УСТРОЙСТВО ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ С ПОМОЩЬЮ ПОВЕРХНОСТНОГО ПЛАЗМОННОГО РЕЗОНАНСА

Полезная модель относится к области медицинской диагностики, биоаналитической химии и биохимической технологии и представляет собой устройство для детекции биологических объектов с помощью поверхностного плазмонного резонанса.
Известен метод детекции вирусов (антигенов) или антител с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА), основанный на определении комплекса антиген-антитело с помощью конъюгатов, меченых индикаторным ферментом. Для этого один из компонентов серологического комплекса иммобилизуют на поверхности твердой фазы (полистироловые луночные планшеты или шарики). Например, для индикации вирусных антигенов на поверхности твердой фазы иммобилизуют специфические иммуноглобулины (антитела), которые сорбируют антиген из исследуемого образца.
В настоящее время для экспресс-диагностики в медицине успешно применяют биосенсорную диагностику, основанную на использовании различных физико-химических методов анализа, совмещенных с биолическими методами индикации [1]. Преимуществами биосенсорной диагностики являются быстрая регистрация происходящих взаимодействий без введения специальных меток в исследуемые молекулы, высокая специфичность биораспознающего элемента, способность осуществлять распознавание без дополнительных затрат энергии (повышения температуры и т.д.). Принципиально для биосенсорной диагностики необходимы распознающий (чувствительный) элемент, преобразователь и система регистрации и обработки сигнала.
Среди огромного количества биосенсоров выделяют сенсоры, чувствительные к изменению массы (пьезокварцевые микровесы), электрохимические сенсоры (например, амперометрические, потенциометрические), оптические сенсоры и другие. Так, в клинической диагностике применяются пьезокварцевые иммуносенсоры для определения вируса гепатита А и В на чувствительных элементах антитело/белок [2; 3], вирусов табачной мозаики на чувствительных пьезоэлементах, модифицированных полимерами с молекулярными отпечатками [4]. Основными недостатками таких систем является длительная подготовка образцов и невысокая специфичность.
Одним из методов, используемым для биосенсорной диагностики, является спектроскопия поверхностного плазмонного резонанса (ППР). ПНР - это квантовое оптико-электрическое явление, возникающее при взаимодействии света с поверхностью металла. Взаимодействие света с поверхностью металла приводит к возникновению квазичастицы - плазмона, колебания которого соответствует частоте возбужденных электронов, которые проявляют себя как единый электрический объект. Плазмон, в свою очередь, генерирует электрическое поле, которое распространяется приблизительно на 300 нм над и под металлической поверхностью. Особенность этого явления, которая обусловливает аналитические функции метода ППР, такова, что любое изменение химического состава среды в области действия поля плазмона, вызывает изменения угла падения света, при котором возникает резонанс с плазмоном. Т.е. химическое изменение выражается в сдвиге резонансного угла, и величина сдвига количественно связана с величиной химического изменения.
Несомненным преимуществом спектроскопии ППР является возможность определения резонансного угла с большой точностью. Световое пятно, возбуждаемое лазером, стационарно, а проведение измерения занимает несколько секунд. Единый сенсорный формат (т.е., размер, протокол хранения и использования, показания и т.д.) может использоваться для самых разных химических анализов, включая иммунологические [6], связывания нуклеиновых кислот [7], энзиматические [8]. Однако в этих исследованиях для детекции соединения полианилина не применяли.
Спектроскопия ППР может быть совмещена с электрохимическими измерениями, что дает новые возможности для изучения биоэлектрокаталитических свойств энзиматических электродов и создания новых оптических биосенсоров на их основе [8]. Известно, что для создания электрохимических сенсоров, детектирующих биологические объекты, используют различные проводящие полимеры. В частности, для детекции вируса бычьей диареи применяли электрохимический сенсор, чувствительным элементом которого является модифицированный антителами полианилин [9], для определения альбумина сыворотки использовали сенсор с полипирролом, модифицированным антителами [10].
