ГЕЛЬ ГИАЛУРОНОВОЙ КИСЛОТЫ ДЛЯ ВНУТРИКОЖНОЙ ИНЪЕКЦИИ
GEL OF HYALURONIC ACID FOR INTRACUTANEOUS INJECTION

Настоящее изобретение относится к имплантатам на основе гиалуроновой кислоты, которые могут быть инъецированы подкожно или внутрикожно.
Гиалуроновая кислота (ГК) в ее кислотной форме или в форме соли (гиалуроната) является основным компонентом внеклеточного матрикса. Она, в частности, представлена в соединительных тканях, называемых "мягкими", в противоположность другим гликозаминогликанам, таким как хондроитинсерная кислота, присутствующая в тканях, называемых "твердыми", таких как хрящ. Таким образом, она находится в значительных количествах в коже.
ГК представляет собой линейный несульфатированный гликозаминогликан, состоящий из повторяющихся звеньев D-глюкуроновой кислоты и N-ацетил-D-глюкозамина (Tammi R., Agren U.M., Tuhkanen A.L, Tammi M. Hyaluronan metabolism in skin. Progress in Histochemistry & Cytochemistry. 29(2): 1-81, 1994).
В нормальной коже ГК синтезируется, в основном, дермальными фибробластами и эпидермальными кератиноцитами (Tammi R., цит. выше). За счет отрицательно заряженных остатков ГК играет роль водного насоса, что дает возможность поддержания эластичности кожи. ГК играет главную роль в регуляции диффузии нутриентов, гормонов, витаминов и неорганических солей соединительной ткани и в выведении отходов метаболизма, способных к индукции воспалительных реакций. С возрастом количество ГК и степень ее полимеризации уменьшается, приводя в результате к уменьшению количества воды, удерживаемой в соединительной ткани. Затем кожа претерпевает процесс старения, который приводит к повышению фиброза и к падению содержания эластичных волокон. В нормальной коже человека ГК существует в форме высокомолекулярного полимера (600000-1000000 Да). Физиологический распад ГК в коже происходит посредством (i) интернализации кератиноцитами и (ii) внутриклеточной фрагментации гиалуронидазами на фрагменты промежуточного размера (600000-300000 Да). Фрагментированная ГК высвобождается кератиноцитами, пересекает базальную мембрану и высвобождается непосредственно в лимфатические сосуды (Tammi R. et al., цит. выше).
Роль гиалуроновой кислоты (ГК) в дерматологии хорошо известна в различных областях, включая заживление ран и гидратацию. Гиалуроновая кислота чаще всего действует посредством ее взаимодействий со связывающими белками и, в частности, с трансмембранным рецептором CD44 (Tool В.Р. 2001, Sem. Cell. Devel. Biol. 12: 79-87, Liao Y-H., Stuart A.J., Drug Delivery, 12: 327-342, 2005). Активация этого рецептора выражается через его роль в морфогенезе, в размножении и пролиферации клеток, в ангиогенезе и в миграции клеток (G.Weindl, M.Schaller, Skin Pharm. Physiol. 2004; 17; 207-213). Данные, приведенные в литературе, позволяют предположить, что эти различные действия являются функцией клеточного окружения, молекулярной массы гиалуроновой кислоты и ее концентрации. Например, более высокие молекулярные массы ингибируют ангиогенез, тогда как олигосахариды стимулируют его.
В Японской патентной заявке JP 11279042 продемонстрировано соответствующее действие сульфатированных фрагментов гиалуроновой кислоты (ФГК) (молекулярной массы между 1 и 50 кДа), которые могли бы дать возможность поддержания эластичности кожи и избежать кератинизации.
В недавнем исследовании, проведенном на фрагментах гиалуроновой кислоты (молекулярной массы между 50 и 750 кДа) соответственно, продемонстрировано усиление синтеза гиалуроновой кислоты кератиноцитами (патентные заявки FR 2865651, WO 2005 082327). Эта пролиферативная активность индуцирована ФГК точных молекулярных масс, то есть эта активность не проявляется при более высоких или более низких молекулярных массах.
