КОНТЕЙНЕР ДЛЯ ИЗОЛЯЦИИ И ИДЕНТИФИКАЦИИ МИКРООРГАНИЗМА
CONTAINER FOR ISOLATION AND IDENTIFICATION OF MICROORGANISM

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННУЮ ЗАЯВКУ
Данная заявка претендует на приоритет в отношении предварительной заявки на патент США №61/110187, озаглавленной "Method and System for Detection and/or Characterization of a Biological Particle in a Sample", поданной 31 октября 2008, которая включена в данную заявку.
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение направлено на сепаратор для разделения микроорганизмов. В частности, сепаратор по настоящему изобретению можно использовать для разделения микроорганизмов для характеристики и/или идентификации.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Обнаружение патогенных микроорганизмов в биологических жидкостях следует осуществлять в кратчайшее по возможности время, в частности, в случае септицемии, для которой смертность остается высокой, несмотря на широкий спектр антибиотиков, доступных врачам. Присутствие биологически активных агентов, таких как микроорганизмы, в жидкости организма пациента, в частности в крови, обычно определяют, используя флаконы гемокультуры. Инфекции системы кровообращения связаны с высокой заболеваемостью и смертностью, кроме того, осуществление современных способов диагностики, культивирования с последующей биохимической идентификацией и тестирования на чувствительность к антибиотикам может занять несколько суток. Обычно начинают эмпирическую терапию на основании клинических симптомов, и результаты тестов влияют на клинические решения только тогда, когда первоначальная терапия неудачна. Способность охарактеризовать инфекции кровообращения в пределах первых нескольких часов, предпочтительно в пределах часа, после положительного результата гемокультуры значительно усилило бы клиническую релевантность предоставленной диагностической информации. Для восполнения данной потребности предложены способы молекулярной амплификации, но при данном подходе остаются серьезные проблемы. Сама среда положительной гемокультуры представляет собой естественно амплифицированную популяцию микроорганизмов с потенциалом использования быстрых тестов идентификации (ID).
Традиционные автоматические фенотипические ID тесты, такие как системы Vitek, Phoenix™ и Microscan, или ручные фенотипические тесты, такие как API, требуют, чтобы микроорганизмы находились в соответствующей фазе роста и были свободны от мешающих сред и продуктов крови с целью получения надежных результатов. Эти системы используют колонии, выращенные из положительной культуры в течение 18-24 часов на средах в чашках Петри. Однако при стремлении получить более быстрые результаты некоторые лаборатории сообщили об использовании этих систем с микроорганизмами, выделенными из флаконов с положительными гемокультурами. Эти тесты "непосредственно из флакона" пригодны не для всех микроорганизмов (например, непригодны для грамположительных кокков), не подтверждены изготовителями тестов и, как правило, занимают 3-8 часов для получения результатов. Более быстрые и более широко специфичные тесты крайне необходимы в целях обеспечения врача клинически релевантными результатами в пределах первых нескольких часов, предпочтительно в пределах часа, после положительного результата культуры.
Способы оптической спектроскопии, такие как собственная флуоресценция (IF), инфракрасная спектроскопия (FTIR) или рамановская спектроскопия, и способы масс-спектрометрии, такие как MALDI-TOF (времяпролетная ионизация лазерной десорбцией с использованием матрицы), обладают потенциалом, предоставляющим возможность идентификации микроорганизмов очень быстро, но они могут столкнуться с интерференцией от множества высоко флуоресцентных и поглощающих соединений, присутствующих в жидких микробиологических культуральных средах и в клинических образцах, таких как кровь, или в их сочетании. Чаще всего используемые способы выделения микроорганизмов непосредственно из положительной гемокультуры представляют собой двухступенчатое дифференциальное центрифугирование и центрифугирование в пробирке для отделения сыворотки. Однако эти способы имеют несколько недостатков. Полученный в результате препарат микроорганизмов часто содержит загрязняющие эритроциты, тромбоциты, липидные частицы, плазматические ферменты и клеточный детрит, что может вызвать плохие результаты в традиционных ID тестах. Эти способы также являются очень трудоемкими и небезопасными за счет стадий, которые могут привести в результате к аэрозольному воздействию потенциально опасных патогенов на пользователя. Необходимы простые, безопасные и надежные способы изоляции микроорганизмов из гемокультуры и других комплексных образцов, которые свободны от этих интерферирующих материалов и совместимы с технологиями быстрой идентификации.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение направлено на сепаратор или контейнер, который можно использовать для разделения микроорганизмов из образца, который содержит или подозревается на содержание микроорганизмов. В соответствии с настоящим изобретением сепаратор можно использовать для разделения или осаждения неизвестного микроорганизма и последующего исследования разделенного образца или осадка для характеристики и/или идентификации неизвестного микроорганизма.
В одном аспекте настоящее изобретение направлено на контейнер для изоляции и идентификации микроорганизма, включающий:
(a) верхнюю часть, имеющую широкий внутренний диаметр;
(b) нижнюю часть, имеющую узкий внутренний диаметр; и
(c) оптическое окно на дне, сверху и/или на одной или более чем одной стенке контейнера, которое является прозрачным по меньшей мере для части ближнего инфракрасного, видимого и/или ультрафиолетового светового спектра. Необязательно этот контейнер может дополнительно иметь среднюю коническую секцию, соединяющую широкий внутренний диаметр верхней части с узким внутренним диаметром нижней части.
В другом аспекте настоящее изобретение направлено на одноразовый сепаратор, включающий:
(a) контейнер цилиндрической формы, содержащий корпус, имеющий продольную ось, который определяет продольную внутреннюю капиллярную трубку, ориентированную вдоль оси, имеющую первый конец и второй конец, где корпус дополнительно определяет резервуар, соединенный с первым концом капиллярной трубки;
(b) где корпус вблизи второго конца капиллярной трубки изготовлен из оптически прозрачного материала;
(c) крышку для резервуара для обеспечения доступа в резервуар, дающую возможность дозировать жидкий образец в резервуар.
