СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕСКЛЕТОЧНОГО МАТРИКСА ДЕРМЫ ДЛЯ ПОСЛЕДУЮЩЕЙ РЕКОНСТРУКЦИИ ОБШИРНЫХ ДЕФЕКТОВ МЯГКИХ ТКАНЕЙ
METHOD FOR PRODUCTION OF CELL-FREE MATRIX OF DERMA FOR FURTHER RECONSTRUCTION OF EXTENSIVE DEFECTS OF SOFT TISSUES

Изобретение относится к области медицины, в частности, к биомедицине, а именно к органной трансплантации, тканевой инженерии и может быть использовано на лабораторных животных в научных учреждениях.
Актуальность предлагаемого способа определяется необходимостью хирургической реконструкции поврежденных участков с использованием аутологичных лоскутов мягких тканей при полученной травме, вследствие обширных термических, химических и радиационных ожогов, хирургических вмешательств (например, при резекции опухолей), повторного донорства. Однако, подобная реконструкция обширных дефектов мягких тканей хоть и эффективна, но имеет существенные ограничения, связанные с недостаточным количеством аутологичных лоскутов мягких тканей, пригодных для реконструкции, с морбидностью донорского участка. Морбидность донорского участка может быть вызвана травмами, множественными вмешательствами, обширной резекцией.
Для решения проблем аутологичной трансплантации лоскутов мягких тканей существуют подходы регенеративной медицины и тканевой инженерии.
К первой группе можно отнести способы замещения обширных дефектов мягких тканей с использованием композитных васкуализированных аллотрансплантатов, что является рутинной процедурой в современной клинической дерматопластике и реконструктивной хирургии (J.T. Shores, G. Brandacher, W.P. Lee, Hand and upper extremity transplantation: an update of outcomes in the worldwide experience, Plast. Reconstr. Surg. 135, 2015); так, например, известны более 100 случаев успешной аллотрансплантации мягких тканей с замещением дефектов в самых различных участках, в частности, в лицевой области (М. Kueckelhaus, S. Fischer, М. Seyda, Е.М. Bueno, М.А. Aycart, М. Alhefzi, A. ElKhal, В. Pomahac, S.G. Tullius, Vascularized composite allotransplantation: current standards and novel approaches to prevent acute rejection and chronic allograft deterioration, Transpl. Int. (2015)). Однако, нельзя не отметить, что выживание композитных аллотрансплантатов без развития реакции отторжения определяется характером иммунодепрессивной медикации, которая несет риск развития неоплазм, оппортунистических инфекций и конечной органной токсичности (М. Siemionow, Т. Ortak, D. Izycki, R. Oke, В. Cunningham, R. Prajapati, J.E. Zins, Induction of tolerance in composite-tissue allografts, Transplantation 74 (2002). Кроме того, в частном случае, получение функционального васкуализированного кожного аллотрансплантата с проводящей сосудистой ножкой крайне сложная задача с хирургической точки зрения, и не имеет практического применения в клинической практике.
Ко второй группе условно можно отнести способы замещения обширных дефектов кожи/мягких тканей посредством бесклеточных матриксов синтетического/полусинтетического происхождения. Большинство из них - это коммерчески доступные запатентованные клинические изделия, либо одобренные Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (Food and Drug Administration - FDA), либо проходящие I или II фазу клинических испытаний. Так, например, GraftJacket (продукт компании Wright Medical Technology), представляет собой донорский лоскут кожи, с которого удаляют эпидермис и клеточные компоненты, с сохранением коллагена, эластина, протеогликанов, который подвергают кросс - сшиванию и криоконсервируют (Turner, Badylak, 2015). Другим более известным продуктом является Integra™ - синтетический заменитель кожного лоскута состоящий из поперечно - сшитых волокон бычьего коллагена и хондроитина6 - сульфата с инкорпорированной силиконовой мембраной, одобренный FDA в апреле 2001 г. и предназначенный для лечения термических ожогов (L.E. Dickinson, Front Physiol. 2016; 7: 341.). Также одобренный FDA, Promogran™ - это коллаген - содержащее покрытие для ран, в композицию которого включены замороженный - высушенный коллаген (55%) и оксигенированная целлюлоза; отмечается, что данное изделие абсорбирует раневой экссудат с формированием биодеградируемого геля (https://www.accessdata.fda.gov/cdrh_docs/pdf6/k061060.pdf). Очевидно, что недостатком вышеприведенных биомедицинских изделий является их структура, которая обусловливает регенерацию главным образом поверхностных ран; кроме того, в частности для Integra общеизвестно, что силиконовая мембрана в составе матрикса отслаивается и таким образом потенциально может возникнуть необходимость в дополнительном покрытии для регенерации эпидермиса. В целом данный вид биомедицинских изделий предназначен для лечения косметических ран и дефектов, в случае обширного дефекта может быть применен лишь в конечной стадии лечения. Сложность в реализации данных биомедицинских изделий связана с риском наличия трансмиссивных вирусных заболеваний при использовании компонентов внеклеточного матрикса (ВКМ) животного происхождения в качестве исходных материалов, именно поэтому строгость их регуляции значительно выше по сравнению с матриксами, полученными способом децеллюляризации. В этом заключается одно из преимуществ метода децеллюляризации, который будет рассмотрен ниже.
К третьей группе также условно относится реконструкция дефектов мягких тканей посредством матриксов, полученных в результате детергентно-ферментативной децеллюляризации, т.е. процесса удаления ядерных элементов, цитозольных и мембранных белков с помощью комбинации осмотического лизиса, сочетания ионных/неионных детергентов (пермеабилизация мембран, денатурация белков, разрушение хроматина и ДНК), ферментативного расщепления (трипсин - EDTA, неспецифическая эндонуклеаза бензоаза, ДНКаза I из бычьей поджелудочной железы, папаин, и т.д.), также могут использоваться токсины, блокирующие отдельные фазы клеточного цикла (латрункулин В), циклов размораживания - замораживания и т.д.
Одобренный FDA и уже зарекомендовавший в зарубежной клинической практике биомедицинский продукт DermACELL (LifeNet Health, US Patent 6,743,574) является человеческим кожным аллотрансплантатом полученным по технологии MATRACELL, оригинально разработанной для сердечно - сосудистых аллотрансплантатов.
-6
Известен способ получения матрикса дермы человека по технологии MATRACELL, использованный в статье M.A. Moore с соавт. «Decellularization of human dermis using non-denaturing anionic detergent and endonuclease: a review» (Cell Tissue Bank. 2015; 16(2): 249-259.) и заключающийся в том, что: 1) обрабатываемый кожный лоскут (дерма) выдерживается в растворе анионного детергента N - лауроил саркозината, (NLS), рекомбинантной неспецифичной нуклеазы бензоазы и в смеси антибиотиков (с добавлением полимиксина В, ванкомицина и линкомицина); 2) лоскут дермы тщательно отмывается от децелляризирующих агентов, что достигается за счет циркуляции промывочной жидкости через сорбент - анионобменник и второй гидрофобный сорбент, тем самым циркулирующий перфузат постоянно обновляется; 3) затем дермальный лоскут обрабатывается многоатомном спирте, вытесняющем воду, например, в глицерине (US Patents 6,293,970(2001); 6,544,289(2003); 6,569,200(2003); 7,063,726 (2006)), до конечной упаковки и 4) полученный бесклеточный матрикс дермы проходит терминальную стерилизацию при низкой температуре, облучение также проводят при низкой дозе гамма - излучения. Отмечается, что приведенная в данном способе терминальная стерилизация приводит к уровню стерильности равному 1×10, что соответствует ожидаемому значению для биомедицинского изделия и инактивирует вирусы. Результаты гистологических исследований показали как полное отсутствие ядер клеток на всей глубине дермы, так и отсутствие МНС - I позитивных клеток. С использованием набора для определения содержания двухцепочечной ДНК Quant-iT™ PicoGreen dsDNA было установлено, что редукция содержания ДНК в образце после децеллюляризации составила более 97%. Сила удерживания шва (сила, при которой шовный материал может разорвать образец) кожного матрикса полученного в данном способе была достоверно выше (около 130Н) чем у GraftJacket (кожный аллотрансплантат, обрабатываемый сшивающими агентами и криоконсервированный).
