Способ идентификации иммуногенных несоответствий ДНК в парах донор - пациент при планировании трансплантации гемопоэтических стволовых клеток
METHOD OF IDENTIFICATION OF IMMUNOGEN DNA DISCREPANCIES IN DONOR - PATIENT PAIRS WHEN PLANNING HEMATOPOIETIC STEM CELL TRANSPLANTATION

Изобретение относится к области молекулярной биологии и медицины и может быть использовано при проведении трансплантации гемопоэтических стволовых клеток для идентификации несоответствий ДНК в парах донор-пациент, способных вызывать иммунный ответ после трансплантации. Подобные несоответствия также могут быть использованы как мишени для посттрансплантационной иммунотерапии.
Гемобластозы - это обширная группа злокачественных заболеваний кроветворной ткани, приводящих к нарушению нормального соотношения популяций клеток крови и нарушению нормального функционирования иммунной системы.
Современный подход к лечению тяжелых форм гемобластозов заключается в элиминации кроветворных клеток реципиента посредством химиотерапии или радиотерапии и последующей трансплантации кроветворных клеток от здорового донора. После трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (ТГСК) у реципиента происходит репопуляция клеточных ниш и восстановление функций иммунной системы за счет клеток донора. При трансплантации вместе со стволовыми кроветворными клетками в организм реципиента попадают и зрелые иммунные клетки со сформировавшейся антигенной специфичностью. Такие клетки могут вызвать реакцию «трансплантат против опухоли» (РТПО) и реакцию «трансплантат против хозяина» (РТПХ). В случае РТПО клетки иммунной системы донорского происхождения воспринимают оставшиеся в организме реципиента гемопоэтические клетки, в том числе злокачественные, как чужеродные и уничтожают их. РТПО снижает вероятность рецидива после трансплантации.
При РТПХ мишенями являются здоровые клетки организма пациента, и развивается воспалительный процесс, который в острой форме может приводить к летальному исходу, а в хронической - к инвалидизации. Необходимость использования иммуносупрессии для подавления РТПХ снижает возможный положительный эффект РТПО.
+
+
Основными эффекторными клетками, ответственными за острую форму РТПХ и РТПО, являются цитотоксические CD8Т-клетки. Эти клетки в процессе развития приобретают уникальные Т-клеточные рецепторы (ТКР), специфичные к различным пептидным антигенам (АГ), причем параллельно происходит процесс негативного отбора, направленный на элиминацию аутореактивных Т-клеточных клонов. В процессе своей жизнедеятельности CD8Т-клетки анализируют представляемый на клетках организма репертуар пептидов. Если клетка заражена вирусом, то на поверхности может появиться вирусный пептид, и если в организме присутствует Т-клеточный клон с ТКР, специфичными к этому АГ, то запускается цепочка иммунных процессов для уничтожения зараженной клетки. Репертуар представляемых на поверхности клетки пептидов зависит от молекул главного комплекса гистосовместимости (ГКГС) - высоко полиморфных молекул. Т-клетки связываются с комплексом пептид-молекула ГКГС. От набора аллелей ГКГС зависит, какие пептиды, образуемые в клетках, будут презентированы на поверхности клеток и могут быть распознаны Т-лимфоцитами. Совокупность АГ, представленных на клетках с помощью молекул ГКГС, составляет иммунопептидом.
+
При планировании ТГСК донора подбирают по аллелям ГКГС: при полной совместимости иммунопептидомы максимально похожи, и это уменьшит риск РТПХ. Полиморфизмы человеческого генома приводят к появлению минорных антигенов гистосовместимости (МАГ) (Martin PJ, Levine DM, Storer BE, Warren EH, Zheng X, Nelson SC, et al. Genome-wide Minor Histocompatibility Matching as Related to the Risk of Graft-versus-host Disease. Blood. 2016). МАГ - это вариантные пептиды, презентируемые в контексте молекул ГКГС, из-за полиморфизмов в генах такие пептиды могут отличаться между собой на одну и более аминокислот. Аллельные варианты МАГ могут быть неиммуногенны, например, за счет того, что вариантный пептид не способен встраиваться в ГКГС. При ТГСК цитотоксические CD8Т-клетки донора распознают несоответствия МАГ, и развивается иммунный ответ, опосредованный теми же механизмами, которые вовлечены в борьбу с вирусными инфекциями. Для большинства известных МАГ показана иммуногенность только в одном направлении: необходимо, чтобы донор был гомозиготен по неиммуногенному МАГ, а реципиент нес хотя бы одну аллель иммуногенного МАГ. На сегодняшний день известно около 60 МАГ, из них 20 представляются в ГКГС аллельной группы А*02. Аллельная группа ГКГС А*02 является одной из самых распространенных среди европейской части России и в Европе. Например, по информации базы данных allelefrequencies.net, где собраны данные по генотипированию аллелей ГКГС со всего мира, в московском регионе доля носителей аллельной группы А*02 достигает 30%. В силу широкого распространения аллельной группы ГКГС А*02 в европейской популяции МАГ, презентируемые в контексте молекул ГКГС данной аллельной группы, представляют наибольший интерес.
Первоначально МАГ открыли как АГ, приводящие к отторжению трансплантата, или к РТПХ при ГКТС-совместимой ТГСК. Поскольку иммунный ответ на МАГ, экспрессируемый только в гемопоэтических клетках, вызывает РТПО без увеличения риска РТПХ, они являются перспективными мишенями для направленной клеточной терапии рецидивов после ТГСК. Быстрый и дешевый метод генотипирования аллелей МАГ дает врачу инструмент для предсказания возможных последствий ТГСК, а так же позволяет подобрать мишени для направленной Т-клеточной терапии. (Akatsuka Y, Morishima Y, Kuzushima К, Kodera Y, Takahashi T. Minor histocompatibility antigens as targets for immunotherapy using allogeneic immune reactions. Cancer Science. 2007, 98: 1139-1146).
