Оценка противоопухолевой активности веро- анастразола на экспериментальных моделях животных с перевиваемыми опухолями рака яичников и рака эндометрия

оценка противоопухолевой активности веро-анастразола на экспериментальных моделях животных с перевиваемыми опухолями рака яичников

И РАКА ЭНДОМЕТРИЯ

УДК 615.2

© А. С. Лисянская12, Г. М. Манихас12, Н. И. Тапильская2, С. В. Степанов3

1 Санкт-Петербургскийгосударственный медицинский университет им. акад. И. П. Павлова, Санкт-Петербург, Россия;

2 Санкт-Петербургский городской онкологический диспансер;

3 Институт токсикологии ФМБА России

Ключевые слова:

веро-анастрозол; доклинические исследования; противоопухолевое действие.

Резюме:

На сегодняшний день согласно проспективным исследованиям ингибиторы, ароматазы являющиеся препаратами первой линии в лечении рака молочной железы, находят свое применение в лечении распространенного рака яичников и рака эндометрия. В статье на модели животных продемонстрирован противоопухолевый эффект отечественного препарата веро-анастразола, по химической структуре являющегося ингибитором ароматазы третьего поколения.

Библиографическая ссылка:

Лисянская А. С., Манихас Г. М., Тапильская Н. И., Степанов С. В. Оценка противоопухолевой активности веро-анастразола на экспериментальных моделях животных с перевиваемыми опухолями рака яичников и рака эндометрия // Обзоры по клин. фармакол. и лек. терапии. — 2010. — Т.8. — № 4. — С.48-53.

Создание и внедрение в клиническую практику ингибиторов ароматазы третьего поколения с принципиально новыми фармакологическими эффектами является предпосылкой для формирования

новой стратегии лекарственной терапии не только рака эндометрия, но и рака яичников. На сегодняшний день опубликованы обнадеживающие результаты ряда клинических исследований использования ингибиторов ароматазы в лечении распространенного рака яичников и рака эндометрия [13, 14].

Основной целью данного исследования явилось экспериментальное сравнительное изучение противоопухолевой активности ингибитора ароматазы третьего поколения анастразола (препарата веро-анастрозол производства ООО «ЛЭНС-Фарм») на моделях рака яичников и рака эндометрия.

материалы и методы

Исследование проведено на базе лаборатории доклинических исследований ФГУН «Институт токсикологии» ФМБА России, г. Санкт-Петербург

Штаммы опухолевых клеток рака эндометрия, а также штамм опухолевых клеток рака яичников получены из НИИ онкологии им. проф. Н. Н. Петрова МЗиСР РФ (г. Санкт-Петербург). Клеточные культуры транспортировали и хранили при температуре жидкого азота. Пассаж опухолевых клеток для их активации при подготовке основного эксперимента проводился на 6 животных. Перед исследованием животных подвергали десятидневному карантину. В исследовании использованы мыши линии С57BL/6j, полученные из питомника «Рапполово» РАМН (Ленинградская область) [1, 2].

Таблица 1. Описание экспериментальных групп

Название группы Количество животных в группе Инокуляция опухолевых клеток Введение исследуемых или референтных веществ

Контрольная 10 + Дистиллированная вода

Веро-анастрозол 10 + Веро-анастрозол

Веро-тамоксифен 10 + Веро-тамоксифен

Таблица 2. Схема описания эксперимента

Название группы Количество животных в группе Инокуляция опухолевых клеток Введение исследуемых или референтных веществ

Контрольная 10 + Дистиллированная вода

Веро-анастрозол 10 + Веро-анастрозол

Мегейс 10 + Мегейс

В исследовании тест-системой являлись животные с перевитой опухолью. Использованы следующие тест-системы: мыши линии С57Ы^ с перевитыми клетками рака яичников, возраст мышей 6-8 недель, масса 19-25 г. Мыши самцы линии С57 Ы/6] с перевитыми клетками рака эндометрия, возраст мышей 6-8 недель, масса 19-25 г

Модель рака яичников

Культуру опухолевых клеток рака яичников, хранящуюся при температуре жидкого азота, размораживали и разводили в стерильном растворе Хенкса до концентрации 5 х 105 клеток/мл. 0,2 мл полученной суспензии, содержащей 105 клеток, инокули-ровали внутрибрюшинно 6 мышам линии С57Ы^. На 9-й день пассажа опухолевых клеток проводили выборочную оценку количества образовавшейся в организме асцитной жидкости. Случайным образом выбирали животное, умерщвляли его и из брюшной полости извлекали с помощью шприца 2 мл асцитной жидкости. День получения асцитной жидкости считался днем исследования «0», то есть днем начала проведения основного эксперимента [5, 10, 11].

