Влияние высокого гидростатического давления на жизнеспособность и уровень мутагенеза Salmonella typhimurium

генетическая токсикология

© Н. С. Карамова, П. В. Зеленихин, В. Д. Киселев, А. А. Липатникова, О. Н. Ильинская

ФГАОУ ВО «Казанский (Приволжский) федеральный университет», Казань

В настоящей работе было исследовано влияние высокого гидростатического давления (ВГД) на выживаемость и уровень мутагенеза Salmonella typhimurium. Установлено, что значительное снижение выживаемости бактерий происходит при воздействии ВГД 200 МПа и выше. При этом показатель жизнеспособности бактерий по числу колониеобразующих единиц (КОЕ) был до шести порядков ниже такового по данным цитофлуо-риметрического анализа. Вероятно, этот факт связан с переходом части популяции бактерий в не-культивируемое, но жизнеспособное состояние (НС). ВГД 50 МПа вызывало увеличение числа колоний ^+-ревертантов в 1,9 раза у штамма S. typhimurium ТА98, что свидетельствует о возможности индукции генных мутаций в данных условиях. Обсуждаются механизмы снижения жизнеспособности и генетических изменений в клетках бактерий в условиях ВГД.

C Ключевые слова: высокое гидростатическое давление; жизнеспособность; некультивируемое состояние; мутагенез; мутации; Salmonella typhimurium; проточная цитометрия; тест Эймса.

Поступила в редакцию 15.04.2015 Принята к публикации 07.12.2015

УДК 579.253.4, 579.24, 57.022

влияние высокого гидростатического давления на жизнеспособность и уровень мутагенеза salmonella typhimurium

ВВЕДЕНИЕ

Микроорганизмы являются самыми древними обитателями Земли, которые в процессе длительной эволюции адаптировались к жизни на различных субстратах в постоянно изменяющихся условиях внешней среды (Wächtershäuser, 2006; Zeng et al., 2009). Основными физико-химическими факторами, оказывающими определяющее влияние на жизнь микроорганизмов, являются рН, температура, гидростатическое давление, электромагнитные излучения.

Гидростатическое давление — один из ключевых физических параметров биосферы, величина которого может варьировать от 0,1 МПа на уровне моря (атмосферное давление) до 110 МПа в бездне Челленджера — самой глубинной точке океана, расположенной на 11 км ниже уровня моря в Марианской впадине (Aertsen et al., 2009; Mota et al., 2013).

Многие микроорганизмы хорошо растут и размножаются в условиях обычного атмосферного давления, прекращая рост при воздействии гидростатического давления выше 50 МПа (Mota et al., 2013). В то же время для микроорганизмов-пьезофилов, обитающих в глубинной биосфере (глубины Мирового океана, подводные гидротермальные источники, нефтяные скважины), оптимальным для роста является гидростатическое давление 40-60 МПа (Jannasch, Taylor, 1984; Meersman, McMillan, 2014; Oger, Jebbar, 2010). Активный рост облигатных пьезофилов, например Moritella yayanosii, происходит при давлении 80 МШ.

Начиная с 1990-х г. ВГД в пределах 200-800 МПа используется для консервирования пищевых продуктов. Считается, что такой способ обработки позволяет не только уничтожать патогенные микроорганизмы, но и, в отличие от температурной обработки, лучше сохранять вкусовые и питательные свойства продуктов (High-pressure microbiology, 2008; Aersten et al., 2009). Вместе с тем показано, что разные виды микроорганизмов и даже разные штаммы одного вида могут отличаться по чувствительности к действию ВГД (Alpas et al., 1999). Более того, в нескольких работах были представлены данные о выделении пьезорезистентных мутантов мезофильных бактерий: Escherichia coli (Hauben et al., 1997; Gao et al., 2001) и Listeria monocytogenes (Karatzas and Bennik, 2002), сохраняющих жизнеспособность при летальных для мезофильных микроорганизмов значениях давления (до 800 МПа). Согласно данным Ванлинт с соавторами (Vanlint et al., 2011), выделенные ими пьезорезистентные мутанты Escherichia coli сохраняют жизнеспособность даже при давлении 1,2-2 ГПа. В работе Хаубен с соавторами (Hauben et al., 1997) баротолерантные штаммы E. coli были изолированы после многократного воздействия ВГД. Согласно мнению авторов, пьезорезистентные клетки E. coli не присутствовали изначально в популяции данных бактерий, а высокий уровень баротолерантности у выделенных штаммов является результатом накопления множественных мутаций (Hauben et al., 1997). В некоторых случаях пьезорезистентные штаммы мезофильных микроорганизмов

проявляют новые уникальные свойства, связанные с изменением метаболизма, что открывает возможности их использования в различных процессах, связанных с применением высокого давления, а также для микробного биосинтеза новых продуктов, в том числе для нужд фармакологии и биомедицины (Aertsen et al., 2009; Mota et al., 2013).

Вместе с тем следует подчеркнуть, что до настоящего времени остаются малоизученными генетические изменения, происходящие в клетках при действии ВГД. Детальное исследование возможных генетических эффектов и генетического контроля адаптивных реакций в условиях ВГД актуально не только в связи с перспективностью применения ВГД в производстве (для консервирования пищевых продуктов и в микробной биотехнологии), но и для понимания последствий такого воздействия на биологические системы в целом и механизмов адаптации, обеспечивающих выживание и рост в экстремальных условиях.