Известен способ генотипирования аллелей МАГ НА-1 в образце ДНК. Способ включает в себя: а) приведение в контакт геномных полинуклеиновых кислот в образце с по меньшей мере одной парой праймеров, в результате чего 5' и/или 3' праймер из, по меньшей мере, одной пары праймеров специфически гибридизуется с целевыми областями, включающими полиморфные нуклеотиды аллелей, и проведение реакции амплификации; б) выявление для каждой из, по меньшей мере, одной пары праймеров, образуется ли на стадии «а» продукт амплификации; в) определение из результата стадии «б», какие аллели НА-1 присутствуют в образце. Настоящее изобретение также относится к способу геномного типирования аллелей МАГ НА-1 в образце ДНК. Этот способ включает в себя: а) амплификацию фрагментов аллелей, содержащих, по меньшей мере, один полиморфный нуклеотид, с использованием, по меньшей мере, одной пары праймеров, специфически гибридизующихся с консервативной целевой областью, состоящей из одного или более полиморфных нуклеотидов аллеля; б) гибридизацию амплифицированного продукта из шага «а» с, как минимум, одним зондом, специфично связывающимся с целевым регионом, содержащим один или более полиморфных нуклеотидов аллеля; в) определение из результата стадии «б», какой аллель НА-1 присутствует в образце. Кроме того, настоящее изобретение описывает праймеры и зонды для использования в указанных выше методах. Также представлены диагностические наборы, позволяющие реализацию данных методов (US6830883 В1, 14.12.2004). В изобретении для определения аллелей всего одного МАГ требуется произвести две последовательные операции: полимеразная цепная реакция (ПЦР) для наработки фрагмента гена содержащего полиморфизм и либо электрофорез в агарозном геле, либо гибридизацию с зондом. Такие подходы усложняют процесс определения и требуют дополнительных временных затрат. Также, помимо амплификатора, требуется дополнительное оборудование для проведения электрофореза в агарозном геле и для фотографирования агарозных гелей после электрофореза или гибридизационных чипов после гибридизации с зондами. Процесс гибридизации с зондами дополнительно усложняет процесс анализа, поскольку помимо необходимости изготавливать чипы, требует аккуратности и внимательности при выполнении. Оба указанных воплощения изобретения по патенту плохо поддаются мультиплексированию и масштабированию.
Известен также способ геномного типирования аллелей минорного антигена гистосовместимости НА-1 в образце ДНК, причем указанный способ включает: а) приведение в контакт геномных полинуклеиновых кислот в образце с, по меньшей мере, одной парой праймеров, в результате чего 5' и/или 3' праймер, по меньшей мере, одной пары праймеров специфически гибридизуется с целевыми областями, включающими полиморфные нуклеотиды аллелей, и проведение реакции амплификации; б) выявление для каждой из, по меньшей мере, одной пары праймеров, образуется ли на стадии «а» продукт амплификации; в) определение из результата стадии «б», какой аллель НА-1 присутствует в образце. Настоящее изобретение также относится к способу геномного типирования аллелей МАГ НА-1 в образце ДНК. Этот способ включает в себя: а) амплификацию фрагментов аллелей, при этом фрагмент содержит, по меньшей мере, один полиморфный нуклеотид, с использованием, по меньшей мере, одной пары праймеров, специфически связывающихся с консервативной целевой областью, содержащей один или более полиморфных нуклеотидов аллеля; б) гибридизацию амплифицированного продукта из шага «а» с, как минимум, одним зондом, специфично связывающимся с целевым регионом, содержащим один или более полиморфных нуклеотидов аллеля; в) определение из результата стадии «б», какой НА-1 аллель присутствует в образце. Кроме того, настоящее изобретение описывает праймеры и зонды для использования в указанных выше методах. Также предоставлены диагностические наборы, обеспечивающие осуществление методов (ЕР 0965648 А1, 22.12.1999). Недостатками данного изобретения также являются недостаточный охват других минорных антигенов, две стадии определения и сложности с мультиплексированием и масштабированием. Эти факторы делают метод согласно изобретению малоподходящим для регулярного генотипирования многих генов, кодирующих МАГ.
Наиболее близким техническим решением является способ и набор для диагностики полиморфизмов, дающих МАГ, разработанный Spierings и другими. Способ подразумевает использование ПЦР с сиквенс-специфичными праймерами (ПЦР-ССП) для 10 аутосомных МАГ: НА-1, НА-2, НА-3, НА-8, НВ-1, АСС-1, АСС-2, SP110, PANE1 и UGT2B17. Еще один - H-Y - связан с Y хромосомой. Метод геномного типирования МАГ позволяет добавить его к обычным процедурам типирования ГКГС. Для проверки метода была использована ДНК из ранее проверенных клеточных линий. Авторы утверждают, что разработана простая, единообразная и быстрая методика, позволяющая определять МАГ всех идентифицированных на момент публикации технического решения МАГ. Метод генотипирования МАГ облегчает клиническое применение МАГ как противоопухолевых мишеней после ТГСК. (Eric Spierings, Jos Drabbels, Matthijs Hendriks et al A Uniform Genomic Minor Histocompatibility Antigen Typing Methodology and Database Designed to Facilitate Clinical Applications, PLoS ONE, 2006, 1(1): e42).
Такой набор охватывает только пять представленных в контексте аллельной группы ГКГС А*02 минорных антигенов и основан на двухстадийном ферментативном методе детектирования несинонимичного однонуклеотидного полиморфизма (нсОНП) - полимеразной цепной реакции с сиквенс-специфичными праймерами (ПЦР-ССП) с последующей визуализацией продуктов реакции с помощью электрофореза в агарозном геле. Реализация изобретения требует проведения двух последовательных процессов: ПЦР и электрофореза. Такой подход увеличивает общее время проведения теста. Хотя авторы и говорят, что метод может быть совмещен с рабочим процессом по определению аллелей ГКГС, он выполняется на том же оборудовании и может потребовать дополнительного оборудования для постановки, чтобы не увеличивать общее время, требуемое для анализа аллелей ГКГС. Кроме МАГ UGT2B17 и H-Y, такой набор требует постановки двух отдельных реакций для каждого антигена каждого образца. Проведение генотипирования 11 МАГ для пары донор-пациент согласно изобретению потребует постановки 40 независимых ПЦР реакций с последующим независимым анализом в агарозном геле. Помимо праймеров для определения аллелей генов, кодирующих МАГ, в каждой реакции есть внутренний контроль - праймеры к различным генам. ПЦР для контрольных генов и их анализ происходит параллельно. Стандартный амплификатор позволяет проведение 96 реакций, таким образом, один запуск прибора позволяет генотипировать две пары донор-пациент по 11 антигенам. Выборочная постановка ПЦР-ССП только для МАГ, связанных с аллелями ГКГС, представленными у донора и реципиента, может уменьшить общее количество реакций, но осложнит постановку из-за необходимости индивидуального планирования теста для каждой пары донор-пациент. Вместе эти факторы указывают на сложность масштабирования метода и невысокую производительность.
Технический результат заключается в создании быстрого, легкого и экономически эффективного метода генотипирования МАГ, который для своего осуществления не требует дорогостоящего оборудования и персонала высокой квалификации, при этом позволяет с помощью разработанных набора и тест-системы проводить генотипирование полиморфизмов с высокой специфичностью и чувствительностью в один этап.
