарственное средство (ADC), содержащему гуманизированное антитело или его фрагмент или производное в соответствии с настоящим изобретением, конъюгированное с терапевтическим средством, необязательно через линкерный фрагмент.
Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к фармацевтическому составу для лечения медицинского нарушения, связанного с надэкспрессией PSMA, включающему в себя гуманизированное антитело или его фрагмент антитела или производное антитела в соответствии с настоящим изобретением, вместе по меньшей мере с фармацевтически приемлемым носителем. Указанное медицинское нарушение, связанное с надэкспрессией PSMA, может представлять собой рак предстательной железы. Указанный фармацевтический состав в соответствии с настоящим изобретением может представлять собой состав, который подходит по меньшей мере для внутривенного, внутримышечного или подкожного введения.
Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к гуманизированному антителу или его фрагменту антитела или производному антитела в соответствии с настоящим изобретением для применения в лечении рака предстательной железы.
Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения больного, страдающего раком предстательной железы, предусматривающему введение эффективного количества гуманизированного антитела или его фрагмента антитела или производного антитела в соответствии с настоящим изобретением больному.
Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей гуманизированное антитело, его фрагмент антитела или производное антитела в соответствии с настоящим изобретением.
Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, способной продуцировать гуманизированное антитело, его фрагмент антитела или производное антитела в соответствии с настоящим изобретением. Указанная клетка-хозяин в соответствии с настоящим изобретением может представлять собой клетку млекопитающего. Указанная клетка млекопитающего в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно представляет собой клетку линии СНО.
Антитела, или фрагменты, или производные в соответствии с настоящим изобретением могут быть получены путем трансфекции клетки-хозяина вектором экспрессии, включающим в себя последовательность, кодирующую антитело в соответствии с настоящим изобретением. Вектор экспрессии или рекомбинантную плазмиду получают путем помещения кодирующих антитело последовательностей под контроль подходящих регуляторных генетических элементов, включающих в себя промоторные и энхансерные последовательности, такие как, например, промотор CMV. Последовательности тяжелой и легкой цепей могут быть экспрессированы из отдельных векторов экспрессии, которые совместно трансфицированы, или из двойных векторов экспрессии. Указанная трансфекция может быть временной трансфекцией или стабильной трансфекцией. Трансфицированные клетки затем культивируют для получения конструкции трансфицированного антитела. После осуществления стабильной трансфекции стабильные клоны, секретирующие антитела с надлежащим образом связанными тяжелыми и легкими цепями, отбирают путем скрининга с помощью соответствующего анализа, такого как, например, ELISA, субклонируют и размножают для последующего получения.
Примеры
Хотя настоящее изобретение было проиллюстрировано и подробно описано в графических материалах и в предшествующем описании, такое иллюстрирование и описание следует считать иллюстративными или примерными, а не ограничивающими; настоящее изобретение не ограничивается раскрываемыми вариантами осуществления. Специалисты в данной области смогут понять и осуществить другие варианты раскрываемых вариантов осуществления при практическом применении заявляемого изобретения при изучении графических материалов, настоящего описания и прилагаемой формулы изобретения. В формуле изобретения слово «содержащий» не исключает других элементов или стадий, а использование единственного числа не исключает множественное число. Тот факт, что определенные меры изложены во взаимосогласованных различных зависимых пунктах формулы изобретения, не означает, что комбинация этих мер не может быть успешно использована. Любые ссылочные позиции в формуле изобретения не следует рассматривать как ограничение объема.
Все аминокислотные последовательности, раскрываемые в настоящем документе, показаны от N-конца до С-конца; все последовательности нуклеиновых кислот, раскрываемые в настоящем документе, показаны в направлении 5'->3'.
Пример 1. Гуманизация и деиммунизация мышиного антитела 3F11
Мышиное антитело против PSMA 3/F11 (Wolf et al., 2010a; ЕР 1883698 B2) подвергали гуманизации путем прививания определяющих комплементарность областей (CDR) в отобранный акцепторный каркас из ряда зародышевых линий человека.
