СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛИЗОВАННЫХ ПРОИЗВОДНЫХ ГИАЛУРОНОВОЙ КИСЛОТЫ И ОБРАЗОВАНИЯ ИХ ГИДРОГЕЛЕЙ
METHOD OF OBTAINING FUNCTIONALISED DERIVATIVES OF HYALURONIC ACID AND FORMATION OF THEIR HYDROGELS

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к способу получения функционализованных производных гиалуроновой кислоты и соответствующих гидрогелей. В частности, настоящее изобретение относится к двухстадийному способу, применяемому для внедрения функциональных групп в молекулу гиалуроновой кислоты посредством образования определенных активных групп на гидроксильных группах гиалуроновой кислоты и последующего замещения введенных активных групп, причем боковая группа содержит на своем конце по меньшей мере нуклеофильную функциональную группу. Группа, вводимая путем нуклеофильного замещения, может содержать на другом своем конце иную нуклеофильную функциональную группу, используемую для дальнейшей химической функционализации, в частности для того, чтобы способствовать образованию поперечных сшивок цепей гиалуроновой кислоты при получении гидрогелей.
Известный уровень техники
Гиалуроновая кислота (НА) является наиболее распространенным несульфированным гликозаминогликаном, присутствующим в межклеточном матриксе всех тканей. Она представляет собой полисахарид, образованный повторяющимися звеньями D-глюкуроновой кислоты (GlcUA) и N-ацетил-D-глюкозамина (GlcNAc); ее структура может быть изображена следующей формулой, показывающей два последовательных звена (число n повторяющихся звеньев может быть соответствующим молекулярной массе от 50000 до нескольких миллионов дальтон).
Гиалуроновая кислота активно участвует в ряде важных биологических процессов, как, например, в подвижности и дифференцировке клеток, в заживлении ран. В частности, гиалуроновая кислота играет ключевую структурную роль в организации межклеточного матрикса хрящевой ткани, участвуя в образовании более распространенных протеогликанов, например агрекана.
Гиалуроновая кислота с высокой молекулярной массой используется в вискоиндукции суставов (вискосаплементарной терапии и хирургии), в офтальмологии и для облегчения болей при остеоартрите в качестве смазывающего агента, вводимого путем внутрисуставных инъекций.
Недавно разработан ряд функциональных или поперечно-сшитых производных гиалуроновой кислоты в виде пленок или губок для применения при лечении ран, поскольку эти продукты обладают свойством заживления тканей.
В области тканевой инженерии - новой отрасли науки, занимающейся разработкой технологий и методов восстановления или полной замены поврежденных тканей в человеческом организме - гиалуроновая кислота в последнее время использовалась в основном для получения трехмерных пористых структур, известных как скаффолды. Эти матрицы усиливают рост и дифференцировку клеток в ткани, способствуя ее регенерации и восстановлению структуры.
Для применения в этой роли гиалуроновая кислота используется в замещенном виде, обеспечивающем образование гидрогеля. Известные гидрогели образуются природными или синтетическими полимерами или их производными или комбинациями природных и синтетических полимеров, молекулы которых взаимодействуют за счет ван-дер-ваальсовых сил, водородных связей, электростатическим или химическим путем. Гидрогели таким образом представляют собой сети из гидрофильных полимеров, способные поглощать воду в количествах, в сотни раз превосходящих их сухой вес. В вязи с гидрофильными свойствами и потенциальной биологической совместимостью гидрогелей к ним растет интерес в области фармацевтических и медикобиологических применений.
Химическая функционализация полисахаридной структуры гиалуроновой кислоты путем внедрения боковых функциональных групп имеет целью получение фармацевтических средств, продлевающих высвобождение лекарственного агента в системах его доставки; в таких системах лекарственный агент физически или химически связан с полисахаридным носителем и его высвобождение происходит таким образом и в таком режиме, чтобы повышать биологическую доступность лекарства.
Ввиду большого интереса к упомянутым выше фармацевтическим, медико-биологическим и косметологическим применениям гиалуроновой кислоты ясно, что существует настоятельная потребность в новых химических подходах, позволяющих получать новые, более простые модификации гиалуроновой кислоты. Эти новые производные можно будет использовать для различных потенциальных применений.
Ранее был описан ряд химических модификаций гиалуроновой кислоты, в которых использовались ее гидроксильные и карбоксильные группы, и ряд производных гиалуроновой кислоты для применения в медико-биологической или фармацевтической областях.
Например, в патенте США №4582865 (Balasz et al., Biomatrix Inc.) описывается поперечное сшивание молекул гиалуроновой кислоты путем взаимодействия с дивинилсульфоном в сильно щелочной среде. В заявке на патент ЕР 0216453 (Fidia S.p.A.) описывается этерификация солей гиалуроновой кислоты с помощью алкилгалогенидов в полярных апротонных растворителях. Такие производные нашли широкое применение в фармацевтике, например, в качестве скаффолдов в тканевой инженерии и в качестве средств для контролируемого высвобождения лекарственных агентов. Эти эфирные производные гиалуроновой кислоты обладают измененными физико-химическими свойствами, например повышенной растворимостью в органических растворителях (например, в диметилсульфоксиде), способствующими промышленному применению для получения волокон, пористых скаффолдов и пленок.
2
В последнее время предлагались и другие различные химические подходы для функционализации гиалуроновой кислоты путем внедрения боковых функциональных структур, использующие как взаимодействия с карбоксильными группами остатков глюкуроновой кислоты, так и с гидрокисльными группами повторяющихся звеньев. В частности, в ряде работ описывается применение карбодиимидного метода (с использованием соединений формулы R'-N=C=N-R) для химической функционализации остатков D-глюкуроновой кислоты в гиалуроновой кислоте.
2
2
2
Например, Г.Прествич и Т.Пуяни с коллегами использовали водорастворимые карбодиимиды для внедрения гидразидных боковых цепей в «скелет» гиалуроновой кислоты (патент США 5502081, Prestwich et al., The Research Foundation of State University of New York; патент США 5616568, Т. Pouyany et al.; Т. Pouyany, G. D. Prestwich Functionalized Derivatives of Hyaluronic Acid Oligosaccharides: Drug Carriers and Novel Biomaterials, Bioconjugate Chem., 1994, 5, 339-347). В этих примерах карбоксильные группы гиалуроновой кислоты взаимодействовали с бифункциональными соединениями общей формулы HN-NH-CO-A-CO-NHNH, где А является стандартной разделяющей группой, образуя функционализованные производные гиалуроновой кислоты, несущие боковые гидразидные группы формулы HA-CONH-NH-CO-A-CO-NH-NH. Следуя тому же направлению исследований, К. Веркрайс с сотрудниками (K.Vercruysse et al., "Synthesis and in Vitro Degradation of New Polyvalent Hydrazide Cross-Linked Hydrogels of Hyalyronic Acid, Bioconjugate Chem., 1997, 8, 686-694) описали функционализацию гиалуроновой кислоты с использованием соединений, несущих более двух концевых гидразидных групп, что обеспечивало поперечную сшивку исходного полисахарида и тем самым формирование гидрогелей.
