ЛЕЧЕНИЕ СВИНЕЙ С ПОМОЩЬЮ АНТИГЕНА PCV2
TREATMENT OF PIGS WITH PCV2 ANTIGEN

Ссылка на родственную заявку
По настоящей заявке испрашивается приоритет в соответствии с предварительной заявкой на патент США серийный номер 60/870311, поданной 15 декабря 2006 г., сущность и содержание которой включены в настоящее описание в качестве ссылки.
Перечень последовательностей
В настоящую заявку входит перечень последовательностей в бумажной и электронной версии, сущность и содержание которых включены в настоящее описание в качестве ссылки. Перечень последовательностей идентичен включенному в WO 06/072065.
Предпосылки создания изобретения
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к применению иммуногенной композиции, которая содержит антиген, представляющий собой цирковирус свиней типа 2 (PCV2), которая предназначена для предупреждения, уменьшения серьезности клинических признаков, уменьшения количества случаев инфекции и/или клинических признаков и лечения нескольких клинических проявлений у животных, имеющих специфические в отношении PCV2 антитела. Предпочтительно указанные специфические в отношении PCV2 антитела представляют собой антитела, полученные от матери.
Описание известного уровня техники
Цирковирус свиней типа 2 (PCV2) представляет собой небольшой (диаметром 17-22 нм) ДНКовый, не имеющий оболочки вирус с икосаэдральной структурой, который несет одноцепочечный циклический геном. Последовательность PCV2 примерно на 80% идентична последовательности цирковируса свиней типа 1 (PCV1). Однако в настоящее время установлено, что в отличие от PCV1, который, как правило, является невирулентным, заражение свиней PCV2 ассоциируется с рядом болезненных синдромов, которые в целом обозначают как ассоциированные с цирковирусом болезни свиней (PCVAD) (известные также как болезни свиней, связанные с цирковирусом (PCVD)) (Allan и др., IPVS Congress, 2006). Как правило, основным клиническим проявлением PCVAD считается синдром послеотъемного мультисистемного истощения (PCVD) (Harding и др., Swine Health Prod; 5, 1997, c.201-203; Kennedy и др., J Comp Pathol; 122, 2000, c.9-24). PCVD поражает свиней возрастом 5-18 недель. C клинической точки зрения PCVD характеризуется истощением, бледностью кожи, худосочностью, респираторным дистресс-синдромом, диареей, желтухой новорожденных и желтухой. У некоторых пораженных заболеванием свиней проявляется комбинация всех симптомов, в то время как у других свиней проявляются только один или два из указанных симптомов (Muirhead, Vet. Rec., 150, 2002, с.456). При вскрытии трупа выявляют также микроскопические и макроскопические повреждения многих тканей и органов, причем наиболее часто повреждения встречаются в лимфоидных органах (Allan и Ellis, J Vet. Diagn. Invest., 12, 2001, cc.3-14). Обнаружена выраженная корреляция между количеством нуклеиновой кислоты или антигеном PCV2 и серьезностью микроскопических лимфоидных повреждений. Уровни смертности у свиней, пораженных PCV2, могут достигать 80%. Помимо PCVD с PCV2 связаны несколько других инфекций, включая псевдобешенство, репродуктивно-респираторный синдром свиней (PRRS), болезнь Глассера, стрептококковый менингит, сальмонеллез, колибактериоз отъемышей, связанный с кормом гепатоз и гнойную плевропневмонию. Однако к настоящему времени отсутствуют исследования, подтверждающие, что все эти клинические симптомы действительно являются непосредственным результатом заражения PCV2. Кроме того, пока не известно, можно ли какие-либо указанные клинические симптомы эффективно снижать или излечивать с помощью действующих веществ, оказывающих непосредственное воздействие на PCV2.
Подходы к лечению вызываемых PCV2 инфекций, основанные на применении ДНК-вакцины, описаны в US 6703023. В WO 03/049703 описано получение живой химерной вакцины, содержащей каркас PCV-1, в которой ген каркаса PCV-1 заменен на иммуногенный ген патогенных штаммов PCV2. В WO 99/18214 описано несколько штаммов PCV2 и процедуры получения убитой вакцины против PVC2. Однако отсутствуют данные об их эффективности. Эффективная субъединичная вакцина на основе ORF-2 (открытой рамки считывания 2) описана в WO 06/072065 и WO 2007/028823. Любая из указанных вакцин предназначена для применения с целью вакцинации/лечения свиней или молодых свиней (свиней, не достигших половой зрелости) старше 3 недель. Ни для одной из указанных вакцин не указана возможность применения на молодых поросятах возрастом меньше 3 или 2 недель.
Установлено, что полученный от матери иммунитет обеспечивает определенную степень защиты от вызываемой PCV2 инфекции и клинических состояний, связанных с PCV2-инфекцией. Установлено, что указанная защита зависит от титра антител: как правило, более высокие титры обеспечивают защитное действие, а при более низких титрах оно отсутствует (McKeown и др., Clin. Diagn. Lab. Immunol., 12, 2005, c.1347-1351). Установлено, что среднее время полужизни антител у животных-отъемышей составляет 19,0 дней и окно распада связанных с пассивной иммунизацией антител к PCV2 в популяции является относительно широким (Opriessnig и др., J. Swine Health Prod. 12, 2004, c.186-191). Установлено, что при низких титрах распад антител к PCV2, присутствие которых у животных возрастом 10-12 дней связано с пассивной иммунизацией, происходит при достижении животными возраста примерно 4,9+1,2 недель, при средних титрах антитела распадаются при достижении возраста примерно 8,1+1,9 недель, а при высоких титрах антитела распадаются при достижении возраста примерно 11,1+2,5 недель (Opriessnig и др., 37-th Annual Meeting of the American Association of Swine Veterinarians (37-й Ежегодный съезд американской ассоциации по ветеринарии свиней), 2006 г.). Обнаружена тесная корреляция между снижением титров антител и появлением первых клинических признаков PCVAD, которые возникают у поросят в возрасте примерно 5-12 недель (Allan и др., Vet. Diagn. Investigation, 12, 2000, c.3-14). Кроме того, PCV2 был выделен также из лимфатических узлов новорожденных поросят (Hirai и др., Vet. Record, 148, 2001, cc.482-484), что свидетельствует о том, что даже более молодые поросята могут поражаться PCVAD в отсутствие титров защитных материнских антител. Выраженная корреляция между титром антител и защитным действием установлена в опыте, проведенном в полевых условиях в Испании: поросята, имеющие низкие титры антител в 7-недельном возрасте (средний титр антител 1:100, диапазон от 0 до 1:320), отличались существенно более высоким коэффициентом смертности в течение следующих 5 недель, чем животные с более высокими титрами антител (Rodriguez-Arrioja и др., Am. J Vet. Res. 63, 2002, c.354-357).
Присутствие полученных от матери антител не только может обеспечивать определенную степень защиты от вирусной инфекции, что, однако, является непрогнозируемым, но так же, как известно, влияет на эффективность иммунизации. Например, более высокие титры полученных от матери антител к классическому вирусу лихорадки свиней (CSFV) ингибируют как клеточный, так и гуморальный иммунный ответ на вакцину против CSFV, а при более низких титрах не обнаружено значительного воздействия (Suradhat и Damrongwatanapokin, Vet. Microbiol, 92, 2003, c.187-194). Кроме того, было высказано предположение, что живые вакцины против PCV2 должны работать более эффективно при их введении поросятам старше 7 или 8 недель, поскольку к этому времени материнские антитела в основном распадаются. На взаимодействие с материнскими антителами влияет тип вызываемого иммунного ответа (Th1 или Th2), который зависит (среди прочего) от типа вакцины, типа антигена, типа адъюванта, а также количества введенного антигена. Следовательно, можно предположить, что взаимодействие с материнскими антителами может быть различным для разных вакцин, даже если они защищают от одного и того же патогена. В целом, полученные от матери антитела к PCV2 могут обеспечивать определенную степень защиты от PCV2, но, с другой стороны, эти антитела могут влиять на эффективность любой вакцины против PCV2.
Защита животных путем активной иммунизации усложняется также тем обстоятельством, что а) время распада полученных от матери антител (MDA) варьируется от животного к животному и б) многие болезни возникают вскоре после распада антител. С учетом этой проблемы в нескольких стратегиях предусматривается применение двух режимов вакцинации путем впрыскивания для молодых животных: первую вакцинацию осуществляют на ранней стадии жизни для защиты животных с низкими титрами MDA. Считается, что эта первая вакцинация может не обладать эффективностью для животных с высокими титрами MDA из-за взаимодействия с антигеном вакцины. Для того чтобы осуществлять защиту также и этих животных, требуется вторая вакцинация, когда ожидается, что высокие титры MDA уже снизились. Этот тип схемы вакцинации применяют в случае вакцин для многих мелких животных (например, вакцин против парвовирусов кошек, гепатита кошек), вакцин для лошадей (например, вакцин против лошадиного гриппа) и вакцин для свиней (например, против Actinobacillus pleuropneumoniae, Haemophilus parasuis). Поскольку возникновение PCVAD у животных возрастом 5 недель или старше, вероятно, связано с распадом антител к PCV2, что, как известно, происходит у животных возрастом 4-11 недель, описаны некоторые основанные на применении вакцин подходы к защите от PCVAD, в которых применяют два режима вакцинации путем впрыскивания для того, чтобы избежать возможного взаимодействия с материнскими антителами.
В WO 2007/028823 описана вакцинация поросят, которые имеют полученные от матери антитела к PCV2, с использованием более 20 мкг антигена/дозу с помощью описанного режима двух вакцинаций путем впрыскивания. Начальную вакцинацию осуществляют в возрасте от 1 до 4 недель. Всех животных повторно вакцинируют через три недели после начальной вакцинации, когда полученные от матери антитела у животных с высокими титрами MDA в момент первой вакцинации должны снизиться или исчезнуть. Таким образом, пока отсутствует информация, касающаяся точного воздействия полученных от матери антител к PCV2 на степень защиты или взаимодействия. По этой причине рекомендовано не вакцинировать поросят возрастом до трех (3) недель с использованием по меньшей мере режима одной вакцинации путем впрыскивания. Вакцинация поросят возрастом менее 3 недель связана с некоторой степенью неопределенности касательно эффективности иммунизации. С другой стороны, поросята с более низкими титрами полученных от матери антител к PCV2, хотя к настоящему времени никому не известны точные значения указанных низких уровней, не имеют достаточной защиты от инфекции, вызываемой PCV2, в возрасте до 3 недель. Другими словами, стада, в которых животные имеют низкие титры MDA, если их не вакцинируют в возрасте до 3 недель, имеют постоянный риск заражения PCV2 из-за отсутствия достаточного иммунного статуса.
Кроме того, не описано, что такие вакцины обусловливают защитный иммунитет от заражения PCV2 или снижение, уменьшение серьезности, или исцеление любых клинических симптомов, ассоциированных с ними у молодых свиней, которые уже имеют антитела к PCV2, предпочтительно которые имеют материнские антитела к PCV2.
Краткое описание чертежей
На чертежах показано:
на фиг.1 - уровни титров антител к PCV2 к моменту вакцинации;
на фиг.2 - сравнение живой массы тела у вакцинированных животных с низкими (<1:100) и высокими (>1:1000) титрами антител к PCV2;
на фиг.3 - различие в массе тела у вакцинированных (IVP) животных по сравнению с контрольными обработанными плацебо животными (СР).
Описание изобретения
Настоящее изобретение позволяет решить присущие прототипам проблемы, и оно обеспечивает выраженный прогресс в данной области техники. Основным объектом настоящего изобретения является способ лечения или профилактики заражения PCV2 или снижения клинических симптомов, вызываемых или ассоциированных с заражением PCV2, у животных, которые имеют антитела к PCV2, заключающийся в том, что животному, которое нуждается в таком лечении, вводят в эффективном количестве антиген PCV2 или иммуногенную композицию, содержащую антиген PCV2. При создании изобретения непредсказуемо и неожиданно было установлено, что присутствие антител к PCV2, полученных от матери, не влияет на эффективность вакцины, содержащей антиген PCV2.
Понятие «вакцина» или «иммуногенная композиция» (оба понятия являются синонимами) в контексте настоящего описания относится к любой фармацевтической композиции, которая содержит антиген PCV2, при этом композицию можно применять для предупреждения или лечения ассоциированного с заражением PCV2 заболевания или состояния у животного. Предпочтительная иммуногенная композиция может индуцировать, стимулировать или повышать иммунный ответ на PCV2. Под это понятие подпадают как субъединичные иммуногенные композиции, описанные ниже, так и композиции, которые содержат убитые (полностью обезвреженные) или ослабленные и/или инактивированные PCV2.
