Роль апоптоза в регуляции иммунного ответа

РОЛЬ АПОПТОЗА В РЕГУЛЯЦИИ ИММУННОГО ОТВЕТА

©Цыган В.Н.

Российская Военно-медицинская академия, Санкт-Петербург

Ключевые слова _____________________________________

апоптоз, иммунная система, Т-лимфоциты, В-лимфоци-ты, аутоиммунный пролиферативный синдром

Цыган В.Н. Роль апоптоза в регуляции иммунного ответа // Обзоры по клин, фармакол. и лек. терапии. — 2004. — Т. 3. — № 2. — С. 62-77.

Рассмотрены механизмы физиологического апоптоза и роль иммунной системы в его регуляции. Основное внимание уделено каспазным механизмам апоптоза, участию белков-регуляторов в апоптозе, апоптозным процессам в Т- и В-лимфоцитах, описанию аутоиммунного лимфопролиферативного синдрома и генетических подходов к изучению клеточной смерти. Библ. 10 назв.

1. СОВРЕМЕННАЯ КОНЦЕПЦИЯ АПОПТОЗА

1.1. Общие представления

В самообновляющихся тканях человеческого организма, таких как кожа, кишечный эпителий и костный мозг, 50-70 миллиардов клеток ежедневно погибают путем программированной клеточной смерти из-за необходимости освободить место для миллиардов новых клеток. Масса продуцируемых и параллельно обновляющихся в течение года клеток равна массе тела. В отличие от случайной клеточной смерти, вызываемой, например, травмой, эта физиологическая смерть осуществляется путем включения специализированной генетической программы и морфологически выражается в фрагментации клеток на окруженные мембраной тельца, которые подвергаются фагоцитозу без воспалительных реакций и рубцевания ткани.

Основной признак апоптоза — фрагментация ДНК Са2+-Мд2+-зависимыми эндонуклеазами, расщепляющими ДНК в межнуклеосомных сайтах на 180-200-нуклеотидные олигомеры, которая визуализируется в агарозном гель-электрофорезе в виде так называемой апоптозной лестницы. Целый ряд генов, которые тесно связаны с клеточной пролиферацией и канцерогенезом, также ассоциирован с

апоптозом и, следовательно, регуляция этих процессов имеет общие механизмы. Дерегуляция контроля клеточного цикла может склонять клетку на путь апоптоза, а дерегуляция апоптоза — способствовать канцерогенезу.

Апоптоз — это нормальный процесс элиминации лишних клеток в ходе развития, в поддержании гомеостаза, а также аутореактивных иммунных клеток, клеток с нерепарабельными повреждениями или представляющих по какой-либо причине угрозу для организма. Механизм апоптоза является комплексной сетью блокаторов и индукторов клеточной смерти, действующих разнонаправленно в тонком равновесии для достижения надлежащего тканевого гомеостаза. У млекопитающих эти регуляторы обычно существуют как мультигенное семейство гомологов, каждый из которых имеет собственный уникальный паттерн экспрессии в разных тканях.

К стрессовым факторам, способным индуцировать апоптоз, относятся облучение, ишемия, гипоксия, вирусная инфекция, а также удаление ростовых факторов. Дисрегуляция апоптоза может привести к иммортализации клетки и раку или, наоборот, к нежелательному усилению клеточной гибели как при СПИДе и некоторых нейродегенеративных заболеваниях. Морфологические изменения клеток, претерпевающих апоптоз, включают потерю клеткой объема и спадение ее стенок, тогда как клетки, погибающие по механизму некроза, разбухают. Хроматин конденсируется, формируя мелкие диффузные образования, которые могут сливаться и мигрировать к ядерной мембране в виде круглых плотных структур. Ядра часто расщепляются на мембраносвязанные тельца, которые могут содержать или не содержать хроматин. И сама клетка может расщепляться на множество апоптозных телец, содержащих фрагменты ядра, или спадаться и превращаться в единичное круглое плотное апоптозное тело. Биохимические изменения при апоптозе включают специфическое расщепление ДНК, рибо-сомальной РНК и белков, повышение внутриклеточного уровня ионов кальция, потерю митохондриального трансмембранного потенциала и высвобождение из митохондрий цитохрома С, выделение фосфатидилсерина из внутренней плазматической мембраны. Общепризнанный биохимический индикатор апоптоза — расщепление ДНК на олигонукле-осомальные фрагменты. Набор этих морфологических и биохимических признаков апоптоза может

В ПОМОЩЬ ЛЕКТОРУ

варьировать между клеточными типами и индуцирующими факторами.

В отличие от клеток, умирающих по неапоптоз-ным механизмам, которые характеризуются повышенной проницаемостью мембран и разбуханием клетки, случайной деградацией хроматина и, наконец, клеточным лизисом, апоптозные клетки обычно остаются мембраносвязанными, что исключает воспалительную реакцию. Распознавание апоптоз-ных клеток фагоцитирующими клетками отчасти обусловлено выделением фосфатидилсерина во время апоптоза.

В настоящее время известен ряд примеров патологических изменений экспрессии и функции генов, которые ответственны за дисрегуляцию апоптоза, и те пути, которыми аберрантная регуляция этих генов способствует патогенезу некоторых заболеваний.

1.2. Механизмы апоптоза

Каспазы. Эффекторное плечо апоптозного пути представлено семейством внутриклеточных про-теаз, называемых каспазами. Термин «каспаза» (caspase) отражает свойства белков данного семейства: «с» подчеркивает цистеинпротеазный (cystein protease) механизм действия, «asp» — способность расщеплять белки после аспартата (aspartic acid), «ase» указывает на каталитическую функцию. Каспазы синтезируются какзимогены (неактивные проферменты), состоящие из аминотерминального продомена и большой и малой субъединиц, но могут быть активированы протеолиуическим расщеплением в консервативных сайтах (аспарагиновых остатках), генерирующим субъединицы ферментативно активных протеаз. Каспазные продомены содержат модули межбелкового взаимодействия, которые облегчают ассоциацию множества факторов, необходимых для каспазной активации в ответ на апоптозиндуцирующие стимулы. Активация требует протеолитического удаления продомена и формирования гетеродимера между большой и малой субъединицами.

Активные протеазы представляют собой гетеро-тетраме1ры, состоящие из двух больших и двух малых субъединиц. В соответствии с концепцией каскадного механизма активации каспазы делятся на инициа-торные(( каспазы 8 и 10) и эффёкторные (в основном каспазы 3,6 и 7). Каспаза 9 служит медиатором митохондриального пути апоптозного сигналинга (рис. 1). Эффекторные каспазы активируются расщеплением инициаторными каспазами. Необратимое расщепление специфических белковых клеточных субстратов эффектррными каспазами приводит к морфологическим .изменениям, распознаваемым как апоптоз: характерной конденсации хроматина, ядерной фрагментации, сморщиванию клетки, пузырчатости плазматических мембран и другим ультраструктурным изменениям.

Продомены инициаторных каспаз 8 и 10 содержат

домен DED {death effector domain), которым они свя-

i

зываются с DED-доменом адапторного белка FADD (Fas-assciated death domain protein). Это привлекает каспазу к лигандактивированным рецепторам смерти на клеточной мембране, где формируется DISC-комплекс (death-inducing signaling complex) и происходит ее активация. Формирование DISC-комплекса запускается связыванием лигандов клеточной смерти (FasL, TNFa и TRAIL) с соответствующими рецепторами смерти: Fas (CD95/APO-1), TNFR1 и TNFR2 (TNF receptor), TRAIL-R1 (TNF-related apoptosis-inducing ligand receptor 1), TRAIL-R2 (TNF-related apoptosis-inducing ligand receptor 2), TRAMP (TNF receptor-related apoptosis mediating protein), DR6 (death receptor 6).

Продомен каспазы 9 содержит домен CARD (caspase recruitment domain), посредством которого она связывается с фактором Apaf-1 (apoptotic protease activating factor-1) во время формирования апоптосомы — цитоплазматического каспазоакти-вирующего комплекса. В обоих случаях для каспазной активации требуется сборка мультифакторных комплексов, в которых происходит расщепление прокаспазы. Рецепторы смерти содержат цитоплазматические домены смерти DD (death domain), которые, связываясь с лигандом смерти, привлекают адапторныё белки, содержащие домены DD и DED. Взаимодействие DED-доменов адаптора и прокаспазы приводит к аутопротеолитической активации и включению каспазного каскада.

В ответ на апоптозиндуцирующие стимулы, действующие через рецепторы смерти, каспаза 8 активирует (расщепляет) белок Bid (Вох1, член Вс12-семейства), который транслоцируется в митохондрии и усиливает проапоптозный сигнал. В результате происходит высвобождение цитохрома С, который выходит из митохондрий в цитозоль и включает формирование апоптосомы. Апоптосома состоит из цитохрома С, прокаспазы-9 и протеа-зоактивирующего фактора белка Apaf-1, который может взаимодействовать как с прокаспазой-9, так и с ингибитором апоптоза белком Bcl-XL. В первом случае происходит расщепление и активация кас-пазы-9, которая затем активирует эффекторные каспазы, подобные каспазе-3, непосредственно расщепляющие белки, обеспечивающие жизнедеятельность клетки. Во втором случае связывание Apaf-1 с Bcl-XL ингибирует этот процесс. Митохондриальный путь апоптоза может быть ингибирован на различных уровнях антиапоптозными белками семейств Bcl-2 (Bcl-2 и Bcl-XJ и IAP (inhibitors of apoptosis proteins), которые в свою очередь ингибируются белком SMAC/DIABLO (second mito-chondria-derived activator of caspase / direct IAP binding protein with low pi). Другая возможность ингибировать апоптоз заключается в трансдукции сигналов выживания (ростовых факторов и цитоки-нов) которые активируют Р13К-путь передачи сигнала. Протеинкиназа PI3K активирует АКТ-киназу, которая фосфорилирует и инактивирует Bad, проапоптозный белок Вс!2-семейства (см. рис. 1).

i

. а . ...... . . _

DR-путь

Лиганд смерти

Рецептор смерти

ООООООО эооооооооооооооооооооооооооооооос

ооооооо э^оооосюоооооооооооо^оооо^ооос

Митохондриальный путь

Проапоптозный

сигнал

Клеточная

мембрана

Прокаспаза в прокаспаза 10

1^—

FLIP

Каспаза 8 каспаза 10

°° °S?° 00 оо о° °о

OOOOOOC»OOOOTOOO(XDTOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOO

PI3K

АКТ-

FADD

Bad-

Апоптосома: Apafl, цитохром С, прокаспаза 9

Bcl-2

Bcl-XL

Митохондрия

Эффекторные каспазы

SMAC/DIABLO

1 IAP

Рис. 1. Основные пути индукции апоптоза

Апоптоз может быть инициирован двумя альтернативными путями: 1) связыванием лиганда смерти

Каспазы определяются во всех клеточных типах, но их экспрессия дифференциально регулируется в ответ на различные стимулы. Для некоторых каспаз определено множество.вариантов альтернативного сплайсинга и изоформ белка.

