ШТАММ ВИРУСА ГРИППА А/17/MALLARD/НИДЕРЛАНДЫ/00/95(H7N3) ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ЖИВОЙ И ПРОИЗВОДСТВА ИНАКТИВИРОВАННОЙ ГРИППОЗНЫХ ВАКЦИН
STRAIN OF INFLUENZA VIRUS A/17/MALLARD/NETHERLANDS/00/95(H7N3) FOR PRODUCTION OF LIVE AND INACTIVATED INFLUENZA VACCINES

Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано в здравоохранении для профилактики гриппа, вызванного пандемически опасными вирусами гриппа птиц. Для производства интраназальной живой гриппозной вакцины (ЖГВ) или инактивированной гриппозной вакцины (ИГВ) предложен реассортантый штамм вируса гриппа А/17/mallard/Нидерланды/00/95(H7N3).
Несмотря на широкое распространение пандемического вируса гриппа подтипа А(H1N1), вирусы птичьего гриппа подтипов A(H5N1), A(H7N1) и A(H9N2) продолжают вызывать вспышки заболевания среди людей. Вирусы подтипа Н7 могут получать широкое распространение среди домашней птицы, приобретая при этом свойства повышенной патогенности в результате дополнительной адаптации и рекомбинационного процесса, как было показано во время вспышек, вызванных A(H7N7), A(H7N1) и A(H7N4) - в Европе и Австралии. Необходимость разработки соответствующих вакцинных препаратов, в том числе, и для борьбы с вирусами птичьего гриппа, отражена в приказе Минздрава РФ [Приказ №40 МЗ РФ от 28.12.2004].
В настоящее время вакцинные штаммы для ЖГВ получают методом реассортации современных эпидемических вирусов с холодоадаптированными донорскими штаммами, в результате чего образуются реассортанты, имеющие смешанный геном. Донор аттенуации А/Ленинград/134/17/57(H2N2) - холодоадаптированный температурочувствительный штамм вируса гриппа, разрешенный для получения безвредных интраназальных вакцин для взрослых и детей [Александрова Г.И. Новое в эпидемиологии и профилактике вирусных инфекций. Л., 1986. - С.66-83]. Гены, кодирующие гемагглютинин (НА) и нейраминидазу (NA), наследуются от антигенно актуального эпидемического штамма, а шесть генов внутренних и неструктурных белков (РВ2, РВ1, PA, NP, М, NS) - от безвредного ХА донора аттенуации. Из полученных реассортантов выбирают вакцинный кандидат с формулой генома 6:2, наиболее отвечающий требованиям антигенной специфичности, характерной для родительского вируса «дикого» типа, а также соответствующий признакам холодовой адаптации, по способности к репродукции при пониженной температуре.
Применяемые в настоящее время для профилактики эпидемического гриппа А вакцинные штаммы подтипов H1N1 и H3N2 не могут вызывать защитную реакцию в случае широкомасштабной вспышки, вызванной вирусами гриппа с подтипом гемагглютинина подтипа Н7, к которым у подавляющего большинства населения нет иммунитета.
В настоящее время известен реассортантный штамм А/17/утка/Потсдам/86/92(H5N2) [Патент №2318871, опубл. 10.03.2008], предназначенный как для производства живой, так и инактивированной вакцины против птичьего гриппа подтипа Н5. Но он не может дать профилактический эффект в случае распространения вирусов гриппа подтипа Н7.
За рубежом для подготовки вакцинного штамма ЖГВ подтипа Н7 на основе донорского штамма А/Энн Арбор/6/60(H2N2) был использован высокопатогенный вирус А/Нидерланды/219/03(H7N7) [Min J., J. Virol. 2010 Nov; 84(22): 11950-60].
