Разработка наборов реагентов для выявления днк генетически модифицированной кукурузы линий 5307 и m0n89034 методом полимеразной цепной реакции в реальном времени

Известия ТСХА, выпуск 6, 2015 год

УДК 573.6

РАЗРАБОТКА НАБОРОВ РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ДНК ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННОЙ КУКУРУЗЫ ЛИНИЙ 5307 И М0Ш9034 МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ

М.В. МОИСЕЕВА1- 2, ЕЮ. БУКИНА2, Я.И. АЛЕКСЕЕВ1, Е.В. БЕЛЕНОВИЧ1, О.В. КУЗУБОВА1, Д.А. ВАРЛАМОВ1- 2, Е.С. МАЗУРИН1, П.Н. ХАРЧЕНКО1

(1 Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии;

2 Закрытое акционерное общество «Синтол»)

В Российской Федерации пищевые продукты, содержащие генетически модифицированные организмы (ГМО), подлежат обязательной маркировке. Распространенным методом выявления ДНК ГМО является полимеразная цепная реакция в реальном времени. Нами были разработаны два новых набора реагентов, обеспечивающих возможность выявления генетически модифицированной кукурузы линий 5307 и MON89034, разрешенных в 2014 г. для использования в продуктах питания, пищевом сырье и кормах для животных на территории Российской Федерации.

Ключевые слова: полимеразная цепная реакция в реальном времени, анализ генетически модифицированных организмов, кукуруза линии 5307, кукуруза линии MON89034.

Кукуруза — ценная сельскохозяйственная культура, широко используемая в пищевой и легкой промышленности, а также в производстве кормов. Это основной источник крахмала, который применяется в бумажной, строительной промышленности и фармацевтике. Она также является сырьем в производстве биогаза и биоэтанола.

С каждым годом в мире возрастает производство сельскохозяйственных ГМ культур. По данным КААА [5], в 2014 г. суммарная площадь посевов ГМ культур составила 181,5 млн га. Правительство Российской Федерации уделяет большое внимание безопасности продуктов питания человека и кормов для животных. В России обязательной маркировке подлежит продукция, содержащая более 0,9% ДНК ГМО.

По состоянию на 2015 г. на территории Российской Федерации для использования в продуктах питания, пищевом сырье и кормах для животных разрешены 23 вида линий ГМ растений: 7 линий сои, 12 линий кукурузы, 1 линия риса, 1 линия сахарной свеклы, 2 линии картофеля [4]. В частности, в 2014 г. были зарегистрированы две новые линии ГМ кукурузы: 5307 и М0№9034. В связи с этим появилась необходимость разработки наборов реагентов для обнаружения и идентификации данных линий.

108

Линия кукурузы 5307 устойчива к жесткокрылым насекомым-вредителям рода Diabrotica. Линия кукурузы MON89034 устойчива к чешуекрылым насекомым. Ре-гуляторные последовательности и трансгенные вставки этих линий перечислены в таблице 1.

Т а б л и ц а 1

Регуляторные последовательности и гены вставок линий кукурузы 5307 и М0И89034

Линия ГМО Производитель Промотор Ген Терминатор

Кукуруза 5307 SyngentaAG, Швейцария CMP ZmUbilnt Pmi Ecry3.1Ab NOS

Кукуруза MON89034 Monsanto Company, США CaMV35S CaMV 35S FMV 35S Cry2Ab2 Cry1A.105 NOS T-Hsp17

Устойчивость к насекомым возникает благодаря введенным в геном кукурузы генов Cry2Ab2, Cry1A.105 и Ecry3.1Ab (это синтетическая форма генов Cry3A и Cry 1 Ab бактерий Bacillus thuringiensis). Эти гены отвечают за синтез эндотоксинов, действие которых основано на специфическом связывании с рецепторами клеток кишечного эпителия насекомого, что приводит к нарушению осмотического равновесия и лизису клеток [8].

Одним из наиболее широко используемых методов обнаружения ГМО является полимеразная цепная реакция в реальном времени (ПЦР-РВ) [1, 2, 9]. Метод позволяет быстро и с высокой специфичностью и чувствительностью исследовать любой образец, содержащий ДНК.

Материалы и методы

Для обнаружения ДНК кукурузы линий 5307 и MON89034 был проведен дизайн праймеров и зондов для ПЦР-РВ на основании анализа последовательностей генов, взятых из официальных международных данных [6, 7].

Исследование специфичности и чувствительности разработанных прайме-ров и зондов проводили с помощью реакционных смесей, подготовленных следующим образом. В готовую 2,5-кратную реакционную смесь с Taq-ДНК полимеразой (ЗАО «Синтол», Россия) добавляли по 6 пмоль каждого праймера и 4 пмоль зонда, 5 мкл исследуемой ДНК и стерильную бидистиллированную воду до конечного объема 25 мкл.

