ШТАММ ГИБРИДНЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНОГО Mus musculus L. - ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ БЕЛКА VP40 ВИРУСА МАРБУРГ (ШТАММ Рорр) (ВАРИАНТЫ), МОНОКЛОНАЛЬНОЕ АНТИТЕЛО, ПРОДУЦИРУЕМОЕ ШТАММОМ (ВАРИАНТЫ), НАБОР ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОЙ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ФОРМАТА "СЭНДВИЧ" ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ МАТРИКСНОГО БЕЛКА VP40 ВИРУСА МАРБУРГ (ШТАММ Рорр)
STRAIN OF HYBRID ANIMAL CELLS Mus musculus L - PRODUCER OF MONOCLONAL ANTIBODIES FOR EXPOSING VP40 PROTEIN OF MARBURG VIRUS, (Popp STRAIN) (VERSIONS), MONOCLONAL ANTIBODY PRODUCED BY SAID STRAIN (VERSIONS) AND SET FOR "SANDWICH" FORMAT IMMUNOENZYMOMETRIC SYSTEM FOR EXPOSING VP40 MATRIX PROTEIN OF MARBURG VIRUS (Popp STRAIN)

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к медицинской вирусологии и иммунологии, и может быть использовано для проведения иммунодиагностики геморрагической лихорадки Марбург (ГЛМ).
Вирус Марбург (ВМ) относится к семейству филовирусов, вызывает геморрагическую лихорадку человека с уровнем летальности от 40 до 90%, как показали эпидемиологические исследования во время самой большой вспышки в 2004-2005 г. в Анголе [1, 2]. Природный резервуар и переносчики не известны, эффективные средства специфической профилактики для людей отсутствуют. Несмотря на географически ограниченный ареал возникновения неожиданных вспышек, потенциал аэрозольной передачи высок и риск распространения среди человеческой популяции в разных регионах мира возможен [3, 4, 5]. Попытки получения вакцины на основе инактивированного вируса не принесли результата [6]. В настоящее время только в одном Центре (военно-медицинский исследовательский институт инфекционных болезней США) идет поиск подходов к созданию вакцины на основе векторов доставки генов филовирусных белков. Описано несколько кандидатов для вакцины: 1) ДНК вакцинация плазмидами, несущими гены ВМ, 2) дефектные вирусные частицы Венесуэльского энцефаломиелита, содержащие филовирусные белки, 3) аденовирусная векторная система, 4) бивакцина на основе аденовирусоподобных частиц, несущих белки нескольких штаммов ВМ и вируса Эбола (ВЭ) [7, 8, 9, 10]. Исследователи определились с основными белками, вызывающими полную защиту инфицированных животных, это гликопротеин (GP) и матриксный белок VP40. Возможно, что защита людей против смертельных филовирусных лихорадок со временем будет достигнута. Матриксный белок VP40 играет важную роль на последних стадиях сборки вирионов. Было показано, что для формирования вирусоподобных частиц, морфологически подобных натуральным, при трансфекции культуры клеток 293 плазмидами, содержащими ген, кодирующий белок VP40 достаточно участия его одного [11, 12]. Белок VP40 филовирусов является одним из трех мажорных компонентов, составляя 37,7% (белок VP35 - 24,5% и нуклеопротеин (NP) - 17% соответственно) от массы вириона, вызывает образование антител в организме людей, переболевших ГЛМ [13, 14]. ВМ появляется в крови и выделениях инфицированных морских свинок и обезьян Масаса mulatta на 4 сутки от заражения и может быть обнаружен методом иммуноферментного анализа (ИФА) [15, 16]. Морских свинок заражали кровью, спермой, мочой и смывом из носоглотки сотрудника, инфицированного ВМ при случайном лабораторном заражении. Все животные пали, а из их органов был выделен ВМ [17]. В настоящее время в России нет коммерчески доступных ИФА тест-систем по экспрессному выявлению антигена ВМ для контроля за импортированными животными для зоопарков и исследовательских целей и туристами, прибывшими из стран Африки с симптомами, подобными при ГЛМ. Препараты очищенных моноклональных антител (МКА) могут служить основой такой системы самостоятельно или как подтверждающий тест к ПЦР-диагностике, которая в России так же пока не разработана.
