Способы лечения кальцификации тканей
METHODS OF TREATING TISSUE CALCIFICATION

Данная заявка притязает на приоритет предварительной заявки на патент США №62/094943, поданной 19 декабря 2014 г., и предварительной заявки на патент США №62/249781, поданной 2 ноября 2015 г. Все идеи указанных выше заявок включены сюда посредством ссылки.
ССЫЛКА НА ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ, ПРЕДСТАВЛЕННЫЙ В ЭЛЕКТРОННОМ ВИДЕ
Содержимое перечня последовательностей, представленного в электронном виде в ASCII-текстовом файле (название: 081245-0208_ascii.txt; размер: 88556 байт; и дата создания: 15 декабря 2015 г.), поданного с данной заявкой, полностью включено сюда посредством ссылки.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Кальцификация сосудов может характеризоваться образованием очень небольших рассредоточенных кристаллов гидроксиапатита (НА) и как крупные кальцифицированные отложения в ткани сосудов, таких как артерии (Amann, K. Clin J Am Soc Nephrol 2008, 3, 1599-605). Внеклеточный пирофосфат (PPi) является ключевым эндогенным ингибитором кальцификации сосудов, ингибируя образование НА (Lomashvili, K.A. et al., J Am Soc Nephrol 2004, 15, 1392-1401; Fleisch, H. et al., Nature 1966, 212, 901-903).
Эктонуклеотидпирофосфатаза/пирофосфорилаза (NPP1) представляет собой эктофермент, расщепляющий АТФ (аденозинтрифосфат) с образованием внеклеточного пирофосфата (PPi). Пирофосфат является сильным ингибитором образования гидроксиапатита и, в нормальных условиях, функционирует для ингибирования кальцификации сосудов.
-/-
У людей дефицит NPP1 приводит к снижению уровней циркулирующего PPi и вовлечен в такие состояния, как артериальная кальцификация и генерализованная артериальная кальцификация детей грудного возраста (GACI) (Rutsch, F. et al., Am J Pathol 2001, 158, 543-554). При высоком содержании фосфатов в корме мыши без NPP1 (Enpp1) также имеют сниженные уровни PPi и демонстрируют фенотип, сходный с таковым у людей с дефицитом NPP1 (Harmey, D. et al., Am J Pathol 2004, 164, 1199-1209). Кальцификация сосудов является также хорошо известным и частым осложнением у субъектов с хроническим заболеванием почек (CKD) и терминальной стадией почечного заболевания (ESRD) и ассоциирована с повышенной заболеваемостью и смертностью (Giachelli, С. J Am Soc Nephrol 2004, 15, 2959-64; Raggi, P. et al., J Am Coll Cardiol 2002, 39, 695-701).
Дефицит эктонуклеотидпирофосфатазы/фосфодиэстеразы 1 (NPP1/ENPP1/PC-1) является редким заболеванием, вызываемым мутациями в NPP1, трансмембранном гликопротеине II типа. NPP1 расщепляет ряд субстратов, включая фосфодиэфирные связи нуклеотидов и нуклеотидных Сахаров и пирофосфатные связи нуклеотидов и нуклеотидных Сахаров. Установлена связь дефицита NPP1 с идиопатической инфантильной артериальной кальцификацией (IIАС), инсулинорезистентностью, гипофосфатемическим рахитом и окостенением задней продольной связки позвоночника.
IIAC, редкое аутосомно-рецессивное и почти всегда фатальное расстройство, характеризуется кальцификацией внутренней эластической мембраны мышечных артерий и стенозом вследствие миоинтимальной пролиферации. Во всем мире зарегистрировано более 160 случаев IIAC. Чаще всего симптомы заболевания появляются в раннем младенчестве, и заболевание приводит к летальному исходу к возрасту 6 месяцев, обычно из-за ишемической кардиомиопатии и других осложнений обструктивной артериопатии, включая стеноз почечных артерий.
Несмотря на то, что при таком серьезном заболевании, как IIAC, были отмечены дефекты белка NPP1, в настоящее время недоступно лечение для людей, пораженных этим заболеванием и другими заболеваниями с кальцификацией, вызванными высоким общим содержанием кальция и фосфора в организме из-за аномального метаболизма костей, низкими уровнями циркулирующих и продуцированных местно ингибиторов образования фосфатов или нарушенной почечной экскрецией.
Существующие терапевтические варианты предотвращения кальцификации сосудов имеют ограниченную эффективность и нежелательные и/или неприемлемые побочные эффекты. Например, для эффективности нужны очень большие количества экзогенного PPi, а другие ингибиторы образования гидроксиапатита ингибируют кальцификацию костей и могут приводить к остеомаляции. В частности, было обнаружено, что непосредственное введение экзогенного PPi предотвращало кальцификацию в моделях на животных с уремией (, W.С. et al., Kidney Int 2011, 79, 512-517; Riser, В.L. et al., Nephrol Dial Transp 2011, 26, 3349-3357). Но, ввиду короткого периода полувыведения PPi, для этого подхода требовались высокие дозы PPi, что приводило к супрафизиологическим уровням PPi плазмы и местному раздражению. Для лечения кальцификации сосудов, например, в моделях на животных, были применены бисфосфонаты, которые являются негидролизуемыми аналогами PPi (Fleisch, Н. et al., Europ J Clin Invest 1970, 1, 12-18; Price, P.A. et al., Arteriosclerosis Throm and Vas Bio 2001, 21, 817-824; Price, P.A. et al., Kidney Int 2006, 70, 1577-1583; Lomashvili, K.A. et al., Kidney Int 2009, 75, 617-625). Тем не менее, бисфосфонаты также ингибируют образование костей. Бисфосфонаты могут отсрочить, но не остановить кальцификацию у субъектов с GACI (Rutsch, F. et al., Circ Cardiovasc Genet 2008, 1, 133-140) и, как и у животных, приводят к остеомаляции (Otero, J.Е., et al., J Bone Miner Res 2013, 28, 419-430).
Braddock, D. et al., (WO 2014/126965 A2) раскрывают композиции и способы лечения патологической кальцификации и окостенения посредством введения NPP1. Quinn, A. et al., (WO 2012/125182 А1) раскрывают слитый белок NPP1 для лечения состояний, включающих GACI, артериальную кальцификацию, инсулинорезистентность, гипофосфатемический рахит и окостенение задней продольной связки позвоночника.
Несмотря на значительное количество исследований в данной области, сохраняется потребность в новых вариантах терапии для эффективного ингибирования кальцификации сосудов, предпочтительно без вызывания остеомаляции. Также сохраняется потребность в эффективном и безопасном лекарственном средстве для лечения IIAC, кальцификации сосудов при хроническом заболевании почек (VCCKD), эластической псевдоксантомы (РХЕ), инсулинорезистентности, гипофосфатемического рахита и окостенения задней продольной связки позвоночника.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к применениям выделенной рекомбинантной человеческой растворимой NPP1, в которой отсутствуют N-концевой цитозольный и трансмембранный домены, и ее слитых белков для лечения дефицита NPP1 или других прогрессирующих расстройств, характеризующихся накоплением отложений кальция и других минералов.
Белки по изобретению могут быть неожиданным образом использованы для восстановления активности NPP1 в крови и восстановления нормального уровня пирофосфата у субъектов, имеющих дефициты активности NPP1 или демонстрирующих накопление отложений кальция в костях, суставах, сердце, кровеносных сосудах, глазах и/или коже.
Конкретнее, белки NPP1 и слитые белки NPP1 по изобретению, могут быть использованы для лечения субъектов с дефицитом NPP1 или другими заболеваниями или расстройствами, связанными с низкими уровнями пирофосфата, включая, без ограничения, идиопатическую инфантильную артериальную кальцификацию (IIAC, также известную как генерализованная артериальная кальцификация у детей грудного возраста), кальцификацию сосудов при хроническом заболевании почек (VCCKD), эластическую псевдоксантому (РХЕ), инсулинорезистентность, гипофосфатемический рахит, кальцификацию суставов, ишемию миокарда и окостенение задней продольной связки позвоночника. Объем настоящего изобретения включает любое прогрессирующее расстройство, характеризующееся накоплением отложений кальция и других минералов в тканях артерий и/или соединительных тканях.
В некоторых аспектах изобретение относится к способу уменьшения кальцификации тканей, предпочтительно кальцификации сосудов, у субъекта, нуждающегося в этом. Способ включает введение субъекту с низким пирофосфатом (PPi) плазмы или повышенным неорганическим фосфатом (Pi) плазмы двух или более доз терапевтически эффективного количества композиции, содержащей растворимую эктонуклеотидпирофосфатазу/фосфодиэстеразу (NPP1). Каждая доза содержит количество растворимой NPP1, достаточное для достижения временного повышения PPi плазмы у субъекта. Временное повышение PPi плазмы характеризуется пиковым уровнем PPi, составляющим по меньшей мере приблизительно 40% нормального уровня PPi плазмы, и возвратом к исходному уровню PPi в течение приблизительно 48 часов после введения дозы. Период времени между дозами составляет по меньшей мере 2 суток.
Временное повышение PPi плазмы сохраняется в течение по меньшей мере приблизительно 4 часов, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 6 часов, по меньшей мере приблизительно 8 часов, по меньшей мере приблизительно 10 часов или по меньшей мере приблизительно 12 часов.
Кальцификация тканей может представлять собой кальцификацию сосудов, такую как венозная или артериальная кальцификация, и кальцификация может представлять собой калцификацию интимы или медии.
Субъект, нуждающийся в терапии, может иметь дефицит NPP1, хроническое заболевание почек (CKD), терминальную стадию почечного заболевания (ESRD), генерализованную артериальную кальцификацию детей грудного возраста (GACI), сердечно-сосудистое расстройство, сахарный диабет II типа, атеросклероз или эластическую псевдоксантому (РХЕ). Когда у субъекта низкий PPi плазмы, уровни пирофосфата (PPi) плазмы у субъекта до лечения по меньшей мере приблизительно на 40% ниже нормальных уровней PPi плазмы и субъект представляет собой человека. Когда у субъекта высокие уровни Pi, уровни Pi у субъекта до лечения обычно составляют по меньшей мере приблизительно 110% нормальных уровней Pi плазмы.
Количество sNPP1, вводимое в каждой дозе, может составлять от приблизительно 1,0 мг/кг до приблизительно 5,0 мг/кг NPP1 или от приблизительно 1,0 мг/кг до приблизительно 10,0 мг/кг NPP1. Период времени между дозами NPP1 составляет по меньшей мере 2 суток и может быть дольше, например по меньшей мере 3 суток, по меньшей мере 1 неделя, 2 недели или 1 месяц. sNPP1 можно вводить любым подходящим путем, например внутривенно, подкожно или внутрибрюшинно.
10
В предпочтительных аспектах вводят слитый белок NPP1. Предпочтительные слитые белки содержат NPP1-компонент, Fc-область иммуноглобулина и возможно нацеливающую группировку. Предпочтительная нацеливающая группировка представляет собой Asp. Наиболее предпочтительные слитые белки NPP1 для введения в соответствии со способами, раскрытыми здесь, имеют аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 12.
Другие признаки и преимущества изобретения будут очевидны из последующего подробного описания и формулы изобретения.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
На Фиг. 1 представлена аминокислотная последовательность белка NPP1 дикого типа (SEQ ID NO: 1). Цитозольная и трансмембранная области подчеркнуты. Потенциальные сайты N-гликозилирования выделены жирным шрифтом. Аминокислотный мотив «PSCAKE» (SEQ ID NO: 17), выделенный жирным шрифтом, является началом растворимой NPP1, содержащей область с высоким содержанием цистеина.
На Фиг. 2 представлена аминокислотная последовательность sNPP1, содержащей область с высоким содержанием цистеина, каталитическую область и С-концевую область (SEQ ID NO: 2).
На Фиг. 3 представлена аминокислотная последовательность слитого белка sNPP1-Fc (SEQ ID NO:3).
На Фиг. 4 представлена аминокислотная последовательность sNPP1-Fc-D10 (SEQ ID NO: 4). Последовательность Fc подчеркнута. Нацеливающая группировка D10 (SEQ ID NO: 18) выделена жирным шрифтом.
На Фиг. 5 показаны уровни пирофосфата в крови мышей дикого типа после введения sNPP1-Fc или sNPP1-Fc-D10 внутривенно (1 час после инъекции) и подкожно (4 часа после инъекции).
На Фиг. 6 показано предотвращение кальцификации аорты у мышей Enpp1(-/-) посредством введения sNPP1-Fc-D10. Мышам Enpp1(-/-) подкожно вводили наполнитель или 6 мг/кг sNPP1-Fc-D10 через сутки на протяжении периода продолжительностью 21 сутки. Показаны уровни кальция в аорте у самцов и самок.
На Фиг. 7 показаны уровни PPi и ферментативной активности в крови мышей Enpp1(-/-), которым вводили 6 мг/кг sNPP1-Fc-D10 внутривенно. Во временных точках 0, 4, 24, 48 и 72 часа получали плазму и анализировали ее на предмет уровней активности NPP1 (прерывистая линия) и PPi (сплошная линия). Было определено, что уровень PPi у мышей дикого типа составлял 2,18 мкМ (данные не показаны). Горизонтальными прерывистыми линиями показаны уровни PPi для мышей дикого типа, гетерозиготных мышей Enpp1(+/-) и гомозиготных asj-мышей Enpp1(-/-) (Li et al., 2013). Профили sNPP1-Fc были сходны с профилями sNPP1-Fc-D10.
asj
asj
На Фиг. 8 показана повышенная выживаемость самцов мышей Enpp1 гомозиготных, получавших 5 мг/кг sNPP1-Fc, в сравнении с мышами, получавшими наполнитель. Мыши дикого типа и Enpp1 с рождения получали корм с высоким содержанием фосфора и низким содержанием магния. Наполнитель или sNPP1-Fc (5 мг/кг) вводили подкожно через сутки, начиная с возраста 14 суток. Кривые выживаемости Каплана-Мейера продемонстрировали, что более 50% asj-мышей умерли до 6 недель, а к 9 неделям умерли все животные. Для сравнения, 50% животных, получавших sNPP1-Fc, выжили после 7 недель и все еще живы в 9 недель.
asj
asj
asj
asj
asj
На Фиг. 9А и 9В показан повышенный процент прибавки массы тела у самцов мышей Enpp1, получавших 5 мг/кг sNPP1-Fc (Фиг. 9В), в сравнении с мышами, получавшими наполнитель (Фиг. 9А). Мыши дикого типа и Enpp1 с рождения получали корм с высоким содержанием фосфора и низким содержанием магния. Наполнитель или sNPP1-Fc (5 мг/кг) инъецировали подкожно через сутки, начиная с возраста 14 суток. Строили диаграмму процента прироста массы тела для мышей дикого типа (сплошные линии) и Enpp1 (кружки) в возрасте от двух до девяти недель. В группе наполнителя все животные Enpp1 умерли (незакрашенные кружки) к девяти неделям (верхнее изображение). Для сравнения, в группе введения sNPP1-Fc к концу девятой недели пять мышей Enpp1 были живы (закрашенные кружки) и пять умерли (незакрашенные кружки).
asj
asj
На Фиг. 10А-10С представлены фотографии мыши дикого типа (Фиг. 10А, сверху), мыши Enpp1, получавшей наполнитель (Фиг. 10В, посередине), и мыши Enpp1, получавшей sNPP1-Fc (5 мг/кг) (Фиг. 10С, снизу).
asj/asj
as/asj
На Фиг. 11 показаны уровни фактора роста фибробластов 23 у мышей дикого типа, получавших наполнитель, мышей Enpp1, получавших наполнитель, и мышей Enpp1, получавших sNPP1-Fc (5 мг/кг).
На Фиг. 12А-12Н представлены аминокислотные последовательности соединений, партнеров по слиянию и слитых белков растворимой NPP1. На Фиг. 12А показана аминокислотная последовательность растворимой NPP1, содержащая аминокислоты 107-925 SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 5). На Фиг. 12В показана аминокислотная последовательность растворимой NPP1, содержащая аминокислоты 187-925 SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 6). На Фиг. 12C показана аминокислотная последовательность Fc-области человеческого lgG1, включая шарнирную область (SEQ ID NO: 7). На Фиг. 12D показана аминокислотная последовательность Fc человеческого lgG1, включая часть шарнирной области (SEQ ID NO: 8). На Фиг. 12Е показана аминокислотная последовательность слитого белка NPPI-Fc (SEQ ID NO: 9). NPP1-компонент содержит SEQ ID NO: 5, и последовательность Fc содержит шарнирную область. На Фиг. 12F показана аминокислотная последовательность слитого белка NPP1-Fc (SEQ ID NO: 10). Растворимая NPP1 содержит SEQ ID NO: 5, и последовательность Fc содержит часть шарнирной области. На Фиг. 12G показана аминокислотная последовательность слитого белка NPP1-Fc (SEQ ID NO: 11). Растворимая NPP1 содержит SEQ ID NO: 6, и последовательность Fc содержит шарнирную область. На Фиг. 12Н показана аминокислотная последовательность слитого белка NPP1-Fc (SEQ ID NO: 12). Растворимая NPP1 содержит SEQ ID NO: 6, и последовательность Fc содержит часть шарнирной области.
-/-
-/-
-/-
-/-
На Фиг. 13А-13С представлены авторадиограммы тонкослойных хроматограмм, на которых показана активность рекомбинантной NPP1 in vitro и in vivo. Фиг. 13А: 100 нМ АТФ инкубировали со 130 мкг/мл sNPP1-Fc-D10 в течение одного часа при 37°С. Фиг. 13 В: 100 нМ АТФ инкубировали с плазмой мышей дикого типа (WT), мышей Enpp и мышей Enpp1 через 2 часа после в/в (внутривенного) введения рекомбинантной NPP1 (6 мг/кг). Фиг. 13С: 100 нМ АТФ инкубировали с аортой мышей дикого типа (WT), мышей Enpp и мышей Enpp1 через 2 часа после в/в введения рекомбинантной NPP1 (6 мг/кг). Pi -ортофосфат; АТФ - аденозинтрифосфат; PPi - пирофосфат.
На Фиг. 14А и 14В представлены гистограммы, иллюстрирующие динамику активности NPP1 плазмы (Фиг. 14А, сверху) и концентрации пирофосфата плазмы (Фиг. 14В, снизу) у мышей Enpp1(-/-) после подкожного введения рекомбинантной NPP1 (5 мг/кг).
На Фиг. 15 представлена точечная диаграмма, иллюстрирующая взаимосвязь активности NPP1 плазмы и пирофосфата (PPi) плазмы для мышей Enpp1(-/-) в различные моменты времени после подкожного введения рекомбинантной NPP1 (5 мг/кг) (кружки) и для мышей дикого типа (квадраты).
На Фиг. 16А-16С представлены гистограммы, иллюстрирующие синтез пирофосфата в крови человека. Фиг. 16А: гепаринизированная кровь или плазма, полученные из одного и того же образца крови. Фиг. 16В: центрифугированные клетки крови с (все клетки) или без лейкоцитной пленки (эритроциты), удаленные, суспендированные в HEPES(4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота)-забуференном физиологическом растворе. Фиг. 16С: выделенные лейкоциты или тромбоциты, суспендированные в HEPES-забуференном физиологическом растворе. Образцы инкубировали при 37°С в течение 2 часов с рекомбинантной NPP1 или без нее (145 мкг/мл).
На Фиг. 17 представлена гистограмма, иллюстрирующая эффект рекомбинантной NPP1 на кальцификацию аорты у мышей Enpp1(-/-). Рекомбинантную NPP1 инъецировали подкожно (6 мг/кг) каждые 48 часов мышам, получавшим корм с высоким содержанием фосфатов. Каждый столбик соответствует одному животному в возрасте, указанном снизу в неделях. М - пара самцов; F - пара самок. Прерывистой линией показано среднее содержание кальция в аортах однопометных животных дикого типа.
На Фиг. 18 представлена гистограмма, иллюстрирующая эффект рекомбинантной NPP1 на кальцификацию аорты у крыс с уремией при почечной недостаточности. sNPP1-Fc-D10 или контроль инъецировали подкожно (5 мг/кг) 5 доз в неделю на протяжении 21 суток крысам с уремией, получавшим корм с высоким содержанием аденина. Каждый столбик соответствует одному животному в возрасте приблизительно 4 месяцев.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Определения
Если не указано иное, все технические и научные термины, использованные здесь, имеют то же значение, в котором их обычно понимает специалист в области, к которой относится данное изобретение. Несмотря на то, что в практическом применении или испытании настоящего изобретения могут быть применены любые материалы и методы, сходные с описанными здесь или эквивалентные им, описаны предпочтительные методы и материалы.
Подразумевают, что при использовании здесь в связи с измеряемыми значениями, такими как количество, продолжительность во времени и тому подобное, «приблизительно» включает отклонения на ±20% или ±10%, более предпочтительно ±5%, еще более предпочтительно ±1% и еще более предпочтительно ±0,1% от указанного значения, поскольку такие отклонения приемлемы для осуществления раскрытых способов.
