ГУМАНИЗИРОВАННЫЕ АНТИТЕЛА, СПЕЦИФИЧЕСКИЕ ДЛЯ ПЕПТИДА-6, ПОЛУЧЕННОГО ИЗ HSP65, СПОСОБЫ ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ
HUMANISED ANTIBODIES SPECIFIC FOR HSP65-DERIVED PEPTIDE-6, METHODS AND USES THEREOF

Область техники
Настоящее изобретение относится к гуманизированным антителам против пептида, полученного из HSP65, специфически к антителам против пептида-6 и любым их фрагментам, связывающим антиген. Более конкретно, изобретение относится к гуманизированным антителам к пептиду-6, композициям, способам и их использованию для лечения иммунных нарушений.
Уровень техники
Все публикации, упомянутые в настоящей заявке, включены в нее в полном объеме путем ссылки, включая все цитированные в них ссылки.
Белок теплового шока в 65 кДа (HSP65) Mycobacterium tuberculosis (МТ) играет важную роль в патогенезе аутоиммунного артрита. Его эффект хорошо проявляется в экспериментальной модели адъювантного артрита (АА). АА может быть индуцирован в восприимчивых, инбредных линиях крыс, таких как крысы Льюиса или Уистара, путем внутрикожной инокуляции убитых теплом микобактерий, суспендированных в адъюванте Фройнда. АА может пассивно передаваться клоном Т-клетки, реактивным к остаткам 180-188 HSP65 [Holoshitz, J. et al. Science 219:56-58 (1983)].
Сообщались доказательства того, что защита от заболевания может происходить из-за клеточных реакций на HSP65 [Lider, О. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 84:4577-4580 (1987); Moudgil, K. et al. J. Exp. Med. 185:1307-1316 (1997)], предполагая, что этот белок содержит разные эпитопы, которые участвуют как в патогенезе, так и в получении резистентности. Авторы настоящего изобретения ранее сообщили, что резистентность к АА также может вызываться антителами к HSP65 и может пассивно передаваться путем внутривенной инфузии иммуноглобулинов от штаммов, стойких к артриту, крысам, восприимчивым к артриту [Ulmansky, R. and Naparstek, Y. Eur. J. Immunol. 25:952-957 (1995)]. Дальнейшей анализ определил специфичность эпитопа протективных антител анти-HSP к аминокислотным остаткам 31-46, обозначенным как пептид-6 (также обозначаемый последовательностью SEQ ID NO. 15) [Ulmansky, R. and Naparstek, Y. J. Immunol. 168:6463-6469 (2002)]. Вакцинация крыс Льюиса этим пептидом привела к производству антител против всей молекулы, а также к резистентности к индукции заболевания.
Авторы настоящего изобретения ранее сообщали, что поликлональные антитела, направленные против пептида-6, стимулируют производство Интерлейкина-10 (IL-10) периферийными кровяными одноядерными клетками (ПКОК) [Ulmansky (2002) ibid.]. Противовоспалительный цитокин IL-10 играет важную роль во врожденном иммунитете, главным образом из-за его ингибиторных эффектов, которые позволяют подавлять воспалительные реакции. Было доказано, что антипептид-6 моноклональные антитела, созданные авторами настоящего изобретения, сохраняют этот защитный эффект путем связывания с ПКОК и стимулирования секрецию IL-10 из клеток.
Авторы настоящего изобретения кроме того доказали, что антитела, направленные против пептида-6, взаимодействуют не только с пептидом-6, но более того, они явно перекрестно реагируют непосредственно с поверхностными лигандами на макрофагах, и это взаимодействие является ключом к пониманию механизма действия этих антител. После связывания антипептид-6 антител с макрофагами происходит активация пути трансдукции сигнала, который приводит к увеличению производства и секреции цитокинов, специфично IL-10. Как противовоспалительный цитокин, IL-10 уменьшает и ингибирует воспалительные процессы, этим приводя к уменьшению симптомов и лечению воспалительного нарушения. Это снижает баланс между про-воспалительными цитокинами Th1, такими как фактор некроза опухоли-альфа (ФНО-альфа), и противовоспалительными цитокинами Th2, такими как IL-10. Модуляция баланса Th1/Th2 в сторону противовоспалительной реакции Th2 с использованием антипептид-6 антител поэтому применима при лечении воспалительных нарушений.
Однако введение антител или фрагментов антител грызунов имеет недостатки, которые ограничивают их применимость для людей, отчасти, из-за иммуногенности антител или их фрагментов. Для преодоления нежелательных свойств антител грызунов были разработаны гуманизированные антитела путем замены участков структуры, исключая сайт, связывающий антиген, участками человеческого антитела. Один способ, часто используемый для приготовления таких гуманизированных антител, основан на селекции гена, кодирующего антитело человека, имеющее наиболее тесное сходство последовательности с антителом мыши, и замене только определяющего комплементарность участка (CDR) антитела человека на такой участок антитела мыши способом прививки CDR. Преимущество такого гуманизированного антитела заключается в уменьшении иммунной реакции in vivo. Однако, как только CDR привит на антитело человека, его селективность и реактивность часто ухудшаются.
Более того, хотя методы гуманизации дали антитела, которые в общем хорошо переносятся при введении человеку и в общем имеют меньшую иммуногенность чем нечеловеческие моноклональные антитела, несколько антител, созданных этими методами, показали, что они вызывают иммуногенность у пациентов, даже когда генетическое происхождение таких антител является человеческим. Такая индукция иммуногенность возможно происходит из-за присутствия в вариабельном участке антитела трактов несобственных аминокислотных последовательностей, которые, в некоторых случаях, могут создавать эпитопы Т-клеток, которые индуцируют реакции Т-клеток, приводящие к иммуногенности.
Потенциальное использование антипептид-6 антител в качестве иммуномодулирующих агентов требует производства гуманизированного антитела, имеющего пониженный антигенный потенциал. Поэтому существует необходимость в производстве высоко специфических гуманизированных антипептид-6 антител, имеющих высокие первичные последовательности человеческого происхождения и избегающие создания последовательностей, которые могут индуцировать реакции Т-клеток.
Поэтому одной целью настоящего изобретения является предложение таких гуманизированных антипептид-6 антител для модуляции баланса Th1/Th2 у пациента, страдающего иммунным нарушением.
Эти и другие цели изобретения станут очевидными из нижеприведенного описания.
Раскрытие изобретения
Согласно первому аспекту, изобретение относится к гуманизированному антителу или любому его фрагменту, связывающему антиген, который специфически связывает полипептид, включающий SEQ ID NO: 15. Необходимо отметить, что полипептид SEQ ID NO. 15, известный как пептид-6, секретирован из HSP65.
Согласно одному варианту осуществления, гуманизированное антитело изобретения включает:
(a) вариабельный участок тяжелой цепи, который включает Cys в положении Н22, Ser в Н23, Gly в Н26, Phe в Н27, Ser в Н28, Leu в Н29, Ser в Н30, Thr в Н31, Ser в Н32, Asn в Н33, Met в Н34, Gly в Н35, Val в Н35А, Gly в Н35 В, Leu в Н48, His в Н50, Ile в Н51, Leu в Н52, Trp в Н53, Asn в Н54, Asp в Н55, Ser в Н56, Lys в Н57, Tyr в Н58, Tyr в Н59, Asn в Н60, Pro в Н61, Ala в Н62, Leu в Н63, Lys в Н64, Ser в Н65, Cys в Н92, Met в Н95, Gly в Н96, Gly в Н97, Tyr в Н98, Tyr в Н99, Gly в Н100, Asn в Н100А, Tyr в Н100 В, Gly в Н100С, Tyr в H100D, Tyr в Н100Е, Ala в H100F, Met в H100G, Asp в Н101 и Tyr в H102 и, по выбору, по меньшей мере одну из Leu в Н49, Tyr в Н74, Ile в H11, Ser в H41 и Ser в Н108; и
(b) вариабельный участок легкой цепи, который включает Gln в положении L1, Cys в L23, Thr в L24, Ala в L25, Ser в L26, Ser в L27, Ser в L27A, Val в L28, Ser в L29, Ser в L30, Ser в L31, Tyr в L32, Leu в L33, His в L34, Trp в L47, Ser в L50, Thr в L51, Ser в L52, Asn в L53, Leu в L54, Ala в L55, Ser в L56, Tyr в L71, Cys в L88, His в L89, Gln в L90, Tyr в L91, His в L92, Arg в L93, Ser в L94, Pro в L95, Pro в L96 и Thr в L97 и, по выбору, по меньшей мере одну из Met в L21, He в L10 и Ala в L80. Необходимо понимать, что все указанные положения определены согласно системе нумерации по Кабату.
Еще один аспект изобретения относится к композиции, содержащей в качестве активного ингредиента эффективное количество по меньшей мере одного изолированного и очищенного гуманизированного антитела согласно изобретению.
Изобретение кроме того предлагает фармацевтическую композицию для предотвращения, лечения, уменьшения симптомов или ингибирования иммунного нарушения. Фармацевтическая композиция изобретения содержит в качестве активного ингредиента терапевтически эффективное количество по меньшей мере одного изолированного о очищенного гуманизированного антитела изобретения.
В еще одном аспекте изобретение предлагает композицию и способ для повышения экспрессии и уровней IL-10 (Интерлейкина-10) у пациента, нуждающегося в нем, конкретно у пациента, страдающего от иммунного нарушения.
Еще один аспект изобретения предлагает способ для предотвращения, лечения, уменьшения симптомов или ингибирования иммунного нарушения. Способ изобретения включает этап введения нуждающемуся в этом пациенту терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного изолированного и очищенного гуманизированного антитела согласно изобретению или композиции, содержащей то же самое в качестве активного ингредиента.
Согласно одному варианту осуществления, способ изобретения может быть в частности применим для лечения и уменьшения симптомов иммунных нарушений, таких как аутоиммунные или воспалительные нарушения.
Кроме того, изобретение предлагает объединенную композицию, включающую по меньшей мере одно изолированное и очищенное гуманизированное антитело согласно изобретению и по меньшей мере один противовоспалительный агент. В некоторых вариантах осуществления такой противовоспалительный агент может быть выбран из группы, состоящей из метилпреднизона (МПЗ), анти-ФНО агентов, этанерцепта (Энбрель), инфликсимаба (Ремикад), адалимумаба (Хумира) и цертолизумаб пэгола (Цимзия), анти-IL-6 агентов, токилизумаба (Актемра), анти-IL-1-рецепторных агентов, кинерета (Анакинра), CTLA-4-Ig, абатацепта (Оренсия), анти-CD20 агентов, ритуксимаба (МабТера; Ритуксан), метотрексата, любых кортикостероидных производных и любого другого противовоспалительного агента, который индуцирует противовоспалительную реакцию посредством любого сигнального пути. Более конкретно, дополнительный противовоспалительный агент может индуцировать путь, который отличается от путей, индуцируемых анти-пептид 6 антителами, например, любой путь, вовлеченный в индукцию IL-10. Упомянутая объединенная композиция может, по выбору, кроме того включать фармацевтически приемлемый носитель, наполнитель или разбавитель.
Еще один аспект изобретения относится к набору для достижения терапевтического эффекта у пациента, страдающего от иммунного нарушения, включающему:
(i) по меньшей мере одно изолированное и очищенное гуманизированное антитело согласно изобретению или любого его фрагмента, связывающего антиген, или его фармацевтически приемлемое производное и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель, по выбору, в форме первой лекарственной формы;
(ii) по меньшей мере один противовоспалительный агент и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель, по выбору, в форме второй лекарственной формы; и
(iii) контейнерное средство для содержания упомянутых первой и второй формы дозы.
В некоторых вариантах осуществления противовоспалительный агент, содержащийся в наборе изобретения, может быть выбран из группы, состоящей из метилпреднизона (МПЗ), анти-ФНО агентов, этанерцепта (Энбрель), инфликсимаба (Ремикад), адалимумаба (Хумира) и цертолизумаб пэгола (Цимзия), анти-IL-6 агентов, токилизумаба (Актемра), анти-IL-1-рецепторных агентов, кинерета (Анакинра), CTLA-4-Ig, абатацепта (Оренсия), анти-CD20 агентов, ритуксимаба (МабТера; Ритуксан), метотрексата, любых кортикостероидных производных и любого другого противовоспалительного агента, который индуцирует противовоспалительную реакцию посредством любого сигнального пути.
Еще один аспект изобретения относится к линии клетки-хозяина, трансформированной или трансфектированной экспрессирующим вектором, кодирующим гуманизированное антитело изобретения. Более конкретно, линия клетки-хозяина изобретения экспрессирует гуманизированное антитело, имеющее вариабельный участок тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность, обозначенную SEQ ID NO: 21, и вариабельный участок легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность, обозначенную SEQ ID NO: 26.
В еще одном аспекте изобретение предлагает химерное моноклональное антитело, которое специфически связывает полипептид, включающий SEQ ID NO: 15, или с любым полипептидом, включающим такую последовательность, причем упомянутое антитело включает постоянный участок человеческого иммуноглобулина и вариабельный участок мышиного иммуноглобулина.
Другие аспекты станут понятны с помощью следующих фигур чертежей.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1А-1В: аминокислотные и нуклеинокислотные последовательности химерного мышино-человеческого антитела анти-пептид-6
На чертеже показаны аминокислотные и нулеинокислотные последовательности вариабельного домена химерного мышино-человеческого антитела.
На Фиг. 1А показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NO. 1) и кодирующая нуклеинокислотная последовательность (SEQ ID NO. 3) вариабельного участка тяжелой цепи мышиного антитела.
На Фиг. 1В показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NO. 2) и кодирующая нуклеинокислотная последовательность (SEQ ID NO. 4) вариабельного участка легкой цепи мышиного антитела.
Определения CDR белковых последовательностей согласно Кабату. Нуклеотидные и белковые последовательности CDR подчеркнуты.
Сокращения: М. Heav.Ch. Seq (последовательность мышиной тяжелой цепи); М. Ligh.Ch. Seq (последовательность мышиной легкой цепи); SEQ ID NO (идентификационный номер последовательности).
Фиг. 2: Схемы экспрессирующих векторов pANTVK, VK и pANTVhG1/4, VH
На чертеже показаны схемы экспрессирующих векторов VK и VH с указанием основных генетических элементов и сайты рестриктаз. Элементы для распространения в бактериях (включая репликон ColE1 и ген резистентности к ампициллину) не показаны.
Сокращения: Hin. (шарнир).
Фиг. 3А-3В: Кривые связывания химерных анти-пептид-6 антител с пептидом-6
На Фиг. 3А-3В показаны кривые связывания для мышиного IgM (3А) и химерного мышино-человеческого IgG1 (3В) с антигеном пептида-6, покрытым при 10 мкг/мл.
Сокращения: OD (оптическая плотность).
Фиг. 4: Составная последовательность антитела и выровненные сегменты и ограничивающие аминокислоты
На этой Фигуре показаны аминокислотная последовательность тяжелой (VH1-4) и легкой (VK1-3) цепей (Линия 1), карта ограничивающих остатков (Линия 2) и сегменты последовательности, используемые в сборке составных человеческих последовательностей (Линия 3) (Линия 3 на фигуре состоит из линий 3, 4, 5, которые представляют разные сегменты, обозначенные SEQ ID NO. 12-14, 16-19 и 34-59, 96 и 97) разных вариантов.
Сокращения: VH (вариабельная тяжелая цепь), VK (вариабельная легкая цепь), SEQ ID NO. (идентификационный номер последовательности).
Фиг. 5: Фланкирующие последовательности, используемые в клонировании синтезированных генов VH и VK Composite Human Antibody™ (составного человеческого антитела) в экспрессирующие векторы
На фигуре показаны фланкирующие последовательности (SEQ ID NO. 5, 6, 7 и 8), используемые в клонировании синтезированных генов VH и VK составного человеческого антитела в экспрессирующие векторы.
Сокращения: Flank. Seq. (фланкирующая последовательность), SEQ ID NO. (идентификационный номер последовательности), VH (вариабельная тяжелая цепь), VK (вариабельная легкая цепь).
Фиг. 6A-6G: Аминокислотные и нуклеинокислотные последовательности разных вариантов гуманизированных антител
На Фиг. 6A-6D показаны нуклеотидные и выведенные аминокислотные последовательности вариабельной тяжелой цепи вариантов VH1-4, имеющих аминокислотные последовательности SEQ ID NO. 20, 21, 22 и 23, и нуклеинокислотные последовательности SEQ ID NO. 27, 28, 29 и 30, соответственно.
На Фиг. 6E-6G. показаны нуклеотидные и выведенные аминокислотные последовательности вариабельной легкой цепи вариантов VK1-3, имеющих аминокислотные последовательности SEQ ID NO. 24, 25 и 26 и нуклеинокислотные последовательности SEQ ID NO. 31, 32 и 33, соответственно.
Определения CDR и нумерация белковых последовательностей по Кабату. Нуклеотидные и белковые последовательности подчеркнуты. Аминокислоты, изменившиеся из оригинальной последовательности гибридомы выделены жирным шрифтом.
Сокращения: Var. (вариант), CDR (определяющий комплементарность участок), VH (вариабельная тяжелая цепь), VK (вариабельная легкая цепь), SEQ ID NO. (идентификационный номер последовательности).
Фиг. 7А-7С: Связывание составных человеческих антител с пептидом-6
Связывание вариантов очищенных составных человеческих антител с пептидом-6 было проверено с помощью метода иммуноферментного анализа (ИФА). Варианты антител разбавили от 100 мг/мл до 6,125 мг/мл и связали с пептидом-6, нанесенным на пластинку с ячейками NuncMaxiSorp 96. Связывание детектировали посредством античеловеческого субстрата IgG kappa HRP и ТМВ. Спектральную поглощательную способность измеряли при 450 нм. Сокращения: VH (вариабельная тяжелая цепь), VK (вариабельная легкая цепь), СН/CK химерное антитело мыши, OD (оптическая плотность).
Фиг. 8: Химерное анти-пептид-6 антитело стимулирует секрецию IL-10 из макрофагов человека
Гистограмма показывает секрецию IL-10 человеческих клеток ПКОК, которые были инкубированы разными дозами химерного анти-пептид-6 антитела мыши-человека в течение 48 часов. Необработанные клетки служили в качестве контрольной группы. Супернатант был собран и проанализирован с помощью набора для детектирования IL-10 ИФА (R&D Systems).
Сокращения: Chim. М-Н a-pept. 6 (химерный античеловеческий пептид-6 мыши), а (анти), U.T. (необработанная).
Фиг.9: Химерное анти-пептид-6 антитело подавляет тяжесть установленного АА
На Фигуре показана оценка артрита в разных экспериментальных группах животных, обработанных мышиными IgM и химерными мышиными-человеческими IgG1 анти-пептид-6 антителами, контрольным химерным антителом Rituximab и солевым раствором. Оценка артрита является средней для 6-7 животных. *p<0,05 по сравнению с крысами, обработанными солевым раствором на 20 сутки.
Сокращения: D.A. Ind. АА. (суток после индукции артрита); Sal. (солевой раствор); Chim. М-Н (химерное мышиное анти-человеческое); АА Sc. (оценка артрита).
Фиг. 10А-10В: Химерное анти-пептид-6 антитело подавляет тяжесть установленного АА
На Фигуре показаны данные патологии суставов крыс, обработанных химерным анти-пептид-6 антителом мыши-человека (Фиг. 10В) по сравнению с крысами, обработанными контрольным антителом Rituximab (Фиг. 10А).
Сокращения: Chim. М-Н Pept 6 (химерный мышиный анти-человеческий пептид-6).
Фиг. 11: Влияния химерного анти-пептид-6 антитела, МПЗ и Энбреля на установленный АА
На Фигуре показана оценка артрита разных экспериментальных групп животных, обработанных химерным мышиным-человеческим IgG1 анти-пептид-6 антителом, метилпреднизоном (МПЗ) или Энбрелем и их сочетания с химерным мышиным-человеческим антителом. Оценка артрита является средним для 6 животных. p<0,05, p<0,02, p<0,05 при сравнении химерного анти-пептид-6 антитела, Энбреля или МПЗ, соответственно, с ФБР на 21 сутки. p<0,05 при сравнении МПЗ с ФБР на 19 сутки. Р0,02 и p<0,05 при сравнении химерного анти-пептид-6 антитела + Энбрель с ФБР на 21 и 23 сутки, соответственно. p<0,02, p<0,02, р0,01 и p<0,05 при сравнении химерного анти-пептид-6 антитела + МПЗ с ФБР на 18, 19, 21 и 23 сутки, соответственно. Сокращения: D.A. Ind. АА. (суток после индукции артрита); Chim. М-Н (химерное мышиное анти-человеческое); Chim. (химерное); АА. Sc. (оценка артрита).
Фиг. 12А-12С: Гуманизированное анти-пептид-6 антитело связывается с макрофагами человека (клетки CD14+)
Человеческие клетки ПКОК окрашивали только анти-CD 14 антителом (АРС-конъюгированным) или дважды окрашивали гуманизированным VH2/VK3 антипептид-6 антителом (FITC-конъюгированным; 10 мкг). Затем клетки подвергали анализу FACS на связывание антител.
На Фиг. 12А, 12В показаны графики плотности анти-CD 14 окрашенных клеток (А) и клеток, окрашенных анти-CD14 + гуманизированными антителами (В).
На Фиг. 12С показана гистограмма окрашенных клеток.
Сокращения: Hum. (гуманизированное); Cou. (отсчет); а (анти), VH (вариабельная тяжелая цепь), VK (вариабельная легкая цепь).
Фиг. 13: Гуманизированное анти-пептид-6 антитело связывает чрезмерно экспрессированные His-CAP1, но не His-CREBP
Коммерческое мышиное анти-человеческое CAP1, коммерческое мышиное анти-His-tag и гуманизированное анти-пептид-6 антитело, вариант VH2/VK3, использовали для вестерн-блоттинг анализа чрезмерно экспрессированных и очищенных His-CAP1 (I) и His-CREB (II).
