ТОКСИЧНОСТЬ КУЛЬТУРАЛЬНОГО ФИЛЬТРАТА И АГРЕССИВНОСТЬ ГЕОГРАФИЧЕСКИ ОТДАЛѐННЫХ ИЗОЛЯТОВ PHOMOPSIS (DIAPORTHE) HELIANTHI MUNT.-CVETK., MICHAL., PETR. ДЛЯ ПОДСОЛНЕЧНИКА

МАСЛИЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ.

Научно-технический бюллетень Всероссийского научно-исследовательского института масличных культур 2006, вып. 2

Т. С. Антонова,

доктор биологических наук Н. М. Арасланова, кандидат биологических наук Т. А. Челюстникова,

старший научный сотрудник

ГНУ ВНИИ масличных культур

ТОКСИЧНОСТЬ КУЛЬТУРАЛЬНОГО ФИЛЬТРАТА И АГРЕССИВНОСТЬ ГЕОГРАФИЧЕСКИ ОТДАЛЁННЫХ ИЗОЛЯТОВ РНОМОРБШБ (йШАРОЯТНЕ) НЕШЫТНШМУМТ.-СУЕТК., МТСНАЬ, РЕТЯ. ДЛЯ ПОДСОЛНЕЧНИКА

УДК 633.854.78:632

Среди заболеваний подсолнечника фомопсис является одним из наиболее вредоносных и распространённых в большинстве стран мира, возделывающих культуру. Возбудитель его, гриб Phomopsis (Diaporthe) heianthi Munt.-Cvetk., Michal., Petr., относится к карантинным объектам в России. В годы, благоприятные для развития болезни, потери урожая семян подсолнечника могут достигать 50 % при сопутствующем снижении мас-личности на 10-15 %. В связи с этим созданию устойчивых гибридов и сортов должно уделяться постоянное внимание.

Поражение подсолнечника фомопсисом в значительной степени регулируется взаимодействием генотип-среда, где хозяин и патоген, взаимодействуя друг с другом, оба подвержены сильному влиянию условий окружающей среды. Показано, что устойчивость к фомопсису листьев и стеблей подсолнечника горизонтального типа, и безотносительно к селекции листовой ли, стеблевой ли устойчивости, агрессивность изолятов возбудителя, используемых для инокуляции, должна быть предварительно испытана, чтобы обеспечить степень заболевания, оптимальную для генотипической дифференциации селекционного материала (Degener & al., 1999). Другими словами, необходимо использовать изоляты фомопсиса с высокой степенью агрессивности, чтобы отбор на устойчивость был эффективным.

Известны исследования (Viguie & al., 1999), в которых культурально-морфологи-ческие признаки, такие, как скорость роста колоний, вид и цвет мицелия, количество стром и другие, не коррелировали с высокой агрессивностью культур гриба в естественных условиях заражения. Исследованиями Pecchia & al. (2001) при изучении большой группы изолятов из разных стран была показана связь экологических потребностей (влияние температуры и водной активности на радиальный рост колоний) с географическим происхождением изолятов.

Выявление таких признаков, которые можно определить заранее в лабораторных условиях, могло бы способствовать облегчению и ускорению селекционного процесса при отборах на устойчивость к фомопсису. Одним из таких признаков могла бы служить токсичность выделений гриба.

Целью наших исследований было сравнить токсичность культурального фильтрата и агрессивность географически отдалённых изолятов фомопсиса при искусственном заражении ими растений подсолнечника в полевых условиях.

Материалы и методы исследований. Изоляты Phomopsis heiianthi, собранные в Краснодарском, Ставропольском краях, Волгоградской и Ростовской областях (табл. 1) выделяли в чистую культуру на картофельно-глюкозный агар (КГА). Питательную среду готовили следующим образом: 200 г очищенного картофеля варили в 1 л воды 2,5 часа, сцеживали отвар, добавляли в него 20 г глюкозы, 5 г поваренной соли, 20 г агара. Авто-клавировали при 1,2 атм. и разливали в чашки Петри. Фрагменты поражённых стеблей подсолнечника размером 0,5-1,0 см стерилизовали в 96о спирте, обжигали и высевали на среду. Выращивали при естественном освещении и температуре 25 оС в течение 14 дней.

Для определения токсичности культурального фильтрата высечки колоний чистой 14-дневной культуры указанных выше изолятов гриба помещали в колбы со 100 мл жидкой картофельно-глюкозной среды (КГ). Выращивали штаммы каждого изолята в

жидкой культуре в 10 колбах в течение двух и трёх недель. Затем жидкость фильтровали, мицелий гриба на фильтрах высушивали и взвешивали. В соответствии с выросшей массой мицелия усредняли фильтраты по каждому изоляту, и замачивали в них на 24 часа предварительно промытые проточной водой и ополоснутые розовым раствором перманганата калия семена подсолнечника сильно восприимчивого к фомопсису сорта Р- 453. Затем раскладывали семена на увлажнённой фильтровальной бумаге, сворачивали в рулоны, и проращивали в течение 5 дней при температуре 25 оС. По каждому генотипу закладывали две повторности по 50 штук учитываемых семян. Далее учитывали количество непроросших семян, ненормально проросших, сгнивших и длину главного корня.