В области косметологии существуют различные инъекционные препараты, основанные на гиалуроновой кислоте. В мезотерапии применяют растворы витаминов, антиоксидантов, неорганических солей или гиалуроновой кислоты. Витамины присутствуют для стимуляции и поддержания клеточного метаболизма, и, таким образом, усиливают продуцирование коллагена, антиоксиданты борются против старения, а неорганические соли незаменимы для клеточных ферментативных активностей. Ролью гиалуроновой кислоты является обеспечение возможности поддержания объема и гидратации кожи и создания защитного экрана против разрушительных действий свободных радикалов (H.Trommer, S.Wartewig, Int. Journ. Of Pharm. 254 (2003) 223-234). При достаточных концентрациях гиалуроновая кислота создает оптимальную окружающую среду для клеточной пролиферации и нового синтеза коллагена.
Окислительный стресс, генерирующий свободные радикалы в дерме и эпидермисе, ответственен за старение кожи и появление морщин, мелких и тонких морщинок и провисания тканей.
Кроме того, также продемонстрировано, что свободные радикалы также ответственны за деполимеризацию гиалуроновой кислоты in situ, которая вносит дополнительный вклад в провисание тканей и их преждевременное старение (Mendoza G., et al. Carbohydrate Research 342, 2007, 96-102).
Внеклеточный матрикс (ВКМ) представляет собой динамичную структуру, играющую структурную и регуляторную роль для тканей. ВКМ состоит из волокон коллагена и эластина, а также из основной среды (главным образом, воды, минеральных солей и протеогликанов). Этот матрикс придает коже ее упругость и ее механические свойства плотности, эластичности и тонуса.
Макромолекулы коллагена представляют собой фибриллярные белки, образованные из трех полипептидных цепей, сшитых ковалентными и водородными связями. Известно девятнадцать типов коллагена, где половина из них находится в коже. Большинство кожных коллагенов принадлежит к фибриллярным коллагенам I, III и V.
У молодых совершеннолетних состав дермы на 80% составляет коллаген типа I и на 20% коллаген типа III; однако, это соотношение изменяется с возрастом как следствие старения.
Эластины представляют собой белки, организованные в волокна внутри кожи, и они придают коже свойства эластичности и гибкости. Эти эластины обогащены аминокислотами гидрофобного характера.
Распад ВКМ принимает участие во время некоторых физиологических процессов, таких как заживление раны, эмбриональное развитие или ангиогенез, а также в патологических ситуациях, таких как артрит, атероз или атеросклероз, и, безусловно, во время фаз прогрессирования опухоли с образованием метастазов (Fisher et al., 1997. N England J. Med., 337, 1419-28; Shapiro, 1998. Current Opinions in Cell Biology, 10, 602-608).
Компоненты ВКМ, главным образом, расщепляются ферментами эндопептидазами, называемыми матриксными металлопротеинами или ММР. Эти ММР вносят активный вклад в процесс заживления раны, а также вносят вклад в релаксацию кожи и появление морщин, которые являются первыми признаками старения кожи. Семейство ММР состоит примерно из 22 ферментов, которые различают по специфичности по отношению к субстрату, который они расщепляют.
ММР-1, или интерстициальная коллагеназа, преимущественно расщепляет тройную спираль фибриллярных коллагенов типа III, но также коллагены I, II, VII, VIII и X.
ММР-3 расщепляет гликопротеины, такие как фибронектин и ламинин, некоторые протеогликаны, эластин, желатин и коллагены IV и V. Эти два ММР экспрессируются как кератиноцитами, так и фибробластами.
Для заполнения морщин гели химически сшитой ГК инъецируют внутрикожно для заполнения впадины, вызванной морщиной. Сшивание дает возможность повысить устойчивость препарата внутри дермы. Таким образом, если препарат правильно инъецирован в соответствии с генетическим профилем каждого человека, этот препарат дает возможность заполнения в течение 4-6 или даже 8 месяцев. Затем он претерпевает полную резорбцию в дерме.