Термин «измененное отношение PPi:Pi» относится к отношению PPi плазмы к Pi сыворотки, которое по меньшей мере на 10% или по меньшей мере на 20% выше или ниже нормального отношения PPi:Pi для субъекта данного типа (например, человека). Измененное отношение PPi:Pi может присутствовать из-за уровней PPi плазмы ниже нормальных или уровней Pi сыворотки выше нормальных. Отношение PPi:Pi выражают как ([PPi]/[Pi])*1000, и у человека нормальное отношение составляет приблизительно 1,75.
При использовании здесь термин «фрагмент», применительно к белкам NPP1, относится к подпоследовательности полноразмерной NPP1. Длина «фрагмента» белка или пептида может составлять по меньшей мере приблизительно 20 аминокислот, например по меньшей мере приблизительно 50 аминокислот, по меньшей мере приблизительно 100 аминокислот, по меньшей мере приблизительно 200 аминокислот, по меньшей мере приблизительно 300 аминокислот или по меньшей мере приблизительно 400 аминокислот (и любое целое промежуточное значение). Размер фрагментов может составлять от четырех аминокислотных остатков до полноразмерной аминокислотной последовательности без одной аминокислоты. Таким образом, белок, «содержащий по меньшей мере часть аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1», включает полноразмерную NPP1 и ее фрагменты.
При использовании здесь термин «высокий Pi сыворотки» относится к уровню неорганического фосфата (Pi) сыворотки у субъекта, составляющему по меньшей мере 110% нормального уровня Pi для субъекта данного типа (например, человека). Предпочтительно, уровень Pi сыворотки у субъекта составляет по меньшей мере приблизительно 120%, по меньшей мере приблизительно 150%, по меньшей мере приблизительно 200% или по меньшей мере приблизительно 300% нормального уровня Pi для субъекта данного типа. Согласно сообщениям, нормальные уровни Pi для человека составляют 1,5±0,5 миллимоль (Rutsch, F. et al., Circ Cardiovasc Genet 1:133-140 (2008)).
«Выделенный» или «очищенный» растворимый белок NPP1 или его биологически активный фрагмент или слитый белок по существу свободны от клеточного материала или других белковых примесей из клеточного или тканевого источника, из которого получены белок NPP1, биологически активный фрагмент или слитый белок NPP1, или по существу свободны от химических предшественников или других химических веществ в случае химического синтеза. Фраза «по существу свободны от клеточного материала» включает препараты белка NPP1, биологически активного фрагмента или слитого белка NPP1, где белок отделен от компонентов клеток, из которых он выделен или получен рекомбинантным способом. В одном воплощении фраза «по существу свободны от клеточного материала» включает препараты белка NPP1, биологически активного фрагмента или слитого белка NPP1, имеющие менее приблизительно 30% (по сухой массе) белка/фрагмента/слитого белка, не являющегося NPP1 (также называемых здесь «белковыми примесями»), более предпочтительно менее приблизительно 20% белка/фрагмента/слитого белка, не являющегося NPP1, еще более предпочтительно менее приблизительно 10% белка/фрагмента/слитого белка, не являющегося NPP1, и наиболее предпочтительно менее приблизительно 5% белка/фрагмента/слитого белка, не являющегося NPP1. При получении белка NPP1, его слитого белка или биологически активного фрагмента рекомбинантным способом, он также предпочтительно по существу свободен от культуральной среды, то есть культуральная среда составляет менее приблизительно 20%, более предпочтительно менее приблизительно 10% и наиболее предпочтительно менее приблизительно 5% объема белкового препарата.
При использовании здесь термин «низкий PPi плазмы» относится к уровню пирофосфата (PPi) плазмы у субъекта, составляющему не более 50% нормального уровня PPi для субъекта данного типа (например, человека). Предпочтительно, уровень PPi плазмы у субъекта составляет не более приблизительно 40%, приблизительно 30%, приблизительно 20% или приблизительно 10% нормального уровня PPi для субъекта данного типа. Согласно сообщениям, нормальные уровни PPi для человека составляют 2,63±0,47 микромоль ( et al., Nephrol Dial Transplant 2010, 25, 187-191). Пирофосфат можно количественно определять ферментативно с применением подходящих известных методов, таких как уридиндифосфоглюкозный (UDPG) метод (Ryan, L.М. et al., Arthritis Rheum 1979, 22, 886-91).
Диапазоны: в данном описании различные аспекты изобретения могут быть представлены в форме диапазонов. Следует понимать, что описание в форме диапазона применено исключительно для удобства и краткости, и его не следует трактовать как жесткое ограничение объема изобретения. Соответственно, описание диапазона следует рассматривать как конкретное указание всех возможных поддиапазонов, а также отдельных числовых значений в пределах этого диапазона. Например, описание такого диапазона, как от 1 до 6, следует рассматривать как конкретное указание таких поддиапазонов, как от 1 до 3, от 1 до 4, от 1 до 5, от 2 до 4, от 2 до 6, от 3 до 6 и так далее, а также отдельных чисел в пределах этого диапазона, например 1, 2, 2,7, 3, 4, 5, 5,3 и 6. Это применимо независимо от ширины диапазона.
При использовании здесь термин «субъект» включает млекопитающих и субъектов, не являющихся млекопитающими. Примеры млекопитающих включают, без ограничения, людей, шимпанзе, человекообразных обезьян, крупный рогатый скот, лошадей, овец, коз, свиней, кроликов, собак, кошек, крыс, мышей, морских свинок и тому подобное. Примеры субъектов, не являющихся млекопитающими, включают, без ограничения, птиц, рыб и тому подобное.
При использовании здесь термин «терапевтически эффективное количество» относится к нетоксичному, но достаточному количеству агента (например, белков sNPP1), которое, по сравнению с соответствующим субъектом, не получившим такого количества, приводит к улучшению лечения, излечения, предотвращения или облегчения заболевания, расстройства или побочного эффекта или снижению темпов прогрессирования заболевания или расстройства. Объем данного термина также включает количества, эффективные для усиления нормальной физиологической функции.
Термин «лечение» включает применение или введение белков, фрагментов и слитых белков NPP1 по изобретению субъекту или применение или введение белков, фрагментов и слитых белков NPP1 по изобретению субъекту с заболеванием или расстройством, ассоциированным с NPP1, или другим заболеванием или расстройством, ассоциированным с низкими уровнями пирофосфата в крови, или другим прогрессирующим расстройством, характеризующимся накоплением отложений кальция и других минералов (минерализацией), с целью лечения, излечения, облегчения, уменьшения степени тяжести, изменения, исцеления, уменьшения интенсивности, предотвращения, улучшения заболевания или расстройства или влияния на заболевание или расстройство. Термин «лечение» относится к любым признакам успеха лечения или уменьшения интенсивности повреждения, патологии или состояния, включая любой объективный или субъективный параметр, такой как уменьшение степени выраженности, ремиссия, уменьшение симптомов или осуществление лучшей переносимости повреждения, патологии или состояния субъектом, уменьшение скорости дегенерации или ухудшения, обеспечение менее ослабляющей конечной точки дегенерации или улучшение физического или психического благополучия субъекта. Лечение может быть терапевтическим или профилактическим. Лечение или уменьшение интенсивности симптомов может быть основано на объективных или субъективных параметрах, включая результаты медицинского осмотра.
Способы лечения
Настоящее изобретение относится к применениям выделенной рекомбинантной человеческой растворимой NPP1 («sNPP1»), в которой отсутствует N-концевая часть (то есть отсутствуют цитозольный и трансмембранный домены) и ее слитых белков для лечения заболеваний и расстройств, связанных с NPP1. Белки по изобретению могут быть неожиданным образом использованы для повышения активности NPP1 in vivo и повышения или восстановления нормального уровня пирофосфата (PPi) в крови у субъектов. Белки по изобретению могут также быть использованы для предотвращения накопления отложений кальция в суставах, почках, сердце (например, в аорте), артериях, кровеносных сосудах или задней продольной связке позвоночника.
Субъект может представлять собой пациента-человека с недостаточной активностью NPP1 (дефицитом NPP1), демонстрирующего низкие уровни пирофосфата, страдающего от заболевания или расстройства, ассоциированного с низкими уровнями пирофосфата, или страдающего от прогрессирующего расстройства, характеризующегося накоплением отложений кальция и других минералов (минерализацией) в эластических волокнах. Минерализация может происходить в сердце, артериях, кровеносных сосудах, почках, связках позвоночника, коже, глазах и пищеварительном тракте.
Более конкретно, белки NPP1 и слитые белки NPP1 по изобретению могут быть использованы для лечения субъектов, имеющих заболевания или расстройства, ассоциированные с NPP1, включая, без ограничения, идиопатическую инфантильную артериальную кальцификацию (IIAC), инсулинорезистентность, гипофосфатемический рахит и окостенение задней продольной связки позвоночника, или другими заболеваниями, такими как кальцификация сосудов при хроническом заболевании почек (VCCKD), ишемия миокарда, кальцификация суставов, ангиоидные полосы и эластическая псевдоксантома (РХЕ).
Растворимые белки NPP1, фрагменты и слитые белки NPP1 можно использовать для лечения широкого спектра состояний у субъекта. Например, объем изобретения включает лечение состояний, при которых можно добиться улучшения посредством уменьшения и/или устранения одной или более чем одной кальцифицированной структуры и/или предотвращением образования кальцифицированных структур у субъекта, такого как млекопитающее, например у пациента-человека.
В одном особенно полезном воплощении состояние, подлежащее лечению, представляет собой генерализованную артериальную кальцификацию (также известную как идиопатическая инфантильная артериальная кальцификация и инфантильная кальцификация медии артерий).
В других воплощениях с применением способов, описанных здесь, можно также лечить такие состояния, как эластическая псевдоксантома, кальцификация сосудов при хроническом заболевании почек, инсулинорезистентность, гипофосфатемический рахит или окостенение задней продольной связки позвоночника.
Обычно доза слитого белка, вводимая субъекту, будет варьировать в зависимости от таких известных факторов, как возраст, состояние здоровья и масса тела реципиента, тип сопутствующего лечения, частота лечения и тому подобное. Обычно доза активного ингредиента (то есть слитого белка) может составлять от приблизительно 0,0001 до приблизительно 50 миллиграммов на килограмм массы тела. Точную дозу, частоту введения и продолжительность лечения будет определять врач, являющийся специалистом в области введения терапевтических белков.
Предпочтительное воплощение настоящего изобретения включает способ лечения заболевания, ассоциированного с NPP1, или других заболеваний с кальцификацией, включающий стадию введения терапевтически эффективного количества выделенного растворимого белка NPP1 (sNPP1), биологически активного фрагмента или слитого белка NPP1 субъекту. Как определено здесь, терапевтически эффективное количество белка (то есть эффективная доза) составляет от приблизительно 0,001 до 50 мг/кг массы тела. Специалисту в данной области будет ясно, что на дозу, необходимую для эффективного лечения субъекта, могут влиять определенные факторы, включая, без ограничения, тяжесть заболевания, предшествующие лечения, общее состояние здоровья и/или возраст субъекта и наличие других заболеваний. Более того, лечение субъекта терапевтически эффективным количеством белка может включать однократное введение или, предпочтительно, может включать серию введений. Также следует понимать, что эффективная доза белка, используемого для лечения, может увеличиваться или уменьшаться в процессе определенного лечения.
Как определено здесь, терапевтически эффективное количество белка или полипептида (то есть эффективная доза) составляет от приблизительно 0,001 до 50 мг/кг массы тела, предпочтительно приблизительно от 0,01 до 25 мг/кг массы тела, более предпочтительно приблизительно от 0,1 до 20 мг/кг массы тела и еще более предпочтительно приблизительно от 1 до 10 мг/кг, от 2 до 9 мг/кг, от 3 до 8 мг/кг, от 4 до 7 мг/кг или от 5 до 6 мг/кг массы тела. Специалисту в данной области будет ясно, что на дозу, необходимую для эффективного лечения субъекта, могут влиять определенные факторы, включая, без ограничения, тяжесть заболевания или расстройства, предшествующие лечения, общее состояние здоровья и/или возраст субъекта и наличие других заболеваний. Более того, лечение субъекта терапевтически эффективным количеством белка, полипептида или антитела может включать однократное введение или, предпочтительно, может включать серию введений.
В предпочтительном примере, в диапазоне от приблизительно 0,1 до 20 мг/кг массы тела, один раз в неделю, два раза в неделю, один раз в приблизительно 10 суток, один раз в 12 приблизительно суток, один раз в приблизительно 14 суток, один раз в 17 приблизительно суток, один раз в приблизительно 20 суток, один раз в приблизительно 25 суток или один раз в приблизительно 30 суток. Также следует понимать, что эффективная доза растворимого белка SNPP1, его биологически активного фрагмента или слитого белка, используемого для лечения, может увеличиваться или уменьшаться в процессе определенного лечения.
Согласно изобретению предложена терапевтически эффективная доза sNPP1, ее биологически активного фрагмента или слитого белка для введения пациенту от одного раза каждые 5 суток до одного раза каждые 30 суток на протяжении периода времени, определенного практикующим врачом, являющимся специалистом в области медицинских наук. В одном воплощении период времени будет равен оставшейся продолжительности жизни пациента. В одном воплощении частота дозирования составляет от одного раза каждые 5 суток до одного раза каждые 25 суток. В одном воплощении частота дозирования составляет от одного раза каждые 5 суток до одного раза каждые 21 сутки. В другом воплощении частота дозирования составляет от одного раза каждые 7 суток до одного раза каждые 14 суток. sNPP1, ее биологически активный фрагмент или слитый белок можно вводить один раз каждые 5 суток, один раз каждые 6 суток, один раз каждые 7 суток, один раз каждые 8 суток, один раз каждые 9 суток, один раз каждые 10 суток, один раз каждые 11 суток, один раз каждые 12 суток, один раз каждые 13 суток или один раз каждые 14 суток. В некоторых воплощениях sNPP1, ее биологически активный фрагмент или слитый белок вводят приблизительно раз в неделю. В других воплощениях sNPP1, ее биологически активный фрагмент или слитый белок вводят приблизительно раз в две недели. В одном воплощении частота дозирования составляет один раз в приблизительно 30 суток.
В одном воплощении возраст пациента составляет менее 2 лет. В некоторых воплощениях пациенту с дефицитом NPP1 или другим заболеванием с кальцификациней вводят приблизительно 0,1 мг, приблизительно 0,2 мг, приблизительно 0,3 мг, приблизительно 0,4 мг, приблизительно 0,5 мг, приблизительно 1 мг, приблизительно 2 мг, приблизительно 3 мг, приблизительно 5 мг, приблизительно 10 мг, приблизительно 15 мг, приблизительно 20 мг, приблизительно 25 мг, приблизительно 30 мг, приблизительно 35 мг, приблизительно 40 мг или приблизительно 45 мг sNPP1, ее биологически активного фрагмента или слитого белка. В некоторых воплощениях пациенту вводят от приблизительно 0,5 до приблизительно 30 мг, от приблизительно 0,5 до приблизительно 20 мг, от приблизительно 0,5 до приблизительно 10 мг или от приблизительно 0,5 до приблизительно 5 мг.
В одном воплощении приблизительно 1 мг/кг sNPP1, ее биологически активного фрагмента или слитого белка вводят пациенту один раз в неделю. В одном воплощении приблизительно 2 мг/кг sNPP1, ее биологически активного фрагмента или слитого белка вводят пациенту один раз в неделю. В одном воплощении приблизительно 3 мг/кг sNPP1, ее биологически активного фрагмента или слитого белка вводят пациенту один раз в неделю. В одном воплощении приблизительно 4 мг/кг sNPP1, ее биологически активного фрагмента или слитого белка вводят пациенту один раз в неделю. В одном воплощении приблизительно 5 мг/кг sNPP1, ее биологически активного фрагмента или слитого белка вводят пациенту один раз в неделю. В одном воплощении приблизительно 6 мг/кг sNPP1, ее биологически активного фрагмента или слитого белка вводят пациенту один раз в неделю. В одном воплощении приблизительно 7 мг/кг sNPP1, ее биологически активного фрагмента или слитого белка вводят пациенту один раз в неделю. В одном воплощении приблизительно 8 мг/кг sNPP1, ее биологически активного фрагмента или слитого белка вводят пациенту один раз в неделю. В одном воплощении приблизительно 9 мг/кг sNPP1, ее биологически активного фрагмента или слитого белка вводят пациенту один раз в неделю. В одном воплощении приблизительно 10 мг/кг sNPP1, ее биологически активного фрагмента или слитого белка вводят пациенту один раз в неделю.
В некоторых воплощениях уровень PPi в крови у пациента до лечения составляет приблизительно 1%, приблизительно 2%, приблизительно 3%, приблизительно 5%, приблизительно 10%, приблизительно 15%, приблизительно 20%, приблизительно 30%, приблизительно 40%, приблизительно 50%, приблизительно 60%, приблизительно 70% или приблизительно 80% от нормальных уровней PPi, наблюдаемых у нормального индивидуума-человека. В одном воплощении уровень PPi у пациента до лечения составляет приблизительно 50% или менее от нормальных уровней PPi, наблюдаемых у нормального индивидуума-человека. В одном воплощении уровень PPi у пациента до лечения составляет приблизительно 40% или менее от нормальных уровней PPi, наблюдаемых у нормального индивидуума-человека. В некоторых воплощениях уровень PPi у пациента до лечения составляет приблизительно 30% или менее от нормальных уровней PPi, наблюдаемых у нормального индивидуума-человека. В некоторых воплощениях уровень PPi у пациента до лечения составляет приблизительно 30% или менее от нормальных уровней PPi, наблюдаемых у нормального индивидуума-человека. В некоторых воплощениях уровень PPi у пациента до лечения составляет приблизительно 20% или менее от нормальных уровней PPi, наблюдаемых у нормального индивидуума-человека. В некоторых воплощениях уровень PPi у пациента до лечения составляет приблизительно 10% или менее от нормальных уровней PPi, наблюдаемых у нормального индивидуума-человека. В некоторых воплощениях уровень PPi у пациента до лечения составляет приблизительно 5% или менее от нормальных уровней PPi, наблюдаемых у нормального индивидуума-человека. В некоторых воплощениях пациент демонстрирует PPi, не поддающийся измерению.
sNPP1, ее биологически активный фрагмент или слитый белок можно вводить посредством, например, подкожных инъекций, внутримышечных инъекций и внутривенных (в/в) инфузий или инъекций.
В одном воплощении sNPP1, ее биологически активный фрагмент или слитый белок вводят внутривенно посредством в/в инфузии любым пригодным способом. В одном примере sNPP1, ее биологически активный фрагмент или слитый белок можно вводить посредством внутривенной инфузий через периферическую линию. В другом примере sNPP1, ее биологически активный фрагмент или слитый белок можно вводить посредством внутривенной инфузий через периферически введенный центральный катетер.
В другом воплощении sNPP1, ее биологически активный фрагмент или слитый белок вводят внутривенно посредством в/в инъекции.
В другом воплощении sNPP1, ее биологически активный фрагмент или слитый белок можно вводить посредством внутрибрюшинной инъекции.
В другом воплощении sNPP1, ее биологически активный фрагмент или слитый белок можно вводить посредством подкожных инъекций.
В другом воплощении sNPP1, ее биологически активный фрагмент или слитый белок можно вводить посредством внутримышечных инъекций.
В еще одном воплощении sNPP1, ее биологически активный фрагмент или слитый белок вводят с использованием фармацевтически приемлемой капсулы терапевтического белка. Например, капсула может представлять собой желатиновую капсулу с кишечнорастворимым покрытием.
В одном воплощении способ включает введение растворимого белка NPP1 или слитого белка NPP1 по изобретению самих по себе или в комбинации с другим(и) агентом(ами). В одном воплощении способ включает введение белка NPP1 или слитого белка NPP1 по изобретению в качестве терапии для компенсации сниженной или аберрантной экспрессии или активности NPP1 у субъекта с дефицитом NPP1 или ассоциированным с ней заболеванием или расстройством.
В одном воплощении выделенные белки, фрагменты и слитые белки sNPP1 можно вводить до, после или одновременно с агентом или можно вводить совместно с другими известными терапиями. Совместное введение выделенных белков, фрагментов и слитых белков sNPP1 по настоящему изобретению с другими терапевтическими агентами может обеспечить два агента, действующих по разным механизмам, которые обеспечивают получение повышенного терапевтического эффекта. Такое совместное введение может решить проблемы, обусловленные развитием резистентности к лекарственным средствам.
В определенных аспектах настоящее изобретение относится к способу уменьшения кальцификации сосудов у субъекта, нуждающегося в этом. Способ основан на неожиданном обнаружении того, что растворимые формы NPP1 можно вводить животным, имеющим низкие уровни PPi (ингибитора кальцификации тканей) плазмы или высокие уровни Pi сыворотки, приводя к временному повышению PPi плазмы у животных, и это временное повышение PPi плазмы может ингибировать кальцификацию сосудов у животного. Поскольку повышение PPi плазмы является временным, терапию можно приспособить так, чтобы ингибировать нежелательную или патологическую кальцификацию тканей, такую как кальцификация сосудов, не ингибируя кальцификацию костей или не индуцируя остеомаляцию.
В общих чертах, изобретение относится к способу уменьшения кальцификации тканей (например, кальцификации сосудов) у субъекта, нуждающегося в этом, посредством введения субъекту двух или более доз растворимой NPP1 (sNPP1). Каждая из доз содержит количество растворимой NPP1, достаточное для достижения временного повышения PPi плазмы у субъекта, предпочтительно с возвратом к исходному уровню PPi в течение приблизительно 48 часов после введения дозы. Период времени между введениями каждой дозы обычно составляет по меньшей мере 2 суток.
