ПОЛУЧЕНИЕ ПИКОРНАВИРУСОПОДОБНЫХ ЧАСТИЦ В РАСТЕНИЯХ
OBTAINING PICORNAVIRUS-LIKE PARTICLES IN PLANTS

Область техники, к которой относится изобретение
Данное изобретение относится к получению структурных белков пикорнавирусов в растениях. В частности, настоящее изобретение также относится к получению вирусоподобных частиц, содержащих структурные белки пикорнавирусов, в растениях.
Сведения о предшествующем уровне техники
Пикорнавирусы представляют собой малые безоболочечные вирусы, содержащие плюс-нитевую РНК, которые могут вызвать широкий спектр клинических проявлений у человека и животных. Исходя из ряда свойств, включая гомологии последовательностей и чувствительность к кислоте, пикорнавирусы подразделяются на несколько родов, среди которых имеется много важных патогенов человека и животных.
Пикорнавирусы содержат голый нуклеокапсид. Капсид составлен из 60 протомеров в плотно упакованную икосаэдрическую структуру. Каждый протомер состоит из 4 полипептидов, известных как VP (вирусный белок) 1, 2, 3 и 4. Полипептиды VP2 и VP4 происходят из предшественника, известного как VP0, который расщепляется после интернализации вирусной геномной РНК внутрь клетки. VP4 погружен внутрь капсида. В зависимости от типа и степени дегидратации размер вирусной частицы составляет около 27-30 нм в диаметре.
Пикорнавирусы имеют однокомпонентный линейный полиаденилированный (+)ssRNA геном размером 7,1-8,9 тысяч пар оснований (kb), который состоит из одной открытой рамки считывания (ORF), кодирующей полипротеин. Вирусная геномная РНК содержит вирусный белок (VPg) на ее 5'-конце вместо кэп-структуры метилированных нуклеотидов. Длинная нетранслируемая область (UTR) на 5'-конце содержит участок внутренней посадки рибосомы (IRES). Область Р1 кодирует структурные полипептиды. Области Р2 и Р3 кодируют неструктурные белки, связанные с репликацией. Более короткая 3'-UTR является важной для синтеза минус-нити. L представляет собой дополнительный N-терминальный лидерный белок, присутствующий в некоторых родах, который может являться протеазой (афтовирусы, эрбовирусы) или иметь другую функцию (кобувирус, кардиовирус).
Вирионная РНК является инфекционной, и служит в качестве геномной и вирусной матричной РНК. IRES делает возможной прямую трансляцию полипротеина. Первоначально, полипротеин процессируется протеазой(ами) вируса на различные предшественники и зрелые белки с образованием структурных белков, репликазы, VPg и ряда белков, которые модифицируют клетку-хозяина, что в конечном счете приводит к лизису клетки.
Энтеровирус 71 (EV71) является членом семейства вирусов Picornaviridae, содержащих однонитевую РНК. Энтеровирус 71 является безоболочечным вирусом и его капсид составлен из множества белков оболочки, продуцированных в виде фрагментов одного продукта трансляции вирусов. Процессинг вирусного полипротеина в структурные и неструктурные компоненты представлен на фигуре 1 (известный уровень техники). Область Р1 гена полипротеина кодирует структурные белки, тогда как области Р2 и Р3 кодируют неструктурные компоненты вируса. После отщепления предшественника структурного белка P1 (1ABCD на фигуре 1) от полипротеина вирусной протеазой 2А, предшественник Р1 процессируется в капсидные белки VP0, VP1 (фрагмент 1D на фигуре 1) и VP3 (фрагмент 1С на фигуре 1). Компонент 3С и его предшественник 3CD - кодированный областью Р3 - представляют собой вирусные протеазы, ответственные за процессинг предшественника Р1 в капсидные белки. Протомеры VP0, VP1 и VP3 спонтанно собираются в пустые капсиды, и полагают, что вирусная РНК упакована в частицы после сборки пустых частиц. Связь пустого капсида с геномной РНК приводит к структурному сдвигу, интернализации РНК, автокаталитическому расщеплению VP0 на VP2 (фрагмент 1В на фигуре 1) и VP4 (фрагмент 1А на фигуре 1), и созреванию в стабильный вирион 150S. Пустые капсиды, содержащие нерасщепленный предшественник VP0, обычно обнаруживаются во время пикорнавирусных инфекций.
Продукция вирусоподобных частиц (VLP) EV71 в клетках насекомых была достигнута в результате коэкспрессии белка-предшественника Р1 и протеазы 3CD (Ни et al., 2003, Biotechnology Letters 25: 919-925). Использование одного бакуловирусного вектора для получения Р1 и 3CD описано Chung et al. (2008, Vaccine 26: 1855-1862). Исследования иммуногенности, проведенные на мышах, показали, что очищенные вирусоподобные частицы (VLP) EV71 обеспечивают защиту против заражения летальными дозами вируса.
Белок VP1 вируса EV71 был продуцирован в плодах трансгенных томатов, и кормление мышей трансгенным плодом, содержащим VP1, привело к росту VP1-специфических уровней фекального IgA и сывороточного IgG (Chen et al., 2006, Vaccine24: 2944-2951).
Белок-предшественник P1 и протеаза 3С вируса ящера (FMDV) коэкспрессировались в трансгенной люцерне (Dus Santos et al. 2005, Vaccine 23: 1838-1843). Люцерна была стабильно трансформирована с помощью одного вектора, содержащего область генома FMDV Р1 (1А, 1В, 1С, 1D), 2А, первые 16 аминокислотных остатков на N-конце 2В, полную последовательность 3В1, 3В2, 3В3, 3С и первые 16 аминокислотных остатков на N-конце 3D. Иммуногенность сырых экстрактов белка из трансгенных растений была продемонстрирована путем интраперитонеального введения мышам Balb/c. Иммунизированные мыши были также защищены против летального заражения FMDV. Уровни экспрессии антигена были низкими для практических целей.
В аргентинской заявке AR078257 описано трансгенное растение, экспрессирующее пустой капсидный вирус, при этом трансгенное растение содержит в своем геноме конструкцию ДНК, кодирующую полипептид-предшественник Р1, связанный с автокаталитической протеазой 2А. Конструкция ДНК может дополнительно содержать фрагмент белка 2В, присоединенный к последовательности, кодирующей протеазу 3С, связанную с фрагментом последовательности, кодирующим фрагмент белка 3D.
Краткое описание изобретения
Настоящее изобретение относится к получению структурных белков пикорнавируса в растениях. В частности, настоящее изобретение также относится к получению вирусоподобных частиц, содержащих структурный белок пикорнавируса в растениях.
В соответствии с настоящим изобретением предлагается способ (А) получения пикорнавирусоподобных частиц (PVLP) в растении, включающий:
a) введение первой нуклеиновой кислоты, содержащей первую регуляторную область, активную в растении, оперативно связанной с нуклеотидной последовательностью, кодирующей один или несколько полипротеинов пикорнавируса, в растение или часть растения,
b) введение второй нуклеиновой кислоты, содержащей вторую регуляторную область, активную в растении и функционально связанную со второй нуклеотидной последовательностью, кодирующей одну или несколько протеаз;
c) инкубацию растения, части растения в условиях, которые делают возможной экспрессию первой и второй нуклеиновых кислот, с получением, таким образом, PVLP.
Также, в настоящем изобретении предлагается способ (В) получения пикорнавирусоподобной частицы (PVLP), включающий:
a) обеспечение растения, части растения или клетки растения, содержащей первую нуклеиновую кислоту, содержащую первую регуляторную область, активную в растении, оперативно связанную с первой нуклеотидной последовательностью, кодирующей один или несколько полипротеинов пикорнавируса, и вторую нуклеиновую кислоту, содержащую вторую регуляторную область, активную в растении, оперативно связанную со второй нуклеотидной последовательностью, кодирующей одну или несколько протеаз;
b) инкубацию растения, части растения или клетки растения в условиях, которые делают возможной экспрессию нуклеиновых кислот, с получением, таким образом, PVLP.
Первая регуляторная область, активная в растении, и вторая регуляторная область, активная в растении, могут быть одинаковыми или различными.
Кроме того, в способе (А) или (В) процентное соотношение между первой нуклеиновой кислотой и второй нуклеиновой кислотой, введенными в растение, часть растения или клетку растения, может составлять от 95%:5% до 50%:50% или от примерно 20:1 до примерно 0,5:1.
Настоящее изобретение также включает способы (А) или (В), описанные выше, в которых последовательность первой нуклеиновой кислоты, содержащую первую регуляторную область, оперативно связанную с одним или более чем одним энхансером комовируса, нуклеотидную последовательность, кодирующую полипротеин, и один или более чем один элемент амплификации геминивируса, и третью нуклеиновую кислоту, кодирующую репликазу геминивируса, вводят в растение или часть растения. Один или более чем один энхансер комовируса может представлять собой UTR комовируса, например, UTR вируса мозаики коровьего гороха (Cowpea Mosaic Virus hyperanslatable, CPMV-HT), такую как 5', 3'UTR CPMV-HT, или их комбинацию. Один или более чем один элемент амплификации геминивируса может быть выбран из длинной межгенной области вируса желтой карликовости фасоли (Bean Yellow Dwarf Virus, BeYDV LIR) и короткой межгенной области BeYDV (BeYDV SIR).
Способы, описанные выше (Способ А), могут также включать введение другой последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей супрессор сайленсинга, например, HcPro или р19.
Способы, описанные выше (Способ В), могут также включать дополнительное обеспечение растения, части растения или клетки растения, которая содержит другую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую супрессор сайленсинга, например, HcPro или р19.
Настоящее изобретение также включает способ (А), описанный выше, в котором на стадии введения (стадии а) нуклеиновая кислота транзиентно экспрессируется в растении. В альтернативном варианте на стадии введения (стадии а) нуклеиновая кислота стабильно экспрессируется в растении.
Способы (А) и (В), описанные выше, могут дополнительно включать стадию сбора растения и очистки PVLP.
Настоящее изобретение включает композицию, содержащую эффективную дозу PVLP, как описано выше, для индукции иммунного ответа и фармацевтически приемлемый носитель.
Настоящее изобретение также включает способ индукции иммунитета к пикорнавирусной инфекции у субъекта, включающий введение PVLP, как описано выше, субъекту. PVLP можно вводить субъекту перорально, интрадермально, интраназально, внутримышечно, интраперитонеально, внутривенно или подкожно.
В настоящем изобретении также предлагается растительный материал, содержащий PVLP, полученные описанным выше способом (А) и/или (В). Растительный материал может быть использован в индукции иммунитета к пикорнавирусной инфекции у субъекта. Растительный материал можно также примешивать в виде пищевой добавки.
Данное краткое описание изобретения необязательно описывает все отличительные признаки изобретения.
Краткое описание чертежей
Данные и другие отличительные признаки изобретения станут более очевидными из следующего описания, в котором сделано обращение на прилагаемые чертежи, на которых:
На фигуре 1 изображен геном пикорнавируса (энтеровирус 71) и промежуточные продукты процессинга полипротеина предшествующего уровня техники (со страницы ViralZone в сети Интернет).
На фигуре 2 показан вестерн-блот-анализ экспрессии Р1 и процессинга, катализируемого 3CD. Десять микрограмм белковых экстрактов из растений, трансформированных с помощью экспрессионных векторов, указанных выше, загружали и подвергали электрофорезу в невосстановительных условиях. Мышиные моноклональные анти-VP1 антитела использовали для иммунологического анализа. Соотношения обозначают отношение Р1 (конструкт 1300 или 1301 смотри в таблице 1) к 3CD (конструкт 1310, 1311 или 1315 смотри в таблице 1) штаммов Agrobacterium в бактериальной суспензии, используемой для трансформации. Указаны предполагаемые положения Р1 и VP1.
