НАБОР ОЛИГОДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕОТИДНЫХ ПРАЙМЕРОВ И ФЛУОРЕСЦЕНТНО-МЕЧЕНОГО ЗОНДА ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ДНК БОКАВИРУСА ЧЕЛОВЕКА
SET OF OLIGODESOXYRIBONUCLEOTIDE PRIMERS AND FLUORESCENCE MARKED PROBES FOR IDENTIFYING DNA OF HUMAN BOCAVIRUS

Изобретение относится к наборам праймеров и флуоресцентно-меченного зонда для выявления генетического материала (ДНК) бокавируса человека в клинических образцах, секционных пробах, образцах окружающей среды, культуральных вируссодержащих жидкостях и прочих биопрепаратах с целью постановки диагноза, коррекции лечения, эпидемиологического расследования, а также для решения научно-исследовательских задач по мониторингу и изучению свойств коронавируса, созданию диагностических, профилактических и лечебных препаратов и может быть использовано в медицине, биотехнологии и эпидемиологии.
При помощи разработанных диагностических праймеров и флуоресцентно-меченных зондов возможно выявление генетического материала (ДНК) бокавируса человека.
Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) является наиболее распространенным методом, используемым в лабораторной практике для дифференциальной диагностики инфекционных заболеваний. В ПЦР происходит многократное избирательное удвоение целевого участка ДНК (амплификация). Амплифицируемый участок ДНК является маркерным, так как строго ограничен последовательностями ДНК-затравок (праймеров) без которых невозможно протекание ПЦР. Для детекции накопления продуктов амплификации в режиме реального времени помимо пары праймеров необходим также флуоресцентно-меченый ДНК-зонд. Сложность выбора праймеров и зонда обусловлена требованием их строгой видоспецифичности. В случае если выбранные олигонуклеотиды не обладают видовой специфичностью к целевому объекту, либо не обладают достаточной гомологией к целевой нуклеотидной последовательности, возможны ложноотрицательные результаты исследования. В случае если выбранные праймеры и зонды демонстрируют сродство к нецелевым последовательностям ДНК, то возможны ложноположительные результаты исследования. Правильный выбор сочетания пары праймеров и флуоресцентно-меченого ДНК-зонда позволяет осуществить строго специфическую амплификацию целевого фрагмента кДНК и провести детекцию накопления продуктов ПЦР в режиме реального времени.
Известны зарубежные аналоги, представляющие собой наборы праймеров, обеспечивающих специфичный синтез фрагментов на матрице геномной ДНК бокавируса. В патенте Китая № CN 102329887, опубл. 2012 г.) опубликованы олигонуклеотиды для ПЦР в реальном времени, дизайн которых проводился на основе двух геномных последовательностей бокавируса человека (номера в GenBank: NC 007455, EF 441262).
В патентах Китая № CN 101550452, опубл. 2009 г., Кореи № KR 20080111661, опубл. 2008 г., заявке США № US 20120178079, опубл. 2012 г. опубликованы наборы реагентов для детекции бокавируса человека методом ПЦР в реальном времени.
Наиболее близким аналогом (прототипом) является набор праймеров для детекции ДНК бокавируса человека методом ПЦР "АмплиСенсОРВИ-скрин-FL" (http://www.pacxodka39.ru/product_3056.html ЦНИИ Эпидемиологии, г.Москва). Набор реагентов предназначен для выявления возбудителей острых респираторных вирусных инфекций человека (ОРВИ): РНК респираторно-синцитиального вируса, метапневмовируса, вирусов парагриппа 1-4 типов, коронавирусов, риновирусов, ДНК аденовирусов групп В, С и Е и бокавируса в клиническом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией. Бокавирус был открыт недавно, в 2005 г., в Швеции и в международной базе данных имеется сравнительно немного секвенированных последовательностей генома бокавируса человека. С разработкой и широким внедрением в практику так называемого неспецифического секвинирования в международной базе данных GenBank каждый день появляются новые нуклеотидные последовательности геномов бокавируса человека, отличающиеся друг от друга по наличию полиморфизма (точечных мутаций).