Использовали стандартные образцы, содержащие ДНК линий ГМ кукурузы (MON810, Bt11, MON88017, T25, NK603, 5307, MON89034), сои (GTS4032, А2704-12, А5547-35, MON89788), а также различные пищевые продукты, не содержащие ГМО. ДНК из образцов выделяли набором «Сорб-ГМО-Б» (ВНИИСБ/Син-тол, Россия) в соответствии с инструкцией производителя.

109

Исследования методом ПЦР-РВ проводили на приборе АНК-32 (Институт аналитического приборостроения РАН, Россия) при следующих условиях: 95°С — 300 с, (60°С — 40 с, 95°С — 15 с) 50 циклов.

Результаты

Специфичность праймеров и зонда для обнаружения ДНК кукурузы линии М0№9034 была исследована методом ПЦР-РВ на образцах ДНК, выделенных из сои, кукурузы, риса, ГМ-линий сои (GTS4032, А2704-12, А5547-35, М0Ш9788) и ГМ-линий кукурузы (М0Ш10, ВШ, M0N88017, Т25, NK603, 5307, M0N89034). Возрастание сигнала флуоресценции наблюдалось только в реакции с образцом ДНК, выделенным из кукурузы линии М0№9034. Для всех остальных образцов возрастание сигнала флуоресценции не наблюдалось, что подтверждает специфичность подобранных праймеров и зонда для ПЦР-РВ на исследованной выборке. Исследования специфичности праймеров и зонда для обнаружения ДНК кукурузы линии 5307 показали аналогичные результаты (табл. 2).

Т а б л и ц а 2

Специфичность подобранных праймеров и зондов

№ Образец, % ГМО Результаты анализа, пороговый цикл реакции по каналу ROX

кукуруза линии MON89034 кукуруза линии 5307

1 Соя, 0% > 50 > 50

2 Кукуруза, 0% > 50 > 50

3 Рис, 0% > 50 > 50

4 Соя GTS 40-3-2, 100% > 50 > 50

5 Соя А27, 100% > 50 > 50

6 Соя А5547-35, 100% > 50 > 50

7 Соя MON89788, 100% > 50 > 50

8 Кукуруза MON810, 100% > 50 > 50

9 Кукуруза Bt11, 100% > 50 > 50

10 Кукуруза T25, 100% > 50 > 50

11 Кукуруза NK603, 100% > 50 > 50

12 Кукуруза MON88017, 100% > 50 > 50

13 Кукуруза 5307, 100% > 50 22,64 ± 0,04

14 Кукуруза M0N89034, 100% 22,89 ± 0,01 > 50

15 Отрицательный контрольный образец (вода) > 50 > 50

110

Чувствительность определения ДНК ГМ-линий кукурузы с использованием разработанных праймеров и зондов исследовали на серии образцов, полученных путем десятикратных разведений раствора ДНК, выделенного из стандартных образцов, содержащих 100% ГМ кукурузу. Анализ кинетических кривых ПЦР-РВ проводили, используя аппроксимацию рекурсивными функциями [3]. На рисунке 1 показаны результаты анализа.

Для исключения ложноотрицательных результатов в состав реакционных смесей был введен внутренний положительный контроль (ВПК), представляющий собой синтетическую плазмидную ДНК и пару праймеров и зонд для ее выявления. В наборе реагентов «Кукуруза MON89034 идентификация» по каналу детекции флуоресцентного красителя ROX (карбокси-Х-родамин) проводится выявление фрагмента гена (Cry2Ab2) кукурузы линии MON89034, по каналу детекции флуоресцентного красителя Cy5 (индодикарбоцианин) — выявление ДНК внутреннего положительного контроля. Аналогичный дизайн имеет набор реагентов «Кукуруза 5307 идентификация», за исключением того, что по каналу детекции ROX выявляется фрагмент гена есгу3.1АЬ кукурузы линии 5307.

Эффективность работы наборов реагентов «Кукуруза MON89034 идентификация» и «Кукуруза 5307 идентификация» определяли на образцах ДНК, содержащих разный процент ГМ ДНК соответствующей линии. Для этого раствор ДНК, выделенный из 100% ГМ линии кукурузы, разводили раствором ДНК, выделенным из не ГМ кукурузы до заданного процентного соотношения. На рисунке 2 приведен пример работы набора реагентов «Кукуруза MON89034 идентификация» на серии образцов с различным содержанием ДНк кукурузы линии MON89034 (10%, 1%, 0,1%, 0,01%) по двум каналам детекции. Пример работы набора реагентов «Кукуруза 5307 идентификация» на серии образцов с различным содержанием ДНК кукурузы линии 5307 (10%, 1%, 0,1%, 0,01%) приведен на рисунке 3.