На фигуре 3 показан скрининг стратегий экспрессии 3CD для максимального накопления VP1. Пять микрограмм белковых экстрактов из растений, трансформированных с помощью экспрессионных векторов, указанных выше, загружали и подергали электрофорезу в невосстановительных условиях. Мышиные моноклональные анти-VP1 антитела использовали для иммунологического анализа. Соотношения обозначают отношение Р1 (1301) к 3CD (1310, 1311, 1312 и 1313) штаммов Agrobacterium в бактериальных суспензиях, используемых для трансформации.
На фигуре 4 показана оценка сборки капсида EV71. (А) Аналитический одномерный электрофорез (SDS-PAGE) с окраской гелей Кумасси и вестерн-блот-анализ элюированных фракций, полученных в результате разделения методом эксклюзионной хроматографии (SEC) белковых экстрактов из растений, коэкспрессирующих Р1 и 3CD (конструкты 1301+1310 (4:0,5)). Показана полоса, предположительно соответствующая VP1 в окрашенном Кумасси геле. (В) Исследование методом трансмиссионной электронной микроскопии с негативным окрашиванием фракции 12, полученной элюированием методом SEC. Масштаб равен 100 нм.
На фигуре 5 показана характеристика очищенных PVLP EV71. (А) Аналитический одномерный электрофорез (SDS-PAGE) с окраской гелей Кумасси и вестерн-блот-анализ очищенных PVLP EV71. Показана полоса, соответствующая VP1 в окрашенном Кумасси геле. Также, идентифицированы другие полосы, соответствующие по молекулярной массе другим капсидным белкам EV71. (В) Исследование методом трансмиссионной электронной микроскопии с негативным окрашиванием очищенных PVLP EV71. Образец разбавлен 1/100 перед началом исследования. Масштаб равен 100 нм.
На фигуре 6 показано исследование партии 479-23-018 методом электронной микроскопии.
На фигуре 7 показан анализ методом крио-электронной микроскопии PVLP EV71, экстрагированных с помощью методов, процессов с использованием ферментов, и отобранных с помощью HIC (номер партии 479-31-020).
На фигуре 8 показан анализ методом крио-электронной микроскопии PVLP EV71, экстрагированных с помощью метода механической экстракции (pH 8,0) с тепловой обработкой (номер партии 479-32-020).
На фигуре 9А показан 3CD из штамма HK08 EV71, содержащий аминокислоты 1549-2193 (SEQ ID NO: 1), как указано в базе данных GenBank с инвентарным номером ADG57603. На фигуре 9В показан 3CD из штамма HK08EV71, содержащий нуклеотид 5387-7321 (SEQ ID NO: 2), представленный в базе данных GenBank с инвентарным номером GQ279369. На фигуре 9С показан 3CD из штамма GDFS08 EV71, содержащий аминокислоты 1549-2193 (SEQ ID NO: 3), как указано в базе данных GenBank с инвентарным номером ACI25378. На фигуре 9D показан 3CD из штамма GDFS08 EV71, содержащий нуклеотид 5387-7321 (SEQ ID NO: 4), указанный в базе данных GenBank с инвентарным номером FJ194964. На фигуре 9Е показана последовательность аминокислот Р1, представленная в базе данных GenBank с инвентарным номером ADG57603 (аминокислоты 1-862) (SEQ ID NO: 5). На фигуре 9F показана нуклеотидная последовательность Р1, представленная в базе данных GenBank с инвентарным номером GQ279369 (нуклеотиды 743-3328) (SEQ ID NO: 6). На фигуре 9G показана нуклеотидная последовательность полипротеина PVgp1 из энтеровируса С человека серотипа PV-1 (с инвентарным номером NC_002058 в базе данных GenBank для генома и NP_041277 для полипротеина: нуклеотиды 5438-7369) (SEQ ID NO: 7). На фигуре 9Н показана аминокислотная последовательность полипротеина из полиовируса (аминокислоты 1566-2209 из базы данных GenBank с инвентарным номером NP_041277) (SEQ ID NO: 8). На фигуре 91 показана нуклеотидная последовательность полипротеина PVgp1 [энтеровирус С человека] (нуклеотиды 743-3385 из базы данных GenBank с инвентарным номером NC_002058) (SEQ ID NO: 9). На фигуре 9J показана аминокислотная последовательность полипротеина [энтеровирус С человека] из базы данных GenBank с инвентарным номером NP_041277 (аминокислоты 1-881 из базы данных GenBank с инвентарным номером NP_041277) (SEQ ID NO: 10).
Подробное описание изобретения
Далее представлено описание предпочтительного варианта осуществления изобретения.
Настоящее изобретение относится к вирусоподобным частицам (VLP), содержащим один или более структурных белков пикорнавируса (то есть пикорнавирусоподобный белок или PVLP), и способам получения PVLP в растениях или в частях растения. Таким образом, PVLP может содержать один или более чем один структурный белок пикорнавируса. Например, PVLP может содержать один или более чем один структурный белок энтеровируса.
Пикорнавирус может быть выбран из группы, состоящей из вирусов рода Aphthovirus (афтовирус), Avihepatovirus (авигепатовирус), Cardiovirus (кардиовирус), Enterovirus (энтеровирус), Erbovirus (эрбовирус), Hepatovirus (гепатовирус), Kobuvirus (кобувирус), Parechovirus (парэховирус), Sapelovirus (сапеловирус), Senecavirus (сенекавирус), Teschovirus (тесховирус) и Tremovirus (тремовирус). В неограничивающем примере пикорнавирус может представлять собой энтеровирус, например, энтеровирус 71 (EV71) или энтеровирус человека С (также называемый как полиовирус).
Кроме того, в настоящем изобретении предлагается способ получения VLP, например, PVLP или энтеровирусоподобной частицы в растении. Способ может включать введение первой нуклеиновой кислоты, содержащей первую регуляторную область, активную в растении, оперативно связанную с первой нуклеотидной последовательностью, кодирующей один или несколько полипротеинов пикорнавируса, в растение или часть растения, и введение второй нуклеиновой кислоты, содержащей вторую регуляторную область, активную в растении, оперативно связанную со второй нуклеотидной последовательностью, кодирующей протеазу. После инкубации растения или части растения в условиях, которые делают возможной экспрессию нуклеиновых кислот, получают, таким образом, PVLP.
Термин «вирусоподобная частица» (VLP), или «вирусоподобные частицы» или «VLP» относится к структурам, которые самособираются и содержат один или более чем один структурный белок, например, один или более чем один структурный белок пикорнавируса, или один или более чем один структурный белок энтеровируса, или их комбинацию, например, но без ограничения, структурный белок VP0, VP1, VP2, VP3, VP4, или их комбинацию. Как правило, вирусоподобные частицы (VLP) морфологически и антигенно сходны с вирионами, продуцируемыми при инфекции, но лишены генетической информации, достаточной для репликации и, таким образом, являются неинфекционными. Вирусоподобные частицы (VLP) могут быть получены в подходящих клетках-хозяевах, включая клетки растения-хозяина. После экстракции из клетки-хозяина и после изоляции, и последующей очистки в подходящих условиях вирусоподобные частицы (VLP) могут быть очищены в виде интактных структур.
Термин «пикорнавирусоподобная частица» (PVLP) относится к вирусоподобной частице (VLP) или вирусоподобным частицам (VLP), содержащим один или более чем один структурный белок пикорнавируса. Термин «энтеровирусоподобная частица» относится к вирусоподобной частице (VLP) или вирусоподобным частицам (VLP), содержащим один или более чем один структурный белок энтеровируса. Пример структурных белков пикорнавируса может включать, но без ограничения, структурный белок VP0, VP1, VP2, VP3, VP4 или их комбинацию. Пример структурных белков энтеровируса может включать, но без ограничения, структурный белок VP0, VP1, VP2, VP3, VP4 или их комбинацию.
Под полипротеином понимается белок, который содержит один или более чем один белок или предшественник белка, который при протеолитическом процессинге обеспечивает один или несколько белков. Например, полипротеин может содержать один или несколько структурных белков. Один или несколько белков, например структурных белков, в полипептиде могут быть, например, разделены сайтами расщепления, такими как, например, сайты расщепления протеазой. Неограничивающим примером «полипротеина» является предшественник структурного белка Р1, также называемый как «Р1-область». Р1-область определена как такая часть полипротеина пикорнавируса, которая генерирует «структурные белки» или «белки оболочки», например, VP0, VP1, VP2, VP3, VP4 или их комбинацию. Неограничивающие примеры пикорнавируса Р1 или фрагментов Р1, которые могут быть использованы в соответствии с настоящим изобретением, включают Р1 из энтеровируса, например, энтеровируса 71.
Примером Р1-области, который не должен рассматриваться как ограничивающий, является аминокислотная последовательность, приведенная в базе данных GenBank с инвентарным номером ADG57603, содержащая аминокислоты 1-862 (SEQ ID NO: 5), или последовательность, обладающая по меньшей мере примерно 90-100% сходством с упомянутой последовательностью, включая любое процентное сходство в этих диапазонах, такое как 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% сходство с упомянутой последовательностью. Кроме того, неограничивающим примером нуклеотидной последовательности, кодирующей Р1-область, является нуклеотидная последовательность, приведенная в базе данных GenBank с инвентарным номером GQ279369, содержащая нуклеотиды 743-3328 (SEQ ID NO: 6), или последовательность, обладающая по меньшей мере примерно 90-100% сходством с упомянутой последовательностью, включая любое процентное сходство в этих диапазонах, такое как 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% сходство с упомянутой последовательностью.
Еще одним примером Р1-области, который не следует рассматривать как ограничивающий, является аминокислотная последовательность, приведенная в базе данных GenBank с инвентарным номером NP_041277, содержащая аминокислоты 1566-2209 (SEQ ID NO: 8), или последовательность, обладающая по меньшей мере примерно 90-100% сходством с упомянутой последовательностью, включая любое процентное сходство в этих диапазонах, такое как 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% сходство с упомянутой последовательностью. Кроме того, неограничивающим примером нуклеотидной последовательности, кодирующей Р1-область, является нуклеотидная последовательность, приведенная в базе данных GenBank с инвентарным номером NC_002058, содержащая нуклеотиды 5438-7369 (SEQ ID NO: 7), или последовательность, обладающая по меньшей мере примерно 90-100% сходством с упомянутой последовательностью, включая любое процентное сходство в этих диапазонах, такое как 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% сходство с упомянутой последовательностью. В еще одном примере, который не следует рассматривать как ограничивающий, Р1-область содержит аминокислотную последовательность, приведенную в базе данных GenBank с инвентарным номером NP_041277, содержащую аминокислоты 1-881 (SEQ ID NO: 10), или последовательность, обладающую по меньшей мере примерно 90-100% сходством с упомянутой последовательностью, включая любое процентное сходство в этих диапазонах, такое как 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% сходство с упомянутой последовательностью. Кроме того, неограничивающим примером нуклеотидной последовательности, кодирующей Р1-область, является нуклеотидная последовательность, приведенная в базе данных GenBank с инвентарным номером NC_002058, содержащая нуклеотиды 743-3385 (SEQ ID NO: 9), или последовательность, имеющая по меньшей мере примерно 90-100% сходство с упомянутой последовательностью, включая любое процентное сходство в этих диапазонах, такое как 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% сходство с упомянутой последовательностью.
