АНТИТЕЛА К СУЛЬФАТИДАМ И СУЛЬФАТИРОВАННЫМ ПРОТЕОГЛИКАНАМ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
ANTIBODIES TO SULPHATIDES AND SULPHATED PROTEOGLYCANS AND THEIR USE

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к новым моноклональным антителам (мАт), которые специфически и с высокой аффинностью распознают сульфатиды и сульфатированные протеогликаны. Кроме того, настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим моноклональные антитела по изобретению или фрагменты, полученные из этих антител. Кроме того, настоящее изобретение относится к набору реагентов, подходящих для диагностики сердечно-сосудистых заболеваний, содержащему Ат по изобретению или их фрагменты.
Предшествующий уровень техники
После более чем 30-летнего развития гибридомной технологии получения мАт мышей (Koehler y Milstein Nature, 256: 495-497, (1975) доказано, что они очень эффективны для диагностики заболеваний и в фундаментальных исследованиях, но для лечения человека зарегистрировано лишь 20 Ат (Pharma Vitae, Monoclonal Abs Update, 6-363, 2008). В основном это объясняется их коротким периодом полувыведения из крови и слабым распознаванием мышиных эффекторных функций иммунной системой человека, а также иммунным ответом, из-за мышиного происхождения этих Ат при их введении пациентам (ответ HAMA, акроним для Ат человека к Ат мыши). В нескольких исследованиях показано, что после введения чужеродного антитела иммунный ответ, возникающий у пациента, может быть достаточно сильным и может в значительной степени уменьшать терапевтическую эффективность антитела после начального лечения. Кроме того, после введения пациенту мАт мыши, последующая терапия неродственными Ат мыши может быть неэффективной или даже опасной из-за перекрестного ответа HAMA в соответствии с публикацией Khazaeli, M.B. y col. Journal of Immunotherapy 15:42-52 (1994).
На основе приведенной выше информации очевидно, что существует необходимость в получении вариантов терапевтических Ат, которые являются менее иммуногенными для людей, которые легче и экономичнее получать и которые подходят для получения терапевтических составов и для других целей. Morrison S.L. y col. Adv Immunol., 44: 65-92 (1989).
Разработано несколько способов гуманизирования Ат мыши или крысы и, таким образом, снижения ксеногенного ответа на эти чужеродные белки после их введения людям. Одной из первых попыток снизить иммуногенность являлось получение "химерных" Ат, в которых вариабельные домены белков мыши связаны с константными доменам молекул человека, при котором добивались не только сниженной иммуногенности, но также и активации иммунных эффекторных функций. Morrison S.L. y col. PNAS USA, 81: 6851-6855 (1984). Estas moléculas quiméricas mantienen las características del anticuerpo original en relación con la unión al antígeno y su región constante no es inmunogénica. Эти химерные молекулы сохраняют свойства исходного антитела по отношению к связыванию антигена, в то время как их константная область не является иммуногенной.
Атеросклероз и его последствия оказывают громадное влияние на население всего мира и являются ведущей причиной заболеваемости и смертности в развитых странах (Melián, A. y col. Am. J. Pathol., 155:775, 1999) и на Кубе уже в течение нескольких лет (QMS, 2004, Anuario Estadístico, MINSAP, 2007).
Атеросклероз представляет собой хроническое воспалительное заболевание многофакторной природы, которое вносит значительный вклад в патогенез инфаркта миокарда и головного мозга, гангрены и потери функций конечностей. Greaves, D. R. y col. Trends Immunol 22: 180-181 (2001); Ross, R. y col. Am Heart J 138(5 Pt 2): S419-20 (1999).
Одной из лидирующих причин атеросклероза является гиперхолестеринемия. Низкомолекулярные липопротеины (ЛПНП) при прохождении через артериальную стенку попадают во внеклеточный матрикс интимы артерий за счет взаимодействия с протеогликанами, и претерпевают окислительные модификации. Липопротеины, связанные с протеогликанами интимы артерий, более подвержены изменениям, таким как окисление и ферментативный гидролиз, как в липидной, так и в белковой составляющих молекулы, что повышает их атерогенную силу. ApoB-100 содержит несколько областей, посредством которых он может связаться с гликозаминогликановыми цепями протеогликанов, как правило, содержащих множество основных аминокислот. Camejo, G., E. y col. Atherosclerosis 139: 205-22, (1998); Chang, T. Y. y col. Curr Opin Lipidol 12: 289-96 (2001); Camejo, G., U. y col. Atheroscler Suppl 3: 3-9 (2002).
Плотность отрицательных зарядов в гликозаминогликанах влияет на их взаимодействие с ЛПНП, для которых степень сульфатирования влияет на взаимодействие ЛПНП с протеогликанами. Sambandam T. y col. Arterioascler Thromb, 11: 561-568 (1991).
