Способ определения антигенных различий вирусов рода Arenavirus семейства Arenaviridae
METHOD FOR DETERMINING ANTIGENIC DIFFERENCES OF ARENAVIRUS GENES OF ARENAVIRIDAE FAMILY

Изобретение относится к области микробиологии, а именно вирусологии, и представляет собой способ определения антигенных различий вирусов рода Arenavirus семейства Arenaviridae
Изобретение может быть использовано в вирусологических и иммунологических исследованиях для оценки уровня антигенной изменчивости при характеристике вновь выделенных штаммов возбудителей и при адаптации аренавирусов к различным лабораторным животным, для выявления и идентификации в исследуемых пробах аренавирусов, для качественной и количественной оценки наличия в антителсодержащих субстратах вируснейтрализующих антител к аренавирусам.
Род Arenavirus семейства Arenaviridae в настоящее время включает в себя 26 отдельных видов вирусов. С помощью серологических тестов разделяют две основные группы аренавирусов - аренавирусы Старого Света (прототипные представители вирус лимфоцитарного хориоменингита и вирус Ласса) и аренавирусы Нового Света (прототипный представитель вирус Такарибе) [14].
Восемь аренавирусов (вирусы лимфоцитарного хориоменингита, Ласса и Луйо - представители филогенетической группы Старого Света, вирусы Мачупо, Хунин, Гуанарито, Сэбиа и Чапаре - представители филогенетической группы Нового Света) способны вызывать у человека геморрагическую лихорадку [7-10, 12-19]. Данные возбудители представляют потенциальную угрозу для здравоохранения вследствие возможности их случайного завоза в неэндемичные регионы, поэтому актуальным является вопрос о создании специфических медицинских средств защиты в отношении вызываемых ими заболеваний. Уровень летальности среди заболевших достигает 80% (для геморрагической лихорадки Луйо и Боливийской геморрагической лихорадки (БГЛ)) [18].
Диагностика отдельных случаев аренавирусных геморрагических лихорадок является сложной задачей, особенно при их возникновении на неэндемичных территориях. Ни одна из аренавирусных геморрагических лихорадок не имеет специфической симптоматики, они являются схожими как между собой, так и с вирусными геморрагическими лихорадками, вызываемыми вирусами II группы патогенности.
Среди вирусологических методов выявления и идентификации аренавирусов приоритетное положение занимают различные виды реакции нейтрализации. Их отличительной (по отношению к иммунохимическим и молекулярно-биологическим методам анализа) особенностью является то, что они позволяют провести выявление и идентификацию только способного к репродукции биологически активного вируса и только вируснейтрализующих антител (ВНА).
Виды реакции нейтрализации различаются в зависимости от лежащего в их основе метода определения биологически активного вируса.
В зависимости от использованных в ходе данного процесса тест-объектов способы определения концентрации можно условно разделить на альтернативные и количественные [3].
При альтернативных методах информация, получаемая при использовании одного тест-объекта, равна 1 бит (в результате инфицирования индивидуального тест-объекта может быть достигнут один из двух возможных результатов). Для проведения количественной оценки при альтернативных методах необходимо использование репрезентативной группы тест-объектов.
При количественных методах для определения концентрации биологически активного возбудителя в исследуемой биологической пробе может быть достаточно использования одного тест-объекта.
Среди количественных методов определения концентрации биологически активного вируса ведущее место занимает метод негативных колоний на монослойной культуре клеток под агаровым покрытием.
Метод бляшек (негативных колоний) был внедрен в практику вирусологических исследований в 1952 г. Dulbecco R. et al. [11]. Он внес решающий вклад в развитие методов количественной оценки вирусов в различных материалах. Изучение генетики вирусов человека и животных показало, что значение метода бляшек не ограничивается его использованием для титрования вируссодержащих культур. Анализ закономерностей распределения размеров негативных колоний, выявление в популяциях различных штаммов вирусов, клонов с генотипически обусловленными различиями по данному показателю, использование определенных культур клеток в качестве модельных тест-объектов сделали метод бляшек одним из основных инструментов вирусологических исследований [1, 2, 5].
Данный метод позволяет с высокой точностью проводить определение концентрации биологически активного вируса и одновременно проводить изучение структуры вирусной популяции по размеру негативных колоний (S-признак). Для ряда возбудителей установлена связь данного генетического маркера с вирулентностью природных штаммов внутри вида вируса.
Необходимо отметить, что точность количественных методов существенно выше таковой для альтернативных методов. Так, для метода негативных колоний величина ошибки единичного определения очень мало зависит от конкретного возбудителя и используемой культуры клеток и в среднем составляет приблизительно ±0,1 lg [3].
