СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РЕЦИДИВИРОВАНИЯ САРКОМ МЯГКИХ ТКАНЕЙ
METHOD FOR PREDICTION OF RECURRENT SOFT TISSUE SARCOMAS

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано при лечении сарком мягких тканей для прогнозирования возникновения рецидива.
Из литературных источников известен способ прогнозирования метастазов у больных раком желудка, в котором в качестве одного из маркеров метастазирования используется фактор ингибитора апоптоза bcl-2 (RU 2445632 C1, опубл. 20.03.2012 г., Бюл. №8, G01N /33). Способ включает в себя определение маркера пролиферативной активности Ki-67 и маркера апоптоза p53, отличающийся тем, что у больных раком желудка различного морфологического строения проводят иммуногистохимическое исследование (ИГХ), дополнительно определяют маркер апоптоза bcl-2 и устанавливают, что при абсолютных значениях при перстневидно-клеточном раке: p53 - 10%, bcl-2 - 10%, Ki-67 - 12%; при недифференцированном раке: p53 - 13%, bcl-2 - 11%, Ki-67 - 9%; при аденокарциноме: p53 - 10%, bcl-2 - 9%, Ki-67 - 12% прогнозируют возникновение метастазов в лимфоузлах, а при p53 - 6%, bcl-2 - 5%, Ki-67 - 10% прогнозируют отсутствие метастатического поражения лимфоузлов.
Известен способ прогнозирования метастазирования увеальной меланомы на основе маркеров апоптоза Bax и Bcl-2 (см. RU 2242766 C1, G01N 33/68, опубл. 20.12.2004). Способ включает иммуногистохимическое определение в удаленной опухоли наличия клеток, экспрессирующих Bax, и отличается тем, что дополнительно определяют наличие клеток, экспрессирующих Bcl-2, и если первые выявляют, а вторые не выявляют, то прогнозируют высокую вероятность метастазирования. Однако приведенные известные исследования в совокупности факторов, выявляемых при иммуногистохимическом исследовании не обеспечивают прогнозирование неблагоприятного течения сарком мягких тканей.
Известен способ прогнозирования рецидива заболевания, в котором до и после операции по удалению саркомы мягких тканей у мужчин и женщин проводят биохимическое определение уровня креатинкиназы в крови больного и при показателях фермента до и после операции в пределах нормы прогнозируют длительный безрецидивный период, а при уровне фермента, значительно превышающем норму после операции, прогнозируют появление рецидива в ближайшие месяцы после операции (RU 2471191 C2, опубл. 27.12.2012, Бюл. №36).
Однако на наш взгляд предлагаемый авторами способ прогнозирования рецидива опухолевого образования по уровню креатинкиназы не совсем специфичен для сарком мягких тканей.
Техническим результатом предлагаемого нами изобретения является повышение точности и информативности способа прогнозирования рецидивирования сарком мягких тканей.
Технический результат достигают тем, что дополнительно определяют наличие клеток, экспрессирующих EGFR, CD 34, bcl 6, bcl 2, и при выявлении клеток с гиперэкспрессией EGFR, CD 34, bcl 6, bcl 2 прогнозируют появление рецидива в короткие сроки, а при наличии клеток со слабой экспрессией EGFR, CD 34, bcl 6, bcl 26 прогнозируют благоприятный исход.
Выбор в качестве маркеров метастазирования сарком мягких тканей таких белков, как EGFR, CD 34, bcl 6, bcl 2, обусловлен их ролью в развитии рецидивирующего процесса. Так, белок CD34 локализуется в клетках эндотелия новообразованных тонкостенных сосудов и регулирует неоангиогенез. Белок bcl-2 экспрессируется на мембранах клеток опухолей, регулирует процессы апоптоза. Белок EGFR - трансмембранный гликопротеин, запускает внутриклеточный сигнальные каскады, приводящие к повышению пролиферации и росту клеток, ангиогенезу, метастазированию. Белок bcl-6 регулирует степень пролиферации и роста клеток опухоли.
Выбранный нами набор белков позволил оценить биологические потенции мягкотканных сарком, позволяющие дать оценку их прогрессии, рецидивирования, неоангиогенеза.
В таблице 1 представлены результаты ретроспективного исследования иммуногистохимических маркеров EGFR, CD 34, bcl 6, bcl 2 в срезах тканей опухолей у 20 пациентов с рецидивирующей саркомой мягких тканей в анамнезе (1 группа) и у 20 пациентов с благоприятным исходом (без рецидивов) (2 группа). При сравнении результатов исследования между двумя группами пациентов обнаружено, что у пациентов с рецидивирующей саркомой мягких тканей наблюдалась гиперэкспрессия EGFR, CD 34, bcl 6, bcl 2 белков, а у пациентов с саркомой мягких тканей без рецидивов наблюдалась слабая экспрессия белков EGFR, CD 34, bcl 6, bcl 2.
Маркер ИГХ
1 группа пациентов, количество (%) экспрессирующих клеток, n=20 p<0,05
2 группа пациентов, количество (%) экспрессирующих клеток, n=20 p<0,05
EGFR
70%
10%
CD 34
100%
7%
Bcl 6
73%
20%
Bcl 2
65%
10%
Подобных иммуногистохимических исследований при изучении прогнозирования сарком мягких тканей в доступной нам научно-медицинской и патентной литературе не встречалось.
Сравнительный анализ известных способов прогнозирования течения заболевания и предлагаемого нами способа позволяет выявить его новизну и отличия от известных.
