СПОСОБ ИСПЫТАНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS К ЛЕКАРСТВЕННЫМ СРЕДСТВАМ, ПРИМЕНЕНИЕ ИНДИКАТОРА И ТВЕРДОЙ СРЕДЫ
METHOD OF SENSITIVITY TESTING OF MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS TO PHARMACEUTICALS, USE OF INDICATOR AND SOLID MEDIUM

[0001] Изобретение относится к области лабораторной медицины для испытания чувствительности Mycobacterium tuberculosis к лекарственным средствам, в частности к способу испытаний чувствительности Mycobacterium tuberculosis к лекарственным средствам, применению индикатора, используемого в способе испытания чувствительности Mycobacterium tuberculosis к лекарственным средствам, твердой среде, а также к нагревательному термостату и боксу для культивирования, используемому для способа испытаний чувствительности Mycobacterium tuberculosis к лекарственным средствам.
[0002] Устойчивость туберкулеза к лекарственным средствам является развивающейся проблемой общественного здравоохранения, которая представляет серьезную угрозу для контроля туберкулеза. Чжун Наньшань, академик Академии инженерных наук Китая, заявил, что в Китае почти 4,5 миллионов пациентов больны активным туберкулезом, количество носителей бактерий доходит до 550 миллионов, а вероятность восприимчивости к туберкулезу за время жизни носителя бактерий составляет 10%. В апреле 2009 г.на состоявшемся в Пекине совещании на уровне министров на тему «Страна с высоким бременем мультирезистентного туберкулеза и туберкулеза с широкой лекарственной устойчивостью» министр здравоохранения Китая Чэнь Чжу заявил о случае лекарственно-резистентного туберкулеза в Китае. Выборочные обследования китайского Центра по контролю и профилактике заболеваний выявили, что среди больных туберкулезом пациентов в Китае показатель заболеваемости мультирезистентным ТБ составляет 8,32%, а суммарное количество пациентов с мультирезистентным ТБ насчитывает порядка 120000, что является вторым показателем в мире; показатель заболеваемости ТБ с широкой лекарственной устойчивостью составляет 0,68% при общем количестве пациентов с ТБ с широкой лекарственной устойчивостью порядка 10 000, и ущерб от него намного выше, чем от СПИДа. Испытания чувствительности к лекарственным средствам очень важны для определения устойчивости Mycobacterium tuberculosis к лекарственным средствам. Предшествующие способы испытаний чувствительности Mycobacterium tuberculosis к лекарственным средствам обычно включают способ испытаний с помощью бумажных полосок и концентрационный способ испытаний. Способ испытаний с помощью бумажных полосок применяется для определения чувствительности Mycobacterium tuberculosis к лекарственным средствам посредством наблюдения зоны ингибирования препарата, формирующейся на полоске медицинской бумаги, которая закреплена на поверхности твердой среды. Концентрационный способ испытаний применяется для определения чувствительности Mycobacterium tuberculosis к лекарственным средствам посредством наблюдения и определения условий роста Mycobacterium tuberculosis в контейнерах для испытаний, конфигурация которых выбирается в соответствии с различными лекарственными средствами и концентрациями лекарственных средств. Как в способе испытаний с помощью бумажных полосок, так и в концентрационном способе испытаний полный процесс испытания чувствительности к лекарственным средствам, как правило, включает три этапа: подготовка пробы, размножение или отделение культуры и испытание чувствительности к лекарственным средствам. В вышеуказанном способе испытаний с помощью бумажной полоски этап подготовки пробы включает следующие операции:
[0003] 1. Помещение пробы в контейнер для испытаний через всасывающую трубку;
[0004] 2. Добавление в контейнер для испытаний пищеварительной жидкости, переваривающей слизь в пробе и полностью открывающей для воздействия слизь в пробе, и покрытые загрязнениями бактерии; и
[0005] 3. После разделения центрифугированием удаляемая надосадочная жидкость сливается для получения обогащенных проб; выполняется размножение или разделение культуры после получения обогащенных проб.
