Полная последовательность митохондриального генома D. littoralis (Diptera: Drosophilidae): сравнительный анализ митохондриальных геномов в группе дрозофил virilis

УДК 575.13:595.773.4

ПОЛНАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ МИТОХОНДРИАЛЬНОГО ГЕНОМА D. LITTORALIS (DIPTERA: DROSOPHILIDAE): СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ МИТОХОНДРИАЛЬНЫХ ГЕНОМОВ В ГРУППЕ ДРОЗОФИЛ VIRILIS

С.Ю. Сорокина1, Б.В. Андрианов2, В.Г. Митрофанов1

Представлен анализ полной последовательности митохондриального (мт) генома D. lit-toralis. Приведены его основные характеристики, размер, нуклеотидный состав, последовательность генов, а также степень давления стабилизирующего отбора на разные участки генома. Обсуждены особенности структуры белок-кодирующих генов и генов тРНК. Приведена структура некодирующих районов: контрольного района и межгенных спейсеров мтДНК группы virilis. Найдены фрагменты мт-генов atp6 и cox3 в ядерном геноме D. virilis. Эволюционная история митохондриальных и ядерных последовательностей этих генов указывает на то, что процесс образования мт-псевдогенов идет в настоящее время и связан с активностью ретротранспозонов.

Ключевые слова: митохондриальный геном, нуклеотидная последовательность, межгенный спейсер, псевдоген, ретротранспозон Tv1, Drosophila littoralis.

D. littoralis является одним из одиннадцати видов-двойников группы virilis. Данная группа на протяжении многих лет служит объектом исследований в области микроэволюции и видообразования [1]. Вид D. littoralis широко распространен на территории Евразии, где образует генетически гетерогенные природные популяции, структура которых хорошо изучена на основании инверсионного [2] и аллозимного [3] полиморфизмов, а также полиморфизма мтДНК [4].

Результаты и обсуждение

Мт-геном D. littoralis представляет собой кольцевую молекулу размером 16,017 п.о. с суммарным содержанием A + T — 76,2%. Порядок генов такой же, как и у других видов дрозофил [5]. МтДНК содержит 37 генов (13 генов белков внутренней мембраны, 2 гена рРНК и 22 гена тРНК) и один протяженный некодирующий участок (контрольный район). Гены расположены на обеих нитях и не содержат интронов. Межгенные последовательности составляют всего 1,6% мт-генома D. littoralis.

Сравнение мт-геномов D. littoralis и D. virilis (GenBank: BK006340) позволило оценить давление отбора для индивидуальных генов. Мы рассчитали соотношение синонимичных (Ks) и несинониминых (Kn) замен для каждого гена (рис. 1). Значения Kn/Ks для всех 13 белок-кодирующих генов меньше единицы, что указывает на давление стабилизирующего отбора. Наиболее изменчивыми оказались гены nadó, nad3, nad4L, наименее изменчивым — coxl.

Все белок-кодирующие гены, кроме coxl, имеют канонические старт-кодоны ATR (метионин) или АТУ(изолейцин). Открытая рамка считывания гена coxl начинается с неканонического кодона TCG. Было показано, что у других видов дрозофил рамка трансляции также начинается с неканонического кодона (T/C)CG [6]. Шесть генов, nad2, coxl, atp8, atp6, cox3 и nad3, имеют канонические кодоны терминации трансляции ТАА или TAG. У остальных семи генов кодоны терминации неполные: Т или ТА. Гены с неполными стоп-кодонами

Рис. 1. Соотношение несинонимичных и синонимичных замен (Кп/Кя) для 13 белок-кодирующих генов при сравнении мт-ге-номов Б. ¡ШогаШ и Б.

I Cvi

D. virilix uípú

Cvi иишарб

1«

Рис. 2. ПЦР-идентификация мт псевдогена, ассоциированного с ретротранспозо-ном Т\1. А — арб/Ту1, размер ожидаемого фрагмента — 900 п.о.; Б — сохЗ/Ту1, размер ожидаемого фрагмента — 950 п.о. 1,2— С Б. ¡ШогаШ; 3, 4 — ¥ Б. ¡ШогаШ; 5, 6 — С Б. утШ; 7, 8 — ¥ Б. утИэ

у D. littoralis, как правило, непосредственно граничат с генами тРНК. Полный стоп-кодон, напротив, найден в генах, которые граничат с некодирующим спейсером.

По первичной последовательности, вторичной структуре и антикодонам все 22 мт-гена тРНК D. littoralis соответствуют генам тРНК других дрозофил [6]. Все тРНК имеют д типичную структуру клеверного листа за исключением tPHK&,'(Ó4C¡W)-Эта тРНК имеет простую DHU-пет-лю без стебля. Необычная структура не влияет на функцию молекулы, так как кодон AGN, узнаваемый данной тРНК, широко используется в мито-хондриальном геноме D. littoralis.

