СТАБИЛЬНАЯ ВОДНАЯ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ИНГАЛЯЦИЙ, СОДЕРЖАЩАЯ ГЕКСАПЕПТИД
STABLE AQUEOUS PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR INHALATIONS CONTAINING A HEXAPEPTIDE

Область изобретения
Изобретение относится к стабильным водным фармацевтическим композициям для ингаляций, предназначенным для лечения болезней легких.
Сведения о предшествующем уровне техники
Гесксапептид с аминокислотной последовательностью H-Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Leu-Arg-OH (YdAGFLR) является сильным основанием, который в форме соли (диацетата) известен под названием даларгин. Даларгин применяется в составе инъекционных лекарственных средств лечения язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, панкреатита и панкреонекроза. Применение даларгина в составе лекарственных средств раскрыто в следующих патентах РФ (№№): 2032422, 2241488, 2198641, 2104717, 2270025, 2351334,  2343885, 2405534, 2363455, 2515550, 2180598, 2635083, 2436588, 2473325, 2144831, 2646569, 2200026, 2146530, 2155608, 2185176, 2139725, 2266130, 2326661, 2299742, 2218896, 2416398, 2318503, 2430753, 2299438, 2258529, 2099077, 2122415, 2261713, 2006039, 2366416, 2228762, 2185849, 2496493, 2366417, 2017488, 2167671, 2181564, 2284192, 2290203, 2286793, 2366432, 2299065, 2429002, 2196603, 2142814, 2285522, 2203693, 2230549, 2180591, 2142736, 2113856, 2217139, 2266752, 2261722,  2362580, 2223741, 222814869, 2217186, 2266130, 2326661, 2299742, 2218896, 2672888, 2416398, 2318503, 2430753, 2299438, 2258529, 2099077, 2122415, 2261713, 2006039, 2366416. Наиболее часто используемая лекарственная форма даларгина представляет собой твердый лиофилизат, который растворяют в изотоническом растворе хлорида натрия непосредственно перед внутримышечным или внутривенным введением пациенту, чтобы избежать проблем, связанных с возможной нестабильностью пептида в растворе при хранении. Известна стабильная жидкая лекарственная форма даларгина для инъекций, содержащая даларгин, натрия хлорид и воду для инъекций (патент РФ №2241488), в которой устойчивость (стабильность) даларгина при хранении обеспечивается введением натрия хлорида в состав раствора в качестве стабилизатора и консерванта. Нами неожиданно обнаружено, что стабильная водная лекарственная форма гексапептида может быть приготовлена без использования стабилизаторов и консервантов при использовании процедуры стерилизующей фильтрации, исключающей присутствие в растворе бактериальных пептидаз, ответственных за деградацию гекспептида в растворе.
Боровская и др. Бюллетень физиологии и патологии дыхания. 2004, 17:85-88
Каленикова ЕИ и др. Фармакокинетика даларгина. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии.1988, 34(1): 75-83
Известно, что при инъекционном введении даларгин может быть полезен в лечении легочных заболеваний, в частности, внутримышечное введение даларгина приводило к улучшению состояния слизистой оболочки долевого бронха у пациентов с внебольничной пневмонией. . Однако лечение легочных болезней с использованием инъекционных форм даларгина малоэффективно, так как при инъекционном введении, даларгин быстро выводится из организма с временем полувыведения несколько минут, причем абсорбция гексапептида даларгина тканями легких при внутривенном введении составляет 0,4% от общей дозы вводимого препарата. . Таким образом, существует необходимость в новых лекарственных средствах и формах указанного гексапептида, предназначенных для лечения заболеваний легких и обеспечивающих намного более высокую терапевтическую концентрацию активного вещества в легких, чем при инъекционном введении.
Описание изобретения
Настоящее изобретение относится к стабильной фармацевтической водной композиции для ингаляций, содержащей от 0,1 мг/мл до 100 мг/мл гексапептида формулы H-Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Leu-Arg-OH (I) или его фармацевтически приемлемой соли; где композиция имеет рН от 3,0 до 8,5.
Техническим результатом настоящего изобретения является то, что стабильная фармацевтическая водная композиция для ингаляций настоящего изобретения обеспечивает направленную доставку активного вещества в легкие и многократно повышает терапевтические уровни гексапептида (I) в легких по сравнению с теми, что достигаются при инъекционном введении гексапептида в той же дозе.
Еще одним техническим результатом настоящего изобретения является то, что повышение терапевтических концентраций гексапептида (I) в легких, достигаемое с использованием стабильной фармацевтической водной композиции для ингаляций настоящего изобретения, обеспечивает высокую терапевтическую эффективность композиций настоящего изобретения в лечении легочных заболеваний, в частности пневмонии, по сравнению с инъекционными лекарственными формами гексапептида.
Еще одним техническим результатом настоящего изобретения является то, что фармацевтическая водная композиция для ингаляций настоящего изобретения не содержит консервантов и стабилизаторов, но при этом имеет высокую стабильность, что достигается включением в процесс приготовления композиций настоящего изобретения стадии стерилизующей фильтрации, исключающей появление в растворе бактериальных пептидаз, ответственных за деградацию гекспептида (I) в растворе при хранении.
