Полиморфизм гена каппа-казеина у быков-производителей

компетенции и воспитывает системность мышления, кругозор, способность ставить и решать задачи, выходящие за пределы «чистой» математики; 2. Дисциплина «Математика» имеет значительный

воспитательный потенциал и наряду с формированием профессиональных компетенций способствует становлению ряда надпрофессиональных компетенций и личностных качеств будущих инженеров и технологов, сочетает воспитание его профессиональных, деловых, этических, культурных качеств.0 с. 2. Кондратьев, В.В. Методология науки и высшего профессионального образования/ В.В. Кондратьев. - Казань: Изд-во Казан. Гос. Технол. Ун-та, 2001. - 152 с. 3. Осипов, П.Н. Инновационная воспитательная деятельность в техничес-ком ВУЗе/ П.Н. Осипов. - Казань: Школа, 2007. -223 с.

РОЛЬ ДИСЦИПЛИНЫ «МАТЕМАТИКА» В ПОВЫШЕНИИ КАЧЕСТВА ПОДГОТОВКИ ИНЖЕНЕРНЫХ КАДРОВ НА ФАКУЛЬТЕТЕ БИОТЕХНОЛОГИИ И

СТАНДАРТИЗАЦИИ

Матвеева С. Г.

Резюме

В статье рассматривается роль дисциплины «Математика» в формировании ключевых компетенций будущих специалистов -выпускников факультета биотехнологии и стандартизации.

THE ROLE OF SUBJECT «MATHEMATIC» IN RASING THE QUALITY OF TRAINING ENGINEERS ON THE FACULTY OF BIOTECNOLOGY AND

STANDARDIZATION

Matveeva S.G.

Summary

The article is devoted to uncovering the key competitions of future specialties - the graduates of the faculty of biotechnology and standardization with the help of teaching mathematics.

УДК 636.2.034:636.2.082.2

ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНА КАППА-КАЗЕИНА У БЫКОВ-ПРОИЗВОДИТЕЛЕЙ

Муллахметов Р.Р., Ахметов Т.М., Тюлькин С.В.

Казанская государственная академия ветеринарной медицины

Ключевые слова: бык-производитель, каппа-казеин, генотип, полиморфизм, ПЦР, ДНК.

Key words: bull-producer, kappa-casein, genotype, polymorphism, PCR,

DNA.

Учёными показана прямая выгода от использования быков-производителей, несущих в своем геноме В-аллель каппа-казеина в зонах, связанных с сыроварением. Концентрация ценного В-аллеля каппа-казеина в отечественных стадах чёрно-пёстрого корня ничтожно мала, что вызывает тревогу за настоящие и будущие качественные показатели молока от этих пород. Ведь достаточно найти несколько быков с В-аллелем или сделать заказное скрещивание с целью получить гомозиготных (ВВ) быков-производителей. Используя таких быков в селекции, можно не только не потерять или поддерживать концентрацию В-аллеля в маточном поголовье, но и главное - получать весьма ощутимую экономическую прибыль (Е.А. Денисенко, 2004).

Спрос на сыры постоянно растёт, объёмы производства увеличиваются, ассортимент расширяется. В таких странах как Франция, Германия, Италия, Дания, США, Канада на производство сыра расходуется от 30 до 40% заготовляемого молока. В РФ на данный момент этот

показатель в среднем составляет около 5%. Среди причин, отрицательно

сказывающихся на функционировании и развитии сыродельной промышленности, важное место занимают недостаточные объёмы производства и низкое качество заготовляемого молока.

Принимая во внимание современные тенденции селекции на

качество сырья с точки зрения диетических и технологических свойств

молока, информация о генотипах аллелей молочных белков является у

племенных животных существенным фактором, который должен быть

учтён при разведении породы, особенно в стратегии выбора быков для

стада. В селекции крупного рогатого скота 90-96% генетического

^ /~1 ^

прогресса в стаде зависит от вклада производителей. С этой целью

большое внимание обращено на комплектование племпредприятия быками-производителями. Использование метода ПЦР-диагностики позволяет проводить широкомасштабные исследования генетического полиморфизма и отбор животных с желательными аллельными вариантами (Е.А. Денисенко, 2004; А.В. Баршинова, 2005; Л. А. Калашниковой, Т.Б. Ганченковой, 2008).

Всё выше сказанное говорит о том, что изучению полиморфизма гена каппа-казеина у быков-производителей уделяется большое внимание.

