МНОГОКАНАЛЬНЫЙ КАПИЛЛЯРНЫЙ ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗАТОР

Настоящая полезная модель относится к области аналитического приборостроения, а конкретно - к области генетического анализа с использованием метода капиллярного электрофореза. Генетические анализаторы предназначены для секвенирования и фрагментного анализа ДНК с целью обеспечения потребностей медицины и медико-биологических научных исследований, в частности для установления первичной структуры молекул ДНК, выделенных из биологических образцов (крови и ткани пациентов), а также для санитарного, экологического, медико-биологического и криминалистического контроля.
Повышенная производительность анализаторов достигается за счет обеспечения выполнения параллельных анализов нескольких исследуемых образцов при использовании системы из нескольких капилляров.
Известен прибор для капиллярного электрофореза, содержащий систему капилляров, к которым через световоды подводится лазерное излучение, две системы линз, одна из которых фокусирует лазерное излучение на каждый из капилляров, вторая система линз собирает флуоресцентный сигнал с каждого из капилляров в соответствующий световод. Посредством модуляции флуоресцентные сигналы капилляров разделяются при детектировании (ЕР 0793098 А1, МПК 6 G01N 27/447, G01N 21/59, G01N 21/64, опубл. 1997 г.). Этот известный прибор характеризуется относительно сложной системой фокусировки на капилляры и обеспечивает возможность использования не более десяти капилляров.
Известна система множественной флуоресцентной детекции с использованием по крайней мере двух капилляров. Узел облучения каждого капилляра содержит источник лазерного излучения, которое фокусируется одним из объективов и подводится к торцу каждого капилляра посредством световодов. Узел детекции с помощью второго объектива собирает флуоресцентный сигнал, который регистрируется ПЗС-матрицей (патент США N 5498324, МПК 6 G01N 27/26, опубл. 1996 г.). Недостатком этой системы является сложность конструкция его оптической части, имеются серьезные проблемы с фокусировкой на капилляр.
Известно другое устройство, предназначенное для разделения и анализа высокомолекулярных биополимеров методом электрофореза, содержащее систему капилляров. Излучение лазера, сфокусированное линзой, облучает одновременно все капилляры. При этом флуоресцентный сигнал собирается оптической системой, включающей линзу и светофильтр, отрезающий лазерное излучение и через световод подается на регистрирующее устройство, а через аналого-цифровой преобразователь поступает в компьютер для последующей обработки (патент США N 5584982, МПК 6 G01N 27/26, G01N 27/447, опубл. 1996 г.).
Недостатком этого устройства является значительно снижение удельной мощности, падающей на каждый капилляр вследствие одновременного облучения всех капилляров. Сбор флуоресцентных сигналов может быть обеспечен только с применением многоканального приемника, который по чувствительности уступает одноканальному приемнику. Эти особенности конструктивного выполнения устройства не позволяют достичь оптимальных результатов.
Известна система для возбуждения и детекции излучения от множества капиллярных каналов, содержащая капилляры, расположенные на поперечно сканирующем столике. Лазерный источник облучает капилляры в зоне детекции, а оптический сигнал преобразуется оптической системой, включающей объектив, фокусирующий лазерное излучение и собирающий флуоресцентный сигнал, дихроичное зеркало, отражающее лазерное излучение и направляющее его в объектив, а также пропускающее флуоресцентный сигнал,. два светофильтра, один из которых отрезает отраженное от капилляра лазерное излучение, а второй - интерференционный светофильтр. Пройдя эту оптическую систему, сигнал регистрируется фотоэлектронным умножителем (ФЭУ). В одном из вариантов реализации устройства, флуоресцентный сигнал может разделяться на четыре эквивалентных пучка, каждый из которых пропускают через соответствующий интерференционный светофильтр и регистрируют ФЭУ. Сигнал с ФЭУ после усиления поступает в компьютер для соответствующей обработки (патент США N 5274240, МПК 6 G01, N 21/64, опубл. 1993 г.). Основным недостатком этой системы является необходимость многократного изгиба капилляров при расположении их на сканирующем столике.
Наиболее близкой к настоящей полезной модели по технической сущности и достигаемому результату при использовании является многоканальный капиллярный генетический анализатор (патент РФ №2145078, МПК G01N 21/64, G01N 27/447, опубл. 2000 г.).
В этом анализаторе технический результат заключается в повышении чувствительности анализатора за счет ориентации лазерного излучения под углом α к оси микрообъектива, а также за счет использования оптической схемы, включающей дифракционную решетку.