Еще одним техническим результатом настоящего изобретения является то, что высокая стабильность композиций настоящего изобретения позволяет использовать их в производстве лекарственных средств лечения легочных заболеваний, учитывая то, что требование стабильности при хранении является одним из нормативных требований к лекарственным средствам.
35
51
9
8
Гексапептид формулы (I), короткое название гексапептид (I), имеет брутто-формулу CHNO, молекулярную массу 725,84 дальтон и регистрационный номер CAS 81733-79-1 в качестве идентификатора. Химическое название гексапептида (I) - тирозил-D-аланил-глицил-фенилаланил-лейцил-аргинин.
35
51
9
8
2
4
2
Настоящее изобретение относится к гексапептиду формулы (I) и всем его фармацевтически приемлемым солям, а также сольватам. Неэксклюзивные примеры фармацевтически приемлемых солей гексапептида формулы (I) включают хлорид, бромид, сульфат, ацетат, пируват, малат, фумарат, цитрат. Предпочтительной фармацевтически приемлемой солью гексапептида формулы (I) является диацетат гексапептида (I), имеющий формулу CHNOx 2CHO. Химическое название диацетата гексапептида (I) - тирозил-D-аланил-глицил-фенилаланил-лейцил-аргинина диацетат.
Гексапептид формулы (I) может быть получен любым способом известным из уровня техники, в частности, твердофазным синтезом. Гексапептид формулы (I) и его соли и сольваты коммерчески доступны, например, в каталоге Bachem № 4030569.0100 (https://shop.bachem.com/4030569.html). Кроме того, диацетат гексапептида формулы (I) производится в качестве коммерчески доступной фармацевтической субстанции в Российской Федерации несколькими производителями.
Термин «фармацевтическая водная композиция» описывает раствор гексапептида (I) в воде фармакопейного качества, который содержит по меньшей мере одну буферную систему в количествах достаточных для поддержания требуемого уровня рН; и который может содержать другие вспомогательные вещества для придания раствору определенных физико-химических свойств.
Термин «вода фармакопейного качества» относится к воде, удовлетворяющей требованиям фармакопеи и нормативных документов РФ и других стран, в частности, требованиям ФС.2.2.0020.15 «вода очищенная»; требованиям ФС.2.2.0019.15 «вода для инъекций»; нормативным документам «Руководство по качеству воды для применения в фармации. Методические рекомендации», Федеральная служба по надзору в сфере здравоохранения и социального развития РФ, 2009» и «CPMP/QWP/158/01 «Note for Guidance on Quality of Water for Pharmaceutical Use», EMEA, 2002»; или любым другим нормативным актам действующим в этой сфере. Предпочтительно, вода в составе композиций настоящего изобретения выбирается из группы, состоящей из воды очищенной и воды для инъекций.
Термин «буферная система» описывает комбинацию кислоты и основания, предпочтительно сопряженного основания, в количествах достаточных для поддержания требуемого уровня рН. Неэксклюзивные примеры фармацевтически приемлемых буферных систем для поддержания рН в интервале от 3,0 до 8,5 описаны в фармакопее РФ (ОФС.1.3.0003.15 «Буферные растворы») и включают ацетатный буфер, цитратный буфер, сукинатный буфер, фосфатный буфер, имидазольный буфер, трис-натрий ацетатный буфер. Диацетат гексапептида (I) также представляет собой буферную систему, содержащую комбинацию уксусной кислоты и ее опряженного основания ацетата в форме моноацетата гексапептида (I), при молярном соотношении кислоты и сопряженого основания 1:1.
Термин «фармацевтическая водная композиция для ингаляций» означает фармацевтическую водную композицию, предназначенную для введения действующего вещества в легкие в виде паров или дисперсий жидких частиц в газовой среде с целью получения эффекта.
Термин «стабильная» означает, что фармацевтическая водная композиция для ингаляций настоящего изобретения удовлетворяет требованию отсутствия значительных изменений (более 5%) показателя "количественное определение" от первоначального значения, как установлено ГОСТ Р 57129-2016 «Лекарственные средства для медицинского применения. Часть 1. Изучение стабильности новых фармацевтических субстанций и лекарственных препаратов». Срок годности фармацевтической водной композиции для ингаляций настоящего изобретения по критерию «стабильность» может быть от 3 до 36 месяцев, предпочтительно не менее 3 месяцев.
В одном из воплощений настоящего изобретения, стабильная фармацевтическая водная композиция для ингаляций содержит от 0,1 мг/мл до 100 мг/мл диацетата гексапептида формулы (I) и имеет рН от 3,0 до 8,5.
В другом воплощении настоящего изобретения, стабильная фармацевтическая водная композиция для ингаляций содержит от 0,9 мг/мл до 1,1 мг/мл диацетата гексапептида формулы (I) и имеет рН от 4,0 до 6,5.
Стабильная фармацевтическая водная композиция для ингаляций настоящего изобретения может содержать вспомогательные вещества.