Кроме того, окисленные ЛПНП могут интернализовать макрофаги посредством фагоцитарных рецепторов на поверхности этих клеток, что приводит к накоплению внутриклеточного холестерина с последующим образованием пенистой клетки. Эти явления представляют собой основные стадии запуска воспалительного ответа с вовлечением моноцитов/макрофагов, тучных клеток, дендритных клеток, T-клеток и NKT. Camejo, G. y col. Atherosclerosis 139(2): 205-22 (1998); Hurt-Camejo, E. y col. Invest Clin 42 Suppl 1: 43-73 (2001); Skalen, K., M. y col. Nature 417:750-754 (2002).
Существуют экспериментальные данные, указывающие вовлечение протеогликанов, присутствующих на поверхности макрофагов, в связывание окисленных ЛПНП с этими клетками и в интернализацию или поглощение этих частиц, которые в конечном счете приводят к образованию пенистой клетки. Halvorsen B. y col. Biochem J. 331:743-752(1998).
Без сомнения ведение более здорового образа жизни в сочетании с приемом антитромботических средств и снижающих содержание липидов средств влияют на снижение риска развития сердечно-сосудистых явлений, но этих мер все еще недостаточно для полного устранения этих рисков.
Как указано выше, атеросклероз является многофакторным воспалительным заболеванием, в развитии которого важно множество антигенов, поэтому с целью достижения большего терапевтического воздействия на это заболевание разрабатывают различные стратегии для проведения активной и пассивной иммунотерапии.
Одной из этих стратегий являются способы лечения, направленные на повышение уровня ЛПВП, ввиду обратной зависимости между холестерином ЛПВП и сердечно-сосудистым заболеванием. Ключевым ферментом в метаболизме ЛПВП является CETP, и он считается потенциальной мишенью для терапии, потому что уменьшение его активности повышает уровни ЛПВП. В WO 1997/041227 и WO 2006/133196 описана стратегия использования вакцин для индукции Ат, способных к связыванию и ингибированию функции CETP. Однако в последних исследованиях, демонстрирующих неудачу III фазы клинических испытаний, в которых использовали ингибитор CETP - торцетрапиб, поставили под сомнение эту стратегию. Nicholls S. J. y col. Circulation. 9; 118:2506-14 (2008); Hermann M. y col. Curr Hypertens Rep, 11:76-80 (2009).
У некоторых авторов описаны вакцины, в которых в качестве иммуногенов для подавления образования атеросклеротических бляшек используют окисленные ЛПНП. Palinski W. y col. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:821-25 (1995); Ameli S y col. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 16:1074-79 (1996); Freigang S. y col. Arterioscl. Thromb. Vasc. Biol. 18:1972-82 9 (1998); Zhou X. y col. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 21:108-14 (2001); George J. y col. Atherosclerosis 138:147-52 (1998); Fredrikson G.N. y col. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 23:879-84 (2003); US 2008/0070265A1.
Другой стратегией является разработка профилактических и терапевтических вакцин на основе специфических фрагментов окисленного аполипопротеина C-III с целью индукции иммунного ответа, способного предотвратить или уменьшить образование атеросклератических повреждений (WO 2001/064008, WO 2003/020765, WO 2004/080375 y WO 2004/081045).
Другой описанный подход с применением вакцин, основан на пептиде, конъюгированном с альдегидом, таким как MDA или 4-HNE, с индукцией Ат, которые взаимодействуют с альфа/бета рецепторами T-клеток, предотвращая образование атеросклеротических повреждений (WO 2001/068119).
Некоторые авторы настаивают на важности вакцин против патогенных факторов атеросклероза для предотвращения развития атеросклеротических бляшек (WO 1998/033510, US 006291437 B1, US 6471965 B1, US 006808713 B1).
Другой предлагаемой стратегией для замедления или снижения тяжести атеросклероза, вызываемого потреблением холестерина с пищей, является использование вакцин против стеринов (US 2002/0018808 A1).
a
Также при атеросклерозе важную роль в качестве терапевтического средства может играть пассивная иммунотерапия. Описана пассивная иммунотерапия для лечения или профилактики атеросклероза с использованием Ат к окисленным или модифицированным фрагментам Apo B100 (US 005196324, US 2007/0098725 A1, US 2008/0075716 A1).
Кроме того, для лечения или профилактики атеросклероза в качестве комбинированной терапии предложена пассивная иммунизация со специфическими Ат к фосфорилхолину (US 2007/0286868 A1, US 2007/0122419 A1).
Другой описанной стратегией является использование Ат или антиген-связывающих фрагментов, которые специфически связываются с М-КСФ человека (US 2007326414 B2).
Еще одним терапевтическим подходом к этому заболеванию является использование мАт, которые предотвращают адгезию моноцитов к эндотелию сосудов и, таким образом, предотвращают проникновение этих клеток в эндотелий и окружающие ткани (US 005541296 A).
Описано использование моноклональных Ат в качестве ингибиторов рецепторов гликопротеинов IIb/IIIa и, таким образом, агрегации тромбоцитов (WO 1999/052551, US 005976532 A).
