ШТАММ "DD1" ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОЙ БУРСАЛЬНОЙ БОЛЕЗНИ КУР СЕМЕЙСТВА BIRNAVIRIDAE, РОДА AVIBIRNAVIRUS, 1 СЕРОТИПА ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ИНАКТИВИРОВАННЫХ СОРБИРОВАННЫХ И ЭМУЛЬГИРОВАННЫХ ВАКЦИН
STRAIN "DD1" OF A VIRUS OF INFECTING BURSAL DISEASE OF THE HEN OF BIRNAVIRIDAE FAMILY, AVIBIRNAVIRUS GENUS, SEROTYPE 1 FOR PRODUCTION OF INACTIVATED SORBED AND EMULSIFIED VACCINES

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и может быть использовано при изготовлении средств диагностики и специфической профилактики инфекционной бурсальной болезни, а также при оценке иммуногенности вакцин против инфекционной бурсальной болезни.
Инфекционная бурсальная болезнь (ИББ) - высококонтагиозная болезнь, которая поражает преимущественно цыплят 2-15 недельного возраста. ИББ может протекать как в острой, так и в субклинической форме. Тяжесть заболевания зависит от возраста и чувствительности породы инфицированных цыплят, вирулентности штамма и уровня пассивного иммунитета. Наиболее чувствительны к ИББ цыплята 3-6 недельного возраста, у которых она протекает остро с выраженными клиническими признаками: поражением фабрициевой сумки, почек, геморрагиями в грудных мышцах и мышцах ног, диареей с выделением водянистого, беловато-желтого помета, глубокой прострацией. Смертность может достигать 20 - 30% и выше. [9].
Экономический ущерб, причиняемый ИББ, складывается из убытков от гибели и вынужденной выбраковки птицы, снижения продуктивности, проявления вторичных инфекций на фоне иммунодепрессивного воздействия вируса на организм птиц.
Возбудитель ИББ - вирус с двухцепочечным РНК-геномом, состоящим из двух сегментов (А и В), принадлежит к роду Avibirnavirus семейства Birnaviridae. Вирионы икосаэдрической формы, диаметром 55 - 60 нм. Заболевание распространено во всех странах с развитым птицеводством.
Для вируса ИББ установлены два серотипа: серотип 1 и серотип 2, но только серотип 1 патогенен для цыплят.[9] Штаммы серотипа 1 можно далее подразделить на четыре группы: классические вирулентные штаммы, аттенуированные штаммы, вариантные штаммы и высоковирулентные штаммы. [10]. Классические вирулентные штаммы у SPF (specific pathogen-free) цыплят вызывают воспаление бурсы и тяжелый лимфоидный некроз, что приводит к иммунодефициту и смертности от 20 до 30%. [14]. Вариантные штаммы вируса ИББ, вызывающие быструю атрофию бурс без проявления клинических симптомов на фоне высокого уровня материнских антител, получили распространение в таких странах как Соединенные Штаты Америки, Мексика, Венесуэла, Колумбия [12].
Для высоковирулентных штаммов вируса ИББ характерна способность преодолевать достаточно высокий уровень материнских антител и вызывать смертность, достигающую у SPF цыплят до 60 - 100%. Вспышки ИББ, вызванные высоковирулентным вирусом, впервые зарегистрированные в Голландии и Бельгии в 1986 г. [8, 13], быстро распространились по многим регионам мира. В отличие от американских вариантных штаммов высоковирулентные штаммы, обладая высокой патогенностью, не имеют новых антигенных свойств и антигенно подобны классическим штаммам [11, 13].
Известен штамм "М-92" вируса ИББ для производства диагностикумов, но этот штамм относится к серотипу 2 [1]. Известны такие штаммы вируса ИББ как штамм "СТ" [6], штамм «БГ» [2], штамм «КБК» [3], штамм «К-58» [5], но это все вакцинные штаммы.
В период с 1993 по 1999 гг. острая форма ИББ была зарегистрирована в более чем 156 птицехозяйствах РФ. Известны изоляты IBDVRF-03/94, IBDVRF-03/96, IBDVRF-08/96, IBDVRF-11/97, IBDVRF-10/98 и т.д., выделенные из патологического материала в этот период и идентифицированные как высоковирулентные [7]. Однако это изоляты и более подробная информация о них в открытых источниках отсутствует.
Наиболее близким предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является классический вирулентный штамм «52/70-М» вируса ИББ серотипа 1 [4].