Известен штамм гибридных клеток животных Mus musculus L. M1/N-10G9, продуцирующих в течение 30 изученных пассажей in vitro моноклональные антитела к структурному белку GP вируса Марбург, штамм Рорр, относящиеся к изотипу IgG, пригодные для приготовления на их основе диагностикумов для специфического выявления вируса Марбург с помощью иммуноферментного анализа (патент РФ №2186107, МПК C12N 5/18, опубл. 27.07.2002 г.).
Однако продуцируемые указанным штаммом гибридных клеток моноклональные антитела специфичны к поверхностному белку, которым является гликопротеин GP с молекулярной массой (ММ) 125 кД.
Наиболее близким аналогом (прототипом) является мышиная гибридомная клеточная линия, продуцирующая МКА к матриксному белку VP40 [7] вируса Марбург (штамм Musoke).
Однако не известны гибридные линии клеток животных, продуцирующие МКА, не конкурирующих между собой за антигенные эпитопы матриксного белка VP40.
Известны МКА, используемые в лабораторных ИФА тест-системах в формате "сэндвич" для выявления антигена ВМ [15, 22, 23, 24].
Однако из указанных лабораторных ИФА тест-систем в формате "сэндвич" для выявления антигена ВМ нет системы на основе двух МКА, не конкурирующих между собой за антигенные эпитопы матриксного белка VP40.
Техническим результатом предлагаемого технического решения является получение таких штаммов гибридных клеток Mus musculus L., продуцирующих специфические МКА к белку VP40 ВМ (штамм Рорр), не конкурирующих между собой за антигенные эпитопы, что позволяет использовать их в иммуноферментной системе формата "сэндвич" для выявления белка VP40 ВМ при совместном использовании МКА в качестве "захватывающих" антиген и в качестве "индикаторных", меченных биотином, что обеспечит повышение достоверности ИФА при лабораторных исследованиях ВМ и при конструировании тест-систем для выявления антигена.
Указанный технический результат достигается путем создания штамма гибридных клеток животного Mus musculus L. 7D8, депонированного в Коллекции клеточных культур ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора, являющегося продуцентом моноклональных антител, специфичных к матриксному белку VP40 вируса Марбург (штамм Рорр) и используемых в качестве «захватывающих» антиген в иммуноферментной системе формата "сэндвич" для выявления матриксного белка VP40 вируса Марбург (штамм Рорр).
Указанный технический результат достигается также путем создания штамма гибридных клеток животного Mus musculus L. 7H10, депонированного в Коллекции клеточных культур ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора, являющийся продуцентом моноклональных антител, специфичных к матриксному белку VP40 вируса Марбург (штамм Рорр) и используемых в качестве индикаторных меченных биотином в иммуноферментной системе формата "сэндвич" для выявления матриксного белка VP40 вируса Марбург (штамм Рорр).
Указанный технический результат достигается также путем использования моноклональных антител 7D8, продуцируемых штаммом гибридных клеток животного Mus musculus L. 7D8, относящихся к субклассу иммуноглобулинов IgGI, имеющих тяжелую 55 кДа и легкую 25 кДа цепь и моноклональных антител 7Н10, продуцируемых штаммом гибридных клеток животного Mus musculus 1. 7Н10, относящихся к субклассу иммуноглобулинов IgGI, имеющих тяжелую 55 кДа и легкую 25 кДа цепи и используемых совместно в иммуноферментной системе формата "сэндвич" для выявления матриксного белка VP40 вируса Марбург (штамм Рорр).
Так же возможно индивидуальное использование МКА в иммунофлуоресцентном и иммуноферментном методах для выявления ВМ в инфицированных клетках и тканях.
Штаммы получены путем слияния клеток мышиной p3-X63/Ag8.653 (NS/1) миеломы с клетками селезенок мышей BALB/c, иммунизированных очищенным, концентрированным, инактивированным препаратом ВМ, полученным из плазмы крови инфицированных морских свинок [18] и инактивированным димером этиленимина до 0,17% как описано [19].
Заявляемые штаммы гибридных клеток Mus musculus L. ГНЦ ВБ "Вектор" - 7D8 и Mus musculus L. ГНЦ ВБ "Вектор" - 7Н10 получены в Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии "Вектор" Роспотребнадзора Российской Федерации и депонированы в Коллекции клеточных культур ГНЦ ВБ "Вектор". Авторское название гибридомных клеточных линий - 7D8 и 7Н10.
