КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БИОФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ, НЕ СОДЕРЖАЩИХ АНТИБИОТИКОВ, В ХЛОРОПЛАСТАХ САЛАТА

1. Транспластомное растение, не содержащее антибиотиков и экспрессирующее биофармацевтический белок в пластидах, где указанные белки выбраны из группы, состоящей из CTB-proIGF1, PTD-proIGF1, CTB-проинсулина, CTB-AMA, CTB-MSP, CTB-FIX, CTB-FIX-фурина, CTB-Экзендина, CTB-ESAT6, CTB-Mtb72F, CTB-VP1, CTB-MBP, CTB-Ace2, CTB-Ang1-7, CTB-GAA, CTB-FVIII-HC, CTB-FVIII-C2, оптимизированного по кодонам CTB-FVIII-HC, оптимизированного по кодонам CTB-FVIII-LC, и оптимизированного по кодонам CTB-FVIII-SC.
2. Растение по п. 1, где указанный белок выбран из CTB-proIGF1 и PTD-proIGF1, где каждый из указанных белков содержит e-пептид.
3. Растение по п. 2, где указанный IGF1 был изменен для удаления участков гликозилирования.
4. Растение по п. 1, где указанный белок кодируется нуклеиновой кислотой, которая была оптимизирована по кодонам для экспрессии в пластидах.
5. Выделенная растительная клетка, полученная из растения по п. 2.
6. Способ получения растений, продуцирующих биофармацевтические препараты, не содержащие антибиотиков, для перорального потребления, в пластидах высших растений, включающий
a) введение вектора для трансформации пластиды в растительную клетку, указанный вектор, содержащий ген селективного маркера, кодирующий антибиотик и функционально связанный с пластидным промотором, указанные ген и промотор фланкированы последовательностями ДНК прямых повторов длиной 600-800 нуклеотидов, указанный вектор, дополнительно содержащий гетерологичную нуклеиновую кислоту, включающую второй пластидный промотор, функционально связанный с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей интересующий биофармацевтический белок, где указанный интересующий белок необязательно включает нацеливающий пептид и/или нуклеиновая кислота, кодирующая указанный белок, оптимизирована по кодонам для экспрессии в указанном растении;
b) культивирование растительных клеток из стадии a) в присутствии указанного антибиотика в среде для регенерации в течение подходящего периода для получения побегов;
c) оценка указанных побегов на удаление гена селективного маркера;
d) перенос побегов, которые демонстрируют удаление гена селективного маркера, на среду без антибиотиков, подходящую антибиотик для индуцирования роста корней;
e) создание транспластомного растения, экспрессирующего указанный белок, представляющий интерес, в котором отсутствует указанный ген селективного маркера, из корней, индуцированных на стадии d).
7. Способ по п. 6, где растение из стадии e) оценивают на гомоплазмию.
8. Способ по п. 6, где указанный ген селективного маркера представляет собой ген aadA, и указанный антибиотик представляет собой спектиномицин.
9. Способ по п. 6, где указанные прямые повторы кодируются SEQ ID NO: 16.
10. Способ по п. 6, где указанная гетерологичная нуклеиновая кислота кодирует оптимизированный по кодонам IGF1, функционально связанный с пептидом PTD и e-пептидом.
11. Способ по п. 6, где указанная гетерологичная нуклеиновая кислота кодирует оптимизированный по кодонам IGF1, функционально связанный с пептидом CTB.
12. Способ по п. 6, где указанный интересующий гетерологичный белок выбран из CTB-проинсулина, CTB-AMA, CTB-MSP, CTB-FIX, CTB-FIX-фурина, CTB-Экзендина, CTB-ESAT6, CTB-Mtb72F, CTB-VP1, CTB-MBP, CTB-Ace2, CTB-Ang1-7, CTB-GAA, CTB-FVIII-HC, CTB-FVIII-C2, оптимизированного по кодонам CTB-FVIII-HC, оптимизированного по кодонам CTB-FVIII-LC, и оптимизированного по кодонам CTB-FVIII-SC.
13. Способ по п. 6, где указанное растение выбрано из салата, томата, моркови и соевых бобов.
14. Способ по п. 13, где указанное растение представляет собой растение салата.
15. Способ по п. 6, где указанный период времени в стадии b) составляет от 4 до 6 недель.
16. Способ по п. 15, где указанный период составляет 4 недели.
17. Способ по п. 6, где экспрессия указанного интересующего гетерологичного белка сохраняется в последующих поколениях.
18. Способ по п. 6, где указанные растения оценивают на удаление маркера с использованием ПЦР с праймерами, которые выявляют наличие или отсутствие продуктов удаления.
19. Способ по п. 6, где указанные последовательности ДНК прямых повторов происходят из гена atpB и в них отсутствует один или несколько эндогенных промоторных элементов, показанных на фигуре 6.
20. Способ по п. 6, где указанный второй промотор содержит промотор psbA и 5’UTR, эндогенные для видов растений, которые предполагается трансформировать.
21. Способ по п. 6, включающий выделение указанного биофармацевтического белка из растения из стадии e).
22. Способ лечения индивидуума, нуждающегося в терапии IGF-1, включающий пероральное введение эффективного количества растения салата или растительного продукта из салата, не содержащего антибиотиков и содержащего белок IGF-1, функционально связанный с пептидом PTD и e-пептидом, указанный e-пептид усиливает функцию IGF-1, указанное эффективно для облегчения или улучшения или симптомов генетических мышечных заболеваний, острой атрофии, травм, или остеопороза, или перелома.
23. Способ по п. 22, где введение приводит к повышению уровней IGF-1 в одном или нескольких из сыворотки крови, мышцы или кости.
24. Способ по п. 22, где введение приводит к пролиферации и/или дифференцировке остеобластов, на что указывают повышенные уровни экспрессии ALP, Osx и/или RUNX2.
25. Способ по п. 22, где введение введение эффективно для увеличения объема костной ткани, плотности и/или площади.
26. Вектор для трансформации пластиды растений, содержащий ген селективного маркера, кодирующий антибиотик и функционально связанный с пластидным промотором, указанные ген и промотор фланкированы последовательностями ДНК прямых повторов длиной 600-800 нуклеотидов, указанный вектор, дополнительно содержащий гетерологичную нуклеиновую кислоту, включающую второй пластидный промотор, функционально связанный с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей интересующий биофармацевтический белок, где указанный интересующий белок необязательно включает нацеливающий пептид и/или нуклеиновая кислота, кодирующая указанный белок, оптимизирована по кодонам для экспрессии в указанном растении, где указанная гетерологичная нуклеиновая кислота представляет собой оптимизированный по кодонам IGF-1, функционально связанный с последовательностями нуклеиновой кислоты, кодирующими PTD и e-пептид.
27. Выделенная транспластомная, не содержащая антибиотиков растительная клетка, экспрессирующая биофармацевтический белок в пластидах, указанный белок выбран из группы, состоящей из CTP-proIGF1-PTD, CTB-проинсулина, CTB-AMA, CTB-MSP, CTB-FIX, CTB-FIX-фурина, CTB-Экзендина, CTB-ESAT6, CTB-Mtb72F, CTB-VP1, CTB-MBP, CTB-Ace2, CTB-Ang1-7, CTB-GAA, CTB-FVIII-HC, CTB-FVIII-C2, оптимизированного по кодонам CTB-FVIII-HC, оптимизированного по кодонам CTB-FVIII-LC, и оптимизированного по кодонам CTB-FVIII-SC, и экспрессируется из вектора, в котором отсутствует ген селективного маркера.