Характеристика действия строгих молекулярных часов при изменениях позиции аминокислот в кодонах гена белка е штаммов вируса клещевого энцефалита, выделенных в Сибирском регионе

ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Характеристика действия строгих молекулярных часов при изменениях позиции аминокислот в кодонах гена белка Е штаммов вируса клещевого энцефалита, выделенных в Сибирском регионе

Д.О. Киселев1, Ю.П. Джиоев1, 2, Ю.С. Букин3, 4, И.В. Козлова2, А.И. Парамонов2, С.Е. Ткачев5,

A.А. Бадмаев6, Д. Ружек7, 8,

Ч. Чу9,

B.И. Злобин1

1 ФГБОУ ВО «Иркутский государственный медицинский университет» Минздрава России

2 ФГБНУ «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека», Иркутск

3 ФГБУН «Лимнологический институт» СО РАН, Иркутск

4 ФГБОУ ВО «Иркутский национальный исследовательский технический университет»

5 ФГБУН «Институт химической биологии и фундаментальной медицины» СО РАН, Новосибирск

6 ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Республике Бурятия», Улан-Удэ

7 Институт паразитологии биологического центра АН Республики Чехия, Ческе-Будеёвице

8 Университет ветеринарии и фармацевтики в Брно, Республика Чехия

9 Харбинский медицинский университет, Китайская Народная Республика

С помощью ряда компьютерных программ получена новая информация о механизме действия строгих молекулярных часов при накоплении замен нуклеотидов в различных позициях в кодонах гена белка Е вируса клещевого энцефалита (ВКЭ). Эта информация показана через реконструкцию филогенетических деревьев штаммов ВКЭ, выделенных на территории Сибирского региона. Выявлены топологические изменения в конструкциях филогенетических деревьев, связанных с накоплением замен в различных позициях нуклеотидов в кодонах гена белка Е ВКЭ. Учет накопленных замен в 1-й и во 2-й позициях нуклеотидов в кодонах (исключая 3-ю позицию) меняет топологию ветвей как внутри генотипических кластеров, так и между кластерами генотипов ВКЭ. Перенасыщение замен нуклеотидов в 3-й позиции в кодонах по причине вырожденности генетического кода может не приводить к изменению аминокислотного состава белка, но играет значимую роль в определении генетических дистанций в исследовании эволюции вирусов.

Ключевые слова:

вирус клещевого энцефалита, Сибирский регион, молекулярная эпидемиология, филогенетический анализ, строгие молекулярные часы

Characteristic actions strict molecular clock with changes in the position of the amino acid codons of the protein E gene strains of tick-borne encephalitis virus, isolated in Siberian Region

D.O. Kiselev1, Yu.P. Dzhioev12, 1 Irkutsk State Medical University

Yu.S. Bukin3,4,I.V. Kozlova2, 2 Scientific Center for Problems of Family Health and Human

A.I. Paramonov2, S.E. Tkachev5, Reproduction, Irkutsk

A.A. Badmaev6, D. Ruzek78, Z. Qu9, 3 Limnological Institute, Irkutsk

V.I. Zlobin1 4 National Research Irkutsk State Technical University

5 Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, Novosibirsk

6 Center for Hygiene and Epidemiology in the Republic of Buryatia, Ulan-Ude

7 Institute of Parasitology, Biology Centre of the Academy of Sciences of the Czech Republic, Ceske Budejovice, Czech Republic

8 Department of Virology, Veterinary Research Institute, Brno, Czech Republic

9 Harbin Medical University, China

With the help of a number of computer programs obtained new information on the mechanisms of action of strict molecular clock in the accumulation of nucleotide substitutions at different positions in the protein E gene codons IRB. This information is shown through the reconstruction of phylogenetic trees TBEV strains isolated in the Siberian region. Identified topological changes in the construction of phylogenetic trees associated with the accumulation of substitutions at various positions in the nucleotide codons of E protein gene of the virus. Accumulated substitutions in the first and second positions in the nucleotide codons (excluding the third position) changes within the branches of topology genotypic clusters and between clusters of genotypes of TBE. Glut nucleotide substitutions in the third position in codons, because of the degeneracy of the genetic code, can not change the amino acid composition of the protein, but also plays a significant role in determining the genetic distance in the study of the evolution of viruses.