Асцитную жидкость, полученную от животного после пассажа опухолевых клеток, разводили стерильным раствором Хенкса до концентрации 5 х 105 клеток/мл. В день исследования «0» животным контрольной и экспериментальной группы провели внутрибрюшинную инъекцию суспензии опухолевых клеток. Доза инокулюма — 105 клеток на мышь и объем инъекции — 0,2 мл на мышь. Инъекции осуществлялись одноразовыми шприцами (табл. 1).

Модель рака эндометрия

Культуру опухолевых клеток рака эндометрия, хранящуюся при температуре жидкого азота, размораживали и разводили в стерильном растворе

Хенкса до концентрации 3,5 х 106 клеток / 0,1 мл. Затем ее вводили мышам под кожу правого бока в стерильном физиологическом растворе. На 10-й день пассажа опухолевых клеток в стерильных условиях были взяты опухоли от 2 мышей и проведена перевивка мышам для основного эксперимента. Опухолевая ткань в стерильных условиях измельчалась и смешивалась ручным способом в стеклянном тканевом гомогенизаторе, готовилась 10% взвесь опухолевых клеток в стерильном физиологическом растворе. Перевивку опухоли осуществляли под кожу правого бока по 0,2 мл взвеси опухолевых клеток на мышь, содержащей 3,5 х 106 опухолевых клеток (табл. 2). Инъекции осуществлялись одноразовыми шприцами [3, 4, 6-10].

постановка опытов, исследуемые препараты

Препарат веро-анастрозол, таблетки 1 мг (ООО «ЛЭНС-Фарм», Россия), серия 21208, годен до 01.2011 г.

Препараты сравнения: мегейс, таблетки 160 мг, серия 924921, годен до 08.2011 г.; веро-тамоксифен, таблетки 10 мг, серия 241108, годен до 11.2010 г.

День перевивки опухоли считался днем окончания пассажа и являлся днем исследования «0». Рандомизация животных и их индивидуальная метка проводилась на следующий день после перевивки, считавшийся днем исследования «1». Было сформировано 3 экспериментальных группы животных:

1. Контрольная группа с перевивкой опухолевых клеток — 10 мышей.

2. Группа с перевивкой опухолевых клеток и получающих веро-анастрозол 20 мг/кг — 10 мышей.

3. Группа с перевивкой опухолевых клеток и получающих препарат стандартной терапии — 10 мышей.

Название группы N животного и его продолжительность жизни в днях

1 2 3 4 5 6 7 B 9 10

Контроль 12 14 11 15 13 13 14 11 12 12

Bеро-анастрозол 24 21 25 22 23 23 21 23 20 22

Bеро-тамоксифен 21 25 22 25 21 20 23 24 23 21

Таблица 4. Влияние веро-анастрозола на среднюю продолжительность жизни животных с перевиваемой опухолью яичников

Название группы СПЖ в днях, M±m УПЖ, %

Контроль 12,6 ± 0,31

Bеро-анастрозол 22,4 ± 0,36* 76,3

Bеро-тамоксифен 22,5 ± 0,26* 77,1

Примечание. *р < 0,05 от контроля.

B контрольной группе № 1 животным с 1-го дня после перевивки опухоли и до конца эксперимента ежедневно вводили аналогичные по объемам количества растворителя — дистиллированной воды.

Исследуемое вещество веро-анастрозол вводили внутрижелудочно (в/ж) через атравматичный металлический зонд ежедневно, начиная с 1 дня после инокуляции опухолевых клеток в дозе 0,1 мг/кг в пересчете на анастрозол 1 раз в сутки.

Препарат веро-тамоксифен вводили внутриже-лудочно (в/ж) через атравматичный металлический зонд ежедневно, начиная с 1-го дня после инокуляции опухолевых клеток, в дозе 1 мг/кг в пересчете на тамоксифен 2 раза в сутки.

Препарат мегейс вводили внутрижелудочно (в/ж) через атравматичный металлический зонд в 1 день после инокуляции опухолевых клеток в дозе 5 мг/кг однократно в пересчете на мегестрола ацетат.