Таким образом, следующим объектом настоящего изобретения является способ лечения или профилактики заражения PCV2 или снижения клинических симптомов, вызываемых или ассоциированных с заражением PCV2, у животных, которые имеют антитела к PCV2, прежде всего полученные от матери антитела к PCV2, заключающийся в том, что животному, которое нуждается в таком лечении, вводят в эффективном количестве антиген PCV2 или иммуногенную композицию, которая содержит антиген PCV2, где иммуногенная композиция представляет собой субъединичную иммуногенную композицию, композицию, содержащую убитые (полностью обезвреженные) или ослабленные и/или инактивированные PCV2.
В контексте настоящего описания понятие «субъединичная иммуногенная композиция» относится к композиции, которая содержит по меньшей мере один иммуногенный полипептид или антиген, но не все антигены, выведенные или являющиеся гомологами антигена PCV2. Такая композиция практически свободна от интактного PCV2. Таким образом, «субъединичную иммуногенную композицию» получают по меньшей мере из частично очищенных или фракционированных (предпочтительно практически очищенных) иммуногенных полипептидов из PCV2, или их рекомбинантных аналогов. Субъединичная иммуногенная композиция может содержать субъединицу антигена или антигенов, представляющих интерес, которые практически свободны от других антигенов или полипептидов из PCV2, или являются фракционированными. Предпочтительная иммуногенная субъединичная композиция содержит белок ORF-2 PCV2, описанный ниже. Наиболее предпочтительными являются иммуногенные субъединичные композиции, которые содержат любой из антигенов PCV2, представленных в WO 06/072065, которая полностью включена в настоящее описание в качестве ссылки.
Понятие «иммунный ответ» относится, но не ограничиваясь только этим, к формированию в хозяине клеточно- и/или антитело-опосредованного иммунного ответа на представляющую интерес композицию или вакцину. Как правило, «иммунный ответ» включает, но не ограничиваясь только ими, одну или несколько из следующих реакций: производство или активацию антител, В-клеток, Т-клеток-хелперов, Т-клеток-супрессоров и/или цитотоксических Т-клеток, специфически направленных на антиген или антигены, включенный(е) в представляющую интерес композицию или вакцину. Предпочтительно организм-хозяин должен вырабатывать либо терапевтический, либо защитный иммунологический (вторичный иммунный ответ) ответ так, чтобы повышалась устойчивость к новой инфекции и/или снижалась клиническая серьезность заболевания. Такое защитное действие можно выявлять либо по снижению уровня или серьезности, либо по отсутствию описанных выше симптомов, ассоциированных с заражением хозяина PCV2, замедлению появления вируса в крови (виремия), снижению персистентности вируса, снижению общей вирусной нагрузки и/или снижению вирусной экскреции.
Понятие «антиген» в контексте настоящего описания относится к аминокислотной последовательности, которая вызывает иммунологический ответ, описанный выше. Антиген в контексте настоящего описания включает полноразмерную последовательность любых белков PCV2, их аналогов или их иммуногенных фрагментов. Понятие «иммуногенный фрагмент» обозначает фрагмент белка, который содержит один или несколько эпитопов и в результате этого вызывает описанный выше иммунологический ответ. Такие фрагменты можно идентифицировать с помощью любого из многочисленных методов картирования эпитопов, хорошо известных в данной области (см., например, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, том 66, под ред. Glenn Е. Morris, изд-во Humana Press, Totowa, New Jersey, 1996). Например, линейные эпитопы можно выявлять, например, осуществляя конкурентный синтез большого количества пептидов на твердых подложках, где пептиды соответствуют фрагментам молекулы белка, и, подвергая пептиды взаимодействию с антителами, при этом пептиды остаются прикрепленными к подложкам. Такие методы известны в данной области и описаны, например в US 4708871; у Geysen и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1984, c.3998-4002; Geysen и др., Molec. Immunol. 23, 1986, c.709-715. Аналогично этому, конформационные эпитопы легко можно идентифицировать путем определения пространственной конформации аминокислот, например, с помощью рентгеновской кристаллографии и 2-мерного ядерного магнитного резонанса (см., например, Epitope Mapping Protocols, выше).
Понятие включает также синтетические антигены, например полиэпитопы, фланкирующие эпитопы и другие, полученные рекомбинантными или синтетическими методами антигены (см., например, Bergmann и др., Eur. J. Immunol. 23, 1993, c.2777-2781; Bergmann и др., J. Immunol. 157, 1996, c.3242-3249; Suhrbier A., Immunol, и Cell Biol. 75, 1997, c.402-408; Gardner и др., 12th World AIDS Conference, Geneva, Switzerland, 28 июня - 3 июля 1998 г.).
Следующим объектом изобретения является иммуногенная композиция, как она определена в контексте настоящего описания, которая наиболее предпочтительно содержит полипептид или его фрагмент, экспрессируемый ORF-2 PCV2, ДНК ORF-2 PCV2 и белок, которые применяют согласно изобретению для приготовления композиций и с помощью способов, предлагаемых в изобретении, представляет собой высококонсервативный домен в изолятах PCV2 и поэтому согласно изобретению любая ORF-2 PCV2 должна быть эффективной в качестве источника ДНК ORF-2 PCV и/или полипептида. Предпочтительным белком ORF-2 PCV2 является белок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:11 в настоящем описании и в WO 06/072065. Другим предпочтительным полипептидом ORF-2 PCV является полипептид, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:5 в настоящем описании и в WO 06/072065. Однако специалистам в данной области должно быть очевидно, что последовательность может варьироваться в пределах 6-10% в соответствии с понятием гомологии последовательностей и все еще сохранять антигенные характеристики, которые делают ее приемлемой для включения в иммуногенные композиции. Антигенные характеристики иммунологической композиции можно оценивать, например, путем экспериментов по контрольному заражению, описанных в примере 4 WO 06/072065. Кроме того, антигенные характеристики модифицированного антигена все еще сохраняются, когда модифицированный антиген обусловливает по меньшей мере 70%, предпочтительно 80%, более предпочтительно 90% защитного иммунитета по сравнению с белком ORF-2 PCV2, который кодируется полинуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:4 в настоящем описании и в WO 06/072065.
Таким образом, еще одним объектом настоящего изобретения является способ лечения или профилактики заражения PCV2 или снижения клинических симптомов, вызываемых или ассоциированных с заражением PCV2, у животных, которые имеют антитела к PCV2, прежде всего полученные от матери антитела к PCV2, заключающийся в том, что животному, которое нуждается в таком лечении, вводят в эффективном количестве антиген PCV2 или иммуногенную композицию, которая содержит антиген PCV2, где антиген PCV2 представляет собой антигенный белок ORF-2 PCV2, который обусловливает по меньшей мере 70%, предпочтительно 80%, более предпочтительно 90% защитного иммунитета по сравнению с белком ORF-2 PCV2, который кодируется полинуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:4 в настоящем описании и в WO 06/072065. Предпочтительно белок ORF-2 PCV2 имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:5 в настоящем описании и в WO 06/072065.
В некоторых вариантах иммуногенные участки белка ORF-2 PCV2 применяют в качестве антигенного компонента в иммуногенной композиции, содержащей антиген PCV2. Понятие «иммуногенный участок» в контексте настоящего описания относится к укороченным и/или имеющим замены формам или фрагментам белка и/или полинуклеотида ORF-2 PCV2 соответственно. Предпочтительно такие укороченные и/или имеющие замены формы или фрагменты должны содержать по меньшей мере 6 смежных аминокислот из полноразмерного полипептида ORF-2. Более предпочтительно укороченные или имеющие замены формы или фрагменты должны содержать по меньшей мере 10, более предпочтительно по меньшей мере 15 и еще более предпочтительно по меньшей мере 19 смежных аминокислот из полноразмерного полипептида ОRF-2. PCV. Две предпочтительные в этом плане последовательности представлены в виде SEQ ID NO:9 и SEQ ID NO:10 в настоящем описании и в WO 06/072065. Следует понимать также, что указанные последовательности могут представлять собой часть более крупных фрагментов или укороченных форм.
Как указано выше, предпочтительным является также любой полипептид ОRF-2 PCV2, который кодируется нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:4. Кроме того, как должно быть очевидно специалистам в данной области, эта последовательность может варьироваться в пределах 6-20% в соответствии с понятием гомологии последовательностей и все еще сохранять антигенные характеристики, которые делают ее приемлемой для включения в иммуногенные композиции. В некоторых вариантах укороченные или имеющие замены формы или фрагменты полипептида ORF-2 PVC2 применяют в качестве антигенного компонента в композиции. Предпочтительно такие укороченные или имеющие замены формы или фрагменты должны содержать по меньшей мере 18 смежных нуклеотидов из полноразмерной нуклеотидной последовательности ORF-2 PVC2, например, SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:4. Более предпочтительно укороченные или имеющие замены формы или фрагменты должны содержать по меньшей мере 30, более предпочтительно по меньшей мере 45 и еще более предпочтительно по меньшей мере 57 смежных нуклеотидов из полноразмерной нуклеотидной последовательности ORF-2 PVC2, например, SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:4.
Понятие «идентичность последовательностей», как известно в данной области, относится к родству между двумя или большим количеством полипептидных последовательностей или двумя или большим количеством полинуклеотидных последовательностей, а именно между референс-последовательностью и рассматриваемой последовательностью, подлежащей сравнению с референс-последовательностью. Идентичность последовательностей определяют путем сравнения данной последовательности с референс-последовательностью после оптимального выравнивания последовательностей для получения наиболее высокой степени сходства последовательностей, что определяют по совместимости между отрезками указанных последовательностей. После выравнивания идентичность последовательностей оценивают по находящимся в одинаковых положениях основаниям (по типу «положение с положением»), например, последовательности являются «идентичными» в определенном положении, если в этом положении нуклеотиды или аминокислотные остатки идентичны. Общее количество таких идентичных положений затем делят на общее количество нуклеотидов или остатков в референс-последовательности, получая % идентичности последовательностей. Идентичность последовательностей легко можно рассчитывать с помощью известных методов, включая, но не ограничиваясь только ими, описанные в: Computational Molecular Biology, под ред. Lesk A. N., изд-во Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, под ред. Smith D.W., изд-во, Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, часть I, под ред. Griffin A.M. и Griffin H. G., изд-во Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge G., изд-во Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, под ред. Gribskov M. и Devereux J., изд-во М. Stockton Press, New York, 1991; и Carillo H. и Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48, 1988, с.1073, содержание которых включено в настоящее описание в качестве ссылки. Предпочтительные методы определения идентичности последовательностей созданы так, чтобы получать наибольшее соответствие между изучаемыми последовательностями. Методы определения идентичности последовательностей приведены в систему в доступных общественности компьютерных программах, которые позволяют определять идентичность последовательностей для рассматриваемых последовательностей. Примерами таких программ являются, но не ограничиваясь только ими, пакет программ GCG (Devereux J. и др., Nucleic Acids Research, 12(1), 1984, с.387), BLASTP, BLASTN и FASTA (Altschul S. F. и др., J. Molec. Biol., 215, 1990, c.403-410).
Программа BLASTX является доступной общественности от фирмы NCBI и других источников (BLAST Manual, Altschul S. и др., NCVI NLM NIH Bethesda, MD 20894, Altschul S. F. и др., J. Molec. Biol., 215, 1990, c.403-410), содержание которых включено в настоящее описание в качестве ссылки). Эти программы позволяют осуществлять оптимальное выравнивание последовательностей с помощью принимаемых по умолчанию значений, таких как вес бреши, для того, что получать наиболее высокий уровень идентичности последовательностей для рассматриваемой последовательности и референс-последовательности. В качестве иллюстрации: когда упоминается полинуклеотид, нуклеотидная последовательность которого по меньшей мере на 85%, предпочтительно на 90%, еще более предпочтительно на 95% «идентична последовательности» нуклеотидной референс-последовательности, то подразумевается, что нуклеотидная последовательность данного полинуклеотида идентична референс-последовательности за исключением того, что данная полинуклеотидная последовательность может включать вплоть до 15, предпочтительно вплоть до 10, еще более предпочтительно вплоть до 5 точечных мутаций на каждые 100 нуклеотидов нуклеотидной референс-последовательности. Другими словами, для того, чтобы полинуклеотид имел нуклеотидную последовательность, идентичную по меньшей мере на 85%, предпочтительно на 90%, еще более предпочтительно на 95% с нуклеотидной референс-последовательностью, вплоть до 15%, предпочтительно 10%, еще более предпочтительно 5% нуклеотидов в референс-последовательности можно изымать путем делеции или заменять на другой нуклеотид, или вплоть до 15% нуклеотидов, предпочтительно 10%, еще более предпочтительно 5% от общего количества нуклеотидов в референс-последовательности можно встраивать в референс-последовательность. Эти мутации референс-последовательности могут иметь место на 5'- или 3'-конце нуклеотидной референс-последовательности или в любом положении между этими концами, либо находясь индивидуально среди нуклеотидов в референс-последовательности, либо в виде одной или нескольких смежных групп в референс-последовательности.
