Питательная среда для микроклонального размножения гречихи посевной
NUTRIENT MEDIUM FOR MICROPROPAGATION OF BUCKWHEAT

Изобретение относится к области сельского хозяйства и биотехнологии и может быть использовано для ускоренного размножения гречихи посевной in vitro.
Известна питательная среда для регенерации растений яблони из семядолей (патент RU №2134506, МПК А01Н 4/00, 1999 г.) где в питательную среду Мурасиге-Скуга добавляют стимулятор роста - настойку стеркулии 30-75 мл/л.
Недостатком изобретения является незначительный ареал произрастания растения, дороговизна препарата, частое его отсутствие в аптечной сети и высокий расход настойки.
Известна питательная среда для индукции каллуса и микроклонального размножения персика из незрелых зародышей (патент RU 2128429, МПК А01Н 4/00, 1999 г.), составленная по прописи среды Мурасиге-Скуга, содержащая в качестве стимулятора роста сок каланхоэ.
Недостаток изобретения заключается в незначительном ареале произрастания растения, высокие нормы расхода препарата.
Известна питательная среда для микроклонального размножения подвоев яблони (патент RU 2111652, МПК А01Н 4/00, 1998 г.), составленная по прописи среды Мурасиге-Скуга, содержащая в качестве стимулятора роста экстракт родиолы.
Недостатком данного изобретения является краснокнижный статус родиолы, что затрудняет использование данного растения в качестве сырья для экстракта.
Известна питательная среда для микроклонального размножения косточковых культур (патент RU 2045891, МПК А01Н 3/00, 1995 г.), где в среду Мурасиге-Скуга добавляют стимулятор роста - экстракт алоэ.
Недостаток изобретения - дороговизна препарата алоэ и высокая норма расхода препарата.
Известна питательная среда для микроклонального размножения груши (патент RU 2141524, МПК А01Н 4/00,), составленная по прописи среды Мурасиге-Скуга, содержащая в качестве стимулятора роста настойку лимонника.
Недостатком изобретения является ограниченный ареал распространения растения и высокая норма расхода препарата.
Известна питательная среда для регенерации растений абрикоса из незрелых зародышей (патент RU 2198505, МПК А01Н 3/00, 2003 г.), составленная по прописи среды Мурасиге-Скуга, содержащая в качестве стимулятора роста экстракт элеутерококка.
Аналогично Д.Г. Шорников предложил использовать спиртовой экстракт корня элеутерококка для стимуляции побегообразования эксплантов элеутерококка колючего (Шорников Д.Г. Совершенствование технологии размножения редких садовых растений в культуре in vitro и оценка их потенциала устойчивости к абиотическим стрессорам: диссертация канд. с.-х. наук. Мичуринск. 2008. 192 с.).
Недостатком предлагаемой питательный среды является ограниченный ареал распространения растения и дороговизна препарата.
В исследованиях М.Т. Упадышева выявлено, что фенольные соединения повышали эффективность размножения растений на этапах пролиферации, укоренения и адаптации (патент RU 2111653, МПК А01Н 4/00, 1998 г; А.с., RU, №1706481, МПК А01Н 4/00, 1992 г.)
Для биотехнологического размножения гречихи известны различные варианты питательных сред, в том числе с использованием стимуляторов (регуляторов) роста (Барсукова Е.Н. Использование метода культуры ткани в селекции гречихи. Дисс… канд. с.-х. наук, Благовещенск, 2000; Takahata Y. Plant regeneration from cultured immature inflorescence of Common Buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench) and Perennial Buckwheat (F. cymosum Meisn.), Japan J. Breed. (1988), 38(4), 409-413; Klcova L., Gubišova M. Evaluation of different approaches to buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench) micropropagation, Czech J. Genet. Plant Breed. (2008), 44 (2), 66-72; Dobránszki J. Role of cytokinins and explant type in shoot multiplication of buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench) in vitro, Eur. J. Plant Sci. Biotechnol. (2009), 3 (1), 66-70; Slavinska J., Kantartsi K., Obendorf R. In vitro organogenesis of Fagopyrum esculentum Moench (Polygonaceae) as a method to study seed set in buckwheat, Eur. J. Plant Sci. Biotechnol. (2009), 3, 75-78 c.)
