НОВЫЕ РАДИОИММУНОКОНЪЮГАТЫ И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
NOVEL RADIOIMMUNOCONJUGATES AND THEIR APPLICATIONS

Область техники изобретения
Настоящее изобретение относится к радиоиммунотерапии гематологической раковой опухоли меченным радиоактивным изотопом моноклональным антителом с неожиданно высокой цитотоксичностью.
Предпосылки изобретения
Терапия с помощью меченных радиоактивным изотопом антител была введена в отношении неходжкинской лимфомы (NHL), и в настоящее время она является одобренным способом. На рынке имеется два продукта, Zevalin™ и Bexxar™, и мишенями для обоих служит CDZO-антиген (Jacene et al., 2007).
Также CD20-антиген служит мишенью для иммунотерапевтического средства ритуксимаб (Rituxan™/Mabthera™). Одной проблемой обработки в отношении одной и той же мишени является вероятность иммунофенотипического дрейфа в ходе течения болезни (Ngo et al., 2009), который может служить причиной ослабленных эффектов терапии, направленной на CD20, как в случае повторяемой в течение продолжительного времени терапии ритуксимабом, или если радиоиммунотерапию (RIT), основанную на CD20, вводят вслед за продолжительной терапией ритуксимабом.
Большое число пациентов, получающих CD20-направленную терапию, со временем будут переживать рецидив (Buchegger et al., 2006; Gordon et al., 2004). Таким образом, для NHL-пациентов существует значительная необходимость в RIT, мишенью для которой служит другой антиген, отличный от CD20.
На раннем этапе развития RIT два антигена, CD37 и CD20, расценивались в качестве мишеней (Press et al., 2001). Был сделан вывод, что CD20-нацеленная RIT является более подходящей, и, следовательно, развитие CD37-направленной RIT было оставлено. Таким образом, в уровне техники известно, что моноклональные антитела являются подходящими для применения в RIT в отношении лимфомы, но что радиоиммуноконъюгат (RIC), мишенью которого служит CD20, превосходит RIC, с мишенью CD37 (Press et al., 2001).
В последние годы CD37 привлек некоторый новый интерес (Heider et al., 2009; Grosmaire, 2007), главным образом, как мишень для иммунотерапии с применением химерных или гуманизированных конструктов антител. Эти работы не рекомендуют применение традиционных мышиных IgG моноклональных антител, т.к. мышиные антитела могут индуцировать у пациентов выработку человеческого антитела к мыши (МАМА), которые могут служить причиной дискомфорта и уменьшают эффективность иммунотерапии.
Для RIT традиционные мышиные моноклональные антитела по-прежнему считаются интересными, т.к. обычно применяемые дозы белков снижены, и нет необходимости в повторении лечения в таком же объеме, как при иммунотерапии. Также клиренс мышиного IgG, как правило, немного быстрее, чем у гуманизированных или химерных версий того же IgG, что может быть более подходящим в отношении радиационного воздействия на все тело в результате RIT, по меньшей мере в некоторых параметрах. Необходимо отметить, что оба Bexxar и Zevalin имеют в основе мышиные антитела.
Настоящее изобретение обеспечивает мышиное антитело НН1 к CD37 в качестве носителя радиоизотопа. Оригинальный клон гибридомы, производящий мышиное антитело НН1 к CD37, разработали в 1980-х (Smeland et al., 1985), а антитело НН1 имелось в продаже для in vitro применения в иммуногистохимии в течение нескольких лет.
131
НН1 не оценивался прежде в отношении радиоиммунотерапии в плане поиска тканей-мишеней и клеточной цитотоксичности. Текущая работа, следовательно, предпринималась для оценки пригодности НН1 в радиоиммунотерапии. В отличие от предыдущих клинических и доклинических исследований RIC к CD37, применявших непосредственное мечение радиоактивным изотопом I остатков тирозина с применением способов с хлораминомТ/Иодогеном, НН1 метили радиоактивным изотопом через хелатор с применением металлического радионуклида вместо галогена.
131
Применение металлического радионуклида, меченного через хелатор-линкер, может иметь преимущество, т.к. применение антитела, меченного I, связано с облучением щитовидной железы различными количествами йода, высвобождаемого из RIC.
205,206
В предыдущем исследовании, чтобы оценить подходит ли НН1 для получения радиоиммуноконъюгата, к НН1 конъюгировали CHX-A-DTPA и конъюгат метили Bi для целей in vitro моделирования (Henriksen et al., 1997).
Поглощение в клеточной линии Raji сравнили для висмута, конъюгированного с НН1, и стрептавидина. В последнем случае клетки были предварительно насыщены биотинилированным-HH1.
212
213
Обнаружено, что число хелаторов, требуемых для обеспечения функционального RIC, при мечении Bi или Bi было лимитирующим фактором. Следовательно, было предложено применять биотинилированный НН1 вместо RIC, основанных на НН1. Биотинилированный НН1, после того как присоединен к клеткам, может затем служить мишенью для меченного радиоактивным изотопом стрептавидина.
Таким образом, исследование предполагает, что НН1, меченный радионуклидом, излучающим альфа-частицы, был менее пригодным из-за недостаточной специфической активности при концентрациях хелатора, которые считаются приемлемыми для того, чтобы НН1 сохранял достаточную способность к связыванию.
В статье также указывается, что бета-излучатель будет даже менее пригодным для конструирования функционального RIC по сравнению с альфа-излучателем (Henriksen et al., 1997), поскольку авторы утверждают, что нацеленная радиотерапия с бета-излучателем должна быть менее эффективна при диссеминированном поражении, потому что для получения достаточного эффекта необходимо глубинно-сфокусированное облучение.
Таким образом, цитированная выше работа не рекомендует применение в радиоиммунотерапии непосредственно хелатированного НН1, а также применение НН1 в RIC, основанном на бета-излучателе.
Краткое описание изобретения
211
213
212
212
225
227
90
186
188
199
194
166
159
153
149
142
111
109
77
67
47
177
Настоящее изобретение относится к радиоиммуноконъюгату, который связывает человеческий CD37, включающий мышиное моноклональное антитело НН1, линкер и радионуклид, выбранный из группы, состоящей из At, Bi, Bi, Pb, Ac, Th, Y, Re, Re, Au, Ir, Ho, Gd, Sm, Pm, Pr, Ag, Pd, As, Cu, Sc и Lu.
177
В варианте осуществления настоящего изобретения линкер представляет собой хелатообразующий линкер, а радионуклид представляет собой Lu.
Аспект настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции, включающей радиоиммуноконъюгат настоящего изобретения и фармацевтически приемлемый носитель.
В варианте осуществления настоящего изобретения фармацевтическая композиция настоящего изобретения включает одно или более дополнительных антител или радиоиммуноконъюгатов.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения для одного или более дополнительных антител или радиоиммуноконъюгатов мишенью служит CD20.
Дополнительный вариант осуществления настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции настоящего изобретения для обработки неопластических В-клеток, экспрессирующих CD37-антиген.
Вариант осуществления настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции для лечения неходжкинской лимфомы и хронического лимфолейкоза.
Аспект настоящего изобретения относится к применению радиоиммуноконъюгата настоящего изобретения для обработки В-клеточных неоплазий.
Вариант осуществления настоящего изобретения относится к применению радиоиммуноконъюгата настоящего изобретения, вводимого в комбинации с или в дополнение к другой терапии.
В варианте осуществления настоящего изобретения терапию выбирают из предварительного лечения, химиотерапии, терапии моноклональными антителами, хирургического вмешательства, радиотерапии и/или фотодинамической терапии.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения терапия включает предварительную обработку с применением моноклонального антитела к CD20 и/или к CD37 перед началом обработки радиоиммуноконъюгатом настоящего изобретения.
Аспект настоящего изобретения относится к способу обработки В-клеточной неоплазии, выбранной из неходжкинской лимфомы и хронического лимфолейкоза, включающему введение эффективного количества фармацевтической композиции настоящего изобретения.
Другой аспект настоящего изобретения относится к набору для изготовления радиоиммуноконъюгата настоящего изобретения, включающему два или больше флаконов, где один флакон содержит конъюгат, включающий хелатор, присоединенный к мышиному моноклональному антителу НН1; а второй флакон содержит радионуклид.
Вариант осуществления настоящего изобретения относится к набору по настоящему изобретению, где содержимое одного или более флаконов или лиофилизировано, или в растворе.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения радиоиммуноконъюгат образуется путем смешивания содержимого двух флаконов.
