Идентификация гена устойчивости к антракнозу lanr 1 у люпина узколистного ( Lupinus angustifolius L. ) с помощью ДНК-маркеров AnSeq3 и AnSeq4

СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2015, том 50, № 1, с. 30-36

Молекулярная структура генома и селекция

УДК 633.367.2:632.4:575.174.015.3:577.21 doi: 10.15389/agrobiology.2015.1.30rus

ИДЕНТИФИКАЦИЯ ГЕНА УСТОЙЧИВОСТИ К АНТРАКНОЗУ Lanrl У ЛЮПИНА УЗКОЛИСТНОГО (Lupinus angustifolius L.) С ПОМОЩЬЮ ДНК-МАРКЕРОВ AnSeq3 И AnSeq4*

С.Ю. ГРИШИН1, В.В. ЗАЯКИН1, И.Я. НАМ1, П.А. АГЕЕВА2,

М.И. ЛУКАШЕВИЧ2, Н.С. КУПЦОВ3

Антракноз — заболевание люпина узколистного (Lupinus angustifolius L.), вызываемое грибом Colletotrichum lupini. Устойчивость к нему носит не абсолютный, а относительный характер: высокоустойчивые образцы могут поражаться инфекцией, но в меньшей степени, чем неустойчивые растения. Относительно общего числа генов, связанных с толерантностью к антракно-зу, до сих пор нет единого мнения. В настоящее время селекционеры из разных стран заняты созданием более устойчивых к антракнозу сортов посредством объединения в одном генотипе неаллельных генов устойчивости к болезни. Для быстрого и эффективного отбора устойчивых растений разрабатываются ДНК-маркеры, сцепленные с генами устойчивости к заболеванию. Прежде чем использовать ДНК-маркеры в селекции, необходим предварительный анализ их эффективности для тех или иных селекционных образцов из-за возможных «ложноположительных» результатов. Наиболее близкими к Lanrl представляются ДНК-маркеры AnSeq3 и AnSeq4 (однонуклеотидные полиморфизмы — single nucleotide polymorphisms, SNPs), которые фланкируют ген на расстоянии 0,9 сМ (H. Yang et al., 2012). В настоящей работе мы исследовали возможность использования ДНК-маркеров AnSeq3 и AnSeq4 в селекции российских и белорусских сортов люпина узколистного на устойчивость к антракнозу. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) применяли для выявления аллелей ДНК-маркеров, сцепленных с геном Lanrl устойчивости к антракнозу люпина узколистного. Объектами для изучения служили 50 сортов и образцов люпина российской, белорусской, польской и австралийской селекции. ДНК выделяли индивидуально из семян в 3-кратной повторности. Представлен список селекционных образцов, а также состав реакционной смеси для ПЦР и условия амплификации ДНК. Для ПЦР использовали ферменты и реактивы фирмы «СибЭнзим» (Россия), праймеры к маркерам AnSeq3 и AnSeq4 сайтспецифичны и синтезированы фирмой «Синтол» (Россия). Электрофорез в полиакриламидном геле применяли для разделения маркерных аллелей. Устойчивый и восприимчивый к антракнозу австралийский селекционный материал использовался в качестве контролей для аллелей AnSeq3 и AnSeq4. ДНК-фрагменты длиной 92 и 87 п.н., соответствующие маркерам AnSeq3 и AnSeq4, были получены для всех 50 селекционных образцов, включенных в исследование. Для 13 сортов российской и 10 сортов польской селекции были обнаружены маркерные аллели, соответствующие восприимчивости к антракнозу. Для белорусского селекционного образца БГБ-6 аллели устойчивости были выявлены по маркерам AnSeq3 и AnSeq4, для сорта Миртан — только по маркеру AnSeq3. Остальным 21 образцам белорусской селекции соответствовали аллели восприимчивости к антракнозу. Ранее с помощью других ДНК-маркеров — AntjM1 и AntjM2 мы показали, что современные сорта Всероссийского НИИ люпина не содержат устойчивых маркерных аллелей, сцепленных с геном Lanrl. Проведенные исследования показали, что ДНК-маркеры AnSeq3 и AnSeq4, сцепленные с геном Lanrl, могут быть полезны в селекции российских и белорусских сортов на устойчивость к антракнозу.

