Способ прогнозирования риска развития сочетания генитального эндометриоза и гиперпластических процессов эндометрия на основе молекулярно-генетических данных
METHOD FOR FORECASTING THE RISK OF DEVELOPMENT OF COMBINATION OF GENITAL ENDOMETRIOSIS AND HYPERPLASTIC ENDOMETRY PROCESSES BASED ON MOLECULAR-GENETIC DATA

Изобретение относится к области медицинской диагностики, может быть использовано для прогнозирования риска развития сочетания генитального эндометриоза и гиперпластических процессов эндометрия.
Генитальный эндометриоз – процесс, при котором за пределами полости матки происходит доброкачественное разрастание ткани, по морфологическим и функциональным свойствам подобной эндометрию [Acién P., Velasco I. Endometriosis: A Disease That Remains Enigmatic // ISRN Obstetrics and Gynecology. 2013. V. 2013. 242149]. Данное заболевание встречается у 10% женщин репродуктивного возраста и является одной из основных причин бесплодия, дисменореи, диспареунии, а также хронических тазовых болей, спаечного процесса органов малого таза, что в совокупности приводит к общему ухудшению качества жизни женщин [Mehedintu C., Plotogea M., Ionescu S., Antonovici M. Endometriosis still a challenge // J of Medicine and Life. 2014. V. 7(3). P. 349-357].
Гиперпластические процессы эндометрия – хроническое прогрессирующее заболевание, характеризующееся нефизиологической пролиферацией железистого и стромального компонента слизистой оболочки матки [Chandra V., Kim J.J., Benbrook D.M., et al. Therapeutic options for management of endometrial hyperplasia // J Gynecol Oncol. 2016. V. 27(1). e8]. В структуре гинекологической заболеваемости гиперплазия эндометрия составляет от 10 до 50% [Orbo A., Arnes M., Vereide A.B., Straume B. Relapse risk of endometrial hyperplasia after treatment with the levonorgestrel impregnated intrauterine system or oral progestogens // BJOG. 2016. V. 123(9). P. 1512–1519]. Чаще всего гиперплазия эндометрия протекает бессимптомно, особенно в постменопаузальном периоде. Риск развития рака эндометрия у женщин предменопаузального и постменопаузального периода значительно увеличивается с возрастом [Yuk J.-S. The incidence rates of endometrial hyperplasia and endometrial cancer: a four-year population-based study // Peer J. 2016. 4. e2374].
Сочетанное развитие генитального эндометриоза и гиперпластических процессов эндометрия характеризуется более тяжелым клиническим течением и создает трудности при проведении дифференциального диагноза и выборе адекватного метода лечения.
С практической точки зрения представляется крайне необходимым выделение критериев индивидуального прогнозирования у женщин риска развития сочетания генитального эндометриоза и гиперпластических процессов эндометрия на основании исследования генов-кандидатов с целью выявления индивидуумов, предрасположенных к формированию генитального эндометриоза и гиперпластических процессов эндометрия.
В изученной научно-медицинской и доступной патентной литературе авторами не было обнаружено способа прогнозирования риска развития сочетания генитального эндометриоза и гиперпластических процессов эндометрия на основе данных о комбинации генетических вариантов локусов rs4633, rs757647 и rs555621.
Для оценки сложившейся патентной ситуации был выполнен поиск по охранным документам за период с 1990 по 2017 гг. Анализ документов производился по направлению: способ прогнозирования риска развития сочетания генитального эндометриоза и гиперпластических процессов эндометрия на основе молекулярно-генетических данных в зависимости от полиморфных маркеров генов rs3756261, rs7753051, rs1544410 и rs2090409.
За прототип выбран патент РФ № 2468367 (дата публикации 12.08.2011) «Способ прогнозирования риска развития гиперплазии эндометрия у женщин с генитальным эндометриозом», который заключается в том, что у пациентки выделяют ДНК из периферической венозной крови, получают данные о генетическом полиморфизме -308G/A фактора некроза опухоли α. В случае выявления аллеля -308 А больные генитальным эндометриозом имеют высокий риск развития гиперплазии эндометрия.
Недостаток метода заключается в том, что он позволяет прогнозировать риск возникновения гиперплазии эндометрия среди больных генитальным эндометриозом и не дает возможность спрогнозировать риск развития сочетания эндометриоза и гиперпластических процессов эндометрия среди здоровых женщин.
Задачей настоящего исследования является расширение арсенала способов диагностики, а именно создание способа прогнозирования риска развития сочетания генитального эндометриоза и гиперпластических процессов эндометрия на основе данных о сочетании однонуклеотидных полиморфизмов – rs3756261, rs7753051, rs1544410 и rs2090409.