Выполняли иммунопрофилирование Epibase™ родительского 3/F11 против 85 аллотипов HLA класса II, анализ эпитопов или кластеров смежных эпитопов на предмет возможных замен, которые могли бы удалить или уменьшить связывание с аллотипами HLA с акцентом на аллотипы HLA-DRB1. Идентифицировали важные положения, составляющие межцепочечный интерфейс VH/VL или ответственные за дискретный набор канонических структур CDR. На основе выравнивания последовательностей последовательности родительского антитела с последовательностями зародышевой линии человека идентифицировали наиболее совпадающую оптимальную последовательность зародышевой линии человека в качестве акцептора, принимая во внимание, в частности, идентичность последовательностей в каркасе, идентичные или совместимые остатки межцепочечного интерфейса, поддерживающие петли с родительскими каноническими конформациями CDR и сочетание тяжелых и легких цепей зародышевых линий, обнаруженных в экспрессируемых антителах. Обнаружили, что 3/F11 наиболее совместимо с VK2-A17 легкой цепи зародышевой линии человека и VH1-1-69 тяжелой цепи зародышевой линии человека семейства легких цепей VK2 зародышевой линии и семейством тяжелых цепей VH1 зародышевой линии человека, соответственно. Для прививки CDR аминокислоты в родительском каркасе, которые отличаются от выбранного акцептора, заменяли соответствующей аминокислотой человека.
Последовательности анализировали на предмет потенциальных сайтов посттрансляционной модификации (дезамидирование аспарагина, изомеризация аспартата, клипирование С-концевого лизина, свободные тиольные группы Cys, N- и О-гликозилирование, N-концевая циклизация, окисление и образование пироглутамата), которые могут вызывать проблемы во время разработки терапевтического продукта. Структурные модели FV-области 3/F11 и вариантов создавали с использованием платформы моделирования in-silico, и структурные фрагменты-кандидаты для каркасов и CDR, а также полный FV оценивали и ранжировали.
Чтобы оценить влияние всех рассматриваемых замен эффективным образом, замены группировали там, где это необходимо, и отирали в общей сложности четыре гуманизированных/деиммунизированных легких цепи и четыре гуманизированных/деиммунизированных тяжелых цепи. В таблице 1 перечислены названия сконструированных аминокислотных цепей вместе с описанием модификаций. Аминокислотные последовательности сконструированных цепей приведены в таблице 6. Выравнивания последовательностей гуманизированных/деиммунизированных легких и тяжелых цепей, соответственно, показаны на фиг. 3 и 4.
Вариант вариабельного домена тяжелой цепи 3F11-VH-1 включает в себя все три CDR родительской последовательности VH мыши. В варианте 3F11-VH-2 две CDR идентичны исходной последовательности VH мыши, тогда как Н2 CDR отличается в четырех положениях от родительской последовательности мыши (аа 61-63: NEN>AQK, аа 65: K>Q). В варианте 3F11-VH-3, опять таки, две CDR идентичны родительской последовательности VH мыши, тогда как Н2 CDR отличается в пяти положениях от родительской последовательности мыши (аа 58: Т>V, аа 61-63: NEN>AQK, аа 65: K>Q). В варианте 3F11-VH-4, опять таки, две CDR идентичны родительской последовательности VH мыши, тогда как Н2 CDR отличается в шести положениях от родительской последовательности мыши (аа 56: G>S, аа 58: Т>V, аа 61-63: NEN>AQK, аа 65: K>Q).
Вариант вариабельного домена легкой цепи 3F11-VL-1 содержит все три CDR родительской последовательности VL мыши. В варианте 3F11-VL-2 две CDR идентичны родительской последовательности VL мыши, тогда как LI CDR содержит замену по аминокислоте №35 (N>Q). В варианте 3F11-VL-3 две CDR идентичны родительской последовательности VL мыши, тогда как LI CDR отличается в двух положениях от родительской последовательности мыши (аа 33: N>S, аа 35: N>Q). В варианте 3F11-VL-4 CDR L1 отличается в двух положениях (аа 33: N>S, аа 35: N>Q), a L2 CDR отличается в одном положении (аа 60: F>А) от родительской мышиной последовательности, и L3 CDR идентична родительской мышиной последовательности.
3F11-VL-2 необязательно имеет следующую мутацию: аа 41: F>Y. 3F11-VL-3 необязательно имеет следующую мутацию: аа 41: F>Y. 3F11-VL-4 необязательно имеет следующие мутации: аа 41: F>Y; аа 42: L>Q и/или аа 90: V>Т.
Для оценивания влияния комбинаций замен разрабатывали экспериментальный план комбинации вариантов, показанный в таблице 2. Путем комбинации четырех гуманизированных/деиммунизированных тяжелых цепей и четырех гуманизированных/деиммунизированных легких цепей получали 16 различных гуманизированных/деиммунизированных полноразмерных антител, которые обозначены, как показано в таблице 2.
