ТЕРМОСТАБИЛЬНЫЕ КОМПЛЕКСЫ АКТИВАЗЫ RUBISCO
THERMOSTABLE RUBISCO ACTIVASE COMPLEXES

Область техники, к которой относится настоящее изобретение
Настоящее изобретение относится к термостабильным комплексам, содержащим активазу Rubisco. В частности, настоящее изобретение относится к термостабильным комплексам, содержащим активазу Rubisco и рибулозо-1,5-бифосфаткарбоксилазу/оксигеназу, и их применениям в отношении термостойких растений.
Уровень техники
2
В процессе фотосинтеза растения создают биомассу путем превращения неорганического углерода в форме CO в углеводы с использованием энергии света. Следовательно, для повышения продуктивности сельскохозяйственных культур целью является повышение эффективности фотосинтеза посредством традиционных селекционных методов и трансгенных подходов.
2
2
2
2
2
Рибулозо-1,5-бифосфаткарбоксилаза/оксигеназа (Rubisco) катализирует включение (фиксацию) CO в рибулозо-1,5-бифосфат с образованием двух молекул 3-фосфоглицерата. Rubisco может присутствовать либо в активном, либо в неактивном состоянии, и для фиксации CO необходим ее переход из неактивного состояния в активное состояние с помощью активазы rubisco. Этот процесс влечет за собой карбамилирование конкретного остатка лизина в Rubisco. При прикреплении рибулозо-1,5-бифосфата из стромы к Rubisco, он вызывает конформационные изменения, что позволяет ферменту катализировать реакцию CO с новосеквестрированным сахаросодержащим бифосфатом и начать каталитический цикл. Тем не менее, при отсутствии активазы Rubisco (RCA), жесткое связывание рибулозо-1,5-бифосфата с некарбамилированной Rubisco инактивирует Rubisco, в результате чего снижается скорость фиксации CO. RCA отсоединяет рибулозо-1,5-бифосфат от декарбамилированных активных центров и таким образом способствует получению доступа CO для карбамилирования (активации) фермента. То есть активация Rubisco усиливает его каталитическую способность и таким образом способствует прохождению фотосинтеза.
RCA обычно присутствует в двух формах, называемых альфа (длинная форма) и бета (короткая форма), причем последняя представляет собой укороченную форму альфа-белка.
Фотосинтез снижается, если температура превышает оптимальный диапазон для конкретного растения, а снижение фотосинтеза при повышенных температурах связано с дезактивацией Rubisco в результате ингибирования RCA.
В основе настоящего изобретения лежит обнаружение того факта, что комплексы, содержащие RCA из Oryza australiensis и Rubisco, активны при повышенных температурах.
Сущность изобретения
Авторами настоящего изобретения было обнаружено, что активаза Rubisco (RCA) из Oryza australiensis придает термостабильность комплексу RCA с эндогенной рибулозо-1,5-бифосфаткарбоксилазой/оксигеназой (Rubisco). Также было обнаружено, что выделенная RCA из Oryza australiensis придает термостабильность комплексу, образованному с Rubisco из других растений. Следовательно, выделенную RCA из Oryza australiensis можно применять для повышения термостойкости у растения.
В соответствии с первым аспектом, настоящее изобретение относится к комплексу, содержащему RCA из Oryza australiensis, или ее функциональные варианты, и Rubisco, которая не происходит из О. australiensis, причем RCA придает комплексу термостабильность.
RCA может содержать по меньшей мере одну из SEQ ID NO: 2-37, 39 или 40.
В соответствии со вторым аспектом, настоящее изобретение относится к RCA из Oryza australiensis, и ее функциональным вариантам, которая может образовывать комплекс с Rubisco из растения, отличного от О. australiensis, и придавать комплексу термостабильность.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, RCA содержит по меньшей мере одну из SEQ ID NO: 2-37, 39 или 40. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, RCA имеет последовательность, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентична SEQ ID NO: 39 или 40.
В соответствии с третьим аспектом, настоящее изобретение относится к выделенной нуклеиновой кислоте, кодирующей термостабильную RCA по второму аспекту настоящего изобретения.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая термостабильную RCA, содержит по меньшей мере одну из SEQ ID NO: 41, 42, 50, 51 и 52. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, выделенная нуклеиновая кислота имеет последовательность, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентична SEQ ID NO: 41, 42, 50, 51 и 52.
В соответствии с одним вариантом осуществления, выделенная нуклеиновая кислота содержит SEQ ID NO: 51.
В соответствии с четвертым аспектом, настоящее изобретение относится к химерному гену или вектору, содержащему нуклеиновую кислоту по третьему аспекту настоящего изобретения.
Нуклеиновая кислота функционально связана с промотором, обычно с экспрессируемым у растения промотором. Промотор может представлять собой индуцируемый теплом промотор, промотор зеленой ткани или химически индуцируемый промотор.
В соответствии с пятым аспектом, настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, содержащей комплекс по первому аспекту настоящего изобретения, RCA по второму аспекту настоящего изобретения, нуклеиновую кислоту по третьему аспекту настоящего изобретения или вектор по четвертому аспекту настоящего изобретения.
В соответствии с одним вариантом осуществления, клетка-хозяин представляет собой растительную клетку. В соответствии с одним вариантом осуществления, растительная клетка представляет собой клетку риса.
В соответствии с шестым аспектом, настоящее изобретение относится к термостабильному комплексу по первому аспекту настоящего изобретения у вида растения, отличного от О. australiensis, для повышения термостойкости у растения.
В соответствии с одним вариантом осуществления, вид растения относится к роду Oryza. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, растение или растительная клетка не относится к О. australiensis.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, растения выбраны из ячменя, маиса, томата, картофеля, риса, сои, хлопчатника, подсолнечника, люцерны, салата, канолы (масличного рапса), сорго и пшеницы.
В соответствии с одним вариантом осуществления, растение представляет собой рис. В соответствии с другим вариантом осуществления, растение представляет собой пшеницу.
В соответствии с седьмым аспектом, настоящее изобретение относится к способу повышения термостойкости у растений путем экспрессии RCA по второму аспекту настоящего изобретения у растения.
Способ может дополнительно предусматривать введение в растение нуклеиновой кислоты по третьему аспекту настоящего изобретения или химерного генома или вектора по четвертому аспекту настоящего изобретения.
В соответствии с одним вариантом осуществления, растение способно фиксировать диоксид углерода в условиях теплового стресса.
В соответствии с одним вариантом осуществления, RCA экспрессируется в одной или нескольких пластидах растения.
В соответствии с другим вариантом осуществления, экспрессия RCA приводит в результате к увеличению скорости фотосинтеза у растения в условиях теплового стресса.
В соответствии с восьмым аспектом, настоящее изобретение относится к применению комплекса, содержащего активазу Rubisco (RCA) из Oryza australiensis и Rubisco из растения, отличного от О. australiensis, для придания комплексу растения термостабильности с помощью RCA.
По всему настоящему описанию, если контекст не требует иного, слово «содержать» или варианты, такие как «содержит» или «содержащий», будут понимать как подразумевающее включение указанного элемента, целого числа или стадии или группы элементов, целых чисел или стадий, но не исключение любого другого элемента, целого числа или стадии или группы элементов, целых чисел или стадий.
Любое рассмотрение документов, актов, материалов, устройств, изделий и т.п., которое было включено в настоящее описание, предназначено исключительно для обеспечения контекста для настоящего изобретения. Не следует считать, что эти предметы частично или полностью формируют часть уровня техники или являются общедоступными сведениями в области, к которой относится настоящее изобретение, поскольку они существовали до даты приоритета каждого пункта формулы по настоящему описанию.
Некоторые виды Oryza указаны в настоящем документе с помощью приписки су. Су или CY, которая обозначает Кейп-Йорк, Австралия, который является источником происхождения экземпляра. Аналогичным образом, другие виды Oryza указаны с использованием приписки kr или KR, которая относится к Кип Ривер, Австралия, который является источником происхождения экземпляра.
Для того, чтобы настоящее изобретение могло быть более понятным, будут описаны варианты осуществления с привязкой к приведенным далее чертежам и примерам.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1. Влияние высокой температуры на скорость удлинения листьев (LER) у генотипов риса. Показатели скорости удлинения измеряли в течение 12-часового периода для О. sativa cv. Doongara (закрашенные круги), О. meridionalis-CY (закрашенные квадраты) и О. meridionalis-KR (незакрашенные квадраты) и О. australiensis (закрашенные треугольники). Значения выражены в процентах от скорости удлинения листьев (LER) О. sativa cv. Amaroo, измеренном за одинаковый период. Через 4 часа при 28°С температуру повышали до 45°С, поддерживали в течение 4 ч, а затем уменьшали до 28°С, как указано с помощью заштрихованной (45°С) области. Измерения длины листа начинали за 1 час до начала и заканчивали в конце 12-часового фотопериода. Сплошная серая линия представляет собой температуру среды камеры. Значения представляют собой среднее из шести экспериментальных повторов. Для ясности были опущены величины ошибки.
Фиг. 2. Скорость удлинения листьев (LER) пяти генотипов риса через 4 часа при 28°С или 45°С. LER измеряли либо при 28°С (закрашенные круги/сплошная линия), либо при 45°С (незакрашенные круги/пунктирная линия) в течение 4-часового периода для О. sativa cv. Amaroo (Os-A) (a); O. sativa cv. Doongara (Os-D) (b); O. meridionalis-CY (Om-CY) (c); O. meridionalis-KR (Om-KR) (d); и О. australiensis (e). В секции f, LER при 45°С всех пяти генотипов изображены вместе в виде графика. Значения представляют собой средние ± SE (n=6).
n
Фиг. 3. Влияние повышенной температуры на газообмен у пяти генотипов риса, которые показаны на фиг. 1. Результирующую скорость фотосинтеза (P) измеряли при 28°С (незакрашенные столбцы на диаграмме) или при 45°С (закрашенные столбцы на диаграмме). Растения подвергали воздействию 45°С в течение 2-4 часов перед измерением. Зависимые от температуры различия в параметрах для каждого генотипа определяли с помощью t-критерия для двух выборок. * указывает на значимость при Р<0,05, ** указывает на значимость при Р<0,01 и *** указывает на значимость при Р<0,001. Значения представляют собой средние ± SE трех повторностей в камерах.
2
Фиг. 4. Взаимосвязь между скоростью удлинения листьев (LER) и состоянием активации Rubisco у пяти генотипов риса (О. sativa cvs Amaroo и Doongara; O. meridionalis CY и KR; O. australiensis) при 28°С и 45°С. Средняя LER для каждого генотипа в каждом состоянии роста была нанесена на график относительно соответствующего состояния активации и был проведен линейно-регрессионный анализ (сплошная линия, y=0,033x+1,45, Р=0,0004, r=0,5106).
-1
Фиг. 5. Зависимая от концентрации активация Rubisco с помощью RCA, экстрагированной из листьев из Oryza sativa (Os) (незакрашенные круги) и Oryza australiensis (Оа) (закрашенные квадраты), а также с помощью рекомбинантной RCA из Os (сплошные линии) и Оа (пунктирные линии). Две линии для каждого вида представляют собой альфа- и бета-рекомбинантные изоформы, причем бета-изоформа всегда более активна и, следовательно, представлена верхней линией. Концентрация RCA приведена в массе на объем, мольности и мольном соотношении RCA к Rubisco в анализе. Для всех анализов используемая концентрация Rubisco составляла 1,5 мг.мл (2,7 мкМ). Мольность рассчитывали с использованием молекулярной массы полного комплекса Rubisco (553 кДа) и активного комплекса RCA (220 кДа) по образованию олигомеров (Keown, J. R., et al., (2013). J. Biol. Chem. 288, 20607-20615). Сплошная вертикальная линия и пунктирная вертикальная линия представляют собой ожидаемую концентрацию in vivo RCA соответственно от Os и Оа, с учетом используемой концентрации Rubisco. Все измерения проводили при 30°С.
Фиг. 6. Влияние экстрагированных из листьев белков на термостабильность рекомбинантной Оа бета RCA (активность показана закрашенными квадратами). Значения представляют собой средние ± SE трех экспериментальных повторностей. Незакрашенные квадраты были получены путем вычитания закрашенных синих кругов (экстракт белков из листьев с удалением RCA) из закрашенных треугольников (рекомбинантной Оа бета RCA, инкубированной в экстракте белков из листьев с удаленной RCA).
Фиг. 7. Векторные карты плазмид, содержащих гены RCA, адаптированные к частоте использования кодона у Е.coli, для экспрессии у Е.coli, и нуклеотидная последовательность соответствующих генов RCA. Все гены RCA были клонированы в рЕТ-23d+. (A) rcaIOs-2Pb, содержащий длинную изоформу RCA из Oryza sativa, SEQ ID NO: 46; (В) rcaIOau-2Pb, содержащий длинную изоформу RCA из Oryza australiensis, SEQ ID NO: 47; (С) rcaIIOs-3Pb, содержащий короткую изоформу RCA из Oryza sativa, SEQ ID NO: 48; (D) rcaIIOau-3Pb, содержащий короткую изоформу RCA из Oryza australiensis, SEQ ID NO: 49; (Е) rcaIIOau-2Pb, содержащий длинную форму RCA нуклеиновой кислоты активазы Rubisco из О. australiensis (адаптированную к частоте использования кодона у риса), SEQ ID NO: 50; (F) rcaIIOau-3Pb, содержащий короткую форму RCA нуклеиновой кислоты активазы Rubisco из О. australiensis с 5АА укорочением на конце гена SEQ ID NO: 51; (G) rcaIIOau-3Pb, содержащий короткую форму RCA нуклеиновой кислоты активазы Rubisco из О. australiensis (адаптированную к частоте использования кодона риса) SEQ ID NO: 52.
Фиг. 8. Гидролитическая активность в отношении АТФ у α (секция А) и β (секция В) рекомбинантных изоформ RCA от О. sativa (закрашенные круги/сплошная линия) и О. australiensis (незакрашенные круги/пунктирная линия), рассчитанная с помощью анализа связывания НАДН.
Фиг. 9. (А): Гидролитическая активность в отношении АТФ у α рекомбинантных изоформ RCA от О. sativa (закрашенные круги/сплошная линия) и О. australiensis (незакрашенные круги/пунктирная линия), рассчитанная с помощью анализа высвобождения фосфата. (В): Гидролитическая активность в отношении АТФ у β рекомбинантных изоформ RCA от О. sativa (закрашенные круги/сплошная линия) и О. australiensis (незакрашенные круги/пунктирная линия), рассчитанная с помощью анализа высвобождения фосфата.
