Выделение комплекса ФVIII/ФВ из плазмы донорской крови

with or wihtout sirolimus: a prospective randomized study. Haematologica. 2009; 94(3): 348-54.

11. Brodsky R.A., Chen A.R., Dorr D., Fuchs E.J., Huff C.A., Luznik L., et al. High-dose cyclophosphamide for severe aplastic anemia: long-term follow-up. Blood. 2010; 115(3): 2136-41. doi: 10.1182/blood-2009-06-225375.

12. Zhang F., Zhang L., Jing L., Zhou K., Wang H., Peng G., et al. High-dose cyclophosphamide compared with antithy-mocyte globulin for treatment of acquired severe aplastic anemia. Exp. Hematol. 2013; 41(4): 328-34. doi: 10.1016/j. exphem.2013.01.001.

13. Scheinberg P., Nunez O., Weinstein B., Scheinberg P., Bian-cotto A., Wu C.O., Young N.S. Horse versus rabbit antithymo-cyte globulin in acquired aplastic anemia. N. Engl. J. Med. 2011; 365(5): 430-8. doi: 10.1056/NEJMoa1103975.

14. Feng X., Scheinberg P., Biancotto A., Rios O., Donaldson S., Wu C.O., et al. In vivo effects of horse and rabbit antithymocyte globulin in patients with severe aplastic anemia. Haematologica. 2014; 99(9): 1433-40. doi: 10.3324/haematol.2014.106542.

15. Marsh J.C., Kulasekararaj A.G. Management of the refractory aplastic anemia patient: what are the options? Hematology Am. Soc. Hematol. Educ. Program. 2013; 2013: 87-94. doi: 10.1182/ asheducation-2013.1.87.

16. Socie G. Allogeneic BM transplantation for the treatment of aplastic anemia: current results and expanding donor possibilities. ASH Education Program Book. Hematology Am. Soc. Hematol. Educ. Program. 2013; 2013: 82-6. doi: 10.1182/ashe-ducation-2013.1.82.

17. Gupta V., Goron-Smith E.C., Cook G., Parker A., Duguid J.K.M., Keith M.O. A third course of anti-thymocyte globulin in aplastic anaemia is only beneficial in previous responders. Br. J. Haematol. 2005; 129(1): 110-7

18. Scheinberg P., Nunez O., Weinstein B., Scheinberg P., Wu C.O., Young N.S. Activity of alemtuzumab monotherapy in treatment-naive, relapsed, and refractory severe acquired aplastic anemia. Blood. 2012; 119(2): 345-54. doi: 10.1182/ blood-2011-05-352328.

19. Cheong J.W., Kim H.J., Lee K.H., Yoon S.S., Lee J.H., Park H.S., et al.; Korean Society of Hematology Acute Myeloid Leukemia/

Myelodysplastic Syndrome Working Party. Deferasirox improves hematologic and hepatic function with effective reduction of seum ferritin and liver iron concentration in transfusional iron overload patients with myelodysplastic syndrome or aplastic anemia. Transfusion. 2014; 54(6): 1542-51. doi: 10.1111/trf.12507.

20. Nakao S., Sugimori C., Yamazak H. Clinical significance of a small population of paroxysmal nocturnal hemoglobinuri-type cells in the management of bone marrow failure. Int. J. Hematol. 2006; 84(2): 118-22.

21. Scheinberg P., Marte M., Nunez O., Young N.S. Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria clones in severe aplastic anemia patients treated with horse anti-thymocyte globulin plus cyclosporin. Haematologica. 2010; 95(7): 1075-80. doi: 10.3324/ haematol.2009.017889.

22. Михайлова Е.А., Савченко В.Г. Протокол программного лечения больных апластической анемией: комбинированная иммуносупрессивная терапия. В кн.: Савченко В.Г., ред. Программное лечение заболеваний системы крови. М.: Практика; 2012. т. 2: 135-50.

[Mikhaylova E.A., Savchenko V.G. The protocol ofprogram treatment of patients with aplastic anemia: a combined immunosuppressive therapy. In: Savchenko V.G., ed. The program treatment of blood system diseases. Moscow: Praktika; 2012].

23. Sutherland D.R., Keeney M., Illingworth A. Practical guidelines for the high-sensitivity detection and monitoring of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria clones by flow cytometry. Cytometry B Clin. Cytom. 2012; 82(4): 195—208. doi: 10.1002/cyto.b.21023.

