СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОРГАНИЧЕСКИХ РАСТВОРИТЕЛЕЙ, ПРЕИМУЩЕСТВЕННО БУТАНОЛА
METHOD OF PRODUCING ORGANIC SOLVENTS, MAINLY BUTANOL

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения органических растворителей - бутанола, ацетона и этанола путем биосинтеза углеводсодержащих материалов.
Наиболее ценным из перечисленных растворителей является бутанол.
Бутанол - это дорогостоящий органический растворитель, широко применяется при изготовлении нитролаков и масляных лаков в производстве сложных растворителей, синтетической резины и шелка, при экстрагировании фармацевтических препаратов, служит сырьем для производства практически всех пластмасс и их растворителей, поэтому на рынке химических реактивов и веществ имеет постоянно большой спрос.
Органические растворители могут быть использованы также и в качестве биотоплива.
В настоящее время в связи с появлением новых экономичных технологий производства резко возрос интерес к получаемому микробиологическим путем бутанолу и его использованию в качестве биотоплива. При этом бутанол обладает целом рядом преимуществ перед этанолом. По сравнению с этанолом, бутанол может быть смешан в более высоких пропорциях с бензином и может использоваться в существующих двигателях автомобилей без модификации системы формирования воздушно-топливной смеси. Бутанол выделяет чистой энергии на рабочий цикл больше, чем этанол или метанол, и примерно на 10% больше, чем бензин.
4
9
3
2
3
2
2
3
3
2
3
Бутиловый спирт (бутанол) СНOН - бесцветная жидкость с характерным запахом сивушного масла. Известны нормальный первичный бутиловый спирт СН(СН)3ОН, нормальный вторичный бутиловый спирт CHСНСН(ОН)СН, изобутиловый спирт (CH)2СНСНOН, триметилкарбинол (СН)3СОН.
В промышленности бутанол получают оксосинтезом из пропилена с использованием никель-кобальтовых катализаторов при 130-150°С и давление 20-35 МПа.
Бутанол начал производиться в 10-х годах XX века микробиологическим путем с использованием бактерии вида Clostridium acetobutylicum. Сырьем для производства была глюкоза сахарного тростника, свеклы, кукурузы, пшеницы, маниоки.
Известно, что бактерии вида Clostridium acetobutylicum при сбраживании различных углеводов синтезируют одновременно три целевых продукта: бутанол, ацетон и этанол, процентное соотношение которых примерно 60:30:10 (соответственно). Это соотношение не является строго постоянным и может изменяться в сторону увеличения выхода того или иного продукта брожения. При этом на выход растворителей и долевое соотношение целевых продуктов в значительной степени влияет состав сырья, используемого для брожения. Так, при культивировании на мучных средах различные штаммы Clostridium acetobutylicum синтезируют общее количество растворителей, составляющие 18-19 г/л, в том числе 11-12 г/л и 4-5 г/л ацетона. Кроме того, на средах из муки синтезируется 1,5-2,5 г/л этанола (Корнеева О.С. Жеребцов Н.А. и др. Роль амилолитических ферментов Clostridium acetobutylicum в биосинтезе растворителей. Биотехнология, 1986 г., №3, стр.133-136).
Известен способ повышения выхода растворителей при периодическом культивировании бактерий вида Clostridium acetobutylicum на мучных средах за счет предварительного разжижения крахмала рециркулируемой бражкой, содержащей активные амилолитические ферменты. При этом, общий выход растворителей достигает 19 г/л, а время брожения сокращается а.с. SU 160485, 21.12.88.
Вышеописанные способы обладают всеми недостатками периодических процессов.
Известен отъемно-доливной способ получения бутанола, используемый в промышленных масштабах, который позволил частично компенсировать недостатки периодического процесса биосинтеза бутанола. При таком способе из ферментера постоянно удаляется часть объема культуральной среды и добавляется равный объем среды. Отобранная порция культуральной среды направляется на ректификацию. Очевидно, что при этом безвозвратно теряются сахара, содержащиеся в отобранной порции. Кроме того, в классическом варианте ацетонобутилового брожения с 4%-ым уровнем доступной глюкозы в культуральной среде ферментация прекращается через 72 часа по причине «выедания» микроорганизмами доступной глюкозы (в случае, когда не вносилось дополнительных питательных веществ, кроме изначальных). Более того, внесение дополнительного питания не приводит к увеличению продолжительности ферментации за счет того, что к 72 часу в культуральной среды достигается концентрация растворителей, токсическая для продуцирующего микроорганизма. Известным фактом является то, что в процессе биосинтеза спиртов по мере накопления бутанола, этанола и ацетона, происходит снижение активности биосинтезирующих микроорганизмов, т.к. спирты являются ингибиторами самого процесса спиртового брожения. С целью исключения подобного бутанол и другие органические соединения постоянно выводят из процесса.