Keywords:

tick-borne encephalitis virus, Siberian Region, molecular epidemiology, phylogenetic analysis, strict molecular clock

Вирус клещевого энцефалита (ВКЭ) относится к семейству F1aviviridae, роду ГЫтгиз. Он является возбудителем смертельно опасной нейроинфекции, передающейся главным образом клещами. Геном ВКЭ представлен одноцепочечной молекулой РНК положительной полярности длиной около 11 тыс. нуклеотидов, кодирующих 3 структурных и 7 неструктурных генов. Оболочечный белок Е обеспечивает связывание вируса с клеточным рецептором и таким образом выступает фактором вирулентности для вируса [1, 15]. Описаны 3 основных генотипа ВКЭ: дальневосточный, западный и сибирский. Также обнаружены и описаны еще 2 дополнительных генетических варианта вируса, претендующие на статус отдельных генотипов [2-4, 9].

В настоящее время изучение клещевого энцефалита сместилось в сторону детального изучения природы возбудителя инфекции. Знание генетической архитектоники ВКЭ и понимание эволюционных механизмов его развития могут послужить основой для разработки более эффективных методов его профилактики и лечения [4, 5, 8, 10]. С началом эры секвенирования ДНК происходит быстрое накопление большого количества расшифрованных последовательностей вирусных геномов и генов, которые становятся предметом специальных аналитических работ [6, 7, 13, 16].

Цели данной работы - исследование влияния эффекта насыщения заменами в разных позициях нуклеотидов в ко-донах гена оболочечного белка Е на результаты молекулярно-филогенетического анализа и оценка работы строгих молекулярных часов посредством методов популяционной генетики.

Материал и методы

В работе использованы последовательности полного гена Е 49 штаммов ВКЭ из базы данных GenBank, выделенных

на территории Сибирского региона России с 1963 по 2011 г. Для сравнения взяты также штаммы Savran-160 (Украина), 0shima5-10 (Япония), Glubinnoe и Sofjin (Дальний Восток, РФ), MDJ-01 (Китай), Neudoerfl (Австрия). В качестве аут-групп взяты последовательности одноименного гена родственных вирусов омской геморрагической лихорадки (ОГЛ) и Лангат [11, 12].

Набор нуклеотидных последовательностей визуализировали и редактировали с помощью программы SeaView [14]. Модели эволюции ДНК выбирали с помощью программы jModelTest v. 2.1.7 [19] на основе значения байесовского информационного критерия. Насыщение заменами различных положений кодонов тестировали в программе DAMBE с помощью индекса насыщения [22, 23]. Посредством тест-пакета проверяли нулевую гипотезу (H0) - исследуемый набор последовательностей перенасыщен заменами.

Эволюционную историю генотипов ВКЭ реконструировали с помощью метода объединения ближайших соседей средствами пакета «ape» для языка программирования R [18]. Для расчетов статистических поддержек применялся байесовский подход (расчет апостериорных вероятностей) в программе MrBayes v. 3.2.0 [17]. Полученные в программе MrBayes v. 3.2.0 выборки деревьев экспортировали в язык программирования R и с помощью пакета «ape» сопоставляли с деревом, реконструированным методом объединения ближайших соседей для расчета апостериорных вероятностей узлов. Визуализацию деревьев проводили с помощью программы FigTree [20].

Гипотезу строгих молекулярных часов тестировали с помощью Tajima Relative Rate Test of Molecular Clock [21]. При тестировании рассчитывали попарные значения вероятностей (P_value) при принятии Н0 о работе строгих молекулярных часов для анализируемых последовательностей.

Попарные значения P_vaLue объединяли в матрицу, на основе которой проводили кластерный анализ методом UPGMA средствами языка программирования R. Н0 отвергалась при значении P_vaLue <0,05.

Результаты и обсуждение

При тестировании набора последовательностей в программе jModeLTest наиболее подходящей моделью эволюции ДНК была выбрана модель Тамуры и Нея 1993 г. с инвариантной и гамма-коррекцией ^N93+^) [22]. Эта модель была использована при филогенетических реконструкциях.