[0006] Этап размножения или отделения культуры включает следующие этапы:
[0007] 4. Приготовление меньшего количества обогащенных образцов в жидкости с высокой концентрацией бактерий; и
[0008] 5. Посев жидкости с высокой концентрацией бактерий на твердую среду, например, размножение или отделение культуры на среде Левенштейна-Йенсена, обычно включает культивирование жидкости с высокой концентрацией бактерий в инкубаторе в течение около одного месяца при температуре 37°С с последующим культивированием отдельных бактерий в колонии бактерий; после получения колоний бактерий осуществляется переход на этап испытания чувствительности к лекарственным средствам.
[0009] Этап испытания чувствительности к лекарственным средствам включает следующие операции:
[0010] 6. Отбор колоний бактерий в малых количествах (как правило, отбирается 1-3 колонии бактерий) и растворение и рассеивание колоний бактерий для получения жидкости с высокой концентрацией бактерий;
[0011] 7. Посев жидкости с высокой концентрацией бактерий на твердую среду, например, посев на поверхность агаровой среды;
[0012] 8. Закрепление полоски медицинской бумаги на поверхности твердой среды;
[0013] 9. Культивирование жидкости с высокой концентрацией бактерий в инкубаторе при температуре 37°С в течение около одного месяца и последующее наблюдение зоны ингибирования лекарственного средства для определения чувствительности Mycobacterium tuberculosis к лекарственным средствам.
[0014] Предшествующий способ испытаний с помощью бумажных полосок обладает преимуществами, заключающимися в удобстве осуществления, простоте оборудования и малых затратах, однако он имеет также следующие недостатки: (1) слишком длительное выполнение полного испытания: этап размножения и отделения культуры занимает порядка месяца, этап испытания чувствительности к лекарственным средствам занимает около месяца, т.е. суммарное время испытания составляет порядка двух месяцев. Если медикаментозная терапия назначается после испытания чувствительности к лекарственным средствам, это приводит к серьезному влиянию на время терапии. Медикаментозная терапия, применяемая без выполнения клинических испытаний чувствительности к лекарственным средствам, может привести к отрицательным последствиям: во-первых, возможны серьезные последствия, связанные с устойчивостью Mycobacterium tuberculosis к лекарственным средствам; во-вторых, трудно добиться хорошего терапевтического эффекта для пациентов, больных туберкулезом, вызванным лекарственно-резистентными Mycobacterium tuberculosis. (2) Операция небезопасна. Искусственный посев в ходе всего испытания выполняется дважды. В связи с заразностью Mycobacterium tuberculosis они представляют собой потенциальную угрозу для безопасности операторов, а также возможный источник риска заражения окружающей среды.
[0015] В предшествующем концентрационном способе твердая среда вводится на этапе размножения культуры. Операции двух этапов подготовки проб и размножения или отделения культур аналогичны этапам предшествующего способа испытаний с помощью бумажных полосок, но операции этапа испытания чувствительности к лекарственным средствам отличаются от аналогичных операций для способа испытания с помощью бумажных полосок, в частности, отбор одной или более колоний бактерий, полученных путем размножения или отделения культуры от твердой среды; растворение и рассеивание колоний бактерий для получения бактерийной взвеси; разлив бактерийной взвеси в ряд контейнеров для испытаний, конфигурация которых выбирается в соответствии с различными лекарственными средствами и концентрациями лекарственных средств, для приготовления проб для сравнительных испытаний; наблюдение и определение условий роста Mycobacterium tuberculosis в контейнерах для испытаний чувствительности Mycobacterium tuberculosis к лекарственным средствам. Концентрационный способ испытаний обладает такими преимуществами, как простота оборудования и малые затраты, однако имеет также следующие недостатки: (1) требует большого количества времени, поскольку способ и операции этапа размножения или отделения культуры аналогичны способу испытаний с помощью бумажных полосок, время, необходимое только для этапа размножения или отделения культуры, составляет порядка месяца; (2) операция является сложной и небезопасной, кроме того, высока вероятность получения неправильных результатов испытания. Необходимо выбрать конфигурацию ряда контейнеров для испытаний, а процесс конфигурирования является трудоемким и небезопасным, представляя таким образом потенциальную угрозу для безопасности операторов, а также возможный риск заражения окружающей среды; контейнеры для испытаний в ходе конфигурирования легко загрязняются другими бактериями, что может привести к неправильным результатам испытания.
