ОДНОВАЛЕНТНЫЕ АСИММЕТРИЧНЫЕ БИСПЕЦИФИЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА С ТАНДЕМНЫМ FAB
MONOVALENT ASYMMETRIC BISPECIFIC ANTIBODIES WITH TANDEM FAB

Область изобретения
Настоящее изобретение относится к сконструированным биспецифическим антителам, их композициям и способам изготовления и применения таких биспецифических антител.
Уровень техники
В течение последних пятидесяти лет попытки конструирования новых форм антител привели к демонстрации и существованию различных биспецифических и полиспецифических связывающих форматов. Различные форматы включают, например, одноцепочечные Fv-антитела (scFv, Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5879-5883 (1988)), четырехвалентные гибриды IgG-scFv (Coloma and Morrison, Nat. Biotechnol., 15: 159-163 (1997)), диатела (Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)), тандемные scFv-молекулы (см., например, Bargou et al., Science 321, 974-977 (2008)), четырехвалентные IgG-подобные антитела с двойным вариабельным доменом («DVD-Ig», Wu et al., Nat. Biotechnol., 25: 1290-1297 (2007)), четырехвалентные иммуноглобулины «Fab в тандеме» («FIT-Ig»), (WO 2015/103072, Epimab Biotheraupeutics), двухвалентные гибридные биспецифические IgG крысы/мыши (Lindhofer et al., J. Immunol., 155: 219-225 (1995)) и биспецифические кросс-МАТ связывающие белки, (см., например, WO 2013/026831 (Roche Glycart AG); WO 2014/167022 (Engmab AG)). Особый интерес для возможного применения в лечении заболеваний представляет конструирование и получение различных сконструированных биспецифических антител, способных связывать два различных эпитопа или антигена, тем самым устраняя необходимость применения комбинированных терапевтических средств. См., например, обзоры Spiess et al., Molec. Immunol., 67: 95-106 (2015), Riethmüller, Cancer Immun., 12: 12-18 (2012), Kontermann, Acta Pharmacologica Sinica, 26 (1): 1-9 (2005), Marvin et al., Acta Pharmacologica Sinica, 26(6): 649-658 (2005).
Растет интерес к разработке биспецифических антител для лечения различных видов рака. Особый интерес представляет потенциальное применение биспецифических антител для перенацеливания Т-клеток с целью уничтожения различных опухолевых клеток. В примере такого подхода по «перенацеливанию Т-клеток» можно сконструировать биспецифическое антитело, связывающееся с антигеном на поверхности раковой клетки-мишени, а также с активирующим компонентом Т-клеточного рецепторного (TCR) комплекса на незрелой Т- клетке, например, CD3. Одновременное связывание биспецифического антитела с клетками обоих типов обеспечивает временную связь (межклеточный синапс) между клеткой-мишенью и Т-клеткой, что приводит к активации цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL), атакующих раковые клетки-мишени. Таким образом, Т-клетки искусственно перенацеливаются на специфические раковые клетки-мишени независимо от презентации пептидного антигена клеткой-мишенью или специфичности Т-клетки, обычно необходимых для MHC-ограниченной активации CTL. В данном контексте особенно важно, что CTL активируются только при презентации им биспецифического антитела леткой-мишенью, т.е. при имитации иммунологического синапса, а не просто при связывании антитела с антигеном Т-клетки.
Формат биспецифического антитела, к которому сохраняется интерес в рамках перенацеливания Т-клеток на опухолевые клетки, представляет собой «биспецифический активатор Т-клеток» или «BiTE»-антитело, например, содержащее два scFv-антитела, связанные стандартным глицин-сериновым (G4S) линкером, причем один scFv-фрагмент содержит сайт связывания опухолевого антигена (например, опухолевого антигена 17-1A), а другой scFv-фрагмент - сайт связывания антигена CD3 на Т-клетке (Mack et al., Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 92: 7021-7025 (1995)). Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) одобрило применение BiTE-антитела против CD3 × против CD19, блинатумомаба, для лечения редкой формы B-клеточного острого лимфобластного лейкоза (ОЛЛ). Другими форматами биспецифических антител, исследуемыми с точки зрения возможного применения для перенацеливания Т-клеток на присоединение к раковым клеткам, являются четырехвалентные тандемные диатела («TandAb,» Kipriyanov et al., J. Mol. Biol., 293: 41-56 (1999); Arndt et al., Blood, 94: 2562-2568 (1999)) и перенацеливающие белки с двойной аффинностью («DART», Johnson et al., J. Mol. Biol., 399: 436-449 (2010)). Кроме того, биспецифические антитела исследуют для ия применения в перенацеливании цитотоксических эффекторных клеток, например, NK-клеток и макрофагов, на опухолевые клетки (например, статья Weiner et al., Cancer Res., 55: 4586-4593 (1995).
В настоящее время неясно, какой подход к применению для перенацеливания Т-клеток или других клеток на раковые клетки является предпочтительным в лечении субъекта-человека. Например, активация Т-клеток может стимулировать интенсивное и продолжительное высвобождение цитокинов. Такой «цитокиновый шторм» может оказывать вредоносное влияние не только на местные ткани, но и в целом на пациента. Соответственно, способы перенацеливания Т-клеток или других клеток с целью лечения рака может включать одно или более поэтапных действий, выполняемых in vitro, ex vivo или in vivo.
Во многих биспецифических форматах, например, BiTE, диателах, DART и TandAb, используется одноцепочечный формат связывания различных вариабельных доменов пептидными линкерами для достижения двойной специфичности. Поскольку эти форматы не содержат Fc-области, они обычно обладают крайне небольшим временем полужизни in vivo и являются физически нестабильными (Spiess et al. (2015), op. cit.). Обычно Fc-содержащие биспецифические форматы конструируют с учетом увеличения периода полужизни; кроме того, они могут обеспечивать эффекторную функцию Fc. Ряд таких Fc-содержащих биспецифических форматов используют технологию «выступ-во-впадину» («KiH») (Ridgway et al, Protein Eng., 9: 617-621 (1996)) для улучшения сборки и стабильности Fc-области, а также для стимуляции гетеродимеризации между CH3-доменами тяжелых цепей двух различных антител, что приводит к образованию двусторонне гетерогенного биспецифического антитела, хотя у некоторых форматов могут быть и другие проблемы, например, возможность неправильного спаривания легких цепей. Неправильное спаривание легких цепей может привести к неэффективной продукции заданного формата. Соответственно, в ходе попыток решения этой проблемы разработано большое количество различных форматов.
Как очевидно из вышеприведенного обсуждения, существует широкий спектр форматов биспецифических антител, разработанных и изученных в качестве возможных форматов для разработки новых терапевтических антител. В то же время на данный момент не существует ни одного формата, обладающего исчерпывающим набором свойств, которые делали бы его пригодным для разработки новых терапевтических антител для лечения большинства заболеваний. С учетом растущего количества возможных вариантов применения биспецифических связывающих белков и различных результатов, ассоциированных с существующими в нестоящее время форматами, по-прежнему существует потребность в разработке улучшенных форматов, которые можно было бы сконструировать для решения конкретных проблем, связанных с разработкой антител для лечения конкретных заболеваний.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение позволяет удовлетворить вышеуказанную потребность, обеспечивая биспецифические антитела на основе тандемно соединенных Fab, сконструированные для связывания двух различных эпитопов, присутствующих в одном и том же антигене-мишени или в двух различных антигенах-мишенях. Биспецифическое антитело согласно настоящему изобретению содержит две единицы Fab, причем каждая единица Fab связывает только один из эпитопов или антигенов, связываемых антителом, и называется «одновалентным асимметричным биспецифическим антителом с тандемным Fab» или «биспецифическим антителом MAT-Fab» или просто «антителом MAT-Fab». Биспецифическое антитело MAT-Fab согласно настоящему изобретению является одновалентным (один сайт связывания) по отношению к каждому из двух различных эпитопов или двух различных антигенов, связываемых антителом MAT-Fab. Биспецифическое антитело MAT-Fab согласно настоящему изобретению представляет собой тетрамерный белок, содержащий: «тяжелую полипептидную цепь» (или «тяжелую цепь MAT-Fab»), «Fc-полипептидную цепь» (или «Fc-цепь MAT-Fab»)и две различные легкие цепи («первую легкую цепь MAT-Fab» и «вторую легкую цепь MAT-Fab»).
Fab-фрагмент иммуноглобулина состоит из двух компонентов, ковалентно связанных с образованием сайта связывания антитела. Каждый из этих двух компонентов представляет собой цепь «вариабельный домен-константный домен» (VH-CH1 или VL-CL), и поэтому каждую цепь V-C Fab можно описать как «половину» связывающей единицы Fab. Тяжелая цепь антитела MAT-Fab содержит половину первой и половину второй единицы Fab (V-C), соединенные в виде тандема, за ними располагается Fc-область, содержащая шарнирную область, CH2-домен и C-концевой CH3-домен. Fc-цепь MAT-Fab содержит N-концевую шарнирную область, присоединенную к CH2-домену, который, в свою очередь, присоединен к С-концевому CH3- домену в таком же порядке, как в природной молекуле IgG. В то же время Fc-цепь биспецифического антитела MAT-Fab согласно настоящему изобретению не содержит фрагментов Fab-единиц или любых других функциональных доменов, присоединенных к N- концевой шарнирной области или С-концевому CH3-домену, что важно для образования функциональных связывающих единиц Fab. Каждая из двух легких цепей MAT-Fab содержит вторую половину (V-C) каждой связывающей единицы Fab. Легкие и тяжелые цепи MAT-Fab сконструированы таким образом, что каждая легкая цепь связана в своей соответствующей V-C-области с тяжелой цепью, образуя заданную связывающую единицу Fab и предотвращая мешающее неправильное спаривание легких цепей с неверной V-C-областью тяжелой цепи. Поскольку желательна димеризация Fc-цепи MAT-Fab с Fc-областью тяжелой цепи MAT-Fab, предпочтительной является фактическая идентичность Fc-цепи MAT-Fab соответствующей области тяжелой цепи MAT-Fab, за исключением мутаций, образующих структуры типа «выступ-во-впадину» (KiH) и предназначенных для стимуляции преимущественного спаривания CH3-доменов тяжелой цепи и Fc-цепи MAT-Fab по сравнению с гомодимеризацией двух тяжелых цепей MAT-Fab или двух легких Fc-цепей MAT-Fab. В CH3-домены тяжелой цепи и Fc-цепи MAT-Fab необязательно можно внести дополнительные благоприятные модификации путем внедрения остатка цистеина для стимуляции образования дополнительной дисульфидной связи или путем внедрения одного или более солевых мостиков, причем такие дополнения приводят к улучшению стабильности гетеродимера. Солевой мостик содержит водородную связь и вступает в электростатическое взаимодействие, которое может, например, возникать между остатками глутамата и лизина.
Сборка функционального биспецифического антитела MAT-Fab согласно настоящему изобретению достигается путем связывания каждой легкой цепи MAT-Fab с соответствующей ей половиной Fab-сегмента в тяжелой цепи с образованием полноценной связывающей единицы Fab и гетеродимеризацией Fc-домена тяжелой цепи с Fc-доменом Fc-цепи MAT-Fab. Гетеродимеризацию Fc-домена тяжелой цепи с Fc-доменом Fc-цепи направляет и стимулирует одна или более известных мутаций согласно технологии «выступы-во-впадины» («KiH»), при которой CH3-домен одной Fc-области на одной цепи мутируют с образование структуры выступа, которая делает невыгодной гомодимеризацию с идентичными цепями, содержащими выступ. CH3-домен другой Fc-области другой цепи мутируют с образованием структурной впадины, которая эффективно спаривается с CH3-доменом, содержащим мутацию, обеспечивающую образование структурного выступа, также препятствуя гомодимеризации с идентичными цепями, содержащими впадины (Ridgway et al., Protein Eng., 9: 617-621 (1996); Atwell et al., J. Mol. Biol., 270: 26-35 (1997)). Таким образом, сборка четырех полипептидных цепей обеспечивает образование биспецифического антитела, являющегося одновалентным по отношению к каждому эпитопу антигена и структурно асимметричным в том смысле, что все Fab-единицы образованы легкими цепями, связанными с единственной тяжелой цепью.
В настоящем изобретении предложено одновалентное асимметричное биспецифическое антитело с тандемным Fab («антитело MAT-Fab», «MAT-Fab»), содержащее четыре полипептидных цепи (a), (b), (c) и (d):
A
B
(a) тяжелую полипептидную цепь («тяжелую цепь»), причем каждая тяжелая цепь содержит (по направлению от N-конца к С-концу): VL-CL-VH-CH1-шарнир-CH2-CH3m1, где:
A
A
B
B
B
B
VL-вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина человека, присоединенный непосредственно к CL, который представляет собой константный домен легкой цепи иммуноглобулина человека, причем VL-CL представляет собой половину первой связывающей единицы Fab (распознающей антиген или эпитоп «A») и присоединен непосредственно к VH, причем VH представляет собой вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина человека, присоединенный непосредственно к CH1, который представляет собой константный CH1-домен тяжелой цепи иммуноглобулина человека, причем VH-CH1 представляет собой половину второй связывающей единицы Fab (распознающей антиген или эпитоп «B»), причем VH-CH1 присоединен непосредственно к структуре шарнир-CH2, причем структура шарнир-CH2 представляет собой область шарнир-CH2 тяжелой цепи иммуноглобулина, и структура шарнир-CH2 присоединена непосредственно к CH3m1, который представляет собой первый константный CH3-домен тяжелой цепи иммуноглобулина человека, мутированный посредством одной или более мутаций, обеспечивающих образование структур «выступ-во-впадину» (KiH) с образованием структурного выступа или структурной впадины в указанном константном домене CH3m1;
A
A
A
(b) первую легкую цепь, содержащую VH-CH1, где VH - вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина человека, присоединенный непосредственно к CH1, который представляет собой константный CH1-домен тяжелой цепи иммуноглобулина человека, а VH-CH1 представляет собой другую половину указанной первой связывающей единицы Fab;
B
B
B
(с) вторую легкую цепь, содержащую VL-CL, где VL - вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина человека, присоединенный непосредственно к CL, который представляет собой константный домен легкой цепи иммуноглобулина человека, а VL-CL представляет собой другую половину указанной второй связывающей единицы Fab;
и
(d) Fc-цепь, содержащую шарнир-CH2-CH3m2, где структура шарнир-CH2 представляет собой область шарнир-CH2 тяжелой цепи иммуноглобулина, и структура шарнир-CH2 присоединена к CH3m2, который представляет собой второй константный CH3-домен тяжелой цепи иммуноглобулина человека, мутированный посредством одной или более мутаций, обеспечивающих образование структур «выступ-во-впадину» (KiH) с образованием структурного выступа или структурной впадины в указанном константном домене CH3m2;
при условии, что:
при мутировании домена CH3m1 тяжелой цепи с образованием структурного выступа домен CH3m2 Fc-цепи мутируют с образованием структурной впадины, что благоприятствует спариванию домена CH3m1 с доменом CH3m2; и
при мутировании домена CH3m1 тяжелой цепи с образованием структурной впадины домен CH3m2 Fc-цепи мутируют с образованием структурного выступа, что способствует спариванию домена CH3m1 с доменом CH3m2; и необязательно содержащее (содержащее или не содержащее) мутацию как в домене CH3m1 тяжелой цепи, так и в домене CH3m2 Fc-цепи, приводящую к внедрению остатка цистеина, способствующего образованию дисульфидной связи при спаривании домена CH3m1 с доменом CH3m2.
Дополнительным вариантом является конструирование одного или более солевых мостиков между доменами CH3m1 и CH3m2 посредством мутирования одного из или обоих доменов таким образом, чтобы остаток в одном из доменов мог образовывать водородную связь и электростатически взаимодействовать (связываться) с остатком в другом домене. Например, в числе прочего, солевой мостик можно внедрить посредством изменения (мутирования) аминокислотного остатка в домене CH3m1 на остаток глутамата или аспартата и изменения (мутирования) остатка в домене CH3m2 на остаток лизина или аргинина таким образом, чтобы остаток глутамата или аспартата в домене CH3m1 мог образовывать водородную связь и электростатически взаимодействовать с остатком лизина или аргинина в домене CH3m2.
Вышеупомянутые комплементарные CH3-домену мутации в домене CH3m1 тяжелой цепи и домене CH3m2 Fc-цепи способствуют образованию гетеродимера по сравнению с гомодимеризацией, т.е. соответствующее мутации в домене CH3 предназначены для стимуляции преимущественного спаривания Fc-цепи MAT-Fab и тяжелой цепи MAT-Fab по сравнению с гомодимеризацией двух Fc-цепей и двух тяжелых цепей.
B
Вышеописанная особенность структуры биспецифического антитела MAT-Fab состоит в том, что все смежные вариабельные и константные домены тяжелой и легких цепей иммуноглобулина непосредственно соединены друг с другом без участия промежуточной аминокислоты или пептидного линкера. Такое непосредственное присоединение смежных доменов иммуноглобулина (также называемое «непосредственным слиянием» домена со смежным доменом) устраняет потенциально иммуногенные сайты, которые могли бы образовываться при внедрении одной или более промежуточных аминокислот, создании пептидного линкера, которые являлись бы гетерогенными или «чужеродными» для данного субъекта и могли бы распознаваться как таковые иммунной системой субъекта. Вопреки общим представлениям в области конструирования и продукции антител, отсутствие линкеров между CL-доменом и VH-доменом тяжелой цепи MAT-Fab и, соответственно, между тандемными связывающими единицами Fab не оказывает нежелательного действия на связывающую активность любой из связывающих единиц Fab в антителе MAT-Fab.
В соответствии с вышеописанной структурой биспецифического антитела MAT-Fab, домен CH3m1 тяжелой цепи или домен CH3m2 Fc-цепи содержат мутации типа «выступ-во- впадину» (KiH), что приводит к образованию структурного выступа, способствующего спариванию одного из CH3-доменов (т.е. CH3m1 или CH3m2), содержащего структурный выступ, с другим CH3-доменом (т.е. CH3m2 или CH3m1), содержащим структурную впадину. Предпочтительно, одна или более мутаций предназначена для образования структурного выступа в домене CH3m1 тяжелой цепи для спаривания с доменом CH3m2, который содержит комплементарную структурную впадину. Примеры мутаций, приводящих к замене аминокислотного остатка с образованием структурного выступа в CH3-домене антитела MAT-Fab, описанного в настоящем документе, включают замену остатка треонина на остаток тирозина или замену остатка треонина на остаток триптофана, но не ограничиваются ими.
Примеры конкретных мутаций, приводящих к замене аминокислотного остатка с образованием структурного выступа в CH3-домене антитела MAT-Fab, описанного в настоящем документе, включают замену остатка треонина-366 на остаток тирозина (T366Y) или замену остатка треонина-366 на остаток триптофана, но не ограничиваются ими (T366W). Ridgway et al., Protein Eng., 9: 617-621 (1996); Atwell et al., J. Mol. Biol., 270: 26-35 (1997).
В соответствии с вышеописанной структурой биспецифического антитела MAT-Fab, домен CH3m1 тяжелой цепи или домен CH3m2 Fc-цепи содержит мутации типа «выступ-во- впадину» (KiH), что приводит к образованию структурной впадины, способствующей спариванию одного из CH3-доменов (т.е. CH3m1 или CH3m2), содержащего структурную впадину, с другим CH3-доменом (т.е. CH3m2 или CH3m1), содержащим структурный выступ.
Предпочтительно, одна или более мутаций предназначена для образования структурной впадины в домене CH3m2 полипептидной Fc-цепи для спаривания с доменом CH3m1, который содержит структурный выступ. Примеры мутаций, приводящих к замене одного или более остатков с образованием структурной впадины в CH3-домене биспецифического антитела MAT- Fab, описанного в настоящем документе, включают замену остатка тирозина на остаток треонина и комбинацию замены остатка треонина на остаток серина, замены остатка лейцина на остаток аланина и замены остатка тирозина на остаток валина, но не ограничиваются ими. Предпочтительная мутация для образования структурной впадины в CH3-домене антитела MAT-Fab согласно настоящему изобретению представляет собой замену остатка тирозина-407 на остаток треонина (Y407T). Ridgway et al., Protein Eng., 9: 617-621 (1996). Предпочтительная комбинация мутаций для образования структурной впадины в CH3-домене антитела MAT-Fab согласно настоящему изобретению включает замену остатка треонина-366 на остаток серина (T366S), замену остатка лейцина-368 на остаток аланина (L368A) и замену остатка тирозина-407 на остаток валина (Y407V). Atwell et al., J. Mol. Biol., 270: 26-35 (1997).
В еще одном варианте реализации можно внести дополнительную мутацию для получения остатка цистеина, например, замены остатка серина на остаток цистеина или замену остатка тирозина на остаток цистеина в домене CH3m1 тяжелой цепи и в домене CH3m2 полипептидной Fc-цепи с образованием дополнительной дисульфидной связи при спаривании домена CH3m1 тяжелой цепи с доменом CH3m2 полипептидной Fc-цепи биспецифического антитела MAT-Fab согласно настоящему изобретению. Конкретный неограничивающий пример инсерции цистеина представляет собой замену остатка серина-354 на цистеин (S354C) и замену остатка тирозина-349 на цистеин (Y349C) в комплементарных цепях. Merchant et al., Nat. Biotechnol., 16: 677-681 (1998).
В предпочтительном варианте реализации биспецифическое антитело MAT-Fab согласно настоящему изобретению может связывать один или два антигена-мишени, выбранных из группы, состоящей из: цитокинов, белков поверхности клеток, ферментов и рецепторов.