Д.Эшлиман и его коллеги (патент США 6630457, D.Aeschlimann et al., Оthogene LLC; соответствует патенту № EP 1757314) модифицировали способ активации карбоксильных групп гиалуроновой кислоты, предложенный Пуяни, объединив использование водорастворимых карбодиимидов и таких нуклеофильных активаторов, как гидроксисукцинимиды и гидрокситриазолы. В частности, предложенный способ подразумевает внедрение новых функциональных групп в «скелет» гиалуроновой кислоты путем вначале активации ее карбоксильных групп с образованием промежуточных эфирных групп, а затем замещения этих эфирных групп с использованием соединений, содержащих сильные нуклеофильные группы, с одной стороны, и химически защищенные функциональные группы, с другой стороны. Таким образом, активированные интермедиаты гиалуроновой кислоты более стабильны, и, следовательно, последующая функционализация с помощью бифункциональных нуклеофильных соединений более избирательна. Таким путем были получены аминовые и альдегидные производные гиалуроновой кислоты, пригодные для последующего поперечного сшивания, тем самым обеспечивалось получение биологически совместимых гидрогелей на основе гиалуроновой кислоты.
Кроме того, в публикации WO 02/098923, представленной Eurand Pharmaceuticals Ltd. (авторы Е. Mariotti et al.), описываются способы получения функционализованных производных гиалуроновой кислоты, в которых ее гидроксильные группы этерифицируются или карбамоилируются (HA-O-CONH-) и карбоксильные группы полностью или частично этерифицируются спиртами. Такие карбамоилированные гидроксильные группы получают путем взаимодействия полисахаридов с алкил-, арил- или арилалкилизоцианатами (R-N=C=O). Так были получены карбамоилированные и этерифицированные производные гиалуроновой кислоты для применения в качестве неподвижной фазы в хроматографическом анализе.
В патенте EP 1538166 (авторы Chen Jui-hsiang et al., представлено от Industrial Technology Research Institute) описывается, наподобие работы Мариотти с сотрудниками, получение производных гиалуроновой кислоты, несущих в качестве боковых цепей гидрофобные, гидрофильные и амфифильные полимеры, полученные в результате взаимодействия полисахаридов с изоцианатными производными тех же полимеров.
Последние два из упомянутых здесь патентов описывают образование карбаматных производных гиалуроновой кислоты на первичных гидроксильных группах повторяющихся дисахаридных звеньев путем осуществления реакции с использованием солей гиалуроновой кислоты, растворимых в полярном апротонном растворителе, и реакционноспособных изоцианатов. В этом случае гидроксильные группы гиалуроновой кислоты были функционализованы путем одностадийной реакции с образованием карбаматной связи (-O-СО-NH-, называемой также уретановой связью) между гиалуроновой кислотой и новыми боковыми функциональными группами; такая функционализация может быть описана с помощью следующей общей формулы (НА-O-CO-NH-R), где R может быть гидрофильной, липофильной или амфифильной цепью. Однако упомянутые здесь методики страдают тем неудобством, что функционализация ограничена лишь изоцианатными производными, которые приходится использовать в качестве исходных реагентов.
Что касается описанных выше методик, то настоящее изобретение имеет целью предложить новый способ получения функционализованных производных гиалуроновой кислоты, которые можно использовать для получения поперечно-сшитых гидрогелей или в качестве ценных интермедиатов для дальнейшей функционализации как в водных, так и в органических растворителях. В цели настоящего изобретения также входит предложить методики, которые позволяют легко применять эти функциональные производные гиалуроновой кислоты для получения новых гидрогелей.
Раскрытие изобретения
Преследуя указанные выше цели, авторы настоящего изобретения нашли универсальный химический способ получения функциональных производных гиалуроновой кислоты таким путем, который не требует участия в химической реакции карбоксильных групп остатков глюкуроновой кислоты в гиалуроновой кислоте. Этот способ включает двухстадийный процесс, в котором первая стадия представляет собой введение активной химической группировки по меньшей мере по одной гидроксильной группе гиалуроновой кислоты для образования активного интермедиата, а на второй стадии указанный активный интермедиат взаимодействует с реакционноспособным нуклеофилом, причем указанный реакционноспособный нуклеофил несет по меньшей мере одну первичную аминогруппу. Последовательное применение указанного двухстадийного процесса обеспечивает образование по меньшей мере одной карбаматной группы (-О-СО-NH-), присоединенной к «скелету» гиалуроновой кислоты через по меньшей мере одну из ее гидроксильных групп.
2
2
2
В частности, на первой стадии способа по данному изобретению для внедрения нитрофеноксикарбонильных групп (NO-Ph-O-CO-) по гидроксильным группам гиалуроновой кислоты (первичным и/или вторичным) используются определенные активирующие соединения, как, например, хорошо известные в данной области техники и имеющиеся в продаже бис(4-нитрофенилкарбонат) или хлорнитрофенилкарбонат; на второй стадии легко отделяющаяся внедренная группа (нитрофеноксильная) замещается нуклеофильным соединением общей формулы NH-R. Такое нуклеофильное соединение должно содержать по меньшей мере одну первичную аминогруппу, причем R представляет NH, алкиламиногруппу, алкильную цепь, арилалкильную цепь, полиакрильную цепь, полиоксиэтиленовую цепь или в более общем смысле любое соединение с низкой (например, лекарственное вещество) или высокой (например, полимер, белок и проч.) молекулярной массой; предпочтительно указанное соединение с низкой или высокой молекулярной массой является биологически совместимым и растворимым в органических растворителях или в водной среде.
По данному изобретению путем двухфазной реакции можно получать новые карбаматные связи по первичным и/или вторичным гидроксильным группам гиалуроновой кислоты, применяя подходящий интермедиат активации. В частности, реакционноспособный бис(4-нитрофенилкарбонат) использовался для образования реакционноспособного нитрофенилкарбонатного производного гиалуроновой кислоты, легко вступающего в реакцию с нуклеофильными соединениями, предпочтительно несущими аминогруппу или гидразидную группу.
Боковая группа, внедряемая на второй стадии процесса, при необходимости может нести по меньшей мере другую функциональную группу, доступную для дальнейших химических функционализаций, осуществляемых в органической либо водной среде, взаимодействующую с соединениями, несущими иные функциональные группы, в частности химические группы, способные обеспечить реакцию поперечного сшивания.
Предлагаемый данным изобретением способ можно применять для получения производных гиалуроновой кислоты, несущих новые аминогруппы или гидразидные группы, или для получения производных гиалуроновой кислоты, несущих гидрофильные или липофильные боковые цепи.