Такие гели на основе ГК или сшитой ГК дают возможность уменьшения морщины за счет эффекта механического заполнения в кожной впадине, являющейся результатом этой морщины. Эти препараты наделены только этим механическим эффектом и никоим образом не вносят вклад ни в профилактику, ни в лечение в отношении старения кожи и разрушения ВКМ, существенного для поддержания механических свойств кожи, таких как ее эластичность и ее плотность. Такие имплантаты, если они дают возможность удаления морщин или тонких и мелких морщинок, создают эффект, который ограничен по времени, и который только частично маскирует эффекты присущего коже старения, что касается поддерживающих структур, представленных ВКМ.
К настоящему времени несколько препаратов применяют в данной области. Гели или силиконовые масла являются простыми для применения, но они обладают недостатком вследствие миграции в ткани, расположенные непосредственно внизу от точек инъекции. Таким образом, в результате возникают хронические воспалительные явления или аллергические реакции. Кроме того, силикон не является биоразлагаемым и оказывается в некоторых органах, таких как печень. Предложены также различные суспензии полимерных частиц, но большинство вызвали реакции отторжения, инфекции или воспаления. Наконец, в течение последних нескольких лет применяют коллагеновые суспензии. Однако коллаген претерпевает резорбцию относительно быстро (между 1 и 3 месяцами) и вызывает некоторые аллергические реакции благодаря своему происхождению, поскольку он, как правило, имеет бычье или свиное происхождение.
Сохраняется необходимость в инъецируемых имплантатах, способных осуществлять функцию как заполнения морщин, так и восстановления жизненно важных функций дермы и эпидермиса и вносить вклад в ограничение процессов клеточного старения, сопутствующего старению кожи, у которых отсутствуют вышеупомянутые недостатки, либо они намного меньше выражены, причем всему этому сопутствует простота и повышенное удобство при применении.
Настоящее изобретение, таким образом, относится к подкожно или внутрикожно инъецируемому имплантату в форме монофазного гидрогеля, характеризующемуся тем, что он содержит от 0,5% до 5% мас./мас., предпочтительно от 0,5% до 4%, более предпочтительно 2% гиалуроновой кислоты, и в котором:
- от 50% до 95%, предпочтительно от 60% до 90%, даже более предпочтительно 85% мас./мас. гиалуроновой кислоты находится в форме сшитого геля;
- от 5% до 50%, предпочтительно от 10% до 30%, даже более предпочтительно 15% мас./мас. гиалуроновой кислоты находится в свободной форме или в форме одной из физиологически приемлемых солей ГК молекулярной массы между 500 и 2800 кДа, предпочтительно между 750 и 2600 кДа, более предпочтительно между 800 и 2500 кДа, даже более предпочтительно между 1000 и 1500кДа,
в физиологически приемлемой жидкости-носителе, где отношение между массой геля сшитой гиалуроновой кислоты и массой свободной гиалуроновой кислоты составляет между 1:1 и 1:0,05.
В конкретном воплощении изобретения имплантат может содержать примерно 80% сшитой гиалуроновой кислоты и примерно 20% свободной гиалуроновой кислоты, что принципиально важно в контексте применения имплантата согласно изобретению для лечения тонких и мелких морщинок. В случае лечения глубоких морщин количество сшитой гиалуроновой кислоты должно предпочтительно составлять примерно 85%, а количество свободной гиалуроновой кислоты примерно 15%.
В контексте настоящего изобретения гиалуроновую кислоту или ГК определяют как несульфатированный линейный гликозаминогликан, состоящий из повторяющихся звеньев D-глюкуроновой кислоты и N-ацетил-D-глюкозамина.
Монофазный гидрогель означает гидрогель в одной однородной фазе.
Физиологически приемлемая соль гиалуроновой кислоты означает, в частности, натриевые и калиевые соли, а также их смеси. Преимущественно соль представляет собой натриевую соль.