Необязательно контейнер цилиндрической формы может содержать плотностный буфер внутри резервуара. Контейнер может дополнительно иметь коническую секцию, соединяющую резервуар и капиллярную трубку.
В одной форме осуществления настоящего изобретения микробный агент разделяют или осаждают на дне капиллярной трубки, расположенной в сепараторе или контейнере таким образом, как описано в данной заявке. Разделенный или осажденный микробный агент можно исследовать для характеристики и/или идентификации этого микробного агента.
В другой форме осуществления сепаратор может быть герметичным, например, устройство может быть герметично закрыто. Такие устройства могут обеспечить преимущества безопасности при обращении с потенциально инфекционными агентами. В других возможных формах осуществления сепаратор может обеспечивать средства для доступа к разделенному, изолированному или осажденному образцу микроорганизма, давая посредством этого возможность извлечь образец из сепаратора перед исследованием, или для дополнительного тестирования.
Контейнер может содержать полипропиленовый шарик.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
Фиг.1 представляет собой перспективное изображение сепаратора в соответствии с одной формой осуществления настоящего изобретения.
Фиг.2 представляет собой вид в поперечном разрезе сепаратора фиг.1.
Фиг.3 представляет собой перспективное изображение сепаратора в соответствии с другой формой осуществления настоящего изобретения.
Фиг.4 представляет собой вид в поперечном разрезе верхней части сепаратора, показанного на фиг.3.
Фиг.5 представляет собой вид в поперечном разрезе нижней части сепаратора, показанного на фиг.3. Нижняя часть сепаратора подогнана к нижнему концу верхней части сепаратора фиг.4.
Фиг.6 представляет собой вид в поперечном разрезе сепаратора фиг.3, показывающий разделенный микробный агент в секции капиллярной трубки сепаратора (например, осадок после центрифугирования).
Фиг.7 представляет собой вид в поперечном разрезе другой формы осуществления нижней части сепаратора фиг.3. Как показано, данная форма осуществления имеет две противоположные стороны с насечками, ведущие к прилежащим узким боковым стенкам, таким образом, давая возможность исследовать разделенный микробный агент в секции капиллярной трубки со стенки сепаратора.
Фиг.8 представляет собой схематическую иллюстрацию концентрированного микробного агента в сепараторе фиг.6, который исследуют через дно трубки с помощью модуля исследования.
Фиг.9 представляет собой перспективное изображение еще одной альтернативной формы осуществления сепаратора по настоящему изобретению.
Фиг.10 представляет собой вид в поперечном разрезе сепаратора фиг.9.
Фиг.11 представляет собой перспективное изображение альтернативной крышки для сепаратора по настоящему изобретению.
На фиг.12 показана фотография сепаратора в соответствии с одной формой осуществления настоящего изобретения. На фотографии четко виден лизированный образец, плотностный буфер и осадок микроорганизма в соответствии с настоящим изобретением.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение может быть осуществлено в различных формах и не должно рассматриваться как ограниченное формами осуществления, изложенными в данной заявке. Вероятнее, эти формы осуществления представлены, чтобы данное описание было более тщательным и полным и полностью передавало объем изобретения специалистам в данной области техники. Например, признаки, проиллюстрированные в отношении одной формы осуществления, могут быть включены в другие формы осуществления, а признаки, проиллюстрированные в отношении конкретной формы осуществления, могут быть удалены из этой формы осуществления. Кроме того, различные изменения и дополнения к предложенным здесь формам осуществления, которые не отклоняются от настоящего изобретения, будут очевидны специалистам в данной области техники в свете настоящего описания.
Способы разделения, характеристики и/или идентификации микроорганизмов раскрыты в приведенных ниже заявках на патент США, принадлежащих одному и тому же правообладателю: (1) серийный №__, озаглавленной "Method for the Isolation and Identification of Microorganisms", поданной 30 октября 2009; (2) серийный №__, озаглавленной "Method for Separation, Characterization and/or Identification of Microorganisms using Spectroscopy", поданной 30 октября 2009; (3) серийный №__, озаглавленной "Method for Separation, Characterization and/or Identification of Microorganisms using Mass Spectrometry", поданной 30 октября 2009; и (4) серийный №__, озаглавленной "Method for Separation, Characterization and/or Identification of Microorganisms using Raman Spectroscopy", поданной 30 октября 2009. Эти заявки включены в данную заявку посредством ссылки. Кратко, этими авторами изобретений раскрыты способы изоляции, характеристики и/или идентификации микроорганизмов в образце. Эти способы дают возможность разделения, характеристики и/или идентификации микроорганизмов быстрее, чем методы предшествующего уровня техники, что приводит в результате к более быстрым диагнозам (например, у субъекта, страдающего или подозреваемого на септицемию) и характеристике/идентификации зараженных материалов (например, пищевых продуктов и фармацевтических препаратов). В этих и других способах характеристики и/или идентификации микроорганизмов часто необходимо обеспечить разделенный, изолированный или осажденный образец микроорганизма для последующих методов характеристики и/или идентификации. В настоящем изобретении раскрыт сепаратор, который можно использовать для разделения, изоляции и/или осаждения микроорганизмов из образца. Например, сепаратор по настоящему изобретению можно использовать для осаждения микроорганизмов (например, путем центрифугирования) из жидкой культуры (например, гемокультуры). Осадок микроорганизма может проходить одну или более чем одну стадию исследования для проведения измерений, полезных для характеристики и/или идентификации микроорганизма.