В еще одном варианте реализации биспецифическое антитело MAT-Fab, описанное в настоящем документе, может модулировать биологическую функцию одного или двух антигенов-мишеней. Более предпочтительно, биспецифическое антитело MAT-Fab, описанное в настоящем документе, может ингибировать или нейтрализовывать один или более антигенов- мишеней.
В одном варианте реализации настоящего изобретения биспецифическое антитело MAT-25 Fab, описанное в настоящем документе, может связывать два различных цитокина. Такие цитокины выбирают из группы, состоящей из: лимфокинов, монокинов и полипептидных гормонов.
В еще одном варианте реализации биспецифическое антитело MAT-Fab согласно настоящему изобретению может связывать по меньшей мере один антиген-мишень, экспрессируемый на поверхности клетки. Более предпочтительно, биспецифическое антитело MAT-Fab согласно настоящему изобретению связывает два антигена поверхности клетки. Указанные два антигена поверхности клетки могут находиться на одной и той же клетке или на двух клетках одного и того же типа. В то же время в более предпочтительном случае биспецифическое антитело MAT-Fab согласно настоящему изобретению связывает антиген, экспрессируемый на поверхности первой клетки, и связывает второй антиген, экспрессируемый на поверхности второй клетки, причем первая и вторая клетка принадлежат к различным типам клеток. Биспецифическое антитело MAT-Fab, описанное в настоящем документе, предпочтительно связывает первый антиген поверхности клетки, экспрессируемый на эффекторной клетке иммунной системы, а также связывает второй антиген поверхности клетки, экспрессируемый на поверхности клетки, считающейся вредоносной для индивида, вследствие чего желательно устранение или существенное снижение популяции таких клеток.
Эффекторные клетки включают T-клетки, NK-клетки, моноциты, нейтрофилы и макрофаги.
Клетки, которые считаются или могут считаться вредоносными для индивида, нуждающегося в лечении, и поэтому могут связываться антителом MAT-Fab, описанным в настоящем документе, включают раковые клетки, клетки, реагирующие с антигенами собственного организма, и клетки, инфицированные вирусами. Соответственно, в особо предпочтительном варианте реализации биспецифическое антитело MAT-Fab согласно настоящему изобретению связывает антиген, экспрессируемый на поверхности эффекторной клетки, и связывает антиген, экспрессируемый на поверхности раковой клетки, клетки, реагирующей с антигенами собственного организма, или клетки, инфицированной вирусами.
В предпочтительном варианте реализации биспецифическое антитело MAT-Fab согласно настоящему изобретению связывает пару антигенов-мишеней, выбранных из группы пар антигенов, состоящей из: CD20 и CD3, CD3 и CD19, CD3 и Fc-гамма-RIIIA, CD3 и TPBG, CD3 и Epha10, CD3 и ИЛ-5Rα, CD3 и TASCTD-2, CD3 и CLEC12A, CD3 и проминина-1, CD3 и ИЛ-23R, CD3 и ROR1, CD3 и ИЛ-3Rα, CD3 и PSA, CD3 и CD8, CD3 и глипикана-3, CD3 и FAP, CD3 и EphA2, CD3 и ENPP3, CD3 и CD33, CD3 и CD133, CD3 и EpCAM, CD3 и CD19, CD3 и Her2, CD3 и CEA, CD3 и GD2, CD3 и PSMA, CD3 и BCMA, CD3 и A33, CD3 и B7-H3, CD3 и EGFR, CD3 и P-кадгерина, CD3 и HMW-MAA, CD3 и TIM-3, CD3 и CD38, CD3 и TAG-72, CD3 и SSTR, CD3 и FRA, CD16 и CD30, CD64 и Her2, CD 137 и CD20, CD138 и CD20, CD19 и CD20, CD38 и CD20, CD20 и CD22, CD40 и CD20, CD47 и CD20, CD 137 и EGFR, CD137 и Her-2, CD 137 и PD-1, CD 137 и PDL-1, PD-1 и PD-L1, VEGF и PD-L1, Lag-3 и TIM-3, OX40 и PD-1, TIM-3 и PD-1, TIM-3 и PDL-1, EGFR и DLL-4, VEGF и EGFR, HGF и VEGF, первого эпитопа VEGF и второго (другого) эпитопа VEGF, VEGF и Ang2, EGFR и cMet, PDGF и VEGF, VEGF и DLL-4, OX40 и PD-L1, ICOS и PD-1, ICOS и PD-L1, Lag-3 и PD-1, Lag-3 и PD-L1, Lag-3 и CTLA-4, ICOS и CTLA-4, CD138 и CD40, CD38 и CD138, CD38 и CD40, CD-8 и IL-6, CSPGs и RGM A, CTLA-4 и BTN02, CTLA-4 и PD-1, IGF1 и IGF2, IGF1/2 и Erb2B, IGF-IR и EGFR, EGFR и CD13, IGF-IR и ErbB3, EGFR-2 и IGFR, первого эпитопа Her2 и второго (другого) эпитопа Her2, фактора IXa и Met, фактора X и Met, VEGFR-2 и Met, VEGF-A и ангиопоэтина-2 (Ang-2), ИЛ-12 и TWEAK, ИЛ-13 и ИЛ-1β, MAG и RGM A, NgR и RGM A, NogoA и RGM A, OMGp и RGM A, PDL-1 и CTLA-4, PD-1 и TIM-3, RGM A и RGM B, Te38 и ФНОα, ФНОα и Blys, ФНОα и CD22, ФНОα и CTLA-4, ФНОα и GP130, ФНОα и ИЛ-12p40, и ФНОα и лиганда RANK.
В одном варианте реализации биспецифическое антитело MAT-Fab, описанное в настоящем документе, связывает CD3 на эффекторной клетке. Примеры эффекторных клеток включают T-клетки, естественные киллеры (NK-клетки), моноциты, нейтрофилы и макрофаги, но не ограничиваются ими.
В еще одном варианте реализации биспецифическое антитело MAT-Fab согласно настоящему изобретению связывает поверхностный антиген, экспрессируемый на эффекторной клетке. Поверхностный антиген предпочтительно выбирают из группы, состоящей из: CD3, CD16 (также называемого «FcγRIII») и CD64 (также называемого «FcγRI»). Более предпочтительно, антитело MAT-Fab связывает CD3, экспрессируемый на T-клетке, CD16, экспрессируемый на естественном киллере (NK-клетке) или CD64, экспрессируемый на макрофаге, нейтрофиле или моноците.
В еще одном варианте реализации биспецифическое антитело MAT-Fab согласно настоящему изобретению связывает поверхностный антиген, являющийся опухолеассоциированным антигеном. Предпочтительные варианты реализации MAT-Fab могут распознавать опухолеассоциированные антигены, например, выбранные без ограничений из группы, состоящей из: CD19, CD20, рецептора-2 эпидермального фактора роста человека («Her2»), эмбрионального опухолевого антигена («CEA»), молекулы адгезии эпителиальных клеток («EpCAM») и орфанного рецептора-1 белка, подобного рецепторной тирозинкиназе (ROR1).
В еще одном варианте реализации биспецифическое антитело MAT-Fab согласно настоящему изобретению связывает антиген на эффекторной клетке, что активирует эффекторную клетку, а также связывает антиген поверхности злокачественной B-клетки.
Биспецифическое антитело MAT-Fab согласно настоящему изобретению предпочтительно связывает антиген на эффекторной клетке, что активирует эффекторную клетку, а также связывает антиген поверхности злокачественной B клетки, ассоциированный с раковым заболеванием, выбранным из группы, состоящей из: острого лимфобластного лейкоза, лимфомы  Ходжкина, неходжкинской лимфомы (NHL), B-клеточного лимфобластного лейкоза/лимфомы с вовлечением клеток-предшественников, В-клеточных новообразований с вовлечением зрелых клеток, B-клеточного хронического лимфоцитарного лейкоза/мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы, B-клеточного пролимфоцитарного лейкоза, лимфоплазмоцитарной лимфомы, лимфомы из клеток мантии, фолликулярной лимфомы, лимфомы из центральных клеток фолликулов кожи, B-клеточной лимфомы маргинальной зоны, волосатоклеточного лейкоза, диффузной крупноклеточной B-клеточной лимфомы, лимфомы Беркитта, плазмоцитомы, плазмаклеточной миеломы, посттрансплантационного лимфопролиферативного нарушения, макроглобулинемии Вальденстрема и анапластической крупноклеточной лимфомы.
В предпочтительном варианте реализации биспецифическое антитело MAT-Fab связывается с антигенами-мишенями CD3 и CD20.
В еще одном варианте реализации биспецифическое антитело MAT-Fab, описанное в настоящем документе, связывает поверхностный антиген, экспрессируемый на эффекторной клетке, и опухолеассоциированный антиген, экспрессируемый на опухолевой клетке. В предпочтительном варианте реализации биспецифическое антитело MAT-Fab, описанное в настоящем документе, связывает CD3 на Т-клетке и CD20 на злокачественной В-клетке. Более предпочтительно, биспецифическое антитело MAT-Fab связывает CD20 посредством своей внешней (N-концевой) связывающей единицы Fab, а CD3 - внутренней (C-концевой) связывающей единицы Fab.
В предпочтительном варианте реализации биспецифическое антитело MAT-Fab связывает CD20 и CD3 и содержит четыре полипептидные цепи, содержащие аминокислотные последовательности, приведенные в таблицах 1-4, или аминокислотные последовательности, приведенные в таблицах 5-8.
В еще одном варианте реализации биспецифическое антитело MAT-Fab согласно настоящему изобретению может связывать один или два цитокина, белка, родственных цитокинам, или рецептора цитокинов.
В еще одном варианте реализации биспецифическое антитело MAT-Fab согласно настоящему изобретению может связывать один или более хемокинов, рецепторов хемокинов или белков, родственных хемокинам.
В еще одном варианте реализации биспецифическое антитело MAT-Fab согласно настоящему изобретению может связывать CD3 на T-клетках, а также антиген или эпитоп, происходящий от белка оболочки вируса, присутствующий на поверхности клеток, инфицированных вирусом, например, CD4+ T-клеток, инфицированных ВИЧ.
В еще одном варианте реализации биспецифическое антитело MAT-Fab согласно настоящему изобретению также может рецепторы, в том числе рецепторы лимфокинов, рецепторы монокинов и рецепторы полипептидных гормонов.
В одном варианте реализации биспецифическое антитело MAT-Fab, описанное выше, является гликозилированным. Гликозилирование предпочтительно соответствует картине гликозилирования у человека.
В еще одном варианте реализации настоящего изобретения предложена одна или более выделенных нуклеиновых кислот, кодирующих одну, две, три или все четыре полипептидные цепи биспецифического антитела MAT-Fab, описанного в настоящем документе. В предпочтительном варианте реализации указанные одна или более нуклеиновых кислот кодируют четыре полипептидные цепи, содержащие аминокислотные последовательности, приведенные в таблицах 1-4, или аминокислотные последовательности, приведенные в таблицах 5-8 ниже.
В еще одном варианте реализации настоящего изобретения предложен вектор, содержащий одну или более выделенных нуклеиновых кислот, кодирующих один, два, три или все четыре полипептида биспецифического антитела MAT-Fab, описанного в настоящем документе. Вектор может представлять собой автономно реплицирующийся вектор или вектор, встраивающий выделенную нуклеиновую кислоту, находящуюся в указанном векторе, в геном клетки-хозяина. Кроме того, выделенные нуклеиновые кислоты, кодирующие одну, две, три или все четыре полипептидные цепи антитела MAT-Fab, можно вставить в вектор для выполнения различных генетических анализов, для экспрессии антитела MAT-Fab или для исследования или улучшения одного или более свойств антитела MAT-Fab, описанного в настоящем документе.
В еще одном варианте реализации вектор согласно настоящему изобретению можно применять для репликации указанной выделенной нуклеиновой кислоты для получения большего количества нуклеиновой кислоты, кодирующей один или более полипептидов биспецифического антитела MAT-Fab, описанного в настоящем документе.
В еще одном варианте реализации вектор согласно настоящему изобретению можно применять для экспрессии выделенной нуклеиновой кислоты, кодирующей одну, две, три или все четыре полипептидные цепи биспецифического антитела MAT-Fab, описанного в настоящем документе. Предпочтительные векторы для клонирования и экспрессии нуклеиновых кислот, описанных в настоящем документе, включают pcDNA, pTT (Durocher et al, Nucleic Acids Res., 30(2e9): 1-9 (2002)), pTT3 (pTT с дополнительными сайтами множественного клонирования), pEFBOS (Mizushima and Nagata, Nucleic Acids Res., 18(17): 5322 (1990)), pBV, pJV, pcDNA3.1
TOPO, pEF6 TOPO и pBJ, но не ограничиваются ими.
Кроме того, в настоящем изобретении предложена выделенная клетка-хозяин, содержащая вышеописанный вектор. Такая выделенная клетка-хозяин, содержащая вектор, описанный в настоящем документе, может представлять собой выделенную прокариотическую клетку или выделенную эукариотическую клетку.
В варианте реализации настоящего изобретения выделенная прокариотическая клетка- хозяин, содержащая вектор, описанный в настоящем документе, представляет собой бактериальную клетку-хозяина. Бактериальная клетка-хозяин может представлять собой грамположительную, грамотрицательную или грамвариабельную бактериальную клетку.
Бактериальная клетка-хозяин, содержащая вектор, описанный в настоящем документе, предпочтительно представляет собой грамотрицательную бактерию. Еще более предпочтительно, бактериальная клетка-хозяин, содержащая вектор, описанный в настоящем документе, представляет клетку Escherichia coli.
В варианте реализации настоящего изобретения выделенная клетка-хозяин, содержащая вектор, описанный в настоящем документе, представляет собой эукариотическую клетку- хозяина. Предпочтительные выделенные эукариотические клетки-хозяева, содержащие вектор, описанный в настоящем документе, могут включать клетку-хозяина млекопитающего, клетку- хозяина насекомого, растительную клетку-хозяина, клетку-хозяина гриба, клетку-хозяина эукариотической водоросли, клетку-хозяина нематоды, клетку-хозяина простейшего или клетку-хозяина рыбы. Выделенная клетка-хозяин млекопитающего, содержащая вектор, описанный в настоящем документе, предпочтительно выбрана из группы, состоящей из:. клетки яичника китайского хомяка (CHO), клетки COS, клетки Vero, клетки SP2/0, миеломной клетки NS/0, клетки почки эмбриона человека (HEK293), клетки почки детеныша хомяка (BHK), клетки HeLa, B-клетки человека, клетки CV-1/EBNA, L-клетки, клетки 3T3, клетки HEPG2, клетки PerC6 и клетки MDCK. Выделенные клетки-хозяева гриба, содержащие вектор, описанный в настоящем документе, предпочтительно выбраны из группы, состоящей из:. Aspergillus, Neurospora, Saccharomyces, Pichia, Hansenula, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Yarrowia и Candida. Более предпочтительно, клетка-хозяин Saccharomyces, содержащая вектор, описанный в настоящем документе, представляет собой клетку Saccharomyces cerevisiae.
Кроме того, предложен способ продукции биспецифического антитела MAT-Fab, описанного в настоящем документе, включающий культивирование выделенной клетки- хозяина, содержащей вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую все четыре полипептидные цепи молекулы биспецифического антитела MAT-Fab в условиях, достаточных для продукции биспецифического антитела MAT-Fab.
Еще одним аспектом настоящего изобретения является биспецифическое антитело MAT-Fab, полученное с помощью вышеописанного способа.
3
14
35
90
99
111
131
177
166
153
Биспецифическое антитело MAT-Fab, описанное в настоящем документе, можно конъюгировать с другим соединением, например, в пределах С-конца или по С-концу любого или обоих спаренных доменов CH3m1 и CH3m2, аналогично другим конъюгированным антителам. Соединения, которые можно конъюгировать с биспецифическим антителом MAT-Fab, включают цитотоксический агент, агент для визуализации и терапевтический агент, но не ограничиваются ими. Предпочтительные агенты для визуализации, которые можно конъюгировать с биспецифическим антителом MAT-Fab, включают, без ограничений, радиоактивную метку, фермент, флуоресцентную метку, люминесцентную метку, магнитную метку, биотин, стрептавидин и авидин. Радиоактивные метки, которые можно конъюгировать с биспецифическим антителом MAT-Fab, описанным в настоящем документе, включают H, C, S, Y, Tc, In, I, Lu, Ho и Sm, но не ограничиваются ими. Предпочтительные цитотоксические или терапевтические соединения, которые можно конъюгировать с биспецифическим антителом MAT-Fab, описанным в настоящем документе, включают антиметаболит, алкилирующий агент, антибиотик, фактор роста, цитокин, антиангиогенный агент, антимитотический агент, антрациклин, токсин и антиапоптозный агент, но не ограничиваются ими.
В еще одном варианте реализации биспецифическое антитело MAT-Fab, описанное в настоящем документе, может быть кристаллизованными антителом MAT-Fab, сохраняющим связывающую активность по отношению к эпитопам или антигенам, связываемым некристаллизованным антителом MAT-Fab. Такие кристаллизованные биспецифические антитела MAT-Fab также могут обеспечивать контролируемое высвобождение MAT-Fab без носителя при введении индивиду. Кристаллизованное биспецифическое антитело MAT-Fab также может обладать увеличенным периодом полужизни in vivo при введении индивиду по сравнению с некристаллизованной формой.
В одном варианте реализации настоящего изобретения предложена композиция для высвобождения кристаллизованного биспецифического антитела MAT-Fab, причем указанная композиция содержит кристаллизованное биспецифическое антитело MAT-Fab, описанное в настоящем документе, вспомогательный ингредиент и по меньшей мере один полимерный носитель. Вспомогательный ингредиент предпочтительно выбирают из группы, состоящей из: альбумина, сахарозы, трегалозы, лактита, желатина, гидроксипропил-β-циклодекстрина, метоксиполиэтиленгликоля и полиэтиленгликоля. Полимерный носитель предпочтительно представляет собой полимер, выбранный из одной или более групп, состоящих из: полиакриловой кислоты, полицианоакрилатов, полиаминокислот, полиангидридов, полидепсипептидов, полиэфиров, полимолочной кислоты, сополимера молочной и гликолевой кислот или PLGA, поли-b-гидроксибутирата, поликапролактона, полидиоксанона; полиэтиленгликоля, полигидроксипропилметакриламида, полиорганофосфазена, поли(орто-эфиров), поливинилового спирта, поливинилпирролидона, сополимеров малеинового ангидрида и алкилвинилового эфира, плюрониловых полиолов, альбумина, целлюлозы и производных целлюлозы, коллагена, фибрина, желатина, гиалуроновой кислоты, олигосахаридов, гликаминогликанов, сульфатированных полисахаридов, их смесей и сополимеров.
В еще одном варианте реализации предложен способ лечения млекопитающего, включающий этап введения млекопитающему эффективного количества композиции, содержащей кристаллизованное биспецифическое антитело MAT-Fab, описанное выше.
В еще одном варианте реализации настоящего изобретения предложен способ лечения заболевания или нарушения у индивида, включающий введение указанному индивиду биспецифического антитела MAT-Fab, связывающего один или два эпитопа или антигена, считающихся вредоносными для индивида, причем связывание указанных одного или двух эпитопов или антигенов биспецифическим антителом MAT-Fab обеспечивает лечение указанного заболевания или нарушения.
Биспецифическое антитело MAT-Fab, описанное в настоящем документе, в особенности применимо в способе лечения нарушения, включающем перенацеливание (или «рекрутирование») эффекторных клеток (например, T-клеток, NK-клеток, моноцитов, нейтрофилов, макрофагов) для атаки специфических клеток-мишеней, считающихся вредоносными для субъекта-человека, в связи с чем желательно устранение или существенное снижение популяции вредоносных клеток-мишеней. Предпочтительные примеры таких вредоносных клеток-мишеней представляют собой опухолевые клетки, например, опухолевые клетки крови (включая лимфу) и клетки плотных опухолей (Satta et al., Future Oncol., 9(4): 527-539 (2013)); клетки, ассоциированные с аутоиммунным заболеванием, например, B-клетки, реагирующие на антигены собственного организма (Zocher et al., Mol. Immunol., 41(5): 511-518 (2004)); а также клетки, инфицированные вирусом (например, CD4+ T-клетки, инфицированные ВИЧ (Sung et al., J. Clin. Invest., 125(11): 4077-4090 (2015)). В способе перенацеливания согласно настоящему изобретению антитело MAT-Fab связывает антиген, экспрессируемый на поверхности эффекторной клетки, и антиген, экспрессируемый на поверхности клетки-мишени, являющейся вредоносной для субъекта-человека, причем связывание антитела MAT-Fab с антигеном эффекторной клетки и с антигеном вредоносной клетки-мишени опосредует желательное или благоприятное межклеточное взаимодействие, например, биспецифическое связывание MAT-Fab активирует эффекторную клетку, которая атакует вредоносную клетку- мишень. Одновременное связывание биспецифического антитела MAT-Fab, описанного в настоящем документе, с единственным антигеном-мишенью на эффекторной клетке и единственным антигеном-мишенью на вредоносной клетке-мишени может активировать эффекторную клетку, что приведет к атаке клетки-мишени при выгодном отсутствии массивного и нежелательного высвобождения цитокинов («цитокинового шторма»), который возможен в ином случае при димеризации антигенов эффекторной клетки с помощью антител, одновременно связывающих два или более антигена эффекторной клетки (т.е. перекрестном связывании антигенов эффекторной клетки).
