Выделение аборигенных хемолитотрофных микроорганизмов из руд месторождений и рудопроявлений Камчатской никеленосной провинции

© Т.О. Хайнасова, В.Е. Кунгурова, О.О. Левенец, 2016

УДК 550.72

Т.С. Хайнасова, В.Е. Кунгурова, О.О. Левенец

ВЫДЕЛЕНИЕ АБОРИГЕННЫХ ХЕМОЛИТОТРОФНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ ИЗ РУД МЕСТОРОЖДЕНИЙ И РУДОПРОЯВЛЕНИЙ КАМЧАТСКОЙ НИКЕЛЕНОСНОЙ ПРОВИНЦИИ

Представлены результаты этапа выделения аборигенных хемолитотро-фов из месторождений и рудопроявлений Камчатской никеленосной провинции с целью последующего создания коллекции микроорганизмов, перспективных для использования в бактериально-химических процессах переработки сульфидных медно-никелевых руд. Ключевые слова: аборигенные микроорганизмы, хемолитотрофы, сульфидная медно-никелевая руда, Камчатская никеленосная провинция, месторождение Шануч, рудопроявление Северное.

В рамках исследований по разработке экологически чистых и экономически выгодных микробных технологий переработки сульфидных медно-никелевых руд создание коллекции микроорганизмов, перспективных для использования в бактериально-химических процессах, является одной из приоритетных задач.

Цель настоящей работы состояла в выделении аборигенных хемолитотрофов из минерального сырья Камчатской никеленосной провинции (КНП).

Для достижения поставленной цели были использованы образцы сульфидной медно-никелевой руды месторождений, рудопроявлений и пунктов минерализации КНП, хранящиеся в коллекции НИГТЦ ДВО РАН (табл. 1), а также пробы руды и воды месторождения Шануч (табл. 2, 3) и проба руды (К92015/1) рудопроявления Северное.

Работы выполнялись в соответствии со стандартными классическими методами, принятыми в микробиологии. Выделение накопительных культур из образцов руды коллекции НИГТЦ ДВО РАН осуществляли в колбах Эрленмейера объемом 250 мл с использованием минеральной основы питательной среды Сильвермана и Люндгрена (9К) [1] без соли двухвалентного

Таблица 1

Перечень проб руды из коллекции НИГТЦ ДВО РАН

№ п/п № пробы Дата отбора, год Рудный объект

1 РК-77 - Рассоха

2 РК-99/В - Рассоха

3 А-105-1, 247 2010 Аннабергитовая щель

4 200-25, 44 (200-25; 133,5-133,7) 2006 Восточно-Геофизическое

5 199-1, 447(199-1; 101,5101,6) 2006 Восточно-Геофизическое

6 169-18; 139,5-139,6 - Восточно-Геофизическое

7 1120/1А - Нижнемедвежье

Таблица 2

Перечень и характеристика проб руды, отобранных на месторождении Шануч. Дата отбора: сентябрь 2014 г.

№ п/п № пробы Место отбора Характеристика материала

1 3041-1 Штольня, гор. 350 м в 27 м от маркш. точки 227; стенки штольни Массивная руда

2 3041-2 Штольня, гор. 350 м, в 27 м от маркш. точки 227; Стенки штольни Массивная руда, переходящая на отдельных участках в брекчиевидную и прожилко-во-вкрапленную руды

3 3041-3 Штольня, гор. 350 м, в 27 м от маркш. точки 227; стенки штольни Натеки окисленной руды

4 3042 Место временного складирования руды у штольни гор. 350 м Массивная руда, плавно переходящая в прожилково-вкрапленную руду

5 3043 Склад № 2 Окисленные руды

6 3044 Склад № 1 Окисленные руды

7 3045-1 Склад № 1 Массивная руда

8 3045-2 Склад № 1 Брекчиевидная, прожилково-вкрапленная руда

9 3045-3 Склад № 1 Тонкопрожилковая, тонков-крапленная руда, более бедная по количеству рудных минералов

Окончание табл. 2

№ п/п № пробы Место отбора Характеристика материала

10 3046 Складированные мешки с рудой Издробленная руда, с налетом окислов - гидроокислов Ре и зеленым налетом окислов Си

11 3047 Из-под мешков, подготовленный к отправке -склад мешков руды на улице Осадочный материал из-под мешков с рудой: полужидкая масса, состоящая из песчано-глинистого материала желто-коричневого цвета и более крупных щебнистых зеленоватых обломков

Таблица 3 Перечень н характеристика проб воды, отобранных на месторождении Шануч. Дата отбора: сентябрь 2014 г.