В одной форме осуществления стадию исследования можно осуществлять, когда разделенный, изолированный или осажденный образец микроорганизма остается в сепараторе. Например, герметичный сепаратор (например, герметично закрытое устройство) можно использовать для получения разделенного, изолированного или осажденного образца микроорганизма, а затем этот разделенный, изолированный или осажденный образец микроорганизма можно подвергать неинвазивному методу исследования для получения данных или измерений, способных к характеристике и/или идентификации микроорганизма. В другой форме осуществления разделенный, изолированный или осажденный образец микроорганизма можно извлечь из сепаратора перед исследованием. Например, разделенный, изолированный или осажденный микроорганизм можно ресуспендировать в соответствующем буфере и извлечь (например, пипеткой) из устройства или контейнера. В другой форме осуществления, как раскрыто в данной заявке, сепаратор или контейнер может включать нижнюю часть, которую можно удалить или оторвать от сепаратора или контейнера (то есть отъемную нижнюю часть). При работе эту нижнюю часть можно оторвать от сепаратора или контейнера, чтобы обеспечить доступ к разделенным или изолированным микроорганизмам, находящимся в ней.
В целом сепаратор или контейнер по настоящему изобретению может представлять собой любое устройство или контейнер, полезный для разделения, изоляции или осаждения микроорганизма из тестируемого образца, содержащего или подозреваемого на содержание микроорганизмов. Например, сепаратор или контейнер может включать одно- или многочастный корпус и крышку или колпачок. Корпус устройства может быть получен литьем, литьем с раздувом или сформован с использованием других хорошо известных методов в данной области техники. Как правило, любой известный пластмассовый, стеклянный или прозрачный материал или тому подобное можно использовать для сепаратора. Сепаратор будет сформован таким образом, чтобы он имел отверстие на одном конце, дающее доступ к внутренней части устройства или контейнера для загрузки и/или выгрузки тестируемых образцов. В форме осуществления сепаратор или контейнер включает корпус цилиндрической формы, который закрыт на одном и открыт на противоположном конце. Типично для крышки или колпачка можно использовать любой известный механизм для закрывания или иной герметизации внутренней части устройства или контейнера от внешней окружающей среды. Например, крышка или колпачок может представлять собой крышку с защелкой, которая прикреплена к корпусу устройства или контейнера, и которую можно защелкивать над отверстием устройства или контейнера, чтобы закрыть или герметизировать внутреннюю часть устройства или контейнера от внешней окружающей среды. Альтернативно крышка может представлять собой крышку с резьбой, которую можно завинчивать на устройстве или контейнере, чтобы закрыть устройство/контейнер. Как хорошо известно в данной области техники, крышка может иметь резьбу на внутренних сторонах крышки, которую заворачивают или навинчивают на резьбу, расположенную на внешней стенке устройства или контейнера. В одной форме осуществления крышка может содержать одно или более чем одно резиновое 0-образное кольцо на ее внутренней поверхности, как хорошо известно в данной области техники. Использование одного или более чем одного 0-образного кольца обеспечивает уплотнение (например, герметичное уплотнение). В другой возможной форме осуществления, как показано на фиг.11, крышка или колпачок 100 может иметь прокалываемую перегородку 104, которую можно прокалывать, например, иглой или тому подобным, давая посредством этого возможность доставки тестируемого образца в герметично закрытое устройство или контейнер. Использование прокалываемой перегородки 104 может дать преимущество безопасности для пользователя или лаборанта при обращении с потенциально инфекционными агентами и обеспечить автоматизацию способа идентификации. Прокалываемая перегородка 104 также гарантирует, что устройство или контейнер остается герметичным (например, герметично закрытым), и, следовательно, предоставляет защиту от возможного загрязнения сепаратора.
Тестируемые образцы, которые можно подвергать разделению, изоляции или осаждению в сепараторе или контейнере по настоящему изобретению, включают как клинические, так и неклинические образцы, в которых присутствие и/или рост микроорганизма существует, либо его можно подозревать, а также образцы материалов, которые обычно или время от времени тестируют на присутствие микроорганизмов. Например, тестируемый образец может представлять собой культуральную среду от культуры клинического или неклинического образца. Типичные образцы, которые можно культивировать, а затем подвергать методу разделения для разделения, изоляции или осаждения микроорганизмов, содержащихся в них, могут включать кровь, сыворотку, плазму, фракции крови, суставную жидкость, мочу, семенную жидкость, слюну, фекалии, цереброспинальную жидкость, содержимое желудка, вагинальные секреции, гомогенаты тканей, пунктаты костного мозга, костные гомогенаты, мокроту, пунктаты, мазки и промывные воды мазков, другие жидкости организма и тому подобное.
В одной форме осуществления, как описано далее в данной заявке, в сепараторе или контейнере можно применить использование плотностного буфера для разделения, изоляции или осаждения микроорганизмов из тестируемого образца. Как используют в данной заявке, термин "плотностный буфер" относится к раствору, имеющему однородную плотность по всему раствору. Полезные плотностные буферы далее описаны в данной заявке. Например, тестируемый образец, о котором известно, что он содержит или может содержать микроорганизмы, можно наносить на плотностный буфер, содержащийся внутри устройства или контейнера, и контейнер или устройство центрифугировать, чтобы изолировать или осадить микроорганизмы. В соответствии с данной формой осуществления сепаратор или контейнер будет иметь достаточный объем, чтобы удержать плотностный буфер и образец. В одной форме осуществления контейнер приспособлен или может быть приспособлен к центрифужному ротору. Объем контейнера может составлять от примерно 0,1 мл до примерно 25 мл, например, от примерно 1 мл до примерно 15 мл, например, от примерно 1,5 мл до примерно 8 мл. Если разделение проводят в микромасштабе, объем контейнера может составлять от примерно 2 мкл до примерно 100 мкл, например, от примерно 5 мкл до примерно 50 мкл. В некоторых формах осуществления, как более подробно обсуждено в данной заявке, сепаратор или контейнер может быть предварительно загружен плотностным буфером. В некоторых формах осуществления промежуточный слой (жидкость или твердое вещество) может быть помещен сверху на плотностный буфер перед тем, как образец наносят или наслаивают сверху, с целью предотвращения какого-либо смешивания плотностного буфера и образца. Например, тонкая мембрана может быть помещена сверху на предварительно упакованный плотностный буфер, чтобы предотвратить смешивание плотностного буфера с тестируемым образцом, добавленным позже. Еще в одной другой форме осуществления сепаратор или контейнер может быть предварительно загружен плотностным буфером, а затем предварительно загружен раствором для лизиса. Полезные растворы для лизиса раскрыты в заявках на патент США, принадлежащих одному и тому же правообладателю, обсуждаемых в данной заявке. В соответствии с данной формой осуществления тонкую мембрану можно использовать, чтобы разделить плотностный буфер и раствор для лизиса, предотвращая посредством этого смешивание.
