Особенности дифференцировки и пролиферации клеток плоскоклеточного рака гортани

УДК 616.22-006.6-091-076

ОСОБЕННОСТИ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ И ПРОЛИФЕРАЦИИ КЛЕТОК ПЛОСКОКЛЕТОЧНОГО РАКА ГОРТАНИ

Роман Николаевич Кулагин Казанский государственный медицинский университет

Реферат

Цель. Изучение закономерностей пролиферативных процессов и экспрессии цитокератинов, происходящих в клетках рака гортани и близлежащем нормальном эпителии.

Методы. Был исследован операционный материал, взятый у 66 больных плоскоклеточным раком гортани, из них у 21 (30,4%) с метастазами в регионарные лимфатические узлы. Иммуногистохимический анализ проводился с помощью набора антител против цитокератинов №№ 5, 8,14,18,19, полипептидных цепей корнео-десмосом, белков кератогиалиновых гранул, профилаггрина, филаггрина и ядерного белка Ki-67. Характер им-муногистохимических реакций оценивался визуально в баллах с учетом интенсивности окраски и процента окрашенных клеток. Индекс пролиферации Ki-67 подсчитывали с использованием морфометрической окулярной сетки Г.Г. Автандилова.

Результаты. Установлено, что увеличение степени дифференцировки плоскоклеточного рака гортани и клинической стадии заболевания сопровождается повышением индекса пролиферативной активности опухолевых клеток (МКАТ к Ki-67). МКАТ ЕЕ21-06 является достоверным маркером плоскоклеточного рака гортани любой степени дифференцировки.

Выводы. Для разграничения ороговевающего и неороговевающего рака, а также для выявления микрометастазов в регионарные лимфатические узлы необходимо определение цитокератинов №№ 1, 2, 9, 10, 11. Увеличение экспрессии цитокератинов №№ 8, 18, 19 является показателем снижения гистопатологической дифференцировки опухоли, а экспрессия филаггрина, профилаггрина, антигенов G36-19 — признаком кератинизации ракового эпителия.

Ключевые слова: рак гортани, пролиферация, цитокератины, дифференцировка, иммуногистохимия.

CHARACTERISTICS OF DIFFERENTIATION AND PROLIFERATION OF CELLS OF LARYNGEAL SQUAMOUS CELL CARCINOMA. R.N. Kulagin. Kazan State Medical University. Aim. To study the patterns of proliferative processes and expression of cytokeratins, which occur in the cells of laryngeal cancer and in the nearby normal epithelium. Methods. Studied was the operational material obtained from 66 patients with squamous cell carcinoma of the larynx, of whom 21 (30.4%) had metastases to regional lymph nodes. Immunohistochemical analysis was performed using a set of antibodies against cytokeratins number 5, 8,14,18,19, polypeptide chains of the corneodesmosomes, proteins of keratohyalin granules, profilaggrin, filaggrin and nuclear protein Ki-67. The immunohistochemical reactions were assessed visually according to a scale, taking into account the intensity of staining and the percentage of stained cells. The proliferation index of Ki-67 was calculated using the morphometric ocular grid of G.G. Avtandilov. Results. It was established that an increase in the degree of differentiation of squamous cell carcinoma of the larynx and the clinical stage of disease is accompanied by an increase in the index of proliferative activity of tumor cells (monoclonal antibodies to Ki-67). Monoclonal antibodies EE21-06 are reliable markers of squamous cell carcinoma of the larynx of any degree of differentiation. Conclusions. In order to distinguish between squamous and non-squamous cancer, as well as to detect micrometastases in regional lymph nodes it is necessary to determine cytokeratins number number 1, 2, 9, 10, 11. Increased expression of cytokeratins number 8, 18, 19, is an indicator of a decrease in histopathologic tumor differentiation, while the expression of filaggrin, profilaggrin, G36-19 antigens is a sign of keratinization of the cancer epithelium. Keywords: cancer of the larynx, proliferation, cytokeratins, differentiation, immunohistochemistry.

