Набор последовательностей праймеров и аллель-специфических зондов для дифференциации аллелей каппа-казеина у крупного рогатого скота
SET OF SEQUENCES OF PRIMERS AND ALLELE-SPECIFIC PROBES FOR DIFFERENTIATION OF KAPPA-CASEIN ALLELES IN CATTLE

Изобретение относится к области молекулярной биологии и селекции сельскохозяйственных животных и может быть использовано для дифференциации аллелей А и В гена каппа-казеина крупного рогатого скота.
Каппа-казеин - белок молока, который отвечает за взаимодействие с сычужным ферментом и образование казеинового сгустка, тем самым, являясь основным белком для сыроварения. От конформационной структуры данного белка зависит качество сыродельческой продукции и общий выход сыра и, соответственно, количество используемого сырья для его производства. Белок, входящий в состав молока, полученного от коров с гомозиготным генотипом ВВ гена каппа-казеина, обладает лучшими коагуляционными свойствами, что сказывается на сокращение времени образования казеинового сгустка на 24% и повышение общего выхода сыра из данного молока на 10%. Знание информации о генотипе животного по данному гену позволит производителям молока формировать стада животных для получения узконаправленной продукции, которую можно будет сдавать на перерабатывающие предприятия на 2-3 рубля (10%) выше, чем среднерыночная, а перерабатывающим предприятиям - повысить собственную производительность и снизить себестоимость конечной продукции, что позволит увеличить оборот на 20%.
Ген каппа-казеина располагается в 6 хромосоме и на текущий момент имеет 13 аллелей, из которых А и В являются самыми часто встречаемыми. Основой, влияющей на технологические свойства белка каппа-казеина, являются замены в позициях 136 и 148 белковой цепи IV экзона. Это замена аминокислоты Треонин (аллель А) на Изолейцин (аллель В), вследствие нуклеотидной замены (SNP) C>T, и Аспаргина на Аланин, вследствие нуклеотидной замены А>С в позициях 136 и 148, соответственно. При этом, по данным базы данных NCBI в IV экзоне имеются еще две синонимические мутации (SNP), отличающие аллель А от аллеля В, одна из которых, позиция 168 A>G (Ala>Ala), подтверждена Федерацией разведения крупного рогатого скота Ирландии.
A
B
C
E
Известен набор последовательностей праймеров и аллель-специфических зондов для одновременной генодиагностики четырех мутантных аллелей каппа-казеина κ-CN, κ-CN, κ-CN, κ-CN у крупного рогатого скота путем проведения полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (патент РФ 2646140, МПК C12Q 1/68, опубл. 01.03.2018). Однако использование шести аллель-специфических зондов значительно усложняет диагностику, а идентификация генотипов по четырем мутантным аллелям является излишней для сортировки животных по показателям молочной продуктивности и технологическим свойствам молока. Патент РФ №2646140, принятый за прототип, основан на распознавании стандартной SNP-мутации А>С и, соответственно, применении ДНК-зондов, отличающихся только одним mismatch-нуклеотидом.
Задачей настоящего изобретения была разработка методики ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией (ПЦР в режиме «реального времени») для определения аллельного полиморфизма гена каппа-казеина крупного рогатого скота.
Технический результат заключается в специфичной дифференциации аллелей А и В гена каппа-казеина крупного рогатого скота более точным и менее трудозатратным способом.
Технический результат достигается проведением полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флюоресцентной детекцией в режиме «реального времени» с использованием праймеров CSN3-RT-F-114 и CSN3-RT-R-114 и аллель-специфических зондов Probe 1 и Probe 2.
На фиг. 1 приведена схема расположения SNP в IV экзоне гена каппа-казеина.
Предложенная последовательность праймеров и олигонуклеотидных ДНК-зондов отличается от прототипа тем, что олигонуклеотидные зонды подобраны к участку IV экзона гена каппа-казеина, содержащего две синонимические мутации (SNP), располагающиеся на расстоянии друг от друга в 8 п.о., и отличающиеся друг от друга двумя mismatch-нуклеотидами. Использование данной конструкции олигонуклеотидных ДНК-зондов приводит к большей разнице в температурах плавления между mismatch и комплементарных ДНК-зондом и усилению конкурентных условий при одновременном присутствии обоих ДНК-зондов в реакционной смеси, что приводит к полному ингибированию неспецифического связывания олигонуклеотидных зондов.
2
Указанный технический результат достигается тем, что проводят выделение ДНК из биологического материала, постановку полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с использованием указанных олигонуклеотидных праймеров и ДНК-зондов. Реакционную смесь для ПЦР готовят из расчета количества имеющихся образцов и дополнительно контрольные образцы в количестве 4 шт.: отрицательный, положительный с генотипом АА, положительный с генотипом АВ, положительный с генотипом ВВ. Смешанные реактивы, содержащие 50 мМ KCl, 50 мМ TRIS-HCl, 200 нМ dNTP, 2,5 мМ MgCl, праймеры в концентрации 0,2 рМ/мкл, аллель-специфические зонды в концентрации 0,1 рМ/мкл, разливают в ПЦР-пробирки или ПЦР-планшеты объемом 0,2 мл, в количестве 19 мкл и добавляют 1 мкл выделенной ДНК или контрольных образцов. Пробирки помещают в амплификатор с функцией «real-time». Для анализа используется следующий протокол:
Инициация: 37°С - 5 минут
Предварительная денатурация: 94°С - 5 минут
Цикл из 40 повторов
Денатурация: 94°С - 15 секунд
Совмещенный отжиг и элонгация: 60°С - 1 минута
Считывание уровня флюоресценции каждый цикл по окончанию этапа отжига и элонгации.
Интерпретация результатов проводится на основании пересечения кривой флюоресценции в соответствующих каналах детекции с пороговой линией и по конечному уровню флюоресценции. Пересечение пороговой линии и величина уровня флюоресценции в пределах 25-29 и 1200-1800, соответственно, в канале FAM и отсутствие в канале HEX, интерпретируется как гомозигота ВВ. Пересечение пороговой линии и величина уровня флюоресценции в пределах 22-27 и 1800-2300, соответственно, в канале HEX и отсутствие в канале FAM, интерпретируется как гомозигота АА. Пересечение пороговой линии и величина уровня флюоресценции в пределах 24-30 и 900-1500, соответственно, в обоих каналах, интерпретируется как гетерозигота АВ.
Перечень последовательностей
Праймеры:
SEQ ID No1   CSN3-RT-F-114: 5'-agagcccacctgagatcaac-3'
SEQ ID No2   CSN3-RT-R-114: 5'-tcttggctgttattcattttgc-3'
Зонды:
SEQ ID No3   Probe 1:   FAM-caactgcggtctaaatactctaaggag-BHQ1
SEQ ID No4   Probe 2:   HEX-caactgcagtctaaaaactctaaggag-BHQ1