Для исследования влияния на результаты молекулярно-филогенетического анализа эффекта насыщения заменами в разных позициях нуклеотидов в кодонах гена Е и оценки работы строгих молекулярных часов использовали серию популяционных тестов. Всю выборку (49 штаммов) анализировали двумя вариантами подходов. В первом варианте популяционно-генетические расчеты вели при оценке накопления замен во всех трех позициях нуклеотидов в кодонах

(стандартное филогенетическое дерево, рис. 1). Во втором варианте оценивали накопление замен в 1-й и во 2-й позициях нуклеотидов в кодоне, без учета замен в 3-й позиции (рис. 2).

По данным первой топологической схемы (см. рис. 1) представители всех генотипов формируют отдельные кластеры штаммов, не нарушая стандартные реконструкцион-ные схемы родственных отношений штаммов как внутри генотипов, так и между ними.

На филогенетическом дереве (см. рис. 2), составленном по данным накопления замен в 1-й и во 2-й позициях нуклеотидов в кодоне гена Е, обнаруживаются существенные отличия по сравнению с первой топологической схемой. Так, происходит заметное перераспределение генетических дистанций между генотипами ВКЭ и его ближайшими предками (ОГЛ и Лангат). В результате наиболее близким к общему предку оказывается дальневосточный генотип ВКЭ, за ним следуют группа штаммов 886-84, сибирский и западный генотипы. Происходит изменение кластерного и подкластер-ного деления генотипов вируса. Так, штаммы Zmeinogorsk-1,

<3% 0Г**18.

1ГкШ5кßR 1456-09 IrkutskBR 1434-09 Zmeinogorsk-1

ImeinogorsK-9

oQOi^'5

.30-0°

Рис. 1. Топологическая схема вируса клещевого энцефалита в Сибирском регионе РФ по полному гену Е

Здесь и на рис. 2: neighbor-joining метод, I - западный генотип вируса клещевого энцефалита (ВКЭ), II - дальневосточный генотип ВКЭ, III - группа штаммов 178/886, IV - сибирский генотип ВКЭ.

Tomsk-'

-200S

% %

^ в? % % ^

ч, ч

6/иь'пп0е Tomsk-M83 Tomsk-M202 40

Tomsk-K6

К_РТ12--VT

Рис. 2. Топологическая схема вирусного клещевого энцефалита в Сибирском регионе РФ по гену Е

-5 и -9, образующие отдельный ранний подкластер на первой топологической схеме, перемещаются в более позднее поколение штаммов западного генотипа. Подобные изменения наблюдаются и в кластерном делении дальневосточного генотипа. Так, штаммы ZabaikaLye-1-98/6-09/30-00 и MDJ-01 (Китай) перемещаются в более поздние поколения штаммов дальневосточного генотипа. В филогенетической структуре штаммов сибирского генотипа сохраняется деление на 2 основных кластера, в то же время внутри основных кластеров происходит перераспределение генетических дистанций между штаммами. Полученные результаты могут указывать на высокую значимость накопления нуклеотид-ных замен в 3-й позиции кодонов при определении генетических дистанций между вирусными штаммами, что должно быть принято во внимание при дальнейшем изучений пространственно-временной эволюции ВКЭ.

Тестирование двух вариантов выборок, состоящих из 1-й и 2-й позиций кодона исходных последовательностей и 3-й позиции кодона исходных последовательностей, с учетом наличия двух аутгрупп ОГЛ и Лангат-вируса с помощью индекса насыщения заменами показало, что 3-е положение

кодона гена белка E ВКЭ перенасыщено заменами и не может быть использовано для получения адекватного результата филогенетического анализа. Результаты тестирования с помощью индекса насыщения заменами объясняют различие, возникающее в топологиях филогенетических деревьев, полученных по 1-2-му положению кодона и по всем трем позициям кодона гена белка E ВКЭ.

