Иммунобиологическое средство и способ его использования для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 (варианты)
IMMUNOBIOLOGICAL AGENT AND A METHOD FOR USE THEREOF FOR INDUCING SPECIFIC IMMUNITY AGAINST THE SARS-COV-2 SEVERE ACUTE RESPIRATORY SYNDROME VIRUS (VERSIONS)

Область техники
Изобретение относится к биотехнологии, иммунологии и вирусологии. Предложенное средство может применяться для профилактики заболеваний, вызванных вирусом тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2.
Уровень техники
SARS-CoV-2 – новый штамм коронавируса, выделенный в конце 2019 года в г. Ухань (Китай), который за несколько месяцев распространился во всему миру. В январе 2020 года Всемирная организация здравоохранения объявила эпидемию, связанную с SARS-CoV-2, чрезвычайной ситуацией в области здравоохранения международного значения, а в марте 2020 года охарактеризовала распространение болезни как пандемию. В начале апреля 2020 года количество заболевших превысило 1 млн человек, а количество погибших - 60 тыс. человек.
Заболевание, которое вызывает SARS-CoV-2 получило собственное название COVID-19. Это потенциально тяжёлая острая респираторная инфекция, которая может протекать как в легкой, так и в тяжелой форме и сопровождаться такими осложнениями, как пневмония, острый респираторный дистресс-синдром, острая дыхательная недостаточность, острая сердечная недостаточность, острая почечная недостаточность, септический шок, кардиомиопатии, и др.
SARS-CoV-2 распространяется путем передачи от человека человеку воздушно-капельным путем или при прямом контакте. Репродуктивный индекс SARS-CoV-2 (Basic reproduction number, R0), т.е. количество людей, которые заражаются от одного инфицированного человека, по разным источникам составляет от 2,68 (Wu JT, Leung K, Leung GM. Nowcasting and forecasting the potential domestic and international spread of the 2019-nCoV outbreak originating in Wuhan, China: a modelling study. Lancet. 2020) до 6,6 (Sanche S, Lin YT, Xu C, Romero-Severson E, Hengartner N, Ke R. The Novel Coronavirus, 2019-nCoV, is Highly Contagious and More Infectious Than Initially Estimated. medRxiv. 2020), а средний инкубационный период составляет 5,2 дня (Li Q, Guan X, Wu P, Wang X, Zhou L, Tong Y. et al. Early Transmission Dynamics in Wuhan, China, of Novel Coronavirus-Infected Pneumonia. N Engl J Med. 2020).
Филогенетические исследования штаммов, выделенных от больных COVID-19, показали, что наиболее близкие к SARS-CoV-2 вирусы обнаруживаются у летучих мышей (Zhou P. et al. A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin. Nature. 2020; 579: 270-273). Также, предполагается, что другие виды млекопитающих могут быть «промежуточными» хозяевами, в которых SARS-CoV-2 смог приобрести некоторые или все мутации, необходимые для эффективной передачи человеку (Zhang YZ, Holmes EC. A Genomic Perspective on the Origin and Emergence of SARS-CoV-2. Cell. 2020 Mar 26.)
Высокий процент смертности, быстрое географическое распространение SARS-CoV-2 и нечетко определенная этиология заболевания создали острую необходимость в создании эффективных средств профилактики и лечения заболеваний, вызываемых данным вирусом.
За прошедшие годы было предпринято немало усилий по созданию различных вакцин против коронавирусных инфекций. Разработанные кандидатные вакцины можно классифицировать на шесть типов: 1) вакцины на основе вирусных векторов; 2) ДНК-вакцины; 3) субъединичные вакцины; 4) вакцины на основе наночастиц; 5) вакцины на основе инактивированного цельного вируса 6) живые аттенуированные вакцины. Данные вакцины были основаны на различных вирусных белках, таких как белок нуклеокапсида N, белок оболочки E, белок NSP16, S белок коронавируса (Ch. Yong et al. Recent Advances in the Vaccine Development Against Middle East Respiratory Syndrome-Coronavirus. Front Microbiol. 2019 Aug 2;10:1781). Часть из этих препаратов находится на стадии клинических исследований (https://www.clinicaltrials.gov/). Однако, данные препараты не эффективны против нового вируса SARS-CoV-2, это объясняется главным образом низкой гомологией данного коронавируса с возбудителями заболеваний человека SARS-CoV и MERS-CoV. Так, например, степень гомологии между S белком SARS-CoV-2 и SARS-CoV составляет всего 76% (Xu X, Chen P, Wang J, Feng J, Zhou H, Li X, et al. Evolution of the novel coronavirus from the ongoing Wuhan outbreak and modeling of its spike protein for risk of human transmission. Sci China Life Sci. 2020;63(3):457-60). Таким образом, на данный момент не существует ни одной зарегистрированной вакцины против заболеваний вызываемых SARS-COV-2.
6398
106
Известно решение по патенту US 7452542 B2, в котором предлагается использование живой аттенуированной коронавирусной вакцины, в которой указанный вирус характеризуется как содержащий геном, кодирующий полипептид ExoN, включающий замену на тирозин MHV-A59 или его аналогичное положение, и полипептид Orf2a, содержащий замену на лейцин MHV-A59 или его аналогичное положение, и  фармацевтически приемлемый разбавитель.
Известно решение по патенту WO 2016116398 A1, в котором рассматривается вакцина против коронавируса MERS-CoV, представляющая собой N-нуклеокапсидный белок вируса MERS-CoV и / или его иммуногенный фрагмент или молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую N-нуклеокапсидный белок MERS-CoV и / или его иммуногенный фрагмент.
Известно решение по патенту CN 100360557 C, в котором описано использование S белка вируса SARS, который имеет мутацию в одном из положений: 778D → Y; 77D → G; 244T → I; 1182K → Q; 360F → S; 479N → R или K; 480D → G; 609A → L для производства вакцины против тяжелого острого респираторного синдрома. Дата приоритета заявки 10.07.2003.
Известно решение по заявке на изобретение US 20080267992 A1, где описана вакцина против тяжелого острого респираторного синдрома на основе рекомбинантного аденовируса человека 5 серотипа, содержащего последовательность полного протективного антигена S вируса SARS-CoV, или последовательность, которая включает домен S1 антигена S вируса SARS-CoV или домен S2 антигена S вируса SARS-CoV, или оба домена. Кроме того, данный рекомбинантный аденовирус в составе экспрессионной кассеты содержит промотор цитомегаловируса человека (CMV-промотор) и сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста (polyА BGH).
Данный патент как наиболее близкий по техническому решению был выбран авторами заявляемого изобретения за прототип. Существенным недостатком данного решения является использование антигенов вируса другого вида семейства коронавирусов.
Таким образом, в уровне техники существует острая потребность в разработке нового иммунобиологического средства, обеспечивающего индукцию эффективного иммунного ответа против коронавируса SARS-CoV-2.
Раскрытие изобретения
Целью заявленной группы изобретений является создание иммунобиологического средства для эффективной индукции иммунного ответа против вируса SARS-CoV-2.
Технический результат заключается в создании эффективного средства для индукции специфического иммунитета к SARS-Cov-2.
Указанный технический результат достигается тем, создано иммунобиологическое средство для профилактики заболеваний, вызванных вирусом тяжелого респираторного синдрома SARS-CoV-2 на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа или рекомбинантного аденовируса человека 26-го серотипа, содержащее оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность протективного антигена S вируса SARS-CoV-2 с делецией 18 аминокислот на С’-конце гена (SEQ ID NO:2).
Также указанный технический результат достигается тем, что создано иммунобиологическое средство для профилактики заболеваний, вызванных вирусом тяжелого респираторного синдрома SARS-CoV-2 на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа или рекомбинантного аденовируса человека 26-го серотипа, содержащее оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность полного протективного антигена S вируса SARS-CoV-2 и последовательность Fc-фрагмента от человеческого IgG1 (SEQ ID NO:3).
Также указанный технический результат достигается тем, что создано иммунобиологическое средство для профилактики заболеваний, вызванных вирусом тяжелого респираторного синдрома SARS-CoV-2 на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа или рекомбинантного аденовируса человека 26-го серотипа, содержащее оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность рецептор-связывающего домена белка S вируса SARS-CoV-2 с последовательностью лидерного пептида вируса (SEQ ID NO:4).
Также указанный технический результат достигается тем, что создано иммунобиологическое средство для профилактики заболеваний, вызванных вирусом тяжелого респираторного синдрома SARS-CoV-2 на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа или рекомбинантного аденовируса человека 26-го серотипа, содержащее оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность рецептор-связывающего домена белка S вируса SARS-CoV-2 с трансмембранным доменом гликопротеина вируса везикулярного стоматита (SEQ ID NO:5).
Также указанный технический результат достигается тем, что создано иммунобиологическое средство для профилактики заболеваний, вызванных вирусом тяжелого респираторного синдрома SARS-CoV-2 на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа или рекомбинантного аденовируса человека 26-го серотипа, содержащее оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность рецептор-связывающего домена белка S вируса SARS-CoV-2 с последовательностью лидерного пептида и последовательностью Fc-фрагмента от человеческого IgG1 (SEQ ID NO:6).
Также указанный технический результат достигается тем, что создано иммунобиологическое средство для профилактики заболеваний, вызванных вирусом тяжелого респираторного синдрома SARS-CoV-2 на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа или рекомбинантного аденовируса человека 26-го серотипа, содержащее оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность полного протективного антигена S вируса SARS-CoV-2 на основании последовательностей генов белка S вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO:1) в комбинации с иммунобиологическими средствами (SEQ ID NO:2), и/или (SEQ ID NO:3), и/или (SEQ ID NO:4), и/или (SEQ ID NO:5), и/или (SEQ ID NO:6).
Также указанный технический результат достигается  способом индукции специфического иммунитета к вирусу SARS-CoV-2, включающий введение в организм млекопитающих одного или более средств (SEQ ID NO:1), и/или (SEQ ID NO:2), и/или (SEQ ID NO:3), и/или (SEQ ID NO:4), и/или (SEQ ID NO:5), и/или (SEQ ID NO:6) в эффективном количестве.
Также указанный технический результат достигается способом индукции специфического иммунитета к вирусу SARS-CoV-2, где последовательно вводят в организм млекопитающих два различных иммунобиологических средств на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа или два различных иммунобиологических средств на основе рекомбинантного аденовируса человека 26-го серотипа с интервалом более чем в 1 неделю.
Также указанный технический результат достигается  способом индукции специфического иммунитета к вирусу SARS-CoV-2, где последовательно вводят в организм млекопитающих любое из иммунобиологических средств на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа и любое из иммунобиологических средств на основе рекомбинантного аденовируса человека 26-го серотипа с интервалом более чем в 1 неделю, или в последовательном введении в организм млекопитающих любого из иммунобиологических средств на основе рекомбинантного аденовируса человека 26-го серотипа и любого из иммунобиологических средств на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа с интервалом более чем в 1 неделю.
Также указанный технический результат достигается  способом индукции специфического иммунитета к вирусу SARS-CoV-2, где одновременно вводят в организм млекопитающих любые два иммунобиологических средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го или 26-го серотипа.
Сущность заявленной группы изобретений поясняется чертежами, где на фиг. 1-5 представлены результаты оценки эффективности иммунизации.
Осуществление изобретения
Краткое описание фигур
На фиг. 1 представлены результаты оценки эффективности иммунизации разработанным иммунологическим средством на основе рекомбинантного аденовируса, содержащего оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность протективного антигена (белков S, RBD, S-del, S-Fc, RBD-G, RBD-Fc) SARS-CoV-2 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 по оценке доли пролиферирующих CD4+ лимфоцитов, рестимулированных гликопротеином S SARS-CoV-2, на 8 день после иммунизации испытуемых животных.
Ось ординат – количество пролиферирующих клеток, %
Ось абсцисс – различные группы животных:
1) фосфатный буфер (100 мкл)
8
2) Ad5-S-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
3) Ad5-S-del-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
4) Ad5-S-Fc-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
5) Ad5-RBD-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
6) Ad5-RBD-G-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
7) Ad5-RBD-Fc-CoV-2 10БОЕ/мышь
На фиг. 2 представлены результаты оценки эффективности иммунизации разработанным иммунологическим средством на основе рекомбинантного аденовируса, содержащего оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность протективного антигена (белков S, RBD, S-del, S-Fc, RBD-G, RBD-Fc) SARS-CoV-2 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6  по оценке доли пролиферирующих CD4+ лимфоцитов, рестимулированных гликопротеином S SARS-CoV-2, на 15 день после иммунизации испытуемых животных.