Таким образом к гиалуроновой кислоте через ее гидроксильные группы (первичные и/или вторичные) может быть присоединено множество разнообразных химических функциональных групп, имеющихся в продаже. Кроме того, осуществление данного способа открывает возможность дальнейшей функционализаций таких амино- и гидразидных производных также в органическом окружении: в частности, для дальнейшей функционализаций можно использовать тетрабутиламмониевые (ТВА) соли таких амино- или гидразидных производных гиалуроновой кислоты. Как правило, такая дальнейшая функционализация может осуществляться и в водной, и в органической среде, в частности в полярных апротоннных растворителях, например в диметилсульфоксиде, диметилформамиде, диметилацетамиде и их смесях.
Краткое описание чертежей
Некоторые результаты экспериментов иллюстрируются следующими чертежами.
1
2
Фигура 1 изображает спектр Н-ЯМР (DO) полученного способом по данному изобретению этилендиаминового производного гиалуроновой кислоты (HA-EDA) со степенью функционализации этилендиаминовыми группами 50% моль/моль.
1
2
Фигура 2 изображает спектр Н-ЯМР (DO) полученного способом по данному изобретению бутиламинового производного гиалуроновой кислоты (НА-ВТА) со степенью функционализации бутильными группами 52% моль/моль.
1
2
Фигура 3 изображает спектр Н-ЯМР (DO) полученного способом по данному изобретению аминополиэтиленгликолевого производного гиалуроновой кислоты (НА-NH-PEG) со степенью функционализации полиоксиэтилен-монометил-моноаминоцепями 33% моль/моль.
1
2
Фигура 4 изображает спектр Н-ЯМР (DO) полученного способом по данному изобретению этилендиамин-метакрильного производного гиалуроновой кислоты (НА-EDA-MA) со степенью функционализации 50% моль/моль этилендиаминовыми группами и 50% моль/моль метакрильными группами.
На фигуре 5 представлена фотография лиофилизованного гидрогеля этилендиамин-бензоилцистеинового производного гиалуроновой кислоты (0,5% масса/объем HA-EDA-ВС), полученная с помощью сканирующего электронного микроскопа.
Фигура 6 демонстрирует пролиферацию человеческих хондроцитов в гидрогеле этилендиамин-бензоилцистеинового производного гиалуроновой кислоты, отражаемую величиной поглощения при 550 нм +/- стандартное отклонение (n=9).
Фигура 7 демонстрирует окрашивание (живые клетки/мертвые клетки) хондроцитов, растущих в гидрогеле этилендиамин-бензоилцистеинового производного гиалуроновой кислоты через трое суток культивирования. Мертвые клетки показаны рамками.
Осуществление изобретения
Конкретной целью настоящего изобретения является способ получения функциональных производных гиалуроновой кислоты, состоящий из следующих стадий:
(а) активация по меньшей мере одной гидроксильной группы гиалуроновой кислоты (гиалуроновая кислота берется в виде соли, растворимой в органических растворителях); взаимодействие этой соли гиалуроновой кислоты в полярном апротонном растворителе с карбонатобразующим агентом, выбираемым из фениловых эфиров карбоновых кислот или фениловых эфиров галогенмуравьиной кислоты;
2
2
(b) взаимодействие активированной соли гиалуроновой кислоты, полученной на стадии (а) путем нуклеофильного замещения, с соединением общей формулы NH-R, где R может быть NH, аминоалкильной группой, алкильной цепью, арилалкильной цепью, полиакрильной цепью, полиоксиэтиленовой цепью, или низкомолекулярным соединением (например, лекарственным агентом), или высокомолекулярным соединением (например, полимером, белком и др.); предпочтительно указанное соединение с низкой или высокой молекулярной массой является биологически совместимым и растворимым в органических растворителях или в водной среде.
В частности, карбонатобразующий реагент, используемый на первой стадии, может быть бис(4-нитрофенилкарбонатом) и/или хлорнитрофенилкарбонатом.
Соль гиалуроновой кислоты, растворимую в органических растворителях, предпочтительно следует выбирать из солей тетрабутиламмония (обозначен здесь ТВА) или цетилтриметиламмония (обозначен здесь СТА).
По некоторым предпочтительным аспектам осуществления изобретения органический растворитель, используемый для реакций функционализации, выбирают из диметилсульфоксида, диметилформамида, диметилацетамида и их смесей, причем обе стадии - активация (а) и нуклеофильное замещение (b) - осуществляются при температуре от 10 до 60°С.
Степень функционализации получаемых производных гиалуроновой кислоты может варьировать от лишь одной гидроксильной группы до всех гидроксильных групп гиалуроновой кислоты и зависит (прямо пропорционально) от количества реакционноспособного карбонилирующего агента, используемого в описанном выше процессе. Предпочтительно степень функционализации варьирует от 5 до 95%, более предпочтительно от 20 до 80% (для большей ясности см. Пример 1).
2
2
2
2
2
n
2
2
2
2
2
2
2
По другим конкретным воплощениям данного изобретения соединение общей формулы NH-R выбирают из гидразина (NH-NH) и бис-аминоалкильной группы формулы NH-(CH)-NH, где число n составляет от 1 до 30, предпочтительно от 1 до 10. В другом конкретном воплощении данного изобретения, описанном в приведенной ниже экспериментальной части настоящего документа, использовали бифункциональные соединения, как, например, этилендиамин (NH-CH-CH-NH, обозначен здесь EDA) и гидразин (NH-NH, обозначен здесь Hy), которые присоединяли к «скелету» гиалуроновой кислоты (НА), чтобы получить производные HA-EDA и HA-Hy соответственно.
По настоящему изобретению такие производные гиалуроновой кислоты, как HA-EDA или HA-Hy, можно использовать для получения гидрогелей путем самообразования поперечных сшивок с использованием карбодиимидов в качестве активирующих агентов или путем применения бифункциональных сшивающих агентов, как, например, глутарового альдегида, или иных полифункциональных соединений. Конкретные подробности упомянутых воплощений данного изобретения описаны в приведенной ниже экспериментальной части настоящего документа.
Настоящим изобретением предлагаются способы применения солей, растворимых в органических растворителях, в частности тетрабутиламмониевых, амино- или гидразиновых производных гиалуроновой кислоты или водорастворимых солей гиалуроновой кислоты, получаемых способом по данному изобретению, для дальнейшего образования производных. Дальнейшее образование производных может осуществляться в органических растворителях или в водной среде. По другим предпочтительным аспектам настоящего изобретения производные солей гиалуроновой кислоты, получаемые на стадии (b) способа по данному изобретению, подвергаются дальнейшей функционализации путем нуклеофильного замещения с помощью соединений общей формулы Y-R', где Y является легко отделяющейся уходящей группой, как, например, галогеном, N-оксисукцинимидом, алкоксильной группой, содержащей 1-6 атомов углерода, или же Y является электрофильной частью ангидрида или эпоксида, a R' является такой группой, как акрилолил или метакрилоил (и та, и другая при необходимости могут быть замещенными), или частью соединения, растворимого в органическом растворителе или в водной среде.