Сокращения: a Hum. САР1 (анти-человеческое САР1 антитело); a His (анти-his tag антитело); Hum. сс-рер. 6. (гуманизированное анти-пептид-6 антитело, вариант VH2/VK3).
Фиг. 14: Гуманизированное анти-пептид-6 антитело индуцирует секрецию IL-10 из макрофагов человека
Гистограмма показывает секрецию IL-10 клеток ПКОК человека, которые были инкубированы двумя вариантами гуманизированных анти-пептид-6 антител, VH2/VK1 и VH2/VK3, в течение 48 часов. Необработанные клетки служили в качестве контрольной группы. Супернатант собрали и проанализировали с помощью набора ИФА для детектирования IL-10 (R&D Systems).
Сокращения: U.T. (необработанные), VH (вариабельная тяжелая цепь), VK (вариабельная легкая цепь).
Фиг. 15А-15В: Связывание составных человеческих антител с пептидом-6 и индукция IL-10 прямо не коррелируются
Фиг. 15А: возможности клеток ПКОК разных вариантов VH и VK гуманизированных антител в количестве 33 мкг/мл или 100 мкг/мл индуцировать IL-10.
Фиг. 15В: сродство пептидов-6 для VH3/VK2, VH2/VK3, VH2/VK1 и VH2/VK2. Сокращения: Chim. (химера); O.D. (оптическая плотность); Ab. Conc, (концентрация антитела), U.T. (необработанные), VH (вариабельная тяжелая цепь), VK (вариабельная легкая цепь).
2
Фиг. 16А-16С: фрагмент гуманизированного анти-пептида-6 F(ab) связывается с макрофагами человека
2
Человеческие клетки ПКОК окрашивали только анти-CD 14 антителом (РЕ-конъюгированным) или дважды окрашивали фрагментом F(ab) гуманизированного VH2/VK3 анти-пептид-6 антитела (FITC-конъюгированного; 10 мкг).
На Фиг. 16А, 16В показаны графики плотности анти-CD 14 окрашенных клеток
(A) и клеток, окрашенных анти-CD 14+F(ab)2 фрагмент гуманизированных антител
(B).
На Фиг. 16С показана гистограмма окрашенных клеток.
Сокращения: Frag, (фрагмент); Сои. (отсчет); а (анти); VH (вариабельная тяжелая цепь); VK (вариабельная легкая цепь).
Фиг. 17: Фрагмент F(ab)2 гуманизированного анти-пептида-6 индуцирует секрецию IL-10 из макрофагов человека
Гистограмма показывает секрецию IL-10 человеческими клетками ПКОК, которые были инкубированы фрагментом F(ab)2 гуманизированного анти-пептида-6, вариант VH2/VK3, в течение 48 часов. Необработанные клетки служили в качестве контрольной группы. Супернатант собирали и анализировали с помощью набора для детектирования IL-10 ИФА (R&D Systems). Сокращения: U.T. (необработанные).
Фиг. 18: Гуманизированное анти-пептид-6 антитело подавляет тяжесть установленного АА
На Фигуре показана оценка артрита животных, обработанных мышиным-человеческим химерным IgG1 анти-пептид-6 антителом, гуманизированным анти-пептидом-6, вариант VH2/VK3, или ФБР в качестве контроля. Оценка артрита является средней для 6-7 животных. *P0,02 при сравнении гуманизированного анти-пептид-6 антитела с ФБР на сутки 20 и 22, и Р<0,05 на сутки 24. *Р<0,01 при сравнении химерного анти-пептид-6 антитела с ФБР на сутки 20 и 22, and Р0,02 на сутки 24, и Р<0,05 на сутки 18.
Сокращения: D.A. Ind. АА. (суток после индукции артрита); Chim. М-Н a Pept. 6 (химерный мышиный анти-человеческий пептид-6); Hum. (гуманизированное); АА. Sc. (оценка артрита).
Фиг. 19: Действие гуманизированного анти-пептид-6 антитела на разные цитокины в AA
Гистограмма показывает уровни следующих цитокинов: IL-6, IFN-γ, IL-4, IL-10, IL-17, IL-1 и ФНО-α в сыворотке крыс с установленным АА. Животных обработали гуманизированным вариантом VH2/VK3 анти-пептида-6 или ФБР. Сыворотка здоровых, не имеющих артрита животных служила в качестве контрольной группы. Результаты являются средним значением ± стандартное отклонение для 2 крыс в каждой группе для всех цитокинов, за исключением IL-17, IL-1 и ФНО-α, где результаты представляют 1 крысу в каждой группе. Сокращения: Health, (здоровая); Hum. (гуманизированный); IFN-γ (интерферон-гамма), VH (вариабельная тяжелая цепь), VK (вариабельная легкая цепь).
Фиг. 20: Гуманизированное анти-пептид-6 антитело подавляет тяжесть установленного артрита, вызванного коллагеном (CIA)
На Фигуре показана оценка артрита животных, обработанных гуманизированным VH2/VK3 анти-пептид-6 антителом, в сравнении с животными, обработанными TBS.
Артрит оценивали путем измерения диаметра ноги, и результат является средним для 8 мышей в каждой группе. *p<0,05 по сравнению с мышами, обработанными TBS.
Сокращения: Hum. (гуманизированное); D.A. Diseas. Ons. (суток после наступления заболевания); Aver. Fee. Diam. (средний диаметр ноги), VH (вариабельная тяжелая цепь), VK (вариабельная легкая цепь).
Фиг. 21: Гуманизированное анти-пептид-6 антитело индуцирует секрецию IL-10 из клеток ПКОК пациентов с ревматоидным артритом
Уровни IL-10 в супернатанте культуры клеток ПКОК, собранном с двух пациентов с ревматоидным артритом после 48 часов инкубации VH2/VK3 анти-пептид-6 гуманизированным антителом или без нее. Сокращения: U.T. (необработанные); Pat. (пациент), hum. α-рер-6 (VH2/VK3 анти-пептид-6 гуманизированное антитело).
Фиг. 22: Гуманизированное анти-пептид-6 антитело уменьшает симптомы колита, индуцированного TNBS, модели для воспалительного заболевания кишечника (ВЗК)
Гистограмма показывает массу тела (в граммах), измеренную на модели с индуцированным TNBS колитом у животных, обработанных гуманизированным вариантом VH2/VK3 антитела, по сравнению с контрольными животными (10 животных в каждой группе). *p<0,05 по сравнению с контрольными мышами.
Сокращения: Bod. Weigh. Gr. (масса тела в граммах); Weigh. Los (потеря массы); Sens, (на время сенсибилизации); Dis. Ind. (на время индукции заболевания); Sacrif. D. 3 (при гибели (сутки 3)); Hum. (гуманизированное); Cont. (контроль), VH (вариабельная тяжелая цепь), VK (вариабельная легкая цепь).
Фиг. 23А-23С: Гуманизированное анти-пептид-6 антитело уменьшает симптомы колита, индуцированного TNBS, модель для воспалительного заболевания кишечника (ВЗК)
На Фиг. 23А показана гистограмма, указывающая микроскопную оценку заболевания индуцированным TNBS колитом у животных, обработанных гуманизированным вариантом VH2/VK3 антитела, по сравнению с контрольными животными (10 животных в каждой группе).
На Фиг. 23В-23С показан срез ткани, взятой у обработанных (В) и контрольных (С) животных (увеличение 100Х). *p<0,05 по сравнению с контрольными мышами.
Сокращения: Micro. Dis. Sc. (микроскопная оценка заболевания); Hum. (гуманизированное); Cont. (контроль), VH (вариабельная тяжелая цепь), VK (вариабельная легкая цепь).
Фиг. 24: Гуманизированное анти-пептид-6 антитело подавляет потерю массы тела в модели ВЗК с колитом, индуцированным TNBS
Сравнение массы тела мышей с внутрикишечно вводимой TNBS и обработанных гуманизированным анти-пептид-6 антителом (VH2/VK3), Rituximab или ФБР в сутки -7 (сенсибилизация), сутки 0 (индукция заболевания) и сутки 3 (гибель); использовали 10 мышей в каждой группе. *p<0,05 по сравнению с контрольными мышами.
Сокращения: Bod. Wei. (масса тела); Sens, (сенсибилизация); Dis. Ind. D. 3 (индукция заболевания (сутки 3)); Sacrif. (гибель); Hum. α-рер-6 (гуманизированное антипептид-6 антитело, вариант VH2/VK3).
Фиг. 25: Фармакокинетический профиль гуманизированного анти-пептид-6 антитела
График уровней гуманизированного анти-пептид-6 антитела (гуманизированное анти-пептид-6 антитело, вариант VH2/VK3) в сыворотке мышей в течение 11-суточного периода после или внутрибрюшинного или подкожного введения гуманизированного анти-пептид-6 антитела.
Сокращения: S.C. (подкожное); LP. (внутрибрюшинное); D. Ant. Adm. (суток с момента введения антитела).
Фиг. 26: Карта бицистронного экспрессирующего вектора pPR014
Показаны элементы, необходимые для экспрессии IgC человека и для селекции в эукариотических клетках (не по масштабу). Участком VH является вариант 2 тяжелой цепи PRO01, и участком VK является вариант 3 легкой цепи PRO01. Детали элементов для прокариотической репродукции и селекции не показаны.
Сокращения: Hin. (шарнир).
Фиг. 27А-27В: Продуктивность и рост клеточной линии PRO01-SF-14-S24-AJ
Анализ характеристик продуктивности и роста клеточной линии PRO01-SF-14-524-AJ за период десяти поколений. Культуры для определения ПУП (показателей удельной продуктивности) были созданы для десяти поколений по отдельности, как 70 мл культуры в 250 мл встряхиваемых колбах, и пробы брали ежедневно для подсчета клеток, определения жизнеспособности клеток и титрования IgG. (Фиг. 27А) ПУП#1, (Фиг. 27В) ПУП#2. Пунктирные линии показывают временное окно для вычисления пикового ПУП.
Сокращения: Cel. Dens, (плотность клеток); Cel. Cou. (подсчет клеток); Tit. (титр); Т.D. PI (время в сутках после инокуляции).
Фиг. 28А-28В: Продуктивность и рост клеточной линии PRO01SF-14-S24-АО
Анализ характеристик продуктивности и роста клеточной линии PRO01-SF-14-524-АО. Культуры для определения ПУП были созданы для десяти поколений по отдельности, как 70 мл культуры в 250 мл встряхиваемых колбах, и пробы брали ежедневно для подсчета клеток, определения жизнеспособности клеток и титрования IgG. (Фиг. 28А) ПУП#1, (Фиг. 28В) ПУП#2. Пунктирные линии показывают временное окно для вычисления пикового ПУП.
Сокращения: Cel. Dens, (плотность клеток); Cel. Cou. (подсчет клеток); Tit. (титр); Т.D. PI (время в сутках после инокуляции).
Фиг. 29А-29В: Продуктивность и рост клеточной линии PRO01SF-14-S24-AZ
Анализ характеристик продуктивности и роста клеточной линии PRO01-SF-14-524-AZ за период десяти поколений. Культуры для определения ПУП были созданы для десяти поколений по отдельности, как 70 мл культуры в 250 мл встряхиваемых колбах, и пробы брали ежедневно для подсчета клеток, определения жизнеспособности клеток и титрования IgG. (Фиг. 28А) ПУШ1, (Фиг. 28В) ПУП#2. (Фиг. 29А) ПУП#1, (Фиг. 29В) ПУП#2. Пунктирные линии показывают временное окно для вычисления пикового ПУП.
Сокращения: Cel. Dens, (плотность клеток); Cel. Cou. (подсчет клеток); Tit. (титр); Т. D. PI (время в сутках после инокуляции).
Фиг. 30А-30В: Продуктивность и рост клеточной линии PRO01SF-14-524-ВЕ
Анализ характеристик продуктивности и роста клеточной линии PRO01-SF-14-524-ВЕ за период десяти поколений. Культуры для определения ПУП были созданы для десяти поколений по отдельности, как 70 мл культуры в 250 мл встряхиваемых колбах, и пробы брали ежедневно для подсчета клеток, определения жизнеспособности клеток и титрования IgG. (Фиг. 30А) ПУП#1, (Фиг. 30В) ПУП#2. Пунктирные линии показывают временное окно для вычисления пикового ПУП.
Сокращения: Cel. Dens, (плотность клеток); Cel. Cou. (подсчет клеток); Tit. (титр); Т. D. PI (время в сутках после инокуляции).
Фиг. 31: Связывание антител от разных клеточных линий
Связывание антител, очищенных от супернатантов клеточных линий PRO01-SF-14-524-AJ, PRO01-SF-14-524-AO, PRO01-SF-14-524-AZ и PRO01-SF-14-524-BE. Серию разбавлений каждого антитела инкубировали в микротитровальной чашке, предварительно покрытой 10 мкг/мл пептида-6. Связывание детектировали с помощью помеченных HRP мышиных анти-человеческих kappa легких цепей и ТМВ.
Сокращения: Chim. (химерное); Ant. Cone, (концентрация антитела), Abs (спектральная поглощательная способность).
Подробное описание изобретения
Сокращения
БСА - Бычий сывороточный альбумин
CDR - Участок определения комплементарности вариабельного участка антитела (пронумерован CDR 1-3 для каждой из тяжелых и легких цепей, по определению Кабата).
Ес (0.1%) Спектральная поглощательная способность раствора белка 1 мг/мл
ED50 - Концентрация испытываемого вещества, которая дает 50% максимального наблюдаемого эффекта.
ИФА - Иммуноферментный анализ
FR - Участок каркаса - участок каркаса вариабельного домена, поддерживающий участки CDR
IgG - Иммуноглобулин G
mAb - Моноклональное антитело
МНС - Основной комплекс тканевой совместимости
OD280nm - Оптическая плотность, измеренная при 280 нм
ФБР - Фосфатный буферный раствор
ТМВ - 3,3′,5,5′-тетраметилбензидин
ЦРП - цепная реакция полимеразы
V-участок - Вариабельный участок цепи антитела
Настоящее изобретение предлагает гуманизированные антитела, которые специфически распознают и связывают полипептид, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO. 15. Необходимо отметить, что полипептид SEQ ID NO. 15, известный как пептид-6, секретируется из HSP65. Как продемонстрировано ниже, примеры гуманизированных антител изобретения были созданы путем объединения сегментов аминокислотной последовательности из гаммы других вариабельный участков человеческих антител. На первом этапе была создана библиотека генов разных вариабельных участков, клонирована в экспрессирующий вектор и впоследствии обследована для выявления членов библиотеки с желательными свойствами, такими как связывание с пептидом-6 (SEQ ID NO. 15).
Эти сегменты были выбраны как содержащие ″ограничивающие″ аминокислотные остатки, вовлеченные в распознавание эпитопов, которые также присутствуют в контрольном мышином антителе, используемом в изобретении.
www.bioinf.org.uk/abs/simkab.html
www.ncbi.nlm.nih.gov
www.ebi.uniprot.org
www.prf.or.ip
Более конкретно, библиотека VH и VL последовательностей разработана путем выбора сегментов VH и VL последовательности из известных последовательностей В-участка человека, таких как имеющиеся в базе данных антител Кабата (), базе данных NCBI () и в базах данных белков, таких как UniProt () и PRF/SBQDB (). Кроме этого, они могут быть дополнены коллекцией VH и VL последовательностей человека путем прямого секвенсирования увеличенных в объеме VH и VL мРНК человеческого источника из одного или больше отдельных сегментов. Для конструирования VH и VL генов были учтены различные сочетания сегментов последовательностей.
Специалистам в данной области будет понятно, что в дополнение к вышеописанным способам будут и другие способы создания и тестирования гуманизированных антител изобретения и способы оптимизации свойств таких антител. Антитела настоящего изобретения являются новыми и, как результат полностью человеческого происхождения В-участков, должны быть менее иммуногенны для человека чем другие антитела, содержащие нечеловеческие последовательности. Дополнительные необязательные признаки гуманизированных антител изобретения, а именно избежание эпитопов Т-клеток, также может способствовать снижению иммуногенности. Следует понять, что сегменты антител и их сочетания, создающие составное человеческое антитело, могут быть выбраны так, чтобы соответствовать гамме критериев, включая необязательное избежание эпитопы Т-клеток. Например, сегменты последовательности человеческого белка и их комбинации могут быть выбраны для избежания эпитопов В-клеток и других эпитопов, таких как МНС класс I-ограниченные эпитопы, для избежания аминокислотных последовательностей, которые могут быть вредны для экспрессии гуманизированного антитела, для избежания последовательностей, которые могут направлять неподходящую модификацию гуманизированных антител, такую как N-гликозилирование, для включения определенных функций, таких как хелперы эпитопы Т-клеток и/или эпитопы В-клеток (например, в применении к вакцине), для последующей конъюгации с другими компонентами и для гаммы других критериев. Необходимо упомянуть, что используемый здесь термин ″эпитопы Т-клеток″ относится к антигенным детерминантам, распознаваемым и связываемым рецептором Т-клеток. Эпитопы, распознаваемые рецептором Т-клеток, часто расположены на внутренней, закрытой стороне антигена и становятся доступными для рецептора Т-клеток после протеолитической обработки антигена. Распознавание МНС-ограниченного антигена или МНС-ограничение относится к тому факту, что данная Т-клетка будет распознавать антиген пептида только тогда, когда он связан с конкретной молекулой МНС. Обычно, когда Т-клетки стимулируются только в присутствии молекул МНС, антиген распознается только как пептиды, связанные с молекулами МНС.
В одном варианте осуществления вариабельные участки тяжелой и легкой цепей анти-пептид-6 гуманизированного антитела или его фрагмент, связывающий антиген, получены полностью из одного или нескольких человеческих антител, как описано в документе WO2006/08246. В другом варианте осуществления вариабельные участки состоят из сегментов аминокислотной последовательности из одного или нескольких человеческих антител. В еще одном варианте осуществления человеческие сегменты являются двумя или больше аминокислотами по длине. В одном варианте осуществления человеческие сегменты являются 100 или меньше аминокислотами по длине, в других вариантах осуществления человеческие сегменты являются 50 или меньше, 40 или меньше, 30 или меньше, 20 или меньше, 15 или меньше, 10 или меньше, 9 или меньше, 8 или меньше, 7 или меньше, 6 или меньше, 5 или меньше, 4 или меньше, или 3 или меньше аминокислотами по длине. Примеры таких сегментов показаны на Фиг. 4.
Таким образом, согласно первому аспекту, изобретение относится к изолированному и очищенному гуманизированному антителу или любому его связывающему антиген фрагменту, который специфически связывает полипептид, включающий SEQ ID NO: 15.
Согласно одному варианту осуществления, гуманизированное антитело изобретения включает:
(а) вариабельный участок тяжелой цепи, который включает Cys в положении Н22, Ser в Н23, Gly в Н26, Phe в Н27, Ser в Н28, Leu в Н29, Ser в Н30, Thr в Н31, Ser в Н32, Asn в Н33, Met в Н34, Gly в Н35, Val в Н35А, Gly в Н35 В, Leu в Н48, His в Н50, Ile в Н51, Leu в Н52, Trp в Н53, Asn в Н54, Asp в Н55, Ser в Н56, Lys в Н57, Tyr в Н58, Tyr в Н59, Asn в Н60, Pro в Н61, Ala в Н62, Leu в Н63, Lys в Н64, Ser в Н65, Cys в Н92, Met в Н95, Gly в Н96, Gly в Н97, Tyr в Н98, Tyr в Н99, Gly в Н100, Asn в Н100А, Tyr в Н100 В, Gly в Н100С, Tyr в H100D, Tyr в Н100Е, Ala в H100F, Met в H100G, Asp в Н101 и Tyr в Н102 и, по выбору, по меньшей мере одну из Leu в Н49, Tyr в Н74, Ile в H11, Ser в H41 и Ser в Н108; и
(b) вариабельный участок легкой цепи, который включает Gln в положении L1, Cys в L23, Thr в L24, Ala в L25, Ser в L26, Ser в L27, Ser в L27A, Val в L28, Ser в L29, Ser в L30, Ser в L31, Tyr в L32, Leu в L33, His в L34, Trp в L47, Ser в L50, Thr в L51, Ser в L52, Asn в L53, Leu в L54, Ala в L55, Ser в L56, Tyr в L71, Cys в L88, His в L89, Gln в L90, Tyr в L91, His в L92, Arg в L93, Ser в L94, Pro в L95, Pro в L96 и Thr в L97 и, по выбору, по меньшей мере одну из Met в L21, Ile в L10 и Ala в L80.
Необходимо понимать, что все указанные положения определены согласно системе нумерации Кабата.
Необходимо отметить, что согласно некоторым вариантам осуществления, ограничивающие аминокислотные остатки, специфически остатки Ser в L27, Ser в L27A, Val в L28, Ser в L29, Ser в L30, Ser в L31 вариабельного участка легкой цепи, могут быть пронумерованы согласно нумерации, показанной на Фиг. 1В, следующим образом: Ser в L27, Ser в L28, Val в L29, Ser в L30, Ser в L30A.
Кроме того необходимо отметить, что аминокислотные остатки, указанные выше, были идентифицированы настоящим изобретением как ″ограничивающие″ аминокислоты, которые вовлечены в распознавание эпитопа, пептида-6 (SEQ ID NO. 15). Эти остатки также присутствуют в соответствующем контрольном мышином антителе, имеющем вариабельный участок тяжелой цепи, обозначенный SEQ ID NO. 1, и вариабельный участок легкой цепи, обозначенный SEQ ID NO. 2. Поэтому, согласно одному варианту осуществления, вариабельный участок тяжелой цепи гуманизированного антитела изобретения включает по меньшей мере 30% идентичности с SEQ ID NO. 1, и вариабельный участок легкой цепи включает по меньшей мере 25% идентичности с SEQ ID NO 2 мышиных контрольных вариабельных участков.
