СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВИРУСНЫХ ВЕКТОРОВ (ВАРИАНТЫ)

1. Способ производства рекомбинантного лентивирусного вектора, включающий
a. культивирование клеток-продуцентов в культуральной среде в адгезионном режиме на матриксе, содержащем макроносители низкой плотности, в биореакторе для адгезионных культур, имеющем некоторую высоту слоя и объем биореатора, до достижения клетками-продуцентами заданной плотности;
b. трансфекцию клеток-продуцентов смесью реагентов для трансфекции, содержащей один или более полинуклеотидов ДНК, фосфат кальция (CaPho) при нейтральном pH и забуференный солевой раствор (необязательно, солевой раствор, забуференный HEPES),
c. сбор рекомбинантного лентивирусного вектора с получением собранного материала.
2. Способ по п. 1, в котором биореактор для адгезивных культур iCELLis имеет модульный неподвижный слой.
3. Способ по п. 1 или 2, в котором высота слоя макроносителей низкой плотности составляет 2, 4 или 10 см.
2
4. Способ по любому из пп. 1–3, в котором заданная плотность клеток, достигаемая до этапа трансфекции, составляет 150–300  × 106 клеток на см.
5. Способ по любому из пп. 1–4, в котором смесь реагентов для трансфекции содержит примерно 125 мМ CaPho и имеет рН примерно 7,2 при температуре 37°C.
6. Способ по любому из пп. 1–5, в котором смесь реагентов для трансфекции содержит примерно 20 мкг/мл одного или более полинуклеотидов ДНК.
7. Способ по любому из пп. 1–6, в котором этап трансфекции включает добавление в биореактор для адгезивных культур смеси реагентов для трансфекции в количестве примерно один объем на каждые три объема культуральной среды.
8. Способ по любому из пп. 1–7, включающий после этапа трансфекции рециркуляцию культуральной среды через матрикс в течение примерно 5–7 ч с поддержанием рН на уровне примерно 7,2.
9. Способ по любому из пп. 1–8, в котором этап сбора включает поддержание рН культуральной среды на уровне ниже примерно 7,0.
10. Способ по любому из пп. 1–9, в котором этап сбора включает перфузию матрикса по меньшей мере примерно 4 объемами реактора среды для сбора на протяжении примерно 24, 48, 60 или 72 ч.
11. Способ по любому из пп. 1–10, включающий обработку собранного материала проводят в полузакрытой или закрытой системе с получением очищенного материала.
12. Способ по п. 11, в котором этап обработки включает одну или более из ионообменной хроматографии и эксклюзионной хроматографии.
13. Способ по п. 11 или 12, в котором этап обработки включает концентрирование рекомбинантного лентивирусного вектора путем центрифугирования собранного материала в одной или более концентрирующих центрифугах.
14. Способ по п. 11 или 12, в котором этап обработки включает концентрирование рекомбинантного лентивирусного вектора путем тангенциальной поточной фильтрации.
15. Способ по любому из пп. 11–14, включающий анализ очищенного материала для определения инфекционного фильтра рекомбинантного лентивирусного вектора.
16. Способ по любому из пп. 1–15, в котором рекомбинантный лентивирусный вектор, произведенный указанным способом, демонстрирует эффективность вирусной трансдукции, которая по меньшей мере на 20% выше, чем у рекомбинантного лентивирусного вектора, произведенного без оптимизации параметров процесса.
17. Способ по любому из пп. 1–16, в котором полинуклеотид кодирует кассету экспрессии гена на основе лентивирусного вектора, содержащую ген, представляющий интерес, или кодирующую полипептид, представляющий интерес, необязательно выбранный из следующей группы: RPK, ITGB2, FANCA, FANCC, FANCG, TCIRG1, CLCN7, TNFSF11, PLEKHM1, TNFRSF11A и OSTM1.
18. Способ по любому из пп. 1–17, в котором произведенный указанным способом лентивирусный вектор способен обеспечивать более чем 10% приживление и репопуляцию генномодифицированных клеток при введении субъекту.
19. Способ по любому из пп. 1–18, в котором лентивирусный вектор представляет собой вектор на основе ВИЧ.
20. Способ по любому из пп. 1–19, в котором клетки-продуценты представляют собой клетки HEK293 или их производные, необязательно, клетки HEK293T или их производные.
21. Рекомбинантный лентивирусный вектор, произведенный способом по любому из пп. 1–20.
22. Фармацевтическая композиция, содержащая рекомбинантный лентивирусный вектор по п. 21 и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или вспомогательное вещество.
23. Фармацевтическая композиция, содержащая популяцию клеток, причем некоторое количество указанных клеток трансдуцировано рекомбинантным лентивирусным вектором.
24. Применение рекомбинантного лентивирусного вектора по п. 21 для введения в клетку полипептида, кодируемого полинуклеотидом.
25. Применение фармацевтической композиции по п. 22 для введения в клетку полипептида, кодируемого полинуклеотидом.
26. Применение рекомбинантного лентивирусного вектора по п. 21 для лечения заболевания или нарушения у субъекта-млекопитающего, нуждающегося в этом.
27. Применение фармацевтической композиции по п. 22 для лечения заболевания или нарушения у субъекта-млекопитающего, нуждающегося в этом.
28. Применение биореактора для адгезивных культур в способе по любому из пп. 1–20.