ШТАММ Mycobacterium tuberculosis BN ДЛЯ МОДЕЛИРОВАНИЯ ЛАТЕНТНОЙ ТУБЕРКУЛЕЗНОЙ ИНФЕКЦИИ
STRAIN OF MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS BN FOR MODELLING LATENT TUBERCULOSIS INFECTION

Область техники
Mycobacterium tuberculosis BN
M. tuberculosis
Изобретение относится к области микробиологии, а именно к новому аттенуированному штамму  микобактерий туберкулеза, полученному в результате многократного пассирования штамма  H37Rv на жидких средах. Штамм может быть использован для моделирования латентной туберкулезной инфекции и разработки противотуберкулезной вакцины.
Уровень техники
Mycobacterium tuberculosis
M. tuberculosis
Создание штаммов  с новыми генетическими свойствами является актуальной задачей для исследования механизмов взаимодействия в системе «патоген - макроорганизм», факторов вирулентности микобактерии; развития лекарственной резистентности, выявления структур , обладающих вакцинными свойствами.
Измененные микобактерии (ослабленные, мутантные, с вставками или делециями тех или иных генов и т.д.) являются инструментом с широкими возможностями. С их помощью возможно исследовать взаимодействие между патогеном и макроорганизмом, механизмы формирования дормантных форм микобактерий при латентном туберкулезе и его реактивации (Sambandamurthy V. K., Wang X., Chen B. et al., Nature Medicine, 2002, vol. 8, p. 1171-1174; Shleeva M.O., Kudyakina Yu. K., Vostroknutova G.M., et al. Tuberculosis, 2011, vol. 91, №2, p. 146-154), формирование лекарственной устойчивости  V. L., Rifat D., Chuang Yu-M, Thomas R. Ioerger T.R., Karakousis P.C. Front. Microbiol., 2018, vol. 9, Article 494 https://doi.org/10.3389/fmicb.2018.00494; Karakousis Р.С., Williams E.P., Bishai W.R. J. Antimicrob. Chemother., 2008, vol. 61 (2): 323-331. Doi: org./10.1093/ jac/dkm485).
Mycobacterium bovis
M. bovis in vitro
M. tuberculosis
Mycobacterium tuberculosis
ie
В настоящее время вакцина Кальметта - Герена (БЦЖ), приготовленная из , остается единственной официально одобренной вакциной для вакцинации людей от туберкулеза (ТБ). Первая попытка вакцинации человека от туберкулеза вакциной БЦЖ была предпринята в 1921 г. БЦЖ была получена в результате пассирования вирулентных  на картофельной среде (с добавлением бычьей желчи и глицерина для предотвращения скопления бактерий) в течение 13 лет (1908-1921). Тестирование на животных выявило существенное ослабление штамма [Calmette A. L'infection bacillaire et la tuberculose chez l'homme et chez les animaux. Paris, 1920, Masson et C Editeurs; Calmette A, Guerin C, Weill-Halle B. Bull Acad Med. Vol. 91. Essai d'immunisation contre l'infection tuberculeuse. Paris, 1924, pp. 787-96], обзор [Luka S, Mihaescu T. Vaccine. Maedica (Bucur). 2013; 8(1): 53-58]). БЦЖ - одна из самых известных вакцин, когда-либо использовавшихся; несмотря на то, что ее эффективность варьирует в зависимости от популяции, в которой она используется. БЦЖ обеспечивает защиту от развития тяжелых форм детского туберкулеза [Trunz BB, Fine P, Dye C. Lancet. 2006; 367: 1173-1180], но в разной степени эффективна против легочного туберкулеза у взрослых и совершенно неэффективна в некоторых популяциях [Samreen F, Kumari A, Das G, Dwivedi VP. Life Sci. 2020; 252:117594. doi: 10.1016/j.lfs.2020.1175945]. Стоит упомянуть исследования генетических вариаций штаммов БЦЖ, потенциально влияющих на эффективность вакцинации [Ritz N, Hanekom WA, Robins-Browne R, et al.  FEMS Microbiol Rev. 2008; 32:821-841; Behr M.A. Lancet Infect Dis. 2002; 2:86-92]. Ранее предпринимались неоднократные попытки улучшить существующие субштаммы БЦЖ с помощью генетических манипуляций, которые включают в себя как вставку генов из , так и нарушение работы генов БЦЖ, потенциально мешающих эффективности вакцинации [Andersen P, Kaufmann SH. Cold Spring Harb Perspect Med. 2014; 4: a018523; Ahn S, Tran V, Leung A, et al. Mol. Ther. 2018; 26(12): 2863-2874. doi: 10.1016/j.ymthe.2018.08.023; Hoft DF, Blazevic A, Abate Get al. J Infect Dis. 2008; 198:1491-1501] и несколькими стратегиями первичной иммунизации, которые сочетают БЦЖ с субъединичными вакцинами-кандидатами [Gupta N, Garg S, Vedi S, et al. Front Immunol. 2018; 9:2371. doi: 10.3389/fimmu.2018.02371]. Важно отметить, что генетическое ослабление  до приемлемых стандартов безопасности также привлекало внимание различных исследователей [Arbues A, Aguilo JI, Gonzalo-Asensio J. et al. Vaccine. 2013; 31:4867-4873; Spertini F, Audran R, Chakour R, et al. Lancet Respir. Med. 2015; 3:953-962].
