СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ ГЕМОСТИМУЛИРУЮЩИМ, АНТИМУТАГЕННЫМ, ПРОТИВООПУХОЛЕВЫМ, ЦЕРЕБРОПРОТЕКТОРНЫМ, АНТИГИПОКСИЧЕСКИМ, НООТРОПНЫМ, АНКСИОЛИТИЧЕСКИМ И ПРОТИВОНЕВРОТИЧЕСКИМ ДЕЙСТВИЕМ
MEDICATION POSSESSING HAEMOSTIMULATING, ANTIMUTAGENIC, ANTITUMOUR, CEREBROPROTECTIVE, ANTIHYPOXIC, NOOTROPIC, ANXIOLYTIC AND ANTINEUROTIC ACTION

Изобретение относится к медицине, конкретно к фармакологии.
Высокая частота встречаемости и недостаточная эффективность лечения заболеваний системы крови и гематологических осложнений, в том числе ятрогенного характера, связанных с проведением противоопухолевой цитостатической терапии, а также патологических состояний центральной нервной системы, в том числе нарушений высшей нервной деятельности, является основанием для разработки новых лекарственных средств, обладающих гемостимулирующим, антимутагенным, противоопухолевым и психотропным действием.
Существует большое количество средств, обладающих гемостимули-рующим, антимутагенным, противоопухолевым, церебропротекторным, антигипоксическим, ноотропным, анксиолитическим и противоневротическим действием [1].
Наиболее близким по природе происхождения и техническому результату к предлагаемому средству является экстракт корня природного растения шлемника байкальского Scutellaria baicalensis Georg [2]. Данное средство выбрано в качестве прототипа.
Недостатком данного средства является его недостаточная гемостимулирующая, противоопухолевая, церебропротекторная, антигипоксическая, ноотропная, анксиолитическая и противоневротическая активности и отсутствие у него антимутагенного действия.
Существует технология культивирования in vitro ткани корней шлемника байкальского Scutellaria baicalensis Georg, обеспечивающая получение большой массы растительного сырья с помощью биореактора для биотехнологического выращивания растительных эксплантов (ООО «Биоплант», г.Томск).
Нами впервые выявлена выраженная гемостимулирующая, антимутагенная, противоопухолевая, церебропротекторная, антигипоксическая, ноотропная, анксиолитическая и противоневротическая активности экстракта культуры ткани корней шлемника байкальского Scutellaria baicalensis Georg.
Задачей, решаемой данным изобретением, является расширение арсенала средств, обладающих гемостимулирующим, антимутагенным, противоопухолевым, церебропротекторным, антигипоксическим, ноотропным, анксиолитическим и противоневротическим действием, и повышение эффективности терапии опухолевых заболеваний и патологических состояний, характеризующихся нарушением процессов кроветворения и расстройствами деятельности центральной нервной системы.
Поставленная задача достигается применением в качестве гемостимулирующего, антимутагенного, противоопухолевого, церебропротекторного, антигипоксического, ноотропного, анксиолитического и противоневротического средства экстракта культуры корней шлемника байкальского Scutellaria baicalensis Georg, представляющего собой продукт экстрагирования hairy root («волосатые корни») культуры 70% этанолом в течение 1,5 ч при соотношении сырье:экстрагент 1: 20 при температуре 80-85°C с последующим упариванием и досушиванием до влажности 5%.
Новым в предлагаемом изобретении является применение экстракта культуры ткани корней шлемника байкальского Scutellaria baicalensis Georg в качестве гемостимулирующего, антимутагенного, противоопухолевого, церебропротекторного, антигипоксического, ноотропного, анксиолитического и противоневротического средства.
Используемое нами оригинальное средство - экстракт культуры ткани корней шлемника байкальского было разработано и получено НИИ фармакологии СО РАМН (г.Томск) совместно с Институтом физиологии растений им. К.А.Тимирязева (г.Москва).
Токсичность используемых в современной онкологии противоопухолевых препаратов существенно ограничивает их практическое применение. Практически все лекарственные средства данной группы оказывают выраженное повреждающее действие на кроветворную ткань и вызывают, в той или иной мере, нарушения функций центральной нервной системы и высшей нервной деятельности, определяемые в значительной степени повреждением генетического аппарата различных клеток организма [3, 4]. Кроме того, постоянное увеличение частоты встречаемости заболеваний психической сферы, в том числе представляющих собой последствия травм и гипоксических повреждений ЦНС, и недостаточная эффективность их терапии существующими препаратами [1] указывают на актуальность разработки новых психотропных средств.
Известно, что экстракт корня природного растения шлемника байкальского Scutellaria baicalensis Georg обладает гемостимулирующим, противоопухолевым, антиметастатическим, анксиолитическим, церебропротекторным действием и некоторыми видами психотропной активности [2]. В то же время, данное средство не оказывает антимутагенного эффекта, что, безусловно, сказывается на выраженности его терапевтических свойств. Кроме того, существует сложность получения однородного по составу экстракта, связанная со значительными различиями содержания биологически активных веществ в природных растениях, определяемыми климатогеографическими и другими факторами внешней среды [5]. В отличие от этого технология культивирования тканей in vitro позволяет получать максимально однородные культуры, в том числе с заданными характеристиками, за счет создания одинаковых внешних условий (температура, состав питательной среды и т.д.) [6].
Тем не менее, сведений о возможности получения фармакологически более активного экстракта Scutellaria baicalensis Georg и появления у него антимутагенных свойств в результате использования в качестве субстрата культуру корней данного растения не существует.
