СПОСОБ ИЗВЛЕЧЕНИЯ ЛИПИДОВ ИЗ БИОМАССЫ МИКРОВОДОРОСЛЕЙ CHLORELLA И ДРОЖЖЕЙ YARROWIA LIPOLYTICA
METHOD FOR EXTRACTION OF LIPIDS FROM BIOMASS OF MICROALGAE CHLORELLA AND YEAST YARROWIA LIPOLYTICA

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способам получения биодизеля из биомассы микроводорослей, предварительно выращенной в фотобиореакторах различной конструкции (открытых, закрытых, цилиндрических, плоских и трубчатых), а также биомассы дрожжей. Собранная биомасса микроводорослей предназначена для дальнейшей переработки с целью выделения липидов и получения из них биодизеля, остаточная биомасса используется для наращивания дрожжевой биомассы, из которой также выделяют липиды для получения биодизеля.
Новым перспективным подходом получения энергии из возобновляемых источников является использование микроводорослей - продуцентов липидов (Singh A. et. al., 2011; Lee D.H. 2011).
Продуктивность микроводорослей по биомассе и липидам на порядок превышает продуктивность наземных растений. Так, например, в некоторых видах водорослей при оптимальных условиях культивирования содержание липидов от сухой массы превышает таковое в масличных растениях: Botryococcus braunii 25-75%, Chlorella sp. 28-32%, Crypthecodinium cohnii 20%, Cylindrotheca sp. 16-37%, Dunaliella primolecta 23%, Isochrysis sp. 25-33%, Monallanthus salina >20, Nannochloris sp. 20-35%, Nannochloropsis sp. 31-68%, Neochloris oleoabundans 35-54%, Nitzschia sp. 45-47%, Phaeodactylum tricornutum 20-30%, Tetraselmis sueica 15-23. При этом площадь, необходимая для их выращивания, составляет в 50-100 раз и в 350-750 раз меньше чем, например, для рапса и кукурузы соответственно (Chisti Y., 2007).
На основе литературных данных можно сделать вывод, что достаточно большое количество видов микроводорослей обладают способностью к увеличенному продуцированию липидов. Однако для полной реализации биосинтетического потенциала того или иного штамма необходимо подобрать наиболее подходящие условия как для культивирования, так и для накопления липидов.
Известны различные способы культивирования биомассы микроводорослей для получения липидов.
Согласно способу (Патент РФ 2507251) инокулят микроводоросли Desmodesmus sp. штамм 2С166Е вносят в минеральную среду BG-11 до конечной концентрации хлорофилла в смеси 4-6 мкг/мл. Культивируют при постоянном освещении и барботировании среды атмосферным воздухом в течение 12-16 суток при температуре 25-27°C с последующим отделением биомассы микроводорослей от питательной среды с получением биомассы микроводоросли, содержащей 33-35% жирных кислот от сухого веса клеток.
9
11
8
9
Согласно способу (Патент РФ 2497944) культивирование микроводорослей биотопливного назначения включает две стадии альголизации. На первой стадии осуществляют альголизацию первичным инокулятом культуры, преимущественно Chlorella vulgaris BIN, полученным в фотобиореакторе, синхронно или со сдвигом по времени многофункциональных закрытых бассейнов со светопроницаемыми ограждениями. Общий объем указанных бассейнов составляет от 1/30 до 1/15 от общего объема открытых водоемов. Выращивают вторичный инокулят с объемной плотностью 10-10 клеток/л, при этом культивирование начинают в весенний период при среднесуточной температуре воды в бассейнах в диапазоне 12-18°C. Вторую стадию культивирования микроводорослей начинают путем отбора из бассейнов вторичного инокулята при температуре воды в открытых водоемах 12-18°C и продолжают его подачу в открытые водоемы до достижения в них объемной плотности микроводорослей 2⋅10-10. Частично отбирают вторичный инокулят из бассейна в качестве готового продукта в весенний и осенний периоды при температуре воды в них в диапазоне 8-12°C, при этом в многофункциональные бассейны добавляют равное количество воды с растворенными в ней биогенами. Изобретение обеспечивает увеличение производительности способа культивирования микроводорослей. Полученные микроводоросли содержат 33,9% клетчатки, 51,0% белков, 7,3% жиров.
