СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВОДНЫХ НАНОДИСПЕРСИЙ ФУЛЛЕРЕНА
METHOD FOR PRODUCING AQUEOUS NANODISPERSIONS OF FULLEREN

Изобретение относится к способам получения стабильных водных растворов (нанодисперсий) фуллерена и может быть использовано в широком спектре областей, от электроники до медицины, например, для создания косметических средств, препаратов для лечения заболеваний, связанных с воспалением и окислительным стрессом (аллергия, астма, дерматиты, ишемические болезни), противораковых препаратов, антиоксидантов, антимикробных средств, радиопротекторов, соединений для доставки генного материала.
Известно, что производные фуллерена обладают различными типами биологической активности: противоопухолевой, антивирусной, антибактериальной, антиоксидантной, нейропротективной и др. Фуллерен Ceo не проявляет заметную токсичность и может выводиться полностью из организма в течение нескольких дней, фуллерен и его аддукты способны проходить через биологические мембраны и могут быть использованы в качестве энхансера доставки лекарственных средств. Фуллерен и его производные проявляют антиоксидантную активность, способность инактивировать свободные радикалы.
Перспективное медицинское применение фуллерена связано с доставкой нуклеиновых кислот, в том числе малых интерферирующих РНК, как универсальных терапевтических препаратов. Введение позитивно заряженных групп на поверхность фуллерена приводит к амфифильным катионным производным, способным, благодаря электростатическим взаимодействиям, связывать нуклеиновые кислоты, сворачивать их в компактную структуру и обеспечивать их проникновение внутрь клеток путем эндоцитоза.
Главная проблема в использовании фуллерена в медицине - это его практически полная нерастворимость в водных средах - 0,02 нг/л. Для решения этой проблемы наиболее часто используют получение водных нанодисперсий фуллерена, создание донорно-акцепторных комплексов с гидрофильными соединениями и химическую модификацию путем навешивания гидрофильных групп на каркас фуллерена.
60
60
Большинство способов образования достаточно стабильных водных нанодисперсий фуллерена (НДФ) основано на переносе фуллерена из органического раствора (бензол, толуол, тетрагидрофуран) в водную фазу с применением ультразвука с последующим постепенным удалением органического растворителя с помощью вакуума либо продувкой инертным газом (Deguchi Sh., Mukai S.-A. Top-down preparation of dispersions of C nanoparticles in organic solvents. Chemistry Letters, 2006; 35(4): 396-397; Andrievsky G.V., Kosevich M.V., Vovk О.M., Shelkovsky V.S., Vashcenko L.A. On the production of an aqueous colloidal solution of fullerenes. J. Chem. Soc, 1995, 12, 1281 - 128215). Как правило, в результате образуется коллоидный раствор желто-коричневого цвета, содержащий гидратированные кластеры из молекул С (нанокристаллы), размер которых зависит от особенностей метода и колеблется в нанометровом диапазоне (10-1000 нм). Свойства НДФ, размер частиц, стабильность, pH коагуляции и др., зависят от метода их приготовления. Наличие отрицательного заряда на поверхности кластеров играет важную роль в стабилизации водных дисперсий фуллерена, поэтому при изменении pH и ионной силы среды они легко агрегируют. Кроме того, их нельзя высушивать, поскольку они теряют способность растворяться в воде. При этом стоимость таких препаратов достаточно высока ввиду малого выхода фуллерена в раствор и затрат на различные манипуляции, а потому они не находят широкого применения.
