БАКТЕРИЦИДНАЯ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ПАРЕНТЕРАЛЬНОГО ПРИМЕНЕНИЯ В ФОРМЕ ЛИОФИЛИЗАТА С ЭНДОЛИЗИНОМ
BACTERICIDAL PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR PARENTERAL USE IN THE FORM OF LYOPHILIZATE WITH ENDOLYSIN

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к медицине, а именно лекарственным средствам, предназначенным для борьбы с инфекциями, вызываемыми грамотрицательными бактериями.
Уровень техники
Устойчивость бактерий к существующим антимикробным средствам является одной из основных проблем современности в области здравоохранения. Горизонтальный перенос генов позволяет бактериям быстро приобретать новые механизмы резистентности, что, наряду с неправильным использованием и злоупотреблением антибиотиками среди населения, а также в сельском хозяйстве и промышленности, приводит к появлению штаммов, частично или полностью невосприимчивых к антибиотикам. Всемирная организация здравоохранения обращает особое внимание на патогены группы ESKAPE, к которым относятся Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae и другие представители Enterobacteriaceae. Данные бактерии способны приобретать устойчивость сразу к нескольким антибактериальным средствам и чаще других вызывают опасные для жизни пациентов инфекции, в том числе и внутрибольничные. Перечисленные обстоятельства диктуют актуальность и востребованность разработки новейших средств, обладающих антибактериальными свойствами в отношении данных патогенных микроорганизмов.
Из уровня техники из патента RU 2715694 С1 02.03.2020 фармацевтическая композиция для лечения глазных инфекций, вызванных метициллин-устойчивыми штаммами Staphylococcus aureus, включающая в качестве активного начала N-концевой СНАР-домен эндолизина бактериофага K Staphylococcus aureus, при следующем соотношении компонентов в лиофилизованной смеси, мас. % на сухой вес: N-концевой СНАР-домен эндолизина Бактериофага K Staphylococcus aureus 1,9 гипромеллоза 7,5 декспантенол 5,1 натрия хлорид 33,0 бензалкония хлорид 0,6 повидон 30,3 лимонная кислота моногидрат 0,8 двузамещенный натрия фосфат 10,8.
Однако известная композиция не обладает антибактериальными свойствами по отношению к грамотрицательным бактериям и не может быть применена для лечения и профилактики инфекций, вызываемых ими. Также указанная композиция не предназначена для парентерального использования, в связи с чем не имеет системного действия.
Описание изобретения
Заявленная бактерицидная фармацевтическая композиция для парентерального применения в форме лиофилизата имеет следующий состав, мас. %:
• рекомбинантный модифицированный эндолизин LysECD7-SMAP - 0,1-0,5%,
• полоксамер 188 - 0,01%,
• фосфатный буферный раствор рН=7,5 - 99,49-99,89%.
Задачами настоящей фармацевтической композиции для парентерального применения в форме лиофилизата являются лечение и профилактика различных видов системных инфекций, вызванных грамотрицательными бактериями, чувствительными к действию эндолизина LysECD7-SMAP.
В частности, LysECD7-SMAP активен в отношении возбудителей различных инфекций, в том числе обладающих множественной лекарственной устойчивостью, включая Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Escherichia coli, Achromobacter spp, Burkholderia cepacia complex и Enterobacter spp. Кроме того, возможно применение препаратов на его основе в отношении Staphylococcus aureus и Listeria monocytogenes.
Бактерицидное средство - эндолизин - разрушает клеточную стенку грамположительных и грамотрицательных бактерий, вызывая их гибель.
Технический результат заключается в использовании фармацевтической композиции, обладающей выраженной специфической фармакологической (антибактериальной) активностью в отношении грамотрицательных бактерий при системном применении, включая бактерии с множественной лекарственной устойчивостью.
Раскрытие изобретения
Указанный технический результат реализуется за счет определенного состава фармацевтической композиции, а также определенных дозировок ингредиентов, входящих в состав композиции.
Бактерицидная фармацевтическая композиция для парентерального применения в форме лиофилизата имеет следующий состав, мас. %: рекомбинантный модифицированный эндолизин LysECD7-SMAP - 0,1-0,5%, полоксамер 188 - 0,01%, фосфатный буферный раствор рН=7,5 - 99,49-99,89%.
Пример 1
Действующим веществом в композиции является модифицированный эндолизин LysECD7-SMAP, аминокислотная последовательность которого представлена в перечне аминокислотных последовательностей Seq ID №1.
Эндолизин получают биотехнологическим путем посредством создания генетической конструкции для экспрессии в штамме Е. coli Bl21(DE3)pLysS. Исходная кодирующая последовательность LysECD7-SMAP была искусственно синтезирована в векторе pALTA-LysECD7-SMAP и интегрирована в экспрессионный вектор рЕТ-42b (+), в результате чего получали плазмиду pET42b-LysECD7-SMAP.
Субстанцию белка получают по следующей технологии: культивирование клеток-продуцентов Е. coli в ферментере с индукцией экспрессии белка, получение растворимых фракций лизатов биомассы клеток продуцента, их трехстадийная хроматографическая очистка (катионообменная хроматография на носителе Capto SP Impres, с последующей двухэтапной гель-эксклюзионной хроматографией на носителях Superdex 75 и Sephadex G25) и концентрирование препарата до концентрации 20 мг/мл.
