КАНТИЛЕВЕРНЫЙ СЕНСОР ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОСТАТ-СПЕЦИФИЧЕСКОГО АНТИГЕНА

Полезная модель относится к области биофизики и касается кантилеверного сенсора для определения простат-специфического антигена (ПСА), который может быть использован, например, для раннего обнаружения рака предстательной железы человека (РПЖ).
Известен кантилеверный сенсор для определения ПСА, состоящий из плоской гибкой консоли, одна из плоскостей которой покрыта золотом, и содержит молекулы, специфически распознающие простат-специфический антиген (Jeong Hoon Lee, Kyo Seon Hwang, Jaebum Park, Ki Hyun Yoon, Dae Sung Yoon, Tae Song Kim // Immunoassay of prostate-specific antigen (PSA) using resonant frequency shift of piezoelectric nanomechanical microcantilever, Biosensors and Biolectronics, 20, 2005, 2157-2162).
Наиболее близким к заявляемому является известный кантилеверный сенсор для определения ПСА, состоящий из плоской гибкой консоли, одна из плоскостей которой покрыта золотом, и содержит молекулы, специфически распознающие ПСА (Guanghua Wu, Ram H. Datar, Karolyn M. Hansen, Richard J. Cote and Arun Majumbar // Bioassay of prostate-specific antigen (PSA) using microcantilever / Nature biotechnology, V.19, 2001, 856-860) - прототип. В данном техническом решении кантилевер, представляет собой консоль, выполненную из кремния, одна из плоскостей которого покрыта слоем напыленного золота. Позолоченная плоскость консоли содержит молекулы антитела, специфически распознающего ПСА.
Недостатком известного технического решения является недостаточная чувствительность сенсора для определения ПСА, зависящая от состава жидкой среды и составляющая для модельной системы, аналогичной сыворотки крови человека, 0,2 нанограмм/миллилитр (нг/мл), не позволяющая достоверно регистрировать низкие концентрации ПСА в жидкой среде и, тем самым, не позволяющая выявлять ранние стадии заболевания РПЖ.
Задача полезной модели заключается в создании кантилеверного сенсора для определения ПСА, обладающего более высокой чувствительностью, а также расширение арсенала технических средств, которые могут быть использованы в качестве сенсора для определения ПСА.
Указанный технический результат достигается тем, что в кантилеверном сенсоре для определения ПСА, состоящем из плоской гибкой консоли, одна из плоскостей которой покрыта золотом, и содержит молекулы, специфически распознающие простат-специфический антиген, в качестве молекул, специфически распознающих простат-специфический антиген, использованы фрагменты иммуноглобулина с тиоловой группой, специфически распознающего простат-специфический антиген.
Предлагаемый кантилеверный сенсор для определения ПСА не описан в научно-технической литературе и является новым.
Предлагаемое техническое решение может быть использовано для анализа жидких сред, например, таких как природные биологические жидкости (сыворотка крови человека, моча и т.д.), и модельных водных растворов, содержащих ПСА.
В предложенной полезной модели геометрические размеры консоли могут быть различны в пределах размеров кантилеверов, используемых в атомно-силовой микроскопии, что обусловлено тем, что полезным сигналом на присутствие ПСА в исследуемой биологической среде является механическая деформации консоли - изгиб, о степени которого, можно судить, например, по отклонению луча света, отраженного от поверхности кантилевера. При этом форма кантилевера может быть различной. Следует отметить, что используемый кантилевер обязательно должен быть достаточно гибким, что обусловлено способом регистрации присутствия ПСА в исследуемой жидкой среде, и плоским, что повышает гибкость кантилевера.
В предлагаемом техническом решении, по крайней мере, одна из плоскостей кантилевера должна содержать золото, что обусловлено тем, что именно золотом можно осуществить ковалентное связывание фрагментов иммуноглобулинов с тиоловыми группами. В предлагаемом техническом решении кантилевер может быть выполнен как из кремния, так и из других материалов, например, из металла, из пластика и т.д. При использовании для изготовления кантилевера других материалов кроме золота, необходимо дополнительно осуществить напыление золота на одну из плоскостей кантилевера.
В предлагаемом техническом решении у консоли только одна из плоскостей должна быть покрыта золотом, и содержать молекулы, специфически распознающие ПСА (фрагменты иммуноглобулина с тиоловыми группами). Если у консоли обе плоскости будут содержать молекулы, специфически распознающие ПСА, то полезная модель становится неработоспособной вследствие того, что при взаимодействии ПСА со специфическими фрагментами иммуноглобулина, закрепленными на кантилевере, не будет происходить изгиб кантилевера из-за уравновешивания сил, действующих на каждую из плоскостей кантилевера. Таким образом, в предложенной полезной модели одна из плоскостей содержит закрепленные специфические к ПСА фрагменты иммуноглобулина, а поверхность другой плоскости не может специфически связываться с ПСА. Для понижения реакционной способности плоскости кантилевера не покрытой золотом ее поверхность может быть модифицирована молекулами покрыта бычьего сывороточного альбумина (БСА), молекулами антител неспецифических к ПСА, полиэтиленгликолем и т.д.
