БИОКАТАЛИЗАТОР ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЭТАНОЛА ИЗ ПЕНТОЗ
BIOCATALYST FOR PRODUCING ETHANOL FROM PENTOSE

Изобретение относится к биотехнологии, конкретно к биокатализаторам на основе клеток мицелиальных грибов, включенных в матрицу полимерного гелевого носителя, катализирующих конверсию пентоз в этиловый спирт, и предназначено для повышения эффективности биотехнологического получения этанола из целлюлозосодержащего сырья.
В современных промышленных процессах этанол получают микробиологическим способом ферментацией глюкозы с использованием клеток дрожжей в качестве биокатализаторов. В качестве источника глюкозы используют химические или ферментативные гидролизаты крахмало- или целлюлозосодержащих продуктов, отходов сельскохозяйственного или промышленного производства. Помимо глюкозы, они содержат до 25 г/л пентоз (ксилоза, арабиноза и рибоза), не сбраживаемых традиционно применяемыми в промышленности спиртовыми расами дрожжей. Для повышения экономической привлекательности процесса получения этанола из целлюлозосодержащего сырья целесообразно использовать биокатализаторы, обеспечивающие получение этанола из пентоз.
В качестве таких биокатализаторов применяют природные штаммы мицелиальных грибов родов Rhizopus Aspergillus, Fuzarium и Mucor, способные сбраживать различные сахара, в том числе и пентозы, в этанол [Olsson L., Hahn-Hägerdal В. (1996) Fermentation of lignoellulosic hydrolysates for ethanol production. // Enzyme Microb. Technol., V.18, p.312-331]. Биокатализаторы, представляющие собой развитый метаболически активный мицелий гриба, получают культивированием спор в богатых питательных средах в аэробных условиях с последующим их применением для получения этанола из пентоз в анаэробных условиях. В качестве источника сбраживаемых сахаров могут быть использованы как растворы индивидуальных пентоз, так и среды, содержащие пентозы в составе сложных смесей сахаров, в частности химические и ферментативные гидролизаты целлюлозосодержащего сырья [Millati R., Edebo L., Taherzadeh M.J. (2005) Performance of Rhizopus, Rhizomucor, and Mucor in ethanol production from glucose, xylose, and wood hydrolyzates. // Enz. Microb. Technol., V.36, p.294-300].
Эффективность биокатализаторов, предназначенных для конверсии пентоз в этанол, удобно сравнивать по следующим показателям:
- длительность процесса конверсии (ч);
- выход этанола в расчете на исходный субстрат (%);
- продуктивность процесса или скорость конверсии (сбраживания), определяемая как концентрация целевого продукта - этанола, отнесенная к длительности процесса конверсии (г/л/ч).
8
Известен биокатализатор для получения этанола из пентоз, представляющий собой мицелий гриба Aspergillus terreus [Pushalkar S., Rao K.K. (1998) Short communication: Ethanol fermentation by a cellulolytic fungus Aspergillus terreus. II World J. Microbiol. Biotechn., V.14, p.289-291]. Для получения биокатализатора 10 спор/мл вносят в питательную среду, содержащую 1% глюкозы и набор солей, необходимых для роста клеток, затем проводят культивирование клеток в аэробных условиях при 28°С при постоянном перемешивании в течение 24 ч. Полученный биокатализатор в анаэробных условиях обеспечивает выход этанола из ксилозы 5,6% за 144 ч, а из арабинозы - 8% за 120 ч. Продуктивность процесса конверсии (скорость сбраживания) составляет соответственно 0,02 и 0,03 г/л/ч. Основным недостатком этого биокатализатора является крайне низкая продуктивность процесса, которую он обеспечивает.