Преимущественно гель, изготовленный из сшитой гиалуроновой кислоты согласно изобретению, имеет вязкость между 200 и 2000 Па·с, более конкретно между 500 и 1800 Па·с, даже более конкретно между 1000 и 1800 Па·с.
В случае имплантата для лечения глубоких морщин, то есть содержащего 85% сшитой гиалуроновой кислоты, вязкость последнего устанавливают около 1000-1500 Па·с, в частности, около 1200 Па·с. В случае имплантата, в основном, для неглубоких морщин, следовательно, с меньшим содержанием сшитой гиалуроновой кислоты, то есть примерно 80% сшитой гиалуроновой кислоты, вязкость такого имплантата устанавливают около 200-500 Па·с, более конкретно около 350 Па·с.
-1
В данном описании указанные вязкости соответствуют значениям, измеренным для скорости сдвига 0,01 с.
Преимущественно сшитая гиалуроновая кислота, которая составляет гель согласно изобретению, имеет молекулярную массу между 1000 и 6000 кДа, более предпочтительно между 1000 и 4000 кДа.
Согласно предпочтительному аспекту изобретения инъецируемый имплантат также содержит хондроитинсульфат.
Преимущественно количество хондроитинсульфата составляет между 0,05% и 5% мас./мас. от суммарной массы.
Преимущественно хондроитинсульфат имеет молекулярную массу между 2 и 80 кДа, более предпочтительно между 20 и 50 кДа.
Имплантат согласно изобретению может содержать различные общепринятые добавки. Для примера можно упомянуть красители, красящие пигменты, растительные масла, загустители, модификаторы pH и регуляторы осмомолярности.
Свободная гиалуроновая кислота или одна из ее физиологически приемлемых солей преимущественно распределена гомогенно внутри геля сшитой гиалуроновой кислоты.
Жидкость-носитель преимущественно представляет собой апирогенный стерильный изотонический буфер.
Инъецируемый имплантат согласно изобретению также преимущественно содержит по меньшей мере одно другое активное вещество, применяемое в дермокосметике.
Преимущественно дермокосметическое активное вещество выбрано из витаминов, антиоксидантов, неорганических солей, антисептиков и хондроитинсульфата.
В конкретном воплощении изобретения инъецируемый имплантат содержит маннит, который действует как антиоксидант на уровне дермы и вносит вклад в предохранение ГК от деполимеризации, индуцируемой свободными радикалами, генерируемыми внутри дермы в результате окислительного стресса. Действительно, описано, что сочетание маннита с ГК улучшает защиту против повреждения, индуцированного свободными радикалами (Belda et al., 2005, J. Cataract Refract. Surg., 31: 1213-1218). Таким образом, следующим аспектом настоящего изобретения является разработка инъецируемого имплантата, как определено выше, и содержащего маннит в качестве антиоксиданта.
Другой аспект данного изобретения заключается в применении маннита в инъецируемом имплантате согласно настоящему изобретению в целях защиты дермы от свободных радикалов и/или ограничения деполимеризации гиалуроновой кислоты, содержащейся в нем.
Изобретение, таким образом, также относится к применению гиалуроновой кислоты в свободной форме или в форме одной из ее физиологически приемлемых солей молекулярной массы между 500 и 2800 кДа, предпочтительно между 750 и 2600 кДа, более предпочтительно между 800 и 2500 кДа, даже более предпочтительно между 1000 и 1500 кДа в присутствии антиоксиданта, такого как маннит, для изготовления имплантата, предназначенного для защиты дермы от свободных радикалов и/или для ограничения деполимеризации гиалуроновой кислоты дермы и/или для предупреждения старения кожи.
Имплантат согласно данному изобретению инъецируют в поверхностную, среднюю или глубокую дерму.
Преимущество его составляет способность вызывать в момент инъекции активизацию фибробластов путем стимуляции клеточной пролиферации и нового синтеза коллагена. Затем активация фибробластов создает модулирование механизмов, вовлеченных в ремоделирование внеклеточного матрикса, которые выражено в восстановлении жизненно важных функций дермы.