ППР-исследования проводят с помощью специального прибора - спектрометра. Известны фирмы-производители спектрометров ППР: Autolab (Нидерланды), XanTec (Германия), Вiасоге(Швеция), Optrel (Германия), Moritex systems (США), Texas Instruments, Inc. (США), Analytical-µSystem (Германия) и др. Для исследований необходимы ППP-электроды. Например, 111 IP-электроды фирмы Analytical-nSystem, (Германия), представляют собой покрытые золотом стеклянные пластины (руководство пользователя к прибору "Biosuplar-2"). Для детекции биологических объектов производитель, как правило, предлагает сенсоры с готовым чувствительным элементом, нанесенным на ППP-электроды. Например, ХапТес или Biacore в качестве чувствительного элемента используют многослойные структуры, включающие пленки декстрана и иммобилизованного биологического объекта (Sensor Chip CM5, Biacore).
Полианилин является перспективным материалом для использования в качестве материала матрицы чувствительного элемента ПНР-сенсора, т.к. способен сорбировать без потери активности такие биологические объекты, как нуклеиновые кислоты, белки, вирусы, антитела. Известны способы определения глюкозы методом ПНР с помощью полимерной композиции полианилин/полиакриловая кислота с ковалентно-пришитыми коферментами и иммобилизованными на них апоферментами [11]. В патенте №2290444 (RU) продемонстрирована возможность иммобилизации антител вируса гриппа на поверхности полианилиновой пленки. Иммобилизованные антитела сохраняли способность взаимодействовать с гомологичным антигеном (вирусом) исследуемого образца [12]. В патенте №2372951 (RU) соединения полианилина (ПАн) в виде основания эмеральдина или интерполимерного комплекса полианилина с поли-(2-акриламидо-2-метил-1-пропан)-сульфоновой кислотой (Пан/ПАМПСК) используют в качестве сорбентов вирусов, белков, антител, а также в качестве основы иммуносорбентов, которые стабильны и сохраняют функциональную активность, т.е. способность избирательно связывать биологические объекты, находящиеся в анализируемых растворах. Важно также, что Пан/ПАМПСК можно использовать не только в виде порошка, но и в виде пленок [13]. В предлагаемом устройстве эти вещества в виде пленок используют для приготовления матрицы чувствительного элемента сенсора для детекции биологических объектов с помощью метода спектроскопии ППР.
Технической задачей предлагаемой полезной модели является создание чувствительного элемента ППP-сенсора - устройства для детекции биологических объектов с помощью метода спектроскопии поверхностного плазменного резонанса. В работе под ПНР-сенсором подразумевают 1U IP-электрод с нанесенным на его поверхность чувствительным элементом, способным избирательно связываться с исследуемым образцом (аналитом). Биологическими объектами могут являться вирусы (антигены), антитела, нуклеиновые кислоты и др. белковые струтуры.
Технический результат, достигаемый в предложенном устройстве для детекции биологических объектов с помощью метода поверхностного плазменного резонанса, заключается в обеспечении возможности быстрого детектирования биологических объектов с высокой чувствительностью и селективностью, в возможности работы с использованием малых объемов проб без их специальной подготовки, а также в низкой стоимости предлагаемого устройства - чувствительного элемента сенсора. Для достижения необходимого технического результата на поверхности ППP-электрода осуществляется осаждение тонкой полианилиновой матрицы с дальнейшей иммобилизацией биологического агента. Заявленное техническое решение устраняет недостатки, присущие наиболее близким импортным аналогам, и обеспечивает реализацию поставленной задачи.
Поставленная задача решается путем создания на поверхности 1 U IP-электрода устройства для детекции биологических объектов методом поверхностного плазменного резонанса (ППP), являющегося чувствительным элементом сенсора, нанесенным на поверхность ППP-электрода, и состоящего из интерполимерной матрицы толщиной 10-180 нм, представленной комплексом полианилин/поли(2-акриламидо-2-метил-1-пропан)-сульфоновая кислота (Пан/ПАМПСК), и иммобилизованного биологического агента, способного избирательно связываться с исследуемым объектом(аналитом), содержащимся в анализируемом образце.
