СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТАУРИНА И АЛЛАНТОИНА ПРИ СОВМЕСТНОМ ПРИСУТСТВИИ В ЛЕКАРСТВЕННОЙ ФОРМЕ ГЕЛЬ
METHOD OF QUANTITATIVE SPECTROPHOTOMETRIC DETERMINATION OF TAURINE AND ALLANTOIN IN THE JOINT PRESENCE IN THE GEL DRUG FORM

Изобретение относится к области медицины и фармации, а именно к количественному определению таурина и аллантоина при совместном присутствии в лекарственных формах и смесях методом спектрофотомерии.
Таурин (2-аминоэтансульфоновая кислота) - условно незаменимая аминокислота, проявляющая антиоксидантное, мембраностабилизирующее действие, уменьшающая перекисное окисление липидов, стимулирующая репаративные процессы (Effect of taurine on wound healing / S. Dinger [et al.] // AminoAcids. - 1996. - Vol. 10. - P. 59-71).
Известен способ количественного определения таурина методом ВЭЖХ с предколоночной дериватизацией 2,4-динитрохлорбензолом (Determination of free amino acids and taurine in Sinonova culaconstricta with 2, 4-dinitrochlorobenzene precolumn derivatization, Wang Yue Hong, International Conferenceon New Technology of Agricultural Engineering - ICAE, 2011).
Недостатком известного способа является длительность пробоподготовки и количество реактивов, одним из которых является ацетонитрил (класс опасности - 3).
Известен способ количественного определения алифатических аминокислот (RU 2167410, G01N 21/78, 20.05.2001), где определение проводят путем обработки исследуемого образца 1% спиртовым раствором нингидрина в среде фосфатного буферного раствора с рН от 6,4 до 7,6 в присутствии 1 мг аскорбиновой кислоты. Полученный окрашенный раствор разбавляют водой и измеряют оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 568 нм в кювете с толщиной слоя 1 см.
Недостатком указанного способа является неселективность методики вследствие того, что аминогруппы находятся как в молекуле аллантоина, так и в молекулах хитозана и таурина, что затрудняет количественное определение действующих веществ в разработанном композитном составе.
Известен способ количественного определения таурина с помощью формольного титрования (ФС.2.1.0039.15 Государственная Фармакопея XIII), где 0,15 г субстанции растворяют в 30 мл воды, прибавляют 5 мл формалина и титруют 0,1 М раствором натрия гидроксида до появления слабо-розового окрашивания (индикатор фенолфталеин) или определяют точку эквивалентности потенциометрически. Параллельно проводят контрольный опыт.
Недостатком указанного способа является неселективность метода при совместном присутствии таурина, хитозана и аллантоина.
Аллантоин - производное аминокислоты аланин. Образуется при окислении мочевой кислоты. Обладает антиоксидантными, антимутагенными свойствами (П.А. Федосов и др. Обоснование выбора компонентов и их совместимости для разработки ранозаживляющего геля на основе хитозана. Международный научно-исследовательский журнал. Екатеринбург. - 2015. - №9 (40). Часть 4. - С. 83-85).
Известен способ количественного определения аллантоина с фенилгидразином (Chen, Х.В. and M.J. Gomes, 1992. Estimation of microbial protein supply to sheep and cattle based on urinary excretion of purine derivatives An overview of the technical details, International Feed Resources Unit, Rowett Research Institute, Bucksburn Aberdeen AB2 9SB, UK Occasional Publication). Недостатком указанного способа является принадлежность фенилгидразина к 3 классу опасности.
Известен способ количественного определения аллантоина с использованием метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (Final report of the safety assessment of allantoin and its related complexes. Int J Toxicol. 2010 May; 29 (3 Suppl): 84S-97S. doi: 10.1177/1091581810362805).
Недостатком указанного способа является длительность пробоподготовки и большое количество реактивов.
Авторами настоящего изобретения была подана заявка РФ №2015115143, в которой приведен состав ранозаживляющего геля ХТА для наружного применения, включающий таурин, хитозан, аллантоин, уксусную кислоту, воду очищенную, разработанный гель обладает ранозаживляющим действием.
Задачей настоящего изобретения является разработка способа проверки подлинности геля ХТА, а также определения количественного содержания таурина и аллантоина при совместном присутствии в лекарственных формах и смесях.
Техническим результатом изобретения является разработка экспрессного, точного, экономически целесообразного спектрофотометрического способа, позволяющего производить количественную оценку содержания таурина и аллантоина в лекарственной форме гель при совместном присутствии. Для выполнения анализа необходим распространенный спектрофотометр, время проведения анализа менее 1 часа вместе с пробоподготовкой, все используемые реактивы легко доступны.
Технический результат достигается осуществлением двух различных пробоподготовок с гелем, измерением оптической плотности полученных растворов и определением концентрации исследуемых веществ по калибровочным графикам, причем для количественного определения таурина к водному раствору геля, полученному из расчета на 100 мл 1,875 г геля и доведение объема водой, добавляют 0,1% спиртовой раствор 2,4-динитрохлорбензола и фосфатный буферный раствор с рН=9,18 в объемном соотношении 1:1:1, полученную смесь нагревают, разбавляют в соотношении смесь: вода 3:7, а оптическую плотность измеряют при длине волны 359±2 нм; а для количественного определения аллантоина раствор геля в 0,5 М гидроксида натрия, полученный из расчета на 100 мл 0.2 г геля и доведение объема гидроксидом натрия, разбавляли 1:9 0,5 М раствором гидроксида натрия, а оптическую плотность измеряют при длине волны 218±2 нм.
На фиг. 1 представлена метрологическая оценка результатов количественного определения таурина и аллантоина при совместном присутствии в геле на основе хитозана с таурином и аллантоином. На фиг. 2(а) и (b) представлены спектры поглощения таурина и аллантоина соответственно. На фиг. 3(а) и (b) приведены калибровочные графики таурина и аллантоина соответственно.
Пример
Проводили исследования геля ХТА на основе хитозана, таурина и аллантоина, описанного авторами в заявке РФ №2015115143.
Пробоподготовка №1 для количественного определения таурина: помещали 1,875 г геля ХТА в колбу на 100 мл и доводили водой очищенной до метки, осуществляли забор 1 мл получившегося раствора с добавлением 1,0 мл 0,1%-ного спиртового раствора (используя 95% этиловый спирт) 2,4-динитрохлорбензола и 1,0 мл фосфатного буферного раствора с рН=9,18. Нагревали полученную смесь на кипящей водяной бане с температурой 90°С в течение 30 мин, затем добавляли 7,0 мл воды очищенной, измеряли оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 359±2 нм. Оптическая плотность составляла 0,53±0,01, что соответствует концентрации таурина 73,52±0,85 мкг/мл. Статистическая обработка данных показала, что средняя ошибка определения количественного содержания таурина заявленным методом не превышала 1,19%.
Пробоподготовка №2 для количественного определения аллантоина: 0,2 г геля ХТА помещали в колбу на 100 мл и доводили до метки 0,5 М раствором гидроксида натрия, далее отбирали 10 мл полученного раствора в колбу на 100 мл и доводили 0,5 М раствором гидроксида натрия до метки, измеряли оптическую плотность конечного раствора при длине волны 218±2 нм. Оптическая плотность составляла 0,59±0,01, что соответствует концентрации аллантоина 10,05±0,05 мкг/мл. Статистическая обработка данных показала, что средняя ошибка определения количественного содержания аллантоина заявленным методом не превышала 0,72%.