Недостатками этих сред являются невысокие темпы роста и развития эксплантов и коэффициента размножения, дороговизна применяемых стимуляторов роста.
Наиболее близкой по технической сущности к изобретению является питательная среда с минеральной основой по Мурасиге-Скуга (далее - МС) (Murashige, Т., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tussue cultures. Physiol. Plant. (1962), 15, 473-497. DOI 10.1098/rstb.2000.0713.), дополненная рекомендуемым соотношением компонентов согласно исследованиям Н.И. Румянцевой и др. (Румянцева Н.И., Сергеева Н.В., Хакимова Л.Э. и др. Органогенез и соматический эмбриогенез в культуре двух видов гречихи. Физиология растений (1989), 36(1), 187-194; Румянцева Н.И. Морфогенез в культуре тканей гречихи: теоретические и прикладные аспекты. Дис.… канд. биол. наук. Казань, 1990. 217 с.) и использованная в работе Е.Н. Барсуковой (Барсукова Е.Н. Использование метода культуры ткани в селекции гречихи. Дисс.…канд. с.-х. наук, Благовещенск, 2000. 160 с.). В состав среды прототипа входят компоненты, представленные в табл. 1. Данная среда имеет недостатки. В процессе микроклонального размножения на МС не всегда наблюдаются высокие темпы роста и развития растений, может замедляться или отсутствовать ризогенез, что снижает коэффициент размножения и возможность полноценной приживаемости микроклонов, а также увеличивает длительность технологического процесса. Введение в среду регуляторов роста - фитогормонов (ауксины, кинетины) как природного, так и
синтетического происхождения, увеличивает эффективность регенерации, но при этом повышается стоимость питательной среды, что приводит к возрастанию себестоимости получаемых растений-регенерантов. Кроме этого, для приготовления среды используют гидролизат казеина, что также ведет к существенным дополнительным затратам.
Цель изобретения - сокращение сроков получения нормально развитых растений-регенерантов и уменьшение стоимости питательной среды.
Указанная цель достигается тем, что в питательную среду для микроклонального размножения гречихи посевной, содержащую аммоний азотнокислый, калий азотнокислый, калий фосфорнокислый однозамещенный, магний сернокислый семиводный, кальций хлористый двухводный, борную кислоту, марганец сернокислый четырехводный, кобальт хлористый шестиводный, медь сернокислую пятиводную, цинк сернокислый семиводный, натрий молибденовокислый двухводный, калий йодистый, тиамин хлорид, пиридоксин хлорид, сахарозу, агар и воду, согласно изобретения в ее состав дополнительно вводят деалкоголизированный экстракт рейнутрии японской в количестве 1-5 мл/л среды.
По сравнению с прототипом признаками изобретательского уровня предлагаемой питательной среды для микроклонального размножения гречихи посевной является:
1. «…в ее состав дополнительно вводят деалкоголизированный экстракт рейнутрии японской…», что позволяет:
- достичь положительного эффекта, заключающегося в увеличении морфологических показателей культивируемых in vitro растений и увеличить коэффициент размножения;
- уменьшить срок получения нормально развитых растений-регенерантов, усилить ризогенез и как следствие, способность микроклонов лучше приживаться и быстрее адаптироваться к новым питательным субстрактам;
- в питательную среду не добавлять гидролизат казеина, а использовать дешевое и доступное сырье растения рейнутрии японской, дающего большую вегетативную массу, что в совокупности снизит стоимость питательной среды и себестоимость получаемых микроклонов.
2. «…в количестве 1-5 мл/л среды», что позволяет:
- экономно использовать экстракт рейнутрии японской и избежать перерасхода действующего биологически активного вещества.
Признаки, указанные в отличительной части описания достижения цели, доказывают, что заявляемая питательная среда для микроклонального размножения гречихи посевной обладает новизной. Совокупность признаков, приведенных в сравнении свойств заявляемого и известного решений, дает основание сделать вывод, что заявляемая питательная среда имеет изобретательский уровень.
Техническим результатом изобретения является использование в качестве стимулятора роста и развития микроклонов деалкоголизированного экстракта рейнутрии японской в количестве 1-5 мл/л среды, полученного из дешевого, доступного сырья при одновременном снижении расхода препарата.