Предпочтительно дальнейшая функционализация осуществляется в полярном апротонном растворителе, выбираемом из диметилсульфоксида, диметилформамида, диметилацетамида и их смесей, при температуре от 5 до 60°С; по другим предпочтительным аспектам данного изобретения эта реакция осуществляется в присутствии катализатора, выбираемого из диэтиламина, триэтиламина, диметиламинопиридина и их смесей.
Для получения акриловых или метакриловых производных гиалуроновой кислоты соединение общей формулы Y-R' предпочтительно является метакриловым ангидридом, метакрилоилхлоридом, акрилоилхлоридом, глицидилакрилатом или глицидилметаркилатом; для получения другого конкретного производного, описанного в приведенной ниже экспериментальной части настоящего документа, а именно бензоилцистеинового производного гиалуроновой кислоты, соединение общей формулы Y-R' является моноэфиром N-оксисукцинимида или диэфиром N,N'-дибензоил-L-цистина или сходных его производных.
В этом последнем примере производное, полученное в результате такой дальнейшей функционализации, подвергается затем восстановлению, чтобы получить бензоилцистеиновую группировку, связанную с гиалуроновой кислотой.
Другим объектом настоящего изобретения являются новые продукты, состоящие из функционализованных производных гиалуроновой кислоты, с молекулярной массой в диапазоне 50000-1500000 дальтон, которые можно получить описанным выше способом.
Ниже в настоящем документе приводятся структурные формулы, которые лишь представляют тип функционализации (ковалентное связывание), имеющей место по гидроксильным группам гиалуроновой кислоты при осуществлении описанного выше способа. Приведенные ниже структуры не следует считать представляющими степень функционализации, которая, как говорилось выше, прямо пропорциональна количеству реакционноспособного карбонилирующего агента, используемого в описанном выше способе.
В своем предпочтительном воплощении настоящее изобретение относится к акриловым или метакриловым производным гиалуроновой кислоты с молекулярной массой в диапазоне 50000-1500000 дальтон, которые можно получить описанным выше способом.
Тип фунционализации таких метакриловых производных гиалуроновой кислоты может быть представлен следующей структурной формулой, изображающей два последовательных дисахаридных звена гиалуроновой кислоты, где по меньшей мере одна гидроксильная группа функционализована.
Акриловые производные могут быть представлены изображенной выше формулой, в которой вместо метакрилоиловой группы присутствует акрилоиловая группа.
Такие акриловые или метакриловые производные гиалуроновой кислоты могут быть получены по двухстадийному способу, предлагаемому данным изобретением, с последующей функционализацией, как говорилось выше.
Кроме того, возможно контролировать меру третьей стадии - функционализации акрильными или метакрильными группами, чтобы получать производные, несущие свободные аминогруппы в диапазоне 5-95%.
Из описанных выше продуктов можно получать поперечно-сшитые гидрогели, применяя метод фотосшивания, при концентрациях вышеупомянутых функционализованных производных в водном или органическом растворителе в диапазоне 1-20% (масса/объем). Предпочтительно гидрогель получают путем облучения при длинах волн в диапазоне 180-800 нм в течение от 5 минут до 10 часов (с помощью радикальных фотоинициаторов или без них). Такие гидрогели можно получать также с помощью γ-излучения, микроволнового излучения или иного ионизирующего излучения.
Такое фотосшивание может происходить также в присутствии подходящих добавок - акриловых или метакриловых мономеров, полиэтиленгликоль-метакрилатов и акрилатов, как моно-, так и полифункциональных, или в присутствии иных добавок, применяемых для влияния на пластичность, жесткость, гидрофильность и липофильность.
В другом своем аспекте настоящее изобретение имеет определенную задачу - новое производное, получаемое предлагаемым двухстадийным способом, а именно бензоилцистеиновое производное гиалуроновой кислоты или сходные производные с молекулярной массой в диапазоне 50000-1500000 дальтон, получаемые описанным выше способом. Такие бензоилцистеиновые производные гиалуроновой кислоты могут быть представлены следующей структурной формулой, охватывающей два последовательных дисахаридных звена исходной гиалуроновой кислоты, где по меньшей мере одна гидроксильная группа функционализована:
Такое аминокислотное производное может быть получено в результате двухстадийного способа по данному изобретению с дальнейшей функционализацией, как описано выше, и последующим восстановлением дисульфидных мостиков в производном гиалуроновой кислоты.
В этом случае возможно получить поперечно-сшитые гидрогели даже в результате окисления на воздухе.
В целом, в объем данного изобретения входят гидрогели, получаемые описанными здесь способами, причем с помощью соответствующих технических приемов такие гидрогели могут быть получены в виде наночастиц или микрочастиц, пленок, мембран, волокон и скаффолдов.
Наконец, настоящее изобретение относится к применению описанных гидрогелей для получения систем доставки лекарственных веществ или генов, в косметологических целях или для нужд производства сельскохозяйственной пищевой продукции, для производства систем заживления ран, органов или тканей, для производства имплантируемых материалов и скаффолдов для восстановления тканей.
Определенные особенности данного изобретения (его преимущества, технологические приемы и примеры конкретных применений), относящиеся к дальнейшей функционализации производных и изготовлению гидрогелей, станут ясны из нижеследующего иллюстративного осуществления изобретения.
Экспериментальная часть
Пример 1. Синтез этилендиаминового производного гиалуроновой кислоты (HA-EDA).
3 г тетрабутиламмониевой соли гиалуроновой кислоты (HA-TBA), полученной путем нейтрализации раствора гиалуроновой кислоты (средняя молекулярная масса гиалуроновой кислоты 270 кДа) раствором гидроксида тетрабутиламмония, растворяли в 270 мл безводного диметилсульфоксида (DMSO).
В 30 мл безводного диметилсульфоксида растворяли нужное количество бис(4-нитрофенил)карбоната (4-NPBC), взятое из расчета получить молярное отношение 4-NPBC/HA-TBA соответственно 0,75, 0,5 и 0,25; этот раствор добавляли по каплям к раствору НА-ТВА при температуре 40°C при перемешивании. Через 4 часа прибавляли по каплям 3 мл этилендиамина (EDA) и полученный раствор оставляли еще на 3 часа при температуре 40°C. После этого выделяли продукт реакции: вначале высаживали производное гиалуроновой кислоты в ацетон, затем промывали тем же растворителем до тех пор, пока не получали желаемый продукт реакции без промежуточных продуктов.
