СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ БАКТЕРИЙ РОДА Pseudomonas
METHOD FOR CULTURING Pseudomonas BACTERIA

Изобретение относится к области сельского хозяйства и химии и может быть использовано при производстве биотехнологических продуктов в экологической и сельскохозяйственной биотехнологии (производство биоудобрений, биопрепаратов для защиты растений, производство биополимеров, белка одноклеточных, очистка сточных вод, производство биопрепаратов для рекультивации загрязненных территорий и т.д.).
В настоящее время наибольшая стоимость питательных сред при производстве различных биотехнологических продуктов приходится на источники углерода и энергии (энергетический субстрат), при этом, среди перечня критериев эффективности биотехнологического производства, наибольшая роль уделяется экономическому коэффициенту. Экономический коэффициент показывает, какая часть субстрата перешла в биомассу, чем он выше, тем эффективнее микроорганизмы утилизируют субстрат, тем выше выход их биомассы и численности с 1 г потребленного субстрата, тем меньше себестоимость готовой продукции. Поэтому разработка способов и методов уменьшения затрат субстрата при увеличении выхода продукции является одной из основных задач биотехнологии на протяжении всего существования данной науки. Особенно остро этот вопрос возник на современном этапе развития человечества и связан с исчерпанием традиционных субстратов.
Известен способ выращивания бактерий рода Pseudomonas (патент US 4555487, опубл. 26 ноября 1985, МПК C12N 1/38), в котором в питательную среду добавляют по меньшей мере одно амидное соединение, выбранное из группы, состоящей из акриламида, метакриламида, кротонамида и н-бутирамида. Способ позволяет обеспечить производство клеток бактерий рода Pseudomonas, имеющих высокую активность нитрилгидратазы, с высоким выходом.
Известен способ культивирования бактерий рода Pseudomonas (патент US 4880739, опубл. 14.11.1989, МПК C12N 9/78), в котором клетки бактерий рода Pseudomonas получают путем непрерывного или с приращением, но не в одной партии за один раз, добавления к питательной среде в течение воспроизводства и пролиферации клеток бактерий Pseudomonas, по меньшей мере, одного соединения, выбранного из группы, состоящей из пропионитрил, изобутиронитрил, пропионовой кислоты и изобутирамид в количестве, эффективном для повышения активности нитрилгидратазы на единицу культуральной жидкости культуральной среды. Способ позволяет обеспечить производство клеток бактерий рода Pseudomonas, имеющих высокую активность нитрилгидратазы, с высоким выходом.
Недостатками аналогов является увеличение стоимости питательной среды при добавлении органических соединений при активизации нитрилгидратазы бактерий рода Pseudomonas и отсутствие увеличения выхода самих микробов-агентов биотехнологии при увеличении стоимости питательной среды.
Известен способ получения культивирования бактерий Pseudomonas fluorescens АР-33 и Pseudomonas aureofaciens BS 1393 на среде, содержащей глюкозу в качестве единственного источника энергетического субстрата, с добавлением наночастиц диоксида титана (Сухушина О.А., Минаева О.М. Влияние наночастиц диоксида титана на рост культуры клеток бактерий Pseudomonas aureifaciens BS 1393. // Наука XXI века: Новый подход: Материалы VIII молодежной международной научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых (29-29 января 2014 г.). - СПб: Изд-во «Айсинг», 2014. - С. 55-59), выбранный в качестве прототипа.
Способ заключается в засеве культуры на предварительно стерилизованную и обработанную ультразвуком жидкую питательную среду, содержащую глюкозу в качестве единственного источника энергетического субстрата и диоксид титана.
Недостатками прототипа является:
1. невозможность увеличения численности бактериальной популяции и выхода продукции при добавлении наночастиц диоксида титана,
2. культивирование ограниченного круга бактерий, а также увеличенное время культивирования.
3. отсутствие возможности регулирования биотехнологических процессов и прогнозирования получаемых результатов.