Во второй части работы представлены результаты проверки Н0 о работоспособности строгих молекулярных часов в изучаемой выборке штаммов. На рис. 3 представлена кластерная визуализация результатов теста посредством программы Tajima Relative Rate Test of Molecular Clock [21]. Пороговым значением вероятности принятия Н0 о работоспособности строгих молекулярных часов принято критическое значение 0,5. Кластеризация была выполнена на основе матрицы, отражающей значения 1-P_value принятия Н0 о работе строгих молекулярных часов для пар рассматриваемых штаммов. Длина ветвей на дендрограмме, таким образом, отражает степень различия по скорости течения молекулярных часов. Если 2 штамма разделены ветками длиной более 0,95, значит, скорости накопления замен для них

Cluster Dendrogram

=п сэ

О

от 1— оо

со о

оо

со со г-

сс

CQ

ts

ut

СО C\J

-г- C\J

^ £

от о от ос

п

"X

Л

5 §

СО

£ Сi °

от от ОС

d

hclust

Рис. 3. Кластерная визуализация результатов теста на работоспособность строгих молекулярных часов. В пределах 1-го и 2-го кластеров скорости накопления нуклеотидных замен в поколениях одинаковы

достоверно различаются (Р^а1ие<1-0,95<0,05, пороговая вероятность принятия гипотезы о равенстве скоростей накопления замен меньше критического значения в 0,05). По данным полученной дендрограммы в изучаемой выборке можно выделить 2 подвыборки, внутри которых скорость накопления нуклеотидных замен одинакова (достоверно не отличается). Поэтому гипотеза о строгих молекулярных часах между двумя подвыборками отвергается.

Таким образом, в исследуемой выборке штаммов обнаруживается разная скорость накопления нуклеотидных замен в поколениях, что следует принимать во внимание при дальнейшем изучении филогении и филогеографии ВКЭ в регионе. Важно отметить, что распределение штаммов в подгруппах носит смешанный характер, не позволяющий предполагать генотипическую или локальную специфичность наблюдаемых различий в скорости накопления замен в РНК ВКЭ.

Согласно основным законам молекулярной биологии, нуклеотидные замены в 1-й и во 2-й позициях кодонов отражают фенотипическую изменчивость вида и приводят к изменению аминокислотной последовательности закодированного белка. В то же время накопление нуклеотидных замен в 3-й позиции кодона по причине вырожденности ге-

нетического кода может не приводить к изменению аминокислотного состава белка, но играет значимую роль в определении генетических дистанций в исследовании эволюции биологического объекта.

Результаты проведенного молекулярно-эпидемиологиче-ского исследования уточняют и развивают представления об историческом развитии и современной эволюции ВКЭ и могут быть использованы для лучшего понимания механизмов внутривидовой изменчивости и характера распространения возбудителя опасной природно-очаговой инфекции клещевого энцефалита на территории Сибирского региона России.

Исследование выполнено при финансовой поддержке грантов:

1. Российского фонда фундаментальных исследований в рамках научного проекта № 16-04-01336.

2. Программы фундаментальных исследований Президиума РАН № 1 по стратегическим направлениям развития науки на 2014 г. «Фундаментальные проблемы математического моделирования».

3. Российского научного фонда № 14-15-00615 (по разделу анализа по штаммам западного генотипа вируса клещевого энцефалита).

СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ

Киселев Дмитрий Олегович - аспирант кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии с курсом клинической лабораторной диагностики ФГБОУ ВО «Иркутский государственный медицинский университет» Минздрава России E-mail: rancevich89@mail.ru

Джиоев Юрий Павлович - кандидат биологических наук, ассистент кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии с курсом клинической лабораторной диагностики ФГБОУ ВО «Иркутский государственный медицинский университет» Минздрава России, ведущий научный сотрудник НИИ биомедицинских технологий, ФГБНУ «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека» E-mail: alanir07@mail.ru

Букин Юрий Сергеевич - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник ФГБУН «Лимнологический институт» СО РАН, старший научный сотрудник кафедры биотехнологии и биоинформатики ФГБОУ ВО «Иркутский национальный исследовательский технический университет» E-mail: bukinyura@mail.ru

Козлова Ирина Валерьевна - доктор медицинских наук, старший научный сотрудник, заведующая лабораторией ФГБНУ «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека», Иркутск E-mail: alanir07@mail.ru