24. Scheinberg P., Rios O., Scheinberg P., Weinstein B., Wu C.O., Young N.S. Prolonged cyclosporine administration after antithymocyte globulin delays but does not prevent relapse in severe aplastic anemia. Am. J. Hematol. 2014; 89(6): 571-4.

25. Kulagin A., Lisukov I., Ivanova M., Golubovskaya I., Kruchko-va I., Bodarenko S., et al. Prognostic value of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria clone presence in aplastic anaemia patients treated with combined immunosuppression: results of two-centre prospective study. Br J Haematol. 2014; 164(4): 546—54. doi: 10.1111/bjh.12661.

Поступила 16.10.14 Received 16.10.14

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014 УДК 615.382.03:616.151.514].012

ВЫДЕЛЕНИЕ КОМПЛЕКСА OVIII/ФВ ИЗ ПЛАЗМЫ ДОНОРСКОЙ КРОВИ

Кутюрова О.Г., Дереза Т.Л., Скрылева И.А., Берковский А.Л.

ФГБУ Гематологический научный центр Минздрава России, 125167, Москва

Резюме. Разработан лабораторный метод выделения и очистки комплекса фактора VIII №VIII) с фактором Виллебранда (ФВ), основанный на сочетании анионообменной хроматографии с методами осаждения. Оптимизированы условия осаждения с использованием ПЭГ-4000, позволяющие удалить не менее 65% основного балластного белка, фибриногена, со средним выходом ФVШ на данной стадии не менее 70%. Выход по ФVШ на ступени ионообменной хроматографии составил не менее 98%. Установлено, что основным параметром, определяющим соотношение компонентов в получаемом комплексе ФVШ/ФВ, является величина нагрузки на сорбент по специфической активности. Разработанный метод позволяет варьировать содержание ФВ от 1,9 до 0,23 МЕ на 1 МЕ ФVNI. Полученные результаты могут быть положены в основу технологии получения препаратов, оказывающих терапевтическое действие как при гемофилии А, так и при болезни Виллебранда.

Ключевые слова: свежезамороженная плазма; криопреципитат; полиэтиленгликоль; ионообменная хроматография; комплекс ФVШ/ФВ.

ISOLATION OF FVIII/VWF COMPLEX FROM DONOR PLASMA

Kutyurova O.G., Dereza T.L., Skryleva I.A., BerkovskyA.L.

Hematology Research Center, Moscow, 125167, Russia

Summary. Laboratory method for isolation and purification of factor VIII (FVIII) - von Willebrand's factor (vWF) complex is based on a combination of anion exchange chromatography with precipitation methods. The PEG-4000 precipitation conditions are optimized, due to which at least 65% main ballast protein (fibrinogen) is removed, and the mean output of FVIII at this stage reaches at least 70%. At the ion exchange chromatography

stage the FVIII output is at least 98%. The main parameter determining the proportion of components in the resultant FVIII/vWF complex is the specific activity loading of the adsorbent. This method allows variations of vWF from 1.9 to 0.23 U/U FVIII. The results can serve the base for technology for creation of drugs for the treatment of patients with hemophilia A and von Willebrand's disease.

Key words: fresh-frozen plasma; cryoprecipitate; polyethylene glycol; ion exchange chromatography; FVIII/vWF complex.

Фактор VIII (ФУШ) и фактор Виллебранда (ФВ) представляют собой гликопротеины, циркулирующие в плазме крови в виде нековалентно связанного комплекса. ФVШ играет важную роль во внутреннем пути свертывания. Роль ФВ в системе гемостаза состоит в поддержании гемостаза, с одной стороны, за счет защиты ФVШ от протеолитической деградации, а с другой - за счет участия в процессах адгезии и агрегации тромбоцитов.

Гемофилия А обусловлена недостатком в организме ФVШ либо нарушениями его структуры. Распространенность гемофилии А составляет 1:10 000.

