Морфологическое исследование коллагенсодержащего модуля при замещении тканевых дефектов

http://dx.doi.org/10.26787/nydha-2226-7425-2017-19-11-209-216

УДК 57.085.2

МОРФОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ КОЛЛАГЕНСОДЕРЖАЩЕГО МОДУЛЯ ПРИ ЗАМЕЩЕНИИ ТКАНЕВЫХ ДЕФЕКТОВ

Орлинская Н.Ю., Кулакова К.В., Давыденко Д.В.

ФГБУ Приволжский федеральный медицинский исследовательский центр, г. Нижний Новгород, Российская Федерация

Аннотация: в представленной работе приведены результаты морфологического исследования разработанных коллагенсодер-жащих модулей, выполненных в виде плёночных покрытий для лечения ран. Нейтральный коллаген для создания модулей выделяется по оригинальной методике из ксеногенной дермы. Коллагеновый слой покрытия может быть импрегнирован мелкодисперсным ксеногенным деминерализованным костным матриксом. Дегидратированный материал в виде пленки либо гелевой пленки представляет собой раневое покрытие, выполненное с учетом современных требований, способное оптимизировать раневой процесс и значительно сокращать сроки эпителизации ран кожи. Кроме того, в таком виде материал представляет собой основу для получения клеточно-тканевого комплекса. В работе описаны морфологические характеристики изменений в тканях животных в эксперименте на различных сроках исследования. Проведенное морфологическое исследование кожных покровов крыс на модели скальпированной раны с коллагенсодержащим модулем показало, что разработанный материал в виде пленочного покрытия способствует менее выраженным воспалительным проявлениям и отсутствию некрозов в поверхностных участках дефекта, более раннему созреванию грануляционной ткани, более ранней и более выраженной краевой эпителизации в пограничных участках дефекта. Представляется перспективным дальнейшее экспериментальные и клинические исследования различных способов применения и эффективности разработанных материалов. Ключевые слова: коллаген, регенерация, тканевая инженерия, плёночные покрытия, заживление ран.

Введение. Одним из доминирующих направлений в создании современных покровных материалов и перевязочных средств является разработка продуктов, способных замещать кожные дефекты продолжительное время. Для реализации этого направления активно используются ксеноткани и их производные с формированием трехмерных биодеградируемых матриц, способствующих регенерации окружающей ткани [1-5].

Несмотря на то, что в настоящее время существует много разнообразных видов раневых покрытий, создание новых, более совершенных, эффективных и экономичных покровных материалов продолжается. На примере разработки тканевой гетерогенной матрицы на основе коллагена [Патент РФ 2456810 27.07.2012] описаны алгоритмы и методические подходы к изготовлению и экспериментальному исследованию коллагенсо-держащих матриц [6-8]. Однако на этапе изготовления особенно важно представлять их морфологическую структуру и особенности их взаимодействия с макроорганизмом на различных сроках экспериментального исследования.

Цель работы: провести морфологическое исследование пленочных покрытий для лечения ран, изготовленных в ФГБУ «ПФМИЦ» Минздрава России, и дать морфологическую характеристику изменений в тканях

животных в эксперименте на различных сроках исследования.

Материалы и методы. Материалом для исследования послужили образцы коллагеновых материалов, применяемые в раневых моделях в эксперименте в виде базового модуля (полисахаридно-коллагеновая матрица, рис.2), модуля повышенной прочности с интегрированным ацеллюлярным дермальным матриксом (АДМ, рис.3) и модуля с введением культуры ме-зенхимальных стромальных клеток (МСК). Электронно-микроскопическое исследование поверхности разработанного плёночного материала было выполнено на сканирующем электронном микроскопе JEOL JSM-IT300LV в режиме высокого вакуума и при низких значениях тока зонда (<0,1 нА), чтобы уменьшить воздействие электронного пучка на исследуемые образцы, диаметр электронного зонда до 3 нм. Для характеристики морфологических изменений в ране и оценки ранозаживляющих свойств материала проведено экспериментальное исследование, при котором моделировалась рана в первой опытной группе с нанесением импрегнированного ДКМ, во второй - с культурой МСК (рис. 1). Эксперимент in vivo был выполнен на крысах линии Wistar, средней массой тела 230 г, наркоз — «Золетил» (15 мг/кг) и «Ксила» (5 мг/кг).

