Применение мультипараметрической проточной цитометрии для одновременной оценки функции и фенотипа νκ-клеток

ИММУНОЛОГИЯ № 3, 2012

В. Биологически активные сфинголипиды в перевиваемых опухолях различного гистогенеза // Биоорган. химия. - 2006.

- № 1. - С. 98-102.

6. Кандыба А. А., Козлов А. М., Сомова О. Г., Дятловицкая Э. В. Сравнительное исследование сфинголипидов в перевиваемых меланомах с высокой и низкой метастатической активностью // Биоорган. химия. - 2008. - № 2. - С. 252-255.

7. Коростелев С. А. Противоопухолевые вакцины // Соврем. онкол. - 2003. - № 4. - С. 15-19.

8. Моисеенко В. М. Возможности вакцинотерапии меланомы кожи // Практ. онкол. - 2001. - № 4. - С. 58-64.

9. Москалева Е. Ю., Северин С. Е. Перспективы создания противоопухолевых вакцин с использованием дендритных клеток человека // Иммунология. - 2002. - Т. 23, № 4. - С. 8-15.

10. Пащенков М. В., Пинегин Б. В. Физиология клеток врожденной иммунной системы: Дендритные клетки // Иммунология. - 2006. - № 6. - С. 368-377.

11. Степаненко Р. Н., Власенко Р. Я., Львов В. Л. и др. Конъюгат олигосахаридного фрагмента опухольассоциированного антигена ганглиозидной природы с гемоцианином - прототип противоопухолевой вакцины // Докл. РАН. - 2007. - Т. 415. - С. 425-429.

12. Степаненко Р. Н., Власенко Р. Я., Цветков Ю. Е. и др. Гуморальный иммунный ответ мышей на конъюгат синтетических углеводных фрагментов опухольассоциированного антигена ганглиозидной природы с белком гемоцианином - прототипа противоопухолевой вакцины // Иммунология. - 2010. - № 2.

- С. 86-92.

13. Хатунцева Е. А., Юдина О. Н., Цветков Ю. Е. и др. Синтез Р_3-аминопропилгликозида сиалил-3’-лактозы и неогликоконъюгатов на его основе - прототипа онковакцины и искусственных антигенов для контроля иммунного ответа // Изв. РАН. Сер. хим. - 2006. - № 11. - С. 2016-2023.

14. Шпакова А. П., Павлова К. С., Булычева Т. И. МТТ-колори-метрический метод определения цитотоксической активно-

сти естественных киллерных клеток // Клин. лаб. диагн. -2000. - № 2. - С. 20-23.

15. Berzofsky J. A., Terabe M., Oh S. K. et al. Progress on new vaccine strategies for the immunotherapy and prevention of cancer // J. Clin. Invest. - 2004. - Vol. 113. - P. 1515-1525.

16. Bitton R. J., GuthmannM. D., GabryM. R. et al. Cancer vaccine: An update with special focus on ganglioside antigens // Oncol. Rep. - 2002. - Vol. 9. - P 267-276.

17. Carr A., Mazorra Z., Alonso D. F. et al. A purified GM3 ganglioside conjugated vaccine induces specific, adjuvant-dependent and non-transient antitumour activity against B16 mouse melanoma in vitro and in vivo // Melanoma Res. - 2001. - Vol. 11.

- P 219-227.

18. Carr A., Rodrigues E., Arango M. C. et al. Immunotherapy of advanced breast cancer with a heterophilic ganglioside (NeuGcGM3) cancer vaccine // J. Clin. Oncol. - 2003. - Vol. 21, N 6. - P. 1015-1021.

19. Guermonprez P., Valladeau J., Zitvogel L. et al. Antigen presentation and T cell stimulation by dendritic cells // Annu. Rev. Immunol. - 2002. - Vol. 20. - P. 621-667.

20. Hammerstrom A. E., Cauley D. H., Atkinson B. J., Sharma

P.Cancer immunotherapy: sipuleucel-T and beyond //

Pharmacotherapy. - 2011. - Vol. 31, N 8. - P. 813-828.

21. Joyce S., Van KaerL. CD1-restricted antigen presentation: an oily matter // Curr. Opin. Immunol. - 2003. - Vol. 15. - P. 95-104.

22. Moody D. B., Porcelli S. A. Intracellular pathways of CD1 antigen presentation // Nature Rev. Immunol. - 2003. - Vol. 3. - P. 11-22.