Технический результат использования изобретения – получение критериев оценки риска развития сочетания генитального эндометриоза и гиперпластических процессов эндометрия у женщин русской национальности, уроженок Центрального Черноземья на основе данных о комбинации генетических вариантов локусов rs3756261, rs7753051, rs1544410 и rs2090409.
В соответствии с поставленной задачей был разработан способ прогнозирования риска развития сочетания генитального эндометриоза и гиперпластических процессов эндометрия, включающий:
- выделение ДНК из периферической венозной крови;
- анализ полиморфизмов генов rs3756261, rs7753051, rs1544410 и rs2090409;
-прогнозирование повышенного риска развития сочетания генитального эндометриоза и гиперпластических процессов эндометрия у женщин русской национальности, уроженок Центрального Черноземья в случае выявления комбинации аллеля G rs3756261 с аллелем T rs7753051 с аллелем A rs1544410 с аллелем T rs2090409.
Новизна и изобретательский уровень заключаются в том, что из уровня техники не известна возможность прогноза риска развития сочетания генитального эндометриоза и гиперпластических процессов эндометрия по данным о комбинации генетических вариантов локусов rs3756261, rs7753051, rs1544410 и rs2090409.
Способ осуществляют следующим образом:
ДНК выделяют из образцов периферической венозной крови  индивидуумов в 2 этапа. На первом этапе к 4 мл крови добавляют 25 мл лизирующего буфера, содержащего 320мМ сахарозы, 1% тритон Х-100, 5мМ MgCl2, 10мМ трис-HCl (pH=7,6). Полученную смесь перемешивают и центрифугируют при 4ºС, 4000 об./мин. в течение 20 минут. После центрифугирования надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 4 мл раствора, содержащего 25 мМ ЭДТА (рН=8,0) и 75 мМ NaCl, ресуспензируют. Затем прибавляют 0,4 мл 10% SDS, 35 мкл протеиназы К (10мг/мл) и инкубируют образец при 37ºС в течение 16 часов.
На втором этапе из полученного лизата последовательно проводят экстракцию ДНК равными объемами фенола, фенол-хлороформа (1:1) и хлороформа с центрифугированием при 4000 об./мин. в течение 10 минут. После каждого центрифугирования производят отбор водной фазы. ДНК осаждают из раствора двумя объемами охлажденного 96% этанола. Сформированную ДНК растворяют в бидистиллированной, деионизованной воде и хранят при -200С. Выделенную ДНК используют для проведения полимеразной цепной реакции синтеза ДНК.
Анализ всех локусов rs3756261, rs7753051, rs1544410 и rs2090409 осуществляют методами полимеразной цепной реакции (ПЦР) синтеза ДНК. ПЦР проводят на аппарате IQ5 (Bio-Rad) в режиме real time с использованием ДНК-полимеразы Thermus aquaticus производства фирмы «Силекс-М» и стандартных олигонуклеотидных праймеров и зондов, синтезированных фирмой «Синтол» с последующим анализом полиморфизмов методом дискриминации аллелей. Для дискриминации аллелей используют программу Bio-Rad «IQ5-Standart Edition».
Возможность использования предложенного способа для оценки риска развития сочетания генитального эндометриоза и гиперпластических процессов эндометрия подтверждает анализ результатов наблюдений 85 женщин русской национальности, являющихся уроженками Центрального Черноземья РФ, имеющих сочетание генитального эндометриоза с гиперпластическими процессами эндометрия и 981 человек контрольной группы. Обследование пациенток проводили врачи гинекологического отделения и отделения вспомогательных репродуктивных технологий перинатального центра Белгородской областной клинической больницы Святителя Иоасафа. В контрольную группу включалиь женщин, не имеющих пролиферативных заболеваний органов малого таза и доброкачественных заболеваний молочных желез. Формирование контрольной выборки осуществляли при профилактических осмотрах (диспансеризации). Обследование женщин проводили врачи консультативно-диагностического отделения перинатального центра Белгородской областной клинической больницы Святителя Иоасафа.
Критерии включения в исследуемые выборки:
1. Женщины русской национальности, родившиеся в Центральном Черноземье России и не имеющие между собой родства;
2.  Добровольное согласие пациенток на проведение исследования.
3. В группу больных включались индивидуумы только после установления диагнозов генитального эндометриоза и гиперпластических процессов эндометрия, подтвержденных с помощью клинических, клинико-инструментальных и клинико-лабораторных методов исследования.