Болезнь Виллебранда наряду с гемофилией А относится к наиболее распространенным нарушениям системы гемостаза. Распространенность болезни Виллебранда, самой частой наследственной патологии гемостаза, составляет 1:800-1000 [1]. Причиной болезни Виллебранда является дефицит или аномальный мультимерный состав ФВ. Из-за неспособности ФВ выполнять стабилизирующую роль в отношении ФVШ у пациентов, страдающих этим заболеванием, часто снижено содержание и ФVШ. При этом могут проявляться симптомы, характерные для гемофилии А, вызванные инактивацией ФVШ. Таким образом, у этих больных снижение активности ФVШ является непрямым следствием количественных и качественных изменений ФВ.

В течение длительного времени основным терапевтическим препаратом при лечении обоих заболеваний являлся криопреципитат (КП), лечебная эффективность которого обусловлена прежде всего высоким содержанием в нем ФVШ по сравнению со свежезамороженной плазмой (СЗП). Помимо ФVШ, в состав КП входят также ФВ, фибриноген, фибро-нектин, иммуноглобулины (Ig) классов G, А и М и другие белки [2]. Однако КП имеет ряд недостатков, ограничивающих его применение в качестве лекарственного средства, в том числе таких, как высокий риск передачи трансмиссивных инфекций, высокая вероятность возникновения нарушений в иммунном статусе больного, частые аллергические реакции и необходимость больших объемов для переливания.

В настоящее время для терапии гемофилии А и болезни Виллебранда используют концентраты

Для корреспонденции:

Кутюрова Оксана Георгиевна, научный сотрудник лаборатории фракционирования белков крови и стандартизации методов контроля препаратов плазмы ФГБУ Гематологический научный центр Минздрава России.

Адрес: 125167, Москва, Новый Зыковский проезд, д.4а. E-mail: kuturova@blood.ru

Corresponding author:

Kutyurova Olga (kuturova@blood.ru).

ФVШ средней и высокой степени очистки, обладающие высокой степенью вирусной безопасности получаемые как из плазмы, так и рекомбинантные.

Кроме того, существует другой подход к терапии болезни Виллебранда: использование десмопресси-на (синтетического аналога вазопрессина), высвобождающего эндогенный ФВ из эндотелиальных клеток. Большинство больных со временем становится менее восприимчивым к терапии десмопрес-сином [3-5]. Для терапии пациентов с болезнью Виллебранда типа 3 и больных, не восприимчивых к десмопрессину, используют концентраты ФVШ/ФВ. Содержание ФВ в концентратах сильно варьирует в зависимости от способа их получения.

Для выделения и очистки концентратов ФVШ из КП наиболее часто используют анионообменную и иммуноаффинную хроматографию. В отличие от последней, когда, как правило, комплекс ФVШ/ФВ диссоциирует в процессе очистки, при использовании ионообменной хроматографии ФВ не удаляется полностью. Тем не менее наиболее широко применяемые технологии производства концентрата ФVШ на основе ионообменной хроматографии пока не позволяют стандартизировать содержание в нем ФВ [1]. Для терапии гемофилии А обычно используют концентраты с высоким содержанием ФVШ, однако для больных, страдающих болезнью Виллебран-да, использование таких концентратов может быть связано с повышенным риском тромбозов. Большинство лицензированных препаратов ФVШ, представленных на рынке, было разработано для терапии гемофилии А, имеет низкое содержание ФВ по сравнению с ФVШ и, следовательно, не предназначено для терапии болезни Виллебранда [6].

Основным осложнением при терапии гемофилии А является развитие ингибиторных форм гемофилии. В исследованиях in vitro было показано, что при использовании ФVШ/ФВ-концентратов с высоким содержанием ФВ риск развития ингибиторов ниже, чем при использовании концентратов с низким его содержанием и рекомбинантного ФVШ, не содержащего ФВ [7-9]. Клинические исследования также подтвердили, что использование препаратов реком-бинантного ФVШ, не содержащих ФВ, в 2,5-3 раза увеличивает риск развития ингибиторной формы гемофилии по сравнению с таковым при использовании препаратов ФVШ, получаемых из СЗП, с высоким содержанием ФВ [10-13].

Таким образом, существует насущная потребность в разработке технологии получения ФVШ/ФВ с возможностью варьирования соотношения компонентов для удовлетворения растущих клинических требований.

Объем элюции, мл

Рис. 1. Хроматографическая очистка комплекса ФУП/ФВ на

Fractogel EMD-TMAE. Условия: колонка: XK16/20; высота слоя сорбента 10 см, давление 1-3 бар, температура комнатная.