Далее для формуляции лекарственного препарата полученную ФС модифицированного эндолизина LysECD7-SMAP разбавляют стерильным раствором PBS, рН 7,5 до конечных концентраций 1 мг/мл, 2,5 мг/мл и 5 мг/мл, а затем смешивают с 10% раствором Полоксамера 188 до концентрации 0,01% и фильтруют с помощью одноразовых фильтрационных систем в асептических условиях. Растворы разливают в стерильные стеклянные флаконы и подвергают лиофильной сушке.
Пример 2
Оценка спектра действия и степени антибактериальной активности ГЛФ на основе LysECD7-SMAP проводилась в экспериментах in vitro в отношении широкого спектра различных представителей как грамотрицательных, так и грамположительных бактерий. Каждый вид был представлен 4-5 штаммами или клиническими изолятами с различной степенью устойчивости к антибиотикам. В концентрации 100 мкг/мл эндолизин проявлял бактерицидную активность в отношении 47 штаммов из 59 исследуемых с активностью выше 33,33%).
При этом спектр активности и эффективность в отношении грамотрицательных штаммов был ожидаемо выше, чем по отношению к грамположительным бактериям. Особенно ярко выраженная активность была отмечена к представителям таких видов как Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Escherichia coli, Achromobacter spp, Burkholderia cepacia complex и Enterobacter spp, медианное значение антибактериальной активности к ним составляло более 50%, а для двух видов - 100% (фиг. 1).
Также LysECD7-SMAP проявлял выраженную активность по отношению к грамположительным Staphylococcus aureus и Listeria monocytogenes. Таким образом, в спектр антибактериальной активности модифицированного эндолизина входят практически все представители социально значимой группы патогенных бактерий ESKAPE, а также другие важные возбудители инфекционных заболеваний различной этиологии.
Пример 3
3
Самкам мышей линии BALB/c (24-26 г) внутрибрюшинно вводили взвесь клеток штамма K. pneumoniae М9 в дозе 1×10 КОЕ/животное. Спустя 2 часа после заражения внутривенно вводили исследуемую ГЛФ с концентрацией эндолизина 1, 2,5 и 5 мг/мл, плацебо или антибиотики гентамицин и ампициллин в соответствии с планом эксперимента. Лечение проводили ежедневно, 5 дней, 2 раза в сутки. В течение 10 суток за животными проводили наблюдение, учитывали их гибель и ежедневно регистрировали массу тела животных (фиг. 2). На 1, 3 и 7 сутки проводили оценку обсемененности селезенки и легких, а на 1 и 3 сутки - высевы из крови методом бактериологического посева различных разведений крови или гомогенатов органов на плотную питательную среду с дальнейшим культивированием в течение 18 ч при температуре 37°С, проводя подсчет выросших бактериальных колоний.
С учетом оценки обсемененности паренхиматозных органов, а также высевов крови животных, двукратное внутривенное ежедневное введении ГЛФ в концентрации 2,5 мг/мл в течение 5 дней показало наибольшую эффективность при лечении бактериального клебсиеллезного сепсиса в изученной модели, при этом, в отдельных случаях, эффективность применения была сопоставима с применением гентамицина, к действию которого клетки модельного штамма чувствительны.
Пример 4
6
Самкам мышей линии BALB/c (24-26 г) интраназально вводили взвесь клеток штамма K. pneumoniae М9 в дозе 2×10 КОЕ/животное. Спустя 2 часа после заражения внутривенно вводили исследуемую ГЛФ с концентрацией эндолизина 2,5 мг/мл или плацебо в соответствии с планом эксперимента. Лечение проводили ежедневно, 5 дней, 1 или 2 раза в сутки. В течение 10 суток за животными проводили наблюдение, учитывали их гибель и ежедневно регистрировали массу тела животных. На 1, 3 и 7 сутки проводили оценку обсемененности селезенки и легких, а на 1 и 3 сутки - высевы из крови методом бактериологического посева различных разведений крови или гомогенатов органов на плотную питательную среду с дальнейшим культивированием в течение 18 ч при температуре 37°С, проводя подсчет выросших бактериальных колоний.
В ходе проведенного исследования было показано, что при лечении клебсиеллезной пневмонии ГЛФ на основе модифицированного эндолизина LysECD7-SMAP в концентрациях 1, 2,5 и 5 мг/мл, выживаемость испытуемых мышей линии BALB/c значимо повышается при двукратном внутривенном ежедневном лечении. Кроме того, показано снижение обсемененности легких при введении препарата в дозе 2,5 мг/мл в течение 5 дней.
Заявленная фармацевтическая композиция может быть получена специалистом на практике и при ее использовании обеспечивает реализацию заявленного назначения. Возможность осуществления на практике следует из того, что для каждого ингредиента, включенного в формулу изобретения на основании описания, известен материальный эквивалент, что позволяет сделать вывод о соответствии критерию «промышленная применимость» для изобретения и критерию «полнота раскрытия» для изобретения.
ПЕРЕЧЕНЬ АМИНОКИСЛОТНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
Seq ID №1
MFKLSQRSKD RLVGVHPDLV KVVHRALELT PVDFGITEGV RSLETQKKYV AEGKSKTMKS 60
RHLHGLAVDV VAYPKDKDTW NMKYYRMIAD AFKQAGRELG VSVEWGGDWV SFKDGVHFQL 120
PHSKYPDPKL ERKLRRLKRK IAHKVKKY 148