СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОМБИНИРОВАННОЙ БИВАЛЕНТНОЙ, КУЛЬТУРАЛЬНОЙ, ИНАКТИВИРОВАННОЙ, КОНЦЕНТРИРОВАННОЙ, ОЧИЩЕННОЙ ВАКЦИНЫ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ ЛИХОРАДКИ С ПОЧЕЧНЫМ СИНДРОМОМ
METHOD FOR PREPARING COMBINED BIVALENT, TISSUE-CULTURE, INACTIVATED, CONCENTRATED, PURIFIED VACCINE FOR PREVENTING HEMORRHAGIC FEVER AND RENAL SYNDROME

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к получению вакцины для профилактики вирусных инфекций, а именно инфекции геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС).
Возбудителями ГЛПС являются 4 вируса, из которых 2 вируса "ПУУМАЛА" и "ДОБРАВА" вызывают тяжелое заболевание только на территории европейской части России и других европейских стран, в то время как два других вируса "ХАНТААН" и "СЕУЛ" существуют и заражают человека, как правило, только в азиатских странах, главным образом в Китае. В настоящее время коммерческие вакцины против ГЛПС производятся только в Китае, однако ни одна из этих вакцин не может применяться в европейских регионах России и других странах Европы, поскольку они производятся на основе вирусов "ХАНТААН" и "СЕУЛ", которые не обладают защитным действием против вирусов "ПУУМАЛА" и "ДОБРАВА" [Yong-K. Chu, et. al., A vaccinia virus-vectored Hantaan virus vaccine protects hamsters from challenge with Hantaan and Seoul viruses but not Puumala virus, Journal of virology, Oct. 1995, p.6417-6423; Е.А.Ткаченко и С.Г.Дроздов. Хантавирусы и хантавирусные лихорадки. Эпидемиология и вакцинопрофилактика 2002, 6, с.14-18].
Известно, что трудности, связанные с разработкой вакцинных препаратов против вирусов "ПУУМАЛА" и "ДОБРАВА", обусловлены особенностями репродукции штаммов этих вирусов в чувствительных клеточных системах. Для них характерен довольно длительный цикл размножения, низкий уровень продукции и отсутствие цитопатогенного действия.
Целью предлагаемого изобретения является получение впервые в мире бивалентной, культуральной, инактивированной, концентрированной, очищенной вакцины против вирусов "ПУУМАЛА" и "ДОБРАВА".
Процесс получения вакцины включает репродуцирование вируса в культуре клеток, сбор вируссодержащего субстрата, инактивирование вируса, концентрирование и очистка инактивированного вируса, сорбция очищенного вируса на гидроокиси алюминия.
Для получения вируссодержащего субстрата используют линию перевиваемых клеток почек зеленой мартышки VERO, аттестованную и рекомендованную ВОЗ и ГИСК им. Л.А.Тарасевича в качестве возможного субстрата для производства инактивированных вакцин. Накопление культуры-продуцента достигают путем серийных пассажей культуры клеток, восстановленной из "банка" посевных клеток. Культуру клеток для заражения вирусами выращивают в роллерных бутылях объемом 1 л в среде Игла MEM с двойным набором витаминов и аминокислот и 5% сыворотки крови плодов коров. Для заражения клеток используют штаммы ПУУ-ТКД/VERO и ДОБ-EAT/VERO вирусов "ПУУМАЛА" и "ДОБРАВА", депонированные в Государственной коллекции вирусов (НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН) от 24 ноября 2009 г. под №1026 и №1027 соответственно. Заражение проводят на 3-4 сутки после рассева клеток, сформировавших плотный монослой, без признаков дегенерации и контаминации посторонней микрофлорой. Перед заражением клетки дважды отмывают рабочим раствором Хенкса, после чего в бутыли вносят пул вируса, предварительно разведенного средой Игла 2МЕМ до концентрации, обеспечивающей множественность заражения 0,1-0,5 ФОЕ/кл при объеме инокулята 15 мл на 1 литровую роллерную бутыль. Для адсорбции вируса на клетки зараженные бутыли помещают в роллерную установку и инкубируют 1 час при температуре (37±I)°С. По истечении указанного времени в каждую бутыль вносят 100 мл поддерживающей рост клеток среды Игла MEM с двойным содержанием аминокислот и витаминов (без добавления сыворотки крови плодов коров) и снова помещают в роллерную установку в термостатную комнату с температурой (37±I)°С. Сбор вируссодержащего материала проводят на 6, 7, 8, 9, 10 сутки после заражения и с одного монослоя клеток получают до 5 сборов вируссодержащей жидкости. Сведению подлежат сборы только вируссодержащих культуральных жидкостей, в которых инфекционный титр вируса составляет не менее 5,5 lg ФОЕ/мл. Вирус, содержащийся в объединенной культуральной жидкости, подвергают инактивации формалином. Оптимальный режим инактивирования инфекционной активности вирусов включает экспозицию вируссодержащего субстрата при температуре 6±2°С в присутствии 0,025% раствора формалина в течение 30 суток.