Объекты. Объектами исследований были оболочечные вирусы, к которым, как известно, относятся, например, семейства парамиксовирусов, ортомиксовирусов (вирусы гриппа), флавивирусов и др. Известна их способность к сорбции, например, на эритроциты животных или на Пан и комплексПан/ПАМПСК [13]. В качестве представителей оболочечных вирусов брались для испытаний вирусы гриппа А и вирус гриппа В. Испытания представлены примерами с пандемическим штаммом вируса гриппа A/IIV-Moscow/01/2009 (H1N1)swl [14], эталонными штаммами вируса гриппа А/Новая Каледония/20/99 (H1N1) и вируса гриппа В/Флорида/04/06, обладающими различной структурой поверхностных белков, а также с антителами, гомологичными к вирусам гриппа, и кДНК вирусов гриппа, полученных методом полимеразной цепной реакции, в качестве примера взаимодействия с нуклеиновой кислотой. Вирусы культивировали на куриных эмбрионах.
Способ формирования матрицы чувствительного элемента сенсора в виде ультратонких пленок ПАн и его интерполимерных комплексов.
В работе использованы ППР-электроды фирмы Analytical-nSystem (Германия). Ультратонкие пленки Пан/НСl или интерполимерного комплекса ПАн/ПАМПСК могут быть сформированы на поверхности 1 U IP-электрода различными методами, например, методом электрохимической полимеризации анилина (потенциостатический, гальваностатический режим или в режиме циклирования потенциала), методом вакуумного термического напыления, из растворов (режимы "cast", "spincoating", "layer-by-layer") или методом Ленгмюра-Блоджетт.Модифицированные таким образом ППР-электроды использовали в дальнейшем для иммобилизации биологических агентов с целью последующих 1 U IP-исследований.
Методы исследования
Для ПНР-измерений использовали спектрофотометр "Biosuplar-2" (Analytical-USystem, Германия) с лазерным диодом с длиной волны λ=670 нм и выходной мощностью 0,2 мВт. ПНР-данные обрабатывали с помощью программного обеспечения "Biosuplar-2" (версия 2.2.30) на PC компьютере. Экспериментальные спектры ППР полимерных пленок обрабатывали путем математического моделирования на основе пятифазных вычислений Френеля с использованием алгоритма минимизации Нелдера-Мида.
В работе использовали электрохимический анализатор DPC-Compact №1705, Cronas Ltd, Россия, подсоединенный к PC компьютеру (программное обеспечение IPC-Compact №1705, версия 7.9+).
Для испытаний в качестве рабочего электрода применяли ПНР-сенсор с полианилиновой матрицей, нанесенной на пленку поликристаллического золота на стеклянной подложке (20×20 мм).
Явление ППР не является специфичным. Хотя это может казаться ограничением, на самом деле это является огромным преимуществом. Специфичность зависит от выбора пары молекул, которые реагируют только друг с другом. Из этой пары одна молекула является детектором, а другая - анализируемым объектом (аналитом, т.е. веществом, которое мы хотим определить и количественно охарактеризовать). Любая пара молекул, которая обладает специфической связью, может быть использована для ПНР-измерений. Такими парами могут быть антиген и антитело, фрагмент ДНК и комплементарно сопряженная ей ДНК, энзим и его субстрат, масло и газ или жидкость, которые растворимы в этом масле, или комплексообразователь и ион металла [5]. Ниже приведены испытания, демонстрирующие детекцию биологических объектов, на примере взаимодействия вирусов и антител. В примерах ППР-сенсором является ПНР-электрод с нанесенным на его поверхность чувствительным элементом, способным избирательно связываться с исследуемым образцом (аналитом). Схематически ПНР-сенсор представлен на Фиг.2 и Фиг.3.
Краткое описание чертежей
Для более ясного понимания заявленной полезной модели, сущность которой отражена в формуле полезной модели, а также для демонстрации ее особенностей и преимуществ далее приводится подробное описание со ссылками на фигуры чертежей.
На фиг.1 приведена таблица, в которой при испытаниях методом поверхностного плазменного резонанса определена сорбция кДНК (вирусов гриппа) на полианилиновых матрицах различной толщины. Как видно из таблицы, величина сорбции, что подтверждается изменением резонансного угла Θ, зависит от толщины полианилиновой матрицы, нанесенной в виде пленки на ППР-электрод. На коммерческом ППР-электрод е с золотом, обозначенном в таблице «Контроль на золото» сорбция кДНК не происходит.