Термин «вспомогательное вещество» означает вещество неорганического или органического происхождения, используемое в процессе производства, изготовления лекарственного препарата для придания ему необходимых физико-химических свойств.
Неэксклюзивные примеры вспомогательных веществ для использования в композициях настоящего изобретения включают очищенную воду, воду для инъекций, буферные системы для поддержания значения рН на уровне 3,0-8,5, регуляторы тоничности растворов, антимикробные консерванты, поверхностно-активные вещества, стабилизирующие агенты, эмульгаторы. Подбор вспомогательных веществ для использования в композициях настоящего изобретения может быть осуществлен на основе следующих критериев: вспомогательное вещество не должно влиять на основное терапевтическое действие композиции, не должно быть токсичными в используемых количествах и не должно неблагоприятно воздействовать на функции слизистой оболочки дыхательных путей и ее реснитчатого эпителия.
В некоторых воплощениях настоящего изобретения, композиции могут содержать от 0,001 до 99,999% вспомогательного вещества.
В практике настоящего изобретения, стабильные фармацевтические водные композиции для ингаляций настоящего изобретения предпочтительно имеют осмоляльность ≤300 мОсмоль/кг. Для этого в состав композиции может быть включен регулятор тоничности. Предпочтительным регулятором тоничности настоящего изобретения является натрий хлорид в количестве от 0,1 до 0,9% указанной композиции.
Настоящее изобретение предоставляет далее процесс получения стабильной фармацевтической водной композиции для ингаляций, включающий стадию стерилизующей фильтрации указанной композиции. Стерилизующая фильтрация обеспечивает отсутствие контаминации композиций настоящего изобретения и, как следствие, отсутствие микробных пептидаз, которые играют главную роль в деградации гексапептида (I) при хранении и, таким образом, обеспечивает стабильность композиций настоящего изобретения в отсутствие стабилизаторов и консервантов.
Далее, настоящее изобретение относится к применению стабильной фармацевтической водной композиции для ингаляций для производства лекарственного средства для лечения болезни легких.
Термин «лекарственное средство» в настоящем изобретении означает вещество или комбинации веществ, вступающие в контакт с организмом человека или животного, проникающие в органы, ткани организма человека или животного, применяемые для профилактики, диагностики, лечения заболевания, реабилитации. К лекарственным средствам относятся фармацевтические субстанции и лекарственные препараты.
Термин «фармацевтическая субстанция» означает обладающее фармакологической активностью действующее вещество, которое предназначено для производства, изготовления лекарственных препаратов и определяет их эффективность
Термин «лекарственный препарат» означает лекарственное средство в виде лекарственной формы, применяемой для профилактики, диагностики, лечения заболевания, и реабилитации.
Термин «лекарственная форма» означает состояние лекарственного препарата, соответствующее способам его введения и применения и обеспечивающее достижение необходимого лечебного эффекта.
В одном из воплощений настоящего изобретения, лекарственное средство для лечения болезни легких производится в виде раствора или эмульсии для последующего распыления с помощью небулайзера.
Лекарственное средство настоящего изобретения содержит стабильную фармацевтическую водную композицию настоящего изобретения в количествах, позволяющих вводить от 0,1 до 50 мг гексапептида формулы (I) в одной дозе.
Термин «доза» означает количество действующего вещества, которое должно быть введено субъекту за один раз.
В одном из воплощений настоящего изобретения, лекарственное средство является дозированным и содержит 10 мг диацетата гексапептида формулы (I) в одной дозе.
Термин «небулайзер» обозначает устройство для ингаляций, обеспечивающее преобразование жидкого лекарственного средства для распыления в дисперсию в газовой среде для доставки действующего вещества в легкие. Примеры небулайзеров включают компрессорные, ультразвуковые, либо небулайзеры иного типа.
В одном из воплощений настоящего изобретения, лекарственное средство производится в виде эмульсии или раствора, находящегося под давлением в упаковке с дозирующей клапанно-распылительной системой (аэрозоли и спреи) для последующего распыления.
Размеры частиц в дисперсии (аэрозоле) при ингаляции композиций настоящего изобретения составляют от 0,5 до 30 мкм.
Лекарственное средство настоящего изобретения может быть произведено способами, хорошо известными из уровня техники и в соответствии с признанными фармацевтическими процедурами, например, описанными в Фармацевтическом научном справочнике Ремингтона, 17-е издание, под ред. Альфонсо Р. Дженнаро, Мак Паблишинг Компании, Истон, Пенсильвания, 18-е издание (Remington's Pharmaceutical Sciences, seventeenth edition, ed. Alfonso R. Gennaro, Mack Publishing Company, Easton, Pa., Eighteenth edition, 1990).
Термин «болезнь легких» означает болезни органов дыхания, коды J00-J99 согласно Международной Классификации Болезней 10-го пересмотра (МКБ-10), в том числе пневмонию (J12-18); острые респираторные инфекции нижних дыхательных путей (J20-J22); хронические болезни нижних дыхательных путей (J40-J47); болезни легкого, вызванные внешними агентами (J60-J70); респираторные болезни, поражающие главным образом интерстициальную ткань (J80-J84).
