СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ САХАРНОГО РАСТВОРА
METHOD OF PRODUCING SUGAR SOLUTION

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
[0001] Настоящее изобретение относится к способу получения сахаросодержащей жидкости из биомассы.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0002] В недавние годы были обстоятельно исследованы способы получения сахаросодержащей жидкости путем предварительной обработки содержащей целлюлозу биомассы кислотой, горячей водой, щелочью или тому подобными средствами и затем добавления к ней целлюлазы для проведения гидролиза. Однако эти способы с использованием целлюлазы имеют тот недостаток, что, поскольку используется большое количество целлюлазы и целлюлаза является дорогостоящей, становится высокой стоимость получения сахаросодержащей жидкости.
[0003] Среди методов разрешения проблемы были предложены способы, в которых целлюлазу, использованную для гидролиза целлюлозы, извлекают и используют повторно. Представленные примеры таких способов включают способ, в котором проводят непрерывное твердофазно-жидкостное разделение с помощью спин-фильтра, и полученную сахаросодержащую жидкость фильтруют через ультрафильтрационную мембрану для отделения целлюлазы (Патентный Документ 1), способ, в котором на стадии ферментативного осахаривания вводят поверхностно-активное вещество для подавления адсорбции целлюлазы и тем самым повышения эффективности извлечения (Патентный Документ 2), и способ, в котором остаток, полученный ферментативным осахариванием, подвергают электрической обработке для извлечения целлюлазного компонента (Патентный Документ 3), но эти способы не в состоянии коренным образом разрешить эту проблему.
ДОКУМЕНТЫ УРОВНЯ ТЕХНИКИ
Патентные Документы
[0004]
[Патентный Документ 1] JP 2006-87319 А
[Патентный Документ 2] JP 63-87 994 А
[Патентный Документ 3] JP 2008-206484 А
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
ЗАДАЧИ, РЕШАЕМЫЕ ИЗОБРЕТЕНИЕМ
[0005] Настоящее изобретение имеет целью, как было описано выше, сокращение количества целлюлазы, используемой в гидролизе целлюлозы.
СРЕДСТВА РЕШЕНИЯ ЗАДАЧ
[0006] Авторы настоящего изобретения провели обстоятельные исследования для разрешения вышеописанной проблемы и в результате этого сосредоточили внимание на добавлении мелассы к гидролизату целлюлозы. В результате авторы настоящего изобретения обнаружили, что это повышает количество целлюлазы, извлекаемой из гидролизата целлюлозы, тем самым создав настоящее изобретение.
[0007] Настоящее изобретение охарактеризовано признаками, приведенными ниже в пунктах [1]-[7].
[0008] [1] Способ получения сахаросодержащей жидкости, включающий следующие стадии (1)-(3):
стадию (1) добавления целлюлазы из мицелиальных грибов к продукту предварительной обработки целлюлозы для получения гидролизата;
стадию (2) добавления мелассы к указанному гидролизату для получения гидролизата, содержащего мелассу; и
стадию (3) подвергания указанной гидролизата содержащего мелассу, твердофазно-жидкостному разделению и проведения фильтрации полученного раствора как выделенного компонента через ультрафильтрационную мембрану для извлечения целлюлазы из мицелиальных грибов в качестве концентрата и для получения сахаросодержащей жидкости в качестве пермеата.
[0009] [2] Способ получения сахаросодержащей жидкости согласно пункту [1], в котором целлюлаза из мицелиальных грибов на стадии (1) представляет собой целлюлазу, продуцируемую грибами рода Trichoderma.
[0010] [3] Способ получения сахаросодержащей жидкости согласно пунктам [1] или [2], в котором продукт предварительной обработки целлюлозы на стадии (1) представляет собой один или более продуктов, выбранных из группы, состоящей из продуктов, полученных гидротермической обработкой, обработкой разбавленной серной кислотой или обработкой щелочью.
[0011] [4] Способ получения сахаросодержащей жидкости согласно любому из пунктов [1]-[3], в котором на стадии (2) мелассу добавляют к гидролизату для получения гидролизата, содержащего мелассу, концентрация сахара в которой варьирует в диапазоне от 50 до 200 г/л.
[0012] [5] Способ получения сахаросодержащей жидкости согласно любому из пунктов [1]-[4], в котором стадия (2) включает процесс инкубации гидролизата, содержащего мелассу при температуре в диапазоне от 40 до 60°C.
[0013] [6] Способ получения сахаросодержащей жидкости согласно любому из пунктов [1]-[5], причем способ включает стадию, на которой проводят фильтрацию сахаросодержащей жидкости со стадии (3) через нанофильтрационную мембрану и/или мембрану обратного осмоса для удаления ингибиторов брожения в качестве пермеата и для получения сахарного концентрата в качестве концентрата.
[0014] [7] Способ получения химического продукта, причем способ включает стадию, на которой выполняют ферментацию культурой микроорганизма, способного продуцировать химический продукт, с использованием в качестве исходного сырья для ферментации сахаросодержащей жидкости, полученной способом получения сахаросодержащей жидкости согласно любому из пунктов [1]-[6].
ТЕХНИЧЕСКИЙ РЕЗУЛЬТАТ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0015] Настоящее изобретение повышает степень извлечения фермента, целлюлазы из мицелиальных грибов, из гидролизата целлюлозы, так что может быть сокращено количество целлюлазы, используемой в способе получения сахаросодержащей жидкости. Кроме того, в настоящем изобретении при добавлении мелассы к гидролизату целлюлозы для получения гидролизата, содержащего мелассу, сахаристые компоненты могут быть выделены не только из целлюлозы, но также из мелассы.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[0016]
Фиг. 1 - блок-схема способа по изобретению.
Фиг. 2 - схема установки для выполнения настоящего изобретения.
Фиг. 3 - схема установки для получения концентрированной сахаросодержащей жидкости («сахарного сиропа»).
Фиг. 4 - схема способа получения химического продукта с использованием сахаросодержащей жидкости и/или концентрированной сахаросодержащей жидкости в качестве исходного сырья для ферментации.
Фиг. 5 - схема устройства, когда установка для получения сахаросодержащей жидкости, включающая устройство по фиг. 2, находится рядом с существующей установкой для производства сахара.
ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫЙ ВАРИАНТ ВЫПОЛНЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0017] Ниже подробно описаны варианты выполнения настоящего изобретения на каждой стадии.
[0018] Стадия (1)
Продукт предварительной обработки целлюлозы на стадии (1) означает содержащую целлюлозу биомассу, которая была предварительно обработана для гидролиза. Конкретные примеры содержащей целлюлозу биомассы включают травяные биомассы, такие как выжимки сахарного тростника, просо, слоновая трава, шерстоцвет (Erianthus), кукурузные стебли, рисовая солома и пшеничная солома; древесные биомассы, такие как древесина и отходы строительных материалов; и биомассы, происходящие из водной среды, такие как водоросли и крупные морские водоросли. Такие биомассы содержат, в дополнение к целлюлозе и гемицеллюлозе (далее называемым «целлюлозой» как родовым термином для целлюлозы и гемицеллюлозы), лигнин в качестве ароматических макромолекул и тому подобные. В частности, в настоящем изобретении предварительную обработку содержащей целлюлозу биомассы проводят, чтобы повысить эффективность гидролиза биомассы целлюлазой, происходящей из мицелиальных грибов, и продукт, полученный в результате этого, называется продуктом предварительной обработки целлюлозы.
[0019] Примеры предварительной обработки включают кислотную обработку, обработку серной кислотой, обработку разбавленной серной кислотой, щелочную обработку, гидротермическую обработку, обработку субкритической водой, пульверизационную обработку, обработку запариванием и сушильную обработку. В настоящем изобретении предварительная обработка предпочтительно представляет собой гидротермическую обработку, обработку разбавленной серной кислотой или щелочную обработку, поскольку щелочная обработка, гидротермическая обработка и обработка разбавленной серной кислотой обеспечивают лучшие эффективности ферментативного осахаривания и требуют меньших количеств фермента по сравнению с другими способами.
[0020] В случае гидротермической обработки добавляют воду таким образом, что концентрация содержащей целлюлозу биомассы составляет от 0,1 до 50% по весу, и полученную смесь обрабатывают при температуре от 100 до 400°C в течение от 1 секунды до 60 минут. При обработке в таких температурных условиях может быть получен продукт предварительной обработки целлюлозы, который может быть легко гидролизован целлюлазой. Число циклов обработки не является ограниченным, и обработка может быть проведена 1 или более раз. В частности, в случаях, где обработку проводят 2 или более раз, условия первой обработки могут отличаться от условий второй и последующих обработок.
[0021] В случае обработки разбавленной серной кислотой, концентрация серной кислоты предпочтительно составляет от 0,1 до 15% по весу, более предпочтительно от 0,5 до 5% по весу. Температура реакции может быть отрегулирована на диапазон от 100 до 300°C, и предпочтительно устанавливается в диапазоне от 120 до 250°C. Продолжительность реакции может быть в диапазоне от 1 секунды до 60 минут. Число циклов обработки не является ограниченным, и обработка может быть проведена 1 или более раз. В частности, в случаях, где обработку проводят 2 или более раз, условия первой обработки могут отличаться от условий второй и последующих обработок. Поскольку гидролизат, полученный при обработке разбавленной серной кислотой, содержит кислоту, необходима нейтрализация, чтобы в дальнейшем проводить реакцию гидролиза с помощью целлюлазы или чтобы использовать гидролизат в качестве исходного сырья для ферментации.
[0022] Щелочная обработка представляет собой способ, в котором щелочь, выбранную из гидроксида натрия, гидроксида кальция и аммиака, вводят для воздействия на содержащую целлюлозу биомассу. В качестве щелочи, используемой в щелочной обработке, в особенности предпочтительно может быть применен аммиак. Обработка аммиаком может быть проведена способами, описанными в патентных документах JP 2008-161125 А и JP 2008-535664 А. Например, аммиак добавляют к содержащей целлюлозу биомассе при концентрации в диапазоне от 0,1 до 15% по весу, и обработку проводят при температуре от 4 до 200°C, предпочтительно от 90 до 150°C. Добавляемый аммиак может быть в состоянии либо жидкости, либо газа. Кроме того, добавляемый аммиак может быть в форме либо чистого аммиака, либо водного раствора аммиака. Число циклов обработки не является ограниченным, и обработка может быть проведена 1 или более раз. В частности, в случаях, где обработку проводят 2 или более раз, условия первой обработки могут отличаться от условий второй и последующих обработок. Обработанный продукт, полученный действием аммиака, должен быть подвергнут нейтрализации аммиака или удалению аммиака, чтобы в дальнейшем проводить реакцию ферментативного гидролиза. Нейтрализация аммиака может быть проведена либо после удаления твердого компонента из гидролизата твердофазно-жидкостным разделением, либо в состоянии, где содержится твердый компонент. Кислотный реагент, применяемый для нейтрализации, не является ограниченным. Для удаления аммиака обработанный аммиаком продукт может быть выдержан при пониженном давлении, чтобы обеспечить испарение аммиака с переходом в газообразное состояние. Удаленный аммиак может быть извлечен и использован повторно.