№ п/п № пробы Место отбора Характеристика материала

1 3042 Ручей, выходящий из штольни гор. 350 м Вода с ржавым осадком, непрозрачная

2 3047 Из-под мешков, подготовленных к отправке Вода с зеленоватым оттенком

железа (FeSO4-7H2O) в стационарных условиях. Соотношение образца руды к среде составляло 1:5 (20 г руды + 100 мл питательной среды). Исходное значение рН питательной среды -1,92. Температура культивирования - 20-22 °С. Общая продолжительность процесса - 3 месяца.

Выделение накопительных культур из руд и рудничной воды месторождения Шануч, а также из рудопроявления Северное проводили также стационарно в колбах Эрленмейера объемом 250 мл с использованием нескольких вариантов питательных сред: а) минеральная основа среды 9К с добавлением соли двухвалентного железа (FeSO4-7H2O) из расчета 6 г/л Fe и пен-тагидрата тиосульфата натрия (Na2S2O3-5H2O) из расчета 3 г/л Na2S2O3 в вариациях с добавлением дрожжевого экстракта 2 %-го и без него; б) DSM 71; в) DSM 882. Выбор количества и качества питательных сред был обоснован свежестью материала для выделения и вследствие этого большой вероятностью полу-

чения более разнообразных в видовом отношении микробных культур - не только железо- и сероокисляющих автотрофов, но и гетеротрофов. Соотношение соответствующего образца руды/воды к питательной среде составляло 1:8 (15 г руды/15 мл воды + 120 мл питательной среды). Культивирование осуществляли при 20-22 °С и 35 °С в течение 2 месяцев.

Перечень накопительных микробных культур и более подробное описание условий их выделения представлены в табл. 4.

Таблица 4

Перечень накопительных культур микроорганизмов и условия их выделения

№ п/п № культуры Условия выделения микроорганизмов

1 1К мин. основа 9К без Ре+руда №РК-77 (Рассоха), 20-22 °С

2 2К мин. основа 9К без Ре+руда №РК-99/В (Рассоха), 20-22 °С

3 3К мин. основа 9К без Ре+руда №А-105-1, 247 (Аннаберги-товая щель), 20-22 °С

4 4К мин. основа 9К без Ре+руда №200-25, 447 (200-25; 133,5-133,7) (Восточно-Геофизическое), 20-22 °С

5 5К мин. основа 9К без Ре+руда №199-1, 447 (199-1; 101,5101,6) (Восточно-Геофизическое), 20-22 °С

6 6К мин. основа 9К без Ре+руда №169-18;139,5-139,6 (Восточно-Геофизическое), 20-22 °С

7 7К мин. основа 9К без Ре+руда №1120/1А (Восточно-Геофизическое), 20-22 °С

8 1 мин. основа 9К+Ре(6 г/л)+На2Б203(3 г/л)+дрожжевой экстракт 2 %+ рудничная вода № 3042 (Шануч), 20-22 °С

9 2 мин. основа 9К+Ре(6 г/л)+На2Б203(3 г/л)+дрожжевой экстракт 2 %+рудничная вода № 3047 (Шануч), 20-22 °С

10 3 мин. основа 9К+Ре(6 г/л)+На2Б203(3 г/л)+рудничная вода №3042 (Шануч), 20-22 °С

11 4 мин. основа 9К+Ре(6 г/л)+На2Б203(3 г/л)+рудничная вода №3047(Шануч), 20-22 °С

12 5 мин. основа 9К+Ре(6 г/л)+На2Б203(3 г/л)+дрожжевой экстракт 2 %+руда №3047 (Шануч), 20-22 °С

13 6 мин. основа 9К+Ре(6 г/л)+На2Б203(3 г/л)+дрожжевой экстракт 2 %+руда №3046 (Шануч), 20-22 °С