Известен ферментационный способ получения бутанола и других органических растворителей с использованием двух различных штаммов бактерий, с постоянным отводом образующихся органических соединений. Изобретение описывает процесс получения растворителей, преимущественно бутанола, из сахара, протекающий в две стадии, за каждую из которых ответственны разные микроорганизмы. Первая стадия - производство масляной кислоты из раствора углеводов первым микроорганизмом, вторая стадия - производство бутанола из масляной кислоты вторым микроорганизмом, а затем - выделение бутанола. Для стадии ацидогенеза могут быть использованы штаммы анаэробных бактерий таких как: Clostridium tyrobutyricum, С. thermobutyricum, С. butyricum, С. cadaveros, С. cellobioparum, С. cochlearium, С. felsineum, С. pasteurianum, С. roseum, С. rubrum, С. sporogenes. Для стадии сольвентогенеза чаще всего используются штаммы следующих микроорганизмов: Clostridium acetobutylicum, С. beijerinkii, С. aurantibutyricum and С. tetanomorphum. В данном изобретении главным производителем масляной кислоты является С. thermobutyricum, С. tyrobutyricum, а производителем бутанола С.acetobutylicum или схожей бактерии, находящейся в сольвентогенезной фазе роста. Процесс осуществляют следующим образом: стерильный раствор углеводов в первом реакторе преобразуется в масляную кислоту с помощью первого микроба; масляная кислота, после стерилизации или удаления иным способом первого микроба, направляется во второй реактор для преобразования в бутанол; бутанол и другие органические соединения постоянно извлекаются из второго реактора активированными сорбентами, мембранами или перегонкой (US №5753474, 1988 г.).
Известен способ сбраживания углеводсодержащих сред с помощью бактерий, продуцирующих бутанол, ацетон, этанол и/или изопропанол, состоящий из, по меньшей мере, двух стадий, причем на первой стадии в основном происходит непрерывное размножение бактерий, а на второй, проводимой непрерывно или периодически, образуется целевой продукт. Образующиеся на второй стадии продукты отводят из среды (предпочтительно непрерывно) путем диффузионного испарения, используя для этой цели перфузионную мембрану, в частности из силиконового каучука (RU 2044773, 1989 г.).
Основные недостатки описанных способов связаны со сложностями выделения органических растворителей из культуральной среды, поскольку это наиболее энергоемкое и дорогостоящее звено в технологии их получения. Сегодня известно немало способов выделения спиртов из гетерогенной среды: дистилляция - перегонка через паровую фазу см. «Касаткин А.Г. Основные процессы и аппараты химической технологии, 8 изд., М., 1971»; разделение на мембранах см. «Хванг С.-Т., Каммермайер К. Мембранные процессы разделения. М.: Химия, 1981» или «Шапошник В.А. Мембранная электрохимия // Соросовский Образовательный Журнал. 1999. №2. С.71-77»; сепарацию с помощью сорбентов «Zolotov Yu.A., Kuz'min N.M. Preconcentraion in Inorganic Analysis. Amsterdam: Elsevier, 1990»; вымораживание «Пап Л. Концентрирование вымораживанием, М., 1982».
Недостатками всех известных способов выделения является высокая энергоемкость и необходимость относительно частой замены или восстановления исходных свойств функциональных элементов - мембран или твердых сорбентов.
В настоящее время основными направлениями исследований в области получения органических растворителей и биотоплива в Великобритании, США, Германии, Китае и Японии являются конструирование новых штаммов ацетонобутиловых бактерий методами генетической инженерии и разработка новых технологических приемов выделения конечных целевых продуктов.
Усовершенствования известных отечественных технологий в ацетоно-бутиловом производстве касаются, как правило, создания новых штаммов, обеспечивающих повышение выхода целевых продуктов, главным образом, бутанола, как наиболее ценного из них.
Наиболее близким к предложенному является непрерывный способ получения органических растворителей, в частности ацетон-бутанол-этанола (ABE), включающий подготовку углеводсодержащего сырья, сбраживание его в ферментере на питательной среде с помощью бактерий, продуцирующих бутанол, ацетон и этанол, отгонку органических растворителей и газов, образующихся в процессе сбраживания, и подпитку растворами углеводов и минеральных солей (US 2005089979, 2005-04-28).
