Влияние подострого отравления тетрахлорметаном на функцию субпопуляций Т-лимфоцитов

Литература

1. Александров В. Я. Клетки, макромолекулы и

температура.- Л.: Наука, 1975.- 330 с.

2. Баллюзек Ф. В. Управляемая гипертермия.- СПб:

Невский Диалект, 2001.- 123 с.

3. Ефремов А. В. и др. Способ экспериментального

моделирования общей гипертермии у мелких лабораторных

животных. Патент РФ N 2165105. Опубл. в Бюл. N 10.- 2001.

4. Збарский И. Б. Организация клеточного ядра.- М.: Медицина, 1988.- 367 с.

5. Козлов Н.Б. Гипертермия: биохимические основы

патогенеза, профилактики, лечения.- Воронеж: Изд-во

ВоронежГУ, 1990.- 103 с.

6. Ступко А. И., Служинская А. Б. Здравоохранение Белоруссии.- 1990.- №9.- С. 59-61.

7. Swan H. Thermoregulation and bioenergetic.- Amsterdam : Elsevier, 1974.- 342 p.

EVALUATION OF PATHOGENETIC AND SANOGENETIC EFFECTS OF GENERAL CONTROLED HYPERTHERMIA, AN EXAMPLE THE ANALYSIS STATE OF TISSUE MICROAREA OF LIVER IN RATS WISTAR

K.A. ASTAFIEVA, K.K. DMITRIEVA, A.V. EFREMOV, A.V. IGNATOVA,

S.V. MICHURINA,EV. OVSYANKO,YA.U. OVSYANKO,

YU.V. PAKHOMOVA, M.G. PUSTOVETOVA, V.S. SAZONOV,

A.V. SAMSONOV

Summary

The pathomorphologcal and ultramicroscopic studies of tissue microarea of liver in acute period after general controlled hyperthermia allow to reveal the presence of pathogenetic and sanogenetic action effects of high exterior temperature on animal organisme.

Key words: microarea of liver, high exterior temperature

УДК 615.91.036.11-07:616.155.32-092

ВЛИЯНИЕ ПОДОСТРОГО ОТРАВЛЕНИЯ ТЕТРАХЛОРМЕТАНОМ НА ФУНКЦИЮ СУБПОПУЛЯЦИЙ Т-ЛИМФОЦИТОВ

П.Ф. ЗАБРОДСКИЙ, В.Ф. КИРИЧУК, С.В. БАЛАШОВ, В.Г. ЛИМ,

А.А. СВИСТУНОВ*

Тетрахлорметан (ТХМ, четыреххлористый углерод) широко используется в промышленности как растворитель, для чистки и обезжиривания одежды в быту и производственных условиях. В клинической токсикологии отравления ТХМ составляют до 60% всех больных с токсическим поражением печени [2]. Летальность, которая при пероральных отравлениях составляет 30%, а при ингаляционных - 15-20%, может быть связана с вторичным иммунодефицитным состоянием [1]. От особенностей поражения ТХМ популяций Т-лимфоцитов, В-клеток зависит характер формирования вторичного иммунодефицитного состояния и способы коррекции нарушений иммунного статуса [1,5].

Цель работы - оценка цитокинового профиля (содержание в крови ИФН-у, ИЛ-2, ИЛ-4) и связанных с ним иммунных реакций, отражающих функцию ТЫ- и Th2-лимфоцитов, активности эстераз в Т-клетках при подостром отравлении ТХМ.

Материал и методы. Опыты проводили на неинбредных белых крысах обоего пола массой 180-240 г. ТХМ вводили per os в растворе оливкового масла (DL50 ТХМ составляла 6,5+0,6 г/кг). ТХМ применяли в дозе 1/4 DL50 в течение 4 сут и 1/13 DL50 в течение 13 сут для оценки соответственно функции Th1- и Th2-лимфоцитов. Концентрацию ИФН-у исследовали плазме крови крыс через 4 сут после первой инъекции ТХМ, а цитокины ИЛ-2 и ИЛ-4 - через 13 сут после первого введения ТХМ методом ферментного иммуносорбентного анализа (ELISA), используя наборы (ELISA Kits) фирмы BioSource Int. Сроки определения цитокинов в крови соответствовали особенностям иммуногенеза при иммунизации эритроцитами барана (ЭБ). Показатели системы иммунитета оценивали общепринятыми методами в экспериментальной иммунотоксикологии и иммунологии [1,3]. Гуморальную иммунную реакцию к тимусзависимому антигену (ЭБ), характеризующую способность Th1-лимфоцитов участвовать в продукции В-лимфоцитами (плазматическими клетками) IgM,