Технический результат достигается тем, что в первом воплощении изобретения создан способ идентификации иммуногенных несоответствий ДНК в парах донор-пациент, при планировании трансплантации гематопоэтических стволовых клеток, путем генотипирования аллелей генов, кодирующих минорные антигены гистосовместимости, презентируемые в молекулах главного комплекса гистосовместимости аллельной группы А* 02 посредством полимеразной цепной реакции в реальном времени с сиквенс-специфичными праймерами (ПЦР-РВ-ССП), для этого проводят ДНК-тестирование на наличие аллелей полиморфизмов в генах ERBB2, НМНА1, MYO1G, KIAA1551, TOR3A, CLYBL, C19ORF48, TRIM22, PRCP, SSR1, WNK1, TRIM42, KIAA0020, HIVEP1, NISCH, UGT2B17, CCL4, NCAPD3, NDC80, WDR27 человека, при этом осуществляют:
(а) мультиплексную полимеразную цепную реакцию в реальном времени с сиквенс-специфичными праймерами (ПЦР-РВ-ССП) для амплификации фрагментов генов ERBB2, НМНА1, MYOIG, KIAA1551, TOR3A, CLYBL, C19ORF48, TRIM22, PRCP, SSR1, WNK1, TRIM42, KIAA0020, HIVEP1, NISCH, UGT2B17, CCL4, NCAPD3, NDC80, WDR27 человека и контрольного гена с использованием геномной ДНК пациента и донора в качестве матриц, и набора праймеров с последовательностями SEQ ID NO: 54 - 114 и зондов с последовательностями SEQ ID NO: 1-21.
(б) контроль правильности прохождения ПЦР-РВ-ССП с использованием плазмидных контрольных матриц, полученных с помощью праймеров SEQ ID NO: 22-61.
(в) определение аллелей исследуемых несинонимичных однонуклеотидных полиморфизмов в целевых генах или определение делеции гена у пациента и донора на основе результатов ПЦР-РВ-ССП и установление потенциально иммуногенных сочетаний состояния исследуемых генов у донора и пациента.
Причем геномную ДНК пациента и донора выделяют из материала клинического образца, представляющего собой цельную кровь, костный мозг, или лейкоцитную массу.
А на стадии (в) результаты ПЦР-РВ-ССП анализируют с помощью поставляющегося с прибором или стороннего программного обеспечения.
Кроме того указанные полиморфизмы в генах ERBB2, НМНА1, MYO1G, KIAA1551, TOR3A, CLYBL, C19ORF48, TRIM22, PRCP, SSR1, WNK1, TRIM42, KIAA0020, HIVEP1, NISCH, CCL4, NCAPD3, NDC80, WDR27 человека представляют собой полиморфизмы: rs1058808, rs1801284, rs61739531, rs2166807, rs2296377, rsl7577293, rs3745526, rsl87416296, rs2229437, rsl0004, rsl2828016, rs9876490, rs2173904, rs2228220, rs887515, rsl719152, rsl2292394, rs9051 и rs4236176 соответственно и полную делецию гена UGT2В17.
Во втором воплощении изобретения создан набор для идентификации иммуногенных несоотвествий ДНК в парах донор-пациент, при планировании трансплантации гематопоэтических стволовых клеток, который включает праймеры, имеющие последовательности по п. 1, аллель-специфично амплифицирующие участки генов по п. 1 и ген-специфичные флуоресцентные зонды с последовательностями по п. 1 сгруппированные таким образом, чтобы одновременно определять аллели четырех генов, кодирующих МАГ и проводить ПЦР-РВ для одного контрольного гена - В2М.
В третьем воплощении изобретения создана тест-система для идентификации иммуногенных несоотвествий ДНК в парах донор-пациент, при планировании трансплантации гематопоэтических стволовых клеток, содержащая набор праймеров и зондов по п. 1 для проведения мультиплексной ПЦР-РВ-ССП, где праймеры и зонды собраны в пять панелей: для FAM: панель 1 - Her2/Neu; панель II - ADIR; панель III - PRCP; панель IV - НА8; панель V - CCL4-1T, для HEX: панель 1 - НА1; панель II - CLYBL; панель III - SSR1; панель IV - HIVEP; панель V - NCAPD3-1Q, для ROX: панель 1 - НА2; панель II - C19ORF48; панель III - WNK1; панель IV - LB-NISCH; панель V - NDC80-1Р, для Су5: панель 1 - UTA2-1; панель II - TRIM22; панель III - Т4А1; панель IV - UGT2B17; панель V - WDR27-1L, для Су5,5: панель 1 - В2М; панель II -В2М; панель III - В2М; панель IV - В2М; панель V - В2М, причем в каждой панели зонды и праймеры сгруппированы в две смеси для определения референсных и альтернативных аллелей четырех генов, кодирующих МАГ, и одного контрольного гена В2М, а также контрольные матрицы, полученные с помощью праймеров по п. 1, ферменты и реагенты, обеспечивающие проведение ПЦР-РВ-ССП.
Способ осуществляется следующим образом.
Следует отметить, что в генах ERBB2, НМНА1, MYO1G, KIAA1551, TOR3A, CLYBL, C19ORF48, TRIM22, PRCP, SSR1, WNK1, TRIM42, KIAA0020, HIVEP1, NISCH, CCL4, NCAPD3, NDC80, WDR27 к появлению МАГ приводит несинонимичный однонуклеотидный полиморфизм (нсОНП) -замена одного нуклеотида в гене, приводящая к замене аминокислоты в белке, кодируемом этим геном. В случае гена UGT2B17 МАГ присутствует, если есть хотя бы одна копия гена, если произойдет делеция обеих копий гена - белок, кодируемый UGT2B17, не транслируется и, соответственно, отсутствует МАГ.
В таблице 1 показаны исследуемые минорные антигены гистосовместимости (МАГ). Показаны МАГ, представляемые в молекулах аллельной группы ГКГС А*02. Все генотипируемые полиморфизмы, кроме UGT2B17, представляют собой несинонимичные однонуклеотидные полиморфизмы (нсОНП) - в разных аллелях гена в определенной позиции находятся разные нуклеотиды, из-за чего в кодируемом белке в соответствующей позиции присутствуют разные аминокислоты. В случае гена UGT2B17 происходит полная делеция гена, в результате антиген отсутствует. В таблице использованы сокращения: МАГ - минорные антигены гистосовместимости; Хр. - хромосома - номер хромосомы человека, содержащей исследуемый ген; НК - нуклеотид - возможные состояния нсОНП данного МАГ: референсный/альтернативный нуклеотиды, согласно версии референсного генома в базе данных NCBI GRCh38.p7; АМК - аминокислота -аминокислоты в белке для двух состояний нсОНП; Ч. - частота референсного аллеля нсОНП для европейской популяции на основе данных проекта «1000 геномов»; Код ПМ - идентификационный номер нсОНП в базе коротких генетических вариаций dbSNP. Приведенные обозначения полиморфизмов являются номенклатурными и принятыми в данной области техники.