—--—

Журнал включен в Перечень рецензируемых научных изданий ВАК

Животным на предварительно освобожденную от шерсти среднюю треть спины наносили скальпированную круглую рану площадью 2% поверхности тела. У крыс контрольной группы раневые дефекты не укрывались (заживление под естественным струпом), у животных двух опытных групп — укрывались разработанным коллагеновым плёночным материалом с ДКМ. У животных второй опытной группы в область дефекта кожи были введены инъекционно 1 мл МСК в PBS — по 0,2 мл в 4 точки по периметру раны и 0,2 мл непо-

'

Ch *

средственно под раневое покрытие. Экспериментальных животных рассаживали в клетки по 1 особи с целью предупреждения взаимного травмирования и повреждения зон дефекта. Животных содержали в стандартных условиях вивария; все манипуляции проводили в соответствии с приказом Минздравсоцразвития РФ № 708н от 23.08.2010 «Об утверждении правил лабораторной практики». Выведение крыс из эксперимента производили через 3, 6, 12 суток после нанесения раны.

а 6 В

Рис. 1. Схема эксперимента на крысах: а) нанесение дефекта, б) наложение смоделированного по размеру и форме дефекта коллагенсодержащего раневого покрытия, в) введение культуры клеток по периметру раны и

под раневое покрытие.

Фоторегистрация экспериментального материала проводилась камерой Fujifilm Finepix HX 25. Экспериментальный материал фиксировался в 10% формалине при температуре 37° С в течение 24 часов. Стандартная гистологическая проводка осуществлялась на аппарате «Excelsior ES» (Thermo Scientific). Изготовление парафиновых блоков производилось с использованием заливочной станции «HistoStar» (Thermo Scientific). Серийные срезы толщиной 4-6 микрон получали на микротоме MICROM HM 325 (Thermo Scientific). Для мор-фометрической обработки и создания видеоархива полученного материала использовался микроскоп Leica 2500, объектив хП, х10, х20, х40, х100, окуляр х10.

Статистическая обработка полученных результатов проводилась с использованием программ Microsoft Excel и Statistica 6.0. Оценка результатов проводилась с применением непараметрической статистики с использованием U-критерия Манна-Уитни; при р<0,05 контрольная и опытная группы считались статистически значимо отличающимися друг от друга.

Результаты и обсуждение. Запатентованный коллективом авторов материал состоит из коллагенового и полисахаридного компонентов (патент № 2136318 «Плёночное покрытие для ран»): нейтральный коллаген выделяется по оригинальной методике из ксено-генной дермы, коллагеновый слой покрытия может

быть импрегнирован мелкодисперсным ксеногенным деминерализованным костным матриксом (ДКМ), содержащим комплекс тканевых факторов роста [9, 10]. Выбор компонентов обусловлен их способностью активно влиять на регенеративный процесс и оптимизировать условия для его протекания. Аморфный коллаген III типа выполняет роль депо аминокислот для построения собственных коллагеновых волокон фиб-робластами, в то время как ДКМ представляет собой структурированный коллаген I типа с сохранённой архитектоникой и в силу этого может служить эффективным носителем различных биологически активных веществ, обеспечивать необходимые особенности микрорельефа поверхности для прикрепления клеток и интенсифицировать их миграцию в область поражения из подлежащих тканей. Полисахаридный слой изолирует раневую поверхность от внешней среды и обеспечивает покрытию необходимые физические свойства: прочность, эластичность, адгезивные и адсорбционные свойства, проницаемость для жидкости и газов. Морфологический анализ полученного коллагеново-поли-сахаридного материала с интегрированным ДКМ показал, что частицы матрикса занимают в нём пограничное положение и, кроме того, образуют разновеликие агломераты, размеры которых варьируют в широких пределах (Рис.2).

/

Könnt« itmri икр

A

ф

WLrií

ШЖ V*

дкм

¿5

Потоки аридны н стой

ÁAí ^JfjR?4

^ У ДКМ Ц Киллаш liBtj^

TV;-T ^ -Яг

Рис. 2. Препарат коллагеново-полисахаридного материала с деминерализованным костным матриксом: а) поперечный срез, б) продольный срез. Увеличение х400, окраска: гематоксилин-эозин.

б

Рис. 3. Экспериментальный образец армированного ацеллюлярным дермальным матриксом материала с колла-генсодержащим слоем: а) окраска гематоксилин-эозин увеличение х200, х400, поперечный срез б) исследование поверхности материала методом сканирующей электронной микроскопии.