Аналогично этому под полипептидом, данная аминокислотная последовательность которого идентична по меньшей мере, например на 85%, предпочтительно на 90%, еще более предпочтительно на 95% аминокислотной референс-последовательности, подразумевают, что рассматриваемая аминокислотная последовательность полипептида идентична референс-последовательности за исключением того, что рассматриваемая полипептидная последовательность может включать вплоть до 15, предпочтительно вплоть до 10, еще более предпочтительно вплоть до 5 аминокислотных замен на каждые 100 аминокислот аминокислотной референс-последовательности. Другими словами, для получения данной полипептидной последовательности, которая по меньшей мере на 85%, предпочтительно на 90%, еще более предпочтительно на 95% идентична последовательности аминокислотной референс-последовательности, вплоть до 15%, предпочтительно вплоть до 10%, еще более предпочтительно вплоть до 5% аминокислотных остатков в референс-последовательности можно изымать путем делеции или заменять на другую аминокислоту, или вплоть до 15% аминокислот, предпочтительно вплоть до 10%, еще более предпочтительно вплоть до 5% от общего количества аминокислотных остатков в референс-последовательности можно встраивать в референс-последовательность. Эти изменения референс-последовательности могут иметь место на амино- или карбоксиконце аминокислотной референс-последовательности или в любом положении между этими концевыми положениями, либо находясь индивидуально среди остатков в референс-последовательности, либо в виде одной или нескольких смежных групп в референс-последовательности. Предпочтительно положения остатков, которые являются неидентичными, отличаются консервативными аминокислотными заменами. Однако консервативные замены не относят к совместимым при определении идентичности последовательностей.
Определение «гомологии последовательностей» в контексте настоящего описания относится к методу определения сходства двух последовательностей. Для определения гомологии последовательностей две или большее количество последовательностей подвергают оптимальному выравниванию и при необходимости интродуцируют бреши. В отличие от оценки идентичности последовательностей при определении гомологии последовательностей консервативные аминокислотные замены считают удовлетворяющими условиям гомологии. Другими словами, для того чтобы полипептид или полинуклеотид имел 95% гомологию последовательности с референс-последовательностью 85%, предпочтительно 90%, еще более предпочтительно 95% аминокислотных остатков или нуклеотидов в референс-последовательности должны соответствовать или содержать консервативную замену на другую аминокислоту или нуклеотид, или количество аминокислот или нуклеотидов, составляющее вплоть до 15%, предпочтительно вплоть до 10%, еще более предпочтительно вплоть до 5% от общего количества аминокислотных остатков или нуклеотидов, не включая консервативные замены, в референс-последовательности можно встраивать в референс-последовательность. Предпочтительно гомологичная последовательность содержит по меньшей мере участок, состоящий из 50, еще более предпочтительно из 100, еще более предпочтительно из 250, еще более предпочтительно из 500 нуклеотидов.
Понятие «консервативная замена» относится к замене аминокислотного остатка или нуклеотида на другой аминокислотный остаток или нуклеотид, имеющий сходные характеристики или свойства, включая размер, гидрофобность и т.д., в результате чего общая функциональность не изменяется существенно.
Понятие «выделенный» означает «измененный человеком» относительно его встречающегося в естественных условиях состояния, т.е., если он встречается в природе, то его изменяют или удаляют из естественного окружения, или осуществляют и то, и другое. Например, полинуклеотид или полипептид, встречающийся в естественных условиях в живом организме, не является «выделенным», но этот же полинуклеотид или полипептид, отделенный от материала, с которым он существует совместно в его естественном состоянии, является «выделенным» согласно применяемому в описании понятию.
Таким образом, еще одним объектом настоящего изобретения является способ лечения или профилактики заражения PCV2 или снижения клинических симптомов, вызываемых или ассоциированных с заражением PCV2, у животных, которые имеют антитела к PCV2, прежде всего полученные от матери антитела к PCV2, заключающийся в том, что животному, которое нуждается в таком лечении, вводят в эффективном количестве антиген PCV2 или иммуногенную композицию, которая содержит антиген PCV2, где белок ORF-2 PCV2 представляет собой любой из указанных выше белков. Предпочтительно белок ORF-2 PCV2 представляет собой:
I) полипептид, содержащий последовательность, представленную в SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 или SEQ ID NO:11 в настоящем описании или в WO 06/07065;
II) любой полипептид, который по меньшей мере на 80% гомологичен полипептиду, указанному в I),
III) любой иммуногенный фрагмент полипептидов, указанных в I) и/или II),
IV) иммуногенный фрагмент, указанный в III), который содержит по меньшей мере 10 смежных аминокислот, входящих в последовательности, представленные в SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 или SEQ ID NO:11 в настоящем описании или в WO 06/072065,
V) полипептид, который кодируется ДНК, содержащей последовательность, представленную в SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:4 в настоящем описании или в WO 06/072065.
VI) любой полипептид, кодируемый полинуклеотидом, который по меньшей мере на 80% гомологичен полинуклеотиду, указанному в V),
VII) любой иммуногенный фрагмент полипептидов, которые кодируются полинуклеотидом, указанным в V) и/или VI),
VIII) иммуногенный фрагмент, указанный в VII), где полинуклеотид, кодирующий иммуногенный фрагмент, содержит по меньшей мере 30 смежных нуклеотидов, входящих в последовательности, которые представлены в SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:4 в настоящем описании или в WO 06/072065.
Предпочтительно любой из указанных иммуногенных фрагментов имеет иммуногенные характеристики белка ORF-2 PCV2, кодируемого последовательностями, которые представлены в SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:4 в настоящем описании или в WO 06/07065.
Таким образом, согласно следующему объекту изобретения белок ORF-2 PCV2 содержится в иммуногенной композиции с таким уровнем включения антигена, который является эффективным для индукции требуемого иммунного ответа, а именно для снижения количества случаев, уменьшения серьезности или предупреждения или снижения одного или нескольких клинических симптомов, являющихся результатом заражения PCV2 или ассоциированных с ним. Предпочтительно уровень включения белка ORF-2 PCV2 соответствует по меньшей мере 0,2 мкг антигена/мл конечной иммуногенной композиции (мкг/мл), более предпочтительно от примерно 0,2 до примерно 400 мкг/мл, еще более предпочтительно от примерно 0,3 до примерно 200 мкг/мл, еще более предпочтительно от примерно 0,35 до примерно 100 мкг/мл, еще более предпочтительно от примерно 0,4 до примерно 50 мкг/мл, еще более предпочтительно от примерно 0,45 до примерно 30 мкг/мл, еще более предпочтительно от примерно 0,5 до примерно 18 мкг/мл, еще более предпочтительно от примерно 0,6 до примерно 15 мкг/мл, еще более предпочтительно от примерно 0,75 до примерно 8 мкг/мл, еще более предпочтительно от примерно 1,0 до примерно 6 мкг/мл, еще более предпочтительно от примерно 1,3 до примерно 3,0 мкг/мл, еще более предпочтительно от примерно 1,4 до примерно 2,5 мкг/мл, еще более предпочтительно от примерно 1,5 до примерно 2,0 мкг/мл и наиболее предпочтительно примерно 1,6 мкг/мл.
Согласно еще одному объекту изобретения уровень включения антигена ORF-2 PCV составляет по меньшей мере 0,2 мкг белка ORF-2 PCV2, описанного выше, на дозу конечной антигенной композиции (мкг/дозу), более предпочтительно от примерно 0,2 до примерно 400 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 0,3 до примерно 200 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 0,35 до примерно 100 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 0,4 до примерно 50 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 0,45 до примерно 30 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 0,5 до примерно 18 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 0,6 до примерно 15 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 0,75 до примерно 8 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 1,0 до примерно 6 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 1,3 до примерно 3,0 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 1,4 до примерно 2,5 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 1,5 до примерно 2,0 мкг/дозу и наиболее предпочтительно примерно 1,6 мкг/дозу. При создании изобретения неожиданно было установлено, что уровень включения белка ORF-2 PCV2 (содержание антигена) из расчета 20 мкг/дозу, предпочтительно примерно от 0,5 до 18 мкг/дозу, может обусловливать иммунитет у молодых животных и/или у животных, позитивных в отношении антител к PCV2, в частности, которые являются позитивными в отношении полученных от матери антител. Таким образом, еще одним объектом настоящего изобретения является способ лечения или профилактики заражения PCV2 или снижения клинических симптомов, вызываемых или ассоциированных с заражением PCV2, у животных, которые имеют антитела к PCV2, прежде всего полученные от матери антитела к PCV2, заключающийся в том, что животному, которое нуждается в таком лечении, вводят менее 20 мкг/дозу, предпочтительно примерно от 0,5 до 18 мкг/дозу антигена PCV2 или иммуногенной композиции, содержащей антиген PCV2. Указанный антиген PCV2 представляет собой любой из указанных в настоящем описании. Предпочтительно указанный антиген PCV2 представляет собой любой белок ORF-2 PCV2, предпочтительно любой белок ORF-2 PCV2, представленный в настоящем описании.
Полипептид ORF-2 PCV2, применяемый в иммуногенной композиции, предлагаемой в настоящем изобретении, можно получать любым путем, включая выделение и очистку ORF-2 PCV2, стандартный метод синтеза белков и метод рекомбинантной ДНК. Предпочтительные методы получения полипептида ORF-2 PCV2 представлены в WO 06/072065, сущность и содержание которой полностью включены в настоящее описание в качестве ссылки. В целом, метод состоит в следующем: заражают чувствительные клетки рекомбинантным вирусным вектором, который содержит кодирующие последовательности ДНК ORF-2 PCV2, экспрессируют полипептид ORF-2 PCV2 с помощью рекомбинантного вируса и выделяют экспрессируемый полипептид ORF-2 PCV2 из супернатанта путем фильтрации, и инактивируют общепринятым методом, предпочтительно используя бинарный этиленимин (БЭИ), который затем нейтрализуют для прекращения процесса инактивации.
Понятие «иммуногенная композиция» в контексте настоящего описания относится также к композиции, которая содержит I) любой белок ORF-2 PCV2, описанный выше, предпочтительно в указанных выше концентрациях, и II) по меньшей мере часть вирусного вектора, экспрессирующего указанный белок ORF-2 PCV2, предпочтительно рекомбинантного бакуловируса. Кроме того, иммуногенная композиция может содержать I) любой из белков ORF-2 PCV2, описанных выше, предпочтительно в указанных выше концентрациях, II) по меньшей часть вирусного вектора, экспрессирующего белок ORF-2 PCV2, предпочтительно рекомбинантного бакуловируса, и III) часть супернатанта клеточной культуры.
Таким образом, еще одним объектом настоящего изобретения является способ лечения или профилактики заражения PCV2 или снижения клинических симптомов, вызываемых или ассоциированных с заражением PCV2, у животных, которые имеют антитела к PCV2, прежде всего полученные от матери антитела к PCV2, заключающийся в том, что животному, которое нуждается в таком лечении, вводят в эффективном количестве антиген PCV2 или иммуногенную композицию, которая содержит антиген PCV2, где антиген PCV2 представляет собой рекомбинантный ORF-2 PCV2, предпочтительно экспрессируемый в бакуловирусе ORF-2 PCV2. Предпочтительно рекомбинантные или экспрессируемые в бакуловирусе ORF-2 PCV2 имеют указанную выше последовательность.
Понятие «иммуногенная композиция» в контексте настоящего описания относится также к композиции, которая содержит I) любой из белков ORF-2 PCV2, описанных выше, предпочтительно в указанных выше концентрациях, II) по меньшей мере часть вирусного вектора, экспрессирующего указанный белок ORF-2 PCV2, предпочтительно рекомбинантного бакуловируса, и III) часть клеточной культуры; где примерно 90% компонентов имеют размер менее 1 мкм.