23. Novellino L., Castelli C., Parmiani G. A listing of human tumor antigens recognized by T cells // Cancer Immunol. Immunother.

- 2005. - Vol. 54, N 3. - P. 187-207.

24. Slingluff C. L. Jr., Speiser D. E. Progress and controversies in developing cancer vaccines // J. Translat. Med. - 2005. - Vol. 3. - P. 1-9.

Поступила 30.09.11

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012 УДК 612.017.1.014.08

В. В. Муругин, М. В. Пащенков, Б. В. Пинегин

применение мультипараметрической проточной цитометрии для одновременной оценки функции и фенотипа nk-клеток

Лаборатория клинической иммунологии ФГБУ ГНЦ Институт иммунологии ФМБА России

NK-клетки (естественные киллеры) вносят весомый вклад в уничтожение вирусинфицированных и опухолевых клеток. Замечено, что лишь небольшая часть субпопуляции cD56dim NK-клеток дегранулирует при взаимодействии с клетками-мишенями, например с клетками К562. Используя цитометрический тест на дегрануляцию NK-клеток, мы показали, что cD56dim NK-клетки, не дегранулирующие при взаимодействии с К562, тем не менее отвечают на клетки-мишени, что выражается в падении поверхностной экспрессии активационных рецепторов cD16 и cD314. доля NK-клеток, дегранулирующих при инкубации с клетками К562, была выше в субпопуляциях cD94brighl, cD159a+ и cD335dim, чем соответственно в субпопуляциях cD94dim, cD159a- и cD335high. Наиболее высокий дегрануляционный ответ наблюдали в субпопуляции cD94highcD335dim. Эти данные показывают, что среди cD56dim NK-клеток присутствуют субпопуляции клеток с разной цитотоксической активностью; необходим дальнейший поиск поверхностных маркеров этих субпопуляций.

Ключевые слова: NK-клетки, дегрануляция, проточная цитометрия, CD107a, CD94, CD335

Пинегин Борис Владимирович - д-р мед. наук, проф., зав. лаб. клинической иммунологии, тел. (499)617-76-49, факс (499)617-10-27; e-mail:bvpinegin@yandex.ru

- 128 -

КЛЕТОЧНАЯ ИММУНОЛОГИЯ

VVMurugin, M.VPashchenkov, B.VPinegin

THE APPLICATION OF MULTIPARAMETER FLOW CYTOMETRY FOR THE SIMULTANEOUS ASSESSMENT OF THE NK CELL FUNCTION AND PHENOTYPE

NK cells make a significant contribution to the elimination of virally infected and malignant cells. It has been noted, however, that only a minor part of the “cytotoxic” cD56dim NK cells degranulate upon interaction with the target cells, for example with K562 cells. Using a cytometry-based NK-cell degranulation assay, we show here that those cD56dim NK cells that do not degranulate upon co-incubation with K562, still do respond to the target cells as manifested by a decrease in the surface expression of two activation receptors, cD16 and cD314. The proportion of cD56dim NK cells degranulating upon co-incubation with K562 was higher in the subpopulations CD94bright, CD159a+ and CD335dim as compared with CD94dim, CD159a- and CD335high respectively. The highest degranulation response was observed in the CD94highCD335dim subpopulation. These data show that among CD56dim NK cells, there may exist subpopulations with different degranulation capacity and therefore with different cytotoxicity; the search for more specific surface markers of these subpopulations is warranted.

Keywords: NK cells, degranulation, flow cytometry, CD107a, CD94, CD335

Введение. NK-клетки (естественные киллеры) являются важной составной частью врожденной иммунной системы и играют одну из ключевых ролей в противовирусном и противоопухолевом иммунитете. В периферической крови взрослого человека выделяют две субпопуляции NK-клеток: регуляторную CD56bright и цитотоксическую CD56dim [9]. CD56dim NK-клетки убивают вирусинфицированные и злокачественные клетки путем дегрануляции - выброса содержимого литических гранул на поверхность клетки-мишени. В результате дегрануляции мембрана литических гранул сливается с поверхностной мембраной NK-клеток, что приводит к экстернализа-ции мембранных антигенов гранул. Экстернализация одного из таких антигенов - CD107a - является информативным маркером дегрануляции NK-клеток [2], а также CD8+-Т-клеток [4] и CD4+-Т-клеток [8].