2
Инактивированный объединенный сбор (антигенсодержащая культуральная жидкость) подвергают концентрированию путем ультрафильтрации в тангенциальном потоке, используя систему концентрирования с пределом отсечения 100 кДа и площадью фильтрации от 0,1 до 0,5 м. Процесс ультрафильтрации ведут до уменьшения первоначального объема антигенсодержащей культуральной жидкости в 70-100 раз.
2
На первом этапе очистки концентрата инактивированного вируса балластные компоненты удаляют с помощью осветляющей фильтрации, используя фильтр Poly Pro XL (CUNO) с размерами пор и площади поверхности 0.6 мкм и 0,14 м соответственно. Второй этап - гель-фильтрация с использованием Sepharose 6 FF и хроматографа АКТА purifier (GE Healthcare). Для оптимизации процессов, осуществляемых на каждом из этих этапов, предварительно определяют параметры взаимодействия вируса с разными пористыми сорбентами. Выбирают гельфильтрационную схему очистки вируса, приводящую к получению высокоактивных препаратов, удовлетворяющих требованиям к чистоте конечного продукта.
После стерилизующей фильтрации через фильтр Миллипор с размером пор 0,22 мкм хроматографически очищенную фракцию разводят буферным раствором в соответствии с его антигенной активностью и используют для получения моновалентных вакцин против вирусов "ПУУМАЛА" и "ДОБРАВА". Для приготовления бивалентной вакцины против этих вирусов определяют антигенную активность каждой вакцины и рассчитывают их рабочие дозы (РД). В соответствии с предварительно установленным соотношением зависимости между количеством содержащегося в вакцине специфического антигена и ее иммуногенной активностью минимальная иммунизирующая доза (МИД), то есть максимальное разведение исходного препарата, обеспечивающее продукцию вируснейтрализующих антител у 50% животных, соответствует 8 антигенным единицам (АЕ). Разведение исходного препарата, содержащего 4 МИД или 32 АЕ, принимают за 1 РД моновалентной вакцины. После сведения равных объемов моновалентных препаратов в разведениях, содержащих по 1 РД для каждой из моновакцин, и добавления адсорбента-гидроокиси алюминия (конечная концентрация 1,5±0,5 мг/мл) получают готовую комбинированную (бивалентную) вакцину против вирусов "ПУУМАЛА" и "ДОБРАВА".
Согласно требованиям ВОЗ в вакцинах, изготовленных на основе перевиваемых клеточных культур, жестко лимитируется содержание остаточной ДНК: оно не должно превышать 10 пг на 1 дозу вакцины для исключения потенциальной возможности ее онкогенного и трансформирующего действия. Существуют ограничения по содержанию в конечном продукте таких гетерологичных белков, как белки сыворотки крови крупного рогатого скота.