В предложенной полезной модели в качестве молекул, специфически распознающие простат-специфический антиген использованы соответствующие фрагменты иммуноглобулина с тиоловой группой. Экспериментально было установлено, что это соединение способно ковалентно связываться с поверхностью консоли, содержащей золото, с образованием монослоя. Также экспериментально было установлено, что с поверхностью кантилевера, не содержащей золото, фрагменты иммуноглобулина с тиоловой группой ковалентно не связывается. Следует отметить, что в предлагаемом техническом решении молекулы фрагменты иммуноглобулина с тиоловой группой, специфически распознающего простат-специфический антиген, должны быть обязательно химически связаны с модифицированной поверхностью кантилевера. Это достигается обработкой модифицированной поверхности кантилевера раствором, содержащим фрагменты иммуноглобулина с тиоловой группой, специфически распознающего простат-специфический антиген, с последующей отмывкой не вступивших в реакцию молекул. После этого на поверхности кантилевера остаются только фрагменты иммуноглобулина, химически связанные с поверхностью кантилевера. Если на поверхности кантилевера кроме связанных также будут присутствовать молекулы фрагменты иммуноглобулина с тиоловой группой, специфически распознающего простат-специфический антиген, несвязанные с кантилевером, то результаты анализа с использованием таких кантилеверов будут недостоверными.
Предлагаемые кантилеверный сенсор на ПСА может быть получен, например, путем использования плоского гибкого кремниевого кантилевера, содержащего на одной из плоскостей напыленный слой золота. Золотую поверхность кантилевера после этого обрабатывают в течение ночи при 4°С раствором молекул фрагментов иммуноглобулина с тиоловой группой, специфически распознающего ПСА, взятых в концентрации 100 мкг/мл в 0,01 молярном (М) K-фосфатном водном буферном растворе с рН 7,2, содержащем 0,15 М NaCl, после чего кантилевер промывают дистиллированной водой. После таких обработок получают плоский гибкий кантилевер, одна из плоскостей которого покрыта золотом, и содержит фрагменты иммуноглобулина с тиоловой группой, специфически распознающего простат-специфический антиген.
Анализ жидкой среды на присутствие в ней ПСА с помощью предлагаемого кантилевера можно проводить как с использованием одного предлагаемого нами кантилевера, так и с использованием дополнительного кремниевого кантилевера сравнения, содержащего на одной из плоскостей напыленный слой золота и обработанного с двух сторон БСА. Кантилевер сравнения необходим для учета влияния побочных факторов среды. Следует отметить, что при использовании одного кантилевера, содержащего напыленный материал, обязательно нужно осуществлять термостатирование исследуемой жидкой среды, чтобы избежать побочного изгиба кантилевера, вызванного разными коэффициентами расширения используемых материалов. Далее кантилевер закрепляют одним концом в жидкостной ячейке системы для определения положения кантилевера. В ячейку вводят сначала жидкую среду, не содержащую ПСА, затем на позолоченную плоскость кантилевера направляют световое излучение. По отклонению светового излучения от отражательной поверхности кантилевера определяют положение кантилевера. Отклонение отраженного луча света регистрируют с помощью позиционно-чувствительного фотодетектора. После того, как система придет в состояние равновесия, раннее используемую жидкую среду вытесняют анализируемой жидкой средой. Изменение отклонения кантилевера свидетельствует о присутствии ПСА в анализируемой жидкой среде. Таким методом можно осуществлять качественное определение ПСА. Если произвести предварительную градуировку системы, то можно осуществлять количественное определение ПСА в жидкой среде. Чувствительность определения (предел обнаружения) ПСА с помощью предложенного и известного кантилеверных сенсоров определяют путем последовательного снижения концентрации ПСА в анализируемой жидкой среде. Чувствительность кантилеверного сенсора для определения ПСА может варьироваться в зависимости от состава жидкой среды.
Преимущества предложенного кантилеверного сенсора для определения ПСА иллюстрируют следующие примеры.
Пример 1.
Опыт проводят с использованием исходного кремниевого кантилевера, представляющего собой плоскую гибкую консоль прямоугольной формы, содержащую на одной плоскости напыленный слой золота, поверхность которого обладает хорошими отражательными способностями. Кантилевер в течение ночи при 4°С обрабатывают раствором фрагментов иммуноглобулина с тиоловыми группами к ПСА в концентрации 100 мкг/мл в 0,01 М калий-фосфатном водном буферном растворе с рН 7,2, содержащем 0,15 М NaCl, после чего кантилевер промывают дистиллированной водой. При этом не позолоченная плоскость кантилевера остается не модифицированной. После этого полученный и обрабатывают в течение 1 ч 1%-ным раствором БСА в том же буферном растворе. В результате на кремниевой поверхности кантилевера сорбируются молекулы БСА, затем кантилевер промывают дистиллированной водой. Получают кантилеверный сенсор на ПСА. У сенсора одна из плоскостей покрыта золотом и содержит фрагменты иммуноглобулина, специфически распознающего ПСА, химически связанные с золотом посредством тиоловой группы.