Тест на дегрануляцию с использованием маркера CD107a позволил выявить функциональную гетерогенность NK-клеток: по данным разных групп исследователей, лишь небольшая часть цитотоксических CD56dim NK-клеток дегранулирует при взаимодействии с клетками-мишенями, а значит, обладает реальной цитотоксической способностью [2, 3, 7]. Это позволяет предположить, что среди CD56dim NK-клеток присутствуют субпопуляции с разной цитотоксической активностью. В то же время частичная дегрануляция CD56dim NK-клеток может быть обусловлена особенностями постановки реакции in vitro, в частности отсутствием достаточных контактов между всеми NK-клетками и всеми клетками-мишенями.

В настоящей работе мы применили тест на дегрануляцию NK-клеток в сочетании с мультипараметрической проточной цитометрией для характеризации поверхностного фенотипа дегранулирующей субпопуляции CD56dim NK-клеток. В качестве кандидатных маркеров дегранулирующей субпопуляции использовали такие, которые экспрессируются только частью CD56dim NK-клеток либо всеми CD56dim NK-клетками, но с различной интенсивностью. К первой группе маркеров относятся, в частности, CD8, CD57 и CD159a, ко второй - CD94 и CD335 [5, 13]. Также исследовали экспрессию CD16 и CD314 - поверхностных рецепторов NK-клеток, уровень которых падает при активации [6, 10].

Материалы и методы. Доноры. Обследовали 12 доноров (5 мужчин и 7 женщин) в возрасте от 25 до 52 лет, давших добровольное согласие на участие в исследовании. Критерием включения в исследование были отсутствие острых инфекций в течение минимум 2 нед до взятия крови, отсутствие

хронических инфекций и клинически явных хронических воспалительных заболеваний любого генеза, отсутствие онкологических заболеваний. От всех обследуемых получали не менее 10 мл венозной гепаринизированной крови.

Тест на дегрануляцию NK-клеток в сочетании с определением поверхностного фенотипа. Дегрануляцию NK-клеток in vitro оценивали с помощью проточной цитометрии по методике, подробно описанной ранее [1]. Кратко: выделенные из венозной крови мононуклеарные клетки (МНК) инкубировали в течение 4 ч в присутствии FITC-меченных антител (АТ) к CD107a (клон H4A3; «BD Pharmingen», США) и моненсина (10 мкМ, «Sigma», США) либо без активаторов, либо с клетками К562 в соотношении 1:1, либо с форбол-12-миристат-13-ацетатом, иономицином и цитохалазином Б (ФМА + ИОН + ЦБ, все реагенты «Sigma», США, конечная концентрация 100 нг/мл, 0,5 и 5 мкг/мл соответственно). По окончании инкубации МНК докрашивали Р05-меченными моноклональными АТ (МАТ) к CD3 и Р07-меченными МАТ к CD56 (оба «Beckman Coulter», США) для идентификации CD3'CD56+-NK-клеток, а также одним из следующих PE-меченных МАТ: анти-CDS, анти-CD57, анти-CD94, анти-CD159a (NKG2A), анти-CD314 (NKG2D), анти-CD3з5 (NKp46) (все «Beckman Coulter», США), либо анти-CD16 («Сорбент», Россия).

В некоторых опытах по техническим соображениям вместо FITC-меченных МАТ к CD107a использовали PC5-меченные («BD Pharmingen», США). После инкубации с индукторами дегрануляции клетки докрашивали FITC-меченными МАТ к CD94, PE-меченными МАТ к CD335, ECD-меченными МАТ к CD3 и PC7-меченными МАТ к CD56 (все «Beckman Coulter», США).

Результаты оценивали на 5-канальном проточном цитометре Cytomics FC500 с использованием программного обеспечения CXP (оба «Beckman Coulter», США). NK-клетки идентифицировали как CD3'CD56+-клетки со светорассеянием лимфоцитов. Результаты представляли как процент CD107a+ (дегранулировавших) клеток по отношению ко всей популяции CD56dim-NK-клеток либо к их субпопуляциям, определяемым экспрессией CDS, CD57, CD94, CD159a и CD335. Оценивали также среднюю интенсивность флюоресценции (СИФ) CDS, CD57, CD94, CD159a и CD335 на всех CD56dlm-NK-клетках.

В случае маркеров CD16 и CD314 определяли их СИФ на CD107a+ и CD107a- CD56dlm-NK-клетках.

