Способ получения профилактической противовирусной композиции на основе эпигаллокатехин-3-галлата (EGCG)
METHOD FOR PRODUCING PROPHYLACTIC ANTIVIRAL COMPOSITION BASED ON EPIGALLOCATECHIN-3-GALLATE (EGCG)

Изобретение относится к области медицины, в частности, к способам получения композиций для профилактики вирусных инфекций.
Противовирусная активность EGCG была показана в ряде работ ранее. На сегодняшний день проводятся многочисленные исследования катехинов зеленого чая. Были получены данные по противовирусной активности катехинов зеленого чая в отношении различных вирусов. Активность катехинов была изучена по отношению к вирусу простого герпеса, аденовирусов, вирусов гриппа и иммунодефицита человека (Li S, Hattori Т, Kodama EN. (2011) Epigallocatechin gallate inhibits the HIV reverse transcription step, Antivir Chem Chemother, 21(6), 239- 243). Было показано, что in vitro катехины значительно подавляют инфекционную активность вируса простого герпеса, влияя, по большей части, на стадию прикрепления и проникновения вируса в клетку хозяина, работая уже и на более поздних стадиях инфицирования (Cheng HY, Lin CC, Lin TC (2002) Antiviral properties of prodelphinidin B-2 3,-O-gallate from green tea leaf, Antivir Chem Chemother, 13 (4), 223-229).
Исследователями из Кореи были опубликованы данные по противогриппозной активности катехинов зеленого чая в отношении вирусов гриппа типа A (H1N1 и H3N2) и типа В. Авторы показали гемагглютин-ингибирующую активность ряда катехинов, причем действие EGCG было более выраженным. В клетках МСК нарушал функционирование вируса, подавлял синтез вирусной РНК и ингибировал нейраминидазную активность (Song JM, Lee КН, Seong BL (2005) Antiviral effect of catechins in green tea on influenza virus, Antiviral Res., 68 (2), 66-74). В другой работе было показано, что галлат эпигаллокатехина блокировал инфицирование и репликацию вируса в альвеолярных макрофагах при репродуктивно-респираторном синдроме у свиней (Ge et al., 2018). Также EGCG предотвращает инфицирование вируса Зика (Carneiro et al., 2016), мешает взаимодействию вируса иммунодефицита человека 1 типа с рецепторами на поверхности таргетных клеток (Liu et al.,2005). In vitro эксперименты показали активность EGCG по отношению к вирусу лихорадки Денге, через деформацию вирусных частиц (Raekiansyah et al., 2018). Также было показано, что EGCG блокирует инфицирование HCV клеток гепатомы и первичной культуры гепатоцитов (Ciesek et al.,2011), ингибирует слияние клеток при вирусах гриппа A/H1N1, A/H3N2, B (Song et al., 2005).
По отношению к вирусу SARS-CoV-2 по данным ряда авторов EGCG свое противовирусное свойство проявляет плейотропно. EGCG, вероятно, ингибирует химотрипсин-подобную протеазу - 3CLpro (Lu et al., 2020), блокирует 6vw1-связывающий домен S белка вируса (Mf et al., 2020), подавляет АТРазную активность GRP78 (Ibrahim et al., 2019).
Большинство исследований (как доклинических, так и клинических апробаций) биологической активности EGCG проводились по отношению к пероральным формам препарата. При такой форме приема препаратов, содержащих катехины зеленого чая, максимальная концентрация EGCG в плазме испытуемых не превышала 1 мкМ, повышение дозировок приводило к появлению побочных эффектов, но не отражалось существенно на содержании EGCG в крови (Н-Н. Sherry Chow, Yan Cai, David S. Alberts, et al. (2001) Polyphenon E Single-dose Administration of Epigallocatechin Gallate and Phase I Pharmacokinetic Study of Tea Polyphenols following, Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 10, 53-58).