Кроме того, для использования в пассивной иммунотерапии получены моноклональные Ат человека против защитных пептидных эпитопов аполипопротеина CIII (WO 2004/081046).
Также атеропротективным эффектом может обладать использование внутривенного иммуноглобулина (IVIG). Udi N y y col. Autoimmunity reviews 7:445-452 (2008).
Химерные мАт, которые вступают в реакцию с сульфатидами и сульфатированными гликозаминогликанами или которые распознают макрофаги и атеросклеротические повреждения, обладающие способностью к подавлению образования атеросклеротических повреждений при приеме в малых дозах и к индукции гуморального иммунного ответа на сульфатированные молекулы, не описаны.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к моноклональным Ат, характеризующимся способностью распознавать сульфатиды и сульфатированные протеогликаны, или фрагментам, полученным из них.
2
Ат к сульфатидам и сульфатированным протеогликанам по изобретению предпочтительно представляют собой моноклональные антитела. В объем изобретения также включены фрагменты Ат, такие как Fab фрагменты, Fab', Fab'-SH и F(ab') Ат к сульфатидам и сульфатированным протеогликанам, предоставленным по настоящему описанию. Эти фрагменты Ат можно получать традиционными способами, такими как ферментативное расщепление, или их можно получать рекомбинантными способами. Эти фрагменты Ат могут быть химерными или гуманизированными. Эти фрагменты подходят для диагностических и терапевтических целей, указанных в настоящем описании. Настоящее изобретение также относится к вариантам осуществления по существу чистых Ат и фрагментов.
В конкретном варианте осуществления Ат по настоящему изобретению характеризуются следующими последовательностями вариабельной области тяжелой и легкой цепей:
Тяжелая цепь:
HCDR1 RYSVH
HCDR2 MIWGGGSTDYNSALKS
HCDR3 SGVRRGRAQAWFAY
HFR1 QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLS
HFR2 WVRQPPGKGLEWLG
HFR3 RLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAMYYCAR
HFR4 WGQGTLVTVSA
Легкая цепь:
LCDR1 KASQDVSTAVA
LCDR2 SASYRYT
LCDR3 QQHYSTPWT
LFR1 DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITC
LFR3 GVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYC
LFR4 FGGGTKLELK
Кроме того, антитело по изобретению включает константные области IgG1 человека в тяжелой цепи и Cĸ человека в легкой цепи.
Настоящее изобретение относится к композициям, содержащим фармацевтические композиции, которые содержат антитела к сульфатидам и сульфатированным протеогликанам по изобретению или фрагменты, полученные из них. Как следует из настоящего описания, композиции содержат одно или несколько Ат, которые связываются с сульфатидами и сульфатированными протеогликанами.
Эти композиции могут дополнительно содержать подходящие носители, такие как фармацевтически приемлемые эксципиенты, включая буферные растворы или адъюванты, которые хорошо известны на существующем уровне техники.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей мАт, последовательности вариабельных областей тяжелых и легких цепей которого представлены ниже.
Тяжелая цепь:
HCDR1 RYSVH
HCDR2 MIWGGGSTDYNSALKS
HCDR3 SGVRRGRAQAWFAY
HFR1 QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLS
HFR2 WVRQPPGKGLEWLG
HFR3 RLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAMYYCAR
HFR4 WGQGTLVTVSA
Легкая цепь:
LCDR1 KASQDVSTAVA
LCDR2 SASYRYT
LCDR3 QQHYSTPWT
LFR1 DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITC
LFR2 WYQQKPGQSPKLLIY
LFR3 GVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYC
LFR4 FGGGTKLELK
В третьем аспекте, настоящее изобретение относится к набору реагентов, подходящих для диагностики атеросклеротических повреждений, включающих одно из Ат по изобретению или фрагменты, полученные из них. И более конкретно, набор реагентов, содержащих мАт с последовательностями вариабельных областей тяжелых и легких цепей, описанных выше.
В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к использованию Ат по изобретению для лечения сердечно-сосудистых заболеваний, особенно тех, которые демонстрируют очевидные признаки атеросклеротических повреждений.
Термин антитело в основном относится к мАт, а более конкретно к мАт мыши или химерному Ат.
Получение антитела:
Как правило, мАт к сульфатидам и сульфатированным протеогликанам по изобретению можно получать гибридомным способом, впервые описанным в Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), у мышей, иммунизированных гликолипидными экстрактами, полученными из натуральных или синтетических источников. Клетки селезенки от иммунизированных мышей сливают с миеломными клетками P3.X63Ag8 6.5.3, культивируют в селективной среде, как описано, и полученные клоны отбирают посредством детекции иммуноглобулинов в супернатанте культуры посредством ELISA.