Чтобы обеспечить этот технический результат, в известном многоканальном капиллярном генетическом анализаторе с использованием электрофореза, содержащем заполненные разделяющим полимером и расположенные на сканирующем столике капилляры, концы которых помещены в катодную и анодную ванночки и подключены к источнику высокого напряжения, устройство когерентного излучения, включающее лазер и узел фокусировки лазерного излучения, оптическую систему, включающую микрообъектив и блок спектрального анализа флуоресцентного сигнала, блок регистрации флуоресцентного сигнала, соединенный с компьютером, устройство когерентного излучения ориентирует лазерное излучение на капилляр под углом 10°-80° к оси микрообъектива, оптическая система содержит установленные последовательно по ходу оптического луча микрообъектив, узел визуального контроля фокусировки на капилляр и блок спектрального анализа флуоресцентного сигнала, включающий дифракционную решетку, разлагающую флуоресцентный сигнал в спектр, и фокусирующие линзы, установленные по ходу соответствующих спектральных полос, блок регистрации флуоресцентного сигнала содержит фотоприемники, расположенные в фокусах соответствующих линз блока спектрального анализа, при этом выход каждого фотоприемника через АЦП соединен со входом компьютера, а дополнительный фотоприемник для регистрации отраженного лазерного излучения размещен в спектральной полосе, соответствующей лазерному излучению и его выход соединен с одним из входов АЦП;
- а также тем, что в нем устройство когерентного излучения содержит второй лазер, а узел фокусировки лазерного излучения включает расположенные последовательно по ходу лазерного излучения одного из лазеров смеситель, зеркало, фокусирующую линзу и второе зеркало, установленное в оптическом канале второго лазера, ориентирующее излучение на смеситель, который может быть выполнен в виде дихроичного зеркала;
- узел контроля фокусировки на капилляр содержит установленные последовательно по ходу отраженного флуоресцентного сигнала отражатель, линзу, экран и окуляр, причем отражатель установлен подвижно с возможностью его вывода из оптического канала с флуоресцентным сигналом по окончании процесса фокусировки, отражатель при этом может быть выполнен в виде призмы полного внутреннего отражения, а экран - в виде матового стекла;
- блок регистрации флуоресцентного сигнала может содержать интерференционные светофильтры, расположенные перед соответствующими фотоприемниками, в качестве которых могут быть использованы фотоэлектронный умножитель, или фотодиод, или ПЗС-линейка, или ПЗС-матрица.
Принципиальная схема такого анализатора приведена на фиг.1.
Капилляры 1, наполненные разделяющим полимером, размещены в специальном узле крепления 2 на поперечно сканирующем столике. К концам капилляров, помещенных в катодную 4 и анодную 5 ванночки, заполненные буферным раствором, приложено высокое напряжение. В зоне детекции капилляры под углом одновременно облучаются двумя лазерами: 532 нм 6 и 488 нм 7. Лазеры 6, 7, зеркала 8, 9, линза 10 и дихроичное зеркало 11 образуют устройство когерентного излучения 12, в котором зеркало 8 служит для направления излучения второго лазера на смеситель, выполненный в виде дихроичного зеркала 11, зеркало 9 служит для направления смешанного лазерного излучения на капилляры, а линза 10 фокусирует это излучение внутри капилляра. Флуоресцентный сигнал собирается микрообъективом 13 и разлагается в спектр дифракционной решеткой 14 в блоке спектрального анализа 15. Четыре спектральные линии после прохождения через соответствующие интерференционные светофильтры 16 фокусируются линзами 17 на соответствующие фотоэлектронные умножители (ФЭУ) 18 блока регистрации флуоресцентного сигнала 19. Сигналы с каждого ФЭУ через аналого-цифровой преобразователь 20 поступают в компьютер 21 для окончательной обработки. Присвоение спектральной характеристики конкретному капилляру происходит по сигналу с дополнительного фотоприемника, в качестве которого может использоваться фотодиод 22, т.к. сигнал на фотодиоде 22 возникает только в случае наличия отраженного от капилляра лазерного излучения, что, в свою очередь, происходит лишь в момент попадания капилляра в фокус объектива 13. Фотодиод 22 расположен в спектральной полосе, соответствующей лазеру 532 нм. Для проверки фокусировки объектива 13 на капилляр предусмотрен узел визуального контроля фокусировки 23, состоящий из последовательно установленных подвижной призмы 24, линзы 25, матового стекла 26 и окуляра (на фиг.1 не показан). В момент проверки фокусировки призма 24 находится в положении, показанном на фиг.1; после проверки призма 24 выводится из оптического канала в положение, показанное на фиг.1 пунктиром.
Фотодиод 22 расположен в спектральной полосе, соответствующей длине волны лазерного излучения, и предназначен для улавливания отраженного от внешней поверхности капилляра 1 лазерного луча. В тот момент, когда капилляр попадает в зону детекции, т.е. в фокус микрообъектива 13, лазерный луч отражается от поверхности капилляра 1, и на фотодиоде 22 возникает соответствующий электрический сигнал. Этот сигнал служит командой для накопления данных с этого капилляра и записи в соответствующий файл.