Полученное твердое вещество, образованное сополимером HA-TBA-EDA, измельчали в порошок.
Раствор HA-TBA-EDA в диметилсульфоксиде пропускали через колонку с ионообменной смолой DOWEX 50 Wx8, активированной в натриевой форме, таким образом получая натриевую соль этилендиаминового производного гиалуроновой кислоты (HA-EDA). Искомый продукт выделяли путем диализа диметилсульфоксидного раствора против воды, после чего водный раствор лиофилизировали. Эта функционализация изображена на схеме 1.
Схема 1. Реакция функционализации тетрабутиламмониевой соли гиалуроновой кислоты (НА-ТВА) этилендиамином с получением этилендиаминового производного гиалуроновой кислоты (HA-EDA)
1
1
2
3
2
2
2
Соединение HA-EDA характеризовали путем Н-ЯМР; спектры показаны на Фигуре 1 (см. чертежи). В частности, данные Н-ЯМР (DO) следующие: δ 1,9 (m, -NH-СО-СН); δ 3,1 (m, CO-NH-CH-CH-NH).
3
Степень функционализации рассчитывали, сравнивая площадь пика при δ 1,9, относимую к СН в N-ацетилглюкозаминовой части гиалуроновой кислоты, с площадью пика при 53,1, относимого к этилендиаминовой части, связанной с гиалуроновой кислотой. Степень функционализации выражали как отношение (в процентах) числа молей внедренной этилендиаминовой части к числу молей повторяющегося звена гиалуроновой кислоты.
В приведенной ниже Таблице 1 представлены в качестве примера данные по молярной функционализации этилендиаминовыми группами, связанными с гиалуроновой кислотой, полученные при трех различных величинах отношения числа молей 4-NPBC к числу молей повторяющихся звеньев НА-ТВА.
Таблица 1
Отношение числа молей 4-NPBC к числу молей повторяющихся звеньев НА-ТВА
Молярная степень функционализации этилендиаминовыми группами, связанными с гиалуроновой кислотой
0,25
22% моль/моль
0,50
52% моль/моль
0,75
70% моль/моль
Пример 2. Синтез гидразинового производного гиалуроновой кислоты (HA-Hy)
3 г тетрабутиламмониевой соли гиалуроновой кислоты (НА-ТВА) растворяли в 270 мл безводного диметилсульфоксида (средняя молекулярная масса гиалуроновой кислоты 270 кДа). Затем 30 мл безводного диметилсульфоксида, в которых было растворено 0,73 г бис(4-нитрофенил)карбоната (4-NPBC) добавляли по каплям к раствору НА-ТВА и оставляли для протекания реакции при температуре 40°С на 4 часа. По истечении этого времени прибавляли по каплям 2,7 мл гидразина моногидрата и полученный раствор оставляли еще на 1 час при температуре 40°С. После этого выделяли продукт реакции:
вначале высаживали производное гиалуроновой кислоты в диэтиловый эфир, затем промывали ацетоном. Чтобы получить натриевую соль HA-Hy, реакционный раствор пропускали через колонку с ионообменной смолой DOWEX 50 Wx8, активированной в натриевой форме, после чего высаживали в ацетон и промывали тем же растворителем. Полученное твердое вещество растворяли в воде, диализовали против воды, после чего лиофилизировали. Степень функционализации, которую определяли колориметрически с тринитробензолсульфоновой кислотой (TNSB), составляла 50% моль/моль.
Эта реакция изображена на схеме 2.
Схема 2. Реакция функционализации тетрабутиламмониевой соли гиалуроновой кислоты (НА-ТВА) гидразина моногидратом с получением гидразинового производного гиалуроновой кислоты (HA-Hy)
Пример 3. Синтез производного гиалуроновой кислоты, функционализованного бутиламином (НА-ВТА)
3 г тетрабутиламмониевой соли гиалуроновой кислоты (НА-ТВА) растворяли в 270 мл безводного диметилсульфоксида (средняя молекулярная масса гиалуроновой кислоты 270 кДа). Затем 30 мл безводного диметилсульфоксида, в которых было растворено 0,73 г бис(4-нитрофенил)карбоната (4-NPBC) добавляли по каплям к раствору НА-ТВА и оставляли для протекания реакции при температуре 40°С на 4 часа при перемешивании. По истечении этого времени прибавляли по каплям 4,7 мл бутиламина и реакционную смесь оставляли еще на 24 часа при температуре 40°С. После этого реакционный раствор пропускали через колонку с ионообменной смолой DOWEX 50 Wx8, активированной в натриевой форме, после чего высаживали в ацетон и промывали тем же растворителем. Затем диализовали против воды и лиофилизировали. Отсутствие непрореагировавшего бутиламина в полученном производном (НА-ВТА) подтверждали путем анализа с тринитробензолсульфоновой кислотой (TNSB).
Эта функционализация изображена на схеме 3.
Схема 3. Реакция функционализации тетрабутиламмониевой соли гиалуроновой кислоты (НА-ТВА) бутиламином (ВТА) с получением бутиламинового производного гиалуроновой кислоты (НА-ВТА)
1
2
2
2
2
3
2
2
2
3
2
2
2
3
3
2
2
2
3
Производное НА-ВТА характеризовали путем Н-ЯМР (DO), что показано на Фигуре 2: δ 0,8 (-NH-CH-CH-CH-CH); δ 1,3 (-NHCH-CH-CH-CH); δ 1,4 (-NH-CH-СН-СН-СН); δ 2,0 (s, -NH-СОСН); δ 3,1 (-NH-CH-CH-CH-CH). Степень функционализации рассчитывали, сравнивая площади пиков при δ 0,8, 1,3, 1,4 и 3,1, относимых к метиленовой группе в бутиламиновой цепи, с площадью пика при δ 2,0, относимого к метильной группе N-глюкозаминовой части гиалуроновой кислоты. Степень функционализации составляла 52% моль/моль.
Пример 4. Синтез аминополиэтиленгликолевого производного гиалуроновой кислоты (НА-NH-PEG)
2
1 г тетрабутиламмониевой соли гиалуроновой кислоты (НА-ТВА) растворяли в 90 мл безводного диметилсульфоксида (средняя молекулярная масса исходной гиалуроновой кислоты 230 кДа). В 10 мл безводного диметилсульфоксида растворяли 0,4 г бис(4-нитрофенил)карбоната (4-NPBC). Раствор 4-NPBC добавляли по каплям к раствору НА-ТВА при температуре 40°С при перемешивании и оставляли реакционную смесь при той же температуре на 4 часа. По истечении этого времени прибавляли по каплям 6 г O-(2-аминоэтил)-O-метил-полиэтиленгликоля (PEG-NH) (молекулярная масса 750 Да), растворенные в 5 мл диметилсульфоксида, и полученный раствор оставляли на 24 часа при температуре 40°С. После этого реакционный раствор пропускали через колонку с ионообменной смолой DOWEX 50 Wx8, активированной в натриевой форме, после чего высаживали в ацетон и промывали тем же растворителем. Полученный продукт HA-NH-PEG лиофилизировали, затем растворяли в воде и диализовали против воды в течение 5 суток, используя диализную мембрану Spectrapor с отсечением по молекулярной массе 12000-14000.