В одной форме осуществления устройство или контейнер имеет верхнюю внутреннюю камеру или резервуар, имеющий широкий диаметр, чтобы удерживать тестируемый образец и большую часть плотностного буфера, и нижнюю внутреннюю камеру или капиллярную трубку, имеющую узкий диаметр для сбора разделенных, изолированных или осажденных микроорганизмов. Верхняя внутренняя камера или резервуар может иметь внутренний диаметр от примерно 0,32 (8,13 мм) до примерно 0,40 (10,16 мм) дюймов, например, от примерно 0,34 (8,64 мм) до примерно 0,38 (9,65 мм) дюймов, например, примерно 0,36 (9,14 мм) дюймов. Для разделений в микромасштабе внутренние диаметры могут быть даже меньше. Например, внутренний диаметр узкой части может составлять от примерно 0,001 (0,03 мм) до примерно 0,04 (1,02 мм) дюймов, например, от примерно 0,002 (0,05 мм) до примерно 0,01 (0,254 мм) дюймов. Нижняя внутренняя камера или капиллярная трубка может иметь внутренний диаметр от примерно 0,04 (1,02 мм) до примерно 0,12 (3,04 мм) дюймов, например, от примерно 0,06 (1,52 мм) до примерно 0,10 (2,54 мм) дюймов, например, примерно 0,08 (2,032 мм) дюймов.
В другой форме осуществления устройство или контейнер представляет собой одноразовый сепаратор, включающий трубчатый контейнер, содержащий корпус, который имеет продольную ось, где этот корпус определяет продольную внутреннюю капиллярную трубку, ориентированную вдоль оси, имеющую первый конец и второй конец, где этот корпус дополнительно определяет резервуар, соединенный с первым концом капиллярной трубки. В одном аспекте данной формы осуществления корпус вблизи второго конца капиллярной трубки изготовлен из оптически прозрачного материала. Резервуар снабжен отъемной крышкой или колпачком, который обеспечивает доступ в резервуар, давая возможность дозировать жидкий образец в резервуар. Необязательно плотностный буфер может быть предварительно упакован в устройстве или контейнере.
Сепаратор или контейнер может также иметь среднюю коническую часть или камеру, соединяющую верхнюю внутреннюю камеру или резервуар с нижней внутренней камерой или капиллярной трубкой. Внутренние боковые стенки средней конической части могут иметь коническую форму или могут уменьшать диаметр между верхней внутренней камерой или резервуаром и нижней внутренней камерой или капиллярной трубкой. Эти внутренние боковые стенки конической части могут иметь угол от примерно 20 до примерно 70 градусов, например, от примерно 30 до примерно 60 градусов. В одной форме осуществления нижняя узкая часть составляет менее половины от общей высоты контейнера, например, менее чем примерно 40%, 30%, 20% или 10% от общей высоты контейнера.
В некоторых формах осуществления контейнер сконструирован так, чтобы разделенные, изолированные или осажденные микроорганизмы можно было легко выделить из контейнера после разделения, либо вручную, либо автоматизированным способом (так, чтобы лаборанты не подвергались воздействию содержимого контейнера). Например, контейнер может содержать отъемную часть или отделяемую часть, которая содержит осадок, и которая может быть отделена от остальной части контейнера. В другой форме осуществления контейнер содержит средства для доступа к осадку после разделения, такие как одно или более чем одно отверстие или одна или более чем одна проницаемая поверхность для вставки шприца или другого дозатора или для вытягивания осадка. В одной форме осуществления контейнер может представлять собой пробирку, например центрифужную пробирку. В другой форме осуществления контейнер может представлять собой чип или плату. В одной форме осуществления контейнер представляет собой отдельно стоящий контейнер, то есть устройство для разделения одного образца.
Контейнер может содержать оптическое окно, через которое можно осуществлять исследование. Оптическое окно может находиться на дне, сверху и/или на стенках контейнера. Это окно может состоять из любого материала, который является прозрачным для света (например, по меньшей мере части ближнего инфракрасного (БИК; 700 нм - 1400 нм), ультрафиолетового (УФ; 190 нм - 400 нм) и/или видимого (ВИД; 400 нм - 700 нм) светового спектра. Примеры подходящих материалов включают без ограничения акриловую смолу, метакрилат, кварц, кварцевое стекло, сапфир, циклический олефиновый сополимер (СОС) и/или циклоолефиновый полимер (СОР) (например, Zeonex (Zeonex, San Diego, CA)). В одной форме осуществления контейнер полностью изготовлен из материала оптического окна. В другой форме осуществления контейнер может быть изготовлен (например, отлит) из двух или более чем двух отдельных частей, таких как оптический УФ-ВИД-БИК прозрачный компонент для оптического окна и другой материал (например, стандартная формованная пластмасса низкой стоимости) для изготовления остальной части контейнера. В одной форме осуществления оптическое окно является достаточно тонким, чтобы давать возможность спектроскопического исследования, которое будет зависеть от материала окна. В другой форме осуществления является тонким насколько возможно, чтобы уменьшить интерференцию при спектроскопическом исследовании. Например, окно может иметь толщину менее чем примерно 0,20 (5,08 мм) дюймов, например, менее чем примерно 0,15 (3,8 мм), 0,10 (2,54 мм) или 0,05 (1,27 мм) дюймов.