Основные недостатки этой системы обусловлены многократным изгибом капилляров при сканировании. Изгиб капилляров может привести к их разрушению, поскольку на столике расположена та часть капилляров, в которой для получения оптического окна удалена оболочка, обеспечивающая механическую прочность капилляров. Капилляры, размещенные на поперечно сканирующем столике, затруднительно разместить в термостате.
Другими недостатками этой системы является сложность конструкции: используются два устройства для фокусировки на капилляр лазерного луча и фокусировки на капилляр микрообъектива. Еще одно устройство используется для совмещения лучей двух лазеров.
Предлагаемая полезная модель лишена этих недостатков и решает задачу повышения надежности и стабильности, а также упрощения конструкции и методики настройки.
Указанная задача решается за счет того, что в многоканальном капиллярном генетическом анализаторе с использованием электрофореза, содержащем заполненные разделяющим полимером капилляры, концы которых помещены в катодную и анодную ванночки и подключены к источнику высокого напряжения, лазер, микрообъектив и блок спектрального анализа флуоресцентного сигнала, содержащий множество фотоприемников, расположенных в фокусах соответствующих линз блока спектрального анализа и соединенных с компьютером, по ходу лазерного луча расположены дихроичный фильтр, отражающий прямой и обратный лазерные лучи и пропускающий флуоресцентный сигнал, и зеркало, при этом зеркало и микрообъектив расположены на санирующем устройстве, снабженном датчиком положения для обеспечения при сканировании фокусировки лазерного луча последовательно на каждый неподвижный капилляр, для сбора флуоресцентного сигнала и для передачи его в блок спектрального анализа. Таким образом, повышается надежность и стабильность предлагаемого анализатора за счет устранения многократного изгиба капилляров и неподвижного их расположения, при этом сканирование обеспечивается перемещением микрообъектива. А помещение рабочего участка капилляров в термостат и использование устройства выделения дополнительной спектральной полосы (пятой) флуоресцентного сигнала для калибровки длины исследуемых фрагментов ДНК еще более усиливают стабильность и надежность анализатора. Использование микрообъектива для одновременного обеспечения оптимального совмещения лазерного луча с капилляром и получения сигнала флуоресценции при возможности использования одного лазера и реактивов для флуоресцентного переноса энергии значительно упрощает конструкцию и методику настройки прибора.
В предлагаемом многоканальном капиллярном генетическом анализаторе использованы технические решения, приведенные на функциональной схеме, изображенной на фиг.2.
Предлагаемый многоканальный капиллярный генетический анализатор с использованием электрофореза содержит заполненные разделяющим полимером капилляры 1, концы которых помещены в катодную 2 и анодную 3 ванночки и подключены к источнику высокого напряжения 4, лазер 5, микрообъектив 6 и блок спектрального анализа флуоресцентного сигнала 7, содержащий интерференционные светофильтры 8 и линзы 9, блок регистрации флуоресцентного сигнала 10, содержащий множество фотоприемников 11, расположенных в фокусах соответствующих линз блока спектрального анализа и соединенных с компьютером 12.
В предлагаемом анализаторе по ходу лазерного луча расположены дихроичный фильтр 13, отражающий прямой и обратный лазерные лучи и пропускающий флуоресцентный сигнал, и зеркало 14, при этом зеркало 14 и микрообъектив 6 расположены на сканирующем устройстве с датчиком положения 15, и обеспечивают при сканировании фокусировку лазерного луча последовательно на каждый неподвижный капилляр, сбор флуоресцентного сигнала, а также передачу его в блок спектрального анализа флуоресцентного сигнала.
Сканирующее устройство с зеркалом и микрообъективом при сканировании капилляров перемещается вдоль направления лазерного луча, падающего на зеркало.
Блок спектрального анализа флуоресцентного сигнала содержит дихроичные фильтры 16 для разделения спектральных полос флуоресцентного сигнала.
Блок спектрального анализа флуоресцентного сигнала содержит узкополосный режекторный фильтр (notch filter) 17 лазерного излучения.
Блок спектрального анализа флуоресцентного сигнала и блок регистрации флуоресцентного сигнала содержат зеркало 18, интерференционный светофильтр 19, линзу 20 и фотоприемник 21 для выделения дополнительной спектральной полосы (пятой) флуоресцентного сигнала и получения электрического сигнала для калибровки длин фрагментов ДНК.
Для контроля фокусировки микрообъектива на капилляр и контроля мощности лазера анализатор содержит светоделительную пластину 22, нейтральные светофильтры 23 и 24, передающие часть прямого и обратного лазерного луча на дополнительные фотоприемники 25 и 26. Светоделительная пластина установлена подвижно с возможностью вывода ее из оптического канала.