50
25
50
Известен также температурочувствительный реассортантный штамм А/17/дикая утка/Нидерланды/00/84(H7N3), полученный методами классической генетической реассортации в развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ) на основе донорского штамма Лен/17 [Дешева А., ЖМЭИ- 2009. - №1. - С.31-36]. Однако указанный реассортантный штамм не вполне удовлетворял требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам, включаемым в состав ЖГВ для иммунизации людей. В первую очередь, штамм был недостаточно холодоадаптированным: разность в репродуктивной активности при пониженной до 25°С температуре для штамма А/17/дикая утка/Нидерланды/00/84(H7N3) составляла 4,2 Ig ЭИД (rct-признак), в то время как установлено, что для холодоадаптированных вакцинных штаммов эта разница не должна превышать 3,0 Ig ЭИД [Science, 1959. - Vol.129. - №3358. - Р.1287-1288]. Помимо этого, прямое нуклеотидное секвенирование показало присутствие нуклеотидной замены G→A в положении 543 гена НА реассортантного штамма А/17/дикая утка/Нидерланды/00/84(H7N3) по сравнению с геном НА «дикого» вируса птичьего гриппа. Указанная замена сопровождалась аминокислотным замещением глицина на глютаминовую кислоту в положении 214, что приводило к изменению полярности и заряда аминокислоты вблизи рецепторосвязывающего участка НА. Такие замены являются нежелательными для вакцинных штаммов, так как могут отрицательно влиять на их антигенную специфичность, вызывая снижение защитной эффективности вакцинации.
9
Поскольку задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является получение полностью холодоадаптированного вакцинного штамма с гемагглютинином подтипа Н7 для иммунизации людей, были проведены дополнительные этапы клонирования. Для этого был выбран метод так называемых «коротких пассажей» [Fazekas de St. Groth, Intervirology, 1975. - Vol.5. - P.335-341] при пониженной температуре, когда смесь вирусных клонов пассируют в чувствительной системе (куриные эмбрионы, КЭ) в присутствии селектирующих факторов при укороченном сроке инкубации. Смесь вирусных клонов, полученных после скрещивания донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57(H2N2) и апатогенного вируса гриппа птиц А/mallard/Нидерланды/12/00 (H7N3) в аллантоисной полости 10-11-дневных куриных эмбрионов (КЭ), прошедшую 2 селективных пассажа и одно клонирование в присутствии антисыворотки к донору аттенуации А/Ленинград/134/17/57(H2N2) при пониженной до 25°С температуре инкубации, дополнительно клонировали 2 раза при пониженной до 30°С температуре в течение укороченного до 28 часов срока, увеличив конечное разведение до 1:10. С помощью подбора именно этих условий удалось выделить клон А/17/mallard/Нидерланды/00/95(H7N3), который отличался своими характеристиками от прочих, например наиболее выраженными признаками холодовой адаптации, поскольку уровень его репродукции при пониженной до 25°С температуре был в 100 раз выше, чем у полученных ранее реассортантных вирусов (табл.1).
Таблица 1
Репродукция при пониженной температуре клонов A(H7N3)
Реассортант (№ клона)
Количество пассажей в процессе реассортации
Репродуктивная активность ЭИД<sub>50</sub>/0,2 мл
RCT<sub>25 </sub>ЭИД<sub>50</sub>/0,2 мл
34°С
34°С
8/4
6
8,1±0,5
4,1±0,4
4,0
8/6
6
8,7±0,2
4,7±0,2
4,0
8/10
6
8,3±0,1
4,0±0,1
4,3
9/5 АЛ 7/mallard/Нидерланды/00/95(H7N3)
7 (включая 2 «укороченных»)
8,7±0,2
6,4±0,2
2,3
Высокий уровень холодовой адаптации реассортанта А/17/mallard/Нидерланды/00/95(H7N3) был обоснован молекулярно-генетическими методами. Секвенирование реассортантного штамма выявило наличие в гене внутреннего белка NP дополнительного нуклеотидного замещения С-1066-А, которое приводило к аминокислотной замене Leu-341-lie. Эта замена ранее была выявлена у дополнительно аттенуированного донорского штамма, А/Ленинград/134/47/57(H2N2), который был получен после ряда пассажей штамма А/Ленинград/134/17/57(H2N2) в КЭ при пониженной температуре и в дальнейшем широко использовался в течение ряда лет при подготовке ЖГВ для иммунизации детей младшего возраста [Klimov et al., 1992].