Теперь со ссылкой на графические материалы далее проиллюстрировано несколько возможных конфигураций сепаратора или контейнера по настоящему изобретению. Одна возможная форма осуществления сепаратора показана на фиг.1-2. Как показано на фиг.1 и 2, сепаратор 2 включает нижнюю часть 6, обычно имеющую цилиндрическую форму, и верхнюю часть, определенную выходящей наружу ребристой структурой или выступом 8, отверстие 9 и запорный колпак 4. Нижняя часть 6 включает корпус 10 контейнера, в котором заключена внутренняя камера, включающая верхний резервуар 14, среднюю коническую секцию 16 и нижнюю капиллярную трубку 18, где все они устроены вокруг продольной оси контейнера. Как показано, средняя коническая секция 16 соединяет верхний резервуар 14 более широкого внутреннего диаметра и капиллярную трубку 18 меньшего диаметра. Как правило, корпус 10 контейнера может быть отлит или сформован иным путем из любого известного пластмассового материала, известного в данной области техники. Выступающая наружу ребристая структура или выступ 8 может функционировать как стопор для запорного колпака 4 и/или может обеспечить признак, дающий возможность улучшенного захвата устройства пользователем. Верхняя часть устройства может также содержать резьбу 12 на наружной стенке устройства 2 для навинчивания или завинчивания запорного колпака 4 на устройстве 2, посредством этого закрывая или герметизируя внутреннюю камеру. Устройство может дополнительно содержать тонкое оптическое окно 19, через которое можно осуществлять исследование. В одной форме осуществления диаметр оптического окна 19 может быть сконструирован так, чтобы соответствовать оптоволоконному кабелю и способствовать точному соединению устройства со спектрометром. Как описано выше, оптическое окно 19 включает секцию устройства, которая состоит из материала, являющегося прозрачным для света, и через которую можно осуществлять исследование. В других формах осуществления устройство может быть полностью изготовлено из материала, который является прозрачным для света, позволяя посредством этого проводить исследование.
В некоторых формах осуществления сепаратор 2 данной формы осуществления может быть предварительно загружен плотностным буфером 43 (показано, например, на фиг.6-7), чтобы облегчить разделение, изоляцию или осаждение микроорганизмов. В другой форме осуществления плотностный буфер может быть добавлен в сепаратор 2 непосредственно перед нанесением образца, который нужно подвергать стадии разделения, описанной в данной заявке. Еще в одной другой форме осуществления сепаратор 2 может быть предварительно загружен плотностным буфером 43 и раствором для лизиса (не показано), чтобы облегчить лизис образца и разделение, изоляцию или осаждение микроорганизмов, как описано в заявках на патент США, принадлежащих одному и тому же правообладателю, на которые ссылаются в данной заявке.
В другой форме осуществления, как показано на фиг.3-6 и 8, сепаратор 20 может состоять из двух отдельных секций, верхней секции 22 и нижней секции 24, которые могут быть зафиксированы вместе защелкой или прикреплены иначе с образованием единого сепаратора 20. Нижняя секция 24 может быть подвижно прикреплена или неподвижно прикреплена к верхней секции 22, как правило, с помощью средств, известных в данной области техники. Верхняя секция 22 включает верхний корпус 32, обычно содержащий цилиндрическую форму, выступающую наружу ребристую структуру или выступ 30 и отверстие 29. Отверстие может быть закрыто или герметизировано с использованием крышки или колпачка 52 (см. фиг.8). Верхний корпус 32 дополнительно определяет верхние части внутренней камеры. Внутренняя камера включает верхний резервуар 40, среднюю коническую секцию 42 и верхнюю часть 44 капиллярной трубки 45, где все они устроены вокруг продольной оси контейнера. Нижний корпус 34 включает нижнюю часть 46 капиллярной трубки 45. Когда верхний корпус 32 и нижний корпус 34 фиксируют вместе защелкой или скрепляют иначе, они закрывают верхнюю камеру, снова включая верхний резервуар 40, среднюю коническую секцию 42 и капиллярную трубку 45. Как показано, средняя коническая секция 42 соединяет верхний резервуар 40 более широкого внутреннего диаметра и капиллярную трубку 45 меньшего диаметра. Нижний корпус 34 дополнительно включает структуру, например, выступающее ребро 36, образованное сверху нижнего корпуса 34, которое может быть вставлено (например, зафиксировано защелкой или прикреплено) в соответствующее гнездо 38 в дне нижнего корпуса 32. Нижний корпус 34 устройства 20 может дополнительно содержать тонкое оптическое окно 26, через которое можно осуществлять исследование. Как описано выше, оптическое окно 26 включает секцию устройства, которая состоит из материала, являющегося прозрачным для света, и посредством которого можно осуществлять исследование. В других формах осуществления устройство может быть полностью изготовлено из материала, который является прозрачным для света, позволяя посредством этого проводить исследование. Как описано выше, контейнер сконструирован таким образом, что разделенные, изолированные или осажденные микроорганизмы можно легко выделить из контейнера после разделения, либо вручную, либо автоматизированным способом (так чтобы лаборанты не подвергались воздействию содержимого контейнера). Например, нижняя секция 24 может быть отъемной после стадии разделения, посредством этого давая доступ пользователю к разделенным или осажденным микроорганизмам, которые будут содержаться в нижней части 46 капиллярной трубки 45 нижней секции 24.
В некоторых формах осуществления сепаратор 20 данной формы осуществления может быть предварительно загружен плотностным буфером 43 (показано, например, на фиг.6-7), чтобы облегчить разделение, изоляцию или осаждение микроорганизмов. В другой форме осуществления плотностный буфер может быть добавлен в сепаратор 20 непосредственно перед нанесением образца, который нужно подвергать стадии разделения, описанной в данной заявке. Еще в одной другой форме осуществления сепаратор 20 может быть предварительно загружен плотностным буфером 43 и раствором для лизиса (не показано), чтобы облегчить лизис образца и разделение, изоляцию или осаждение микроорганизмов.