Фиг. 10. Гидролитическая активность в отношении АТФ у рекомбинантной RCA О. sativa (Os) или О. australiensis (Oa), определенная с помощью анализа связывания НАДН (незакрашенные круги) или анализа высвобождения фосфата (закрашенные круги), нормализованная соответственно к 28°С и 30°С.Следует отметить, что оба способа дают схожую температурную реакцию гидролиза АТФ, за исключением смещения к более высоким температурам при анализе высвобождения фосфата.
Os
Oa
Фиг. 11. Зависимая от температуры активность активации Rubisco, определяемая с помощью того же анализа, что и на фиг. 13, для экстрагированной из листьев RCA (закрашенные круги/сплошные линии) и экстрагированной из листьев RCA (незакрашенные круги/пунктирные линии). Показатели скорости активации приведены как индивидуальные результаты измерений трех биологических повторов в температурном диапазоне с подобранными квадратичными уравнениями (А), после учета различий в концентрации белка RCA между видами (В) и при нормализации скорректированных по белку значений к значениям, измеренным при 30°С (С).
Фиг. 12. Активность активации Rubisco у рекомбинантной RCA, измеренная либо при 30°С, либо при 36°С. Две изоформы RCA измеряли изолированно или в смеси в соотношении α к β 8:1, 4:1, 2:1, 1:1. Значения представляют собой средние SE трех экспериментальных повторностей.
-1
-1
-1
Фиг. 13. Зависимая от температуры активация Rubisco посредством RCA, экстрагированной из экстрактов листьев Os и Oa (LE) и измеренной в концентрации 0,2 мг.мл для Os и в различных концентрациях, составлявших 0,24, 0,49 или 0,96 мг.мл, для Oa (указана значениями рядом с соответствующими кривыми). Во всех анализах использовали постоянную концентрацию Rubisco Os, составлявшую 1,5 мл.мл. В верхней секции приведены абсолютные значения, а в нижней - значения, релятивизированные к 30°С.
-1
m
Фиг. 14. Дифференциальная сканирующая флуориметрия (DSF) альфа- и бета-изоформ рекомбинантных RCA от О. sativa (сплошные линии) и О. australiensis (пунктирные линии). Первая производная детектируемой флуоресценции (dR) изображена в виде графика относительно температуры, и максимальная dR соответствует температуре плавления белка (7 т). Для всех образцов использовали один мг.мл белка. Каждая кривая является средним от трех повторностей. Заштрихованная область представляет диапазон T по четырем вариантам RCA, охватывающий температуры от 41°С до 43°С.
Фиг. 15. Теплозависимая реакция экспрессии гена альфа- и бета-изоформ RCA (слева) и теплозависимое содержание белка альфа- и бета-изоформы RCA, полученное в результате визуального анализа очищенных с помощью анионного обмена образцов из листьев. Соотношение альфа-изоформ к бета-изоформам представлено как мРНК альфа, деленное на мРНК бета, или белок альфа, деленное на белок бета.
Фиг. 16. Влияние концентрации рекомбинантной RCA на активность альфа- и бета-форм RCA по результатам измерения АТФазной активности для О. sativa (верхняя секция) и О. australiensis (нижняя секция). Значения представляют собой средние ± SE трех экспериментальных повторностей.
Фиг. 17. Зависимая от температуры стабильность аутоагрегирующего олигомера рекомбинантной RCA и комплекса RCA-Rubisco для О. sativa (верхняя секция) и О. australiensis (нижняя секция). Стабильность определяют как отсутствие значимого снижения активности по сравнению с таковой при 30°С. Стабильность олигомера RCA принимают за равную стабильности гидролитической активности в отношении АТФ. Стабильность комплекса RCA-Rubisco принимают как представляющую стабильность активации Rubisco, опосредованной рекомбинантной RCA. Температуры, при которых комплекс RCA-Rubisco является термолабильным, представлены светло-серым оттенком, тогда как термолабильный диапазон как для комплекса RCA-Rubisco, так и для олигомера RCA представлен темно-серым оттенком.
Os
Oa
Os
Oa
Os
Oa
Oa
Os
Oa
Oa
Фиг. 18. Зависимая от температуры стабильность активации Rubisco рекомбинантной и экстрагированной из листьев RCA и RCA в сочетании с Rubisco из О. sativa (Rubisco) и от О. australiensis (Rubisco). Экстрагированные из листьев RCA и RCA в сочетании с Rubisco и рекомбинантная RCA и RCA в сочетании с Rubisco представлены в двух повторностях.
Фиг. 19. Теплозависимая генная реакция альфа- и бета-изоформы RCA. Визуальный анализ кДНК из трех биологических повторностей, причем один набор, приведенный справа, позволил определить соотношение альфа-изоформ к бета-изоформам. Соотношение альфа-изоформ к бета-изоформам представлено как % общей мРНК RCA, которая состоит из альфа-изоформы.
Фиг. 20. Эффект обработки на RCA, экстрагированной из контрольных листьев, подвергнутых тепловой обработке листьев и листьев после тепловой обработки, согласно результатам определения путем сравнения значений активированной фракции при 38°С относительно 28°С.
Фиг. 21. Зависимая от температуры стабильность аутоагрегирующего олигомера RCA (незакрашенные круги), комплекса рекомбинантной RCA-Rubisco (закрашенные круги) и комплекса нативной RCA-Rubisco (незакрашенные треугольники) для О. sativa (верхняя секция) и О. australiensis (нижняя секция). Стрелка указывает на резкое улучшение теплостабильности нативного комплекса RCA-Rubisco О. australiensis относительно рекомбинантного комплекса. В связи со стабильностью нативного комплекса, RCA О. australiensis совместно ограничена как стабильностью RCA-Rubisco, так и стабильностью аутоагрегации при гораздо более высокой температуре, чем О. sativa.
Os
Oa
пшеницы
пшеницы
Os
Oa
Os
Os
Oa
-1
Фиг. 22. Активация Rubisco пшеницы и риса с помощью RCA из риса. Специфическая активность Rubisco из О. sativa (Rubisco), Rubisco из О. australiensis (Rubisco) и Rubisco из пшеницы (Rubisco) (секция А) и взаимодействие RCA с Rubisco (секции В-С). В секции А показана специфическая активность полностью карбамилированной Rubisco пшеницы, О. sativa (Os) или О. australiensis (Oa) (закрашенные символы) и спонтанной активности ингибированной Rubisco без добавления RCA (незакрашенные символы). В секции В показана зависимая от температуры активация Rubisco пшеницы бета-изоформой RCA, экстрагированной из пшеницы, листьев Os или Oa. RCA частично очищали из листовой ткани путем осаждения сульфатом аммония с последующей дополнительной стадией очистки на анионообменнике, как описано в примере 19. Вкратце, обессоленный экстракт RCA из листьев пропускали через сильную анионообменную колонку (Q-сефарозу) с последующим элюированием 0,2 М KCl, что позволяло выделить и собрать бета-изоформу RCA. За анализ использовали 0,4 мг мл экстракта RCA. В секции С представлена зависимая от концентрации активация Rubisco пшеницы посредством рекомбинантной RCA (синие круги) и RCA (красные квадраты). Сплошные и пунктирные кривые представляют собой зависимую от концентрации активацию Rubisco посредством соответственно изоформы RCA и RCA рекомбинантной RCA. На секциях А и В приведены графики средних и SE трех экспериментальных повторностей, в то время как в секции С приведены графики результатов индивидуальных наблюдений.
Фиг. 23. Показаны температурные условия и световые условия климатической камеры для эксперимента с трансгенными линиями риса.
n
cmax
n
Фиг. 24. Показаны значения результирующей скорости фотосинтеза (A) (A), максимальные показатели скорости карбоксилирования rubisco (V) (В) и индукционная кинетика для rubisco после перехода «день-ночь» (A/мин.) (С) соответствующих трансгенных и незиготических линий риса (rcaIIOa). Показаны коробчатые диаграммы со средними и стандартными отклонениями для всех параметров (n≥6). Звездочки указывают на значимое различие между гомозиготной линией с одной копией rcaIIOa и ее соответствующей нуль-линией (p≤0,05).
Фиг. 25. Показано увеличение сухой массы в течение первых 35 дней роста всходов для О. sativa и О. australiensis при трех дневных температурах (25°С, 35°С и 45°С). Ночные температуры устанавливали на уровне 21°С. Затем использовали сухую биомассу для расчета показателей относительной скорости роста (RGR) с интервалом 7-35 дней. RGR для О. sativa с 7 по 28 день при 45°С представлена отдельной точкой, при этом блокировка роста через 28 дней подавляла RGR. Столбцы обозначают стандартные ошибки среднего значения, в то время как на коробчатых диаграммах показаны средние с диапазонами и значениями критерия Таки, указывающими значимые различия.
2
Фиг. 26. Показана скорость нетто-ассимиляции (NAR) и удельная площадь листа (SLA) в виде графика зависимости от относительной скорости роста на основе биомассы (RGR) с использованием результатов наблюдения от всех температур (25,35 и 45°С) и двух видов (О. sativa и О. australiensis). Из данных видна значимая корреляция между NAR и RGR (r=0,76; О. sativa; 0,95 О. australiensis), что свидетельствует, что ассимиляция (сравнительная морфология листьев) должна быть задающей переменной для роста этих молодых всходов риса. Точки данных изображены со стандартной ошибкой среднего значения.
Фиг. 27. Выравнивание последовательностей ДНК активазы Rubisco для О. sativa ssp. japonica cv. Nipponbare (номер доступа NCBI: AB 110180) с O. sativa cv. Amaroo, O. meridionalis су, О. meridionalis kr и О. australiensis. Заштрихованные остатки представляют собой нуклеотидные отличия. Положения 258, 666 и 774 представляют собой различия между О. sativa и О. meridionalis. Различия последовательностей О. sativa и как О. Meridionalis, так и О. australiensis также наблюдаются в положениях 669, 1017 и 1065. Остальные заштрихованные остатки в последовательности О. australiensis представляют собой различия между О. sativa и О. australiensis.
Фиг. 28. Аминокислотное выравнивание между короткой формой (номер доступа NCBI: BAA97584.1) и длинной формой (номер доступа NCBI: BAC78572.1) активазы Rubisco из О. sativa ssp. japonica cv. Nipponbare и длинной формы от О. sativa cv. Amaroo, О. meridionalis су, О. meridionalis kr и О. australiensis. Следует отметить, что единственная различие между этими двумя формами заключается в дополнительных 40 остатках на карбоксильном конце длинной формы активазы. Заштрихованными показаны остатки, которые отличаются у белковых последовательностей.
Фиг. 29. Аминокислотное выравнивание О. sativa cv. Amaroo и О. australiensis с адаптированными к теплу видами Gossypium hirsutum (хлопчатник) и Larrea tridentata (креозотовый куст) и адаптированными к холоду видами Spinacia oleracea (шпинат) и Deschampsia antarctica (луговик антарктический). Заштрихованными показаны остатки, которые есть как у О. australiensis, так и у адаптированных к теплу видов, но отсутствуют у О. sativa или двух адаптированных к холоду видов.
Фиг. 30. Количества ростков, измеренные для каждого генотипа по всем 14 блокам после семи недель ежедневной обработки на уровне 45°С. Приведены коробчатые диаграммы, которые описаны на фиг. 24.
Фиг. 31. Результаты в виде ростков на растение для восьми линий, подсчитанных у шестинедельных растений, которые были подвергнуты в течение одной недели дневным температурам на уровне 45°С, как описано для фиг. 23. Линии 1-8 приведены соответственно в порядке 474,472,478, 476, 473, 475, 480 (контроль) и 479.
Способны) осуществления настоящего изобретения
Настоящее изобретение относится к RCA (активазе Rubisco) и функционально эквивалентным полипептидам, которые придают термостабильность комплексу, содержащему RCA (или функционально эквивалентный полипептид) и Rubisco.
Полипептиды и нуклеиновые кислоты активазы Rubisco (RCA)
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, комплексы содержат RCA О. australiensis или любую RCA, содержащую по меньшей мере одну из SEQ ID NO: 2-37, 39, 40 и 50-52, как указано в таблице 1, таблице 2 и таблице 6.
1
X = заряженный (K, R, N, M, Q, H, D, E)
2
X = алифатический (L, I, V)
3
Х = положительно заряженный (K, R, N, M, Q, H)
4
X = небольшой (A, G)
a = остаток, встречающийся в соответствующем положении в активазе Rubisco О. australiensis
b = остаток, встречающийся в аналогичном положении в активазе Rubisco адаптированных к теплу видов Gossypium hirsutum (хлопчатник) и Larrea tridentate (креозотовый куст)
* = положение относительно SEQ ID No: 38 (ВАС78572.1)
Следует понимать, что настоящее изобретение также охватывает комплексы, содержащие Rubisco и RCA, например, представленные SEQ ID NO: 39 и 40, модифицированные RCA или полученные из RCA полипептиды, которые придают комплексу термостабильность. RCA, модифицированные RCA или полученные из RCA полипептиды включают их варианты, в том числе практически схожие последовательности, фрагменты, аналоги, гомологи или мутанты. Модифицированные RCA сохраняют по меньшей мере одну функцию RCA. Эти функции включают, например, биологические активности, такие как активация Rubisco или способность образовывать комплекс, содержащий Rubisco. В соответствии с одним вариантом осуществления, полипептиды по настоящему изобретению являются по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 97%, 98% или 99% идентичными полипептидной последовательности под любым из SEQ ID NO: 39 и 40. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, полипептиды по настоящему изобретению изменяются в 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 положениях, соответствующих остаткам 54, 61, 82, 91, 111, 112, 113, 114, 115, 142, 171, 363, 382, 389, 393, 405, 406, 429 из SEQ ID NO: 38 RCA O. sativa. (т.е. короткой формы RCA) или соответствующих остаткам 54, 61, 82, 91, 111, 112, 113, 114, 115, 142, 171, 363, 382, 389, 393, 405, 406, 434 длинной формы RCA O. sativa (SEQ ID NO: 43).
Будет понятно, что настоящее изобретение также охватывает нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды, которые могут образовывать комплексы, содержащие Rubisco и RCA, например, кодируемые с помощью SEQ ID NO: 50 и 52, или кодирующие модифицированные RCA или полученные из RCA полипептиды, которые придают термостабильность комплексу. В соответствии с одним вариантом осуществления, нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды по настоящему изобретению, являются по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 97%, 98% или 99% идентичными последовательности нуклеиновой кислоты под любым из SEQ ID NO: 50-52.
