Устройство, комплект и способ для введения трансплантата в костный регенерат
DEVICE, KIT AND METHOD FOR TRANSPLANT INTRODUCTION INTO BONE REGENERATE

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к области медицины и медицинской технике, а именно к экспериментальной травматологии и ортопедии, регенеративной медицине, трансплантологии. Изобретение может быть использовано в травматологии для сращивания костей при переломах в условиях in vivo.
Предпосылки создания изобретения
Восстановление дефекта кости критического размера остается главной клинической ортопедической проблемой. Дефекты кости критического размера технически определены как те, которые не заживают спонтанно, естественным путем в течение жизни пациента. Критический дефект может возникать как в случае случайного события (травма), так и преднамеренно (экспериментальные исследования на лабораторных животных). Способности человека и млекопитающих, в целом, и восстанавливать кость путем репаративной регенераци ограничены, поэтому для костей существует понятие о дефектах, превышающие критические размеры, но для каждой кости они имеют свои параметры и отличаются как по объему утраченных тканей, так и по конфигурации.
В экспериментах на животных моделях с искусственными критическими дефектами костей было показано (Миронов С.П., Омельяненко Н.П., Ильина В.К., Карпов И.Н., Дорохин А.И., Кожевников О.В. ТКАНЕВЫЕ И КЛЕТОЧНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ УПРАВЛЕНИЯ РЕПАРАТИВНЫМ ОСТЕОГЕНЕЗОМ // Кремлевская медицина. Клинический вестник. - 2007. - №1. - С. 48-52), что на месте утраченных опорных тканей - между опилами костей спонтанно формируется надтканевая временная структура - «грануляционная ткань», богатая новообразованными сосудами. При дальнейшей естественной регенерации в этой молодой соединительной ткани происходит редукция сосудистого русла, формируется атипичная для данной локализации грубоволокнистая структура - соединительнотканный рубец.
Кость также регенерирует через динамически изменяющийся соединительнотканный регенерат, так как костная ткань - является разновидностью скелетных соединительных тканей. Вторичное костное сращение последовательно проходит пять сменяющих друг друга фаз морфологической перестройки костного регенерата: 1) формирование провизорной (остеогенной) мозоли; 2) дифференцировка клеток провизорной мозоли в хрящ и грубоволокнистую костную ткань; 3) образование первичных костномозговых полостей с костным мозгом; 4) разрушение хряща и образование на его месте энхондральной кости, имеющей губчатое строение; 5) замена грубоволокнистой энхондральной кости параллельно-волокнистой (Бабаева, Анна Георгиевна Регенерация: факты и перспективы / А.Г. Бабаева; Российская акад. мед. наук, ГУ НИИ морфологии человека РАМН. - Москва: Изд-во РАМН, 2009. - 333, [1] с. с. 182-183).
Костный регенерат длительно перестраивается: сначала происходит репаративное ремоделирование, а далее, уже на завершающем этапе, под действием постепенно нарастающей механической нагрузки осуществляется адаптивно-функциональное ремоделирование. После этих достаточно длительных перестроек кость полностью восстанавливает свои функции как орган: костный регенерат полностью консолидирован с костными отломками или краями дефекта и не отличается от соседней интактной костной ткани.
При дефектах, превышающих критический размер, кость регенерирует, но консолидация перелома невозможна, - образуются купола выростов на отломках (опилах) костей, которые не взаимодействуют достаточным образом между собой, так как их длины недостаточно для соприкосновения с костным регенератом на противоположной стороне. Остеогенные структуры самостоятельно не могут проникнуть в грануляционную ткань, так как нет необходимых факторов хемотаксиса для остеогенных клеток. Также там нет индукторов остеогенеза, количество клеток недостаточно. В итоге открытые костномозговые каналы закрываются замыкательными костными пластинками, и костная регенерация на этом заканчивается.
Таким образом, естественной регенерации недостаточно для преодоления костной тканью расстояния дефекта, поэтому такой дефект получил название «дефект, превышающий критические размеры». Отломки кости остаются несоединенными, регенерат (грануляционная ткань) между отломками костей превращается в обычный рубец, человек остается инвалидом.
Известно (Омельяненко Н.П., Ильина В.К., Карпов И.Н., Ковалев А.В., Хлыстова А.В. Провизорная естественная клеточно-матриксная основа для индуцируемой репаративной костной регенерации //Тезисы на Х юбилейном всероссийском съезде травматологов - ортопедов 16-19 сентября 2014 г, Москва. Сб. материалов съезда, стр. 469), что клеточные трансплантации могут изменить структурную динамику соединительнотканных регенератов, позволяя использовать эти естественные матрицы на этапах фиброгенеза - ангиогенеза как структурную основу для рукотворного «выращивания» утраченных частей костей внутри живых организмов, что может стать основой трансляционных исследований в травматологии и ортопедии. То есть, если периодически вводить остеогенные клетки и индукторы остеогенеза, питательные и биологически активные вещества в грануляционную ткань, можно изменить схему восстановления и обеспечить сращение костных отломков в случае, когда естественным путем это неосуществимо.
Известны различные методы восполнения костного дефекта, например, при направленной трансплантации клеток с помощью матриксов из биомедицинских материалов (имплантатов), в зону дефекта. Известен способ восстановления 2,1 см дефекта бедренной кости собак, с помощью полого пористого матрикса, заселенного аллогенными мезенхимными стволовыми клетками костного мозга (Arinzeh TL, Peter SJ, Archambault MP et al. Allogeneic mesenchymal stem cells regenerate bone in a critical-sized canine segmental defect // J Bone Joint Surg Am. 2003. Vol.85-A (10). P: 1927-35). Для заселения матриксов клетками использовали метод вакуумной загрузки клеточного материала. С этой целью пустой матрикс помещали в шприц, с помощью которого набирали культуральную среду с клеточным материалом. На один матрикс наслаивали 37,5 млн клеток. Через 16 недель на месте дефекта наблюдалось формирование костной ткани.
