РАЗМЫКАЕМЫЙ ВОЛОКОННО-ОПТИЧЕСКИЙ ЗОНД С МНОГОКАНАЛЬНЫМИ ВОЛОКНАМИ

Область техники
Предлагаемое техническое решение относится к волоконно-оптическим устройствам, предназначенным для получения оптических изображений глубоколежащих тканей головного мозга живых свободно движущихся лабораторных животных, с целью исследования функционально значимых нейрофизиологических процессов с клеточным разрешением и адресного воздействия на выделенные клетки.
Уровень техники
Оптические методы играют все более заметную роль в исследованиях нейрофизиологических и когнитивных функций, процессов формирования памяти, что связано с их эффективностью, высоким пространственным разрешением и малой инвазивностью. Оптическая микроскопия обеспечивает субклеточное разрешение, однако получение изображений возможно только для поверхностных тканей. Развитие современных методик конфокальной и нелинейно-оптической микроскопии позволяет увеличить глубину оптического контроля биологических тканей до величин порядка 1 мм, что является безусловно огромным достижением в области биовизуализации, однако не решает проблемы получение изображений более глубоко лежащих тканей, в частности, глубоко расположенных нейронных сетей в мозге живых животных. Одним из решений проблемы доставки возбуждающего оптического излучения и сбора оптического сигнала является применение волоконно-оптических эндоскопов, что позволяет преодолеть проблемы исследований глубоко лежащих тканей минимальном вмешательстве в морфологию и функциональные связи в мозге животных.
Одним из наиболее перспективных методов получения изображений биологических объектов и живых тканей в эндоскопическом режиме является использование многоканальных оптических световодов.
Волоконно-оптические флуоресцентные эндоскопы хорошо себя зарекомендовали как инструменты для минимально возмущающей визуализации глубоко лежащих структур биологических тканей, требуемых в задачах in vivo визуализации в живых свободноподвижных животных. Физический принцип оптического детектирования во всех описанных устройствах основывается на регистрации флуоресцентного отклика, что обычно предусматривает наличие биологических красителей или генетически встроенных маркеров, что накладывает условия на проведение экспериментов, в частности, связанных с выбором длин волн для возбуждения целевых биомаркеров. Настоящим прорывом в области использования волоконно-оптических зондов для исследования функциональных процессов в тканях головного мозга животных стали работы группы К. Диссерота (K. Deisseroth) из университета г. Стенфорда (США), которые фактически заложили новую дисциплину - оптогенетику. Суть оптогенетических методик заключается в целенаправленном генетическом маркировании нейронов головного мозга с целью изучения их функциональных свойств с помощью оптических и оптоволоконных методов, а также в возможности управления реакцией клеток на световое воздействие, что достигается за счет внедрения светочувствительных белков Channelrhodopsin в мембраны клеток. Группа К. Диссерота обладает рядом патентов в этой области, описывающих устройства и методы, которые позволяют не только измерять процессы, но и осуществлять обратную стимуляцию выбранных областей мозга оптическим излучением: US 9238150 «Optical tissue interface method and apparatus for stimulating cells», US 9458208 "Optically-based stimulation of target cells and modifications thereto"; US 20160194624 "System for optical stimulation of targets cells"; US 9308392 Materials and approaches for optical stimulation of the peripheral nervous system; US 9271674 "Optogenetic magnetic resonance imaging"; US 8401609 "System, method and applications involving identification of biological circuits such as neurological characteristics".
Развитие оптических технологий привело к стремительному совершенствованию технологий и росту областей применения специальных типов оптических световодов, включая многосердцевинные, для целей получения изображений тканей с высоким пространственным разрешением. [см., например, Hecht, J. (1999) City of Light: the Story of Fiber Optics, Oxford University Press, Oxford; S. Yashvinder et. al. Applied Optics, 38, 7133-7144 (1999); J. Knittel, et. al. Optics Communication, 188, 267-273 (2001); B.A. Flusberg, et. al. Nature Methods 5, 935 (2008); K.K. Ghosh, et. al. Nature Methods 8, 871 (2011)., W. Gobel, et. al. Opt. Lett. 29, 2521 (2004); B.A. Flusberg, et. al. Nature Methods 2, 941-950 (2005); D. Yelin, et. al. Nature 443, 765 (2006)] Анализ этих работ демонстрирует заманчивые перспективы для систем получения изображений на основе оптических многоканальных световодов в задачах биофотоники. Современные технологии обеспечивают производство многоканальных волокон с малым размером световодных каналов порядка нескольких микрометров и большой плотностью самих каналов, что обеспечивает возможность получения изображения биологических тканей вплоть до клеточного. Относительно малый размер внешнего диаметра волокна позволяет осуществить проникновения вглубь ткани с минимальными повреждениями.
