ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКИЙ ЧИП ДЛЯ ЭКСПРЕСС-АНАЛИЗА

Полезная модель относится к области микрофлюидной технологии, в частности к электрофоретическому чипу для экспресс-анализа органических и неорганических частиц в мобильных пунктах экологического контроля, полевых сельскохозяйственных лабораториях, предприятиях пищевой промышленности.
В настоящее время на рынке известно немало устройств, использующих чипы для электрофореза, которые обеспечивают необходимую степень разделения пробы и детектирования. Условно их можно разделить на две группы.
Первая из них основана на электрофоретическом анализе катионов и анионов, а также органических молекул с использованием емкостно-связанной бесконтактной схемы обнаружения проводимости. Например, система электрофореза «ChipGenie Edition Е», в основе которого лежит электрофорез на чипе, производства «microfluidic ChipShop GmbH» [1], представляет собой единое устройство, состоящие из биполярного источника питания, высокочастотного генератора и управляющего устройства, тогда как чип представляет собой цельное изделие из полиметилметакрилата (ПММА) с лунками, микроканалом и парой электродов детектора.
Устройство в компоновке «все-в-одном» удобно для пользователя, однако, производитель заявляет одноразовое использование своих чипов, что делает пользователя зависимым от постоянных поставок и создает трудности для утилизации ПММА в местах использования системы. Более того, существуют трудности с химической модификацией ПММА, что осложняет инвертирование электроосмотического потока в микроканале чипа.
На рынке так же представлена система ER455 производства компании eDAQ [2], представляющую собой по сути набор устройств в отдельных корпусах таких как система сбора данных, источник высокого напряжения, платформа для электрофореза, а также стеклянные чипы производства компании «Micronit microfluidics» [3].
Особенностью чипов является треугольная форма лунок, что по заявлению изготовителя приводит к уменьшению количества пузырьков воздуха в лунках. Однако, подобная форма также приводит к затруднениям при заправке и очистке лунок, так как поперечное сечение наконечника стандартного инъекционного шприца представляет собой окружность. Так же необходимо отметить, что такая дискретность оборудования приводит к усложнению процесса использования системы конечным пользователем, а также к увеличению занимаемого пространства.
Недостатки являются критическими для мобильных пунктов. К тому же производителем предполагается использование в чипах стандартных калибровочных растворов и рабочих буферов их собственного производства, что неизбежно ведет к увеличению стоимости анализов, сама система и отдельные чипы для нее при этом являются крайне дорогостоящими.
Вторая группа представлена устройствами с использованием оптического детектирования. Известна система Bioanalyzer 2100 [4] производства корпорации «Agilent Technologies Inc.» для анализа ДНК, РНК, белков и клеток, в основе которой лежит применение готовых чипов, заполненных агарозным гелем. Движение фрагментов ДНК в канале-капилляре чипа, как и в "классической" методике, происходит под действием тока. Система состоит из станции подготовки чипов, устройства перемешивания и программного обеспечения для управляющего устройства.
Система позволяет анализировать одновременно 12 образцов на одном чипе, однако, любой анализ, независимо от количества загруженных образцов, занимает 25-45 минут, более того, отсутствует возможность обнаруживать неорганические частицы в пробе. Чип представляет собой многоразовый картридж со съемным 16-контактным электродом. Очистка и перезаправка картриджа агарозным гелем происходит с помощью специальной установки, что усложняет конструкцию, увеличивает количество деталей способных выходить из строя и повышает цену изделия.
К тому же, производителем не учитывается время подготовки геля к исследованию, его относительно короткое время жизни и высокая стоимость.
Еще одним представителем систем электрофореза на чипе является аппарат МСЕ-202 MultiNA производства Shimadzu Corporation [5]. Система представляет собой находящиеся в одном корпусе источник питания, генератор высокого напряжения, высокочувствительный оптический детектор, штатив для одновременной загрузки до 108 образцов и 4 чипов, автоматическую систему инжектирования проб и очистки чипов. Подобная конструкция позволяет несколько уменьшить занимаемый прибором объем и снизить количество выполняемых оператором манипуляций, однако сводит на нет мобильность системы (вес 43 кг). Чип изготовлен из кварца высокой чистоты, включает интегрированные платиновые электроды и микроемкости для автоматической загрузки образца и реагентов.