Недостатком данного метода является то, что для формирования костной ткани требуется большое число клеточного материала, кроме того, не весь матрикс замещается костной тканью, и через 16 недель он детектируется в достаточно большом количестве.
Таким образом, существует необходимость постоянно кратно вводить остеогенные клетки. При этом естественная остеогенная недостаточность преодолевается, замещение пространства костного дефекта фибробластами параоссальных тканей не происходит, и остеогенез стимулируется.
Известен аналог (С.П. Миронов, Н.П. Омельяненко, О.В. Кожевников и др Возможности клеточных технологий при лечении врожденных ложных суставов костей голени у детей. // КТТИ - VII (2) - 2012 - С. 38-39), в котором раскрыт метод лечения различных патологических состояний, связанных с повреждением соединительной ткани или нарушением ее регенерации. В данном методе осуществляют инъекции аутологичных соединительнотканных клеток (ССТК) в зону резекции ложного сустава, что приводит к формированию полноценного костного регенерата между костными отломками.
Сложность такой процедуры заключается в том, что трансплантировать остеогенные клетки надо часто и со стороны открытого костномозгового канала, а это весьма болезненная процедура. Более того, в глубине тканей тяжело попасть именно в костный регенерат, длины иглы часто не хватает, а ход длинной иглы хуже контролируется.
Соответственно возрастает актуальность поиска альтернативных методов введения клеточного материала, при которых можно как создавать и поддерживать остеогенную среду для костной регенерации со стороны двух отломков перед костными регенератами, так и проведения клеточных трансплантаций, способствуя соединению отломков кости через объединяющий соединительнотканный регенерат в единую кость, а также устраняя факторы, препятствующие остеогенезу.
Суть изобретения
Задача настоящего изобретения состоит в снижении травматизации пациентов при длительном периодическом введении трансплантата локально в зону костной регенерации, в обеспечении быстрого доступа к области дефекта в любое время в течение периода восстановления дефекта кости.
Технический результат данного изобретения заключается в разработке нового устройства для введения трансплантата, способа введения в область костной регенерации трансплантата, а также биологически активных веществ, питательных сред, факторов дифференцировки для создания благоприятной локальной среды регенерации, поддерживающей репаративный остеогенез, и в разработке нового комплекта, с помощью которого указанный способ осуществляется, для восстановления (заживления) костного дефекта, превышающего критический размер (критический костный дефект).
Использование новых устройства, комплекта и способа для введения трансплантата позволит получить эффективный и постоянный доступ к области костной регенерации для ее подпитки клеточным материалом (клеточными трансплантатами, тканевыми сфероидами) и биоактивными веществами в определенных режимах с целью восстановления (заживления) костного дефекта, превышающего критический размер (критический костный дефект).
Технический результат и техническая задача обеспечиваются за счет того, что предлагаемое устройство для введения трансплантата в соединительнотканный регенерат на месте костного дефекта выполнено в виде эластичной трубки-стержня из биоинертного материла, имеющей изгиб, позволяющий ввести ее в костно-мозговой канал так, чтобы трубка-стержень упиралась во внутреннюю стенку костномозгового канала на противоположной стороне просверленному отверстию в области метафиза. Причем трубка-стержень выполнена с возможностью ввода через ее просвет незакрепленного катетера с иглой на конце, трубка-стержень имеет внутренний конец и наружный конец, внутренний конец заострен и имеет косой срез по большей кривизне трубки-стержня, а наружный конец выполнен с внешней резьбой.
В частных вариантах воплощения изобретения внешняя поверхность внутреннего конца трубки-стержня имеет зазубрины.
В частных вариантах воплощения изобретения биоинертным материалом трубки-стержня является титан или нержавеющая сталь.
Технический результат и техническая задача обеспечиваются за счет того, что предлагаемый комплект для введения трансплантата в соединительнотканный регенерат на месте костного дефекта включает две трубки-стержня, описанные выше, по меньшей мере один катетер с иглой на конце, по меньшей мере один мандрен, по меньшей мере переходник, устанавливаемый на наружный конец трубки-стержня для присоединения шприца, по меньшей мере один шприц, две канюли с крышкой или две крышки, устанавливаемые герметично на наружные концы трубок-стержней с помощью резьбового соединения.
В частных вариантах воплощения изобретения мандрен выполнен с заостренным рабочим концом.
В частных вариантах воплощения изобретения комплект дополнительно снабжен направляющей деталью с прямолинейным сквозным каналом для возможного прохождения через него трубки-стержня.
В частных вариантах воплощения изобретения катетер имеет рентгеноконтрастную метку, расположенную вдоль длины катета и нанесенную линейку, в которой отсчет ведется от основания иглы катетера.
В частных вариантах воплощения изобретения комплект дополнительно снабжен мембраной, имеющей отверстия.
В частных вариантах воплощения изобретения мембрана является резорбируемой.
В частных вариантах воплощения изобретения мембрана представляет собой коллагеновую мембрану, децеллюлизированную и лиофилизированную аллогенную или ксеногенную надкостницу.
В частных вариантах воплощения изобретения отверстия в мембране имеют диаметр до 0,8 см. При этом отверстия в мембране могут составлять до 20% от общей площади поверхности всей мембраны.
2
В частных вариантах воплощения изобретения на 4-6 см площади поверхности мембраны имеется одно отверстие.
Технический результат и техническая задача обеспечиваются за счет того, что предлагаемый способ введения трансплантата в соединительнотканный регенерат для восстановления кости при дефектах, размеры которых превышают критический размер, включает следующие этапы:
- вводят две трубки-стержни, описанные выше, с установленными в них мандренами, с двух сторон травмированной кости через ее метафизы, дистальный и проксимальный, по направлению к центру кости, и выводят их в дефект через открытые костномозговые каналы костных отломков, продвигая трубки-стержни вдоль костномозговых каналов таким образом, чтобы точка упора о внутреннюю стенку костномозгового канала находилась со стороны, противоположной костному каналу в кортексе метафиза,
- вынимают мандрены, при этом наружные концы трубок-стержней остаются над поверхностью кожи,
- через трубки-стержни подают трансплантат посредством катетера с иглой, проводимого через канюлю, закрепленную на наружном конце по меньшей мере одной трубки -стержня, или через шприц, закрепленным на переходнике, установленном на наружном конце по меньшей мере одной трубки -стержня,
- извлекают трубки-стержни после начала минерализации костного регенерата в центральной части.
