Влияние структурно-функциональных свойств деминерализованного костного матрикса на возможность заселения его клетками и на их жизнеспособность с целью создания эффективных тканеинженерных конструкций

УДК 616.8-091.94

А.В. КОРЕЛЬ, А.А. ВОРОПАЕВА, Л.А. ЧЕРДАНЦЕВА, И.А. КИРИЛОВА

Новосибирский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии имени Я.Л. Цивьяна МЗ РФ

Влияние структурно-функциональных свойств деминерализованного костного матрикса на возможность заселения его клетками и на их жизнеспособность с целью создания эффективных тканеинженерных конструкций

Контактная информация:

Корель Анастасия Викторовна — кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник научно-исследовательского отдела организации научных исследований

Адрес: 630091, Новосибирск, ул. Фрунзе, д. 17, тел. +7-923-744-11-16, e-mail: AKorel@niito.ru

Изучено влияние свойств деминерализованного костного матрикса губчатой и компактной кости человека на свойства клеток остеогенного и хондрогенного ряда, заселенных на костную матрицу для создания тканеинженерных конструкций. Проведено предварительное исследование физико-механических, прочностных, морфологических характеристик и пьезоэлектрических свойств образцов деминерализованного костного матрикса. В исследовании in vitro определена возможность заселения образцов деминерализованного костного матрикса клетками остеогенного ряда и хондрогенного ряда и их влияние на сам матрикс. Методом цитохимического окрашивания проведена идентификация гистопринадлежности клеток, заселяемых на костные матрицы. Выявили взаимосвязь равномерности и глубины заселения деминерализованного костного матрикса клетками остеогенного и хондрогенного ряда с условиями обработки матрикса, его свойствами, а также более выраженную степень резорбтивной способности клеток остеогенного ряда в отношении материала матриц, чем у клеток хондрогенного ряда.

Ключевые слова: костно-пластические материалы, тканеинженерные конструкции, деминерализованный костный матрикс, культивирование клеток, клетки остеогенного и хондрогенного ряда.

DOI: 10.32000/2072-1757-2019-1-73-75

A.V. KOREL, AA VOROPAEVA, L.A. CHERDANTSEVA, I.A. KIRILOVA

Novosibirsk Research Institute of Traumatology and Orthopaedics named after Ya. L. Tsivyan

Effect of structural and functional properties of demineralized bone matrix on the possibility of settling cells and their viability to create effective tissue engineering constructions

Contact details:

Korel A.V. — D. Sc. (biology), Leading Researcher

Address: 1 Frunze St., Novosibirsk, Russian Federation, 630091, tel.: +7-923-744-11-16, e-mail: AKorel@niito.ru

74 ПРАКТИЧЕСКАЯ МЕДИЦИНА

Том 17, №1. 2019

The effect was studied of the properties of demineralized bone matrix of spongy and compact human bone upon the properties of osteogenic and chondrogenic cells, which were populated on the bone matrix in order to create tissue engineering structures for regenerative medicine. The samples were preliminarily studied for physical-mechanical, strength, morphological characteristics and piezoelectric properties of demineralized bone matrix. In vitro, the possibility of populating the selected samples of demineralized bone matrix by osteoblast and chondrocyte cells and their effect on the matrix itself was determined. By cytochemical coloring method, the histological belonging of cells populated in the bone matrix was determined. The relationship was found between the evenness and depth of populating the demineralized bone matrix by osteogenic and chondrogenic cells and the processing conditions of the matrix, and matrix properties. The expressed resorptive ability of osteogenic cells in relation to the matrix material was revealed compared to the cells of chondrogenic series.

Key words; bone-plastic materials; tissue-engineering constructions; demineralized bone matrix; cultivation of cells; cells of osteogenic and chondrogenic series.