Материал и методика исследований. Для проведения исследований было отобрано 70 быков-производителей в ГУП ГПП «Элита» Высокогорского района РТ. В нашем исследовании использовались как чистопородные, так и помесные по голштинской породе быки-производители, все быки имели комплексный класс элита-рекорд.

Для определения полиморфизма гена каппа-казеина в стаде, у подопытных быков-производителей были отобраны пробы крови.

Кровь, полученную из яремной вены животных, вносили в пробирки с 50 мМ ЭДТА до конечной концентрации 5 мМ. Выделение ДНК из крови проводили комбинированным щелочным способом. Для амплификации фрагмента гена каппа-казеина использовали праймеры:

ав1: 5/-татасталатлаатлтсстлаттлта-3/,

АВ2: 5-асаттатсттсттталтатстссттла-з/,

сконструированных А. ВаггоБО й а1. (1998).

ПЦР проводили на программируемом термоциклере «Терцик» (Россия) в объеме реакционной смеси 20 мкл, содержащей 60 мМ трис-Нс1 (рН 8,5), 1,5 мМ М^с12, 25 мМ Кс1, 10 мМ меркаптоэталол; 0,1 мМ тритон Х-100; 0,2 мМ дНТФ, 1 ед. Taq ДНК полимеразы, по 0,5 мкМ каждого из праймеров АВ1 и АВ2, для амплификации фрагмента гена каппа-казеина длиной 453 Ьр, 1 мкл пробы ДНК в оптимизированном режиме:

х1: 94 0С - 4 мин; х40: 94 0С - 10 сек, 63 0С - 10 сек, 72 0С - 10 сек;

х1: 72 0С - 5 мин; хранение: 4 0С.

Для ПДРФ-идентификации генотипов гена каппа-казеина 20 мкл ПЦР -пробы обрабатывали 10 ед. эндонуклеазы рестрикции Ит/ I в 1 хбуфере «О» фирмы СибЭнзим (Россия) или 10 ед. эндонуклеазы рестрикции ИМШ в 1х буфере <^» фирмы СибЭнзим (Россия) при 37 0С течение ночи.

Для визуализации фрагментов ДНК пробы вносили в лунки 2,5 % агарозного геля с содержанием этидия бромида (0,5 мкг/мл) и проводили горизонтальный электрофорез при 15 В/см в течение 50 мин в 1хТВЕ буфере.

После электрофореза гель просматривали в УФ-трансиллюминаторе при длине волны 310 нм и фотографировали с использованием оранжевого светофильтра. Идентификацию генотипов определяли по количественным и качественным признакам ПЦР-ПДРФ.

Частоту встречаемости генотипов определяли по формуле: п

р = ^, где р - частота определения генотипа, п - количество

особей, имеющих определенный генотип, N - число особей.

Частоту отдельных аллелей определяли по формуле:

РА = (2пЛЛ+пЛВ) : 2N

дВ = (2пВВ+пЛВ) : 2N, где РА - частота аллеля А, qB - частота аллеля В,

N - общее число аллелей.

По закону Харди-Вайнберга рассчитывали ожидаемые результаты частот генотипов в исследуемой популяции.

Полученные результаты в ходе научных исследований обработаны биометрическим методом с использованием ЭВМ и программного приложения Microsoft Excel.

Результаты собственных исследований. Для оценки качества работы известных протоколов по генотипированию крупного рогатого скота по гену каппа-казеина нами была протестирована серия олигонуклеотидных праймеров: AB1: 57-

TGTGCTGAGTAGGTATCCTAGTTATG-3/ и АВ2: 57-

GCGTTGTCTTCTTTGATGTCTCCTTAG-3/, сконструированных A. Barroso et al. (1998) по оптимизированной нами технике ПЦР-ПДРФ (см. «Материал и методика исследований»).

Праймеры AB1+AB2 инициируют амплификацию фрагмента гена-каппа-казеина крупного рогатого скота длиной 453 bp, а ПДРФ-Hinf профиль

идентифицируют его генотипы (рис. 1).