Факт применения экстракта культуры ткани корней шлемника байкальского с достижением нового технического результата, заключающегося в эффективной стимуляции гемопоэза, а также противоопухолевом, церебропротектрном, антигипоксическом, ноотропном, анксиолитическом и противоневротическом действии на фоне появления антимутегенных свойств, для специалиста является не очевидным.
Эксперимент показал непредсказуемые результаты.
Заявляемые существенные признаки проявили в совокупности новые свойства, не вытекающие явным образом из уровня техники в данной области. Предлагаемое изобретение может быть использовано в экспериментальной медицине с выходом в практическое здравоохранение. Идентичной совокупности признаков при исследовании уровня техники по патентной и научно-медицинской литературе не обнаружено.
Исходя из вышеизложенного следует считать заявляемое техническое решение соответствующим критериям: «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».
Эксперименты были проведены на 234 беспородных мышах и 672 линейных мышах (линии CBA/CaLac и C57BL/6), а также мухах дрозофилах Drosophila melanogaster. Мыши получены из питомника отдела экспериментального биомедицинского моделирования НИИ фармакологии СО РАМН (сертификат имеется).
Исследование фармакологических свойств средства проводились в соответствии с «Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» [7].
В качестве контроля использовали экстракт корней природного шлемника байкальского (ЭПШБ).
Пример 1.
Корни шлемника байкальского культивировали - (hairy root культура) - в стерильных условиях в конических колбах емкостью 300 мл, содержащих 200 мл жидкой питательной среды, с регулярными пересадками корневых эксплантов через каждые 6 недель. Устройство для биотехнологического выращивания растительных эксплантов представляло собой систему из: герметичной камеры, резервуара для питательной среды, подводящего и отводящего трубопроводов, клапана, регулирующего подачу питательной среды, распылительного устройства, фильтров для стерилизации входящих и выходящих газов, насоса для подачи питательной среды, клапана (ООО «Биоплант», г.Томск). Выращенные корни лиофилизировали, высушивали до влажности 7-8% и экстрагировали 70% этанолом на водяной бане с обратным холодильником в течение 1-3 ч при соотношении сырье:экстрагент 1:20 при температуре 80-85°С. Полученный экстракт упаривали на роторном испарителе до густой сиропообразной жидкости и затем досушивали в термостате при температуре 55°С до влажности 5%. Выход экстракта из сырья составляет 20%, содержание суммы флавоноидов в пересчете на байкалин 30-35%.
Пример 2.
Эффективность стимуляции гемопоэза изучали на мышах линии CBA/CaLac на модели цитостатической миелосупрессии, вызванной введением МПД (максимально переносимой дозы) циклофосфана (250 мг/кг) в 0,3 мл физиологического раствора. Опытным животным на фоне моделирования миелосупрессии перорально 1 раз в день в течение 9 сут в дозе 50 мг/кг вводили экстракт культуры корней шлемника байкальского (ЭКШМ). Контрольные животные в аналогичном режиме получали экстракт корней природного шлемника байкальского («Экстракт шлемника байкальского», ГНЦЛС, г.Харьков, Украина). Используемая доза и схема введения средств в предварительных экспериментах были определены как максимально эффективные для экстракта шлемника байкальского.
Показатели системы крови определяли с помощью стандартных и культуральных методов исследования на 3, 5, 10-е сут после моделирования миелосупрессии [8].
Введение циклофосфана закономерно приводило к развитию выраженной миелосупрессии. Имело место резкое падение содержания клеточных элементов в костном мозге и периферической крови (табл.1, 2).
Введение обоих средств сопровождалось значительным ускорением регенерации кроветворной ткани. Однако при этом наиболее существенные сдвиги наблюдались в группе мышей, получавших экстракт культуры шлеемника байкальского. Так, количество незрелых и зрелых нейтрофильных гранулоцитов, а также эритроидных клеток в костном мозге в данном случае было в 2,8 (5-е сут); 1,9 (5-е сут) и 3,7 (10-е сут) раз выше таковых в контрольной группе соответственно. Причем указанные изменения явились отражением реакции со стороны пула родоначальных клеток грануломоноцитарного (КОЕ-ГМ) и эритроидного (КОЕ-Э) ростков кроветворения (табл.3).
Таким образом, экстракт культуры корней ткани шлемника байкальского обладал выраженными гемостимулирующими свойствами, определяемыми воздействием на систему регуляции гемопоэза [9]. При этом эффективность данного средства значительно превосходит таковую у стандартного экстракта шлемника байкальского.
Пример 3.
Исследование антимутагенных свойств.
Эксперименты проводились на мышах линии CBA/CaLac и мухах Drosophila melanogaster.
Для оценки антимутагенных свойств экстракта шлемника байкалького использовали метод учета хромосомных аберраций в клетках костного мозга мышей и тест систему соматического мозаицизма на Drosophila melanogaster, рекомендованные для подобного рода исследований [7].
Повреждение генома осуществляли путем однократного и курсового (5 раз через 48 часов) внутрибрюшинного введения: 1) циклофосфана (ЦФ) в дозе 20 мг/кг, либо 2) цисплатина (ЦП) в дозе 6 мг/кг, либо 3) паклитаксела (ПТ) в дозе 40 мг/кг.