Соответственно, в настоящем изобретении предложен способ лечения нарушения у субъекта-человека, включающий этап введения субъекту-человеку биспецифического антитела MAT-Fab, описанного в настоящем документе и связывающего антиген на эффекторной клетке и антиген, ассоциированный с нарушением и экспрессирующийся на клетке-мишени, вредоносной для субъекта-человека, причем связывание биспецифического антитела MAT-Fab как с эффекторной клеткой, так и с вредоносной клеткой-мишенью вызывает терапевтически благоприятное межклеточное взаимодействие между эффекторной клеткой и клеткой-мишенью. Для лечения многих нарушения такое благоприятное межклеточное взаимодействие должно включать активацию эффекторной клетки, приводящую к атаке вредоносной клетки-мишени. В других ситуациях благоприятный эффект может заключаться в опсонизации и/или уничтожении одной или обеих связанных клеток-мишеней.
Способ перенацеливания эффекторной клетки, приводящего к атаке вредоносной клетки-мишени, согласно настоящему изобретению предпочтительно включает контакт эффекторной клетки и вредоносной клетки-мишени с биспецифическим антителом MAT-Fab, описанным в настоящем документе, которое связывает антиген, экспрессируемый на эффекторной клетке и выбранный из группы, состоящей из: CD3, CD16 (также называемого «FcγRIII») и CD64 (также называемого «FcγRI»). Более предпочтительно, данный способ включает антитело MAT-Fab, которое связывает CD3, экспрессируемый на T-клетке, CD16, экспрессируемый на естественном киллере (NK-клетке) или CD64, экспрессируемый на макрофаге, нейтрофиле или моноците.
В одном варианте реализации настоящего изобретения предложен способ лечения опухоли у субъекта-человека, нуждающегося в лечении, включающий введение субъекту- человека антитела MAT-Fab, связывающего антиген на эффекторной клетке, а также связывающего антиген на опухолевой клетке-мишени, причем связывание антитела MAT-Fab с эффекторной клеткой и опухолевой клеткой-мишенью активирует эффекторную клетку и приводит к атаке опухолевой клетки. Антиген на эффекторной клетке предпочтительно представляет собой CD3, экспрессируемый на Т-клетке.
В предпочтительном варианте реализации способ лечения рака, характеризующегося наличием опухолевых клеток у субъекта-человека, нуждающегося в лечении, включает перенацеливание эффекторной клетки, приводящее к атаке опухолевой клетки-мишени, включающее этап контакта эффекторной клетки и опухолевой клетки-мишени с биспецифическим антителом MAT-Fab, описанным в настоящем документе и связывающим антиген на эффекторной клетке и антиген на опухолевой клетке-мишени, причем антиген на опухолевой клетке-мишени выбирают из группы, состоящей из: CD19, CD20, рецептора-2 эпидермального фактора роста человека («Her2»), эмбрионального опухолевого антигена («CEA»), молекулы адгезии эпителиальных клеток (EpCAM) и орфанного рецептора-1 белка, подобного рецепторной тирозинкиназе (ROR1).
В еще одном варианте реализации настоящего изобретения предложен способ лечения опухоли, ассоциированной с В-клетками, у субъекта-человека, включающий введение индивиду, нуждающемуся в таком лечении, биспецифического антитела MAT-Fab, связывающего антиген на эффекторной T-клетке, что активирует T-клетку, и связывающего антиген на злокачественных B-клетках. Биспецифическое антитело MAT-Fab согласно настоящему изобретению предпочтительно связывает антиген на злокачественных B-клетках при раковом заболевании, выбранном из группы, состоящей из: острого лимфобластного лейкоза, лимфомы Ходжкина, неходжкинской лимфомы (NHL), B-клеточного лимфобластного лейкоза/лимфомы с вовлечением клеток-предшественников, В-клеточных новообразований с вовлечением зрелых клеток, B-клеточного хронического лимфоцитарного лейкоза/мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы, B-клеточного пролимфоцитарного лейкоза, лимфоплазмоцитарной лимфомы, лимфомы из клеток мантии, фолликулярной лимфомы, лимфомы из центральных клеток фолликулов кожи, B-клеточной лимфомы маргинальной зоны, волосатоклеточного лейкоза, диффузной крупноклеточной B-клеточной лимфомы, лимфомы Беркитта, плазмоцитомы, плазмаклеточной миеломы, посттрансплантационного лимфопролиферативного нарушения, макроглобулинемии Вальденстрема и анапластической крупноклеточной лимфомы.
В особенно предпочтительном варианте реализации способ, предложенный для лечения опухоли, ассоциированной с В-клетками, у субъекта-человека, включает введение биспецифического антитела MAT-Fab, описанного в настоящем документе и связывающего CD3 на T-клетке и CD20 на злокачественной B-клетке. Более предпочтительно, биспецифическое антитело MAT-Fab связывает CD20 посредством своей внешней (N-концевой) Fab-связывающей единицы, а CD3 - внутренней (C-концевой) Fab-связывающей единицы.
В еще одном варианте реализации способ лечения нарушения согласно настоящему изобретению может включать приведение антитела MAT-Fab в контакт с эффекторными клетками и вредоносными клетками-мишенями в процедуре ex vivo, при которой эффекторные клетки, выделенные из организма субъекта-человека, нуждающегося в лечении, контактируют с антителом MAT-Fab за пределами организма человека, и через некоторое время, необходимое для связывания антитела MAT-Fab с эффекторными клетками, эффекторные клетки, связанные с антителом MAT-Fab, вводят субъекту-человеку таким образом, что комплексы антитела MAT-Fab, связанного с эффекторными клетками, могут быть ориентированы на связывание вредоносных клеток-мишеней, например, опухолевых клеток, в организме субъекта-человека. В еще одном варианте реализации эффекторные клетки и опухолевые клетки, выделенные из организма субъекта-человека, нуждающегося в лечении, контактируют с антителом MAT-Fab за пределами организма человека, и через некоторое время, необходимое для связывания антитела MAT-Fab с эффекторными клетками и опухолевыми клетками, эффекторные и опухолевые клетки, связанные с антителом MAT-Fab, вводят субъекту-человеку.
В еще одном варианте реализации можно сконструировать биспецифическое антитело MAT-Fab, доставляющее цитотоксический агент к вредоносной клетке-мишени, например, опухолевой клетке. В этом варианте реализации одна связывающая единица Fab антитела MAT-Fab содержит сайт связывания антигена-мишени на вредоносной клетке-мишени, а другая связывающая единица Fab содержит сайт связывания цитотоксического агента. Такое сконструированное антитело MAT-Fab согласно настоящему изобретению можно смешать или иным образом привести в контакт с цитотоксическим агентом, с которым оно связывается посредством своей сконструированной связывающей единицы Fab. Затем антитело MAT-Fab, несущее связанный цитотоксический агент, можно привести в контакт с вредоносной опухолевой клеткой с целью доставки цитотоксического агента к вредоносной опухолевой клетке. Такая система доставки в особенности эффективна, если антитело MAT-Fab связывается с вредоносной опухолевой клеткой и затем интернализируется в клетку вместе со связанным цитотоксическим агентом таким образом, что цитотоксический агент может высвобождаться во вредоносной опухолевой клетке.
Настоящее изобретение обеспечивает фармацевтические композиции, содержащие биспецифическое антитело MAT-Fab, описанное в настоящем документе, и фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтическая композиция, содержащая биспецифическое антитело MAT-Fab, может также содержать дополнительный агент, выбранный из группы, состоящей из терапевтического агента, агента для визуализации и цитотоксического агента. Кроме того, в соответствии со способами ex vivo, описанными в настоящем документе, фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению может содержать биспецифическое антитело MAT-Fab в составе комплекса с эффекторной клеткой или цитотоксическим агентом.
В еще одном варианте реализации предпочтительная фармацевтическая композиция, содержащая биспецифическое антитело MAT-Fab, описанное в настоящем документе, может дополнительно содержать одно или более других терапевтически активных соединений для лечения нарушения. Примеры предпочтительных дополнительных терапевтически активных соединений, которые можно включать в фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению, включают антибиотик, противовирусное соединение, противораковое соединение (не являющееся биспецифическим антителом MAT-Fab), седативное средство, стимулятор, местный анестетик, кортикостероид, антигистаминный агент, нестероидный противовоспалительный препарат (НПВП) и их соответствующие комбинации, но не ограничиваются ими.
В еще одном варианте реализации можно изготовить вышеописанную фармацевтическую композицию для введения индивиду посредством по меньшей мере одного способа, выбранного из группы, состоящей из: парентерального, подкожного, внутримышечного, внутривенного, внутрисуставного, внутрибрюшного, внутрикапсулярного, внутрихрящевого, внутриполостного, внутримозжечкового, интрацеребровентрикулярного, внутрикишечного, интрацервикального, внутрижелудочного, внутрипеченочного, внутрисердечного, внутрикостного, внутритазового, внутриперикардиального, внутрибрюшинного, внутриплеврального, внутрипростатного, внутрилегочного, интраректального, внутрипочечного, интраретинального, интраспинального, интрасиновиального, внутригрудного, внутриматочного, внутрипузырного, болюсного, вагинального, ректального, буккального, сублингвального, интраназального и трансдермального введения.
В еще одном варианте реализации биспецифическое антитело MAT-Fab, описанное в настоящем документе, можно применять в одном из различных анализов иммунологического обнаружения или форматов очистки, существующих в данной области техники и предназначенных для обнаружения, количественной оценки или выделения антигена-мишени или клеток, экспрессирующих антиген-мишень. Такие анализы и форматы включают анализы на основе иммуноблоттинга (например, вестерн-блоттинг); иммуноаффинную хроматографию, например, при адсорбции или связывании биспецифического антитела MAT-Fab с хроматографической смолой или гранулами; анализы иммунопреципитации; иммуночипы; анализы на основе иммуногистохимии тканей; проточную цитометрию (в том числе сортировку клеток с активацией флуоресценции); сэндвич-иммуноанализы; иммуночипы, где антитело MAT-Fab иммобилизовано или связано с подложкой; радиоиммуноанализ (РИА); иммуноферментный анализ (ИФА); твердофазный иммуноферментный анализ (твердофазный ИФА); конкурентные иммуноанализы с ингибированием; флуоресцентный поляризационный иммуноанализ (ФПИА); методику иммуноанализа с ферментативным усилением (EMIT); резонансный перенос энергии биолюминесценции (BRET); и гомогенный хемилюминесцентный анализ, но не ограничиваются ими. Настоящее изобретение обеспечивает способы с использованием масс-спектрометрии, которые включают MALDI (лазерная десорбция-ионизация с активацией матрицы) или SELDI (лазерная десорбция-ионизация, усиленная поверхностью) с участием антитела MAT-Fab, связывающего антиген-мишень или эпитоп на антигене или фрагмент антигена, но не ограничиваются ими.
Кроме того, в настоящем изобретении предложен способ обнаружения антигена в образце (например, смеси, композиции, растворе или биологическом образце), включающий контакт образца с биспецифическим антителом MAT-Fab согласно настоящему изобретению, связывающим антиген-мишень (или эпитоп), присутствующий или предположительно присутствующий в образце. Биологические образцы, которые можно использовать в качестве образца для анализа иммунологического обнаружения согласно настоящему изобретению, включают, без ограничения, цельную кровь, плазму, сыворотку, экстракты различных тканей, слезы, слюну, мочу и другие физиологические жидкости.
3
14
35
90
99
111
125
131
177
166
153
Биспецифическое антитело MAT-Fab можно непосредственно или косвенно пометить соединением, поддающимся обнаружению, с целью облегчения обнаружения связанного или несвязанного биспецифического антитела MAT-Fab. В предпочтительном варианте реализации биспецифическое антитело MAT-Fab, пригодное для анализа обнаружения, сконструировано таким образом, что одна из связывающих единиц Fab связывает соединение, генерирующее обнаруживаемый сигнал, а другая связывающая единица Fab связывает антиген-мишень (или эпитоп), присутствующий или предположительно присутствующий в образце. Подходящие вещества, поддающиеся обнаружению, доступны в данной области техники и включают, без ограничений, различные ферменты, простетические группы, флуоресцентные материалы, люминесцентные материалы и радиоактивные материалы. Предпочтительный фермент, который можно применять в анализе иммунологического обнаружения согласно настоящему изобретению, представляет собой фермент, способный обеспечивать обнаруживаемый сигнал при контакте с одним или более реагентами. Такие ферменты включают пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, β-галактозидазу или ацетилхолинэстеразу, но не ограничиваются ими. Примеры комплексов подходящих простетических групп включают, без ограничений, стрептавидин/биотин и авидин/биотин. Примеры подходящих флуоресцентных материалов, которые можно применять в анализе иммунологического обнаружения согласно настоящему изобретению, включают умбеллиферон, флуоресцеин, флуоресцеинизотиоцианат, родамин, дихлортриазиниламинфлуоресцеин, дансилхлорид и фикоэритрин, но не ограничиваются ими. Примером люминесцентного материала, который можно применять в анализе иммунологического обнаружения согласно настоящему изобретению, является люминол. Примеры подходящих радиоактивных изотопов, которые можно применять в анализе иммунологического обнаружения согласно настоящему изобретению, включают H, C, S, Y, Tc, In, I, I, Lu, Ho и Sm, но не ограничиваются ими.
Ввиду наличия димеризованной Fc-области биспецифическое антитело MAT-Fab согласно настоящему изобретению также можно метить по Fc-области аналогично природным молекулам антител, например, антител IgG.
Краткое описание чертежей
Фигура 1A представляет собой диаграмму, на которой показана доменная структура биспецифического антитела MAT-Fab. Фигура 1B представляет собой диаграмму, на которой описан порядок структурных генов, вставленных в конструкты экспрессирующих векторов для рекомбинантной экспрессии каждой из полипептидных цепей, при сборке которых образуется связывающий белок MAT-Fab согласно настоящему изобретению. Фигура 1C представляет собой диаграмму, на которой описаны четыре экспрессированные полипептидные цепи (1-4) для получения связывающего белка MAT-Fab, показанного на фиг. 1A, с указанием порядка иммуноглобулин-подобных доменов от N-конца к C-концу каждой цепи.
На фигуре 2 показан профиль и связанные данные анализа биспецифического антитела MAT-Fab KiH1, полученного согласно описанию в примере 1, с использованием эксклюзионной хроматографии (SEC). SEC-анализ позволил выявить, что 98,19% препарата антитела MAT-Fab KiH1 после одноэтапной очистки посредством хроматографии с белком A были представлены единственным веществом, что указывает на гомогенность тетрамерного белкового продукта.
На фигуре 3 показан профиль и связанные данные анализа биспецифического антитела MAT-Fab KiH2, полученного согласно описанию в примере 1, с использованием эксклюзионной хроматографии (SEC). SEC-анализ позволил выявить, что 95,7% препарата антитела MAT-Fab KiH2 после одноэтапной очистки посредством хроматографии с белком A были представлены единственным веществом, что указывает на гомогенность тетрамерного белкового продукта.
На фигуре 4 показаны результаты анализа способности биспецифических антител MAT- Fab KiH1 и MAT-Fab KiH2 связывать CD20, экспрессируемый на поверхности клеток Raji, с использованием сортировки клеток с активацией флуоресценции (FACS), как описано в примере 1.
На фигуре 5 показаны результаты анализа способности биспецифических антител MAT-Fab KiH1 и MAT-Fab KiH2 связывать CD3, экспрессируемый на поверхности клеток Jurkat, с использованием сортировки клеток с активацией флуоресценции (FACS), как описано в примере 1.
На фигуре 6 показаны результаты анализа способности биспецифических антител MAT-Fab KiH1 и MAT-Fab KiH2 связывать CD20 на клетках Raji (B-клетках) и индуцировать в В-клетках апоптоз, опосредованный Т-клетками, на 2 день в анализе истощения В-клеток. Обозначения на графике: «Офатумумаб» представляет собой полностью человеческое моноклональное антитело против CD20; «CD3 мАт» представляет собой моноклональное антитело против CD3; MAT-Fab KiH1 и MAT-Fab KiH2 соответствуют описанию в примере 1; и «Офатумумаб/CD3 мАт» представляет собой смесь равных количеств офатумумаба против CD20 и мАт против CD3. Оба биспецифических антитела MAT-Fab могли индуцировать апоптоз В-клеток, опосредованный Т-клетками, на 2 день анализа.
Подробное описание изобретения
Для многих иммунных рецепторов активация клеток выполняется за счет перекрестного связывания при одновалентном связывающем взаимодействии. Механизм перекрестного связывания обычно опосредован иммунными комплексами антитело/антиген или взаимодействием эффекторной клетки с клеткой-мишенью. Например, активирующие Fc-гамма-рецепторы (FcγR) с низкой аффинностью, например, CD16 (FcγRIIIa) и CD32a (FcγRIIa), опосредующие уничтожение клеток, одновалентно связываясь с Fc-областью антитела. В то время как одновалентное связывание не приводит к активации сигнальных путей клетки, при взаимодействии эффекторной клетки с клеткой-мишенью происходит перекрестное связывание и кластеризация рецепторов на поверхности клетки, что приводит к активации. Активация CD3 на Т-клетках происходит при взаимодействии ассоциированного с ним Т-клеточного рецептора (TCR) в авидном межклеточном синапсе с главным комплексом гистосовместимости (MHC), несущим антиген, на антигенпрезентирующих клетках. Двухвалентные антитела, мишенью которых является CD3, могут вызывать массивное высвобождение цитокинов (часто называемое «цитокиновым штормом»), и последующие токсические явления представляют проблему для разработки антител против CD3 в качестве терапевтических средств. В противоположность этому, одновалентное связывание CD3 в биспецифических форматах приводит к значительно пониженному уровню активации T-клеток. Для двухвалентных моноспецифических антител следствие этого биологического явления состоит в том, что двухвалентное перекрестное связывание рецепторов может привести к неспецифической активации эффекторной клетки в отсутствие клеток-мишеней. Таким образом, если целью терапии является совместное взаимодействие иммунного рецептора, одновалентное связывание обычно в значительной степени более предпочтительно по по сравнению с двухвалентным связыванием. Этот режим несовместим с применением обычных двухвалентных антитела и большинства полиспецифических, но поливалентных форматов антител, например, иммуноглобулинов с двойным вариабельным доменом (DVD-Igs) и иммуноглобулинов «Fab- в тандеме» (FIT-Igs).
В настоящем изобретении предложено решение таких проблем, описанных выше, за счет биспецифического формата антитела, включающего Fc-область со структурой «выступ-во-впадину» (KiH) и гетеродимеризацию тяжелой цепи тандемного Fab с укороченной Fc-цепью, которая дает возможность одновременного одновалентного связывания двух различных антигенов или эпитопов Биспецифическое антитело согласно настоящему изобретению особенно хорошо подходит для перенацеливания Т-клетки как механизма лечения рака.
В настоящем изобретении предложен сконструированные биспецифические антитела, содержащие две связывающие единицы Fab, присоединенные друг к другу в виде тандема, в которых одна связывающая единица Fab связывает эпитоп или антиген, отличающийся от эпитопа или антигена, связываемого другой связывающей единицей Fab. Таким образом, биспецифическое антитело согласно настоящему изобретению называется «одновалентным» по отношению к каждому связываемому им эпитопу или антигену. Кроме того, хотя биспецифическое антитело согласно настоящему изобретению содержит димеризованную константную Fc-область иммуноглобулина (т.е. димеризованную структуру шарнир-CH2-CH3), каждая половина тандемных связывающих единиц Fab находится на единственном полипептидном плече, отходящем от лишь одной из димеризованных цепей Fc-области (см. фиг. 1A). Соответственно, биспецифическое антитело согласно настоящему изобретению является «одновалентным» по отношению к сайтам связывания для каждого связываемого эпитопа или антигена, является «асимметричным» по отношению к местоположению Fab-единиц по отношению к димеризованной Fc-области; и содержит «тандемные» связывающие единицы Fab, присоединенные непосредственно друг к другу по направлению от N-конца к C-концу посредством обычной тяжелой цепи. Соответственно, биспецифическое антитело согласно настоящему изобретению также называют «одновалентным асимметричным биспецифическим антителом с тандемным Fab». Альтернативные термины-синонимы для биспецифического антитела согласно настоящему изобретению - «биспецифическое антитело MAT-Fab», «антитело MAT-Fab» или просто «MAT-Fab».
В настоящем документе термины «кристалл» и «кристаллизованный» относятся к антителу, в том числе биспецифическому антителу MAT-Fab согласно настоящему изобретению, находящемуся в форме кристалла. Кристалл - это одна из форм твердого состояния вещества, отличающаяся от других форм, например, аморфного твердого состояния или жидкокристаллического состояния. Кристаллы состоят из правильных повторяющихся трехмерных решеток из атомов, ионов, молекул (например, белков, например, антител) или молекулярных агрегатов (например, комплексов антиген/антитело). Эти трехмерные решетки упорядочены в соответствии со специфическими математическими зависимостями, хорошо известными в данной области техники. Основная единица или строительный блок, повторяющийся в структуре кристалла, называется триклинной единицей. Повторяющиеся триклинные единицы, упорядоченные в соответствии с четко заданной кристаллографической симметрией, образуют «элементарную ячейку» кристалла. Повторяющиеся элементарные ячейки при регулярном смещении во всех трех измерениях образуют кристалл. См. Giegé et al., Chapter 1, in Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, a Practical Approach, 2nd ed., Ducruix and Giegé, eds. (Oxford University Press, New York, 1999) pp. 1-16. Кристаллизованные биспецифические антитела MAT-Fab согласно настоящему изобретению можно получить в соответствии со способами, известными в данной области техники, например, описанными Shenoy и соавторами в международной публикации № WO 2002/072636, включенной в настоящий документ посредством ссылки.