Таким образом, несомненными достоинствами данного способа являются: 1 Эффективное, минимизированное расходование реагентов; 2) соответствие получаемого матрикса основным критериям биосовместимости; 3) фактически полное удаление остаточного детергента за счет постоянного обновления промывочного раствора. К недостаткам данного метода относится в первую очередь то, что технология MATRACELL изначально разрабатывалась для сердечно-сосудистых аллографтов, т.е. для тонких тканей, поэтому применительно к лечению глубоких дефектов мягких тканей может дать неудовлетворительные результаты. В способе отсутствуют этапы экстракции полярных и неполярных липидов, дегидратации - регидратации. Не указывается в способе, какой тип низкотемпературной обработки предшествовал терминальной стерилизации матрикса (криоконсервация/гипотермическая консервация).
Известен также способ получения бесклеточного дермального матрикса, который заключается в том, что дерму толщиной 0,2-0,3 мм помещают в 30%-ный раствор карбамида с добавлением хлористого кальция до концентрации 0,5%. Соотношение объемов дермы и раствора карбамида от 1:3. Дерму в растворе карбамида выдерживают 24 часа при +4°С. После этого дермальный матрикс переносят в 20%-ный раствор карбамида и выдерживают в нем 1 час при комнатной температуре при периодическом встряхивании. Полученный бесклеточный дермальный матрикс может быть сразу использован для пересадки или помещен на консервацию с помощью любого метода, применяемого для сохранения кожи для последующей пересадки (Денисов В.М. (RU), Анфимов П.Е. (RU), Ряскова Е.А. ГУ "Нижегородский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии", №2240809).
К недостаткам способа относится потенциально высокая цитотоксичность, поскольку дерма не отмывалась от карбамида, кроме того в способе не приведен анализ качества полученного матрикса; кроме того, используемая толщина матрикса (200-300 мкм) позволяет использовать его лишь для устранения косметических дефектов на конечной стадии регенерации трансплантированного лоскута. К преимуществам способа можно отнести его простоту.
Известен многоэтапный способ изготовления дермального матрикса, позволяющий добиться отслоения эпидермиса (Хубутия М.Ш. (RU), Андреев Ю.В. (RU), Боровкова Н.В. (RU). «Способ изготовления дермального матрикса», и др. ГБУЗ НИИ скорой помощи им. Н.В. Склифосовского. Патент РФ №2524619) и состоящий из следующих этапов:
(1) Забор кожи человека, посредством использования дерматома, от донора-трупа, толщиной до 1 мм. Операцию по забору кожи проводят в операционной дерматомом по стандартной методике с соблюдением правил асептики и антисептики;
(2) Сразу после заготовки биологический материал помещают в стерильную емкость, содержащую водный раствор антибиотика широкого спектра действия. С сохранением стерильности емкость герметично закрывают. Биоматериал хранят при -40°С до получения результатов патологоанатомического исследования донора, исследования биологической безопасности тканей донора.
(3) Лоскут кожи, с сохранением стерильности, упаковывают в индивидуальный стерильный пакет для криоконсервирования объемом 500 или 1000 мл. Объем криопакета выбирается в зависимости от размера биоматериала. Криопакет запаивают и ваакуумизируют.
(4) Кожу замораживают до -96°С в течение 15 минут, размораживают до +37°С в течение 5 минут. Цикл замораживания-размораживания повторяют троекратно.
(5) В криопакет объемом 500 мл вносят 250 мл и объемом 1000 мл вносят 400 мл стерильного 1,8 М раствора NaCl и помещают при комнатной температуре на орбитальный перемешиватель со скоростью вращения 250 об/мин до отделения эпидермиса. Контроль проводят каждые 2 часа.
(6) После отслоения эпидермиса дерму с сохранением стерильности перемещают в стерильную емкость объемом 400 мл (не более 2 лоскутов в одну емкость). Емкость стерильно и герметично закрывают.
(7) В емкость с дермой вносят 250-300 мл 0,2% раствора SDS. Емкость стерильно и герметично закрывают, помещают при комнатной температуре на орбитальный перемешиватель со скоростью вращения 250 об/мин в 1 час. В завершении этапа децеллюляризации раствор SDS удаляют из емкости.
(8) В емкость с биоматериалом с сохранением стерильности вносят 250 мл стерильного физиологического раствора и помещают при комнатной температуре на орбитальный перемешиватель со скоростью вращения 250 об/мин. Каждые 10 минут проводят смену раствора в полном объеме в течение 1 часа.
(9) После 6 смены раствора емкость с биоматериалом заполняют стерильным физиологическим раствором и помещают при комнатной температуре на орбитальный перемешиватель со скоростью вращения 220 об/мин раствором на 12 часов
(10) Из готовой партии ДМ берут, для проведения контроля качества, 3 образца размером 1*1 см и 1 образец длиной не менее 6 см и шириной не менее 1 см. Контроль проводят по следующим параметрам: технический, бактериологический, морфологический, биосовместимость.
(11) Дермальный матрикс, с сохранением стерильности, упаковывают в индивидуальный стерильный криопакет объемом 500 или 1000 мл. Криопакет выбирается в зависимости от размера матрикса. Криопакет запаивают и ваакуумизируют, маркируют и указывают: код донора-трупа, дату изготовления, срок годности, геометрические размеры, заключение о результатах контроля качества дермального матрикса. Упакованные дермальные матриксы хранят при температуре -80°С° в течение срока годности (1 год).
К недостаткам данного способа можно отнести то обстоятельство, что при циклическом замораживании - размораживании авторы помещают дерму в криопакет, при этом замораживание происходит в отсутствии криопротекторов. Использование внутриклеточных криопротекторов для децеллюляризации не является обязательным, однако, в отсутствии экстрацеллюлярных криопротекторов из-за формирования внеклеточных кристаллов льда происходит не только гибель клеток, но и разрушение внеклеточного матрикса, его разволокнение вплоть до удаления отдельных слоев, гомогенизация. Кроме того, для участка дермы толщиной до 1 мм упоминаемые в способе объемы растворов избыточны. Данный способ теоретически можно применить для децеллюляризации композитного кожного лоскута, изъятого с комплексом прилегающих тканей: жировой ткани, прилегающих сосудов, мыщц и нервов, однако он будет недостаточно эффективен, поскольку этапы экстракции, расщепления жира и последовательной регидратации - дегидртации отсутствуют. К достоинствам данного способа следует отнести то, что он позволяет добиться отслаивания в случае обработки композитных, сложных тканей, но применительно к тонким тканям может вызвать повреждения и гомогенизацию волокон внеклеточного матрикса. Кроме того, в способе хорошо проработаны процедуры маркировки и контроля кожного лоскута.