Ось ординат – количество пролиферирующих клеток, %
Ось абсцисс – различные группы животных:
1) фосфатный буфер (100 мкл)
8
2) Ad5-S-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
3) Ad5-S-del-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
4) Ad5-S-Fc-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
5)        Ad5-RBD-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
6) Ad5-RBD-G-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
7) Ad5-RBD-Fc-CoV-2 10БОЕ/мышь
На фиг. 3 представлены результаты оценки эффективности иммунизации разработанным иммунологическим средством на основе рекомбинантного аденовируса, содержащего оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность протективного антигена (белков S, RBD, S-del, S-Fc, RBD-G, RBD-Fc) SARS-CoV-2 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 по оценке доли пролиферирующих CD8+ лимфоцитов, рестимулированных гликопротеином S SARS-CoV-2, на 8 день после иммунизации испытуемых животных.
Ось ординат – количество пролиферирующих клеток, %
Ось абсцисс – различные группы животных:
1) фосфатный буфер (100 мкл)
8
2) Ad5-S-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
3) Ad5-S-del-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
4) Ad5-S-Fc-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
5) Ad5-RBD-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
6) Ad5-RBD-G-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
7) Ad5-RBD-Fc-CoV-2 10БОЕ/мышь
На фиг. 4 представлены результаты оценки эффективности иммунизации разработанным иммунологическим средством на основе рекомбинантного аденовируса, содержащего оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность протективного антигена (белков S, RBD, S-del, S-Fc, RBD-G, RBD-Fc) SARS-CoV-2 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 по оценке доли пролиферирующих CD8+ лимфоцитов, рестимулированных гликопротеином S вируса SARS-CoV-2, на 15 день после иммунизации испытуемых животных.
Ось ординат – количество пролиферирующих клеток, %
Ось абсцисс – различные группы животных:
1) фосфатный буфер (100 мкл)
8
2) Ad5-S-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
3) Ad5-S-del-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
4) Ad5-S-Fc-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
5)        Ad5-RBD-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
6) Ad5-RBD-G-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
7) Ad5-RBD-Fc-CoV-2 10БОЕ/мышь
На фиг. 5 представлены результаты оценки эффективности разработанного иммунобиологического средства на основе рекомбинантного аденовируса, содержащего оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность протективного антигена (белков S, RBD, S-del, S-Fc, RBD-G, RBD-Fc) SARS-CoV-2 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 по оценке прироста концентрации ИФН-гамма в среде после стимуляции спленоцитов иммунизированных аденовирусными конструкциями мышей линии C57/BL6 рекомбинантным полноразмерным белком S вируса SARS-CoV-2, на 15 день после иммунизации испытуемых животных.
Ось ординат – значения прироста концентрации ИФН-гамма в среде стимулированных клеток при сравнении с интактными клетками (разы).
8
Ось абсцисс – исследуемые группы животных: интактные животные и животные, которым вводили по 10БОЕ/мышь
1) фосфатный буфер (100 мкл)
8
2) Ad5-S-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
3) Ad5-S-del-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
4) Ad5-S-Fc-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
5) Ad5-RBD-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
6) Ad5-RBD-G-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
7) Ad5-RBD-Fc-CoV-2 10БОЕ/мышь
Первым этапом в разработке иммунобиологического средства против коронавируса SARS-CoV-2 являлся выбор вакцинного антигена. В ходе работы был проведен литературный поиск, который показал, что наиболее перспективным антигеном для создания кандидатной вакцины является S белок коронавируса. Это трансмембранный гликопротеин I типа, который отвечает за связывание, слияние и проникновение вирусных частиц в клетку. Было показано, что он является индуктором нейтрализующих антител (Liang M et al, SARS patients-derived human recombinant antibodies to S and M proteins efficiently neutralize SARS-coronavirus infectivity. Biomed Environ Sci. 2005 Dec;18(6):363-74).
S белок состоит из сигнального пептида (аминокислоты 1-12) и 3 доменов: внеклеточного домена (аминокислоты 13-1193), трансмембранного домена (аминокислоты 1194-1215), внутриклеточного домена (аминокислоты 1216-1255). Внеклеточный домен состоит из 2 субъединиц S1 и S2, и небольшого участка между ними, функции которого до конца не ясны. Субъединица S1 отвечает за связывание вируса с рецептором ACE2 (angiotensin-converting enzyme 2). Участок, который находится в среднем регионе субъединицы S1 (аминокислоты 318-510) называется рецептор-связывающим доменом (receptor-binding domain (RBD)). Субъединица S2, которая содержит предполагаемый пептид слияния (putative fusion peptide) и два гептадных повтора (heptad repeats (HR1 and HR2)), отвечает за слияние между вирусом и целевой клеточной мембраной. Инфекция инициируется связыванием RBD субъединицы S1 вируса с клеточным рецептором ACE2. После этого формируется ядро слияния между HR1 и HR2 регионами субъединицы S2, что влечет за собой сближение вирусной и клеточной мембран, которые в результате сливаются и вирус проникает в клетку. Следовательно, использование S белка или его фрагментов, в составе вакцины, может индуцировать антитела, блокирующие проникновение вируса в клетку.
Для достижения максимально эффективной индукции иммунных реакций авторы предложили различные варианты модификаций данного антигена, а также возможность его комбинации с трансмембранным доменом гликопротеина вируса везикулярного стоматита для повышения уровня экспрессии целевого белка.
Было получено 6 различных вариантов нуклеотидных последовательностей (модифицированного гена S вируса SARS-CoV-2 либо рецептор-связывающего домена белка S) путем оптимизации данных последовательностей под экспрессию в клетках млекопитающих.
Далее было разработано несколько конструкций на основе рекомбинантных аденовирусов человека 5-го и 26-го серотипов для эффективной доставки модифицированных генов в клетки млекопитающих. Аденовирусные векторы были выбраны, поскольку они обладают такими преимуществами, как безопасность, широкий диапазон тканевого тропизма, хорошо охарактеризованный геном, легкость генетических манипуляций, способность включать большие вставки трансгенной ДНК, присущие им свойства адъюванта, способность индуцировать устойчивый Т-клеточный и гуморальный ответ.
Из ряда известных аденовирусов, наиболее исследованными являются аденовирусы человека 5-го серотипа, поэтому они стали основой для создания векторов для генотерапии. Были разработаны технологии получения векторов первого и второго поколений, химерных векторов (содержащих белки вирусов других серотипов) (J.N. Glasgow et al., An adenovirus vector with a chimeric fiber derived from canine adenovirus type 2 displays novel tropism, Virology, 2004, № 324, 103–116) и ряда других векторов. Также, были созданы векторы, производные от других серотипов, например, 26-го (H. Chen et al., Adenovirus-Based Vaccines: Comparison of Vectors from Three Species of Adenoviridae, Virology, 2010, № 84(20), 10522–10532).
+
Векторы на основе аденовируса человека 26-го серотипа показывают высокий уровень иммуногенности у приматов, где они способны индуцировать мощный CD8 Т-клеточный ответ, качественно превосходящий Т-клеточный ответ при введении в организм векторов на основе аденовируса человека 5-го серотипа (J. Liu et al., Magnitude and phenotype of cellular immune responses elicited by recombinant adenovirus vectors and heterologous prime-boost regimens in rhesus monkeys, Virology, 2008, № 82, 4844–4852). При этом происходит распознавание большего числа эпитопов и индукция выработки более широкого спектра факторов, а не преимущественно интерферона гамма (J. Liu et al., Magnitude and phenotype of cellular immune responses elicited by recombinant adenovirus vectors and heterologous prime-boost regimens in rhesus monkeys, Virology, 2008, № 82, 4844–4852). Эти данные позволяют предполагать, что векторы на основе аденовируса человека 26-го серотипа обладают фундаментальными отличиями в способности индуцировать формирование иммунного ответа на целевой антиген относительно других аденовирусных векторов.
Изобретение по варианту 1 представляет собой рекомбинантный аденовирус человека 5-го серотипа, или рекомбинантный аденовирус человека 26-го серотипа, содержащий оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность полного протективного антигена S вируса SARS-CoV-2 на основании последовательностей генов белка S вируса SARS-CoV-2  (SEQ ID NO:1).
Изобретение по варианту 2 представляет собой рекомбинантный аденовирус человека 5-го серотипа, или рекомбинантный аденовирус человека 26-го серотипа, содержащий оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность полного протективного антигена S SARS-CoV-2 с делецией 18 аминокислот на С’-конце гена (SEQ ID NO:2).
Изобретение по варианту 3 представляет собой рекомбинантный аденовирус человека 5-го серотипа, или рекомбинантный аденовирус человека 26-го серотипа, содержащий оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность полного протективного антигена S вируса SARS-CoV-2 и последовательность Fc-фрагмента от человеческого IgG1 (SEQ ID NO:3).
Изобретение по варианту 4 представляет собой рекомбинантный аденовирус человека 5-го серотипа, или рекомбинантный аденовирус человека 26-го серотипа, содержащий оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность рецептор-связывающего домена белка S вируса SARS-CoV-2 с последовательностью лидерного пептида вируса (SEQ ID NO:4).
Изобретение по варианту 5 представляет собой рекомбинантный аденовирус человека 5-го серотипа, или рекомбинантный аденовирус человека 26-го серотипа содержащий оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность рецептор-связывающего домена белка S вируса SARS-CoV-2 с трансмембранным доменом гликопротеина вируса везикулярного стоматита (SEQ ID NO:5).
Изобретение по варианту 6 представляет собой рекомбинантный аденовирус человека 5-го серотипа, или рекомбинантный аденовирус человека 26-го серотипа, содержащий оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность рецептор-связывающего домена белка S вируса SARS-CoV-2 с последовательностью лидерного пептида и последовательностью Fc-фрагмента от человеческого IgG1 (SEQ ID NO:6).
Разработан способ индукции специфического иммунитета к вирусу SARS-CoV-2, включающий во введении в организм млекопитающих одного или более средств по вариантам 1-6 в эффективном количестве. Данный способ предусматривает:
1) последовательное введение в организм млекопитающих двух различных иммунобиологических средств на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа или двух различных иммунобиологических средств на основе рекомбинантного аденовируса человека 26-го серотипа по вариантам 1-6 с интервалом более чем в 1 неделю
2) последовательное введение в организм млекопитающих любого из иммунобиологических средств на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа и любое из иммунобиологических средств на основе рекомбинантного аденовируса человека 26-го серотипа по вариантам  1-6 с интервалом более чем в 1 неделю, или в последовательном введении в организм млекопитающих любого из иммунобиологических средств на основе рекомбинантного аденовируса человека 26-го серотипа и любого из иммунобиологических средств на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа по вариантам 1-6 с интервалом более чем в 1 неделю.
3) Одновременное введение в организм млекопитающих любых двух иммунобиологических средств на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го или 26-го серотипа по п. 1, и/или п. 2, и/или п. 3, и/или п. 4, и/или п. 5, и/или п. 6.
Осуществление изобретения подтверждается следующими примерами.
Пример 1. Получение различных вариантов гликопротеина S SARS-CoV-2
На первом этапе работы авторы разработали несколько модификаций вакцинного антигена для достижения наиболее эффективного иммунного ответа.
За основу был взят S белок вируса SARS-CoV-2 с последовательностью          SEQ ID NO:1, который затем был модифицирован несколькими способами:
1) Для представления белка S на плазматической мембране была произведена делеция 18 аминокислот на С’-конце белка S (S-del) SEQ ID NO:2 (использована для варианта 2).
2) Кроме того, была получена оптимизированная экспрессию в клетках млекопитающих последовательность полного протективного антигена S вируса SARS-CoV-2 с последовательностью Fc-фрагмента от человеческого IgG1 (использована для варианта 3). Такая модификация усиливает иммуногенность за счет возможного связывания Fc фрагмента белка с Fc рецептором на антиген-презентирующих клетках (Li Z., Palaniyandi S., Zeng R., Tuo W., Roopenian D.C., Zhu X., Transfer of IgG in the female genital tract by MHC class I-related neonatal Fc receptor (FcRn) confers protective immunity to vaginal infection. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2011, №108, 4388–93), а также увеличивает стабильность белка и продлевает период его полу-жизни in vivo (Zhang M.Y., Wang Y., Mankowski M.K., Ptak R.G., Dimitrov D.S., Cross-reactive HIV-1-neutralizing activity of serum IgG from a rabbit immunized with gp41 fused to IgG1 Fc: Possible role of the prolonged half-life of the immunogen, Vaccine, 2009, №27, 857–863).
3) Для исследования иммуногенности только рецептор-связывающего домена (RBD) белка S вируса SARS-CoV-2 в секретируемой форме, была создана последовательность SEQ ID NO:4 (использована для варианта 4), содержащая последовательность рецептор-связывающего домена белка S с последовательностью лидерного пептида (добавлена для секреции белка).
