СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ ОСТРОЙ РЕАКЦИИ ТРАНСПЛАНТАТ ПРОТИВ ХОЗЯИНА ПОСЛЕ ТРАНСПЛАНТАЦИИ АЛЛОГЕННОГО КОСТНОГО МОЗГА
METHOD FOR PREVENTION OF ACUTE GRAFT-VERSUS-HOST DISEASE FOLLOWING MARROW ALLOGRAFTING

Изобретение относится к медицине, а именно к гематологии, и может быть использовано для модуляции иммунного ответа, в частности для профилактики острой реакции трансплантат против хозяина (оРТПХ) после трансплантации аллогенного костного мозга.
Трансплантация аллогенных гемопоэтических стволовых клеток (ТГСК) используется для лечения многих онкогематологических заболеваний, а также апластической анемии и солидных опухолей и является, зачастую, единственным методом полного излечения пациентов. Реакция трансплантат против хозяина (РТПХ) - это главное осложнение, возникающее после трансплантации аллогенных стволовых кроветворных клеток, связанное с повреждением органов и тканей реципиента иммунокомпетентными Т-лимфоцитами донора. Целью множества работ является достижение успешного приживления донорских кроветворных клеток, сопровождающегося противоопухолевым эффектом и при этом не приводящего к РТПХ. Несмотря на все усилия, у 10-80% пациентов после трансплантации аллогенных гемопоэтических стволовых клеток в течение первых 100 дней после ТГСК развивается острая РТПХ. Основные органы-мишени при этом осложнении: кожа, печень и желудочно-кишечный тракт. Реакция трансплантат против хозяина, особенно ее резистентная форма, остается основной причиной смерти реципиентов после ТГСК. Примерно половина пациентов с резистентными к лечению формами оРТПХ погибают, как правило, вследствие ассоциированных с этим процессом инфекций. Профилактика реакции трансплантат против хозяина с помощью иммуносупрессивной терапии или удаления донорских лимфоцитов из трансплантированных кроветворных клеток не всегда является полностью успешной. Лечение оРТПХ включает использование иммуносупрессивных препаратов, таких как глюкокортикоиды, циклоспорин/такролимус, антитимоцитарный глобулин, моноклональные антитела. Однако все эти средства увеличивают риск неприживления трансплантата, развития инфекционных осложнений и рецидивов исходного заболевания.
Хроническая реакция трансплантат против хозяина (хРТПХ) обычно развивается через 100-500 дней после ТГСК примерно у 50% пациентов и сопровождается симптомами, аналогичными аутоиммунным заболеваниям. Частота развития хРТПХ выше у больных, ранее перенесших острую РТПХ. Современная терапия хронической реакции трансплантат против хозяина включает в себя иммуносупрессоры и цитостатические препараты. Как и в случае с оРТПХ, длительное лечение иммуносупрессивными препаратами повышает риск развития инфекций и рецидивов заболевания. В связи с этим исключительно важным является применение новых методов терапии РТПХ.
Для клеток человека было предложено определять мезенхимальные стволовые клетки (МСК) как прилипающие к пластику фибробластоподобные клетки костного мозга, способные дифференцироваться в костном, хрящевом и жировом направлениях под действием соотвествующих индукторов in vitro (Caplan, (1991) J.Orthop.Res., 9:641-650). Для клеток, отвечающих этому определению, невозможно доказать способность к самоподдержанию. В связи с этим было предложено называть подобные клетки мультипотентными мезенхимальными стромальными клетками (ММСК) (Horwitz et al., (2005) Cytotherapy., 7:393-395), а термин МСК использовать только для клеток, у которых доказана способность к самоподдержанию. В клеточной терапии используются мезенхимальные клетки-предшественники, являющиеся по сути ММСК.