М123456789

1500 Ьр 1000 Ьр

500 Ьр 400 Ьр 300 Ьр

200 Ьр 100 Ьр

1. Электрофореграмма результата ПЦР-ПДРФ гена каппа-казеина

крупного рогатого скота с праймерами ЛБ1+ЛБ2 и последующего эндонуклеазного расщепления ферментом Ніп/І или НіпШІІ

Обозначения: М) ДНК-маркеры 1500-100 Ьр

цельный ПЦР-фрагмент генотипа ББ гена каппа-казеина

генотип ББ

цельный ПЦР-фрагмент генотипа АА гена каппа-казеина

генотип АА (326/100/27 Ьр (Ніп/І)); 6) генотип АА (453 Ьр (ИіпйІІІ)); 7) цельный ПЦР-фрагмент генотипа ЛБ гена каппа-казеина (453 Ьр); 8) генотип ЛБ (426/326/100/27 Ьр (Ніп/І)); 9) генотип ЛБ (453/351/102 Ьр (НіпйІЩ).

В результате ДНК-диагностики по локусу гена каппа-казеина из 70 быков-производителей 48 (68,6%) имели генотип АА; 18 (25,7%) - АВ и лишь 4 (5,7%) - ВВ. При этом частота аллеля А составила 0,81, а аллеля В -0,19 (табл. 1).

Определению полиморфизма каппа-казеина у быков-производителей посвящены исследования S.J. Pinder et al. (1991), M.P. Sabour et al. (1996), Е.С. Усенбеков (1995), Е.А. Денисенко (2004), В.С. Матюкова (2004), А.В. Баршинова (2005), Л. А. Калашниковой,

Т.Б. Ганченковой (2008) .

1. Полиморфизм гена каппа-казеина у быков-производителей

Хозяйство n АА АВ ВВ Частота аллелей Х2

n % n % n % А В

ПП »та Г Г «Эл Н 7G 48 68,6 18 25,7 4 5,7 G,81 G,19 G,85

О 46 65,7 21 3G,G 3 4,3

Н - наблюдаемое распределение генотипов, О - ожидаемое распределение генотипов

В результате исследований В.С. Матюкова (2004) на Центральной станции искусственного осеменения, у чистопородных черно-пестрых быков и низкокровных помесей черно-пестрых с голштинами частота аллеля В составила 0,105, у чистокровных голштинов - 0,204, у высококровных помесей - 0,054.

Изучение генотипов каппа-казеина быков-производителей чернопестрой и голштинской породы в Ленинградской области показало, что частота встречаемости аллельных вариантов А и В составила соответственно 0,62 и 0,38. Необходимо при этом отметить, что генотип каппа-казеина ВВ у быков голштинской породы вообще не обнаружен (Е.С. Усенбеков, 1995).

Сходные данные по голштинской породе получены и зарубежными исследователями. Например, у быков-производителей в Великобритании частота встречаемости аллеля А составила 0,80, аллеля В - 0,20 (S.J. Pinder et al., 1991), в Канаде - 0,86 и 0,14 соответственно (M.P. Sabour et al., 1996).

В Канаде на 7 станциях искусственного осеменения животных методом ДНК-диагностики были протестированы генотипы у 132 быков-производителей айрширской породы, 641 - голштинской и 20 -

джерсейской. Частота встречаемости аллеля В гена каппа-казеина составила 0,23 у животных айрширской породы и 0,14 - у голштинской. В то же время у 17 из 20 быков джерсейской породы установлен генотип каппа-казеина ВВ, а соответственно, частота встречаемости аллеля В достигла 0,92 (M.P. Sabour et al., 1996).

В результате генотипирования по локусу каппа-казеина 30 быков-производителей красно-пестрой породы и 30 быков-

производителей симментальской породы получены данные того, что частота встречаемости В-аллеля в целом невысока и составляет 0,30, различие в распределении частот генотипов каппа-казеина отсутствует. Генотип АА каппа-казеина был выявлен у 15 быков-производителей красно-пестрой породы и у 15 быков-производителей симментальской породы. Гетерозиготный генотип АВ каппа-казеина обнаружен у 10 быков-производителей красно-пестрой и 11 быков-производителей симментальской пород. Генотип ВВ каппа-казеина был выявлен у 5

^ л ^

голов красно-пестрой породы и 4 головы у симментальской породы (А.В. Баршинова, 2005).

Е.А. Денисенко (2004) приводит данные своих исследований, что у быков-производителей черно-пестрой породы частота аллеля А достигает 0,83, аллеля В - 0,17. Тогда как генотип ВВ у быков не обнаружен.