Исследования фармакокинетики EGCG показали низкую биодоступность катехинов, которая, по разным данным, не превышала 1%. При такой биодоступности пероральный прием катехинов не позволяет достичь необходимого терапевтического уровня катехинов в органах - мишенях, а, следовательно, добиться устойчивого лечебного эффекта. В связи с этим, предпринимаются различные попытки улучшения этого параметра путем создания различных формуляций на основе катехинов (Imtiaz A. Siddiqui, Vaqar М. Adhami, Dhruba J. Bharali, Bilal B. Hafeez, Mohammad, Asim, Sabih I. Khwaja, Nihal Ahmad, Huadong Cui, Shaker A. Mousa, and Hasan, Mukhtar (2009) Introducing Nanochemoprevention as a Novel Approach for Cancer Control: Proof of Principle with Green Tea Polyphenol Epigallocatechin-3 -Gallate, Cancer Res., 69(5), 1712-1716; Kristin R. Landis-Piwowar, Congde Huo, Di Chen, Vesna Milacic, Guoqing Shi, Так Hang Chan and Q. Ping Dou (2007) A Novel Prodrug of the Green Tea Polyphenol Epigallocatechin-3 -Gallate as a Potential Anticancer Agent, Cancer Res, 67, 4303-4310).
MELISA Institute Genomics & Proteomics Research SpA проводят набор в клиническое исследование II/III препарата Превифенон (Previfenon) NCT04446065 для апробации данного препарата, представляющего собой капсулы по 250 мг с EGCG в качестве профилактического противовирусного средства. Ранее двойное слепое, плацебо контролируемое клиническое исследование показало снижение риска респираторных инфекций до 75% медицинскими работниками во время вспышки гриппа H1N1. Одновременно усиливалась активность иммунной системы за счет увеличения пролиферации ϒδ Т-клеток (28%) и продукции IFN-γ (26% пациентов). Активность против вируса гриппа продемонстрирована в исследовании NCT01008020 (Masahiro Morikawa).
В патенте CN105030757A раскрывается применение эпигаллокатехин-галлат (EGCG) против респираторно-синцитиального вируса (РСВ). Было установлено, что EGCG может ингибировать РСВ как in vitro, так и in vivo. In vitro EGCG может предотвратить заражение клеток и ингибировать биосинтез РСВ в клетках, а in vivo может облегчить патологическое поражение легочной ткани и снизить вирусный титр в легочной ткани. При концентрации в 16 мкг/мл EGCG не оказывает явной цитотоксичности, при концентрации 5,49 мкг/мл предотвращает проникновение вируса в клетку. Концентрация, необходимая для ингибирующего действия на вирус, находится в пределах 2 – 32 мкг/мл.
В патенте WO2012130893A1 описывается применение эпигаллокатехин-галлат в качестве альтернативы для пациентов с гепатитом С, для которых не применима терапия иммуномодулирующими агентами и/или ингибиторами вирусного метаболизма. В композиции действующее вещество используется в форме эфира или соли. Композиции на основе EGCG предотвращают инфицирование клетки, а также передачу вируса от заражённой клетки к здоровой. Ингибирующее действие достигается предотвращением взаимодействия между гликопротеинами Е1 и/или Е2 на поверхности вируса и белком-мишенью на клетке хозяйна.
В другом патенте, US9901565B2, описываются фармацевтические композиции на основе различных изомеров эпигаллокатехин-галлата, которые ингибируют процесс слияния мембран, в том числе и с вирусными мембранами.
В патенте WO2006083318A2 описываются композиции на основе катехина и, в частности, эпигаллокатехин-галлат, которые инактивируют вирус SARS-CoV. Стоит отметить, что данные композиции авторы предполагают использовать исключительно для обработки поверхностей, что, в свою очередь, подразумевает, что в составе композиций могут присутствовать компоненты, улучшающие адгезивные свойства. Концентрация действующего вещества по рецептуре от 0,01 μM до 1,0 nM. Композиции могут использоваться в виде порошка, спрея, мыла или шампуня и могут быть нанесены непосредственно на поверхность и/или вместе с водой.
