СПОСОБ ГИБРИДИЗАЦИИ НК

1. Способ гибридизации НК, включающий стадии:
(а) нагревание гибридизационного раствора, содержащего НК, до температуры, при которой происходит денатурация НК,
(б) охлаждение нагретого гибридизационного раствора до температуры, при которой происходит гибридизация НК с зондами, иммобилизованными на твердой фазе,
(в) гибридизация НК, содержащихся в охлажденном гибридизационном растворе, с зондами, иммобилизованными на твердой фазе, которая находится при температуре гибридизации,
согласно которому гибридизуемые нуклеиновые кислоты перемещаются между зонами денатурации, охлаждения и гибридизации.
2. Способ по п.1, согласно которому нуклеиновые кислоты включают синтетические и/или природные олигонуклеотиды и/или НК в однонитевой и/или двунитевой форме.
3. Способ по п.1, согласно которому нуклеиновые кислоты включают НК, выделенную и/или наработанную из биологического образца.
4. Способ по п.1, согласно которому нуклеиновые кислоты включают ПЦР продукты симметричной или ассиметричной ПЦР.
2
5. Способ по п.1, согласно которому гибридизационный раствор включает в качестве основы воду и компоненты, образующие ионную силу, включая NaCl, KCl, MgCl, гуанидин-изотиоцианат, гуанидин хлорид, тетраэтиламмоний ацетат, тетраметиламмоний хлорид и/или бетаин.
6. Способ по п.1, согласно которому гибридизационный раствор включает ЭДТА, Твин, фосфатный буфер, трис-буфер, формамид, раствор Денхарда, метанол, этанол, HEPES и/или глицерин.
7. Способ по п.1, согласно которому НК, содержащиеся в гибридизационном растворе, маркируют.
8. Способ по п.7, согласно которому НК, содержащиеся в гибридизационном растворе, маркируют радиоактивными метками.
9. Способ по п.7, согласно которому НК, содержащиеся в гибридизационном растворе, маркируют фолуоресцентными метками.
10. Способ по п.7, согласно которому НК, содержащиеся в гибридизационном растворе, маркируют масс-метками для масс-спектрометрического анализа.
11. Способ по п.9, согласно которому флуоресцентная метка включает красители CY-7, CY-5.5, CY-5, CY-3.5, CY-3, BodiPy, TexasRed, FITC, TMR, BlackHoleQuencher1, BlackHoleQuencher2 и/или BlackHoleQuencher3.
12. Способ по п.1, согласно которому НК фрагментируют.
13. Способ по п.12, согласно которому НК фрагментируют перед гибридизацией.
14. Способ по п.12, согласно которому НК фрагментируют во время гибридизации.
15. Способ по п.12, согласно которому НК фрагментируют не зависящим от последовательности способом.
16. Способ по п.12, согласно которому НК фрагментируют случайным способом.
17. Способ по п.12, согласно которому НК фрагментируют случайным и не зависимым от последовательности способом.
18. Способ по п.12, согласно которому НК фрагментируют так, чтобы средняя длина фрагментов была примерно равна длинам иммобилизованных зондов.
19. Способ по п.12, согласно которому НК фрагментируют ферментативно.
20. Способ по п.19, согласно которому НК фрагментируют с помощью урацил-гликозилазы.
21. Способ по п.19, согласно которому НК фрагментируют с помощью ДНКазы.
22. Способ по п.12, согласно которому НК фрагментируют с помощью ультразвука.
23. Способ по п.1, согласно которому стадии (а), (б) и (в) осуществляют за один цикл.
24. Способ по п.1, согласно которому стадии (а), (б) и (в) осуществляют многократно путем рециркуляции в замкнутом цикле.
25. Способ по п.1, согласно которому стадии (а), (б) и (в) осуществляют возвратно поступательно.
26. Способ по п.1, согласно которому стадии (а), (б) и (в) осуществляют прерывисто.
27. Способ по п.1, в котором нагревание гибридизационного раствора на стадии (а) производят до температур, выше, чем температуры денатурации гибридизуемых НК.
28. Способ по п.1, согласно которому время нахождения НК в нагретом состоянии на стадии (а) при температурах, выше, чем температура денатурации НК, больше, чем общее время денатурации в сумме с диффузионным временем расхождения НК.
29. Способ по п.1, согласно которому время охлаждения НК на стадии (б) меньше, чем время ренатурации НК.
30. Способ по п.1, согласно которому общее время нахождения НК в охлажденном состоянии на стадии (б) при температурах ниже температур денатурации в сумме со временем контактирования НК с твердой фазой на стадии (в) должно быть не больше, чем время ренатурации НК.
31. Способ по п.1, согласно которому стадия охлаждения совмещена со стадией гибридизации.
32. Способ по п.1, согласно которому температура охлаждения на стадии (б) отличается от температуры гибридизации.