2
Известен способ (Патент РФ 2508398), по которому культивирование штамма микроводоросли Chlorella vulgaris Al 123 проводят в лабораторных условиях при температуре 25°C на среде ВВМ pH 6.8 в лимитированных по азоту условиях проводя в течение 7 дней, в объеме среды 200 мл в колбах на 500 мл, при непрерывном барботировании суспензии стерильным воздухом со скоростью 200 мл/мин, при освещенности 120 Вт/м с фотопериодом 16 ч. Содержание липидов в биомассе микроводоросли Chlorella vulgaris Al 123 на среде с глюкозой при миксотрофном культивировании составляет 32% (по сухому весу).
Исходя из этого, предлагается для переработки использовать микроводоросли рода Chlorella.
Наиболее близким техническим решением, выбранным в качестве прототипа, является способ извлечения биологически активных веществ из биомассы микроводоросли рода Chlorella [Патент RU 2044770 C1, C12N 1/12, С12Р 21/00, A23J 3/20, A23K 1/00, 1992] - двухстадийный способ извлечения биологически активных веществ из биомассы микроводоросли рода Chlorella, который позволяет получить продукты различной природы. На первой стадии для получения липидно-пигментного комплекса с максимальным выходом сухую биомассу микроводоросли заливают 6 л экстрагента (этанол, бензин или смесь этанол-бензин (1:2)) и перемешивают в течение 6 ч при комнатной температуре. Экстракт отделяют фильтрованием, а оставшуюся биомассу заливают свежей порцией растворителя в объеме 4 л, перемешивают в течение 3 ч и фильтруют. Экстракты объединяют и концентрируют в вакуумном испарителе при температуре не выше 45°C. Конечными продуктами являются липид-пигментный комплекс с выходом 11-15% (массовых) и обезжиренная биомасса. На второй стадии процесса обезжиренную биомассу подвергают гидролизу ферментами целлюлолитического и протеолитического действия, проводят термообработку для инактивации ферментов, разделяют белковый гидролизат и шрот.
Данным способом выделяют липиды только на первой стадии с выходом 11-15% (массовых).
Задачей предлагаемого изобретения является создание способа, позволяющего перерабатывать микроводоросли рода Chlorella в замкнутом безотходном цикле для получения липидов с высоким выходом (до 37% по сухому весу), которые затем используются для производства биодизеля.
Для достижения указанного результата предложен способ извлечения липидов из биомассы микроводоросли рода Chlorella, заключающийся в том, что биомассу микроводоросли отделяют от культуральной среды, обрабатывают органическими растворителями для экстракции липидной фракции, а остаточную биомассу микроводоросли направляют на дальнейшую переработку, при этом остаточную биомассу микроводоросли подвергают гидролизу и в виде водной суспензии используют в качестве питательной среды для выращивания дрожжей Yarrowia lipolytica W23, после чего биомассу дрожжей отделяют от культуральной среды и экстрагируют из нее липидную фракцию, а остаточную биомассу дрожжей подвергают гидролизу и направляют на стадию их выращивания.
Кроме того,
- в качестве органического растворителя используют хлороформ-метанол в соотношении 2:1 - 1:2;
- биомассу микроводоросли Chlorella подвергают гидролизу при температуре 80-140°C 20-90 минут;
- остаточную биомассу дрожжей Yarrowia lipolytica W23 подвергают гидролизу при температуре 80-140°C 20-90 минут;
- используют 5% - 20% водную суспензию остаточной биомассы микроводоросли;
- количество остаточной биомассы дрожжей в питательной среде для их выращивания составляет 5-10%.
