БИОМАРКЕРЫ СТАРЕНИЯ СЕРДЦА И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
CARDIAC AGING BIOMARKER AND METHODS FOR USING THEM

Перекрестные ссылки на имеющие отношение заявки
Эта заявка претендует на приоритет предварительной заявки на патент США серийный №61/280879, поданной 10 ноября 2009, раскрытие которой включено в настоящий документ путем отсылки.
Уровень техники
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение, в общем, относится к области дополнительного питания для поддержания здоровья и долголетия у животных. В особенности, изобретение обеспечивает набор биомаркеров старения в сердце, включающий несколько генов, вовлеченных в Wnt-сигнальный путь. Изобретение дополнительно обеспечивает применение этих биомаркеров для установления питательных веществ и режимов питания для замедления старения сердца и для модуляции самих генов, чтобы замедлить старение сердца.
Описание уровня техники
Старение организма и составляющих его органов в настоящее время является предметом пристального внимания в биологических и медицинских исследованиях. Признаки старения включают снижение функции стволовых клеток и клеток-предшественников и снижение регенерации тканей (Rando, 2006, Nature 441: 1080-1086). Стареющие ткани демонстрируют снижение присущей им устойчивости к повреждению или поражению. Резидентные и циркулирующие стволовые клетки и клетки-предшественники представляют собой неспециализированные клетки, которые являются критическими для текущего восстановления поврежденных тканей. Эта регенеративная функция снижается при старении ткани. Было предположено, что нарушение функции стволовых клеток и клеток-предшественников может вносить вклад в старение и заболевание.
В последних сообщениях описывают связь между сигнальным путем Wnt/бета-катенин и старением стволовых клеток (см., например, White et al., 2007, Current Biology 17(21): R923-925; Brack et al., 2007, Science 317:807-810; Liu et al., 2007, Science 317: 803-806; Nusse, 2008, Cell Research 18: 523-527; Rando, 2006, supra). Бета-катенин представляет собой ключевой медиатор сигнального пути Wnt (Willert & Nusse, 1998, Current Opinion in Genetics & Development 8: 95-102; Nusse, 2008, supra). Когда белок Wnt связывается со своими рецепторами на мембране клетки, то внутри клетки запускается цепь биохимических реакций. В конечном итоге, сигнальный каскад входит в ядро через бета-катенин, который передает Wnt-сигнал из цитозоля в ядро для регуляции экспрессии генов другими ядерными белками (Huelsken & Birchmeirer, 2001, Curr. Op.Genet. & Devel. 11:547-553).
Сообщалось о том, что передача Wnt-сигнала усиливается в различных тканях и органах в моделях ускоренного старения на животных (Liu et al., 2007, supra). Сообщалось о том, что длительное воздействие Wnt вызывает клеточное старение. Также сообщалось об усилении передачи Wnt-сигнала в стволовых клетках старых скелетных мышц (Brack et al., 2007, supra). Кроме того, сообщалось о том, что передача Wnt-сигнала активирует превращение мышечных стволовых клеток из миогенных в фиброгенные и торможение этого сигнала сохраняет миогенное состояние.
Deb et al. сообщили о том, что в сердце торможение передача Wnt-сигнала путем секреции связанного с ожогом белка 2 (SFRP2), внеклеточного антагониста Wnt ингибирует дифференциацию и поддерживает эмбриональные и взрослые сердечные клетки-предшественники в недифференцированном состоянии (Deb et al., 2008, Stem Cells 26: 35-44). Затем эти же исследователи выдвинули гипотезу о том, что передача Wnt-сигнала усиливается со старением и этот сигнал переводит сердечные стволовые клетки и клетки-предшественники в фиброгенную линию (Deb, 2008, Research Proposal Summary - New Scholar Award in Aging, Ellison Medical Foundation at URL ellisonfoundation.org/). Ashton et al. сообщили о понижающей регуляции сигнального пути Wnt в «старом» сердце по сравнению с молодым сердцем (Ashton et al., 2005, Experimental Gerontology 41: 189-204), но в этом исследовании не сообщалось об экспрессии бета-катенина. Кроме того, хотя даже было показано то, что пик функционально компетентных сердечных клеток-предшественников у мышей приходится на возраст 20 месяцев (Gonzales et al., 2008, Circulation Research 102: 597-606), возраст мышей в «старой» группе в исследовании Ashton et al. варьировал от 16-18 месяцев. Таким образом, мыши, примененные в исследовании Ashton et al., не были действительно старыми.
Было показано, что ограничение в калорийности потребляемой пищи до уровня много ниже ad libitum увеличивает продолжительность жизни, снижает или откладывает наступление многих связанных с возрастом состояний, улучшает устойчивость к стрессу и замедляет ухудшение функций организма у многих видов животных, включая млекопитающих, таких как грызуны и приматы. Действительно, начались клинические испытания для оценки стимулирующего долголетие эффекта ограничения в калорийности пищи (CR) у людей. Но у людей, как и у животных, маловероятно, что CR представляет собой эффективную стратегию для увеличения долголетия у большинства индивидуумов, из-за степени и продолжительности требуемых ограничений. Именно поэтому поиск был сосредоточен на идентификации веществ, например фармацевтических средств, питательных веществ и т.п., способных имитировать эффект CR без существенного изменения в пищевом рационе.
Усилия были направлены на идентификацию средств, которые могут имитировать один или несколько физиологических или биохимических эффектов CR (например, Barger et al., 2008, PLoS ONE 3(6): е2264. doi:10.1371/joumal.pone.0002264), или которые могут воспроизводить профиль экспрессии генов, связанных с CR в определенных тканях и органах (например, Spindler, патент США 6,406,853; публикация патента США 2003/0124540; Barger et al., 2008, supra). В связи с последним, были раскрыты способы анализа генов, связанных с CR, и основанный на получении профиля экспрессии генов скрининг, проводимый для обнаружения миметиков CR (Spindler et al., публикации патента США 2004/0180003, 2004/0191775 и 2005/0013776; Pan et al., публикация патента США 2007/0231371).
Сообщали о ряде веществ, которые взаимодействуют с бета-катенином и/или с передачей Wnt-сигнала в различных, не относящихся к сердечным, клеточных и тканевых системах, включая: альгинат (Dettmar et al., 2007, Biomater Sci Polym Ed 18: 317-333), апигенин Shukia et al., 2007, Cancer Res. 67: 6925-6935), аскорбиновую кислоту (Quintanilla et al., 2005, JBiol Chem 280:1 1615-11625), куркумин (Mahmoud et al., 2000, Carcinogenesis 21: 921-927), флаванон (Park et al., 2005, Biochem Biophys Res Commun 331: 1222-1228), генистеин (Guo et al., 2002, Am J Physiol Cell Physiol 283: C.722-734), гиалуроновую кислоту (Bowguignon et al., 2007, J Biol Chem 282: 1265-1280), магний (Caveda et al., 1996, J din Invest 98: 886-893), моноолеилфосфатидную кислоту (Malbon, 2005, Sci STKE 292: pe35), нарингенин (Lee et al., 2005, Biochem Biophys Res Commun 335: 771-776), оксид азота (нитроглицерин) (Prevotat et al., 2006, Gastroenterology 131: 1142-1152), кверцитин (van Erk et al., 2005, Eur J Nutr 44: 143-556), ресвератрол (Hope et al., 2008, MolNutr Food Res 52: S52-S61), S-карбамилцистеин (Proweller et al., 2006, Cancer Res 66: 7438-7444), бутират натрия (Abramova et al., 2006, J Biol Chem 281: 21040-21051), салицилат натрия (Lee et al., 2003, Int J Oncol 23: 503-508), спермидин (Guo et al., 2002, Am J Physiol Cell Physiol 283: C722-734), сфингозин (Olsson et al., 2004, Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 287: G929-937), тролокс (производное витамина Е) (Quintanilla et al., 2005, supra) и глюкозу (Lin et al., 2006, J Am Soc Nephrol 17: 2812-2820). Однако механизмы, посредством которых происходят такие взаимодействия, и эффект таких взаимодействий во многих случаях остались неясными.
Несмотря на доступность подходов, изложенных выше, остается необходимость в более надежных, быстрых и менее дорогостоящих способах скрининга средств, которые могут замедлить или обратить процесс старения, или всего организма, или специфических тканей и органов, стимулировать здоровое старение и увеличить долголетие. Кроме того, несмотря на доступность описанных выше способов и лекарственных средств остается необходимость в способах и композициях, которые могут замедлять старение, или всего организма, или специфических тканей и органов, таких как сердце, или имитировать эффекты CR без необходимости для индивидуумов существенно изменять калорийность потребляемой ими пищи. Настоящее изобретение удовлетворяет эти потребности,
Раскрытие изобретения
Следовательно, цель настоящего изобретения заключается в обеспечении одного или нескольких генов или сегментов генов, которые дифференциально экспрессируются в клетках и тканях сердца старых субъектов по сравнению с молодыми субъектами.
Дополнительная цель изобретения заключается в обеспечении комбинации, включающей множество полинуклеотидов, которые дифференциально экспрессируются в клетках и тканях сердца старых субъектов по сравнению с молодыми субъектами.
Еще одна цель изобретения заключается в обеспечении композиции из двух или нескольких полинуклеотидных или полипептидных зондов, подходящих для обнаружения экспрессии генов, дифференциально экспрессируемых в клетках и тканях сердца старых субъектов по сравнению с молодыми субъектами.
Дополнительная цель изобретения заключается в обеспечении способов измерения биологического старения клеток или тканей сердца.
Еще одна цель изобретения заключается в обеспечении способа измерения эффекта тестируемого вещества на профиль экспрессии одного или нескольких генов, дифференциально экспрессируемых в клетках и тканях сердца старых субъектов по сравнению с молодыми субъектами или стандартным образцом.
Еще одна цель изобретения заключается в обеспечении способа замедления старения сердца у индивидуума.
Одну или несколько из этих других целей достигают, применяя новые комбинации полинуклеотидов или полипептидов, представляющих гены и сегменты генов, которые дифференциально экспрессируются в клетках и тканях сердца старых субъектов по сравнению с молодыми субъектами, в которых связь между генами заключается в их вовлечении в сигнальный путь Wnt в сердце, в снижении их экспрессии в старой в сравнении с молодой тканью сердца и в обращении такого связанного с возрастом снижения под действием CR или путем приема ресвератрола. Полинуклеотиды применяют для получения композиций, зондов, устройств, основанных на зондах, и способов определения статуса полинуклеотидов, дифференциально экспрессируемых в выбранных тканях старых субъектов по сравнению с молодыми субъектами или стандартным образцом, которые полезны для вышеуказанных целей, например для прогнозирования и диагностирования связанных с возрастом состояний в сердце и для скрининга веществ при определении того, могут ли они оказывать противовозрастной эффект в сердце. Полинуклеотиды дополнительно применяют для модуляции экспрессии или активности генов и генных продуктов, вовлеченных в передачу Wnt-сигнала в сердце, в особенности генов бета-катенина и белков бета-катенина. Также обеспечивают наборы, включающие комбинации реагентов, таких как зонды, устройства с применением зондов и веществ, а также упаковки, содержащие такие наборы, компьютерные программы с информацией по их применению, и информационные ресурсы для передачи информации, относящейся к дифференциально экспрессируемым генам и способам их применения.