Цель настоящей работы - разработка метода выделения комплекса ФУШ/ФВ из плазмы донорской крови, позволяющего направленно варьировать содержание ФВ в получаемом концентрате.

Материалы и методы

Выделение и очистка комплекса ФVIII/ФВ. КП растворяли в воде, содержащей 3 МЕ/мл гепарина. Полученный раствор обрабатывали гидроокисью алюминия при перемешивании при комнатной температуре для удаления белков протромбинового комплекса. После центрифугирования при 4500 об/мин супернатант (СН) обрабатывали раствором ПЭГ-4000 для удаления основного балластного белка фибриногена. Повторно центрифугировали в тех же условиях. СН подвергали антивирусной обработке с использованием смеси реагентов - три-п-бутилфосфата и твина-80 (0,31 и 1,1% соответственно) при перемешивании в течение 6 ч при комнатной температуре.

Стадию хроматографической очистки проводили на системе AKTA Explorer 100 с программным обеспечением Unicorn, версия 5.1 («GE Healthcare», Швеция). Использовали хроматографические колонки XK16/20 и X10/20 («GE Healthcare»). Раствор КП после стадии вирусной инактивации наносили на колонку, заполненную анионооб-менником Fractogel EMD TMAE («Merck», Германия). Колонку уравновешивали и промывали после загрузки образца стартовым буферным раствором, содержащим 20 мМ трис, 10 мМ трехзамещенного цитрата натрия, 2,5 мМ хлорида кальция и 16 мМ лизина в качестве стабилизатора. Выделение комплекса ФУШ/ФВ проводили в ступенчатом градиенте ионной силы, создаваемом повышением концентрации хлорида натрия в стартовом буферном растворе.

Аналитические исследования. Специфическую активность ФУШ во фракциях, получаемых в процессе фракционирования КП, определяли коагулологическим методом на коагулометре MC4 Plus («Amelung», Германия). Построение калибровочного графика и вычисление специфической активности в образцах проводили с помощью программы Microsoft Excel. За величину международной единицы активности (МЕ) принимали специфическую активность 1 мл нормальной плазмы.

Распределение белков во фракциях, получаемых на ступени хроматографической очистки комплекса ФУШ/ФВ при нагрузке на сорбент в интервале от 18,9 до 30,7 МЕ ФУШ/мл сорбента. Результаты представлены как среднее значение по 7 опытам

Белок, % от исходного Фракция белков, не сорбированных на колонке Фракция промежуточной промывки Фракция элюата

ФУ111 1,3 ± 0,1 0,5 ± 0,09 96,3 ± 4,1

Общий белок 81,8 ± 9,6 17,3 ± 7.6 0,2 ± 0,08

Фибриноген 86,1 ± 8,1 12,7 ± 2,1 *

Фибронектин 16,2 ± 2,5 81,8 ± 4,5 *

IgG Следовые количества Следовые количества *

IgA Следовые количества Следовые количества *

IgM * * *

Примечание. * - ниже пределов измерения.

Измерение специфической активности OVTII в получаемом концентрате комплекса ФУШ/ФВ проводили аналогично, но для построения калибровочного графика и измерений специфической активности разведения проводили плазмой, субстратдефицитной по ФVШ.

Ристоцетин-кофакторную активность ФВ определяли методом агглютинации на стекле фиксированных отмытых тромбоцитов в присутствии ристоцетина [14]. Построение калибровочного графика проводили с помощью программы Microsoft Excel. Полученные результаты выражали в МЕ/мл.

Для определения содержания фибриногена (в г/л) применяли клоттинговый метод по Клауссу [15]. Содержание общего белка определяли методом Бредфорда [16]. Содержание фибронектина (в мкг/мл) в конечном продукте определяли методом иммуноферментного анализа с применением набора фирмы «Имтек». Количественное определение содержания IgG, IgA и ^М (в г/л) проводили методом радиальной иммунодиффузии в агарозном геле по Манчини [17].

Расчет средних значений и стандартного отклонения производили с помощью программы Microsoft Excel.