Семейство TNF-рецепторов. Наиболее изучены механизмы каспазной активации, вовлекающие семейство TNF-рецепторов, включая TNFR1 (CD120a), Fas (CD95), DR3 (Wsl-1; TRAMP), DR4 (TRAIL-R1), DR5 (TRAIL-R2), DR6 и CAR-1, которые передают в клетку проапоптозные сигналы. Эти «рецепторы смерти» (DR — death receptor) содержат цитозольный домен, известный как домен смерти, который ответственен за привлечение адапторных белков, таких как FADD, к рецепторному комплексу после связывания лиганда. Домен DED белка FADD связывает каспазы 8 и 10, которые содержат его гомологи в своих продоменах. Олигомеризация каспаз приводит к транспроцессингу зимогенов, обладающих низкой протеолитической активностью до того, как они полностью процессируются в активные каспазы. В ходе процессинга инициаторной каспазы происходит удаление DED-содержащего продомена и высвобождение активированной протеазы в цитозоль, где она может расщеплять и активировать другие прокаспазы (рис. 2).

Описаны несколько механизмов резистентности клеток к апоптозу, индуцируемому Fas и другими рецепторами смерти:

а) мутации в генах, кодирующих рецепторы;

б) подавление экспрессии рецепторов;

в) дефекты в путях апоптозной сигнальной транс-дукции.

У человека и других млекопитающих, а также у вирусов идентифицированы DED-содержащие ингибиторы передачи сигналов рецепторов смерти. Один из таких антиапоптозных белков, c-FLIP/ FLAME, является гомологом каспаз 8 и 10 и содержит домен DED, но лишен протеолитической активности. FLIP и другие антиапоптозные белки DED-ce-мейства конкурируют с каспазами, вовлеченными в TNF-сигналинг, за связывание с белком FADD и следовательно функционируют как трансдоминантные ингибиторы этих каспаз.

Субстраты каспазного протеолиза в апоптоз-ныхклетках. Расщепление каспазами некоторых про-теинкиназ (РАК2, изоформы РКС5 и 0, МЕКК-1) придает им проапоптозные свойства. Мишенями каспаз являются также некоторые структурные белки, поддерживающие клеточную архитектуру, расщепление которых приводит к морфологическим изменениям, ассоциированным с апоптозом. Каспазы

соон

, Flip/Flame

Рис. 2. Модель Fas-опосредовчнной сигнальной трансдукции

также расщепляют и инактивируют ингибиторы апоптоза (ICAD, Вс12 и Bcl-XL) и протеинкиназы, вовлеченные в антиапоптозный сигналинг (Raf-1 и Akt).

Каспаза-3-подобные протеазы ответственны также за активацию цитоплазматической эндонуклеазы CAD (caspase-activated deoxyribonuclease), которая расщепляет ДНК на олигонуклеосомальные фрагменты. CAD находится в инактивированном состоянии благодаря ассоциации с белком ICAD/DFF-45 {inhibitor of CAD/DNA fragmentation factor). При индукции апоптоза ICAD подвергается расщеплению, CAD при этом активируется, транслоцируется в ядро и там деградирует ДНК.

1.3. Эндогенная регуляция апоптоза

Семейство Вс12. Семейство клеточных белков Вс12 насчитывает 17 членов. Ген Вс12 кодирует основной ^лен данного семейства, митохондриальный антиапоптозный белок Вс12, который экспрессируется в клеточных типах, характеризующихся большой продолжительностью жизни: нейронах, иммунных клетках памяти, гемопоэтических стволовых клетках|и стволовых клетках дифференцирующегося эпителия кожи и кишечника, а также в железис-

I

том эпителии! где гиперплазия и инволюция контролируются гормонально. В большинстве случаев экспрессия Вс12 происходит в зонах, содержащих пролиферирующие клетки или клетки с большой продолжительностью жизни, т. е. его экспрессия оказывает гомеостатический эффе^ на численность клеточной популяции. Экспрессия Вс!2 про-

длевает жизнь В- и Т-клеток памяти и поддерживает долговременный иммунный ответ.

Семейство Вс12 включает в себя субсемейства, различающиеся функционально и структурно:

1) субсемейство Вс12 наиболее близких гомологов (Bcl2, Bcl-XL, Bcl-w, Mc.i-1, A1/Bfl-1) — ингибиторов апоптоза;

2) белки субсемейств Вах (Вах, Bak, Bok)nBH3(Bik, Blk, Hrk, BimL, Bad, Bid, BNIP3) промотируют апоптоз.

Белки семейства Bcl2 функционируют, формируя в зависимости от концентрации гомо- или гетеродимеры с другими членами семейства. Например, если в избытке присутствует Вс12, формируются ингибирующие апоптоз гетеродимеры Вс12/Вах; если.преобладает Вах, формируется гомодимер Вах/Вах и клетки становятся чувствительными к апоптозу. Относительный уровень Вах и Вс12 определяет судьбу клетки — апоптоз и^и жизнь, и димеризация различных компонентов — существенное событие в дифференциальной регуляции функции Вс12.

Таким образом, белки семейства Вс12 проявляют широкий спектр активности от ингибирования апоптоза до его индукции. Образование димеров обеспечивает механизм, которым контролируется гомеостаз клеточной популяции. Конкурирующие белки, сила и избирательность их связывания создают иерархию комплексов с апоптозной функцией. Один из альтернативных механизмов потери апоптозсупрессирующей функции Вс!2 обусловлен усиленным фосфорилированием.

Вс12 и другие антиапоптозные белки способствуют выживанию преимущественно связыванием с белком Apaf-1 во время формирования апоптосомы, что предотвращает активацию финального звена в цепи эффекторов апоптоза — каспазного каскада.

Апоптоз ассоциируется с различными изменениями в митохондриях, включая редукцию мембранного потенциала й высвобождение в цитоплазму цитохрома С и белка AIF (apoptosis inducing factor). Вс12-родственные белки включены в регуляцию этих изменений путем формирования пор (каналов) в мембране, через которые происходит пассаж цитохрома С и AIF. При этом Вс12 и Bcl-XL ингибируют выброс цитохрома С, а Вах — стимулирует, но Вс12 может ингибировать способность Вах формировать поры. Кроме того, Вс12 и Bcl-XL могут связывать цитохром С непосредственно и вытеснять его из апоптосомы, предотвращая этим.активацию каспаз.

Гиперэкспрессия белка Вс12 впервые была показана в фолликулярных и диффузных лимфомах, каковому обстоятельству он и обязан своим названием (В cell lymphoma 2), а позднее — во многих типах солидных опухолей.

Митогенные и стресс-активируемые протеинкиназы фосфорилируют и активируют белки семейства Вс12. Быстрая и обратимая регуляция фосфо-рилирования Вс12 является результатом баланса индукторов и ингибиторов Вс12-специфических протеинкиназ и служит сенсором соответствующих стимулов: благоприятные для роста условия акти-

вируютфосфорилирование Вс12; неблагоприятные, апоптозиндуцирующие условия побуждают цера-мид (и возможно другие негативные регуляторы) активировать дефосфорилирование Вс12. Функциональная активность других членов семейства, подобно Вс12, динамически регулируется фосфорили-рованием, а цитокиновая стимуляция ИЛ-З-подоб-ными цитокинами может супрессировать апоптоз.

Расщепление Вс12 и Bcl-)^ молекулярными ножницами — протеиназами семейства каспаз влияет на их апоптозную функцию. Например, расщепление Вс12 каспазой-3 по остатку аспарагина-34 в домене FLD превращает Вс12 в проапоптозную молекулу. Но клетки, экспрессирующие мутантный Вс12, который имитирует фосфорилированное состояние, резистентны KTNFa-индуцированному апоптозу; экспрессия такого мутантного Вс12 пролонгирована, поскольку он не поддается деградации протеосомами.

Ингибиторы апоптоза. Клетки защищены от неразборчивой индукции смерти эндогенными ингибиторами апоптоза. Многие из них вовлечены в инициацию и прогрессию рака. Апоптоз, индуцированный через рецепторы смерти, может быть ингибирован DED-содержащим белком FLIP (FADD-like inhibitor protein), который конкурирует за домен ОЕОадаптор-ного белка FADD/MORT1 (Fas-assciated death domain protein) и либо удаляет прокаспазу из DISC-комплек-са, либо препятствует ее включению в него. Гипреэкс-прессия FLIP обнаружена в метастазирующих меланомах человека.

Индуцированная рецепторами смерти активация каспаз может быть ингибирована экспрессией дефектных рецепторов для белка TRAIL (TNF-related apoptosis-inducing ligand), которые либо содержат усеченные нефункциональные DD-домены, либо вовсе лишены их. Нейтрализация проапоптозного лиганда TRAIL такими рецепторами предотвращает формирование DISC-комплексов и TRAIL-индуциро-ванный апоптоз. Многие клеточные опухолевые линии проявляют специфичную чувствительность к TRAIL-индуцированному апоптозу, вероятно, по причине утраты рецепторов для TRAIL во время трансформации.

Семейство белков IAP. Протеины IAP (inhibitor of apoptosis protein) — группа эволюционно консервативных супрессоров апоптоза, гомологи которых идентифицированы у вирусов, дрозофилы, нематоды Caenorhabditis elegans, мыши и человека. Механизмы их действия еще недостаточно изучены; идентифицирована только активность этих протеинов как ингибиторов каспаз, которую проявляют некоторые IAP при непосредственном связывании с каспазами 3, 7 и 9. Семейство ингибиторов про-апоптозных белков IAP включает NIAP (нейрональный IAP), XIAP (Х-сцепленный IAP), IAP1, IAP2 и белок сервивин (survivin). Клетки, в которых происходит гиперэкспрессия IAP, защищены от апоптоза, индуцированного множеством стимулов.