4) Для исследования RBD белка S вируса SARS-CoV-2 в несекретируемой форме, была выбрана последовательность SEQ ID NO:5 (использована для варианта 5), состоящая из RBD белка S вируса SARS-CoV-2, к которой была добавлена последовательность трансмембранного домена гликопротеина вируса везикулярного стоматита (RBD-G).
5) Для исследования секретируемой формы RBD белка S с последовательностью лидерного пептида и последовательностью Fc-фрагмента от человеческого IgG1 была выбрана последовательность SEQ ID NO:6 (использована для варианта 6). Добавление Fc-фрагмента от человеческого IgG1 усиливает иммуногенность за счет возможного связывания Fc фрагмента белка с Fc рецептором на антиген-презентирующих клетках (Z. Li et. al., Transfer of IgG in the female genital tract by MHC class I-related neonatal Fc receptor (FcRn) confers protective immunity to vaginal infection, Proceedings of the National Academy of Sciences  USA, 2011, № 108, 4388–4393), а также может усилить стабильность белка и продлить период полужизни in vivo (M.Y. Zhang et. al., Crossreactive HIV-1-neutralizing activity of serum IgG from a rabbit immunized with gp41 fused to IgG1 Fc: Possible role of the prolonged half-life of the immunogen, Vaccine, 2008, № 27, 857–63).
Пример 2. Получение генетических конструкций, кодирующих ген белка S в различных вариантах
На следующем этапе работы аминокислотные последовательности по примеру 1 (SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6) были переведены в нуклеотидные последовательности. Далее была проведена оптимизация полученных последовательностей под экспрессию в клетках млекопитающих. Все нуклеотидные последовательности были получены методом синтеза компанией ЗАО «Евроген» (Москва). В итоге были получены следующие генетические конструкции:
1) pVax-S-CoV-2, содержащая нуклеотидную последовательность полного гена S вируса SARS-CoV-2;
2) pVax-S-del-CoV-2, содержащая нуклеотидную последовательность гена S вируса SARS-CoV-2 c с делецией 18 аминокислот на С’-конце гена;
3) pVax-S-Fc-CoV-2, содержащая нуклеотидную последовательность полного гена S вируса SARS-CoV-2 и последовательность Fc-фрагмента от человеческого IgG1
4) pAL2-T-RBD-CoV-2, содержащая нуклеотидную последовательность рецептор-связывающего домена белка S с последовательностью гена лидерного пептида;
5) pAL2-T-RBD-G-CoV-2, содержащая нуклеотидную последовательность рецептор-связывающего домена белка S c геном G вируса везикулярного стоматита;
6) pAL2-T-RBD-Fc-CoV-2, содержащая нуклеотидную последовательность рецептор-связывающего домена белка S с последовательностью гена лидерного пептида и нуклеотидной последовательностью Fc-фрагмента от человеческого IgG1.
Далее с помощью методов генной инженерии последовательность гена белка S из конструкции pVax-S-CoV-2 была клонирована с использованием эндонуклеазы рестрикции XbaI в челночную плазмиду pShuttle-CMV (StratаGen, США) и полученная плазмида была названа pShuttle-S-CoV-2. Таким образом, была создана челночная плазмида pShuttle-S-CoV-2, несущая оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих нуклеотидную последовательность аминокислотной последовательности S (SEQ ID NO:1), полученной в примере 1.
Аналогично нуклеотидные последовательности модифицированных вариантов белка S SARS-CoV-2 были клонированы в челночную плазмиду pShuttle-CMV (StratаGen, США) и были получены следующие челночные плазмиды:
- pShuttle-S-del-CoV-2 (содержит оптимизированную нуклеотидную последовательность гена S вируса SARS-CoV-2 с делецией 18 аминокислот на С’-конце);
- pShuttle-S-Fc-CoV-2, содержащая оптимизированную нуклеотидную последовательность полного гена S вируса SARS-CoV-2 и последовательность Fc-фрагмента от человеческого IgG1;
- pShuttle-RBD-CoV-2 (содержит оптимизированную нуклеотидную последовательность рецептор-связывающего домена S SARS-CoV-2);
- pShuttle-RBD-G-CoV-2 (содержит оптимизированную нуклеотидную последовательность рецептор-связывающего домена S SARS-CoV-2 с трансмембранным доменом гликопротеина вируса везикулярного стоматита);
- pShuttle-RBD-Fc-CoV-2 (содержит оптимизированную нуклеотидную последовательность рецептор-связывающего домена S SARS-CoV-2 с оптимизированной последовательностью Fc-фрагмента от человеческого IgG1).
Пример 3. Получение иммунобиологического средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа
На следующем этапе работы была получена рекомбинантная аденовирусная плазмида pAd5-S-CoV-2, содержащая оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность полного протективного антигена S SARS-CoV-2 (SEQ ID NO:1) (вариант 1). Данная плазмида была получена методом гомологичной рекомбинации между плазмидой pAd-Easy (AdEasy™ Adenoviral Vector System, StratаGen, США), содержащей геномную часть аденовируса человека 5 серотипа с удаленной E1 и E3 областями, и челночной плазмидой pShuttle-S (полученной в примере 3), несущей гомологичные участки генома аденовируса и экспрессионную кассету с целевым геном (белка S). Для этого, полученная в примере 3 челночная плазмида pShuttle-S была линеаризована эндонуклеазой рестрикции PmeI.
10
11
Гомологичную рекомбинацию проводили в клетках E. coli штамма BJ5183. Плазмиду Ad-Easy смешивали с плазмидой pShuttle-S, а затем полученной смесью трансформировали клетки E.coli методом электропорации согласно руководству «MicroPulser™ Electroporation Apparatus Operating Instructions and Applications Guide» (Bio-Rad, США). После трансформации клетки E.coli штамма BJ5183 высевали на чашки с LB-агаром, содержащим селективный антибиотик и подращивали в течение 18 часов при температуре +37ºС. Эффективность трансформации составляла 10 –10 трансформированных клонов на 1 мкг плазмиды pBluescript II SK(-).
В результате гомологичной рекомбинации в плазмиде pAd-Easy появлялась кассета с целевым трансгеном (белка S), и менялся ген устойчивости к антибиотику.
Таким образом, была сконструирована рекомбинантная аденовирусная плазмида pAd5-S-CoV-2, содержащая полноразмерный геном рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа (с делетированными Е1 и Е3 областями генома) со встроенной генетической конструкцией, полученной в примере 3. Далее плазмиду pAd5-S-CoV-2 гидролизовали эндонуклеазой рестрикции Pac I и трансфецировали ею пермессивную культуру клеток эмбриональной почки человека линии НЕК 293. Клетки линии НЕК 293 содержат в своем геноме встроенную область Е1 генома аденовируса человека 5-го серотипа, благодаря чему в них может происходить размножение рекомбинантных репликативно-дефектных аденовирусов человека 5-го серотипа. На шестой день после трансфекции проводили первые слепые пассажи для более эффективного получения рекомбинантного аденовируса. После наступления цитопатического действия вируса (данные микроскопирования), клетки с культуральной средой трехкратно перемораживали для разрушения клеток и выхода вируса.  В результате был получен материал, который затем был использован для накопления препаративных количеств рекомбинантных аденовирусов.
Активность препарата pAd5-S-CoV-2 здесь и далее оценивали стандартным методом титрования на культуре чувствительных клеток 293 HEK в реакциях бляшкообразования.
Для подтверждения создания конструкции предлагаемой рекомбинантной псевдоаденовирусной частицы на основе аденовируса человека 5 серотипа, экспрессирующей ген S вируса SARS-CoV-2, проводили полимеразную цепную реакцию (ПЦР) по известной стандартной методике.
Аналогичным образом были получены еще пять рекомбинантных аденовирусов:  Ad5-S-del-CoV-2, Ad5-S-Fc-CoV-2, Ad5-RBD-CoV-2, Ad5-RBD-G-CoV-2, Ad5-RBD-Fc-CoV-2.
Таким образом, в результате проведенной работы были получены варианты иммунобиологического средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа, содержащего:
1) оптимизированную нуклеотидную последовательность рецептор-связывающего домена S SARS-CoV-2 (вариант 1);
2) оптимизированную нуклеотидную последовательность протективного антигена S вируса SARS-CoV-2 с делецией 18 аминокислот на С’-конце гена (вариант 2);
3) оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность полного протективного антигена S вируса SARS-CoV-2 и последовательность Fc-фрагмента от человеческого IgG1 (вариант 3);
4) оптимизированную нуклеотидную последовательность рецептор-связывающего домена белка S с последовательностью лидерного пептида (вариант 4),
5) оптимизированную нуклеотидную последовательность рецептор-связывающего домена белка S с трансмембранным доменом гликопротеина вируса везикулярного стоматита (вариант 5),
6) оптимизированную последовательность рецептор-связывающего домена белка S с последовательностью лидерного пептида и последовательностью Fc-фрагмента от человеческого IgG1 (вариант 6).
Пример 4. Получение иммунобиологического средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 26-го серотипа
На первом этапе, в рекомбинантный вектор pAd26-ORF6-Ad5 была помещена экспрессионная кассета с геном S SARS-CoV-2. Для этого вектор pAd26-ORF6-Ad5 был линеаризован с помощью эндонуклеазы рестрикции PmeI, а плазмидная конструкция pShuttle-S, полученная в примере 3 была обработана эндонуклеазами рестрикции PmeI.  Продукты гидролиза лигировали, после чего при помощи стандартных методов была получена плазмида pAd26-S-CoV-2.
На следующем этапе плазмиду pAd26-S-CoV-2 гидролизовали эндонуклеазами рестрикции PacI и SwaI и трансфецировали ею пермессивную культуру клеток линии НЕК 293. На третий день после трансфекции проводили первые слепые пассажи для более эффективного получения рекомбинантного аденовируса. После наступления цитопатического действия вируса (данные микроскопирования), клетки с культуральной средой трехкратно перемораживали для разрушения клеток и выхода вируса. В результате был получен материал, который затем был использован для накопления препаративных количеств рекомбинантных аденовирусов. Активность препарата pAd26-S-CoV-2 здесь и далее оценивали стандартным методом титрования на культуре клеток 293 HEK в реакции бляшкообразования.
Для подтверждения создания конструкции предлагаемой рекомбинантной псевдоаденовирусной частицы на основе рекомбинантного аденовируса человека 26-го серотипа, экспрессирующей ген S SARS-CoV-2, проводили полимеразную цепную реакцию (ПЦР) по известной стандартной методике.
Аналогичным образом были получены еще пять рекомбинантных аденовирусов: pAd26-S-dek-CoV-2, pAd26-S-Fc-CoV-2, pAd26-RBD-CoV-2, pAd26-RBD-G-CoV-2, pAd26-RBD-Fc-CoV-2.
Таким образом, в результате проведенной работы были получены варианты иммунобиологического средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 26-го серотипа, содержащего:
1) оптимизированную нуклеотидную последовательность рецептор-связывающего домена S SARS-CoV-2 (вариант 1);
2) оптимизированную нуклеотидную последовательность протективного антигена S вируса SARS-CoV-2 с делецией 18 аминокислот на С’-конце гена (вариант 2);
3) оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность полного протективного антигена S вируса SARS-CoV-2 и последовательность Fc-фрагмента от человеческого IgG1 (вариант 3);
4) оптимизированную нуклеотидную последовательность рецептор-связывающего домена белка S с последовательностью лидерного пептида (вариант 4),
5) оптимизированную нуклеотидную последовательность рецептор-связывающего домена белка S с трансмембранным доменом гликопротеина вируса везикулярного стоматита (вариант 5),
6) оптимизированную последовательность рецептор-связывающего домена белка S с последовательностью лидерного пептида и последовательностью Fc-фрагмента от человеческого IgG1 (вариант 6).
Пример 5. Проверка экспрессии различных вариантов гена гликопротеина S SARS-CoV-2 в клетках линии HEK293 после добавления иммунобиологического средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа
Целью данного эксперимента была проверка способности сконструированных рекомбинантных аденовирусов Ad5-S-CoV-2, Ad5-S-del-CoV-2, Ad5-S-Fc-CoV-2, Ad5-RBD-CoV-2, Ad5-RBD-G-CoV-2, Ad5-RBD-Fc-CoV-2 экспрессировать различные варианты гена белка S в клетках млекопитающих.
