ВЫСОКОПРОИЗВОДИТЕЛЬНЫЙ СКРИНИНГ СОЕДИНЕНИЙ, МОДУЛИРУЮЩИХ ЭКСПРЕССИЮ КЛЕТОЧНЫХ МАКРОМОЛЕКУЛ

1. Способ идентификации и количественного определения специфической молекулы-мишени в образце, включающий:
скрининг образца, содержащего специфическую молекулу-мишень в высокопроизводительном скрининговом анализе, включающем стадии: (1) добавления первого и второго лиганда, каждый из которых имеет первую и вторую детектируемую метку, (2) связывания каждого из первого и второго лигандов с отдельными и специфическими сайтами на специфической молекуле-мишени, где из скринингового анализа исключена стадия (3) промывания;
обнаружение излучения света, когда первый и второй лиганды специфически связываются со специфической молекулой-мишенью; и
идентификацию и количественное определение специфической молекулы-мишени в образце.
2. Способ по п.1, где детектируемая метка включает: флуорофоры, люминесцентные молекулы, ферменты или радионуклиды.
3. Способ по п.1, где свет включает: флуоресценцию, хемилюминесценцию или биолюминесценцию.
2
4. Способ по п.1, где первый или второй лиганды включают: антитела, фрагменты антител, Fv-фрагменты; одноцепочечные Fv (scFv)-фрагменты; Fab′-фрагменты; F(ab′)-фрагменты, гуманизированные антитела и фрагменты антител; верблюдизированные антитела и фрагменты антител, человеческие антитела и фрагменты антител, моноспецифические или биспецифические антитела, дисульфид-стабилизированные Fv-фрагменты, scFv-тандемы ((scFv)-фрагменты), диатела, триатела или тетратела, пептоиды, пептидные или нуклеиновокислотные аптамеры, миметики антител или их комбинации.
5. Способ по п.1, представляющий собой высокопроизводительный скрининговый анализ, включающий резонансный перенос энергии Ферстера (FRET), резонансный перенос энергии биолюминесценции (BRET) или флуоресцентный поляризационный анализ.
6. Способ по п.1, где специфическая молекула-мишень включает: гликопротеин, липопротеин, белковый фрагмент, белок, фрагменты белка, пептиды, пептидную нуклеиновую кислоту, синтетические или природные макромолекулы.
7. Способ по п.1, где специфическая молекула-мишень присутствует в образце, содержащем: жидкость, полужидкость, гель, биологический образец, интактную клетку, пермеабилизированную клетку, разрушенную клетку, клеточный гомогенат, мембрану или клеточную органеллу.
8. Способ по п.1, где первый и второй лиганды включают: полипептид, антитела, фрагменты антител, миметики антител, одноцепочечные антитела, нуклеиновые кислоты, аптамер, пептоид или сахарную группировку, или их комбинацию.
9. Способ по п.8, где первый и второй лиганды представляют собой пептидные или нуклеиновокислотные аптамеры.
10. Способ по п.8, где первый и второй лиганды представляют собой сахарные группировки, включающие гликозаминогликаны, гепарансульфаты или хондроитинсульфаты.
11. Способ количественного определения специфического белка в образце, включающий стадии:
помещения образца, содержащего специфическую молекулу-мишень в приемник, позволяющий облучать образец при длине волны, подходящей для возбуждения флуорофора-донора и измерять флуоресценцию флуорофора-акцептора посредством высокопроизводительного анализа;
добавления первого лиганда, который связывается со специфическим сайтом на молекуле-мишени, где первый лиганд связан с первым флуорофором ("флуорофором-донором");
добавления второго лиганда, который связывается со специфическим сайтом на той же молекуле-мишени, отличным от сайта, с которым связывается первый лиганд, где второй лиганд связан со вторым флуорофором ("флуорофором-акцептором");
исключение стадий промывки между стадиями;
облучения образца, содержащего молекулу-мишень, связанную с лигандами, при длине волны, оптимальной для возбуждения флуорофора-донора и измерения интенсивности света, излучаемого флуорофором-акцептором; и
количественного определения специфического белка.
12. Способ по п.11, где интенсивность излучаемого света измеряют посредством флуориметрии с временным разрешением.
13. Способ по п.11, где молекула-мишень не прикреплена к поверхности подложки.
14. Способ по п.11, где молекула-мишень прикреплена к поверхности подложки.
15. Способ по п.11, где возбуждение передается флуорофору-акцептору, когда флуорофор-акцептор находится на расстоянии от флуорофора-донора равном или меньшем, чем расстояние, определяемое радиусом Ферстера.