«Полипротеин пикорнавируса» относится ко всему или части полипротеина пикорнавируса, изолированного из пикорнавируса, присутствующего в любом природном или вариантном штамме, или изоляте пикорнавируса, например, полипротеин энтеровируса. Сходным образом, «структурный белок пикорнавируса» может относиться ко всему или части структурного белка пикорнавируса, изолированного из пикорнавируса, присутствующего в любом природном или вариантном штамме, или изоляте пикорнавируса, например, структурный белок энтеровируса, например, полученный из полиовируса или энтеровируса 71. Таким образом, термин «полипротеин пикорнавируса» и «структурный белок пикорнавируса», и тому подобное, включает природные варианты полипротеина пикорнавируса, структурный белок пикорнавируса или их комбинацию, которые были продуцированы путем мутации в течение жизненного цикла вируса или в ответ на селективное давление (например, лекарственную терапию, расширение тропизма по отношению к клетке-хозяину или инфекционность, и т.п.). Термин «полипротеин пикорнавируса» дополнительно включает «полипротеин энтеровируса» и «структурный белок энтеровируса», и тому подобное, включая природные варианты полипротеина энтеровируса, структурный белок энтеровируса или их комбинацию, которые были продуцированы путем мутации в течение жизненного цикла вируса или в ответ на селективное давление (например, лекарственную терапию, расширение тропизма в отношении клетки-хозяина или инфекционность, и т.п.). Термин «полипротеин пикорнавируса» может также включать «полипротеин полиовируса» и «структурный белок полиовируса», и тому подобное, включая природные варианты полипротеина полиовируса, структурный белок полиовируса или их комбинацию, которые были продуцированы путем мутации в течение жизненного цикла вируса или в ответ на селективное давление (например, лекарственную терапию, расширение тропизма в отношении клетки-хозяина или инфекционность, и т.п.). Специалисту в данной области будет понятно, что нативные и вариантные полипротеины пикорнавируса, энтеровируса или полиовируса, или структурный белок пикорнавируса, энтеровируса или полиовируса могут быть также продуцированы с использованием рекомбинатных технологий.
Полипротеин может содержать один или несколько структурных белков, например, капсидных белков. Неограничивающие примеры структурного белка или капсидных белков пикорнавируса представляют собой белки пикорнавируса VP0, VP1, VP2, VP3 и VP4, и фрагмент VP0, VP1, VP2, VP3 и VP4. Неограничивающие примеры VP0, VP1, VP2, VP3 и VP4, или фрагментов белков VP0, VP1, VP2, VP3 и VP4, которые могут быть использованы в соответствии с изобретением, включают белки VP0, VP1, VP2, VP3 и VP4 из энтеровируса, например, полиовируса или энтеровируса 71. Кроме того, структурный белок полипротеина или их комбинация может быть, например, из энтеровируса 71 штамма НК08 или штамма GDFS08. В другом неограничивающем примере структурный белок полипротеина или их комбинация может быть из человеческого энтеровируса С, также известного как полиовирус.
Сходство или идентичность аминокислотной последовательности может быть определено с использованием программ BLASTP и TBLASTN, в которых используется алгоритм BLAST (Basic local alignment search tool) 2.0. Способы вычисления сходства или идентичности аминокислотных последовательностей хорошо известны специалистам в данной области, и использование алгоритма BLAST описано в ALTSCHUL et al. (1990, J Mol. Biol. 215: 403- 410) и ALTSCHUL et al. (1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402).
В настоящем изобретении пикорнавирусоподобные, энтеровирусоподобные (включая полиовирусоподобные) частицы получены в растении, части растения или клетке растения путем коэкспрессии нуклеиновой кислоты (первой нуклеиновой кислоты), кодирующей полипротеин пикорнавируса, энтеровируса или полиовируса, например, но без ограничения, Р1, со второй нуклеиновой кислотой, кодирующей протеазу, например, протеазу прикорнавируса, энтеровируса или полиовируса, такую как, например, но без ограничения, 3CD, с получением, таким образом, вирусоподобной частицы VLP.
Примером протеазы, который не следует рассматривать как ограничивающий, является аминокислотная последовательность из штамма HK08 EV71, содержащая аминокислоты 1549-2193, как приведено в базе данных GenBank с инвентарным номером ADG57603 (SEQ ID NO: 1). Нуклеотидная последовательность, приведенная в базе данных GenBank с инвентарным номером GQ279369 (SEQ ID NO: 2) от нуклеотида 5387 до нуклеотида 7321, или последовательность, имеющая по меньшей мере примерно 90-100% сходство с SEQ ID NO: 2, включая любое процентное сходство в указанном диапазоне, например 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% сходство с упомянутой последовательностью. Другим неограничивающим примером является аминокислотная последовательность из штамма GDFS08 EV71, содержащая аминокислоты 1549-2193, как приведено в базе данных GenBank с инвентарным номером ACI25378 (SEQ ID NO: 3). Нуклеотидная последовательность, приведенная в базе данных GenBank с инвентарным номером FJ194964 (SEQ ID NO: 4) от нуклеотида 5387 до нуклеотида 7321 может быть использована для получения аминокислотной последовательности. Кроме того, последовательность, имеющая примерно 90-100% сходство с SEQ ID NO: 4, включая любое процентное сходство в указанном диапазоне, например 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% сходство с упомянутой последовательностью.
Первая нуклеиновая кислота и вторая нуклеиновая кислота могут быть введены в растение за одну стадию, или могут быть введены в растение последовательно.
Последовательности
Неограничивающий пример последовательностей, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, включают следующие.
Последовательность Р1 из рода Aphthovirus (афтовирус), Avihepatovirus (авигепатовирус), Cardiovirus (кардиовирус), Enterovirus (энтеровирус), Erbovirus (эрбовирус), Hepatovirus (гепатовирус), Kobuvirus (кобувирус), Parechovirus (парэховирус), Sapelovirus (сапеловирус), Senecavirus (сенекавирус), Teschovirus (тесховирус) и Tremovirus (тремовирус) могут быть использованы для получения полипротеина Р1. В неограничивающем примере последовательность, кодирующая полипротеин Р1, может быть из энтеровируса, например энтеровируса 71, или энтеровируса человека С (также известного как полиовирус).
Кроме того, неограничивающие примеры последовательностей, которые могут быть использованы для кодирования протеазы для описанного здесь применения, включают последовательность протеазы 3CD, например, полученную из вирусов рода Aphthovirus (афтовирус), Avihepatovirus (авигепатовирус), Cardiovirus (кардиовирус), Enterovirus (энтеровирус), Erbovirus (эрбовирус), Hepatovirus (гепатовирус), Kobuvirus (кобувирус), Parechovirus (парэховирус), Sapelovirus (сапеловирус), Senecavirus (сенекавирус), Teschovirus (тесховирус) и Tremovirus (тремовирус). В неограничивающем примере последовательность, кодирующая протеазу 3CD, может быть из энтеровируса, например энтеровируса 71, или полиовируса (также известного как энтеровирус человека С).
Было обнаружено, что путем введения и совместной экспрессии полипротеина и протеазы в растении или части растения можно модулировать выход полученной вирусоподобной частицы (VLP). Полипротеин и протеаза могут быть обеспечены на отдельных конструктах нуклеиновой кислоты и коэкспрессироваться, или они могут быть обеспечены на одном и том же конструкте, но с дифференциальной экспрессией каждой последовательности, требуемой для оптимизации продукции VLP, как описано ниже.
Под термином «коэкспрессированы» понимается, что две или более чем две нуклеотидные последовательности экспрессируются примерно в одно и то же время в пределах растения, в пределах одной и той же ткани растения, и в пределах одних и тех же клеток в растении. Более того, может потребоваться, чтобы две или более чем две нуклеотидные последовательности экспрессировались в пределах одного и того же клеточного компартмента, такого как, например, эндоплазматический ретикулум, аппарат Гольджи, апопласт, цитозоль, митохондрия, хлоропласт, пероксисома. Нет необходимости в том, чтобы нуклеотидные последовательности экспрессировались точно одновременно. Скорее, две или более чем две нуклеотидные последовательности экспрессируются таким образом, что у кодированных продуктов имеется возможность взаимодействия. Например, протеаза может экспрессироваться либо до, либо в период экспрессии полипротеина, таким образом, что может происходить расщепление полипротеина на структурные белки. Две или более чем две нуклеотидные последовательности могут коэкспрессироваться с использованием транзиентной экспрессионной системы, когда две или более последовательностей вводят в пределы растения примерно одновременно в условиях, при которых экспрессируются обе последовательности. Две или более чем две последовательности могут присутствовать на разных конструктах, и коэкспрессия требует введения каждого конструкта в растение, часть растения или клетку растения, или две или более чем две последовательности могут присутствовать на одном конструкте, и конструкт вводят в растение, часть растения или клетку растения.
Альтернативно, растение, содержащее одну из нуклеотидных последовательностей, например последовательность, кодирующую протеазу, может быть трансформировано транзиентно или стабильным образом с помощью дополнительной последовательности, кодирующей полипротеин. В этом случае последовательность, кодирующая протеазу, может экспрессироваться в пределах желательной ткани, во время желательной стадии развития, или ее экспрессия может быть индуцирована с использованием индуцируемого промотора, и дополнительная последовательность, кодирующая полипротеин, может экспрессироваться в аналогичных условиях и в той же самой ткани для обеспечения коэкспрессии нуклеотидных последовательностей. Кроме того, последовательность, кодирующая полипротеин, может быть трансформирована транзиентно или стабильным образом с помощью дополнительной последовательности, кодирующей протеазу. В этом случае последовательность, кодирующая полипротеин, может экспрессироваться в пределах желательной ткани, во время желательной стадии развития, или ее экспрессия может быть индуцирована с использованием индуцируемого промотора, и дополнительная последовательность, кодирующая протеазу, может экспрессироваться в аналогичных условиях и в той же самой ткани для обеспечения коэкспрессии нуклеотидных последовательностей.
Как видно на фигурах 2 и 3, на уровень накопления VLP в растении, части растения или клетке растения влияет соотношение между содержащими полипротеин Agrobacterium и содержащими протезазу Agrobacterium, инфильтрованными в растение, часть растения или клетку растения. Соотношение между содержащими полипротеин и содержащими протезазу Agrobacterium может изменяться, например, от примерно 20:1 до примерно 0,5:1 (полипротеин:протеаза), или представляет любое соотношение в указанном диапазоне, например, около 20:1, 18:1, 16:1, 14:1, 12:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 0,5:1 (полипротеин:протеаза), или любое соотношение в указанных диапазонах.
Соотношение между полипротеином и протеазой можно изменять, например, путем введения различных соотношений между Agrobacterium, содержащими первую нуклеиновую кислоту, и Agrobacterium, содержащими вторую нуклеиновую кислоту, в растение, часть растения или клетку растения. В альтернативном варианте, если полипротеин и протеаза присутствуют на одном и том же конструкте, и, следовательно, вводятся в одни и те же Agrobacterium, они могут дифференциально экспрессироваться в пределах растения, части растения или клетке растения с использованием подходящих промоторов, таким образом, что будет получено желательное соотношение между полипротеином и протеазой.
Таким образом, настоящее изобретение также обеспечивает способ увеличения выхода PVLP путем модулирования соотношения между первой и второй нуклеиновыми кислотами.
В одном варианте осуществления процентное содержание Agrobacterium, содержащих протеазу, может составлять от 0,5% до 50% от общего количества инфильтрованных Agrobacterium, или любое количество в указанном диапазоне. Например, процентное содержание Agrobacterium, содержащих протеазу, может составлять 0, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%) или 50% или любое количество в указанных диапазонах.
Процентное соотношение между Agrobacterium, содержащими полипротеин, и Agrobacterium, содержащими протеазу, может составлять от 95%:5% до 40%:60% от общего содержания инфильтрованных Agrobacterium, или любое количество в указанных диапазонах. Например, процентное содержание Agrobacterium, содержащих полипротеин, может составлять 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80%, 79%, 78%, 77%, 76%, 75%, 74%, 73%, 72%, 71%, 70%, 69%, 68%, 67%, 66%, 65%, 64%, 63%, 62%, 61%, 60%, 59%, 58%, 57%, 56%, 55%, 54%, 53%, 52% или 51% от общего количества инфильтрованных Agrobacterium. Например, процентное соотношение между Agrobacterium, содержащими полипротеин, и Agrobacterium, содержащими протеазу, может составлять от 50%:50% до 95%:5%, или любое процентное соотношение в указанных диапазонах, или процентное соотношение между Agrobacterium, содержащими полипротеин, и Agrobacterium, содержащими протеазу, может составлять 50%:50%, 55%:45%, 60%:40%, 65%:35%, 70%:30%, 75%:25%, 80%:20%, 85%:15%, 90%: 10%, 95%:5%, или любое процентное соотношение в указанных диапазонах.