Опытным животным в первой серии экспериментов экстракт культуры корней шлемника байкальского в дозе 50 мг/кг вводили однократно мышам-самцам. Во второй серии испытуемое средство в дозе 50 мг/кг вводили самцам и самкам в течение 5 суток. Забор клеток костного мозга для исследования производили после однократного ввдедения через 24 и 48 ч, и только через 24 часа после введения цитостатика и корректора. В качестве контроля служили группы мышей, получавших экстракт корней природного шлемника байкальского («Экстракт шлемника байкальского», ГНЦЛС, г.Харьков, Украина) и универсальный антимутаген - α-токоферол при курсовом (10 раз) внутрижелудочном введении в дозе 1 мл/кг [7].
В ходе эксперимента за 1,5 часа до окончания экспозиции (24 ч) для накопления метафаз мышам внутрибрюшинно вводили 0,025% колхицин по 0,01 мл на 1 г массы животного. Костный мозг из бедренной кости готовили по Форду и Хамертону /11, 12/. Во всех группах от каждого животного анализировали 50-100 метафаз. Для анализа отбирали неразрушенные клетки округлой формы с хорошим разбросом хромосом, без наложений, с модульным числом 40. В клетках костного мозга учитывали долю поврежденных клеток в процентах, аберрантные хромосомы на 100 клеток. Среди структурных нарушений хромосом отмечали одиночные, парные фрагменты и обмены. Отмечали клетки с множественными разрывами хромосом.
В экспериментальных группах животных через 24 часа после однократного внутрибрюшинного введения цитостатиков отмечалось достоверное повышение уровня аберрантных хромосом - 72,53±5,05% (от циклофосфана в дозе 20 мг/кг), 37,00±2,61% (от цисплатина в дозе 6 мг/кг), 7,23±1,68% (от паклитаксела в дозе 40 мг/кг) (табл.4).
При введении экспериментальными животными за час до введения цитостатиков ЭКШБ наблюдалась достоверное снижение уровня аббераций. Так, значение данного показателя через 24 часа составляло 34,75±4,17% (в комбинации с циклофосфаном), 15,60±0,51% (в комбинации с цисплатином) и 1,78±0,48% (в комбинации с паклитакселом). Фактор эффективности антимутагена (ФЭА) был соответственно 0,52; 0,57 и 0,75. Аналогичные сдвиги имели место и через 48 часов (табл.4).
Выраженным защитным действием ЭКШБ обладал и при его курсовом введении (табл.5).
При изучении цитогенетической активности у ЭПШБ и α-токоферола было обнаружено полное отсутствие антимутагенного эффекта в первом случае и значительно менее выраженное действие во втором (табл.6).
Кроме того, антимутагенное действие экстракта культуры корней шлемника байкальского было подтверждено с помощью метода соматического мозаицизма на Drosophila melanogaster при использовании маркеров yellow и singed [7].
2
2
В ходе эксперимента противоопухолевые препараты вызывали достоверное повышение количества самок с мутациями, в то время как добавление ЭКШБ в питательную среду в концентрации 0,1%, (что соответствует дозе 50 мг/кг для мышей [7]) отменяло развитие спонтанных мутаций (χ=17,77 по сравнению с циклофосфаном и χ=6,26 по сравнению с цисплатином). ФЭА был соответственно равен 0,61, 0,41 (табл.7).
В целом, результаты исследования свидетельствуют о выраженном генопротекторном (антимутагеном) действии экстракт культуры корней шлемника байкальского.
Пример 4.
В соответствии с требованиями «Руководства по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» [7] на мышах-самках линии C57BL/6 с перевиваемой карциномой легких Льюис изучали влияние ЭКШБ на рост основного опухолевого узла и развитие метастазов без проведения цитостатической терапии и на фоне внутрибрюшинного введения циклофосфана в дозе 125 мг/кг (на 10-е сут после перевивки опухоли).
Опытным животным перорально 1 раз в день в течение 9 сут в дозе 50 мг/кг вводили экстракт культуры корней шлемника байкальского (ЭКШМ). Контрольные животные в аналогичном режиме получали экстракт корней природного шлемника байкальского («Экстракт шлемника байкальского», ГНЦЛС, г.Харьков, Украина). Используемая доза и схема введения средств в предварительных экспериментах были определены как максимально эффективные для экстракта шлемника байкальского.
Оценка эффективности терапевтических воздействий, которую проводили по окончании курса лечения на 21 сутки после перевивки опухоли, показала, что изолированное введение мышам-самкам линии C57BL/6 обоих видов экстракта шлемника байкальского не приводило к снижению массы первичной опухоли (табл.8).
В то же время использование ЭКШБ и ЭПШБ снижало степень диссеминации карциномы легких Льюис, а в случае применения ЭКШБ имело место еще и уменьшение площади метастатического поражения легких.
Предлагаемое средство существенно повышало эффективность цитостатической терапии (табл.8). При этом наблюдалось не только потенцирующие влияние препарата в отношении антиметастазирующего действия циклофосфана, но и значительное усиление торможения роста первичной опухоли.
В частности, имело место снижение частоты метастазирования с 54% (только ЦФ) до 33% и 20% при дополнительном введении экстракта природного растения и его культуры соответственно. При этом наблюдались соответствующие изменения и количества и площади метастазов на 1 мышь. Кроме того, отмечалось торможение роста опухоли с 25% (ЦФ) до 38% при сочетанном применении цитостатика с ЭКШБ, в то время как ЭПШБ на данный показатель влияния не оказывал (табл.8).
Таким образом, введение ЭКШБ оказывало тормозное влияние как на рост опухолевого узла, так и на процесс диссеминации и ингибиции гематогенного метастазирования.