Если в настоящем документе не задано иное, научные и технические термины, используемые в связи с настоящим изобретением, имеют значения, принятые среди специалистов в данной области. Однако в случае скрытой неоднозначности определения, приведенные в настоящем изобретении, имеют преимущество перед любым словарным или внешним определением. Кроме того, если иное не предусмотрено контекстом, употребление терминов в единственном числе включает множественное число, а употребление терминов во множественном числе включает единственное число. В настоящей заявке использование «или» означает «и/или», если не указано иное. Кроме того, использование термина «включая», а также других форм, таких, как «включает» и «включал», не является ограничивающим. Кроме того, такие термины, как «элемент» или «компонент» охватывают как элементы и компоненты, содержащие один блок, так и элементы и компоненты, которые включают более чем одну субъединицу, если иное не указано недвусмысленным образом.
В общем случае номенклатуры и методики работы, относящиеся к области культивирования клеток и тканей, молекулярной биологии, иммунологии, микробиологии, генетики и химии белков и нуклеиновых кислот, а также гибридизации, описанные в настоящем документе, известны и широко используются в данной области техники. Способы и методики согласно настоящему изобретению в общем случае выполняют в соответствии с общепринятыми способами, хорошо известными в данной области техники и описанными в различных источниках общего характера или более специфичных методиках, которые цитируются и обсуждаются в тексте настоящего описания, если не указано иное. Ферментативные реакции и методики очистки выполняют в соответствии с процедурами, общепринятыми в данной области техники, спецификациями производителя или описанием, приведенным в настоящем документе. Номенклатуры, лабораторные процедуры и методики в области аналитической химии, органического синтеза и медицинской и фармацевтической химии, описанные в настоящем документе, известны и широко используются в данной области техники. Стандартные методики включают методики, используемые для химического синтеза, изготовления, составления и доставки фармацевтических средств, а также лечения пациентов.
В настоящем документе термины «нарушение» и «заболевание» являются синонимами и относятся к патофизиологическому состоянию.
В настоящем документе подразумевается, что термин «нарушение (или заболевание), при котором антиген на клетке (или активность антигена) является вредоносным» включает нарушение, при котором показано, что наличие антигена у субъекта-человека, страдающего этим нарушением, обуславливает или предположительно обуславливает патофизиологию нарушения либо является или предположительно является фактором, вносящим вклад в усугубление нарушения. Соответственно, заболевание, при котором антиген или активность антигена является вредоносной, представляет собой нарушение, при котором ожидается, что снижение уровня антигена или активности антигена должно облегчить один или более симптомов нарушения или прогрессирование нарушения. Такие нарушения можно подтверждать, например, по увеличению концентрации антигена в крови или другой физиологической жидкости субъекта-человека, страдающего данным нарушением.
Термины «опухоль» и «рак» являются синонимами, если не указано иное. Рак или опухоль могут представлять собой гемобластоз или гематологическое опухолевое новообразование (в том числе из лимфоидных клеток) или солидный рак или опухоль.
Термины «индивид» и «субъект» относятся к субъекту-человеку.
В настоящем документе термины «Fab», «Fab-фрагмент» или «связывающая единица Fab» являются синонимами и относятся к единице иммуноглобулина, связывающей эпитоп (антигена) и образованной ассоциацией полипептидной цепи, содержащей вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина (VL-домен), присоединенный к константному домену легкой цепи иммуноглобулина (CL-домену), и полипептидной цепи, содержащей вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина (VH-домен), присоединенный к константному домену тяжелой цепи иммуноглобулина (CH1-домену), причем VL-домен спаривается с VH-доменом с образованием эпитоп(антиген)-связывающего сайта, а CL-домен спаривается с CH1-доменом. Так, в настоящем докуенте термины «Fab», «Fab-фрагмент» и «связывающая единица Fab» охватывают природные Fab-фрагменты, полученные папаиновым гидролизом природного иммуноглобулина, например, IgG, причем папаиновый гидролиз позволяет получить два Fab- фрагмента, содержащие фрагмент тяжелой цепи, содержащий VH-CH1, и фрагмент легкой цепи, содержащий VL-CL. В настоящем документе эти термины также охватывают рекомбинантные Fab, в которых выбранный VL-домен присоединен к выбранному CL-домену, а выбранный VH- домен присоединен к выбранному CH1-домену. Кроме того, в настоящем документе эти термины также охватывают тип «перекрестный Fab», в котором VH-CH1 присутствует в виде полипептида легкой цепи, а VL-CL присутствует на более крупной тяжелой цепи. В частности, в биспецифическом антителе MAT-Fab согласно настоящему изобретению N-концевая (внешняя) связывающая единица Fab относится к этому типу «перекрестного Fab», в котором VL-CL присутствует в тяжелой полипептидной цепи и спаривается с легкой цепью, содержащей VH-CH1. В противоположность этому, внутренняя (C-концевая) связывающая единица Fab содержит VH-CH1 в тяжелой цепи, которая спаривается с легкой цепью, содержащей VL-CL. Такой порядок внешних и внутренних связывающих единиц Fab в биспецифическом антителе MAT-Fab согласно настоящему изобретению выгодно способствует правильной ассоциации каждой структуры VL-CL с соответствующей структурой VH-CH1 с образованием двух функциональных связывающих единиц Fab и препятствует нефункциональным ассоциациям.
В настоящем документе композиция или способ, описанные как «содержащие» один или более из названных элементов или этапов, допускают изменения, что означает, что указанные элементы или этапы имеют важное значение, но в рамки указанной композиции или способа можно добавить другие элементы или этапы. Кроме того, во избежание многословия следует понимать, что любая композиция или способ, описанные как «содержащие» (или «которые содержат») один или более из названных элементов или этапов, также описывают соответствующие, более ограниченные, композицию или способ, «главным образом состоящие из» (или «которые состоят главным образом из») одинаковых указанных элементов или этапов, что означает, что композиция или способ включает указанные важные элементы или этапы, а также может включать дополнительные элементы или этапы, которые не оказывают существенного влияния на основные и новые характеристики указанной композиции или способа. Кроме того, следует понимать, что в настоящем документе любая композиция или способ, описанные как «содержащие» или «состоящие главным образом из» одного или более из указанных элементов или этапов, также описывают соответствующие, более ограниченные и жестко заданные композиции или способы, «состоящие из» (или «которые состоят из») указанных элементов или этапов и исключают любые неуказанные элементы или этапы. В любой композиции или способе, описанных в настоящем документе, можно заменять любые указанные важные элементы или этапы известными или описанными эквивалентами.
Элемент или этап, «выбранный из группы, состоящей из …» с дальнейшим перечислением элементов или этапов, относится к одному или более из элементов или этапов в приведенном далее списке, включая комбинации двух или более из перечисленных элементов или этапов.
Организация и получение биспецифических антител MAT-Fab
Одновалентное асимметричное биспецифическое антитело с тандемным Fab (биспецифическое антитело «MAT-Fab») согласно настоящему изобретению содержит:
A
B
A
A
B
B
B
B
(а) тяжелую полипептидную цепь («тяжелую цепь»), причем указанная тяжелая цепь содержит (по направлению от N-конца до С-конца): VL-CL-VH-CH1-шарнир-CH2-CH3m1, где: VL - вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина человека, присоединенный к CL, который представляет собой константный домен легкой цепи человека, причем VL-CL представляет собой половину первой связывающей единицы Fab (способной связывать антиген или эпитоп «A») и присоединен непосредственно к VH, причем VH представляет собой вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина человека, присоединенный к CH1, который представляет собой константный CH1-домен тяжелой цепи иммуноглобулина человека, причем VH-CH1 представляет собой половину второй связывающей единицы Fab (способной связывать антиген или эпитоп «B»), причем VH-CH1 присоединен к структуре шарнир-CH2, причем структура шарнир-CH2 представляет собой область шарнир-CH2 тяжелой цепи иммуноглобулина, и структура шарнир-CH2 присоединена к CH3m1, который представляет собой первый константный CH3-домен тяжелой цепи иммуноглобулина человека, мутированный посредством одной или более мутаций, обеспечивающих образование структур «выступ-во-впадину» (KiH) с образованием структурного выступа или структурной впадины в указанном константном домене CH3m1;
A
A
A
(b) первую легкую цепь, содержащую VH-CH1, где VH представляет собой вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина человека, присоединенный к CH1, который представляет собой константный CH1-домен тяжелой цепи иммуноглобулина человека, а VH-CH1 представляет собой другую половину указанной первой связывающей единицы Fab (способной связываться с антигеном или эпитопом «А»);
B
B
B
(c) вторую легкую цепь, содержащую VL-CL, где VL представляет собой вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина человека, присоединенный к CL, который представляет собой константный домен легкой цепи иммуноглобулина человека, а VL-CL представляет собой другую половину указанной второй связывающей единицы Fab (способной связываться с антигеном или эпитопом «B»); и
(d) Fc-цепь, содержащую шарнир-CH2-CH3m2, где структура шарнир-CH2 представляет собой область шарнир-CH2 константной области тяжелой цепи иммуноглобулина, и структура шарнир-CH2 присоединена к CH3m2, который представляет собой второй константный CH3- домен тяжелой цепи иммуноглобулина человека, мутированный посредством одной или более мутаций, обеспечивающих образование структур «выступ-во-впадину» (KiH) с образованием структурного выступа или структурной впадины в указанном константном домене CH3m2, комплементарном соответствующей структурной впадине или структурному выступу домена CH3m1 тяжелой цепи (а);
при условии, что:
при мутировании домена CH3m1 тяжелой цепи (а) с образованием структурного выступа домен CH3m2 Fc-цепи (d) мутируют с образованием комплементарной структурной впадины, что способствует спариванию домена CH3m1 с доменом CH3m2; или
при мутировании домена CH3m1 тяжелой цепи (а) с образованием структурной впадины домен CH3m2 Fc-цепи (d) мутируют с образованием комплементарного структурного выступа, что способствует спариванию домена CH3m1 с доменом CH3m2; и
необязательно содержит (т.е. может содержать или не содержать) мутацию как в домене CH3m1, так и в домене CH3m2, приводящую к внедрению остатка цистеина, способствующего образованию дисульфидной связи при спаривании домена CH3m1 с доменом CH3m2.
234
235
234
235
478
479
478
479
40
41
40
41
Fc-области тяжелой цепи и Fc-цепь можно необязательно модифицировать с целью модуляции эффекторной функции Fc. Например, известно, что мутация LeuLeu в CH2- домене, например, на AlaAla (нумерация ЕС) ослабляет или устраняет эффекторные функции ADCC/CDC. Такая изменение MAT-Fab приведено ниже в примерах, где внесли замену LeuLeu→AlaAla по остаткам 18-19 области шарнир-CH2 тяжелой цепи и Fc-цепи MAT-Fab (KiH1), а также тяжелой цепи и Fc цепи MAT-Fab (KiH2) (т.е. см. AlaAla в SEQ ID NO:1 в таблице 1 и AlaAla в SEQ ID NO:5 в таблице 5; и AlaAla в SEQ ID NO:4 в таблице 4 и AlaAla в SEQ ID NO:8 в таблице 8).
B
Особенность структуры биспецифического антитела MAT-Fab, описанного в настоящем документе, состоит в том, что все смежные вариабельные и константные домены тяжелой и легких цепей иммуноглобулина непосредственно соединены друг с другом без участия промежуточной синтетической аминокислоты или пептидного линкера. Такое непосредственное присоединение смежных доменов иммуноглобулина устраняет потенциально иммуногенные сайты, которые могут образовываться при внедрении одной или более промежуточных аминокислот. В данной области техники в общем случае считается, что промежуточные гибкие пептидные линкеры (например, линкер GGGGS и его повторы) в сконструированных молекулах антител с тандемно соединенными связывающими доменами нужны для обеспечения возможности одновременного связывания смежных сайтов связывания с антигенами и во избежание взаимных стерических помех. В противоположность таким представлениям, отсутствие линкеров в формате MAT-Fab не оказывает нежелательного действия на связывающую активность любой из связывающих единиц Fab антитела MAT-Fab. В частности, обнаружено, что добавление линкеров между CL и VH тяжелой полипептидной цепи не увеличивает связывающую активность любой из связывающих единиц Fab. Это означает, что структурная организация антитела MAT-Fab, описанная выше, сама по себе обеспечивает оптимальную гибкость и трехмерную конфигурацию, что проявляется в доступности и способности каждой связывающей единицы Fab связывать заданный антиген или эпитоп.
В соответствии с вышеописанной структурой биспецифического антитела MAT-Fab, домен CH3m1 тяжелой цепи MAT-Fab или домен CH3m2 Fc-цепи MAT-Fab содержат мутации типа «выступ-во-впадину» (KiH), что приводит к образованию структурного выступа, способствующего спариванию одного из CH3-доменов (т.е. CH3m1 или CH3m2), содержащего структурный выступ, с другим CH3-доменом (т.е. CH3m2 или CH3m1), содержащим структурную впадину. Предпочтительно, мутация предназначена для образования структурного выступа в домене CH3m1 тяжелой цепи для спаривания с доменом CH3m2 Fc-цепи, который содержит комплементарную структурную впадину. Примеры мутаций, приводящих к замене одного или более аминокислотных остатков с образованием структурного выступа в CH3- домене антитела MAT-Fab, описанного в настоящем документе, включают замену остатка треонина на остаток тирозина или замену остатка треонина на остаток триптофана, но не ограничиваются ими. Примеры конкретных мутаций, приводящих к замене аминокислотного остатка с образованием структурного выступа в CH3-домене антитела MAT-Fab, описанного в настоящем документе, включают замену остатка треонина-366 на остаток тирозина (T366Y) или замену остатка треонина-366 на остаток триптофана, но не ограничиваются ими (T366W). Ridgway et al., Protein Eng., 9: 617-621 (1996); Atwell et al., J. Mol. Biol., 270: 26-35 (1997). Такое конкретное изменение в составе MAT-Fab приведено ниже в примерах, где внесена замена Thr→Tyr по остатку 21 CH3-домена MAT-Fab (KiH1) и замена Thr→Trp по остатку 21 CH3-домена MAT-Fab (KiH2) (т.е. см. Tyr610 в SEQ ID NO:1 в таблице 1 и Trp610 в SEQ ID NO:5 в таблице 5).
174
213
В соответствии с вышеописанной структурой биспецифического антитела MAT-Fab, домен CH3m1 тяжелой цепи MAT-Fab или домен CH3m2 Fc-цепи содержат мутации типа «выступ-во-впадину» (KiH), что приводит к образованию структурной впадины, способствующей спариванию одного из CH3-доменов, содержащего структурную впадину, с другим CH3-доменом, содержащим структурный выступ. В данной области техники известно большое количество различных мутаций типа «выступ-во-впадину» в CH3-доменах Fc-областей антител. См., например, Ridgway et al., Protein Eng., 9: 617-621 (1996); Atwell et al., J. Mol. Biol., 270: 26-35 (1997); Klein et al., mAbs, 4(6): 653-663 (2012). Примеры мутаций, приводящих к замене одного или более остатков в CH3-домене с образованием структурной впадины в CH3- домене биспецифического антитела MAT-Fab, описанного в настоящем документе, включают замену остатка тирозина на остаток треонина и комбинацию замены остатка треонина на остаток серина, замены остатка лейцина на остаток аланина и замены остатка тирозина на остаток валина, но не ограничиваются ими. Предпочтительная мутация для образования структурной впадины в CH3-домене антитела MAT-Fab согласно настоящему изобретению представляет собой замену остатка тирозина-407 на остаток треонина (Y407T). Ridgway et al., Protein Eng., 9: 617-621 (1996). Такое изменение в составе MAT-Fab приведено ниже в примерах, где внесена замена Tyr→Thr по остатку 62 CH3-домена MAT-Fab (KiH1) (т.е. см. Thr213 в SEQ ID NO:4 в таблице 4). Предпочтительная комбинация мутаций для образования структурной впадины в CH3-домене антитела MAT-Fab согласно настоящему изобретению включает замен остатка треонина-366 на остаток серина (T366S), замену остатка лейцина-368 на остаток аланина (L368A) и замену остатка тирозина-407 на остаток валина (Y407V). Atwell et al., J. Mol. Biol., 270: 26-35 (1997). Такое конкретное изменение в составе MAT-Fab приведено ниже в примерах, где внесена замена Thr→Ser по остатку 21 CH3-домена MAT-Fab (KiH2), замена Leu→Ala по остатку 23 CH3-домена MAT-Fab (KiH2) и замена Tyr→Val по остатку 62 CH3-домена MAT- Fab (KiH2) (т.е. см. Ser172, Ala и Val в SEQ ID NO:8 в таблице 8). Предпочтительно, одна или более мутаций предназначена для образования структурной впадины в домене CH3m2 полипептидной Fc-цепи для спаривания с доменом CH3m1, который содержит структурный выступ.
В домены CH3m1 и CH3m2 антитела MAT-Fab, описанного в настоящем документе, можно внести дополнительную мутацию, приводящую к внедрению остатка цистеина для образования дополнительной дисульфидной связи при спаривании домена CH3m1 тяжелой цепи MAT-Fab с доменом CH3m2 Fc-цепи MAT-Fab и, тем самым, стабилизации гетеродимера Fc-области антитела MAT-Fab. Конкретные примеры таких мутаций включают, без ограничений, замену серина-354 на цистеин (S354C) и тирозина-349 на цистеин (Y349C). Merchant et al., Nat.
598
155
Biotechnol., 16: 677-681 (1998). Такие Cys-замены в составе MAT-Fab приведены ниже в примерах, где внесена замена Ser→Cys по остатку 9 CH3-домена тяжелой цепи MAT-Fab (KiH2) и замена Tyr→Cys по остатку 4 CH3-домена Fc-цепи MAT-Fab (KiH2) (т.е. см. Cys в SEQ ID NO:5 и Cys в SEQ ID NO:8 в таблице 8).
Дополнительным вариантом является конструирование одного или более солевых мостиков между доменами CH3m1 и CH3m2 антитела MAT-Fab, описанного в настоящем документе, посредством мутирования одного из или обоих доменов таким образом, чтобы остаток в одном из доменов мог образовывать водородную связь и электростатически взаимодействовать (связываться) с остатком в другом домене. Например, солевой мостик можно внедрить посредством изменения (мутирования) аминокислотного остатка в домене CH3m1 на остаток глутамата или аспартата и изменения (мутирования) остатка в домене CH3m2 на остаток лизина или аргинина таким образом, чтобы остаток глутамата или аспартата в домене CH3m1 мог образовывать водородную связь и электростатически взаимодействовать с остатком лизина или аргинина в домене CH3m2.
478
479
478
479
В дополнение к модификациям в константной области формата MAT-Fab, обсуждавшихся выше, каждая из константных областей тяжелой цепи и/или Fc-цепи биспецифического антитела MAT-Fab, описанного выше, необязательно содержит (т.е. может содержать или не содержать) одну или более мутаций, ослабляющих или устраняющих по меньшей мере одну эффекторную функцию Fc, например, антитело-зависимую цитотоксичность (ADCC) или комплементзависимую цитотоксичность (CDC). Такие мутации включают замену лейцина-234 на аланин (L234A) и замену лейцина-235 на аланин (L235A), но не ограничиваются ими (Canfield et al., J. Exp. Med., 173(6):1483-91 (1991)). Биспецифическое антитело MAT-Fab предпочтительно содержит модификации аминокислот в CH2-доменах тяжелой цепи и Fc-цепи для замены лейцина-234 на аланин (L234A, нумерация ЕС) и замены лейцина-235 на аланин (L235A, нумерация ЕС). Такое изменение в составе MAT-Fab приведено ниже в примерах, где внесена замена LeuLeu→AlaAla по остаткам 18-19 области шарнир-CH2 MAT-Fab (KiH1) и MAT-Fab (KiH2) (т.е. см. AlaAla в SEQ ID NO: 1 в таблице 1 и AlaAla в SEQ ID NO:5 в таблице 5).
Биспецифические антитела MAT-Fab, описанные в настоящем документе, могут связывать каждый эпитоп антигена с высокой аффинностью. Конкретно, в настоящем изобретении предложен подход к конструированию биспецифического антитела MAT-Fab с использованием двух исходных антител, причем одно исходное антитело связывает первый эпитоп антигена, а другое исходное антитело связывает второй эпитоп антигена.
Вариабельные домены тяжелой и легкой цепи (VH, VL) и константные домены тяжелой и легкой цепи иммуноглобулина (например, CL, CH1, CH2, CH3) для применения в биспецифическом антителе MAT-Fab согласно настоящему изобретению можно получить или изготовить из известных или продуцированных иммуноглобулинов или их генетически модифицированных (мутированных) версий. Например, связывающие единицы Fab, отдельные вариабельные домены и отдельные константные домены легко получить из «исходных» антител, связывающих эпитопы или антигены-мишени, которые должно связывать биспецифическое антитело MAT-Fab. Отдельные константные домены иммуноглобулинов также можно получить из исходных антител, не связывающихся с тем же эпитопом или антигеном, с которым должно связываться антитело MAT-Fab, поскольку такие константные домены могут быть присоединены к вариабельным доменам, полученным из другого исходного антитела, которое связывает желательный эпитоп или антиген-мишень, с которым должно связываться антитело MAT-Fab. Другие источники связывающих единиц Fab или отдельных вариабельных и константных доменов иммуноглобулинов включают рекомбинантные исходные антитела или связывающие белки, связывающие один или более эпитопов или антигенов, которые должно связывать биспецифическое антитело MAT-Fab. Исходные антитела, которые можно использовать в качестве источников связывающих единиц Fab или отдельных вариабельных и константных доменов для использования при продукции антитела MAT-Fab согласно настоящему изобретению, включают клинически одобренные терапевтические антитела.
