КОНТЕЙНЕР ДЛЯ КЛОНАЛЬНОГО МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ РАСТЕНИЙ (ВАРИАНТЫ)

Полезная модель относится к области размножения растений in vitro из тканевых культур в питательной среде для научных исследований и растениеводства.
Процесс роста растения из клеток в значительной степени определяется микроклиматическими параметрами и составом питательной среды. К микроклиматическим параметрам относятся температура, свет, оптимальный состав кислорода и углекислого газа. Оптимальная скорость газообмена зависит от объемов контейнеров, этапа микроразмножения и роста биомассы, а также от возможности газообмена с окружающей средой.
Известны контейнеры для клонального микрорастений, выполненные с герметически закрываемыми крышками без возможности газообмена, например, цилиндрические контейнеры, применяемые для хранения пищи для детей или контейнеры трапециидальной формы для хранения горячих продуктов [1].
Известны контейнеры фирмы GROWTEK [2], в которых для уменьшения каплеобразования используют специальный наклон во внутренней части крышки контейнера.
Развитие растений в замкнутом объеме не достаточно эффективно, поэтому в ряде изобретений конструкции контейнеров для микроразмножения содержат элементы, которые осуществляют обмен газов между окружающей средой и между рабочим объемом контейнера.
Известно устройство для микроразмножения растений [3], в котором для осуществления газообмена формируется щель между верхним и нижними листами, формирующими одну из сторон контейнера, при этом нижний лист ограничивает рабочие объемы нескольких ячеек, входящих в состав контейнера. Недостаток конструкции состоит в неудобстве загрузки эксплантов и питающей среды при заполнении ячеек и неконтролируемый уровень газового обмена.
Известен патент США №5,558,984 [4], в котором используют два типа мембраны. Через первую мембрану, размещенную на дне контейнера, осуществляется смена питающей среды, через вторую мембрану, расположенную на боковой стене контейнера, происходит газообмен. К недостатку таких конструкций контейнеров можно отнести сложность конструкции.
Известно авторское свидетельство SU №1537181 [5], в котором для улучшения выращивания растения используют газоселективную мембрану, выполненную в виде кольца и вклеенную по торцам в материал крышки. За счет того, что конструкция микротеплицы дополнительно содержит вытяжную трубу, размещенную в центре крышки, то материал газоселективной мембраны должен обеспечивать достаточную жесткость для крепления трубы в центральной части крышки, которая контактирует с внутренней границей кольцевой мембраны. При этом затруднена возможность очистки мембраны или ее смены при разборке конструкции.
Известна разработка фирмы Innosca [6]. Фирма разработала фильтр с порами 7 микрон и диаметром фильтра 25 мм., которые с помощью специального клея вклеивается в центральную часть верхней крышки контейнера. Фильтр используется для установки в крышки контейнеров фирмы Magenta, контейнеров цилиндрической формы других фирм и для установки в крышки контейнеров «baby food jars» используемых для приготовления пищи для детей.
2
2
Следует отметить, что контейнеры разных фирм, в которые фирма Innosca устанавливает фильтры, имеют разный объем и соответственно разную площадь верхней поверхности питающей среды. В этих условиях возникает либо избыточный газообмен в маленьких контейнерах цилиндрической формы с внутренней поверхностью питающей среды около 7 см, либо проходит недостаточный газообмен для больших контейнеров фирмы Magenta с площадью поверхности питающей среды около 50 см. За счет большой разницы в газообмене для разных типов контейнеров газообмен проходит не эффективно, что приводит к снижению результатов микроразмножения.
Аналогичное техническое решение с установкой вклеиваемого фильтра выполненного на основе полимера полиэтилентерефталата (PTFE) с диаметром пор 10 микрон в крышку контейнера фирмы Magenta использует фирма Sirius Biotechnology Pte Ltd [7] для производства вентилируемого контейнера SIRIUS TCC-S450.
Серьезным недостатком вклеиваемых несменных фильтров является то, что они могут забиваться, менять свои газообменные свойства или трескаться при мойке и автоклавировании. Следует отметить, что из-за конструктивных особенностей рассматриваемых контейнеров стенки контейнеров выбраны достаточно толстыми, выполнены из полистирола и следовательно стоимость изготовления контейнеров достаточно высока. Для сокращения расходов их многократно используют, однако при этом теряется прозрачность материала, а также тратится значительное время на их мойку и автоклавирование, что дополнительных требует расходов на электроэнергию и горячую воду.