Субъект, нуждающийся в этом, может быть любого возраста и пола, и предпочтительно имеет низкий PPi плазмы или высокий Pi сыворотки (что, например, приводит к измененному отношению PPi:Pi). Низкий PPi плазмы может быть обусловлен, например, врожденным дефицитом NPP1, таким как мутация в гене, кодирующем NPP1, приводящая к сниженной экспрессии активной NPP1 или сниженной ферментативной активности (ассоциирована с дефицитом NPP1 и аутосомно-рецессивным гипофосфатемическим рахитом), и мутация в гене, кодирующем MRP6 (белок 6 со множественной лекарственной устойчивостью), приводящая к отсутствию или нефункциональности белка MRP6 (ассоциирована с эластической псевдоксантомой). Низкий PPi плазмы или высокий Pi сыворотки также часто наблюдают у пациентов с хронической болезнью почек, терминальной стадией почечного заболевания/недостаточности, сахарным диабетом и другими состояниями. Соответственно, у субъекта, нуждающегося в терапии, может быть хроническое заболевание почек (CKD), терминальная стадия почечного заболевания (ESRD), генерализованная артериальная кальцификация детей грудного возраста (GACI), сахарный диабет II типа, аутосомно-рецессивный гипофосфатемический рахит, сердечно-сосудистое расстройство, атеросклероз и/или эластическая псевдоксантома (РХЕ). Субъект обычно представляет собой человека, но может также быть любым другим подходящим млекопитающим или субъектом, не являющимся млекопитающим.
Кальцификация тканей является прогрессирующим процессом, и индивиды, родившиеся с врожденным дефицитом NPP1, могут не демонстрировать кальцификации тканей на протяжении нескольких лет. При по возможности максимально раннем начале терапии высока вероятность, что кальцификация у таких субъектов может быть уменьшена и/или минимизирована. У субъектов с низкими уровнями PPi плазмы, не вызванными мутацией в половых клетках, или с высокими уровнями Pi сыворотки (например, с измененным отношением PPi:Pi плазмы) терапию следует начинать настолько рано, насколько это практически выполнимо (то есть вскоре после постановки диагноза таких состояний, как хроническое заболевание почек (CKD) или терминальная стадия почечного заболевания (ESRD)). В определенных воплощениях возраст субъекта, подлежащего лечению, может составлять от 1 месяца до 24 месяцев, менее 1 месяца, менее 2 месяцев, менее 3 месяцев, менее 4 месяцев или менее 5 месяцев.
Каждая доза sNPP1, вводимая субъекту, содержит количество SNPP1, достаточное для достижения временного повышения PPi плазмы у субъекта. Предпочтительно, временное повышение PPi плазмы характеризуется пиковым уровнем PPi, составляющим по меньшей мере приблизительно 40% нормального уровня PPi плазмы, по меньшей мере приблизительно 50% нормального уровня PPi плазмы, по меньшей мере приблизительно 60% нормального уровня PPi плазмы, по меньшей мере приблизительно 70% нормального уровня PPi плазмы, по меньшей мере приблизительно 80% нормального уровня PPi плазмы, от приблизительно 40% до 100% нормального уровня PPi плазмы, от приблизительно 50% до 100% нормального уровня PPi плазмы, от приблизительно 60% до 100% нормального уровня PPi плазмы, от приблизительно 70% до 100% нормального уровня PPi плазмы, от приблизительно 80% до 100% нормального уровня PPi плазмы или от приблизительно 100% до 200% нормального уровня PPi плазмы.
Предпочтительно, временное повышение PPi плазмы после введения sNPP1 сохраняется по меньшей мере приблизительно 4 часа, по меньшей мере приблизительно 6 часов, по меньшей мере приблизительно 8 часов, по меньшей мере приблизительно 10 часов или по меньшей мере приблизительно 12 часов. Кроме того, предпочтительно, чтобы после временного повышения PPi плазмы происходил возврат к исходному уровню PPi у субъекта в течение приблизительно 48 часов после введения дозы, в течение приблизительно 3 суток после введения дозы или в течение приблизительно 4 суток после введения дозы.
Низкий PPi плазмы у субъекта до лечения составляет приблизительно 50% или менее, предпочтительно 40% или менее от нормальных уровней PPi, наблюдаемых у нормального субъекта (например, человека). В некоторых аспектах уровень PPi у субъекта до лечения составляет приблизительно 30% или менее от нормальных уровней PPi. В других аспектах уровень PPi у субъекта до лечения составляет приблизительно 20% или менее от нормальных уровней PPi. В некоторых других аспектах уровень PPi у субъекта до лечения составляет приблизительно 10% или менее от нормальных уровней. В некоторых аспектах субъект может не иметь поддающегося измерению PPi до лечения.
Высокий Pi сыворотки у субъекта до лечения составляет приблизительно 110% или более, предпочтительно 125% или более от нормальных уровней Pi, наблюдаемых у нормального субъекта (например, человека). В некоторых аспектах уровень Pi у субъекта до лечения составляет приблизительно 150% или более от нормальных уровней PPi. В других аспектах уровень Pi у субъекта до лечения составляет приблизительно 200% или более от нормальных уровней PPi. В некоторых других аспектах уровень Pi у субъекта до лечения составляет приблизительно 300% или более от нормальных уровней. Вне связи с какой-либо конкретной теорией, полагают, что временное повышение PPi сыворотки может компенсировать повышенные уровни Pi плазмы и временно восстановить нормальное или приближенное к нормальному отношение PPi:Pi, ингибируя посредством этого кальцификацию тканей, стимулируемую уровнями Pi сыворотки, превышающими нормальные.
Количество sNPP1, достаточное для достижения временного повышения PPi плазмы, может быть легко определено квалифицированным клиницистом, например посредством введения дозы, которая, согласно ожиданиям, приведет к временному повышению PPi плазмы, определения того, произошло ли это временное повышение, и затем соответствующего корректирования дозы. На вводимое количество будет влиять ряд обычных факторов, включая конкретную используемую sNPP1, возраст, состояние здоровья и массу тела субъекта, чувствительность субъекта к лекарственным средствам и другие значимые факторы. Обычно количество sNPP1 для введения в каждой дозе составляет от приблизительно 0,001 до приблизительно 50 миллиграммов на килограмм массы тела, предпочтительно от 1 мг/кг до 5 мг/кг, от 1 мг/кг до 10 мг/кг, от 1 мг/кг до 20 мг/кг, 1 мг/кг, 2 мг/кг, 3 мг/кг, 4 мг/кг, 5 мг/кг, 6 мг/кг, 7 мг/кг, 8 мг/кг, 9 мг/кг, 10 мг/кг, 11 мг/кг, 12 мг/кг, 13 мг/кг, 14 мг/кг, 15 мг/кг, 16 мг/кг, 17 мг/кг, 18 мг/кг, 19 мг/кг или 20 мг/кг. Точную дозировку, частоту введения и продолжительность лечения может определить врач, являющийся специалистом в области введения терапевтических белков.
В некоторых предпочтительных воплощениях каждая доза содержит от приблизительно 1,0 мг до приблизительно 5,0 мг sNPP1 на кг массы тела, от приблизительно 1,0 мг до приблизительно 10,0 мг sNPP1 на кг массы тела или от приблизительно 1,0 мг до приблизительно 20,0 мг sNPP1 на кг массы тела.
Период времени между дозами выбирают так, чтобы дать уровням PPi сыворотки у субъекта вернуться к исходным уровням, и он составляет по меньшей мере 2 суток (48 часов), но может быть более длительным, по желанию или по показаниям. Например, период времени между дозами может составлять 3 суток, 4 суток, 5 суток, 6 суток, одну неделю, 10 суток, 12 суток, две недели, три недели или приблизительно 1 месяц.
В целом, терапию в соответствии со способами, описанными здесь, желательно начинать настолько рано, насколько это практически выполнимо, после постановки диагноза низкого PPi плазмы, высокого Pi сыворотки или дефицита NPP1. Субъекты, родившиеся с врожденным дефицитом NPP1, могут не демонстрировать кальцификации тканей на протяжении нескольких лет. При по возможности максимально раннем начале терапии высока вероятность, что кальцификация у таких субъектов может быть уменьшена и/или минимизирована. У субъектов с низкими уровнями PPi плазмы, не вызванными с мутацией в половых клетках, или с высоким Pi сыворотки терапию следует начинать настолько рано, насколько это практически выполнимо, после постановки диагноза таких состояний, как хроническое заболевание почек (CKD) или терминальная стадия почечного заболевания (ESRD).
Способ обеспечивает эффективный путь уменьшения кальцификации тканей (например, кальцификации сосудов) у субъекта с низким PPi плазмы или с высоким Pi сыворотки, включая субъектов с измененным отношением PPi к Pi. Кальцификация тканей предпочтительно представляет собой кальцификацию сосудов, которая предпочтительно представляет собой артериальную кальцификацию, но может также представлять собой кальцификацию вен. Кальцификация сосудов может представлять собой кальцификацию интимы или медии. У субъекта, подлежащего лечению в соответствии со способами, описанными здесь, может быть дефицит NPP1, генерализованная артериальная кальцификация (GACI), также известная как идиопатическая инфантильная артериальная кальцификация и инфантильная кальцификация медии артерий. У субъекта, подлежащего лечению, может также быть сердечно-сосудистое расстройство, такое как ишемическая болезнь сердца и/или атеросклероз. У субъекта, подлежащего лечению, может быть хроническое заболевание почек (CKD) или терминальная стадия почечного заболевания (ESRD). У субъекта, подлежащего лечению, может быть сахарный диабет (например, диабет II типа). У субъекта, подлежащего лечению, может быть эластическая псевдоксантома (РХЕ).
sNPP1 можно вводить любым подходящим способом или путем введения, таким как парентеральный, пероральный или посредством ингаляции. Предпочтительным является парентеральное введение, такое как внутривенная инъекция или инфузия, подкожная инъекция, внутрибрюшинные инъекции или внутримышечные инъекции.
Если желательно, sNPP1 можно вводить с одним или более чем одним агентом для совместной терапии. Для совместной терапии sNPP1 и один или более чем один дополнительный терапевтический агент вводят таким образом, чтобы фармакологические эффекты каждого из них у субъекта существенным образом накладывались друг на друга. Соответственно, любой агент для совместной терапии можно вводить до введения sNPP1, одновременно с ним или после него. Совместная терапия может обеспечить два агента, действующих по разным механизмам, которые обеспечивают получение повышенного терапевтического эффекта.
Полагают, что в дополнение к временному повышению PPi сыворотки введение sNPP1 в соответствии со способами, описанными здесь, может изменять уровни определенных белков у субъекта. Например, вне связи с какой-либо конкретной теорией, полагают, что введение sNPP1 в соответствии со способами, описанными здесь, может снижать уровни остеопонтина, остеопротегерина и фактора роста фибробластов 23 (FGF-23) у субъекта. Поэтому уровни этих белков можно также использовать в дополнение к уровням PPi плазмы и Pi сыворотки, для контролирования терапии и подбора дозы.
sNPP1
В настоящем изобретении использована растворимая NPP1, представляющая собой биологически активный NPP1-домен NPP1 (то есть NPP1-компоненты, содержащие по меньшей мере один внеклеточный каталитический домен встречающейся в природе NPP1 для пирофосфатазной и/или фосфодиэстеразной активности). Растворимые белки NPP1 по изобретению содержат по меньшей мере домен NPP1, необходимый для осуществления пирофосфатазной и/или фосфодиэстеразной активности.
В одном воплощении растворимая NPP1, ее фрагмент и слитые белки могут образовывать функциональные гомодимеры или мономер. В предпочтительном воплощении растворимый белок NPP1 или его слитый белок NPP1 можно анализировать на предмет пирофосфатазной активности, а также способности повышать уровни пирофосфата in vivo.
Предпочтительные растворимые белки NPP1 и слитые белки NPP1 по изобретению обладают ферментативной активностью in vivo (например, у человека). В одном воплощении растворимый белок содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 60, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% идентичную следующей последовательности:
(SEQ ID NO: 2).
В способах, описанных здесь, может быть использована любая желаемая форма растворимой NPP1, обладающая ферментативной активностью. sNPP1, обладающая ферментативной активностью, может повышать уровни PPi в подходящих ферментативных анализах и может быть проанализирована на предмет пирофосфатазной активности, фосфодиэстеразной активности или пирофосфатазной и фосфодиэстеразной активности Обычно sNPP1 содержит по меньшей мере NPP1-компонент, не имеющий N-концевого цитозольного и трансмембранного доменов встречающейся в природе трансмембранной NPP1. В предпочтительных аспектах NPP1-компонент содержит область с высоким содержанием цистеина (аминокислоты 99-204 SEQ ID NO: 1) и каталитическую область (аминокислоты 205-591 SEQ ID NO: 1) встречающейся в природе человеческой NPP1. Обычно NPP1-компонент также включает С-концевую область (аминокислоты 592-925 SEQ ID NO: 1) и имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. Тем не менее, если желательно, С-концевая область может быть усечена. Соответственно, предпочтительные NPP1-компоненты содержат область с высоким содержанием цистеина и каталитическую область человеческой NPP1 (аминокислоты 99-591 SEQ ID NO: 1) или область с высоким содержанием цистеина, каталитическую область, и С-концевую область человеческой NPP1 (SEQ ID NO: 2). Другие предпочтительные NPP1-компоненты содержат только часть домена с высоким содержанием цистеина и имеют последовательность аминокислот 107-925 SEQ ID NO: 1 или аминокислот 187-925 SEQ ID NO: 1.
Область NPP1 с высоким содержанием цистеина (то есть аминокислоты 99-204 SEQ ID NO: 1) может способствовать димеризации sNPP1. sNPP1, включая слитые белки, может быть в форме мономера или функционального гомодимера.
Аминокислотная последовательность NPP1-компонента может представлять собой вариант встречающейся в природе последовательности NPP1, при условии, что NPP1-компонент обладает ферментативной активностью. Варианты NPP1 обладают ферментативной активностью, и их аминокислотная последовательность по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% и, более предпочтительно, по меньшей мере на 96% идентична соответствующей части белка NPP1 человека (например, по всей длине области с высоким содержанием цистеина; каталитической области; С-концевой области; области с высоким содержанием цистеина и каталитической области; области с высоким содержанием цистеина, каталитической области и С-концевой области). Аминокислотная последовательность предпочтительных вариантов NPPI по меньшей мере на 90%, предпочтительно по меньшей мере на 95%, более предпочтительно по меньшей мере на 97% идентична (1) аминокислотной последовательности остатков 205-591 SEQ ID NO: 1, (2) аминокислотной последовательности остатков 99-591 SEQ ID NO: 1, (3) аминокислотной последовательности остатков 99-925 SEQ ID NO: 1, (4) аминокислотной последовательности остатков 107-925 SEQ ID NO: 1 или (5) аминокислотной последовательности остатков 187-925 SEQ ID NO: 1. Подходящие положения для варьирования аминокислот хорошо известны из исследований структуры NPP1 и анализа мутаций NPP1, ассоциированных с заболеваниями. Например, замена следующих аминокислот происходит при определенных мутациях, ассоциированных с заболеваниями, снижающих ферментативную активность NPP1, и варьирований аминокислот в этих положениях следует избегать: Ser216, Gly242, Pro250, Gly266, Pro305, Arg349, Tyr371, Arg456, Tyr471, His500, Ser504, Tyr513, Asp538, Tyr570, Lys579, Gly586; Tyr659, Glu668, Cys726, Arg774, His777, Asn792, Asp804, Arg821, Arg888 и Tyr901. (См., например, Jansen, S. et al., Structure 20:1948-1959 (2012).)
В одном воплощении растворимый белок NPP1 может представлять собой слитый белок, рекомбинантно слитый или химически связанный (например, ковалентной связью, ионной связью, гидрофобной связью и силой Ван-дер-Ваальса) с партнером по слиянию. В другом воплощении последовательность слитого белка по меньшей мере на 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4.
Для определения процента идентичности двух аминокислотных последовательностей последовательности выравнивают в целях оптимального сравнения (например, для оптимального выравнивания в одну или обе из первой и второй аминокислотных или нуклеотидных последовательностей могут быть введены разрывы, и в целях сравнения негомологичные последовательности могут быть проигнорированы). В предпочтительном воплощении длина эталонной последовательности, выравниваемой в целях сравнения, составляет по меньшей мере 30%, предпочтительно по меньшей мере 40%, более предпочтительно по меньшей мере 50%, еще более предпочтительно по меньшей мере 60% и еще более предпочтительно по меньшей мере 70%, 80% или 90% длины эталонной последовательности (например, аминокислотной последовательности sNPP1 SEQ ID NO: 2; аминокислот 107-925 SEQ ID NO: 1 или аминокислот 187-925 SEQ ID NO: 1). Затем сравнивают аминокислотные остатки или нуклеотиды в соответствующих аминокислотных положениях. Когда положение в первой последовательности занято тем же аминокислотным остатком или нуклеотидом, что и соответствующее положение во второй последовательности, молекулы идентичны в этом положении (при использовании здесь аминокислота эквивалентна «гомологии» аминокислот или нуклеиновых кислот). Процент идентичности двух последовательностей является функцией числа идентичных положений в последовательностях, с учетом числа разрывов и длины каждого разрыва, которые необходимо ввести для оптимального выравнивания двух последовательностей.
Сравнение последовательностей и определение процента идентичности двух последовательностей можно осуществить с применением математического алгоритма. В предпочтительном воплощении процент идентичности двух аминокислотных последовательностей определяют с применением алгоритма Нидлмана-Вунша (Needleman and Wunsch) (J Mol Biol 1970, 48, 444-453), включенного в программу GAP пакета программ GCG (доступного на www.gcg.com), с использованием матрицы Blosum 62 или матрицы РАМ250 со штрафом за разрыв 16, 14, 12, 10, 8, 6 или 4 и штрафом за длину разрыва 1, 2, 3, 4, 5 или 6. В другом воплощении процент идентичности двух аминокислот определяют с применением алгоритма Е. Meyers и W. Miller (CABIOS, 1989, 4, 11-17), включенного в программу ALIGN (версия 2.0 или 2.0U), с использованием таблицы значений для остатков РАМ120, штрафом за длину разрыва 12 и штрафом за разрыв 4.
sNPP1 может состоять из или состоять по существу из NPP1-компонента, как описано здесь. Альтернативно, sNPP1 может быть в форме слитого белка, содержащего NPP1-компонент и один или более чем один другой полипептид, называемые партнерами по слиянию, возможно через подходящий линкер в каждом примере, или в форме конъюгата NPP1-компонента и другой молекулы (например, PEG (полиэтиленгликоль)). Когда sNPP1 представлен в форме слитого белка, каждый партнер по слиянию предпочтительно расположен ближе к С-концу относительно NPP1-компонента. Вне связи с какой-либо конкретной теорией, полагают, что слитые белки, содержащие NPP1-компонент, содержащий область с высоким содержанием цистеина и каталитическую область и один или более чем один слитый белок, расположенные ближе к С-концу относительно NPP1-компонента, предпочтительнее других конфигураций слитых белков NPP1, поскольку они могут быть экспрессированы на достаточных уровнях и достаточно стабильны для использования в качестве терапевтических белков.
В слитый белок может быть включен любой подходящий партнер по слиянию. Предпочтительным образом, в данной области хорошо известен ряд партнеров по слиянию, которые могут обеспечить определенные преимущества, такие как сниженная агрегация и иммуногенность, повышенная растворимость, улучшенная экспрессия и/или стабильность и улучшенное фармакокинетическое и/или фармакодинамическое действие. См., например, Strohl, W.R. BioDrugs 29:215-239 (2015). Например, хорошо известно, что в слитые белки могут быть включены альбумин, фрагменты альбумина или варианты альбумина (например, человеческий сывороточный альбумин и его фрагменты или варианты) и что такие слитые белки могут легко быть очищены, стабильны и имеют улучшенный период полувыведения из плазмы. Подходящие альбумин, фрагменты альбумина и варианты альбумина, которые могут быть использованы в слитых белках sNPP1, раскрыты, например, в WO 2005/077042 А2 и WO 03/076567 А2, каждая из которых полностью включена сюда посредством ссылки. Также известно, что слияние с человеческим трансферрином улучшает период полувыведения. См., например, Kim BJ et al., J Pharmacol Expr Ther 334(3):682-692 (2010); и WO 2000/020746. Могут также быть использованы пептиды, связывающиеся с альбумином или трансферрином, такие как антитела или фрагменты антител. См., например, ЕР 0486525 В1, US 6267964 В1, WO 04/001064 А2, WO 02/076489 А1, WO 01/45746, WO 2006/004603 и WO 2008/028977. Сходным образом, хорошо известны слитые белки с Fc иммуноглобулинов. См., например, Czajkowsky DM et al., EMBO Mol Med 4(10): 1015-1028 (2012), патент США №7902151 и патент США №7858297, все идеи которых полностью включены сюда посредством ссылки. Слитый белок может также содержать последовательность СТР (карбокси-концевой пептид) (см. также Fares et al., Endocrinol 2010, 151, 4410-4417; Fares et al., Proc Natl Acad Sci 1992, 89, 4304-4308; и Furuhashi et al., Mol Endocrinol 1995, 9, 54-63). Предпочтительно партнер по слиянию представляет собой Fc иммуноглобулина (например, Fc человеческого lgG1). Fc может содержать СН1, СН2 и СН3 человеческого lgG1 и, возможно, шарнирную область человеческого lgG1 (EPKSCDKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 13)) или часть шарнирной области человеческого lgG1 (например, DKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 14) или PKSCDKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 15)), если это желательно. В некоторых слитых белках Fc может содержать СН2 и СН3 человеческого lgG1 или Fc человеческого lgG2 или человеческого lgG4, если это желательно.