Контрольный район (КР) — единственный протяженный некодирую-щий район мт-генома дрозофилы. Данный район насыщен А/T нуклео-тидами (A+T-район) и содержит точки начала репликации и промоторы для обеих нитей мт-генома. КР локализован между геном 12S рРНК и геном тРНК11е D. littoralis и имеет длину 1023 п.о. В составе КР выявляется две поли-Т последовательности: одна вблизи гена тРНКIle, другая на противоположной нити в центральной части КР. Экспериментально показано, что эти поли-Т блоки расположены непосредственно в точках начала репликации обеих нитей мт-генома у четырех видов дрозофил (D. yakuba, D. obscura, D. albomi-cans и D. virilis) [7]. В центральной части КР между поли-Т блоками идентифицирована высоко консервативная последовательность длиной 275 п.о., известная как HCSE [7].

При сравнении ИС8Б Б. 1ШогаШ и Б. у1тШ$ величина ^-дистанции равна 0,05 ± 0,01, что в 3 раза меньше, чем величина ^-дистанции, рассчитанная для всего КР в целом. В области КР, примыкающей к гену 128рРНК, вышвлена последовательность из четырех О-нуклеотидов (О-ост-ров), которая может являться частью сигнальной последовательности для терминации синтеза минорной нити мтДНК [7].

На долю межгенных спейсеров приходится всего 20% некодирующей мтДНК Б. 1ШогаШ (250 п.о.). Самый протяженный спейсер в мтДНК Б. 1ШогаШ обнаружен между генами а1рб и сохЗ и имеет длину 45 п.о. Наличие данного спейсера является характерной особенностью мтДНК дрозофил группы у1тШ$. Мы определили нуклеотидную последовательность этого спейсера и прилежащих фрагментов а1рб и сохЗ у 9 видов дрозофил группы у1тШ$. Размер спейсера в группе у1тШ$ зависит от числа повторов (ТА)п и ко-

I

Ía.americmia atpó В

Da.lexurta atpó Б

D.novamt'xicana atpó gjj

_¿>. virilis NUMTaft^

100

59

_D.kanekoi atpó

DJirturulis atpó O. esoatM atpó O. ¡no nía na atpó

^DJacicola atpó

D.yakuha atpó D, mclatjogmier atpó

Phyíade vírilis

Phylade americana

Phyíade montana

74 100

ir— D.navi П D.a.iexa, I_ D.ít.am*

D. novamcxtcana сахЗ ttexana coxS americana caxS D.virílis сохЗ

Cvi Ni MT сохЗ

• D. kanekoiсихЗ _D.czaana cvx3

. D.tacicoia сахЗ

Phyladeamericana

Phylade virilis

Phylade montana

i00' D montana сохЗ

- D.tirtaralis сохЗ

_ D.melanogwster сохЗ

Dyakithíi сахЗ

Рис. 3. Эволюционные взаимоотношения в группе \1тйЬ, основанные на последовательностях мт-генов. Дендрограмма построена методом минимальной эволюции в МЕОА4.1.; А — фрагмент мт-гена а1рб длиной 261 п.о., соответствующий позициям 4478—4738 мт-генома Б. (0епеБапк:БК006340) и мт-псевдоген (МиМТ) а1рб; Б — фрагмент мт-гена сохЗ длиной 301 п.о., соответствующий позициям 4791—5091 мт-генома Б. утИэ (0епеБапк:БК006340) и мт-псевдоген (ЫиМТ) сохЗ;

Су1 — пересеваемая клеточная линия 79f7Dv3g Б.

леблется между 29 п.о. (Б. капгког) и 75 п.о. (Б. 1ас1-со1а). Экспансия (ТА)п, характерная для дрозофил группы уш/к, позволяет рассматривать межгенный спейсер а1рб/сох3 как горячую точку изменчивости мт-геномов дрозофил этой группы.

Ранее нами было показано, что 8-нуклеотидная последовательность 5'-АТАТАТАТ-3' фланкирует хромосомные копии специфичного для группы утШ ретротранспозона Ту1 [8]. Следовательно, район повторов (ТА)п между генами а1рб и сохЗ может служить сайтом интеграции Ту1. Мы предположили, что если возможны транспозиции Ту1 между ядерным и мт геномами, то есть вероятность обнаружить фрагменты мтДНК, прилегающие к сайту интеграции Ту1, в ядерном геноме. Для проверки этой гипотезы мы разработали две пары праймеров для ожидаемой последовательности мт-фрагмента, содержащего гены а1рб/сох3 с инсерциями Ту1. Положительные результаты получены только на ДНК самцов Б. ут11$ (рис. 2). Клонирование полученных ПЦР-фрагментов в р1вшТ (Рготе§а) и секвенирова-ние отдельных клонов подтвердило их химерную

(ту1-мтДНК) природу. Полученные фрагменты мт-ге-нов не имеют рамки считывания. Этот результат позволяет картировать мт-псевдоген а1рб/сох3 на У-хро-мосоме Б. утШ.