6
Известен биокатализатор на основе клеток мицелиального гриба Mucor indicus для получения этанола из пентоз, присутствующих в среде в качестве единственного источника сбраживаемых сахаров, или входящих в состав смесей сахаров в кислотных гидролизатах древесины [Sues A., Millati R., Edebo L., Taherzadeh M.J. (2005) Ethanol production from hexoses, pentoses, and dilute-acid hydrolyzate by Mucor indicus.11 FEMS Yeast Research, V.5, p.669-676]. Для получения биокатализатора 1 мл суспензии спор с концентрацией (5-6)×10 спор/мл вносят в 150 мл питательной среды, содержащей 33 г/л глюкозы и необходимый набор солей и органических компонентов. Проводят культивирование клеток до формирования метаболически активного мицелия при 30°С в аэробных условиях при постоянном перемешивании в течение 24 ч. При конверсии индивидульных пентоз выход этанола составляет: из ксилозы 18% за 88 ч, из арабинозы 15% за 93 ч, что соответствует скорости сбраживания - 0,068 или 0,053 г/л/ч соответственно. Выход этанола при конверсии ксилозы, присутствующей в составе кислотных гидролизатов отходов переработки древесины хвойных пород, составляет 13,3%, а скорость сбраживания 0,025 г/л/ч. К недостаткам биокатализатора следует отнести невысокую скорость сбраживания пентоз и относительно невысокие выходы целевого продукта.
Применение аналогичного катализатора, полученного в условиях повышенной температуры (37°С) при контроле рН среды (5,0±0,7), позволяет повысить выход целевого продукта до 22% от внесенного субстрата, а скорость сбраживания до 0,11 г/л/ч. [Millati R., Edebo L., Taherzadeh M.J. (2005) Performance of Rhizopus, Rhizomucor, and Mucor in ethanol production from glucose, xylose, and wood hydrolyzates.// Enz. Microb. TechnoL, V. 36, p.294-300]. Однако использование повышенных температур и необходимость контроля рН технологически и экономически усложняет процесс. Повышение температуры способствует снижению продуктивности биокатализатора под действием накапливающегося этанола.
8
Известны биокатализаторы, представляющие собой клетки мицелиальных грибов Rhizopus javanicus или Rhizopus oryzae, предназначенные для получения этанола из ксилозы [Skory C.D., Freer S.N., Bothast R.J. (1997) Screening for ethanol-producing filamentous fungi. // Biotechn. Lett., V.19, p.203-206]. Для получения биокатализатора 10 спор вносят в 20 мл питательной среды, содержащей 0,3% дрожжевого экстракта, 0,5% пептона, 0,3% солодового экстракта и 50 г/л ксилозы. Проводят культивирование клеток до формирования метаболически активного мицелия в аэробных условиях при постоянном перемешивании в течение 24 ч. Выход этанола составляет 23,4% (Rhizopus javanicus) и 21,6% (Rhizopus oryzae) от внесенного субстрата, а скорость сбраживания соответственно - 0,16 или 0,15 г/л/ч.
2
Общим недостатком всех описанных биокатализаторов является то, что все они рассчитаны на однократное применение. Невозможность повторного использования связана с быстрым ухудшением первоначальных характеристик биокатализатора под воздействием накапливающегося в среде этанола и вследствие снижения рН среды за счет растворения выделяющегося в процессе брожения СО и накопления побочных продуктов, в частности уксусной кислоты и других органических кислот. Невозможность повторного использования биокатализатора создает проблему постоянного наращивания свежей биомассы и утилизации отработанных клеток и делает процесс экономически неэффективным.
Улучшить характеристики биокатализатора и повысить его привлекательность для использования в промышленных процессах позволяет его получение в иммобилизованном виде.
Иммобилизация позволяет повысить устойчивость клеток мицелиальных грибов по отношению к отрицательным воздействиям вышеуказанных факторов и увеличить время, в течение которого биокатализатор сохраняет свою активность.
Биокатализаторы на основе иммобилизованных клеток обладают большей технологической и экономической привлекательностью за счет возможности их многократного использования, упрощения процедуры отделения биомассы клеток от среды культивирования, а также элиминирования необходимости утилизации отработанной биомассы после каждого рабочего цикла.