* Саратовский ГМУ, ГСП-71, ул. Большая Казачья,112

определяли по числу антителообразующих клеток (АОК) в селезенке через 4 сут после иммунизации, функцию ТЫ-лимфоцитов - по реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ). Функцию ТЪ2-лимфоцитов исследовали по числу АОК, синтезирующие ^О к ЭБ, в селезенке на пике продукции данного иммуноглобулина (14 сут) методом непрямого локального гемолиза в геле [3]. Крыс иммунизировали внутривенно ЭБ в дозе 2-108 клеток одновременно с первым введением ТХМ. При оценке всех иммунных реакций животные получали суммарную эквилеталь-ную дозу ТХМ (1,0 ЭЬзо). Активность ацетилхолинэстеразы (АХЭ) в Т-лимфоцитах определяли через 4 сут после интоксикации, выделяя клетки из селезенки методом [4] и осуществляя реакции и расчеты по методу [6]. Активность а-нафтил-А8-ацетатэстеразы и а-нафтил-бутиратэстеразы, содержащихся в основном в Т-клетках спленоцитов [1], изучали гистохимическим методом [1] через 4 сут после воздействия ТХМ в дозе 1/4 ЭЬзо. Данные обрабатывали статистически по ^критерию достоверности Стьюдента. Определяли коэффициенты корреляции (г) между показателями иммунного статуса, активностью АХЭ Т-клеток

Результаты. При исследовании уровня цитокинов в плазме крови крыс (табл. 1) установлено уменьшение содержания ИФН-у на 5 сут и ИЛ-4 на 14 сут после отравления ТХМ соответственно в 2,50 и 1,58 раза (р<0,05). Снижение соотношения ИФН-у/ИЛ-4 под влиянием ТХМ в 4,2 раза по сравнению с контролем (6,6) говорит о большей супрессии активности лимфоцитов ТЫ-типа по сравнению с функцией ТЪ2-клеток [1].

Таблица 1

Влияние подострой интоксикации ТХМ на содержание цитокинов в плазме крови крыс, пг/мл

Цитокины Контроль ТХМ

ИФН-у 987±78 395±37*

ИЛ-4 150±22 95±10*

ИФН-y /ИЛ-4 6,6 4,2

ИЛ-2 1446+95 580+34*

Примечание: * -р<0,05 по сравнению с контролем.

Снижение в плазме крови под влиянием ТХМ ИЛ-2 свидетельствует о супрессии его продукции Т-лимфоцитами (как СЭ4+, относящимися к лимфоцитам ТЪ0- типа), так и некоторыми СЭ8+, редукции пролиферации Т- и В-клеток (синтеза 1-цепи молекулы иммуноглобулина), активности естественных клеток-киллеров (ЕКК) [3]. При воздействии ТХМ (табл. 2) отмечалось уменьшение гуморального иммунного ответа через 4 сут к Т-зависимому антигену (по числу АОК в селезенке), характеризующему синтез ^М В-клетками и функцию ТЫ-лимфоцитов, по сравнению с контрольным уровнем в 2,57 раза (р<0,05). При подостром отравлении ТХМ на 5 сут отмечалась существенная супрессия реакции ГЗТ (функция ТЫ-клеток) соответственно в 2,27 раза (р<0,05). Через 13 сут после иммунизации (пик иммунного ответа, оцениваемый по ^О) отмечалось уменьшение продукции ^О (по числу АОК в селезенке) в 1,42 раза (р<0,05), свидетельствующее о редукции функции ТЪ2-лимфоцитов.