[0016] Кроме того, существует способ определения чувствительности к лекарственным средствам с использованием специальных инструментов, таких как системы ВАСТЕС-ТВ460 и ВАСТЕС 960. Преимуществами этого способа являются простота осуществления и короткое время процесса испытания, при котором средний срок определения чувствительности составляет 14,4 дней, а кратчайший срок составляет около 10 дней. Основные недостатки данного способа следующие: инструмент является дорогостоящим и требует высоких затрат; эксплуатационные расходы также высоки: во-первых, значительные расходы на эксплуатацию инструментов, а во-вторых, требуется большое количество проб для сравнительных испытаний при высокой стоимости реактивов; в связи с высокими затратами данный способ практически недоступен для обычных больниц, в связи с чем его распространение затруднено.
[0017] Из подробного анализа предшествующих способов испытаний чувствительности Mycobacterium tuberculosis к лекарственным средствам можно сделать выводы о том, что способ испытания с помощью бумажных полосок и концентрационный способ испытания обладают следующими недостатками: 1. слишком длительная реализация полного процесса испытания; 2. сложность осуществления; 3. небезопасность; 4. высокая вероятность неправильных результатов. Способ определения чувствительности к лекарственным средствам с использованием специальных инструментов является крайне дорогостоящим, требует высоких эксплуатационных затрат, и его распространение затруднено.
[0018] Одной из целей изобретения является предложение способа испытания чувствительности Mycobacterium tuberculosis к лекарственным средствам, применения индикатора и твердой среды, являющихся менее дорогостоящими, не требующими высоких эксплуатационных затрат, а также безопасными и удобными в применении.
[0019] Для достижения цели изобретения способ испытания чувствительности Mycobacterium tuberculosis к лекарственным средствам включает следующие этапы:
[0020] (1) Предварительная обработка целевых проб для получения обогащенных проб;
[0021] (2) Добавление жидкой среды к обогащенным пробам для получения проб жидкой культуры и выполнение обогащающего культивирования в течение 0-7 дней;
[0022] (3) Нагрев и расплавление твердой среды для получения расплавленной твердой среды и снижение температуры расплавленной твердой среды до соответствующей температуры культивирования проб жидкой культуры или до комнатной температуры, твердая среда обладает температурой плавления 50-95°С и температурой затвердевания 25-45°С для твердой среды, содержащей агар или агарозу и питательные вещества;
[0023] (4) Смешивание проб жидкой культуры с расплавленной твердой средой для получения жидких проб для испытания чувствительности к лекарственным средствам;
[0024] (5) Отверждение жидких проб для испытания чувствительности к лекарственным средствам для получения твердых проб для испытания чувствительности к лекарственным средствам с помощью бумажных полосок, чувствительных к лекарственным средствам;
[0025] (6) Культивирование твердых проб для испытания чувствительности к лекарственным средствам в течение 5-15 дней;
[0026] (7) Наблюдение зоны ингибирования лекарственного средства по уровню индикации индикатора и определение чувствительности Mycobacterium tuberculosis к лекарственным средствам.
[0027] В способе испытания чувствительности Mycobacterium tuberculosis к лекарственным средствам, индикатор является индикатором роста Mycobacterium tuberculosis или индикатором биохимических реакций.
[0028] В способе испытания чувствительности Mycobacterium tuberculosis к лекарственным средствам индикатор содержит теллурит, смесь теллурита и мочевины, мочевину, МТТ, ХТТ или аламар синий.
[0029] В способе испытания чувствительности Mycobacterium tuberculosis к лекарственным средствам после 5-15 дней культивирования твердых проб для испытания чувствительности к лекарственным средствам теллурит по капле добавляется в твердую пробу для испытания чувствительности к лекарственным средствам в качестве индикатора.
[0030] В способе испытания чувствительности Mycobacterium tuberculosis к лекарственным средствам индикаторные компоненты, за исключением теллурита, добавляются в жидкую или твердую среду.