Все вышеописанные способы, и последний в том числе, обладают недостатками, присущими известным процессам выделения целевых продуктов - высокой энергоемкостью и необходимостью восстановления исходных свойств - мембран или твердых сорбентов, а, кроме того, характеризуются невысоким выходом целевых продуктов, в частности бутанола. Ни в одном из известных источников не описана возможность изменения соотношения долевого выхода органических растворителей (ацетон-бутанол-этанола) с целью повышения выхода бутанола, как наиболее ценного из них, хотя известным является тот факт, что в незначительной степени изменить соотношение долевого выхода органических растворителей можно, используя для культивирования разные питательные среды. Возможно также конструирование новых штаммов ацетонобутиловых бактерий методами генетической инженерии.
Технической задачей настоящего изобретения является повышение выхода бутанола за счет создания оптимальных условий для биосинтеза растворителей при одновременном снижении энергопотребления на стадии выделения бутанола.
Для решения этой задачи предложен способ получения органических растворителей, включающий подготовку углеводсодержащего сырья, сбраживание его в ферментере на питательной среде с помощью бактерий, продуцирующих бутанол, ацетон и этанол, отгонку органических растворителей и газов, образующихся в процессе сбраживания, и подпитку растворами углеводов и минеральных солей, в котором процесс биосинтеза ведут с периодическим понижением давления в ферментере во время сбраживания углеводсодержащего сырья и одновременной отгонкой органических растворителей и газов, образующихся в процессе сбраживания.
2
Понижение давления начинают при достижении концентрации органических растворителей ферментере, приближающейся к токсическим для продуцирующей культуры, оптимально - по достижению концентрации бутанола в культуральной среде - 8-9 г/л и продолжают до достижения уровня концентрации бутанола в культуральной среде - 5-2 г/л, при этом давление в ферментере во время отгонки составляет 0,90-0,94 кг/см.
В качестве бактерии, продуцирующей бутанол, ацетон и этанол, предпочтительно использовать бактерию вида Clostridium acetobutylicum, хотя могут быть использованы и другие, например Clostridium beijerinckii.
Известны способы получения этилового спирта, в которых процесс биосинтеза ведут непрерывно одновременно с отгонкой образующихся вводно-спиртовых паров и углекислого газа при пониженном давлении. РФ 2230788, 2001 г., евразийский патент 000876, от 1999 г.
Однако авторам неизвестны источники информации, которые описывали бы использование данного приема при производстве бутанола, возможно потому, что температура кипения бутанола значительно выше (117°С), чем температура кипения этанола (76°С) и воды.
Многочисленные исследования, проводимые авторами, показали, что, если в процессе биосинтеза органических растворителей осуществлять периодическое понижение давления и отводить при этом газы, образующиеся в процессе сбраживания, то изменение концентраций образующихся органических растворителей носит квазициклический характер, т.е. процесс протекает квазициклически.
Термин квазициклический (квази … от лат. quasi - нечто вроде, как будто, как бы, составная часть сложных слов, соответствующая по значению словам: "якобы", "мнимый", "ложный". Большая Советская Энциклопедия) был использован авторами в связи с тем, что вообще-то процесс биосинтеза может быть осуществлен непрерывно и может продолжаться практически сколь угодно долго.
Во время исследований авторами было неожиданно обнаружено, что в период понижения давления синтез растворителей резко усиливается. Возможным объяснением этого является действие переменного давления на биологические системы, что влечет за собой изменение микроокружения клеточных мембран, приводящее к нарушению процессов переноса веществ через мембраны, изменению скоростей ферментативных процессов в клетке, возникновению и развитию репаративных реакций, сопровождаемых новыми синтезами (Акопян В.Б., Коржевенко Г.Н, Шангин-Березовский Г.Н.. Скрытый резерв роста и развития живых систем. Вестник сельскохозяйственной науки, 1988, №4, (380), с.96-105).
Исследования также показали, что концентрация сахаров в процессе понижения давления практически не меняется, а в промежутках снижается. Можно предположить, что в промежутках между понижениями давления происходит накопление в культуре кислот-предшественников (масляной и уксусной). Затем, в процессе понижения давления, происходит усиленная переработка кислот-предшественников в растворители. Это может быть связано в первую очередь с перераспределением части культуры из кислотопродуцирующей морфологии в продуценты растворителей. Важно отметить, что соотношение образующихся растворителей, зафиксированное во время понижения давления (наибольший выход бутанола), сохраняется таковым и в течение последующих 20 часов после предыдущего понижения давления, а это значит, что усиление процесса биосинтеза растворителей во время понижения давления не прекращается и после его нормализации.
