Влияние углеводородов на состав микробного сообщества в луговой глеевой почве

Вестник ДВО РАН. 2015. № 5

УДК 631.46

О.А. КИРИЕНКО, Е Л. ИМРАНОВА

Влияние углеводородов на состав микробного сообщества в луговой глеевой почве

В лабораторном эксперименте исследованы динамика, численность и состав почвенных микроорганизмов в условиях загрязнения луговой глеевой почвы нефтью и нефтепродуктами. Количество и состав микроорганизмов в почве зависят от концентрации и качественного состава загрязняющих веществ. Полученные данные позволяют дать рекомендации для предотвращения негативного воздействия на почвенные экосистемы.

Ключевые слова: загрязнение, микроорганизмы, нефть, нефтепродукты.

Effect of hydrocarbons on microbial community composition in the meadow gley soil. O A. KIRIENKO, E.L. IMRANOVA (Institute of Water and Ecological Problems, FEB RAS, Khabarovsk).

The dynamics, abundance and composition of soil microorganisms in conditions of meadow gley soil contamination by crude oil and petroleum products in a model laboratory experiment was studied. Number and composition of microorganisms in the soil depend on the concentration and qualitative composition of pollutants. The obtained data allow us to make recommendations to prevent adverse effects on soil ecosystems.

Key words: contamination, microorganisms, oil, petroleum products.

Проблема нарушения земель под влиянием нефтяного загрязнения является чрезвычайно важной. Поступая в почву, углеводороды могут повлиять на почвообразовательные процессы, привести к нарушению экологического равновесия.

Плодородие почвы в первую очередь связано с жизнедеятельностью микроорганизмов, которые осуществляют один из главных процессов в почве - разложение органических соединений. Уменьшение численности или исчезновение одной из физиологических групп микроорганизмов, которые участвуют в этом процессе, может привести к снижению потенциала самоочищения почвы. Несмотря на наличие ряда исследований в данной области, многие вопросы, связанные с оценкой воздействия нефтяного загрязнения на почву и почвенный покров, до сих пор остаются нерешенными [4, 6, 12, 15, 18].

В почвах каждой климатической зоны формируются свои микробоценозы, обладающие различной активностью трансформации нефти и нефтепродуктов. Эта активность зависит от типа, состава и свойств почвы, от способности конкретного типа почв к самоочищению, от вида, концентрации, токсичности и скорости распада поллютанта и многого другого, поэтому не может быть единого показателя нефтяного загрязнения почв [14, 16, 17].

Прежде всего для каждого типа почв с учетом природных механизмов самоочищения необходимо выявить верхний допустимый уровень содержания углеводородов, выше которого почва не может сама справиться с загрязнением. Этот уровень принято считать

* КИРИЕНКО Ольга Александровна - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, ИМРАНОВА Елена Львовна - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник (Институт водных и экологических проблем ДВО РАН, Хабаровск). *Е-таП: micro@ivep.as.khb.ru

пределом потенциального самоочищения (I II 1С) почв. Почвы с уровнем загрязнения выше ППС подлежат восстановлению.

В процессе проведения модельного эксперимента с луговой глеевой почвой, искусственно загрязненной нефтью и керосином, предпринята попытка оценить ее способность к естественной биоремедиации.

С целью оценки влияния нефти и керосина на почвенную экосистему из почвенного горизонта на глубине 0-25 см отбирали образцы для дальнейшего исследования. Керосин и нефть вносили в количестве 1 г, 2 г, 10 г и 50 г на 1 кг почвы. Варианты опыта были обозначены, соответственно: К1, К2, К10, К50 и Н1, Н2, Н10, Н50. Контролем служила почва без нефтепродуктов. Влажность исследуемой почвы доводили до 60 % от полной влагоемкости, образцы инкубировали при комнатной температуре.

Микробиологические анализы проводились каждый месяц (через 30, 60, 90, 120 дней). Развитие гетеротрофных и углеводородокисляющих бактерий, микромицетов и актиноми-цетов в динамике изучали методом посева почвенной суспензии на плотные питательные среды с последующим подсчетом.

Таксономическую принадлежность микромицетов выясняли на основании изучения органов и типов спороношения, используя определители [2, 8, 9].

Эксперимент продолжался 120 дней. Содержание остаточной нефти и нефтепродуктов в почвенных образцах после завершения эксперимента определяли методом ИК-спектрофотометрии с экстракцией в четыреххлористом углероде на приборе КН-2М.

Токсичность загрязненных почв оценивали с помощью кресс-салата (Lepidium sativum) [3]. Для компенсации нарушения водно-воздушного режима загрязненной почвы семена кресс-салата предварительно замачивали на сутки в дистиллированной воде и раскладывали на поверхности почвы, что давало возможность оценить непосредственное токсическое воздействие углеводородов в условиях нефтяного загрязнения [11].

