ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ СИНТЕЗ L-НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

1. Способ добавления одного или нескольких L-нуклеотидов к 3′-концу первой L-нуклеиновой кислоты, включающий стадию проведения реакции одного или нескольких L-нуклеотидов с первой L-нуклеиновой кислотой в присутствии белка, содержащего фрагмент, проявляющий ферментативную активность, которая способна добавлять один или несколько L-нуклеотидов к 3′-концу первой L-нуклеиновой кислоты.
2. Способ по п. 1, в котором фрагмент, проявляющий ферментативную активность, состоит из аминокислотной последовательности, состоящей из D-аминокислот.
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что фрагмент, проявляющий ферментативную активность, является фрагментом, проявляющим полимеразную активность.
4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что полимеразная активность представляет собой активность термостабильной полимеразы.
5. Способ по п. 3, отличающийся тем, что аминокислотная последовательность фрагмента, проявляющего полимеразную активность, включает по меньшей мере 300 аминокислот.
6. Способ по п. 3, отличающийся тем, что фрагмент, проявляющий полимеразную активность, выбирают из группы, состоящей из полимеразы X вируса африканской чумы свиней, корового домена полимеразы X Thermus thermophilus, крысиной полимеразы-бета, эукариотической полимеразы-бета, фрагмента Кленова, экзополимеразы Кленова, ДНК-полимеразы Т4, ДНК-полимеразы Phi29, секвеназы, ДНК-полимеразы Т7, полимеразы SP6, ДНК-полимеразы I, полимеразы-лямбда, и вариантов всех и любой из них,
при том, что предпочтительно фрагмент, проявляющий полимеразную активность, представляет собой полимеразу X вируса африканской чумы свиней или ее вариант, состоящие из аминокислотных последовательностей, выбранных из группы, состоящей из аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 1, аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 2, аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 3, и аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 4.
7. Способ по п. 3, отличающийся тем, что фрагмент, проявляющий полимеразную активность, выбирают из группы полимеразы DPO4, ДНК-полимеразы Thermococcus litoralis, ДНК-полимеразы Pyrococcus sp., ДНК-полимеразы Pyrococcus furiosus, полимеразы Pfuturbo, ДНК-полимеразы Sulfolobus solfataricus, ДНК-полимеразы Thermococcus gorgonarius, полимеразы KOD, полимеразы Taq, полимеразы Tth, полимеразы Pyrobest, полимеразы Pwo, полимеразы Sac, полимеразы Bst, полимеразы Рос, полимеразы Pab, полимеразы Mth, полимеразы Pho, полимеразы ES4, полимеразы EX-Taq, полимеразы LA-Taq, полимераз Expand, полимераз Platinum Taq, высокоточной (Hi-Fi) полимеразы, полимеразы Tbr, полимеразы Tfl, полимеразы Tru, полимеразы Тас, полимеразы Tne, полимеразы Tma, полимеразы Tih, полимеразы Tfi, AmpliTaq, фрагмента Стоффеля, ДНК-полимеразы 9°Nm, Therminator, Therminator II, высокоточной полимеразы Phusion, Paq5000, Pfx-50, Proofstart, FideliTaq, элонгазы, и их вариантов,
при том, что предпочтительно фрагмент, проявляющий полимеразную активность, представляет собой полимеразу Dpo4 или ее вариант, состоящие из аминокислотных последовательностей, выбранных из группы, состоящей из аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 15, аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 16, аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 17, аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 18, аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 19, аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 20, аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 21, и аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 22.
8. Способ по любому из пп. 1-7, отличающийся тем, что реакция дополнительно включает вторую L-нуклеиновую кислоту, при том, что одна молекула первой L-нуклеиновой кислоты гибридизуется с одной молекулой второй L-нуклеиновой кислоты, предпочтительно, путем спаривания оснований по Уотсону-Крику.
9. Способ амплификации целевой L-нуклеиновой кислоты в присутствии L-нуклеотидов и белка, содержащего фрагмент, проявляющий ферментативную активность, в котором ферментативная активность способна амплифицировать целевую L-нуклеиновую кислоту.
10. Способ по п. 9, отличающийся тем, что фрагмент, проявляющий ферментативную активность, состоит из аминокислотной последовательности, при том, что аминокислоты аминокислотной последовательности являются D-аминокислотами.
11. Способ по п. 9, отличающийся тем, что фрагмент, проявляющий ферментативную активность, является фрагментом, проявляющим полимеразную активность.
12. Способ по п. 11, отличающийся тем, что полимеразная активность представляет собой активность термостабильной полимеразы.
13. Способ по п. 11, отличающийся тем, что аминокислотная последовательность фрагмента, проявляющего полимеразную активность, включает по меньшей мере 300 аминокислот.