14 7 мин. основа 9К+Ре(6 г/л)+На2Б203(3 г/л)+дрожжевой экстракт 2 %+руда №3045-3 (Шануч), 20-22 °С

Продолжение табл. 4

№ п/п № культуры Условия выделения микроорганизмов

15 8 мин. основа 9K+Fe(6 T/n)+Na2S2O3(3 г/л)+дрожжевой экстракт 2 %+руда №3045 (Шануч), 20-22 °С

16 9 мин. основа 9K+Fe(6 T/n)+Na2S2O3(3 г/л)+дрожжевой экстракт 2 %+руда №3044 (Шануч), 20-22 °С

17 10 мин. основа 9K+Fe(6 T/n)+Na2S2O3(3 г/л) )+дрожжевой экстракт 2 %+руда №3045-1 (Шануч), 20-22 °С

18 11 мин. основа 9K+Fe(6 T/n)+Na2S2O3(3 г/л)+дрожжевой экстракт 2 %+руда №3043 (Шануч), 20-22 °С

19 12 мин. основа 9K+Fe(6 T/n)+Na2S2O3(3 г/л)+дрожжевой экстракт 2 %+руда №3042 (Шануч), 20-22 °С

20 13 мин. основа 9K+Fe(6 T/n)+Na2S2O3(3 г/л)+дрожжевой экстракт 2 %+руда №3041-1 (Шануч), 20-22 °С

21 14 мин. основа 9K+Fe(6 T/n)+Na2S2O3 (3 г/л)+дрожжевой экстракт 2 %+руда №3041-2 (Шануч), 20-22 °С

22 15 мин. основа 9K+Fe(6 г/л)+Na2S2O3(3 г/л)+дрожжевой экстракт 2 %+руда №3041-3 (Шануч), 20-22 °С

