Субстратный способ определения суммарной ферментативной активности дрожжей

УДК 543.068.8; 663.12

А. П. Асташкина, А. Ю. Яговкин, А. А. Бакибаев

СУБСТРАТНЫЙ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУММАРНОЙ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ ДРОЖЖЕЙ

Ключевые слова: субстрат, ферментативная кинетика, ферментативная активность, дрожжевые клетки S. cerevisiae, кондуктометрический метод, substratum, enzyme kinetics, fermentation activity, S. cerevisiae, conductivity method.

Предложен экспрессный метод определения суммарной ферментативной активности (СФА) дрожжевых клеток, основанный на изменении электропроводности культуральной среды дрожжевых клеток после внесения субстратов углеводного типа и определении константы скорости реакции линейной зависимости между скоростью изменения электропроводности и количеством клеток. Подготовка образца и измерение занимают не более 20 мин. Исследовано влияние концентрации клеток (106-109 Кл./мл), температуры (4-350С), природы субстратов (глюкоза, фруктоза, лактоза, сахароза) на скорость ферментативной реакции. Показана возможность применения метода для оценки уровня суммарной ферментативной активности дрожжевых клеток в процессе старения. Совокупность СФА по различным субстратам является идентификационной характеристикой анализируемой культуры. Метод представляет собой ценность для анализа активности дрожжевых клеток и их ферментов в пищевой промышленности и биотехнологии. An express method for determining the total fermentation activity of yeast cells based on the change conductivity of cultural medium of yeast cells after addition substratum of sugar species and determining the fermentation reaction rate constant is proposed. A linear relationship between the initial rate offermentation reaction and the concentration of yeasts is pointed out. The sample preparation and measurement itself does not take more than 20 min. The influence of temperature (4-350С), number of microorganisms (106-109 yeasts/ml) and sensitive to sugar species (sucrose, lactose, fructose, lactose) on the reaction rate has been measured. The applicability of the assessment method of the total fermentation activity of cell yeast's to monitor the death process of cell yeast's was demonstrated. Whole the total fermentation activity of cell yeast's to different substratum's is identification description of investigated microorganisms. This method is of special value for food industry and biotechnology, analyzing activity of cell yeast's.

Дрожжи, вероятно, одни из наиболее древних «домашних организмов». Виноделие, пивоварение и хлебопечение существуют уже несколько тысячелетий. Естественно, что за это время были отселекционированы сотни видов заквасок, которые в настоящее время используются при приготовлении пива, кваса, традиционных русских напитков, в косметологии, фармации и научных исследованиях [1-3].

При современном производстве пива и выпечки большое значение придаётся качеству продукта, полупродукта, вследствие чего требуется обеспечение стабильности процессов брожения. Получение качественного продукта возможно только при строгом контроле в биотехнологическом процессе активности дрожжей. Стабильность процессов брожения возможна при использовании чистых и здоровых дрожжевых клеток с высоким уровнем жизнеспособности, то есть способных начать процесс брожения с минимальной задержкой на привыкание (короткая лаг-фаза) [4]. Из большого количества методов определения жизнеспособности дрожжевых клеток на практике обычно применяется сравнительно ненадежный, но быстрый и простой метод окрашивания метиленовым синим [5]. В

стандартизации бродильного процесса используются физиологические тесты определения бродильной способности: по измерению расхода растворенного кислорода, концентрации выделившегося углекислого газа, концентрации ионов Mg2+. Основным недостатком этих методов является то, что они позволяют только косвенно оценить активность ферментативных комплексов дрожжевых клеток в процессе брожения.

В этой связи разработка новых, более совершенных вариантов определения ферментативной активности дрожжевых клеток является актуальной.

В ряде известных публикаций показано, что дрожжевые клетки активно вовлекают углеводы питательной среды и подвергают их ферментативному расщеплению [1,6-8]. Скорость сбраживания различных углеводов дрожжевыми клетками существенно различается [8]. Так, при внесении в анализируемую культуральную среду субстрата (моно- или дисахарида), который легко поглощается дрожжевыми клетками и претерпевает ферментативное расщепление, происходит активизация различных биохимических превращений и электропроводность культуральной среды изменяется за счет образования электрохимически активных веществ [9]. Электрические свойства субстратов и продуктов метаболизма, таким образом, отличаются, следовательно, суммарные электрические характеристики анализируемой культуральной среды изменяются. Это явление привело нас к идее разработать способ оценки суммарной ферментативной активности дрожжевых клеток по отношению к вносимому субстрату.

Мы пришли к выводу, что быстрое (в течение нескольких минут) определение суммарной ферментативной активности дрожжевых клеток по интенсивности биохимического превращения может быть осуществлено электрохимическим методом.