В соответствии с другим вариантом осуществления, полипептиды по настоящему изобретению включают фрагменты RCA, необязательно имеющие одно или несколько из вышеуказанных изменений. Такие фрагменты сохраняют по меньшей мере одну функцию RCA и составляют в длину по меньшей мере 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400 или 425 смежных аминокислот.
В соответствии с другим вариантом осуществления, полипептид RCA по настоящему изобретению содержит SEQ ID NO: 39 или 40.
В соответствии с одним вариантом осуществления, полипептид RCA по настоящему изобретению представляет собой фрагмент, который соответствует функциональному домену RCA, включающему без ограничения АТФ-связывающий домен и домен(ы), который взаимодействует с Rubisco. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, полипептиды по настоящему изобретению включают в себя домены RCA, такие как центральный АТФазный домен (модуль ААА+), или по меньшей мере один из N-концевого Р-петлевого альфа-бета-альфа субдомена или С-концевого все-альфа субдомена. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, полипептиды по настоящему изобретению включают в себя С-концевой домен и/или N-концевой домен RCA. В последовательности альфа-RCA О. australiensis границы доменов являются следующими: М-концевой = 1-55 остатков; ААА+ мотив = 56-344; АТФазный центр = 181-281; С-концевой = 345-464. Такие границы основаны на 3D структуре RCA табака (Stotz, M. et al. (2011) Nat. Struct. Mol. Biol. 18, 1366-1370) и выравнивании аминокислотных последовательностей альфа-RCA Оа и RCA табака.
В RCA дикого типа можно внести одну или несколько замен, дополнений и/или делеций остатков. Например, можно ввести 1, 2, 3, или от 4 до 10, или от 10 до 20 замен, и/или, например, 1, 2, 3 или от 4 до 10, или от 10 до 20 дополнений, и/или, например, 1, 2, 3, или от 4 до 10, или от 10 до 20 делеций. Например, создают полипептиды RCA для усиления необходимой характеристики (например, термостабильности или способности образовывать комплекс с Rubisco). Альтернативно, можно создать полипептиды RCA для уменьшения нежелательной характеристики (например, склонности к агрегированию). В соответствии с одним вариантом осуществления, полипептиды RCA улучшают термостабильность по сравнению с RCA дикого типа. В соответствии с другим вариантом осуществления, полипептиды RCA по настоящему изобретению обладают ферментативной активностью в условиях теплового стресса (до 40°С), которая аналогична или выше ферментативной активности той же RCA в нормальных условиях (например, 30°С).
Изменения в последовательности могут быть внесены стандартными методиками, такими как методики направленной молекулярной эволюции (например, способы перестановки в ДНК), олигонуклеотид-направленный мутагенез, химический мутагенез, кассетный мутагенез, насыщающий мутагенез и редактирование генов. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, изменения в последовательности могут приводить к одной или нескольким консервативным или неконсервативным аминокислотным заменам в целевых сайтах. В соответствии с другими вариантами осуществления, для создания молекул нуклеиновой кислоты RCA применяют случайный мутагенез.
«Неконсервативная аминокислотная замена» представляет собой замену, при которой аминокислотный остаток заменяют аминокислотным остатком с отличающейся боковой цепью. Аминокислотные остатки со схожими боковыми цепями известны из уровня техники. Например, существуют аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислыми боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота, аспарагин, глутамин), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, серин, треонин, тирозин, цистеин), неполярными боковьми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин).
Альтернативно или в дополнение к неконсервативным заменам аминокислотных остатков, изменения последовательностей могут приводить к консервативным аминокислотным заменам. «Консервативная аминокислотная замена» представляет собой замену, при которой аминокислотный остаток заменяют аминокислотным остатком со схожей боковой цепью. После мутагенеза, можно экспрессировать кодируемый белок и можно определить активность белка, как описано ниже.
В соответствии с одним вариантом осуществления, молекулы нуклеиновых кислот являются по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% или 99% идентичными с любой из молекул нуклеиновых кислот под SEQ ID NO: 41, 42, 50, 51 или 52.
В соответствии с одним вариантом осуществления, молекулы нуклеиновых кислот являются молекулами нуклеиновых кислот под SEQ ID NO: 41, 42, 50, 51 или 52.
В соответствии с одним вариантом осуществления, молекула нуклеиновой кислоты содержит SEQ ID NO: 51.
В соответствии с другим вариантом осуществления, молекулы нуклеиновой кислоты кодируют полипептид, который выполняет по меньшей мере одну функцию RCA (например, активацию Rubisco) и составляет по меньшей мере 100, 250, 500, 750, 1000 или 1250 смежных нуклеотидов в длину.
В соответствии с одним вариантом осуществления, молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению соответствует молекуле нуклеиновой кислоты, которая кодирует функциональный домен RCA, например, АТФ-связывающий домен и Rubisco-связывающий домен.
Настоящее изобретение также относится к молекулам нуклеиновой кислоты, химерным генам и векторам, содержащим молекулы нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению.
Настоящее изобретение дополнительно относится к клеткам, предпочтительно растительным клеткам, содержащим нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению.
Термостабильные комплексы, содержащие RCA
Настоящее изобретение относится к термостабильным комплексам, содержащим RCA и Rubisco. Применяемый в контексте настоящего изобретения термин «улучшенная термостабильность» относится к повышенной способности комплекса, содержащего RCA по настоящему изобретению и Rubisco, функционировать в условиях теплового стресса по сравнению с комплексом, содержащим RCA О. sativa и Rubisco. В соответствии с одним вариантом осуществления, комплексы, содержащие полипептиды RCA по настоящему изобретению, обладают ферментативной активностью в условиях теплового стресса (например, 35°С или выше), которая превышает ферментативную активность комплексов, содержащих RCA О. sativa, в таких же условиях. В соответствии с другим вариантом осуществления, комплексы, содержащие полипептиды RCA по настоящему изобретению, обладают ферментативной активностью в условиях теплового стресса (от приблизительно 28°С до приблизительно 30°С, или от приблизительно 30°С до приблизительно 32°С, или от приблизительно 32°С до приблизительно 34°С, или приблизительно 34°С или приблизительно 36°С, или от приблизительно 34°С до приблизительно 36°С, или от приблизительно 36°С до приблизительно 38°С, или до приблизительно 38°С, до приблизительно 40°С, или приблизительно 40°С или выше), которая практически аналогична или превышает активность комплексов, содержащих RCA О. sativa, в таких же условиях.
В соответствии с одним вариантом осуществления, настоящее изобретение относится к термостабильному комплексу, содержащему выделенную RCA от первого вида растений и выделенную Rubisco из второго вида растений. Например, комплекс может содержать выделенную RCA от О. australiensis и выделенную Rubisco из О. sativa. Например, комплекс может содержать выделенную RCA из одного вида рода Oryza и выделенную Rubisco из другого вида рода Oryza. Предполагают, что полипептиды RCA по настоящему изобретению можно применять для образования комплексов с Rubisco из растений любых видов, таких как другие виды однодольных. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, Rubisco в комплексе происходит от растений ячменя, маиса, томата, картофеля, риса, сои, хлопчатника, подсолнечника, люцерны, салата, масличного рапса, сорго или пшеницы. В соответствии с конкретными вариантами осуществления, Rubisco в комплексе происходит от ячменя, сорго, риса или пшеницы.
Комплексы могут быть образованы in vitro или in vivo. Например, комплексы могут быть образованы in vitro путем приведения в контакт рекомбинантной RCA О. australiensis с Rubisco из О. sativa, присутствующей в экстракте из листьев, или Rubisco, которая была очищена из О. sativa. Альтернативно, комплексы могут быть образованы in vivo посредством экспрессии полипептида RCA по настоящему изобретению в таком растении, чтобы он образовывал комплекс с эндогенной Rubisco растения.
Для анализа активности комплексов, содержащих полипептиды RCA (включая без ограничения активацию Rubisco и гидролиз АТФ), можно применять любой известный из уровня техники способ.
14
14
3
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, комплексы, содержащие полипептиды RCA, анализируют in vitro. В соответствии с одним вариантом осуществления, комплексы, либо собранные из изолированных компонентов (например, созданных посредством рекомбинантной экспрессией), либо комплексы, очищенные или экстрагированные, например, из листовой ткани, могут быть проанализированы в отношении активации Rubisco при инкубации в растворе, включающем дезактивированную Rubisco, RuBP, АТФ и источник меченого углерода (например, [C]NaHCO). В соответствии с настоящим вариантом осуществления, для оценки активации Rubisco можно отслеживать включение С в 3-фосфоглицериновую кислоту. В соответствии с другим вариантом осуществления, полипептиды RCA можно анализировать в отношении гидролиза АТФ при инкубации в растворе, содержащем АТФ. Анализы обычно проводят при различных температурах в диапазоне от нормальных условий до условий теплового стресса.
2
В соответствии с другими вариантами осуществления, комплексы, содержащие полипептиды RCA, анализируют in vivo. Растения, которые экспрессируют один или несколько полипептидов RCA по настоящему изобретению, можно анализировать в отношении скорости фотосинтеза, скорости увеличения биомассы, показателей скорости роста и урожая семян в условиях теплового стресса и сравнить с растениями, которые экспрессируют RCA дикого типа. Растения можно полностью вырастить в условиях теплового стресса или выращивать в условиях теплового стресса в течение периодов времени. В соответствии с некоторым вариантом осуществления, условия теплового стресса определяют на поверхности листа. Анализы в отношении скорости фотосинтеза, скорости увеличения биомассы, показателей скорости роста и урожайности семян известны из уровня техники. Например, показатели скорости фотосинтеза можно измерить путем анализа фиксации CO. Показатели скорости роста можно оценить путем измерения увеличения площади листьев с течением времени. Урожай семян можно оценить путем определения количества семян и/или массы семян.
Способы повышения термостойкости у растений
RCA активирует Rubisco у растений и является ограничивающей скорость стадией процесса фотосинтеза, особенно в условиях теплового стресса (Salvucci, М.Е. & Crafts-Brandner, S.J. (2004) Physiol. Plant. 120, 179-186). В отсутствие активности RCA, Rubisco остается неактивной, а фотосинтез замедляется или останавливается. Авторами настоящего изобретения было показано, что комплексы, содержащие RCA и Rubisco, теряют активность при высоких температурах, тем самым свидетельствуя, что повышенные температуры дестабилизируют и/или денатурируют комплексы, содержащие RCA и Rubisco, тем самым делая RCA менее способной или неспособной активировать Rubisco. Таким образом, термостойкость растений может быть увеличена путем применения комплексов, содержащих полипептиды RCA по настоящему изобретению. В частности, полипептиды RCA по настоящему изобретению можно экспрессировать у растений.
Для экспрессии по меньшей мере одного полипептида RCA у растения можно применять любой известный из уровня техники способ. Например, можно получить трансгенные растения, экспрессирующие один или нескольких полипептидов RCA во всех тканях или в подгруппе тканей, предпочтительно в тех тканях или органеллах, которые вовлечены в процесс фотосинтеза. Полипептид RCA может быть экспрессирован конститутивно или находиться под контролем индуцируемого промотора, такого как индуцируемый теплом или химически индуцируемый промотор. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, экспрессия и/или активность эндогенной RCA у растения можно уменьшить или устранить.
Рекомбинантная экспрессия
Молекулы нуклеиновой кислоты и полилептиды по настоящему изобретению могут быть экспрессированы рекомбинантно с помощью стандартных методик рекомбинантной ДНК и молекулярного клонирования, которые хорошо известны из уровня техники (например, Sambrook, Fritsch, and Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, (1989)). Кроме того, для создания конструкций нуклеиновых кислот, пригодных для применения при получении трансгенных растений, можно применять известные в настоящей области методики рекомбинантной ДНК.
Настоящее изобретение также относится к химерным генам или нуклеиновым кислотам, с которых экспрессируются химерные белки или полипептиды, в том числе к молекуле нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению или ее варианту. Термин «химерный ген» относится к молекуле нуклеиновой кислоты, образованной путем объединения в комбинацию частей одной или нескольких нуклеиновых кислот различного происхождения. Химерный ген представляет собой искусственный ген, сконструированный путем функционального связывания фрагментов неродственных генов или других последовательностей нуклеиновых кислот. Иными словами, «химерный ген» обозначает ген, который в норме не встречается у вида растения, т.е. он является гетерологичным по отношению к растению, в которое его внедряют, или относится к любому гену, в котором промотор или один или несколько других регуляторных участков гена не связаны по своей природе с частью или всей транскрибируемой нуклеиновой кислотой, т.е. являются гетерологичными по отношению к транскрибируемой нуклеиновой кислоте. Более конкретно, химерный ген является искусственным, т.е. не встречающимся в природе геном, полученным путем образования функциональной связи подлежащей транскрибированию последовательности нуклеиновой кислоты.
Настоящее изобретение также относится к векторам, предпочтительно векторам экспрессии, содержащим молекулу нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению или ее вариант. Термин «вектор» относится к полинуклеотиду, который можно применять для сохранения другой нуклеиновой кислоты, с которой он был связан. Например, типичным вектором является плазмида или вирус.
Настоящее изобретение относится к рекомбинантным векторам экспрессии и химерным генам или молекулам нуклеиновой кислоты, которые содержат молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид RCA по настоящему изобретению, в форме, подходящей для экспрессии в клетке-хозяине. Специалисту будет понятно, что выбор компонентов химерного гена и вектора экспрессии будет зависеть от таких факторов, как трансформируемая клетка-хозяин, необходимый уровень экспрессии полипептида, ткань в организме, в которой необходима экспрессия, и т.д. Как правило, рекомбинантные векторы экспрессии или химерные гены можно вводить в клетки-хозяева для получения белков или пептидов, включая слитые белки или пептиды.
Рекомбинантные векторы экспрессии, или химерные гены, или молекулы нуклеиновых кислот могут быть предназначены для экспрессии полипептида RCA в прокариотических клетках (например, бактериях или дрожжах) или эукариотических клетках (например, клетках насекомых, млекопитающих или растений). Альтернативно, рекомбинантные векторы экспрессии могут быть транскрибированы и транслированы in vitro, например, с помощью промоторных регуляторных последовательностей Т7 и полимеразы Т7.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению может быть экспрессирована в растительных клетках с помощью рекомбинантного вектора экспрессии, или химерного гена, или молекулы нуклеиновой кислоты, которые предназначены для применения в растениях, например, вектора экспрессии на основе вируса табачной мозаики и вируса картофеля или любого другого вектора экспрессии у растения, который известен из уровня техники.
Для экспрессии нуклеиновых кислот по настоящему изобретению можно применять ряд известных из уровня техники промоторов, например, промоторы могут быть конститутивными, тканеспецифическими или индуцируемыми.
