Исследование противоопухолевого эффекта липосомального циклоплатама in vivo

ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО ЭФФЕКТА ЛИПОСОМАЛЬНОГО ЦИКЛОПЛАТАМА IN VIVO

И.Б. Шоуа, Н.М. Перетолчина, А.П. Полозкова, А.В. Ланцова,

Н.А. Оборотова, А.Ю. Барышников

ГУ Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН, г. Москва

Циклоплатам - новое, оригинальное по структуре комплексное соединение платины второго поколения, синтезировано П.А. Чельцовым с сотр. в 1982 г. в Институте общей и неорганической химии им. Н. С. Курнакова РАН. Целью данной работы является создание новой липосомальной лекарственной формы циклоплатама и изучение его противоопухолевого эффекта. В результате исследований показано, что размер полученных липосом с циклоплатамом равен 142 + 3 нм. Работа in vivo проведена на экспериментальной солидной опухоли мышей - меланоме В-16, как наиболее чувствительном штамме опухоли в эксперименте. Представленные данные показывают преимущество липосомальной лекарственной формы циклоплатама перед лиофилизированной, о чем можно судить как по степени торможения роста опухоли, так и по продолжительности противоопухолевого эффекта.

INVESTIGATION OF ANTICANCER EFFECT OF LIPOSOMAL CYCLOPLATAM IN VIVO

I.B. Showa, N.M. Peretolchina, A.P. Polozkova, A.V. Lantsova, N.A. Oborotova, A.Yu. Barishnikov

Russian N.N. Blokhin memorial cancer research center RAMS, Moscow

Cycloplatam is a new complex compound of platinum with original structure was synthesized by P.A. Tchelcov et. al. in 1982 in N.C. Kurnakov Institute of general and inorganic chemistry of RAS. The purpose of this investigation was to create a new liposomal form of cycloplatam and to study its anticancer effect. Average size of liposomes with cycloplatam was 142 + 3 nm. The in vivo study was made on a murine melanoma B-16. Received data demonstrates the advantage of liposomal form of cycloplatam than lyophilized form on inhibition of tumor growth and on duration of the effect.

Циклоплатам (S(-) малатоамин (циклопенталамин) платина (II) - новое, оригинальное по структуре комплексное соединение платины второго поколения синтезировано П.А. Чельцовыш с сотрудниками в 1982 г. в Институте общей и неорганической химии им.

Н.С. Курнакова РАН. Механизм действия циклоплата-ма во многом совпадает с механизмом действия цисп-латина и других производных платины. Циклоплатам ковалентно связытается с ДНК с образованием аддук-тов в положении N-7 гуанина и аденина, которые в отсутствие процессов репарации способны реагировать с нуклеофильными центрами пуриновык оснований или белка с образованием сшивок ДНК-ДНК или ДНК-белок [2, 4]. Можно предположить, что ингибирование синтеза ДНК в клетках, индуцированное циклопла-тамом, обусловлено не только образованием сшивок ДНК-ДНК, но и действием на ДНК-полимеразу а. Межи внутринитевые сшивки блокируют репликацию ДНК, что ведет к гибели злокачественной клетки [3].

В ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН быши проведены исследования противоопухолевой активности

циклоплатама на перевиваемых опухолях животных. Клинические испытания препарата были начаты в 1991 г., показано, что он обладает широким спектром противоопухолевого действия - эффективен при лечении больных раком яичников, мезотелиомой плевры, раком шейки матки, предстательной железы, множественной миеломой. Однако следует отметить, что основным недостатком препарата является его общая токсичность, в том числе нефротоксичность, способность вызывать миелосупрессию, гастроинтестинальные нарушения.

Целью данной работы является создание новой липосомальной лекарственной формы циклоплата-ма и изучение его противоопухолевого эффекта.