Пример 5.
Исследование церебропротекторной и психотропной активностей.
Было исследовано влияние ЭКШБ на психоневрологический статус мышей, перенесших гипоксическую травму, животных с постгипоксической энцефалопатией, а также его действие на поведение в условиях конфликтной ситуации.
При изучении церебропротекторных свойств в отношении гипоксии животные разделялись на 4 группы. В процессе эксперимента часть животных погибала при моделировании гипоксии (эти животные в оценке результатов не учитывались). Часть животных отбраковывалось в процессе выработки условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ). Гипоксическое воздействие проводилось на модели гипоксии гермобъема [10]. Гермокамера представляла собой стеклянный сосуд с выверенным объемом в 500 мл (±<1,0%) и герметически закрывающейся крышкой. Животных помещали в гермокамеру, после чего ее крышка плотно закрывалась. Мыши находились там до появления предсмертного судорожного припадка или первого агонального вдоха, после чего их извлекали и давали «раздышаться». Для получения выраженной энцефалопатии гипоксическое воздействие моделировалось дважды с интервалом в 48 часов. При этом при использовании гермокамеры 500 мл у животных сразу после гипоксической травмы наблюдается быстрое (в течение 2-3 часов) восстановление всех функций. Функциональные нарушения со стороны центральной нервной системы, вызванные гипоксическим воздействием, оценивались по изменению ориентировочно-исследовательского поведения в открытом поле и сохранности УРПИ.
При такой постановке методики в течение 10-15 дней после последней гипоксии мыши, подвергнутые ее воздействию, практически ничем не отличаются от нормальных животных, однако, начиная с 14-21 дня у них начинают проявляться нарушения мнестической деятельности, а к концу четвертой недели наблюдается частичная гибель. Оценку состояния животных по сохранности УРПИ проводили через 48 часов, на 7, 14, 21 и 28 дни после выработки рефлекса. Гибель животных учитывалась к 35 дню эксперимента. Результаты оценивались по доле животных с сохранившимся рефлексом и по доле животных, погибших к исходу пятой недели после гипоксической травмы. Ориентировочно-исследовательское поведение в открытом поле и выработку УРПИ осуществляли через 1 час после повторной гипоксической травмы.
Экспериментальная установка «открытое поле» представляла собой камеру размером 40×40×20 см с квадратным полом и стенками белого цвета [11]. Ее пол, разделенный на 16 квадратов, имел в каждом квадрате круглое отверстие диаметром 3 см. Сверху камера освещалась электрической лампой накаливания мощностью 100 ватт, расположенной на высоте 1 м от пола. Мышь помещалась в один из ее углов и в течение 3-х минут, раздельно в первую и две последующие минуты, регистрировали количество перемещений с квадрата на квадрат (горизонтальная активность), количество вставаний на задние лапки (вертикальная активность), количество обследований отверстий (норковый рефлекс), количество умываний (груминг) и количество актов дефекации по количеству фекальных шариков (болюсов) и вычислялся коэффициент асимметрии поведения в виде отношения количества горизонтальных перемещений к общей двигательной активности, выраженного в процентах. Результаты первой и двух последующих минут тестирования оценивались раздельно и в сумме.
Методика УРПИ основана на подавлении врожденного рефлекса предпочтения темного пространства, имеющегося у грызунов [11]. Экспериментальная установка представляла собой камеру, состоящую из двух отсеков: большого - освещенного и малого - темного. Животное помещалось в светлый отсек и вскоре (через 10-20 секунд), в силу врожденного рефлекса предпочтения темного пространства, переходило в малый отсек, после чего дверка, соединяющая оба отсека, перекрывалась и на пол темного отсека, состоящего из параллельных чередующихся электродов, подавали электрический ток импульсами продолжительностью 50 Mс, частотой 5 Hz и амплитудой 50 мА. Через 10 секунд дверку открывали и животное могло выскочить в светлый отсек с обычным полом. В результате описанной процедуры у животных вырабатывался условный рефлекс избегания темного пространства. При проверке воспроизводимости рефлекса животных помещали в светлый отсек в угол, противоположный от входа в темный отсек, и наблюдали в течение 3-х минут. Регистрировали время первого захода в темный отсек (латентное время захода), суммарное время пребывания в темном отсеке. Выработанным рефлекс считался, если в течение всех 3-х минут наблюдения животное ни разу не посетило темный отсек или латентное время захода превышало 150 с. О качестве рефлекса судили по доле животных с наличием рефлекса. Дополнительными показателями, характеризующими условно-рефлекторную деятельность и поведенческий статус, служили количество дефекаций, груминг, количество обследований входа в темный отсек, время пребывания в светлом отсеке, количество заходов в темный отсек и время пребывания в темном отсеке.
Животные, которые после помещения в светлый отсек сохраняли неподвижность, и не приближались ко входу в темный отсек, при подсчете результатов не учитывались.
В дни проверки сохранности рефлекса животным вводили ЭПШБ («Экстракт шлемника байкальского», ГНЦЛС, г.Харьков, Украина) и заявляемое средство, чтобы исключить влияние феномена диссоциации, в дозе 50 мг/кг.