Рабочий участок заполненных разделяющим полимером капилляров 1 помещен в термостат 27.
Предлагаемый анализатор снабжен устройством ввода геля, содержащим насос 28, клапаны 29, 30 и сосуд с гелем 31.
Предлагаемый анализатор снабжен позиционером 32, в который устанавливаются катодная ванночка 2 и планшет с исследуемыми образцами 33.
Сканирующее устройство с датчиком положения, термостат, дополнительные фотоприемники, насос, клапаны и позиционер соединены с компьютером.
Исследуемые образцы в планшете 33 содержат реактивы, обеспечивающие получение нескольких спектральных полос флуоресцентного сигнала за счет флуоресцентного переноса энергии при возбуждении от одного лазера. Флуоресцентный перенос энергии - это перенос энергии возбужденного состояния от донора к акцептору без промежуточного испускания фотонов. Флуоресцентный перенос энергии происходит в результате диполь-дипольных и других взаимодействий между флуоресцентными красителями.
Предлагаемый многоканальный капиллярный генетический анализатор работает следующим образом. Работа выполняется по заданной программе в автоматическом режиме. Генетические анализы многочисленных проб выполняются без участия оператора. Выбирается и стабилизируется оптимальная температура капилляров в термостате. При закрытом клапане 29 и открытом клапане 30 насос 28 заполняется гелем из сосуда 31. При закрытых клапанах 29 и.30 насос заполняет капилляры гелем. При открытом клапане 29 капилляры соединяются с анодной ванночкой 3. Позиционер 32 совмещает лунки планшета с исследуемыми образцами с концом капилляра. На заданное время включается источник высокого напряжения 4, при этом электрокинетическим способом в капилляры вводятся пробы. Позиционер 32 совмещает катодную ванночку 2 с концом капилляра. Включается источник высокого напряжения 4. За счет электрофореза выполняется разделение флуоресцентно-меченных фрагментов ДНК.
Фотоприемник 26 предназначен для улавливания отраженного от внешней поверхности капилляра 1 лазерного луча. Когда лазерный луч отражается от поверхности одного из капилляров 1, то на выходе фотоприемника 26 возникает электрический сигнал, который служит командой для регистрации сигналов флуоресценции от этого капилляра.
Воспроизводимость нумерации капилляров обеспечивается сканирующим устройством с датчиком положения 15.
В результате регистрации сигналов флуоресценции от 4 спектральных каналов на экране компьютера получаются по 4 графика от проб в каждом капилляре. На этих графиках пики соответствуют четырем видам нуклеотидов, составляющих молекулу ДНК. Объединение этих графиков при вторичной обработке позволяет расшифровывать нуклеотидную последовательность ДНК.
Предлагается добавлять в пробы маркер для калибровки анализатора, при этом в пятом спектральном канале получаются графики с пиками фрагментов известной длины. Сравнение положения пиков на 5 графиках позволяет определить длину всех исследуемых фрагментов. Применение калибровки в реальном времени позволяет устранить ошибки при определении последовательности и длины фрагментов ДНК, связанные с нестабильностью работы анализатора.
Положительный эффект при применении предлагаемой полезной модели заключается в повышении надежности и стабильности, а также в упрощении конструкции и методики настройки. В предлагаемом анализаторе не нужно многократно изгибать капилляры. Сканирование капилляров обеспечивается перемещением микрообъектива, при этом исключена раздельная регулировка положения луча лазера и микрообъектива, поскольку с помощью микрообъектива обеспечено оптимальное совмещение лазерного луча с капилляром и одновременное получение сигнала флуоресценции. Термостатирование рабочего участка капилляров и калибровка длин исследуемых фрагментов ДНК значительно повышают стабильность анализатора и воспроизводимость результатов анализов. Не требуется совмещать при настройке лучи двух лазеров. За счет применения реактивов для флуоресцентного переноса энергии удается обеспечить получение всех спектральных полос сигнала флуоресценции с помощью одного лазера.
Источники информации
1. Патент ЕР 0793 098 А1, МПК 6 G01N 27/447, G01N 21/59, G01N 21/64, опубл. 1997 г. Прибор для капиллярного электрофореза.
2. Патент США N5498324, МПК 6 G01N 27/26, опубл. 1996 г. Система множественной флуоресцентной детекции.
3. Патент США N5584982, МПК 6 G01N 27/26, G01N 27/447, опубл. 1996 г. Устройство, предназначенное для разделения и анализа высокомолекулярных биополимеров методом электрофореза.
4. Патент США N5274240, МПК 6 G01, N 21/64, опубл. 1993 г. Система для возбуждения и детекции излучения от множества капиллярных каналов.
5. Патент РФ №2145078, МПК G01N 21/64, G01N 27/447, опубл. 2000 г. Многоканальный капиллярный генетический анализатор (прототип).