Каспазы 1, 6 и 8 не являются мишенью ингибирующего действия IAP Значение этой избирательно-

сти в том, что ингибированию подвержены каспазы, действующие в дистальной части апоптозного про-теолитического каскада, которые функционируют как конечные эффекторы апоптоза, расщепляющие различные клеточные белки и ответственные за клеточную смерть. Мало известно об экспрессии большинства белков семейства 1АР в нормальных тканях и в опухолях. Описана гиперэкспрессия белка сер-вивина в значительной части опухолей человека, но не в нормальных тканях, что является доказательством его участия в процессе канцерогенеза. Повышенный уровень сервивина ассоциирован с худшим прогнозом для пациентов.

Зависимость от клеточного и внеклеточного контекста. Что определяет этап коммитирования на путь апоптоза, из которого клетка уже не может быть спасена, и какое значение имеют различные апоптоз-ные белки, регулирующие этот этап? Блокирование апоптоза, индуцированного противоопухолевыми лекарствами, не обязательно тождественно блокированию его коммитирования. Обработка опухолевых клеток химиотерапевтическими препаратами однозначно проявляется в протеолитическом процессинге каспаз и расщеплении их субстратов, и хотя ингибирование каспаз низкоспецифичными ингибиторами обычно блокирует все признаки апоптоза, индуцированного противоопухолевыми веществами, во многих случаях такие поврежденные ци-тостатиками клетки все-таки погибают в результате отсроченного (замедленного) некроза (рис. 3). Этой замедленной неапоптозной смерти предшествует (и, вероятно, действительно обусловливает ее) повреждение митохондрий, сопровождающееся высвобождением ряда митохондриальных белков, в том

Некроз

1

Цитохром С

Митохондрия

Apaf 1

©

Каспазы

Ядерный коллапс фрагментация ДНК, апоптоз

Рис. 3. Высвобождение цитохрама С из митохондрии под действием цитостатиков может индуцировать и апоптоз, и некроз

1 — выброс цитохрома С блокируется белком Вс12;

2 — Вс12 или его гомологи (ВЫ-Х^ также способны связываться с АраМ и препятствовать активации каспаз

числе цитохрома С, прерыванием цепи электронного транспорта и продукцией свободных радикалов, потерей электрохимического градиента мембран и истощением пула АТФ.

Важным фактором, влияющим на апоптоз, является полифункциональный транскрипционный фактор NFkB (nuclear factor кВ), кодируемый геном REL (гомолог вирусного онкогена reticuloendotheliosis, v-rel), который активируется сигналами, передаваемыми с рецепторов смерти по Р13К-пути сигнальной трансдукции. В норме он находится в цитоплазме в латентном состоянии, в комплексе с ингибитором 1кВ. Многие внешние стимулы, в том числе цитокины и цитостатики, разрушают этот гетеродимер, 1кВ подвергается фосфорилированию и деградации протеосомами, и ДНК-связывающая частица NFkB мигрирует в ядро, где активирует гены, чьи промоторы содержат последовательности, известные как кВ-сайты. Гены-мишени фактора NFkB можно разделить на 4 класса: 1) иммунорегуляторные и воспалительные; 2) про- и антиапоптозные; 3) позитивные регуляторы пролиферации и 4) негативные регуляторы ативности самого NFkB (IkB ос и [}). В зависимости от стимулов и клеточного констекста NFkB может активировать проапоптозные гены, такие как Fas/CD95, FasL и TRAIL-рецепторы, и антиапоптозные гены семейств Вс12 и IAP и ингибитор каспазы-8 белок FLIP. Конститутивная активация NFkB ассоциирована с несколькими аспектами канцерогенеза: бесконтрольной пролиферацией, предотвращением апопто-за, опухолевым ангиогенезом и метастазированием.

2. АПОПТОЗ ЗРЕЛЫХ Т-ЛИМФОЦИТОВ

2.1. Проприоцидальная регуляция

Резистентные к апоптозу зрелые посттимические Т-клетки могут стать высокочувствительными к нему, если начинают, пролиферировать в ответ на антигенную'Стимуляцию. Для понимания Т-клеточного апоптоза важно помнить, что Т-клеточный ответ на антиген-происходит в две последовательные фазы, различающиеся, молекулярными событиями: фаза активац'ии и фаза пролиферации. Ключевые события фазы акп-ивации — индукция генов ИЛ-12 и его .высокоаффинного рецептора. В начале фазы активации апо]птоз происходит крайне редко, что позволяет развиться защитному иммунному ответу. Пролиферативная фаза Т-клеточного ответа начинается после связывания ИЛ-2 с его рецептором, инициирующего прогрессию клеточного цикла. Только после прохождения хотя бы одного клеточного цикла и вхождения в позднюю в1- или Б-фазу Т-клетки становятся чувствительными к апоптозу. Хотя Т-клеточ-ные клоны различаются между собой по степени чувствительности, способность пролиферирующих Т-клеток лимфоузлов к антиген-индуцирующему апоптозу является общей для всех основных Т-кле-

точныхсубтипов: ySTCR, CD4, CD8, Th 1 nTh2, атак-же родственных им NK-клеток. Таким образом, ИЛ-2 является ключевым регулятором Т-клеточного апоптоза. Экспериментальные мыши с дефектом ИЛ-2-сигналинга, лишенные генов ИЛ-2 и его рецептора, характеризуются аномальным накоплением. активированныхТ-клеток, ассоциированным с нарушением TCR-индуцированног.о апоптоза. Эта новая регуляторная роль ИЛ-2 вступает в противоречие с его хорошо известным пролиферативным эффектом. Согласно концепции проприоцидальной регуляции или контроля апоптоза по принципу обратной связи, судьба Т-мютки определяется уровнем антигенной стимуляции и, следовательно, связана с главным условием иммунного ответа. Если антигенная стимуляция прекращается, эксперссия ИЛ-2 и его рецептора падает и происходит пассивный (ин-, дуцированный лишением лимфокина) апоптоз, который сокращает численность размножившейся Т-клеточной популяции в завершение иммунного ответа. Наоборот, если продолжается сильная антигенная стимуляция пролиферирующих Т-клеток, происходит активный антиген-индуцированный апоптоз. Смерть, обусловленная активацией TCR, ограничивает экспансию Т-клеток, когда антиген присутствует хронически или встречается повторно.

Даже если пролиферирующие Т-клетки обречены на смерть после сильной антигенной стимуляции, эффекторные функции, такие как продукция лимфокинов или цитотоксичность, экспрессируются. Антиген-стимулированная клеточная смерть отличается на молекулярном уровне от активации тем, что в ней участвует только TCR. Ко-стимуляторные молекулы, такие как CD28, которые активируют покоящиеся клетки, не влияют на антиген-индуциро-ванный апоптоз. Аетивная и пассивная формы апоптоза имеют молекулярные различия. Пассивный апоптоз нуждается^ белковом синтезе de novo, протекает скорее по митохондриальному механизму, чем по цитокин-рецепторному, и подвержен сильному ингибирующему действию антиапоптозных белков семейства Вс1-2. Активный апоптоз нуждается в TCR-стимуляции й вовлекает апоптоз-индуцирую-щие цитокины, такие как FasL и TNF, не зависит от белкового синтезаи слабо ингибируется Bcl-2.

Пассивный апоптоз может быть предотвращен некоторыми цитокинами, которые являются факторами Т-клеточного роста и содержат общую у-цепь: ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-7 и ИЛ-15. Причем их защитное действие обнаруживается даже без индукции клеточного цикла. Активный апоптоз происходит в присутствии таких концентраций этих цитокинов, которые способствуют пролиферации, но ИЛ-2 обусловливает наибольший уровень пролиферации и чувствительности к активному апоптозу. Как результат ответа по принципу обратной связи, эти две формы апоптоза элиминируют Т-клетки, если, слишком много или слишком мало антигена и ИЛ-2. Активный иммунный ответ балансирует между этими крайностями. Фракция пролиферирующих Т-клеток может

избегать как активного, так и пассивного апоптоза и стать долгоживущим пулом Т-клеток памяти.

Необходимость проприоцидального механизма возможно диктуется стохастической природой иммунного ответа. Почти случайные Т-клеточные кло-нотипы встречаются с антигеном непредсказуемым образом. Как показал кибернетический анализ сложных систем (систем, для которых конечный результат непредсказуем, исходя из начальных условий), контроль по принципу обратной связи необходим для регуляции ответа. Он состоит из двух компонентов: способности «осмысливать» существующие условия и способности отвечать на них. В иммунной системе «осмысление» (sensing) среды происходит через рецептор ИЛ-2 и антиген. Ответ — либо жизнь, либо смерть клетки. Апоптозный ответ устанавливает негативный проприоцидальный контроль, который имеет внутреннюю тенденцию стабилизировать сложную систему. Эта новая регуляторная парадигма объясняет наблюдения о том, что повторная или хроническая антигенная стимуляция, которая, как теперь известно, является потенциальным стимулом апоптоза, обусловливает скорее супрессию, нежели усиленный ответ. Пассивное снижение уровня ИЛ-2 ответственно за рёзкую Т-клеточную делецию, которая восстанавливает Т-клеточный репертуар после сильного иммунного ответа. Контроль по принципу обратной связи позволяет гомеостатически регулировать ответы на многочисленные антигены в постоянно изменяющейся и непредсказуемой среде.

2.2. Два пути апоптоза активированных Т-клеток

Антиген-индуцированный (активный) апоптоз.

