Способ биодеградации малахитового зеленого (варианты)
METHOD OF BIODEGRADATION OF MALACHITE GREEN (OPTIONS)

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к биодеградации токсических соединений с помощью микроорганизмов. Предложен способ биодеградации малахитового зеленого. Способ предусматривает процесс разложения малахитового зеленого свободными клетками или бесклеточным экстрактом штамма Azospirillum brasilense SR80, при этом деградация красителя осуществляется непосредственно живыми клетками, эффективность которой с увеличением времени культивирования, по мере роста культуры возрастает, что позволяет рассматривать используемый штамм как потенциальный агент для очистки окружающей среды, а использование бесклеточного экстракта штамма позволяет сократить срок 100% биоредукции малахитового зеленого до 5 часов.
Малахитовый зеленый - краситель трифенилметанового ряда. Традиционно его используют для окраски шелка, кожи и бумаги для визуализации микроскопических препаратов, как индикатор рН в криминалистике. Малахитовый зеленый обладает мощными фунгицидными и антибактериальными свойствами, и активно применяется в аквариумистике, и в аквакультуре. В странах Евросоюза и США данный краситель запрещен к применению в рыбных хозяйствах, однако благодаря его дешевизне и широкому спектру действия, на территории многих стран он применяется или используется нелегально. Запреты на использование красителя в аквакультуре обусловлены опасностью для здоровья человека от употребления в пищу содержащей его рыбы. Показано, что данный краситель и его восстановленная форма обладают высокой степенью канцерогенности и тератогенности и способны к бионакоплению в тканях растений и животных. Загрязнение воды и почвы данным веществом также происходит в результате сброса в акваторию недоочищенных сточных вод текстильных предприятий, которые также используются на полях сельскохозяйственного назначения.
Существуют физико-химические и биологические методы разложения малахитового зеленого. Физико-химические методы требуют крупных инвестиций, а также трудозатратны, кроме того, с помощью физической адсорбции и седиментации не удается полностью удалить малахитовый зеленый из сточных вод, что способно вызвать вторичное загрязнение. В связи с этим для минимизации экологических рисков от промышленного использования малахитового зеленого, в последние годы активно идет поиск и разработка новых методов биоредукции данного соединения.
Известен способ биологического разрушения малахитового зеленого с использованием энтеробактерий рода Pantoea (см. патент № CN 101050436 А, опуб. 10.10.2007 г.). Согласно данному способу бактерии вносят в стерильную среду, содержащую малахитовый зеленый в концентрации 0,5-2 мг/л, и культивируют в шейкерах при температуре 20-30°C, при этом в течение 5-10 дней отмечают деградацию красителя, которая с увеличением времени, по мере роста культуры, достигает 90%.
Недостатками данного способа является длительность технологического процесса, а также неоправданные экологические риски с использованием представителей рода Pantoea, которые считаются возбудителями оппортунистических инфекций.
Известен способ деструкции малахитового зеленого с использованием Enterobacter CV-v (патент № CN 104830729 А, опуб. 07.05.2015 г.), включающий выращивание данного штамма на богатой питательной среде, с последующей инокуляцией большим числом бактерий (0.2 г/л) среды с высоким содержанием малахитового зеленого. Деградация красителя проводится при инкубации на шейкере в широком диапазоне температур, с достижением степени деколоризации через 6 часов от 40% до 90%.
Недостатком данного способа является, то, что процесс деколоризации малахитового зеленого осуществляется с внесением большого количества посевного материала, кроме того, предварительное культивирование бактерии идет с использованием богатой питательной среды, что требует дополнительных вложений.
Наиболее близким к заявленному является способ биоредукции с использованием штамма Rhodococcus JB301 (патент № CN 102618462 В, опуб. 17.04.2013 г.). Согласно данному способу бактерии, выращенные до логарифмической фазы в течение 48 часов, а затем 24 часов в 40 мл богатой питательной среды собирают центрифугированием и смешивают с аналогичным объемом стерильной среды, содержащей малахитовый зеленый в концентрации 25-50 мг/л, и инкубируют в шейкерах при 27-30°C, через 8 часов отмечают степень деградации красителя от 80 до 96% в зависимости от условий.
Недостатками данного способа, как и предыдущего аналога является его высокая себестоимость, поскольку требуется значительных материальных затрат на подготовку богатой питательной среды для культивирования, а также использование большого количества бактериальных клеток. Существенным недостатком данного способа является его многостадийность, а также то, что биодеструкция с использованием штамма Rhodococcus JB301 возможна только при смешивании бактериальной биомассы, выращенной до этого в течение 48 часов, а затем 24 часов до логарифмической стадии роста в равных объемах, со средой, содержащей краситель, что исключает возможность осуществлять процесс деградации красителя непосредственно живой нарастающей культурой.
В данном изобретении наряду с обнаружением способности к деколоризации малахитового зеленого планктонными клетками штамма Azospirillum brasilense SR80 в процессе культивирования, впервые показано свойство к деструкции красителя бесклеточными экстрактами данного штамма.
Техническим результатом предлагаемого способа является обеспечение полной деструкции малахитового зеленого, предусматривающий использование нарастающей культуры непатогенного микроорганизма, и вследствие этого повышение экологической безопасности природной среды, а также повышение эффективности процесса биоредукции красителя за счет сокращения объема вносимого инокулята, выращивания на бедной по составу среде и снижения продолжительности технологии процесса.
