Способ прогнозирования врожденной расщелины губы и нёба у ребёнка при планировании беременности в регионе с экотоксикантами с применением генетических маркеров
METHOD FOR PREDICTING CONGENITAL CLEFT LIP AND PALATE IN A CHILD WHEN PLANNING PREGNANCY IN A REGION WITH ECOTOXICANTS USING GENETIC MARKERS

Изобретение относится к медицине, а именно к стоматологии, и может быть использовано для прогнозирования врожденной расщелины губы и нёба у ребенка при планировании беременности в регионе с экотоксикантами с применением генетических маркеров.
Врожденная расщелина губы и нёба (ВРГН) - это тяжелый порок развития челюстно-лицевой области, проявляющийся нарушением непрерывности верхней губы, альвеолярного отростка и нёба и сопровождающийся значимыми функциональными нарушениями. Вероятной причиной формирования ВРГН является воздействие факторов внешней среды, таких как физические факторы (радиация, температура), химические соединения, обладающие тератогенным действием, а также биологические агенты.
Проведенные близнецовые и семейные исследования выявили, что генетические факторы играют важную роль в этиологии ВРГН [Lie RT, 1994, GeX, 2019]. Показано, что при семейном наследовании риск рецидива в первом поколении родственников у лиц с ВРГН примерно в 40 раз больше, чем в общей популяции. В некоторых родословных можно установить менделевский тип наследования [LieRT, 2001, SkjaervenR,. 1999]. Однако в большинстве случаев ВРГН представлен несиндромальной формой, т.е. является многофакторным заболеванием. Несиндромальная расщелина губы и нёба является одним из наиболее распространенных полигенных заболеваний [Ge X,. 2019]. На развитие такой формы ВРГН оказывают влияние факторы окружающей среды. В сочетании определенных факторов внешней среды и генотипа формируется большинство случаев ВРГН, что усложняют осуществление генетического анализа несиндромальных форм ВРГН и раннее выявление таких случаев.
Используя более узкий и функционально обоснованный метод анализа генетических изменений, так называемый ген-кандидатный подход, были выявлены гены, ассоциированные с ВРГН. В последнее время стали активно изучаться гены, участвующие в биотрансформации ксенобиотиков (CYP1A1, GSTM1, NAT2), принимающие участие в обезвреживании чужеродных соединений у человека. Вместе с тем, получаемые при этом ассоциации отличаются противоречивостью, что объясняется различными частотами полиморфных вариантов этих генов в различных популяциях. Интересным представляется тот факт, что при одинаковом воздействии вредных факторов среды на организм беременных женщин не у всех рождаются дети с ВРГН. Это можно объяснить с точки зрения наличия генетически детерминированной индивидуальной чувствительности организма на действие среды. В данной связи актуальным представлялось провести анализ полиморфных вариантов генов детоксикации ксенобиотиков у матерей.
Наиболее близким аналогом изобретения является способ прогнозирования возникновения врожденной расщелины губы и нёба у детей, проживающих в регионе с нефтехимической промышленностью, заключающийся в том, что методом комплексного молекулярно-генетического анализа полиморфизма генов ферментов детоксикации ксенобиотиков CYP1A1, GSTM1 и GSTP1 установлена ассоциация мутантного аллеля Val полиморфного локуса Ile462Val гена CYP1A1 с риском развития расщелины верхней губы и нёба, выявлена взаимосвязь мутантного аллеля Val полиморфного локуса Ile105Val гена GSTP1 с риском развития расщелины губы и нёба у мальчиков. Молекулярно-генетический анализ проведен у 100 больных с изолированной ВРГН, в возрасте от 6 месяцев до 17 лет, находившихся на лечении в отделении челюстно-лицевой хирургии РДКБ [Шайхутдинова Д.И. Использование генетических маркеров для прогнозирования возникновения врожденной расщелины губы и нёба у детей, проживающих в регионе с нефтехимической промышленностью. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук. Москва-2007]. Недостатком прототипа является недостаточная точность прогноза, так как исследование проводили с использованием крови детей, локусы аллелей Val гена CYP1A1 и Val гена GSTP1 менее эффективны и менее изучены и проверены на практике.
Техническим результатом изобретения является повышение точности прогноза.