Статистическая обработка данных. Все данные представляли в виде медианы (минимум-максимум). Статистическую обработку проводили с помощью программы GraphPad Instat 3 («GraphPad Software», США). Для статистических сравнений использовали непараметрический тест Уилкоксона, если не указано иное.

Результаты. Поверхностный фенотип дегранулирующих NK-клеток. В предыдущих работах нами [1] и другими авторами [2, 3, 7] отмечено, что лишь небольшая часть NK-клеток дегранулирует при контакте с NK-чувствительными клетками-мишенями, в

- 129 -

ИММУНОЛОГИЯ № 3, 2012

а б в

Без активаторов К562 ФМА+ИОН+ЦБ

CD107a

Рис. 1. Типичная цитометрическая картина дегрануляции NK-клеток здорового донора по маркеру CD107a.

Дегрануляцию NK-клеток при 4-часовой инкубации с указанными активаторами оценивали, как описано в "Материалах и методах"; цифры на графиках - процент дегранулирующих (CD107a+) клеток среди всех NK-клеток; а - показаны субпопуляции CD56bnght и CD56dim-NK-клеток.

частности К562. Типичная цитометрическая картина дегрануляции NK-клеток здорового донора приведена на рис. 1. Как видно на рис.

1, б, при взаимодействии с К562 дегранулирует меньшая часть как всех NK-клеток, так и считающихся цитотоксическими CD56dim-NK-клеток. При использовании более мощного стимула - ФМА + ИОН + ЦБ - дегранулировало большинство NK-клеток (см. рис. 1, в). Таким образом, отсутствие дегрануляции большей части NK-клеток при взаимодействии с К562 нельзя объяснить тем, что в недегранули-рующих NK-клетках отсутствуют литические гранулы, способные к экзоцитозу содержимого.

Приведенные данные позволяют предположить, что среди цитотоксических CD56dlm-NK-клеток имеется субпопуляция клеток с немедленными эффекторными свойствами, и именно эта субпопуляция деграну-лирует при кратковременной (до 4 ч) инкубации с клетками-мишенями. Далее можно сделать предположение о том, что такая субпопуляция исходно - до активации - обладает характерным набором поверхностных маркеров. В настоящей работе предпринята попытка охарактеризовать исходный поверхностный фенотип дегранулирующих NK-клеток с помощью маркеров CD8, CD57, CD94, CD159a и CD335. Окраску на эти маркеры проводили после стимуляции,

поэтому вначале необходимо было убедиться в том, что стимуляция не влияет на их экспрессию. Для этого МНК культивировали 4 ч с клетками К562 или без К562, после чего сравнивали СИФ CD8, CD57, CD94, CD159a и CD335 на CD56dlm-NK-клетках. Как следует из табл. 1, инкубация с К562 достоверно не влияла на экспрессию ни одного из маркеров, что позволяло использовать их для оценки исходного фенотипа дегранулирующих NK-клеток.

Субпопуляции CD56dlm-NK-клеток, различающиеся по экспрессии CD8, CD57, CD94, CD159a и CD335, выделяли, как показано на рис. 2. В случае CD8, CD57

Рис. 2. Идентификация субпопуляций CD56dim NK-клеток с помощью проточной цитометрии.

а - среди лимфоцитов выделяют популяцию CD3-CD56+ NK-клеток; б-е - среди NK-клеток выделяют субпопуляции CD56dlm-NK-клеток, различающихся по экспрессии CD8 (б), CD57 (в), CD94 (г), CD159a (д) и CD335 (е).

- 130 -

КЛЕТОЧНАЯ ИММУНОЛОГИЯ

Таблица

СИФ указанных маркеров на CD56Illm-NK-KieTKax после инкубации без активаторов и с К562

Показатель CD8 CD57 CD94 CD159a CD335

Без активаторов 20,0

К562 20,5

Примечание. Здесь и в табл. 3: показаны медианы (минимум-максимум). Здесь и в табл. 2, 3: n -личество опытов.