2
2
Клетки HEK293 культивировали в среде DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки в инкубаторе при температуре 37ºС и 5% СО. Клетки помещали на 35 мм культуральные чашки Петри и инкубировали в течение суток до достижения 70% конфлюэнтности. Далее к клеткам добавили исследуемые препараты рекомбинантных аденовирусов (Ad5-S-CoV-2, Ad5-S-del-CoV-2, Ad5-S-Fc-CoV-2, Ad5-RBD-CoV-2, Ad5-RBD-G-CoV-2, Ad5-RBD-Fc-CoV-2), контрольный препарат (Ad5-null – рекомбинантый аденовирус, не содержащий вставок) из расчета 100 БОЕ/клетку и фосфатно-солевой буфер (ФСБ) в качестве отрицательного контроля. Через 2 суток после трансдукции клетки собрали, лизировали в 0,5 мл однократного буфера CCLR (Promega), лизат развели карбонат-бикарбонатным буфером и внесли в лунки планшета для ИФА. Инкубировали планшет в течение ночи +4ºС.
Промыли лунки планшета однократным буфером для промывки трижды объемом 200 мкл на лунку, а затем внесли по 100 мкл блокирующего буфера, накрыли крышкой и инкубировали 1 час 37ºС на шейкере при 400 об/мин. Далее промыли лунки планшета однократным буфером для промывки трижды объемом 200 мкл на лунку и внесли по 100 мкл сыворотки крови реконвалесцента. Накрыли планшет крышкой и инкубировали при комнатной температуре на шейкере при 400 об/мин в течение 2 часов. Далее промыли лунки планшета однократным буфером для промывки трижды объемом 200 мкл на лунку, затем внесли 100 мкл раствора вторичных антител, конъюгированных с биотином. Накрыли планшет крышкой и инкубировали при комнатной температуре на шейкере при 400 об/мин в течение 2 часов. Далее приготовили раствор стрептавидина, конъюгированного с пероксидазой хрена. Для этого развели конъюгат объемом 60 мкл в 5,94 мл буфера для анализа. Промыли лунки планшета дважды однократным буфером для промывки объемом 200 мкл на лунку и во все лунки планшета внесли по 100 мкл раствора стрептавидина, конъюгированного с пероксидазой хрена. Планшет инкубировали при комнатной температуре на шейкере при 400 оборотов в минуту в течение 1 часа. Затем лунки планшета промыли дважды однократным буфером для промывки объемом 200 мкл на лунку и во все лунки планшета внесли по 100 мкл ТМБ субстрата и инкубировали в темноте при комнатной температуре 10 минут, а затем добавили во все лунки по 100 мкл останавливающего раствора. Значение оптической плотности определяли измерением на планшетном спектрофотометре (Multiskan FC, Thermo) при длине волны 450 нм. Результаты эксперимента представлены в таблице 1.
Таблица 1 - Результаты эксперимента по проверке экспрессии различных вариантов гена гликопротеина S SARS-CoV-2 в клетках линии HEK293 после добавления иммунобиологического средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа
Среднее значение оптической плотности при длине волны 450 нм
ФСБ
0,19 (±0,05)
Ad5-null
0,23 (±0,08)
Ad5-S-CoV-2
1,85 (±0,15)
Ad5-S-del-CoV-2,
1,63 (±0,19)
Ad5-S-Fc-CoV-2
1,57 (±0,30)
Ad5-RBD-CoV-2
1,47 (±0,21)
Ad5-RBD-G-CoV-2
1,52 (±0,19)
Ad5-RBD-Fc-CoV-2
1,58± (0,11)
Как видно из полученных данных, во всех клетках, трансдуцированных рекомбинантными аденовирусами Ad5-S-CoV-2, Ad5-S-del-CoV-2, Ad5-S-Fc-CoV-2, Ad5-RBD-CoV-2, Ad5-RBD-G-CoV-2, Ad5-RBD-Fc-CoV-2 наблюдалась экспрессия различных вариантов целевого белка.
Пример 6. Проверка экспрессии различных вариантов гена гликопротеина S SARS-CoV-2 в клетках линии HEK293 после добавления иммунобиологического средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 26-го серотипа
Целью данного эксперимента была проверка способности сконструированных рекомбинантных аденовирусов pAd26-S-CoV-2, Ad26-S-del-CoV-2, Ad26-S-Fc-CoV-2, pAd26-RBD-CoV-2, pAd26-RBD-G-CoV-2, pAd26-RBD-Fc-CoV-2 экспрессировать различные варианты гена белка S в клетках млекопитающих.
2
2
Клетки HEK293 культивировали в среде DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки в инкубаторе при температуре 37ºС и 5% СО. Клетки помещали на 35мм культуральные чашки Петри и инкубировали в течение суток до достижения 70% конфлюэнтности. Далее к клеткам добавили исследуемые препараты рекомбинантных аденовирусов (pAd26-S-CoV-2, Ad26-S-del-CoV-2, Ad26-S-Fc-CoV-2, pAd26-RBD-CoV-2, pAd26-RBD-G-CoV-2, pAd26-RBD-Fc-CoV-2), контрольный препарат (Ad26-null – рекомбинантый аденовирус, не содержащий вставок) из расчета 100 БОЕ/клетку и фосфатно-солевой буфер (ФСБ) в качестве отрицательного контроля. Через 2 суток после трансдукции клетки собрали, лизировали в 0,5 мл однократного буфера CCLR (Promega), лизат развели карбонат-бикарбонатным буфером и внесли в лунки планшета для ИФА. Инкубировали планшет в течение ночи +4ºС.
Промыли лунки планшета однократным буфером для промывки трижды объемом 200 мкл на лунку, а затем внесли по 100 мкл блокирующего буфера, накрыли крышкой и инкубировали 1 час 37ºС на шейкере при 400 об/мин. Далее промыли лунки планшета однократным буфером для промывки трижды объемом 200 мкл на лунку и внесли по 100 мкл сыворотки крови реконвалесцента. Накрыли планшет крышкой и инкубировали при комнатной температуре на шейкере при 400 об/мин в течение 2 часов. Далее промыли лунки планшета однократным буфером для промывки трижды объемом 200 мкл на лунку, затем внесли 100 мкл раствора вторичных антител, конъюгированных с биотином. Накрыли планшет крышкой и инкубировали при комнатной температуре на шейкере при 400 об/мин в течение 2 часов. Далее приготовили раствор стрептавидина, конъюгированного с пероксидазой хрена. Для этого развели конъюгат объемом 60 мкл в 5,94 мл буфера для анализа. Промыли лунки планшета дважды однократным буфером для промывки объемом 200 мкл на лунку и во все лунки планшета внесли по 100 мкл раствора стрептавидина, конъюгированного с пероксидазой хрена. Планшет инкубировали при комнатной температуре на шейкере при 400 оборотов в минуту в течение 1 часа. Затем лунки планшета промыли дважды однократным буфером для промывки объемом 200 мкл на лунку и во все лунки планшета внесли по 100 мкл ТМБ субстрата и инкубировали в темноте при комнатной температуре 10 минут, а затем добавили во все лунки по 100 мкл останавливающего раствора. Значение оптической плотности определяли измерением на планшетном спектрофотометре (Multiskan FC, Thermo) при длине волны 450 нм. Результаты эксперимента представлены в таблице 2.
Таблица 2 - Результаты эксперимента по проверке экспрессии различных вариантов гена гликопротеина S SARS-CoV-2 в клетках линии HEK293 после добавления иммунобиологического средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 26-го серотипа
Среднее значение оптической плотности при длине волны 450 нм
ФСБ
0,17 (±0,08)
Ad26-null
0,22 (±0,09)
Ad26-S-CoV-2
1,68 (±0,21)
Ad26-S-del-CoV-2
1,65 (0,14)
Ad26-S-Fc-CoV-2
1,71 (±0,13)
Ad26-RBD-CoV-2
1,61 (±0,18)
Ad26-RBD-G-CoV-2
1,45 (±0,22)
Ad26-RBD-Fc-CoV-2
1,51± (0,14)
Как видно из полученных данных, во всех клетках, трансдуцированных рекомбинантными аденовирусами pAd26-S-CoV-2, Ad26-S-del-CoV-2, Ad26-S-Fc-CoV-2, pAd26-RBD-CoV-2, pAd26-RBD-G-CoV-2, pAd26-RBD-Fc-CoV-2 наблюдалась экспрессия различных вариантов целевого белка.
Пример 7. Способ использования разработанного иммунобиологического средства путем однократного введения в организм млекопитающих в эффективном количестве для индукции специфического иммунитета к SARS-CoV-2
Разработанное иммунобиологическое средство на основе рекомбинантных аденовирусов человека 5-го и 26-го серотипов, содержащего оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность протективного антигена (белков S, S-del, S-Fc, RBD, RBD-G, RBD-Fc) SARS-CoV-2 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 используется путем введения в организм млекопитающих любым из известных для данного вирусного вектора способов введения (подкожно, внутримышечно, внутривенно, интраназально). При этом в организме млекопитающих развивается иммунный ответ к целевому белку гликопротеина SARS-CoV-2.
Одной из основных характеристик эффективности иммунизации является титр антител. В примере представлены данные, касающиеся изменения титра антител против гликопротеина SARS-CoV-2 через 21 день после однократной внутримышечной иммунизации животных иммунобиологическим средством, включающим  рекомбинантный аденовирус человека 5-го или 26-го серотипа, содержащий оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность протективного антигена (белков S, S-del, S-Fc, RBD, RBD-G, RBD-Fc) SARS-CoV-2 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6.
В эксперименте использовались млекопитающие - мыши линии C57BL/6, самки 18г. Все животные были разделены на 43 групп по 5 животных, которым внутримышечно вводили:
7
1) Ad5-S-CoV-2 10БОЕ/мышь
7
2) Ad5-S-del-CoV-2 10БОЕ/мышь
7
3) Ad5-S-Fc-CoV-2 10БОЕ/мышь
7
4) Ad5-RBD-CoV-2 10БОЕ/мышь
7
5) Ad5-RBD-G-CoV-2 10БОЕ/мышь
7
6) Ad5-RBD-Fc-CoV-2 10БОЕ/мышь
7
7) Ad5-null 10БОЕ/мышь
8
8) Ad5-S-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
9) Ad5-S-del-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
10) Ad5-S-Fc-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
11) Ad5-RBD-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
12) Ad5-RBD-G-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
13) Ad5-RBD-Fc-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
14) Ad5-null 10БОЕ/мышь
9
15) Ad5-S-CoV-2 10БОЕ/мышь
9
16) Ad5-S-del-CoV-2 10БОЕ/мышь
9
17) Ad5-S-Fc-CoV-2 10БОЕ/мышь
9
18) Ad5-RBD-CoV-2 10БОЕ/мышь
9
19) Ad5-RBD-G-CoV-2 10БОЕ/мышь
9
20) Ad5-RBD-Fc-CoV-2 10БОЕ/мышь
9
21) Ad5-null 10БОЕ/мышь
7
22) Ad26-S-CoV-2 10БОЕ/мышь
7
23) Ad26-S-del-CoV-2 10БОЕ/мышь
7
24) Ad26-S-Fc-CoV-2 10БОЕ/мышь
7
25) Ad26-RBD-CoV-2 10БОЕ/мышь
7
26) Ad26-RBD-G-CoV-2 10БОЕ/мышь
7
27) Ad26-RBD-Fc-CoV-2 10БОЕ/мышь
7
28) Ad26-null 10БОЕ/мышь
8
29) Ad26-S-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
30) Ad26-S-del-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
31) Ad26-S-Fc-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
32) Ad26-RBD-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
33) Ad26-RBD-G-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
34) Ad26-RBD-Fc-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
35) Ad26-null 10БОЕ/мышь
9
36) Ad26-S-CoV-2 10БОЕ/мышь
9
37) Ad26-S-del-CoV-2 10БОЕ/мышь
9
38) Ad26-S-Fc-CoV-2 10БОЕ/мышь
9
39) Ad26-RBD-CoV-2 10БОЕ/мышь
9
40) Ad26-RBD-G-CoV-2 10БОЕ/мышь
9
41) Ad26-RBD-Fc-CoV-2 10БОЕ/мышь
9
42) Ad26-null 10БОЕ/мышь
43) фосфатно-солевой буфер
Через три недели у животных отбирали кровь из хвостовой вены и выделяли сыворотку крови. Титр антител определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) по следующему протоколу:
Белок (S) адсорбировали на лунках 96-луночного планшета для ИФА в течение 16 часов при температуре +4ºС.
o
Далее для избавления от неспецифического связывания осуществилась "забивка" планшета 5 %  молоком, растворенном в TPBS в объеме 100 мкл на лунку. Инкубировали на шейкере при температуре 37С на протяжении часа.
Методом 2-х кратных разведений разводили образцы сыворотки иммунизированных мышей. Всего было приготовлено 12 разведений каждого образца.
Добавляли по 50 мкл каждого разведенного образца сыворотки в лунки планшета.
Далее проводили инкубацию в течение 1 часа при 37ºС.
После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером.
Затем добавляли вторичные антитела против иммуноглобулинов мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена.