«Тканеспецифический промотор» может управлять экспрессией нуклеиновых кислот по настоящему изобретению в ткани, органе или клетке конкретного типа. Тканеспецифический промотор также может быть индуцируемым промотором. Альтернативно, «конститутивный промотор» определяют как промотор, который будет управлять экспрессией гена во всех тканях и является активным в большинстве окружающих условиях и состояниях развития или дифференциации клетки.
Термин «индуцируемый промотор» относится к промотору, который находится под строгим контролем окружающей среды или стадии развития. В соответствии с конкретными вариантами осуществления, индуцируемый промотор может представлять собой химически индуцируемый промотор, или индуцируемый теплом промотор, или индуцируемый светом промотор. В число примеров химически индуцируемых промоторов в растениях входят промоторы, которые индуцируются под воздействием химических реагентов, которые могут быть применены к растению, такие как гербициды или антибиотики. Например, можно применять промотор In2-2 маиса, активируемый антидотами бензолсульфонамидных гербицидов (De Veylder (1997) Plant Cell Physiol. 38:568-577); применение различных антидотов гербицидов индуцирует различные паттерны экспрессии генов, включая экспрессию в корне, гидатодах и апикальной меристемы побега. Кодирующая последовательность может находиться под контролем, например, индуцируемого тетрациклином промотора, например, как описано с трансгенными растениями табака, содержащими ген аргининдекарбоксилазы Avena sativa L. (овес) (Masgrau (1997) Plant J. 11:465-473); или чувствительного к салициловой кислоте элемента (Stange(1997) Plant J. 11:1315-1324). С помощью химически (например, гормоном или пестицидом) индуцированных промоторов, т.е. промоторов, реагирующих на химические вещества, которые можно применить по отношению к трансгенному растению в поле, экспрессия полипептида по настоящему изобретению может быть индуцирована на определенной стадии развития растения. Также можно использовать индуцируемую эстрогеном систему экспрессии, которая описана в патенте США 6784340 и Zuo et al. (2000, Plant J. 24: 265-273), для управления экспрессией нуклеиновых кислот, применяемых для осуществления на практике настоящего изобретения.
В число примеров индуцируемых теплом промоторов в растениях входят промоторы теплового шока, например, промотор Hsp90p, или другие индуцируемые теплом промоторы, такие как гены OsHsfB2cp и РМ19р.
В число примеров индуцируемых светом промоторов входят, например, промоторы зеленых тканей, такие как промотор гороха rbcS-3А (Kuhlemeier et al. (1989) Plant Cell 1: 471-478) и промотор маиса rbcS (Schafflier and Sheen (1991) Plant Cell 3: 997-1012).
В соответствии с одним аспектом, настоящее изобретение относится к клеткам-хозяевам, в которые была внедрена нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид RCA по настоящему изобретению. Внедрение нуклеиновой кислоты в клетку можно осуществлять любым известным в настоящей области техники способом, например, с помощью микроинъекции; Agrobacterium-опосредованной трансформации; прямого переноса генов; баллистического ускорения частиц; опосредованной вирусом трансформации; трансформации хлоропласта или электропорации. Термин «клетка-хозяин» относится к конкретной рассматриваемой клетке и к потомству или потенциальному потомству такой клетки. В последующих поколениях клетки-хозяина могут возникать модификации, например, в связи с либо мутационными, либо средовыми воздействиями, и, следовательно, последующие поколения по факту могут не быть идентичными исходной клетке-хозяину, но все еще подпадать под объем применяемого в настоящем документе термина.
В соответствии с другими вариантами осуществления, нуклеиновая кислота по настоящему изобретению может быть внедрена в растение или растительную клетку путем скрещивания растения, содержащего такую нуклеиновую кислоту, с другим растением, которое не содержит такую нуклеиновую кислоту, так чтобы по меньшей мере некоторые из потомков в результате скрещивания содержали такую нуклеиновую кислоту.
Следовательно, настоящее изобретение относится к растениям и растительным клеткам, содержащим нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению.
Получение растений
Полипептиды RCA и нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению могут быть пригодны для получения трансгенных растений. Для трансформации растения или растительной клетки молекулой нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению можно применять любой известный в настоящей области способ. Молекулы нуклеиновой кислоты могут быть включены в растительную ДНК (например, геномную ДНК или ДНК хлоропластов) или поддерживаться без вставки в ДНК растений (например, с помощью искусственных хромосом). Подходящие способы внедрения молекул нуклеиновых кислот в растительные клетки включают микроинъекцию; Agrobacterium-опосредованную трансформацию; прямой перенос генов; баллистическое ускорение частиц; опосредованную вирусом трансформацию; трансформацию хлоропласта; и электропорацию. Выбор применяемого способа трансформации будет зависеть от типа подлежащего трансформации растения или растительной клетки (например, однодольного или двудольного).
Трансформированные клетки растений, которые получают любой из вышеуказанных методик трансформации, могут быть культивированы до регенерации всего растения, которое обладает трансформированным генотипом и, следовательно, необходимым фенотипом. Такие методики регенерации основаны на манипулировании определенными фитогормонами в среде для культивирования тканевой культуры, причем в их основе обычно лежит биоцидный и/или гербицидный маркер, который был внедрен вместе с необходимыми нуклеотидными последовательностями. Регенерация растений из культивируемых протопластов описана в уровне техники. Регенерацию также можно осуществить из каллюса, эксплантов, органов растений или их частей. Методики регенерации также известны из уровня техники.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, растительные клетки по настоящему изобретению представляют собой неразмножающиеся растительные клетки.
Растения, содержащие полипептиды RCA и нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению, можно получить путем скрещивания растения, содержащего такую нуклеиновую кислоту, с другим растением, которое не содержит такую нуклеиновую кислоту, так чтобы по меньшей мере некоторые из потомков в результате скрещивания содержали такую нуклеиновую кислоту.
Применяемый в контексте настоящего изобретения термин «растение» относится к целым растениям, прорастающим вегетативным органам/структурам (например, листьям и стеблям), корням, цветкам и цветочным органам/структурам (например, прицветникам, чашелистикам, лепесткам, тычинкам, плодолистикам, пыльникам и семязачаткам), семени (включая зародыш, эндосперм и семенную оболочку) и плоду (зрелый семязачаток), растительной ткани (например, сосудистой ткани, основной паренхиме и т.п.) и клеткам (например, защитные клетки). Термин «растение» также относится к высшим и низшим растениям, пригодным для методик трансформации, включая покрытосеменные (однодольные и двудольные растения), голосеменные, папоротниковые и многоклеточные водоросли. Также включены растения различных уровней плоидности, в том числе анеуплоидные, полиплоидные, диплоидные, гаплоидные и гемизиготные растения.
Молекулы нуклеиновых кислот по настоящему изобретению можно применять для экспрессии полипептидов RCA по настоящему изобретению в любом растении, в том числе видах рода Agrotis, Allium, Ananas, Anacardium, Apium, Arachis, Asparagus, Athamantha, Atropa, Avena, Bambusa, Beta, Brassica, Bromus, Browaalia, Camellia, Cannabis, Carica, Ceratonia, Cicer, Chenopodium, Chicorium, Citrus, Citrullus, Capsicum, Carthamus, Cocos, Coffea, Coix, Cucumis, Cucurbita, Cynodon, Dactylis, Datura, Daucus, Dianthus, Digitalis, Dioscorea, Elaeis, Eliusine, Euphorbia, Festuca, Ficus, Fragaria, Geranium, Glycine, Graminae, Gossypium, Helianthus, Heterocallis, Hevea, Hibiscus, Hordeum, Hyoscyamus, Ipomoea, Lactuca, Lathyrus, Lens, Lilium, Linum, Lolium, Lotus, Lupinus, Lycopersicon, Macadamia, Macrophylla, Malus, Mangifera, Manihot, Majorana, Medicago, Musa, Narcissus, Nemesia, Nicotiana, Onobrychis, Olea, Olyreae, Oryza, Panicum, Panicum, Panieum, Pannisetum, Pennisetum, Petunia, Pelargonium, Persea, Pharoideae, Phaseolus, РЫешп, Picea, Poa, Pinus, Pistachia, Pisum, Populus, Pseudotsuga, Pyrus, Prunus, Pseutotsuga, Psidium, Quercus, Ranunculus, Raphanus, Ribes, Ricinus, Rhododendron, Rosa, Saccharum, Salpiglossis, Secale, Senecio, Setaria, Sequoia, Sinapis, Solanum, Sorghum, Stenotaphrum, Theobromus, Trigonella, Trifolium, Trigonella, Triticum, Tsuga, Tulipa, Vicia, Vitis, Vigna и Zea.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, трансгенными растениями являются растения ячменя, маиса, томата, картофеля, риса, сои, хлопчатника, подсолнечника, люцерны, салата, масличного рапса, сорго или пшеницы. В соответствии с конкретными вариантами осуществления, трансгенными растениями являются однодольные растения или злаковые растения, такие как ячмень, сорго, рис, кукуруза или пшеница. Специалист в настоящей области признает, что после получения трансгенного растения молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению в этом трансгенном растении может быть внесена в другие растения в результате полового скрещивания. Для достижения этой цели можно применять любую известную из уровня техники стандартную методику скрещивания.
Определение экспрессии у растений
Для определения наличия или уровня экспрессии у растения молекулы нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению или полипептида RCA по настоящему изобретению можно применять любой известный в настоящей области способ. Например, уровень экспрессии у растения полипептида RCA можно оценить с помощью молекулярных методик, включая, например, иммуноанализ, иммунопреципитацию, гель-электрофорез и масс-спектрометрию.
Кроме того, экспрессию полипептида RCA у растения можно оценить по изменению фенотипа растения (например, скорости фотосинтеза, скорости роста или урожайности семян) в условиях теплового стресса по сравнению с растениями, экспрессирующими RCA дикого типа.
Кроме того, в анализах in vitro можно применять экстракты или полипептиды, выделенные из трансгенных растений, их тканей, клеток или семян.
Специалистам в настоящей области техники будет понятно, что в настоящее изобретение могут быть внесены многочисленные изменения и/или модификации, как показано в конкретных вариантах осуществления, без отступления от сущности или объема настоящего изобретения, которое описано в наиболее широком смысле. С учетом вышесказанного, настоящие варианты осуществления во всех отношениях следует рассматривать как иллюстративные, а не ограничивающие.
Примеры
Пример 1
Секвенирование ДНК и выравнивание последовательностей
Первоначально, общую РНК экстрагировали из 100 мг листовой ткани с помощью набора для выделения РНК RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen). РНК преобразовывали в кДНК с помощью набора для синтеза кДНК Superscript VILO cDNA Synthesis Kit (Invitrogen) с использованием 2,1 мкг РНК в качестве матрицы. ПЦР проводили на 2 мкл кДНК-продукта с помощью мастер-микса GoTaq Green Master Mix (Promega). См. дополнительные способы в Scafaro, A. P., Haynes, Р. А. & Atwell, В. J. (2010) J. Exp.Bot. 61, 191-202 для программы циклов ПЦР и используемых праймеров. Продукт гнали на 1,5% агарозном геле, окрашенном Gel Red (Biotium). Бэнды вырезали из геля с помощью скальпеля и очищали ДНК с помощью набора для экстракции ДНК из геля DNA Gel Extraction Kit (Qiagen). ПЦР-продукты секвенировали в обоих направлениях с помощью тех же праймеров, которые были использованы для амплификации ПЦР. Подготовку последовательностей осуществляли с помощью реакционной смеси для секвенирования Big Dye Terminator V3.1 в соответствии с инструкциями производителя, а образцы гнали на анализаторе Genetic Analyzer 3130х1 (Applied Biosystems, Фостер Сити, Калифорния, США). Несколько последовательностей ДНК и белка выравнивали с помощью алгоритма MUSCLE [Edgar RC (2004) MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic Acids Research 32: 1792-1797] и программного обеспечения с открытым исходным кодом UniproUGENE v1.9.0.
Результаты: RCA и ее экспрессия
a
b
Секвенировали гены RCA Oryza sativa L. ssp. japonica cv. Amaroo, два экземпляра О. meridionalis и O. australiensis, и были обнаружены различия между видами. Не было различий в последовательности между двумя экземплярами О. meridionalis. Имело место 50 изменений оснований между О. australiensis и О. sativa, включая 44 замены оснований и шесть делеций в гене О. australiensis. Три замены оснований О. australiensis, не обнаруженные у О. sativa, также были обнаружены у О. meridionalis. Еще четыре изменения оснований были уникальными для О. meridionalis. При трансляции последовательности ДНК в аминокислотную последовательность, различия в последовательностях ДНК между О. sativa и О. meridionalis не транслировались в отличительный признак в белке. Тем не менее, имели место 18 изменений/делеций остатков, уникальных для обеих изоформ RCA О. australiensis (см. таблицу 1). Белковую последовательность О. australiensis затем сравнивали с двумя адаптированными к теплу видами Gossypium hirsutum (хлопчатник) и Larrea tridentata (креозотовый куст) и адаптированными к холоду видами Spinacia oleracea (шпинат) и Deschampsia antarctica (луговик антарктический). Четыре из различающихся остатков, обнаруженных у О. australiensis, были такими же, как один или оба из соответствующих остатков, обнаруженных у адаптированных к теплу видов, но не у какого-либо из видов, адаптированных к холоду (см. таблицу 1).
Пример 2
Превосходная стойкость к тепловому стрессу у дикого риса Oryza australiensis из-за термостабильной RCA.
МАТЕРИАЛЫ И СПОСОБЫ
-2
-1
Рост растений-кратковременная термообработка (см. фиг. 1-3) Семена Oryza sativa L. ssp. japonica cv. Amaroo (Os-A) и О. sativa L. ssp. indica cv. Doongara (Os-D) были получены из Сельскохозяйственного института Янко (Отделения первичного производства. Новый Южный Уэльс, Австралия). Семена Oryza meridionalis Ng. собирали из диких популяций, расположенных на полуострове Кейп-Йорк в Австралии согласно координатам S15°42', Е145°03' (далее их называют О. meridionalis CY или Om-CY) и из Кип Ривер к северу от Западной Австралии согласно координатам S15°58', Е129°03' (далее их называют О. meridionalis KR или Om-KR). Oryza australiensis Domin. собирали из того же места, что и О. meridionalis KR. Для всех экспериментов растения выращивали в камерах для контролируемого роста (Thermoline Scientific Equipment, Смитфилд, Новый Южный Уэльс, Австралия) с 12-часовым фотопериодом с плотностью фотосинтетического фотонного потока (PPFD) от 600 до 800 мкмоль м с. Растения выращивали при 28/22°С (день/ночь) в почве краснозема с мелкозернистой структурой (местного происхождения из Робертсона, Новый Южный Уэльс, Австралия) в соотношении 3:1 и органической смеси в горшках без дренажных отверстий. Для экспериментов по скорости удлинения листьев растения выращивали в 2-литровых горшках, а измерения проводили на стадии 5-го листа. Для всех других экспериментов растения измеряли после выращивания в течение 60 дней в 10-литровых горшках. Почву постоянно увлажняли и позволяли скапливаться небольшим лужицам на поверхности, если растения были старше 40 дней. Коммерческое жидкое удобрение (Aquasol, Йетс, Австралия) вносили один раз в неделю согласно инструкциям производителя, начиная с 10 дней после прорастания.