К четвертой группе методов реконструкции обширных дефектов можно отнести применение для этой цели децеллюляризированных дермальных матриксов, заселенных аутологичными кератиноцитами/фибробластами или аллогенными мезенхимальных стромальных клеток. Примером коммерческой реализации биомедицинских клеточных продуктов подобного типа может являться Apligraf - матрикс из коллагена I типа, заселенный человеческими неонатальными фибробластами и кератиноцитами. Отмечается что, несмотря на то, что фибробласты и кератиноциты в составе Apligraf утрачивают жизнеспособность после 6 недель при трансплантации (Hu et al., 2006), тем не менее они крайне важны для стимуляции пролиферации и дифференцировки вследствие секреции ими ростовых факторов (Falanga et al., 2002). Apligraf был первым аллогенным биомедицинским клеточным продуктом, одобренным FDA в 1998 году и разрешенным для лечения венозных трофических язв.
Известен способ получения комбинированного трансплантата дермального матрикса (патент на изобретение №2526813. Хубутия М.Ш., Боровкова Н.В. (RU), Филиппов О.П. (RU) и др. Комбинированный трансплантат дермального матрикса с мезенхимальными мультипотентными стромальными клетками, способ его получения и способ лечения ран с его использованием. ГБУЗ НИИ скорой помощи имени Н.В. Склифосовского, 2014.) Этот способ состоит из трех этапов, каждый из которых заключается в следующем:
- (1) получение дермального матрикса, который изготавливают из расщепленной кожи человека, заготовленной от донора-трупа, толщиной до 1 мм. Забор кожного лоскута производится в операционной при помощи дискового дерматома с соблюдением правил асептики и антисептики.
Изготовление дермального матрикса (ДМ) разделено на 3 этапа: разделение дермы и эпидермиса, девитализация дермы, обеспечение биосовместимости матрикса.
- (2) получение аутологичных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга.
+
+
-
-
2
У пациента под местной анестезией или наркозом в условиях операционной с соблюдением правил асептики и антисептики из крыла подвздошной кости забирают костный мозг объемом 20-40 мл. На градиенте плотности Лимфолит р=1.077 выделяют ядросодержащие клетки. Клетки помещают в культуральные флаконы для получения пластикадгезивных клеток. Прикрепившиеся к пластику клетки культивируют 3-4 пассажа в среде ДМЕМ с добавлением 10% бычьей фетальной сыворотки, для получения культуры мезенхимальных стромальных клеток. После третьего пассажа в суспензии ММСК определяют фенотип и количество поврежденных клеток. Клеточный материал пригоден для изготовления комбинированного трансплантата в том случае, если он биобезопасен, содержит 80-95% неповрежденных клеток и более 80% клеток с фенотипом CD105CD90CD45CD34. При подтверждении культуры принадлежности к мезенхимальным стромальным клеткам, из нее готовят суспензию в культуральной среде ДМЕМ, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки с концентрацией клеток не менее 1 млн/мл. Для применения используют 1 млн мезенхимальных стромальных клеток на 5 см ДМ.
- (3) создание комбинированного трансплантата ДМ с мезенхимальных стромальных клеток.
2
2
2
В условиях культурального блока с обеспечением стерильности трансплантат ДМ площадью 25-30 см помещают в стерильную чашку Петри, соответствующего размера. В чашку Петри на ДМ пипеткой наносят суспензию мезенхимальных стромальных клеток в концентрации 1 млн/мл, из расчета 1 млн мезенхимальных стромальных клеток на 5 см ДМ (например, 5 мл суспензии, содержащей не менее 5-6 млн мезенхимальных стромальных клеток). Для колонизации ДМ мезенхимальных стромальных клеток трансплантат помещают в CO2-инкубатор при температуре 37°С и 5% концентрации CO2 в воздухе на 24 часа. Клеточный компонент оценивают витальным окрашиванием флуоресцентным красителем. С сохранением стерильности на пипеткой наносят стерильный флуоресцентный краситель, окрашивающий живые клетки без их повреждения. С помощью флуоресцентного микроскопа подсчитывают количество прикрепившихся клеток, содержащий на своей поверхности 750-1500 тыс. клеток на 1 см.
К преимуществам данного способа следует отнести то, что в результате получается комбинированный кожный трансплантат, состоящий из аутологичного/аллогенного дермального матрикса и аутологичных мезенхимальных стромальных клеток, который при имплантации потенциально будет способствовать усиленной васкуляризации и регенерации раны ввиду секреции мезенхимальных стромальных клеток ростовых факторов и цитокинов, в частности, IL-1β и IL-6 в то время как в результате децеллюляризации ростовые факторы не сохраняются. Альтернативная технология, при которой в результате двухфазного электроспининга смешиваются растворы биоразлагаемого полимера с ростовым фактором, также позволяет получить комбинированный трансплантат, однако ее доступность сильно ограничена и сам метод требует тщательного моделирования. Кроме того, к недостаткам данного способа можно отнести необходимость точного расчета площади матрикса, что не всегда представляется возможным, особенно в том случае если изымается участок дермы вместе с жировой клетчаткой. Следует также обратить внимание на то, что культивирование матрикса толщиной до 1 мм с целью колонизации в данном способе проводится всего 24 часа, что связано с тем, что культивирование проходит на двумерной поверхности, и в этих условиях насыщение объемного матрикса культуральной средой было бы ограничено его поверхностью, но не срединной частью. Именно поэтому при заселении матриксов с низким отношением поверхность/объем такой способ не используется.
2
Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому способу является способ получения получения бесклеточного матрикса дермы, описанный в статье Q. Zhang с соавт. «Decellularized skin/adipose tissue flap matrix for engineering vascularized composite soft tissue flaps» (Acta Biomaterialia Vol. 35, 2016, 166-184). Отличительные особенности способа - это: (1) использование перфузионной системы, представленной цифровым приводом - дозатором Masterflex L/S (Cole-Parmer, Vernon Hills, IL), (2) для создания децеллюляризированного матрикса изымали участки кожи крыс Fischer 344 возрастом от 8 до 10 недель, площадью 2*4 см из паховой области, вместе с прилежащей подкожной клетчаткой, нервами и проводящими сосудами - так, были выделены сообщающиеся с изъятым лоскутом наджелудочная и бедренная артерии, бедренный нерв, а также бедренная вена. Каннюлировали именно бедренную артерию ввиду ее большей доступности; каннюляцию проводили использованием периферического катетера 24G и затем орошали лоскут физиологическим раствором до полного отмывания от резидуальной крови; (3) для проведения детергентно-ферментативной децеллюляризации использовали многоэтапный лизис полярных и неполярных липидов, а также последовательную серию дегидратации - регидратации ткани:
- Кожные лоскуты замораживали при -80°С и размораживали при комнатной температуре 3 раза. Во всех лоскутах катетеризировали бедренную артерию, после чего с помощью перистальтических трубок и люэр-коннекторов катетер соединяли с цифровым приводом - дозатором MasterFlex L/S и перфузировали кожный лоскут в течение 24 часов стерильной водой со скоростью 2 мл/мин.