Апоптоз Т-клеток управляется антиген-индуциро-ванной экспрессией цитокинов смерти, в основном FasL/Apo-1L и TNF (tumor necrosis factor), которые действуют на ранней и поздней стадиях антиген-ин-дуцированного апоптоза соответственно. В активированных Т-клетках идентифицированы дополнительные гомологи TNR но их роль в Т-клеточной смерти уточняется. У мышей линий gld и Ipr, которые имеют генетические дефекты FasL и его рецептора Fas соответственно, отмечаются нарушения Т-клеточного апоптоза, лимфопролиферация и аутоиммунитет. Сильнейшая лимфоидная экспансия у мышей этих линий иллюстрирует значение апоптоза для Т- клеточной регуляции. В покоящихся Т-клетках экспрессия генов FasL и TNF слабо индуцируется TCR-стимуля-цией, но ИЛ-2 резко усиливает ее. Это различие отчасти объясняет, почему TCR-стимуляция убивает пролиферирующие, но не покоящиеся Т-клетки, т. е. оно ограничивает эффект обратной связи необходимостью контроля Т-клеточной экспансии. Оба про-апоптозных цитокина, FasL и TNF, обнаруживаются в мембраносвязанной форме. Это означает, что условием апоптоза является взаимодействие двух клеток, однако обе молекулы могут быстро отделяться от клеточной поверхности металлопротеиназами. Следова-

тельно, единичная Т-клетка может убить сама себя в отличие от В-клеток, Fas-зэвисимый апоптоз которых запускается только Т-клетками, экспрессирующими FasL, поскольку В-клетки его не экспрессируют. Экспрессия лигандов смерти Т-лимфоцитами позволяет им контролировать судьбу других клеток, вовлеченных в иммунный ответ, и выполнять цитото-ксические эффекторные функции. FasL и TNF осуществляют свое действие, взаимодействуя со структурно близкими рецепторами клеточной поверхности, чья экспрессия индуцируется TCR-сигналами: Fas/Apo-1/CD95, TNFR1 и TNFR2. Эти рецепторы являются членами суперсемейства TNFR и содержат общие для всех молекул этого суперсемейства экст-раклеточные домены связывания с лигандами.

Рецептор Fas/CD95 конститутивно присутствует на циркулирующих Т-клетках памяти, число которых увеличивается в процессе старения. TNFR2 экспрессируется после активации зрелых Т-клеток. Детекция поверхностной экспрессии TNFR1 затруднена, и возможно он не обязателен для Т-клеточного апоптоза. FasL быстрее индуцирует апоптоз, чем TNF и контролирует апоптоз преимущественно Т-лимфоцитов CD4c, тогда как TNF — в основном CD8c.

Инициация апоптозного сигнала при взаимодействии лиганда смерти с рецептором приводит к формированию комплекса сигнальных белков, акти-вирующего каспазный каскад, как это описано в разделе 1.

Экспрессия FasL на нелимфоидных клетках предположительно является способом установления иммунной толерантности посредством умерщвления реактивных Т-клеток при контакте с FasL-не-сущими клетками, но данные по этому вопросу противоречивы.

Регуляция чувствительности Т-лимфоцитов KFasLnTNF. Чувствительность Т-лимфоцитов к FasL-и TNF-зависимому апоптозу подвержена влиянию многих факторов, включая общее состояние клеток и высокоспецифичные ингибиторные молекулы. Усиленный ответ пролиферирующих Т-клеток на проапоптозные цитокины и повышение количества продуцируемых ими цитокинов приводит к сенсибилизации покоящихся Т-клеток к антиген-индуциро-ванному апоптозу интерлейкином-2. Сенсибилизация требует прогрессии клеточного цикла и может нуждаться в прохождении многих циклов. Т-лимфо-циты становятся более чувствительными к Fas-ин-дуцированному апоптозу после продолжительного культивирования в присутствии ИЛ-2 по причине более эффективного привлечения адапторного белка FADD и каспазы-8.

Специфические клеточные и вирусные ингибиторы вызывают резистентность к Fas-индуцировэнно-му апоптозу. Белок Е8 вируса герпеса содержит два DED-домена, которые связываются с DED-домена-ми клеточного белка FADD и блокируют Fas-индуци-рованный апоптоз. Клеточный белок лимфоцитов l-FLACE (Usurpin, FLAME, MRIT или casper) блокирует Fas-сигналинг, предотвращая взаимодействие бел-

ков аналогичным образом. Молекула I-FLACE структурно близка каспазе-8, но содержит аминокислотные замены, лишающие белок ферментативной активности, поэтому, конкурируя с каспазой-8 за место в сигнальном комплексе, он препятствует активации каспазного каскада. Эти DED-содержащие ингибиторные белки получили название FLIP [FLICE (caspase-8) inhibitory protein]: v-FLIP для вирусного белка и c-FLIP для клеточного. Уровень экспрессии c-FLIP снижается после стимуляции ИЛ-2 и, как предполагают, регулирует чувствительность Т-кле-ток к Fas-индуцированной смерти.

Т-лимфоциты экспрессируют ингибиторные белки семейства IAP и множество других модуляторов апоптоза, которые также играют физиологически важную роль. >

Один из наиболее физиологически важных способов облегчения Т-клеточной смерти посредством FasL или TNF осуществляется благодаря TCR. Уже в первых наблюдениях антиген-индуцированного апоптоза Т-лимфоцитов было замечено, что только специфически стимулированные через TCR Т-клет-ки доступны умерщвлению. Последующие исследования ясно продемонстрировали, что в гетерогенном пуле пролиферирующих апоптоз-чувствитель-ныхТ-клетоксмерти подвержены только те, которые получили TCR-стимуляцию во время FasL/Fas-B3a-имодействия. Таким образом, TCR-стимуляция необходима для апоптоза дважды: один раз, чтобы стимулировать продукцию FasL и/или TNF и другой — после активации этими цитокинами их рецепторов, чтобы позволить им активировать апоптозный каскад. Оказалось, что TCR-сигнал «компетентности к смерти» отличается от сигнала, индуцирующего продукцию цитокинов. Молекулярный механизм функции «компетентности» не известен, но понятно, что потребность в TCR-сигналинге во время активации Fas п редотв ращает гибель других Т - клеток, участвующих в гетерогенных иммунных ответах.

Пассивный апоптоз (при удалении лимфоки-нов). Удаление антигена в конце иммунного ответа сопровождается резкой делецией специфически активированных Т-клеток. Этотфеномен, наблюдаемый в иммунных ответах на суперантигены, пептидные антигены и вирусную инфекцию, играет фундаментальную роль в Т-клеточном гомеостазе, редуцируя экспансию специфических-Т-клеточных клонов, когда они ^становятся больше не нужны. Совпадение исчезновения антигена и лимфоцитарного истощения указывает на то, что пассивный апоптоз является результатом убывания иммуностимулирующего вещества, такого как ИЛ-2. In vitro пролиферирующие Т-клетки быстро претерпевают апоптоз после удаления ИЛ-2 из культуральной среды. Этот процесс сопровождается генной экспрессией и может быть блокирован ингибитором транскрипции акти-номицином Д и ингибитором трансляции циклогек-симидом в отличие от апоптоза, индуцированного связыванием Fas или родственных ему рецепторов, который не зависит от белкового синтеза de novo.

Непрерывное ведение ИЛ-2 in vivo восстанавливает делетированные Т-клеточные популяции после су-перантигенной стимуляции.

Пассивный апоптоз может быть ингибирован митохондриальными апоптоз-ингибирующими белками Вс1-2 и Bcl-XL. Уместно заметить, что дисрегуля-ция Т-клеточного апоптоза, например, при конститутивной гиперэкспрессии гена Вс1-2, способствует лимфоидной злокачественной трансформации.

Пассивный апоптоз Т-лимфоцитов не требует участия цитокинов смерти и их рецепторов и осуществляется через митохондриальный путь активации каспаз. Изменения электрохимического градиента митохондриальной мембраны и последующее высвобождение цитохрома С и других митохондриальных белков в цитоплазму индуцирует активацию каспазного каскада. Ассоциация цитохрома С и белков Apaf-1 с каспазой 9 инициирует ее протеолити-ческую активацию. Активная каспаза 9 процессиру-ет каспазу 3 и другие эффекторные каспазы и возможно создает петлю позитивной обратной связи, так как каспаза 9 является субстратом каспазы 3. Т-клеточный апоптоз, вызванный действием генотоксических агентов и глюкокордикоидов, протекает по этому же механизму. Белки Bcl-2 и Bcl-XL могут ингибировать эту форму апоптоза, блокируя выход цитохрома С, связываясь с митохондриальной мембраной, с ApafH .или с обоими.

Один из возможных механизмов индукции митохондриальных изменений и апоптоза при удалении лимфокинов изучен на ИЛ-З-зависимой клеточной линии. ИЛ-3 поддерживает в этих клетках фосфори-лирование члена семейства Вс1-2 проапоптозного белка Bad через Р13К/Ак1-протеинкиназный путь сигнальной трансдукции. После удаления ИЛ-Зфос-форилированный Bad дефосфорилируется, высвобождается из комплекса с белком 14-3-3 и формирует димеры с другими членами семейства Bcl-2, тем самым блокируя их антиапоптозную функцию. Применим ли этот механизм к другим лимфокинам, ИЛ-2 в частности, пока не известно.

Молекулы, контролирующие выбор между жизнью и смертью покоящихся Т-клеток. Подавляющее большинство лимфоцитов пребывает в покоящемся состоянии, оставаясь в фазе GO клеточного цикла, и не выполняет эффекторные функции актит вированных клеток. Это касается так называемых наивных лимфоцитов и возможно некоторых клеток памяти, которые вошли в пул. долгоживущих клеток после антигенной стимуляции. Для выживания покоящихся клеток необходима экспрессия Bcl-2. Bcl-2- и Bcl-X-дефицитные лимфоциты склонны к апоптозу.

Выживание покоящихся клеток сложным образом регулируется антигенными рецепторами. Наивные Т-клетки нуждаются в экспрессии антигенов системы МНС для своего выживания, а для выживания покоящихся В-клеток необходима экспрессия поверхностных иммуноглобулинов. Влияние этих сигналов выживания может лимитироваться условиями, создающими конкуренцию между резидентными клетками и

«новоприбывшим» свежим пополнением для поддержания константной численности периферического лимфоидного пула. Таким образом, антигенные рецепторы и возможно лиганды, вызывающие частичную активацию, могут обеспечить нормальную продолжительность жизни лимфоцитов в покоящемся состоянии.

Молекулярный контроль выживания покоящихся клеток включает в себя работу транскрипционного фактора LKLF (lung kruppel-like factor), который экспрессируется в однопозитивных тимоцитах и покоящихся (но не активированных) Т-кпетках. Отсутствие функционально активного LKLF приводит к апоптозу этих клеток. Генетические дефекты транскрипционного фактора NFkB и родственных ему молекул также усиливают спонтанный и TNF-индуцированный апоптоз лимфоцитов. Апоптоз наивных Т- и В-клеток ассоциирован с экспрессией генов FasL и Fas соответственно. Цитокины ИЛ-4, ИЛ-6 и ИЛ-7 способствуют выживанию покоящихся Т-лимфоцитов. Совокупность этих процессов обеспечивает разнообразие лимфоцитарного репертуара и элиминирует бесполезные потенциально опасные и злокачественно трансформированные лимфоциты.