Наиболее близким техническим решением к рассматриваемому, является разработка фирмы TISSUE QUICK PLANT LABORATORIES [8]. Фирма разработала фильтр с микропорами на основе сложного полиэфира полиэтилентерефталата (PTFE), снабженного сеткой для создания конструкционной жесткости и клеевым слоем нанесенном по краям диска. Фильтр диаметром 18,6 мм и рабочим диаметром 10 мм устанавливается на крышку цилиндрического контейнера диаметром 90 мм и высотой 70 мм. Однако технология производства фильтра достаточно дорога, что определяет его высокую цену. При этом для окупаемости расходов также требуется проводить многоразовое использование как фильтра, так и контейнера в котором он установлен, что требует промывок и автоклавирования. Кроме этого за счет малой площади пор фильтра его эффективность по газообмену жестко связана с определенным объемом небольшого контейнера, что не очень удобно для проведения разных этапов выращивания растений требующих разных объемов контейнера.
Технический результат, на достижение которого направлена заявленная полезная модель, связан с обеспечением улучшенных условий микроразмножения при минимальных расходах.
Следующий технический результат, на достижение которого направлена заявленная полезная модель, связан с расширением арсенала технических средств за счет обеспечения возможности вторичного применения крышки с установленным фильтром используемой при микроразмножении, для формирования другой конструкции контейнера с большим объемом, обеспечивающий улучшенные условия роста растения на последующем этапе выращивания.
Следующий технический результат, на достижение которого направлена заявленная полезная модель связан с возможностью исключения трудовых затрат, связанных с чисткой и стерилизацией контейнеров за счет их одноразового использования.
Одним объектом полезной модели является контейнер для микроразмножения растений in vitro из тканевых культур в питательной среде, который содержит корпус различный по объему и конфигурации для размещения питательной среды с эксплантами и герметично закрывающуюся крышку, снабженную отверстием для газообмена, причем над отверстием размещен, по меньшей мере, один фильтр. Фильтр выполнен из слоя тканого или нетканого материала, снабженного односторонним клеевым слоем. Фильтр закреплен клеевым слоем к верхней и/или к нижней поверхности крышки, прилегающей к внешней границе отверстия для газообмена. При этом для осуществления эффективного газообмена площадь отверстия в крышке относится к площади поверхности питающей среды, размещенной в корпусе контейнера, в диапазоне от 1/140 до 1/275.
Другим объектом полезной модели является контейнер для микроразмножения растений in vitro из тканевых культур в питательной среде, который содержит корпус различный по объему и конфигурации для размещения питательной среды с эксплантами и герметично закрывающуюся крышку, снабженную отверстием для газообмена.
Контейнер содержит от 2 до 5 фильтров, каждый фильтр выполнен из слоя тканого или нетканого материала, снабженного односторонним клеевым слоем. При этом первый фильтр закреплен клеевым слоем к поверхности крышки, прилегающей к внешней границе отверстия для газообмена, другие фильтры закреплены последовательно друг над другом, при этом соотношение площади отверстия для газообмена к площади поверхности питающей среды лежит в пределах от 1/100 до 1/140.
Следующим объектом полезной модели является то, что в зависимости от этапа роста растения обеспечивается возможность присоединения к крышке, снабженной фильтром, других типоразмеров корпуса с большим внутренним объемом в диапазоне от 125 мл. до 500 мл. или от 500 мл. до 2000 мл., а эффективность газообмена регулируется количеством используемых фильтров.
Следующим объектом полезной модели является то, что фильтр выполнен из материала фиксирующего пластыря, который выбирают из группы состоящей из Omniplast, Omnistrip, Omnisilk, Omnipor, Omnifix, URGO.
Следующим объектом полезной модели является то, что форму отверстия для газообмена выбирают из группы, состоящей из: круга, квадрата, прямоугольника, эллипса, треугольника, многоугольника.
Перечень фигур
На фиг.1 изображен разрез фрагмента контейнера в сборе. Где а) фильтрующий элемент закреплен над отверстием для газообмена на верхней поверхности крышки, б) фильтрующие элементы закреплены над отверстием для газообмена на верхней и нижней поверхности крышки, в) фильтрующие элементы установлены над отверстием для газообмена в виде многослойной конструкции (друг над другом).