В основе метода идентификации иммуногенных несоответствий ДНК в парах донор-пациент, при планировании трансплантации гематопоэтических стволовых клеток лежит реакция полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ) с флуоресцентными TaqMan зондами и сиквенс-специфичными праймерами. Для дискриминации аллелей используются сиквенс-специфичные праймеры (ССП), а для визуализации накопления продукта ПЦР - ген-специфичные зонды. Праймеры с последовательностями SEQ ID NO: 54 - 114 и TaqMan зонды с последовательностями SEQ ID NO: 1 - 21 сгруппированы - это позволяет в одной пробирке, генотипировать несколько генов, кодирующих МАГ. Так же в каждой группе праймеров и зондов присутствуют праймеры и зонды к одному контрольному гену В2М для внутреннего контроля. Сиквенс-специфичные праймеры - это олигонуклеотиды ДНК, подобранные таким образом, чтобы ПЦР с их участием происходила, только в случае связывания с целевым аллелем исследуемого гена. TaqMan зонд - это олигонуклеотид ДНК, который несет на 5' конце флуоресцентный краситель, а на 3' конце гаситель флуоресценции и в нормальном состоянии при облучении нужной длиной волны краситель испускает свет, который улавливается гасителем. Зонд в ходе ПЦР специфично связывается с амплифицированными фрагментами ДНК между участками связывания общего праймера и ССП, с той нитью ДНК, с которой связывается ССП. В ходе образования двунитевой ДНК, Taq полимераза двигается от ССП в сторону 5' конца зонда и за счет своей нуклеазной активности, расщепляет зонд, и свободная метка попадает в раствор. Такой процесс идет одновременно на множестве молекул ДНК, и по мере накопления продукта ПЦР растет количество свободного красителя, что можно оценить по интенсивности его флуоресценции. Параллельно в одной пробирке с разными ПЦР-продуктами за счет специфичности связывания могут независимо гибридизоваться несколько разных зондов, что дает возможность оценить накопление отдельных продуктов ПЦР, так как TaqMan зонды, используемые в реакции несут различные флуоресцентные метки.
Схема метода ПЦР-РВ-ССП по одному из воплощений изобретения приведена на фигуре 1. Для упрощения понимания приведена схема для одного гена и на схеме приведен случай, когда образец - гомозигота по референсному состоянию нсОНП. В двух пробирках по отдельности анализируются аллели гена, кодирующего минорный антиген. Сиквенс-специфичные праймеры в каждой пробирке связываются только с одним аллелем гена. В приведенном примере в образце присутствуют две копии одного аллеля и поэтому ПЦР идет только в одной лунке из двух, где имеется ССП к данному аллелю. ПЦР запускается при условии, когда специфичный к определенному состоянию полиморфизма праймер, свяжется с целевым участком гена, в приведенном примере - с референсным состоянием нсОНП (слева). В пробирке, содержащей ССП к альтернативному аллелю (справа) из-за неэффективного связывания 3' окончания праймера с альтернативным состоянием нсОНП ПЦР не пройдет или будет на несколько порядков менее эффективна. ССП и общий праймер позволяют амплифицировать участок ДНК, a TaqMan зонд позволяет визуализировать накопление этого продукта: полимераза в процессе синтеза новой нити ДНК расщепляет зонд, в результате эмиссия флуоресцентного красителя в составе зонда больше не поглощается гасителем флуоресценции в этом зонде. Эффективность ПЦР оценивают по кривым зависимости флуоресценции от цикла ПЦР, формируемым программным обеспечением оборудования. В тесте, согласно одному из воплощений изобретения, в одной пробирке одновременно анализируют четыре аллеля четырех генов и один контрольный ген. ССП - сиквенс-специфичный праймер; МАГ - минорный антиген гистосовместимости; ПЦР-РВ - полимеразная цепная реакция в реальном времени.
Проведение ПЦР и сбор данных о накоплении продуктов ПЦР происходит одновременно. Для этого используют прибор для проведения ПЦР в реальном времени. ПЦР-РВ прибор в ходе ПЦР регистрирует интенсивность флуоресценции в реакционных лунках на каждом цикле ПЦР. После ПЦР-РВ программное обеспечение ПЦР-РВ амплификатора для каждой реакции и для каждого флуоресцентного зонда строит график интенсивности флуоресценции в зависимости от цикла ПЦР.
Для анализа двух аллелей одного МАГ, используют две пробирки. В каждую пробирку вносят специфичный праймер только для одного из аллелей исследуемого гена. Такой праймер комплементарен содержащему полиморфизм участку гена, причем 3' нуклеотид праймера приходится непосредственно на нсОНП. Полимераза начинает процесс элонгации нити ДНК с затравки - праймера, причем эффективность этого процесса зависит от степени сродства 3' окончания праймера и матрицы. Общая эффективность ПЦР-ССП отличается на несколько порядков в случае полностью комплементарного и не полностью комплементарного ССП. Помимо ССП в каждой пробирке присутствуют общий праймер и зонд, их связывание с исследуемым фрагментом гена не зависит от нуклеотида в нсОНП. После прохождения ПЦР уровень флуоресценции в пробирке будет соответствовать количеству синтезированных фрагментов ДНК. По эффективности ПЦР с разными ССП можно установить аллели нсОНП в образце ДНК: сопоставляя накопление продукта между двумя пробирками оценивают, какие аллели присутствуют в исследуемой ДНК.
Пример результатов ПЦР-РВ-ССП в зависимости от сочетания аллелей минорного антигена LB-PRCP-1D в трех образцах приведены на фигуре 2. Для каждого образца показаны графики зависимости флуоресценции от цикла ПЦР-РВ для обеих пробирок содержащих ССП к референсному и альтернативному состояниям нсОНП в гене PRCP, кодирующем МАГ LB-PRCP-1D. Приведены кривые флуоресценции только для этого МАГ. Кривые флуоресценции для других МАГ не показаны для упрощения восприятия.
Зонды для разных генов несут разные флуоресцентные метки, детектируемые оборудованием независимо, это обеспечивает проведение в одной пробирке нескольких ПЦР-РВ-ССП: для изучаемых генов и контрольного гена. Постановка дополнительной реакции на контрольный ген в каждой пробирке позволяет достоверно сравнить две пробирки для генотипирования исследуемой пары донор-реципиент и избежать ложноотрицательного результата. По одному из воплощений изобретения для одного человека 20 полиморфизмов приводящих к появлению МАГ анализируют с использованием пяти пар пробирок, содержащих скомпонованные праймеры и зонды. Для проведения ПЦР-РВ-ССП используют любой ПЦР-РВ термоциклер. Подобное оборудование применяется для рутинных исследований в клинических лабораториях при онкологических и гематологических клиниках. Большинство ПЦР-РВ амплификаторов за счет световых фильтров позволяет детектировать три и более спектра флуоресценции в одной пробирке. Согласно одному из воплощений изобретения используют ПЦР-РВ амплификатор на 48 или 96 лунок с пятью группами световых фильтров, например, CFX96 или iQ5 фирмы BioRad, DTlite 5 фирмы ДНК-Технология, АНК-48 фирмы Синтол или QuantStudio 5 фирмы Applied Biosystems.