[0023] На стадии (1) описанный выше продукт предварительной обработки целлюлозы подвергают гидролизу целлюлазой для получения гидролизата. Гидролиз целлюлозы означает снижение молекулярной массы целлюлозы. Кроме того, при гидролизе целлюлозы в то же время гидролизуются гемицеллюлозные компоненты, такие как ксилан, маннан и арабинан. Примеры моносахаридных компонентов, содержащихся в гидролизате, включают глюкозу, ксилозу, маннозу и галактозу, и основным моносахаридным компонентом является глюкоза, которая представляет собой гидролизат целлюлозы. Кроме того, в случаях, где гидролиз является недостаточным, содержатся дисахариды, такие как целлобиоза и ксилобиоза; целло-олигосахариды; ксило-олигосахариды; и тому подобные.
[0024] На стадии (1), продукт предварительной обработки целлюлозы подвергают гидролизу с помощью целлюлазы из мицелиальных грибов. Примеры целлюлазы из мицелиальных грибов включают целлюлазы, продуцируемые штаммами Trichoderma, Aspergillus, Cellulomonas, Clostridium, Streptomyces, Humicola, Acremonium, Irpex, Mucor, Talaromyces, Phanerochaete, бело-красной плесенью и бурой гнилью. В настоящем изобретении, среди таких целлюлаз из мицелиальных грибов предпочтительно используют целлюлазу, продуцируемую грибами Trichoderma.
[0025] Целлюлаза, продуцируемая грибами Trichoderma, представляет собой ферментную композицию, включающую целлюлазу, происходящую из микроорганизма, принадлежащего к роду Trichoderma, в качестве основного компонента. Микроорганизм, принадлежащий к роду Trichoderma, не является ограниченным и предпочтительно представляет собой вид Trichoderma reesei. Конкретные примеры такого микроорганизма включают Trichoderma reesei QM9414, Trichoderma reesei QM9123, Trichoderma reesei Rut C-30, Trichoderma reesei PC3-7, Trichoderma reesei CL-847, Trichoderma reesei MCG77, Trichoderma reesei MCG80 и Trichoderma viride QM9123. Целлюлаза также может быть выделена из мутантного штамма, происходящего из вышеописанного микроорганизма Trichoderma, причем мутантный штамм был получен мутагенезом с использованием мутагена, УФ-облучения или тому подобного, для усиления продуцирования целлюлазы.
[0026] Целлюлаза из грибов Trichoderma, применяемая в настоящем изобретении, представляет собой ферментную композицию, которая содержит многочисленные ферментные компоненты, такие как целлобиогидролаза, эндоглюканаза, экзоглюканаза, р-глюкозидаза, ксиланаза и ксилозидаза, причем ферментная композиция проявляет активность в гидролизе целлюлозы, обеспечивая осахаривание. При деградации целлюлозы, фермент целлюлаза из грибов Trichoderma проявляет согласованное действие или взаимодополняющее действие многочисленных ферментных компонентов и тем самым позволяет более эффективно гидролизовать целлюлозу. Используемая в настоящем изобретении целлюлаза в особенности предпочтительно содержит целлобиогидролазу и ксиланазу, происходящие из грибов Trichoderma.
[0027] Целлобиогидролаза представляет обобщенное наименование целлюлаз, которые гидролизуют целлюлозу с концевых участков. Ферменты из группы, принадлежащей к целлобиогидролазе, описываются ЕС-номером: ЕС3.2.1.91.
[0028] Эндоглюканаза представляет общий термин для целлюлаз, которые гидролизуют молекулярные цепи целлюлозы от их центральных участков. Ферменты из группы, принадлежащей к эндоглюканазе, описываются ЕС-номерами: ЕС3.2.1.4, ЕС3.2.1.6, ЕС3.2.1.39 и ЕС3.2.1.73.
[0029] Экзоглюканаза представляет общий термин для целлюлаз, которые гидролизуют молекулярные цепи целлюлозы от их концов. Ферменты из группы, принадлежащей к экзоглюканазе, описываются ЕС-номерами: ЕС3.2.1.74 и ЕС3.2.1.58.
[0030] β-Глюкозидаза представляет общий термин для целлюлаз, которые действуют на целло-олигосахариды или целлобиозу. Ферменты из группы, принадлежащей к β-глюкозидазе, описываются ЕС-номером: ЕС3.2.1.21.
[0031] Ксиланаза представляет общий термин для целлюлаз, которые действуют на гемицеллюлозу или, более конкретно, ксилан. Ферменты из группы, принадлежащей к ксиланазе, описываются ЕС-номером: ЕС3.2.1.8.
[0032] Ксилозидаза представляет общий термин для целлюлаз, которые действуют на ксило-олигосахариды. Ферменты из группы, принадлежащей к ксилозидазе, описываются ЕС-номером: ЕС3.2.1.37.
[0033] В качестве целлюлазы из грибов Trichoderma предпочтительно используют сырой ферментный продукт. Сырой ферментный продукт выделяют из надосадочной жидкости культуры, полученной выращиванием микроорганизма Trichoderma в течение произвольного периода времени в среде, приготовленной таким образом, чтобы микроорганизм продуцировал целлюлазу. Компоненты применяемой среды не являются ограниченными, и в основном может быть использована среда, пополненная целлюлозой, чтобы стимулировать продуцирование целлюлазы. В качестве сырого ферментного продукта может быть применена культуральная жидкость как таковая, или предпочтительно используют культуральную надосадочную жидкость, обработанную только для удаления клеток Trichoderma.
[0034] Весовые соотношения ферментных компонентов в сыром ферментном продукте не являются ограниченными. Например, культуральная жидкость, полученная от Trichoderma reesei, содержит от 50 до 95% по весу целлобиогидролазы и также содержит в качестве прочих компонентов эндоглюканазу, β-глюкозидазу и тому подобные. В то время как микроорганизмы, принадлежащие к роду Trichoderma, продуцируют строго целлюлазные ферменты в культуральной жидкости, активность β-глюкозидазы в культуральной жидкости является низкой, поскольку β-глюкозидаза задерживается в клетках или на поверхностях клеток. Поэтому β-глюкозидаза может быть добавлена к сырому ферментному продукту от другого вида или из того же вида. В качестве β-глюкозидазы от другого вида грибов предпочтительно может быть использована β-глюкозидаза, продуцируемая грибами Aspergillus. Примеры β-глюкозидазы, продуцируемой грибами Aspergillus, включают фермент Novozyme 188, который имеется в продаже на рынке от фирмы Novozyme. Способ добавления β-глюкозидазы от другого вида или от того же вида к сырому ферментному продукту также может представлять собой способ, в котором в микроорганизм, принадлежащий к роду Trichoderma, введен ген для выполнения такой генетической рекомбинации микроорганизма, чтобы в культуральной жидкости продуцировалась β-глюкозидаза, и затем выращивают микроорганизм, принадлежащий к роду Trichoderma, с последующим отделением культуральной жидкости.
[0035] Температура реакции гидролиза посредством целлюлазы из мицелиальных грибов предпочтительно варьирует в диапазоне от 15 до 100°C, более предпочтительно в диапазоне от 40 до 60°C, наиболее предпочтительно составляет 50°C. Величина pH в реакции гидролиза предпочтительно варьирует в диапазоне pH от 3 до 9, более предпочтительно в диапазоне pH от 4 до 5,5, наиболее предпочтительно составляет pH 5. Для корректирования величины pH может быть добавлена кислота или щелочь, чтобы довести значение pH до желательного уровня. Кроме того, если требуется, может быть применен буфер.
[0036] В дополнение, при гидролизе продукта предварительной обработки целлюлозы предпочтительно проводят взбалтывание/перемешивание, чтобы содействовать лучшему контакту между продуктом предварительной обработки целлюлозы и целлюлазой из мицелиальных грибов и для достижения однородной концентрации сахара в гидролизате. Концентрация твердого вещества в качестве продукта предварительной обработки целлюлозы более предпочтительно варьирует в диапазоне от 1 до 25% по весу. В частности, на стадии (1) концентрация твердого вещества как продукта предварительной обработки целлюлозы предпочтительно регулируют в диапазоне от не менее 2 до 10% по весу. Это делают с целью обеспечения достаточного количества жидкости для разбавления мелассы на стадии (2) на более позднем этапе. Еще одним преимуществом регулирования концентрации твердого вещества в диапазоне от не менее 2 до 10% по весу является повышение эффективности гидролиза продукта предварительной обработки целлюлозы. Это обусловливается тем свойством целлюлазы из мицелиальных грибов, что ферментативная реакция ингибируется сахаристыми продуктами, такими как глюкоза и целлобиоза, которые представляют собой продукты, образуемые гидролизом.
[0037] Концентрация сахара в гидролизате, полученном на стадии (1) согласно настоящему изобретению, не является ограниченной и предпочтительно варьирует в диапазоне от 10 до 100 г/л, более предпочтительно в диапазоне от 20 до 80 г/л, в расчете на концентрацию моносахаридов. Это обусловлено тем, что концентрация сахаров в пределах этого диапазона позволяет корректировать концентрацию сахаров до наиболее подходящего значения при смешивании с мелассой на более позднем этапе.
[0038] Стадия (2)
В настоящем изобретении к гидролизату, полученному в описанной выше стадии (1), добавляют мелассу. Меласса (Molasses) является побочным продуктом (отбросом), получаемым в процессе производства сахара из сока сахароносных сельскохозяйственной культуры, такой как сахарный тростник, сахарная свекла, Beta vulgaris, свекла или виноград, или из сахара-сырца, полученного однократной кристаллизацией такого сока из сахарного тростника. Меласса представляет собой раствор, содержащий сахаристые компоненты, которые остаются после стадии кристаллизации сахара в процессе производства сахара. Как правило, стадию кристаллизации сахара обычно проводят многократно таким образом, что первый сахар образуется как кристаллический компонент, полученный при первой кристаллизации, второй сахар образуется как кристаллический компонент, полученный кристаллизацией жидкости, оставшейся от первого сахара (первого утфеля), третий сахар образуется при кристаллизации жидкости, оставшейся от второго сахара (второго утфеля), и стадию дополнительно повторяют. Полученная в результате остаточная жидкость называется мелассой, которая является отбросами (отходами) производства. Сахаристые компоненты, содержащиеся в мелассе, главным образом представляют собой сахарозу, глюкозу и фруктозу, и в ней также могут содержаться определенные количества других сахаристых компонентов, таких как ксилоза и галактоза. Когда число циклов кристаллизации увеличивают, в мелассе возрастают концентрации иных компонентов, нежели сахаристые компоненты, происходящие из сахароносной сельскохозяйственной культуры. Таким образом, меласса известна как содержащая также большое количество ингибиторов брожения. Примеры ингибиторов брожения, содержащихся в мелассе, включают уксусную кислоту, муравьиную кислоту, гидроксиметилфурфурол, фурфурол, ванилин, ацетованилон, гваякол и разнообразные неорганические вещества (ионы). Однако компоненты и количества сахаров и ингибиторов брожения, содержащиеся в мелассе, не являются ограниченными.