[0031] На этапе (3) после приготовления расплавленной твердой среды снижение температуры до соответствующей температуры культивирования проб жидкой культуры или до комнатной температуры означает, что температура расплавленной твердой среды снижается до того же или аналогичного уровня температуры для пробы жидкой культуры в условиях обогащающего культивирования пробы жидкой культуры; если обогащающее культивирование не выполняется, температура снижается до комнатной, но твердая среда при этом находится в жидком состоянии.
[0032] Изобретение далее предусматривает использование индикатора для способа испытания чувствительности Mycobacterium tuberculosis к лекарственным средствам, индикатором является теллурит или смесь теллурита и мочевины; после 5-15 дней культивирования твердых проб для испытания чувствительности к лекарственным средствам индикатор теллурит добавляется по капле в твердую пробу для испытания чувствительности к лекарственным средствам.
[0033] Теллурит представляет собой теллурит натрия или теллурит калия.
[0034] Соотношение твердой среды и жидкой среды в жидкой пробе испытания чувствительности к лекарственным средствам определяется добавлением части твердой среды на каждые 100 мл жидкой среды. Каждая часть твердой среды включает 50-100 мл желтковой жидкости, 2-8 г растворимого крахмала, 0,1-0,8 г L-казеина, 2-8 мл фенолового красного, 0,5-3,5 г агара или агарозы и соответствующее количество бактериостата.
[0035] В твердую среду может быть добавлена мочевина в количестве 0,1-0,5 г на каждую часть твердой среды.
[0036] Твердая среда помещается в первичную упаковку и запечатывается согласно количеству для единовременного применения.
[0037] Жидкой средой изобретения является стандартная питательная среда с эффектом обогащения Mycobacterium tuberculosis, к примеру, среда 7Н9.
[0038] Нагревательный термостат для способа испытания чувствительности mycobacterium tuberculosis к лекарственным средствам включает теплопроводящий блок, электрическое нагревательное устройство и устройство контроля температуры, в котором зона высокой температуры и зона с постоянной температурой расположены в теплопроводящем блоке, первое отверстие для зажима высокотемпературной чашки находится в зоне высокой температуры, а второе отверстие для зажима чашки с постоянной температурой находится в зоне с постоянной температурой.
[0039] Зона равновесия и зона смешивания с постоянной температурой расположены соответственно в зоне нагревательного термостата с постоянной температурой, где второе отверстие для зажима чашки с постоянной температурой находится в зоне равновесия с постоянной температурой, а третье отверстие для зажима чашки смешивания находится в зоне смешивания.
[0040] Канавка для зажима на вогнутой пластине находится в зоне смешивания нагревательного термостата.
[0041] Бокс для культивирования для способа испытания чувствительности Mycobacterium tuberculosis к лекарственным средствам включает корпус бокса с закрытой окружной стенкой, закрытым дном и открытым верхним концом, в котором на дне корпуса бокса находится линейка, а на верхней боковой поверхности дна корпуса бокса закрепляется чувствительная к лекарству бумажная полоска.
[0042] В боксе для культивирования на верхней боковой поверхности дна корпуса бокса закрепляется шесть чувствительных к лекарству бумажных полосок.
[0043] Способ испытания чувствительности к лекарственным средствам данного изобретения основан на предшествующих способах: способе испытания с помощью бумажных полосок и концентрационном способе. Ниже перечислены причины сокращения времени выполнения полного процесса испытания:
[0044] 1. Использование подлежащих испытанию Mycobacterium tuberculosis в отобранной пробе в полном объеме. Большая часть обогащенных Mycobacterium tuberculosis в отобранной пробе используется в испытании чувствительности к лекарственным средствам, подлежащие испытаниям Mycobacterium tuberculosis в пробе используются в полном объеме, исходное количество бактерий в испытании чувствительности к лекарственным средствам велико, так что время обогащающего культивирования уменьшается, что ведет к уменьшению времени полного процесса испытания.