Наборы были апробированы на четырех видах ГМ сои, семи видах ГМ кукурузы и трех видах не ГМ растений, наиболее часто встречающихся в продуктах питания и кормах (соя, кукуруза, рис).

В результате проведенных экспериментов было установлено, что аналитическая чувствительность разработанных наборов реагентов составляет 0,01% содержания ДНК ГМО в образце, что соответствует 10 геном-эквивалентам в реакции. Коэффициент корреляции R2, рассчитанный с помощью метода наименьших квадратов, при исследовании серии четырех десятикратных разведений составил 0,999. Эффективность ПЦР-РВ для разработанных наборов составила более 95%. Специфичность определения на исследованной выборке составила 100%.

Заключение

Разработаны наборы реагентов «Кукуруза 5307 идентификация» и «Кукуруза MON89034 идентификация», позволяющие выявлять и идентифицировать ДНК линий кукурузы 5307 и MON89034 в продуктах питания, пищевом сырье и кормах для животных методом полимеразной цепной реакции в реальном времени.

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации (соглашение № 14.621.21.0003 от 15.08.2014 г. RFMEFI62114X0003) с использованием научного оборудования Центра коллективного пользования «Биотехнология» Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной биотехнологии.

111

Рис. 1. Кинетические кривые серии десятикратных разведений ДНК ГМ кукурузы линии МОЫ89034

112

6 500 6 000 5 500

А

2 4 500 О

_- 4 000 К

3 3 500 X

а з 000

и

си

а 2 500

о >

С 2 000 ©

1 500

1 000 500 0

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

Цикл

Рис. 2. Кинетические кривые роста сигнала флуоресценции при ПЦР-РВ анализе образцов с различным содержанием ДНК кукурузы линии MON89034 (10%, 1%, 0,1%, 0,01%), полученные с помощью набора реагентов «Кукуруза М0Ы89034 идентификация». Коэффициент корреляции Р составил 0,9987, эффективность

ПЦР-РВ — 96,9%

113

©

ш О

X

а

и о а

о >

л ©

10 "000 9 500 9 000 8 500 8 000 7 500 7 000 6 500 6 000 5 500 5 000 4 500 4 000 3 500 3 000 2 500 2 000 1 500 1 000 500 0

Цикл

©

ш О

X

а

и о а

о >

л ©

620 600 580 560 540 520 500 480 460 440 420 400 380 360 340 320 300 280 260 240 220 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0

Цикл

Рис. 3. Кинетические кривые роста сигнала флуоресценции при ПЦР-РВ анализе образцов с различным содержанием ДНК кукурузы линии 5307 (10%, 1%, 0,1%, 0,01%), полученные с помощью набора реагентов «Кукуруза 5307 идентификация». Коэффициент корреляции Р составил 0,9990, эффективность ПЦР-Рв —

99,2%

114

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Библиографический список

1. Алексеев Я.И. и др. 35S промотор вируса мозаики норичника (P-FMV) — новая мишень для анализа на содержание генетически модифицированных организмов // Известия ТСХА. 2011. Вып. 6. С. 156-161.

2. ГОСТ Р 53244-2008. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и полученных из них продуктов. М.: Стандартинформ, 2009. 61 с.

3. Сочивко Д.Г. и др. Стохастическое моделирование кинетических кривых полимераз-ной цепной реакции // Доклады Академии наук. 2011. Т. 439. № 5. С. 696-699.

4. Реестр продукции, прошедшей государственную регистрацию (выданные Федеральной службой, включая Управления): http://fp.crc.ru/gosregfr/.

5. James C. GM Crops: Global Status of Commercialized Biotech. ISAAA Brief № 49. Ithaca, NY, 2014.

6. JRC. Event-specific method for the quantification of maize line 5307 using real-time PCR. Validation report, 2014.

7. JRC. Event-specific method for the quantification of maize line M0N89034 using realtime PCR. Protocol, 2008.

8. Kumar P.A., MalikV.S., Sharma, R.P. The Insecticidal proteins of Bacillus thuringiensis // Adv. Appl. Microbiol. 1996. Vol. 42. P. 1-43.

9. Wu Y. et al. Development of a general method for detection and quantification of the P35S promoter based on assessment of existing methods. Sci. Rep. 4, 7358; D0I:10.1038/srep07358 (2014).