Эта функционализация изображена на схеме 4.
Схема 4. Реакция функционализации тетрабутиламмониевой соли гиалуроновой кислоты (НА-ТВА) O-(2-аминоэтил)-O-метил-полиэтилвнгликолем (PEG-NH2) с получением производного гиалуроновой кислоты HA-NH-PEG
2
Отсутствие непрореагировавшего PEG-NH подтверждали колориметрически (определяли свободные аминогруппы с помощью тринитробензолсульфоновой кислоты).
1
2
2
2
n
3
3
2
2
n
3
Производное HA-NH-PEG характеризовали путем Н-ЯМР (DO), как показано на Фигуре 3 в прилагаемых иллюстрациях; наблюдались следующие пики: δ 1,4 (s, -CO-NH-(O-СН-СН)-O-СН); δ 2,0 (s, -NH-CO-СН); δ 3,7 (s, -СО-NH-(О-СН-CH)-О-СН).
Степень функционализации составляла 33% моль/моль.
Получение метакриловых производных этилендиаминового производного гиалуроновой кислоты (НА-ЕОА-МА)
В свете большого интереса к получению фотосшиваемых производных гиалуроновой кислоты для нужд тканевой инженерии, систем доставки лекарственных веществ, контурной пластики и др. одним из более предпочтительных применений предлагаемого здесь способа является функционализация аминосополимеров гиалуроновой кислоты метакриловыми группами.
В научной литературе появлялись сообщения о ряде метакриловых производных гиалуроновой кислоты. В способе, впервые описанном К. Смедсом с коллегами (Smeds K.A. et al., J. Biomed. Mat. Res. 2001; 54(1):115-121), метакриловое производное гиалуроновой кислот (НА-МА) получали в водной среде, содержащей 20-кратный молярный избыток (по отношению к первичным гидроксильным группам гиалуроновой кислоты) метакрилового ангидрида. Однако этим способом получается двухфазная система, что снижает эффективность функционализации.
Недавно М.Оудшурн с коллегами (M.Oudshoorn et al., Polymer 48 (2007) 1915-1920) описали образование сополимеров НА-МА путем взаимодействия тетрабутиламмониевой соли гиалуроновой кислоты с глицидилметакрилатом (GMA) в органическом апротонном растворителе (диметилсульфоксиде). В этом случае достигалась степень функционализации лишь 30% моль/моль при отношении числа молей GMA к числу молей гидроксильных групп гиалуроновой кислоты, равном 200.
В способе, описываемом в настоящем документе, присутствие в боковых цепях гиалуроновой кислоты более нуклеофильных групп (например, аминогруппы в этилендиаминовом производном гиалуроновой кислоты) можно с успехом использовать для осуществления более эффективной функционализации, используя, например, такой реагент, как метакриловый ангидрид (АМА).
Чтобы изучить потенциальные возможности этого способа и продемонстрировать избирательную функционализацию свободных аминогрупп гиалуроновой кислоты, были получены, как описано в нижеследующем Примере 5, три различных образца тетрабутиламмониевой соли аминопроизводных гиалуроновой кислоты (HA-TBA-EDA) с молярной степенью функционализации 75, 50 и 25% моль/моль (см. Пример 1) соответственно. В частности, в этом примере для достижения полной функционализации всех аминогрупп, присутствующих в этилендиаминовом производном гиалуроновой кислоты, оказалось достаточно всего лишь двукратного молярного избытка метакрилового ангидрида по отношению к свободным аминогруппам HA-TBA-EDA; в результате был получен сополимер HA-EDA-MA. Отсутствие непрореагировавших аминогрупп в сополимерах HA-EDA-MA определяли колориметрически с тринитробезолсульфоновой кислотой (TNBS). Кроме того, можно контролировать степень функционализации метакриловыми группами для получения производных HA-EDA-MA, содержащих от 5 до 95% свободных аминогрупп.
Пример 5. Синтез метакриловых производных этилендиамин-гиалуроновой кислоты (HA-EDA-MA)
1 г HA-TBA-EDA, полученного, как описано в Примере 1, со степенью функционализации этилендиаминовыми группами 50% моль/моль растворяли в 100 мл безводного диметилсульфоксида (DMSO). Затем добавляли такой объем метакрилового ангидрида (АМА), чтобы достичь двукратного молярного избытка по отношению к числу молей аминогрупп в HA-TBA-EDA. Прибавляли катализатор (диэтиламин) в эквимолярном соотношении с числом молей аминогрупп в HA-EDA-TBA и полученный раствор оставляли на 24 часа при температуре 40°С. По истечении этого времени органический раствор пропускали через колонку с ионообменной смолой DOWEX 50 Wx8, активированной в натриевой форме. Элюированный раствор высаживали в ацетон и полученное твердое вещество HA-EDA-MA несколько раз промывали тем же растворителем, после чего высушивали, растворяли в воде и диализовали против дистиллированной воды. Затем этот раствор фильтровали и лиофилизировали. Эта реакция изображена на схеме 5.
Схема 5. Реакция функционализации тетрабутиламмониевой соли этшендиаминового производного гиалуроновой кислоты (HA-EDA-TBA) метакриловым ангидридом (АМА), в результате которой получают производное HA-EDA-MA
1
2
3
3
3
Соединение HA-EDA-MA характеризовали путем Н-ЯМР (DO) (см. Фигуру 4); наблюдались следующие пики: δ 1,9 (s, -СО-СН=СН-СН); δ 2,0 (s, -NH-CO-СН); δ 5,5 e 5,8 (m, -СО-СН=СН-СН).
Степень функционализации определяли, сравнивая площади пиков при δ 5,5 и 5,8, относимых к протону винилового радикала метакриловой группы, с площадью пика при δ 1,9, относимого к метильной группе N-ацетилглюкозаминовой части повторяющихся звеньев гиалуроновой кислоты. Степень функционализации метакриловыми группами, связанными с повторяющимися звеньями HA-EDA, получалась равной 50% моль/моль, т.е. все аминогруппы провзаимодействовали с метакриловым ангидридом.
Получение бензоилцистеинового производного этилендиамин-гиалуроновой кислоты (HA-EDA-BC)
Одной из наиболее существенных структурных особенностей межклеточного матрикса является его волокнистая организация, обусловленная присутствием коллагена и других белков. Такая структура создает основу для связи клеток с их окружением и для оптимального распределения гуморальных факторов и питательных веществ. В последнее время прилагались немалые усилия в поисках возможностей создавать искусственные опорные конструкции (скаффолды) с волокнистой структурой (Biomaterials 29 (2008) 1989-2006).