Таблица 2

Процентное содержание дегранулирующих (CD107a+) клеток в указанных субпопуляциях CD56lIlm-NK-клеток

Маркер Субпопуля- ция % дегранулирующих NK-клеток

без активаторов К562

CD8

CD8- 0,5

CD57

CD57- 0,6

CD94 (n = 8) CD94bright 0,2 (0,1-0,6) 9,6 (3,3-18,6)*

CD94dim 0,6

CD159a (n = 5) CD159a+ 0,3 (0,1-0,5) 6,9 (4,8-15,9)*

CD159a- 0,3

CD335 (n = 5) CD335bright 0,2 (0,0-0,4) 2,9 (2,4-6,3)*

CD335dim 0,4

Примечание. * - р < 0,05 при сравнении CD94brieht и CD94dim, cDl59a+ и CD159-, CD335bri8ht и CD335dim субпопуляций, при стимуляции К562 (тест Уилкоксона). Показаны медианы (10-90-й процен-тили).

Таблица 3

Процентное содержание дегранулирующих клеток в субпопуляциях CD56Ilm-NK-клеток, выделенных по коэкспрессии CD94 и CD335

Субпопуляция

Без стимуляции

Стимуляция К562

CD94dimCD335“8“ CD94briettCD335brieht CD94dimCD335dim CD94bri8htCD335dim Примечание.

0,4

7,2

14.8

18.9 (13,0-27,7)*

0,05 при сравнении с субпопуляцией

CD94dimCD335bright парным /-тестом.

и CD159a выделяли субпопуляции, позитивные (+) и негативные (-) по каждому из маркеров. В случае CD94 и CD335, которые с разной интенсивностью экспрессируются всеми NK-клетками, выделяли субпопуляции с высокой (high) и низкой (low) экспрессией указанных маркеров.

При стимуляции клетками К562 дегрануляцию отмечали во всех субпопуляциях CD56dim-NK-клеток, доля дегранулирующих клеток в различных субпопуляциях была неодинаковой (табл. 2).

В субпопуляции CD94bnght дегранулировало примерно в 2 раза больше клеток, чем в субпопуляции CD94dim (p < 0,05; см. табл. 2). В субпопуляции CD159a+ дегранулировало 6,9 (4,8-15,9)% клеток, что было достоверно выше, чем в субпопуляции CD159a- - 5,2 (3,2-7,7)% (р < 0,05). Сходство результатов для субпопуляций CD94bnght и CD159a+, вероятно, объясняется тем, что CD94 и CD159a экспрессируются в виде гетеродимера.

В то же время в субпопуляции CD335bnght дегра-нулировало примерно в 3 раза меньше клеток, чем в CD335dim (р < 0,05; см. табл. 2). Проценты дегранулирующих клеток в субпопуляциях, позитивных/ негативных по антигенам CD8 и CD57, достоверно не различались.

Для того чтобы понять, как соотносятся между собой субпопуляции CD56dim NK-клеток, различающиеся по уровню экспрессии CD94 и CD335, исследовали коэкспрессию этих маркеров. Выявили субпопуляции CD56dim NK-клеток со всеми четырьмя возможными сочетаниями экспрессии CD94 и CD335: CD94bright" CD335bng“, CDdimCD335bng“, CD94dimCD335dim и CD94-brightCD335dim (данные не показаны).

Результаты, приведенные в табл. 2, позволяли предположить, что субпопуляция CD94brightCD335dim будет давать наиболее выраженный дегрануляционный ответ, а субпопуляция CD94dimCD335bright - наименее выраженный. Результаты опытов подтвердили это предположение (табл. 3).

Процент дегранулирующих NK-клеток в субпопуляции CD94brightCD335dim был приблизительно в 3 раза выше, чем в CD94dimCD335bright. Таким образом, сочетание маркеров CD94 и CD335 позволяет идентифицировать субпопуляцию CD94brightCD335dim NK-клеток с более выраженными эффекторными свойствами. Однако следует отметить, что существенный дегрануляционный ответ наблюдали и в остальных трех субпопуляциях NK-клеток (см. табл. 3).

Сопоставление дегрануляции с другими признаками активации NK-клеток. Поскольку при стимуляции клетками К562 дегранулирует лишь меньшая часть CD56dim NK-клеток, то представляло интерес, отвечают ли остальные CD56dim NK-клетки каким-либо образом на стимуляцию клетками-мишенями. В качестве признака ответа использовали падение поверхностной экспрессии CD16 и CD314 на NK-клетках [6, 10].

При инкубации с К562 падение поверхностной экспрессии CD16 отмечали как на CD107a+, так и на CD107a- NK-клетках, хотя в первом случае падение было более выраженным (рис. 3, а—д). Еще более убедительные результаты были получены для CD314 (рис. 3, е—з). NK-клетки, дегранулирующие и неде-гранулирующие в присутствии К562, мало различались по уровню поверхностного CD314. В то же время СИФ CD314 на обеих субпопуляциях NK-клеток была в несколько раз ниже, чем на NK-клетках, инкубированных без активаторов (соответственно в 5,6 и 3,8 раза).