Далее проводили инкубацию в течение 1 часа при 37ºС.
После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером
Затем добавили раствор тетраметилбензидина (ТМВ), который является субстратом пероксидазы хрена и в результате реакции превращается в окрашенное соединение. Реакцию останавливали через 15 минут добавлением серной кислоты. Далее с помощью спектрофотометра измеряли оптическую плотность раствора (OD) в каждой лунке при длине волны 450 нм.
Титр антител определяли, как последнее разведение, в котором оптическая плотность раствора была достоверно выше, чем в группе отрицательного контроля. Полученные результаты (среднее геометрическое значение) представлены в таблице 1.
Таблица 3 - Титр антител к белку S в сыворотке крови мышей (среднее геометрическое значение титра антител)
Рекомбинантный аденовирус
БОЕ/мышь
10<sup>7</sup>
10<sup>8</sup>
10<sup>9</sup>
Ad5-null
0
0
0
Ad5-S-CoV-2
1:10809
1:18820
1:57052
Ad5-S-del-CoV-2
1:21619
1:28526
1:114105
Ad5-S-Fc-CoV-2
1:14263
1:18820
1:57052
Ad5-RBD-CoV-2
1:12417
1:14263
1:99334
Ad5-RBD-G-CoV-2
1:32768
1: 49667
1:172951
Ad5-RBD-Fc-CoV-2
1:10809
1:12417
1:28526
Ad26-null
0
0
0
Ad26-S-CoV-2
1:18820
1:24834
1:43238
Ad26-S-del-CoV-2
1:24834
1:43238
1:57052
Ad26-S-Fc-CoV-2
1:28526
1:32768
1:86475
Ad26-RBD-CoV-2
1:12417
1:18820
1:86475
Ad26-RBD-G-CoV-2
1:24834
1:32768
1:150562
Ad26-RBD-Fc-CoV-2
1:9410
1:12417
1:24834
Результаты эксперимента показали, что разработанное иммунобиологическое средство, введенное в организм млекопитающего, индуцирует гуморальный иммунный ответ к гликопротеину SARS-CoV-2 во всем диапазоне выбранных доз. При этом, очевидно, что увеличение доз будет приводить к увеличению титра антител в крови млекопитающих до наступления токсического эффекта.
Пример 8. Способ использования разработанного иммунобиологического средства путем последовательно введения в организм млекопитающих в эффективном количестве для индукции специфического иммунитета к SARS-CoV-2.
В данном примере описан способ использования разработанного иммунобиологического средства основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа, содержащего оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность протективного антигена (белков S, S-del, S-Fc, RBD, RBD-G, RBD-Fc) SARS-CoV-2 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 путем их последовательного введения в организм млекопитающих с интервалом в 1 неделю, для индукции специфического иммунитета к SARS-CoV-2.
Эксперимент был выполнен согласно протоколу, описанному в примере 7.
Все животные были разделены на 29 групп (по 3 животных), которым внутримышечно вводили:
фосфатный буфер (100 мкл), а через неделю фосфатный буфер (100мкл)
8
фосфатный буфер (100 мкл), а через неделю Ad5-null 10БОЕ/мышь
8
Ad5-null 10БОЕ/мышь, а через неделю фосфатный буфер (100мкл)
8
8
Ad5-null 10БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-null 10БОЕ/мышь
8
8
Ad5-S-CoV-2 10БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-S-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
8
Ad5-S-CoV-2 10БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
8
Ad5-S-CoV-2 10БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-S-del-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
8
Ad5-S-CoV-2 10БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-S-Fc-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
8
Ad5-S-CoV-2 10БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
8
Ad5-S-CoV-2 10БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD-G-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
8
Ad5-S-CoV-2 10БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD-Fc-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
8
Ad5- S-del -CoV-2 10БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-S-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
8
Ad5-S-del-CoV-2  10БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-S-del-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
8
Ad5- S-del -CoV-2 10БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-S-Fc-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
8
Ad5- S-del -CoV-2 10БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
8
Ad5- S-del -CoV-2 10БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD-G-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
8
Ad5- S-del -CoV-2 10БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD-Fc-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
8
Ad5- S-Fc -CoV-2 10БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-S-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
8
Ad5- S-Fc -CoV-2  10БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-S-del-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
8
Ad5- S-Fc -CoV-2 10БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-S-Fc-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
8
Ad5- S-Fc -CoV-2 10БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
8
Ad5- S-Fc -CoV-2 10БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD-G-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
8
Ad5- S-Fc -CoV-2 10БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD-Fc-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
8
Ad5-RBD-CoV-2 10БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-S-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
8
Ad5-RBD-CoV-2  10БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-S-del-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
8
Ad5-RBD-CoV-2 10БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-S-Fc-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
8
Ad5-RBD-CoV-2 10БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
8
Ad5-RBD-CoV-2 10БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD-G-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
8
Ad5-RBD-CoV-2 10БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD-Fc-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
8
Ad5-RBD-G-CoV-2 10БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-S-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
8
Ad5-RBD-G-CoV-2  10БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-S-del-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
8
Ad5-RBD-G-CoV-2 10БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-S-Fc-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
8
Ad5-RBD-G-CoV-2 10БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
8
Ad5-RBD-G-CoV-2 10БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD-G-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
8
Ad5-RBD-G-CoV-2 10БОЕ/мышь, а через неделю Ad5- RBD-Fc-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
8
Ad5-RBD-Fc-CoV-2 10БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-S-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
8
Ad5-RBD-Fc-CoV-2  10БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-S-del-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
8
Ad5-RBD-Fc-CoV-2 10БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-S-Fc-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
8
Ad5-RBD-Fc-CoV-210БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
8
Ad5-RBD-Fc-CoV-2 10БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD-G-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
8
Ad5-RBD-Fc-CoV-2 10БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD-Fc-CoV-2 10БОЕ/мышь
Результаты представлены в таблицах 4 и 5.
Таблица 4 - Титр антител к белку S вируса SARS-CoV-2 в сыворотке крови мышей контрольных групп
Вторая иммунизация (через неделю)
PBS
Ad5-null
Первая иммунизация
PBS
0
0
Ad5-null
0
0
Таблица 5 - Титр антител к белку S вируса SARS-CoV-2 в сыворотке крови мышей опытных групп
Вторая иммунизация (через неделю)
Первая иммунизация
Ad5-S-CoV-2
Ad5-S-del-CoV-2
Ad5-S-Fc-CoV-2
Ad5-RBD-CoV-2
Ad5- RBD-G-CoV-2
Ad5-RBD-Fc-CoV-2
Ad5-S-CoV-2
1:32768
1:131072
1:104032
1:131072
1:65536
1:104032
Ad5-S-del- CoV-2
1:65536
1:131072
1:131072
1:131072
1:65536
1:104032
Ad5-S-Fc- CoV-2
1:65536
1:104032
1:65536
1:104032
1:52016
1:131072
Ad5-RBD-CoV-2
1:52016
1:65536
1:131072
1:65536
1:32768
1:52016
Ad5-RBD-G-CoV-2
1:131072
1:131072
1:104032
1:131072
1:65536
1:104032
Ad5-RBD-Fc-CoV-2
1:82570
1:131072
1:65536
1:32768
1:65536
1:65536
Таким образом, результаты эксперимента полностью подтвердили, что последовательная иммунизация разработанными иммунобиологическими средствами в различных комбинациях, включающими различные формы белка S SARS-CoV-2 вызовет более мощную индукцию иммунного ответа, чем иммунизация по аналогичной схеме одним и тем же антигеном.
Пример 9. Определение эффективности иммунизации разработанным иммунобиологическим средством по оценке доли пролиферирующих лимфоцитов.
Пролиферативный анализ позволяет оценивать способность лимфоцитов усиленно делиться после встречи с антигеном. Для того, чтобы оценить пролиферацию авторы использовали окраску лимфоцитов флуоресцентным красителем CFSE. Данный краситель связывается с клеточными белками, и сохраняется долгое время и при этом никогда не передается соседним клеткам в популяции. Однако, флуоресцентная метка передается дочерним клеткам. Концентрация метки, а, следовательно, и интенсивность флуоресценции, снижаются ровно в два раза. Поэтому делящиеся клетки легко отслеживать по уменьшению их флуоресценции.
В эксперименте использовались мыши линии C57BL/6. Все животные были разделены на 8 групп (по 3 животных), которым внутримышечно вводили:
1) фосфатный буфер (100 мкл)
8
2) Ad5-null 10БОЕ/мышь
8
3) Ad5-S-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
4) Ad5-S-del-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
5) Ad5-S-Fc-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
6) Ad5-RBD-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
7) Ad5-RBD-G-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
8) Ad5-RBD-Fc-CoV-2 10БОЕ/мышь
Дозы рекомбинантных аденовирусов были выбраны на основании данных, полученных при определении титра антител.
Через две недели животных усыпляли. Из селезенки выделяли лимфоциты методом центрифугирования в градиенте фиколла-урографина. Затем выделенные клетки окрашивали CFSE по методике (B.J. Quah et. al., Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester, Nature Protocols, 2007, № 2(9), 2049-2056) и культивировали в присутствие антигена. Далее клетки анализировали методом проточной цитофлуориметрии. Полученные результаты представлены на Фиг. 1, 2, 3, 4. Таким образом, можно заключить, что полученные аденовирусные конструкции индуцируют формирование антиген-специфического иммунного ответа (как CD4+, так и CD8+).
Как видно из результатов эксперимента (Фиг. 1, 2, 3, 4), разработанные иммунобиологические средства по п.1, п.2, п.3, п.4, п.5 в данной дозе эффективно стимулируют пролиферацию лимфоцитов.
Пример 10. Способ использования разработанных иммунобиологических средств на основе рекомбинантных аденовирусов человека 5-го и 26-го серотипов путем их последовательного введения в организм млекопитающих для индукции специфического иммунитета к SARS-CoV-2.
Эксперимент был выполнен согласно протоколу, описанному в примере 7. Комбинации иммунобиологических средств были выбраны исходя из примеров 7 и 8.
Все животные были разделены на 31 группу (по 3 животных), которым внутримышечно вводили:
1. фосфатный буфер (100 мкл), а через неделю фосфатный буфер (100мкл)
8
2. Ad26-null 10БОЕ/мышь, а через неделю фосфатный буфер (100 мкл)
8
3. фосфатный буфер (100 мкл), а через неделю Ad26-null 10БОЕ/мышь
8
8
4. Ad26-null 10БОЕ/мышь, а через неделю Ad26-null 10БОЕ/мышь
8
5. Ad5-null 10БОЕ/мышь, а через неделю фосфатный буфер (100 мкл)
8
6. фосфатный буфер (100 мкл), а через неделю Ad5-null 10БОЕ/мышь
8
8
7. Ad5-null 10БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-null 10БОЕ/мышь
8
8
8. Ad5-null 10БОЕ/мышь, а через неделю Ad26-null 10БОЕ/мышь
8
8
9. Ad26-null 10БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-null 10БОЕ/мышь
8
8
10. Ad5-S-CoV-2 10БОЕ/мышь, а через неделю Ad26-RBD-G-CoV-2  10БОЕ/мышь
8
8
11. Ad5-RBD-G-CoV-2  10БОЕ/мышь, а через неделю Ad26-S-CoV-2  10БОЕ/мышь
8
8
12. Ad26-S-CoV-2 10БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD-G-CoV-2  10БОЕ/мышь
8
8
13. Ad26-RBD-G-CoV-2 10БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-S-CoV-2  10БОЕ/мышь
8
8
14. Ad5-S-del-CoV-2 10БОЕ/мышь, а через неделю Ad26-RBD-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
8
15. Ad26-S-G-CoV-2 10БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
8
16. Ad5-RBD-CoV-2 10БОЕ/мышь, а через неделю Ad26-S-del-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
8
17. Ad26-S-G-CoV-2 10БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
8
18. Ad26-RBD-CoV-2 10БОЕ/мышь, а через неделю Ad5- S-del -CoV-2 10БОЕ/мышь
8
8
19. Ad5-RBD-CoV-2 10БОЕ/мышь, а через неделю Ad26- S-del -CoV-2 10БОЕ/мышь
8
8
20. Ad5-S-del-CoV-2 10БОЕ/мышь, а через неделю Ad26-RBD-G-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
8
21. Ad5-RBD-G-CoV-2 10БОЕ/мышь, а через неделю Ad26- S-del -CoV-2 10БОЕ/мышь
8
8
22. Ad26-S-del -CoV-2 10БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD-G-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
8
23. Ad26-RBD-G-CoV-2 10БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-S-G-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
8
24. Ad5-S-CoV-2 10БОЕ/мышь, а через неделю Ad26-RBD-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
8
25. Ad26-S-CoV-2 10БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
8
26. Ad5-RBD-CoV-2 10БОЕ/мышь, а через неделю Ad26-S-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
8
27. Ad26-RBD-CoV-2 10БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-S-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
8
28. Ad5- S-del -CoV-2 10БОЕ/мышь, а через неделю Ad26-S-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
8
29. Ad26- S-del -CoV-2 10БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-S-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
8
30. Ad5-S-CoV-2 10БОЕ/мышь, а через неделю Ad26- S-del -CoV-2 10БОЕ/мышь
8
8
31. Ad26-S-CoV-2 10БОЕ/мышь, а через неделю Ad5- S-del -CoV-2 10БОЕ/мышь
Результаты представлены в таблицах 6 и 7.