2.3. Аутоиммунный лимфопролиферативный синдром — генетический подход к изучению клеточной смерти

Основные формы регулируемой гибели Т-лимфо-цитов вовлекают рецепторный сигналинг и следовательно представляют собой скорее гибкий ответ на влияние внешней среды, нежели жестко предопределенную судьбу клетки. Благоприятная возможность генетического анализа Т-клеточного апоптоза представилась при определении аутоиммунного лимфопролиферативного синдрома (АЛ ПС) какауто-сомно-доминантного заболевания с неполной пене-трантностью, при котором дефект TCR-индуциро-ванного апоптоза ассоциирован с хронической незлокачественной лимфоидной пролиферацией и характерными гистологическими изменениями в лимфоузлах и селезенке, в редких случаях прогрессирующими в лимфому. У пациентов с АЛПС наблюдается увеличение редкой в норме популяции цито-токсических Т-лимфоцитов фенотипа TCRy8 CD4+ CD8+, а также дефекты антиген-индуцированного апоптоза Т-лимфоцитов и Fas-индуцировэнного апоптоза В- и Т-лимфоцитов. Безудержная лимфоидная пролиферация может быть результатом стимуляции как аутоантигенами, так и чужеродными антигенами внешней среды. Т-клетки при АЛПС проявляют дефекты TCR-индуцированного апоптоза. У большинства пациентов они обусловлены наследственными инактивирующими мутациями в гене Fas, приводящими к аминокислотным заменам в цитоплазматическом домене рецептора Fas.

Антиген-индуцированный апоптоз как терапевтический подход к болезням, обусловленным наруше-

ниями Т-клеточного гомеостаза. Как только стало известно, что антигены могут специфически индуцировать смерть активированных Т-лимфоцитов, была рассмотрена возможность терапевтического использования этого эффекта. Лечение Т-клеточных болезней (аутоиммунные заболевания, отторжение аллотрансплантата и аллергии) может быть усовершенствовано элиминацией антиген-специфичного Т-клеточного компонента. В то время как вакцины стимулируют увеличение популяции реактивных Т-клеток, терапия путем антиген-индуцированного апоптоза может использовать естественный имму-норегуляторный механизм редукции или элиминации патогенных Т-лимфоцитов. Антиген-специфич-ный подход к Т-клеточным болезням может усилить или заменить современные методы их лечения. Стероиды и циклоспорин А оказывают генерализованное иммуносупрессивное действие и имеют другие тяжелые побочные эффекты. Поэтому терапевтический антиген-индуцированный апоптоз мог бы стать серьезным прорывом, однако трудности определения патогенных антигенов на фоне многочисленных антигенов системы МНС и изготовления таких белков для фармакологического применения отодвигают его клиническое применение в будущее. Кроме того, теоретически возможно увеличение числа патогенных эпитопов в процессе болезни. Тем не менее будущие усилия в этом направлении оправданы значительным числом тяжелых и распространенных заболеваний с Т-клеточным компонентом, таких как диабет, ревматоидный артрит, рассеянный склероз и другие. Кроме того, элиминация патогенных Т-лимфоцитов облегчит успех трансплантаций аллогенно-го костного мозга и других органов и тканей.

2.4. Перспективы дальнейших исследований

Популяция зрелых Т-лимфоцитов строго контролируется по численности, разнообразию репертуара и толерантности с помощью апоптоза. Апоптоз Т-клеток может происходить как в покоящемся, так и в активированном состоянии. Однако особенно важную роль в управлении иммунным гомеостазом и толерантностью апоптоз играет после антигенной стимуляции. Проприоцидальная регуляция (или регуляция по принципу обратной связи) Т-клеточного апоптоза направляется цитокином ИЛ-2 и уровнем антигенов в локальной иммунной среде. Уровень клеточной пролиферации, индуцированной ИЛ-2, детерминирует уровень апоптоза, индуцированного активацией Т-клеточных рецепторов. Активный антиген-индуцированный Т-клеточный апоптоз отчасти подавляет иммунный ответ в присутствии высоких уровней ИЛ-2 и антигена, тогда как пассивная гибель Т-клеток вследствие удаления лимфокинов удаляет избыточные Т-клетки в условиях низкого уровня ИЛ-2 и слабой антигенной стимуляции в конце иммунного ответа. Антиген-индуцированная Т-кле-точная гибель опосредуется цитокинами смерти

FasL и TNF и соответствующими рецепторами, которые привлекают и активируют каспазы. Избыточная лимфоидная пролиферация и аутоиммунитет представляют собой последствия дефектов анти-ген-индуцированного апоптоза.

Быстрый прогресс в понимании механизмов апоптоза Т-лимфоцитов открывает ряд новых направлений исследований: i

1) молекулярных основ гибели тимоцитов, индуцированной позитивной и негативной селекцией в процессе развития;

2) механизма, лежащего в основе необходимости взаимодействия TCR:MHC для выживания покоящихся Т-клеток;

3) природы антигенов, вовлеченных в патогенез аутоиммунных болезней; .

4) механизма умерщвления Т-лимфоцитов CD4c вирусом иммунодефита человека;

5) происхождения Т-лимфоцитов CD4- и CD8~ при АЛПС; генетических факторов, контролирующих пенетрантность аутоиммунного лимфопролиферативного синдрома, и специфических антигенов, запускающих органо-специфйчный аутоиммунитет;

6) как прогрессия клеточного цикла, вызванная цитокином ИЛ-2, способствует гибели Т-клеток при активации TCR йли удалении лимфокинов;

7) одинаковы или различаются механизмы регуляции Тгкпеточной смерти в различных лимфоидных областях, таких как селезенка, лимфоузлы и слизистые оболочки;

8) кёк Т-клетки CD4 и CD8 избегают гибели й становятся клетками памяти.

3. АПОПТОЗ В-ЛИМФОЦИТОВ

АП0П|Т03 может происходить на различных стадиях естественного В-клеточного развития, выполняя три основные функции. Во-первых, он является одним из молекулярных механизмов сохранения В-кпеточной толерантности во время антиген-незав.исимой (лимфороэз) и антиген-зависимой (иммунопоэз) фаз В'-клето^ного развития. Во-вторых, он поддерживает гомеостаз В-клеточного компартмента, чтобы избежать дисрегулированной экспансии В-лимфоцитов, которая'может привести к развитию неоплазии. И наконец, апоптоз способствует улучшению иммуноглобулиновогоотве'га элиминацией несоответствующих В:КЛеТО|Ч,НЫХ клонов, которые могли получить ошибочную Т-клеточную стимуляцию, и низкоаффинных мутантных клонов, возникших во время антиген-стиму-лирова^ного увеличения разнообразия В-клеточного репертуара в терминальны* центрах.

3.1. Поддержание В-клеточной толерантности

Изучение динамики клеточных популяций привело к заключению, что популяция В-клёточных предше-

> ! __________________ _____ ____ _____

ственников резко сокращается во время раннего развития. Первая фаза усиленного апоптоза имеет место после завершения VDJ-реаранжировки во время перехода из стадии про-В-клетки в стадию пре-В-клетки и отражает элиминацию В-клеточных предше-. ственников с неправильно реаранжированной Нц-це-пью (или неправильно ассоциированной с псевдолег-кой цепью \|/L). Вторая фаза апоптоза встречается на стадии незрелых В-клеток и .позволяет элиминировать В-клетки, которые не смогли реаранжировать легкую цепь, и аутореактивные В-клетки.

Одна из первоочередных функций В-клеточных рецепторов (BCR) на. пре-В и незрелых В-клетках -управление селекцией В-клеточного репертуара, чтобы только В-клетки с продуктивно реаранжированны-ми и правильно ассоциированными тяжелыми и легкими иммуноглобулиновыми цепями могли избежать апоптоза. Этот процесс называется позитивной селекцией. Негативной селекцией называется деле'ция незрелых В-клеток, чьи BCR распознают.аутоантигены микросреды с достаточно высокой авидностью.

3.2. Механизмы негативной селекции

Негативная селекция начинается в первичных лимфоидных органах (фетальной печени, костном мозге) и продолжается в селезенке. Процесс селекции в периферии позволяет поддерживать В-кле-точную толерантность к аутоантигенам, не встречающимся в микросреде костного мозга. Согласно современным представлениям, сила взаимодействия между BCR и аутоантигеном предопределяет результат селекции на стадии незрелой В-клетки. Высокоавидные взаимодействия приводят к апоп-тозу или побуждают клетку пройти повторную VJ-реаранжировку (рецепторное редактирование) в локусе L-цепи. Низкая авидность взаимодействия приводит к анергии. Незрелые В-клетки со слабой экспрессией BCR сохраняет жизнеспособность и мигрируют в периферию, где проходят второй этап селекции и дают начало зрелым В-лимфоцитам. Переход от незрелых (только IgM) к зрелым (IgM и IgD) В-кпеткам происходит в селезенке.

I На стадии незрелых В-клеток, во время которой происходит делеция аутореактивных клеток, экспрессия основных: антиапоптозных белков Вс12 и Bcl-XL, блокирующих всю апоптогенную активность митохондрий, репрессирована. Это говорит о том, что негативная селекция В-клеточного репертуара осуществляется по механизму митохондриального апоптоза (как показали экспериментальные исследования, Bcl-XL-ингибируемому).

В настоящее время мало известно об экспрессии рецепторов смерти на развивающихся В-кле-точных предшественниках. В нормальном костном мозге человека экспрессия рецепторов Fas (CD95) ограничена фракцией незрелых про- и пре-В-кле-ток. Дефектная экспрессия CD95 избавляет аутореактивные клетки от делеции, следовательно CD95 является ключевым элементом негативной селекции. Информация, о возможной экспрессии других

I

рецепторов смерти (TNFRI, TRAIL-R1 и 2, DR3 и DR6) в раннем В-клеточном развитии отсутствует. Мутации гена FADD, кодирующего главный элемент Fas-проксимальной сигнальной трансдукции, общий для всех рецепторов смерти, легальны.

