СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РАБОЧЕГО ПОСЕВНОГО МАТЕРИАЛА ВИРУСА ГРИППА, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВАКЦИНЫ ОТ ГРИППА С ПРИМЕНЕНИЕМ УКАЗАННОГО ПОСЕВНОГО МАТЕРИАЛА И ПОСЕВНОЙ МАТЕРИАЛ ВИРУСА, ПОЛУЧЕННЫЙ УКАЗАННЫМ СПОСОБОМ
METHOD FOR OBTAINING WORKING INFLUENZA VIRUS INOCULUM, METHOD FOR OBTAINING INFLUENZA VACCINE USING SPECIFIED INOCULUM, AND VIRUS INOCULUM OBTAINED BY THE SPECIFIED METHOD

[Область техники]
[1] Настоящее изобретение относится к способу получения рабочего посевного материала вируса гриппа, к способу повышения инфекционности рабочего посевного материала вируса гриппа, к способу получения вакцины от гриппа с применением посевного материала, полученного указанным способом получения, к вакцине от гриппа, полученной указанным способом получения, и к рабочему посевному материалу вируса гриппа с повышенной инфекционностью, полученному указанным способом получения.
[2] [Уровень техники]
[3] Вирусы гриппа представляют собой РНК-вирусы, которые принадлежат к семейству Orthomyxoviridae и имеют заключенные в оболочку вирионы диаметром от 80 до 120 нм. Существует три типа вирусов гриппа, которые обозначают А, В и С. Вирусы гриппа А способны инфицировать свиней, лошадей, человека, птиц и других животных, а вирусы гриппа В и С способны инфицировать только человека. Вирусы гриппа А подразделяются на комбинации из 18 различных подтипов гемагглютинина (НА) и 11 различных подтипов нейраминидаз (NA). Подтипы вирусов гриппа В и С на данный момент не известны.
[4] Вирусы гриппа, как и остальные РНК-вирусы, мутируют быстрее и чаще, чем ДНК-вирусы. Соответственно, вакцины от гриппа для инокуляции, в отличие от других вакцин, разрабатывают заново каждый год с использованием вакцинных штаммов, рекомендованных ВОЗ. Такие сезонные вирусы гриппа обычно разделяют на A/H1N1, A/H3N2, В/Ямагата и В/Виктория в зависимости от типа сыворотки. Помимо этого, если в результате мутации изменяются антигенные свойства, то возникает новый вирус гриппа, который заражает людей без иммунитета, в результате чего возникает глобальная пандемия. Этот инфекционный вирус гриппа называют пандемическим вирусом гриппа. ВОЗ рассматривает подтипы Н5 и Н7 в качестве потенциальных пандемических вирусов.
[5] ВОЗ информирует и распределяет вакцинные штаммы сезонных и потенциально пандемических вирусов гриппа, благодаря чему производители вакцин могут получать вакцины от гриппа с применением вакцинных штаммов. Существует ряд методик получения таких вакцинных штаммов, такие как использование штаммов дикого типа, рекомбинация и обратная генетика. Используя полученные вакцинные штаммы, производители вакцин получают рабочие посевные материалы вируса гриппа. Таким образом, существует необходимость в разработке способа получения рабочего посевного материала вируса гриппа с высокой инфекционностью в количестве, достаточном для применения в нескольких различных партиях.
[6] Если необходимо получить рабочий посевной материал вируса гриппа с применением клеточной культуры, то клетки, как правило, инфицируют вирусом в определенном диапазоне кратности инфицирования (MOI). MOI представляет собой отношение патогенного вируса к инфицированным клеткам и определяется в анализе бляшкообразования для измерения инфекционности вируса гриппа. Проведение анализа бляшкообразования обычно занимает от 3 до 7 дней. В анализе гемагглютинации (далее называемом просто «анализом ГА») отбирают вирус, имеющий высокий титр ГА. В анализе бляшкообразования после сравнения титров бляшкообразующих единиц (БОЕ) отбирают вирус, имеющий максимальный показатель БОЕ.