Задачей настоящего изобретения является получение нового высоковирулентного штамма вируса ИББ, обладающего высокой биологической активностью в нативном виде, а также высокой антигенной и иммуногенной активностью после инактивации с целью изготовления высокоспецифичных и чувствительных диагностикумов и высокоиммуногенных и безвредных инактивированных вакцинных препаратов, а также для оценки иммуногенности вакцин методом контрольного заражения.
Поставленная задача достигается получением высоковирулентного штамма «DD1» вируса ИББ для производства инактивированных сорбированных и эмульгированных вакцин, оценки их иммуногенности, а также диагностических целей.
4,0
4,5
3
50/см
Штамм «DD1» вируса ИББ выделен из гомогената фабрициевых сумок клинически больных цыплят-бройлеров заражением SPF цыплят 40 суточного возраста. После проведения 7 адаптационных последовательных пассажей на SPF цыплятах титр биологической активности вируса составляет 10 ÷ 10ЭИД.
Полученный штамм депонирован в Государственной коллекции вирусов в НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России под № 2888.
По сравнению с прототипом штамм «DD1» вируса ИББ обладает более высокой биологической и антигенной активностью в нативном виде и после инактивации. Экспериментально подтверждена возможность его использования для оценки иммуногенности вакцин методом контрольного заражения, для изготовления диагностических препаратов и инактивированных вакцин против ИББ.
Штамм «DD1» вируса ИББ поддерживается на SPF цыплятах. Для поддержания  и наработки вируссодержащего материала используется  система посевных материалов (seed lot system).
Штамм «DD1» вируса ИББ характеризуется следующими признаками и свойствами.
Морфологические свойства
При электронно-микроскопическом исследовании методом негативного контрастирования фосфорно-вольфрамовой кислотой установлено, что вирусные частицы штамма «DD1» гексагональной конфигурации, не имеют внешней липопротеиновой мембраны, размер вирионов составляет 55 - 60 нм, грань состоит из 4 капсомеров величиной по 8-9 нм.
Генетические признаки
При молекулярно-генетическом исследовании установлено, что нуклеотидные последовательности сегментов А и B штамма «DD1» имеют 99%-ную гомологию с нуклеотидными последовательностями целого ряда высоковирулентных штаммов вируса ИББ, представленных в базе данных Genbank.
по сегменту А:- D6948 (Нидерланды) - 20 замен- UK661 (Великобритания) - 28 замен- 89163 (Франция) - 22 замены
по сегменту B:- D6948 (Нидерланды) - 9 замен- UK661 (Великобритания) - 9 замен- 89163 (Франция) - 14 замен
Биотехнологические характеристики
3,0
50
Штамм «DD1» вируса ИББ накапливают путем окулярно-интраназального заражения SPF цыплят 35-40 суточного возраста дозой вируса, равной 10ИД. Через 72 часа собирают бурсы от павших цыплят и цыплят с ярко выраженными клиническими признаками. Бурсы гомогенизируют в 0,001 М фосфатно-буферном растворе (рН 7,2-7,4) в соотношении 1:1 (вес на объем). Затем трижды замораживают - оттаивают и центрифугируют при 5000 g в течение 30 мин. Полученную надосадочную жидкость пропускают через стерилизующий фильтр и  проверяют на стерильность, биологическую и антигенную активность.
Патогенные свойства
3
3,0
50
Экспериментально установлено, что окулярно-интраназальное введение вируса в объеме 0,1 см в дозе 10ИДSPF цыплятам 35-40 суточного возраста вызывает у них на 2-3 сутки после инокуляции вялость, сонливость, отказ от корма, диарею с выделением водянистого, беловато-желтого помета и гибель до 90%. При патологоанатомическом вскрытии у цыплят отмечаются поражения фабрициевой сумки, почек, геморрагии в грудных мышцах и мышцах ног.
Антигенные свойства
Штамм «DD1» вируса ИББ индуцирует у кур выработку вируснейтрализующих и преципитирующих антител к вирусу ИББ.
Инактивированный вируссодержащий материал в адъювантной форме, введенный парентерально цыплятам, индуцирует выработку антител в высоких титрах, регистрируемых в ИФА и РДП.
Устойчивость к химическим агентам
Штамм «DD1» вируса ИББ устойчив к растворителям (эфиру, хлороформу), чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению, четвертичным аммонийным соединениям.
Условия хранения
При хранении штамма в нативном состоянии при температуре -70°С допустимая длительность хранения без освежения составляет 24 мес., а при хранении в лиофилизированном состоянии под вакуумом при той же температуре  -  5 лет.