Двойное преимущество имплантата согласно настоящему изобретению состоит в получении непосредственного и немедленного эффекта уменьшения морщины в результате механического заполнения кожной впадины и косвенного эффекта в течение длительного срока клеточной регенерации посредством стимуляции синтеза коллагена и регуляции ММР.
Сшитая гиалуроновая кислота вносит вклад непосредственно в эффект механического заполнения и дает возможность, посредством ее сшитой природы, получить такой эффект продолжительно в течение более длительных периодов, чем несшитая ГК.
Кроме того, свободная ГК, содержащаяся в имплантате согласно изобретению, ингибирует гиперэкспрессию ММР-1, а также гиперэкспрессию коллагена III. Кроме ее регуляторного действия на ММР-1, она вносит вклад в ограничение деструктуризации и разрушения ВМК, незаменимой структуры для поддержания механических свойств плотности и эластичности кожи.
Кроме того, продемонстрировано, что соотношение коллаген III/коллаген I повышается во время старения кожи (Weber et al, 1984, J. Invest. Dermatol., 82, 156-60). Зная, что в контексте данного изобретения наблюдали, что фракция свободной ГК, используемой в имплантате согласно изобретению, ингибирует экспрессию коллагена типа III, не влияя на экспрессию коллагена типа I, разумно считать, что имплантат согласно изобретению способен к восстановлению соотношения коллаген III/коллаген I до соотношения, измеренного в молодых тканях.
Таким образом, целью данного изобретения является применение имплантата согласно данному изобретению для изготовления лекарственного средства, предназначенного для поддержания и/или восстановления соотношения коллаген III/коллаген I до соотношения, измеренного в молодых тканях.
Следствием сочетания свободной ГК молекулярной массы между 500 и 2800 кДа с гелем сшитой ГК является немедленная гидратация и поддержание объема кожи. Кроме того, оно индуцирует активацию фибробластов дермы, в основном, благодаря присутствию свободной ГК, и эта активация фибробластов пролонгирована по времени по мере прогрессирования in vivo разложения геля сшитой ГК.
Имплантат согласно настоящему изобретению может быть представлен в виде трехмерной сетки, изготовленной из сшитой ГК, содержащей внутри нее молекулы свободной ГК, способные к индукции стимуляции фибробластов, ингибированию распада ВКМ посредством ингибирования ММР и регуляции синтеза коллагена посредством ориентации последнего в направлении состояния, соответствующего наблюдаемому в молодой ткани.
Эти молекулы свободной ГК прогрессивно высвобождаются из этого трехмерного матрикса сшитой ГК по мере пассивной диффузии посредством распада со временем матрикса сшитой ГК в течение недель и месяцев после инъекции. Это прогрессирующее высвобождение дает возможность такого омолаживающего действия стимуляции клеток in situ этими молекулами свободной ГК, которые предохранены от биологического разложения внутри указанного матрикса в течение нескольких недель, и могут, следовательно, осуществлять свое действие в течение более длительного периода, чем при инъекции их одних.
Таким образом, настоящее изобретение также относится к применению гиалуроновой кислоты в ее свободной форме или в форме одной из ее физиологически приемлемых солей, молекулярной массы между 500 и 2800 кДа, предпочтительно между 750 и 2600 кДа, более предпочтительно между 800 и 2500 кДа, даже более предпочтительно между 1000 и 1500 кДа, распределенной внутри геля сшитой гиалуроновой кислоты, для изготовления подкожного имплантата для заполнения морщин и стимуляции эпидермальных клеток и/или поддержания механических свойств плотности и эластичности кожи.
Таким образом, имплантат согласно изобретению объединяет механический эффект сшитого геля, который набухает и восстанавливает форму морщины, с биологическим действием свободной ГК.
Изобретение также относится к набору в форме шприца, содержащего инъецируемый имплантат, такой как описано выше.
