КОМПОЗИЦИИ ИЗОКВЕРЦИТРИНА
ISOQUERCITRIN COMPOSITIONS

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
Настоящей заявке испрашивается приоритет по предварительной заявке США № 62/796126, поданной 24 января 2019 года. Содержание предшествующей заявки включено в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Изокверцитрин представляет собой 3-O-глюкозид кверцетина, и ему приписывают несколько неожиданных видов биологической активности. Например, было описано, что изокверцитрин может ингибировать протеиндисульфидизомеразу (PDI) - фермент, в высокой степени вовлеченный в образование тромбов. См. Flaumenhaft et al., Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vasc. Biol., 2015, 35:16-23. Полагают, что ингибиторы PDI, например, изокверцитрин, могут препятствовать тромбозу или блокировать его.
Продолжается клиническое испытание фазы II/III для тестирования способности изокверцитрина ингибировать ассоциированный со злокачественной опухолью тромбоз. См. испытание CAT IQ в интернете на clinicaltrials.gov. Следует отметить, что суточные дозы изокверцитрина, вводимые в испытании, составляют 500 мг и 1000 мг. Эти дозы являются необычно высокими по сравнению с дозами типичных фармацевтических веществ. Вероятно, что большая доза изокверцитрина требуется для достижения достаточной биодоступности вследствие его относительно низкого перорального всасывания.
Был разработан ферментативно модифицированный изокверцитрин (EMIQ) с более высокой растворимостью в воде для повышения биодоступности изокверцитрина. См. Murota et al., Arch. Biochem. Biophys., 2010, 501:91-97. Тем не менее, EMIQ представляет собой смесь по меньшей мере пяти биологически активных производных изокверцитрина. См. Akiyama et al., J. Food Hyg. Soc. Japan, 1999, 41:54-60. Является непрактичным использование такой смеси активных ингредиентов в качестве лекарственного средства у человека в соответствии с рекомендациями Федерального управления по лекарственным средствам США.
Существует потребность в разработке фармацевтических композиций с более высоким пероральным всасыванием изокверцитрина посредством улучшенной растворимости в воде без описанных выше недостатков.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Для удовлетворения описанной выше потребности предусматривается растворимая в воде фармацевтическая композиция, которая содержит изокверцитрин, L-аргинин и щелочную соль аскорбиновой кислоты. В композиции молярное соотношение между изокверцитрином, L-аргинином и щелочной солью аскорбиновой кислоты составляет 1: 1,6-2,6: 0,16-1,95.
Детали изобретения указаны в описании ниже. Другие признаки, задачи и преимущества изобретения станут очевидными из подробного описания, чертежа, а также из прилагаемой формулы изобретения.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕЧЕРТЕЖА
На фиг.1 представлен график концентрации в плазме против времени после введения 500 мг изокверцитрина (IQC 500 мг) и 250 мг изокверцитрина в качестве изокверцитрина/L-аргинина (IQC 250 мг/Arg).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
Как упоминалось выше, в настоящем описании описана растворимая в воде композиция, которая содержит L-аргинин, изокверцитрин и щелочную соль аскорбиновой кислоты. Молярное соотношение между этими тремя компонентами составляет 1: 1,6-2,6: 0,16-1,95, предпочтительно 1: 1,8-2,5: 0,36-1,25. Иллюстративная растворимая в воде композиция содержит изокверцитрин, L-аргинин и щелочную соль аскорбиновой кислоты в молярном соотношении 1: 2,3: 0,42.
Примечательно, что щелочная соль аскорбиновой кислоты может представлять собой натриевую соль или калиевую соль. В конкретной композиции щелочная соль может представлять собой соль натрия.
Растворимая в воде фармацевтическая композиция также может включать витамин B1, витамин B3, витамин B6, витамин B9 или витамин B12, в дополнение к изокверцитрину, L-аргинину и щелочной соли аскорбиновой кислоты. Молярное соотношение изокверцитрина и каждого растворимого в воде витамина в композиции может составлять 1: 0,01-0,1.
Растворимая в воде фармацевтическая композиция может быть составлена для перорального введения или для местного введения. Например, композиция для перорального введения может представлять собой жидкость, капсулу, таблетку, пилюлю или гель. При составлении для местного введения композиция может представлять собой раствор, линимент, лосьон, крем, мазь, пасту, гель или эмульгель.
Растворимые в воде композиции изокверцитрина, L-аргинина и щелочной соли аскорбиновой кислоты, описанные выше, можно получать способами, указанными в патентных заявках США № 62/661255 и 62/720651, содержание которых включено в настоящее описание в качестве ссылок в полном объеме.