Понятие «иммуногенная композиция» в контексте настоящего описания относится также к композиции, которая содержит I) любой из белков ORF-2 PCV2, описанных выше, предпочтительно в указанных выше концентрациях, II) по меньшей мере часть вирусного вектора, экспрессирующего указанный белок ORF-2 PCV2, предпочтительно рекомбинантного бакуловируса, III) часть клеточной культуры, IV) инактивирующий агент, предназначенный для инактивации рекомбинантного вирусного вектора, предпочтительно БЭИ, где примерно 90% компонентов I)-III) имеют размер менее 1 мкм. Предпочтительно БЭИ присутствует в концентрациях, эффективных для инактивации бакуловируса, предпочтительно от 2 до примерно 8 мМ БЭИ, предпочтительно примерно 5 мМ БЭИ.
Понятие «иммуногенная композиция» в контексте настоящего описания относится также к композиции, которая содержит I) любой из белков ORF-2 PCV2, описанных выше, предпочтительно в указанных выше концентрациях, II) по меньшей мере часть вирусного вектора, экспрессирующего указанный белок ORF-2 PCV2, III) часть клеточной культуры, IV) инактивирующий агент, предназначенный для инактивации рекомбинантного вирусного вектора, предпочтительно БЭИ, и V) нейтрализующий агент, предназначенный для прекращения инактивации, опосредуемой инактивирующим агентом, где примерно 90% компонентов I)-III) имеют размер менее 1 мкм. Предпочтительно, если инактивирующий агент представляет собой БЭИ, то указанная композиция содержит тиосульфат натрия в количествах, эквивалентных количеству БЭИ.
Полипептид включают в композицию, которую можно вводить животному, чувствительному к заражению PCV2. В предпочтительных вариантах в композицию можно включать дополнительные компоненты, известные специалистам в данной области (см. также Remington's Pharmaceutical Sciences, 18-е изд., изд-во Mack Publ., Easton, 1990). Кроме того, в состав композиции могу входить один или несколько приемлемых для применения в ветеринарии носителей. В контексте настоящего описания понятие «приемлемый для применения в ветеринарии носитель» включает, но не ограничиваясь только ими, любые из перечисленных или все растворители, дисперсионные среды, материалы для нанесения покрытия, адъюванты, стабилизаторы, разбавители, консерванты, антибактериальные и противогрибковые агенты, агенты для придания изотоничности, замедляющие адсорбцию агенты и т.п. В предпочтительном варианте осуществления изобретения иммуногенная композиция содержит белок ORF-2 PCV2, описанный выше, предпочтительно в указанных выше концентрациях, который смешивают с адъювантом, предпочтительно карбополом, и физиологическим раствором.
Специалистам в данной области должно быть очевидно, что композиция, которую применяют согласно изобретению, может включать известные пригодные для инъекции физиологически приемлемые стерильные растворы. Для приготовления готового к применению раствора для парентеральной инъекции или инфузии широко используют водные изотонические растворы, такие, например, как физиологический раствор или соответствующие растворы белков плазмы. Кроме того, иммуногенные композиции и вакцины, предлагаемые в настоящем изобретении, могут включать разбавители, агенты для придания изотоничности, стабилизаторы или адъюванты. Разбавители могут представлять собой воду, физиологический раствор, декстрозу, этанол, глицерин и т.п. Агенты для придания изотоничности могут представлять собой среди прочего хлорид натрия, декстрозу, маннит, сорбит и лактозу. Стабилизаторы представляют собой среди прочего альбумин и соли щелочных металлов и этилендиаминтетрауксусной кислоты.
Понятие «адъюванты» в контексте настоящего описания может относиться к гидроксиду алюминия и фосфату алюминия, сапонинам, таким, например, как Quil A, QS-21 (фирма Cambridge Biotech Inc., Кэмбридж, шт.Массачусетс), GPI-0100 (фирма Galenica Pharmaceuticals, Inc., Бирмингем, шт.Алабама), эмульсии вода-в-масле, эмульсии масло-в-воде, эмульсии вода-в-масле-в-воде. Основой эмульсии может являться, в частности, легкое жидкое парафиновое масло (соответствующее Европейской фармакопеи); изопреноидное масло, такое как сквалан или сквален; масло, образовавшееся в результате олигомеризации алкенов, прежде всего изобутена или децена; эфиры кислот или спиртов, содержащие линейную алкильную группу, более конкретно растительные масла, этилолеат, ди(каприлат/капрат) пропиленгликоля, три(каприлат/капрат) глицерина или диолеат пропиленгликоля; эфиры разветвленных жирных кислот или спиртов, в частности, эфиры изостеариновой кислоты. Масла применяют в сочетании с эмульгаторами для получения эмульсии. Эмульгаторы предпочтительно представляют собой неионогенные поверхностно-активные вещества, прежде всего сложные эфиры сорбитана, маннида (например, безводный маннитолеат), гликоля, полиглицерина, пропиленгликоля и олеиновой, изостеариновой, рицинолеиновой или гидроксистеариновой кислоты, которые необязательно являются этоксилированными, и блок-сополимеры полиоксипропилена-полиоксиэтилена, в частности продукты типа Pluronic, прежде всего L121 (см. Hunter и др., The Theory and Practical Application of Adjuvants, под ред. Stewart-Tull D. E. S., изд-во John Wiley and Sons, NY, c.51-94, 1995 и Todd и др., Vaccine 15, 1997, c.564-570).
Например, можно применять SPT-эмульсию, описанную на с.147 в: «Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach», под ред. M. Powell и М. Newman, изд-во Plenum Press, 1995, и эмульсию MF59, описанную на с.183 в этой же публикации.
Другим примером адъюванта является соединение, выбранное из полимеров акриловой или метакриловой кислоты и сополимеров малеинового ангидрида и алкенильного производного. Предпочтительными адъювантами являются полимеры акриловой или метакриловой кислоты, прежде всего, сшитые с простыми полиалкениловыми эфирами сахаров или многоатомными спиртами. Эти соединения известны под названием карбомеры (Phameuropa, т.8, №. 2 июня 1996 г.). Специалистам в данной области в качестве ссылки можно предложить US 2909462, в котором описаны указанные акриловые полимеры, сшитые с полигидроксилированным соединением, которое имеет по меньшей мере 3 гидроксильные группы, предпочтительно не более 8, при этом атомы водорода по меньшей мере трех гидроксильных групп замещены ненасыщенными алифатическими радикалами, которые имеют по меньшей мере 2 атома углерода. Предпочтительными являются радикалы, которые содержат от 2 до 4 атомов углерода, например, винильные, аллильные и другие ненасыщенные группы ряда этилена. Ненасыщенные радикалы могут сами содержать другие заместители, такие как метил. Наиболее предпочтительными являются продукты, поступающие в продажу под названием карбопол (фирма BF Goodrich, шт.Огайо). Их сшивают с аллилсахарозой или аллилпентаэритритолом. Среди них прежде всего следует упомянуть карбопол 974Р, 934Р и 971P. Наиболее предпочтительным для применения является карбопол 971P. Наиболее предпочтительно применять карбопол, в частности можно применять карбопол 971P, предпочтительно в количествах от примерно 500 мкг до примерно 5 мг на дозу, еще более предпочтительно в количестве от примерно 750 мкг до примерно 2,5 мг на дозу и наиболее предпочтительно в количестве примерно 1 мг на дозу.
Также приемлемыми адъювантами среди прочего являются, но не ограничиваясь только ими, система RIBI-адъювантов (фирма Ribi Inc.), блок-сополимеры (фирма CytRx, Атланта, шт.Джорджия), SAF-M (фирма Chiron, Emeryville, шт.Калифорния), монофосфорил-липид А, адъювант на основе амина липида авридина, термолабильный энтеротоксин Е.coli (рекомбинантный или нет), токсин холеры, IMS 1314 или мурамил-дипептид.
Предпочтительно адъювант добавляют в количестве от примерно 100 мкг до примерно 10 мг на дозу. Еще более предпочтительно адъювант добавляют в количестве от примерно 100 мкг до примерно 10 мг на дозу. Еще более предпочтительно адъювант добавляют в количестве от примерно 500 мкг до примерно 5 мг на дозу. Еще более предпочтительно адъювант добавляют в количестве от примерно 750 мкг до примерно 2,5 мг на дозу. Наиболее предпочтительно адъювант добавляют в количестве примерно 1 мг на дозу.
Кроме того, композиция может включать один или несколько фармацевтически приемлемых носителей. В контексте настоящего описания понятие «фармацевтически приемлемый носитель» включает любой из перечисленных или все растворители, дисперсионные среды, материалы для нанесения покрытия, стабилизаторы, разбавители, консерванты, антибактериальные и противогрибковые агенты, агенты для придания изотоничности, замедляющие адсорбцию агенты и т.п. Наиболее предпочтительно композиция, предлагаемая в изобретении, содержит белок ORF-2 PCV2, выделенный из супернатанта культивируемых in vitro клеток, где указанные клетки инфицируют рекомбинантным вирусным вектором, который содержит ДНК ORF-2 PCV2 и экспрессирует белок ORF-2 PCV2, и где указанную клеточную культуру обрабатывают от примерно 2 до примерно 8 мМ БЭИ, предпочтительно примерно 5 мМ БЭИ, для инактивации вирусного вектора и нейтрализующего агента, взятого в эквивалентной концентрации, предпочтительно раствором тиосульфат натрия в конечной концентрации от примерно 2 до примерно 8 мМ, предпочтительно примерно 5 мМ.
Настоящее изобретение относится также к иммуногенной композиции, которая содержит I) любой из белков ORF-2 PCV2, описанных выше, предпочтительно в указанных выше концентрациях, II) по меньшей мере часть вирусного вектора, экспрессирующего указанный белок ORF-2 PCV2, III) часть клеточной культуры, IV) инактивирующий агент, предназначенный для инактивации рекомбинантного вирусного вектора (предпочтительно БЭИ), и V) нейтрализующий агент, предназначенный для прекращения инактивации, опосредуемой инактивирующим агентом, предпочтительно тиосульфат натрия в количествах, эквивалентных количеству БЭИ; и VI) приемлемый адъювант, предпочтительно карбопол 971 в указанных выше количествах; где примерно 90% компонентов I)-III) имеют размер менее 1 мкм. Согласно еще одному объекту изобретения указанная иммуногенная композиция содержит также фармацевтически приемлемую соль, предпочтительно фосфат, в физиологически приемлемых концентрациях. Предпочтительно значение рН указанной иммуногенной композиции доводят до физиологического значения рН, т.е. примерно от 6,5 до 7,5.
В контексте настоящего описания иммуногенная композиция представляет собой также композицию, которая содержит в одном мл: I) по меньшей мере 1,6 мкг белка ORF-2 PCV2, описанного выше, предпочтительно менее 20 мкг, II) по меньшей мере часть бакуловируса, экспрессирующего указанный белок ORF-2 PCV2, III) часть клеточной культуры, IV) примерно от 2 до 8 мМ БЭИ, V) тиосульфат натрия в количествах, эквивалентных количеству БЭИ, и VI) примерно 1 мг карбопола 971, и VII) фосфат в физиологически приемлемой концентрации; где примерно 90% компонентов I)-III) имеют размер менее 1 мкм, и значение рН указанной иммуногенной композиции доведено примерно до 6,5-7,5.
Иммуногенные композиции могут содержать также один или несколько других иммуномодулирующих агентов, таких, например, как интерлейкины, интерфероны или другие цитокины. Иммуногенные композиции могут содержать также гентамицин и мертиолат. Хотя специалист в данной области легко может определить количества и концентрации адъювантов и добавок, которые можно применять в контексте настоящего изобретения, в настоящем изобретении предложены композиции, содержащие от примерно 50 до примерно 2000 мкг адъюванта и предпочтительно примерно 250 мкг/мл дозы композиции вакцины. Так, иммуногенная композиция, предлагаемая в изобретении, представляет собой также композицию, которая содержит от примерно 1 до примерно 60 мкг/мл антибиотиков и более предпочтительно менее примерно 30 мкг/мл антибиотиков.