Другие и дополнительные цели, признаки и преимущества изобретения будут понятны специалистам в этой области техники.
Осуществление изобретения
Определения
Термин «старение» означает биологическое или физиологическое старение организма, органа, ткани или любой из их частей. Термин включает развитие связанных с возрастом заболеваний в организме, органе, ткани или в любой из их частей. Подобным образом, «старение сердца» означает биологического или физиологическое старение сердца или любой его части, включая развитие связанных с возрастом заболеваний в сердце или в любой его части. Отсылка к сердцу или к любому другому органу, указанная в настоящей заявке, предназначена для включения всех клеток и тканей, составляющих сердце или другой орган.
Термин «животное» означает человека или другое животное, включая птиц, коров, собак, лошадей, кошек, коз, мышей, овец и свиней. Если термин применяют в контексте сравнения исследуемых субъектов, то сравниваемые животные представляют собой животных одних и тех же видов и, по возможности, одной и той же расы или породы. Термин «животное, не относящееся к человеку» может быть применен в настоящей заявке для отсылки ко всем животным, кроме человека. Термин «животное-компаньон» означает любое одомашненное животное и включает, без ограничений, кошек, собак, кроликов, морских свинок, хорьков, хомяков, мышей, песчанок, лошадей, коров, коз, овец, ослов, свиней и т.п. В особенности животное представляет собой человека или животное-компаньона, такое как собака или кошка.
Термин «антитело» означает любой иммуноглобулин, который связывается со специфическим антигеном, включая антитела IgG, IgM, IgA, IgD и IgE. Термин включает поликлональные, моноклональные, моновалентные, гуманизированные антитела, гетероконъюгаты, композиции антител с полиэпитопной специфичностью, химерные, биспецифические антитела, диатела, одноцепочечные антитела и фрагменты антител, такие как Fab, Fab', F(ab')2 и Fv, или другие антигенсвязывающие фрагменты.
Термин «чип» означает упорядоченное расположение, по меньшей мере, двух зондов на подложке. По меньшей мере, один из зондов представляет собой контроль или стандарт и, по меньшей мере, один из зондов представляет собой диагностический зонд. Упорядоченное размещение от примерно двух до примерно 40000 зондов на подложке обеспечивает индивидуальное различие по размеру и интенсивности сигнала для каждого меченого комплекса, образовавшегося между зондом и полинуклеотидом или полипептидом образца.
Термин «комплекс связывания» означает комплекс, сформировавшийся при условии, что полипептид в образце специфически связывается (как определено в этой заявке) с партнером по связыванию, такому как антитело или его функциональный фрагмент.
Термин «ограничение в калориях» или «ограничение в калорийности пищи» («CR») означает любой режим питания с низким содержанием калорий без недостаточности питания. В общем, ограничение представляет собой общее количество калорий, полученных из углеводов, жиров и белков. Ограничение обычно равно, хотя не ограничивается, от примерно 25% до примерно 40% калорийности потребляемой пищи по сравнению с потреблением ad libitum.
«Пищевая добавка» представляет собой продукт, который предназначен для приема внутрь сверх нормального питания животного. Пищевые добавки могут быть в любой форме, например твердые, жидкие, в виде гелей, таблеток, капсул, порошков и т.п. Предпочтительно, чтобы их обеспечивали в удобных лекарственных формах. В некоторых воплощениях их обеспечивают в многодозовых розничных упаковках, таких как нерасфасованные порошки или жидкости. В других воплощениях добавки обеспечивают в виде крупных партий для включения в другие пищевые изделия, такие как сухой завтрак, лакомства для домашних животных, батончики с добавками, напитки и т.п.
Термин «эффективное количество» означает количество соединения, материала, композиции, лекарственного средства или другого материала, или условия режима, такого как режим питания или курс физических упражнений, которые будут эффективны для достижения определенного биологического результата, такого как обращение или замедление старения в выбранной ткани, такой как сердце, как описано в этой заявке.
Термин «экспрессия», например «экспрессии генов», означает транскрипцию гена с образованием мРНК и трансляцию мРНК с образованием белка. Увеличение в скорости транскрипции или трансляции или увеличение в образовании продукта транскрипции или трансляции, например, мРНК или белка включают в термины «увеличение в экспрессии генов», «повышающая регуляция экспрессии генов» и т.п. Подобным образом, снижение в скорости транскрипции или трансляции или снижение в образовании продукта транскрипции или трансляции, например, мРНК или белка, включают в термины «снижение экспрессии генов», «понижающая регуляция экспрессии генов» и т.п. Термины «модуляция экспрессии генов», «воздействие на экспрессию генов» и т.п. относятся к увеличению или снижению экспрессии генов. Термин «дифференциальная экспрессия» или «дифференциально экспрессируемый» означает усиленную экспрессию или повышающую регуляцию экспрессии генов или сниженную экспрессию или пониженную регуляцию экспрессии генов, которая детектируется по отсутствию, присутствию или, по меньшей мере, по 1,2-кратному изменению в количестве транскрипируемой информационной РНК или транслируемого белка в образце.
«Пролонгированное» введение, как применено в настоящей заявке, в общем, относится к периодам длительностью свыше одного месяца. Рассматриваются периоды длительностью свыше двух, трех или четырех месяцев. Также включают более продолжительные периоды длительностью свыше 5, 6, 7, 8, 9 или 10 месяцев. Периоды, превышающие 11 месяцев или 1 год, также включены. В настоящей заявке рассматривают также сроки, превышающие 1, 2, 3 или более лет. В случае определенных животных предусматривается, что животному будут вводить вещества, идентифицированные с помощью настоящих способов на постоянной основе. Термины «постоянная основа», «постоянное введение» и/или «постоянный прием внутрь», как применены в настоящей заявке, означают, по меньшей мере, еженедельное введение. Предусматривается более частое введение, такое как два раза или три раза в неделю. Также включены режимы, которые включают введение, по меньшей мере, один раз, два раза, три раза или более раз в день. Любая частота приема лекарственного средства, вне зависимости от того, приведена ли в явной форме в настоящей заявке, рассматривается как применимая. Специалистам понятно, что частота приема лекарственного средства будет представлять собой функцию вещества, которое предполагается вводить, и что некоторые композиции могут требовать более или менее частого введения для поддержания желаемого биохимического, физиологического эффекта или влияния на экспрессию генов, а именно эффекты включают один или несколько из следующего: прием пищи, чувство сытости, метаболизм липидов и утилизация жиров и профиль экспрессии ассоциированных с ними генов. Термины «пролонгированное на постоянной основе», «пролонгированное постоянное введение» и/или «пролонгированный постоянный прием внутрь», как применены в настоящей заявке, означают пролонгированное введение вещества на постоянной основе.
Термин «пища» или «пищевая композиция» означает композицию, которая предназначена для потребления животным, включая человека, и обеспечивает его питание. «Пищевое изделие, составленное для потребления человеком» представляет собой любую композицию, специфически предназначенную для приема внутрь человеком. «Корма для домашних животных» представляют собой композиции, предназначенные для потребления домашними животными, предпочтительно животными-компаньонами. «Полный и сбалансированный по питательным веществам корм для домашних животных» - это такой корм, который содержит все известные необходимые питательные вещества для реципиента или потребителя, которому эта пища предназначена, в соответствующих количествах и пропорциях, основанных, например, на рекомендациях признанных авторитетов в области питания животных-компаньонов. Такие корма, следовательно, могут служить в качестве единственного источника пищевого рациона для поддержания жизни или стимулируют продуктивность, без введения дополнительных источников питательных веществ. Композиции сбалансированных по питательным веществам кормов для домашних животных широко известны и широко применяются в этой области техники.
Термин «фрагмент» означает (1) олигонуклеотидную или полинуклеотидную последовательность, которая представляет собой часть полной последовательности и которая обладает такой же или похожей активностью при определенном применении, как и полная полинуклеотидная последовательность, или (2) пептидную или полипептидную последовательность, которая представляет собой часть полной последовательности и которая обладает такой же или похожей активностью при определенном применении, как и полная полипептидная последовательность. Такие фрагменты могут включать любое число нуклеотидов или аминокислот, считающееся подходящим для определенного применения. В общем, олигонуклеотидные или полинуклеотидные фрагменты содержат, по меньшей мере, примерно 10, 50, 100 или 1000 нуклеотидов, и полипептидные фрагменты содержат, по меньшей мере, примерно 4, 10, 20 или 50 следующих друг за другом аминокислот из полной последовательности. Термин охватывает полинуклеотидные и полипептидные варианты фрагментов.
Термин «ген» или «гены» означает полный или частичный сегмент ДНК, вовлеченный в продукцию полипептида, включая области, предшествующие и следующие за кодирующей областью (лидерная и трейлерная последовательности) и встроенные последовательности (интроны) между индивидуальными кодирующими сегментами (экзонами). Термин охватывает любую последовательность ДНК, которая гибридизуется с цепью комплементарной кодирующей последовательности гена.
Термин «генный продукт» означает продукт транскрипции гена, такой как мРНК или ее производные (например, кДНК), или трансляции генного транскрипта. Термин «генный продукт», в общем, относится к продукту трансляции, который представляет собой белок. В настоящей заявке термин «генный продукт» может быть применен взаимозаменяемо с термином «белок» или «полипептид».
Термин «гомолог» означает (1) полинуклеотид, включая полинуклеотиды от одних и тех же или разных видов животных, обладающие более чем 30%, 50%, 70% или 90% сходством в последовательности с последовательностью сравнения, имеющий такие же или практически такие же свойства и демонстрирующий такую же или практически такую же функцию, как полинуклеотид сравнения, или обладающий способностью специфически гибридизоваться с последовательностью сравнения в жестких условиях, или (2) полипептид, включая полипептиды от одних и тех же или разных видов животных, обладающие более чем 30%, 50%, 70% или 90% сходством в последовательности с полипептидом сравнения, имеющий такие же или практически такие же свойства и демонстрирующий такую же или практически такую же функцию, как полипептид сравнения, или обладающий способностью специфически связываться с полипептидом сравнения. При отсылке к фрагментам полной длины, кодирующим последовательности, функция этих фрагментов может заключаться просто в кодировании выбранной части полипептида определенной последовательности или в том, что они представляют собой соответственно похожую последовательность для гибридизации с другим полинуклеотидным фрагментом, кодирующим этот полипептид. При отсылке к фрагментам полипептидов функция этих фрагментов может заключаться просто в формировании эпитопа, подходящего для генерации антитела. Сходство в последовательности двух полипептидных последовательностей или двух полинуклеотидных последовательностей устанавливают с помощью способов, известных специалистам, например алгоритм Карлина и Альтшуля (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268 (1990)). Такой алгоритм включен в программы NBLAST и XBLAST в работе Altschul et al., 1990 (J. Mol. Biol. 215:403-410). Для получения выравниваний, содержащих пробелы, для целей сравнения, может быть применена программа Gapped Blast, такая как описана в работе Altschul et al., 1997 (Nucl. Acids Res. 25: 3389-3402). При использовании программ BLAST и Gapped BLAST применяют параметры по умолчанию соответствующих программ (например, XBLAST и NBLAST).