Антиген-связывающие вариабельные домены и связывающие единицы Fab биспецифического антитела MAT-Fab, описанного в настоящем документе, можно получить из исходных антител, включая моноклональные антитела, поликлональные антитела и любые рекомбинантные антитела, но не ограничиваясь ими. Такие исходные антитела могут быть природными или могут быть получены с использованием рекомбинантной технологии.
Специалистам в данной области техники известно большое количество способов продукции антител, включая использование гибридомных методик, способ получения антител из отобранных лимфоцитов (SLAM), использование библиотек (например, фагового, дрожжевого дисплея или дисплея гибридов РНК-белок или других библиотек), иммунизацию животного, не являющегося человеком и несущего по меньшей мере некоторые локусы иммуноглобулинов человека, и получение химерных, гуманизированных антител и антител с трансплантированными CDR, но не ограничиваясь этим. См., например, Neuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270; Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327; и EP 2443154 B1 (2013).
Кроме того, вариабельные домены можно получить с использованием методик созревания аффинности.
В соответствии с настоящим изобретением, способ изготовления антитела MAT-Fab включает отбор исходных антител, обладающих по меньшей мере одним свойством, желательным для антитела MAT-Fab. Указанным желательными свойством предпочтительно является одно или более свойств, используемых для описания характеристик антитела MAT-Fab, например, специфичность к антигену или эпитопу, аффинность к антигену или эпитопу, активность, биологическая функция, распознавание эпитопа, стабильность, растворимость, эффективность продукции, пониженная иммуногенность, фармакокинетика, биодоступность, перекрестная реакционная способность по отношению к тканям или связывание ортологичного антигена.
Вариабельные домены можно получить из исходных антител с использованием методик рекомбинантных ДНК. В одном варианте реализации вариабельный домен представляет собой вариабельный домен тяжелой или легкой цепи мыши. В еще одном варианте реализации вариабельный домен представляет собой полученный в результате трансплантации CDR или гуманизированный вариабельный домен тяжелой или легкой цепи. В еще одном варианте реализации вариабельный домен, используемый в антителе MAT-Fab согласно настоящему изобретению, представляет собой вариабельный домен тяжелой или легкой цепи человека.
Один или более константных доменов можно присоединить друг к другу или к вариабельным доменам с использованием методик рекомбинантных ДНК, ПЦР или других способов, доступных в данной области техники, подходящих для рекомбинирования доменов иммуноглобулинов. В одном варианте реализации последовательность, содержащая вариабельный домен тяжелой цепи, присоединена к константному домену тяжелой цепи, а последовательность, содержащая вариабельный домен легкой цепи, присоединена к константному домену легкой цепи. В еще одном варианте реализации изобретения константные домены представляют собой константные домены тяжелой цепи иммуноглобулина человека и константные домены легкой цепи иммуноглобулина человека, соответственно.
Кроме того, вариабельные и константные домены можно модифицировать с целью улучшения свойства предполагаемого биспецифического антитела MAT-Fab. Например, как отмечено выше, CH3-домены Fc-областей антитела MAT-Fab согласно настоящему изобретению несут мутации типа «выступ-во-впадину», которые способствуют правильной ассоциации Fc-областей тяжелой полипептидной цепи MAT-Fab и полипептидной Fc-цепи MAT-Fab. Кроме того, СН3-домены можно дополнительно мутировать с целью внедрения остатков цистеина, образующих дополнительную дисульфидную связь при связывании двух СН3-доменов с образованием стабильного Fc-гетеродимера антитела MAT-Fab. Кроме того, Fc- область антитела MAT-Fab может содержать одну или более модификаций аминокислот с целью усиления или ослабления функции Fc, включая антитело-зависимую цитотоксичность (ADCC), комплементзависимую цитотоксичность (CDC), фагоцитоз, опсонизацию или связывание клеток или рецепторов, но не ограничиваясь ими.
Как отмечено выше, каждый из двух Fc-доменов биспецифического антитела MAT-Fab, описанных в настоящем документе, содержит мутации типа «выступ-во-впадину» (KiH), благоприятствующие ассоциации Fc-области тяжелой полипептидной цепи MAT-Fab с Fc-цепью MAT-Fab. В то же время могут быть желательны дополнительные свойства или модификации Fc-областей. Например, Fc-область антитела MAT-Fab можно получить из Fc- области иммуноглобулина, выбранного из группы, состоящей из: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgE или IgD. В еще одном варианте реализации можно модифицировать одну или более аминокислот в Fc-области для усиления или ослабления сродства Fc-области биспецифического антитела MAT-Fab к FcγR (Fc-рецептору) по сравнению с немодифицированной Fc-областью. Например, модификация(и) Fc-области может изменять аффинность к FcγRI, FcγRII и/или FcγRIII.
В еще одном варианте реализации можно модифицировать одну или более аминокислот в Fc-области для модуляции функционального или физического периода полужизни биспецифического антитела MAT-Fab in vivo.
Структурная организация каждой из полипептидных цепей биспецифического антитела MAT-Fab согласно настоящему изобретению обеспечивает правильную внутриклеточную сборку антитела MAT-Fab с использованием естественных механизмов экспрессии, фолдинга и секреции белка, присутствующих в клетке, без необходимости использовать после продукции способы процессинга для получения функционального антитела MAT-Fab. Особенно предпочтительным является использование выделенной клетки-хозяина млекопитающего, содержащей один или более экспрессирующих векторов, кодирующих четыре полипептидные цепи желательного биспецифического антитела MAT-Fab, описанного в настоящем документе, для продукции и экспрессии функционального антитела MAT-Fab.
Связывание антигена-мишени
Биспецифическое антитело MAT-Fab согласно настоящему изобретению способно связывать один или два эпитопа или антигена-мишени. Обычно биспецифическое антитело к MAT-Fab конструируют с учетом связывания эпитопа на одном антигене и эпитопа на другом антигене, что позволяет антителу MAT-Fab являться искусственным звеном между двумя антигенами для достижения определенного результата благодаря связыванию антигенов. Антитело к MAT-Fab согласно настоящему изобретению можно сконструировать с учетом связывания цитокина, полипептидного лиганда, рецептора клеточной поверхности, белка клеточной поверхности, не являющегося рецептором, фермента, комплекса из двух или более вышеперечисленных компонентов или их комбинации.
В еще одном варианте реализации биспецифическое антитело MAT-Fab, описанное в настоящем документе, может модулировать биологическую функцию одного или двух антигенов-мишеней. Более предпочтительно, биспецифическое антитело MAT-Fab, описанное в настоящем документе, может нейтрализовывать один или более антигенов-мишеней.
Кроме того, биспецифическое антитело MAT-Fab, описанное в настоящем документе, может связывать два различных цитокина. Такие цитокины можно выбрать из группы, состоящей из: лимфокинов, монокинов и полипептидных гормонов.
В еще одном варианте реализации биспецифическое антитело MAT-Fab согласно настоящему изобретению может связывать по меньшей мере один антиген-мишень, экспрессируемый на поверхности клетки. Более предпочтительно, биспецифическое антитело MAT-Fab согласно настоящему изобретению связывает два антигена поверхности клетки. Указанные два антигена поверхности клетки могут находиться на одной и той же клетке или на двух клетках одного и того же типа. В то же время в более предпочтительном случае биспецифическое антитело MAT-Fab согласно настоящему изобретению связывает антиген, экспрессируемый на поверхности первой клетки, и связывает второй антиген, экспрессируемый на поверхности второй клетки, причем первая и вторая клетка принадлежат к различным типам клеток. Биспецифическое антитело MAT-Fab, описанное в настоящем документе, предпочтительно связывает первый антиген поверхности клетки, экспрессируемый на эффекторной клетке иммунной системы, а также связывает второй антиген поверхности клетки, экспрессируемый на поверхности клетки, считающейся вредоносной для индивида, вследствие чего желательно устранение или снижение размера популяции таких клеток. Эффекторные клетки, которые может связывать биспецифическое антитело MAT-Fab согласно настоящему изобретению, включают Т-клетки, естественные киллеры (NK-клетки), моноциты, нейтрофилы и макрофаги. Примеры клеток, которые считаются вредоносными для индивида и которые может связывать биспецифическое антитело MAT-Fab согласно настоящему изобретению, включают опухолевые клетки, клетки, реагирующие с антигенами собственного организма, и клетки, инфицированные вирусом.
В еще одном варианте реализации биспецифическое антитело MAT-Fab согласно настоящему изобретению связывает поверхностный антиген, экспрессируемый на эффекторной клетке. Поверхностный антиген предпочтительно выбирают из группы, состоящей из: CD3, CD16 (также называемого «FcγRIII») и CD64 (также называемого «FcγRI»). Более предпочтительно, антитело MAT-Fab связывает CD3, экспрессируемый на T-клетках, CD16, экспрессируемый на естественных киллерах (NK-клетках) или CD64, экспрессируемый на макрофагах, нейтрофилах или моноцитах.
В еще одном варианте реализации биспецифическое антитело MAT-Fab согласно настоящему изобретению связывает поверхностный антиген, являющийся опухолеассоциированным антигеном. Предпочтительные опухолеассоциированные антигены, связываемые антителом MAT-Fab согласно настоящему изобретению, выбирают из группы, состоящей из: CD19, CD20, рецептора-2 эпидермального фактора роста человека («Her2»), эмбрионального опухолевого антигена («CEA»), молекулы адгезии эпителиальных клеток (EpCAM) и орфанного рецептора-1 белка, подобного рецепторной тирозинкиназе (ROR 1).
В одном варианте реализации биспецифическое антитело MAT-Fab, описанное в настоящем документе, связывает CD3 на эффекторной клетке.
В одном варианте реализации биспецифическое антитело MAT-Fab, описанное в настоящем документе, связывает CD20, присутствующий на раковой клетке.
В еще одном варианте реализации биспецифическое антитело MAT-Fab, описанное в настоящем документе, связывает поверхностный антиген, экспрессируемый на эффекторной клетке согласно описанию в настоящем документе, и опухолеассоциированный антиген, экспрессируемый на опухолевой клетке согласно описанию в настоящем документе. В предпочтительном варианте реализации биспецифическое антитело MAT-Fab, описанное в настоящем документе, связывает CD3 на Т-клетке и CD20 на злокачественной В-клетке.
В предпочтительном варианте реализации биспецифическое антитело MAT-Fab, описанное в настоящем документе, связывает CD3 и CD20. Более предпочтительно, биспецифическое антитело MAT-Fab связывает CD20 посредством своей внешней (N-концевой) связывающей единицы Fab, а CD3 - внутренней (C-концевой) связывающей единицы Fab.
В предпочтительном варианте реализации биспецифическое антитело MAT-Fab связывает CD20 и CD3 и содержит четыре полипептидные цепи, содержащие аминокислотные последовательности, приведенные в таблицах 1-4 (SEQ ID NO:1, 2, 3, 4), или аминокислотные последовательности, приведенные в таблицах 5-8 (SEQ ID NO:5, 6, 7, 8).
В предпочтительном варианте реализации биспецифическое антитело MAT-Fab согласно настоящему изобретению связывает пару антигенов-мишеней, выбранных из группы пар антигенов, состоящей из: CD20 и CD3, CD3 и CD19, CD3 и Fc-гамма-RIIIA, CD3 и TPBG (гликопротеина трофобластов), CD3 и Epha10, CD3 и ИЛ-5Rα, CD3 и TASCTD-2, CD3 и CLEC12A, CD3 и проминина-1, CD3 и ИЛ-23R, CD3 и ROR1, CD3 и ИЛ-3Rα, CD3 и PSA (простата-специфического антигена), CD3 и CD8, CD3 и глипикана-3, CD3 и FAP (белка активакции фибробластов), CD3 и EphA2, CD3 и ENPP3, CD3 и CD33, CD3 и CD133, CD3 и EpCAM, CD3 и CD19, CD3 и Her2, CD3 и CEA, CD3 и GD2, CD3 и PSMA (простаточпецифического мембранного антигена), CD3 и BCMA (антигена созревания В-клеток), CD3 и A33, CD3 и B7-H3, CD3 и EGFR (рецептора эпидермального фактора роста), CD3 и P-кадгерина, CD3 и HMW-MAA (высокомолекулярного человеческого меланома- ассоциированного антигена), CD3 и TIM-3, CD3 и CD38, CD3 и TAG-72, CD3 и SSTR (рецептора сомтостатина), CD3 и FRA, CD16 и CD30, CD64 и Her2, CD 137 и CD20, CD138 и CD20, CD19 и CD20, CD38 и CD20, CD20 и CD22, CD40 и CD20, CD47 и CD20, CD 137 и EGFR, CD137 и Her-2, CD 137 и PD-1, CD 137 и PDL-1, PD-1 и PD-L1, VEGF и PD-L1, Lag-3 и TIM- 3, OX40 и PD-1, TIM-3 и PD-1, TIM-3 и PDL-1, EGFR и DLL-4, VEGF и EGFR, HGF (фактора роста гепатоцитов) и VEGF (фатора роста эндотелия сосудов), первого эпитопа VEGF и второго (другого) эпитопа VEGF, VEGF и Ang2, EGFR и cMet, PDGF (тромбоцитарного фактора роста) и VEGF, VEGF и DLL-4, OX40 и PD-L1, ICOS и PD-1, ICOS и PD-L1, Lag-3 и PD-1, Lag-3 и PD-L1, Lag-3 и CTLA-4, ICOS и CTLA-4, CD138 и CD40, CD38 и CD138, CD38 и CD40, CD-8 и IL-6, CSPGs (хондроитин-сульфат протеогликанов) и RGM A (молекулы А отталкивания направляющего сигнала), CTLA-4 и BTN02, CTLA-4 и PD-1, IGF1 и IGF2, IGF1/2 и Erb2B, IGF-IR и EGFR, EGFR и CD13, IGF-IR и ErbB3, EGFR-2 и IGFR, первого эпитопа Her2 и второго (другого) эпитопа Her2, фактора IXa и Met, фактора X и Met, VEGFR-2 и Met, VEGF-A и ангиопоэтина-2 (Ang-2), ИЛ-12 и TWEAK, ИЛ-13 и ИЛ-1β, MAG и RGM A, NgR и RGM A, NogoA и RGM A, OMGp и RGM A, PDL-1 и CTLA-4, PD-1 и TIM-3, RGM A и RGM B, Te38 и ФНОα, ФНОα и Blys, ФНОα и CD22, ФНОα и CTLA-4, ФНОα и GP130, ФНОα и ИЛ-12p40, и ФНОα и лиганда RANK.
В еще одном варианте реализации биспецифическое антитело MAT-Fab согласно настоящему изобретению может связывать один или два цитокина, белка, родственных цитокинам, или рецептора цитокинов.
В еще одном варианте реализации биспецифическое антитело MAT-Fab согласно настоящему изобретению может связывать один или более хемокинов, рецепторов хемокинов или белков, родственных хемокинам.
В еще одном варианте реализации биспецифическое антитело MAT-Fab согласно настоящему изобретению также может рецепторы, в том числе рецепторы лимфокинов, рецепторы монокинов и рецепторы полипептидных гормонов. Гликозилированные биспецифические антитела MAT-Fab
Антитело MAT-Fab согласно настоящему изобретению может содержать один или более углеводных остатков. Биспецифическое антитело MAT-Fab, описанное выше, предпочтительно является гликозилированным. Более предпочтительно, гликозилирование соответствует картине гликозилирования у человека.
Продукция образующегося белка in vivo может требовать дополнительного процессинга, известного как посттрансляционная модификация. В частности, возможно ферментативное добавление углеводных (гликозильных) остатков; этот процесс известен как гликозилирование.
Полученные белки, несущие ковалентно связанные олигосахаридные боковые цепи, известны как гликозилированные белки или гликопротеины.
Природные антитела представляют собой гликопротеины с одним или более углеводными остатками в Fc-домене, а также вариабельном домене. Углеводные остатки в Fc- домене оказывают существенное влияние на эффекторную функцию Fc-домена при минимальном влиянии на связывание антигена или период полужизни антитела (Jefferis, Biotechnol. Prog., 21: 11-16 (2005)). В противоположность этому, гликозилирование вариабельного домена может оказывать влияние на антиген-связывающую активность антитела. Гликозилирование в вариабельном домене может отрицательно влиять на аффинность связывания антигена, вероятно, вследствие стерических помех (Co, M.S., et al., Mol. Immunol., 30: 1361-1367 (1993)), или может привести к повышению сродства к антигену (Wallick et al., J. Exp. Med., 168:1099-1109 (1988); Wright, A., et al., EMBO J., 10: 2717-2723 (1991)).
Один аспект настоящего изобретения направлен на создание мутантов по сайту гликозилирования, с мутированным сайтом O- или N-связанного гликозилирования антитела MAT-Fab. Специалист в данной области техники может создавать такие мутанты с использованием стандартных хорошо известных технологий. Еще одним объектом настоящего изобретения являются мутанты по сайту гликозилирования, сохраняющие биологическую активность, но обладающие повышенной или пониженной связывающей активностью.
В еще одном варианте реализации гликозилирование антитела MAT-Fab согласно настоящему изобретению модифицируют. Например, можно изготовить агликозилированное антитело MAT-Fab (т.е. антитело без гликозилирования). Гликозилирование можно модифицировать, например, с целью увеличения сродства антитела MAT-Fab к одному или более антигенов. Такие модификации углеводов можно выполнить, например, модифицируя один или более сайтов гликозилирования в последовательности антитела. Например, можно внести одну или более аминокислотных замен, которые приводят к удалению одного или более сайтов гликозилирования в вариабельной области, тем самым устраняя гликозилирование по этому сайту. Такое агликозилирование может повысить аффинность антитела MAT-Fab к антигену. Такой подход подробнее описан в международной публикации № WO 2003/016466 и патентах США № 5714350 и 6350861.
В качестве альтернативы или дополнения, можно получить модифицированное антитело MAT-Fab согласно настоящему изобретению, характеризующееся модифицированным типом гликозилирования, например, гипофукозилированное антитело с уменьшенным количеством фукозильных остатков (см. Kanda et al., J. Biotechnol., 130(3): 300-310 (2007)) или антитело с повышенным количеством структур, разделенных пополам за счет GlcNAc. Продемонстрировано, что такие модифицированные схемы гликозилирования усиливают ADCC-активность антител. Такие модификации углеводов можно выполнить, например, выполняя экспрессию антитела в клетке-хозяине с модифицированными механизмами гликозилирования. Клетки с модифицированным механизмом гликозилирования описаны в данной области техники и могут использоваться в качестве клеток-хозяев, в которых можно экспрессировать рекомбинантные антитела согласно настоящему изобретению изобретению, тем самым продуцируя антитело с модифицированным гликозилированием. См., например, Shields et al., J. Biol. Chem., 277: 26733-26740 (2002); Umana et al., Nat. Biotech., 17: 176-180 (1999), а также европейский патент № EP 1176195; международные публикации № WO 2003/035835 и WO 1999/54342.
Гликозилирование белков зависит от аминокислотной последовательности рассматриваемого белка, а также от клетки-хозяина, в которой экспрессируется белок. Различные организмы могут продуцировать различные ферменты гликозилирования (например, гликозилтрансферазы и гликозидазы) и использовать различные субстраты (нуклеотиды и углеводы). Из-за таких факторов картина гликозилирования белка и состав гликозильных остатков могут различаться в зависимости от системы хозяина, в которой экспрессируется конкретный белок. Гликозильные остатки, используемые в настоящем изобретении, могут включать глюкозу, галактозу, маннозу, фукозу, N-ацетилглюкозамин и сиаловую кислоту, но не ограничиваются ими. Гликозилированное антитело MAT-Fab предпочтительно содержит гликозильные остатки, соответствующие картине гликозилирования у человека.
Специалистам в данной области техники известно, что различная картина гликозилирования может привести к различающимся характеристикам белка. Например, эффективность терапевтического белка, продуцируемого в клетке микроорганизма-хозяина, например, дрожжевой клетке, и гликозилированного с использованием эндогенного пути дрожжей, может быть снижена по сравнению с эффективностью того же белка, экспрессируемого в клетке млекопитающего, например, клетке линии СНО. Кроме того, такие гликопротеины могут быть иммуногенными для человека и характеризоваться пониженным временем полужизни in vivo после введения. Специфические рецепторы у человека и других животных могут распознавать специфические гликозильные остатки и стимулировать быстрое выведение белка из кровотока. Другие нежелательные эффекты могут включать изменения фолдинга, растворимости, восприимчивости белка к протеазам, переноса, транспортировки, компартментализации, секреции, распознавания белка другими белками или факторами, антигенности или аллергенности белка. Соответственно, для практикующего специалиста может быть предпочтительным антитело MAT-Fab с определенным составом и картиной гликозилирования, например, составом и картиной гликозилирования, идентичными или по меньшей мере аналогичными гликозилированию антител, продуцируемых в клетках человека или в видоспецифических клетках предполагаемого субъекта-животного.