Рост растений - долговременная термообработка (см. фиг. 25-26)
Семена Oryza sativa L. ssp. japonica cv. Amaroo (Os-A) и Oryza australiensis Domin. выращивали, как описано выше, и через 7 дней после прорастания проростки подвергали воздействию трех температур (25, 35 и 45°С) в течение дня (12 часов) и 21 градусам в ночное время, пока растения не достигали 35-дневного возраста. Всходы собирали еженедельно, делая замеры площади листа, а также свежей и сухой биомассы для побегов и корней. Показатели относительной скорости роста и показатели нетто-ассимиляции рассчитывали с использованием сухой массы и площади листьев на период обработки (7-35 дни после прорастания).
Показатели скорости удлинения листьев
Показатели скорости удлинения листа измеряли с помощью измерительного преобразователя линейных перемещений (LVDT) HR4000. После появления пятого листа растения переносили в камеру, содержащую блок LVDT, и случайным образом назначали на одну из восьми измерительных станций. Пятый лист прикрепляли зажимами к аппарату и измеряли рост в течение 24-часового периода. Растения выращивали при 22°С в течение первых 12 ч роста в темноте с последующими 28°С в течение первых 4 ч светового периода. Затем температуру в камере повышали до 45°С на 4 ч и возвращали до 28°С на последние 4 ч дневного периода. Длину листа измеряли и регистрировали каждые 6 минут с помощью программного обеспечения VuGrowth, версии 1.0 (Applied Measurement, Оакли, Виктория, Австралия). Температуру окружающей среды камеры регистрировали каждые 10 минут портативным регистратором данных (Onset НОВО, Массачусетс, США), размещенным рядом с растениями. Показатели длины листьев преобразовывали в скорость удлинения листьев (LER) путем вычитания длины листа в любой заданный момент времени из длины листа за 1 час до этого измерения. Эксперимент повторяли шесть раз с девятью растениями для каждого из всех измеряемых генотипов.
Анализы состояния газообмена и активации Rubisco
2
-2
-1
2
Показатели газообмена измеряли с помощью Licor 6400 (LI-COR, Линкольн, США). CO в воздухе эталонной камеры устанавливали на уровне 380 ppm и для всех измерений использовали PPFD 1500 мкмоль м с. Измерения проводили в камере для роста, а температуру воздуха кюветы для газоообмена устанавливалиравной 28°С или 45°С в соответствии с температурой камеры. Контрольные измерения проводили при 28°С, начиная с 2 часов в светлый период. Измерения при 45°С начинали через 2 часа после воздействия 45°С и продолжали в течение 2-часового периода путем случайного измерения различных генотипов на протяжении этого 2-часового периода. Все измерения проводили на здоровых, полностью распустившихся листьях. Измерения проводили на 3-6 листьях из 3 горшков-повторностей. Для определения состояния активации Rubisco, два листовых диска 0,266 см быстро вырезали из зрелых, полностью распустившихся листьев с помощью листового перфоратора и немедленно замораживали в жидком азоте. Состояние активации Rubisco рассчитывали путем измерения общей и начальной активности Rubisco. Образцы собирали на протяжении светового периода так, чтобы это соответствовало измерениям роста. Образцы собирали через 2 ч при 28°С (2 ч света), 2 часа при 45°С (4 ч света), 4 часа при 45°С (6 ч света) и снова при 28°С через 1 ч восстановления от более высоких температур (7 ч света). Четыре повторности собирали из отдельных горшков, случайным образом размещенных по всей камере.
Иммуноблот-анализ
Для иммуноблот-анализа растительный материал собирали при температуре камеры 28°С или через 2 часа при 45°С, как описано выше для активации Rubisco. Растительный материал измельчали в жидком азоте и 100 мг мелкодисперсной ткани взвешивали перед экстракцией путем встряхивания на вортексе в 800 мкл буфера для экстракции на основе SDS, содержащего 30% сахарозы, 2% SDS, 0,1 М Tris-HCl, pH 8,0, 5% β-меркаптоэтанола. Образцы центрифугировали на 10000 g в течение 5 мин. и добавляли 10 мкл супернатанта к 3 мкл 5Х SDS-загрузочного буфера с красителем (Invitrogen). Образцы подвергали электрофорезу в SDS-PAGE гелях NuPage с 6-12% градиентом BIS-TRIS (Invitrogen) вместе с предварительно окрашенными маркерами молекулярной массы (Precision Plus All Blue Standard, Bio-Rad, город, страна). Полипептиды переносили в поливинилидендифторидные (PVDF) мембраны для иммунологической детекции RCA с помощью первичного антитела к активазе табака (Law, D., Crafts-Brandner, S. & Salvucci, M. (2001) Planta 214, 117-125.) в сочетании с конъюгированным с щелочной фосфатазой вторичным антителом к антителам кролика (Sigma Aldrich). Иммуноблоты окрашивали посредством NBT/BCIP (Promega). Иммуноблот-анализы проводили в трех повторностях, т.е. с использованием образцов, полученных от трех различных растений. Первичное антитело к RCA, используемое в вестерн-блоттинге, имеет более высокую аффинность к RCA-Oa, чем к RCA-Os. С учетом различия реактивности антител по стандартной кривой, построенной по результатам от очищенной рекомбинантной RCA в известной концентрации, была получена концентрация RCA в листе.
Статистика
Все графики и статистика были созданы с помощью программного обеспечения GraphPad Prism. 5.0d (GraphPad Prism Software Inc., Сан-Диего, США). Для данных состояния активации как LER, так и Rubisco сначала проводили двухфакторный дисперсионный анализ. При необходимости, после этого теста проводили отдельные однофакторные дисперсионные анализы и вычисляли критерии множественного сравнения Таки. Данные о газообмене анализировали с помощью t-критерия для двух выборок между контролем и термообработкой независимо для каждого генотипа.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Зависимый от температуры рост и фотосинтез
Относительную тепловую чувствительность четырех генотипов определяли путем сравнения их LER с LER Os-A (фиг. 1). Из результатов сравнения видно, что LER всех генотипов были схожими с таковыми Os-A при 28°С, но при 45°С показатели скорости были сравнительно более высокими, характеризуясь видоспецифическими различиями в реакции на высокую температуру. При снижении температуры до 28°С, LER снова была схожа у всех генотипов, в том числе Os-A. Показатели скорости удлинения листьев были схожими для всех генотипов риса спустя 1 ч воздействия 45°С. Однако к концу 4-часового периода воздействия теплом, различия в показателях скорости роста между Os-A и четырьмя другими генотипами были очевидными. О. sativa cv. Doongara (Os-D) был более стойким, чем Os-A, но менее стойким, чем генотипы дикого риса. У двух популяций (Om-CY и Om-KR) О. meridionalis была схожая реакция, и их термостойкость была промежуточной между Os-D и О. australiensis. У Oryza australiensis наблюдали наибольшую стойкость к высокой температуре; спустя 4 ч воздействия 45°С его LER вдвое превышала таковую у Os-A.
Значимое взаимодействие между эффектами температуры роста и временем воздействия на LER наблюдали для всех генотипов, за исключением О. australiensis (таблица 8). Это взаимодействие было очевидным по относительно стабильным показателям скорости роста при 28°С по сравнению со сниженными показателями скорости при 45°С (фиг. 2). Oryza australiensis был уникальным среди генотипов в сохранении схожей LER при 28 и 45°С (фиг. 2е). По причине отсутствия ингибирования роста при 45°С не было значимых различий в LER между двумя температурами или на протяжении периода воздействия у О. australiensis. При сравнении LER на протяжении 4-часового периода воздействия при 45°С, у всех пяти генотипов наблюдали наиболее высокие показатели скорости при наименьшем времени воздействия (1-часовом). Для обоих сортов О. sativa LER непрерывно и заметно снижалась на протяжении 4-часового периода воздействия (фиг. 2а, b). Более умеренное снижение LER имело место в двух популяциях О. meridionalis (фиг. 2с, d), поскольку на LER у О. australiensis не оказывалось значимого влияния на протяжении 4-часового периода воздействия 45°С.
Растения выращивали при окружающей температуре либо 28°С, либо 45°С в течение времени воздействия 4 ч и измеряли показатели длины листьев каждые 6 мин. с помощью LVDT (см. фиг. 1). Вся статистика была основана на шести экспериментальных повторностях.
Тепло, воздействующее на растения в течение часов дневного освещения, использовали в течение четырех недель для проверки того, могут ли эффекты термостойкости, наблюдаемые в ходе удлинения листьев в О. australiensis, быть воспроизведены на протяжении более длительных периодов времени (фиг. 25). Наблюдали два основных эффекта: (1) О. australiensis рос так же быстро при 45°С, как и при 35°С, и (2) рост О. sativa резко замедлялся через три недели термообработки. Это отражали показатели относительной скорости роста, а О. australiensis производил приблизительно одну треть биомассы О. sativa к концу термообработки. На фиг. 26 показана корреляция между относительной скоростью роста и скоростью нетто-ассимиляции/удельной площадью листа, двумя детерминантами относительной скорости роста. Это иллюстрирует, что скорость нетто-ассимиляции является задающей переменной для роста по шести комбинациям температура × генотип. Это, в свою очередь, свидетельствует о том, что ключевыми факторами роста являются метаболизм и фотосинтез/дыхание, а не строение листьев.
n
n
Влияние повышенной температуры на скорость нетто-фотосинтеза (P) также было видоспецифическим. Нетто-фотосинтез уменьшался спустя 2-4 ч при 45°С для всех генотипов, за исключением О. australiensis (фиг. 3). Снижение P было более выраженным для О. sativa (42% для Os-A и 39% для Os-D), промежуточным для О. meridionalis (25% для Om-CY и 29% для Om-KR) и минимальным для О. australiensis (1%).
Состояние активации Rubisco
n
Реакция состояния активации Rubisco на повышенную температуру (таблица 9) была схожа реакции, наблюдаемой для LER и P у пяти генотипов (фиг. 2 и 3). При воздействии 45°С, активация Rubisco уменьшалась более всего у двух сортов О. sativa, по сравнению с более умеренным уменьшением у двух популяций О. meridionalis и минимальным уменьшением у О. australiensis. Для всех пяти генотипов имело место начальное снижение состояния активации Rubisco через 2 ч при 45°С. Интересно отметить, что снижение активации Rubisco, которое имело место после 2-часового воздействия 45°С, было наиболее низким в двух генотипах из наиболее жаркой среды, т.е. Кип Ривер. При увеличении периода воздействия теплом до 4 ч активация Rubisco либо оставалась на том же нижнем уровне (Os-A и Om-KR и -CY), либо дополнительно снижалась (Os-D), за исключением О. australiensis. У О. australiensis активация Rubisco восстанавливалась в ходе длительного воздействия 45°С, и если за 4-часовым тепловым воздействием следовал 1-часовой период восстановления при 28°С, то достигалось состояние активации, сравнимое с начальным состоянием активации при 28°С. Напротив, состояние активации Rubisco у двух других видов оставалось ингибированным даже после 1-часового периода восстановления при 28°С.
Для определения, было ли значимое различие в реакции состояния активации Rubisco на время воздействия высокой температуры среди различных генотипов, проводили двухфакторный дисперсионный анализ. Из результатов анализа было видно, что не было значимого взаимодействия генотип × время воздействия (F=0,9516, P=0,5037, df=12). В результате однофакторного дисперсионного анализа были выявлены значимые различия (Р=0,0016) между видами только после воздействия на растения в течение 4 ч температурой 45°С, если состояние активации Os-A было ниже, чем у О. australiensis, a состояние активации Os-D было ниже, чем у Om-KR и О. australiensis (таблица 8). Не было обнаружено значимых различий (Р>0,05) в состоянии активации между генотипами О. meridionalis и О. australiensis. Кроме того, для этих трех генотипов отсутствовало значимое влияние (Р>0,05) повышенной температуры на состояние активации. Напротив, у обоих сортов О. sativa наблюдали значимое снижение (Р=0,0032 для Os-A и Р=0,002 для Os-D) в состоянии активации после 4-часового воздействия 45°С по сравнению с состоянием активации при 28°С.
Однофакторный дисперсионный анализ применяли для определения различий между генотипами для одного условия роста, а другой однофакторный дисперсионный анализ - для различий в генотипе для всех условий роста. Растения анализировали до (28°С), во время термообработки (2 ч при 45°С и 4 ч при 45°С), а также после периода восстановления 1 ч при 28°С (восстановление при 28°С). Все значения представляют собой средние ± SE (n=4).
Сходство в температурной реакции LER и состояния активации Rubisco для каждого генотипа привело к определению положительной взаимосвязи между двумя переменными (фиг. 4). Из результатов линейно-регрессионного анализа было видно, что 51% изменения LER можно было объяснить за счет изменений состояния активации Rubisco.
RCA и ее экспрессия
Секвенирование генов RCA от О. sativa cv. Amaroo, двух популяций О. meridionalis и О. australiensis, выявляло различия в последовательности RCA среди трех видов, но не между двумя популяциями О. meridionalis. Имело место 50 различий оснований между О. australiensis и О. sativa, включая 44 замены оснований и шесть делеций в гене О. australiensis. Три замены оснований, обнаруженные в О. australiensis при сравнении с О. sativa, также были обнаружены у О. meridionalis. В дополнение к этому, еще четыре изменения оснований были уникальными для О. meridionalis. При трансляции последовательностей ДНК генов RCA в последовательности белка, различия между О. sativa и О. meridionalis на нуклеотидном уровне не транслировались в различия на уровне аминокислот. Напротив, сравнение аминокислотных последовательностей для RCA из разных генотипов выявляло три делеций остатков и 15 замен остатков, которые были уникальны для О. australiensis, как для малой формы, так и для большой формы.