Материалы и методы

Лиофилизированная форма циклоплатама создана в лаборатории разработки лекарственных форм НИИ ЭДиТО ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. Экспериментально установлены также режимы применения

препарата - ежедневное введение в дозе 20-25 мг/кг в течение 5 дней или 3-кратное применение в дозе 40-50 мг/кг каждый 4-й день [1]. Рекомендованными дозами для циклоплатама в клинике являются 100 мг/м2 или для ранее леченных и ослабленных больных -80 мг/м2 с 1 -го по 5-й день . Препарат вводится внутривенно капельно в 400 мл 5 % раствора глюкозы.

Получение малых однослойных липосом (МОЛ) с циклоплатамом

При получении малых однослойных липосом с циклоплатамом использовали метод гидратации, при этом липидную пленку получали вакуум-упариванием раствора липидов в хлороформе при постоянном перемешивании с помощью роторного испарителя (ИР- 1М). Липидную пленку смывали раствором цик-лоплатама, который включается в водное пространство липосом.

Липосомальную суспензию МОЛ получают путем сонифицирования в ультразвуковой ванне в течение 30 мин с частотой 20 кГ ц. Для получения липо-сом с одинаковыми размерами, увеличения гомогенности и стерилизации суспензии применили экструзию через поликарбонатные мембраны. Размер липосом определяли с помощью прибора NICOMP MODEL 380, США. Для освобождения липосомальной суспензии от несвязавшегося циклоплатама проводили равновесный диализ. Определение количественного содержания циклоплатама в липосомах про водили методом УФ-спектрофотометрии.

Изучение противоопухолевой активности липо-сомального циклоплатама in vivo

Оценка активности препарата проведена in vivo на модели перевиваемой солидной опухоли мышей - меланоме В-16, как наиболее чувствительном штамме опухоли. Меланома В-16 описана в 1954 г. Geran et. al. как спонтанно возникшая в коже мыши C57B1/6 около глаза [1-3]. Она относится к числу быстрорастущих опухолей, средняя продолжительность жизни мышей с опухолью составляет 22-30 дней. Химиотерапевтический эксперимент выполнен на самцах-гиб-ридах первого поколения C57B 1/6хDBА/2-F 1. Животные были получены из питомника ГУ РОНЦ РАМН, содержались в одинаковых условиях вивария с брикетированным режимом кормления. В опытах использованы мыши-самцы массой 18-20 г в возрасте

1,5-2 мес. Количество животных в контрольных группах составляло 10 мышей, в опытных группах -7-9 мышей. Инокуляцию опухолевых клеток проводили подкожно в правую подмышечную область, каждой мыши вводили по 50 мг опухолевой взвеси в среде 199 в разведении 1 : 10 (5х10 6 клеток).

Режимы введения и дозы циклоплатама in vivo

Лечение мышей начинали через 48 ч после подкожной трансплантации опухолевых клеток. Лиофи-лизированную и липосомальную формы циклопла-тама готовили ex tempore, разводили в 5 % растворе глюкозы и вводили внутривенно в хвостовую вену мышей 3 раза каждый 3 -й день.

Оценка результатов

Критериями эффективности исследуемых препаратов служили:

1. Торможение роста опухоли (ТРО), которое вычисляли по формуле

Vk - Уо

ТРО% =-----------х 100,

Vk

где Vk и Уо - средний объем опухоли (мм3) в контрольной и опытной группах соответственно, который определяли как произведение трех величин перпендикулярных диаметров опухолевого узла. Измерение объема опухолей проводили на 7, 9, 12, 16, 20-е сут после перевивки опухоли.

2. Увеличение продолжительности жизни (УПЖ) леченых животных по сравнению с контрольными животными, которое вычисляли по формуле

По - Пк

УПЖ% =-----------х100,

Пк

где По и Пк - средняя продолжительность жизни в опытной и контрольной группах животных соответственно.

3. О токсическом действии двух лекарственных форм препарата судили по числу павших животных до начала гибели животных в контрольной группе, по изменению массы тела, а также массы селезенки, макроскопической картине внутренних органов.

Статистическую обработку данных проводили по методу Фишера - Стьюдента и Колмогорова - Смир-

Исследование противоопухолевого эффекта липосомального циклоплатама in vivo

41

нова. Различия сравниваемых величин считали достоверными при р < 0,05.