Результаты и обсуждение

В качестве сырья для выделения комплекса ФVШ/ ФВ использовали КП, получаемый по методу J. Newman [18]. Использовали 3 серии КП с различным отношением ФVШ к ФВ от 1:1,21 до 1:2,21 и со специфической активностью ФVШ от 0,44 до 0,68 МЕ ФVШ в 1 мг. После обработки раствора КП гидроокисью алюминия для удаления остатков белков протромбинового комплекса и центрифугирования полученный СН обрабатывали ПЭГ-4000 для удаления балластных белков. Процесс осаждения ПЭГ оптимизировали с целью обеспечения максимального выхода по ФVШ и ФВ. С этой целью варьировали концентрацию ПЭГ в растворе КП в интервале от 1 до 3%. Показано, что оптимальной является кон-

центрация ПЭГ, равная 1%. В этом случае выход ФВ составляет не менее 89% от его исходного содержания в КП, а выход ФУШ - не менее 57%. При этом обеспечивается удаление до 70% балластных белков, основным из которых является фибриноген.

На стадии антивирусной обработки потери целевых белков, ФУШ и ФВ составили соответственно менее 1 и 16%.

Для хроматографической очистки раствора КП после антивирусной обработки на основании данных литературы [6, 19] был выбран анионообмен-ный сорбент Fractogel EMD ТМАЕ, поскольку он позволяет обеспечить максимальный выход ФУШ по сравнению с другими анионообменниками.

После загрузки образца колонку промывали двумя объемами стартового буферного раствора. Элю-цию комплекса ФУШ/ФВ проводили в ступенчатом градиенте ионной силы, создаваемом повышением концентрации хлорида натрия в стартовом буферном растворе. На первой ступени концентрацию хлорида натрия повышали до 160 мМ, линейная скорость потока составляла 120 см/ч. На следующей ступени элюировали комплекс ФУШ/ФВ буферным раствором, содержащим 500 мМ хлорида натрия, линейную скорость потока снижали до 60 см/ч. Типичная хроматограмма выделения комплекса ФУШ/ФВ представлена на рис. 1.

Нагрузку на сорбент варьировали в интервале от 8 до 158 МЕ ФУШ на 1 мл сорбента (нагрузка по ФВ составила соответственно 15-897 МЕ/мл).

Распределение белков во фракциях, получаемых на стадии хроматографической очистки при средней нагрузке по ФУШ, составляющей 18,1-29,5 МЕ/мл, представлено в таблице.

В соответствии с представленными данными на ступени загрузки образца и промывки стартовым буферным раствором удаляется основное количество не связанных и слабо связанных с сорбентом конта-минантных белков, в том числе до 95% фибриногена. Кроме того, на этой ступени удаляется основное

90 -

80 -

р 70 -

о

X СГ 60 -

й 50 -

40 -

О

чР 30 -

20 "

10 -

0 -I

Потери ФВ, %

Выход ФВ, %

Нагрузка по ФУШ 9 МЕ/мл Нагрузка по ФУШ 26 МЕ/мл Нагрузка по ФУШ 158 МЕ/мл

количество вирусинактивирующих реагентов. При этом ФУШ остается сорбированным на колонке и его потери, по данным 6 экспериментов, в среднем составляют 1,3% от исходного количества. Промывка раствором промежуточной ионной силы, содержащим 160 мМ №С1, позволяет удалить в среднем около 17% общего белка. Потери ФУШ на этой ступени не превышают 0,5%.

Концентрат, получаемый на стадии элюции раствором, содержащим 500 мМ №С1, содержит не менее 90% ФУШ от его исходного количества в растворе КП.

Удельная активность получаемого концентрата составила в среднем 48,3 ± 6,3 МЕ ФУШ в 1 мг, что соответствует кратности очистки не менее 2400 раз.

Таким образом, в выбранных условиях хроматографии при нагрузке на сорбент, не превышающей 31 МЕ ФУШ, выход ФУШ в получаемом концентрате составляет не менее 90%.

В отличие от ФУШ, который практически полностью элюируется в 500 мМ №С1-фракции, ФВ распределяется между тремя фракциями: фракцией не-сорбированных белков, фракцией промывки с промежуточной ионной силой и элюатом раствором, содержащим 500 мМ №С1. Это распределение сильно варьирует в зависимости от нагрузки на сорбент.

По данным литературы [20-22], концентраты ФУШ/ФВ с повышенным содержанием ФВ предпочтительны для терапии больных с ингибиторными формами гемофилии. Как указывалось ранее, высокое содержание ФВ в концентратах является необходимым для терапии болезни Виллебранда, однако вопрос об оптимальном соотношении до конца не решен. Тем не менее показано [1], что продукты с соотношением ФУШ/ФВ не более 0,77 успешно применяли для терапии болезни Виллебранда.