Заявляемые штаммы гибридных клеток входят в состав коллекции ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор», состоящей из 21 гибридомной клеточной линии, из которых 11 продуцируют МКА к белку VP40 вируса Марбург (штамм Рорр) [20].
Родословная штаммов. Штаммы гибридных клеток получены путем слияния клеток мышиной p3-X63/Ag8.653 (NS/1) миеломы с клетками селезенок мышей BALB/c, иммунизированных очищенным, концентрированным, инактивированным препаратом ВМ. В качестве сливающего агента использовали 45% раствор полиэтиленгликоля фирмы "Sigma" с молекулярным весом 1300-1600 кД по методу
[25]. Клетки после слияния выращивали в селективной среде ГАТ в 96-луночных культуральных планшетах. В качестве фидерных клеток использовали перитонеальные макрофаги беспородных мышей. Гибридомы, стабильно продуцирующие специфические МКА, клонировали 3 раза. Выход позитивных клонов в последнем клонировании составил 100%. Число пассажей к моменту депонирования: 7-10 пассажей. Маркерные признаки и методы их оценки. Штаммы секретируют мышиные иммуноглобулины субкласса IgG (имеющие тяжелую 55 кДа и легкую 25 кДа цепи), специфически взаимодействующие с белком VP40 ВМ. Анализ мышиных иммуноглобулинов проводят методом ИФА, используя в качестве антигена инактивированный ВМ (штамм Рорр) или рекомбинантный белок VP40 (полученный в результате биосинтеза в клетках E.coli на основе плазмидной конструкции, включающей полный ген VP40 ВМ как описано [21]) и антитела против IgG мыши, меченные пероксидазой хрена. Контаминация бактериями и грибами не обнаружена.
Культуральные свойства. Среда для культивирования DMEM/F12 с глутамином, пиридоксином, Hepes (ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора). Содержание фетальной сыворотки, оптимизированной для гибридом (HyClone, USA) в ростовой среде - 10%. В среду также добавляют, 80-160 мкг/мл сульфата гентамицина.
Штаммы являются монослойно-суспензионными культурами, в которых до 20% клеток находится в суспензии, не прикрепляясь к поверхности посуды для культивирования. Клетки с поверхности культуральной посуды удаляются раствором трипсина/версена = 1/1 (объем/объем). Посевная доза 200 тысяч кл/мл. Частота пассирования через 3-4 суток. Индекс пролиферации - не менее 5. Культивирование гибридом в организме животного. Самкам мышей BALB/c (виварий ГНЦВБ "Вектор") предварительно вводят внутрибрюшинно 0,3-0,5 мл пристана (Sigma). Через 2-4 недели животным прививают внутрибрюшинно 10 млн гибридных клеток. Асцитическая опухоль формируется на 7-10 день. Гибридомы прививаются в 100% случаев. От одного животного можно получить 3-5 мл асцитической жидкости, содержащей МКА.
Характеристика полезного продукта. Типирование гибридомных иммуноглобулинов проведено методом твердофазного ИФА с использованием моноспецифических мышиных антител («Sigma», США). МКА относятся к субклассу IgGl. Они специфически взаимодействуют с нативным белком VP40 ВМ (32 кДа) и рекомбинантным белком VP40 ВМ (36 кДа) в реакции иммуноблота. В ИФА титр МКА в асците составляет для 7D8 - 1:2187000 и для 7Н10 - 1:729000 соответственно. Стабильная продукция МКА сохраняется на протяжении не менее 10 пассажей in vitro при непрерывном культивировании. Из одного миллилитра асцитической жидкости можно получить 3-5 мг очищенных моноклональных антител.
Криоконсервирование. Среда для замораживания - среда ДМЕМ(М) - 50%, фетальная сыворотка - 40%, диметилсульфоксид - 10%. 1-1,5 мл клеточной суспензии переносят в пластиковые криопробирки и помещают в пенопластовый контейнер с толщиной стенок 1 см. Контейнер вносят в пары жидкого азота и через 18-24 часа пробирки переносят в жидкий азот. Размораживание проводят, опуская пробирки в воду с температурой 37-41°С. Клетки разводят средой ДМЕМ(М) и центрифугируют при 1000 об/мин. Осадок ресуспендируют в ростовой среде и клетки переносят в культуральные флаконы в концентрации 200-300 тысяч в миллилитре. Жизнеспособность клеток после размораживания составляет 60-80% (по результатам окрашивания 0,25% трипановым синим). Каждая ампула содержит не менее 1 млн/мл клеток.