Целью настоящей работы явилась оценка влияния высокого гидростатического давления на жизнеспособность бактерий Salmonella typhimurium и возможности индукции генных мутаций в клетках бактерий в условиях ВГД.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Бактериальные штаммы и условия культивирования

В работе использованы штаммы S. typhimurium ТА100 и ТА98, полученные из коллекции микроорганизмов кафедры генетики МГУ. Генотипы штаммов представлены в таблице 1.

18-часовую культуру каждого бактериального штамма в среде LB разбавляли свежим бульоном LB и подращивали 2,5 ч при 37 °С до достижения экспоненциальной фазы роста (1—2 * 109 кл/мл). Клетки осаждали центрифугированием. Осадок дважды отмывали и ресус-пендировали в 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,0). Суспензию клеток переливали в стерильные тефлоновые цилиндры и подвергали действию ВГД.

обработка бактерий ВгД

Эксперименты проводили при комнатной температуре (23—24 °С). Суспензию микроорганизмов в тефлоно-вом цилиндре (диаметр 14 мм, высота 20 мм) закрывали тефлоновой крышкой и помещали в стальной цилиндр (внешний диаметр 80 мм, внутренний диаметр 14,14 мм).

Таблица 1

Генотипы тестерных штаммов Salmonella typhimurium

Штамм Генотип

ТА98 hisD3052, rfa, AuvrB, bio-, pKm 101

ТА100 hisG46, rfa, AuvrB, bio-, pKm 101

Высокое давление создавали методом мультипликации 50 : 1 в баростате, используя метод «пистон-цилиндр» при диаметре большого цилиндра 100 мм, малого пистона — 14,14 мм (High-pressure techniques in chemistry and physics, 1997). Усиление давления определяется отношением площадей этих цилиндров: Р (низ) х (100 х 100)/(14,14 х 14,14) = 50 х Р (низ). Низкое давление в первом цилиндре создавали гидравлическим насосом плунжерного типа (до 20 МПа). Высокое давление в тефлоновом цилиндре рассчитывали из соотношения: Р (выс) = Р (низ) х 50. То есть для 800 МПа создавали давление в первой камере, равное 16 МПа. После выбранного интервала времени эксперимента, давление сбрасывали и тефлоновый цилиндр извлекали из баростата. Суспензию клеток бактерий подвергали действию ВГД 50, 100, 200, 300, 500, 800 МПа в течение 15 минут.

оценка жизнеспособности бактерий по числу

кое

Суспензию клеток S. typhimurium ТА100 соответствующего разведения (100 мкл) после воздействия высокого гидростатического давления высевали на поверхность чашек Петри с LB-агаром, чашки инкубировали при 37 °С в течение 24 ч. В контрольном варианте высевали суспензию бактерий, не подвергавшихся действию высокого давления. После 24 ч инкубации подсчитывали число колоний бактерий (колониеобразующих единиц — КОЕ), выросших в чашках Петри с LB-агаром. Жизнеспособность бактерий оценивали по критерию «выживаемость»:

Число KOE после

воздействия давления

Выживаемость (%) =---г;^-• 100.

Число KOE

в контроле

цитофлуориметрический анализ жизнеспособности бактерий

Долю жизнеспособных клеток в популяции микроорганизмов непосредственно после воздействия высокого давления и в контрольном варианте (суспензия клеток, не подвергавшихся воздействию ВГД) определяли с помощью окраски флуоресцентным красителем йодидом пропидия (PI). PI не способен проникать в клетку, если цитоплазматическая мембрана сохраняет свою целостность. У мертвых клеток из-за нарушения целостности мембраны PI проникает в цитозоль и связывается с ДНК. В результате интенсивность флуоресценции возрастает в 20—30 раз. Эта особенность позволяет с помощью PI цитометрически различать живые и мертвые клетки микроорганизмов.

К суспензии клеток микроорганизмов добавляли PI в конечной концентрации 10 мкг/мл, выдерживали в темноте при 37 °С 2 мин. Далее осуществляли анализ проницаемости мембран клеток на проточном цитофлу-

генетическая токсикология

101

ориметре BD FACSCanto II (Becton Dickinson, США). Оценку количества живых и мертвых клеток в образцах проводили по гистограмме (флуоресценция PI против числа событий).

Полуколичественный метод учета генных мутаций

Для оценки влияния ВГД на уровень мутагенеза бактерий использовали тестерные штаммы S. typhimurium ТА100 и ТА98. Эксперименты проводили согласно методу Эймса (Mortelmans, Zeiger, 2000) в варианте без метаболической активации S9 фракцией печени животных. Тестерные штаммы являются ауксотрофами по гистидину за счет точечной мутации в гистидиновом опероне. При действии мутагенных факторов тестерные штаммы ревертируют к прототрофности путем замены пар оснований (штамм ТА100) или сдвига рамки считывания (штамм тА98). Суспензии тестерных бактерий (2 х 109 кл/мл) подвергали действию разных доз ВГД. Негативный контроль представлял собой суспензию тес-терных бактерий, не подвергавшихся действию высокого давления. В качестве положительного контроля в экспериментах использовали известные мутагены: азид натрия (2 мкг/чашку) для тестерного штамма ТА100 и 2-нитро-флуорен (2 мкг/чашку) для штамма ТА98.

Статистическая обработка результатов

Статистическую обработку данных проводили с помощью статистического пакета программ приложения Microsoft Excel 2003. Рассчитывали среднее арифметическое группы данных и стандартное отклонение. Анализ соответствия нормальности распределения группы данных проводили при помощи критерия Шапиро—Уилка.