Цель работы - разработка метода определения суммарной ферментативной активности дрожжевых клеток на основании результатов исследования изменения электропроводности культуральной среды после внесения субстратов углеводного типа.

Экспериментальная часть

Приборы. Электрохимические измерения были выполнены на кондуктометрическом анализаторе со следующими характеристиками: частота источника напряжения 20 кГц, источник напряжения 0,2 В. Электрохимическая ячейка представляла собой стаканчик, объёмом 50 см3, закрываемый крышкой с 3 отверстиями. В отверстия крышки вставлены кондукметрический датчик и термодатчик. Через третье отверстие вносили раствор субстрата в анализируемую пробу.

Для контроля изменения концентрации дрожжевых клеток во время измерения электропроводности культуральной среды использовали методы окрашивания метиленовым синим. Для подсчета количества дрожжевых клеток использовали счётную камеру Горяева. Микроскопический анализ проводили на бинокулярном микроскопе МС 100 (S) производства фирмы «Micros Handelsgesellschaft m.b.H.» Австрия.

Среда и микроорганизмы. Для экспериментов использовали расы пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae в прессованном виде (ТУ 9182-018-00353572-2005), сухом виде (ТУ 9182001-48975583-2000) и низовые пивные дрожжи расы Saccharomyces carlsbergensis. Культуру пивных дрожжей хранили в пробирках на скошенной агаризированой среде при 4 0С. Чистую культуру пивных дрожжей выращивали анаэробно при 10 0С в пивном сусле в течение 8 дней. Для исследований использовали 40-48 часовую культуру пивных дрожжей в логарифмической фазе роста. На 40 мл дистиллированной воды вносили 2 мл инокулята.

Для экспериментов пекарские дрожжи разводили в дистиллированной воде в соотношении 1:20 массовых частей (прессованные дрожжи), 1:110 массовых частей (сухие дрожжи).

В качестве субстратов были выбраны следующие углеводы: глюкоза, фруктоза, сахароза, лактоза. В основе сбраживания сахаров лежит механизм гликолиза, исходным соединением для которого является глюкоза. Для сбраживания других сахаров они сначала должны быть превращены в глюкозу. Исходя из этого, мы исследовали влияние нескольких субстратов, но более подробно глюкозы, на суммарную ферментативную активность дрожжевых клеток при добавлении

субстрата к образцу в ходе кондуктометрического анализа. Поскольку концентрация субстрата влияет на скорость ферментативной реакции [10], то для поддержания постоянной концентрации готовили насыщенные растворы субстратов. Для приготовления насыщенных растворов каждого из субстратов в 100 мл дистиллированной воды растворяли (г): d-лактозы -52,6; d-глюкозы -82; фруктозы -63,6; сахарозы -179.

Перед началом работы определили константу ячейки с использованием насыщенного раствора кальция сернокислого: К=90 1/м при Т = 200 С. Далее образец объемом 40 мл вносили в электрохимическую ячейку и закрывали крышкой. Измерения проводили с включенной магнитной мешалкой (400 об/мин). Значение электропроводности во времени фиксировали через каждые 30 с в течение 600 с. Причем, в первые 300 с в ячейку не вносили субстрат для установления стационарного состояния в культуральной среде, затем вносили 2 мл насыщенного раствора субстрата и продолжали измерение еще 300 с. Исследования проводили при комнатной температуре. Суммарную ферментативную активность (СФА) дрожжевых клеток определяли по формуле: СФА = tg а / Скл,

где tg а - значение тангенса угла наклона линейного участка временной зависимости удельной проводимости после внесения субстрата, мСм/м-с; Скл — концентрация клеток, Кл/мл.

Результаты и их обсуждение

Определение суммарной ферментативной активности клеток

Обычно об активности судят по скорости протекания ферментативных реакций, сопровождающихся поглощением субстрата и выделением метаболита. Ход ферментативной реакции, как правило, не описывается обычными уравнениями для гомогенных химических реакций из-за влияния различных факторов. Поэтому рекомендуется определять активность, по возможности, на основе измерений начальной скорости реакции под влиянием изменения только одного фактора, то есть исследуют только начальный участок хода кривой и определяют его тангенс угла наклона [11].

Известно, что в качестве меры ферментативной активности чаще всего приводят константу скорости реакции [11]. Скорость протекания ферментативной реакции в рассматриваемых нами процессах зависит от концентрации субстрата (Cs) и клеток (Скл.) при постоянной температуре:

V = k-Cs-Скл.

