Противотуберкулезное средство на основе производного пиридоксина
ANTITUBERCULAR AGENT BASED ON A PYRIDOXINE DERIVATIVE

Изобретение относится к химии органических гетероциклических соединений, а именно - к новому производному пиридоксина формулы I в виде смеси E и Z-изомеров, проявляющему противотуберкулезную активность. Соединение может найти применение в медицине и ветеринарии.
World Health Organization. Global Tuberculosis Report. - Geneva, Switzerland, 2020. - 232 р.
Туберкулез - инфекционное заболевание, с которым человечество борется уже не одно тысячелетие. В настоящее время туберкулез занимает девятое место среди основных причин смертности в мире. Согласно оценкам ВОЗ, в 2020 году число умерших от туберкулеза составило 1.2 миллиона человек, а число вновь заболевших около 10 миллионов, причем порядка 500 тысяч из них заболели туберкулезом с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ-ТБ) - формой туберкулеза, вызываемой бактериями, нечувствительными к самым эффективным препаратам первого ряда - изониазиду и рифампицину - одновременно. Успех лечения МЛУ-ТБ составляет лишь около 50% и требует длительной терапии (от 12 месяцев и более) с использованием большого количества препаратов первого и второго ряда [].
M. tuberculosis
katG
C. Vilchèze, W.R. Jacobs Jr. The mechanism of isoniazid killing: clarity through the scope of genetics / Annu. Rev. Microbiol. - 2007. - V. 61. - P. 35-50.
Важнейшим противотуберкулезным препаратом первого ряда является изониазид. Изониазид обладает высокой бактерицидной активностью (МИК = 0.05 мкг/мл) в отношении штаммов , превосходя все другие противотуберкулезные препараты. Изониазид является пролекарством и, проникнув в микобактерию путем пассивной диффузии, подвергается окислению ферментом каталазой-пероксидазой (синтез этого фремента контролирует ген ) [].
P. Preziosi. Isoniazid: Metabolic Aspects and Toxicological Correlates / Curr. Drug Metab. - 2007. - V. 8, N. 8. - P. 839-851.
Важнейшими недостатками изониазида являются его гепатотоксическое и нейротоксическое действие. Кроме того, в настоящее время многие штаммы микобактерий выработали к нему устойчивость [].
B. Mathew, J. Suresh, M.J. Ahsan, G.E. Mathew, D. Usman, P.N.S. Subramanyan, K.F. Safna, S. Maddela. Hydrazones as a Privileged Structural Linker in Antitubercular Agents: A Review / Infect. Disord. Drug Targets. - 2015. - V. 15, N. 2. -P. 76-88.
Изоникотиноилгидразоны являются самым обширным классом производных изониазида, относящихся к классу гидразонов. Во-первых, их популярность объясняется легкостью образования иминной связи через конденсацию изониазида с карбонильными соединениями. Во-вторых, замещение терминального атома азота изониазида относительно лабильным фрагментом позволяет контролировать метаболизм и распределение [].
М.Н. Щукина, Г.Н. Першин, Е.Д. Сазонова, О.О. Макеева Ароматические изоникотиноилгидразоны - новый класс химиотерапевтических противотуберкулезных веществ / Проблемы туберкулеза. - 1954. - №. 2. - С. 44-50.
.
Машковский, М.Д. Лекарственные средства / М.Д. Машковский. 16 - е изд., перераб., испр. и доп. - М.: Новая волна: Издатель Умеренков, 2014. - 1216 с.
А.В. Сыроешкин, Н.А. Степанова, П.И. Попов, А.В. Балышев, Т.В. Плетнева. Прогнозирование токсичности химических соединений группы противотуберкулезных лекарственных средств методом количественных корреляций структура-активность / Судебно-медицинская экспертиза - 2009. - №4. - С. 28-31
Фтивазид (изоникотиноилгидразон 3-метокси-4-оксибензальдегида) - изоникотиноилгидразон, разработанный еще во времена СССР []Фтивазид применяется при лечении лекарственно-чувствительного туберкулеза у людей с ослабленным иммунитетом, когда применение изониазида нежелательно []. Недостатками фтивазида являются, во-первых, его меньшая, по сравнению с изониазидом, противотуберкулезная активность (МИК = 1 мкг/мл) [], а во-вторых, быстрая выработка к нему устойчивости у микобактерий туберкулеза.