[7]
[Описание]
[Техническая задача]
[8] Одной из задач настоящего изобретения является обеспечение способа получения рабочего посевного материала вируса гриппа, который имеет повышенную инфекционность по сравнению с исходным вирусом, и способа эффективного получения вакцины от гриппа с применением посевного материала, полученного указанным способом получения, за короткий период времени.
[9] Другой задачей настоящего изобретения является снижение продолжительности и стоимости получении вакцины от гриппа и обеспечение при этом повышенной эффективности получения.
[10] [Техническое решение]
[11] Один из аспектов настоящего изобретения относится к способу получения рабочего посевного материала вируса гриппа, включающему инфицирование клеточной линии, адаптированной к бессывороточной культуре и суспензионной культуре, вакцинным вирусом гриппа, культивирование инфицированной клеточной линии и дальнейшее пассирование вирусной культуры в той же клеточной линии, причем из культур с различными коэффициентами разбавления, используемых для инфицирования вирусом в пассаже, отбирают культуру с коэффициентом разбавления, при котором достигается самая высокая жизнеспособность клеток, при условии, что если титры в анализе гемагглютинации (ГА) (за исключением 0) двух или более культур различаются в 4 раза или более, то отбирают культуру, имеющую коэффициент разбавления, для которого получают самый высокий титр ГА, и используют для следующего пассажа.
[12] Другой аспект настоящего изобретения относится к способу повышения инфекционности рабочего посевного материала вируса гриппа, включающему инфицирование клеточной линии, адаптированной к бессывороточной культуре и суспензионной культуре, вакцинным вирусом гриппа, культивирование инфицированной клеточной линии и дальнейшее пассирование вирусной культуры в той же клеточной линии с получением рабочего посевного материала вируса гриппа, причем из культур с различными коэффициентами разбавления, используемых для инфицирования вирусом в пассаже, отбирают культуру с коэффициентом разбавления, при котором достигается самая высокая жизнеспособность клеток, при условии, что если титры в анализе гемагглютинации ГА) (за исключением 0) двух или более культур различаются в 4 раза или более, то отбирают культуру, имеющую коэффициент разбавления, для которого получают самый высокий титр ГА, и используют для следующего пассажа.
[13] Дополнительный аспект настоящего изобретения относится к способу получения вакцины от гриппа, включающему получение рабочего посевного материала вируса гриппа, полученного согласно соответствующему аспекту, или рабочего посевного материала вируса гриппа с повышенной инфекционностью согласно соответствующему аспекту и ослабление (аттеньюацию) или инактивацию вирусного посевного материала.
[14] Еще один аспект настоящего изобретения относится к рабочему посевному материалу вируса гриппа с повышенной инфекционностью, полученному соответствующим способом, или к вакцине от гриппа, полученной соответствующим способом.
[15] [Полезные эффекты]
[16] Способ согласно одному из аспектов настоящего изобретения может эффективно обеспечивать рабочий посевной материал вируса гриппа за короткое время и при этом не требует проведения анализа бляшкообразования для измерения инфекционности вируса гриппа.
[17] Способ согласно одному из аспектов настоящего изобретения может обеспечивать рабочий посевной материал вируса гриппа с повышенной по сравнению с исходным вирусом гриппа инфекционностью, это позволяет получать большие количества вакцины от гриппа с низкими затратами за короткий период времени, что является предпочтительным с экономической точки зрения.
[18]
[Реализация изобретения]
[19] Один из аспектов настоящего изобретения относится к способу получения рабочего посевного материала вируса гриппа, включающему инфицирование клеточной линии, адаптированной к бессывороточной культуре и суспензионной культуре, вакцинным вирусом гриппа, культивирование инфицированной клеточной линии и дальнейшее пассирование вирусной культуры в той же клеточной линии, причем из культур с различными коэффициентами разбавления, используемых для инфицирования вирусом, отбирают культуру с коэффициентом разбавления, при котором достигается самая высокая жизнеспособность клеток, при условии, что если титры в анализе гемагглютинации (ГА) (за исключением 0) для двух или более культур различаются в 4 раза или более, то отбирают культуру, имеющую коэффициент разбавления, для которого получают самый высокий титр ГА, и используют для следующего пассажа.