В контексте настоящего описания иммуногенная композиция представляет собой также композицию, которая содержит I) любой из белков ORF-2 PCV2, описанных выше, предпочтительно в указанных выше концентрациях, II) по меньшей мере часть вирусного вектора, экспрессирующего указанный белок ORF-2 PCV2, III) часть клеточной культуры, IV) инактивирующий агент, предназначенный для инактивации рекомбинантного вирусного вектора, предпочтительно БЭИ, и V) нейтрализующий агент, предназначенный для прекращения инактивации, опосредуемой инактивирующим агентом, предпочтительно тиосульфат натрия в количествах, эквивалентных количеству БЭИ; VI) приемлемый адъювант, предпочтительно карбопол 971 в указанных выше количествах; VII) соляной буфер в фармацевтически приемлемой концентрации, предпочтительно фосфат, и VIII) противомикробное действующее вещество; где примерно 90% компонентов 1)-Ш) имеют размер менее 1 мкм. Понятие «иммуногенная композиция, которую можно применять согласно изобретению», относится также к Ingelvac CircoFLEX™ (фирма Boehringer Ingelheim Vetmedica Inc, St Joseph, шт.Миссури, США), CircoVac (фирма Merial SAS, Лион, Франция), CircoVent (фирма Intervet Inc., Millsboro, шт.Делавэр, США) или Suvaxyn PCV-2 One Dose (фирма Fort Dodge Animal Health, Канзас-Сити, шт.Канзас, США).
Таким образом, еще одним объектом настоящего изобретения является способ лечения или профилактики заражения PCV2 или снижения клинических симптомов, вызываемых или ассоциированных с заражением PCV2, у животных, которые имеют полученные от матери антитела к PCV2, заключающийся в том, что животному, которое нуждается в таком лечении, вводят в эффективном количестве антиген PCV2 или иммуногенную композицию, которая содержит антиген PCV2, где иммуногенная композиция представляет собой CircoFLEX, CircoVac, CircoVent или Suvaxyn PCV-2 One Dose. Наиболее предпочтительно иммуногенная композиция представляет собой Ingelvac CircoFLEX™, и/или антиген PCV2 представляет собой ORF-2 PCV2, предпочтительно, экспрессируемый в бакуловирусе белок ORF-2 PCV2, наиболее предпочтительно включенный в Ingelvac CircoFLEX™.
Для изучения возможного взаимодействия антигена PCV2 с материнским антителом проводили опыт, в котором определяли титры антитела у подопытных животных в момент вакцинации, и затем животных разделяли на группы с низким, средним или высоким титром антител: геометрические средние значения титров <1:100 рассматривались как низкие титры, титры от 1:100 до 1:1000 рассматривались как средние титры, а титры >1:1000 рассматривались как высокие титры антител. Эта схема группировки животных соответствует схеме, которую применяли в полевом опыте, проведенном в Канаде, в котором титры антител 1:80 рассматривались как низкие, титры антител 1:640 как средние, а титры антител >1:1280 как высокие (Larochelle и др., Can. J. Vet. Res.; 67, 2003, c.114-120). Для того чтобы проанализировать влияние низких, средних и высоких титров антител в момент вакцинации на виремию, вакцинированных и обработанных плацебо животных сравнивали в отношении начала, окончания, продолжительности виремии, количества дней, в которые были получены положительные образцы, и вирусной нагрузки. При создании изобретения неожиданно было установлено, что присутствие антител к PCV2, в частности полученных от матери антител, не оказывало существенного влияния на какой-либо из указанных параметров. Другими словами, при создании изобретения неожиданно было установлено, что эффективность антигена PCV2 в отношении предупреждения или лечения заражения PCV2 или снижения клинических симптомов, вызываемых или ассоциированных с заражением PCV2 у животных, не зависела от присутствия в день вакцинации антител к PCV2, предпочтительно от титра антител PCV2 вплоть до 1:100, предпочтительно превышающего 1:100, еще более предпочтительно превышающего 1:250, еще более предпочтительно превышающего 1:500, еще более предпочтительно 1:640; еще более предпочтительно превышающего 1:750, наиболее предпочтительно превышающего 1:1000. Это явление продемонстрировано в эксперименте с использованием одной вакцинации путем впрыскивания, т.е. когда антиген PCV2 вводили только один раз и без какой-либо последующей обработки антигеном PCV2.
Методы выявления и количественной оценки антител к PCV2 хорошо известны в данной области. Например, выявление и количественную оценку антител к PCV2 можно осуществлять с помощью метода непрямой иммунофлуоресценции, описанного у Magar и др., Can. J. Vet Res.; 64, 2000, c.184-186 или у Magar и др., J. Comp. Pathol.; 123, 2000, c.258-269. Другие методы количественной оценки антител к PCV2 описаны у Opriessnig и др., 37-th Annual Meeting of the American Association of Swine Veterinarians (37-й Ежегодный съезд американской ассоциации по ветеринарии свиней), 2006 г.). Кроме того, в примере 2 описан также непрямой иммунофлуоресцентный анализ, который может применять специалист в данной области. В случае спорных результатов и при любых сомнениях следует иметь в виду, что указанные в настоящем описании титры антител к PCV2 относятся к титрам, которые установлены/могут быть установлены с помощью анализа, описанного в примере 2.
Таким образом, следующим объектом настоящего изобретения является способ лечения или профилактики заражения PCV2 или снижения клинических симптомов, вызываемых или ассоциированных с заражением PCV2, у животных, которые имеют антитела к PCV2, прежде всего полученные от матери антитела, заключающийся в том, что животному, которое нуждается в таком лечении, вводят в терапевтически эффективном количестве антиген PCV2, предпочтительно из расчета менее 20 мкг/дозу, где у животного выявлен титр антител к PCV2 вплоть до 1:100, предпочтительно превышающий 1:100, еще более предпочтительно превышающий 1:250, еще более предпочтительно превышающий 1:500, еще более предпочтительно 1:640, еще более предпочтительно превышающий 1:750, наиболее предпочтительно превышающий 1:1000. Предпочтительно указанный титр антител к PCV2 определяют и оценивают количественно с помощью специфического иммунного анализа антител к PCV2, предпочтительно анализа, описанного в примере 2. Более предпочтительно указанные антитела к PCV2 представляют собой полученные от матери антитела. Наиболее предпочтительно антиген PCV2 вводят, только один раз, предпочтительно в дозе менее 20 мкг/дозу.
Поросята, которые имеют лишь низкие титры (<1:100) или средние титры (<1:1000) полученных от матери антител к PCV2, не защищены в достаточной степени от заражения PCV2, которое происходит в возрасте менее 3 недель. Поэтому требуется вакцинация на очень ранней стадии жизни. Благодаря ранее не предсказанным и неожиданным результатам, полученным при создании настоящего изобретения, и демонстрирующим отсутствие взаимосвязи между антителами к PCV2 и антигеном PCV2, вакцинация/обработка животных возрастом менее 3 недель, становится реально возможной. Кроме того, при создании изобретения неожиданно было установлено, что титры антител к PCV2, превышающие 1:1000, не оказывали влияния на эффективность вакцины против PCV2 вне зависимости от величины существующего начального титра антител. Например, вакцинация имеющих высокие титры животных (титр антител к PCV2 >1:1000) приводила к укороченной на 9,5 дня продолжительности виремии, на 11,9 дня более раннему окончанию виремии, на 1,9 дня уменьшению количества дней, в которые были получены положительные в отношении виремии образцы, и к примерно двукратному снижению суммы геномных эквивалентов/мл по сравнению с невакцинированным контрольными животными. При сравнении вакцинированных животных с «высокими», «средними» и «низкими» титрами не обнаружено существенной разницы в различных параметрах связанной с PCV2 виремии. Эти результаты свидетельствуют также о том, что в присутствии высоких титров антител к PCV2 антиген PCV2, примененный для вакцинации, еще может существенно снижать виремию в крови (окончание виремии, продолжительность виремии, вирусная нагрузка). В свете этих данных не обнаружено никаких различий в живой массе тела при сравнении животных в вакцинированных группах, имеющих низкие и высокие титры. Кроме того, у вакцинированных животных с высоким титром (>1:1000) антител к PCV2 в момент вакцинации/обработки обнаружен также существенно больший вес тела после начала виремии по сравнению с обработанными плацебо животными с начальными высокими титрами (см. фиг.3). Следовательно, возможна вакцинация/обработка животных возрастом 1 день или старше антигеном PCV2. Однако вакцинацию следует осуществлять в течение первых 8, предпочтительно первых 7 недель жизни. Таким образом, еще одним объектом настоящего изобретения является способ лечения или профилактики заражения PCV2 или снижения клинических симптомов, вызываемых или ассоциированных с заражением PCV2, у животных, заключающийся в том, что животному, которое нуждается в таком лечении, предпочтительно в возрасте 1 день или старше, но не старше 8 недель, вводят в эффективном количестве антиген PCV2. Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения требуется менее 20 мкг антигена PCV2/дозу для придания иммунитета такому животному. Согласно более предпочтительному варианту осуществления изобретения антиген PCV2, предпочтительно в количестве менее 20 мкг/дозу, вводят только один раз животному, которое нуждается в таком лечении.
Таким образом, следующим более общим объектом настоящего изобретения является способ лечения или профилактики заражения PCV2 или снижения клинических симптомов, вызываемых или ассоциированных с заражением PCV2, у молодых животных, заключающийся в том, что животному, которое нуждается в таком лечении, вводят в эффективном количестве антиген PCV2.
Понятие «молодое животное» в контексте настоящего описания относится к животному возрастом от 1 до 22 дней. Предпочтительно под понятием молодое животное подразумевают животное возрастом от 1 до 20 дней. Более предпочтительно под понятием молодое животное подразумевают животное возрастом от 1 до 15 дней, еще более предпочтительно возрастом от 1 дня до 14 дней, еще более предпочтительно возрастом от 1 до 12 дней, еще более предпочтительно возрастом от 1 до 10 дней, еще более предпочтительно возрастом от 1 до 8 дней, еще более предпочтительно возрастом от 1 до 7 дней, еще более предпочтительно возрастом от 1 до 6 дней, еще более предпочтительно возрастом от 1 до 5 дней, еще более предпочтительно возрастом от 1 до 4 дней, еще более предпочтительно возрастом от 1 до 3 дней, еще более предпочтительно возрастом от 1 до 2 дней, наиболее предпочтительно животное возрастом 1 день. Таким образом, еще одним объектом настоящего изобретения является способ лечения или профилактики заражения PCV2 или снижения клинических симптомов, вызываемых или ассоциированных с заражением PCV2, у молодых животных, заключающийся в том, что вводят в эффективном количестве антиген PCV2 животному, которое нуждается в таком лечении, возрастом 1-22 дня, предпочтительно возрастом 1-20 дней, более предпочтительно возрастом 1-15 дней, еще более предпочтительно возрастом 1-14 дней, еще более предпочтительно возрастом 1-12 дней, еще более предпочтительно возрастом 1-10 дней, еще более предпочтительно возрастом 1-8 дней, еще более предпочтительно возрастом 1-7 дней, еще более предпочтительно возрастом 1-6 дней, еще более предпочтительно возрастом 1-15 дней, еще более предпочтительно возрастом 1-4 дня, еще более предпочтительно возрастом 1-3 дня, еще более предпочтительно возрастом 1 или 2 дня, наиболее предпочтительно возрастом 1 день. Например, установлено, что вакцинация/обработка, которую проводят в возрасте от 19 до 22 дней, является высокоэффективной вакцинацией. Кроме того, установлено, что вакцинация/обработка, которую проводят в возрасте от 12 до 18 дней, предпочтительно от 12 до 14 дней, также является очень эффективной в отношении снижения клинических симптомов, ассоциированных с заражением PCV2, снижения общей вирусной нагрузки, снижения продолжительности виремии, замедления начала виремии, прироста массы. Кроме того, установлено также, что вакцинация, которую проводят в возрасте 1 неделя, является также очень эффективной в отношении снижения клинических симптомов, ассоциированных с заражением PCV2, снижения общей вирусной нагрузки, снижения продолжительности виремии, замедления начала виремии, прироста массы. Предпочтительно для придания иммунитета указанным молодым животным требуется менее 20 мкг антигена PCV2/дозу. Таким образом, согласно более предпочтительному варианту осуществления изобретения антиген PCV2 вводят предпочтительно в количестве менее 20 мкг только один раз указанному молодому животному, которое нуждается в таком лечении.