Опытный специалист поймет, что числа положений тяжелой и легкой цепей обозначены в соответствии с обычными схемами нумерации, например, схемой нумерации Кабата и Чотия (Chothia). Система нумерации по Чотия идентична системе по Кабату, но помещает вставки в CDR-L1 и CDR-H1 в структурно разные положения. Если не указано иное, здесь использована система нумерации Кабата в отношении положений в последовательности. Положение аминокислотного остатка в конкретной Vh или Vl последовательности не относится к количеству аминокислот в конкретной последовательности, а относится к положению, обозначенному со ссылкой на систему нумерации.
Положения участков CDR и, следовательно, положений каркасных участков тяжелой цепи и легких цепей человека определены с использованием определений, которые являются стандартными в данной области. Например, обычно используются следующие четыре определения. Определение Кабата основано на вариабельности последовательности и является наиболее обычным. Определение Чотия основано на месте участков структурной петли. Определение AbM является компромиссом между этими двумя, используемыми программным обеспечением, моделирующим антитело AbM Oxford Molecular. Недавно введено контактное определение, которое основано на анализе имеющихся комплексных кристаллических структур.
Например, каркас легкой цепи изобретения обычно включает остатки 1-23, 35-49, 57-88 и 98-109 (или 98 до С-терминального остатка, например, 98-108), используя нумерацию по Кабату. Специалисту в данной области будет понятно, что эти числа могут не относиться к количеству аминокислот в последовательности Vh или Vl, а к положениям остатков, используя систему нумерации Кабата (или другую систему нумерации).
Термин ″антитело″ относится к полипептиду, кодированному геном иммуноглобулина или его функциональными фрагментами, которые специфически связывают и распознают антиген (т.е., фрагментами, связывающими антиген, которые определены ниже). Распознаваемые гены иммуноглобулина включают kappa, лямбда, альфа, гамма, дельта, ипсилон и мю гены постоянного участка, а также мириадные гены вариабельного участка иммуноглобулина. Легкие цепи классифицируются как kappa или лямбда. Тяжелые цепи классифицируются как гамма, мю, альфа, дельта или ипсилон, которые в свою очередь определяют классы иммуноглобулина, IgG, IgM, IgA, IgD и IgE, соответственно.
L
H
Пример структурной единицы иммуноглобулина (антитела) содержит тетрамер. Каждый тетрамер состоит из двух идентичных пар полипептидных цепей, при этом каждая пара имеет одну ″легкую″ (приблизительно в 25 кДа) и одну ″тяжелую″ цепь (приблизительно в 50-70 кДа). N-конец каждой цепи определяет вариабельный участок приблизительно 100-110 или больше аминокислот, ответственных главным образом за распознание антигена. Термины ″вариабельная легкая цепь″ (V) и вариабельная тяжелая цепь (V) относятся к этим легкой и тяжелой цепи, соответственно. Более конкретно, вариабельный участок разделен на гипервариабельный и каркасный (FR) участки. Гипервариабельные участки имеют высокое отношение разных аминокислот в каком-то данном положении относительно наиболее общей аминокислоты в этом положении. В легких и тяжелых цепях существуют три гипервариабельных участка. Четыре FR участка, которые имеют более стабильные аминокислотные последовательности, разделяют гипервариабельные участки. Гипервариабельные участки непосредственно контактируют с частью поверхности антигена. По этой причине гипервариабельные участки именуются здесь ″определяющие комплементарность участки″, или ″участки CDR″. Участки FR формируют структуру бета-листа, который служит в качестве клеточного каркаса для удержания гипервариабельных участков в положении контакта с антигеном.
От N-конца до С-конца легкая и тяжелая цепи включают домены FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. Участки CDR главным образом ответственны за связывание с эпитопом антигена. Участки CDR каждой цепи обычно называются CDR1, CDR2 и CDR3, с последовательной нумерацией, начиная с N-конца, а также обычно определяются цепью, в которой расположен конкретный участок CDR. Таким образом, Vh CDR3 расположен в вариабельном домене тяжелой цепи антитела, в котором он находится, тогда как VICDR1 является участком CDR1 из вариабельного домена легкой цепи антитела, в котором он находится. Нумерация вариабельных участков тяжелой и легкой цепей, описанная здесь, соответствует Кабату [см., например, Johnson et al., (2001) ″Kabat Database and its applications: future directions″ Nucleic Acids Research, 29: 205206; и the Kabat Database Sequences of Proteins of Immunological Interest, Feb. 22, 2002 Dataset], если не указано иное.
″Каркас″ Vh или Vl цепи относится к каркасным участкам цепи. Этот термин в применении к каждой цепи охватывает все каркасные участки.
Используемый здесь термин ″гуманизированное антитело″ относится к антителу, которое включает связывающую специфичность контрольного антитела, т.е., участки CDR, которые по существу идентичны таковым контрольного антитела, обычно мышиного моноклонального антитела. Более конкретно, согласно настоящему изобретению, контрольное антитело может быть моноклональным мышиным антипептид-6 антителом, имеющим вариабельные участки SEQ ID NO. 1 и 2 тяжелой и легкой цепи, соответственно. Используемое здесь ″гуманизированное антитело″ связывается с тем же эпитопом, что и контрольное антитело, и обычно имеет по меньшей мере 25% связывающего сродства. Пример анализа связывающего сродства описан в Примере 2 (Фиг. 7). Способы определения того, связывается ли антитело с тем же эпитопом, хорошо известны в данной области, смотрите, например, Harlow & Lane, Using Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999, где раскрыты способы картирования эпитопов или, альтернативно, конкурентные эксперименты для определения того, связывается ли антитело с тем же эпитопом, что и контрольное антитело.
L
H
2
Как сказано выше, согласно некоторым вариантам осуществления, изобретение предлагает гуманизированное анти-пептид-6 антитело и любой его фрагмент, связывающий антиген. Термин ″фрагмент, связьшающий антиген″ относится к любой части антитела, которая удерживает связь с антигеном. Примеры функциональных фрагментов антитела включают, но без ограничения, полные молекулы антитела, фрагменты антитела, такие как Fv, Fv (scFv) одной цепи, определяющие комплементарность участки (CDR), V (вариабельный участок легкой цепи), V (вариабельный участок тяжелой цепи), Fab, F(ab)′ и любую их комбинацию или любую другую функциональную часть пептида иммуноглобулина, способного связываться с целевым антигеном. Специалисту в данной области будет понятно, что разные фрагменты антитела могут быть получены разными способами, например, ферментацией интактного антитела ферментом, таким пепсин, или синтезом de novo. Фрагменты антитела часто синтезируют de novo химически или используя технологию рекомбинантной ДНК. Таким образом, используемый здесь термин ″антитело″, включает фрагменты антитела, произведенные модификацией всего антитела или синтезированные de novo с использованием технологии рекомбинантной ДНК (например, одинарная цепь Fv) или идентифицированные с использованием фаг-дисплейных библиотек. Термин ″антитело″ также включает бивалентные молекулы, диатела, триатела и тетратела.
Ссылки на ″Vh″ или ″VH″ относятся к вариабельному участку тяжелой цепи иммуноглобулина, включая Fv, scFv, дисульфид-стабилизированному Fv (dsFv) или Fab. Ссылки на ″Vl″ или ″VL″ относятся к вариабельному участку легкой цепи иммуноглобулина, включая Fv, scFv, dsFv или Fab.
Более конкретно, фраза ″одинарная цепь Fv″ или ″scFv″ относится к антителу, в котором вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи традиционного антитела с двумя цепями соединены для образования одной цепи. Обычно линкерный пептид вводят между этими двумя цепями, чтобы позволить стабилизировать вариабельные домены, не мешая укладке и созданию активного связывающего сайта. Гуманизированное антитело изобретения с одинарной цепью, например, гуманизированное антипептид-6 антитело, может связываться как мономер. Другие примеры антитела с одинарной цепью могут образовывать диатела, триатела и тетратела.
2
Кроме того, гуманизированные антитела изобретения, например, гуманизированное пептид-6 антитело, может также образовывать один компонент ″реконструированного″ антитела или фрагмента антитела, например, Fab, мономер Fab′, димер F(ab) или полную молекулу иммуноглобулина. Необходимо отметить, что гуманизированное антитело настоящего изобретения может кроме того включать человеческий Fc участок.
Согласно некоторым вариантам осуществления, изобретение предлагает гуманизированное антитело, которое специфически распознает полипептид SEQ ID NO. 15 (пептид-6), или любую последовательность, содержащую пептид-6, например, последовательность SEQ ID NO. 98. В некоторых вариантах осуществления, гуманизированное антитело изобретения также может распознавать последовательность, содержащую фрагмент SEQ ID NO. 15. Не ограничивающий пример такого фрагмента обозначен SEQ ID NO. 101 (обозначен как пептид-7).
Поэтому необходимо отметить, что термин ″специфичность связывания″, ″специфически связывается с антигеном″, ″специфически иммуно-реактивный с″, ″специфически направленный против″ или ″специфически распознает″ в применении к эпи-топу относится к реакции связывания, которая определяет присутствие эпитопа в гетерогенной популяции белков и других биологий. Таким образом, в указанных условиях иммуноанализа указанные антитела связываются с конкретным эпитопом по меньшей мере в два раза больше фенотипа и, более типично больше чем в 10-100 раз больше фенотипа. Разные форматы иммуноанализа могут быть использованы для выбора антитела, специфически иммунореактивного с конкретным белком или углеводом. Например, твердофазные ИФА иммуноанализы обычно используют для выбора антител, специфически иммунореактивных с белком или углеводом. Термин ″эпитоп″ относится к той части любой молекулы, способной быть связанной антителом, которая также может быть распознана таким антителом. Эпитопы или ″антигенные детерминанты″ обычно состоят из химически активных поверхностных групп молекул, таких как аминокислоты или боковые цепи сахара, и имеют специфические трехмерные структурные характеристики, а также специфические зарядовые характеристики.
Как сказано выше, в некоторых вариантах осуществления изобретение предлагает изолированные и очищенные гуманизированные антитела. Используемые здесь термины ″изолированные″ или ″в сущности очищенные″ в контексте антитела или молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело, означают, что антитело или нуклеиновая кислота удалена из ее естественной среды или изменена по сравнению с ее естественным состоянием. Как таковой, термин ″изолированные″ необязательно отражает степень очистки антитела или молекулы нуклеиновой кислоты. Однако, необходимо понимать, что антитело или молекула нуклеиновой кислоты, которая очищена до некоторой степени, является ″изолированной″. Если антитело или молекула нуклеиновой кислоты не существует в естественной среде, т.е., не существует в природе, молекула является ″изолированной″ независимо от того, где она присутствует. Для примера, гуманизированное антитело, которое в естественных условиях не существует в человеке, является ″изолированным″, даже когда оно присутствует в человеке.
Кроме того, термины ″изолированные″ или ″в сущности очищенные″ в применении к нуклеиновой кислоте или белку означают, что нуклеиновая кислота или белок в сущности не содержит других клеточных компонентов, с которыми они связаны в естественном состоянии. Они предпочтительно находятся в гомогенном состоянии, хотя могут быть либо сухими, либо в водном растворе. Чистоту и гомогенность обычно определяют, используя методы аналитической химии, такие как электрофорез на полиакриламидном геле или жидкостная хроматография высокого разрешения. Белок, который является доминирующим видом, присутствующим в препарате, является в сущности очищенным.
Как показано на Фиг. 4 и в Таблице 3, вариабельные участки гуманизированных антител изобретения состоят из разных сегментов, полученных из разных человеческих антител и объединенных для создания вариабельных участков тяжелой и легкой цепей антитела изобретения. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления вариабельные участки тяжелой и легкой цепей упомянутого гуманизированного антитела состоят по меньшей мере из двух и больше сегментов по меньшей мере двух и больше человеческих антител, создавая гуманизированное антитело, которое полностью состоит из сегментов человеческого происхождения. Необходимо отметить, что такие сегменты не являются ни полными участками CDR, ни каркасными участками.
В контексте настоящего изобретения термин ″сегменты″ относится к заменимой аминокислотной последовательности, находящейся в молекуле антитела, при этом такие сегменты имеют размер от 2 до 125 аминокислот в длину, предпочтительно от 2 до 31 аминокислот в длину, и такие сегменты не являются ни участками CDR, ни целыми каркасными участками. Как показано на Фиг. 4, гуманизированные антитела настоящего изобретения обычно будут объединять два или больше сегментов аминокислотной последовательности из разных человеческих антител в вариабельных участках гуманизированного антитела. В частности, настоящее изобретение относится к вариабельным участкам тяжелой и легкой цепи гуманизированного антитела (VH и VL, соответственно), где каждый VH и VL полностью состоит из сегментов последовательности из двух или больше вариабельных участков человеческого антитела, и где обычно каждый составной VH и VL включает сегменты в положениях последовательности человеческих вариабельных участков, соответствующие их положениям в исходных участках VH и VL в исходном человеческом антителе, например, аминокислоты 1-10 в составной последовательности VH будут происходить из аминокислот 1-10 в человеческом антителе. Альтернативно, сегменты человеческой VH или VL последовательности в гуманизированном антителе изобретения могут быть расположены в любом месте последовательности, независимо от положения последовательности в исходном VH или VL человеческого антитела. Исходные участки VH и VL человеческого антитела будут любой существующей аминокислотной последовательностью вариабельного (V) участка человеческого антитела, например, которая представлена в базах данных последовательностей V-участков человеческих моноклональных антител, и может включать последовательности из созревших в сродстве антител с соматическими мутациями V-участка и другими вариациями, отличающимися от зародышевой линии, последовательностей из В-участков зародышевой линии, последовательностей из искусственно сконструированных В-участков антитела, созданных из сегментов последовательности из антител этих видов, таких как антитела с набором фиксированных каркасов V-участков, но с вариабельными участками CDR, последовательностей, выбранных из библиотек человеческих антител, таких как фаг-дисплейные библиотеки, и последовательностей человеческих антител, полученных от трансгенных животных, экспрессирующих гены, кодирующие человеческие антитела или фрагменты антител.
Более конкретно, как показано на Фиг. 4 и в Таблице 3, согласно одному варианту осуществления вариабельный участок тяжелой цепи гуманизированного антитела изобретения может включать:
a) каркасный участок 1 (FR1), включающий аминокислотную последовательность сегментов SEQ ID NO. 12 и SEQ ID NO. 13 или любую ее часть; или сегменты SEQ ID NO. 40 и SEQ ID NO. 13 или любую их часть;
b) определяющий комплементарность участок 1 (CDR1), включающий аминокислотную последовательность сегментов SEQ ID NO. 13 или любую ее часть и SEQ ID NO. 14 или любую ее часть;
c) FR2, включающий аминокислотную последовательность сегментов SEQ ID NO. 16, SEQ ID NO. 14 и SEQ ID NO. 17 или любую ее часть или сегментов SEQ ID NO. 41, SEQ ID NO. 14 и SEQ ID NO. 17 или сегментов SEQ ID NO. 41, SEQ ID NO. 14 и SEQ ID NO. 44;
d) CDR2, включающий аминокислотную последовательность сегментов SEQ ID NO. 18 и SEQ ID NO. 19 или любую ее часть;
e) FR3, включающий аминокислотную последовательность сегментов SEQ ID NO. 34, SEQ ID NO. 19, SEQ ID NO. 35 и SEQ ID NO. 36 или любую ее часть или сегментов SEQ ID NO. 43, SEQ ID NO. 19 и SEQ ID NO. 36 или любую ее часть;
f) CDR3, включающий аминокислотную последовательность сегментов SEQ ID NO. 36 или любую ее часть, SEQ ID NO. 37 и SEQ ID NO. 38 или любую ее часть или сегментов SEQ ID NO. 36 или любую ее часть, SEQ ID NO. 37 и SEQ ID NO. 42 или любую ее часть, или сегментов SEQ ID NO. 36 или любую ее часть, SEQ ID NO. 96 и SEQ ID NO. 42 или любую ее часть; и
g) FR4, включающий аминокислотную последовательность сегментов SEQ ID NO. 38 или любую ее часть и SEQ ID NO: 39 или сегмента SEQ ID NO. 42 или любую ее часть;
Необходимо отметить, что вариабельный участок тяжелой цепи включает замещение по меньшей мере в одном положении, выбираемом из группы, состоящей из Н10, H11, Н12, Н13, Н15, Н19, Н41, Н49, Н74, Н75, Н79, Н81, Н82, Н82А, Н82С, Н84, Н85 и H108, при этом положения определены согласно системе нумерации по Кабату.
Согласно еще одному варианту осуществления, вариабельный участок легкой цепи упомянутого составного антитела, показанного на Фиг. 4 и в Таблице 3, включает:
a) FR1, включающий аминокислотную последовательность сегментов SEQ ID NO. 45, SEQ ID NO. 46 и SEQ ID NO. 47 или любую ее часть или сегментов SEQ ID NO. 45, SEQ ID NO. 57 и SEQ ID NO. 47 или любую ее часть или сегментов SEQ ID NO. 45 и SEQ ID NO. 97 или любую ее часть;
b) CDR1, включающий аминокислотную последовательность сегментов SEQ ID NO. 47 или любую ее часть, SEQ ID NO. 48 и SEQ ID NO. 49 или любую ее часть, или сегментов SEQ ID NO. 97 или любую ее часть, SEQ ID NO. 48 и SEQ ID NO. 49 или любую ее часть;
c) FR2, включающий аминокислотную последовательность сегментов SEQ ID NO. 49 или любую ее часть, SEQ ID NO. 50 или любую ее часть и SEQ ID NO. 51 или любую ее часть;
d) CDR2, включающий аминокислотную последовательность сегментов SEQ ID NO. 50 или любую ее часть, SEQ ID NO. 51 или любую ее часть и SEQ ID NO. 52 или любую ее часть;
e) FR3, включающий аминокислотную последовательность сегментов SEQ ID NO. 52 или любую ее часть, SEQ ID NO. 53 или любую ее часть, SEQ ID NO. 54 или любую ее часть и SEQ ID NO. 55 или любую ее часть или сегментов SEQ ID NO. 52 или любую ее часть, SEQ ID NO. 58 или любую ее часть и SEQ ID NO. 59 или любую ее часть;
f) CDR3, включающий аминокислотную последовательность сегментов SEQ ID NO. 54 или любую ее часть, SEQ ID NO. 55 или любую ее часть и SEQ ID NO. 56 или любую ее часть или сегментов SEQ ID NO. 58 или любую ее часть, SEQ ID NO. 59 или любую ее часть и SEQ ID NO. 56 или любую ее часть; и
g) FR4, включающий аминокислотную последовательность сегмента SEQ ID NO. 56 или любую ее часть. Согласно еще одному варианту осуществления, вариабельный участок легкой цепи может включать замещение по меньшей мере в одном положении, выбираемом из группы, состоящей из L10, L11, L13, L15, L19, L21, L22, L42, L43, L60, L70, L72, L78, L79, L80, L83 и L100, при этом эти положения определены согласно системе нумерации по Кабату.
Следует понимать, что согласно некоторым вариантам осуществления гуманизированные антитела изобретения сконструированы путем объединения многочисленных сегментов VH и VL человеческой последовательности, раскрытой в Таблице 3, в сочетаниях, которые ограничивают или избегают человеческих эпитопов Т-клеток в конечных В-участках гуманизированного антитела. Устранение эпитопов Т-клеток снижает иммуногенность составного гуманизированного антитела.
Человеческими эпитопами Т-клеток в этом отношении являются аминокислотные последовательности, которые могут связываться с человеческими молекулами МНС класса II и, посредством представления Т-клеткам CD4, индуцируют реакцию хелпера Т-клетки. Могут быть выбраны сегменты VH и VL человеческой последовательности и сочетания сегментов, которые ограничивают или избегают эпитопов Т-клеток в конечном гуманизированном антителе. Это может быть достигнуто путем использования сегментов, которые не содержат эпитопы Т-клеток, таких как из последовательностей человеческих зародышевых линий, и путем соединения смежных сегментов для создания новой последовательности, которая не содержит эпитопы Т-клеток, например, путем создания последовательности, не связывающейся с МНС в месте соединения двух сегментов, путем создания еще одной последовательности человеческой зародышевой линии, или путем создания последовательности, которая не индуцирует реакцию хелпера Т-клетки, несмотря на последовательность не зародышевой линии.
Таким образом, согласно одному варианту осуществления, вариабельные участки и тяжелой, и легкой цепей гуманизированного антитела изобретения лишены эпитопов человеческих Т-клеток. Более конкретно, приблизительно от 70% до 99%, от 75% до 99%, от 80% до 99%, от 85% до 99%, специфически от 90 до 99%, более конкретно 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% всех возможных эпитопов Т-клеток удалены при объединении всех человеческих сегментов, чтобы создать конечные гуманизированные антитела изобретения.
Термин ″иммуногенность″ относится к способности антитела или фрагмента, связывающего антиген, устранять иммунную реакцию (гуморальную или клеточную) при введении пациенту и включает, например, реакцию НАМА (человеческого антимышиного антитела). Реакция НАМА инициируется, когда Т-клетки из субъекта вызывают иммунную реакцию на введенное антитело. Затем Т-клетки рекрутируют В-клетки для генерации специфического ″анти-антитело″ антитела.
Как сказано выше, гуманизированное антитело изобретения включает гуманизированную тяжелую цепь и гуманизированную легкую цепь. Вариабельные участки тяжелой цеп и легкой цепи состоят из объединенных сегментов человеческого происхождения. Согласно одному конкретному варианту осуществления, гуманизированная легкая цепь включает три определяющих комплементарность участка (CDR1, CDR2 и CDR3), имеющих аминокислотные последовательности, которые в сущности идентичны, по меньшей мере приблизительно на 60%-95%, соответствующим определяющим комплементарность участкам контрольного мышиного анти-пептид-6 антитела. Согласно одному конкретному варианту осуществления, контрольное мышиное антипептид-6 антитело имеет вариабельные тяжелую и легкую цепи, включающие аминокислотные последовательности SEQ ID NO. 1 и 2, соответственно.
В еще одном конкретном варианте осуществления гуманизированное антитело изобретения включает вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий CDR1, CDR2 и CDR3, которые показаны в SEQ ID NO: 1, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий CDR1, CDR2 и CDR3, которые показаны в SEQ ID NO: 2, контрольных мышиных вариабельных участков.