Таблица 2

Влияние подострой интоксикации ТХМ на функцию Th1- и Th2-лимфоцитов у крыс

Серия опытов Функция ТЫ-лимфоцитов Функция ТЬ2-лимфоцитов

АОК к ЭБ (IgM), 103 ГЗТ, % АОК к ЭБ (IgG), 103

Контроль 43,5+4,0 38,8+3,3 52,8+5,4

ТХМ 16,9+2,1* 17,1+2,2* 37,2+3,8*

Примечание: * -p<0,05 по сравнению с контролем.

Характеризующие иммунные реакции и связанную с ними функцию ТЪ1 -лимфоцитов параметры при действии ТХМ в среднем снижались в 2,42 раза. Установлена значительно меньшая редукция иммунного ответа, который обеспечивается функцией ТЪ2-лимфоцитов (и В-клеток), при отравлении ТХМ (соответствующее редукции числа АОК, синтезирующих ^О). Полученные данные подтверждают выявленную особенность поражения функции ТЫ-лимфоцитов под влиянием ТХМ в большей степени по сравнению с супрессией активности ^2-лимфоцитов. Редукция параметров иммунной системы сопровождалась снижением активности АХЭ в Т-лимфоцитах спленоцитов и содержанием а-нафтил-А8-ацетатэстеразо- и а-нафтил-

бутиратэстеразопозитивных клеток в селезенке крыс (табл. 3).

Таблица 3

Влияние подострой интоксикации ТХМ на активность ацетилхолинэ-стеразы в Т-лимфоцитах и содержание а-нафтил-А8-ацетатэстеразо- и а-нафтил-бутиратэстеразопозитивных клеток в селезенке крыс через 4 сут

Показатель Контроль ТХМ

Активность АХЭ Т-клеток,мЕД/109 клеток 65,2+6,7 30+ 3,9*

Содержание а-нафтил-А8-ацетатэстеразопозитивных клеток,% 50,5+4,0 26,1+3,7*

Содержание а-нафтил-бутиратэстеразопозитивных клеток,% 42,6+4,4 20,4+3,5*

Примечание: * - p<0,05 по сравнению с контролем.

По сравнению с контролем, острое действие ТХМ вело к снижению активности АХЭ Т-клеток, а-нафтил-AS-ацетатэстеразы а-нафтил-бутиратэстеразы спленоцитов соответственно в 2,16; 1,93 и 2,09 раз (p<0,05). Значение r между значениями иммунных реакций при подостром отравлении ТХМ и активностью АХЭ Т-клеток находилось в пределах от -0,698 до -0,850 (p<0,05). Редукция функции Т-клеток обусловлена ингибированием АХЭ Т-лимфоцитов и других типов эстераз, локализованных в макрофагах, нейтрофилах и моноцитах [1].

Выводы. Подострое действие ТХМ снижает концентрацию в крови цитокинов (ИФН-у, ИЛ-2, ИЛ-4) и уменьшает соотношение ИФН-у/ИЛ-4 по сравнению с контролем. ТХМ вызывает ингибирование АХЭ Т-клеток, а-нафтил-АS-ацетатэстеразы и а-нафтилбутиратэстеразы спленоцитов, а также. большее поражение Thl-клеток по сравнению с Th2-лимфоцитами. Выявлена высокая степень отрицательной корреляции между активностью ацетилхолинэстеразы в Т-лимфоцитах и иммунными реакциями.

Литература

1.Забродский П.Ф., Мандыч В.Г. Иммунотоксикология ксенобиотиков: Монография.- СВИБХБ, 2007.- 420 с.

2. Венгеровский А.И. и др.// Эксперим. и клин. фармакол.-2004.-Т.67, №4.- С. 50-53.

3.Ройт А. И др. Иммунология / Пер. с англ.- М.: Мир, 2000.- 582 с.

4. Ширшев С.В.//Бюл. эксп. биол. и мед .-1998.-№6.- С. 666.