Таким образом, NK-клетки, которые не деграну-лируют при взаимодействии с К562 (или у которых экстернализация CD107a ниже порога детекции), тем не менее отвечают на клетки-мишени, что выражается в падении поверхностной экспрессии активационных рецепторов CD16 и CD314. Другими словами, отсутствие дегрануляции большей части NK-клеток не обусловлено тем, что эти NK-клетки не смогли за время инкубации образовать контакты с клетками-

- 131 -

ИММУНОЛОГИЯ № 3, 2012

Рис. 3. Снижение уровня поверхностного CD16 и CD314 при активации и дегрануляции NK-клеток здоровых доноров.

а - выделен гейт лимфоцитов (ЛФ) среди МНК; б - выделена субпопуляция CD56dlm-NK-клеток среди лимфоцитов; в, г - поверхностная экспрессия CD107a и CD16 на CD56dlm-NK-клетках после 4-часовой инкубации без активаторов (в) и после стимуляции К562 (г); е и ж - поверхностная экспрессия CD107a и CD314 на CD56dlm-NK-клетках после 4-часовой инкубации без активаторов (е) и после стимуляции К562 (ж); указан процент CD56dlm-клеток, находящихся в соответствующих квадрантах. 1 репрезентативный опыт из 7. Д и з - СИФ CD16 (4 донора) и CD314 (7 доноров) на NK-клетках, инкубированных 4 ч без активаторов и на CD107a-- и CDl07a+-NK-клетках, инкубированных с К562; * -p < 0,05; ** -p < 0,01; з - тест Уилкоксона; д - парный f-тест (различия в тесте Уилкоксона недостоверны из-за малого количества доноров). Горизонтальные линии на графиках д и з - медианы.

мишенями, либо тем, что эти NK-клетки не несут активационных рецепторов, способных распознать клетки К562.

Обсуждение. Цитометрический тест на дегрануляцию дает возможность выявить гетерогенность CD56dlm-NK-клеток при выполнении эффектор-ных функций: по данным этого теста лишь меньшая часть CD56dlm-NK-клеток дегранулирует при взаимодействии с NK-чувствительными клетками-мишенями. Эти данные сходны с сообщениями других групп исследователей [2, 3, 7]. Недегранулирую-щие NK-клетки тем не менее тоже активируются, о чем свидетельствует падение на них поверхностной экспрессии CD16 и CD314 (см. рис. 3). Эти данные можно интерпретировать, исходя из предположения

о том, что среди циркулирующих CD56dlm-NK-клеток присутствует субпопуляция клеток с немедленными эффекторными свойствами, которая дегранулирует при относительно кратковременной коинкубации с клетками-мишенями. Действительно O. Penack и со-авт. показали, что только CD107a+-, но не CD107a--NK-клетки, отсортированные после 4-часовой коинкубации с мишенями, обладают NK-активностью при повторном взаимодействии с мишенями [12]. Если эффекторная субпопуляция NK-клеток существует, то она, вероятно, должна иметь характерный набор маркеров, который отличал бы ее от остальных NK-клеток. При окраске на дополнительные поверхностные маркеры установили, что при инкубации с клетками К562 процент дегранулирующих

- 132 -

КЛЕТОЧНАЯ ИММУНОЛОГИЯ

NK-клеток выше в субпопуляции CD94brightCD159a+, чем в CD94dimCD159a-, что согласуется с данными литературы [3]. Это можно рассматривать как свидетельство обучения NK-клеток: согласно концепции обучения, цитотоксический потенциал приобретают только те NK-клетки, которые экспрессируют хотя бы один ингибиторный рецептор, способный распознать собственный антиген МНС I класса, например CD94/CD159a [11]. Однако очевидно, что и в этой обученной субпопуляции дегранулирует лишь меньшая часть клеток (см. табл. 2), в то время как дегрануляция отмечается и в потенциально не обученных субпопуляциях CD94dim/CD159a- (см. табл. 2) и CD159a-KIR- [3, 5].