+
+
[0039] Меласса, используемая на стадии (2), предпочтительно представляет собой мелассу, полученную после многих циклов кристаллизации. Более конкретно, данная меласса представляет собой мелассу, которая остается после многократной кристаллизации, проведенной предпочтительно не менее 2 раз, более предпочтительно не менее 3 раз. Кроме того, концентрация сахаров в мелассе предпочтительно составляет не менее 200 г/л, более предпочтительно не менее 500 г/л. В случаях, когда концентрация сахаристых компонентов в мелассе составляет менее 200 г/л, степень извлечения целлюлазы из мицелиальных грибов не возрастает, что не является предпочтительным. С другой стороны, хотя верхний предел концентрации сахаристых компонентов в мелассе, используемой на стадии (2), не является ограниченной, верхним пределом концентрации сахаристых компонентов в мелассе, получаемой в обычном процессе производства сахара, считается величина 800 г/л. Концентрация сахаров в мелассе может быть измерена с использованием известного метода измерения, такого как HPLC (высокоэффективная жидкостная хроматография, ВЭЖХ). Кроме того, меласса, в дополнение к вышеописанным сахарам, предпочтительно содержит ионы К. Концентрация ионов К в мелассе, используемой в настоящем изобретении, составляет не менее 1 г/л, более предпочтительно не менее 5 г/л, наиболее предпочтительно не менее 10 г/л.
[0040] Мелассу добавляют к гидролизату стадии (1) для получения гидролизата, содержащего мелассу. Концентрация сахаров в гидролизате, содержащем мелассу, предпочтительно составляет не более 200 г/л, более предпочтительно не более 150 г/л, поскольку в случаях, где концентрация сахара в гидролизате, содержащем мелассу, является слишком высокой, вязкость становится слишком большой, так что может быть слабым течение в последующей обработке с использованием ультрафильтрационной мембраны. С другой стороны, в случаях, где концентрация сахара в гидролизате, содержащем мелассу, составляет менее 4 0 г/л, может быть низкой концентрация конечной полученной сахаросодержащей жидкости, так что концентрация сахаров в гидролизате, содержащем мелассу, предпочтительно составляет не менее 40 г/л, более предпочтительно не менее 50 г/л. То есть, мелассу добавляют таким образом, что концентрация сахаров в гидролизате, содержащем мелассу, предпочтительно варьирует в диапазоне от 40 до 200 г/л, более предпочтительно в диапазоне от 50 до 150 г/л. Хотя гидролизат, содержащий мелассу, может быть инкубирован при комнатной температуре (25°C), эту жидкость предпочтительно инкубируют при температуре в диапазоне от 40 до 60°C, более предпочтительно инкубируют при температуре около 50°C. Благодаря этому повышают количество фермента, который может быть извлечен с помощью ультрафильтрационной мембраны в последующей стадии, что является предпочтительным.
[0041] Некоторые типы микроорганизмов, используемых для ферментации, проявляют низкую эффективность использования сахарозы, которая представляет собой основной сахар в мелассе, в качестве источника углерода. Таким образом, в случаях, где мелассу применяют в качестве исходного сырья для ферментации при получении химического продукта с использованием такого микроорганизма, предпочтительно заблаговременно гидролизовать сахарозу, содержащуюся в мелассе, в глюкозу и фруктозу. Гидролитическая обработка мелассы также может представлять собой тепловую обработку в кислотных или щелочных условиях. Кроме того, может быть проведена ферментативная обработка с помощью инвертазы, сахаразы и/или тому подобной. Инвертаза также называется β-фруктофуранозидазой и означает фермент, который гидролизует сахарозу до глюкозы и фруктозы. Сахараза также означает фермент, который гидролизует сахарозу до глюкозы и фруктозы. Используемая в настоящем изобретении инвертаза не является ограниченной и может быть приобретена и использована инвертаза дрожжевого происхождения, имеющаяся в продаже на рынке от фирм Biocon (Japan) Ltd. или Mitsubishi-Kagaku Foods Corporation. Условия обработки инвертазой могут быть такими, какие обычно применяются для ее эффективного действия. Применяемая сахараза также не является ограниченной, и может быть приобретена и использована сахараза, имеющаяся в продаже на рынке от фирм Wako Pure Chemical Industries, Ltd. или Mitsubishi-Kagaku Foods Corporation. Условия обработки сахаразой могут быть такими, какие обычно применяются для ее эффективного действия. Обработка инвертазой или сахаразой может быть проведена заблаговременным добавлением инвертазы или сахаразы к одной только мелассе или может быть проведена после приготовления гидролизата, содержащего мелассу, добавлением мелассы к гидролизату стадии (1). Поскольку, как было описано выше, инкубация гидролизата, содержащего мелассу, при температуре в диапазоне от 40 до 60°C увеличивает количество извлекаемого фермента, реакция гидролиза сахаразой также может быть проведена добавлением инвертазы или сахаразы в этот процесс.
[0042] Стадия (3)
На стадии (3) гидролизат, содержащий мелассу, полученный на стадии (2), подвергают твердофазно-жидкостному разделению и извлекают раствор как выделенный компонент. Твердофазно-жидкостное разделение может быть проведено известным методом твердофазно-жидкостного разделения, таким как: центрифугирование с использованием шнекового декантера или тому подобного; фильтрация, включающая напорно-вакуумное фильтрование; или мембранная фильтрация, включающая микрофильтрацию. Такое твердофазно-жидкостное разделение также может быть проведено с использованием комбинации более чем одного метода и не является ограниченным в такой мере, насколько твердые вещества могут быть эффективно удалены с его помощью. Однако по соображениям предотвращения засорения ультрафильтрационной мембраны на последующей стадии, раствор как выделенный компонент после твердофазно-жидкостного разделения предпочтительно не содержит твердых веществ в такой степени, насколько это возможно, и, более конкретно, предпочтительно, чтобы первое твердофазно-жидкостное разделение проводили центрифугированием или фильтрацией с использованием фильтр-пресса или тому подобного, после чего полученный раствор как выделенный компонент подвергали дополнительной мембранной фильтрации через микрофильтрационную мембрану, чтобы полностью удалить твердые вещества. Микрофильтрацию через мембрану также называют мембранной фильтрацией, и эта мембрана представляет собой разделительную мембрану, которая отделяет и удаляет частицы, имеющие размер от около 0,01 до 10 мкм, из суспензии дисперсных веществ с использованием разности давлений в качестве движущей силы. Микрофильтрационная мембрана имеет на своей поверхности поры с размером в диапазоне от 0,01 до 10 мкм, и дисперсные компоненты с величиной крупнее этих пор могут быть отделены/удалены на одной стороне мембраны. Примеры материала микрофильтрационной мембраны включают, но не ограничиваются таковыми, ацетат целлюлозы, ароматический полиамид, поливиниловый спирт, полисульфон, поливинилиденфторид, полиэтилен, полиакрилонитрил, керамические материалы, полипропилен, поликарбонат и политетрафторэтилен (Teflon (зарегистрированный товарный знак)). Мембрана предпочтительно представляет собой микрофильтрационную мембрану из поливинилиденфторида, из соображений устойчивости к загрязнению, химической стойкости, прочности, производительности фильтрования, и тому подобным характеристикам.
[0043] Затем раствор как выделенный компонент подвергают обработке с помощью ультрафильтрационной мембраны. Ультрафильтрационная мембрана в основном означает разделительную мембрану, которая имеет поры с размером в диапазоне от 1,5 нанометра до 250 нанометров, и может задерживать водорастворимые макромолекулы, имеющие молекулярные массы в диапазоне от 1000 до 200000, в качестве концентрата. Предельная величина отсечки молекулярной массы для ультрафильтрационной мембраны не является ограниченной в такой мере, насколько может быть извлечена целлюлаза из мицелиальных грибов, и предельная величина отсечки молекулярной массы предпочтительно составляет от 1000 до 100000 дальтон, более предпочтительно от 10000 до 30000 дальтон. Примеры материала ультрафильтрационной мембраны, которая может быть использована, включают простой полиэфирсульфон (PES), поливинилиденфторид (PVDF) и искусственное целлюлозное волокно, и, поскольку целлюлоза разлагается под действием целлюлазы из мицелиальных грибов, материал ультрафильтрационной мембраны предпочтительно представляет собой синтетический полимер, такой как PES или PVDF. Предпочтительные примеры формы ультрафильтрационной мембраны включают трубчатую форму, спиральный элемент и плоскую мембрану. Примеры режима фильтрации через ультрафильтрационную мембрану включают динамическую тангенциальную фильтрацию и статичную тупиковую фильтрацию, и в плане засорения и интенсивности течения предпочтительной является тангенциальная («кросс-флоу») фильтрация.
[0044] В результате фильтрования раствора как выделенного компонента через ультрафильтрационную мембрану может быть получена сахаросодержащая жидкость в качестве пермеата. Полученная сахаросодержащая жидкость представляет собой жидкость, образованную почти полным удалением твердых примесей, которые первоначально содержались в гидролизате, содержащем мелассу, посредством твердофазно-жидкостного разделения. С другой стороны, путем фильтрации через ультрафильтрационную мембрану окрашенные вещества и водорастворимые макромолекулы в гидролизате, содержащем мелассу, удаляются и задерживаются на стороне концентрата, причем водорастворимые макромолекулы содержат компонент целлюлазы из мицелиальных грибов, использованной на стадии (1). Извлекаемый компонент целлюлазы из мицелиальных грибов не является ограниченным, и весь компонент целлюлазы из мицелиальных грибов, или часть его, использованный в гидролизе, может быть извлечен как концентрат. Поскольку концентрат также содержит сахаристые компоненты, происходящие из гидролизата, содержащего мелассу, операция, в которой добавляют воду к концентрату и проводят дополнительное фильтрование полученной смеси через ультрафильтрационную мембрану, может быть повторена для извлечения таких сахаристых компонентов.
[0045] Результатом стадии (3) является заметное увеличение количества фермента целлюлазы из мицелиальных грибов, содержащейся в извлеченном ферменте, по сравнению с традиционными способами, и среди компонентов целлюлазы из мицелиальных грибов с особенно высокой эффективностью извлекаются целлобиогидролаза и ксиланаза. При повторном использовании извлеченной целлюлазы из мицелиальных грибов для гидролиза продукта предварительной обработки целлюлозы может быть сокращено количество применяемой целлюлазы из мицелиальных грибов. Целлюлаза из мицелиальных грибов может быть повторно использована для гидролиза как таковая по отдельности или может быть повторно применена после смешения со свежей целлюлазой из мицелиальных грибов. Кроме того, в некоторых случаях извлеченная целлюлаза из мицелиальных грибов может быть эффективно использована в ином варианте применения, нежели гидролиз целлюлозы.
[0046] Стадия концентрирования сахара
При фильтрации, как в методе, описанном в патентном документе WO 2010/067785, сахаросодержащей жидкости, полученной на стадии (3), с помощью нанофильтрационной мембраны и/или мембраны обратного осмоса может быть получена концентрированная сахаросодержащая жидкость, содержащая концентрированные сахаристые компоненты, в качестве концентрата.