В некоторых воплощениях настоящего изобретения, лекарственное средство предназначено для лечения болезни легких выбранной из группы, состоящей из бронхита, трахеобронхита, пневмонии, легочного отека, хронической обструктивной болезни легких, эмфиземы, астмы, респираторного дистресс-синдрома, острого респираторного дистресс-синдрома.
В предпочтительном воплощении настоящего изобретения, лекарственное средство предназначено для лечения пневмонии.
Термин «пневмония» означает острое инфекционное заболевание любой этиологии, характеризующееся очаговым поражением респираторных отделов легких с обязательным наличием внутриальвеолярной экссудации. К неэксклюзивным примерам пневмоний относятся пневмонии перечисленные в Международной классификации болезней (МКБ-10) под кодами J10-J18.
Вследствие высокой терапевтической концентрации гексапептида (I) в легких достигаемой при ингаляционном способе введения, композиции и способы настоящего изобретения особенно эффективны для лечения легочных заболеваний.
Настоящее изобретение предоставляет далее способ лечения болезни легких у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение этому субъекту терапевтически эффективного количества стабильной фармацевтической водной композиции для ингаляций.
В некоторых воплощениях настоящего изобретения, болезнь легких выбрана из группы, состоящей из бронхита, трахеобронхита, пневмонии, легочного отека, хронической обструктивной болезни легких, эмфиземы, астмы, респираторного дистресс-синдрома, острого респираторного дистресс-синдрома.
В предпочтительном воплощении настоящего изобретения, болезнь легких это пневмония.
Термин «лечение» означает означает уменьшение проявления одного или нескольких клинических признаков (симптомов) заболевания у субъекта, нуждающегося в таком лечении.
Термин «терапевтически эффективное количество» означает такое количество стабильной фармацевтической водной композиции для ингаляций настоящего изобретения, которое достаточно для того чтобы обеспечить желаемый терапевтический эффект. В предпочтительном варианте, терапевтически эффективное количество стабильной фармацевтической водной композиции для ингаляций содержит гексапептид (I) в количестве от 0,01 до 1 мг/кг веса тела субъекта.
Терапевтически эффективные количества гексапептида (I) известны из уровня техники и составляют от и составляют от 1 до 1000 мкг/кг веса тела млекопитающего. Для человека эффективное количество гексапептида (I), обычно используемое в клинике, составляет от 1 до 20 мг в сутки, как указано, например, в инструкции по применению препарата даларгин. Справочник Видаль. Цитировано по интернет: https://www.vidal.ru/drugs/dalargin__17150.
Термин «субъект» означает млекопитающего, в том числе человека.
В одном из воплощений настоящего изобретения, терапевтически эффективное количество стабильной фармацевтической водной композиции для ингаляций вводят субъекту с помощью небулайзера, преобразующего жидкую композицию в дисперсию в газовой среде для доставки действующего вещества в легкие в течение 10-120 мин, предпочтительно от 30 до 90 мин, один раз в день или чаще. Введение может быть однократным или курсовым, курсом до 30 дней.
Следующие примеры демонстрируют изобретение. Примеры иллюстрируют изобретение и не предназначены для ограничения объема изобретения тем или иным образом.
Пример 1.
Пример иллюстрирует стабильную водную фармацевтическую композицию настоящего изобретения.
Состав стабильной водной фармацевтической композиции настоящего изобретения показан в таблице 1.
Таблица 1. Состав стабильной водной фармацевтической композиции.
Состав
Содержание
Гексапептид (I) диацетат
0,1-100 мг/мл
рН
3,0-8,5
Вода очищенная
остальное
Стабильную водную фармацевтическую композицию получают следующим образом. Диацетат гексапептида (I) растворяют в воде очищенной в количествах необходимых для получения раствора с содержанием гексапептида (I) указанным в таблице 1. Для поддержания рН в интервале 3,0-8,5 в раствор добавляют фармацевтически приемлемый фосфатный буфер как описано в «ФС.2.2.0020.15. буферные растворы». Полученный раствор подвергают стерилизующей фильтрации и разливают во флаконы или ампулы в атмосфере азота. В способе лечения пневмонии полученный раствор вводится субъекту, нуждающемуся в этом, ингаляционно в виде аэрозоля с помощью небулайзера.
Пример 2.
Пример иллюстрирует стабильную водную фармацевтическую композицию настоящего изобретения.
Состав стабильной водной фармацевтической композиции настоящего изобретения показан в таблице 2.
Таблица 2. Состав стабильной водной фармацевтической композиции.