Таблица 6 - Титр антител к белку S вируса SARS-CoV-2 в сыворотке крови мышей контрольных групп
Вторая иммунизация (через неделю)
PBS
Ad5-null
Ad26-null
Первая иммунизация
PBS
0
0
0
Ad5-null
0
0
0
Ad26-null
0
0
0
Таблица 7 - Титр антител к белку S вируса SARS-CoV-2 в сыворотке крови мышей опытных групп
Группа животных
Среднее геометрическое значение титра антител
Ad5-S-CoV-2 10<sup>8</sup>БОЕ/мышь, а через неделю Ad26-RBD-G 10<sup>8</sup>БОЕ/мышь
1:208064
Ad5-RBD-G-CoV-2 10<sup>8</sup>БОЕ/мышь, а через неделю Ad26-S-CoV-2 10<sup>8</sup>БОЕ/мышь
1:1321123
Ad26-S-CoV-2 10<sup>8</sup>БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD-G-CoV-2 10<sup>8</sup>БОЕ/мышь
1:832255
Ad26-RBD-G-CoV-2 10<sup>8</sup>БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-S-CoV-2 10<sup>8</sup>БОЕ/мышь
1:1321123
Ad5- S-del -CoV-2 10<sup>8</sup>БОЕ/мышь, а через неделю Ad26-RBD-CoV-2 10<sup>8</sup>БОЕ/мышь
1:165140
Ad26- S-del -CoV-2 10<sup>8</sup>БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD -CoV-2 10<sup>8</sup>БОЕ/мышь
1:104032
Ad5-RBD-CoV-2 10<sup>8</sup>БОЕ/мышь, а через неделю Ad26- S-del -CoV-2 10<sup>8</sup>БОЕ/мышь
1:104032
Ad26- S-del -CoV-2 10<sup>8</sup>БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD-CoV-2 10<sup>8</sup>БОЕ/мышь
1:52016
Ad26-RBD-CoV-2 10<sup>8</sup>БОЕ/мышь, а через неделю Ad5- S-del -CoV-2 10<sup>8</sup>БОЕ/мышь
1:131072
Ad5-RBD-CoV-2 10<sup>8</sup>БОЕ/мышь, а через неделю Ad26- S-del -CoV-2 10<sup>8</sup>БОЕ/мышь
1:104032
Ad5- S-del -CoV-2 10<sup>8</sup>БОЕ/мышь, а через неделю Ad26-RBD-G-CoV-2 10<sup>8</sup>БОЕ/мышь
1:165140
Ad5-RBD-G-CoV-2 10<sup>8</sup>БОЕ/мышь, а через неделю Ad26- S-del -CoV-2 10<sup>8</sup>БОЕ/мышь
1:208064
Ad26- S-del -CoV-2 10<sup>8</sup>БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD-G-CoV-2 10<sup>8</sup>БОЕ/мышь
1:660561
Ad26-RBD-G-CoV-2 10<sup>8</sup>БОЕ/мышь, а через неделю Ad5- S-del -CoV-2 10<sup>8</sup>БОЕ/мышь
1:416128
Ad5-S-CoV-2 10<sup>8</sup>БОЕ/мышь, а через неделю Ad26-RBD-CoV-2 10<sup>8</sup>БОЕ/мышь
1:208064
Ad26-S-CoV-2 10<sup>8</sup>БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD-CoV-2 10<sup>8</sup>БОЕ/мышь
1:65536
Ad5-RBD-CoV-2 10<sup>8</sup>БОЕ/мышь, а через неделю Ad26-S-CoV-2 10<sup>8</sup>БОЕ/мышь
1:131072
Ad26-RBD-CoV-2 10<sup>8</sup>БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-S-CoV-2 10<sup>8</sup>БОЕ/мышь
1:165140
Ad5- S-del -CoV-2 10<sup>8</sup>БОЕ/мышь, а через неделю Ad26-S-CoV-2 10<sup>8</sup>БОЕ/мышь
1:208064
Ad26-S-G-CoV-2 10<sup>8</sup>БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-S-CoV-2 10<sup>8</sup>БОЕ/мышь
1:208064
Ad5-S-CoV-2 10<sup>8</sup>БОЕ/мышь, а через неделю Ad26- S-del -CoV-2 10<sup>8</sup>БОЕ/мышь
1:165140
Ad26-S-CoV-2 10<sup>8</sup>БОЕ/мышь, а через неделю Ad5- S-del -CoV-2 10<sup>8</sup>БОЕ/мышь
1:165140
Таким образом, результаты эксперимента полностью подтвердили, что последовательная иммунизация разработанными иммунобиологическими средствами, включающими различные аденовирусные векторы (на основе аденовирусов человека 5-го и 26-го серотипов) вызовет более мощную индукцию иммунного ответа, чем иммунизация по аналогичной схеме одним и тем же вектором.
Пример 11. Определение эффективности иммунизации разработанным иммунобиологическим средством по оценке индукции ИФН-гамма
В данном эксперименте проводили оценку эффективности иммунизации разработанным иммунобиологическим средством на основе рекомбинантного аденовируса, содержащего оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность протективного антигена (белков S, S-del, S-Fc, RBD, RBD-G, RBD-Fc) вируса SARS-COV-2 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 по определению прироста концентрации ИФН-гамма в среде после стимуляции спленоцитов иммунизированных аденовирусными конструкциями мышей линии C57/BL6 рекомбинантным полноразмерным белком S вируса SARS-CoV-2.
Для определения уровня ИФН-гамма был использован набор Mouse IFN gamma Platinum ELISA (Affymetrix eBioscience, USA).
Порядок проведения ИФА. Промыли лунки планшета однократным буфером для промывки дважды объемом 200 мкл на лунку, а затем внесли по 100 мкл стандартов и 100 мкл раствора для разведения образцов в качестве отрицательного контроля. В лунки образцов внесли по 50 мкл раствора для разведения образцов, а затем по 50 мкл самих образцов (среда от стимулированных спленоцитов). Приготовили раствор антител, конъюгированных с биотином. Для этого развели конъюгат объемом 60 мкл в 5,94 мл буфера для анализа. Затем во все лунки внесли по 50 мкл раствора антител, конъюгированных с биотином, накрыли планшет крышкой и инкубировали при комнатной температуре на шейкере при 400 об/мин в течение 2 часов. Далее приготовили раствор стрептавидина, конъюгированного с пероксидазой хрена. Для этого развели конъюгат объемом 60 мкл в 5,94 мл буфера для анализа. Промыли лунки планшета дважды однократным буфером для промывки объемом 200 мкл на лунку и во все лунки планшета внесли по 100 мкл раствора стрептавидина, конъюгированного с пероксидазой хрена. Планшет инкубировали при комнатной температуре на шейкере при 400 оборотов в минуту в течение 1 часа. Затем лунки планшета промыли дважды однократным буфером для промывки объемом 200 мкл на лунку и во все лунки планшета внесли по 100 мкл ТМБ субстрата и инкубировали в темноте при комнатной температуре 10 минут, а затем добавили во все лунки по 100 мкл останавливающего раствора. Значение оптической плотности определяли измерением на планшетном спектрофотометре (Multiskan FC, Thermo) при длине волны 450 нм.
Результаты измерения продукции ИФН-гамма на 15-й день после иммунизации испытуемых животных аденовирусными конструкциями представлены графически на Фиг. 5 в виде прироста концентрации ИФН-гамма (разы) при сравнении клеток, стимулированных рекомбинантным полноразмерным белком S вируса SARS-CoV-2, с интактными клетками.
По результатам исследования было показано, что введение полученных конструкций животным приводит высокому уровню индукции экспрессии ИФН-гамма спленоцитами при стимуляции рекомбинантным белком S вируса SARS-CoV-2, что свидетельствует о формировании специфического Т-клеточного иммунитета.
Пример 12. Способ использования разработанных иммунобиологических средств на основе рекомбинантных аденовирусов человека 5-го серотипа, содержащих оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность протективного антигена (белка S и RBD-G) SARS-CoV-2 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:5 путем их одновременного введения в организм млекопитающих, для индукции специфического иммунитета к SARS-CoV-2.
Эксперимент был выполнен согласно протоколу, описанному в примере 7. Комбинация иммунобиологических средств была выбрана исходя из примеров 8 и 11.
Все животные были разделены на 17 групп (по 5 животных), которым внутримышечно вводили:
1. фосфатный буфер (100 мкл)
5
2. Ad5-null 10 вирусных частиц/мышь
6
3. Ad5-null 10 вирусных частиц/мышь
7
4. Ad5-null 10 вирусных частиц/мышь
8
5. Ad5-null 10 вирусных частиц/мышь
9
6. Ad5-null 10 вирусных частиц/мышь
10
7. Ad5-null 10 вирусных частиц/мышь
10
8. Ad5-null 5*10 вирусных частиц/мышь
11
9. Ad5-null 10 вирусных частиц/мышь
5
10. Ad5-S-CoV-2 + Ad5-RBD-G-CoV-2 10 вирусных частиц/мышь
6
11. Ad5-S-CoV-2 + Ad5-RBD-G-CoV-2 10 вирусных частиц/мышь
7
12. Ad5-S-CoV-2 + Ad5-RBD-G-CoV-2 10 вирусных частиц/мышь
8
13. Ad5-S-CoV-2 + Ad5-RBD-G-CoV-2 10 вирусных частиц/мышь
9
14. Ad5-S-CoV-2 + Ad5-RBD-G-CoV-2 10 вирусных частиц/мышь
10
15. Ad5-S-CoV-2 + Ad5-RBD-G-CoV-2 10 вирусных частиц/мышь
10
16. Ad5-S-CoV-2 + Ad5-RBD-G-CoV-2 5*10 вирусных частиц/мышь
11
17. Ad5-S-CoV-2 + Ad5-RBD-G-CoV-2 10 вирусных частиц/мышь
Результаты представлены в таблицах 8 и 9.
Таблица 8 - Титр антител к белку S вируса SARS-CoV-2 в сыворотке крови мышей контрольных групп
Группа животных
Среднее геометрическое значение титра антител к белку S SARS-CoV-2
фосфатный буфер
0
Ad5-null 10<sup>5</sup> вирусных частиц/мышь
0
Ad5-null 10<sup>6</sup> вирусных частиц/мышь
0
Ad5-null 10<sup>7</sup> вирусных частиц/мышь
0
Ad5-null 10<sup>8</sup> вирусных частиц/мышь
0
Ad5-null 10<sup>9</sup> вирусных частиц/мышь
0
Ad5-null 10<sup>10</sup> вирусных частиц/мышь
0
Ad5-null 5*10<sup>10</sup> вирусных частиц/мышь
0
Ad5-null 10<sup>11</sup> вирусных частиц/мышь
0
Таблица 9 - Титр антител к белку S вируса SARS-CoV-2 в сыворотке крови мышей опытных групп
Группа животных, вирусных частиц/мышь
Среднее геометрическое значение титра антител к белку S SARS-CoV-2
Ad5-S-CoV-2+ Ad5-RBD-G-CoV-2 10<sup>5</sup>
0
Ad5-S-CoV-2+ Ad5-RBD-G-CoV-2 10<sup>6</sup>
1:14263
Ad5-S-CoV-2+ Ad5-RBD-G-CoV-2 10<sup>7</sup>
1:99334
Ad5-S-CoV-2+ Ad5-RBD-G-CoV-2 10<sup>8</sup>
1:131072
Ad5-S-CoV-2+ Ad5-RBD-G-CoV-2 10<sup>9</sup>
1:172951
Ad5-S-CoV-2+ Ad5-RBD-G-CoV-2 10<sup>10</sup>
1:301124
Ad5-S-CoV-2+Ad5-RBD-G-CoV-2 5*10<sup>10</sup>
1:345901
Ad5-S-CoV-2+ Ad5-RBD-G-CoV-2 10<sup>11</sup>
1:524288
6
11
Таким образом, результаты эксперимента полностью подтвердили, что одновременная иммунизация разработанными иммунобиологическими средствами индуцирует гуморальный иммунный ответ к гликопротеину SARS-CoV-2 в диапазоне доз от 10 вирусных частиц/мышь до 10 вирусных частиц/мышь. При этом, очевидно, что увеличение доз будет приводить к увеличению титра антител в крови млекопитающих до наступления токсического эффекта.
