Влияние гипоксии на синтез низкомолекулярных антиоксидантов Fragaria viridis Duch

Влияние гипоксии на синтез низкомолекулярных антиоксидантов Fragaria viridis Duch.

Н.Ф. Гусев, д.б.н., профессор, Г.В. Петрова, д.с.-х.н., профессор, Оренбургский ГАУ; О.Н. Немерешина, к.б.н, Оренбургская ГМА; Т.В. Бомбела, к.фарм.н., Пермская ГФА

Кислородная недостаточность является одним из неблагоприятных экологических факторов, влияющих на рост и развитие растений, при затоплении растений во время весеннего разлива рек. Сразу после прекращения действия кислородной недостаточности, когда растения вновь оказываются в условиях нормальной аэрации, у них развивается окислительный стресс. Следовательно, растения, устойчивые к гипоксии, должны обладать устойчивостью и к окислению. Изучение путей адаптации растений к гипоксии и последующей реаэрации представляет как теоретический, так и практический интерес с точки зрения создания тестовых систем для селекции экоустойчивых форм полезных растений, а также для разработки способов выращивания растений

на затопляемых почвах и для программирования урожая растений, различающихся по устойчивости к кислородному дефициту.

Поэтому целью представленной работы явилось изучение уровня синтеза и накопления биологически активных веществ-антиоксидантов Fragaria viridis Duch. на плакорном участке и в зоне регулярного подтопления паводковыми водами.

Научные исследования, посвящённые проблеме окислительного стресса растительных организмов, ведутся в разных странах мира [1—3, 11, 15]. Указанное объясняется тем, что в клетках растений при работе цепей транспорта электронов в мембранах хлоропластов и митохондрий всегда идет образование некоторого количества активных форм кислорода (АФК), обладающих способностью повреждать практически все компоненты клетки. АФК представляют собой свободнорадикальные частицы (супероксидный анион-радикал, перекисные радикалы, гидрок-

сильный радикал) или нейтральные молекулы (пероксид водорода и синглетный кислород). Образование АФК является нормальным метаболическим процессом, их содержание в клетках невелико (2% по сравнению с 98% кислорода, используемого в дыхании), и они быстро ме-таболизируют. Однако в стрессовых условиях происходит чрезмерное накопление активных метаболитов кислорода, например при действии некоторых токсических веществ, ионизирующего и УФ-излучений, а также реоксигенации после гипоксии. Следствием повышенного образования АФК могут быть патологические изменения клеточных мембран и других структур, повреждение нуклеиновых кислот, белков и липидов. Доказано, что повышенные концентрации АФК тормозят экспрессию генов, рост и деление клетки, включают механизм апоптоза [4].

Система защиты клеток и тканей растений от свободных радикалов состоит из ферментативного и неферментативного звеньев антиокис-лительной клеточной защиты. Известно, что растения обладают способностью к индукции компонентов антиокислительных систем под действием стрессов [5]. Механизм работы ферментативного и неферментативного звеньев антиокислительной зашиты растений в условиях перехода от гипоксии к нормальной аэрации до конца не выяснен, хотя фрагментарные исследования в мире ведутся длительное время [4, 11, 12].

Ферментативное звено системы защиты от свободных радикалов включает супероксиддис-мутазу и различные пероксидазы. Антиоксидантную защиту, связанную с восстановлением пероксида водорода, осуществляют главным образом аскорбатпероксидаза и глутатионпе-роксидаза. Кроме того, в вакуолях растений, а также у видов с низкой активностью аскорбатпе-роксидазы обезвреживание пероксида водорода или органических пероксидов эффективно обеспечивается гваяколпероксидазой [4]. Различные изоформы гваяколпероксидазы играют важную роль в защите клеток от окислительного стресса, а также участвуют в процессах лигнификации клеток растений и распада ауксинов. Субстратом для реакций, катализируемых гваяколпероксидазами, являются растительные полифенолы.

Неферментативное звено антиокислительной защиты клеток растений включает биологически активные вещества, обладающие высокой окис-ляемостью: аскорбиновую кислоту, токоферолы, полифенолы, глутатион, каротиноиды и другие соединения.

Ферментативные и неферментативные компоненты антиокислительной защиты образуют сложную высокоэффективную систему, все части которой являются взаимосвязанными. Так, из-

вестно, что в вакуолях или клеточной стенке, не имеющих высокоактивных изоформ аскорбатпе-роксидаз, но содержащих высокие концентрации полифенольных соединений и аскорбата, обезвреживание свободных радикалов осуществляется комплексом гваяколпероксидаза-полифенолы-аскорбат. При этом полифенолы сначала окисляются гваяколпероксидазой, а затем восстанавливаются аскорбатом, в результате происходит детоксикация продуктов окисления. Благодаря работе систем клеточной защиты происходит эффективное обезвреживание АФК и других форм свободных радикалов, что предотвращает повреждения клеточных структур и в итоге апоптоз клетки [4].