60
60
60
60
Наиболее известным способом получения водных дисперсий фуллерена является метод с заменой растворителя в органическом растворе фуллерена, где происходит последовательное разбавление/замена хорошего растворителя для фуллерена (бензол, толуол, хлорбензол) гидрофильным растворителем (ацетон, тетрагидрофуран) и затем водой. Органический растворитель постепенно вытесняется путем продувки смеси инертных газов, упариванием и/или интенсивной ультразвуковой обработкой, обеспечивающей нагрев системы (Мчедлов-Петросян Н.О. Растворы фуллерена С: коллоидный аспект. Хiмiя, фiзика та технолопя поверхш, 2010, Т. 1, №1, 19-37 г. ) Указанные органические растворители являются токсичными и биологически несовместимыми веществами. И, несмотря на действия в процессе обработки дисперсий по их удалению, ароматические растворители практически трудно полностью удалить из водной дисперсии фуллерена, ввиду их специфического (π-стэкинг) взаимодействия с молекулами фуллерена (Konarev D.V., Litvinov A.L., Kovaltvsky A.Yu., Drichko N.V., Coppens R.N., Lubovskaya R.N. Molecular complexes of fullerene C with aromatic hydrocarbons: Crystal structures of (ТРЕ)2С and DPA·C. Synthetic Metals, 2003, 133-134, 675-677).
60
60
60
Известны способы получения водных дисперсий путем прямого механического диспергирования порошка фуллерита (кристаллы фуллерена) в водной среде, часто его сочетают с растиранием фуллерена в ступке и озвучиванием (Labille J., Brant J.A., Villieras F., Pelletier M., Wiesner M.R., Bottero J.-Y. Affinity of C fullerenes with water. Fullerenes, Nanotubes, and Carbon Nanostructures, 2006, 14(2-3):307-14). Такой способ имеет довольно малую эффективность, требует очень длительного перемешивания (от нескольких суток до многих месяцев), а выход фуллерена в раствор очень низкий. Имеется предположение, что аэробные условия, присутствие озона, приводят к образованию эпоксида на поверхности кристаллических фуллереновых наночастиц, что увеличивает их гидрофильность и лежит в основе механизма перехода кристаллита фуллерена в нанодисперсное состояние (Murdianti В.S., Damron J.Т., Hilburn М.Е., Maples R.D., Koralege Н.R.S., Kuriyavar S. I., Ausman К.D. C oxide as key component of aqueous C colloidal suspensions. Environ. Sci. Technol., 2012, 46, 7446-7453).
60
60
Фуллерен может быть также переведен в раствор при кипячении фуллерита с водным раствором γ-циклодекстрина (ЦД, циклические сахара, состоящие из 6-8 остатков глюкозы) с преимущественным мольным соотношением С:ЦД=1:2. Фуллерен внутри комплекса находится в свободной и гидратированной формах. Однако, даже при использовании гель-хроматографии для очистки фуллерена, он все же медленно распадается. Таким образом, стабильность таких комплексов недостаточна для длительных манипуляций и в среде всегда будут находиться в равновесном состоянии свободные компоненты, в результате такая дисперсия может оказаться нестабильной (Andersson Т., Nilsson К., Sundahl М., Westman G., Wennerstrom О. С embedded in γ-cyclodextrin: a water-soluble fullerene. J. Chem. Soc, Chem. Commun., 1992; 604-605; Пиотровский Л.Б., Киселев О.И. Фуллерены в биологии. СПб: Росток; 2006 г.). Комплексы подобного типа формируют также каликсарены и другие «корзиноподобные» соединения.
60
60
Из амфифильных полимеров, способных образовывать водорастворимые комплексы с С, наиболее популярен биосовместимый полимер поливинилпирролидон (ПВП). Водные нанодисперсии С/ПВП окрашены в желто-коричневые цвета, а содержание фуллерена в них достигает 0,5-1% в зависимости от условий получения и молекулярной массы ПВП (Пиотровский Л.Б., Киселев О.И. Фуллерены в биологии. СПб: Росток; 2006; Yamakoshi Y.N., Yagami Т., Fukuhara К., Sueyoshi S., Miyata N. Solubilization of fullerenes into water with polyvinylpyrrolidone applicable to biological tests. J. Chem. Soc. Chem. Commun., 1994; 517-518). Такие нанодисперсии обладают биологической активностью, сравнимой с исходным фуллереном.