Для всех пяти генотипов риса на содержание белка RCA не оказывало влияние воздействие 45°С в течение 2 ч, равно как и соотношение большой и малой формы RCA. Независимо от температуры, для всех генотипов наблюдали схожее общее содержание РСА.
Выводы
Три вида риса отличались своей термостойкостью, о чем свидетельствовали различия в вегетативном росте при 45°С. Одомашненный рис, О. sativa, был наиболее восприимчивым к ингибированию теплом, тогда как дикий рис, О. meridionalis, был менее восприимчивым, а О. australiensis проявлял стойкость к тепловому стрессу. Изменчивость стойкости среди видов была связана с уровнем ингибирования фотосинтеза при повышенной температуре, что, в свою очередь, было связано со степенью дезактивации Rubisco. У термостойкого О. australiensis не наблюдали снижения роста, фотосинтеза или активации Rubisco при воздействии 45°С в течение более 2 ч. Для объяснения различий в термостойкости нами было выдвинуто предположение, что различия в структуре активазы между О. australiensis и двумя другими видами, в сочетании с потенциально большим содержанием белка, улучшали термостойкость активации Rubisco у О. australiensis с последующим влиянием на фотосинтез и рост.
Пример 3
Стехиометрия Rubisco и RCA в полевых условиях
Концентрацию Rubisco и RCA определяли с помощью вестерн-блоттинга экстрагированного из листьев общего растворимого белка, откалиброванного относительно очищенной Rubisco и RCA с известной концентрацией.
Для определения концентраций in vivo двух ферментов строили стандартные кривые с использованием очищенного фермента с известной концентрацией. Концентрацию Rubisco определяли с использованием антитела, специфичного к 53 кДа большой субъединице Rubisco. Поскольку четвертичная структура комплекса Rubisco содержит 8 больших и 8 малых (16 кДа) субъединиц, из этих вестернов можно было вывести общее содержание Rubisco. В таблице 4 приведены концентрации Rubisco и RCA для двух видов и соотношение между двумя функционально полными ферментами. Несмотря на существенную изменчивость между биологическими и техническими повторностями, полученную с использованием такого косвенного способа, подтверждения статистически значимых различий между видами отсутствовали. Тем не менее, в отсутствие более точной методики, которая является относительно простой, мы полагали, что эти концентрации заслуживали доверия. Несмотря на некоторую изменчивость, концентрации ферментов in vivo, которые приведены в таблице 10, соответствовали концентрациям, обнаруженным после очистки белка (т.е. концентрациям, достигаемым при экстракции RCA и Rubisco из листьев). Учитывая, что концентрации Rubisco и RCA были определены из одних и тех же образцов ткани, мы могли быть относительно уверенными в сопоставимых соотношениях двух белков по видам. Однако на различия в абсолютной концентрации Rubisco и RCA между видами могли оказывать влияние различия в условиях роста между сборами образцов, в частности в доступности азота, на которые влияет стадия жизненного цикла.
# Миллиграмм белка на грамм свежей массы листьев, по результатам вестерн-блоттинга.
* Мольность основана на функциональной молекулярной массе фермента Rubisco, составляющей 553000 Да, и олигомера RCA с наибольшей активностью, имеющего молекулярную массу 220000 Да на основе анализа нативного геля (представленного в примере 4). Согласно предположению, один грамм свежей массы равен 1 мл объема. Как О. sativa, так и О. australiensis выращивали при 28°С.
Пример 4
Зависимое от концентрации RCA образование олигомера (нативные гели)
Анализ нативного геля позволял наблюдать зависимую от концентрации самоолигомеризацию субъединиц RCA. По сведениям авторов настоящего изобретения, это первый раз, когда нативные гели были использованы для визуализации взаимодействия субъединиц RCA. Другими исследователями была продемонстрирована аналогичная самосборка RCA у хлопчатника и табака с использованием методик флуоресценции и малоуглового рентгеновского рассеивания (Henderson, J. N., Hazra, S., Dunkle, A. M., Salvucci, M. E. & Wachter, R. M. (2013) Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics 1834, 87-97; Wachter, R. et al. (2013) Photosynthesis Res. 117, 557-566). Аналогичным образом, RCA О. australiensis (Оа) и О. sativa (Os) образуют более крупный комплекс посредством самоассоциации при увеличении концентрации фермента. Ингибирование активности активации при низких концентрациях RCA является результатом падения самоассоциирующегося комплекса ниже определенного порога, примерно трех субъединиц RCA. Следует отметить, что из-за различий в изоэлектрических точках белка и физической формы белка, нативные бэнды могли мигрировать на ±15% от ожидаемого, исходя из молекулярной массы.
Вместо увеличения различий по размеру, увеличение концентрации RCA приводило к некоторому диапазону размеров олигомеров RCA, смещаясь от более низких к более высоким молекулярным массам по мере увеличения концентрации. С увеличением концентрации, бета-изоформа, по-видимому, образовывала по меньшей мере три различных молекулярных массы олигомера, в то время как альфа-изоформа встречалась в основном как отдельный олигомер, который переходил к более высоким молекулярным массам при повышении концентрации RCA.
Несмотря на то, что на нативных гелях были обнаружены различные бэнды комплекса RCA и комплекса Rubisco, при смешивании двух ферментов различимый комплекс Rubisco/RCA отсутствовал.
Для определения температурных эффектов на представляющие интерес белковые комплексы образцы инкубировали при 28°С или 38°С в течение 20 минут перед загрузкой на нативные гели. Более высокая температура не мешала отдельным комплексам Rubisco или RCA. Это подтверждало вывод о том, что несмотря на то, что комплексы Rubisco и комплексы RCA от Оа и Os обладали различными характеристиками термостабильности, каждый из них был стабилен при высоких температурах, а взаимодействие Rubisco с RCA (экстрагированной из листьев или рекомбинантной), т.е. комплекс Rubisco-RCA, был термолабильным, особенно у О. sativa (см. фиг. 21).
Разделение на SDS-PAGE очищенной из листьев RCA от О. australiensis и от пшеницы. Общий белок из листьев сначала осаждали в 35% насыщенном сульфате аммония с последующей анионообменной хроматографией с использованием Q-сефарозной среды и различных концентраций солей. Бета-изоформа элюировалась из анионообменника при 0,2 М KCl, в то время как альфа-изоформа элюировалась при 0,5 М KCl. 0,2 М фракцию, содержащую RCA, использовали в последующих анализах взаимодействия RCA с Rubisco пшеницы.
Представлявшие интерес бэнды вырезали из нативных гелей и проводили LC-MS/MS на расщепленных трипсином белках, экстрагированных из этих бэндов. Идентифицированные белки приведены в таблице 11. Идентификация белка была такой же, как ожидалось, с четкой идентификацией двух субъединиц Rubisco и идентификацией RCA с варьирующей молекулярной массой. Два белка, идентифицированные в некоторых из бэндов экстрагированной из листьев RCA, представляли собой глутаминсинтазу и сахаросинтазу. Маловероятно, чтобы происходило взаимодействие между RCA и глутаминсинтазой или сахаросинтазой, более вероятно, что эти белки образовывали комплексы со схожей молекулярной массой с RCA, поэтому занимали одно и то же пространство бэнда. Следует отметить, что только бета-изоформа RCA была идентифицирована во всех бэндах, связанных с RCA, однако учитывая, что две изоформы были идентичны отдельно по 38 аминокислотам на С-конце альфа-изоформы, вполне вероятно, что присутствовали обе, но пептидные последовательности имели более высокую вероятность совпадения идентичных участков и отнесения пептида к бета-, а не к альфа-изоформе.
# Относится к общему числу пептидов, которые совпадали с идентифицированным белком.
Пример 5
Зависимая от концентрации активность RCA
На фиг. 5 показана зависимая от концентрации скорость активации Rubisco у экстрагированной из листьев RCA от О. australiensis и О. sativa, а также альфа- и бета-рекомбинантных изоформ Os (сплошные линии) и Оа (пунктирные линии). Анализ активации Rubisco проводили, фактически как описано в работе Barta, С., Carmo-Silva, A. Е. & Salvucci, М. Е. (2011) Methods Mol. Biol. 684, 375-382, с двумя модификациями: (1) блокированные образцы для анализа на второй стадии сушили на нагревательном блоке перед ресуспендированием в сцинтилляционном коктейле до подсчета; (2) все сообщаемые результаты анализа активации Rubisco были от ингибированной Rubisco, инкубированной с RCA в течение 5 мин. перед определением активности Rubisco. Рекомбинантную RCA получали, как описано в работе Barta, С., Carmo-Silva, А. Е. & Salvucci, М. Е. (2011) Methods Mol. Biol. 684, 363-374. Использовали следующие плазмиды: pEV61, pGA220, pEV63 и pGA221, кодирующие соответственно альфа- и бета-изоформы RCA от О. sativa и альфа- и бета-изоформы от О. australiensis. Аналогично использованным в анализах абсолютным концентрациям RCA, таким же образом назначали мольное соотношение RCA к Rubisco, поскольку реакция активации зависела от концентрации как Rubisco, так и RCA. RCA из листьев Оа могла достигать высоких скоростей активности относительно RCA от Os при использовании высоких концентраций RCA с мольным соотношением RCA к Rubisco 1:6. В этих условиях скорости активации увеличивались по сравнению со скоростями для рекомбинантной формы RCA. Это мольное соотношение было значительно выше того, которое было обнаружено в листе, и отмечено на фиг. 5 вертикальными линиями. Маловероятно, что низкая специфическая активность in vitro у экстрагированной из листьев RCA от Оа отражалась бы in vivo, поскольку показатели скорости фотосинтеза между двумя видами были схожими, чего не было бы, если бы RCA от Оа была функциональной только на уровне 40% от показателей скорости Os. Таким образом, уменьшенная специфическая активность у Оа, по-видимому, была связана с результатами измерения in vitro по все еще неизвестной причине. Что интересно, RCA из листьев Os также имела более низкую специфическую активность по сравнению с ее рекомбинантным аналогом, но различие было минимальным.
Если более низкая специфическая активность, наблюдаемая у RCA, экстрагированной из листьев Оа, должна была быть вызвана неспецифическим ингибирующим веществом, можно было бы ожидать, что такое вещество также будет ингибировать и рекомбинантную RCA. Для того, чтобы проверить это, нами был проведен эксперимент по смешиванию, в котором экстракт листьев Os, из которого была устранена RCA, добавляли к рекомбинантной бета-RCA Оа и RCA с измеренной активностью (фиг. 6). Не наблюдали ингибирования рекомбинантного белка при добавлении к нему экстракта листьев с устраненной RCA.
Пример 6
Теплостабильность RCA
2
Для определения теплостабильности RCA использовали три методики. С помощью двух методик, анализа связанного НАДН и фосфатного анализа, измеряли гидролиз АТФ посредством RCA, который является функцией, которую фермент выполняет независимо от присутствия Rubisco, но которая особенно необходима для активации Rubisco. С помощью третьей методики, анализа активации Rubisco, непосредственно измеряли способность RCA активировать Rubisco путем оценки связывания CO. Для всех трех методик необходимо, чтобы RCA была очищена, по меньшей мере частично. Для анализов активации Rubisco, перед постановкой экспериментов необходимо было очистить Rubisco, а также RCA. В экспериментах применяли либо частично очищенную RCA из экстрактов листьев, либо полную очистку рекомбинантного белка, экспрессированного в Е.coli.
Пример 7
Экспрессия гена рекомбинантной RCA и очистка белка
Трансформированная Е.coli, содержащая векторы pEV61 (содержащий ген rcaIOs-2Pb (кодирующий длинную изоформу RCA О. sativa)), pEV63 (содержащий ген rca10au-2Pb (кодирующий длинную изоформу RCA О. australiensis)), pGA220 (содержащий ген rcaIIOs-3Pb (кодирующий короткую изоформу RCA О. sativa)) и pGA221 (содержащий ген rcaIIOau-3Pb (кодирующий короткую изоформу RCA О. australiensis)) для экспрессии у О. sativa и О. australiensis и изоформ RCA. Плазмидные карты этих векторов приведены на фиг. 7. Экспрессия и очистка RCA позволяли проводить анализ теплостабильности фермента. Поскольку вектор экспрессии обеспечивал образование относительно высоких концентраций белка, белок можно было очистить до высокой степени очистки. В противоположность этому, более низкие концентрации RCA, экстрагированной из листьев, не позволяли очистить экстрагированную из листьев RCA до такой же степени, поскольку разведение во время гель-фильтрационной хроматографии приводило к потере комплекса RCA и, следовательно, к невозможности очистки белка до высокой степени.
Все векторы, за исключением pGA221, экспрессировали RCA, и на каждые 100 мл клеточной культуры было очищено примерно 2,5 мг белка. Очистка рекомбинантной RCA включала осаждение RCA путем добавления насыщенного сульфата аммония в гомогенизированный экстракт клеток Е.coli. Затем осажденную RCA суспендировали в буфере, и загружали на колонку для гель-фильтрации, и собирали соответствующий пик. В результате второй хроматографической стадии прохождения RCA через сильную анионообменную колонку получали конечную очищенную RCA. В результате прогона очищенного белка на геле была видна степень очистки, при этом практически не было видно никаких других белков.
Пример 8
RCA из экстрактов листьев и частичная очистка
14
В отличие от очистки рекомбинантного белка, очистка RCA из экстракта листьев была более сложной задачей, поэтому RCA риса до этого момента никогда не подвергали анализу in vitro. Пара попыток очистить экстрагированную из листьев RCA аналогично очистке рекомбинантного белка провалились. Проблема с экстрагированной из листьев RCA заключалась в ограниченном количестве RCA, доступной на единицу листа, и в наличии протеаз, которые быстро расщепляли белок. Была возможна частичная очистка RCA из экстракта листьев, которая предусматривала осаждение RCA насыщенным сульфатом аммония с последующим обессоливанием. Хотя RCA была далеко не единственным белком, оставшимся в образце, ее содержание было преобладающим, а на гелях было видно лишь незначительное расщепление протеазами. Поскольку RCA является единственным белком, ответственным за активацию Rubisco, присутствие других белков в образце мало влияло на результаты анализа активации C-Rubisco. Пригодны анализы активации, выполняемые на образцах RCA, экстрагированной из листьев, поскольку влияние посттрансляционных модификаций и белок-белковых взаимодействий на активность RCA по меньшей мере частично согласованы. Другими словами, этот анализ был более репрезентативен в том, что можно будет ожидать in vivo в трансгенных растениях.