Последнее обстоятельство делает метод негативных колоний надежным способом определения концентрации биологически активного вируса при оценке чувствительности современных иммунохимического и молекулярно-биологического методов выявления и идентификации возбудителей вирусных инфекций.
Для выявления и идентификации аренавирусов описано использование реакции подавления бляшкообразования (РПБО). Данную реакцию проводят в двух модификациях - использование в эксперименте постоянной дозы вируса и варьирующих концентраций антителсодержащего субстрата (иммунная сыворотка или асцитическая жидкость (АЖ), содержащая специфические вируснейтрализующие антитела (ВНА), либо варьирующих доз вируса и постоянной концентрации антителсодержащего субстрата. В качестве контроля используют вариант опыта с применением нормальной сыворотки или АЖ, не содержащих специфичных, по отношению к исследуемому возбудителю, ВНА.
Для проведения взаимодействия вируса и антителсодержащего субстрата проводят инкубирование их смеси при 37°С в течение 60 минут.
Далее определение проводят по стандартной методике негативных колоний.
N
При проведении первой из рассмотренных нами модификаций РПБО конечным результатом является определение индекса нейтрализации (I)
S
или индекса подавления (I)
оп
-1
где - А биологическая активность вируса, БОЕ⋅мл, в варианте опыта (со специфическими ВНА).
K
-1
А - биологическая активность вируса, БОЕ⋅мл, в контроле.
При проведении второй модификации РПБО конечным результатом является определение титра ВНА. За титр ВНА принимают разведение антителсодержащего субстрата, которое обеспечивает не менее чем на 50% подавление биологически активного вируса.
Недостатком РПБО является то, что в процессе инкубирования вируса и антителсодержащего субстрата происходит образование как инфекционных, так и неинфекционных комплексов «вирус+антитело». Полученная при завершении инкубации вируссодержащего препарата и антителсодержащего субстрата смесь содержит находящиеся в состоянии динамического равновесия неинфекционные комплексы «вирус-антитело», инфекционные комплексы «вирус-антитело», а также несвязанные вирусы и антитела. Инфекционные комплексы «вирус-антитело» обладают большей, (по отношению к интактным вирионам возбудителя) сорбционной способностью на монослойную культуру клеток. Помимо устойчивых комплексов «вирус-антитело» формируются также неустойчивые комплексы, которые могут легко разрушаться при осуществлении внешнего воздействия (разведении, встряхивании, пипетировании, нагревании или охлаждении раствора).
Другими недостатками являются термоинактивация биологически активного вируса в процессе инкубирования и необходимость подбора адекватной нормальной сыворотки.
Целью настоящего изобретения является способ определения антигенных различий вирусов рода Arenavirus семейства Arenaviridae, основанный на использовании реакции гашения негативных колоний (РГНК).
Разработанный способ определения антигенных различий вирусов рода Arenavirus семейства Arenaviridae не имеет аналогов в РФ.
AD
Техническим результатом изобретения является возможность идентификации исследуемого аренавируса, определения уровня антигенных различий между штаммами одного аренавируса по показателю L, представляющему соотношение концентраций иммунной сыворотки в первичном агаровом покрытии, вызывающей 50% снижение показателя относительного размера негативных колоний при гетерологичной и гомологичной реакций гашения негативных колоний.
Указанный технический результат изобретения достигается за счет разработанной модификации РН (РГНК), в процессе которой антителсодержащий субстрат вносят в первичное агаровое покрытие при постановке реакции нейтрализации на монослойной культуре клеток методом негативных колоний, что обеспечивает снижение размеров негативных колоний при взаимодействии гомологичной или близкородственной пары «вирус-антитело».
Сущность изобретения заключается в использовании РГНК для определения антигенных различий аренавирусов. РГНК представляет собой вариант реакции нейтрализации (РН), в ходе которого антителсодержащий субстрат вносят в первичное агаровое покрытие при постановке метода негативных колоний на монослойной культуре клеток. Происходящая адсорбция антител на клетки замедляет формирование негативных колоний в соответствии с механизмом «cell to cell», что приводит к снижению определяемых размеров негативных колоний по сравнению с контролем. Существует диапазон концентрации ВНА в агаровом покрытии, в котором размер негативных колоний находится в линейной зависимости от логарифма концентрации антителсодержащего субстрата. РГНК является высокоспецифичной на видовом уровне.