[0047] Нанофильтрационная мембрана также называется нанофильтром (нанофильтрационной мембраной, NF-мембраной) и в общем смысле определяется как «мембрана, которая обеспечивает прохождение одновалентных ионов, но задерживает двухвалентные ионы». Мембрана рассматривается как содержащая тонкие полости, имеющие размеры около нескольких нанометров, и главным образом используется для задерживания тонкодисперсных частиц, молекул, ионов, солей и тому подобных в воде.
[0048] Мембрана обратного осмоса также называется RO-мембраной и в основном определяется как «мембрана, исполняющая функцию деминерализации также в отношении одновалентных ионов». Мембрана рассматривается как имеющая сверхтонкие полости, имеющие размеры от нескольких ангстрем до нескольких нанометров, и главным образом используется для удаления ионных компонентов в таких ситуациях, как обессоливание морской воды и получение сверхчистой воды.
[0049] Примеры материала нанофильтрационной мембраны или мембраны обратного осмоса, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, включают полимерные материалы, такие как полимеры на основе ацетата целлюлозы, полиамиды, сложные полиэфиры, полиимиды, винильные полимеры и полисульфоны. Мембрана не ограничивается мембраной, состоящей из одного из этих материалов, и может быть мембраной, включающей многочисленные мембранные материалы.
[0050] В качестве нанофильтрационной мембраны, применяемой в настоящем изобретении, предпочтительным является спирально намотанный рулонный мембранный элемент. Конкретные примеры предпочтительных нанофильтрационных мембранных элементов включают нанофильтрационный мембранный элемент на основе ацетата целлюлозы GE Sepa, производимый фирмой GE Osmonics; нанофильтрационные мембранные элементы NF99 и NF99HF, производимые фирмой Alfa-Laval, которые имеют полиамидные функциональные слои; нанофильтрационные мембранные элементы NF-45, NF-90, NF-200, NF-270 и NF-400, производимые фирмой FilmTec Corporation, которые имеют сшитые пиперазин-полиамидные функциональные слои; и нанофильтрационные мембранные элементы SU-210, SU-220, SU-600 и SU-610, производства фирмы Тоrау Industries, Inc., включающие нанофильтрационную мембрану UTC60, изготавливаемую тем же производителем, которая включает сшитый пиперазин-полиамид в качестве основного компонента. Более предпочтительным является нанофильтрационный мембранный элемент NF99 или NF99HF; NF-45, NF-90, NF-200 или NF-400; или SU-210, SU-220, SU-600 или SU-610. Еще более предпочтительным является нанофильтрационный мембранный элемент SU-210, SU-220, SU-600 или SU-610.
[0051] В отношении материала для мембраны обратного осмоса, используемой в настоящем изобретении, примеры мембраны включают композитную мембрану, содержащую полимер на основе ацетата целлюлозы в качестве функционального слоя (далее называемую ацетатцеллюлозной мембраной обратного осмоса), и композитную мембрану, включающую полиамид в качестве функционального слоя (далее называемую полиамидной мембраной обратного осмоса). Примеры ацетатцеллюлозного полимера здесь включают полимеры, полученные на основе сложных эфиров целлюлозы с органическими кислотами, такие как ацетат целлюлозы, диацетат целлюлозы, триацетат целлюлозы, пропионат целлюлозы и бутират целлюлозы, которые могут быть использованы по отдельности, в виде смеси или в виде смешанного сложного эфира. Примеры полиамида включают линейные полимеры и сшитые полимеры, составленные алифатическими и/или ароматическими диаминами в качестве мономеров.
[0052] Конкретные примеры мембраны обратного осмоса, используемой в настоящем изобретении, включают полиамидные мембранные модули обратного осмоса, производимые фирмой TORAY INDUSTRIES, INC., SUL-G10 и SUL-G20, которые представляют собой модули типа сверхнизкого давления, и SU-710, SU-720, SU-720F, SU-710L, SU-720L, SU-720LF, SU-720R, SU-710P и SU-720P, которые представляют собой модули типа низкого давления, а также SU-810, SU-820, SU-820L и SU-820FA, которые представляют собой модули типа высокого давления, содержащие UTC80 в качестве мембраны обратного осмоса; ацетатцеллюлозные мембраны обратного осмоса, изготавливаемые тем же производителем, SC-L100R, SC-L200R, SC-1100, SC-1200, SC-2100, SC-2200, SC-3100, SC-3200, SC-8100 и SC-8200; NTR-759HR, NTR-729HF, NTR-70SWC, ES10-D, ES20-D, ES20-U, ES15-D, ES15-U и LF10-D, производства фирмы Nitto Denko Corporation; R098pHt, RO99, HR98PP и CE4040C-30D, производимые фирмой Alfa-Laval; GE Sepa, производства фирмы GE; BW30-4040, TW30-4040, XLE-4040, LP-4040, LE-4040, SW30-4040 и SW30HRLE-4040, производства фирмы FilmTec Corporation; TFC-HR и TFC-ULP, изготавливаемые фирмой KOCH; и ACM-1, ACM-2 и ACM-4, производства фирмы TRISEP.
[0053] Концентрирование сахаросодержащей жидкости с использованием нанофильтрационной мембраны и/или мембраны обратного осмоса имеет то преимущество, что может быть повышена концентрация сахара в сахаросодержащей жидкости, и ингибиторы брожения могут быть удалены в виде пермеата. Термин «ингибиторы брожения» здесь означает компоненты, иные, нежели сахара, которые подавляют брожение в стадии ферментации на более позднем этапе, и конкретные примеры ингибиторов брожения включают ароматические соединения, производные фурана, органические кислоты и одновалентные неорганические соли. Показательные примеры таких ароматических соединений и производных фурана включают фурфурол, гидроксиметилфурфурол, ванилин, ванилиновую кислоту, сиреневую кислоту, конифериловый альдегид, кумаровую кислоту и феруловую кислоту. Примеры органических кислот и неорганических солей включают уксусную кислоту, муравьиную кислоту, соли калия и натрия. Концентрация сахара в концентрированной сахаросодержащей жидкости может быть отрегулирована произвольно в диапазоне от 50 г/л до 400 г/л, в зависимости от условий обработки с использованием нанофильтрационной мембраны и/или мембраны обратного осмоса, и может быть произвольно установлена в зависимости от применения концентрированной сахаросодержащей жидкости и/или тому подобного. В случаях, где требуется более полное удаление ингибиторов брожения, к сахаросодержащей жидкости или концентрированной сахаросодержащей жидкости может быть добавлена вода, с последующим концентрированием полученного продукта через нанофильтрационную мембрану и/или мембрану обратного осмоса до желательной концентрации сахаров. Этим путем ингибиторы брожения могут быть удалены в виде пермеата.
[0054] Применение нанофильтрационной мембраны является более предпочтительным, поскольку она обеспечивает более эффективное удаление ингибиторов брожения, чем мембрана обратного осмоса.
Применение ли нанофильтрационной мембраны или же применение мембраны обратного осмоса может быть выбрано, принимая во внимание концентрацию ингибиторов брожения, содержащихся в гидролизате, содержащем мелассу, или в зависимости от того, как ингибиторы брожения повлияют на ферментацию на более позднем этапе.
[0055] Вышеописанная концентрированная сахаросодержащая жидкость может быть дополнительно сконцентрирована с использованием вакуумного испарителя, выпарной батареи, сублимационной камеры, распылительной сушилки, сушилки горячим воздухом и/или тому подобной.
[0056] Сахаросодержащая жидкость/концентрированная сахаросодержащая жидкость
Сахаросодержащие жидкости и/или концентрированные сахаросодержащие жидкости, полученные с помощью настоящего изобретения, могут быть использованы для таких вариантов применения, как пищевые продукты, подсластители, корма для животных и сырьевые материалы для ферментации.
[0057] Способ получения химического продукта
С использованием сахаросодержащей жидкости и/или концентрированной сахаросодержащей жидкости, полученной в рамках настоящего изобретения, в качестве исходного сырья для ферментации для выращивания микроорганизмов, имеющих способность продуцировать химические продукты, могут быть получены разнообразные химические вещества. «Выращивание микроорганизмов с использованием сахаросодержащей жидкости и/или концентрированной сахаросодержащей жидкости в качестве исходного сырья для ферментации» здесь означает, что сахаристые компоненты или источники аминосоединений, содержащиеся в сахаросодержащей жидкости, используются как питательные вещества для микроорганизмов, чтобы инициировать рост микроорганизмов и обеспечивать его продолжение. Конкретные примеры химических продуктов включают спирты, органические кислоты, аминокислоты и нуклеиновые кислоты, которые представляют собой вещества, получаемые в промышленном масштабе в бродильном производстве. Такие химические продукты образуются и накапливаются внутри и снаружи живого организма при использовании сахаристых компонентов, содержащихся в сахаросодержащей жидкости, в качестве вовлекаемых в метаболизм источников углерода. Конкретные примеры химических продуктов, которые могут продуцироваться микроорганизмами, включают спирты, такие как этанол, 1,3-пропандиол, 1,4-пропандиол и глицерин; органические кислоты, такие как уксусная кислота, молочная кислота, пировиноградная кислота, янтарная кислота, яблочная кислота, итаконовая кислота и лимонная кислота; нуклеозиды, такие как инозин и гуанозин; нуклеотиды, такие как инозиновая кислота и гуаниловая кислота; и аминосоединения, такие как кадаверин. Кроме того, сахаросодержащая жидкость согласно настоящему изобретению может быть использована для получения ферментов, антибиотиков, рекомбинантных белков и тому подобных. Микроорганизм, применяемый для получения такого химического продукта, не является ограниченным в такой мере, насколько микроорганизм способен эффективно продуцировать представляющий интерес химический продукт, и примеры микроорганизма, который может быть использован, включают такие микроорганизмы, как Е. coli, дрожжи, мицелиальные грибы и базидиомицеты.
[0058] В случаях, когда сахаросодержащую жидкость и/или концентрированную сахаросодержащая жидкость по изобретению используют в качестве исходного сырья для ферментации при получении химического продукта, к ним при необходимости могут быть добавлены источник(и) азота и/или неорганическая(ие) соль(и), и, если необходимо, к ним может(гут) быть добавлен(ы) органический(ие) микронутриент(ы), такой(ие) как аминокислота(ы) и/или витамин(ы). Кроме того, в некоторых случаях сахаросодержащая жидкость и/или концентрированная сахаросодержащая жидкость могут быть дополнены ксилозой и/или еще одним/другим источником(ами) углерода, для приготовления исходного сырья для ферментации, и примеры источника(-ков) углерода включают сахара, такие как глюкоза, сахароза, фруктоза, галактоза и лактоза; осахаренные крахмальные растворы, содержащие эти сахара; патока из сладкого картофеля; меласса из сахарной свеклы; и высокосахаристая меласса; и, кроме того, органические кислоты, такие как уксусная кислота; спирты, такие как этанол; и глицерин. Примеры источника(ов) азота, которые могут быть использованы, включают газообразный аммиак; водный аммиак; соли аммония; мочевину; нитраты; и прочие вторично используемые органические источники азота, такие как растительные выжимки масличных культур, соевые гидролизаты, казеиновые бульоны, прочие аминокислоты, витамины, кукурузный сироп, дрожжи или дрожжевые экстракты, мясные экстракты, пептиды, такие как пептон, и клетки разнообразных вызывающих брожение микроорганизмов, и их гидролизаты. Примеры неорганической(их) соли(ей), которые могут быть добавлены, если это уместно, включают фосфаты, соли магния, соли кальция, соли железа и соли марганца.