Термин «комплекс гибридизации» означает комплекс, который формируется между полинуклеотидами образца, когда пурины одного полинуклеотида образуют водородную связь с пиримидинами комплементарного полинуклеотида, например 5'A-G-T-C-3'пары оснований с 3'T-C-A-G-5'. Степень комплементарности и применение аналогов нуклеотидов влияет на эффективность и жесткость реакций гибридизации.
Термин «совместно с» означает, что лекарственное средство, пищу или другое вещество вводят животному (1) вместе с композицией, в особенности с пищевой композицией, или (2) раздельно с такой же или с другой частотой, применяя те же или другие пути введения, примерно в то же время или через определенные промежутки времени. «Через определенные промежутки времени» означает, что вещество вводят по схеме применения, подходящей для специфического вещества. «Примерно в одно и то же время», в общем, означает, что вещество (пищу или лекарственное средство) вводят в одно и то же время или в течение примерно 72 часов друг от друга. «Совместно с» специфически включает схемы введения, в которых вещества, такие как лекарственные средства, вводят в течение предписанного периода и композиции изобретения вводят в течение неопределенного времени.
Термин «индивидуум» при отсылке к животному означает индивидуальное животное любого вида или породы. Этот термин применяют взаимозаменяемо с термином «субъект».
Термин «полинуклеотид» или «олигонуклеотид» означает полимер нуклеотидов. Термин охватывает молекулы ДНК и РНК (включая кДНК и мРНК), как одноцепочечные, так и двуцепочечные, и, если молекулы одноцепочечные, то их комплементарную последовательность или в линейной, или в кольцевой форме. Термин также охватывает фрагменты, варианты, гомологи и аллели, в соответствии с последовательностью, которая имеет такие же или практически такие же свойства и демонстрирует такую же или практически такую же функцию, как исходная последовательность. В особенности, термин охватывает гомологи из различных видов, например мышь и собака или кошка. При выравнивании последовательности могут быть полностью комплементарны (без нарушения комплементарности) или могут иметь вплоть до примерно 30% нарушений в комплементарности последовательности. Необязательно, для полинуклеотидов, цепь содержит от примерно 50 до 10000 нуклеотидов, более предпочтительно от примерно 150 до 3500 нуклеотидов. Необязательно, для олигонуклеотидов, цепь содержит от примерно 2 до 100 нуклеотидов, более предпочтительно от примерно 6 до 30 нуклеотидов. Точный размер полинуклеотида или олигонуклеотида будет зависеть от различных факторов и от конкретного приложения и применения полинуклеотидов или олигонуклеотидов. Термин включает нуклеотидные полимеры, которые синтезируют и которые изолируют и очищают из природных источников. Термин «полинуклеотид» охватывает термин «олигонуклеотид».
Термин «полипептид», «пептид» или «белок» означает полимер аминокислот. Термин охватывает природные и неприродные (синтетические) полимеры и полимеры, в которых одна или несколько аминокислот заменены на искусственные химические миметики. Термин также охватывает фрагменты, варианты и гомологи, которые имеют такие же или практически такие же свойства, и демонстрирует такую же или практически такую же функцию, как исходная последовательность. Термин охватывает полимеры любой длины, необязательно полимеры, содержащие от примерно 2 до 1000 аминокислот, более специфически от примерно 5 до 500 аминокислот. Термин включает полимеры аминокислот, которые синтезируют и которые изолируют и очищают из природных источников.
Термин «зонд» означает (1) олигонуклеотид, или полинуклеотид, или РНК, или ДНК, как природный, так и очищенный путем ограниченного ферментного расщепления или полученный синтетически, который способен к отжигу или к специфической гибридизации с полинуклеотидом, имеющим последовательность, комплементарную зонду, или (2) соединение или вещество, включая пептид или полипептид, способное к специфическому связыванию с конкретным белком или белковым фрагментом со значительным исключением других белков или белковых фрагментов. Олигонуклеотидный или полинуклеотидный зонд может быть как одноцепочечным, так и двухцепочечным. Точная длина зонда будет зависеть от многих факторов, включая температуру, источник и применение. Например, для приложения в области диагностики, в зависимости от сложности целевой последовательности, олигонуклеотидный зонд обычно содержит от примерно 10 до 100, от 15 до 50 или от 15 до 25 нуклеотидов. В некоторых диагностических приложениях полинуклеотидный зонд содержит примерно 100-1000, 300-600 нуклеотидов, предпочтительно примерно 300 нуклеотидов. Зонды в настоящей заявке выбирают так, чтобы они были «практически» комплементарны различным нитям определенной целевой последовательности. Это означает, что зонды должны быть практически комплементарны для специфической гибридизации или отжига со своими соответственно целевыми последовательностями в заданном наборе условий. Следовательно, последовательность зонда не должна точно отражать точную комплементарную последовательность мишени. Например, некомплементарный нуклеотидный фрагмент может быть прикреплен к 5' или 3'-концу зонда, тогда когда оставшаяся часть последовательности зонда будет комплементарной целевой последовательности. Альтернативно, некомплементарные основания или более длинные последовательности могут быть вставлены в зонд, если последовательность зонда достаточно комплементарна последовательности целевого полинуклеотида для специфического отжига с целевым полинуклеотидом. Пептидный или полипептидный зонд может представлять собой любую молекулу, с которой белок или пептид специфически связывается, включая ДНК (для ДНК-связывающих белков), антитела, рецепторы клеточной мембраны, пептиды, кофакторы, пектины, сахара, полисахариды, клетки, клеточные мембраны, органеллы и мембраны органелл.
Термин «образец» означает любую животную ткань или жидкость, содержащую, например, полинуклеотиды, полипептиды, антитела, метаболиты и т.п., включая клетки и другие ткани, содержащие ДНК и РНК. Примеры включают жировую ткань, кровь, хрящевую, соединительную, эпителиальную, лимфатическую, мышечную, нервную ткань, мокроту и т.п. Образец может быть твердым или представлять собой жидкость и может представлять собой ДНК, РНК, кДНК, жидкости организма, такие как кровь или моча, клетки, клеточные препараты или растворимые фракции или аликвоты среды из них, хромосомы, органеллы и т.п.
Термин «единая упаковка» означает, что компоненты набора физически объединены в одном или нескольких контейнерах или с одним или несколькими контейнерами и рассматриваются как единица для производства, распространения, продажи или применения. Контейнеры включают, но не ограничиваются, пакеты, коробки, бутылки, упаковки в термоусадочной пленке, присоединенные скобками или иным способом зафиксированные компоненты или их комбинации. Единая упаковка может представлять собой контейнеры с индивидуальными пищевыми композициями, физически объединенные так, чтобы их можно было рассматривать как единицу для производства, распространения, продажи или применения.
Термин «специфически связывается» означает специальное и точное взаимодействие между двумя молекулами, которое зависит от их структуры, в особенности от боковых групп их молекулы. Например, интеркаляция регуляторного белка в большую бороздку молекулы ДНК, образование водородной связи вдоль углеродного скелета между двумя одноцепочечными нуклеиновыми кислотами или связывание между эпитопом белка и агонистом, антагонистом или антителом.
Термин «специфически гибридизуется» означает ассоциацию между двумя одноцепочечными полинуклеотидами, имеющими достаточную комплементарную последовательность для того, чтобы гибридизация могла проходить в заданных условиях, в общем, применяемых в этой области техники (иногда называемую «практически комплементарную»). Например, термин может означать гибридизацию полинуклеотидного зонда с практически комплементарной последовательностью, содержащейся внутри молекулы одноцепочечной ДНК или РНК, в соответствии с аспектом изобретения, с существенным исключением гибридизации полинуклеотидного зонда с одноцепочечными полинуклеотидами некомплементарной последовательности.
Термин «стандарт» или «сравнение» означает (1) контрольный образец, который содержит ткань от индивидуума, которому вводили контрольное вещество или вещество-сравнение, или не вводили вещество, по сравнению с образцом, который содержит ткань от индивидуума, которому вводили тестируемое вещество, например, для определения того, вызывает ли тестируемое вещество избирательную экспрессию генов, в случаях, соответствующих контексту его применения.
2
4
Термин «жесткие условия» означает (1) гибридизацию в 50% (объем/объем) формамиде с 0,1% бычьим сывороточным альбумином, 0,1% Фиколле, 0,1% поливинилпирролидоне, 50 мМ натрий фосфатном буфере при рН 6,5 с 750 мМ NaCl, 75 мМ цитрате натрия при 42°С, (2) гибридизацию в 50% формамиде, 5х SSC (0,75 М NaCl, 0,075 М цитрат натрия), 50 мМ фосфате натрия (рН 6,8), 0,1% пирофосфате натрия, 5х растворе Денхардта, с обработанной ультразвуком ДНК из молок лососевых (50 мкг/мл), 0,1% SDS и 10% сульфате декстрана при 42°С; с промыванием при 42°С в 0,2х SSC и 0,1% SDS или промыванием с 0,015 М NaCl, 0,0015 М цитратом натрия, 0,1% NaSO при 50°С или аналогичные процедуры, при которых применяют те же реагенты для промывки и сходные денатурирующие агенты при низкой ионной силе и высокой температуре.
Термин «вариант» означает (1) полинуклеотидную последовательность, содержащую любое замещение, изменение, модификацию, перестановку, делецию или вставку одного или нескольких нуклеотидов из полинуклеотидной последовательности или в полинуклеотидную последовательность, и которая обладает такими же или практически такими же свойствами и демонстрирует такую же или практически такую же функцию, как исходная последовательность, и (2) полипептидную последовательность, содержащую любое замещение, изменение, модификацию, перестановку, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот из полипептидной последовательности или в полипептидную последовательность, и которая обладает такими же или практически такими же свойствами и демонстрирует такую же или практически такую же функцию, как исходная последовательность. Термин, следовательно, включает одиночные нуклеотидные полиморфизмы (SNP) и аллельные варианты и включает консервативные и неконсервативные аминокислотные замены в полипептидах. Термин также охватывает химические производные полинуклеотида или полипептида и замещение нуклеотидов или аминокислот на нуклеотиды или аминокислоты, которые не встречаются в природе, по необходимости.