Предсказанные критические эпитопы HLA DRB1, DRB3/4/5, DQ и DP для родительских и гуманизированных/деиммунизированных последовательностей представлены в таблице 3. Различия между родительскими и вариантными антителами в таблице 3 объясняются соответствующим удалением потенциальных эпитопов.
Пример 2. Экспрессия и очистка вариантов гуманизированного антитела против PSMA
Синтезировали вариабельные домены тяжелой и легкой цепей антител и субклонировали в векторы GS Xceed™ (Lonza). Области, кодирующие вариабельный домен легкой цепи, переносили в рХС-Карра, а области, кодирующие вариабельный домен тяжелой цепи - в векторы pXC-IgGlzadeltaK, соответственно.
6
Векторы отдельных генов (SGV) временно совместно трансфицировали в нокаутные клетки яичника китайского хомячка GS (CHOK1SV GS-KO) вместе с эталонным мышиным антителом в масштабе 200 мл. Временные трансфекции выполняли посредством электропорации (Gene Pulse XCell, BioRad) с использованием клеток CHOK1SV GS-KO, которые находились в культуре не менее двух недель. Клетки субкультивировали за 24 часа до трансфекции, и жизнеспособность клеток на момент трансфекции составляла >99%. Через шесть суток после трансфекции во время сбора измеряли жизнеспособность клеток и концентрации жизнеспособных клеток. Обнаружили, что клетки характеризуются диапазоном 4,4-7,5 × 10 жизнеспособных клеток/мл с жизнеспособностями, варьирующими от 89,0 до 96,1%.
Осветленные надосадочные жидкости очищали хроматографией на белке А с использованием предварительно упакованных 5-мл колонок HiTrap MabSelect SuRE на очистителе АКТА стандартными процедурами. После элюирования 10 мМ формиатом натрия, рН 3,5, рН фракций, содержащих белок, немедленно доводили путем добавления 2× забуференного фосфатом солевого раствора (PBS), чтобы получить конечные буферные условия: 1× PBS, 5 мМ формиат натрия, рН 7,4. В приведенной ниже таблице 4 показаны титры и выходы продуктов для родительского мышиного антитела 3F11 и различных вариантов гуманизированного антитела.
В качестве неожиданного эффекта авторы настоящего изобретения наблюдали значительно более высокие титры экспрессии для некоторых из вариантов гуманизированного антитела против PSMA по сравнению с родительским мышиным антителом 3F11 (см. таблицу АА). С гуманизированными вариантами 3F11_var2, 3F11_var6, 3F11_var9, 3F11_var11, 3F11_var13, 3F11_var15 и 3F11_var16 получали титры экспрессии 9,5-13 мг/л по сравнению с 3,88 мг/л для родительского мышиного антитела 3F11. Из-за увеличения титров экспрессии в 3-4- раза можно ожидать значительное снижение затрат на получение терапевтических продуктов на основе гуманизированных/деиммунизированных вариантов.
Пример 3. Биохимическая характеристика вариантов гуманизированного антитела против PSMA
Очищенные образцы анализировали электрофорезом в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) и методом разделения по размеру (SE)-HPLC в системе Agilent серии 1200 с использованием колонки Zorbax GF-250 (внутренний диаметр 9,4 мм × 25 см) (Agilent).
1
В гелях SDS-PAA в невосстанавливающих условиях наблюдали сигнал при >98 кДа для всех вариантов, сравнимых с контрольным антителом (IgG) и родительским 3F11, что согласуется с полноразмерным антителом. В восстанавливающих условиях сигнал при приблизительно 28 кДа и один сигнал при приблизительно 49 кДа можно было наблюдать для всех вариантов, сравнимых с контрольным антителом и родительским 3F11, что согласуется с размерами легкой и тяжелой цепей антитела, соответственно. Типичные результаты показаны на фиг. 5.
Время удерживания гуманизированных мономерных антител варианта 3F11 (7,96-8,00 минуты) в SE-HPLC было сравнимо с таковым для мышиного родительского антитела 3F11 (7,968 минуты). Хроматографии SE-HPLC для всех образцов показывали дополнительный минорный пик при более низких временах удерживания (приблизительно 7,2 минуты) с площадью до 5,4%, что соответствует примесям с более высокой молекулярной массой, таким как растворимые агрегаты.