Новизна изобретений, уровень промышленного применения
Предлагаемое техническое решение является новым, поскольку из общедоступных сведений в Российской Федерации (РФ) не известна данная модификация РГНК для определения антигенных различий вирусов рода Arenavirus семейства Arenaviridae.
Предлагаемое техническое решение имеет изобретательский уровень, поскольку предлагаемый метод был разработан в результате выявления феномена снижения (или отсутствия снижения) размеров негативных колоний, образуемых аренавирусами на монослойной культуре клеток под агаровым покрытием в гомологичной, близкородственной, отдаленнородственной и гетерологичной РГНК; при разработке данного метода создан математический аппарат для определения антигенных различий вирусов рода Arenavirus семейства Arenaviridae.
Предлагаемое техническое решение промышленно применимо, поскольку для его реализации может быть использовано типовое вирусологическое оборудование, а также широко распространенные в вирусологических исследованиях материалы, реактивы и экспериментальные объекты.
Примеры выполнения
При использовании чувствительной по отношению к данному возбудителю монослойной культуры клеток (применительно к аренавирусам это различные постоянные культуры клеток почки африканской зеленой мартышки), размер негативных колоний во многом определяется возможностью процесса адсорбции и пенетрации вируса на клетки, граничащими с инфицированными. Адсорбция специфических (по отношению к исследуемому вирусу антител при внесении последних в первичное агаровое покрытие замедляет указанные процессы, что приводит к снижению размеров негативных колоний.
Модифицированный нами [6] состав агарового покрытия для определения концентрации различных аренавирусов (на примере вируса Мачупо) представлен в таблице 1.
Определение размера негативных колоний проводят с помощью масштабного клина, представляющего собой прямоугольный треугольник с длиной катетов 1 см и 10 см. Катет с длиной 10 см разбит на деления с интервалом 1 мм. Масштабный клин выполнен из прозрачного органического стекла. Для измерения диаметра бляшки на флакон с окрашенным агаровым покрытием накладывают масштабный клин и в промежуток между гипотенузой и большим катетом помещают негативную колонию. Полученный результат считывают по маркировке катета длиной 10 см. Точность измерения составляет ±0,1 мм. Измерения проводят во флаконах, количество бляшек в которых не превышает 50 штук.
Пример 1 Математический аппарат для определения антигенных различий аренавирусов с помощью РГНК
При проведении РГНК различные концентрации иммунной сыворотки вносят в первичное агаровое покрытие непосредственно перед внесением последнего во флакон с монослойной культурой клеток.
В зависимости от уровня антигенного родства используемых при проведении РН вируса и иммунной сыворотки все типы РН (в том числе и РГНК) можно разделить на:
- гомологичную РН (реакция между определенным штаммом вируса и иммунной сывороткой, полученной при инфицировании животных, используемых для получения иммунной сыворотки, этим же штаммом вируса);
- близкородственную РН (иммунная сыворотка получена при инфицировании животных другим штаммом вируса, используемым в РН);
- отдаленнородственную РН (иммунная сыворотка получена при инфицировании животных другим вирусом, но входящим в тот же антигенный комплекс, что и вирус, используемый в РН);
- гетерологичную РН (иммунная сыворотка получена при иммунизации животных вирусом, не имеющим антигенного родства с вирусом, используемым в РН).
Экспериментально установлено:
- снижение размеров негативных колоний в РГНК происходит только в гомологичной и близкородственной РГНК, причем при использовании одной и той же иммунной сыворотки в гомологичной реакции данный феномен выражен сильнее, чем в близкородственной;
- изменение среднего размера негативных колоний в РГНК (в области его достоверного снижения) находится в линейной зависимости от логарифма концентрации иммунной сыворотки в агаровом покрытии.
В качестве критерия результатов РГНК используют соотношение концентраций иммунной сыворотки, вызывающей 50% снижение среднего размера негативных колоний в гомологичной и близкородственной РГНК.
Первичными данными для математической обработки служат средний размер негативных колоний в каждом из вариантов опыта, в том числе и контроле, без внесения иммунной сыворотки в агаровое покрытие и концентрация иммунной сыворотки в агаровом покрытии. Результаты заносят в таблицу 2.
отн
По полученным данным рассчитывают показатели относительного размера негативных колоний (Р ) и логарифма концентрации иммунной сыворотки в агаровом покрытии (lg С). В результате получаем следующую таблицу 3.
Для расчетов строим уравнение линейной регрессии
где
отн
У-lg C; X-P.
Для удобства расчета целесообразно использовать следующую таблицу 4.