В рассматриваемом случае (рис.1) при постоянной концентрации субстрата скорость реакции можно описать уравнением псевдопервого порядка:

V = к-Скл. ~ d^/dt = tg а = const.

Изменение концентраций всех участвующих в ферментативных процессах субстратов и метаболитов влияет, в конечном счете, на электропроводность анализируемой среды, причем линейно, согласно уравнению 2. Таким образом, суммарная скорость ферментативных реакций пропорциональна скорости изменения проводимости среды d^/dt и постоянна при определенной концентрации клеток и температуре.

В условиях проведённого эксперимента концентрация клеток остается постоянной, а, следовательно, и значение скорости реакции будет определяться как тангенс угла наклона линейного участка (от 400 до 800 с, рис.1) временной зависимости электропроводности.

Показано, что при проведении параллельно «холостых» опытов (без добавления субстрата) тангенс угла наклона имеет нулевое значение (рис. 1).

В экспоненциальной фазе и в начале стационарной фазы удельная метаболическая активность клеток практически остается постоянной [12]. Мы нашли, что скорость изменения проводимости в культуральной среде действительно линейно пропорциональна концентрации клеток в соответствии с уравнением 2 (рис. 2-3). Таким образом, тангенс угла наклона линейного участка этих зависимостей предлагаем рассматривать в качестве меры общей ферментативной активности анализируемых объектов.

Однако, зависимость скорости изменения регистрируемой электропроводности от времени возрастает с увеличением концентрации клеток и достигает предела. Это объясняется недостаточно большой концентрацией субстрата, скорость реакции начинает зависеть от его концентрации и начинает описываться уравнением 1._

О

24 23 22 21 20

19

и д

о в о

^ 18

17 16 15

у = -0,0002х + 22,761

0

200

400

600

800

Время, с

1000

Рис. 1 - Кривая изменения электропроводности культуральной среды дрожжевых клеток (сухие дрожжи) от времени до и после внесения глюкозы:  - холостая проба (без внесения субстрата);  - с внесением субстрата

Рис. 2 - Зависимость скорости изменения проводимости культуральной среды пекарских прессованных (); сухих () и пивных (•) дрожжей от концентрации клеток в

суспензии после внесения глюкозы при 18 С

Рис. 3 - Гистограмма значений СФА О^Р) различных культур дрожжей по различным субстратам при 200С: Ш - пивные дрожжи; ОН - пекарские сухие дрожжи; Ш -пекарские прессованные дрожжи

При объёме 40 мл возможно обнаружение 5х106Кл./мл при внесении 2 мл субстрата. Увеличение объёма суспензии до 5-10 мл в 40 мл образца позволяет определить 2х10 Кл./мл. Очевидно, что может быть достигнут более низкий уровень детекции при наличии образца соответствующего объёма и конфигурации кондуктометрического датчика. Кроме того, имеется дополнительный резерв для увеличения предела детекции путём увеличения концентрации вносимого субстрата.

Ферментативная природа процесса подтверждается тем, что после автолиза дрожжевых клеток в исследуемых условиях отсутствует значимое изменение проводимости исследуемого образца с внесённым субстратом. Это объясняется разрушением ферментных комплексов, ответственных за расщепление углеводов.

Известно, что скорость утилизации клетками субстрата зависит от биохимических свойств культуры и природы субстратов. Было показано выше, что суммарная ферментативная активность исследуемых культур после внесения одного и того же субстрата различается. Более того, как видно на рис.3, при использовании различных субстратов суммарная ферментативная активность дрожжей отличается. Таким образом, данный метод может быть использован для биохимической идентификации различных видов дрожжевых клеток.

Исследование влияния температуры на активность дрожжевых клеток

Известно, что температура оказывает влияние на константы ферментативных реакций. Поэтому температурные условия оказываются одним из важнейших факторов, влияющих на интенсивность обменных процессов. В работе проводили исследования по влиянию температуры на проводимость раствора дрожжей в диапазоне от 40С до 350С.

Зависимость скорости протекания ферментативных процессов в культуральной среде от температуры имеет характер кривой с максимумом (рис. 4).

Рис. 4 - Зависимость СФА О^Р) культуральной среды дрожжевых клеток после внесения глюкозы от температуры:  - прессованные пекарские дрожжи;  - пивные дрожжи; - - сухие пекарские дрожжи

Различие в суммарной ферментативной активности исследованных культур обусловлено биохимическими особенностями штаммов дрожжей. При повышении температуры раствора с 250С линейной зависимости электропроводности культуральной среды от времени при внесении субстрата не наблюдается. Причиной этого является протекание бурного пенообразования и других процессов, сопутствующих брожению дрожжей. Из полученных экспериментальных данных можно сделать вывод, что у каждой культуры есть свой температурный диапазон, характеризующийся максимальной скоростью утилизации субстрата дрожжевыми клетками: для пекарских сухих - 14-150С, прессованных - 180С, пивных -13-140С.

