Чувствительность растительных и бактериальных тест-систем при определении мутагенного влияния нефтезагрязнений на окружающую среду

МУТАГЕНЕЗ И КАНЦЕРОГЕНЕЗ

© П.М. Джамбетова,

Н.В. Реутова

Кабардино-Балкарский государственный университет им. Х.М. Бербекова, кафедра генетики, селекции и семеноводства, г. Нальчик

Ш При исследовании мутагенного влияния почв, загрязненных продуктами горения и кустарной переработки нефти, растительная тест-система соя (Glycine max. (L.) Merill) линии Т219 оказалась более чувствительной, чем стандартный тест Эймса. При проведении подобного рода исследований предпочтительней использовать растительные тест-системы, так как они являются более чувствительными, простыми в использовании и дешевыми по сравнению с бактериальными.

Ш Ключевые слова: бенз(а)пирен; мутагенез; продукты переработки нефти; тест-системы; тяжелые металлы

ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ РАСТИТЕЛЬНЫХ И БАКТЕРИАЛЬНЫХ ТЕСТ-СИСТЕМ ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ МУТАГЕННОГО ВЛИЯНИЯ НЕФТЕЗАГРЯЗНЕНИЙ НА ОКРУЖАЮЩУЮ СРЕДУ

ВВЕДЕНИЕ

Среди множества загрязнителей окружающей среды необходимо выделить нефть и нефтепродукты, поступление которых постоянно возрастает и оказывает негативное влияние на воду, почвенный покров, растительный и животный мир. В комплексе экологических проблем, связанных с нефтезагрязнениями, особое место занимает прогноз возможных генетических последствий этого загрязнения.

Существенный вклад в загрязнение окружающей среды в Чеченской республике внесли десятки горевших в течение нескольких лет нефтяных скважин и распространившаяся в последнее время кустарная переработка нефти. Мини-заводы, на которых производится кустарная переработка нефти, могут быть практически в любых местах. Чаще всего их устанавливают на окраинах населенных пунктов или лесополосах. Количество их может насчитывать от нескольких десятков до нескольких сотен около одного селения [3].

В качестве метода определения генотоксичности загрязнителей предлагается использовать набор специальных тест-систем по изменению маркерных признаков которых можно судить о степени загрязнения окружающей среды. Но подобрать единый универсальный набор биотестов для всех случаев оценки степени загрязнения почвы и ее токсичности практически невозможно [2, 9]. В качестве тест-систем используют и бактериальные системы, примером которых служит тест Эймса, и растительные тест-системы, представленные пигментными мутантами. Остановимся подробнее на описании последних.

У сои известно по крайней мере 19 рецессивных генов, вызывающих появление желтых листьев [10]. Разного типа соматические мутации вызывают появление разного типа пятен на листьях. У растений использованной нами линии Т219 синтез хлорофилла определяется аллелями гена Уп: доминантной Уц обусловливающей темно-зеленую окраску листьев и рецессивной уц обусловливающей золотисто-желтую окраску листьев. УПУП растения — гомозиготные доминанты — имеют темно-зеленую окраску, упуп — рецессивные гомозиготы — золотисто-желтого цвета. Растения золотисто-желтого цвета при выращивании быстро погибают после того, как разовьются 2 первых простых листа, и лишь в редких случаях успевает появиться первый сложный тройчатый лист. Уп уп — гетерозиготные растения светло-зеленого цвета, то есть здесь имеет место неполное доминирование.

На всех трех типах листьев могут появляться разного рода мозаичные пятна, являющиеся результатом разных типов мутаций. Целый ряд мутагенов, таких как алкилирующие соединения, ингибиторы аппарата митотического веретена, нуклеотиды и их аналоги, ингибиторы синтеза ДНК и белка, разные виды облучения были протестированы на сое, и полученные результаты вполне согласуются с результатами, полученными на других тест-системах. В итоге стало возможным довольно точно определить генетическую природу возникающих пятен и специфичность действия не исследованных ранее мутагенов [11 — 17].