[20] В настоящем документе выражение «клеточная линия, адаптированная к бессывороточной культуре и суспензионной культуре» относится к клеточной линии, адаптированной к среде, по существу не содержащей сыворотку, и суспензионной культуре, в условиях, в которых носитель по существу отсутствует. «По существу не содержащий сыворотку» означает, что содержание сыворотки составляет 0,5% (об/об) или менее, в частности, 0,2% (об/об) или менее, более конкретно 0,01% (об/об) или менее, или что сыворотка отсутствует. «Отсутствие по существу носителя» означает, что содержание носителя составляет 0,5% (об/об) или менее, в частности, 0,2% (об/об) или менее, более конкретно 0,01% (об/об) или менее, или что носитель отсутствует. «Адаптированная» клеточная линия относится к клеточной линии, способной к пролиферации в бессывороточной культуре и суспензионной культуре.
[21] Клеточная линия, адаптированная к бессывороточной культуре и суспензионной культуре, может представлять собой, например, клеточную линию MDCK, в частности, MDCK В-702, MDCK KCLRF-BP-00297, MDCK Sky1023 (DSM АСС3112), MDCK Sky10234 (DSM ACC3114) или MDCK Sky3851 (DSM ACC3113), более конкретно MDCK Sky1023 (DSM ACC3112), MDCK Sky10234 (DSM ACC3114) или MDCK Sky3851 (DSM ACC3113). Пассирование вируса в клеточной линии приводит к повышению его инфекционности по сравнению с исходным вирусом.
[22] Вирус гриппа может представлять собой вирус человеческого или птичьего гриппа. Вирус человеческого гриппа может представлять собой вирус А, В или С. На внешней оболочке вирусов гриппа содержатся по меньшей мере два различных поверхностных гликопротеинов-антигенов, тример гемагглютинина (НА), состоящий из трех отдельных мономеров НА, и нейраминидаза (NA), которая существует в виде тетрамера. Как НА, так и NA, вызывают выработку специфических антител вследствие высокой иммуногенности при инфицировании восприимчивых клеток. Существует множество подтипов вируса гриппа А, которые отличаются природой гликопротеинов НА и NA. Идентифицировано 18 НА (от H1 до H18) и 11 NA (от N1 до N11). Например, подтипы вируса гриппа А могут представлять собой H5N1, H9N1, H7N7, H2N2, H7N1, H1N1, H1N2, H3N2, H3N8, H4N8, H5N2, H5N3, H5N8, H5N9, H6N5, H7N1, H7N2, H7N3, H7N4, H7N7, H8N4, H9N2, H10N7, H11N7, H11N6, H12N5, H13N6 и H14N5.
[23] Вирус гриппа В имеет явные отличия от вируса гриппа А и инфицирует человека, в частности, детей.
[24] В одном из вариантов реализации вирус гриппа может представлять собой вирус, который по данным ВОЗ является сезонным и потенциально пандемическим и который распределяется Всемирной организацией здравоохранения.
2
4
8
5
7
[25] Исходно полученный вирус гриппа может быть разбавлен с различными коэффициентами разбавления, и каждый из разбавленных образцов пассируют два или более раз в клеточной линии, адаптированной к бессывороточной культуре и суспензионной культуре. Для первого пассажа вирус гриппа разбавляют с различными коэффициентами разбавления, например, от 1/1 до 1/10000 или от 1/1 до 1/1000, в частности, 1/10, 1/100 и 1/1000, и инфицируют клеточную линию, адаптированную к бессывороточной культуре и суспензионной культуре, предварительно определенным количеством разбавленного препарата. Затем культивируют инфицированную клеточную культуру при перемешивании со скоростью от 10 об/мин до 150 об/мин при температуре от 32°С до 38°С в течение 4 дней или менее, в частности, от 1 дня до 3 дней. Необязательно, в среду можно добавлять трипсин в концентрации от 1 мкг/мл до 10 мкг/мл. Инфицированную клеточную линию необязательно можно выращивать в присутствии от примерно 1% до примерно 10% СО. Инфицированная клеточная линия может присутствовать в концентрации от примерно 1,0×10 клеток/мл до примерно 1,0×10 клеток/мл, в частности, от примерно 1,0×10 клеток/мл до примерно 1,0×10 клеток/мл.