В результате экспрессия первой и второй нуклеотидных последовательностей в пределах клетки растения происходит формирование VLP, и VLP можно использовать, например, для получения антитела, которое способно связывать вирусный белок, такой как, например, структурный белок пикорнавируса, включая, но без ограничения VP0, VP1, VP2, VP3 и/или VP4. Вирусоподобная частица (VLP) при введении субъекту вызывает иммунный ответ.
Как описано далее ниже, соотношение между полипротеином и протеазой может быть дополнительно изменено, например, с помощью дифференциальной экспрессии полипротеина и протеазы. Экспрессия может быть изменена путем модулирования, например, репликации, транскрипции, трансляции, или их комбинации, полипротеина, протеазы или протеина и протеазы. Например, могут быть использованы различные регуляторные элементы, включая промоторы, элементы амплификации, энхансеры, или их комбинация, дополнительно к различным соотношениям между содержащими полипротеин Agrobacterium и содержащими протеазу Agrobacterium, инфильтрованными, как описано выше. Первый набор или комбинация регуляторных элементов может быть использована для регулирования репликации, транскрипции, или их комбинации, первой нуклеиновой кислоты, и второй набор или комбинация регуляторных элементов может быть использована для регулирования репликации, транскрипции, или их комбинации, второй нуклеиновой кислоты. Первый набор или комбинация регуляторных элементов отличается от второго набора или комбинации регуляторных элементов, и делает возможной дифференциальную экспрессию первой и второй нуклеиновых кислот для обеспечения модулирования соотношения полипротеин : протеаза in vivo. Например, что не следует рассматривать как ограничение, один набор или комбинация регуляторных элементов, например первый набор, может включать элемент амплификации, например элементы, полученные из BeYDV, при этом элементы амплификации, например полученные из BeYDV, могут отсутствовать в другом наборе или комбинации регуляторных элементов, например во втором наборе. В альтернативном варианте, второй набор может включать элемент амплификации (например, элементы, полученные из BeYDV), тогда как элемент амплификации (например, элементы, полученные из BeYDV) может отсутствовать в первом наборе или комбинации регуляторных элементов. Сходным образом, сила промоторов может различаться между первым и вторым набором или комбинацией регуляторных элементов, или один из промоторов может быть индуцируемым, и другой конститутивным, таким образом, что дифференциальная экспрессия между полипротеином относительно протеазы достигается in vivo.
Размер
Возникновение вирусоподобных частиц (VLP) может быть обнаружено с использованием любого подходящего способа, например, градиентов сахарозы или эксклюзионной хроматографии. Вирусоподобные частицы (VLP) могут быть оценены с точки зрения структуры и размера с помощью, например, электронной микроскопии или эксклюзионной хроматографии.
В случае эксклюзионной хроматографии общие растворимые белки могут быть экстрагированы из ткани растения путем гомогенизации (Polytron) образца измельченного в замороженном состоянии растительного материала в буфере для экстракции, и удаления нерастворимого материала путем центрифугирования. Также, может быть полезным концентрирование путем осаждения с помощью PEG. Вирусоподобная частица (VLP) может быть также продуцирована путем получения протопластов или фракции протопластов с использованием способов, описанных в WO 2011/035422 (который включен здесь путем отсылки). Проводят количественное определение содержания растворимого белка, и экстракт пропускают через колонку Sephacryl™, например, колонку Sephacryl™ S500. В качестве калибровочного стандарта может быть использован Blue Dextran 2000.
Клеточный дебрис может быть удален центрифугированием. Затем центрифугированный экстракт может быть фильтрован. Без привязки к теории полагают, что на такой стадии или стадиях фильтрации можно удалить твердые вещества, содержащиеся в суспензии, снизить бионагрузку и стабилизировать, а также поддерживать состояние экстракта до последующей очистки. Благодаря своим размерам, PVLP могут быть дополнительно очищены с использованием тангенциальной поточной фильтрации (TFF). Без привязки к теории полагают, что TFF эффективно и селективно удаляет растворимые белки с более низкой молекулярной массой, обнаруживаемые в осветленном экстракте, включая ферменты, используемые для деполимеризации клеточной стенки. Кроме того, на стадии TFF также происходит концентрирование VLP и создаются условия для буферного обмена при подготовке к хромотографии. После стадии TFF может следовать несколько хроматографических стадий, например, анионный обмен, катионный обмен, хроматография гидрофобного взаимодействия (HIC) и/или псевдоаффинная хроматография. После стадий хроматографии могут быть добавлены дополнительные стадии TFF. После хроматографии и/или TFF фракции могут быть дополнительно проанализированы с помощью иммуноблоттинга для определения состава белков во фракции.
Отделенная фракция может представлять собой, например, супернатант (в случае центрифугирования, седиментации или осаждения) или фильтрат (в случае фильтрации), и является обогащенной белками или супраструктурными белками, такими как, например, частицы более высокого порядка, более высокой молекулярной массы, или полные VLP. Отделенная фракция может быть дополнительно обработана для изоляции, очистки, концентрирования, или их комбинации, белков, супраструктурных белков или частиц более высокого порядка с помощью, например, дополнительных стадий центрифугирования, осаждения, хроматографических стадий (например, эксклюзионной, ионообменной, аффинной хроматографии), тангенциальной поточной фильтрации или их комбинации. Присутствие очищенных белков, супраструктурных белков или частиц более высокого порядка, таких как VLP, может быть подтверждено, например, с помощью нативного электрофореза в полиакриламидном геле или SDS-PAGE, Вестерн-блоттинга с использованием соответствующего детекторного антитела, капиллярного электрофореза, электронной микроскопии или любого другого способа, как будет очевидно специалисту в данной области.
На фигуре 4А показан пример профиля элюирования анализа методом эксклюзионной хроматографии экстракта растения, содержащего PVLP. В этом случае VLP, содержащие капсид энтеровируса EV71, элюировали во фракции с 9 по приблизительно 14, с пиком во фракции 12.
Вирусоподобные частицы (VLP) могут быть очищены или экстрагированы с использованием любого подходящего способа, например, химической или биохимической экстракции. Вирусоподобные частицы (VLP) могут быть относительно чувствительными к десикации, нагреву, pH, поверхностно-активным веществам и детергентам. Таким образом, может быть полезным использовать способы, которые максимально увеличивают выход, сводят к минимуму загрязнение фракции VLP клеточными белками, поддерживают целостность белков или VLP, и способы ослабления клеточной стенки для высвобождения белков или VLP. Например, могут быть использованы способы, в которых продуцируются протопласты и/или сферопласты (смотри, например, WO 2011/035422, который включен здесь путем отсылки) для получения описанных здесь VLP. Сведение к минимуму или устранение использования детергентов или поверхностно-активных веществ, таких как, например, SDS или Triton Х-100, может быть предпочтительным для улучшения выхода экстракта VLP. VLP могут быть оценены с точки зрения структуры и размера с помощью, например, электронной микроскопии или при помощи эксклюзионной хроматографии, как указано выше, и подвергания аналитическому ультрацентрифугированию.
Размер (то есть диаметр) указанных выше PVLP может быть измерен, например, с помощью методов динамического рассеяния света (DLS) или электронной микроскопии (ЕМ) и обычно составляет от 20 до 50 нм, или любой размер в указанном диапазоне. Например, размер PVLP интактной структуры может варьировать от примерно 25 нм до примерно 35 нм, или представлять любой размер в указанном диапазоне, или составлять 20 нм, 21 нм, 22 нм, 23 нм, 24 нм, 25 нм, 26 нм, 27 нм, 28 нм, 29 нм, 30 нм, 31 нм, 32 нм, 33 нм, 34 нм, 35 нм, 36 нм, 37 нм, 38 нм, 39 нм, 40 нм, 41 нм, 42 нм, 43 нм, 44 нм, 45 нм, 46 нм, 47 нм, 48 нм, 49 нм, 50 нм или любой размер в пределах указанных значений.
Пикорнавирусоподобная частица (PVLP) может быть синтезирована в количестве до 2 г на килограмм свежей растительной массы, соответствующем примерно 40% от общего содержания белков в растении. Например, как описано здесь, количество синтезированной VLP может составлять от 10 мг до 2,0 г на килограмм свежей массы или любое количество в указанном диапазоне, такое как 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775, 800, 825, 850, 875, 900, 925, 950, 975, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900 или 2000 мг на килограмм свежей массы или любое количество в пределах указанных значений.
Хозяин
Одна или несколько генетических конструкция по настоящему изобретению могут быть экспрессированы в любом подходящем растении-хозяине или части растения, например, одном или нескольких листьях, стебле и одном или нескольких листьях, или корнях, которое трансформировано при помощи нуклеотидной последовательности или конструкций, или векторов по настоящему изобретению. Примеры подходящих «хозяев» включают, но без ограничения, сельскохозяйственные культуры, включая люцерну, канолу, капусту семейства Brassica spp., кукурузу, никотиану Nicotiana spp., картофель, женьшень, горох, овес, рис, сою, пшеницу, ячмень, подсолнечник, хлопок и т.п.
Одна или несколько генетических конструкций по настоящему изобретению могут дополнительно содержать 3'-нетранслируемую область. Указанная 3'-нетранслируемая область относится к части гена, содержащей сегмент ДНК, в котором имеется сигнал полиаденилирования и любые другие регуляторные сигналы, способные осуществлять процессинг мРНК или экспрессию гена. Сигнал полиаденилирования обычно характеризуется выполнением присоединения следов полиадениловой кислоты к 3'-концу прекурсора мРНК. Сигналы полиаденилирования обычно распознаются по присутствию гомологии к канонической форме 5' ААТААА-3', хотя вариации не являются обычным явлением. Неограничивающими примерами подходящих 3'-областей являются 3'-транскрибированные нетранслируемые области, содержащие сигнал полиаденилирования опухоли агробактерии Agrobacterium, индуцирующей (Ti) плазмидные гены, такие как нополин синтаза (ген NO-синтазы), и гены растения, такие как гены белка хранения сои и малая субъединица гена рибулозо-1,5-бисфосфат карбоксилазы (ssRUBISCO; US 4962028; который включен здесь путем отсылки), промотор, используемый в регуляции экспрессии пластоцианина, описанный в US 7125978 (который включен здесь путем отсылки).
Одна или несколько генетических конструкций по настоящему изобретению могут также включать дополнительные энхансеры, энхансеры трансляции или транскрипции, при необходимости. Энхансеры могут быть расположены в положении 5'- или 3'- по отношению к транскрибируемой последовательности. Области энхансера хорошо известны специалисту в данной области и могут включать инициирующий кодон ATG, смежные последовательности или т.п. Инициирующий кодон, в случае присутствия, должен находиться в одной фазе с рамкой считывания («в рамке считывания») кодирующей последовательности для обеспечения правильной трансляции транскрибированной последовательности.
Конструкции по настоящему изобретению могут быть введены в клетки растения с использованием Ti-плазмид, Ri-плазмид, векторов вирусов растений, прямой трансформации ДНК, микроинъекции, электропорации и т.п. Для ознакомления с этими методами, см., например, Weissbach и Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academy Press, New York VIII, pp. 421-463 (1988); Geierson и Corey, Plant Molecular Biology, 2d Ed. (1988); и Miki и Iyer, Fundamentals of Gene Transfer in Plants. In Plant Metabolism, 2d Ed. DT. Dennis, DH Turpin, DD Lefebrve, DB Layzell (eds), Addison Wesly, Langmans Ltd. London, pp. 561-579 (1997). Другие методы включают прямое усвоение ДНК, использование липосом, электропорациию, например использование протопластов, микроинъекции, микроснарядов или вакуумной инфильтрации. Смотри, например, Bilang, et al. (Gene 100: 247-250 (1991), Scheid et al. (Mol. Gen. Genet. 228: 104-112, 1991), Guerche et al. (Plant Science 52: 111-116, 1987), Neuhause et al. (Theor. Appl Genet. 75: 30-36, 1987), Klein et al., Nature 327: 70-73 (1987); Howell et al. (Science 208: 1265, 1980), Horsch et al. (Science 227: 1229-1231, 1985), DeBlock et al., Plant Physiology 91: 694-701, 1989), Methods for Plant Molecular Biology (Weissbach and Weissbach, eds., Academic Press Inc., 1988), Methods in Plant Molecular Biology (Schuler and Zielinski, eds., Academic Press Inc., 1989), Liu and Lomonossoff (J Virol Meth, 105: 343-348, 2002), патенты США 4945050; 5036006; и 5100792, заявки на патент США с рег. №№08/438666, поданной 10 мая 1995 года и 07/951715, поданной 25 сентября 1992 года (все из которых включены здесь путем отсылки).