Ранее [6] была изучена возможность получения концентратов ФУШ/ФВ с различным соотношением компонентов за счет изменения состава буферных растворов на стадии хроматографии. Было показано, что наиболее значимым параметром является концентрация хлорида натрия в растворах промежуточной ионной силы и в меньшей степени - концентрации хлорида кальция. Авторам удалось увеличить

80-1 706050403020-ю-о-

т 0

I

л т

300 350 400

Рис. 2. Распределение ФВ во фракциях, получаемых на ступени хроматографической очистки, в зависимости от нагрузки на сорбент по ФУШ.

0 50 100 150 200 250

Нагрузка ФВ, МЕ/мл

Рис 3. Зависимость выхода ФВ в ФУШ/ФВ-комплексе от динамической нагрузки на сорбент.

отношение ФВ к ФVШ с 0,40 до 1,47 снижением ионной силы промежуточных промывок. Дальнейшее снижение ионной силы приводило к резкому падению чистоты получаемого комплекса.

Нами была изучена зависимость выхода ФВ в получаемом комплексе от нагрузки на сорбент по одному из компонентов, а именно по ФVШ, при постоянном составе буферных растворов. Показано, что увеличение нагрузки по ФVШ приводит к резкому увеличению потерь ФВ на стадиях загрузки и промывки стартовым буфером. Соответственно снижаются выход ФВ на стадии элюции и содержание ФВ в получаемом ФVШ/ФВ комплексе. Полученные результаты представлены на рис. 2 и 3.

Как следует из данных, представленных на рисунках, снижение нагрузки на сорбент по фактору ФVШ от 9 до 158 МЕ/мл сорбента приводит к снижению потерь ФВ во фракциях несорбированного белка и промежуточной промывки. При этом ФВ на стадии элюции повышается от 5 до 73% от его исходного содержания в растворе КП при практически количественном выходе ФVШ в данном интервале нагрузок на сорбент. Соответственно отношение ФВ к ФVШ в получаемом комплексе увеличивается от 0,23:1 до 1,9:1.

Таким образом, нами была разработана методика выделения и очистки комплекса ФVШ/ФВ из плазмы донорской крови, основанная на комбинации метода осаждения ПЭГ-4000 с ионообменной хроматографией на Fractogel EMD TMAE.

Разработанный метод позволяет получить комплекс ФVШ/ФВ с выходом ФVШ на ступени хро-матографической очистки не менее 90%. Специфическая активность по ФVШ конечного продукта составляет не менее 48,3 ± 6,3 МЕ ФVШ в 1 мг. При этом содержание фибриногена, фибронектина и IgA, IgG, IgM в продукте ниже пределов измерения.

Методика позволяет направленно варьировать содержание ФВ в конечном продукте без изменения условий хроматографии только за счет изменения нагрузки на сорбент по ФVШ. Так, в изученном интервале нагрузки на сорбент от 9 до 158 МЕ ФVШ/мл сорбента соотношение основных компонентов ФВ и ФVШ варьирует от 0,23:1 до 1,9:1.

Разработанная методика может быть положена в основу промышленной технологии получения лекарственных препаратов, эффективных как в отношении гемофилии А, так и болезни Виллебранда.

ЛИТЕРАТУРА [REFERENCES]

1. Federici A.B. Highly purified VWF/FVIII concentrates in the treatment and prophylaxis of the von Willebrand disease: the PRO.WILL Study. Haemophilia. 2007; 13(Suppl. 5): 15-24.

2. Ажигирова М.А., Дереза Т. Л., Кутюрова О.Г., Ципилева Т.А. Влияние условий получения криопреципитата на его состав. Гематология и трансфузиология. 2008; 1: 12-4.

[Azhigirova M.A., Dereza T.L., Kutyurova O.G., Tsipileva T.A. Influence of conditions of obtaining cryoprecipitate on its composition. Gematologiya i transfuziologiya. 2008; 1: 12-4].

3. Castaman G., Federici A.B., Rodeghiero F., Mannucci P.M. Von Willebrand's disease in the year 2003: towards the complete identification of gene defects for correct diagnosis and treatment. Haematologica. 2003; 88(1): 94-108.