Соответствие национальным и международным требованиям к медицинским иммунобиологическим препаратам, вводимым людям, достигается тем, что заявленный способ предусматривает заражение вирусами-возбудителями ГЛПС культуры клеток с последующей репродукцией и выходом вируса в культуральную среду, его инактивированием, концентрированием, очисткой и сорбцией на адъюванте. На стадии репродукции вируса используется культуральная среда без добавления сыворотки крупного рогатого скота. Специфическая безопасность (отсутствие живого вируса), бактериологическая стерильность вакцины достигаются использованием жесткого режима инактивации вируса формалином и фильтрацией через пакет фильтров с конечным размером пор 0,22 мкм. Отсутствие туморогенности обеспечено за счет резкого снижения на стадии гельфильтрации содержания клеточной ДНК (менее чем 10 пг в одной вакцинной дозе). Практически на всех этапах изготовления вакцины, начиная от штаммов вируса и кончая готовой формой вакцины, предусмотрен ряд известных и новых физико-химических и молекулярно-биологических тестов, а также контролей на животных и в культуре клеток. Эта система надежно обеспечивает безопасность применения новой вакцины, высокий уровень и стабильность ее иммунологической активности.
Цель изобретения - создание технологии изготовления вакцинных препаратов, которые могут быть использованы для специфической профилактики ГЛПС. Известен аналог [Y.Choi et. al. Inactivated Hantaan virus vaccine derived from suspension culture of Vero cells. Vaccine 21 (2003) 1867-1873], где клетки VERO Е6 культивировали в спиннерных колбах на микроносителе Cytodex 3. После сбора вируссодержащей жидкости проводили центрифугирование для удаления клеточного детрита. Концентрирование проводили на ультрафильтрационных кассетах (Millipore) с молекулярным весом проходимых частиц 300000 Дальтон и последующим ультрацентрифугированием при 80000 g. Осадок ресуспендировали в трис-HCl буфере и проводили ультрацентрифугирование в градиенте сахарозы. Недостаток данного метода получения и очистки вирусного концентрата состоит в том, что дважды используется центрифугирование. Применение высокоскоростного центрифугирования нельзя считать технологичным в масштабах промышленного производства вакцинных препаратов, т.к. требует больших временных затрат и дополнительных условий, обеспечивающих безопасность работы персонала с особо опасными вирусами, к которым относятся возбудители ГЛПС. Другим аналогом данного изобретения можно считать патент [Huang Yongcheng et. al. Production of vaccine for epidemic hemorrhagic fever using prinmary kidney cills of golden hamster. CN 1109782], где субстратом для получения вируссодержащей культуральной жидкости служила первичная культура клеток почек золотистых хомячков. Собранную вируссодержащую жидкость фильтровали и инактивировали формальдегидом. Концентрирование вирусного антигена проводили при помощи ультрацентрифугирования в градиенте сахарозы с последующей гель-фильтрацией с целью удаления сахарозы. Очистку осуществляли при помощи ионообменной хроматографии на Cellufine Sulfate геле. Недостатками данного метода получения вирусного концентрата можно считать использование первичной культуры клеток почек золотистых хомячков. Применение первичных культур клеток связано с риском микробной и вирусной контаминации целевого продукта. Можно отметить, что использование первичной культуры клеток в производстве вирусных вакцин связано с использованием большого числа животных, а следовательно, с удорожанием технологического процесса. Применение перевиваемых культур клеток в качестве субстрата для репродуцирования вирусов позволяет уменьшить риск микробной и вирусной контаминации целевого продукта и существенно снизить себестоимость конечного продукта. Перевиваемые культуры клеток позволяют получать более стандартные результаты по репродуцированию вирусов по сравнению с первичными культурами клеток. Использование ультрацентрифугирования в градиенте сахарозы требует дополнительной стадии очистки от сахарозы. Ультрацентрифугирование в градиенте сахарозы концентратов вирусов позволяет эффективно разделять вирусные частицы от балластных белков, но требует большого числа единиц оборудования для работы в промышленных масштабах. В работе [Агафонов А.