[0045] 2. Малое время этапа обогащающего культивирования. В связи с тем, что обогащающее культивирование изобретения выполняется в жидкой среде, если провести сравнение, скорость размножения бактерий в жидкой среде выше, чем у бактерий в твердой среде; кроме того, подлежащие испытаниям Mycobacterium tuberculosis в отобранной пробе используются полностью, а исходное количество бактерий до обогащающего культивирования велико, в связи с чем этап размножения культуры сокращен и занимает самое большее 7 дней. Если результатом определения состояния больного туберкулезом пациента является ++++, обеспечивается большое количество Mycobacterium tuberculosis, используемых в пробе для испытаний чувствительности к лекарственным средствам, вследствие чего при выполнении испытания чувствительности к лекарственным средствам не требуется осуществление размножения культуры.
[0046] 3. Сокращенное время этапа испытания чувствительности к лекарственным средствам. Проба жидкой культуры после размножения культуры смешивается с расплавленной твердой средой изобретения, твердая проба для испытаний чувствительности к лекарственным средствам с чувствительной к лекарственным средствам бумажной полоской приготавливается с использованием процесса разлива под наклоном, и все Mycobacterium tuberculosis после размножения культуры используются в испытании чувствительности к лекарственным средствам, так что исходное количество бактерий в испытании чувствительности к лекарственным средствам велико, зона ингибирования лекарственного средства формируется проще, зону ингибирования можно определить визуально по индикационным следам индикатора, этап испытания чувствительности к лекарственным средствам продолжается всего 5-15 дней и по сравнению с предшествующим способом испытания с помощью бумажных полосок требуемое время сокращено.
[0047] 4. Использование быстрого цветового индикатора. В связи с тем, что в изобретении в качестве индикатора используется теллурит, посредством выполнения серии испытаний изобретателем было доказано, что колонии бактерий, формирующиеся в твердой пробе чувствительности к лекарственному средству, чернеют или принимают темно-серую окраску в течение 2-48 часов.
[0048] 5. Использование предшествующего индикатора. В твердую среду в изобретении добавляется мочевина, Mycobacterium tuberculosis далее продуцирует уреазу для расщепления мочевины, и твердая проба для испытаний чувствительности к лекарственным средствам становится розовой или светло-желтой, так что условия роста Mycobacterium tuberculosis в твердой пробе для испытаний чувствительности к лекарственным средствам возможно предварительно оценить на этапе испытания чувствительности к лекарственным средствам путем наблюдения цвета твердой пробы для испытаний чувствительности к лекарственным средствам. Если пробы для испытаний чувствительности к лекарственным средствам розового или светло-желтого цвета, это свидетельствует о том, что количество Mycobacterium tuberculosis в твердой пробе для испытаний чувствительности к лекарственным средствам достигло количества, необходимого для формирования зоны ингибирования и зона ингибирования может быть сформирована в течение 2-48 часов после добавления по капле индикатора теллурита, так что время этапа испытания чувствительности к лекарственным средствам может быть сокращено.
Серии испытаний, выполненные изобретателем, показывают, что при использовании данного способа испытаний чувствительности к лекарственным средствам Mycobacterium tuberculosis среднее время определения составляет порядка 10 дней. В заключение, по сравнению с предшествующими способом испытаний с помощью бумажных полосок и концентрационным способом, испытаний способ испытаний чувствительности к лекарственным средствам достигает цели в течение более короткого времени процесса испытания.
[0049] Причины более низкой стоимости и эксплуатационных затрат данного способа испытаний чувствительности к лекарственным средствам заключаются в том, что для проведения испытаний согласно данному изобретению требуется наличие только центрифуги, инкубатора, нагревательного термостата и т.д.; центрифуги, инкубатор, нагревательный термостат являются простыми в изготовлении и не требуют высоких затрат на производство, в связи с чем снижаются затраты на оборудование, необходимое для полного испытания; разовый контейнер для испытаний, как и среда культивирования, индикатор и другие реактивы требуются в меньшем количестве и менее затратны, и используются в изобретении в пропорциональном соотношении, инструментарий для изобретения является менее дорогостоящим и не требует высоких эксплуатационных затрат, обеспечивая дальнейшее снижение эксплуатационных затрат изобретения. В связи с этим, по сравнению с способом определения чувствительности к лекарственным средствам с использованием специальных инструментов, способ испытаний чувствительности к лекарственным средствам позволяет эффективно добиваться цели при меньшей стоимости и эксплуатационных затратах.