Предпочтительно, слитый белок sNPP1 содержит NPP1-компонент и пептид, увеличивающий период полувыведения слитого белка, наиболее предпочтительно Fc иммуноглобулина (например, Fc человеческого lgG1). При использовании здесь «белок, увеличивающий период полувыведения слитого белка», относится к белку, который при слиянии с растворимой NPP1 или биологически активным фрагментом увеличивает период полувыведения растворимого полипептида или биологически активного фрагмента NPP1 по сравнению с периодом полувыведения растворимого полипептида NPP1 самого по себе или биологически активного фрагмента NPP1 самого по себе.
В одном воплощении период полувыведения слитого белка NPP1 увеличен на 50% по сравнению с периодом полувыведения полипептида или биологически активного фрагмента NPP1 самого по себе. В другом воплощении период полувыведения слитого белка NPP1 увеличен на 60% по сравнению с периодом полувыведения полипептида или биологически активного фрагмента NPP1 самого по себе. В другом воплощении период полувыведения слитого белка NPP1 увеличен на 70% по сравнению с периодом полувыведения полипептида или биологически активного фрагмента NPP1 самого по себе. В другом воплощении период полувыведения слитого белка NPP1 увеличен на 80% по сравнению с периодом полувыведения полипептида или биологически активного фрагмента NPP1 самого по себе. В другом воплощении период полувыведения слитого белка NPP1 увеличен на 90% по сравнению с периодом полувыведения полипептида или биологически активного фрагмента NPP1 самого по себе.
В другом воплощении период полувыведения слитого белка NPP1 увеличен в 2 раза, в 3 раза, в 4 раза, в 5 раз, в 6 раз, в 7 раз, в 8 раз, в 9 раз или в 10 раз по сравнению с периодом полувыведения полипептида или биологически активного фрагмента NPP1 самого по себе. Способы определения периода полувыведения белка или слитого белка хорошо известны в данной области. Например, в Zhou et al., Determining Protein Half-Lives, Methods in Molecular Biology 2004, 284, 67-77 описано множество способов анализа периода полувыведения белка. Если желательно, слитый белок может быть конъюгирован с полимерами или другими подходящими соединениями, увеличивающими период полувыведения; например, со слитыми белками NPP1 может быть конъюгирован полиэтиленгликоль (PEG).
В одном воплощении пептид, увеличивающий период полувыведения слитого белка представляет собой последовательность СТР (см. также Fares et al., 2010, Endocrinol., 151(9):4410-4417; Fares et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci, 89(10):4304-4308; и Furuhashi et al., 1995, Molec. Endocrinol., 9(1):54-63).
В другом воплощении пептид, увеличивающий период полувыведения слитого белка представляет собой Fc-домен иммуноглобулина.
10
Партнеры по слиянию могут также быть выбраны для нацеливания слитого белка в желаемые места, важные с клинической или биологической точки зрения (например, в место кальцификации). Например, пептиды, имеющие высокую аффинность к костям, описаны в патенте США №7323542, все идеи которого включены сюда посредством ссылки. Пептиды, которые могут усиливать нацеливание белка в места кальцификации, могут содержать участок из по меньшей мере приблизительно 4 расположенных друг за другом кислых аминокислот, например глутаминовой кислоты или аспарагиновой кислоты. Обычно пептид, нацеливающий слитый белок в места кальцификации, будет содержать от 4 до 20 расположенных друг за другом кислых аминокислот, например 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 расположенных друг за другом аминокислот, выбранных из глутаминовой кислоты и аспарагиновой кислоты. Пептид может состоять исключительно из остатков глутаминовой кислоты, исключительно из остатков аспарагиновой кислоты или представлять собой смесь остатков глутаминовой кислоты и аспарагиновой кислоты. Особенно предпочтительной группировкой для нацеливания в места кальцификации является Asp (SEQ ID NO: 18).
В одном воплощении слитый белок NPP1 по изобретению содержит полипептид NPP1 и группировку, усиливающую нацеливание в места кальцификации, такую как участок из расположенных друг за другом кислых аминокислот, например глутаминовой кислоты или аспарагиновой кислоты.
4
n
4
3
Подходящие пептидные линкеры для использования в слитых белках хорошо известны, обычно принимают гибкую протяженную конформацию и не препятствуют функционированию NPP1-компонента или партнеров по слиянию. Последовательности пептидных линкеров могут содержать остатки Gly, His, Asn и Ser в любой комбинации. Полезные пептидные линкеры включают, без ограничения, поли-Gly, поли-His, поли-Asn или поли-Ser. В последовательности линкера могут также быть использованы другие приблизительно нейтральные аминокислоты, такие как Thr и Ala. Аминокислотные последовательности, которые могут быть полезным образом использованы в качестве линкеров, включают последовательности, раскрытые в Maratea et al., Gene 1985, 40, 39-46; Murphy et al., Proc Natl Acad Sci USA 1986, 83, 8258-8262; патенте США №4935233 и патенте США №4751180. Другие подходящие линкеры, такие как шарнирная область иммуноглобулина, могут быть получены из встречающихся в природе белков. Предпочтительным синтетическим линкером является (GlySer), где n представляет собой 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 (SEQ ID NO: 19). Предпочтительно, n представляет собой 3 или 4. Например, в некоторых воплощениях линкер представляет собой (GlySer) (SEQ ID NO: 16) и слитый белок содержит линкер с аминокислотной последовательностью GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer (SEQ ID NO: 16). Обычно длина линкера составляет от 1 до приблизительно 50 аминокислотных остатков или от 1 до приблизительно 25 аминокислот. Часто длина линкера составляет от приблизительно 8 до приблизительно 20 аминокислот.
Предпочтительные слитые белки NPP1 содержат, от N-конца к С-концу: NPP1-компонент; возможно линкер; Fc-область иммуноглобулина (например, Fc человеческого lgG1, возможно содержащую шарнирную область или ее часть); возможно второй линкер; и возможно нацеливающую группировку. Таким образом, каждая из Fc-области и возможно нацеливающей группировки, когда она присутствует, расположена ближе к С-концу относительно NPP1-компонента. NPP1-компонент предпочтительно содержит область с высоким содержанием цистеина и каталитический домен NPP1, не имеет N-концевого цитозольного и трансмембранного доменов и возможно содержит С-концевую область.
Предпочтительный слитый белок содержит, от N-конца к С-концу: NPPI-компонент, содержащий домен с высоким содержанием цистеина, каталитический домен и С-концевую область человеческой NPP1; и Fc-область человеческого иммуноглобулина, содержащую шарнирную область. Предпочтительно, Fc-область имеет происхождение от человеческого lgG1. В определенных воплощениях последовательность слитого белка по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична SEQ ID NO: 3. Предпочтительный слитый белок этого типа имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3.
4
3
Другой предпочтительный слитый белок содержит, от N-конца к С-концу: NPP1-компонент, содержащий домен с высоким содержанием цистеина, каталитический домен и С-концевую область человеческой NPP1; линкер (например, (GlySer) (SEQ ID NO: 16)); и Fc-область человеческого иммуноглобулина, содержащую шарнирную область. Предпочтительно, Fc-область имеет происхождение от человеческого lgG1.
10
10
Другой предпочтительный слитый белок содержит, от N-конца к С-концу: NPP1-компонент, содержащий домен с высоким содержанием цистеина, каталитический домен и С-концевую область человеческой NPP1; Fc-область человеческого иммуноглобулина, содержащую шарнирную область или ее часть; и группировку, нацеливающую слитый белок в места кальцификации. Предпочтительно, Fc-область имеет происхождение от человеческого lgG1. Предпочтительно, группировка, нацеливающая слитый белок в места кальцификации, представляет собой Asp (SEQ ID NO: 18). Более предпочтительно, Fc-область имеет происхождение от человеческого lgG1, и группировка, нацеливающая слитый белок в места кальцификации, представляет собой Asp (SEQ ID NO: 18). В определенных воплощениях последовательность слитого белка по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична SEQ ID NO: 4. Предпочтительный слитый белок этого типа имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4.
4
3
10
10
Другой предпочтительный слитый белок содержит, от N-конца к С-концу: NPP1-компонент, содержащий домен с высоким содержанием цистеина, каталитический домен и С-концевую область человеческой NPP1; линкер (например, (GlySer) (SEQ ID NO: 16)); Fc-область человеческого иммуноглобулина, содержащую шарнирную область или ее часть; и группировку, нацеливающую слитый белок в места кальцификации. Предпочтительно, Fc-область имеет происхождение от человеческого lgG1. Предпочтительно, группировка, нацеливающая слитый белок в места кальцификации, представляет собой Asp (SEQ ID NO: 18). Более предпочтительно, Fc-область имеет происхождение от человеческого lgG1, и группировка, нацеливающая слитый белок в места кальцификации, представляет собой Asp (SEQ ID NO: 18).
4
3
Другой предпочтительный слитый белок содержит, от N-конца к С-концу: NPP1-компонент, содержащий часть домена с высоким содержанием цистеина, каталитический домен и С-концевую область человеческой NPP1; возможно линкер (например, (GlySer) (SEQ ID NO: 16)); Fc-область человеческого иммуноглобулина, содержащую шарнирную область или ее часть. Предпочтительно, Fc-область имеет происхождение от человеческого lgG1. В определенных воплощениях последовательность слитого белка по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 12. Предпочтительные слитые белки этого типа имеют аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 12.
В особенно предпочтительных аспектах в соответствии с описанными здесь способами вводят слитый белок с SEQ ID NO: 3. В другом особенно предпочтительном аспекте в соответствии с описанными здесь способами вводят слитый белок с SEQ ID NO: 4. В другом особенно предпочтительном аспекте в соответствии с описанными здесь способами вводят слитый белок с SEQ ID NO: 9. В другом особенно предпочтительном аспекте в соответствии с описанными здесь способами вводят слитый белок с SEQ ID NO: 10. В другом особенно предпочтительном аспекте в соответствии с описанными здесь способами вводят слитый белок с SEQ ID NO: 11. В другом особенно предпочтительном аспекте в соответствии с описанными здесь способами вводят слитый белок с SEQ ID NO: 12.
nd
Слитые белки по настоящему изобретению могут быть получены с применением стандартных способов, включая рекомбинантные методики или химическую конъюгацию, хорошо известные в данной области. Методики, полезные для выделения и характеристики нуклеиновых кислот и белков по настоящему изобретению, хорошо известны специалистам в данной области, и для выбора подходящих протоколов для использования можно обращаться к стандартным руководствам по молекулярной биологии и биохимии, не проводя ненужных экспериментов. См., например, Sambrook et al., 1989, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2 ed., Cold Spring Harbor, содержание которого полностью включено сюда посредством ссылки.
Выделенная рекомбинантная человеческая sNPP1, ее фрагмент и слитые белки могут быть получены в любой подходящей системе для экспрессии белков, включая, без ограничения, клеточные культуры (например, клетки СНО, клетки COS, HEK203), бактерий, таких как Escherichia coli (Е. coli), и трансгенных животных, включая, без ограничения, млекопитающих и птиц (например, кур, перепелок, уток и индеек). Для экспрессии используют конструкцию, кодирующую sNPP1 и содержащую подходящую сигнальную последовательность (например, от тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина, NPP2, NPP4, NPP7 или человеческого сывороточного альбумина) в рамке с последовательностью sNPP1 и функционально связанную с подходящими элементами контроля экспрессии.
th
sNPP1, включая слитые белки и их физиологически приемлемые солевые формы, обычно готовят в виде фармацевтической композиции для введения в соответствии со способами, описанными здесь. Фармацевтические композиции обычно содержат фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент. Композиции, содержащие такие носители, включая сложные молекулы, изготавливают хорошо известными традиционными способами (см., например,  Pharmaceutical Sciences, 14 ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, все идеи которого включены сюда посредством ссылки). Носитель может содержать разбавитель. В одном воплощении фармацевтический носитель может представлять собой жидкость и слитый белок может быть в форме раствора. Фармацевтический носитель может представлять собой воск, жир или спирт. В другом воплощении фармацевтически приемлемый носитель может быть твердым в форме порошка, лиофилизированного порошка или таблетки. В одном воплощении носитель может содержать липосому или микрокапсулу. Фармацевтические композиции быть в форме стерильного лиофилизированного порошка для инъецирования после восстановления в разбавителе. Разбавитель может представлять собой воду для инъекций, бактериостатическую воду для инъекций или стерильный физиологический раствор. Лиофилизированный порошок может быть получен посредством лиофильной сушки раствора слитого белка с получением белка в сухой форме. Как известно в данной области, лиофилизированный белок обычно имеет более высокую стабильность и более продолжительный срок хранения, чем жидкий раствор белка.
ПРИМЕРЫ
Далее изобретение описано посредством следующих примеров. Примеры приведены лишь в иллюстративных целях, и подразумевают, что они никоим образом не ограничивают изобретение, и их не следует трактовать как какое-либо ограничение изобретения.
Способы
Животные
Использовали самцов мышей C57BI/6J дикого типа в возрасте шести недель. Средняя масса тела этих мышей составляла 21-22 г. Мышам вводили sNPP1-Fc [1,04 мг/мл] или sNPP1-Fc-D10 [1,03 мг/мл] путем подкожной (п/к) или внутривенной (в/в) инъекции в концентрации 5 мг/кг. Таблица 1.
-/-
2
4
2
4
Использовали две разные линии мышей, не имеющих NPP1. Мыши Enpp1 были ранее описаны в Lomashvili, K.A. et al., Kidney Int 2014, 85, 1351-1356. Для ускорения артериальной кальцификации в корм добавляли 1,5%-й фосфат (конечное содержание фосфора 2%) с использованием смеси NaHPO и NaHPO в соотношениях, обеспечивающих нейтральный рН, как описано ранее (, W.С. et al., Kidney Int 2011, 79, 512-517).
Модель хронического заболевания почек (CKD). В исследованиях с моделированием CKD были использованы крысы Sprague-Dawley дикого типа. Крысам давали корм с 0,25-0,75% аденина и высокими уровнями фосфора (0,75-0,9% фосфора против 0,4% в обычном корме). Избыток аденина в корме насыщает нормальный аденинфосфорибозилтрансферазный «реутилизационный» путь, и вместо этого аденин метаболизируется до 2,8-дигидроксиаденина, выпадающего в осадок и образующего кристаллы в канальцах почек из-за своей низкой растворимости. Эти кристаллы вызывают повреждение канальцев, воспаление, обструкцию и фиброз в почках, приводя к фенотипу, соответствующему CKD у человека. Развивающиеся в результате повреждение почек и почечная недостаточность приводят к нарушению выведения фосфата, результатом чего являются аномально высокие уровни Pi в сыворотке и расстройство минерального обмена, такое как генерализованная кальцификация мягких тканей. Высокий уровень фосфора в корме ускоряет артериальную кальцификацию. У крыс, получающих корм с высоким содержанием аденина, развиваются уремия, гиперфосфатемия, вторичный гиперпаратиреоз, почечная остеодистрофия и кальцификация сосудов.
Получение плазмы
Кровь отбирали посредством кардиальной пункции и сразу перемешивали (9:1, об. : об., кровь к 110 мМ раствору лимонной кислоты). Отбор сыворотки приводит к высвобождению избыточного количества пирофосфата (PPi) из тромбоцитов, а ингибирование свертывания с использованием EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота) может повлиять на результаты анализа. Пробирки с цитратной кровью покачивали в течение нескольких минут и затем центрифугировали при 2000×g в течение 10-15 мин. Отбирали верхний слой плазмы (100-300 мкл) и приблизительно 200 мкл наносили на 10 кДа Centricon. Эти пробирки затем центрифугировали при 12000×g для депротеинизации плазмы. После центрифугирования проточную жидкость собирали в новую пробирку. До анализа плазму и депротеинизированные образцы замораживают при -20°С.
Флуорометрический анализ PPi
В этом анализе используют флуорогенный PPi-сенсор, интенсивность флуоресценции которого пропорциональным образом зависит от концентрации PPi. Образцы, профильтрованные через 10 кДа фильтр (4 мкл), добавляли к 46 мкл аналитического буфера. Исходный раствор PPi-сенсора (200х) разводили в аналитическом буфере и 50 мкл добавляли в образец. После инкубации при комнатной температуре в течение 20 мин в черном 96-луночном планшете определяли флуоресценцию (Ex/Em=316/456 нм).
Анализы
Активность NPP1 измеряли, как описано ранее (Villa-Bellosta, R. et al., Am J Physiol Heart Circ Physiol 2011, 301, H61-H68). Кратко, плазму добавляли к 20 объемам физиологического буфера, содержащего 200 нМ АТФ и 1,5 мкКи [32Р]АТФ/мл, на 10 минут при 37°С. Реакционную смесь затем разделяли посредством тонкослойной хроматографии на полиэтилениминцеллюлозе и количество образованного PPi определяли посредством денситометрии авторадиограмм. PPi измеряли, как описано ранее (Lomashvili, K.A. et al., Kidney Int 2014, 85, 1351-1356), с применением свежепрофильтрованной (через 30 кДа фильтр с ограниченной полосой пропускания) плазмы и ферментного анализа, основанного на превращении PPi и UDP-глюкозы в UTP и глюкозо-1-фосфат под действием UDP-глюкозопирофосфорилазы. Всю используемую воду предварительно обрабатывали гидроксиапатитом для удаления примесей PPi. Кальций в аорте измеряли калориметрически в HCI-кислых экстрактах высушенных аорт, как описано ранее (Lomashvili, K.A. et al., Kidney Int 2014, 85, 1351-1356). Содержание кальция нормализовали по сухой массе и частичные уменьшения кальцификации определяли после вычитания содержания кальция в нормальных мышиных аортах.
Фракционирование клеток крови
Для получения лейкоцитов и тромбоцитов свежую гепаринизированную человеческую кровь центрифугировали при 250 g в течение 15 минут при комнатной температуре. Плазму удаляли и центрифугировали при 2200 g в течение 12 минут для получения тромбоцитов. Осадок после первого центрифугирования ресуспендировали в нормальном физиологическом растворе до исходного объема крови и добавляли 4 объема лизирующего буфера (155 ммоль/л хлорида аммония; 10 ммоль/л бикарбоната натрия; 0,1 ммоль/л EDTA, рН 7,4) на льду на 5-10 минут. Это повторяли после центрифугирования и удаления супернатанта, получая очищенные лейкоциты после завершающего центрифугирования.
Статистический анализ
Непрерывные переменные выражали как средние значения плюс/минус стандартные ошибки и различия определяли критерием Стьюдента. Содержание кальция в аортах анализировали после логарифмической трансформации.
Пример I
Вводная информация. Эксперимент проводили для определения того, присутствует ли повышение уровней PPi у мышей дикого типа, которым вводят варианты sNPP1. Для этого при однократном внутривенном введении была выбрана временная точка 1 час, а при однократном подкожном введении - временная точка 4 часа. Оценку уровней PPi проводили посредством флуорометрического анализа PPi (Abcam).
Результаты. Необработанные данные от 1 мин (всего 9 значений) усредняли и переводили в % от нормальной плазмы (WT). Таблица 2.
Внутривенная или подкожная инъекция вариантов белка sNPP1 (5 мг/кг) мышам дикого типа демонстрирует повышение концентрации PPi выше нормальных уровней плазмы, как показано на Фиг. 5. На Фиг. 5 показан уровень пирофосфата в крови мышей дикого типа после введения sNPP1-Fc или sNPP1-Fc-D10 внутривенно (1 час после инъекции) и подкожно (4 часа после инъекции).
Пример II
Нокаутным мышам Enpp1(-/-) подкожно вводили наполнитель или 6 мг/кг sNPP1-Fc-D10 через сутки на протяжении периода продолжительностью 21 сутки. Показаны уровни кальция в аорте у самцов и самок. На Фиг. 6 показано эффективное предотвращение кальцификации аорты у мышей Enpp1(-/-) посредством введения sNPP1-Fc-D10.
Пример III
Нокаутным мышам Enpp1(-/-) вводили 6 мг/кг sNPP1-Fc-D10 внутривенно для определения уровней PPi и ферментативной активности в крови. Как показано на Фиг. 7, во временных точках 0, 4, 24, 48 и 72 часа получали плазму и анализировали ее на предмет уровней активности NPP1 (прерывистая линия) и PPi (сплошная линия). Было определено, что уровень PPi у мышей дикого типа составлял 2,18 мкМ (данные не показаны). Горизонтальными прерывистыми линиями показаны уровни PPi для мышей дикого типа, гетерозиготных мышей Enpp1(+/-) и гомозиготных мышей Enpp1(-/-) (Li et al., 2013). Профили sNPP1-Fc были сходны с профилями sNPP1-Fc-D10.
