Биосинтетические характеристики мутантного штамма 2Р-15 в присутствии экзогенных аминокислот

Вісник Дніпропетровського університету. Біологія. Екологія. - 2008. - Вип. 16, т. 1. - С. 78-83. Visnyk ofDnipropetrovsk University. Biology. Ecology. - 2008. - Vol. 16, N 1. - P. 78-83.

УДК 579.22+577.15

И. В. Жерносекова, А. А. Тымчук, А. Г. Понизовцева,

Н. П. Черногор, А. И. Винников

Днепропетровский национальный университет

БИОСИНТЕТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ МУТАНТНОГО ШТАММА 2Р-15 В ПРИСУТСТВИИ ЭКЗОГЕННЫХ АМИНОКИСЛОТ

Досліджено дію екзогенних амінокислот на прояв біосинтетичної активності рифампіци-ностійкого штаму 2Р-15. Показано, що амінокислоти в оптимальних концентраціях (50, 100, 200 мкг/мл) викликають максимальне збільшення синтезу білка, накопичення біомаси, активності стафілолітичних ферментів і продуктивності стрептоміцету в умовах глибинної ферментації. Всі досліджені амінокислоти забезпечили підвищення стимулювальної активності штаму в 2,0-3,7 раза.

I. V. Zhernosekova, А. А. Tymchuk, А. G. Ponizovtseva,

N. P. Chernogor, А. I. Vinnikov

Dnipropetrovsk National University

BIOSINTHETICAL DESCRIPTION OF MUTANT STRAIN 2Р-15 IN THE PRESENCE OF EXOGENOUS AMINO ACIDS

The effect of exogenous amino acids on the biosynthetical activity of 2P-15 rifampycin -resistant strain was studied. Addition of the amino acids to the medium for the 2P-15 cultivation in the optimal concentrations (50, 100, 200, ^g/ml) entailed the augmentation of a synthesis of protein, biomass, activity of staphylococcus-lytic enzymes and strain’s productivity in the conditions of deep fermentation. All studied amino acids ensure the increase of stimulating activity of the mutant 2P-15 strain 2.0-3.7 times.

Введение

Коммерческое производство продуктов, которые синтезируются микроорганизмами в результате их жизнедеятельности, является приоритетом традиционной биотехнологии. В последнее время существенно расширился список ценных биотехнологических продуктов, с помощью которых преодолеваются продовольственные, энергетические, сырьевые и экологические проблемы. Для создания высококачественного продукта необходимо наличие высокоактивных культур микроорганизмов - продуцентов биологически активных веществ, получение которых возможно как традиционными методами селекции, пропластированием, так и методами генетической инженерии [3; б; І4; І5].

Известно, что для реализации высокой активности штаммов продуцентов большое значение имеют физико-химические показатели среды, источники питания, экзогенные факторы роста: аминокислоты, пурины, пиримидины, требуемые в малых количествах [І5; І7; 1S]. У многих микроорганизмов потребности в питательных веществах изучены пока недостаточно и их удается культивировать лишь на средах, содержащих сложные природные компоненты, такие как сыворотка крови, жидкость

© И. В. Жерносекова, А. А. Тымчук, А. Г. Понизовцева, Н. П. Черногор, А. И. Винников, 200S 7S

рубца, дрожжевой автолизат или пептоны [4; 16]. Микроорганизмы способны изменять свой обмен в соответствии с изменениями окружающей среды, что открывает возможность для управления их ростом и ферментативной активностью [3; 17].

Применение различных стимуляторов вызывает изменение метаболических процессов у микроорганизмов в сторону увеличения выхода конечного продукта, повышения окислительно-восстановительных процессов, биосинтеза белка и проницаемости клеточных мембран [17; 20]. Особого внимания заслуживают стимуляторы химической природы - ростовые факторы и предшественники синтеза макромолекул, а именно аминокислоты. Так, внесение гистидина и глутаминовой кислоты в среду культивирования грибов - продуцентов пектолитических ферментов - вызывает усиление их роста и активизацию синтеза энзимов [1]. Экзогенный метионин усиливает синтез щелочных и нейтральных экзопротеаз у Acremonium chrysogenum [13], лизин - биосинтез цефалоспорина С у С. aeramonium [26], а также пенициллина у Р. chrysogenum [25], глутаминовая кислота повышает выход тилозина у S. fradiae [21]. Кроме того, аланин и цистеин усиливают в 1,5-3,0 раза рост и накопление белка в мицелии гриба Fusarium [7]. Ауксинообразование у фото- и гетеротрофных бактерий [8; 10; 11] также усиливается под воздействием экзогенных аминокислот. Добавление триптофана в концентрациях 50-200 мкг/мл в среды выращивания культур Sphingomonas sp. 18, Mycobacterium sp. 1, Rhizobium sp. 5 увеличивает образование ауксина (ИУК) в 28, 30 и 34 раза, а к бактериям Rhodococcus sp. 37 и Pseudomonas sp. 24 - в 124 и 103 раза соответственно [19]. Эксперименты in vitro показали, что только некоторые бактериальные культуры могут синтезировать небольшое количество ИУК без добавления экзогенного триптофана, являющегося его метаболическим предшественником [9; 23].