14. Способ по п. 11, отличающийся тем, что фрагмент, проявляющий полимеразную активность, выбирают из группы, состоящей из полимеразы X вируса африканской чумы свиней, корового домена полимеразы X Thermus thermophilus, крысиной полимеразы-бета, эукариотической полимеразы-бета, фрагмента Кленова, экзополимеразы Кленова, ДНК-полимеразы Т4, ДНК-полимеразы Phi29, секвеназы, ДНК-полимеразы Т7, полимеразы SP6, ДНК-полимеразы I, полимеразы-лямбда и вариантов всех и любой из них,
при том, что предпочтительно фрагмент, проявляющий полимеразную активность, представляет собой полимеразу X вируса африканской чумы свиней или ее вариант, состоящие из аминокислотных последовательностей, выбранных из группы, состоящей из аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 1, аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 2, аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 3, и аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 4.
15. Способ по п. 11, отличающийся тем, что фрагмент, проявляющий полимеразную активность, выбирают из группы, состоящей из полимеразы DPO4, ДНК-полимеразы Thermococcus litoralis, ДНК-полимеразы Pyrococcus sp., ДНК-полимеразы Pyrococcus furiosus, полимеразы Pfuturbo, ДНК-полимеразы Sulfolobus solfataricus, ДНК-полимеразы Thermococcus gorgonarius, полимеразы KOD, полимеразы Taq, полимеразы Tth, полимеразы Pyrobest, полимеразы Pwo, полимеразы Sac, полимеразы Bst, полимеразы Рос, полимеразы Pab, полимеразы Mth, полимеразы Pho, полимеразы ES4, полимеразы EX-Taq, полимеразы LA-Taq, полимераз Expand, полимераз Platinum Taq, высокоточной (Hi-Fi) полимеразы, полимеразы Tbr, полимеразы Tfl, полимеразы Tru, полимеразы Тас, полимеразы Tne, полимеразы Tma, полимеразы Tih, полимеразы Tfl, AmpliTaq, фрагмента Стоффеля, ДНК-полимеразы 9°Nm, Therminator, Therminator II, высокоточной полимеразы Phusion, Paq5000, Pfx-50, Proofstart, FideliTaq, элонгазы и их вариантов,
при том, что предпочтительно фрагмент, проявляющий полимеразную активность, представляет собой полимеразу Dpo4 или ее вариант, состоящие из аминокислотных последовательностей, выбранных из группы, состоящей из аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 15, аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 16, аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 17, аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 18, аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 19, аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 20, аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 21, и аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 22.
16. Способ по любому из пп. 9-15, отличающийся тем, что использует по меньшей мере один праймер, предпочтительно, два праймера, при том, что по меньшей мере один праймер состоит из L-нуклеотидов и, необязательно, модификации.
17. Белок, содержащий фрагмент, проявляющий ферментативную активность, в котором фрагмент, проявляющий ферментативную активность, состоит из аминокислотной последовательности, при том, что аминокислоты аминокислотной последовательности являются D-аминокислотами, где ферментативная активность способна добавлять один или несколько L-нуклеотидов к 3′-концу первой L-нуклеиновой кислоты.
18. Белок по п. 17, отличающийся тем, что фрагмент, проявляющий ферментативную активность, является фрагментом, проявляющим полимеразную активность.
19. Белок по п. 18, отличающийся тем, что полимеразная активность представляет собой активность термостабильной полимеразы.
20. Белок по любому из пп. 18-19, в котором аминокислотная последовательность фрагмента, проявляющего полимеразную активность, включает по меньшей мере 300 аминокислот.
21. Белок по п. 18, отличающийся тем, что фрагмент, проявляющий полимеразную активность, выбирают из группы, состоящей из полимеразы X вируса африканской чумы свиней, корового домена полимеразы X Thermus thermophilus, крысиной полимеразы-бета, эукариотической полимеразы-бета, фрагмента Кленова, экзополимеразы Кленова, ДНК-полимеразы Т4, ДНК-полимеразы Phi29, секвеназы, ДНК-полимеразы Т7, полимеразы SP6, ДНК-полимеразы I, полимеразы-лямбда, и вариантов всех и любой из них,
при том, что предпочтительно фрагмент, проявляющий полимеразную активность, представляет собой полимеразу X вируса африканской чумы свиней или ее вариант, состоящие из аминокислотных последовательностей, выбранных из группы, состоящей из аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 1, аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 2, аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 3, и аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 4.