Эпигаллокатехин-галлат также может использоваться для приготовления инактивированных вакцин на основе ряда вирусов, что описано в патенте KR101843564B1. Среди таких вирусов перечислены вирусы гриппа типов А (H1N1, H3N2, H5N2, H9N2), Б и С, а также коронавирус (штамм М41 вируса инфекционного бронхита), ВПЧ и норовирус. Инактивация вируса происходит в результате взаимодействия эпигаллокатехин-галлата с вирусными белками (например, с нуклеопротеином или гемагглютинином).
В патенте US20110052727A1 описана пищевая добавка, состоящая по крайней мере из трех действующих агентов, в числе которых эпигаллокатехин-галлат (EGCG). Также в состав данной композиции могут быть включены вплоть до 6 агентов: лакрица (солодка), глицирризиновая кислота, кверцетин, зеленый чай, эпигаллокатехин галлата, корица, коричный ангидрид, киновальная кислота, селен и прополис. Соединение предназначено для лечения и профилактики инфекции, вызванной вирусом простуды штамма H1N1. По заявлению авторов патента, данная композиция снижает вирусную инфекционность, ингибирует рост и репликацию вируса, а также снижает титр вируса в организме. 50% эффективность ингибирования вируса достигается при концентрации EGCG равной 22-28 µM, а при 500 µM на 80% подавляется синтез вирусной РНК, что показано на клеточной модели. При концентрации 350 µM в 1.5 раза снижается ферментативная активность. Добавка может быть в форме таблеток, капсул и жидкого сиропа, а доставка веществ может осуществляться через слизистую щеки и трансэпитеально.
В патенте JP2013094119A авторы предлагают метод введения EGCG внутримышечно, внутрибрюшинно и внутривенно против малярии, а также различных вирусных и бактериальных инфекций.
В CN105687226B описывается фармакологическая композиция на основе эпигаллокатехин-галлата (EGCG) для подавления коронавирусной инфекции. В составе композиции кроме основного действующего вещества, EGCG, присутствуют дубильная кислота и полисахариды астрагала в пропорции 1:1:1,5.
В патентах US5795911A и US5968973A описано противовирусное воздействие эпигаллокатехин-галлата на вирус папилломы человека.
Описан патент EP2179722A1 на фармацевтическую композицию, предназначенную для местного применения в целях профилактики половой передачи вирусной инфекции, в котором основным действующим веществом может быть эпигаллокатехин-галлат (EGCG), полученный из экстракта зелёного чая. Фармацевтическая композиция может быть использована в виде мази, крема, геля, суппозитория, жидкости для вагинального спринцевания, вагинального кольца или концентрата. Композиция может применяться против ряда вирусных инфекций: ВИЧ (ВИЧ-1 и ВИЧ-2), Т-лимфотропного вируса человека (HTLV-1 или HTLV-2), вирусов гепатита B и C, ВПЧ, а также вирусов простого герпеса и герпеса человека 8 типа. Содержание действующего вещества может составлять около 2-20% по весу катехинов для мазей и около 50-500 мг/капсулу для суппозитория.
Известен патент CN101028382A, в котором описана композиция на основе эпигаллокатехин-галлата для подавления вируса гепатита B. Эпигаллокатехин-галлат получен из экстракта зеленого чая. При концентрации в пределах 6.25—50 μМ, данная композиция эффективно используется для подавления экспрессии белка антигена вируса гепатита В и подавления репликации вирусной ДНК.