Из-за повсеместного распространения PCV2 в полевых условиях большая часть молодых поросят является серопозитивной в отношении PCV2. Таким образом, еще одним объектом настоящего изобретения является способ лечения или профилактики заражения PCV2 или снижения клинических симптомов, вызываемых или ассоциированных с заражением PCV2, у молодых животных, которые имеют антитела к PCV2 в день вакцинации, заключающийся в том, что животному возрастом 1-22 дня, предпочтительно возрастом 1-20 дней, более предпочтительно возрастом 1-15 дней, еще более предпочтительно возрастом 1-14 дней, еще более предпочтительно возрастом 1-12 дней, еще более предпочтительно возрастом 1-10 дней, еще более предпочтительно возрастом 1-8 дней, еще более предпочтительно возрастом 1-7 дней, еще более предпочтительно возрастом 1-6 дней, еще более предпочтительно возрастом 1-5 дней, еще более предпочтительно возрастом 1-4 дня, еще более предпочтительно возрастом 1-3 дня, еще более предпочтительно возрастом 1 или 2 дня, наиболее предпочтительно возрастом 1 день, которое нуждается в таком лечении, вводят в эффективном количестве антиген PCV2. Предпочтительно указанное молодое животное в день вакцинации/обработки имеет выявляемый титр антител к PCV2 вплоть до 1:100, предпочтительно превышающий 1:100, еще более предпочтительно превышающий 1:250, еще более предпочтительно превышающий 1:500, еще более предпочтительно 1:640, еще более предпочтительно превышающий 1:750, наиболее предпочтительно превышающий 1:1000. Предпочтительно для придания иммунитета указанным молодым животным требуется менее 20 мкг антигена PCV2/дозу. Таким образом, согласно более предпочтительному варианту осуществления изобретения антиген PCV2 вводят предпочтительно в количестве менее 20 мкг только один раз указанному молодому животному, которое нуждается в таком лечении.
Как описано выше, вакцинация/лечение молодых животных антигеном PCV2 приводит к укорочению фазы виремии по сравнению с невакцинированными контрольными животными. Среднее укорочение времени составляет 9,5 дня по сравнению с невакцинированными контрольными животными этого же вида. Таким образом, еще одним объектом настоящего изобретения является также способ лечения или профилактики заражения PCV2 или снижения клинических симптомов, вызываемых или ассоциированных с заражением PCV2, у молодых животных, заключающийся в том, что вводят в эффективном количестве антиген PCV2 животному, которое нуждается в таком лечении, при этом лечение или профилактика приводит к укорочению фазы виремии на 5 или более дней, предпочтительно на 6 или более дней, еще более предпочтительно на 7 или более дней, еще более предпочтительно на 8 или более дней, еще более предпочтительно на 9 дней, еще более предпочтительно на 10 дней, еще более предпочтительно на 12 дней, еще более предпочтительно на 14 дней, наиболее предпочтительно более чем на 16 дней, по сравнению с животными этого же вида из необработанной контрольной группы. В некоторых случаях фаза виремии укорачивается более чем на 20 дней. В целом, вакцинация молодых поросят приводит к снижению потери прироста веса, укорочению продолжительности виремии, более раннему окончанию виремии и пониженной вирусной нагрузке. Таким образом, еще одним объектом настоящего изобретения является также способ лечения или профилактики заражения PCV2 или снижения клинических симптомов, вызываемых или ассоциированных с заражением PCV2, у молодых животных, заключающийся в том, что животному, которое нуждается в таком лечении, вводят в эффективном количестве антиген PCV2, при этом лечение или профилактика заражения PCV2 приводит к улучшению по сравнению с животными этих же видов из необработанной контрольной группы параметра эффективности, выбранного из группы, включающей снижение потери прироста массы, укорочение продолжительности виремии, более раннее окончание виремии, понижение вирусной нагрузки или их комбинации. Предпочтительно требуется менее 20 мкг антигена PCV2/дозу для повышения указанного выше параметра эффективности вакцины. Кроме того, для достижения повышения указанного выше параметра эффективности вакцины требуется только одно введение одной дозы.
Понятие «эффективное количество» в контексте настоящего описания означает, но не ограничиваясь только указанным, количество антигена, которое вызывает или может вызывать иммунный ответ у животного, которому вводят антиген PCV2 в эффективной дозе. Предпочтительно эффективное количество означает количество антигена, при использовании которого продолжительность иммунитета (DOI) составляет примерно 10 недель, предпочтительно DOI составляет по меньшей мере 12 недель, более предпочтительно DOI составляет по меньшей мере 15 недель, наиболее предпочтительно DOI составляет по меньшей мере 20 недель.
2,0
9,0
3,0
8,0
4,0
8,0
3,0
6,0
4,0
5.0
2,0
9,0
3,0
6,0
4,0
5,0
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
Эффективное количество зависит от ингредиентов вакцины и схемы введения. Как правило, когда в комбинированной вакцине применяют препарат инактивированного вируса или модифицированного живого вируса, то вакцину применяют в количестве, соответствующем от примерно 10 до примерно 10 TCID на дозу, предпочтительно от примерно 10 до примерно 10 TCID на дозу, более предпочтительно от примерно 10 до примерно 10 TCID на дозу. В частности, когда в вакцинах применяют модифицированный живой PCV2, то рекомендованная для введению чувствительному животному доза составляет предпочтительно от примерно 10 TCID (средняя цитопатогенная доза, инфицирующая 50% клеток)/дозу до примерно 10 TCID/дозу и более предпочтительно от примерно 10 TCID/дозу до примерно 10 TCID/дозу. В целом, количество антигена должно составлять от примерно 0,2 до 5000 мкг и от 10 до 10 TCID, предпочтительно от 10 до 10 TCID, более предпочтительно от 10 до 10 TCID, при применении очищенного антигена.
Субъединичные вакцины, как правило, вводят с уровнем включения антигена, составляющим по меньшей мере 0,2 мкг антигена на дозу, предпочтительно от примерно 0,2 до примерно 400 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 0,3 до примерно 200 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 0,35 до примерно 100 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 0,4 до примерно 50 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 0,45 до примерно 30 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 0,5 до примерно 18 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 0,6 до примерно 16 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 0,75 до примерно 8 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 1,0 до примерно 6 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 1,3 до примерно 3,0 мкг/дозу.
При создании изобретения неожиданно было установлено, что профилактическое применение описанных выше иммуногенных композиций является эффективным в отношении снижения клинических симптомов, вызываемых или ассоциированных с заражением PCV2, предпочтительно у молодых животных и/или у животных, имеющих пассивный иммунитет к PCV2 в день обработки. В частности, установлено, что профилактическое применение описанных выше иммуногенных композиций, и в частности композиции, содержащей антиген ORF-2 PCV2, обладают эффективностью в отношении снижения лимфаденопатии, лимфоидного истощения и/или многоядерных/гигантских гистоцитов у животных, зараженных PCV2 и имеющих полученные от матери антитела к PCV-2, в день обработки/вакцинации. Кроме того, описано профилактическое применение иммуногенных композиций, предлагаемых в изобретении, и прежде всего композиций, которые содержат антиген ORF-2 PCV2, обладающих эффективностью в отношении уменьшения таких показателей, как (1) интерстициальная пневмония, сопровождающаяся интерглобулярным отеком, (2) бледность кожи или желтуха новорожденных, (3) пятнистая атрофия печени, (4) язва желудка, (5) нефрит и (6) репродуктивные нарушения, такие, например, как выкидыш, мертворождение, высыхание плода в матке и т.д., (7) Pia-подобные повреждения, как правило, ассоциированные с заражением Lawsonia intracellularis (илеит), (8) лимфаденопатия, (9) лимфоидное истощение и/или (10) уровень многоядерных/гигантских гистоцитов, (11) синдром свиного дерматита и нефропатии (PDNS), (12) ассоциированная с PCVAD смертность, (13) ассоциированная с PCVAD потеря массы, (14) относительная вариабельность роста, (15) относительная частота появления «карликовых» животных, (16) относительное совместное заражение комплексом возбудителей репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRSV). Указанная иммуногенная композиция обладает эффективностью также в отношении повышения экономической важности параметров роста, таких как время до убоя, масса мясной туши, относительное содержание тощей массы. Таким образом, понятие «клинические симптомы» в контексте настоящего описания означают, но не ограничиваясь только ими, (1) интерстициальную пневмонию, сопровождающуюся интерглобулярным отеком, (2) бледность кожи или желтуху новорожденных, (3) пятнистую атрофию печени, (4) язву желудка, (5) нефрит и (6) репродуктивные нарушения, такие, например, как выкидыш, мертворождение, высыхание плода в матке и т.д., (7) Pia-подобные повреждения, как правило, ассоциированные с заражением Lawsonia intracellularis (илеит), (8) лимфаденопатию, (9) лимфоидное истощение и/или (10) уровень многоядерных/гигантских гистоцитов, (11) синдром свиного дерматита и нефропатии (PDNS), (12) ассоциированную с PCVAD смертность, (13) ассоциированную с PCVAD потерю массы, (14) относительную вариабельность роста, (15) относительную частоту появления «карликовых» животных, (16) относительное совместное заражение комплексом возбудителей репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRSV). Кроме того, антигенная композиция, представленная в настоящем описании, снижает общую нагрузку цирковируса, включая более позднее начало, укороченную продолжительность и более ранее окончание виремии, а понижение вирусной нагрузка и ее иммуносупрессорного действия на молодых животных, в частности имеющих антитела к PCV2 в день вакцинации, приводит к более высокому уровню общей устойчивости к заболеванию и снижению случаев ассоциированных с PCV2 заболеваний и симптомов.
Таким образом, еще одним объектом изобретения является способ лечения или профилактики заражения PCV2 или снижения клинических симптомов, вызываемых или ассоциированных с заражением PCV2, у молодых животных и/или у животных, которые имеют антитела к PCV2, заключающийся в том, что вводят в эффективном количестве антиген PCV2 или иммуногенную композицию, содержащую антиген PCV2, животному, которое нуждается в таком лечении, где клинические симптомы выбирают из группы, включающей: (1) интерстициальную пневмонию, сопровождающуюся интерглобулярным отеком, (2) бледность кожи или желтуху новорожденных, (3) пятнистую атрофию печени, (4) язву желудка, (5) нефрит и (6) репродуктивные нарушения, такие, например, как выкидыш, мертворождение, высыхание плода в матке и т.д., (7) Pia-подобные повреждения, как правило, ассоциированные с заражением Lawsonia intracellularis (илеит), (8) лимфаденопатию, (9) лимфоидное истощение и/или (10) уровень многоядерных/гигантских гистоцитов, (11) синдром свиного дерматита и нефропатии (PDNS), (12) ассоциированную с PCVAD смертность, (13) ассоциированную с PCVAD потерю массы, (14) относительную вариабельность роста, (15) относительную частоту появления «карликовых» животных, (16) относительное совместное заражение комплексом возбудителей репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRSV). Таким образом, еще одним объектом настоящего изобретения является способ лечения или профилактики заражения PCV2 или снижения клинических симптомов, вызываемых или ассоциированных с заражением PCV2, у молодых животных, заключающийся в том, что вводят в эффективном количестве антиген PCV2 или иммуногенную композицию, содержащую антиген PCV2, животному, которое нуждается в таком лечении, где клинические симптомы выбирают из группы, включающей: (1) интерстициальную пневмонию, сопровождающуюся интерглобулярным отеком, (2) бледность кожи или желтуху новорожденных, (3) пятнистую атрофию печени, (4) язву желудка, (5) нефрит и (6) репродуктивные нарушения, такие, например, как выкидыш, мертворождение, высыхание плода в матке и т.д., (7) Pia-подобные повреждения, как правило, ассоциированные с заражением Lawsonia intracellularis (илеит), (8) лимфаденопатию, (9) лимфоидное истощение и/или (10) уровень многоядерных/гигантских гистоцитов, (11) синдром свиного дерматита и нефропатии (PDNS), (12) ассоциированную с PCVAD смертность, (13) ассоциированную с PCVAD потерю массы, (14) относительную вариабельность роста, (15) относительную частоту появления «карликовых» животных, (16) относительное совместное заражение комплексом возбудителей репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRSV).