Злокачественные новообразования гортани вносят значительный вклад в статистику онкологических заболеваний. Для исследования эпителиальных опухолей этой локализации в настоящее время все чаще используются иммуногистохимический метод. Несмотря на достаточно широкую панель моноклональных антител (МКАТ), применяемую при изучении рака гортани, экспрессия некоторых маркеров требует более тщательного анализа. В первую очередь, это касается цитокератинов (ЦКР), создающих цитоскелет клеток, а также маркеров пролиферативной активности, экспрессия которых является ключевым клинико-мор-

Адрес для переписки: rnkulagin@gmail.com

фологическим признаком раковой опухоли, наряду с инвазивностью, степенью анапла-зии, васкуляризацией и апоптозом. Известно, что ЦКР—это семейство промежуточных филаментов эпителиальных клеток, которые ассоциированы с различными белками. Один из таких белков — филаггрин. Он синтезируется зрелыми клетками плоского ороговевающего эпителия из предшественника профилаггрина. В эпидермисе профи-лаггрин и филаггрин выявляются только в верхней части шиповатого слоя и выше. Таким образом, эти белки могут выступать как специфические маркеры зрелости и терминальной дифференцировки плоского эпителия, как и антигены G36-19, D40-Ю, которые обнаружены в зернистом слое эпи-

дермиса [13]. Антиген G36-19 расположен в так называемых корнеодесмосомах — межклеточных мостиках, соединяющих клетки зернистого и отчасти рогового слоев эпидермиса. Антиген D40-10 локализуется в кератогиалиновых гранулах зернистого слоя, экспрессируется в клетках при регенерации эпидермиса после повреждений.

Важную роль в определении течения и прогноза заболевания играет пролиферативная активность опухоли, которая в настоящее время изучается при помощи моноклональных антител против антигенов Ю-67, PCNA и др. Оба являются потенциальными прогностическими биомаркерами в различных опухолях включая рак гортани [2, 4]. Индекс пролиферации увеличивается при снижении степени дифференцировки опухолей гортани [2, 8], а также при наличии метастазов в лимфатические узлы [4].

Целью исследования являлось изучение закономерностей пролиферативных процессов и экспрессии цитокератинов, происходящих в клетках рака гортани и близлежащем нормальном эпителии.

Был исследован материал, взятый у 66 больных плоскоклеточным раком гортани (ПКР), находившихся на стационарном лечении в Республиканском клиническом онкологическом диспансере МЗ РТ с 1991 по 2002 г. Опухолевую ткань и близлежащую нормальную слизистую оболочку гортани для исследования брали в ходе оперативного вмешательства. При оценке каждого случая учитывали локализацию, размеры опухоли, характер роста, наличие или отсутствие метастазов, гистологическую структуру и стадию опухоли в соответствии с системой ТЫМ, а также характер лечения, возраст и пол пациентов. Средний возраст больных составлял 57,9 года. Метастазы в регионарные лимфатические узлы были выявлены в 16 (24,2%) случаях, гематогенные метастазы не обнаружились. Комбинированное лечение (облучение + операция) проводилось у 34 (51,5%) больных.

Для иммуногистохимических реакций криостатные срезы толщиной 7 мкм помещали на предметные стекла и фиксировали ацетоном. Демаскировку парафиновых срезов производили кипячением в 0,1М цитратном буфере pH 6,0 в течение 20 минут. В качестве системы визуализации применяли набор фирмы DAKO LSAB-2. Пероксидазу выявляли раствором диами-нобензидина. Препараты заключали в канадский бальзам. Характер иммуногисто-852

химических реакций оценивали визуально в баллах с учетом интенсивности окраски и процента окрашенных клеток. Индекс пролиферации Ю-67 вычисляли с использованием морфометрической окулярной сетки Г.Г. Автандилова [1]. Статистическую обработку производили с помощью критерия Вилкоксона — Манна — Уитни.

