Способ прогнозирования веса новорожденного у беременных с преэклампсией и отягощенным семейным анамнезом по преэклампсии
METHOD FOR PREDICTION OF NEWBORN'S WEIGHT IN PREGNANT WOMEN WITH PRE-ECLAMPSIA AND A FAMILY HISTORY OF PRE-ECLAMPSIA

Изобретение относится к области медицинской диагностики, может быть использовано для прогнозирования веса новорожденного у беременных женщин русской национальности, являющихся уроженками Центрального Черноземья России, с преэклампсией (далее ПЭ) и отягощенным семейным анамнезом по преэклампсии.
Антропометрические параметры (вес, рост) являются одними из ключевых показателей состояния новорожденного, которые, во-первых,  характеризуют течение прошедшей беременности  - эмбриональный рост, как известно, является важным показателем исхода беременности и отражает взаимодействие физиологических и патологических факторов, влияющих на плод в течении внутриутробного развития [Плацентарная недостаточность: Патогенез. Прогнозирование. Диагностика. Профилактика. Акушерская тактика [Текст]/ Стрижаков А.М., Липатов И.С., Тезиков Ю.В. // Самара: ООО «ОФОРТ». 2014. - 239 с.]. По данным ВОЗ среднее значение массы новорожденного составляет 3200 г. для девочек и 3300 г. для мальчиков, дети с массой менее 2500 г. считаются плодами с низкой массой при рождении [https://www.who.int/ru/]. Нередко такие осложнения беременности как плацентарная недостаточность и преэклампсия приводят к рождению маловесных детей и в ряде случаев к развитию задержки роста плода [Intrauterine Growth Restriction: Antenatal and Postnatal Aspects [Text]/ Sharma D, Shastri S, Sharma P.// Clinical Medicine Insights: Pediatrics. 2016;10:67-83.]. Во-вторых, низкий вес у новорожденных, является известным фактором риска перинатальной заболеваемости (развитие дистресс-синдрома, мекониальной аспирации, некротизирующего энтероколита и др.) и смертности [Neonatal Morbidities of Fetal Growth Restriction: Pathophysiology and Impact [Text]/ Malhotra A, Allison BJ, Castillo-Melendez M, Jenkin G, Polglase GR, Miller SL. // Front Endocrinol (Lausanne). 2019;10:55.]. В-третьих, у маловесных детей повышен риск развития различных заболеваний (сердечно-сосудистых, дислипидемии, метаболического синдрома и др.) во взрослой жизни [Intrauterine Growth Restriction: Hungry for an Answer [Text]/ Devaskar SU, Chu A.// Physiology (Bethesda). 2016;31(2):131–146.; Молекулярно-генетические и эпигенетические аспекты нарушения рецептивности эндометрия у женщин с низкой массой тела при рождении [Текст]/ Мелкозерова О.А., Башмакова Н.В., Третьякова Т.Б., Щедрина И.Д.// Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии. 2019; 18(4): 35–43].
Согласно данным литературы важное значение в формировании антропометрических характеристик новорожденного (вес, рост) имеют материнские факторы (сосудистые и метаболические заболевания, тромбофилические состояния, нарушения питания, лекарственные препараты и др.) [Fetal growth restriction: current knowledge.Nardozza [Text]/  L. M. M., Caetano, A. C. R., Zamarian, A. C. P., Mazzola, J. B., Silva, C. P., Marçal, V. M. G., et al.// Arch. Gynecol. Obstet. 2017. 295, 1061–1077] и в том числе  генетические детерминанты материнского организма [Genetic markers for inherited thrombophilia are associated with fetal growth retardation in the population of Central Russia [Text]/  Reshetnikov E, Zarudskaya O, Polonikov A, Bushueva O, Orlova V, Krikun E, Dvornyk V, Churnosov M.// J. Obstet. Gynaecol. Res.// 2017;43(7):1139-1144]. В исследованиях последних лет (в том числе выполненных на полногеномном уровне) показана связь полиморфизма ряда генов-кандидатов «материнского» генома с ростом и весом новорожденного [Genome-wide associations for birth weight and correlations with adult disease [Text]/ Horikoshi M. et al.// Nature. 2016. 538(7624): 248–252].