23 16 мин. основа 9K+Fe(6^)+Na2S2O3(3 г/л)+руда №3047 (Шануч), 20-22 °С

24 17 мин. основа 9K+Fe(6 г/л)+Na2S2O3(3 г/л)+руда №3046 (Шануч), 20-22 °С

25 18 мин. основа 9K+Fe(6 г/л)+Na2S2O3(3 г/л)+руда №3045-3 (Шануч), 20-22 °С

26 19 мин. основа 9K+Fe(6 TA)+Na2S2O3(3 г/л)+руда №3045-2 (Шануч), 20-22 °С

27 20 мин. основа 9K+Fe(6 г/л)+Na2S2O3(3 г/л)+руда №3045-1 (Шануч), 20-22 °С

28 21 мин. основа 9K+Fe(6 г/л)+Na2S2O3(3 г/л)+руда №3044 (Шануч), 20-22 °С

29 22 мин. основа 9K+Fe(6 г/л)+Na2S2O3(3 г/л)+руда №3041-3 (Шануч), 20-22 °С

30 23 мин. основа 9K+Fe(6 г/л)+Na2S2O3(3 г/л)+руда №3042 (Шануч), 20-22 °С

31 24 мин. основа 9K+Fe(6 TA)+Na2S2O3(3 г/л)+руда №3043 (Шануч), 20-22 °С

32 25 мин. основа 9K+Fe(6 г/л)+Na2S2O3(3 г/л)+руда №3041-1 (Шануч), 20-22 °С

33 26 мин. основа 9K+Fe(6 г/л)+Na2S2O3(3 г/л)+руда №3041-2 (Шануч), 20-22 °С

34 27 DSM 71+руда №3045-1 (Шануч), 20-22 °С

35 28 DSM 71+рудничная вода №3042 (Шануч), 20-22 °С

36 29 DSM 882+рудничная вода №3042 (Шануч), 20-22 °С

Продолжение табл. 4

№ п/п № культуры Условия выделения микроорганизмов

37 30 DSM 71+рудничная вода № 3047 (Шануч), 20-22 °С

38 31 DSM 882+рудничная вода №3047 (Шануч), 20-22 °С

39 32 DSM 882+руда №3042 (Шануч), 20-22 °С

40 33 DSM 882+руда №3045-1 (Шануч), 20-22 °С

41 34 DSM 882+руда №3041-1 (Шануч), 20-22 °С

42 35 DSM 882+руда №3041-2 (Шануч), 20-22 °С

43 36 DSM 882+руда №3046 (Шануч), 20-22 °С

44 37 DSM 882+руда №3043 (Шануч), 20-22 °С

45 38 DSM 882+руда №3044 (Шануч), 20-22 °С

46 39 DSM 882+руда №3045-2 (Шануч), 20-22 °С

47 40 DSM 882+руда №3041-3 (Шануч), 20-22 °С

48 41 DSM 882+руда №3045-3 (Шануч), 20-22 °С

49 42 DSM 882+руда №3047 (Шануч), 20-22 °С

50 43 DSM 71+руда №3041-2(Шануч), 20-22 °С

51 44 DSM 71+руда №3044 (Шануч), 20-22 °С

52 45 DSM 71+руда №3045-3 (Шануч), 20-22 °С

53 46 DSM 71+руда №3042 (Шануч), 20-22 °С

54 47 DSM 71+руда №3043 (Шануч), 20-22 °С

55 48 DSM 71+руда №3047 (Шануч), 20-22 °С

56 49 DSM 71+руда №3046 (Шануч), 20-22 °С

57 50 DSM 71+руда №3041-3 (Шануч), 20-22 °С

58 51 DSM 71+руда №3045-2 (Шануч), 20-22 °С

59 52 DSM 71+руда №3041-1 (Шануч), 20-22 °С

60 53 мин. основа 9K+Fe(6 rA)+Na2S2O3(3 г/л)+руда №3044 (Шануч), 35 °С

61 54 мин. основа 9K+Fe(6 rA)+Na2S2O3(3 г/л)+дрожжевой экстракт 2 %+руда №3045-2 (Шануч), 35 °С

62 55 мин. основа 9K+Fe(6 rA)+Na2S2O3(3 г/л)+дрожжевой экстракт 2 %+рудничная вода №3042 (Шануч), 35 °С

63 56 мин. основа 9K+Fe(6 rA)+Na2S2O3(3 г/л)+рудничная вода №3042 (Шануч), 35 °С

64 57 мин. основа 9K+Fe(6 rA)+Na2S2O3(3 г/л)+дрожжевой экстракт 2 %+руда №3041-3 (Шануч), 35 °С

65 58 мин. основа 9K+Fe(6 TA)+Na2S2O3(3 г/л)+дрожжевой экстракт 2 %+руда №3041-1 (Шануч), 35 °С

66 59 мин. основа 9K+Fe(6 TA)+Na2S2O3(3 г/л)+дрожжевой экстракт 2 %+руда №3043 (Шануч), 35 °С

67 60 мин. основа 9K+Fe(6 г/л)+Na2S2O3(3 г/л)+дрожжевой экстракт 2 %+руда №3045-1 (Шануч), 35 °С

68 61 мин. основа 9K+Fe(6 г/л)+Na2S2O3(3 г/л)+дрожжевой экстракт 2 %+руда №3042 (Шануч), 35 °С

Окончание табл. 4

№ п/п № культуры Условия выделения микроорганизмов

69 62 мин. основа 9K+Fe(6 TA)+Na2S2O3(3 г/л)+дрожжевой экстракт 2 %+руда № 3041-2 (Шануч), 35 °С

70 63 мин. основа 9K+Fe(6 TA)+Na2S2O3(3 г/л)+дрожжевой экстракт 2 %+руда №3045-3 (Шануч), 35 °С

71 64 мин. основа 9K+Fe(6 TA)+Na2S2O3(3 г/л)+руда №3043 (Шануч), 35 °С

72 65 мин. основа 9K+Fe(6 TA)+Na2S2O3(3 г/л)+дрожжевой экстракт 2 %+руда №3045-3 (Шануч), 35 °С

73 66 мин. основа 9K+Fe(6 TA)+Na2S2O3(3 г/л)+дрожжевой экстракт 2 %+руда №3046 (Шануч), 35 °С