Из результатов анализа изображений SDS-PAGE гелей частично очищенных экстрактов листьев было видно, что О. australiensis имел более низкое содержание RCA, что было учтено в некоторых результатах активации Rubisco. Тем не менее, концентрация RCA по отношению к частично очищенному белку, экстрагированному из листьев, была схожей между О. sativa и О. australiensis, составляя приблизительно 25% частично очищенного белка для обоих видов. Схожие концентрации RCA между видами, наблюдаемые в экстрактах листьев, очень важны для экспрессии генов и содержания белка.
На гелях было видно большее содержание изоформы у О. sativa относительно О. australiensis, причем О. sativa имел примерно равные количества двух изоформ, тогда как О. australiensis имел гораздо больше β-изоформы, чем а. Соотношение двух изоформ, по-видимому, изменялось с температурой роста. В частности, О. saliva, выращиваемый в течение 72 часов при повышенной дневной температуре 40°С, практически не имел видимой β-формы, но существенно больше α-формы относительно растений, выращиваемых при дневной температуре 30°С.
Пример 9
Очистка Rubisco
Для анализа активации Rubisco также необходима очищенная Rubisco в анализе. Один грамм массы свежих листьев давал на выходе примерно один миллиграмм Rubisco. Очистка Rubisco включала экстракцию из листьев с последующим осаждением белка насыщенным сульфатом аммония. После осаждения сульфатом аммония образец пропускали через градиент сахарозы с применением высокоскоростного центрифугирования, при этом большой комплекс Rubisco мигрировал в более высокие концентрации сахарозы. После разделения по градиенту сахарозы образец отделяли путем анионообменной хроматографии, получая в результате высокочистый экстракт Rubisco.
Пример 10
АТФазные анализы
+
i
Для того, чтобы активировать Rubisco, для RCA необходим АТФ. АТФазная активность RCA напрямую не связана с активностью активации Rubisco, так как Rubisco не нужна для прохождения гидролиза АТФ. АТФазную активность RCA от обоих видов (Оа и Os) измеряли в диапазоне температур. Для определения АТФазной активности применяли два альтернативных способа. Сначала измеряли реакцию связывания, включающую превращение НАДН в НАД и последующее изменение поглощения на 340 нм (фиг. 8). В качестве альтернативы, измеряли образование фосфата при превращении АТФ в АДФ + P (фиг. 9). Для обоих способов наблюдали схожу температурную реакцию.
Из результатов обоих анализов на основе АТФазной активности было видно, что независимо от вида, β-изоформа обладала значимо более высокой специфической активностью, чем α-изоформа.
Для сравнения температурной реакции между двумя способами, применяемыми для определения гидролиза АТФ (реакция связывания фосфата и НАДН), нормализованные значения, полученные при помощи обоих способов, совместно наносили на график (фиг. 10).
Пример 11
14
Анализы активации С Rubisco
Двухступенчатый анализ, в котором RCA первоначально инкубировали с инактивированной Rubisco в течение заданного периода времени с последующими измерениями специфической активности Rubisco, позволял определить эффективность активации Rubisco посредством RCA. Во всех экспериментах инактивированную Rubisco инкубировали с RCA в течение пяти минут при заданных температурах. Общую активность Rubisco, независимо от RCA, определяли путем удаления Rubisco из инкубационной смеси, что позволяло всем центрам Rubisco стать активными. Следует отметить, что при температурах до 42°С общая активность не падала, а несколько увеличивалась. Отсутствие снижения общей активности Rubisco с повышением температуры подтверждало общее мнение о том, что RCA является термолабильной, в то время как Rubisco относительно нечувствительна к высокой температуре (Salvucci, М. Е. & Crafts-Brandner, S. J. (2004) Plant Physiol. 134, 1460-1470; Crafts-Brandner, S. J. & Salvucci, М. Е. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 13430-13435).
Были проведены две независимые серии экспериментов по измерению активности экстрагированной из листьев RCA. Фиг. 11 относится к RCA, экстрагированной из листового материала. RCA экстрагировали из листового материала три раза, а результаты были основаны на трех биологических повторностях и до восьми технических повторностях. Измерения проводили при 25, 30, 34, 36, 38, 40 и 42°С. Значения активации не были скорректированы с учетом различий в концентрации RCA между этими двумя видами, поскольку не было известно количество очищенного белкового экстракта, добавляемого к каждому анализу. Поэтому изменение активации с температурой было более информативным, чем приведенные абсолютные значения (фиг. 11a).
Затем значения корректировали по разностям концентраций RCA между двумя видами (фиг. 11b).
Os
Os
Oa
Из активации Rubisco было видно, что RCA была активнее при температуре 30°С, но активность RCA резко снижалась при температуре 36°С и выше. В противоположность этому, RCA была менее активна при умеренных температурах, но фермент сохранял близкую к постоянной скорость до температуры 42°С. Из анализа индивидуально построенных кривых получали пик эффективности активации RCA 29,9±0,5°С для О. sativa и 33,0±0,3°С для О. australiensis.
Oa
Oa
После учета различий в концентрации белка RCA между видами активация при 36°С существенно не различалась между видами (как показано на фиг. 11b). Кроме того, при более высоких температурах 38°С и 42°С активность RCA была выше. При нормализации скорректированных по белку значений к 30°С стойкость активности RCA при температурах выше 38°С была еще более очевидной (см. фиг. 11 с).
Os
Oa
Также проводили анализ активации Rubisco рекомбинантным очищенным белком (фиг. 12). Рекомбинантный белок измеряли при 30°С и 36°С. Интерпретации результатов предыдущей работы приводили к ожиданию того, чтобы более высокое соотношение α-изоформы к β улучшило бы теплостабильность фермента. Тем не менее, при увеличении соотношения α-изоформы активность комплекса RCA падала. Падение активности с увеличением α-изоформы было более выраженным для О. sativa и особенно при 30°С, чем при 36°С, однако такой паттерн, по-видимому, имел место как для вида, так и для температур. Что интересно, хотя β-изоформа RCA обладала более высокой активностью, чем RCA, имело место небольшое различие в активности α-изоформы между видами.
До настоящего времени теплостабильность RCA листьев Оа была измерена только на уровне активированной фракции, составлявшем ≤0,1 RCA листьев Оа, а теперь она была измерена в виде показателей скорости активированной фракции >0,3 путем увеличения концентрации экстрагированного из листьев белка и, следовательно, концентрации RCA. Для оценки того, сохранялась ли теплостабильность RCA листьев Оа, даже если активность совпадала с активностью Os, строили кривую температурной реакции активации Rubisco с различными концентрациями экстрагированной из листьев Оа RCA (фиг. 13).
-1
-1
Если активация Rubisco в экстрактах Оа усиливалась при использовании концентраций ферментов, сравнимых с концентрациями в экстрактах Os, значит RCA из листа Оа характеризовалась превосходной теплостабильностью относительно RCA из Os. Наивысшая измеренная концентрация RCA Оа имела такую же абсолютную скорость, как и у RCA Os при 25°С. Выше 25°С активность RCA Оа превосходила RCA Os и при 42°С Оа имела абсолютную скорость изменения активности, в четыре раза превышавшую таковую у Os. Из текущих результатов видно, что теплостабильность несколько снижалась, когда концентрация достигала 0,96 мг/мл, с почти 50% снижением активности при 42°С относительно 30°С по сравнению с менее 20% падением при концентрациях 0,24 и 0,49 мг.мл. Это могло отражать стехиометрическую взаимосвязь между RCA и Rubisco. Однако, даже при такой «высокой» концентрации, активированная фракция была все еще значительно выше 80% уменьшения с помощью RCA Os при сравниваемых температурах.
Пример 12
Термостабильность олигомера RCA риса
Os
Oa
m
m
m
Дифференциальная сканирующая флуориметрия (DSF) является относительно новым и простым способом определения термической стабильности белков. Он основан на сигнале от красителя, который предпочтительно флуоресцирует в неполярной (несложенном белке), а не в полярной среде (сложенном или агрегированном белке). DSF проводили на рекомбинантных RCA и RCA с применением оранжевого красителя SYPRO и линейного изменения температуры 1°С в минуту от 25°С до 90°С (фиг. 14). Значения первой производной (dR) флуоресценции наносили на график относительно температуры, причем температура плавления белка (T) была температурой, при которой первая производная была максимальной. T представляет собой температуру, при которой имели место равные концентрации сложенного и несложенного белка. На фиг. 14 показано, что все четыре варианта RCA имели T от 41 до 43°С. Это подтверждало основные заключения, сделанные по результатам АТФазной активности. В частности, что олигомер RCA является теплостабильным при температурах до 40°С и что существует небольшое различие в теплостабильности олигомера RCA между двумя видами.
Пример 13
Теплозависимая регуляция изоформ RCA
Исследовали содержание белков альфа- и бета-изоформ RCA из подвергнутых тепловой обработке растений риса и те же образцы подвергали анионообменной хроматографии и гнали на SDS-PAGE гелях. Польза от стадии анионообменной подготовки образцов заключалась в том, что две изоформы RCA можно было увидеть более четко. Что интересно, в Оа присутствовало гораздо меньше альфа-изоформы, чем на вид присутствовало в исходных осажденных сульфатом аммония образцах. Возможно, присутствовал перекрывающий белок, что делало похожим, будто бы предыдущие образцы Оа имели большее содержание альфа-изоформы.
Из результатов анализа изображений SDS-PAGE гелей наряду с экспрессией гена изоформы RCA виден достаточно схожий паттерн реакции на более высокие температуры роста между экспрессией гена и содержанием белка для двух изоформ Os (фиг. 15). Анализ экспрессии гена изоформы RCA проводили, как описано в работе Scafaro, A. P., Haynes, P. А. & Atwell, В. J. (2010) J. Exp. Bot. 61, 191-202. При повышенной температуре, как экспрессия гена, так и содержание белка альфа-изоформы Os увеличивались в течение 24 часов, но затем выравнивались и падали. Несмотря на схожую реакцию изоформы RCA Os на повышенную температуру, наблюдали выраженное количественное расхождение между экспрессией гена и содержанием белка, поскольку альфа-изоформа составляла лишь 30% мРНК бета-RCA, но белка альфа-RCA было на 50% больше, чем бета-RCA спустя 24 ч при 38°С. В отличие от Os, нагревание увеличивало экспрессию альфа-изоформы Оа, но не повышало альфа-изоформу белкового продукта.
Пример 14
Зависимая от концентрации специфическая АТФазная активность (рекомбинантный белок)
Oa
Os
Ингибирование активации Rubisco при низкой концентрации RCA могло быть связано либо с невозможностью самосборки белка в функционирующий олигомер, либо с положительным аллостерическим взаимодействием между RCA и Rubisco. Для установления того, какое явление объясняет потерю функции при низкой концентрации RCA, специфическую активность гидролиза АТФ посредством RCA определяли в диапазоне концентраций RCA (фиг. 16). АТФазная активность RCA не зависит от Rubisco и обусловлена образованием аутоагрегирующего олигомера. Поэтому разумно было предположить, что гидролиз АТФ посредством RCA является наиболее прямым показателем функционирования самовзаимодействующего ферментного олигомера. Результаты, представленные на фиг. 16, подтверждали вывод о том, что низкие концентрации RCA ограничивали образование олигомеров, что приводило к потере активности RCA. Это было очевидным из того, что специфическая активность гидролиза АТФ падала при низких концентрациях RCA. Если бы олигомер RCA не ингибировался низкой концентрацией RCA, специфическая активность была бы постоянной, так как концентрация фермента была бы скрыта при расчете специфической активности. Из результатов предыдущих исследований на шпинате также было видно, что АТФазная активность ингибировалась низкими концентрациями RCA, что объясняли влиянием концентрации на аутоагрегирующий олигомер (Wang, Z. Y., Ramage, R. Т. & Portis Jr, A. R. (1993) Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Protein Structure and Molecular Enzymology 1202, 47-55). Следует отметить, что ингибирование АТФазной активности при низкой концентрации было больше для RCA, чем для RCA, и особенно для альфа-, чем для бета-изоформы, что совпадало с ограничениями зависящей от концентрации активации Rubisco.
Пример 15
Температурная реакция рекомбинантной RCA
Из температурной реакции частично очищенной экстрагированной из листьев RCA от вида Oryza было видно, что активность активации Rubisco у RCA от О. sativa была чувствительна к температурам 36°С и выше (фиг. 11). В противоположность этому, активность активации Rubisco у экстрагированной из листьев RCA от О. australiensis была стабильна при всех измеренных температурах до 42°С.
Oa
Os
Oa
Os
Гидролитическую активность в отношении АТФ оценивали, как описано в работе Barta, С., Carmo-Silva, А. Е. & Salvucci, М. Е. (2011) Methods Mol. Biol. 684, 375-382. Рекомбинантная RCA имела более низкую гидролитическую активность в отношении АТФ, чем RCA в сравнимых концентрациях (фиг. 9). На фиг. 17 показан график теплостабильности олигомера RCA, которую определяли по АТФазной активности, относительно теплостабильности комплекса RCA-Rubisco, которую определяли по RCA-опосредованной активации Rubisco. Температурная стабильность гидролиза АТФ у рекомбинантной RCA совпадала с температурной стабильностью у RCA, причем обе они были теплостабильными и не теряли активность до 40°С (фиг. 9), что значительно превышало ингибирование активности активации Rubisco у рекомбинантной RCA (фиг. 17). Поэтому взаимодействие RCA с Rubisco было важным фактором в теплостабильности активности активации у RCA, намного большим, чем чувствительность RCA к температуре в изолированном состоянии.
Пример 16
Тепловая стабильность олигомерной RCA относительно тепловой стабильности RCA-Rubisco
Интересно было рассмотреть термолабильную природу комплексов рекомбинантной RCA-Rubisco О. sativa и О. australiensis, которые представлены сплошными линиями на фиг. 17. Поскольку аутоагрегирующий рекомбинантный олигомер RCA (О. sativa и О. australiensis) был теплостабильным (определяли по теплостабильности гидролиза АТФ, который свидетельствовал о функциональном белке), хотя комплекс RCA-Rubisco был термолабильным (определяли по активности активации Rubisco у RCA, которая зависела от взаимодействий RCA и Rubisco), чувствительность RCA к нагреванию у риса, таким образом, должна была быть обусловлена белок-белковыми взаимодействиями RCA с Rubisco, а не взаимодействием RCA самой с собой. На фиг. 17 показан график теплостабильности олигомера RCA, которую определяли по АТФазной активности, относительно теплостабильности комплекса RCA-Rubisco, которую определяли по RCA-опосредованной активации Rubisco. Результаты подтверждали тепловую восприимчивость комплекса RCA-Rubisco как ограничение активации Rubisco для обоих видов.