На фиг.2 изображены растения осины, полученные в результате микроразмножения размножения осины из стеблевых эксплантов (междоузлий). Где: а) представлен внешний вид сверху контейнера с крышкой без отверстия для газообмена, b) представлен внешний вид сверху контейнера с крышкой с отверстием для газообмена закрытое фильтром.
Описание
Контейнер для выращивания растений in-vitro при клональном микроразмножении содержит корпус 1 и съемную крышку 2, обеспеченную отверстием 4 и фильтром 3. При этом корпус может быть изготовлен в форме полого цилиндра со сферическим или плоским дном, в виде полого параллелипипеда, полого куба или полых усеченных конусообразных цилиндрических или пирамидальных тел, преимущественно с плоским дном или в виде перевернутых усеченных конусообразных цилиндрических или пирамидальных тел с плоским дном для последующей установки контейнеров на стеллажи с горизонтальной поверхностью. Более предпочтительны варианты форм корпусов контейнера прямоугольной или цилиндрической формы, поперечное сечение которых представляет перевернутую усеченную трапецию. Эти формы корпусов контейнеров широко используют для хранения пищевых продуктов в многоразовых и одноразовых контейнерах.
Конструкции контейнеров приспособлены для фиксации крышек на корпусе контейнера. С этой целью крышки и корпус содержат дополнительные зоны, которые обеспечивают стыковку крышки и корпуса и обеспечивают дополнительную жесткость конструкции. Дополнительно крышки снабжены удобным язычком для отсоединения крышки от корпуса.
Наиболее предпочтительным материалом контейнера является полипропилен. Контейнеры из полипропилена (ПП) дешевы (от 1,5 рублей за контейнер 250 мл) и выпускаются многими производителями, например фирмой «Upax-Unity» [9]. Контейнеры просты в изготовлении и производятся путем горячего формования (термоформование) полипропиленовой ленты.
Удобный язычок для отсоединения крышки от корпуса, кольца жесткости на крышке и корпусе, формирующие возможность плотной стыковки и герметизацию стыка, возможность автоклавирования контейнера - создают неоспоримые преимущества данной упаковки для выполнения задач микроразмножения.
Кроме этого полипропилен подходит для производства контейнеров для микроразмножения, поскольку полипропилен признан безопасным полимером и экологически чистым материалом. Полипропилен рекомендован в качестве безопасного материала для одноразовой упаковки и применяется для фасовки и упаковки продуктов детского питания. Кроме этого известно, что полипропилен обладает высокой прочностью, термостойкостью и прозрачностью. Полипропилен сохраняет целостность при воздействии агрессивных химических соединений, хорошо держит форму при нагреве или автоклавировании, не теряя при этом пластичность
Контейнеры из полипропилена выпускаются с емкостью от 125 мл. до 2000 мл. Наиболее подходящие для задач микроразмножения, являются контейнеры объемом от 125 до 500 мл. с одним типом прямоугольной крышки, размером 100×75 мм. в комбинации с разными корпусами с высотой от 35 до 100 мм., или контейнеры с крышкой 186×132 мм в комбинации с разными корпусами с высотой от 35 до 122 мм., с объемом от 500 мл до 2000 мл. Универсальность стыковки крышек с верхней частью контейнеров позволяет в последующем автоматизировать разлив питающей среды и укладку эксплантов на автоматизированных линиях микрочеренкования. Разный объем и высота контейнеров позволяет улучшить условия роста растений на последующих этапах формирования растения для подготовки его выращивания в теплице.
Таким образом, выбранная конструкция и материал контейнера позволяет обеспечить один из технических результатов, связанный со снижением расходов на улучшение условий жизнедеятельности растений. Снижение расходов связано с выбором контейнеров с низкой стоимостью, с повышением удобства транспортировки и хранения из-за малого веса и объема упаковки контейнеров, с простотой и удобством подготовки контейнеров к клональному микроразмножению. Данные возможности конструкции контейнера - создают неоспоримые преимущества для выполнения задач микроразмножения.