Принципиальная схема реализации способа показана на чертеже.
В качестве микроводоросли использовали Chlorella vulgaris GKV-1.
Выбор дрожжей Yarrowia lipolytica W23 обусловлен их способностью накапливать большое количество липидов, а также возможностью генной модификации разработанными методами с целью увеличения выхода липидов.
Стадии способа:
1. Культивируют микроводоросль Chlorella vulgaris GKV-1;
2. Биомассу микроводоросли Chlorella vulgaris GKV-1 отделяют от культуральной среды и высушивают;
3. Измельчают биомассу микроводоросли и экстрагируют липидную фракцию органическим растворителем;
4. Отделяют липидную фракцию от растворителей;
5. Получают биодизель из липидной фракции;
6. Остаточную биомассу микроводоросли подвергают гидролизу; из гидролизованной остаточной биомассы микроводоросли готовят водную суспензию и направляют ее для выращивания дрожжей Yarrowia lipolytica.
7. Выращивают биомассу дрожжей Yarrowia lipolytica W23 на остаточной биомассе микроводорослей, отделяют биомассу дрожжей и высушивают;
8. Измельчают биомассу дрожжей и экстрагируют липидную фракцию с помощью органического растворителя.;
9. Отделяют липидную фракцию и направляют ее на получение биодизеля;
10. Остаточную биомассу подвергают гидролизу и используют для выращивания дрожжей Yarrowia lipolytica W23.
Параметры способа были выбраны исходя из следующих соображений.
Биомассу микроводоросли Chlorella vulgaris и дрожжей Yarrowia lipolytica подвергают гидролизу при температуре от 80°C до 140°C в течение 20-90 минут; данный диапазон температур и времени обработки является наиболее подходящим для гидролиза биомассы микроводорослей и дрожжей для использования их в качестве компонента питательных сред с целью получения липидов: при температуре ниже 80°C не достигается необходимого разрушения биомассы, выше 140°C дополнительного разрушения биомассы не происходит.
В качестве органического растворителя используют хлороформ-метанол при соотношении 2:1-1:2; при данных соотношениях органических растворителей наблюдается наибольшее количество извлекаемых липидов из биомассы микроводорослей и дрожжей.
Концентрация водной суспензии из гидролизованной биомассы микроводоросли Chlorella vulgaris, которую направляют для выращивания дрожжей Yarrowia lipolytica, составляет 5%-20%, при таких концентрациях наблюдается наибольший выход липидов при переработке дрожжей.
Гидролизованную биомассу дрожжей Yarrowia lipolytica вносят в качестве компонента в питательную среду для выращивания дрожжей Yarrowia lipolytica. Посевная доза дрожжей составляет 5-15% от объема среды, при таких концентрациях наблюдается наибольший выход липидов при переработке дрожжей.
Примеры реализации способа
Пример 1.
Выращивание микроводоросли Chlorella vulgaris GKV-1 происходит фототрофно в течение 7 суток, температура 24±2°C, на стандартной среде Basal medium ((Yeh and Chang, 2012), pH 7.0, в объеме среды 250 мл в колбах на 500 мл, при непрерывном барботировании суспензии стерильным воздухом с скоростью 250 мл/мин, при освещенности 3000 люкс с фотопериодом 24 ч.