Другая форма осуществления нижней секции сепаратора показана на фиг.7. Нижняя секция 48 может быть подвижно прикреплена или неподвижно прикреплена к верхней секции 22 с образованием сепаратора 39 в соответствии с данным изобретением. Верхняя секция 22 и нижняя секция 47 включают верхний корпус 32 и нижний корпус 49, соответственно, которые определяют внутреннюю камеру. Внутренняя камера включает верхний резервуар (не показано), среднюю коническую секцию 42 и капиллярную трубку 45. Как показано, нижний корпус 34 дополнительно содержит наружные стенки, которые имеют наклон вовнутрь 48, что приводит в результате к тонким боковым стенкам на противоположных сторонах дна внутренней капиллярной трубки 45. Эти тонкие боковые стенки дают возможность исследования разделенного, изолированного или осажденного микроорганизма 50 через стенку сепаратора.
Еще одна другая форма осуществления сепаратора 60 показана на фиг.9-10. Ссылаясь на эти фигуры, сепаратор 60 состоит из корпуса 62, который определяет внутренний резервуар 80, среднюю коническую секцию 82 и нижнюю капиллярную трубку 84. Средняя коническая секция 82 соединяет верхний резервуар 80 большего диаметра с нижней капиллярной трубкой 84. Верхний резервуар 80 имеет доступ через съемную крышку или колпачок 72, который можно навинчивать или завинчивать на резьбу 66, созданную на верхней наружной стенке корпуса 62. В соответствии с данной формой осуществления нижняя часть корпуса 62 содержит четыре закрепляющих крыла 68, используемых для обеспечения устойчивости сепаратора 60 при вертикальном стоянии, например, на столе. В другой форме осуществления четыре выемки на дне крыльев 68 создают углубленную область для точного соединения оптоволоконного кабеля. Центрирование возбуждающего пучка таким путем приводит в результате к улучшенной воспроизводимости флуоресценции и сниженной контаминации сигнала испускания случайно рассеянным светом. Сепаратор 60 дополнительно содержит оптическое окно 70, образованное в корпусе 62 на дне капиллярной трубки 84. Оптическое окно 70 включает малую секцию уменьшенной толщины на корпусе 62, через которую можно исследовать разделенный, изолированный или осажденный микроорганизм. Как описано в данной заявке, оптическое окно 70 может быть изготовлено из оптически прозрачного материала.
В некоторых формах осуществления сепаратор 60 данной формы осуществления может быть предварительно загружен плотностным буфером 85 (как показано, например, на фиг.10), чтобы облегчить разделение, изоляцию или осаждение микроорганизмов. В другой форме осуществления плотностный буфер может быть добавлен в сепаратор 60 непосредственно перед нанесением образца, который нужно подвергать стадии разделения, описанной в данной заявке. Еще в одной другой форме осуществления сепаратор 60 может быть предварительно загружен плотностным буфером и раствором для лизиса, чтобы облегчить лизис образца и разделение, изоляцию или осаждение микроорганизмов.
На фиг.8 показана операция исследования концентрированного микробного агента 50 внутри сепаратора 60. В одной форме осуществления разделенные, изолированные или осажденные микроорганизмы можно исследовать, используя любые известные средства в данной области техники (представленные в данной заявке как средства исследования 58). Для примеров, как раскрыто в совместно поданной заявке на патент США, серийный №__, озаглавленной "Method for the Isolation and Identification of Microorganisms", поданной 30 октября 2009, стадию исследования можно осуществлять, используя собственную флуоресцентную спектроскопию, рамановскую спектроскопию или другой оптический метод.
Хотя в вышеописанной форме осуществления концентрированный микробный агент исследуют, когда он еще находится внутри сепаратора, также рассматривают, что разделенный, изолированный или осажденный образец микроорганизма может быть извлечен из сепаратора и исследован, например, с использованием масс-спектрометрии, как раскрыто в совместно поданной заявке на патент США, серийный №__, озаглавленной "Method for Separation, Characterization and/or Identification of Microorganisms using Mass Spectrometry", поданной 30 октября 2009.
Как отмечено в данной заявке выше, стадию разделения, изоляции или осаждения можно осуществлять, чтобы разделить микроорганизмы от других компонентов образца (например, не микроорганизмов или их компонентов) и концентрировать микроорганизмы в разделенном, изолированном или осажденном образце, который можно исследовать в целях идентификации и характеристики. Стадия разделения или осаждения не обязательно должна быть полной, то есть, нет необходимости, чтобы произошло 100% разделение. Необходимо только, чтобы разделение микроорганизмов от других компонентов образца было достаточным, чтобы дать возможность исследования микроорганизмов без существенной интерференции от других компонентов. Например, разделение может привести в результате к осадку микроорганизмов, который является чистым по меньшей мере примерно на 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% или выше.
В одной форме осуществления, как описано более полно в заявках на патент США, принадлежащих одному и тому же правообладателю, обсуждаемых в данной заявке, разделение осуществляют посредством стадии центрифугирования, на которой тестируемый образец (например, лизированный образец) помещают сверху на плотностный буфер в разделительном контейнере, и контейнер центрифугируют в условиях, которые дает возможность изолировать микроорганизмы (например, микроорганизмы могут образовать осадок на дне и/или на стенках контейнера). В соответствии с данной формой осуществления другие компоненты образца (например, не микроорганизмы или их компоненты, которые могут присутствовать в среде образца) остаются сверху на плотностном буфере или внутри верхней части плотностного буфера. Данная стадия разделения изолирует микроорганизмы от материалов в образце, таких как среда, клеточный детрит и/или другие компоненты, которые могли бы интерферировать при исследовании микроорганизмов (например, за счет собственной флуоресценции). В одной форме осуществления плотностный буфер также служит для разделения живых микроорганизмов и мертвых микроорганизмов (которые не проходят через плотностный буфер). В другой форме осуществления плотностный буфер не содержит плотностного градиента ни до, ни после центрифугирования. Иными словами, разделительный контейнер не центрифугируют в течение достаточного количества времени и/или с достаточным ускорением для материала, образующего плотностный буфер, чтобы создать плотностной градиент.