Из области техники известен «Способ оценки функционального состояния плода с использованием кардиотокографии» по патенту РФ № 2628240  от 15.07.2016.  Способ включает выполнение кардиотахографии и анализ полученных кардиотахограмм с определением характеристик частоты сердечного сокращения (ЧСС) и выделением одного из трех типов кардиотахограмм, соответствующих состояниям плода: нормального, подозрительного и патологического. Оценку проводят во II триместре беременности по показателям: кратковременная вариабельность сердечного ритма, долговременная вариабельность сердечного ритма, эпизоды высокой вариабельности, эпизоды низкой вариабельности, децелерации. Критерием нормального типа кардиотахограммы плода является одновременное достижение следующих нормальных значений показателей: кратковременная вариабельность сердечного ритма - не менее 3,5 мс, долговременная вариабельность сердечного ритма - не менее 37 мс, эпизоды высокой вариабельности - более 5 мин, эпизоды низкой вариабельности - не более 4 мин, децелерации - не более 3. Критерием подозрительного типа кардиотахограммы плода является отклонение от нормального значения по меньшей мере одного из показателей: эпизоды высокой вариабельности, эпизоды низкой вариабельности, децелерации. Критерием патологического типа кардиотахограммы является выявление по крайней мере одного из условий: отклонение от нормы кратковременной вариабельности сердечного ритма; отклонение от нормы долговременной вариабельности сердечного ритма; одновременно эпизоды высокой вариабельности составляют менее 5 мин, эпизоды низкой вариабельности составляют более 5 мин, децелерации более 3; одновременно эпизоды высокой вариабельности составляют 0, эпизоды низкой вариабельности составляют более 5 мин, децелерации более 3. Способ позволяет прогнозировать и выявлять во II триместре беременности патологии плода, связанные с плацентарной недостаточностью, в т.ч. задержку внутриутробного развития. Недостатками данного способа являются: 1) возможность использования только во II триместре беременности; 2) способ не включает генетические маркеры, что исключает раннюю диагностику и проведение профилактических мероприятий по предотвращению рождения маловесных детей.
За прототип выбран патент РФ № 2557952 по заявке № 2014124787/15 от 18.06.2014 «Способ прогнозирования веса новорожденного с учетом полиморфных вариантов локуса 10976 G/A FVII».  Способ включает выделение ДНК из периферической венозной крови и проведение анализа полиморфизма генов VII фактора коагуляции 10976 G/A FVII. Вес тела новорожденного при рождении прогнозируют на сроке 37 и более недель беременности у женщин русской национальности, являющихся уроженками Центрального Черноземья России. У женщин, рожающих не в первый раз, вес тела новорожденного определяют по уравнению: y=6123,431-25,579x1+0,267x2+205,739x3, где y - прогнозируемый вес новорожденного, x1- рост женщины в сантиметрах; x2- вес ребенка в предыдущих родах в граммах, x3- генетический вариант локуса 10976G/A FVII, при этом x3=1 для генотипа 10976 GG FVII, x3=2 для генотипов 10976 GA и 10976 AA FVII. У первородящих женщин вес тела новорожденного определяют по уравнению: y=6278,037-21,739x1+232,170x2, где x1- рост женщины в сантиметрах; x2- генетический вариант локуса 10976 G/A FVII, при этом x2=1 для генотипа 10976 GG FVII, x2=2 для генотипов 10976 GA и 10976 AA FVII.  Недостатком способа является невозможность прогнозирования веса новорожденного на ранних сроках беременности у женщин с ПЭ, которые относятся к группе высокого риска по рождению детей с низкой массой тела.
Задачей настоящего исследования является расширение арсенала способов прогнозирования веса новорожденного, а именно создание способа прогнозирования веса новорожденного у беременных с ПЭ и имеющих отягощенный семейный анамнез по ПЭ.
Технический результат использования изобретения – получение критериев оценки прогноза веса новорожденного у беременных русской национальности, являющихся уроженками Центрального Черноземья, имеющих преэклампсию и отягощенный семейный анамнез по ПЭ на основе данных о полиморфизме rs833061 гена VEGFA.
Поставленную задачу решает предложенный способ, включающий:
- выделение ДНК из периферической венозной крови;
- анализ полиморфизма гена фактора роста эндотелия сосудов А rs833061 VEGFA;
- прогнозирование веса новорожденного: при выявлении аллеля Т полиморфизма rs833061 гена VEGFA прогнозируется рождение плода с нормальной массой тела. При выявлении аллеля C rs833061 VEGFA прогнозируется низкая масса новорожденного.