В частных вариантах воплощения изобретения до введения трансплантата осуществляют стабилизацию костных опилов или отломков в области дефекта по направлению друг к другу с помощью установки аппарата внешней фиксации, а также осуществляют установку мембраны, имеющую отверстия.
В частных вариантах воплощения изобретения при установке мембраны она фиксируется по краям шовными рассасывающимися нитями.
В частных вариантах воплощения изобретения после установки мембраны полость между мембраной и костным дефектом заполняется питательной средой F12, аутологичной обогащенной тромбоцитами плазмой, аутологичной сывороткой крови, альгинатным гелем или их смесью.
В частных вариантах воплощения изобретения после установки мембраны полость между мембраной и костным дефектом заполняется смесью альгинатного геля с питательной средой F12.
В частных вариантах воплощения изобретения трансплантат вводят многократно по мере развития соединительнотканного регенерата периодически.
В частных вариантах воплощения изобретения дополнительно периодически вводят цитокины, остеоиндукторы, индукторы дифференцировки, гранулы гидроксиаппатита, соли фосфата кальция в виде гранул, питательную среду, биологически активные вещества и/или суспензию измельченной деминерализованной кости.
В частных вариантах воплощения изобретения после установки трубок-стержней их заполняют изотоническим стерильным раствором поваренной соли.
В частных вариантах воплощения изобретения перед введением трубок-стержней их дополнительно изгибают для соответствия их кривизны геометрии костномозгового канала и упора во внутреннюю стенку костномозгового канала на противоположной стороне просверленному отверстию в области метафиза.
В частных вариантах воплощения изобретения для подачи питательных и/или биоактивных веществ и суспензии живых клеточных культур аутологичных клеток в трубку-стержень вводят катетер с иглой на заранее установленную длину, при этом длина катетера соответствует длине трубки-стержня плюс половине расстояния между опилами кости.
В частных вариантах воплощения изобретения для подачи суспензии сфероидов в трубку-стержень вводят катетер с иглой таким образом, чтобы конец иглы находился в центре дефекта.
В частных вариантах воплощения изобретения для введения суспензии сфероидов катетер с иглой вынимают.
В частных вариантах воплощения изобретения костный дефект является дефектом трубчатой кости.
При это трансплантат представляет собой суспензию на основе остеогенных клеток, живых клеточных культур аутологичных клеток надкостницы, надхрящницы, стромальных клеток костного мозга, суспензию на основе клеточных или биокомпозитных сфероидов или различные их сочетания. сфероиды представляют собой сфероиды на основе аутологичных клеток надхрящницы, сфероиды на основе аутологичных клеток надкостницы, сфероиды на основе аутологичных и аллогенных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга и измельченной частично деминерализованной аллогенной кости или их смесь.
Способ по изобретению основан на том, что в области травматического дефекта формируется временная надтканевая структура - грануляционная ткань - естественно-клеточная матрица (далее ЕКМ) спонтанно, естественным путем и, частично, в ответ на стимулирующее воздействие трансплантированного клеточного материала на ангиогенез и торможение редукции сосудов за счет паракринных эффектов. Указанная ЕКМ является соединительнотканным регенератом параоссальных тканей и насыщается извне остеогенными клетками, цитокинами, индукторами костной дифференцировки - всем тем, что необходимо для стимуляции репаративного остеогенеза. Далее ЕКМ с пересаженными остеогенными клетками или сфероидами постепенно замещается костной мозолью, соединяющую костные отломки, которая в ходе ремоделирования регенерата уже естественным путем под действием механических нагрузок превращается в полноценную кость.
Насыщение извне происходит с использованием незакрепленного катетера с иглой или шприца через эластичные трубки-стержни из биоинертного материала. Трубки-стержни вводятся по передней поверхности с двух сторон травмированной кости через ее метафизы (дистальный и проксимальный) по направлению к центру кости и выходят в дефект через открытые костномозговые каналы костных отломков. Трубки-стержни вводятся таким образом, чтобы точка упора о внутреннюю стенку костномозгового канала находилась со стороны, противоположной костному каналу в кортексе метафиза
В настоящем изобретении через трубку-стержень в одном из вариантов осуществления движется незакрепленный катетер с иглой на конце по направлению к центру кости с целью достичь область дефекта, выйдя в нее со стороны открытого костномозгового канала. Игла катетера проникает в грануляционную ткань в области регенерации - эта ткань состоит преимущественно из сосудов, насыщающих область регенерации кислородом, мигрирующими клетками и питательными веществами. В ЕКМ инъецируют остеогенные клетки, сфероиды и только те факторы индукции и стимуляторы, которые поддерживают репаративный остеогенез, не удаляя уже существующие там необходимые биологически активные вещества, поддерживающие регенерацию.
Катетеры с иглами двигаются навстречу друг с другом через трубки-стержни, способствуя внедрению остеогенных клеток в ЕКМ и сближению костных регенератов. Нервных болевых окончаний там крайне мало, движения иглы безболезненны.
То есть, использование настоящего изобретения позволяет:
1) стержнем-трубкой мешать формированию замыкательных костных пластин и прекращению костной регенерации;
2) точно проникать внутрь к костным регенератам и ЕКМ с двух сторон через катетер с иглой по стержню - трубке, насыщать ЕКМ остеогенными клетками, цитокинами и индукторами дифференцировки, а также питательными веществами;
3) препятствовать редукции сосудов в грануляционной ткани, завершению фазы регенерации и формированию атипичного регенерата - соединительнотканного рубца, препятствующему репаративному остеогенезу;
4) использовать ЕКМ как естественную, хорошо насыщенную кислородом и питательными материалами матрицу, которая искусственным путем насыщается остеогенным материалом, меняет свои свойства и структуру, через которую проникают с двух сторон костные регенераты (по способу трансплантационной регенерации) и соединяются между собой непрерывными волоконными остовами (волокна коллагена внеклеточного костного матрикса, тканевого и органного уровней структурной организации), в которой фиксируют костные отломки в единую систему, в результате чего кость эффективно регенерирует.