M. bovis
M. tuberculosis
Исторически так сложилось, что десятки штаммов БЦЖ, которые производились и использовались в то или иное время [Corbel M.J., Fruth U., Griffiths F., Knezevic I. Vaccine. 2004; 22:2675-2680], являются потомками предкового штамма, используемого Кальметтом и Гереном в Лилле с 1908 г. Поскольку лиофилизация БЦЖ была введена только в 1961 г. [Gheorgiu M., Augier J., Lagrange P.H. Bull Ist Pasteur. 1983, 281-288], существующие штаммы БЦЖ представляют собой множество генетически различных бацилл, которые со временем приобрели различное количество генетических изменений в течение длительного периода прохождения через разные культуральные среды. Более того, исторический прототип штамма исчез и недоступен для анализа. Поразительная вариабельность эффективности БЦЖ в разных популяциях, выявленная несколько десятилетий назад (обзор в [Colditz G.A., Brewer T.F., Berkey C.S., et al. JAMA. 1994; 2 71:698-702; Davenne T., McShane H. Expert Rev Vaccines. 2016; 15(8): 1009-1013]), сразу поставила вопрос о том, были ли эти вариации результатом антигенного разнообразия между вакцинными штаммами, особенно после описания достаточных вариаций в последовательностях генома различных субштаммов БЦЖ (см. обзор [Abdallah AM, Hill-Cawthorne GA, Otto TD, Sci Rep. Scientific Reports, 2015, v. 5, Article number: 15443]. Еще более очевидным всегда был вопрос об антигенных различиях между аттенуированной вакциной BCG,  и вирулентными штаммами , на долю которых приходится более 90 процентов всех случаев туберкулеза у людей.
M. bovi
M. tuberculosis
Различными исследователями было ясно продемонстрировано, что s BCG не имеет множества генов, присутствующих в . Многие из них не только играют важную роль в вирулентности, но и кодируют иммунодоминантные белки, такие как члены системы секреции ESX-1, отсутствующие во всех штаммах БЦЖ за счет делеции области RD1 [Behr M.A., Wilson M.A., Gill W.P., et al. Science. 1999; 284(5419):1520-1523. doi: 10.1126/science.284.5419.1520; Behr MA, Small PM. A historical and molecular phylogeny of BCG strains. Vaccine. 1999; 17(7-8):915-22. doi: 10.1016/s0264-410x(98)00277-1; Brosch R., Gordon S.V., Garnier T., et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007; 104(13):5596-601. doi: 10.1073/pnas.0700869104.015; 5:15443. doi: 10.1038/srep15443].