5. CorsiniE., Kimber I. // Toxicol. Lett.- 2007.- №3.- P.255.

6. Szelenyi J.G., Bartha E., Hollan S.R.// Brit. J. Haematol.-1982.- Vol. 50, № 7.- P. 241-245.

УДК 612.124- 074: 612. 014. 464

ВОЗМОЖНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ВОЗДЕЙСТВИЯ ОЗОНА НА БЕЛКИ ПЛАЗМЫ КРОВИ

Л.М. ОБУХОВА, М.В. ВЕДУНОВА, К.Н. КОНТОРЩИКОВА*

Озон применяют при терапии ряда патологических состояний. Несмотря на исследования, посвященные изучению влияния озона на различные ферментные системы, влияние этого окислителя на белковые молекулы изучено недостаточно.

Цель работы - изучение воздействия различных концентраций озона на состояние белков плазмы крови и сывороточного человеческого альбумина, определяемое по параметрам макропортрета высохшей капли, изменению интенсивности свободнорадикальных процессов и уровню окислительной модификации.

Методика. На первом этапе использовали 10% раствор сывороточного человеческого альбумина выпуска 2005 и 2007 г. при добавлении различных объемных соотношений и концентраций озона в 0,9% растворе NaCl и деионизированной воде. Контролем служили пробы 10% раствора сывороточного человеческого альбумина с добавлением тех же объемных соотношений неозонированных физиологического раствора и деионизированной воды. На втором было проведено исследование плазмы крови больных до и после озонотерапии. В исследуемую группу вошло 60 человек с заболеваниями, связанными с активацией свободнорадикальной активности (атеросклероз, гипертоническая болезнь, сахарный диабет II типа). Курс озонотерапии включал 6-8 процедур внутривенного введения физиологического раствора с концентрацией озона 0,30-0,40 мг/л. Исследование вели методом

* Нижегородский госун-т им. Н.И. Лобачевского

клиновидной дегидратации [4]. Определяли интенсивность свободно-радикальных процессов методом индуцированной хеми-люминесценции (1тах; 8), содержание окислительно-

модифицированных белков плазмы крови [1].

Рис. Структурный макропортрет альбумина (х20) при добавлении различных объемных соотношений нативного и озонированного физиологического раствора (содержание озона - 0,57мг/л): 1 - массивы; 2 - штриховые трещины; 3 - круглые трещины

Результаты. В ходе предварительных исследований было изучена зависимость интенсивности изменений параметров высохшей капли 10% раствора альбумина от времени инкубации с озонированным раствором 0,9% КаС1. С течением времени под воздействием озона изменялось количество особенностей и массивов в структурном макропортрете раствора альбумина. Максимальная интенсивность изменений имела место после 30 минут инкубации. При использовании деионизированной воды вместо озонированного физиологического раствора обнаружены отсутствие массивов и иной характер кристаллов в высохшей капле. Динамика изменений ширины краевой зоны и количества особенностей оставались неизменными. Сразу после добавления озонированного физиологического раствора в дегидратированной капле альбумина наблюдались те же особенности, что и при добавлении нативного физиологического раствора (рис.). Характер и количество особенностей менялся только после 30минутной инкубации с озонированным 0,9% раствором №С1.

Добавление озонированного физиологического раствора сразу же снижает интенсивность массивообразования в высохшей капле, но после 30-минутной инкубации число массивов возрастало (рис.). Наличие массивов в фации биологической жидкости [5] связывают с наличием измененных белков. При определенной концентрации КаС1 молекулы альбумина теряют сольватную оболочку, белок утрачивает присущую ему конформацию. При этом концы белковых молекул слипаются, образуя макрострук-турную сеть, что является отражением процесса агрегации белковых молекул. Следовательно, изменение количества массивов в высохшей капле альбумина при добавлении озонированного физиологического раствора можно объяснить тем, что первоначально окислительное воздействие озона вызывало разрушение крупных белковых агрегатов, но затем их количество еще более возрастало. Соотношение ширины краевой зоны к радиусу дегидратированной капли раствора альбумина с добавлением 0,9% раствора КаС1 и характер кристаллов в центре не менялся с течением времени и при воздействии озона во всех сериях опытов. Поскольку ширина краевой зоны высохшей капли определяется количеством белка в пробе [4], и вид кристаллов зависит от концентрации и типа солей [3], можно считать, что озонирование не влияет на содержание белка и неорганических солей в пробе.

В опытах с раствором альбумина исследовано влияние физиологического раствора с разной концентрацией озона: 0,55 и