После идентификации гибридомных клеток, которые продуцируют Ат с желаемой специфичностью, аффинностью и/или активностью, клоны, продуцирующие Ат, можно субклонировать посредством серийных разведений и можно выращивать стандартными способами культивирования клеток (Goding, Monoclonal Abs: Principles and Practice, págs. 59-103 (Academic Press, 1986)). Среды для культивирования, подходящие для этой цели, включают, например, среду D-MEM или RPMI-1640. Кроме того, гибридомные клетки можно выращивать in vivo у животного в форме асцитной опухоли.
МАт, секретированные субклонами, удобно выделять из среды для культивирования, асцитной жидкости или сыворотки общепринятыми способами очистки иммуноглобулинов, например, посредством белка A-сефарозы, хроматографии на гидроксиапатите, электрофореза в геле, диализа или аффинной хроматографии.
Также Ат по изобретению можно получать способами генетической инженерии, должным образом манипулируя генами иммуноглобулинов мыши. Например, химерные Ат по изобретению можно получить на основе РНК, выделяемой из клеток, продуцирующих моноклональные Ат мыши общепринятыми способами манипуляции с генами, такими как амплификация, клонирование, секвенирование генов и ферментативное расщепление, наряду с другими, описанными на существующем уровне техники, например в Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd. edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel, et al. eds., (2003)); la serie Methods in Enzimology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A practical approach (M. J. MacPherson, B. D. Hames y G. R. Taylor eds. (1995)), Harlow y Lane, eds. (1988) ABS, A laboratory manual, y Animal cell culture (R. I. Freshney, ed. (1987)).
Синтез кДНК и амплификацию ПЦР (акроним полимеразной цепной реакции) вариабельных областей Ат можно осуществлять на основе РНК, кодирующей Ат мыши, кДНК синтезируют, вариабельные области VK и VH амплифицируют с применением ПЦР, это можно осуществлять указанными ниже общепринятыми способами, описанными для этой цели на существующем уровне техники.
Продукты ПЦР для каждой из тяжелой и легкой цепей, соответственно, клонировали в векторы, используемые для секвенирования генов. Полученные в результате клоны секвенируют любым из способов, описанных для этой цели, например, способа с дидезоксинуклеотидами с применением ДНК-полимеразы T7 по инструкциям производителя.
Гены вариабельных областей тяжелой VH и легкой VK цепей получают посредством ферментативной рестрикции промежуточных конструкций и клонируют в соответствующие экспрессирующие векторы общепринятыми способами конструирования химерных генов. Для таких целей пригодны любые из описанных векторов для эффективной экспрессии рекомбинантных белков, особенно мАт.
Для экспрессии химерных Ат можно использовать клетки NS0, которые подвергают электропорации конструкциями ДНК в соответствующих экспрессирующих векторах, содержащих гены Ат. Эти клетки выращивают в селективной среде. Определение клонов, продуцирующих иммуноглобулин, проводят посредством измерения в супернатанте культур с использованием ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ).
Отбор Ат с желаемой специфичностью и функцией:
В определенных вариантах осуществления Ат по настоящему изобретению можно детектировать различными способами, описанными для этой цели на современном уровне техники, например, посредством ELISA.
В определенных вариантах осуществления анализируют биологическую активность Ат. В некоторых вариантах осуществления Ат по изобретению тестируют на их активность связывания антигена.
Анализы на связывание антигена, известные в данной области и которые можно использовать в настоящем описании изобретения, наряду с остальным, включают анализы прямого или конкурентного связывания, в которых применяют такие способы, как вестерн-блоттинг, радиоиммунный анализ, ELISA, иммунологический анализ с двумя антителами (сэндвич), анализ иммунопреципитации, флуоресцентные иммунологические анализы и иммунологические анализы с использованием белка А. Иллюстративные анализы на связывание антигена включены ниже в разделе примеров.
Кроме того, по настоящему изобретению можно идентифицировать клоны, продуцирующие Ат, способные распознавать атеросклеротические бляшки в срезах ткани аорты человека, это можно осуществлять общепринятыми иммуногистохимическими способами, описанными на существующем уровне техники.
В другом аспекте можно определять способность Ат по настоящему изобретению индуцировать антигепариновый ответ у мышей. Для этого различные группы животных иммунизируют Ат по изобретению и образцы сыворотки этих животных тестируют на присутствие Ат к гепарину.
В дополнительном аспекте можно определять антиатеросклеротический эффект Ат по настоящему изобретению, и для этого можно использовать модель индукции атеросклеротических повреждений у кроликов с применением липофундина. (Takács E, Hársing J, Füzesi S, Jellinek H. 1986 Arteriosclerosis developing in rabbits after lipofundin administration. Morphol Igazsagugyi Orv Sz. 26:99-105; Noa M & Más R (1992). Ateromixol y lesión aterosclerótica en conejos inducida por lipofundin. Progresos en Ciencias Médicas, 6: 14-19).