Необходимость восстановления анатомической и функциональной целостности костной ткани является актуальной задачей современной хирургии [1, 2], решение которой связано с использованием биологических имплантатов в разных областях реконструктивно-пластической хирургии [3, 4, 5]. Поиск новых материалов, способных активировать остеогенез с целью формирования органотипиче-ского регенерата на основе костно-пластических материалов (КПМ), является актуальным и связан с использованием КПМ на основе костной ткани донора. Предварительная физико-химическая обработка костной ткани может обуславливать изменение биологических и структурно-функциональных свойств нативной аллогенной костной ткани при имплантации. С целью обеспечения запросов практической хирургии необходима разработка биоинженерных конструкций, пригодных для замещения костных дефектов, обладающих анатомо-прочност-ными характеристиками донорской костной ткани и высоким регенераторным потенциалом. Одной из современных тенденций биоинженерии тканей является заселение матриц костными клетками реципиента с сохранением основных витальных функций [6].

Цель исследования - изучение влияния свойств деминерализованного костного матрикса губчатой и компактной кости человека на возможность заселения клеток остеогенного и хондрогенного ряда на костную матрицу с целью создания эффективных тканеинженерных конструкций.

Материал и методы

В качестве потенциального матрикса для создания тканеинженерных конструкций были изготовлены образцы деминерализованного костного матрикса (ДКМ) губчатой и компактной кости человека методом освобождения от клеток с получением иммунотолерантной конструкции на основе естественного матрикса. Для изучения физико-механических, прочностных характеристик, морфологии и пьезоэлектрических свойств образцов ДКМ был применен комплексный подход: метод электронной сканирующей микроскопии (изучение микроструктуры образцов костного матрикса); метод восстановленного отпечатка путем вдавливания алмазной

четырехгранной пирамидой Виккерса с углом 136° между противоположными гранями (измерение микротвердости и нанотвердости образцов); метод исследования на трехточечный изгиб на универсальной настольной электромеханической испытательной машине Instron 3369 (США, «Instron»); метод макрофотосъемки (анализ пористости образцов костной ткани); запись пьезоэлектрических потенциалов с образца компактной деминерализованной аллокости [7]. В качестве образцов матриц использовали ДКМ размером 1x1x1 см с поэтапной физико-химической очисткой до нейтральных значений pH для удаления цитотоксических веществ. Выполнено исследование in vitro с использованием клеток остеогенного и хондрогенного ряда (гиалинового хряща) мини-поросенка, полученных с соблюдением положений Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации и Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных (приказ Министерства Здравоохранения Российской Федерации от 19.03.2003 г. № 226). Хондроциты выделяли стандартным способом с культивированием в течение 20 суток. Перед заселением матриц хондроцитами 1-го пассажа, для повышения эффективности клеточной адгезии на костный матрикс осуществляли 3-х кратное воздействие ультразвуком с предварительной обработкой ДКМ 1% раствором желатина [8]. Идентификацию гистопринадлежности клеток, заселяемых на костные матрицы, осуществляли методами цитохимического окрашивания с использованием ализаринового красного (наличие кальциевых депозитов) и альцианового синего (гликозаминогликаны).

Результаты исследования

Макроскопически морфология образцов костной ткани одинакового размера была представлена пористой структурой с различным расположением пор и меньшей пористостью в образцах компактной ДКМ. По результатам комплексного исследования были выявлены различия физико-механических, морфологических и прочностных характеристик губчатого и компактного образцов ДКМ. Исходя из литературных данных и по результатам собственного исследования, выявили, что для заселения дифференцированными клетками остеогенного ряда наиболее подходящими являются образцы

губчатого костно-пластического материала [9, 10]. При идентификации гистопринадлежности клеток, заселенных на костные матрицы, выявили их принадлежность к хондро- и остеогенному ряду. В серии исследований выявили более низкую эффективность заселения образцов ДКМ клетками хондрогенного ряда, в сравнении с показателями у клеток остеогенного ряда, что, возможно, связанно с жесткими условиями изготовления и последующей подготовки матрицы [8]. При этом увеличение глубины миграции клеток в структуры матрицы сопровождалось нарушениями микроциркуляции с недостаточной трофикой клеток в глубоких слоях тканеинженерной конструкции и, как следствие, замедлением метаболических процессов с нарушением витальных характеристик. Однако после обработки матриц желатином детектировали высокую степень насыщения тела матрицы хондрогенными клетками, но с меньшей их адгезией в лакунах. Так же выявили преобладание резорбтивной способности в отношении материала ДКМ у клеток остео-генного ряда, в сравнении с таковым у хондроци-тов. Лизирование матрицы из деминерализованной костной ткани лизосомальным экстрактом хондро-цитов развивалось в течение 3 суток и составило 9,6%, а литический потенциал клеток костной ткани, который оценивали по активности катепсина К и суммарной активности матриксных металлопроте-аз в гомогенате костной ткани, характеризовался уменьшением объема матрицы на 10% за 1,5 суток.

