Способ ферментативного получения модифицированных ДНК для создания реагентов, специфично связывающихся с гидрофобными участками высокомолекулярных органических соединений

1. Способ ферментативного получения модифицированных ДНК для создания реагентов, специфично связывающихся с гидрофобными участками высокомолекулярных органических соединений, включающий последовательные стадии:
(а) - органический синтез мономеров - модифицированных трифосфатов дезоксиуридина, содержащих на гетероциклическом основании специальным образом сконструированные функциональные группы, способные специфично связываться с гидрофобными участками высокомолекулярных органических соединений;
(б) - органический синтез немодифицированной одноцепочечной ДНК с заданной последовательностью, зависящей от задач исследования;
(в) - органический синтез высокоспецифичных фланкирующих праймеров для ферментативной амплификации немодифицированной одноцепочечной ДНК;
(г) - ферментативную амплификацию синтетической немодифицированной ДНК с целью наработки необходимого ее количества для последующего введения модифицированных нуклеотидов, с применением полимеразной цепной реакции;
(д) - органический синтез высокоспецифичного праймера, содержащего по 5'-концу биотин для последующего разделения цепей двухцепочечной ДНК;
(е) - проведение, в зависимости от задач исследования, полимеразной цепной реакции либо транскрипции либо обратной транскрипции либо реакции удлинения праймера, с применением амплифицированной ДНК, фланкирующих праймеров и модифицированного трифосфата дезоксиуридина;
(ж) - получение одноцепочечной модифицированной ДНК с использованием модифицированного трифосфата дезоксиуридина с целью создания реагента, способного специфично связываться с гидрофобными участками высокомолекулярных органических соединений.
2. Способ по п. 1, в котором в качестве реагентов, специфично связывающихся с гидрофобными участками высокомолекулярных органических соединений, выступают фрагменты ДНК с заранее заданной фиксированной нуклеотидной последовательностью;
3. Способ по п. 1, в котором в качестве реагентов, специфично связывающихся с гидрофобными участками высокомолекулярных органических соединений, выступают фрагменты ДНК с т.н. «вырожденным» участком последовательности -полным перебором четырех нуклеотидов - аденина, гуанина, цитидина и одного из модифицированных производных дезоксиуридина (а), для создания аптамеров, модифицированных аптамеров, сомамеров;
4. Способ по п. 1, в котором реагенты в соответствии с п.п. 2 и 3 способны связываться с гидрофобными участками белков, полипептидов, пептидогликанов, гликопротеинов, углеводородов, липосом, липидных мембран, двусторонних липидных мембран;
5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что химически-модифицированное азотистое основание представляет собой производное трифосфата дезоксиуридина с характерными для белков функциональными группами, связанными с азотистым основанием через транс-алкеновые линкеры различной длины (а).
6. Соединения по п. 5 общей формулы
где:
n=1-3
М+ представляет собой Н+, Na+, Li+, К+, [CH3(CH2)×](4-y)NHy+ (где х=0-5, у=0-4).
7. Соединения по п. 6, представляющие собой
тетранатриевую соль 5-[4-аза-5-оксо-6-(1Н-индол-3-ил)гекс-1-ен-1-ил)]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата
тетракалиевую соль 5-[4-аза-5-оксо-6-(1Н-индол-3-ил)гекс-1-ен-1-ил)]-2'-дезоксиуридин- 5'-трифосфата
тетралитиевую соль 5-[4-аза-5-оксо-6-(1Н-индол-3-ил)гекс-1-ен-1-ил)]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата
тетрааммониевую соль 5-[4-аза-5-оксо-6-(1Н-индол-3-ил)гекс-1-ен-1-ил)]-2'-дезоксиуридин-5'трифосфата
тетракис(триэтиламмониевую) 5-[4-аза-5-оксо-6-(1Н-индол-3-ил)гекс-1-ен-1-ил)]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата соль
тетранатриевую соль 5-[4-аза-5-оксо-7-(1Н-индол-3-ил)гепт-1-ен-1-ил)]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата
тетракалиевую соль 5-[4-аза-5-оксо-7-(1Н-индол-3-ил)гепт-1-ен-1-ил)]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата
тетралитиевую соль 5-[4-аза-5-оксо-7-(1Н-индол-3-ил)гепт-1-ен-1-ил)]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата
тетрааммониевую соль 5-[4-аза-5-оксо-7-(1Н-индол-3-ил)гепт-1-ен-1-ил)]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата
тетракис(триэтиламмониевую) соль 5-[4-аза-5-оксо-7-(1Н-индол-3-ил)гепт-1-ен-1-ил)]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата
тетранатриевую соль 5-[4-аза-5-оксо-8-(1Н-индол-3-ил)окт-1-ен-1-ил)]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата
тетракалиевую соль 5-[4-аза-5-оксо-8-(1Н-индол-3-ил)окт-1-ен-1-ил)]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата
тетралитиевую соль 5-[4-аза-5-оксо-8-(1Н-индол-3-ил)окт-1-ен-1-ил)]-2'-дезоксиуридин-5'трифосфата
тетрааммониевую соль 5-[4-аза-5-оксо-8-(1Н-индол-3-ил)окт-1-ен-1-ил)]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата
тетракис(триэтиламмониевую) соль 5-[4-аза-5-оксо-8-(1Н-индол-3-ил)окт-1-ен-1-ил)]-2'-дезоксиуридин-5'трифосфата
8. Соединения по п. 5 общей формулы
где:
m=1-3
М+ представляет собой Н+, Na+, Li+, К+, [CH3(CH2)×](4-y)NHy+ (где х=0-5, у=0-4).