Модель конфликтной ситуации по Vogel является одной из наиболее распространенных моделей невроза. Она позволяет с достаточной достоверностью предсказать противоневротические свойства препаратов [12]. Конфликтная ситуация моделировалась путем столкновения двух рефлексов: питьевого условного рефлекса и безусловного рефлекса избегания электроболевого раздражения. Для этого животных предварительно оставляли на двое суток без воды, затем в течение 4-х суток на 20 минут ежедневно помещали в пластиковую камеру размерами 30×40×20 см, в одной из торцевых стенок которой была устроена ниша с поилкой, где крыса могла напиться. В качестве позитивного контроля (препарата, показатели действия которого в условиях данной методики характеризуют валидность результатов данного экспериментального исследования был использован препарат с известными анксиолитическими свойствами - феназепам. Прототип (ЭПШБ) в дозе 50 мг/кг, заявляемое средство в той же дозе и препарат позитивного контроля - феназепам в дозе 1 мг/кг - вводили, начиная с первого дня обучения в желудок за 1 час до помещения в камеру в виде взвеси в воде очищенной, контрольным животным вводили воду в течение всего срока выработки рефлекса. В день регистрации результатов через 1 час после очередного введения веществ крыс снова помещали в камеру и между металлическим полом камеры и электродом, опущенным в поилку, создавалась разность потенциалов так, что при попытке взятия воды животное получало удар током. Силу тока регулировали таким образом, чтобы она имела надпороговое значение, увеличивая ее при первом пробном тестировании на трех пробных животных до первых реакций избегания боли при касании языком воды. Количество взятий воды регистрировали автоматически по количеству замыканий цепи в момент касания языком воды. Количество подходов к поилке регистрировали также автоматически с помощью фотоэлемента. Об анксиолитической активности препаратов судили по разнице в числе взятий воды, несмотря на удар током (наказуемое взятие воды), в контрольной и опытной группах. Дополнительными показателями, характеризующими условно-рефлекторную, эмоциональную и смещенную активность, служили число подходов к поилке, горизонтальные перемещения по клетке, груминг, число вертикальных стоек. Каждое животное наблюдали индивидуально в течение 20 минут.
Введение препаратов начинали за 4 дня до гипоксического воздействия и 5-й раз за 1 час перед гипоксией животные интактного и гипоксического контролей получали очищенную воду. Указанная схема введения позволяет оценивать церебропротекторное действие, антигипоксическое и ноотропное действие препаратов фармакологических веществ [7].
Проведенные исследования показали (табл.9, 10) что перенесенная гипоксия вызывала снижение ориентировочно-исследовательского поведения в открытом поле со сдвигом коэффициента асимметрии поведения с 54% до 72%. В группе гипоксического контроля отмечалось увеличение латентного времени захода в темную камеру при выработке рефлекса, что свидетельствует о нарушении ориентировочного рефлекса. Применение прототипа привело к частичной нормализации ориентировочно-исследовательского поведения в открытом поле, однако он существенно уступал в этом качестве заявляемому средству. Особенно это касается ориентировочного рефлекса, выраженность которого при применении ЭПШБ (прототипа) имела тенденцию к еще большему ухудшению, в то время как заявляемое средство оказало на него нормализующее влияние. Проявления постгипоксической энцефалопатии у животных гипоксического контроля начались с 14 суток, прогрессивно нарастая к 28 дню при этом в этой группе отмечалась гибель 65% животных. Применение обоих видов экстракта оказало защитное действие на животных, повысив воспроизводимость рефлекса и снизив гибель животных, что свидетельствовало о наличии у них церебропротекторной, антигипоксической и ноотропной активностей [7]. При этом выраженность эффектов при использовании экстракта культуры корней шлемника байкальского значительно превосходила таковую при применении прототипа (табл.9, 10)
При изучении влияния препаратов в условиях конфликтной ситуациии у феназепама было обнаружено выраженное анксиолитическое действие по всем основным показателям, что свидетельствовало об адекватности условий эксперимента (табл.11) [7]. Прототип также проявлял анксиолитические свойства, несколько уступая по активности феназепаму по главному показателю методики - числу наказуемых взятий воды. Заявляемое средство обнаружило выраженный анксиолитический эффект, статистически значимо превосходящий по активности и прототип и позитивный контроль (последний в виде тенденции), и свидетельствующий в данном случае еще и о противоневротическом действии [7, 12].
Результаты исследований свидетельствуют о способности ЭКШБ защищать центральную нервную систему от наиболее распространенных травмирующих воздействий - гипоксии и психоэмоционального перенапряжения, и коррегировать расстройства высшей нервной деятельности (когнитивных функций), вызываемые патологическими факторами. Таким образом, предлагаемое средство проявляет церебропротекторные, антигипоксические, ноотропные (антиамнестическое) и анксиолитические свойства.
В целом, исходя из полученных данных следует, что экстракт культуры корней шлемника байкальского обладает выраженной гемостимулирующей, антимутагенной, противоопухолевой, церебропротектрной, антигипоксической, ноотропной, анксиолитической и противоневротической активностями. При этом широта спектра терапевтического действия предлагаемого средства и его эффективность значительно превосходят таковые у экстракта корней природного растения.
Цитируемая литература
1. Машковский М.Д. Лекарственные средства. - 15 изд. перераб., испр. и доп. - М: ООО «Издательство Новая волна», 2005. - С.717.
2. Шлемник байкальский. Фитохимия и фармакологические свойства / Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Литвиненко В.И., Попова Т.П., Суслов Н.И. - Изд-во Томского университета, Томск. - 1994. - 225 С.
3. Воронова О.Л., Пашинский В.Г. Фармакологическая коррекция цитогенетического эффекта циклофосфана. //Вопросы онкологии. - 1991. - N 2. - С.233-235.
