6,13,13-ТРИМЕТИЛ-6,8,9,12-ТЕТРАГИДРО-6,9-МЕТАНОАЗЕПИНО[2,1-b]ХИНАЗОЛИН-10(7Н)-ОН В КАЧЕСТВЕ ИНГИБИТОРА ВИРУСОВ ГРИППА А
6,13,13-TRIMETHYL-6,8,9,12-TETRAHYDRO-6,9-METHANOSEPINO[2,1-B]HINAZOLIN-10(7H)-ONE AS THE INHIBITOR OF INFLUENZA VIRUSES

Изобретение относится к химии и медицине, а именно к биологически активным веществам, конкретно к новому соединению 6,13,13-триметил-6,8,9,12-тетрагидро-6,9-метаноазепина[2,1-b]хинозалин-10(7Н)-ону формулы I (включая его пространственные изомеры, в том числе оптически активные формы):
у которого выявлена биологическая активность, заключающаяся в ингибировании репродукции вируса гриппа. Данное соединение I может использоваться в качестве ингибитора репродукции вирусов гриппа А (штаммы A/Puerto Rico/8/34 (H1N1), A/Aichi/2/68 (H3N2), A/mallard/Pennsylvania (H5N2)) и может быть использовано в медицине, вирусологии и фармакологии.
Грипп - острое заболевание с коротким инкубационным периодом, внезапным началом и циклическим течением, которое характеризуется выраженным токсикозом, поражением верхних дыхательных путей и легких. Грипп и другие респираторные вирусные инфекции являются наиболее массовыми заболеваниями. В период эпидемии болеют от 5 до 20% населения. При пандемиях, когда происходят резкие изменения свойств вируса, заболевает каждый второй человек. В настоящее время для профилактики и лечения многих заболеваний предпочтение отдается препаратам, обладающим широким спектром фармакологической активности.
Актуальность поиска средств для терапии тяжелых форм гриппа диктуется развитием предпандемической ситуации в мире и опасностью появления в человеческой популяции высокопатогенных штаммов вируса гриппа, в частности подтипа H5N1. Пандемия гриппа A(H1N1)pdm09 характеризовалась широким охватом населения многих стран мира, в том числе Российской Федерации, тяжелым клиническим течением и высокой летальностью. Неблагоприятные исходы чаще всего наблюдались не только у лиц с сопутствующими хроническими заболеваниями, но и у молодых людей без существенной предшествующей патологии, в том числе у беременных женщин. В последние годы отмечены также случаи инфицирования человека вирусами гриппа птичьего происхождения подтипов H5N1, H7N7 и H7N9. На данный момент наибольшую опасность для здоровья населения представляют собой штаммы A(H1N1)pdm09 и A(H3N2) (http://www.who.int/influenza/surveillance_monitoring/updates/en/).
Противовирусные средства для лечения гриппа представляют собой очень ограниченную группу лекарственных препаратов, причем для большинства из них известна лекарственная резистентность. Для профилактики и терапии гриппозной инфекции доступны препараты, обладающие различным механизмом действия. Международно признанными этиотропными противогриппозными препаратами являются химические соединения двух групп - производные адамантана (амантадин и ремантадин) (Scholtissek С., Quack G., Klenk H.D., Webster R.G. How to overcome resistance of influenza A viruses against adamantane derivatives // Antiviral Res. - 1998 - Vol. 37 - P. 83-95.) и ингибиторы вирусной нейраминидазы - осельтамивир (Тамифлю) и занамивир (Реленца) (De Clercq Е. Antiviral agents active against influenza A viruses // Nat Rev Drug Discov. - 2006. - Vol. 5. - P. 1015-1025). В США и Японии разработаны еще два ингибитора нейраминидазы - перамивир (Рапиакта) для внутривенного использования (Shetty А.K., Peek L.A. Peramivir for the treatment of influenza // Expert Rev. Anti Infect. Ther. - 2012. - Vol. 10. - P. 123-143), и ланинамивир (Инавир) - для ингаляционного (Vavricka C.J., Li Q., Wu Y., Qi J., Wang M., Liu Y., Gao F., Liu J., Feng E., He J., Wang J., Liu H., Jiang H., Gao G.F. Structural and functional analysis of laninamivir and its octanoate prodrug reveals group specific mechanisms for influenza NA inhibition // PLoS Pathog. - 2011. - Vol. 7. - e1002249). В России ни перамивир, ни ланинамивир не сертифицированы.