В зависимости от типа корпуса контейнера крышки могут закрепляться или с помощью защелок или закручиваться по резьбе. Поскольку крышки не соприкасаются с питающей средой, то в качестве материала крышек может быть использован не только полипропилен, но и другие типы пластмасс, кроме фторопласта, обладающего низкой адгезией к разным типам клея.
Для реализации технической задачи необходима конструкция прочного, недорогого фильтра, снабженного с одной стороны клеящим слоем. Известно, что в конструкциях фильтров для очистки воздуха используют тканные и нетканые фильтры, которые обеспечивают газообмен и эффективно задерживают частицы пыли и микроорганизмы, находящиеся в окружающей среде. В результате исследования было обнаружено, что пропитка нетканых и тканых материалов водоотталкивающими жидкостями, а также последующее одностороннее нанесение клея на поверхность тканных и нетканых материалов, незначительно снижает эффективность газообмена таких материалов и позволяет создать гибкие воздушные фильтры простым креплением тканых материалов по краям отверстий диаметром до 2 до 15 мм. с помощью клеевого соединения. Кроме этого было обнаружено, что расширение числа последовательно наклеенных фильтров друг над другом позволяет увеличить размер отверстия за счет усиления конструкции, а использование разного количества слоев от 2 до 5 позволяет регулировать газообмен не меняя отверстие в крышке контейнера.
В дальнейших экспериментах было выявлено неочевидное свойство материалов, используемых в медицине для создания фиксирующих пластырей, при создании фильтров с высокой воздухо- и паропроницаемостью. В качестве клеевой основы таких пластырей используют каучуковый или полиакрилатный клей. Тканые или нетканые материалы обрабатывают водоотталкивающими соединениями. Испытания фильтров, выполненных из разных типов фиксирующих пластырей, входящих в группу, состоящую из пластырей Omniplast, Omnistrip, Omnisilk, Omnipor, Omnifix, URGO [10], показал их эффективность при создании фильтров с достаточным газообменом в разных типах контейнеров с разным объемом, и их эффективность при фильтрации загрязнений воздуха.
Было установлено, что для контейнеров с объемом от 125 мл до 500 мл. площадь отверстия 4 для газообмена относится к площади поверхности 5 питающей среды 6, размещенной в корпусе 1 контейнера, в диапазоне от 1/140 до 1/275, что соответствует диаметру отверстия для газообмена в пределах от 5 до 7 мм в контейнере с площадью питающей среды от 52 до 55 кв. см. При этом фильтр закрепляют клеевым слоем к верхней и/или к нижней поверхности крышки, прилегающей к внешней границе отверстия для газообмена.
В другом варианте для контейнеров от 500 мл. до 2000 мл. формируют отверстие большее 7 мм и соотношение площади отверстия для газообмена к площади поверхности питающей среды лежит в пределах от 1/100 до 1/140. Для регулирования эффективности газообмена используют от 2 до 5 фильтров. Каждый фильтр выполнен из слоя тканого или нетканого материала, снабженного односторонним клеевым слоем, при этом первый фильтр закреплен клеевым слоем к поверхности крышки, прилегающей к внешней границе отверстия для газообмена, другие фильтры закреплены последовательно друг над другом.
Форму отверстия 4 для газообмена в контейнере выбирают из группы, состоящей из: круга, квадрата, прямоугольника, эллипса, треугольника, многоугольника.
Таким образом синергетический эффект при использовании тонких одноразовых контейнеров на основе полипропилена и фильтров выполненных из материалов снабженных клеевым однослойным покрытием, в том числе выполненных из тканых и нетканых материалов дает возможность получить простую, дешевую и надежную конструкцию, обеспечивающую оптимальные условия для микроразмножения растений.
Устройство работает следующим образом. Предварительно, перед установкой фильтрующего элемента, в крышке с помощью пуансона формируют отверстие для газообмена, площадь которого выбирают с учетом площади верхней поверхности питающей среды. Выбирают тип фильтрующего элемента и из выбранного материала пластыря вырезают фильтр в зависимости от формы отверстия и площади клеевого соединения. Приклеивают, по меньшей мере, один фильтр к верхней и/или нижней крышке используя давление на его внешнюю поверхность. На фиг.1а приведен вариант фильтра 3 укрепленного на верхней поверхности крышки 2. На фиг.1б приведен вариант крепления фильтров 3 к верхней и нижней части крышки. На фиг.1в) приведен вариант, в котором сформирована многослойная конструкция фильтра 3 за счет приклеивания фильтров друг над другом.
