СПОСОБЫ И КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ САЙЛЕНСИНГА ГЕНОВ С ПОМОЩЬЮ ИСКУССТВЕННЫХ МИКРОРНК

1. Полинуклеотидный конструкт, содержащий
(a) первый элемент, содержащий рекомбинантный конструкт для экспрессии, который содержит полинуклеотид, представляющий интерес, характеризующийся по меньшей мере 80% идентичности последовательности с целевой последовательностью; и
(b) второй элемент, содержащий рекомбинантный конструкт для экспрессии miRNA,
где указанный рекомбинантный конструкт для экспрессии miRNA кодирует miRNA, состоящую из 21 нуклеотида (21-нуклеотидную), и где указанная miRNA при экспрессии в растительной клетке снижает уровень мРНК целевой последовательности без снижения уровня мРНК указанного первого элемента.
2. Полинуклеотидный конструкт по п. 1, где указанная кодируемая miRNA соответствует цепи, комплементарной участку мРНК целевой последовательности, где указанный участок содержит 3 или менее нуклеотидов, не комплементарных указанной 21-нуклеотидной miRNA; и
где указанная miRNA содержит 5 или более нуклеотидов, не комплементарных любому заданному участку по всей длине мРНК, кодируемой полинуклеотидом, представляющим интерес.
3. Полинуклеотидный конструкт по п. 2, где указанная цепь, комплементарная участку мРНК целевой последовательности, характеризуется наличием
(a) 2 нуклеотидов, не комплементарных указанной 21-нуклеотидной miRNA;
(b) 1 нуклеотида, не комплементарного указанной 21-нуклеотидной miRNA; или
(c) 100% комплементарности последовательности с указанной 21-нуклеотидной miRNA.
4. Полинуклеотидный конструкт по любому из пп. 1-3, где целевая последовательность является эндогенной по отношению к указанной растительной клетке.
5. Полинуклеотидный конструкт по любому из пп. 1-3, где
(a) указанный первый элемент содержит первый промотор, функционально связанный с указанной последовательностью, кодирующей полинуклеотид, представляющий интерес; и
(b) указанный второй элемент содержит второй промотор, функционально связанный с указанной последовательностью, кодирующей рекомбинантный конструкт для экспрессии miRNA;
где указанные первый и второй промоторы активны в растении.
6. Полинуклеотидный конструкт по любому из пп. 1-3, где указанный первый элемент и указанный второй элемент функционально связаны с одним и тем же промотором.
7. Полинуклеотидный конструкт по любому из пп. 1-3, где указанный полинуклеотид, представляющий интерес, является подвергнутым шаффлингу вариантом целевой последовательности.
8. Полинуклеотидный конструкт по п. 7, где указанная целевая последовательность кодирует представителя семейства белков фосфоенолпируват-карбоксилаз.
9. Полинуклеотидный конструкт по п. 7, где указанная целевая последовательность кодирует RUBISCO-активазу 1.
10. Трансформированная растительная клетка, содержащая
(a) рекомбинантный конструкт для экспрессии, содержащий полинуклеотид, представляющий интерес, характеризующийся по меньшей мере 80% идентичности последовательности по отношению к эндогенной целевой последовательности, экспрессируемой в указанной растительной клетке; и
(b) рекомбинантный конструкт для экспрессии miRNA, который может транскрибироваться в последовательность РНК в указанной растительной клетке,
где указанный рекомбинантный конструкт для экспрессии miRNA кодирует miRNA, состоящую из 21 нуклеотида (21-нуклеотидную), и где указанная miRNA при экспрессии в указанной растительной клетке снижает уровень мРНК указанной эндогенной целевой последовательности без снижения уровня мРНК указанного полинуклеотида, представляющего интерес.
11. Трансформированная растительная клетка по п. 10, где указанная кодируемая miRNA соответствует цепи, комплементарной участку мРНК целевой последовательности, где указанный участок содержит 3 или менее нуклеотидов, не комплементарных указанной 21-нуклеотидной miRNA; и
где указанная miRNA содержит 5 или более нуклеотидов, не комплементарных любому заданному участку по всей длине мРНК, кодируемой полинуклеотидом, представляющим интерес.
12. Трансформированная растительная клетка по п. 11, где указанная цепь, комплементарная участку мРНК целевой последовательности, характеризуется наличием
(a) 2 нуклеотидов, не комплементарных указанной 21-нуклеотидной miRNA;
(b) 1 нуклеотида, не комплементарного указанной 21-нуклеотидной miRNA; или
(c) 100% комплементарности последовательности с указанной 21-нуклеотидной miRNA.
13. Трансформированная растительная клетка по любому из пп. 10-12, где указанный рекомбинантный конструкт для экспрессии, содержащий полинуклеотид, представляющий интерес, и указанный рекомбинантный конструкт для экспрессии miRNA интегрированы в геном растительной клетки в одном и том же полинуклеотидном конструкте.
14. Трансформированная растительная клетка по любому из пп. 10-12, где указанный рекомбинантный конструкт для экспрессии и указанный рекомбинантный конструкт для экспрессии miRNA интегрированы в геном растительной клетки в разных полинуклеотидных конструктах.
15. Трансформированная растительная клетка по любому из пп. 10-12, где указанный полинуклеотид, представляющий интерес, является подвергнутым шаффлингу вариантом целевой последовательности.