Недостатком этих препаратов является то, что вирус способен быстро вырабатывать к ним устойчивость. С середины 90-х гг., например, отмечен рост доли ремантадин-устойчивых вирусов, и на сегодняшний день практически все изоляты вируса гриппа устойчивы к препаратам адамантанового ряда - амантадину и ремантадину (Govorkova Е.А., Baranovich Т., Seiler P., Armstrong J., Burnham A., Guan Y., Peiris M., Webby R.J., Webster R.G. Antiviral resistance among highly pathogenic influenza A (H5N1) viruses isolated worldwide in 2002-2012 shows need for continued monitoring // Antiviral Res. - 2013. - Vol. 98, N2. - P. 297-304). To же было отмечено в пределах подтипа сезонного гриппа A(H1N1), когда за полтора года (с ноября 2007 по март 2009 г.) уровень устойчивости к осельтамивиру вырос с 0% до 100% во всех регионах земного шара (Dixit R., Khandaker G., Ilgoutz S., Rashid H., Booy R. Emergence of Oseltamivir Resistance: Control and Management of Influenza before, during and after the Pandemic // Infect. Disord. Drug Targets. - 2013. - Vol. 13, N1. - P. 34-45). Таким образом, разработка новых противовирусных агентов, обладающих широким спектром активности, является одной из важнейших задач медицинской химии.
Авторами предлагаемого изобретения предложен способ получения нового соединения, обладающего широким спектром противовирусной активности на основе камфорной кислоты и ароматического диамина. Наиболее близким к структуре заявляемого соединения - прототипом настоящего изобретения является дейтифорин, представляющий собой фармацевтические соли (2-(1'-аминоэтил)бицикло[2.2.1]гептана общей формулы II
Недостатком известного соединения II является многостадийный синтез и невысокая активность против пандемичного вируса гриппа A (H1N1).
Задачей изобретения является повышение эффективности подавления репродукции вируса гриппа и расширение ассортимента ингибиторов репродукции вируса гриппа, имеющих широкий спектр действия для преодоления лекарственной устойчивости современных вирусных штаммов.
Поставленная задача решается новым соединением формулы I, обладающим выраженными свойствами ингибитора репродукции вируса гриппа
Соединение формулы I перспективно далее для использования как в индивидуальном виде, так и в качестве компонента композиционных противовирусных лекарственных форм. Синтез соединения I проводили при кипячении без растворителя и катализатора эквимолярной смеси камфорной кислоты и 2-аминобензиламина. Продукт I был выделен с выходом 60%.
Исследования биологической активности соединения I, проведенные в отношении штаммов вируса гриппа А (штамм A/Puerto Rico/8/34 (H1N1), Aichi/2/68 (H3N2) и Mallard/Pennsylvania (H5N2)), показали высокую эффективность данного вещества в качестве ингибитора репродукции этих вирусов. Полученные количественные показатели ингибирования подтверждают высокую степень подавления репликации вируса гриппа в культуре клеток MDCK соединениями I, сравнимую или превышающую тот же показатель у эталонов сравнения - амантадина, ремантадина (Таблица 1). Использование в качестве препаратов сравнения адамантановых производных обусловлено наличием жестких структурных фрагментов как в полученных нами соединениях, так и в указанных препаратах. Следует отметить, что исходные соединения - камфорная кислота и о-аминобензиламин - не проявляют противовирусной активности.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами:
Пример 1.
Н
С
-1
-1
Величины удельного вращения определяли на спектрометре PolAAr 3005. Спектры ЯМР 1Н и 13С регистрировали на спектрометрах Bruker AV-400 (1Н: 400.13 МГц, 13С: 100.61 МГц), DRX-500 (1Н: 500.13 МГц, 13С: 125.76 МГц). В качестве внутреннего стандарта использовали остаточные сигналы растворителя - хлороформа (δ 7.24, δ 76.90 м.д.). Нумерация атомов в соединении I дана для отнесения сигналов в спектрах ЯМР и не совпадает с нумерацией атомов в номенклатурном названии. Масс-спектр высокого разрешения записывали на спектрометре DFS Thermo Scientific в режиме полного сканирования в диапазоне m/z 0-500, ионизация электронным ударом 70 эВ при прямом вводе образца. Хромато-масс-спектры записывали на газовом хроматографе Agilent 7890 А с квадрупольным масс-спектрометром Agilent 5975С в качестве детектора, кварцевая колонка HP-5MS 30000⋅0.25 мм, газ-носитель - гелий. Удельное вращение выражено в (град⋅мл)⋅(г⋅дм), концентрация раствора (г)⋅(100 мл).
Синтез соединения 6,13,13-триметил-6,8,9,12-тетрагидро-6,9-метаноазепино[2,1-b]хинозалин-10(7Н)-она (I).