- Затем лоскуты перфузировали гипертоническими растворами с возрастающими концентрациями NaCl - 0,5 М в течение 4 часов и 1 М в течение 4 часов, с двукратной заменой раствора. Гипертонический раствор используется практически в любом протоколе децеллюляризации кожного лоскута, поскольку именно в условиях слущивания мембран клеток происходит отделение эпидермиса от собственно дермы.
- Лоскуты обрабатывали 0,25% р-ром трипсина - EDTA в течение 2 часов при 37°С, и после остановки лизиса, отмывали от остаточного трипсина дистиллированной водой в течение 1 часа;
- Матриксы выдерживался в 100% изопропаноле в течение ночи при непрерывном встряхивании;
- Затем лоскуты перфузировали 1% Triton X100 в течение 2 дней, с заменой раствора на свежий на каждые сутки, промывали в стерильной воде на протяжении двух дней (3 замены в день) и в PBS в течение 24 часов, все этапы промывания проводились с включенным приводом - дозатором.
- Полученные децеллюляризиованные матриксы дермы с подкожной клетчаткой и проводящими сосудами стерилизовали в 70% этаноле и еще раз промывали в PBS. Хранили матриксы при +4°С в PBS с добавлением 1% пенициллина - стрептомицина.
Впоследствии от полученных децеллюляризированных матриксов изымались срезы, которые после заливки в парафин обрабатывались с целью проведения гистологического и иммунногистохимического анализов. Препараты окрашивали гематоксилином - эозином, трихромом по Массону и 4,6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI). Готовые блоки окрашивали с использованием первичных антител на фактор рост эндотелия сосудов (VEGF), основного фактора роста фибробластов (bFGF), MHC-I и ламинина. Удаление клеток также подтверждали определением остаточного содержания ДНК в супернатантах срезов, расщепленных папаином при 60°С. Отмечается, что наблюдалась достоверное снижение количества остаточной ДНК в децеллюляризированной ткани, нормализованное на исходный сухой вес, по сравнению с нативными срезами - до 40 μg/mg в срезе децеллюляризированной дермы и около 50 μg/mg в жировой клетчатке. На изображениях, полученных с помощью SEM, было заметно отсутствие ядер как на срезах со стороны дермы, так и жирового депо, и была выражена трехмерная пористая структура матрикса (пористость составила 83,6±7,8%). Кроме того, наноразмерные волокна ВКМ хорошо сохранились после децеллюляризации, размер волокон - 302,3±90,4 нм).
4
2
5
6
5
На изображениях, полученных с помощью конфокальной микроскопии было заметно отсутствие ядер мертвых клеток после 1 и 7 дней культивирования человеческих стволовых клеток из стромально-сосудистой фракции (hADSCs) и эндотелиоцитов вены пупочного канатика (HUVECs) с плотностью посева 2,5*10/см (матрикс засевали следующим образом: в 200 μl среды суспендированные 2*10 HUVECs в артерию и венозную сосудистую ножку, а суспензию 1*10 hADSCs и 2*10 HUVECs в 1 мл среды инъецировали в 10 точек матрикса, 3 из которых находились в дерме, а 7 = в жировом депо) при двойном окрашивании витальным красителем кальцеином AM и гомодимером этидия -1.
К недостаткам данного способа можно отнести длительность самого процесса децеллюляризации и необходимость многократной смены растворов, невозможность экстраполяции способа в клиническую практику ввиду трудоемкости или невозможности изъятия участка дермы с сосудистой ножкой у человека.
Техническим результатом предлагаемого нами способа получения бесклеточного матрикса дермы человека является получение стерильного матрикса с сохранной структурой ВКМ, ядра в котором гистологически не обнаруживаются, имеющего в составе гликозаминогликаны, коллаген, характеризующегося отсутствием экспрессии МНС - 1 на поверхности, пригодного для ксенотрансплантации с целью дальнейшей реконструкции обширных дефектов мягких тканей. Полученный с помощью предложенного нами способа, но животного происхождения матрикс возможного использования для дальнейших этапов тканевой и клеточной инженерии, в частности, для заселения аутологичными фибробластами и кератиноцитами или аллогенными МСК из СВФ, для нанесения дополнительных адгезионных и стабилизирующих покрытий и/или модификации биоразлагаемыми полимерами (поскольку биомеханические свойства матрикса могут быть значительно изменены по сравнению с нативной дермой), а также для криоконсервации и терминальной стерилизации.
Указанный технический результат достигается тем, что используют перфузионный модуль, интегрируемый в биореактор EBERS ТЕВ 500, собранный из двух резервуаров различного объема, соединенных между собой с помощью трубок и люэр-фиттингов, при этом лоскут, помещенный в перфузионный модуль, предварительно три раза замороженный - размороженный в 70% изопропиловом спирте с добавлением 3% поливинилпирролидона (PVP), обрабатывают следующим образом:
(1) отмывают путем перфузии лоскута 250 мл PBS с добавлением антибиотиков - 0,25% стрептомицина сульфата, 0,25% амикацина сульфата и 0,25% цефтазидима, в течение суток;
(2) затем кожный лоскут помещают в емкость, заполненную 250 мл 0,5 М NaCl, и встряхивают на шейкере при комнатной температуре со скоростью 500-600 об/мин в течение 2 часов с целью отделения эпидермиса, заменяют раствор на свежий и снова встряхивают в течение 2 часов;
(3) встряхивают при комнатной температуре со скоростью 500-600 об/мин в 250 мл 1 М NaCl в течение 2 часов, заменяют раствор на свежий и снова встряхивают в течение 2 часов;
(4) встряхивают при комнатной температуре со скоростью 500-600 об/мин в 250 мл стерильной очищенной воды в течение 2 часов, заменяют раствор на свежий и снова встряхивают в течение 2 часов;
(5) далее помещают кожный лоскут в емкость с 50 мл 0,25% трипсином - ЭДТА, платформенный шекер размещают в рабочем пространстве биореактора EBERS ТЕВ 500 или инкубатора, имеющего в своей стенке резьбовой порт для дополнительных соединений, и встряхивают при 370С со скоростью 500-600 об/мин в течение 2 часов;
(6) затем лоскут помещают в емкость 250 мл очищенной стерильной водой и встряхивают при комнатной температуре со скоростью 500-600 об/мин в течение часа;
(7) далее заменяют стерильную воду на 100% изопропиловый спирт и встряхивают при комнатной температуре со скоростью 500-600 об/мин;
(8) затем помещают фиксированный лоскут в перфузионный модуль и проводят перфузию 250 мл свежего профильтрованного раствора 1% 4-(1,1,3,3-тетраметилбутил)фенил-полиэтиленгликоля (коммерческое название - TritonX100) и 0,8% деоксихолата натрия (NaDOC) в течение 45 часов, при этом по истечению 24 часов раствор заменяют на свежий и с целью отмывания от детергентов перфузионный модуль не разбирают, а наливают в осушенный резервуар для перфузата 200-250 мл стерильной воды с добавлением 0,3% азида натрия и 1% ампипиллина натрия, перфузию проводят в течение 48 часов с тремя заменами в течение каждых суток;
(9) далее останавливают перфузию, отключают перфузионный модуль от биореактора и переносят модуль ламинарно-потоковый шкаф, сливают отмывочный раствор и в пустой резервуар добавляют 155 мл 40% этилового спирта, затем снова переносят в рабочее пространство биореактора EBERS ТЕВ 500 и перфузируют лоскут со скоростью 20 мл/мин в течение двух часов, и после лоскут переносят в новую емкость, заполненную 125 мл 70% этанола на +40С;
(10) затем лоскут консервируют в 200-250 мл 7,14% DMSO и 7,14% PVP в DMEM, хранят при температуре -800С.