Новизна и изобретательский уровень заключаются в том, что из уровня техники не известна возможность прогнозирования веса новорожденного у беременных с преэклампсией и отягощенным семейным анамнезом  по ПЭ с учетом полиморфизма rs833061 гена VEGFA.
Способ осуществляют следующим образом:
Выделение геномной ДНК из периферической крови осуществляют методом фенольно-хлороформной экстракции (Mathew, 1984) в два этапа. На первом этапе к 4 мл крови с ЭДТА добавляют 25 мл лизирующего буфера, содержащего 320мМ сахарозы, 1% тритон Х-100, 5 мМ MgCl2, 10 мМ трис-HCl с pH=7,6. Полученную смесь перемешивают и центрифугируют при 4°С, 4000 об./мин. в течение 20 минут. После центрифугирования надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 4 мл раствора, содержащего 25 мМ ЭДТА с рН=8,0 и 75 мМ NaCl, ресуспензируют. Затем прибавляют 0,4 мл 10% SDS, 35 мкл протеиназы К, 10 мг/мл, и инкубируют образец при 37ºС в течение 16 часов.
На втором этапе из полученного лизата последовательно проводят экстракцию ДНК равными объемами фенола, фенол-хлороформа (1:1) и хлороформа с центрифугированием при 4000 об./мин. в течение 10 минут. После каждого центрифугирования производят отбор водной фазы. ДНК осаждают из раствора двумя объемами охлажденного 96% этанола. После лиофилизации полученную ДНК растворяют в бидистиллированной, деионизованной воде и хранят при минус 200°С. Выделенную ДНК используют для проведения полимеразной цепной реакции синтеза ДНК.
Анализ полиморфизма гена фактора роста эндотелия сосудов А rs833061 VEGFA проводят методом ПЦР-синтеза ДНК на амплификаторе СFX96 (Bio-Rad) с использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров и зондов с последующим анализом полиморфизма методом дискриминации аллелей. Реакционная смесь объемом 25 мкл включает: 67 мМ трис-HCl с pH=8,8, 2,5мМ MgCl2, 0,1 мкг геномной ДНК, по 10 пМ каждого праймера, по 5 пкмоль каждого зонда, по 200 мкМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP и 1 единицу активной Taq-полимеразы. После денатурации в течение 5 мин при 95°С выполняют 40 циклов амплификации по схеме: отжиг праймеров – 1 мин. при t=54°С; денатурация – 15 сек при t=95°С. При проведении ПЦР в амплификаторе CFX96 с флюоресцентной детекцией генотипирование осуществляют методом Tag Man зондов по данным величин ОЕФ (относительные единицы флуоресценции). Для rs833061 VEGFA зонд с флуоресцентным красителем ROX соответствует аллелю С, зонд с красителем FAM – аллелю Т (фиг.1).
Генотипирование полиморфизма rs833061 гена VEGFA осуществляют методом детекции TagMan зондов по данным величин ОЕФ (относительные единицы флуоресценции) каждого зонда на амплификаторе CFX96 c детектирующей системой в режиме реального времени.
Изобретение характеризуется фигурами.
Фиг. 1. Дискриминации аллелей методом детекции TaqMan зондов по данным величин ОЕФ (относительные единицы флуоресценции) каждого зонда на амплификаторе CFX96 c детектирующей системой в режиме реального времени полиморфизма VEGFA (rs833061):    - СС,     - ТТ,   - СТ, • - отрицательный контроль.
Для изучения ассоциации полиморфного локуса rs833061 VEGFA с весом новорожденного использовался лог-линейный регрессионный анализ (рассматривались аллельная, аддитивная, рецессивная и доминантная генетические модели). Вычисления проводились в программе PLINK v. 2.050 (http://zzz.bwh.harvard.edu/plink/). Рассчитывались коэффициенты регрессии (β) и их ошибки (SE), характеризующие направленность изменения изучаемого количественного показателя (веса новорожденного) на один полиморфный генетический вариант (минорный аллель).