Учитывая, что аминокислоты служат строительными блоками для образования основных компонентов микробных клеток - белков, а также ферментов, способствуя усилению биосинтетических процессов у многих микроорганизмов, целью данной работы было установить влияние экзогенных аминокислот на проявление биосинтетических свойств мутантного штамма стрептомицета 2Р-15.

Материал и методы исследований

Объектом исследования был штамм стрептомицета, устойчивый к рифампици-ну - Streptomyces recifensis var. lyticus 2P-15, синтезирующий комплекс бактериоли-тических ферментов и стимулятор роста [6; 20]. Исследования литической активности продуцента проводили с использованием музейного штамма S. aureus 209 Р; стимулирующей активности - промышленного штамма C. tropicalis 51. Биосинтетическую активность определяли при глубинном культивировании штамма-продуцента на ферментационной среде на протяжении 72 ч при +28°С, в рабочем объеме среды 50 мл и частоте вращения качалки 220 об./мин. [6]. Массу мицелия стрептомицета, отфильтрованного, отмытого 5 % раствором ТХУ и высушенного при +105°С до постоянного веса, определяли весовым методом и выражали в мг/мл. В работе использовали аминокислоты фирмы «Реахим», которые добавляли после стерилизации до конечной концентрации 50, 100, 200 мкг/мл. Стафилолитическую активность определяли турбидиметрическим методом Isono [4] и выражали в ед./мл или ед./мг белка. Белок в пробах определяли методом Bradford [28].

При исследовании ростстимулирующей активности продуцента фильтраты культуральной жидкости (КЖ) предварительно инактивировали автоклавированием. Исследуемые растворы, разведенные 1:10, вносили в стерильную синтетическую сре-

среду Ридера из расчета 1 % от объема. Инокулятом служила суточная агаризованная культура дрожжей, приготовленная по стандарту мутности 10. О ростстимулирую-щей активности штамма 2Р-15 судили по величине прироста биомассы дрожжей в сравнении с контролем, которую выражали в %. Накопление биомассы дрожжей оценивали оптическим методом на КФК 2 МП при 590 нм в кювете шириной 0,5 см. Стимулирующую активность рассчитывали по формуле, предложенной Н. П. Черно-гор [20], и выражали в ед./мл. Все эксперименты проводили в трех повторностях и обрабатывали статистически.

Результаты и их обсуждение

Синтез белка штаммом 2Р-15 в присутствии треонина (табл. 1) увеличился при действии всех исследуемых концентраций, достигнув максимального показателя 156 % к контролю. Показатели синтеза белка при минимальной (50 мкг/мл) и максимальной (200 мкг/мл) концентрации кислоты также превысили контроль, но в меньшей степени, и составили 147 и 139 % соответственно. Очевидно, концентрация треонина 100 мкг/мл является оптимальной для стрептомицета, вызывая самое большое увеличение биосинтеза белка. Из данных литературы известно, что треонин не формирует аминокислотного фонда в микробной клетке, а немедленно сразу после проникновения включается в белок [2]. В присутствии ароматической аминокислоты триптофана биосинтез белка у продуцента стал выше контрольного уровня на 27 % только при минимальной ее концентрации. Известно, что ароматические аминокислоты полностью в неизменном виде используются микробной клеткой на биосинтетические цели [2].

Таблица 1

Биосинтетические характеристики штамма 2Р-15 в присутствии аминокислот

Концентрация, мкг/мл Белок Биомасса Литическая активность Удельная активность Продуктив- ность Удельная скорость роста, ц

мг/мл % от К мг/мл % от К ед/мл % от К ед./мг коэфф. разл. ед./мг % от К -1 ч коэфф. разл.