[26] Для определения подходящего момента времени для сбора вируса гриппа измеряют жизнеспособность клеток и титры ГА разбавленных препаратов с различными коэффициентами разбавления через 1 день после инфицирования (1DPI) и 2 дня после инфицирования (2DPI). Момент времени для сбора исследуемого вируса гриппа может быть определен с учетом измеренных значений жизнеспособности клеток и титра ГА. В частности, из культур с различными коэффициентами разбавления, использованных для инфицирования вирусом, отбирают культуру с коэффициентом разбавления, при котором достигается самая высокая жизнеспособность клеток, при условии, что если титры в анализе гемагглютинации (ГА) (за исключением 0) для двух или более культур различаются в 4 раза или более, то отбирают культуру, имеющую коэффициент разбавления, для которого получают самый высокий титр ГА, и используют для следующего пассажа. Распространенной практикой является отбор вирусной культуры, имеющей самый высокий титр ГА. Согласно настоящему изобретению было показано, что для получения вируса с высокой инфекционностью предпочтительно учитывать показатель жизнеспособности клеток. В частности, предпочтительно жизнеспособность клеток должна составлять по меньшей мере примерно 50%, по меньшей мере примерно 60%, по меньшей мере примерно 70%, по меньшей мере примерно 80%, по меньшей мере примерно 90%, примерно 100% или находиться в любом диапазоне между указанными значениями. Учет жизнеспособности клеток при определении подходящего момента времени для сбора исследуемого вируса гриппа противоречит общим техническим знаниям. Согласно уровню техники учитывается только тот момент времени, когда достигается самый высокий титр ГА, а жизнеспособность клеток при этом не рассматривается. Таким образом, для культур, которые отбирают только на основании значения титра ГА, часто пропускается момент достижения наивысшей жизнеспособности клеток. Согласно настоящему изобретению было показано, что отбор культуры, имеющей самую высокую жизнеспособность клеток, обеспечивает получение вируса с высокой инфекционностью. Титр ГА может составлять 0, по меньшей мере примерно 100, по меньшей мере примерно 200, по меньшей мере примерно 300, по меньшей мере примерно 400, по меньшей мере примерно 500, по меньшей мере примерно 1000, по меньшей мере примерно 1100, по меньшей мере примерно 1200, по меньшей мере примерно 1300, по меньшей мере примерно 1400, более конкретно, по меньшей мере примерно 1500, или находиться в любом диапазоне между указанными значениями. Тем не менее, если титры в анализе гемагглютинации (ГА) (за исключением 0) двух или более культур различаются в 4 раза или более, то предпочтительно отбирают культуру, имеющую фактор разбавления, при котором достигается самый высокий титр ГА.
Рассмотрение в качестве определяющего параметра титра ГА, но не жизнеспособности клеток, позволяет отбирать культуру с наивысшей инфекционностью.
[27] Предпочтительно следует отбирать наиболее оптимальные результаты при сравнении жизнеспособности клеток и значений титра ГА культур с различными коэффициентами разбавления. Например, культура, имеющая самую высокую жизнеспособность клеток, является предпочтительной из культур, имеющих различные коэффициенты разбавления, при условии, что если две культуры или более имеют одинаковую жизнеспособность клеток, то можно отобрать культуру, имеющую самый высокий титр ГА. В качестве другого примера, культура, имеющая самую высокую жизнеспособность клеток, является предпочтительной из культур, имеющих различные коэффициенты разбавления, при условии, что если титр ГА культуры, имеющей более низкую жизнеспособность клеток, по меньшей мере в четыре раза выше титра ГА культуры, имеющей самую высокую жизнеспособность клеток, то можно отобрать культуру, имеющую более низкую жизнеспособность клеток. В качестве еще одного примера, если две или более культур с различными коэффициентами разбавления имеют одинаковую самую высокую жизнеспособность клеток, то можно отобрать культуру, имеющую самый высокий титр ГА.