К недостаткам можно отнести способность системы анализировать только ДНК и РНК, необходимость использовать в чипах набор специфических для каждого типа анализа окрашивающих веществ, и реактивы для очистки микроканала чипа от адсорбированных на поверхности компонентов красителя, что сильно повышает стоимость анализов.
Использование известных электрофоретических чипов приводит оператора к необходимости дополнительно приобретать специфические реагенты для заправки или очистки микроканалов чипа. Применение более легких в обработке новых полимерных материалов ведет к сложностям по их химической модификации и последующей утилизации по сравнению со стеклом. Необходимость задействовать для операций с чипами дополнительные устройства в роде автоматических насосов и специальных станций, а также дискретность аппаратуры создает трудности для пользователя и снижает общую надежность системы. Сами импортные приборы электрофореза на чипе является крайне дорогостоящими.
Известно устройство для обнаружения ионов методом капиллярного электрофореза [1], состоящее из электрофоретического чипа и управляющего устройства. Чип в виде параллелепипеда имеет выступающие за поверхность чипа три лунки для проб и лунку сброса, соединяющий их прямой микроканал и два электрода детектора вблизи лунки сброса. Чип выполнен из ПММА. Электроды выполнены из тонких пленок титана и золота. Недостатками являются невозможность последующей переработки чипов для новых исследований вследствие их неразборности, трудности с вторичным использованием ПММА, трудности с химической модификацией поверхности микроканала для инвертирования электроосмотического потока, расположение цилиндров лунок, выступающих за пределы поверхности чипа, что может привести к их откалыванию при неаккуратной заправке и, как следствие, к разлитию пробы. Это устройство взято нами за прототип.
Техническим результатом полезной модели, является создание разборного электрофоретического чипа для экспресс-анализа органических и неорганических частиц в мобильных управляющих устройствах.
Этот результат достигается тем, что основа электрофоретического чипа представлена боросиликатным предметным стеклом для микроскопии со шлифованными краями, на которое ламинатором нанесен слой пленочного фоторезиста, в котором методом фотолитографии созданы пять лунок для проб, лунка сброса и объединяющий их микроканал с прямоугольным сечением, имеющий в средней части извитую форму; поверх слоя пленочного фоторезиста приклеена двусторонняя ПЭТ-лента с перфорациями, соответствующими по диаметру лункам; к ПЭТ-ленте силиконовым адгезивом фиксирована текстолитовая плата, имеющая встроенные электроды детектора и соответствующие лункам сквозные отверстия с медно-золотым покрытием внутренних диаметров; внешние края отверстий не выступают за поверхность платы; внутренние диаметры лунок и отверстий платы соответствуют размеру стандартного наконечника инъекционного шприца; для соединения с мобильным управляющим устройством плата чипа имеет два медно-золотых контактных вывода электродов детектора, пять контактных площадок лунок для проб и контактную площадку лунки сброса.
Боросиликатное предметное стекло для микроскопии со шлифованными краями позволяет обеспечить инертность дна микроканала к буферному раствору, простоту инвертирования электроосмотического потока в микроканале. Данное стекло более стойко к механическим повреждениям, чем обычное, что позволяет использовать его многократно. Является широко распространенным материалом удобным в обращении.
Пленочный фоторезист дает возможность легко сформировать необходимое количество лунок и микроканал различной длины и формы. Наличие пяти лунок для проб позволяет провести на одном чипе до трех параллельных анализов. Извитая в средней части форма микроканала позволяет увеличить степень разделения пробы и упростить тем самым детектирование. Микроканал с прямоугольным сечением позволяет добиться высокого отношения общей площади внутренней поверхности к его общей длине, что позволяет увеличить степень разделения и способствует быстроте выполнения анализа.
