СПОСОБ МНОГОЛЕТНЕГО ХРАНЕНИЯ СЕМЯН РАСТЕНИЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЕСТЕСТВЕННОГО ХОЛОДА ТОЛЩИ ВЕЧНОМЕРЗЛЫХ ГОРНЫХ ПОРОД
METHOD FOR OVER-YEARS STORAGE OF PLANT SEEDS WITH APPLICATION OF NATURAL COLD OF EVER-FROZEN ROCKS DEPTH

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии и предназначено для сохранения в жизнеспособном и генетически интактном состоянии семян растений в течение длительного времени, исчисляемого многими десятилетиями.
Использование естественного холода криолитозоны с температурой минус 6÷8°С, постоянной на протяжении всего годичного цикла, позволяет без дополнительных энергозатрат на создание искусственного холода сохранять жизнеспособность семян растений и функциональную активность генетического аппарата, предотвращать его повреждения в течение длительного времени в режиме максимальной защищенности от локальных, глобальных природных и техногенных катастроф.
Криолитозона (вечномерзлые горные породы) - толща горных пород различного состава, имеющая отрицательную температуру - занимает около 70% территории России и заключает в себе громадные холодовые ресурсы. Мощность криолитозоны, зависящая от географического положения и высоты местности, геологического строения, теплофизических свойств горных пород, других факторов, измеряется десятками, сотнями и даже тысячами метров. Например, в Якутии она достигает 1500 м, а в районе г.Якутска - 250-350 м.
Последствия исчезновения генетических ресурсов растений и животных в связи с разрушением мест их обитания ощущаются уже в настоящее время. По прогнозам специалистов к 2015 г. биологическое разнообразие планеты может сократиться на 10%, а к середине XXI века 60 тысяч видов высших растений (1/4 общего числа видов в мире) могут оказаться под угрозой исчезновения или серьезной генетической эрозии. В настоящее время следует уделять особое внимание 50 тысячам видов, из которых 20 тысяч находятся в угрожаемом положении, 15 тысяч потенциально могут стать исчезающими и еще 15 тысяч видов представляют интерес в качестве экономически важных. Непрогнозируемый ущерб видовому разнообразию растений и животных могут нанести глобальные изменения климата, а также техногенные катастрофы, включая ядерные, химические, бактериологические. Вместе с тем известно, что биологическое разнообразие обеспечивает устойчивость и надежность биоценозов и экосистем.
Семена - наиболее удобная для хранения часть растений. За небольшим исключением, каждое семя несет свою генетическую информацию. Необходимо, чтобы в каждом конкретном образце семян присутствовал широкий спектр генетической изменчивости, который будет способствовать в будущем минимизации потерь генетической целостности вида. То есть качественные и количественные показатели, характеризующие диагностические признаки вида, должны максимально сохраняться.
Долговременное хранение растительного материала в виде семян является одним из самых распространенных и эффективных подходов к сохранению большинства видов растений мира. Создание банков семян имеет значительные преимущества по сравнению с другими методами сохранения растений ex-situ: легкость хранения большого количества образцов, экономия места и сравнительно низкая трудоемкость.
Международная программа ботанических садов по охране биологического разнообразия растительного мира определяет приоритетные направления по долговременному сохранению геномов растений ex-situ. Прежде всего, это семенные банки редких и хозяйственно-ценных видов; полевые генные банки для сохранения видов-рекальцинтрантов (20% от общего мирового числа видов), семена которых не сохраняют жизнеспособность при хранении, а также видов, размножающихся вегетативно; банки сеянцев и криоконсервация семян. Во многих ботанических учреждениях развитых и развивающихся стран мира (свыше 200) созданы банки семян видов культурной флоры и их дикорастущих сородичей (табл).
Семена мобилизуют и сохраняют в течение уже многих десятилетий. Однако, согласно национальным отчетам, около 130 стран не имеют необходимого современного оборудования для долговременного хранения образцов. Многие коллекции плохо изучены, требуют частой регенерации (воспроизводства) семян. Тем не менее многие страны важнейшим национальным приоритетом в своих программах ставят наличие своего генетического банка и репарацию гермоплазмы. Так, в семенных банках Африки сохраняются около 200 тыс. образцов; Европы - 1,3 млн.; Азии и Тихоокеанского региона - 1,8 млн.; Ближнего Востока - 28,5 тыс.; Латинской Америки - 245 тыс.; Северной Америки - более 600 тыс.
Международный совет по генетическим ресурсам растений разработал общие стандарты сохранения гермоплазмы, которых должны придерживаться все страны мира. Согласно этим стандартам семенной банк состоит из базовой и рабочей (действующей) коллекций. Рабочая коллекция используется для регулярного тестирования и возможной регенерации образцов. Материал базовой коллекции сохраняют как можно дольше и не направляют в другие страны или организации. Перед закладкой семена, в зависимости от вида, высушивают до 5-7%-ной влажности и сохраняют в герметически закрываемых контейнерах при отрицательных температурах.