На листьях растений разной окраски могут появляться различного типа пятна. Эти пятна имеют четкие границы, что позволяет довольно легко отличить их от пятен, появляющихся в результате физиологических процессов. Так, на темно-зеленых листьях УцУц растений могут появляться ярко-зеленые пятна в результате прямой Уп ^ уп мутации и очень темно-зеленые пятна в результате нерасхождения хромосом, то есть появления УПУП У11 клеток на У11У11 основе [16].

На золотисто-желтых листьях упуп растений может появиться только один тип пятен — ярко-зеленые. Единственной причиной этого может быть только обратная мутация уп ^ Уп [14,17]. Наибольшим разнообразием появляющихся пятен отличаются гетерозиготные УцУц растения. На их листьях могут появляться участки золотисто-желтого цвета, причиной которых может быть как прямая Уп ^ уп генная мутация, так и потеря Уп фрагмента в результате делеции; темно-зеленые пятна, сходные с УцУц фенотипом за счет как обратных генных мутаций, так и нерасхождения хромосом, когда компонент из моносомных клеток не развился, а также приобретения клеткой Уп фрагмента, возникшего в результате делеции в ближайшей клетке; двойные пятна, когда рядом с темно-зеленым пятном находится желтое, являющееся почти его зеркальным отражением. Причиной появления таких пятен является митотический кроссинговер. Иногда один компонент двойного пятна может не развиться, и тогда возникнет одиночное пятно [13, 14, 17].

Поскольку появление одного и того же типа пятна может быть обусловлено разными причинами, необходимо анализировать относительное возрастание частоты всех типов пятен на всех типах листьев, чтобы сделать заключение о специфичности и механизмах мутационного воздействия того или иного реагента.

Данная работа посвящена исследованию мутагенного влияния почв загрязненных продуктами добычи, переработки и горения нефти с использованием растительных и бактериальных тест-систем и проведению сравнительного анализа пригодности данных тест-систем для этих целей. В качестве бактериальной тест-системы был использован стандартный тест Эймса. В качестве рас-

тительной тест-системы была использована соя (Glycine max. (L.) Merill).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для проведения исследования были выбраны несколько населенных пунктов, где более 13 лет производится кустарная переработка нефти. К таким населенным пунктам относятся села: Долинск (Грозненский район), Алхан-Юрт (Урус-Мартановский район), Мескер-Юрт (Шалинский район), Цоцан-Юрт (Ша-линский район), Гельдеген (Курчалоевский район). Выбор территорий связан с тем, что села эти располагаются в одном природно-климатическом районе, обладают одинаковыми ландшафтными характеристиками, имеют одинаковый растительный покров.

Перечисленные населенные пункты взяты как загрязненные зоны. В качестве условно-чистой зоны было выбрано село Гойты (Урус-Мартановский район), в котором подобного производства не было и которое также относится к данному природно-климатическому району.

В вышеперечисленных населенных пунктах были отобраны образцы почв. Химический анализ проб почв проводили на содержание нефтепродуктов, некоторых тяжелых металлов (Pb, Cd, Cr, Co, Mn) и бенз(а)пире-на, содержание которого позволит судить о наличии в почве всего спектра полициклических ароматических углеводородов, являющихся канцерогенными и мутагенными веществами.

Анализы проб почвы на содержание нефтепродуктов и тяжелых металлов проводили в лаборатории химии гумуса почвенного стационара факультета почвоведения МГУ им. М.В. Ломоносова. Для определения нефтепродуктов использовали методику ускоренного определения содержания нефтепродуктов в различных природных средах (водах, почвах) методом инфракрасной спектроскопии [4].

Содержание тяжелых металлов определяли методом атомно-абсорбционной спектрофотометрии на приборе 5100РС фирмы Perkin Elmer по стандартной методике фирмы-изготовителя прибора.

Определение содержания бенз(а)пирена проводили в испытательной лаборатории почв, кормов, сельскохозяйственной и пищевой продукции, природных вод АНО НПЦ «Эконорма» при МГУ им. М.В. Ломоносова методом спектрофлуориметрического анализа при низких температурах.

