СПОСОБ ОЦЕНКИ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ГЛИКОПРОТЕИНА-P В ГЕМАТОЭНЦЕФАЛИЧЕСКОМ БАРЬЕРЕ
METHOD FOR ASSESSING THE FUNCTIONAL ACTIVITY OF GLYCOPROTEIN-P IN THE BLOOD-BRAIN BARRIER

Изобретение относится к медицине, а именно к фармакологии и клинической фармакологии, и может быть использовано с целью оценки функциональной активности гликопротеина-Р (Pgp) в гематоэнцефалическом барьере для осуществления эффективной и безопасной фармакотерапии ряда неврологических заболеваний.
Pgp − АТФ-зависимый белок-транспортер, удаляющий в мочу, желчь и просвет органов широкий спектр липофильных эндогенных и экзогенных, в том числе лекарственных, веществ. Локализуясь в гематоэнцефалическом барьере, он препятствует проникновению его субстратов в головной мозг, с чем связывают развитие лекарственно-резистентной эпилепсии, болезни Альцгеймера и неэффективности фармакотерапии острого нарушения мозгового кровообращения.
Известны модели для изучения проникновения веществ в центральную нервную систему на культурах капиллярных эндотелиальных клетках мозга [Naik P., Cucullo L. // J. Pharm. Sci. 2012. V. 101. P. 1337–1354.]. Однако эксперименты in vitro не дают возможности полноценно проанализировать функционирование транспортеров, в том числе Pgp, в гематоэнцефалическом барьере на организменном уровне. Следует также отметить, что для проведения исследований на культурах клеток необходимо дорогостоящее оборудование и материалы.
Известен способ определения функциональной активности Pgp на уровне целостного организма [RU2587780C1]. Сущность способа заключается в том, что в качестве маркерного субстрата кроликам однократно перорально вводится фексофенадин в дозе 67,5 мг/кг массы в форме суспензии, приготовленной на воде очищенной, далее 3 раза у животных производится забор крови с последующим анализом плазменной концентрации фексофенадина. Для оценки функционирования Pgp рассчитывают его максимальную концентрацию − C<sub>max</sub>, значение которой обратно пропорционально функциональной активности белка-транспортера. Однако данным способом возможно оценить активность Pgp во всем организме, а не локально в гематоэнцефалическом барьере.
11
Известен способ оценки функционирования Pgp в ГЭБ in vivo по анализу церебрального объема распределения R-C-верапамила (субстрата Pgp) методом протонно-эмиссионной томографии [O.L. de Klerk, A.T.M. Willemsen, M. Roosink, A.L. Bartels, N.H. Hendrikse, F.J. Bosker. // Int. J. Neuropsychopharmacol.  2009. V.12. P.895–904]. Однако в связи с медленным поступлением указанного вещества в мозг, при повышенной функциональной активности белка-транспортера может наблюдаться большой шум сигнала, что затрудняет анализ [Syvanen S., Hammarlund-Udenaes M. Curr Top Med Chem. 2010. V. 10. P. 1799–1809]. Кроме того, оборудование для протонно-эмиссионной томографии является весьма дорогостоящим, а работа с радиоактивными изотопами, которые сами по себе являются весьма токсичными и небезопасными, требует наличия соответствующей лаборатории и высокой квалификации сотрудников.
Техническим результатом настоящего изобретения является разработка способа оценки функциональной активности Pgp локально в гематоэнцефалическом барьере, который был бы безопасен, информативен,  не требовал бы дорогостоящего лабораторного оборудования, материалов и комплектующих.
Для решения поставленной задачи был выполнен эксперимент на 90 крысах-самцах вистар массой 200–350 г.
Оценку функциональной активности Рgp проводили по количественному анализу его маркерного субстрата – фексофенадина, фармакокинетика которого (всасывание, распределение, выведение и проникновение в головной мозг) зависит преимущественно от функционирования данного белка-транспортера. Введение индуктора белка-транспортера совместно с его субстратом приводит к снижению всасывания субстрата, уменьшению его проникновения через ГЭБ и ускорению выведения почками и печенью, а применение ингибитора Рgp – к обратному изменению фармакокинетики субстрата [Якушева Е.Н., Черных И.В., Щулькин А.В., Попова Н.М. Успехи  физиологических наук. 2014. Т. 45 (4). С. 89-98]. Поэтому для подтверждения адекватности разработанного способа животным вводили фексофенадин после введения индуктора Pgp и его ингибитора.
Первой группе (n=30) в хвостовую вену вводили фексофенадин  в дозе 10 мг/кг  [Jaisue S.,  Gerber J.P.,  Davey A.K.  // Xenobiotica. 2010. V. 40. № 11. P. 743–750].
Первоначально для оценки активности Pgp в ГЭБ предполагалось вводить фексофенадин перорально [RU2587780C1], однако его фармакокинетика оказалась вариабельной, поэтому в дальнейшем применялось внутривенное введение субстрата, при котором его биодоступность составляет 100%.
В связи с отсутствием лекарственной формы фексофенадина для парентерального введения производилась экстракция лекарственного вещества из таблеток "Аллегра", "Sanofi", Франция (180 мг) следующим образом. Одна таблетка измельчалась и суспендировалась в 20 мл ацетонитрила, после чего взбалтывалась на приборе Shaker в течение 15 мин с последующим центрифугированием 15 мин при 3500 об/мин. Надосадочный слой упаривали на роторно-вакуумном испарителе и сухой остаток растворяли в 10 мл воды для инъекций. Для исследования полученный раствор вводили в хвостовую вену крыс в объеме 2 мл/кг. Концентрацию фексофенадина в полученном растворе определяли методом ВЭЖХ.