M. tuberculosis
M. tuberculosis
M. tuberculosis
in vitro
Также было показано, что повторное введение ESX-1 в субштаммы BCG Pasteur и Russia не восстановило полностью вирулентность [Pym A.S., Brodin P., Brosch R., et al. Mol Microbiol. 2002; 46:709-717], что указывает на наличие других важных детерминант вирулентности и, предположительно, иммуногенности. С тех пор было предпринято множество попыток генетически нацелить , чтобы снизить вирулентность, но сохранить иммуногенные характеристики, максимально близкие к исходным. Среди частично успешных попыток следует отметить делецию области RD1 [Lewis K.N., Liao R., Guinn K.M., et al. J. Infect. Dis. 2003; 187(1):117-23. doi: 10.1086/345862], развитие мутантов ауксотрофных  [Sampson S.L., Dascher C.C., Sambandamurthy V.K. Infect. Immun. 2004; 72:3031-3037. doi:10.1128/iai.72.5.3031-3037.2004; Jain P., Hsu T., Arai M., et al.  mBio. 2014, 5:e01245-14. doi:10.1128/mBio.01245-14] и штаммов , несущих множественные делеции генов семейства Rpf [Yeremeev V.V., Kondratieva T.K., Rubakova E.I., et al. Infect Immun. 2003; 71(8):4789-94. doi: 10.1128/iai.71.8.4789-4794.2003; Kondratieva T, Rubakova E, Kana B.D. et al. Tuberculosis (Edinb). 2011; 91(3):219-23. doi: 10.1016/j.tube.2011.01.005]. Эти целенаправленные подходы казались вполне логичными с точки зрения современной молекулярной генетики и обеспечивали вакцины, эффективность которых на экспериментальных животных моделях была сопоставима с таковой у БЦЖ. Тем не менее, ни один из новых штаммов не продемонстрировал существенно более высокой эффективности по сравнению в экспериментальных моделях. Все подходы к созданию этих штаммов были очень далеки от исходной стратегии - создания противотуберкулезной вакцины путем множественных пассажей . Этот подход привел к значительному ослаблению исходного вирулентного штамма, как было доказано Кальметтом и Гереном [Calmette A, Guerin C, Weill-Halle B. Bull Acad Med. Vol. 91. Essai d'immunisation contre l'infection tuberculeuse. Paris, 1924, pp. 787-96].
M. tuberculosis
.
panCD
M. tuberculosis
2
2
Наиболее близким к заявляемому является штамм  Mc6030В этом штамме произошла делеция генетической областей RD1 и, определяющих вирулентность микобактерии (Hinchey J. At al. et al. J Clin Invest, 2007, 117(8):2279-88. doi: 10.1172/JCI31947; Scriba T. J. et al., J Inf Dis, 2016, 214 (1): 659-664, https://doi.org/10.1093/infdis/jiw228 ). Данный штамм потерял генетическую область RD-1, что привело его к утрате вирулентности, в то же время у заявленного штамма область RD-1 сохранена, а утрата вирулентности имеет иную генетическую природу. В отличие от  Mc6030 заявленный штамм взаимодействует с макроорганизмом путем отличных механизмов, что, в частности, подтверждается его способностью защищать мышей CBA/N.
Технической проблемой, решаемой заявляемым изобретением, является создание нового штамма для изучения взаимодействия микобактерия - макроорганизм, с целью проведения экспериментальных исследований в области латентного туберкулеза. В перспективе - разработать противотуберкулезную вакцину.
Раскрытие изобретения
Техническим результатом
Mycobacterium tuberculosis
M. tuberculosis
M. tuberculosis
изобретения является создание нового аттенуированного штамма , с генетическими свойствами, отличными от исходного вирулентного штамма. BN проявляет вакцинные свойства равные/превосходящие БЦЖ в мышиной модели туберкулеза. При подкожном введении с последующим заражением вирулентным штаммом  обеспечивает пролонгирование выживаемости мышей и снижение микобактериальной нагрузки в легких на уровне БЦЖ. При ингаляционном и внутривенном вакцинировании обеспечивает более эффективную защиту, чем БЦЖ.
Mycobacterium tuberculosis
BN
Технический результат достигается штаммом , задепонированным в государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» (Федеральное бюджетное учреждение науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» (ФБУН ГНЦ ПМБ)) с присвоенным идентификатором B-9359.
Описание штамма:
Mycobacterium, Mycobacterium tuberculosis
M. tuberculosis
M. tuberculosis
Штамм выведен из вирулентного  H37Rv (CIP 64.31T в коллекции из Пастеровского института, Париж) путем 70-ти последовательных пересевов в жидкой среде 7Н9 (Nikonenko B. et al. Antimicob. Agents Chemother., 2004; 48(12): 4550-5).  H37Rv Pasteur хранится в коллекции микроорганизмов Центрального НИИ туберкулеза (г. Москва, Россия), в коллекции компании Sequella, inc. (США) и в Институте Пастера в Париже.