Оценка результатов эксперимента in vivo проводилась в области краев раны, со стороны её дна и непосредственно в зоне дефекта. Характер изменений оценивался по характеру клеточных элементов, степени выраженности воспалительной реакции, наличию некрозов, степени зрелости грануляционной ткани. Визуальная оценка показала, что образцы коллагено-

вых материалов удовлетворительно прилегали к поверхности ран без дополнительной фиксации и без необходимости замены на всем протяжении эксперимента (до 12 суток) и обеспечивали достаточную защиту от внешних загрязнений. Результаты гистологического анализа показали, что через 3 суток после травмы в группе контроля (заживление под естествен-

ным струпом) в области раневого дефекта имелись обширные участки некрозов с выраженной воспалительной инфильтрацией с примесью значительного количества нейтрофильных сегментоядерных лейкоцитов и

ПММТ'

¡Ук т.  ^

UJ

шшт

v ' ' .V  '

______LU_i.

гнойных телец. В центральной части дефекта происходило начальное и незначительное по протяженности формирование молодой грануляционной ткани (Рис.

4).

к  К; ^ '  . V Я

1 :

Я

_1_ ШМ' <

Рис. 4. Контроль, зона дефекта, 3 сутки эксперимента: а), б) увеличение х200, в) пролиферативная активность клеточных элементов в зоне дефекта увеличение х400.

Окраска: гематоксилин-эозин

Через 12 суток в группе контроля фиксировалась слабовыраженная эпителизация по периферии раны, а также широкий слой грануляционной ткани с большим

количеством сосудов капиллярного типа и хаотично расположенными фибробластами (Рис. 5).

а б

Рис. 5. Контроль, зона дефекта, 12 сутки эксперимента: а) слабо выраженная краевая эпителизация, увеличение х50, б) грануляционная ткань, увеличение х200.

Окраска: гематоксилин-эозин

В первой опытной группе с применением ДКМ на 3 сутки эксперимента между поверхностью ран и пле-

ночными покрытиями наблюдали прослойку, образованную скоплениями нейтрофильных сегментоядер-ных лейкоцитов (Рис. 6).

Рис. 6. Группа с введением ДКМ, зона дефекта, 3 сутки эксперимента: а) умеренно выраженная прослойка воспалительного инфильтрата под пленочным покрытием, увеличение х100, б) та же зона, увеличение х400. Окраска: гематоксилин-эозин

Во второй опытной группе с введением МСК на 3 сутки к покрытию наблюдались плотно прилежащие фибробластоподобные клеточные элементы, образующие местами несколько рядов клеток (Рис. 7а). Уже на

этом сроке грануляционная ткань характеризовалась зональностью строения с более выраженной зрелостью в верхних слоях и менее выраженной - в глубоких слоях (рис. 76).

ВНК'

а б

Рис. 7. Группа с введением МСК, зона дефекта, 3 сутки эксперимента: а) зональность строения грануляционной ткани, увеличение х100, б) фибробластоподобные клеточные элементы, прилежащие к покрытию, х400. Окраска: гематоксилин-эозин

В первой опытной группе с применением ДКМ на 12 сутки в зоне дефекта присутствовала сформированная зрелая грануляционная ткань с наличием большого количества фибробластов и коллагеновых волокон.

приобретающих параллельную ориентацию (Рис. 8). Вновь образованная эпителиальная выстилка более протяженная, чем в контроле.

Й \

т

V,

; г - -.

ж

.

¡¡иЙ

.".'..л

• / • .

V:,: • М • ;,

= Ш Х-'-  тш

Рис. 8. Группа с применением ДКМ, зона дефекта, 12 сутки эксперимента, вновь образованная эпителиальная

выстилка, увеличение х100. Окраска: гематоксилин-эозин

Во второй опытной группе с применением МСК на 12 сутки эксперимента в зоне дефекта имелась зрелая

грануляционная ткань со значительным количеством коллагеновых волокон, большая часть из которых располагалась параллельно поверхности раны, с преобладанием клеток фиброцитарного ряда. Протяженная

эпителиальная выстилка покрывала зрелую грануляционную ткань (Рис. 9).

Рис. 9. Группа с применением МСК, зона дефекта на 12 сутки эксперимента, увеличение х400. Окраска: гематоксилин-эозин

Оценка результатов планиметрического исследования показала, что применение покровных материалов способствует сокращению размеров дефектов уже с 3 суток эксперимента. При сравнении двух опытных групп между собой отмечено, что в случае совместного применения коллагенового материала с культурой кле-

ток (выбранный способ применения клеточно-ткане-вого комплекса), начиная с 6 суток эксперимента, наблюдалась тенденция более быстрого сокращения размеров дефекта, по сравнению с опытной группой, в которой использовалось только раневое покрытие (Рис.10). Отличия между группами находятся на границе статистической значимости (р >0,049).