При этом используют набор праймеров и флуоресцентно меченных олигонуклеотидных зондов для специфичной, аллель-зависимой амплификации участков генов ERBB2, НМНА1, MYO1G, KIAA1551, TOR3A, CLYBL, C19ORF48, TRIM22, PRCP, SSR1, WNK1, TRIM42, KIAA0020, HIVEP1, NISCH, UGT2B17, CCL4, NCAPD3, NDC80, WDR27 человека, кодирующих МАГ, презентируемые в контексте молекул ГКГС аллельной группы А*02, при осуществлении способа идентификации аллелей МАГ у донора и пациента при планировании ТГСК или поиске мишеней для клеточной терапии, где праймеры имеют последовательности SEQ ID NO: 54 - 114, а зонды - SEQ ID NO: 1-21.
А для идентификации полиморфизмов в генах ERBB2, НМНА1, MYO1G, KIAA1551, TOR3A, CLYBL, C19ORF48, TRIM22, PRCP, SSR1, WNK1, TRIM42, KIAA0020, HIVEP1, NISCH, UGT2B17, CCL4, NCAPD3, NDC80, WDR27 человека, кодирующих МАГ, презентируемые в контексте ГКГС аллельной группы А*02, осуществляют: мультиплексную полимеразную цепную реакцию в реальном времени с сиквен-специфичными праймерами (ПЦР-РВ-ССП) для амплификации фрагментов генов ERBB2, НМНА1, MYO1G, KIAA1551, TOR3A, CLYBL, C19ORF48, TRIM22, PRCP, SSR1, WNK1, TRIM42, KIAA0020, HIVEP1, NISCH, UGT2B17, CCL4, NCAPD3, NDC80, WDR27 человека, содержащих полиморфизмы, кодирующие МАГ, с использованием геномной ДНК пациента и донора в качестве матриц, и набора праймеров с последовательностями SEQ ID NO: 54 - 61, 64 - 114 и зондов с последовательностями SEQ ID NO: 2-21, а так же праймеров SEQ ID NO: 62, 63 и зонда SEQ ID NO: 1 для амплификации фрагмента контрольного гена В2М и определение аллелей исследуемых нсОНП в целевых генах или определение делеции гена у пациента и донора на основе результатов ПЦР-РВ-ССП и установление потенциально иммуногенных сочетаний состояния исследуемых генов у донора и пациента.
При этом для идентификации полиморфизмов в генах ERBB2, НМНА1, MYO1G, KIAA1551, TOR3A, CLYBL, C19ORF48, TRIM22, PRCP, SSR1, WNK1, TRIM42, KIAA0020, HIVEP1, NISCH, UGT2B17, CCL4, NCAPD3, NDC80, WDR27 человека, приводящих к образованию минорных антигенов гистосовместимости, используют набор для проведения мультиплексной ПЦР-РВ-ССП, где указанный набор праймеров для проведения ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) для генотипирования двадцати генов по полиморфизмам, приводящим к образованию МАГ, представляемых в контексте молекул ГКГС аллельной группы А*02, сгруппирован вместе по пять: четыре исследуемых гена и один контрольный ген. Тест-система позволяет в случае нсОНП определять гомо- или гетерозиготность образца ДНК по исследуемому полиморфизму. Набор позволяет выявлять как однонуклеотидные замены, так и делеции. Диагностируемые в настоящем изобретении полиморфизмы приведены в таблице 1.
Для осуществления изобретения также разработан набор олигонуклеотидных праймеров, обеспечивающих амплификацию фрагментов исследуемых генов, содержащих полиморфизмы и одного контрольного гена в ходе ПЦР в реальном времени, и набор флуоресцентно-меченных олигонуклеотидных зондов для визуализации накопления продуктов ПЦР.
Праймеры для проведения ПЦР-РВ-ССП имеют последовательности SEQ ID NO: 54 - 114, зонды - SEQ ID NO: 1 - 21. Праймеры для создания контрольных матриц имеют последовательности SEQ ID NO: 22-61.
В таблице 2 показаны необходимые сочетания праймеров и зондов по изобретению для генотипирования исследуемых генов. Цель - целевой МАГ; Тип - назначение смеси праймеров: реф. - определение референсного аллеля МАГ в ПЦР-РВ-ССП, согласно базе ОНП dbSNP, альт.- определение альтернативного аллеля; клон. - создание контрольных матриц; контр. - контрольный ген; Пр., и Обр. праймеры - прямой и обратный праймеры соответственно; п. н. - пары нуклеотидов; Аллель ПФ - состояние нуклеотида в полиморфизме, выявляемое в данной реакции, в случае UGT2B17/A2 выявляется делеция гена, в случае ПЦР для создания контрольных матриц указаны состояния нсОНП, для которых создавались контроли, в случае контрольного гена выявляется наличие гена.
Праймеры для создания контрольных матриц подобраны таким образом, чтобы получаемые ПЦР фрагменты содержали исследуемые полиморфизмы и участки связывания праймеров и зондов для ПЦР-РВ-ССП.
Праймеры для проведения ПЦР-РВ-ССП подобраны так, что один праймер из пары специфичен к конкретному состоянию полиморфизма - ССП, а второй праймер - к данному гену - он является общим для двух специфичных праймеров. В несколько сиквенс-специфичных праймеров при разработке специально внедрены несоответствующие нуклеотиды для увеличения чувствительности метода при определении разных аллелей одного гена.
Олигонуклеотидный флуоресцентный зонд подобран так, чтобы он гибридизовался на участке между праймерами, на той же нити ДНК и в той же ориентации, что и сиквенс-специфичный праймер. Зонд дополнительно несет две метки: на 5'-конце - химически присоединенный флуоресцентный краситель, а на 3'-конце - химически присоединенный гаситель флуоресценции. Зонд имеет температуру плавления на пять-десять градусов выше, чем праймеры. Флуоресцентно-меченные олигонуклеотидные зонды имеют последовательности SEQ ID NO: 1-21.