В целом, при критических дефектах костей, отдельно идет костная регенерация, приводящая к закрытию костномозговых каналов замыкательной костной пластинкой, отдельно - формирование и редукция грануляционной ткани с образованием рубца в центре костного дефекта. Использование разработанного устройства и комплекта для введения трансплантата (суспензии клеток и тканевых сфероидов) позволяет объединить эти два процесса регенерации за счет эффективной стимуляции костной регенерации, изменения клеточного состава, структуры и свойств грануляционной ткани, а также предотвратить механическое препятствие - образование рубца и обеспечить объединение костных регенератов с двух сторон от костных отломков с формированием целой кости.
Устройство, комплект и способ согласно настоящему изобретению позволяет создавать и поддерживать локальную остеогенную среду благоприятную для костной регенерации со стороны двух отломков перед костными регенератами, способствуя их соединению через объединяющий костный регенерат в единую кость, а также устраняя факторы, препятствующие остеогенезу.
Краткое описание чертежей
Прилагаемые чертежи, которые включены в состав настоящего описания и являются его частью, иллюстрируют варианты осуществления изобретения и совместно с вышеприведенным общим описанием изобретения и нижеприведенным подробным описанием вариантов осуществления служат для пояснения принципов настоящего изобретения.
На фиг. 1 показана принципиальная схема способа введения клеточного материала.
На фиг. 1 цифрами обозначены следующие позиции:
1 - муфта из специальной пленки - «Остеопласт-К»
2 - подающая эластичная трубка-стержень, проходящая через костномозговой канал.
3 - костная ткань, кортикал диафиза кости.
4 - уплотняющая манжета.
5 - кость
6 - расстояние между отломками костей, параоссальные ткани.
Термины и определения
Для лучшего понимания настоящего изобретения ниже приведены некоторые термины, использованные в настоящем описании изобретения. Если не определено отдельно, технические и научные термины в данной заявке имеют стандартные значения, общепринятые в научной и технической литературе.
В настоящем описании и в формуле изобретения термины «включает», «включающий» и «включает в себя», «имеющий», «снабженный», «содержащий» и другие их грамматические формы не предназначены для истолкования в исключительном смысле, а, напротив, используются в неисключительном смысле (т.е., в смысле «имеющий в своем составе»). В качестве исчерпывающего перечня следует рассматривать только выражения типа «состоящий из».
В материалах настоящей заявки под термином «соединительнотканный регенерат» понимают новообразованную в результате репаративной регенерации соединительная ткань.
В материалах настоящей заявки под термином «естестественная клеточная матрица» (ЕКМ) понимают провизорную структуру, которая формируется регенерирующей волокнистой рыхлой неоформленной соединительной тканью (мягкими параоссальными тканями) на месте костного дефекта, размер которого превышает критический размер. При типичном заживлении в таких случаях межклеточный матрикс и клетки грануляционной ткани, превращаются в атипичный регенерат - соединительнотканный рубец.
В материалах настоящей заявки под термином «грануляционная ткань» понимают временную надтканевую структуру, молодую соединительную ткань, образующуюся при процессах заживления дефектов в различных тканях и органах. Развитие грануляций - приспособительный процесс, который содействует заживлению ран и язв, организации и элиминации инородных тел и нежизнеспособных тканей.
В материалах настоящей заявки под термином «костный регенерат», «регенерат» понимают: 1 - совокупность незрелых пролиферирующих клеток в зоне повреждения; 2 - заново образованную в результате регенерации ткань, в данном случае костную.
В материалах настоящей заявки под термином «область регенерации» - место протекания репаративной регенерации в живом организме.
В материалах настоящей заявки под термином «травматический дефект» - какой-либо телесный недостаток, образуемый в результате травмы.
В материалах настоящей заявки под термином «перелом», «перелом кости» понимают полное или частичное нарушение целостности кости при нагрузке, превышающей прочность травмируемого участка скелета. Переломы могут возникать как вследствие травмы, так и в результате различных заболеваний, сопровождающихся изменениями в прочностных характеристиках костной ткани.
В материалах настоящей заявки термины «остеогенные структуры», «остеогенные клетки» являются синонимами, представляют собой следующие за стволовыми стромальными клетками клетки этапа остеобластической дифференцировки, являются частично коммитированными, камбиальными в остеобластическом клеточном диффероне. Популяция остеогенных клеток неоднородна, включает по крайней мере два типа клеток - детерминированные остеогенные клетки-предшественники (для реализации своих остеогенных потенций не нуждаются в какой-либо индукции, но для остеобластической дифференцировки им необходимо наличие тесных межклеточных контактов с клетками микроокружения) и индуцибельные остеогенные клетки-предшественники (проявляют остеогенные свойства только после действия определенных индукторов остеогенеза, индуцибельными к остеогенезу являются адвентициальные клетки, сопровождающие сосуды, клетки в надкостнице и в экстраскелетных органах).
В материалах настоящей заявки под терминами «индукторы остеогенеза», «факторы или индукторы костной дифференцировки», «остеоиндукторы» понимают вещество, которое может стимулировать дифференцировку стволовых клеток и клеток предшественников в направлении остеобластического дифферона - остеобластов, образования костной ткани.
«Индуктор дифференцировки» - это вещество, которое может стимулировать дифференцировку стволовых клеток и клеток предшественников в определенном нарпавлении.
«Индуцированная дифференцировка» - дифференцировка клеток, происходящая в результате воздействия на нахи определенных факторов биологической или химической природы.