На Фиг.2 схематически изображен сенсор для детекции биологических объектов методом поверхностного плазменного резонанса. В частности, в поперечном сечении представлен сенсор, используемый для селективного определения вирусов, в котором чувствительный элементом является полианилиновая матрица (3) и иммобилизованный биологический агент - антитело (4). Чувствительный элемент нанесен на коммерческий ППP-электрод, состоящий из стекла (1) и пленки золота (2).
На Фиг.3 схематически изображен сенсор для детекции биологических объектов методом поверхностного плазменного резонанса. В частности, в поперечном сечении представлен сенсор, используемый для селективного определения антител вирусов, в котором чувствительный элемент представлен полианилиновой матрицей (3) и иммобилизованным биологическим агентом - вирусом (4). Чувствительный элемент нанесен на коммерческий ППP-электрод, состоящий из стекла (1) и пленки золота (2).
На Фиг.4 представлена сенсограмма поверхностного плазменного резонанса. Отрезок 1 - это базовая линия сенсограммы, соответствующая 111 IP-электроду, с нанесенным на его поверхность интерполимерным комплексом Пан/ПАМПСК, в буферном растворе. Отрезок 2 сенсограммы демонстрирует изменение резонансного угла Θ при иммобилизации антитела вируса А/Новая Каледония/20/99(Н1N1) на полианилиновой матрице. Отрезок 3 сенсограммы соответствует введению в раствор вируса гриппа В/Флорида/04/06, который не взаимодействует с негомологичными антителами, что подтверждается отсутствием изменений резонансного угла Θ. Отрезок 4 сенсограммы соответствует сорбции введенного в раствор вируса А/Новая Каледония/20/99(НШ1), который взаимодействует с ммобилизованным гомологичным антителом, образуя комплекс антиген-антитело, что подтверждается изменением ППР-сигнала в виде изменения резонансного угла Θ.
На Фиг.5 представлена сенсограмма поверхностного плазменного резонанса. Отрезок 1 - это базовая линия сенсограммы, соответствующая, НИР-электроду, с нанесенным на его поверхность интерполимерным комплексом Пан/ПАМПСК, в буферном растворе. Отрезок 2 сенсограммы демонстрирует изменение резонансного угла Θ при иммобилизации вируса A/IIV-Moscow/01/2009(H1N1)swl на полианилиновой матрице. Отрезок 3 сенсограммы соответствует введению в раствор антител вируса гриппа В, которые не взаимодействуют с негомологичными антигенами, что подтверждается отсутствием изменений резонансного угла Θ. Отрезок 4 сенсограммы соответствует сорбции введенных в раствор антител вируса A/IIV-Moscow/01/2009(H1N1)swl, которые взаимодействуют с имммобилизованным гомологичным антигеном, образуя комплекс антиген-антитело, что подтверждается изменением ПНР-сигнала в виде изменения резонансного угла Θ.
Пример 1. Создание устройства - чувствительного элемента сенсора с иммобилизованным биологическим агентом.
В качестве биологического агента использовали кДНК вирусов гриппа. В качестве контроля применяли ППР-электрод с поликристаллическим золотом на стеклянной подложке (20×20 мм).
Пленки ПАн/ПАМПСК различной толщины применяли для иммобилизации кДНК вирусов гриппа. Взаимодействие кДНК с полианилиновой матрицей фиксировали по изменению резонансного угла, обозначенного в таблице как ΔΘ (Фиг.1). В таблице приведены результаты исследования сорбции кДНК. Установлено, что сорбция кДНК происходит на матрицах кДНК различной толщины, но увеличение толщины пленки ПАн/ПАМПСК приводит к уменьшению ΔΘ.
Пример 2. Создание устройства - чувствительного элемента сенсора с иммобилизованным биологическим агентом, комплементарным вирусу гриппа.