В растворимой в воде композиции изокверцитрин, как правило, присутствует в количестве 10 масс.% или выше (например, 20 масс.% или выше, 30 масс.% или выше, и 50 масс.% или выше). L-аргинин также присутствует в количестве 10 масс.% или выше (например, 20 масс.% или выше, 30 масс.% или выше, и 50 масс.% или выше). Щелочная соль аскорбиновой кислоты присутствует в количестве 2 масс.% или выше (например, 4 масс.% или выше, 6 масс.% или выше, и 10 масс.% или выше).
Изокверцитрин может быть в форме гидрата или в безводной форме. Аналогично, L-аргинин также может быть в форме гидрата или в безводной форме.
Растворимая в воде композиция, либо в твердой форме, либо в жидкой форме, может находиться в различных составах для фармацевтического, медицинского или косметического применения.
В одном варианте осуществления композиция находится в пероральном составе, например, жидкости, капсуле, таблетке, пилюле и геле. Иллюстративная композиция находится в капсуле или таблетке, каждая из которых сформирована с кишечно-растворимым покрытием. Кроме того, композиция может содержать фармацевтически активное вещество, фармацевтически приемлемый эксципиент или их комбинацию. Этот вариант осуществления включает композицию, которая представляет собой фармацевтическое лекарственное средство, пищевую добавку, натуральный медицинский продукт, косметический продукт, продукт питания или напиток.
В другом варианте осуществления композиция находится в местном составе, например, в одном из раствора, линимента, лосьона, крема, мази, пасты, геля и эмульгеля. Композиция, кроме того, может содержать фармацевтически активное вещество, приемлемый для местного применения эксципиент или их комбинацию. Этот вариант осуществления включает композицию, которая представляет собой косметический продукт, продукт для ухода за кожей или фармацевтическое лекарственное средство.
Без дальнейших деталей полагают, что специалист в данной области может на основе приведенного выше описании использовать настоящее изобретение в его наиболее полной степени. Таким образом, приведенные ниже конкретные примеры следует истолковывать как только иллюстративные, но не ограничивающие оставшуюся часть изобретения никоим образом. Публикации, цитированные в настоящем описании, включены в настоящее описание в качестве ссылок в полном объеме.
ПРИМЕР 1: Получение образцов изокверцитрина/L-аргинина
Иллюстративную смесь изокверцитрина/L-аргинина получали путем смешения 0,01 моль изокверцитрина с водным раствором, содержавшим 0,02 моль L-аргинина, нагревания смеси до 80°C до полного растворения изокверцитрина и добавления 0,001 моль аскорбата натрия. После охлаждения проводили тестирование стабильности изокверцитрина посредством нагревания смеси до 50°C и количественного определения посредством ВЭЖХ интактного изокверцитрина, оставшегося через 0 ч, 5 ч и 24 ч. Результаты показали, что количество интактного изокверцитрина через 5 ч и 24 ч при 50°C составляло 100% и 98,1%, соответственно, от первоначального количества изокверцитрина в растворе. Сходное испытание проводили для оценки стабильности флавоноида, родственного изокверцитрину, т.е. катехина, после растворения его L-аргинином и аскорбатом натрия. Количество интактного катехина, оставшееся в растворе через 5 ч и 24 ч при 50°C, составляло 30,8% и 2,3%, соответственно. Было совершенно неожиданным, что происходила деградация только 1,9% изокверцитрина через 24 ч, по сравнению с 97,7% катехина в идентичных условиях.
2
Вторую иллюстративную смесь изокверцитрина/L-аргинина получали, сначала растворяя 105,5 г L-аргинина (0,61 моль) в 845 мл HO, нагретой до 45°C, затем добавляя 20,9 г натриевой соли L-аскорбиновой кислоты (0,11 моль) и 46,5 г гидрогенизированного полидекстрина и перемешивая до полного растворения.
2
К описанному выше раствору добавляли 127 г изокверцитрина моногидрата (0,26 моль) и полученную смесь нагревали при 80°C в течение 30 мин. После завершения растворения изокверцитрина раствор сушили распылением и просеивали через сито размера 80. Любую оставшуюся HO выпаривали в вакууме с получением вязкого масла с последующей вакуумной сушкой при 60°C в течение 8 часов с получением желто-оранжевой твердой композиции (253,9 г).
ПРИМЕР 2: Получение состава капсул
TM
Составы изокверцитрина и изокверцитрина/L-аргинина получали с компонентами, представленными в таблице 1 ниже. Для исследований растворения составы использовали как есть. Для клинических испытаний составы инкапсулировали в устойчивые к кислотам капсулы гипромеллозы отсроченного высвобождения размера #1 (DRcaps), производимые Capsugel.