33. Способ по п.1, согласно которому температура гибридизации на стадии (в) ниже, чем температура нагревания на стадии (а).
34. Способ по п.1, согласно которому температура гибридизации на стадии (в) равна или ниже, чем температура ренатурации НК.
35. Способ по п.1, согласно которому температура гибридизации находится в диапазоне температур плавления дуплексов между гибридизуемыми НК и зондами.
36. Способ по п.1, согласно которому температура гибридизации ниже, чем диапазон температур плавления дуплексов между гибридизуемыми НК и зондами.
37. Способ по п.1, согласно которому зонды, иммобилизованные на твердой фазе, экспонированы в жидкой фазе гибридизационного раствора.
38. Способ по п.1, согласно которому скорость перемещения при потоке гибридизационного раствора с НК в местах иммобилизации зондов на твердой фазе была отлична от нуля.
39. Способ по п.1, согласно которому скорость перемещения НК при потоке гибридизационного раствора в местах иммобилизации зондов на твердой фазе была отлична от нуля.
40. Способ по п.1, согласно которому время прохождения НК от попадания в зону охлаждения до непосредственного момента гибридизации меньше времени ренатурации.
41. Способ по п.1, согласно которому стадию (в) гибридизации проводят в камере, через которую осуществляют перемещение гибридизационного раствора с НК.
42 Способ по п.41, согласно которому камера представляет собой герметичный сосуд, предназначенный для организации потока гибридизационного раствора, содержащий внутри твердую фазу с иммобилизованными зондами, через которую осуществляют перемещение гибридизационного раствора с НК.
43 Способ по п.41, согласно которому камера имеет вход и выход для организации перемещения гибридизационного раствора.
44. Способ по п.41, согласно которому стадии (а), (б) и (в) проводят в одной камере.
45. Способ по п.44, согласно которому камера имеет охлаждаемую и нагреваемую зоны для организации потока гибридизационного раствора с помощью конвекции.
46. Способ по п.44, согласно которому камера имеет охлаждаемую и нагреваемую поверхность, а организацию перемещения гибридизационного раствора осуществляют с помощью внутреннего или внешнего насоса.
47. Способ по п.46, согласно которому насос включает ультразвуковой и/или лепестковый насос.
48. Способ по п.1, согласно которому поверхность твердой фазы в местах прикрепления зондов является гидрофильной.
49. Способ по п.1, согласно которому твердая фаза включает стекло, пористое стекло, кремний, пористый кремний, металл, керамику, полимерный материал, пористый полимерный материал, целлюлозу или нитроцеллюлозу.
50. Способ по п.49, согласно которому на поверхности твердой фазы сформирован дополнительный слой пористого сорбента или гидрогеля.
51. Способ по п.50, согласно которому пористый сорбент или гидрогель включает акриламид, полиметаакрилат, агарозу, гиалуроновую кислоту, альгиновую кислоту и/или декстран.
52. Способ по п.50, согласно которому слой пористого сорбента или гидрогеля сформирован в виде ячеек.
53. Способ по п.52, согласно которому ячейки отделены друг от друга промежутками.
54. Способ по п.52, согласно которому ячейки располагаются вплотную друг к другу.
55. Способ по п.52, согласно которому гидрогелевые ячейки включают акриламид, полиметаакрилат, агарозу, целлюлозу, гиалуроновую кислоту, альгиновую кислоту, декстран.
56. Способ по п.52, согласно которому ячейки образуют регулярный одномерный или двумерный массив.
57. Способ по п.1, согласно которому время диффузии НК гибридизационного раствора через пористые структуры твердой фазы к иммобилизованным зондам в сумме с временем прохождения зоны охлаждения и гибридизации меньше, чем время ренатурации НК.
58. Способ по п.1, согласно которому твердая фаза включает биочип, микрочип, или микроматрицу.
59. Способ по п.1, согласно которому твердая фаза дополнительно включает температурные маркеры для определения температуры.
60. Способ по п.1, согласно которому твердая фаза дополнительно включает температурные маркеры, содержащие однонитевую НК с внутримолекулярной структурой-шпилькой, которая раскрывается при заданной температуре, а на ее концах располагаются флуоресцентная метка и тушитель флуоресценции.
61. Способ по п.60, согласно которому флуоресцентная метка включает красители CY-7, CY5.5, CY-5, CY-3,5, CY-3, BodiPy, TexasRed, FITC, TMR.
62. Способ по п.60, согласно которому тушитель флуоресценции включает красители BlackHoleQuencher1, BlackHoleQuencher2, BlackHoleQuencher3, CY-7, CY5.5, CY-5, CY-3,5, CY-3, BodiPy, TexasRed, FITC, TMR.
63. Способ по п.1, согласно которому зонды, иммобилизованные на твердой фазе, включают фрагменты НК или пептидно-нуклеиновых кислот.
64. Способ по п.1, согласно которому зонды, иммобилизованные на твердой фазе, включают синтетические олигонуклеотиды.