Компания Mauna Kea Technologies (Франция) производит и использует в своих устройствах многоканальные оптические световоды, содержащие большое количество световодных сердцевин с размерами порядка нескольких микрометров. Компания обладает рядом патентов в этой области, в частности, в заявке US 20050242298 "Method and equipment for fiber optic high-resolution, in particular confocal, fluorescence imaging", описаны устройство и принципиальные особенности получения изображений органов и тканей с клеточным разрешением с помощью многосердцевинного волоконно-оптического зонда. В состав устройства входит оптическое многосердцевинное волокно, лазерный источник возбуждения, система заведения излучения в волокно на основе сканирующих гальванических зеркал и оптическая система регистрации. Оптическое излучение заводится в отдельные каналы многосердцевинного волокна, и далее из свободного (дистального) торца волокна "точечно" возбуждает флуоресценцию исследуемых объектов. Сигнал флуоресценции передается в направлении "назад" в систему регистрацию, где происходит формирование изображения. Также в заявках Mauna Kea Technologies (Франция) US 20050242298 "Method and equipment for fiber optic high-resolution, in particular confocal, fluorescence imaging", US 20120184842 "Method, an optical probe and a confocal microscopy system for inspecting a solid organ" описываются схемы реализации подобных устройств и конструктивные особенности устройств для исследования различных органов и биологических тканей с помощью многоканальных зондов, и, в частности, описывается устройство и методы для получения изображений нейронов мозга в режиме in vivo. Также в патентах Mauna Kea Technologies содержатся описание различных методик обработки изображений, получаемых из многосердцевинных волоконных зондов. В патенте US 8237131 "System and method for carrying out fibre-type multiphoton microscopic imaging of a sample" рассматриваются нелинейно-оптические методы с применением сверхкоротких лазерных импульсов для получения изображений тканей.
Известен патент Mauna Kea Technologies US 9107575 "Apparatus and method for brain fiber bundle microscopy", описывающий устройство крепления на черепе животного имплантируемого отрезка оптического волокна, который можно рассматривать как прямой аналог настоящего изобретения. Устройство содержит отрезок оптического волокна, дистальных конец которого, располагаемый в мозге животного, имеет небольшой скос. Скос упрощает проникновение дистального конца волокна в мозг животного. Устройство позволяет отсоединять оптическое волокно в случае необходимости. Однако для наблюдения процессов в мозге животного оптическое волокно нужно вставить на выбранную глубину, причем сам процесс установки оптического волокна для наблюдения наблюдаемых ранее структур мозга должен производиться с точностью до 1 мкм, что трудно реализуемо на живых существах и травмирует клетки мозга при каждой установке волокна. Кроме того, в описанном изобретении предусмотрена возможность получения изображения клеток мозга, но отсутствует возможность обратного воздействия.
Описанные выше методы получения изображений в глубоких слоях мозга обладают серьезными недостатками, связанными однократным и постоянным способом крепления зонда, что ограничивает их применение для исследования процессов формирования памяти и обучения живых свободноподвижных животных в ходе долговременных измерений. Также недостатком вышеприведенных технических решений является условие, что лабораторное животное должно постоянно содержаться в клетке в непосредственной близости от системы регистрации, а возможность проводить биологические эксперименты на протяжении длительного времени является ключевой для ряда методик исследований.
Эта проблема решается с помощью концепции размыкаемых устройств волоконных устройств (D.R. Sparta, A.M. Stamatakis, J.L. Phillips,, R. van Zessen, and G.D. Stuber, "Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits," Nature Protocols 7, 12-23 (2012). G.D. Stuber, D.R. Sparta, A.M. Stamatakis, W.A. van Leeuwen, J.E. Hardjopajinto, S. Cho, K.M. Туе, K.A. Kempadoo, F. Zhang, K. Deisseroth, and A. Bonci, "Excitatory transmission from the amygdale to nucleus accumbend facilitates reward seeking," Nature 475, 377-380 (2011). L.V. Doronina-Amitonova, I.V. Fedotov, О.I. Ivashkina, M.A. Zots, A.B. Fedotov, K.V. Anokhin, and A.M. Zheltikov, "Implantable fiber-optic interface for parallel multisite long-term optical dynamic brain interrogation in freely moving mice," Sci. Rep. 3, 3265.)