[0050] Причины того, что способ испытаний чувствительности к лекарственным средствам безопасен и удобен в применении, заключаются в том, что обогащение пробы для испытания и интерпретацию результатов можно выполнить в разовом закрытом контейнере, другое оборудование не загрязняется, после выполнения операции осуществляется стандартная стерилизационная обработка, а процедуры операций, выполняемых вручную, в ходе полного процесса испытания упрощены, и их количество уменьшено, таким образом, воздействие Mycobacterium tuberculosis на рабочий персонал и окружающую среду снижены, и биологическая безопасность испытаний существенно увеличена; возможность риска подверженности заражению другими бактериями снижена, а также обеспечено эффективное снижение вероятности получить неправильные результаты испытаний. В связи с этим, по сравнению с предшествующими способом испытаний с помощью бумажных полосок и концентрационным способом испытаний, способ испытаний чувствительности к лекарственным средствам может эффективно достигнуть безопасности и удобства в применении.
[0051] Следующие чертежи и варианты осуществления предназначены для дальнейшего описания способа испытания чувствительности Mycobacterium tuberculosis к лекарственным средствам, применения индикатора и твердой среды изобретения.
[0052] РИС.1 представляет вид нагревательного термостата изобретения сверху;
[0053] РИС.2 представляет вид нагревательного термостата, показанного на РИС.1, в разрезе по линии А-А;
[0054] РИС.3 представляет вид бокса культивирования данного изобретения сверху без крышки; и
[0055] РИС.4 представляет вид бокса культивирования, показанного на РИС.3, в разрезе.
[0056] 1. корпус; 2. канавка для зажима на вогнутой пластине; 3. третье отверстие для зажима чашки смешивания; 4. теплопроводящий блок; 5. теплоизоляционная стенка; 6. первое отверстие для зажима высокотемпературной чашки; 7. панель управления; 8. второе отверстие для зажима чашки с постоянной температурой; 9. электрическое нагревательное устройство; 10. корпус бокса; 11. чувствительная к лекарственному средству бумажная полоска; 12. линейка; 13. крышка бокса.
[0057] Нагревательное устройство показано на РИС.1 и РИС.2. Теплопроводящий блок 4 установлен в корпусе 1 и содержит зону высокой температуры и зону с постоянной температурой. Температура в зоне высокой температуры регулируется в диапазоне 50-95°C, и оптимальная температура составляет 90°С. Температура зоны с постоянной температурой регулируется в диапазоне 25-45°С, оптимальная температура составляет 42°С. Первое отверстие для зажима высокотемпературной чашки 6 и панель управления 7 расположены в зоне высокой температуры. Зона равновесия и зона смешивания с постоянной температурой расположены в зоне с постоянной температурой. Второе отверстие для зажима чашки с постоянной температурой 8 выполнено в зоне равновесия с постоянной температурой. Третье отверстие для зажима чашки смешивания 3 и канавка для зажима на вогнутой пластине 2 выполнены соответственно в зоне смешивания. Теплоизоляционная стенка 5 расположена между зоной высокой температуры и зоной с постоянной температурой. Электрическое нагревательное устройство 9 расположено в теплопроводящем блоке 4. Устройство контроля температуры расположено в корпусе 1.
[0058] Бокс культивирования показан на РИС.3 и РИС.4. Корпус бокса 10 представляет собой конструкцию с закрытой окружной стенкой, закрытым дном и открытой верхней частью, где на дне корпуса бокса 10 находится линейка 12; на верхней боковой поверхности дна корпуса бокса 10 закрепляется шесть чувствительных к лекарству бумажных полосок 11, а на открытом конце корпуса бокса 10 устанавливается крышка корпуса 13.
[0059] Ниже приведены варианты осуществления для способа испытания чувствительности Mycobacterium tuberculosis к лекарственным средствам, применения индикатора и твердой среды изобретения.
[0060] В боксе для культивирования на верхней боковой поверхности дна корпуса 10 бокса закрепляется шесть чувствительных к лекарству бумажных полосок 11, а объем корпуса бокса составляет 30 мл.