Ключевые слова: Lupinus angustifolius L., антракноз, полимеразная цепная реакция (ПЦР), ДНК-маркеры AnSeq3, AnSeq4.

Антракноз — инфекционное заболевание многих сельскохозяйственных культур, в том числе люпина узколистного Lupinus angustifolius L. Болезнь у растений люпина вызывает гриб Colletotrichum lupini (1). В годы развития эпифитотий антракноза происходит значительное снижение урожайности у восприимчивых к патогену сортов. Посевы люпина, сильно пораженные заболеванием, не рекомендуется использовать на семенные цели, зернофураж и силосование (2). По данным литературы, впервые в

* Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Министерства образования и науки Российской Федерации, соглашение № 14.132.21.1768 «Проведение поисковых и прикладных исследований по разработке и внедрению в селекционный процесс геномных технологий ДНК-маркирования хозяйственно ценных признаков люпина».

30

СССР антракноз был обнаружен именно на люпине узколистном, который поражался в наибольшей степени по сравнению с другими видами (3). Однако благодаря многолетней селекции на устойчивость к антракно-зу некоторые современные сорта L. angustifolius L. обладают толерантностью к болезни. В то же время необходимо отметить, что устойчивость носит не абсолютный, а относительный характер, потому что так называемые высокоустойчивые образцы могут поражаться инфекцией, но в меньшей степени, чем растения, которые считаются неустойчивыми.

До сих пор среди исследователей нет единого мнения по поводу общего числа генов, связанных с толерантностью к антракнозу (4). Американские сорта люпина узколистного Rancher, Frost и австралийские сорта Marri, Illyarrie, Yandee, Danja несут доминантный ген устойчивости к антракнозу An (5). Австралийский сорт Kalya обладает доминантным геном Lanr2, обусловливающим среднюю устойчивость к антракнозу (6). Высокая устойчивость к антракнозу у австралийских сортов Wonga и Tanjil контролируется доминантным геном Lanrl (7). По данным гибридологического анализа, в генотипе белорусских сортов Миртан и Першацвет, показывающих устойчивость к антракнозу на уровне сортов Wonga и Tanjil, содержатся блоки из трех неаллельных доминантных генов Rcll Rcl2 Rcl3.

Следует подчеркнуть, что в настоящее время селекционеры из разных стран развернули исследования по созданию более устойчивых к антракнозу сортов посредством объединения в одном генотипе неаллельных генов устойчивости к болезни (4). С целью быстрого и эффективного отбора устойчивых к антракнозу растений разрабатываются ДНК-маркеры, сцепленные с генами устойчивости к заболеванию. Так, австралийскими исследователями были предложены ДНК-маркеры AntjMl (7), AntjM2 (8), AnSeq3 и AnSeq4 (9), сцепленные с геном Lanrl. С помощью праймеров для соответствующих маркеров устойчивости к антракнозу у люпина узколистного можно определить наличие гена Lanrl в изучаемых образцах при использовании полимеразной цепной реакции (ПЦР) с последующим анализом ДНК-фрагментов.

Скрининг селекционного материала с применением ДНК-маркеров позволяет выявить и рекомендовать для включения в селекционный процесс устойчивые к антракнозу растения. В то же время, как показали результаты работы австралийских исследователей, прежде чем использовать ДНК-маркеры в селекции, необходим предварительный анализ их эффективности для тех или иных селекционных образцов (10). Ранее при изучении устойчивости к антракнозу, контролируемой геном Lanrl, мы применили маркеры AntjMl, AntjM2 для анализа ДНК у 14 сортов люпина узколистного российской и белорусской селекции (11). К настоящему времени наиболее близкими к Lanrl представляются ДНК-маркеры AnSeq3 и AnSeq4, которые фланкируют ген на расстоянии 0,9 сМ (9).