оценка результатов

Оценку противоопухолевого действия проводили на основании оценки накопления асцита по регистрации прибавки веса животных и продолжительности жизни животных. При оценке продолжительности жизни животных последним днем жизни считался предыдущий день перед днем гибели. Процент увеличения продолжительности жизни животных вычислялся по формуле:

СПЖ опыт — СПЖ контроль УПЖ = -------------------------- х 100 %.

СПЖ контроль Полученные экспериментальные данные были обработаны статистически с помощью пакета стандартных программ для персонального компьютера.

Рассчитывали среднее арифметическое значение и стандартную ошибку среднего. Сравнение между группами проводили с помощью ^критерия Стью-дента и критерия х2.

результаты исследования

Проведена оценка влияния препарата веро-анастрозол на динамику накопления асцитической жидкости в качестве показателя опухолевой прогрессии и среднюю продолжительность жизни на модели опухолевого процесса, индуцированного введением в организм мышей клеток рака яичников (РЯ).

Результаты влияния препарата веро-анастрозол на развитие рака яичников представлены в табл. 3.

В таблице приведена средняя продолжительность жизни животных с перевиваемыми опухолями рака яичников и контрольной группы, а также данные увеличения продолжительности жизни по сравнению с контрольной группой в %.

Как видно из табл. 4, средняя продолжительность жизни мышей контрольной группы с перевитыми опухолевыми клетками яичников составила 12,6 ± 0,31 дня. Введение веро-анастрозола достоверно увеличило продолжительность жизни мышей до 22,4 ± 0,36 дня, процент увеличения продолжительности жизни по сравнению с контролем составил 76,3 % для веро-анастрозола; введение веро-тамоксифена достоверно увеличило продолжительность жизни мышей до 22,5 ± 0,26 дня, процент увеличения продолжительности жизни по сравнению с контролем составил 77,1%, однако различия между опытными группами оказались статистически недостоверными.

День Контрольная группа Веро-анастрозол Веро-тамоксифен

Средняя прибавка веса, М ± т, % Средняя прибавка веса, М ± т, % % торможения по сравнению с контролем Средняя прибавка веса, М ± т, % % торможения по сравнению с контролем

1 0,4 ± 0,2 0,3 ± 0,2 0,3 ± 0,1

2 0,8 ± 0,2 0,7 ± 0,2 0,8±0,3

3 5,0 ± 0,4 2,2±0,2* 56,00 2,1±0,3* 58,00

4 11,6 ± 1,2 4,1 ± 1,1* 64,66 4,4 ± 1,2* 62,07

5 15,8 ± 2,1 8,3±1,1* 47,47 8,1±1,0* 48,73

6 20,1 ± 2,0 11,5 ± 1,5* 42,79 12,4 ± 1,6* 38,31

7 25,8 ± 1,6 13,2 ± 1,8* 48,84 14,1 ± 2,1* 45,35

14 33,4 ± 1,1 17,8 ± 1,2* 46,72 18,5 ± 1,4* 44,61

Примечание. *р < 0,05 от контроля.

Таблица 6. Влияние веро-анастрозола на продолжительность жизни мышей с перевиваемым раком эндометрия

Название группы N животного и его продолжительность жизни в днях

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Контроль 26 29 21 24 25 20 29 28 24 27

Веро-анастрозол 47 42 51 48 42 43 47 47 46 45

Мегейс 45 49 43 44 48 47 48 50 42 39

Таблица 7. Влияние веро-анастрозола на среднюю продолжительность жизни животных с перевиваемым раком эндометрия

Название группы СПЖ в днях, М ± т УПЖ, %

Контроль 25,3 ± 0,99

Веро-анастрозол 45,80 ± 0,90* 81,1

Мегейс 45,70 ± 1,11* 79,8

Примечание. *р < 0,05 от контроля.

В процессе эксперимента проводилось ежедневное взвешивание животных с целью оценки накопления асцита и изучения сравниваемых препаратов на данный процесс. Результаты оценки прибавки веса представлены в табл. 5.

Как видно из табл. 5, веро-анастрозол достоверно уменьшал накопление асцита у мышей с перевитыми опухолями яичников. Прибавка веса тела у мышей, получавших исследуемый препарат, была достоверно меньше, чем в контрольной группе (38-64 %).