В результате иммуногистохимического исследования фенотипа нормального многослойного плоского неороговевающего эпителия гортани человека мы обнаружили, что маркеры простого эпителия («простые» цитокератины) ЦКР№№ 8,18 в нем не экспрессируются, хотя очаговая реакция иногда отмечалась в слоях клеток, расположенных ближе к базальному слою. ЦКР№19 гетерогенно выявлялся в базальных клетках и оча-гово — в супрабазальном слое. В многорядном эпителии, расположенном в подсвязочном пространстве, имела место экспрессия цитокератинов №№ 8, 18, и 19. Эпителий голосовых связок, лежащий вблизи зоны стыка с многорядным эпителием желудочков и подсвязочного пространства, экспрессировал ЦКР №№8, 18 в самых верхних слоях, а ЦКР №19 присутствовал здесь гетерогенно. В супрабазальных отделах многослойного плоского неороговевающего эпителия оча-гово и диффузно экспрессировались эпидермальные маркеры (ЦКР №№ 1,10/11). МКАТ G-36-19 против антигена корнеодесмосом зернистого слоя эпидермиса нормальный эпителий гортани не окрашивали. Белок терминальной дифференцировки кератино-цитов профилаггрин, а также его конечный продукт филаггрин в неизмененном многослойном плоском эпителии гортани также не выявлялся. В нормальной слизистой оболочке гортани МКАТ к Ю-67 окрашивались ядра базальных клеток как многослойного, так и многорядного эпителиев.

При изучении пролиферативной активности опухолей средний индекс Ю-67 составлял 45,6±1,9%. В высокодифференцированных новообразованиях (степень диффе-ренцировки G1) Ю-67-позитивные ядра опухолевых клеток располагались по периферии опухолевых гнезд и вокруг «раковых жемчужин», в низкодифференцированных (степень дифференцировки G3) — как по периферии, так и в центре раковых гнезд (рис. 1), при этом в высокодифференцированных новообразованиях его среднее значение составляло 42,2±1,7%, в низкодифференцированных — 48,6±1,9% (р<0,05).

Анализ пролиферации клеток умерен-

Рис. 1. Высокая пролиферативная активность в клетках низкодифференцированного рака гортани. Реакция с МКАТ против Ю-67. LSAB-метод с докраской гематоксилином. х 200.

но дифференцированных новообразований показал позитивную ядерную реакцию на Ю-67 не только по периферии, но и ближе к центру опухолевых гнезд (45,9±2,1%). Индекс Ю-67 у больных во II клинической стадии был равен 47,4±2,2%, в III — 41,2±2,1%, в IV — 49,1±1,8%. Наименьший индекс обнаружен в III стадии и при его сравнении с таковым в II и IV стадиях определялись статистически значимые различия (р<0,05 и р<0,01 соответственно).

Экспрессия филаггрина и профилаг-грина наблюдалась в виде зернистого окрашивания как «раковых жемчужин», так и единичных клеток высокодифференцированного рака. Реакция антител к филаггри-ну в ряде наблюдений была менее интенсивной, а в 18% — отрицательной. В 82% случаев в единичных неопластических клетках были обнаружены ке-ратогиалиновые гранулы, характерные для зернистого слоя эпидермиса. В 92,5% случаев высокодифференцированных опухолей по краю и в центре «раковых жемчужин», а также в клетках, находившихся рядом с «жемчужинами», отмечалась позитивная реакция с антителами 036-19.

Экспрессия ЦКР №№ 1,10/11 наблюдалась во всех случаях высоко- и умеренно дифференцированных новообразований. В 12 (55%) из 22 случаев низкодифференцированных новообразований экспрессия этих маркеров обнаруживалась в единичных клетках, лежавших беспорядочно в отдельных опухолевых гнездах. В 64% наблюдений плоскоклеточного рака выявлялась положительная реакция с ЦКР №№8 и 18 (рис. 2). Отчетливо прослеживалась парная экспрессия ЦКР №№8 и 18. Если в одних опухолях имело место гомогенное окраши-

Рис. 2. Реакция с МКАТ против ЦКР №18 по периферии опухолевого гнезда. LSAB-метод с докраской гематоксилином. х 200.

вание всех опухолевых гнезд, то в других — отрицательная реакция. Более интенсивное окрашивание было по периферии раковых гнезд — по границе инвазии, т.е. там, где располагались менее дифференцированные опухолевые клетки.