Плотность буфера выбрана таким образом, чтобы микроорганизмы в образце проходили через этот буфер, тогда как другие компоненты образца (например, культуральная среда гемокультуры, клеточный детрит) оставались сверху на плотностном буфере или не проходили весь путь через плотностный буфер. Плотностный буфер может быть также выбран таким образом, чтобы разделить живые микроорганизмы (которые проходят через градиент) и мертвые микроорганизмы (которые не проходят через буфер). Подходящие плотности будут зависеть от материала, используемого в плотностном буфере, и от образца, подлежащего разделению. В одной форме осуществления плотность буфера находится в интервале от примерно 1,025 до примерно 1,120 г/мл, например, от примерно 1,030 до примерно 1,070 г/мл, от примерно 1,040 до примерно 1,060 г/мл или в любом интервале от примерно 1,025 до примерно 1,120 г/мл. В другой форме осуществления плотность буфера составляет примерно 1,025, 1,030, 1,035, 1,040, 1,045, 1,050, 1,055, 1,060, 1,065, 1,070, 1,075, 1,080, 1,085, 1,090, 1,095, 1,100, 1,105, 1,110, 1,115 или 1,120 г/мл.
Материал для плотностного буфера может представлять собой любой материал, который имеет соответствующий диапазон плотности для способов по данному изобретению. В одной форме осуществления этот материал представляет собой коллоидный кремнезем. Коллоидный кремнезем может быть без покрытия (например, Ludox (W.R.Grace, CT)) или с покрытием, например, силаном (например, PureSperm (Nidacon Int'l, Швеция) или Isolate (Irvine Scientific, Santa Ana, CA)) или поливинилпирролидоном (например, Percoll, Percoll Plus (Sigma-Aldrich, St. Louis, МО)). В одной форме осуществления выбран коллоидный кремнезем, проявляющий наименьшую интерференцию при спектроскопическом исследовании, например, материал с самой низкой собственной флуоресценцией. Коллоидный кремнезем может быть разведен в любой подходящей среде с образованием соответствующей плотности, например, в сбалансированных солевых растворах, в физиологическом растворе и/или в 0,25 М сахарозе. Соответствующие плотности могут быть получены с коллоидным кремнеземом при концентрации от примерно 15% до примерно 80% об/об, например, от примерно 20% до примерно 65% об./об. Другим подходящим материалом для плотностных буферов является йодированный контрастный агент, например, йогексол (Omnipaque™, NycoPrep™ или Nycodenz) и йодиксанол (Visipaque™ или OptiPrep™). Соответствующие плотности могут быть получены с йогексолом или йодиксанолом при концентрации от примерно 10% до примерно 25% мас./об., например, от примерно 14% до примерно 18% мас./об., для образцов гемокультуры. Сахарозу можно использовать в качестве плотностного буфера при концентрации от примерно 10% до примерно 30% мас./об., например, от примерно 15% до примерно 20% мас./об., для образцов гемокультуры. Другие подходящие материалы, которые можно использовать для получения плотностного буфера, включают масла низкой вязкости, высокой плотности, такие как иммерсионное масло для микроскопа (например, Type DF; Cargille Labs, Нью-Йорк), минеральное масло (например, Drakeol5, Draketex 50, Peneteck; Penreco Co., Пенсильвания), силиконовое масло (полидиметилсилоксан), фторсиликоновое масло, силиконовый гель, метризоат-Фиколл (LymphoPrep™), например, при концентрации от примерно 75% до примерно 100% для образцов гемокультуры, диатризоат-декстран (PolymorphoPrep™), например, при концентрации от примерно 25% до примерно 50% для образцов гемокультуры, карбоксиметилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, полиэтиленоксид (высокой молекулярной массы), Pluronic F127, Pluronic F68, смеси соединений Pluronic, полиакриловую кислоту, сшитый поливиниловый спирт, сшитый поливинилпирролидин, сополимер ПЭГ метилового эфира и метакрилата, пектин, агарозу, ксантан, геллан, Phytagel, сорбит, Фиколл (например, Фиколл 400 при концентрации от примерно 10% до примерно 15% для образцов гемокультуры), глицерин, декстран (например, при концентрации от примерно 10% до примерно 15% для образцов гемокультуры), гликоген, хлорид цезия (например, при концентрации от примерно 15% до примерно 25% для образцов гемокультуры), перфторуглеродные жидкости (например, перфтор-н-октан), гидрофторуглеродные жидкости (например, Vertrel XF) и тому подобное, которые хорошо известны в данной области техники. В одной форме осуществления плотностный буфер выбран из одного или более чем одного из коллоидного кремнезема, йодиксанола, йогексола, хлорида цезия, метризоат-Фиколла, диатризоат-декстрана, сахарозы, Фиколла 400 и/или декстрана в любой комбинации. Плотностный буфер может также состоять из комбинации материалов, например комбинации коллоидного кремнезема и масла. Некоторые комбинации вышеописанных соединений могут быть полезны для стадий разделения и считывания по настоящему изобретению, например комбинации соединений с различными свойствами гашения УФ света, такие как хлорид цезия и йогексол.