Парамонов Алексей Игоревич - лаборант-исследователь ФГБНУ «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции

человека», Иркутск

E-mail: paramonov_a.i@mail.ru

Ткачев Сергей Евгеньевич - научный сотрудник ФГБУН «Институт химической биологии и фундаментальной медицины»

СО РАН, Новосибирск

E-mail: sergey.e.tkachev@mail.ru

Бадмаев Алдар Александрович - заведующий отделения дезинфекции ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Республике

Бурятия», Улан-Удэ

E-mail: 19aab85@gmail.com

Ружек Даниель (Ruzek Daniel) - научный сотрудник Института паразитологии биологического центра АН Республики Чехия (г. Ческе-Будеёвице), отдела вирусологии Института ветеринарии и фармацевтики в Брно (Чехия) E-mail: ruzekd@paru.cas.cz

Чжангуй Чу (Zhangyi Qu) - профессор, заведующий отделом природно-очаговых инфекций Харбинского медицинского университета, Китай E-mail: rancevich89@mail.ru

Злобин Владимир Игоревич - академик РАН, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой микробиологии, вирусологии и иммунологии с курсом клинической лабораторной диагностики ФГБОУ ВО «Иркутский государственный медицинский университет» Минздрава России E-mail: vizlobin@mail.ru

ЛИТЕРАТУРА

1. Борисов В.А., Малов И.В., Ющук Н.Д. Клещевой энцефалит. Новосибирск : Наука, Сибирское отделение, 2002. 184 с.

2. Верхозина М.М., Злобин В.И., Козлова И.В. и др. Молекулярно-эпидемиологическая характеристика региональной популяции вируса клещевого Восточной Сибири // Бюл. ВСНЦ. 2002. Т. 2, № 4. С. 46-49.

3. Демина Т.В., Джиоев Ю.П., Козлова И.В. и др. Генотипы 4 и 5 вируса клещевого энцефалита: особенности структуры геномов возможный сценарий их формирования // Вопр. вирусол. 2012. № 4. С. 13-19.

4. Джиоев Ю.П., Злобин В.И., Беликов С.И., Адельшин Р.В. Эволюционный возраст популяции вируса клещевого энцефалита на азиатской территории России // Бюл. ВСНЦ СО РАМН. 2002. Т. 2, № 4. С. 60-63.

5. Джиоев Ю.П., Букин Ю.С., Парамонов А.И. и др. Филогеографиче-ский анализ популяции вируса клещевого энцефалита // Журн. инфекционной патологии. 2012. Т. 19, № 3. С. 18.

6. Злобин В.И., Газо М.Х., Беликов С.И. и др. Молекулярные зонды для генетического типирования вируса клещевого энцефалита // Вопр. вирусол. 2001. № 4. С. 43-47.

7. Злобин В.И., Беликов С.И., Джиоев Ю.П. и др. Новая концепция природной генетической вариабельности вируса клещевого энцефалита // Тихоокеанский мед. журн. 2001. № 2. С. 75-78.

8. Киселев Д.О., Джиоев Ю.П., Парамонов А.И. и др. Филогенетическая структура и характеристики эволюционных возрастов штаммов сибирского и дальневосточного генотипов вируса клещевого энцефалита в природных экосистемах Евразии // Сибир. мед. журн. (Иркутск). 2015. № 2. С. 93-98.

9. Козлова И.В., Верхозина М.М., Демина Т.В. и др. Комплексная характеристика оригинальной группы штаммов вируса клещевого энцефа-

лита, изолированного на территории Восточной Сибири // Сибир. мед. журн. (Иркутск). 2012. Т. 111, № 4. С. 80-85.

10. Тюлько Ж.С., Якименко В.В. Вариабельность нуклеотидных последовательностей геномов вируса клещевого энцефалита, связанная с их структурой // Сибир. мед. журн. (Иркутск). 2012. Т. 111, № 4. С. 27-30.

11. Ястребов В.К., Якименко В.В. Омская геморрагическая лихорадка: результаты исследований (1946-2013) // Вопр. вирусол. 2014. № 6. С. 5-11.