Машковский, М.Д. Лекарственные средства / М.Д. Машковский. 16 - е изд., перераб., испр. и доп. - М.: Новая волна: Издатель Умеренков, 2014. - 1216 с.
Салюзид (изоникотиноилгидразон 2-карбокси-3,4-диметоксибензальдегида) - еще один изоникотиноилгидразон, применяемый в клинической практике. Применение салюзида, также как и фтивазида, основано на его меньшей токсичности, которая позволяет проводить лечение больных с ослабленным иммунитетом []. Как и в случае с фтивазидом, салюзид проявляет более низкую противотуберкулезную активность и формирует устойчивость к нему у микобактерий туберкулеза.
6
Patent US2810725; C07D213/86. Pyridoxal derivatives of isonicotinic acid hydrazide / B. Jack; Olin Mathieson Chemical Corporation. - Опубл. - 22.10.1957.
P. Ponka, J. Borova, J. Neuwirt, O. Fuchs Mobilization of iron from reticulocytes: Identification of pyridoxal isonicotinoyl hydrazone as a new iron chelating agent / FEBS Lett. - 1979. - V. 97, N. 2. - P. 317-321.
Изоникотиноилгидразон пиридоксаля (PIH) - соединение, полученное конденсацией пиридоксаля (активной формы витамина В) и изониазида - в 50-60-ых годах прошлого века рассматривался как перспективный противотуберкулезный препарат []. Однако в 1979 году выяснилось, что изоникотиноилгидразон пиридоксаля имеет сильное сродство к ионам железа, которое вызывает железодефицитную анемию []. По этой причине дальнейшая разработка этого соединения как противотуберкулезного препарата была прекращена.
S. Ellis, D.S. Kalinowski, L. Leotta, M.L.H. Huang, P. Jelfs, V. Sintchenko, D.R. Richardson, J.A. Triccas Potent Antimycobacterial Activity of the Pyridoxal Isonicotinoyl Hydrazone Analog 2-Pyridylcarboxaldehyde Isonicotinoyl Hydrazone: A Lipophilic Transport Vehicle for Isonicotinic Acid Hydrazide / /Mol. Pharmacol. - 2014. - V. 85, N. 2. - P. 269-278.
E. Becker, D.R. Richardson. Development of novel aroylhydrazone ligands for iron chelation therapy: 2-pyridylcarboxaldehyde isonicotinoyl hydrazone analogs / Transl. Res. - 1999. - V.134, N. 5. - P. 510-521.
Другой ближайший аналог заявленного изобретения - изоникотиноилгидразон 2-пиридилкарбальдегид [] хоть и проявляет высокую в сравнении с изониазидом противотуберкулезную активность, но также склонен к комплексообразованию с ионами железа, и поэтому вызывает аналогичные изоникотиноилгидразон пиридоксалю побочные эффекты [].
.
Следует отметить, что описанные выше лекарственные средства, по мнению заявителя, не могут рассматриваться в качестве аналогов к заявленному изобретению вследствие того, что они не совпадают с заявляемым соединением по химической структуре, хотя и обладают сходной в целом противотуберкулезной активностью (совпадают по назначению), сопоставимой с заявленным техническим решением в большей или меньшей степени
Задачей заявленного технического решения является создание нового высокоактивного и малотоксичного противотуберкулезного средства на основе производного пиридоксина, с целью расширения арсенала известных средств указанного назначения.
Техническим результатом заявленного технического решения является получение нового соединения формулы I, содержащего в своем составе как фрагмент природного соединения (пиридоксина), так и фрагмент противотуберкулезного препарата изониазида.