Расчет достоверности различий между группами данных проводили с помощью ^критерия Стьюдента. Анализ цитометрических данных приведен для 100 000 событий. Приведенные в работе данные об оценке КОЕ и мутагенности представляют собой среднее арифметическое значение трех независимых экспериментов (три повтор-ности на каждый образец в эксперименте) ± а (среднеквадратичное отклонение). Различие между группами данных считали достоверными при р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние ВгД на жизнеспособность Б. typhimu-

гшт ТА100

Результаты оценки жизнеспособности клеток 5. ty-phimurium ТА100 по числу КОЕ представлены в таблице 2. Процент выживаемости клеток уменьшался обратно пропорционально возрастанию давления. При воздействии давления 50 МПа, 100 МПа значительного угнетения способности бактерий к колониеобразованию не наблюдали (выживаемость составила 92 и 89 % соответственно). Начиная с давления 200 МПа число КОЕ заметно снижалось. После воздействия на бактерии давления 800 МПа в течение 15 мин на питательной среде не обнаружено ни одной колонии. Таким образом, такое давление полностью подавляло способность бактерий к образованию колоний.

Оценка жизнеспособности 5. typhimurium ТА100 методом проточной цитометрии также свидетельствует об угнетающем действии повышенного давления на жизнедеятельность данных бактерий (рис. 1).

Известно, что в соответствии с принципом Ле-Ша-телье повышение давления приводит к уменьшению объема биологической системы, что в свою очередь вы-

Таблица 2

Выживаемость клеток Salmonella typhimurium ТА100 при действии высокого гидростатического давления

Образцы Число КОЕ/чашка# Выживаемость, %

Контроль (110,4 ± 9,2) х 107 92,0

ВГД, 50 МПа (101,3 ± 8,7) х 107*

Контроль (72,0 ± 6,4) х 107 89,0

ВГД, 100 МПа (64,0 ± 2,3) х 107*

Контроль (382,3 ± 32,6) х 107 3,5

ВГД, 200 МПа (132,3 ± 2,3) х 106*

Контроль (168,7 ± 11,8) х 107 6,5 х 10-6

ВГД, 300 МПа 110,3 ± 9,7*

Контроль (490,3 ± 39,6) х 107 0,3 х 10-6

ВГД, 500 МПа 13,7 ± 0,9 *

Контроль (220,7 ± 19,7) х 107 0

ВГД, 800 МПа 0

# — данные представляют собой среднее арифметическое значение трех независимых экспериментов (три повторности на каждый образец в эксперименте) ± а (среднеквадратичное отклонение); * — статистически достоверно отличается от контроля, р < 0,05, ^критерий Стьюдента

х

о —

=

Г

I ЧЧМЧ, I

-Збв" 0 ^

& В

мертвые . - . Ü

rm-1 ч I Ulli]-1-

Интенсивность флуоресценции, ус. 6Д.

х 8

=

Г

Интенсивность флуоресценции, ус. ед.

ж

с -

-

X

X

е -

£ о

305 и ,u 1U " ,и Д

Интенсивность флуоресценшш, ус. ед.

I ' иЩи»Г,

K1-ltr о itr

мертвые

rf—I I ! ? ИП|—-г—- гиду

,¿3

ю" lö5 g Интенсивность флуоресценции, ус. ед.

х -

X с

.jjj-ICr1 О 1В1 » 1« iu р

Интенсивность флуоресценции, ус. ед.

100

ЁО

м

3

i «

ж

S 20

Ш

50

100

3»

£00

ВГД, Л та

Рис. 1. Влияние высокого гидростатического давления (ВГД) на жизнеспособность клеток Salmonella typhimurium TA100 (данные проточной цитометрии). А — контроль (клетки, не подвергавшиеся действию ВГД); Б — 50 МПа; В — 100 МПа; Г — 300 МПа; Д — 800 МПа; Е — суммарное представление жизнеспособности бактерий, доля живых клеток в попу-ляции,%; К — контроль; * — статистически достоверно отличается от контроля, р < 0,05

зывает различные структурные изменения биомолекул и нарушение равновесия химических реакций (Meersman, McMillan, 2014; Oger, Jebbar, 2010).

Согласно данным, представленным в литературе, высокое давление в первую очередь влияет на целостность и функционирование мембран и является ингибитором ключевых ферментов клетки. Воздействие давления около 200 МПа вызывает негативные изменения в биологических мембранах и, как следствие, резкое снижение жизнеспособности большинства микроорганизмов (High-pressure microbiology, 2008; Meersman, McMillan, 2014). Результаты, полученные в настоящей работе для

S. typhimurium ТА100, подтверждают факт значительного снижения выживаемости клеток при действии ВГД 200 МПа и выше, ранее обнаруженный для других видов бактерий (табл. 2, рис. 1).

