СПОСОБ СИНТЕЗА ЖЕЛАТИНОВЫХ НАНОЧАСТИЦ
METHOD FOR SYNTHESIS OF GELATIN NANOPARTICLES

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам синтеза желатиновых наночастиц, которые могут быть использованы в пищевой промышленности, медицине, ветеринарии, создании новых материалов.
Желатин - белок, получаемый при гидролизе коллагена. Источником желатина является соединительная ткань (шкуры, кости, рога, сухожилия) крупного и мелкого рогатого скота, прежде всего коров и свиней, а также рыб, домашней птицы и ряда других животных. Желатин обогащен такими аминокислотами как глицин, пролин и гидроксипролин. Аминокислотный состав желатина варьирует в зависимости от источника и способа гидролиза. Одним из важных показателей свойства желатина является его сила желирования. Сила желирования выражается в единицах блумах (обычно от 50 до 325 блум), она характеризует силу, которую необходимо приложить для погружения измерительного зонда в желатиновый гель. Сила желирования желатина зависит от его молекулярной массы: чем выше масса, тем выше сила желирования. Желатиновые наночастицы способны инкапсулировать или нести на своей поверхности целый ряд низкомолекулярных химических соединений, полимеров, биомолекул, что обусловливает их широкий спектр применения в различных отраслях хозяйства. Преимуществами желатина как материала для изготовления наночастиц является его безопасность, биосовместимость, доступность, наличие функциональных групп, пригодных для химических модификаций с целью управления свойствами композитов (в том числе наноматериалов) на его основе.
В пищевой промышленности желатиновые наночастицы используются для инкапсулирования эфирных масел и других компонентов растительных экстрактов, придающих пищевым продуктам ценные лечебные (например, антиоксидантные), вкусовые и органолептические свойства. Желатиновые наночастицы защищают содержимое от деградации при обработке пищи, улучшают растворимость гидрофобных молекул.
Желатиновые наночастицы используются как компонент композиционных упаковочных материалов, в том числе биодеградируемых и биосовместимых. Использование желатиновых наночастиц улучшает механические свойства таких материалов (прочность, степень набухания и др.)
В ветеринарии и медицине желатиновые наночастицы используются в качестве носителей терапевтических (антибиотики, противоопухолевые средства), профилактических (вакцинные препараты), иммуномодулирующих (адъюванты, регуляторные олигонуклеотиды), диагностических (флуоресцентные красители) средств. Применение желатиновых наночастиц снижает риск проявления побочных эффектов от использования лекарственных препаратов, улучшает растворимость гидрофобных лекарственных препаратов в крови, лимфе и тканевой жидкости, а также способствует медленному выделению препаратов из объема наночастиц в окружающие ткани, что позволяет дополнительно регулировать специфическую активность таких препаратов.
В настоящее время наиболее распространенным и простым методом синтеза желатиновых наночастиц является метод десольватации (англ. desolvation) ( A.L., Pangua, С, Reboredo, С.,  R., Morales-Gracia, J., Irache, J.M. International Journal of Pharmaceutics, 2020, 581, статья №119289). Принцип метода состоит в медленном добавлении к водному раствору желатина органического растворителя (ацетон, этанол и др.), который способен смешиваться с водой. Добавление производится при постоянном контролируемом перемешивании. Повышение концентрации растворителя приводит к слипанию белковых молекул и образованию наночастиц. Для стабилизации молекул добавляют сшивающий агент, как правило глутаровый альдегид, но кроме этого используют 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид, глиоксаль, фермент трансглутаминазу и др. Эти молекулы способствуют формированию ковалентных связей между различными молекулами желатина, входящими в состав одной и той же наночастицы. После стабилизации наночастиц их отмывают при помощи центрифугирования или иным способом, а затем хранят в виде суспензии, лиофилизата или подвергают дальнейшей обработке в зависимости от цели их применения. Преимуществами метода являются простота, доступность реагентов, возможность масштабирования, в том числе с использованием проточных реакторов.