Таким образом, в одном конкретном варианте осуществления гуманизированное антитело изобретения может включать: (а) вариабельный участок тяжелой цепи, который, по меньшей мере приблизительно на 70%, идентичен SEQ ID NO. 1 контрольного мышиного антитела; и (b) вариабельный участок легкой цепи, который, по меньшей мере приблизительно на 70%, идентичен SEQ ID NO. 2 контрольного мышиного антитела. Более конкретно, тяжелый и легкий вариабельные участки гуманизированного антитела изобретения могут быть приблизительно на 70%-85% идентичны вариабельным участкам контрольных мышиных тяжелой и легкой цепей SEQ ID NO. 1 и 2, соответственно. Более конкретно, такая идентичность аминокислотной последовательности может составлять по меньшей мере 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84% или 85%.
Термины ″идентичный″, ″существенная идентичность″, ″существенная гомология″ или ″идентичность в процентах″ в контексте двух или больше нуклеиновых кислот или полипептидных последовательностей относятся к двум или больше последовательностям или суб-последовательностям, которые такие же или имеют определенный процент аминокислотных остатков, или нуклеотидам, которые являются такими же (т.е., приблизительно, идентичность 60%, предпочтительно 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или больше в определенном участке (например, аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 1 или 2), когда их сравнивают и выравнивают для максимального соответствия в окне сравнения или назначенной области) при измерении с использованием алгоритмов BLAST или BLAST 2.0 для сравнения последовательностей с описанными ниже параметрами по умолчанию или путем ручного выравнивания и визуальной проверки. Такие последовательности затем, как говорят, являются ″в сущности идентичными″. Это определение также относится или может быть применено к комплименту тестовой последовательности. Это определение также включает последовательности, которые имеют изъятия и/или добавления, а также те, которые имеют замещения. Как сказано ниже, предпочтительные алгоритмы могут учитывать пробелы и т.п. Предпочтительно, идентичность существует на участке, который равен по длине по меньшей мере приблизительно 25 аминокислотам или нуклеотидам, или, более предпочтительно, на участке, который равен по длине 50-100 аминокислотам или нуклеотидам.
Для сравнения последовательностей обычно одна последовательность действует как контрольная, с которой сравнивают испытываемые последовательности. При использовании алгоритма сравнения последовательностей испытываемые и контрольную последовательности вводят в компьютер, при необходимости обозначают координаты суб-последовательности, и обозначают параметры программы-алгоритма последовательностей. Предпочтительно, можно использовать параметры программы по умолчанию или назначить альтернативные параметры. Алгоритм сравнения последовательностей затем вычисляет идентичность последовательностей в процентах для испытываемых последовательностей по отношению к контрольной последовательности на основании параметров программы.
Кроме того, гуманизированное антитело изобретения включать вариабельный участок тяжелой цепи, который по меньшей мере приблизительно на 30%-70% идентичен контрольному мышиному вариабельному участку тяжелой цепи SEQ ID NO. 1, более конкретно, по меньшей мере приблизительно на 40%, 50%, 60%, 65% или 70% идентичен контрольному мышиному вариабельному участку тяжелой цепи SEQ ID NO. 1. В одном конкретном варианте осуществления гуманизированное антитело изобретения может включать вариабельный участок тяжелой цепи, который по меньшей мере приблизительно на 70% идентичен контрольному мышиному вариабельному участку тяжелой цепи SEQ ID NO. 1, имеющему замещение по меньшей мере в одном положении, выбираемом из группы, состоящей из Н10, H11, Н12, Н13, Н15, Н19, Н41, Н49, Н74, Н75, Н79, Н81, Н82, Н82А, Н82С, Н84, Н85 и Н108. Вариабельный участок легкой цепи гуманизированного антитела изобретения может быть по меньшей мере приблизительно на 70% идентичен контрольному мышиному вариабельному участку тяжелой цепи SEQ ID NO. 2 и включает замещение по меньшей мере в одном положении, выбираемом из группы, состоящей из L10, L11, L13, L15, L19, L21, L22, L42, L43, L60, L70, L72, L78, L79, L80, L83 и L100. Как сказано выше, все указанные положения определены согласно системе нумерации по Кабату.
В одном варианте осуществления вариабельные участки тяжелой и легкой цепей анти-пептид-6 гуманизированного антитела или его фрагмента, связывающего антиген имеют 18 или меньше аминокислотных замещений по сравнению с контрольным мышиным или родительским антителом, которое связывает пептид-6 (SEQ ID NO. 15), или любой пептид, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO. 15, например, пептид SEQ ID NO. 98, или пептид, включающий фрагмент SEQ ID NO. 15, например, последовательность, обозначаемую SEQ ID NO. 101. В другом варианте осуществления вариабельные участки тяжелой и легкой цепей анти-пептид-6 гуманизированного антитела имеют 17 или меньше, 16 или меньше, 15 или меньше, 14 или меньше, 13 или меньше, 12 или меньше, 11 или меньше, 10 или меньше, 9 или меньше, 8 или меньше, или 7 или меньше аминокислотных замещений в указанных положениях по сравнению с контрольным мышиным анти-пептид-6 антителом. В одном варианте осуществления вариабельные участки тяжелой и легкой цепей имеют по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, или по меньшей мере 13 аминокислотных замещений, специфически в положениях, указанных выше, по сравнению с контрольным мышиным анти-пептид-6 антителом, которое имеет вариабельные участки тяжелой и легкой цепей SEQ ID NO. 1 и 2, соответственно.
По отношению к аминокислотным последовательностям специалист поймет, что отдельные замещения, изъятия или добавления к нуклеинокислотной, пептидной, полипептидной или белковой последовательности, которая изменяет, добавляет или убирает одну аминокислоту или небольшой процент аминокислот в кодируемой последовательности, является ″консервативно модифицированным вариантом″, где изменение приводит к замещению аминокислоты химически подобной аминокислотой. Таблицы консервативных замещений с функционально подобными аминокислотами хорошо известны в данной области. Такие консервативно модифицированные варианты являются дополнением и не исключают полиморфные варианты, межвидовые гомологии и аллели изобретения.
Например, могут быть сделаны замещения, при которых алифатическую аминокислоту (G, A, I, L или V) замещают другим элементом группы, или может быть сделано замещение, такое как замещение одного полярного остатка другим, например, аргинина вместо лизина, глутаминовой кислоты вместо аспарагиновой кислоты или глутамина вместо аспарагина. Каждая из следующих восьми групп включает другие примеры аминокислот, которые являются консервативными замещениями одна другой:
1) аланин (А), глицин (G);
2) аспарагиновая кислота (D), глутаминовая кислота (Е);
3) аспарагин (N), глутамин (Q);
4) аргинин (R), лизин (K);
5) изолейцин (I), лейцин (L), метионин (М), валин (V);
6) фенилаланин (F), тирозин (Y), триптофан (W);
7) серии (S), треонин (Т); и
8) цистеин (С), метионин (М).
Согласно одному конкретному варианту осуществления, гуманизированное антитело изобретения включает:
(a) вариабельный участок тяжелой цепи, который показан в SEQ ID NO: 1, за тем исключением, что Н10 - Ala, H11 - Ile или Leu, Н12 - Val, Н13 - Lys, Н15 - Thr, H19 - Thr, H41 - Ser или Ala, H49 - Leu или Ala, H74 - Tyr или Ser, H75 - Lys, H79 - Val, H81 - Thr, H82 - Met, H82A - Thr, H82C - Met, H84 - Pro, H85 - Val и H108 - Ser или Leu; и
(b) вариабельный участок легкой цепи, который показан в SEQ ID NO: 2, за тем исключением, что L10 - Ile или Thr, L11 - Leu, L13 - Leu, L15 - Pro, L19 - Ala, L21 - Met или Leu, L22 - Ser, L42 - Lys, L43 - Ala, L60 - Ser, L70 - Asp, L72 - Thr, L78 - Leu, L79 - Gln, L80 - Ala или Pro, L83 - Phe и L100 - Gln. Эти положения определены согласно системе нумерации по Кабату.
Более конкретно, изобретение предлагает гуманизированное антитело, включающее:
(a) вариабельный участок тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность любого одного из SEQ ID NO. 21, 22, 23 и 20 или любой ее вариант. Такой вариант может включать замещение по меньшей мере в одном положении, выбираемом из группы, состоящей из Н10, H11, Н12, Н13, Н15, Н19, Н41, Н49, Н74, Н75, Н79, Н81, Н82, Н82А, Н82С, Н84, Н85 и H108; и
(b) вариабельный участок легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность любого одного из SEQ ID NO. 26, 24 и 25 или любой ее вариант. Такой вариант может включать замещение по меньшей мере в одном положении, выбираемом из группы, состоящей из L10, L11, L13, L15, L19, L21, L22, L42, L43, L60, L70, L72, L78, L79, L80, L83 и L100 (согласно системе нумерации по Кабату).
Варианты гуманизированных антител изобретения могут иметь сходство последовательности по меньшей мере на 80%, часто сходство последовательности по меньшей мере на 85%, сходство последовательности на 90% или сходство последовательности по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% на уровне аминокислоты, с представляющим интерес белком, таким как разные варианты гуманизированного анти-пептид-6 антитела изобретения.
Как сказано выше, термин ″варианты″ может быть применен к аминокислотным и нуклеинокислотным последовательностям. По отношению к конкретным нуклеинокислотным последовательностям предпочтительны консервативно модифицированные варианты. Эти варианты относятся к тем нуклеинокислотным последовательностям, которые кодируют идентичные или в сущности идентичные аминокислотные последовательности или, если нуклеиновая кислота не кодирует аминокислотную последовательность, к в сущности идентичным нуклеинокислотным последовательностям. Из-за вырожденности генетического кода большое число функционально идентичных нуклеиновых кислот кодируют любой данный полипептид. Например, кодоны GCA, GCC, GCG и GCU все кодируют аланин. Таким образом, в каждом положении, где аланин определен кодоном, кодон может быть изменен на любой из соответствующих описанных кодонов без изменения кодированного полипептида. Такие вариации нуклеиновой кислоты являются ″молчащими вариациями″, которые являются одним видом консервативно модифицированных вариаций. В настоящем документе каждая нуклеинокислотная последовательность, которая кодирует полипептид, также описывает каждую возможную молчащую вариацию нуклеиновой кислоты. Специалист поймет, что каждый кодон в нуклеиновой кислоте (за исключением AUG, который обычно является единственным кодоном для метионина) может быть модифицирован для получения функционально идентичной молекулы. Соответственно, каждая молчащая вариация нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид, подразумевается в каждой описанной последовательности.
Следует понимать, что аминокислоты для замещения выбирают на основании их возможного влияния на конформацию CDR и/или связывания с пептид-6 антигеном. Исследование таких возможных влияний осуществляют путем моделирования, изучения характеристик аминокислот в конкретных местах или путем эмпирического наблюдения за эффектами замещения или мутагенеза конкретных аминокислот.
Обычно участки CDR в гуманизированных антителах в сущности идентичны и, более обычно, идентичны соответствующим участкам CDR в контрольном мышином антителе. Хотя это обычно нежелательно, иногда можно осуществить одно или больше консервативных аминокислотных замещений остатков CDR без значительного влияния на связывающее сродство получаемого гуманизированного иммуноглобулина. В некоторых случаях замещения участков CDR может усилить связывающее сродство.
В одном конкретном варианте осуществления изобретение относится к гуманизированному антителу, имеющему вариабельный участок тяжелой цепи, выбираемый из группы, состоящей из SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 и SEQ ID NO: 20. Согласно еще одному конкретному варианту осуществления, вариабельный участок легкой цепи такого гуманизированного антитела можно выбирать из группы, состоящей из SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 24 и SEQ ID NO: 25.
В разных вариантах осуществления представленное здесь гуманизированное анти-пептид-6 антитело включает вариабельный участок тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21,22,23 и 20 или аминокислотную последовательность имеющую идентичность последовательности 60% или больше, 70% или больше, 80% или больше, 85% или больше, 90% или больше, 95% или больше, 98% или больше или 99% или больше с SEQ ID NO: 21, 22, 23 и 20. В некоторых вариантах осуществления, где антитело включает вариабельный участок тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность, имеющую идентичность последовательности 90% или больше, 95% или больше, 98% или больше или 99% или больше с SEQ ID NO: 21, 22, 23 и 20, одно или больше или все различия аминокислот являются консервативными замещениями.
В некоторых вариантах осуществления представленное здесь анти-пептид-6 антитело включает аминокислотную последовательность вариабельного участка легкой цепи SEQ ID NO: 26, 24 и 25 или аминокислотную последовательность, имеющую идентичность последовательности 60% или больше, 70% или больше, 80% или больше, 85% или больше, 90% или больше, 95% или больше, 98% или больше или 99% или больше с SEQ ID NO: 26, 24 и 25. В некоторых вариантах осуществления, где антитело включает вариабельный участок легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность, имеющую идентичность последовательности 90% или больше, 95% или больше, 98% или больше, или 99% или больше с SEQ ID NO: 26,24 и 25, одно или больше или все различия аминокислот являются консервативными замещениями. Конечно, здесь подразумеваются любые возможные комбинации таких аминокислотных последовательностей тяжелой цепи и легкой цепи.
Соответственно, в одном варианте осуществления, изобретение предлагает гуманизированное антитело, имеющее вариабельный участок тяжелой цепи SEQ ID NO: 21 и вариабельный участок легкой цепи, который может быть выбран из группы, состоящей из SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 24 и SEQ ID NO: 25.
Согласно одному конкретному варианту осуществления, гуманизированное антитело изобретения имеет вариабельный участок тяжелой цепи SEQ ID NO: 21 и вариабельный участок легкой цепи SEQ ID NO: 26. Такой вариант гуманизированного антитела обозначен VH2/VK3.
В другом конкретном варианте осуществления гуманизированное антитело изобретения включает вариабельный участок тяжелой цепи SEQ ID NO: 21 и вариабельный участок легкой цепи SEQ ID NO: 25. Такое гуманизированное антитело обозначено VH2/VK2.
В другом конкретном варианте осуществления, гуманизированное антитело изобретения включает вариабельный участок тяжелой цепи SEQ ID NO: 21 и вариабельный участок легкой цепи SEQ ID NO: 24. Такой вариант обозначен VH2/VK1.
В другом варианте осуществления изобретение предлагает гуманизированное антитело, имеющее вариабельный участок тяжелой цепи SEQ ID NO: 22 и вариабельный участок легкой цепи, который может быть выбран из группы, состоящей из SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 и SEQ ID NO: 26.
Согласно одному конкретному варианту осуществления, гуманизированное антитело изобретения может включать вариабельный участок тяжелой цепи SEQ ID NO: 22 и вариабельный участок легкой цепи SEQ ID NO: 25. Такой вариант гуманизированного антитела обозначен VH3/VK2.
Другие варианты осуществления изобретения предлагают гуманизированные антитела, имеющие вариабельный участок тяжелой цепи SEQ ID NO: 22 и вариабельный участок легкой цепи SEQ ID NO: 24 (VH3/VK1), вариабельный участок тяжелой цепи SEQ ID NO: 22 и вариабельный участок легкой цепи SEQ ID NO: 26 (VH3/VK3), вариабельный участок тяжелой цепи SEQ ID NO: 23 и вариабельный участок легкой цепи SEQ ID NO: 24 (VH4/VK1), вариабельный участок тяжелой цепи SEQ ID NO: 23 и вариабельный участок легкой цепи SEQ ID NO: 25 (VH4/VK2), вариабельный участок тяжелой цепи SEQ ID NO: 23 и вариабельный участок легкой цепи SEQ ID NO: 26 (VH4/VK3), вариабельный участок тяжелой цепи SEQ ID NO: 20 и вариабельный участок легкой цепи SEQ ID NO: 24 (VH1/VK1), вариабельный участок тяжелой цепи SEQ ID NO: 20 и вариабельный участок легкой цепи SEQ ID NO: 25 (VH1/VK2), вариабельный участок тяжелой цепи SEQ ID NO: 20 и вариабельный участок легкой цепи SEQ ID NO: 26 (VH1/VK3).
Как сказано выше, согласно конкретным вариантам осуществления, гуманизированное антитело изобретения особенно подходит для индукции IL-10, когда оно включает вариабельный участок тяжелой цепи, который показан в SEQ ID NO: 1, за тем исключением, что Н10 - Ala, H11 - Ile или Leu, Н12 - Val, Н13 - Lys, Н15 - Thr, H19 - Thr, H41 - Ser или Ala, H49 - Leu или Ala, H74 - Tyr или Ser, H75 - Lys, H79 - Val, H81 - Thr, H82 - Met, H82A - Thr, H82C - Met, H84 - Pro, H85 - Val и H108 - Ser или Leu, что продемонстрировано вариантами тяжелой цепи Н2, Н3, Н4 и H1, обозначенными SEQ ID NO. 21,22,23 и 20, соответственно, и вариабельный участок легкой цепи, который показан в SEQ ID NO: 2, за тем исключением, что L10 - Ile или Thr, L11 - Leu, L13 - Leu, L15 - Pro, L19 - Ala, L21 - Met или Leu, L22 - Ser, L42 - Lys, L43 - Ala, L60 - Ser, L70 - Asp, L72 - Thr, L78 - Leu, L79 - Gln, L80 - Ala или Pro, L83 - Phe and L100 - Gln; что продемонстрировано вариантами легкой цепи K3, K2 и K1, обозначенными SEQ ID NO. 26, 25 и 24, соответственно.
Необходимо отметить, что эти положения определены согласно системе нумерации по Кабату.
Как показано в следующих Примерах и, в частности, на сравнительных Фиг. 7, 14 и 15, каждое из этих замещений важно и может способствовать связывающему сродству разных вариантов с пептидом-6 или может быть отражено способностью разных вариантов индуцировать экспрессию IL-10.
Более конкретно, как показано на Фиг. 7, варианты, которые состоят из тяжелой цепи VH2, показали наилучшее связывающее сродство с пептидом-6, тогда как варианты VH1 показали низшее связывающее сродство. Поэтому, согласно некоторым вариантам осуществления, предпочтительным замещением остатка H11 может быть Leu, как показано в варианте VH2. В еще одном варианте осуществления предпочтительным замещением остатка Н41 является Ala, предпочтительным замещением Н74 может быть Tyr и предпочтительным замещением H108 может быть Leu, как в варианте VH1. На Фиг. 15В показано, что вариант VH2/VK3 имеет наилучшее сродство, тогда как вариант VH3/VK2 показывает намного пониженное сродство. Замещение остатка Н74 на Tyr в Н2 по сравнению с Ser в Н3 кажется важным. Разные комбинации с разными легкими цепями также могут способствовать разному связывающему сродству, например, вариант VH2/VK3 имеет более хорошее связывающее сродство по сравнению с VH2/VK2. Единственной разницей между легкими цепями обоих вариантов является замещение в L21 на Met в варианте, содержащем VK2, по сравнению с L21 Leu в предпочтительном варианте VK3. Комбинация VH2/VK1 показало низшее сродство и поэтому может указывать, что предпочтительной комбинацией замещений в легкой цепи может быть L10 Thr, L21 Leu и L80 Pro.
Как показано на Фиг. 15, связывание разных вариантов с пептидом-6 и индукция IL-10 прямо не связаны. Поэтому, разные комбинации замещений в тяжелой и легкой цепях могут быть выражены в разной способности вариантов индуцировать экспрессию IL-10. Например, как показано на Фиг. 15А и В, вариант VH2/VK3 проявляет наилучшую индукцию IL-10. При сравнении разных тяжелых цепей вариант, включающий VH2, лучше чем вариант VH3. Единственной разницей между обоими является остаток Tyr в положении Н74 в варианте VH2 по сравнению с Н74 Ser в варианте VH3. Необходимо отметить, что в индукции IL-10 комбинация с разными вариантами VK также отражена функционально. Например, вариант VH2/VK3 показал значительно более сильную индукцию IL-10 при сравнении с вариантом VH2/VK2. Единственной разницей между обоими вариантами является легкая цепь, которая отличается одним остатком. Leu в положении L21 в варианте VK3 по сравнению с Met в менее эффективном варианте, включающем VK2. Эти результаты показывают, что даже одно замещение может иметь значительный функциональный эффект.
Поэтому, в некоторых конкретных вариантах осуществления необходимо отметить, что H11 можно заместить любой одной из Ile и Leu, для связывания пептида-6 предпочтительна Leu и для индукции экспрессии IL-10 предпочтительна Leu; Н41 может быть любой одной из Ser и Ala, для связывания пептида-6 предпочтительна Ala и для индукции экспрессии IL-10 предпочтительна Ala; Н49 может быть любой одной из Leu и Ala, для связывания пептида-6 предпочтительна Leu и для индукции экспрессии IL-10 предпочтительна Leu; Н74 может быть любой одной из Tyr и Ser, для связывания пептида-6 предпочтительна Tyr и для индукции экспрессии IL-10 предпочтительна Tyr; H108 может быть любой одной из Leu и Ser, для связывания пептида-6 предпочтительна Leu и для индукции экспрессии IL-10 предпочтительна Leu; L10 может быть замещен любой одной из Ile и Thr, для связывания пептида-6 предпочтительна Thr, и для индукции экспрессии IL-10 предпочтительна Thr; L21 может быть замещен любой одной из Met и Leu, для связывания пептида-6 предпочтительна Leu, и для индукции экспрессии IL-10 предпочтительна Leu; L80 может быть замещен любой одной из Pro и Ala, для связывания пептида-6 предпочтительна Pro, и для индукции экспрессии IL-10 предпочтительна Pro.