Некоторые эффекты давления на биомолекулы и биологические системы, изученные в условиях in vitro, могут быть объяснены на основе термодинамических принципов денатурации белков и фазовых переходов в мембранах (High-pressure microbiology, 2008). При повышении давления липидный бислой мембран теряет текучесть, становится непроницаемым для жизненно необходимых молекул воды и ряда других

веществ. Для выживания в таких условиях в клеточных мембранах увеличивается содержание ненасыщенных жирных кислот (Oger, Jebbar, 2010). Показано, что после воздействия давления в 200 МПа в течение 30 мин у дрожжей Saccharomyces cerevisiae наблюдается повышение содержания ненасыщенных жирных кислот за счет усиленной экспрессии гена olel (Fernandes et al., 2004). У облигатно пьезофильных штаммов Shewanella sp. DB21MT-2 и Moritella sp. DB21MT-5, выделенных из бездны Челленджера, липиды мембран примерно на 70 % состояли из ненасыщенных жирных кислот (Kato et al., 1998; Nogi et al., 1998). ВГД вызывает нарушение белок-липидных взаимодействий, необходимых для целостности биологических мембран и их нормального функционирования (Winter, Jeworrek, 2009). К числу важнейших причин гибели клеток при повышении давления относятся нарушение структуры и функций белков, а также диссоциация рибосом. Стабилизация молекулы ДНК в условиях высокого давления значительно усложняет структурные перестройки молекулы, необходимые для протекания жизненно важных процессов репликации, транскрипции и трансляции (High-pressure microbiology, 2008). Окислительный стресс, индуцируемый высоким давлением в бактериях, также рассматривается как одна из возможных причин снижения их жизнеспособности в данных условиях (Aertsen et al., 2005).

Сравнительный анализ результатов, полученных в нашей работе с использованием двух методов, показывает, что согласно данным цитофлуориметрического анализа процент жизнеспособных клеток, сохранившихся в популяции тестерных бактерий в условиях ВГД, гораздо выше, чем при оценке способности бактерий к образованию колоний. Так, после воздействия ВГД 300 МПа выживаемость клеток S. typhimurium ТА100, рассчитанная по числу КОЕ, составляет миллионные доли процента, в то время как по данным цитофлуориметрическо-го анализа в популяции живыми регистрируются 19,2 % клеток (табл. 2, рис. 1).

Данный факт можно объяснить тем, что при повышении давления большая часть клеток популяции переходит в некультивируемое состояние (НС), сохраняя при этом жизнеспособность. Бактериальные клетки, находящиеся в таком состоянии, проявляют метаболическую активность, но не способны подвергаться непрерывному делению, необходимому для определения роста в питательной среде (Юдин, 2007; Colwell, 2000). Индукторами НС бактерий могут быть различные стрессовые факторы окружающей среды: недостаток питательных веществ, температурные изменения, недостаток влаги, излучения и др. (Голод и др., 2009; Кряжевских и др., 2012). Возможность перехода в НС при действии ВГД было показано для Listeria monocytogenes (Ritz et al., 2001).

Оценка возможности индукции генных мутаций у бактерий при воздействии ВГД

Несомненный интерес для понимания механизмов адаптации к жизни в условиях высокого давления у пье-зофилов, а также у обнаруженных в ряде исследований пьезотолерантных штаммов некоторых мезофильных микроорганизмов (Hauben et al., 1997; Karatzas, Bennik, 2002; Vanlint et al., 2011) представляет изучение генетических изменений, индуцируемых при воздействии ВГД. На сегодняшний день имеется лишь незначительное число исследования в данной области (Aertsen et al., 2004; Gross, 1965; Rosin, Zimmerman, 1977).

В настоящей работе была исследована возможность индукции генных мутаций у S. typhimurium в условиях ВГД. Так как согласно полученным нами результатам ВГД выше 200 МПа оказывает негативное влияние на бактерии, вызывая как их гибель, так и потерю способности к колониеобразованию, в тесте Эймса мы использовали только три дозы ВГД: 50 МПа, 100 МПа и 200 МПа. Как видно из результатов, представленных в таблице 3, после воздействия давления от 50 до 200 МПа в течение 15 мин не наблюдалось существенного увеличения числа колоний ревертантов штамма S. typhimurium ТА100. В то же время ВГД 50 МПа

Таблица 3

Мутагенный эффект высокого гидростатического давления (ВГД) на штамме Salmonella typhimurium ТА100

Варианты Количество His+-ревертантов/чашку#

Контроль 103,6 ± 9,7

ВГД, 50 МПа 115,3 ± 10,2*

Контроль 83,6 ± 9,3

ВГД,100 МПа 79,3 ± 8,1

Контроль 97,0 ± 9,2

ВГД, 200 МПа 91,6 ± 8,7

Контроль 95,4 ± 10,2

Азид натрия (2 мкг/чашку) 782,3 ± 63,4*

# — данные представляют собой среднее арифметическое значение трех независимых экспериментов (три повторности на каждый образец в эксперименте) ± а (среднеквадратичное отклонение); * — статистически достоверно отличается от контроля, р < 0,05, t-критерий Стьюдента

Таблица 5

Зависимость количества спонтанных ревертантов штаммов Salmonella typhimurium ТА98 и ТА100 от плотности инокулята в тесте Эймса

Таблица 4

Мутагенный эффект высокого гидростатического давления (ВГД) на штамме Salmonella typhimurium ТА98_

Варианты Количество His+-ревертантов/чашку#

Контроль 33,7 ± 5,8

ВГД, 50 МПа 62,3 ± 9,2*

Контроль 42,6 ± 7,8

ВГД,100 МПа 50,7 ± 9,2

Контроль 57,0 ± 8,8

ВГД, 200 МПа 56,4 ± 6,3

Контроль 64,3 ± 5,8

2-нитрофлуорен (2 мкг/чашку) 597,7 ± 42,4*

# — данные представляют собой среднее арифметическое значение трех независимых экспериментов (три повторности на каждый образец в эксперименте) ± а (среднеквадратичное отклонение); * — статистически достоверно отличается от контроля, р < 0,05, ^критерий Стьюдента