Предлагаемый способ прогнозирования ВРГН у ребенка при планировании беременности в регионе с экотоксикантами осуществляется следующим образом. Кровь матери набирают в пробирки со стандартным консервантом (ЭДТА) в соотношении 4:1.
Для получения ДНК необходимой степени чистоты и достаточного молекулярного веса используют метод выделения ДНК из крови фенольно-хлороформной экстракцией, описанный Мэтью [Mathew С.С. The isolation of high molecular weight eucariotic DNA // Methods in Molecular Biology. / Ed. Walker J.M., N.Y., L.: Human Press.; - 1984. - V. 2. - P.31-34].
2
1. Кровь в пробирке с консервантом тщательно перемешивают и переливают в центрифужный стакан на 100 мл, туда же добавляют 40 мл охлажденного лизирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% раствор тритона Х-100, 5 мМ MgCl, 10 мМтрисНСl (рН 7,6).
2. Смесь центрифугируют при 4°С и 4000 об/мин в течение 20 минут.
2
3. Надосадочную жидкость сливают, к получившемуся осадку повторно добавляют 10 мл охлажденного лизирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% раствор тритона Х-100, 5 мМ MgCl, 10 мМтрисНСl (рН 7,6).
4. Смесь центрифугируют при 4°С и 4000 об/мин в течение 10 минут.
5. Полученный осадок ресуспензируют в 400 мкл буфера SolineEDTA (25 мМ EDTA, NaCl 5М, рН8,0).
6. Добавляют 40 мкл 10% SDS и 30-40 мклпротеиназы К («Promega» США; 10 мг/мл).
7. Инкубируют при 37°С в течение 16 часов.
Экстракцию ДНК осуществляют в следующем порядке.
1. Раствором забуференного фенола (200 мклмеркаптоэтанола на 50 мл фенола - Трис-HCI, рН 7,8), смесью фенола - хлороформа (1:1) и хлороформом (2 мл изоамилового спирта на 48 мл хлороформа) в равных объемах (1000 мкл) с плавным перемешиванием на ротаторе в течение 10 мин.,
2. Центрифугируют при 10000-12000 об/мин в течение 8-10 мин и отбирают водную фазу, содержащую ДНК, РНК и неденатурированные белки после каждого этапа.
3. Преципитацию ДНК производят добавлением двух объемов охлажденного 96% этанола.
4. Осажденную ДНК дважды промывают 96% раствором этилового спирта.
5. Подсушивают на воздухе.
2
6. Образовавшийся осадок ДНК растворяют в 1,5 мл деионизированной HO; раствор хранят при -20°С.
В дальнейшем полученную ДНК используют в качестве матрицы для полимеразной цепной реакции (ПЦР) для амплификации полиморфных локусов генов GSTM1 и GSTP1.
2
Состав реакционной смеси для ПЦР следующий: 1,25 мкл 10Х ПЦР-буфера (60 MMTris-HCl, рН 8,5, 1,5 mM MgCl, 25 mMKCl, 10 mM 2-меркаптоэтанол, 0,1% тритон Х-100), 1,0 мкл смеси 5 мMdNTP («Сибэнзим»), около 200 нг геномной ДНК, 1 едТаq-полимеразы («Сибэнзим»), необходимое количество деионизированной воды до объема 12,5 мкл, а также по 0,5 мкл соответствующих праймеров, предварительно разбавленных до концентрации 1 ОЕ/мл.
Режим амплификации следующий: предварительная денатурация (94°С, 5-7 мин), 30-32 цикла амплификации: денатурация - 94°С, 40 сек; отжиг - 55°С (температура варьирует от 54°С до 60°С) 40 сек; синтез -72°С, 1 мин, завершающий синтез (72°С, 5 - мин).
После амплификации ПЦР-продукты всех полиморфизмов подвергают гидролизу соответствующими эндонуклеазами рестрикции. Для этого 5 мкламплификата смешивают с 5 ед. фермента в соответствующем буфере, смесь выдерживают при определенной температуре согласно рекомендациям производителей («Сибэнзим», «Fermentas», «Promega») в течение ночи.
Специфические последовательности олигонуклеотидных праймеров для гена GSTM1 взяты из работы Baranova H., et al., 1997 [Baranova, H., Bothorishvilli, R., Canis, M., Albuisson, E., Perriot, S., Glowaczower, E.,... &Malet, P. (1997). Glutathione S-transferase Ml gene polymorphism and susceptibility to endometriosis in a French population. Molecular human reproduction, 3(9), 775-780.].