[28] Отобранную первичную культуру можно использовать непосредственно или впоследствии для вторичного или следующего пассажа. В качестве альтернативы, отобранную первичную культуру можно замораживать и хранить при температуре в диапазоне от -50°С до -80°С, например, от -55°С до -70°С, перед последующим использованием, а после этого ее можно пассировать один или более раз.
[29] Для проведения последующего вторичного пассажа культуры первичную культуру можно разбавлять до достижения различных коэффициентов разбавления и инфицировать новую клеточную линию, адаптированную к бессывороточной культуре и суспензионной культуре. Вторичный пассаж проводят таким же способом, что описан для первичного пассажа. Коэффициенты разбавления могут составлять, например, от 1/1 до 1/10000, но коэффициент разбавления выбирают таким образом, чтобы значения жизнеспособности и титра ГА в первичной культуре были наивысшими. После этого, культуры, имеющие различные коэффициенты разбавления, культивируют таким же образом, что и первичную культуру, измеряют жизнеспособность клеток и титр ГА тем же способом, что описан для первичной культуры, и отбирают культуру, имеющую самую высокую жизнеспособность клеток, которая равна или превышает значение для первичной культуры. Собирают отобранную культуру. Собранная культура может применяться как рабочий посевной материал вируса гриппа.
[30] Необязательно можно проводить третичный или следующий пассаж отобранной культуры таким же способом, что описан выше. Титр вирусного посевного материала в анализе бляшкообразования после вторичного или следующего пассажа увеличиться по меньшей мере примерно в 10 раз, в частности, по меньшей мере примерно в 100 раз, по меньшей мере примерно в 200 раз, по меньшей мере примерно в 300 раз или по меньшей мере примерно в 400 раз по сравнению с вирусом гриппа перед пассированием, например, с исходным вирусом гриппа.
[31] Другой аспект настоящего изобретения относится к способу повышения инфекционности рабочего посевного материала вируса гриппа, включающему инфицирование клеточной линии, адаптированной к бессывороточной культуре и суспензионной культуре, вакцинным вирусом гриппа, культивирование инфицированной клеточной линии и дальнейшее пассирование вирусной культуры в той же клеточной линии с получением рабочего посевного материала вируса гриппа, причем из культур с различными коэффициентами разбавления, используемыми для инфицирования вирусом, отбирают культуру с коэффициентом разбавления, при котором достигается самая высокая жизнеспособность клеток, при условии, что если титры в анализе гемагглютинации (ГА) (за исключением 0) для двух или более культур различаются в 4 раза или более, то отбирают культуру, имеющую коэффициент разбавления, для которого получают самый высокий титр ГА, и используют для следующего пассажа. Указанный аспект может быть реализован в соответствии с предшествующим аспектом, и, таким образом, его описание опущено во избежание повторения.
[32] Дополнительный аспект настоящего изобретения относится к способу получения вакцины от гриппа, включающему получение больших количеств рабочего посевного материала вируса гриппа, полученного согласно соответствующему аспекту, или рабочего посевного материала вируса гриппа с повышенной инфекционностью согласно соответствующему аспекту и ослабление или инактивацию вирусного посевного материала. Этот аспект позволяет в короткие сроки получать большое количество вируса с повышенной инфекционностью по сравнению с исходным вирусом перед пассированием (например, с исходно полученным вирусом), который, таким образом, подходит для крупномасштабного получения вируса с повышенной инфекционностью. Ослабленный или инактивированный вирус может представлять собой ослабленный цельный вирус, субвирион (так называемую сплит-вакцину), в котором очищенные частицы вируса разрушаются детергентом, растворяющим липидную оболочку, или другими реагентами, или очищенные НА или NA (субъединичную вакцину).