2
2
Чтобы обеспечить протекание процесса вышеописанным способом, при повышении в культуральной среде концентрации органических растворителей (в основном, бутанола) до величин, приближающихся к токсическим для продуцирующей культуры, давление в ферментере над поверхностью жидкости, понижают до уровня, обеспечивающего испарение органических растворителей из жидкой среды, удаление и конденсирование их паров. При создании отрицательного, относительно атмосферного, давления над поверхностью жидкой среды в ферментере, давление паров растворителей над поверхностью падает, а скорость испарение с поверхности жидкой среды ускоряется пропорционально степени понижения давления. Следовательно, удаление паров растворителей и газообразных метаболитов из пространства над поверхностью жидкой среды приводит к ускорению их эвакуации из объема. Дополнительная интенсификации процесса эвакуации обусловлена многочисленными пузырьками газа (СО, H), образующимися в процессе биосинтеза, всплывающими к поверхности, что существенно увеличивает площадь границы раздела жидкость/газ, на которой за счет поверхностной сорбции концентрируются молекулы органических растворителей, обладающие высокой поверхностной активностью.
Отобранная газовая среда направляется в холодильное устройство, где растворители конденсируются и перетекают в накопительный объем. Удаление органических растворителей продолжается до тех пор, пока их концентрация (в основном, бутанола) в культуральной жидкости не снизится до значений, не влияющих на процессы биосинтеза, но достаточных для снижения содержания уровня посторонней микрофлоры, т.е. до значений, обеспечивающих безопасность протекания основного процесса.
После этого удаление паров растворителей временно прекращают, и в культуральную среду вводят питательные вещества в количестве, компенсирующем убыль этих веществ, за счет их утилизации продуцирующими микроорганизмами в предыдущий период. Биосинтез продолжается, содержание органических растворителей, в основном, бутанола), в среде возрастает и цикл повторяется. Подпитка необходимыми питательными веществами может быть осуществлена и непрерывно.
Частота повторения циклов зависит от верхнего (при котором начинают снижать давление) и нижнего (при котором прекращают эвакуацию) уровней содержания бутанола в среде, от скорости эвакуации парообразных продуктов, площади испарения.
Варьируя вышеуказанными параметрами, возможно получение целевых продуктов с различными долевыми соотношениями их выходов; можно увеличить выход бутанола до 70-90% по сравнению с 60% - в известных способах.
Площадь испарения может быть увеличена, например, за счет повышения интенсивности «холодного» кипения при пониженном давлении, создания волн на поверхности, разбрызгивания среды специальными устройствами.
Предлагаемый способ получения органических растворителей, преимущественно бутанола, может быть осуществлен следующим образом.
9
-1
В ферментер вносят подготовленную стандартным способом углеводоминеральную смесь (раствор минеральных солей, необходимый набор витаминов и один из следующих источников углерода: глюкозу, маннозу, ксилозу, галактозу, ферментолизат не пищевых полисахаридов растений, содержащий глюкозу, маннозу, ксилозу, арабинозу, отделенных от остатков древесины (лигнина), или лактозу молочной сыворотки, в концентрации 2-4%); затем вносят инокулят бактерий Clostridium acetobutylicum, вар. elyzaveticus с плотностью клеток 1-2 млрд/мл. Через 30 мин после засева начинается интенсивное выделение газов брожения, через 5-6 часов - синтез органических кислот и на 10-12 часах - интенсивный синтез органических растворителей, скорость которого достигает максимума к 28-36 часу. В это время концентрация клеток бактерий в ферментере также максимальна - 3·10 кл/мл суспензии. В это же время начинают понижение давления в ферментере для удаления растворителей из культуральной среды до уровня 5-2 г/л и одновременную подачу в ферментер раствора углеводов и минеральных солей, поддерживая концентрацию углеводов в ферментере в пределах 0,8-1,2%, при этом периодически удаляя растворители из ферментера и часть суспензии, чтобы скорость протока была в пределах 0,025-0,035 час. Процесс продолжается в непрерывном режиме в течение 500 часов, хотя ограничений по времени культивирования и синтезу растворителей практически нет.
Изобретение поясняется примерами, которые не носят ограничивающего характера.
Пример 1. Периодический способ осуществления процесса биосинтеза органических растворителей.