Краткое описание фигур
Фигура 1
111
111
125
125
Антитело, связанное с клеткой, непосредственно (А) и через 96 часов (В) после промывки при инкубации клеток Raji, Rael и Daudi с In-HH1, In-ритуксимабом, I-HH1 и I-ритуксимабом.
Фигура 2
177
177
Активность после связывания с клетками Daudi после инкубации с Lu-HH1 или Lu-ритуксимабом в течение 2 ч (А) и 18 ч (В). Блокированные клетки блокировали с помощью 100 мкг/мл немеченого антитела.
Фигура 3
177
177
Рост клеток Daudi, инкубированных с Lu-HH1 (А) или Lu-ритуксимабом
(В) в течение 2 ч перед промывкой.
Фигура 4
177
177
Рост клеток Daudi, инкубированных с Lu-HH1 (А) или Lu-ритуксимабом
(В) в течение 18 ч перед промывкой.
Фигура 5
111
Поиск тканей-мишеней НН1, In-меченным через хелатор, у мышей с ксенотрансплантатами Daudi.
Фигура 6
FITC-гистограммы немеченых клеток Daudi, клеток Daudi, меченных только вторичным антителом или меченных НН1, ON.108, IP0.24 или 6D263.
Фигура 7
177
Поиск тканей-мишеней Lu- у самок голых мышей с опухолью Daudi.
Фигура 8
177
Терапия мышей с в/в инъецированными клетками Daudi. Выживание мышей, обработанных 50 и 100 МБк/кг Lu-HH1, не содержащим радиоактивных веществ НН1, не содержащим радиоактивных веществ ритуксимабом и NaCl.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к применению антитела НН1 в радиоиммунотерапии.
Комбинация металлического радионуклида, линкера и моноклонального антитела к CD37 показала, что меченное радиоактивным изотопом НН1 имеет релевантный поиск тканей-мишеней и поглощение опухолью в модели ксенотрансплантат/голая мышь.
Это является важной информацией, которая указывает на пригодность для применения в радиоиммунотерапии.
Радиоиммуноконъюгаты
177
177
177
Настоящее изобретение показывает, что радиоиммуноконъюгат Lu-HH1 демонстрировал значительную цитотоксичность на диссеминированных опухолевых клетках и что Lu-HH1 был более цитотоксичным, чем Lu-ритуксимаб в отношении опухолевых клеток для данной дозировки.
177
Это открытие было неожиданным, т.к. больше радиоактивности связывалось на клетку, а также удержание связанного радионуклида было подобным или лучшим для Lu-ритуксимаба.
Это противоречит известному знанию в области техники, свидетельствующему, что для радиоиммунотерапии антитело к CD20 лучше, чем антитело к CD37. Кроме того, настоящая работа отличается от предыдущей точки зрения, заключающейся в том, что для бета-излучателя глубинно-сфокусированное облучение, которое невозможно получить в случае диссеминированных клеток, должно быть необходимым для получения достаточного эффекта (Henriksen et al., 1997).
Причина наблюдаемого эффекта неясна. Данные из экспериментов с различными дозировками немеченного НН1 и ритуксимаба не показали каких-либо эффектов со стороны немеченых антител в использованном анализе роста.
Одним возможным объяснением может быть то, что имеется меньшее число клеток с очень низкой антигенной плотностью CD37 по сравнению с CD20, даже, несмотря на то, что CD20 в среднем более сильно экспрессируется на использованной клеточной линии.
Данные удержания не означали лучшего удержания из-за интернализации CD37, что, напротив, может быть возможным объяснением, т.к. интернализация сообщалась для CD37-антигена (Press et al, 2001).
211
213
212
212
225
227
90
186
188
199
194
166
159
153
149
142
111
109
77
67
47
177
Таким образом, настоящее изобретение относится к радиоиммуноконъюгату, который связывает человеческий CD37, включающему мышиное моноклональное антитело НН1, линкер и радионуклид, выбранный из группы, состоящей из At, Bi, Bi, Pb, Ac, Th, Y, Re, Re, Au, Ir, Ho, Gd, Sm, Pm, Pr, Ag, Pd, As, Cu, Sc и Lu.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения линкер представляет собой хелатообразующий линкер.
177
В другом варианте осуществления настоящего изобретения радионуклид представляет собой Lu.
В еще одном варианте осуществления радионуклид представляет собой или бета-излучатель, или альфа-излучатель.
Настоящее изобретение предполагает, с in vitro данными, что меченный радиоактивным изотопом НН1 связывается более эффективно с CD37-антигеном, чем меченный радиоактивным изотопом ритуксимаб связывается с CD20-антигеном, т.е. он достигал максимального связывания с антигеном, требуя меньшего количества циркулирующего антитела (таблица 2, фигура 2).
Ему также требовалось меньше времени для достижения максимального связывания (фигура 2). Это может быть важными свойствами in vivo, также потому, что это означает, что опухолевые клетки могут улавливать RIC даже при более низкой концентрации циркулирующих антител, в ситуации, которая может иметь место в менее доступных участках солидных опухолей и для отдельных опухолевых клеток и микрометастазов, расположенных в удаленных участках нормальных тканей.
Это значительно отличается от предыдущих данных, указывающих, что более высокая концентрация антитела требовалась для насыщения антигена и получения благоприятного поиска тканей-мишеней при использовании другого антитела к CD37, нежели НН1 (Bernstein et al., 1990), также по сравнению с использованием антитела к CD20 (Press et al., 1993).
К тому же настоящее изобретение показывает, что НН1 имеет несколько отличающиеся свойства связывания антигена по сравнению с набором из трех различных антител к CD37, несмотря на то, что все антитела, главным образом, связываются с одним и тем же эпитопом.
Блокирующие эксперименты, т.е. с применением клеток, предварительно насыщенных немеченым антителом, показали, что на живых клетках НН1 будет блокировать CD37 от связывания с меченным радиоактивным изотопом НН1 значительно лучше, чем три другие антитела к CD37.
В клеточном анализе, сравнивающем меченные радиоактивным изотопом антитела, НН1 показал намного лучшую иммунореактивную долю по сравнению с тремя другими антителами. Под иммунореактивной долей подразумевают долю антитела, которая может связываться с антигеном, если имеется неограниченный избыток антигенов. Различные антитела могут иметь различную способность сохранять иммунореактивность после прохождения через процедуру мечения. Результаты в примере 6, эксперименте IV, таблице 5 показывают, что иммунореактивность НН1 лучше сохранялась, чем иммунореактивность трех коммерчески доступных антител.
С другой стороны, иммуногистохимические анализы показали, что три антитела окрашивали срезы ткани из образцов фиксированных опухолей, заключенных в парафин, тогда как НН1 не окрашивало. Различия во взаимодействиях антитело-антиген не поддались обнаружению с помощью проточной цитометрии.
Гистограммы проточной цитометрии были подобными для НН1 и трех других антител к CD37 (фигура 6). В целом эти данные показывают, что НН1 имеет выраженное индивидуальное взаимодействие с антигеном, которое в некоторых аспектах не может быть предсказано из работ с другими антителами к CD37.
177
Новый радиоиммуноконъюгат к CD37 с сильными цитотоксическими свойствами, описанный в настоящем документе, состоит из мышиного моноклонального антитела НН1, хелатообразующего линкера и бета-излучателя Lu.
Радионуклид может присоединяться к антителу сначала проведением реакции бифункционального хелатора, например p-SCN-bn-DOTA (Macrocyclics, Техас, США), с антителом, с последующей очисткой для удаления неконъюгированного хелатора и затем реакцией конъюгата хелатор-антитело с радионуклидом, с последующей очисткой для удаления любого неконъюгированного радионуклида.
Альтернативно, хелатор и радионуклид можно комбинировать в первую очередь и впоследствии конъюгировать к антителу.
177
Хелатообразующие линкеры, как, например, p-SCN-bn-DOTA, можно применять для конъюгирования к НН1 других металлических радионуклидов точно так же, как описано для Lu.
Можно применять любой тип линкера с достаточной способностью к комплексообразованию и функциональной группой, обеспечивающей прямую или непрямую конъюгацию к белку или пептиду. Примеры таких линкеров описываются в литературе (например, Brechbiel, 2008; Liu, 2008). Некоторые применимые примеры представляют собой бифункциональные циклические хелаторы, как p-SCN-bn-DOTA, DOTA-NHS-сложный эфир; бифункциональные линейные хелаторы, как p-SCN-Bn-DTPA и СНХ-A”-DTPA.