Исследования молекулярных механизмов BCR-индуцированного апоптоза проведены в большинстве случаев на двух основных моделях: 1) клеточные линии незрелых В-лимфоцитов, такие как линия WEHI-231 из мышиной В-клеточной лимфомы; 2) клеточные линии из лимфом Беркитта. Все данные по биохимии BCR-индуцированной В-клеточной смерти совпадают в том, что митохондрии являются ее главными исполнителями. В частности, показано, что блокада апоптосомной функции фармакологическими агентами предотвращает активацию каспаз и BCR-индуцированный апоптоз, а гиперэкспрессия Вс12 и Bcl-XL уничтожает В-кпеточную толерантность. BCR-индуцированный апоптоз регулируется на митохондриальном уровне и не вовлекает рецепторы смерти. Это убедительно продемонстрировано тем, что доминантно-негативная форма FADD не способна предотвратить апоптоз клеток лимфомы Беркитта, экспонированных к антигену.

3.3. Регуляция В-клеточного гомеостаза

1. До индукции иммунного ответа. Во взрослом здоровом организме число клеток в периферии строго контролируется и остается константным, несмотря на непрерывное поступление вновь сформированных В-клеток из костного мозга и избирательной экспансии некоторых В-клеточных клонов после антигенной стимуляции. Ежедневной продукции В-клеток достаточно для полного обновления периферического пула за 5-6 дней. Считается, что размер периферического пула регулируется меж-клональной конкуренцией, отчасти зависящей от функционального антигенного рецептора, что подтверждается быстрой гибелью периферических В-лимфоцитов в случае аблации BCR. Специфичность BCR также является важным параметром межкло-нальной конкуренции. Возникает вопрос, требуется ли связываение BCR с лигандом для доставки сигнала выживания? Делеция V-области BCR резко редуцирует конкурентоспособность и сокращает продолжительность жизни В-клеток. Следовательно распознавание антигена через BCR необходимо для персистенции периферических В-лимфоцитов.

2. На пике иммунного ответа. Представление о том, что антиген может сам регулировать размер эффекторной лимфоидной популяции, принято для Т-лимфоцитов, но остается спорным для В-лимфоцитов. Долгое время преобладало мнение о том, что способность BCR трансдуцировать апоптозный сигнал ограничена стадией незрелых В-клеток, где он является инструментом делеции аутореактивных В-клеток. Теперь известно, что связывание BCR может промотировать апоптоз зрелых В-клеток опухолей, таких как лимфома Беркитта! и что зрелые В-клет-ки, предварительно стимулированные связыванием

CD40 или BCR, также чувствительны к BCR-инду-цированному апоптозу. Чувствительность зрелых В-клеток к BCR-индуцированному апоптозу позитивно коррелирует с пролиферативным статусом. BCR-сигналинг приводит к апоптозу зрелых В-лимфоцитов, если сигнал, доставляемый антигеном, превышает оптимальный уровень или доставляется уже активированным и пролиферирующим В-клет-кам. В этом отношении BCR-индуцированный апоптоз зрелых В-клеток очень напоминает активный антиген-индуцированный апоптоз Т-лимфоцитов и может предотвратить чрезмерную экспансию активированных В-клеток на пике иммунного ответа.

BCR-индуцированному апоптозу могут препятст-свовать активированные Т-лимфоциты, мембраносвязанные молекулы типа CD40L и CD5, а также растворимые медиаторы, такие как интерфероны типа I (а, р и со) и ИЛ-4. BCR-индуцированный апоптоз репрессирован до тех пор, пока В-клетки имеют доступ к ресурсам (цитокинам, ростовым факторам, Т-клеточной помощи).

3.4. Контроль специфичности и аффинности иммуноглобулинового ответа

1. В начале иммунного ответа В-клеточный апоптоз выполняет две основные функции: сохранение толерантности периферических В-клеток элиминацией аутореактивных В-клеток, избежавших делеции во время раннего развития, и предотвращение активации низкоаффинных или несущественных В-клеточных клонов в контексте Т-зависимого иммуноглобулинового ответа.

Первая встреча Т- и В-клеток имеет место на границе между В-клеточными фолликулами и Т-клеточ-ной областью. Она является вторичной по отношению к активации Т-клеток через распознавание антигенных пептидов, презентируемых дендритными клетками в контексте МНС. Праймированные Т-клетки экспрессируют CD40L (CD154) и обладают способностью стимулировать соответствующие антиген-специфичные В-клетки, а также бесполезные или потенциально опасные В-клетки. Ассоциация комплекса TCR/CD3 на Т-клетках антиген-презентирую-щими клетками проявляется в индукции CD178. Т-кле-точный CD178 участвует в элиминации несоотвест-вующих В-клеток, которые могли случайно получить Т-клеточную помощь. Антиген-специфичные В-клет-ки защищены от Fas-индуцированного апоптоза во время Т/В-клеточного взаимодействия сигналами, доставляемыми через BCR. При десенсибилизации антигенного рецептора уровень BCR-стимуляции в толеризованных аутореактивных В-клетках слишком низок, чтобы защитить их от Fas-индуцировэнной гибели. Такие клетки будут делетированы при встрече с праймированными Т-клетками. Тот же самый механизм обусловливает апоптоз В-клеток, экспрессирующих несоответствующий BCR, если им случится встретиться с праймированными Т-клетками.

Некоторые низкоаффинные В-клеточные клоны могут оставаться чувствительными к Fas-зэвисимо-

му апоптозу, несмотря на их реактивность к иммунизирующему антигну. Система CD95/CD178 также может способствовать селекции В-клеток с наиболее подходящими антигенными рецепторами до начала иммунной реакции в герминальном центре, что согласуется с гипотезой об участии CD95 в межкло-нальной конкуренции в герминальных центрах.

2. Во время созревания аффинности антител. В поздней стадии иммунного ответа созревание аффинности антител (создание высокоаффинных антител) делает возможной продукцию антител с большей антигентсвязывающей аффинностью, чем у антител, продуцированных в ранней фазе ответа. Завершение этого процесса совпадает с развитием герминального центра. Мутации, приводящие к отсутствию формирования герминальных центров, отменяют продукцию высокоаффинных антител в.ответ на иммунизацию. Создание аффинности иммуно-глобулинового ответа выражается в двух процессах, которые имеют место в различных областях герминального центра. Первый процесс — это расширение разнообразия иммуноглобулинового репертуара антиген-активиро-ванных В-лимфоцитов в темной зоне герминального центра, которое осуществляется случайным введением точечных мутаций в V-область иммуноглобулино-вых генов. Мутантные В-клетки могут проявлять более высокую или более низкую аффинность к иммунизирующему антигену или экспрессировать новую специфичность, которая может быть безобидной или вредной, если приводит к аутореактивности. Второй процесс — это этап селекции, происходящий в светлой зоне герминального центра, который позволяет спасти В-клеточные клоны с высокой антиген-связы-вающей способностью, тогда как клоны с низкой аффинностью или нежелательной специфичностью элиминируются. Позитивная селекция соматических мутантов в светлой зоне основывается на их способности к эффективному связыванию и презентации антигена хелперным Т-лимфоцитам. В основе ан-тиген-зависимой селекции В-клеток в герминальном центре .'лежит апоптоз. BCR и CD40 способствуют позитивной селекции, предотвращая В-кпеточный апоптоз. Концепция позитивной селекции, принятая сегодня, заключается в том, что отбираются высо-коафф^нные В-клеточные клоны, получившие последовательно два сигнала, которые блокируют выполнение апоптозной программы. Первый обеспечивается самим антигеном, который воспринимается как иммунный комплекс в сети фолликулярных дендритных клеток. Только те В-клетки, чьи BCR обладают достаточно высокой аффинностью (т. е. способные к перемещению низкоаффинных антител IgM, формирующих иммунные комплексы), получают доступ к антигену и сигнал выживания. Второй сигнал обеспечивается CD40, когда В-клетки презентируют процесЬированные антигенные пептиды в классическом МНС-рестриктированном контексте хелперным Т-клеткам в светлой зоне герминального центра.

3. Роль фолликулярных дендритных клеток (ФДК) в выживании В-клеток герминального центра обус-

1 ____________ ______ ______ _____ ______

ловлена тем, что они презентируют иммунные комплексы. Однако их антиапоптозная функция простирается за пределы простой антигенной презентации. Они могут также защищать В-клетки от апоптоза в ранней стадии иммунного ответа в герминальном центре во время пролиферации и мутирования V-областей их иммуноглобулиновых генов. ФДК препяствуют апоптозному процессу в В-клет-ках герминальногощентра по крайней мере на двух уровнях. Во-первых, они блокируют индукцию Fas-индуцированного сигнала, предотвращая разрушение апоптозного ингибитора FLIR Во-вторых, они блокируют дистальный этап апоптозного каскада выключением нуклеазной активности в ядрах В-кле-ток. Убедительно показана важная роль адгезионных молекул ICAM-1 и VCAM-1, экспрессируемых на ФДК, и их рецепторов LFA-1 и VLA-4 соответственно, на В-лимфоцитах.: Адгезионные взаимодействия между ФДК и В-клетками не отвечают за спасение высокоаффинных мутантов непосредственно, но могут способствовать усилению сигнала выживания, доставляемого антигеном, удерживаемым на ФДК.

3.5. Регуляция выживания В-клеток памяти

1. Пул В-клеток памяти. Главным доказательством того, что персистенция В-клеток памяти нуждается в контакте с иммунизирующим или перекрестно реагирующим антигеном, является тот факт, что В-клетки памяти могут выжить в наивном организме, только если они передаются совместно с,антигеном. Предположение о том, что антиген участвует в регуляции продолжительности жизни В-клеток памяти, подразумевает, что в организме имеются места, в которых В-клетки могут оставаться в контакте с антигеном долгое время после разрешения инфекции. Герминальные центры пред-ставлются вероятными хранилищами запаса антигена. Показано, что у мышей, инфицированных вирусом стоматита (VSV), вирусные белки, ассоциированные с ФДК,| могут персистировать 100 дней после инфекции и что VSV-специфичные В-лимфо-циты определяются в герминальных центрах еще долго после затухания иммунного ответа и разрешения инфекции. Тем не менее долговременная персистенция неразмножающегося антигена формально не доказана.

Уверенность в том, что контакт с антигеном необходим для выживания В-клеток памяти, поколеблено экспериментами, в которых показано, что В-клетки памяти могут заменять свой антиген-специфичный BCR другим, который не распознает иммунизирующий антиген, и оставаться живыми длительный период времени. Это свидетельствует в пользу отсутствия зависимости персистенции В-клеток памяти от иммунизирующего антигена. Кроме того, пул В-кле-ток памяти состоит в основном из неделящихся клеток. Таким образом, В-клеточная память поддерживается долгоживующими покоящимися клетками.