Данный технический результат достигается реализацией заявляемого способа биодеградации малахитового зеленого, заключающийся во взаимодействии в жидкой среде красителя с планктонными бактериями штамма Azospirillum brasilense SR80, либо с бесклеточным экстрактом используемого микроорганизма.
7
При осуществлении процесса деградации малахитового зеленого планктонной культурой одновременно с посевным материалом (12-часовая культура) в количестве 1-2% от конечного объема (т.е. 10 кл/мл) в культуральную среду вносят краситель в конечной концентрации 0,01-0,1 мМ. Культивирование бактерий в бедной по составу культуральной среде, содержащей источники углерода, азота, фосфора и минеральные соли. Бактерии выращивают при 35°C 2-10 дней.
При осуществлении процесса деградации малахитового зеленого бесклеточным экстрактом штамма Azospirillum brasilense SR80, культуру клеток выращивают в течение 48 часов бедной по составу культуральной среде, содержащей источники углерода, азота, фосфора и минеральные соли, используя инокулят в количестве 1-2% от конечного объема. По окончании культивирования клетки осаждают в течение 15 мин при 7000 g центрифугированием. Супернатант используют для биодеградации красителя, который вносят в бесклеточный экстракт в конечной концентрации 0,01-0,1 мМ, инкубацию проводят при температуре 35°C в течение 1-5 часов.
Осуществление заявленного способа обеспечивает высокую эффективность разрушения малахитового зеленого указанным штаммом азоспирилл. Если процесс ведут с применением планктонных клеток эффективность деколоризации малахитового зеленого составляет более 80% от исходной концентрации через 2-е суток культивирования, с дальнейшим полным исчезновением (утилизацией) красителя в среде. Если процесс ведут с использованием бесклеточных экстрактов эффективность деградации малахитового зеленого составляет более 80% через 1 час инкубирования, с полной деструкцией красителя через 5 часов.
Изобретение направлено на обеспечение полной деструкции малахитового зеленого на основе эффективной технологии процесса биодеградации с использованием культуры Azospirillum brasilense SR80. Применяемый в способе штамм Azospirillum brasilense SR80 (IBPPM 24) является известным, содержится в Коллекции ризосферных микроорганизмов Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук (г. Саратов, Россия).
Таким образом, заявленный способ оказался эффективным в отношении удаления красителя малахитового зеленого из жидких сред и может быть применен для очистки сточных вод, содержащих данный краситель. Также штамм Azospirillum brasilense SR80 может являться потенциальным агентом для удаления малахитового зеленого из загрязненных почв сельскохозяйственного назначения.
Изобретение поясняется следующими изображениями.
Фиг. 1 Деградация 0,01 мМ малахитового зеленого планктонной культурой Azospirillum brasilense SR80, влияние времени культивирования.
Фиг. 2 Оптическая спектроскопия образцов, содержащих 0,01 мМ малахитовый зеленый: 1 - начальное поглощение (контроль); 2 - после 48 часов культивирования в присутствии культуры Azospirillum brasilense SR80, 3 - поглощение после 3 часов инкубации с бесклеточным экстрактом.
Фиг. 3 Хроматографический профиль элюции малахитового зеленого до и после деградации: 1 - 0 часов; 2-48 часов культивирования в присутствии культуры Azospirillum brasilense SR80, 3-3 часа инкубации с бесклеточным экстрактом.
Фиг. 4, 5 Деградация 0,1 мМ; 0,05 мМ и 0,01 мМ малахитового зеленого бесклеточным экстрактом Azospirillum brasilense SR80, влияние времени культивирования.
Способ иллюстрируют 2 примера.
нач
кон
Пример 1. Деградация 0,01 мМ малахитового зеленого планктонной культурой Azospirillum brasilense SR80, влияние времени культивирования. Культуру Azospirillum brasilense SR80 выращивали при температуре 35°C на жидкой малатно-солевой среде. Одновременно с внесением посевного материала в стерильных условиях в среду культивирования вносили малахитовый зеленый в конечной концентрации 0,01 мМ. Разрушение малахитового зеленого оценивали спектрофотометрически через 2, 4, 6, 8 суток культивирования бактерий в присутствии красителя (Фиг. 1, Фиг. 2). Степень деградации красителя выражали в процентах и рассчитывали по формуле:  где А - начальное поглощение, а А - конечное поглощение красителя после культивирования. Степень деградации красителя возрастала с увеличением времени культивирования, на 2-е сутки была более 80%, а на 10-е сутки культивирования - около 100% (Фиг. 1, Фиг. 2). Так же разрушение красителя подтверждали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (Фиг. 3).
Пример 2. Деградация малахитового зеленого бесклеточным экстрактом штамма Azospirillum brasilense SR80, влияние времени культивирования. Культуру клеток выращивали в течении 48 часов на жидкой бедной по составу малатно-солевой среде. По окончании культивирования клетки осаждали центрифугированием в течение 15 мин при 7000 g. Супернатант (бесклеточный экстракт) использовали для биодеградации красителя, который вносили в конечной концентрации 0,01 мМ - 0,1 мМ, инкубацию проводили при температуре 35°C. Разрушение малахитового зеленого определяли спектрофотометрически через 1, 3, и 5 часов. Деградацию красителя оценивали как в Примере 1 (Фиг. 2, Фиг. 3, Фиг. 4, Фиг. 5). Степень деструкции малахитового зеленого во всех исследуемых концентрациях была выше 80% уже через 1 час инкубации красителя с бесклеточным экстрактом Azospirillum brasilense SR80. Через 5 часов инкубации отмечалось 100% удаление красителя из среды.