Радионуклиды в настоящем изобретении будут предпочтительно конъюгировать с молекулой-мишенью с применением бифункциональных хелаторов.
Они могут представлять собой циклические, линейные или разветвленные хелаторы. Особого упоминания заслуживают полиаминополикислотные хелаторы, включающие линейный, циклический или разветвленный полиазаалкановый скелет с кислотными (например, карбоксиалкильными) группами, присоединенными к азотам скелета.
Примеры подходящих хелаторов включают производные DOTA, такие как р-изотиоцианатобензил-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7,10-тетрауксусная кислота (p-SCN-Bz-DOTA), и производные DTPA, такие как р-изотиоцианатобензил-диэтилентриаминпентауксусная кислота (p-SCN-Bz-DTPA), первые представляют собой циклические хелаторы, последние - линейные хелаторы.
Металлирование комплексообразующей части можно осуществлять до или после конъюгации комплексообразующей части с нацеливающей частью.
Процедура мечения радиоактивным изотопом в общем будет удобнее в плане затраченного времени и т.д., если хелатор конъюгируют с антителом перед тем, как происходит мечение радиоактивным изотопом.
Принципы приготовления меченных радиоактивным изотопом конъюгатов с применением хелаторов, прикрепляемых к антителам, шире описываются в, например, Liu, 2008.
Таким образом, НН1 можно применять для приготовления радиоиммуноконъюгатов с отличиями в радиационных свойствах и эффективными периодами полураспада.
177
211
213
212
212
225
227
90
186
188
199
194
166
159
153
149
142
111
109
77
67
47
Например, радиоиммуноконъюгат к CD37, состоящий из мышиного моноклонального антитела НН1, хелатообразующего линкера и бета- или альфа-излучающего радионуклида, включающий, но без ограничений, Lu At, Bi, Bi, Pb, Ac, Th, Y, Re, Re, Au, Ir, Ho, Gd, Sm, Pm, Pr, Ag, Pd, As, Cu, Sc, можно приготавливать и применять для приготовления фармацевтических препаратов, а также применять в терапевтических целях.
Фармацевтические композиции
Радиоиммунотерапевтический продукт на основе НН1 обычно будет обеспечиваться как фармацевтическая композиция, состоящая из радионуклида по описанию выше, присоединенного через хелатор к мышиному моноклональному антителу НН1, растворенного в буферном растворе, который в существенной степени поддерживает химическую целостность радиоиммуноконъюгата и является физиологически приемлемым для инфузии в пациентов.
Таким образом, аспект настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции, включающей радиоиммуноконъюгат настоящего изобретения, а также фармацевтически приемлемый носитель и/или наполнитель.
Приемлемые фармацевтические носители включают, но без ограничений, нетоксичные буферы, заполнители, изотонические растворы и т.д. Более конкретно, фармацевтический носитель может представлять собой, но без ограничений, нормальный солевой раствор (0/9%), полунормальный солевой раствор, лактат Рингера, 5% декстрозу, 3,3% декстрозу/0,3% солевой раствор. Физиологически приемлемый носитель может включать радиолитический стабилизатор, например аскорбиновую кислоту, которая защищает целостность радиофармацевтического средства во время хранения и транспортировки.
Один вариант осуществления настоящего изобретения включает фармацевтическую композицию настоящего изобретения, а также один или несколько дополнительных антител или радиоиммуноконъюгатов. Антитела включают, но без ограничений, Ритуксимаб, Эпратузумаб, L19, F8, F16, Галиксимаб, Торализумаб, Алемтузумаб, Офатумумаб, Велтузумаб, Афутузумаб, Тозитумомаб, Редитукс и Ибритумомаб. Радиоиммуноконъюгаты включают, но без ограничений, Zevalin и Bexxar.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения для одного или нескольких дополнительных антител или радиоиммуноконъюгатов мишенью служит CD20. Антитела включают, но без ограничений, Ритуксимаб, Велтузумаб, Офатумумаб, Афутузумаб, Тозитумомаб, Редитукс и Ибритумомаб. Радиоиммуноконъюгаты включают, но без ограничений, Zevalin и Bexxar.
Дополнительный вариант осуществления настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции настоящего изобретения для обработки неопластических В-клеток, экспрессирующих CD37-антиген.
В варианте осуществления настоящего изобретения фармацевтическая композиция предназначена для лечения неходжкинской лимфомы и хронического лимфолейкоза.
Идентичность последовательности
Как определяется обычно, "идентичность" в настоящем документе определяется как идентичность последовательности между генами или белками на нуклеотидном или аминокислотном уровне, соответственно.
Таким образом, в настоящем контексте "идентичность последовательности" представляет собой меру идентичности между белками на аминокислотном уровне и меру идентичности между нуклеиновыми кислотами на нуклеотидном уровне.
Идентичность последовательности белка можно определять, сравнивая аминокислотную последовательность в данном положении в каждой последовательности, когда последовательности выровнены.
Подобным образом, идентичность последовательности нуклеиновой кислоты можно определять, сравнивая нуклеотидную последовательность в данном положении в каждой последовательности, когда последовательности выровнены.
Для определения процента идентичности двух последовательностей нуклеиновой кислоты или аминокислотных последовательностей последовательности выравнивают для целей оптимального сравнения (например, могут вводиться гэпы в последовательность первой аминокислотной последовательности или последовательность нуклеиновой кислоты для оптимального выравнивания со второй аминокислотной последовательностью или последовательностью нуклеиновой кислоты). Затем сравниваются остатки аминокислот или нуклеотиды в соответствующих аминокислотных или нуклеотидных положениях.
Когда положение в первой последовательности занимает тот же аминокислотный остаток или нуклеотид, как в соответствующем положении во второй последовательности, тогда молекулы являются идентичными по данному положению. Процент идентичности между двумя последовательностями представляет собой функцию числа идентичных положений, общих для последовательностей (т.е., % идентичности=кол-во идентичных положений/общее кол-во положений (например, перекрывающихся положений) × 100). В одном варианте осуществления две последовательности имеют одинаковую длину.
Можно вручную выравнивать последовательности и подсчитывать число идентичных нуклеиновых кислот или аминокислот. Альтернативно, выравнивание двух последовательностей для определения процента идентичности можно осуществлять с применением математического алгоритма. Такой алгоритм внедрен в программы NBLAST и XBLAST. Поиски нуклеотидов BLAST можно осуществлять с помощью программы NBLAST, оценка=100, длина «слова»=12, для получения нуклеотидных последовательностей, гомологичных молекулам нуклеиновой кислоты настоящего изобретения. Поиски белков BLAST можно осуществлять с помощью программы XBLAST, оценка=50, длина «слова»=3, для получения аминокислотных последовательностей, гомологичных молекуле белка настоящего изобретения.
Для получения выравниваний с гэпами для целей сравнения может быть полезен Gapped BLAST. Альтернативно, PSI-Blast можно применять для осуществления итеративного поиска, который обнаруживает отдаленные взаимоотношения между молекулами. При использовании программ NBLAST, XBLAST и Gapped BLAST можно применять параметры по умолчанию соответствующих программ. См. http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Альтернативно, идентичность последовательности можно рассчитывать после того, как последовательности были выровнены, например, с помощью программы BLAST в базе данных EMBL (www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST).
В основном, для выравнивания можно применять установки по умолчанию в отношении, например, «матрицы замен» и «штрафа за гэп». В контексте настоящего изобретения установки по умолчанию BLASTN и PSI BLAST могут быть предпочтительными.
Процент идентичности между двумя последовательностями можно определить с применением методов, подобных описанным выше, допуская или не допуская гэпы. При расчете процента идентичности подсчитываются только точные пары.
Вариант осуществления настоящего изобретения относится к изолированной нуклеиновой кислоте, включающей последовательность, разделяющую 80% идентичности последовательности с последовательностью VH (SEQ ID NO: 1) и/или последовательностью VL (SEQ ID NO: 3) антитела НН1.
Вариант осуществления настоящего изобретения относится к изолированной нуклеиновой кислоте, включающей последовательность с последовательностью VH (SEQ ID NO: 1) и/или последовательностью VL (SEQ ID NO: 3) антитела НН1.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения изолированная нуклеиновая кислота включает последовательность, разделяющую по меньшей мере 90% идентичности последовательности с последовательностью VH (SEQ ID NO: 1) и/или последовательностью VL (SEQ ID NO: 3) антитела НН1, как, например, 90% идентичности, 91% идентичности, 92% идентичности, 93% идентичности, 94% идентичности, 95% идентичности, 96% идентичности, 97% идентичности, 98% идентичности или 99% идентичности.
Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к антителу, включающему полипептидную последовательность, разделяющую 80% идентичности последовательности с последовательностью VH (SEQ ID N0: 2) и/или последовательностью VL (SEQ ID NO: 4) антитела НН1.
Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к антителу, включающему полипептидную последовательность с последовательностью VH (SEQ ID NO: 2) и/или последовательностью VL (SEQ ID NO: 4) антитела НН1.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения антитело включает последовательность, разделяющую по крайней мере 90% идентичности последовательности с последовательностью VH (SEQ ID NO: 2) и/или последовательностью VL (SEQ ID NO: 4) антитела НН1, как, например, 90% идентичности, 91% идентичности, 92% идентичности, 93% идентичности, 94% идентичности, 95% идентичности, 96% идентичности, 97% идентичности, 98% идентичности или 99% идентичности.
Генетическая изменчивость
Генетическая изменчивость обусловлена изменением в порядке оснований в нуклеотидах в генах. Эта изменчивость обуславливает мутации в генах и впоследствии в белках, кодируемых такими генами.
Эти мутации могут быть как смысловыми, так и миссенс-мутациями или заменами.
Вариант осуществления настоящего изобретения относится к изолированной последовательности нуклеиновой кислоты VH-цепи (SEQ ID NO: 1) и/или VL-цепи (SEQ ID NO: 3) моноклонального антитела НН1, которая включает по меньшей мере 50, как, например, 20, как, например, 10, как, например, 5, как, например, 4, как, например, 3, как, например, 2, как, например, 1 смысловую мутацию.
Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к изолированной последовательности нуклеиновой кислоты VH-цепи (SEQ ID NO: 1) и/или VL-цепи (SEQ ID NO: 3) моноклонального антитела НН1, которая включает 0-50, как, например, 1-50, как, например, 0-20, как, например, 1-20, как, например, 0-10, как, например, 1-10, как, например, 0-5, как, например, 1-5, как, например, 3, как, например, 1 смысловую мутацию.
Миссенс-мутация (тип несинонимичной мутации) представляет собой точечную мутацию, при которой меняется один нуклеотид, что приводит к кодону, кодирующему отличающуюся аминокислоту (мутации, которые меняют аминокислоту на стоп-кодон, рассматриваются скорее как нонсенс-мутации, а не миссенс-мутации). Миссенс-мутация может переводить в нефункциональное состояние получающийся в результате белок.
Однако не все миссенс-мутации ведут к заметным изменениям белка. Аминокислота может замещаться аминокислотой с очень похожими химическими свойствами, в этом случае белок может, тем не менее, функционировать нормально; это называется нейтральной, «тихой» или консервативной мутацией.
Альтернативно, замена аминокислоты может происходить в участке белка, который не влияет значительно на вторичную структуру или функцию белка. Когда аминокислота может кодироваться более чем одним кодоном (так называемый «вырожденный код»), мутация в кодоне может не производить никакого изменения в трансляции; это будет синонимичная мутация (форма молчащей мутации), а не миссенс-мутация.
Вариант осуществления настоящего изобретения относится к антителу, включающему полипептидную последовательность VH-цепи (SEQ ID NO: 1) и/или VL-цепи (SEQ ID NO: 3) моноклонального антитела НН1, которая включает по меньшей мере 50, как, например, 20, как, например, 10, как, например, 5, как, например, 4, как, например, 3, как, например, 2, как, например, 1 миссенс-мутацию.
Вариант осуществления настоящего изобретения относится к антителу, включающему полипептидную последовательность VH-цепи (SEQ ID NO: 1) и/или VL-цепи (SEQ ID NO: 3) моноклонального антитела НН1, которая включает 0-50, как, например, 1-50, как, например, 0-20, как, например, 1-20, как, например, 0-10, как, например, 1-10, как, например, 0-5, как, например, 1-5, как, например, 3, как, например, 1 миссенс-мутацию.
Консервативная замена представляет собой замену одной аминокислоты на другую с, главным образом, похожими свойствами так, чтобы, скорее всего, не повлиять серьезно на общее функционирование.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения миссенс-мутации представляют собой консервативные мутации или замены.
Дополнительный вариант осуществления настоящего изобретения относится к изолированной последовательности нуклеиновой кислоты или полипептидной последовательности с 80% идентичности последовательности к вариабельной тяжелой цепи (SEQ ID NO: 2) и/или вариабельной легкой цепи (SEQ ID NO: 4) последовательностей НН1, где изменчивость последовательности представляет собой консервативные замены.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения идентичность последовательности является 80% идентичности, как, например, 90% идентичности, 91% идентичности, 92% идентичности, 93% идентичности, 94% идентичности, 95% идентичности, 96% идентичности, 97% идентичности, 98% идентичности или 99% идентичности, а изменчивость последовательности представляет собой консервативные замены.
С целью улучшения этапа мечения радиоактивным изотопом может быть полезным введение дополнительного лизина в, например, Fc-фрагмент НН1. Это может снижать вероятность прикрепления хелаторов, связывающих лизин, в антиген-комбинирующие участки на антителе, таким образом, снижая риск подвергания опасности иммунореактивности во время мечения радиоактивным изотопом.
Способы для введения лизина в, например, Fc-фрагмент НН1 известны в уровне техники, например Hemminki et al., 1995.
Вариант осуществления настоящего изобретения относится к радиоиммуноконъюгату настоящего изобретения, который был модифицирован 10 Lys в Fc-фрагменте НН1, как, например, 8 Lys, как, например, 6 Lys, как, например, 5 Lys, как, например, 4 Lys, как, например, 3 Lys, как, например, 2 Lys, как, например, 1 Lys.
Обработка
Терапевтическое применение фармацевтического раствора по настоящему изобретению может быть для обработки неопластических клеток, экспрессирующих CD37-антиген, включающих, но без ограничений, неходжкинскую лимфому и хронический лимфолейкоз.
Другими применениями может быть лечение аутоиммунных заболеваний и лечение эффектов, связанных с трансплантацией. Терапия может основываться на, но без ограничений, излучении бета-частиц, или излучении альфа-частиц, или их комбинации.
Терапию можно вводить или в виде монотерапии, или в комбинации с другими терапиями, преимущественно стандартными обработками. Такие другие терапии могут представлять собой предварительное лечение, хирургическое вмешательство, химиотерапию, иммунотерапию, фотодинамическую терапию, радиоиммунотерапию или комбинацию двух или большего числа из них. Под введением подразумевают внутривенную инфузию или внутривенную инъекцию. Более конкретно, радиоиммуноконъюгат настоящего изобретения можно вводить непосредственно в вену с помощью периферической канюли, присоединенной к капельнице, которая предотвращает воздушную эмболию и позволяет оценить скорость потока в пациента.
В одном варианте осуществления радиоиммуноконъюгат можно вводить многократно.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения радиоиммуноконъюгат можно вводить многократно, но с различными радионуклидами, например, за бета-радиоиммунотерапией может следовать альфа-радиоиммунотерапия или наоборот.
Аспект настоящего изобретения относится к применению радиоиммуноконъюгата настоящего изобретения для обработки В-клеточных неоплазий.
Вариант осуществления настоящего изобретения относится к применению радиоиммуноконъюгата настоящего изобретения, вводимого в комбинации с или в дополнение к другой терапии.
В варианте осуществления настоящего изобретения другие терапии выбирают из предварительного лечения, химиотерапии, терапии моноклональными антителами, хирургического вмешательства, радиотерапии и/или фотодинамической терапии.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения другими терапиями являются пересадка костного мозга или пересадка стволовых клеток и/или терапия.
Другой вариант осуществления настоящего изобретения включает терапевтическую предварительную обработку с применением моноклонального антитела к CD20 и/или к CD37 перед началом обработки радиоиммуноконъюгатом настоящего изобретения.
Аспект настоящего изобретения относится к способу обработки В-клеточной неоплазии, выбранной из неходжкинской лимфомы и хронического лимфолейкоза, включающему введение эффективного количества фармацевтической композиции настоящего изобретения.
177
В одном варианте осуществления настоящего изобретения дозировка антитела составляет 1-1000 мг на пациента, более предпочтительно 5-50 мг на пациента, a Lu в размере 1-200 МБк/кг, более предпочтительно 10-100 МБк/кг веса тела.