ММСК, выделенные из костного мозга, обладают иммуносупрессивными свойствами, что было продемонстрировано в исследованиях in vivo и in vitro. ММСК не экспрессируют маркеры кроветворных клеток, такие как CD45, CD34, CD3, CD14, тогда как CD29, CD90, CD73, CD105, CD106, CD146 и CD273 являются маркерами ММСК (Majumdar et al., (2003) J.Biomed. Sci., 10:228-241). ММСК - это мультипотентные клетки, способные дифференцироваться в различные линии мезенхимной дифференцировки, включая адипоциты, хондроциты и остеоциты (Pittenger et al., (1999) Science, 284:143-147). ММСК секретируют различные цитокины, ростовые факторы и молекулы внеклеточного матрикса, которые играют важную роль в пролиферации и созревании стволовых кроветворных клеток (Jones et al., (2008) Exp. Hematol., 36:733-741). Изучение свойств ММСК при культивировании в системе in vitro показало, что эти клетки не иммуногенны и обладают иммуносупрессивными свойствами. Возможность получить при культивировании большое количество ММСК, необходимое для терапевтических нужд, привело к быстрому переходу от экспериментального изучения in vitro к использованию этих клеток в Фазе П клинических протоколов (Jones et al., (2008) Exp. Hematol., 36:733-741).
ММСК получают из различных эмбриональных и взрослых тканей, к которым относятся костный мозг, жировая ткань, дерма, клетки пуповинной крови, плаценты и амниотической жидкости. Основным способом их получения является выделение популяции фибробластоподобных клеток, прилипающих к пластику культуральной посуды (номера патентов RU 2331670 C1, 20.08.2008, RU 2323252 C1, 27.04.2008, RU 2303632 C1, 27.07.2007, RU 2280462 C2, 27.07.2006, RU 2252252 C1, 20.05.2005, WO 1999047163, 23.09.1999, WO 2005093044, 06.10.2005, WO 2007143139, 13.12.2007, WO 2009040666, 02.04.2009).
Было показано, что ММСК избегают аллогенного отторжения у человека (Aggarwal et al., (2005) Blood, 105:1815-1822), (Le Blanc et al., (2004) Scand.J.Immunol., 60:307-315) и могут быть трансплантированы без специальной иммуносупрессии (Majumdar et al., (2003) J.Biomed.Sci., 10:228-241).
Наличие у ММСК иммуномодулирующих свойств позволяет их использовать для лечения аутоиммунных заболеваний (RU 2298410 C1, 10.05.2007, WO 2005093044, 06.10.2005, WO 2008042174, 10.04.2008). В некоторых работах использовали биотрансплантат для лечения аутоиммунных и ревматических заболеваний, содержащий мезенхимальные стволовые клетки (МСК), полученные из фетального, донорского или аутологичного материала, при этом ткань дезагрегировали, полученную клеточную суспензию ресуспендировали и культивировали на ростовой среде, содержащей трансферин, инсулин, фактор роста фибробластов и гепарин до накопления в культуре клеток зрелой стромы. Способ лечения аутоиммунных и ревматических заболеваний заключался во внутривенном капельном введении МСК от 50 до 500 млн в 50-100 мл физиологического раствора или инфукола (RU 2298410 C1, 10.05.2007). В других случаях МСК культивировали на ростовой среде, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, до накопления в культуре необходимого количества клеток. Способ лечения заключался во внутривенном, внутрибрюшинном или локальном (непосредственно в орган) введении от 10 тыс. до 100 млн МСК (WO 2005093044, 06.10.2005, WO 2008042174, 10.04.2008).
В последнее время были получены важные данные по изучению иммуномодулирующих свойств ММСК, с помощью которых эти клетки могут предотвращать или лечить РТПХ.
На основании полученных данных ММСК начали использовать в клинике (Le Blanc et al., (2004) Lancet, 363:1439-1441), было пролечено большое количество пациентов с помощью ММСК и получены обнадеживающие результаты (Jorgensen С. et al., (2003) Gene Therapy, 10, 928-931). В работе Ле Бланк с соавторами (Ringden et al., (2006) Transplantation, 81:1390-1397) было показано, что введение ММСК связано со значительным улучшением состояния больных без достоверных побочных эффектов. Однако механизм действия ММСК, приводящий к клиническому улучшению состояния больных, остается неизвестным, а работы на моделях животных пока не дали однозначных результатов. В различных исследованиях на животных было установлено, что ММСК высокоэффективно предотвращают развитие РТПХ, однако, не являются предпочтительной терапией для лечения уже развившейся тяжелой РТПХ (Tisato et al., (2007) Leukemia, 21:1992-1999), (Sudres et al., (2006) J. Immunol., 176:7761-7767). Работа Toubai Т. et al., Mesenchymal Stem Cells for Treatment and Prevention of Graft-Versus-Host Disease After Allogeneic Hematopoietic Cell Transplantation, Current Stem Cell Research & Therapy, 2009, 4, 252-259, в которой приведены 6 работ по профилактике острой реакции трансплантат против хозяина на мышиных моделях, в частности работа (Tisato et al., (2007) Leukemia, 21:1992-1999), является ближайшим аналогом (прототипом) заявленного способа. В данном аналоге признаками, совпадающими с существенными признаками заявляемого изобретения, являются (1) использование ММСК для (2) профилактики развития оРТПХ. Однако работы выполнены на ММСК мыши либо на ММСК, полученных из пуповинной крови человека, в качестве реципиентов были использованы иммунодефицитные мыши, что препятствует получению технического результата, который обеспечивается представляемым изобретением. В настоящее время все опубликованные работы по профилактике острой реакции трансплантат против хозяина выполнены на мышах. Нет ни одной работы по профилактике острой реакции трансплантат против хозяина с помощью мезенхимальных клеток у человека.