Задачей заявленного изобретения является разработка способа культивирования широкого круга бактерий рода Pseudomonas с увеличением численности бактерий на 1 г потребленного питательного субстрата и уменьшением сроков культивирования до достижения необходимой бактериальной численности путем добавления в богатую питательную среду, оптимизированную по содержанию основных органических и минеральных компонентов, наночастиц диоксида титана размером 5-6 нм в расчетной концентрации.
9
2
Поставленная задача решается тем, что бактерии рода Pseudomonas засевают на предварительно стерилизованную и обработанную ультразвуком в течение 20-25 мин при частоте 35 кГц жидкую питательную среду с диоксидом титана, при этом диоксид титана добавляют в виде водной суспензии, предварительно обработанной ультразвуком в течение 20-25 мин при частоте 35 кГц, а засев маточной культуры бактерий с концентрацией 1-8*10 клеток/мл в объеме 10% от общего проводится в обработанную и стерилизованную питательную среду, бактерии выращивают при температуре +28-30°С, с аэрацией при минимальной концентрации растворенного кислорода pO=5,0-6,0 мг/л в течение 24-32 ч до достижения фазы замедления бактериального роста, при следующем соотношении компонентов, масс. %:
пептон - 2,0%;
глицерин - 1,0%;
4
MgSO - 0,15%;
2
4
KHPO - 0,15%;
диоксид титана - 0,002-0,0025%;
остальное - вода.
В водной суспензии диоксид титана находится в виде наночастиц, которые получают методом электровзрыва. Они имеют размер 5-6 нм. Их верификацию проводят как с помощью электронной микроскопии в проходящем свете, так и методом динамического светорассеяния с помощью анализатора размеров диспергированных частиц.
Таким образом, одной из наиболее основных операций при культивировании бактерий рода Pseudomonas с диоксидом титана является не только его наличие в среде и концентрация, но и введение в питательную среду обязательно суспензии наночастиц диоксида титана во взвешенном состоянии.
Пептон, входящий в состав предложенной среды для культивирования бактерий, является наиболее широко используемым энергетическим субстратом, пригодным для роста и развития практически всех известных почвенных, ризосферных и других видов бактерий рода Pseudomonas, относящихся к аммонификаторам. Пептон является субстратом, содержащим целый набор аминокислот и полипептидов, которые легко усваиваются бактериями различного систематического положения. Глицерин, входящий в состав в среды, является более трудно усваиваемым субстратом, однако способствует росту микроорганизмов на более поздних фазах культивирования и продляет сроки хранения микробных препаратов. В целом, предложенная среда является универсальной и обеспечивает рост и развитие практически всех бактерий рода Pseudomonas.
Техническая сущность изобретения поясняется примером. Для культивирования бактерий рода Pseudomonas готовят в ферментере или других емкостях питательную среду для выращивания бактерий следующего состава (масс. %):
пептон - 2,0%;
глицерин - 1,0%;
4
MgSO - 0,15%;
2
4
KHPO - 0,15%;
остальное - вода.
9
2
Стерилизуют рабочий объем ферментера с питательной средой при температуре +116°С 20-25 мин или емкости с питательной средой в паровом стерилизаторе при режиме 1 атм 20-25 мин. В колбах в концентрации 1 г/л готовят водную суспензию наночастиц диоксида титана и также стерилизуют. Остывшую водную суспензию наночастиц диоксида титана в колбах обрабатывают ультразвуком в течение 20-25 мин при частоте 35 кГц в ультразвуковой ванной для перевода наночастиц во взвешенное состояние. Немедленно вводят взвешенную суспензию диспергированных наночастиц диоксида титана в питательную среду до достижения концентрации наночастиц в среде (масс. %) 0,002-0,0025%. Осуществляют засев питательной среды предварительно выращенной маточной культурой бактерий с концентрацией 1-8*10 клеток/мл в объеме 10% от общего. Выращивают бактерии при температуре +28-30°С, аэрации на уровне рО=4,0-5,0 мг/л в течение 18-24 ч в зависимости от планируемой бактериальной численности.
