СПОСОБ ОЦЕНКИ ЛОКАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА ЭНДОМЕТРИЯ
METHOD FOR ENDOMETRIAL LOCAL IMMUNITY ASSESSMENT

Область применения
Предлагаемое изобретение относится к области медицины, а именно к лабораторной диагностике.
Исследования последних лет показали, что хронические воспалительные заболевания органов малого таза не сопровождаются нарушениями параметров клеточного и гуморального иммунитета, определяемыми в периферической крови. В связи с этим для определения состояния эндометрия возникает необходимость оценки локального иммунитета. Бактериально-вирусная колонизация эндометрия является следствием неспособности иммунной системы полностью элиминировать инфекционный агент, и в то же время возникает ограничение его распространения за счет эффекторных свойств Т-лимфоцитов, NK-клеток и макрофагов. Под воздействием специфических антигенов в ткани эндометрия происходит изменение локального иммунитета, в частности, дифференцировка Т-хелперов на субпопуляции Th-1 и Th-2, специализированные на синтезе определенных цитокинов: IFN-γ (Th-1) и IL-4 (Th-2). Активация Th-1 может вести к развитию избыточно выраженных воспалительных реакций в эндометрии даже в условиях низкой концентрации инфекционного агента, что позволяет использовать определение функциональных характеристик Т-хелперов для оценки выраженности иммунопатологических процессов в эндометрии (1, 2, 3, 4).
Уровень техники
Аналогами данного изобретения являются внедренные в клиническую практику акушерства и гинекологии современные методы диагностики состояния эндометрия: гистологический, учитывающий совокупность общих морфологических признаков хронического воспаления, иммуногистоцитохимический с определением спектра параметров (4, 5, 6).
Прототипом предложенного изобретения является описанный в отечественной литературе способ оценки активности локального воспаления, заключающийся в определении методом ИФА уровня IFN-y в биоматериале, взятом путем мазка с поверхности зоны трансформации шейки матки. Несмотря на очевидные достоинства метода (отсутствие травматичности при заборе материала, наличие прогностических пороговых уровней данного показателя), недостатком метода является то, что оценка активности воспаления проводится с использованием одного параметра (7).
Сущность изобретения
Цель изобретения заключается в разработке способа оценки локального иммунитета у женщин с патологией эндометрия, основанного на определении количества лимфоцитов, экспрессирующих цитокины IFN-γ и IL-4.
Предлагаемый способ позволяет установить вовлеченность иммунной системы в патологический процесс в исследуемой ткани (эндометрии).
Способ осуществляют следующим образом: у женщин с патологией эндометрия на 7-9-й день менструального цикла путем пайпель-биопсии проводят забор ткани эндометрия. 1 мл полученного пайпель-биоптата помещают в пробирку со 100 Ед гепарина натрия в 1 мл фосфатно-солевого буфера (ФСБ). Пайпель-биоптат в ФСБ механически измельчают и доводят до гомогенизированного состояния, пропуская с помощью шприца через иглы нисходящего диаметра. Из полученного гомогената эндометрия выделяют фракцию мононуклеаров на градиенте плотности: 2 мл гомогената аккуратно наслаивают на 2 мл фиколл-верографина и центрифугируют 40 минут при 1500 об/мин. После центрифугирования аккуратно с помощью дозатора собирают опалесцирующее кольцо мононуклеаров, переносят в сухую чистую пробирку и промывают ФСБ дважды путем центрифугирования 15 мин при 1500 об/мин.
2
- Определение содержания лимфоцитов, экспрессирующих цитокины IFN-γ и IL-4 в мононуклеарах пайпель-биоптата эндометрия проводят согласно рекомендациям фирмы-производителя реагентов (Becton Dickinson, США). Для этого в две пробирки наливают по 200 мкл полной культуральной среды RPMI 1640 и добавляют по 200 мкл мононуклеаров. В обе пробирки добавляют по 0,5 мкл ингибитора белкового транспорта GolgiPlug. В одну пробирку для оценки стимулированной продукции цитокинов добавляют 1 мкл Leukocyte Activation Coctail, содержащий активатор протеинкиназы С форбол-12-миристат-13-ацетат (ФМА) в комбинации с ионофором кальция иономицином. Инкубируют 4 часа при 37°С и 5% СO. Затем добавляют в пробирки, в которых по 100 мкл стимулированных и нестимулированных мононуклеаров 4 мкл CD3PerCP. Инкубируют 15-30 мин при комнатной температуре в темном месте. По окончании инкубации лизируют эритроциты, добавив 1 мл готового лизирующего раствора (Lisyng). Инкубируют при комнатной температуре в темном месте 10-15 мин. Центрифугируют 5 мин при 1500 об/мин и удаляют супернатант. Отмывают 1 раз добавлением 1 мл буфера CellWASH с последующим центрифугированием. Добавляют 250 мкл раствора Cytofix/Cytoperm. Инкубируют 20 мин при комнатной температуре в темноте. Центрифугируют 5 мин при 1500 об/мин и удаляют супернатант. Добавляют 1 мл буфера Perm/Wash и инкубируют 10 мин при комнатной температуре в темноте. Центрифугируют 5 мин при 1500 об/мин и удаляют супернатант. Добавляют 4 мкл меченых моноклональных антител IFN-γFITC и IL-4PE. Инкубируют 30 мин при комнатной температуре в темноте. Отмывают клетки один раз в 1 мл буфера Perm/Wash. Ресуспендируют клетки в CellFIX буфере для анализа на проточном цитофлуориметре, используя программу CELLQuest.