[0061] 1) 5 мл пробы утренней мокроты пациента отбирается и переваривается щелочной смесью 2% гидроксида натрия и 0,5% N-ацетиленцистеина;
[0062] 2) Проба утренней мокроты помещается в центрифугу и сепарируется в ней в течение 10 минут при скорости вращения 4500 об/мин, после чего Mycobacterium tuberculosis в пробе полностью осаждаются;
[0063] 3) Надосадочная жидкость удаляется для получения обогащенных проб, после чего подготовка проб завершается;
[0064] 4) Обогащенная проба разбавляется 10 мл жидкой среды для приготовления пробы жидкой культуры в форме жидкой бактерийной взвеси;
[0065] 5) Проба жидкой культуры помещается в инкубатор при температуре 37°С для обогащающего культивирования, при этом конкретное время обогащающего культивирования определяется в зависимости от количества бактерий, отобранных у пациентов. Если результатом определения состояния больного туберкулезом пациента является ++++, обогащающее культивирование не выполняется;
[0066] 6) Приготовление жидких проб для испытаний чувствительности к лекарственным средствам Mycobacterium tuberculosis:
[0067] (1) Температура зоны высокой температуры нагревательного термостата устанавливается на 90°С, а температура зоны с постоянной температурой устанавливается на 42°С;
[0068] (2) Твердая среда вводится в первое отверстие для зажима высокотемпературной чашки 6 в зоне высокой температуры нагревательного термостата для нагрева и расплавления до жидкого состояния; после смешивания пробы жидкой культуры с твердой средой объем составляет 30 мл; твердая среда обладает физическими свойствами, определяющими переход твердой среды в жидкое состояние, когда температура достигает 90°С; твердая среда переходит в твердое состояние из жидкого после падения температуры до 40°С;
[0069] (3) Расплавленная твердая среда помещается во второе отверстие для зажима чашки с постоянной температурой 8 в зоне равновесия с постоянной температурой нагревательного термостата для охлаждения, и когда температура расплавленной твердой среды падает до 42°С, твердая среда все еще находится в жидком состоянии;
[0070] (4) Проба жидкой среды после обогащающего культивирования помещается во второе отверстие для зажима чашки с постоянной температурой 8 в зоне с постоянной температурой нагревательного термостата, чтобы обеспечить повышение температуры до 42°С;
[0071] (5) Расплавленная твердая среда с температурой 42°С и проба жидкой культуры с температурой 42°C наливаются в чашку смешивания для получения жидких проб для испытания чувствительности к лекарственным средствам. Для обеспечения жидкого состояния твердой среды в процессе смешивания чашку для смешивания следует поместить в третье отверстие для зажима чашки для смешивания 3 в зоне с постоянной температурой нагревательного термостата для смешивания.
[0072] 7) Приготовление твердых проб для испытания чувствительности к лекарственным средствам:
[0073] (1) Корпус бокса 10 без крышки бокса 13 устанавливается в канавку для зажима на вогнутой пластине 2 в зоне с постоянной температурой нагревательного термостата, чтобы обеспечить повышение температуры до 42°С;
[0074] (2) Жидкие пробы для испытания чувствительности к лекарственным средствам наливаются в корпус бокса 10;
[0075] (3) После закрытия крышки бокса 13 бокс для культивирования извлекается и выдерживается при нормальной температуре для отверждения жидкой пробы для испытаний чувствительности к лекарственным средствам IV и приготовления твердой пробы для испытаний чувствительности к лекарственным средствам.
[0076] 8) Твердая проба для испытания чувствительности к лекарственным средствам помещается в инкубатор при температуре 37°С для культивирования, наблюдается цвет твердой пробы для испытаний чувствительности к лекарственным средствам, и когда цвет становится розовым или светло-желтым, может быть осуществлен следующий этап испытания;
[0077] 9) После открытия крышки бокса 13 в твердую пробу для испытаний чувствительности к лекарственным средствам в качестве индикатора добавляется 1 мл теллурита калия, после чего крышка бокса 13 закрывается;
[0078] 10) Твердая проба для испытаний чувствительности к лекарственным средствам помещается в инкубатор при температуре 37°С; наблюдается зона ингибирования, и воздействие лекарственных средств на бактерии оценивается в соответствии с размерами зоны ингибирования.