[0059] Примеры способа культивирования микроорганизма включают известные методы выращивания бродильных заквасок, такие как периодическое культивирование, периодическое культивирование с подпиткой и непрерывное культивирование. В частности, поскольку твердые вещества полностью удалены из сахаросодержащей жидкости и/или концентрированной сахаросодержащей жидкости согласно настоящему изобретению с использованием ультрафильтрационной мембраны и/или тому подобной, можно отделить и собрать использованный для ферментации микроорганизм таким методом, как центрифугирование или мембранное разделение, чтобы повторно использовать микроорганизм. При таком отделении/сборе и повторном использовании микроорганизма микроорганизм можно отделять/собирать в непрерывном режиме по мере добавления свежей сахаросодержащей жидкости и/или концентрированной сахаросодержащей жидкости во время культивирования, или микроорганизм может быть отделен/собран после завершения культивирования для повторного использования для выращивания следующей партии.
[0060] Конструкция установки для получения сахаросодержащей жидкости
Ниже приведено описание способа получения сахаросодержащей жидкости согласно настоящему изобретению, сосредоточенное на применяемой для этого установке, со ссылкой на схематические чертежи.
[0061] Фиг. 1 схематически представляет технологическую блок-схему, показывающую стадии согласно настоящему изобретению. Его подробности являются такими, как описано выше.
[0062] Фиг. 2 представляет схематическую диаграмму установки для выполнения настоящего изобретения. Продукт предварительной обработки целлюлозы и целлюлазу из мицелиальных грибов подают в гидролитический реактор (2), где проводят гидролиз. Для эффективного выполнения гидролиза гидролитический реактор (2) предпочтительно включает термостат (1) и мешалку (3). По завершении гидролиза в гидролитический реактор (2) подают мелассу. Подводимая меласса может представлять собой мелассу, предварительно разбавленную по соображениям простоты обращения с ней. После добавления мелассы к гидролизату полученную смесь предпочтительно перемешивают с использованием мешалки (3). Для повышения эффективности извлечения целлюлазы из мицелиальных грибов может быть использован термостат (1), чтобы поддерживать температуру в гидролитическом реакторе в диапазоне от 40 до 60°C. После этого гидролизат, содержащий мелассу, полученный в гидролитическом реакторе (2), подают в твердофазно-жидкостный сепаратор (5) с использованием устройства для перекачивания жидкости, такого как жидкостный нагнетательный насос (4). В качестве твердофазно-жидкостного сепаратора (5) может быть использован известный твердофазно-жидкостный сепаратор, такой как центрифуга, фильтр-пресс, шнековый пресс, барабанный вращающийся фильтр или ленточный фильтр. Твердофазно-жидкостное разделение предпочтительно проводят фильтрацией с использованием разделительной мембраны. Раствор как выделенный компонент, полученный с использованием твердофазно-жидкостного сепаратора (5), может быть дополнительно профильтрован через микрофильтрационное мембранное устройство (6). Таким образом, в процессе твердофазно-жидкостного разделения раствор как выделенный компонент, полученный с использованием твердофазно-жидкостного сепаратора (5) и микрофильтрационного мембранного устройства (б), собирают в сборном резервуаре (7) для раствора. Сборный резервуар (7) для раствора через насос (8) ультрафильтрационной мембраны соединен с ультрафильтрационной мембраной (9), где вышеуказанный раствор как выделенный компонент разделяют на целлюлазу из мицелиальных грибов и сахаросодержащую жидкость. Ультрафильтрационная мембрана (9) предпочтительно представляет собой мембрану, выполненную в форме модуля, такого как спиральный модуль. Целлюлазу из мицелиальных грибов, отделенную с помощью ультрафильтрационной мембраны (9), собирают в качестве концентрата через сборный резервуар (7) для раствора. С другой стороны, пермеат ультрафильтрационной мембраны (9) может быть собран как сахаросодержащая жидкость и может быть использован для получения химического продукта или тому подобного.
[0063] Фиг. 3 представляет схематическую диаграмму установки для дополнительного концентрирования сахаросодержащей жидкости согласно настоящему изобретению. Сахаросодержащая жидкость согласно настоящему изобретению сохраняется в сборном резервуаре (10) для сахаросодержащей жидкости, который через высоконапорный насос (11) соединен с нанофильтрационной мембраной и/или мембраной (12) обратного осмоса. Сахаристый компонент согласно настоящему изобретению собирают в качестве концентрата нанофильтрационной мембраны и/или мембраны (12) обратного осмоса, и собирают в виде концентрированной сахаросодержащей жидкости в сборном резервуаре (10) для сахаросодержащей жидкости. В качестве пермеата нанофильтрационной мембраны и/или мембраны (12) обратного осмоса удаляют ингибиторы брожения вместе с избыточной водой.
[0064] Фиг. 4 представляет схематическую диаграмму, показывающую установку для получения химического продукта с использованием сахаросодержащей жидкости и/или концентрированной сахаросодержащей жидкости согласно настоящему изобретению. Сахаросодержащую жидкость и/или концентрированную сахаросодержащую жидкость по изобретению подают в ферментер (14), включающий мешалку (15) и термостат (13). Микроорганизм подают в ферментер и выращивают в нем для получения химического продукта, тогда как микроорганизм может быть отделен с помощью устройства (16) для отделения микроорганизма от культуральной жидкости, включающей химический продукт, после завершения культивирования или во время процесса культивирования. Микроорганизм, отделенный с помощью устройства (16) для отделения микроорганизма, собирают в ферментере (14).
[0065] Фиг. 5 представляет схематическую диаграмму, показывающую конструкцию установки в случае, где установку для получения сахаросодержащей жидкости, включающую устройство для получения сахаросодержащей жидкости согласно настоящему изобретению, сооружают после существующей установки для производства сахара. Диаграмма показывает вариант выполнения, в котором в существующей установке для производства сахара используют сахарный тростник в качестве сырьевого материала для сахара. Установка для производства сахара включает измельчитель (стадия резки) (17) для измельчения сахарного тростника, выжимной пресс (стадия выжимки) (18) для выжимания сахарного тростника, чтобы получать сок сахарного тростника, сокосборный резервуар (19) для хранения сока сахарного тростника, выпарной аппарат (выпарная батарея) (20) для концентрирования сока сахарного тростника (стадия концентрирования), кристаллизатор (21) для кристаллизации сахара, содержащегося в концентрате (стадия кристаллизации), и разделительное устройство (22) для отделения закристаллизованного сырого сахарного материала, мелассу, которую используют в настоящем изобретении, выводят из кристаллизатора (21) или разделительного устройства (22). Жом сахарного тростника, выведенный из выжимного пресса (18), направляют транспортером (23), таким как конвейер, в установку для получения сахаросодержащей жидкости. Жом сахарного тростника измельчают с помощью измельчителя (24) в стадии перед стадией предварительной обработки. В качестве измельчителя может быть использована мельница с бегунами мелкого помола, режущая мельница, молотковая дробилка или тому подобные, или может быть применена комбинация из многочисленных таких устройств. Измельченный жом сахарного тростника подвергают предварительной обработке в нагревателе (25), исполняющем по меньшей мере функцию нагревания (стадия предварительной обработки). При предварительной обработке могут быть добавлены кислота, щелочь, разбавленная серная кислота, аммиак, каустическая сода или тому подобные, как было описано выше. Продукт предварительной обработки целлюлозы подвергают гидролизу с помощью целлюлазы из мицелиальных грибов, с использованием описанной выше (Стадия 1) установки согласно фиг. 2. После этого мелассу (мелассу), выведенную из установки для производства сахара, добавляют в гидролизат стадии (1). Источник мелассы соединен с установкой из фиг. 2 транспортным трубопроводом (26). После установки согласно фиг. 2 может быть добавлена установка согласно фиг. 3 для концентрирования сахара. Кроме того, как было описано выше, сахаросодержащая жидкость согласно настоящему изобретению может быть использована для пищевых продуктов, кормов для животных, сырьевых материалов для ферментации и тому подобных.
ПРИМЕРЫ
[0066] Настоящее изобретение описано ниже более конкретно на Примерах. Однако настоящее изобретение ими не ограничивается.
[0067] КОНТРОЛЬНЫЙ ПРИМЕР 1
Получение продукта предварительной обработки целлюлозы (гидротермическая обработка)
В качестве содержащей целлюлозу биомассы использовали жом сахарного тростника. Содержащую целлюлозу биомассу погрузили в воду и подвергли обработке с использованием автоклава (изготовленного фирмой Nitto Koatsu Co., Ltd.) с перемешиванием при температуре 180°C в течение 20 минут. После обработки провели твердофазно-жидкостное разделение центрифугированием (с ускорением 3000 G) для отделения продукта предварительной обработки целлюлозы от раствора как выделенного компонента.
Полученный продукт предварительной обработки целлюлозы использовали в приведенных ниже примерах.
[0068] КОНТРОЛЬНЫЙ ПРИМЕР 2
Измерение концентрации сахара
Концентрации сахарозы, глюкозы и ксилозы, содержащихся в сахаросодержащей жидкости, измеряли в описанных ниже условиях хроматографического разделения с помощью HPLC (высокоэффективной жидкостной хроматографии, ВЭЖХ), в сравнении со стандартными образцами.
2
[0069] Колонка: Luna NH (производства фирмы Phenomenex, Inc.)
Подвижная фаза: MilliQ: ацетонитрил=25:75 (величина расхода потока, 0,6 мл/минуту)
Реакционный раствор: нет
Метод детектирования: рефрактометрический (RI) (по разности показателей преломления)
Температура: 30°C
[0070] КОНТРОЛЬНЫЙ ПРИМЕР 3
Анализ ингибиторов брожения
Количественную оценку ароматических соединений и производных фурана провели в описанных ниже условиях HPLC на основе сравнения со стандартными образцами. Каждый аналитический образец центрифугировали при ускорении 3500 G в течение 10 минут, и полученную надосадочную жидкость подвергали следующему анализу.
[0071] Колонка: Synergi Hidro RP 4,6 мм×250 мм (производства фирмы Phenomenex)
3
4
Подвижная фаза: ацетонитрил-0,1% НРO (величина расхода потока, 1,0 мл/минуту)
Метод детектирования: ультрафиолетовый (УФ) (длина волны 283 нм)
Температура: 40°C
Количественную оценку уксусной кислоты и муравьиной кислоты проводили в описанных ниже условиях HPLC на основе сравнения со стандартными образцами. Каждый аналитический образец центрифугировали при ускорении 3500 G в течение 10 минут, и полученную надосадочную жидкость подвергали следующему анализу.
[0072] Колонка: Shim-Pack и Shim-Pack SCR101H (производства фирмы Shimadzu Corporation), которые размещены в одну линию
Подвижная фаза: 5 мМ раствор пара-толуолсульфоновой кислоты (величина расхода потока, 0,8 мл/минуту)
Реакционный раствор: 5 мМ раствор пара-толуолсульфоновой кислоты, 20 мМ раствор буфера Bis-Tris, 0,1 мМ раствор динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA-2Na) (величина расхода потока, 0,8 мл/минуту)
Метод детектирования: электрическая проводимость
Температура: 45°C
[0073] КОНТРОЛЬНЫЙ ПРИМЕР 4
Получение целлюлазы грибов Trichoderma
Целлюлазу грибов Trichoderma получили следующим способом.