Дополнительные сведения о штамме
Свободен от контаминации бактериями, микоплазмами, грибами и другими вирусами.
На основании полученных данных можно утверждать, что вариантный штамм «DD1» вируса ИББ является оригинальным, в таксономическом отношении новым, ранее неизвестным изолятом высоковирулентного вируса ИББ.
Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования:
Пример 1. Приготовление диагностического антигена
3
Вируссодержащий материал разводили до оптимальной заражающей дозы. Полученным разведением окулярно-интраназальным методом заражали СПФ цыплят 35-40 суточного возраста. Объем инокулята составлял 0,1 см. От павших цыплят  и цыплят с ярко выраженными клиническими признаками через 48-72 ч отбирали бурсы. Бурсы гомогенизировали  в 0,001 М фосфатно-буферном растворе (рН 7,2-7,4) в соотношении 1:1 (вес на объем). Затем трижды замораживали - оттаивали и центрифугировали при 5000 g в течение 30 мин. Полученную надосадочную жидкость пропускали через стерилизующий фильтр и отбирали пробы для постановки реакции диффузионной преципитации (РДП) с антисывороткой к вирусу ИББ. При наличии титра вируса в РДП не ниже, чем 1:8 вируссодержащий материал подвергали  инактивации. Инактивацию вируссодержащего материала проводили теотропином. Контроль полноты инактивации вируса осуществляли методом трех последовательных пассажей на развивающихся SPF эмбрионах кур. Контроль стерильности - посевом на стерильные питательные среды: МПА, МПБ, МППБ под вазелиновым маслом, бульон Сабуро. Полученный антиген был пригоден для постановки реакции диффузионной преципитации.
Пример 2. Приготовление инактивированной вакцины
Для изготовления инактивированной эмульгированной вакцины против ИББ использовали антиген вируса ИББ из штамма «DD1», полученный по методике, указанной в примере 1. Эмульсию получали методом гомогенизации водного и масляного компонентов в соотношении 30:70 с помощью гомогенизатора Ultraturrax T-25. В качестве масляной фазы использовали адъювант АБ-4М (или другой). Полученную вакцину контролировали на стерильность, стабильность и вязкость эмульсии, полноту инактивации, безвредность и антигенную активность.
Пример 3. Определение антигенной и иммуногенной активности вакцины
6,7
3
3
50/см
Проведены сравнительные испытания антигенной активности двух инактивированных эмульгированных вакцин против ИББ из штамма «DD1» и штамма «52/70-М», изготовленных как указано в примере 2. В изготовлении вакцин был использован вируссодержащий материал с одинаковой биологической активностью равной 10ЭИД, определенной до инактивации.СПФ цыплята 10-дневного возраста в количестве 60 голов были разделены на 3 группы по 20 голов в каждой. Цыплят первой группы иммунизировали образцом инактивированной вакцины из штамма «DD1», цыплят второй группы - из штамма «52/70-М». Цыплята третьей группы оставались в качестве чистого контроля. Иммунизацию цыплят осуществляли подкожным введением препарата объемом 0,5 см в среднюю треть шеи. Через 28 дней после вакцинации от всех цыплят взяли кровь, получили сыворотки и исследовали их в ИФА на наличие антител к вирусу ИББ.
Вакцину считали антигенно активной, если титры поствакцинальных антител в ИФА к вирусу ИББ не менее чем в 2 раза превышали минимальный положительный титр, указанный в инструкции набора BioChek (1:391) при отрицательном иммунном фоне (уровень титров антител к вирусу ИББ у цыплят контрольной группы). Результаты исследований образцов вакцин  на антигенную активность представлены в Таблице 1.
Таблица 1.
Антигенная активность образцов инактивированных вакцин, содержащих в своем составе антигены вируса ИББ, изготовленные из штамма «DD1», штамма « 52/70-М»
Штамм вируса ИББ
DD1
52/70-М
Контроль
Титр<sub>ср.</sub> антител к вирусу ИББ в ИФА
1:8238
1:4854
1:278
Для оценки иммуногенности инактивированных эмульгированных вакцин против ИББ из штамма «DD1» и штамма «52/70-М» через 30 дней после вакцинации каждую группу цыплят разделили на две равные подгруппы, одних цыплят заразили окулярно-интраназальным методом штаммом «DD1», а других - штаммом «52/70-М». Результаты контрольного заражения представлены в Таблице 2 и Таблице 3.
Таблица 2.