Композицию, предлагаемую в изобретении, можно вводить орально, внутрикожно, внутритрахеально или внутривлагалищно. Предпочтительно композицию следует вводить внутримышечно или интраназально, наиболее предпочтительно внутримышечно. Может оказаться предпочтительным вводить описанные выше фармацевтические композиции в организм животного внутривенно или путем инъекции непосредственно в ткани-мишени. Для системного введения предпочтительными являются внутривенный, внутрисосудистый, внутримышечный, интраназальный, внутриартериальный, внутрибрюшинный, оральный или внутриоболочечный пути введения. Более локальное введение можно осуществлять подкожно, интрадермально, внутрикожно, внутрисердечно, внутридольково, интрамедуллярно, внутрилегочно или непосредственно в ткань, подлежащую обработке, или в близлежащую область (соединительная, костная, мышечная, нервная, эпителиальная ткань). В зависимости от требуемой продолжительности и эффективности лечения композиции, предлагаемые в изобретении, можно вводить один или несколько раз, а также периодически, например, с интервалом один день в течение нескольких дней, недель или месяцев или с использованием различных доз.
Предпочтительно одну дозу описанной выше иммуногенной композиции вводят внутримышечно индивидууму, нуждающемуся в этом. Еще одним объектом изобретения является антиген PCV2 или иммуногенная композиция, содержащая любой описанный выше антиген PCV2, которую фасуют в пузырьки и вводят из расчета один (1) мл на дозу. Таким образом, еще одним объектом настоящего изобретения является иммуногенная композиция объемом 1 мл, которая содержит описанный выше антиген PCV-2, предназначенная для лечения или профилактики заражения PCV2 или снижения клинических симптомов, вызываемых или ассоциированных с заражением PCV2, у молодых животных путем введения в эффективном количестве антигена PCV2 или иммуногенной композиции, содержащей антиген PCV2, животному, которое нуждается в таком лечении. Таким образом, еще одним объектом настоящего изобретения является также иммуногенная композиция объемом 1 мл, которая содержит описанный выше антиген PCV-2, предназначенная для лечения или профилактики заражения PCV2 или снижения клинических симптомов, вызываемых или ассоциированных с заражением PCV2, у животных, которые имеют антитела к PCV2, путем введения в эффективном количестве антигена PCV2 или иммуногенной композиции, содержащей антиген PCV2, животному, которое нуждается в таком лечении.
Таким образом, еще одним объектом изобретения является по меньшей мере одно дополнительное введение одной дозы иммуногенной композиции, описанной выше, животному, которое нуждается в этом, где второе или любое дополнительное введение осуществляют по меньшей мере через 14 дней после первого или любого другого предыдущего введения. Предпочтительно иммуногенную композицию вводят в сочетании с агентом, стимулирующим иммунитет. Предпочтительно указанный агент, стимулирующий иммунитет, вводят по меньшей мере дважды. Предпочтительно между первым и вторым или любым следующим введением агента, стимулирующего иммунитет, должно пройти по меньшей мере 3 дня, более предпочтительно по меньшей мере 5 дней, еще более предпочтительно по меньшей мере 7 дней. Предпочтительно агент, стимулирующий иммунитет, вводят по меньшей мере через 10 дней, предпочтительно 15 дней, еще более предпочтительно 20 дней, еще более предпочтительно по меньшей мере 22 дня, после первоначального введения иммуногенной композиции, предлагаемой в изобретении. Предпочтительным агентом, стимулирующим иммунитет, является, например, гемоцианин лимфы улитки (KLH), предпочтительно эмульгированный с неполным адъювантом Фрейнда (KLH/ICFA). Однако, как должно быть очевидно, можно применять любой другой агент, стимулирующий иммунитет, известный специалисту в данной области. Понятие «агент, стимулирующий иммунитет» в контексте настоящего описания относится к любому агенту, который может «запускать» иммунный ответ, предпочтительно без инициации или повышения специфического иммунного ответа, например, иммунного ответа на специфический патоген. Кроме того, принято вводить агент, стимулирующий иммунитет, в приемлемой дозе.
Понятие «животное» в контексте настоящего описания включает свинью, молодую (не достигшую половой зрелости) свинью или поросенка.
Подробное описание предпочтительных вариантов осуществления изобретения
Ниже в примерах представлены предпочтительные материалы и процедуры, применяемые в настоящем изобретении. Хотя при воплощении на практике и проверке настоящего изобретения можно применять любые методы и материалы, аналогичные или эквивалентные представленным в настоящем описании, ниже описаны предпочтительные методы, устройства и материалы. Однако следует понимать, что эти примеры даны только с целью иллюстрации и не направлены на ограничение общего объема изобретения.
Пример 1
Получение антигена ORF-2 PCV2
6
6
Начальные культуры клеток линии SF+, взятые из хранящейся в жидком азоте культуры, выращивали в среде Excell 420 (фирма JRH Biosciences, Inc., Ленекса, шт.Канзас) в суспензии в стерильных вращающихся колбах при постоянном перемешивании. Культуры выращивали во вращающихся колбах объемом от 100 до 250 мл, содержащих от 25 до 150 мл бессывороточной среды Excell 420. Когда клетки размножились до клеточной плотности 1,0-8,0×10 клеток/мл, их разделяли, перенося в новые сосуды, используя плотность посева 0,5-1,5×10 клеток/мл. Следующие размножающие культуры выращивали во вращающихся колбах объемом вплоть до 36 л или биореакторах из нержавеющей стали объемом вплоть до 300 л в течение 2-7 дней при 25-29°С.
После посева колбы инкубировали при 27°С в течение 4 ч. Затем в каждую колбу вносили рекомбинантный бакуловирус, содержащий ген ORF-2 PCV2 (SEQ ID NO:4). Рекомбинантный бакуловирус, содержащий ген ORF-2 PCV2, создавали согласно методу, описанному в WO 06/072065. После внесения бакуловируса колбы инкубировали при 27±2°С в течение 7 дней и при этом перемешивали при 100 об/мин в течение этого времени. Колбы закрывали вентиляционными крышками, пропускающими воздушных поток.
После инкубации полученный супернатант собирали, фильтровали для удаления клеточного дебриса и инактивировали. Для инактивации супернатанта его температуру доводили до 37±2°С и к супернатанту добавляли бинарный этиленимин (БЭИ) до конечной концентрации 5 мМ. Последующее перемешивание образца продолжали в течение 72-96 ч. Добавляли 1,0 М раствор тиосульфата натрия до конечной минимальной концентрации 5 мМ для нейтрализации любых остаточных количеств БЭИ. После инактивации ORF-2 PCV2 забуферивали фосфатным буфером и добавляли карбопол до примерно 0,5-2,5 мг/дозу. Конечная доза содержала примерно 16 мкг антигена ORF-2 PCV2.
Пример 2
Иммуноанализ антител к PCV-2
50
Клетки линии PK15 (например, АТСС CCL-33) или VIDO R1, описанные в WO 02/07721, высевали в 96-луночный планшет (примерно 20000-60000 клеток на лунку). Клетки заражали изолятом PCV2, когда конфлюэнтность монослоев достигала примерно 65-85%. Зараженные клетки инкубировали в течение 48 ч. Среду удаляли и лунки отмывали дважды ЗФР. Буфер для отмывки отбрасывали и клетки обрабатывали холодным фиксатором, представляющем собой смесь 50/50 метанол/ацетон (~100 мкл/лунку) в течение примерно 15 мин при температуре примерно -20°С. Фиксатор отбрасывали и планшеты сушили на воздухе. Готовили серийные разведения свиной сыворотки в ЗФР, добавляли в планшеты и инкубировали, давая антителам, если они присутствовали в образцах сыворотки, связываться, в течение примерно 1 ч при 36,5±1°С. Кроме того, параллельно оценивали серийные разведения, положительные в отношении антител к PCV2, и отрицательные контрольные образцы (образцы, представляющие собой положительный контроль и отрицательный контроль). Затем планшеты отмывали трижды ЗФР. ЗФР отбрасывали. Затем планшеты окрашивали поступающим в продажу козьим антисвиным антителом, конъюгированным с ФИТЦ, разведенным в соотношении 1:100 в ЗФР, и инкубировали в течение примерно 1 ч при 36,5±1°С, что давало возможность выявлять антитела, связанные с зараженными клетками. После завершения инкубации микропланшеты изымали из инкубатора, конъюгат отбрасывали и планшеты отмывали дважды ЗФР. Планшеты оценивали с помощью УФ-микроскопа и индивидуальные лунки обозначали как позитивные или негативные. Для оценки тест-системы использовали образцы, представляющие собой положительный контроль и отрицательный контроль. Если результаты, полученные для контролей, находились в ожидаемых пределах, то результаты опыта принимались как приемлемые с позиций метода оценки параметров. Титры сывороточных антител рассчитывали на основе наибольшего разведения, при котором наблюдалась специфическая IFA (метод непрямой иммунофлуоресценции)-реактивность, и определяли количество позитивных лунок для каждого разведения или рассчитывали конечное значение TCID с помощью соответствующей формулы Рида-Менча.
Пример 3
Эффективность ORF-2 PCV2 (Ingelvac CircoFLEX™) в отношении молодых животных, имеющих низкий или высокий титр антител к PCV2
Для изучения возможного взаимодействия вакцины с материнским антителом проводили опыт, в котором титры антител у всех подопытных животных определяли в момент вакцинации, после чего животных группировали по признаку низкого, среднего или высокого титра антител: геометрические средние значения титров <1:100 рассматривались как низкие титры, титры от 1:100 до 1:1000 рассматривались как средние титры, а титры >1:1000 рассматривались как высокие титры антител.
Схема опыта
Для опыта использовали примерно 500 животных. Этих подопытных животных сбалансировано и поровну разделяли на две обрабатываемые группы в зависимости от начального веса тела и принадлежности к определенному приплоду. Всем животные в возрасте 20 дней вводили одну дозу (1 мл) вакцины против PCV2 (Investigational Veterinary Product (исследуемый ветеринарный продукт), IVP) или одну дозу (1 мл) плацебо, содержащего супернатант клеточной культуры с адъювантом (Control Product (контрольный продукт), СР) путем внутримышечной инъекции с правую сторону шеи. Подопытных животных исследовали до конца периода откорма.
Отбирали образцы крови всех животных и затем анализировали с помощью IFAT (метод непрямой иммунофлуоресценции) для определения титров антител в момент вакцинации. Затем определяли корреляцию начальных титров антител и прироста массы. Кроме того, в зависимости от начальных титров антител животных группировали в три класса (низкие, средние и высокие начальные титры антител)) и животных, имеющих «высокий титр», из обеих обрабатываемых групп затем сравнивали в отношении возможных различий в отношении прироста массы и виремии.
Результаты
Начальные титры антител
В момент проведения вакцинации большинство животных имели либо средние титры антител (на уровне от 1:100 до 1:1000), либо высокие титры антител (на уровне >1:1000). Только примерно у 13% животных обнаружены низкие титры антител (на уровне <1:100). Поскольку в момент начала опыта заражение PCV2 отсутствовало, можно предположить, что титры антител в день 0 опыта получены от матери. Никаких существенных различий титров антител в день опыта 0 не обнаружено между двумя обрабатываемыми группами. Данные о количестве животных (в процентах), относящихся к каждому классу титров, представлены на фиг.1.
Корреляция между титрами антител в момент вакцинации и виремией в крови
Для решения вопроса о том, оказывали ли воздействия высокие титра антител (>1:1000) в момент вакцинации виремию, сравнивали вакцинированных и обработанных плацебо животных с высокими титрами антител в отношении начала, конца, продолжительности виремии, количества дней, в которые были получены положительные (в отношении виремии) образцы, и вирусной нагрузки.
В таблице 1 обобщено сравнение параметров виремии у имеющих «высокие титры животных» в обеих обрабатываемых группах.
Таблица 1
Сравнение параметров виремии у имеющих «высокие титры животных» в обеих обрабатываемых группах
Оцениваемый параметр
Обрабатываемая группа
Количество поросят
Среднее значение
Медиана
Р
Начало виремии
СР
38
111,90 дня
113,00 дней
0,7843
IVP
36
109,50 дня
113,00 дней
ns
CP-IVP
2,4 дня
Продолжитель-ность виремии
СР
38
27,00 дней
27,50 дня
<0,0001
IVP
36
17,50 дня
6,50 дня
***
CP-IVP
9,50 дня
Конец виремии
СР
38
138,90 дня
141,00 день
0,0033
IVP
36
127,00 дней
122,50 дня
**
CP-IVP
11,9 дня
Кол-во дней получения положительных образцов
СР
39
3,70 дня
3,00 дня
0,0082
IVP
47
1,80 дня
1,00 день
**
CP-IVP
1,9 дня
Среднее значение суммы gE (log 10)
СР
39
18,79gE
17,21 gE
<0,0001
IVP
47
9,12 gE
5,38 gE
***
CP-IVP
9,67 gE
gE: сумма геномных эквивалентов на мл
Р: p-значение согласно критерию Уилкоксона-Манна-Уитни для сравнения между группами;
ns: не достоверно, p>0,05; ** достоверно, p<0,01; *** достоверно, p<0,001
По сравнению с обработанными плацебо животными, имеющими высокий титр, у вакцинированных животных с высоким титром продолжительность виремии оказалась короче на 9,5 дня, конец виремии наступал раньше на 11,9 дня, на 1,9 дня снижалось количество дней получения положительных в отношении виремии образцов и примерно 2 раза снизилась сумма геномных эквивалентов/мл в процессе опыта. Эти результаты свидетельствуют о том, что IVP даже в присутствии высоких титров материнских антител все еще может существенно снижать виремию в крови (конец виремии, продолжительность виремии, вирусная нагрузка).