Пример IV
asj
asj
Мыши дикого типа и Enpp1 с рождения получали корм с высоким содержанием фосфора и низким содержанием магния. Наполнитель или sNPP1-Fc (5 мг/кг) вводили подкожно через сутки, начиная с возраста 14 суток. Кривые выживаемости Каплана-Мейера продемонстрировали, что более 50% asj-мышей умерли до 6 недель, а к 9 неделям умерли все животные. Для сравнения, 50% животных, получавших sNPP1-Fc, выжили после 7 недель и все еще живы в 9 недель. На Фиг. 8 показана повышенная выживаемость самцов гомозиготных Enpp1 мышей, получавших 5 мг/кг sNPP1-Fc, в сравнении с мышами, получавшими наполнитель.
Пример V
asj
asj
asj
asj
asj
asj
asj
Мыши дикого типа и Enpp1 с рождения получали корм с высоким содержанием фосфора и низким содержанием магния и, начиная с возраста 14 суток, получали наполнитель или sNPP1-Fc (5 мг/кг) подкожно через сутки для определения темпов роста. Как показано на Фиг. 9А и 9В, строили диаграмму процента прироста массы тела для мышей дикого типа (сплошные линии) и Enpp1 (кружки) в возрасте от двух до девяти недель. На Фиг. 9А и 9В показан повышенный процент прибавки массы тела у самцов мышей Enpp1, получавших 5 мг/кг sNPP1-Fc, в сравнении с мышами, получавшими наполнитель. В группе наполнителя к девяти неделям все животные Enpp1умерли (незакрашенные кружки, верхнее изображение). Для сравнения, в группе введения sNPP1-Fc к концу девятой недели пять мышей Enpp1 были живы (закрашенные кружки) и пять умерли (незакрашенные кружки). На Фиг. 10А-10С показаны изображения мыши дикого типа (Фиг. 10А, сверху), мыши Enpp1, получавшей наполнитель (Фиг. 10В, посередине), и мыши Enpp1, получавшей sNPP1-Fc (5 мг/кг) (Фиг. 10С, снизу).
Пример VI
asj
asj
+/+
asj/asj
asj/asj
У самцов мышей дикого типа и Enpp1 измеряли FGF-23 (фактор роста фибробластов 23), биомаркер фосфатного метаболизма. Мыши дикого типа и Enpp1 с рождения получали корм с высоким содержанием фосфора и низким содержанием магния (TD.00442, Harlan). Наполнитель или sNPP1-Fc-D10 (5 мг/кг) вводили подкожно через сутки, начиная с возраста 18 суток. Все образцы сыворотки получали через 24 часа после дозирования и анализировали с использованием набора FGF-23 ELISA kit (Kainos Laboratories Inc., Tokyo, Japan) для мышей. Уровни FGF-23 измеряли у мышей Enpp1, получавших наполнитель (сплошная черная линия), Enpp1, получавших наполнитель (прерывистая черная линия), и Enpp1, получавших sNPP1-Fc-D10 (сплошная серая линия), исходно (0 сутки), перед началом лечения и во время лечения.
asj/asj
asj/asj
asj
asj
У мышей Enpp1 уровни FGF-23 повышались по мере прогрессирования заболевания (к 9 суткам [к возрасту 27 суток]). Тем не менее, мыши Enpp1, получавшие 5 мг/кг sNPP1-Fc-D10, продемонстрировали снижение уровня FGF-23 по сравнению с группой, получавшей наполнитель, к 17 суткам введения. * р меньше 0,05 согласно однофакторному ANOVA (дисперсионный анализ) или t-критерию Стьюдента. На Фиг. 11 показаны уровни фактора роста фибробластов у мышей Enpp1, получавших наполнитель (посередине), и мышей Enpp1, получавших sNPP1-Fc (5 мг/кг) (снизу).
Пример VII: Активность in vitro и in vivo
Рекомбинантный sNPP1-Fc-D10 полностью гидролизовал АТФ до PPi in vitro без гидролиза PPi до ортофосфата, как показано на Фиг. 13А.
-/-
Ферментативная активность в плазме показана на Фиг. 13В. Существенная активность присутствовала в плазме мышей дикого типа, при этом несколько больше одной трети АТФ превращалось в PPi за 10 минут, что соответствует активности в 7,6±1,0 нмоль/ч/мл. Оставшаяся часть превращалась в ортофосфат под действием нуклеотидтрифосфатаз. Плазма мышей Enpp1 была по существу лишена NPP1, при этом небольшое количество PPi соответствовало примеси PPi в [32Р] АТФ. Активность была заметно повышена до 10,3±0,3 нмоль/ч/мл через два часа после внутривенной инъекции NPP1 (5 мг/кг), и этому сопутствовало повышение PPi плазмы от 0,07±0,02 до 1,00±0,14 мкМ, по сравнению с уровнем 2,39±0,37 мкМ у мышей дикого типа.
-/-
В аортах активность NPP1 не поддавалась выявлению ни у мышей дикого типа, ни у мышей Enpp1, и не увеличивалась после введения NPP1, как показано на Фиг. 13С. Активность также не была выявлена в печени после введения рекомбинантной NPP1.
-/-
Динамика активности NPP1 и концентрации PPi плазмы после подкожного введения в дозе 5 мг/кг мышам Enpp1 показана на Фиг. 14. Пик активности NPP1 и концентрации PPi наблюдали через 12 часов после введения на уровнях, составлявших 195% и 41% относительно соответствующих уровней у однопометных животных дикого типа. Уровни быстро снижались и через 24 часа почти не поддавались определению.
Подкожное введение sNPP1-Fc-D10 (5 мг/кг) демонстрирует корреляцию уровней PPi плазмы и активности NPP1 плазмы, как показано на Фиг. 15. Корреляция PPi плазмы и NPP1 плазмы указывала на то, что PPi образовался в циркулирующей крови. Это анализировали, инкубируя свежую человеческую кровь с рекомбинантой NPP1 и измеряя затем PPi плазмы. Человеческую кровь попользовали из-за ограниченного объема крови, который можно получить у мышей. Количество NPP1, добавляемое в кровь, рассчитывали, чтобы получить уровни, сходные с полученными после введения мышам.
На Фиг. 16А показано, что рекомбинантная NPP1 повышала PPi плазмы при ее добавлении в цельную кровь на 2 часа, но не при добавлении в плазму саму по себе, что указывает на необходимость присутствия клеток. Для оценки роли эритроцитов относительно других клеток кровь центрифугировали и отбирали плазму, оставляя или не оставляя лейкоцитную пленку. Затем добавляли HEPES-забуференный физиологический раствор для восстановления исходного гематокрита. Как показано на Фиг. 16В, образование происходило только при оставлении лейкоцитной пленки, указывая на необходимость присутствия лейкоцитов или тромбоцитов, но не эритроцитов. Инкубация выделенных лейкоцитов или тромбоцитов в HEPES-забуференном физиологическом растворе показала, что клетки обоих типов высвобождали или образовывали PPi, но синтез в ответ на экзогенную NPP1 происходил только в случае лейкоцитов, как показано на Фиг. 16С.
Пример VIII: Терапевтические модели
А. Дефицит NPP1
-/-
Мыши Enpp1 получали корм с высоким содержанием фосфатов и наполнитель или sNPP1-Fc-D10 (6 мг/кг) подкожно через сутки, как показано на Фиг. 17, для определения эффекта рекомбинантной NPP1 на артериальную кальцификацию. Каждой мыши, получавшей лечение, соответствовала парная мышь того же пола и сходного возраста, получавшая только наполнитель в том же объеме. Через 18 суток среднее содержание кальция в аорте составило 61±30 нмоль/мг у мышей, получавших наполнитель, и 8,8±1,0 нмоль/мг у мышей, получавших рекомбинантную NPP1 (р равно 0,016). У однопометных животных дикого типа содержание составляло 6,3±3,4 нмоль/мг (n равно 16). Содержание было повышено (на два стандартных отклонения больше, чем у однопометных животных дикого типа) в 6 из 8 контрольных аорт (80±37 нмоль/мг) и только в одной аорте у животных, получавших лечение (15 нмоль/мг). У пар, где в контрольных аортах присутствовала кальцификация, это представляло собой уменьшение кальцификации на 91±2%.
-/-
Для определения возможного накопления NPP1 после многократного введения измеряли активность NPP1 и PPi плазмы посмертно (через 24 часа после инъекции), при этом оба показателя не поддавались определению. В отдельной группе мышей Enpp1 активность NPP1 в аорте не поддавалась определению после 3 инъекций рекомбинантной NPP1 через сутки.
В. Хроническое заболевание почек
В этом примере показана эффективность sNPP1-Fc-D10 в лечении хронического заболевания почек (CKD) в моделях уремии у крыс. Для определения эффекта рекомбинантной NPP1 на артериальную кальцификацию у крыс с уремией и почечной недостаточностью крысам с уремией давали корм с высоким содержанием аденина и подкожно инъецировали контроль или sNPP1-Fc-D10 (5 мг/кг), 5 доз в неделю, как показано на Фиг. 18. Через 21 сутки лечения среднее содержание кальция в аорте составило 25,7±4,9 нмоль/мг у крыс, получавших контроль, и 7,0±1,0 нмоль/мг у крыс, получавших рекомбинантную NPP1 (р равно 0,0068). Нормальное содержание кальция в аорте составляло 5 нмоль/мг.
Примеры VII и VIII демонстрируют активность sNPP1 и эффективное применение sNPP1 в моделях дефицита эктонуклеотидпирофосфатпирофосфорилазы и хронического заболевания почек. Эти примеры показывают, что временного повышения PPi достаточно для эффективной терапии кальцификации сосудов и дефицита NPP1.
ЭКВИВАЛЕНТЫ
Несмотря на то, что изобретение было подробно продемонстрировано и описано со ссылкой на его типичные воплощения, специалистам в данной области будет ясно, что возможны различные изменения, по форме и в частностях, без выхода за рамки объема изобретения, охваченного приложенной формулой изобретения.
--->
SEQUENCE LISTING
<110> ALEXION PHARMACEUTICALS, INC.
<120> METHODS OF TREATING TISSUE CALCIFICATION
<130> 081245-0208
<140>
<141>
<150> 62/249,781
<151> 2015-11-02
<150> 62/094,943
<151> 2014-12-19
<160> 19
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 925
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Met Glu Arg Asp Gly Cys Ala Gly Gly Gly Ser Arg Gly Gly Glu Gly
1               5                   10                  15
Gly Arg Ala Pro Arg Glu Gly Pro Ala Gly Asn Gly Arg Asp Arg Gly
20                  25                  30
Arg Ser His Ala Ala Glu Ala Pro Gly Asp Pro Gln Ala Ala Ala Ser
35                  40                  45
Leu Leu Ala Pro Met Asp Val Gly Glu Glu Pro Leu Glu Lys Ala Ala
50                  55                  60
Arg Ala Arg Thr Ala Lys Asp Pro Asn Thr Tyr Lys Val Leu Ser Leu
65                  70                  75                  80
Val Leu Ser Val Cys Val Leu Thr Thr Ile Leu Gly Cys Ile Phe Gly
85                  90                  95
Leu Lys Pro Ser Cys Ala Lys Glu Val Lys Ser Cys Lys Gly Arg Cys
100                 105                 110
Phe Glu Arg Thr Phe Gly Asn Cys Arg Cys Asp Ala Ala Cys Val Glu
115                 120                 125
Leu Gly Asn Cys Cys Leu Asp Tyr Gln Glu Thr Cys Ile Glu Pro Glu
130                 135                 140
His Ile Trp Thr Cys Asn Lys Phe Arg Cys Gly Glu Lys Arg Leu Thr
145                 150                 155                 160
Arg Ser Leu Cys Ala Cys Ser Asp Asp Cys Lys Asp Lys Gly Asp Cys
165                 170                 175
Cys Ile Asn Tyr Ser Ser Val Cys Gln Gly Glu Lys Ser Trp Val Glu
180                 185                 190
Glu Pro Cys Glu Ser Ile Asn Glu Pro Gln Cys Pro Ala Gly Phe Glu
195                 200                 205
Thr Pro Pro Thr Leu Leu Phe Ser Leu Asp Gly Phe Arg Ala Glu Tyr
210                 215                 220
Leu His Thr Trp Gly Gly Leu Leu Pro Val Ile Ser Lys Leu Lys Lys
225                 230                 235                 240
Cys Gly Thr Tyr Thr Lys Asn Met Arg Pro Val Tyr Pro Thr Lys Thr
245                 250                 255
Phe Pro Asn His Tyr Ser Ile Val Thr Gly Leu Tyr Pro Glu Ser His
260                 265                 270
Gly Ile Ile Asp Asn Lys Met Tyr Asp Pro Lys Met Asn Ala Ser Phe
275                 280                 285
Ser Leu Lys Ser Lys Glu Lys Phe Asn Pro Glu Trp Tyr Lys Gly Glu
290                 295                 300
Pro Ile Trp Val Thr Ala Lys Tyr Gln Gly Leu Lys Ser Gly Thr Phe
305                 310                 315                 320
Phe Trp Pro Gly Ser Asp Val Glu Ile Asn Gly Ile Phe Pro Asp Ile
325                 330                 335
Tyr Lys Met Tyr Asn Gly Ser Val Pro Phe Glu Glu Arg Ile Leu Ala
340                 345                 350
Val Leu Gln Trp Leu Gln Leu Pro Lys Asp Glu Arg Pro His Phe Tyr
355                 360                 365
Thr Leu Tyr Leu Glu Glu Pro Asp Ser Ser Gly His Ser Tyr Gly Pro
370                 375                 380
Val Ser Ser Glu Val Ile Lys Ala Leu Gln Arg Val Asp Gly Met Val
385                 390                 395                 400
Gly Met Leu Met Asp Gly Leu Lys Glu Leu Asn Leu His Arg Cys Leu
405                 410                 415
Asn Leu Ile Leu Ile Ser Asp His Gly Met Glu Gln Gly Ser Cys Lys
420                 425                 430
Lys Tyr Ile Tyr Leu Asn Lys Tyr Leu Gly Asp Val Lys Asn Ile Lys
435                 440                 445
Val Ile Tyr Gly Pro Ala Ala Arg Leu Arg Pro Ser Asp Val Pro Asp
450                 455                 460
Lys Tyr Tyr Ser Phe Asn Tyr Glu Gly Ile Ala Arg Asn Leu Ser Cys
465                 470                 475                 480
Arg Glu Pro Asn Gln His Phe Lys Pro Tyr Leu Lys His Phe Leu Pro
485                 490                 495
Lys Arg Leu His Phe Ala Lys Ser Asp Arg Ile Glu Pro Leu Thr Phe
500                 505                 510
Tyr Leu Asp Pro Gln Trp Gln Leu Ala Leu Asn Pro Ser Glu Arg Lys
515                 520                 525
Tyr Cys Gly Ser Gly Phe His Gly Ser Asp Asn Val Phe Ser Asn Met
530                 535                 540
Gln Ala Leu Phe Val Gly Tyr Gly Pro Gly Phe Lys His Gly Ile Glu
545                 550                 555                 560
Ala Asp Thr Phe Glu Asn Ile Glu Val Tyr Asn Leu Met Cys Asp Leu
565                 570                 575
Leu Asn Leu Thr Pro Ala Pro Asn Asn Gly Thr His Gly Ser Leu Asn
580                 585                 590
His Leu Leu Lys Asn Pro Val Tyr Thr Pro Lys His Pro Lys Glu Val
595                 600                 605
His Pro Leu Val Gln Cys Pro Phe Thr Arg Asn Pro Arg Asp Asn Leu
610                 615                 620
Gly Cys Ser Cys Asn Pro Ser Ile Leu Pro Ile Glu Asp Phe Gln Thr
625                 630                 635                 640
Gln Phe Asn Leu Thr Val Ala Glu Glu Lys Ile Ile Lys His Glu Thr
645                 650                 655
Leu Pro Tyr Gly Arg Pro Arg Val Leu Gln Lys Glu Asn Thr Ile Cys
660                 665                 670
Leu Leu Ser Gln His Gln Phe Met Ser Gly Tyr Ser Gln Asp Ile Leu
675                 680                 685
Met Pro Leu Trp Thr Ser Tyr Thr Val Asp Arg Asn Asp Ser Phe Ser
690                 695                 700
Thr Glu Asp Phe Ser Asn Cys Leu Tyr Gln Asp Phe Arg Ile Pro Leu
705                 710                 715                 720
Ser Pro Val His Lys Cys Ser Phe Tyr Lys Asn Asn Thr Lys Val Ser
725                 730                 735
Tyr Gly Phe Leu Ser Pro Pro Gln Leu Asn Lys Asn Ser Ser Gly Ile
740                 745                 750
Tyr Ser Glu Ala Leu Leu Thr Thr Asn Ile Val Pro Met Tyr Gln Ser
755                 760                 765
Phe Gln Val Ile Trp Arg Tyr Phe His Asp Thr Leu Leu Arg Lys Tyr
770                 775                 780
Ala Glu Glu Arg Asn Gly Val Asn Val Val Ser Gly Pro Val Phe Asp
785                 790                 795                 800
Phe Asp Tyr Asp Gly Arg Cys Asp Ser Leu Glu Asn Leu Arg Gln Lys
805                 810                 815
Arg Arg Val Ile Arg Asn Gln Glu Ile Leu Ile Pro Thr His Phe Phe
820                 825                 830
Ile Val Leu Thr Ser Cys Lys Asp Thr Ser Gln Thr Pro Leu His Cys
835                 840                 845
Glu Asn Leu Asp Thr Leu Ala Phe Ile Leu Pro His Arg Thr Asp Asn
850                 855                 860
Ser Glu Ser Cys Val His Gly Lys His Asp Ser Ser Trp Val Glu Glu
865                 870                 875                 880
Leu Leu Met Leu His Arg Ala Arg Ile Thr Asp Val Glu His Ile Thr
885                 890                 895
Gly Leu Ser Phe Tyr Gln Gln Arg Lys Glu Pro Val Ser Asp Ile Leu
900                 905                 910
Lys Leu Lys Thr His Leu Pro Thr Phe Ser Gln Glu Asp
915                 920                 925
<210> 2
<211> 827
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 2
Pro Ser Cys Ala Lys Glu Val Lys Ser Cys Lys Gly Arg Cys Phe Glu
1               5                   10                  15
Arg Thr Phe Gly Asn Cys Arg Cys Asp Ala Ala Cys Val Glu Leu Gly
20                  25                  30
Asn Cys Cys Leu Asp Tyr Gln Glu Thr Cys Ile Glu Pro Glu His Ile
35                  40                  45
Trp Thr Cys Asn Lys Phe Arg Cys Gly Glu Lys Arg Leu Thr Arg Ser
50                  55                  60
Leu Cys Ala Cys Ser Asp Asp Cys Lys Asp Lys Gly Asp Cys Cys Ile
65                  70                  75                  80
Asn Tyr Ser Ser Val Cys Gln Gly Glu Lys Ser Trp Val Glu Glu Pro
85                  90                  95
Cys Glu Ser Ile Asn Glu Pro Gln Cys Pro Ala Gly Phe Glu Thr Pro
100                 105                 110
Pro Thr Leu Leu Phe Ser Leu Asp Gly Phe Arg Ala Glu Tyr Leu His
115                 120                 125
Thr Trp Gly Gly Leu Leu Pro Val Ile Ser Lys Leu Lys Lys Cys Gly
130                 135                 140
Thr Tyr Thr Lys Asn Met Arg Pro Val Tyr Pro Thr Lys Thr Phe Pro
145                 150                 155                 160
Asn His Tyr Ser Ile Val Thr Gly Leu Tyr Pro Glu Ser His Gly Ile
165                 170                 175
Ile Asp Asn Lys Met Tyr Asp Pro Lys Met Asn Ala Ser Phe Ser Leu
180                 185                 190
Lys Ser Lys Glu Lys Phe Asn Pro Glu Trp Tyr Lys Gly Glu Pro Ile
195                 200                 205
Trp Val Thr Ala Lys Tyr Gln Gly Leu Lys Ser Gly Thr Phe Phe Trp
210                 215                 220
Pro Gly Ser Asp Val Glu Ile Asn Gly Ile Phe Pro Asp Ile Tyr Lys
225                 230                 235                 240
Met Tyr Asn Gly Ser Val Pro Phe Glu Glu Arg Ile Leu Ala Val Leu
245                 250                 255
Gln Trp Leu Gln Leu Pro Lys Asp Glu Arg Pro His Phe Tyr Thr Leu
260                 265                 270
Tyr Leu Glu Glu Pro Asp Ser Ser Gly His Ser Tyr Gly Pro Val Ser
275                 280                 285
Ser Glu Val Ile Lys Ala Leu Gln Arg Val Asp Gly Met Val Gly Met
290                 295                 300
Leu Met Asp Gly Leu Lys Glu Leu Asn Leu His Arg Cys Leu Asn Leu
305                 310                 315                 320
Ile Leu Ile Ser Asp His Gly Met Glu Gln Gly Ser Cys Lys Lys Tyr
325                 330                 335
Ile Tyr Leu Asn Lys Tyr Leu Gly Asp Val Lys Asn Ile Lys Val Ile
340                 345                 350
Tyr Gly Pro Ala Ala Arg Leu Arg Pro Ser Asp Val Pro Asp Lys Tyr
355                 360                 365
Tyr Ser Phe Asn Tyr Glu Gly Ile Ala Arg Asn Leu Ser Cys Arg Glu
370                 375                 380
Pro Asn Gln His Phe Lys Pro Tyr Leu Lys His Phe Leu Pro Lys Arg
385                 390                 395                 400
Leu His Phe Ala Lys Ser Asp Arg Ile Glu Pro Leu Thr Phe Tyr Leu
405                 410                 415
Asp Pro Gln Trp Gln Leu Ala Leu Asn Pro Ser Glu Arg Lys Tyr Cys
420                 425                 430
Gly Ser Gly Phe His Gly Ser Asp Asn Val Phe Ser Asn Met Gln Ala
435                 440                 445
Leu Phe Val Gly Tyr Gly Pro Gly Phe Lys His Gly Ile Glu Ala Asp
450                 455                 460
Thr Phe Glu Asn Ile Glu Val Tyr Asn Leu Met Cys Asp Leu Leu Asn
465                 470                 475                 480
Leu Thr Pro Ala Pro Asn Asn Gly Thr His Gly Ser Leu Asn His Leu
485                 490                 495
Leu Lys Asn Pro Val Tyr Thr Pro Lys His Pro Lys Glu Val His Pro
500                 505                 510
Leu Val Gln Cys Pro Phe Thr Arg Asn Pro Arg Asp Asn Leu Gly Cys
515                 520                 525
Ser Cys Asn Pro Ser Ile Leu Pro Ile Glu Asp Phe Gln Thr Gln Phe
530                 535                 540
Asn Leu Thr Val Ala Glu Glu Lys Ile Ile Lys His Glu Thr Leu Pro
545                 550                 555                 560
Tyr Gly Arg Pro Arg Val Leu Gln Lys Glu Asn Thr Ile Cys Leu Leu
565                 570                 575
Ser Gln His Gln Phe Met Ser Gly Tyr Ser Gln Asp Ile Leu Met Pro
580                 585                 590
Leu Trp Thr Ser Tyr Thr Val Asp Arg Asn Asp Ser Phe Ser Thr Glu
595                 600                 605
Asp Phe Ser Asn Cys Leu Tyr Gln Asp Phe Arg Ile Pro Leu Ser Pro
610                 615                 620
Val His Lys Cys Ser Phe Tyr Lys Asn Asn Thr Lys Val Ser Tyr Gly
