СПОСОБ КЛОНИРОВАНИЯ ГИБРИДОМ

Полезная модель относится к области биотехнологии и может быть использована при получении клонов клеток.
При получении гибридом, продуцирующих моноклональные антитела, важное значение имеет этап клонирования, без которого невозможно обойтись. После слияния гибридомных клеток и элиминирования исходных лимфоцитов и клеток миеломы в лунках планшета, где находятся клетки гибридомы, возможно обнаружение смесей клеток разных клонов, продуцирующих моноклональные антитела, а также непродуцирующих клеток. Если не отделить продуцирующие клетки от непродуцирующих, то последние, размножаясь быстрее (т.к. не тратят энергию на синтез антител), дадут намного больше клеток-потомков по сравнению с нужными продуцирующими клетками, которые могут погибнуть от недостаточного поступления питательных веществ. Из смеси продуцирующих клеток также важно выделить клетки одного клона, чтобы можно было получить препарат одного моноклонального антитела, а не смесь разных моноклональных антител. Таким образом, суть клонирования заключается в получении культуры клеток, происходящей из одной предковой клетки, т.е. одного клона идентичных друг другу клеток, продуцирующих один тип моноклональных антител.
В качестве прототипа выбран способ клонирования гибридом (Кенет Р.Г. Клонирование в полужидком агаре / Ред. Р.Р. Кенет, Т.Дж. Мак-Керн, Д.Б. Бехтол; пер. с англ. Е.Д. Айнгорн // Моноклональные антитела. Гибридомы: новый уровень биологического анализа. - М.: Медицина, 1983. - С. 372-374), заключающийся в создании равномерной суспензии клеток гибридомы в питательной среде с легкоплавким агаром при температуре 41°C (когда агар еще жидкий, а клетки гибридомы сохраняют жизнеспособность), через 2 недели появившиеся колонии отбирают пастеровской пипеткой и переносят в питательную среду для дальнейшего культивирования.
Признаками, совпадающими с существенными признаками заявляемого способа, являются: визуально контролируемый отбор клеток и перенос их в питательную среду для дальнейшего культивирования.
Техническим результатом полезной модели является: получение в ранние сроки после слияния стабильных клонов гибридом, продуцирующих моноклональные антитела, с минимальными затратами времени и средств на клонирование и без риска потери ценных клонов или снижения их продуктивности.
Причинами, которые препятствуют достижению ожидаемого технического результата являются: трудности при подборе подходящего легкоплавкого агара (большинство выпускаемых агаров при температуре 41°C остаются твердыми); необходимость поддерживать постоянную температуру весь период смешивания; очень узкий (в пределах 1-2°C) интервал допустимых колебаний температуры при смешивании, что делает весьма вероятным потерю культуры, т.к. при более низкой температуре агар застывает неравномерно, а при более высокой - гибнут клетки.
В основу полезной модели поставлена задача усовершенствования способа-прототипа путем проведения более раннего прицельного забора клеток с использованием пипеточного микродозатора с насадкой, что позволяет минимизировать риск потери ценного клона, уменьшить материальные затраты и сократить сроки получения стабильных гибридом, продуцирующих моноклональные антитела, то есть достичь ожидаемого технического результата.
Поставленная задача решается тем, что при осуществлении способа клонирования гибридом, заключающегося в визуально контролируемом заборе клеток и переносе их в новую питательную среду для дальнейшего культивирования, согласно полезной модели, после слияния и выбора объектов клонирования под визуальным контролем прицельно отбирают гибридомные клетки четко отграниченного клона пипеточным микродозатором с насадкой, имеющей тонкую длинную носовую часть, после чего клетки переносят в свежую питательную среду для дальнейшего культивирования.
Между совокупностью существенных признаков предлагаемого способа и ожидаемым техническим результатом прослеживается следующая причинно-следственная связь: проведение раннего прицельного забора клеток, когда клоны, размножающиеся в одной лунке планшета еще не слились, позволяет быстро получить стабильные продуцирующие клоны, а вероятная в процессе многократного реклонирования потеря ценного клона практически исключается, использование для забора клеток пипеточного микродозатора с насадками, которые прекрасно выдерживают стерилизацию, удобны в работе и могут быть легко и быстро изготовлены, также сокращает сроки получения и уменьшает затраты средств на клонирование.
Предлагаемый способ клонирования гибридом заключается в следующем.
После слияния гибридомы, обнаружения гибридомных клонов и выбора объектов клонирования под визуальным контролем, используя инвертированный микроскоп, производят прицельный забор клеток из центральной части четко отграниченного клона при помощи пипеточного микродозатора с предварительно простерилизованной насадкой, имеющей тонкую длинную носовую часть. Клетки переносят в лунку другого планшета со свежей питательной средой и питающими клетками. При наличии в одной лунке нескольких клонов, отбор клеток каждого из них проводят отдельно с использованием новой насадки.
Возможность применения предлагаемого способа иллюстрируется примером.
Пример.
В процессе получения мышиных гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к липофорину из гемолимфы Adscita geryon (Insecta), через 9 дней после слияния гибридные клетки клонов, выбранных в результате иммунологического тестирования, были прицельно отобраны предложенным способом и перенесены в новые лунки с питательной средой.
В одном случае из одной лунки с тремя отдельно расположенными клонами перенос клеток каждого из клонов производили в разные лунки с использованием новой стерилльной насадки для каждого из клонов.
Наличие необходимого иммунного ответа подтверждено иммуноферментным анализом через 7 дней после клонирования.
Ни в одном случае не возникла необходимость в реклонировании, не наблюдалась гибель клона, а также снижение или потеря продуктивности.
В результате клонирования предлагаемым способом в кратчайшие сроки были получены четыре штамма гибридомных клеток, стабильно продуцирующих необходимые моноклональные антитела к различным антигенным детерминантам липофорина.
Использование предлагаемого способа позволяет осуществлять клонирование в кратчайшие сроки после слияния гибридомных клеток. В случае присутствия в одних и тех же лунках планшета клеток различных отграниченных гибридных клонов, способ позволяет эффективно отделить клетки клонов, продуцирующих различные моноклональные антитела, или продуцирующие клоны от не продуцирующих, при этом практически исключается потеря ценного клона, исчезает необходимость в реклонировании, а продуктивность полученных гибридом сохраняется.
Данный способ минимизирует затраты времени на клонирование, а кроме того, не требует дополнительных материальных затрат и применения сложной аппаратуры по сравнению со способом-прототипом.
Заявляемый способ прост и удобен, легко выполним в условиях биотехнологической лаборатории.