4. Журков B.C., Новакова Я.Н., Шрам Р.Я. Частота хромосомных аберраций в клетках костного мозга мышей при воздействии циклофосфамида. Гигиена и санитария, 1978, №1, с.12-14.
5. Куркина А.В., Осипова А.А. Новые подходы к стандартизации сырья эрвы шерстистой // Химия растительного сырья - 2010. - №2. - 119-121.
6. Кузовкина И.Н., Гусева А.В., Ковач Г., Секе Е., Вдовитченко М.Ю. Флавоноиды генетически трансформированных корней шлемника байкальского {Scutellaria baicalensis} и индукция их образования при элиситации метилжасмонатом // Физиология растений. - 2005. - Т.52. - С.90-96.
7. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под ред Р.У.Хабриева. - 2 изд. - М.: ОАО «Изд-во «Медицина», 2005. - С.54-69.
8. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Шахов В.П. Методы культуры ткани в гематологии. - Томск: Изд-во ТГУ, 1992. - 272 с.
9. Дыгай A.M., Жданов B.B., Удут Е.В. Фармакологическая регуляция эритропоэза. М.: Издательство РАМН, 2009. 176 с.
10. Патент (RU) на изобретение №2240604 «Способ моделирования постгипоксической энцефалопатии и связанных с ней нарушений в системе крови», 2004 г.(опубл. 20.11.2004 г., Бюл. №32). Авторы: Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Суслов Н.И.
11. Буреш Я, Бурешова О., Хьюстон Дж. П. Методики и основные эксперименты по изучению мозга и поведения. / пер. с англ. Под ред проф. А.С.Батуева). - М.: Высшая школа, 1991. - 398 С.
12. Клыгуль Т.А., Кривопалов В.А. Установка с автоматической регистрацией поведения крыс для оценки действия малых транквилизаторов. // Фарм. и токс. - 1966. - №2. - С.241 - 244.
Таблица 1
Показатели периферической крови у мышей линии CBA/CaLac после введения дистиллированной воды (1), 50 мг/кг экстракта природного шлемника байкальского (2) и 50 мг/кг экстракта культуры шлемника байкальского (3) на фоне моделирования цитостатической миелосупрессии, (X±m)
Сроки исследо-вания, сутки
Эритроциты, Т/л
Ретикулоциты, в промиллях
Палочкоядерные нейтрофилы, Г/л
Сегментоядерные нейтрофилы, Г/л
Тромбоциты, Т/л
Фон
8,61±0,18
14,1±0,3
0,40±0,06
2,26±0,02
796,57±77,49
3-е
1
7,89±0,28*
10,7±0,24*
0,01±0,01*
0,12±0,03*
503,80±25,97*
2
7,19±0,21*
9,89±0,37*
0,01±0,01*
0,13±0,03*
557,83±46,69*
3
7,84±0,25*
12,8±0,6*#
0,02±0,01*
0,17±0,02*
505,67±24,25*
5-е
1
7,53±0,15*
18,4±1,3*
0,16±0,04*
0,75±0,23*
349,40±36,84*
2
7,85±0,17*
27,6±2,4*#
0,13±0,05*
1,65±0,10*#
393,33±33,96*
3
8,59±0,12#$
37,5±1,89#$
0,41±0,08#$
1,7±0,16#
321,60±23,22
10-е
1
7,29±0,18
15,6±1,4
1,31±0,32
3,13±0,23
977,33±27,66
2
7,18±0,15
16,7±0,78
1,71±0,42
5,36±1,15#
843,33±100,51
3
7,33±0,15
16,4±0,97
1,17±0,23
7,42±0,18#$
884,17±33,78
* - различия достоверны по отношению к фону,# - различия достоверны по отношению к группе, получавшей дистиллированную, при p<0,05$ - различия достоверны с группой животных, получавших экстракта природного шлемника байкальского, при p<0,05
Таблица 2
Динамика костномозгового кроветворения у мышей линии CBA/CaLac (×106/бедро) после введения дистиллированной воды (1), 50 мг/кг экстракта природного шлемника байкальского (2) и 50 мг/кг экстракта культуры шлемника байкальского (3) на фоне моделирования цитостатической миелосупрессии, (X±m)
Сроки исследования, сутки
Незрелые нейтрофильные гранулоциты
Зрелые нейтрофильные гранулоциты
Эозинофильные гранулоциты
Лимфоидные клетки
Моноциты
Эритроидные клетки
фон
1,10±0,10
3,72±0,31
0,47±0,09
3,38±0,30
0,48±0,06
1,79±0,12
3-е
1
0,04±0,01
0,11±0,04
0
1,87±0,15
0,55±0,04
0,18±0,05
2
0,05±0,02
0,16±0,03
0
1,57±0,13
0,60±0,11
0,23±0,03#
3
0,13±0,03#
0,15±0,04
0
1,36±0,10#
0,42±0,09
0,31±0,02#
5-е
1
2,22±0,26
1,45±0,26
0,30±0,08
2,03±0,21
0,86±0,08
1,04±0,16
2
4,82±0,46#
1,69±0,23
0,07±0,07
2,66±0,26
0,98±0,20
1,77±0,18#
3
6,31±0,52#$
2,2±0,11*#$