Фармацевтическая композиция:
В одном из вариантов осуществления изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей одно или несколько Ат по настоящему изобретению. В одном из вариантов осуществления композиция, содержащая антитело, дополнительно содержит эксципиент, который является фармацевтически приемлемым.
В одном из аспектов изобретение относится к набору реагентов, который содержит одно или несколько Ат по изобретению и может дополнительно содержать буферный раствор. В одном из вариантов осуществления буферный раствор является фармацевтически приемлемым. В одном из вариантов осуществления композиция, содержащая Ат, также включает молекулу-носитель, которая в некоторых вариантах осуществления является фармацевтически приемлемой. В одном из вариантов осуществления набор реагентов также включает инструкции для введения или использования этой композиции (например, Ат индивидууму).
Фармацевтические композиции, содержащие Ат по изобретению, получают для их хранения посредством смешивания Ат желаемого уровня чистоты с молекулами-носителями, необязательными физиологически приемлемыми эксципиентами или стабилизаторами (Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th edition (2000)), в форме водных растворов, лиофилизированных или других лиофилизированных составов. Приемлемые носители, эксципиенты или стабилизаторы являются нетоксичными для реципиентов во всех применяемых дозах и концентрациях.
МАт по изобретению находятся в фармацевтической композиции в комбинации в количествах, эффективных для намеченной цели.
in vivo
Составы для введения  должны быть стерильными. Этого достигают посредством фильтрации через стерильные фильтрационные мембраны.
В одном из аспектов в изобретении показано, как использовать Ат по изобретению для получения лекарственного средства для терапевтического и/или профилактического лечения такого нарушения, как сердечно-сосудистое заболевание.
Ат по изобретению можно использовать для лечения, подавления, замедления прогрессирования, предотвращения/задержки начала возникновения атеросклеротических повреждений, облегчения течения или предотвращения заболеваний, нарушений или процессов, связанных с экспрессией и/или активностью одной или нескольких антигенных молекул.
По настоящему изобретению терапевтическая доза этих Ат находится в диапазоне от 10 микрограмм до 10 мг в на дозу, предпочтительно, от 100 микрограмм до 1 мг на дозу.
МАт по изобретению вводят любыми соответствующими способами, включая парентеральный, подкожный, интраперитонеальный, внутрилегочный и интраназальный пути и, при желании, местное лечении, введение внутрь пораженной ткани.
В другом аспекте изобретение относится к набору реагентов для диагностики такого нарушения, как сердечно-сосудистое заболевание.
ПРИМЕРЫ:
Приведенные ниже примеры предназначены для иллюстрации изобретения без ограничения его объема.
Если не указано иначе, в приведенных ниже примерах все ферменты рестрикции или модификации, а также используемые реагенты и материалы получали из коммерческих источников.
3
Пример 1. Распознавание сульфатидов бычьего головного мозга химерным мАт к SO.
3
Планшеты PolySorp, Nunc, с использованием ELISA покрывали раствором сульфатидов бычьего головного мозга 50 мкл/лунку в концентрации 4 мкг/мл в метаноле, и растворитель выпаривали посредством инкубации в течение 90 минут при 37°C. Затем планшеты блокировали 200 мкл/лунку фосфатно-солевым буфером (PBS), содержащим 1% бычьего сывороточного альбумина (SAB), в течение одного часа при комнатной температуре. Затем, добавляли различные концентрации химерного антитела к SO в PBS в количестве 50 мкл/лунку и инкубировали в течение одного часа при 37°C. Затем планшеты промывали PBS и добавляли 50 мкл/лунку антисыворотки козы к гамма-цепи человека, конъюгированной с щелочной фосфатазой (Sigma). После инкубации планшетов в течение 1 часа при 37°C их снова промывали и добавляли 100 мкл/лунку раствора субстрата, состоящего из 1 мг/мл п-нитрофенилфосфата в диэтаноламиновом буфере, pH 9,8. Коэффициент поглощения продукта реакции измеряли в сканере ELISA при 405 нм через 30 минут инкубации при комнатной температуре.
3
3
В качестве отрицательного контроля использовали химерные мАт, модифицированные посредством замещения R на S в вариабельной области тяжелой цепи в положении 98 химерного моноклонального антитела к SO-. На фиг.1 показана реакционноспособность различных химерных мАт в отношении сульфатидов. На графике показано, что химерное моноклональное антитело к SO- распознает сульфатиды даже при такой низкой концентрации, как 0,01 мг/мл. В отличие от этого, химерные мАт, модифицированные в положении 98, не продемонстрировали какой-либо реакционноспособности.
Пример 2. Тест распознавания гепарина.
3
Затем оценивали, распознают ли химерные моноклональные антитела к SO- сульфатированные молекулы более сложные, чем сульфатиды. Для исследования выбрали гепарин, высокосульфатированную молекулу, которую используют в качестве модели сульфатированных гликозаминогликанов.