Первой тест-системой, которую мы использовали для определения возможного мутагенного влияния загрязненных почв, был тест Эймса. В настоящее время он широко используется в большинстве лабораторий мира как один из основных методов анализа химических соединений, являющихся потенциальными мутагенами или промутагенами. Нами были использованы

индикаторные штаммы Salmonella typhimurium TA98, ТА100 [7, 8]. Наличие мутагенного эффекта у исследуемого препарата учитывали по индукции обратных мутаций от ауксотрофности по гистидину к прототроф-ности. Получение органических экстрактов из образцов почвы проводили следующим образом: 50 г пробы почвы заливали в соотношении 1 : 5 смесью органических растворителей (ацетон : гексан — 1:1) и выдерживали в течение суток. Полученный экстракт сливали в колбу, а процедуру повторяли еще 2-3 раза до получения неокрашенного экстракта. Объединенные экстракты упаривали до сухого веса на роторном испарителе и разводили осадок в 2,5 мл ДМСО.

Второй тест-системой была растительная тест-система соя (Glycine max. (L.) Merill) линии Т219 (Y11y11). Данная тест-система уже была использована ранее для исследования мутагенного влияния отходов горно-обогатительного комбината и показала высокую чувствительность [5].

Для изучения мутагенного действия загрязнения окружающей среды продуктами нефтепереработки и горения нефти семена проращивали в теплицах на почвах, взятых в вышеперечисленных населенных пунктах. Растения поливали водопроводной водой. Проращивали семена по 50 штук в четырехкратной повторности в течение 3—4 недель до появления двух простых и одного сложного листа. Одновременно определяли всхожесть семян.

В данных указывали количество пятен на лист и анализировали как общее их количество, так и частоту отдельного типа пятен по каждому типу листьев, что позволило сделать заключение о характере проявляющихся мутаций. Цифровой материал по частоте разного типа пятен на разных типах листьев подвергли дисперсионному анализу по Рокицкому [6].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Наши исследования по изучению влияния нефти и нефтепродуктов мы начали с определения уровня загрязнения почв. В табл. 1 приведены данные по содержанию нефтепродуктов и бенз(а)пирена в почвах изучаемых населенных пунктов. Как видно из таблицы, в почвах исследуемых населенных пунктов отмечено повышенное содержание углеводородов, нефтепродуктов и бенз(а)пи-рена. Несмотря на то, что населенный пункт Гойты выделен для исследований в качестве условно чистой зоны, в почвах, отобранных в его окрестностях, в небольших количествах содержатся нефтепродукты (0,02 %) и бенз(-а)пирен (0,03 мг/кг), концентрация которого превышает ПДК в 1,5 раза. Учитывая, что в условно чистой зоне не производилась кустарная переработка нефти, подобное загрязнение почвы можно объяснить переносом веществ воздушными потоками [1].

Таблица 1

Содержание нефтепродуктов и бенз(а)пирена в исследуемых почвах [1]

№ Место отбора почвы Углеводороды % Нефте- продукты, % Бенз(а)- пирен, мг/кг

1 Г ойты 0,03 0,02 0,03

2 Цоцан-Юрт 0,86 0,73 0,06

3 Гельдеген 0,63 0,52 0,14

4 Мескер-Юрт 1,17 1,10 0,15

5 Алхан-Юрт 1,48 i,48 0,26

6 Долинск 1,72 i,56 i,83

Химический анализ почв на содержание тяжелых металлов, являющихся мутагенами, показал, что их содержание не превышает предельно допустимых концентраций для Сё, Сг, Со и Мп (табл. 2). Концентрация РЬ превышает ПДК в населенных пунктах Гельдеген, Ал-хан-Юрт и Долинск в 1,8—2,0 раза, а по сравнению с условно чистой зоной в 1,4—1,6 раза.

По данным табл. 1 и 2 видно, что практически все отобранные почвы содержат повышенное количество нефтепродуктов и бенз(а)пирена, причем наиболее загрязненным районом по всем показателям (кроме Сё) является Долинск.