В России проблемой сохранения геномов культурных растений и их диких сородичей занимается Всероссийском НИИ растениеводства (ВНИИР) им. Н.И. Вавилова РАСХН, который фактически выполняет роль института-координатора и несет ответственность за сохранение национального и мирового генофонда образцов семян различных сортов, форм, популяций и видов. Академик Н.И. Вавилов одним из первых в 20-30-е гг. XX века начал сбор и изучение генетического многообразия культурных растений [Вавилов Н.И. Организация сельскохозяйственной науки в СССР. М.: Агропромиздат, 1987. 383 с.]. Появление этого направления имело огромное значение для мировой селекции, позволив использовать биологические ресурсы растений планеты в качестве источников генов для получения исходного материала при целенаправленной селекции. На сегодняшний день во ВНИИР им. Н.И. Вавилова РАСХН собрана одна из крупнейших в мире и богатых по видовому представительству коллекция мирового генетического разнообразия растений, которая насчитывает около 400 тысяч образцов.
Большая часть этой коллекции хранится в контролируемых условиях (при плюс 4°С, частично при минус 18°С; аналог) в подземном хранилище филиала института - Кубанский генетический банк семян. Образцы коллекции хранятся в герметичной или полузакрытой таре со сроком хранения без пересевов 25-30 лет.
Между тем исследования, проведенные после девяти лет хранения семян 2263 видов растений, показали, что околонулевые положительные температуры не позволяют длительно сохранять семена без ухудшения их качества и уменьшения жизнеспособности вследствие биохимических процессов старения и появления хромосомных аберраций [Мокроносов А.Т., Купцова Е.С., Попов А.С., Кузнецов В.В. Генетическая коллекция как способ сохранения биоресурсов планеты // Вестник Российской академии наук. 1994. Том 64, №11. С.991-1001; Далецкая Т.В., Полякова Е.Н. Криоконсервация генетических ресурсов в проблеме сохранения биоразнообразия. Влияние криоконсервации на прорастание семян и некоторые стадии метаболизма // Биофизика живой клетки. 1994. Том 6. С.81-85].
Хранение семян при околонулевых отрицательных температурах и низкой (видоспецифичной, оптимальной) влажности позволяет сохранять жизнеспособность семян в течение десятков и даже сотен лет. Всхожесть семян проверяется через определенные промежутки времени (тестирование), обычно каждые 5 лет из образцов семян рабочей коллекции. При снижении всхожести формируют новый образец путем выращивания растений из сохранившихся семян и мобилизации. Воспроизводство (регенерация) - процесс дорогостоящий, требующий времени и больших затрат.
Для обеспечения условий, необходимых для долговременного сохранения жизнеспособности семян (стабильно низкая температура), в ряде стран сооружены криохранилища генетических ресурсов растений, использующие искусственный холод, т.е. являющиеся, по сути, большими холодильными установками.
Однако их содержание является очень дорогостоящим из-за затрат на электроэнергию и обслуживание, необходимость регулярного тестирования на всхожесть, силу роста и способность к возобновлению. При таком хранении существует реальная угроза потери всего материала банков семян при воздействии внешних факторов, как, например, отключение электроэнергии в результате социальных, техногенных или природных катастроф, неблагоприятных природных условий. Свидетельством этого является печальный факт потери в середине 90-х годов XX века из-за перебоев в электроснабжении громадного числа образцов в банке семян ВНИИР им. Н.И. Вавилова.
Наиболее близким аналогом (прототипом) к предлагаемому изобретению является способ хранения семян в подземных хранилищах в толще вечномерзлых пород, дополнительно оборудованных холодильными установками, с помощью которых поддерживается температура минус 18°С, реализуемый с 2006 г. в Норвегии (Шпицберген, г.Свальбард) в рамках строительства государственного Международного криохранилища семян [Seed samples stored at SGSV (Svalbard Global Seed Vault - www.regjeringen.no/en/dep/lmd/campain/svalbard-global-seed-vault.html?id].
Недостатками этого способа хранения семян являются, во-первых, затраты энергии холодильными установками, расходы на их обслуживание, угроза потери банка семян при аварийных отключениях холодильных установок. Во-вторых, длительное хранение семян при температуре ниже минус 10°С может привести к гибели зародышей семян. Особенно это касается семян субтропических и тропических культур.