6
M. tuberculosis
Первоначально в среду 7H9 вносили порядка 10 клеток  H37Rv, в дальнейшем из культуры с появившейся мутностью небольшую часть переносили в свежую среду 7Н9 и т.д.
Генетика штамма
M. tuberculosis
: Восемь однонуклеотидных вставок и делеций (in/del), дифференцирующих штаммы BN и H37Rv в генах Rv0092, Rv0997, Rv1046c, Rv1575, Rv2690c, Rv2933, Rv3655c и Rv3911, привели к сдвигу рамки считывания в соответствующих белках. Делеция нуклеотида C в положении 1894 в гене Rv2933, кодирующем PpsC, phenolpthiocerol I типа синтеза фенолптиоцерина. Делеция нуклеотида C в положении 119 в гене Rv0092, кодирующем белок CtpA, медь-транспортную АТФазу P-типа. Транспорт ионов тяжелых металлов через плазматическую мембрану необходим для внутриклеточного выживания различных бактерий (Rowland and Niederweis, 2012). Вставка нуклеотида Т в положение 1763 в гене Rv2690c, кодирующем предполагаемый консервативный интегральный мембранный белок, богатый аланином / валином / лейцином, принадлежащий суперсемейству acid-polyamine-organocation (APC). Делеция нуклеотида C в положении 478 в гене sigM. Белок SigM относится к альтернативным сигма-факторам микобактерий. Делеция нуклеотида G в положении 299 в гене Rv3655c. Соответствующий белок препятствует активации caspase-8 и связывается с E3 ubiquitin-protein ligase RNF213 хозяина RNF213. Кроме того, мы идентифицировали 5 синонимичных SNP и 4 несинонимичных (миссенс) SNP, расположенных в генах Rv0950c и Rv2627c (гипотетические консервативные белки), Rv2380c (mbtE), кодирующем пептид-синтазу, и Rv3229c (desA3), кодирующем предполагаемый linoleoyl-CoA desaturase. Следует подчеркнуть, что не было обнаружено мутаций в генах области EXS-1 / RD-1 и других систем секреции, что указывает на то, что сильное ослабление  BN не было связано с нарушением секреции факторов вирулентности.
На плотных средах (Dubos agar или Middelbrook 7H10) формируют морщинистые, сухие колонии с неровными краями; вырастают в хорошо различимые визуально макроколонии в течение около 3 недель. Микобактерии окрашиваются по Циль-Нильснену.
о
Для выращивания культуры использовали жидкие среды Difco Dubos Broth или Difco Middelbrook 7H9 Broth (Bacton, Dikinson and Company, Sparks, USA). Культура вырастала до формирования мутности за 2 недели при температуре 37°С в шейкере при перемешивании. Условия хранения: в фосфатном солевом буфере с 0.05% Tween80 и 0.01% БСА при -80С, или в лиофилизированном виде.
M. tuberculosis
Как  по патогенности штамм должен быть отнесен к группе III, однако штамм аттенуирован и совершенно не патогенен для лабораторных мышей.
6
Мыши, получившие внутривенно по 10 КОЕ, прожили более полутора лет и были выведены из эксперимента.
Вирулентность отсутствует, штамм стимулирует клеточный и гуморальный ответ при введении мышам.
Краткое описание чертежей
Изобретение поясняется следующими чертежами.
6
6
6
6
M. tuberculosis
M. tuberculosis
На фиг. 1 представлены фотографии легких: а) мыши C57BL/6 через 300 дней после введения БЦЖ (10); б) мыши C57BL/6 через 300 дней после введения штаммаBN (10); в) мыши I/S через 300 дней после введения БЦЖ (10); г) мыши I/S через 300 дней после введения штаммаBN (10).