Прекультивирование
5
Приготовили смесь 5% (вес/объем) кукурузного сиропа, 2% (вес/объем) глюкозы, 0,37% (вес/объем) тартрата аммония, 0,14% (вес/объем) сульфата аммония, 0,2% (вес/объем) дигидрофосфата калия, 0,03% (вес/объем) дигидрата хлорида кальция, 0,03% (вес/объем) гептагидрата сульфата магния, 0,02% (вес/объем) хлорида цинка, 0,01% (вес/объем) гексагидрата хлорида железа (III), 0,004% (вес/объем) пентагидрата сульфата меди (II), 0,0008% (вес/объем) тетрагидрата хлорида марганца, 0,0006% (вес/объем) борной кислоты и 0,0026% (вес/объем) тетрагидрата гептамолибдата гексааммония в дистиллированной воде, и 100 мл этой смеси поместили в колбу Эрленмейера емкостью 500 мл с отражательными перегородками, с последующей стерилизацией путем обработки в автоклаве при температуре 121°C в течение 15 минут. После того как смесь остыла, к ней добавили РЕ-М и Tween 80, каждый из которых был стерилизован автоклавированием при температуре 121°C в течение 15 минут отдельно от смеси, в количестве 0,01% (вес/объем) каждого. Эту среду для прекультивирования засеяли Trichoderma reesei РС3-7 в количестве 1×10 клеток/мл, и клетки культивировали при температуре 28°C в течение 72 часов при взбалтывании (шейкер: BIO-SHAKER BR-40LF, производства фирмы TAITEC CORPORATION) со скоростью 180 об/мин, для выполнения прекультивирования.
[0074] Основное культивирование
Приготовили смесь 5% (вес/объем) кукурузного сиропа, 2% (вес/объем) глюкозы, 10% (вес/объем) целлюлозы (Avicel), 0,37% (вес/объем) тартрата аммония, 0,14% (вес/объем) сульфата аммония, 0,2% (вес/объем) дигидрофосфата калия, 0,03% (вес/объем) дигидрата хлорида кальция, 0,03% (вес/объем) гептагидрата сульфата магния, 0,02% (вес/объем) хлорида цинка, 0,01% (вес/объем) гексагидрата хлорида железа (III), 0,004% (вес/объем) пентагидрата сульфата меди(Н), 0, 0008% (вес/объем) тетрагидрата хлорида марганца, 0,0006% (вес/объем) борной кислоты и 0,0026% (вес/объем) тетрагидрата гептамолибдата гексааммония в дистиллированной воде, и 2,5 л этой смеси поместили в резервуар емкостью 5 л с мешалкой (производства фирмы ABLE, DPC-2A), с последующей стерилизацией в автоклаве при температуре 121°C в течение 15 минут. После того как смесь остыла, к ней добавили РЕ-М и Tween 80, каждый из которых был стерилизован автоклавированием при температуре 121°C в течение 15 минут отдельно от смеси, в количестве 0,1% каждого. Полученную смесь засеяли 250 мл предварительно приготовленной прекультуры Trichoderma reesei РС3-7 в жидкостной среде описанным выше методом. Затем клетки культивировали при температуре 28°C в течение 87 часов при перемешивании со скоростью 300 об/мин и со степенью аэрации 1 vvm (отношение объема воздуха к объему реактора). После центрифугирования надосадочную жидкость подвергли мембранной фильтрации (Stericup-GV, производства фирмы Millipore, материал: поливинилиденфторид (PVDF)). К культуральной жидкости, приготовленной в описанных выше условиях, добавили β-глюкозидазу (Novozyme 188) при весовом отношении к белку 1/100, и полученную смесь использовали в качестве целлюлазы грибов Trichoderma в нижеприведенных примерах.
[0075] КОНТРОЛЬНЫЙ ПРИМЕР 5
Способ измерения количества извлеченной целлюлазы из
мицелиальных грибов
Количество целлюлазы из мицелиальных грибов, которое могло быть извлечено на стадии (3), оценивали количественно измерением 3 видов деградационной активности (далее называемыми значениями активности): 1) целлюлозо-деградирующая активность; 2) целлобиозо-деградирующая активность; и 3) ксилан-деградирующая активность.
[0076] 1) Активность деградации кристаллической целлюлозы
К жидкому ферментному препарату (приготовленному при предварительно заданных условиях) добавили кристаллическую целлюлозу Avicel (Cellulose Microcrystalline, производства фирмы Merck) в количестве 1 г/л, и добавили натрий-ацетатный буфер (pH 5,0) при концентрации 100 мМ, и затем оставили полученную смесь реагировать при температуре 50°C в течение 24 часов. Эту жидкую реакционную смесь приготовили в пробирке емкостью 1 мл, и реакцию проводили при перемешивании вращением при вышеописанных условиях. После этого пробирку подвергли центрифугированию, и измерили концентрацию глюкозы в надосадочном жидкостном компоненте. Измерение концентрации глюкозы проводили согласно методу, описанному в контрольном примере 2. Концентрацию образовавшейся глюкозы (г/л) использовали в качестве показателя уровня активности деградации кристаллической целлюлозы, и использовали для сравнения количества извлеченного фермента.
[0077] 2) Целлобиозо-деградирующая активность
К жидкому ферментному препарату добавили целлобиозу (от фирмы Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) в количестве 500 мг/л, и добавили натрий-ацетатный буфер (pH 5,0) при концентрации 100 мМ, и затем оставили полученную смесь реагировать при температуре 50°C в течение 0,5 часа. Эту жидкую реакционную смесь приготовили в пробирке емкостью 1 мл, и реакцию проводили при перемешивании вращением при вышеописанных условиях. После этого пробирку подвергли центрифугированию, и измерили концентрацию глюкозы в надосадочном жидкостном компоненте. Измерение концентрации глюкозы проводили согласно методу, описанному в контрольном примере 2. Концентрацию образовавшейся глюкозы (г/л) использовали в качестве показателя уровня активности в отношении активности при деградации целлобиозы, и использовали для сравнения количества извлеченного фермента.
[0078] 3) Ксилан-деградирующая активность
К жидкому ферментному препарату добавили ксилан (ксилан березовой древесины от фирмы Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) в количестве 10 г/л, и добавили натрий-ацетатный буфер (pH 5,0) при концентрации 100 мМ, и затем оставили полученную смесь реагировать при температуре 50°C в течение 4 часов. Эту жидкую реакционную смесь приготовили в пробирке емкостью 1 мл, и реакцию проводили при перемешивании вращением при вышеописанных условиях. После этого пробирку подвергли центрифугированию, и измерили концентрацию ксилозы в надосадочном жидкостном компоненте. Измерение концентрации ксилозы проводили согласно методу, описанному в контрольном примере 2. Концентрацию образовавшейся ксилозы (г/л) использовали как показатель уровня ксилозо-деградирующей активности, и использовали для сравнения количества извлеченного фермента.
[0079] КОНТРОЛЬНЫЙ ПРИМЕР 6
Измерение концентрации неорганических ионов
Концентрации катионов и анионов, содержащихся в сахаросодержащей жидкости, количественно оценивали в условиях HPLC, показанных ниже, на основе сравнения со стандартными образцами.
[0080] 1) Анализ катионов
Колонка: Ion Pack AS22 (производства фирмы DIONEX)
2
3
3
Подвижная фаза: 4,5 мМ раствор NaCO/l,4 мМ раствор NaHCO(величина расхода потока, 1,0 мл/минуту)
Реакционный раствор: нет
Метод детектирования: электрическая проводимость (с использованием супрессора)
Температура: 30°C
2) Анализ анионов
Колонка: Ion Pack CS12A (производства фирмы DIONEX)
Подвижная фаза: 20 мМ раствор метансульфоновой кислоты (величина расхода потока, 1,0 мл/минуту)
Реакционный раствор: нет
Метод детектирования: электрическая проводимость (с использованием супрессора)
Температура: 30°C
КОНТРОЛЬНЫЙ ПРИМЕР 7
Анализ компонентов мелассы
В качестве мелассы использовали «мелассу (Molasses Agri)» (производства фирмы Organic Land Co., Ltd.). Сырьевой материал мелассы представлял собой сахар-сырец, полученный из сахарного тростника. Результаты анализа сахаристых компонентов, органических кислот, ароматических/фурановых соединений и неорганических ионов в мелассе показаны в таблицах 1-4. Общая концентрация каждой группы компонентов показана в таблице 5. Анализ компонентов проводили согласно контрольному примеру 2, контрольному примеру 3 и контрольному примеру 6.
[0081]
[0082]
[0083]
[0084]  [0085]
[0086] КОНТРОЛЬНЫЙ ПРИМЕР 8
Анализ концентрации этанола
Концентрацию накопившегося этанола количественно оценивали с помощью газовой хроматографии. Ее оценку проводили путем детектирования и расчета с помощью водородного пламенно-ионизационного детектора с использованием прибора Shimadzu GC-2010 с капиллярной колонкой GC ТС-1 (фирмы GL Science) длиной 15 метров × внутренним диаметром 0,53 мм, дисперсность носителя 1,5 мкм.
[0087] СРАВНИТЕЛЬНЫЙ ПРИМЕР 1
Получение сахаросодержащей жидкости без добавления мелассы к гидролизату
СТАДИЯ (1):
К продукту предварительной обработки целлюлозы (0,5 г), приготовленному в контрольном примере 1, добавили дистиллированную воду, и добавили целлюлазу грибов Trichoderma, приготовленную в контрольном примере 4, с последующим дополнительным добавлением дистиллированной воды до общего веса 10 г. После этого к полученной композиции добавили разбавленную серную кислоту или разбавленный раствор каустической соды таким образом, чтобы величина pH композиции была в диапазоне от 4,5 до 5,3. После корректирования величины pH композицию перенесли в пробирку с боковым отводом (производства фирмы Tokyo Rikakikai Co., Ltd., диаметр 30 мм, нормальный шлиф (NS) 14/23, компактная механическая мешалка CPS-1000, переходник, питающая впускная насадка с трехходовым краном, термостат MG-2200), и инкубировали с перемешиванием при температуре 50°C в течение 24 часов для получения гидролизата.
[0088] СТАДИЯ (2):
Стадию (2) в данном сравнительном примере не проводили.