E, Z
Задача решается, и указанный технический результат достигается посредством синтеза нового производного пиридоксина формулы I: () - изоникотиноилгидразона 3-гидрокси-4,5-бис(гидроксиметил)-2-метилпиридин-6-карбальдегида:
Сущностью заявленного технического решения является производное пиридоксина I, обладающее противотуберкулезной активностью:
Заявленное техническое решение иллюстрируется Фиг.1 - Фиг.8.
На Фиг. 1
M. Tuberculosis
приведена Таблица 1, в которой представлены значения минимальной ингибирующей концентрации (МИК) (в мкг/мл) для соединения I, а также препаратов сравнения на штамме  H37Rv.
На Фиг. 2
M. Tuberculosis
приведена Таблица 2, в которой представлены характеристики лекарственно-устойчивых изолятов , где:
ЛУ - лекарственная устойчивость к препаратам: S - стрептомицин, H - изониазид, R - рифампицин, E - этамбутол, K - канамицин, Et - этионамид, Cap - капреомицин, A - амикацин, Z - пиразинамид;
МЛУ - множественная лекарственная устойчивость.
На Фиг. 3
M. Tuberculosis
приведена Таблица 3, в которой представлены значения минимальной ингибирующей концентрации (МИК) (в мкг/мл) для соединения I на лекарственно-устойчивых изолятах .
На Фиг. 4
50
приведена Таблица 4, в которой представлены значения СС для соединения I и препаратов сравнения на различных клеточных линиях.
На Фиг. 5
приведена Таблица 5, в которой представлены результаты исследования острой токсичности соединения I при внутрижелудочном введении мышам.
На Фиг. 6
M. Tuberculosis H37Rv
приведена Таблица 6, в которой представлены показатели тяжести течения туберкулезной инфекции у мышей C57black/6, зараженных , через 5 недель от начала лечения.
На Фиг. 7
M. Tuberculosis H37Rv
приведена Таблица 7, в которой представлена высеваемость микобактерий туберкулеза из легочной ткани мышей C57black/6, зараженных , через 5 недель от начала лечения.
На Фиг. 8
K
T
2
приведена Таблица 8, в которой представлены условные ступенчатые константы образования (lg) комплексов железа(III) c соединениями I и изоникотиноилгидразоном пиридоксаля (PIH) при pH 6.0 на фоне MES-буфера (0.01 М),  = 25.0±0.1°C.
Далее заявителем приведено описание заявленного технического решения.
Заявленное соединение I получают по нижеприведенной Схеме 1:
Схема 1
Характеристики нового соединения, а также описание его синтеза, приведены далее в примерах конкретного выполнения.
1
13
1
13
Структура полученного соединения подтверждена методами масс-спектрометрии, Н и С ЯМР-спектроскопии. Спектры ЯМР регистрировали на приборе Bruker AVANCE-400. Химический сдвиг определялся относительно сигналов остаточных протонов дейтерированных растворителей (H и С). Температуру плавления определяли с помощью прибора Stanford Research Systems MPA-100 OptiMelt. ВЭЖХ/МС-эксперимент был проведен с использованием масс-спектрометра TripleTOF 5600, AB Sciex (Германия) из раствора в метаноле методом ионизации - турбоионный спрей (TIS) - при энергии столкновения с молекулами азота 10 еВ.
Далее заявителем приведены примеры конкретного выполнения заявленного технического решения.
E, Z
Пример 1. Получение соединения формулы (I) - () - изоникотиноилгидразона 3-гидрокси-4,5-бис(гидроксиметил)-2-метилпиридин-6-карбальдегида (см. Схему 1).
N.V. Shtyrlin, O.A. Lodochnikova, Yu.G. Shtyrlin Regioisomeric oximes and thiosemicarbazones derived from 6-substituted pyridoxines / Mendeleev Commun. - 2012. - V. 22, N. 3. - P. 169-170.