В материалах настоящей заявки под термином «факторы индукции и стимуляторы, которые поддерживают остеогенез, не удаляя существующие необходимые биологически активные вещества, поддерживающие регенерацию» понимают различные химические вещества, обладающие биологической активностью, которые присутствуют в тканевой жидкости в области регенерирующих структур. Они необходимы для реализации процессов направленных на восстановление биологических структур, в данном случае - кости.
В материалах настоящей заявки под термином «остеогенная среда для костной регенерации» понимают локальную искусственно поддерживаемую тканевую среду для направленной дифференцировки стволовых и прогениторных клеток в направлении остеобластической линии дифференцировки, благоприятную для костной регенерации, содержащую индукторы костной регенерации, в том числе 0,1 мкМ дексаметазона, 0,05 мМ аскорбиновой кислоты, 10 мМ глицерол-2-фосфата.
В материалах настоящей заявки под термином «питательные вещества» (в контексте клеточных технологий) понимают все вещества в легко усваиваемом виде, необходимые для удовлетворения пищевых и энергетических потребностей живых клеток.
Используемый в данной заявке термин «питательная среда» - это смесь неорганических солей и других питательных соединений, предназначенная для обеспечения выживания, поддержания роста и/или пролиферации клеток за пределами организма в искусственных условиях, обычно используется основная среда с добавками, например, сывороткой или факторами роста.
В материалах настоящей заявки термин «биологически активные вещества» - химические вещества, обладающие при небольших концентрациях высокой физиологической активностью по отношению к определенным группам живых организмов или к отдельным группам их клеток.
Используемый в данной заявке термин «сфероиды» относится к плотно упакованным клеточным агрегатам шарообразной формы, сформированных путем трехмерного культивирования. Их важным свойством является способность к взаимной адгезии и последующему тканевому слиянию, а также к адгезии к элементам внеклеточного матрикса реципиента. Тканевые сфероиды имеют тканеподобное строение - часто называют трехмерными микротканями, максимизирующими межклеточные взаимодействия.
В материалах настоящей заявки под термином «клеточный материал», «клеточный трансплантат» понимают остеогенные клетки, живые клеточные культуры аутологичных клеток надкостницы, надхрящницы, стромальных клеток костного мозга, клеточные (тканевые) сфероиды, полученные из этих клеток, биокомпозитные сфероиды, различные их сочетания.
В материалах настоящей заявки под термином «трансплантат» понимают суспензию на основе остеогенных клеток, живых клеточных культур аутологичных клеток надкостницы, надхрящницы, стромальных клеток костного мозга, суспензию на основе клеточных (тканевых) или биокомпозитных сфероидов или различные их сочетания. При этом сфероиды представляют собой сфероиды на основе аутологичных клеток надхрящницы, сфероиды на основе аутологичных клеток надкостницы, сфероиды на основе аутологичных и аллогенных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга и измельченной частично деминерализованной аллогенной кости или их смесь.
Термин «соединенный» означает функционально соединенный, при этом может быть использовано любое количество или комбинация промежуточных элементов между соединяемыми компонентами (включая отсутствие промежуточных элементов).
Кроме того, термины «первый», «второй», «третий» и т.д. используются просто как условные маркеры, не накладывая каких-либо численных или иных ограничений на перечисляемые объекты.
Подробное описание изобретения
В целом настоящее изобретение относится к стержню-трубке, комплекту для введения трансплантата в область дефекта, в частности для трансплантации суспензии клеток или сфероидов и способу введения трансплантата в соединительнотканный регенерат с использованием комплекта.
Комплект для трансплантации клеточного материала включает по меньшей мере одну эластичную трубку-стержень, мандрен, катетер с иглой, шприц, канюлю с герметичной крышкой или крышку с внутренней резьбой, переходник для присоединения шприца.
Эластичная трубка-стержень имеет изгиб, позволяющий ввести ее в костномозговой канал. Изгиб трубки-стержня способствует ее стабилизации в костномозговом канале.
Диаметр трубки-стержня может варьироваться от 3 мм до 1 см и зависит от типа кости и ширины костномозгового канала. Длина трубки может быть любой.
Трубка-стержень имеет наружный конец и внутренний конец. Изогнутый край внутреннего конца облегчает проведение трубки -стержня внутри костномозгового канала за счет «скольжения». Длина изогнутого края не должна превышать ширины самой узкой части костномозгового канала. Внутренний конец трубки-стержня имеет косой срез по большой кривизне для более точного движения иглы и катетера внутри трубки-стержня. Таким образом, внутренний конец заострен. Также внешняя поверхность внутреннего конца трубки-стержня имеет зазубрины, позволяющие расклинивать ткани при прохождении трубки-стержня в просверленном костном канале.
На наружном конце трубки-стержня имеется внешняя (наружняя) резьба, позволяющая крепить канюлю, крышку, Т-образную рукоятку для ввода трубки-стержня или переходник для присоединения шприца. Все вышеперечисленные элементы должны быть выполнены с ответной резьбой для резьбового соединения с трубкой -стержнем.
Просвет трубки-стержня выбран исходя из возможной проходимости внутри него катетера с короткой съемной иглой на конце для инъекций.
В качестве материала трубки-стрежня может быть выбран любой биоинертный материал, поддерживающий форму трубки-стержня и просвет трубки-стержня. В предпочтительном варианте изобретение основным материалом для изготовления трубки-стержня является титан. Изготовление трубки-стержня из титана позволяет ей умеренно изгибаться, но не быть жесткой. В некоторых вариантах осуществления материалом трубки-стержня является нержавеющая сталь.
Катетер имеет вдоль своей длины рентгенконтрастную метку и нанесенную линейку, где «0» - основание иглы (соединение иглы с катетером). Съемная игла имеет длину, которая позволяет осуществлять движения катетера внутри просвета трубки-стержня. Длина иглы ограничена кривизной трубки-стержня. Толщина съемных игл может варьировать, позволяя трансплантировать как клеточную суспензию, так и сфероиды.
Мандрен выполнен с заостренным рабочим концом.
В некоторых вариантах осуществления комплект снабжен направляющей деталью с прямолинейным сквозным каналом для возможного прохождения через него трубки-стержня.