THE DEVELOPMENT OF REAGENTS SET FOR DETECTION DNA OF GENETICALLY MODIFIED MAIZE LINES 5307 AND MON89034 BY REAL-TIME POLYMERASE CHAIN REACTION METHOD

M.V. MOISEEVA1 2, E.YU. BUKINA2, YA.I. ALEKSEEV1, E.V. BELENOVICH1, O.V. KUZUBOVA1, D.A. VARLAMOV1 2, E.S. MAZURIN1, P.N. KHARCHENKO1

(1 All-Russian Research Institute of Agricultural Biotechnology;

2 Closed Joint Stock Company «Syntol»)

In the Russian Federation any food containing more than 0.9% DNA of genetically modified organisms (GMO) have to be specially labeled. The most widely used reference method for GMO detection is real-time polymerase chain reaction (real-time PCR). Two real-time PCR kits for identification genetically modified maize lines 5307 and MON89034 permitted for use in food and feed in the Russian Federation since 2014 were designed.

Key words: real-time polymerase chain reaction, genetically modified organism, maize line 5307, maize line MON89034.

Моисеева Мария Викторовна — мл. науч. сотр. ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии», мл. науч. сотр. ЗАО «Синтол» (127550, г. Москва, ул. Тимирязевская, 42; тел.: (495) 984-69-93; e-mail: maria. moiseeva92@gmail.com).

115

Букина Елена Юрьевна — науч. сотр. ЗАО «Синтол» (127550, г. Москва, ул. Тимирязевская, 42; тел.: (499) 976-65-44).

Алексеев Яков Игоревич — врио директора ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии», зав. лабораторией анализа ГМО (127550, г. Москва, ул. Тимирязевская, 42; тел.: (499) 976-65-44).

Беленович Екатерина Владимировна — науч. сотр. ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии» (127550, г. Москва, ул. Тимирязевская, 42; тел.: (499) 976-65-44).

Кузубова Ольга Владимировна — к. б. н., ст. науч. сотр. ЦКП «Биотехнология» ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии» (127550, г. Москва, ул. Тимирязевская, 42; тел.: (499) 976-65-44).

Варламов Дмитрий Александрович — ст. науч. сотр. ЦКП «Биотехнология» ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии» (127550, г. Москва, ул. Тимирязевская, 42; тел.: (499) 976-65-44).

Мазурин Евгений Сергеевич — к. б. н., руководитель ЦКП «Биотехнология» ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии», зав. лаб. диагностики патогенов растений (127550, г. Москва, ул. Тимирязевская, 42; тел.: (499) 976-65-44).

Харченко Петр Николаевич — д. б. н., акад. РАН, науч. руководитель ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии» (127550, г. Москва, ул. Тимирязевская, 42; тел.: (499) 976-65-44).

Moiseeva Mariya Viktorovna — junior researcher of All-Russian Research Institute of Agricultural Biotechnology, junior researcher of the closed joint stock company «Syntol» (127550, Moscow, Timiryazevskaya str., 42; tel.: +7 (495) 984-6993; email: maria.moiseeva92@gmail.com).

Bukina Elena Yurevna — researcher of the closed joint stock company «Syntol» (127550, Moscow, Timiryazevskaya str., 42; tel.: +7 (499) 976-65-44).

Alekseev Yakov Igorevich — temporarily appointed director of All-Russian Research Institute of Agricultural Biotechnology, Head of the Laboratory of GMO Analysis (127550, Moscow, Timiryazevskaya str., 42; tel.: +7 (499) 976-65-44).

Belenovich Ekaterina Vladimirovna — research associate of All-Russian Research Institute of Agricultural Biotechnology (127550, Moscow, Timiryazevskaya str., 42; tel.: +7 (499) 976-65-44).

Kuzubova Olga Vladimirovna — PhD in Biology, senior researcher of the center of collective use «Biotechnology», All-Russian Research Institute of Agricultural Biotechnology (127550, Moscow, Timiryazevskaya str., 42; tel.: +7 (499) 976-65-44).

Varlamov Dmitriy Aleksandrovich — senior researcher of the center of collective use «Biotechnology», All-Russian Research Institute of Agricultural Biotechnology (127550, Moscow, Timiryazevskaya str., 42; tel.: +7 (499) 976-65-44).

Mazurin Evgeniy Sergeevich — PhD in Biology, Head of the center of collective use «Biotechnology», All-Russian Research Institute of Agricultural Biotechnology, Head of the Laboratory of Diagnostics of Plants Pathogens (127550, Moscow, Timiryazevskaya str., 42; tel.: +7 (499) 976-65-44).

Kharchenko Petr Nikolaevich — Doctor of Biological Sciences, a member of Russian Academy of Sciences, scientific director of All-Russian Research Institute of Agricultural Biotechnology (127550, Moscow, Timiryazevskaya str., 42; tel.: +7 (499) 976-65-44).

116