При подборе всех праймеров и зондов избегают участков, содержащих какие либо дополнительные полиморфизмы ДНК. Праймеры и зонды не должны формировать вторичные структуры (шпильки) с высокими температурами плавления, связываться с другими участками геномной ДНК человека, образовывать дуплексы и гетеро-дуплексы - комплексы одинаковых и сродственных олигонуклеотидов соответственно. Праймеры и зонды тестировались по отдельности и группами с использованием специального программного обеспечения для того, чтобы избежать указанных ошибок разработки.
В качестве флуоресцентной метки выступает любой флуоресецентный краситель, известный в данной области техники. В роли таких красителей могут выступать: Су3, Су5, Су5.5, Су7, TAMRA, ROX, JOE, Texas Red, FAM, FITC, ALEXA488, HEX и прочие. В качестве гасителей флуоресценции могут использоваться химические соединения, известные в данной области техники со спектром поглощения, перекрывающим спектр излучения соответствующего красителя, например TAMRA, BHQ-1, BHQ-2, BHQ-3, RTQ-1, RTQ-2.
Праймеры и зонды по изобретению позволяют проводить мультиплексную ПЦР, то есть, в одной реакции возможно использовать сразу несколько пар праймеров с соответствующими зондами, что значительно сокращает трудозатраты и стоимость исследования.
Праймеры и зонды могут быть использованы отдельно или объединены в несколько групп, в зависимости от количества независимых каналов детекции флуоресценции в приборе для ПЦР-РВ, на котором планируется проводить генотипирование. В одном из воплощений праймеры и зонды по изобретению используются отдельными группами, представленными в таблице 3, что позволяет проводить мультиплексную ПЦР-РВ-ССП на приборе Bio-Rad CFX1000.
В таблице 3 приведены группы праймеров и зондов для исследуемых генов. Они сгруппированы таким образом, чтобы неспецифичные взаимодействия друг с другом были минимальны. Каждая панель представляет собой два набора праймеров и зондов для пяти генов; наборы в панели отличаются только сиквенс-специфичными праймерами для генов, кодирующих МАГ: в одной смеси находятся ССП к референсному состоянию нсОНП, в другой - к альтернативному. В случае UGT2B17 используются одинаковые ССП для двух наборов праймеров в панели. В каждой панели присутствуют праймеры и зонды для гена В2М в качестве контроля. TaqMan зонды в каждой панели несут пять флуоресцентных меток, отличающихся спектром эмиссии. Используемые согласно изобретению красители указаны в первом столбце. Фл. метка - флуоресцентная метка - краситель, используемый с соответствующим зондом в каждой панели, согласно одному из воплощений изобретения.
Допускается использовать и другие сочетания пар праймеров и зондов в группах, комбинируя праймеры и зонды для отдельных МАГ, уменьшая или увеличивая их количество в каждом пуле.
Плазмидные ДНК-мишени для контроля прохождения реакций созданы с использованием праймеров согласно изобретению и набора для клонирования ПЦР-фрагментов CloneJET (ThermoFisher, USA), согласно инструкции производителя. Фрагменты генов с необходимым аллелем МАГ получали из ДНК генотипированных волонтеров с помощью праймеров SEQ ID NO: 22-61 и лигировали в плазмидный вектор, правильность вставки проверялась секвенированием по Сэнгеру. Плазмиды сгруппировали в две группы, так чтобы контрольные плазмиды для разных аллелей одного МАГ были в разных смесях.
Проводят мультиплексную ПЦР-РВ-ССП для амплификации с автоматической регистрацией накопления продуктов ПЦР, содержащих нсОНП или для определения делеции гена (согласно таблице 1), а также одного контрольного гена, с использованием геномной ДНК пациента и донора в качестве матрицы и набора праймеров с последовательностями SEQ ID NO: 54 - 114 и зондов для ПЦР-РВ, имеющих последовательности SEQ ID 1-21 и сгруппированных согласно таблицам 2 и 3.
В таблице 4 показаны последовательности праймеров согласно изобретению. SeqID - номер олигонуклеотида. Исп.- использование олигонуклотида: П. - использование только при анализе аллелей минорных антигенов в ПЦР-РВ-ССП; П/К - использование праймеров для ПЦР-РВ-ССП и для создания контрольных матриц на основе плазмид, такие плазмиды содержат фрагменты генов с исследуемым полиморфизмом и сайтами связывания праймеров и зондов для ПЦР-РВ-ССП; для каждого аллеля каждого гена создавалась отдельная плазмида; К - использование праймеров только для создания контрольных матриц. Тип - вид нуклеотида: 3 - TaqMan зонд; П -обычный праймер; С - сиквенс-специфичный праймер.
Затем производят анализ и интерпретацию результатов указанной ПЦР-РВ-ССП с установлением аллелей исследуемых генов, кодирующих МАГ и выявление потенциально иммуногенных несоответствий.
В одном из частных воплощений геномную ДНК пациента и донора выделяют из материала клинического образца, представляющего собой цельную кровь, костный мозг, или лейкоцитную массу. Для проведения анализа достаточно одной пробы клинического материала. Для выделения геномной ДНК из клинического образца может быть использована любая доступная специалисту методика. Например, выделение геномной ДНК возможно с использованием коммерческих наборов, таких как ЭкстрактДНК (Евроген), Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega), DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen) или Genomic DNA Purification Kit (Thermo Scientific).
Геномную ДНК пациента и донора используют в качестве матриц в ПЦР-РВ-ССП для специфичной амплификации фрагментов генов ERBB2, НМНА1, MYO1G, KIAA1551, TOR3A, CLYBL, C19ORF48, TRIM22, PRCP, SSR1, WNK1, TRIM42, KIAA0020, HIVEP1, NISCH, UGT2B17, CCL4, NCAPD3, NDC80, WDR27 с праймерами SEQ ID NO 54 - 61 и 64 - 114 и зондами 2-21 для визуализации накопления продуктов ПЦР-РВ.
Проводить ПЦР-РВ-ССП можно на любом приборе для ПЦР-РВ, способном регистрировать флуоресценцию минимум в пяти диапазонах длин волн с помощью пяти пар светофильтров, например CFX96 или iQ5 фирмы Bio-Rad, DTlite 5 фирмы ДНК-Технология, АНК-48 фирмы Синтол или QuantStudio 5 фирмы Applied Biosystems. Настройка и калибровка приборов проводится согласно инструкции производителя.
Анализ результатов ПЦР-РВ проводят с использованием программного обеспечения (ПО) ПЦР-РВ амплификатора или с помощью стороннего ПО.