2
Раствор альдегида 1 (0.45 г, 1.89 ммоль) [] в 3 мл смеси HO/HOAc (10:1) перемешивают в течение 5 часов при 60 °C. Затем добавляют изониазид (0.26 г, 1.89 ммоль) и реакционную смесь перемешивают еще 2 часа при той же температуре. Далее растворитель удаляют в вакууме, остаток заливают водой, нерастворившийся осадок отфильтровывают и промывают водой и метанолом.
E:Z
Выход: 73% (0.43 г); смесь  изомеров = 7:3; желтое кристаллическое вещество; т.пл. 198-205 °С (разл.).
1
3
3
3
1
3
3
3
d
Е
d
Z
6
3
2
2
HH
2
HH
HH
6
3
2
2
HH
2
HH
HH
H
H
H
H
H
H
СпектрH ЯМР (ДМСО-) -изомер, δ, м.д.: 2.40 (c, 3H, CH), 4.72 (c, 2H, COH), 4.81 (c, 2H, COH), 5.16 (т, 1Н, J = 6.7 Гц, CHO), 7.77 (AA’ часть AA’XX’ системы, 2Н, J= 6.0 Гц), 8.41 (с, 1Н, СН=N), 8.81 (XX’ часть AA’XX’ системы, 2Н, J= 6.0 Гц), 12.26 (уш.с, 1H, NH).СпектрH ЯМР (ДМСО-) -изомер, δ, м.д.: 2.49 (c, 3H, CH), 4.72 (c, 2H, COH), 4.81 (c, 2H, COH), 5.35 (т, 1Н, J = 5.1 Гц, CHO), 7.82 (д, AA’ часть AA’XX’ системы, 2Н, J=6 Гц), 7.77 (с, 1Н, СН=N), 8.85 (д, XX’ часть AA’XX’ системы, 2Н, J= 6 Гц), 15.96 (с, 1H, NH).
13
1
d
Е
Z-
6
3
3
2
2
2
2
пир
СпектрC {H} ЯМР (ДМСО-) смесь- и изомеров, δ, м.д.: 19.54 (CH), 19.57 (CH), 54.95 (c, CH), 55.66 (CH), 55.85 (CH), 55.87 (CH), 121.11, 121.27, 121.56, 123.02, 133.06, 133.94, 134.31, 136.08, 137.93, 140.90, 140.79, 141.21, 141.55, 144.48, 146.09, 149.57, 149.97, 150.20, 150.44, 150.57, 150.81, 150.85 (С+С=N), 161.71 (C=O), 161.94 (C=O).
М+H
+
+
11
14
4
Масс-спектр (HRMS-ESI): Найдено 317.1252 []. Вычислено для [CHNO]-317.1244.
in vitro
Пример 2. Исследование противотуберкулезной активности соединения формулы I
Mycobacterium tuberculosis
Первоначально исследование противотуберкулезной активности соединения I проводили на чувствительном референтном штамме  H37Rv TBC # 1/47.
A. Martin, M. Camacho, F. Portaels, J.C. Palomino. Resazurin microtiter assay plate testing of Mycobacterium tuberculosis susceptibilities to second-line drugs: rapid, simple, and inexpensive method / Antimicrob. Agents Chemother. - 2003. - V. 47, N. 11. - P. 3616-3619.
Минимальную ингибирующую концентрацию (МИК) определяли с помощью метода REMA [].
В качестве препаратов сравнения использовали широко используемые в клинической практике противотуберкулезные препараты изониазид, рифампицин, этамбутол, а также моксифлоксацин.
M. tuberculosis
37
Трехнедельную культуру  HRv TBC # 1/47 (источник - Институт гигиены и эпидемиологии, Прага. 1976 г., получен 03.10.2018 из ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России), выращенную на плотной яичной среде Левенштейна-Йенсена, вносили в сухую стерильную пробирку и затем дробно добавляли 5 мл бульона Миддлбрука 7Н9. Взвесь клеток оставляли для осаждения крупных конгломератов на 40 мин.