Анализ клонированного вакцинного штамма А/17/mallard/Нидерланды/00/95(H7N3) был выполнен также с использованием рестрикционного анализа ДНК-копий сегментов РНК, полученных с помощью обратно-транскриптазной полимеразно-цепной реакции (ОТ-ПЦР) [Klimov A.I., J. Virol. Method. - 1995. - №55. - P. 445-446]. Полученные с помощью ОТ-ПЦР ДНК-копии сегментов РВ2, РВ1, PA, NP, M и NS обрабатывали соответственно эндонуклеазами рестрикции Tru9l, Hindlll, BamHI, Asnl, EcoRI, Pvul, Ncil соответственно. Дополнительно копии сегментов РВ1, PA и M были обработаны рестриктазами BstXI, Asnl и BciVI. Рестрикционный анализ ДНК-копий сегментов РНК (Табл.2) и прямое нуклеотидное секвенирование показали, что реассортант А/17/mallard/Нидерланды/00/95 (H7N3) имеет состав генома 6:2. Все кодирующие нуклеотидные замещения, характерные для донора аттенуации A/Ленинград/134/17/57(H2N2), обнаружены в генах внутренних и неструктурных белков реассортантного штамма A/17/mallard/Нидерланды/00/95 (H7N3).
Нуклеотидное секвенирование гена НА реассортантного вируса А/17/mallard/Нидерланды/00/95(H7N3) не выявило отличий в нуклеотидном составе от родительского вируса «дикого» типа. Проведенное секвенирование гена NA реассортантного вируса А/17/mallard/Нидерланды/00/95(H7N3) также не выявило отличий в нуклеотидном составе от родительского вируса «дикого» типа.
9
50
Таким образом, полученный реассортантный штамм характеризуется сочетанием требуемых для вакцинных штаммов ЖГВ признаков: холодовой адаптацией и идентичностью поверхностных антигенов родительскому вирусу «дикого» типа. В то же время полученный штамм обладает высокой репродуктивностью в куриных эмбрионах (>10 ЭИД/мл), что позволяет использовать его при производстве инактивированной гриппозной вакцины (ИГВ), где требуется получение большого количества вирусного материала для его последующей очистки и концентрации.
Принадлежность гемагглютинина родительскому штамму «дикого» типа А/mallard/Нидерланды/12/00(H7N3) у реассортанта была подтверждена в реакции торможения гемагглютинации (РТГА). Изучение антигенных свойств показало, что апатогенный птичий вирус А/mallard/Нидерланды/12/00 (H7N3) и его ХА реассортант являются антигенно идентичными (взаимодействие с гомологичной типоспецифической сывороткой согласно ТУ 42-14-79-79). Показатели взаимодействия реассортанта А/17/mallard/Нидерланды/00/95(H7N3), так же как и родительского штамма А/mallard/Нидерланды/12/00(H7N3) с антисыворотками хорьков, полученными к вирусам, выделенным от людей во время вспышки в Нидерландах в 2003 году, включая и случай летальной инфекции (А/Нидерланды/219/03), отличались от гомологичных титров соответствующих антигенов не более чем в 2 раза (табл.2).
Таблица 2
Антигенная специфичность апатогенного вируса птичьего гриппа А/mallard/Нидерланды/12/00 (H7N3) и его ХА реассортанта
Вирусы
Подтип
Антисыворотки хорьков
Mallard/NL/00
NL/219/03
NL/230/03
NL/231/03
Нормальная сыворотка
A/mallard/H идерланды/12/00 (Mallard/NL/00)
H7N3
320
640
160
40
5
А/17/mallard/Нидерланды/00/95 (6:2 реассортант)
H7N3
320
320
160
40
5
А/Нидерланды/219/2003 (NL/219/03)
H7N7
320
640
160
40
5
А/Нидерланды/230/2003 (NL/230/03)
H7N7
320
640
320
80
5
А/Нидерланды/231/2003 (NL/231/03)
H7N7
320
320
160
80
5
Для оценки генетической стабильности реассортантного штамма А/17/mallard/Нидерланды/00/95(H7N3) проводили 5 серийных пассажей в 10-11-дневных КЭ. После выделения вирусной РНК проводили ОТ-ПЦР рестрикционный анализ. Было показано, что нуклеотидные замещения, ранее охарактеризованные для генов внутренних и неструктурных белков донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57(H2N2), присутствуют в геноме вакцинного штамма после пяти пассажей в КЭ (Табл.3).