Целью настоящей работы было исследование возможности использования ДНК-маркеров AnSeq3 и AnSeq4, сцепленных с геном Lanrl, в селекции российских и белорусских образцов люпина узколистного, в связи с чем мы оценили наличие гена устойчивости к антракнозу Lanrl у сортов и образцов различного селекционного происхождения с помощью двух указанных молекулярных маркеров.

Методика. Материалом для исследования служили 50 сортов и образцов люпина узколистного (Lupinus angustifolius L.) российской, белорусской, польской и австралийской селекции.

ДНК выделяли индивидуально из семян в 3-кратной повторности по методике, использованной ранее (11). ПЦР проводили в амплификато-

31

ре Терцик («ДНК-Технология», Россия). В состав реакционной смеси объемом 10 мкл входила геномная ДНК (10-20 нг), прямой и обратный праймеры (0,3 мкМ), Taq-полимераза Е 338 (0,25 ед.), MgCl2 (1,5 мМ), dNTPs (0,15 мМ), В321 AS буфер (1 мкл). Использовали ферменты и реактивы фирмы «СибЭнзим» (Россия). Условия амплификации — начальная денатурация 1 мин при 95 °С; далее 30 циклов: денатурация 30 с при 95 °С, отжиг 20 с при 51 °С для праймеров в случае маркера AnSeq3 и при 53 °С для праймеров к маркеру AnSeq4, элонгация 10 с при 72 °С; заключительная элонгация 2 мин при 72 °С. Использованные праймеры к маркерам AnSeq3 и AnSeq4 сайтспецифичны (9) и синтезированы фирмой «Синтол» (Россия). Разделение фрагментов ДНК проводили в 11-13 % полиакриламидных гелях с использованием камеры для вертикального электрофореза VE-20 («Хеликон», Россия). Продукты ПЦР разделяли в течение 5-6 ч при напряжении 270-300 В. Еель помещали в раствор бромистого этидия (концентрация 0,5 мг/л) на 20-30 мин. После окрашивания его визуализировали на сканере гелей GelDocXR («Bio-Rad», США). В качестве контролей для определения длины маркерных аллелей использовали продукты ПЦР с ДНК растений, представляющих сорта австралийской селекции Tanjil, Wonga, Kalya.

Результаты. Нами были исследованы 50 образцов люпина узколистного разного происхождения (табл.).

Образцы люпина узколистного, включенные в исследование по идентификации аллелей ДНК-маркеров AnSeq3 и AnSeq4 гена устойчивости к ан-тракнозу Lanrl

Предоставлено Россией | Предоставлено Белоруссией

Сорта и образцы российской селекции (всего 13): Сорта и образцы белорусской селекции (всего 23):

Радужный, Сидерат 38, Кристалл, Снежеть, Белозер- Привабны, Першацвет, Митан, Еелена, Миртан, ный 110, Смена, Надежда, Брянский 123, Витязь, Уз- Хвалько, Ян, БЕБ-6, Ееркулес, Жодинский, Ранний, колистный 53-02, Вектор, Белозерный 121, СН 78-07 БЕБ-3, Миртан 312, МК-ВДС-Беис, ПЭЛ-МРЛ, Рас' а и , 1т монок, 4Б-129, БЕБ-1, БЕБ-2, БЕБ-4, Вада 40, Ва-

Сорта и образцы польской селекции (всего 10): 5 v 5 5 5 ^ 5

Барон, Борута, Бояр, Ераф, Зевс, Калиф, Нептун, силек Дивный Регент, Цезарь, Эльф

Сорта и образцы австралийской селекции (всего 4):

Tanjil, Wonga, Kalya, W2248_____________________

Примечание. Российский и белорусский селекционный материал был предоставлен соответственно Всероссийским НИИ люпина (г. Брянск) и НПЦ НАН Беларуси по земледелию (г. Жодино ).