Экспрессии гликозилированных антител MAT-Fab, отличающейся от экспрессии в клетке-хозяине, можно достичь путем генетической модификации клетки-хозяина с целью экспрессии гетерологичных ферментов гликозилирования. Используя способы, известные в данной области техники, практикующий специалист может получить антитело MAT-Fab с картиной гликозилирования, характерной для человека. Например, штаммы дрожжей генетически модифицировали с целью экспрессии не встречающихся у них в природе ферментов гликозилирования, так что гликозилированные белки (гликопротеины), продуцируемые в этих штаммах дрожжей, демонстрировали гликозилирование белка, идентичное гликозилированию белка в клетках животных, в частности, клетках человека (например, публикации патентов США № 2004/0018590 и 2002/0137134).
Нуклеиновые кислоты, векторы, хозяева
В настоящем изобретении предложена одна или более выделенных нуклеиновых кислот, кодирующих одну, две, три или все четыре полипептидные цепи биспецифического антитела MAT-Fab, описанного в настоящем документе.
В настоящем изобретении также предложен вектор, содержащий одну или более выделенных нуклеиновых кислот, кодирующих один, два, три или все четыре полипептида биспецифического антитела MAT-Fab, описанного в настоящем документе. Вектор может представлять собой автономно реплицирующийся вектор или вектор, встраивающий выделенную нуклеиновую кислоту, находящуюся в указанном векторе, в геном клетки-хозяина. Кроме того, выделенные нуклеиновые кислоты, кодирующие одну, две, три или все четыре полипептидные цепи антитела MAT-Fab, можно вставить в вектор для выполнения различных генетических анализов, для экспрессии антитела MAT-Fab или для исследования или улучшения одного или более свойств антитела MAT-Fab, описанного в настоящем документе.
Вектор согласно настоящему изобретению можно применять для репликации выделенной нуклеиновой кислоты, кодирующей одну, две, три или все четыре полипептидные цепи антитела MAT-Fab, описанного в настоящем документе.
Вектор согласно настоящему изобретению можно применять для экспрессии выделенной нуклеиновой кислоты, кодирующей биспецифическое антитело MAT-Fab, описанное в настоящем документе, или для экспрессии одной или более выделенных нуклеиновых кислот, кодирующих одну или более полипептидных цепей антитела MAT-Fab.
Предпочтительные векторы для клонирования и экспрессии нуклеиновых кислот, описанных в настоящем документе, включают pcDNA, pTT (Durocher et al, Nucleic Acids Res., 30(2e9): 1-9 (2002)), pTT3 (pTT с дополнительными сайтами множественного клонирования), pEFBOS (Mizushima and Nagata, Nucleic Acids Res., 18(17): 5322 (1990)), pBV, pJV, pcDNA3.1 TOPO, pEF6 TOPO и pBJ, но не ограничиваются ими.
Кроме того, в настоящем изобретении предложена выделенная клетка-хозяин, содержащая вышеописанный вектор. Такая выделенная клетка-хозяин, содержащая вектор, описанный в настоящем документе, может представлять собой выделенную прокариотическую клетку или выделенную эукариотическую клетку.
Выделенная прокариотическая клетка-хозяин, содержащая вектор, описанный в настоящем документе, может представлять собой бактериальную клетку-хозяина. Бактериальная хозяина клетка-хозяин может представлять собой грамположительную, грамотрицательную или грамвариабельную бактериальную клетку-хозяина. Бактериальная клетка-хозяин, содержащая вектор, описанный в настоящем документе, предпочтительно представляет собой грамотрицательную бактерию. Еще более предпочтительно, бактериальная клетка-хозяин, содержащая вектор, описанный в настоящем документе, представляет клетку Escherichia coli.
Выделенная клетка-хозяин, содержащая вектор, описанный в настоящем документе, может представлять собой эукариотическую клетку-хозяина. Предпочтительные выделенные эукариотические клетки-хозяева, содержащие вектор, описанный в настоящем документе, могут включать клетку-хозяина млекопитающего, клетку-хозяина насекомого, растительную клетку- хозяина, клетку-хозяина гриба, клетку-хозяина эукариотической водоросли, клетку-хозяина нематоды, клетку-хозяина простейшего или клетку-хозяина рыбы. Выделенная клетка-хозяин млекопитающего, содержащая вектор, описанный в настоящем документе, предпочтительно выбрана из группы, состоящей из:. клетки яичника китайского хомяка (CHO), клетки COS, клетки Vero, клетки SP2/0, миеломной клетки NS/0, клетки почки эмбриона человека (HEK293), клетки почки детеныша хомяка (BHK), клетки HeLa, B-клетки человека, клетки CV-1/EBNA, L-клетки, клетки 3T3, клетки HEPG2, клетки PerC6 и клетки MDCK. Выделенные клетки-хозяева гриба, содержащие вектор, описанный в настоящем документе, предпочтительно выбраны из группы, состоящей из: Aspergillus, Neurospora, Saccharomyces, Pichia, Hansenula, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Yarrowia и Candida. Более предпочтительно, клетка-хозяин Saccharomyces, содержащая вектор, описанный в настоящем документе, представляет собой клетку Saccharomyces cerevisiae.
Кроме того, предложен способ продукции биспецифического антитела MAT-Fab, описанного в настоящем документе, включающий культивирование выделенной клетки- хозяина, содержащей вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело MAT-Fab в условиях, достаточных для продукции антитела MAT-Fab.
Еще одним аспектом настоящего изобретения является биспецифическое антитело
MAT-Fab, полученное с помощью вышеописанного способа.
Конъюгаты
3
14
35
90
99
111
131
177
166
153
В основном ввиду наличия димеризованной Fc-области биспецифическое антитело MAT-Fab согласно настоящему изобретению можно конъюгировать с различными агентами, которые в настоящее время конъюгируют с антителами IgG. Например, вышеописанное биспецифическое антитело MAT-Fab можно конъюгировать с агентом, выбранным из группы, состоящей из: молекулы иммуноадгезии, агента для визуализации, терапевтического агента и цитотоксического агента. Предпочтительный агент для визуализации, который можно конъюгировать с биспецифическим антителом MAT-Fab согласно настоящему изобретению, выбирают из группы, состоящей из: радиоактивной метки, фермента, флуоресцентной метки, люминесцентной метки, магнитной метки, биотина, стрептавидина или авидина. Радиоактивные метки, которые можно конъюгировать с биспецифическим антителом MAT-Fab, описанным в настоящем документе, включают H, C, S, Y, Tc, In, I, Lu, Ho и Sm, но не ограничиваются ими. Предпочтительные цитотоксические или терапевтические соединения, которые можно конъюгировать с биспецифическим антителом MAT-Fab, описанным в настоящем документе, включают антиметаболит, алкилирующий агент, антибиотик, фактор роста, цитокин, антиангиогенный агент, антимитотический агент, антрациклин, токсин и антиапоптозный агент, но не ограничиваются ими. В некоторых случаях антитело MAT-Fab конъюгируют непосредственно с агентом. В качестве альтернативы, антитело MAT-Fab конъюгируют с агентом посредством линкера. Подходящие линкеры включают аминокислотные и полипептидные линкеры, описанные в настоящем документе, но не ограничиваются ими. Линкеры могут быть расщепляемыми или нерасщепляемыми.
Кристаллизованные формы
Биспецифическое антитело MAT-Fab согласно настоящему изобретению можно использовать в кристаллизованной форме, полученной с использованием крупно-масштабного способа кристаллизации, например, описанного Shenoy и соавторами в международной публикации № WO 2002/072636, включенной в настоящий документ посредством ссылки. Такие способы позволяют получить молекулы антител, существенно отличающиеся от молекул, используемых в классических исследованиях рентгеновской кристаллографии. В то время как качество кристаллов имеет очень важное значение для точных измерений в исследованиях рентгеновской кристаллографии, это не относится к кристаллам, полученным крупномасштабными способами кристаллизации для фармацевтического применения. Кристаллы молекул антител, полученные с использованием крупномасштабных способов кристаллизации, являются достаточно чистыми для фармацевтических исследований и производства, сохраняют биологическую активность, особенно хорошо подходят для хранения (поскольку кристаллы антител менее подвержены нежелательным взаимодействиям, которые могут иметь место в растворах), могут использоваться для получения препаратов для парентерального введения, содержащих очень высокие концентрации молекулы биологически активного антитела, могут использоваться для получения подходящих дозированных препаратов (содержащих высокие концентрации в неводных суспензиях), могут обеспечить увеличенный период полужизни in vivo и могут быть получены в составе с (инкапсулированы в) полимерными носителями для контролируемого высвобождения молекул антител in vivo.
Особенно предпочтительным является кристаллизованное антитело MAT-Fab, сохраняющее связывающую активность, а также любую желательную биологическую активность некристаллической формы. Кристаллизованное биспецифическое антитело MAT-Fab также может обеспечивать контролируемое высвобождение MAT-Fab без носителя при введении индивиду.
Предпочтительная композиция для высвобождения кристаллизованного биспецифического антитела MAT-Fab согласно настоящему изобретению содержит кристаллизованное биспецифическое антитело MAT-Fab, описанное в настоящем документе, вспомогательный ингредиент и по меньшей мере один полимерный носитель. Вспомогательный ингредиент предпочтительно выбирают из группы, состоящей из альбумина, сахарозы, трегалозы, лактита, желатина, гидроксипропил-β-циклодекстрина, метоксиполиэтиленгликоля и полиэтиленгликоля. Полимерный носитель предпочтительно представляет собой полимер, выбранный из одной или более групп, состоящих из: полиакриловой кислоты, полицианоакрилатов, полиаминокислот, полиангидридов, полидепсипептидов, полиэфиров, полимолочной кислоты, сополимера молочной и гликолевой кислот или PLGA, поли-b-гидроксибутирата, поликапролактона, полидиоксанона; полиэтиленгликоля, полигидроксипропилметакриламида, полиорганофосфазена, поли(орто-эфиров), поливинилового спирта, поливинилпирролидона, сополимеров малеинового ангидрида и алкилвинилового эфира, плюрониловых полиолов, альбумина, целлюлозы и производных целлюлозы, коллагена, фибрина, желатина, гиалуроновой кислоты, олигосахаридов, гликаминогликанов, сульфатированных полисахаридов, их смесей и сополимеров.
Применение биспецифических антител MAT-Fab
В настоящем изобретении предложен способ лечения заболевания или нарушения у субъекта-человека, включающий введение указанному индивиду биспецифического антитела MAT-Fab, связывающего один или два эпитопа-мишени, один или два антигена-мишени или комбинацию эпитопа-мишени и антигена-мишени, считающихся вредоносными для субъекта- человека, причем связывание эпитопов или антигенов биспецифическим антителом MAT-Fab обеспечивает лечение указанного заболевания или нарушения.
Подразумевается, что нарушение, при котором эпитоп, антиген или активность антигена являются вредоносными, включает нарушение, при котором показано, что наличие эпитопа (например, эпитопа белка поверхности клетки или растворимого белка) или антигена или активности антигена у субъекта-человека, страдающего этим нарушением, обуславливает или предположительно обуславливает патофизиологию нарушения либо является или предположительно является фактором, вносящим вклад в усугубление нарушения. Соответственно, нарушение, при котором эпитоп, антиген или активность антигена является вредоносной, представляет собой нарушение, при котором ожидается, что снижение уровня эпитопа, антигена или активности антигена должно облегчить один или более симптомов нарушения или прогрессирование нарушения и, тем самым, лечение нарушения. Такие нарушения можно подтверждать, например, по увеличению концентрации антигена (или эпитопа) в крови или другой физиологической жидкости субъекта-человека, страдающего данным нарушением.
В еще одном варианте реализации настоящего изобретения предложен способ лечения субъекта-человека, страдающего нарушением, при котором один или два антигена или эпитопа- мишени, способных связываться с биспецифическим антителом MAT-Fab, описанным в настоящем документе, является вредоносным для субъекта-человека, причем указанный способ включает введение субъекту-человеку биспецифического антитела MAT-Fab, описанного в настоящем документе, таким образом, что активность одного или двух антигенов или эпитопов-мишеней у субъекта-человека ингибируется и достигается лечение.
Биспецифическое антитело MAT-Fab, описанное в настоящем документе, в особенности применимо в способе лечения нарушения, включающем «перенацеливание» (или «рекрутирование») эффекторных клеток (например, T-клеток, NK-клеток, моноцитов, нейтрофилов, макрофагов) для атаки специфических клеток-мишеней, экспрессирующих антиген, ассоциированный с нарушением, и считающихся вредоносными для субъекта-человека, в связи с чем желательно устранение или существенное снижение популяции вредоносных клеток-мишеней. Предпочтительные примеры таких вредоносных клеток-мишеней представляют собой опухолевые клетки (например, опухолевые клетки крови (включая лимфу) и клетки плотных опухолей), клетки, реагирующие на антигены собственного организма, и клетки, инфицированные вирусом. В способе перенацеливания согласно настоящему изобретению антитело MAT-Fab связывает антиген, экспрессируемый на поверхности эффекторной клетки, и антиген, экспрессируемый на поверхности клетки-мишени, являющейся вредоносной для субъекта-человека, причем связывание антитела MAT-Fab с антигеном эффекторной клетки и с антигеном вредоносной клетки активирует эффекторную клетку, которая атакует вредоносную клетку-мишень.
Соответственно, в настоящем изобретении предложен способ лечения нарушения у субъекта-человека, включающий этап введения субъекту-человеку биспецифического антитела MAT-Fab, описанного в настоящем документе, которое связывает антиген на эффекторной клетке и антиген, ассоциированный с нарушением, экспрессируемый на клетке-мишени, которая является вредоносной для субъекта-человека, причем связывание биспецифического антитела MAT-Fab как с эффекторной клеткой, так и с клеткой-мишенью активирует эффекторную клетку, которая атакует вредоносную клетку-мишень.
Одновременное связывание биспецифического антитела MAT-Fab, описанного в настоящем документе, с единственным антигеном-мишенью на эффекторной клетке и единственным антигеном-мишенью на вредоносной клетке-мишени может активировать эффекторную клетку, что приведет к атаке клетки-мишени при выгодном отсутствии массивного вредоносного высвобождения цитокинов (цитокинового шторма). Массовое высвобождение цитокинов (цитокиновый шторм) может оказывать вредоносное воздействие не только на локальные ткани, но и на более отдаленные ткани организма пациента, что может привести к возможным осложнениям и неблагоприятным побочным эффектам. Такой цитокиновый шторм может возникать при естественном иммунном ответе, при котором эффекторная клетка, например, Т-клетка, связывает антиген-презентирующую клетку (АПК), или при искусственном перекрестном связывании двух или более антигенов на поверхности эффекторной клетки двухвалентным или поливалентным антителом. В отличие от вышесказанного, благодаря конструкции биспецифического антитела MAT-Fab согласно настоящему изобретению, предусматривающей связывание антигена на эффекторной клетке только одной из связывающих единиц Fab, вероятность неспецифической активации Т-клеток и последующего цитокинового шторма значительно снижается, при этом антитело сохраняет способность активировать эффекторную клетку, что приводит к атаке вредоносной клетки-мишени, связываемой другой связывающей единицей Fab антитела MAT-Fab.
Способ перенацеливания эффекторной клетки, приводящего к атаке вредоносной клетки-мишени, предпочтительно включает контакт эффекторной клетки и вредоносной клетки- мишени с биспецифическим антителом MAT-Fab, описанным в настоящем документе, которое связывает антиген на вредоносной клетке-мишени и антиген, экспрессируемый на эффекторной клетке. Предпочтительные антигены эффекторных клеток включают CD3, CD16 (также называемый «FcγRIII») и CD64 (также называемый «FcγRI»). Более предпочтительно, данный способ включает антитело MAT-Fab, которое связывает CD3, экспрессируемый на T-клетке, CD16, экспрессируемый на естественном киллере (NK-клетке) или CD64, экспрессируемый на макрофаге, нейтрофиле или моноците.
В еще одном варианте реализации настоящего изобретения предложен способ лечения опухоли у субъекта-человека, нуждающегося в лечении, включающий стадию введения субъекту-человеку антитела MAT-Fab, которое связывает антиген на эффекторной клетке, а также связывает антиген на опухолевой клетке-мишени, причем связывание антитела MAT-Fab с эффекторной клеткой и опухолевой клеткой-мишенью активирует эффекторную клетку, которая атакует опухолевую клетку. Антиген на эффекторной клетке предпочтительно представляет собой CD3, экспрессируемый на Т-клетке.
В предпочтительном варианте реализации способ лечения опухоли у субъекта-человека, нуждающегося в лечении, включает перенацеливание эффекторной клетки, приводящее к атаке опухолевой клетки-мишени, включающее этап введения субъекту-человеку биспецифического антитела MAT-Fab, описанного в настоящем документе и связывающего антиген на эффекторной клетке и антиген на опухолевой клетке-мишени, причем антиген на опухолевой клетке-мишени выбирают из группы, состоящей из: CD19, CD20, реептора-2 эпидермального фактора роста человека («Her2»), эмбрионального опухолевого антигена («CEA»), молекулы адгезии эпителиальных клеток (EpCAM) и орфанного рецептора-1 белка, подобного рецепторной тирозинкиназе (ROR 1).
В еще одном варианте реализации настоящего изобретения предложен способ лечения опухоли, ассоциированной с В-клетками, у субъекта-человека, включающий этап введения субъекту-человеку, нуждающемуся в таком лечении, биспецифического антитела MAT-Fab, связывающего антиген на эффекторной клетке и антиген на злокачественных B-клетках. Биспецифическое антитело MAT-Fab согласно настоящему изобретению предпочтительно связывает антиген на злокачественных B-клетках при раковом заболевании, выбранном из группы, состоящей из: острого лимфобластного лейкоза, лимфомы Ходжкина, неходжкинской лимфомы (NHL), B-клеточного лимфобластного лейкоза/лимфомы с вовлечением клеток- предшественников, В-клеточных новообразований с вовлечением зрелых клеток, B-клеточного хронического лимфоцитарного лейкоза/мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы, B-клеточного пролимфоцитарного лейкоза, лимфоплазмоцитарной лимфомы, лимфомы из клеток мантии, фолликулярной лимфомы, лимфомы из центральных клеток фолликулов кожи, B-клеточной лимфомы маргинальной зоны, волосатоклеточного лейкоза, диффузной крупноклеточной B-клеточной лимфомы, лимфомы Беркитта, плазмоцитомы, плазмаклеточной миеломы, посттрансплантационного лимфопролиферативного нарушения, макроглобулинемии Вальденстрема и анапластической крупноклеточной лимфомы.
В особенно предпочтительном варианте реализации способ лечения опухоли, ассоциированной с В-клетками, у субъекта-человека включает введение субъекту-человеку биспецифического антитела MAT-Fab, описанного в настоящем документе и связывающего CD3 на T-клетке и CD20 на опухолевой B-клетке-мишени. Более предпочтительно, биспецифическое антитело MAT-Fab связывает CD20 посредством своей внешней (N-концевой) связывающей единицы Fab (например, см. Fab-содержащие домены VHA-CH1 и VLA-CL на фиг. 1А), а CD3 - внутренней (C-концевой) связывающей единицы Fab (например, см. Fab-содержащие домены VHB-CH1 и VLB-CL на фиг. 1А).
В еще одном варианте реализации способ лечения нарушения согласно настоящему изобретению может включать приведение антитела MAT-Fab в контакт с эффекторными клетками и вредоносными клетками-мишенями в процедуре ex vivo определенного типа, при которой эффекторные клетки, выделенные из организма субъекта-человека, нуждающегося в лечении, контактируют с антителом MAT-Fab за пределами организма человека, и через некоторое время, необходимое для связывания антитела MAT-Fab с эффекторными клетками, эффекторные клетки, связанные с антителом MAT-Fab, вводят субъекту-человеку таким образом, что комплексы антитела MAT-Fab, связанного с эффекторными клетками, могут быть ориентированы на связывание вредоносных клеток-мишеней, например, опухолевых клеток, в организме субъекта-человека. В еще одном варианте реализации эффекторные клетки и опухолевые клетки, выделенные из организма субъекта-человека, нуждающегося в лечении, контактируют с антителом MAT-Fab за пределами организма человека, и через некоторое время, необходимое для связывания антитела MAT-Fab с эффекторными клетками и опухолевыми клетками, эффекторные клетки и опухолевые клетки, связанные с антителом MAT-Fab, вводят субъекту-человеку.
В еще одном варианте реализации можно сконструировать биспецифическое антитело MAT-Fab, доставляющее цитотоксический агент к вредоносной клетке-мишени, например, опухолевой клетке. В этом варианте реализации одна связывающая единица Fab антитела MAT-Fab содержит сайт связывания антигена-мишени на вредоносной клетке-мишени, а другая связывающая единица Fab содержит сайт связывания цитотоксического агента. Такое сконструированное антитело MAT-Fab согласно настоящему изобретению можно смешать или иным образом привести в контакт с цитотоксическим агентом, с которым оно связывается посредством своей сконструированной связывающей единицы Fab. Затем антитело MAT-Fab, несущее связанный цитотоксический агент, можно привести в контакт с вредоносной опухолевой клеткой с целью доставки цитотоксического агента к вредоносной опухолевой клетке. Такая система доставки в особенности эффективна, если антитело MAT-Fab связывается с вредоносной опухолевой клеткой и затем интернализируется в клетку вместе со связанным цитотоксическим агентом таким образом, что цитотоксический агент может высвобождаться во вредоносной опухолевой клетке.