Композиция EGCG в таблетированной или капсульной форме описана в патенте CN2009101498189A. В состав препарата, помимо активной субстанции, могут входить различные компоненты в вариациях (крахмал, глазурь, декстрин, лактоза, микрокристаллическая целлюлоза, манни кальция сульфат, кислый фосфат кальция, кальция карбонат, смачивающий агент, карбоксиметил целлюлоза или метилцеллюлоза (МЦ), этилцеллюлоза (ЕС), гипромеллоза (ГПМЦ), 10%-20% раствор желатина, 50%-70% раствор сахарозы, 3%-5% 30 повидон водный раствор или спиртовой раствор,  очищенная вода, магния стеарат, микропорошок силикагеля,  гидрогенизированное растительное и жидких продуктов; (4) антиоксидант, таких как ве, КНБК и т. д.; Регулятор рН - это этандиевая кислота, дигидрофосфат натрия и др.
Близким по способу применения является изобретение RU2440821C2 для ухода за полостью рта и содержащее растительные экстракты, в том числе зеленого чая. Однако состав композиции отличен от предлагаемого в заявке, поскольку включает в себя как минимум 2 вида растительных экстракта в липофильной композиции. Авторы другого изобретения WO2013066208A2 для повышения биодоступности EGCG предложили использовать композицию, содержащую блок-сополимер оксиэтилена и оксипропилена, однако это делает технологию разведения EGCG более дорогостоящей.  Наиболее приближенным по механизму действия и по способу применения является изобретение, описанное в патенте RU2514103C1, которое представляет собой фармацевтическую композицию для лечения местных проявлений инфекций, вызванных вирусом простого герпеса, и для профилактики гриппа и острых респираторных вирусных инфекций, состоящий из эпигаллокатехин-3-галлата (EGCG) 70-90 мас. %, коллоидного серебра и гелеобразующей основы, которая включает пропиленгликоль, в качестве солюбилизатора - карбопол, в качестве эмульгатора - триэтаноламин и в качестве консерванта - нипагин в количестве 0,07-0,09 мас.% и нипазол в количестве 0,01-0,03 мас. %. Для профилактики ОРВИ применялся гель, содержащий 10 мас. % эпигаллокатехин-3-галлата и 1 мас. % раствора коллоидного серебра. Гель предлагают закладывать в оба носовых хода с помощью ватного аппликатора 2 раза в день в течение 21 дня. Весь период наблюдения за добровольцами включал 3-недельный курс профилактики и четыре недели наблюдения после окончания профилактики. Общий период наблюдения составил 7 недель. За весь период наблюдения (профилактический курс приема препарата и месяц после его окончания) при активном клиническом осмотре наблюдаемых лиц ответственным врачом не было выявлено каких-либо побочных реакций со стороны различных органов и систем, а также не было зафиксировано развитие реакции в местах аппликации препарата (слизистая носа), что свидетельствует в пользу абсолютной безвредности и полной безопасности комбинированного геля. Субъективных данных о непереносимости препарата, о побочных негативных, аллергических или каких-либо других нежелательных явлениях в дневниках наблюдения зафиксировано не было. Таким образом, при проведении профилактического курса против гриппа и ОРВИ среди здоровых взрослых лиц 10% гелем эпигаллокатехин-3-галлата, содержащим 1% раствора коллоидного серебра, показана его полная безвредность и хорошая переносимость. Проведенный профилактический курс применения препарата обеспечил снижение частоты возникновения гриппа и ОРВИ в основной группе. Показатель заболеваемости среди лиц, регулярно применявших комбинированный гель (2,7%), отличался от соответствующего показателя в контрольной группе (8,0%). Индекс эффективности (ИЭ) составил 2,9.
В течение 4-х недель после прекращения профилактического курса в контрольной группе заболело гриппом и ОРВИ 6 человек (6,9%), тогда как в основной группе выявлено 4 случая заболевания (3,6%). За период наблюдения (с первого дня применения - всего 7 недель) показатели заболеваемости составили 6,3% и 14,9% в опытной и контрольной группах соответственно. ИЭ равен 2,3; при этом показатель защищенности составил 57%. Это свидетельствует о стабильном, а не кратковременном профилактическом эффекте препарата, с положительным последействием.