Возможность использования предложенного способа прогнозирования веса новорожденного у беременных с преэклампсией и отягощенным семейным анамнезом  по ПЭ подтверждает анализ результатов наблюдений 190 пациенток с преэклампсией (средний возраст 26,88±5,37 лет). В исследуемую группу включались женщины русской национальности, являющиеся уроженками Центрального Черноземья России и не имеющие родства между собой. Диагноз преэклампсия ставился на основании наличия: отеков, артериальной гипертензии и протеинурии. К критериям исключения были отнесены: заболеваниями матки (фибромиома матки, аномалии развития внутренних половых органов), другая патология беременности (аномалии прикрепления и расположения  плаценты, задержка роста плода, резус-конфликт), патологией плода (ВПР), многоплодная беременность. Клиническое и клинико-лабораторное обследование беременных проводилось на сроке родоразрешения на базе перинатального центра Белгородской областной клинической больницы Святителя Иоасафа. Соматометрия новорожденных проводилась стандартными методами. Типирование молекулярно-генетических маркеров осуществлялось в лаборатории «Молекулярной генетики человека» медицинского факультета Белгородского государственного национального исследовательского университета. Данное исследование проводилось под контролем этического комитета медицинского факультета НИУ БелГУ (от каждой женщины, включенной в исследование, было получено информированное согласие).
При проведении лог-линейного регрессионного анализа установлена ассоциация полиморфизма rs833061 гена VEGFA с весом новорожденного у женщин с преэклампсией и  отягощенным семейным анамнезом: минорный аллель Т полиморфизма rs833061 гена VEGFA достоверно связан с рождением плода с нормальной массой тела (для аллельной модели β = 0,171, p=0,003,  рperm=0,005, аддитивной модели  β = 0,176, p=0,002,  рperm=0,002, доминантной модели  β = 0,212, p=0,02,  рperm=0,02, рецессивной модели  β = 0,248, p=0,008,  рperm=0,009); референсный аллель C rs833061 VEGFA - ассоциирован с низким весом новорожденных. При наличии у женщины генотипа ТТ полиморфизма rs833061 вес новорожденного максимальный, а при определении генотипа СС – вес новорожденного минимальный.
Примеры использования предлагаемого способа.
Пример 1. У беременной женщины А., установлен диагноз:  преэклампсия средней тяжести. Из истории болезни определено наличие отягощенного семейного анамнеза. По данным молекулярно-генетического обследования выявлен генотип ТТ полиморфизма rs833061 VEGFA, что позволило отнести ее в группу беременных с низким риском рождения плода с низкой массой тела. Дальнейшее наблюдение за данной пациенткой показало, что вес новорожденного, родившегося на сроке 40-41 недель, составил 3350 грамм.
Пример 2. У беременной женщины В. установлен диагноз:  преэклампсия средней тяжести. Из истории болезни определено наличие отягощенного семейного анамнеза. По данным молекулярно-генетического обследования определен генотип СТ полиморфизма rs833061 гена VEGFA, что позволило отнести ее в группу с повышенным риском рождения плода с низкой массой тела. Дальнейшее наблюдение за данной пациенткой показало, что вес новорожденного, родившегося на сроке 38-39 недель, составил 2600 грамм.
Пример 3. У беременной женщины З. установлен диагноз: тяжелая преэклампсия. Из истории болезни определено наличие отягощенного семейного анамнеза. По данным молекулярно-генетического обследования установлен генотип СС полиморфизма rs833061 VEGFA, что позволило отнести ее в группу высокого риска рождения плода с низкой массой тела. Дальнейшее наблюдение за данной пациенткой показало, что вес новорожденного, родившегося на сроке 37-38 недель, составил 2150 грамм.
Пример 4. У беременной женщины Л. установлен диагноз:  преэклампсия средней тяжести. Из истории болезни определено наличие отягощенного семейного анамнеза.  По данным молекулярно-генетического обследования выявлен генотип СТ полиморфизма rs833061 VEGFA, что позволило отнести ее в группу беременных с повышенным риском рождения плода с низкой массой тела. Дальнейшее наблюдение за данной пациенткой показало, что вес новорожденного, родившегося на сроке 39-40 недель, составил 2500 грамм.
Таким образом, предложенный способ дает возможность прогнозирования веса новорожденного у женщин с преэклампсией русской национальности, являющихся уроженками Центрального Черноземья России и имеющих отягощенный семейный анамнез  по ПЭ, с учетом полиморфизма rs833061 гена VEGFA.
Прогнозирование рождения детей с низкой массой поможет улучшить комплекс мероприятий, направленных на профилактику и лечение данного осложнения беременности, что позволит улучшить перинатальные исходы.