60
В патенте RU 2462474 описан синтез ковалентных аминокислотных производных фуллерена С, где фуллерен и триметилсилилированные аминокислоты растворяют в полярных апротонных растворителях с высокой диэлектрической проницаемостью: N-метил-2-пирролидоне, диметилсульфоксиде, диметилформамиде или диметилацетамиде, и где в присутствии кислорода происходит реакция образования аминокислотного аддукта. Для выделения конечного продукта смесь обрабатывают водой для удаления триметилсилильных групп, затем экстрагируют образованный триметилсилоксан этилацетатом, водный слой подвергают диализу, удаляя излишек аминокислоты и образованный при гидролизе ацетамид, и полученный диализат лиофильно осушают, выделяя твердое вещество - фуллерен-аминокислоту (аддукт). Однако, в этом способе получают не водную дисперсию свободного фуллерена, а его производное, другое вещество.
Наиболее близким из известных к описываемому изобретению является способ получения водных нанодисперсий фуллерена (Andrievsky G.V., Kosevich М.V., Vovk О.М., Shelkovsky V.S., Vashcenko L.A. On the production of an aqueous colloidal solution of fullerenes. J. Chem. Soc, 1995, 12, 1281-1282), включающий получение раствора фуллерена в органическом растворителе (например, толуол), с последующим ультразвуковым воздействием и переводом фуллерена из раствора в водную среду. После этого водную среду, содержащую фуллерены, дополнительно подвергают фильтрации через микрофильтры. Получают водные молекулярно-коллоидные растворы гидратированных фуллеренов в виде прозрачных растворов от желтого до коричневато-оранжевого цвета, который опалесцирует в отраженном свете, что свидетельствует о их коллоидных свойствах.
60
Условия осуществления известного способа практически трудно точно воспроизвести, поскольку зависят от мощности установки, времени обработки, геометрии зоны, подвергаемой воздействию, от температуры среды, цикличности воздействия и т.п. Поэтому применение ультразвуковой обработки для дробления частиц, используемой во всех известных методах получения nC, всегда вносит неопределенность в протокол метода, что влияет на эффективность диспергирования. Кроме того, некоторые режимы могут приводить к окислению фуллерена и генерации свободных радикалов.
60
60
60
Технический результат настоящего изобретения состоит в создании простого эффективного и мягкого способа получения водного раствора фуллерена С (нанодисперсии, nC), повышение технологичности и экологичности метода получения водных растворов фуллерена С за счет того, что процесс не требует предварительного измельчения кристаллов фуллерена, не использует токсичные растворители, а также не применяет ни ультразвуковой обработки, ни нагревания, ни упаривания в вакууме.
60
60
Указанный технический результат достигается тем, что способ получения водных нанодисперсий фуллерена включает растворение фуллерена в виде кристаллов фуллерита С в N-метилпирролидоне и разбавление полученного раствора N-метилпирролидон - С водой, или водным раствором аминокислоты, или водным раствором моносахарида с последующим исчерпывающим диализом или диафильтрацией. При необходимости полученный раствор концентрируют.
Водная среда может содержать стабилизирующую добавку. При этом в качестве стабилизирующей добавки может быть использована аминокислота, или моносахарид, или пептид, или глицерин, или водорастворимый полимер, или поливинилпирролидон.
Предпочтительно после диализа раствор концентрировать, например, путем упаривания в вакууме.
60
Процесс проводят при комнатной температуре. Первую стадию процесса (растворение фуллерена в МП) осуществляют в течение нескольких часов. Время-лимитирующей стадией получения nC является диализ, который проводят в течение времени порядка двух суток. В ходе диализа осуществляют удаление из раствора фуллерена свободных аминокислот и N-метилпирролидона. N-метилпирролидон (МП) является малотоксичным биосовместимым растворителем и легко удаляется в процессе диализа.
60
Для получения раствора фуллерена в качестве агентов могут быть использованы дополнительные природные нетоксичные компоненты как стабилизирующие добавки (СД) (L-аминокислоты, сахара и др.), которые способствуют диспергированию и стабилизации дисперсии С.
60
Дисперсия nC, полученная в отсутствии СД (т.е. просто диализ раствора фуллерена в смеси МП/вода) также образуется, однако она менее устойчива и наночастицы довольно крупные (>0.45 мкм), ее концентрирование приводит к образованию осадка. В качестве СД могут быть использованы пептиды и моносахариды. Например, трипептид Arg-Lys-Asp (RKD) является хорошим стабилизатором, выход фуллерена в раствор составляет около 100%, как и при использовании рамнозы.