2
4
2
4
4
Известен биокатализатор для получения этанола из ксилозы, представляющий собой клетки мицелиального гриба Mucor circinelloides АТСС 1216 В, распределенные в матрице белкового полимера поли-D-лизина [Lubbehusen T.L., Nielsen. J., Mclntyre M. (2004) Aerobic and anaerobic ethanol production by Mucor circinelloides during submerged growth.//Appl. Microbiol. Biotechnol, V.63, p.543-548]. Для получения биокатализатора в ячейку, представляющую собой два покрывных стекла (26 мм × 76 мм), разделенных между собой тонкой прокладкой и помещенных в металлический корпус с отверстиями для подвода субстрата и отвода культуральной жидкости, заливают 1 мл 0,1% раствора полимера поли-D-лизина, обладающего свойствами поликатионита. Далее в ячейку вносят споры до их конечной концентрации 50-80 спор в ячейке. Иммобилизация спор основана на адсорбции спор на стекле за счет множественных электростатических взаимодействий между отрицательно заряженными химическими группами, находящимися на поверхности спор, и покрывающим стекло положительно заряженным белковым полимером. Далее через ячейку прокачивают со скоростью 3 мл/ч питательную среду, содержащую 20 г/л ксилозы, 4,83 г/л клейстеризованной рисовой муки, 60 г/л никотиновой кислоты, 60 г/л тиамина, 60 г/л NaHPO 30 г/л KHPO 5 г/л NaCl, 10 г/л (NH)Cl. Культивирование клеток проводят при рН среды около 5,0 при 28°С в аэробных условиях в течение 40 ч до формирования метаболически активного мицелия. Такой биокатализатор обеспечивает в течение 40 ч получение 0,08 г/л этанола при конверсии 20 г/л ксилозы. Выход целевого продукта составляет 0,4% от внесенного субстрата, а скорость сбраживания - 0,002 г/л/ч. На арабинозе активность биокатализатора не исследована. В отличие от приведенных аналогов данный катализатор может быть использован в проточном реакторе, то есть многократно в объеме одного и того же реактора.
Данное техническое решение как наиболее близкое к заявляемому по типу биокатализатора, представляющего собой иммобилизованные клетки микроскопического гриба, способного сбраживать пентозы в этанол, принято за прототип.
Основным недостатком биокатализатора, принятого за прототип, является его низкая продуктивность, обусловленная следующими причинами:
1. Применяемый способ иммобилизации позволяет исходно ввести в биокатализатор очень низкую концентрацию спор, распределенных по поверхности носителя. Количество активных иммобилизованных клеток биокатализатора, определяющее его продуктивность, лимитировано геометрическими размерами реактора, поскольку иммобилизация осуществляется за счет электростатических взаимодействий спор с полимером, распределенным на поверхности стеклянных пластин. Вследствие этого возможность повышения продуктивности процесса ограничена возможностью увеличения геометрических размеров реактора. Это обстоятельство затрудняет масштабирование процесса.
2
2. Зависимость от рН прочности электростатического взаимодействия между иммобилизованными клетками и полилизином в составе биокатализатора. При сдвиге рН в кислую область в результате накопления метаболитов и частичного растворения образующегося при брожении СО прочность электростатического комплекса уменьшается, часть иммобилизованных клеток выходит из биокатализатора, что приводит к снижению его продуктивности. Необходимость поддержания рН на постоянном уровне усложняет технологию и удорожает получение целевого продукта.
3. Функционирование биокатализатора рассчитано только на аэробные условия, в которых основная часть потребляемого субстрата используется клетками для накопления биомассы. Возможность функционирования данного биокатализатора в анаэробных условиях, являющихся, как известно, наиболее благоприятными для снижения скорости роста клеток и накопления целевого продукта [Шлегель Г. Общая микробиология. // М.: Мир, 1987, 567 с.], авторами разработки не предусмотрена.
Задачей предлагаемого изобретения является получение биокатализатора на основе иммобилизованных клеток мицелиальных грибов для получения этанола из пентоз, длительно сохраняющего высокую продуктивность и пригодного для многократного использования в периодическом процессе.