Пример 4. Исследования клеточного связывания с вариантами гуманизированного антитела против PSMA
2
50
6
Качество и активность связывания всех вариантов гуманизированного антитела 3F11 оценивали в анализах клеточного связывания с использованием линии клеток карциномы предстательной железы человека LNCAP (Немецкая коллекция микроорганизмов и культур клеток, DSMZ №АСС 256) в формате анализа на 96-луночном планшете и клеточного анализа FACS. Предварительно слитые клетки LNCAP при 80-90% конфлюэнтности промывали и отделяли от планшетов с помощью трипсина перед 1-часовой инкубацией при 37°С, 5% СО в колбах для восстановления белков клеточной поверхности. Клетки промывали и доводили до 1 × 10 клеток/мл в среде для окрашивания (RPMI-1640, 25 мМ HEPES, 3% h.i. FBS и 0,02% азид натрия). Различные концентрации образцов моноклональных антител (мышиных дикого типа и 16 гуманизированных вариантов) в диапазоне от 50 до 0,0032 мкг/мл готовили в среде для окрашивания и инкубировали с клетками в предварительно охлажденных 96-луночных планшетах в течение 30 минут на льду, чтобы обеспечить связывание антитела с поверхностью клеток LNCAP. Затем клетки промывали при 4°С с помощью PBS для удаления свободного антитела, а связанное антитело метили конъюгированным с FITC вторичным антителом козы против IgG человека с предварительно поглощенным H&L (Abcam) в течение 30 минут на льду. Наконец, клетки промывали, фиксировали и измеряли флуоресценцию FITC, связанного с антителом, связанным с клетками, с помощью проточной цитометрии (цитометр GUAVA 8НТ). Данные анализировали с использованием программного обеспечения Incyte GuavaSoft 2.7 (Merck-Millipore). Полученные данные зависимости ответа от дозы (нанесенные на график в виде зависимости ответа от логарифмически преобразованной дозы) обычно давали сигмоидальные кривые с переменным наклоном, которые были подогнаны к 4-параметрическому логистическому уравнению зависимости ответа от дозы с использованием программного обеспечения GraphPad Prism. Дозу ЕС, определяемую как концентрация антитела, которая обеспечивает половину максимального связывания с целевыми клетками, использовали для сравнения биологической активности различных вариантов антител. Точки данных представляют собой среднее значение для лунок в двух повторностях и стандартную ошибку среднего (SEM). Кривые связывания родительского антитела 3F11 дикого типа и шестнадцати гуманизированных вариантов показаны на фиг. 6.
50
50
50
50
50
Совершенно неожиданно клеточный анализ связывания показал, что все шестнадцать гуманизированных вариантов 3F11 связываются с клетками, экспрессирующими PSMA, с более высокой аффинностью, чем полученной с родительским мышиным антителом 3F11. Связывающая активность (ЕС) гуманизированных вариантов варьировала от 0,1784 до 0,3732 мкг/мл и в большинстве случаев была значительно выше (на основе 95% доверительного интервала, CI), чем у родительского антитела 3F11 (ЕС = 0,4189 мкг/мл). 3F11-var7 показывал самую высокую связывающую активность (ЕС=0,1784 мкг/мл), за ним следовали 3F11-var8 и 3F11-var6 (ЕС=0,2040 мкг/мл и ЕС=0,2187 мкг/мл, соответственно, см. таблицу 5). Результаты одного эксперимента показаны на фиг. 7.
Эти результаты были особенно неожиданными, поскольку большинство гуманизированных вариантов (все варианты, которые не включали в себя вариант тяжелой цепи 3F11_VH_1) не требовали каких-либо обратных мутаций в каркасных областях, охватывающих CDR, и особенно потому, что ни один из вариантов не прошел через созревание аффинности, которое, как известно, обычно требуется после гуманизации антител из-за значительного снижения или потери аффинности. Неожиданно обнаружили, что такие дополнительные усилия не требуются для процедуры создания гуманизированных вариантов и для вариантов в соответствии с настоящим изобретением.
Пример 5. Исследования клеточного связывания с конструкциями scFv против PSMA
Комбинации цепей 3F11-VH-1 и 3F11-VL-1 (3F11-var1) и цепей 3F11-VH-4 и 3F11-VL-4 (3F11-var16) также использовали для создания конструкций одноцепочечного Fv (scFv). Для обеих конструкций соответствующие последовательности вариабельных доменов клонировали в композиции VL-VH в вектор экспрессии pHOG21 и экспрессировали в бактериальных клетках. После очистки аффинной хроматографией тестировали связывание обеих конструкций scFv с экспрессирующими PSMA клетками субклеточной линии С4-2 LNCAP и с PSMA-отрицательными клетками рака предстательной железы DU145. Обе конструкции scFv показывали сильное связывание с клетками С4-2, но не связывались с клетками DU145 отрицательного контроля.