[0089] СТАДИЯ (3):
Гидролизат, полученный на стадии (1), подвергли твердофазно-жидкостному разделению центрифугированием (с ускорением 3000 G, в течение 10 минут), и тем самым разделили на раствор как выделенный компонент (6 мл) и твердые вещества. Раствор как выделенный компонент дополнительно профильтровали с использованием фильтрационного устройства Millex HV (33 мм; изготовленного из PVDF; размер пор, 0,45 мкм). Концентрации сахаров (концентрации глюкозы и ксилозы) в полученном растворе как выделенном компоненте измеряли согласно методу, описанному в контрольном примере 2. Измеренные концентрации сахаров показаны в таблице 6. Полученный раствор как выделенный компонент профильтровали через ультрафильтрационную мембрану, имеющую предельную величину отсечки молекулярной массы 10000 (VIVASPIN 20, производства фирмы Sartorius stedim biotech, материал: PES (простой полиэфирсульфон)), и центрифугировали при ускорении 4500 G, пока мембранная фракция не сократилась до 1 мл. К мембранной фракции добавили 10 мл дистиллированной воды, и полученную смесь центрифугировали вновь при ускорении 4500 G, пока мембранная фракция не сократилась до 1 мл. Эту операцию провели еще один раз, и извлеченную ферментную жидкость собрали с мембранной фракции. Количество извлеченного фермента количественно оценивали измерением каждого значения активности согласно контрольному примеру 5. Значение активности, измеренное в данном сравнительном примере 1, было определено как «1 (контроль)» и использовано для сравнения с количествами извлеченного фермента в описанных позднее сравнительном примере 2 и примере 1 (таблица 7).
[0090] (СРАВНИТЕЛЬНЫЙ ПРИМЕР 2)
Получение сахаросодержащей жидкости с добавлением реактивной сахаросодержащей жидкости
СТАДИЯ (1):
Стадию (1) проводили по такой же методике, как на стадии (1) сравнительного примера 1.
[0091] СТАДИЯ (2):
К гидролизату стадии (1) добавили реактивную сахаросодержащую жидкость, которая не является мелассой. Реактивную сахаросодержащую жидкость приготовили таким образом, что концентрации сахаров были такими же, как концентрации в мелассе, описанной в контрольном примере 7. То есть, реактивная сахаросодержащая жидкость была приготовлена в стадии, в которой полностью растворили 148 г глюкозы, 163 г фруктозы и 371 г сахарозы в 1 л полученной обратным осмосом (RO) воды. К гидролизату стадии (1) добавили 0,5 мл этого полученной реактивной сахаросодержащей жидкости. После этого полученную смесь перемешивали при комнатной температуре (25°C) в течение около 5 минут для получения гидролизата, содержащего мелассу в виде однородной жидкости.
[0092] СТАДИЯ (3):
Гидролизат, содержащий мелассу, полученный на стадии (2), использовали для проведения твердофазно-жидкостного разделения и обработки на ультрафильтрационной мембране по такой же методике, как на стадии (3) сравнительного примера 1. Концентрации полученных сахаров показаны в таблице 6. Каждое измеренное значение активности разделили на значение активности сравнительного примера 1. Полученное значение показано в таблице 7 как количество извлеченного фермента в сравнительном примере 2.
[0093] ПРИМЕР 1
Способ получения сахаросодержащей жидкости с добавлением мелассы к гидролизату целлюлозы
СТАДИЯ (1):
Стадию (1) проводили по такой же методике, как на стадии (1) сравнительного примера 1.
[0094] СТАДИЯ (2):
К гидролизату (10 мл), полученному на стадии (1), добавили 0,5 г мелассы (контрольный пример 7; концентрация сахаров, 689 г/л). После этого полученную смесь (гидролизат, содержащий мелассу) перемешивали при комнатной температуре (25°C) в течение около 5 минут для получения гидролизата, содержащего мелассу в виде однородной жидкости.
[0095] СТАДИЯ (3):
С использованием гидролизата, содержащего мелассу, полученного на стадии (2), провели твердофазно-жидкостное разделение и обработку на ультрафильтрационной мембране по такой же методике, как на стадии (3) сравнительного примера 1. Концентрации полученных сахаров показаны в таблице б. Каждое измеренное значение активности разделили на значение активности сравнительного примера 1. Полученное значение показано в таблице 7 как количество извлеченного фермента в примере 1.
[0096] На основе сравнения среди сравнительного примера 1, сравнительного примера 2 и примера 1, количество извлеченного фермента было более высоким в примере 1, чем в сравнительном примере 1, так что было предположено, что меласса содержит компонент, который увеличивает количество извлеченного фермента. Кроме того, поскольку количество извлеченного фермента контрольного примера 2 было почти таким же, как количество из контрольного примера 1, было высказано предположение, что сахаристые компоненты в мелассе (сахароза, глюкоза и фруктоза) не влияют на количество извлеченного фермента и что увеличенное извлечение фермента обусловливается еще одним компонентом.
[0098]
[0099] ПРИМЕР 2
Взаимосвязь между количеством добавленной мелассы и количеством извлеченного фермента
Стадию (2) проводили таким же образом, как в примере 1, за исключением того, что мелассу добавляли в количестве 0,1 г (пример 1), 0,5 г, 1 г, 2 г или 5 г, и сравнивали количество целлюлазы из мицелиальных грибов, которое удалось извлечь. Каждое значение активности извлеченного фермента в каждой экспериментальной группе делили на значение активности сравнительного примера 1. Полученное значение показано в таблице 8 как количество извлеченного фермента (относительное значение).
В результате было найдено, что, когда количество добавленной мелассы увеличивается, возрастает количество извлеченного фермента, в частности количество фермента, обусловливающего целлюлозо-деградирующую активность.
[0100]
[0101] СРАВНИТЕЛЬНЫЙ ПРИМЕР 3
Взаимосвязь между количеством добавленного реактивного сахара и количеством извлеченного фермента
Стадию (2) проводили таким же образом, как в сравнительном примере 2, за исключением того, что реактивную сахаросодержащую жидкость добавляли в количестве 0,1 г (сравнительный пример 2), 0,5 г, 1 г, 2 г или 5 г, и сравнивали количество целлюлазы из мицелиальных грибов, которое удалось извлечь. В результате было найдено, как показано в таблице 9, что, в отличие от результата примера 2, количество извлеченного фермента не увеличивается в отношении любой из активностей, даже если количество реактивного сахара возрастает. То есть, было обнаружено, что увеличенное количество извлеченного фермента обусловливается иным компонентом, нежели сахарами, содержащимися в мелассе.
[0102]
[0103] ПРИМЕР 3
Взаимосвязь между температурой инкубации гидролизата, содержащего мелассу, и количеством извлеченного фермента
Стадию (2) проводили таким же образом, как в примере 1, за исключением того, что температуру инкубации после добавления 0,5 г мелассы для получения гидролизата, содержащего мелассу, регулировали на 25°C (Пример 1), 40°C, 50°C, 60°C или 70°C. Значения активности извлеченного фермента были измерены для сравнения количества извлеченного фермента среди экспериментальных групп (таблица 10). В результате было найдено, что инкубация гидролизата, содержащего мелассу в пределах температурного диапазона от 40 до 60°C, дополнительно увеличивает количество извлеченного фермента.
[0104]
[0105] ПРИМЕР 4
Стадия получения концентрированной сахаросодержащей жидкости с использованием нанофильтрационной мембраны или мембраны обратного осмоса
Получение сахаросодержащей жидкости
Сахаросодержащую жидкость (1 л) приготовили в следующих условиях.
[0106] Стадия (1):
К продукту предварительной обработки целлюлозы (400 г), полученному в контрольном примере 1, добавили 4 г целлюлазы грибов Trichoderma, и дополнительно добавили дистиллированную воду до общего веса 8 кг. Кроме того, значение pH композиции скорректировали разбавленным раствором каустической соды до величины в диапазоне от 4,5 до 5,3. Жидкость инкубировали в течение 24 часов таким образом, что инкубацию жидкости проводили, поддерживая температуру жидкости от 45 до 50°C, и к жидкости добавляли разбавленную серную кислоту и/или разбавленный раствор каустической соды, чтобы поддерживать значение pH в диапазоне от 4,5 до 5,3, для получения 8 кг гидролизата.
[0107] Стадия (2):
К 8 кг гидролизата, полученного на стадии (1), добавили 0,4 кг мелассы. После этого полученную смесь перемешивали в течение 5 минут для получения гидролизата, содержащего мелассу в виде однородной жидкости.
[0108] Стадия (3):
Гидролизат, содержащий мелассу, полученный на стадии (2), подвергали твердофазно-жидкостному разделению и обработке на ультрафильтрационной мембране. Для твердофазно-жидкостного разделения использовали компактное фильтр-прессовое устройство (фильтр-пресс МО-4, производства фирмы Yabuta Industries Co., Ltd.). В качестве фильтрующей ткани использовали текстильную ткань из сложного полиэфира (Т2731С, производства фирмы Yabuta Industries Co., Ltd.). Гидролизат, содержащий мелассу, в количестве 8 л поместили в небольшой резервуар. При аэрации сжатым воздухом, подводимым со дна, жидкостный впускной канал был открыт для медленной подачи жидкостной суспензии в фильтрационную камеру с использованием пневматического насоса (66053-3ЕВ, производства фирмы Taiyo International Corporation). После этого провели стадию сжатия путем выпучивания диафрагмы, размещенной в фильтрационной камере. Давление сжатия медленно повысили до 0,5 МПа, и затем установку оставили стоять в течение около 30 минут для извлечения раствора как выделенного компонента в качестве фильтрата. Общий объем раствора как выделенного компонента составлял 6 л. Остальной жидкостный компонент был потерян вследствие мертвого объема установки. Затем раствор как выделенный компонент после твердофазно-жидкостного разделения профильтровали через микрофильтрационную мембрану. Микрофильтрацию проводили с использованием системы Stericup HV емкостью 1000 mL (производства фирмы Millipore; материал PVDF; средний размер пор, 0,45 мкм) для получения 5 л фильтрата. Полученный фильтрат (раствор как выделенный компонент) обработали с использованием компактного фильтрационного устройства с плоской мембраной (Sepa (зарегистрированный товарный знак) CF II Med/High Foulant System, производства фирмы GE), оснащенного плоской ультрафильтрационной мембраной, имеющей предельную величину отсечки молекулярной массы 10000 (SEPA PW серии, производства фирмы GE, материал функциональной поверхности: простой полиэфирсульфон). В то время как рабочее давление регулировали таким образом, чтобы величина расхода потока на стороне подачи постоянно составляла 2,5 л/минуту и поток через мембрану постоянно составлял 0,1 m/D, отфильтровали 4 л из 5 л вышеуказанного фильтрата для получения сахаросодержащей жидкости.
[0109] Обработка сахаросодержащей жидкости с использованием нанофильтрационной мембраны или мембраны обратного осмоса
С использованием 1 л сахаросодержащей жидкости, полученной на стадиях (1)-(3), провели концентрирование через нанофильтрационную мембрану или концентрирование через мембрану обратного осмоса. В качестве нанофильтрационной мембраны использовали «DESAL-5L» (производства фирмы Desalination). В качестве мембраны обратного осмоса использовали мембрану обратного осмоса из сшитого полностью ароматического полиамида «UTС80» (производства фирмы Toray Industries, Inc.). Каждую мембрану смонтировали на компактном фильтрационном устройстве с плоской мембраной («Sepa» (зарегистрированный товарный знак) CF II Med/High Foulant System, производства фирмы GE), и фильтрационную обработку проводили при температуре сырьевой жидкости 25°C под давлением 3 МПа с использованием высоконапорного насоса. При такой обработке получили 0,5 л концентрата нанофильтрационной мембраны и 0,5 л пермеата (двукратное концентрирование). Концентрированная сахаросодержащая жидкость, полученная с использованием нанофильтрационной мембраны, показана в таблице 11, а концентрированная сахаросодержащая жидкость, полученная с использованием мембраны обратного осмоса, показана в таблице 12. Как показано в таблице 11 и таблице 12, было найдено, что, хотя концентрирование сахаросодержащей жидкости возможно с помощью любой из нанофильтрационной мембраны или мембраны обратного осмоса, концентрирование через нанофильтрационную мембрану обеспечивает более эффективное удаление ингибиторов брожения, таких как HMF, фурфурол, уксусная кислота и ионы калия.