Механизмы метаболической адаптации растений к гипоксии весьма разнообразны и направлены на обеспечение противодействия и репарацию изменений при возвращении в нормальные условия аэрации (у устойчивых растений) либо ведут к необратимым повреждениям вследствие истощения приспособительных возможностей [5]. Метаболические изменения при гипоксии растений связаны прежде всего с использованием альтернативных путей окисления восстановленных коферментов при накоплении в клетках малата, сукцината и других метаболитов, что призвано поддерживать необходимый для выживания уровень протекания энергетических процессов. Перестройка метаболических процессов растений при гипоксии существенно меняет также параметры углеводного и липидного обменов [5].

Ф.М. Шакирова отмечает активацию поли-фенолоксидаз в тканях растений при гипоксии. Выявлено, что на стадии кислородной недостаточности клетки растений индуцируют синтез полифенольных соединений, являющихся важным компонентом их защиты от свободных радикалов при реоксигенации тканей [3].

Для полифенольных соединений характерна высокая антиоксидантная активность, поскольку они могут являться донорами водорода. Значение полифенолов как антиоксидантов выше, чем у токоферолов и аскорбата, так как многие из них обладают способностью связывать металлы переменной валентности, которые служат катализаторами свободнорадикального окисления [13].

Полифенолы способны блокировать взаимодействие окисляющегося субстрата с перекисным радикалом и, следовательно, тормозить цепное окисление по схеме:

риои+ю; ^ ръо • + яоои.

В результате при окислении фенолят-иона образуется феноксильный радикал, который претерпевает димеризацию с образованием связей углерод — углерод или углерод — кислород:

Феноксильные радикалы могут также обезвреживаться глутатионпероксидазой по схеме:

2PhO • + 2HS - G ^ 2PhOH + GS - SG.

Наиболее распространённые из полифенолов в растениях флавоноиды способны изменять кинетику пероксидации липидов, преобразуя порядок расположения липидных компонентов мембран и снижая их ненасыщенность [13]. В литературе упоминается также, что фенольные соединения вовлечены и в пероксид-защитный каскад [14].

Отмеченное выше характерно для земляники зелёной (клубники), встречающейся в степной зоне Предуралья, территория которого нередко подвергается подтоплению.

Fragaria viridis Duch. — земляника зелёная (семейство розоцветные — Rosaceae L.) — многолетнее травянистое растение высотой 5—20 см, с толстым бурым корневищем и стелющимися укореняющимися побегами. Листья сложные, тройчатые, крупнозубчатые, сверху почти голые, снизу волосистые. Верхушечный листочек яйцевидный, на коротком черешке; два боковых листочка сидячие. Цветки белые, с подчашием, многочисленными тычинками и пестиками. Плоды овальные, ароматные, с прижатыми к плодам чашелистиками. Цветёт в мае — июне. Встречается в лесной и лесостепной зонах европейской части РФ, на Урале, в Сибири. На Южном Урале (в Оренбургской области) растёт по травянистым склонам, балкам, степным лугам, опушкам колков. Возделывается на огородах, имеет множество сортов.

В составе полифенольного комплекса листьев земляники зелёной отмечены дубильные вещества, фенолкарбоновые кислоты, флавоноиды и предшественники лигнина. В составе листьев также обнаружены аскорбат и следы алкалоидов. Корневища и листья земляники обладают вяжущим, кровоостанавливающим, антисептическим, противовоспалительным, мочегонным и желчегонным свойствами, а также обладают способностью уменьшать потоотделение. Отвар листьев применяют для полоскания горла при воспалении слизистых оболочек полости рта, при желтухе и нарушениях деятельности желудочно-кишечного тракта, особенно при поносах [6].

С целью оценки влияния гипоксии на метаболизм нами проведён сравнительный анализ содержания дубильных веществ (танидов) в растениях, произрастающих на плакорных участках остепнённого луга и зоне подтопления паводковыми водами. Сырьём для проведения фитохимического анализа нами были выбраны листья Fragaria viridis Duch. , собранной в окрестностях с. Нежинка Оренбургского района Оренбуржья.

Дубильные вещества, или таниды, представляют собой полифенольные соединения с высокой молекулярной массой, способные осаждать белки, в частности раствор желатина, и обладающие вяжущим вкусом. Кроме того, таниды образуют нерастворимые комплексы с алкалоидами и солями тяжёлых металлов. Свойство дубить кожу животных и является главным критерием для отнесения химических соединений к группе дубильных растительных веществ. В их состав могут входить полиме-ризованные катехины, лейкоантоцианидины, флавоноиды, галловая и эллаговая кислоты и другие соединения. В химическом отношении дубильные вещества делятся на три группы: гидролизуемые (или производные пирогаллола), конденсированные (производные пирокатехина) и смешанная группа.

Дубильные вещества широко распространены среди растений, что объясняется их участием в ферментативных окислительных процессах растительных организмов наряду с другими фенольными соединениями. По данным многих исследователей [7—9], таниды выполняют в растениях защитную функцию, поэтому их выработка в значительной степени зависит от влияния стрессовых факторов. Задачей нашего исследования явилось выявление зависимости синтеза танидов от кислородной недостаточности.

