Роль фактора Nanog в регуляции плюрипотентности и дифференцировки эмбриональных стволовых клеток

тттт

Новости клеточных технологий

Роль фактора Nanog в регуляции плюрипотентности и дифференцировки эмбриональных стволовых клеток

Фактор Nanog является гомеодоменным протеином, экспрессирующимся в эмбриональных стволовых клетках (ЭСК) и дифференцирующихся первичных половых клетках [1]. Делеция Nanog приводит к гибели эмбрионов [2], в то время как его конститутивная экспрессия обеспечивает самообновление популяции ЭСК и поддержание их плюри-потентного состояния как in vivo, так и in vitro [3, 4]. Прекращение экспрессии Nanog считается свидетельством начала дифференцировки ЭСК. При повышении уровня этого белка клетки дольше сохраняют способность к самообновлению и дольше остаются недифференцированными in vitro [5].

До настоящего времени подавляющее большинство исследований было связано с выявлением влияния Nanog на дифференцировку и самообновление клеток [6]. Мало известно о том, каким образом профиль экспрессии этого гена связан с процессами эмбрионального развития, как снижение или полное прекращение его экспрессии влияет на закладку зародышевых листков, и жизнеспособны ли Nanog-/- ЭСК. Исследователи из группы I. Chambers в своей работе, результаты которой были опубликованы в журнале Nature, провели несколько серий экспериментов с целью определения биологической роли этого фактора.

Первая серия экспериментов, проведенная in vitro на культурах ЭСК мыши, была направлена на определение характера экспрессии Nanog различными клетками в пределах одной популяции. Авторы произвели инсерцию гена зеленого флуоресцентного белка (eGFP) в область AUG кодона гена Nanog, в результате чего экспрессия Nanog приводила к последующей экспрессии GFP. Было показано, что в культуре присутствовали как GFP-, так и GFP+ клетки, однако авторы не указывают сроков, на которых производился анализ. При этом оба типа клеток экспрессировали маркеры ЭСК Oct4 и SSEA1. При разделении двух популяций с помощью флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS) и их дальнейшем раздельном культивировании было показано, что практически 100% GFP+ клеток могут давать начало GFP--популяциям, но при этом, что особенно интересно, может происходить и обратный процесс, то есть в клетках может происходить реактивация гена Nanog.

Предыдущие исследования предполагали, что индуцированная остановка экспрессии гена Nanog должна приводить к дифференцировке ЭСК [2]. Для проверки этой гипотезы авторы использовали линию трансгенных ЭСК, в которых экспрессия Nanog подавлялась тамоксифеном. Однако при этом не происходило мгновенной активизации процессов дифференцировки клеток. Отдельные дифференцированные клетки появлялись только на 5-7 сутки после обработки клеточной культуры тамоксифеном. Подавление экспрессии Nanog никак не сказывалось на экспрессии протеинов Sox2 и Oct4, а также так называемых транскриптов, ассоциированных с эмбриональными стволовыми клетками, (embryonic stem-cell associated transcripts, ECATs).

При этом клоногенный потенциал Nanog-/ - ЭСК отличался от клоногенного потенциала Nanog+Z+ЭСК. Nanog-/-клетки формировали гораздо меньшее число колоний, в которых при этом наблюдалось понижение уровня щелочной фосфатазы. Тем не менее, часть колоний характеризовалась повышенной экспрессией этого фермента, и формирование таких колоний зависело от присутствия экзогенного фактора LIF (leukaemia inhibitory factor). Это служит доказательством

того, что плюрипотентность Nanog-/ - клеток не вызвана эпигенетическими факторами, так как клетки, вторично индуцированные к плюрипотентности, не способны реагировать на стимуляцию LIF (т.н. эпиЭСК) [7].

Для определения способности Nanog-/- ЭСК к дифференцировке авторы провели трансплантацию этих клеток под капсулу почки иммунодефицитным мышам. Было показано, что Nanog^-ЭСК формируют «тератомы», в которых присутствуют производные трех зародышевых листков.