625                 630                 635                 640
Phe Leu Ser Pro Pro Gln Leu Asn Lys Asn Ser Ser Gly Ile Tyr Ser
645                 650                 655
Glu Ala Leu Leu Thr Thr Asn Ile Val Pro Met Tyr Gln Ser Phe Gln
660                 665                 670
Val Ile Trp Arg Tyr Phe His Asp Thr Leu Leu Arg Lys Tyr Ala Glu
675                 680                 685
Glu Arg Asn Gly Val Asn Val Val Ser Gly Pro Val Phe Asp Phe Asp
690                 695                 700
Tyr Asp Gly Arg Cys Asp Ser Leu Glu Asn Leu Arg Gln Lys Arg Arg
705                 710                 715                 720
Val Ile Arg Asn Gln Glu Ile Leu Ile Pro Thr His Phe Phe Ile Val
725                 730                 735
Leu Thr Ser Cys Lys Asp Thr Ser Gln Thr Pro Leu His Cys Glu Asn
740                 745                 750
Leu Asp Thr Leu Ala Phe Ile Leu Pro His Arg Thr Asp Asn Ser Glu
755                 760                 765
Ser Cys Val His Gly Lys His Asp Ser Ser Trp Val Glu Glu Leu Leu
770                 775                 780
Met Leu His Arg Ala Arg Ile Thr Asp Val Glu His Ile Thr Gly Leu
785                 790                 795                 800
Ser Phe Tyr Gln Gln Arg Lys Glu Pro Val Ser Asp Ile Leu Lys Leu
805                 810                 815
Lys Thr His Leu Pro Thr Phe Ser Gln Glu Asp
820                 825
<210> 3
<211> 1058
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 3
Pro Ser Cys Ala Lys Glu Val Lys Ser Cys Lys Gly Arg Cys Phe Glu
1               5                   10                  15
Arg Thr Phe Gly Asn Cys Arg Cys Asp Ala Ala Cys Val Glu Leu Gly
20                  25                  30
Asn Cys Cys Leu Asp Tyr Gln Glu Thr Cys Ile Glu Pro Glu His Ile
35                  40                  45
Trp Thr Cys Asn Lys Phe Arg Cys Gly Glu Lys Arg Leu Thr Arg Ser
50                  55                  60
Leu Cys Ala Cys Ser Asp Asp Cys Lys Asp Lys Gly Asp Cys Cys Ile
65                  70                  75                  80
Asn Tyr Ser Ser Val Cys Gln Gly Glu Lys Ser Trp Val Glu Glu Pro
85                  90                  95
Cys Glu Ser Ile Asn Glu Pro Gln Cys Pro Ala Gly Phe Glu Thr Pro
100                 105                 110
Pro Thr Leu Leu Phe Ser Leu Asp Gly Phe Arg Ala Glu Tyr Leu His
115                 120                 125
Thr Trp Gly Gly Leu Leu Pro Val Ile Ser Lys Leu Lys Lys Cys Gly
130                 135                 140
Thr Tyr Thr Lys Asn Met Arg Pro Val Tyr Pro Thr Lys Thr Phe Pro
145                 150                 155                 160
Asn His Tyr Ser Ile Val Thr Gly Leu Tyr Pro Glu Ser His Gly Ile
165                 170                 175
Ile Asp Asn Lys Met Tyr Asp Pro Lys Met Asn Ala Ser Phe Ser Leu
180                 185                 190
Lys Ser Lys Glu Lys Phe Asn Pro Glu Trp Tyr Lys Gly Glu Pro Ile
195                 200                 205
Trp Val Thr Ala Lys Tyr Gln Gly Leu Lys Ser Gly Thr Phe Phe Trp
210                 215                 220
Pro Gly Ser Asp Val Glu Ile Asn Gly Ile Phe Pro Asp Ile Tyr Lys
225                 230                 235                 240
Met Tyr Asn Gly Ser Val Pro Phe Glu Glu Arg Ile Leu Ala Val Leu
245                 250                 255
Gln Trp Leu Gln Leu Pro Lys Asp Glu Arg Pro His Phe Tyr Thr Leu
260                 265                 270
Tyr Leu Glu Glu Pro Asp Ser Ser Gly His Ser Tyr Gly Pro Val Ser
275                 280                 285
Ser Glu Val Ile Lys Ala Leu Gln Arg Val Asp Gly Met Val Gly Met
290                 295                 300
Leu Met Asp Gly Leu Lys Glu Leu Asn Leu His Arg Cys Leu Asn Leu
305                 310                 315                 320
Ile Leu Ile Ser Asp His Gly Met Glu Gln Gly Ser Cys Lys Lys Tyr
325                 330                 335
Ile Tyr Leu Asn Lys Tyr Leu Gly Asp Val Lys Asn Ile Lys Val Ile
340                 345                 350
Tyr Gly Pro Ala Ala Arg Leu Arg Pro Ser Asp Val Pro Asp Lys Tyr
355                 360                 365
Tyr Ser Phe Asn Tyr Glu Gly Ile Ala Arg Asn Leu Ser Cys Arg Glu
370                 375                 380
Pro Asn Gln His Phe Lys Pro Tyr Leu Lys His Phe Leu Pro Lys Arg
385                 390                 395                 400
Leu His Phe Ala Lys Ser Asp Arg Ile Glu Pro Leu Thr Phe Tyr Leu
405                 410                 415
Asp Pro Gln Trp Gln Leu Ala Leu Asn Pro Ser Glu Arg Lys Tyr Cys
420                 425                 430
Gly Ser Gly Phe His Gly Ser Asp Asn Val Phe Ser Asn Met Gln Ala
435                 440                 445
Leu Phe Val Gly Tyr Gly Pro Gly Phe Lys His Gly Ile Glu Ala Asp
450                 455                 460
Thr Phe Glu Asn Ile Glu Val Tyr Asn Leu Met Cys Asp Leu Leu Asn
465                 470                 475                 480
Leu Thr Pro Ala Pro Asn Asn Gly Thr His Gly Ser Leu Asn His Leu
485                 490                 495
Leu Lys Asn Pro Val Tyr Thr Pro Lys His Pro Lys Glu Val His Pro
500                 505                 510
Leu Val Gln Cys Pro Phe Thr Arg Asn Pro Arg Asp Asn Leu Gly Cys
515                 520                 525
Ser Cys Asn Pro Ser Ile Leu Pro Ile Glu Asp Phe Gln Thr Gln Phe
530                 535                 540
Asn Leu Thr Val Ala Glu Glu Lys Ile Ile Lys His Glu Thr Leu Pro
545                 550                 555                 560
Tyr Gly Arg Pro Arg Val Leu Gln Lys Glu Asn Thr Ile Cys Leu Leu
565                 570                 575
Ser Gln His Gln Phe Met Ser Gly Tyr Ser Gln Asp Ile Leu Met Pro
580                 585                 590
Leu Trp Thr Ser Tyr Thr Val Asp Arg Asn Asp Ser Phe Ser Thr Glu
595                 600                 605
Asp Phe Ser Asn Cys Leu Tyr Gln Asp Phe Arg Ile Pro Leu Ser Pro
610                 615                 620
Val His Lys Cys Ser Phe Tyr Lys Asn Asn Thr Lys Val Ser Tyr Gly
625                 630                 635                 640
Phe Leu Ser Pro Pro Gln Leu Asn Lys Asn Ser Ser Gly Ile Tyr Ser
645                 650                 655
Glu Ala Leu Leu Thr Thr Asn Ile Val Pro Met Tyr Gln Ser Phe Gln
660                 665                 670
Val Ile Trp Arg Tyr Phe His Asp Thr Leu Leu Arg Lys Tyr Ala Glu
675                 680                 685
Glu Arg Asn Gly Val Asn Val Val Ser Gly Pro Val Phe Asp Phe Asp
690                 695                 700
Tyr Asp Gly Arg Cys Asp Ser Leu Glu Asn Leu Arg Gln Lys Arg Arg
705                 710                 715                 720
Val Ile Arg Asn Gln Glu Ile Leu Ile Pro Thr His Phe Phe Ile Val
725                 730                 735
Leu Thr Ser Cys Lys Asp Thr Ser Gln Thr Pro Leu His Cys Glu Asn
740                 745                 750
Leu Asp Thr Leu Ala Phe Ile Leu Pro His Arg Thr Asp Asn Ser Glu
755                 760                 765
Ser Cys Val His Gly Lys His Asp Ser Ser Trp Val Glu Glu Leu Leu
770                 775                 780
Met Leu His Arg Ala Arg Ile Thr Asp Val Glu His Ile Thr Gly Leu
785                 790                 795                 800
Ser Phe Tyr Gln Gln Arg Lys Glu Pro Val Ser Asp Ile Leu Lys Leu
805                 810                 815
Lys Thr His Leu Pro Thr Phe Ser Gln Glu Asp Pro Lys Ser Cys Asp
820                 825                 830
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala
835                 840                 845
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
850                 855                 860
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
865                 870                 875                 880
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
885                 890                 895
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
900                 905                 910
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
915                 920                 925
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
930                 935                 940
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
945                 950                 955                 960
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
965                 970                 975
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
980                 985                 990
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn  Asn Tyr Lys Thr Thr  Pro Pro Val
995                 1000                 1005
Leu Asp  Ser Asp Gly Ser Phe  Phe Leu Tyr Ser Lys  Leu Thr Val
1010                 1015                 1020
Asp Lys  Ser Arg Trp Gln Gln  Gly Asn Val Phe Ser  Cys Ser Val
1025                 1030                 1035
Met His  Glu Ala Leu His Asn  His Tyr Thr Gln Lys  Ser Leu Ser
1040                 1045                 1050
Leu Ser  Pro Gly Lys
1055
<210> 4
<211> 1068
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 4
Pro Ser Cys Ala Lys Glu Val Lys Ser Cys Lys Gly Arg Cys Phe Glu
1               5                   10                  15
Arg Thr Phe Gly Asn Cys Arg Cys Asp Ala Ala Cys Val Glu Leu Gly
20                  25                  30
Asn Cys Cys Leu Asp Tyr Gln Glu Thr Cys Ile Glu Pro Glu His Ile
35                  40                  45
Trp Thr Cys Asn Lys Phe Arg Cys Gly Glu Lys Arg Leu Thr Arg Ser
50                  55                  60
Leu Cys Ala Cys Ser Asp Asp Cys Lys Asp Lys Gly Asp Cys Cys Ile
65                  70                  75                  80
Asn Tyr Ser Ser Val Cys Gln Gly Glu Lys Ser Trp Val Glu Glu Pro
85                  90                  95
Cys Glu Ser Ile Asn Glu Pro Gln Cys Pro Ala Gly Phe Glu Thr Pro
100                 105                 110
Pro Thr Leu Leu Phe Ser Leu Asp Gly Phe Arg Ala Glu Tyr Leu His
115                 120                 125
Thr Trp Gly Gly Leu Leu Pro Val Ile Ser Lys Leu Lys Lys Cys Gly
130                 135                 140
Thr Tyr Thr Lys Asn Met Arg Pro Val Tyr Pro Thr Lys Thr Phe Pro
145                 150                 155                 160
Asn His Tyr Ser Ile Val Thr Gly Leu Tyr Pro Glu Ser His Gly Ile
165                 170                 175
Ile Asp Asn Lys Met Tyr Asp Pro Lys Met Asn Ala Ser Phe Ser Leu
180                 185                 190
Lys Ser Lys Glu Lys Phe Asn Pro Glu Trp Tyr Lys Gly Glu Pro Ile
195                 200                 205
Trp Val Thr Ala Lys Tyr Gln Gly Leu Lys Ser Gly Thr Phe Phe Trp
210                 215                 220
Pro Gly Ser Asp Val Glu Ile Asn Gly Ile Phe Pro Asp Ile Tyr Lys
225                 230                 235                 240
Met Tyr Asn Gly Ser Val Pro Phe Glu Glu Arg Ile Leu Ala Val Leu
245                 250                 255
Gln Trp Leu Gln Leu Pro Lys Asp Glu Arg Pro His Phe Tyr Thr Leu
260                 265                 270
Tyr Leu Glu Glu Pro Asp Ser Ser Gly His Ser Tyr Gly Pro Val Ser
275                 280                 285
Ser Glu Val Ile Lys Ala Leu Gln Arg Val Asp Gly Met Val Gly Met
290                 295                 300
Leu Met Asp Gly Leu Lys Glu Leu Asn Leu His Arg Cys Leu Asn Leu
305                 310                 315                 320
Ile Leu Ile Ser Asp His Gly Met Glu Gln Gly Ser Cys Lys Lys Tyr
325                 330                 335
Ile Tyr Leu Asn Lys Tyr Leu Gly Asp Val Lys Asn Ile Lys Val Ile
340                 345                 350
Tyr Gly Pro Ala Ala Arg Leu Arg Pro Ser Asp Val Pro Asp Lys Tyr
355                 360                 365
Tyr Ser Phe Asn Tyr Glu Gly Ile Ala Arg Asn Leu Ser Cys Arg Glu
370                 375                 380
Pro Asn Gln His Phe Lys Pro Tyr Leu Lys His Phe Leu Pro Lys Arg
385                 390                 395                 400
Leu His Phe Ala Lys Ser Asp Arg Ile Glu Pro Leu Thr Phe Tyr Leu
405                 410                 415
Asp Pro Gln Trp Gln Leu Ala Leu Asn Pro Ser Glu Arg Lys Tyr Cys
420                 425                 430
Gly Ser Gly Phe His Gly Ser Asp Asn Val Phe Ser Asn Met Gln Ala
435                 440                 445
Leu Phe Val Gly Tyr Gly Pro Gly Phe Lys His Gly Ile Glu Ala Asp
450                 455                 460
Thr Phe Glu Asn Ile Glu Val Tyr Asn Leu Met Cys Asp Leu Leu Asn
465                 470                 475                 480
Leu Thr Pro Ala Pro Asn Asn Gly Thr His Gly Ser Leu Asn His Leu
485                 490                 495
Leu Lys Asn Pro Val Tyr Thr Pro Lys His Pro Lys Glu Val His Pro
500                 505                 510
Leu Val Gln Cys Pro Phe Thr Arg Asn Pro Arg Asp Asn Leu Gly Cys
515                 520                 525
Ser Cys Asn Pro Ser Ile Leu Pro Ile Glu Asp Phe Gln Thr Gln Phe
530                 535                 540
Asn Leu Thr Val Ala Glu Glu Lys Ile Ile Lys His Glu Thr Leu Pro
545                 550                 555                 560
Tyr Gly Arg Pro Arg Val Leu Gln Lys Glu Asn Thr Ile Cys Leu Leu
565                 570                 575
Ser Gln His Gln Phe Met Ser Gly Tyr Ser Gln Asp Ile Leu Met Pro
580                 585                 590
Leu Trp Thr Ser Tyr Thr Val Asp Arg Asn Asp Ser Phe Ser Thr Glu
595                 600                 605
Asp Phe Ser Asn Cys Leu Tyr Gln Asp Phe Arg Ile Pro Leu Ser Pro
610                 615                 620
Val His Lys Cys Ser Phe Tyr Lys Asn Asn Thr Lys Val Ser Tyr Gly
625                 630                 635                 640
Phe Leu Ser Pro Pro Gln Leu Asn Lys Asn Ser Ser Gly Ile Tyr Ser
645                 650                 655
Glu Ala Leu Leu Thr Thr Asn Ile Val Pro Met Tyr Gln Ser Phe Gln
660                 665                 670
Val Ile Trp Arg Tyr Phe His Asp Thr Leu Leu Arg Lys Tyr Ala Glu
675                 680                 685
Glu Arg Asn Gly Val Asn Val Val Ser Gly Pro Val Phe Asp Phe Asp
690                 695                 700
Tyr Asp Gly Arg Cys Asp Ser Leu Glu Asn Leu Arg Gln Lys Arg Arg
705                 710                 715                 720
Val Ile Arg Asn Gln Glu Ile Leu Ile Pro Thr His Phe Phe Ile Val
725                 730                 735
Leu Thr Ser Cys Lys Asp Thr Ser Gln Thr Pro Leu His Cys Glu Asn
740                 745                 750
Leu Asp Thr Leu Ala Phe Ile Leu Pro His Arg Thr Asp Asn Ser Glu
755                 760                 765
Ser Cys Val His Gly Lys His Asp Ser Ser Trp Val Glu Glu Leu Leu
770                 775                 780
Met Leu His Arg Ala Arg Ile Thr Asp Val Glu His Ile Thr Gly Leu
785                 790                 795                 800
Ser Phe Tyr Gln Gln Arg Lys Glu Pro Val Ser Asp Ile Leu Lys Leu
805                 810                 815
Lys Thr His Leu Pro Thr Phe Ser Gln Glu Asp Pro Lys Ser Cys Asp
820                 825                 830
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala
835                 840                 845
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
850                 855                 860
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
865                 870                 875                 880
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
885                 890                 895
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
900                 905                 910
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
915                 920                 925
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
930                 935                 940
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
945                 950                 955                 960
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
965                 970                 975
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
980                 985                 990
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn  Asn Tyr Lys Thr Thr  Pro Pro Val
995                 1000                 1005
Leu Asp  Ser Asp Gly Ser Phe  Phe Leu Tyr Ser Lys  Leu Thr Val
1010                 1015                 1020
Asp Lys  Ser Arg Trp Gln Gln  Gly Asn Val Phe Ser  Cys Ser Val
1025                 1030                 1035
Met His  Glu Ala Leu His Asn  His Tyr Thr Gln Lys  Ser Leu Ser
1040                 1045                 1050
Leu Ser  Pro Gly Lys Asp Asp  Asp Asp Asp Asp Asp  Asp Asp Asp
1055                 1060                 1065
<210> 5
<211> 819
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 5
Ser Cys Lys Gly Arg Cys Phe Glu Arg Thr Phe Gly Asn Cys Arg Cys
1               5                   10                  15
Asp Ala Ala Cys Val Glu Leu Gly Asn Cys Cys Leu Asp Tyr Gln Glu
20                  25                  30
Thr Cys Ile Glu Pro Glu His Ile Trp Thr Cys Asn Lys Phe Arg Cys
35                  40                  45
Gly Glu Lys Arg Leu Thr Arg Ser Leu Cys Ala Cys Ser Asp Asp Cys
50                  55                  60
Lys Asp Lys Gly Asp Cys Cys Ile Asn Tyr Ser Ser Val Cys Gln Gly
65                  70                  75                  80
Glu Lys Ser Trp Val Glu Glu Pro Cys Glu Ser Ile Asn Glu Pro Gln
85                  90                  95
Cys Pro Ala Gly Phe Glu Thr Pro Pro Thr Leu Leu Phe Ser Leu Asp
100                 105                 110
Gly Phe Arg Ala Glu Tyr Leu His Thr Trp Gly Gly Leu Leu Pro Val
115                 120                 125
Ile Ser Lys Leu Lys Lys Cys Gly Thr Tyr Thr Lys Asn Met Arg Pro
130                 135                 140
Val Tyr Pro Thr Lys Thr Phe Pro Asn His Tyr Ser Ile Val Thr Gly
145                 150                 155                 160
Leu Tyr Pro Glu Ser His Gly Ile Ile Asp Asn Lys Met Tyr Asp Pro
165                 170                 175
Lys Met Asn Ala Ser Phe Ser Leu Lys Ser Lys Glu Lys Phe Asn Pro
180                 185                 190
Glu Trp Tyr Lys Gly Glu Pro Ile Trp Val Thr Ala Lys Tyr Gln Gly
195                 200                 205
Leu Lys Ser Gly Thr Phe Phe Trp Pro Gly Ser Asp Val Glu Ile Asn
210                 215                 220
Gly Ile Phe Pro Asp Ile Tyr Lys Met Tyr Asn Gly Ser Val Pro Phe
225                 230                 235                 240
Glu Glu Arg Ile Leu Ala Val Leu Gln Trp Leu Gln Leu Pro Lys Asp
245                 250                 255
Glu Arg Pro His Phe Tyr Thr Leu Tyr Leu Glu Glu Pro Asp Ser Ser
260                 265                 270
Gly His Ser Tyr Gly Pro Val Ser Ser Glu Val Ile Lys Ala Leu Gln
275                 280                 285
Arg Val Asp Gly Met Val Gly Met Leu Met Asp Gly Leu Lys Glu Leu
290                 295                 300
Asn Leu His Arg Cys Leu Asn Leu Ile Leu Ile Ser Asp His Gly Met
305                 310                 315                 320
Glu Gln Gly Ser Cys Lys Lys Tyr Ile Tyr Leu Asn Lys Tyr Leu Gly
325                 330                 335
Asp Val Lys Asn Ile Lys Val Ile Tyr Gly Pro Ala Ala Arg Leu Arg
340                 345                 350
Pro Ser Asp Val Pro Asp Lys Tyr Tyr Ser Phe Asn Tyr Glu Gly Ile
355                 360                 365
Ala Arg Asn Leu Ser Cys Arg Glu Pro Asn Gln His Phe Lys Pro Tyr
370                 375                 380
Leu Lys His Phe Leu Pro Lys Arg Leu His Phe Ala Lys Ser Asp Arg
385                 390                 395                 400
Ile Glu Pro Leu Thr Phe Tyr Leu Asp Pro Gln Trp Gln Leu Ala Leu
405                 410                 415
Asn Pro Ser Glu Arg Lys Tyr Cys Gly Ser Gly Phe His Gly Ser Asp
420                 425                 430
Asn Val Phe Ser Asn Met Gln Ala Leu Phe Val Gly Tyr Gly Pro Gly
435                 440                 445
Phe Lys His Gly Ile Glu Ala Asp Thr Phe Glu Asn Ile Glu Val Tyr
450                 455                 460
Asn Leu Met Cys Asp Leu Leu Asn Leu Thr Pro Ala Pro Asn Asn Gly
465                 470                 475                 480
Thr His Gly Ser Leu Asn His Leu Leu Lys Asn Pro Val Tyr Thr Pro
485                 490                 495
Lys His Pro Lys Glu Val His Pro Leu Val Gln Cys Pro Phe Thr Arg
500                 505                 510
Asn Pro Arg Asp Asn Leu Gly Cys Ser Cys Asn Pro Ser Ile Leu Pro