Транзиентная экспрессия
Без привязки к теории полагают, что концентрация белка и соотношение различных структурных белков пикорнавируса, полипротеина пикорнавируса и/или протеазы могут быть важными для эффективности сборки PVLP. Таким образом, множественность и время возникновения инфекции могут быть важными для манипулирования концентрацией белков и общей эффективности сборки VLP в растениях.
Конструкция по настоящему изобретению может быть транзиентно экспрессирована в растении, части растения или клетке растения. Система транзиентной экспрессии, основанная на эпихромосомной экспрессии введенного рекомбинатного полипротеина путем инфильтрации Agrobacterium tumefaciens в растение, часть растения или клетку растения, может быть использована для экспрессии структурного белка пикорнавируса, полипротеина и/или протеазы пикорнавируса для направления в различные клеточные компартменты или субкомпартменты. Система транзиентной экспрессии обеспечивает высокую скорость продукции. Кроме того, высокие уровни белка могут быть достигнуты в течение нескольких дней после инфильтрации растений рекомбинантными Agrobacterium (Rybicki, 2010; Fischer et al., 1999). Также, возможно экспрессировать длинные последовательности генов и иметь несколько генов, одновременно экспрессирующихся в одной и той же клетке, делая возможной эффективную сборку мультимерных белков (Lombardi et al., 2009).
Однако во время транзиентной экспрессии посттранскрипционный сайленсинг генов может ограничивать экспрессию гетеро логичных белков в растениях. Коэкспрессия супрессора сайленсинга, например, но без ограничения, Nss из вируса бронзовости томата, может быть использована для противодействия специфической деградации мРНК трансгена (Brigneti et al., 1998). Альтернативные супрессоры сайленсинга известны из существующего уровня техники и могут быть использованы так, как изложено в настоящем документе (Chiba et al., 2006, Virology 346: 7-14; который включен здесь путем отсылки), например, но без ограничения, НсРго, вирус гравировки табака TEV-p1/HC-Pro (Tobacco etch virus-p1/НС-Pro), BYV-p21, p19 вируса кустистой карликовости томатов (TBSV p19), капсидный белок вируса курчавости томата (TCV-CP), вирус мозаики огурца 2b (CMV-2b), р25 вируса картофеля X (PVX-р25), p11 вируса картофеля М (PVM-p11), p11 вируса картофеля S (PVS-p11), р16 вируса ожога черники (BScV-p16), р23 вируса тристеца цитрусовых (CTV-p23), р24 вируса скручивания листьев винограда-2 (Grapevine leafroll-associated virus-2) (GLRaV-2 p24), p10 вируса винограда A (GVA-p10), p14 вируса винограда В (GVB-p14), p10 латентного вируса борщевика (Heracleum latent virus) (HLV-p10) или p16 общего латентного вируса чеснока (Garlic common latent virus) (GCLV-p16). Таким образом, супрессор сайленсинга, например НсРго, TEV-p1/HC-Pro, BYV-p21, TBSV-p19, TCV-CP, CMV-2b, PVX-p25, PVM-p11, PVS-p11, BScV-p16, CTV-p23, GLRaV-2 p24, GBV-p14, HLV-p10, GCLV-p16 или GVA-p10, может быть коэкспрессирован вместе с одним или несколькими структурными белками пикорнавируса, полипротеином и/или протеазой пикорнавируса, чтобы дополнительно обеспечить высокие уровни продукции белка в растении, части растения или клетке растения.
Настоящее изобретение также обеспечивает способ, как описано выше, в котором дополнительная (третья) нуклеотидная последовательность экспрессируется в пределах растения, при этом дополнительная (третья) нуклеотидная последовательность, кодирующая супрессор сайленсинга, оперативно связана с дополнительной (третьей) регуляторной областью, которая является активной в растении. Нуклеотидная последовательность, кодирующая супрессор сайленсинга, может представлять собой, например, Nss, HcPro, TEV-p1/HC-Pro, BYV-p21, TBSV р19, TCV-CP, CMV-2b, PVX-p25, PVM-p11, PVS-p11, BScV-p16, CTV-p23, GLRaV-2 p24, GBV-p14, HLV-p10, GCLV-p16 или GVA-p10.
Как приведено в описании ниже, методы транзиентной экспрессии могут быть использованы для экспрессии конструкций в соответствии с настоящим изобретением (смотри Liu и Lomonossoff, 2002, Journal of Virological Methods, 105: 343-348; который включен здесь путем отсылки). В альтернативном варианте может быть использован метод транзиентной экспрессии, базирующейся на вакууме, как это изложено Kapila et al., 1997, который включен здесь путем отсылки. Эти методы могут включать, например, но без ограничения, метод агроинокуляции или агроинфильтрации, инфильтрации с помощью шприца, однако, как было отмечено выше, также могут быть применены другие транзиентные методы. В случае агроинокуляции, агроинфильтрации или инфильтрации с помощью шприца смесь Agrobacteria, содержащая искомую нуклеиновую кислоту, проникает в межклеточные пространства ткани, например, листья, надземную часть растения (включая стебель, листья и цветок), другие части растения (стебель, корень, цветок) или все растение. После преодоления эпидермиса Agrobacteria инфицируют и переносят копии Т-ДНК в клетки. Т-ДНК эписомально транскрибируется, а мРНК транслируется, вызывая продуцирование целевого белка в инфицированных клетках, однако проникновение Т-ДНК внутрь ядра является временным.
Также, рассмотренной частью данного изобретения являются трансгенные растения, клетки растения или семена, содержащие нуклеиновые кислоты, или одну или более чем одну генную конструкцию по настоящему изобретению. Способы регенерации целых растений из клеток растений известны в данной области. Как правило, трансформированные клетки растения культивируют в соответствующей среде, которая может содержать селективные агенты, такие как антибиотики, при этом селективные маркеры используются для содействия идентификации стабильно трансформированных клеток растения. Для содействия идентификации стабильно трансформированных клеток растения, конструкции по данному изобретению могут быть дополнительно манипулированы для включения селективных в отношении растения маркеров. Подходящие селективные маркеры включают ферменты, которые обеспечивают устойчивость к химическим веществам, таким как антибиотики, например, гентамицин, гигромицин, канамицин, или гербициды, такие как фосфинотрицин, глифосат, хлорсульфурон, и т.п. Аналогичным образом, могут быть использованы ферменты, обеспечивающие получение соединения, идентифицируемого по изменению цвета, например, бета-глюкуронидаза (GUS), или по свечению, например люцифераза или зеленый флуоресцентный белок (GFP). После образования каллюса формирование отростков может быть вызвано путем использования соответствующих растительных гормонов в соответствии с известными способами, и отростки помещены в субстрат для выращивания растений для регенерации растений. Полученные растения могут быть затем использованы для создания повторяющихся поколений либо в форме семян, либо путем использования методов вегетативного размножения. Трансгенные растения могут быть также созданы без использования тканевых культур.
Элементы амплификации
Соотношение между полипротеином и протеазой может быть изменено, например, с помощью использования различных регуляторных элементов или комбинации регуляторных элементов в последовательностях нуклеиновой кислоты, используемых для управления экспрессией полипротеина и протеазы. Например, первый набор или комбинация регуляторных элементов может быть использована для регуляции репликации, транскрипции, или их комбинации, первой нуклеиновой кислоты, и второй набор или комбинация регуляторных элементов может быть использована для регуляции репликации, транскрипции, или их комбинации, второй нуклеиновой кислоты, таким образом, чтобы достигнуть различия в экспрессии первой и второй нуклеиновых кислот, модулируя, тем самым, соотношение полипротеин : протеаза in vivo. Например, что не следует рассматривать как ограничение, первый набор или комбинация регуляторных элементов может включать элемент амплификации, например, элементы, полученные из BeYDV, тогда как элемент амплификации может отсутствовать во втором наборе или комбинации регуляторных элементов. В альтернативном варианте, второй набор может включать элемент амплификации, например, элементы, полученные из BeYDV, тогда как элемент амплификации может отсутствовать в первом наборе или комбинации регуляторных элементов.
«Экспрессионная кассета» относится к нуклеотидной последовательности, содержащей целевую нуклеиновую кислоту, которая находится под контролем или оперативно (или функционально) связана с подходящим промотором или другими регуляторными элементами, для транскрипцию целевой нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине.
Система экспрессии, описанная здесь, может содержать экспрессионную кассету на основе двухкомпонентного вируса или вируса с двухкомпонентным геномом. Например, двухкомпонентный вирус может принадлежать семейству Comoviridae. Семейство Comoviridae включает роды Comovirus (комовирус), Nepovirus (неповирус), Fabaviras (фабавирус), Cheravirus (черавирус) и Sadwavirus (садвавирус). Комовирусы включают мозаичный вирус коровьего гороха (Cowpea mosaic virus, CPMV), вирус тяжелой мозаики коровьего гороха (Cowpea severe mosaic virus, CPSMV), вирус мозаики тыквы (Squash mosaic virus, SqMV), вирус крапчатости красного клевера (Red clover mottle virus, RCMV), вирус пятнистости стручков бобовых (Bean pod mottle virus, BPMV), вирус кольцевой пятнистости турнепса (Turnip ringspot virus, TuRSV), вирус мозаики кормовых бобов (Broad bean true mosaic virus, BBtMV), вирус пятнистости кормовых бобов (Broad bean stain virus, BBSV), вирус мозаики редиса (Radish mosaic virus, RaMV). Примеры последовательностей PHK-2 комовируса, содержащих элементы энхансера, которые могут быть пригодными для различных аспектов изобретения, включают, но без ограничения: CPMV RNA-2 (номер доступа в GenBank NC_003550), RCMV RNA-2 (номер доступа в GenBank NC_003738), BPMV RNA-2 (номер доступа в GenBank NC_003495), CPSMV RNA-2 (номер доступа в GenBank NC_003544), SqMV RNA-2 (номер доступа в GenBank NC_003800), TuRSV RNA-2 (номер доступа в GenBank NC_013219.1). BBtMV RNA-2 (номер доступа в GenBank GU810904), BBSV RNA2 (номер доступа в GenBank FJ028650), RaMV (номер доступа в GenBank NC_003800).
Сегменты РНК-генома двухкомпонентного комовируса называются RNA-1 и RNA-2. RNA-1 кодирует белки, вовлеченные в репликацию, тогда как RNA-2 кодирует белки, необходимые для межклеточного транспорта, а также два капсидных белка. Любые подходящие кассеты на основе комовируса могут быть использованы, включая CPMV, CPSMV, SqMV, RCMV или BPMV, например, кассета экспрессии может быть основана на CPMV.
Системы экспрессии могут также содержать элементы амплификации из геминивируса, например элемент амплификации из вируса желтой карликовости фасоли (bean yellow dwarf virus, BeYDV). BeYDV принадлежит роду Mastreviruses, адаптированному к двудольным растениям. BeYDV является однокомпонентным, имеющим геном однонитевой кольцевой ДНК, и может реплицироваться с чрезвычайно высоким числом копий по механизму разматывающегося рулона. Векторные системы на основе репликона ДНК вируса BeYDV использовали для быстрого продуцирования белка с высоким выходом в растениях.