Однако номенклатура известных праймеров и зондов для ПЦР-диагностики всех циркулирующих в настоящее время бокавирусов человека в природе явно недостаточно, чтобы решить проблемы диагностики указанных вирусных инфекций.
Техническим результатом заявляемого изобретения является расширения спектра импортозамещающих олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченных зондов, позволяющих идентифицировать бокавирус человека, методом ПЦР в реальном времени.
Указанный результат достигается разработкой набора олигодезоксирибонуклеотидных праймеров для детекции ДНК бокавируса человека, содержащего пару олигонуклеотидных полимеров, обладающих активностью прямого и обратного праймеров в полимеразной цепной реакции, а также флуоресцентно-меченый ДНК-зонд. Указанные олигонуклеотиды имеют следующую структуру:
В рамках заявляемого технического решения разработанные праймеры и ДНК-зонды обладают высокой степенью гомологии ко всем известным нуклеотидным последовательностям геномов изолятов бокавируса человека, доступным в международной базе данных биотехнологической информации GenBank.
Апробация олигонуклеотидов была осуществлена с использованием назофарингеальных смывов от пациентов с симптомами ОРВИ (порядок проведения исследования одобрен этическим комитетом ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» (IRB 00001360)). Экспериментально было показано, что выбранные праймеры и ДНК-зонд обеспечивают надежный синтез целевых ДНК-фрагментов. Специфичность амплификации дополнительно подтверждали секвенированием.
Характеристика набора праймеров и участка амплифицируемой геномной ДНК. Предлагаемые к патентованию праймеры фланкируют участок гена, кодирующего вирусный гликопротеин 1 (VP41-ген). В ПЦР амплифицируется фрагмент генома с 3123 по 3362 нуклеотид (239 п.н.). Использование в комплекте с диагностическими праймерами флуоресцентно-меченного ДНК-зонда позволяет производить детекцию накопления продуктов амплификации в режиме реального времени.
Важно отметить, что оптимизация условий проведения ПЦР осуществлялась с использованием наборов коммерчески доступных реагентов, приборов и ферментов, предназначенных для массового использования в лабораторной практике, что позволяет быстрое и надежное применение данного изобретения в медицинских и научно-исследовательских лабораториях.
Перечень графических материалов
На фиг.1 представлены графики оптимизации ПЦР-РВ по концентрации флуоресцентно-меченого ДНК-зонда в реакционной смеси с использованием плазмидной конструкции pBoV.
На фиг.2 приведены графики исследования назофарингеальных смывов от людей с симптомами ОРВИ. В образце №2 обнаружена ДНК бокавируса человека.
Методика конструирования набора диагностических праймеров и флуоресцентно-меченных зондов
На основе теоретического изучения структуры генома бокавируса человека, на консервативную область гена вирусного гликопротеина 1 (VP1-ген) были рассчитаны и синтезированы праймеры и флуоресцентно-меченый ДНК-зонд для проведения полимеразной цепной реакции (таблица 1). В ходе работы было проанализировано 1356 имеющихся в базе данных нуклеотидных последовательностей генома бокавируса человека.
Таблица 1
Праймеры и зонды для детекции бокавируса человека
Вирус
Последовательность в GenBank
Локализация
Нуклеотидная последовательность 5'-3'
Tm, °C
ПЦР-продукт, п.н.
BoV
NC_007455.1
3123-3144
ATCCWCTTGADAACGGTRAACC
50.6
239
3362-3341
RGGRATAAAGAGMGAGCYCAA
50.1
3322-3338
Cy5-CGCCGTGGCTCCTGCTC-BHQ2
57.4
Методика получения положительных контрольных образцов
Положительные контрольные образцы были получены методом TOPO-T/A клонирования. После чего компетентные клетки Е. coli линии TOP 10 (Invitrogen, США) были трансформированы полученными плазмидами pCR2.1 (Invitrogen, США), несущими вирусспецифическую вставку синтезированных фрагментов ДНК. В ходе проделанной работы была сконструирована рекомбинантная плазмида: pBoV. Наличие специфической к вирусному геному ДНК-вставки подтверждали секвенированием.