[33] Еще один аспект настоящего изобретения относится к рабочему посевному материалу вируса гриппа с повышенной инфекционностью, полученному соответствующим способом, или к вакцине от гриппа, полученной соответствующим способом. Инфекционность рабочего посевного материала вируса гриппа или вакцины от гриппа может быть повышена по меньшей мере примерно в 10 раз, в частности, по меньшей мере примерно в 10 раз, по меньшей мере примерно в 100 раз, по меньшей мере примерно в 200 раз, по меньшей мере примерно в 300 раз или по меньшей мере примерно в 400 раз при определении по титру в анализе бляшкообразования.
[34]
[35] Настоящее изобретение будет подробно описано при помощи приведенных ниже представительных вариантов реализации, предназначенных для лучшего понимания настоящего изобретения. В варианты реализации настоящего изобретения, тем не менее, могут быть внесены изменения с образованием некоторых других форм, и объем настоящего изобретения не следует рассматривать как ограниченный приведенными ниже вариантами реализации. Варианты реализации настоящего изобретения предназначены для более исчерпывающего объяснения настоящего изобретения специалистам в данной области техники.
[36] ПРИМЕРЫ
[37]<Пример 1>Различия в инфекционности в зависимости от жизнеспособности клеток и титра ГА при выращивании штаммов вакцинных вирусов
2
6
6
[38] Клеточную линию MDCK (MDCK Sky3851), адаптированную к бессывороточной культуре и суспензионной культуре, выращивали при 34°С и 5% СО при перемешивании со скоростью 80 об/мин. После того, как клетки вырастали сверх предварительно определенного уровня в ходе нескольких пассажей, среду заменяли на новую. Затем помещали клетки в четыре 125 мл роллерные колбы в концентрации от 3,0х10 клеток/мл до 4,0х10 клеток/мл и дополняли среду трипсином для инфицирования. В указанном эксперименте использовали вакцинные штаммы гриппа 2005-2006, 2009-2010 и 2016-2017 годов. Условия выращивания вирусов показаны в таблице 1.
[40] Вакцинные штаммы вируса гриппа разбавляли в 1-1/1000 раз для выращивания вируса и инфицировали клеточную линию предварительно определенным количеством каждого разбавленного препарата. Для определения соответствующего момента времени для сбора каждого вируса гриппа измеряли жизнеспособность клеток и титр ГА в культурах через 1 день или 2 дня после инфицирования (DPI). Из культур, имеющих различные коэффициенты разбавления, отбирали культуры с различными значениями жизнеспособности клеток, титры ГА в которых отличались в 2 или 4 раза. Результаты показаны в таблице 2.
[42] На основании результатов, приведенных в таблице 2, можно увидеть, что жизнеспособность клеток и титр ГА культур вакцинного штамма гриппа NYMC Х-283А (А/Лиссабон/32/2015), имеющих коэффициенты разбавления 1/1 и 1/10, были сравнимыми, и, таким образом, жизнеспособность клеток (90%) культуры, имеющей коэффициент разбавления 1/10, была выше жизнеспособности (80%) культуры с коэффициентом разбавления 1/1. Кроме того, титр ГА культуры с коэффициентом разбавления 1/10 был в два раза ниже по сравнению с культурой, имеющей коэффициент разбавления 1/1. В анализе бляшкообразования было показано, что культура, имеющая коэффициент разбавления 1/10, имела в ~24,5 раза более высокий титр в анализе бляшкообразования, несмотря на в два раза более низкий титр ГА.
[43] В случае штаммов NYMC Х-157 (А/Нью-Йорк/55/2004) и В/Малайзия/2506/2004 для культур, имевших более высокие значения жизнеспособности клеток, были получены более высокие титры в анализе бляшкообразования, несмотря на то, что они имели в два раза более низкие титры ГА.