Используемое здесь выражение «элементы амплификации» относится к сегменту нуклеиновой кислоты, содержащему, по меньшей мере, часть одной или нескольких длинных межгенных областей (LIR) генома геминивируса. Используемое здесь выражение «длинная межгенная область» относится к длинной межгенной области, которая содержит сайт связывания Rep-белка, способный опосредовать вырезание и репликацию Rep-белком геминивируса. В некоторых аспектах сегмент нуклеиновой кислоты, содержащий одну или несколько LIR, может дополнительно содержать короткую межгенную область (SIR) генома геминивируса. Используемое здесь выражение «короткая межгенная область» относится к комплементарной нити (короткой IR (SIR) Mastreviruses). В настоящем документе может быть использован любой подходящий элемент амплификации, полученный из геминивируса. Смотри, например, WO 2000/20557; WO 2010/025285; Zhang X. et al. (2005, Biotechnology and Bioengineering, Vol. 93, 271-279), Huang Z. et al. (2009, Biotechnology and Bioengineering, Vol. 103, 706-714), Huang Z. et al. (2009, Biotechnology and Bioengineering, Vol. 106, 9-17); которые включены здесь путем отсылки).
Регуляторный элемент
Настоящее изобретение, кроме того, относится к генной конструкции, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую полипротеин, такой как один или несколько белков пикорнавируса, или протеазу, например, но без ограничения, протеазу пикорнавируса, описанную выше, оперативно связанную с регуляторным элементом, который является функциональным в растении.
Под используемыми в настоящей заявке терминами «регуляторная область», «регуляторный элемент» или «промотор» понимается часть нуклеиновой кислоты, обычно, но не всегда расположенной перед областью кодирования белка гена, которая может состоять либо из ДНК, либо из РНК, или из ДНК и РНК одновременно. Когда регуляторная область является активной и находится в функциональном взаимодействии или функционально связана с целевым геном, это может привести к экспрессии целевого гена. Регуляторный элемент может обладать способностью опосредования органной специфичности или контроля развивающейся или временной активации гена. «Регуляторная область» может включать в себя элементы протомора, элементы активной зоны промотора, демонстрирующие базовую активность промотора, элементы, индуцируемые в ответ на внешние раздражители, элементы, которые способствуют активности промотора, например отрицательные регуляторные элементы или транскрипционные энхансеры. Используемая в настоящем документе «регуляторная область» также может включать в себя элементы, являющиеся активными, следуя за транскрипцией, например регуляторные элементы, модулирующие экспрессию генов, например трансляционные и транскрипционные энхансеры, трансляционные и транскрипционные репрессоры, вышележащие активирующие последовательности, а также детерминанты нестабильности мРНК. Последние из указанных элементов могут быть расположены близко к области кодирования.
Примеры регуляторных элементов, функционирующих в клетке растения, и которые могут быть использованы в соответствии с настоящим изобретением, включают, но без ограничения, регуляторную область пластоцианина (патент США 7125978; который включен здесь путем отсылки) или регуляторную область рибулоза-1,5-бифосфат-карбоксилазы/оксигеназы (RuBisCO; патент США 4962028; который включен здесь путем отсылки), хлорофилл a/b связывающий белок (CAB; Leutwiler et al; 1986; который включен здесь путем отсылки), ST-LS1 (связанный с кислород-выделяющим комплексом фотосистемы II и описанный Stockhaus et al. 1987, 1989; который включен здесь путем отсылки).
В контексте настоящего изобретения термин «регуляторный элемент» или «регуляторная область» обычно относится к последовательности ДНК, чаще, не всегда, расположенной перед (5'-концом) кодирующей последовательностью структурного гена, контролирующего экспрессию области кодирования путем обеспечения распознавания полимеразы РНК и/или другие факторы, необходимые для инициирования транскрипции в конкретном сайте. Однако следует понимать, что другие нуклеотидные последовательности, расположенные внутри интронов или 3'-конца последовательности, также могут участвовать в регулировании экспрессии целевой кодирующей области. Примером регуляторного элемента, обеспечивающего распознавание полимеразы РНК или прочих транскрипционных факторов с целью инициирования конкретного сайта, является элемент промотора. Большинство, но не все эукариотные элементы промотора, содержат ТАТА-бокс, то есть консервативную последовательность нуклеиновой кислоты, состоящую из пар нуклеотидов аденозин и тимидин, обычно расположенную на удалении приблизительно в 25 пар нуклеотидов перед сайтом инициирования транскрипции. Элемент промотора содержит основной элемент промотора, отвечающий за инициацию транскрипции, а также прочие регуляторные элементы (перечислены выше), модифицирующие экспрессию генов.
Существует несколько типов регуляторных областей, включая области, регулируемые в процессе развития, индуцируемые или конститутивные. Регуляторная область, регулируемая в процессе развития или контролирующая дифференциальную экспрессию гена, находящегося под ее контролем, активируется в пределах определенных органов или тканей органа в конкретные промежутки времени в период развития указанного органа или ткани. Однако некоторые регуляторные области, которые регулируются в процессе развития, могут в предпочтительном случае быть активными в пределах определенных органов или тканей на конкретных стадиях развития, они могут быть также активными в режиме регулирования или на основном уровне в других органах или тканях растения. Примеры тканеспецифичных регуляторных областей, для примера смотри конкретную регуляторную область, включают в себя промотор напина, а также промотор круциферина (Rask et al., 1998, J. Plant Physiol. 152: 595-599; Bilodeau et al., 1994, Plant Cell 14: 125-130). Пример специфичного к листьям промотора включает в себя промотор пластоцианина (смотри патент США 7125978, который включен здесь путем отсылки).
Индуцируемой регуляторной областью является область, способная напрямую или косвенно активировать транскрипцию одной или нескольких последовательностей ДНК или генов в ответ на индуктор. При отсутствии индуктора последовательности ДНК или гены не будут транскрибированы. Обычно белковый фактор, который специфически связывается с индуцируемой регуляторной областью для активации транскрипции, может присутствовать в неактивной форме, которая затем напрямую или опосредованно превращается в активную форму с помощью индуктора. Однако белковый фактор может также отсутствовать. Индуктором может выступать химический агент, такой как белок, метаболит, регулятор роста, гербицид или фенольное соединение, или же физиологический стресс, вызванный непосредственно теплом, холодом, солью или токсичными элементами, или косвенно через воздействие патогена или болезнетворного агента, такого как вирус.Клетка растения, содержащая индуцируемую регуляторную область, может подвергаться воздействию индуктора при внешнем применении индуктора к клетке или растению, таком как опрыскивание, полив, нагрев или сходные способы. Индуцируемые регуляторные элементы могут быть получены из генов как растительного, так и нерастительного происхождения (например, Gatz, С. и Lenk, LR.P., 1998, Trends Plant Sci. 3, 352-358; который включен путем отсылки). Примеры потенциально индуцируемых промоторов включают, но без ограничения, индуцируемый тетрациклином промотор (Gatz, С., 1997, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48, 89-108; который включен путем отсылки), индуцируемый стероидом промотор (Aoyama. Т. and Chua, N.H., 1997, Plant 1. 2, 397-404; который включен путем отсылки) и индуцируемый этанолом промотор (Salter, M.G., et al, 1998, Plant 10urnal 16, 127-132; Caddick, M.X., et al, 1998, Nature Biotech. 16, 177-180, который включен путем отсылки), индуцируемые цитокином гены IB6 и CKI 1 (Brandstatter, I. and K. ieber, 1.1., 1998, Plant Cell 10, 1009-1019; Kakimoto, Т., 1996, Science 274, 982-985; которые включены путем отсылки) и индуцируемый ауксином элемент DR5 (Ulmasov, Т., et al., 1997, Plant Cell 9, 1963-1971; который включен путем отсылки).
Конститутивная регуляторная область направляет экспрессию генов через различные части растения и непрерывно в течение всего развития растения. Примеры известных конститутивных регуляторных элементов включают промоторы, связанные с транскриптом вируса мозаики цветной капусты CaMV 35S (Odell et al., 1985, Nature, 313: 810-812), актин 1 риса (Zhang et al, 1991, Plant Cell, 3: 1155-1165), актин 2 (An et al., 1996, Plant J., 10: 107-121), или триметилсилил 2 (патент США 5428147, включенный здесь путем отсылки), и гены триозефосфатизомеразы 1 (Xu et. aI., 1994, Plant Physiol. 106: 459-467), ген убиквитина кукурузы 1 (Cornejo et ai, 1993, Plant Mol. Biol. 29: 637-646), гены убиквитина 1 и 6 Arabidopsis (Holtorf et aI, 1995, Plant Mol. Biol. 29: 637-646), и ген фактора 4A инициирования трансляции табака (Mandel et aI, 1995, Plant Mol. Biol. 29: 995-1004).
Термин «конститутивная», используемый здесь, необязательно означает, что ген, находящийся под контролем конститутивной регуляторной области, экспрессируется на одном уровне во всех типах клеток, а то, что ген экспрессируется в широком диапазоне типов клеток, хотя часто наблюдается колебание в численности. Конститутивные регуляторные элементы могут быть связаны с другими последовательностями для дополнительного усиления транскрипции и/или трансляции нуклеотидной последовательности, с которой они оперативно связаны. Например, система CPMV-HT получена из нетранслируемых областей вируса мозаики коровьего гороха (Cowpea mosaic virus, CPMV) и демонстрирует усиленную трансляцию ассоциированной кодирующей последовательности. Термин «нативная» означает, что нуклеиновая кислота или аминокислотная последовательность имеет природное происхождение или является «дикого типа». Термин «оперативно связанная» означает, что конкретные последовательности, например регуляторный элемент и целевая кодирующая область, взаимодействует прямо или опосредованно для выполнения предназначенной функции, такой как опосредование или модулирование экспрессии генов. Взаимодействие оперативно связанных последовательностей может, например, быть опосредовано белками, которые взаимодействуют с оперативно связанными последовательностями.
Соотношение между полипротеином и протеазой может быть дополнительно изменено, например, путем использования регуляторных элементов, элемента амплификации и/или энхансеров. Например, первая нуклеиновая кислота может содержать регуляторные элементы, элемент амплификации и/или энхансеры. Вторая нуклеиновая кислота может содержать или не содержать такую же комбинацию регуляторных элементов, элемента амплификации и/или энхансеров.
Например, могут быть использованы различные промоторы для управления дифференциальной экспрессией между полипротеином по отношению к протеазе in vivo. Например, первый набор или комбинация регуляторных элементов может включать индуцируемый промотор, тогда как промотор во втором наборе или комбинации регуляторных элементов может быть конститутивным, или второй набор или комбинация регуляторных элементов может содержать индуцируемый промотор, тогда как промотор в первом наборе или комбинации регуляторных элементов может быть конститутивным. Сила промотора также может различаться между первым и вторым набором или комбинацией регуляторных элементов, таким образом, что дифференциальная экспрессия между полипротеином относительно протеазы достигается in vivo.
Настоящее изобретение будет дополнительно проиллюстрировано в следующих примерах.
Пример 1. Экспрессия EV71
Синтез генов
Использовали сегменты ДНК, кодирующие структурный белок Р1 и протеазу 3CD EV71. Кандидатные последовательности для Р1 и 3CD доступны в базе данных GenBank. Неограничивающими примерами этих последовательностей являются:
- Для Р1 аминокислотная (аа) последовательность: последовательность аминокислот с инвентарным номером ADG57603 в базе данных GenBank (аминокислоты 1-862) (SEQ ID NO: 5); нуклеотидная последовательность: инвентарный номер GQ279369 в базе данных GenBank (нуклеотиды 743-3328) (SEQ ID NO: 6);
- Для 3CD (штамм HK08): аминокислотная последовательность: инвентарный номер ADG57603 в базе данных GenBank (аминокислоты 1549-2193) (SEQ ID NO: 1); нуклеотидная последовательность: инвентарный номер GQ279369 в базе данных GenBank (нуклеотиды 5386-7321) (SEQ ID NO: 2);
- Для 3CD (штамм GDFS08): аминокислотная последовательность с инвентарным номером ACI25378 в базе данных GenBank (аминокислоты 1549-2193) (SEQ ID NO: 3); нуклеотидная последовательность: инвентарный номер FJ194964 в базе данных GenBank (нуклеотиды 5387-7321) (SEQ ID NO: 4).