ДНК-фрагменты длиной 92 и 87 п.н., соответствующие маркерам AnSeq3 и AnSeq4, были получены для всех 50 селекционных образцов, включенных в исследование. В ходе сопоставления маркерных аллелей, выявленных для австралийских контрольных сортов и других селекционных образцов, определили аллели восприимчивости (S) и устойчивости (R) к антракнозу. Аллели AnSeq3 и AnSeq4 представляют собой однонуклеотидные полиморфизмы (single nucleotide polymorphism — SNP), имеющие одинаковую длину для каждого маркера. При электрофоретическом разделении в полиакриламидном геле фрагменты, соответствующие маркерным аллелям устойчивости для AnSeq3 из-за наличия одной замены нуклеотида C на T располагались ниже ампликонов аллелей восприимчивости, тогда как для AnSeq4 наблюдалось обратное распределение вследствие единичной замены G на A в нуклеотидной последовательности (7). Так, у сортов Tanjil и Wonga (положительные контроли устойчивости по гену Lanrl) ДНК-фрагменты для аллелей AnSeq3 и AnSeq4 располагались соответственно ниже и выше амплифицируемых у сорта Kalya (отрицательный контроль устойчивости по гену Lanrl). Продукты ПЦР, полученные для ДНК каждого из сортообразцов люпина узколистного, включен-

32

ных в исследование, воспроизводились во всех трех повторностях. Маркерные аллели AnSeq3, AnSeq4 для различных сортов и образцов российской, белорусской и австралийской селекции представлены на рисунке.

S 51 S S S а S R S S 5 S $ $ $ R R S S S S S 5 S К S S S S S S S

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

S S S S К S S R S К S S S R S R R S S S S R S S R S R S S S R S

* — * * — —

19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33

S S ^ S S S S к R S S S S S S S R S S S S S S S

2 4 5 0 7 8 9 10 П 12 13 14 15 16 17 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 J3 14 15 16

S S S S S S S R S R S S 8 R S R R S S S S S S S К S R S S S R S

* * * •* * — — — - _ _ — _ — —

19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33

34

34

Результаты электрофоретического разделения ПЦР-продуктов, полученных для аллелей ДНК-маркеров AnSeq3 (1-34, вверху) и AnSeq4 (1-34, внизу) восприимчивости и устойчивости к ан-тракнозу, у изученных сортов и селекционных образцов разного происхождения: А — фотодокументирование, Б — схематические изображения; 1, 17, 18, 34 — Tanjil, 2 — Радужный, 3 — Сидерат 38, 4 — Кристалл, 5 — Снежеть, 6 — Белозерный 110, 7 — Смена, 8 — Надежда, 9, 26 — Wonga, 10, 27 — Kalya, 11 — Брянский 123, 12 — Витязь, 13 — Узколистный 53-02, 14 — Вектор, 15 — Белозерный 121, 16 — СН 78-07, 19 — Привабны, 20 — Першацвет, 21 — Митан, 22 — Гелена, 23 — Миртан, 24 — Хвалько, 25 — Ян, 28 — БГБ-6, 29 — Геркулес, 30 — Жодинский, 31 — Ранний, 32 — W 2248, 33 — БГБ-3; S и R — соответственно маркерные аллели восприимчивости и устойчивости, сцепленные с геном Lanrl (12 % полиакриламидный гель; описание сортов и селекционных образцов см. в тексте статьи).

В результате при ПЦР-анализе для образцов российской селекции не были выявлены R-аллели ДНК-маркеров AnSeq3 и AnSeq4, сцепленных с геном Lanrl, который контролирует устойчивость к антракнозу у австралийских сортов Wonga и Tanjil. Ранее информация о том, что современные внесенные в Государственный реестр селекционных достижений РФ сорта Всероссийского НИИ люпина не содержат устойчивых маркерных аллелей, сцепленных с геном Lanrl, нами была получена также с помощью других ДНК-маркеров — AntjM1 и AntjM2 (11). Известно, что генетический материал, который находится в основе устойчивости к антракнозу у австралийских сортов Wonga и Tanjil, в селекции исследованных в настоящей работе российских сортов использован не был, что подтвердили результаты молекулярно-генетического анализа аллелей ДНК-маркеров гена Lanrl. Сортам польской селекции, как и российским образцам, соответствовали маркерные аллели восприимчивости к антракнозу по гену Lanrl. По фенотипическим проявлениям у сортов польской селекции, включенных в настоящее исследование, выраженная устойчивость к антракнозу на уровне австралийских сортов Tanjil и Wonga отсутствовала, что согласуется с данными по маркерам AnSeq3 и AnSeq4.

Для большинства белорусских образцов были характерны аллели восприимчивости к антракнозу. Аллели устойчивости по двум маркерам AnSeq3, AnSeq4 обнаружили только у компонента биологического банка генов узколистного люпина БГБ-6. Этот селекционный образец имеет близкородственные связи с сортами Wonga и Tanjil и также проявляет высокую устойчивость к антракнозу в полевых и лабораторных испытаниях (4).

Для сорта Миртан были выявлены маркерные аллели устойчивости только по AnSeq3. В предыдущей работе с маркерами AntjM1 и AntjM2 у этого сорта мы обнаружили восприимчивые аллели, причем с помощью праймеров для маркера AntjM2 был амплифицирован аллель, который не

33

идентифицировался у других образцов, что характеризует генетическое своеобразие названного сорта (11). Вариацию аллелей устойчивости/вос-приимчивости к антракнозу по маркерам AnSeq3 и AnSeq4 можно объяснить различной генетической основой белорусского сорта Миртан и австралийского сорта Tanjil. Несмотря на то, что сорт Миртан характеризуется относительно высокой устойчивостью к антракнозу, при его селекции не использовался австралийский устойчивый к заболеванию материал. Таким образом, представляется вероятным то, что у сорта Миртан маркер AnSeq3 дает «ложноположительные» результаты по сравнению с маркером AnSeq4 и выявленный при этом аллель устойчивости не связан с геном Lanrl.

Кроме сорта Миртан и образца БГБ-6, относительно высокой устойчивостью к антракнозу, обусловленной наличием в генотипах растений блока из нескольких неаллельных генов Rcl, обладает сорт Першацвет. Гены устойчивости к антракнозу, характерные для этого сорта, по всей видимости, неаллельны Lanrl, что согласуется с результатами настоящих исследований, в которых для сорта Першацвет не наблюдали устойчивость к антракнозу по маркерным аллелям, сцепленным с геном Lanrl. Следует отметить, что аллели восприимчивости выявили у остальных белорусских образцов люпина узколистного, которые не имели близкородственных связей с австралийскими сортами Wonga и Tanjil. R-аллели маркеров An-Seq3 и AnSeq4 были также обнаружены у австралийской селекционной линии Walan 2248. Этот факт отражает результаты программы селекции на устойчивость к антракнозу, реализуемой в Австралии при создании сортов узколистного люпина.

В целом оказалось, что ДНК-маркеры AnSeq3 и AnSeq4 позволяют достаточно эффективно выявлять устойчивые и восприимчивые к антракнозу генотипы по гену Lanrl. Так, для 50 сортов и селекционных образцов люпина узколистного неоднозначная информация по аллелям изученных маркеров была получена только у сорта Миртан. Эти результаты подтвердили необходимость предварительного анализа применимости ДНК-мар-керов при широкомасштабных скрещиваниях, так как использование «ложноположительных» маркерных аллелей может привести к ошибкам при выборе устойчивых к антракнозу растений.

Стабильно высокая устойчивость сортов Tanjil, Wonga, несущих ген Lanrl, подтверждена в различных условиях испытаний (4, 5, 12). Поэтому включение гена Lanrl в генотипы новых сортов, полученных после скрещивания белорусского или российского селекционного материала с устойчивыми к антракнозу австралийскими образцами, способно повысить общую устойчивость к заболеванию. Для индивидуального, высокоточного и быстрого отбора генотипов, содержащих ген Lanrl, могут быть применены соответствующие ДНК-маркеры.

Таким образом, при изучении образцов люпина узколистного (Lu-pinus angustifolius L.) разного происхождения у сортов российской и польской селекции не были обнаружены аллели устойчивости к антракнозу по маркерам AnSeq3 и AnSeq4, сцепленным с геном Lanrl. У белорусского селекционного образца БГБ-6 аллели устойчивости были выявлены по обоим изученным маркерам AnSeq3 и AnSeq4, для сорта Миртан — только по маркеру AnSeq3. Устойчивый и восприимчивый к антракнозу австралийский селекционный материал использовался в качестве контролей соответствующих аллелей AnSeq3 и AnSeq4. Проведенные исследования показали, что использование ДНК-маркеров AnSeq3 и AnSeq4, сцепленных с геном Lanrl, может быть полезно в селекции российских и белорусских сортов, несущих ген Lanrl устойчивости к антракнозу. В то же время при

34

широкомасштабных скрещиваниях необходимо предварительно оценивать применимость выбранных ДНК-маркеров, так как использование «ложноположительных» маркерных аллелей может привести к ошибкам при отборе устойчивых к антракнозу растений.

ЛИТЕРАТУРА

1. Nirenberg H.I., Feiler U., Hagedorn G. Description of Colletotrichum lupini comb. Nov. in modern terms. Mycologia, 2002, 94: 307-320 (doi: 10.2307/3761809).

2. Купцов H.C., Шор В.Ч., Шашко Ю.К. Антракноз люпина и как с ним бороться. Белорусское сельское хозяйство, 2010, 7: 20-23.

3. Евсиков Д.О., Иванюк В.Г. Антракноз люпина и меры борьбы с ним. Весщ Акадэми аграрных навук Рэспублт Беларусь, 2001, 4: 57-64.

4. Купцов H.C., Такунов И.П. Люпин. Генетика, селекция, гетерогенные посевы. Клинцы, 2006.

5. Cowling W.A. Pedigrees and characteristics of narrow-leafed lupin cultivars released in Australia from 1967 to 1998. Bulletin 4365, Agriculture Western Australia, 1999.

6. Buirchell B.J., Yang H. Breeding narrow-leafed lupins in Western Australia for yield, disease resistance and quality using recurrent selection and molecular markers. Mexico, where old and new world lupins meet. Proc. the 11th Int. Lupin Conferense. Guadalajara, Jalisco, Mexico, May 4-9, 2005. ILA, Canterbury, New Zealand, 2005: 10-13.

7. Yang H., Boersma J.G., You M., Buirchell B.J., Sweetingham M.W. Development and implementation of a sequence-specific PCR marker linked to a gene conferring resistance to anthracnose disease in narrow-leafed lupin (Lupinus angustifolius L.). Mol. Breed., 2004, 14: 145-151 (doi: 10.1023/B:M0LB.0000038003.49638.97).

8. You M., Boersma J.G., Buirchell B.J., Sweetingham M.W., Siddique K.H.M., Yang H. A PCR-based molecular marker applicable for marker-assisted selection for anthracnose disease resistance in lupin breeding. Cel. Mol. Boil. Let., 2005, 10: 123-134.

9. Yang H., Tao Y., Zheng Z., Li C., Sweetingham M.W., H o w ie s o n J.G. Application of next-generation sequencing for rapid marker development in molecular plant breeding: a case study on anthracnose disease resistance in Lupinus angustifolius L. BMC Genomics, 2012, 13: 318 (doi: 10.1186/1471-2164-13-318).

10. Yang H., Renshaw D., Thomas G., Buirchell B., Sweetingham M. A strategy to develop molecular markers applicable to a wide range of crosses for marker assisted selection in plant breeding: a case study on anthracnose disease resistance in lupin (Lupinus an-gustifolius L.). Mol. Breed., 2008, 21: 473-483 (doi: 10.1007/s11032-007-9146-2).

11. Гришин С.Ю., Заякин В.В., Нам И.Я. Алтельный полиморфизм ДНК-маркеров устойчивости к антракнозу AntjM1, AntjM2 у российских и белорусских сортов люпина узколистного Lupinus angustifolius (L.). Досягнення i проблеми генетию, селекцц, та бютехнологв: зб. наук. пр. Киев, 2012, т. 4: 291-295.

12. Ruge-Wehling B., Dieterich R., Thiele C., Eickmeyer F., Wehling P. Resistance to anthracnose in narrow-leafed lupin (Lupinus angustifolius L.): sources of resistance and development of molecular markers. Journal fur Kulturpflanzen, 2009, 61: 62-65.

13. Агеева П.А., Почутина Н.А. Реализация биологического потенциала культуры узколистного люпина селекционным путем. Кормопроизводство, 2005, 6: 6-8.

14. Артюхова А.В., Гришин С.Ю., Лукашевич М.И., Заякин В.В., Нам И.Я. Разработка метода паспортизации сортов люпина. Вестник Брянского государственного университета, 2010, 4: 82-85.

15. Календарь Р.Н., Глаз ко В.И. Типы молекулярно-генетических маркеров и их применение. Физиология и биохимия культурных растений, 2002, 34(4): 279-296.

16. Купцов Н.С. Внутривидовое разнообразие узколистного люпина (Lupinus angustifolius L.) и его использование в селекции. Научные труды по земледелию и растениеводству БелНИИЗК, 1999, 36: 77-85.

17. Наумкин В.Н., Артюхов А.И., Лукашевич М.И., Агеева П.А. Перспективы культуры люпина в юго-западной части Центрально-Черноземного региона. Бюллетень научных работ (Белгородская государственная сельскохозяйственная академия), 2008, 15: 3-9.

18. Саук И.Б., Анохина В.С., Тимошенко М.К., Цибульская И.Ю., Брыль Е.А. Морфогенетические и биохимические исследования коллекции желтого и узколистного люпина. Молекулярная и прикладная генетика, 2008, 8: 133-137.

19. Boersma J.G., Pallotta M., Li C., Buirchell B.J., S i v a s i t h a m p a r a m K., Yang H. Construction of a genetic linkage map using MFLP and identification of molecular markers linked to domestication genes in narrow-leafed lupin (Lupinus angustifolius L.). Cel. Mol. Biol. Let., 2005, 10: 331-344.

20. Yang H., Sweetingham M.W., Cowling W.A., Smith P.M.C. DNA fingerprinting based on microsatellite-anchored fragment length polymorphisms, and isolation of sequence-

35

specific PCR markers in lupin (Lupinus angustifolius L.). Mol. Breed., 2001, 7: 203-209 (doi: 10.1023/A:1011363205557).

1ФГБОУ ВПО Брянский государственный Поступила в редакцию

университет им. академика И.Г. Петровского, 14 ноября 2013 года

241036 Россия, г. Брянск, ул. Бежицкая, 14, e-mail: syugrishin@gmail.com;

2ГНУ Всероссийский НИИ люпина Россельхозакадемии,

241524 Россия, г. Брянск, пос. Мичуринский, ул. Березовая, 2, e-mail: lupin_mail@mail.ru;

3Научно-практический центр НАН Беларуси по земледелию,

222160 Республика Беларусь, г. Жодино, ул. Тимирязева, 1, e-mail: tinck@inbox.ru

Sel’skokhozyaistvennaya biologiya [Agricultural Biology], 2015, V. 50, № 1, pp. 30-36

IDENTIFICATION OF THE Lanrl GENE OF RESISTANCE TO ANTHRACNOSE OF NARROW-LEAFED LUPIN (Lupinus angustifolius L.) USING DNA-MARKERS AnSeq3 AND AnSeq4

S.Yu. Grishin1, V.V. Zayakin1, I.Ya. Nam1, P.A. Ageeva2, M.I. Lukashevich2,

N.S. Kuptsov3

1Bryansk State University, 14, ul. Bezhitskaya, Bryansk, 241036 Russia, e-mail syugrishin@gmail.com;

2All-Russian Research Institute of Lupine, 2, ul. Berezovaya, pos. Michurinskii, Bryansk, 241524 Russia, e-mail lu-pin_mail@mail.ru;

3Scientific and Practical Center on Agriculture of NAS of Belarus, 1, ul. Timiryazeva, Zhodino, 222160 Republic of Belarus, e-mail tinck@inbox.ru

Supported by the Ministry of Education and Science of the Russian Federation

Received November 14, 2013 doi: 10.15389/agrobiology.2015.1.30eng

Abstract

Anthracnose is one of the fungal diseases of the narrow-leafed lupine (Lupinus angusti-folius L.) caused by Colletotrichum lupini. Resistance to anthracnose is not absolute in character, as the plants with high resistance can be affected by the pathogen but in less extent than those nonresistant. Recent suggestions of the total number of genes involved in control of anthracnose tolerance are discrepant. Current approach in breeding anthracnose-tolerant lupine is based on combination of non-allele genes of resistance in a single genotype. Specific DNA markers are being developed which are linked to the genes of resistance and can be used for rapid and effective selection of resistant plants, but prior to their application the efficacy of DNA marker should be specifically tested with the breeding material of interest to avoid false positive responces. The AnSeq3 and An-Seq4 DAN markers flanking Lanr1 gene at 0.9 cM distance are considered the closest to it (H. Yang et al., 2012). In this article we report the possibility of using DNA markers AnSeq3 and An-Seq4, the single nucleotide polymorphisms (SNPs), in selecting forms resistant to anthracnose among varieties of narrow-leafed lupine. A total of 50 Russian, Belarusian, Polish and Australian varieties and samples were tested to detect the allele DNA markers of susceptibility or resistance to an-thracnose. DNA was individually isolated from seeds in three replicates. Polymerase chain reaction (PCR) was used to detect alleles of DNA markers linked to the Lanr1 gene. The list of tested plants, PCR mix composition and protocol are specified. PCR enzymes and reagents of the SibEnzyme company (Russia) were used. The praimers for AnSeq3 and AnSeq4 markers were site-specific and synthesized by the Syntol company (Russia). Polyacrylamide gel electrophoresis was used for visualization of the allele markers. The Australian varieties resistant and susceptible to anthracnose were used as a control for AnSeq3 and AnSeq4 alleles. DNA fragments of 92 and 87 base pairs corresponding to the markers AnSeq3 and AnSeq4, respectively, were obtained for all 50 breeding samples included in the study. For 13 Russian and 10 Polish varieties the marker alleles of susceptibility to anthracnose were detected. For BGB-6 Belarusian sample the resistance alleles were identified by AnSeq3 and AnSeq4 markers, and for Myrtan variety only the AnSeq3-specific pattern was shown. The rest of 21 Belarusian samples possessed the alleles of susceptibility to anthracnose. Earlier by means of other DNA markers, AntjM1 and AntjM2, we showed the absence of alleles linked to Lanr1 in currently registered varieties originated from All-Russian Research Institute of Lupine. Thus, the DNA markers AnSeq3 and AnSeq4 linked to gene Lanr1 may be useful in breeding Russian and Belarusian anthracnose-resistant lupine varieties.

Keywords: Lupinus angustifolius L., anthracnose, polymerase chain reaction (PCR), DNA markers AnSeq3, AnSeq4.

36