Кроме того, биспецифические антитела MAT-Fab, предложенные в настоящем документе, можно применять для тканеспецифической доставки (адресного действия на тканевой маркер и медиатор заболевания для усиления местной фармакокинетики и, таким образом, более высокой эффективности и/или более низкой токсичности), включая внутриклеточную доставку (мишенью которой являются интернализующий рецептор и молекула внутри клетки), доставку в головной мозг (например, адресное действие на рецептор трансферрина и медиатор заболевания центральной нервной системы (ЦНС) для преодоления гематоэнцефалического барьера). Антитела MAT-Fab также можно использовать в качестве белка-носителя для доставки антигена в конкретное место посредством связывания с ненейтрализующим эпитопом этого антигена, а также для увеличения периода полужизни антигена.
Кроме того, конструкция биспецифического антитела MAT-Fab может предусматривать физическое присоедиенние к медицинским устройствам, имплантированным в организм пациента, или адресное действие на эти медицинские устройства (см. Burke et al. (2006) Advanced Drug Deliv. Rev. 58(3): 437-446; Hildebrand et al. (2006) Surface and Coatings Technol. 200: 6318-6324; «Drug/device combinations for local drug therapies and infection prophylaxis,» Wu, Peng, et al., (2006) Biomaterials, 27(11):2450-2467; «Mediation of the cytokine network in the implantation of orthopedic devices,» Marques et al., in Biodegradable Systems in Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Reis et al., eds. (CRC Press LLC, Boca Raton, 2005) pp. 377-397). Направление клеток соответствующих типов к области медицинского имплантата может стимулировать заживление и восстановление нормального функционирования тканей. В качестве альтернативы, биспецифические антитела MAT-Fab можно применять для ингибирования медиаторов (в том числе цитокинов, но не ограничиваясь ими), высвобождающихся при имплантации устройства. В настоящем изобретении также предложено диагностическое применение, включая способы диагностического анализа, диагностические наборы, содержащие один или несколько связывающих белков, и адаптацию указанных способов и наборов для использования в автоматизированных и/или полуавтоматических системах, но не ограничиваясь ими. Предложенные способы, наборы и варианты адаптации можно использовать для обнаружения, мониторинга и/или лечения заболевания или нарушения у индивида. Это подробно освещается ниже.
Биспецифическое антитело MAT-Fab, описанное в настоящем документе, легко адаптировать в одном из различных анализов иммунологического обнаружения и форматов очистки, существующих в данной области техники и предназначенных для обнаружения, количественной оценки или выделения антигена-мишени или клетки, экспрессирующей антиген-мишень. Такие форматы включают анализы на основе иммуноблоттинга (например, вестерн-блоттинг); иммуноаффинную хроматографию, например, при адсорбции или связывании биспецифического антитела MAT-Fab с хроматографической смолой или гранулами; анализы иммунопреципитации; иммуночипы; анализы на основе иммуногистохимии тканей; проточную цитометрию (в том числе сортировку клеток с активацией флуоресценции); сэндвич-иммуноанализы; иммуночипы, где антитело MAT-Fab иммобилизовано или связано с подложкой; радиоиммуноанализ (РИА); иммуноферментный анализ (ИФА); твердофазный иммуноферментный анализ (твердофазный ИФА); конкурентные иммуноанализы с ингибированием; флуоресцентный поляризационный иммуноанализ (ФПИА); методику иммуноанализа с ферментативным усилением (EMIT); резонансный перенос энергии биолюминесценции (BRET); и гомогенный хемилюминесцентный анализ, но не ограничиваются ими. Настоящее изобретение обеспечивает способы с использованием масс-спектрометрии, которые включают MALDI (лазерная десорбция-ионизация с активацией матрицы) или SELDI (лазерная десорбция-ионизация, усиленная поверхностью) с фрагментом MAT-Fab, связывающего антиген-мишень или эпитоп на антигене или его фрагмент, но не ограничиваются ими.
Кроме того, в настоящем изобретении предложен способ обнаружения антигена в образце (например, смеси, композиции, растворе или биологическом образце), включающий контакт образца с биспецифическим антителом MAT-Fab согласно настоящему изобретению, связывающим антиген-мишень. Биологические образцы, которые можно использовать в качестве образца для анализа иммунологического обнаружения согласно настоящему изобретению, включают, без ограничения, цельную кровь, плазму, сыворотку, экстракты различных тканей, слезы, слюну, мочу и другие физиологические жидкости. Иммунологический анализ согласно настоящему изобретению предпочтительно позволяет обнаруживать любое из следующего: биспецифическое антитело MAT-Fab, связанное с антигеном-мишенью, комплекс биспецифического антитела MAT-Fab и антигена-мишени, или биспецифическое антитело MAT-Fab, остающееся в несвязанном состоянии. В способах обнаружения комплекса связывания, содержащего антиген-мишень и антитело MAT-Fab, предпочтительно используют систему обнаружения, которая использует одну или более молекул, генерирующих сигнал (обнаружимых меток), которые должны генерировать сигнал, легко обнаруживаемый невооруженным глазом или легко обнаруживаемый или измеряемый прибором для обнаружения сигнала (например, спектрофотометром). Биспецифическое антитело MAT-Fab можно непосредственно или косвенно пометить системой, генерирующей обнаружимый сигнал, с целью облегчения обнаружения связанного или несвязанного биспецифического антитела MAT-Fab. Обнаружимые сигналы, которые можно использовать при обнаружении комплекса связывания, содержащего антиген-мишень и биспецифическое антитело MAT-Fab, включают флуоресцентный сигнал (например, генерируемый флуоресцентным красителем или молекулой цианина, которую можно связать с одной из связывающих единиц Fab антитела MAT-Fab или другим способом присоединить к антителу MAT-Fab); видимый цветной сигнал (например, генерируемый ферментом или окрашенной молекулой (например, пигментом), который также можно непосредственно или косвенно присоединить к антителу MAT-Fab); радиоактивный сигнал (например, генерируемый радиоизотопом, который можно непосредственно или косвенно присоединить к антителу MAT-Fab); и световой сигнал (например, генерируемый хемилюминесцентной или биолюминесцентной системой), но не ограничиваются ими. Примером биолюминесцентной системы является система люциферин-люцифераза, в которой люциферазу можно непосредственно или косвенно присоединить к антителу MAT-Fab или вторичному антителу для обнаружения с целью генерации обнаружимого светового сигнала в присутствии субстрата люциферина.
Предпочтительный фермент, который можно применять в анализе иммунологического обнаружения согласно настоящему изобретению, представляет собой фермент, способный обеспечивать обнаруживаемый сигнал при контакте с одним или более реагентами. Такие ферменты включают пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, β-галактозидазу или ацетилхолинэстеразу, но не ограничиваются ими.
Примеры подходящих флуоресцентных материалов, которые можно применять в анализе иммунологического обнаружения согласно настоящему изобретению, включают умбеллиферон, флуоресцеин, флуоресцеинизотиоцианат, родамин, дихлортриазиниламинфлуоресцеин, дансилхлорид и фикоэритрин, но не ограничиваются ими.
Примером люминесцентного материала, который можно применять в анализе иммунологического обнаружения согласно настоящему изобретению, является люминол.
3
14
35
90
99
111
125
131
177
166
153
Примеры подходящих радиоактивных изотопов, которые можно применять в анализе иммунологического обнаружения согласно настоящему изобретению, включают H, C, S, Y, Tc, In, I, I, Lu, Ho и Sm, но не ограничиваются ими.
Фармацевтические композиции
Настоящее изобретение обеспечивает фармацевтические композиции для применения в целях лечения субъекта-человека, содержащие биспецифическое антитело MAT-Fab, описанное в настоящем документе. Такие композиции получают с использованием методик и ингредиентов, хорошо известных в данной области для получения фармацевтических композиций для введения терапевтических антител субъектам-людям. Композицию, содержащую антитело MAT-Fab, описанное в настоящем документе, можно составить для введения любым из различных способов или путей введения. Композицию, содержащую антитело MAT-Fab, описанное в настоящем документе, можно составить для парентерального или непарентерального введения. Композицию, содержащую антитело MAT-Fab для применения в лечении рака, аутоиммунного заболевания или воспалительного заболевания, можно составить для парентерального введения, например, внутривенного, подкожного, внутрибрюшинного или внутримышечного введения, но не ограничиваясь этим. Более предпочтительно, композицию составляют для внутривенного введения. Такое парентеральное введение предпочтительно выполняют путем инъекции или вливания композиции.
Композиции, содержащие антитело MAT-Fab для введения человеку, могут содержать эффективное количество антитела MAT-Fab в комбинации с одним или более фармацевтически приемлемых компонентов, например, фармацевтически приемлемым носителем (средой-носителем, буфером), вспомогательным веществом или другим ингредиентом. Под термином «фармацевтически приемлемый» подразумевается, что соединение, компонент или ингредиент композиции совместимы с физиологией субъекта-человека, а также не оказывает вредоносного влияния на эффективную активность компонента антитела MAT-Fab или на желательное свойство или активность любого другого компонента, который может присутствовать в композиции для введения субъекту-человеку. Примеры фармацевтически приемлемых носителей включают воду, физиологический раствор, физиологический раствор с фосфатным буфером, декстрозу, глицерин, этанол и т.п., а также их комбинации, но не ограничиваются ими. Во многих случаях может быть предпочтительным включение в композицию изотонических агентов, в том числе углеводов, многоатомных спиртов, например, маннита или сорбита; хлорида натрия и их комбинаций, но не ограничиваясь ими. Фармацевтически приемлемые носители могут дополнительно содержать незначительные количества вспомогательных веществ, например, увлажнителей или эмульгаторов, консервантов или буферов для увеличения периода полужизни или эффективности композиции. Вспомогательное вещество в общем случае представляет собой любое соединение или комбинацию соединений, придающее композиции желательное свойство, помимо основной терапевтической активности. Может быть необходима коррекция рН композиции, например, для стимуляции или поддержания растворимости ингредиентов, поддержания стабильности одного или более ингредиентов состава и/или для сдерживания нежелательного роста микроорганизмов, которые потенциально могут быть внесены в нее в некоторые моменты процедуры.
Композиции, содержащие антитело MAT-Fab, могут также содержать один или более других ингредиентов, например, других лекарственных средств (например, противораковый агент, антибиотик, противовоспалительное соединение и противовирусный агент), наполнителей, адъювантов и их комбинаций.
Композиция согласно настоящему изобретению может находиться в различных формах. Эти формы включают жидкие, полужидкие и твердые лекарственные формы, дисперсии, суспензии, таблетки, пилюли, порошки, липосомы и суппозитории, но не ограничиваются ими. Предпочтительная форма зависит от предполагаемого пути введения. Предпочтительные композиции находятся в форме растворов для инъекций или вливаний, например, композиции, аналогичные композициям, применяемым для введения терапевтических антител, утвержденных для применения у людей. В предпочтительном варианте реализации антитело MAT-Fab, описанное в настоящем документе, вводят аутем внутривенной инъекции или вливания. В еще одном варианте реализации антитело MAT-Fab вводят путем внутримышечной или подкожной инъекции.
Терапевтические композиции должны быть стерильными и стабильными в условиях производства и хранения. Композицию можно составить в виде раствора, микроэмульсии, дисперсии, липосомы или другой структуры, подходящей для высокой концентрации лекарственного агента. Стерильные растворы для инъекций можно получить путем включения активного соединения, т.е. антитела MAT-Fab, в необходимом количестве в соответствующий растворитель, необязательно в комбинации с ингредиентами, обеспечивающими желательное свойство композиции, с последующей стерилизацией фильтрованием в соответствии с требованиями. Как правило, дисперсии изготавливают путем включения активного соединения в стерильную среду-носитель, содержащую основную дисперсионную среду (например, стерильную воду, стерильный изотонический физиологический раствор и т.п.) и, необязательно, один или более других ингредиентов, которые могут потребоваться для получения надлежащей дисперсии. В случае стерильных лиофилизированных порошков для приготовления стерильных растворов для инъекций предпочтительные способы изготовления включают вакуумную сушку и распылительную сушку, которые позволяют получить порошок активного ингредиента в сочетании с любым дополнительным желательным ингредиентом из его раствора, ранее стерилизованного фильтрацией. Надлежащую текучесть раствора можно поддерживать, например, путем использования покрытий, например, лецитина, путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсии и путем использования ПАВ. Длительное поглощение композиций, вводимых путем инъекции, можно осуществить путем включения в композицию агента, замедляющего поглощение, например, соли - моностеарата и/или желатина.
Антитело MAT-Fab можно вводить с помощью разнообразных способов, известных в данной области техники. Практикующий специалист должен принимать во внимание, что путь или режим введения варьируется в зависимости от желательных результатов. В некоторых вариантах реализации антитело MAT-Fab можно изготовить в комбинации с носителем, защищающим антитело от быстрого высвобождения, например, в виде состава для контролируемого высвобождения, включая имплантаты, трансдермальные пластыри и микрокапсулированные системы доставки. Можно использовать биоразлагаемые биосовместимые полимеры, например, этиленвинилацетат, полиангидрид, полигликолевую кислоту, коллаген, полиортоэфир и полимолочную кислоту. Различные способы изготовления таких составов известны специалистам в данной области техники.
Вышеописанную фармацевтическую композицию для введения индивиду можно изготовить посредством по меньшей мере одного способа, выбранного из группы, состоящей из: парентерального, подкожного, внутримышечного, внутривенного, внутрисуставного, внутрибрюшного, внутрикапсулярного, внутрихрящевого, внутриполостного, внутримозжечкового, интрацеребровентрикулярного, внутрикишечного, интрацервикального, внутрижелудочного, внутрипеченочного, внутрисердечного, внутрикостного, внутритазового, внутриперикардиального, внутрибрюшинного, внутриплеврального, внутрипростатного, внутрилегочного, интраректального, внутрипочечного, интраретинального, интраспинального, интрасиновиального, внутригрудного, внутриматочного, внутрипузырного, болюсного, вагинального, ректального, буккального, сублингвального, интраназального и трансдермального введения.
Дополнительные варианты реализации и особенности настоящего изобретения станут очевидны из следующих неограничивающих примеров.
ПРИМЕРЫ
Пример 1. Конструирование, экспрессия, очистка и анализ биспецифического антитела CD20/CD3 MAT-Fab
Для демонстрации технологии MAT-Fab получили примеры биспецифического антитела CD20/CD3 MAT-Fab, различающиеся по мутациям типа «выступ-во-впадину» в Fc-области:
MAT-Fab (KiH1) и MAT-Fab (KiH2).
Для получения антител MAT-Fab синтезировали de novo ДНК, кодирующую каждую полипептидную цепь.
Конструкт ДНК, использованный для получения антител MAT-Fab, способных связывать CD3 и CD20, кодировал вариабельные и константные домены исходных моноклональных антител (мАт). Каждое антитело MAT-Fab состояло из четырех полипептидов, приведенных ниже на схеме:
где «(KiH)» означает наличие одной или более мутаций, благоприятствующих или стабилизирующих гетеродимеризацию CH3-домена в тяжелой цепи и Fc-цепи, антиген «A» представляет собой CD20, а антиген «B» представляет собой CD3.
Два конструкта, обозначенные как MAT-Fab (KiH1) и MAT-Fab (KiH2), различались только по мутациям типа «выступ-во-впадину» в Fc-областях, благоприятствующим гетеродимеризации.
Вкратце, исходные мАт включали два антитела с высокой аффинностью - мАт против CD20 (офатумумаб) и мАт против CD3 (публикация патента США № 2009/0252683).
Конструкты тяжелых цепей MAT-Fab KiH1 и MAT-Fab KiH2
Для продукции тяжелых цепей биспецифических антител MAT-Fab (KiH1) и MAT-Fab (KiH2) конструкт ДНК кодировал сигнальный пептид из 22 аминокислот, присоединенный к VL- CL легкой цепи исходного мАт против CD20 (офатумумаб), присоединенной к N-концу области VH-CH1 исходного мАт против CD3 (публикация патента США № 2009/0252683), присоединенной к области шарнир-CH2 исходного мАт против CD3, присоединенной к мутированной CH3-области IgG1, полученной из исходного мАт против CD3.
610
213
CH3-домен тяжелой цепи биспецифического антитела MAT-Fab (KiH1) мутировали для замены остатка треонина (T) на остаток тирозина (Y) для образования структурного выступа по остатку 21 CH3-домена. См. Y в SEQ ID NO:1 в таблице 1 ниже (остаток выделен подчеркнутым шрифтом), где показана эта мутация. Соответствующее положение CH3-домена Fc-цепи MAT-Fab (KiH1) мутировали для замены остатка тирозина (Y) на остаток треонина (T) для образования структурного выступа по остатку 62 CH3-домена. См. T в SEQ ID NO:4 в таблице 4 ниже (остаток выделен подчеркнутым шрифтом), где показана эта мутация.
172
174
213
CH3-домен тяжелой цепи биспецифического антитела MAT-Fab (KiH2) мутировали для замены остатка треонина (T) на триптофан (W) для образования структурного выступа в CH3- домене. См. W610 в SEQ ID NO:5 в таблице 5 ниже (остаток выделен подчеркнутым шрифтом), где показана эта мутация. CH3-домен Fc-цепи MAT-Fab (KiH2) мутировали для замены треонина (T) на серин (S), лейцина (L) на аланин (A) и тирозина (Y) на валин для образования структурной впадины в CH3-домене. См. S, A и V в SEQ ID NO:8 в таблице 8 ниже (остаток выделен подчеркнутым шрифтом), где показаны эти мутации.
598
155
CH3-домен тяжелой цепи биспецифического антитела MAT-Fab (KiH2) также мутировали для замены остатка серина (S) на остаток цистеина (C); а в Fc-цепи биспецифического антитела MAT-Fab (KiH2) вносили соответствующую мутацию для замены остатка тирозина (Y) на остаток цистеина (C). Внедрение этих остатков цистеина (C) обеспечивает образование дисульфидной связи с комплементарно мутированным CH3-доменом полипептидной Fc-цепи, что приводит к улучшенной стабильности гетеродимера. См. C в SEQ ID NO:5 в таблице 5 (остаток выделен подчеркнутым шрифтом) и C в SEQ ID NO:8 в таблице 8 ниже (остаток выделен подчеркнутым шрифтом), где показаны эти замены на цистеин.
478
479
40
41
478
479
40
41
Тяжелые цепи и Fc-цепи как MAT-Fab KiH1, так и MAT-Fab KiH2 также мутировали для замены двух остатков лейцина в положениях 18-19 области шарнир-CH2 на два остатка аланина с целью ослабления или устранения эффекторных функций ADCC/CDC (Canfield et al. J. Exp. Med., 173(6): 1483-1491 (1991)). Эти мутации замены лейцина на аланин показаны в AA в SEQ ID NO:1 в таблице 1, AA в SEQ ID NO:4 в таблице 4, AA в SEQ ID NO:5 в таблице 5 и AA в SEQ ID NO:8 в таблице 8.
Конструкты первых легких цепей MAT-Fab KiH1 и MAT-Fab KiH2
Для получения первых легких цепей биспецифических антител MAT-Fab (KiH1) и MAT-Fab (KiH2) конструкт ДНК кодировал сигнальный пептид из 19 аминокислот, присоединенный к фрагменту VH-CH1 исходного мАт против CD20 (офатумумаба).
Конструкты вторых легких цепей MAT-Fab KiH1 и MAT-Fab KiH2
Для получения вторых легких цепей биспецифических антител MAT-Fab (KiH1) и MAT-Fab (KiH2) конструкт ДНК кодировал сигнальный пептид из 20 аминокислот, присоединенный к фрагменту VL-CL легкой цепи исходного мАт против CD3 (публикация патента США № 2009/0252683).
Конструкты Fc-цепей MAT-Fab KiH1 и MAT-Fab KiH2
Для продукции полипептидных Fc-цепей биспецифических антител MAT-Fab (KiH1) и MAT-Fab (KiH2) конструкт ДНК кодировал сигнальный пептид из 22 аминокислот (такой же, как для конструктов тяжелой цепи), присоединенный к области шарнир-CH2 исходного мАт против CD3, присоединенной к мутированной области CH3 изотипа IgG1, содержащей мутации, обсуждавшиеся выше в обусждении конструктов тяжелой цепи MAT-Fab.
CH3-домен тяжелой цепи для Fc-цепи биспецифического антитела MAT-Fab (KiH2) мутировали для замены остатка тирозина (Y) на остаток треонина (T) с целью образования структурной впадины в CH3-домене, комплементарной мутации структурного выступа в CH3- домене тяжелой цепи (см. выше).
CH3 домен Fc-цепи биспецифического антитела MAT-Fab (KiH2) мутировали для замены остатка треонина (T) на остаток серина (S), замены остатка лейцина (L) на остаток аланина (A) и замены остатка тирозина (Y) на остаток валина (V) для образования структурной впадины в CH3-домене. CH3-домен также мутировали для замены остатка тирозина (Y) на остаток цистеина (C). Внедрение этого остатка цистеина (C) обеспечивает образование дисульфидной связи с вышеописанным комплементарно мутированным CH3-доменом тяжелой цепи MAT-Fab (KiH2), что дополнительно стабилизирует гетеродимеризацию.