Полученный кантилевер и кантилевер сравнения (содержащий на одной из напыленный слой золота и обработанный с двух сторон БСА), необходимый для учета влияния побочных факторов среды, закрепляют одним концом в жидкостной ячейке системы для определения положения кантилеверов. В ячейку вводят сначала буферный раствор (0,01 М калий-фосфатный водный буферный раствор с рН 7,2, содержащий 0,15 М NaCl), затем на позолоченные плоскости кантилеверов направляют луч лазера. По отклонению луча от отражательной поверхности кантилеверов определяют положение кантилеверов. Отклонение отраженного луча лазера регистрируют с помощью позиционно-чувствительного фотодетектора. После того как система придет в равновесие производят ввод в жидкостную ячейку того же буферного раствора, содержащего различные концентрации ПСА (от 0 до 120 нг/мл). Разность отклонений предложенного кантилеверного сенсора и кантилевера сравнения, составляющая от 17 нм до 210 нм, свидетельствует о присутствии ПСА в анализируемом растворе. Таким образом, данный кантилеверный сенсор позволяет проводить качественный анализ на ПСА, в модельной системы, аналогичной сыворотки крови человека, с чувствительностью определения 0,1 нг/мл.
Пример 2 (контрольный, с использованием жидкой среды, не содержащей ПСА).
Опыт проводят аналогично примеру 1, однако используют жидкую модельную среду, не содержащую ПСА. Нулевая разность отклонений предложенного кантилеверного сенсора и кантилевера сравнения свидетельствует об отсутствии ПСА в анализируемой жидкой среде.
Пример 3
Опыт проводят аналогично примеру 1, но без кантилевера сравнения, и в качестве исходного кантилевера используют плоский гибкий кремниевый кантилевер с полированной поверхностью, способной отражать световое излучение, на каждой из плоскостей которого содержится диоксид кремния. При этом только одна плоскость кантилевера обработана раствором АПС, а в качестве жидкой среды используют сыворотку крови человека. В ходе эксперимента на кантилеверный сенсор направляют фокусированный луч света от люминесцентного светодиода. Данный сенсор позволяет проводить качественный анализ сыворотки крови на присутствие ПСА с чувствительностью определения 0,5 нг/мл.
Пример 4
Опыт проводят аналогичный примеру один, но без кантилевера сравнения. Чувствительность определения ПСА в модельной системе, аналогичной сыворотки крови человека, составляет 0,1 нг/мл.
Пример 5
Опыт проводят аналогично примеру 1, но без кантилевера сравнения, и в качестве исходного кантилевера используют плоскую гибкую консоль, выполненную из полимерного материала марки SU-8, на одну из плоскостей которого напылен слой золота. В качестве модельной жидкой среды используют буферный раствор (0,01 М калий-фосфатный водный буферный раствор с рН 7,2, содержащий 0,15 М NaCl), дополнительно содержащий другой белок - сывороточный альбумин человека в концентрации 1 мг/мл. В ходе эксперимента на кантилеверный сенсор и кантилевер сравнения направляют фокусированный луч света от ртутной лампы.
Данный сенсор позволяет проводить качественный анализ жидкой среды на присутсвие ПСА с чувствительностью определения 0,1 нг/мл.
Пример 6 (количественный анализ ПСА)
Опыт проводят с использованием кантилеверного сенсора на ПСА, описанного в примере 1, но без кантилевера сравнения. Для количественного определения ПСА проводят предварительную градуировку системы. Для этого проводят эксперименты с пятью различными стандартными пробами, приготовленными на основе сыворотки крови человека и содержащими различные известные концентрации ПСА. На основе полученных экспериментальных результатов строят градуировочную кривую зависимости разности отклонений кантилеверного сенсора на ПСА и сенсора сравнения от концентрации ПСА в сыворотке крови.
После этого аналогичным образом определяют разность отклонений кантилевера для исследуемых образцов сыворотки крови с различными концентрациями ПСА. Разность отклонений в 16-200 нм свидетельствует о том, что анализируемые образцы сыворотки крови действительно содержат ПСА в концентрации 0,5-100 нг/мл.
Также были проведены эксперименты, которые показали, что кантилеверный сенсор, состоящий из плоской гибкой консоли, не будет являться сенсором на ПСА, если он не будет содержать, на одной из плоскостей слой золота. Сенсор также будет неработоспособен, если обе его плоскости будут покрыты рецепторами на ПСА. Кроме того, сенсор будет неработоспособен, если у него одна из плоскостей будет покрыта рецепторами на ПСА, химически незакрепленными на поверхности кантилевера. Сенсор также утрачивает работоспособность, если он не будет плоским или гибким.
Таким образом, из приведенных примеров видно, что предложенный кантилеверный сенсор действительно позволяет проводить качественный и количественный анализ жидких сред на содержание ПСА и позволяет повысить чувствительность определения ПСА в модельной системе, аналогичной сыворотки крови человека, с 0,2 нг/мл (прототип) до 0,1 нг/мл. Кроме того, предложенный сенсор расширяет арсенал технических средств, которые могут быть использованы в качестве сенсора на ПСА.