Поставленная задача решается тем, что биокатализатор для получения этанола из пентоз содержит биомассу мицелия микроскопического гриба, способного сбраживать пентозы в этиловый спирт, включенную в гелевую матрицу полимерного носителя, при этом в качестве гелевой матрицы биокатализатор содержит криогель поливинилового спирта, при следующем соотношении компонентов (мас.%):
биомасса мицелия микроскопического гриба - 7,5÷20,0;
поливиниловый спирт - 2,5÷5,0;
вода - до 100.
В качестве биомассы мицелия микроскопического гриба может быть использована биомасса мицелия любых микроскопических грибов, способных к продуцированию этанола из пентоз.
Криогель ПВС, формируемый при замораживании-оттаивании водного раствора поливинилового спирта, характеризуется хорошими эксплуатационными характеристиками, а также высокой пористостью образующейся гелевой матрицы, обеспечивающей незатрудненную диффузию субстратов и продуктов [Лозинский В.И. Новое семейство макропористых и сверхмакропористых материалов биотехнологического назначения - полимерные криогели. // Известия РАН. Сер. Химическая, 2008, №5, с.1-18]. Криогель ПВС химически стабилен при низких значениях рН среды, а также в присутствии этилового спирта и других микробных метаболитов, накапливающихся в процессе получения этанола.
Иммобилизация мицелиальных гиф в объеме криогеля ПВС приводит к их пространственному разобщению пористой структурой матрицы, что в отличие от прототипа позволяет создать в объеме реактора высокие концентрации клеток, равномерно распределенных и зафиксированных в носителе, и тем самым увеличить скорость накопления этанола в среде культивирования. Такое пространственное распределение клеток создает улучшенные условия для метаболизма, что обеспечивает увеличение выхода целевого продукта и повышение продуктивности процесса.
Заявляемый биокатализатор обеспечивает высокую продуктивность процесса в течение длительного времени, период полуинактивации составляет от 17 до 36 суток в зависимости от культуры.
Удобство отделения иммобилизованной биомассы от культуральной среды в сочетании со способностью сохранять высокую продуктивность в течение длительного времени позволяет использовать заявляемый биокатализатор многократно в периодических условиях для получения этанола из пентоз.
Количественные соотношения, в которых компоненты входят в состав заявляемого биокатализатора, найдены экспериментально.
Размер пор в формирующейся матрице зависит от количества в ней ПВС, которое предопределяется его концентрацией в исходной смеси со спорами, подлежащей замораживанию-оттаиванию. При содержании ПВС менее 2,5 мас.% происходит формирование слишком больших пор, через которые происходит вымывание спор из носителя, сопровождающееся снижением продуктивности биокатализатора и уменьшением его механической прочности. При содержании ПВС в биокатализаторе выше 5,0 мас.% повышается вязкость его исходных растворов в суспензии со спорами, что затрудняет равномерное диспергирование спор, а также приводит к заметному уменьшению размера пор. Последнее обстоятельство приводит к ухудшению массообменных условий внутри биокатализатора и снижению его продуктивности.
Нижний предел концентрации биомассы мицелия в заявляемом составе биокатализатора определяется тем, что при концентрации ниже 7,5 мас.% получаемый биокатализатор обладает недостаточно высокой продуктивностью, а верхний предел концентрации биомассы определяется тем, что при накоплении мицелия в порах полимерной матрицы свыше 20,0 мас.% происходит закупорка пор клетками метаболически активного мицелия, ухудшающая условия массообмена внутри гранул биокатализатора и снижающая эффективность действия биокатализатора. Таким образом, превышение указанного верхнего предела концентрации клеток нецелесообразно.
Заявляемый биокатализатор получают следующим образом: к водному раствору ПВС, содержащему рассчитанное количество полимера, прибавляют суспензию спор мицелиального гриба, перемешивают до получения однородной массы, которую затем используют для формирования криогеля ПВС с одновременным включением спор в его пористую структуру путем замораживания этой массы, ее выдерживания в замороженном состоянии и последующего оттаивания. Для получения биокатализатора заявляемого состава полученный криогель ПВС помещают в питательную среду и проводят культивирование в аэробных условиях для прорастания спор внутри пор полимерной матрицы и формирования метаболически активного мицелия, способного в анаэробных условиях продуцировать этанол из пентоз.