Для лечения и профилактики РТПХ в зарубежных патентах в качестве иммуносупрессивного агента предлагается применять как сами ММСК, так и кондиционированную среду, в которой предварительно культивировали ММСК, а также лизаты этих клеток (WO 2001032189, 10.05.2001, WO 1999047163, 23.09.1999, WO 2009134429, 05.11.2009). В некоторых случаях применение ММСК сочетали со стандартной иммуносупрессивной терапией (WO 2007089627, 09.08.2007, WO 2007143139, 13.12.2007).
Все описанные методы получения ММСК использовали либо бессыворочную среду, либо эмбриональную телячью сыворотку (ЭТС). Известно, что на бессывороточной среде клетки хуже растут и быстрее стареют. Использование ЭТС связано, во-первых, с соприкосновением клеток человека с продуктом животного происхождения, что может привести к различным осложнениям (Samuelsson et al., (2009) Cytotherapy., 11:129-136), а во-вторых, на остатки ЭТС, попадающие в организм пациентов, у них развивается иммунный ответ. Так, при лечении несовершенного остеогенеза у ребенка, получавшего несколько раз ММСК от отца, выращенные в среде с ЭТС, выработались антитела к ЭТС, которые нивелировали действие трансплантата (Horwitz et al., (1999) Nat.Med., 5:309-313).
Этих осложнений можно избежать, если использовать вместо ЭТС плазму, обогащенную тромбоцитами. В работе Ланге с соавторами (Lange et al., (2007) J.Cell Physiol, 213:18-26) показано, что добавление к среде культивирования 5% лизата тромбоцитов, полученного из концентрата тромбоцитов, обеспечивает рост ММСК с эффективностью, аналогичной росту в присутствии ЭТС.
Технический результат заявленного изобретения на основе разработанной клеточной технологии заключается в повышении эффективности профилактики оРТПХ за счет снижения осложнений при использовании ММСК из клеток костного мозга доноров.
6
9
Задача профилактики оРТПХ решается за счет того, что используют мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки донора (ММСКД), выращенные на среде с плазмой крови человека, обогащенной лизированными тромбоцитами. При этом клетки вводят внутривенно в количестве 1×10на кг веса больного в момент восстановления лейкоцитов в периферической крови больного после трансплантации аллогенного костного мозга более 1,0×10/л.
9
Плазму крови человека, обогащенную тромбоцитами (концентрация тромбоцитов 0,5-1.9×10/мл), получают, предпочтительно, в результате размораживания предварительно замороженного при -70°С аппаратного тромбоконцентрата с последующим осаждением лизата тромбоцитов при 12000 об/мин в течение 15 минут.
ММСКД могут быть получены из ядросодержащих клеток костного мозга донора.
Ядросодержащие клетки костного мозга донора получают ресуспендированием костного мозга в питательной среде с 0,1% метилцеллулозы, инкубацией смеси при комнатной температуре в течение 40 минут и последующим центрифугированием фракции, не содержащей эритроцитов, при 1500 об/мин в течение 10 минут.
2
Ядросодержащие клетки культивируют в среде αМЕМ с 4% плазмы, обогащенной тромбоцитами, 200 мМ L-глутамина и антибиотиками в концентрации 120000 клеток на см площади дна флакона.
2
Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки донора, достигшие конфлуэнтности, снимают с подложки с помощью 0,025% трипсина и пассируют в концентрации 4500 клеток на 1 см дна флакона.