Плотность инокулята, кл/мл Количество His+-ревертантов/чашку*

ТА98 ТА100

1 - 2 х 109 57,3 ± 8,2 112,4 ± 10,6

1 - 2 х 108 54,6 ± 9,4 104,6 ± 14,2

1 - 2 х 107 50,8 ± 6,8 98,7 ± 12,3

1 - 2 х 106 12,2 ± 1,9 18,7 ± 0,8

1 - 2 х 105 1,5 ± 0,07 2,8 ± 0,2

* — данные представляют собой среднее арифметическое значение трех независимых экспериментов

вызывало повышение числа колоний His+-ревертантов у штамма ТА98 в 1,9 раза (табл. 4), что свидетельствует

0 возможности индукции генных мутаций в клетках бактерий при повышении давления. При дальнейшем увеличении давления также происходил рост His+-ревертантов, при этом их количество было сопоставимо со спонтанным фоном мутирования. Следует отметить, что даже при действии ВГД 200 МПа, снижающем выживаемость тестерных бактерий до 3,5 % (по числу КОЕ), мы не наблюдали уменьшения количества His+-ревертантов ниже спонтанного фона мутирования для обоих тестерных штаммов. По всей вероятности, количество ревертантов 5. typhimurium не уменьшается прямо пропорционально снижению выживаемости бактерий. Данное предположение подтверждается результатами, представленными в таблице 5. При оценке зависимости уровня спонтанного мутагенеза от плотности высеваемой культуры тестерных штаммов 5. typhimurium было установлено, что количество спонтанных ревертантов у штаммов тА98 и тА100 остается практически постоянным при разведении исходной суспензии бактерий плотностью

1 — 2 х 109 кл/мл до 1 — 2 х 107 кл/мл. Подобные результаты для штамма 5. typhimurium ТА98 ранее были получены Жук (Жук, 2010).

Вопрос о возможности индукции повреждений ДНК и мутаций при повышении давления остается малоизученным. В работе Росина и Зиммермана было обнаружено повышение частоты цитоплазматических мутантов у S. cerevisiae в условиях ВГД (Rosin, Zimmerman, 1977). Возникновение большого числа мутантов Euglena gracilis с измененными каротиноидами и лишенных хлорофилла при действии давления от 500 до 1000 атмосфер показано Гросс (Gross, 1965).

Аэрстен с соавт. (Aertsen et al., 2004) сообщили об индукции высоким давлением SOS ответа в клетках E. coli. SOS-ответ, как правило, индуцируется в клетках бактерий при действии ДНК-повреждающих факторов. Однако авторы вышеназванной работы предполагают, что высокое давление первоначально вызывает денатурацию ферментных белков репликативного комплекса. Сигналом для индукции SOS-ответа является одноцепочечная ДНК, образующаяся из-за нарушения процесса репликации ДНК. Из всех функций, объединяемых в SOS-ответ клетки, особого внимания заслуживает SOS-мута-генез — результат «ошибочной» SOS-репарации ДНК. Повышенный уровень мутагенеза и рекомбинации ДНК, как и все другие SOS-функции, направлен на повышение генетической изменчивости в популяции как шанс

адаптации и выживания в стрессовых условиях (Radman, 2001). Таким образом, SOS-мутагенез можно рассматривать как один из возможных путей индукции адаптивных мутаций у микроорганизмов в условиях ВГД.

Дальнейшие исследования, направленные на изучение клеточной пьезофизиологии и генетических механизмов регуляции адаптации к жизни в условиях высокого давления, откроют новые перспективы биоинженерии пьезотолерантных микроорганизмов для применения в биотехнологии, а также внесут вклад в направления медико-биологических исследований, связанных с изучением состояний повышенного давления.

Работа выполнена за счет средств субсидии, выделенной в рамках государственной поддержки Казанского (Приволжского) федерального университета в целях повышения его конкурентоспособности среди ведущих мировых научно-образовательных центров.

ЛИТЕРАТУРА

1. Голод Н. А., Лойко Н. Г., Мулюкин А. Л. и др. (2009) Адаптация молочнокислых бактерий к неблагоприятным для роста условиям. Микробиология. Т. 78 (3): С. 317-335.

2. Жук А. С. (2010) Экспериментальная модель оценки последствий воздействия стрессорных факторов окружающей среды: Магистерская диссертация. Санкт-Петербург.

3. Кряжевских Н. А., Демкина Е. В., Манучарова Н. А. и др. (2012) Реактивация покоящихся и некультиви-руемых форм бактерий из древних почв и мерзлых подпочвенных отложений. Микробиология. Т. 81 (4): С. 474-485.

4. Юдин И. П. (2007) Современные подходы к оценке жизнеспособности бактерий с акцентом на феномене некультурабельности. Annals of Mechnicov Institute. № 3: С. 8-16.

5. Aertsen A., De Spiegeleer P., Vanoirbeek K. et al. (2005) Induction of oxidative stress by high hydrostatic pressure in Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. V. 71 (5): P. 2226-2231.

6. Aertsen A., Houdt R., Vanoirbeek К., et al. (2004) An SOS Response Induced by High Pressure in Escherichia coli. J. Bacteriol. V. 186 (18): P. 6133-6141.