Задачей предлагаемого изобретения является разработка нового способа получения композиции для профилактики заболеваний, вызываемых коронавирусами.
Способ получения композиции осуществляют следующим образом:
22
18
11
Для получения композиции EGCG, (тип катехина, содержащийся в больших количествах в зеленом чае, CHO), предварительно растворяют в этиловом спирте, ввиду его малой растворимости в водных растворах. 10 мг EGCG разводят в 25 мл 70% этанола, после чего доводят до 1 л 0,9% раствором хлорида натрия (физиологический раствор). Полученную композицию асептически фильтруют в ламинарном боксе через 0,20 мкм фильтр. Концентрацию EGCG, используемую в композиции, эффективную и при этом не цитотоксическую, определяли в цитотоксических тестах на разных клеточных линиях.
Данный состав пригоден для розлива по стерильным флаконам, предназначенным для дозированного нанесения/орошения слизистых оболочек, в том числе носовой и/или ротовой полости (флакон разного объема со спреем и крышкой или диспенсером). Может быть использован в качестве средства гигиены.
Данные позволяют говорить о безопасности и потенциальной эффективности в качестве гигиенического и лечебно-профилактического средства предлагаемой нами композиции. При этом, низкая биодоступность потенциально снижает риски передозировок и проявления системных эффектов при местном применении на слизистых оболочках носовой и ротовой полостей.
in vitro
Противовирусная профилактическая активность композиции EGCG в отношении новой коронавирусной инфекции SARS-CoV-2 показана в экспериментах .
Для этого использовали EGCG, 1000х раствор от предполагаемой действующей концентрации в DMSO. Условия хранения: в морозильнике при температуре -20 °С, без повторного замораживания/размораживания. Препарат сравнения – Плаквенил (Plaquenil), таблетки, покрытые пленочной оболочкой. Действующее вещество – гидроксихлорохин, 200 мг. Условия хранения: в холодильнике при температуре +2°С – +8°С.
Тест-система: культура клеток Vero (ATCC CCL-81), культура клеток Vero E6 (ECACC 85020206). Вирус SARS-CoV-2, клинический изолят на третьем пассаже в культуре клеток Vero, хранение при температуре -80°С.
Методы, используемые при изучении специфической противовирусной фармакологической активности
in vitro
на культуре клеток
Определение цитотоксичности препаратов
6
Цитотоксичность препарата ЕGCG и препарата сравнения Плаквенил в отношении клеточной культуры Vero был определена с помощью метода Моссмана (МТТ-теста). Для исследования использовали 96-луночные планшеты со 100% монослоем клеток Vero, посеянные в плотности 2*10кл/планшет накануне эксперимента.
Для исследования готовили двукратные разведения концентрированного (1000Х или 10 mM) препарата ЕGCG в DMSO: 500X, 250X, 125X, 63X, 32X, 16X, 8X. Затем разведения препарата добавляли в культуральную среду 1:100, таким образом, что концентрации вещества Е в лунках с клетками составили от 10Х до 0.08Х, а концентрация DMSO во всех лунках была одинакова и составляла 1%.
Разведения препарата Плаквенил готовили в ростовой среде, конечные концентрации препарата Плаквенил в лунках с клетками составили от 40 мкг/мл до 0,625 мкг/мл.
50
По окончании 3 дней инкубации оценивали жизнеспособность клеток с использованием красителя МТТ (метилтетразолиум бромид), оптическую плотность измеряли на планшетном анализаторе Victor2 Wallas (Perkin Elmer) На основании полученных данных с помощью программного обеспечения GraphPad Prizm 5.0 рассчитывали ЦТД (концентрация препарата, вызывающая гибель 50 % клеток).
Определение противовирусной активности препаратов
Для исследования использовали 6-луночные планшеты со 100% монослоем клеток Vero E6. Для оценки противовирусной активности препаратов были использованы две схемы внесения препарата.
Схема №1
2.
2
2.
