ШТАММ БАКТЕРИЙ SERRATIA MARCESCENS M-10 - ПРОДУЦЕНТ ВНЕКЛЕТОЧНОЙ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОЙ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ, ОБЛАДАЮЩЕЙ ВЫРАЖЕННЫМ ПРОТИВОВИРУСНЫМ ДЕЙСТВИЕМ
STRAIN OF BACTERIA SERRATIA MARCESCENS M-10 IS PRODUCER OF EXTRACELLULAR NON-SPECIFIC ENDONUCLEASE WITH MARKED ANTIVIRAL ACTION

Изобретение относится к области биотехнологии и касается штамма Serratia marcescens М-10, являющегося продуцентом невнеклеточной неспецифической эндонуклеазы. Фермент эндонуклеаза бактериальная может быть использован как основное действующее вещество препаратов для лечения и профилактики вирусных инфекционных заболеваний животных, в частности телят и птицы, и насекомых (пчелы).
Цель изобретения - увеличение содержания эндонуклеазы (ед. акт.) в 1 мл культуральной среды. Увеличение эндонуклеазной активности достигается получением штамма Serratia marcescens М-10 из музейного штамма Serratia marcescens (Bacterium prodiglosum) В-10 M-2 (ВКПМ В-1992) под действием нитрозометилмочевины с последующим отбором наиболее высокоактивных вариантов.
Известен штамм Serratia marcescens (Bacterium prodiglosum) B-10 M-2 (ВКПМ B-1992), синтезирующий неспецифическую энлонуклеазу в количестве до 15000 ед. фермента на 1 мл культуральной жидкости при выращивании на пептонной среде (МПБ или среда Лурия). Штамм получен из штамма Bacterium prodiglosum В-10 М-1 под действием мутагена - нитрозометилмочевины (Институт цитологии и генетики СО АН СССР, авторы - З.И. Панфилова, Р.И. Салганик; SU 928794 А1).
Недостатком данного штамма является низкая активность (15000 ед. акт.) и соответственно выход фермента эндонуклеазы бактериальной. В настоящее время бактериальная эндонуклеаза применяется в основном для лечения вирусных заболеваний пчел. Неспецифическая бактериальная эндонуклеаза может быть также использована для лечения вирусных инфекционных заболеваний птиц и молодняка крупного рогатого скота.
Увеличение эндонуклеазной активности достигается получением штамма Serratia marcescens М-10 из музейного штамма Serratia marcescens (Bacterium prodiglosum) В-10 M-2 (ВКПМ В-1992) под действием нитрозометилмочевины. Для этого штамм Serratia marcescens В-10 М-2 выращивали на среде L (Лурия) следующего состава, г:
дрожжевой экстракт - 5,0;
пептон - 15,0;
NaCl - 5,0;
вода дистиллированная - до 1 л.
Культуру выращивали в течение 18 часов при 30°С до оптической плотности 0,7. Оптическую плотность измеряли на фотоэлектроколориметре ФЭК-М (светофильтр №3). Затем культуру охлаждали в течение 1 ч до 15°С, клетки отделяли центрифугированием в течение 20 мин, скорость вращения ротора 5000 об/мин. В клеточную массу добавляли свежей среды L (0,5 л) и 0,2% нитрозометилмочевины, инкубировали при встряхивании на качалке в течение 15 мин при 30°С. Суспензию, обработанную мутагеном, высевали на индикаторную среду и инкубировали в течение 24 ч при 30°С. Индикаторная среда имела следующий состав, г:
рибонуклеиновая кислота (РНК) - 0,6;
толуидиновый голубой - 0,1;
агар питательный - 38;
вода дистиллированная до - 1 л.
Краситель толуидиновый голубой окрашивал среду в голубой цвет. После инкубирования культуры в результате гидролиза РНК при выделении эндонуклеазы вокруг колоний появлялись ореолы розового цвета. Диаметр ореолов служил качественным показателем ферментной активности. Отбирали клоны, у которых проявились ореолы наибольших размеров по сравнению исходным штаммом, диаметр не менее 18-20 мм.
В результате отбора был отобран штамм-мутант Serratia marcescens М-10, характеризующийся следующими морфологическими и культуральными признаками.
Морфологические признаки. Клетки - подвижные, прямые, палочковидные, размером 0,5-0,8 × 1,0-3,0 мкм, грамотрицательные.
Культуральные признаки. При посеве на мясо-пептонном агаре (МПА) через 48 ч роста при 30°С культура образует округлые, гладкие, выпуклые колонии светло-коричневого цвета, диаметром 1,5-1,7 мм. Оптимальный режим роста: pH 6,5-7,5; температура 28-30°С.
Физиолого-биохимические свойства. Штамм является ауксотрофом. Из глюкозы, сахарозы, мальтозы и маннита образует кислоту. На лактозе кислоту не образует. Крахмал гидролизирует слабо, клетчатку не разлагает. Молоко свертывает, желатин разжижает. Нитраты восстанавливает до нитритов.
При выращивании на мясо-пептонном бульоне (МПБ) штамм Serratia marcescens М-10 к 24 ч роста образует 25000-30000 ед. фермента на 1 мл культуральной жидкости, тогда как штамм Serratia marcescens (Bacterium prodiglosum) В-10 M-2 к 24 ч роста образует 15000 ед. фермента.
9
7
Пример. Штамм Serratia marcescens М-10 и штамм Serratia marcescens В-10 М-2 выращивали на МПА в течение 24 ч. Затем отбирали типичные колонии, суспендировали клетки в среде L до плотности 1×10 кл/мл и инокулировали в количестве 1×10 кл/мл в 250 мл среды L. Инкубирование проводили при 30°С в колбах Эрленмейера объемом 750 мл со встряхиванием на лабораторном шейкере Stuart SSL1, скорость 180 об/мин. Через каждые 2 часа из культуральной среды отбирали пробы по 5 мл для качественного и количественного определения эндонуклеазной активности.
3
Качественная оценка эндонуклеазной активности проводилась на индикаторной среде с красителем толуидиновый голубой. Количественное определение внеклеточной эндонуклеазы проводилось по появлению кислородорастворимого осадка под действием культуральной жидкости на РНК, с последующей адсорбцией при 260 нм. Измерение проводили на спектрофотометре СФ-16 (кювета L=1 дм).
Данные по количеству и времени накопления внеклеточной эндонуклеазы штаммами Serratia marcescens М-10 и Serratia marcescens В-10 М-2 приведены в таблице.