СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕНОТИПА ЧЕЛОВЕКА ПО ПОЛИМОРФИЗМУ В ГЕНЕ МАТРИКСНОЙ МЕТАЛЛОПРОТЕИНАЗЫ 3 (ММР3) -11715А/6А
METHOD FOR HUMAN GENOTYPE DETERMINATION BY POLYMORPHISM IN MATRIX METALLOPROTEINASE 3 (MMR3) -11715A/6A GENE

1. Область техники
Предложенный способ относится к области медицины (медицинской генетике), биологии и биотехнологии.
Белки семейства матриксной металлопротеиназы (MMPs) играют ключевую роль в расщеплении внеклеточного матрикса тканей в нормальных физиологических процессах, как морфогенез, ангиогенез и ремоделирование тканей, так и в ряде патологических, включая, атеросклероз, гломерулонефрит, пародонтиты, опухолевую трансформацию и метастазирование [1]. Активность металлопротеиназ является одним из ведущих механизмов формирования дисплазий соединительной ткани. В настоящее время известен ряд полиморфных вариантов генов MMPs (например, ММР2(-1306 С/Т), ММР-3(-11715А/6А), ММР9(-1562С/Т), модифицирующих уровень экспрессии их белковых продуктов и ассоциированных с развитием разных патологических состояний. Инсерционно-делеционный полиморфизм промотерной области гена матриксной металлопротеиназы-3 (ММР-3) (-11715А/6А), rs35068180 или rs3025058 исследован в разных популяциях в связи с проблемой формирования сердечно-сосудистых патологий, ревматоидного артрита, развитием неопластических образований, индукцией и прогрессированием фиброза органов.
Показано, что полиморфизм ММР-3 (-11715А/6А) может быть ассоциирован с развитием осложнений артериальной гипертензий, в частности, установлено, что носители генотипа 6А/6А характеризуются более быстрым прогрессированием атеросклероза коронарных сосудов [2], кроме того, у пациентов с генотипом 6А/6А возрастает риск инфаркта миокарда [3]. При исследовании российских пациенток с РМЖ выявлена ассоциация аллеля 6А с рисками метастазирования [4]. Польскими исследователями было показано, что у больных с хронической обструктивной болезнью легких, являющихся носителями генотипа 5А/6А, статистически реже развивается рак легких относительно гомозигот обоих типов по ММР-3 (-11715А/6А) [5]. Установлено, что у пациентов с хроническим вирусным гепатитом аллель 6А ассоциирован с рисками прогресса фиброза и развитием цирроза печени [6].
Принимая во внимание представленные примеры, а также многочисленные данные других исследований, на сегодняшний день полиморфизм ММР-3 (-11715А/6А) rs35068180, rs3025058 являет прогностическим маркером развития большего числа тяжелых заболеваний.
2. Уровень техники
Широко распространен способ определения типа нуклеотида, находящегося в определенном месте ДНК, основанный на использовании аллель-специфичных праймеров с регистрацией результатов ПЦР по окончании реакции с помощью электрофореза. При использовании ПЦР с регистрацией результатов в ходе реакции известны различные способы определения генотипа исследуемого образца. Существуют различные способы, позволяющие определить тип нуклеотида, находящегося в определенном месте ДНК, основанные на использовании аллель-специфичных праймеров с регистрацией результатов ПЦР непосредственно в ходе реакции с помощью использования флуоресцентно-меченных проб (олигонуклеотидов) (Andreas R. Tobler at all, "THE SNPlex Genotiping System: A Flexible and Scalable Platform for SNP Genotyping", Journal of Biomolecular Techniques, V. 16, issue 4, Desember 2005). Например, в наборах производства Applied Biosystems используют одну пару праймеров для каждого аллеля и два зонда с различными флуорецентными метками, в зависимости от генотипа аллеля фиксируют разгорание различных меток ("TaqMan SNP Genotyping Assays", Applied Biosistems, Prodakt Bulletin, USA, 06/2006). Недостатком способа, используемого в данных наборах, является сравнительно невысокая достоверность результатов исследования из-за небольшой разницы между получаемыми кривыми флуоресценции для разных аллелей. Предлагаемым подходом к детекции генетического полиморфизма является использование двух аллель-специфичных и меченных разными флуоресцентными метками олигонуклеотидов, а также олигонуклеотида, несущего гаситель флуоресценции и гибридизирующегося на матрицу рядом с аллель-специфичным олигонуклеотидом. Гибридизация аллель-специфичного олигонуклеотида на матрицу ведет к переносу энергии с находящегося на нем флуорофора-донора на гаситель флуоресценции расположенного рядом «гасящего» олигонуклеотида. Регистрацию результатов амплификации ведут по окончании ПЦР путем снятия спектра флуоресценции при изменении температуры реакционной смеси в диапазоне от 25 до 80 градусов по Цельсию (так называемые «кривые плавления»). При получении графиков флуоресценции возможен как нагрев, так и охлаждение реакционной смеси в указанном интервале температур. Предлагаемое изобретение делает определение вариабельных позиций в ДНК более надежными, удешевляет подобные исследования благодаря использованию стандартного оборудования.