Таблица 1. Содержимое составов
Ингредиент
Состав 1
Состав 2
Состав 3
Изокверцитрин (мг) / (масс./масс.%)
250/77,9
125/32,2
62,5/19,9
L-аргинин (%)
26,7%
16,6%
аскорбиновая кислота, соль Na (масс./масс. %)
5,3%
3,2%
декстрин (масс./масс.%)
15,8%
11,8%
7,3%
Кристаллическая целлюлоза (масс./масс.%)
19,0%
46,7%
Сложный эфир глицерина и жирной кислоты (масс./масс. %)
6,3%
5,0%
6,3%
Итого (масс./масс.%)
100%
100%
100%
ПРИМЕР 3: Испытание растворимости
2
Способность изокверцитрина растворяться в HO из состава 1 и состава 2 определяли следующим образом.
2
Каждое из количества состава 1, содержавшего 500 мг изокверцитрина, и количества состава 2, содержавшего 250 мг изокверцитрина, добавляли для отделения 25 мл дистиллированной HO и встряхивали в течение 30 с. Аликвоту удаляли (0 мин.), после чего каждую смесь нагревали при 37°C при медленном перемешивании. Аликвоты собирали из каждой смеси через 5 мин и 30 мин после начала тепловой обработки. Каждую аликвоту пропускали через 0,45-мкм фильтр и измеряли концентрацию изокверцитрина в фильтрате посредством ВЭЖХ. Результаты представлены ниже в таблице 2.
Таблица 2. Растворимость изокверцитрина в воде
Время инкубации
Состав 1
Состав 2
Кратность отличий
0 мин
0,02 мг/мл
7,9 мг/мл
395
5 мин
0,06 мг/мл
9,9 мг/мл
165
30 мин
0,07 мг/мл
9,8 мг/мл
140
Результаты показывают, что количество изокверцитрина, растворившегося из состава 2, т.е. изокверцитрин/L-аргинин/аскорбат, было в 140-395 раз более высоким, чем количество изокверцитрина, растворившегося из состава 1, который свободен от L-аргинина и аскорбата. Очевидно, состав 2 содержит значительно более растворимый изокверцитрин чем состав 1.
ПРИМЕР 4 Испытание проницаемости в клетках Caco-2
Проникновение лекарственного средства в культивируемые клетки кишечника Caco-2 определяют для прогнозирования относительной скорости всасывания лекарственного средства при пероральном введении.
Составы 1 и 2, описанные выше в примере 2 добавляли по отдельности в раствор. 500-мкл аликвоту каждого образца добавляли на апикальную сторону клеток Caco-2, которые культивировали в течение 19 суток, и 2000 мкл буфера HBSS помещали на базолатеральную сторону клеток. Клетки культивировали в инкубаторе в течение 2 часов при 37°C, после чего среду извлекали как с апикальной, так и с базолатеральной стороны клеток. Концентрацию изокверцитрина в среде определяли посредством ВЭЖХ, и степень всасывания с апикальной стороны на базолатеральную сторону определяли по следующему уравнению:
.
Результаты показали, что состав 1, который содержал изокверцитрин, но был лишен L-аргинина и аскорбата, имел проницаемость 0,008%, в то время как состав 2, который содержал изокверцитрин, L-аргинин и аскорбат, демонстрировал выраженное повышение проницаемости (всасывания) в 37 раз до 0,298%.
Пример 5: Клиническое испытание фармакокинетики
Проводили рандомизированное клиническое фармакокинетическое испытание для сравнения трех различных составов изокверцитрина, описанных выше в примере 2, введенных в однократной дозе 10 добровольцам в условиях натощак. В испытании участвовали здоровые мужчины в возрасте от 24 до 39 лет включительно, имеющие величины индекса массы тела в диапазоне 19,6-24,3.
Капсулы, содержавшие составы 1-3, показанные в таблице 1, получали как описано выше. Каждый доброволец принимал две капсулы, содержавшие (i) состав 1 (IQC; всего 500 мг изокверцитрина), (ii) состав 2 (IQC/Arg; всего 250 мг изокверцитрина) или (iii) состав 3 (IQC/Arg; всего 125 мг изокверцитрина) в течение трех суток испытания, вводимых в соответствии с заранее рандомизированной последовательностью.
Уровни изокверцитрина измеряли в образцах крови, взятых от участников перед дозированием (0 ч) и через 0,5, 1, 2, 4 и 8 ч после дозирования в соответствии с установленными методиками. Более конкретно, для определения уровней изокверцитрина плазму, полученную из каждого образца крови, сначала обрабатывали для расщепления метаболитов изокверцитрина на агликоны кверцетин и изорамнетин, которые затем количественно определяли посредством ВЭЖХ.