Состав
Содержание
Гексапептид (I) диацетат
0,1-100 мг/мл
Натрия хлорид
0,1-0,9%
рН
3,0-8,5
Вода очищенная
остальное
Стабильную водную фармацевтическую композицию получают следующим образом. Фармацевтически приемлемый фосфатный буферный раствор, обеспечивающий поддержание рН в интервале 3,0-8,5 готовят растворением компонентов буферной системы в воде очищенной как описано в «ФС.2.2.0020.15. буферные растворы». В полученный раствор добавляют диацетат гексапептида (I) и натрия хлорид в количествах необходимых для получения раствора с содержанием компонентов как указано в таблице 2. Добавление натрия хлорида обеспечивает требуемую изотоничность раствора в диапазоне ≤300 мОсмоль/кг.  Полученный раствор подвергают стерилизующей фильтрации и разливают во флаконы или ампулы в атмосфере азота. В способе лечения пневмонии полученный раствор вводится субъекту, нуждающемуся в этом, ингаляционно в виде аэрозоля с помощью небулайзера.
Пример 3.
Пример иллюстрирует процесс приготовления лекарственного средства настоящего изобретения.
Состав лекарственного средства настоящего изобретения показан в таблице 3.
Таблица 3. Состав лекарственного средства.
Состав
Содержание в одном флаконе
Гексапептид (I) диацетат
10 мг
Вода для инъекций по ФС.2.2.0019.18 (ГФ XIV)
До 10 мл
рН
4,8
Лекарственное средство получают следующим образом. Расчетные количества гексапептида (I) диацетата растворяют в воде для инъекций до получения раствора с содержанием 1 мг/мл, выход 100%. Значения рН раствора определяются буферными свойствами диацетата гексапептида (I), представляющего собой буферную систему состоящую из уксусной кислоты и сопряженного основания моноацетата гексапептида (I) в мольном соотношении 1:1.  Полученный нестерильный раствор подают на фильтрацию с использованием стерилизующего фильтра 0,22 мкм (Merck Millipore), выход 99%. Полученный стерильный раствор разливают во флаконы (тип 10R), стерильные в комплекте с пробкой бутилкаучуковой стерильной, в токе азота или любого другого инертного газа, снабжают алюминиевым колпачком, и флакон обжимают. В способе лечения пневмонии полученный раствор вводится субъекту, нуждающемуся в этом, ингаляционно в виде аэрозоля с помощью небулайзера.
Пример 4.
Пример иллюстрирует сравнительную фармакокинетику гексапептида (I) в легких при ингаляционном и инъекционном введении.
Мышам-самцам линии C57Bl вводили диацетат гексапептида формулы (I) в составе композиции из примера 3 в дозе 10 мг/кг внутримышечно (группа 1) или ингаляционно в течение 10 мин (группа 2). Концентрацию гексапептида (I) в легких (гомогенате легких) измеряли до (0 мин) и через 1, 5, 10, 15, 60 мин методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемным детектированием с применением времяпролетного масс-детектора ВЭЖХ-МС-МС (Agilent 1260, оснащенный автодозатором, с масс-селективным детектором Agilent 6545XT Accurate mass Q-TOF LC/MS). Результаты представлены в таблице 4 как среднее ± ошибка среднего (n=3) концентрации гексапептида (I) в легких, соответственно.
Таблица 4. Фармакокинетика.
Время, мин
Концентрация гексапептида (I) в легких, нг/мл
Внутримышечное введение (группа 1)
Ингаляционное введение (группа 2)
01
0538 ± 24733 ± 1156 ± 2328 ± 1023 ± 2
049 ± 7*287 ± 12*535 ± 267*61 ± 23*37 ± 11*
5
10
1560
*Достоверное отличие от внутримышечного введения (p<0,05).
Таблица 4 показывает, что ингаляционное введение фармацевтической композиции настоящего изобретения обеспечивает достоверно более высокую концентрацию гексапептида (I) в легких, чем инъекционное внутривенное введение гексапептида (I) в той же дозе. Площадь под фармакокинетической кривой (AUC) концентрации гексапептида (I) в легких за 60 мин составила 6446 нг/мл, против 2991 нг/мл при инъекционном введении, т.е. ингаляционное введение обеспечивает более чем двукратное увеличение  концентрации гексапептида (I) в легких по сравнению инъекционным введением. Таким образом, фармацевтические композиции настоящего изобретения для ингаляций обладают тем преимуществом по сравнению с инъекциями, что они обеспечивают достижение значительно более высоких терапевтических концентраций гексапептида (I) в легких, по сравнению с инъекциями.
Пример 5.
Пример иллюстрирует фармакокинетику гексапептида (I) при ингаляционном введении композиций настоящего изобретения.
Мышам-самцам линии C57Bl вводили ингаляционно диацетат гексапептида формулы (I) в количестве 10 мг/кг за 10 мин в составе водных композиций настоящего изобретения (из примера 1), содержащих 1 мг/мл диацетата гексапептида (I) и имеющих значения рН 3,0; 4,8; 7,0; или 8,5. Измеряли содержание гексапептида (I) в легких как описано в примере 4. Результаты представлены в таблице 5 как среднее ± ошибка среднего (n=4) концентрации гексапептида (I) в легких.
Таблица 5. Концентрация гексапептида (I) в легких.