Стоковые растворы тестируемых соединений с концентрацией 10 мг/мл в диметилсульфоксиде в день опыта доводили до концентрации 10 мкг/мл бульоном Миддлбрука 7Н с ростовой добавкой OADC. Раствор исследуемого вещества вносили в 96-луночные стерильные планшеты и производили последовательное двукратное разведение. Конечные концентрации препарата: 0.02-0.04-0.08-0.16-0.31-0.62-1.25-2.5-5.0 мкг/мл.
M. tuberculosis
Во все лунки вносили рабочую суспензию  в объеме 100 мкл, после чего планшеты инкубировали в течение 7 дней в термостате при температуре +35 °С.
На 7 сутки инкубации во все лунки добавляли по 30 мкл водного раствора резазурина с концентрацией 0.01 %. Планшеты повторно инкубировали 18 ч при +35 °С. Рост бактерий регистрировали как визуально по изменению цвета индикатора резазурина (с голубого на розовый), так и с помощью планшетного флуориметра FLUOstarOptima (длина волны возбуждения - 520 нм, излучения - 590 нм). Величину МИК вычисляли как средние значения интенсивности свечения индикатора роста (резаруфина, в который превращается резазурин при воздействии комплекса редуктаз микроорганизмов). Минимальной ингибирующей концентрацией считали концентрацию препарата, в которой среднее значение флуоресценции значимо не превышало среднего значения 1 % контроля роста и/или точку выхода кривой на «плато». Полученные результаты представлены в Таблице 1 на Фиг.1.
Как видно из представленных данных, соединение I существенно превосходит по своей активности этамбутол, но несколько уступает рифампицину, моксифлоксацину и изониазиду по своей активности.
Mycobacterium tuberculosis
rpoB
katG, inhA, ahpC
Далее для соединения I было проведено исследование противотуберкулезной активности на 3 клинических штаммах  с множественной лекарственной устойчивостью и различными сочетаниями мутаций в генах (резистентность к рифампицину),  (устойчивость к изониазиду). Штаммы были выделены из респираторного материала больных впервые выявленным инфильтративным туберкулезом легких, проходивших лечение в клинике ФГБУ «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии» Минздрава России в период с 2009 по 2011 годы (штамм 5023 - в 2009 г.; штамм 7126 - в 2010 г.; штамм 2712 - в 2011 г.). Характеристика штаммов приведена в Таблице 2 на Фиг.2.
Данные по исследованию представлены в Таблице 3 на Фиг.3. Для соединения I величина МИК на всех клинических штаммах составила 2.5 мкг/мл, что представляет особенный интерес, поскольку все эти штаммы устойчивы к изониазиду.
in vitro
Пример 3. Исследование цитотоксичности соединения I
in vitro
Для соединения I была проведена оценка токсичности  на 4 условно-нормальных клеточных линиях (WI38 - эмбриональные клетки легкого человека, HEK 293 - эмбриональные клетки почки человека, Ch.L -клетки печени, MSK-мультипатентные клетки)) с использованием МТT-теста в сравнении с изониазидом, этамбутолом и моксифлоксацином.
2
Клетки (3 тыс. клеток в лунке) культивировали в 90 мкл среды α-MEM в стандартных условиях в 96-луночном культуральном планшете в течение суток (для их прикрепления к поверхности дна лунки). Далее добавляли 10 мкл раствора тестируемого соединения и инкубировали в стандартных условиях в течение 72 часов. Концентрация стокового раствора составляла 10 мг/мл. Далее среду с препаратами заменяли на чистую среду α-MEM 80 мкл и добавляли по 20 мкл МТТ-реагента (5 мг/мл), инкубировали в CO-инкубаторе при температуре 37 °С в течение 3.5 часов, затем убирали среду и добавляли 100 мкл ДМСО. По истечении 10 минут измеряли оптическую плотность клеточных растворов при 555 нм (референтная длина волны - 650 нм) на планшетном ридере TECAN (Швейцария). Результаты представляли в процентном отношении к контролю, не подвергавшемся действию препаратов. Результаты исследования представлены в Таблице 4 на Фиг. 4.
in vitro
in vivo
Как видно из представленных данных, соединение I  является существенно менее токсичным (в 1.5-3 раза) в сравнении с референсными противотуберкулезными препаратами, что позволяет предполагать его меньшую нефро- и гепатотоксичность в экспериментах .