Растения подсолнечника восприимчивой к фомопсису линии ВК 462 и высоко толерантной ВК 680 высевали стандартным способом в полевых условиях и заражали по 25 растений каждым изолятом в отдельности путём помещения инокулюма в разрез основания листового черешка. Заражение осуществляли, когда растения находились в фазе бутонизации. У каждого растения заражали ближайший к корзинке самый крупный лист, помещая заражённый фомопсисом фрагмент стебля подсолнечника в разрез черешка, закрывая этот участок влажной ватой и фольгой.

Инокулюм для заражения готовили предварительно следующим способом: чистую культуру каждого изолята, выращенную на агаризованной картофельно-глюкозной среде в течение двух недель, использовали для заражения фрагментов сухих стеблей подсолнечника. Колбы на 250 мл заполняли фрагментами сухих стеблей и стерилизовали в автоклаве. В стерильных условиях вносили в колбы по 3-4 высечки (диаметром 1 см) агаризованной среды с чистой культурой гриба. На этом субстрате мицелий выращивали также в течение двух недель. Длина фрагментов стеблей около 2 см, ширина 3-4 мм, что имеет значение лишь для удобства вкалывания их в основание листового черешка, как можно ближе к стеблю. В каждый черешок вкалывали по одному фрагменту стебля с видимым на нём мицелием гриба.

Погодные условия периода заражения и дальнейшей динамики патологического процесса были благоприятны для развития фомопсиса. На протяжении второй и третьей декад июля сумма осадков превышала среднее многолетнее значение, относительная влажность воздуха колебалась в пределах 60 оС. Температура воздуха в дневное время суток совпадала со средней многолетней от 22 до 24 оС, что на 1-3 оС ниже оптимума для этого гриба.

Через 14 дней после заражения проводили первое измерение длины участка поражения стебля и далее через каждые 2-3 дня отмечали динамику её изменения.

Статистическая обработка данных выполнена однофакторным дисперсионным анализом в программе Excel ПК.

Таблица 1 - Изоляты РНошорв/'в НеИапОч', выделенные из растений подсолнечника в разных районах возделывания

Шифр изолята Район сбора Год Название

фомопсиса сбора пораженного хозяина

11 Окрестности Краснодара 2003 Гибрид NSH-630

14 Окрестности Краснодара 2004 Гибрид Сигнал

28 Окрестности Краснодара 2004 Сорт Р-453

36 Окрестности Краснодара 2004 Гибрид NSH-626

47 Окрестности Краснодара 2004 Гибрид Аурасол

48 Гулькевичский, Краснодарского края 2005 Гибрид ПР64А83

49 Окрестности Волгограда 2005 Гибрид РТ31-Х

50 Каневской, Краснодарского края 2005 Сорт СУР

51 Морозовский, Ростовской области 2005 Гибрид Сигнал

52 Ипатовский, Ставропольского края 2005 Гибрид Арон

53 Староминской, Краснодарского края 2005 Сорт Р-453

Результаты и обсуждение. Наши более ранние исследования в период 20032004 гг. (не опубликовано) показали, что культуральные фильтраты полевых изолятов фомопсиса могут одновременно угнетать прорастание семян и рост корня у 5-дневных проростков подсолнечника. Изоляты могут угнетать только прорастание семян и не оказывать влияния на рост корня. Они могут стимулировать рост корня и не влиять на прорастание семян или не оказывать никакого воздействия.

В данной работе двухнедельные фильтраты всех изолятов были токсичны для прорастающих семян, если в качестве контроля рассматривать воду. Самыми токсичными для семян были фильтраты изолятов 36, 11, 50 (табл. 2). Из данных эксперимента видно, что сама по себе чистая картофельно-глюкозная среда тоже угнетает прорастание семян, что, очевидно, связано с её свойством удерживать в связанном виде воду, необходимую для набухания замачиваемых семян. Сахар, содержащийся в среде, нарушает осмотическое давление в живых клетках. По мере роста гриба, потребляющего сахар, водоудерживающие свойства среды снижаются, и её влияние на прорастание семян ослабевает. Двухнедельные фильтраты угнетали также рост корня у проростков подсолнечника, за исключением изолятов 47, 48, 52 и 53, фильтраты которых либо стимулировали его рост, либо действовали на уровне контроля.

