СПОСОБ СПЕЦИФИЧЕСКОГО ВЫДЕЛЕНИЯ ПОЛНОГО ДНК-СОДЕРЖИМОГО БАКТЕРИАЛЬНЫХ ВОБУДИТЕЛЕЙ ИНФЕКЦИИ И НАБОР, ИСПОЛЬЗУЮЩИЙСЯ ДЛЯ ЭТИХ ЦЕЛЕЙ

2
2
1. Способ специфического выделения полного ДНК-содержимого бактериальных возбудителей инфекции из образцов, в ходе которого клетки лизируют, ДНК-содержимое лизата выборочно связывают, промывают и затем обессоленную линейную полимерную нуклеиновую кислоту элюируют со связывающей поверхности водным раствором, отличающийся тем, что на предварительном этапе нежизнеспособные клетки отделяют от жизнеспособных на основе различных физико-химических свойств их клеточной поверхности, различной проницаемости поверхности этих клеток и аффинитета ионов, используя промывочный раствор с различной проникающей способностью, содержащий детергент и электролит, предпочтительно буферную смесь из Тритона Х-100, этилендиаминтетрауксусной кислоты, KCl или NaCl, моногидрата лимонной кислоты; при этом изменяют центробежную силу, влияющую на осаждение клеток, в результате чего только двухцепочечные ДНК, полученные при лизисе жизнеспособных клеток, связывают с матрицей -SiO-TiO-, содержащей химически активированные группы -ОН и додециламиновые группы.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что лизис жизнеспособных бактериальных клеток проводят путем механического разрушения, производимого с использованием настольного оборудования, или комбинированного механического и ферментативного разрушения, предпочтительно расщепления лизоцимом, в специально изготовленных пробирках для разрушения клеток.
4
2
2
3. Способ по п.2, отличающийся тем, что двухцепочечное ДНК-содержимое бактериального образца, содержащего не менее 10 КОЕ/мл, выделяют с использованием буфера для лизиса, содержащего окислительно-восстановительный компонент, хелатирующий агент и детергенты, предпочтительно дитиотреитол (ДТТ), этилендиаминтетрауксусную кислоту (EDTA), Тритон Х-100 и натрия додецилсульфат (НДС); при этом возможные окрашивающие агенты, получающиеся из жизнеспособных бактериальных клеток, и ингибиторы ПЦР-амплификации (порфирины, гемовые соединения, полиароматические материалы) отделяют при осаждении бактериального лизата, и свободное от деградации выборочное связывание двухцепочечных ДНК, полученных из лизата жизнеспособных бактериальных клеток, проводят на матрице -SiO-TiO-, содержащей химически-активированные группы -ОН и додециламиновые группы и предварительно поперечно-сшитой додециламиновыми линкерами; и на которой образование неспецифических вторичных связей, в частности, связей РНК, белков и других макромолекул, блокируют путем добавления трегалозы или декстрана, и бычьего сывороточного альбумина (БСА).
260
280
4. Способ по п.3, отличающийся тем, что количество и чистоту выделенной двухцепочечной ДНК проверяют с использованием УФ-спектрофотометра при длине волны 260 нм, и количество и чистоту выделенной двухцепочечной ДНК также проверяют с использованием УФ-спектрофотометра при длине волны 280 нм, после чего проводят сравнение значений оптической плотности ОП и оптической плотности ОП.
5. Набор, предназначенный для выделения полного ДНК-содержимого бактериальных возбудителей инфекции, для реализации способа по п.1, характеризующийся тем, что, прежде всего, он предназначен для анализа воды, продуктов питания, образцов, полученных при исследовании окружающей среды, и других образцов, которые используются в санитарной медицине.