Иммуногенная активность образцов инактивированных вакцин, содержащих в своем составе антигены вируса ИББ, изготовленные из шт. «DD1», шт.«52/70-М»
Контрольное заражение выполнено штаммом «DD1» вируса ИББ
Образец инактивированной вакцины
Кол-во цыплят
Результаты зараженияКлинические проявления/гибель
Иммуногенность (%)
Штамм DD1
10
0/0
100
Штамм 52/70-М
10
0/0
100
Чистый контроль
10
2/8
-
Таблица 3.
Иммуногенная активность образцов инактивированных вакцин, содержащих в своем составе антигены вируса ИББ, изготовленные из штамма «DD1», штамма «52/70-М»
Контрольное заражение выполнено штаммом «52/70-М» вируса ИББ
Образец инактивированной вакцины
Кол-во цыплят
Результаты заражения Клинические проявления/гибель
Иммуногенность (%)
Штамм DD1
10
0/0
100
Штамм 52/70-М
10
0/0
100
Чистый контроль
10
6/4
-
Пример 4. Приготовление диагностической сыворотки
3
SPF цыплят 20-дневного возраста двукратно с интервалом в 30 дней иммунизировали инактивированной эмульгированной вакциной против ИББ из штамма «DD1». Иммунизацию цыплят осуществляли подкожным введением препарата объемом 0,5 см в среднюю треть шеи. Через 3-4 недели после второй вакцинации цыплят обескровливали, получали сыворотку и определяли ее активность в ИФА и РДП.
Таким образом, штамм «DD1» вируса инфекционной бурсальной болезни, полученный в соответствии с предлагаемым изобретением, обладает высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью, пригоден для изготовления высокоиммуногенных инактивированных вакцин, оценки иммуногенной активности вакцин, а также диагностических целей, и расширяет арсенал новых отечественных производственных штаммов вируса ИББ.
Источники информации
1. Патент РФ № 2092555; C12N7/00; 10.10.1997 г.
2. Патент РФ №2127602; A61K39/12, C12N7/00; 20.03.1999 г.
3. Патент РФ № 2205021; A61K39/12, C12N7/00; 27.05.2003 г.
4. Патент РФ № 2261274; A61K; 10.08.2004 г
5. Патент РФ № 2272649; A61K39/12, C12N7/00; 27.03.2006 г.
6. Патент  РФ № 2276995; A61K39/12; 27.05.2006 г.
7. Щербакова,  Л.О. Молекулярная эпизоотология ИББ в России / Л.О. Щербакова, А. В. Борисов, Ю. А. Бочков  и др.// Аграрная Россия. - 2002. -  № 2. - С. 16-19.
8. Chettle, N. Outbreak of virulent infectious bursal disease in East Anglia / N. Chettle, J.C. Stuart, P.J.  Wyeth// Vet. Rec. -1989. - Vol. 125, No 10. - Р. 271-272
9. Eterradossi, N. Infectious Bursal Disease/ N. Eterradossi, Saif  Y. M.// Diseases of Poultry, 12th Edn. Iowa State University Press Ames, Iowa, USA -2008. - Р. 185-202.
10. Eterradossi, N. Critical amino acid changes in VP2 variable domain are associated with typical and atypical antigenicity in very virulent infectious bursal disease viruses / N. Eterradossi, C. Arnauld, D. Toquin  et al. // Arch Virol. -1998. - Vol. 143, No 8. - P. 1627-1636
11. Eterradossi, N. Pathogenicity and  preliminary antigenic characterization of six infectious bursal disease virus strains isolated in France from acute outbreaks / N. Eterradossi, J.F. Picault, P. Drouin et al. // J. Vet. Med. R. B. - 1992. - V. 39, № 4. - P. 683-391
12. Vakharia, V. N. Molecular basis of antigenic variation in infectious bursal disease virus / V. N.Vakharia ,J. He, B. Ahamed, D.B. Snyderba// Virus Res. - 1994.  - 31:265-273
13. Van den Berg T.P. Acute infectious bursal disease in poultry: protection afforded by maternally derived antibodies and interference with live vaccination/ T.P. Van den Berg, G. Meulemans // Aviian Pathol. - 1991. - Vol. 20, No.3. - P. 409-421
14. Van den Berg T.P. Infectious bursal disease (Gumboro disease) / T.P. Van den Berg, N. Eterradossi, D. Toquin et al.// Rev. sci. tech. Off. int. Epiz. - 2000. - Vol. 19, No 2. - 527-543