СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОЧИЩЕННОГО БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОГО ГЕТЕРОЛОГИЧНОГО БЕЛКА (ВАРИАНТЫ), ОЧИЩЕННЫЙ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЙ ГЕТЕРОЛОГИЧНЫЙ БЕЛКОВЫЙ ПРОДУКТ И ОЧИЩЕННЫЙ ИНСУЛИН ГЛАРГИН (ВАРИАНТЫ)

1. Способ получения очищенного, биологически активного гетерологичного белка, рекомбинантно экспрессирующегося в дрожжевой экспрессирующей системе, характеризующийся получением вышеназванного беска свободным от содержания или содержанием по существу минимальных количеств гликозилированных побочных продуктов, с выходом белка, чистота которого составляет по меньшей мере 96%.
2. Способ по п.1, в котором ДНК, кодирующая гетерологичный белок, представлена формулой I
Х-В-Y-А,
в которой Х представляет собой последовательность лидерного пептида, содержащую по меньшей мере одну аминокислоту,
В представляет собой последовательность аминокислот В-цепи молекулы инсулина, ее производных или аналогов,
Y представляет собой линкерный пептид, содержащий по меньшей мере две аминокислоты,
А представляет собой последовательность аминокислот А-цепи молекулы инсулина, ее производных или аналогов, причем указанные А- и В-цепь могут быть модифицированы заменой, делецией и/или добавлениями аминокислот.
3. Способ по п.2, в котором линкерный пептид представляет собой последовательность, содержащую по меньшей мере две аминокислоты, при условии, что первые две аминокислоты представляют собой "RR".
4. Способ по п.1, в котором указанный белок определяют SEQ ID: 1 или SEQ ID: 2.
5. Способ по п.1, в котором клетку-хозяин дрожжевой экспрессирующей системы выбирают из Pichia sp.
6. Способ по п.1, в котором клетку-хозяин дрожжевой экспрессирующей системы выбирают из группы, включающей Pichia pastoris, Pichia methanolica, Saccharomyces cerevisiae, Schisosaccharomyces pombe, Yarrovia lipolitica, Hansenula polymorpha и Kluyveromyces lactis.
7. Способ по п.1, в котором гликозилированная форма белка является моногликозилированной, тригликозилированной или полигликозилированной.
8. Способ по п.1, в котором указанный очищенный белок содержит по большей мере 1% гликозилированных примесей.
9. Способ получения очищенного биологически активного гетерологичного белка, рекомбинантно экспрессирующегося в клетке-хозяине, включающий:
стадию культивирования клеток-хозяев, трансформированных вектором, содержащим последовательность ДНК, определенную формулой Х-В-Y-А, кодирующей гетерологичный белок, в условиях, подходящих для экспрессии белка, в которой
Х представляет собой последовательность лидерного пептида, содержащую по меньшей мере одну аминокислоту,
В представляет собой последовательность аминокислот В-цепи молекулы инсулина, ее производных или аналогов,
Y представляет собой линкерный пептид, содержащий по меньшей мере две аминокислоты,
А представляет собой последовательность аминокислот А-цепи молекулы инсулина, ее производных или аналогов,
и А- и В-цепь могут быть модифицированы заменой, делецией и/или добавлениями аминокислот,
стадию выделения экспрессирующегося белка, включающую отделение указанного белка от клеток-хозяев с получением препарата выделенного белка,
стадию кристаллизации белка, полученного на стадии выделения,
стадию проведения ферментативной конверсии в присутствии трипсина или трипсиноподобного фермента,
стадию очистки указанного белка, содержащего по меньшей мере одну родственную примесь, включающую контактирование указанной смеси белков с хроматографической матрицей, с использованием полярного органического буферного растворителя в водной фазе, содержащей буфер на основе органической кислоты, и
стадию осаждения элюированного белка.
10. Способ по п.9, в котором линкерный пептид представляет собой последовательность, содержащую по меньшей мере две аминокислоты, при условии, что первые две аминокислоты представляют собой "RR".
11. Способ по п.9, в котором ген, определенный SEQ ID 1 или 2, клонируют в рамке считывания с сигнальным пептидом.
12. Способ по п.11, в котором ген, определенный SEQ ID 1 или 2, клонируют в рамке считывания с сигнальным пептидом mat-α.
13. Способ по п.9, в котором клетку-хозяин выбирают из Pichia sp.
14. Способ по п.13, в котором клетку-хозяин выбирают из группы, включающей Pichia pastoris, Pichia methanolica, Saccharomyces cerevisiae, Schisosaccharomyces pombe, Yarrovia lipolitica, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces lactis.
15. Способ по п.14, в котором клетка-хозяин представляет собой Pichia pastoris.
16. Способ по п.15, в котором штамм-хозяин представляет собой GS115.
17. Способ по п.9, включающий стадию инокуляции водной ферментационной среды трансформантом штамма дрожжей, несущим экспрессирующий вектор, который направляет экспрессию указанного белка, и стадию выращивания трансформированного штамма в ферментационной среде в условиях, эффективных для экспрессии указанного белка.
18. Способ по п.17, в котором экспрессирующийся белок извлекают из ферментационного бульона с использованием ионообменной хроматографии.
19. Способ по п.9, включающий стадию кристаллизации белка посредством добавления хлорида цинка и фенола.
20. Способ п.9, включающий стадию ферментативной конверсии, которую осуществляют в присутствии трипсина в водорастворимом органическом растворителе.
21. Способ по п.9, в котором водорастворимый органический растворитель выбирают из группы, включающей ДМСО, ДМФ, этанол, ацетон, ацетонитрил, этилацетат или их смеси.
22. Способ по п.9, включающий стадию очистки ОФ-ВЭЖХ смеси белков, содержащей по меньшей мере одну родственную примесь, посредством контактирования указанной смеси белков с матрицей хроматографической смолы, с использованием полярного органического буферного растворителя в водной фазе, содержащей буфер на основе органической кислоты.
23. Способ по п.9, в котором полярный буферный растворитель представляет собой ацетонитрил.
24. Способ по п.19, в котором буфер на основе органической кислоты выбирают из группы, включающей лимонную кислоту, уксусную кислоту, борную кислоту, муравьиную кислоту, хлористоводородную кислоту и фосфорную кислоту.
25. Очищенный биологически активный гетерологичный белковый продукт, полученный способом по любому из пп.1-24, чистота которого составляет по меньшей мере 96%.
26. Очищенный инсулин гларгин, чистота которого составляет по меньшей мере 96%.
27. Очищенный инсулин гларгин, содержащий по большей мере 1% гликозилированных примесей.
28. Инсулин по п.27, в котором гликозилированная форма белка может быть моногликозилированной, тригликозилированной или полигликозилированной.
29. Очищенный инсулин гларгин, свободный от гликозилированных примесей.