60
60
60
Тем же способом, путем смешиваниям раствора фуллерена в N-метилпирролидоне и раствора поливинилпирролидона в воде с последующим диализом легко получают комплекс фуллерена с поливинилпирролидоном (С/ПВП). В то время как известные способы получения таких комплексов предполагают использование токсичных растворителей, например, смешение раствором С в орто-дихлорбензоле осуществляют с раствором ПВП в хлороформе, с последующим удалением растворителей и растворением сухого остатка в воде (Патент РФ №2255942, МПК C08F 126/10, C08F 8/00, А61К 31/785, оп. в 2005 г.). По существу, описываемый способ удобно использовать и для получения комплексов С с любыми водорастворимыми полимерами и белками.
60
60
Нанодисперсии nC легко сконцентрировать путем упаривания в вакууме. Например, исходная концентрация для nC/Gln=57 мкг/мл, а после упаривания на роторном испарителе в вакууме она повышается до 226 мкг/мл (см. фиг. 2), т.е. концентрирование в 4 раза.
60
340
Молекулы фуллерена, как известно, в водной среде находятся исключительно в кластерной форме, формируя ассоциаты, неспособные проходить через поры диализной мембраны, что удобно для очистки дисперсии от низкомолекулярных соединений. В результате указанных манипуляций образуется коричневато-желтый раствор, который имеет электронный спектр, характерный для нанодисперсии фуллерена С: три пика в области 200-220, 260-270 и 335-345 и слабая полоса поглощения между 400 и 500 нм. Концентрация фуллерена, измеряемая по данным оптической плотности при 340 нм (ε=46450) составляет 60-140 мг/л в зависимости от применяемого СД (фиг.2-11).
Способ получения дисперсии фуллерена в соответствии с изобретением иллюстрируется чертежами и рисунками, где представлены:
60
на фиг. 1 - блок-схема получения водной дисперсии фуллерена nC;
60
60
на фиг. 2 - электронный спектр поглощения (УФ-ВИД) дисперсии С, полученной в присутствии Thr (C/Thr);
60
на фиг. 3 - электронный спектр поглощения дисперсии С/Ala;
на фиг. 4 - электронный спектр поглощения дисперсии Ceo/Leu;
60
на фиг. 5 - электронный спектр поглощения дисперсии С/Trp;
60
на фиг. 6 - электронный спектр поглощения дисперсии С/Аср;
60
на фиг. 7 - электронный спектр поглощения дисперсии C/Arg;
60
на фиг. 8 - электронный спектр поглощения дисперсии C/His;
60
на фиг. 9 - электронный спектр поглощения дисперсии С/Gln;
60
на фиг. 10 - электронный спектр поглощения дисперсии C/Met;
60
на фиг. 11 - электронный спектр поглощения дисперсии С/L-рамноза;
60
на фиг. 12 - электронный спектр поглощения дисперсии С/RKD;
60
на фиг. 13 показан электронный спектр поглощения дисперсии С/ПВП;
60
на фиг. 14 - электронный спектр поглощения дисперсии С/-СД (отсутствие СД);
60
на фиг. 15 - ИК-Фурье спектр образца лиофильно высушенного раствора С/Thr;
60
на фиг. 16 - ИК-Фурье спектр образца лиофильно высушенного раствора С/L-рамноза;
60
на фиг. 17 - ИК-Фурье спектр образца лиофильно высушенного раствора С/His;
60
на фиг. 18 - ИК-Фурье спектр образца лиофильно высушенного раствора С/Met;
60
на фиг. 19 - ИК-Фурье спектр образца лиофильно высушенного раствора C/RKD;
60
на фиг. 20 - ИК-Фурье спектр образца лиофильно высушенного раствора С/ПВП;
60
на фиг. 21 - Фото нанодисперсии С/Thr;
60
на фиг. 22 - Фото нанодисперсии С/L-рамноза;
60
на фиг. 23 - Фото нанодисперсии С/His;
60
на фиг. 24 - Фото нанодисперсии С/Met;
60
на фиг. 25 Фото нанодисперсии С/RKD;
60
на фиг. 26 Фото нанодисперсии С/ПВП.