Описание способа
После соблюдения всех этапов законодательства РФ проводят забор лоскута кожи с дермой и жиром брюшной стенки кожи по стандартной методике в асептических условиях и помещают в транспортную среду (0,9% физиологический раствор). После удаляют избыточную жировую ткань, от нативного лоскута изымают образцы для приготовления срезов для: (1) рутинной гистологического исследования - окрашивания гематоксилином - эозином, (2) окрашивания по Массону; (3) окрашивание алыдиановым синим на кислые мукополисахариды; (4) для проведения ИГХ с антителами на МНС I; (5) определения уровня ДНК в нг/мг, нормализованного на массу высушенного среза ткани, (6) для определения наличия зрелых адипоцитов и жировых капель в них в способе используют прижизненное окрашивание витальным красителем Oil Red. Образцы для приготовления срезов измают на разной глубине - со стороны дермы и жирового депо, т.к. они морфологически неоднородны, итого взяли 12 срезов.
После завершения макроскопического осмотра и предварительной обработки лоскут помещают в 100 мл PBS с добавлением 166,6 МЕ/мл гепарина и 100 μg/мл - 100 ед/мл стрептомицина - пенициллина и инкубируют при +4°С в течение 8 час. с целью отмывания биоматериала от резидуальной крови.
На следующий день готовят 70% р-р изопропилового спирта с добавлением 3% поливинилпирролидона (250 мл) для криоконсервации кожного лоскута при температуре замерзания -29°С, соответственно лоскут можно хранить при температуре -20°С, не вызывая формирования зародышей внеклеточного льда; добавление высокомолекулярного поливинилпирролидона повышает вязкость раствора, что также снижает температуру замораживания. Внутриклеточные криопротекторы не используются т.к. для более эффективной децеллюляризации целесообразно индуцировать хладовой цитолиз, при этом максимально увеличивая время формирования внеклеточных зародышей льда и последующей кристаллизации. С этой целью также можно использовать синтетические ингибиторы нуклеации льда, например, DP-6.
Затем кожный лоскут помещают в емкость с 250 мл криоконсервирующего раствора, маркируют. В течение 1 часа лоскут выдерживают при температуре +4°С, в течение последующих 3 часов - при температуре -20°С, и переносят с соблюдением теплоизоляции (криоконтейнер с сухим льдом и хладоэлементами на -20°С) в низкотемпературный морозильник при температуре -80°С и хранят не более 6 месяцев. Данная температура хранения была выбрана, поскольку при размораживании позволяет избежать температурного интервала температур от -160°С до -100°С, быстрое размораживание при котором гарантированно приводит к образованию макроскопических фрактур и трещин.
2
Размораживают лоскут в водяной бане при температуре +37°С. Всего проводят три цикла замораживания - размораживания с использованием 70% раствора изопропилового спирта с добавлением 3% поливинилпирролидона (250 мл). Особенностью второго цикла являются ускоренное время замораживания - для этого в криоконтейнер с кожным лоскутом с раствором для криоконсервирования помещают в жидкий азот и оставляют при температуре -80°С до полного испарения азота. Таким образом, LN покрывает не всю поверхность лоскута, а создается неравномерный хладовой фронт, в отличие от, простого погружения криопробирки при температуре -180°С. При этом способе неравномерность хладового фронта желательна, поскольку потенциально приводит к хладовому цитолизу. Затем выдерживают при температуре -80°С сам лоскут до его кристаллизации, ввиду того что 70% изопропиловый спирт кристаллизуется гораздо медленнее лоскута (несколько дней, в то время как лоскут при данных условиях - в течение 1,5-2 часов). Размораживают емкость с лоскутом в водяной бане при +37°С.
Особенностью третьего цикла является медленное размораживание кожного лоскута при комнатной температуре. Преимуществом данного способа криоконсервации является то, что лоскут можно замораживать в одном и том же объеме, не меняя емкость.
После третьего размораживания емкость с лоскутом помещают в стерильный контейнер и переносят в ламинарно-потоковый шкаф. Далее дегидратированный и компактированный лоскут тщательно отмывают от изопропилового спирта. Для этого делают следующее:
(1) проводят настройку биореактора EBERS Teb 500 - устанавливают начальную температуру 37°С, регулируют газовый состав если в этом есть необходимость;
(2) удалив избыточную жировую ткань, кожный лоскут фиксируют. Нефиксированный лоскут в процессе перфузии за счет потери массы будет подниматься вверх в водном растворе, что потенциально приводит к протечкам в перфузионном контуре. С целью фиксации, иглой от периферического катетера 18G лоскут, повернув на сторону подкожной клетчатки (чтобы избежать повреждения и отрыва дермы), прокалывают сбоку в двух местах, таким образом, иглой продевают всю поверхность клетчатки, и фиксируют места прокола с ближайшими свободными участками клетчатки с помощью нерассасывающегося шовного материала Prolene 2/0 (важно, чтобы нить была достаточно толстой). Отметим, что в данном способе перфузию целесообразно использовать только на определенных этапах процесса децеллюляризации ввиду того, что, не смотря на хорошую химическую устойчивость перистальтических трубок к кислотам и щелочам, ряд агентов, например, кетоны и УВ, могут вызвать деградацию трубок.
(3) далее собирают модуль децеллюляризации, образованный:
- резервуаром для размещения лоскута, он образован бутылью 100 мл с резьбой GL 45 под трехпортовую крышку, крышкой с 3 открытыми колпачками - портами с резьбой портов GL14 - 1 порт под фильтрационную систему, остальные два - для приводящих раствор трубок.
Соединив катетер 18G с люэр-переходником 3,2 мм, а переходник, в свою очередь, с трубкой 3*5 мм, лоскут опускают на дно 100 мл стеклянного резервуара и трубку продевают через винт GL14 резьбовой крышки. С целью герметизации на горлышко резервуара одевают уплотнительное кольцо, а в порты вставляют силиконовые уплотнители. Затем одевают порт GL14 на соединенную с катетером трубку и завинчивают на трехпортовой крышке. Чтобы собрать участок модуля, возвращающий избыточный объем обратно в резервуар с перфузатом, сначала берут короткий фрагмент трубки 3*5 мм и продевают в порт GL14 и фиксируют порт с вдетой трубкой на одном из двух свободных винтов крышки. Собирают фильтрационную систему для резервуара с перфузатом, для этого берут красный порт с адаптером под 3-3,2 мм и одевают на него короткий (не более 0,5 см) фрагмент трубки соответствующего диаметра, затем на свободный конец трубки одевают фильтр 0,25 мкм.