Ссылки
Almagro JC, Fransson J (2008). Humanization of antibodies. Frontiers in Bioscience Vol.13: 1619-1633.
Baker MP, Jones TD (2007). Identification and removal of immunogenicity in therapeutic proteins. Curr. Opin. Drug Discov. Devel. Vol.10: 219-227.
Bander NH, Nanus DM, Milowsky M, Kostakoglu L, Vallabahajosula S, Goldsmith SJ (2003). Targeted systemic therapy of prostate cancer with a monoclonal antibody to prostate-specific membrane antigen. Seminars in Oncology Vol.30, No. 5: 667-676.
Barinka С,  P,  J, Man P, Bezouska K, Slusher BS et al. (2004). Identification of the N-glycosylation sites on glutamate carboxypeptidase II necessary for proteolytic activity. Protein Sci 13:1627 1635.
С, Rojas С, Slusher В, Pomper M (2012). Glutamate carboxypeptidase II in diagnosis and treatment of neurologic disorders and prostate cancer. Curr Med Chem 19: 856.
Chamberlain P. (2002). knmunogenicity of therapeutic proteins. Part 1: Causes and clinical manifestations of immunogenicity. The Regulatory Review Vol.5: 4-9.
Cooperberg MR, Broering JM, Carroll PR (2010). Time trends and local variation in primary treatment of localized prostate cancer. J Clin Oncol 28: 1117-1123.
Eiber M, Fendler WP, Rowe SP, Calais J, Hofman MS, Maurer T, Schwarzenboeck SM, Kratowchil C, Herrmann K, Giesel FL. (2017). Prostate-Specific Membrane Antigen Ligands for Imaging and Therapy. JNucl Med 2017; 58:67S-76S.
U, Wolf P, Gierschner D,  P, Schultze-Seemann W, and Wetterauer U. (2006). A new generation of monoclonal and recombinant antibodies against cell-adherent prostate specific membrane antigen for diagnostic and therapeutic targeting of prostate cancer. The Prostate 66:1359-1370.
Evans JC, Malhotra M, Cryan JF and O'Driscoll CM. (2016). The therapeutic and diagnostic potential of the prostate specific membrane antigen/glutamate carboxypeptidase II (PSMA/GCPII) in cancer and neurological disease. British Journal of Pharmacology 173: 3041-3079.
Foote J and Winter G. (1992). Antibody framework residues affecting the conformation of hypervariable loops. J. Mol. Biol. 224:487-499.
Haffher MC, Kronberger IE, Ross JS, Sheehan CE, Zitt M,  G et al. (2009). Prostate-specific membrane antigen expression in the neovasculature of gastric and colorectal cancers. Hum Pathol 40:1754 1761.
Horoszewicz JS, Kawinski E, Murphy G. (1986). Monoclonal antibodies to a new antigenic marker in epithelial prostatic cells and serum of prostatic cancer patients. Anticancer Res 7: 927-935.
Israeli RS, Powell CT, FairWR, Heston WD. (1993). Molecular cloning of a complementary DNA encoding a prostate-specific membrane antigen. Cancer Res 53: 227-230.
Liu H, Moy P, Kim S, Xia Y, Rajasekaran A, Navarro V, Knudsen B, and Bander NH. (1997). Monoclonal antibodies to the extracellular domain of prostate-specific membrane antigen also react with tumor vascular endothelium. Cancer Research 57, 3629-3634.
Nanus DM, Milowsky MI, Kostakoglu L, Smith-Jones PM, Vallabahajosula S, Goldsmith SJ, and Bander NH. (2003). Clinical use of monoclonal antibody HuJ591 therapy: targeting prostate specific membrane antigen. Journal of Urology Vol.170:S84 S89.
M, Ptacek J,  P,  J, Lubkowski J,  С et al. (2014). Structural and biochemical characterization of the folyl-poly-γ-l-glutamate hydrolyzing activity of human glutamate carboxypeptidase II. FEBS J 281: 3228-3242.
Queen C. et al. (1989). A humanized antibody that binds to the interleukin 2 receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. 86:10029-10033.
Schellekens, H (2002). Immunogenicity of therapeutic proteins: clinical implications and future prospects. Clin. Ther. Vol.4: 1720-40.