В настоящем исследовании позитивная реакция на Ki-67 определялась во всех опухолях в виде диффузной и/или зернистой окраски ядер. В центре гнезд высокодифференцированного рака ядра клеток обычно негативны, низкодифференцированного — число Ki-67 позитивных клеток, как правило, увеличивалось с тенденцией к выявлению их по периферии опухолевых гнезд. Подобная картина была описана Kearsley et al. [7], которые считали, что данные клеточные элементы являются незрелыми пролиферирующими клетками-предшест-венниками дифференцированных клеток центральной части опухолевого пласта. Что касается связи индекса Ki-67 с клинической стадией заболевания, то нами обнаружено различие между II и III (p<0,05) и II и IV (p<0,01) стадиями, что согласуется с данными Gunzl H.J. [6] и не соответствует результатам исследования Takes R. et al. [15]. Подобные противоречия объясняются тем фактом, что рост опухоли зависит не только от пролиферации клеток, но и от степени апоптоза, васкуляризации, поэтому синергизм этих факторов может быть различным. В части низкодифференцированных (G3) новообразований даже при наличии в их клетках биохимических признаков ороговения сохранялся высокий уровень пролиферации, характерный для всей группы этих опухолей.

Экспрессия филаггрина описана в высокодифференцированных новообразованиях

кожи и ротовой полости [5]. Как нам удалось установить, окрашивание на филаг-грин зависело от степени дифференцировки опухоли, при этом интенсивность реакции колебалась от слабой до выраженной.

Позитивная корреляция между ЦКР №№1,10/11 и степенью дифференцировки ракового пласта также обнаружена рядом исследователей [3, 11]. Хотя присутствие ЦКР №№1,10/11 обычно связывают с формированием «раковых жемчужин», мы их выявили и в морфологически незрелых клетках. Этот факт, видимо, свидетельствует как о сохранении программы плоскоклеточной дифференцировки, так и об ее изменениях, проявляющихся в экспрессии низкомолекулярных цитокератинов.

Процессы ороговения в высокодифференцированном раке схожи с процессами, проходящими в нормальном эпидермисе, где кератиноциты проходят дифференцировку и созревание продвигаясь от базального к роговому слою. В то же время в некоторых опухолях в хорошо сформированных «раковых жемчужинах» реакция на маркеры ороговения отсутствовала, что указывает на его биохимическую «неполноценность» в высокодифференцированном ороговевающем раке.

В литературе имеется достаточно данных об экспрессии «простых» ЦКР в неизмененных эпителиальных тканях и опухолях. Так, показано, что базальные клетки нормального неороговевающего плоского эпителия также способны экспрессировать небольшое количество ЦКР №№8, 18 и 19 [3]. Ранее считалось, что «простые» цитокератины (№8 и др.) экспрессируются лишь в низкодифференцированных опухолях, но позднее C. Matthias et al. [9] показали возможность экспрессии этих кератинов и в дифференцированных опухолях.

Наблюдаемая нами в 6% случаев более интенсивная окраска «простых» ЦКР по периферии опухолевых гнезд в литературе определяется как «interface» — феномен границы инвазии, который встречается примерно в 1/2 всех случаев плоскоклеточного рака головы и шеи [12]. Этот процесс может быть связан с усилением пролиферации, снижением уровня дифференцировки и/ или влиянием клеток опухолевой стромы. Как и другие исследователи [10, 14], мы не обнаружили связи между экспрессией ЦКР №№8,18 с гистопатологической дифферен-цировкой, клинической стадией и комбинированным лечением.

Механизм, в результате которого реали-

зуется экспрессия маркеров простого эпителия в предраке и плоскоклеточном раке, пока неизвестен. ЦКР №8 — самый первый кератин, который выявляется в процессе эмбриогенеза. Эта экспрессия инициируется во всех эмбриональных клетках, но в дальнейшем по мере дифференцировки плоского эпителия она постепенно останавливается и затем полностью прекращается. При этом показано, что появление ЦКР №№8 и 18 в дефинитивном многослойном плоском эпителии может сопровождать его злокачественную трансформацию [10].