Обсуждение

Равномерность и глубина заселения деминерализованного костного матрикса клетками остеогенного и хондрогенного ряда связана не только с условиями обработки матрикса, обусловливающими его физико-химические, прочностные характеристики, но и с его морфологией. А резорбтивные способности клеток остеогенного ряда в отношении материала матриц из ДКМ более выражены у клеток остеогенного происхождения, в сравнении с аналогичными способностями у хондроцитов. Проблема замедления метаболизма клеток в тканеинженер-ной конструкции в виде ДКМ может быть устранена путем комбинирования физико-химического метода очистки ДКМ с ультразвуковым способом.

Выводы

Полученные результаты свидетельствуют о оптимальной пригодности деминерализованной костной

матрицы из губчатой костной ткани человека для эффективного заселения клеток остеогенного и, в меньшей степени, хондрогенного ряда, при условии комбинирования методов подготовки ДКМ для их эффективного функционирования с целью активации процессов репаративной регенерации костной ткани при реконструктивно-пластическом хирургическом лечении.

Корель А.В.- ORCID ID: 0000-0002-2945-3658 Воропаева А.А. - ORCID ID: 0000-0001-8609-1764 Черданцева Л.А. - ORCID ID: 0000-0002-4729-3694 Кирилова И.А. - ORCID ID: 0000-0003-1911-9741

ЛИТЕРАТУРА

1. Кирилова И.А. Анатомо-функциональные свойства кости как основа создания костно-пластических материалов для травматологии и ортопедии: автореф. дис. ... д-ра мед. наук. - Новосибирск, 2011.

2. Нигматуллин Р.Т., Щербаков Д.А., Мусина Л.М. и др. Некоторые аспекты клинического применения костных и хрящевых аллотрансплантатов // Медицинский вестник Башкортостана. -2012. - T. 7, № 4. - C. 78-83.

3. Швец А.И., Ивченко В.К. Костные трансплантаты и их заменители в хирургии позвоночника // Ортопедия, травматология и протезирование. - 2008. - T. 3. - C. 66-69.

4. Подорожная В.Т., Кирилова И.А., Шаркеев Ю.П. и др. Изучение структурно-функциональных характеристик срединных распилов головок бедренных костей. Успехи современного естествознания. - 2015. - T. 9. - C. 126-129.

5. Грудянов А.И., Николаев А.В. Сравнительный анализ отдаленных результатов использования различных ауто- и аллотрансплантатов для создания зоны кератинизированной десны при вестибулопластике на нижней челюсти // Стоматология. - 2016. -Т. 95, № 1. - С. 40-43.

6. Murphy S.V., Atala A. Organ engineering - combining stem cells, biomaterials, and bioreactors to produce bioengineered organs for transplantation // Bio essays. - 2012. - № 35. - P. 163-172.

7. Кирилова И.А., Подорожная В.Т., Шаркеев Ю.П., и др. Свойства деминерализованного костного матрикса для биоинженерии тканей // Комплексные проблемы сердечно-сосудистых заболеваний. - 2017. - Т. 6. - № 3. - С. 25-36.

8. Щелкунова Е.И., Воропаева А.А., Корель А.В. и др. Заселение деминерализованного костного матрикса клетками хондрогенного ряда // Комплексные проблемы сердечно-сосудистых заболеваний. - 2018. - Т. 7, № 2. - С. 102-111.

9. Швец А.И., Ивченко В.К. Костные трансплантаты и их заменители в хирургии позвоночника // Ортопедия, травматология и протезирование. - 2008. - № 3. - С. 66-69.

10. Hofer S., Leopold S.S., Jacobs J. Clinical perspectives on the use of bone graft based on allografts In: Laurencin CT, editor. Bone graft substitutes // West Conshohocken, PA: ASTM International. -2003. - P. 68-95.