Troyer J, Feng Q, Beckett M, Wright GJ. (1995). Biochemical characterization and mapping of the 7 E11-C5.3 epitope of the prostate specific membrane antigen. Urol Oncol l(1):29-37.
Tykvart J,  V,  F, Corey E, Colombatti M, Fracasso G, Koukolik F,  C,  P, and Konvalinka J. (2014). Comparative analysis of monoclonal antibodies against prostate-specific membrane antigen (PSMA). The Prostate 1-14.
Wolf P, Freudenberg N,  P, Alt K, Schultze-Seemann W, Wetterauer U, and  U. (2010a). Three conformational antibodies specific for different PSMA epitopes are promising diagnostic and therapeutic tools for prostate cancer. The Prostate 70:562-569.
Wolf P, Alt K, Wetterauer D,  P, Gierschner D, Katzenwadel A, Wetterauer U, and  U. (2010b). Preclinical evaluation of a recombinant anti-prostate specific membrane antigen single-chain immunotoxin against prostate cancer. J Immunother. 33:262 271.
Последовательности
Приведенные ниже последовательности составляют часть описания настоящей заявки. Электронный перечень последовательностей, совместимый с WIPO ST 25, также предоставляется с настоящей заявкой. Во избежание неоднозначности, если имеются расхождения между последовательностями в следующей таблице и электронным перечнем последовательностей, последовательности в данной таблице считаются правильными.
h/d, гуманизированное/деиммунизированное; CDR, определяющая комплементарность область; FR, каркасная область; CR, константная область.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  Хейделберг Фарма Ресерч Гмбх
<120>  Гуманизированные антитела против PSMA
<130>  HD40496
<160>  37
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  7
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная последовательность
<400>  1
Gly Tyr Thr Phe Thr Tyr Phe
1               5
<210>  2
<211>  17
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная последовательность
<400>  2
Gly Ile Ser Pro Gly Asp Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Glu Asn Phe Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>  3
<211>  11
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная последовательность
<400>  3
Asp Gly Asn Phe Pro Tyr Tyr Ala Met Asp Ser
1               5                   10
<210>  4
<211>  16
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная последовательность
<400>  4
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His
1               5                   10                  15
<210>  5
<211>  7
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная последовательность
<400>  5
Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser
1               5
<210>  6
<211>  8
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная последовательность
<400>  6
Ser Gln Ser Thr His Val Pro Thr
1               5
<210>  7
<211>  17
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная последовательность
<400>  7
Gly Ile Ser Pro Gly Asp Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1               5                   10                  15
Gly
<210>  8
<211>  16
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная последовательность
<400>  8
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Gln Thr Tyr Leu His
1               5                   10                  15
<210>  9
<211>  17
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная последовательность
<400>  9
Gly Ile Ser Pro Gly Asp Gly Asn Val Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1               5                   10                  15
Gly
<210>  10
<211>  16
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная последовательность
<400>  10
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Ser Gly Gln Thr Tyr Leu His
1               5                   10                  15
<210>  11
<211>  17
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная последовательность
<400>  11
Gly Ile Ser Pro Gly Asp Ser Asn Val Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1               5                   10                  15
Gly
<210>  12
<211>  7
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная последовательность
<400>  12
Thr Val Ser Asn Arg Ala Ser
1               5
<210>  13
<211>  120
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная последовательность
<400>  13
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Tyr Phe
20                  25                  30
Asp Ile Asn Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Gly Ile Ser Pro Gly Asp Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Glu Asn Phe
50                  55                  60
Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ile Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85                  90                  95
Ala Arg Asp Gly Asn Phe Pro Tyr Tyr Ala Met Asp Ser Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  14
<211>  112
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная последовательность
<400>  14
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
85                  90                  95
Thr His Val Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100                 105                 110
<210>  15
<211>  120
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная последовательность
<400>  15
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Tyr Phe
20                  25                  30
Asp Ile Asn Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Gly Ile Ser Pro Gly Asp Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ile Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Asp Gly Asn Phe Pro Tyr Tyr Ala Met Asp Ser Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  16
<211>  112
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная последовательность
<400>  16
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20                  25                  30
Asn Gly Gln Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser
85                  90                  95
Thr His Val Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100                 105                 110
<210>  17
<211>  120
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная последовательность
<400>  17
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Tyr Phe
20                  25                  30
Asp Ile Asn Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Gly Ile Ser Pro Gly Asp Gly Asn Val Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ile Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Asp Gly Asn Phe Pro Tyr Tyr Ala Met Asp Ser Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  18
<211>  112
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная последовательность
<400>  18
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20                  25                  30
Ser Gly Gln Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser
85                  90                  95
Thr His Val Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100                 105                 110
<210>  19
<211>  120
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная последовательность
<400>  19
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Tyr Phe
20                  25                  30
Asp Ile Asn Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Gly Ile Ser Pro Gly Asp Ser Asn Val Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ile Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Asp Gly Asn Phe Pro Tyr Tyr Ala Met Asp Ser Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  20
<211>  112
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная последовательность
<400>  20
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20                  25                  30
Ser Gly Gln Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Thr Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser
85                  90                  95
Thr His Val Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100                 105                 110
<210>  21
<211>  450
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная последовательность
<400>  21
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Tyr Phe
20                  25                  30
Asp Ile Asn Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Gly Ile Ser Pro Gly Asp Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Glu Asn Phe
50                  55                  60
Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ile Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85                  90                  95
Ala Arg Asp Gly Asn Phe Pro Tyr Tyr Ala Met Asp Ser Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115                 120                 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130                 135                 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145                 150                 155                 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165                 170                 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180                 185                 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195                 200                 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210                 215                 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225                 230                 235                 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245                 250                 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260                 265                 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275                 280                 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290                 295                 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305                 310                 315                 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325                 330                 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340                 345                 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355                 360                 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370                 375                 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385                 390                 395                 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405                 410                 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420                 425                 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435                 440                 445