Предусматриваются также все комбинации вышеуказанных замещений, включая замещенную тяжелую цепь, включающую H11 Leu, Н41 Ala, Н49 Ala, H74 Ser и H108 Leu, и замещенную легкую цепь, включающую L10 Thr, L21 Leu и L80 Pro; причем замещенная тяжелая цепь включает H11 Leu, Н41 Ala, Н49 Ala, H74 Ser и H108 Leu, и замещенная легкая цепь включает L10 Thr, L21 Met и L80 Pro; замещенная тяжелая цепь включает H11 Leu, Н41 Ala, Н49 Ala, H74 Ser и H108 Leu, и замещенная легкая цепь включает L10 Ile, L21 Met и L80 Ala; замещенная тяжелая цепь включает H11 Leu, Н41 Ala, Н49 Leu, H74 Tyr и H108 Leu, и замещенная легкая цепь включает L10 Thr, L21 Leu и L80 Pro; замещенная тяжелая цепь включает H11 Leu, Н41 Ala, Н49 Leu, H74 Tyr и H108 Leu, и замещенная легкая цепь включает L10 Thr, L21 Met и L80 Pro; замещенная тяжелая цепь включает H11 Leu, Н41 Ala, Н49 Leu, H74 Tyr и H108 Leu, и замещенная легкая цепь включает L10 Ile, L21 Met и L80 Ala; замещенная тяжелая цепь включает H11 Ile, Н41 Ser, Н49 Leu, Н74 Tyr и H108 Ser, и замещенная легкая цепь включает L10 Thr, L21 Leu and L80 Pro; замещенная тяжелая цепь включает H11 Ile, Н41 Ser, Н49 Leu, Н74 Tyr и Н108 Ser, и замещенная легкая цепь включает L10 Thr, L21 Met и L80 Pro; замещенная тяжелая цепь включает H11 Ile, Н41 Ser, Н49 Leu, Н74 Tyr и H108 Ser, и замещенная легкая цепь включает L10 Ile, L21 Met и L80 Ala; замещенная тяжелая цепь включает H11 Leu, Н41 Ala, Н49 Leu, H74 Ser и H108 Leu, и замещенная легкая цепь включает L10 Thr, L21 Met и L80 Pro; замещенная тяжелая цепь включает H11 Leu, Н41 Ala, Н49 Leu, H74 Ser и H108 Leu, и замещенная легкая цепь включает L10 Ile, L21 Met и L80 Ala и, наиболее предпочтительно, замещенная тяжелая цепь включает H11 Leu, Н41 Ala, Н49 Leu, H74 Ser и H108 Leu, и замещенная легкая цепь включает L10 Thr, L21 Leu и L80 Pro.
Необходимо не пропустить тот факт, что частичные замещения, при которых некоторые из вышеуказанных замещений происходят, а некоторые нет, также предусматриваются.
Следует понимать, что гуманизированные антитела изобретения включают антитела, имеющие все типы постоянных участков, включая IgM, IgG, IgD, IgA и IgE, и любой изотип, включая IgGl, IgG2, IgG3 и IgG4. Гуманизированное антитело может включать последовательности из более чем одного класса или изотипа. Согласно одному конкретному варианту осуществления, антитело изобретения относится к изотипу IgG-1.
5
6
7
8
9
10
-1
Согласно некоторым вариантам осуществления, гуманизированные антитела изобретения могут проявлять специфическое связывающее сродство для их соответствующего антигена (пептида-6 или любой аминокислотной последовательности, включающей упомянутый пептид, например, пептид SEQ ID NO. 98) по меньшей мере 10, 10, 10, 10, 10, или 10 М. Часто верхний и нижний пределы связывающего сродства гуманизированных антител находятся в пределах коэффициента три или пять или десять от таковых у контрольного мышиного антитела, из которых они получены.
Участки тяжелой и легкой цепей изобретения обычно получают, используя технологию рекомбинантной ДНК. Способы рекомбинантной ДНК, которые обычно применяют для этого, хорошо известны специалистам в данной области. Обычно нуклеинокислотные последовательности, кодирующие разные сегменты, содержащиеся в составном гуманизированном антителе изобретения, создаются ГЩР, например, путем расширения перекрытия. В этом способе последовательности сегментов обычно соединяют путем введения желательной последовательности в олигонуклеотиды и создания серии продуктов с использованием ПЦР, которые включают желательные последовательности сегментов. Эти продукты затем могут быть соединены, обычно с использованием дополнительных реакций ПЦР, в требуемой ориентации, чтобы создать цепи VH и VL. ДНК-последовательности Vl и Vh могут быть лигированы друг с другом или прямо, или посредством ДНК-последовательности, кодирующей линкер пептида, с использованием способов, хорошо известных специалистам в данной области. Эти способы включают ПЦР, а также такие приемы, как лигирование in vitro. Последовательности Vl и Vh могут быть связаны в любой ориентации.
Специалист поймет, что используя информацию о последовательностях для вариабельных участков, нуклеиновые кислоты, кодирующие эти последовательности, могут быть получены с использованием любого количества дополнительных способов, хорошо известных специалистам в данной области. Таким образом, ДНК, кодирующую FB-участки, получают любым подходящим способом, включая, например, другие способы амплификации, такие как лигазная цепная реакция (ЛЦР), транскрипция, амплификация и самоподдерживающаяся репликация последовательности, или клонирование и рестрикция подходящих последовательностей. Ее можно преобразовать в двухцепочечную ДНК путем гибридизации с комплементарной последовательностью или путем полимеризации с полимеразой ДНК, используя одну цепь как шаблон. Хотя можно химически синтезировать весь FV-участок одной цепи, предпочтительно синтезировать некоторое количество более коротких последовательностей (приблизительно 100-150 оснований), которые обычно позже сплайсируют, например, используя ПЦР для расширения перекрытия.
Для нуклеиновых кислот размеры приведены или в тысячах оснований (килооснования), или в парах оснований (по). Ими являются оценки, полученные электрофорезом на агарозном или акриламидном геле из секвенсированных нуклеиновых кислот или из опубликованных ДНК-последовательностей. Для белков размеры приведены в килодальтонах (кДа) или номерах аминокислотных остатков. Размеры белков оценивают путем электрофореза на геле из секвенсированных белков, из полученных аминокислотных последовательностей или из опубликованных белковых последовательностей.
Домены VH и VL антитела изобретения могут быть связаны непосредственно или могут быть разделены линкером, например, для стабилизации вариабельных легкой и тяжелой цепей доменов антитела, соответственно. Подходящие линкеры хорошо известны специалистам в данной области и включают хорошо известный линкер GlyGlyGlyGlySer или его вариант.
Для получения высокого уровня экспрессии клонированного гена или нуклеиновой кислоты, такой как комплементарная ДНК, кодирующая гуманизированные антитела, например, гуманизированное анти-пептид-6 антитело, изобретения или их фрагмент Fab, обычно субклонируют нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело в экспрессирующий вектор, который содержит подходящий промотер для направления транскрипции, терминатор транскрипции/трансляции, и, если для нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, сайт связывания рибосомы для инициации трансляции. Подходящие бактериальные промотеры хорошо известны в данной области и описаны, например, в публикациях Сэмбрука и др. (Sambrook et al.) и Осубела и др. (Ausubel et al.). Бактериальные экспрессирующие системы для экспрессии белка доступны, например, в Е. coli, Bacillus sp.и Salmonella. Наборы для таких экспрессирующих систем имеются в продаже. Эукариотические экспрессирующие системы для клеток млекопитающих, дрожжей и клеток насекомых хорошо известны в данной области и также имеются в продаже.
Часто для того, чтобы экспрессировать белок, например, варианты VH или VK изобретения на высоких уровнях в клетке, рассматривается кодон-предпочтение для экспрессирующей системы при конструировании нуклеинокислотной последовательности, которая будет экспрессироваться. Таким образом, нуклеиновая кислота из одного организма, например, человека или мыши, может подвергнуться инжинирингу, чтобы разместить кодон-предпочтение экспрессирующей системы.
Промотер, используемый для направления экспрессии гетерологичной нуклеиновой кислоты, зависит от конкретного применения. Промотер, по выбору, располагают приблизительно на таком же расстоянии от сайта начала гетерологичной транскрипции как и от сайта начала транскрипции в его естественном окружении. Однако, в данной области известно, что некоторое изменение в этом расстоянии может быть введено без потери функции промотера.
В дополнение к промотеру, экспрессирующий вектор обычно содержит звено транскрипции или экспрессирующую кассету, которая содержит все дополнительные элементы, требуемые для экспрессии кодирующей белок нуклеиновой кислоты в клетках-хозяевах. Типичная экспрессирующая кассета таким образом содержит промотер, оперативно связанный с нуклеинокислотной последовательностью, кодирующей белок, подлежащий экспрессии, и сигналы, требуемые для эффективного полиаденилирования транскрипта, сайтов связывания рибосом и окончания трансляции. Нуклеинокислотная последовательность, кодирующая белок, может обычно быть связана с расщепляемой сигнальной пептидной последовательностью, чтобы способствовать секреции кодированного белка трансформированной клеткой. Такие сигнальные пептиды включают, помимо прочего, сигнальные пептиды из тканевого плазминогенного активатора, инсулина и фактора роста нейронов и эстеразу ювенильных гормонов Heliothis virescens. Дополнительные элементы кассеты могут включать энхансеры и, если в качестве структурного гена используется геномная ДНК, интроны с функциональными донорными и акцепторными сайтами сплайсинга.
В дополнение к последовательности промотера экспрессирующая кассета должна также содержать участок терминации транскрипции после структурного гена для обеспечения эффективной терминации. Участок терминации может быть получен из того же гена, что и последовательность промотера, или может быть получен из других генов.
L
Последовательности управления экспрессией, которые подходят для использования в конкретной клетке-хозяине, часто получают путем клонирования гена, который экспрессирован в этой клетке. Обычно используют прокариотические последовательности управления, которые определены здесь как включающие промотеры для инициации транскрипции, по выбору с оператором, вместе с последовательностями сайтов связывания рибосом. Такими обычно используемыми промотерами являются, например, CMV-промотер, показанный в векторах на Фиг. 2, промотерные системы бета-лактамазы (пенициллиназы) и лактозы (lac), промотерная система триптофана (tip), промотер tac и лямбда-полученный промотер P и сайт связывания рибосомы N-гена. Конкретная промотерная система не критична для изобретения, можно использовать любой доступный промотер, который функционирует в прокариотах.
Эукариотические экспрессирующие системы для клеток млекопитающих, дрожжей и клеток насекомых хорошо известны в данной области и также имеются в продаже. В дрожжах векторы включают плазмиды, интегрирующие дрожжи (например, YIp5) и плазмиды, реплицирующие дрожжи (плазмиды серии YRp) и pGPD-2. Экспрессирующие векторы, содержащие регуляторные элементы из эукариотических вирусов, обычно используют в эукариотических экспрессирующих векторах, например, векторах SV40, векторах вируса папилломы и векторах, полученных из вируса Эпштейна-Барра (Epstein-Barr). Другие примеры эукариотических векторов включают векторы, позволяющие экспрессировать белки под управлением SV40 раннего промотера, SV40 позднего промотера, промотера металлотионеина, промотера фактора рака молочных желез мышей, промотера вируса саркомы Рауса, промотера полихедрина или других промотеров с доказанной эффективностью для экспрессии в эукариотических клетках.
Некоторые экспрессирующие системы имеют маркеры, которые обеспечивают амплификацию генов, такие как тимидинкиназа, гидромицин-B-фосфотрансфераза и дигидрофолатредуктаза. Альтернативно, также подходят высоко производительные экспрессирующие системы без амплификации генов, такие как использующие бакуловирусный вектор в клетках насекомых, с GPCR-кодирующей последовательностью под управлением промотера полихедрина или других сильных промотеров бакуловируса.
Элементы, которые обычно включены в экспрессирующие векторы, также включают репликон, который функционирует в Е. coli, ген, кодирующий резистентность к антибиотикам, чтобы позволить выбрать бактерии, которые вмещают рекомби-нантные плазмиды, и уникальные рестрикционные сайты в несущественных участках плазмида, чтобы позволить вводить эукариотические последовательности. Конкретный выбор гена резистентности к антибиотикам не критичен, и подходят любые гены резистентности, известные в данной области. Прокариотические последовательности по выбору выбирают так, чтобы они не мешали репликации ДНК в эукариотических клетках, если это необходимо.
Стандартные способы трансфекции используются для производства клеточных линий бактерий, млекопитающих, дрожжей или насекомых, которые экспрессируют большие количества белка, специфически, разные варианты гуманизированных антипептид-6 антител изобретения, которые затем очищают, используя стандартные приемы.
Можно использовать любые из хорошо известных процедур для введения инородной нуклеотидной последовательности в клетки-хозяева. Эти процедуры включают трансфекцию фосфата кальция, полибрен, соединение протопластов, электропорацию, липосомы, микроинъекцию, векторы плазмы, вирусные векторы и любые другие хорошо известные способы для введения клонированной геномной ДНК, кДНК, синтетической ДНК или другого инородного генетического материала в клетку-хозяин. Необходимо только, чтобы конкретная используемая процедура генетической инженерии была способна успешно вводить по меньшей мере один ген в клетку-хозяин, способную экспрессировать полипептид изобретения.
После введения экспрессирующего вектора в клетки трансфектные клетки культивируют в условиях, благоприятствующих экспрессии белка, который извлекают из культуры, используя стандартные приемы, описанные ниже.
Специалист поймет, что можно внести модификации в нуклеиновую кислоту, кодирующую варианты гуманизированного антитела настоящего изобретения без снижения ее биологической активности. Некоторые модификации могут быть выполнены для облегчения клонирования, экспрессии или введения требуемой молекулы в гибридный белок. Такие модификации хорошо известны специалистам в данной области и включают, например, кодоны терминации, метионин, добавленный в аминотерминус для обеспечения инициации, сайт, дополнительные аминокислоты, помещенные на любой терминус для создания удобно расположенных сайтов рестрикции, или дополнительные аминокислоты (такие как поли-His) для помощи на этапах очистки.
После экспрессии гуманизированные антитела настоящего изобретения могут быть очищены по стандартным процедурам в этой области, включая осаждение сульфата аммония, колонки для аффинной хроматографии, колоночную хроматографию и т.п. В сущности, чистые композиции по меньшей мере приблизительно 90-95% гомогенности предпочтительны, и 98-99% или больше гомогенности наиболее предпочтительны для использования в фармацевтике. После очистки, частичной или до требуемой гомогенности, если они будут использоваться в терапевтических целях, полипептиды должны в сущности не содержать эндотоксина.
Часто функциональные гетерологичные белки из Е. coli или других бактерий изолированы от включений и требуют солюбилизации с использованием сильных денатурирующих агентов и последующей повторной укладки. На этапе солюбилизации, как хорошо известно в данной области, должен присутствовать восстановитель для разделения дисульфидных связей. Пример буфера с восстановителем: 0,1 М Tris рН 8, 6 М гуанидина, 2 мМ ЭДТА, 0,3 М ДТЭ (дитиоэритритола). Повторное окисление дисульфидных связей может происходить в присутствии тиоловых реагентов с низкой молекулярной массой в восстановленной и окисленной форме.
Ренатурацию обычно осуществляют путем разбавления (например, в 100 раз) денатурированного и восстановленного белка в буфере для повторной укладки. Пример буфера: 0,1 М Tris, рН 8,0, 0,5 М L-аргинина, 8 мМ окисленного глютатиона (GSSG) и 2 мМ ЭДТА.
Как модификация для протокола очистки двухцепочечного антитела, участки тяжелой и легкой цепей солюбилизируют и восстанавливают раздельно и затем объединяют в растворе для повторной укладки. Предпочтительный выход продукта получают, когда эти два белка смешивают в молярном отношении так, чтобы не был превышен 5-кратный молярный избыток одного белка над другим. Желательно добавить избыток окисленного глютатиона или других низкомолекулярных соединений в раствор для повторной укладки после завершения восстановительно-окислительной процедуры.
В дополнение к рекомбинантным способам антитела изобретения также можно конструировать полностью или частично, используя стандартный синтез пептида. Твердофазный синтез полипептидов настоящего изобретения, имеющих меньше приблизительно 50 аминокислот в длину, может быть осуществлен путем прикрепления C-терминальной аминокислоты последовательности к нерастворимому носителю, после чего следует постепенное добавление остальных аминокислот в последовательность.
Помимо этого, приемы, используемые для скрининга антител, чтобы идентифицировать желательное антитело, могут влиять на свойства полученных антител. Имеется много разных способов тестирования взаимодействий антитело/антиген, чтобы идентифицировать особенно желательные антитела. Такие способы включают ИФА, анализы резонансного связывания поверхностного плазмона (например, анализ связывания Biacore, компания Biacore АВ, Уппсала, Швеция), сандвичевые анализы (например, система парамагнитных гранул компании IGEN International, Inc., Гайтерс-бург, штат Мэриленд, США), вестерн-блоттинг, дот-блоттинг, ELIspot, анализы иммуноосаждения и иммуногистохимии.
Кроме того необходимо понимать, что настоящая заявка также предлагает и поэтому охватывает полинуклеотидные последовательности, кодирующие каркасные участки тяжелой и легкой цепей и участки CDR описанных здесь антител, а также экспрессирующие векторы для их эффективной экспрессии в клетки млекопитающих. Более конкретно, настоящее изобретение охватывает нуклеинокислотные последовательности, кодирующие вариабельные варианты тяжелой и легкой цепей изобретения, специфически, VH1-4 and VK1-3, обозначенные любым одним из SEQ ID NO. 21, 22, 23, 20, 26, 24 и 25. В одном конкретном варианте осуществления такие нуклеинокислотные последовательности могут включать последовательности, обозначенные любым одним из 28, 29, 30, 27, 33, 31 и 32, соответственно. Изобретение кроме того предлагает конструкты нуклеиновой кислоты и экспрессирующие векторы, включающие по меньшей мере одну из упомянутых нуклеинокислотных последовательностей и любое их сочетание, а также клетки-хозяева, трансформированные или трансфектированные упомянутыми конструктами, экспрессию по меньшей мере одного из упомянутых VH и VK вариантов.
Термины ″нуклеиновая кислота″ и ″полинуклеотид″ используются взаимозаменяемо для указания деоксирибонуклеотидов или рибонуклеотидов и их полимеров в одно- или двухцепочечной форме. Термин охватывает нуклеиновые кислоты или модифицированные остатки или сцепления остова, которые являются синтетическими, встречающимися в природе и не встречающимися в природе, которые имеют связывающие свойства, сходные с контрольной нуклеиновой кислотой, и которые метаболизируются подобно контрольным нуклеотидам. Примеры таких аналогов включают, но без ограничения, фосфортиоаты, фосфорамидаты, метилфосфонаты, хирал-метилфосфонаты, 2-О-метилрибонуклеотиды, пептид-нуклеиновые кислоты (ПНК). Специалист в данной области поймет, что комплемент нуклеинокислотной последовательности можно легко определить из последовательности другой нити. Таким образом, любая конкретная нуклеинокислотная последовательность, указанная в настоящем документе, также раскрывает комплементарную нить.
″Полипептид″, ″пептид″ и ″белок″ используются взаимозаменяемо для указания полимера аминокислотных остатков. Эти термины применяются к встречающимся в природе аминокислотным полимерам, а также к аминокислотным полимерам, в которых один или больше аминокислотных остатков являются искусственным химическим миметиком соответствующей аминокислоты, встречающейся в природе.
″Аминокислота″ относится к встречающимся в природе и синтетическим аминокислотам, а также к аналогам аминокислот и миметикам аминокислот, которые функционируют подобно встречающимся в природе аминокислотам. Встречающиеся в природе аминокислоты это те, которые кодированы генетическим кодом, а также те, которые позже модифицированы, например, гидроксипролин, γ-карбоксиглутамат и О-фосфосерин. Термин ″аналоги аминокислот″ ссылается на соединения, которые имеют одинаковую собственную химическую структуру с встречающимися в природе аминокислотами, т.е., альфа-углерод, который связан с водородом, карбоксильная группа, аминогруппа и R-группа, например, хомосерин, норлейцин, метионин сульоксид, метионин метилсульфоний. Такие аналоги имеют модифицированные R-группы или модифицированные пептидные остовы, но сохраняют такую же основную химическую структуру, как и встречающиеся в природе аминокислоты. Термин ″миметики аминокислоты″ означает химические соединения, которые имеют структуру, которая отличается от общей химической структуры аминокислоты, но которая функционирует подобно встречающимся в природе аминокислотам. Аминокислоты могут быть названы здесь либо их общеизвестными трехбуквенными символами, либо однобуквенным символом, рекомендованным Комиссией по биохимической номенклатуре IUPAC-IUB.
Следует понимать, что в некоторых аспектах настоящая заявка предлагает гибридомные клеточные линии, а также моноклональные гуманизированные антитела, продуцированные этими гибридомными клеточными линиями. Раскрытые клеточные линии имеют и другое применение чем использование для производства моноклональных антител. Например, эти клеточные линии могут быть соединены с другими клетками (такими как маркированная подходящим лекарством человеческая миелома, мышиная миелома, человеческая-мышиная гетеромиелома или человеческие лимфобластоидные клетки) для производства дополнительных гибридом, и, таким образом, обеспечивать передачу генов, кодирующих моноклональные антитела. Кроме того, эти клеточные линии можно использовать как источник нуклеиновых кислот, кодирующих анти-пептид-6 гуманизированное антитело, которые могут быть изолированы и экспрессированы.
Также, для диагностических или терапевтических целей, описанных ниже, антитела настоящего изобретения могут быть, по выбору, ковалентно или нековалентно связаны с детектируемой меткой или с дополнительным терапевтическим агентом. Детектируемые метки, подходящие для такого использования, включают любую композицию, детектируемую спектроскопическими, фотохимическими, биохимическими, иммунохимическими, электрическими, оптическими или химическими средствами. Метки, которые могут использоваться в настоящем изобретении, включают магнитные гранулы (например, DYNABEADS), флуоресцентные красители (например, флуоресцентный изотиоцианат, техасский красный, родамин, зеленый флуоресцентный белок и т.п.), радиоактивные метки (например, Н, I, S, С или Р), ферменты (например, пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза и другие гранулы, обычно используемые в ИФА и конкурентных ИФА и других подобных способах, известных в данной области) и колориметрические метки, такие как коллоидное золото или окрашенное стекло или пластик (например, полистирол, полипропилен, латекс, и т.д.).