Активными в противоопухолевом отношении принято считать препараты, которые вызывают торможение роста опухоли более чем на 50 % или увеличение продолжительности жизни животных более чем на 25%.

Результаты и обсуждение

Для стандартизации липосомальной суспензии использовали следующие критерии: размер липосом, содержание препарата в липосомах, противоопухолевая активность циклоплатама в липосомальной лекарственной форме. В результате исследований было показано, что размер липосом с циклоплатамом составил 142 + 3 нм. Эффективность включения циклоплатама в липосомы составила 68 %.

Исследование противоопухолевой активности ли-посомальной и лиофилизированной форм циклопла-тама проведено на мышах с меланомой В-16, в диапазоне доз 30-50 мг/кг. В эксперименте было 2 контрольные группы: мыши, которые не получали лечения (контроль1), и мыши, которым вводили пустые липосомы (контроль2) в том же объеме, что и липосо-мальный циклоплатам в дозе 50 мг/кг (табл. 1). Животным в опытных группах вводили липосомальную форму либо лиофилизировнную форму циклоплатама.

При сравнительном изучении противоопухолевой активности липосомальной и лиофилизирован-ной формы циклоплатама показано, что при введении липосомального циклоплатама в дозе 30 мг/кг торможение роста опухоли в начале опыта составило 71 %, к концу эксперимента - 52 %; тогда как при введении лиофилизированной формы препарата в той же дозе ТРО было ниже и составило - 43 % в начале и 44 % в конце опыта (табл. 1). При использовании ли-посомального циклоплатама в дозе 40 мг/кг ТРО составило 68 % в начале эксперимента, а в его конце (20-е сут) снижалось до 52 %; для лиофилизирован-ной формы в той же дозе ТРО составило 56% в начале и 37 % в конце исследования. Как видно из табл. 1, оптимальный противоопухолевый эффект наблюдается после полного курса лечения на 12-16-е сут. При введении липосомальной формы циклоплатама в дозе 50 мг/кг ТРО в начале опыта при этом составило 76 %, к 12-м суткам эффект нарастает до 82 %, однако к 16-м суткам начинается гибель животных от токсичности, и концу опыта она достигает 67 %. В случае

применения лиофилизированной формы величина эффекта в этой же дозе определена в 52 %, а в конце эксперимента она снижается до 31 % (табл. 1). Г ибе-ли мышей от токсичности при этом не наблюдается.

Таблица 1 Действие лиофилизированной и липосомальной форм циклоплатама на рост меланомы В-16 при внутривенном введении

Г руппа опыта Доза, мг/кг ТРО % по объему опухоли. Дни опыта

7 9 12 16 20

Лиофили- зированная форма циклоплатама 30 43 20 48' 48 44

40 56 10 57' 37' 37'

50 52 34 59' 46' 31

Липосомальная форма циклоплатама 30 71' 36 64' 57' 52

40 68' 44 75' 72' 52'

50 76' 57' 82*' ''

Контроль1 - 582 +329 2225 +702 7103 +1453 12436 +2642 20239 +2919

Контроль2 - 749 +334 2071 +418,2 5462 +858 12420 +3222 16878 +3501

Примечание: контроль1 - мыши без лечения;контроль2 -мыши, которым вводили пустые липосомы в том же объеме (0,5 мл2), что и липосомальный циклоплатам в дозе 50 мг/кг; * - р<0,05; ** - к 16-20-м сут 67% животных погибли от

токсичности.

Таблица 2 Действие лиофилизированной и липосомальной форм циклоплатама на рост опухоли и продолжительность жизни мышей с меланомой В-16

Группа опыта Доза, мк/кг Ср.масса опухоли ТРО, % по массе опухоли СПЖ, дни УПЖ,%0

Контроль1 9 10,5+2,5 9 23,1+2,4 9

Контроль2 9 10,0+2,3 0 24,8+7,4 7

Лиофили- зированная форма циклоплатама 30 12,2+2,5 +16 24,0+3,9 4

40 9,2+3,5 12 293+1,0 27

50 8,2+4,3 22 25,3+1,3 10

Липосомальная форма циклоплатама 30 8,0+2,2 20 26,0+2,1 13

40 4,5+2,8 55 29,5+8,3 28

50 3,6+1,2 64 15,3+2,2 934

Примечание: контроль1 - мыши без лечения;

контроль2 - мыши, которым вводили пустые липосомы в том же объеме (0,5 мл2), что и липосомальный циклоплатам в дозе 50 мг/кг; * - УПЖ со знаком “-” означает гибель животных раньше контроля от токсического действия.