Таблица 2 - Влияние культурального фильтрата изолятов фомопсиса 2- и 3-недельной культуры на прорастание семян и рост корня 5-дневных проростков подсолнечника

Изолят Количество непроросших семян*, шт. Длина корня проростка, см

после замачивания семян в фильтрате жидкой культуры:

2-недельной 3-недельной 2-недельной 3-недельной

11 45 28 4,7 6,1

14 36 33 4,6 5,3

28 38 22 4,0 5,4

36 56 41 4,0 4,5

47 32 21 5,2 6,2

48 30 21 5,6 5,6

49 35 17 4,7 5,3

50 44 30 4,1 5,5

51 33 18 4,3 5,3

52 30 40 5,9 4,8

53 22 37 5,2 4,5

Контроль КГ среда 42 30 5,2 6,1

Контроль вода 20 26 6,0 7,2

НСР05 3,0 2,4 0,4 0,5

* В эту группу также входят сгнившие семена и проросшие с аномалиями в развитии проростков

Фильтраты 3-недельных культур при сравнении с 2-недельными оказались менее токсичны как для семян, так и для корня проростков у всех изолятов за исключением 52 и 53. Эти два изолята показали существенно большее угнетение семян при сравнении с КГ средой в качестве контроля, то есть на протяжении третьей недели культивирования у них происходило нарастание токсичности фильтрата (табл. 2). Сравнение действия 2-и 3-недельных фильтратов показывает, что токсины, выделяемые грибом, при естественном освещении и температуре 22-24 оС нестойкие и, по-видимому, быстро трансформируются в субстанции, которые не только утрачивают токсичность, но и начинают стимулировать рост растительных клеток. Изоляты 52 и 53 в этом смысле стоят особняком. Таким образом, у большинства изученных изолятов фомопсиса токсичность культурального фильтрата снижалась с увеличением возраста культуры в период от 14 до 21 дня, а у двух возрастала.

Культуральные фильтраты изолятов фомопсиса не только угнетали прорастание семян и рост корня у проростков, но и вызывали различные аномалии в развитии последних. Самый высокий процент (23) проростков с аномалиями в развитии был получен

при обработке семян фильтратом изолята 36. Существенные различия с контролем имели также изоляты 11, 48, 50, 52 (табл. 3). По остальным изолятам количество аномалий проростков было на уровне контрольных вариантов. В целом, сравнение изолятов по действию их культурального фильтрата позволяет выделить как наиболее токсичные изоляты 36, 50, 11, 53. Самыми слабыми проявили себя изоляты 47 и 48.

Таблица 3 - Влияние культурального фильтрата изолятов РНошорБ/Б НеНапН/'

2-недельной культуры на прорастание семян и рост корня у 5-дневных проростков подсолнечника

Май 2006

Количество семян, штук* Длина корня проростков, см Действие фильтрата на корень

не проросших проросших с аномалиями сгнивших

11 30 12 3 4,7 Угнетает

14 23 8 5 4,6 Угнетает

28 27 9 2 4,0 Угнетает

36 27 23 6 4,0 Угнетает

47 25 3 4 5,2 Не действует

48 16 13 1 5,6 Стимулирует

49 29 4 2 4,7 Угнетает

50 29 13 2 4,1 Угнетает

51 23 7 3 4,3 Угнетает

52 15 11 4 5,9 Стимулирует

53 12 7 3 5,2 Не действует

Контроль -КГ среда 32 8 2 5,2

Контроль -вода 12 7 1 6,0

НСР05 2,4 1,2 0,4

* Общее количество семян - 100 штук по каждому варианту

Два критерия агрессивности изолятов фомопсиса были выбраны для оценки степени поражения растений подсолнечника при их искусственном заражении. Первый -это процент поражённых стеблей через 14 и 30 дней после заражения, а второй - длина поражённого участка стебля, наблюдаемая в динамике на протяжении 30 дней после заражения. Два изолята: с самой слабой (47) и самой сильной (36) токсичностью культурального фильтрата не были использованы в полевом эксперименте для уменьшения объёма работы.

Наибольший процент поражённых растений по обеим линиям в оба срока учёта дал изолят 50. Он же и по токсичности фильтрата для прорастающих семян входит в группу самых сильных. Лишь по линии ВК 462 его обогнал изолят 53 (табл. 4), отличающийся линейным ростом токсичности фильтрата в период от 14 до 21 дня. Изоляты 49 и 11 через 14 дней после заражения по проценту поражённых стеблей занимают соответственно 3 и 4 место. На 30-й день в их ряды вливается изолят 52, у которого рост токсичности фильтрата так же, как и у 53, продолжается в период от 14 до 21 дня. Изоляты 50, 52, 49 и 53 (перечислены в порядке убывания) имеют самый высокий процент поражения стеблей у линии ВК 680 через 30 дней после заражения растений. Если судить в целом по двум линиям, то самыми слабыми проявили себя изоляты 28 и 48. По линии ВК 680 в эту группу вливаются изоляты 14 и 51 (табл. 4). Таким образом, по первому критерию как самые агрессивные выделяются изоляты 50, 53, 49, 52, 11 (расположены в порядке убывания).