Наборы
Аспект настоящего изобретения относится к набору для изготовления радиоиммуноконъюгата настоящего изобретения, включающему два или более флаконов, где один флакон содержит конъюгат, включающий хелатор, присоединенный к мышиному моноклональному антителу НН1; а второй флакон содержит радионуклид.
В случае набора перед инфузией может потребоваться осуществление некоторых процедур, например, мечения радиоактивным изотопом и/или очистки.
Вариант осуществления настоящего изобретения относится к набору настоящего изобретения, где содержимое одного или нескольких флаконов или лиофилизировано, или в растворе.
Конечный продукт появится при смешивании содержимого двух флаконов для образования радиоиммуноконъюгата. Таким образом, в другом варианте осуществления настоящего изобретения радиоиммуноконъюгат образуется путем смешивания содержимого двух флаконов. Может потребоваться очистка этого продукта перед применением.
Примеры
Пример 1. Мечение НН1 радиоактивным изотопом
125
Йодирование: Антитела метили I посредством непрямого йодирования, с применением пробирок для йодирования, предварительно покрытых IODOGEN (Pierce, Рокфорд, Иллинойс) в соответствии с описанием производителя.
111
177
Мечение In и Lu; Антитела вначале приводили в реакцию с хелатором (p-SCN-Bn-DTPA или p-SCN-Bn-DOTA).
111
177
Хелатор DTPA или DOTA растворяли в 0,05 М HCl и затем добавляли к антителу, рН которого доводили до приблизительно 8 промывкой карбонатным буфером, в соотношении 5:1. Затем снова проверяли рН и, при необходимости, доводили. Раствор встряхивали в течение 60 мин при комнатной температуре и затем реакцию останавливали добавлением 50 мкл 200 мМ раствора глицина (на мг антитела). Для удаления свободного хелатора конъюгированное антитело промывали 4-5 раз PBS (РАА), а затем доводили до рН 5 промывкой ацетатом аммония. Затем к 0,5 мг DOTA-Ab добавляли In или Lu (Perkin Elmer, Бостон, Массачусетс, США) и встряхивали в течение одного часа при 42°С. Наконец, продукт очищали элюированием на колонке для гель-фильтрации, например Sephadex G-25 PD10 (GE health) или подобной. Общий выход мечения варьировал от 17% до 63%.
111
177
7
Качество радиоиммуноконъюгатов оценивали с применением клеток лимфомы и модифицированного метода Линдмо. Для компенсации умеренной специфической активности In-конъюгатов применяли концентрации клеток до 108 клеток на мл. Для Lu-конъюгатов (имеющих более высокую специфическую активность) достаточным является применение клеточных концентраций до 4·10 клеток на мл.
Иммунореактивность и специфическую активность радиоиммуноконъюгатов можно увидеть в таблице 1.
Пример 2. Параметры связывания
d
max
a
d
max
125
Константу скорости ассоциации, ka, равновесную константу диссоциации, K, и среднее число участков связывания, B, оценивали одношаговым методом построения кривой (Dahle et al. 2007). Параметры связывания оценивали для НН1 и ритуксимаба и для трех различных клеточных линий лимфомы; клеток Raji, Rael и Daudi (таблица 2). Специфичное связывание оценивали как функцию времени и концентрации антитела, и решение дифференциального уравнения, описывающего чистую скорость образования комплекса антиген-антитело, аппроксимировали к точкам экспериментальных данных с применением константы скорости ассоциации, k, равновесной константы диссоциации, K, и среднего числа участков связывания, B, в качестве параметров. Применяли пять миллионов клеток на мл, четыре концентрации I-меченного антитела (100 нг/мл, 1000 нг/мл, 5000 нг/мл и 10000 нг/мл) и 7 моментов времени инкубации (5 мин, 10 мин, 20 мин, 30 мин, 1 ч, 1,5 ч и 2 ч). После инкубации клетки промывали дважды PBS и затем подсчитывали в счетчике гамма-частиц.
Пример 3. Удержание антитела, связанного с клеткой
111
111
125
125
Удержание антитела, связанного с клеткой, непосредственно и через 96 часов после промывки оценивали после инкубации клеток Raji, Rael и Daudi с In-HH1, In-ритуксимабом, I-HH1 и I-ритуксимабом (фигура 1).
125
111
Один миллион клеток в 1 мл среды RPMI 1640 с 10% фетальной бычьей сывороткой, 1% L-глутамином и 1% пенициллином/стрептомицином инкубировали с 1 мкг/мл I- или n-меченным НН1 или ритуксимаба в течение одного часа, промыли дважды средой и инкубировали дополнительно в течение четырех дней. Активность после связывания с клеткой определяли непосредственно после промывки (фигура 1А) и после четырех дней инкубации (фигура 1В) путем оценки числа клеток (Vi Cell Viability Analyzer, Beckman Coulter, Фуллертон, Калифорния, США) и количества радиоактивности с помощью откалиброванного гамма-детектора (автоматический гамма-детектор Cobra II, Packard Instrument Company, Мериден, Коннектикут, США).
177
177
Пример 4. Обработка клеток лифомы in vitro Lu-HH1 или Lu-ритуксимабом
177
Эксперимент I: связывание Lu-HH1 с клетками Daudi
177
177
177
177
Один мл суспензии клеток Daudi (1 миллион клеток/мл) высеяли в 24 пробирки и половину пробирок блокировали 100 мкг/мл или НН1, или ритуксимаба и инкубировали в течение 30 минут при 37°С. Затем в каждую пробирку добавляли или Lu-HH1, или Lu-ритуксимаб до конечной концентрации 0, 1, 2,5, 5, 10 или 20 мкг/мл и инкубировали дополнительно при 37°С. Специфическая активность составляла 91,6 кБк/мкг для Lu-HH1 и 136,6 кБк/мкг для Lu-ритуксимаба.
Количество добавочной активности оценивали во время периода инкубации с помощью гамма-детектора (автоматический гамма-детектор Cobra II, Packard Instrument Company). Спустя 2 часа половину клеток промыли и оценили активность после связывания с клеткой (фигура 2А), а половину клеток инкубировали в течение ночи (18 ч) перед промывкой и оценкой активности после связывания с клеткой (фигура 2В).
Не было обнаружено отличия между клетками, которые инкубировали с НН1, и клетками, которые инкубировали с ритуксимабом, после 2 часов инкубации, а после 18 часов инкубации активность после связывания с клеткой была в два раза выше для клеток, которые инкубировали с ритуксимабом, по сравнению с клетками, которые инкубировали с НН1 (фигура 2).
Таблицы 3 и 4 показывают, что меченный радиоактивным изотопом НН1 насыщает антиген быстрее и при более низкой концентрации антитела, чем ритуксимаб. Неспецифическое связывание оказывается подобным для двух радиоиммуноконъюгатов (RIC), и оно увеличивается с увеличением концентрации RIC в среде.
177
Максимальное число специфичного связанного Lu было примерно в два раза выше для ритуксимаба по сравнению с НН1. Однако при дозировке 1 мкг/мл практически не было отличий в числе специфично связанных радиоактивных атомов.
177
Эксперимент II: двухчасовая инкубация с Lu-IgG: данные клеточного роста
Клетки Daudi инкубировали с радиоиммуноконъюгатами, как в эксперименте I (фигура 2А).
177
177
Рост клеток Daudi после 2 часов инкубации с Lu-HH1 или Lu-ритуксимабом оценивали с помощью посева 50000 клеток из каждой пробирки в три лунки в шесть 12-луночных планшетов. Количество клеток оценивали для нескольких моментов времени следующих 14 дней с применением автоматической системы визуализации (Clone Select Imager, Gentix Ltd, Гэмпшир, Великобритания).
177
177
177
He был обнаружен эффект на клеточный рост немеченого антитела самого по себе. Однако блокированные клетки, обработанные Lu-антителом, явно не росли так быстро, как необработанные контрольные клетки, указывая, что существовал эффект на клетки несвязанного Lu-антитела или неспецифично связанного Lu-антитела (фигура 3).
177
177
177
Обработка неблокированных клеток Lu-антителом привела к увеличению в задержке роста на 44% для клеток, обработанных 10 мкг/мл Lu-HH1 (фигура 3А), и на 31% для клеток, обработанных 10 мкг/мл Lu-ритуксимабом (фигура 3В).