Мы также показали, что субпопуляция CD335dim-NK-клеток дегранулирует интенсивнее, чем CD335bnght. Более того, сочетание маркеров CD94 и CD335 позволило выявить субпопуляцию CD94bnghtCD335dim-NK-клеток с особенно высокой дегрануляцией в ответ на клетки К562 (см. табл. 3). Пока не ясно, почему NK-клетки, экспрессирующие более высокий уровень активационного рецептора CD335 (NKp46), деграну-лируют менее интенсивно. Следует подчеркнуть, что дегрануляционный ответ наблюдали в субпопуляциях как CD335dim, так и CD335bright: другими словами, уровень экспрессии CD335, как и CD94/CD159a, не является абсолютным маркером дегранулирующих NK-клеток.

Таким образом, среди CD56dlm-NK-клеток можно выделить субпопуляции, различающиеся по способности к дегрануляции. Сочетание высокой экспрессии CD94 и низкой экспрессии CD335 позволяет определить субпопуляцию NK-клеток с высокой способностью дегранулировать. Функциональная связь между экспрессией этих маркеров и дегрануляцией, а также количественные изменения субпопуляции CD94highCD335dim при различных патологиях нуждаются в дальнейшем изучении. Необходим также дальнейший поиск маркеров, характеризующих дегранулирующую субпопуляцию CD56dlm-NK-клеток.

Благодарность. Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований, грант 10-04-01370.

ЛИТЕРАТУРА

1. Муругин В. В., Муругина Н. Е., Продеус А. П. и др. Дегрануляция NK-клеток у больных синдромом Вискотта-Олдрича и хронической гранулематозной болезнью // Иммунология.

- 2009. - Т. 30, № 6. - С. 376-382.

2. Alter G., Malenfant J. M., Altfeld M. CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity // J. Immunol. Meth. - 2004. - Vol. 294. - P. 15-22.

3. Anfossi N., Andre P., Guia S. et al. Human NK cell education by inhibitory receptors for MHC class I // Immunity. - 2006. - Vol. 25. - P. 331-342.

4. Betts M. R., Brenchley J. M., Price D. A. et al. Sensitive and viable identification of antigen-specific CD8+ T cells by a flow cytometric assay for degranulation // J. Immunol. Meth. - 2003.

- Vol. 281. - P. 65-78.

5. Bjorkstrom N. K., Riese P., Heuts F. et al. Expression patterns of NKG2A, KIR, and CD57 define a process of CD56dim NK-cell differentiation uncoupled from NK-cell education // Blood.

- 2010. - Vol. 116. - P. 3853-3864.

6. Borrego F., Lopez-Beltran A., Pena J., Solana R. Downregulation of Fc gamma receptor IIIA alpha (CD16-II) on natural killer cells induced by anti-CD16 mAb is independent of protein tyrosine kinases and protein kinase C // Cell. Immunol. - 1994. - Vol. 158. - P. 208-217.

7. Bryceson Y. T., March M. E., Barber D. F. et al. Cytolytic granule polarization and degranulation controlled by different receptors in resting NK cells // J. Exp. Med. - 2005. - Vol. 202. - P. 1001-1012.

8. Casazza J. P., Betts M. R., Price D. A. et al. Acquisition of direct antiviral effector functions by CMV-specific CD4+ T lymphocytes with cellular maturation // J. Exp. Med. - 2006. - Vol. 203.

- P. 2865-2877.

9. Cooper M. A., Fehniger T. A., Turner S. C. et al. Human natural killer cells: a unique innate immunoregulatory role for the CD56 (bright) subset // Blood. - 2001. - Vol. 97. - P. 3146-3151.

10. Coudert J. D., Zimmer J., Tomasello E. et al. Altered NKG2D function in NK cells induced by chronic exposure to NKG2D ligand-expressing tumor cells // Blood. - 2005. - Vol. 106. - P. 1711-1717.

11. OrrM. T., Lanier L. L. Natural killer cell education and tolerance // Cell. - 2010. - Vol. 142. - P. 847-856.

12. Penack O., Gentilini C., Fischer L. et al. CD56dimCD16neg cells are responsible for natural cytotoxicity against tumor targets // Leukemia. - 2005. - Vol. 19. - P. 835-840.

13. Yu J., Mao H. C., Wei M. et al. CD94 surface density identifies a functional intermediary between the CD56bright and CD56-dim human NK-cell subsets // Blood. - 2010. - Vol. 115. - P. 274-281.

Поступила 30.09.11

- 133 -