Новый способ введения клеточного материала с использованием описанного выше комплекта осуществляется следующим образом.
В костномозговой канал определенным образом устанавливают трубки-стержни для подачи в область травматического дефекта остеогенных клеток или клеточных сфероидов, цитокинов, индукторов костной дифференцировки - всем тем, что необходимо для поддержания и стимуляции репаративного остеогенеза. Перед установкой вставляют в каждую трубку-стержень мандрен с заостренным концом, чтобы трубка не забивалась, каждую трубку-стержень дополнительно изгибают для того, чтобы подправить их кривизну в зависимости от геометрии костномозгового канала.
Трубки - стержни вводят биполярно через два отверстия в передней поверхности метафиза: одну с проксимальной стороны, другую - с дистальной. Трубки-стержни протягиваются от выполненного отверстия в кости до отверстия костномозгового канала со стороны костного дефекта через костномозговой канал с каждой из сторон навстречу друг с другом.
Для этого высверливают отверстия для ввода трубок-стержней. Первое отверстие в кортикальной пластинке на уровне метафиза выполняется с помощью хирургического шила или дрели. Вначале инструмент располагается перпендикулярно, однако по мере погружения в костное вещество направление и ориентация шила или сверла меняется в сторону перелома. Второе отверстие биполярно делают аналогичным образом.
Далее эластичная изогнутая на необходимую величину трубка-стержень закрепляется в Т-образной рукоятке (Т-образная рукоятка навинчивается на наружный конец трубки-стержня) и вводится через трепанационное отверстие в костномозговой канал. Изогнутый конец трубки-стержня вводится перпендикулярно отверстию, но как только он проходит кортикальный слой, направляется в сторону перелома. Зазубрины внутреннего конца трубки-стержня помогают расклинить трубку-стержень в кортикале метафиза в костном канале. Трубка -стержень проходит через кожу, мягкие ткани, кость с переходом в костномозговой канал. Далее трубка-стержень скользит вдоль стенки костномозгового канала с помощью легких ротационно-поступательных движений хирурга и продвигается в сторону костного дефекта. Трубка-стержень вводится таким образом, чтобы точка упора о внутреннюю стенку костномозгового канала находилась со стороны, противоположной костному каналу в кортексе метафиза.
Вторая трубка-стержень вводится аналогичным способом. Эластичные трубки-стержни с мандреном продвигают вдоль костномозговых каналов до выхода из костномозгового канала в дефект (там еще регенерат не образовался). После этого Т-образная рукоятка отвинчивается, мандрен удаляется.
В зависимости от дальнейших действий на наружный конец каждой трубки-стержня накручивается либо переходник для присоединения шприца, либо канюля для проведения через нее катетера с иглой.
Трубка-стержень находится в костномозговом канале до момента начала минерализации костного регенерата в центральной части.
В том случае, когда не выполняются какие-либо на трубку-стержень навинчивают канюлю и закрывают ее герметично крышкой, или на наружный конец трубки-стержня герметично навинчивается крышка.
Каждая из трубок - стержня позволяет:
1. вводить клетки, проводя через просвет трубы-стержня катетер с иглой на конце, и уже через этот катетер с помощью шприца инъецировать суспензию клеток, в том числе суспензию кусочков дименерализованного костного матрикса, кристаллов гидроксиаппатита, фосфата кальция;
2. подавать остеоиндукторы, цитокины, питательную среду, обогащенную тромбоцитами плазму крови через трубку-стержень напрямую через шприц с иглой или через катетер;
3. подавать тканевые (клеточные) сфероиды, биокомпозитные сфероиды через просвет трубки-стержня с помощью катетера с иглой на конце. Могут подаваться любые сфероиды, размеры которых позволяют это сделать.
До или после введения трубок-стержней (это не имеет принципиального значения) осуществляют стабилизацию костных отломков с помощью аппарата внешней фиксации. В предпочтительном варианте осуществления фиксацию отломков технически значительно проще осуществлять после введения трубок-стержней. В момент стабилизации костных отломков в области костного дефекта размещается мембрана с отверстиями, после чего рана послойно ушивается.
Стабилизация костных отломков осуществляется с помощью аппарата внешней фиксации, а именно костные отломки устанавливаются в направлении друг к другу, после чего следует установка мембраны с отверстиями. Туры мембраны закрепляются к концам опилов костей рассасывающимися нитями, полость, образованная мембраной, заполняется альгинатным гелем или изотоническими растворами или средой F12. Рана послойно ушивается. Мембрана позволяет более длительно поддерживать локальную среду, благоприятную для костной регенерации,
После первой операции по стабилизации костных отломков с помощью аппарата внешней фиксации (в частности, «Комплект аппаратов спице-стержневых для чрескостного остеосинтеза длинных и коротких трубчатых костей АСС-ЧК-"ГЭП ЦИТО" с набором инструментов для их установки (по типу Г.А. Илизарова) ("Аппарат Илизарова")») и установки мембраны с отверстиями, в течение периода времени от 5 до 8 суток в отграниченной мембраной зоне - внутри полости - формируется соединительнотканный регенерат - грануляционная ткань, проникающая внутрь полости через отверстия в мембране. Установка мембраны, имеющей отверстия, в область костного дефекта осуществляется для частичного отграничения полости дефекта от регенерирующих параоссальных тканей.
2
Возможно использование любой резорбируемой мембраны, в частности мембрана может представлять собой коллагеновую мембрану, в частности мембрану «Остеопласт» или OSSIX Plus (Datum Dental), децеллюлизированную и лиофилизированную аллогенную или ксеногенную надкостницу, в которой делаются специальные отверстия диаметром до 0,8 см. В частных вариантах воплощения изобретения мембрана характеризуется наличием одного отверстия на 4-6 см площади поверхности мембраны. Отверстия могут составлять до 20% от общей площади поверхности всей мембраны.