4. Sadler J.E., Budde U., Ejkenboom J.C.J., Favaloro E.J., Hill F.G.H., Holmberg L., et al. Update on the pathophysiology and classification of von Willebrand factor. J. Thromb. Haemost. 2006; 4 (10): 2103-14.

5. Mannucci P.M. Drug Therapy: Treatment of von Willebrand disease. N. Engl. J. Med. 2004; 351 (7): 683-94.

6. Mori F., Nardini I., Rossi P., Nardini C., Farina C. Progress in large-scale purification of factor VIII/von Willebrand factor concentrates using ion-exchange chromatography. Vox Sang. 2008; 95(4): 298-307.

7. Tagariello G., Zanotto D., Radossi P., Sartori R., Belvini D., Sal-viato R. In vitro reactivity of factor VIII inhibitors with von Willebrand factor in different commercial factor VIII concentrates. Am. J. Haematol. 2007; 82 (6): 460-2.

8. Ettingshausen C.E., Kreuz W. Role of von Willebrand factor in immune tolerance induction. Blood Coagul. Fibrinolysis. 2005; 16: S27-31.

9. Dasgupta S., Repesse Y., Bayry J., Navarrete A.M., Wootla B., Delignat S. VWF protects FVIII from endocytosis by dendritic cells and subsequent presentation to immune effectors. Blood. 2007; 109 (2): 610-2.

10. Berntorp E., Ekman M., Gunnarsson I..M., Nilsson I.M. Variation in factor VIII inhibitor reactivity with different commercial factor VIII. Haemophilia. 1996; 2

11. Gouw S.C., Van der Bom J.G., Auerswald G., Ettinghausen C. E., Tedgard U., Van Den Berg H.M. Recombinant versus plasma-derived factor VIII products and the development of inhibitors in previously untreated patients with severe hemophilia A: the CANAL cohort study. Blood. 2007; 109 (11): 4693-7.

12. Zwick Y. The Octanate ITI experience in patients with poor ITI prognosis. Thromb. Haemost. 2007; Spec. Iss.: 13-5.

13. Gringeri A. VWF/FVIII concentrates in high-risk immunotoler-ance: the RESIST study. Haemophilia. 2007; 13(Suppl. 5): 73-7.

14. Sarji K.E. Nature of von Willebrand factor: a new assay and a specific inhibitor. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1974; 71(8): 2937-41.

15. Clauss V.A. Gerinnungsphysiologische schnellmethode zur bestimmung des fibrinogens. Acta Haematol. 1957; 17(4): 237-46.

16. Bradford М.М. А rapid and sensitive method for the quantita-tion of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 1976; 72(1-2): 248-54.

17. Анастасиев В.В. Иммуноглобулин для внутривенного введения. Нижний Новгород: Изд-во НГМА; 2000.

[Anastasiev V.V. Immunoglobulin for intravenous administration

18. Newman J., Johnson A.J., Karpatkin M.H., Pushkin S. Methods for the production of clinically effective intermediate and high-puriy factor-VIII concentrate. Br. J. Haematol. 1971; 21(1): 1-20.

19. Ажигирова М.А., Дереза Т.Л., Кутюрова О.Г., Ципилева Т.А. Изучение сорбции комплекса факторов свертывания крови VIII и фон Виллебранда на ионообменных сорбентах. ВестникМИТХТ. 2009; 5: 20-4.

[Azhigirova M.A., Dereza T.L., Kutyurova O.G., Tsipileva T.A. Study of adsorption complex of blood coagulation factors VIII and von Willebrand's disease ion-exchange sorbents. Vestnik MITKhT. 2009; 5: 20-4].

20. Sukhu K., Keeling D.M., Giangrande P.L.F. Variation in inhibitor reactivity in acquired haemophilia A with different concentrates. Clin. Lab. Haematol. 2000; 22(5): 287-90.

21. Berntorp E. VWF/FVIII complex and the management of patient with inhibitors: from laboratory to clinical practice. Haemophilia. 2007; 13(Suppl. S5): 69-72.

22.Federici A.B. Management of von Willebrand disease with factor VIII/von Willebrand concentrates: results form current studies and surveys. Blood Coagul. Fibrinolysis. 2005; 16(Suppl. 1): S17-21.

Поступила 07.08.13 Received 07.08.13