Таким образом, полученные результаты позволяют сделать заключение о том, что веро-анастрозол проявляет выраженное противоопухолевое действие и тормозит рост опухолевых клеток рака яичников у мышей, что проявилось в достоверном увеличении продолжительности жизни и достоверном торможении накопления асцита экспериментальных животных. Признаков интоксикации на фоне введения исследуемого препарата не зарегистрировано.

Проведена оценка влияния веро-анастрозола на среднюю продолжительность жизни препарата на

модели опухолевого процесса, индуцированного введением в организм мышей клеток рака эндометрия.

Результаты влияния веро-анастрозола на развитие рака эндометрия представлены в табл. 6.

В табл. 7 приведена средняя продолжительность жизни животных с перевиваемыми опухолями раком эндометрия и контрольной группы, а также данные увеличения продолжительности жизни по сравнению с контрольной группой в процентах.

Как видно из таблицы 7, средняя продолжительность жизни мышей контрольной группы с перевитыми опухолевыми клетками раком эндометрия составила 25,3 ± 0,99 дня. Введение веро-анастрозола достоверно увеличило продолжительность жизни мышей до 45,80 ± 0,90 дня, процент увеличения продолжительности жизни по сравнению с контролем составил 81,1% для веро-анастрозола. Введение препарата мегейс достоверно увеличило продолжительность жизни мышей до 45,70 ± 1,11 дня, процент увеличения продолжительности жизни по срав-

День Контрольная группа Bеро-анастрозол Мегейс

Средняя прибавка веса, М ± m, % Средняя прибавка веса, М ± m, % % торможения по сравнению с контролем Средняя прибавка веса, М ± m, % % торможения по сравнению с контролем

1 0,3 ± 0,2 0,2 ± 0,1 0,4 ± 0,1

2 0,7 ± 0,2 0,6 ± 0,2 0,7 ± 0,2

3 4,B±0,6 2,3 ± 0,4* 52,0B 2,6 ± 0,5* 45,B3

4 10,9 ± 1,5 5,4±1,2* 50,46 4,9±1,6* 55,05

5 16,3 ± 1,B 7,6 ± 1,4* 53,99 B,5±1,5* 47,B5

6 23,5± 1,7 12,6 ± 1,2* 46,3B 13,B ± 1,7* 41,2B

7 27,9±1,5 15,3 ± 1,5* 45,16 15,B ± 1,7* 43,37

14 34,3 ± 1,1 1B,4 ± 1,2* 46,36 17,5 ± 1,5* 4B,B6

21 3B,3 ± 1,5 21,2 ± 1,4* 44,65 20,5 ± 1,3* 46,42

Примечание. * р < 0,05 от контроля.

нению с контролем составил 79,8 % для препарата мегейс.

Как видно из табл. 8 веро-анастрозол достоверно уменьшал накопление асцита у мышей с перевитыми опухолями рака эндометрия. Прибавка веса тела у мышей, получавших исследуемый препарат, была достоверно меньше, чем в контрольной группе (41-55 %).

Таким образом, полученные результаты позволяют сделать заключение о том, что веро-анастрозол проявляет выраженное противоопухолевое действие и тормозит рост опухолевых клеток раком эндометрия у мышей, что проявилось в достоверном увеличении продолжительности жизни и достоверном торможении накопления асцита экспериментальных животных. Признаков интоксикации на фоне введения исследуемого препарата не зарегистрировано. Исходя из вышеизложенного возможно проведение клинических исследований эффективности анастрозола в лечении рака яичников и рака эндометрия.

Литература

1. Анисимов В. Н. Спонтанные опухоли у крыс различных линий // Вопр. онкологии. — 1976. — № 8. — С. 98-110.

2. Анисимов В. Н., Александров В. А., Климашевский В. Ф. и др. Спонтанные опухоли у крыс разводки питомника «Рапполово» АМН СССР // Вопр. онкологии. — 1978. — № 1. — С. 64-70.

3. Бейли Н. Статистические методы в биологии. — М.: Мир, 1963. — 271 с.

4. Иоганнсен М. Г., Романов А. Н., Романов К. П. Онкологическая характеристика белых беспородных крыс разводки НИИ онкологии им. проф. Н. Н. Петрова Минздрава СССР // Вопр. онкологии. — 1982. — № 12. — С. 75-46.

5. Методические указания по изучению противоопухолевой активности действия фармакологических ве-

ществ // Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. — М.: Ремедиум, 2005.

6. ШеффеГ. Дисперсионный анализ. — М.: Наука, 1980. — 519 с.