74 67 мин. основа 9K+Fe(6 TA)+Na2S2O3(3 г/л)+руда №3041-2 (Шануч), 35 °С

75 68 мин. основа 9K+Fe(6 TA)+Na2S2O3(3 г/л)+руда №3042 (Шануч), 35 °С

76 69 мин. основа 9K+Fe(6 г/л)+Na2S2O3(3 г/л)+дрожжевой экстракт 2 %+руда №3044 (Шануч), 35 °С

77 70 мин. основа 9K+Fe(6 г/л)+Na2S2O3(3 г/л)+руда №3041-1 (Шануч), 35 °С

78 71 мин. основа 9K+Fe(6 г/л)+Na2S2O3(3 г/л)+руда №3041-3 (Шануч), 35 °С

79 72 мин. основа 9K+Fe(6 г/л)+Na2S2O3(3 г/л)+руда №3045-2 (Шануч), 35 °С

80 73 мин. основа 9K+Fe(6 TA)+Na2S2O3(3 г/л)+руда №3045-1 (Шануч), 35 °С

81 74 мин. основа 9K+Fe(6 г/л)+Na2S2O3(3 г/л)+руда №3047 (Шануч), 35 °С

82 75 мин. основа 9K+Fe(6 г/л)+Na2S2O3(3 г/л)+дрожжевой экстракт 2 %+руда №3047 (Шануч), 35 °С

83 76 мин. основа 9K+Fe(6 TA)+Na2S2O3(3 г/л)+руда №3046 (Шануч), 35 °С

84 77 мин. основа 9K+Fe(6 г/л)+Na2S2O3(3 г/л)+дрожжевой экстракт 2 %+рудничная вода №3047 (Шануч), 35 °С

85 78 мин. основа 9K+Fe(6 г/л)+Na2S2O3(3 г/л)+рудничная вода №3047 (Шануч), 35 °С

86 79 мин. основа 9K+Fe(6 г/л)+Na2S2O3(3 г/л)+дрожжевой экстракт 2 %+руда №K92015/1 (Северное), 35 °С

87 80 мин. основа 9K+Fe(6 TA)+Na2S2O3(3 г/л)+дрожжевой экстракт 2 %+руда №K92015/1 (Северное), 20-22 °С

88 81 DSM 71+руда №K92015/1 (Северное), 20-22 °С

89 82 DSM 882+руда №K92015/1 (Северное), 20-22 °С

90 83 мин. основа 9K+Fe(6 г/л)+Na2S2O3(3 г/л)+руда №K92015/1 (Северное), 20-22 °С

91 84 мин. основа 9K+Fe(6 г/л)+Na2S2O3(3 г/л)+руда №K92015/1 (Северное), 35 °С

Количество клеток определяли путем прямого подсчета на микроскопе с фазово-контрастной насадкой «Микромед 3 вар. 3-20» (Микромед, Китай).

Спустя месяц культивирования осмотр накопительных культур, выделенных из проб руды коллекции НИГТЦ ДВО РАН, не обнаружил роста клеточной биомассы. Только спустя 3 месяца в 6 (1К-5К, 7К) из них были отмечены неподвижные клетки в концентрациях, не превышающих 106 кл/мл, которые в дальнейшем не развились. Таким образом, результат выделения считали отрицательным. В случае микроорганизмов из месторождения Шануч спустя 2 месяца культивирования из 78 посевов в различном количестве (от единичных до 108 кл/мл) в накопительные культуры выделился 51 вариант. Посев проб руды из рудопроявления Северное после 2-х месяцев культивирования обнаружил выделение микроорганизмов в концентрации клеток 107 кл/мл (в 3-х вариантах питательных сред). Численность микроорганизмов представлена в табл. 5.

Таблица 5

Численность микроорганизмов в накопительных культурах

Численность микроорганизмов

№ культу- N-107, № культу- N-107, № куль- N-107,

ры кл/мл ры кл/мл туры кл/мл

1К 0,31 25 0 56 0

2К 0,09 26 ед. 57 2,5

3К 0,13 27 0 58 ед.

4К 0,22 28 2,6 59 ед.

5К 0,13 29 1,1 60 ед.

6К 0 30 0 61 ед.

7К 0,13 31 ед. 62 0,61

1 0 32 0 63 0

2 0 33 0 64 2,5

3 0 34 0 65 0

4 0,13 35 7,1 66 0,44

5 18 36 33 67 ед.