Контроль(без аминокислоты) 0,33 100 11,5±0,06 100 2800±148 100 8485 1,0 243,5 100 0,16 1,0

Трипто- фан 50 100 200 0,421 127 11,6±0,08* 101 4000±224 143 9501 1,1 344,8 141 0,16 1,0

0,289 87 11,6±0,06* 101 3733±96 133 12916 1,5 321,8 132 0,16 1,0

0,296 90 10,0±0,10 87 2600±132* 93 8783 1,0 260,0 107 0,14 0,9

Трео- нин 50 100 200 0,484 147 10Д±0,10 89 3733±101 133 7713 0,9 366,0 150 0,14 0,9

0,515 156 15,0±0,08 130 3733±98 133 7248 0,8 248,9 102 0,21 1,3

0,460 139 16,6±0,12 144 3200±82* 114 6956 0,8 192,8 79 0,23 1,4

Глута- миновая к-та 50 100 200 0,242 73 13,2±0,05 115 3466±86 124 14322 1,7 262,6 108 0,18 1,1

0,234 71 12,4±0,08 108 3466±82 124 14812 2,1 279,5 115 0,17 1,1

0,265 80 24,4±0,14 212 3200±79* 114 12075 1,4 131,1 54 0,34 2,1

Арги- нин 50 100 200 0,234 71 14,2±0,13 123 4533±183 162 19371 2,3 319,2 131 0,20 1,2

0,289 87 22,6±0,10 196 3200±96* 114 11073 1,3 141,6 58 0,31 1,9

0,242 73 10,8±0,06 94 4000±160 143 16529 1,9 370,4 152 0,15 0,9

Примечание: * -р < 0,05.

Присутствие аминокислот (глутаминовой, аргинина) не вызвало увеличения синтеза белка у мутантного штамма 2Р-15 ни в одной из исследуемых концентраций. Их показатели ниже контрольного уровня (колебались в пределах 71-87 %). Это объясняется тем, что глутаминовая кислота очень быстро образует внутриклеточный пул, но он только частично расходуется для биосинтеза, а аргинин образует относи-

тельно большой пул, который сохраняется в течение очень большого промежутка времени без каких бы то ни было изменений [2].

Все исследуемые аминокислоты обеспечили увеличение накопления биомассы штаммом на разных уровнях. Присутствие экзогенного треонина способствовало повышению биомассы на 30-44 % при соответствующих концентрациях 100200 мкг/мл. Это связано с повышением удельной скорости роста ц в 1,3 и 1,4 раза по сравнению с контролем. Глутаминовая кислота и аргинин увеличили накопление биомассы штамма до максимального значения 212 и 196 % соответственно, где ц превысила контроль в 2,1 и 1,9 раза. Аминокислота триптофан не вызывала активного накопления биомассы, так как ц колебалась в пределах контрольного уровня.

Анализируя активность стафилолитических ферментов, синтезируемых продуцентом, следует отметить, что все исследуемые аминокислоты вызывают повышение активности стафилолизинов в пределах от 114 до 162 %. Максимальный показатель активности выявлен в присутствии аргинина в концентрации 50 мкг/мл, что и обеспечило самый высокий показатель удельной активности на уровне 19371 ед./мг. Известно, что синтез ферментов усиливается в присутствии экзогенных аминокислот, вносимых в питательную среду для культивирования плесневых грибов, вследствие непосредственного включения их в молекулу активного белка. Авторы полагают, что «аминокислоты-стимуляторы» компенсируют недостающие свободные внутриклеточные аминокислоты, необходимые для синтеза фермента [17].

Поскольку в большинстве опытов стабильные биосинтетические характеристики штамма 2Р-15 были получены нами с использованием экзогенного треонина, представляло интерес выяснить возможность замены в среде культивирования продуцента источника азотного питания, а именно соли МНМО3 на треонин в концентрации 100 мкг/мл. Из литературы известно, что аминокислоты служат вторыми по значению питательными субстратами после сахаров и являются для бактерий источниками углерода, азота и энергии [5; 16]. Замена источника азота на треонин привела к снижению всех исследуемых биосинтетических характеристик мутантного штамма 2Р-15 (табл. 2).

Таблица 2

Биосинтетические характеристики штамма 2Р-15 при замене источника азотного питания

Вариант опыта Белок Биомасса Литическая активность Удельная активность Продуктив- ность

мг/мл % от К мг/мг % от К ед/мл % от К ед./мг коэфф. разл. ед./мг % от К ч-1 % от К

Контроль 0,46 100 9,6±0,04 100 2089±70,81 100 4541 1,0 217,6 100 0,13 100

Опыт Л 0,104 22 8,58±0,03* 89 1044±34,66* 50 10038 2,2 122,0 56 0,12 92

Примечание: Л - среда с заменой источника азота; * -р > 0,05.