Для открытия дубильных веществ в растениях готовили водные извлечения из растительного сырья согласно Государственной Фармакопее СССР [10]. С водными извлечениями проводили реакции осаждения с раствором желатина и солями алкалоидов, как общепринятые и наиболее специфичные методы обнаружения дубильных веществ [8, 9].

Количественное определение общей суммы дубильных веществ в листьях земляники зелёной проводили по общепринятой методи-

Содержание дубильных веществ в листьях Fragaria viridis Duch.

Год сбора Местообитание Фенофаза Содержание танидов

Контрольный участок № 1 (плакор и повышенные элементы рельефа) цветение 7,32±0,41

2008 Контрольный участок № 2 (плакор) вегетация цветение 7, 04±0,32 7,74±0,70

Зона подтопления паводковыми водами (западины) вегетация цветение плодоношение 9,58±0,42 9,72±0,39 7,66±0,35

Контрольный участок № 1 (плакор и повышенные элементы рельефа) цветение цветение плодоношение 6,68±0,22 7,56±0,46

вегетация 6,56±0,31

2009 Контрольный участок № 2 (плакор) цветение плодоношение 7,83±0,28

Зона подтопления паводковыми водами (западины) вегетация цветение плодоношение 075 <N с* ©° ©° ©° -н-н-н *4 ^

ке [8, 10]. Исследования показали, что фаза развития растений и экологические факторы оказывают существенное влияние на содержание дубильных веществ в растениях (табл.). В листьях Fragaria viridis Duch., подвергавшихся в период подтопления в пойме р. Урала гипоксии с последующей реоксигенацией тканей при возвращении к нормальным условиям аэрации, содержание дубильных веществ превышает контрольные показатели на 19%. Указанное полностью согласуется с данными о высокой антиоксидантной активности полифе-нольных соединений, являющихся донорами водорода при обезвреживании перекисных соединений в реакциях, катализируемых гвая-колпероксидазой.

Таким образом, при воздействии на Fragaria viridis Duch. гипоксии и последующего окислительного стресса происходит метаболическая адаптация растений, направленная на обезвреживание свободных радикалов и защиту структурных компонентов клеток, в первую очередь фосфолипидов мембран.

На уровне содержания вторичных метаболитов в тканях растений метаболические изменения проявляются в повышении синтеза и накоплении дубильных соединений.

Литература

1. Немерешина О.Н., Гусев Н.Ф. О влиянии гипоксии на некоторые компоненты неферментативной антиокислительной защиты Linaria vulgaris Mill. // Вестник ИрГСХА. 2011. № 4 (44). С. 88-95.

2. Немерешина О.Н., Гусев Н.Ф., Карпюк М.С. К вопросу активизации клеточной защиты растений под влиянием выбросов предприятий Газпрома // Проблемы анализа риска. Т. 8 (4). М., 2011. С. 36-46.

3. Шакирова Ф.М. Неспецифическая устойчивость растений к стрессовым факторам и её регуляция. Уфа: Гилем, 2001. 195 с.

4. Чиркова Т.В. Физиологические основы устойчивости растений. СПб: Изд-во СПбГУю, 2002. 240 с.

5. Ласточкин В.В., Емельянов В.В., Чиркова Т.В. Участие пероксидазы в антиоксидантной системе при адаптации растений к аноксии и постаноксической аэрации // Сборник трудов. Вып. 5. Воронеж, 2003. С. 163-169.

6. Махлаюк В.П. Лекарственные растения в народной медицине. М.: Нива России, 1992. 478 с.

7. Блажей А., Шутый Л. Фенольные соединения растительного происхождения. М.: Мир, 1977. 239 с.

8. Запрометов М.Н. Фенольные соединения и методы их исследования. М., 1971. С. 185-207.

9. Муравьёва Д.А., Самылина И.А., Яковлев Г.П. Фармакогнозия: учебник. 4-е изд., перераб., доп. М.: Медицина, 2002. 656 с.

10. Государственная Фармакопея СССР. 11-е изд. Вып. 2. М.: Медицина, 1990. 400 с.

11. Biemelt S., Keetman U., Aibrecht G. Re-aeration following hypoxia or anoxia leads to activation of the antioxidative defense system in roots of wheat seedlings // Plant. Physiol. 1998. V. 116. P. 651-658.

12. Blockhina О.В., Fagerstedt K.V., Chirkova T.V. Anoxic stress leads to hydrogen peroxide formation in plant cells. II J. Exp. Bot. 2001. V. 52. № 359. P. 1179-1190.

13. Rice-Evans C.A., Miller N.J., Paganga G. Antioxidant properties of phenolic compounds. II Trends in Plant Sciences. 1997. V. 2. P. 152-159.

14. Takahama U., Oniki T. A peroxidase I phenolics I ascorbate system can scavenge hydrogen peroxide in plant cell // Physiol. Plant. 1997. V. 101. P. 845-852.

15. Yan В., Dai Q., Liu X., Huang S., Wang Z. Flooding-induced membrane damage, lipid oxidation and activated oxygen generation in corn leaves. II Plant and Soil. 1996. V. 179. P. 261-268.