П. и др. Способ получения концентратов вирусов, вызывающих геморрагические лихорадки и обладающих иммуногенной и протективной активностью. RU 2029561] авторы культивируют вирус Марбург на культуре клеток фибробластов человека с добавлением человеческого сывороточного альбумина. Полученную вируссодержащую жидкость фильтруют на фильтрах МФА-С-0,6-1,5. После фильтрации ее концентрируют на ультрафильтрационной системе в 20 раз. Очистку проводят при помощи диафильтрации с десятикратным объемом раствора Хэнкса. Существенным отличием данного примера получения вирусных концентратов и заявленного изобретения является тот факт, что в процессе репродуцирования вирусов-возбудителей ГЛПС в клетках VERO не используется сыворотка плода крупного рогатого скота. После проведения диафильтрации вирусного концентрата авторы определяют, что концентрация общего белка в препарате составляет 2,5±0,5 мг/мл, тогда как в заявленном способе после хроматографической очистки вируссодержащего материала содержание общего белка в нем составляет 0,2-0,3 мкг/мл. Использование хроматографической очистки в предложенном способе позволяет снизить концентрацию общего белка примерно в десять раз. Аналогом представленного изобретения можно считать статью [Immunization effect of purified bivalent vaccine to haemorrhagic fever with renal syndrome manufactured from primarycultured hamster kidney cells. Chin Med J. 2005 118 (9), 766-768], где вирусные штаммы, выделенные на территории Китая, культивируют на первичной культуре клеток почек хомячков. Полученную вируссодержащую жидкость инактивируют формальдегидом и проводят очистку на колонке с Сефарозой 4 ФФ. Существенным отличием описанного выше способа от заявленного способа являются: применение в качестве субстрата для репродуцирования вирусов первичной культуры клеток, а также отсутствие стадии концентрирования вируссодержащей жидкости. В заявленном способе используется перевиваемая культура клеток, что позволяет снизить риск микробной и вирусной контаминации вируссодержащей жидкости. Кроме того, применение предварительной стадии концентрирования вируссодержащей жидкости позволяет использовать вируссодержащую жидкость со средними и низкими значениями титра вируса, что в условиях промышленного производства позволяет увеличить эффективность технологического процесса. Хранение концентратов вирусов требует меньших площадей холодильных и морозильных камер, что является еще одной положительной стороной применения стадии концентрирования вируссодержащей жидкости. Необходимо отметить, что хроматографическая очистка вирусных концентратов, индекс концентрирования которых может составлять 100-200 раз, требует соответственно меньших временных затрат по сравнению с хроматографической очисткой исходного объема вируссодержащей жидкости.
Сравнение заявленного способа с известными аналогами показывает, что отличительные от прототипов признаки позволяют достичь поставленной цели. Отличительными признаками являются: репродуцирование хантавирусов на перевиваемой культуре клеток VERO без добавления сыворотки плода крупного рогатого скота, пятикратный сбор вируссодержащей жидкости с одного монослоя клеток, осветление вируссодержащей жидкости от клеточного детрита на фильтрах с порами от 0,6 мкм до 0,22 мкм, концентрирование на ультрафильтрационных кассетах в 100-200 раз, хроматографическая очистка на колонках с Сефарозой 4 ФФ или с Сефарозой 6 ФФ.
Таким образом, сущность изобретения заключается в способе получения инактивированных очищенных вирусных концентратов для приготовления вакцинных препаратов в промышленных масштабах.