7. Aertsen A., Meersman F., Hendrickx M. E. et al. (2009) Biotechnology under high pressure: applications and implications. Trends in Biotechnology. V 27 (7): P 434-441.

8. Alpas H., Kalchayanand N., Bozoglu F. et al. (1999) Variation in resistance to hydrostatic pressure among strains of foodborne pathogens. Appl. Environ. Microbiol. V. 65: P. 4248-4251.

9. Colwell R. R. (2000) Bacterial death revisited. In: Grimes D. J. editor. Nonculturable microorganisms in the environment. Washington, D. C.: ASM Press; p. 325-342.

10. Fernandes P. M., Domitrovic T., Kao C. M. et al. (2004) Genomic expression pattern in Saccharomyces cer-evisiae cells in response to high hydrostatic pressure. FEBS Lett. V. 556 (1-3): P. 153-160.

11. Gao X., Li J., and Ruan K. C. (2001) Barotolerant Escherichia coli induced by high hydrostatic pressure. Sheng Wu Hua Xue Yu Sheng Wu Wu Li Xue Bao (Shanghai). V. 33: P. 77-81.

12. Gross J. A. (1965) Pressure-induced color mutation of Euglenagracilis. Science. V. 147 (3659): P. 741-742.

13. Hauben K. J., Bartlett D. H., Soontjens C. C. et al. (1997) Escherichia coli mutants resistant to inactiva-tion by high hydrostatic pressure. Appl. Environ. Microbiol. V. 63 (3): P. 945-950.

14. High-pressure microbiology (2008) Editors Mi-chiels Ch., Bartlett D. H., Aertsen A. Washington: ASM Press.

15. High-pressure techniques in chemistry and physics. A practical approach (1997) Editors Holzapfel W B., Isaacs N. S. Oxford, New York, Tokyo: Oxford University Press.

16. Jannasch H. W, Taylor C. D. (1984) Deep-sea microbiology. Annu. Rev. Microbiol. V. 38: P. 487-514.

17. Karatzas K. A., Bennik M. H. (2002) Characterization of a Listeria monocytogenes Scott A isolate with high tolerance towards high hydrostatic pressure. Appl. Environ. Microbiol. V. 68: P. 3183-3189.

18. Kato C., Li L., Nogi Y. et al. (1998) Extremely baro-philic bacteria isolated from the Mariana Trench, Challenger Deep, at a depth of 11,000 meters. Appl. Environ. Microbiol. V. 64 (4): P. 1510-1513.

19. Meersman F., McMillan P F. (2014) High hydrostatic pressure: a probing tool and a necessary parameter in biophysical chemistry. Chem. Commun. V 50: P 766-775.

20. Mortelmans K., Zeiger E. (2000) The Ames Salmo-nella/microsome mutagenicity assay. Mutat. Res. V. 455 (1-2): P. 29-60.

21. Mota M. J., Lopes R. L., Delgadillo I. et al. (2013) Microorganisms under high pressure — Adaptation, growth and biotechnological potential. Biotechnol. Adv. V. 31 (8): P. 1426-1434.

22. Nogi Y., Kato, C., Horikoshi K. (1998) Taxonomic studies of deep-sea barophilic Shewanella strains and description of Shewanella violacea sp. nov. Arch. Microbiol. V. 170 (5): P. 331-338.

23. Oger Ph. J., Jebbar M. (2010) The many ways of coping with pressure. Res. Microbiol. V 161 (10): P. 799-809.

24. Radman M. (2001) Fidelity and infidelity. Nature. V. 413 (15): P. 413-115.

25. Ritz M., Tholozan J. L., Fedeeighi M. et al. (2001) Morphological and physiological characterization of Listeria monocytogenes subjected to high hydrostatic pressure. Appl. Environ. Microbiol. V. 67 (5): P. 2240-2247.

26. Rosin M. P., Zimmerman A. M. (1977) The induction of cytoplasmic petite mutants of Saccharomyces

cerevisiae by hydrostatic pressure. J. Cell Sci. V. 26: P. 373-385.

27. Vanlint D., Mitchell R., Bailey E. et al. (2011) Rapid acquisition of gigapascal-high-pressure resistance by Escherichia coli. mBio. V. 2 (1): P 00130-10.

28. Wachtershauser G. (2006) From volcanic origins of chemoautotrophic life to Bacteria, Archaea and Eukarya. Phil. Tran. R. Soc. B. V. 361: P. 1787-1808.

29. Winter R., Jeworrek C. (2009) Effect of pressure on membranes. Soft Matter. V. 5 (17): P. 3157-73.

30. Zeng X., Birrien J. L., Fouquet Y. et al. (2009) Pyococcus CH1, an obligate piezophilic hyperthermophile: extending the upper pressure-temperature limits for life. The ISME journal. V. 3 (7): P. 873-876.

HIGH HYDROSTATIC PRESSURE INFLUENCE ON VIABILITY AND MUTAGENESIS OF SALMONELLA TYPHIMURIUM

Karamova N. S., Zelenikhin P. V., Kiselev V. D., Lipatnikova A. A., Ilinskaya O. N.