/ V, I
С этой целью на поверхность ППР-электрода состоящего из пленки золота (Фиг.2, элемент 2) напыленного на стеклянную подложку (Фиг.2, элемент 1) наносили полианилиновую матрицу (Пан/ПАМПСК) (Фиг.2, элемент 3). Толщина полианилиновой матрицы составляла 10-80 нм. Далее на интерполимерный комплекс иммобилизовали биологический активный агент - антитела к вирусу гриппа А/Новая Каледония/20/99(Н1Ш) или антитела к вирусу гриппа В (Фиг.2, элемент 4). Процесс иммобилизации антител на полианилиновой матрице и его завершение контролировали методом поверхностного плазменного резонанса (Фиг.4 отрезок 2 сенсограммы). ППР-сенсор с чувствительным элементом, состоящим из полианилиновой матрицы и иммобилизованного биологического агента, представленного антителами вируса гриппа, например, вируса гриппа А/Новая Каледония/20/99(НП\Г1), используют для селективного определения вируса гриппа (Фиг.2). Эта структура стабильна и сохраняет функциональную активность.
Пример 3. Создание устройства - чувствительного элемента сенсора с иммобилизованным биологическим агентом, гомологичным антителу вируса гриппа.
С этой целью на поверхность ППР-электрода состоящего из пленки золота (Фиг.3, элемент 2) напыленного на стеклянную подложку (Фиг.3, элемент 1) наносили полианилиновую матрицу (Пан/ПАМПСК) (Фиг.2, элемент 3). Толщина полианилиновой матрицы составляла 10-80 нм. Далее на интерполимерный комплекс иммобилизовали биологический активный агент - вирус гриппа, например a/iiv-moscow/o 1/2009 (HlNl)swl (Фиг.2, элемент 4). Процесс иммобилизации (сорбции) вируса гриппа на полианилиновой матрице и его завершение контролировали методом поверхностного плазменного резонанса (Фиг.5 отрезок 2 сенсограммы). ППР-сенсор с чувствительным элементом, состоящим из полианилиновой матрицы и иммобилизованного биологического агента, представленного вирусом a/iiv-moscow/o 1/2009 (HlNl)swl, используют для селективного определения антител к вирусу гриппа (Фиг.З). Эта структура стабильна и сохраняет функциональную активность. Пример 4. Детекция вируса гриппа A(H1N1) с помощью предлагаемого устройства.
Селективное определение вируса гриппа А/Новая Каледония/20/99 (H1N1) осуществляли с помощью сенсора, имеющего чувствительный элемент «ПАн/ПАМПСК -антитело к вирусу А/Новая Каледония/20/99 (H1N1)». Подготовленный по методике, описанной в примере 2, ППР-сенсор использовали для определения вируса гриппа А/Новая Каледония/20/99 (H1N1) с концентрацией 256 ГАЕ (гемагглютинирующих единиц) в физиологическом растворе (0,15М NaCI). Детекцию аналита из исследуемого
образца осуществляли методом ППР. Отсутствие взаимодействия вируса гриппа В с негомологичными антителами подтверждается тем, что резонансный угол остается без изменений (Фиг.4 отрезок 3 сенсограммы). Образование комплекса "антиген-антитело" приводило к изменению оптических характеристик чувствительного элемента сенсора, и, следовательно, к изменению резонансного угла, что позволяет селективно детектировать вирус гриппа А/Новая Каледония/20/99 (H1N1) с помощью данного метода (Фиг.4 отрезок 4 сенсограммы). Пример 5. Детекция антител к вирусу с помощью предлагаемого устройства.
Селективное определение антител к вирусу гриппа a/iiv-moscow/o 1/2009 (HlNl)swl производили с помощью сенсора, чувствительного элемент которого представлен «ПАн/ПАМПСК - вирус a/iiv-moscow/o 1/2009 (HlNl)swl». Подготовленный по методике, описанной в примере 3, чувствительный элемент сенсора использовали для выявления антител вируса гриппа A/IIV-Moscow/01/2009 (HlNl)swl. Детекцию аналита из исследуемого образца осуществляли методом поверхностного плазменного резонанса. Отсутствие взаимодействия иммобилизованного вируса гриппа A/IIV-Moscow/01/2009 (HlNl)swl с негомологичными антителами (антитела вируса гриппа В) подтверждается тем, что резонансный угол остается без изменений (Фиг.5 отрезок 3 сенсограммы). Образование комплекса "антиген-антитело" приводит к изменению оптических характеристик чувствительного элемента сенсора, и, следовательно, к изменению резонансного угла, что позволяет селективно детектировать антитела вируса гриппа A/IIV-Moscow/01/2009 (HlNl)swl с помощью данного метода (Фиг.5 отрезок 4 сенсограммы).