Исследование влияния процесса старения дрожжей на активность

дрожжевых клеток

Процесс старения дрожжевых клеток определяли по сопротивляемости к голоданию. По мере старения процент мертвых клеток прогрессивно увеличивается и, следовательно, количество жизнеспособных клеток и их активность уменьшаться. Для экспериментов использовали пекарские прессованные дрожжи. Культуру хранили при комнатной температуре в течение 25 дней. Суммарную ферментативную активность дрожжей измеряли каждый день в вышеописанных условиях по глюкозе. На рис. 5-6 представлены значения суммарной ферментативной активности дрожжевых клеток и доля мертвых клеток по дням.

Полученные результаты позволяют сделать вывод, что процесс старения приводит к снижению жизнеспособности клеток и уменьшению СФА. Кроме того, следует заметить, что на 13 сутки хранения дрожжей значение скорости ферментативных реакций резко уменьшается, а содержание мертвых клеток увеличивается. Полученные данные объясняют требования ГОСТ 171-81: срок хранения прессованных хлебопекарных дрожжей 12 дней.

Рис. 5 - Зависимость изменения суммарной ферментативной активности пекарских прессованных дрожжей после внесения глюкозы от доли мёртвых клеток при старении

Рис. 6 - Зависимость изменения суммарной ферментативной активности пекарских прессованных дрожжей после внесения глюкозы при старении

Таким образом, предложен экспрессный метод, позволяющий определить суммарную ферментативную активность (СФА) дрожжевых клеток. Метод основан на кондукто-метрическом определении суммарной константы скорости ферментативных реакций в условиях избытка субстрата. Метод позволяет получить информацию о количестве клеток с использованием независимого метода и осуществлять мониторинг уровня ферментативной активности в процессе старения. Совокупность СФА по различным субстратам является

идентификационной характеристикой анализируемой культуры. Метод представляет собой ценность для пищевой промышленности и биотехнологии. С помощью предложенного метода можно контролировать биотехнологические процессы при приготовлении продуктов или полупродуктов. В целом метод более эффективен в сочетании с другими.

Литература

1. Бабьева, И.П. Биология дрожжей / И.П. Бабьева, И.Ю.Чернов. - М.: Товарищество научных изданий КМК, 2004. - 456 с.

2. Barnett, А. Beginnings of microbiology and biochemistry: the contribution of yeast research / А. Barnett, A. James // Microbiology. - 2003. - Vol. 149. - P. 557-567.

3. Balasubramanian, M. Comparative analysis of cytokinesis in budding yeast, fission yeast and animal cells / M. Balasubramanian, E. Bi, M. Glotzer // Curr. Biol. - 2004. - Vol. 14. - № 18. - P. 806-818.

4. Материалы II Международной научно-практической конференции «Разработка, производство, продвижение и продажа вин, алкогольных и пивобезалкогольных напитков». - М.: Ивент маркетинг, 2003. - С. 50.

5. Бродильные производства. Т. 1/ Под ред. Г.И.Фертмана.- М.: Пищепромиздат, 1959. - 450 с.

6. Biodiversity and ecophysiology of yeasts. - Berlin: Springer, 2006. - P. 579.

7. Физиологическая регуляция метаболизма дрожжей/ Под ред. М.В Залашко. - Менск: Навука i тэхшка, 1991. 332 с.

8. Коновалов, С.А. Биохимия дрожжей / С.А. Коновалов. - М.: Пищевая промышленностьсть, 1980. - 270 с.

9. Биотехнология / Под ред. акад. РАСХН Е.С.Воронина. - СПб.: ГИОРД, 2005. - 792 с.

10. Мосс, Д. Ферменты / Д. Мосс. - М.: Мир, 1970. - С. 34-35.

11. Диксон, М. Ферменты. Т. 1 / М. Диксон, Э. Уэбб. - М.: Мир, 1982. - 392 с.

12. Kuznetsov, B.A. et al.// Bioelectrochemistry. - 2004. - Vol. 64. - № 6. - P. 125-131.

© А. П. Асташкина - асп. каф. физической и аналитической химии Томского политехнического университета; А. Ю. Яговкин - канд. хим. наук, руководитель ООО «Сибвар» (г. Томск); А. А. Бакибаев - д-р хим. наук, проф., зав. каф. физической и аналитической химии Томского политехнического университета.