Концепция размыкаемых нейроинтрфейсов отражена в заявке на патент US 2011224554 A1 «Optogenetic Fiber Optic Cannula and Adapted Fiber Optic Connector», в которой представлена концепция размыкаемого коннектора. В основе коннектора имеется канула, которая крепится на черепе исследуемого животного, в канулу вставляется две ферулы содержащие отрезки оптического волокна, при этом дистальный конец волокна первой ферулы опускается в исследуемую ткань, а другой конец оптически соединен с длинным концом волокна, закрепленной в ответной феруле. Оптический контакт обеспечивается за счет внешней канули. Длинный конец оптического волокна соединен с системой регистрации. При этом в феруле может содержаться несколько оптических волокон. Компания Optomak, Inc. (Канада) является обладателем этого и ряда патентов в области волоконных устройств для оптогенетики. В частности, в заявке US 20140226932 «Independent dual path optical rotary joint» описывается устройство, позволяющее вращать две части коннектора друг относительно друга, а в заявке на патент US 20150366437 «Image relaying cannula with detachable self-aligning connector» описан коннектор, увеличивающий точность позиционирования канули на черепе животного и более точное оптическое соединение.
Таким образом, использование размыкаемых устройств является одним из магистральных направлений развития волоконных зондов для нейрофизиологии, однако, в описанных выше устройствах отсутствует возможность исследования тканей мозга с клеточным разрешением или они являются достаточно сильно инвазивными по отношению к живой ткани мозга животного.
Раскрытие полезной модели
Задачей заявляемого решения является создание размыкаемого волоконно-оптического зонда на основе многоканальных волокон для системы адресного контроля нейронов мозга живых свободноподвижных животных, позволяющего с минимальной инвазивностью получать оптические изображения тканей мозга с клеточным разрешением и воздействовать на отдельную адресно выбранную клетку.
Для решения поставленной задачи предлагается размыкаемый волоконно-оптический зонд с многоканальными волокнами, состоящий из двух частей, где первая часть выполнена с возможностью закрепления на черепе животного и содержит первую керамическую цилиндрическую ферулу с закрепленным в ней первым коротким отрезком многоканального оптического волокна, а вторая часть содержит коннектор со второй цилиндрической керамической ферулой и закрепленным в ней вторым длинным отрезком многоканального оптического волокна, контактные поверхности первой и второй ферул выполнены плоскими, первый и второй отрезки многоканального волокна содержат не менее одной тысячи световодов микронного размера, плоскость контакта первой и второй керамических ферул расположена в керамическом коннекторе, дистальный конец первого отрезка оптического волокна имеет плоскую поверхность, скошенную на угол от 30 до 60 градусов относительно оси оптического волокна, диаметр многоканального оптического волокна составляет от 250 мкм до 600 мкм. Скос дистального конца оптоволокна определяется необходимостью достижения эффекта «ножа», что необходимо для более плавного раздвижения клеток при проникновении волокна в ткани мозга, что уменьшает инвазивность воздействия. Скос дистального конца оптоволокна на угол от 30 до 60 градусов относительно оси волокна в случае многосердцевинного волокна с тысячами световодов микронного размера обеспечивает не только увеличение объема исследуемой области, но предоставляет возможность контроля процессов, происходящих в разных слоях тканей головного мозга, в том числе имеющих разную функциональную значимость. Предлагаемый волоконно-оптический зонд предназначен для использования в комплексной системе адресного контроля нейронов мозга живых свободноподвижных животных, в состав которой входят лазерная системой возбуждения флуоресценции и система регистрации. Эти системы соединяются посредством длинного отрезка многоканального волокна второй части зонда. Использование волоконно-оптического зонда с многоканальными волокнами в составе системы позволяет селективно возбуждать отдельные группы клеток и/или отдельные клетки мозга и получать флуоресцентные изображения генетически встроенных меток с микронным разрешением. Применение предлагаемого волоконно-оптического зонда в системе адресного контроля нейронов мозга животных позволяет следить за функциональными изменениями в отдельных клетках и нейронных сетях. Две части волоконно-оптического зонда соединяют между собой только во время проведения измерений, а при их отсутствии животные могут жить в стандартных для них условиях без опасности повредить длинный отрезок оптоволокна. Сохранение первой части зонда на черепе животного обеспечивает гарантированный доступ к одной и той же группе клеток мозга в течение длительного времени.