[0079] В качестве жидкой среды в данном варианте осуществления принимается 7Н9.
[0080] Соотношение между твердой средой и жидкой средой в данном варианте осуществления определяется добавлением части твердой среды на каждые 100 мл среды 7Н9. Каждая часть твердой среды содержит 75 мл желточной жидкости, 4,6 г растворимого крахмала, 0,25 г L-казеина, 4 мл фенолового красного, 1,25 г агарозы, 0,2 г мочевины и соответствующее количество бактериостата (малахитовый зеленый).
[0081] Дополнительно индикатором в данном варианте осуществления является теллурит натрия.
[0082] Для отверждения среды в испытании чувствительности к лекарственным средствам в данном изобретении используется агароза в твердой среде. Помимо агарозы, также можно выбрать агар.
[0083] Твердая среда в изобретении обладает такими физическим свойствами, что она остается твердой при нормальной температуре; когда температура поднимается до температуры плавления, твердая среда остается в твердом состоянии, а при подъеме температуры выше температуры плавления твердая среда расплавляется в жидкость; когда температура опускается, оставаясь выше температуры затвердевания, твердая среда остается в жидком состоянии, а после понижения температуры ниже температуры затвердевания твердая среда затвердевает.
[0084] Критерии выбора температуры плавления твердой среды в данном изобретении являются следующими: 1. Когда температура твердой среды повышается до температуры плавления, питательные вещества не разрушаются; 2. Когда твердая проба для испытаний чувствительности к лекарственным средствам помещается в инкубатор при температуре 37°С, она все еще находится в твердом состоянии; 3. Эта операция удобна в выполнении. В связи с этим температура плавления твердой среды изобретения находится в диапазоне от 50°С до 95°С.
[0085] Критерии выбора температуры затвердевания твердой среды в данном изобретении являются следующими: 1. Когда температура твердой среды опускается ниже температуры затвердевания, Mycobacterium tuberculosis смешиваются с твердой средой, температура должна быть приемлема для выживания Mycobacterium tuberculosis; 2. Температуры культивирования 37°С для Mycobacterium tuberculosis можно достичь быстрее; 3. Эта операция удобна в выполнении. Таким образом, температура затвердевания твердой среды в изобретении варьируется от 25°С до 45°С. Когда температура затвердевания слишком низкая и даже ниже комнатной температуры, особенно в жаркую погоду, для отверждения твердой среды приходится использовать холодильное оборудование, в связи с чем выполнение операции становится неудобным; при этом если температура намного ниже температуры культивирования 37°С для Mycobacterium tuberculosis, невозможно достаточно быстро достичь температуры культивирования Mycobacterium tuberculosis. Если температура затвердевания слишком высокая, это неприемлемо для выживания Mycobacterium tuberculosis.
[0086] В качестве индикатора в изобретении может быть использован индикатор роста или индикатор биохимических реакций. Индикатор роста должен удовлетворять требованиям индикации роста и воспроизводства Mycobacterium tuberculosis, а также он должен обеспечивать поддающееся наблюдению изменение цвета, применимы МТТ, ХТТ и аламар синий. Индикатор биохимических реакций должен удовлетворять требованиям, согласно которым индикатор биохимических реакций может принимать участие в определенных биохимических реакциях Mycobacterium tuberculosis, а также он должен обеспечивать поддающееся наблюдению изменение цвета, применимы мочевина, теллурит калия и теллурит натрия.
[0087] В качестве индикатора в данном варианте осуществления используется мочевина и теллурит калия, кроме того, в качестве индикатора можно выбрать мочевину, МТТ, ХТТ и аламар синий. Процесс испытания состоит всего из 8 этапов, причем первые семь аналогичны, а на последнем твердая проба для испытания чувствительности к лекарственным средствам помещается в инкубатор при температуре 37°С для культивирования, осуществляется наблюдение зоны ингибирования, и воздействие лекарственных средств на бактерии оценивается в соответствии с размерами зоны ингибирования.