0,12±0,08
2,28±0,36
1,29±0,15
1,98±0,30#
10-е
1
0,80±0,18
4,65±0,45
0,76±0,45
1,82±0,25
0,60±0,09
0,35±0,06
2
0,80±0,11
6,57±0,53#
0,51±0,10
1,87±0,17
0,66±0,14
0,39±0,03
3
1,29±0,06#$
6,11±0,57*#
0,33±0,10
2,39±0,50
0,94±0,21
1,29±0,19#$
 - различия достоверны по отношению к фону,# - различия достоверны по отношению к группе, получавшей дистиллированную, при p<0,05$ - различия достоверны с группой животных, получавших экстракта природного шлемника байкальского, при p<0,05
Таблица 3
Динамика содержания КОЕ-Э и КОЕ-ГМ в костном мозге мышей линии CBA/CaLac (на 10<sup>5</sup> неприлипающих миелокариоцитов) после введения дистиллированной воды (1), 50 мг/кг экстракта природного шлемника байкальского (2) и 50 мг/кг экстракта культуры шлемника байкальского (3) на фоне моделирования цитостатической миелосупрессии, (X±m)
Сроки исследования, сутки
КОЕ-Э
КОЕ-ГМ
Фон
6,9±0,73
4,35±0,38
3-е
1
9,50±0,50*
8,38±0,63*
2
10,88±0,81*#
10,00±0,87*#
3
13,13±0,43*#$
12,38±0,82#
5-е
1
7,25±0,70
6,63±0,73
2
12,50±0,53#
5,75±0,75
3
18,13±0,44#$
10,88±0,55*#$
10-е
1
6,38±0,68
4,25±0,56
2
5,75±0,37
5,50±0,42
3
7,88±0,83
7,14±0,70
 - различия достоверны по отношению к фону,# - различия достоверны по отношению к группе, получавшей дистиллированную, при p<0,05$ - различия достоверны с группой животных, получавших экстракта природного шлемника байкальского, при p<0,05
Таблица 4
Оценка цитогенетической активности паклитаксела, цисплатина и циклофосфана и их комбинаций со шлемником байкальским в тесте по учету хромосомных аберраций в клетках костного мозга мышей линии CBA/CaLac, X±m.
Условия эксперимента
Сроки исследования
Количество аберраций, (%)
Полиплоидные клетки, тетроплоиды, (%)
Доля поврежденных клеток, (%)
Циклофосфан
24 ч
72,53±5,05
0,20±0,20
34,36±1,38
48 ч
10,82±2,27
0,20±0,20
8,33±1,45
ЦФ+ЭКЩБ
24 ч
34,75±4,17*
0,25±0,25
18,00±1,29*
48 ч
4,50±1,19*
0,00±0,00
4,00±0,91*
ЦП
24 ч
37,00±2,61
0,00±0,00
24,2±1,1
48 ч
12,2±0,42
0,00±0,00
10,9±0,3
ЦП+ЭКШБ
24 ч
15,60±0,51*
0,00±0,00
12,00±1,00*
48 ч
4,00±0,55*
0,20±0,20
4,00±0,55*
ПТ
24 ч
7,23±1,68
5,83±1,51
6,56±1,50
48 ч
4,66±0,93
19,90±2,50
3,65±0,50
ПТ+ЭКШБ
24 ч
1,78±0,48*
15,02±0,82*
1,78±0,48*
48 ч
1,73±0,23*
21,83±0,57
1,73±0,23*
* - достоверность различий между опытом и цитостатиком при p<0,05
Таблица 5
Оценка цитогенетической активности цисплатина и циклофосфана и их комбинаций с курсовым введением шлемника байкальского через 24 ч в тесте по учету хромосомных аберраций в клетках костного мозга мышей - самцов линии CBA/CaLac, X±m.
Условия эксперимента
Количество аберраций, (%)
Полиплоидные клетки, тетроплоиды,(%)
Доля поврежденных клеток, (%)
ЦФ
72,53±5,05
0,20±0,20
34,36±1,38
ЦФ+ЭКШБ
40,20±2,20*
0,00±0,00
18,00±1,29*
ЦП
37,00±2,61
0,00±0,00
24,20±1,10
ЦП+ЭКШБ
17,60±3,03*
0,00±0,00
11,40±1,69*
* - достоверность различий между опытом и цитостатиком при p<0,05
Таблица 6
Оценка цитогенетической активности Циклофосфана и коррекция ее α-токоферолом в тесте по учету хромосомных аберраций в клетках костного мозга мышей-самцов линии СВА
Условия эксперимента
Сроки исследования
Количество аберраций, (%)
Полиплоидные клетки, тетроплоиды,(%)
Доля поврежденных клеток, (%)
ЦФ
24 ч
80,6±5,96
0,20±0,20
32,0±1,3
48 ч
3,60±1,70
0,00±0,00
3,20±1,50
ЦФ + α-токоферол
24 ч
68,5±6,61
0,00±0,00
26,5±1,9*
48 ч
1,16±0,32
0,00±0,00
1,16±0,32
ЦФ+ЭПШБ
24 ч
81,6±4,20
0,00±0,00
31,60±1,20
48 ч
3,50±0,30
0,00±0,00
3,50±0,60
* - достоверность различий между опытом и контролем при p<0,05
Таблица 7
Учет соматического мозаицизма на Drosophila melanogaster при использовании маркеров yellow и singed
Препарат, доза
Число просмотренных самок
Число самок с мутациями
χ<sup>2</sup> по сравнению с контролем
χ<sup>2</sup> по сравнению с цитост.