Объем/высота плотностного буфера должна быть достаточна, чтобы достичь разделения микроорганизмов от других компонентов образца. Объем будет зависеть от размера и формы разделительного контейнера. Как правило, можно использовать объем от примерно 0,1 до примерно 5 мл, например, от примерно 0,2 до примерно 1 мл, например, от примерно 0,2 мл до примерно 0,5 мл. Если разделение осуществляют в микромасштабе, объем плотностного буфера может составлять от примерно 1 мкл до примерно 100 мкл, например, от примерно 5 мкл до примерно 50 мкл. Объем образца, нанесенного или наслоенного сверху на плотностный буфер, должен быть достаточным, чтобы обеспечить достаточное количество микроорганизмов для получения осадка, пригодного для исследования. Обычно можно использовать любой объем, который входит в контейнер. Например, можно использовать объем от примерно 0,1 мл до примерно 5 мл, например, от примерно 0,2 мл до примерно 1 мл, например, от примерно 0,2 мл до примерно 0,5 мл. Если разделение осуществляют в микромасштабе, объем образца может составлять от примерно 1 мкл до примерно 100 мкл, например, от примерно 5 мкл до примерно 50 мкл. Доступное пространство в контейнере для образца будет зависеть от размера и формы контейнера. В некоторых формах осуществления сверху на плотностный буфер можно поместить промежуточный слой (жидкости или твердого вещества) перед тем, как наносить или наслаивать образец сверху, чтобы предотвратить какое-либо смешивание плотностного буфера и образца. В одной форме осуществления промежуточный слой может представлять собой полиэтиленовые гранулы. В другой форме осуществления маленький пузырек воздуха можно расположить между плотностным буфером и образцом, чтобы предотвратить смешивание. В следующей форме осуществления плотностный буфер можно наслаивать сверху на материал высокой плотности (например, перфторуглеродную жидкость), так чтобы микроорганизмы проходили через плотностный буфер во время разделения и собирались на границе между плотностным буфером и материалом высокой плотности.
В одной форме осуществления изобретения разделительный контейнер центрифугируют в колебательном роторе, так что микроорганизмы образуют осадок непосредственно на дне контейнера. Контейнер центрифугируют при достаточном ускорении и в течение достаточного времени, чтобы разделить микроорганизмы (например, образовавшийся осадок) от других компонентов образца. Ускорение центрифугирования может составлять от примерно 1000×g до примерно 20000×g, например, от примерно 2500×g до примерно 15000×g, например, от примерно 7500×g до примерно 12500×g и т.д. Время центрифугирования может составлять от примерно 30 секунд до примерно 30 минут, например, от примерно 1 минуты до примерно 15 минут, например, от примерно 1 минуты до примерно 5 минут. Центрифугирование можно осуществлять при температуре от примерно 2°С до примерно 45°С, например, от примерно 15°С до примерно 40°С, например, от примерно 20°С до примерно 30°С. В одной форме осуществления разделительный контейнер содержит крышку, и крышку накладывают на контейнер с образованием герметичного закрытия перед центрифугированием. Наличие крышки уменьшает риск в результате обращения с микроорганизмами, которые являются или могут быть инфекционными и/или опасными, а также риск контаминации образца. Одним из преимуществ способов по изобретению является способность осуществлять одну или более чем одну из стадий этих способов (например, лизис, разделение, исследование и/или идентификацию) с микроорганизмами в герметичном контейнере (например, в герметично закрытом контейнере). Настоящие способы, включающие использование автоматизированных систем, позволяют избежать риска для здоровья и безопасности, связанного с обращением с высоко вирулентными микроорганизмами, который встречается при выделении микроорганизмов из образцов для непосредственного тестирования. В одной форме осуществления контейнер не центрифугируют в течение достаточного времени и/или не подвергают достаточному ускорению, чтобы градиент плотности образовался внутри плотностного буфера. Настоящее изобретение не включает ультрацентрифугирование образцов, например центрифугирование при ускорениях выше, чем примерно 100000×g. Кроме того, настоящее изобретение не включает изопикническую (равновесную) седиментацию или бэндинг.
Как только разделенный, изолированный или осажденный образец микроорганизма получен, можно осуществлять последующую стадию исследования, чтобы получить измерения, полезные для характеристики и/или идентификации микроорганизма. Полезные средства исследования известны в данной области техники. Дополнительные средства исследования описаны в заявках на патент США, принадлежащих одному и тому же правообладателю, обсуждаемых в данной заявке выше.
ПРИМЕРЫ
ПРИМЕР 1. Устройства и способы для идентификации in situ очищенного осадка микроорганизмов
Чтобы исследовать потенциал быстрого разделения и идентификации in situ микроорганизмов в сепараторе, несколько устройств было разработано и отлито из пластмассы, пропускающей УФ свет. Эти устройства имели несколько общих признаков, включая крышку, резервуар для образца и коническую нижнюю область оптического качества для обеспечения спектроскопического исследования седиментированного осадка микроорганизмов снизу и/или на стенке, и признаков, которые облегчают соединение устройства со спектрофотометром. Эти устройства также должны быть способны выдерживать относительно высокие g-силы во время стадии разделения. Было сконструировано несколько итераций этой пробирки, чтобы улучшить выделение микроорганизмов, воспроизводимость флуоресценции, а также снизить контаминацию случайно рассеиваемым светом. Пробирка была также сконструирована как герметично закрытая.
Оптическое исследование седиментированного осадка микроорганизмов было достигнуто либо путем вставки сепаратора в изготовленный по заказу адаптер, помещенный внутри отделения для образца спектрофотометра, либо путем прямого соединения сепаратора с разветвленным шестижильным 300-400-микронным оптоволоконным кабелем (Ocean Optics, Dunedin, FL), присоединенным к спектрофотометру (Fluorolog 3 (HORIBA Jobin Yvon Inc., New Jersey)). Трехзеркальный оптоволоконный адаптер был сконструирован так, чтобы обеспечить использование обеих систем детекторов (ФЭУ и ПЗС). Спектры полной матрицы возбуждения-испускания (ЕЕМ) снимали на каждом осадке микроорганизмов (диапазон сканирования: возбуждение 260-800 нм; испускание 260-1100 нм; инкременты 5 нм).
Исследования воспроизводимости и надежности калибровки проводили на одноразовой конфигурации устройства и оптоволоконного кабеля, используя растворы очищенного триптофана и рибофлавина. Целевые CV<2,5% были получены для обоих флуорофоров, что подтверждает качество одноразового устройства и исследовательскую платформу.
Доказано, что эти устройства полезны для разделения и исследования микроорганизмов из культуральной среды. На фиг.12 показан пример устройства после разделения путем центрифугирования лизированного образца гемокультуры, содержащего S.aureus, с использованием плотностного буфера. На фотографии четко виден лизированный образец, плотностный буфер и осадок микроорганизмов в соответствии с настоящим изобретением.