16. Трансформированная растительная клетка по п. 15, где указанная целевая последовательность кодирует представителя семейства белков фосфоенолпируват-карбоксилаз.
17. Трансформированная растительная клетка по п. 15, где указанная целевая последовательность кодирует RUBISCO-активазу 1.
18. Растение, содержащее трансформированную растительную клетку по любому из пп. 10-17.
19. Трансгенное семя, содержащее трансформированную растительную клетку по любому из пп. 10-17.
20. Трансформированная растительная клетка по любому из пп. 10-12, 16 или 17, где указанная растительная клетка получена из двудольного растения.
21. Трансформированная растительная клетка по п. 20, где указанным двудольным растением является соя, Brassica, подсолнечник, хлопчатник или люцерна.
22. Трансформированная растительная клетка по любому из пп. 10-12, 16 или 17, где указанная растительная клетка получена из однодольного растения.
23. Трансформированная растительная клетка по п. 22, где указанным однодольным растением является маис, сахарный тростник, пшеница, рис, ячмень, сорго или рожь.
24. Способ снижения уровня мРНК целевой последовательности в растительной клетке, включающий введение в растительную клетку
(a) рекомбинантного конструкта для экспрессии, содержащего полинуклеотид, представляющий интерес, характеризующийся по меньшей мере 80% идентичности последовательности с эндогенной целевой последовательностью, функционально связанной с промотором, активным в растительной клетке; и
(b) рекомбинантного конструкта для экспрессии miRNA, где указанный рекомбинантный конструкт для экспрессии miRNA кодирует miRNA, состоящую из 21 нуклеотида (21-нуклеотидную);
отличающийся тем, что уровень мРНК указанной эндогенной целевой последовательности снижается относительно уровня мРНК эндогенной целевой последовательности в отсутствие транскрипции указанного рекомбинантного конструкта для экспрессии miRNA, а уровень мРНК указанного полинуклеотида, представляющего интерес, не снижается относительно уровня мРНК указанного полинуклеотида, представляющего интерес, в отсутствие транскрипции указанного рекомбинантного конструкта для экспрессии miRNA.
25. Способ по п. 24, отличающийся тем, что указанный рекомбинантный конструкт для экспрессии, содержащий указанный полинуклеотид, представляющий интерес, и указанный рекомбинантный конструкт для экспрессии miRNA вводят в указанную растительную клетку в одном и том же полинуклеотидном конструкте.
26. Способ по п. 24, отличающийся тем, что указанный рекомбинантный конструкт для экспрессии, содержащий указанный полинуклеотид, представляющий интерес, и указанный рекомбинантный конструкт для экспрессии miRNA вводят в указанную растительную клетку в разных полинуклеотидных конструктах.
27. Способ по любому из пп. 24-26, отличающийся тем, что указанная кодируемая miRNA соответствует цепи, комплементарной участку мРНК целевой последовательности, где указанный участок содержит 3 или менее нуклеотидов, не комплементарных указанной 21-нуклеотидной miRNA; и
где указанная miRNA содержит 5 или более нуклеотидов, не комплементарных любому заданному участку по всей длине мРНК, кодируемой полинуклеотидом, представляющим интерес.
28. Способ по п. 27, отличающийся тем, что указанная цепь, комплементарная участку мРНК целевой последовательности, характеризуется наличием
(a) 2 нуклеотидов, не комплементарных указанной 21-нуклеотидной miRNA;
(b) 1 нуклеотида, не комплементарного указанной 21-нуклеотидной miRNA; или
(c) 100% комплементарности последовательности с указанной 21-нуклеотидной miRNA.
29. Способ по любому из пп. 24-26 или 28, отличающийся тем, что
(a) указанный рекомбинантный конструкт для экспрессии содержит указанный представляющий интерес полинуклеотид, функционально связанный с первым промотором; и
(b) указанная последовательность, кодирующая указанный рекомбинантный конструкт для экспрессии miRNA, функционально связана со вторым промотором,
где указанные первый и второй промоторы активны в растении.
30. Способ по любому из пп. 24-26 или 28, отличающийся тем, что указанный рекомбинантный конструкт для экспрессии и указанный рекомбинантный конструкт для экспрессии miRNA функционально связаны с одним и тем же промотором.
31. Способ по любому из пп. 24-26 или 28, отличающийся тем, что указанный полинуклеотид, представляющий интерес, является подвергнутым шаффлингу вариантом целевой последовательности.
32. Способ по п. 31, отличающийся тем, что указанная целевая последовательность кодирует представителя семейства белков фосфоенолпируват-карбоксилаз.
33. Способ по п. 31, отличающийся тем, что указанная целевая последовательность кодирует RUBISCO-активазу 1.
34. Способ по любому из пп. 24-26, 28, 32 или 33, отличающийся тем, что указанная растительная клетка получена из двудольного растения.
35. Способ по п. 34, отличающийся тем, что указанным двудольным растением является соя, Brassica, подсолнечник, хлопчатник или люцерна.
36. Способ по любому из пп. 24-26, 28, 32 или 33, отличающийся тем, что указанная растительная клетка получена из однодольного растения.
37. Способ по п. 36, отличающийся тем, что указанным однодольным растением является маис, сахарный тростник, пшеница, рис, ячмень, сорго или рожь.