Клетки микроводоросли отделяют центифугированием при 8500g в течение 7 минут. Полученную биомассу микроводоросли высушивают. Далее сухую биомассу микроводоросли измельчают в гомогенизаторе. Извлечение липидов осуществляют путем встряхивания на качалке с частотой вращения 200 об/мин с органическим растворителями - хлороформ-метанол (2:1) при комнатной температуре. Затем надосадочную жидкость (липидная фракция) отделяют центрифугированием. Липидную фракцию концентрируют в вакууме на роторном испарителе и затем используют для получения биодизельного топлива. Остаточную биомассу микроводоросли после извлечения липидов гидролизуют в автоклаве при 121°C 30 минут, из него готовят 10% водную суспензию, стерилизуют в автоклаве при 121°C 20 минут и используют в качестве питательной среды для выращивания дрожжей Yarrowia lipolytica W23. Посевная доза дрожжей составляет 5% от объема среды. Дрожжи выращиваются в объеме среды 250 мл в колбах на 500 мл, в течение 48 часов при 25±2°C на качалке с частотой вращения 150 об/мин. Клетки дрожжей отделяют центифугированием при 8500g в течение 7 минут. Полученную биомассу дрожжей высушивают. Далее сухую биомассу дрожжей измельчают в гомогенизаторе. Извлечение липидов осуществляют путем встряхивания с частотой вращения 200 об/мин на качалке с органическим растворителями - хлороформ-метанол (2:1) при комнатной температуре. Затем надосадочную жидкость (липидная фракция) отделяют центрифугированием. Липидную фракцию концентрируют в вакууме на роторном испарителе и затем используют для получения биодизельного топлива. Содержание общих липидов определяли гравиметрически.
Выход липидов из биомассы микроводорослей составил 15% (по сухому весу), из биомассы дрожжей 21,5% (по сухому весу). В сумме выход по липидам составляет 36,5% (по сухому весу).
Пример 2.
То же, что в примере 1, только остаточная биомасса микроводорослей гидролизуется в автоклаве при 121°C 60 минут, из нее готовят 15% водную суспензию, которая используется для выращивания дрожжей.
Выход липидов из биомассы микроводорослей составил 15% (по сухому весу), из биомассы дрожжей 21,7% (по сухому весу). В сумме выход по липидам составляет 36,7% (по сухому весу).
Пример 3.
То же, что в примере 1, только остаточная биомасса микроводорослей гидролизуется в автоклаве при 121°C 30 минут, из нее готовят 10% водную суспензию, к ней добавляют гидролизованную при 121°C 30 минут остаточную биомассу дрожжей в количестве 5%. Данная питательная среда используется для выращивания дрожжей.
Выход липидов из биомассы микроводорослей составил 15% (по сухому весу), из биомассы дрожжей 21,8% (по сухому весу). В сумме выход по липидам составляет 36,8% (по сухому весу).
Пример 4.
То же, что в примере 1, только остаточная биомасса микроводорослей гидролизуется в автоклаве при 121°C 60 минут, из нее готовят 10% водную суспензию, к ней добавляют гидролизованную при 121°C 60 минут остаточную биомассу дрожжей в количестве 10%. Данная питательная среда используется для выращивания дрожжей.
Выход липидов из биомассы микроводорослей составил 15% (по сухому весу), из биомассы дрожжей 22% (по сухому весу). В сумме выход по липидам составляет 37% (по сухому весу).
Пример 5.
То же, что в примере 1, только извлечение липидов из биомассы микроводорослей осуществляли органическими растворителями - хлороформ-метанол в соотношении 1:1.
Выход липидов из биомассы микроводорослей составил 14,9% (по сухому весу), из биомассы дрожжей 21,3% (по сухому весу). В сумме выход по липидам составляет 36,2% (по сухому весу).
Пример 6.
То же, что в примере 1, только извлечение липидов из биомассы микроводорослей осуществляли органическими растворителями - хлороформ-метанол в соотношении 1:2.
Выход липидов из биомассы микроводорослей составил 14,8% (по сухому весу), из биомассы дрожжей 21,2% (по сухому весу). В сумме выход по липидам составляет 36% (по сухому весу).
В таблице приведено сравнение предлагаемого способа получения липидов из биомассы микроводорослей и дрожжей со способом, представленным в Патенте RU 2044770.
Использование остаточной биомассы микроводорослей и остаточной биомассы дрожжей позволяет повысить суммарный выход липидов в замкнутом безотходном цикле до 37,0% (по сухому весу)