Уровень белка был снижен на 78 %, накопление биомассы стрептомицетом не превышало контрольного уровня и достигло лишь 89 %, активность стафилолитичес-ких ферментов, лизирующих клетки стафилококка, уменьшилась в 2 раза. Наблюдалось также снижение продуктивности штамма на 44 % на фоне уменьшения удельной скорости роста клеток стрептомицета на 8 %. Таким образом, замена источника азотного питания (КНКОз) аминокислотой треонином, которая привела к снижению всех биосинтетических параметров продуцента, нецелесообразна, так как эта среда оказалась несбалансированной по азотному питанию. Подобное изменение В. Г. Де-бабов объясняет при переносе клеток с полноценной среды на минимальную, когда

одновременно с замедлением скорости роста наблюдается резкое уменьшение синтеза стабильных типов РНК (рРНК и тРНК), при этом не возрастает активность ряда ферментов (триптофансинтетазы, гомосериндегидрогеназы, треаниндезаминазы) биосинтеза аминокислот, что очевидно, является причиной задержки роста [3].

При исследовании стимулирующей активности штамма 2Р-15 на клетках Candida tropicalis, получено увеличение оптической плотности (ОД) клеток дрожжей при внесении КЖ в концентрации 1 %. Максимальный прирост биомассы дрожжей (А, %) в присутствии аргинина составил 282 % (табл. 3).

Таблица З

Стимулирующая активность штамма 2Р-15 на клетках Candida tropicalis

Вариант опыта Конц. КЖ, % Оптическая плотность, ОД 590 нм Стимулирующая активность Белок Удельная стимулирующая активность

X±m % от К Д% контр. КЖ, % ед./мл % от К мг/мл ед./мг коэфф. различия

Контроль без КЖ 0 0,17i0,03 100 0 - 0 - - - -

КЖ без аминокислот 1 0,30i0,08* 176 76 100 2530 100 0,33 7666 1,0

КЖ + триптофан 50 1 0,43i0,10* 253 153 143 5100 201 0,42 12143 1,6

КЖ + треонин 100 1 0,46i0,05 270 170 153 5670 224 0,52 10904 1,4

КЖ + глутаминовая кислота 100 1 0,39i0,05 229 129 130 4300 170 0,23 18696 2,4

КЖ + агринин 100 1 0,65i0,03 382 282 217 9400 371 0,29 32414 4,2

Примечание: * -р < 0,05.

Уровень стимулирующей активности продуцента в контроле (КЖ без аминокислоты) достиг 2530 ед ./мл, в присутствии экзогенного триптофана - 5100, треонина -5670, глутаминовой кислоты - 4300, аргинина - 9400 ед./мл. Увеличилась также удельная стимулирующая активность в 1,4-4,2 раза по сравнению с контролем.

Выводы

Внесение экзогенных аминокислот в среду выращивания штамма 2Р-15 положительно повлияло на биосинтетическую активность продуцента. Активно увеличился синтез белка на 56 % при внесении треонина, выход биомассы стрептомицета - на 112 % в присутствии глутаминовой кислоты, активность стафилолизинов - на 62 % при добавлении аргинина, продуктивность штамма - на 50-52 % в присутствии треонина и аргинина. Внесение триптофана повысило стимулирующую активность продуцента в 2,0 раза, треонина - в 2,2, глутаминовой кислоты - в 1,7, аргинина - в 3,7 раза.

Библиографические ссылки

1. Астапович Н. И. Нуклеотидный фонд и метаболизм микробной клетки. - Минск, 1979. -150 с.

2. Гершанович В. Н. Транспорт аминокислот, полипептидов и органических кислот у бактерий. - М.: Медицина, 1977. - 184 с.

3. Дебабов В. Г. Современные методы создания промышленных штаммов микроорганизмов / В. Г. Дебабов, В. А. Лившиц // Биотехнология. - М.: Высшая школа, 1988. - Т. 2. - 208 с.

4. Джавец Э. Руководство по медицинской микробиологии / Э. Джавец, Д. А. Мельник,

Э. А. Эйдельберг. - М.: Медицина, 1982. - Т. і. - 368 с.

5. Елинов Н. П. Химическая микробиология. - М.: Высшая школа, 1989. - 448 с.