6 9,7 37 1,6 68 0

7 0 38 5,7 69 ед.

8 0 39 0 70 ед.

9 2,72 40 0 71 1,2

Окончание табл. 5

Численность микроорганизмов

№ культу- N-107, № культу- N-107, № куль- N-107,

ры кл/мл ры кл/мл туры кл/мл

10 ед. 41 0 72 ед.

11 2,61 42 ед. 73 ед.

12 9,1 43 2,2 74 2

13 ед. 44 0,52 75 1,9

14 8,2 45 0 76 27

15 15 46 ед. 77 ед.

16 3,5 47 17 78 0

17 25 48 6,7 79 0

18 0 49 6,7 80 0,15

19 ед. 50 ед. 81 3,11

20 0 51 0 82 0,30

21 5,8 52 0 83 0

22 2,6 53 ед. 84 0

23 0 54 0 - -

24 2,1 55 0 - -

На основании результатов количественного определения концентрации клеток на момент осмотра культур было отмечено следующее. При использовании таких питательных сред, как модифицированная 9К с пониженной концентрацией железа (6 г/л) и тиосульфатом натрия (3 г/л), DSM 71 и DSM 882, выделение микроорганизмов из руд месторождения Шануч происходило преимущественно в среду 9К независимо от того, присутствует ли дрожжевой экстракт или нет. В случае культур из рудопроявления Северное наилучший рост клеток был отмечен в среде DSM 71. При этом из всей совокупности выделенных культур 79 % приходилось на микрофлору, выделенную при температуре 20-22 °С, против 21 % выделенных при 35 °С микроорганизмов.

Таким образом, в ходе проведения этапа выделения аборигенной хемолитотрофной микрофлоры были получены накопительные культуры из месторождения Шануч (51 шт.) и рудопроявления Северное (3 шт.). Несмотря на наличие единичных клеток, коллекционные образцы руды оказались не пригодными для получения микроорганизмов.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Каравайко Г.И., Росси Дж., Агате А., Грудев С., Авакян З.А. М.: центр международных проектов ГКНТ, 1989. - 375 с. ЕШ

КОРОТКО ОБ АВТОРАХ -

Хайнасова Татьяна Сергеевна - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, khainasova@yandex.ru,

Кунгурова Валентина Егоровна - кандидат геолого-минералогических наук, ведущий научный сотрудник, kunwe@rambler.ru,

Певенец Ольга Олеговна - кандидат технических наук, старший научный сотрудник, levenets@yandex.ru,

Научно-исследовательский геотехнологический центр Дальневосточного отделения Российской академии наук (НИГТЦ ДВО РАН).

UDC 550.72

ISOLATION OF INDIGENOUS CHEMOLITHOTROPHIC MICROORGANISMS FROM ORES OF NICKEL PROVINCE OF KAMCHATKA

Khainasova T.S., Candidate of Biological Sciences, Senior Researcher, khainasova@yandex.ru, Research Geotechnological Center, Far Eastern Branch of Russian Academy of Sciences, Russia,

Kungurova V.Ye., Candidate of Geological and Mineralogical Sciences, Leading Researcher, kunwe@rambler.ru, Research Geotechnological Center, Far Eastern Branch of Russian Academy of Sciences, Russia,

Levenets O.O., Candidate of Technical Sciences, Senior Researcher, levenets@yandex.ru, Research Geotechnological Center, Far Eastern Branch of Russian Academy of Sciences, Russia.

The results of isolation of indigenous chemolithotrophs from deposits and ore occurrences of nickel province of Kamchatka in order to future create a collection of microorganisms promising for use in bacterial-chemical processing of sulfide copper-nickel ores are presented in article.

Key words: indigenous microorganisms, chemolithotrophs, copper-nickel sulfide ore, nickel province of Kamchatka, deposit Shanuch, ore occurrence Severnoe. REFERENCES

1. Karavajko G.I., Rossi Dzh., Agate A., Grudev S., Avakjan Z.A. Moscow: Centr mezhdunarodnyh proektov GKNT (Center of international projects of SCST), 1989. 375 p.