(О 80

а.

Ш Ш 50

О 40

3 6 Э 12

продолжительность эксперимента, сутки Рис. 10. Динамика сокращения раневого дефекта у животных контрольной и опытных групп в ходе эксперимента

Заключение. Разработка раневого покрытия, представляющего собой многослойную гетерогенную мембрану, которая в силу особенностей своей структуры может включать широкий спектр биологически активных веществ, потребовала от нас модифицирования продукта и дополнения исходного модуля компонентами, актуальными в условиях проводимого эксперимента, либо конкретной клинической ситуации. Дегидратированный материал в виде пленки либо гель-пленки представляет собой раневое покрытие, выполненное с учетом современных требований, способное

оптимизировать раневой процесс и значительно сокращать сроки эпителизации ран кожи, кроме того, в таком виде материал представляет собой основу для получения клеточно-тканевого комплекса. Морфологическое исследование кожных покровов крыс на модели скальпированной раны с коллагенсодержащим модулем показало, что разработанный коллагенсодержа-щий материал в виде пленочного покрытия способствует менее выраженным воспалительным проявлениям и отсутствию некрозов в поверхностных участ-

ках дефекта, более раннему созреванию грануляционной ткани, более ранней и более выраженной краевой эпителизации в пограничных участках дефекта. Таким образом, к настоящему времени нами разработано несколько вариантов биологически активных материалов на основе коллагеновых комплексов, полученных путём дополнения базового модуля. Исходя из полученных результатов целесообразно продолжить дальнейшее совершенствование биологически активных кол-лагеновых комплексов, а также экспериментальные и клинические исследования различных способов их применения и эффективности.

Благодарности. Электронно-микроскопическиое исследование выполнено в центре коллективного пользования «Новые материалы и ресурсосберегающие технологии» ННГУ им Н.И. Лобачевского города Нижнего Новгорода. Авторы выражают глубокую признательность директору центра коллективного пользования НМиРТ, д.х.н., профессору Е.В. Сулейманову за предоставленный доступ к оборудованию и благодарность научному сотруднику ЦКП НМиРТ, к.ф.-м.н. А.В. Борякову за проведённые исследования.

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

[1] Shahrokhi S., Amo A., Jeschke M.G. The use of dermal substitutes in burn surgery: acute phase // Wound Repair. Regen. 2014. V. 22, № 1. P. 14-22.

[2] Potential of human bone marrow stromal cells to accelerate wound healing in vitro / Han S.K., Yoon T.H., Lee D.G., Lee M.A., Kim W.K. // Ann. Plast. Surg. 2005. V. 55, №4.

P. 414-419.

[3] Tissue-engineered skin containing mesenchymal stem cells improves burn wounds / Liu P., Deng Z., Han S., Liu T., Wen N., Lu W., Geng X., Huang S., Jin Y. // Artif. Organs. 2008. V. 32, №12. P. 925-931.

[4] Use of mesenchymal stem cells for cutaneous repair and skin substitute elaboration / Laverdet B., Micallef L., Lebreton C., Mollard J., Lataillade J.J., Coulomb B., Desmouliere A. // Pathologie Bilogie. 2014. V.62, № 2: P. 108-117.

[5] Васильев М.П. Коллагеновые нити, волокнистые и пленочные материалы. Санкт-Петербург: СПГУТД, 2004. 397 с.

[6] Денисов В.М., Бугров С.Н., Анфимов П.Е. Способ получения нейтрального коллагена из биологического материала. Патент РФ 2456810. 27.07.2012.

[7] Клеточно-тканевые комплексы для восстановления дефектов кожного покрова / Кулакова К.В., Бугров С.Н., Алейник Д.Я., Чарыкова И.Н., Сидорова Т.И., Стручков А.А. // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. 2016. № 4-4, C. 703706.

[8] Кулакова К.В., Алейник Д.Я., Чарыкова И.Н. Совместное использование разработанных коллагенсодержащих комплексов и культуры клеток для создания новых тканевых эквивалентов // Бюллетень сибирской медицины. 2016; №15 (5): С. 7582.

[9] Денисов В.М., Анфимов П.Е., Краснова Н.С., Куприянов В.А., Стручков А.А. Плёночное покрытие для ран. Патент РФ 2136318. 10.09.1999.