Изобретение поясняется графическим материалом, представленным на фиг.1-3.
На фиг.1 представлена электрофореграмма очищенных моноклональных антител, где:
1, 2 - препараты очищенных МКА 7Н10 и 7D8 (по 1 мкл), стрелками обозначены цепи иммуноглобулинов:
т - тяжелая цепь (55 кДа); л - легкая цепь (25 кДа);
3 - белковые маркеры молекулярного веса (10 мкл)(Bio-Rad);
4 - значения молекулярного веса белковых маркеров.
На фиг.2а представлена электрофореграмма нативных белков вируса Марбург и рекомбинантного белка VP40, где:
1 - значения молекулярного веса белковых маркеров;
2 - белковые маркеры молекулярного веса (10 мкл)(Bio-Rad);
3 - очищенный рекомбинантный белок VP40 (10 мкл);
4 - препарат вируса Марбург (10 мкл), стрелками обозначены вирусные белки;
5 - обозначения вирусных белков;
На фиг.2в представлен иммуноблот нативного и рекомбинантного белков VP40 с МКА, где:
1 - препарат вируса Марбург обработан МКА 7Н10 в разведении 1:500;
2 - препарат вируса Марбург обработан МКА 7D8 в разведении 1:500;
3 - рекомбинантный белок VP40 обработан МКА 7Н10 в разведении 1:500;
4 - рекомбинантный белок VP40 обработан МКА 7D8 в разведении 1:500;
5 - препарат вируса Эбола обработан МКА 7Н10 в разведении 1:500 (отрицательный контроль);
6 - препарат вируса Эбола обработан МКА 7D8 в разведении 1:500 (отрицательный контроль);
7 - лизат E.coli. обработан МКА 7Н10 в разведении 1:500 (отрицательный контроль);
8 - лизат E.coli. обработан МКА 7D8 в разведении 1:500 (отрицательный контроль).
На фиг.3 изображен график титрования антигена вируса Марбург и рекомбинантного белка VP40 парой МКА 7D8 и 7Н10*, где исходная концентрация препаратов антигенов по СФ 1 мг/мл, первая точка титрования в разведении 1:400 соответствует концентрации 2500 нг/мл;
7Н10* - индикаторные МКА меченные биотином;
в качестве отрицательного контроля использовали пару МКА 4А2 и 1С1*, специфичные к белку VP40 вируса Эбола;
концентрация МКА для "захвата" антигенов - 10 мкг/мл;
концентрация индикаторных МКА, меченных биотином - 1 мкг/мл.
Методика получения заявляемых штаммов
Штаммы гибридных клеток Mus musculus L. ГНЦ ВБ "Вектор" - 7D8 и Mus musculus L. ГНЦ ВБ "Вектор" 7Н10 получают следующим образом. Самок мышей BALB/c (виварий ГНЦВБ "Вектор"), массой 15-20 г, иммунизируют по схеме, которая приведена ниже в таблице.
Схема иммунизации
дни
раствор для разведения антигена
доза антигена (мкг/мышь)
область инъекции
0
полный адьювант Фрейнда
10
внутрибрюшинно
7
неполный адьювант Фрейнда
10
внутрибрюшинно
11
Физиологический раствор
33
внутривенно
12
Физиологический раствор
45
внутривенно
14
Гибридизация
(забор селезенки)
Для слияния используют соотношение 3/1 селезеночных клеток мышей и клеток мышиной миеломы NS/1. Смесь клеток центрифугируют, супернатант тщательно удаляют и к клеточному осадку добавляют 0,4 мл 45% раствора полиэтиленгликоля (ПЭГ) с молекулярной массой 1300-1600. Смесь центрифугируют 15 мин при 1000 об/мин. После 3 мин паузы слой ПЭГ медленно разбавляют 5 мл раствора версена, после чего осадок  ресуспендируют.