При нефтяном загрязнении взаимодействует ряд экологических факторов, которые необходимо учитывать, давая оценку последствиям загрязнения почв нефтепродуктами [14]. К таких факторам относятся состав и структура самой почвенной экосистемы, а также активность процессов метаболизма у почвенных микроорганизмов, поскольку микробиологическая активность почв является лабильным признаком, реагирующим даже на незначительные концентрации нефтепродуктов.

Общая оценка динамики численности бактерий в ходе модельного эксперимента показала зависимость качественного и количественного состава микробоценоза от концентрации нефтепродуктов и времени экспозиции. На фоне снижения численности бактерий, использующих минеральные формы азота, происходил рост гетеротрофных и углеводородокисляющих (УОБ) бактерий, что было связано с возможностью утилизации данного вида нефти и керосина почвенным микробным комплексом и невыраженным токсическим эффектом (рис. 1, 2).

Гетеротрофные бактерии в почве осуществляют весь спектр реакций разложения органических соединений и являются индикатором функционального состояния почвы. Рядом авторов отмечено, что при загрязнении почвы нефтепродуктами может происходить стимуляция жизнедеятельности бактерий в определенном диапазоне концентрации загрязнителя либо ингибирование активности бактериоценоза при превышении критического уровня загрязнителя [7, 10, 12].

Исследования показали, что при загрязнении луговой глеевой почвы керосином через 30 сут произошло увеличение численности гетеротрофных бактерий по сравнению с контролем, тогда как в вариантах почвы с внесенной нефтью увеличение численности данной группы микроорганизмов отмечено при более высоких концентрациях (рис. 1). Повышение численности бактерий в почве при концентрации нефти 10 г/кг (вариант Н10) и концентрации керосина 50 г/кг (вариант К50) происходило и в конце эксперимента. Во

Рис.

Сутки

30 60 90 120 30 60 90 120

1. Динамика численности гетеротрофных бактерий в луговой глеевой почве,

>ть; контроль - незагрязненная

загрязненной нефтепродуктами. а - керосин, б - н почва; 1 - вариант почвы с внесением нефтепродукта в концентрации 1 г/кг почвы, 2 - 2 г/кг, 3 - 10 г/кг, 4 - 50 г/кг

Рис. 2. Динамика численности углеводородокисляющих бактерий в луговой глеевой почве, загрязненной нефтепродуктами. Условные обозначения см. на рис. 1

всех других опытных вариантах численность гетеротрофных бактерий снизилась до уровня незагрязненной почвы.

Углеводородокисляющие бактерии играют основную роль в процессе биологической деструкции углеводородов, они присутствуют как в нефтезагрязненных, так и в чистых почвах, поэтому показатель их численности свидетельствует об интенсивности процессов окисления нефтепродуктов.

В вариантах с внесением керосина и нефти в луговую глеевую почву численность УОБ через 30 дней практически не изменилась, за исключением образца с концентрацией нефти 50 г/кг. Наибольшее количество УОБ отмечено на 60-е сутки эксперимента (рис. 2).

Через 4 мес. значения УОБ в почвенных образцах с низкой концентрацией нефтепродуктов (от 1 до 10 г/кг) приближались к контрольным, происходило постепенное восстановление сообщества почвенных микроорганизмов, что можно объяснить разложением керосина и нефти к концу исследования. При более высоких концентрациях численность УОБ остается выше контроля, что является свидетельством продолжения процессов разложения углеводородов в почве.

Установлено, что загрязнение почвы нефтью и нефтепродуктами оказывает сильное влияние на одну из основных групп почвенных микроорганизмов - актиномице-тов. Их численность была невысокой и в течение эксперимента резко падала вплоть до

исчезновения из микробоценоза. Актиномицеты в почве, загрязненной нефтепродуктами в концентрациях 10 г/кг и 50 г/кг, не обнаруживались или были представлены единичными колониями.

Микроскопические грибы - наиболее активные компоненты почвенного ценоза. По сравнению с остальными организмами они обладают экономным обменом веществ, им свойственны чрезвычайный полиморфизм и плеоморфизм. В ходе развития микромицеты синтезируют и выделяют во внешнюю среду разнообразные гидролитические ферменты, расщепляющие любые органические субстраты.

Микробиологическая диагностика загрязненных почв показала, что численность почвенных грибов не всегда коррелирует со степенью и качеством загрязнителя, тогда как их видовой состав претерпевает значительные изменения.