22. Белок по любому из пп. 18-19, отличающийся тем, что фрагмент, проявляющий полимеразную активность, выбирают из группы, состоящей из полимеразы DPO4, ДНК-полимеразы Thermococcus litoralis, ДНК-полимеразы Pyrococcus sp., ДНК-полимеразы Pyrococcus furiosus, полимеразы Pfuturbo, ДНК-полимеразы Sulfolobus solfataricus, ДНК-полимеразы Thermococcus gorgonarius, полимеразы KOD, полимеразы Taq, полимеразы Tth, полимеразы Pyrobest, полимеразы Pwo, полимеразы Sac, полимеразы Bst, полимеразы Рос, полимеразы Pab, полимеразы Mth, полимеразы Pho, полимеразы ES4, полимеразы EX-Taq, полимеразы LA-Taq, полимераз Expand, полимераз Platinum Taq, высокоточной (Hi-Fi) полимеразы, полимеразы Tbr, полимеразы Tfl, полимеразы Tru, полимеразы Тас, полимеразы Tne, полимеразы Tma, полимеразы Tih, полимеразы Tfi, AmpliTaq, фрагмента Стоффеля, ДНК-полимеразы 9°Nm, Therminator, Therminator II, высокоточной полимеразы Phusion, Paq5000, Pfx-50, Proofstart, FideliTaq, элонгазы, и их вариантов,
при том, что, предпочтительно, фрагмент, проявляющий полимеразную активность, представляет собой полимеразу Dpo4 или ее вариант, состоящие из аминокислотных последовательностей, выбранных из группы, состоящей из аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 15, аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 16, аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 17, аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 18, аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 19, аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 20, аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 21, и аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 22.
23. Полимераза, содержащая аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 15, отличающаяся тем, что аминокислоты аминокислотной последовательности являются D-аминокислотами.
24. Полимераза, содержащая аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 1, в которой аминокислоты аминокислотной последовательности являются D-аминокислотами.
25. Вариант полимеразы, являющийся полимеразой дикого типа, отличающийся тем, что полимераза дикого типа состоит из аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 15, и тем, что обладает полимеразной активностью, предпочтительно, активностью термостабильной полимеразы.
26. Вариант полимеразы по п. 25, отличающийся тем, что включает аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности полимеразы дикого типа по меньшей мере в одной аминокислотной позиции.
27. Вариант полимеразы по любому из пп. 25-26, отличающийся тем, что аминокислоты аминокислотной последовательности варианта полимеразы являются D-аминокислотами.
28. Вариант полимеразы, являющийся полимеразой дикого типа, в котором полимераза дикого типа состоит из аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 1, и обладающий полимеразной активностью.
29. Вариант полимеразы по п. 28, отличающийся тем, что вариант полимеразы включает аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности полимеразы дикого типа по меньшей мере в одной аминокислотной позиции.
30. Вариант полимеразы по любому из пп. 28-29, отличающийся тем, что аминокислоты аминокислотной последовательности варианта полимеразы являются D-аминокислотами.
31. Применение белка, содержащего фрагмент, проявляющий ферментативную активность, в способе добавления одного или нескольких L-нуклеотидов к 3'-концу L-нуклеиновой кислоты.
32. Применение белка, содержащего фрагмент, проявляющий ферментативную активность, в способе амплификации целевой L-нуклеиновой кислоты в присутствии L-нуклеотидов.
33. Применение по п. 32, отличающееся тем, что способ амплификации целевой L-нуклеиновой кислоты представляет собой полимеразную цепную реакцию.
34. Применение по любому из пп. 31-33, отличающееся тем, что белок представляет собой белок по любому из пп. 17-30, отличающийся тем, что состоит из аминокислотной последовательности, при том, что аминокислоты аминокислотной последовательности являются D-аминокислотами.
35. Способ идентификации целевой молекулы, связывающей молекулу L-нуклеиновой кислоты, включающий следующие стадии:
(a) генерирование гетерогенной популяции молекул L-нуклеиновой кислоты;
(b) введение в контакт гетерогенной популяции молекул L-нуклеиновой кислоты стадии (а) с целевой молекулой;
(c) отделение молекул L-нуклеиновой кислоты, не связанных целевой молекулой; и
(d) амплификация молекул L-нуклеиновой кислоты, связанных целевой молекулой, в котором на стадии амплификации используется белок по любому из пп. 17-30,
при том, что белок состоит из аминокислотной последовательности, состоящей из D-аминокислот.
36. Способ продуцирования белка по любому из пп. 17-30, отличающийся тем,
что:
а) два или больше фрагментов белка по любому из пп. 17-30 являются химически синтезированными, посредством чего фрагменты образуют целиком аминокислотную последовательность белка, предпочтительно, фрагменты синтезированы методом твердофазного пептидного синтеза, и
b) фрагменты стадии а) лигируют друг с другом путем сегментной конденсации, нативного химического лигирования, ферментативного лигирования или их комбинации,
при том, что белок состоит из аминокислотной последовательности, состоящей из D-аминокислот.
37. Способ лигирования первого D-пептида или первого D-белка и второго D-пептида или второго D-белка друг с другом путем ферментативного лигирования, где
первый D-пептид или первый D-белок защищен на своем N-конце защитной группой и защищен на своем С-конце 4-гуанидинофенилэфирной группой, и
второй D-пептид или второй D-белок содержит свободный N-конец и содержит тиоалкилэфирную или тиоарилэфирную группу на своем С-конце.