in vivo
Пример 4. Исследование острой токсичности соединения I в эксперименте на мышах
10
16
50
84
Исследование острой токсичности соединения I проводилось на мышах линии ICR (CD-1) (6-8 недель, 20-25 г) обоего пола, по 6 голов в группе. Использовалось однократное внутрижелудочное введение каждого из тестируемых соединений в объеме не более 1.0 мл на 25 г массы тела мыши. После введения тестируемого вещества животные наблюдались индивидуально на протяжении 30 минут, затем не реже раза в час на протяжении 4-х часов, далее ежедневно 1 раз в день в течение 14 дней. Расчет токсических доз ЛД, ЛД, ЛД и ЛД производился с использованием пробит-анализа в программном обеспечении IBM SPSS Statistics. Результаты исследования представлены в Таблице 5 на Фиг.5.
50
50
50
Brennan, P.J. Isoniazid / P.J. Brennan, D.B. Young // Tuberculosis. - 2008. - V. 88, Iss. 2. - P. 112-116
von Keutz, E. Preclinical safety evaluation of moxifloxacin, a novel fluoroquinolone / E. von Keutz, G. Schlüter // J. Antimicrob. Chemother. - 1999. - V. 43, Iss. 2. - P. 91-100.
Обобщая данные по исследованию острой токсичности соединения I необходимо отметить, что при внутрижелудочном введении мышам в дозе 2000 мг/кг не наблюдалось гибели животных и величина ЛДдля него составляет более 2000 мг/кг. Таким образом, соединение I существенно менее токсично, чем изониазид (ЛД при внутрижелудочном введении мышам составляет 170 мг/кг [.]) и моксифлоксацин (ЛД при внутрижелудочном введении мышам составляет 500 мг/кг []).
in vivo
Пример 5. Исследование противотуберкулезной активности соединения I в релевантных моделях  на мышах
in vivo
Оценка терапевтической эффективности соединения I была исследована в релевантной модели  на мышах-самцах линии C57black/6.
Введение изучаемых соединений модельным животным начинали на четвертый день после заражения.
Препаратами сравнения служили противотуберкулезные препараты в средних терапевтических дозах: изониазид в дозе 10 мг/кг и моксифлоксацин в дозе 7 мг/кг. Соединение I вводили в дозе 10 мг/кг (сопоставимой с изониазидом).
Длительность курса лечения составила 5 недель, когда в контрольной (зараженные, без лечения) группе смертность достигла 70%.
Эффективность оценивалась по следующим критериям (Таблицы 6 и 7 на Фиг. 6 и 7): летальность мышей, биометрические показатели легких и селезенки (в условных единицах), макроскопическая регистрация пораженности легких (в условных единицах), оценка массивности роста микобактерий в дозированных посевах гомогенатов легких на плотную яичную среду Левенштейна-Йенсена (в пересчете на массу легких).
При анализе показателей терапевтической эффективности исследуемых соединений необходимо отметить, что для всех соединений, в сравнении с контролем, наблюдалось значительное уменьшение летальности (10-30 % в сравнении с 70%). Эффективность соединения I значительно превосходила таковую для моксифлоксацина и лишь немного уступала изониазиду.
Пример 6. Исследование комплексообразующих свойств соединения I
Исследование комплексообразующей способности соединения I с ионами железа (III) было проведено в сравнении с изоникотиноилгидразоном пиридоксаля (PIH) в системах Fe(III) - L (L = PIH) и Fe(III) - L’ (L’ = I).