Плоскость контакта первой и второй ферул с отрезками многоканальных волокон составляет угол от 0 до 30 градусов относительно оси, перпендикулярной оси многоканального оптического волокна, контактные поверхности первой и второй ферул и отрезков многоканальных волокон полированы с точностью порядка 300 нм, что обеспечивает качественный оптический контакт между двумя частями зонда. Скол и полировка осуществляется под углом 0-30 градусов относительно плоскости перпендикулярной оси волокна. Скос в данном случае обеспечивает воспроизводимость и соосность соединения между отдельными сердцевинами волокна при актах замыкания/размыкания двух частей зонда. Такая конструкция также уменьшает сдвиг отдельных каналов волокна друг относительно друга при механических возмущениях, вызванных в частности движением животного, что в конечном счете приводит к существенному улучшению стабильности и повышает качество получаемых флуоресцентных изображений.
Масса первой части зонда не более 0,3 г, что не доставляет серьезных неудобств даже небольшим животным (таким, как лабораторные мыши), что особенно важно для случая, когда зонд находится в разомкнутом состоянии и животные могут находиться в привычных для них условиях, например, в своих клетках.
Длина второго отрезка оптического волокна составляет от 0,5 м до 2 м, а длина первого отрезка волокна - не более 3 см. Первый отрезок многоканального оптического волокна предназначен для закрепления на голове животного, длина первого отрезка определяется глубиной расположения дистального конца волокна. Отрезка длиной до 3 см достаточно для получения изображения глубоко лежащих тканей мозга лабораторных животных. Длина второго отрезка выбирается таким образом, чтобы обеспечить проведение долговременных экспериментов на животном и обеспечить ему свободное перемещение в пределах как минимум одного квадратного метра. Длины второго отрезка волокна в пределах от 0,5 м до 2 м достаточно для проведения большинства стандартных экспериментов с лабораторными животными, использование второго отрезка волокна длиной более двух метров может привести к повреждению длинного отрезка волокна.
Первый отрезок многоканального оптического волокна и второй отрезок многоканального оптического волокна эквивалентны по структуре. Такое исполнение обеспечивает более высокую степень оптического контакта и качество получаемых изображений.
Техническим результатом представленного технического решения является создание размыкаемого волоконно-оптического зонда с многоканальными волокнами, применение которого в системе для адресного контроля нейронов головного мозга живых свободно подвижных животных позволит с минимальной инвазивностью получать оптические изображения тканей мозга с клеточным разрешением и воздействовать на отдельную адресно выбранную клетку или группу клеток. Созданная конструкция дает возможность проводить долговременный ряд экспериментов на одном и том же животном в любой структуре мозга и при этом сохранять уверенность в получении сигнала от одной и той же группы клеток, а также осуществлять обратное воздействие на выбранные клетки.
Описание чертежей
Заявляемое решение поясняется чертежами и фотографиями.
На фиг. 1. представлена схема системы, в которой используется размыкаемый волоконно-оптический зонд с многоканальными волокнами.
На фиг. 2. представлен общий вид размыкаемого зонда, вживляемого в череп подопытного животного в замкнутом (а) и разомкнутом (б) состоянии.
На фиг. 3. представлены флуоресцентные изображения находящихся в водной среде тестовых полистироловых шариков размером порядка 7,5 мкм, полученные посредством предлагаемой системы.
На фиг. 4. представлены флуоресцентные изображения соматосенсорной коры головного мозга трансгенных мышей линии Thy1-EGFP, полученные с помощью системы для адресного взаимодействия с нейронами мозга живых свободноподвижных животных на основе размыкаемого волоконно-оптического зонда с многоканальными волокнами.