ВЫВОДЫ

1. Чем выше степень дифференцировки плоскоклеточного рака гортани и клиническая стадия заболевания, тем больше индекс пролиферативной активности опухолевых клеток (МКАТ к Ki-67).

2. МКАТ ЕЕ21-06 являются достоверным маркером плоскоклеточного рака гортани любой степени дифференцировки.

3. Для разграничения ороговевающего и неороговевающего рака, а также обнаружения микрометастазов в регионарные лимфатические узлы необходимо выявление ЦКР №№ 1, 2, 9, 10, 11.

4. Увеличение экспрессии ЦКР №№ 8, 18 и 19 служит показателем снижения ги-стопатологической дифференцировки опухоли.

5. Экспрессия филаггрина, профилаг-грина, антигенов G36-19 является признаком кератинизации ракового эпителия.

ЛИТЕРАТУРА

1. Автандилов А.Г. Медицинская морфометрия. — М.: Медицина, 1990. — 384 с.

2. Горбань Н.А., Тен В.П., Панкратов В.А. Экспрессия антигена Ki-67 и белка р53 как показателей агрессивности течения плоскоклеточного рака гортани // Вопр. онкол. — 2007. — Т. 53. — С. 668 — 673.

3. Cohen-Kerem R., Lahat N., Elmalah I. et al. Detection of cytokeratins in normal and malig-nant laryngeal epithelia by means of reverse transcriptase-polymerase chain reaction // Ann. Otol. Rhinol. Laryngol. — 2002. — Vol. 111(2). — P. 149 — 154.

4. Franchi A, Gallo O., Boddi V., Santucci M. Prediction of occult neck metastasis in laryn-geal carcinoma: role of proliferating cell nuclear antigen, MIB-1 and E-cadherin immuno-histochemical determination //Clin. Cancer Res. — 1996. — Vol.2. — P. 1801 — 1808.

5. Grosso M., Lentini M., De Marco E.B. et al. Immunohistochemical localization of filaggrin in benign and malignant lesions of the oral mucosa // Basic Appl. Histochem. — 1990. — Vol. 34. — P. 51 — 58.

6. Gunzl H.J., Horn H., Schecke R. et al. Prognostic value of PCNA and cytokeratins for radiation therapy of oral squamous cell carcinoma // Eur. J. Cancer. Part B. Oral. —

1993. - Vol. 29(B). - P. 140 - 145.

7. Kearsley J.H., Furlong K.L., Cooke R.A. et al. An immunohistochemical assessment of cel-lular proliferation markers in head and neck squamous cell cancers // Br. J. Cancer - 1990. - Vol. 61. - P. 821 - 827.

8. Liu M., Lawson G., Delos M. et al. Prognostic value of cell proliferation markers, tumour suppressor proteins and cell adhesion molecules in primary squamous cell carcinoma of the larynx and hypopharynx // Eur. Arch. Otorhinolaryngol. - 2003. - Vol. 260. - P. 28 - 34.

9. Matthias C, Mack B, Berghaus A, Gires O. Keratin 8 expression in head and neck epithelia // BMC Cancer. -2008. - Vol. 8. - P. 267 - 281.

10. Markey A.C., Lane E.B., Churchill I.J. et al. Expression of simple epithelial keratins 8 and 18 in epidermal neoplasia // J. Inv. Dermatol. - 1991. - Vol. 97. - P.763 - 770.

11. Plzak J., Smetana K., Hrdlickova E. et al. Expression of galectin-3-reactive ligands in squamous cancer and normal epithelial cells as a marker of differentiation // Int.

УДК 616.314.2-089.23-06: [616.379-008.64+616.33-002.2]

J. Oncol. — 2001. — Vol. 19 (1). — P. 59 — 64.

12. Schaafsma H.F., van Velden Y., Manni J.J. et al. Increased expression of cytokeratins 8, 18 and vimentin in the invasion front of mucosal squamous cell carcinoma // J. Pathol. — 1993. — Vol. 170. — P.77 — 86.