Специфические последовательности олигонуклеотидных праймеров для гена GSTP1 взяты из ра6оты Harries LW. et al, 1997 [Harries LW, Stubbins MJ, Forman D, Howard GC, Wolf CR. Identification of genetic polymorphisms at the glutathione S-transferase Pi locus and association with susceptibility to bladder, testicular and prostate cancer. Carcinogenesis. 1997 Apr;18(4):641-4. doi: 10.1093/carcin/18.4.641. PMID: 9111193.].
Амплифицированные фрагменты ДНК разделяют электрофоретически в 7-8%-ном полиакриламидном неденатурированном геле (ПААГ). Электрофорез проводят в однократном трисборатном буфере (0,089 МТрис-HCl рН=7,8; 0,089 M борная кислота; 0,002 M ЭДТА с рН=8,0) в вертикальных стеклянных пластинах при постоянном напряжении 250-300 вольт после 30-минутного преэлектрофореза. Перед нанесением на гель пробы смешивают в соотношении 1:5 с буфером, содержащим 0,25% бромфенолового синего, 0,25% ксиленцианола, 15% фикола. Для визуализации результатов гель окрашивают раствором бромистого этидия (0,1 мкг/мл) в течение 10 минут и анализируют в проходящем ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе («VilberLourmat», ТСР-20М). Размеры аллелей определяют путем одновременного электрофореза с маркером (ДНК фага λ, гидролизированный рестриктазой PstI).
Идентификацию генотипов гена GSTM1 проводят следующим образом: наличие ПЦР-продукта размером 271 пн интерпретируют как нормальный вариант (генотип GSTM1*N или NN), отсутствие ПЦР-продукта интерпретируют как наличие делеции в гомозиготном состоянии (генотип GSTM1*del или del/del).
Идентифицированные генотипы AG-GG полиморфного локуса rsl695 гена GSTP1 выявляют следующим образом. Аллель А размером 176 пн, аллель G размером 91 пн и 85 пн. Соответственно гомозиготы АА имеют одну полосу продукта определяемую как 176 пн, гетерозиготы AG имеют три полосы, 176 пн, 91 пн и 85 пн и гомозиготы GG на электрофорезе определяются двумя полосами 91 пн и 85 пн.
При выявлении в сочетании рисковых генотипов двух генов глутатион-S-трансфераз: делеции гена GSTM1 и генотипов AG или GG локуса rsl695 гена GSTP1 прогнозируют высокий риск рождения ребенка с врожденной расщелиной губы и нёба.
В качестве контроля обследовали группу практически здоровых индивидов, проживающих на территории Республики Башкортостан (119 человек), не имеющих данной патологии.
Результаты молекулярно-генетического анализа делеции гена GSTM1 и генотипов AG-GG локуса rsl695 гена GSTP1 у матерей с детьми с врожденной расщелиной губы и нёба (25 человек) и в контрольной группе, не имеющих данной патологии, представлены в таблице 1.
Анализ распределения генотипов и аллелей генов глутатион-S-трансфераз показал, что у родителей-носителей делеции гена GSTM1 чаще рождались дети с ВРГН (OR=2.65 (CI 95% 1.10-6.41), Р=0.028). Статистически значимая ассоциация была показана и при сравнении частот аллелей. В группе родителей детей с ВРГН частота делеции достигала 60.0% тогда как у здорового контроля на долю этого аллеля приходилось 36.13% (табл. 1). Показатель отношения шанса в родительской группе составил OR=2.65 (CI 95% 1.42-4.95), Р=0.003.
Статистически значимые различия были получены в аддитивной модели (OR=2.21 (CI 95% 1.05-4.67), Р=0.038) (табл. 2). В данном случае присутствие аллеля G в генотипе пациента увеличивает риск рождения ребенка с ВРГН в 2.21 (CI 95% 1.05-4.67), (Р=0.038).
Сущность изобретения поясняется следующими клиническими примерами.