В этом смысле представляется многообещающим получение гибридных сополимеров, способных к самопроизвольной сборке в определенные древовидные структуры. Например, Ш. Чжан и его сотрудники (Sh. Zhang et al., Chemical Biology 2002, 6:865-871) получили аутокомплементарные олигопептиды, которые, будучи растворены в водном буферном растворе, способны к самопроизвольному образованию волокнистых скаффолдов; эти матрицы нашли различное применение в области тканевой инженерии.
Интерес к получению скаффолдов, способных к самостоятельному образованию поперечных сшивок после введения в организм, обусловлен тем, что их непосредственное внедрение в место повреждения органа или ткани (например, для восстановления суставного хряща) может снять необходимость в хирургическом вмешательстве (имплантации), способствуя интеграции новообразованного межклеточного матрикса в исходную ткань.
С этой точки зрения критически важно, чтобы образование поперечных сшивок не включало реакции, потенциально токсичные для тканей, а кроме того, поперечное сшивание должно оставлять возможность для расположения клеток, производящих межклеточный матрикс, и притом не влиять на их жизнеспособность (Advanced Drug Delivery Reviews 59 (2007) 263-273). Например, недавно С. Шу и его коллеги (X. Shu et al., Biomaterials 25 (2004) 1339-1348; Biomaterials 24 (2003) 3825-3834 WO 2005/056608) разработали тиоловое производное гиалуроновой кислоты, способное к медленному поперечному сшиванию в результате окисления на воздухе или к быстрому поперечному сшиванию в присутствии полиэтиленгликоль-диакрилата (PEGDA), в качестве сшивающего агента.
Некоторые не являющиеся полимерами соединения способны к самопроизвольному объединению молекул в органических и водных средах с образованием гидрогелей. Например, аминокислота N-N′-дибензоил-L-cystine (DBC) и ее производные (J. Med. Chem. 1967, 10, 1172) образуют гидрогели в результате спонтанной самосборки даже при очень низких концентрациях. Движущей силой самопроизвольной агрегации служит возникновение π-π-взаимодействий, обусловленных наличием арильных групп (Angew. Che., In. Ed. Engl., 1995, 34, 584; J. Am. Chem. Soc. 2000, 122, 11679-11691).
Что касается способности DBC и ее производных образовывать гидрогели волокнистой структуры путем спонтанной самосборки с возникновением дисульфидных мостиков, то при необходимости этот процесс может быть обратимо прекращен путем окислительно-восстановительной реакции с образованием свободных тиоловых групп, которые потом можно вновь окислить до S-S-мостиков. Способ, предлагаемый настоящим изобретением, можно применять для синтеза бензоилцистеинового производного этилендиамин-гиалуроновой кислоты (HA-EDA-BC), проявляющего как окислительные свойства, так и способность к самосборке с образованием волокнистой структуры.
Пример 6. Синтез бензоилцистеинового производного этилендиамин-гиалуроновой кислоты (HA-EDA-BC)
1,3 г N,N'-дибензоил-L-цистина (DBC) растворяли в 28 мл дихлорметана и 20 мл безводного диметилсульфоксида. К этому раствору прибавляли 0,6 г дициклогексилкарбодиимида (DCC) и 0,34 г N-гидроксисукцинимида (NHS). Реакцию активации осуществляли при комнатной температуре в течение 24 часов. По истечении этого времени полученный раствор фильтровали и избыток дихлорметана удаляли в вакууме.
Этот раствор, содержащий N-оксисукцинимидное производное N,N'-дибензоил-L-цистина (DBC-NOS), добавляли по каплям к 80 мл диметилсульфоксида, содержащему 1 г HA-TBA-EDA со степенью функционализации аминогруппами 30% моль/моль. Реакцию проводили 28 часов при температуре 40°C с диэтиламином в качестве катализатора (960 мкл). Полученный раствор пропускали через колонку с ионообменной смолой DOWEX 50 Wx8, активированной в натриевой форме. Элюированный сополимер высаживали в диэтиловый эфир и промывали этиловым спиртом и ацетоном. Полученное таким образом соединение HA-EDA-DBC измельчали в порошок и диспергировали в воде до образования гомогенного гидрогеля. Доводили pH полученного гидрогеля до 8 при помощи 1 н. NaOH и затем прибавляли 1,2 г дитиотриэтола для восстановления дисульфидных мостиков, получая таким образом бензоилцистеиновое производное этилендиамин-гиалуроновой кислоты (HA-EDA-BC).
Этот раствор оставляли на 24 часа при комнатной температуре, затем доводили pH до 3,5 и диализовали против подкисленной воды в течение 5 суток, после чего фильтровали и лиофилизировали.
Эта функционализация изображена на схеме 6.
Схема 6. Реакция функционализации тетрабутиламмониевой соли этилендиамин-гиалуроновой кислоты (HA-TBA-EDA) N-оксисукцинимидным производным N,N'-дибензоил-L-цистина (DBC-NOS) с последующим восстановлением дисульфидных мостиков для получения бензоилцистеинового производного этилендиамин-гиалуроновой кислоты (HA-EDA-BC).
1
По данным Н-ЯМР и колориметрического анализа степень функционализации гиалуроновой кислоты бензоилцистеином составила 30% моль/моль. Колориметрический анализ с TNSB продемонстрировал отсутствие непрореагировавших аминогрупп в НА-EDA-BC.
Гидрогели поперечно-сшитых производных гиалуроновой кислоты
Поперечное сшивание метакриловых производных гиалуроновой кислоты типа HA-EDA-MA осуществляли в водной или органической среде с помощью фотоинициаторов (или без них) после воздействия излучения в γ-диапазоне, ультрафиолетовой, видимой или микроволновой области.
Полученные экспериментальные данные подтвердили, что водные растворы получаемых способом по данному изобретению сополимеров HA-EDA-MA (в диапазоне концентраций 1-20% масса/объем) с разной молярной степенью функционализации этилендиаминовыми или метакрильными группами, связанными с гиалуроновой кислотой, образуют гидрогели после воздействия излучения с длиной волны 180-800 нм или от источника микроволнового, γ- или иного ионизующего излучения.
Поперечное сшивание гидразиновых производных гиалуроновой кислоты (HA-Hy) осуществляли в водной среде предпочтительно при pH 4,75 в присутствии водорастворимых карбодиимидов, например 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)-карбодиимида (EDCI).
Поперечное сшивание этилендиаминовых производных гиалуроновой кислоты (HA-EDA) осуществляли в фосфатном буферном растворе (pH 7-8) с помощью бифункциональных или полифункциональных сшивающих агентов, предпочтительно с помощью глутарового альдегида.