ММСКД после снятия с подложки могут быть центрифугированы при 1500 об/мин в течение 10 минут и ресуспендированы в полиглюкине в необходимом количестве.
6
ММСКД вводят в количестве 1×10/кг веса больного внутривенно в течение 10 мин.
ММСКД могут быть использованы как непосредственно после их получения, так и после размораживания клеток, ранее замороженных в парах жидкого азота в среде с 10% диметилсульфоксида.
9
Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки донора могут быть введены для профилактики оРТПХ в период восстановления кроветворения после трансплантации стволовых кроветворных клеток (ТСКК), определяемый по восстановлению количества лейкоцитов в его периферической крови более 1,0×10/л. Достигаемый результат заключается в получении совместимых с иммунной системой больного ММСКД в оптимальных условиях культивирования, а также введении их больному в необходимом количестве и в строго определенное время.
Пример 1.
9
6
6
Больная Б., 20 лет, диагноз - хронический миелолейкоз, вес 56 кг. Трансплантация аллогенного костного мозга выполнена 17.12.08. Через 27 дней в периферической крови больной было отмечено восстановление лейкоцитов до 1,4×10/л. ММСКД в дозе 70×10 (1,25×10/кг) введены 14.01.2009. Осложнений отмечено не было. Признаков реакции «трансплантат против хозяина» отмечено не было. Срок наблюдения составляет 1 год 9 месяцев.
Пример 2.
9
6
6
Больная К., 22 лет, диагноз - острый лимфобластный лейкоз, вес 48 кг. Трансплантация аллогенного костного мозга выполнена 10.02.09. Через 20 дней в периферической крови больной было отмечено восстановление лейкоцитов до 1,6×10/л. ММСКД перелиты 11.03.2009, доза 53×10 (1,1×10/кг). Отмечалось повышение температуры до 37,8°С. Признаков реакции «трансплантат против хозяина» отмечено не было. Срок наблюдения составляет 1 год 8 месяцев.
Пример 3.
9
6
6
Больная П., 29 лет, диагноз - острый миелобластный лейкоз, вес 60 кг. Трансплантация аллогенного костного мозга выполнена 20.02.09. Через 24 дня в периферической крови больной было отмечено восстановление лейкоцитов до 1,0×10/л. 23.03.2009 введены ММСКД в дозе 60×10 (1,0×10/кг). Отмечалось повышение температуры до 38,1°С с ознобом. Признаков РТПХ нет. Срок наблюдения составляет 1 год 8 месяцев.
Пример 4.
9
6
6
Больная Р., 46 лет, с диагнозом острый миелобластный лейкоз, вес 56 кг. Трансплантация аллогенного костного мозга проведена 27.03.09. Через 20 дней в периферической крови больной было отмечено восстановление лейкоцитов до 1,0×10/л. 20.05.2009 введены ММСКД в дозе 60×10 (1,07×10/кг). Отмечалось повышение температуры до 38,8°С с ознобом. Признаков РТПХ нет. Срок наблюдения составляет 1 год 7 месяцев.
Пример 5.
9
6
6
Больной Р., 47 лет, с диагнозом миелодиспластический синдром, вес 70 кг. Трансплантация аллогенного костного мозга проведена 08.12.09. Через 23 дня в периферической крови больного было отмечено восстановление лейкоцитов до 1,2×10/л. 11.01.2010 введены ММСКД в дозе 65×10 (0,93×10/кг). Отмечалось повышение температуры до 37,8°С с ознобом. Признаков РТПХ нет. Срок наблюдения составляет 10 месяцев.
9
Всего для профилактики оРТПХ вводили ММСКД 13 пациентам. У всех 13 не было отмечено развития оРТПХ - II и более степени, у двух пациентов до ведения ММСКД отмечались признаки острой реакции трансплантат против хозяина I ст, которые полностью регрессировали после введения мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток донора. Из 12 пациентов, которым не вводили ММСКД в период восстановления количества лейкоцитов в периферической крови более 1,0×10/л, у 9 развилась оРТПХ II и более степени. Не обнаружено разницы в инфекционных осложнениях, количестве рецидивов основного заболевания, случаев отторжения трансплантата и общей летальности в группах пациентов, которым проводилась и не проводилась профилактика оРТПХ с помощью ММСКД.
Таким образом, своевременное введение ММСКД является эффективной профилактикой развития оРТПХ у больных после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток.