ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЕ ПРАЙМЕРЫ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ ГИСТОПЛАЗМОЗА HISTOPLASMA CAPSULATUM
OLIGONUCLEOTIDE PRIMERS FOR IDENTIFICATION OF HISTOPLASMOSIS AGENT HISTOPLASMA CAPSULATUM

Изобретение относится к биотехнологии, молекулярной биологии и может быть использовано в медицине для выявления генетического материала возбудителя гистоплазмоза Н.capsulatum в пробах как для диагностики в практическом здравоохранении и службе Роспотребнадзора, так и для научных исследований.
Гистоплазмоз - инфекционное заболевание, вызываемое диморфными грибами, относящимися к виду Н.capsulatum. Высокоэндемичные очаги Histoplasma capsulatum var. capsulatum - возбудителя классического (американского) гистоплазмоза, расположены вдоль реки Миссисипи (США), в Латинской Америке (Венесуэла, Эквадор, Бразилия, Парагвай, Уругвай, Аргентина). Условия окружающей среды в областях высокой эндемичности представлены умеренным климатом с постоянной влажностью. Ареалами существования Н.capsulatum в естественных условиях служат многие азиатские страны, такие как Индонезия, Таиланд, Индия. Histoplasma capsulatum var. duboisii - вариант африканского гистоплазмоза, эндемичен для тропических районов Африки.
Возбудителя гистоплазмоза относят к агентам II группы патогенности, все работы с ними строго регламентированы СП 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)». Манипуляции с данными грибами могут проводиться только в специализированных учреждениях, квалифицированными специалистами, имеющими опыт работы с возбудителями особо опасных инфекций.
Метод полимеразной цепной реакции является прямым методом выявления ДНК данных микромицетов и обладает высокой специфичностью и чувствительностью. В основе метода ПЦР лежит природный процесс репликации ДНК - комплементарное достраивание ДНК матрицы, осуществляемое с помощью фермента ДНК-полимеразы.
Процесс удвоения нуклеиновых кислот можно использовать для получения копий коротких участков ДНК, специфичных для конкретных микроорганизмов, т.е. осуществлять целенаправленный поиск таких специфических участков, что и является целью генодиагностики для выявления возбудителя гистоплазмоза.
Для эффективного проведения ПНР необходимы праймеры - синтетические олигонуклеотиды определенного размера, специфические для каждого типа возбудителей. Праймеры комплементарны последовательностям ДНК на левой и правой границах специфического фрагмента и ориентированы таким образом, что достраивание новой цепи ДНК протекает только между ними. В результате ПЦР происходит многократное увеличение числа копий (амплификация) специфического участка гена, катализируемое ферментом ДНК-полимеразой. Выбор специфического фрагмента и подбор праймеров играет важнейшую роль в специфичности проведения амплификации, что сказывается на качестве проведения анализа исследуемых микромицетов.
A.Bracca et al. разработали полугнездную ПЦР с олигонуклеотидными затравками, фланкирующими фрагменты гена Н-антигена, кодирующего фермент каталазу. В работе использовали пробы крови, биоптата и кожных покровов. Все пробы анализировали с помощью микроскопии, культуральным методом и ПЦР. При исследовании биопсии и кожи результаты всех трех методов совпадали. 4 образца крови были положительные в ПЦР, хотя в двух из них не определялись другими используемыми в работе методами [Molecular detection of Histoplasma capsulatum var. capsulatum in human clinical samples / Bracca A., Tosello M. E., Girardini J.E. et al. // J.Clin.Microbiol. - 2003. - Vol.41, №4. - Р.1753-1755].
Применение гнездной и полугнездой ПЦР имеет определенный недостаток - это высокий риск контаминации проб на втором этапе постановки реакции.
Разработаны праймеры на основе нуклеотидных последовательностей гена М-антигена, кодирующего продукцию β-глюкозидазы. Авторы исследовали чистые культуры, пробы почвы и клинические образцы. Праймеры детектировали H.capsulatum var. capsulatum и H.capsulatum var. duboisii, в то время как пробы, содержащие Н.capsulatum var. farciminosum, были отрицательными [PCR assay for identification of Histoplasma capsulatum based on the nucleotide sequence of the M antigen / Н.L. de Matos Guedes, Guimaraes A.J., Peralta J.M. et al. // J.Clin.Microbiol. - 2003. - Vol.41, №2. - Р.535-539].