По длине участка поражения стебля у растений каждой линии (второй критерий агрессивности изолятов) изоляты 28 и 48, определённые как самые слабые по первому критерию, и здесь существенно отставали от других (данные не показаны). По линии ВК 680 в эту группу добавился изолят 14, а изолят 50 проявил себя как самый сильный. Подчеркнём, что по токсичности культурального фильтрата, как для прорастающих семян, так и для роста корня, этот изолят входит в группу самых сильных.

Таблица 4 - Процент поражённых стеблей подсолнечника у линий ВК462 и ВК 680 при искусственном заражении в черешок листа географически отдалёнными изолятами фомопсиса

Дней после заражения Шифр изолята

11 14 28 48 49 50 51 52 53

Линия ВК 462

14 33 28 0 4 44 50 25 20 75

30 83 71 8 58 94 90 69 90 95

Линия ВК 680

14 5 0 0 0 8 16 0 10 8

30 42 39 12 42 58 68 39 68 46

Таблица 5 показывает, что между токсичностью культурального фильтрата и одним из критериев агрессивности изолятов фомопсиса, а именно, процентом поражённых стеблей, имеется существенная связь, так как теоретический коэффициент корреляции меньше фактического. Через 30 дней после заражения восприимчивой линии ВК 462 коэффициент корреляции 0,76 указывает на сильную связь рассматриваемых признаков. Доля вклада токсичности выделений в патогенность изолятов в этом случае составила 58 %. По высоко толерантной линии ВК 680 оба срока учёта показали значимые коэффициенты (0,69 и 0,70), являющиеся предельными значениями интервала средней связи. Доля вклада токсичности в патогенность здесь составляет 48 и 49%. Однако для средней связи используемая выборка пар признаков недостаточна, чтобы с определённостью судить о наличии зависимости. Возможно, что по этой линии коэффициенты корреляции получились несколько ниже, чем в рассмотренном выше случае, по причине её значительной толерантности к фомопсису. Поэтому они из пределов сильной связи могли переместиться в верхний предел средней зависимости (г = 0,3-0,7). Толерантность хозяина здесь могла сыграть роль фактора, оказавшего своё влияние на признак пато-генности гриба. В целом же, полученные данные свидетельствуют о наличии связи между токсичностью выделений изолятов фомопсиса и первым критерием агрессивности.

По второму критерию агрессивности, а именно, длине поражённого участка стебля, наличие или отсутствие связи осталось недоказанным, так как фактический коэффициент корреляции получился меньше теоретического. Необходимо использовать большее количество изолятов.

Таблица 5 - Сопряжённость токсичности для прорастающих семян подсолнечника культурального фильтрата изолятов (фомопсиса с их агрессивностью в полевых условиях при искусственном заражении растений в черешок листа

Критерии агрессивности* Линия Дней после Заражения растений Коэффициент

корреляции, г детерминации, йх„

1 ВК 462 14 0,65 0,42

30 0,76 0,58

ВК 680 14 0,69 0,48

30 0,70 0,49

2 ВК 462 30 0,55 0,30

ВК 680 30 0,54 0,29

Гтеоо.05 0,666

* 1 - процент растений с переходом поражения на стебель; 2 - длина поражённого участка стебля

Таким образом, выделены изоляты, отличающиеся высокой и слабой токсичностью культурального фильтрата. Между токсичностью культурального фильтрата и агрессивностью изолятов фомопсиса прослеживается определённая связь по первому критерию агрессивности. По второму критерию связь не доказана. Сложность перекрё-

стных взаимосвязей генотип-среда в данном случае оказывает своё влияние, и необходимо проведение дополнительных экспериментов с большей выборкой изолятов гриба.

Исследования выполнены при финансовой поддержке Международного научно-технического центра (МНТЦ), грант 3034.

Литература

1. Degener J., Melchinger A. E, Hahn V.. Resistance in the leaf and stem of sunflower after infection with two isolates of Phomopsis// Plant Breeding. - 1999. - 118. - Р. 405-410.

2. Anne Viguie, Feiicity Vear and Denis Tourvieiile de Labrouhe. Interactions between French isolates of Phomopsis Diaporthe helianthi Munt.-Cvet. et al. and sunflower (Heiianthus annuus L.) genotypes // European Journal of Plant Pathology. - 1999. - 105. - Р. 693-702.

3. Pecchia S, Pati L., Languasco L., Rossi V., Guidi L., Degl'Innocenti E, Soidatini G.F., Vannacci G. Physiological characterization of Diaporthe helianthi isolates // Journal of Plant Pathology. - 2001. - 83(3). - Р. 240.