Полоса двусторонней клейкой ПЭТ-ленты защищает микроканал и лунки от попадания в них силиконового адгезива, который, в свою очередь, обеспечивает герметичность конструкции и позволяет сделать электрофоретический чип разборным.
Текстолитовая плата обладает хорошими изоляционными свойствами, легко обрабатывается, что позволяет использовать уже готовые платы. Медно-золотое покрытие элементов отвечает требованиям химической инертности и стабильности при хранении и проведении анализа. Чип изготавливают без выступающих частей, которые могут быть повреждены. Внутренний диаметр лунок и соответствующих отверстий в плате отвечает размеру стандартного наконечника инъекционного шприца, что делает чип удобным для обращения в любой лаборатории.
Полезная модель поясняется графическим материалом. На фигуре 1 изображена схема чипа. На фигуре 2 изображена фотография чипа, вид сверху. Изображены боросиликатное предметное стекло 1 для микроскопии со шлифованными краями с нанесенным на него слоем пленочного фоторезиста 2, в котором сформированы лунки 3 для проб, лунка 4 сброса, которые связаны между собой микроканалом 5 имеющим в средней части извитую форму, ПЭТ-лента 6, силиконовый адгезив 7, текстолитовая плата 8 с контактными выводами 9 электродов детектора 10 и сквозными отверстиями 11, соответствующими лункам 3 и 4. Контактные площадки 12 лунок 3 для проб, контактная площадка 13 лунки 4 сброса.
Электрофоретический чип для экспресс-анализа изготавливают следующим образом. На чистое обезжиренное боросиликатное предметное стекло для микроскопии со шлифованными краями с помощью ламинатора без нагрева наносят слой пленочного фоторезиста, выдерживают его в темноте до полного прилегания. В фоторезисте методом фотолитографии создают пять лунок для проб, лунку сброса и объединяющий их микроканал, имеющий прямоугольное сечение и в средней части извитую форму. Выдерживают полученную заготовку при 140°С до полного затвердевания фоторезиста. На фоторезист приклеивают двустороннюю ПЭТ-ленту с перфорациями, соответствующими по диаметру лункам. На чистую обезжиренную текстолитовую плату, содержащую шесть соответствующих лункам отверстий с медно-золотым покрытием внутренних диаметров, пять контактных площадок лунок для проб, контактную площадку лунки сброса, два электрода детектора и два контактных вывода электродов детектора, наносят силиконовый адгезив и при помощи ракеля распределяют его до достижения однородности поверхности. Соединяют полученные части электрофоретического чипа путем контакта силиконового адгезива нанесенного на текстолитовую плату и наружной поверхности ПЭТ-ленты. Удерживают части чипа струбцинами и помещают его в вакуумную камеру для удаления микропузырьков воздуха. При необходимости остатки адгезива удаляют из лунок скальпелем.
Электрофоретический чип для экспресс-анализа используют следующим образом. Предварительно чип заполняют раствором рабочего буфера через лунку сброса пробы, используя инъекционный шприц без иглы. Чип устанавливают в мобильное управляющее устройство отверстиями платы вверх. Подключение контактных выводов электродов детектора, контактных площадок лунок для проб и контактной площадки лунки сброса чипа к управляющему устройству осуществляют через игольчатые коннекторы электродов в крышке управляющего устройства. На управляющем устройстве задают режим термостатирования для приведения микроканала чипа в кондиционное состояние. Открывают крышку управляющего устройства, удаляют рабочий буфер из лунок шприцем и по каплям прибавляют новый. При необходимости процедуру можно проводить многократно. Осуществляют калибровку.