[0110]
[0111]
[0112] ПРИМЕР 5
Испытание спиртового брожения с использованием сахаросодержащей жидкости в качестве исходного сырья для ферментации
С использованием сахаросодержащей жидкости, полученной в процессе получения сахаросодержащей жидкости примера 4 (проведенного со стадиями (1)-(3)), и с использованием дрожжей (Saccharomyces cerevisiae ОС-2: винные дрожжи) провели испытание спиртового брожения. Для сравнения в качестве исходного сырья для брожения использовали также гидролизат, содержащий мелассу, полученный проведением стадий (1) и (2) в процессе получения сахаросодержащей жидкости примера 4. Дрожжи прекультивировали в среде YPD (2% глюкозы, 1% дрожжевого экстракта (Bacto Yeast Extract, производства фирмы BD), 2% полипептона (производства фирмы Ninon Pharmaceutical Co., Ltd.)) в течение 1 дня при температуре 25°C. Затем полученную культуральную жидкость добавили к сахаросодержащей жидкости или гидролизата, содержащего мелассу (концентрация сахаров, 57 г/л) при концентрации 1% (20 мл). После добавления микроорганизма выполняли инкубацию при температуре 25°C в течение 2 дней. Культуральную жидкость, полученную при этой операции, подвергли анализу концентрации накопленного этанола по методике контрольного примера 8. Как показано в таблице 13, было найдено, что непосредственное применение гидролизата, содержащего мелассу, приготовленного только смешением гидролизата целлюлозы с мелассой, имеет результатом низкую концентрацию накопленного этанола. Как предполагается, это обусловлено действием веществ, которые должны быть удалены на стадии (3) как факторы ингибирования брожения.
[0113]
[0114] ПРИМЕР 6
Испытание спиртового брожения с использованием концентрированной сахаросодержащей жидкости в качестве исходного сырья для брожения
Концентрированную сахаросодержащую жидкость, полученную с использованием нанофильтрационной мембраны, и концентрированную сахаросодержащую жидкость, полученную с использованием мембраны обратного осмоса, в Примере 4 разбавили в два раза водой, полученной обратным осмосом (RO), и использовали в качестве сбраживаемых сред по такой же методике, как в примере 5. В результате, как показано в таблице 14, обе концентрированные сахаросодержащие жидкости («сиропы») показали более высокую производительность сбраживания, чем сахаросодержащая жидкость примера 5, и было обнаружено, что концентрированная сахаросодержащая жидкость, полученная с использованием нанофильтрационной мембраны, является особенно превосходно сбраживаемой средой.
[0115]
[0116] ПРИМЕР 7
Обработка гидролизата, содержащего мелассу инвертазой к гидролизату (10 мл) стадии (2) примера 1 добавили 0,5 г мелассы (контрольный пример 7; концентрация сахаров, 689 г/л). После этого полученную смесь перемешивали при комнатной температуре (50°C) в течение около 5 минут для получения гидролизата, содержащего мелассу в виде однородной жидкости. Затем к гидролизату, содержащему мелассу добавили 1 г дрожжевой инвертазы (раствор инвертазы из дрожжей; фирмы Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), и полученную смесь оставили стоять в течение дополнительного 1 часа.
[0117] Стадия (3)
С использованием гидролизата, содержащего мелассу, полученного на стадии (2), провели твердофазно-жидкостное разделение и обработку на ультрафильтрационной мембране по такой же методике, как на стадии (3) сравнительного примера 1. Концентрации полученных сахаров показаны в таблице 15.
[0118]
[0119] Как показано в таблице 15, было найдено, что, вследствие гидролиза сахарозы концентрации сахаров глюкозы и фруктозы повышены сравнительно с их концентрациями в Примере 1.
[0120] ПРИМЕР 8
Получение L-молочной кислоты с использованием сахаросодержащей жидкости, обработанной инвертазой
Штаммом Lactococcus lactis JCM7 638 засеяли 5 мл сахаросодержащей жидкости примера 7, и провели статическое культивирование в течение 24 часов при температуре 37°C. Концентрацию L-молочной кислоты в культуральной жидкости проанализировали в следующих условиях.
Колонка: Shim-Pack SPR-H (производства фирмы Shimadzu Corporation)
Подвижная фаза: 5 мМ раствор пара-толуолсульфоновой кислоты (величина расхода потока, 0,8 мл/минуту)
Реакционный раствор: 5 мМ раствор пара-толуолсульфоновой кислоты, 20 мМ раствор буфера Bis-Tris, 0,1 мМ раствор динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA-2Na) (величина расхода потока, 0,8 мл/минуту)
Метод детектирования: электрическая проводимость
Температура: 45°C
В результате анализа было обнаружено накопление L-молочной кислоты до концентрации 26 г/л, и удалось подтвердить, что молочная кислота может быть продуцирована с использованием сахаросодержащей жидкости согласно настоящему изобретению.
[0121] СРАВНИТЕЛЬНЫЙ ПРИМЕР 4
Получение L-молочной кислоты с использованием реактивной сахаросодержащей жидкости.
Для сравнения смешали между собой глюкозу, ксилозу, сахарозу и фруктозу таким образом, чтобы была достигнута концентрация сахаров, описанная в Таблице 15, для приготовления 5 мл реактивной сахаросодержащей жидкости. Штаммом Lactococcus lactis JCM7 638 засеяли реактивную сахаросодержащую жидкость, и провели статическое культивирование в течение 24 часов при температуре 37°C. Однако роста обнаружить не удалось. Это рассматривали как следствие отсутствия, в отличие от сахаросодержащей жидкости примера 8, аминокислот, витаминов и тому подобных для роста молочнокислых бактерий в реактивной сахаросодержащей жидкости.
[0122] КОНТРОЛЬНЫЙ ПРИМЕР 9
В качестве содержащей целлюлозу биомассы использовали жом сахарного тростника. Содержащую целлюлозу биомассу погрузили в 1%-ный водный раствор серной кислоты, и подвергли обработке с использованием автоклава (изготовленного фирмой Nitto Koatsu Co., Ltd.) при температуре 150°C в течение 30 минут. После этого провели твердофазно-жидкостное разделение для разделения полученного продукта на водный раствор серной кислоты (далее называемый жидкостью, обработанной разбавленной серной кислотой) и продукт предварительной обработки целлюлозы (разбавленной серной кислотой).
[0123] СРАВНИТЕЛЬНЫЙ ПРИМЕР 5
Получение сахаросодержащей жидкости без добавления мелассы к гидролизату с использованием продукта предварительной обработки целлюлозы (разбавленной серной кислотой), полученного в контрольном примере 9, собрали извлеченную ферментную жидкость по такой же методике, как в сравнительном примере 1. Количество извлеченного фермента количественно оценивали измерением каждого значения активности согласно контрольному примеру 5. Значение активности, измеренное в данном сравнительном примере 5, определили как «1 (контроль)», и использовали для сравнения с количествами извлеченного фермента в описываемых позже сравнительном примере 6 и примере 9 (таблица 16).
[0124] СРАВНИТЕЛЬНЫЙ ПРИМЕР 6
Получение сахаросодержащей жидкости с добавлением реактивной сахаросодержащей жидкости к гидролизату
Стадия (1):
Стадию (1) проводили по такой же методике, как на стадии (1) сравнительного примера 1.
[0125] Стадия (2):
Стадию (2) проводили по такой же методике, как в сравнительном примере 2.
[0126] Стадия (3):
С использованием гидролизата, содержащего мелассу, полученного на стадии (2), провели твердофазно-жидкостное разделение и обработку на ультрафильтрационной мембране по такой же методике, как на стадии (3) сравнительного примера 1. Каждое измеренное значение активности разделили на значение активности сравнительного примера 5. Полученное значение показано в таблице 16 как количество извлеченного фермента сравнительного примера 6.
[0127] ПРИМЕР 9
Способ получения сахаросодержащей жидкости с добавлением мелассы к гидролизату целлюлозы
Стадия (1):
Стадию (1) проводили по такой же методике, как на стадии (1) сравнительного примера 1.
[0128] Стадия (2):
Стадию (2) проводили по такой же методике, как в примере 1.
[0129] Стадия (3);
С использованием гидролизата, содержащего мелассу, полученного на стадии (2), провели твердофазно-жидкостное разделение и обработку на ультрафильтрационной мембране по такой же методике, как на стадии (3) сравнительного примера 1. Каждое измеренное значение активности разделили на значение активности сравнительного примера 5. Полученное значение показано в таблице 16 как количество извлеченного фермента примера 9.
[0130] На основе сравнения среди сравнительного примера 5, сравнительного примера 6 и примера 9, количество извлеченного фермента было более высоким в примере 9, чем в сравнительном примере 5, так что было предположено, что меласса содержит компонент, который увеличивает количество извлеченного фермента. Кроме того, поскольку количество извлеченного фермента сравнительного примера 6 было почти таким же, как количество из сравнительного примера 5, было высказано предположение, что сахаристые компоненты, содержащиеся в мелассе (сахароза, глюкоза и фруктоза) не влияют на количество извлеченного фермента, и что увеличенное извлечение фермента обусловливается еще одним компонентом. Настоящие результаты показывают, что меласса повышает активности извлеченного фермента, независимо от того, была ли целлюлоза подвергнута предварительной обработке или нет.
[0131]
ПРОМЫШЛЕННАЯ ПРИМЕНИМОСТЬ
[0132] Настоящее изобретение позволяет получать сахаросодержащую жидкость из содержащей целлюлозу биомассы, причем сахаросодержащая жидкость может быть использована в качестве исходного сырья для сбраживания в бродильном производстве разнообразных химических продуктов.
СПИСОК ПОЗИЦИЙ
[0133]
1 Термостат
2 Гидролитический реактор
3 Мешалка
4 Жидкостный нагнетательный насос
5 Твердофазно-жидкостный сепаратор
6 Микрофильтрационное мембранное устройство
7 Сборный резервуар для раствора
8 Насос ультрафильтрационной мембраны
9 Ультрафильтрационная мембрана
10 Сборный резервуар для сахаросодержащей жидкости
11 Высоконапорный насос
12 Нанофильтрационная мембрана и/или мембрана обратного осмоса
13 Термостат
14 Ферментер
15 Мешалка
16 Устройство для отделения микроорганизмов
17 Измельчитель
18 Выжимной пресс
19 Сокосборный резервуар
20 Выпарной аппарат
21 Кристаллизатор
22 Разделительное устройство
23 Транспортер
24 Измельчитель
25 Нагреватель
26 Транспортный трубопровод