Пример 17
Взаимодействие RCA с Rubisco О. australiensis
Os
Oa
До настоящего времени для всех экспериментов по активации Rubisco применяли Rubisco, экстрагированную и очищенную из О. sativa. Изучение взаимодействия RCA и RCA с Rubisco О. australiensis является важным, учитывая, что взаимодействие RCA-Rubisco имеет решающее значение для температурного ограничения активности RCA. На фиг. 18 приведено сравнение зависящей от температуры реакции как рекомбинантной, так и экстрагированной из листьев RCA относительно Rubisco, экстрагированной и очищенной из двух видов. Далее приведены основные результаты исследования.
- Независимо от применяемой Rubisco, рекомбинантная RCA была термолабильной.
- При взаимодействии с Rubisco О. australiensis улучшалась теплостабильность экстрагированной из листьев RCA, но не с Rubisco О. sativa.
Из результатов видно, что первичная структура Rubisco из О. australiensis отличалась от первичной структуры Rubisco из О. sativa и что Rubisco могла влиять на стабильность комплекса RCA-Rubisco. Из взаимодействий между экстрагированной из листьев Os и Оа RCA и Rubisco Os и Оа (фиг. 18), представлялось, что уменьшенная активность активации Rubisco у экстрагированной из листьев RCA при окружающей температуре, по сравнению с рекомбинантной RCA, была связана с повышенной теплостабильностью активности активации Rubisco у экстрагированной из листьев RCA при более высокой температуре.
Пример 18
Регуляция альфа- и бета-изоформы RCA представляла собой теплозависимую положительную регуляцию альфа-изоформы
При повышенной температуре роста от 28 до 38°С наблюдали увеличение экспрессии мРНК альфа-изоформы RCA. Экспрессия бета-изоформы оставалась относительно постоянной, причем высокие температуры роста увеличивали соотношение альфа-изоформы к бета-изоформам RCA (фиг. 19). Увеличение соотношения альфа-изоформы к бета-изоформе под воздействием тепла было одинаковым как для О. sativa, так и для О. australiensis, что свидетельствовало об общем паттерне регуляции генов у обоих видов. Увеличение экспрессии альфа-изоформ достигало пика в течение 72 ч воздействия тепла до начала небольшого снижения к 120 ч тепла. Спустя 48 часов снижения температуры роста до 28°С уровень мРНК альфа- - бета-изоформы возвращался к уровням до тепловой обработки.
Содержание белка альфа- и бета-изоформ RCA было пропорциональным уровням мРНК. При визуализации частично очищенных экстрактов RCA, которые гнали на SDS-PAGE, наблюдали большее содержание белков альфа-RCA с 72 ч теплового воздействия и далее. В отличие от экспрессии РНК, заметного увеличения содержания альфа-изоформы до 72 ч не наблюдали, но имело место большее содержание при 28°С после восстановления от теплового воздействия. Результаты свидетельствовали о том, что содержание белка имело 48 ч отставание от изменений в экспрессии генов.
Для проверки, влияли ли изменения состава изоформы комплекса RCA на теплостабильность ферментативной функции RCA, при 28 и 38°С измеряли влияние температуры на активацию Rubisco у RCA, экстрагированной из растений, с течением времени тепловой обработки, и результаты показаны на фиг. 20. Теплостабильность RCA не улучшалась в результате увеличения соотношения альфа- к бета-изоформе. Собственно, теплостабильность RCA незначительно падала у обоих видов, если имело место большее наличие альфа-изоформы.
Пример 19 Способность RCA от риса активировать Rubisco пшеницы
пшеницы
Для определения активности активации у RCA риса и RCA пшеницы на Rubisco из пшеницы (Rubisco), проводили частичную очистку RCA из листьев. Альфа- и бета-изоформы разделяли с помощью анионообменной хроматографии и использовали бета-изоформу для определения активности активации Rubisco. Использовали бета-изоформу, поскольку она имела более высокую степень чистоты RCA и меньше Rubisco, чем фракция альфа-изоформы. Несмотря на далеко не идеальную чистоту (прим. 60-70% от общего белка), образцы имели более высокую степень чистоты, чем образцы после осаждения в сульфате аммония, ранее использованные (см. фиг. 5, 11 и 13) для экспериментальных исследований экстрагированной из листьев RCA (прим. 30-40%).
-1
-1
При сравнении Rubisco из двух видов риса и пшеницы, наблюдали схожу реакцию на температуру (фиг. 22А). Для всех трех видов специфическая активность полностью карбамилированной Rubisco варьировала в диапазоне от 0,5 до 0,8 ед.мг по диапазону измеряемых температур, и для всех наблюдали небольшое увеличение активности с ростом температуры. Для ингибированной Rubisco без добавления RCA также наблюдали небольшое увеличение специфической активности с повышенной температурой, и все три вида имели схожую скорость, никогда не превышавшую 0,2 ед.мг.
пшеницы
пшеницы
пшеницы
Os
При активации Rubisco экстрагированной из листьев бета-изоформой, при умеренной температуре ниже 34°С, RCA пшеницы была по меньшей мере в два раза активнее, чем изоформы RCA риса (фиг. 22 В). Выше 34°С наблюдали меньшие различия в результате более сильного ингибирования Rubisco при более высоких температурах. Кривая температурной реакции RCA пшеницы, воздействующей на Rubisco, была схожей с экстрагированной из листьев RCA от риса, воздействующей на Rubisco (фиг. 11), с небольшим снижением от 25 до 34°С, но более выраженным снижением, если температура достигала 38 и 42°С.
Os
Oa
пшеницы
риса
пшеницы
риса
пшеницы
В секции С на фиг. 22 показано, что рекомбинантные формы RCA и RCA были способны активировать Rubisco в той же степени, что и активация Rubisco из риса (Rubisco). В отличие от результатов, полученных от экстрагированной из листьев RCA, результаты, полученные от рекомбинантной RCA, свидетельствовали, что RCA от обоих видов риса была способна активировать Rubisco в той же степени, что и Rubisco, и поэтому полностью совместима с Rubisco.
Пример 20
Эксперимент с ростовой камерой на трансгенных линиях риса при высокой дневной температуре на уровне 45°С
Векторы экспрессии растений и трансформация
Кодирующие последовательности для кодирующего участка короткой RCA (rcaII) и длинной RCA (rcaI) от О. australiensis были получены с помощью химического синтеза ДНК и адаптированы под частоту использования кодона у риса. Получали различные векторы (фиг. 7) с использованием синтетических генов с полной последовательностью rcaIIOa (SEQ ID NO 52) и с 5АА укороченной последовательностью rcaIIOa (SEQ ID NO 51), а также с полной последовательностью rcaIOa (SEQ ID NO: 50). Во всех векторах ген находился под управлением промотора rcaI от О. meridionalis (SEQ ID NO 53). Промежуточный вектор клонирования (например, pTKAW39, pTKA40, pTNVS299) был сконструирован в Escherichia coli. Посредством теплового шока его переносили в акцепторный штамм Agrobacterium tumefaciens. Agrobacterium-опосредованный перенос гена промежуточного вектора(векторов) клонирования приводил в результате к переносу фрагмента ДНК между граничными повторами Т-ДНК в геном растения.
В качестве целевой ткани для трансформации незрелый зародыш или полученный из зародышей каллюс, который был получен из сортов риса japonica и indica, разрезали на мелкие кусочки, по сути с помощью методики, описанной в патентной РСТ публикации WO 92/09696. Agrobacterium в течение нескольких дней совместно культивировали с рисовыми тканями, а затем удаляли с помощью подходящих антибиотиков. Трансформированные рисовые клетки отбирали путем добавления глюфосината аммония (с фосфинотрицином 5 мг/л) в среду для культивирования рисовой ткани.
Каллюс, растущий на средах с глюфосинатом аммония, переносили в регенерационную среду. После развития проростков с корнями и побегами, их переносили в почву и помещали в теплицу.
Генотипы
Тестировали пять трансгенных линий, под номерами 475-479. Информация о тестируемых растениях приведена в таблице 12.
Схема эксперимента
-2
-1
Трансгенный рис (гомозиготные Т3 линии с одной копией rcaIIOa) и объединенные в пул незиготические линии высевали в поддоны для сева с 66 лунками после того, как семена были пропитаны водой в течение 1,5 дня. Всходы пересаживали в 9 см горшки спустя 20 дней и для эксперимента выбирали 14 экземпляров со схожим размером/высотой (визуальная оценка). Применяли схему рандомизированных блоков с пограничными растениями. Нормальными/контрольными условиями ростовой камеры были 12 ч освещения (примерно 300 мкмоль м с PAR), 22°C в течение ночи и 28, 29°С в течение дня. Максимальную температуру задавали в течение 12 ч в ходе светового периода, в то же время растения выдерживали при 22°C в течение ночи. Температуру повышали поэтапно от 28/29°С до 45°С в течение 48-часового периода через 10 дней после пересадки (через 30 дней после посева). См. фиг. 23 для температурных условий после достижения 45°С (высокой дневной температуры). Относительную влажность поддерживали на уровне от 60 до 70% в течение всего эксперимента.
Показатели скорости удлинения листьев (LVDT)
-1
Удлинение листьев измеряли на растениях каждый день в течение пяти последовательных дней, один раз в «утренний период» (с приблизительно 9 утра до приблизительно 1 часа дня) и снова в «дневной период», который начинался к 2 часам, когда растения прикрепляли к устройству. Таким образом, измерения «дневных» растений прекращали следующим утром. Одно растение каждого генотипа (пять жизнеспособных трансгенных линий и один незиготический контроль) прикрепляли к системе шкивов и начинали считывания, причем длину листа регистрировали 10 раз в час. Питательную среду обильно вносили всем образцам. Растения последовательно выбирали из 14 блоков, и для каждого из десяти измерений, проводимых в течение пяти дней, был необходим новый молодой растущий лист. Показатели скорости удлинения анализировали обычным способом с помощью журналов в электронных таблицах Excel для расчета показателей скорости (мм ч) в течение периода устойчивого удлинения в наиболее жаркий период. Показатели скорости значимо не отличались между генотипами в течение ночи.
Листовой газообмен
После 2 недель обработки высокой дневной температурой, осуществляли измерения листового газообмена при пиковой дневной температуре. С помощью открытой системы инфракрасного газоанализатора LI-6400XT (LI-COR Inc., Линкольн, Небраска, США) регистрировали следующие параметры:
n
2
a) показатели скорости нетто-фотосинтеза (A) при насыщающем свете 1500 PAR (встроенный источник света листовой камеры LI-6400XT) и при 400 ppm CO и 45°С (температурные условия блока),
c,max
n
i
2
2
b) максимальные показатели скорости карбоксилирования Rubisco (V), полученные из углового коэффициента кривых A от C (внутренняя концентрация CO под устьицем), которые регистрировали путем поэтапного изменения концентрации CO вокруг листа внутри листовой камеры,
n
c) скорость индукции A в ходе переходов от темнового к световому периоду, при котором растения подвергались условиям низкой освещенности (примерно 50 PAR) в течение приблизительно 30 минут, а затем измеренный лист освещали 1500 PAR, при этом происходило увеличение An на протяжении некоторого периода времени (примерно 15 мин.).
Начальный угловой коэффициент брали как заменитель индукционной кинетики фотосинтеза и, следовательно, активации Rubisco (Carmo-Silva and Salvucci, 2013 Plant Physiol. 161, 1645-1655; Yamori et al., 2012 Plant J. Cell Mol. Biol. 71, 871-880).
Проводили статистический анализ (дисперсионный анализ) с помощью локально разработанного R-пакета.
Время цветения / биомасса / масса семян
Для каждого растения регистрировали дни до цветения. После того, как первое растение начинало цвести, температуру снижали до 28, 29°С (контрольные условия) во избежание стерилизации пыльцы. Все растения собирали в полной степени зрелости и учитывали количество ростков, метелок и семян, а также принимали во внимание силу (визуальная оценка от 1 до 6), завязь семян (%), свежую и сухую массу (г) на растение. Массу семян регистрировали после сушки семян.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Активация Rubisco и фотосинтез
n
c,max
n
c,max
n
-1
У трансгенных растений риса 479 с вектором pTKAW39 наблюдали более высокие значения A и V по сравнению с их незиготическими контролями через 2 недели тепловой обработки (фиг. 24), в то время как у других четырех линий наблюдали схожий A и тенденцию к увеличению V. Скорость индукции активности Rubisco (угловой коэффициент A мин.) была значимо выше у трансгенных растений 479 с вектором pTKAW39 (22%) и выше у 477 (pTKAW40), чем у незиготических аналогов, свидетельствуя о благоприятном эффекте коротких вариантов RCA О. australiensis (rcaIIOa) на активацию Rubisco. Таким образом, экспрессия rcaIIOa, по-видимому, способствовала улучшению фотосинтетических характеристик при тепловом стрессе.
Скорость удлинения листьев (LER)
-1
Шесть линий растений, под номерами 472-479, и незиготический контроль, 480, тестировали на скорость удлинения листьев (LER), и результаты приведены в таблице 13 и таблице 14. Эти показатели скорости являются средними, рассчитанными для периода нагрева, как определено на фиг. 23. LER снижалась приблизительно на 50% в течение периода нагрева, что отражало увеличение ингибирующего эффекта, поскольку тепло оказывало свое влияние на метаболизм, но к следующему утру восстанавливалась до уровня 6-8 мм ч. Линии 475 и 479 удлинялись быстрее, причем линия 475 была единственным генотипом, который был значимо быстрее, чем другие семь генотипов, хотя линия 479 не удлинялась значимо медленнее, чем линия 475.
Развитие ростков
Количества ростков подсчитывали для растений в каждом блоке спустя неделю тепловой обработки (шестинедельные растения) в качестве показателя развития побегов (таблица 14). Количества ростков повторно подсчитывали спустя семь недель тепловой обработки, и они показаны на фиг. 30. Линия 479 всегда имела значимо больше ростков (7 на растение), чем остальные линии, в том числе контроль (линия 480).
На фиг. 31 показаны результаты подсчета ростков на растение для восьми линий, подсчитанных у шестинедельных растений, которые были подвергнуты в течение одной недели дневными температурами на уровне 45 С, как описано на фиг. 23. Линии 1-8 приведены соответственно в порядке 474, 472, 478, 476, 473, 475, 480 (контроль) и 479.
Специалистам в настоящей области техники будет понятно, что в настоящее изобретение могут быть внесены многочисленные изменения и/или модификации, как показано в конкретных вариантах осуществления, без отступления от сущности или объема технологии, которая описана в наиболее широком смысле. С учетом вышесказанного, настоящие варианты осуществления необходимо рассматривать во всех отношениях как иллюстративные, а не ограничивающие.