2
В предварительно стерилизованный ферментер с рабочим объемом 3 л вводят 2.5 л 4% раствора глюкозы, 120 г муки, 300 мл инокулята, состоящего из муки (40 г/л), воды и бактерий Clostridium acetobutylicum CK 425, регистрационный номер ВКПМ В-4786 с плотностью 1-2 млрд/мл. Осуществляют ацетон-бутанол-этаноловое брожение при температуре 37°С. Ферментацию продолжают в течение 72 часов. После 72 часов процесс ферментации прекращают, понижают давление в ферментере на 3 часа до значения - 0,94 кг/см и конденсацией отогнанных паров получают в среднем 250 мл раствора, содержащего 5% бутанола, 1,5% ацетона и 0,5% этанола. Продуктивность процесса в среднем - 3 г/л/день.
Пример 2. Способ осуществления процесса биосинтеза органических растворителей в соответствии с настоящим изобретением.
В предварительно стерилизованный ферментер с рабочим объемом 3 л вводят 2.5 л 4% раствора глюкозы, добавляют 120 г муки, 300 мл инокулята, состоящего из муки (40 г/л), воды и бактерий Clostridium acetobutylicum, регистрационный номер ВКМ В-1787 с плотностью 1-2 млрд/мл. Осуществляют непрерывное ацетон-бутанол-этаноловое брожение при температуре 37°С. Продолжительность процесса не менее недели. При концентрации бутанола в среде 9 г/л снижают давление в ферментере на 3 часа до - 0,92 кг/см. Конденсацией отогнанных паров получают в среднем 250 мл раствора, содержащего 6,5% бутанола, 2% ацетона и 0,75% этанола (соотношение растворителей 70:21:9). Как только концентрация бутанола в среде достигает 2 г/л, давление в ферментере повышают до атмосферного. Процедуру снижения давления повторяют каждый раз при достижении концентрации бутанола в 9 г/л. После удаления бутанола и сопутствующих газов вводят в ферментер питательную среду, с содержанием 50 г глюкозы. Раз в три дня в питательную среду добавляют 28 г дрожжевого автолизата. Продуктивность процесса в среднем 8,5 г/л/ день.
Пример 3. Способ осуществления процесса биосинтеза органических растворителей в соответствии с настоящим изобретением.
2
В предварительно стерилизованный ферментер с рабочим объемом 3 л вводят 2.5 л 4% раствора глюкозы, добавляют 120 г муки, 300 мл инокулята, состоящего из муки (40 г/л), воды и бактерий Clostridium beijerinckii, регистрационный номер КМ МГУ №101 с плотностью 1-2 млрд/мл. Осуществляют ацетон-бутанол-этаноловое брожение при температуре 37°С. Продолжительность процесса не менее недели. Продуктивность процесса в среднем 4 г/л/день. При концентрации бутанола в среде 9 г/л снижают давление в ферментере на 0,5 часа до - 0,94 кг/см. Конденсацией отогнанных паров получают 50-60 мл раствора, который расслаивается при выдерживании. При этом верхний слой (5-10 мл) содержит 70-75% бутанола, 2-4% ацетона и 0,1-1% этанола. Нижний слой содержит 5-7% бутанола, 0,5-1,5% ацетона и 0,1-1% этанола. Поскольку растворимость бутанола в жидкости 6,7%, это дает возможность отделить верхний слой 75-80% бутанола от воды простой декантацией, что позволяет в дальнейшем исключить дорогостоящие операции выделения целевого продукта и значительно снизить энергозатраты. Как только концентрация бутанола в среде достигает 5 г/л, давление в ферментере повышают до атмосферного. Процедуру снижения давления повторяют каждый раз при достижении концентрации бутанола в ферментере 9 г/л. После эвакуации бутанола при низком давлении в ферментер вводят питательную среду, содержащую 50 г глюкозы. Раз в три дня в питательную среду добавляют 28 г дрожжевого автолизата. Продуктивность процесса в среднем 10 г/л/день.
На представленных чертежах, на фиг.1 и 2 показан график зависимости выхода целевых продуктов и характера процесса от времени ферментации. Фиг.1 иллюстрирует стандартный процесс биосинтеза, фиг.2 - предложенный способ.
Таким образом, предлагаемый процесс биосинтеза позволяет совмещать процессы брожения и одновременной отгонки органических растворителей из ферментера при сохранении жизнеспособности и бродильной активности клеток продуцирующей бактерии.
Преимуществом предложенного технического решения является повышение выхода бутанола за счет создания оптимальных условий для процесса биосинтеза при одновременном снижении энергопотребления на стадии выделения.
Из анализа полученных данных следует, что процесс биосинтеза в данном случае протекает квазициклически, что достигается за счет периодического понижения давления в ферментере во время сбраживания углеводсодержащего сырья и одновременной отгонки органических растворителей и газов, образующихся в процессе сбраживания. Такой процесс оказывается лишенным недостатков как непрерывного, так и периодического процессов.