Изобретение также относится к имплантату, как описано выше, в качестве лекарства.
Изобретение также относится к применению инъецируемого имплантата, как описано выше, для заполнения морщин, тонких и мелких морщинок, кожных впадин и/или рубцов, включающему подкожную инъекцию такого имплантата.
Инъецируемый имплантат согласно изобретению можно применять для изготовления лекарства, предназначенного для стимуляции эпидермального и дермального метаболизма и/или для стимуляции эпидермальной клеточной активности.
Инъецируемый имплантат согласно изобретению можно применять для изготовления лекарства, предназначенного для стимуляции антиоксидантной активности дермы и/или предупреждения старения кожи.
Изобретение также относится к косметическому способу заполнения морщин и/или мелких морщинок, при котором инъецируют по меньшей мере один инъекционный имплантат согласно изобретению.
Изобретение также относится к способу изготовления инъецируемого имплантата, как описано выше. Он может быть изготовлен с помощью любой методики, известной специалистам в данной области техники, например, с помощью диэпокси, в частности, бутандиолдиглицидилового эфира (BDDE) или 1,2,7,8-диэпоксиоктана. При сшивании в базовой среде концентрация диэпокси может варьировать, например, между 5 и 15% по отношению к гиалуроновой кислоте для сшивания на водяной бане при 45-55°C в течение 1,5-6 ч. Затем сшитый гель очищают с помощью классических методик специалистов в данной области техники: различных бань с деионизованной водой, спиртового осаждения, диализа и т.д. для удаления следов остаточного сшивающего агента. К этому очищенному гелю добавляют ГК соответствующей молекулярной массы, предварительно гидратированную в подходящем буфере. Наконец, готовый продукт дегазируют, помещают в шприц или любой другой подходящий контейнер и стерилизуют автоклавированием.
Предпочтительная методика согласно изобретению включает следующие стадии:
1) приготовление сшитого геля в соответствии со следующими стадиями:
- добавление гиалуроновой кислоты к основной жидкости,
- набухание, гомогенизация при медленном перемешивании и сшивание при нагревании,
- нейтрализация и набухание сшитого геля в буферном растворе при pH примерно 7 при добавлении агента, придающего изоосмомолярность,
- удаление сшивающего агента,
2) приготовление геля свободной гиалуроновой кислоты путем:
- добавления гиалуроновой кислоты к буферному раствору с pH примерно 7, изоосмомолярному:
- набухания,
3) смешивание сшитого геля, полученного на стадии 1), с гелем свободной гиалуроновой кислоты, полученным на стадии 2),
4) возможная дегазация и возможная упаковка в бутылочки или шприцы, а затем стерилизация.
Преимущественно pH геля после стерилизации равно примерно 7, и осмомолярность составляет около 250-350 мОсм, предпочтительно между 300 и 320 мОсм.
Далее изобретение проиллюстрировано, не ограничивая его, приведенными ниже примерами.
Пример 1:
Характеристика активности ГК различных молекулярных масса на:
- здоровых фибробластах;
2
2
- стареющих фибробластах (посредством окислительного стресса HO).
2
2
ММР-1 (коллагеназа 1) представляет собой интерстициальную коллагеназу, которая расщепляет тройную спираль фибриллярных коллагенов, таких как коллагены I и III. В коже она экспрессируется и секретируется фибробластами и кератиноцитами. ММР-1 вовлечена в старение. Действительно, ее сверхпродукция в процессе старения может быть вовлечена в утрату плотности и эластичности и в появление морщин. Когда старение индуцировано NO, в фибробластах наблюдают значительное повышение ММР-1. Основные активные вещества, способные к снижению этой сверхпродукции, следовательно, могут обладать свойствами "против старения".