Поперечное сшивание бензоилцистеиновых производных этилендиамин-гиалуроновой кислоты (HA-EDA-BC) осуществляли в фосфатном буферном растворе предпочтительно с pH 7,4 путем окисления на воздухе.
Пример 7. Получение гидрогелей на основе HA-EDA-MA
Водный раствор сополимера HA-EDA-MA (в концентрации 1-20% масса/объем), полученного по Примеру 5, с молярной степенью функционализации 50% моль/моль этилендиаминовыми группами и 50% моль/моль метакриловыми группами, связанными с гиалуроновой кислотой, распределяли по дну чашки Петри, так что получался слой толщиной несколько миллиметров.
Чашки Петри помещали в охлаждаемый контейнер при температуре 12°С и облучали с помощью полимерной лампы мощностью 125 ватт (Italquartz, Milan) с диапазоном излучения 250-370 нм и максимальной интенсивностью при 310 нм. Расстояние между лампой и чашкой Петри составляло около 30 см. Время облучения составляло от 15 до 90 минут. Для каждого значения концентрации полимера определяли время, требующееся для формирования пленки гидрогеля, легко отделяемой от дна чашки.
В приведенной ниже Таблице 2 представлены данные о продолжительности облучения, требующейся для получения пленки гидрогеля при трех различных концентрациях производного гиалуроновой кислоты.
Таблица 2
Концентрация HA-EDA-MA% (масса/объем)
Время образования пленки гидрогеля на основе HA-EDA-MA (мин)
2
60
4
45
8
20
Пример 8. Самостоятельное образование поперечных сшивок в гидразиновом производном гиалуроновой кислоты (HA-Hy)
Соединение HA-Hy, полученное, как описано в Примере 2, со степенью функционализации гидразиновыми группами 50% моль/моль растворяли в дистиллированной воде до концентрации 1% (масса/объем). Доводили pH раствора до 4,75, добавляя несколько капель 0,1 н. HCl. Прибавляли 1-этил-3-(диметиламинопропил-карбодиимид) (EDCI) в количестве, эквимолярном количеству гидразиновых групп, связанных с гиалуроновой кислотой, и поддерживали pH на постоянном уровне с помощью 0,1 н. HCl до тех пор, пока не сформировался гидрогель. Гидрогель выделяли, промывали дистиллированной водой и лиофилизировали.
Весовой выход гидрогеля составил 80% относительно исходного полимера. Полученное твердое вещество характеризовали путем Фурье-спектроскопии (FTIR).
Пример 9. Получение гидрогелей HA-EDA-BC
Гелеобразующий раствор получали, диспергируя нужное количество полимера в фосфатном буферном растворе в модификации Дульбекко при pH 7,4 и затем перемешивали встряхиванием в течение 5 минут до полной солюбилизации. Получали образцы гидрогелей на основе HA-EDA-BC (0,5% масса/объем) путем окисления на воздухе. После того как гель сформировался, образцы промывали дистиллированной водой, замораживали жидким азотом, лиофилизировали и изучали при помощи сканирующего электронного микроскопа. Как показано на Фигурах 5а и 5b, гидрогель HA-EDA-BC обладает волокнистой структурой из связанных между собой волокон диаметром от 500 нм до 1 мкм.
6
2
Пример 10. Определение включения хондроцитов в гель и их жизнеспособности Свежевыделенные хондроциты из суставного хряща человека культивировали в течение двух пассажей на протяжении двух недель в полной среде DMEM. Лиофилизованную HA-EDA-BC стерилизовали с помощью ультрафиолетового излучения (УФ-лампа мощностью 125 ватт) в течение 2 часов. Затем растворяли 150 мг HA-EDA-BC в 9,4 мл DMEM, осторожно перемешивая в течение 10 минут, потом образовавшуюся пену устраняли путем обработки ультразвуком в течение 3 минут. После этого вводили хондроциты: прибавляли 0,6 мл DMEM, содержащие 5×10 клеток, и осторожно встряхивали в течение нескольких минут, чтобы клетки распределились равномерно. Затем 150 мкл гелеобразующей суспензии помещали во вкладыши для 24-луночного планшета (поликарбонатная мембрана; производство фирмы NUNC). Оставляли на 2 часа, затем добавляли 1,1 мл DMEM и инкубировали при 37°С в атмосфере, содержащей 5% CO. Жизнеспособность включенных в гель хондроцитов определяли колориметрически тетразолиевым методом (с MTS) через 2 часа, 3, 7, 14 и 21 день. В каждый из этих моментов времени брали по три вкладыша, содержавших хондроциты, включенные в гидрогель HA-EDA-BC, обрабатывали 100 мл раствора MTS и оставляли для протекания реакции на 4 часа, после чего измеряли поглощение при 550 нм (n=9) в 96-луночном планшете; контролем служил гидрогель HA-EDA-BC без клеток, обработанный так же, как гидрогель с хондроцитами. Цитосовместимость (живые клетки/мертвые клетки) определяли в нагруженном хондроцитами гидрогеле HA-EDA-BC путем двойного окрашивания, используя кальцеин AM и гомодимер этидия-III (EthDIII).
Кальцеин AM представляет собой проникающее в клетки нефлуоресцирующее вещество, которое в клетках расщепляется внутриклеточными эстеразами с образованием флуоресцирующего зеленым цветом соединения. EthDIII дает окрашивание при связывании с ДНК; он не проникает внутрь живых клеток, но может диффундировать через мембрану мертвых клеток и связываться с их ДНК, давая красную флуоресценцию. Через 3 суток культивирования вкладыши, содержавшие гель, промывали трижды PBS (pH 7,4) и затем инкубировали в течение 1 часа с окрашивающими растворами, после чего вновь промывали, чтобы удалить избыток окрашивающих растворов. Гели размещали на покровных стеклах и исследовали с помощью флуоресцентного микроскопа Axioscop 2 (Zeiss) и делали снимки с помощь цифровой камеры Axiocam (Zeiss), подсоединенной к компьютеру.
Как можно видеть на Фигуре 6, величина поглощения при определении с MTS возрастала на протяжении всех 21 суток инкубации, что демонстрировало хороший уровень жизнеспособности и пролиферации клеток, включенных в трехмерную структуру гидрогеля (скаффолд) на основе HA-EDA-BC.
Картина флуоресценции, выявляющая живые и мертвые клетки, через 3 суток культивирования, которая представлена на Фигуре 7, выявила лишь немногочисленные мертвые клетки (на фото выделены рамками) среди живых, что свидетельствует о хорошей биологической совместимости данного способа создания опоры для клеток. На цветном снимке живые клетки зеленые, а мертвые - красные.
Настоящее изобретение здесь описано конкретными воплощениями, но следует иметь в виду, что специалисты в данной области техники могут воплотить очевидные варианты и модификации, что не ограничивает объем изобретения.