177
При обработке 20 мкг/мл различие между двумя антителами было даже больше, т.к. не было возобновления роста клеток, обработанных Lu-HH1. Этот результат был неожиданным, т.к. клетки были мечены одинаковым количеством антитела (фигура 2А).
177
Эксперимент III: восемнадцатичасовая инкубация Lu-IgG: данные клеточного роста.
177
177
Клетки Daudi инкубировали с радиоиммуноконъюгатами, как в эксперименте I (фигура 2В). Рост клеток Daudi после 18 часов инкубации с Lu-HH1 или Lu-ритуксимабом оценивали с помощью посева 50000 клеток из каждой пробирки в три лунки в шесть 12-луночных планшетов.
Количество клеток оценивали для нескольких моментов времени следующих 14 дней с применением автоматической системы визуализации (Clone Select Imager, Gentix Ltd, Гэмпшир, Великобритания). Не было обнаружено эффекта на клетки немеченого антитела самого по себе.
177
Ингибирование клеточного роста на блокированных клетках, обработанных Lu-антителом, было больше в этом эксперименте (фигура 4), чем в эксперименте II (фигура 3) из-за увеличенного на 16 часов времени инкубации с радиоиммуноконъюгатом в среде.
177
177
177
177
177
Обработка неблокированных клеток Lu-антителом привела к увеличению в задержке роста на 107% для клеток, обработанных 2,5 мкг/мл Lu-HH1 (фигура 4 А), и на 52% для клеток, обработанных 2,5 мкг/мл Lu-ритуксимабом (фигура 4В). Этот результат был неожиданным, т.к. после 18 ч инкубации клеткам, меченным Lu-ритуксимабом, была присуща в два раза большая активность после связывания с клеткой, чем клеткам, меченным Lu-HH1 (фигура 2В).
Пример 5. Поиск тканей-мишеней НН1
111
3
Поиск тканей-мишеней для In-меченного НН1 изучали на мышах BALB/c-nude (nu/nu) с помощью ксенотрансплантатов Daudi с размером 32-256 мм в начале исследования.
Мечение радиоактивным изотопом осуществляли с применением pSCN-Bz-DOTA, в качестве бифункционального хелатообразующего средства для образования комплекса с радионуклидом и прикрепления его к антителу (см. Пример 1). Препарат вводили инъекцией в хвостовую вену 100 мкл раствора в каждое животное.
111
Каждое животное инъецировали эквивалентом активности в 120 кБк. Для каждого момента времени применяли по пять животных. Вскрытия осуществляли после дислокации шейных позвонков в различные моменты времени после инъекции. Определяли вес каждого образца ткани и оценивали In с помощью откалиброванного гамма-детектора (автоматический гамма-детектор Cobra II, Packard Instrument Company, Мериден, Коннектикут, США). Образцы вводимых растворов применяли в качестве эталонов в процедурах измерения.
111
111
Поглощение In-HH1 через 24 часа после инъекции мышей с ксенотрансплантатами Daudi и поиск тканей-мишеней в нормальных тканях представлены на фигуре 5. Меченное радиоактивным изотопом антитело имеет релевантную нацеленность на опухоль и поиск тканей-мишеней. In-НН1, конъюгированный через хелатор, показывает хорошую стабильность in vivo.
Пример 6. Сравнение HH1 с тремя другими антителами к CD37
Эксперимент I: Антиген-блокирующая способность антител к CD37 по сравнению с меченным радиоактивным изотопом НН1
125
Чтобы проверить, может ли взаимодействие HH1-антиген блокироваться другими антителами к CD37, клетки Daudi блокировали предварительной инкубацией с какими-либо антителами НН1, O.N.108, IPO-24 или 6D263. Клетки Daudi (2 миллиона/мл) инкубировали в течение 15 минут с какими-либо антителами НН1, O.N.108, IPO-24 или 6D263 (20 мкг/мл), а также добавляли I-меченное антитело НН1 и инкубировали в течение 1 часа.
125
В дальнейшем клетки центрифугировали и промывали 3 раза и активности в супернатанте и клеточных осадках подсчитывали с применением счетчика рентгеновского/гамма-излучения. По сравнению с клетками, блокированными НН1, связанная доля I-меченного НН1 была на 48%, 44% и 51% выше для клеток, блокированных O.N.108, IPO-24 или 6D263, соответственно.
125
Таким образом, связывание антигена I-HH1 лучше блокировалось НН1, чем тремя другими антителами, предполагая некоторые отличия во взаимодействии с антигеном. В заключение необходимо отметить, что НН1 имеет значительно отличающиеся свойства связывания антигена по сравнению с набором из трех других моноклональных антител к CD37.
Эксперимент II: Связывание антитела с образцами ткани лимфомы, заключенными в парафин
Чтобы сравнить способность НН1 и трех коммерчески доступных антител к CD37 связываться с фиксированными образцами лимфомы, биопсии от пациентов с лимфомой фиксировали в формалине, заключали в парафин и нарезали на срезы толщиной 10 мкм, которые монтировали на предметные стекла.
Образцы метили антителами НН1, IP0.24, ON.108 и 6D263, а степень мечения определяли с применением поликлонального антитела кролика к мыши и окраски пероксидазой.
Антитела IP0.24 и ON.108 приводили к самому сильному мечению образцов лимфомы. Антитело 6D263 метило образец немного слабее. Мечение срезов антителом НН1 было незначительным.
Таким образом, можно сделать заключение, т.к. НН1 не связывался, тогда как три другие антитела к CD37 связывались, что НН1 имеет значительно отличающееся взаимодействие с антигеном.
Эксперимент III: Проточная цитометрия антител НН1, IPO. 24, ON. 108 и 6D263
Чтобы исследовать отличия в экспрессии антигена, обнаруженные с помощью различных антител к CD37 по сравнению с НН1, клетки Daudi промывали дважды средой RPMI 1640 с 5% фетальной бычьей сывороткой и метили 10 мкг/мл первичными антителами НН1, IPO. 24, ON.108 и 6D363 в течение 0,5 часа в 0,2 мл среды с 10% FCS на льду.
Впоследствии клетки промывали дважды PBS с 0,25% FCS и метили FITC-меченным поликлонального IgG Fab'2 кролика к мыши (разведенным 1:20) (фигура 6) в течение 0,5 часа на льду. Флуоресценцию FITC-метки определяли возбуждением 488 нм лазером в проточном цитометре.
Мертвые клетки и дублеты исключали с применением прямого рассеяния, бокового рассеяния и сигналов пропидиум иодида. Не обнаружено значительного различия среди различных FITC-гистограмм различных антител к CD37 (фигура 6).
В заключение необходимо отметить, что НН1 и три других антитела к CD37, IPO.24, ON. 108 и 6D363, дают похожие гистограммы проточной цитометрии.
Эксперимент IV: Доля связывания для НН1 и трех коммерчески доступных антител к CD37.
Чтобы сравнить долю связывания НН1 с антителами O.N.108, IPO-24 или 6D263 (Santa Cruz Biotechnology), применяют клетки Daudi. Клеточные суспензии, представляющие большой избыток антигена, состоящие из 60 миллионов клеток Daudi в 0,2 мл среды RPMI 1640 с 5% фетальной бычьей сыворотки блокировали в течение 15 минут с помощью антител НН1, O.N.108, IPO-24 или 6D263 (500 мкг/мл), принимая во внимание неспецифическое связывание антитела. Другие параллельные опыты не блокировались.
125
Затем добавили I-меченные антитела НН1, O.N.108, IPO-24 или 6D263 (5-10нг/мл) и клетки инкубировали в течение 2 часов при 4°С с легким встряхиванием. После чего клетки центрифугировали и промывали 2 раза PBS с 1% FCS. Клеточные осадки перемещали в чистые пробирки и подсчитывали с применением счетчика гамма-частиц.
Долю связывания определяли как отличие в активности для неблокированных и блокированных флаконов по сравнению с добавочной активностью. НН1 показало намного более высокую долю связывания по сравнению с другими антителами к CD37 (таблица 5). В заключение необходимо отметить, что НН1 показало намного более высокую иммунореактивность в отношении живых клеток, по сравнению с IP0.24, ON. 108 и 6D363, когда антитела были помечены радиоактивным изотопом аналогично. Этот результат указывает, что НН1 имеет иное взаимодействие с антигеном, нежели три других антитела.
Пример 7. ДНК- и аминокислотная последовательность вариабельных областей легкой и тяжелой цепи
Генная и белковая последовательности вариабельных областей антитела НН1 к CD37 представляют собой следующее.