65. Способ по п.1, согласно которому зонды, иммобилизованные на твердой фазе, включают фрагменты к-ДНК
66. Способ по п.1, согласно которому зонды, иммобилизованные на твердой фазе, включают все переборы олигонуклеотидов заданной длинны.
67. Способ по п.1, согласно которому зонды маркируют.
68. Способ по п.67, согласно которому зонды маркируют фолуоресцентными метками.
69. Способ по п.67, согласно которому зонды маркируют фолуоресцентными метками в целях определения количества иммобилизованных зондов на твердой фазе методом измерения сигнала от маркированных зондов.
70. Способ по п.1, согласно которому зонды маркированы температурными маркерами, позволяющими определять температуру в месте их расположения.
71. Способ по п.1, согласно которому температурные маркеры включают однонитевую НК с внутримолекулярной структурой-шпилькой, которая раскрывается при заданной температуре, а на ее концах располагаются флуоресцентная метка и тушитель флуоресценции.
72. Способ по п.71, согласно которому флуоресцентная метка включает красители CY-7, CY-5, CY-3,5, CY-3, BodiPy, TexasRed, FITC, TMR.
73. Способ по п.71, согласно которому тушитель флуоресценции включает красители BlackHoleQuencher1, BlackHoleQuencher2, BlackHoleQuencher3, CY-7, CY-5.5, CY-5, CY-3,5, CY-3, BodiPy, TexasRed, FITC, TMR.
74. Способ по п.1, согласно которому перемещение осуществляют при помощи организации потока жидкости гибридизационного раствора.
75. Способ по п.74, согласно которому поток гибридизационного раствора организуют с помощью прокачивания.
76. Способ по п.1, согласно которому перемещение осуществляют диффузией.
77. Способ по п.1, согласно которому перемещение осуществляют конвекцией.
78. Способ по п.75, согласно которому прокачивание осуществляют с помощью насоса.
79. Способ по п.78, согласно которому насос включает перистальтический насос, ультразвуковой насос, мембранный насос, поршневой насос.
80. Способ по п.1, согласно которому скорость потока гибридизационного раствора с НК обеспечивает нагревание гибридизационного раствора на стадии (а) до температур, выше, чем температура денатурации НК раствора.
81. Способ по п.1, согласно которому скорость потока гибридизационного раствора с НК обеспечивает общее время нагревания на стадии (а) большее, чем время денатурации в сумме с диффузионным временем расхождения НК.
82. Способ по п.1, согласно которому скорость потока гибридизационного раствора с НК обеспечивает охлаждение гибридизационного раствора на стадиях (б) и (в) до температуры гибридизации.
83. Способ по п.1, согласно которому скорость потока гибридизационного раствора с НК обеспечивает общее время охлаждения на стадиях (б) и (в), меньшее, чем время ренатурации НК.
84. Способ по п.1, согласно которому скорость потока гибридизационного раствора с НК обеспечивает нагревание гибридизационного раствора на стадии (а) до температур, выше, чем температура денатурации при общем времени нагрева большем, чем время денатурации в сумме с диффузионным временем расхождения НК, и охлаждение на стадиях (б) и (в) до температуры гибридизации при общем времени охлаждения на стадиях (б) и (в), меньшем чем время ренатурации НК.
85. Способ по п.1, согласно которому стадии (а), (б) и (в) проводят фиксированное время.
86. Способ по п.1, согласно которому стадии (а), (б) и (в) проводят до достижения величины гибридизационных сигналов стационарного уровня.
87. Способ по п.86, согласно которому стационарный уровень обеспечивает установление термодинамического равновесия в образовании дуплексов НК с зондами твердой фазы.
88. Способ по п.86, согласно которому достижение величин обеспечивается с точностью до погрешности.
89. Способ по п.88, согласно которому погрешность определяется стандартным отклонением математического ожидания суммарного сигнала со всех одинаковых зондов.
90. Способ по п.1, согласно которому стадии (а), (б) и (в) проводят до достижения такой величины гибридизационных сигналов, при которой интегральные сигналы, полученные со всех одинаковых зондов, соответствующие количеству образовавшихся при гибридизации дуплексов зондов с НК, отличаются друг от друга на величины, большие, чем стандартное отклонение математического ожидания при усреднении этого сигнала по одинаковым зондам или площади, где расположены одинаковые зонды.
91. Способ по п.1, согласно которому величины сигналов определяют с помощью аналитического способа.
92. Способ по п.91, согласно которому аналитический способ включает радиоактивный способ с применением радиоактивных меток для маркирования НК; флуоресцентный способ с применением флуоресцентных меток для маркирования НК; способ плазмонного резонанса, не требующий меток, и способ регистрации, основанный на измерении электромагнитных полей и электрических токов, включающий размещение чувствительных элементов под зондами, которые включают гальванический или изолированный электрод и/или полевой транзистор.