7. Gart J. J., Krewski D., Lee P. N., Tarone R. E., Wahren-dorf J. Statistical methods in cancer research // IARC Sci. Publ. №79. — Lyon: IARC, 1986.

8. Guideline for the format and content of nonclinical pharmacology/toxicology section of the application. — U.S. Dept. of health and human services: U.S. government printing office, 1987. — 27 p.

9. Nonclinical laboratory studies // GLP Federal Registered. 43, 247. — 1978. — P. 59986-60024.

10. Pathology of tumors in laboratory animals. Vol.1. Tumours of rat. 2nd ed. / Ed. by Y. S.Turusov, U. Mohr // IARC Sci. Publ. № 99. — Lyon: IARC, 1990.

11. Pathology of tumors in laboratory animals. Vol.2. Tumours of the mouse / Ed. by V. S. Turusov // IARC Sci. Publ. № 23. — Lyon: IARC, 1979.

12. Rose P. G., Brunetto V. L., Van Le L. et al. A Pase II trial of anastrasole in advanced reccurent or persistent endometrial carcinoma: a gynecologic oncology group study // Gy-nec. Oncol. — 2000. — Vol. 78. — P. 212-216.

13. Burnett A. F., Bahador A., Amezcua C. Anastrazole, an aromatase inhibitor, and medroxyprogesterone acetate therapy in premenopausal obese women with endometrial cancer: a report of two cases susccesfuly treated without hysterectomy // Gynecol. Oncol. — 2004. — Vol. 94. — P. 832-834.

14. Zheng H., Kavanagh J. J., Hu W. et al. Hormonal therapy in ovarian cancer // Int. J. Gynecol. Cancer. — 2007. — Vol. 17. — P. 325-338.

EvALuATioN oF ANTiTuMoR ACTiviTY oF vERo-anastrazol in experimental animal models with passed tumors of ovarian cancer and endomenrial cancer

Lisyanskaya A. S., Manihas G. M., Tapilskaya N. I., Stepanov S. V.

♦ Summary: According to prospective investigations, the aromatase inhibitors are the drugs of the first line in treatment of breast cancer. Today they are used in therapy of

both persistent ovarian cancer and endomentrial cancer too. In the paper, an antitumor effect of the Russian drug vero-anastrazol, an aromatase inhibitor of the third generation on its structure, is demonstrated in the experimental models in mice with passed tumors.

♦ Key words: vero-anastrazol; preclinical investigations; antitumor effect.

♦ Информация об авторах

Лисянская Алла Cергеевна — к. м. н., доцент кафедры онкологии, заведующая отделением Санкт-Петербургского городского онкологического диспансера.

Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И. П. Павлова.

197022, Санкт-Петербург, ул. Льва Толстого, 6/B.

E-mail: tapnatalia@yandex.ru

Манихас Георгий Моисеевич — д. м. н., заведующий кафедрой онкологии.

Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И. П. Павлова.

197022, Санкт-Петербург, ул. Льва Толстого, 6/B.

E-mail: tapnatalia@yandex.ru

Тапильская Наталья Игоревна — д. м. н., профессор кафедры акушерства и гинекологии.

Санкт-Петербургская государственная педиатрическая медицинская академия.

194100, Санкт-Петербург, ул. Литовская, 2.

E-mail: tapnatalia@yandex.ru

Степанов Сергей Владимирович — к. м. н., с. н. с.

Институт токсикологии ФМБА России.

195002, Санкт-Петребрург, ул. Бехтерева, 1.

E-mail: tapnatalia@yandex.ru

Lisyanskaya Алла Оергеевна — PhD.

P. Pavlov State Medical University. 197089, St. Petersburg, Lev Tolstoy st., 6/8.

E-mail: tapnatalia@yandex.ru

Manihas Георгий Моисеевич — Doctor of Medical Sciences, head of the Oncology department.

I. P. Pavlov State Medical University. 197089, St. Petersburg, Lev Tolstoy st., 6/8.

E-mail: tapnatalia@yandex.ru

Tapilskaya Natal'ya Igorevna — Doctor of Medical Sciences, professor.

Saint-Petersburg State Pediatric Medical Academy.

194100, St.Petersburg, Litovskaya str., 2.

E-mail: tapnatalia@yandex.ru

Stepanov Sergey Vladimirovich — PhD, the senior researcher. Institute of toxicology.

Behtereva st., 1, St.Petersburg, Russia, 195002.

E-mail: tapnatalia@yandex.ru