Генная последовательность VH aCD37 соответствует SEQ ID NO: 1, а белковая последовательность VH aCD37 соответствует SEQ ID NO: 2.
Генная последовательность VL aCD37 соответствует SEQ ID NO:3, а белковая последовательность VL aCD37 соответствует SEQ ID NO:4.
Аминокислотная последовательность значительно отличается от аминокислотной последовательности CD37-связывающего антитела АО (Heider et al., 2009). Перекрывание между вариабельной легкой цепью НН1 и АО составляет 56%, тогда как перекрывание между вариабельной тяжелой цепью составляет 82%.
Пример 8. Связывание меченного радиоактивным изотопом НН1 на клетках, насыщенных антителом к CD20, ритуксимабом.
Предпосылки
Пациенты с неходжкинской лимфомой часто получают ритуксимаб в качестве стандартной терапии. Было бы удобно, если меченный радиоактивным изотопом НН1 мог бы применяться у пациентов, даже если они подвергаются терапии с ритуксимабом. В качестве модели применяли клетки лимфомы Daudi, которые экспрессируют оба CD20- и CD37-антигена.
Методы
125
125
125
Клетки лимфомы Daudi (3,3 миллиона в 0,5 мл) были или предварительно, или совместно обработаны избыточными количествами (100 мкг/мл ритуксимаба) в течение пяти минут и после чего добавили 1 мкг I-меченного НН1 или данного I-меченного НН1 без предварительной обработки ритуксимабом. Для определения неспецифичного связывания I-HH1 применяли такую же конфигурацию, как выше, но с предварительной обработкой немеченым НН1 (10 мкг/мл). Клетки инкубировали в течение двух часов в PBS при комнатной температуре и подсчитывали в счетчике гамма-частиц, промывали три раза в 1 мл PBS с последующим центрифугированием и, наконец, заново подсчитывали радиоактивность после связывания с клеткой.
Результаты
125
При предварительной обработке/совместной обработке ритуксимабом специфично с клетками связывалось 26,0% (всего связывалось 27,4% - неспецифично связывалось 1,4%) добавочного I-HH1.
125
Без предварительной обработки/совместной обработки ритуксимабом специфично связывалось 25,5% (26,9-1,4) (все числа представляют среднее трех параллельных опытов). Т.е., не было обнаружено значительного отличия в связывании I-HH1 вследствие присутствия ритуксимаба.
Заключение
Предварительная и совместная обработка с избыточными количествами ритуксимаба не изменяли способность клетки к связыванию меченного радиоактивным изотопом НН1 и, Таким образом, не блокировали доступ к CD37-антигену.
Это указывает, что радиоиммунотерапия с помощью меченного радиоактивным изотопом НН1 может подходить для пациентов после или во время иммунотерапии антителом к CD20, так же как и для пациентов, которых не обрабатывали ритуксимабом.
177
Пример 9. Обработка SCID-мышей, которым внутривенно инокулировали клетки лимфомы Daudi, с применением Lu-HHl.
Предпосылки
Лечение пациентов с лимфомой с помощью нынешней радиоиммунотерапии, направленной на CD20, может быть проблематичным у пациентов, предварительно обработанных ритуксимабом, по причине антигенного дрейфа и возможного блокирования CD20-антигена. Следовательно, радиоиммунотерапия, нацеливающаяся на другие антигены, могла бы быть более эффективной. Внутривенная модель опухоли сделана путем внутривенной инъекции клеток человеческой лимфомы в мышей с тяжелой комбинированной иммунной недостаточностью (SCID). Когда SCID-мышам инокулировали внутривенно клетки лимфомы Daudi, у них развивался паралич задних конечностей из-за роста клеток опухоли Daudi.
Опыт
177
177
В SCID-мышей инъецировали внутривенно 10 миллионов клеток Daudi за одну неделю перед введением 50 или 100 МБк/кг Lu-HH1, 50 мкг НН1, 50 мкг ритуксимаба или NaCl. У мышей раз в две недели контролировали паралич задних конечностей и потерю веса тела, а также лейкоцитарную формулу крови. В качестве конечной точки использовали прекращение бессимптомного выживания. Для приготовления меченного радиоактивным изотопом антитела, НН1, в первую очередь, метили p-SCN-Bn-DOTA и очищали. После замены буфера к DOTA-HH1 добавляли Lu (Perkin Elmer, Бостон, Массачусетс, США) и встряхивали в течение 40 минут при 40°С. Специфическая активность конечного продукта составляла приблизительно 3200 МБк/мкг. Каждый препарат растворяли в изотоническом солевом растворе до общего объема инъекции 100 мкл на животное.
Результаты
177
177
Медиана бессимптомного выживания составила 26 дней (диапазон от 21 до 33) для солевого раствора, 40 дней (диапазон от 23 до 44) для НН1 и 40 дней (диапазон от 33 до 44) для ритуксимаба (фигура 8). Для 50 кБк/кг Lu-HH1, 80% животных были живы после 79 дней. Две мыши в группе с 100 кБк/г погибли еще до животных в группах с солевым раствором, и индексы кровяных клеток указывали на радиотоксичность. Третье животное в группе с 100 кБк/г погибло на 49 день. Другие животные (70%) были живы на 79 день. Выживание мышей, обработанных Lu-HH1, было значительно выше, чем выживание мышей, обработанных NaCl, HH1 или ритуксимабом (р<0,005, логарифмический ранговый критерий Манна-Уитни).
Заключение
177
177
Данные показывают, что группы, получающие Lu-HH1 в дозировках 50 или 100 кБк/г по весу, имели значительно лучшее выживание, чем группы, получающие солевой раствор или при иммунотерапии или HH1, или ритуксимабом. Данные токсичности указывают, что активность следует поддерживать ниже 100 кБк/г по весу. Эти данные указывают, что Lu-HH1 имеет релевантные свойства для радиоиммунотерапии in vivo.
177
Пример 10. Поиск тканей-мишеней Lu-HH1 у голых мышей с опухолевыми ксенотрансплантами, экспрессирующими CD37.
Предпосылки
Антитело HH1, меченное лютецием-177, оценивали на in vivo распределение в тканях и нацеливание на опухоль.
Процедура опыта Мечение антитела радионуклидами
В первую очередь антитело метили с помощью хелатора p-SCN-Bn-DOTA. DOTA растворяли в 0,05М НС1, добавляли к антителу в соотношении 5:1 и рН доводили до 8-9 путем промывки карбонатным буфером с применением центрифужных фильтров Amicon (Millipore, США) с отсечением по молекулярному весу 30 кДа.
177
177
Затем вновь проверяли рН и при необходимости регулировали. Раствор встряхивали в течение 60 мин при комнатной температуре и затем реакцию останавливали добавлением 50 мкл 200 мМ раствора глицина (на мг антитела). Для удаления свободного хелатора конъюгированное антитело промывали 4-5 раз PBS (РАА) (с применением Amicon и центрифугирования) и затем доводили до рН 5 промывкой ацетатом аммония. Lu (Perkin Elmer, Бостон, Массачусетс, США) затем комбинировали с 0,5 мг DOTA-HH1 в 2 мл пропиленовой пробирке (Eppendorf, Германия) и встряхивали в течение одного часа при 40°С. Специфические активности для I-конъюгатов составляли, как правило, 25-120 МБк/кг.
Иммунореактивность
Качество радиоиммуноконъюгатов оценивали с применением клеток лимфомы и модифицированного способа Линдмо. Применяли концентрации клеток до 108 клеток на мл. Конъюгаты, использованные в экспериментах, имели иммунореактивность выше 50%.
Поиск тканей-мишеней радиоиммуноконъюгатами
177
177
177
Поиски тканей-мишеней Lu-HH1 определяли на самцах BALB/c голых (nu/nu) мышей, которым за три недели до этого имплантировали 1-1-1 мм ксенотрансплантаты опухоли Daudi. Препараты вводили инъекцией в хвостовую вену по 100 мкл раствора в каждое животное. Средняя активность Lu-HH1 составляла 500 кБк на мышь. На каждый момент времени применялось четыре-пять животных. Вскрытия осуществляли после дислокации шейных позвонков в различные моменты времени после инъекции. Определяли вес каждого образца ткани и оценивали Lu с применением откалиброванного гамма-детектора (автоматический гамма-детектор Cobra II, Packard Instrument Company, Мериден, Коннектикут, США). Образцы инъецируемых растворов применяли в качестве стандартов в процедурах измерения.