В результате исследований выяснено, что в ненарушенной луговой глеевой почве Хабаровского края преобладали микроскопические грибы из рода Pénicillium, а также представители родов Fusarium, Trichoderma, Aspergillus, Verticillium.

Внесение в почву углеводородов привело к перестройке в комплексе почвенных ми-кромицетов. При низких уровнях загрязнения отмечено увеличение разнообразия микроскопических грибов по сравнению с фоновыми почвами. При высоких дозах поллютанта видовое разнообразие резко снижалось, исчезали доминирующие и часто встречающиеся в контрольной почве микромицеты. Доминирование переходило к другим видам грибов -Aspergillus niger, Fusarium oxysporium, Fusarium moniliforme.

Обычно степень самоочищения почв от нефтепродуктов определяют химическим анализом остаточного содержания загрязнителя. С этой целью проводились химические исследования для установления остаточных количеств керосина и нефти в модельных почвенных образцах (рис. 3).

Как показывают экспериментальные данные, основная часть керосина (легкие фракции нефтепродуктов) за 4 мес. пребывания в почве разлагается и испаряется. Причем путем испарения из почвы удаляется 20-40 % легких фракций нефтей [19].

На степень разложения нефти в почве оказывает влияние ее концентрация. Наиболее интенсивно этот процесс протекал в почвах при концентрации 1 г/кг и 2 г/кг (разложилось 65-75 %), наименее - при концентрации 50 г/кг почвы.

Загрязнение почвы нефтью и нефтепродуктами прежде всего сказывается на свойствах гумусового горизонта. В нем увеличивается количество углерода, но изменяются структура почвы и плотность горизонта, ухудшаются свойства почв как питательного субстрата

%

60

50,3

0

К1 К2 К10 К50

Керосин

Hl Н2 НЮ Н50

Нефть

Рис. 3. Остаточное содержание керосина и нефти в луговой глеевой почве после эксперимента

для растений. Система почва-растение очень информативна [17]. Растения представляют собой наиболее уязвимый компонент биоты, так как являются первичными звеньями трофических цепей. Они выполняют основную роль в поглощении разнообразных поллютантов из почвы и подвергаются воздействию различных видов загрязнения. Эти особенности растений определяют их значение как биоиндикаторов при обнаружении загрязнителей [3, 13, 17]. Обычно в качестве тест-объектов используют мелкие семена растений кресс-салата, укропа, льна и др.

Токсичность луговой глеевой почвы, загрязненной углеводородами, оценивали в конце эксперимента (через 120 дней) по комплексу морфологических признаков кресс-салата (см. таблицу).

На основании полученных нами данных можно сделать вывод о том, что фитотокси-ческие свойства луговой глеевой почвы, загрязненной нефтью и керосином, проявляются в вариантах К50 и Н50. Несмотря на то что концентрация нефти в конце эксперимента уменьшилась в 2 раза, а керосина - более чем в 25 раз, снизились всхожесть и скорость прорастания семян тест-объекта (кресс-салат), дальнейшего развития молодых растений не произошло, проростки быстро погибли. Следовательно, в загрязненной почве накапливается некий фактор, делающий ее токсичной для растений.

Массовая гибель проростков при загрязнении почвы нефтепродуктами отмечена многими авторами. Считается, что это явление не всегда связано с ухудшением свойств нефте-загрязненной почвы или прямой токсичностью углеводородов в ней [11] .

По литературным данным, одним из основных факторов, определяющих фитотоксич-ность нефтезагрязненной почвы, является перестройка в сообществе микромицетов, которая способствует увеличению в составе комплекса доли видов, проявляющих фитоток-сическую активность. Кроме того, с увеличением концентрации нефтепродуктов в почве происходит стимуляция жизнедеятельности микромицетов в прикорневой зоне, которые продуцируют токсичные для растений вещества [1, 5, 11].

При высоких концентрациях углеводородов (варианты К50 и Н50) в почве не выделялись представители рода Trichoderma, которые, как известно, проявляют антагонистические свойства в отношении целого ряда фитопатогенных микромицетов. Отмечено наличие микромицетов родов Fusarium и Aspergillus, что отрицательно сказывается на фи-тосанитарном состоянии почвы и способствует накоплению инфекционного материала.

Таким образом, по результатам модельного эксперимента для луговой глеевой почвы Хабаровского края максимально действующей концентрацией углеводородов, до которой не происходит необратимых нарушений в микробной системе, является концентрация 10 г/кг. Эти данные могут быть использованы при экологическом нормировании содержания нефтепродуктов в луговой глеевой почве и проведении оценки экологического ущерба, наносимого окружающей среде при нефтяном загрязнении.

ЛИТЕРАТУРА

1. Гродницкая И.Д., Якименко Е.Е. Агрохимические свойства почвы лесного питомника на юге Красноярского края // Почвоведение. 1996. № 10. С. 1247-1253.