Техническим эффектом предлагаемого изобретения является полное сохранение жизнеспособности и генетической интактности семян в течение десятков (по-видимому, даже сотен) лет без дополнительных затрат электроэнергии, без зависимости от глобальных и локальных природных и техногенных катастроф, без пересевов семян, благодаря физиологическому подавлению интенсивности всех биологических процессов в семенах и угнетению жизнедеятельности микроорганизмов.
Эффект достигается тем, что семена растений хранят в подземных хранилищах, размещаемых в толще вечномерзлых горных пород в слое с постоянной температурой минус 6÷8°С, соответствующей оптимальной температуре хранения семян.
Прецедентов такого рода хранилищ, кроме многолетнего эксперимента заявителя - подземной лаборатории Института мерзлотоведения (ИМЗ) СО РАН и Института биологических проблем криолитозоны (ИБПК) СО РАН, в которой семена хранятся уже более 30 лет - в мире нет [Мокроносов А.Т., Купцова Е.С., Попов А.С., Кузнецов В.В. Генетическая коллекция как способ сохранения биоресурсов планеты // Вестник Российской академии наук. 1994. Том 64, №11. С.991-1001].
Сущность изобретения состоит в том, что в камеру в слое вечномерзлых горных пород при температуре минус 6÷8°С закладываются семена для длительного (многолетнего) хранения. Каждый сортообразец семян, высушенный до определенной видоспецифичной влажности (в интервале 5-7%), помещают в герметичную тару и закупоривают. Проверочные отдельные пересевы должны проводиться не ранее чем через 5-10-25 лет.
Изобретение может быть реализовано следующим образом (на примере криохранилища семян растений Института мерзлотоведения СО РАН и Института биологических проблем криолитозоны СО РАН в г.Якутске, функционирующего более 30 лет - с 1967 года). В четвертичных отложениях (мощность 21 м, возраст около 10 тыс. лет) на глубине 12 м оборудуют криохранилище семян. Отложения представлены супесью и мелкозернистым песком льдистостью 20-30% (по весу) с незначительным (1-3% по объему) количеством воздуха. Благодаря оригинальной технической конструкции подземной лаборатории (фиг.1) температура в камере круглогодично поддерживается в интервале минус 6÷8°С (фиг.2).
Перед закладкой семена, в зависимости от вида, высушивают до 5÷7%-ной влажности и помещают в герметичную тару. Объем выборки семян - не менее 1000 штук для обеспечения максимального сохранения всего разнообразия генофонда вида, особенно дикоросов.
Перед закладкой определяют параметры жизнеспособности семян, функциональной активности, устойчивости и интактности генома: энергию прорастания, всхожесть, выживаемость, функциональную активность генетического аппарата клеток меристематических тканей в процессах репликации, репарации ДНК и направленных на трансляцию, активность защитных систем, уровень хромосомных аббераций. Аналогичные параметры определяют спустя определенный срок криохранения.
Впервые в мировой практике эксперимент по длительному хранению семян в толще вечной мерзлоты был начат ИБПК СО РАН в подземной лаборатории ИМЗ СО РАН в 1977÷1983 гг. Из коллекции ВНИИР им. Н.И. Вавилова РАСХН были взяты семена 18 видов бобовых культур (10200 сортообразцов) и заложены на криохранение. Параллельно семена тех же самых сортообразцов продолжали храниться в хранилищах ВНИИР им. Н.И. Вавилова в гг.Крымск, Екатеринбург, Михнево. В 2005-2007 гг. часть семян из этих хранилищ была взята для определения физиологических, биохимических и цитологических характеристик жизнеспособности, активности и устойчивости генетического аппарата.
Установлено, что хранение семян бобовых растений в стандартных условиях (гг.Крымск, Екатеринбург, Михнево) в течение 11-13 лет приводит к снижению всхожести до 50÷80% при уровне хромосомных аббераций (показатель генетических мутаций) до 6÷14%, а при хранении семян в тех же условиях в течение 28÷31 года семена становятся полностью нежизнеспособными (всхожесть равна нулю).
При хранении аналогичных образцов семян бобовых в условиях подземной шахты Института мерзлотоведения СО РАН (температура минус 6÷8°С) в течение 27-30 лет всхожесть семян даже несколько возросла по сравнению с исходной (при закладке на хранение) и составила 80÷100% при уровне хромосомных аббераций 2÷4%. Скорость синтеза белков составила 60÷70%, клеточного деления - 70÷95% по сравнению с семенами, хранящимися 11÷13 лет в стандартных условиях. Это указывает на истинность процессов криогипобиоза. При этом уровень активности защитных антиоксидантных систем составил 110÷220% по сравнению с семенами, хранящимися 11÷13 лет в стандартных условиях, активность систем репарации ДНК возросла в среднем на 10%. Это привело к тому, что интегральный показатель устойчивости генетического аппарата клеток меристематической ткани проростков возрос в среднем на 48%.