515                 520                 525
Ile Glu Asp Phe Gln Thr Gln Phe Asn Leu Thr Val Ala Glu Glu Lys
530                 535                 540
Ile Ile Lys His Glu Thr Leu Pro Tyr Gly Arg Pro Arg Val Leu Gln
545                 550                 555                 560
Lys Glu Asn Thr Ile Cys Leu Leu Ser Gln His Gln Phe Met Ser Gly
565                 570                 575
Tyr Ser Gln Asp Ile Leu Met Pro Leu Trp Thr Ser Tyr Thr Val Asp
580                 585                 590
Arg Asn Asp Ser Phe Ser Thr Glu Asp Phe Ser Asn Cys Leu Tyr Gln
595                 600                 605
Asp Phe Arg Ile Pro Leu Ser Pro Val His Lys Cys Ser Phe Tyr Lys
610                 615                 620
Asn Asn Thr Lys Val Ser Tyr Gly Phe Leu Ser Pro Pro Gln Leu Asn
625                 630                 635                 640
Lys Asn Ser Ser Gly Ile Tyr Ser Glu Ala Leu Leu Thr Thr Asn Ile
645                 650                 655
Val Pro Met Tyr Gln Ser Phe Gln Val Ile Trp Arg Tyr Phe His Asp
660                 665                 670
Thr Leu Leu Arg Lys Tyr Ala Glu Glu Arg Asn Gly Val Asn Val Val
675                 680                 685
Ser Gly Pro Val Phe Asp Phe Asp Tyr Asp Gly Arg Cys Asp Ser Leu
690                 695                 700
Glu Asn Leu Arg Gln Lys Arg Arg Val Ile Arg Asn Gln Glu Ile Leu
705                 710                 715                 720
Ile Pro Thr His Phe Phe Ile Val Leu Thr Ser Cys Lys Asp Thr Ser
725                 730                 735
Gln Thr Pro Leu His Cys Glu Asn Leu Asp Thr Leu Ala Phe Ile Leu
740                 745                 750
Pro His Arg Thr Asp Asn Ser Glu Ser Cys Val His Gly Lys His Asp
755                 760                 765
Ser Ser Trp Val Glu Glu Leu Leu Met Leu His Arg Ala Arg Ile Thr
770                 775                 780
Asp Val Glu His Ile Thr Gly Leu Ser Phe Tyr Gln Gln Arg Lys Glu
785                 790                 795                 800
Pro Val Ser Asp Ile Leu Lys Leu Lys Thr His Leu Pro Thr Phe Ser
805                 810                 815
Gln Glu Asp
<210> 6
<211> 739
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 6
Glu Lys Ser Trp Val Glu Glu Pro Cys Glu Ser Ile Asn Glu Pro Gln
1               5                   10                  15
Cys Pro Ala Gly Phe Glu Thr Pro Pro Thr Leu Leu Phe Ser Leu Asp
20                  25                  30
Gly Phe Arg Ala Glu Tyr Leu His Thr Trp Gly Gly Leu Leu Pro Val
35                  40                  45
Ile Ser Lys Leu Lys Lys Cys Gly Thr Tyr Thr Lys Asn Met Arg Pro
50                  55                  60
Val Tyr Pro Thr Lys Thr Phe Pro Asn His Tyr Ser Ile Val Thr Gly
65                  70                  75                  80
Leu Tyr Pro Glu Ser His Gly Ile Ile Asp Asn Lys Met Tyr Asp Pro
85                  90                  95
Lys Met Asn Ala Ser Phe Ser Leu Lys Ser Lys Glu Lys Phe Asn Pro
100                 105                 110
Glu Trp Tyr Lys Gly Glu Pro Ile Trp Val Thr Ala Lys Tyr Gln Gly
115                 120                 125
Leu Lys Ser Gly Thr Phe Phe Trp Pro Gly Ser Asp Val Glu Ile Asn
130                 135                 140
Gly Ile Phe Pro Asp Ile Tyr Lys Met Tyr Asn Gly Ser Val Pro Phe
145                 150                 155                 160
Glu Glu Arg Ile Leu Ala Val Leu Gln Trp Leu Gln Leu Pro Lys Asp
165                 170                 175
Glu Arg Pro His Phe Tyr Thr Leu Tyr Leu Glu Glu Pro Asp Ser Ser
180                 185                 190
Gly His Ser Tyr Gly Pro Val Ser Ser Glu Val Ile Lys Ala Leu Gln
195                 200                 205
Arg Val Asp Gly Met Val Gly Met Leu Met Asp Gly Leu Lys Glu Leu
210                 215                 220
Asn Leu His Arg Cys Leu Asn Leu Ile Leu Ile Ser Asp His Gly Met
225                 230                 235                 240
Glu Gln Gly Ser Cys Lys Lys Tyr Ile Tyr Leu Asn Lys Tyr Leu Gly
245                 250                 255
Asp Val Lys Asn Ile Lys Val Ile Tyr Gly Pro Ala Ala Arg Leu Arg
260                 265                 270
Pro Ser Asp Val Pro Asp Lys Tyr Tyr Ser Phe Asn Tyr Glu Gly Ile
275                 280                 285
Ala Arg Asn Leu Ser Cys Arg Glu Pro Asn Gln His Phe Lys Pro Tyr
290                 295                 300
Leu Lys His Phe Leu Pro Lys Arg Leu His Phe Ala Lys Ser Asp Arg
305                 310                 315                 320
Ile Glu Pro Leu Thr Phe Tyr Leu Asp Pro Gln Trp Gln Leu Ala Leu
325                 330                 335
Asn Pro Ser Glu Arg Lys Tyr Cys Gly Ser Gly Phe His Gly Ser Asp
340                 345                 350
Asn Val Phe Ser Asn Met Gln Ala Leu Phe Val Gly Tyr Gly Pro Gly
355                 360                 365
Phe Lys His Gly Ile Glu Ala Asp Thr Phe Glu Asn Ile Glu Val Tyr
370                 375                 380
Asn Leu Met Cys Asp Leu Leu Asn Leu Thr Pro Ala Pro Asn Asn Gly
385                 390                 395                 400
Thr His Gly Ser Leu Asn His Leu Leu Lys Asn Pro Val Tyr Thr Pro
405                 410                 415
Lys His Pro Lys Glu Val His Pro Leu Val Gln Cys Pro Phe Thr Arg
420                 425                 430
Asn Pro Arg Asp Asn Leu Gly Cys Ser Cys Asn Pro Ser Ile Leu Pro
435                 440                 445
Ile Glu Asp Phe Gln Thr Gln Phe Asn Leu Thr Val Ala Glu Glu Lys
450                 455                 460
Ile Ile Lys His Glu Thr Leu Pro Tyr Gly Arg Pro Arg Val Leu Gln
465                 470                 475                 480
Lys Glu Asn Thr Ile Cys Leu Leu Ser Gln His Gln Phe Met Ser Gly
485                 490                 495
Tyr Ser Gln Asp Ile Leu Met Pro Leu Trp Thr Ser Tyr Thr Val Asp
500                 505                 510
Arg Asn Asp Ser Phe Ser Thr Glu Asp Phe Ser Asn Cys Leu Tyr Gln
515                 520                 525
Asp Phe Arg Ile Pro Leu Ser Pro Val His Lys Cys Ser Phe Tyr Lys
530                 535                 540
Asn Asn Thr Lys Val Ser Tyr Gly Phe Leu Ser Pro Pro Gln Leu Asn
545                 550                 555                 560
Lys Asn Ser Ser Gly Ile Tyr Ser Glu Ala Leu Leu Thr Thr Asn Ile
565                 570                 575
Val Pro Met Tyr Gln Ser Phe Gln Val Ile Trp Arg Tyr Phe His Asp
580                 585                 590
Thr Leu Leu Arg Lys Tyr Ala Glu Glu Arg Asn Gly Val Asn Val Val
595                 600                 605
Ser Gly Pro Val Phe Asp Phe Asp Tyr Asp Gly Arg Cys Asp Ser Leu
610                 615                 620
Glu Asn Leu Arg Gln Lys Arg Arg Val Ile Arg Asn Gln Glu Ile Leu
625                 630                 635                 640
Ile Pro Thr His Phe Phe Ile Val Leu Thr Ser Cys Lys Asp Thr Ser
645                 650                 655
Gln Thr Pro Leu His Cys Glu Asn Leu Asp Thr Leu Ala Phe Ile Leu
660                 665                 670
Pro His Arg Thr Asp Asn Ser Glu Ser Cys Val His Gly Lys His Asp
675                 680                 685
Ser Ser Trp Val Glu Glu Leu Leu Met Leu His Arg Ala Arg Ile Thr
690                 695                 700
Asp Val Glu His Ile Thr Gly Leu Ser Phe Tyr Gln Gln Arg Lys Glu
705                 710                 715                 720
Pro Val Ser Asp Ile Leu Lys Leu Lys Thr His Leu Pro Thr Phe Ser
725                 730                 735
Gln Glu Asp
<210> 7
<211> 232
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 7
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1               5                   10                  15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20                  25                  30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35                  40                  45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50                  55                  60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65                  70                  75                  80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85                  90                  95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100                 105                 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115                 120                 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
130                 135                 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145                 150                 155                 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165                 170                 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180                 185                 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195                 200                 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210                 215                 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225                 230
<210> 8
<211> 227
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 8
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1               5                   10                  15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20                  25                  30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35                  40                  45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50                  55                  60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65                  70                  75                  80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85                  90                  95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100                 105                 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115                 120                 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130                 135                 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145                 150                 155                 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165                 170                 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180                 185                 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195                 200                 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210                 215                 220
Pro Gly Lys
225
<210> 9
<211> 1051
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 9
Ser Cys Lys Gly Arg Cys Phe Glu Arg Thr Phe Gly Asn Cys Arg Cys
1               5                   10                  15
Asp Ala Ala Cys Val Glu Leu Gly Asn Cys Cys Leu Asp Tyr Gln Glu
20                  25                  30
Thr Cys Ile Glu Pro Glu His Ile Trp Thr Cys Asn Lys Phe Arg Cys
35                  40                  45
Gly Glu Lys Arg Leu Thr Arg Ser Leu Cys Ala Cys Ser Asp Asp Cys
50                  55                  60
Lys Asp Lys Gly Asp Cys Cys Ile Asn Tyr Ser Ser Val Cys Gln Gly
65                  70                  75                  80
Glu Lys Ser Trp Val Glu Glu Pro Cys Glu Ser Ile Asn Glu Pro Gln
85                  90                  95
Cys Pro Ala Gly Phe Glu Thr Pro Pro Thr Leu Leu Phe Ser Leu Asp
100                 105                 110
Gly Phe Arg Ala Glu Tyr Leu His Thr Trp Gly Gly Leu Leu Pro Val
115                 120                 125
Ile Ser Lys Leu Lys Lys Cys Gly Thr Tyr Thr Lys Asn Met Arg Pro
130                 135                 140
Val Tyr Pro Thr Lys Thr Phe Pro Asn His Tyr Ser Ile Val Thr Gly
145                 150                 155                 160
Leu Tyr Pro Glu Ser His Gly Ile Ile Asp Asn Lys Met Tyr Asp Pro
165                 170                 175
Lys Met Asn Ala Ser Phe Ser Leu Lys Ser Lys Glu Lys Phe Asn Pro
180                 185                 190
Glu Trp Tyr Lys Gly Glu Pro Ile Trp Val Thr Ala Lys Tyr Gln Gly
195                 200                 205
Leu Lys Ser Gly Thr Phe Phe Trp Pro Gly Ser Asp Val Glu Ile Asn
210                 215                 220
Gly Ile Phe Pro Asp Ile Tyr Lys Met Tyr Asn Gly Ser Val Pro Phe
225                 230                 235                 240
Glu Glu Arg Ile Leu Ala Val Leu Gln Trp Leu Gln Leu Pro Lys Asp
245                 250                 255
Glu Arg Pro His Phe Tyr Thr Leu Tyr Leu Glu Glu Pro Asp Ser Ser
260                 265                 270
Gly His Ser Tyr Gly Pro Val Ser Ser Glu Val Ile Lys Ala Leu Gln
275                 280                 285
Arg Val Asp Gly Met Val Gly Met Leu Met Asp Gly Leu Lys Glu Leu
290                 295                 300
Asn Leu His Arg Cys Leu Asn Leu Ile Leu Ile Ser Asp His Gly Met
305                 310                 315                 320
Glu Gln Gly Ser Cys Lys Lys Tyr Ile Tyr Leu Asn Lys Tyr Leu Gly
325                 330                 335
Asp Val Lys Asn Ile Lys Val Ile Tyr Gly Pro Ala Ala Arg Leu Arg
340                 345                 350
Pro Ser Asp Val Pro Asp Lys Tyr Tyr Ser Phe Asn Tyr Glu Gly Ile
355                 360                 365
Ala Arg Asn Leu Ser Cys Arg Glu Pro Asn Gln His Phe Lys Pro Tyr
370                 375                 380
Leu Lys His Phe Leu Pro Lys Arg Leu His Phe Ala Lys Ser Asp Arg
385                 390                 395                 400
Ile Glu Pro Leu Thr Phe Tyr Leu Asp Pro Gln Trp Gln Leu Ala Leu
405                 410                 415
Asn Pro Ser Glu Arg Lys Tyr Cys Gly Ser Gly Phe His Gly Ser Asp
420                 425                 430
Asn Val Phe Ser Asn Met Gln Ala Leu Phe Val Gly Tyr Gly Pro Gly
435                 440                 445
Phe Lys His Gly Ile Glu Ala Asp Thr Phe Glu Asn Ile Glu Val Tyr
450                 455                 460
Asn Leu Met Cys Asp Leu Leu Asn Leu Thr Pro Ala Pro Asn Asn Gly
465                 470                 475                 480
Thr His Gly Ser Leu Asn His Leu Leu Lys Asn Pro Val Tyr Thr Pro
485                 490                 495
Lys His Pro Lys Glu Val His Pro Leu Val Gln Cys Pro Phe Thr Arg
500                 505                 510
Asn Pro Arg Asp Asn Leu Gly Cys Ser Cys Asn Pro Ser Ile Leu Pro
515                 520                 525
Ile Glu Asp Phe Gln Thr Gln Phe Asn Leu Thr Val Ala Glu Glu Lys
530                 535                 540
Ile Ile Lys His Glu Thr Leu Pro Tyr Gly Arg Pro Arg Val Leu Gln
545                 550                 555                 560
Lys Glu Asn Thr Ile Cys Leu Leu Ser Gln His Gln Phe Met Ser Gly
565                 570                 575
Tyr Ser Gln Asp Ile Leu Met Pro Leu Trp Thr Ser Tyr Thr Val Asp
580                 585                 590
Arg Asn Asp Ser Phe Ser Thr Glu Asp Phe Ser Asn Cys Leu Tyr Gln
595                 600                 605
Asp Phe Arg Ile Pro Leu Ser Pro Val His Lys Cys Ser Phe Tyr Lys
610                 615                 620
Asn Asn Thr Lys Val Ser Tyr Gly Phe Leu Ser Pro Pro Gln Leu Asn
625                 630                 635                 640
Lys Asn Ser Ser Gly Ile Tyr Ser Glu Ala Leu Leu Thr Thr Asn Ile
645                 650                 655
Val Pro Met Tyr Gln Ser Phe Gln Val Ile Trp Arg Tyr Phe His Asp
660                 665                 670
Thr Leu Leu Arg Lys Tyr Ala Glu Glu Arg Asn Gly Val Asn Val Val
675                 680                 685
Ser Gly Pro Val Phe Asp Phe Asp Tyr Asp Gly Arg Cys Asp Ser Leu
690                 695                 700
Glu Asn Leu Arg Gln Lys Arg Arg Val Ile Arg Asn Gln Glu Ile Leu
705                 710                 715                 720
Ile Pro Thr His Phe Phe Ile Val Leu Thr Ser Cys Lys Asp Thr Ser
725                 730                 735
Gln Thr Pro Leu His Cys Glu Asn Leu Asp Thr Leu Ala Phe Ile Leu
740                 745                 750
Pro His Arg Thr Asp Asn Ser Glu Ser Cys Val His Gly Lys His Asp
755                 760                 765
Ser Ser Trp Val Glu Glu Leu Leu Met Leu His Arg Ala Arg Ile Thr
770                 775                 780
Asp Val Glu His Ile Thr Gly Leu Ser Phe Tyr Gln Gln Arg Lys Glu
785                 790                 795                 800
Pro Val Ser Asp Ile Leu Lys Leu Lys Thr His Leu Pro Thr Phe Ser
805                 810                 815
Gln Glu Asp Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
820                 825                 830
Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
835                 840                 845
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
850                 855                 860
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
865                 870                 875                 880
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
885                 890                 895
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
900                 905                 910
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
915                 920                 925
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
930                 935                 940
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
945                 950                 955                 960
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
965                 970                 975
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
980                 985                 990
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro  Val Leu Asp Ser Asp  Gly Ser Phe
995                 1000                 1005
Phe Leu  Tyr Ser Lys Leu Thr  Val Asp Lys Ser Arg  Trp Gln Gln
1010                 1015                 1020
Gly Asn  Val Phe Ser Cys Ser  Val Met His Glu Ala  Leu His Asn
1025                 1030                 1035
His Tyr  Thr Gln Lys Ser Leu  Ser Leu Ser Pro Gly  Lys
1040                 1045                 1050
<210> 10
<211> 1046
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 10
Ser Cys Lys Gly Arg Cys Phe Glu Arg Thr Phe Gly Asn Cys Arg Cys
1               5                   10                  15
Asp Ala Ala Cys Val Glu Leu Gly Asn Cys Cys Leu Asp Tyr Gln Glu
20                  25                  30
Thr Cys Ile Glu Pro Glu His Ile Trp Thr Cys Asn Lys Phe Arg Cys
35                  40                  45
Gly Glu Lys Arg Leu Thr Arg Ser Leu Cys Ala Cys Ser Asp Asp Cys
50                  55                  60
Lys Asp Lys Gly Asp Cys Cys Ile Asn Tyr Ser Ser Val Cys Gln Gly
65                  70                  75                  80
Glu Lys Ser Trp Val Glu Glu Pro Cys Glu Ser Ile Asn Glu Pro Gln
85                  90                  95
Cys Pro Ala Gly Phe Glu Thr Pro Pro Thr Leu Leu Phe Ser Leu Asp
100                 105                 110
Gly Phe Arg Ala Glu Tyr Leu His Thr Trp Gly Gly Leu Leu Pro Val
115                 120                 125
Ile Ser Lys Leu Lys Lys Cys Gly Thr Tyr Thr Lys Asn Met Arg Pro
130                 135                 140
Val Tyr Pro Thr Lys Thr Phe Pro Asn His Tyr Ser Ile Val Thr Gly
145                 150                 155                 160
Leu Tyr Pro Glu Ser His Gly Ile Ile Asp Asn Lys Met Tyr Asp Pro
165                 170                 175
Lys Met Asn Ala Ser Phe Ser Leu Lys Ser Lys Glu Lys Phe Asn Pro
180                 185                 190
Glu Trp Tyr Lys Gly Glu Pro Ile Trp Val Thr Ala Lys Tyr Gln Gly
195                 200                 205
Leu Lys Ser Gly Thr Phe Phe Trp Pro Gly Ser Asp Val Glu Ile Asn
210                 215                 220
Gly Ile Phe Pro Asp Ile Tyr Lys Met Tyr Asn Gly Ser Val Pro Phe
225                 230                 235                 240
Glu Glu Arg Ile Leu Ala Val Leu Gln Trp Leu Gln Leu Pro Lys Asp
245                 250                 255
Glu Arg Pro His Phe Tyr Thr Leu Tyr Leu Glu Glu Pro Asp Ser Ser
260                 265                 270
Gly His Ser Tyr Gly Pro Val Ser Ser Glu Val Ile Lys Ala Leu Gln
275                 280                 285
Arg Val Asp Gly Met Val Gly Met Leu Met Asp Gly Leu Lys Glu Leu
290                 295                 300
Asn Leu His Arg Cys Leu Asn Leu Ile Leu Ile Ser Asp His Gly Met
305                 310                 315                 320