[44] При этом, значения жизнеспособности клеток и титра ГА в культурах вакцинного штамма гриппа NYMC Х-275 (А/Мичиган/45/2015), имеющих коэффициенты разбавления 1/1000 и 1/10000, были сравнимыми, и, таким образом, жизнеспособность клеток (90%) в культуре с коэффициентом разбавления 1/10000 была выше жизнеспособности (80%) культуры с коэффициентом разбавления 1/1000. Кроме того, титр ГА в культуре с коэффициентом разбавления 1/10000 был в четыре раза ниже, чем в культуре, имеющей коэффициент разбавления 1/1000. В анализе бляшкообразования было показано, что культура с коэффициентом разбавления 1/1000, которая имела титр ГА, в четыре раза превышающий титр ГА культуры с коэффициентом разбавления 1/10000, имела в ~1,7 раза более высокий титр в анализе бляшкообразования, несмотря на более низкую жизнеспособность клеток.
[45] В случае вакцинных штаммов гриппа NYMC Х-175С (А/Уругвай/716/2007) и NYMC ВХ-35 (В/Брисбен/60/2008) для культур, имевших в четыре раза более высокие титры ГА, были получены более высокие титры в анализе бляшкообразования, несмотря на пониженную жизнеспособность клеток.
[46]
[47]<Пример 2>Получение рабочего посевного материала вируса гриппа (в 125 мл роллерных колбах)
2
6
6
[48] Клеточную линию MDCK (MDCK Sky3851), адаптированную к бессывороточной культуре и суспензионной культуре, выращивали при 34°С и 5% СО при перемешивании со скоростью 80 об/мин. После того, как клетки вырастали сверх предварительно определенного уровня в ходе нескольких пассажей, среду заменяли на новую. Затем помещали клетки в четыре 125 мл роллерные колбы в концентрации от 3,0×10 клеток/мл до 4,0×10 клеток/мл и дополняли среду трипсином для инфицирования. В указанном эксперименте использовали вакцинные штаммы гриппа 2004-2010 годов. Условия выращивания первичных и вторичных культур вирусов показаны в таблице 1.
[49]
[50] Вакцинные штаммы вируса гриппа разбавляли в 1-1/1000 раз для выращивания первичной культуры вируса и инфицировали клеточную линию предварительно определенным количеством каждого разбавленного препарата. Для определения соответствующего момента времени для сбора каждого вируса гриппа измеряли жизнеспособность клеток и титр ГА в культурах через 1 день или 2 дня после инфицирования (DPI). Из культур, имеющих различные коэффициенты разбавления, отбирали культуры с самым высоким значением жизнеспособности клеток. Результаты показаны в таблице 3. В указанном эксперименте культуры, титры ГА (за исключением 0) которых отличались в 4 раза, отсутствовали. Собирали отобранные первичные культуры через 2DPI, центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 минут, разделяли на небольшие порции (по 1 мл) и хранили при ≤-70°С. Размораживали культуру в одной из пробирок и разбавляли в 1-1/10000 раз, инфицировали с получением вторичной пассированной культуры вируса и измеряли жизнеспособность клеток и титр ГА через 1DPI и 2DPI таким же способом, что и в первичной пассированной культуре. Из культур, имеющих различные коэффициенты разбавления, отбирали культуры с самой высокой жизнеспособностью клеток. Результаты показаны в таблице 3. В указанном примере культуры, титры ГА (за исключением 0) которых отличались в 4 раза, отсутствовали. Финальный отбор вторичных культур проводили через 2DPI, собирали их, центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 минут, разделяли на небольшие порции (по 1 мл) и хранили при ≤-70°С, их рассматривали в качестве рабочего посевного материала вируса гриппа.
[52] Проводили анализ бляшкообразования для определения инфекционности надосадочных жидкостей, собранных через 2DPI в первичной культуре и вторичной культуре. Результаты показаны в таблице 4. Проводили два последовательных пассажа вакцинных штаммов гриппа в клеточной линии MDCK (MDCK Sky3851), адаптированной к бессывороточной культуре и суспензионной культуре. В качестве результата было показано, что титры в анализе бляшкообразования в над осадочных жидкостях были в 10-1000 раз выше по сравнению с вакцинными штаммами гриппа.