2
-4
-4
-4
Спектры поглощения водных растворов соединения I и изоникотиноилгидразона пиридоксаля регистрировали на спектрофотометре Perkin-Elmer Lambda EZ-210 в диапазоне длин волн от 340 до 1100 нм с контролем температуры 25.0±0.1 °C в кварцевых кюветах длиной 1 см. Наиболее интенсивное поглощение в обеих системах наблюдалось около 500 нм. Солевой фон и постоянное значение pH 6.0 поддерживались с использованием буфера MES (MES⋅HO, Fluka). Значения pH растворов определяли на автоматическом титраторе Metrohm Titrando 907 с использованием электрода Metrohm 6.0228.000 с точностью ±0.01. В экспериментах использовали нитрат железа(III) с концентрацией 1.00⋅10 М, причем концентрации обоих лигандов варьировали в диапазоне от 1.00⋅10 до 9.00⋅10 М.
-4
A.A. Krutikov, V.G. Shtyrlin, A.O. Spiridonov, N.Yu. Serov, A.N. Il’yin, E.M. Gilyazetdinov, M.S. Bukharov New program for computation of the thermodynamic, spectral, and NMR relaxation parameters of coordination compounds in complex systems / Journal of Physics: Conference Series. - 2012. - V. 394. - 012031 (6 p).
Зависимости оптической плотности (А) от концентрации лигандов L (PIH) и L’ (I) при постоянной концентрации железа(III) 1.00⋅10 М и длине волны 500 нм представлены в Таблице 8 на Фиг. 8. Из этих зависимостей с помощью модифицированной программы STALABS [] выполнены расчёты условных констант равновесий (не учитывающих явно участия протонов).
2
3+
Относительная стабильность комплексов I и PIH c Fe(III) четко выражается путем сравнения условных констант образования второй ступени (lgK). Таким образом, соединение I имеет на порядок меньшую комплексообразующую способность с ионами Fe по сравнению с PIH, что позволяет предположить минимизацию негативного воздействия на пациента и, как следствие, сведение к минимуму развития анемии у пациентов при его клиническом использовании.
Таким образом, из описанного выше можно сделать вывод, что заявителем достигнуты поставленные цели и заявленный технический результат, а именно: создано новое высокоактивное и малотоксичное противотуберкулезное средство -соединение формулы I, содержащее в своем составе как фрагмент природного соединения (пиридоксина), так и фрагмент противотуберкулезного препарата изониазида, что расширяет арсенал известных средств указанного назначения.
Mycobacterium tuberculosis
Соединение I эффективно (МИК 2.5 мкг/мл) на клинических штаммах  с множественной лекарственной устойчивостью, в т.ч. к изониазиду.
in vitro
in vivo
Соединение I является существенно менее токсичным (в 1.5-3 раза) на условно-нормальных клеточных линиях  в сравнении с референсными противотуберкулезными препаратами изониазидом и моксифлоксацином, что позволяет предполагать его меньшую нефро- и гепатотоксичность в экспериментах .
in vivo
50
50
50
При внутрижелудочном введении мышам соединение I оказалось менее токсично (ЛД >2000 мг/кг) чем изониазид (ЛД 170 мг/кг) и моксифлоксацин (ЛД 500 мг/кг).
in vivo
В эксперименте по исследованию противотуберкулезной активности  на мышах соединение I показало значительное уменьшение летальности (10 %) в сравнении с контрольной группой (70%). При этом эффективность соединения I значительно превосходила таковую для моксифлоксацина и лишь немного уступала изониазиду.
3+
Кроме того, соединение I имеет на порядок меньшую комплексообразующую способность с ионами Fe по сравнению с изоникотиноилгидразоном пиридоксаля, что позволяет предположить минимизацию или отсутствие развития анемии у пациентов при его клиническом использовании.
Заявленное техническое решение соответствует условию патентоспособности «новизна», предъявляемому к изобретениям, так как из исследованного уровня техники не выявлены технические решения, обладающие заявленной совокупностью отличительных признаков, обеспечивающих достижение заявленных результатов.
Заявленное техническое решение соответствует условию патентоспособности «изобретательский уровень», предъявляемому к изобретениям, так как не является очевидным для специалиста в данной области науки и техники.
Заявленное техническое решение соответствует условию патентоспособности «промышленная применимость», т.к. может быть реализовано на любом специализированном предприятии с использованием стандартного оборудования, известных реактивов и технологий.