Средства для детектирования таких меток хорошо известны специалистам в данной области. Таким образом, например, радиоактивные метки можно детектировать, используя фотопленку или сцинтилляционные счетчики, флуоресцентные маркеры можно детектировать, используя фотодетектор для детектирования излучаемого света. Ферментные метки обычно детектируют путем снабжения фермента субстратом и детектирования продукта реакции, произведенного действием фермента на субстрат, и колориметрические метки детектируют, просто визуально наблюдая за окрашенной меткой.
Еще один аспект изобретения относится к композиции, включающей в качестве активного ингредиента эффективное количество по меньшей мере одного изолированного и очищенного гуманизированного антитела, которое специфически связывает полипептид, включающий SEQ ID NO: 15, причем гуманизированное антитело включает:
(a) вариабельный участок тяжелой цепи, который включает Cys в положении Н22, Ser в Н23, Gly в Н26, Phe в Н27, Ser в Н28, Leu в Н29, Ser в Н30, Thr в Н31, Ser в Н32, Asn в Н33, Met в Н34, Gly в Н35, Val в Н35А, Gly в Н35 В, Leu в Н48, His в Н50, Ile в Н51, Leu в Н52, Trp в Н53, Asn в Н54, Asp в Н55, Ser в Н56, Lys в Н57, Tyr в Н58, Tyr в Н59, Asn в Н60, Pro в Н61, Ala в Н62, Leu в Н63, Lys в Н64, Ser в Н65, Cys в Н92, Met в Н95, Gly в Н96, Gly в Н97, Tyr в Н98, Tyr в Н99, Gly в Н100, Asn в Н100А, Tyr в Н100 В, Gly в Н100С, Tyr в H100D, Tyr в Н100Е, Ala в H100F, Met в H100G, Asp в Н101 и Tyr в HI02 и, по выбору, по меньшей мере одну из Leu в Н49, Tyr в Н74, Ile в H11, Ser в H41 и Ser в Н108; и
(b) вариабельный участок легкой цепи, который включает Gln в положении L1, Cys в L23, Thr в L24, Ala в L25, Ser в L26, Ser в L27, Ser в L27A, Val в L28, Ser в L29, Ser в L30, Ser в L31, Tyr в L32, Leu в L33, His в L34, Trp в L47, Ser в L50, Thr в L51, Ser в L52, Asn в L53, Leu в L54, Ala в L55, Ser в L56, Tyr в L71, Cys в L88, His в L89, Gln в L90, Tyr в L91, His в L92, Arg в L93, Ser в L94, Pro в L95, Pro в L96 и Thr в L97 и, по выбору, по меньшей мере одну из Met в L21, Ile в L10 и Ala в L80; причем эти положения определены согласно системе нумерации по Кабату. Согласно некоторым вариантам осуществления, композиция изобретения может, по выбору, кроме того включать фармацевтически приемлемый носитель, наполнитель или разбавитель.
Согласно одному варианту осуществления, композиция изобретения может включать в качестве активного ингредиента по меньшей мере одно из гуманизированных антител, раскрытых изобретением, или любые их сочетания или фрагменты. В одном конкретном варианте осуществления композиция изобретения может включать по меньшей мере одно гуманизированное антитело, имеющее вариабельный участок тяжелой цепи SEQ ID NO: 21 и вариабельный участок легкой цепи SEQ ID NO: 26 (VH2/VK3).
В другом конкретном варианте осуществления композиция изобретения может включать по меньшей мере одно гуманизированное антитело, имеющее вариабельный участок тяжелой цепи SEQ ID NO: 21 и вариабельный участок легкой цепи SEQ ID NO: 24 (VH2/VK1).
В другом конкретном варианте осуществления, композиция изобретения может включать по меньшей мере одно гуманизированное антитело, имеющее вариабельный участок тяжелой цепи SEQ ID NO: 21 и вариабельный участок легкой цепи SEQ ID NO: 25 (VH2/VK2).
Согласно еще одному конкретному варианту осуществления, композиция изобретения может включать по меньшей мере одно гуманизированное антитело, имеющее вариабельный участок тяжелой цепи SEQ ID NO: 22 и вариабельный участок легкой цепи SEQ ID NO: 25 (VH3/VK2).
Другие конкретные варианты осуществления изобретения предлагают композиции, включающие по меньшей мере одно из: гуманизированного антитела, имеющего вариабельный участок тяжелой цепи SEQ ID NO: 22 и вариабельный участок легкой цепи SEQ ID NO: 24 (VH3/VK1), гуманизированного антитела, имеющего вариабельный участок тяжелой цепи SEQ ID NO: 22 и вариабельный участок легкой цепи SEQ ID NO: 26 (VH3/VK3), гуманизированного антитела, имеющего вариабельный участок тяжелой цепи SEQ ID NO: 23 и вариабельный участок легкой цепи SEQ ID NO: 24 (VH4/VK1), гуманизированного антитела, имеющего вариабельный участок тяжелой цепи SEQ ID NO: 23 и вариабельный участок легкой цепи SEQ ID NO: 25 (VH4/VK2), гуманизированного антитела, имеющего вариабельный участок тяжелой цепи SEQ ID NO: 23 и вариабельный участок легкой цепи SEQ ID NO: 26 (VH4/VK3), гуманизированного антитела, имеющего вариабельный участок тяжелой цепи SEQ ID NO: 20 и вариабельный участок легкой цепи SEQ ID NO: 23 (VH1/VK1), гуманизированного антитела, имеющего вариабельный участок тяжелой цепи SEQ ID NO: 20 и вариабельный участок легкой цепи SEQ ID NO: 25 (VH1/VK2), и гуманизированного антитела, имеющего вариабельный участок тяжелой цепи SEQ ID NO: 20 и вариабельный участок легкой цепи SEQ ID NO: 26 (VH1/VK3).
Изобретение кроме того предлагает фармацевтическую композицию для предотвращения, лечения, уменьшения симптомов или ингибирования иммунного нарушения. Фармацевтическая композиция изобретения включает в качестве активного ингредиента терапевтически эффективное количество по меньшей мере одного изолированного и очищенного гуманизированного антитела, которое специфически связывает полипептид, включающий SEQ ID NO: 15, или любую аминокислотную последовательность, включающую то же самое, например, SEQ ID NO. 98. Согласно одному варианту осуществления, композиция изобретения включает гуманизированное антитело, включающее:
(a) вариабельный участок тяжелой цепи, который включает Cys в положении Н22, Ser в Н23, Gly в Н26, Phe в Н27, Ser в Н28, Leu в Н29, Ser в Н30, Thr в Н31, Ser в Н32, Asn в Н33, Met в Н34, Gly в Н35, Val в Н35А, Gly в Н35 В, Leu в Н48, His в Н50, Ile в Н51, Leu в Н52, Trp в Н53, Asn в Н54, Asp в Н55, Ser в Н56, Lys в Н57, Tyr в Н58, Tyr в Н59, Asn в Н60, Pro в Н61, Ala в Н62, Leu в Н63, Lys в Н64, Ser в Н65, Cys в Н92, Met в Н95, Gly в Н96, Gly в Н97, Tyr в Н98, Tyr в Н99, Gly в Н100, Asn в Н100А, Tyr в Н100 В, Gly в Н100С, Tyr в H100D, Tyr в Н100Е, Ala в H100F, Met в H100G, Asp в Н101 и Tyr в H102 и, по выбору, по меньшей мере одну из Leu в Н49, Tyr в Н74, Ile в H11, Ser в H41 и Ser в H108; и
(b) вариабельный участок легкой цепи, который включает Gln в положении L1, Cys в L23, Thr в L24, Ala в L25, Ser в L26, Ser в L27, Ser в L27A, Val в L28, Ser в L29, Ser в L30, Ser в L31, Tyr в L32, Leu в L33, His в L34, Trp в L47, Ser в L50, Thr в L51, Ser в L52, Asn в L53, Leu в L54, Ala в L55, Ser в L56, Tyr в L71, Cys в L88, His в L89, Gln в L90, Tyr в L91, His в L92, Arg в L93, Ser в L94, Pro в L95, Pro в L96 и Thr в L97 и, по выбору, по меньшей мере одну из Met в L21, Ile в L10 и Ala в L80. Все положения определены согласно системе нумерации по Кабату. Также необходимо сказать, что композиция изобретения может, по выбору, кроме того включать фармацевтически приемлемый носитель, наполнитель или разбавитель.
Согласно одному конкретному варианту осуществления, фармацевтическая композиция изобретения может включать в качестве активного ингредиента по меньшей мере одно из гуманизированных антител, описанных изобретением, или любые их сочетания.
В одном конкретном варианте осуществления фармацевтическая композиция изобретения включает по меньшей мере одно гуманизированное антитело, имеющее вариабельный участок тяжелой цепи SEQ ID NO. 21 и вариабельный участок легкой цепи SEQ ID NO. 26 (VH2/VK3), или любые их сочетания или смеси.
Результаты, представленные настоящим изобретением, четко демонстрируют терапевтический потенциал антитела изобретения при иммунных нарушениях. Таким образом, согласно еще одному варианту осуществления, фармацевтическая композиция изобретения может специфически подходить для лечения иммунного нарушения, например, аутоиммунного или воспалительного нарушения.
Как сказано выше, следующие примеры 10-13 четко демонстрируют на двух разных моделях животных применимость гуманизированных антител изобретения для лечения установленного воспалительного артрита. Более конкретно, крысы Льюиса, обработанные для индукции АА и впоследствии анти-пептид-6 гуманизированным антителом изобретения (конкретно, вариантом VH2/VK3) показали существенное уменьшение артрита. Подобно этому, лечение мышей DBA/1, индуцированных для развития коллаген-индуцированного артрита (КИА), анти-пептид-6 гуманизированным антителом понизило тяжесть артрита. Изобретение кроме того продемонстрировало ех vivo индукцию IL-10 в ПКОК, получен у пациентов с ревматоидным артритом (РА), а также в ПКОК здоровых людей. Таким образом, в конкретных вариантах осуществления гуманизированные антитела изобретения индуцируют секрецию IL-10 из ПКОК пациентов, страдающих от иммунных нарушений, например, артрита, ВЗК, колита, болезни Крона и диабета. Например, как показано на Примере 13, гуманизированные антитела изобретения индуцировали секрецию IL-10 в ПКОК, полученных у пациентов с ревматоидным артритом. Таким образом, согласно конкретным вариантам осуществления, гуманизированные антитела изобретения индуцируют по меньшей мере 1,1-кратное увеличение, по меньшей мере 1,2-кратное увеличение, по меньшей мере 1,3-кратное увеличение, по меньшей мере 1,4-кратное увеличение, по меньшей мере 1,5-кратное увеличение, по меньшей мере 1,6-кратное увеличение, по меньшей мере 1,7-кратное увеличение, по меньшей мере 1,8-кратное увеличение, по меньшей мере 1,9-кратное увеличение или, предпочтительно, по меньшей мере 2-кратное увеличение в секреции IL-10 из ПКОК по сравнению с необработанными ПКОК. Более того, как показано на Примерах, лечение установленного артрита антителами изобретения может снижать оценку болезни по меньшей мере на 5%, по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 15%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50% или даже по меньшей мере на 55 или 60% или больше по сравнению с оценкой болезни в необработанной контрольной группе.
Кроме того, как указали Берент и др. (Berent, J. et al.), [Berent, J. et al., Springer Semin. Immunopathol. 25:7-63 (2003)], адьювантный артрит (АА) является хорошо установленной животной моделью для ревматоидного артрита (РА), ювенильного идиопатического артрита (ЮНА) и септического артрита. Более того, разные публикации [Myers et al. Life Sciences 61(19):1861-1878 (1997) и Brand et al. Springer Semin Immunopathol (2003) 25:3-18 (2003), соответственно] четко показывают, что коллаген-индуцированный артрит (КИА) также является установленной моделью для РА, а также для других аутоиммунных, ревматических и воспалительных заболеваний.
Следует понимать, что существуют разные формы артрита, которые могут быть в общем разделены на две основные категории: воспалительный артрит и дегенеративный артрит, каждый с разными причинами. Поэтому, согласно одному конкретному варианту осуществления, фармацевтические композиции изобретения могут быть специфически предназначены для лечение и/или уменьшения симптомов воспалительного нарушения, например, воспалительного артрита.
Воспалительный артрит характеризуется синовитом, эрозиями костей, остеопенией, набуханием мягких тканей и равномерным сужением суставного пространства. Более конкретно, признаками совместного воспаления являются синовит и эрозия кости. Последняя будет в начале проявляться как фокальный разрыв тонкой белой субхондральной костной пластинки. Обычно эта субхондральную костную пластинку можно видеть даже в случаях тяжелой остеопении, тогда как ее разрыв указывает на эрозию. Хотя верно, что пениартикулярная остеопения и фокальная субхондральная остеопения могут проявляться перед реальной эрозией кости, именно присутствие эрозии кости указывает на определенное воспаление сустава. С расширением эрозии кости костная деструкция проходит в трабекулы в костномозговой полости. Один важный признак воспалительного артрита относится к концепции маргинальной эрозии кости. Этот термин присвоен эрозии кости, которая происходит на границах воспаленного синовиального сустава. Это специфическое место представляет ту часть сустава, которая является внутрисуставной, но не покрыта гиалиновым хрящом. Поэтому, раннее воспаление будет продуцировать маргинальные эрозии перед эрозиями субхондральной костной пластинки под суставной поверхностью. При поиске эрозий кости существенно важны многочисленные виды сустава, чтобы профилировать разные поверхности кости. Второй важной характеристикой воспалительного процесса в суставе является равномерное сужение суставного пространства. Это происходит, поскольку деструкция суставного хряща равномерна в внутрисуставном пространстве. Третьим признаком воспалительного заболевания сустава является набухание мягких тканей.
Следует понимать, что воспалительный артрит может быть далее разделен на несколько подгрупп, и поэтому композиции, а также способы, объединенные композиции и наборы изобретения, описанные ниже, могут быть применимы для лечения каждого состояния воспалительного артрита разных подгрупп.
Более конкретно, вовлеченность одного сустава указывает на септический артрит. Причина септического артрита обычно связана с гематогенной диссеминацией из-за стафилококковых или стрептококковых микроорганизмов. Рентгенографические признаки септического сустава охватывают признаки любого воспалительного артрита, а именно, вокругсуставная остеопения, равномерное сужение суставного пространства, набухание мягких тканей и эрозии кости. Не все признаки могут быть представлены одновременно, и, точно, эрозии кости могут быть не очевидными. Таким образом, согласно одному варианту осуществления, композиции и способы изобретения могут использоваться для лечения и/или уменьшения симптомов септического артрита.
Общий артрит, напротив, характеризуется вовлеченностью многих суставов и включает две основные категории: ревматоидный артрит и серонегативную спондилоартропатию.
Согласно одному варианту осуществления, композиции, а также способы, объединенные композиции и наборы изобретения могут использоваться для лечения и/или уменьшения симптомов ревматоидного артрита. Ревматоидный артрит (РА) является хроническим, общим аутоиммунным нарушением, который обычно вызывает воспаление и повреждение тканей в суставах (артрит) и сухожильных влагалищах, вместе с анемией. Он также может продуцировать диффузное воспаление в легких, перикарде, плевре и склере глаза, а также узелковые поражения, наиболее обычные в подкожной ткани. Он может быть приводящим к инвалидности и болезненным состоянием, которое может приводить к значительной утрате трудоспособности и мобильности. Серологические маркеры, такие как ревматоидный фактор и антитела к циклическому цитруллинированному пептиду, являются важными показателями ревматоидного артрита. Рентгенографические признаки ревматоидного артрита являются признаками воспаления сустава и включают специфическую остеопению, равномерную потерю суставного пространства, эрозии кости и набухание мягких тканей. Из-за хронического характера воспаления также могут быть очевидными дополнительные признаки, такие как подвывих сустава и субхондральные кисты.
Категория сероотрицательной спондилоартропатии включает псориатический артрит, реактивный артрит и анкилозирующий спондилоартрит и характеризуется признаками воспаления, вовлеченностью многочисленных суставов и дистальным вовлечением рук и ног в патологический процесс с дополнительными признаками пролиферации в кости. Таким образом, согласно одному варианту осуществления, композиции и способы изобретения могут быть использованы для лечения и/или уменьшения симптомов любого состояния категории сероотрицательной спондилоартропатии.
Более конкретно, согласно одному варианту осуществления, композиции и способы изобретения можно использовать для предотвращения, лечения, уменьшения симптомов или ингибирования псориатического артрита. Псориатический артрит является хроническим заболеванием, характеризуемым воспалением кожи (псориаз) и суставов (артрит). Почти 306000 людей в США страдают псориатическим артритом и еще 308000 людей, как считается, страдают этим в пяти ведущих странах Европы. Псориаз и артрит часто проявляются раздельно. Фактически, заболевание кожи предшествует артриту почти у 80% пациентов. Артрит может предшествовать псориазу у почти 15% пациентов.
Псориаз, одна из характеристик псориатического артрита, является общим заболеванием кожи, которое имеет признаки пятнистых, приподнятых красных участков воспаления кожи с отслаиванием чешуек. Псориаз часто поражает локти и колени, кожу головы, пупок и область, окружающую гениталии или ягодицы. Приблизительно 10% пациентов с псориазом также имеют сопутствующее воспаление суставов. Обычно чем тяжелее симптомы на коже, тем больше вероятность, что у пациента разовьется псориатический артрит. Причина псориатического артрита неизвестна, она может быть сочетанием генетических, природных и иммунных причин.
Мужчины и женщины страдают псориазом в равной степени. При псориатическом артрите мужчины более вероятно имеют спондилитическую форму (при которой поражается позвоночник), а женщины более вероятно имеют ревматоидную форму (при которой могут быть вовлечены многие суставы). Псориатический артрит обычно развивается у людей в возрасте 35-55 лет. Однако он может развиваться в людей практически любого возраста. Псориатический артрит делит многие признаки с несколькими другими артритными состояниями, такими как анкилозирующий спондилоартрит, реактивный артрит и артрит, связанный с болезнью Крона и неспецифическим язвенным колитом. Все эти состояния могут вызывать воспаление в позвоночнике и суставах, в глазах, на коже, во рту и в различных органах.
Согласно еще одному варианту осуществления, композиции, а также способы, объединенные композиции и наборы изобретения могут быть использованы для предотвращения, лечения, уменьшения симптомов или ингибирования анкилозирующего спондилоартрита. Анкилозирующий спондилоартрит (АС, ранее известный как болезнь Бехтерева, синдром Бехтерева, болезнь Мари-Штрюмпеля и форма спондилоартрита) обычно является хронической и прогрессирующей формой артрита, вызванной воспалением многочисленных суставов, характеристически спинальных суставов и крестцово-подвздошных суставов в основании позвоночника. Хотя анкилозирующий спондилоартрит стремится поражать эти суставы и мягкие ткани вокруг позвоночника, также могут быть поражены другие суставы, а также ткани, окружающие эти суставы (импланты, где сухожилия и связки крепятся к кости). Анкилозирующий спондилоартрит также может поражать другие области тела чем суставы, такие как глаза, сердце и легкие.
Это нарушение часто приводит к анкилозу (или слиянию), так как термин ″анкилоз″, который происходит из греческого слова ″ankylos″, означает затвердевание сустава. Спондилез означает позвонок (или позвоночник) и относится к воспалению одного или больше позвонков.
Эта болезнь по оценкам поражает приблизительно 0,1-0,2% всего населения. Анкилозирующий спондилоартрит поражает главным образом молодых мужчин. Мужчины в 4-10 раз вероятнее будут иметь анкилозирующий спондилоартрит чем женщины. Большинство пациентов с этой болезнью заболевают ей в возрасте 15-35 лет при среднем возрасте начала 26 лет.
Хотя точная причина неизвестна, считают, что анкилозирующий спондилоартрит происходит из-за сочетания генетического влияния и запускающего фактора окружающей среды. Приблизительно 90-95% пациентов с анкилозирующим спондилоартритом имеют тканевый антиген человеческий лейкоцитный антиген В27 (HLA-B27), по сравнению с 7% у всего населения. Пациенты с анкилозирующим спондилоартритом часто имеют семейную историю этой болезни.
В еще одном варианте осуществления композиции, а также способы, объединенные композиции и наборы изобретения могут быть использованы для предотвращения, лечения, уменьшения симптомов или ингибирования реактивного артрита (РеА). Реактивный артрит, еще один тип сероотрицательной спондилоартропатии, является аутоиммунным состоянием, которое развивается как реакция на инфекцию в другой части тела. Контакт с бактериями и развитие инфекции может запустить реактивный артрит. Он имеет симптомы, подобные разным другим состояниям, известным вместе как ″артрит″, такие как ревматизм. Он вызывается еще одной инфекцией и, таким образом, является ″реактивным″, т.е., зависящим от другого состояния. ″Запускающую″ инфекцию часто излечивают, или она находится в ремиссии в хронических случаях, таким образом делая определение первоначальной причины трудным.
Симптомы реактивного артрита очень часто включают сочетание трех кажущихся несвязанными симптомов, воспалительный артрит крупных суставов, воспаление глаз (конъюнктивит и увеит) и уретрит. Необходимо сказать, что РеА также известен как синдром Рейтера от имени немецкого врача Ганса Рейтера, он также известен как arthritis urethritica, венерический артрит и полиартериит энтерический.
Следует понимать, что существуют многие другие формы воспалительного артрита, включая ювенильный идиопатический артрит, подагра и псевдоподагра, а также артрит, связанный с колитом или псориазом. Поэтому необходимо понимать, что композиции, а также способы, объединенные композиции и наборы настоящего изобретения также применимы и для этих состояний.