Затем клетки снова осаждают (10 мин при 1000 об/мин) и осадок растворяют в ростовой среде. Клетки распределяют в пять 96-луночных микроплат (Costar) по 100 мкл в лунку. Селекцию гибридных клеток проводят в среде ГАТ, состоящей из питательной среды ДМЕМ(М), в которую добавлены 10% фетальной сыворотки коров (Gipco), 0,1 мМ гапоксантина, 0,04 мМ тимидина и 0,01 мМ аминоптерина.
Отбор специфических гибридов проводят методом иммуноферментного анализа (ИФА). В лунки микроплат (ВНИИМедПолимер) в качестве антигена сорбируют 100-200 нг очищенного ВМ. Места неспецифического связывания насыщают 0,5% раствором казеина (ICN). Затем в лунки переносят по 100 мкл культуральной среды исследуемых гибридом и инкубируют 45 мин при 37°С. После инкубации лунки промывают 3-5 раз физиологическим раствором, содержащим 0,05% твин-20 (Sigma). Далее в планшеты вносят по 100 мкл антивидового коньюгата (иммуноглобулины кролика пропив IgG мыши, меченные пероксидазой хрена) и выдерживают 45 мин при 37°С. Планшеты промывают и проводят ферментативную реакцию. Результаты анализа определяют на спектрофотометре "Multiscan" (Финляндия). Полученные гибридные штаммы дважды клонируют методом предельных разведений, переводят в массовую культуру и замораживают в жидком азоте. Приведенные ниже примеры подробно раскрывают полезные свойства объектов изобретения.
Пример 1. Культивирование гибридных клеток штаммов Mus musculus L. ГНЦ ВБ "Вектор" - 7D8 и Mus musculus L. ГНЦ ВБ "Вектор" 7Н10, продуцирующих МКА к белку VP40 ВМ в организме животных, мышей BALB/c.
Мышам BALB/c (виварий ГНЦВБ "Вектор"), весом 20-22 г, не менее чем за 10 дней до прививки гибридомных клеток вводят внутрибрюшинно по 0,3-0,5 мл пристана. Культивируемые клетки, находящиеся в логарифмической фазе роста, стерильно центрифугируют 5-10 мин при 1000 об/мин т центрифуге ОПН-3. Надосадок удаляют, а осадок клеток суспензируют в стерильном растворе Эрла или Хенкса. Самкам мышей BALB/c (виварий ГНЦВБ "Вектор") весом 20-22 г внутрибрюшинно вводят каждой по 1 мл клеточной суспензии, содержащей не менее 10 млн гибридомных клеток. Через 7-10 дней животных усыпляют и в асептических условиях из брюшной полости извлекают 3-5 мл асцитической жидкости. Клетки из асцитической жидкости отделяют центрифугированием, а в надосадочной жидкости определяют тигр МКА с помощью ИФА, как описано выше.
Пример 2. Выделение очищенных моноклональных антител, продуцируемых гибридными культивируемыми клетками штаммов Mus musculis L. ГНЦ ВБ "Вектор"- 7D8 и Mus musculus L. ГНЦ ВБ "Вектор" 7Н10.
Один объем асцитической жидкости, содержащей МКА, разводят 4 объемами 0,6 М ацетатного буфера (0,04 М лимонной кислоты, 0,2 М натрия ацетата), рН 4,0 и доводят рН до 4,5 с помощью 0,1 N раствора едкого натра. К разведенному образцу добавляют по каплям, с постоянным перемешиванием, каприловую кислоту из расчета 25 мкл на 1 мл раствора и инкубируют ночь при +4°С. Затем центрифугируют 30 мин при 8000 g и осадок удаляют, а надосадок смешивают с десятикратным фосфатно-солевым буфером (ФСБ) и устанавливают рН 7,4 раствором 1,0 N едкого натра. Равный объем насыщенного раствора сульфата аммония добавляют к этому раствору, встряхивают и выдерживают ночь при +4°С или 30 мин при +20-25°С. Центрифугируют 15 мин при 5000 g. Надосадок сливают, а осадок растворяют в ФСБ, рН 7,4. Остатки сульфата аммония удаляют путем диализа против 50-100 объемов ФСБ, рН 7,4. Электрофорез очищенных препаратов МКА проводили по методу, описанному в работе [27] в прерывистой буферной системе с использованием 12-15% полиакриламидного геля с 0,1% додецилсульфата натрия в трис-глициновом буфере. Разделяющий гель содержал 0,0625 М трис-HCl (рН 8,8), 0,1% SDS, 10(15)% акриламид, 1% N,N- метиленбисакриламид. Препараты МКА (по 1 мкл) наносили на дорожку в объеме 30 мкл буфера, содержащем 0,0625 М трис-HCl (рН 6,8), 2% SDS, 5% 2-меркаптоэтанол, 10% глицерин, 0,01% бромфеноловый синий. Перед нанесением буфер, содержащий МКА, прогревали 3 мин при 95°С. Электрофорез вели в режиме 10 В/см. Окраску геля проводили при помощи Кумасси G-250. Очищенные препараты в виде электрофореграммы представлены на фиг.1.
