Структурные проявления реакций гуморального иммунитета в селезенке при экспериментальном стафилококковом перитоните

© ПИМЕНОВА Ю. АЗАХАРОВА Л. НАГЕЕВА Т. АЕВСТРОПОВ А.Н. УДК 616.94-022.7:579.353-091.8

СТРУКТУРНЫЕ ПРОЯВЛЕНИЯ РЕАКЦИЙ ГУМОРАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА В СЕЛЕЗЕНКЕ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ СТАФИЛОКОККОВОМ ПЕРИТОНИТЕ

Ю.А. Пименова, Л.Н. Захарова, Т.А. Агеева, А.Н. Евстропов Новосибирский государственный медицинский университет, ректор - д.м.н., проф. И.О. Маринкин; кафедра микробиологии, вирусологии и иммунологии,

зав. - д.м.н. проф. А.Н. Евстропов; кафедра патологической анатомии, зав. -

акад. РАМН В. А. Шкурупий.

Резюме. Изучена структурно-функциональная реакция селезенки крыс Вистар при экспериментальном стафилококковом перитоните. По результатам бактериологического исследования гомогенатов селезенки животные были разделены на 2 подгруппы - с низким содержанием микроба в органе и длительной его персистенцией в этом органе и, соответственно, с высоким содержанием микроба и быстрой его элиминацией. По сравнению с крысами с низким содержанием стафилококка, в подгруппе крыс с высоким содержанием микроба структурные преобразования в селезенке, отражающие активацию иммунитета по гуморальному типу, были более выражены, что в последующем позволило быстрее элиминировать микроб из селезенки и перитонеальной жидкости.

Ключевые слова: перитонит, стафилококк, селезенка.

Пименова Юлия Александровна - ассистент каф. микробиологии, вирусологии и иммунологии НГМУ; e-mail: medic. 81 @mail. ru.

Захарова Людмила Николаевна - к.м.н., доц. каф. микробиологии, вирусологии и иммунологии НГМУ; e-mail: nisngma@ngs.ru.

Агеева Татьяна Августова - д.м.н., проф. каф. патологической анатомии НГМУ; e-mail: ageta@mail.ru.

Перитонит, возникающий, в основном, как осложнение деструктивных процессов органов брюшной полости или результат их повреждения, является одним из самых тяжелых заболеваний в хирургической практике, оставаясь частой причиной смерти больных с острыми хирургическими заболеваниями органов брюшной полости [4, 5]. Перитониты, независимо от причины их вызвавшей, в подавляющем большинстве случаев представляют собой типичное бактериальное воспаление. Наиболее частыми возбудителями гнойных перитонитов являются кишечная палочка (65%) и патогенные кокки (30%). Золотистый стафилококк, будучи хорошо изученным микроорганизмом, продолжает привлекать внимание, поскольку является доминирующим возбудителем в развитии госпитальной инфекции и инициатором инфекционновоспалительных процессов любой локализации. Весомый вклад в иммунную защиту от чужеродных агентов вносит селезенка, являясь крупнейшим лимфоидным органом в организме человека [3, 4]. При общеизвестной роли лимфоидных органов в развитии иммунного ответа отсутствуют полные сведения о структурно-функциональных преобразованиях в селезенке, обеспечивающих защитную реакцию в условиях инфицирования брюшной полости. Соответственно изучение морфофункциональных характеристик селезенки при экспериментальном перитоните позволит более детально охарактеризовать механизмы, приводящие к элиминации или накоплению инфекционного агента в брюшной полости [2].

Исходя из вышеизложенного, целью настоящего исследования явилось изучение динамики элиминации S.aureus и структурных преобразований в селезенке при экспериментальном перитоните.

Материалы и методы

Экспериментальное исследование выполнено на 160 самцах крыс породы Вистар весом 180-200г. Все манипуляции с лабораторными животными

проводили в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (Страсбург, 1986).