3. Раскрытие изобретения
Техническим результатом, на достижение которого направлено предлагаемое изобретение, является повышение доступности подобных исследований, поскольку способ может быть осуществлен на стандартном известном оборудовании. Также он обеспечивает возможность проводить исследование в одной пробирке, что снижает затраты на исследование. Использованный нами способ генотипирования является вариантом классического метода «примыкающих проб». При определении замен одиночных нуклеотидов вначале проводили ПЦР с праймерами, общими для обоих вариантов последовательности, затем температуру реакционной смеси снижали для гибридизации полученной матрицы с олигонуклеотидными пробами. Для определения варианта последовательности использовали два типа олигонуклеотидов, гибридизирующихся на матрицу рядом. Один из олигонуклеотидов метили флуорофором, другой - гасителем флуоресценции. В реакции использовали один общий олигонуклеотид с гасителем флуоресценции и пару аллель-специфичных (сиквенс-специфичных) олигонуклеотидов, несущих флуорофор. Олигонуклеотидные пробы, соответствующие тому или иному варианту последовательности, метили различными флуорофорами, что позволило определять оба варианта в одной пробирке. Определение генотипа проводили после ПЦР и гибридизации путем измерения уровня флуоресценции в ходе температурной денатурации дуплексов олигонуклеотидов и полученных матриц (или наоборот - гибридизации). Данное измерение проводили в режиме реального времени, его результатом являлись кривые плавления. Условия реакции подбирали так, чтобы максимизировать разницу в температурах плавления совершенного и несовершенного дуплексов. Таким образом, если анализируемый образец содержал только один вариант последовательности, т.е. был гомозиготен по данному полиморфизму, температура плавления для пробы образующей совершенный дуплекс была существенно выше, нежели для пробы образующей несовершенный дуплекс. Если же анализировали гетерозиготный образец, температуры плавления были практически одинаковы. Указанный результат достигается путем использования при постановке ПЦР флуоресцентно-меченных аллель-специфичных олигонуклеотидных проб и праймеров (табл. 1):
FAM - означает флуоресцентный краситель FAM, VIC - означает флуоресцентный краситель VIC, BHQ1 - означает темновой гаситель флуоресценции.
4. Осуществление изобретения
В качестве материала для исследования рекомендуется использовать периферическую кровь. Выделение ДНК из биоматериала производится с использованием комплекта реагентов для выделения ДНК (не является предметом данного патента). Полимеразную цепную реакцию и определение температуры плавления олигонуклеотидных проб проводили с помощью детектирующего амплификатора «ДТпрайм» (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия). Использовали следующий температурный режим амплификации: 94°С - 10 с, 64°С - 30 с в течение 50 циклов. По завершении реакции амплификации реакционную смесь остужали до 25°С со скоростью 2°С/сек. Кривые плавления получали следующим образом: температуру реакционной смеси повышали с 25°С до 75°С с шагом 1°С, измеряя уровень флуоресценции на каждом шаге. Результаты, т.е. отнесение образца к гомозиготе или гетерозиготе по данному аллелю, оцениваются по форме кривых плавления ДНК (фиг. 1).
Список литературы
1. Ярмолинская М.И, Молотков А.С, Денисова В.М. Матриксные металлопротеиназы и ингибиторы: классификация, механизм действия. Журнал акушерства и женских болезней 61(1). 2012
2. Sonia Abilleira, Steve Bevan, Hugh S Markus. The role of genetic variants of matrix metalloproteinases in coronary and carotid atherosclerosis. J Med Genet. 2006 Dec; 43(12): 897-901. DOI: 10.1136/jmg.2006.040808
3. Richardson P.D., Davies M.J., Born G.V.R. Richardson P.D. Influence of plaque configuration and stress distribution on fissuring of coronary atherosclerotic plaques // Heart. 2014. 99(10). Pp. 715-721.
4. Shevchenko A.V., Konenkov V.I., Garbukov E.Y., Stakheeva M.N. Associating of polymorphism in the promoter regions of genes of metalloproteinase (MMP2, ММР3, MMP9) with options of the clinical course of breast cancer in Russian women // Problems in oncology. - 2014. - Vol. 60. - N. 5. - P. 630-635. doi: 10.18722/VO2014605630-635
5.  Sochanowicz B, Cymerman M, Grudny J,  et al. Matrix metalloproteinase 3 polymorphisms as a potential marker of enhanced susceptibility to lung cancer in chronic obstructive pulmonary disease subjects. Ann Agric Environ Med. 2014; 21(3):546-51 DOI: 10.5604/12321966.1120599.
6. Shin HP, Lee JI, Jung JH, Yim SV, Kim HJ, Cha JM et al. Matrix metalloproteinase (MMP)-3 polymorphism in patients with HBV related chronic liver disease. Dig Dis Sci. 2008 Mar; 53(3):823-9. DOI: 10.1007/s10620-007-9937-7