16. Способ по п.11, где приемник включает: кювету, мультилуночный планшет, пробирку, колбу, пластину, сферические гранулы, флакон, кассету, проточную кювету, картридж, микрожидкостный чип или их комбинацию, которые позволяют проводить облучение при длине волны возбуждения флуорофора-донора и проводить измерение при длине волны флуорофора-акцептора.
17. Способ по п.11, где молекула-мишень включает: гликопротеин, липопротеин, белковый фрагмент, пептидную нуклеиновую кислоту, синтетические или природные макромолекулы.
18. Способ по п.11, где мишень присутствует в образце, содержащем: жидкость, полужидкий продукт, гель, биологический образец, интактную клетку, пермеабилизованную клетку, разрушенную клетку, клеточный гомогенат, мембрану или клеточные органеллы.
19. Способ по п.11, где первый и второй лиганды, которые специфически связываются с отдельными, неперекрывающимися сайтами ("эпитопами") на мишени, включают: антитела или связывающие эпитоп фрагменты антител, одноцепочечные антитела, миметики антител, пептоиды, аптамеры, полипептиды или нуклеиновые кислоты.
20. Способ по п.11, где первый и второй лиганды включают: полипептид, аптамер, пептоид или сахарную группировку, или их комбинацию.
21. Способ по п.20, где первый и второй лиганды представляют собой пептидные и нуклеиновокислотные аптамеры.
22. Способ по п.20, где первый и второй лиганды представляют собой сахарные группировки, содержащиеся в виде гликозаминогликанов, гепарансульфатов или хондроитинсульфатов.
23. Способ по п.11, где способ представляет собой высокопроизводительный скрининговый анализ, включающий резонансный перенос энергии Ферстера (FRET), резонансный перенос энергии биолюминесценции (BRET) или флуоресцентный поляризационный анализ.
24. Способ скрининга потенциального терапевтического соединения, включающий:
скрининг образца, содержащего специфическую молекулу-мишень в высокопроизводительном скрининговом анализе, включающем стадии: (1) добавления первого и второго лиганда, каждый из которых имеет первую и вторую детектируемую метку, (2) связывания каждого из первого и второго лигандов с отдельными и специфическими сайтами на специфической молекуле-мишени, где из скринингового анализа исключена стадия (3) промывания;
обнаружение излучения света, когда первый и второй лиганды специфически связываются со специфической молекулой-мишенью; и
скрининг потенциального терапевтического соединения.
25. Способ по п.24, где потенциальный терапевтический агент модулирует функцию, активность или экспрессию молекулы-мишени, измеренную посредством излучения света.
26. Способ скрининга потенциального терапевтического соединения, включающий стадии:
помещения образца, содержащего специфическую молекулу-мишень, в приемник, позволяющий облучать образец при длине волны, подходящей для возбуждения флуорофора-донора и измерять флуоресценцию флуорофора-акцептора посредством высокопроизводительного анализа;
добавления первого лиганда, который связывается со специфическим сайтом на молекуле-мишени, где первый лиганд связан с первым флуорофором ("флуорофором-донором");
добавления второго лиганда, который связывается со специфическим сайтом на той же молекуле-мишени, отличным от сайта, с которым связывается первый лиганд, где второй лиганд связан со вторым флуорофором ("флуорофором-акцептором");
исключение стадий промывки между стадиями;
облучения образца, содержащего молекулу-мишень, связанную с лигандами, при длине волны, оптимальной для возбуждения флуорофора-донора, и измерение интенсивности света, излучаемого флуорофором-акцептором; и
скрининг потенциального соединения.
27. Способ по п.26, где потенциальный терапевтический агент модулирует функцию, активность или экспрессию молекулы-мишени, измеренную посредством излучения света.
28. Соединение, идентифицированное способом по п.24 или 26.
29. Соединение по п.28, включающее: белок, пептид, полипептид, нуклеиновую кислоту, полинуклеотид, олигонуклеотид, пептидную нуклеиновую кислоту, гликопротеин, углевод, органическую или неорганическую молекулу, выделенную природную молекулу, синтетическую молекулу, малые молекулы или их комбинации.
30. Фармацевтическая композиция, содержащая соединение, идентифицированное способом по п.24 или 26.
31. Способ диагностики заболевания или расстройства, включающий:
скрининг биологического образца, взятого у пациента, способом по пп.1 или 11;
идентификацию маркера или молекулы, являющихся диагностическими для конкретного заболевания или расстройства; и
диагностику этого заболевания или расстройства.
32. Способ идентификации субъектов, подверженных риску развития заболевания или расстройства, включающий:
скрининг биологического образца, взятого у пациента, способом по пп.1 или 11;
идентификацию маркера или молекулы, являющихся диагностическими для конкретного заболевания или расстройства; и
идентификацию субъектов, подверженных риску развития этого заболевания или расстройства.