Вывод об аллели конкретного МАГ основывается на сравнении цикла ПЦР, на котором график относительного уровня флуоресценции соответствующего зонда в соответствующих пробирках стал больше чем пороговое значение фонового уровня флуоресценции. Пороговое значение может быть выставлено программой автоматически или специалистом в ручном режиме. Такая точка перехода обозначается Cq, Ср или Ct для амплификаторов разных производителей (здесь и далее Cq). Положительным считается Cq меньше 30 цикла ПЦР. Если Cq больше 30, то это рассматривается как неспецифическая амплификация. Нормализацию проводят по формуле Cq исследуемого гена в пробирке минус Cq контрольного гена в данной пробирке, при этом если Cq контрольного гена в соответствующих пробирках отличается не более чем на цикл, то нормализацию можно опустить.
При анализе кривых зависимости уровня флуоресценции от цикла ПЦР для отдельного гена возможны три варианта результатов (см. фиг. 2 А, Б, В):
1. Если после нормализации Cq исследуемого МАГ по Cq контрольного гена в обеих пробирках Cq исследуемого МАГ отличаются не более чем на два цикла, то такой образец считается гетерозиготным по данному нсОНП (см. Фиг. 2 Б).
2. Если амплификация детектируется только в пробирке, соответствующей референсному состоянию нсОНП, то образец считается гомозиготой по этому аллелю исследуемого гена (см. Фиг. 2 А).
3. Если амплификация детектируется только в пробирке, соответствующей альтернативному состоянию ОНП, то образец считается гомозиготой по альтернативному аллелю исследуемого гена (см. Фиг. 2 В).
Если в обеих пробирках одной панели для одного образца в данном канале флуоресценции детектируется амплификация с Cq меньше 30, то необходимо сравнить Cq исследуемых аллелей по приведенному алгоритму анализа. Если Cq исследуемых аллелей в обеих пробирках больше 30 или амплификация не детектируется и Cq контрольного гена больше 25, то в ПЦР-РВ-ССП было взято недостаточно геномной ДНК, ДНК фрагментирована из-за длительного хранения или содержит ингибиторы ПЦР в большом количестве. Необходимо рассмотреть возможность перестановки теста для данного образца.
По аналогии проводится анализ для всех 20 полиморфизмов.
Далее для всех пар донор-пациент определяют потенциально иммуногенные несоответствия: если аллель исследуемого гена приводит к появлению МАГ, то он считается иммуногенным. Потенциально иммуногенное несоответствие по анализируемому гену - это реципиент-гетерозигота или гомозигота по иммуногенному аллелю и донор несущий только неиммуногенный аллель данного гена.
Если оба аллеля одного гена приводят к появлению МАГ, то это кодоминантное состояние. В таком случае иммуногенным считается состояние, при котором донор гомозигота по одному из аллелей, а реципиент несет хотя бы одну копию другого аллеля.
В случае гена UGT2B17 иммуногенным считается состояние, при котором у реципиента данный ген детектируется, а у донора - нет.
На фигуре 3А, Б, В приведены примеры возможных иммуногенных несоответствий в парах доноров и реципиентов для трех минорных антигенов. Как видно из графиков флюоресценции реципиент является гомозиготой по иммуногенному аллелю МАГ Т4А1, а донор наоборот - гомозигота по неиммуногенному аллелю (см. Фиг. 3А). Также возможна ситуация, когда реципиент гетерозиготен, а донор несет только неиммуногенный аллель МАГ, в данном примере, такое происходит для МАГ НА-2 (см. Фиг. 3Б). В таком случае так же может развиться иммунный ответ после ТГСК. В случае делеции целого гена UGT2B17 иммуногенное несоответствие - это полное отсутствие гена у донора, и наличие гена у реципиента (см. Фиг. 3В).
Праймеры и зонды согласно данному изобретению позволяют проводить мультиплексную ПЦР, возможно использовать в одной реакции сразу несколько пар праймеров с соответствующими зондами, что значительно сокращает трудозатраты, расход реактивов и стоимость исследования.
Соответствующие праймеры могут быть использованы отдельно или объединены в несколько групп в зависимости от количества независимых каналов измерения флуоресценции в приборе для ПЦР-РВ, на котором планируется проводить генотипирование. В одном из воплощений праймеры и зонды по изобретению используются отдельными группами, представленными в таблице 3, что позволяет проводить мультиплексную ПЦР-РВ-ССП на приборе Bio-Rad CFX96.
Тест-система
Тест-система для идентификации полиморфизмов в целевых генах человека, приводящих к появлению МАГ, включает:
1. Праймеры SEQ ID NO: 54 - 114 и зонды SEQ ID NO: 1-21 сгруппированные согласно таблицам 2 и 3;
2. Набор плазмид, содержащих фрагменты всех аллелей всех исследуемых генов для верификации работы тест-системы.
В одном из воплощений настоящего изобретения набор для проведения мультиплексной ПЦР-РВ-ССП включает смеси праймеров и зондов для ПЦР-РВ, а так же смеси контрольных матриц.
Еще в одном из воплощений настоящего изобретения набор для проведения мультиплексной ПЦР-РВ-ССП включает смеси праймеров и зондов для ПЦР-РВ, а так же смеси контрольных матриц, а так же традиционно используемый буферный раствор для проведения ПЦР, содержащий дНТФ и Taq-полимеразу. Такие готовые смеси позволяют произвести постановку ПЦР-РВ-ССП с минимальным количеством манипуляций.
Далее изобретение проиллюстрировано примерами, которые не ограничивают объем настоящего изобретения.
Примеры
Пример 1. ПЦР-РВ-ССП
Осуществляют ПЦР-РВ-ССП с использованием готовых растворов для генотипирования.
Для создания готовых смесей для проведения ПЦР-РВ-ССП используют пятикратный готовый реакционный раствор qPCRmix-HS (Евроген, Россия) с Taq ДНК полимеразой. Реакционные смеси готовятся таким образом, чтобы на одну реакцию приходилось 2 мкл пятикратного готового реакционного раствора qPCRmix-HS, что дает 3 мМ Mg2+ и 0,2 мМ каждого нуклеотидтрифосфата в однократном растворе. Также на одну реакцию должно приходиться по 0,3 мМ каждого праймера и по 0,2 мМ каждого зонда, а конечный объем двукратного раствора на одну реакцию доводится до 5 мкл деионизированной водой. Получившиеся двукратные смеси для всех панелей рассчитаны на конечный объем реакции ПЦР-РВ-ССП - 10 мкл.
Для генотипирования по 20 целевым полиморфизмам одного образца ДНК в лунки 96 луночного планшета для ПЦР-РВ вносят десять раз по пять мкл каждого образца ДНК и два раза по пять мкл смеси контрольных матриц и по пять мкл каждой двукратной смеси для референсных и альтернативных аллелей из каждой панели. Таким образом, на один образец ДНК ставят десять отдельных реакций.