C SUMMARY: Background: pressure is a well-known physical environmental parameter. Nevertheless, the basic principles of microbial survival under high hydrostatic pressure (HHP), especially genetic response to pressure, are still poorly understood. The purpose of this study was to investigate the influence of HHP ranging from 50 to 800 MPa on viability and mutagenesis of Salmonella typhimurium. Materials and methods. The standard plate count method (counting the total number of colony forming units (CFUs) on the plate) and the propidium iodide (PI) flow cytometric assay were used to determine the bacterial viability after HHP treatment. Ability of HHP to induce gene mutations was examined by the Ames assay employing Salmonella typhimurium TA100 and TA98. Results. The results obtained showed that survival of S. typhimurium cells considerably decreased when bacteria were exposed to a pressure of 200 MPa and above. Herewith, the survival index calculated according to the total number of CFUs was up to six orders of magnitude lower than that obtained by the flow cytometric analysis under the same HHP. This fact can be explained by the entrance of the some part of bacterial population into the viable but nonculturable (VBNC) state. The pressure of 50 MPa was found to cause a 1.9-fold increase in the number of His+ revertants of S. typhimurium TA98 in Ames test. Conclusion. Our results demonstrate that HPP of 200 MPa and above significantly inhibits the viability of S. typhimurium cells as well as triggers the induction of VBNC state. The results of Ames test suggest that HHP of 50 MPa can induce gene mutations in bacterial cells. The possible mechanisms of HHP effects on cells viability as well as genetic response of bacteria under HHP are discussed.

C KEYWORDS: high hydrostatic pressure; Salmonella typhimurium; viability, viable but nonculturable state, mutagenesis, Ames assay.

REFERENCES

1. Aertsen A., De Spiegeleer P., Vanoirbeek K. et al. (2005) Induction of oxidative stress by high hydrostatic pressure in Escherichia coli. Appl. Environ. Microbi-ol. V 71 (5): P. 2226-2231.

2. Aertsen A., Houdt R., Vanoirbeek K. et al. (2004) An SOS Response Induced by High Pressure in Escherichia coli. J. Bacteriol. V. 186 (18): P. 6133-6141.

3. Aertsen A., Meersman F., Hendrickx M. E. et al. (2009) Biotechnology under high pressure: applications and implications. Trends in Biotechnology. V. 27 (7): P. 434-441.

4. Alpas H., Kalchayanand N., Bozoglu F. et al. (1999) Variation in resistance to hydrostatic pressure among strains of foodborne pathogens. Appl. Environ. Microbiol. V. 65: P.4248-4251.

5. Colwell R. R. (2000) Bacterial death revisited. In: Grimes D. J. editor. Nonculturable microorganisms in the environment. Washington, D. C.: ASM Press; p. 325-342.

6. Fernandes P. M., Domitrovic T., Kao C. M. et al. (2004) Genomic expression pattern in Saccharomyces cerevisiae cells in response to high hydrostatic pressure. FEBS Lett. V. 556 (1-3): P. 153-160.

7. Gao X., Li J., and Ruan K. C. (2001) Barotolerant Escherichia coli induced by high hydrostatic pressure. Sheng Wu Hua Xue Yu Sheng Wu Wu Li Xue Bao (Shanghai). V.33: P. 77-81.

8. Golod N. A., Loyko N. G., Mulyukin A. L. et al. (2009) Adaptaciya molochnokislykh bakterii k neblagopriyat-nym dlya rosta usloviyam [Adaptation of lactic acid bacteria to the adverse growth conditions]. Microbiology. V. 78 (3): P. 317-335.

9. Gross J. A. (1965) Pressure-induced color mutation of Euglenagracilis. Science. V. 147 (3659): P. 741-742.

10. Hauben K. J., Bartlett D. H., Soontjens C. C. et al. (1997) Escherichia coli mutants resistant to inactiva-tion by high hydrostatic pressure. Appl. Environ. Microbiol. V. 63 (3): P. 945-950.

11. High-pressure microbiology (2008) Editors Mi-chiels Ch., Bartlett D. H., Aertsen A. Washington: ASM Press.

12. High-pressure techniques in chemistry and physics. A practical approach (1997) Editors Holzapfel W. B., Isaacs N. S. Oxford, New York, Tokyo: Oxford University Press.

13. Jannasch H. W., Taylor C. D. (1984) Deep-sea microbiology. Annu. Rev. Microbiol. V. 38: P. 487-514.

14. Karatzas K. A., Bennik M. H. (2002) Characterization of a Listeria monocytogenes Scott A isolate with high tolerance towards high hydrostatic pressure. Appl. Environ. Microbiol. V. 68: P. 3183-3189.

15. Kato C., Li L., Nogi Y. et al. (1998) Extremely baro-philic bacteria isolated from the Mariana Trench, Challenger Deep, at a depth of 11,000 meters. Appl. Environ. Microbiol. V.64 (4): P. 1510-1513.

16. Kryazhevskih N. A., Demkina E. V., Manucharova N. A. et al. (2012) Reaktivaciya pokoyaschihsya i nekulti-viruemykh form bakterii iz drevnikh pochv i mierzlykh podpochvennykh otlozhenii [Reactivation of resting

and nonculturable forms of bacteria from ancient soils and frozen subsoil deposits]. Microbiology. V. 81 (4): P. 474-485.

17. Meersman F., McMillan P. F. (2014) High hydrostatic pressure: a probing tool and a necessary parameter in biophysical chemistry. Chem. Commun. V. 50: P. 766-775.

18. Mortelmans K., Zeiger E. (2000) The Ames Salmo-nella/microsome mutagenicity assay. Mutat. Res. V. 455 (1-2): P. 29-60.

19. Mota M. J., Lopes R. L., Delgadillo I. et al. (2013) Microorganisms under high pressure — adaptation, growth and biotechnological potential. Biotechnol. Adv. V. 31 (8): P. 1426-1434.