Термин «виртуальная упаковка» означает, что компоненты набора объединены путем направления к одному или нескольким физическим или виртуальным компонентам набора, инструктирующим потребителя, как получить другие компоненты, например, в пакете, содержащем один компонент и указания, инструктирующие потребителя обратиться к веб-сайту, воспользоваться аудиосообщением, просмотреть видеосообщение или обратиться к лицу, осуществляющему уход за больными, или к консультанту для получения инструкций о способе применения набора.
Термины «сигнальный путь Wnt», «Wnt-путь» и т.п. означают хорошо известный путь передачи сигнала, в который вовлечена сложная сеть генов и кодируемые ими белки, вовлеченные в эмбриогенез, а также в нормальные физиологические процессы у взрослых животных. Эти гены и белки, иногда обозначаемые в настоящей заявке как «Wnt-связанные» гены или белки, продуцируют или регулируют продукцию молекул передачи Wnt-сигнала, их взаимодействия с рецепторами на клетках-мишенях и физиологические ответы клеток-мишеней, которые возникают в результате воздействия на клетки внеклеточных Wnt-лигандов.
«Молодой» означает, в общем, индивидуума в раннем периоде взрослого состояния, т.е. зрелый постпубертатный период или юность, который будет определяться видом или линией, породой или этнической группой внутри вида, в соответствии с известными параметрами. «Состарившийся» или «старый», как применено в настоящей заявке, означает индивидуума, который физически или хронологически находится в периоде последних 30% своей средней продолжительности жизни, которая будет определяться видом или линией, породой или этнической группой внутри вида, в соответствии с известными параметрами.
Диапазоны в настоящей заявке применяют в краткой форме, для того чтобы избежать перечисления и описания каждой и всех величин внутри диапазона. По необходимости, в диапазоне может быть выбрано любое подходящее значение, как верхнее значение, нижнее значение или граница диапазона.
Как применено в настоящей заявке, единственная форма слова включает множественную форму, и наоборот, если только из контекста ясно не следует иное. Таким образом, термины в единственном числе, в общем, включают множественное число соответствующих терминов. Например, отсылка к термину «индивидуум», «животное», «способ» или «заболевание» включает множество таких «субъектов» «животных», «способов» или «заболеваний». Подобным образом, слова «включают», «включает» и «включающий» должны быть интерпретированы включительно, а не исключительно. Аналогичным образом все термины «включают», «включая» и «или» должны быть истолкованы как включительные, если такая конструкция ясно не запрещена контекстом. Подобным образом, термин «примеры», в особенности, за которым следует перечисление терминов, представляет собой только пример и иллюстрацию и его не следует считать исключительным или исчерпывающим.
Термин «включающий» предназначен для включения воплощений, охватываемых терминами «состоящий в основном из» и «состоящий из». Подобным образом, термин «состоящий в основном из» предназначен для включения воплощений, охватываемых термином «состоящий из».
Способы и композиции и другие усовершенствования, раскрытые в настоящей заявке, не ограничены особыми методиками, протоколами и реагентами, поскольку, как понятно специалисту, они могут изменяться. Кроме того, терминология, применяемая в настоящей заявке, предназначена только для цели описания определенных воплощений, и не предназначена для, и не ограничивает, объем того, что раскрыто или заявлено.
Если не определено иным способом, то все технические и научные термины, термины в этой области техники и сокращения, примененные в настоящей заявке, имеют значения, понимаемые обычным образом средним специалистом в этой области техники в области (областях) изобретения или в области (областях), где термин применяют. Хотя в практике изобретения могут быть применены любые композиции, способы, готовые изделия или другие способы или материалы, похожие или эквивалентные тем, что описаны в настоящей заявке, в настоящей заявке описаны предпочтительные композиции, способы, готовые изделия или другие способы или материалы.
Все патенты, патентные заявки, публикации, технические и/или исследовательские статьи и другие ссылки, процитированные в настоящей заявке или на которые ссылались в настоящей заявке, включены в настоящую заявку во всей своей полноте путем отсылки в пределах, разрешенных законом. Обсуждение этих ссылок проведено только для того, чтобы суммировать сделанные в них утверждения. Не было сделано допущения, что такие патенты, патентные заявки, публикации или ссылки или любая из их частей представляют собой относящийся к делу материал или известный уровень техники. Право оспаривать точность и актуальность любого утверждения в таких патентах, патентных заявках, публикациях и других ссылка как относящегося к делу материала или известного уровня техники специально защищено.
Изобретение
Многие аспекты изобретения, описанные в настоящей заявке, возникли частично из открытия авторов изобретения, связанного с возрастом снижения экспрессии нескольких генов, которые представляют собой положительные детерминанты сигнального пути Wnt в сердце. Наблюдение было сделано на двух разных видах животных, следовательно, наблюдаемая понижающая регуляция Wnt-пути в старом сердце не является видоспецифической. В особенности также подавляется бета-катенин, важный компонент в передаче Wnt-сигнала. Эти наблюдения противоречат многим полученным ранее и в настоящее время результатам, согласно которым передача Wnt-сигнала увеличивается при старении. Авторы изобретения также обнаружили, что вмешательство в режим питания, такое как ограничение в калориях (CR) и добавление ресвератрола, о которых известно, что они замедляют процесс старения, в общем, подавляют связанные с возрастом снижения экспрессии генов Wnt-пути и увеличивают экспрессию многих Wnt-генов обратно до уровней, наблюдаемых в ткани сердца из молодых животных.
В соответствии с описанными выше открытиями, в различных аспектах настоящего изобретения, за сигнальным путем Wnt наблюдают или в него вмешиваются путем измерения или модулирования экспрессии одного или нескольких генов, вовлеченных в путь, который, как обнаружили авторы изобретения, подавляется в старой сердечной ткани. Такие гены включают Digh1, Magi3, Akt1, Dab2, Rac1, Ctnnb1, Camk2d, Mapk1, Senp2, Smad3, Mark2, Ccnd1 и Pias4. Полинуклеотиды и их фрагменты, которые формируют эти гены, а также кодируемые ими белки и фрагменты, могут быть применены, например, в диагностических или прогностических анализах, для измерения биологического возраста клеток или тканей сердца, или анализов, применяемых при проведении скрининга изучаемых соединений на их эффективность в отношении замедления старения сердца, или на их способность воздействовать на передачу Wnt-сигнала в сердце для замедления старения сердца.
В некоторых воплощениях изобретения, может быть измерена экспрессия, по меньшей мере, одного дифференциально экспрессируемого гена. В других воплощениях, может быть измерена экспрессия двух или нескольких дифференциально экспрессируемых генов, обеспечивая набор экспрессирующих генов или профиль экспрессии генов.
В различных воплощениях настоящего изобретения, изменения в экспрессии генов могут быть измерены в одном или в обоих из двух путей: (1) измерение транскрипции путем детекции мРНК, продуцируемой определенным геном, и (2) измерение трансляции путем детекции белка, продуцируемого определенным транскриптом.
Сниженная или увеличенная экспрессия может быть измерена на уровне РНК с помощью любых способов, хорошо известных в этой области техники для количественного определения полинуклеотидов, таких как, например, PCR (включая, без ограничений, RT-PCR и qPCR), защита от РНКазы, нозерн-блоттинг, способ с применением микрочипов, способ с применением макроматрицы и другие способы гибридизации. Гены, которые анализируют или исследуют в соответствии с настоящим изобретением, обычно находятся в форме мРНК или обратно транскрибированной мРНК. Гены могут быть клонированы и/или амплифицированы. Скорее всего, само по себе клонирование не искажает представленность генов внутри популяции. Однако может быть предпочтительнее в качестве источника применять полиА+-РНК, поскольку она может быть применена с меньшим числом стадий обработки.
Таким образом, один из аспектов изобретения представляет собой комбинацию, включающую множество полинуклеотидов или экспрессируемых ими белков, которые дифференциально экспрессируются в ткани сердца у старых субъектов по сравнению с молодыми субъектами, в которой полинуклеотиды выбирают из двух или более генов, вовлеченных в передачу Wnt-сигнала в ткани сердца, или их фрагментов. В некоторых воплощениях, гены выбирают из Digh1, Magi3, Akt1, Dab2, Rac1, Ctnnb1, Camk2d, Mapk1, Senp2, Smad3, Mark2, Ccnd1 и Pias4. В других воплощениях, гены выбирают из Digh1, Magi3, Ctnnb1, Camk2d, Mapk1 и Senp2. Еще в других воплощениях, гены представляют собой Magi3, Ctnnb1 и Camk2d. В некоторых воплощениях, дифференциальную экспрессию обращают с помощью CR или путем приема ресвератрола, который может быть введен как часть режима питания, например, как добавка к пище или корму, или в качестве пищевой добавки.
В одном из воплощений, комбинация включает два или несколько полинуклеотидов или белков, экспрессируемых из полинуклеотидов. Предпочтительно, комбинация включает множество полинуклеотидов или белков, экспрессируемых из полинуклеотидов, и может включать вплоть до всех полинуклеотидов или белков, представляющих все перечисленные выше гены или их фрагменты. Если комбинация включает один или нескольких фрагментов, то фрагменты могут быть любого размера, который сохраняет свойства и функцию исходного полинуклеотида или белка, предпочтительно, от примерно 30%, 60% или 90% от исходного.
Полинуклеотиды и белки могут быть от любого животного, например от людей или животных-компаньонов, таких как собаки или кошки. Гомологи полинуклеотидов и белки от различных видов животных могут быть получены путем стандартного способа получения информации и молекулярных способов, хорошо известных специалистам. Например, название или описание функции гена или белка может быть введено в одну из нескольких общедоступных баз данных, с помощью которой будет создан список источников, обеспечивающих информацию об этом гене из разных видов, включая информацию о последовательности. Одна из таких баз данных представляет собой сервер «Information Hyperiinked over Proteins (iHOP)», базу данных, которая доступна в Интернете через uri: ihop-net.org. Альтернативно, для получения информации о последовательности для этого гена или белка и для поиска гомологов или ортологов в других видах с помощью поиска по сравнению последовательностей, может быть применен код доступа известного гена или белка в общедоступных базах данных. Например, код доступа банка генов (GenBank) для гена или белка из мыши можно ввести в базу данных Национального центра биотехнологической информации (NCBI) Национального института здоровья и получить, таким образом, доступ к последовательности ДНК или полипептида для этого мышиного гена. Используя ту же базу данных, можно провести поиск в программе BLAST на последовательности мышиной ДНК или белка или на ее фрагментах, достаточной длины для определения гена или белка, для установления последовательности достаточной гомологии из других видов, например из собак. Коды доступа представляющих интерес последовательностей из других видов можно затем ввести в базу данных для получения информации, относящейся к этим полноразмерным последовательностям нуклеотида или белка, а также к другой описательной информации.