Культивирование иммобилизованных спор осуществляют в стандартных питательных средах, содержащих компоненты, необходимые для роста мицелия по всему объему полимерной матрицы [Семенов С.М. Лабораторные среды для актиномицетов и грибов. Справочник. // М.: Агропромиздат, 1990, 240 с.]. Споровый материал для иммобилизованного биокатализатора получают с применением известных биотехнологических приемов в соответствии с частными характеристиками культуры. После накопления спор проводят их смыв с поверхности плотных питательных сред с использованием традиционных микробиологических методов, применяемых для получения суспензии спор в водных растворах [Практикум по микробиологии. (Под ред. Нетрусова А.И.). // М.: Издат. Академия, 2005, 608 с.]. Культивирование спор, включенных в полимерную матрицу, с целью наращивания мицелия внутри пор носителя и формирования биокатализатора проводят в аэробных условиях при температуре, оптимальной для культивирования соответствующей культуры микроскопического гриба. Длительность культивирования предопределяется вышеуказанными предельными концентрациями накапливающейся в гранулах мицелиальной биомассы. Накопление мицелиальной биомассы контролируют по увеличению содержания сухих веществ в составе биокатализатора стандартным методом доведения образца до постоянной массы.
В отличие от прототипа заявляемому биокатализатору может быть придана любая удобная форма, в частности форма сферических гранул, частиц неправильной формы, гелевых блоков, листов и др. Для этого суспензию спор в растворе полимера либо замораживают в соответствующей форме, либо используют предназначенное для этих целей оборудование (экструдеры, грануляторы и.т.п.). Возможность варьирования формы биокатализатора технически и технологически упрощает его практическое применение и масштабирование.
Получение этанола с помощью заявляемого биокатализатора проводят стандартным путем, а именно - в результате культивирования иммобилизованных клеток в анаэробных условиях в реакторах с жидкими питательными средами, содержащими пентозы. Контроль потребления сахаров и накопления этанола в среде осуществляют известными методами (хроматографическими и спектрофотометрическими) с привлечением стандартного аналитического оборудования.
Заявляемый биокатализатор для получения этанола из пентоз, представляющий собой мицелий микроскопического гриба, способного продуцировать этанол их пентоз, включенный в матрицу криогеля поливинилового спирта, при заявляемом соотношении компонентов является новым и обеспечивает получение технического результата, состоящего в повышении продуктивности процесса получения этанола из пентоз (повышении скорости конверсии пентоз в этанол) и повышении выхода целевого продукта - этанола. Дополнительный технический результат состоит в том, что заявляемый биокатализатор обеспечивает высокую продуктивность процесса конверсии в течение длительного времени, что позволяет его использовать многократно.
На Фиг.1 представлена динамика накопления этанола в периодических процессах сбраживания пентоз при многократном применении заявляемого биокатализатора на основе клеток различных мицелиальных грибов в различных средах, содержащих пентозы:
() на основе клеток мицелиального гриба Aspergillus terreus F-1025 для получения этанола из ксилозы
() на основе клеток мицелиального гриба Mucor circinelloides F-1262 для получения этанола из арабинозы
(●) на основе клеток мицелиального гриба Fuzarium oxisporum F-931 для получения этанола из пентоз, входящих в состав ферментативного гидролизата кукурузных стеблей.
Нижеприведенные примеры иллюстрируют возможность практического осуществления заявляемого технического решения.
Пример 1. Биокатализатор на основе клеток мицелиального гриба Aspergillus terreus F-1025 для получения этанола из ксилозы
6
4
2
4
4
2
4
2
3
4
Для получения биокатализатора к 30 г 11%-ного водного раствора поливинилового спирта добавляют 3 мл суспензии спор мицелиального гриба Aspergillus terreus F-1025 с концентрацией 5×10 клеток/мл и перемешивают до получения однородной массы, которую затем используют для формирования с помощью криогрануляционной установки [Патент РФ №2036095] сферических гранул диаметром 1,5±0,2 мм. Гранулы замораживают при -20°С, выдерживают их в замороженном состоянии 16 ч, затем оттаивают при 8°С. Полученные гранулы криогеля поливинилового спирта (33 г) с включенными в него спорами мицелиального гриба помещают в аэробный реактор с 1 л среды, содержащей глюкозу (120 г/л), дрожжевой экстракт (5 г/л), (NH)SO (3,0 г/л), MgSO×7HO (0,25 г/л), ZnSO×7HO (0,25 г/л); NaCl (5,0 г/л), KHPO (3,0 г/л), и проводят их культивирование при 28°С в течение 48 ч для прорастания спор и накопления мицелиальной биомассы в порах носителя. Сформированный таким образом биокатализатор общей массой 88,5 г имеет следующий состав (мас.%): биомасса мицелия - 10,0; поливиниловый спирт - 3,7; вода - до 100.
4
2
4
2
4
4
2
2
4
Полученный биокатализатор помещают в анаэробный реактор периодического действия (1 л), заполненный средой (рН 5,0), содержащей в качестве основного сбраживаемого субстрата ксилозу (45 г/л), а также соли MgSO×7HO (0,25 г/л); (NH)SO (3,0 г/л); ZnSO×7НО (0,25 г/л); NaCl (5,0 г/л); KHPO (3,0 г/л). Процесс брожения проводят при 30°С без перемешивания. В течение 80 ч получено 20 г/л этанола, выход целевого продукта - 44,4% от внесенного субстрата, скорость сбраживания - 0,25 г/л/ч.
Пример 2. Биокатализатор на основе клеток мицелиального гриба Mucor circinelloides F-1262 для получения этанола из арабинозы
5
4
2
4
4
2
4
2
2
4
Для получения биокатализатора к 50 г 12%-ного водного раствора поливинилового спирта добавляют 5 мл суспензии спор мицелиального гриба Mucor circinelloides F-1262 с концентрацией 1×10 клеток/мл и перемешивают до получения однородной массы, которую затем разливают в 96-луночные иммунологические плашки с плоским дном (по 0,25 мл в лунку) для формирования гранул криогеля поливинилового спирта. Гранулы замораживают при -15°С, выдерживают их в замороженном состоянии 20 ч, затем оттаивают при 4°С. Полученные гранулы криогеля поливинилового спирта (55 г) с включенными в него спорами мицелиального гриба помещают в аэробный реактор с 1 л среды, содержащей глюкозу (100 г/л), дрожжевой экстракт (8 г/л), (NH)SO (3,5 г/л), MgSO×7НО (0,2 г/л), ZnSO×7HO (0,2 г/л); NaCl (3,0 г/л), KHPO (3,0 г/л), и проводят их культивирование при 30°С в течение 62 ч для прорастания спор и накопления мицелиальной биомассы в порах носителя. Сформированный таким образом биокатализатор общей массой 200 г имеет следующий состав (мас.%): биомасса мицелия - 14,5; поливиниловый спирт - 3,0; вода - до 100.
4
2
4
2
4
4
2
2
4
Для получения спирта биокатализатор помещают в анаэробный реактор периодического действия (1 л), заполненный средой (рН 5,0), содержащей арабинозу (45 г/л) в качестве основного сбраживаемого субстрата, а также соли MgSO×7HO (0,25 г/л); (NH)SO (3,0 г/л); ZnSO×7HO (0,25 г/л); NaCl (5,0 г/л), KHPO (3,0 г/л) и проводят процесс брожения при 28°С без перемешивания. В течение 46 ч получено 15,8 г/л этанола, выход целевого продукта - 35% от внесенного субстрата, скорость сбраживания - 0,34 г/л/ч.
Пример 3. Биокатализатор на основе клеток мицелиального гриба Rhizopus oryzae F-814 для получения этанола из рибозы
6
4
2
4
4
2
4
2
2
4
Для получения биокатализатора к 10 г 12,5%-ного водного раствора поливинилового спирта добавляют 5 мл суспензии спор мицелиального гриба Rhizopus oryzae F-814 с концентрацией 1×10 клеток/мл и перемешивают до получения однородной массы, которую затем разливают в 96-луночные иммунологические плашки со сферическим дном (по 0,3 мл в лунку) для формирования гранул криогеля поливинилового спирта. Гранулы замораживают при -15°С, выдерживают их в замороженном состоянии 14 ч, затем оттаивают при комнатной температуре. Полученные гранулы криогеля поливинилового спирта (15 г) с включенными в него спорами мицелиального гриба помещают в аэробный реактор с 300 мл среды, содержащей глюкозу (100 г/л), дрожжевой экстракт (3 г/л), (NH)SO (3,0 г/л), MgSO×7HO (0,2 г/л), ZnSO×7HO (0,2 г/л); NaCl (1,0 г/л), KHPO (3,0 г/л), и проводят их культивирование при 28°С в течение 36 ч для прорастания спор и накопления мицелиальной биомассы в порах носителя. Сформированный таким образом биокатализатор общей массой 50 г имеет следующий состав (мас.%): биомасса мицелия - 20,0; поливиниловый спирт - 2,5; вода - до 100.
4
2
4
2
4
4
2
2
4
Полученный биокатализатор помещают в анаэробный реактор периодического действия (1 л), заполненный средой (рН 5,0), содержащей рибозу (45 г/л) в качестве основного сбраживаемого субстрата, а также соли MgSO×7HO (0,2 г/л); (NH)SO (2,5 г/л); ZnSO×7HO (0,2 г/л); NaCl (3,0 г/л); KHPO (3,0 г/л) и проводят процесс брожения при 28°С без перемешивания. В течение 63 ч получено 12,6 г/л этанола, выход целевого продукта - 28% от внесенного субстрата, скорость сбраживания - 0,20 г/л/ч.
Пример 4. Биокатализатор на основе клеток мицелиального гриба Fuzarium oxisporum F-931 для получения этанола из пентоз, входящих в состав ферментативного гидролизата кукурузных стеблей
8
4
2
4
4
2
4
2
2
4
Для получения биокатализатора к 100 г 10%-ного водного раствора поливинилового спирта добавляют 1 мл суспензии спор мицелиального гриба Fuzarium oxisporum F-931 с концентрацией 1×10 клеток/мл и перемешивают до получения однородной массы, которую затем выливают ровным слоем толщиной 0,3 см на противень, который помещают в морозильную камеру при -13°С, где выдерживают в замороженном состоянии 18 ч, оттаивание проводят при 4°С. Получают криогель поливинилового спирта в виде листового материала (100 г) с включенными в него спорами мицелиального гриба, который с помощью шнекового экструдера и резака измельчают на гранулы произвольной формы с линейным размером не более 2,5 мм. Полученные гранулы помещают в аэробный реактор с 1 л среды, содержащей солодовое сусло (100 г/л), (NH)SO (3,0 г/л), MgSO×7НО (0,25 г/л), ZnSO×7НО (0,1 г/л); NaCl (2,0 г/л), KHPO (3,0 г/л), и проводят их культивирование при 28°С в течение 52 ч для прорастания спор и накопления мицелиальной биомассы в порах носителя. Сформированный таким образом биокатализатор общей массой 200 г имеет следующий состав (мас.%): биомасса мицелия - 7,5; поливиниловый спирт - 5,0; вода - до 100.
Полученный биокатализатор помещают в анаэробный реактор периодического действия (1 л), заполненный средой (рН 4,5), представляющей собой ферментативный гидролизат кукурузных стеблей, содержащий пентозы (ксилозу 7,9 г/л и арабинозу 0,1 г/л) и гексозы (глюкозу 2,4 г/л и галактозу 0,6 г/л), и проводят процесс брожения при 30°С без перемешивания. В течение 24 ч получено 5,5 г/л этанола из всех сахаров, присутствующих в среде, при этом выход целевого продукта из потребленных пентоз составляет 50%, скорость сбраживания - 0,23 г/л/ч.
Пример 5. Биокатализатор на основе клеток мицелиального гриба Aspergillus terreus F-2036 для получения этанола из пентоз, входящих в состав ферментативного гидролизата свекловичного жома
7
4
2
4
4
2
4
2
2
4
Для получения биокатализатора к 100 г 13%-ного водного раствора поливинилового спирта добавляют 15 мл суспензии спор мицелиального гриба Aspergillus terreus F-2036 с концентрацией 2×10 клеток/мл и перемешивают до получения однородной массы, которую затем разливают в 96-луночные иммунологические плашки со сферическим дном (по 0,15 мл в лунку) для формирования гранул криогеля поливинилового спирта. Гранулы замораживают при -20°С, выдерживают их в замороженном состоянии 10 ч, затем оттаивают при 4°С. Полученные гранулы криогеля поливинилового спирта (115 г) с включенными в него спорами мицелиального гриба помещают в аэробный реактор с 1 л среды, содержащей глюкозу (120 г/л), дрожжевой экстракт (8 г/л), (NH)SO (3,0 г/л), MgSO×7HO (0,25 г/л), ZnSO×7HO (0,25 г/л); NaCl (2,0 г/л), KHPO (3,0 г/л), и проводят их культивирование при 30°С в течение 32 ч для прорастания спор и накопления мицелиальной биомассы в порах носителя. Сформированный таким образом биокатализатор общей массой 320 г имеет следующий состав (мас.%): биомасса мицелия - 12,8; поливиниловый спирт - 4,1; вода - до 100.
Полученный биокатализатор помещают в анаэробный реактор периодического действия (1 л), заполненный средой (рН 4,65), представляющей собой ферментативный гидролизат неосветвленных волокон свекловичного жома, содержащий пентозы (арабинозу 10,4 г/л и ксилозу 0,2 г/л) и гексозы (глюкозу 13,0 г/л и фруктозу 2,2 г/л), и проводят процесс брожения при 28°С без перемешивания. В течение 42 ч получено 12,2 г/л этанола из всех сахаров, присутствующих в среде, при этом выход целевого продукта из потребленных пентоз составляет 43,4%, скорость сбраживания - 0,29 г/л/ч.
Пример 6. Пример многократного использования заявляемого биокатализатора для получения этанола из пентоз в периодическом процессе.
При многократном использовании заявляемого биокатализатора в периодическом процессе после завершения одного цикла, осуществленного в условиях, описанных в соответствующих Примерах, содержащую целевой продукт культуральную жидкость сливают через установленный в реакторе сетчатый фильтр, после чего в реактор добавляют новую порцию субстратсодержащего раствора и проводят следующий цикл в аналогичных условиях.
На чертеже представлена зависимость конечной концентрации этанола, накапливающегося в среде к концу каждого рабочего цикла, осуществленного, как описано в Примерах 1 (), 2 () и 4 (●), при многократном использовании биокатализатора в периодическом процессе сбраживания пентоз. Представленные данные подтверждают возможность многократного использования заявляемого биокатализатора для получения этанола из пентоз в периодическом процессе, а также позволяют определить период полуинактивации биокатализаторов, приведенных в Примерах 1, 2 и 4, который составляет соответственно 869 ч, 810 ч и 405 ч.
Приведенные примеры показывают, что заявляемый биокатализатор может быть использован для получения этанола как однократно, так и многократно в периодических процессах для сбраживания различных пентоз (ксилозы, арабинозы, рибозы), взятых по отдельности или в смесях с другими сахарами, при этом он обеспечивает увеличение скорости конверсии до 0,34 г/л/ч и выхода целевого продукта до 50% от внесенного субстрата.
Таким образом, предлагаемое техническое решение может быть использовано для повышения эффективности биотехнологического получения этанола из целлюлозосодержащего сырья.