Экспериментальным животным опытной группы (n=150) внутрибрюшинно под эфирным наркозом вводили 1109 микробных клеток суточной культуры

S.aureus в объеме 1 мл. Животным контрольной группы (n=10) внутрибрюшинно вводили 1 мл стерильного физиологического раствора. Бактериологическое исследование материала проводили по стандартной методике, описанной нами ранее [2]. Для гистологического исследования селезенку фиксировали в 10 % растворе нейтрального формалина, готовили гистологические препараты по стандартной методике, окрашивали гематоксилином и эозином. Изучение структурной организации ткани селезенки проводили при увеличении светового микроскопа Axioplan-2 (Zeiss) до 400 раз. При увеличении в 100 раз определяли численную плотность (Nv) фолликулов со светлыми центрами и без них [1]. При увеличении в 200 раз измеряли площадь селезенки (Sv). Статистическую обработку числовых данных проводили на компьютере с использованием пакета прикладных программ Excel. Достоверность различий сравниваемых средних величин определяли с использованием t-критерия Стьюдента (достоверность различий между средними величинами признаков выявляли для уровней значимости р<0,05).

Результаты и обсуждение Проведенное бактериологическое исследование перитонеальной жидкости и гомогенатов ткани селезенки показало, что реакция животных опытной группы на введенный микроб существенно различалась, в связи с чем для дальнейшего анализа животных разделили на две подгруппы (табл. 1). Характерным для животных первой подгруппы (n=50) было длительное нахождение тест-микроба в организме, животные второй подгруппы (n=100) отличались, соответственно, быстрой элиминацией микроба. При этом концентрация S.aureus в перитонеальной жидкости и в селезенке отличалась в двух подгруппах наблюдения (табл. 1).

Так, у животных 1 подгруппы из перитонеальной жидкости в течение первых 12 часов высевалось не сосчитываемое количество микроба (сплошной рост), тогда как в перитонеальной жидкости животных 2 подгруппы S.aureus на этом же сроке содержалось 8125±608 КОЕ/г. Окончательное освобождение перитонеальной жидкости от инфекта в обеих подгруппах происходило в разные сроки: у животных 2 подгруппы - к 9 суткам, у животных 1 подгруппы -к 14 суткам эксперимента (табл. 1).

В селезенке животных 1 подгруппы через 3 часа после заражения стафилококк содержался в концентрации 7500±632 КОЕ/г (табл. 1).

Морфометрическое исследование селезенки этих животных выявило достоверное увеличение площади органа в 1,7 раза (147,0±15,6 мкм2) по сравнению с контролем (86,6±8,29 мкм2), увеличение общего числа лимфоидных фолликулов более чем в 2 раза - до 16,4±1,5 (в контроле 8,1±0,7), из которых фолликулы без реактивных центров составили более половины -8,8±1,68, фолликулы с реактивными центрами - 7,6±1,6 (табл. 2). Такая структурная перестройка селезенки свидетельствует о развитии индуктивной фазы гуморального иммунного ответа, заключающейся в активации процессов пролиферации и дифференцировки В-лимфоцитов.

Далее на протяжении 1 суток высеваемость стафилококка уменьшалась и через 24 часа составила 190±37 КОЕ/г. В этот период инфекционного процесса в селезенке сохранялась описанная картина морфологических преобразований органа. Так, общая площадь селезенки через 6 часов возросла до 167,1±10,36 мкм2, через 12 часов - 168,4±9,17 мкм2, через 24 часа - 173,3±10,0 мкм2, общее число лимфоидных фолликулов через 6 часов составило 13,8±1,45, через 12 часов — 14,4±2,42, через 24 часа — 17,0±2,85, из них количество фолликулов без реактивных центров через 6 часов было максимальным и составило 9,3±1,47, через 12 часов — 8,0±1,38, через 24 часа было минимальным (7,0±1,23) (табл. 2). Параллельно нарастала доля лимфоидных фолликулов с реактивными центрами: через 6 часов данный показатель составил 4,5±0,43, через 12 часов - 6,4±1,66, через 24 часа количество этих фолликулов стало

максимальным - 10,0±1,78 (табл. 2).