Таблица 2

Содержание тяжелых металлов в исследуемых почвах, мг/кг

№ Место отбора почвы Pb Cd Cr Co Mn

1 Гойты 38,21 0,68 56,23 15,41 40,66

2 Цоцан-Юрт 32,64 1,89 20,14 17,54 18,26

3 Гельдеген 59,85 1,35 85,60 18,64 114,68

4 Мескер-Юрт 34,33 1,62 20,28 19,06 15,96

5 Алхан-Юрт 54,70 1,22 72,44 17,80 136,78

6 Долинск 61,22 1,35 95,32 19,48 170,02

ПДК 30 3,0 100 25 1500

Поскольку наиболее опасным загрязнителем из всех исследованных является бенз(а)пирен, то все населенные пункты мы расположили в порядке возрастания содержания именно этого вещества. В основном эта последовательность совпала и с содержанием нефтепродуктов в почвах. Такого же закономерного возрастания содержания тяжелых металлов в почвах этих населенных пунктов не наблюдается, но поскольку их содержание не превышает ПДК (за исключением РЬ), то вряд ли тяжелые металлы могли оказывать мутагенное вли-

яние. Но даже в этом виде загрязнений выделяется До-линск, где зарегистрировано максимальное количество всех тяжелых металлов (за исключением Сё).

Результаты исследования

В качестве первой тест-системы для обнаружения мутагенного влияния загрязненных почв мы использовали тест Эймса. Результаты экспериментов представлены в табл. 3.

Таблица 3

Мутагенная активность органических экстрактов исследуемых образцов почв в тесте Эймса на штаммах 5. typhimurium ТА 100 и ТА 98

Населенные пункты, вариант опыта Доза экстракта на 1 чашку Штаммы Salmonella typhimurium

ТА-100 ТА-98

НMAC DMAC НMAC DMAC

Гойты 0,1 мл 110 115 32 38

Цоцан-Юрт 0,1 мл 105 112 27 35

Гельдеген 0,1 мл 104 110 33 36

Мескер-Юрт 0,1 мл 98 103 33 35

Алхан-Юрт 0,1 мл 101 109 31 37

Долинск 0,1 мл 109 647 28 173

Контроль — ДМСО 0,1 мл 107 112 29 34

Азид натрия 5 мкг 890

2-аминоантрацен 5 мкг 115 2600 31 1253

2-нитрофлуорен 5 мкг 760

Примечание: в таблице приведено среднее число ревертантов his из трех чаше: НМАС — неполная микросомальная активирующая смесь; ПМАС — полная микросомальная активирующая смесь.

Видно, что вещества, использованные в качестве позитивных контролей эффективно индуцировали мутации у соответствующих штаммов. 2-аминоантрацен индуцировал мутации у обоих штаммов только в вариантах с ПМАС (полная микросомальная активирующая смесь), то есть в результате метаболической активации.

Из исследуемых образцов мутагенную активность показал только экстракт почвы из населенного пункта Долинск, который индуцировал мутации у обоих штаммов в присутствии системы метаболической активации. В почвах данного населенного пункта содержится максимальное количество бенз(а)пирена (см. табл. 1).

Вторая использованная нами тест-система соя Glycine max. (L.) Merill линии Т219 оказалась значительно более чувствительной и более удобной в использовании, так как мутагенное влияние почв обнаруживалось и в менее загрязненных населенных пунктах.

Таблица 4

Влияние нефтезагрязнений на сою Glycine max.

№ Населенный пункт Всхожесть семян, % Всего листьев, шт Всего пятен Пятен на лист

1 Гойты 96,0 795 145 0,182

2 Цоцан-Юрт 80,5 614 416 0,678

3 Гельдеген 70,5 638 436 0,683

4 Мескер-Юрт 77,3 623 556 0,893

5 Алхан-Юрт 77,4 607 484 0,797

6 Долинск 69,5 601 567 0,943

В табл. 4 приведены общие данные по количеству пятен на всех типах листьев. Всхожесть семян показана для того, чтобы можно было судить о токсическом влиянии загрязнителей. Как видно из таблицы, загрязнение почвы нефтепродуктами приводит к снижению всхожести семян в 1,2—1,4 раза по сравнению с условно чистой зоной. Во всех загрязненных зонах общее количество пятен на лист возрастает в несколько раз, что указывает на наличие мутагенного влияния данного типа загрязнений.

Более подробные данные по каждому типу пятен приведены в табл. 5. Во всех исследуемых населенных пунктах происходит равномерное увеличение количества

Таблица 5

Влияние нефтезагрязнений на сою Glycine max.

№ Зоны Светло-зеленые листья (пятен на лист) Желтые листья (пятен на лист) Темно - зеленые листья (пятен на лист) Общее число пятен на лист

желтые пятна темно- зеленые пятна парные пятна светло- зеленые пятна светло- зеленые пятна

1 Гойты 0,16 0,05 0,01 0,29 0,06 0,182

2 Цоцан- Юрт 0,46 0,21 0,04 1,43 0,27 0,678

3 Гельдеген 0,41 0,24 0,03 1,41 0,37 0,683

4 Мескер- Юрт 0,43 0,22 0,04 1,28 0,31 0,893

5 Алхан- Юрт 0,49 0,27 0,05 1,48 0,36 0,797

6 Долинск 0,62 0,30 0,06 1,48 0,40 0,943

всех типов пятен на всех типах листьев, что говорит об отсутствии специфичности мутагенного действия неф-тезагрязнений.

Следует отметить совпадение полученных результатов с уровнем загрязнения почв бенз(а)пиреном и нефтепродуктами, так как наибольшее количество всех типов соматических мутаций проявляется для почв в с. -Долинск, что соответствует максимальному уровню загрязнения (см. табл. 1).

Обсуждение результатов

В данной работе мы попытались оценить токсическое и генетическое влияние продуктов горения и кустарной переработки нефти. Проведенные исследования показали, что содержание в почвах всех населенных пунктов нефтепродуктов и бенз(а)пирена значительно, в ряде случаев в десятки раз, превышает ПДК. Следовательно, продукты кустарной переработки нефти активно поглощаются почвой и сохраняются в ней, проходя и метаболическую переработку почвенной микрофлорой.

Определение токсического влияния загрязнителей не представляет сложности. Значительно труднее выявить возможное генетическое влияние субтоксических концентраций этих же загрязнителей. Исследование генетического влияния загрязнителей окружающей среды требует использования специальных тест-систем. В нашей работе мы использовали одну из растительных тест-систем — сою Glycine max. (L.) Merill линии Т219, пригодную не только для определения наличия мутагенной активности исследуемого вещества, но и типов возникающих мутаций. Использование данной тест-системы показало, что загрязненные почвы обладают мутагенной активностью. Причем влияние тем сильнее, чем выше уровень загрязнения, то есть наблюдается дозо-вая зависимость. Что касается специфичности действия данного вида загрязнений, то оно не выявлено. Имело место более или менее равномерное возрастание количества всех типов пятен на всех типах листьев. Это говорит о том, что продукты кустарной переработки и горения нефти вызывают как генные, так и хромосомные мутации, следовательно, обладают общим генотоксическим действием.

Для подтверждения мутагенного воздействия подобного типа загрязнений мы использовали общепринятый и широко используемый во всем мире тест Эймса. С использованием данного теста было выявлено мутагенное влияние только вытяжки из почв наиболее загрязненного населенного пункта Долинск. То, что вытяжки из других населенных пунктов не проявили мутагенной активности, вполне объяснимо. Вытяжки из почв содержат не весь комплекс загрязняющих веществ и не в том количестве, в котором они имеются в почве. Также не-

обходимо учитывать невысокие концентрации загрязняющих веществ в почвах из остальных населенных пунктов, непродолжительное время воздействия загрязнителей на микроорганизмы и возможное использование ими органических веществ в качестве источника питания, в связи с чем мы и наблюдаем низкую чувствительность данной тест-системы. Тем не менее, мутагенная активность проявляется в селении Долинск и при использовании этой тест-системы.