Таблица 3
Нуклеотидные замещения, обнаруженные в генах внутренних и неструктурных белков реассортантного штамма А/17/mallard/Нидерланды/00/95 (H7N3) до и после пассажей в куриных эмбрионах
Вирус
Характеристика
Nucleotide positions in "internal" genes
РВ2
РВ1
PA
м
NS
1459
819
1795
107
1045
68
969
798
А/Ленинград/134/57 (H2N2)
Эпидемический вирус
G
G
G
Т
G
А
G
G
А/Ленинград/134/17/57 (H2N2)
ХА донор аттенуации
Т
Т
А
С
Т
G
А
А
A/17/mallard/ Нидерланды/00/95 (H7N3) до пассажей в КЭ
Реассортантный вакцинный штамм
Т
Т
А
C
Т
G
А
А
А/17/mallard/Нидерланды/00/95(H7N3) после 5 пассажей в КЭ
Т
Т
А
C
Т
G
А
А
В таблице 4 представлены показатели репродукции в КЭ реассортантного штамма А/17/mallard/Нидерланды/00/95(H7N3). Показано, что реассортант А/17/mallard/Нидерланды/00/95(H7N3) проявлял высокую репродуктивную активность при оптимальной температуре инкубации 34°С. Подобно ХА родительскому штамму А/Ленинград/134/17/57(H2N2), реассортантный штамм А/17/mallard/Нидерланды/00/95(H7N3) хорошо репродуцировался при пониженной до 25-26°С температуре и практически утратил способность к размножению при 40°С (ts-, ca- фенотип). Родительский вирус «дикого» типа А/mallard/Нидерланды/12/00(H7N3), напротив, отличался температуроустойчивостью и отсутствием репродукции при 25°С.
Таблица 4
Репродуктивная активность реассортанта А/17/mallard/Нидерланды/00/95(H7N3) при различных температурных режимах инкубации в куриных эмбрионах
Вирус (характеристика)
Репродуктивная активность при температуре (Ig ЭИД<sub>50</sub>/1 мл)
Фенотип
34°С
40°С
25°С
26°С
А/17/mallard/Нидерланды/00/95(H7N3) (6:2 реассортант)
9,2±0,5
1,8±0,2
6,9±0,5
7,5±0,1
Ts, ca
А/Ленинград/134/17/57(H2N2) (ХА донор аттенуации)
9,5±0,3
1,6±0,1
7,0±0,1
8,7±0,6
7s, ca
А/mallard/Нидерланды/12/00 (H7N3) (апатогенный птичий штамм)
8,7±0,2
8,0±0,2
<1,5
1,6±0,1
Non-ts, non-ca
Таким образом, представленный вакцинный штамм А/17/mallard/Нидерланды/00/95(H7N3) характеризуется сочетанием полезных признаков, необходимых вакцинному штамму - антигенной специфичностью гемагглютинина вируса «дикого» типа А/mallard/Нидерланды/12/00(H7N3), структурой генома, необходимой для реассортантных вакцинных штаммов, температурочувствительностью, хорошей адаптацией к пониженной температуре культивирования, что коррелирует с аттенуацией, характерной для аттенуированного донорского штамма. Характеристики нового штамма -холодоадаптированность и высокая репродуктивная активность в куриных эмбрионах - позволяют использовать его для производства как живой, так и инактивированной гриппозной вакцины.
Штамм депонирован в коллекции Научно-исследовательского института вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН под №2717. Морфология штамма - полиморфная, типичная для вируса гриппа.
ХАРАКТЕРИСТИКА ПОЛУЧЕННОГО ШТАММА.
50
Инфекционная активность при репродукции в развивающихся куриных эмбрионах при 33°С в течение 48 часов - 9,2 Ig ЭИД/ 0,2 мл.
Гемагглютинирующая активность - 1:256.
Паспорт на вакцинный штамм А/17/mallard/Нидерланды/00/95(H7N3)
прилагается (стр.7).
Результаты доклинического изучения заявляемого штамма.
8,1
50
Пример 1. Изучение безвредности реассортанта А/17/mallard/Нидерланды/00/95 (H7N3) проводили на курах породы белый Леггорн. Каждой из восьми 5-недельных кур вводили внутривенно 0,2 мл вируссодержащей аллантоисной жидкости с инфекционной активностью вируса А/17/mallard/Нидерланды/00/95(H7N3) 10 ЭИД/0,2 мл. В течение 10 суток проводили наблюдение за развитием признаков инфекции (респираторная инфекция, слабость, диарея, цианоз в области инокуляции, отек головы, неврологические симптомы). Индекс патогенности рассчитывали как 0 - отсутствие симптомов, 1 - развитие признаков инфекции, 2 - тяжелая инфекция, 3 - летальный исход.