рН
Концентрация гексапептида (I) в легких, нг/мл
3,0
573 ± 49
4,8
535 ± 56
7,0
524 ± 63
8,5
512 ± 78
Таблица 5 показывает, что ингаляционное введение фармацевтических композиций настоящего изобретения, содержащих одно и то же количество гексапептида (I), но имеющих разное значение рН, в одной и той же дозе, обеспечивает одинаково высокие концентрации гексапептида (I) в легких, не имеющих достоверных статистических отличий между композициями (p>0,05). Таким образом, стабильные водные фармацевтические композиции настоящего изобретения обеспечивают воспроизводимые терапевтические концентрации гексапептида (I) в легких при ингаляционном введении в одинаковых дозах во всем заявленном интервале рН 3,0-8,5.
Пример 6.
Пример иллюстрирует фармакокинетику гексапептида (I) при ингаляционном введении композиций настоящего изобретения.
r
Мышам-самцам линии C57Bl вводили ингаляционно за 2 мин по 20 мкл водных фармацевтических композиций настоящего изобретения (из примера 1), рН 4,8-5,2, содержащих 0,1; 1; 10; 100 мг/мл диацетата гексапептида (I), что соответствует дозам 0,1; 1; 10; 100 мг/кг. Измеряли содержание гексапептида (I) в легких как описано в примере 4. Средние измеренные значения концентрации гексапептида (I) в легких (n=3) при введении доз 0,1; 1; 10; 100 мг/кг составили 4; 30; 418; 2930 нг/мл, соответственно, что указывает на строгую линейную зависимость концентрации гексапептида (I) в легких от дозы гексапептида (I) при ингаляционном введении (коэффициент линейной корреляции Пирсона = 0,99; p < 0,0001). Таким образом, стабильные водные фармацевтические композиции настоящего изобретения обеспечивают доза-зависимое повышение концентрации гексапептида (I) в легких при ингаляционном ведении во всем заявленном интервале концентраций гексапептида (I) от 0,1 до 100 мг/мл.
Пример 7
Пример иллюстрирует стабильность водных фармацевтических композиций настоящего изобретения.
3
Водные фармацевтические композиции с составом, указанным в таблице 6, были приготовлены как описано в примерах 1-3 настоящего изобретения. Испытания стабильности проводилось при температуре 25 ± 2°С в течение 3 месяцев (композиции №№1, 3-7) и 12 месяцев (композиция №2). Измерение содержания гексапептида (I) в закупоренных флаконах проводились до (0 мес) и через 3 месяца (композиции №№1-7) и 12 месяцев (композиция №2) после начала испытаний методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемным детектированием с применением времяпролетного масс-детектора ВЭЖХ-МС-МС (Agilent 1260, оснащенный автодозатором, с масс-селективным детектором Agilent 6545XT Accurate mass Q-TOF LC/MS) в следующем режиме: объемная скорость подвижной фазы через колонку 0,4 см/мин; температура термостата колонки 35°С; объем вводимой пробы 20 мкл; cостав подвижной фазы:  компонент А – 0,1% раствор муравьиной кислоты с рН 2,5% в воде, компонент Б – ацетонитрил; режим элюирования – градиент: 5% Б (0 – 5 мин), от 5% до 20%Б (5 – 15 мин), 20% Б (15 – 25 мин), 5%Б (25 – 35мин). Результаты испытаний стабильности показаны в таблице 6.
Таблица 6. Исследования стабильности водных фармацевтических композиций.
№
Содержание гексапептида (I), мг/мл
Содержание NaCl, %
рН
0 мес
3 мес
12 мес
1
0,100
0,098
-
3,0
2
1,020
1,017
0,989
-
4,8
3
1,040
1,019
0,10
4,8
4
0,970
0,952
0,45
4,8
5
1,120
1,109
0,90
4,8
6
9,980
9,681
-
7,0
7
101,120
97,650
-
8,5
Таблица 6 показывает, что водные фармацевтические композиции настоящего изобретения стабильны в течение не менее 3 мес, так как в процессе хранения не происходят значимые изменения содержания гексапатида (I) более 5% показателя "количественное определение" от первоначального значения, как установлено ГОСТ Р 57129-2016 «Лекарственные средства для медицинского применения. Часть 1. Изучение стабильности новых фармацевтических субстанций и лекарственных препаратов». Для композиции №2 (из примера 3) исследования стабильности, проводимые в течение 12 мес, показали, что композиция стабильна.
Пример 8.
Пример иллюстрирует эффективность водной фармацевтической композиции настоящего изобретения в лечении пневмонии и острого респираторного дистресс-синдрома (ОРДС).
D'Alessio FR. Mouse Models of Acute Lung Injury and ARDS. Methods Mol Biol. 2018, 1809:341-350.