Через 2 суток эксперимента изменения морфометрических показателей структурных элементов селезенки животных 1 подгруппы стали более выраженными: увеличились площадь среза органа до 189,6±22,01 мкм2 и общее число лимфоидных фолликулов до 21,7±1,67, что превышает аналогичные показатели контрольной группы более, чем в 2 раза. Параллельно продолжало снижаться содержание микроба. Начиная с 3 суток, по мере элиминации патогена постепенно уменьшалась площадь селезенки и на 9 сутки составила 126,4±11,48 мкм2, оставаясь при этом больше, чем у контрольных животных. Общее количество лимфоидных фолликулов, фолликулов с реактивными центрами и без них до конца наблюдения оставалось высоким, в 2-3 раза превышая контрольные значения.

У животных 2 подгруппы содержание стафилококка в селезенке через 3 часа после введения микроба было значительно большим, чем в 1 подгруппе и составило 12930±103 КОЕ/г (табл. 1). Более выраженные черты имели и морфологические изменения органа, свидетельствующие о развитии иммунологической реакции. Так, площадь среза селезенки в сравнении с 1 подгруппой была больше и составила 174,9±15,31 мкм2 (табл. 3), общее число лимфоидных фолликулов возросло до 22,7±1,2, что больше в 2,8 раза, чем в группе контроля и в 1,3 раза больше соответствующего показателя 1 подгруппы. Численная плотность лимфоидных фолликулов с реактивными центрами в селезенке животных 2 подгруппы составила 9,0±1,0, что в 3 раза больше аналогичного показателя контрольной группы.

Через 6 часов количество стафилококка в селезенке животных 2 подгруппы, относительно предыдущего срока эксперимента, уменьшилось существенно - в 73,8 раза - что, вероятно, является результатом выраженной фагоцитарной функции макрофагов (табл. 1). Численная плотность лимфоидных фолликулов с реактивными центрами возросла до 11,2±0,49 (табл. 3), достоверно отличаясь от этого показателя в 1 подгруппе, что является отражением активно развивающегося гуморального иммунного ответа.

Через 12 часов в селезенке животных 2 подгруппы количество стафилококка продолжало снижаться (табл. 1), площадь среза селезенки уменьшилась (табл. 3), численная плотность лимфоидных фолликулов со светлыми центрами и без них существенно не отличалась от предыдущего срока наблюдения.

Через 1 сутки после инфицирования в селезенке животных 2 подгруппы микроб уже не обнаруживался, в то время как у животных 1 подгруппы инфекционный агент в этот период еще сохранялся в достаточно большом количестве (табл. 1). Начиная со 2 суток наблюдения, морфологическая картина селезенки животных 2 подгруппы характеризовалась структурными проявлениями, указывающими на угасание иммунной реакции (табл. 3): к 7 суткам площадь среза селезенки уменьшилась до 86,5±16,08 мкм2, уменьшилась также численная плотность лимфоидных фолликулов со светлыми центрами и без них.

Анализируя проведенное исследование, можно сделать следующие выводы:

1) при воздействии бактериального агента (стафилококка) в селезенке экспериментальных животных выявлена разная степень выраженности активации иммунного ответа по гуморальному типу и, соответственно, различная динамика элиминации микроба из селезенки и перитонеальной жидкости. Выявленные различия могут определяться феногенотипическими особенностями реакций животных на воздействие инфекционного агента, что приводит к разной степени выраженности системных и морфологических изменений различных органов. Механизмы индукции различного иммунного ответа на компоненты бактерий могут заключаться в SNP полиморфизме генов TLR [4, 5, 6];

2) вне зависимости от скорости элиминации из перитонеальной жидкости и селезенки S. aureus вызывает активацию иммунной системы, которая в обеих экспериментальных подгруппах характеризуется увеличением площади среза селезенки, гиперплазией белой пульпы органа за счет увеличения числа и размеров лимфоидных фолликулов как со светлыми центрами, так и без них;