Таким образом, мы доказали, что продукты кустарной переработки нефти обладают мутагенной активностью. Данные, полученные с использованием двух тест-систем, в основном совпадают. Мы считаем, что в исследованиях подобного рода предпочтительней использовать растительные тест-системы. Они более чувствительны, поскольку в нашей работе соя Glycine max. (L.) Merill линии Т219 реагировала на значительно более низкие уровни загрязнения по сравнению с тестом Эймса. Кроме высокой чувствительности растительные тест-системы удобны, просты в использовании, не требуют дорогого оборудования и стерильных условий.

Литература

1. Джамбетова П.М., Реутова Н.В., Ситников М.Н. Влияние нефте-загрязнений на морфологические и цитогенетические характеристики растений. // Экол. генет. — 2005. — Т. 3, № 4. — С. 5—10.

2. Киреева Н.А., Бакаева М.Д., Тарасенко Е.М. Комплексное биотестирование для оценки загрязнения почв нефтью. // Экология и промышленность России. — 2004. — № 2. — С. 26—29.

3. Оценка природного потенциала и экологического состояния территории Чеченской Республики / Под ред. акад. РАН М.Ч. За-лиханова. — СПб.: Гидрометеоиздат, 2001. — 158 с.

4. Орлов Д.С., Гришина Л.А. Практикум по химии гумуса. — М.: Изд-во МГУ, 1981. — 272 с.

5. Реутова Н.В., Воробьева Т.И., Реутова Т.В. Некоторые подходы к оценке генетического влияния промышленных предприятий на окружающую среду. // Генетика. — 2005. —Т. 41, № 6. — С. 753-758.

6. Рокицкий П.В. Биологическая статистика. — Минск, 1964. — 327 с.

7. Ames B.N., Lee E.D., Durston WE. An improved bacterial test system for the detection and classification of mutagens and carcinogens.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1973. — Vol. 70. — P. 782-786.

8. Ames B.N., McCann J., Yamasaki E. Method for detecting carcinogens and mutagens with the Salmonella/mammalian microsome mutagenecity test.// Mutat. Res. — 1975. — Vol. 31. — P 347-364.

9. Kong M.S., Ma T.H. Genotoxicity of contaminated soil and shallow well water detected by plant bioassays. // Mutat. Res. — 1999. — Vol. 426(2). — P 221-228.

10. Zon J.J, Singh R.J, Hymowitz T. Assodation of the yellow leaf (y10) mutant to soybean chromosome 3. // Hered. — 2003. — Vol. 94, N4. — P352-355.

11. Vig B.K. Soybean (Glycine max (L.) Merill): a new test system for study of genetic parameters as affected by environmental mutagens. // Mutat. Res. — 1975. — Vol. 31. — P 49-56.

12. Vig B.K. Soybean (Glycine max (L.) Merill) as a short-term assay for study of environmental mutagens. // Mutat. Res. — 1982. — Vol. 99. — P. 339-347.

13. Vig В., Somatic crossing over in higher plants. // In: Environmental mutagenesis, carcinogenesis and plant biology: Vol. II. — Praeger Press, 1982. — P 26-54.

14. Vig B.K. Somatic mosaicism in plants with special reference to somatic crossing over. // Environ, health Persp. — 1978. — Vol. 27. — P 27-36,

15. Vig B.K. Soybean (Glycine max): a new test system for study of genetic parameters as affected by environmental mutagens. // Mutat. Res. — 1975. — Vol. 31. — P 43-56.

16. Vig 3.K. Somatic crossing over in Glycine max (L.) Merill: mutagenicity of sodium azide and lack of synergistic with caffeine and mytomycin C. // Genetics. — 1973. — Vol. 75, N 2. — P. 265-277.

17. Vig B.K. Somatic crossing over in Glycine max (L.) Merill: effect of some inhibitors of DNA synthesis on the induction of somatic

crossing — over and point mutation. // Genetics. — 1973. — Vol. 73. — P. 583-596.

Dzhambetova P.M., Reutova N.V.

^ SUMMARY: The plant test system soybean (Glycine max. (L.) Merill) line T219 turned out to be more sensitive than standart Ames test for evaluation of the mutagenic effect of soil, contaminated by products of combustion and domestic cottage processing of oil. It is preferable to use plant test systems for such investigations because they are more sensitive, simple and inexpensive in comparison with microbial ones.