Пример 1. Пациентка И., 29 лет, имеет наследственную отягощенность по ВРГН (в анамнезе ВРГН у сестры). Обратилась по вопросу определения генетического риска развития будущего ребенка. У матери было взято 4 мл венозной крови с последующим выделением ДНК методом фенольно-хлороформной экстракции и амплификацией фрагментов генов GSTP1 и GSTM1 в реакционной смеси, содержащей 0,1-1 мкг геномной ДНК, 1 ед. Taq-полимеразы, 0,25 мкМ каждого олигопраймера, 250 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата в 25 мкл однократного буфера для ПЦР. После амплификации провели электрофорез фрагментов гена GSTM1 при постоянном напряжении 250-300 вольт после 15-минутного преэлектрофореза. После окончания электрофореза гель окрасили раствором бромистого этидия в течение 10 минут и анализировали при ультрафиолетовом освещении на трансиллюминаторе.
Было осуществлено расцепление полученного амплификата локуса rsl695 гена GSTP1 с добавлением фермента BsoMAI. Получен гетерозиготный генотип AG, определяющий повышенный риск ВРГН.
При исследовании полиморфного локуса GSTM1 был выявлен генотип del/del, при котором показатель соотношения шансов развития ВРГН составляет 2.65 (таблица 1). Вывод: учитывая повышенный генетический риск ВРГН у ребенка пациента, родителям были предложены превентивные мероприятия: прием фолиевой кислоты и поливитамины, отказ от вредных привычек. Данные рекомендации не были выполнены в полном объеме, дочь пациентки родилась с ВРГН.
Пример 2. Пациентка Я., 35 лет, имеющая факторы риска ВРГН - работа во вредных условиях труда. Было предложено проведение молекулярно-генетического исследования для определения риска развития ВРГН при следующих беременностях. У пациентки Я. было взято 4 мл венозной крови с последующим выделением ДНК методом фенольно-хлороформной экстракции и амплификацией фрагментов генов GSTP1 и GSTM1 в реакционной смеси, содержащей 0,1-1 мкг геномной ДНК, 1 ед. Taq-полимеразы, 0,25 мкМ каждого олигопраймера, 250 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата в 25 мкл однократного буфера для ПЦР. После амплификации провели электрофорез фрагментов при постоянном напряжении 250- 300 вольт после 15-минутного преэлектрофореза. После окончания электрофореза гель окрасили раствором бромистого этидия в течение 10 минут и анализировали при ультрафиолетовом освещении на трансиллюминаторе. При исследовании полиморфного локуса rsl695 гена GSTP1 был выявлен генотип пониженного риска АА (показатель соотношения шансов развития ВРГН составляет 0,45), а при исследовании полиморфного локуса гена GSTM1 был выявлен генотип NN (таблица 1). Прогноз в отношении развития ВРГН благоприятный. В дальнейшем пациентка к врачу не обращалась.
Пример 3. Пациентка А. имеет первого ребенка с ВРГН, причем пациентка работает во вредных условиях труда нефтехимического производства. Обратилась по вопросу определения генетического риска развития будущего ребенка. У матери было взято 4 мл венозной крови с последующим выделением ДНК методом фенольно-хлороформной экстракции и амплификацией фрагментов генов GSTP1 и GSTM1 в реакционной смеси, содержащей 0,1-1 мкг геномной ДНК, 1 ед. Taq-полимеразы, 0,25 мкМ каждого олигопраймера, 250 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата в 25 мкл однократного буфера для ПЦР. После амплификации провели электрофорез фрагментов гена GSTM1 при постоянном напряжении 250-300 вольт после 15-минутного преэлектрофореза. После окончания электрофореза гель окрасили раствором бромистого этидия в течение 10 минут и анализировали при ультрафиолетовом освещении на трансиллюминаторе.
Было осуществлено расцепление полученного амплификата локуса rsl695 гена GSTP1 с добавлением фермента BsoMAI. Получен гомозиготный GG генотип, определяющий высокий риск ВРГН.
При исследовании полиморфного локуса GSTM1 был выявлен генотип del/del.
Вывод: учитывая высокий генетический риск ВРГН у ребенка пациента, родителям были предложены превентивные мероприятия: прием фолиевой кислоты и поливитамины, отказ от вредных привычек и отказ от работы на вредном производстве. Данные рекомендации не были выполнены в полном объеме, ребенок пациентки родился с ВРГН.