Фибробласты были получены из кожи, имеющей происхождение из остатков операционной от молодых субъектов. Образцы промывали в ФСБ и этаноле. Нарезали маленькие кусочки кожи, распределяли по культуральным чашкам и погружали в среду, благоприятную для пролиферации фибробластов (DMEM + 10% SVF). В эту среду добавляли примоцин. Последний представляет собой антибиотик, противогрибковое средство и средство против микоплазмы. Культуральные чашки помещали в инкубатор.
2
2
Для индукции старения фибробласты высевали в культуральные чашки, Через 24 часа добавляют тестируемое активное вещество при подходящей концентрации к DMEM. После 24 инкубации клетки подвергают окислительному стрессу. Клетки инкубировали в течение 2 часов при 37°С в 75 мкм растворе HO в ФСБ. Вовлечен острый стресс, который вызывает старение клеток. Затем фибробласты снова помещали в полную среду DMEM с 10% SVF. Фибробласты возвращают к старению через 72 часа после окончания стресса.
1.1. Протокол инкубации
2
2
Для стареющих фибробластов: ГК добавляют до конечной концентрации 1 мкг/мл, их оставляют в течение стресса HO, то есть 24 ч инкубации.
Для здоровых фибробластов: ГК также инкубируют в течение 24 ч при 1 мкг/мл.
1.2. Выделение суммарной РНК с помощью набора для выделения Rneasy (Qiagen) в конце эксперимента (сутки 5, то есть 72 ч после стресса).
1.3. Анализ суммарной РНК
Качественный и количественный анализ суммарных РНК проводят с помощью аналитического набора RNA 6000 Nano LabChip и аппарата Bioanalyzer 2100 (Agilent). Он основан на принципе электрофоретической миграции образцов в наночипе. Вычисляют отношение рибосомных РНК 28S/18S; оно является информативным при оценке целостности РНК. Кроме того, оценивают чистоту РНК в отношении геномной ДНК.
1.4. Анализ скорости транскрипции с помощью ПЦР в реальном времени дает возможность количественно определить уровень транскрипционной экспрессии интересующего гена путем амплификации кДНК, полученных путем обратной транскрипции мРНК гена, присутствующих в клеточном лизате. Реакционную смесь готовят из кДНК и смеси группы интересующих праймеров с раствором IQ SybrGreen Supermix (Biorad), содержащим, среди прочего, Taq полимеразу и интеркалирующий агент малой бороздки двойной спирали ДНК: Sybr Green (флуоресцентный интеркалирующий агент). Реакцию проводят в термоциклере Icycler IQ (Biorad); вовлечена последовательность циклов денатурации/гибридизации/элонгации.
1.4.1. Обратная транскрипция: суммарные РНК "обратно транскрибируют" на кДНК с помощью Reverse Transcription System (Promega) и Gene Amp PCR System 2400 (Perkin Elmer).
1.4.2. Измерение скорости транскрипции интересующего гена: уровень экспрессии интересующего гена нормализуют по уровню экспрессии эталонных генов, который мало варьирует при старении. Уровень экспрессии интересующего гена вычисляют в соответствии с формулой: 2 (CTmin-CT), где СТ означает "порог цикла".
Уровень экспрессии нормализуют по отношению к экспрессии трех выбранных эталонных генов согласно вычислению: 2 (СТтт-СТ)/коэффициент нормализации.
1.5. Результаты по экспрессии ММР-1
1
2
Фибробласты, подвергнутые старению путем инкубации с HO, экспрессировали в 2,14 раз больше ММР-1, чем нормальные фибробласты (таким образом, старение правильно индуцировано). В присутствии витамина Е (положительный контроль) гиперэкспрессия ММР-1 стареющими фибробластами была снижена на 40%.
Гиперэкспрессия ММР-1 была снижена на 40% в присутствии ГК 450 кДа (10 мкг/мл), на 75% в присутствии ГК 800 кДа (10 мкг/мл), на 71% в присутствии ГК 1500 кДа (10 мкг/мл) и на 83% в присутствии ГК 2600 кДа (10 мкг/мл).