3) у животных 2 подгруппы стафилококк накапливался в селезенке быстрее и

через 3 часа его было больше в 2 раза (12930±103 КОЕ/г), чем в селезенке животных 1 подгруппы (7500±632 КОЕ/г). Возможно, по причине более высокой первичной концентрации микроба в органе (что определяется феногенотипическими особенностями) и возникает в дальнейшем разница в динамике иммунных реакций и структурных преобразований в селезенке у животных сравниваемых подгрупп [4, 8, 9];

4) санация перитонеальной жидкости от стафилококка в обеих подгруппах животных происходит после полной элиминации микроба из лимфоидного органа. При этом у животных 2 подгруппы этот процесс более динамичен в сравнении с животными 1 подгруппы, несмотря на значительно более высокую первичную концентрация S. aureus в селезенке. Данное обстоятельство может быть связано с более интенсивными, морфологически подтвержденными, реакциями бласттрансформации лимфоидных фолликулов и, соответственно, интенсивной гуморальной иммунной реакцией у животных 2 подгруппы [5, 7].

STRUCTURAL CHANGES OF HUMORAL IMMUNITY REACTION IN SPLEEN DURING EXPERIMENTAL STAPHYLOCOCCUS PERITONITIS

Y.A. Pimenova, L.N. Zaharova, T.A. Ageeva, A.N. Evstropov Novosibirsk State Medical University Abstract. The paper presents study of structural and functional reaction of rats’ Wistar spleen during experimental staphylococcus peritonitis. After bacteriological examination we formed two groups with low bacteria level and long persistence in the spleen; and with high bacterial level and fast elimination from the organ. Structural reorganization that reflects activation of humoral immunity was more expressed in the group with high microbe content compare to rats with low staphylococcus. These changes help later to eliminate microbes from the spleen and peritoneal fluid.

Key words: peritonitis, staphylococcus, spleen.

Литература

1. Автандилов Г. Г. Морфометрия в патологии. - М., 1973. - 248с.

2. Захарова Л. Н., Балтабаева А.К., Пименова Ю.А. и др. Экспериментальная стафилококковая инфекция: микробиологические и иммуноморфологические аспекты //Сибирское медиц. обозрение. - 2010. - № 4. - C. 46-49.

3. Прасолова Л.А., Оськина И.Н., Шихевич С.Г. Морфофункциональные характеристики селезенки у крыс разного поведения после воздействия рестрикционного стресса // Морфология. - 2004. - Т. 125, №1. - С. 59-63.

4. Макарова О.В., Яблонская А. М., Михайлова Л. П. и др. Индивидуальные различия реакций органов - мишеней и иммунной системы при экспериментальном тиреотоксикозе // Архив патологии - 2009. - Т. 71,№ 4. - С. 37-43.

5. Симонян К.С. Перитонит. - М.: Медицина, 1971. - 296с.

6. Симбирцев А. С., Громова А. Ю. Функциональный полиморфизм генов регуляторных молекул воспаления // Цитокины и воспаление. - 2005. - Т. 4, № 1. - С. 3 - 10.

7. Федоров В.Д., Гостищев В.К., Ермолов А.С. Современные представления о классификации перитонита и системах оценки тяжести состояния больных // Хирургия. - 2000. - № 4. - С. 58-62.

8. Bartolomucci A., Sacerdote P., Panerai A.E. et al. Chronic psychosocial stress-induced down-regulation of immunity depends upon individual factors // J. Neuroimmunol. - 2003. - Vol. 141, № 1- 2. - P. 58-64.

9. O Brien G. C., Wang J. H., Redmond H. P. Bacterial lipoprotein induces resistance to Gram-negativi sepsis in TLR4-deficient mice via enhanced bacterial clearance // J. Immunol. - 2005. - Vol. 174, № 2. - P. 1020-1026.