3
2
2
3
Анализ реакционноспособности в отношении гепарина проводили на основе способа ELISA для бигликана, разработанного Skalen, K. M. y cols (Nature 417: 750-754, 2002), с небольшими модификациями. Планшеты для микротитрования Maxisorp (Nunc) покрывали гепарином (Sigma) в концентрации 10 мкг/мл (100 мкл/лунку) в физиологическом растворе, забуференном Hepes (HBSS) (20 мМ Hepes, 150 мМ NaCl, pH 7,4) и инкубировали в течение ночи при 4°C. Планшеты три раза промывали HBSS, а затем блокировали HBSS, содержащим 1% SAB (HBSS-BSA), в течение одного часа при комнатной температуре. Планшеты три раза промывали HBSS-Tween 20 0,02% (HBSS-T) и добавляли серийные разведения химерного моноклонального антитела к SO-, начиная от исходной концентрации 40 мкг/мл в связывающем буфере (10 мМ Hepes, 20 мМ NaCl, 2 мМ CaCl, 2 мМ MgCl, pH 7,4), в течение одного часа при комнатной температуре. В качестве отрицательного контроля использовали химерные Ат, модифицированные замещением R на S в вариабельной области тяжелой цепи в положении 98 химерного моноклонального антитела к SO-. Планшеты дважды промывали HBSS-T, а затем инкубировали в течение одного часа при комнатной температуре с антисывороткой козы к гамма цепи человека, конъюгированной с щелочной фосфатазой (Sigma-Aldrich, USA), в HBSS-T, содержащем 0,1% SAB. Проводили необходимые отмывки, и проводили реакцию с использованием субстрата п-нитрофенилфосфата, растворенного в диэтаноламиновом буфере, pH 9,8. Коэффициент поглощения продукта при 405 нм количественно определяли в сканере ELISA (Organon Teknica, Austria).
3
Как показано на фиг.2, химерное моноклональное антитело к SO- обладало высокой реакционноспособностью в отношении гепарина. В отличие от этого, модифицированное химерное Ат, используемое в качестве изотипического контроля, не продемонстрировало какой-либо реакционноспособности в любой изучаемой концентрации.
Пример 3: Распознавание клеточной линии J774 посредством проточной цитометрии.
Моноциты и макрофаги важны при воспалительных процессах, таких как атеросклероз (Østerud B Björklid E. Physiol Rev 83:1069-1112, 2003). Эти клетки синтезируют протеогликаны и показано, что протеогликаны клеточной мембраны вовлечены в некоторые пути поглощения окисленных ЛПНП макрофагами в процессе образования пенистых клеток (Halvorsen B, et al. Biochem J. 331:743-752, 1998).
3
Для того, чтобы определить, способно ли химерное Ат к SO- распознавать макрофаги, авторы провели эксперименты с применением проточной цитометрии с использованием клеточных линий макрофагов мыши J774, которые культивировали в DMEM-F12 (Gibco BRL, Paisley, Scotland), дополненной 8% инактивированной фетальной телячьей сывороткой (SFT; Gibco), 2 мМ L-глутамином, 100 Ед/мл пенициллином, 100 мкг/мл стрептомицином.
6
3
Клетки (0,5×10 на пробирку) инкубировали с 20 мкл/пробирку инактивированной сыворотки кролика в течение 10 минут при 37°C, для блокирования рецепторов Fc-гамма. Затем добавляли химерное мАт к SO- и модифицированное химерное Ат изотипического контроля, оба биотинилированные, при концентрации 10 мкг/мл в PBS, pH 7,4, содержащем 1% бычий сывороточный альбумин (Sigma, St. Louis, MO) и 0,01% азид натрия, в течение 30 минут в ледяной бане. После промывания клеток, их инкубировали с комплексом стрептавидин-флуоресцеинизотиоцианат (Jackson Immunoresearch laboratories, West Grove, PA) при разведении 1/200 в течение 30 минут на ледяной бане. Клетки промывали, ресуспендировали в PBS, содержащем 1% азида натрия и анализировали на проточном цитометре (Becton-Dickinson, San Jose, CA).
3
Как показано на фиг.3, химерное Ат, используемое в качестве изотипического контроля, не распознавало клеточную линию J774. В отличие от этого, химерное Ат к SO- распознало 93,7% клеток.
Пример 4: Распознавание атеросклеротической бляшки в аорте человека.