На фиг. 1. представлена схема системы, в которой используется размыкаемый волоконно-оптический зонд с многоканальными волокнами: 1 - лазерная система возбуждения, содержащая не менее двух лазерных источников с различными длинами волн и варьируемой мощностью (длины волн лазерных источников должны выбираться в соответствии со спектральными характеристиками генетически встроенных в нейроны биомаркеров и светочувствительных белков, а мощность излучения соответствующего источника должна быть достаточной для открытия ионных каналов в мембране клеток, в которую встроен светочувствительный белок); 2 - система сканирования на основе двух гальванозеркал для позиционирования излучения на отдельные сердцевины многоканального волокна, 3 - дихроичная делительная пластина, отделяющее излучение накачки от излучения флуоресценции, распространяющегося в обратном направлении; 4 - модуль фокусировки (объектив); 5 - длинный отрезок многоканального оптоволокна с ферулой 6 на конце; 7 - короткий отрезок многоканального оптоволокна, закрепляемый на черепе подопытного животного с ферулой 8 на конце; 9 - коннектор для жесткого соединения первой и второй частей размыкаемого зонда; 10 - конфокальная система, обеспечивающая точное выделение регистрируемого излучения флуоресценции от отдельных каналов оптоволокна; 11 - оптическая система регистрации (включающая полосовые фильтры и спектрометр, фотоэлектронные умножители (или фотодиоды), электронную систему управления, аналого-цифровой преобразователь); 12 - система контроля на основе компьютера для управления лазерной системой возбуждения, анализа регистрируемого сигнала, построения изображений исследуемой области мозга и управления мощностью лазеров.
На фиг. 2 представлен общий вид размыкаемого зонда в замкнутом (а) и разомкнутом (б) состоянии: первая часть зонда выполнена в виде керамической ферулы 8, закрепляемой с помощью специального клея на кости черепа подопытного животного 13, и короткого отрезка многоканального оптоволокна 7, при этом дистальный конец многоканального оптоволокна 7 выходит за пределы корпуса ферулы 8 в мозг подопытного животного, а второй конец многоканального оптоволокна 7 находится в феруле 8 и с помощью коннектора 9 механически и оптически присоединяется ко второй части зонда. Вторая часть зонда содержит длинный отрезок многоканального оптоволокна 5, который закреплен с одного конца в керамической феруле 6. Керамический коннектор 9 связывает ферулы 6 и 8, и обеспечивает жесткое механическое соединение и оптический контакт между длинным 5 и коротким 7 отрезками многоканального оптического волокна. Внутренний диаметр керамической ферулы 8 соответствует внешнему диаметру оптического волокна 7 для точного позиционирования и герметичного закрепления (вклеивания). Во время проведения исследований обе части зонда соединяются между собой с помощью коннектора 9, который в разомкнутом состоянии остается на феруле 6.
Осуществление полезной модели
Ниже представлено описание конкретного примера применения заявляемого зонда в системе для получения изображений тестовых объектов и тканей головного мозга свободно движущихся животных (работы проводились в МГУ имени М.В. Ломоносова). Размыкаемая конструкция зонда (также употребимым в данном случае является термин - нейроинтерфейс) является ключевым преимуществом при проведении экспериментов по долговременной регистрации нейронной активности, структурных и морфологических изменений внутри живого мозга с клеточным разрешением. При этом, благодаря небольшому весу и компактному размеру вживляемой части зонда, между измерениями животные могут жить в обычных условиях, не испытывая дополнительного стресса.