Предложенная полезная модель решает задачу быстрого и эффективного детектирования биологических объектов, например: нуклеиновых кислот, белков, вирусов, антител и др. белковых структур, способных избирательно связываться. Упрощает процедуру идентификации, например вирусов, сокращает время, необходимое для определения аналита в растворах. ППР-измерения, совмещенные с электрохимическим методом, позволяют одновременно контролировать по крайней мере два параметра исследуемой системы, например, изменение резонансного угла и изменение потенциала, что в значительной мере расширяет потенциальные возможности применения данного устройства (чувствительного элемента сенсора). Кроме этого, предложенная полезная модель по предварительным расчетам является экономически более выгодной по сравнению с имеющимися коммерческими ППР-сенсорами зарубежных производителей.
Литература:
1. Грин М.Дж. Новые подходы. Биосенсоры: Основы и приложения М.:Мир, 1992
2. Konig В and Gratzel М.A piezoelectric immunosensor for hepatitis viruses.// Anal. Chim. Acta. 1995.V. 309. PP.19-25
3. Zhou X.D., Liu L.J., Нu M., Wang L.L., Hu J.M. Detection of hepatitis В virus by piezoelectric biosensor. II J. Pharm. Biomed. Anal. 2002, V. 27, PP. 341.
4. Dickert F., Hayden O., Bindeus R., Mann K..-J., Blaas D., Waigmann E. Bioimprinted QCM sensors for virus detection-screening of plant sap //Anal. Bioanal. Chem., 2004, V. 378, №8,PP. 1929-1934.
5. Райтман О.А. Метод спектроскопии поверхностного плазмонного резонанса для исследования физико-химических характеристик веществ на твердых подложках, методическое пособие, ИФХЭ РАН, Москва, 2010.
6. M.A.Cooper, D.H. Williams, Y.R.Cho. Surface plasmon resonance analysis of glycopeptide antibiotic activity at a model membrane surface. // Chem.Commun.1997, PP. 1625-1626.
7. J.M.Brockman, A.G.Frutos, R.M.Corn A multistep chemical modification procedure to creat DNA arrays on gold surfaces for the study of protein-DNA interactions with surface plasmon resonance imaging.// J.Am.Chem.Soc. 1999, V.121, PP. 8044-8051
8. S.Koide,Y.Iwasaki, T.Horiuchi, O. Niwa, E.Tamiya K.Yokoyama А novel biosensor using electrochemical surface plasmon resonance http://measurements.il// Chem. Commun. 2000, PP.741-742
9. Z.M.Tahir, E.C.Alocilja, D.L. Grooms Polyaniline synthesis and its biosensor application. // Biosensors and Bioelectronics, 2005, V.20, # 8, PP. 1690-1695
10. A.Sargent, T.Loi, S.Gal, O.A. Sadik. The electrochemistry of antibody-modified conducting polymer electrodes. // J. Electroanal. Chem. 1999, V.470. PP.144-156.
11. О.А.Райтман Оптическое преобразование редокс-состояний полимерных посредников и кофакторов при электро- и биохимических превращениях. Спектроскопия поверхностоного плазмонного резонанса. Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук. Москва 2004, 142 с.
12. Иванов В.Ф., Иванова В.Т., Томилин М.Г. и др. Способ определения вирусов гриппа. Патент РФ №2290444(RU).
13. Иванова В.Т. Иванов В.Ф., Грибкова О.Л. и др. Полианилин в качестве сорбентов для удаления вирусов, белков невирусной природы и в качестве основы иммуносорбентов, способ удаления или фиксации вирусов с помощью этих сорбентов, способ иммуносорбции с помощью этих сорбентов, способ сорбции с помощью этих сорбентов. Патент №2372951 (RU).
14. Львов Д.К., Бурцева Е.И., Прилипов А.Г. и др. Штамм вируса гриппа A/IIV-Moscow/01/2009 (H1N1)swl для разработки средств и методов биологической защиты. Патент РФ №2412244(RU).