Исследования Л.А. Калашниковой, Т.Б. Ганченковой (2008) показали, что имеется значительное преобладание быков-производителей холмогорской породы с генотипом АА каппа-казеина. В целом из 162 быков выявлено 85 с генотипом АА, 60 - с генотипом АВ и только 17 - с желательным генотипом ВВ. Частота А и В аллелей каппа-казеина составила 0,71 и 0,29 соответственно. Результаты оценки свидетельствуют о том, что при комплектовании племенных предприятий не учитывается генотип быков по каппа-казеину.

Полученные нами данные по частоте встречаемости В-аллеля каппа-казеина соответствуют результатам других исследователей. В тоже время наши результаты исследований чистопородных и помесных по голштинской породе быков-производителей несколько ниже аналогичных показателей у производителей голштинской породы - 0,38 (Е.С.

Усенбеков, 1995) и джерсейской породы - 0,92 (М.Р. БаЬоиг ^ а1., 1996).

Выводы. 1. Методом ПЦР-анализа у чистопородных и помесных по голштинской породе быков-производителей выявлено три генотипа по локусу гена каппа-казеина - АА, АВ и ВВ. Частота встречаемости аллеля В составила 0,19%, аллеля А - 0,81%. 2. Различия в частотах встречаемости аллелей между различными стадами одной породы, по-видимому, связано с различиями в методах селекционно-племенной работы, проводимой в хозяйствах.

ЛИТЕРАТУРА: 1. Баршинова, А.В. Полиморфизм гена каппа-казеина и его связь с хозяйственно-полезными признаками скота краснопестрой породы: автореф. дис.канд. биол. наук: 06.02.01 / А.В. Баршинова -Лесные Поляны, 2005. - 128 с. 2. Денисенко, Е. А. Молочная продуктивность и технологические свойства молока коров черно-пестрой породы с различными генотипами каппа-казеина в зоне Сибири : дис. канд. биол. наук : 06.02.01 / Денисенко Елена Александровна. - Лесные поляны,

2004. - 111 с. 3. Калашникова, Л. А. Оценка холмогорских быков-производителей по генотипу каппа-казеина / Л.А. Калашникова, Т.Б. Ганченкова - 2008. - С. 10-12. 4. Матюков, В. С. Внутрипопуляционная дифференциация чистопородного холмогорского скота по генным частотам локуса каппа-казеина / В. С. Матюков // Цитология и генетика. -2004. - Т. 38. - № 2. - С. 46-50. 5. Усенбеков, Е. С. Генотипирование крупного рогатого скота по локусам каппа-казеина, бета-лактоглобулина и мутации Blad : автореф. дис. канд. наук : / Усенбеков Е. С. - Спб. - 16 с. 6. Barroso, A. Detection of Bovine kappa-casein variants A, B, C and E by means of polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism (PCR-SSCP) / A. Barroso, S. Dunner, J. Canon // J. Anim. Sci. - 1998. - V. 76. - № 6. - P. 1535-1538. 7. Pinder, S. J. Analysis of polymorphism in the bovine caseine genes by use of the polymerase chain reaction / S. J. Pinder, B. N. Perry, C. J. Skidmore, D. Sawa // Animal Genetics. - 1991. - V.22. - P. 11-20. 8. Sabour M. P. Association between milk protein genetic variants and genetic values of Canadian Holstein bulls for milk yield traits / M. P. Sabour, C. Y. Lin, A. J. Lee, A. J. McAllister // J Dairy Sci. - 1996. - V. 79. - № 6. - P. 10501056.

ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНА КАППА-КАЗЕИНА У БЫКОВ-ПРОИЗВОДИТЕЛЕЙ

Муллахметов Р.Р., Ахметов Т.М., Тюлькин С.В.

Резюме

В данной работе изучен полиморфизм гена каппа-казеина у быков-производителей, а именно определена частота наиболее распространенных аллельных вариантов А и В. Полученные нами результаты соответствуют данным опубликованным ранее и находятся на нижней границе диапазона исследуемого показателя, при этом частота встречаемости желательного В-аллеля у чистопородных и помесных по голштинской породе быков-производителей составила 0,19.

POLYMORPHISM OF A GENE OF KAPPA-CASEIN IN BULL-PRODUCERS

Mu11a.chmet.ov R.R., Ahmetov T.M., Tjulkin S.V.

Summary

In the given work of kappa-casein gene polymorphism in bull-producers is studied, namely frequency of wide-spread allele variants A and B. Our results correspond with earlier published data and are on the lower of a range of an investigated indicator, thus frequency of allele B in thoroughbred and hybrid holstien bull-producers was 0,19.