Указанные отверстия необходимы для дозирования (ограничения) врастания пара-оссальной ткани в пространство дефекта кости, так как эти ткани несут с собой новообразованные сосуды, которые будут необходимы для формирования сосудистой сети в костном регенерате, поскольку, как правило, сосудов со стороны костного мозга от обломков костей совершенно недостаточно, особенно если речь идет о старом или ослабленном модельном животном или о взрослом человеке. Однако, избыточное количество параоссальных тканей может образовать рубец в области регенерации, что создает препятствие для костной регенерации и отломки костей не сращиваются в единое целое (кость).
Количество отверстий зависит от возраста пациента и способности параоссальных тканей формировать грануляционную ткань с сосудами и проникать в окружающие пространства. У ослабленных пациентов такая способность снижена.
После установки трубок-стержней их сначала заполнят изотоническим стерильным раствором поваренной соли.
При трансплантации клеточного материала сначала подается суспензия с живым материалом, а затем объем катетера заполняется либо питательной средой, либо физиологическим раствором. Периоды введения клеточного материала и других веществ определяются конкретными протоколами лечения. Более подробно введение трансплантата описано ниже.
Через трубки-стержни в соединительнотканный регенерат периодически подается клеточный материал: суспензия живых клеточных культур аутологичных клеток надкостницы, надхрящницы, стромальных клеток костного мозга, клеточные (тканевые) сфероиды, полученные из этих клеток, биокомпозитные сфероиды, различные их сочетания.
Периодическое введение клеточного материала необходимо для того, чтобы одна порция клеточного материала успела прижиться перед тем, как подается следующая порция, которая формирует следующий объем прижившего трансплантата. Периодичность зависит от протокола лечения. Введения клеточного материала кратные, одномоментные, повторяются с интервалом от 12 часов до нескольких суток.
Для обеспечения возможности восстановления целостности кости при дефектах, размеры которых превышают критические, через каждую трубку-стержень попеременно подаются питательные среды (питательные вещества) в область регенерации. Локально изменяя состав тканевой жидкости, насыщая ее питательными веществами и буферными растворами, создаются более благоприятные условия для приживления клеточного материала и костной регенерации. В этих условиях пересаженный живой материал может сохранять свою жизнеспособность, становиться источником регенерации. Дополнительно питательные среды вводят в трубки -стержни через катетер, чтобы внутри катетера не оставался клеточный материал. Полость каждой трубки-стержня вне введений клеточного материала должна быть заполнена сменяемыми солевыми изотоническимм растворами. Полость должны периодически обрабатываться путем промывания противомикробными средствами (хлоргексидин, растворы антибиотиков). Катеры с иглами используются только стерильные.
Когда полость в области дефекта заполнена новообразованной минерализуемой регенерирующей костной тканью (определяют по данным компьютерной томографии), трубки-стержни удаляются, а костный регенерат подвергается последовательному естественному ремоделированию в кость. Трубки-стержни удаляют путем аккуратного вытягивания из костномозгового канала после навинчивания на каждую из них Т-образной рукоятки и установки мандрена. Раневые отверстия кожи могут быть ушиты, а при небольшом диаметре раны заживают самостоятельно. Анестезия у взрослых не требуется.
Для введения суспензии живых клеточных культур аутологичных клеток надкостницы, надхрящницы, стромальных клеток костного мозга в область соединительнотканного регенерата в одном из вариантов осуществления способа на трубку-стержень навинчивается канюля и в трубку-стержень через канюлю вводится катетер, который устанавливается внутри трубки-стержня на определенную длину, которая характеризует размер грануляционной ткани в области костного дефекта. Для этого катетер должен иметь вдоль своей длины рентгенконтрастную метку и иметь нанесенную линейку, где «0» - основание иглы (соединение иглы с катетером). Катетер никак не закреплен в трубке-стержне. Далее по катетеру в область регенерата подается с помощью шприца суспензия клеток.
В некоторых вариантах осуществления способа установленный катетер первые 5 (пять) суток может не извлекаться из трубки-стержня. При этом пространство между катетером и просветом трубки-стержня должно периодически промываться стерильным физиологическим солевым раствором.
После любого введения катетер всегда вынимается из трубки-стержня. Для трансплантации сфероидов в трубку-стержень вставляется катетер с толстой короткой иглой на конце. Игла максимально проталкивается к центру регенерата и по мере извлечения катетера подается суспензия сфероидов в регенерат. Сфероиды остаются как шлейф за постепенно вынимаемым катетером. Иным способом подавать сфероиды достаточно сложно, так как они должны быть пересажены в каналы внутри грануляционной ткани.
Для введения питательной среды или плазмы крови в, обогащенной тромбоцитами, или других растворов в трубку-стержень вводится катетер, который устанавливается внутри трубки-стержня на определенную длину, которая характеризует размер грануляционной ткани в области костного дефекта. Далее по катетеру в область регенерата подается с помощью шприца среда или раствор. Возможна подача растворов без катетера, Шприц присоединяется к переходнику, установленному на наружном конце трубки-стержня, и проводится медленное нагнетание растворов в регенерат.
После первичной консолидации отломков костей титановая трубка-стержень может быть легко извлечена под местной анестезией (или без анестезии), не повреждая костный регенерат. Введение одновременно с двух сторон трубок-стержней согласно настоящему изобретению препятствуют образованию замыкательных костных пластинок и прекращению костной регенерации.
Таким образом, большие объемы кости могут быть сконструированы предсказуемым образом с использованием новых протоколов клеточных трансплантаций, позволяющих часто и безболезненно вводить клеточный материал и среду, которая является благоприятной локальной средой для регенерации в искусственно созданном с помощью мембраны пространстве.
Устройство для введения трансплантата в соединительнотканный регенерат (две трубки-стрежня, вводимые через костномозговые каналы в область дефекта со стороны открытого костномозгового канала) совместно с мембраной, которая отграничивает зону (область) дефекта может рассматриваться как тканеинженерный ин виво биореактор.
Пример осуществления способа по изобретению.