Коэффициенты уравнения линейной регрессии вычисляют путем решения системы двух линейных уравнений:
2
ΣХа+Σ(Х)b=Σ(ХУ)
Определитель данной системы (Δ) равен
а
Определитель данной системы для коэффициента а (Δ) равен
Численное значение коэффициента а находим по формуле
b
Определитель данной системы для коэффициента b (Δ) равен
Численное значение коэффициента b находим по формуле
1
1
0,5
отн
Подставляя полученные значения коэффициентов а и b в уравнение (1) и, вводя величину С (концентрация иммунной сыворотки в агаровом покрытии, приводящая к снижению относительного размера негативных колоний в 2 раза (Р =0,5), получаем следующее уравнение:
Отсюда
0,5
Численное значение С зависит от конкретной используемой в экспериментах иммунной сыворотки.
Вводим обозначения:
0,5 гом
0,5
С - величина С в гомологичной РГНК;
0,5
блр
0,5
С - величина С в близкородственной РГНК.
AD
Уровень антигенных отличий (L) штамма возбудителя с помощью близкородственной РГНК можно определить по формуле:
AD
0,5 гом
AD
Величина L мало зависит от используемой в экспериментах иммунной сыворотки. При использовании иммунных сывороток, для которых величины С различались не менее чем в 10 раз, коэффициент вариации для показателя L не превышал 5%.
При достаточно представительной исследуемой выборке (количество измеренных негативных колоний в каждом из вариантов опыта ≥50, выполняется неравенство
AD
При постановке перекрестной РГНК для выявления антигенных различий сравниваемых штаммов определяют величины L в близкородственных реакциях. Схема результатов оценки представлена в таблице 5.
Пример 2 Идентификация видовой принадлежности исследуемого аренавируса
2
-1
Пластиковые флаконы с площадью рабочей поверхности 25 см фирма «Cellstar», с трехсуточным монослоем клеток Vero В, отобранные для титрования, извлекают из термостата и удаляют из них ростовую среду. Десятикратным шагом готовят разведения исследуемого аренавируса, а также вирусов Мачупо и Хунин на солевом растворе Хенкса, содержащем антибиотики (бензилпенициллина натриевая соль и стрептомицина сульфат) в концентрации 100 Ед⋅мл. На каждом флаконе обозначают номер пробы и ее разведение; на каждое разведение берут не менее четырех флаконов. В каждый из флаконов вносят по 0,5 мл соответствующего разведения и, покачивая флакон, равномерно распределяют инокулят по всему монослою клеток. Затем флаконы укладывают горизонтально, при этом поверхность с монослоем клеток должна находиться внизу, и оставляют при температуре от 36,0 до 37,0°С. Через 60 минут инокулят из флаконов удаляют пипеткой и в каждый флакон вносят по 8,0 мл одного из следующих вариантов первичного агарового покрытия:
- агаровое покрытие по прописи, представленной в таблице 1 (контроль);
- агаровое покрытие, содержащее 0,1% (по объему) иммунной сыворотки к вирусу Мачупо;
- агаровое покрытие, содержащее 0,1% (по объему) иммунной сыворотки к вирусу Хунин.
Флаконы укладывают горизонтально, поверхность с инфицированным монослоем клеток должна находиться внизу. Когда агар застынет, флаконы переворачивают монослоем клеток вверх и помещают в термостат при температуре от 36,0 до 37,0°С. Через 120 часов после нанесения первичного агарового покрытия на монослой клеток наносят вторичное агаровое покрытие по 4 мл во флакон или окрашивают 0,1% раствором нейтрального красного.
Учет негативных колоний проводят через 24 часа после нанесения вторичного агарового покрытия или 0,1% раствора нейтрального красного. Негативные колонии (бляшки) белого цвета, имеют четко очерченные края на розовом фоне живых клеток Vero В.
Размеры негативных колоний измеряют с помощью масштабного клина с точностью ±0,1 мм. Средний размер негативных колоний определяют по формуле:
где
ср
Д  - средний размер негативных колоний;
i
i
n  - количество негативных колоний с диаметром d .
N - общее число измеренных негативных колоний.
Далее проводят определение относительного размера негативных колоний по формуле:
где
отн
Р  - относительный размер негативных колоний;
ср оп
Д  - средний размер негативных колоний в варианте опыта (с внесением иммунной сыворотки);
ср к
Д  - средний размер негативных колоний в контроле (без внесения иммунной сыворотки).
Полученные результаты представлены в таблице 6.
отн.
Как следует из представленных данных, значимое изменение показателя Р  наблюдали только в гомологичной реакции. Полученные данные позволяют говорить о том, что исследуемый аренавирус является вирусом Мачупо.