- оценка способности препарата ингибировать проникновение вируса в клетки. Препарат в соответствующих концентрациях добавляли в культуральную среду клеток за 2 ч до внесения вируса, инкубировали в течение 2 ч при 37 °C, 5% COДалее препарат вносили параллельно с добавлением вирусного инокулята и инкубировали 2 ч при 37 °C, 5% CO. Затем инокулят и препарат удаляли, после чего добавляли к клеткам твердую покровную среду с содержанием 0,9% агара и инкубировали в течение 3 суток при 37°C, 5% CO
Схема №2
2
2.
- оценка способности препарата ингибировать репликацию вируса. Вначале на клеточную культуру наносили вирус и инкубировали в течение 2 ч при температуре 37°C и 5% CO. Далее инокулят удаляли, после чего добавляли к клеткам твердую покровную среду с содержанием 0,9% агара, в которую был добавлен препарат в соответствующих концентрациях и инкубировали в течение 3 суток при температуре 37 °C и 5% CO
50
По окончании срока инкубации клетки фиксировали и окрашивали 0,2% раствором кристаллического фиолетового в 50%-ном этаноле с содержанием 0,05% глутарового альдегида. Далее для каждой исследованной концентрации препарата подсчитывают процент снижения количества бляшек по сравнению с контролем, после чего вычисляли 50%-ную эффективную дозу (ЭД) – концентрацию препарата, которая снижает количество БОЕ в два раза (на 50%).
50
50
Для характеристики перспективности препарата использовали такие показатели, как ХТИ (химиотерапевтический индекс) равный отношению ЦТД к ЭД. Препараты, имеющие ХТИ более 8, принято считать перспективными.
in vitro
50
Результаты определения цитотоксичности препарата  представлены на рисунке 1, на котором представлены результаты определения цитотоксичности препарата ЕGCG (А) и препарата сравнения Плаквенил (Б) с помощью МТТ-теста, m±SD, n=6. Значение ЦТДдля препарата ЕGCG (рис.1А) составило 21,5 μM (примерно соответствует концентрации исходного препарата 2Х). Для препарата сравнения Плаквенил (Рис1Б) соответствующее значение составило 20,2 мкг/мл.
В экспериментах по определению противовирусной активности были использованы концентрации 20 и 10 μM для препарата ЕGCG (2Х и 1Х) и 5 и 2,5 мкг/мл для препарата Плаквенил (выбраны по результатам пилотного эксперимента, в котором дозы 20 и 10 мкг/мл приводили к ухудшению состояния монослоя и невозможности проводить учет количества бляшек).
Результаты исследования способности препарата Е ингибировать проникновение вируса в клетки (схема 1).
При использовании схемы 1 препарат ЕGCG контактировал с клеточной культурой как до внесения вирусного инокулята (в течение 2 ч), так и в течение 2 часов одновременно с вирусом, после чего был удален. Результаты тестирования противовирусной активности препарата представлены на рисунке 2, на котором отображено формирование бляшек в монослое клеток Vero E6 вирусом SARS-CoV-2, в присутствии и отсутствии препарата ЕGCG, а также препарата сравнения Плаквенил при использовании схемы 1.
Из данных, представленных на рисунке, видно, что количество бляшек, вызванных вирусом SARS-CoV-2, снижается при «профилактическом» внесении препарата ЕGCG, также отмечено уменьшение их размера. Ингибирование имеет дозозависимый эффект.
Результаты исследования способности препарата ЕGCG ингибировать репликацию вируса в клетках (схема 2)
При использовании схемы 2 препарат ЕGCG контактировал с клеточной культурой в течение 3 суток после заражения. Результаты тестирования противовирусной активности препарата представлены на рисунке 3 по формированию бляшек в монослое клеток Vero E6 вирусом SARS-CoV-2, в присутствии и отсутствии препарата ЕGCG, а также препарата сравнения Плаквенил при использовании схемы 2.