Аликвоту калибровочного раствора, разведенную в рабочем буфере, тщательно перемешивают перед использованием и вносят в одну из лунок для проб. Закрывают крышку управляющего устройства. На управляющем устройстве задают режим инжекции в зависимости от типа аналита. Проводят анализ инжектированной пробы. Для этого задают режим разделения. На основании полученной электрофореграммы проводят более точную настройку управляющего устройства, замену рабочего буфера на новый. Проводят непосредственно анализ интересующей пробы, используя одну из свободных лунок для проб. Последовательность действий и рабочие режимы те же, что и при калибровке. Оставшиеся лунки для проб могут быть использованы для параллельного анализа. В процессе разделения поддерживают постоянные значения прикладываемого тока и напряжения.
Разбирают чип следующим образом. После проведения анализа его нагревают в токе воздуха и с помощью бритвенного лезвия разрезают слой силиконового адгезива, разделяя тем самым чип на две части. Боросиликатное стекло очищают от остатков пленочного фоторезиста и ПЭТ-ленты выдерживанием в емкости с водным аммиаком. Текстолитовую плату очищают от остатков пленок и адгезива ватой в спирте. Боросиликатное стекло для микроскопии и текстолитовую плату после разбора чипа можно использовать многократно, а микроканал при необходимости можно очистить деионизированной водой и растворами соляной кислоты и гидроксида натрия, что освобождает пользователя от необходимости применять специфические дорогостоящие реагенты.
Использование устройства поясняется примерами.
Пример 1. Чип использовали для экспресс-анализа неорганических катионов в свежевыжатом соке из яблока (сорт Анис). В качестве рабочего буфера использовали 6 мМ раствор бензимидазола и 2.5 мМ винной кислоты, разбавление 1:10. Напряжение инжекции 2 кВ, время инжекции 15 с, напряжение разделения 2.5 кВ, время разделения 3 минуты. В качестве калибровочного раствора использовали 5 мМ раствор хлорида калия. В результате исследования нами была получена электрофореграмма содержания катионов в пробе: калий 541.7 мг/л, натрий 18.6 мг/л, магний 23.4 мг/л, кальций 33.2 мг/л. После проведения анализа электрофоретический чип разбирали. Боросиликатное стекло для микроскопии со шлифованными краями и текстолитовую плату использовали повторно для создания нового чипа и проведения следующего анализа.
Пример 2. Чип с переработанными компонентами из Примера 1 использовали для анализа органических анионов модельного раствора трех органических кислот. В качестве рабочего буфера использовали 10 мМ раствор тетрабората натрия, разбавление 1:10. Напряжение инжекции 2 кВ, время инжекции 15 с, напряжение разделения 3 кВ, время разделения 2 минуты. В качестве калибровочного раствора использовали 5 мМ раствор аскорбиновой, сорбиновой и бензойной кислот. В результате была получена электрфореграмма содержания в аналите анионов аскорбиновой, сорбиновой и бензойной кислот.
Электрофоретический чип может быть использован в исследовательских лабораториях для определения содержания органических и неорганических компонентов в пробах.
ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ
1) Система электрофореза «ChipGenie Edition Е» производства «microfluidic ChipShop GmbH» [inquiries@microfluidic-ChipShop.com; https://www.microfluidic-chipshop.com/wp-content/uploads/2019/10/Lab-on-a-Chip-Catalogue-10-2019.pdf]. 2019 год.
2) Система электрофореза ER 455 производства eDAQ Pty Ltd [info@edaq.com; https://www.edaq.com/ER4551. 2018 год.
3) Чипы для электрофореза ЕТ190-2 и ЕТ145-4 производства «Micronit Microfluidics» [miproto@micronit.com; https://store.micronit.com/microfluidic-chips]. 2017 год.
4) Система капиллярного электрофореза Agilent Bioanalyzer 2100 производства Agilent Technologies [agilentRU@agilent.com:https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalvzer-svstems/bioanalvzer-instrument/2100-bioanalyzer-instrument-2282501.2020 год.
5) Система микрочипового электрофореза для исследования нуклеиновых кислот МСЕ-202 MultiNA производства корпорации Shimadzu [smo@shimadzu.ru; https://www.shimadzu.com/an/products/life-science-lab-instruments/dnarna-analvsis/mce/index.htmll. 2018 год.