2
2
2
2
1.6. Результаты по экспрессии коллагена типа I и типа III. В фибробластах, подвергнутых старению путем инкубации с HO, было измерено вариабельное ингибирование транскрипции коллагена типа I; такое ингибирование казалось, однако, зависимым от доноров. На одном из доноров, для которого транскрипция типа I была ингибирована на 24% стрессом HO, различные ГК различных размеров не восстанавливали синтез коллагена.
2
2
В фибробластах, подвергнутых старению, было измерено повышение +163% - +304% транскрипции коллагена типа III. На доноре, для которого транскрипция коллагена типа III стимулирована на +304% стрессом HO, свободные ГК различных размеров ингибируют синтез коллагена. ГК 450 кДа ингибирует примерно на 25%, тогда как ГК массы, большей, чем 800 кДа, ингибирует транскрипцию примерно на 100%, возвращая ее к уровням, близким к уровням молодых фибробластов.
1.7. Вывод
Вывод этого эксперимента состоит в том, что оказывается, что ГК обладает анти-ММР-1 активностью (следовательно, антиоксидантной, таким образом, обладая потенциальной активностью против старения) в данной модели индуцированного старения. ГК более высокой молекулярной массы (800, 1500 и 2600 кДа) оказываются более эффективными, чем ГК 450 кДа.
В настоящих экспериментальных условиях ГК молекулярной массы 450 кДа активны в отношении ММР-1. ГК молекулярной массы выше, чем 800 кДа, более активны, поскольку они ингибируют гиперэкспрессию от -75 до -83%.
С другой стороны, эти результаты показывают, что различные свободные ГК не действуют на синтез коллагена типа I.
Наконец, свободные ГК ингибируют гиперэкспрессию коллагена типа III, и это особенно заметно для ГК молекулярной массы 800 кДа и выше, которая ингибирует гиперэкспрессию от -118 до -93%.
Таким образом, в дополнение к их регуляторному действию на ММР-1, свободные ГК, содержащиеся в имплантате согласно данному изобретению, вносят вклад в ограничение разрушения и деструктуризации ВКМ. Кроме того, зная, что было продемонстрировано, что отношение коллаген III/коллаген I повышается в процессе старения, ГК, содержащиеся в имплантате согласно изобретению, дают возможность восстановить соотношение, измеренное в молодых тканях.
Пример 2: Приготовление имплантата согласно изобретению.
2.1. Приготовление сшитой ГК
5 г гиалуроната натрия молекулярной массы 1,6 МДа добавляют к 1% гидроксиду натрия (35,6 г). Смесь оставляют для периодической гомогенизации в течение 1 ч и 30 мин. Затем к смеси ГК/NaOH, которая была гомогенизирована, добавляют 315 мг BDDE, закрывают, а затем помещают в водяную баню при 50°С на 2 ч. Смесь нейтрализуют добавлением 5 г 1 н. HCl.
Гель, полученный таким образом, добавляли при желаемой концентрации путем добавления EDI и солей, обеспечивающих изоосмомолярность, а также стабильный нейтральный pH, с получением геля при 20 мг/г по ГК.
2.2. Приготовление имплантата
К данному очищенному гелю добавляют ГК 1,2 МДа, предварительно гидратированную в фосфатном буфере. Затем 60 г геля ГК 1,2 МДа концентрации 20 мг/г добавляют к 226 г полученного сшитого геля. Эти 2 геля гомогенизируют в стандартном лопастном смесителе в течение 1-2 часов.
Конечный продукт можно затем дегазировать, упаковывать в шприцы и стерилизовать паровым автоклавированием путем выполнения цикла, например, 125°C в течение 7 мин, 127°С в течение 4 мин или 130°C в течение 3 мин.
После стерилизации pH препарата составляет 7,1, осмомолярность 320 мОсм, и реологические характеристики дают модуль упругости G' 45 Па·с при частоте 1 Гц. Конечную концентрацию геля оценивают как 19,8 мг/г (анализ с карбазолом в соответствии с методикой Европейской Фармакопеи) для ожидаемой концентрации 20 мг/г.