Из данных, представленных на рисунке, видно, что количество бляшек, вызванных вирусом SARS-CoV-2, снижается в присутствии препарата ЕGCG в дозировке 20 мкМ и близко к контрольному при использовании в дозировке 10 мкМ.
Цитотоксичность ЕGCG в культуре клеток здорового эпителия простаты RWPE и первичной культуры фибробластов кожи человека (FD).
1. Методы, используемые при изучении цитотоксичности активности
1.1 Клетки линии RWPE-1 и фибробласты FD рассевали по 3000 или 2500 клеток на лунку соответственно на лунки 96-луночного планшета.
Среда для фибробластов: DMEM+Glu 2mM+ FBS 10%
Среда для RWPE-1: Keratinocyte SFM (serum-free medium), supplements - rEGF and BPE.
1.2 На следующий день среду в лунках полностью меняли на свежую (такую же) с добавлением EGCG.
1.3 Сухой EGCG растворяли в 70% этаноле и доводили 0,9% NaCl до необходимого объема. Стоковая концентрация EGCG составляла 50 mM. Готовый раствор EGCG фильтровали через стерильный фильтр с диаметром пор 0,22 um.
Финальная концентрация EGCG после добавления к клеткам составляла 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 80, 100 uM. В лунки с нулевой концентрацией EGCG добавляли контрольный раствор (EtOH 70% и 0,9 NaCl в аналогичном соотношении) в объеме, эквивалентном 100 uM EGCG.
1.4 Клетки культивировали без дополнительной смены среды в течение 48 часов. По истечение этого времени в лунках полностью меняли среду на 90 мкл свежей среды без EGCG и добавляли 10 мкл реагента PrestoBlue. Измерение оптической плотности и флуоресценции измеряли через 1 час и 2 часа после добавления реагента на планшетном спектрофотометре.
Каждая точка представлена в трех повторах (три лунки для каждой концентрации EGCG). Для обработки данных использовали результаты измерения флуоресценции, снятые через 2 часа после добавления PrestoBlue. Результаты отображены на рисунке 4 , на котором показаны цитотоксические концентрации (IC50) EGCG в культуре клеток фибробластов в среде с содержанием сыворотки (10%) , и в культуре клеток эпителиальной природы RWPE (нижний ряд)
По результатам тестов IC50 EGCG в культурах эпителиальных клеток и фибробластов лежит в области 16-20  мкМ. При этом эпителиальные клетки линии RWPE более устойчивы к EGCG.
Для исследования механизма цитопротекторного действия препарата EGCG оценивали сродство к S2 и рецептор-связывающему домену (RBD) белка SARS-CoV-2 in vitro с помощью рекомбинантных белков.
Для теста активности EGCG в отношении штамма вируса B.1.1.7. параллельно оценивали сродство вируса к белку RBD, несущему мутацию N501Y, которая определяет повышенную контагиозность вируса по данным СOG-UK Consortium 2020.
Методы, используемые при изучении взаимодействия EGCG c оболочечными белками SARS-CoV-2
in vitro
Детекция комплексообразования методом микромасштабного термофореза
В исследованиях комплексообразования с EGCG использовали флуоресцентно-меченный белок RBD SARS-CoV-2, его аналог с мутацией N501Y – RBDm, а также S2. Флуоресцентное мечение каждого белка по остатку лизина (1 метка на белок) и последующую очистку от избытка красителя методом флеш-хроматографии осуществляли с использованием наборов NT™ Protein Labeling Kit RED-NHS (Nanotemper, Германия) по протоколу производителя. Итоговый раствор белка в рабочем фосфатно-солевом буфере (pH 7,4), содержащем 0,05% Tween-20, титровали EGCG. При этом концентрацию EGCG варьировали в диапазоне от 0 до 150 мкМ, а концентрацию белка поддерживали постоянной 50 нM. Для растворов флуоресцентно-меченого белка (50 нМ) с EGCG (0-150 мкМ) в рабочем буфере регистрировали кривые микромасштабного термофореза с детекцией по флуоресценции метки при 22°C на приборе Monolith NT.115, используя стандартные капилляры (NanoTemper, Германия). По изменению нормализованной флуоресценции в начальном участке термофоретической кривой рассчитывали долю комплекса, далее получали кривые и анализировали кривую связывания, использую программу MO.Affinity Analysis software (NanoTemper, Германия).