M. tuberculosis
На фиг. 2 показаны диаграммы, демонстрирующие: А - бактериальную нагрузку через 300 дней после введения БЦЖ, в органах мышей I/St и C57BL/6. L - легкие, S - селезенки; Б - бактериальную нагрузку через 300 дней после введения аттенуированного штамма BN, в органах мышей I/St и C57BL/6. L - легкие, S - селезенки.
M. tuberculosis
M. tuberculosis
На фиг. 3 представлен график выживаемости мышей BALB/c, зараженныхH37Rv после предварительной подкожной вакцинации BCG и аттенуированным штаммом BN.
M. tuberculosis
M. tuberculosis
На фиг. 4 представлен график выживаемости мышей BALB/c после ингаляционного введения БЦЖ и аттенуированного штамма BN (по 100 КОЕ/легкое) с последующим внутривенным зараженных через 5 недель в/в  H37Rv.
M. tuberculosis
M. tuberculosis
На фиг. 5 представлен показатель выживаемости мышей CBA/N после вакцинации подкожным введением BCG и штамма BN и последующего заражения вирулентным штаммом  H37Rv.
Осуществление изобретения
Выполнение настоящего изобретения, применившего подход, разработанный Кальметом-Гереном, не является единственно возможным, но наглядно демонстрирует достижение высокого результата - получен новый уникальный штамм, являющийся инструментом для исследования механизмов взаимодействия макроорганизм - микобактерия, а также в перспективе для создания новой противотуберкулезной вакцины.
Для выращивания культуры использовали жидкие среду Difco Middelbrook 7H9 Broth (Bacton, Dikinson and Company, Sparks, USA). В 25 мл среды вносили 0.5 мл культуры исходного штамма. Культура вырастала до формирования мутности за 2 недели при температуре 37°С в полулитровых колбах в шейкере. Через 2 недели повторяли процедуру пересева культуры. И так 70 пассажей.
Генетическое описание нового штамма
M. tuberculosis
M.tuberculosis
Проведено полногеномное секвенирование штамма NB на платформе NextSeq 6000 Illumina. Библиотека для секвенирования была получена с использованием набора Hyper library construction kit, Kapa Biosystems (Roche) согласно рекомендациям фирмы-производителя. Полученные нуклеотидные последовательности выравнивали на последовательность генома  H37Rv AL123456.3 с помощью пакета программ Snippy (v.4.3) для выявления мутаций.
Выявлено 5 синонимичных SNP; 5 несинонимичных SNP, расположенных в генах Rv0532 (кодирующем белок PE_PGRS6), Rv0950c и Rv2627c (гипотетические консервативные белки), Rv2380c (mbtE, кодирующем peptide synthetase), Rv3229c (desA3, кодирующем linoleoyl-CoA desaturase (delta(6)-desaturase).
Также выявлены мутации, приводящие к сдвигу рамки считывания в кодируемом белке:
S. typhimurium
Metallomics
7
- Делеция нуклеотида С в позиции 119 гена Rv0092. Ген кодирует белок CtpA, АТФазу, осуществляющую транспорт катионов меди. Показано, что мутации в гене сtpA в бактерии Listeria monocytogenes существенно снижает бактериальную нагрузку в инфицированных мышах (Francis, M.S. and Thomas, C.J., 1997. Mutants in the CtpA copper transporting P-type ATPase reduce virulence ofListeria monocytogenes. Microbial pathogenesis, 22(2), pp.67-78). В  потеря экспрессии гомолога CtpA вызывает повышенную чувствительность бактерий к ионам меди и снижает бактериальную выживаемость в макрофагах (Ladomersky, E. and Petris, M.J., 2015. Copper tolerance and virulence in bacteria. , (6), pp.957-964)
M.tuberculosis
- Делеция нуклеотида C в позиции 1894 гена Rv2933, кодирующего белок PpsC, рhenolpthiocerol synthesis type-I polyketide synthase. PpsC является одним из ключевых белков синтеза компонента клеточной стенки фтиоцерол димикоцерозата. Показано, что мутации в генах семейства pps накапливаются при длительном культивировании  in vitro (Domenech, P. and Reed, M.B., 2009. Rapid and spontaneous loss of phthiocerol dimycocerosate (PDIM) from Mycobacterium tuberculosis grown in vitro: implications for virulence studies. Microbiology (Reading, England), 155 (Pt 11), p.3532)
- Инсерция нуклеотида Т в позиции 1763 гена Rv2690c. Ген кодирует предположительный консервативный белок (probable conserved integral membrane alanine and valine and leucine rich protein). Функции белка неизвестны, но аланин-богатые мембранные белки микобактерий часто обладают иммуногенными свойствами.