Условием долговременного выживания В-клеток памяти является митохондриальная целостность. Это доказано прежде всего тем, что экспрессия трансгена Вс12 резко увеличивает продолжительность жизни В-клеток памяти после их пересадки наивному реципиенту; Кроме того, размер пула В-клеток памяти у трансгенных по Вс12 животных сильно увеличен. Как именно блокирован митохондриальный путь апопто-за в В-клетках памяти, неизвестно, но некоторые косвенные доказательства указывают на роль специализированной микросреды. Резидентные В-клетки памяти локализуются в определенных микроанато-мических областях, таких как маргинальная зона селезенки и субъэпителиальная зона миндалин.

2. Пул плазматических клеток. Плазматические клетки, продуцированные в ранней фазе первичного иммунного ответа, дифференцируются в так называемых экстрафолликулярных центрах селезеночной белой пульпы. Эти плазматические клетки продуцируют низкоаффинные антитела, поскольку они не накапливают соматические мутации, и исчезают путем апоптоза в течение 14 дней после иммунизации. Низкоаффинные антитела постепенно заменяются высокоаффинными, соматически мутированными антителами, которые продуцированы дифференцированными потомками В-клеток герминального центра. Плазматические клетки, продуцированные в ранней фазе иммунного ответа в экстрафолликулярных центрах селезенки, живуттолько несколько дней. Продолжительность жизни соматически мутированных плазматических клеток, возникающих на поздней стадии иммунного ответа, больше, но не превышает 6-7 дней.

В костном мозге локализуются долгоживущие плазматические клетки, функция которых заключается в поддержании высокого уровня защитных антител, представляющих собой защитный барьер в случае повторной инфекции патогена. Пул долгоживущих плазматических клеток костного мозга не пополняется путем дифференцировки В-клеток памяти, не нуждается в иммунизирующем антигене для своей персистенции и может рассматриваться как компонент врожденного иммунитета, который приобретается de novo в процессе адаптивного иммунного ответа.

Выживаемость плазматических клеток зависит от сохранности митохондриального механизма и под-

держивается усиленной экспрессией некоторых анти-апоптозных членов семейства Вс12. Однако экспрессии Вс12 видимо недостаточно для предотвращения апоптоза плазматических клеток, так как изолированные плазматические клетки претерпевают быстрый апоптоз in vitro, несмотря на конститутивную экспрессию Вс12. Возможно, ген A1/Bfl-1, который кодирует другой антиапоптозный белок семейства Вс12, вовлечен в контроль выживаемости плазматических клеток более специфическим образом. Единственный эффективный способ блокировать апоптоз плазматических клеток in vitro — совместное культивирование с фибробластами костномозгового происхождения, но природа их сигналов неизвестна.

Итак, механизмы, лежащие в основе жизни и смерти иммунных клеток, далеки от состояния полной изученности. Однако доступные в настоящее время данные, суммированные в табл. 1 и на рис. 4, показывают, что апоптоз В-клеток в состоянии равновесия контролируются митохондриями, тогда как в течение иммунного ответа вмешиваются рецепторы смерти (DR) и каспазный каскад. Насколько известно, только CD95 рассматривается в качестве регулятора В-клеточных функций, так как сведения о возможном участии других DR в В-клеточном апоптозе отсутствуют. Известно лишь, что DR3 конститутивно экспрессируется, a TRAIL-R1 и TRAIL-R2 могут быть индуцированы на В-лимфоцитах во время активации, но эти рецепторы не обязательно модулируют В-кле-точный ответ индукцией апоптоза. Они трансдуциру-ют сигналы апоптоза или активации в зависимости от контекста. Так, показано, что стимулирующая функция DR способствует развитию Т-клеток в тимусе, а также что DR, использующие FADD как сигнальную молекулу, позитивно регулируют раннее В^кпеточное развитие. Будущие исследования будут вероятно направлены на понимание молекулярных механизмов регуляции выживания клеток памяти и влияния нелимфоидной микросреды на репрессию их апоптоза.

На схеме (рис. 4) представлен процесс антиген-зависимого созревания В-клеток и стадии развития, на которых величина В-клеточного пула может регулироваться с помощью апоптоза. На этапе 1 могут быть элиминированы клетки двух типов, контактировавшие с активированными Т-клетками: аутореак-

Таблица 1. Регуляция выживания В-лимфоцитов во время лимфопоэза и иммунопоэза

В состоянии равновесия Во время иммунного ответа

Толерантность Гомеостаз Клетки памяти Толерантность Гомеостаз Аффинность антител

Путь апоптоза Митохондри- альный Митохон- дриальный Митохондри- альный Каспазный Митохон- дриальный Каспазно-мито- хондриальный

Ап о птоз - и нду ци ру ю -щие сигналы BCR Не известны Не известны CD95 BCR CD95

Апоптоз-репресси-рующие сигналы Не известны BCRBAFF/ APRIL Не известны BCRHTI-4 Т-клетки ИЛ-4С040 IFN тип Г BCRCD40

Медиаторы выживания Вс!2 ВсІ2 Вс!2 FLIPFAIM Вс!2 FLIPBCI2

Зависимость от DR Нет ____ Нет ____________Не известно _____ Да Нет Да

В ПОМОЩЬ ЛЕКТОРУ

Сигнал:

Вовлечение

Т-клеток:^

Апоптозный

путь:

Низкоаффинные короткоживущие плазматические клетки

Эффективный

BCR-сигнал

t

Наивные Ь-

В-клетки W

Дефектный

BCR-сигнап

1. Элиминация

аутореактивных

В-клеток

CD95

Да

Рецепторный

Активированные В-клетки

&

2. Регуляция величины пула активированных В-клеток

ВСР

Нет

Митохон-

дриальный

Герминальный центр

Темная зона: Увеличение репертуара и экспансия Центробласты

Светлая зона: Селекция и дифферен-цировка Центроциты

J

В-клетки памяти

3. Элиминация 4. Рефляция аугореактивных величины и низкоаффин- пула В-клеток ных В-клеток памяти

CD95

?

Рецепторный + ' митохондриальный

?

?

Митохон-

дриальный

Высоко-

аффинные долгоживущие плазматические клетки

5. Регуляция величины пула плазматических клеток

Митохон-

дриальный

Рис. 4. Апоптоз в В-клеточном иммунопоэзе

тивные В-клетки, избежавшие негативной селекции, и несоответствующие В-клетки. В обоих случаях апоптоз! инициируется взаимодействием CD95 на В-кпетках!и CD95L на активированных Т-клетках. На этапе 2 предотвращается чрезмерная экспансия активированных В-клеток BCR-индуцированным апоп-тозом. Этап 3 имеет место во время иммунного ответа в герминальном центре. В-клеточный апоптоз на этой стадии происходит после расширения репертуара путем соматических мутаций в V-области имму-но-глобулиновых генов для элиминации В-клеточных мутантов, не способных распознавать иммунизирующий антиген или имеющих BCR, чья аффинность ниже, чем у антител, продуцированных в ранней фазе иммунного ответа. Апоптоз на этом этапе инициируется С^Эб и возможно другими рецепторами смерти. На э(тапах 4 и 5 В-клеточный апоптоз позволяет сократить популяции эффекторных клеток и клеток памяти] генерированных во время иммунного ответа. Гибель клеток памяти и плазматических клеток — скорее пассивный, нежели активный процесс и может быть индуцирован сокращением ресурсов.

4. АПОПТОЗ НЕИТРОФИЛОВ

И ЕГО МОДИФИКАЦИИ ПРИ ВОСПАЛЕНИИ

Нейтрофилы — наиболее распространенный

класс гранулоцитов, присутствующих в крови. Они

играют важную роль в механизмах антибактериаль-

ной и антивирусной защиты. Во время острого воспалительного ответа они мигрируют в очаг воспаления и элиминируют патоген либо путем фагоцитоза, либо путем выброса токсичных медиаторов. Кроме того, нейтрофилы усиливают воспалительный ответ продукцией цитокинов и могут следовательно считаться как воспалительными эффекторами, так и иммунорегуляторными клетками. При разрешении воспаления накопленные нейтрофилы должны быть безопасно удалены. Апоптоз играет важную рольв их элиминации из воспаленной ткани без выброса внутриклеточного содержимого в межклеточное пространство. Апоптотические нейтрофилы фагоцитируются другими клетками в результате выброса антивоспалительных медиаторов. Таким образом, апоптоз нейтрофилов контролирует длительность и интенсивность воспалительного ответа и степень нейтрофильного повреждения тканей. Кроме того, апоптоз нейтрофилов является механизмом, поддерживающим надлежащее их количество в физиологических условиях, так как в нормальном взрослом организме человека ежедневно генерируется 1011 зрелых нейтрофилов.

Замедленный апоптоз нейтрофилов ассоциирован с тяжелыми острыми и хроническими болезнями и связан с избыточной продукцией гранулоци-тарного колониестимулирующего фактора (G-CSF) и гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF). Спонтанный апоптоз нейтрофилов может быть индуцирован in vitro отсутствием факторов выживания.

4.1. Апоптозрегулирующие молекулы нейтрофилов

Нейтрофилы экспрессируют рецепторы Fas и его лиганд FasL. Однако, в отличие от Т-лимфоцитов, предположение о том, что спонтанный апоптоз нейтрофилов является следствием аутокринного или па-ракринного взаимодействия FasL с рецептором Fas, не подтвердилось. Более того, повышенная вероятность такого взаимодействия при увеличении плотности очищенных нейтрофилов in vitro выражается скорее в замедлении, нежели усилении их гибели.