Второй группе животных (n=30) в течение 14 дней вводили индуктор Pgp − рифампицин перорально в дозе 20 мг/кг два раза в день, а затем на 15-й день внутривенно вводили фексофенадин в дозе 10 мг/кг.
Третьей группе животных (n=30) за 30 мин до введения фексофенадина (10 мг/кг) внутривенно вводили ингибитор Pgp − мексидол в дозе 50 мг/кг [Якушева Е.Н., Щулькин А.В. , Черных И.В. // Экспер. и клин. фармакол. 2015. Т.78. №5. С.19–23; Новиков В.Е., Крюкова Н.О., Новиков А.С. // Экспер. и клин. фармакол. 2010. Т.73. №5. С.15−18].
Крыс выводили из эксперимента под золетиловым наркозом через 5, 10, 15, 30, 45 и 60 мин после введения фексофенадина. Для анализа у них забирали кровь в объеме 4 мл из брюшной аорты в гепаринизированные пробирки, а также кору больших полушарий головного мозга. Для экстракции фексофенадина из плазмы крови и ткани коры больших полушарий применяли ацетонитрил.
Количественное определение фексофенадина в плазме крови крыс и в гомогенате головного мозга производили на хроматографической системе "Stayer" с колонкой Phenomenex Synergi 4u Polar-RP 80A (250х4,6), зернение 4 мкм, при t=35°С и длине волны 220 нм. Подвижная фаза состояла из ацетонитрила, воды деионизированной, триэтиламина, кислоты уксусной ледяной (pH=6,0).
Суммарное количество фексофенадина, попавшее в системный кровоток, оценивали по площади под кривой "концентрация фексофенадина в плазме− время" (AUC<sub>0-t-плазма</sub>); суммарное количество фексофенадина, попавшее в кору больших полушарий − по площади под кривой «концентрация фексофенадина в коре головного мозга − время" (AUC<sub>0-t-мозг</sub>), которые рассчитывали по методу трапеции [Каркищенко Н.Н., Хоронько В.В., Сергеева С.А., Каркищенко В.Н. // Ростов-на-Дону: Феникс. 2001. 384 с.]. Для оценки проницаемости ГЭБ был рассчитан показатель AUC<sub>0-t</sub>-<sub>мозг</sub>/AUC<sub>0-t</sub>-<sub>плазма</sub> − отношение площади под кривой "концентрация фексофенадина в плазме − время" к площади под кривой "концентрация фексофенадина в коре головного мозга − время" [Kerns E.H., Di L. Drug-like Properties: Concepts, Structure Design and Methods: from ADME to Toxicity Optimizati. Academic Press. 2016. 560 p.].
Статистическая обработка результатов проводилась с использованием программы "Statsoft Statistica 7.0" (США).
Характер распределения полученных данных определяли по критерию Шапиро-Уилка. Учитывая, что распределение большинства данных было отличным от нормального, межгрупповые различия оценивали по критерию Крускала-Уоллиса, попарные сравнения выполняли по критерию Манна-Уитни с поправкой Бонферрони.
0-t
плазма
0-t
плазма
Концентрация фексофенадина в плазме крови крыс через 5 мин после его внутривенного введения в дозе 10 мг/кг массы (контроль) составила 16,6 мкг/мл, затем постепенно снижалась и достигала значения 1,0 мкг/мл к 60 мин исследования. Введение рифампицина (индуктор Pgp) существенно не влияло на фармакокинетику фексофенадина: площадь под фармакокинетической кривой концентрация-время (AUC-) статистически значимо не отличалась от показателей  контрольных животных. Курсовое применение мексидола (ингибитор Pgp) вызывало повышение AUC- фексофенадина на 81,2% (p=0,07).
При внутривенном введении фексофенадина крысам вистар в дозе 10 мг/кг массы препарат проникал через ГЭБ и фиксировался в коре больших полушарий уже через 5 мин после введения, достигал максимальной концентрации через 15 мин, а затем его уровень начинал снижаться.
0-t-мозг,
Применение индуктора Pgp – рифампицина перед введением фексофенадина приводило к достоверному снижению AUCчто свидетельствует об уменьшении концентрации фексофенадина в коре головного мозга (фиг. 1).  На фиг. 1: * - показаны достоверные различия (p<0,05) по сравнению с контролем.
0-t-мозг
Применение ингибитора Pgp – мексидола перед иньекцией фексофенадина приводило к  достоверному повышению AUCпо сравнению с данными контрольных животных, что свидетельствует об увеличении концентрации фексофенадина в коре головного мозга (фиг. 1).
0-t-мозг
0-t-плазма
Показано, что при введении рифампицина показатель AUC / AUC достоверно уменьшался (фиг. 1), а при введении мексидола статистически значимо не отличался от данных контрольных животных (фиг. 1). Это обусловлено тем, что концентрация фексофенадина в плазме при приеме рифампицина существенно не изменялась, а концентрация в коре головного мозга снижалась, то есть происходило локальное увеличение активности Pgp в ГЭБ.
При приеме мексидола содержание фексофенадина повышалось как в плазме, так и в коре головного мозга. Это свидетельствует о том, что увеличение содержания фексофенадина в коре мозга связано не с локальным ингибированием Pgp в изучаемом барьере, а с системным повышением концентрации фексофенадина в организме при отсутствии изменений проницаемости ГЭБ.
0-t-мозг
0-t-мозг
0-t-плазма
Таким образом, для адекватной оценки функциональной активности Pgp в гематоэнцефалическом барьере по фармакокинетике его маркерного субстрата фексофенадина целесообразно определять не AUC, аименно отношение AUC / AUC, а также использовать внутривенное введение маркерного субстрата Pgp фексофенадина лабораторным животным.