Используемый зонд состоит из двух отрезков многоканального оптического волокна, содержащего порядка 6000 тысяч световодных сердцевин (каналов). Диаметр каждого канала порядка 1,5 мкм. Расстояние между центрами каналов приблизительно Λ≈3,6±0,3 мкм. Общий диаметр волокна 300 мкм. Числовая апертура NA индивидуального канала на длине волны 473 нм составляет величину около NA≈0,27. Первая часть нейроинтерфейса, состоящая из ферулы 8 и короткого отрезка многоканального волокна 7, позиционируется и фиксируется на голове анестезированного животного с помощью стереотаксиса, при этом дистальный конец многоканального волокна 7 через отверстие в черепе опускается на определенную глубину в мозг животного. Вторая размыкаемая часть зонда состоит из длинного отрезка многоконального волокна 5 и керамической ферулы 6. Длинный 5 и короткий 7 отрезки многоканального волокна являются эквивалентными по структуре. Длина отрезка 5 выбирается таким образом, чтобы обеспечить проведение долговременных экспериментов на животном и обеспечить ему свободное перемещение в пределах как минимум одного квадратного метра. Вторая часть зонда соединена с первой с помощью керамического коннектора 9, который обеспечивает жесткое механическое соединение и оптический контакт между длинным 5 и коротким 7 отрезками многоканального оптического волокна и в разомкнутом состоянии остается прикрепленным к феруле 6. Все время между экспериментами животное может жить в нормальных условиях с первой частью зонда (вес не более 0,3 грамма), что не влияет на нормальную жизнь таких мелких подопытных животных как мыши. Дистальный торец многоканального волокна 7 был скошен под углом 30 градусов по отношению к оси волокна 7 с помощью скалывателя, а затем полировался с грубостью порядка 300 нм. Подобная архитектура скола помогает уменьшить механические повреждения при прохождении волокна вглубь слоев мозга, а также увеличивает площадь сбора флуоресцентного сигнала и позволяет одновременно контролировать отдельные нейроны в различных слоях тканей головного мозга животных. Для реализации функции размыкаемости и обеспечения качественного оптического контакта процедура изготовления обеих частей зонда заключалась в следующем: обе части многоканального волокна 5 и 7, закрепленные соответственно в ферулы 6 и 8, скалывались у основания ферул, а затем полировались вместе с ними для обеспечения заданного качества оптического контакта. Механическое соединение двух частей обеспечивалось керамическим коннектором 9.
В тестовых экспериментах для проверки возможности и качества получаемых изображений через размыкаемый оптический зонд, лазерное излучение с длиной волны 473 нм заводилось в индивидуальные каналы длинного (80 см) отрезка 5 многоканального оптоволокна с помощью гальваносканера 2 и системы фокусировки 4, затем за счет оптического контакта, обеспечиваемого конструкцией размыкаемого оптического зонда (Фиг. 2), передавалось в каналы 10 мм отрезка волокна 7. Далее это излучение оптической накачки выходило из отдельных каналов дистального торца этого отрезка волокна 7 и возбуждало флуоресценцию находящихся в водном растворе 7,5 мкм полистироловых шариков, покрытых маркерным красителем. Излучение флуоресценции в зеленой области спектра (520-540 нм) собиралось тем же волокном 7, передавалось в обратном направлении через соединенные короткий 7 и длинный 5 отрезки многоканального волокна, далее отделялось дихроичным зеркалом 3 от излучения накачки и передавалось в систему регистрации, где строилось изображение полистироловых шариков (результаты представлены на Фиг. 3). Отметим, что размеры полистироловых шариков сопоставимы с размерами нейронов, т.е. тестовые эксперименты продемонстрировали возможность получения изображений флуоресцирующих объектов с масштабами порядка размеров клеток и даже менее. Поскольку в данной реализации скос на конце волокон, закрепленных в керамические ферулы 6, 8 и соединяемых с помощью коннектора 9 отсутствовал (плоскости концов оптических волокна с ферулами полировались под углами 90 градусов относительно оси волокон), то сохранялась возможность поворота двух частей зонда (двух ферул с волокнами) друг относительно друга. Как видно из Фиг. 3, вращение длинного оптоволокна относительно короткого приводит к флуктуации качества изображения и его повороту. Очевидно, что при повороте соосность индивидуальных каналов может нарушаться относительно начальной, однако, сохраняется достаточно хорошее оптическое качество соединения двух отрезков волокна, кроме того, большое количество каналов в среднем компенсирует рассогласование начальной соосности индивидуальных каналов. Полировка торцов волокон с ферулами под определенным углом (наличие скоса) повышает сложность технологической обработки, однако позволяет реализовать большую точность механического соединения и соосность индивидуальных каналов в процессе размыкания/замыкания двух частей оптического зонда, что в результате повышает воспроизводимость получаемых изображений.