3
2
2
3
Иммуногистохимическое определение химерного Ат к SO- проводили на фрагментах аорты человека, помещенных в формалин и залитых парафином. Применяли тканевые срезы толщиной 4 мкм, которые закрепляли на силанизированных покровных стеклах и инкубировали при 68°C в течение 12 часов. В тканевых срезах ксилолом удаляли парафин, и их гидратировали в этаноле при снижающихся концентрациях. Затем их промывали в течение 5 минут в дистиллированной воде и промывали в PBS. Демаскирование антигена проводили с использованием термостатической бани при температуре 100°C. Планшеты, погруженные в цитратный буфер pH 6,0, держали в бане в течение 30 минут, а затем кипятили в цитратном буфере pH 6,8 в течение 10 минут с использованием микроволновой печи. Покровные стекла оставляли для охлаждения в течение 20 минут, а затем промывали дистиллированной водой и PBS. Эндогенную пероксидазу ингибировали 3% раствором HO в течение 10 минут при комнатной температуре, промывали PBS и добавляли биотинилированное химерное Ат к SO- и Ат изотипического контроля в концентрации 50 мкг/мл в течение 30 минут при комнатной температуре. Затем, покровные стекла промывали PBS и добавляли комплекс стрептавидин-пероксидаза (Anacrom Diagnostics) на то же самое время и при той же температуре. В заключение, тканевые срезы инкубировали со свежим раствором смеси 3,3'-диаминобензидина (DAB) в 1 мл субстратного буфера в течение срока от 3 до 5 мин. Контраст осуществляли с применением гематоксилина Майера, образцы обезвоживали при возрастающих концентрациях спирта, очищали ксилолом и в заключение закрепляли на стационарных планшетах для среды Eukitt (Kinder GmbH&Co.). Оценку проводили с использованием оптического микроскопа (Leica).
3
На фиг.4 показано, как химерное Ат к SO- интенсивно реагировало с образцами атеросклеротических повреждений, присутствующих в аорте. Наблюдали реакционноспособность в отношении загруженных липидами макрофагов или пенистых клеток и с липидным ядром очага повреждения (реакционноспособность показана темно-коричневым цветом). На фигуре показано как Ат, используемое в качестве изотипического контроля, не распознавало срезы аорты человека.
3
Пример 5: Возможность индуцировать ответ к гепарину у мышей с применением химерного Ат к SO.
3
3
Использовали десять самок мышей BALB/c; им подкожно вводили 50 мкг химерного Ат к SO- в 200 мкл. Иммунизации проводили каждые 14 суток до введения полных четырех доз. Химерное Ат к SO- вводили без адъюванта или носителя белка. Образцы сыворотки брали на 0 и 49 сутки (семь суток после четвертой дозы).
Наличие Ат к гепарину в сыворотке иммунизированных животных определяли способом ELISA, описанным в примере 2, с использованием планшетов Maxisorp, покрытых гепарином (10 мкг/мл, 100 мкл/лунку). Сыворотки мышей тестировали при разведении 1/100 в связывающем буфере, 100 мкл/лунку. В качестве вторичного антитела применяли антисыворотку с антителами козы к IgG и IgM мыши, конъюгированными с щелочной фосфатазой (Jackson).
3
3
На фиг.5 представлены результаты анализа с сыворотками мышей, полученными на 0 и 49 сутки. Присутствия Ат к гепарину в сыворотке до иммунизации (0 сутки) у какого-либо животного не выявлено. В отличие от этого, присутствие этих Ат в сыворотке после того, как мышей иммунизировали химерными Ат к SO-, выявлено. Этот результат указывает на то, что химерное Ат к SO- не только хорошо распознает гепарин, но имеет неожиданную способность индуцировать ответ против этой молекулы (эффект вакцины).
При оценке тканевых срезов аорты кроликов, не получавших лечение, во всех них выявляли нормальную структуру артерий без каких-либо изменений, как показано на фиг.6.
3
В срезах аорты всех кроликов группы, которая получала липофундин, наблюдали характерные повреждения: наличие утолщения интимы с отложениями внеклеточного вещества между мышечными, эластическими и коллагеновыми волокнами и нарушение структуры ткани. В отличие от этого в образцах у трех кроликов, которые получали три дозы химерного Ат к SO-, а затем получали липофундин, не наблюдали никаких микроскопических повреждений. В образцах у оставшихся двух кроликов наблюдали изменения ткани, заключающиеся в дискретных утолщениях в некоторых областях артериальной стенки с отложением внеклеточного вещества между волокнами. Никакого утолщения интимы не выявляли.
3
Пример 6: Противоатеросклеротический эффект химерных Ат к SO-.
3
Для оценки способности химерного Ат к SO- обеспечивать биологический эффект in vivo, авторы изобретения использовали описанную ранее модель индукции атеросклеротических повреждений у кроликов с применением липофундина (Takács E and cols. Morphol Igazságugyi Orv Sz. 26:99-105, 1998, Noa M&R. More Progress in Medical Sciences, 6:14-19, 1992).
3
Использовали пятнадцать новозеландских кроликов, разделенных на три группы по пять кроликов. Группа 1 не получала никакого лечения (отрицательный контроль). Группа 2 получала ежедневно в течение восьми суток 2 мл на кг липофундина 20% (Braun), внутривенно. Группе 3 подкожно вводили 3 дозы по 100 мкг химерного Ат к SO- в PBS с интервалами семь суток, и на сутки последней иммунизации начинали ежедневное введение липофундина по той же схеме, которую применяли для животных группы 2. Всех кроликов умерщвляли посредством анестезии через сутки после получения последней дозы липофундина и животных отрицательного контроля группы 1 умерщвляли на те же сутки. У животных получали аорты и проводили патологическое исследование для определения присутствия макроскопических и микроскопических атеросклеротических повреждений.