о-Аминобензиламин 1.83 г (15 ммоль) смешали с камфорной кислотой 3 г (15 ммоль). Смесь кипятили без растворителя и катализатора с обратным холодильником при температуре 215°С, в течение 5 часов. Продукт I был выделен осаждением гексаном из насыщенного хлороформного раствора и последующей перекристаллизацией из этанола, с выходом 60%
3
3
пл
3
-1
ЯМР 1H (500.13 МГц, CDCl, δ, м.д., J/Гц): 0.98 (6Н, Н-16,Н-17, s); 1.33 (3Н, Н-15, s); 1.79 (1Н, Н-14); 2.12 (2Н, Н-13, t); 2.16 (1Н, Н-14); 2.67 (1Н, Н-11, d); 4.82 (2Н, H-7,dd); 6.87 (1H, Н-4); 7.02 (1H, Н-2); 7.2 (2Н, Н-1, Н-3). ЯМР 13С (CDCl, δ, м.д.): 176.8 (С-12); 156.6 (С-8); 128.3 (С-5); 126.1 (С-1); 125.7 (С-3); 125.4 (С-2); 121.4 (С-4); 121.1 (С-6); 55.1 (С-11); 54.4 (С-7); 43.2 (С-10); 42.3 (С-9); 35.0 (С-13); 26.7 (С-14); 21.8 (С-17); 19.13 (С-16); 13.9 (С-15). Т=96,1°С (скорость нагрева 5°С/мин).  (CDCl, с=1,014 г/100 мл). ИК (KBr, cm): 2964.19 (С-Н st); 1695.2 (С=O st); 1614.2 (C=N st); 1380.85 (C=N st); 1315.28 (C-O st); 784.92 (C-H δ oop). Найдено, %: С (75,95), H (7,43), N (10,39); Вычислено, %: С (76,09), Н (7,51), N (10,44), О (5,96).
Пример 2.
Изучение цитотоксичности соединения I.
2
2
50
Цитотоксичность продуктов была изучена в отношении клеток MDCK. Клетки MDCK сеяли в 96-луночные планшеты и культивировали при 37°С в среде MEM с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота в атмосфере 5% СО (в газопроточном инкубаторе Sanyo-175) до состояния монослоя. Из исследуемого соединения I готовили маточный раствор концентрации 10 мг/мл в диметилсульфоксиде, после чего готовили серию двукратных разведений препаратов в среде MEM от 1000 мг/мл до 3,75 мг/мл. Растворенный препарат вносили в лунки планшетов и инкубировали 2-е суток при 37°С. По истечении этого срока клетки промывали 2 раза по 5 минут фосфатно-солевым буфером, и количество живых клеток оценивали при помощи микротетразолиевого теста (МТТ). С этой целью в лунки планшетов добавляли по 100 мкл раствора (5 мг/мл) 3-(4,5-диметилтиазолил-2) 2,5-дифенилтетразолия бромида (ICN Biochemicals Inc., Aurora, Ohio) на физиологическом растворе. Клетки инкубировали при 37°С в атмосфере 5% СО в течение 2 часов и промывали 5 минут фосфатно-солевым буфером. Осадок растворяли в 100 мкл на лунку ДМСО, после чего оптическую плотность в лунках планшетов измеряли на многофункциональном ридере Victor 1420 (Perkin Elmer, Finland) при длине волны 535 нм. По результатам теста определяли 50% цитотоксическую дозу (СС), т.е. концентрацию соединения, вызывающую гибель 50% клеток в культуре. Результаты приведены в таблице 1.
Пример 3.
Изучение противовирусной активности препарата.
2
Определение противовирусной активности препаратов проводили на клетках MDCK в 96-луночных планшетах для клеточных культур. Соединение растворяли в поддерживающей среде для клеток, вносили в лунки панелей с клеточным монослоем и инкубировали в течение 1 часа при 36°С в атмосфере 5% СО.
-1
-7
2
50
50
50
Из вируссодержащей жидкости (штаммы A/Puerto Rico/8/34 (H1N1), A/Aichi/2/68 (H3N2), A/mallard/Pennsylvania (H5N2)) готовили серию десятикратных разведений от 10 до 10, добавляли в лунки с препаратами и инкубировали при 36°С в течение 48 часов в атмосфере 5% СО. По окончании срока инкубации 100 мкл культуральной жидкости смешивали с равным объемом 1% куриных эритроцитов в отдельных планшетах с круглым дном. Учет результатов проводили через 60 минут инкубации при 20°С. За титр вируса принимали величину, обратную десятичному логарифму наибольшего разведения исходного вируса, способного вызвать положительную реакцию гемагглютинации в лунке. Вирусингибирующее действие исследуемых соединений оценивали по снижению титра вируса в опыте по сравнению с контролем. На основании полученных данных рассчитывали 50% ингибирующую дозу IC, то есть концентрацию препарата, снижающую уровень вирусной репродукции вдвое по сравнению с контролем, и химиотерапевтический индекс, или индекс селективности (SI), представляющий собой отношение СС к IC.
В процессе исследования ингибирования репродукции вируса гриппа соединениями I и эталонами сравнения (амантадином, ремантадином и дейтифорином) были получены результаты, приведенные в таблице 1.