Результаты и обсуждение
177
Поглощение и удержание Lu-меченного НН1 в нормальных тканях самок мышей BALB/c-голых (nu/nu) с ксенотрансплантами Daudi представлены на фигуре 7. Не отмечено признаков перераспределения нуклида из/в любых органов после начального поглощения радиоиммуноконъюгатов, что указывает, что радиоиммуноконъюгаты были стабильны.
177
177
Инъекция Lu-HH1 в голых мышей с опухолью демонстрирует низкое поглощение в кости. Известно, что свободный Lu аккумулируется в кости, таким образом, этот результат указывает, что радиоиммуноконъюгат был стабилен in vivo. Поглощение в опухолях было значительно выше, чем в других органах в более поздние моменты времени.
177
Это указывает, что Lu имеет релевантное время полураспада для радиоиммунотерапии с применением антитела НН1.
177
Данные поиска тканей-мишеней для Lu-HH1 показывают релевантное поглощение и клиренс в нормальных тканях, а также значительное удержание в опухолевых ксенотрансплантатах, экспрессирующих CD37.
177
Антитело НН1 представляется вполне пригодным для радиоиммунотерапии. Конъюгат Lu-HH1 представляется особенно пригодным, поскольку были получены благоприятные соотношения опухоли относительно нормальной ткани до того, как большая часть радионуклида разрушалась.
Таблицы
Таблица 1
Иммунореактивность и специфическая активность радиоиммуноконъюгатов
Радиоиммуноконъюгат
IRF<sup>1</sup> (%)
Специфическая активность <sup>1</sup>(МБк/мг)
Кол-во ЭКСП
<sup>125</sup>I-HH1
66±17 (39-92)
75±15 (51-104)
17
<sup>111</sup>In-HH1
66±14 (51-78)
22±12 (9-32)
3
<sup>177</sup>Lu-HH1
56
92
1
<sup>125</sup>I-ритуксимаб
62±6 (54-68)
69±30 (34-118)
6
<sup>111</sup>In-ритуксимаб
45
16
1
<sup>177</sup>Lu-ритуксимаб
60
137
1
<sup>1</sup>Среднее±SD (диапазон)
Таблица 2
Среднее число антигенов (B<sub>max</sub>) на клетках Raji, Rael и Daudi, равновесная константа диссоциации (K<sub>d</sub>) и константа скорости ассоциации (k<sub>a</sub>) для антител ритуксимаба и НН1
Антитело
Клеточная
B<sub>max</sub>(Аг/клетку)
K<sub>d</sub> (HM)
k<sub>a</sub> (нМ/ч)
линия
НН1
Raji
146000±7600
6,3±1,7
0,36±0,14
НН1
Rael
263000±27000
12,7±5,5
0,07±0,01
НН1
Daudi
340000±5000
2,7±0,3
0,72±0,07
ритуксимаб
Raji
272000±69000
4,8±0,9
0,08±0,006
ритуксимаб
Rael
626000±36000
12,0±2,0
0,08±0,007
Таблица 3
Число атомов <sup>177</sup>Lu, связанных на клетку Daudi после 2 часов инкубации
Дозировка антитела (м кг/мл)
<sup>177</sup>Lu-HH1
<sup>177</sup>Lu-ритуксимаб
Неблокированный
Блокированный
Специфичный
Неблокированные
Блокированные
Специфичный
0<sup>a</sup>
12
7
5
8
53
-45
1
8318
449
7869
8554
372
8182
2,5
9105
720
8385
11629
885
10744
5
10025
1837
8188
13658
2019
11639
10
13646
3521
10125
17344
2769
14575
20
16290
8473
7812
30095
9709
20386
а
(Различные импульсы для контрольных образцов являются индикаторами колебаний в радиационном фоне для счетчика).
Таблица 4
Число <sup>177</sup>Lu атомов, связанных на клетку Daudi после 18 часов инкубации
Дозировка антитела (мкг/мл)
<sup>177</sup>Lu-HH1
<sup>177</sup>Lu-ритуксимаб
Неблокированный
Блокированный
Чистый
Неблокированный
Блокированный
Чистый
0
12
5
7
10
53
-43
1
10327
301
10026
12831
356
12475
2,5
11757
787
10970
18836
1385
17451
5
12123
1857
10266
24097
1871
22226
10
11548
3205
8343
24249
2860
21389
20
15233
5445
9788
26639
5824
20815
Таблица 5
Доля связывания четырех антител к CD37
Антитело
IRF
НН1
50%
O.N.108
24%
IPO-24
16%
6D263
21%
Ссылки
Bernstein ID, Eary JF, Badger CC, Press OW, Appelbaum FR, Martin PJ, Krohn KA, Nelp WB, Porter B, Fisher D, Miller R, Brown S, Levy R, Donnall Thomas E. High dose radiolabelled antibody therapy of lymphoma. Cancer Res. 1990, 50(3 SuppI), 1017s-1021s.
Brechbiel MW. Bifunctional chelates for metal nuclides. Q J Nucl Med Mol Imaging 2008, 52 (2), 166-173.
131
Buchegger F, Antonescu С, Delaloye AB, Heig C, Kovacsovics T, Kosinski M, Mach JP, Ketterer N. Long-term complete responses after I-tositumomab therapy for relapsed or refractory indolent non-Hodgkin's lymphoma. Br J Cancer. 2006, 94(12), 1770-6.
Dahle, J., Krogh, C., Melhus, K. В., Kaalhus, O., Larsen, R. H. and Stokke, Т. А one-step method for determining the maximum number of bound antibodies, and Ihe affinity and association rate constant of antibody binding. Nuclear Medicine Communications. 2007, 28, 742-747.
Gordon LI, Molina A, Witzig T, Emmanouilides C, Raubtischek A, Darif M, Schilder RJ, Wiseman G, White CA. Durable responses after ibritumomab tiuxetan radioimmunotherapy for CD20+B-cell lymphoma: long-term follow-up of a phase 1/2 study. Blood. 2004, 103(12), 4429-31.
Grosmaire LS, Hayden-Ledbetter MS, Ledbetter JA, Thompson PA, Simon SA, Brady W. B-cell reduction using CD37-specific and CD20-specific binding molecules. US 2007/0059306 Al.
90
131
Heather A. Jacene, Ross Filice, Wayne Kasecamp, and Richard L. Wahl. Comparison of Y-Ibritumomab Tiuxetan and I-Tositumomab in Clinical Practice. J Nucl Med. 2007, 48, 1767-1776.
Heider KH, Borges E, Ostermann E. Anti CD37 antibodies. WO 2009/019312.
Henriksen G, Funderud S, Hoff P. Bi-labelled antibody and Bi-labelled streptavidin. Comparison of targeting efficiacy of a lymphoma cell line in vitro. J Labelled Compds Radiopharm. 1997, 34(12), 1039-1046.
Hemminki A., Hoffren A-M., Takkinen K., Vehniainen M., Makinen M-L, Pettersson K., Teleman O., Soderlund H., Teeri T.T. Introduction of lysine residues on the light chain constant domain improves the labeling properties of a recombinant Fab fragment. Protein Engineering. Vol.8, No. 2, pp.185-191, 1995.
Liu S. Bifunctional coupling agents for radiolabeling of biomolecules and target-specific delivery of metallic radionuclides. Adv Drug Deliv Rev. 2008, 60 (12), 1347-1370.
Ngo NT, Brodie С, Giles С, Horncastle D, Klammer M, Lamport IA, Rahemtulla A, Naresh KN. The significance of tumour cell immunophenotype in myeloma and its impact on clinical outcome. J Clin Pathol. 2009, 62(11), 1009-15.
Press OW, Eary JF, Appelbaum FR, Martin PJ, Badger CC, Nelp WB, Glenn S, Butchko G, Fisher D, Porter B, Matthews DC, Fisher LD, and Bernstein ID Radiolabeled-antibody therapy of B-cell lymphoma with autologous bone marrow support. N Engl J Med. 1993, 329(17), 1219-24.
Press OW, Leonard JP, Coiffier B, Levy R, Timmerman J. Immunotherapy of Non-Hodgkin's lymphomas. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2001, 221-40.
Smeland E, Funderud S, Ruud E, Kill Blomhoff H, Godal T. Characterization of two murine monoclonal antibodies reactive with human В cells. Their use in a high-yield, high-purity method for isolation of В cells and utilization of such cells in an assay for B-cell stimulating factor. Scand J Immunol. 1985, 21(3), 205-14.