Другой аспект изобретения представляет собой композицию, включающую зонды для детекции дифференциальной экспрессии генов в ткани сердца у старых субъектов по сравнению с молодыми субъектами, в которой зонды детектируют два или несколько генов или генных продуктов, вовлеченных в передачу Wnt-сигнала в ткани сердца. В некоторых воплощениях, гены выбирают из Digh1, Magi3, Akt1, Dab2, Raci, Ctnnb1, Camk2d, Mapk1, Senp2, Smad3, Mark2, Ccnd1 и Pias4. В других воплощениях, гены выбирают из Digh1, Magi3, Ctnnb1, Camk2d, Mapk1 и Senp2. Еще в других воплощениях, гены представляют собой Magi3, Ctnnb1 и Camk2d. В некоторых воплощениях, дифференциальную экспрессию обращают с помощью CR или путем приема ресвератрола, который может быть введен как часть режима питания, например как добавка к пище или корму, или в качестве пищевой добавки.
Зонды могут включать полинуклеотиды или олигонуклеотиды, которые специфически гибридизуются с Wnt-связанными генами или с их фрагментами. Альтернативно, они могут включать агенты, связывающие полипептид, которые специфически связываются с полипептидами, продуцируемыми в результате экспрессии Wnt-связанных генов или их фрагментов. В некоторых воплощениях, агенты, связывающие полипептид, представляют собой антитела, и в особом воплощении они представляют собой моноклональные антитела. В предпочтительном воплощении, зонды специфически гибридизуются или связываются с полинуклеотидами или полипептидами человека, собак или кошек.
Обычно композиция включает множество зондов, в общем, примерно 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 или более зондов, для детекции полинуклеотидов или белков или их фрагментов, по необходимости, для определенных видов и применения. Специалисту понятно, что для единственного целевого гена или белка может быть применено множество различных зондов, для улучшения чувствительности или точности анализа с применением зондов. Например, могут быть применены некоторые олигонуклеотидные зонды, специфически гибридизующиеся с различными последовательностями на целевом полинуклеотиде. Таким же образом, могут быть применены некоторые антитела, иммунологически специфические для разных эпитопов на целевом белке.
Для детального исследования образца один или несколько олигонуклеотидных или полинуклеотидных зондов могут быть получены с помощью информации о последовательности для любого из генов, перечисленных в настоящей заявке, из любых видов, таких как человек, собака или кошка. Зонды должны иметь достаточную длину для специфической гибридизации практически исключительно с соответствующими комплементарными генами или транскриптами. В некоторых воплощениях, олигонуклеотидные зонды имеют, по меньшей мере, примерно 10, 12, 14, 16, 18, 20 или 25 нуклеотидов в длину. В некоторых воплощениях, желательно иметь более длинные зонды, длиной, по меньшей мере, примерно 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 нуклеотидов, и зонды длиннее, чем примерно 100 нуклеотидов, могут быть удобны в некоторых воплощениях. Зонды могут включать полноразмерные последовательности, кодирующие функциональные белки. Зонды, представляющие собой нуклеиновые кислоты, делают или получают с помощью известных специалистам способов, например с помощью синтеза in vitro из нуклеотидов, выделения и очистки из природных источников или энзиматического расщепления полинуклеотидов изобретения.
Комплексы гибридизации, включающие зонды, представляющие собой нуклеиновую кислоту, гибридизованные с полинуклеотидом, включающим Wnt-связанный ген, могут быть определены с помощью множества способов, известных в этой области техники. В некоторых воплощениях изобретения, могут быть применены иммобилизованные зонды, представляющие собой нуклеиновую кислоту, для быстрой и специфической детекции полинуклеотидов и паттернов их экспрессии. Обычно зонд, представляющий собой нуклеиновую кислоту, связан с твердой подложкой и целевой полинуклеотид (например, ген, продукт транскрипции, ампликон, или, чаще всего, амплифицированная смесь) гибридизуется с зондом. Как зонд, так и мишень, или и то, и другое, могут быть помечены, обычно флуорофором или другой меткой, такой как стрептавидин. Если мишень помечена, то гибридизация может быть определена детектированием связанной флуоресценции. Если помечен зонд, то гибридизацию обычно детектируют по тушению метки. Если метят и зонд, и мишень, то детекцию гибридизации обычно проводят, регистрируя цветовой сдвиг, возникающий из-за сближения двух связанных меток. В этой области техники известно множество стратегий мечения, меток, и т.п., в особенности для приложений, основанных на флуоресценции.
В другом воплощении, зонды включают агенты, связывающие полипептид, которые специфически связываются с полипептидами или их фрагментами, продуцируемыми экспрессией одного или нескольких генов, перечисленных в настоящей заявке, или их фрагментов. Такие белок-связывающие зонды могут быть получены с помощью информации о последовательности, доступной для любого из Wnt-связанных белков, идентифицированных в настоящей заявке.
Методики анализа, которые могут быть применены для определения уровня белка в образце, также хорошо известны специалистам в этой области техники. Такие способы анализа включают радиоиммуноанализы, анализы по конкурентному связыванию, анализы вестерн-блоттинг и ELISA. В способах анализа, в которых применяют антитела, как поликлональные, так и моноклональные антитела подходят для применения в изобретении. Такие антитела могут быть иммунологически специфическими для определенного белка, или эпитопа белка, или фрагмента белка, как будет понятно специалистам в этой области техники. Способы получения поликлональных и моноклональных антител, иммунологически специфических для белка или пептида, также хорошо известны в этой области техники.
В предпочтительных воплощениях изобретения могут быть применены антитела для детекции и количественного определения белков, продуцируемых экспрессией генов, описанных в настоящей заявке. Хотя белки могут быть определены иммунопреципитацией, аффинным разделением, с помощью вестерн-блоттинга и т.п., в предпочтительном способе применяют ELISA-подобные методики, в которых антитело иммобилизуют на твердой подложке, и целевой белок или пептид взаимодействует с иммобилизованным антителом. Как зонд, так и мишень, или и то, и другое, могут быть помечены. В этой области техники известно множество стратегий мечения, меток и т.п.
В одном из воплощений, могут быть применены чипы с олигонуклеотидными или полинуклеотидными зондами, тогда как в других воплощениях могут быть применены чипы с антителами или другими белками, которые связываются специфически с дифференциально экспрессируемыми генными продуктами. Такие чипы могут быть изготовлены по заказу в соответствии с известными способами, такими как, например, in-situ синтез на твердой подложке или прикрепление предварительно синтезированных зондов к твердой подложке посредством технологии микропринтирования. В предпочтительных воплощениях, чипы с нуклеиновой кислотой или белок-связывающие зонды изготавливают по заказу для специфической детекции транскриптов или белков, продуцируемых двумя или несколькими дифференциально экспрессируемыми генами или фрагментами генов, описанными в настоящей заявке.
Изобретение также обеспечивает способы анализа, в которые вовлечен контроль изменений в экспрессии генов. В соответствии с одним из этих аспектов, был обеспечен способ для измерения относительного биологического возраста клеток или тканей сердца. Способ включает следующие стадии: (а) определение анализируемого профиля экспрессии генов путем измерения транскрипции или продуктов трансляции одного или нескольких генов, относящихся к передаче Wnt-сигнала в клетках или тканях сердца; (b) сравнение исследуемого профиля экспрессии генов с контрольным профилем экспрессии генов из эквивалентных клеток или тканей сердца известного биологического возраста и (с) определение из сравнения относительного биологического возраста клеток или тканей сердца.
В некоторых воплощениях, Wnt-связанные гены представляют собой Digh1, Magi3, Akt1, Dab2, Raci, Ctanb1, Camk2d, Mapk1, Senp2, Smad3, Mark2, Ccnd1 или Pias4. В других воплощениях применяют Digh1, Magi3, Ctnnb1, Camk2d, Mapkl или Senp2. Еще в других воплощениях применяют Magi3, Ctnnbl или Camk2d. В специфическом воплощении, измеряют экспрессию гена, кодирующего бета-катенин, например Ctnnb1.
В некоторых воплощениях, способ выполняют на популяции культивируемых клеток, как подробно описано в приведенных ниже разделах. Как правило, способ выполняют на клетках или ткани из животного. В предпочтительном воплощении, способ применяют для измерения биологического возраста сердца, детектируя дифференциальную экспрессию Wnt-связанных генов людей или животных-компаньонов, чаше всего собак или кошек. В особом воплощении, зонды присоединяют к подложке, предпочтительно, в виде чипа.
В некоторых воплощениях, сравнение между исследуемым профилем экспрессии генов и контрольным профилем проводят относительно одновременно (т.е. в клетках или в ткани сердца от старых и молодых субъектов). Однако в других воплощениях, для сравнения применяют контрольный образец, основанный на данных, которые были получены раньше с помощью способа. В этом воплощении, зонды взаимодействуют с образцом с образованием комплексов гибридизации или связывания, которые детектируют и сравнивают с комплексами стандарта, которые могут включать собранную ранее информацию по коррелированию уровня экспрессии Wnt-генов с известным биологическим возрастом клеток или тканей сердца. Разница между комплексами гибридизации или связывания из образца и из стандарта указывает на дифференциальную экспрессию полинуклеотидов и, следовательно, генов, дифференциально экспрессируемых в ткани старого субъекта против стандарта, который может включать мРНК, ранее изолированную из молодого субъекта или контрольного субъекта другого типа.
Способы, такие как те, что описаны выше, могут быть полезны для осуществления, способствования или управления замедляющим старение режимом, таким как CR, и/или режим питания, или курс физических упражнений. Такие способы включают получение образца тканей сердца от субъекта, соблюдающего такой режим. Образец ткани затем анализируют для обнаружения модулированной экспрессии одного или нескольких Wnt-связанных генов, с помощью генного или белкового чипа или другого способа детекции, как описано в этой заявке. Результаты анализа покажут, было ли лечение или режим эффективны в отношении замедления старения сердца у индивидуума.
Другой аспект изобретения обеспечивает способ скрининга средства или режима в отношении его способности замедлять старение сердца. Этот способ включает следующие стадии: (а) определение первого профиля экспрессии генов путем измерения транскрипции или продуктов трансляции одного или нескольких генов, относящихся к передаче Wnt-сигнала в ткани сердца старого субъекта в отсутствии средства или при несоблюдении режима; (b) определение второго профиля экспрессии генов путем измерения транскрипции или продуктов трансляции одного или нескольких генов, относящихся к передаче Wnt-сигнала в ткани сердца старого субъекта в присутствии средства или при соблюдении режима, и (с) сравнение первого профиля экспрессии генов со вторым профилем экспрессии генов, в котором изменение во втором профиле экспрессии генов указывают на то, что средство, если введено индивидууму, или режим, если соблюдался индивидуумом, могут быть полезны для замедления старения сердца.