2. Егорова Л.Н. Почвенные грибы Дальнего Востока: Гифомицеты. Л.: Наука, 1986. 192 с.

3. Заболотских В.В., Васильев А.В., Танких С.Н. Экспресс-диагностика токсичности почв, загрязненных нефтепродуктами // Изв. Самарского научного центра РАН. 2012. Т. 14, № 1 (3). С. 734-738.

4. Звягинцев Д.Г., Гузев В.С., Левин С.В., Селецкий Г.И., Оборин А.А. Диагностические признаки различных уровней загрязнения почвы нефтью // Почвоведение. 1989. № 1. С. 72-78.

Всхожесть кресс-салата на луговой глеевой почве через 4 мес. после загрязнения

Вариант опыта Кол-во проросших семян из 50 % от контроля

К1 42 84

К2 45 90

К10 48 96

К50 0 0

Н1 46 92

Н2 45 90

Н10 49 98

Н50 0 0

5. Киреева Н.А., Галимзянова А.М., Мифтахова А.Н. Микромицеты почв, загрязненных нефтью, и их фито-токсичность // Микология и фитопатология. 2000. Т. 34, вып. 1. С. 36-41.

6. Колесников С.И., Гайворонский В.Г., Ротина Е.Н., Казеев К.Ш., Валько В.Ф. Оценка устойчивости почв Юга России к загрязнению мазутом по биологическим показателям (в условиях модельного эксперимента) // Почвоведение. 2010. № 8. С. 995-1000.

7. Лабутова Н.М., Щерба А.В., Галова А.В., Орлова Е.Е. Особенности состояния бактериального и грибного микробоценоза нефтезагрязненной дерново-подзолистой почвы в лабораторных экспериментах // Антропогенная трансформация природной среды: материалы междунар. конф. (Пермь, 18-21 окт. 2010 г.). Пермь: Гос. ун-т, 2010. С. 9-14.

8. Литвинов М.А. Определитель микроскопических почвенных грибов. Л.: Наука, 1967. 303 с.

9. Лугаускас А.Ю., Микульскене А.И., Шляужене Д.Ю. Каталог микромицетов - биодеструкторов полимерных материалов. М.: Наука, 1987. 344 с.

10. Мязин В.А. Разработка способов повышения эффективности биоремедиации почв Кольского севера при загрязнении нефтепродуктами (в условиях модельного эксперимента): дис. ... канд. биол. наук. Апатиты, 2014. 159 с.

11. Назаров А.В., Иларионов С.А. Изучение причин фитотоксичности нефтезагрязненных почв // Альтернативная энергетика и экология. 2005. № 1. С. 60-65. - http://isjall.hydrogen.ru/pdf/letters12005nazarov.pdf.

12. Панов А.В., Есикова Т.З., Соколов С.Л., Кошелева И.А., Боронин А.М. Влияние загрязнения почвы на состав микробного сообщества // Микробиология. 2013. Т. 82, № 2. С. 239-246.

13. Петухов В.Н., Фомченков В.М., Чугунов В.А. и др. Биотестирование почвы и воды, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, с помощью растений // Прикл. биохимия и микробиология. 2000. Т. 36, № 6. С. 652-655.

14. Пиковский Ю.И., Геннадиев А.Н., Чернявский С.С., Сахаров Г.Н. Проблема диагностики и нормирования загрязнения почв нефтью и нефтепродуктами // Почвоведение. 2003. № 9. С. 1132-1140.

15. Тесля А.В., Галактионова Л.В., Васильчинко А.С., Елисеева М.В. Оценка степени загрязнения типичных и южных черноземов Предуралья нефтепродуктами // Вестн. ОГУ. 2013. № 6 (155). С. 92-95.

16. Трофимов С.Я., Аммосова Я.М., Орлов Д.С., Осипова Н.Н., Суханова Н.И. Влияние нефти на почвенный покров и проблема создания нормативной базы по влиянию нефтезагрязнения на почвы // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 17, почвоведение. 2000. № 2. С. 30-34.

17. Яковлева Е.В. Полициклические ароматические углеводороды в системе почва-растение: автореф. дис. ... канд. биол. наук. М., 2009. 22 с.

18. Del Panno M.T., Morelli I.S., Engelen B., Berthe-Corti L. Effect of petrochemical sludge concentrations on microbial communities during soil bioremediation // FEMS Microbiol. Ecol. 2005. Vol. 53. P. 305-316.

19. McGill W.W. Soil restoration following oil spills - a review // J. Can. Petrol. Technol. 1977. Vol. 16, N 2. P. 60-67.