Пример 3. Определение методом ИФА специфического взаимодействия МКА, продуцируемых гибридными клетками штаммов Mus musculus L. ГНЦ ВБ "Вектор"- 7D8 и Mus musculus L. ГНЦ ВБ "Вектор" 7Н10 с ВМ и рекомбинантным белком VP40.
2
3
ИФА проводился на полистироловых планшетах. Антиген в рабочем разведении (очищенный и инактивированный вирус Марбург или рекомбинантный белок VP40) сорбировали в ФСБ, рН 7,4 в объеме 100 мкл/лунка на планшеты. Места неспецифического связывания насыщали при 37°С 45 минут 0,5% раствором казеина в буфере ТСБ-Твин (0.145 М хлористого натрия, 20 mM Трис-HCl, 5 mM FMSF (Sigma), 0,1% Tween-20 (Serva), pH 7,4) и затем инкубировали с очищенными МКА 45 минут при 37°С. Специфическое связывание МКА с антигеном выявляли антивидовыми меченными пероксидазой антителами против IgG мыши. Далее добавляли хромоген, 0,1% О-фенилендиамин, в цитратно-фосфатном буфере (0,2 М лимонной кислоты, 0,5 M NaHPO, pH 5,0) с 0,03% перекиси водорода). Останавливали реакцию добавлением 100 мкл на лунку 1 N HCl и измеряли оптическую плотность образцов на спектрофотометре "Multiscan" с использованием светофильтра с максимумом пропускания 492 нм. В качестве отрицательного и положительного контроля использовали гомологичные нормальную (неиммунную) и гипериммунную сыворотки соответственно.
Пример 4. Выявление в иммуноблоте взаимодействия МКА, продуцируемых гибридными клетками штаммов Mus musculus L. Mus musculus L. ГНЦ ВБ "Вектор" - 7D8 и Mus musculus L. ГНЦ ВБ "Вектор" 7Н10 с белком VP40 ВМ (штамм Рорр) и рекомбинантным белком VP40. Вирусные белки и рекомбинантный белок VP40 после 12% ПААГ-электрофореза были перенесены на нитроцеллюлозную мембрану (Millipore, США). Места неспецифического связывания насыщали 0,5% раствором казеина в буфере ТСБ-Твин (0,145 М хлористого натрия, 20 mM Трис-HCl, 5 mM PMSF (Sigma), 0.1% Tween-20 (Serva), pH 7,4) при 37°С 2 часа. Затем отдельные полоски мембраны инкубировали с очищенными МКА 4 часа при 20-22°С. Специфическое связывание антител, взаимодействующих с вирусными белками, выявляли с помощью коньюгата антивидовых антител против IgG мыши, меченных пероксидазой хрена. В качестве отрицательного контроля использовали полоски мембраны с перенесенными после электрофореза инактивированным вирусом Эбола [26] и лизатом Е.coli., так же обработанными МКА. Результаты представлены на фиг.2а и 2в.
Пример 5. Приготовление коньюгатов МКА с биотином.