Критерии исключения из исследуемых выборок:
1. Пациентки со злокачественными заболеваниями органов малого таза и молочных желез;
2. Женщины с нерусской национальностью, родившиеся вне Центрального Черноземья;
3. Индивидуумы, отказавшиеся от участия в исследовании.
Типирование молекулярно-генетических маркеров осуществляли в лаборатории «Молекулярной генетики человека» медицинского института Белгородского государственного национального исследовательского университета.
Изучение роли комбинации генетических вариантов rs3756261, rs7753051, rs1544410 и rs2090409 в формировании сочетания генитального эндометриоза и гиперпластических процессов эндометрия проводили с помощью программного обеспечения АРSampler [http://sources.redhat.com/cygwin/], использующего метод Монте-Карло марковскими цепями и байесовскую непараметрическую статистику [A Gibbs sampler for identiﬁcation of symmetrically structured, spaced DNA motifs with improved estimation of the signal length [Text] / A. V.Favorov, M. S. Gelfand, A. V. Gerasimova [et al.] // Bioinformatics. – 2005. – Vol. 21, № 10. – P. 2240-2245].
Установлены статистически достоверные различия в концентрации комбинации генетических вариантов G rs3756261 с T rs7753051 с A rs1544410 и T rs2090409 между пациентками с сочетанием генитального эндометриоза и гиперпластических процессов эндометрия (9,88%) и контрольной группой (3,10%). Следовательно, комбинация указанных генетических вариантов является фактором риска развития сочетания генитального эндометриоза и гиперпластических процессов эндометрия (p=0,0003, OR=3,42, 95% CI 1,81-6,49).
Таким образом, результаты, полученные с помощью биоинформатического анализа, свидетельствуют о значимом вкладе комбинации полиморфных вариантов генов rs3756261, rs7753051, rs1544410 и rs2090409 в формирование сочетания генитального эндометриоза и гиперпластических процессов эндометрия. Фактором риска развития сочетания генитального эндометриоза и гиперпластических процессов эндометрия у женщин является комбинация аллеля G rs3756261 с аллелем T rs7753051 с аллелем A rs1544410 с аллелем T rs2090409.
В качестве примеров конкретного выполнения разработанного способа приведено генетическое обследование по локусам rs3756261, rs7753051, rs1544410 и rs2090409 трех женщин (добровольцев) русской национальности, являющихся жителями Центрального Черноземья, не имеющих среди родственников 1-й степени родства больных доброкачественными пролиферативными заболеваниями матки.
Пример 1. У женщины А. была выявлена комбинация аллеля G rs3756261 с аллелем T rs7753051 с аллелем A rs1544410 с аллелем T rs2090409. На основании этого женщина включена в группу риска по развитию сочетания генитального эндометриоза и гиперпластических процессов эндометрия. Повторное обследование через 1 год подтвердило обоснованность прогноза. Назначен комплекс лечебных мероприятий, регулярный профилактический осмотр (посещение гинеколога раз в 6 месяцев).
Пример 2. У женщины В. была выявлена комбинация аллеля G rs3756261 с аллелем T rs7753051 с аллелем A rs1544410 с аллелем T rs2090409. На основании этого у нее прогнозируют повышенный риск развития сочетания генитального эндометриоза и гиперпластических процессов эндометрия. Данная женщина включена в группу риска по развитию сочетания генитального эндометриоза и гиперпластических процессов эндометрия, ей назначен комплекс профилактических мероприятий по предупреждению развития генитального эндометриоза и гиперпластических процессов эндометрия (лечение хронических гинекологических заболеваний, рациональное питание, физическая активность, нормализация психо-эмоционального состояния, регулярный профилактический осмотр (посещение гинеколога раз в 6 месяцев и УЗИ органов малого таза) и др.). Повторные осмотры подтвердили эффективность проведенного комплекса профилактических мероприятий.
Пример 3. У женщины С. была выявлена комбинация аллеля A rs3756261 с аллелем C rs7753051 с аллелем G rs1544410 с аллелем G rs2090409. На основании этих результатов у данной пациентки прогнозируют низкий риск развития сочетания генитального эндометриоза и гиперпластических процессов эндометрия, что подтверждено дальнейшим наблюдением.
Применение данного способа позволит формировать среди женщин на доклиническом этапе группы риска по развитию сочетания генитального эндометриоза и гиперпластических процессов эндометрия и своевременно реализовывать в этих группах необходимые лечебно-профилактические мероприятия по предупреждению развития генитального эндометриоза и гиперпластических процессов эндометрия.