Аминокислотные последовательности указанных четырех полипептидных цепей биспецифических антител MAT-Fab (KiH1) и MAT-Fab (KiH2) показаны ниже в таблицах. Таблица 1. Тяжелая цепь биспецифического антитела CD20/CD3 MAT-Fab (KiH1)
12345678901234567890123456789012345678901234567890
Тяжелая цепь MAT-Fab (KiH1)
MDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRCEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSL EPEDFAVYYCQQRSNWPITFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSG TASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSST LTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECEVQLLESGGGLVQP GGSLKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYAD SVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAY WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTV SWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKP SNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVL TVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRE EMTKNQVSLYCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:1)
сигнальнаяпоследовательность
остатки 1-22 SEQ ID NO:1
VL-областьофатумумаба противCD20
остатки 23-129 SEQ ID NO:1
CL офатумумаба
остатки 130-236 SEQ ID NO:1
VH против CD3
остатки 237-361 SEQ ID NO:1
CH1
остатки 362-460 SEQ ID NO:1
шарнир-CH2
остатки 461-588 SEQ ID NO:1
мутированный(KiH1) CH3
остатки 589-691 SEQ ID NO:1
Таблица 2. Первая легкая цепь биспецифического антитела CD20/CD3 MAT-Fab (KiH1)
12345678901234567890123456789012345678901234567890
Первая легкая цепьMAT-Fab (KiH1)
MEFGLSWLFLVAILKGVQCEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFNDYAMHWVRQAPGKGLEWVSTISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKKSLYL QMNSLRAEDTALYYCAKDIQYGNYYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVF PLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC  (SEQ ID NO:2)
сигнальнаяпоследовательность
остатки 1-19 SEQ ID NO:2
VH-областьофатумумаба противCD20
остатки 20-141 SEQ ID NO:2
CH1 офатумумаба
остатки 142-244 SEQ ID NO:2
Таблица 3. Вторая легкая цепь биспецифического антитела CD20/CD3 MAT-Fab (KiH1)
12345678901234567890123456789012345678901234567890
Вторая легкая цепьMAT-Fab (KiH1)
MTWTPLLFLTLLLHCTGSLSELVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGV QPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQA NKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSY LSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS (SEQ ID NO:3)
сигнальнаяпоследовательность
остатки 1-20 SEQ ID NO:3
VL-область противCD3
остатки 21-129 SEQ ID NO:3
CL против CD3
остатки 130-235 SEQ ID NO:3
Таблица 4. Полипептидная Fc-цепь CD20/CD3 MAT-Fab (KiH1)
12345678901234567890123456789012345678901234567890
Полипептидная Fc-цепь MAT-Fab(KiH1)
MDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRCPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPR EPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTT PPVLDSDGSFFLTSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLS PGK (SEQ ID NO:4)
сигнальнаяпоследовательность
остатки 1-22 SEQ ID NO:4
шарнир-CH2
остатки 23-150 SEQ ID NO:4
мутированный(KiH1) CH3
остатки 151-253 SEQ ID NO:4
Таблица 5. Тяжелая цепь биспецифического антитела CD20/CD3 MAT-Fab (KiH2)
12345678901234567890123456789012345678901234567890
Тяжелая цепь MAT-Fab (KiH2)
MDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRCEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSL EPEDFAVYYCQQRSNWPITFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSG TASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSST LTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECEVQLLESGGGLVQP GGSLKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYAD SVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAY WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTV SWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKP SNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVL TVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRE EMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK  (SEQ ID NO:5)
сигнальнаяпоследовательность
остатки 1-22 SEQ ID NO:5
VL-областьофатумумаба противCD20
остатки 23-129 SEQ ID NO:5
CL офатумумаба
остатки 130-236 SEQ ID NO:5
VH против CD3
остатки 237-361 SEQ ID NO:5
CH1
остатки 362-460 SEQ ID NO:5
шарнир-CH2
остатки 461-588 SEQ ID NO:5
мутированный(KiH2)CH3
остатки 589-691 SEQ ID NO:5
Таблица 6. Первая легкая цепь биспецифического антитела CD20/CD3 MAT-Fab (KiH2)
12345678901234567890123456789012345678901234567890
Первая легкая цепьMAT-Fab (KiH2)
MEFGLSWLFLVAILKGVQCEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFNDYAMHWVRQAPGKGLEWVSTISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKKSLYL QMNSLRAEDTALYYCAKDIQYGNYYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVF PLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC  (SEQ ID NO:6)
сигнальнаяпоследовательность
остатки 1-19 SEQ ID NO:6
VH-областьофатумумаба противCD20
остатки 20-122 SEQ ID NO:6
CH1 офатумумаба
остатки 123-244 SEQ ID NO:6
Таблица 7. Вторая легкая цепь биспецифического антитела CD20/CD3 MAT-Fab (KiH2)
12345678901234567890123456789012345678901234567890
Вторая легкая цепьMAT-Fab (KiH2)
MTWTPLLFLTLLLHCTGSLSELVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGV QPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQA NKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSY LSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS (SEQ ID NO:7)
сигнальнаяпоследовательность
остатки 1-20 SEQ ID NO:7
VL-область противCD3
остатки 21-129 SEQ ID NO:7
CL против CD3
остатки 130-235 SEQ ID NO:7
Таблица 8. Полипептидная Fc-цепь CD20/CD3 MAT-Fab (KiH2)
12345678901234567890123456789012345678901234567890
Полипептидная Fc-цепь MAT-Fab(KiH2)
MDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRCPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPR EPQVCTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTT PPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLS PGK (SEQ ID NO:8)
сигнальнаяпоследовательность
остатки 1-22 SEQ ID NO:8
шарнир-CH2
остатки 23-150 SEQ ID NO:8
мутированный(KiH2) CH3
остатки 151-253 SEQ ID NO:8
Уровни экспрессии
Вышеописанные конструкты ДНК, кодирующие каждую из четырех полипептидных цепей для MAT-Fab (KiH1) и MAT-Fab (KiH2), клонировали в экспрессирующий вектор pTT стандартными способами. Затем полученные рекомбинантные векторы pTT, кодирующие SEQ ID NO:1-4 или кодирующие SEQ ID NO:5-8, совместно трансфицировали в клетки HEK 293E для экспрессии соответствующих биспецифических антител MAT-Fab (KiH1) и MAT-Fab (KiH2). Уровни экспрессии в культурах клеток показаны ниже в таблице.
Таблица 9.
Конструкт
Уровень экспрессии
MAT-Fab (KiH1)
20,6 мг/л
MAT-Fab (KiH2)
36,7 мг/л
Очистка и исследование характеристик
После завершения фазы продукции культуры клеток собирали и подвергали очистке белка путем аффинной хроматографии с белком А.
Мономерные фракции каждого из препаратов антител MAT-Fab после одноэтапной очистки путем хроматографии с белком А определяли посредством эксклюзионной хроматографии (SEC). Результаты SEC-анализа показаны на фигурах 2 и 3.
SEC-анализ позволил выявить, что 98,19% препарата антитела MAT-Fab (KiH1) и 95,7% препарата антитела MAT-Fab (KiH2) были представлены единственным веществом («мономерная фракция»).
Сортировка клеток с активацией флуоресценции (FACS)
Способность очищенных MAT-Fab (KiH1) и MAT-Fab (KiH2) связывать антигены- мишени CD20 и CD3, экспрессируемые на поверхности клеток, проверяли путем сортировки клеток с активацией флуоресценции (FACS) с использованием протоколов, описанных ниже.
Оборудование
Серийный номер BD FACSVerse: 01131005894
Серийный номер Olympus CKX41: 01121005367
Серийный номер центрифуги Eppendorf 5810R: 01121005414
Серийный номер Thermo Series II с водяной рубашкой: 01121005408
Материалы и реагенты
Круглодонная пробирка BD Falcon, № по каталогу 352052 № партии 3070549 96-луночный планшет для тканевых культур с U-образным дном и низким уровнем испарения, № по каталогу 353077 № партии 34285048
ФБС, GIBCO № по каталогу 10099, партия 1652792
PBS, GIBCO № по каталогу 10010, партия 1710584
Среда RPMI 1640(1×), GIBCO № по каталогу A10491, № партии 1747206
Антитело мыши против lgG1 человека Alexa Fluor 488. Invitrogen, № по каталогу A-10631, партия
1744792
Линии клеток
Jurkat, ATCC № по каталогу TIB-152, представляет собой линию клеток Т-клеточного лейкоза, экспрессирующую поверхностный антиген CD3.
Raji, ATCC № по каталогу CCL-86, партия 60131961, представляет собой линию В-клеточной лимфомы Беркитта, экспрессирующую поверхностный антиген CD20.
Антитела для FACS
Описание антител
Мишень
Молекулярнаямасса(килодальтон)
мг/мл
IgG1 человека противRAC
низкомолекулярное соединение
150
1,44
MAT-Fab (KiH1)
CD20 и CD3
150
2.19
MAT-Fab (KiH2)
CD20 и CD3
150
2
Процедура FACS
1. Формировали аликвоты по 5×105 клеток в ледяном PBS.
2. Клетки блокировали в 2% ФБС/ФСБ в течение 30 на льду.
3. Клетки инкубировали с антителами против CD20 в течение 1 ч на льду. Исходная концентрация антитела составляла (133,33 нМ) 20 мкг/мл; антитело последовательно разбавляли в соотношении 1:5. Объем каждого разведения составлял 200 мкл.
4. Трижды промывали ФСБ, центрифугировали при 2000 об/мин в течение 5 мин при 4°С.
5. Клетки инкубировали с вторичным антителом мыши против Fc IgG1 человека, 100 мкл (10 мкг/мл) антитела мыши против IgG1 Alexa Fluor 488 (AF488) (разбавленным в соотношении 1:100) в течение 1 ч на льду и держали без доступа света.
6. Трижды промывали ФСБ, центрифугировали при 2000 об/мин в течение 5 мин при 4°С.
7. Клетки ресуспендировали в ФСБ. Среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) определяли на проточном цитометре BD FACSVerse.
Результаты
Результаты показаны на Фигурах 4 и 5. Оба биспецифические антитела MAT-Fab были способны связывать CD20 и CD3 на B-клетках (клетках CD20 Raji) и T-клетках (клетках CD3 Jurkat), соответственно.
Функциональная активность по индукции апоптоза В-клеток в присутствии Т-клеток
Способность очищенных MAT-Fab (KiH1) и MAT-Fab (KiH2) связывать антигены-мишени CD20 и CD3, экспрессируемые на поверхности клеток, проверяли путем анализа апоптоза В-клеток с использованием протоколов, описанных ниже.
Оборудование
Серийный номер BD FACSVerse: 01131005894
Серийный номер Olympus CKX41: 01121005367
Серийный номер центрифуги Eppendorf 5810R: 01121005414
Серийный номер Thermo Series II с водяной рубашкой: 01121005408
Материалы и реагенты
Круглодонная пробирка BD Falcon, № по каталогу 352052 № партии 3070549 96-луночный планшет для тканевых культур с U-образным дном и низким уровнем испарения, № по каталогу 353077 № партии 4292046
ФБС, GIBCO № по каталогу 10099, партия 1652792
ФСБ, GIBCO № по каталогу 10010, партия 1710584
Среда RPMI 1640(1×), GIBCO № по каталогу 11875, № партии 1731226 Фиколл-пак Ficoll Paque Plus, GE HEALTHCARE, № по каталогу GE17144002, партия 10237843 PE-антитело мыши против CD19 человека, BD Pharmingen, № по каталогу 555413, партия: 5274713
Линии клеток
Raji, ATCC № по каталогу CCL-86, партия 60131961.
Номер донора: 00123
Антитела для анализа апоптоза В-клеток
Название антитела
№ партии
Специфичность антитела
MAT-Fab (KiH1)
160411002
CD20/CD3
Офатумумаб
20140225B
CD20
мАт против CD3
Pr2016012817
CD3
MAT-Fab (KiH2)
160429004
CD20/CD3
Процедуры
Процедура выделения мононуклеарных клеток
Подготовка образца крови
1. 100 мл свежей крови человека отбирали в пробирки с антикоагулянтом.
2. К крови добавляли равный объем RPMI1640 (100 мл) и аккуратно перемешивали.
3. Среду с градиентом плотности фиколл-пак нагревали до 18-20°C перед использованием.
4. Флакон со средой фиколл-пак несколько раз переворачивали для гарантии тщательного перемешивания.
5. Среду фиколл-пак (15 мл) добавляли в 50-мл центрифужную пробирку.
6. Разбавленный образец крови (20 мл) осторожно наслаивали на раствор среды фиколл-пак без перемешивания раствора среды фиколл-пак и разбавленного образца крови.
7. Фиколл-пак с образцом крови центрифугировали при 400 g в течение 30-40 мин при температуре от 18°С до 20°С.
8. Слой мононуклеарных клеток переносили из градиента в стерильную центрифужную пробирку. Промывка изолята клеток
1. Выполняли оценку объема перенесенных мононуклеарных клеток и к мононуклеарным клеткам в центрифужной пробирке добавляли по меньшей мере 3 объема ФСБ.
2. Клетки и ФСБ центрифугировали при 400-500 x g в течение 10 min при температуре от 18°С до 20°С, надосадочную жидкость удаляли.
3. Повторно выполняли промывку.
4. Надосадочную жидкость удаляли, а клеточный осадок ресуспендировали в буфере для анализа.
Истощение B-клеток
Среда для анализа представляла собой RPMI1640 с добавлением 10% ФБС
5
1. Клетки-мишени (клетки Raji) собирали в логарифмической фазе роста и однократно промывали средой для анализа. Плотность клеток доводили до 5 × 10 клеток/мл и 100 мкл суспензии клеток вносили в каждую лунку планшета для анализа.
2. Антитело для анализа последовательно разбавляли и добавляли в каждую лунку вышеуказанного планшета для анализа в объеме 50 мкл. Конечная исходная концентрация антитела составляла 50 мг/мл и в дальнейшем подвергалась последовательному разбавлению.
6
3. Плотность МПК доводили до 2,5 × 10 клеток/мл и 100 мкл суспензии клеток вносили в каждую лунку планшета для анализа (соотношение эффекторных клеток и клеток-мишеней 5:1).
2
4. Планшеты для анализа инкубировали при 37°С с 5% CO с течение 1 дня, 2 дней и 3 дней.
В 1, 2 и 3 дни образцы собирали центрифугированием при 2000 об/мин в течение 5 мин при 4°С и однократно промывали ФСБ.
5. Каждый образец инкубировали с 50 мкл с PE-конъюгированным антителом для обнаружения против CD19 человека, разбавленным в соотношении 1:5, в течение 30 минут на льду.
6. Образцы промывали ФСБ и анализировали с помощью FACSVerse.
Результаты
Результаты показаны на фигуре 6. Ко 2 дню анализа истощения клеток оба биспецифические антитела MAT-Fab могли индуцировать апоптоз В-клеток, опосредованный T- клетками.
Все патенты, заявки и публикации, процитированные в вышеприведенном тексте, включены в настоящий документ посредством ссылок.
Дополнительные модификации и варианты реализации изобретения, описанного в настоящем документе, очевидны для специалистов в данной области техники без отхода от описания настоящего изобретения или формулы изобретения, приведенной ниже.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> EPIMAB BIOTHERAPEUTICS, INC.
WU, Chengbin
<120> Одновалентные асимметричные биспецифические антитела с
тандемным Fab
<130> EPM-103.1P
<140>
<141>
<150> PCT/US2017/046875
<151> 15.08.2017
<150> PCT/CN2016/109267
<151> 09.12.2016
<150> PCT/CN2016/095546
<151> 16.08.2016
<160> 8
<170> Версия PatentIn 3.5
<210> 1
<211> 691
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> гибридный иммуноглобулин, использующий последовательности,
происходящие из различных организмов
<400> 1
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1               5                   10                 15
Phe Pro Gly Ser Arg Cys Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr
20                  25                  30
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser
35                  40                 45
Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
50                  55                  60
Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile
65                  70                  75                 80
Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
85                  90                 95
Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
100                 105                 110
Arg Ser Asn Trp Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile
115                 120                 125
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
130                 135                 140
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
145                 150                 155                160
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
165                 170                175
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
180                 185                 190
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
195                 200                 205
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
210                 215                 220
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Glu Val Gln Leu
225                 230                 235                240
Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu
245                 250                255
Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr Ala Met Asn Trp
260                 265                270
Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg
275                 280                 285
Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp
290                 295                300
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln
305                 310                 315                320
Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg
325                 330                335
His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly
340                 345                350
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
355                 360                365
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
370                 375                380
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
385                 390                 395                400
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
405                 410                415
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
420                 425                430
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
435                 440                445
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
450                 455                460
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
465                 470                 475                480
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
485                 490                495
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
500                 505                 510
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
515                 520                 525
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
530                 535                 540
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
545                 550                555                 560
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
565                 570                575
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
580                 585                 590
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
595                 600                605
Leu Tyr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
610                 615                620
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
625                 630                635                 640
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
645                 650                655
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
660                 665                670
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
675                 680                685
Pro Gly Lys
690
<210> 2
<211> 244
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly
1                5                  10                  15
Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20                  25                  30
Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35                  40                  45
Asn Asp Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50                  55                  60
Glu Trp Val Ser Thr Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala
65                  70                  75                 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys
85                  90                  95
Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu
100                 105                110
Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Ile Gln Tyr Gly Asn Tyr Tyr Tyr Gly Met
115                 120                125
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
130                 135                140
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
145                150                 155                160
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
165                 170                 175
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
180                 185                 190
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
195                 200                 205
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
210                 215                 220
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
225                 230                 235                240
Pro Lys Ser Cys
<210> 3
<211> 235
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> гуманизированная легкая цепь иммуноглобулина мыши
<400> 3
Met Thr Trp Thr Pro Leu Leu Phe Leu Thr Leu Leu Leu His Cys Thr
1                5                  10                  15
Gly Ser Leu Ser Glu Leu Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val
20                  25                  30
Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala
35                  40                  45
Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln
50                  55                  60
Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr
65                  70                  75                  80
Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr
85                  90                  95
Leu Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu
100                 105                 110
Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val
115                 120                 125
Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser
130                 135                 140
Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser
145                 150                 155                160
Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser
165                 170                 175
Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn
180                 185                190
Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp
195                 200                205
Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr
210                 215                220
Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
225                 230                235
<210> 4
<211> 253
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> модифицированные шарнирная и константная области иммуноглобулина
человека
<400>                4
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1               5                   10                  15
Phe Pro Gly Ser Arg Cys Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
20                  25                  30
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
35                  40                  45
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
50                  55                  60
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
65                  70                  75                  80
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
85                  90                  95
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
100                 105                 110
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
115                 120                 125
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
130                 135                 140
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
145                 150                 155                160
Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
165                 170                175
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
180                 185                 190
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
195                 200                205
Ser Phe Phe Leu Thr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
210                 215                 220
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
225                 230                 235                240
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
245                 250
<210> 5
<211> 691
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> гибридная тяжелая цепь иммуноглобулина
<400> 5
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1                5                  10                  15
Phe Pro Gly Ser Arg Cys Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr
20                  25                  30
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser
35                  40                  45
Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
50                  55                  60
Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile
65                  70                  75                  80
Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
85                  90                  95
Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
100                  105                110
Arg Ser Asn Trp Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile
115                 120                125
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
130                 135                 140
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
145                 150                 155                160
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
165                 170                175
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
180                 185                 190
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
195                 200                 205
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
210                 215                 220
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Glu Val Gln Leu
225                 230                 235                 240
Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu
245                 250                255
Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr Ala Met Asn Trp
260                 265                 270
Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg
275                280                 285
Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp
290                295                 300
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln
305                310                 315                 320
Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg
325                 330                 335
His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly
340                 345                 350
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
355                360                 365
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
370                 375                 380
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
385                390                 395                 400
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
405                410                 415
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
420                425                 430
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
435                440                 445
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
450                455                 460
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
465                470                 475                 480
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
485                 490                495
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
500                 505                510
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
515                 520                525
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
530                 535                 540
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
545                550                 555                 560
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
565                 570                 575
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
580                 585                 590
Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
595                 600                 605
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
610                 615                 620
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
625                 630                 635                640
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
645                 650                655
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
660                 665                670
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
675                 680                 685
Pro Gly Lys
690
<210> 6
<211> 244
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 6
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly
1                5                  10                  15
Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20                  25                  30
Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35                  40                  45
Asn Asp Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50                  55                  60
Glu Trp Val Ser Thr Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala
65                  70                  75                  80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys
85                  90                  95
Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu
100                 105                110
Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Ile Gln Tyr Gly Asn Tyr Tyr Tyr Gly Met
115                 120                125
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
130                135                 140
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
145                 150                155                 160
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
165                 170                 175
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
180                 185                190
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
195                 200                205
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
210                 215                 220
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
225                 230                 235                240
Pro Lys Ser Cys
<210> 7
<211> 235
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> гуманизированная легкая цепь иммуноглобулина
<400> 7
Met Thr Trp Thr Pro Leu Leu Phe Leu Thr Leu Leu Leu His Cys Thr
1                5                  10                  15
Gly Ser Leu Ser Glu Leu Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val
20                 25                  30
Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala
35                  40                  45
Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln
50                  55                  60
Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr
65                 70                  75                  80
Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr
85                  90                  95
Leu Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu
100                105                 110
Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val
115                120                 125
Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser
130                 135                 140
Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser
145                150                 155                 160
Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser
165                170                 175
Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn
180                185                 190
Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp
195                200                 205
Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr
210                215                 220
Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
225                230                 235
<210> 8
<211> 253
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> модифицированные шарнирная и константная области иммуноглобулина
<400> 8
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1                5                  10                  15
Phe Pro Gly Ser Arg Cys Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
20                  25                  30
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
35                  40                  45
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
50                  55                  60
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
65                  70                  75                  80
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
85                  90                  95
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
100                 105                110
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
115                 120                125
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
130                 135                140
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser
145                150                 155                 160
Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys
165                 170                175
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
180                 185                190
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
195                 200                205
Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
210                215                 220
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
225                 230                 235                240
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
245                250
<---