Синтезировали два гена Р1. Первый ген получали с использованием последовательности дикого типа, тогда как второй ген был основан на оптимизированной последовательности (использование кодона человека), определенной с использованием стандартных способов, известных в данной области. Два гена 3CD синтезировали на основе их последовательностей дикого типа. Три гена дикого типа синтезировали с помощью Invitrogen™ (ранее известный как GeneArt), и оптимизированный ген Р1 оптимизировали и синтезировали с помощью DNA 2.0.
Молекулярное клонирование
Синтезированные гены клонировали в экспрессионные вектора растений. Выбранные компоненты вектора включают транскрипционные и трансляционные регуляторные элементы из кассеты на основе вируса мозаики коровьего гороха (CPMV) или гена пластоцианина люцерны. Оба регуляторных элемента успешно использовали в платформе для высокой экспрессии рекомбинантных белков. Элементы амплификации ДНК из геминивируса желтой карликовости фасоли (BeYDV) являются еще одним свойством, которое может быть интегрировано в экспрессионные вектора растения. Это привело к значительному увеличению экспрессии белка для некоторых кандидатов. Таким образом, авторы клонировали каждую генную конструкцию в экспрессионные вектора с элементами амплификации ДНК или без них. В Таблице 1 представлены экспрессионные кассеты, собранные для проекта.
Анализ экспрессии - Отбор наилучшихрекомбинантных генных конструкций
Каждую экспрессионную кассету клонировали в плазмидный вектор, который затем переносили в Agrobacterium tumefaciens. Транзиентную экспрессию инициировали с помощью вакуумной инфильтрации инокулята трансгенных Agrobacterium, что привело к переносу мобильных ДНК-копий конструкций ДНК в клетки растения. Транзиентную экспрессию множества компонентов (коэкспрессию) выполняли путем инфильтрации смесей инокулятов Agrobacterium (совместной инфильтрации). Так как одним компонентом, вводимым в растение, являлся структурный белок (Р1), и субстратом второго компонента являлась протеаза 3CD, уровень экспрессии двух компонентов был модулирован. Это выполняли путем использования различных промоторов, систем амплификации ДНК различной силы, путем изменения относительного содержания каждого инокулята (Р1 и 3CD) на момент инфильтрации, или их комбинации.
Экспрессионные вектора с 1300 до 1308 подвергали скринингу на их способность экспрессировать только Р1, и при объединении с векторами с 1310 по 1318 на их способность продуцировать высокие уровни протеолитических фрагментов VP1-4. Так как было доступным только анти-VPl антитело (Abnova, МАВ1255-М05), накопление протеолитических фрагментов отслеживали по накоплению VP1 и исчезновению непроцессированного Р1. Как показано на фигуре 2, экспрессия только Р1 (вектор под номером 1300) привела к накоплению VP1-содержащего продукта, имеющего кажущуюся молекулярную массу, соответствующую молекулярной массе непроцессированного структурного белка (98 kDa), указывая на то, что протеазы растения не могут расщеплять Р1 для генерации вирусных капсидных белков. Однако, когда Р1 коэкспрессировался с 3CD (вектора под номерами 1300+1310 и 1300+1315), сигнал с массой 98 kDa полностью исчезал и обнаруживался новый продукт, который соответствовал по молекулярной массе VP1 (33,5 kDa). Этот результат показывает, что вирусная протеаза продуцируется и является высокоактивной в растении, и что она распознает и расщепляет свой совместно продуцированный субстрат в клетках растения для генерации капсидных белков EV71.
Полученные результаты указывают на то, что на уровень накопления VP1 в растении влияет соотношение между Agrobacterium, содержащими белок Р1, и Agrobacterium, содержащими протеазу 3CD, при этом более высокое накопление получено при более низком содержании Agrobacterium, содержащих протеазу 3CD (фигура 2: сравнение 1300+1315 (4:2), 1300+1315 (4:1) и 1300+1315 (4:0,5)). Происхождение 3CD, HK08 в сравнении с GDFS08, также влияет на уровень накопления VP1 в растении (фигура 2: 1300+1310 (4:0.5) в сравнении с 1300+1315 (4:0.5)). В заключение, наблюдалось, что наиболее высокий уровень накопления VP1 был получен из экспрессионных векторов, содержащих элементы амплификации ДНК (фигура 2: 1301+1311 (4:2)).
В следующем эксперименте Р1 находился под контролем CPMV-HT+BeYDV (1301), при этом различные экспрессионные кассеты 3CD совместно трансформировали при различных разведениях на момент инфильтрации. Вестерн-блот-анализ с использованием анти-VP1 моноклонального антитела на сырых белковых экстрактах из трансформированных растений показал, что накопление VP1 наблюдалось в диапазоне соотношений Р1 и протеазы, и компонентов конструкции. Векторная комбинация, вызывающая наиболее высокий уровень накопления VP1, представляет собой 1301+1310 при соотношении концентраций штаммов Agrobacterium 4:0,5 (структурный белок : протеаза) в бактериальной суспензии (фигура 3).
Анализ формирования VLP
Встраивание VP1 в вирусоподобные частицы (VLP) оценивали с использованием эксклюзионной хроматографии (SEC) концентрированных экстрактов. Коллоидные частицы концентрировали из сырых осветленных экстрактов путем высокоскоростного центрифугирования (75000 × г в течение 20 мин). Осадок промывали и ресуспендировали в 1/6 объема буфера для ресуспендирования (50 мМ PBS pH 7,4, 150 мМ NaCl), и нагружали на гель-фильтрационную колонку Sephacryl S-500. Колонку элюировали ресуспензионным буфером, и элюированные фракции оценивали с помощью SDS-PAGE и вестерн-блоттинга.
Белковый экстракт из растений, транзиентно трансформированных 1301+1310 (4:0,5), подвергали разделению методом эксклюзионной хроматографии (SEC), и элюированные фракции анализировали с помощью SDS-PAGE с окраской Кумасси и вестерн-блоттинга анти-VP1. Результаты, представленные на фигуре 4А, показывают, что большая часть белков хозяина элюирована из колонки в поздних фракциях с пиком во фракции 16, тогда как VP1-специфический сигнал детектирован в более ранних фракциях с пиком во фракции 12, в которой обнаружено незначительное содержание белков хозяина. Так как VP1 является относительно малым белком, предполагается, что он будет элюирован из колонки с большей частью белков хозяина, если не будет встроен в высокомолекулярные структуры. Таким образом, профиль элюирования, наблюдаемый для VP1, убедительно свидетельствует о том, что VP1 был интегрирован в высокомолекулярную структуру. Комбинация вестерн-блоттинга и окраски геля Кумасси также дает основание предполагать, что доминирующим белком, указанным стрелкой на фигуре 4А, показывающей SDS-PAGE с окраской Кумасси, может являться VP1.
Образец элюированной фракции 12 из этого эксперимента отправляли в институт Institut Armand-Frappier (IAF, Laval, Quebec) для анализа методом трансмиссионной электронной микроскопии (ТЕМ). Образец исследовали после негативного окрашивания 3%-ной фосфорновольфрамовой кислотой. На фигуре 4В показано, что сферические частицы размером 30 нм, идентичные по размеру и внешнему виду пустым частицам EV71, обнаруженным в EV71-инфицированных клеточных культурах Vero (Liu et al., PLoS ONE 6, e20005), наблюдались в элюированной фракции 12. Этот результат указывает на то, что высокомолекулярные структуры, в которые встроен VP1, представляют собой истинные вирусоподобные частицы (VLP) EV71.
Частичная очистка
4
Платформа скрининга VLPExpress в качестве способа очистки VLP была разработана для очистки обол очечных вирусоподобных частиц (VLP) (140 нм в диаметре) из биомассы трансформированного растения. В способе используется ферментативное расщепление клеточных стенок для высвобождения внеклеточного и цитозольного содержимого, и полученный экстракт подвергают глубокой фильтрации и микрофильтрации перед центрифугированием при 16000 г в течение 6 ч с получением осадка VLP. Осадок ресуспендируют в 1/60 объема ресуспензионного раствора (100 мМ Na/KPO рН 7,4, 150 мМ NaCl, 0,01% Tween-80) и стерильно фильтруют (0,2 мкм).
Способ очистки VLPExpress тестировали на его способность концентрировать необолочечные вирусоподобные частицы (VLP) EV71 размером 30 нм. Способ очистки применяли к растениям, трансформированным с помощью экспрессионных векторов 1301+1310 (4:0,5). Полученный продукт анализировали с помощью SDS-PAGE с окраской Кумасси и вестерн-блоттинга анти-VP1 (фигура 5А). Анализ продукта очистки с помощью SDS-PAGE с окраской Кумасси показал присутствие белков, соответствующих по молекулярной массе белкам оболочки EV71 (показано стрелками, фигура 5А, правая сторона). Идентичность VP1 подтверждали с помощью вестерн-блоттинга (фигура 5А, левая сторона). Для других капсидных белков идентификация основывалась на предполагаемой молекулярной массе; 37,5 kDa для VP0 и 26,5 kDa для VP3. Предполагалось, что VP4 и VP2 будут обнаружены в форме нерасщепленных VP0, поскольку при формировании вирусных частиц расщепление на VP4 и VP2 возникает только после интернализации вирусной РНК. Анализ методом трансмиссионной электронной микроскопии очищенного продукта выявил доминирующие сферические структуры размером 30 нм, соответствующие по размеру и форме вирусоподобным частицам (VLP) EV71 (фигура 5В).
Выводы в отношении экспрессии
Работа, выполненная для демонстрации способности платформы транзиентной экспрессии на основе растений продуцировать вирусоподобные частицы (VLP) EV71, приводит к следующим выводам:
- белки Р1 и 3CD EV71 эффективно продуцируются в системе;
- белок 3CD является активным in plant а и правильно процессирует Р1 в капсидные белки;
- капсидные белки EV71 собираются в вирусоподобные частицы (VLP);
- вирусоподобные частицы (VLP) EV71 являются экстрагируемыми и могут быть очищены в интактном виде из растительной биомассы.
Пример 2 - Экспрессия полиовируса
Синтез генов
Могут быть использованы сегменты ДНК, кодирующие структурный белок Р1 и протеазу 3CD полиовируса (PV) из энтеровируса человека С серотипа PV-1. Кандидатные последовательности для Р1 и 3CD доступны в базе данных GenBank. Неограничивающими примерами этих последовательностей являются:
Для Р1: последовательность аминокислот с инвентарным номером NP_041277 в базе данных GenBank (аминокислоты 1-881) (SEQ ID NO: 10); нуклеотидная последовательность: инвентарный номер NC_002058 в базе данных GenBank (нуклеотиды 743-3385) (SEQ ID NO: 9);
Для 3CD: аминокислотная последовательность с инвентарным номером NP_041277 в базе данных GenBank (аминокислоты 1566-2209) (SEQ ID NO: 8); нуклеотидная последовательность: инвентарный номер NC_002058 в базе данных GenBank (нуклеотиды 5438-7369) (SEQ ID NO: 7).
Могут быть синтезированы два гена Р1. Первый ген может быть получен с использованием последовательности дикого типа, тогда как второй ген может быть основан на оптимизированной последовательности (использовании человеческого кодона), определенной с использованием стандартных способов, известных в данной области. Ген 3CD может быть синтезирован на основе его последовательности дикого типа. Оба гена дикого типа (Р1 и 3CD) могут быть синтезированы с помощью Invitrogen™ (называемый ранее Gene Art), и оптимизированный ген Р1 оптимизирован и синтезирован при помощи DNA 2.0.