- резервуаром для перфузата, который собирают аналогичным образом, что и резервуар для лоскута, с той разницей, что объем перфузата 250 мл, в то время как вместимость резервуара с лоскутом 100-120 мл. Это важно для непрерывной циркуляции перфузата. Трубка, забирающую перфузат, опускают на дно соответствующей емкости, в то время как трубку возвращающую перфузат практически не опускают до максимального уровня жидкости в резервуаре (250 мл);
- далее с помощью системы трубок и люэр-фиттингов, а также перистальтических трубок соединяют две емкости с образованием модуля децеллюляризации. Для этого участок трубки, соединенный с катетером, соединяют с перистальтической трубкой Tygon 2,54 мм с тремя стопперами, с помощью прямых соединителей 3*3 мм или любым другим корректным способом, свободный конец перистальтической трубки соединяют с трубкой 3*5 мм, забирающей перфузат, с помощью прямых соединителей 3*3 мм или любым другим корректным способом (например, использовав трехходовой переключатель, порт (М) которого, соединив с люэр-переходником х штуцер 3,2 мм, можно соединить с перистальтической трубкой, а порт П соединить с силиконовой трубкой 3*5 мм). Затем участок трубки, возвращающей избыточный объем перфузата из емкости с лоскутом, соединяют с соответствующей трубкой, идущей в емкость с перфузатом.
(4) после того, как модуль собран, емкость с перфузатом заполняется 250 мл PBS с добавлением антибиотиков - 0,25% стрептомицина сульфата, 0,25% амикацина сульфата и 0,25% цефтазидима и подключается к биореактору путем закрепления определенного фрагмента перистальтической трубки, ограниченного двумя стопперами, в картриджах перистальтической помпы биореактора.
(5) чтобы снизить температуру до комнатной, в ПО биореактора Ebers Teb 500 во вкладке Incubator задают температуру 25°С и открывают стеклянную крышку, чтобы обеспечить теплообмен и снизить температуру. Закрыв крышку, регистрируют значение температуры.
(6) в ПО биореактора Ebers Teb 500 во вкладке Pumps выбирают помпу, задают скорость перфузии. Скорость перфузии кожного лоскута PBS с добавлением антибиотиков - 0,25% стрептомицина сульфата, 0,25% амикацина сульфата и 0,25% цефтазидима - 20 мл/мин в течение суток.
На следующие сутки после завершения промывания кожного лоскута от изопропилового спирта, помпы биореактора останавливают и извлекают модуль децеллюляризации, переносят его в ламинарно-потоковый шкаф. Разборку модуля начинают с подготовки емкости для слива отходов, отсоединяют трубки от резервуаров и осушают их путем растягивания трубок на максимальную длину. Откручивают крышки и забирают до 3 мл перфузата для бакпосева, далее весь оставшийся перфузат сливают в маркированную емкость для отходов, которую используют не более 72 часов. Далее необходимо отделить поверхностный роговой и зернистый слои эпидермиса от шиповатого и базального слоев. Это можно сделать, с одной стороны, посредством дискового дерматома с электрическим приводом, позволяющего получить кожный лоскут толщиной до 0,76 мм, т.к. использование обычных дерматомов, работающих на поступательном принципе, приводит к получению лоскутов неравномерной толщины. С другой стороны, отделения поверхностных слоев эпидермиса можно добиться с помощью химических методов, наиболее из распространенным из которых является выдерживание лоскута в серии гипертонических растворов с увеличивающийся концентрацией, что способствует слущиванию клеток эпидермиса.
С целью слущивания поверхностных слоев эпидермиса в предлагаемом нами способе кожный лоскут помещают в 250-500 мл емкость, заполненную 250 мл 0,5 М NaCl, ставят емкость с лоскутом на платформенный шейкер Heidolph Vibramax 100. Для фиксации емкости на поверхности шейкера использовали адаптер с прижимными валиками для крепления сосудов и колб любого размера. Для большинства моделей платформенных шейкеров такие адаптеры входят в комплектацию, однако, в том случае, если адаптер отсутствует, можно использовать фрагмент лигатурной проволоки, предварительно замотав оба ее конца винты, выступающие с боковых сторон платформы. После закрепления емкости на платформе задают скорость встряхивания не менее 500-600 об/мин и продолжительность встряхивания - 2 часа. По окончанию 2 часов емкость с лоскутом переносят в ламинарно-потоковый шкаф, сливают р-р 0,5 М NaCl в емкость для отходов н наливают в емкость свежего профильтрованного заранее приготовленного 0,5 М NaCl, снова ставят на платформенный шейкер и после закрепления емкости на платформе задают скорость встряхивания не менее 500-600 об/мин и продолжительность встряхивания - 2 часа. По окончанию 2 часов емкость с лоскутом переносят в ламинарно-потоковый шкаф, сливают р-р 0,5 М NaCl в емкость для отходов н наливают в емкость свежего профильтрованного заранее приготовленного 1 М NaCl. Смену раствора выполняют аналогично и проводят встряхивание при тех же условиях. Таким образом, суммарно лоскут выдерживают в гипертонических растворов до 8 часов, в каждом из двух этапов выдерживания проводят двукратные замены. После завершения промывания в гипертонических растворах берут 3 мл 1 М NaCl и направляют на бактериологический посев.
Затем емкость с лоскутом переносят в ламинарно-потоковый шкаф, удаляют отработанный раствор 1 М NaCl и наливают в емкость стерильную очищенную воду, также помещают на шейкер и встряхивают с двукратной заменой.
На следующее утро емкость с кожным лоскутом переносят в ламинарно-потоковый шкаф, в емкость для отходов сливают 1 М NaCl и помещают лоскут в 100 мл стерильную емкость, заполненную 50 мл 0,25% Трипсин - ЭДТА. Платформенный шейкер размещают в рабочем пространстве биореактора Ebers Teb 500 или инкубатора, имеющего в своей стенке порт для дополнительных соединений. С резьбового порта снимают крышки и продевают провод для питания прибора. Устанавливают температуру 37°С, при более низкой температуре трипсин будет не активен. Устанавливают емкость с кожным лоскутом на шейкер, фиксируют и оставляют в режиме непрерывного встряхивания не более двух часов, чтобы избежать избыточного лизиса лоскута в трипсине. Для остановки лизиса переносят емкость из рабочего пространства биореактора в ламинарно-потоковой шкаф и сразу извлекают лоскут из емкости с 0,25% трипсином - ЭДТА; в ином случае переносят для остановки лизиса емкость с лоскутом, заполненную 0,25% трипсином - ЭДТА, в холодильник на +4°С или ставят в термоизолированный контейнер с сухим льдом. Крайне важно на данном этапе, чтобы длительное нахождение биоматериала при температуре 37°С в трипсине было исключено.
Лоскут помещают в стерильную емкость с очищенной стерильной водой и ставят на платформенный шейкер при комнатной температуре во избежание перегрева прибора при 37°С. Встряхивание проводят при частоте оборотов не менее 500 об/мин в течение часа с целью отмывания кожного лоскута от остаточного трипсина. Далее заменяют стерильную воду на 100% изопропиловый спирт, и встряхивают лоскут в течение ночи.
На следующий день зафиксированный на игле катетера 18G (см. выше в описании способа) кожный лоскут помещают в стерильный стеклянный 100 мл резервуар, собирают перфузионный модуль в алгоритме, аналогичному вышеописанному для данного способа, в резервуар для перфузата заливают 250 мл свежего профильтрованного раствора 1% 4-(1,1,3,3-тетраметилбутил)фенил-полиэтиленгликоля (коммерческое название - TritonX100) и 0,8% деоксихолата натрия (NaDOC).