9. Соединения по п. 8, представляющие собой
тетранатриевую соль 5-[4-аза-5-оксо-6-фенилгекс-1-ен-1-ил)]-2'-
дезоксиуридин-5'-трифосфата
тетракалиевую соль 5-[4-аза-5-оксо-6-фенилгекс-1-ен-1-ил)]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата
тетралитиевую соль 5-[4-аза-5-оксо-6-фенилгекс-1-ен-1-ил)]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата
тетрааммониевую соль 5-[4-аза-5-оксо-6-фенилгекс-1-ен-1-ил)]-2'-
дезоксиуридин-5'-трифосфата
тетракис(триэтиламмониевую) соль 5-[4-аза-5-оксо-6-фенилгекс-1-ен-1-ил)]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата
тетранатриевую соль 5-[4-аза-5-оксо-7-фенилгепт-1-ен-1-ил)]-2'-
дезоксиуридин-5'-трифосфата
тетракалиевую соль 5-[4-аза-5-оксо-7-фенилгепт-1-ен-1-ил)]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата
тетралитиевую соль 5-[4-аза-5-оксо-7-фенилгепт-1-ен-1-ил)]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата
тетрааммониевую соль 5-[4-аза-5-оксо-7-фенилгепт-1-ен-1-ил)]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата
тетракис(триэтиламмониевую) соль 5-[4-аза-5-оксо-7-фенилгепт-1-ен-1-ил)]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата
тетранатриевую соль 5-[4-аза-5-оксо-8-фенилокт-1-ен-1-ил)]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата
тетракалиевую соль 5-[4-аза-5-оксо-8-фенилокт-1-ен-1-ил)]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата
тетралитиевую соль 5-[4-аза-5-оксо-8-фенилокт-1-ен-1-ил)]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата
тетрааммониевую соль 5-[4-аза-5-оксо-8-фенилокт-1-ен-1-ил)]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата
тетракис(триэтиламмониевую) соль 5-[4-аза-5-оксо-8-фенилокт-1-ен-1-ил)]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата.
10. Способ по п. 1, включающий органический синтез немодифицированной ДНК в зависимости от задач исследования (б). В качестве немодифицированной ДНК может выступать i) вырожденная комбинаторная библиотека для получения аптамеров, ii) индивидуальная нуклеотидная последовательность, предварительно охарактеризованная по способности специфично связываться с гидрофобными участками определенного индивидуального высокомолекулярного органического соединения.
11. Соединение по п. 10, представляющее собой фрагмент ДНК с заданной фиксированной последовательностью (i):
5'-GGGTGGTCTGTGTGCAAAACTAAAGAGACGACGAGCGGGAAAAAA-3'.
12. Соединение по п. 10, представляющее собой фрагмент ДНК представленной ниже последовательности (ii), а именно вырожденную «рандомную» комбинаторную ДНК-библиотеку:
CTGTCAGCTCCATACTGGTAGCC-(N)40-GCGTTCGAATCTAGACGGTACGA
, где N - комбинация нуклеотидов А, Т, G, С.
13. Способ по п. 1, включающий синтез высокоспецифичных праймеров для ферментативной амплификации синтетической немодифицированной ДНК (в). Нуклеотидные последовательности праймеров выбираются в зависимости от поставленной задачи и выбранной последовательности синтетической немодифицированной ДНК.