Исследования роли TNFa в индукции апоптоза нейтрофилов дали противоречивые результаты. Возможно, TNFa индуцирует апоптоз нейтрофилов только при определенных условиях или только в некоторых субпопуляциях нейтрофилов. Нейтрофилы экспрессируют также рецепторы проапоптозного лиганда TRAIL, но проявляют резистентность к TRAIL. TNFa считается провоспалительным цитоки-ном, однако его генетическая или функциональная нейтрализация усиливает нейтрофильную воспалительную реакцию на инфекцию. В то время как противовоспалительное действие FasL является очевидно следствием индукции апоптоза воспалительных клеток, в том числе нейтрофилов, менее понятно, как TNFa и TRAIL могут редуцировать воспалительный ответ. Есть данные, позволяющие предположить, что противовоспалительное влияние обусловлено активацией CD 137 (4-1ВВ) в нейтро-филах. CD137 —член суперсемействаTNF/NGF-pe-цепторов, лишенный домена DD. В отличие отТ-, В-клеток и моноцитов, экспрессирующих CD137 в зависимости от клеточной активации, нейтрофилы экспрессируют его конститутивно. Функциональная активация анти-CDI 37-антителами отменяет пролиферативный эффект GM-CSF на эти клетки. Подобный регуляторный механизм не обнаружен у С0137-негативных нейтрофилов.

Как в спонтанном, так и в Fas-зависимом апопто-зе нейтрофилов критическую роль играет каспаза 3, так как лишенные ее нейтрофилы не претерпевают апоптоз. Дефицитные по каспазе 1 нейтрофилы демонстрируют замедленный конститутивный апоптоз, но вполне чувствительны к Fas-индуцировэнному. Кроме каспаз 3 и 1, активация каспазы 8 также была отмечена в нейтрофилах, ее инактивация специфичным ингибитором замедляет клеточную гибель. Аналогичная функциональная инактивация каспазы 9 блокирует апоптоз нейтрофилов. Эти данные в совокупности с тем фактом, что гиперэкспрессия Вс12 блокирует апоптоз нейтрофилов, указывает на то, что наиболее важным апоптозным путем в этих клетках является митохондриальный. Это тем более удивительно, что нейтрофилы известны как клетки с ограниченным числом митохондрий.

В нормальных нейтрофилах наблюдается высокий уровень проапоптозных белков семейства Вс12, что является условием короткой продолжительности их жизни. Например, белки Вах и Вак легко оп-

ределяются в терминально дифференцированных нейтрофилах. Нейтрофильный апоптоз ассоциирован с транслокацией цитозольного Вах на внешнюю мембрану митохондрии и последующими выходом цитохрома С и активацией каспазы 3. Все эти события ингибируются фактором G-CSF. Кроме Вах, нейтрофилы экспрессируют проапоптозные белки Вак, Bid, Bad и Bim, а также антиапоптозные — Mcl-1, А1 и Bcl-XL. Наиболее важным представляется белок А1, так как лишенные его нейтрофилы подвергаются ускоренному спонтанному апоптозу. GM-CSF может усиливать экспрессию белков А1 и Mcl-1, что по крайней мере отчасти объясняет антиапоптозное действие ростовых факторов.

Кроме белков Вс12-семейства, в нейтрофилах обнаружена экспрессия ингибиторов апоптоза семейства IAP (IAP-1, IAP-2 и XIAP), которые действуют дистально по отношению к митохондриям и белкам Вс12. Их субтратами являются каспазы 3, 7 и 9. Уровень IAP в нейтрофилах крови повышается под действием G-CSF.

Показана важная роль кальпаина, некаспазной цистеинпротеазы, в регуляции нейтрофильного апоптоза. Кальпаин участвует в процессинге и активации проапоптозного белка Вах и следовательно является важным элементом раннего апоптозно-го события.

4.2. Механизм действия факторов выживания нейтрофилов

Многие медиаторы воспаления являются факторами выживания нейтрофилов. Кроме G-CSF и GM-CSF, к ним относятсялейкотриен-В4, интерлейкины 1(3, 2, 3, 6, 15, LPS и TNF-y. Упомянутые медиаторы как факторы выживания нейтрофилов могут активировать один или более протеинкиназных путей передачи апоптозного(антиапоптозного)сигнала. Например GM-CSF индуцирует тирозинфосфорилиро-вание ряда клеточных белков. Ингибирование этого фосфорилирования отменяет GM-CSF-зависимое выживание клетки. За передачу GM-CSF-сигнала ответственны Jak2/STAT-, PI3K-, и МАРК-пути сиг-

Удаление антигена Растворимые рецепторы Противовоспалительные цитокины Противовоспалительные лекарства

Сигналы выживания

1— 1 SHP-1

I

1 \ /

Другие гены Антиапоптозные гены С/Э —:

Рис. 5. Некоторые регуляторные механизмы, лимитирующие антиапоптозные влияния на нейтрофилы

напьной трансдукции. Активация этих путей индуцирует фосфорилирование и активацию проапоптоз-ных митохондриальных белков в нейтрофилах, а ингибиторы протеинкиназ — блокирует их. Однако результаты исследований довольны противоречивы. Например, специфичный ингибитор протеинкиназы р38МАРК блокирует конститутивный апоптоз нейт-рофилов, но не имеет влияния на антиапоптозное действие GM-CSF.

Механизмы, контролирующие и лимитирующие пролиферацию нейтрофилов, представлены на рис. 5. Ростовые факторы индуцируют экспрессию антиапоптозных и других генов, а также CIS, который блокирует сигналы выживания. Рецепторы смерти и возможно другие поверхностные молекулы способны активировать SHP-1, который также может ингибировать сигнал выживания. Влияние ростовых факторов может быть редуцировано растворимыми рецепторами цитокинов или противовоспалительными цитокинами, а элиминация патогена проявляется в редуцированной продукции ростовых факторов. И наконец, противовоспалительные лекарства часто модифицируют продукцию провоспалительных цитокинов.

Белок SHP-1 {Src homology domain 2 containing tyrosine phosphatase 1) — ингибиторная фосфатаза, активируемая рецепторами смерти. Ингибирование GM-CSF-индуцированного выживания одновременной активацией рецептора Fas значительно ослаблено в дефектных по SHP-1 нейтрофилах. Это говорит о том, что SHP-1 функционирует как ограничитель антиапоптозного сигнала. Такой механизм объясняет, почему SHP-1-дефицитные мыши демонстрируют персистентное нейтрофильное воспаление. Гиперэкспрессия этой фосфатазы обнаружена у пациентов с тяжелой нейтропенией. Повышенный уровень SHP-1 блокирует цитокиновое действие, важное для дифференцировки и ингибиции апоптоза; После активации рецепторов проапоптозных лигандов FasL, TNFa и TRAIL, SHP-1 взаимодействует с анти-апоптозными сигнальными протеинкиназами, де-фосфорилирует и инактивирует их.

Белок. CIS (cytokine-inducible SH2 containing protein 1) связывается с рецепторами цитокинов ИЛ-2, 3, 5 и GM-CSF и негативно регулирует транс-дукцию|их сигналов. Транскрипция самого CIS инициируется транскрипционным фактором STAT, которая активируется цитокинами ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-5 и GM-CSF Таким образом, белок CIS является регуляторов негативной обратной связи в трансдукции сигналов этих цитокинов.

Большая часть данных о связи белков семейства CIS с негативной регуляцией цитокинового сигналин-га получена на моделях гиперэкспресии in vivo и in vitro. Ген CIS1 идентифицирован в нейтрофилах как GM-CSF-индуцибельный. Это позволяет предположить* что CIS1 может играть главную роль в подавлении ответов этих клеток на ИЛ-3 и GM-CSF Поскольку индуцированная экспрессия CIS1 не предотвращает антиапоптозный. эффект GM-CSF на

нейтрофилы, следует заключить, что эта петля негативной обратной связи недостаточно эффективна, чтобы полностью блокировать GM-CSF-сигналинг.

Исследователями ряда лабораторий показано, что число нейтрофилов регулируется in vivo не только их продукцией в костном мозге, но и уровнем апоптоза. В очагах воспаления апоптоз замедляется, когда прилегающие клетки продуцируют ростовые факторы, или даже аутокринной продукцией провос-палительными цитокинами. Многие компоненты апоптозного механизма и сигнальные молекулы, замедляющие нейтрофильный апоптоз, могут быть обнаружены в клетках и других типов. Другие молекулы, такие как кальпаин и SHP-1, могут играть более специфическую роль в регуляции нейтрофильного апоптоза. Кроме того, тот факт, что кортикостероиды блокируют нейтрофильный апоптоз, но индуцируют апоптоз во многих других клетках, подсказывает, что между нейтрофилами и другими клеточными типами существуют различия в апоптоз-регулирую-щих путях, которые еще слабо изучены.

Точное знание внешних и внутренних регуляторов развития, жизни и смерти клеток иммунной системы поможет пониманию молекулярных дефектов, лежащих в основе иммунодефицитов и злокачественной трансформации, а также созданию соответствующих терапевтических подходов.

I

Литература

1: Новик А.А., Камилова Т.А., Цыган В.Н. Введение в

молекулярную биологию канцерогенеза: Учебное пособие /Под ред. Ю.Л.Шевченко — М.: Гэотар-мед, 2004. - 224 с.

2. Цыган В.Н., Булавин Д.В., Живолупов С.А. Роль глутатиона S-трансферазы Р1-1 и системы глутатиона в регулировании клеточной пролиферации и апоптоза// Тр. Воен.-мед. акад.,

Т. 245. - СПб., 1998. - 232 с.

3. Baumann S., Krueger A., Kirchhoff S., Krammer PH. Regulation of Tcell apoptosis during the immune response// Curr. Mol. Med. - 2002. - Vol. 2, N3.- P. 257-272.

4. Defrance Т., Casamayor-Palleja М., Krammer P.H.

The life and death of a В cell//Adv. Cancer Res. —

2002. - Vol. 86. - P. 195-225.

6. Lenardo М., Ka-Ming Chan F., Hornung F. Mature T lymphocyte apoptosis - immune regulation in a dynamic and unpredictable antigenic environment// Annu. Rev. Immunol. — 1999. — Vol. 17. — P. 221-253.

7. Simon H.-U. Neutrophil apoptosis pathways and their modifications in inflammation // Immunol. Rev. —

2003. - Vol. 193. - P. 101-110.

8. Viret C., Janeway C.A. MHC and Tcell development//

J. Rev. Immunogenet. — 1999. — Vol. 1, N1.— P. 91-104.

9. Diefenbach A., Raulet D.H. Tne innate immune response to tumors and its role in the induction of T-cell immunity// Immunol. Rev. — 2002. — Vol. 188. — P. 9-21.

10. Rammensee H.-G., Weinschenk Т., Gouttenfangeas C., Stevanovic S. Towards patient-specific tumor antigen selection for vaccination // Immunol. Rev. — 2002. — Vol. 188.-P. 164-176.