Пример 1
2
Вируссодержащую культуральную жидкость получают путем репродуцирования штамма ПУУ-ТКД/VERO вируса "ПУУМАЛА" в монослойной перевиваемой культуре клеток почек зеленой мартышки (VERO). Монослой клеток получают в роллерных бутылях объемом 1 л в среде Игла MEM с двойным набором витаминов и аминокислот и 5% сыворотки крови плодов коров. После заражения монослойных культур для поддержки вирусного размножения используется среда, не содержащая компонентов сыворотки крови. Сбор вируссодержащей жидкости начинают на 6 день. С одного монослоя клеток получают от 3 до 5 сборов вируссодержащей жидкости. Полученную вируссодержащую жидкость со средним титром 5,5 lg ФОЕ/мл осветляют с помощью ультрафильтрационных кассет (Millipore) с молекулярным весом проходимых частиц 100000 Дальтон и площадью 0,2 м, инактивируют формалином в концентрации 1:4000 при 6°С в течение 30 суток и концентрируют в 70-200 раз. Инактивированный концентрат очищают на колонке 2,6/70 с Сефарозой 6 Фаст Флоу со скоростью 7 мл/мин. Концентрация общего белка в очищенном концентрате составляет 200±50 мкг/мл. Очищенный инактивированный концентрат фильтруют через фильтр 0,22 мкм и используют для приготовления сорбированной на гидроокись алюминия моновалентной вакцины.
Пример 2
2
Вируссодержащую культуральную жидкость получают путем репродуцирования штамма ДОБ-EAT/VERO вируса "ДОБРАВА" в монослойной перевиваемой культуре клеток почек зеленой мартышки (VERO). Монослой клеток получают в роллерных бутылях объемом 1 л в среде Игла MEM с двойным набором витаминов и аминокислот и 5% сыворотки крови плодов коров. После заражения монослойных культур для поддержки вирусного размножения используется среда, не содержащая компонентов сыворотки крови. Сбор вируссодержащей жидкости начинают на 6 день. С одного монослоя клеток получают от 3 до 5 сборов вируссодержащей жидкости. Полученную вируссодержащую жидкость со средним титром 5,5 lg ФОЕ/мл осветляют с помощью ультрафильтрационных кассет (Millipore) с молекулярным весом проходимых частиц 100000 Дальтон и площадью 0,2 м, инактивируют формалином в концентрации 1:4000 при 6°С в течение 30 суток и концентрируют в 70-200 раз. Инактивированный концентрат очищают на колонке 2,6/70 с Сефарозой 6 Фаст Флоу со скоростью 7 мл/мин. Концентрация общего белка в очищенном концентрате составляет 200±50 мкг/мл. Очищенный инактивированный концентрат фильтруют через фильтр 0,22 мкм и используют для приготовления сорбированной на гидроокись алюминия моновалентной вакцины.
Пример 3
После сведения (до адсорбции на гидроокиси алюминия) равных объемов моновалентных препаратов в разведениях, содержащих по 1 РД для каждой из моновакцин, и добавления адсорбента-гидроокиси алюминия (конечная концентрация 1,5±0,5 мг/мл) получают готовую комбинированную (бивалентную) вакцину против вирусов "ПУУМАЛА" и "ДОБРАВА". Специфическую активность (иммуногенность) бивалентной вакцины проверяют на мышах. Адсорбированный на поверхности геля гидроокиси алюминия концентрат вводят мышам линии Balb/c 10-12-недельного возраста, весом 18-20 г в объеме 0,5 мл подкожно трехкратно с 2-недельным интервалом. В качестве контроля используют мышей Balb/c, которым в те же сроки вводят гидроокись алюминия без вирусного антигена. Через 2 недели после последней иммунизации у животных берут из орбитальной вены кровь и готовят из нее сыворотку. В полученных сыворотках крови определяют титры вирусспецифических антител. В результате исследования сывороток показано, что у мышей Balb/c на 28 день уже после первой иммунизации выявляются вируснейтрализующие антитела к вирусам "ПУУМАЛА" и "ДОБРАВА". Результаты, полученные в экспериментах по иммунизации мышей, дают возможность утверждать, что инактивированный и очищенный концентрат вирусов "ПУУМАЛА" и "ДОБРАВА" индуцирует у мышей выработку гуморального иммунитета, то есть обладает высокой иммуногенностью.