Пятен «sn<sup>3</sup>»
Пятен «y»
Пятен «y sn<sup>3</sup>»
Всего пятен
ЦФ
1096
16
67
0
83
58,19
-
ЦФ + ЭКШБ
1299
14
31
0
45
22,54
17,77
ПТ
1336
26
37
0
63
40,54
-
ПТ + ЭКШБ
535
5
13
0
18
19,23
3,43
ЦП
1154
61
28
3
92
61,85
-
ЦП + ЭКШБ
1000
42
5
4
1
36,25
6,26
ЭКШБ
769
4
3
1
8
0,86
-
Контроль (Na Cl)
937
1
3
0
4
-
-
Таблица 8
Влияние эктрактов шлемника байкальского на развитие карциномы легких Льюис у мышей-самок линии C57BL/6
Группы
Масса опухоли (X±m), г
Торможение роста опухоли, %
Частота метастазирования, %
Количество метастазов на 1 мышь (X±m)
Площадь метастазов на 1 мышь (X±m), мм<sup>2</sup>
Контроль
4,56±0,18
-
100
13,00±0,50
14,83±2,57
ЭКШБ
4,15±0,22
-
100
8,50±0,90*
7,38±1,27*
ЭПШБ
4,41±0,23
-
100
10,6±0,95*
14,32±2,3
ЦФ
3,42±0,Н*
25,0
54
4,81±0,22*
5,97±0,64*
ЦФ+ЭКШБ
2,81±0,07*#
38,4
20
2,3±0,17*#
2,56±0,27*#
ЦФ+ЭПШБ
3,44±0,15
24,6
33
4,0±0,1*#
5,2±0,72*
* - отмечена достоверность различия показателя с контрольной группой при p<0,05,# - отмечена достоверность различия показателя между группами мышей, получавших только ЦФ и ЦФ совместно с экстрактами, при p<0,05,
Таблица 9
Влияние напитка в сравнении с пирацетамом на показатели ориентировочно-исследовательского поведения беспородных мышей-самцов в открытом поле после перенесенной гипоксической травмы за три минуты наблюдения <img file="00000001.tif" he="5" wi="16" img-content="undefined" img-format="tif" />
Группы наблюдения, доза
Суммарная двигательная активность
Горизонтальная активность
Вертикальная активность
Норковый рефлекс
Груминг
Дефекация
Коэффициент асимметрии
Конт-роль интактный
68±9*
37±5*
4,0±1,5
23,3±3,1
1,2±0,6
1,8±0,3*
54±3*
Конт-роль гипок-сический
36±4
26±2
1,4±0,4
6,9±1,0
1,9±0,5
0,2±0,1
72±2
Прототип
46±6
29±4*
3,5±1,0*
12,3±2,0*
0,9±0,3
0,1±0,1
63,7±3*
Заявляемое средство
60±4*
35±4*
4,5±0,6
19,5±2,0*#
0,5±0,2
0,0±0,0
58±3*
* - различия достоверны в сравнении с гипоксическим контролем при p<0,05
Таблица 10
Влияние раствора закиси азота в сравнении с пирацетамом на сохранность условного рефлекса пассивного избегания беспородных мышей-самцов после перенесенной гипоксической травмы <img file="00000001.tif" he="5" wi="16" img-content="undefined" img-format="tif" />
Группы наблюдения, доза
Время гипоксии, сек
Латентное время захода в темную камеру при выработке рефлекса, сек
Доля животных с сохранившимся рефлексом при проверке через (в %)
Доля животных, погибших к исходу 35 суток, в %
48 часов
7 суток
14 суток
21 сутки
28 суток
Контроль ин-тактный
-
12±2*
100*
100*
100*
92
100*
0*
Контроль гипоксический
57,2±4,1
49±2
83
83
33
17
17
65
Прототип
61,3±5,6
68±7
100*
100*
83*
67*
46
20*
Заявляемое средство
75,9±4,8*#
32±4*#
100*
100
100*
92*#
92*#
0*#
* - различия достоверны в сравнении с гипоксическим контролем при p<0,05;# - различия достоверны по отношению к группе, получавшей прототип, при p<0,05
Таблица 11
Влияние заявляемого средства в сравнении с прототипом и положительным контролем (феназепамом) на поведенческие показатели у крыс в условиях конфликтной ситуации в условных единицах (конфликт) <img file="00000001.tif" he="5" wi="16" img-content="undefined" img-format="tif" />
Показатели
Группа наблюдения
Контроль
Феназепам 1 мг/кг
Прототип (ЭПШБ)
Экстракт hairy root культуры ткани (ЭКШБ)
Горизонтальная активность
45±14
61±9
78±20
59±13
Вертикальная активность
17,7±2,7
14,3±0,4
30,3±7,6
17,7±4,5
Груминг
16,56±3
1,9±0,6
15,6±5,5
16,8±4,4
Количество болюсов (фекальных шариков)
0±0
0±0
0±0
0±0
Время замирания
393±32
134±23*
100±21*
88±26*
Время нахождения у поилки, сек
96±66
204±46
84±18
218±42*#
Число подходов к поилке
4,6±1,3
13,5±2,6
6,4±1,3
4,8±0,9
Число взятий воды
30±4
71±7*
58±7
92±8*#
Время питья, сек
38±3
52±5*
100±13
187±27*#
Общая двигательная активность
79±16
91±6
123±31
93±26
* - различия достоверны в сравнении с контролем при p<0,05;# - различия достоверны по отношению к группе животных, получавших прототип при p<0,05.