Gly Lys
450
<210>  22
<211>  218
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная последовательность
<400>  22
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
85                  90                  95
Thr His Val Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100                 105                 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115                 120                 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130                 135                 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145                 150                 155                 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165                 170                 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180                 185                 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195                 200                 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210                 215
<210>  23
<211>  450
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная последовательность
<400>  23
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Tyr Phe
20                  25                  30
Asp Ile Asn Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Gly Ile Ser Pro Gly Asp Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ile Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Asp Gly Asn Phe Pro Tyr Tyr Ala Met Asp Ser Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115                 120                 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130                 135                 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145                 150                 155                 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165                 170                 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180                 185                 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195                 200                 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210                 215                 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225                 230                 235                 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245                 250                 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260                 265                 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275                 280                 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290                 295                 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305                 310                 315                 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325                 330                 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340                 345                 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355                 360                 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370                 375                 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385                 390                 395                 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405                 410                 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420                 425                 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435                 440                 445
Gly Lys
450
<210>  24
<211>  218
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная последовательность
<400>  24
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20                  25                  30
Asn Gly Gln Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser
85                  90                  95
Thr His Val Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100                 105                 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115                 120                 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130                 135                 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145                 150                 155                 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165                 170                 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180                 185                 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195                 200                 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210                 215
<210>  25
<211>  450
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная последовательность
<400>  25
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Tyr Phe
20                  25                  30
Asp Ile Asn Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Gly Ile Ser Pro Gly Asp Gly Asn Val Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ile Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Asp Gly Asn Phe Pro Tyr Tyr Ala Met Asp Ser Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115                 120                 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130                 135                 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145                 150                 155                 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165                 170                 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180                 185                 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195                 200                 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210                 215                 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225                 230                 235                 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245                 250                 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260                 265                 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275                 280                 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290                 295                 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305                 310                 315                 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325                 330                 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340                 345                 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355                 360                 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370                 375                 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385                 390                 395                 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405                 410                 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420                 425                 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435                 440                 445
Gly Lys
450
<210>  26
<211>  218
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная последовательность
<400>  26
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20                  25                  30
Ser Gly Gln Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser
85                  90                  95
Thr His Val Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100                 105                 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115                 120                 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130                 135                 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145                 150                 155                 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165                 170                 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180                 185                 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195                 200                 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210                 215
<210>  27
<211>  450
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная последовательность
<400>  27
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Tyr Phe
20                  25                  30