Проводят ПЦР-РВ-ССП на приборе Bio-Rad CFX96 по следующей программе:
Первичная денатурация 95°С - 2 мин, 35 циклов: 95°С - 10 сек и 61°С - 30 сек  с одновременной измерением флуоресценции по пяти цветовым каналам.
Пример 2. Регистрация результатов ПЦР-РВ-ССП
Приборы для проведения ПЦР-РВ в автоматическом режиме регистрируют флуоресценцию по мере прохождения реакции. После прохождения ПЦР-РВ-ССП на Bio-Rad CFX96 все данные автоматически сохраняются в файл данных с расширением .pcrd и открывается окно анализа данных.
Пример 3. Анализ результатов ПЦР-РВ-ССП
Результаты ПЦР-РВ-ССП анализируют с использованием проприетарного программного обеспечения прибора для ПЦР-РВ или с помощью сторонних программ независимо для всех генов.
Рассмотрим возможные результаты ПЦР-РВ-ССП в зависимости от сочетания аллелей для трех образцов ДНК на примере минорного антигена LB-PRCP-1D. На фигуре 2 показаны графики зависимости флюоресценции от цикла ПЦР-РВ для пары пробирок содержащих ССП для референсного и альтернативного состояний нсОНП в гене PRCP, кодирующем МАГ LB-PRCP-1D. Приведены кривые флюоресценции только для этого МАГ. Кривые флюоресценции для других МАГ во время анализа отключаются для улучшения читаемости графиков. На фигуре 2А приведены графики зависимости флуоресценции от цикла ПЦР-РВ-ССП для образца гомозиготного по референсному аллелю МАГ: кривая флюоресценции, соответствующая накоплению продуктов ПЦР референсного аллеля МАГ LB-PRCP-1D, пересекает пороговое значение значительно раньше, чем кривая для альтернативного. На фигуре 2Б показана ситуация, когда образец содержит оба аллеля гена: кривые пересекают пороговое значение одновременно. Наконец на фигуре 2В - образец гомозиготен по альтернативному аллелю МАГ: есть продукт ПЦР для соответствующего ССП и не детектируется накопление продукта в пробирке с ССП к референсному аллелю гена.
По аналогии проводится анализ для всех 20 полиморфизмов, только в случае UGT2B17 отсутствие сигнала подразумевает отсутствие гена, а не аллеля в образце.
Пример 4. Определение иммуногенных комбинаций аллелей полиморфизмов в парах донор-реципиент
Для всех пар донор-пациент определяют потенциально иммуногенные несоответствия: если аллель исследуемого гена приводит к появлению МАГ, то он считается иммуногенным. Потенциально иммуногенное несоотвествие по анализируемому гену - это реципиент-гетерозигота или гомозигота по иммуногенному аллелю и донор несущий только неиммуногенный аллель данного гена.
Если оба аллеля одного гена приводят к появлению МАГ, то это кодоминантное состояние. В таком случае иммуногенным считается состояние, при котором донор гомозигота по одному из аллелей, а реципиент несет хотя бы одну копию другого аллеля.
В случае гена UGT2B17 иммуногенным считается состояние, при котором у реципиента данный ген детектируется, а у донора - нет.
На фигуре 3 показаны графики зависимости флуоресценции от цикла ПЦР-РВ-ССП для трех возможных пар донор-реципиент с иммуногенными комбинациями аллелей.
Все четыре образца проанализированы как описано в примере 3 и для них определены аллели для каждого МАГ. На фигуре 3А показана ситуация, когда реципиент (слева) является носителем только референсного аллеля МАГ Т4А1, кодируемого геном TRIM42. Донор (справа), напротив, гомозиготен по альтернативному аллелю. В случае гена TPJM42 референсный аллель нсОНП rs9876490 приводит к появлению МАГ Т4А1, таким образом, в данной паре есть иммуногенное несоответствие по минорному антигену Т4А1.
На фигуре 3Б приведены графики ПЦР-РВ-ССП для генотипирования нсОНП, приводящего к появлению МАГ НА-2. К появлению МАГ приводит референсное состояние нсОНП rs61739531 в гене MYOIG. Как следует из анализа кривых флуоресценции реципиент (слева) является гетерозиготой, а донор (справа) гомозигота по альтернативному (неиммуногенному) аллелю нсОНП. Такое сочетание аллелей у донора и реципиента также является иммуногенным.
По аналогии определяются иммуногенные несоответствия по остальным МАГ.
В случае UGT2B17 иммуногенное несоотвествие - это реципиент с детектируемым геном UGT2B17 и донор - без него (фиг. 3В).
Пример 5. Верификация
Определение аналитических свойств тест-системы по изобретению было выполнено с использованием референсных образцов ДНК. Для всех аллелей были изготовлены генные конструкции содержащие участки соответствующих генов. Все генные конструкции были проверены с помощью секвенирования по Сэнгеру, после чего использовались для верификации тест-системы. Анализ результатов тестирования показал полное совпадение результатов анализа с использованием тест-системы по изобретению с генотипами референсных образцов.
Пример 6. Апробация
Для апробации тест-системы по изобретению были взяты образцы ДНК 37 пар донор-реципиент с аллелями ГКГС А*02. Образцы были получены из периферической крови, костного мозга или стволовых кроветворных клеток. Ввиду новизны метода ни доноры, ни реципиенты ранее не генотипировались по исследуемым полиморфизмам ДНК. В нескольких парах, где были найдены иммуногенные несоответствия, развитие иммунного ответа проверялось клеточными методами и были найдены реактивные против найденных МАГ CD8+ Т-клетки.
Ранее ССП уже использовались для генотипирования МАГ при проведении обычной ПЦР, но для визуализации продуктов ПЦР приходилось проводить электрофорез в агарозном геле (ЭФ). Также раздельная постановка ПЦР для каждого полиморфизма требует больше реакционных растворов и больше работы специалиста по сравнению с описываемым по изобретению способом. Более того, быстрый протокол ПЦР-РВ позволяет сократить время проведения реакции до 50 минут.
Изобретение позволяет расширить арсенал средств для генотипирования пары донор-реципиент при планировании ТГСК при лечении гемобластозов, а также при подборе мишеней для направленной клеточной терапии при лечении гемобластозов.
Способ обеспечивает высокую чувствительность и специфичность, при проводении генотипирования полиморфизмов в один этап, а также снижение времени проведения исследования и упрощение постановки реакций. Способ рассчитан на использование для анализа в клинических лабораториях при онкологических и гематологических центрах. Оборудование имеет относительно низкую стоимость в расчете на генотипирование одного полиморфизма и позволяет собирать панели нужных мишеней, при этом не требуется дополнительного дорогостоящего оборудования. Помимо этого изобретение позволяет установить гомо\гетерозиготность соответствующего гена в образце.