СПОСОБ ДЕТЕКТИРОВАНИЯ И ХАРАКТЕРИЗАЦИИ ТОКСИНОГЕННОГО ШТАММА CLOSTRIDIUM DIFFICILE

1. Способ детектирования и характеризации токсиногенного штамма Clostridium difficile в пробе, в котором выполняют следующие стадии:
а. предоставляют пробу;
b. в мультиплексном ПЦР-анализе
i) эту пробу анализируют в отношении присутствия или отсутствия гена tcdB цитотоксина;
ii) эту пробу анализируют в отношении присутствия или отсутствия одной или нескольких из следующих делеций в гене tcdC,
a) делеций 18 п.н. в SEQ ID NO: 1 от нуклеотида 330 до нуклеотида 347;
b) делеций 36 п.н. в SEQ ID NO: 1 от нуклеотида 301 до нуклеотида 336;
c) делеций 39 п.н. в SEQ ID NO: 1 от нуклеотида 341 до нуклеотида 370;
d) делеций 54 п.н. в SEQ ID NO: 1 от нуклеотида 313 до нуклеотида 366;
e) делеций единственного нуклеотида в положении 117 SEQ ID NO: 1,
где мультиплексная ПЦР-амплификация является количественной ПЦР реального времени.
2. Способ по п.1, где пробу дополнительно анализируют в отношении присутствия или отсутствия делеций 1,8 т.п.н. гена tcdA энтеротоксина.
3. Способ по п.1 или 2, где пробу дополнительно анализируют в отношении присутствия или отсутствия cdtA и/или cdtB бинарного токсина.
4. Способ по п.1 или 2, где эту пробу анализируют на
а. присутствие или отсутствие всех из следующих делеций:
b. делеции 18 п.н. в SEQ ID NO: 1 от нуклеотида 330 до нуклеотида 347, делеции 39 п.н. в SEQ ID NO: 1 от нуклеотида 341 до нуклеотида 370,
с. делеции единственного нуклеотида в положении 117 SEQ ID NO: 1,
d. присутствие или отсутствие гена tcdB цитотоксина,
е. присутствие или отсутствие делеции 1,8 т.п.н. tcdA и
f. присутствие или отсутствие гена cdtA/B бинарного токсина.
5. Способ по п.3, где эту пробу анализируют на
а. присутствие или отсутствие всех из следующих делеции:
b. делеции 18 п.н. в SEQ ID NO: 1 от нуклеотида 330 до нуклеотида 347, делеции 39 п.н. в SEQ ID NO: 1 от нуклеотида 341 до нуклеотида 370,
с. делеции единственного нуклеотида в положении 117 SEQ ID NO: 1,
d. присутствие или отсутствие гена tcdB цитотоксина,
е. присутствие или отсутствие делеции 1,8 т.п.н. tcdA и
f. присутствие или отсутствие гена cdtA/B бинарного токсина
6. Способ по любому из пп.1, 2 и 5, в котором
а. если присутствует последовательность гена tcdB, отсутствует делеция tcdA, не присутствует ни делеция единственного нуклеотида в положении 117 SEQ ID NO: 1, ни делеция 18 п.н., ни делеция 39 п.н., то эта проба оценивается как токсиногенный штамм Clostridium difficile,
b. если присутствует последовательность гена tcdB, отсутствует делеция tcdA, присутствует делеция единственного нуклеотида в положении 117 SEQ ID NO: 1, присутствует делеция 18 п.н. и присутствует ген бинарного токсина cdtA/B, то эта проба оценивается как штамм риботипа 027 Clostridium difficile,
с. если присутствует последовательность гена tcdB, присутствует делеция tcdA, не присутствует ни делеция единственного нуклеотида в положении 117 SEQ ID NO: 1, ни делеция 18 п.н., ни делеция 39 п.н. в SEQ ID NO: 1 от нуклеотида 341 до нуклеотида 370, и отсутствует ген cdtA/B бинарного токсина, то эта проба оценивается как штамм риботипа 017 Clostridium difficile, и
d. если присутствует последовательность гена tcdB, отсутствует делеция tcdA, присутствует делеция 39 п.н. в SEQ ID NO: 1 от нуклеотида 341 до нуклеотида 370, присутствует ген cdtA/B бинарного токсина, то эта проба оценивается как штамм риботипа 078 Clostridium difficile.
7. Способ по п.3, в котором
а. если присутствует последовательность гена tcdB, отсутствует делеция tcdA, не присутствует ни делеция единственного нуклеотида в положении 117 SEQ ID NO: 1, ни делеция 18 п.н., ни делеция 39 п.н., то эта проба оценивается как токсиногенный штамм Clostridium difficile,
b. если присутствует последовательность гена tcdB, отсутствует делеция tcdA, присутствует делеция единственного нуклеотида в положении 117 SEQ ID NO: 1, присутствует делеция 18 п.н. и присутствует ген бинарного токсина cdtA/B, то эта проба оценивается как штамм риботипа 027 Clostridium difficile,
с. если присутствует последовательность гена tcdB, присутствует делеция tcdA, не присутствует ни делеция единственного нуклеотида в положении 117 SEQ ID NO: 1, ни делеция 18 п.н., ни делеция 39 п.н. в SEQ ID NO: 1 от нуклеотида 341 до нуклеотида 370, и отсутствует ген cdtA/B бинарного токсина, то эта проба оценивается как штамм риботипа 017 Clostridium difficile, и
d. если присутствует последовательность гена tcdB, отсутствует делеция tcdA, присутствует делеция 39 п.н. в SEQ ID NO: 1 от нуклеотида 341 до нуклеотида 370, присутствует ген cdtA/B бинарного токсина, то эта проба оценивается как штамм риботипа 078 Clostridium difficile.