Asp Ile Asn Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Gly Ile Ser Pro Gly Asp Ser Asn Val Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ile Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Asp Gly Asn Phe Pro Tyr Tyr Ala Met Asp Ser Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115                 120                 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130                 135                 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145                 150                 155                 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165                 170                 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180                 185                 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195                 200                 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210                 215                 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225                 230                 235                 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245                 250                 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260                 265                 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275                 280                 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290                 295                 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305                 310                 315                 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325                 330                 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340                 345                 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355                 360                 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370                 375                 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385                 390                 395                 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405                 410                 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420                 425                 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435                 440                 445
Gly Lys
450
<210>  28
<211>  218
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная последовательность
<400>  28
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20                  25                  30
Ser Gly Gln Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Thr Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser
85                  90                  95
Thr His Val Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100                 105                 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115                 120                 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130                 135                 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145                 150                 155                 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165                 170                 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180                 185                 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195                 200                 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210                 215
<210>  29
<211>  330
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная последовательность
<400>  29
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85                  90                  95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100                 105                 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115                 120                 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130                 135                 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145                 150                 155                 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165                 170                 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180                 185                 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195                 200                 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210                 215                 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225                 230                 235                 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245                 250                 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260                 265                 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275                 280                 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290                 295                 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305                 310                 315                 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325                 330
<210>  30
<211>  106
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная последовательность
<400>  30
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
1               5                   10                  15
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
20                  25                  30
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
35                  40                  45
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
50                  55                  60
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
65                  70                  75                  80
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
85                  90                  95
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100                 105
<210>  31
<211>  259
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная последовательность
<400>  31
Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Glu Pro
1               5                   10                  15
Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
20                  25                  30
Tyr Phe Asp Ile Asn Trp Leu Arg Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu
35                  40                  45
Trp Ile Gly Gly Ile Ser Pro Gly Asp Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Glu
50                  55                  60
Asn Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ile Asp Lys Ser Ser Thr Thr
65                  70                  75                  80
Ala Tyr Ile Gln Leu Ser Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr
85                  90                  95
Phe Cys Ala Arg Asp Gly Asn Phe Pro Tyr Tyr Ala Met Asp Ser Trp
100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Lys
115                 120                 125
Leu Glu Glu Gly Glu Phe Ser Glu Ala Arg Val Asp Ile Glu Leu Thr
130                 135                 140
Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ile Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile
145                 150                 155                 160
Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
165                 170                 175
Leu His Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
180                 185                 190
Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
195                 200                 205
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala
210                 215                 220
Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Thr
225                 230                 235                 240
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Ala
245                 250                 255
Ala Gly Ser
<210>  32
<211>  7
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  Xaa
<222>  (2)..(2)
<223>  Xaa =  Y, F или W
<220>
<221>  Xaa
<222>  (4)..(4)
<223>  Xaa =  Y, F или W
<220>
<221>  Xaa
<222>  (6)..(6)
<223>  Xaa =  Y, F или W
<220>
<221>  Xaa
<222>  (7)..(7)
<223>  Xaa =  Y, F или W
<400>  32
Gly Xaa Thr Xaa Thr Xaa Xaa
1               5
<210>  33
<211>  17
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  Xaa
<222>  (7)..(7)
<223>  Xaa = G или S
<220>
<221>  Xaa
<222>  (9)..(9)
<223>  Xaa = T или V
<220>
<221>  Xaa
<222>  (12)..(12)
<223>  Xaa = N или A
<220>
<221>  Xaa
<222>  (13)..(13)
<223>  Xaa = E или Q
<220>
<221>  Xaa
<222>  (14)..(14)
<223>  Xaa = N или K
<220>
<221>  Xaa
<222>  (16)..(16)
<223>  Xaa = K или Q
<400>  33
Gly Ile Ser Pro Gly Asp Xaa Asn Xaa Asn Tyr Xaa Xaa Xaa Phe Xaa
1               5                   10                  15
Gly
<210>  34
<211>  11
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  Xaa
<222>  (4)..(4)
<223>  Xaa = Y, F или W
<220>
<221>  Xaa
<222>  (6)..(6)
<223>  Xaa = Y, F или W
<220>
<221>  Xaa
<222>  (7)..(7)
<223>  Xaa = Y, F или W
<400>  34
Asp Gly Asn Xaa Pro Xaa Xaa Ala Met Asp Ser
1               5                   10
<210>  35
<211>  16
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  Xaa
<222>  (10)..(10)
<223>  Xaa = N или S
<220>
<221>  Xaa
<222>  (12)..(12)
<223>  Xaa = N или Q
<220>
<221>  Xaa
<222>  (14)..(14)
<223>  Xaa = Y, F или W
<400>  35
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Xaa Gly Xaa Thr Xaa Leu His
1               5                   10                  15
<210>  36
<211>  7
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  Xaa
<222>  (6)..(6)
<223>  Xaa = A, Y, F или W
<400>  36
Thr Val Ser Asn Arg Xaa Ser
1               5
<210>  37
<211>  8
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная последовательность
<400>  37
Ser Gln Ser Thr His Val Pro Thr
1               5
<---