В течение 10 суток после в/в инокуляции реассортантным штаммом А/17/mallard/Нидерланды/00/95(H7N3) ни у одного животного не было зарегистрировано признаков развития инфекции (индекс патогенности 0). Таким образом, реассортантА/17/mallard/Нидерланды/00/95(H7N3) был безвредным при внутривенном введении курам.
50
На третьи сутки после интраназального введения в дозе 6 Ig ЭИД/мл реассортант А/17/mallard/Нидерланды/00/95(H7N3) не был выделен из ротоглоточных и клоакальных смывов.
Выделение вируса А/17/mallard/Нидерланды/00/95(H7N3) из смывов после интраназального введения курам
№ животного
Ротоглототка
Клоака
1001
≤10<sup>0.9</sup>/мл
≤10<sup>0.9</sup>/мл
1002
≤10<sup>0.9</sup>/мл
≤10<sup>0.9</sup>/мл
1003
≤10<sup>0.9</sup>/мл
≤10<sup>0.9</sup>/мл
1004
≤10<sup>0.9</sup>/мл
≤10<sup>0.9</sup>/мл
1005
≤10<sup>0.9</sup>/мл
≤10<sup>0.9</sup>/мл
1006
≤10<sup>0.9</sup>/мл
≤10<sup>0.9</sup>/мл
1007
≤10<sup>0.9</sup>/мл
≤10<sup>0.9</sup>/мл
1008
≤10<sup>0.9</sup>/мл
≤10<sup>0.9</sup>/мл
1009
≤10<sup>0.9</sup>/мл
≤10<sup>0.9</sup>/мл
1010
≤10<sup>0.9</sup>/мл
≤10<sup>0.9</sup>/мл
В течение 14 дней не наблюдалось признаков развития инфекции, вирус не был выделен из ротоглоточных и клоакальных смывов и тканей легких, почек, сердца и головного мозга. На 14-е сутки после интраназального введения не зарегистрировано сероконверсий. Таким образом, эффект при введении реассортантного вируса А/17/mallard/Нидерланды/00/95(H7N3) курам был подобен действию вирусов сезонного гриппа с низким риском инфицирования.
Пример 2. Заявляемый вакцинный штамм А/17/mallard/Нидерланды/00/95 (H7N3) безвреден для мышей и морских свинок.
Суммарные данные определения острой токсичности на мышах и морских свинках
Вид животных
Вирус
Доза
Пало/выжило
Среднее изменение веса, г
Мыши
A/17/mallard/ Нидерланды/ 00/95 (H7N3)
0,5 мл внутрибрюшинно
0/10
+0,8
Морские свинки
A/17/mallard/ Нидерланды/ 00/95 (H7N3)
5 мл подкожно
0/3
+11,7
При гистологическом исследовании показано, что введение вакцинного штамма A/17/mallard/Нидерланды/00/95 лабораторным животным - мышам, не вызывает защитной реакции в виде - воспаления, альтеративных проявлений - в виде дистрофических и деструктивных изменений в печени, почках, селезенке, сердечной мышце - миокарде, стромальном компоненте внутренних органов. Кроме того, не отмечается дистрофических изменений нейронов, глиальных элементов и нарушений кровообращения микроциркуляторного русла головного мозга. Таким образом, применение вакцины не вызывает патоморфологических изменений, что свидетельствует о хорошей переносимости и безвредности вакцины А/17/mallard/Нидерланды/00/95.
Пример 3. Вакцинный штамм A/17/mallard/Нидерланды/00/95(H7N3) иммуногенен для мышей.
Показано, что вакцинный штамм А/17/mallard/Нидерланды/00/95(H7N3) проявляет иммуногенные свойства при интраназальном введении мышам. Среднегеометрические титры антигемагглютинирующих антител возрастают в группе иммунизированных мышей, при этом двукратная иммунизация является более эффективной.
Результаты РТГА с сыворотками мышей, иммунизированных интраназально 10<sup>7</sup> Ig ЭИД<sub>50</sub> штамма А/17/mallard/Нидерланды/00/95(H7N3) через 4 недели после иммунизации
Группы
СГТ
До иммунизации
Однократно
Двукратно
ЖГВ
5,0
8,7
40,0
Плацебо (раствор ФБ)
5,0
5,0
5,0