Анализ эффективности проведенной трансформации осуществляли проведением ПЦР в режиме реального времени в соответствии с протоколом, описанным ниже, где в реакционную смесь в качестве положительного образца добавляли 1×TE-буфер, содержащий рекомбинантную плазмиду pBoV, со встройкой вирусспецифического синтезированного ДНК-дуплекса. В качестве отрицательного контрольного образца в реакционную смесь добавляли 1×TE-буфер.
Экстракция вирусной ДНК
Вирусную ДНК выделяли из 100 мкл назофарингеального смыва с использованием набора «РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИЭ, г.Москва) согласно инструкции производителя.
Проведение полимеразной цепной реакции
Условия проведения амплификации оптимизировали по концентрации ионов магния, концентрации праймеров и зонда (фиг.1) в реакционной смеси, температуре отжига праймеров. На фиг.1 представлена оптимизация ПЦР-РВ по концентрации ДНК-зонда в реакционной смеси с использованием плазмидной конструкции pBoV. Оптимальная концентрация флуоресцентно-меченного ДНК-зонда подобрана в реакционных смесях для ПЦР №1 и 2 (8 пМ и 7 пМ в реакции).
2
Реакцию амплификации проводили в 30 мкл смеси для ПЦР (таблица 2), содержащей 1×Taq буфер для амплификации, 2.5 мМ MgCl, 0.17 мМ каждого из нуклеозидтрифосфатов, 1.5 активных единиц Smart Taq ДНК-полимеразы (все компоненты ООО «Лаборатория МЕДИГЕН»), 20 пМ прямого и обратного праймеров, 8 пМ флуоресцентного ДНК-зонда.
Таблица 2
ПЦР-смесь (из расчета на одну пробирку)
Компонент
Объем, мкл
ПЦР-буфер × 10
3
дНТФ (5 мМ)
1
MgCl<sub>2</sub> (50 мМ)
1.5
Hot Start Taq ДНК-полимераза (5 а.е./мкл)
0.3
Прямой праймер - F (10 нМ)
2
Обратный праймер - R (10 нМ)
2
ДНК-зонд - Z(15 нМ)
0.5
Образец
3
diH<sub>2</sub>O
16.7
ПЦР в режиме реального времени проводили согласно программе амплификации таблица 3. Детекцию интенсивности флуоресценции проводили по каналу - Red 625/660 нм (краситель Cy5). Измерение флуоресценции проводили на приборах "Rotor Gene 6000" (Corbet Research, Австралия) и iQ5 (BioRad, США). Результаты оценивали по наличию флюоресценции до 30 цикла (фиг.2). На фиг.2 приведены графики исследования назофарингеальных смывов от людей с симптомами ОРВИ. В образце №2 обнаружена ДНК бокавируса человека.
Примечание: 1 - положительный контрольный образец (плазмида со вставкой вирусспецифического фрагмента pBoV);
2 - исследуемый образец (назофарингеальный смыв от человека);
3 - отрицательный контрольный образец (1×ТЕ буфер);
Предлагаемые нами к патентованию праймеры и зонд были апробированы в эпидемиологическом исследовании по изучению видового разнообразия вирусных агентов, вызывавших ОРВИ у жителей г. Новосибирска и Новосибирской области в октябре-апреле 2011-2012 гг. Нами было исследовано 164 образца назофарингеальных смывов от пациентов с симптомами острой респираторной вирусной инфекции. Этиологический агент заболевания был нами установлен в 43% случаев (69 образцов). Бокавирус в исследуемых образцах был выявлен в 2% случаев (3 образца). В структуре сочетанных инфекций бокавирус был выявлен нами в 21,7% случаев (5 образцов из 11). Специфичность ПЦР-исследования дополнительно подтверждали секвенированием.
Таким образом, заявляемый набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченного зонда обеспечивает наравне с известными аналогами надежную и достоверную детекцию бокавируса человека в клинических образцах и других биологических материалах.