В данном в отличие от прототипа было решено отказаться TritonX100 в чистом виде, поскольку эффект этого неионного ПАВ в большей степени выражен для тонких срезов тканей или для тканей с высоким отношением поверхность/объем (солюбилизация мембранных белков, разрушение мебран эукариотических клеток), в то время как использование ионного детергента и липолитического агента деоксихолата натрия куда более актуально для удаления ядер адипоцитов, а также для расщепления триацилглеролов и фосфолипидов мембран жировых клеток.
Собранный перфузионный модуль подключают к биореактору, скорость перфузии при этом устанавливают равной не менее 20 мл/мин, поскольку при низкой скорости отмывание неэффективно, а сама жировая ткань на данном этапе крайне разрыхлена и гомогенизирована, чтобы вызвать засорение трубок при перфузии. Перфузию проводят в течение 45 часов, при этом по истечению 24 часов раствор заменяют на свежий. Далее с целью отмывания от детергентов перфузионный модуль не разбирают, а наливают в осушенный резервуар для перфузата 200-250 мл стерильной воды с добавлением 0,3% азида натрия и 1% ампипиллина натрия, перфузию проводят в течение 48 часов с тремя заменами в течение каждых суток.
Далее проводят финальный этап дегидратации ткани, для чего останавливают перфузию, отключают перфузионный модуль от биореактора и переносят модуль в ламинарно-потоковый шкаф. Сливают отмывочный раствор и в пустой резервуар добавляют 155 мл 40% этилового спирта (готовят из исходного 100 мл 95% этанола), затем снова переносят в рабочее пространство биореактора Ebers ТЕВ 500 и перфузируют лоскут со скоростью 20 мл/мин в течение двух часов, и после лоскут переносят в новую емкость, заполненную 125 мл 70% этанола на +4°С, и в таком виде лоскут может храниться в течение суток.
После завершения протокола детергентно-ферментативной децеллюляризации лоскут извлекают из емкости с 125 мл 70% этанола, в условиях ламинарного потока изымают образцы для приготовления срезов для: (1) рутинной гистологического исследования - окрашивания гематоксилином - эозином, (2) окрашивания по Массону; (3) окрашивания альциановым синим на кислые мукополисахариды; (4) для проведения ИГХ с антителами на МНС I; (5) определения уровня ДНК в нг/мг, нормализованного на массу высушенного среза децеллюляризированной/делипидизированной ткани; (6) для определения наличия ядер зрелых адипоцитов и остаточного нейтрального жира в способе используют прижизненное окрашивание витальным красителем Oil Red. Этот метод окрашивания валиден только для свежеприготовленных или замороженных срезов/биоптатов жировой ткани. Образцы для приготовления срезов измают на разной глубине - со стороны дермы и жирового депо, т.к. они морфологически неоднородны, итого взяли 12 срезов. Образцы помещают в 10% забуференный формалин.
Отдельно отметим, что в предлагаемом способе после каждого этапа децеллюляризации до 3 мл промывочного раствора или перфузата направляют на бактериологический посев с целью обеспечения контроля стерильности.
Лоскут консервируют в 200-250 мл криоконсерванта, содержащего 7,14% DMSO и 7,14% PVP в DMEM, при этом в течение часа лоскут выдерживают при температуре +4°С, затем переносят на -20°С и инкубируют при такой температуре до полной кристаллизации среды. С соблюдением термоизоляции лоскут переносят на -80°С и хранят при такой температуре. В предлагаемом способе применяют следующий протокол окрашивания криосрезов жировой ткани красителем Oil Red О (отметим, что для данного протокола требуется альтернативная среда для монтирования срезов):
• Готовят свежие или замороженные срезы жировой ткани; замороженные срезы приготавливают по стандартной методике с погружением блока-формы с иммобилизованным биоптатом/фрагментом ткани (толщиной не более 5 мм) в заливочной среде ОСТ. Далее в 2-метилбутановую ванну с жидким азотом погружают мерный сосуд из нержавеющей стали и ждут пока сосуд охладится, и после блок-форму с иммобилизованным срезом погружают в сосуд заполненный 2-метилбутаном и ждут до тех пор пока блок полностью не затвердеет, и далее переносят его в криостат на -20°С. Блок хранят при -80°С до секционирования.
• После криосекционирования (температура в криостате поддерживается равной -20°С), получения криосрезов толщиной не более 5 μм, стекла переносят в пропиленгликоль и выдерживают до двух минут;
• Затем стекла инкубируют в растворе Oil Red О до 6 минут.
• Готовят 85% раствор пропиленгликоля в дистиллированной воде и дифференцируют срез ткани в течение 1 минуты, после чего стекло 2 раза промывают дистиллированной водой;
• Выдерживают стекло в гематоксилине до 1-2 минут;
• Тщательно промывают стекло под проточной водой;
• Промывают стекло 2 раза дистилированной водой;
• Стекло покрывают с использованием водной среды для монтирования. Результаты проведенных гистологических исследований показали, что полученный в результате децеллюляризированный кожный лоскут,- характеризующийся: 1) отсутствием ядер клеток во всех слоях, гомогенизацией эпидермиса, с трудом различимыми тенями клеток, разволокнением и гомогенизацией подлежащей дермы; 2) присутствием кислых мукополисахаридов и гликозаминогликанов в децеллюляризованным лоскуте, однако их содержание было существенно ниже по сравнению с нативной тканью, что оценивали по интенсивности окрашивания срезов нативного и децеллюляризированного срезов дермы альциановым синим; 3) частичными разволокнением и гомогенизацией коллагеновых волокон; 4) отсутствием ядер адипоцитов и капель нейтрального жира в децеллюляризированном лоскуте; 5) отсутствием экспрессии на поверхности матрикса МНС I класса; 6) содержанием остаточной геномной двуцепочечной ДНК составило 20 ng/mg, нормализованное на сухой вес децеллюляризированного лоскута. Положительный эффект способа.
Способ позволяет получить децеллюляризированные кожные лоскуты, характеризующееся: 1) отсутствием ядер клеток во всех слоях, гомогенизацией эпидермиса, с трудом различимыми тенями клеток, разволокнением и гомогенизацией подлежащей дермы; 2) присутствием кислых мукополисахаридов и гликозаминогликанов в децеллюляризованным лоскуте; 3) частичными разволокнением и гомогенизацией коллагеновых волокон; 4) отсутствием ядер адипоцитов и капель нейтрального жира; 5) отсутствием экспрессии на поверхности матрикса МНС I класса; 6) содержанием остаточной геномной двуцепочечной ДНК составило 20 ng/mg, нормализованное на сухой вес фрагмента ткани.
Пример осуществления способа
Пример 1.
После забора кожи, обрабатывают следующим образом:
(1) удаляют транспортную среду, избыточную жировую ткань, при этом от нативного лоскута изымают образцы для приготовления срезов для комплексного гистологического анализа и определения геномной двуцепочечной ДНК
(2) после завершения макроскопического осмотра и предварительной обработки лоскут помещают в 100 мл PBS с добавлением 166,6 МЕ/мл гепарина и 100 μg/мл - 100 ед/мл стрептомицина - пенициллина и инкубируют при температуре +4°С в течение 8 часов с целью отмывания биоматериала от резидуальной крови.