В корпус контейнера помещают питающую среду 6, в которой размещают экспланты растений, которые вырастают и формируют многочисленные пазушные побеги 7 представленные на Фиг.2а и б. Закрывают крышку и помещают контейнер на световой стеллаж, или в камеру с регулированием температуры и длительности светового периода выращивания растений. При высадке растений крышку снимают. После завершения процесса клонального микроразмножения из корпуса контейнера удаляются остатки питающей среды, корпус промывается и автоклавируется или корпус контейнера заменяют на другой с большим объемом и с другими характеристиками питающей среды. Из-за малой стоимости контейнера возможно его одноразовое применение.
Пример Клональное микроразмножение растений в контейнере
В качестве примера, который включает, но не ограничивает других вариантов, ниже приведен пример клонального микроразмножения лиственного растения осины. Наиболее эффективный способ размножения микрорастений осины - микрочеренкование.
В качестве эксплантов применяют 1-узловые сегменты микропобегов, длиной 0,8-1,5 см, с листовой пластинкой или, возможно, без нее. Экспланты в количестве 20-25 штук помещают вертикально в агаризованную питательную среду WPM (40 мл), размещенную в 250-мл контейнере. Контейнер плотно закрывается крышкой и устанавливается на световой стеллаж, который размещен в термостатируемой комнате или боксе. Каждые 30 дней, после формирования многочисленных пазушных побегов (см. Фиг.2) выполняют субкультивирование.
Для предотвращения бактериального заражения, питательные среды, применяемые на этапе микроразмножения, чередуют: безгормональная среда; среда, дополненная 500-1000 мг/л карбенициллина или 500-1000 мг/л цефотаксима. При наличии обоих антибиотиков, желательно применять их совместно, в концентрации 500 мг/л.
Для укоренения использовали 1-2-почечные сегменты побегов длиной не менее 1 см. Пучки побегов подходящего размера доставали из культуральных сосудов и помещали в чашки Петри, где и производили отбор материала для укоренения. Выбранные побеги и сегменты побегов помещали по 20-25 штук в 250 мл контейнеры, содержащие 40 мл агаризованной среды WPM без гормонов и культивировали при стандартных условиях в течение 4-х недель. Первые корешки появляются через 10 дней, а спустя месяц образуется хорошо развитая корневая система с корнями 2-го и 3-го порядка. На фиг 2 представлены результаты микроразмножения растения осины в контейнере без применения фильтра для газообмена Фиг.2а и с фильтром для газообмена Фиг.2б. Результаты эксперимента показывают большую эффективность микроразмножения с использованием фильтра выполненного из материала пластыря Omniplast.
Предложенный контейнер может быть изготовлен промышленным способом из известных материалов с использованием известных технологий и технических средств и использован для научных исследований или при производстве посадочного материала растений в сельском и лесном хозяйстве.
Литература
1. Технические материалы фирмы «Kitchen Culture. Kits Inc» Bringing Plant Tissue Culture into the Classroom and Home (http://www.kitchenculturekit.com).
2. Технические материалы фирмы «GROWTEK». Novel plant tissue culture system for plantlet growth and aseptic seed germination (http//www.gbiogene.com).
3. Танклевский М.М. и др. Контейнер для микроразмножения растений. Авт свидетельство SU 1341114, 08.04.1985.
4. Young, et al. Automated system and process for heterotrophic growth of plant tissue, Патент США №5,558,984 September 24, 1996.
5. Стрельцов Б.Н. и др. Микротеплица, Авторское свид. SU №1537181 от 23.01.90
6. Технические материалы фирмы «Innosca» (http://www.innosca.com/resources/Innosca_catalogue.pdf).
7. Технические материалы фирмы «Sirius Biotechnology Pte Ltd» (http://www.tradeget.com/free_list/p80449/Our_Product.html).
8. Технические материалы фирмы «TISSUE QUICK PLANT LABORATORIES» (http://www.tissuequickplantlabs.com/amdpg5nf.htm).
9. Технические материалы компании «Upax-Unity». Технические параметры одноразовых контейнеров (http://upax.ru/prod/?del=22).
10. Рекламный проспект (http:/www.apteka-vd.ru/cat.php?code=bnt).