Таким образом, делеция фактора Nanog не приводит к утрате самообновления, клоногенности и плюрипотентности у ЭСК. Они также способны de novo включаться в развивающийся эмбрион, что было показано с помощью создания химерных морул из Nanog-/- и Nanog+/+ клеток. Впоследствии происходило внедрение GFP Nanog-/- клеток в нейроэпителий и ткани печени и мышц взрослых животных. То есть делеция Nanog не влияет и на способность ЭСК давать начало терминально дифференцированным клеткам взрослого организма, что противоречит литературным данным [2].

Однако было показано, что экзогенное подавление экспрессии Nanog приводит к запрету дифференцировки ЭСК в первичные половые клетки. При реактивации Nanog в таких клетках методом гомологичной рекомбинации происходило полное восстановление их потенциала к дифференцировке.

Таким образом, нельзя сказать, что эта работа опровергает данные более ранних исследований. Тем не менее, ее результаты указывают на ошибочность предположений о том, что функционирование Nanog неотделимо от двух других ключевых факторов ЭСК - Sox2 и Oct4 [8]. Действительно, Nanog-/ - ЭСК обладают сниженным в сравнении с клетками дикого типа клоногенным потенциалом и в большей степени склонны дифференцироваться в энтодермальном направлении, хотя образуют производные и других зародышевых листков.

Прекращение экспрессии Nanog не служит необходимым и достаточным сигналом к началу дифференцировки клеток. По-видимому, флуктуации его экспрессии регулируют диффе-ренцировочный потенциал клеток, все больше ограничивая его при повышении внутриклеточной концентрации протеина. Зависимость способности к самообновлению популяции от Nanog носит, по предположению авторов, сходный характер. Этим можно объяснить различные степени коммитации ЭСК к дифференцировке в пределах популяции. Повышение экспрессии Nanog также может вернуть уже коммитированные к дифференцировке ЭСК в плюрипотентное состояние [1 ].

Важно отметить, что в процессе эмбрионального развития Nanog не экспрессируется конститутивно на одном и том же уровне в плюрипотентных клетках эмбриона. Он экспрессируется в клетках бластоцисты, затем уровень его экспрессии падает во время имплантации [1], после чего вновь начинает возрастать в области эпибласта, клетки которого дольше сохраняют характеристики ЭСК [9]. Таким образом, данные работы во многом объясняют функции фактора Nanog, играющего одну из основных ролей в таких процессах, как закладка внутренней клеточной массы бластоцисты и впоследствии зародышевых листков, регуляция плюрипотентности и самоподдержания популяций ЭСК, а также процесс эпигенетического репрограммирования дифференцированных клеток организма в «стволовые», которому уделяется много внимания в современных исследованиях [10].

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том III, № 1, 2008

I I I I III + I  ТП

Новости клеточных технологий

ЛИТЕРАТУРА:

1. Chambers I., Colby D., Robertson M. et al. Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells. Cell 2003; ll3: 643-55.

2. Mitsui K., Tokuzawa Y., Itoh H. et al. The homeoprotein Nanog is required for maintenance of pluripotency in mouse epiblast and ES cells. Cell 2003; 113: 631-42.

3. Boyer L.A., Lee T.I., Cole M.F. et al. Core transcriptional regulatory circuitry in human embryonic stem cells. Cell 2005; 122: 947-56.

4. Loh Y.H., Wu Q., Chew J.L. et al. The Oct4 and Nanog transcription network regulates pluripotency in mouse embryonic stem cells. Nature Genet. 2006; 38: 431-40.

5. Ying Q.L., Nichols J., Chambers I., Smith A. BMP induction of Id proteins suppresses differentiation and sustains embryonic stem cell self-renewal in

collaboration with STAT3. Cell 2003; 115: 281-92.

6. Ivanova N., Dobrin R., Lu R. et al. Dissecting self-renewal in stem cells with RNA interference. Nature 2006; 442: 533-8.

7. Brons I.G., Smithlers L.E., Trotter M.W. et al. Derivation of pluripotent epiblast stem cells from mammalian embryos. Nature 2007; 448: 191-5.

8. Chambers I., Smith A. Self-renewal of teratocarcinoma and embryonic stem cells. Oncogene 2004; 23: 7150-60.

9. Hart A.H., Hartley L., Ibrahim M., Robb L. Identification, cloning and expression analysis of the pluripotency promoting Nanog genes in mouse and human. Dev. Dyn. 2004; 230: 187-98.