2
2
Предлагаемая питательная среда для микроклонального размножения гречихи посевной иллюстрируется приведенным ниже примером ее осуществления. Жидкий концентрированный экстракт рейнутрии японской (Reynoutria japonica Houtt.) получают следующим образом. Листья растений высушивают воздушно-теневым методом до уровня влажности 12%, измельчают на мельнице марки ЛЗМ для размола сухих проб до фракции 1 мм, экстрагируют СНОН 70% (EtOH 70%) с использованием емкости с кипящей водой при температуре 95°С, проводят вакуум-фильтрацию и переносят полученные извлечения в мерные колбы (100 мл). В результате получают экстракт темно-зеленого цвета с коричневым оттенком и травяным ароматом. Готовый препарат хранят в герметически закрывающейся емкости из темного стекла в холодильнике. Перед внесением в питательную среду необходимое количество экстракта диалкоголизируют выпариванием на водяной бане при температуре +90°С до исчезновения запаха спирта и доводят дистиллированной водой до начального объема.
Пример. В качестве объектов исследований использовали регенераты гречихи посевной двух сортов - Изумруд (индетерминантного типа) селекции ФНЦ агробиотехнологии Дальнего Востока им. А.К. Чайки и Дикуль (детерминантного типа) селекции ВНИИ зерновых культур, введенных в культуру in vitro. Асептические одноузловые черенки длиной 15-20 мм с пазушной почкой пассировали на питательную среду с минеральной основой по Мурасиге-Скуга, (без гидролизата казеина) содержащую 20 г/л сахарозы, 6 г/л агара и деалкоголизированный экстракт рейнутрии японской из расчета 1 мл/л, 5 мл/л, 10 мл/л по вариантам опыта (табл. 2). Контрольный вариант - прототип - питательная среда без добавления гидролизата казеина и экстракта рейнутрии. Повторность опыта - трехкратная. Изолированные in vitro объекты культивировали в пробирках с ватно-марлевыми пробками при освещении 4 тыс.лк, температуре 22-25°С, фотопериоде 16 ч в условиях культуральной комнаты. Продолжительность пассажа составила 21 сутки. Приготовление и стерилизация бокса, посуды, инструментов проводилась по общепринятой методике.
Результаты работы приведены в таблице 3. Количество междоузлий на стебле у гречихи посевной является важным показателем, определяющим
эффективность микроклонального размножения путем микрочеренкования. По сравнению с прототипом (контролем) у исследуемых сортов в вариантах с использованием экстракта рейнутрии японской значительно увеличивается (в 2,3-7,5 раза) высота растения (за исключением варианта 1 мл/л содержания компонента в среде для сорта Изумруд) и соответственно, количество междоузлий и коэффициента размножения растений, который выше в 1,7-2,7 раза, а также количество листьев и длина листовой пластинки регенерантов.
Важнейший показатель, характеризующий адаптивные возможности растений - ризогенез. На среде с экстрактом количество и длина корней значительно выше, чем на контроле и составила в среднем 2,33-4,33 шт. и 30,23-110,33 мм соответственно. Большой эффект экстракта отмечен при культивировании сорта Дикуль, особенно в отношении корнеобразования. При этом для обоих сортов максимальный эффект отмечен для питательной среды, содержащей 1-5 мл/л экстракта. Концентрации экстракта в питательной среде до 1 мл/л не приводит к существенному возрастанию эффекта. Отсутствие в среде гидролизата казеина, а также использование дешевого и доступного сырья для приготовления экстракта является фактором, снижающим себестоимость питательной среды.
Таким образом питательная среда для микроклонального размножения гречихи посевной с добавлением деалкоголизированного водного раствора EtOH 70% экстракта рейнутрии японской в диапозоне концентрации 1-5 мл на литр среды значительно стимулирует рост и развитие регенерантов F. esculentum, повышает коэффициент размножения и выход черенков для микроклонального размножения, уменьшая сроки получения нормально развитых регенерантов, а также способствует усилению корнеобразования, что увеличивает степень приживаемости микроклонов в новых питательных субстратах.