Разработана «гнездная» ПЦР с использованием праймеров на основе фрагментов гена 18S рРНК, предложенные Bialek R. в 2001 г. [Diagnosis and monitoring of murine histoplasmosis by a nested PCR assay / Bialek R., Fischer J.R, Feucht A. et al. // J.Clin.Microbiol. - 2001. - Vol.39, №4. - Р.1506-1509]. Преимуществом данной ДНК-мишени для ПЦР является консервативность и мультикопийность этого гена. Однако в реакции амплификации при использовании праймеров, сконструированных на основе рибосомальных генов, могут быть получены ложноположительные результаты. Так, в ходе исследований выявлено, что праймеры, комплементарные последовательностям гена 18S рРНК, детектируют не только H.capsulatum, но и ДНК Paracoccidioides brasiliensis и Blastomyces dermatitidis. Поэтому авторы в работе рекомендуют дополнительно использовать секвенирование для подтверждения специфичности синтезируемых в реакции ампликонов.
Наиболее близким аналогом являются специфичные праймеры на основе фрагментов гена, кодирующего уникальный 100 кДа белок H.capsulatum. Все пробы при последующем секвенировании доказали 100% специфичность этих праймеров [Comparison of staining methods and a nested PCR assay to detect Histoplasma capsulatum in tissue sections / Bialek R., Ernst F., Dietz K. et al. // Microbiology and Infectious Disease. - 2002. - Vol.117. - P.597-603; Evaluation of two nested PCR assays for detection of Histoplasma capsulatum DNA in human tissue / Bialek R., Feucht A., Aepinus C. et al. // J.Сlin.Microbiol. - 2002. - Vоl.40, №5. - Р.1644-1647].
Целью настоящего изобретения является разработка олигонуклеотидных праймеров для идентификации Н.capsulatum методом полимеразной цепной реакции.
Цель достигается конструированием специфичных олигонуклеотидных праймеров для идентификации ДНК возбудителя гистоплазмоза, обладающих активностью прямого и обратного праймеров в реакции амплификации, имеющих следующую структуру:
5'-СССАСАTAGAAAGCCTCGТТСС-3'-HcMs8s
5'-TAGСССTGCTGTTCGTTGС-3'-HcMs8as3
Характеристика олигонуклеотидных праймеров и участка амплифицируемой ДНК.
Основываясь на данных, представленных в базе GenBank NCBI (National Center for Biotechnology Information), была подобрана пара праймеров, обозначенных HcMs8s-HcMs8as3, комплементарная фрагментам гена MS8 (mold-specific MS8 protein) (GenBank NCBI, AY049031), кодирующего белок Н.capsulatum, экспрессия которого происходит в мицелиальной фазе. Протеин ms8 участвует в образовании клеточной стенки гиф, придавая ей гидрофильность и гибкость. Расчетная длина специфического фрагмента составляла 361 п.н.
6
1
В качестве положительного контроля эксперименты проводили на штаммах Н.capsulatum var. capsulatum 6650, 6651, 6652, Н.capsulatum var. duboisii 630, 638, Н.capsulatum var. farciminosum 12-89, используя для выделения ДНК обеззараженные суспензии микромицета в концентрациях от 1×10 клеток/мл до 1×10 клеток/мл. Подсчет клеток дрожжевой фазы проводили в камере Горяева. Апробация праймеров была осуществлена на наборе штаммов возбудителя гистоплазмоза коллекционного центра МЖК Волгоградского научно-исследовательского противочумного института.
2
4
Чувствительность реакции амплификации с праймерами HcMs8s-HcMs8as3 оценивалась при исследовании проб ДНК, выделенных из десятикратных разведений чистых культур возбудителя гистоплазмоза, и составила - 1×10-1×10 клеток/мл.
4
Для обнаружения возбудителя гистоплазмоза методом ПЦР оценена возможность использования сконструированных праймеров для анализа биологического материала (кровь, искусственно контаминированная клетками H.capsulatum). Показано, что использование разработанных праймеров при постановке реакции амплификации позволяет выявлять ДНК возбудителей гистоплазмоза с чувствительностью 1×10 клеток/мл.
Примеры конкретного выполнения.
Пример 1. Методика конструирования олигонуклеотидных праймеров для идентификации ДНК возбудителя гистоплазмоза методом ПЦР.
На основе теоретического изучения секвенированных нуклеотидных последовательностей возбудителя гистоплазмоза, присутствующих в базах данных (EMBL, Genbank, DDBJ), для конструирования праймеров была выбрана последовательность гена MS8 H.capsulatum (mold-specific MS8 protein) (GenBank NCBI, AY049031). Расчетная длина фрагмента ДНК, фланкируемого предлагаемыми праймерами, - 361 п.н. (таблица 1).
Праймеры были проанализированы с помощью компьютерной программы BLAST на web-сервере Национального Центра Биотехнологической Информации (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) для установления гомологии между ними и нуклеотидными последовательностями близкородственных возбудителей особо опасных микозов и гетерологичных микроорганизмов, присутствующих в базах данных (EMBL, GenBank, DDBJ). На момент проведения компьютерного анализа гомологии выявлено не было.