В условиях реальных экспериментов с живыми животными были использованы трансгенные мыши линии Thy1-EGFP. В соответствии с разработанной процедурой вживления первая часть нейроинтерфейса позиционировалась на определенной части черепа животного и дистальный конец оптоволокна опускался на определенную глубину исследуемой области мозга животного. Для возбуждения также использовали непрерывное излучение с длиной волны 473 нм, которое аналогично описанной выше процедуре измерений возбуждало флуоресценцию маркерного белка EGFP (Enhanced Green Fluorescence Protein) в мозге бодрствующего свободноподвижного животного. Флуоресцентный сигнал от биомаркеров в зеленой области спектра собирался тем же самым волокном, передавался в обратном направлении, поступал в систему регистрации, где анализировался с помощью компьютера. На Фиг. 4 а, б представлены типичные фотографии соматосенсорной коры мозга трансгенной мыши линии Thy1-EGFP, полученные с помощью разработанной нами системы. На этих фотографиях видны индивидуальные клетки, при этом особенности расположения клеток воспроизводимы от реализации к реализации в масштабах нескольких дней. Таким образом, эксперименты продемонстрировали высокий потенциал применения размыкаемого зонда для визуализации с высоким пространственным разрешением нейронов генетически кодированных тканей головного мозга бодрствующих и свободно двигающихся животных.
+
2
Для реализации не только возможности получения изображений, но и оптического (оптогенетического) контроля индивидуальных клеток, эти клетки должны быть генетически кодированы не только флуоресцентными маркерами, но дополнительно содержать светочувствительные белки другого типа. Наиболее распространенным светочувствительным белком является каналородопсин-2 (Channelrhodopsin-2). Этот белок встраивается в мембрану клетки и при воздействии синего света достаточной мощности происходит реакция - в мембране клетки открывается канал для проникновения внутрь нее катионов. Проникновение катионов (например, Са) в цитоплазму клетки приводит к запуску определенной функциональной активности клетки. Таким образом, свет является своеобразным триггером, запускающим ту или иную биохимическую реакцию в нейронах, что приводит к определенной функциональной реакции животного (как уже было отмечено, эта методика в узком смысле составляет определение оптогенетики). Светочувствительный белок Channelrhodopsin-2 и флуоресцентный маркер EGFP обладают перекрывающимися спектрами поглощения, поэтому для возбуждения флуоресценции и активации каналородопсина требуется применение лазерного источника в синей области спектра. В случае использования лазера на длине волны 473 нм его спектральные характеристики принципиально допускают возможность одновременного возбуждения обоих типов белков. Однако, для получения изображений с помощью флуоресцентных маркеров мощность используемого излучения на длине волны 473 нм не превышает величины 0,2-0,3 мВт, в то время как для достижения порога открытия ионных каналов требуются гораздо более высокие мощности. Учитывая, что клетка располагается на некотором расстоянии от поверхности дистального торца волокна, и также принимая во внимание дифракционную расходимость излучения и наличие рассеивающей ткани, мощность используемых источников для обеспечения достижения порога «срабатывания» каналородопсиновых клеток (приблизительно 1 мВт/мм) должна быть высокой (в нашей системе предусмотрено наличие мощных лазерных источников до 200 мВт. (Принципиально мощность ограничивается пробоем оптических элементов, в частности, каналов оптоволокна, или нежелательным фоторазрушением биологической ткани.) Т.е. мощность излучения для флуоресцентной визуализации клеток и мощность излучения для инициирования функционального отклика клеток, содержащих каналородопсин, должна отличаться на 2-3 порядка. Это диктует использование лазерных источников достаточно высокой мощности с системой управления (возможно использование несколько источников). Необходимо отметить обязательное наличие обратной связи: анализируя полученные изображения, экспериментатор должен определить, какую определенную клетку (или группу клеток) он должен активировать и с помощью системы сканирования (гальваносканера), излучение заводится только в те сердцевины многоканального волокна, которые в результате адресно облучают выделенную целевую клетку (или клетки). Волоконно-оптическая эндоскопия с помощью разработанного устройства имеет важные преимущества по сравнению со стандартной оптической визуализацией, поскольку обеспечивает получение флуоресцентных изображений тканей с клеточным разрешением и позволяет проникать в исследуемую область головного мозга на практически неограниченную глубину. При этом сохраняется возможность движения животного и контроля его активности. Размыкаемая конструкция волоконно-оптического зонда обеспечивает проведение длительных экспериментов с сохранением доступа к одной и той же группе нейронов, лежащей в глубоких слоях мозга живого животного, что позволяет осуществлять хроническое оптическое зондирование геномной активности нейронов. В ходе представленных экспериментов была продемонстрирована возможность получения флуоресцентных изображений тканей головного мозга подопытных свободно двигающихся животных с клеточным разрешением с помощью волоконно-оптического размыкаемого зонда с многоканальными волокнами.