Способы этого типа могут дополнительно включать сравнение, по меньшей мере, второго профиля экспрессии генов с контрольным профилем экспрессии генов, полученным путем измерения транскрипции или продуктов трансляции одного или нескольких генов, относящихся к передаче Wnt-сигнала в ткани сердца молодого субъекта или в ткани сердца старого субъекта в присутствии контрольного вещества или при выполнении контрольного режима, о которых известно, что они замедляют старение сердца, если введены индивидууму. Такие режимы или веществ включают, например, CR или прием ресвератрола.
Аналогично предыдущим способам, сравнение между исследуемым профилем и контрольным профилем экспрессии генов проводят относительно одновременно, т.е. клетки или ткань сердца старых и молодых субъектов анализируют параллельно. Однако, альтернативно, контроль, применяемый для сравнения, может быть основан на данных, полученных ранее с помощью способа. В этом воплощении, зонды взаимодействуют с образцом с образованием комплексов гибридизации или связывания, которые детектируют и сравнивают с комплексами стандарта, который может включать собранную ранее информацию по коррелированию уровня экспрессии Wnt-генов с известным биологическим возрастом клеток или тканей сердца, или с клетками или тканями сердца после контрольного режима или лечения, имеющего известный эффект на старение сердца, измеряемый по экспрессии Wnt-связанных генов (например, CR или прием ресвератрола).
В некоторых воплощениях, Wnt-связанные гены представляют собой Digh1, Magi3, Akt1, Dab2, Raci, Ctnnb1, Camk2d, Mapkl, Senp2, Smad3, Mark2, Ccnd1 или Pias4. В других воплощениях применяют Digh1, Magi3, Ctnnb1, Camk2d, Mapkl или Senp2. Еще в других воплощениях применяют Magi3, Ctnnb1 или Camk2d. В специфическом воплощении, измеряют экспрессию гена, кодирующего бета-катенин, например Ctnnb1.
В одном из воплощений, способ проводят на популяции культивируемых клеток. Конструкт нуклеиновой кислоты, включающий Wnt-связанный ген в соответствии с изобретением, вводят в культуру клеток-хозяев. Клетки-хозяева могут быть линиями клеток млекопитающих, предпочтительно клетками сердца или культурой клеток сердца, или линиями клеток-предшественников, о которых известно, что они дифференцируют в сердечные клетки, как известно в этой области техники. Кодирующие последовательности генов функционально связаны с соответствующими регуляторными элементами экспрессии, подходящими для использования конкретной клеткой-хозяином. Конструкты нуклеиновой кислоты могут быть введены в клетки-хозяева в соответствии с любым способом, приемлемым в этой области техники, включая, но, не ограничиваясь, трансфекцию, трансформацию, осаждение фосфатом кальция, электропорацию и липофекцию. Такие методики хорошо известны и общеприняты в этой области техники.
Анализы экспрессии генов могут быть выполнены с помощью генного конструкта, включающего промотор выбранного связанного со старением гена, функционального связанного с геном-репортером. Репортерный конструкт может быть введен в подходящую культуру клеток, включая, без ограничений, описанные выше стандартные линии клеток-хозяев или свежевыделенные клетки от субъекта, такие как клетки жировой или мышечной ткани. Анализ проводят, следя за экспрессией гена-репортера в присутствии или в отсутствие исследуемого соединения.
В других воплощениях, способ выполняют на животных. Обычно субъекта подвергают действию исследуемого соединения или исследуемого режима (режим питания, режима физических нагрузок и т.п.) и анализируют профиль экспрессии генов в выбранной ткани сердца субъекта для определения эффекта исследуемого соединения на транскрипцию или трансляцию Wnt-связанных генов или генных продуктов. Экспрессия генов может быть проанализирована in situ или ex vivo для определения эффекта исследуемого соединения. В других воплощениях, субъекту вводят исследуемое соединение или подвергают действию режима и анализируют активность белка, экспрессируемого из гена in situ или ex vivo, с помощью любого способа, применяемого в этой области техники для определения эффекта исследуемого соединения на активность представляющих интерес белков. Кроме того, если исследуемое соединение вводят субъекту, то также могут быть оценены физиологические, системные и физические эффекты соединения, а также потенциальная токсичность соединения.
Тестируемые вещества могут представлять собой любые вещества или комбинации веществ, которые могут иметь эффект на старение сердца, определяемый по изменению или обращению связанных с возрастом изменений в экспрессии Wnt-связанных генов, таких как перечислены выше. Подходящие тестируемые вещества включают, но не ограничиваются, аминокислоты, белки, пептиды, полипептиды, нуклеиновые кислоты, олигонуклеотиды, полинуклеотиды, небольшие молекулы, макромолекулы, витамины, минералы, простые сахара; сложные сахара; полисахариды; углеводы; триглицериды со средней длиной цепи (МСТ); триацилглицериды (TAG); n-3 (омега-3) жирные кислоты, включая DHA, ЕРА, ALA; n-6 (омега-6) жирные кислоты, включая LA, γ-линоленовую кислоту (GLA) и ARA; SA, конъюгированную линолевую кислоту (CLA); источники холина, такие как лецитин; жирорастворимые витамины, включая витамин А и его предшественники, такие как каротиноиды (например, β-каротин), источники витамина D, такие как витамин D2 (эргокальциферол) и витамин D3 (холекальциферол), источники витамина Е, такие как токоферолы (например, α-токоферол) и токотриенолы, а также производные витамина Е, такие как тролокс, и источники витамина К, такие как витамин K1 (филлохинон) и витамин К2 (менадион); водорастворимые витамины, включая витамины В, такие как рибофлавин, ниацин (включая никотинамид и никотиновую кислоту), пиридоксин, пантотеновую кислоту, фолиевую кислоту, биотин и кобаламин; и витамин С (аскорбиновую кислоту); антиоксиданты, включая некоторые из перечисленных выше витаминов, в особенности витамины Е и С; также биофлавоноиды, такие как апигенин, катехин, флавонон, генистеин, нарингенин, кверцетин и теафлавин; хиноны, такие как убихинон; каротеноиды, такие как ликопин и ликоксантин; и α-липоевую кислоту; L-карнитин; D-лимонен; глюкозамин; S-аденозилметионин; хитозан; альгинат; кальций; гиалуроноваую кислоту; магний; моноолеилфосфатидную кислоту; оксид азота (например, в виде нитроглицерина); S-карбамилцистеин (аналог аминокислоты); маслянокислый натрий; салицилат натрия; спермидин; сфингозин и глюкозу. В предпочтительных воплощениях, тестируемые вещества представляют собой питательные вещества, которые могут быть добавлены в пищу или потреблены в качестве добавки.
Изобретение дополнительно обеспечивает вещество, которое при введении индивидууму, или режим, который соблюдает индивидуум, как установлено с помощью вышеупомянутого способа, может замедлять старение сердца. В зависимости от способа, с помощью которого они были идентифицированы, такие вещества будут увеличивать передачу Wnt-сигнала в сердце, или будут увеличивать экспрессию или активность одного или нескольких генов или генных продуктов, вовлеченных в передачу Wnt-сигнала в сердце, или будут, по меньшей мере, частично обращать связанное с возрастом снижение в экспрессии Wnt-связанных генов или в активности генных продуктов в сердце.
Другой аспект изобретения обеспечивает набор для измерения биологического возраста клеток или тканей сердца. Набор включает, в отдельных контейнерах в единой упаковке или в отдельных контейнерах в виртуальной упаковке: (1) реагенты, подходящие для измерения экспрессии одного или нескольких генов, относящихся к передаче Wht-сигнала в клетках или тканях сердца, и (2) инструкции о том, как выполнять измерения экспрессии генов, относящихся к передаче Wnt-сигнала в клетках или тканях сердца для определения биологического возраста клеток или тканей сердца. В некоторых воплощениях, набор включает реагенты, подходящие для измерения двух или нескольких Wnt-связанных генов. В некоторых воплощениях, Wnt-связанные гены представляют собой Digh1, Magi3, Akt1, Dab2, Raci, Ctnnb1, Camk2d, Mapk1, Senp2, Smad3, Mark2, Ccnd1 или Pias4. В других воплощениях применяют Digh1, Magi3, Ctnnb1, Camk2d, Mapk1 или Senp2. Еще в других воплощениях применяют Magi3, Ctnnb1 или Camk2d. В специфическом воплощении, измеряют экспрессию гена, кодирующего бета-катенин, например Ctnnbl. В другом специфическом воплощении, измеряют количество или активность бета-катенина в образце.
В особых воплощениях, по меньшей мере, некоторые из реагентов представляют собой зонды, включающие: (а) полинуклеотиды, которые специфически гибридизуются с продуктами экспрессии генов или усиливают транскрипцию продуктов экспрессии генов или их фрагментов; или (b) агенты, связывающие полипептиды, которые специфически связываются с продуктами трансляции экспрессии генов или их фрагментами. В одном из воплощений, агенты, связывающие полипептиды, представляют собой антитела, которые могут быть поликлональными и/или моноклональными антителами. В некоторых воплощениях, зонды присоединены к подложке и могут быть организованы на подложке в чип.
Набор может дополнительно включать контрольный образец для корреляции уровня экспрессии генов со старением сердца. Такой контрольный образец может включать одно или несколько из следующего: (1) клетки или ткани сердца одного или нескольких известных биологических возрастов или (2) информацию, в которой сообщается об уровне экспрессии, ожидаемом для каждого гена в клетках или тканях сердца одного или нескольких известных биологических возрастов. Набор также может включать контрольное вещество, такое как ресвератрол, которое при приеме внутрь, как было показано авторами изобретения, обращает эффект старения сердца на экспрессию Wnt-генов.
В любом из перечисленных выше типов наборов, если набор включает виртуальную упаковку, то набор ограничен инструкциями в виртуальной среде в комбинации с одним или несколькими физическими компонентами набора. В одном из воплощений, набор содержит зонды и/или другие физические компоненты и доступные через Интернет инструкции по применению зондов и другие компонентов. Набор может содержать дополнительные единицы, такие как устройство для перемешивания образцов, зонды и реагенты и устройства для применения набора, например пробирки или принадлежности для смешивания.