Пример 13 Способ использования разработанного иммунобиологического средства путем последовательно введения в организм млекопитающих через различные интервалы времени в эффективном количестве для индукции специфического иммунитета к SARS-CoV-2.
В данном примере описан способ использования разработанного иммунобиологического средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа, содержащего оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность протективного антигена (белков S, S-del, RBD, RBD-G, RBD-Fc) SARS-CoV-2 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 путем их последовательного введения в организм млекопитающих с интервалом в 1 неделю или с интервалом в 3 недели для индукции специфического иммунитета к SARS-CoV-2.
Эксперимент был выполнен согласно протоколу, описанному в примере 7.
Все животные были разделены на 28 группы (по 3 животных), которым внутримышечно вводили:
1. фосфатный буфер (100 мкл), а через неделю фосфатный буфер (100мкл)
8
8
2. Ad5-null 10БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-null 10БОЕ/мышь
8
8
3. Ad5-S-CoV-2 10БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-S-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
8
4. Ad5-S-del-CoV-2 10БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-S-del-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
8
5. Ad5-S-Fc-CoV-2 10БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-S-Fc-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
8
6. Ad5-RBD-CoV-2 10БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
8
7. Ad5-RBD-G-CoV-2 10БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD-G-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
8
8. Ad5-RBD-Fc-CoV-2 10БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD-Fc-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
8
9. Ad26-S-CoV-2 10БОЕ/мышь, а через неделю Ad26-S-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
8
10. Ad26-S-del-CoV-2 10БОЕ/мышь, а через неделю Ad26-S-del-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
8
11. Ad26-S-Fc-CoV-2 10БОЕ/мышь, а через неделю Ad26-S-Fc-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
8
12. Ad26-RBD-CoV-2 10БОЕ/мышь, а через неделю Ad26-RBD-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
8
13. Ad26-RBD-G-CoV-2 10БОЕ/мышь, а через неделю Ad26-RBD-G-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
8
14. Ad26-RBD-Fc-CoV-2 10БОЕ/мышь, а через неделю Ad26-RBD-Fc-CoV-2 10БОЕ/мышь
15. фосфатный буфер (100 мкл), а через 3 недели фосфатный буфер (100мкл)
8
8
16. Ad5-null 10БОЕ/мышь, а через 3 недели Ad5-null 10БОЕ/мышь
8
8
17. Ad5-S-CoV-2 10БОЕ/мышь, а через 3 недели Ad5-S-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
8
18. Ad5-S-del-CoV-2 10БОЕ/мышь, а через 3 недели Ad5-S-del-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
8
19. Ad5-S-Fc-CoV-2 10БОЕ/мышь, а через 3 недели Ad5-S-Fc-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
8
20. Ad5-RBD-CoV-2 10БОЕ/мышь, а через 3 недели Ad5-RBD-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
8
21. Ad5-RBD-G-CoV-2 10БОЕ/мышь, а через 3 недели Ad5-RBD-G-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
8
22. Ad5-RBD-Fc-CoV-2 10БОЕ/мышь, а через 3 недели Ad5-RBD-Fc-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
8
23. Ad26-S-CoV-2 10БОЕ/мышь, а через 3 недели Ad26-S-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
8
24. Ad26-S-del-CoV-2 10БОЕ/мышь, а через 3 недели Ad26-S-del-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
8
25. Ad26-S-Fc-CoV-2 10БОЕ/мышь, а через 3 недели Ad26-S-Fc-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
8
26. Ad26-RBD-CoV-2 10БОЕ/мышь, а через 3 недели Ad26-RBD-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
8
27. Ad26-RBD-G-CoV-2 10БОЕ/мышь, а через 3 недели Ad26-RBD-G-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
8
28. Ad26-RBD-Fc-CoV-2 10БОЕ/мышь, а через 3 недели Ad26-RBD-Fc-CoV-2 10БОЕ/мышь
Результаты представлены в таблице 10.
Таблица 10 - Титр антител к белку S вируса SARS-CoV-2 в сыворотке крови мышей
2 иммунизация
с интервалом в 1 неделю
с интервалом в 2 недели
ФСБ/ФСБ
0
0
Ad5-null/ Ad5-null
0
0
Ad5-S-CoV-2/ Ad5-S-CoV-2
1:32768
1:41285
Ad5-S-del-CoV-2/ Ad5-S-del-CoV-2
1:41285
1:52016
Ad5-S-Fc-CoV-2/ Ad5-S-Fc-CoV-2
1:82570
1:104032
Ad5-RBD-CoV-2/ Ad5-RBD-CoV-2
1:65536
1:82570
Ad5-RBD-G-CoV-2/ Ad5-RBD-G-CoV-2
1:65536
1:82570
Ad5-RBD-Fc-CoV-2/ Ad5-RBD-Fc-CoV-2
1:65536
1:104032
Ad26-S-CoV-2/ Ad26-S-CoV-2
1:26008
1:32768
Ad26-S-del-CoV-2/ Ad26-S-del-CoV-2
1:52016
1:65536
Ad26-S-Fc-CoV-2/ Ad26-S-Fc-CoV-2
1:26008
1:52016
Ad26-RBD-CoV-2/ Ad26-RBD-CoV-2
1:20643
1:26008
Ad26-RBD-G-CoV-2/ Ad26-RBD-G-CoV-2
1:41285
1:52016
Ad26-RBD-Fc-CoV-2/ Ad26-RBD-Fc-CoV-2
1:13004
1:16384
Таким образом, результаты эксперимента подтверждают, что последовательная иммунизация разработанным иммунобиологическим средством приводит к более высоким уровням иммунного ответа, по сравнению с однократной иммунизацией. Специалисту среднего уровня очевидно, что конечная схема иммунизации готовым препаратом опирается на многолетние исследования и часто корректируется непосредственно врачом, она зависит от многих факторов, в том числе от целевой группы пациентов, их возраста, эпидемиологической ситуации и пр.
Пример 14 Способ использования разработанного иммунобиологического средства путем последовательно введения в организм млекопитающих с интервалом в одну неделю в эффективном количестве для индукции специфического иммунитета к SARS-CoV-2
В данном примере описан способ использования разработанного иммунобиологического средства основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа и рекомбинантного аденовируса человека 26-го серотипа, путем их последовательного введения в организм млекопитающих с интервалом в 1 неделю для индукции специфического иммунитета к SARS-CoV-2.
Эксперимент был выполнен согласно протоколу, описанному в примере 7.
Все животные были разделены на 9 групп (по 5 животных), которым внутримышечно вводили:
фосфатный буфер (100 мкл), затем через неделю фосфатный буфер (100мкл), затем через неделю фосфатный буфер (100мкл)
8
8
8
Ad5-null 10БОЕ/мышь, затем через неделю Ad5-null 10БОЕ/мышь, , затем через неделю Ad5-null 10БОЕ/мышь
8
8
8
Ad26-null 10БОЕ/мышь, затем через неделю Ad26-null 10БОЕ/мышь, , затем через неделю Ad26-null 10БОЕ/мышь
8
8
8
Ad5-S-CoV-2 10БОЕ/мышь, затем через неделю Ad5-S-CoV-2 10БОЕ/мышь, затем через неделю Ad5-S-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
8
8
Ad5-S-CoV-2 10БОЕ/мышь, затем через неделю Ad26-S-CoV-2 10БОЕ/мышь, затем через неделю Ad5-S-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
8
8
Ad5-S-CoV-2 10БОЕ/мышь, затем через неделю Ad26-S-CoV-2 10БОЕ/мышь, затем через неделю Ad26-S-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
8
8
Ad26-S-CoV-2 10БОЕ/мышь, затем через неделю Ad26-S-CoV-2 10БОЕ/мышь, затем через неделю Ad26-S-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
8
8
Ad26-S-CoV-2 10БОЕ/мышь, затем через неделю Ad5-S-CoV-2 10БОЕ/мышь, затем через неделю Ad26-S-CoV-2 10БОЕ/мышь
8
8
8
Ad26-S-CoV-2 10БОЕ/мышь, затем через неделю Ad5-S-CoV-2 10БОЕ/мышь, затем через неделю Ad5-S-CoV-2 10БОЕ/мышь
Результаты представлены в таблице 11.
Таблица 11 - Титр антител к белку S вируса SARS-CoV-2 в сыворотке крови мышей
Группа животных
Титр антител
ФСБ/ФСБ/ФСБ
0
Ad5-null/ Ad5-null/ Ad5-null
0
Ad26-null/ Ad26-null/ Ad26-null
0
Ad5-S-CoV-2/ Ad5-S-CoV-2/ Ad5-S-CoV-2
1:150562
Ad5-S-CoV-2/ Ad26-S-CoV-2/ Ad5-S-CoV-2
1:301124
Ad5-S-CoV-2/ Ad26-S-CoV-2/ Ad26-S-CoV-2
1:228209
Ad26-S-CoV-2/ Ad26-S-CoV-2/ Ad26-S-CoV-2
1:172950
Ad26-S-CoV-2/ Ad5-S-CoV-2/ Ad26-S-CoV-2
1:262144
Ad26-S-CoV-2/ Ad5-S-CoV-2/ Ad5-S-CoV-2
1:301124
Таким образом, результаты данного эксперимента на примере разработанного иммунобиологического средства основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го или 26-го серотипа, содержащего оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность белка S SARS-CoV-2 показали, что 3х кратное последовательное введение любых вариантов данного средства приводит к более сильному иммунному ответу на антиген, по сравнению с однократным и двукратным введением. Специалисту среднего уровня очевидно, что разработанное иммунобиологическое средство можно вводить многократно, что будет приводить к увеличению титра антител в крови млекопитающих до наступления токсического эффекта. Необходимое количество иммунизаций может отличаться в зависимости от целевой категории населения (их национальной принадлежности, возраста, работы и пр.). Кратность иммунизации определяется также экономической целесообразностью.
Пример 15 Способ использования разработанного иммунобиологического средства путем однократного введения в организм млекопитающих различными способами в эффективном количестве для индукции специфического иммунитета к SARS-CoV-2.
В данном примере описан способ использования разработанного иммунобиологического средства основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа и рекомбинантного аденовируса человека 26-го серотипа, путем их однократного введения в организм млекопитающих 3 способами (интраназально, подкожно, внутримышечно) для индукции специфического иммунитета к SARS-CoV-2.
Эксперимент был выполнен согласно протоколу, описанному в примере 7.
Все животные были разделены на 15 групп (по 3 животных), которым вводили:
ФСБ интраназально
ФСБ подкожно
ФСБ внутримышечно
9
Ad5-null 10БОЕ/мышьинтраназально
9
Ad5-null 10БОЕ/мышь подкожно
9
Ad5-null10БОЕ/мышь внутримышечно
9
Ad26-null 10БОЕ/мышь интраназально
9
Ad26-null 10БОЕ/мышь подкожно
9
Ad26-null 10БОЕ/мышь внутримышечно
9
Ad5-S-CoV-2 10БОЕ/мышь интраназально
9
Ad5-S-CoV-2 10БОЕ/мышь подкожно
9
Ad5-S-CoV-2 10БОЕ/мышь внутримышечно
9
Ad26-S-CoV-2 10БОЕ/мышь интраназально
9
Ad26-S-CoV-2 10БОЕ/мышь подкожно
9
Ad26-S-CoV-2 10БОЕ/мышь внутримышечно
Результаты представлены в таблице 12.
Таблица 12 - Титр антител к белку S вируса SARS-CoV-2 в сыворотке крови мышей
Группа животных
Титр антител
ФСБ интраназально
0
ФСБ подкожно
0
ФСБ внутримышечно
0
Ad5-null интраназально
0
Ad5-null подкожно
0
Ad5-null внутримышечно
0
Ad26-null интраназально
0
Ad26-null подкожно
0
Ad26-null внутримышечно
0
Ad5-S-CoV-2 интраназально
1:16384
Ad5-S-CoV-2 подкожно
1:26008
Ad5-S-CoV-2 внутримышечно
1:57052
Ad26-S-CoV-2 интраназально
1:13004
Ad26-S-CoV-2 подкожно
1:24300
Ad26-S-CoV-2 внутримышечно
1:43238
Таким образом, результаты данного эксперимента подтверждают возможность использования разработанного иммунобиологического средства для индукции специфического иммунитета к вирусу SARS-CoV-2 путем его интраназального, внутримышечного или подкожного введения.