10. Silva J., Chambers I., Pollard S., Smith A. Nanog promotes transfer of pluripotency after cell fusion. Nature 2006; 441: 997-1001.

11. Takahashi K., Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 2006; 126: 663-76.

Подготовила A.C. Григорян По материалам: Chambers I., Silva J., Colby D. et al. Nanog safeguards pluripotency and mediates germline development. Nature 2007; 450: 1230-5

Высвобождение тканевых ниш в костном мозге -новое направление предтрансплантационной подготовки реципиента в гематологии

Эффективность трансплантации стволовых кроветворных клеток (СКК) при терапии ряда гематологических заболеваний, таких как тяжелый комбинированный иммунодефицит, некоторые лимфомы и лейкозы, экспериментально доказана и клинически подтверждена [1, 2]. В настоящее время наиболее оптимальным способом трансплантации СКК считается внутривенная трансфузия [1-3]. Источником клеточного материала является костный мозг HLA-идентичных/неидентичных доноров, из которого удалены дифференцированные клетки гемопоэтического ряда [4].

Существуют две основных проблемы, которые препятствуют достижению оптимальных результатов трансплантации, заключающихся в максимально полной реализации потенций введенных СКК и обеспечении нормального уровня дифференцированных клеток крови. Первая состоит в иммунологическом барьере, проявляющемся реакцией отторжения трансплантата. Данное осложнение не наблюдается при использовании HLA-совместимого клеточного материала, а также не характерно для пациентов с иммунодефицит-ными состояниями [1]. Другим фактором, ограничивающим эффективность трансплантации, является конкуренция СКК реципиента и донора за размещение в специфических костномозговых нишах, обеспечивающих реализацию потенций к дифференцировке [3, 5].

При введении аллогенных СКК в организм реципиента с тяжелым комбинированным иммунодефицитом без предварительных мероприятий, направленных на увеличение числа свободных ниш, и дополнительное подавление иммунитета, повышение уровня Т- и В-лимфоцитов связано с реализацией лишь 1% введенных клеток [6]. До настоящего времени в клинической практике в качестве предтрансплантационных мероприятий применяются химиотерапия и облучение, что в зависимости от типа заболевания, с одной стороны, обеспечивает либо ликвидацию малигнизированных клеток, либо подавление иммунитета, а с другой - освобождение костномозговых ниш от пула СКК реципиента. Это вызывает ряд

осложнений, проявляющихся в пострансплантационном периоде (эндокринопатии, гепатопатии, расстройства дыхательной и нервной систем, остеопения) [7]. В этой связи, усилия исследователей направлены на разработку более безопасных подготовительных мероприятий клеточной терапии.

В журнале Science I. Weissman с соавт. опубликовали экспериментальные материалы, указывающие на высокую эффективность предварительного освобождения ниш СКК от нативных клеток без осуществления радикальных процедур. Работа проводилась на иммунодефицитных мышах. Исследователи индуцировали миграцию эндогенных СКК из занимаемых ниш посредством блокады их антигена с-kit антителами АСК2. Именно эти моноклональные антитела способствовали наиболее успешному снижению пула недифференцированных гемопоэтических клеток в костном мозге по сравнению с оцененными в работе 2B8, a-Sca1, p-integrin a4, a-ESAM1. C-kit - мембранный рецептор (CD 117), агонистом которого является фактор стволовых клеток (stem cell factor, SCF), регулирующий пролиферацию клеток, их рост, дифференцировку, адгезию и миграцию [8]. Следовательно, образование временного комплекса «с-к^-АСК2» блокирует SCF-зависимые пути внутриклеточной сигнализации, предотвращая экспансию малодифференцированных клеток в строме костного мозга.

Исследователи внутривенно вводили антитела иммуно-дефицитным и нормальным мышам, часть из которых на 9 день использовали в качестве доноров красного костного мозга для летально облученных животных. Эффективность трансплантации оценивалась посредством установления концентрации гранулоцитов периферической крови, дифференцировавшихся из введенной фракции мононуклеаров костного мозга, меченных GFP. Количество специализированных клеток гемопоэтического ряда в этом случае было на 90% ниже, чем при использовании костного мозга мышей, не подвергнутых действию АСК2. Полученные результаты

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том III, № 1, 2008