Средняя масса опухоли в контрольной группе, в которой мыши получали пустые липосомы, составила 10 ± 2,3 г, что практически не отличалось от показателей средней массы опухоли в контрольной группе без лечения - 10 ± 2,5 г (табл. 2). В группе животных, леченных липосомальным циклоплатамом в дозе 30 мг/кг, средняя масса опухоли составила - 8,0 ± 2,2 г, тогда как при введении такой же дозы лиофилизиро-ванного препарата - 12,2 ± 2,5 г. В группе мышей, получавших 40 мг/кг, - 4,5 ± 2,8 г, при той же дозе лиофилизированного циклоплатама - 9,2 ± 3,5 г. Гибели животных от токсичности в этих группах не наблюдалось. Средняя масса опухоли в группе, получавшей 50 мг/кг липосомальной формы препарата, составила 3,6 ± 1,2 г, лиофилизированного циклоплатама в той же дозе,- 8,2 ± 4,3 г.

Следует отметить, что средняя масса селезенки у мышей, которые получали липосомальную форму циклоплатама в дозе 50 мг/кг, была меньше (44 ± 6,7), чем у мышей, леченных лиофилизированной формой препарата (209 ± 51,6), и у контрольных групп -180,5 ± 64,3 для животных без лечения и 261 ± 39,4 для животных, получавших пустые липосомы. Гибель животных в группе, получавшей липосомальный циклоплатам в дозе 50 мг/кг, наблюдалась раньше, чем в контрольной. Следовательно, в настоящем эксперименте показано, что доза 50 мг/кг для липосомально-го циклоплатама оказалась ниже ранее установленной максимальной переносимой дозы для лиофили-зированной лекарственной формы препарата.

При введении пустых липосом, которые не содержали циклоплатама и состояли из такой же композиции липидов, как и липосомальный циклоплатам, показатели величины опухоли, средней продолжительности жизни животных практически не отличались от показателей в контрольной группе животных, не получавших лечения. Таким образом, композиция

липидов, из которых состояли липосомы, не оказывала влияния на противоопухолевый эффект основного препарата циклоплатама.

Представленные данные свидетельствуют о преимуществе липосомальной лекарственной формы циклоплатама перед лиофилизированной, что подтверждается как более выраженным торможением роста опухоли, так и продолжительностью противоопухолевого эффекта.

Выводы

1. Разработана стабильная липосомальная форма циклоплатама.

2. При использовании липосомального циклоп-латама, по-видимому, меняется биодоступность препарата, в связи с чем диапазон оптимальных терапевтических доз снижается по сравнению с величинами доз препарата в лиофилизированной форме и составляет 30, 40 мг/кг и 40, 50 мг/кг соответственно при внутривенном введении каждый 3-й день.

3. Липосомальный циклоплатам более эффективен при лечении меланомы В-16, чем лиофилизиро-ванная лекарственная форма циклоплатама.

ЛИТЕРАТУРА

1. Kaнoвaлoвa А.Л. Противоопухолевая активность нового противоопухолевого препарата циклоплатам // «Циклоплатам»: Сборник. М.: Изд-во РОНЦ РАМН, 1993. С. 3-15.

2. Ali-Osman F., Berger M.S., Rajagopal S. // Cancer res. 1993. Vol. 53. Р. 5663-5668.

3. Roberts J.J., Tompson A.J. // Prog. Nucl. Acid Res. Mol. Biol. 1979. Vol. 22. P. 71-133.

4. Oswald C., Hall J. // Anticancer Res. 1989. Vol. 9. P. 915-922.

Поступила 5.04.05