13. Serre G., Mils V., Haftek M. et al. Identification of late differentiation antigens of human cornified epithelia. Expressed in re-organised desmosomes and bound to crosslinked envelope // J. Invest. Dermatol. — 1991. — Vol. 97. — P. 1061 — 1072.

14. Suo Z., Holm R., Nesland J.M.Squamous cell carcinomas. An immunohistochemical study of cytokeratins and involucrin in primary and metastatic tumours // Histopathology. — 1993. — Vol. 23. — P. 45 — 54.

15. Takes R., Baaterburg R., Schuuring E. et al. Markers for assessment of nodal metastasis in laryngeal carcinoma // Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg. — 1997. — Vol. 123. — P. 412 — 419.

ОРТОПЕДИЧЕСКОЕ ЛЕЧЕНИЕ БОЛЬНЫХ С СОПУТСТВУЮЩИМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ ПРИ СМЕЩЕНИЯХ НИЖНЕЙ ЧЕЛЮСТИ

Наталья Викторовна Лапина

Кубанский государственный медицинский университет, г. Краснодар

Реферат

Цель. Повышение эффективности ортопедического лечения больных с частичным отсутствием зубов и смещениями нижней челюсти у лиц, в анамнезе которых присутствуют такие заболевания, как медикаментозно компенсированный сахарный диабет, гиперацидный гастрит, невротические расстройства.

Методы. 15 больным с частичным отсутствием зубов, осложненным смещением нижней челюсти и сопутствующими заболеваниями, было проведено ортопедическое лечение в периоде ремиссии и медикаментозной компенсации сопутствующего лечения.

Результаты. Всем больным были изготовлены окклюзионные каппы на верхнюю челюсть с разобщением межокклюзионной высоты на 2 - 3 мм, отпечатками зубов антагонистов и наклонной плоскостью во фронтальном или боковых отделах.

Выводы. Больные пользовались каппой в течение одного-полутора месяца. Заключительным этапом лечения было рациональное протезирование. Боль и чувство дискомфорта в жевательных мышцах и пародонте отсутствовали.

Ключевые слова: окклюзионная каппа, смещения нижней челюсти, ортопедическое лечение, сахарный диабет, гиперацидный гастрит, невротические расстройства.

ORTHOPAEDIC TREATMENT OF PATIENTS WITH UNDERLYING MEDICAL CONDITIONS DURING DISPLACEMENTS OF THE MANDIBLE. N.V. Lapina. Kuban State Medical University, Krasnodar city. Aim. To increase the effectiveness of orthopedic treatment of patients with partial absence of teeth and displacements of the mandible who have a history of present illnesses such as medication compensated diabetes, hyperacid gastritis, neurotic disorders. Methods. Orthopedic treatment in the period of remission and medical compensation of concomitant treatment was conducted for 15 patients with partial absence of teeth, complicated by the displacement of the mandible and with underlying medical conditions. Results. Occlusal splints for the upper jaw with a dissociation of the inter-occlusion height by 2 — 3 mm, impressions of antagonist teeth and with an inclined plane in the frontal or lateral sections were manufactured for all the patients. Conclusions. The patients used the splints for the duration of one or one and a half months. The final stage of treatment was rational prosthesis. No pain or discomfort in the masticatory muscles and paradontium was noted. Key words: occlusal splints, displacement of the mandible, orthopedic treatment, diabetes, hyperacid gastritis, neurotic disorders.

Смещение нижней челюсти — наиболее часто встречающееся осложнение, возникающее в результате частичного отсутствия зубов [1, 4]. Трансверзальное смещение нижней челюсти чаще всего возникает в результате удаления зубов и несвоевремен-

Адрес для переписки: prst_23@mail.ru

ного протезирования, локальной формы повышенной стираемости зубов, ошибок протезирования, преждевременных зубных контактов с последующим смещением нижней челюсти. Жевательные мышцы (чаще крыловидные) для поддержания окклюзионной гармонии находятся в гипертонусе, в дальнейшем развиваются дискоордина-