3
В аортах кроликов группы 1, не получавших никакого лечения, крупных повреждений не выявлено. Во всех аортах кроликов группы 2, получавших 2 мл липофундина на кг в течение восьми суток, наблюдали крупные повреждения. В аортах кроликов, предварительно получавших три дозы химерного Ат к SO-, а затем получавших липофундин, макроскопических повреждений не выявляли.
Для изучения микроскопических повреждений фрагменты аорт помещали в формалин и заливали парафином. Использовали тканевые срезы толщиной 4 мкм, закрепленные на силанизированных покровных стеклах и окрашенные гематоксилином-эозином. Оценку проводили с использованием оптического микроскопа (Leica).
3
При оценке тканевых срезов аорты кроликов, не получавших лечение, во всех них выявляли нормальную структуру артерий без каких-либо изменений, как показано на фиг.6. В срезах аорты всех кроликов группы, которая получала липофундин, наблюдали характерные повреждения: наличие утолщения интимы с отложениями внеклеточного вещества между мышечными, эластическими и коллагеновыми волокнами и нарушение структуры ткани. В отличие от этого в образцах у трех кроликов, которые получали три дозы химерного Ат к SO-, а затем получали липофундин, не наблюдали никаких микроскопических повреждений. В образцах у оставшихся двух кроликов наблюдали изменения ткани, заключающиеся в дискретных утолщениях в некоторых областях артериальной стенки с отложением внеклеточного вещества между волокнами. Никакого утолщения интимы не выявляли.
Краткое описание чертежей:
3
Фигура 1. Распознавание сульфатидов химерным мАт к SO-.
3
В планшеты ELISA, покрытые сульфатидами в концентрации 4 мкг/мл в метаноле, добавляли различные концентрации химерных мАт к SO- и химерные мАт изотипического контроля. Реакционноспособность детектировали с использованием антисыворотки козы к гамма цепи человека, конъюгированной с щелочной фосфатазой. Оптическую плотность продукта при 405 нм количественно определяли на сканере ELISA. (*p<0,05, U-критерий Манна-Уитни).
3
Фигура 2. Распознавание гепарина химерным мАт к SO-.
3
Различные концентрации химерного мАт к SO- и химерное мАт изотипического контроля добавляли к планшетам ELISA, покрытым гепарином в концентрации 10 мкг/мл в HBSS. Реакционноспособность определяли с использованием антисыворотки козы к гамма-цепи человека, конъюгированной с щелочной фосфатазой. Оптическую плотность продукта при 405 нм количественно определяли в сканере ELISA. (*p<0,05, U-критерий Манна-Уитни).
3
Фигура 3. Распознавание клеточной линии J774 химерным мАт к SO-.
Клетки инкубировали с 10 мкг/мл биотинилированных Ат. Реакцию выявляли с использованием антисыворотки козы к IgG человека, конъюгированной с FITC, и анализировали посредством проточной цитометрии.
3
Фигура 4. Распознавание атеросклеротических бляшек человека химерным мАт к SO-.
3
3
Фрагменты аорты человека, помещенные в формалин и залитые парафином (4 мкм), инкубировали с биотинилированным химерным Ат к SO- и Ат изотипического контроля. Реакцию выявляли с использованием комплекса стрептавидин-пероксидаза. Эпитопы, распознаваемые мАт к SO- выделены интенсивным коричневым цветом, а ядра клеток контрастно окрашены гематоксилином. (400 X).
3
Фигура 5: Ответ Ат к гепарину, вызываемый иммунизацией химерным мАт к SO-.
3
Образцы сыворотки, полученной от мышей BALB/c на 0 и 49 сутки по схеме иммунизации с химерным мАт к SO-, анализировали с применением ELISA. Каждый символ представляет собой значение, полученное с использованием сыворотки мыши. pI и hI: перед иммунизацией и гипериммунизация, соответственно (*p<0,05, U-критерий Манна-Уитни).
3
Фигура 6: Эффект лечения химерным мАт к SO- при развитии атеросклеротических повреждений в модели с липофундином у кроликов.
3
Гистологические срезы грудных аорт кроликов, представляющие различные исследуемые группы. (A) группа 1, не получившее лечение животное, которое демонстрирует нормальное строение артерий без изменений. (B) группа 2, животные, получавшие лечение липофундином, где наблюдают утолщение интимы артерий с отложениями внеклеточного вещества между мышечными, эластическими и коллагеновыми волокнами и нарушение строения ткани. (C и D) группа 3, животные, иммунизированные химерным мАт к SO- и которые затем получали липофундин; никакого очевидного повреждения ткани или утолщения интимы не наблюдали. Окрашивание гематоксилином-эозином 180X.