60
Ниже приведены примеры получения водной дисперсии фуллерена в присутствии различных СД, в том числе и ПВП (комплекс С/ПВП).
Пример 1.
60
60
60
60
20 мг кристаллического фуллерена С (99.9%, SES Research, catalog # 600-9969, USA) растворяют в 25 мл N-метилпирролидона (МП) (99%, Panreac) путем перемешивания, используя магнитную мешалку, до полного растворения 3-4 часа. Темно-коричнево-фиолетовый раствор МП смешивают с 20-40 мг СД в 100 мл дистиллированной воды. В качестве СД используют L-треонин. Полученный темно-красный раствор перемешивают 1 час и подвергают исчерпывающему диализу посредством использования мембранной трубки Spectra/Por, 6-8 kDa, Spectrum Labs, Inc. против дистиллированной воды (5 л × 4 смены). В результате получают раствор, обычно коричневато-желтого цвета (фото на фиг. 21). На фиг. 2а) показан электронный спектр поглощения (УФ-ВИД спектр) для этого раствора (С/Thr), где исходный раствор (57 мкг С/мл) разведен водой в 10 раз; а на фиг. 2б) приведен его же УФ-ВИД спектр после концентрирования исходного раствора упариванием до концентрации 226 мкг С/мл (для съемки спектра разведен водой в 10 раз).
Пример 2.
Раствор фуллерена готовят аналогично примеру 1. В качестве СД берут L(+)-рамнозу. Процесс ведут аналогично примеру 1. Спектры и вид раствора показаны на фиг. 11, 16 и 24.
Пример 3.
Раствор фуллерена готовят аналогично примеру 1. В качестве СД берут трипептид Arg-Lys-Asp (RKD). Процесс ведут, как указано в примере 1. Спектры и вид раствора показаны на фиг. 12, 19 и 25.
Пример 4.
Раствор фуллерена готовят аналогично примеру 1. В качестве СД берут ПВП. Процесс ведут аналогично примеру 1. Спектры и вид раствора показаны на фиг. 13, 19 и 26.
Пример 5.
Раствор фуллерена готовят аналогично примеру 1. В качестве СД берут глицерин. Процесс ведут аналогично примеру 1.
60
60
-1
-1
В ИК-Фурье спектрах (условия нарушенного полного внутреннего отражения, FT-IR Spectrometer Alpha, Bruker) лиофильно высушенных образцов nС всегда наблюдаются узкие пики поглощения, характерные для фуллерена, 1182 и 1428 см (С-С связи), а также дополнительные пики, обусловленные, предположительно, присутствием связанной воды и групп ОН - широкие пики в области 3500-3200, 1650-1660, 1000-1070 см (фиг.12-15). По существу все УФ-ВИД-спектры, так же, как и ИК-Фурье спектры, имеют однотипный характер. Можно предположить, что частицы в растворе имеют кристаллическую упаковку, которые стабилизированы за счет поверхностного водного слоя. Дисперсии стабильны, по крайней мере, в течение 3 месяцев при хранении при 4-8°С (максимальное время наблюдения). Значения pH дисперсий nC находятся в пределах 5.5-6.5. Снижение pH до 3.6-3.7 вызывает флокуляцию наночастиц, приводя к образованию хлопьевидных осадков. Процесс является обратимым, осадок может быть переведен в раствор повышением pH.
Следует отметить, размер частиц дисперсии уменьшается при повышении pH (>9) и разбавлении раствора водой.
60
70
74
80
Метод в соответствии с изобретением может быть использован для получения водных дисперсий и других фуллеренов (С, С, С, С и т.п.), поскольку главные физико-химические свойства, определяющие их поведение в растворах, у них достаточно близкие, поэтому закономерности формирования нанодисперсий у них будут также сходные.