3
Для биотинилирования моноклональных иммуноглобулинов использовали следующую методику: готовили свежий раствор NSB(N-hydroxysuccinimidobiotin), для этого растворяли 2 мг биотина в 0,5 мл ДМСО и доводили объем до 2 мл. Затем готовили раствор очищенных МКА (в 0,1М NaHCO рН 9,0) в концентрации 1 мг/мл. Раствор NSB капельно добавляли к раствору МКА в объемном соотношении 1/1 и инкубировали при комнатной температуре в течение 4 часов. Затем доводили объем раствора до 1 мл 0,05М фосфатным буфером (PBS) с рН 7,0, содержащем 0,15М натрия хлорида и 0,1% азида натрия. Диализовали против фосфатного буфера. Процесс включения биотина в иммуноглобулины контролировали титрованием меченых МКА на антигене, иммобилизованном на пластик, с коньюгатом пероксидазы со стрептовидином.
Пример 6. Конкурентный ИФА формата "сэндвич" для выявления нативного белка VP40 вируса ВМ (штамм Рорр) и рекомбинантного белка VP40.
В лунках высокосорбционных полистироловых планшетов ("Testiks" или "Nunc") сорбировали очищенные МКА 7D8 в 0,5 М карбонатом буфере (рН 9,0) в объеме 100 мкл в рабочей концентрации (10 мкг/мл) при 22°С в течение 12 ч. Места для неспецифического связывания антител на планшетах насыщали 0,5% раствором казеина и выдерживали при 37°С в течение 30 минут. Титрование антигена проводили с разведения 1:400 двухкратным шагом в течение ночи при 4°С или при 37°С в течение часа Затем в лунки планшетов вносили коньюгаты МКА 7Н10 с биотином в рабочих разведениях (1 мкг/мл), выдерживали при 37°С в течение часа и, после трехкратной отмывки лунок, вносили в них конъюгат стрептавидина с пероксидазой. Специфическое связывание антител, меченных биотином, с коньюгатом выявляли жидкой субстратной системой ТМБ (3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine, Sigma) по 100 мкл на лунку. Выдерживали планшеты 30 мин в темноте, останавливали реакцию добавлением 100 мкл на лунку 1N соляной кислоты и измеряли оптическую плотность образцов на спектрофотометре "Uniscan" при длине волны 450 нм. Положительным считали результат измерения ОП в лунке, превышающий в 2 раза таковой для лунки с отрицательным контролем. Для отрицательного контроля связывания антител с антигеном использовали пару не конкурирующих МКА, выявляющих белок VP40 вируса Эбола. График титрования антигенов представлен на фиг.3.
Вышеприведенные свойства штаммов гибридных клеток Mus musculus L. ГНЦ ВБ "Вектор" - 7D8 и Mus musculus L. ГНЦ ВБ "Вектор" 7Н10 (авторское название клеточных линий 7D8 и 7Н10) позволяют заключить, что впервые на основе мышиной миеломы получены гибридомы Mus musculus L. ГНЦ ВБ "Вектор" - 7D8 и Mus musculus L. ГНЦ ВБ "Вектор" 7Н10 - продуценты МКА, не конкурирующих между собой за антигенные эпитопы белка VP40 ВМ. Штаммы гибридных клеток обеспечивают получение мышиных моноклональных иммуноглобулинов класса IgGI в количестве 3-5 мг очищенных антител из миллилитра асцитической жидкости. Очищенные МКА специфично реагировали в ИФА с ВМ (титр МКА 7D8 и 7Н10 составлял 1:2187000 и 1:729000 соответственно) и рекомбинантным белком VP40 (титр МКА 7D8 и 7Н10 составлял 1:243000 и 1:729000 соответственно); выявляли в иммуноблоте вирус-ассоциированный белок VP40 и рекомбинантный белок VP40 (полученный в результате биосинтеза в клетках R.coli на основе плазмидной конструкции, включающей полный ген VP40 ВМ). Совместное использование МКА в ИФА в формате "сэндвич" позволяет выявлять нативный и рекомбинантный белки с чувствительностью менее 1 нг/мл. Использование данных препаратов МКА и рекомбинантного белка VP40 в качестве положительного контроля на антиген, позволит эффективно выявлять случаи ГЛМ на территории России в формате ИФА "сэндвич".
Вышеуказанные свойства штаммов Mus musculus L. ГНЦ ВБ "Вектор" - 7D8 и Mus musculus L. ГНЦ ВБ "Вектор" 7Н10 (авторское название клеточных линий 7D8 и 7Н10) отличают их от всех описанных ранее гибридом, продуцирующих МКА к белкам вируса Марбург.