СПОСОБЫ ГЛИКОКОНЪЮГИРОВАНИЯ И КОМПОЗИЦИИ

1. Способ получения гликоконъюгата, содержащего сахарид, конъюгированный с белком-носителем через (2-((2-оксоэтил)тио)этил)-карбаматный (еТЕС) спейсер, включающий стадии:
а) приведения во взаимодействие сахарида с 1,1′-карбонил-ди-(1,2,4-триазолом) (CDT) или 1,1′-карбонилдиимидазолом (CDI) в органическом растворителе с получением активированного сахарида;
б) приведения во взаимодействие активированного сахарида с цистамином или цистеамином либо их солью с получением тиолированного сахарида;
в) приведения во взаимодействие тиолированного сахарида с восстанавливающим агентом с получением активированного тиолированного сахарида, содержащего один или более свободных сульфгидрильных остатков;
г) приведения во взаимодействие активированного тиолированного сахарида с активированным белком-носителем, содержащим одну или более α-галогенацетамидных групп, с получением конъюгата (тиолированный сахарид)-(белок-носитель); и
д) приведения во взаимодействие конъюгата (тиолированный сахарид)-(белок-носитель) с (1) первым блокирующим реагентом, способным блокировать неконъюгированные α-галогенацетамидные группы активированного белка-носителя; и/или (2) вторым блокирующим реагентом, способным блокировать неконъюгированные свободные сульфгидрильные остатки;
с образованием таким образом соединенного через еТЕС гликоконъюгата.
2. Способ по п. 1, где стадия блокирования д) включает приведение во взаимодействие конъюгата (тиолированный сахарид) - (белок-носитель) с (1) N-ацетил-L-цистеином в качестве первого блокирующего реагента и/или (2) йодацетамидом в качестве второго блокирующего реагента.
3. Способ по п. 1, дополнительно включающий стадию перемешивания сахарида при взаимодействии с триазолом или имидазолом с получением перемешанного сахарида, который замораживают в тонком слое, лиофилизируют и повторно разводят в органическом растворителе перед стадией а).
4. Способ по п. 1, дополнительно включающий очистку тиолированного полисахарида, полученного на стадии в), где стадия очистки включает диафильтрацию.
5. Способ по п. 1, где восстанавливающий агент на стадии в) представляет собой трис(2-карбоксиэтил)фосфин (ТСЕР), дитиотреитол (DTT) или меркаптоэтанол.
6. Способ по п. 1, где белок-носитель активирован с использованием активированного производного бромуксусной кислоты.
7. Способ по п. 6, где производное бромуксусной кислоты представляет собой N-гидроксисукцинимидный эфир бромуксусной кислоты (BAANS).
8. Способ по п. 1, дополнительно включающий очистку соединенного через еТЕС гликоконъюгата диафильтрацией.
9. Способ по п. 1, где органический растворитель на стадии а) представляет собой полярный апротонный растворитель, выбранный из группы, состоящей из диметилсульфоксида (DMSO), диметилформамида (DMF), диметилацетамида (DMA), N-метил-2-пирролидона (NMP), ацетонитрила, 1,3-диметил-3,4,5,6-тетрагидро-2(1H)-пиримидинона (DMPU) и гексаметилфосфорамида (НМРА) или их смеси.
10. Способ по п. 1, где соотношение сахарид : (белок-носитель) (масс/масс.) составляет от 0,2 до 4 или от 0,4 до 1,7.
11. Способ по п. 1, где сахарид представляет собой имеющий происхождение из S. pneumoniae капсульный полисахарид, выбранный из группы, состоящей из пневмококковых (Pn) капсульных полисахаридов серотипов 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F и 33F.
12. Способ по п. 11, где капсульный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид Pn-серотипа 11A, 10A, 22F или 33F.
13. Способ по п. 1, где сахарид представляет собой капсульный полисахарид, имеющий происхождение из N. meningitidis.
14. Способ по любому из п.п. 1-13, где белок-носитель представляет собой CRM197 (перекрестно-реагирующий материал).
15. Гликоконъюгат, полученный способом по любому из п.п. 1-14.
16. Иммуногенная композиция, содержащая гликоконъюгат по п. 15 и фармацевтически приемлемый эксципиент, носитель или разбавитель.
17. Гликоконъюгат, содержащий бактериальный капсульный полисахарид, конъюгированный с белком-носителем через еТЕС-спейсер, где полисахарид ковалентно связан с еТЕС-спейсером через карбаматную связь и белок-носитель ковалентно связан с еТЕС-спейсером через амидную связь.
18. Гликоконъюгат по п. 17, где капсульный полисахарид имеет происхождение из S. pneumoniae и выбран из группы, состоящей из капсульных полисахаридов Pn-серотипов 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F и 33F.
19. Гликоконъюгат по п. 18, где капсульный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид Pn-серотипа 10A, 11A, 22F или 33F.
20. Гликоконъюгат по п. 17, где капсульный полисахарид имеет происхождение из N. meningitidis.
21. Гликоконъюгат по п. 17, где полисахарид имеет молекулярную массу от 10 до 2000 кДа, от 50 до 2000 кДа, от 50 до 20000 кДа или от 500 до 10000 кДа.
22. Гликоконъюгат по п. 17, где полисахарид имеет степень O-ацетилирования в диапазоне 75-100%.
197
23. Гликоконъюгат по п. 17, где белок-носитель представляет собой CRM.
197
24. Гликоконъюгат по п. 23, где CRM содержит 2-20 или 4-16 остатков лизина, ковалентно связанных с полисахаридом через еТЕС-спейсер.
25. Гликоконъюгат по п. 17, где соотношение сахарид : (белок-носитель) (масс/масс.) составляет от 0,2 до 4 или от 0,4 до 1,7.
197
26. Гликоконъюгат по п. 23, где на каждые 25, 15, 10 или 4 повторяющихся сахаридных единиц сахарида встречается по меньшей мере одна связь между CRM и сахаридом.
d
27. Гликоконъюгат по любому из п.п. 17-26, имеющий распределение молекул по размерам (K) не менее 35% при не более 0,3.
28. Иммуногенная композиция, содержащая гликоконъюгат по любому из п.п. 17-27 и фармацевтически приемлемый эксципиент, носитель или разбавитель.
29. Иммуногенная композиция по п. 28, дополнительно содержащая дополнительный антиген.
30. Иммуногенная композиция по п. 29, где дополнительный антиген содержит гликоконъюгат капсульного полисахарида, выбранного из группы, состоящей из капсульных полисахаридов Pn-серотипов 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F и 33F.
31. Иммуногенная композиция по любому из п.п. 28-30, дополнительно содержащая адъювант.
32. Иммуногенная композиция по п. 31, где адъювант представляет собой адъювант на основе алюминия, выбранный из группы, состоящей из фосфата алюминия, сульфата алюминия и гидроксида алюминия.