Корреляция между титрами антител в момент вакцинации и приростом массы
Далее был изучен вопрос о том, может ли начальный титр антител оказывать какое-либо воздействие на прирост массы в процессе опыта. В таблице 2 представлены данные о корреляции между начальным титром антител и приростом массы в различные моменты времени, для оценки которых применяли коэффициент ранговой корреляции Спирмана и p-значение.
Обнаружена статистически значимая отрицательная корреляция между титром антител и приростом массы в обеих обрабатываемых группах при оценке в период 0-7 недели опыта, что свидетельствует об отрицательном воздействии высоких титров материнских антител на прирост массы на фазе выращивания. Не обнаружено никаких статистически значимых различий между начальным титром антител и приростом массы в другие изученные различные интервалы времени. Таким образом, можно сделать заключение о том, что величина титра материнских антител не оказывает влияние на прирост массы, начиная с возраста 10 недель (неделя 7 опыта), ни у вакцинированных, ни у обработанных плацебо животных.
Таблица 2
Корреляция между титром антител к PCV2 в момент вакцинации и приростом массы тела в процессе опыта
Корреляция между титром антител в момент вакцинации и приростом массы
Недели опыта 0-7
Недели опыта 7-12
Недели опыта 12-17
Недели опыта 17-22
r
-0,09623
0,03501
-0,00521
-0,02774
СР
P
0,0086 **
0,3425 ns
0,8884 ns
0,4617ns
n
744
737
728
706
r
-0,09748
0,04309
-0,00954
0,02694
IVP
P
0,0077 **
0,2440 ns
0,7974 ns
0,4710ns
n
746
733
727
718
r: коэффициент ранговой корреляции Спирмана
P: p-значения критерия при r=0: ns: не достоверно, p>0,05;
Корреляция между титром антител в момент вакцинации и приростом массы
Недели опыта 0-7
Недели опыта 7-12
Недели опыта 12-17
Недели опыта 17-22
** достоверно, p<0,01
n: количество животных
С этими данными согласуются полученные результаты об отсутствии различий в живой массе тела при сравнении животных, имеющих низкие и высокие титры, в вакцинированной группе. На фиг.2 показано, что масса тела после начала виремии (недели 17 и 22 опыта) практически не зависела от начального титра антител (фиг.2).
Кроме того, у вакцинированных животных с высоким титром антител в момент вакцинации (>1:1000) обнаружена также существенно более высокая масса тела в начале виремии по сравнению с обработанными плацебо животными с начальными высокими титрами антител. Как видно из фиг.3, масса тела (LSMean) в неделю 17 и неделю 22 опыта оказалась действительно существенно выше у вакцинированных «животных с высокими титрами» (неделя 17 опыта: 1,55 кг, p=0,0328; неделя 22 опыта: 3,06 кг, p=0,0007), чем у обработанных плацебо «животных с высокими титрами». В сочетании эти данные свидетельствуют об отсутствии взаимосвязи между IVP и титром антител в момент вакцинации.
Заключение
Для изучения возможного воздействия материнских антител оценивали корреляцию начальных титров антител с двумя параметрами эффективности, такими как виремия в крови и живая масса тела. По сравнению с обработанными плацебо «животными с высокими титрами» обнаружены следующие статистически значимые различия с вакцинированными «животными с высокими титрами»:
- снижение потери прироста массы
- более короткая продолжительность виремии и более ранний конец виремии,
- более низкая вирусная нагрузка.
Пример 4
Эффективность ORF-2 PCV2 (Ingelvac CircoFLEX™) для молодых животных, имеющих антитела к PCV2, в отношении лимфоидного истощения, лимфоидного воспаления и лимфоидной иммуноногистохимии (ИГХ)
Целью этого проводимого вслепую с использованием в качестве контрольного заражения вакцинации опыта была оценка возраста, в котором у поросят, вакцинированных вакциной свиного цирковируса типа 2, содержащей убитый бакуловирусный вектор, развивается иммунитет в присутствии полученных от матери антител к свиному цирковирусу типа 2 (PCV2). После контрольного заражения анализировали три основных параметра. Эти три параметра представляли собой лимфоидное истощение, лимфоидное воспаление и результаты лимфоидного иммуноногистохимического анализа (ИГХ). Для демонстрации развития иммунитета в присутствии полученных от матери антител к PCV2 у выращенных в стандартных условиях поросят, вакцинированных вакциной против PCV2 в возрасте 3 недели или 8 недель, должны быть обнаружены статистически значимые различия (p<0,05) в лимфоидном истощении, лимфоидном воспалении и результатах лимфоидного ИГХ по сравнению с поросятами возрастом 3 недели, которых подвергали контрольному заражению контрольным продуктом.
Схема опыта
Сто двадцать (120) выращенных в стандартных условиях поросят возрастом 21 день в день 0 (Д0) разделяли абсолютно произвольно на 5 обрабатываемых групп. В Д0 брали образцы крови всех поросят, при этом:
- животных в группе 1а обрабатывали исследуемым ветеринарным продуктом (IVP; референс-вакцина против PCV2) в возрасте 3 недели,
- животных в группе 16 обрабатывали исследуемым ветеринарным продуктом (IVP; референс-вакцина против PCV2) в возрасте 8 недель
- животных в группе 2 обрабатывали контрольным продуктом (СР) в возрасте 3 недели.
Поросят обследовали в отношении клинических симптомов после вакцинации, начиная с Д1 до Д59. Кроме того, брали образцы крови перед контрольным заражением в Д14, Д28, Д42, Д56 и Д63. Обобщение данных для PCV2-группы, касающихся геометрических средних серологических титров (GMT), полученных перед контрольным заражением, приведены в таблице 3.
Таблица 3
Данные для PCV2-группы, касающиеся геометрических средних серологических титров, полученные перед контрольным заражением
Группа - вариант обработки
PCV2-серологический статус - GMT
Д0
Д14
Д28
Д42
Д56
Д63
Группа 1а, введение IVP в возрасте 3 недели
556,5
252,8
142,0
56,2
32,0
51,3
Группа 1б, введение IVP в возрасте 8 недель
476,2
308,2
151,6
36,2
29,3
48,3
Группа 2, введение СР в возрасте 3 недели
513,8
310,7
134,3
36,9
16,9
24,5
10
50
Всем остальным поросятам вводили по 2,0 мл гемоцианина лимфы улитки (KLH), эмульгированного в неполном адъюванте Фрейнда (ICFA), IM (внутримышечно) в Д60 (день после контрольного заражения (ДПК) - 3) и Д66 (ДПК 3). В день Д63 (ДПК 0) остальным поросятам вводили по 1,0 мл материала для контрольного заражения PCV2, полученного из Ветеринарной диагностической лаборатории Университета штата Айова (Iowa State University Veterinary Diagnostic Laboratory) (ISUVDL) (4,75 log TCID/мл) IM, и 1,0 мл такого же материала IN (интраназально). В день контрольного заражения и периодически после контрольного заражения определяли массу тела, ректальную температуру, проводили клиническое обследование, брали образцы крови и мазки из носа. При аутопсии каждого поросенка определяли макроскопические повреждения и получали образцы легкого и лимфоидной ткани. Ткань легкого и лимфоидную ткань оценивали в ISUVDL с помощью микроскопа в отношении повреждений и в отношении антигена PCV2 с помощью ИГХ-анализа. Общее описание фазы опыта, включающей контрольное заражение, представлено ниже в таблице 4.
Таблица 4
Фаза опыта, включающая контрольное заражение
Группа - вариант обработки
Кол-во
KLH/ ICFA в Д60(ДПК 3)
Контрольное заражение PCV2 в Д63 (ДПК 0)
KLH/ ICFA в D66 (ДПК 3)
День проведения аутопсии
Группа 1а, введение IVP в возрасте 3 недели
20
Да
Да
Да
Д87 (ДПК 24) или Д88 (ДПК 25)
Группа 1б, введение IVP в возрасте 8 недель
21
Да
Да
Да
Д87 (ДПК 24) или Д88 (ДПК 25)
Группа 2, введение СР в возрасте 3 недели
20
Да
Да
Да
Д87 (ДПК 24) или Д88 (ДПК 25)
В Д86 средние геометрические значения титров составляли 906,6, 2447,1 и 2014,9 соответственно.
Результаты
После осуществления контрольного заражения PCV2 в Д63 и последующей аутопсии для группы 1а обнаружено статистически значимое снижение доли поросят, позитивных в отношении лимфоидного истощения (p=0,0084), снижение доли поросят, позитивных в отношении лимфоидного воспаления (р=0,0079), и снижение доли поросят, ИГХ-позитивных в отношении лимфоидной ткани (р=0,0031), во всех случаях при сравнении с группой 2. После контрольного заражения PCV2 для группы 1б обнаружено статистически значимое снижение доли поросят, позитивных в отношении лимфоидного истощения (р=0,0148), снижение доли поросят, позитивных в отношении лимфоидного воспаления (р=0,0036), и снижение доли поросят, ИГХ-позитивных в отношении лимфоидной ткани (р=0,0013). Обобщение первичных параметров эффективности, полученных в группах 1а, 1б и 2, представлено в таблице 5.
Таблица 5
Обобщение первичных параметров эффективности, полученных в группах 1а, 1б и 2
Группа-вариант обработки
PCV2-серологический статус в день 0
Лимфоидное истощение (+/всего)
Лимфоидное воспаление (+/всего)
Лимфоидная ткань по данным ИГХ (+/всего)
Группа 1а, введение IVP в возрасте 3 недели
Серопозитивный
1/20 (5%) *р=0,0084
3/20 (15%) *р=0,0079
3/20 (15%) *р=0,0031
Группа 1б, введение IVP в возрасте 8 недель
Серопозитивный
2/21 (9,5%) *р=0,0148
3/21 (14,3%) *р=0,0036
3/21 (14,3%) *р=0,0013
Группа 2, введение СР в возрасте 3 недели
Серопозитивный
9/20 (45%)
12/20 (60%)
13/20 (65%)
* p-значение относительно группы 2 - точный критерий Фишера
Обнаружено существенное различие между группами 1а и 1б относительно группы 2 при сравнении результатов микроскопического обследования легочного воспаления (p≤0,0407), но не выявлено существенного различия между этими группами при сравнении позитивной в отношении PCV2 легочной ткани при ИГХ-анализе (p≥0,2317). Не обнаружено существенного различия между группами 1а и 1б относительно группы 2 при сравнении клинических симптомов после вакцинации, ADG (средний суточный прирост массы), клинических признаков после контрольного заражения, гипертермии, носовых выделений PCV2, % общего легочного балла и лимфаденопатии.
Таким образом, животные группы 1а, вакцинированные в возрасте 3 недель и имеющие величину GMT 556,6 в момент вакцинации, оказались в значительной степени защищенными от лимфоидного истощения, лимфоидного воспаления и от того, чтобы их лимфоидная ткань оказалась позитивной в отношении антигена PCV2 по данным ИГХ-анализа, по сравнению с группой 2. Животные группы 1б, вакцинированные в возрасте 8 недель и имеющие величину GMT 151,6 за 1 неделю до вакцинации, оказались в значительной степени защищенными от лимфоидного истощения, лимфоидного воспаления и от того, чтобы их лимфоидная ткань оказалась позитивной в отношении антигена PCV2 по данным ИГХ-анализа, по сравнению с группой 2. Поросята, имеющие полученные от матери антитела к PCV2, оказались защищенными от ассоциированной с цирковирусом болезни свиней (PCVAD), когда их вакцинировали в возрасте 3 недель.