В соответствии с еще одним аспектом, изобретение представляет собой упаковку, включающую реагенты, подходящие для измерения экспрессии одного или нескольких генов, относящихся к передаче Wnt-сигнала в клетках или тканях сердца; упаковку, дополнительно включающую этикетку, прикрепленную к упаковке, этикетку, содержащую слово или слова, рисунок, чертеж, сокращение, рекламный лозунг, фразу или другое знак или их комбинацию, которые указывают на то, что содержимое упаковки содержит реагенты для определения биологического возраста клеток или тканей сердца.
Другой аспект изобретения обеспечивает компьютерную систему, включающую базу данных, содержащую информацию по идентификации уровня экспрессии одного или нескольких генов, относящихся к передаче Wnt-сигнала в клетках или тканях сердца, который снижен в сердцах старых животных по сравнению с молодыми животными, и пользовательский интерфейс, который позволяет пользователю получить доступ к информации в базе данных или применять ее. База данных может содержать информацию по идентификации уровня экспрессии одного или нескольких генов, вовлеченных в передачу Wnt-сигнала, таких как Digh1, Magi3, Akt1, Dab2, Raci, Ctnnbl, Camk2d, Mapk1, Senp2, Smad3, Mark2, Ccnd1 или Pias4, и пользовательский интерфейс для того, чтобы воспользоваться базой данных, в особенности для того, чтобы вводить, применять информацию и ознакомляться с информацией для разных животных или категорий животных. В одном из воплощений, база данных дополнительно содержит информацию по идентификации уровня активности одного или нескольких полипептидов, кодируемых Wnt-связанными генами. В другом воплощении, база данных дополнительно включает информацию о последовательности для одного или нескольких из Wnt-связанных генов и кодируемых ими белков, предпочтительно из разных видов. В других воплощениях, база данных содержит дополнительную информацию, относящуюся к описанию генов в одном или нескольких видах животных. Компьютерная система представляет собой любой электронное устройство, способное содержать и управлять данными и взаимодействовать с пользователем, например обычный компьютер или аналитический инструмент, сконструированный так, чтобы облегчать применение изобретения и выведения результатов, относящихся к статусу животного.
Еще один аспект изобретения представляет собой носитель информацию о применении или инструкцию по применению одного или нескольких из следующего: (1) гены, относящиеся к передаче Wnt-сигнала в клетках или тканях сердца, который снижен в сердцах старых животных по сравнению с молодыми животными, (2) замедление старения сердца у индивидуума путем усиления передачи Wnt-сигнала и/или увеличения количества или активности бета-катенина в сердце индивидуума, (3) замедление старения сердца у индивидуума путем введения средства или режима, которые увеличивают передачу Wnt-сигнала и/или увеличивают количество или активность бета-катенина в сердце индивидуума, (4) скрининг изучаемых соединений или режимов в отношении их способности замедлять старение сердца путем модуляции экспрессии генов, относящихся к передаче Wnt-сигнала в сердце, (5) определение биологического возраста клеток и ткани сердца путем измерения экспрессии генов, относящихся к передаче Wnt-сигнала в клетках и тканях сердца, и (6) наборы и реагенты для измерения дифференциальной экспрессии генов, относящихся к передаче Wnt-сигнала в клетках или тканях сердца старых животных по сравнению с молодыми животными; где носитель включает один или несколько физических или электронных документов, цифровые носители информации, оптические носители информации, аудиопрезентацию, аудиовизуальный дисплей или визуальный дисплей, содержащий информацию или инструкции.
Носитель может быть выбран из различных носителей, известных в этой области техники, или любой комбинации таких носителей, включая, но, не ограничиваясь: отображаемый веб-сайт, центр информации с электронным табло, брошюру, этикетку продукта, вкладыш в упаковку, рекламу, раздаточный материал, публичное объявление, аудиозапись, видеозапись, DVD, CD-ROM, читаемый компьютером чип, читаемая компьютером карта, читаемый компьютером диск, USB-устройство, устройство FireWire и/или память компьютера.
В другом аспекте, изобретение обеспечивает способы замедления старения сердца у индивидуума, которые сфокусированы на усилении передачи Wnt-сигнала в сердце индивидуума. Индивидуумы могут представлять собой животных любых видов или типов, которые состарились, или восприимчивы к заболеванию, или страдают от заболевания или состояния, которое вызывает старение сердца, включая животных любого возраста, видов, состояния здоровья и т.п. Предпочтительно, животные представляют собой людей или животных-компаньонов, таких как собаки или кошки. В одном из воплощений, животные представляют собой состарившихся животных, восприимчивых к старению или страдающих от старения различных клеток и тканей сердца. В других воплощениях, животные представляют собой животных, восприимчивых к заболеванию или состоянию или страдающих от заболевания или состояния, которое приводит сердце к стрессу или старению, или заболевание или состояние сердца, которое связано с пожилыми индивидуумами и которое оказывает разрушительное действие на другие части организма. В любом случае, приложение способов изобретения для замедления старения сердца будет иметь полезный эффект на сердце индивидуума и, таким образом, на индивидуума в целом. Такие состояния или заболевания включают, но не ограничиваются: рак, СПИД, застойные заболевания сердца, хроническое обструктивное заболевание легких, почечную недостаточность, тяжелые ожоги, сердечный приступ (ишемия), заболевание коронарных артерий, атеросклероз, хирургическое вмешательство, например ангиопластику или коронарное шунтирование, заболевание клапанов сердца, гипертрофическую кардиомиопатию и т.п. Индивидуум может считаться «восприимчивым» к старению сердца или к развитию заболеваний или состояний, связанных со старением сердца, если индивидуум демонстрирует один или несколько факторов риска для сердечного заболевания, заболевания кровеносных сосудов и т.п. Такие факторы риска известны специалистам, и включают, но не ограничиваются: избыточный вес, физическую инертность, высокое кровяное давление, высокий холестерин и/или триглицериды, стенокардию, диабет, курение, наследственность, принадлежность к мужскому полу, стресс и злоупотребление алкоголем.
Типичный способ для замедления старения сердца у индивидуума включает следующие стадии: (а) идентификацию индивидуума, для которого желательно замедление старения сердца, и (b) модулирование экспрессии, по меньшей мере, одного гена, который влияет на передачу Wnt-сигнала в сердце индивидуума, в котором модулирование приводит к увеличению передачи Wnt-сигнала в сердце, таким образом, замедляя старение сердца у индивидуума. В некоторых воплощениях, Wnt-связанные гены представляют собой Digh1, Magi3, Akt1, Dab2, Raci, Ctnnb1, Camk2d, Mapk1, Senp2, Smad3, Mark2, Ccnd1 или Pias4. Другие воплощения сфокусированы на модуляции генов Digh1, Magi3, Ctnnb1, Camk2d, Mapk1 или Senp2. Еще в других воплощениях применяют Magi3, Ctnnb1 или Camk2d. В специфическом воплощении модулируют экспрессию гена, кодирующего бета-катенин, например Ctnnb1. В другом специфическом воплощении, модулируют количество или активность бета-катенина у индивидуума.
В одном из воплощений, модуляция включает увеличение экспрессии одного или нескольких генов. В других воплощениях, усиленная передача Wnt-сигнала связана с увеличением количества или активности бета-катенина в сердце индивидуума.
Другое воплощение включает введение индивидууму эффективного количества одного или нескольких средств или воздействие на индивидуума с помощью одного или нескольких режимов, которые увеличивают передачу Wnt-сигнала в сердце или которые, по меньшей мере, частично обращают связанные с возрастом снижения в передаче Wnt-сигнала в сердце, таким образом, замедляя старение сердца у индивидуума. Средство может действовать путем имитации активности бета-катенина в сердце индивидуума.
В некоторых воплощениях, режимы, которые включают CR или прием ресвератрола, могут быть применены для замедления старения сердца путем увеличения передачи Wnt-сигнала в сердце индивидуума или путем, по меньшей мере, частичного обращения связанных с возрастом снижений в передаче Wnt-сигнала в сердце. Такие режимы могут быть скомбинированы с другими режимами или средствами, такими как те, что идентифицируются с помощью способов, описанных в настоящей заявке.
Предпочтительное воплощение включает пероральное введение индивидууму, на постоянной основе, предпочтительно на пролонгированной постоянной основе, вещества, которое увеличивает передачу Wnt-сигнала в сердце, таким образом, замедляя старение сердца. Обычно вещество вводят постоянно в течение, по меньшей мере, двух недель, более предпочтительно в течение, по меньшей мере, четырех недель или в течение более продолжительного периода. Введение вещества может продолжаться неопределенно долго, например в течение одного, двух, трех, шести или девяти месяцев, или в течение года или более, или даже в течение жизни индивидуума. Вещество, в общем, вводят, по меньшей мере, ежедневно, но режим приема будет зависеть от природы и эффективности вещества. Соответственно, введение может быть более частым, например два или три раза в день, или менее частым, например три раза в неделю, два раза в неделю, один раз в неделю, два раза в месяц или один раз в месяц.
В некоторых воплощениях, пролонгированное постоянное пероральное введение вещества вызывает изменение в экспрессии или обращение связанных с возрастом изменений в экспрессии, одного или нескольких Digh1, Magi3, Akt1, Dab2, Raci, Ctnnb1, Camk2d, Mapk1, Senp2, Smad3, Mark2, Ccnd1 или Pias4. Другие воплощения сфокусированы на модуляции Digh1, Magi3, Ctnnb1, Camk2d, Mapk1 или Senp2. Еще в других воплощениях применяют Magi3, Ctnnb1 или Camk2d. В специфическом воплощении, экспрессию гена, кодирующего бета-катенин, например Ctnnb1, модулируют с помощью пролонгированного постоянного перорального введения вещества. В другом специфическом воплощении, модулируют количество или активность бета-катенина у индивидуума. Ресвератрол представляет собой пример вещества, которое, при пероральном введении субъекту на пролонгированной постоянной основе, обращает связанные с возрастом изменения в экспрессии Wnt-связанных генов в сердце.
В одном из воплощений, модуляция включает увеличение экспрессии одного или нескольких генов. В других воплощениях, усиленная передача Wnt-сигнала связана с увеличение в количестве или активности бета-катенина в сердце индивидуума.
При применении в качестве добавки к обычным потребностям в питании, вещество может быть введено непосредственно в животное. Вещество может альтернативно находиться в контакте с ежедневным кормом или пищей или быть примешано к ежедневному корму или пище, включая жидкость, такую как питьевая вода, или поставляться в качестве пищевой добавки. При применении совместно с ежедневным кормом или пищей или при включении в ежедневный корм или пищу введение хорошо известно специалистам. Введение может быть выполнено как часть режима питания для животного. Например, режим питания могут включать принуждение к регулярному приему животным вещества в количестве, эффективном для замедления старения сердца. В других воплощениях, вещество вводят животному совместно с одним или несколькими лекарственными средствами, нутрицевтиками или питательными веществами для замедления старения сердца или для увеличения долголетия в целом.