Glu Gln Gly Ser Cys Lys Lys Tyr Ile Tyr Leu Asn Lys Tyr Leu Gly
325                 330                 335
Asp Val Lys Asn Ile Lys Val Ile Tyr Gly Pro Ala Ala Arg Leu Arg
340                 345                 350
Pro Ser Asp Val Pro Asp Lys Tyr Tyr Ser Phe Asn Tyr Glu Gly Ile
355                 360                 365
Ala Arg Asn Leu Ser Cys Arg Glu Pro Asn Gln His Phe Lys Pro Tyr
370                 375                 380
Leu Lys His Phe Leu Pro Lys Arg Leu His Phe Ala Lys Ser Asp Arg
385                 390                 395                 400
Ile Glu Pro Leu Thr Phe Tyr Leu Asp Pro Gln Trp Gln Leu Ala Leu
405                 410                 415
Asn Pro Ser Glu Arg Lys Tyr Cys Gly Ser Gly Phe His Gly Ser Asp
420                 425                 430
Asn Val Phe Ser Asn Met Gln Ala Leu Phe Val Gly Tyr Gly Pro Gly
435                 440                 445
Phe Lys His Gly Ile Glu Ala Asp Thr Phe Glu Asn Ile Glu Val Tyr
450                 455                 460
Asn Leu Met Cys Asp Leu Leu Asn Leu Thr Pro Ala Pro Asn Asn Gly
465                 470                 475                 480
Thr His Gly Ser Leu Asn His Leu Leu Lys Asn Pro Val Tyr Thr Pro
485                 490                 495
Lys His Pro Lys Glu Val His Pro Leu Val Gln Cys Pro Phe Thr Arg
500                 505                 510
Asn Pro Arg Asp Asn Leu Gly Cys Ser Cys Asn Pro Ser Ile Leu Pro
515                 520                 525
Ile Glu Asp Phe Gln Thr Gln Phe Asn Leu Thr Val Ala Glu Glu Lys
530                 535                 540
Ile Ile Lys His Glu Thr Leu Pro Tyr Gly Arg Pro Arg Val Leu Gln
545                 550                 555                 560
Lys Glu Asn Thr Ile Cys Leu Leu Ser Gln His Gln Phe Met Ser Gly
565                 570                 575
Tyr Ser Gln Asp Ile Leu Met Pro Leu Trp Thr Ser Tyr Thr Val Asp
580                 585                 590
Arg Asn Asp Ser Phe Ser Thr Glu Asp Phe Ser Asn Cys Leu Tyr Gln
595                 600                 605
Asp Phe Arg Ile Pro Leu Ser Pro Val His Lys Cys Ser Phe Tyr Lys
610                 615                 620
Asn Asn Thr Lys Val Ser Tyr Gly Phe Leu Ser Pro Pro Gln Leu Asn
625                 630                 635                 640
Lys Asn Ser Ser Gly Ile Tyr Ser Glu Ala Leu Leu Thr Thr Asn Ile
645                 650                 655
Val Pro Met Tyr Gln Ser Phe Gln Val Ile Trp Arg Tyr Phe His Asp
660                 665                 670
Thr Leu Leu Arg Lys Tyr Ala Glu Glu Arg Asn Gly Val Asn Val Val
675                 680                 685
Ser Gly Pro Val Phe Asp Phe Asp Tyr Asp Gly Arg Cys Asp Ser Leu
690                 695                 700
Glu Asn Leu Arg Gln Lys Arg Arg Val Ile Arg Asn Gln Glu Ile Leu
705                 710                 715                 720
Ile Pro Thr His Phe Phe Ile Val Leu Thr Ser Cys Lys Asp Thr Ser
725                 730                 735
Gln Thr Pro Leu His Cys Glu Asn Leu Asp Thr Leu Ala Phe Ile Leu
740                 745                 750
Pro His Arg Thr Asp Asn Ser Glu Ser Cys Val His Gly Lys His Asp
755                 760                 765
Ser Ser Trp Val Glu Glu Leu Leu Met Leu His Arg Ala Arg Ile Thr
770                 775                 780
Asp Val Glu His Ile Thr Gly Leu Ser Phe Tyr Gln Gln Arg Lys Glu
785                 790                 795                 800
Pro Val Ser Asp Ile Leu Lys Leu Lys Thr His Leu Pro Thr Phe Ser
805                 810                 815
Gln Glu Asp Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
820                 825                 830
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
835                 840                 845
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
850                 855                 860
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
865                 870                 875                 880
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
885                 890                 895
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
900                 905                 910
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
915                 920                 925
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
930                 935                 940
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
945                 950                 955                 960
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
965                 970                 975
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
980                 985                 990
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp  Gly Ser Phe Phe Leu  Tyr Ser Lys
995                 1000                 1005
Leu Thr  Val Asp Lys Ser Arg  Trp Gln Gln Gly Asn  Val Phe Ser
1010                 1015                 1020
Cys Ser  Val Met His Glu Ala  Leu His Asn His Tyr  Thr Gln Lys
1025                 1030                 1035
Ser Leu  Ser Leu Ser Pro Gly  Lys
1040                 1045
<210> 11
<211> 971
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 11
Glu Lys Ser Trp Val Glu Glu Pro Cys Glu Ser Ile Asn Glu Pro Gln
1               5                   10                  15
Cys Pro Ala Gly Phe Glu Thr Pro Pro Thr Leu Leu Phe Ser Leu Asp
20                  25                  30
Gly Phe Arg Ala Glu Tyr Leu His Thr Trp Gly Gly Leu Leu Pro Val
35                  40                  45
Ile Ser Lys Leu Lys Lys Cys Gly Thr Tyr Thr Lys Asn Met Arg Pro
50                  55                  60
Val Tyr Pro Thr Lys Thr Phe Pro Asn His Tyr Ser Ile Val Thr Gly
65                  70                  75                  80
Leu Tyr Pro Glu Ser His Gly Ile Ile Asp Asn Lys Met Tyr Asp Pro
85                  90                  95
Lys Met Asn Ala Ser Phe Ser Leu Lys Ser Lys Glu Lys Phe Asn Pro
100                 105                 110
Glu Trp Tyr Lys Gly Glu Pro Ile Trp Val Thr Ala Lys Tyr Gln Gly
115                 120                 125
Leu Lys Ser Gly Thr Phe Phe Trp Pro Gly Ser Asp Val Glu Ile Asn
130                 135                 140
Gly Ile Phe Pro Asp Ile Tyr Lys Met Tyr Asn Gly Ser Val Pro Phe
145                 150                 155                 160
Glu Glu Arg Ile Leu Ala Val Leu Gln Trp Leu Gln Leu Pro Lys Asp
165                 170                 175
Glu Arg Pro His Phe Tyr Thr Leu Tyr Leu Glu Glu Pro Asp Ser Ser
180                 185                 190
Gly His Ser Tyr Gly Pro Val Ser Ser Glu Val Ile Lys Ala Leu Gln
195                 200                 205
Arg Val Asp Gly Met Val Gly Met Leu Met Asp Gly Leu Lys Glu Leu
210                 215                 220
Asn Leu His Arg Cys Leu Asn Leu Ile Leu Ile Ser Asp His Gly Met
225                 230                 235                 240
Glu Gln Gly Ser Cys Lys Lys Tyr Ile Tyr Leu Asn Lys Tyr Leu Gly
245                 250                 255
Asp Val Lys Asn Ile Lys Val Ile Tyr Gly Pro Ala Ala Arg Leu Arg
260                 265                 270
Pro Ser Asp Val Pro Asp Lys Tyr Tyr Ser Phe Asn Tyr Glu Gly Ile
275                 280                 285
Ala Arg Asn Leu Ser Cys Arg Glu Pro Asn Gln His Phe Lys Pro Tyr
290                 295                 300
Leu Lys His Phe Leu Pro Lys Arg Leu His Phe Ala Lys Ser Asp Arg
305                 310                 315                 320
Ile Glu Pro Leu Thr Phe Tyr Leu Asp Pro Gln Trp Gln Leu Ala Leu
325                 330                 335
Asn Pro Ser Glu Arg Lys Tyr Cys Gly Ser Gly Phe His Gly Ser Asp
340                 345                 350
Asn Val Phe Ser Asn Met Gln Ala Leu Phe Val Gly Tyr Gly Pro Gly
355                 360                 365
Phe Lys His Gly Ile Glu Ala Asp Thr Phe Glu Asn Ile Glu Val Tyr
370                 375                 380
Asn Leu Met Cys Asp Leu Leu Asn Leu Thr Pro Ala Pro Asn Asn Gly
385                 390                 395                 400
Thr His Gly Ser Leu Asn His Leu Leu Lys Asn Pro Val Tyr Thr Pro
405                 410                 415
Lys His Pro Lys Glu Val His Pro Leu Val Gln Cys Pro Phe Thr Arg
420                 425                 430
Asn Pro Arg Asp Asn Leu Gly Cys Ser Cys Asn Pro Ser Ile Leu Pro
435                 440                 445
Ile Glu Asp Phe Gln Thr Gln Phe Asn Leu Thr Val Ala Glu Glu Lys
450                 455                 460
Ile Ile Lys His Glu Thr Leu Pro Tyr Gly Arg Pro Arg Val Leu Gln
465                 470                 475                 480
Lys Glu Asn Thr Ile Cys Leu Leu Ser Gln His Gln Phe Met Ser Gly
485                 490                 495
Tyr Ser Gln Asp Ile Leu Met Pro Leu Trp Thr Ser Tyr Thr Val Asp
500                 505                 510
Arg Asn Asp Ser Phe Ser Thr Glu Asp Phe Ser Asn Cys Leu Tyr Gln
515                 520                 525
Asp Phe Arg Ile Pro Leu Ser Pro Val His Lys Cys Ser Phe Tyr Lys
530                 535                 540
Asn Asn Thr Lys Val Ser Tyr Gly Phe Leu Ser Pro Pro Gln Leu Asn
545                 550                 555                 560
Lys Asn Ser Ser Gly Ile Tyr Ser Glu Ala Leu Leu Thr Thr Asn Ile
565                 570                 575
Val Pro Met Tyr Gln Ser Phe Gln Val Ile Trp Arg Tyr Phe His Asp
580                 585                 590
Thr Leu Leu Arg Lys Tyr Ala Glu Glu Arg Asn Gly Val Asn Val Val
595                 600                 605
Ser Gly Pro Val Phe Asp Phe Asp Tyr Asp Gly Arg Cys Asp Ser Leu
610                 615                 620
Glu Asn Leu Arg Gln Lys Arg Arg Val Ile Arg Asn Gln Glu Ile Leu
625                 630                 635                 640
Ile Pro Thr His Phe Phe Ile Val Leu Thr Ser Cys Lys Asp Thr Ser
645                 650                 655
Gln Thr Pro Leu His Cys Glu Asn Leu Asp Thr Leu Ala Phe Ile Leu
660                 665                 670
Pro His Arg Thr Asp Asn Ser Glu Ser Cys Val His Gly Lys His Asp
675                 680                 685
Ser Ser Trp Val Glu Glu Leu Leu Met Leu His Arg Ala Arg Ile Thr
690                 695                 700
Asp Val Glu His Ile Thr Gly Leu Ser Phe Tyr Gln Gln Arg Lys Glu
705                 710                 715                 720
Pro Val Ser Asp Ile Leu Lys Leu Lys Thr His Leu Pro Thr Phe Ser
725                 730                 735
Gln Glu Asp Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
740                 745                 750
Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
755                 760                 765
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
770                 775                 780
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
785                 790                 795                 800
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
805                 810                 815
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
820                 825                 830
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
835                 840                 845
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
850                 855                 860
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
865                 870                 875                 880
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
885                 890                 895
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
900                 905                 910
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
915                 920                 925
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
930                 935                 940
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
945                 950                 955                 960
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
965                 970
<210> 12
<211> 966
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 12
Glu Lys Ser Trp Val Glu Glu Pro Cys Glu Ser Ile Asn Glu Pro Gln
1               5                   10                  15
Cys Pro Ala Gly Phe Glu Thr Pro Pro Thr Leu Leu Phe Ser Leu Asp
20                  25                  30
Gly Phe Arg Ala Glu Tyr Leu His Thr Trp Gly Gly Leu Leu Pro Val
35                  40                  45
Ile Ser Lys Leu Lys Lys Cys Gly Thr Tyr Thr Lys Asn Met Arg Pro
50                  55                  60
Val Tyr Pro Thr Lys Thr Phe Pro Asn His Tyr Ser Ile Val Thr Gly
65                  70                  75                  80
Leu Tyr Pro Glu Ser His Gly Ile Ile Asp Asn Lys Met Tyr Asp Pro
85                  90                  95
Lys Met Asn Ala Ser Phe Ser Leu Lys Ser Lys Glu Lys Phe Asn Pro
100                 105                 110
Glu Trp Tyr Lys Gly Glu Pro Ile Trp Val Thr Ala Lys Tyr Gln Gly
115                 120                 125
Leu Lys Ser Gly Thr Phe Phe Trp Pro Gly Ser Asp Val Glu Ile Asn
130                 135                 140
Gly Ile Phe Pro Asp Ile Tyr Lys Met Tyr Asn Gly Ser Val Pro Phe
145                 150                 155                 160
Glu Glu Arg Ile Leu Ala Val Leu Gln Trp Leu Gln Leu Pro Lys Asp
165                 170                 175
Glu Arg Pro His Phe Tyr Thr Leu Tyr Leu Glu Glu Pro Asp Ser Ser
180                 185                 190
Gly His Ser Tyr Gly Pro Val Ser Ser Glu Val Ile Lys Ala Leu Gln
195                 200                 205
Arg Val Asp Gly Met Val Gly Met Leu Met Asp Gly Leu Lys Glu Leu
210                 215                 220
Asn Leu His Arg Cys Leu Asn Leu Ile Leu Ile Ser Asp His Gly Met
225                 230                 235                 240
Glu Gln Gly Ser Cys Lys Lys Tyr Ile Tyr Leu Asn Lys Tyr Leu Gly
245                 250                 255
Asp Val Lys Asn Ile Lys Val Ile Tyr Gly Pro Ala Ala Arg Leu Arg
260                 265                 270
Pro Ser Asp Val Pro Asp Lys Tyr Tyr Ser Phe Asn Tyr Glu Gly Ile
275                 280                 285
Ala Arg Asn Leu Ser Cys Arg Glu Pro Asn Gln His Phe Lys Pro Tyr
290                 295                 300
Leu Lys His Phe Leu Pro Lys Arg Leu His Phe Ala Lys Ser Asp Arg
305                 310                 315                 320
Ile Glu Pro Leu Thr Phe Tyr Leu Asp Pro Gln Trp Gln Leu Ala Leu
325                 330                 335
Asn Pro Ser Glu Arg Lys Tyr Cys Gly Ser Gly Phe His Gly Ser Asp
340                 345                 350
Asn Val Phe Ser Asn Met Gln Ala Leu Phe Val Gly Tyr Gly Pro Gly
355                 360                 365
Phe Lys His Gly Ile Glu Ala Asp Thr Phe Glu Asn Ile Glu Val Tyr
370                 375                 380
Asn Leu Met Cys Asp Leu Leu Asn Leu Thr Pro Ala Pro Asn Asn Gly
385                 390                 395                 400
Thr His Gly Ser Leu Asn His Leu Leu Lys Asn Pro Val Tyr Thr Pro
405                 410                 415
Lys His Pro Lys Glu Val His Pro Leu Val Gln Cys Pro Phe Thr Arg
420                 425                 430
Asn Pro Arg Asp Asn Leu Gly Cys Ser Cys Asn Pro Ser Ile Leu Pro
435                 440                 445
Ile Glu Asp Phe Gln Thr Gln Phe Asn Leu Thr Val Ala Glu Glu Lys
450                 455                 460
Ile Ile Lys His Glu Thr Leu Pro Tyr Gly Arg Pro Arg Val Leu Gln
465                 470                 475                 480
Lys Glu Asn Thr Ile Cys Leu Leu Ser Gln His Gln Phe Met Ser Gly
485                 490                 495
Tyr Ser Gln Asp Ile Leu Met Pro Leu Trp Thr Ser Tyr Thr Val Asp
500                 505                 510
Arg Asn Asp Ser Phe Ser Thr Glu Asp Phe Ser Asn Cys Leu Tyr Gln
515                 520                 525
Asp Phe Arg Ile Pro Leu Ser Pro Val His Lys Cys Ser Phe Tyr Lys
530                 535                 540
Asn Asn Thr Lys Val Ser Tyr Gly Phe Leu Ser Pro Pro Gln Leu Asn
545                 550                 555                 560
Lys Asn Ser Ser Gly Ile Tyr Ser Glu Ala Leu Leu Thr Thr Asn Ile
565                 570                 575
Val Pro Met Tyr Gln Ser Phe Gln Val Ile Trp Arg Tyr Phe His Asp
580                 585                 590
Thr Leu Leu Arg Lys Tyr Ala Glu Glu Arg Asn Gly Val Asn Val Val
595                 600                 605
Ser Gly Pro Val Phe Asp Phe Asp Tyr Asp Gly Arg Cys Asp Ser Leu
610                 615                 620
Glu Asn Leu Arg Gln Lys Arg Arg Val Ile Arg Asn Gln Glu Ile Leu
625                 630                 635                 640
Ile Pro Thr His Phe Phe Ile Val Leu Thr Ser Cys Lys Asp Thr Ser
645                 650                 655
Gln Thr Pro Leu His Cys Glu Asn Leu Asp Thr Leu Ala Phe Ile Leu
660                 665                 670
Pro His Arg Thr Asp Asn Ser Glu Ser Cys Val His Gly Lys His Asp
675                 680                 685
Ser Ser Trp Val Glu Glu Leu Leu Met Leu His Arg Ala Arg Ile Thr
690                 695                 700
Asp Val Glu His Ile Thr Gly Leu Ser Phe Tyr Gln Gln Arg Lys Glu
705                 710                 715                 720
Pro Val Ser Asp Ile Leu Lys Leu Lys Thr His Leu Pro Thr Phe Ser
725                 730                 735
Gln Glu Asp Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
740                 745                 750
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
755                 760                 765
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
770                 775                 780
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
785                 790                 795                 800
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
805                 810                 815
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
820                 825                 830
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
835                 840                 845
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
850                 855                 860
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
865                 870                 875                 880
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
885                 890                 895
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
900                 905                 910
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
915                 920                 925
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
930                 935                 940
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
945                 950                 955                 960
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
965
<210> 13
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 13
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1               5                   10                  15
<210> 14
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 14
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1               5                   10
<210> 15
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 15
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1               5                   10
<210> 16
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 16
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1               5                   10                  15
<210> 17
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 17
Pro Ser Cys Ala Lys Glu
1               5
<210> 18
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 18
Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp
1               5                   10
<210> 19
<211> 50
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(50)
<223> This sequence may encompass 1-10 repeating "Gly Gly Gly Gly
Ser" units wherein some positions may be absent
<400> 19
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1               5                   10                  15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20                  25                  30
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
35                  40                  45
Gly Ser
50
<---