[10] Greenholgh D. Role of growth factors in wound healing // J. Trauma. 1996. V.41, №1. P. 159-167.

MORPHOLOGICAL STUDY OF COLLAGEN-CONTAINING MODULE DURING REPLACEMENT OF TISSUE DEFECTS

Orlinskaya N. Yu., Kulakova K. V., Davydenko D. V.

Nizhny Novgorod Research Institute of Traumatology and Orthopedics, Nizhny Novgorod, Russian Federation

Annotation: the presented paper describes the results of a morphological study of the engineered collagen-containing modules made in the form of film coating for the scope of wound healing. Neutral collagen for modules was isolated according to the original method from the xenogeneic dermis. The collagen coating layer can be impregnated with a fine dispersed xenogeneic demineralized bone matrix. The dehydrated material in the form of a film or gel film is a wound coating that is adapted to the current requirements, which can optimize the wound process and significantly shorten the skin wounds epithelization. In addition, in this form the material is the basis for the preparation of the cell-tissue complex. Morphological characteristics of animal tissue changes on different stages of experiment are being described. The conducted morphological study of cutaneous coverings of rats on the model of a degloving injury wound with collagen-containing module demonstrated that the engineered material in the form of film coating favours less pronounced inflammatory manifestations and absence of necrosis in the top surface layer of skin defect, earlier formation of granulation tissue, earlier and more pronounced acentric epithelialization of the marginal areas of skin defect. Further experimental and clinical research of effectiveness and different methods of application of the engineered materials is considered to be promising. Key words: collagen, regeneration, tissue engineering, film coating, wound healing

REFERENCES

[1] Shahrokhi S., Arno A., Jeschke M.G. The use of dermal substitutes in burn surgery: acute phase // Wound Repair. Regen. 2014. V. 22, № 1. P. 14-22.

[2] Potential of human bone marrow stromal cells to accelerate wound healing in vitro / Han S.K., Yoon T.H., Lee D.G., Lee M.A., Kim W.K. // Ann. Plast. Surg. 2005. V. 55, №4.

P. 414-419.

[3] Tissue-engineered skin containing mesenchymal stem cells improves burn wounds / Liu P., Deng Z., Han S., Liu T., Wen N., Lu W., Geng X., Huang S., Jin Y. // Artif. Organs. 2008. V. 32, №12. P. 925-931.

[4] Use of mesenchymal stem cells for cutaneous repair and skin substitute elaboration / Laverdet B., Micallef L., Lebreton C., Mollard J., Lataillade J.J., Coulomb B.,

Desmoulière A. // Pathologie Biologie. 2014. V.62, № 2: P. 108-117.

[5] Vasil'ev M.P. Collagen filaments, fibrous and film materials [Kollagenovye niti, voloknistye i plenochnye materialy]. Sankt-Peterburg: SPGUTD, 2004. 397 p (in Russian).

[6] Denisov V.M., Bugrov S.N., Anfimov P.E. A method for producing collagen from neutral biological material[Sposob polucheniya nejtral'nogo kollagena iz biologicheskogo materiala]. Russian patent [Patent RF] 2456810, 2012 (in Russian).

[7] Cellular tissue complexes to restore skin defects [Kletochno-tkanevye kompleksy dlya vosstanovleniya defektov kozhnogo pokrova / Kulakova K.V., Bugrov S.N., Aleynik D.Ya., Charykova I.N., Sidorova T.I., Struchkov A.A .// International Journal of Applied and Basic Research

[Mezhdunarodnyj zhurnal prikladnyh i fundamental'nyh issledovanij], 2016, no. 4, pp. 703-706 (in Russian).

[8] Kulakova K.V., Alejnik D.YA., Charykova I.N. Joint use of developed collagen-containing complexes and cell cultures in creating new tissue equivalents [Sovmestnoe ispol'zovanie razrabotannykh kollagensoderzhashhikh kompleksov i kul'tury kletok dlya sozdaniya novykh tkanevykh ehkvivalentov] // Bulletin of Siberian medicine [Byulleten' sibirskoj meditsiny]. 2016; №15 (5): p. 75-82 (in Russian).

[9] Film coating for wounds [Plyonochnoe pokrytie dlya ran] / Denisov V.M., Anfimov P.E., Krasnova N.S., Kupriyanov V.A., Struchkov A.A. . Russian patent [Patent RF] 2136318, 1999

[10] Greenholgh D. Role of growth factors in wound healing // J. Trauma. 1996. V.41, №1. P. 159-167.