Helix pomatia
В кратком изложении, образцы плазмы объемом 200 мкл смешивали с 10 мкл 10% дитиотреитола и 50 мкл 0,58 моль/л уксусной кислоты. Смесь обрабатывали 1000 Е бета-глюкуронидазы и 100 Е/мл сульфатазы, обе из  типа HP-2, в 0,1 M натрий-ацетатном буфере (pH 5,0) в течение 120 мин при 37°C.
2
После расщепления к каждому образцу добавляли 500 мкл 10 мМ щавелевой кислоты и смесь центрифугировали при 10000 × g в течение 5 мин. Все обработанные образцы подвергали твердофазной экстракции с использованием предварительно кондиционированных кассет Oasis HLB в соответствии с инструкциями изготовителя (Waters, Milford MA USA). Экстрагированные элюаты упаривали в атмосфере азота и подвергали анализу посредством ВЭЖХ путем нанесения каждого элюита на колонку C18 (Waters ACQUITY UPLC BEH; 1,7 мкм, 2,1×100 мм), применения градиентной системы растворителей для ВЭЖХ из 0,1% муравьиной кислоты в HO/ 0,1% муравьиной кислоты в ацетонитриле, и детекции присутствия кверцетина и изорамнетина с использованием спектрометра LC быстрого разделения, Ultimate 3000, Q Exactive. Концентрацию каждого агликона вычисляли с использованием стандартной кривой, полученной с аутентичными внутренними стандартами кверцетина и изорамнетина. Предел анализа для кверцетина и изорамнетина в описанных выше условиях составлял 0,03 мкМ при 4°C.
max
Профили фармакокинетики представлены на фиг.1. Следует отметить, что введение IQC/Arg 125 мг приводило к профилю фармакокинетики, сходному с профилем фармакокинетики IQC/Arg 250 мг, но с величинами C и AUC, составляющими приблизительно половину от величин, наблюдаемых при более высокой дозе, что указывает на дозозависимую взаимосвязь.
Величины фармакокинетики, вычисленные из профилей, сходных с профилями, представленными на фиг.1, указаны в таблице 3 ниже.
Таблица 3. Фармакокинетика
Параметры
Обработка
IQC 500 мг
IQC/Arg 250 мг
IQC/Arg 125 мг
AUC (мкмоль·ч/л) (0-8 ч)
8,1±1,7
12,5±1,7
4,5±0,9
C<sub>max</sub> (мкМ)
2,2±0,4
4,2±1,0
1,2±0,3
T<sub>max</sub> (ч)
3,8±0,2
2,1±0,2
3,6±0,6
t<sub>1/2</sub> (ч)
1,7±0,2
37,2±16,1
4,3±1,3
AUC (мкмоль·ч/л) (0-∞ ч)
9,6±2,4
76,0±31,4
6,4±1,6
max
Результаты неожиданно показали, что IQC/Arg 250 мг достигал максимальной концентрации в плазме (C) 4,2 мкМ, которая практически в 2 раза превышала концентрацию 2,2 мкМ, продемонстрированную IQC 500 мг. Также было неожиданным, что площадь под кривой, экстраполированная на бесконечность [AUC (0-∞ ч)], являющаяся оценкой общей доступности лекарственного средства, для IQC/Arg 250 мг была практически в 8 раз большей, чем у IQC 500 мг, несмотря на тот факт, что вводили только половину изокверцитрина. Очевидно, эти данные указывают на статистически значимое улучшение всасывания изокверцитрина, когда он был в комбинации с L-аргинином.
max
max
Более того, C и AUC (0-6 ч), ранее описанные для ферментативно модифицированного изокверцитрина (вводимого в дозе 2 мг кверцетина агликона/кг массы тела) составляли 1,84 мкМ и 5,99 мкмоль·ч/л, соответственно. См. Murota et al. Напротив, соответствующие величины C и AUC (0-6 ч) для IQC/Arg 250 мг (вводимого в дозе 2,56 мг кверцетина агликона/кг массы тела) составляли 3,32 мкМ и 9,27 мкмоль·ч/л, что указывает на более высокую биодоступность изокверцетина из состава IQC/Arg по сравнению с ферментативно модифицированным изокверцитрином, несмотря на то, что вводили сходные дозы изокверцитрина.
ДРУГИЕ ВАРИАНТЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
Все из признаков, описанных в описании, можно комбинировать в любой комбинации. Каждый признак, описанный в настоящем описании, может быть заменен альтернативным признаком, имеющим такое же, эквивалентное или сходное назначение. Таким образом, если нет иных явных указаний, каждый описанный признак является только примером общей серии эквивалентных или сходных признаков.
Кроме того, из приведенного выше описания специалист в данной области может без труда установить существенные характеристики настоящего изобретения и без отклонения от его сущности и объема и может внести различные изменения и модификации изобретения для адаптации его к различным применениям и условиям. Таким образом, также в объем формулы изобретения входят другие варианты осуществления.