Промышленная применимость
Преимуществом заявленного технического решения является использование таких доз рекомбинантных аденовирусов, экспрессирующих ген полноразмерного белка, которые позволяют повысить иммуногенность, но при которых еще не наблюдаются токсические эффекты на животных. Также к преимуществам можно отнести дополнительное возрастание иммуногенности рецептор-связывающего домена гена S вируса SARS-CoV-2 за счет присоединения лидерной последовательности для секреции белка из клетки во внешнюю среду. Одним из преимуществ заявленного технического решения является наличие адекватного Т-клеточного ответа (как CD4+, так и CD8+) на введение антигена.
Таким образом, создано иммунобиологическое средство на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа, содержащее аденовирус человека 5-го серотипа с делетированными Е1/Е3 областями и встроенную генетическую конструкцию, кодирующую разработанные оптимальные аминокислотные последовательности протективного антигена S вируса SARS-CoV-2.
Также, создано иммунобиологическое средство на основе рекомбинантного аденовируса человека 26-го серотипа, содержащее аденовирус человека 26-го серотипа с делетированными Е1/Е3 областями, замененной открытой рамкой считывания 6 на открытую рамку считывания аденовируса человека 5-го серотипа и с встроенной генетической конструкцией, кодирующей разработанные оптимальные аминокислотные последовательности протективного антигена S вируса SARS-CoV-2. При этом кодирующие последовательности различных форм белка S вируса SARS-CoV-2 экспрессируются рекомбинантными псевдоаденовирусными частицами непосредственно в организме субъекта.
Разработанное иммунобиологическое средство может рассматриваться в качестве препарата для доклинических исследований, как противовирусная вакцина, которая способна эффективно защищать человека от заражения коронавирусом SARS-CoV-2. Предложена технология производства такой вакцины.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> ФГБУ "НИЦЭМ им. Н.Ф.Гамалеи" Минздрава России
<120> Иммунобиологическое средство и способ его использования
для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого
острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 (варианты).
<160> 5
<170> BISSAP1.3.6
<210> 1
<211> 1273
<212> PRT
<213> SARS-CoV-2
<400> 1
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe
20                  25                  30
Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu
35                  40                  45
His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp
50                  55                  60
Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp
65                  70                  75                  80
Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu
85                  90                  95
Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser
100                 105                 110
Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile
115                 120                 125
Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr
130                 135                 140
Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr
145                 150                 155                 160
Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu
165                 170                 175
Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe
180                 185                 190
Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr
195                 200                 205
Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu
210                 215                 220
Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr
225                 230                 235                 240
Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser
245                 250                 255
Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro
260                 265                 270
Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala
275                 280                 285
Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys
290                 295                 300
Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val
305                 310                 315                 320
Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys
325                 330                 335
Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala
340                 345                 350
Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu
355                 360                 365
Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro
370                 375                 380
Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe
385                 390                 395                 400
Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly
405                 410                 415
Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys
420                 425                 430
Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn
435                 440                 445
Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe
450                 455                 460
Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys
465                 470                 475                 480
Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly
485                 490                 495
Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val
500                 505                 510
Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys
515                 520                 525
Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn
530                 535                 540
Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu
545                 550                 555                 560
Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val
565                 570                 575
Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe
580                 585                 590
Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val
595                 600                 605
Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile
610                 615                 620
His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser
625                 630                 635                 640
Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val
645                 650                 655
Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala
660                 665                 670
Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala
675                 680                 685
Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser
690                 695                 700
Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile
705                 710                 715                 720
Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val
725                 730                 735
Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu
740                 745                 750
Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr
755                 760                 765
Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln
770                 775                 780
Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe
785                 790                 795                 800
Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser
805                 810                 815
Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly
820                 825                 830
Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp
835                 840                 845
Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu
850                 855                 860
Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly
865                 870                 875                 880
Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile
885                 890                 895
Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr
900                 905                 910
Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn
915                 920                 925
Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala
930                 935                 940
Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn
945                 950                 955                 960
Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val
965                 970                 975
Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln
980                 985                 990
Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val
995                 1000                1005
Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu
1010                1015                1020
Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val
1025                1030                1035                1040
Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ser Ala
1045                1050                1055
Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ala Gln Glu
1060                1065                1070
Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Asp Gly Lys Ala His
1075                1080                1085
Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn Gly Thr His Trp Phe Val
1090                1095                1100
Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr
1105                1110                1115                1120
Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr
1125                1130                1135
Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu
1140                1145                1150
Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp
1155                1160                1165
Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp
1170                1175                1180
Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu
1185                1190                1195                1200
Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile
1205                1210                1215
Trp Leu Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile
1220                1225                1230
Met Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys
1235                1240                1245
Ser Cys Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro Val
1250                1255                1260
Leu Lys Gly Val Lys Leu His Tyr Thr
1265                1270
<210> 2
<211> 1255
<212> PRT
<213> SARS-CoV-2
<400> 2
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe
20                  25                  30
Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu
35                  40                  45
His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp
50                  55                  60
Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp
65                  70                  75                  80
Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu
85                  90                  95
Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser
100                 105                 110
Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile
115                 120                 125
Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr
130                 135                 140
Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr
145                 150                 155                 160
Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu
165                 170                 175
Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe
180                 185                 190
Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr
195                 200                 205
Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu
210                 215                 220
Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr
225                 230                 235                 240
Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser
245                 250                 255
Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro
260                 265                 270
Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala
275                 280                 285
Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys
290                 295                 300
Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val
305                 310                 315                 320
Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys
325                 330                 335
Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala
340                 345                 350
Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu
355                 360                 365
Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro
370                 375                 380
Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe
385                 390                 395                 400
Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly
405                 410                 415
Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys
420                 425                 430
Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn
435                 440                 445
Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe
450                 455                 460
Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys
465                 470                 475                 480
Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly
485                 490                 495
Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val
500                 505                 510
Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys
515                 520                 525
Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn
530                 535                 540
Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu
545                 550                 555                 560
Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val
565                 570                 575
Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe
580                 585                 590
Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val
595                 600                 605
Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile
610                 615                 620
His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser
625                 630                 635                 640
Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val
645                 650                 655
Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala
660                 665                 670
Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala
675                 680                 685
Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser
690                 695                 700
Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile
705                 710                 715                 720
Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val
725                 730                 735
Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu
740                 745                 750
Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr
755                 760                 765
Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln
770                 775                 780
Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe
785                 790                 795                 800
Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser
805                 810                 815
Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly
820                 825                 830
Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp
835                 840                 845
Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu
850                 855                 860
Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly
865                 870                 875                 880
Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile
885                 890                 895
Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr
900                 905                 910
Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn
915                 920                 925
Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala
930                 935                 940
Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn
945                 950                 955                 960
Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val
965                 970                 975
Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln
980                 985                 990
Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val
995                 1000                1005
Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu
1010                1015                1020
Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val
1025                1030                1035                1040
Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ser Ala
1045                1050                1055
Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ala Gln Glu
1060                1065                1070
Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Asp Gly Lys Ala His
1075                1080                1085
Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn Gly Thr His Trp Phe Val
1090                1095                1100
Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr
1105                1110                1115                1120
Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr
1125                1130                1135
Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu
1140                1145                1150
Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp
1155                1160                1165
Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp
1170                1175                1180
Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu
1185                1190                1195                1200
Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile
1205                1210                1215
Trp Leu Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile
1220                1225                1230
Met Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys
1235                1240                1245
Ser Cys Gly Ser Cys Cys Lys
1250                1255
<210> 3
<211> 1445
<212> PRT
<213> SARS-CoV-2
<400> 3
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe
20                  25                  30
Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu
35                  40                  45
His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp
50                  55                  60
Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp
65                  70                  75                  80
Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu
85                  90                  95
Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser
100                 105                 110
Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile
115                 120                 125
Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr
130                 135                 140
Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr
145                 150                 155                 160
Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu
165                 170                 175
Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe
180                 185                 190
Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr
195                 200                 205
Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu
210                 215                 220
Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr
225                 230                 235                 240
Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser
245                 250                 255
Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro
260                 265                 270
Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala
275                 280                 285
Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys
290                 295                 300
Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val
305                 310                 315                 320
Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys
325                 330                 335
Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala
340                 345                 350
Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu
355                 360                 365
Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro
370                 375                 380
Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe
385                 390                 395                 400
Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly
405                 410                 415
Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys
420                 425                 430
Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn
435                 440                 445
Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe
450                 455                 460
Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys
465                 470                 475                 480
Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly
485                 490                 495
Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val
500                 505                 510
Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys
515                 520                 525
Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn
530                 535                 540
Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu
545                 550                 555                 560
Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val
565                 570                 575
Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe
580                 585                 590
Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val
595                 600                 605
Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile
610                 615                 620
His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser
625                 630                 635                 640
Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val
645                 650                 655
Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala
660                 665                 670
Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala
675                 680                 685
Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser
690                 695                 700
Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile
705                 710                 715                 720
Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val
725                 730                 735
Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu
740                 745                 750
Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr
755                 760                 765
Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln
770                 775                 780
Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe
785                 790                 795                 800
Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser
805                 810                 815
Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly
820                 825                 830
Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp
835                 840                 845
Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu
850                 855                 860
Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly
865                 870                 875                 880
Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile
885                 890                 895
Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr
900                 905                 910
Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn
915                 920                 925
Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala
930                 935                 940
Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn
945                 950                 955                 960
Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val
965                 970                 975
Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln
980                 985                 990
Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val
995                 1000                1005
Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu
1010                1015                1020
Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val
1025                1030                1035                1040
Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ser Ala
1045                1050                1055
Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ala Gln Glu
1060                1065                1070
Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Asp Gly Lys Ala His
1075                1080                1085
Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn Gly Thr His Trp Phe Val
1090                1095                1100
Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr
1105                1110                1115                1120
Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr
1125                1130                1135
Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu
1140                1145                1150
Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp
1155                1160                1165
Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp
1170                1175                1180
Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu
1185                1190                1195                1200
Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Thr Met Val
1205                1210                1215
Arg Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
1220                1225                1230
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
1235                1240                1245
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
1250                1255                1260
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
1265                1270                1275                1280
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
1285                1290                1295
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
1300                1305                1310
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
1315                1320                1325
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
1330                1335                1340
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
1345                1350                1355                1360
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
1365                1370                1375
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
1380                1385                1390
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
1395                1400                1405
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
1410                1415                1420
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
1425                1430                1435                1440
Leu Ser Pro Gly Lys
1445
<210> 4
<211> 236
<212> PRT
<213> SARS-CoV-2
<400> 4
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Arg Val Gln
1               5                   10                  15
Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro
20                  25                  30
Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp
35                  40                  45
Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr
50                  55                  60
Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr
65                  70                  75                  80
Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val
85                  90                  95
Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys
100                 105                 110
Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val
115                 120                 125
Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr
130                 135                 140
Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu
145                 150                 155                 160
Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn
165                 170                 175
Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe
180                 185                 190
Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu
195                 200                 205
Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys
210                 215                 220
Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe
225                 230                 235
<210> 5
<211> 291
<212> PRT
<213> SARS-CoV-2
<400> 5
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Arg Val Gln
1               5                   10                  15
Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro
20                  25                  30
Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp
35                  40                  45
Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr
50                  55                  60
Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr
65                  70                  75                  80
Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val
85                  90                  95
Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys
100                 105                 110
Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val
115                 120                 125
Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr
130                 135                 140
Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu
145                 150                 155                 160
Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn
165                 170                 175
Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe
180                 185                 190
Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu
195                 200                 205
Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys
210                 215                 220
Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Lys Leu Ser Ser
225                 230                 235                 240
Trp Lys Ser Ser Ile Ala Ser Phe Phe Phe Ile Ile Gly Leu Ile Ile
245                 250                 255
Gly Leu Phe Leu Val Leu Arg Val Gly Ile His Leu Cys Ile Lys Leu
260                 265                 270
Lys His Thr Lys Lys Arg Gln Ile Tyr Thr Asp Ile Glu Met Asn Arg
275                 280                 285
Leu Gly Lys
290
<210> 6
<211> 468
<212> PRT
<213> SARS-CoV-2
<400> 6
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Arg Val Gln
1               5                   10                  15
Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro
20                  25                  30
Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp
35                  40                  45
Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr
50                  55                  60
Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr
65                  70                  75                  80
Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val
85                  90                  95
Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys
100                 105                 110
Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val
115                 120                 125
Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr
130                 135                 140
Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu
145                 150                 155                 160
Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn
165                 170                 175
Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe
180                 185                 190
Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu
195                 200                 205
Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys
210                 215                 220
Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Thr Met Val Arg
225                 230                 235                 240
Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
245                 250                 255
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
260                 265                 270
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
275                 280                 285
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
290                 295                 300
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
305                 310                 315                 320
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
325                 330                 335
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
340                 345                 350
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
355                 360                 365
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
370                 375                 380
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
385                 390                 395                 400
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
405                 410                 415
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
420                 425                 430
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
435                 440                 445
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
450                 455                 460
Ser Pro Gly Lys
465
<---