(3) на следующий день готовят 70% р-р изопропилового спирта с добавлением 3% поливинилпирролидона (250 мл). 70% р-р изопропилового спирта используют в данном способе для криоконсервации кожного лоскута;
(4) затем кожный лоскут помещают в с 250-300 мл криоконсервирующего раствора, маркируют. В течение 1 часа лоскут выдерживают при температуре +4°С, в течение последующих 3 часов - при температуре -20°С, и переносят с соблюдением теплоизоляции (криоконтейнер с сухим льдом и хладоэлементами при температуре -20°С) в низкотемпературный морозильник при температуре -80°С, хранение не более 6 месяцев.
(5) размораживают лоскут в водяной бане при температуре +37°С. Всего проводят три цикла замораживания - размораживания с использованием 70% р-ра изопропилового спирта с добавлением 3% поливинилпирролидона (250 мл).
(6) в ходе третьего, и последнего, цикла замораживания - размораживания проводят медленное размораживание кожного лоскута при комнатной температуре.
(7) после третьего размораживания емкость с лоскутом помещают в стерильный контейнер и переносят в ламинарно-потоковый шкаф. Удалив избыточную жировую ткань, кожный лоскут фиксируют с помощью иглы от катетера 18G.
(8) далее дегидратированный и компактизированный лоскут тщательно отмывают от изопропилового спирта. Отмывание проводят в 250 мл PBS с добавлением антибиотиков - 0,25% стрептомицина сульфата, 0,25% амикацина сульфата и 0,25% цефтазидима, предварительно собирают перфузионный модуль, и заливают раствор в соответствующую емкость для перфузата, собранный модуль подключают к биореактору Ebers Teb 500 и запускают перфузию лоскута;
(9) На следующие сутки после завершения промывания кожного лоскута от изопропилового спирта, помпы биореактора останавливают и извлекают модуль децеллюляризации, переносят его в ламинарно-потоковый шкаф. Разборку модуля начинают с подготовки емкости для слива отходов, отсоединяют трубки от резервуаров и осушают их путем растягивания трубок на максимальную длину. Откручивают крышки и забирают до 3 мл перфузата для бакпосева, далее весь оставшийся перфузат сливают в маркированную емкость для отходов, которую используют не более 72 часов.
(10) С целью слущивания поверхностных слоев эпидермиса в предлагаемом нами способе кожный лоскут помещают в 250-500 мл емкость, заполненную 250 мл 0,5 М NaCl, ставят емкость с лоскутом на платформенный шейкер Heidolph Vibramax 100. После закрепления емкости на платформе задают скорость встряхивания не менее 500-600 об/мин и продолжительность встряхивания - 2 часа. По окончанию 2 часов емкость с лоскутом переносят в ламинарно-потоковый шкаф, сливают р-р 0,5 М NaCl в емкость для отходов н наливают в емкость свежего профильтрованного заранее приготовленного 0,5 М NaCl, снова ставят на платформенный шейкер и задают скорость встряхивания не менее 500-600 об/мин и продолжительность встряхивания - 2 часа. По окончанию 2 часов емкость с лоскутом переносят в ламинарно-потоковый шкаф, сливают р-р 0,5 М NaCl в емкость для отходов н наливают в емкость свежего профильтрованного заранее приготовленного 1 М NaCl. Смену раствора выполняют аналогично и проводят встряхивание при тех же условиях. Таким образом, суммарно лоскут выдерживают в гипертонических растворов до 8 часов, в каждом из двух этапов выдерживания проводят двукратные замены. После завершения промывания в гипертонических растворах берут 3 мл 1 М NaCl и направляют на бактериологический посев.
(11) На следующее утро емкость с кожным лоскутом переносят в ламинарно-потоковый шкаф, в емкость для отходов сливают 1 М NaCl и помещают лоскут в 100 мл стерильную емкость, заполненную 50 мл 0,25% Трипсин - ЭДТА. Устанавливают емкость с кожным лоскутом на шейкер, фиксируют и оставляют в режиме непрерывного встряхивания не более двух часов, чтобы избежать избыточного лизиса лоскута в трипсине.
(12) Лоскут помещают в стерильную емкость с очищенной стерильной водой и ставят на платформенный шейкер при комнатной температуре во избежание перегрева прибора при 37°С. Встряхивание проводят при частоте оборотов не менее 500 об/мин в течение часа с целью отмывания кожного лоскута от остаточного трипсина. Далее заменяют стерильную воду на 100% изопропиловый спирт, и встряхивают лоскут в течение ночи.
(13) На следующий день зафиксированный на игле катетера 18G кожный лоскут помещают в стерильный стеклянный 100 мл резервуар, собирают перфузионный модуль в алгоритме, аналогичному вышеописанному для данного способа, в резервуар для перфузата заливают 250 мл свежего профильтрованного раствора 1% 4-(1,1,3,3-тетраметилбутил)фенил-полиэтиленгликоля (коммерческое название - TritonX100) и 0,8% деоксихолата натрия (NaDOC). Перфузию проводят в течение 45 часов, при этом по истечению 24 часов раствор заменяют на свежий. Далее с целью отмывания от детергентов перфузионный модуль не разбирают, а наливают в осушенный резервуар для перфузата 200-250 мл стерильной воды с добавлением 0,3% азида натрия и 1% ампипиллина натрия, перфузию проводят в течение 48 часов с тремя заменами в течение каждых суток.
(14) Далее проводят финальный этап дегидратации ткани, для чего останавливают перфузию, отключают перфузионный модуль от биореактора и переносят модуль в ламинарно-потоковый шкаф. Сливают отмывочный раствор и в пустой резервуар добавляют 155 мл 40% этилового спирта (готовят из исходного 100 мл 95% этанола), затем снова переносят в рабочее пространство биореактора Ebers ТЕВ 500 и перфузируют лоскут со скоростью 20 мл/мин в течение двух часов, и после лоскут переносят в новую емкость, заполненную 125 мл 70% этанола на + температуре 4°С, и в таком виде лоскут может храниться в течение суток.
(15) После завершения протокола детергентно-ферментативной децеллюляризации лоскут извлекают из емкости с 125 мл 70% этанола, в условиях ламинарного потока изымают образцы для приготовления срезов для: (1) рутинной гистологического исследования - окрашивания гематоксилином - эозином, (2) окрашивания по Массону; (3) окрашивания альциановым синим на кислые мукополисахариды; (4) для проведения ИГХ с антителами на МНС I; (5) определения уровня ДНК в нг/мг, нормализованного на массу высушенного среза децеллюляризированной/делипидизированной ткани; (6) для определения наличия ядер зрелых адипоцитов и остаточного нейтрального жира в способе используют прижизненное окрашивание витальным красителем Oil Red. Этот метод окрашивания валиден только для свежеприготовленных или замороженных срезов/биоптатов жировой ткани. Образцы для приготовления срезов измают на разной глубине - со стороны дермы и жирового депо, т.к. они морфологически неоднородны, итого взяли 12 срезов. Образцы помещают в 10% забуференный формалин.
(16) Лоскут консервируют в 200-250 мл 7,14% DMSO и 7,14% PVP в DMEM, при этом в течение часа лоскут выдерживают при +4°С, затем переносят на температуре -20°С и инкубируют при такой температуре до полной кристаллизации среды. С соблюдением термоизоляции лоскут переносят и хранят при температуре -80°С.