Существуют различные модификации синтеза желатиновых наночастиц методом десольватации. Наиболее часто используется метод, предложенный Coester с соавт. (Coester, C.J., Langer, K., Von Briesen, Н., Kreuter, J. Journal of Microencapsulation, 2000, 17, pp. 187-193). Он состоит в двухэтапном добавлении ацетона к раствору желатина. На первом этапе к раствору желатина одномоментно добавляют равный объем ацетона, при этом в осадок выпадают высокомолекулярные фракции желатина, которые затем разводят в воде. К полученному водному раствору высокомолекулярного желатина медленно добавляют ацетон при перемешивании. Полученные наночастицы стабилизируют глутаровым альдегидом, отмывают смесью воды и ацетона при помощи центрифугирования, после чего ацетон удаляют из готовой суспензии при помощи выпаривания. Ключевой особенностью такого подхода является удаление низкомолекулярных фракций желатина, присутствие которых приводит к синтезу полидисперсных наночастиц с низкой стабильностью. Очевидно, что недостатком такого подхода является необходимость удалять низкомолекулярные фракции желатина, что делает процедуру сложной и длительной.
Для того, чтобы упростить процедуру синтеза желатиновых наночастиц и сделать ее одноэтапной, обычно пытаются исключить этап удаления низкомолекулярных желатиновых фракций. Разработано несколько способов синтеза желатиновых наночастиц, основанных на этом принципе.
Способ 1. Для синтеза используют препараты желатина, искусственно обогащенные высокомолекулярными фракциями желатина (см. патент WO 2006021367 A1). Такие препараты желатина содержат менее 40% молекул желатина с молекулярной массой менее 65 кДа, что способствует образованию стабильных наночастиц.
Способ 2. Для синтеза желатиновых наночастиц используют коммерческие препараты желатина с высокой силой желирования, составляющей 300 блум или более (Geh, K.J., Hubert, М., Winter, G. Journal of Microencapsulation, 2016, 33, 595-604). Препараты желатина с силой желирования 300 блум и более исходно обогащены фракциями желатина с высокой молекулярной массой, что способствует образованию стабильных наночастиц.
Способ 3. Для синтеза желатиновых наночастиц используют рекомбинантный желатин с точно заданной молекулярной массой (см. патент KR100819184B1).
Недостатком подходов 1 и 2 является необходимость использования высокомолекулярного желатина, что вынуждает поддерживать высокую температуру исходных растворов желатина даже при низкой концентрации желатина. Кроме этого, растворы высокомолекулярного желатина имеют большую вязкость, что создает проблемы при дозировании и перемешивании таких растворов, неизбежно приводит к увеличению энергозатрат на перемешивание.
Недостатком использования искусственно синтезированных препаратов рекомбинантного желатина и препаратов желатина, искусственно обогащенного высокомолекулярными фракциями (подходы 1 и 3), является дороговизна исходных реагентов и сложность их синтеза. Гораздо предпочтительнее с экономической точки зрения использовать коммерчески доступный и недорогой желатин, выделяемый из натуральных источников.
Основным и наиболее близким по технической сущности к разработанному способу является способ синтеза желатиновых наночастиц, предложенный в работе (Ofokansi, K., Winter, G., Fricker, G., Coester, С.European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 2010, 76, 1-9)
Сущность способа-прототипа заключается в следующем. 200 мг желатина (сила желирования 225 блум) растворяют в 20 мл высокоочищенной воды при +37°С при постоянном перемешивании на магнитной мешалке (400 оборотов/мин) до получения прозрачного раствора. При помощи 0,2 м NaOH рН полученного раствора доводят до 6,1-8,0, после чего раствор желатина инкубируют при 37°С в течение 90 мин. В качестве органического растворителя используют 96%-ный (массовая доля) водный раствор этанола, который добавляют к раствору желатина в течение 3 мин. Раствор этанола предварительно инкубируют в тех же условиях, что и раствор желатина. Конечная концентрация желатина составляет 0,2% (массовая доля), а этанола - от 65% до 70% (массовая доля). Полученную таким образом смесь инкубируют при температуре +37°С в течение еще 20 мин и разбавляют 1:15 по массе при перемешивании водно-спиртовым раствором (с массовой долей этанола 65-70%), содержащим 200 мкл 25% водного раствора глутарового альдегида для стабилизации полученных наночастиц. Размер синтезированных наночастиц после отмывки составлял 283 нм, а индекс полидисперсности был менее 0,2 (размер частиц и индекс полидисперсности оценивали при помощи метода измерения обратного динамического светорассеяния).
Основными недостатками описанного способа является:
1. Использование препарата желатина, содержащего большой процент высокомолекулярных фракций. В описанном методе использован желатин с силой желирования 225 блум, который содержит существенное количество высокомолекулярных фракций. Это ограничивает потенциальный спектр исходных препаратов желатина, а также приводит к уже описанным выше проблемам, вызванным высокой вязкостью растворов высокомолекулярного желатина.