В некоторых воплощениях, диапазон ежедневных или регулярных доз для вещества, вводимого в соответствии с этим способом, составляет от примерно 0,001 г/кг массы тела до 10 г/кг массы тела. В особенности, доза превышает 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09 или 0,1 г/кг массы тела. В других воплощениях, дозировка может быть равна 0,2, 0,5, 1, 3, 5, 7 или 10 г/кг массы тела или более, в зависимости от вещества и частоты приема лекарственного средства. Специалист знает, как подобрать дозировки и режимы приема для субъектов.
ПРИМЕРЫ
Изобретение может быть дополнительно проиллюстрировано следующим примером, хотя следует понимать, что этот пример включен только для целей иллюстрации и не предназначен для ограничения объема изобретения, если специально не указано иное.
Пример 1
Материалы и методы
Два общедоступных набора данных по экспрессии генов старения в сердце у грызунов были выбраны из базы данных по экспрессии генов «Gene Expression Omnibus» (GEO) NCBI: (1) исследования на крысах университета Вашингтона (UW) (Linford JL et al. (2007) Transcriptional Response to Aging and Calorie Restriction in Heart and Adipose Tissue. Aging Cell 6: 673-688)) (исследование 1) и (2) исследование на мышах компании «LifeGen» (Barger JL et al. (2008) A Low Dose of Dietary Resveratrol partially Mimics Calorie Restriction and Retards Aging Parameters in Mice PLoS ONE 3(6): 1-10) (исследование 2). Материалы и методы для этих двух исследований приведены в ссылках. Третий набор данных был получен из неопубликованного исследования по старению сердца у мышей. В этом исследовании мышей разделяли на две группы (n=7) и содержали на контрольной диете в соответствии с описанием, приведенным в исследовании Barger. Мышей забивали в возрасте 5-ти месяцев (группа молодых) и 25-ти месяцев (группа старых). Ткани сердца собирали и подвергали анализам на экспрессию генов с помощью микрочипов (исследование 3). В исследовании 2 и исследовании 3 применяли генные чипы «Affymetrix mouse genome 430 2,0». В исследовании 1 применяли генные чипы «Affymetrix rat genome 230 2,0». Описание трех исследований приведено в таблице 1.
Таблица 1
Модель
Наименование
Источник
Виды
Молодой
Старый
CR
Ресвератрол
Образец #
Исследование 2
NCBI
Мышь
5
30
30+CR
30+Ресвератрол
5
Исследование 1
NCBI
Крыса
4
28
28+CR
/
6
Исследование 3
Собственное
Мышь
5
25
/
/
7
Первоначально данные были проанализированы на качество и рассмотрены возможные выпадающие значения. Три образца, один из каждого исследования, были признаны выбросами и были удалены из дальнейшего анализа. Дифференциальные гены были идентифицированы между молодой и старой группами в каждом исследовании с помощью алгоритма на уровень значимости анализа с помощью микрочипов (Significance Analysis of Microarrays, SAM) (Tusher, Tibshirani and Chu (2001) Significance analysis of microarrays applied to the ionizing radiation response. PNAS 2001 98: 5116-5121). Критерий отбора включал магнитуду изменений в экспрессии (кратно>=1,2) и уровень ложноположительных результатов (FDR<0,5%).
Для определения влияния изменений экспрессии генов в уровне системы проводят анализ пути на наборах данных из исследования 2 и исследования 3 с помощью компьютерных программ GenMAPP и MAPPFinder (Salomonis, К Hanspers, AC Zambon, К Vranizan, SC Lawlor, KD Dahlquist, SW Doniger, J Stuart, BR Conklin and AR Pico. GenMAPP 2: new features and resources for pathway analysis. BMC Bioinformatics, Jun 2007; 8: 217). Из полного чипа применяли зонды с тем же критерием отбора, кратность >1,2 и FDR<0,5%. Выбирают пути с наиболее существенной связью внутри данных. Авторы изобретения установили, что Wnt-сигнальный путь находится среди путей с наиболее существенной связью (приведенное р-значение равно 0,011 в обоих наборах данных из исследования 2 и из исследования 3).
Гены в Wnt-пути дополнительно проанализировали на изменения в их экспрессии. Примерно двенадцать генов продемонстрировали снижение экспрессии в старом сердце по сравнению с молодым сердцем в исследовании 2. Эти гены/белки перечислены в таблице 2, вместе с соответствующими типичными кодами доступа в Банке генов, и результаты исследования 2 показаны в таблице 3. Экспрессию этих генов также проанализировали в группе с ограничением в калориях (CR) и в группе с ресвератролом («Resv»). Как показано в таблице 3, экспрессия всех кроме трех этих генов возрастала до их уровня в группе молодых, получавших CR или Resv. Большинство генов, которые подавляются в старом сердце, представляют собой положительные детерминанты Wnt-пути, указывая на то, что Wnt-путь подавляется в старых в сравнении с молодыми сердцах у мышей.
Таблица 2
Гены, дифференциально регулируемые в старой в сравнении с молодой тканью сердца (исследование 2)
Зонд ID
Символ
Номер доступа в Банке генов
Номер доступа для белка
Мышь
Крыса
Мышь
Крыса
1450768_at
Digh1
NM_007862
NM_012788
NP_031888
NP_036920
1421035_a_at
Magi3
NM_001159354
NM_139084
NP_001152826
NP_620784
1425711_a_at
Akt1
NM_009652
NM_033230
NP_033782
NP_150233
1430604_a_at
Dab2
NM_023118
NM_024159
NP_075607
NP_077073
1423734_at
Raci
NM_009007
NM_134366
NP_033033
NP_599193
1430533_a_at
Ctnnb1
NM_001165902
NM_053357
NP_001159374
NP_445809
1450008_a_at
Ctnnb1
NM_001165902
NM_053357
NP_001159374
NP_445809
1427763_a_at
Camk2d
NM_001025438
NM_012519
NP_001020609
NP_036651
1426585_s_at
Mapk1
NM_001038663
NM_053842
NP_001033752
NP_446294
1425465_a_at
Senp2
NM_029457
NM_023989
NP_083733
NP_076479
1450471_at
Smad3
NM_016769
NM_013095
NP_058049
NP_037227
1435889_at
Mark2
NM_001080388
NM_021699
NP_001073857
NP_067731
1448698_at
Ccnd1
NM_007631
NM_171992
NP_031657
NP_741989
1455394_at
Pias4
NM_021501
NM_001100757
NP_067476
NP_001094227
Таблица 3
Изменение в экспрессии генов Wnt-пути в старой в сравнении с молодой тканью сердца и влияние CR или ресвератрола (исследование 2)
(А) Кратность изменения*
(B)FDR
Символ
Старое против молодое
CR против старое
Resv против старое
Старое против молодое
CR против старое
Resv против старое
Digh1
-1,528
1,154
1,150
0,010
NS**
NS
Magi3
-1,366
1,195
1,244
0,010
0,010
0,050
Akt1
-1,814
-1,119
-1,315
0,010
NS
NS
Dab2
-1,296
1,201
1,227
0,010
0,010
0,010
Raci
-2,004
1,712
1,509
0,010
0,010
0,010
Ctnnb1(1)
-3,038
3,177
2,787
0,010
0,010
0,010
Ctnnb1(2)
-1,904
2,143
2,017
0,010
0,010
0,010
Camk2d
-1,933
1,541
1,235
0,010
0,010
0,050
Mapk1
-1,290
-1,035
-1,020
0,010
NS
NS
Senp2
-1,538
1,071
1,261
0,010
NS
0,050
Smad3
-1,371
1,412
1,285
0,010
0,010
0,050
Mark2
1,531
-2,069
-2,113
0,010
0,010
0,010
Ccnd1
1,395
-1,651
-1,158
0,010
0,010
NS
Pias4
1,306
-1,514
-1,495
0,010
0,010
0,010
* Числа указывают на изменения экспрессии в разах (А) и уровень ложноположительных результатов (В)
** NS=незначимый
Было проведено интегрированное исследование для установления генов со сходными изменениями профиля экспрессии во всех трех исследованиях и для установления потенциальных биомаркеров. Результаты показаны в таблице 4. Три гена, Magi3, Ctanb1, и Camk2d, подавляются в старом сердце по сравнению с молодым сердцем во всех трех исследованиях. Четвертый ген, Senp2, подавляется в двух исследованиях (исследовании 1 и исследовании 2). Особое внимание было обращено на бета-катенин (ctnnb1), ключевой компонент в Wnt-сигнальном пути. Бета-катенин играет важную роль в передаче сигнала в Wnt-пути, поскольку он опосредует Wnt-сигнал в ядре, чтобы стать партнером с разными транскрипционными факторами для активации набора генов, регулирующий последующие звенья сигнальных каскадов. Как показано в таблице 4, бета-катенин подавляется вплоть до в три раза (-3,04) в старом сердце в исследовании 2 и его экспрессия возвращается к его молодому уровню при диете, дополненной CR (3,18) или ресвератролом (2,79). Второй бета-катениновый зонд также показал похожие изменения со слегка меньшей магнитудой. Кратность изменения экспрессии для бета-катенин была равна -1,3 и -1,5 в старых в сравнении с молодыми сердцами в исследовании 3 и в исследовании 1, соответственно. Сходное изменение профиля экспрессии было показано для Magi3 и Camk2d. Кроме того, два гена, Digh1 и Mapk1, подавляются как в исследовании 1, так и в исследовании 2. Эти результаты показывают, что бета-катенин представляет собой биомаркер старения сердца.
Таблица 4
Дифференциальная экспрессия генов Wnt-пути в трех профилях экспрессии генов в старых в сравнении с молодыми тканями сердца и обработка CR или ресвератролом
Символ
Исследование 3
Исследование 1
Исследование 2
Старое против молодое
Старое против молодое
Старое против молодое
CR против старое
Resv против старое
Digh1
-1,3
-1,528
Magi3
-1,6
-1,4
-1,366
1,195
1,244
Ctnnb1 зонд 1
-1,3
-1,5
-3,038
3,177
2,787
Ctnnb1 Зонд 2
-1,904
2,143
2,017
Camk2d
-2,1
-1,2
-1,933
1,541
1,235
Mapk1
-1,2
-1,290
Senp2
1,5
-1,3
-1,538
1,071
1,261
Числа указывают на изменения экспрессии в разах.
В описании были раскрыты типичные предпочтительные воплощения изобретения. Хотя применяли специфические термины, их применяли только в общем и описательном смысле, а не для целей ограничения. Объем изобретения изложен в формуле изобретения. Очевидно, что в свете приведенной выше идеи возможны многие модификации и изменения изобретения. Следовательно, понятно, что в рамках прилагаемой формулы изобретения изобретение может быть осуществлено на практике иным способом, чем тот, что был специально описан.