[54]<Пример 3>Получение рабочего посевного материала вируса гриппа (в 3 л роллерных колбах)
2
6
6
6
6
[55] Клеточную линию MDCK (MDCK Sky3851), адаптированную к бессывороточной культуре и суспензионной культуре, выращивали при 34°С и 5% СО при перемешивании со скоростью 80-100 об/мин. После того, как клетки вырастали сверх предварительно определенного уровня при проведении нескольких пассажей, заменяли среду на новую. Затем помещали клетки в четыре 125 мл роллерные колбы в концентрации от 3,0×10 клеток/мл до 4,0×10 клеток/мл в случае первичной вирусной культуры и в четыре 3 л роллерные колбы в концентрации от 3,0×10 клеток/мл до 4,0×10 клеток/мл в случае вторичной вирусной культуры и дополняли среду трипсином для инфицирования. В указанном эксперименте использовали вакцинные штаммы гриппа 2013-2017 годов. Условия выращивания первичных и вторичных культур вирусов показаны в таблице 5.
[57] Культуры, отбираемые через 1DPI и 2DPI после выращивания вторичных вирусных культур, получали таким же способом, что и в примере 2. Центрифугировали культуры при 3000 об/мин в течение 10 минут, разделяли на небольшие порции (по 1 мл) и хранили при температуре ≤-70°С, полученные культуры определяли как рабочий посевной материал вируса гриппа. Измеряли жизнеспособность клеток и титр ГА для вакцинных штаммов гриппа через 1DPI и 2DPI для первичных и вторичных пассированных культур. Результаты показаны в таблице 6.
8
[59] Проводили анализ бляшкообразования в конечных культурах для подтверждения инфекционности рабочих посевных материалов вируса гриппа, перечисленных в таблице 6. Результаты показаны в таблице 7. По аналогии с результатами, приведенными в таблице 4 (пример 2), большинство титров в анализе бляшкообразования для рабочего посевного материала вируса гриппа после двух последовательных пассажей в клеточной линии MDCK (MDCK Sky3851), адаптированной к бессывороточной культуре и суспензионной культуре, составляли ≥1,00×10 БОЕ/мл.
[61]<Пример 4>Секвенирование рабочего посевного материала вируса гриппа
[62] Определяли возможные изменения антигенных свойств гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (NA), которые являются основными поверхностными антигенами, после трехкратного пассирования вакцинных штаммов гриппа в клеточной линии MDCK, адаптированной к бессывороточной культуре и суспензионной культуре. Для этого выявляли изменения последовательностей антигенов. Проводили двукратный пассаж вакцинных штаммов таким же образом, что и в примере 2, и проводили еще один пассаж (всего три раза). Затем выделяли РНК из каждого вируса при помощи набора PureLink Viral RNA/DNA (Invitrogen) и проводили селективную амплификацию генов НА и NA путем ПЦР в системе SUPERSCRIPTIII ONE-STEP RT-PCR (Invitrogen) с использованием праймеров, обладающих специфичностью в отношении генов НА и NA в штамме вируса. Затем удаляли примеси из продуктов ПЦР с использованием набора для очистки QIAquick PCR. Проводили секвенирование ДНК в генетическом анализаторе ABI PRISM 3130xl, массив данных о последовательности получали при помощи инструментов SeqMan Pro и MegAlign в программе DNA STAR, Lasergene версии 8.1.
[64] Результаты, приведенные в таблице 8, демонстрируют, что даже после трехкратного пассирования всех вакцинных штаммов гриппа подтипов A/H1N1, A/H3N2 и В в клеточной линии MDCK, адаптированной к бессывороточной культуре и суспензионной культуре, изменения последовательностей генов НА и NA, являющихся основными поверхностными антигенами, не происходили. В завершение, антигенные свойства антигенов оставались неизменными.
[65]