6. Жерносекова И. В. Изменчивость продуцента литических ферментов Streptomyces re-

cifensis var. lyticus и его селекция. Дис. ... канд. биол. наук. - К., 2002. - 150 с.

7. Закордонец Л. А. Влияние аланина и цистеина на образование биологически активных веществ Fusarium sp. / Л. А. Закордонец, С. М. Супрун // Микробиол. журн. - 1983. -Т. 45, № і. - С. 39-43.

8. Иванова Е. Г. Аэробные метилобактерии синтезируют ауксины / Е. Г. Иванова, И. В. Доронина, Ю. А. Троценко // Микробиология. - 200і. - Т. 70, № 4. - С. 452-458.

9. Кравченко Л. В. Роль корневых экзометаболитов в интеграции макроорганизма с растениями. Автореф. дис. ... д-ра биол. наук. - М., 2000. - 51 с.

10. Мишке И. В. Микробные фитогормоны в растениеводстве. - Рига: Зинатне, 1988. - 151 с.

11. Мордухова Е. А. Синтез фитогормона индол-3-уксусной кислоты ризосферными бактериями рода Pseudomonas / Е. А. Мордухова, И. П. Скворцова, В. В. Кочетков // Микро-

биология. - 1991. - Т. 60, № 3. - С. 494-500.

12. Муронец Е. М. Синтез индолилуксусной кислоты сапрофитной ассоциативной бактерией Agrobacterium radiobacter / Е. М. Муронец, И. В. Белавина, Т. И. Митронова // Микробиология. - 1997. - Т. 66, № 4. - С. 506-513.

13. Новак М. И. Регуляция биосинтеза цефалоспорина С у штаммов Acremonium chry-sogenum // Проблемы изыскания и биотехнологии новых антибиотиков. - Пущино, 1982. - С. 23.

14. Прист Ф. Внеклеточные ферменты микроорганизмов. - М.: Мир, 1987. - 117 с.

15. Промышленная микробиология / Под ред. И. С. Егорова. - М.: Высшая школа, 1989. - 688 с.

16. Современная микробиология. Прокариоты / Под ред. Й. Ленгелера. - М.: Мир, 2005. -Т. і. - 656 с.

17. Стимуляция жизнедеятельности микроорганизмов и вирусов / Под ред. М. Х. Шигае-вой. - Алма-Ата: Иаука, 1986. - 184 с.

18. Тимаков В. Д. Микробиология. - М.: Медицина, 1983. - 512 с.

19. Цавкелова Е. А. Образование ауксинов бактериями, ассоциированными с корнями орхидей / Е. А. Цавкелова, Т. А. Чердынцева, А. И. Иетрусов // Микробиология. - 2005. -Т. 74, № і. - С. 55-62.

20. Чорногор Н. П. Дослідження рістстимулюючих властивостей лізоензимного препарату Streptomyces recifensis variant lyticus. Автореф. дис. ... канд. біол. наук. - К., 1998. - 20 с.

21. Штейман Б. Р. Влияние некоторых аминокислот и других соединений на биосинтез тирозина / Б. Р. Штейман, Е. А. Середенко, А. М. Макухина // Проблемы изыскания и биотехнологии новых антибиотиков. - Пущино, 1982. - С. 36-37.

22. Bradford M. M. A rapid and sensitive method for the guantitation of microgram guantities of protein utilizing the principle of protein-dye-binding // Anal. Biochem. - 1976. - Vol. 72 і. -P. 1117-1123.

23. Fallik E. Morphology and physiology of plant roots associated with Azospirillum / E. Fallik, Y. Okon // Ed. V. Okon. - London: C. R. C. - 1994. - P. 77-86.

24. Isono M. Bacteriolytic enzyme and process for the production there of. Pat. 3649454 USA, C 12 K 1/06 / M. Isono, T. Takahashi. Y. Yamadzaki. - Pat. 1004.72.

25. Luengo J. M. Lisine regulation of penicillin biosinthesis in low producing and industrial strains of Penicillium chrisogenum / J. M. Luengo, G. Revilla // J. Gen. Microbiol. - 1979. - Vol. 115. -P. 207-2і і.

26. Menta R. Lysine stimulation of cephalosporin C synthesis in C. aeramonium / R. Mehta, J. L. Speth, C. H. Nach // Eur. J. Appl. Microb. and Biotech. - 1979. - Vol. 8. - P. 177-180.

Надійшла до редколегії l5.04.2007