Aoyagi T et al., Shock. 2019, 52(1):83-91
Модель пневмонии, ОРДС и отека легких: Эффективность водной фармацевтической композиции настоящего изобретения в лечении острого респираторного дистресс-синдрома, и отека легких была изучена на модели легочного заболевания, вызываемого интратрахеальным введением липополисахарида (ЛПС), основного компонента клеточной стенки грамотрицательных бактерий, как описано в  Тяжелая фатальная форма пневмонии вызывалась дополнительным введением иммуносенсибилизатора альфа-галактозилкерамида как описано в . Введение мышам интратрахеально альфа-галактозилкерамид (1 мкг/мышь) и через 24 часа ЛПС (E.coli; 300 мкг/мышь) с добавлением комплекса иммуносенсибилизаторов мурамилдипептида G2 и полного адъюванта Фрейнда вызывает пневмонию, острый респираторный дистресс-синдром и отек легкого. Рисунок 1 показывает гистологический препарат (окраска гематоксилин-эозин) здоровой ткани легкого (Рис.1А) и препарат легкого, полученный от животного пневмонией и ОРДС, индуцированной ЛПС как указано выше (Рис.1Б). Препарат здоровой ткани характеризуются умеренным кровенаполнением, отсутствием патологических измеений в строме и паренхиме, а также в стенках бронхов и бронхиол. Препарат ткани животного, индуцированного интратрахеальным введением ЛПС, характеризуется выраженной картиной бронхопневмонии с участками деструкции стенок бронха и бронхиол, десквамированным на большем протяжении эпителием, и с выраженной воспалительной инфильтрацией, распространяющейся на прилежащие альвеолы, в центре которых отмечается скопление воспалительного инфильтрата. Животные имели затрудненное дыхание и проявляли другие признаки респираторной недостаточности. Таким образом, данная экспериментальная модель воспроизводит существенные признаки пневмонии, характерные для пневмонии, острого респираторного дистресс-синдрома и отека легкого у человека.
Режим дозирования: Мыши-самцы линии C57Bl были отбраны методом рандомизации в три группы по 20 особей в каждой. Всем мышам вводили альфа-галактозилкерамид и ЛПС с комплексом иммуносенсибилизаторов как описано выше. Через 1 час после введения ЛПС в первой группе (контроль) животные получали физ. раствор в/м и далее ежедневно физ. раствор в/м один раз в день в течение 4 дней; во второй группе через 1 час после введения ЛПС животные получали в/м инъекцию 100 мкг/кг гексапептида (I) диацетата (ГП(I) в/м) и далее ежедневно 100 мкг/кг гексапептида (I) диацетата в/м один раз в день в течение 4 дней; в третьей группе через 1 час после введения ЛПС животные получали ингаляционно 100 мкг/кг гексапептида (I) диацетата в виде водной фармацевтической композиции, рН 4,8, из примера 1 (ФК инг) и далее эти же количества композиции ежедневно один раз в день в течение 4 дней. Результаты представлены на рисунке 2 в виде кривых выживания Каплана-Мейера. Анализ кривых выживания показал, что существуют достоверное отличие между группами (p<0,0001; логранковый тест Мантеля-Кокса). Попарное сравнение кривых показывает, что инъекционное введение гексапептида (I) достоверно снижает смертность по сравнению с контролем (p=0,0013; логранковый тест Мантеля-Кокса), причем коэффициент риска (hazard ratio по Мантел-Хензел) гибели животных в группе «ГП(I) в/м» был в 5,1 раза ниже, чем в контроле. Введение водной фармацевтической композиции настоящего изобретения «ФК инг» достоверно снизило гибель животных (p<0.0001) по сравнению с контролем, при этом коэффициент риска гибели животных был в 14,3 раза ниже, чем в контроле. Сравнение выживаемости животных в группах «ГП(I) в/м» и «ФК инг» показывает, что выживаемость животных в группе «ФК инг» была достоверно выше, чем в группе «ГП(I) в/м» (p=0,02), причем коэффициент риска гибели животных был в 5,7 раза ниже, чем в группе «ГП(I) в/м».
Таким образом, стабильная водная фармацевтическая композиция для ингаляций настоящего изобретения более эффективна для лечения пневмонии и острого респираторного дистресс-синдрома, чем гексапептид (I) в той же дозе при инъекционном введении.
Пример 9.
Пример иллюстрирует эффективность водной фармацевтической композиции настоящего изобретения в лечении отека легких.
Для определения эффективности водной фармацевтической композиции для ингаляций настоящего изобретения в снижении отека на модели из примера 8, мыши-самцы линии C57Bl были отбраны методом рандомизации в три группы по 10 особей в каждой. Через 1 час после введения ЛПС в первой группе (контроль) животные получали однократно физ. раствор в/м; во второй группе через 1 час после введения ЛПС животные получали однократно в/м инъекцию 100 мкг/кг гексапептида (I) диацетата в виде водного раствора (ГП(I) в/м); в третьей группе через 1 час после введения ЛПС животные получали однократно ингаляционно 100 мкг/кг гексапептида (I) диацетата в виде водной фармацевтической композиции, рН 4,8, из примера 1 (ФК инг). Четвертая группа сравнения состояла из 10 интактных мышей C57Bl. Оценку отека легких проводили взвешиванием легких на через 6 часов после введения ЛПС. Результаты представлены в таблице 7 как среднее ± ошибка среднего отношения веса влажных легких к весу высушенных легких.
Таблица 7. Отношение веса влажных легких к весу высушенных легких.