12. Adelshin R.V., Melnikova O.V., Karan L.S. et al. Complete genome sequences of four european subtype strains of tick-borne encephalitis virus from Eastern Siberia, Russia // Genome Announc. 2015. Vol. 18, N 3. P. 1-2.

13. Demina T.V., Dzhioev Yu.P., Verkhozina M.M. et al. Genetic variability research and genotyping of tick-borne encephalitis virus by means of desoxyoligonucleotide probes // J. Med. Virol. 2010. Vol. 82. Р. 965-976.

14. Gouy M., Guindon S., Gascuel O. SeaView version 4: a multiplatform graphical user interface for sequence alignment and phylogenetic tree building. // Mol. Biol. Evol. 2010. Vol. 27, N 2. P. 221-224.

15. Gritsun TS, Lashkevich VA, Gould EA. Tick-borne encephalitis // Antiviral Res. 2003. Vol. 57, N 1-2. P. 129-146.

16. Formanova P., Cerny J., Bolfikova B.C. et al. Full genome sequences and molecular characterization of tick-borne encephalitis virus strains isolated from human patients // Ticks Tick Borne Dis. 2015. Vol. 6, N 1. P. 38-46.

17. Huelsenbeck J.P., Ronquist F. MRBAYES: Bayesian inference of phylogenetic trees // Bioinformatics. 2001. Vol. 17, N 8. P. 754-755.

18. Paradis E., Claude J., Strimmer K. APE: analyses of phylogenetics and evolution in R language // Bioinformatics. 2004. Vol. 20, N 2. P. 289290.

19. Posada D. jModelTest: phylogenetic model averaging. // Mol. Biol. EvoL 2008. Vol. 25, N 7. 1253-1256.

20. Rambaut A., Drummond A. FigTree version 1.3.1 [computer program]. http://tree.bio.ed.ac.uk21. Tajima, F. Simple methods for testing molecular clock hypothesis // Genetics. 1993. Vol. 135, N 2. P. 599607.

22. Tamura K., Nei M. Estimation of the number of nucleotide substitutions in the control region of mitochondrial DNA in humans

and chimpanzees // Mol. Biol. Evol. 1993. Vol. 10, N 3. P. 512526.

23. Xia X., Xie Z., Salemi M., Chen L. et al. An index of substitution saturation and its application // Molecular Phylogenet. Evol. 2003. Vol. 26, N 1. P. 1-7.

24. Xia X., Lemey P. Assessing substitution saturation with DAMBE // The Phylogenetic Handbook: a Practical Approach to DNA and Protein Phylogeny. Cambridge : Cambridge University Press, 2009. Vol. 2. P. 615-630.

REFERENCES

1. Borisov V.A., Malov I.V., Yushchuk N.D. Tick-borne encephalitis. Novosibirsk: Nauka, Siberian Branch, 2002: 184 p.

2. Verkhozina M.M., Zlobin V.I., Kozlova I.V., et al. Epidemiological and molecular-genetic analysis of tick-borne encephalitis virus population in Irkutsk region. Byulleten' Vostochno-Sibirskogo nauchnogo tsentra Sibirskogo otdeleniya Rossiyskoy Akademii meditsinskikh nauk [Bulletin of the East Siberian Scientific Center of the Siberian Branch of the Russian Academy of Medical Sciences]. 2002; Vol. 2

3. Demina T.V., Dzhioev Yu.P., Kozlova I.V., et al. Genotypes 4 and 5 of the Tick-Borne Encephalitis Virus: Features of the Genome Structure and Possible Scenario for its Formation. Problemy virusologii [Problems of Virology]. 2012; Vol. 4: 13-9.