Таким образом, представленные данные показывают достижение технического результата: при использовании РГНК, в процессе которой антителсодержащий субстрат вносят в первичное агаровое покрытие при постановке метода негативных колоний на монослойной культуре клеток, происходит снижение размеров негативных колоний не менее чем в 2 раза при взаимодействии гомологичной или близкородственной пары «вирус-антитело», что обеспечивает возможность определения уровня антигенных различий между штаммами одного аренавируса, идентификации исследуемого аренавируса. Постановка РГНК позволяет снизить продолжительность анализа по сравнению с прототипным методом (РПБО) на 60 минут.
Источники информации
1 Гендон Ю.З. Молекулярная генетика вирусов человека и теплокровных животных. - М., Медицина, 1975.
2 Жданов В.М., Ершов Ф.И. Молекулярные основы биологии арбовирусов. - М., Медицина, 1973.
3 Костюкова Н.И. Основы математического моделирования. Оценка биологически активных веществ на основании альтернативных кривых "доза-эффект" Сайт в интернете intuit.ru>department/se/mathmodel/13/3.html
4 Лакин Г.Ф. Биометрия. - М., Высшая школа, 1990.
5 Левкович Е.Н., Карпович Е.Л., Засухина Г.Д. Генетика и эволюция вирусов животных. - М., Медицина, 1971.
6 Сыромятникова С.И., Пантюхов В.Б., Шатохина И.В., Маркин В.А., Пирожков А.П., Тимофеев М.А., Сизикова Т.Е., Румянцева И.Г., Борисевич С.В. Оптимизация условий количественной оценки возбудителя Аргентинской геморрагической лихорадки. - Журн. микробиол. - 2013, №2. - С.51-55.
7 Cajimat M.N.B. Genetic diversity and taxonomical relationships among the Tacaribe serocomplex viruses (family arenaviridae). Dph Dissertation. - 2007, Texas University Press.
8 CDC, 1994. Bolivian hemorrhagic fever - El Beni Department, Bolivia // 1994. MMWR. - 1994. - Vol.43. - P. 943-946.
9 Charrel R.N., de Lamballerie X. Arenaviruses other than Lassa virus // Antiviral Res. - 2003. - Vol.57. - P. 89-100.
10 Childs J.E., Peters C.J. Ecology and epidemiology of arenaviruses and their hosts // In: The Arenaviridae. Ed. M.S. Salvato / Plenum, New York. - 1993. - P. 331-373.
11 Dulbecco R. Production of plaques in monolayer tissue cultures caused by single particles of animal viruses // PNAS USA. - 1952. - V. 38. - P. 747-752.
12 Emia D.A., Feui Hade M.R. Argentine hemorrhagic fever (Junin virus, Arenaviridae): A review on clinical, epidemiological, ecological, treatment and preventive aspects of the disease // An overview of arbovirology in Brazil and neighboring countries. / Ed. A.P.A. Travassos da Rosa, P.F.C. - Vasconcetos. Institute Orlando Chagas, Belem, Brazil. - 1976. - P. 229-232.
13 Gonsales J.P., Bowen M.D., Nichol S.T., Rico-Hesse R. Genetic characterization and phylogeny of Sabia virus, an emergent pathogen in Brazil // Virology. - 1996. - Vol.221, No 2. - P. 318-324.
14 Peters C.J., Buchmeier M., Rollin P.E., et al. Arenaviruses // Field's Virology Third Edition Vol.1 / Ed. B.N. Fields, D.M. Knipe, P.M. Powley - Philadelphia. - 1996. - P. 1521-1551.
15 Salas R., de Manzione N., Tesh R. et al Venezuelan hemorrhagic fever // Lancet. - 1991. - Vol.338. - P. 1033-1036.
16 Suspected Lassa fever // Morbid. Mortal. Wkly. Rep.- 1978. - Vol.27, No 21. - P. 182.
17 Tesh R.B., Jahrling P.B., Salas R., Shope R.E. Description of Guanarito virus (Arenaviridae: Arenavirus), the etiologic agent of Venezuelan hemorrhagic fever // Am. J. Trop. Med. Hyg. - 1994. - Vol.50. - P. 452-459.
18 Vela E. Animal models, profilaxis, and therapeutics for Arenavirus infection // Viruses. - 2012. - No 4. - P. 1802-1829.
19 Zhou X, Ramachaundran S, Mann M, Popkin DL. "Role of Lymphocytic Choriomeningitis virus(LCMV) in understanding viral immunology: Past, Present and Future"// Viruses. 2012. - No 4. - P. 2650-2669.