Новизна способа прогнозирования рецидивирования сарком мягких тканей заключается в использовании дополнительных маркеров, отвечающих за пролиферацию и рост клеток (EGFR, bcl 6), апоптоз (bcl 2) и за ангиогенез (CD 34) с целью повышения точности прогноза рецидивирования заболевания после оперативного удаления опухоли.
Предлагаемый нами способ прогнозирования осуществляют следующим образом.
1. После удаления опухоли мягких тканей готовили из стандартного блока с опухолью 2 парафиновых среза толщиной 3-5 микрон по стандартной методике, депарафинировали в ксилоле и регидратировали в батарее спиртов. Четыре среза использовали для проведения иммуногистохимической реакции с маркерами EGFR, CD 34, bcl 6, bcl 2. Последовательность этапов проведения реакции с каждым из маркеров совпадала.
2. Иммуногистохимическое исследование по оценке экспрессии EGFR, CD 34, Вс12, Вс16 проводили по стандартной методике. Для открытия антигенных детерминант проводили обработку срезов в цитратном буфере [pH 6,0] в течение 30 минут при 95°C на водяной бане.
3. Инкубацию с первичными антителами проводили в течение ночи при 4°C. В качестве первичных антител при оценке экспрессии EGFR, CD 34, Вс12, Вс16 использовали мышиные моноклональные антитела к данным маркерам (разведение EGFR - 1:70, CD 34-1:150, bcl 6 - RTU, bcl-2 - 1:100, фирма производитель DAKO Corp).
4. Для визуализации реакции антиген-антитело использовали стрептавидин-биотиновую тест-систему [DAKO Corp] согласно инструкции. В качестве хромогена использовали ДАБ+[DAKO Corp].
5. Затем срезы докрашивали гематоксилином и заключали в бальзам.
6. Реакцию оценивали с применением светового микроскопа (увеличение ×40) по следующим критериям. Количество положительных клеток оценивали в зонах, содержащих их максимальное количество. В качестве негативного контроля использовали иммуногистохимическую реакцию без добавления первичных антител.
При наличии клеток с гиперэкспрессией EGFR, CD 34, bcl 6, bcl 2 оценивали прогноз для пациента как неблагоприятный (развитие рецидивов в короткие сроки), а при наличии клеток со слабой экспрессией EGFR, CD 34, bcl 6, bcl 2 прогноз расценивался как благоприятный (без рецидивов).
Приводим клинический пример использования способа
Пример 1
Больной А, 49 лет. История болезни №23425/ц.
Образование мягких тканей правого бедра заметил в августе 2007 года. Самостоятельно обратился в РНИОИ.
Отлечен комплексным методом лечения.
21.11.2007 года выполнена операция - удаление опухоли мягких тканей правого бедра.
Гистологическое заключение №982276-282/07 - злокачественная фиброзная гистиоцитома, гигантоклеточный вариант, обширные очаги некроза, степень дифференцировки G2 (умереннодифференцированная).
Данные иммуногистохимического исследования парафинового среза опухоли: выявлено EGFR - позитивных клеток 70%, CD 34 - позитивных клеток 100%, bcl 6 - позитивных клеток 73%, bcl 2 - позитивных клеток 65%. Больного отнесли в группу высокого риска развития метастазов и сократили интервалы между визитами к врачу.
С 20.12.2007 г. по 30.12.2007 г. прошел лучевое лечение в СОД 50 Гр на послеоперационный рубец и пути лимфооттока.
С 17.01.2008 г. по 22.01.2008 г. прошел 2 курса адъювантной химиотерапии:
Доксорубицин 100 мг, Циклофосфан 1600 мг, Цисплатин 100 мг.
В марте 2009 года обнаружено образование в послеоперационном рубце. Диагностирован рецидив опухоли.
30.03.2009 г. выполнена операция: широкое иссечение рецидива опухоли мягких тканей правого бедра.
Пример 2
Больная Б, 74 года. История болезни №2251/ф.
В сентябре 2004 г. заметила опухоль в левой пахово-подвздошной области, обратилась к врачу по месту жительства, направлена в РНИОИ.
Отлечена комплексным методом лечения.
02.03.2005 года выполнена операция: удаление саркомы мягких тканей левой паховой области.
Гистологическое заключение №95234-235/05 - злокачественная фиброзная гистиоцитома, гигантоклеточный вариант, обширные очаги некроза, степень дифференцировки G3.
По данным иммуногистохимического исследования парафинового среза опухоли выявлено EGFR - позитивных клеток 10%, CD 34 - позитивных клеток 7%, bcl 6 - позитивных клеток 24%, bcl 2 - позитивных клеток 10%, что расценено нами как благоприятный прогноз.
Прошла курс в СОД 40 Гр после операции на послеоперационный рубец и пути лимфооттока.
С 7.05.2005 г. по 15.05.2005 г. - прошла 3 курса адъювантной химиотерапии по схеме:
Винкристин 2 мг, доксорубицин 100 мг, циклофосфан 1200 мг
Больная планово проходила диспансерное наблюдение в РНИОИ, данных за рецидив в послеоперационном рубце, метастазирование нет.
Последняя явка 14.12.2012 г. - состояние больной удовлетворительное, жалоб не предъявляет. Послеоперационный рубец без признаков рецидивирования.
Таким способом был рассчитан прогноз 20 больным.
Разработанный способ прогнозирования рецидивирования сарком мягких тканей является промышленно применимым. С помощью этих прогностических факторов можно прогнозировать исход заболевания и планировать лечебные мероприятия.