Группа №№
Отношения веса влажных легких к весу высушенных легких, усл.ед.
1 (контроль)
7,7 ± 0,6
2 (ГП (I) в/м)
6,4 ± 0,3*
3 (ФК инг)
5,2 ± 0,3*<sup>#</sup>
4 (интактные)
4,6 ± 0,2
#
*Достоверное отличие от группы 1 (контроль; p<0,05). Достоверное отличие от группы 2 (ГП(I) в/м; p<0,05).
Таблица 7 показывает, что введение ЛПС (группа 1) вызывает увеличение отношения веса влажных легких к весу высушенных легких по сравнению с интактными животными (группа 4), что указывает на отек легких, вызываемый ЛПС. Введение гексапептид (I) достоверно снижает отек легких как при ингаляционном (группа 3), так и при инъекционном введении (группа 2). Однако, ингаляции стабильной водной фармацевтической композиции настоящего изобретения (группа 3) достоверно более эффективны, чем инъекции гесапептида (I) в той же дозе (группа 2).
Пример 10.
Пример иллюстрирует эффективность стабильной водной фармацевтической композиции настоящего изобретения в подавлении экспрессии интерлейкина-6 (ИЛ-6) в легких.
Rincon M & Irvin CG. Int J Biol Sci. 2012;8(9):1281-90
Rincon M & Irvin CG. Int J Biol Sci. 2012;8(9):1281-90
Karakioulaki M & Stolz D. Int J Mol Sci. 2019 Apr; 20(8): 2004
Интерлейкин-6 играет важную роль в патогенезе легочных заболеваний как показатель поражения легочного эпителия, а не только как провоспалительный фактор. . Пневмония, бронхит, трахеобронхит, астма и хроническая обструктивная болезнь легких сопровождаются повышением уровней ИЛ-6, причем тяжесть заболевания коррелирует с уровнями ИЛ-6.. . Поэтому снижение уровней ИЛ-6 необходимо для снижения тяжести легочных заболеваний.
6
Для оценки эффективности водной фармацевтической композиции для ингаляций настоящего изобретения в лечении легочных заболеваний на модели из примера 8, мыши-самцы линии C57Bl были отбраны методом рандомизации в три группы по 6 особей в каждой. Через 1 час после введения ЛПС в первой группе (контроль) животные получали однократно физ. раствор в/м; во второй группе через 1 час после введения ЛПС животные получали однократно в/м инъекции 100 мкг/кг гексапептида (I) диацетата (ГП(I) в/м); в третьей группе через 1 час после введения ЛПС животные получали однократно ингаляционно 100 мкг/кг гексапептида (I) диацетата в виде водной фармацевтической композиции, рН 4,8, из примера 1 (ФК инг). Четвертая группа сравнения состояла из 6 интактных мышей C57Bl. Ткани легких забирали через три часа после введения гексапаптида (I) или физ. раствора, РНК экстрагировали, и оценку экспрессию гена ИЛ-6 в легких проводили методом ПЦР с помощью детектирующего амплификатора CFX-96 (Biorad, США) с использованием специфических праймеров и флуоресцентных зондов. В качестве референсного гена был выбран ген GAPDH. Результаты представлены в таблице 8 как среднее ± ошибка среднего x10 копий кДНК ИЛ-6.
Таблица 8. Экспрессия ИЛ-6 в легких.
Группа №№
Экспрессия ИЛ-6, x10<sup>6</sup> копий кДНК.
1 (контроль)
7,446 ± 2,559
2 (ГП (I) в/м)
4,256 ± 2,908*
3 (ФК инг)
1,571 ± 1,147*<sup>#</sup>
4 (интактные)
1,179 ± 0,530
#
*Достоверное отличие от группы 1 (контроль; p<0,05). Достоверное отличие от группы 2 (ГП(I) в/м; p<0,05).
Таблица 8 показывает, что ЛПС увеличивает экспрессию гена ИЛ-6 в легких 6,3 раза (группа 1 - контроль; p<0,001) по сравнению с таковой у интактных животных (группа 4). Инъекционное введение гексапептида (I) снижает экспрессию ИЛ-6 в легких в 1,7 раза (группа 2; p>0,05) по сравнению с контролем. Ингаляционное введение гексапептида (I) в составе стабильной водной фармацевтической композиции снижает экспрессию ИЛ-6 в легких в 4,7 раза (группа 3; p<0,002) по сравнению с контролем. Сравнение экспрессии ИЛ-6 в группах 2 и 3 показывает, что ингаляционное введение гексапептида (I) в составе стабильной водной фармацевтической композиции настоящего изобретения достоверно снижает экспрессию ИЛ-6 в легких в 2,7 раза (p<0,05) по сравнению с инъекциями гексапептида (I) в той же дозе.
Таким образом, ингаляционное введение гексапептида (I) в составе стабильной водной фармацевтической композиции настоящего изобретения является достоверно более эффективным в снижении экспрессии ИЛ-6, показателя поражения легочного эпителия, в легких, чем инъекции инъекции гексапептида (I) в той же дозе.