2. Метод требует длительной инкубации желатина при повышенной температуре после доведения рН до нужных значений
3. Метод требует многократного разведения (1:15) смеси наночастиц после их десольватации, что существенно увеличивает объем реакционной среды, а значит усложняет масштабирование технологии
4. Метод (как и другие описанные выше методы на основе десольватации желатина) требует постоянного перемешивания реакционной смеси
Предлагаемое изобретение решает задачу по созданию более простой, экономичной и быстрой технологии синтеза желатиновых наночастиц. Решение задачи осуществляется благодаря тому, что используются тщательно подобранные условия синтеза, а именно рН раствора желатина и режим перемешивания
Новизна разработанного способа состоит в том, что впервые осуществлен синтез стабильных и однородных желатиновых наночастиц с использованием препарата желатина, не содержащего высокомолекулярных фракций, Кроме этого, в ходе синтеза наночастиц не требуется постоянное контролируемое перемешивание, которое является необходимым при синтезе наночастиц из желатина и других биополимеров известными методами.
Описание разработанного способа. Коммерчески доступный желатин (75 блум, молекулярная масса 20-25 кДа) разводят в подогретой до +37°С деионизированной воде. При помощи раствора 1М NaOH рН раствора доводят до 9,0. Подогретый (для предотвращения желирования) раствор желатина помещают в сосуд, куда одномоментно добавляют органический растворитель, а именно раствор этанола в воде (объемная доля этанола 96%), объем которого в три раза превышает объем раствора желатина. В дальнейшем все операции проводятся при комнатной температуре. Сосуд медленно переворачивают 3-4 раза для достижения гомогенности смеси, после чего оставляют в неподвижном состоянии. Спустя 5 минут к сформированным наночастицам добавляют раствор глутарового альдегида в воде из расчета 3 мкл 8%-ного раствора глутарового альдегида на 1 мг желатина. Сосуд медленно переворачивают 3-4 раза для достижения гомогенности смеси, после чего оставляют в неподвижном состоянии. Спустя 30 минут наночастицы трехкратно отмывают водой при помощи центрифугирования. Наночастицы, выпавшие в осадок, ресуспендируют в необходимом объеме воды при помощи быстрой обработки ультразвуком.
Пример.
Синтез желатиновых наночастиц размером 380 нм. Коммерчески доступный желатин (75 блум, молекулярная масса 20-25 кДа) разводили в 4 мл подогретой до +37°С деионизированной воды до концентрации 30 мг/мл. При помощи 1М NaOH рН раствора желатина доводили до 9,0. Подогретый (для предотвращения желирования) раствор желатина помещали в пробирку, далее одномоментно добавляли органический растворитель, а именно 12 мл раствора этанола в воде (объемная доля этанола 96%). В дальнейшем все операции проводили при комнатной температуре. Пробирку медленно переворачивали 3-4 раза для достижения гомогенности смеси, после чего оставляли в неподвижном состоянии. Спустя 5 минут к сформированным наночастицам добавляли 360 мкл 8%-ного раствора глутарового альдегида в воде. Пробирку медленно переворачивали 3-4 раза для достижения гомогенности смеси, после чего оставляли в неподвижном состоянии. Спустя 30 минут наночастицы трехкратно отмывали водой при помощи центрифугирования при 10000 g в течение 10 минут.Наночастицы, выпавшие в осадок, ресуспендировали в 4 мл воды, содержащей 0,02% мертиолята при помощи ультразвуковой обработки (1 мин, 12 Вт). Размеры наночастиц составляли 380 нм, индекс полидисперсности - 0,07 (размер частиц и индекс полидисперсности оценивали при помощи метода измерения обратного динамического светорассеяния). Полученные описанным способом наночастицы сохраняли свои размеры на протяжении 3 месяцев хранения при комнатной температуре.
Таким образом, разработанный метод позволяет использовать для получения наночастиц желатин с низкой молекулярной массой. Это не только расширяет спектр коммерчески доступных препаратов желатина, которые могут быть использованы для синтеза наночастиц, но и удешевляет технологический процесс. При этом, разработанный способ позволяет осуществлять синтез желатиновых наночастиц без постоянных контролируемых перемешивания и подогрева реакционной смеси.
Технический результат от использования изобретения заключается в повышении простоты процедуры синтеза желатиновых наночастиц, снижении энергозатрат на подогрев и перемешивание реакционной смеси, кроме того, не менее, чем в два раза сокращена длительность процедуры синтеза по сравнению со способом-прототипом.
Заявляемое техническое решение соответствует критерию «промышленное применение», так как применяемые реагенты доступны, а исследования легко выполняемы.