14. Олигонуклеотиды по п. 13, представляющие собой праймеры для ферментативной амплификации фрагмента ДНК, характеризованной в п. 11, которые характеризуются приведенными ниже последовательностями:
5'-TCCCGCTCGTCGTCT-3' (3'-праймер)
5'-GGGTGGTCTGTGTGC-3' (5'-праймер).
15. Олигонуклеотиды по п. 13, представляющие собой праймеры для ферментативной амплификации фрагмента ДНК, характеризованной в п. 12, которые характеризуются приведенными ниже последовательностями:
5'-CTGTCAGCTCCATACTGGTAGCC-3' (3'-праймер)
5'-TCGTACCGTCTAGATTCGAACGC-3' (5'-праймер).
16. Способ по п. 1., отличающийся тем, что необходимое для осуществления модификации количество ДНК получают путем ферментативной амплификации синтетической немодифицированной ДНК (г) методом полимеразной цепной реакции с использованием в качестве матриц ДНК, характеризованных в п. 11 либо в п. 12, с применением праймеров, характеризованных в п. 14 либо в п. 15.
17. Способ по п. 1, в котором производится синтез высокоспецифичного праймера, содержащего биотин для разделения двухцепочечной ДНК, получаемой в процессе проведения реакции удлинения праймера с модифицированными трифосфатами дезоксиуридина (д). Нуклеотидная последовательность праймера выбирается в зависимости от поставленной задачи и выбранной последовательности синтетической немодифицированной ДНК.
18. Олигонуклеотид по п. 17, представляющий собой праймеры, содержащий по 5'-концу биотин, характеризующийся приведенной ниже последовательностью:
5'-биотин-TCCCGCTCGTCGTCT-3' (3'-праймер)
19. Олигонуклеотид по п. 17, представляющий собой праймеры, содержащий по
5'-концу биотин, характеризующийся приведенной ниже последовательностью:
5'-биотин-CTGTCAGCTCCATACTGGTAGCC-3' (3'-праймер)
20. Способ по п. 1, отличающийся тем, что модификация в ДНК вводится посредством полимеразной цепной реакции либо транскрипции либо обратной транскрипции либо реакции удлинения праймера, с использованием каждого индивидуального модифицированного трифосфата дезоксиуридина, из характеризованных в п.п. 5-9, в каждой отдельной ферментативной реакции (е). В результате получают индивидуальные модифицированные продукты, при этом выбор трифосфата дезоксиуридина для модификации производят в зависимости от поставленных задач.
21. Способ по п. 20, включающий применение специальных ДНК-полимераз, способных встраивать модифицированные трифосфаты дезоксиуридина. Выбор индивидуальной полимеразы зависит от характеристик и субстратной эффективности индивидуального модифицированного трифосфата дезоксиуридина.
22. Способ по п. 20, отличающийся тем, что в качестве полимеразы нуклеиновой кислоты используют Taq ДНК-полимеразу.
23. Способ по п. 20, отличающийся тем, что в качестве полимеразы нуклеиновой кислоты используют Deep Vent ДНК-полимеразу.
24 Способ по п. 20, отличающийся тем, что в качестве полимеразы нуклеиновой кислоты используют KOD XL ДНК-полимеразу.
25. Способ по п. 1, отличающийся тем, что получение одноцепочечной модифицированной ДНК с использованием модифицированного трифосфата дезоксиуридина с целью создания реагента, способного специфично связываться с гидрофобными участками высокомолекулярных органических соединений, производят на магнитных микрочастицах, способных взаимодействовать с праймером, содержащим биотин (ж).
26. Способ по п.п. 20 и 25, характеризующийся тем, что получаемая ДНК содержит индивидуальный модифицированный трифосфат дезоксиуридина лишь на цепи, полученной посредством удлинения праймера, содержащего биотин.
27. Способ по п.п. 25 и 26, отличающийся тем, что для выделения одноцепочечной ДНК с высокой степенью модификации используются магнитные частицы с ковалентно-пришитыми к их поверхности молекулами стрептавидина.
28. Способ по п.п. 1 и 26, в котором для взаимодействия с гидрофобными группами высокомолекулярных соединений предназначена только цепь ДНК, содержащая индивидуальный модифицированный нуклеотид. Немодифицированная цепь ДНК не предназначена для дальнейшего использования и исключается из последующего специфического взаимодействия с высокомолекулярным органическим соединением. Получаемая в результате применения способа одноцепочечная модифицированная ДНК предназначена в зависимости от задач исследования для дальнейшего получения ДНК-зондов, аптамеров и сомамеров, использующихся в молекулярно-биологических исследованиях и в медицинской диагностике.