8. Способ по п.4, в котором
а. если присутствует последовательность гена tcdB, отсутствует делеция tcdA, не присутствует ни деления единственного нуклеотида в положении 117 SEQ ID NO: 1, ни делеция 18 п.н., ни делеция 39 п.н., то эта проба оценивается как токсиногенный штамм Clostridium difficile,
b. если присутствует последовательность гена tcdB, отсутствует делеция tcdA, присутствует делеция единственного нуклеотида в положении 117 SEQ ID NO: 1, присутствует делеция 18 п.н. и присутствует ген бинарного токсина cdtA/B, то эта проба оценивается как штамм риботипа 027 Clostridium difficile,
с. если присутствует последовательность гена tcdB, присутствует делеция tcdA, не присутствует ни делеция единственного нуклеотида в положении 117 SEQ ID NO: 1, ни делеция 18 п.н., ни делеция 39 п.н. в SEQ ID NO: 1 от нуклеотида 341 до нуклеотида 370, и отсутствует ген cdtA/B бинарного токсина, то эта проба оценивается как штамм риботипа 017 Clostridium difficile, и
d. если присутствует последовательность гена tcdB, отсутствует делеция tcdA, присутствует делеция 39 п.н. в SEQ ID NO: 1 от нуклеотида 341 до нуклеотида 370, присутствует ген cdtA/B бинарного токсина, то эта проба оценивается как штамм риботипа 078 Clostridium difficile.
9. Способ по любому из пп.1, 2, 5, 7 и 8, где мультиплексную реакцию амплификации выполняют в замкнутой системе в присутствии флуоресцентных индикаторов в реакционной смеси (реакционных смесях), причем эти флуоресцентные индикаторы способны генерировать оптический сигнал, связанный с присутствием и/или количеством каждого ампликона в этой реакции амплификации, и позволяют осуществлять мониторинг этого оптического сигнала флуоресцентных индикаторов в этой реакции амплификации.
10. Способ по п.3, где мультиплексную реакцию амплификации выполняют в замкнутой системе в присутствии флуоресцентных индикаторов в реакционной смеси (реакционных смесях), причем эти флуоресцентные индикаторы способны генерировать оптический сигнал, связанный с присутствием и/или количеством каждого ампликона в этой реакции амплификации, и позволяют осуществлять мониторинг этого оптического сигнала флуоресцентных индикаторов в этой реакции амплификации.
11. Способ по п.4, где мультиплексную реакцию амплификации выполняют в замкнутой системе в присутствии флуоресцентных индикаторов в реакционной смеси (реакционных смесях), причем эти флуоресцентные индикаторы способны генерировать оптический сигнал, связанный с присутствием и/или количеством каждого ампликона в этой реакции амплификации, и позволяют осуществлять мониторинг этого оптического сигнала флуоресцентных индикаторов в этой реакции амплификации.
12. Способ по п.6, где мультиплексную реакцию амплификации выполняют в замкнутой системе в присутствии флуоресцентных индикаторов в реакционной смеси (реакционных смесях), причем эти флуоресцентные индикаторы способны генерировать оптический сигнал, связанный с присутствием и/или количеством каждого ампликона в этой реакции амплификации, и позволяют осуществлять мониторинг этого оптического сигнала флуоресцентных индикаторов в этой реакции амплификации.
13. Способ по п.9, где эта замкнутая система дает оптические выходные данные для пользователя, указывающие оценивание пробы как штамм риботипа 027 Clostridium difficile, штамм риботипа 017 Clostridium difficile или штамм риботипа 078 Clostridium difficile.
14. Способ по любому из пп.10-12, где эта замкнутая система дает оптические выходные данные для пользователя, указывающие оценивание пробы как штамм риботипа 027 Clostridium difficile, штамм риботипа 017 Clostridium difficile или штамм риботипа 078 Clostridium difficile.
15. Способ по п.1, где продукты амплификации в мультиплексном ПЦР-анализе имеют размер от 60 до 200 п.н.
16. Способ по п.1, где эта проба является фекалиями человека или животного.
17. Картридж замкнутой системы амплификации, содержащий один или несколько каналов или камер, содержащих праймеры и/или зонды, для амплификации и/или детектирования (i) гена tcdB цитотоксина, (ii) делеции 1,8 т.п.н. в гене tcdA, (iii) делеции 18 п.н. в SEQ ID NO: 1 от нуклеотида 330 до нуклеотида 347 гена tcdC, (iv) делеции 39 п.н. в SEQ ID NO: 1 от нуклеотида 341 до нуклеотида 370 гена tcdC, (v) делеции единственного нуклеотида в положении 117 SEQ ID NO: 1 и праймеры и/или зонды для детектирования гена cdtA/B бинарного токсина.
18. Набор для выполнения способа по любому из предыдущих пунктов, содержащий праймеры и/или зонды для амплификации и/или детектирования (i) гена tcdB цитотоксина, (ii) делеции 1,8 т.п.н. в гене tcdA, (iii) делеции 18 п.н. в SEQ ID NO: 1 от нуклеотида 330 до нуклеотида 347 гена tcdC, (iv) делеции 39 п.н. в SEQ ID NO: 1 от нуклеотида 341 до нуклеотида 370 гена tcdC, (v) делеции единственного нуклеотида в положении 117 SEQ ID NO: 1 и праймеры и/или зонды для (vi) детектирования гена cdtA/B бинарного токсина.