Пример 2. Амплификация специфического фрагмента гена MS8 с помощью разработанных праймеров для идентификации ДНК возбудителя гистоплазмоза.
Для исключения возможности неспецифического отжига праймеров до достижения заданных температурных параметров используют режим «горячего старта». «Горячий старт» обеспечивается приготовлением реакционной смеси, состоящей из двух слоев (верхнего и нижнего), разделенных прослойкой воска. Нижний слой содержит предлагаемые праймеры и дезоксирибонуклеозидтрифосфаты, верхний - реакционный буфер, фермент Taq-полимеразу и ДНК-матрицу. Плавление воска и перемешивание реакционных компонентов происходит на этапе предварительной денатурации ДНК при 95°С.
Общий объем реакционной смеси 25 мкл на 1 пробу.
Приготовление «нижней» реакционной смеси:
Раствор dNTP (2,5 мМ) - 2 мкл
Праймер HcMs8s (12 пМ/мкл) - 1 мкл
Праймер Ms8as3 (12 пМ/мкл) - 1 мкл
Вода деиоинизированная - 1 мкл
Сверху наслаивается расплавленный воск 11 мкл.
(Приготовленные таким образом смеси можно хранить при t +8°С до 6 мес.)
Состав «верхней» реакционной смеси:
Буферный раствор ПЦР-смесь-2-blue или 2,5× ПЦР буфер 7,5 мM
2
MgCl коммерческий препарат фирмы «ЦНИИ Эпидемиологии» (Россия) - 10 мкл
Исследуемая проба ДНК - 10 мкл.
Сверху наслаивают по 30 мкл минерального масла.
Условия проведения реакции для амплификатора «Терцик» (Россия): этап предварительной денатурации ДНК при 95°С - 5 мин, затем в течение 45 циклов - денатурация ДНК при 95°С - 10 сек; отжиг праймеров при 62°С - 10 сек; элонгация цепи при 72°С - 10 сек, с финальной полимеризацией в течение 1 мин.
После этого продукты реакции разделяют путем электрофореза в 1,5% агарозном геле, сравнивая его подвижность с подвижностью полос маркеров молекулярного веса. При использовании разработанного набора праймеров в реакции амплификации с ДНК возбудителя гистоплазмоза синтезируемые ампликоны по электрофоретической подвижности соответствуют расчетным данным (рис.1).
Пример 3. Определение чувствительности и специфичности реакции амплификации с помощью разработанных олигонуклеотидных праймеров для идентификации ДНК возбудителя гистоплазмоза.
Чувствительность реакции амплификации с разработанными специфичными праймерами оценивалась при исследовании проб ДНК, выделенных из десятикратных разведений клеток чистых культур возбудителя гистоплазмоза.
2
4
Обеззараживание исследуемых проб производят добавлением раствора мертиолята натрия до конечной концентрации 0,1% и прогреванием в течение 40 мин при температуре 56°С. Выделение ДНК из чистых культур микромицетов осуществляют с помощью метода гуанидинтиоцианатфенольной экстракции с переосаждением ДНК изопропанолом (Sandhu G.S. et al., 1995). Постановку реакции ПЦР осуществляют, как описано в примере 2. При тестировании коллекции грибных культур H.capsulatum Волгоградского научно-исследовательского противочумного института с использованием разработанных олигонуклеотидных праймеров продукт амплификации синтезировался с ДНК всех штаммов возбудителя гистоплазмоза с чувствительностью 1×10-1×10 клеток/мл. С другими видами близкородственных грибов и гетерологичных микроорганизмов в реакции ПЦР с разработанными праймерами в 100% случаев получен отрицательный результат.
В качестве примера на рисунке 2 показана электрофореграмма результатов реакции амплификации при определении чувствительности сконструированных праймеров с ДНК различных штаммов возбудителя гистоплазмоза.
Таким образом, разработанные праймеры могут быть использованы для идентификации возбудителя гистоплазмоза и позволяют в короткий срок с высокой чувствительностью и специфичностью детектировать возбудителя гистоплазмоза в чистой культуре и биологическом материале.
Таблица 1
Характеристика сконструированных олигонуклеотидных праймеров для идентификации возбудителей гистоплазмоза
Наименование праймеров
Последовательность праймеров
Локализация
Расчетная длина ампликона
HcMs8s
5'-CCCACATAGAAAGCCTCGTTCC-3'
662-683 нуклеотид гена Ms8
361 п.н.
HcMs8as3
5'-TAGCCCTGCTGTTCGTTGC-3'
1004-1022 нуклеотид гена Ms8