Проведено обследование 9 здоровых женщин благоприятного репродуктивного возраста (18-35 лет) и 30 женщин с патологией эндометрия. Установлено, что соотношение IFN-γ и IL-4-продуцирующих лимфоцитов Thl/Th2 более 0,92 у.е. свидетельствует о нарушениях на уровне локального иммунитета у женщин с патологией эндометрия. При Th1/Th2 менее 0,92 у.е. делают заключение об отсутствии признаков нарушений.
Чувствительность метода составляет 83,3%, специфичность - 83,8%, эффективность - 83,6%.
Пример 1. Пациентка С., 32 года, поступила в гинекологическое отделение ФГБУ «НИИ ОММ» Минздравсоцразвития России с диагнозом хронический эндометрит. Акушерский анамнез отягощен тремя регрессирующими беременностями. Менструальная функция не нарушена (через 28-30 дней по 5-6 дней). При исследовании пайпель-биоптата эндометрия Th1/Th2 составило 2,72 у.е., что выше установленного критерия в 0,92 у.е. и свидетельствует о нарушениях локального иммунитета эндометрия. После проведения терапии Th1/Th2 составило 0,64 у.е., что характеризует отсутствие признаков нарушений. При гистологическом исследовании признаков воспаления эндометриальной ткани не выявлено.
Пример 2. Пациентка Г., 27 лет, поступила в гинекологическое отделение ФГБУ «НИИ ОММ» Минздравсоцразвития России с диагнозом хронический эндометрит. Акушерский анамнез отягощен двумя регрессирующими беременностями. Менструальная функция не нарушена (через 24-25 дней по 5 дней). При бактериологическом исследовании мазка из шейки матки выделена Е. coli в диагностическом титре. При исследовании пайпель-биоптата эндометрия Th1/Th2 составило 1,66 у.е., что выше установленного критерия в 0,92 у.е. и свидетельствует о нарушениях локального иммунитета эндометрия. После проведения терапии Th1/Th2 составило 0,84 у.е., что характеризует отсутствие признаков нарушений. При гистологическом исследовании признаков воспаления эндометриальной ткани не выявлено.
Пример 3. Пациентка Т., 35 лет, гинекологически здорова, что подтверждено данными гистологического исследования. При исследовании пайпель-биоптата эндометрия соотношение Th1/Th2 составило 0,87 у.е., что ниже установленного критерия в 0,92 у.е. и свидетельствует об отсутствии нарушений локального иммунитета эндометрия.
Таким образом, приведенные выше примеры наглядно демонстрируют, что предлагаемый способ дает возможность выявить лабораторные признаки, характерные для нарушений локального иммунитета эндометрия, что позволит своевременно решить вопрос о необходимости проведения терапевтической коррекции выявленной патологии.
Источники информации
1. Плужникова Т.А. Диагностика и лечение хронического эндометрита у женщин с невынашиванием беременности в анамнезе / Т.А. Плужникова, Е.К. Комаров // Журнал акушерства и женских болезней. - 2012. - №2. - С.52-55.
2. Подзолкова Н.М. Клинические и патогенетические аспекты неразвивающейся беременности / Н.М.Подзолкова, В.Г.Истратова, Т.В.Золотухина // Рос. вестник акуш.-гинекол. - 2003. - №2. - С.40-43.
3. Скворцова М.Ю. Профилактика репродуктивных потерь и осложнений гестации у пациенток с невынашиванием беременности / М.Ю.Скворцова, Н.М.Подзолкова // Гинекология. - 2010. - №1. - С.46-49.
4. Михнина Е.А. Способ диагностики хронического эндометрита и характера воспаления / Е.А.Михнина, В.Н.Элиниди и др. // Патент на изобретение №2236013.
5. Элиниди В.Н. Современные возможности диагностики хронического эндометрита / В.Н.Элиниди и др. // Журнал акушерства и женских болезней. - 2003. - №3. - С.64-68.
6. Сухих Г.Т. Хронический эндометрит / Г.Т.Сухих, А.В.Шуршалина // М., 2010.
7. Грибова С.Н. Способ оценки активности локального воспаления при фоновых заболеваниях шейки матки. / Грибова С.Н., Захарова Н.Б., Хрипунова Г.И. // Патент на изобретение №2405145.