Контроль численности осуществляют стандартными методами учета (подсчет клеток в камере Горяева, метод Коха, учет численности по оптической плотности культуры и др.).
На фиг. 1 показано изменение концентрации бактерий рода Pseudomonas при их культивировании (средние показатели для пяти изученных штаммов видов P. fluorescence, P. aureofaciens, Pseudomonas sp.). Цифрами обозначено следующее: 1 - контроль (культивирование бактерий в оптимальных условиях без добавления наночастиц диоксида титана), 2 - минимальная среда с глюкозой и наночастицами диоксида титана (25 мг/л), 3 - богатая среда, оптимизированная по составу компонентов для бактерий рода Pseudomonas и наночастицами диоксида титана (25 мг/л).
На фиг. 2 приведено изменение концентрации бактерий рода Pseudomonas при их культивировании (средние показатели с доверительным интервалом (р<0,05) для пяти изученных штаммов видов P. fluorescence, P. aureofaciens, Pseudomonas sp.), где 1 - контроль (культивирование бактерий в оптимальных условиях без добавления наночастиц диоксида титана), 2 - минимальная среда с глюкозой и наночастицами диоксида титана (25 мг/л), 3 - богатая среда, оптимизированная по составу компонентов для бактерий рода Pseudomonas и наночастицами диоксида титана (25 мг/л), 4 - богатая среда, оптимизированная по составу компонентов для бактерий рода Pseudomonas и диоксидом титана в обычной форме (25 мг/л).
9
Согласно фиг. 1 добавление в состав питательной среды наночастиц диоксида титана способствует более быстрому достижению бактериальной культурой заданных значений численности. Так, если культивирование в оптимальном режиме направлено до достижения бактериальной численности, находящейся на уровне 1*10 клеток/мл, то в контроле (линия 1, среда без наночастиц) достижение данной численности наблюдается через 24-25 ч, добавление в минимальную по составу среду, содержащую глюкозу в качестве единственного источника энергетического субстрата (линия 2), наночастиц диоксида титана в концентрации 25 мг/л приводит к ускорению достижения заданного значения на 4-5 часов. Добавление наночастиц в той же концентрации к питательной среде, оптимизированной по составу (линия 3), дополнительно ускоряет процесс на 1,5-2 часа по сравнению с бедной средой.
Рассчитанные, исходя из полученных кривых, описывающих рост микробной культуры, удельные скорости роста также показывают значительное увеличение в присутствии наночастиц диоксида титана (фиг. 2).
Сходные зависимости были отмечены для целого ряда штаммов бактерий рода Pseudomonas, что свидетельствует об универсальности отмеченного эффекта на данную систематическую группу бактерий.
2
Экспериментально показано, что использование наночастиц диоксида титана (TiO) в концентрации 20-25 мг/л в составе питательных сред увеличивает численность бактерий рода Pseudomonas и их биомассу с одного грамма энергетического субстрата (например, глюкозы или глицерина) в 5-7 раз в зависимости от концентрации, увеличивает удельную скорость роста бактериальной культуры на 12-23% (фиг. 2), а значит, сокращают сроки производства биотехнологического продукта. При использовании богатой по составу питательной среды с включением перечня органических соединений в неопределенном составе (например, пептон основной) выход бактериальных клеток может увеличиваться в 10-20 раз (Таблица 1).
Также показано, что в присутствии наночастиц диоксида титана уменьшается скорость потребления энергетического субстрата в 1,6-6 раз в зависимости от вида бактерии и увеличивается его остаточная концентрация в культуре бактерий на 20-30% по сравнению с контролем (р<0,05).
Технический результат - повышение производительности процесса культивирования, увеличение выхода бактерий в процессе культивирования или производства биопрепарата, снижение энергозатрат на процесс и расход субстратов.