Мы провели филогенетический анализ фрагментов генов а1рб (261 п.о.) и сохЗ (301 п.о.) у дрозофил группы утШ, включая последовательности мт-псевдогенов (рис. 3). Дендрограммы, построенные с помощью модели минимальной эволюции, хорошо согласуются с известной филогенией дрозофил группы ут11$ [1]. Последовательности псевдогенов Б. утШ кластеризуются с предковыми мт-последо-вательностями Б. утШ, что указывает на их недавнее происхождение.

* * *

Работа поддержана Российским фондом фундаментальных исследований (грант № 08-04-00958-а) и государственной программой "Генофонды и генетическое разнообразие".

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Throckmorton L.H. The virilis species group // The genetics and biology of Drosophila / Eds. M. Ashburner, H.L.Carson, J.N. Thompson. London: Academic Press, 1982. 3b. P. 227-296.

2. Митрофанов В.Г., Полуэктова E.B. Инверсионный полиморфизм в природной популяции Drosophila imere-tensis Sokolov (D. littoralis Meig.) // Генетика. 1982. Т. 18. № 11. C. 1849-1855.

3. Гончаренко Г.Г., Митрофанов В.Г., Корочкин Л.И. Изучение генотипической структуры Drosophila imeretensis Sokolov (D. littoralis Meigen) в географически разделенных популяциях Краснодарского края и Белоруссии // Докл. АН СССР. 1984. Т. 279. № 1. C. 216-219.

4. Андрианов Б.В., Сорокина С.Ю., Мюге Н.С., Резник Н.Л., Митрофанов В.Г. Популяционная динамика митохондриального полиморфизма в природной популя-

ции Drosophila littoralis // Генетика. 2008. Т. 44. № 2. С. 195-201.

5. Clary D.O., Wolstenholme D.R. The mitochondrial DNA molecule of Drosophila yakuba: Nucleotide sequence, gene organization, and genetic code // J. Mol. Evol. 1985. Vol. 22. N 3. P. 252-271.

6. Montooth K., Abt D., Hofmann J., Rand D. Comparative genomics of Drosophila mtDNA: Novel features of conservation and change across functional domains and lineages // J. Mol Evol. 2009. Vol. 69. N 1. P. 94-114.

7. Saito S., Tamura K., Aotsuka T. Replication origin of mitochondrial DNA in insects // Genetics. 2005. Vol. 171. N 4. P. 1695-1705.

8. Andrianov B.V., Zakharyev V.M., Reznik N.L., Gorelo-va T.V., Evgen'ev M.B. Gypsy group retrotransposon Tvl from Drosophila virilis // Gene. 1999. Vol. 239. N 1. P. 193-199.

Поступила в редакцию 25.04.10

COMPLETE MITOCHONDRIAL GENOME SEQUENCE

OF D. LITTORALIS (DIPTERA: DROSOPHILIDAE): COMPARATIVE ANALYSIS

OF THE MITOCHONDRIAL GENOMES IN DROSOPHILA VIRILIS SPECIES GROUP

S.Yu. Sorokina, B.V. Andrianov, V.G. Mitrofanov

An analysis of the complete sequence of D. littoralis mitochondrial genome (mt-genome) is presented. The basic characters of the mt-genome, such as size, nucleotide composition, genes order, as well as a degree of purifying selection pressure on different parts of the mt-genome are reported. The features of protein-coding genes and tRNA genes are discussed. The structure of mtDNA control region and intergenic spacers in the virilis group are presented. The fragments of mitochondrial genes atp6 and cox3 were found in the nuclear genome of D. virilis. The evolution history of mitochondrial and nuclear genes data indicates that mitochondrial gene transfer to the nucleus is a recent event and connected to the activity of retrotransposons.

Key words: mitochondrial genome, nucleotide sequence intergenic spacer, Tv1 retrotransposone, Drosophila littoralis.

Сведения об авторах

Сорокина Светлана Юрьевна — канд. биол. наук, мл. науч. сотр. лаборатории генетики Института биологии развития имени Н.К. Кольцова РАН. Тел. 7(499)135-87-81; e-mail: svet-lana_ibr@mail.ru

Андрианов Борис Витальевич — канд. биол. наук, ст. науч. сотр. лаборатории сравнительной генетики животных Института общей генетики имени Н.И. Вавилова РАН. Тел. 7(499)135-11-30; e-mail: andrianovb@mail.ru

Митрофанов Владимир Григорьевич — докт. биол. наук, проф., зав. лабораторией генетики Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН. Тел. 7(499)135-87-81.