4. Dzhioev Yu.P., Zlobin V.I., Belikov S.I., Adel'shin R.V. Evolutionary age population of tick-borne encephalitis virus in the Asian territory of Russia. Byulleten' Vostochno-Sibirskogo nauchnogo tsentra Sibirskogo otdeleniya Rossiyskoy Akademii meditsinskikh nauk [Bulletin of the East Siberian Scientific Center of the Siberian Branch of the Russian Academy of Medical Sciences»]. 2002; Vol. 2

5. Dzhioev Yu.P., Bukin Yu.S., Paramonov A.I., et al. Phylogeographic analysis of tick-borne encephalitis virus population. Zhurnal infektsionnoy patologii [Journal of Infectious Pathology]. 2012; Vol. 19

6. Zlobin V.I., Gazo M.Kh., Belikov S.I., et al. Molecular probes for genetic typing of tick-borne encephalitis virus. Voprosy virusologii [Problems of Virology]. 2001;

7. Zlobin V.I., Belikov S.I., Dzhioev Yu.P., et al. A new concept of the natural genetic variability of the virus encephalitis. Tihookeanskij meditsinskij zhurnal [Pacific Medical Journal]. 2001; Vol. 2: 75-8.

8. Kiselev D.O., Dzhioev Yu.P., Paramonov A.I., et al. Phylogenetic structure and age characteristics of strains of siberian and far-eastern tick-borne encephalitis virus genotypes in ecosystems of Northern Eurasia. Sibirskij meditsinskij zhurnal [Siberian Medical Journal]. 2015;

9. Kozlova I.V., Verkhozina M.M., Demina T.V., et al. A comprehensive description of the original group of tick-borne encephalitis virus strains isolated in Eastern Siberia. Sibirskij Meditsinskij Zhurnal [Siberian Medical Journal]. 2012; Vol. 111

10. Tyul'ko Zh.S., Yakimenko V.V. The nucleotide sequences variability of genomes of tick-borne encephalitis virus associated with their structure. Sibirskij Meditsinskij Zhurnal [Siberian Medical Journal]. 2012; Vol. 111

11. Yastrebov V.K., Yakimenko V.V. The Omsk hemorrhagic fever: research results

12. Adelshin R.V., Melnikova O.V., Karan L.S., et al. Complete genome sequences of four european subtype strains of tick-borne encephalitis virus from Eastern Siberia, Russia. Genome Announc. 2015; Vol. 18 (3): 1-2.

13. Demina T.V., Dzhioev Yu.P., Verkhozina M.M., et al. Genetic variability research and genotyping of tick-borne encephalitis virus by means of desoxyoligonucleotide probes. J Med Virol. 2010; Vol. 82: 965-76.

14. Gouy M., Guindon S., Gascuel 0. SeaView version 4: a multiplatform graphical user interface for sequence alignment and phylogenetic tree building. Mol Biol Evol. 2010; Vol. 27 (2): 221-4.

15. Gritsun T.S., Lashkevich V.A., Gould E.A. Tick-borne encephalitis. Antiviral Res. 2003; Vol. 57 (1-2): 129-46.

16. Formanova P., Cerny J., Bolfikova B.C. et al. Full genome sequences and molecular characterization of tick-borne encephalitis virus strains isolated from human patients. Ticks Tick Borne Dis. 2015; Vol. 6 (1): 38-46.

17. Huelsenbeck J.P., Ronquist F. MRBAYES: Bayesian inference of phylogenetic trees. Bioinformatics. 2001; Vol. 17 (8): 754-5.

18. Paradis E., Claude J., Strimmer K. APE: analyses of phylogenetics and evolution in R language. Bioinformatics. 2004; Vol. 20 (2): 289-90.

19. Posada D. jModelTest: phylogenetic model averaging. Mol. Biol. Evol. 2008; Vol. 25 (7): 1253-6.

20. Rambaut A., Drummond A. FigTree version 1.3.1 [computer program]. http://tree.bio.ed.ac.uk21. Tajima F. Simple methods for testing molecular clock hypothesis. Genetics. 1993; Vol. 135 (2): 599-607.

22. Tamura K., Nei M. Estimation of the number of nucleotide substitutions in the control region of mitochondrial DNA in humans and chimpanzees. Mol. Biol. Evol. 1993; Vol. 10 (3): 512-26.

23. Xia X., Xie Z., Salemi M., Chen L., et al. An index of substitution saturation and its application. Mol Phylogenet Evol. 2003; Vol. 26 (1): 1-7.

24. Xia X., Lemey P. Assessing substitution saturation with DAMBE. In: The Phylogenetic Handbook: a Practical Approach to DNA and Protein Phylogeny. Cambridge: Cambridge University Press, 2009; Vol. 2: 615-30.