Детекция комплексообразования EGCG c флуоресцентно меченными белками методом анализа гашения флуоресценции и скорости выгорания метки
Интегральную флуоресценцию красителя, конъюгированного с белком, и скорость его выгорания регистрировали на приборе Monolith NT.115, оборудованном детектором для детекции флуоресценции в красном диапазоне.По изменению флуоресценции рассчитывали долю комплекса, далее получали кривые и анализировали кривую связывания, использую программу MO.Affinity Analysis software (NanoTemper, Германия). Аппроксимируя экспериментальные данные моделью Хилла, определяли KD = EC50 (эффективную концентрацию EGCG, соответствующую доле комплекса 50%).
На основании выраженной цитопротекторной активности EGCG предполагалось, что данный препарат блокирует стадию фузии, либо предшествующее ей взаимодействие RBD S-белка вируса с ACE2 рецептором на поверхности клетки. Для проверки ингибирования фузии анализировали взаимодействие EGCG c меченым S2-белком вируса методом микромасштабного термофореза. Результаты по взаимодействию EGCG с S2 белком представлены на рисунке 5: микротермофоретические кривые (а) и кривая связывания (б). Условия: фосфатно-солевой буфер, рН 7.4, концентрация белка: 50 нМ, 22℃. Как видно из данных рисунка, EGCG проявляет достаточно слабое сродство к S2: KD = 54±6 мкМ. Таким образом, блокирование стадии фузии – один из возможных, но не основной механизм действия препарата.
Для проверки возможности блокирования связывания вируса с клеточным рецептором анализировали взаимодействие EGCG с мечеными RBD (классический вариант) и RBDm (аналог, несущий мутацию N501Y) методами гашения флуоресцентной метки, оценки скорости выгорания метки, а также методом микромасштабного термофореза (Рис. 6, a-в). Взаимодействие EGCG с RBD и RBDm: кривые связывания и спектры кругового дихроизма. (a) Изменения испускаемой флуоресценции меченого белка при титровании препаратом EGCG. (б) Изменения скорости выгорания метки. (в) Изменения нормализованной флуоресценции (по начальному участку микротермофоретической кривой). Условия: фосфатно-солевой буфер, рН 7.4, концентрация белка: 50 нМ, 22℃. (г) Изменения спектров кругового дихроизма RBD при титровании EGCG. Условия: 10 мМ натрий-фосфатный буфер, pH 7,4; 0,7 мкМ RBD, 20℃. Результаты всех экспериментов подтверждают связывание в высоком наномолярном/низком микромолярном диапазоне концентраций; для обоих вариантов белка (RBD, RBDm) KD составляет 0,3 ± 0,2 мкМ. При дальнейшем увеличении концентрации EGCG появляются дополнительные перегибы на кривых. Общий вид кривой указывает на аллостерическое связывание, т.е. индуцированные EGCG конформационные изменения в белке. Последнее проверяли методом спектроскопии кругового дихроизма (Рис. 6 г). При титровании раствора белка препаратом EGCG до финальных концентраций 0-3,7 мкМ наблюдалось снижение амплитуды отрицательной полосы КД в области 210-220 нм, характерной для структурированных белков (альфа-спиральные и бета-складчатые структуры), и постепенное смещение точки экстремума в длинноволновую область. Дальнейшее увеличение концентрации EGCG (> 4 мкМ) приводило к выраженному сдвигу и снижению амплитуды КД-пика. Эти данные подтверждают, то EGCG меняет конформацию RBD, что, препятствует проникновению вируса в клетку.