Поэтому, согласно еще одному варианту осуществления, композиции и способы изобретения могут быть использованы для предотвращения, лечения, уменьшения симптомов или ингибирования ювенильного идиопатического артрита (ЮИА). ЮИА является наиболее обычной формой постоянного артрита у детей (ювенильный в этом контексте относится к наступлению до возраста 16 лет, идиопатический относится к состоянию без определенной причины, и артрит является воспалением синовиального слоя сустава). ЮИА является подгруппой артрита, наблюдаемого в детстве, который может быть преходящим и самоограниченным или хроническим. Он значительно отличается от артрита, обычно наблюдаемого у взрослых (ревматоидный артрит), и других типов артрита, которые могут присутствовать в детстве и которые являются хроническими состояниями (например, псориатический артрит и анкилозирующий спондилоартрит).
Согласно еще одному варианту осуществления, композиции, а также способы, объединенные композиции и наборы изобретения могут быть использованы для лечения и/или уменьшения симптомов подагры. Подагра (метаболический артрит) является болезнью, создаваемой накоплением мочевой кислоты. В этом состоянии кристаллы однозамещенного урата натрия или мочевой кислоты откладываются на суставном хряще суставов, сухожилиях и окружающих тканях. Эти кристаллы вызывают воспаление и боль, оба тяжелые. При отсутствии лечения кристаллы формируют подагрические отложения, которые могут вызывать значительное повреждение ткани. Псевдоподагра является состоянием, которое вызывается кристаллами кальция. Когда кристаллы кальция вызывают приступы воспаления в сухожилиях, это называется ″кальциевый тендинит″. Изобретение кроме того предлагает композиции и способы для лечения также этого нарушения.
В общем, как также сказано выше, существуют много типов артрита, и необходимо отметить, что композиции, а также способы, объединенные композиции и наборы изобретения также могут быть применимы для лечения, в дополнение к всем указанным первичным формам артрита, также всех вторичных форм артрита. Эти состояния могут включать красную волчанку, геморрагическую пурпуру, псориатический артрит, реактивный артрит, гемохроматоз, гепатит, гранулиматоз Вегенера (и многие другие синдромы васкулита), болезнь Лайма, семейную средиземноморскую лихорадку, гипериммуноглобулинемию D с возвратным тифом, периодический синдром, связанный с рецептором ФНО, и воспалительное заболевание кишечника (включая болезнь Крона и язвенный колит).
Примеры 14 и 15 четко демонстрируют значительный улучшающий эффект гуманизированного анти-пептид-6 антитела на модели животного с TNBS-колитом. Таким образом, в другом конкретном варианте осуществления, фармацевтическая композиции, а также способы, объединенные композиции и наборы изобретения могут быть применимы для предотвращения, лечения, уменьшения симптомов или ингибирования воспалительного заболевания кишечника (ВЗК), специфически, язвенного колита и болезни Крона.
Согласно конкретному варианту осуществления, лечение, предотвращение или улучшение при колите или при болезни Крона может быть отражено в подавлении потери массы тела и воспалительной реакции, связанной с болезнью, и улучшение общей микроскопной оценки гистологии болезни. Например, лечение гуманизированными антителами изобретения может уменьшать микроскопную оценку болезни по меньшей мере на 5%, по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 15%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50% или даже по меньшей мере на 55 или 60% или даже больше по сравнению с микроскопной оценкой болезни в необработанной контрольной группе. Кроме того, в другом варианте осуществления, лечение гуманизированными антителами изобретения может уменьшать потерю массы тела по меньшей мере на 5%, по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 15%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 71%, по меньшей мере на 72%, по меньшей мере на 73%, или даже на 75% или даже больше, по сравнению с потерей массы тела в необработанной контрольной группе.
Воспалительные заболевания кишечника (ВЗК) являются обычными желудочно-кишечными нарушениями, которые могут быть поняты как результат дисбаланса между Th1-про-воспалительным и Th2-анти-воспалительным подтипами иммунных реакций. ВЗК является группой воспалительных состояний толстой кишки и тонкой кишки. Основными типами ВЗК являются болезнь Крона и язвенный колит (ЯК). Другие формы ВЗК насчитывают гораздо меньше случаев. Ими являются коллагеновый колит, лимфоцитарный колит, ишемический колит, воспаление в отключенной кишке, синдром Бехчета и недетерминированный колит, который представляет невозможность вынести точный диагноз, отличающий болезнь Крона от язвенного колита.
Основным различием между болезнью Крона и язвенным колитом является место и характер воспалительных изменений. Болезнь Крона может влиять на любую часть желудочно-кишечного тракта, от рта до ануса (перескакивающие поражения), хотя большинство случаев начинается в конце подвздошной кишки. Язвенный колит, напротив, ограничен толстой кишкой и прямой кишкой. Под микроскопом язвенный колит ограничен мукозой (эпителиальной оболочкой кишки), а болезнь Крона влияет на всю стенку кишечника. В заключение, болезнь Крона и язвенный колит присутствуют с внекишечными проявлениями (такими как проблемы с печенью, артрит, кожные проявления и проблемы с глазами) в разных пропорциях. Болезнь Крона и язвенный колит разделяют одни и те же симптомы, такие как диарея, рвота, потеря массы тела, лихорадка и боль в животе.
Недавняя гипотеза указывает, что ВЗК может быть вызвано чрезмерно активной иммунной системой, атакующей разные ткани пищеварительного тракта из-за отсутствия традиционных целей, таких как паразиты и черви. Количество людей с диагнозом ВЗК увеличилось, когда количество паразитарный инфекций, вызываемых круглыми глистами, анкилостомами и человеческими хлыстовиками, снизилось, и это состояние все еще редкое в странах, где паразитарные инфекции являются обычным делом.
Существует несколько внекишечных проявлений, которые сопровождают ВЗК, например: аутоиммунные явления; иммунные комплексы играют роль в повреждении целевого органа; и иммуноподавляющие агенты, такие как глюкокортикоиды, азатиоприн, метотрексат и циклоспорин, используют для облегчения болезни. Пациенты с ВЗК имеют антитела против компонентов клеток толстой кишки и несколько разных бактериальных антигенов. Эти антигены получают доступ к иммунной системе вследствие повреждения эпителия. Аномалии иммунитета, опосредованные Т-клетками, включая одновременную анергию и пониженную реакцию на стимулы Т-клеток, также были описаны для таких пациентов. Помимо этого, были идентифицированы изменения в иммунитете, опосредованные клетками мукозы, включая повышенные концентрации IgG клеток мукозы и изменения в поднаборах Т-клеток, предполагая антигенную стимуляцию. Стимуляция целевых антигенов после инфекции, иммунного или токсического повреждения приводит к активации иммунных клеток мукозы, приводящей к цитокинам, которые ведут к воспалительной реакции мукозы. Секреция про-воспалительных цитокинов, таких как IFNγ, способствует увеличению проницаемости мукозы и была описана на животных моделях ВЗК.
Лимфоциты CD4 и CD8 могут быть типированы или как клетки Th1, которые производят IL-2 и IFNγ, или как клетки Th2, которые производят IL-4 и IL-10. Реакция иммунной системы на инородные и собственные антигены является результатом баланса между этими двумя подтипами реакций. Реакция типа Th1 вовлечена в патогенез нескольких аутоиммунных и хронических воспалительных нарушений, таких как ВЗК. Таким образом, экспериментальный колит и ВЗК у людей могут быть поняты как дисбаланс между про-воспалительными Th1-типами и анти-воспалительными Th2-типа цитокинами. Недавно сообщали, что у животных и людей анти-воспалительные цитокины, такие как IL10 могут снижать про-воспалительные эффекты Th1-опосредованных цитокинов, этим уменьшая симптомы иммунных нарушений.
Обычно лечение ВЗК начинают, назначая лекарства с сильными антивоспалительными эффектами, такие как преднизон. После успешного контроля воспаления пациента обычно переводят на более умеренное лекарство, чтобы удерживать болезнь в ремиссии. При неудаче может быть назначено сочетание иммуноподавляющих лекарств. Целью лечения является достижение ремиссии, после чего пациента обычно переводят на более слабое лекарство с меньшими потенциальными побочными эффектами. Время от времени может проявляться острое возвращение первоначальных симптомов; это известно как ″внезапное обострение болезни″. В зависимости от обстоятельств, оно может пройти само или потребовать медикаментозного лечения. Время между внезапными обострениями может составлять от нескольких недель до нескольких лет и изменяется в широких пределах у разных пациентов - некоторые никогда не испытывали внезапного обострения. Часто для контроля внезапных обострений болезни используют стероиды, и когда-то они были приемлемы в качестве поддерживающего лекарства. Биологические препараты, такие как ингибиторы ФНО, использовали в течение нескольких лет для пациентов с болезнью Крона и в последнее время для пациентов с язвенным колитом. Тяжелые случаи могут требовать хирургического вмешательства, такого как резекция кишечника, стриктуропластия или временная или постоянная колостомия или илеостомия.
Болезнь Крона является одним типом воспалительного заболевания кишечника (ВЗК). Это хроническое состояние, для которого в настоящее время нет способа лечения. Оно характеризуется периодами улучшения, за которыми следуют эпизоды, когда симптомы внезапно возвращаются. Оно может влиять на любой участок пищеварительного тракта, также называемого желудочно-кишечным (ЖК) трактом от рта до ануса, но наиболее часто оно влияет на нижнюю часть тонкой кишки, называемую подвздошная кишка. Набухание проходит глубоко в оболочку пораженного органа. Набухание может вызывать боль и может делать частым опорожнение кишечника, что приводит к диарее. Болезнь Крона может быть классифицирована по области, которую она поражает. Илеоколическая болезнь Крона влияет на подвздошную кишку (последняя часть тонкой кишки, которая соединяется с толстой кишкой) и толстую кишку и насчитывает до 50% случаев. Илеит Крона, влияющий только на подвздошную кишку, насчитывает до 30% случаев, и колит Крона, влияющий на толстую кишку, насчитывает остальные 20% случаев болезни Крона, действующей на последнюю часть тонкой кишки и толстую кишку, и его может быть особенно трудно отличить от язвенного колита. Гастродуоденальная болезнь Крона вызывает воспаление в желудке и первой части тонкой кишки, называемой двенадцатиперстной кишкой. Илеит тощей кишки вызывает пятна воспаления в верхней половине тонкой кишки, называемой тощая кишка. Болезнь Крона также может называться илеитом или энтеритом.
Боль в животе может являться первоначальным симптомом болезни Крона. Она часто сопровождается диареей. Симптомы, вызванные стенозом кишечника, также обычны при болезни Крона. Боль в животе часто наиболее сильная в областях кишечника со стенозами.
Болезнь Крона, как и многие другие хронические воспалительные заболевания, могут вызывать разные соматические симптомы. У детей обычно происходит прекращение роста. Многим детям ставят диагноз болезни Крона на основании неспособности поддерживать рост. В дополнение к соматическому и желудочно-кишечному вовлечению болезнь Крона может влиять на многие другие системы органов. Воспаление внутренней части глаза, известное как увеит, может вызывать глазную боль, особенно при воздействии света (фотофобия). Воспаление также может затрагивать белую часть глаза (склеру), и состояние называться эписклеритом. И эписклерит, и увеит могут приводить к потере зрения, если их не лечить.
Болезнь Крона связана с типом ревматологического заболевания, известного как сероотрицательная спондилоартропатия. Эта группа заболеваний характеризуется воспалением одного или нескольких суставов (артрит) или мест прикрепления мышц к скелету (патология мышц). Артрит может поражать более крупные суставы, такие как колено или плечо, или может исключительно действовать на малые суставы рук и ног. Артрит также может затрагивать позвоночник, приводя к анкилозирующему спондилоартриту, если вовлечен весь позвоночник, или просто сакроилииту, если вовлечен только нижний позвоночник. Симптомы артрита включают болезненные, теплые, набухшие, жесткие суставы и потерю подвижности или функции суставов.
Колоноскопия является лучшим тестом для постановки диагноза болезни Крона, поскольку она позволяет непосредственно визуализировать толстую кишку и терминальную подвздошную кишку, идентифицируя модель вовлеченности болезни. Обнаружение пятнистого распределения болезни при участии толстой кишки или подвздошной кишки, но не прямой кишки, предполагает болезнь Крона.
В настоящее время не существует способа лечения болезни Крона, и ремиссия может быть невозможна или пролонгирована при достижении. Лечение болезни Крона осуществляют только тогда, когда симптомы активные, и включает первоначальное лечение острой проблемы, а затем поддержание ремиссии.
При лечении острых состояний используют лекарства для уменьшения воспаления (обычно аминосалицилатные противовоспалительные лекарства и кортикостероиды). Когда симптомы будут в ремиссии, лечение переходит в поддерживающую терапию с целью избежать возобновления симптомов. Пролонгированное использование кортикостероидов имеет значительные побочные эффекты; как результат, их обычно не используют для длительного лечения. Альтернативы включают только аминосалицилаты, хотя только меньшинство способно поддерживать лечение, и многие требуют иммуноподавляющих лекарств.
Медицинские препараты, используемые для лечения симптомов болезни Крона, включают композиции 5-аминосалициловой кислоты (5-ASA), преднизон, иммуномодуляторы, такие как азатиоприн, меркаптопурин, метотрексат, инфликсимаб, адалимумаб, цертолизумаб и натализумаб. Гидрокортизон используют при тяжелых приступах болезни Крона. С конца 1990х годов доступны биологические препараты (смотрите Инфликсимаб). Болезнь Крона нельзя излечить хирургией, хотя она используется при частичной или полной блокаде кишечника.
Заболеваемость болезнью Крона была предметом исследований населения в Норвегии и США и встречается в 6-7,1 случаев на 100000. Болезнь Крона более распространена в северных странах и преобладает в северных районах страны. Считается, что заболеваемость болезнью Крона одинакова в Европе, но ниже в Азии и Африке. Болезнь Крона имеет бимодальное распределение по заболеваемости как функция возраста: она поражает людей от 13 до 19 лет и после 20, а также в возрасте от 50 до 70 лет.
Необходимо отметить, что гуманизированные антитела изобретения также применимы для лечения и предотвращения болезни Крона, как сказано выше, и язвенного колита, как сказано ниже.
Язвенный колит (ЯК) является еще одним хроническим (длительным) воспалением оболочки ЖК тракта. ЯК обычно начинается из прямой кишки, причем последняя почти неизменно затронута, и болезнь ограничивается толстой кишкой. Оболочка становится воспаленной и характеризуется открытыми язвами. В течение активной фазы язвы формируются там, где воспаление убило клетки, которые обычно покрывают толстую кишку, затем они кровоточат и выделяют гной. Воспаление в толстой кишке также приводит к ее частому опорожнению, вызывая диарею, смешанную с кровью, постепенного проявления. Язвенный колит является прерывистой болезнью, с периодами обостренных симптомов и периодами, в которые симптомы относительно не проявляются. Хотя симптомы язвенного колита иногда могут уменьшиться самостоятельно, болезнь обычно требует лечения для перехода в ремиссию.
Язвенный колит случается у 35-100 людей на каждые 100000 в США, что меньше 0,1% населения. Болезнь преобладает в северных странах мира, а также в северных областях отдельных стран или регионов.
Заболеваемость язвенным колитом в Северной Америке составляет 10-12 новых случаев на 100000 в год, причем пиковая заболеваемость язвенным колитом происходит в возрасте от 15 до 25 лет. Частота случаев составляет 1 на 1000. Считается, что в возрасте начала имеет место бимодальное распределение, а второй пик заболеваемости имеет место в 6-й декаде жизни. Болезнь поражает больше женщин чем мужчин.
Географическое распределение язвенного колита и болезни Крона сходно в мире, при наивысшей заболеваемость в США, Канаде, Великобритании и Скандинавии. Повышенная заболеваемость наблюдается в северных местностях по сравнению с южными местностями в Европе и США.
Как и с болезнью Крона, преобладание язвенного колита больше среди евреев-ашкенази и прогрессивно убывает у других евреев, нееврейских кавказцев, африканцев, испано-язычных американцев и азиатов.
Клиническая картина язвенного колита зависит от степени процесса болезни. Пациенты обычно имеют диарею, смешанную с кровью и слизью, постепенного начала. Они также могут иметь признаки потери массы тела и кровь при ректальном обследовании. Болезнь обычно сопровождается болями в животе разной степени, от умеренного дискомфорта до тяжелых болезненных колик.
Язвенный колит связан с общим воспалительным процессом, который влияет на многие части тела. Иногда эти связанные внекишечные симптомы являются первоначальными признаками болезни, такими как болезненные артритные колени у подростка. Присутствие болезни нельзя однако подтвердить до наступления кишечных проявлений.
Приблизительно половина людей с диагнозом язвенного колита имеют умеренные симптомы. Другие страдают частыми лихорадками, кровавой диареей, тошнотой и тяжелыми коликами в животе. Язвенный колит также может вызывать такие проблемы как артрит (сероотрицательный артрит, анкилозирующий спондилоартрит, сакроилиит), воспаление глаз (ирит, увеит, эписклерит), заболевание печени и остеопороз. Эти осложнения могут быть результатом воспаления, запущенного иммунной системой, поскольку пациенты с язвенным колитом имеют отклонения иммунной системы.
Язвенный колит обычно проходит из прямой кишки по толстой кишке. Болезнь классифицируется по степени вовлечения, в зависимости от того, насколько далеко в толстой кишке зашла болезнь. В дополнение к степени вовлечения пациенты с ЯК также могут характеризоваться по тяжести их болезни.
Стандартное лечение язвенного колита зависит от степени вовлечения и тяжести болезни. Цель заключается в индукции ремиссии сначала лекарствами, после чего назначают поддерживающие лекарства, чтобы предотвратить рецидив болезни. Концепция индукции ремиссии и поддержания ремиссии очень важна. Лекарства, используемые для индукции и поддержания ремиссии в чем-то совпадают, но режимы лечения отличаются. Врачи сначала направляют лечение на индукции ремиссии, которая включает снижение симптомов и излечение мукозы оболочки толстой кишки, и затем продолжают лечение для поддержания ремиссии.
Используемые лекарства включают аминосалицилаты (например, 5-аминосалициловую кислоту или 5-ASA), кортикостероиды (например, преднизон), иммуноподавляющие лекарства (например, метотрексат) и биологическое лечение (например, инфликсимабом). В отличие от болезни Крона, язвенный колит обычно можно излечить путем хирургического удаления толстой кишки.
Язвенный колит не вызывается эмоциональным расстройством или чувствительностью к определенным пищевым продуктам, но эти факторы могут запускать симптомы у некоторых людей. Стресс жизни с язвенным колитом также может способствовать ухудшению симптомов. Хотя имеются лекарства для индукции и поддержания ремиссии, они только частично успешны и приблизительно 25-40% пациентов с язвенным колитом должны в конечном итоге идти на удаление толстой кишки из-за обширного кровотечения, тяжелой болезни, разрыва толстой кишки или риска рака.
Лучшим тестом для диагностики язвенного колита остается эндоскопия. Для обоснования диагноза обычно достаточно гибкой проктосигмоидоскопии. Биопсии мукозы берут для точной диагностики ЯК и отличия его от болезни Крона, с которой клинически обращаются по-другому.
Необходимо отметить, что гуманизированные антитела изобретения также применимы для лечения или предотвращения ВЗК и всех его подтипов, некоторые из которых описаны более подробно выше.
Как и ВЗК, включая болезнь Крона и ЯК, псориаз также является воспалительным нарушением, влияющим и испытывающим влияние производства про- и антивоспалительных цитокинов. Хотя точные причины и патогенез псориаза неизвестны, чрезмерная экспрессия про-воспалительных цитокинов типа 1 (Th1) была продемонстрирована при псориазе и считается имеющей патофизиологическую важность. Что важно, был продемонстрирован относительный недостаток кожной экспрессии IL-10 мРНК по сравнению с другими воспалительными дерматозами. Более того, имеющиеся публикации демонстрируют, что пациенты во время установленной анти-псориатической терапии показали повышенную экспрессию IL-10 мРНК в периферийных кровяных одноядерных клетках чем пациенты до терапии. Это предполагает, что IL-10 может иметь анти-псориатическую способность. Действительно, подкожное введение IL-10 давало иммуноподавляющие эффекты у пациентов (подавленная моноцитная экспрессия HLA-DR, ФНО-альфа и способность к секреции IL-12, уровни плазмы IL-12 и реакция на ″воскресшие″ антигены), а также сдвиг к модели цитокинов типа 2 (Th2) (возрастающая доля Т-клеток, производящих IL-4, IL-5 и IL-10, селективное увеличение в уровнях сыворотки IgE). Таким образом, важность IL-10 для лечения псориаза понятна. Поэтому, согласно одному конкретному варианту осуществления, гуманизированные антитела изобретения могут быть использованы для предотвращения, лечения, уменьшения симптомов или ингибирования псориаза или любых связанных состояний.
Более конкретно, псориаз является общим состоянием кожи, которое имеет пятнистые, поднятые, красные области воспаления кожи с отслаиванием чешуек. Псориаз часто поражает локти и колени, череп, пупок и область, окружающую гениталии или анус. Он происходит, когда иммунная система посылает ложные сигналы, которые ускоряют цикл роста клеток кожи. Чешуйчатые пятна, обычно вызванные псориазом, называемые псориатическими бляшками, являются областями воспаления и чрезмерного производства кожи. Кожа быстро накапливается в этих местах, что придает ей серебристо-белый вид. Бляшки часто встречаются на коже локтей и коленей, но могут поражать любую область, включая череп, ладони рук и подошвы ног и гениталии. В противоположность экземе, псориаз более вероятно будет находиться на внешней стороне сустава. Это нарушение является хроническим рекуррентным состоянием, которое меняется по тяжести от небольших локализованных пятен до полного покрытия тела. Часто бывают поражены ногти на руках и ногах (псориатическая дистрофия ногтей), и это может рассматриваться как изолированный симптом. Как сказано в связи с артритом, псориаз также может вызывать воспаление суставов, которое известно как псориатический артрит. У 10-15% пациентов с псориазом развивается псориатический артрит. Имеется много режимов лечения, но из-за его хронического рекуррентного характера псориаз представляет трудности при лечении. Симптомы псориаза могут проявляться в разных формах. Варианты включают бляшковидный, пустулезный, точечный псориаз и псориаз сгибательных поверхностей. Псориаз может быть классифицирован на непустулезный и пустулезный типы. Необходимо отметить, что способы изобретения предусматривают лечение непустулезного и пустулезного псориаза.