20. Nogi Y., Kato, C., Horikoshi K. (1998) Taxonomic studies of deep-sea barophilic Shewanella strains and description of Shewanella violacea sp. nov. Arch. Microbiol. V. 170 (5): P. 331-338.

21. Oger Ph. J., Jebbar M. (2010) The many ways of coping with pressure. Res. Microbiol. V. 161 (10): P. 799809.

22. Radman M. (2001) Fidelity and infidelity. Nature. V. 413 (15): P. 413-115.

23. Ritz M., Tholozan J. L., Fedeeighi M. et al. (2001) Morphological and physiological characterization of Listeria monocytogenes subjected to high hydrostatic pressure. Appl. Environ. Microbiol. V 67 (5): P. 2240-2247.

24. Rosin M. P., Zimmerman A. M. (1977) The induction of cytoplasmic petite mutants of Saccharomyces cerevisiae by hydrostatic pressure. J. Cell Sci. V. 26: P. 373-385.

25. Vanlint D., Mitchell R., Bailey E. et al. (2011) Rapid acquisition of gigapascal-high-pressure resistance by Escherichia coli. mBio. V. 2 (1): P 00130-10.

26. Wächtershäuser G. (2006) From volcanic origins of chemoautotrophic life to Bacteria, Archaea and Eukarya. Phil. Tran. R. Soc. B. V. 361: P. 1787-1808.

27. Winter R., Jeworrek C. (2009) Effect of pressure on membranes. Soft Matter. V. 5 (17): P. 3157-73.

28. Yudin I. P. (2007) Sovremennye podhody k ocenke zhiznesposobnosti bakterii s akcentom na fenomene nekulturabel'nosti [Modern approaches to bacteria viability assessment with an emphasis on phenomenon of viable but nonculurable state]. Annals of Mechni-cov Institute. V. 3: P. 8-16.

29. Zeng X., Birrien J. L., Fouquet Y. et al. (2009) Pyococcus CH1, an obligate piezophilic hyperthermophile: extending the upper pressure-temperature limits for life. The ISME journal. V. 3 (7): P. 873-876.

30. Zhuk A. S. (2010) Eksperimentalnaya model ocenki posledstviy vozdeystviya stressornyh faktorov okruzh-ayuschey sredy [Experimental model for evaluating effects of environmental stressors]: Master's dissertation. Saint Petersburg.

C Информация об авторах

карамова назира сунагатовна — к. б. н., доцент. Кафедра микробиологии, институт фундаментальной медицины и биологии. ФГАОУ ВО «Казанский (Приволжский) федеральный университет». 420008, Казань, ул. Кремлевская, д. 18. E-mail: nskaramova@mail.ru.

зеленихин павел Валерьевич — к. б. н., доцент. Кафедра микробиологии, институт фундаментальной медицины и биологии. ФГАОУ ВО «Казанский (Приволжский) федеральный университет». 420008, Казань, ул. Кремлевская, д. 18. E-mail: pasha_mic@mail.ru.

киселев Владимир Дмитриевич — д. х. н., профессор. Кафедра физической химии, химический институт им. А. М. Бутлерова. ФГАОУ ВО «Казанский (Приволжский) федеральный университет». 420008, Казань, ул. Кремлевская, д. 18. E-mail: vkiselev.ksu@gmail.com.

липатникова Анастасия Александровна — студентка. Кафедра микробиологии, институт фундаментальной медицины и биологии. ФГАОУ ВО «Казанский (Приволжский) федеральный университет». 420008, Казань, ул. Кремлевская, д. 18. E-mail: stu92@mail.ru.

Karamova Nazira Sunagatovna —Associated Professor, PhD. Department of Microbiology, Institute of Fundamental Medicine and Biology. Kazan (Volga region) Federal University. 420008, Kazan, Kremlevskaya St., 18, Russia. E-mail: nskaramova@mail.ru.

Zelenikhin pavel Valer'evich —Associated Professor, PhD. Department of Microbiology, Institute of Fundamental Medicine and Biology. Kazan (Volga region) Federal University. 420008, Kazan, Kremlevskaya St., 18, Russia. E-mail: pasha_mic@mail.ru.

Kiselev Vladimir Dmitrievich —Professor, Doctor of Chemical Sciences. Department of Physical Chemistry, Alexander Butlerov Institute of Chemistry. Kazan (Volga region) Federal University. 420008, Kazan, Kremlevskaya St., 18, Russia. E-mail: vkiselev.ksu@gmail.com.

Lipatnikova Anastasiya Alexandrovna —Student. Department of Microbiology, Institute of Fundamental Medicine and Biology. Kazan (Volga region) Federal University. 420008, Kazan, Kremlevskaya St., 18, Russia. E-mail: stu92@mail.ru.

ильинская ольга николаевна — д. б. н., заведующая кафедрой микро- Ilinskaya olga Nikolaevna —Head of Department, Professor,

биологии, профессор. Кафедра микробиологии, институт фундамен- Doctor of Biological Sciences. Department of Microbiology, Institute тальной медицины и биологии. ФГАОУ ВО «Казанский

федеральный университет». 420008, Казань, ул. Кремлевская, д. 18. Federal University. 420008, Kazan, Kremlevskaya St., 18, Russia.

E-mail: Ilinskaya_kfu@mail.ru. E-mail: Ilinskaya_kfu@mail.ru.