Молекулярное клонирование
Синтезированные гены могут быть клонированы в экспрессионные вектора растений. Отобранные компоненты векторов включают транскрипционные и трансляционные регуляторные элементы из кассеты на основе вируса мозаики коровьего гороха (CPMV) или гена пластоцианина люцерны, поскольку оба регуляторных элемента успешно использовали ранее для высокой экспрессии рекомбинантных белков. Элементы амплификации ДНК из геминивируса желтой карликовости фасоли (BeYDV) также могут быть интегрированы в экспрессионные вектора растений. Таким образом, каждая генная конструкция может быть клонирована в экспрессионные вектора с элементами амплификации ДНК или без них. В Таблице 2 представлены экспрессионные кассеты растения, которые могут быть собраны.
Анализ экспрессии - Отбор лучших рекомбинантных генных конструкций
Каждая экспрессионная кассета может быть клонирована в плазмидный вектор, который может быть затем перенесен в Agrobacterium tumefaciens. Транзиентная экспрессия может быть инициирована с помощью вакуумной инфильтрации инокулята трансгенных Agrobacterium, что приводит к переносу мобильных ДНК-копий конструкций ДНК в клетки растения. Транзиентная экспрессия множества компонентов (коэкспрессия) может быть выполнена путем инфильтрации смесей инокулятов Agrobacterium (совместной инфильтрации). Так как один компонент, введенный в растение, представляет собой структурный белок (Р1), и субстратом второго компонента является протеаза 3CD, уровень экспрессии двух компонентов может быть модулирован. Это может быть выполнено путем использования различных промоторов, систем амплификации ДНК различной силы, путем изменения относительного содержания каждого инокулята (Р1 и 3CD) на момент инфильтрации, или их комбинации.
Экспрессионные вектора с Р1 могут быть сначала подвергнуты скринингу на их способность экспрессировать только Р1, и при объединении с векторами 3CD на их способность продуцировать высокие уровни протеолитических фрагментов. Накопление протеолитических фрагментов можно отслеживать по исчезновению непроцессированного Р1. Показано, что вирусная протеаза продуцируется и является высокоактивной в растении, а также способна распознавать и расщеплять свой совместно продуцированный субстрат в клетках растения для генерации капсидных белков PV.
На уровень накопления протеолитических фрагментов в растении может влиять соотношение между Agrobacterium, содержащими белок Р1, и Agrobacterium, содержащими протеазу 3CD, при этом более высокое накопление получено при более низком содержании Agrobacterium, содержащих протеазу 3CD. Наблюдение проводили в отношении влияния присутствия элементов амплификации ДНК и использования различных регуляторных элементов на процессинг Р1 и накопление протеолитических фрагментов.
Анализ формирования вирусоподобных частиц (VLP)
Встраивание VP1 в вирусоподобные частицы (VLP) может быть оценено с использованием эксклюзионной хроматографии (SEC) концентрированных экстрактов. Коллоидные частицы могут быть концентрированы из сырых осветленных экстрактов путем высокоскоростного центрифугирования. Осадок может быть промыт и ресуспендирован в 1/6 объема ресуспензионного буфера и нагружен на гель-фильтрационную колонку. Колонка может быть элюирована ресуспензионным буфером и элюированные фракции оценены с помощью SDS-PAGE и вестерн-блоттинга.
Белковый экстракт из транзиентно трансформированных растений может быть подвергнут разделению методом эксклюзионной хроматографии (SEC), и элюированные фракции проанализированы с помощью SDS-PAGE с окраской Кумасси. Результаты могут указывать на то, что большая часть белков хозяина элюирована из колонки в поздних фракциях, тогда как VP1-специфический сигнал может быть обнаружен в более ранних фракциях. Так как VP1 является относительно малым белком, можно ожидать, что он будет элюирован из колонки с большей частью белков хозяина, если не будет встроен в высокомолекулярные структуры. Следовательно, профиль элюирования, наблюдаемый для VP1, может являться веским признаком интегрирования VP1 в высокомолекулярную структуру. Комбинация вестерн-блоттинга и окраски геля Кумасси также дает основание предполагать, что доминирующим белком, наблюдаемым в SDS-PAGE с окраской Кумасси, может являться VP1.
Образец из этого эксперимента может быть отправлен в институт Institut Armand-Frappier (IAF, Laval, Quebec) для анализа методом трансмиссионной электронной микроскопии (ТЕМ). Результат указывает на то, что высокомолекулярные структуры, в которые встроен VP1, являются истинными вирусоподобными частицами (PV) EV71.
Частичная очистка
Платформа скрининга VLPExpress в качестве способа очистки VLP была разработана для очистки оболочечных вирусоподобных частиц (VLP) (140 нм в диаметре) из биомассы трансформированного растения. В способе используется ферментативное расщепление клеточных стенок для высвобождения внеклеточного и цитозольного содержимого, и полученный экстракт подвергают глубокой фильтрации и микрофильтрации перед центрифугированием с получением осадка VLP. Осадок ресуспендируют в ресуспензионном растворе и стерильно фильтруют.
Способ очистки VLPExpress может быть тестирован на его способность концентрировать необол очечные вирусоподобные частицы (VLP) PV. Анализ продукта очистки методом SDS-PAGE с окраской Кумасси может показать присутствие белков, соответствующих по молекулярной массе белкам оболочки PV. Идентификация капсидных белков может быть основана на их предполагаемой молекулярной массе.
Пример 3 - Очистка
Экстракцию белков выполняли с использованием метода механической экстракции или ферментативного расщепления клеточной стенки, как описано в WO 2011/035422 и РСТ/СА2012/050180 (которые включены здесь путем отсылки). Ферментативная экстракция предпочтительнее механической экстракции, так как вызывает повышенное высвобождение продукта с минимальным высвобождением загрязняющих белков растения, при этом основными загрязнителями в полученном экстракте являются ферменты, используемые для разрушения клеточной стенки, которые могут быть удалены с использованием адекватных представленных ниже стадий.
Механические или ферментативные экстракты подвергали центрифугированию для удаления клеточного дебриса, Agrobacteria, ДНК и более крупных частиц. Центрифугированные экстракты затем пропускали через стадии фильтрации, которые выполняли для удаления твердых веществ в суспензии, снижения бионагрузки, а также стабилизации и поддержания состояния экстракта перед последующей обработкой. Хотя извлечение вирусоподобных частиц (VLP) EV71 в фильтрате не может быть оценено при отсутствии количественного анализа, вестерн-блот-анализы показали, что потеря VLP во время стадий фильтрации была минимальной. Полученный осветленный экстракт затем обрабатывали с использованием тангенциальной поточной фильтрации (TFF) или непосредственно нагружали на хроматографическую среду подходящим образом.
Размер вирусоподобных частиц (VLP) позволяет использовать тангенциальную поточную фильтрацию (TFF) для эффективного и селективного удаления растворимых белков, обнаруживаемых в осветленном экстракте, включая ферменты, используемые для деполимеризации клеточной стенки. Также, на стадии тангенциальной поточной фильтрации (TFF) происходит концентрирование вирусоподобных частиц (VLP) и обеспечивается буферный обмен при подготовке для хроматографии.

Несколько хроматографических подходов (анионообменная, катионообменная хроматография, хроматография с гидрофобным взаимодействием (HIC) и псевдоаффинностью), режимов (связывание или проточная) и буферных условий (pH от 5 до 8, проводимость от 10 до 80 мсек/см) оценивали на их способность повышать чистоту и снижать загрязнение ДНК и эндотоксинами, сохраняя при этом желательные характеристики VLP. Было обнаружено, что в определенных условиях POROS D (слабая анионообменная смола), используемая в проточном режиме, может обеспечить наиболее эффективное удаление ДНК и эндотоксинов из концентрированных вирусоподобных частиц (VLP) EV71.
Вторая стадия TFF была добавлена после хроматографии в процесс очистки VLP EV71. Роль этой стадии TFF состояла в концентрировании и формулировании продукта в желательном буфере. Размер пор и условия функционирования для этой второй стадии TFF определяли на основе параметров, идентифицированных для первой TFF. В заключение, лекарственное средство с концентрированными, очевидно чистыми частицами EV71 получали после фильтрации через фильтр 0,22 мкм. Продукт формулировали в PBS, содержащем 0,01% полисорбата 80.
Описание характеристик VLP
Первую партию вирусоподобных частиц (VLP) EV71 получали с помощью адаптированного процесса, описанного выше (партия номер 479-23-018) и продукт полностью характеризовали (Таблица 3, партия номер 479-23-018). Чистоту определяли путем денситометрического анализа изображений гелей, окрашенных Кумасси, на которых только полосы, показывающие положительные сигналы на Вестерн-блотах (анти VP1-VP2), и что может дополнительно подтверждаться с помощью масс-спектрометрии, рассматривались как часть продукта. Анализ профиля качества продукта показал, что препарат содержал высокочистые вирусоподобные частицы (VLP) EV71.
Дополнительный анализ продукта с помощью электронной микроскопии подтвердил, что очищенные вирусоподобные частицы (VLP) EV71 были интактными (фигура 6А), и картирование триптических пептидов с помощью масс-спектрометрии подтвердило чистоту продукта.
Пример 4 - Модификации процесса
Очистка вирусоподобных частиц (VLP) с интактными VP1 с помощью HIC

Во время первоначального скрининга хроматографических подходов к очистке вирусоподобных частиц (VLP) EV71 было замечено, что HIC смолы могут отделять вирусоподобные частицы (VLP), содержащие интактные VP1, от частиц, содержащих фарментированные VP1. В определенных условиях частицы, содержащие низкомолекулярные (LMW) фрагменты VP1, прочно связаны со смолами, тогда как интактные частицы проходят через колонку. Таким образом, эту стадию HIC включали в качестве заключительной стадии (polishing step) после хроматографии POROS D. Очищенные посредством этого процесса частицы EV71 были однородными по размеру (рассеяние света), имели чистоту приблизительно 100%, не содержали белковые загрязнители, обнаруживаемые с помощью масс-спектрометрии. Показатели качества данного продукта (номер партии 479-31-020) представлены в таблице 3 в центральной колонке.
Модифицированная процедура экстракции
Экстракт из растений может быть осветлен путем подкисления при pH около 5,2 или путем тепловой обработки, и коагулят удален путем центрифугирования. Тепловую обработку включали между стадиями механической экстракции и центрифугирования. С использованием тепловой обработки в течение 10 минут при 60°С (pH 8,0) удалялось более чем 90% растворимых белков без нарушения растворимости вирусоподобных частиц (VLP) EV71 до уровня обнаружения. VP1 оставались интактными при экстракции и осветлении в этих условиях.
Механическую экстракцию при pH 8,0 в сочетании с осветлением на основе тепловой обработки выполняли вместо ферментативной экстракции для процесса очистки VLP EV71. Партию VLP получали с помощью этого процесса (партия номер 479-32-020). Характеристики продукта представлены в таблице 4 (третья колонка). Полученные результаты показали, что механическая экстракция, используемая в сочетании с осветлением на основе тепловой обработки белков, представляет эффективную начальную стадию извлечения, которая полностью согласуется с ранее определенными последующими стадиями. Результирующий процесс является высокопроизводительным и обеспечивает получение продукта VLP EV71, который имеет чистоту 98%). Профили рассеяния света вирусоподобных частиц (VLP) EV71, полученных с помощью этого процесса, показали высокую однородность. Анализ методом криогенной просвечивающей электронной микроскопии (Cryo-ТЕМ) этого продукта подтвердил, что частицы имеют размер и форму вирусоподобных частиц (VLP) EV71 (фигура 8).
Все ссылки включены здесь путем отсылки.
Настоящее изобретение описано в отношении одного или нескольких вариантов осуществления. Однако специалисту в данной области будет очевидно, что ряд вариантов и модификаций может быть сделано без отступления от объема изобретения, как определено в формуле изобретения.