В ходе оперативного вмешательства выполняются с помощью хирургического шила и дрели на уровне дистального и проксимального метафизов по передней поверхности два отверстия в кортикальной пластинке кости. При формировании каналов для введения трубки вначале медицинское шило располагается перпендикулярно, однако по мере погружения в костное вещество направление и ориентация шила или сверла меняется в сторону предполагаемого костного дефекта.
Далее эластичная трубка-стержень со вставленным мандреном изгибается на необходимую величину, закрепляется в Т-образной рукоятке (рукоятка имеет гаечную резьбу для накручивания на внешнюю резьбу трубки-стержня) и вводится через трепанационное отверстие в костномозговой канал. Эластичные, изогнутые под геометрию костномозгового канала трубки-стержни, вводили со стороны нижнего и верхнего костных отломков.
Изогнутый конец трубки-стержня вводится перпендикулярно отверстию, но как только он проходит кортикальный слой, направляется в сторону центра диафиза кости, но полное введение трубки в костномозговой канал не завершается.
Далее трубка-стержень скользит вдоль стенки костномозгового канала с помощью легких ротационно-поступательных движений хирурга и продвигается в сторону костного дефекта, выходя за линию опила. Трубка-стержень устанавливается в распор между созданным с помощью шила и сверла каналом трепанационного отверстия и противоположной внутренней стороной костно-мозгового канала, трубка-стержень не должна быть подвижной в костномозговом канале. Крайне осторожно нужно сохранить в ране содержимое костномозгового канала, выдавливаемое при проведении трубки-стержня. Снимается Т-образная рукоятка, вынимается мандрен. Выполняется гемостаз и послойное ушивание раны в том случае, если рана широкая. Наружные концы трубок-стержней при этом всегда остается снаружи над поверхностью кожи.
Накладывается аппарат внешней фиксации Илизарова, «Комплект аппаратов спице-стержневых для чрескостного остеосинтеза длинных и коротких трубчатых костей АСС-ЧК-"ГЭП ЦИТО" с набором инструментов для их установки (по типу Г.А. Илизарова) ("Аппарат Илизарова")»). В предпочтительном варианте осуществления устанавливается мембрана с отверстиями. Можно без нее.
Трубка -стержень заполняется стерильным изотоническим солевым раствором натрия хлорида с помощью шприца, который через переходник прикручивается к трубкам-стержню, затем, шприц с переходником удаляют и закрывают трубку-стержень завинчивающейся крышкой герметично. Нижний край крышки прижимает марлевую подушечку с хлоргексидином к поверхности кожи. Через 3-6 суток крышку отвинчивают, присоединяют канюлю для ввода катетера, и в трубку-стержень вставляется катетер с иглой на конце. Диаметр просвета иглы может быть до 1,5 мм. К катетеру присоединяется шприц типа Люэр, заполненный суспензией сфероидов, клеток, гранул костного матрикса или гидроксиаппатита, размеры которых позволяют ввести их через трубку и катетер.
Введение живого клеточного материала осуществляется продвижением катетера по трубке-стержню с проникновением в грануляционную ткань с помощью иглы.
Трубка-стержень находится в костномозговом канале до момента начала минерализации костного регенерата. Через трубки-стержни могут дополнительно подаваться питательные среды и биологически активные вещества. После завершения процесса трубки-стержни удаляют. Трубки-стержни удаляют либо сразу после выполнения программы (плана) трансплантаций, либо ожидают, периодически подпитывают регенерат, и удаляют только после начала минерализации матрикса костного регенерата по данным компьютерной томографии.
Пример введение трансплантата при проведении эксперимента на кролике.
Эксперимент проводился на кролике. Хирургическим путем создавался дефект большеберцовой кости кролика размером 3 см. На концы опилов костей накладывались туры мембраны с отверстиями, формируя частично отграниченное пространство от параоссальных тканей.
Далее вводили трубки-стержни в область дефекта описанным выше способом, заполняя их физиологическим стерильным раствором. Через 4 суток в трубки-стержни вставляли катетер с иглой и вводили через него в область соединительнотканного регенерата суспензию сфероидов надкостницы и биокомпозитных сфероидов из мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга с кусочком деминерализованной аллогенной кости в центре.
Стерильный катетер с иглой использовался однократно. Раз в 3 (трое) суток последовательно вводили аутологичный клеточный материал: 1) 250 сфероидов из клеток надкостницы; 2) 6 млн мультипотентных мезенхимальных клеток костного мозга; 3) 100 сфероидов из клеток надхрящницы; 4) 100 биокомпозитных сфероидов из ММСК КМ с деминерализованной костью в центре.
После введения катетер всегда извлекался. Через 3-4 часа после извлечения катетера просвет трубки-стержня заполнялся изотоническим раствором натрия хлорида, антибактериальными средствами. Через 2 (двое) суток полость трубки стержня промывалась физиологическим раствором. После чего трубки-стержни удалялись.
В контрольном исследовании на 6 (шестом) месяце кость набрала не менее 80% механической прочности (прочностных характеристик костной ткани), что показывает принципиальная способность предлагаемого способа получить сращение кости при дефекте критического размера.
Таким образом, предложенные согласно настоящему изобретению устройство и комплект позволяет использовать иные протоколы клеточных трансплантаций (более часто вводить клетки и вещества, поддерживать режим ин виво биореактора - подача веществ, поддерживающих костную регенерацию). При этом устройство и комплект позволяет осуществлять все манипуляции безболезненно, не требует дополнительного наркоза и местной анестезии при проведении трансплантаций и инъекций. Использование устройства, комплекта и способа согласно настоящему изобретению позволяет избежать создания дополнительных раневых каналов.
Хотя настоящая патентная заявка относится к определенному в прилагаемой ниже в формуле изобретения, важно отметить, что настоящая заявка на патент содержит основание для формулировки других изобретений, которые могут, например, быть заявлены как объект уточненной формулы изобретения настоящей заявки или как объект формулы изобретения в выделенной и/или продолжающей заявке. Такой объект может быть охарактеризован любым признаком или комбинацией признаков, описанных в настоящем документе.