Для изучения механизмов взаимодействия макроорганизм-микобактерия с использованием заявленного штамма были использованы мыши инбредных линий с различной генетически детерминированной восприимчивостью к туберкулезной инфекции.
Свойства штамма
M. tuberculosis
Штамм  проявил отсутствие вирулентности у мышей инбредных линий (n=8 в каждой группе). Для этого были отобраны мыши трех разных линий:
1. высоко восприимчивые к туберкулезной инфекции I/St
2. имеющие промежуточную восприимчивость к туберкулезной инфекции BALB/c
3. устойчивые к туберкулезной инфекции C57BL/6
6
M. tuberculosis
Отобранным инбредным линиям мышей вводили внутривенно - 10 КОЕ БЦЖ или BN и проводили динамическое наблюдение в последующие 18 месяцев. Среди мышей I/St и BALB/c наблюдали 100% выживаемость, у мышей C57BL/6 регистрировали 1 из 8 (1,3%) летальный исход через 8 месяцев после получения БЦЖ. При морфологическом исследовании патологии выявлено не было (фиг. 1, 2, 3, 4).
3
4
3
4
Изучена микобактериальная нагрузка в легких и селезенке мышей различных линий. Через 300 дней после внутривенного введения штамма BN или БЦЖ у мышей I/St и C57BL/6 выявлен умеренный уровень микобактериальной нагрузки (10 - 10КОЕ). При этом минимальную бактериальную нагрузку отмечали в легких мышей C57BL/6, максимальную - в органах мышей I/St, без превышения значений 10 - 10 (фиг. 2А, 2Б).
M. tuberculosis
M. tuberculosis
6
Подкожное введение штамма BN в дозе 10КОЕ при последующем внутривенном заражении мышей вирулентным штаммом  H37Rv, показало уровень протекции, равный БЦЖ (фиг. 3, таблица 1).
Таблица 1. Среднее время выживаемости среди мышей линии BALB/c при введении БЦЖ и аттенуированного штамма
M. tuberculosis
BN
Исследуемая группа
День гибели мышей
Среднее время выживаемости (дни)
Контрольная
109
117
120
135
147
151
153
133±18
БЦЖ
193
214
227
243
283
304
236±38
BN
201
210
215
244
292
300
244±43
M. tuberculosis
M. tuberculosis
Ингаляционное введение штамма BN в дозе 100 КОЕ/легкое при последующем заражении мышей вирулентным штаммом  H37Rv, показало уровень протекции, превышающий BCG (фиг. 4).
M. tuberculosis
M. tuberculosis
Ранее было показано, что вакцинация БЦЖ не защищает мышей CBA/N от заражения вирулентным штаммом  H37Rv. (Nikonenko et al. Clin Exp Immunol, 1996, 104:37-43; Kondratieva et al. J Immunol, 2010, 184: 1227-34). Однако подкожная вакцинация таких мышей аттенуированным штаммом BN демонстрирует его высокие защитные свойства (фиг. 5).
M. tuberculosis
Длительность выживаемости мышей, вакцинированных БЦЖ, составила 112±21 дней. Наблюдение за мышами через 217 дней после вакцинирования аттенуированным штаммом BNпоказало отсутствие летальности в 100% случаев. При этом средний вес тела мышей составил 26,9±4 г. Ранее показано, что к моменту гибели мышей от туберкулезной инфекции вес мышей составляет 16-17 г (Nikonenko et al. 2004). Вот если бы не публикация, тогда я должен приводить динамику.
M. tuberculosis
На основании полученных результатов был сделан вывод о то, что микобактерии штамма BN, отличаясь генетически от БЦЖ и H37Rv, способны оказывать протективный противотуберкулезный эффект. Этот эффект сравним с таковым при использовании БЦЖ, но осуществляется посредством других механизмов иммунитета, что обеспечивает протективную противотуберкулезную защиту, в некоторых генетических экспериментальных системах, где БЦЖ не работает.