Более конкретно, непустулезный псориаз включает псориаз вульгарный и псориатическую эритродерму. Псориаз вульгарный (также известный как хронический стационарный псориаз или бляшковидный псориаз) является наиболее общей формой псориаза. Он поражает 80-90% людей с псориазом. Бляшковидный псориаз обычно проявляется как поднятые области воспаленной кожи, покрытые серебристо-белой чешуйчатой кожей. Эти области называются бляшками.
Псориатическая эритродерма (эридермический псориаз) включает широко распространившееся воспаление и шелушение кожи на большей части поверхности тела. Он может сопровождаться сильным зудом, набуханием и болью. Он часто является результатом обострения нестабильного бляшковидного псориаза, в частности после резкого прекращения системного лечения. Эта форма псориаза может быть смертельной, так как чрезмерное воспаление и шелушение разрушают способность тела регулировать температуру и разрушают способность кожи выполнять барьерные функции.
В еще одном конкретном варианте осуществления гуманизированные антитела изобретения, а также композиции, способы и наборы могут быть использованы для лечения пустулезного псориаза. Пустулезный псориаз проявляется как поднятые наросты, которые наполнены неинфекционным гноем (пустулы). Кожа под и вокруг пустул становится красной и слабой. Пустулезный псориаз может быть локализован, обычно до рук и ног (пальмоплантарный пустулез) или генерализован с широко распространенными пятнами на любой части тела. Подтипы пустулезного псориаза включают генерализованный пустулезный псориаз (пустулезный псориаз Фон Цумбуша), Pustulosis palmaris et plantaris (персистирующий пальмоплантарный пустулез, пустулезный псориаз типа Барбера, пустулезный псориаз конечностей), аннулярный пустулезный псориаз, хронические акродерматит и герпетиформное импетиго.
Следует понимать, что гуманизированные антитела изобретения, а также его композиции, способы и наборы также могут быть применимы для лечения любых дополнительных типов псориаза, например, псориаз индуцированный лекарствами, инверсионный псориаз, или псориаз сгибательных поверхностей, который проявляется как гладкие воспаленные пятна на коже. Он происходит в складках кожи, в частности вокруг гениталий (между бедром и пахом), в подмышках, под чрезмерным животом (паннус) и под грудью (подгрудная складка). Он отягощается трением и потом и уязвим для грибковых инфекций.
Кроме того, гуманизированные антитела могут быть использованы для лечения псориаза Гуттата. Этот тип псориаза характеризуется многочисленными мелкими, чешуйчатыми, красными или розовыми капельными участками поражения. Эти многочисленные пятна псориаза появляются на больших областях тела, главным образом туловища, но также на конечностях и черепе. Псориазу Гуттата часто предшествует стрептококковая инфекция, обычно стрептококковый фарингит.
Псориаз ногтей, который также можно лечить способом изобретения, производит ряд изменений в внешнем виде ногтей рук и ног. Эти изменения включают обесцвечивание под ногтевой пластинкой, изъязвление ногтей, линии, проходящие по ногтям, утолщение кожи под ногтем и ослабление (онихолизис) и крошение ногтя.
Как сказано выше, гуманизированные антитела изобретения, а также его композиции, способы и наборы могут быть использованы для лечения псориатического артрита.
Псориатический артрит включает воспаление суставов и соединительных тканей. Псориатический артрит может поражать любой сустав, но наиболее часто случается в суставах пальцев рук и ног. Это может приводить к колбасному набуханию пальцев рук и ног, известному как дактилит. Псориатический артрит также может поражать бедра, колени и позвоночник (спондилит). Приблизительно 10-15% пациентов с псориазом также имеют псориатический артрит.
В некоторых вариантах осуществления лечение пациента, страдающего псориазом, может улучшать физиологическое состояние пациента, например, разглаживать кожу, которая стала грубой из-за болезни. В предпочтительных вариантах осуществления топикальное применение гуманизированных антител изобретения не раздражает кожу и не способствует воспалению.
Следует понимать, что другие хронические или острые относящиеся к воспалительным патологические состояния кожи можно лечить гуманизированными антителами изобретения, а также его композициями, способами и наборами. Такие дополнительные состояния включают дерматиты, воспалительные травмы кожи, относящиеся к воспалительным нарушения пигментации кожи, например, витилиго и экземы.
Более конкретно, некоторые варианты осуществления изобретения относятся к использованию гуманизированных антител изобретения, а также его композициям, способам и наборам для лечения дерматитов. Термин ″дерматит″ относится к воспалению кожи, в общем. Разные типы имеют в общем аллергическую реакцию на специфические аллергены. Термин может быть использован для ссылки на экзему, которая также известна как дерматическая экзема или экзематозный дерматит. Диагноз экзема часто подразумевает атопический дерматит (детская экзема), но без правильного контекста он не означает ничего больше чем ″сыпь″, т.е., проходящее воспаление кожи. В некоторых языках ″дерматит″ и ″экзема″ являются синонимами, тогда как в других языках ″дерматит″ подразумевает острое состояние и ″экзема″ хроническое состояние. Эти два состояния часто классифицируют вместе.
Согласно еще одному конкретному варианту осуществления, композиции, а также способы, объединенные композиции и наборы изобретения могут быть использованы для лечения и/или уменьшения симптомов аутоиммунного нарушения, такого как диабет. Таким образом, согласно одному конкретному варианту осуществления, гуманизированные антитела изобретения могут быть использованы для предотвращения, лечения, уменьшения симптомов или ингибирования диабета типа I.
Сахарный диабет является синдромом, характеризующимся неупорядоченным метаболизмом и неподходяще высоким уровнем сахара в крови (гипергликемия) как результат или низких уровней гормона инсулина, или аномальной резистентности к эффектам инсулина в соединении с неадекватными уровнями секреции инсулина для компенсации. Характерными симптомами являются чрезмерная выработка мочи (полиурия), чрезмерная жажда и повышенный прием жидкости (полидипсия) и расплывчатое видение; эти симптомы вероятно отсутствуют, если сахар крови повышен только умеренно.
Существуют три основных формы диабета: тип 1, тип 2 и гестационный диабет (во время беременности). Тип 1 сахарного диабета характеризуется потерей инсулин-продуцирующих бета-клеток островков Лангерханса в поджелудочной железе, что приводит к дефициту инсулина. Основной причиной этой потери бета-клеток является опосредованная Т-клетками аутоиммунная атака. Не существует известных превентивных мер, которые могут быть предприняты против диабета типа 1. Большинство пациентов в ином здоровые и имеют здоровую массу тела при наступлении болезни. Чувствительность и реактивность на инсулин обычно нормальные, особенно на ранних стадиях. Диабет типа 1 может поражать детей и взрослых и традиционно назывался ″ювенильный диабет″, так как он представляет большинство случаев диабета, поражающего детей.
Основным режимом лечения диабета типа 1, даже с самых ранних стадий, является замена инсулина в сочетании с тщательным мониторингом уровней глюкозы в крови с использованием мониторов для проверки крови. Без инсулина может развиться диабетический кетоацидоз, который может привести к коме и смерти. Упор также делается на корректировки в стиле жизни (диета и упражнения), хотя они не могут обратить потери обратно. Помимо обычных подкожных инъекций также можно подавать инсулин насосом, что позволяет осуществлять непрерывную инфузию инсулина 24 часа в сутки в заданных уровнях, и способность программировать дозы (болюс) инсулина, которые необходимы во время еды.
Лечение типа 1 должно продолжаться в течение неопределенного периода времени. Лечение не ухудшает нормальной деятельности, если осуществляются достаточные знания, подходящий уход и дисциплина в проверках и приеме лекарств.
Распространенность в США составляет 0,12% населения или почти 340000 человек. Эта распространенность составляет приблизительно 30000 случаев в год, 0,01% населения.
В еще одном конкретном варианте осуществления гуманизированные антитела изобретения могут быть использованы для предотвращения, лечения, уменьшения симптомов или ингибирования диабета типа П. Сахарный диабет типа 2, или инсулин-независимый сахарный диабет (ИНСД) или взрослый диабет, является метаболическим нарушением, которое характеризуется высоким уровнем глюкозы в крови в контексте резистентности к инсулину и относительного дефицита инсулина. Когда это состояние прогрессирует, могут потребоваться медикаменты. Долгосрочные осложнения от высокого уровня сахара в крови включают повышенный риск сердечных приступов, ударов, ампутации и отказа почек. Существуют много факторов, которые потенциально вызывают или усиливают диабет типа 2. Они включают ожирение, повышенное кровяное давление, повышенный холестерин (объединенная гиперлипидемия) и с состоянием, часто называемым метаболический синдром (также известен как Синдром X, синдром Ривана (Reavan) или CHAOS). Другие причины включают акромегалию, синдром Кушинга, тиротоксикоз, феохромоцитому, хронический панкреатит, рак и лекарства. Дополнительными факторами, повышающими риск диабета типа 2, являются старение, пища с высоким содержанием жиров и менее активный стиль жизни.
Инсулинорезистентность означает, что клетки тела не реагируют соответствующим образом, когда присутствует инсулин. В отличие от сахарного диабета типа 1, инсулинорезистентность является обычно ″пострецепторной″, означая, что это проблема с клетками, которые реагируют на инсулин, а не проблема с выработкой инсулина. От неправильного обращения с диабетом типа 2 могут произойти серьезные осложнения, включая почечную недостаточность, эректильную дисфункцию, слепоту, медленное излечение ран (включая хирургические разрезы) и артериальное заболевание, включая заболевание коронарной артерии. Наступление типа 2 происходит наиболее часто в среднем возрасте и в старости, хотя его можно все чаще встретить у молодых людей и не старых взрослых из-за увеличения ожирения и неактивности у детей. Тип диабета, называемый MODY (диабет взрослого типа у молодых), все больше встречается в молодом возрасте, но он классифицируется как диабет из-за специфической причина, а не как диабет типа 2.
Растет объем доказательств, что может существовать связь между воспалением и патогенезом диабета типа 2. Это развивающаяся концепция, которая предполагает, что инсулинорезистентность и диабет типа 2 могут иметь иммунный компонент, предлагает новый широкий путь к исследованию иммунотерапевтических подходов к понятию патогенеза диабета типа 2 и к развитию новых способов лечения этого заболевания.
В еще одном примере иммунного нарушения изобретение кроме того предлагает использование гуманизированных антител изобретения, а также его композиций и наборов в способах для предотвращения, лечения, уменьшения симптомов или ингибирования множественного склероза. Более конкретно, множественный склероз (сокращенно МС, ранее известный как рассеянный склероз или рассеянный энцефаломиелит) является хроническим, воспалительным, демиелинизирующим заболеванием, которое поражает центральную нервную систему (ЦНС). Наступление заболевание часто происходит у молодых взрослых, более часто у женщин и имеет заболеваемость от 2 до 150 на 100000 в зависимости от страны или конкретного народа.
МС влияет на нейроны в областях мозга и спинного мозга, известного как белое вещество. Эти клетки переносят сигналы между областями серого вещества, где происходит их обработка, и между ними и остальным телом. Более конкретно, МС уничтожает олигодендроциты, которые являются клетками, ответственными за создание и поддержание жирного слоя, известного как миелиновая оболочка, которая помогает нейронам нести электрические сигналы. МС приводит к утоньшению или полной потере миелина и, менее часто, разрезу (рассечению) выходных компонентов нейронов или аксонов. Когда миелин утрачен, нейроны не могут больше эффективно проводить их электрические сигналы. Название ″множественный склероз″ относится к рубцам (уплотнениям - больше известным как бляшки или поражения) в белом веществе. Потеря миелина в этих поражениях вызывает некоторые из симптомов, которые могут широко изменяться в зависимости от того, какие сигналы прерваны. Однако, более совершенные формы изображений сейчас показывают, что большая часть поражения происходит вне этих участков. Почти любой неврологический симптом может сопровождать это заболевание.
МС принимает несколько форм с новыми симптомами, или встречающимися в отдельных эпизодах (возвратные формы) или медленно накапливающимися с течением времени (прогрессивные формы). Большинству пациентов сначала диагностируют возвратно-переходный МС, но затем у них развивается вторичный-прогрессивный МС (ВПМС) спустя несколько лет. Между эпизодами или приступами симптомы могут пройти полностью, но часто сохраняются постоянные неврологические проблемы, особенно с развитием болезни.
Хотя многое известно о механизмах, участвующих в процессе болезни, причина остается неясной. Теория с наибольшим числом приверженцев заключается в том, что болезнь происходит из-за аутоиммунной реакции. Эта болезнь не имеет излечения, но несколько видов терапии оказались полезными. Терапии пытаются возвратить функционирование после эпизода, предотвратить новые приступы и предотвратить инвалидность. Как и при любом лечении, лекарства имеют серьезные неблагоприятные эффекты, и многие терапии все еще находятся в стадии исследования.
МС обычно характеризуется клинически возвратной или хронически прогрессивной неврологической дисфункцией, вызываемой поражениями ЦНС. Патологически, поражения включают множественные области демиелинизации, влияющие на мозг, зрительные нервы и спинной мозг. Лежащая в основе этиология неопределенная, но МС, как считается, является, по меньшей мере отчасти, аутоиммунным или иммунно опосредованным заболеванием. ЭАЭ служит в качестве подходящей экспериментальной модели для исследования новых терапевтических стратегий для МС. Разные иммуноподавляющие агенты были сочтены эффективными для предотвращения и лечения ЭАЭ, включая кортикостероиды и сополимер 1. Однако пациентов до сих пор лечат или симптоматически, или иммуноподавляющими агентами, и удовлетворительной терапии для МС еще не установлено.
Таким образом, изобретение включает композиции и способы лечения, задержки или предотвращения наступления МС, включая введение антитела изобретения нуждающемуся в этом пациенту.
2
Как показано на следующих примерах, анти-пептид-6 гуманизированные антитела изобретения четко проявляют анти-воспалительный эффект. Более конкретно, на Фиг. 14 и 15 показано, что воздействие анти-пептид-6 гуманизированного антитела изобретения (специфически, вариант VH2/VK3 его фрагмент F(ab)) на человеческие ПКОК устраняет последовательные события, происходящие в сущности в результате увеличения экспрессии гена IL-10. Увеличение секреции IL-10 в сайте воспаления может перевести локальный профиль цитокинов с воспалительной на антивоспалительную реакцию и, таким образом, может объяснить механизм защиты от воспаления, создаваемый этими антителами.
Индукция секреции IL-10 может быть прямым эффектом взаимодействия антител с белками макрофагов и не требует присутствия любого HSP антигена. Антипептид-6 гуманизированные антитела изобретения связываются специфически с белками мембран макрофагов человека, как показано на Фиг. 12. Таким образом, антитела изобретения могут быть использованы в качестве иммуномодуляторов, модулируя баланс клеток Th1/Th2 в направлении анти-воспалительной реакции Th2. Поэтому изобретение кроме того предлагает композицию и способ для увеличения экспрессии и уровней IL-10 (Интерлейкин-10). Согласно этому аспекту, композиция изобретения включает в качестве активного ингредиента эффективное количество по меньшей мере одного изолированного и очищенного анти-пептид-6 гуманизированного антитела, направленного против пептида, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID. NO. 15. Композиция изобретения может, по выбору, включать фармацевтически приемлемый носитель, наполнитель или разбавитель.
Согласно одному варианту осуществления, при указании ″увеличения″ или ″повышения″ экспрессии или уровней анти-воспалительного цитокина, например, любого одного из IL-10, IL-4 и IL-6, специфически IL-10, это означает, что такое увеличение или повышение может быть увеличением или повышением экспрессии таких цитокинов приблизительно на 10%-100%. Термины ″увеличение″, ″прирост″ и ″повышение″, которые использованы в настоящем документе, относятся к действию прогрессивного увеличения в размере, величине, количестве или интенсивности. В частности, увеличение экспрессии на 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% по сравнению с подходящей контрольной группой. Также необходимо заметить, что увеличение или повышение также могут быть увеличением приблизительно в 2-100 раз. Кроме того, следует понимать, что увеличение уровней или экспрессии упомянутого цитокина IL-10 может быть в транскрипции, трансляции или стабильности упомянутого цитокина. В отношении вышеуказанного необходимо понимать, что процентные значения, где они указаны, такие как, например, 10%, 50%, 120%, 500% и т.д., взаимозаменяемы с значениями кратного изменения, т.е., 0,1, 0,5,1,2, 5 и т.д. раз, соответственно.
Как сказано выше, повышенная экспрессия IL-10 может модулировать баланс Th1/Th2 в направлении анти-воспалительной реакции Th2. Поэтому, антитела изобретения могут быть полезны в условиях, когда желательна модуляция баланса Th1/Th2 в сторону анти-воспалительной реакции. Таким образом, согласно одному варианту осуществления, композиции изобретения могут быть использованы для увеличения экспрессии и уровней IL-10 у нуждающегося в этом пациента, этим модулируя баланс клеток Th1/Th2 в направлении анти-воспалительной реакции Th2 у пациента. Согласно одному конкретному варианту осуществления, таким пациентом является пациент, страдающий от иммунного нарушения. Например, иммунного нарушения такого как аутоиммунное заболевание (например, артрит, ВЗК, псориаз, диабет типов 1 и 2, множественный склероз (МС), волчанка, базедова болезнь и тироидит), патология отторжения трансплантата и реакция ″трансплантат против хозяина″, и нарушения, индуцированные суперантигенами, такие как токсический шок, септический шок и тяжелый сепсис.
Кроме того необходимо понимать, что в общем композиция, а также способы, объединенные композиции и наборы настоящего изобретения могут быть использованы при предотвращении, лечении, уменьшении симптомов или ингибировании любого аутоиммунного заболевания, такого как, например, но без ограничения, синдром Итона-Ламберта, синдром Гудпасчера, базедова болезнь, синдром Гиллена-Барра, аутоиммунная гемолитическая анения (АИГА), гепатит, инсулинзависимый сахарный диабет (ИЗСД) и ИНСД, системная красная волчанка (СКВ), множественный склероз (МС), миастения Грейвса, нарушения сплетений, например, острый брахиальный неврит, синдром плюригландулярного дефицита, первичный билиарный цирроз печени, ревматоидный артрит, склеродерма, тромбоцитопения, тироидит, например, болезнь Хасимото, синдром Съергена, аллергическая пурпура, псориаз, смешанная болезнь соединительной ткани, полимиозит, дерматомиозит, васкулит, нодозный полиартрит, ревматическая полимиалгия, грануломатоз Вегенера, синдром Рейтера, синдром Бехчета, анкилозирующий спондилоартрит, пемфигус, буллезный пемфигоид, герпетиформный дерматит, воспалительное заболевание кишечника, язвенный колит и болезнь Крона и жировой метаморфоз печени.
Фармацевтические композиции, включающие гуманизированные антитела настоящего изобретения подходят для парентерального введения, т.е., внутрибрюшинно (i.p.), подкожно (s.c), внутримышечно (i.m.) и внутривенно (i.v.), а также для орального и топикального применения. Композиции для парентерального введения обычно включают раствор антител или их коктейль, растворенный в приемлемом носителе, предпочтительно водном носителе. Можно использовать разные водные носители, например, воду, буферную воду, 0,4% физраствор, 0,3% глицин и т.д. Эти растворы стерильные и обычно не содержат твердых частиц. Композиции могут содержать фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, требуемые для аппроксимирования физиологических состояний, такие как рН-регулирующие и буферные агенты, агенты, регулирующие токсичность и т.д., например, ацетат натрия, хлорид натрия, хлорид калия, хлорид кальция, лактат натрия. Концентрация гуманизированных антител в этих композициях может изменяться в широких пределах, т.е., от менее чем приблизительно 0,01%, обычно по меньшей мере приблизительно 0,1%, до 5% по массе и будет выбираться главным образом на основании объемов жидкости и вязкостей в соответствии с конкретным выбранным режимом введения.
Более конкретно, композиции для инъекций, которые включают анти-пептид-6 гуманизированное антитело изобретения, могут быть приготовлены в воде, физрастворе, изотоническом физрастворе, фосфатно-буферном физрастворе, цитратно-буферном физрастворе и т.д. и могут, по выбору, быть смешаны с нетоксичным ПАВ. В обычных условиях хранения и использования эти препараты могут содержать консервант для предотвращения роста микроорганизмов. Фармацевтические лекарственные формы, подходящие для инъекции или инфузии, включают стерильные водные растворы или дисперсии или стерильные порошки, включающие активный ингредиент, причем такие порошки адаптированы для немедленного приготовления стерильных растворов или дисперсий для инъекции или инфузии. Предпочтительно, конечной лекарственной формой является стерильная жидкость, которая стабильна в условиях производства и хранения. Жидким носителем или средой раствора, суспензии или дисперсии может быть растворитель или жидкая дисперсная среда, содержащая, например, воду, этанол, полно л, такой как глицерин, пропиленгликоль или жидкие полиэтиленгликоли и т.д., растительные масла, нетоксичные сложные эфиры глицерина и их подходящие смеси. Надлежащую текучесть растворов, суспензий или дисперсий можно поддерживать, например, путем образования липосом, путем сохранения желательного размера частиц в случае дисперсии или путем использования нетоксичных ПАВ. Предотвращение действия микроорганизмов может быть достигнуто путем использования разных антибактериальных и противогрибковых агентов, например, парабенов, хлорбутанола, фенола, сорбиновой кислоты, тимерозала и т.д. Могут быть включены изотонические агенты, такие как сахара, буферы или хлорид натрия. Пролонгированной абсорбции композиций для инъекции можно добиться путем включения в композицию агентов, замедляющих абсорбцию, например, гидрогелей моностеарата алюминия и желатина. Могут быть добавлены энхансеры растворимости.
Стерильные композиции для инъекции могут быть приготовлены путем включения анти-пептид-6 гуманизированного антитела в желательном количестве в подходящий растворитель с разными другими ингредиентами, например, перечисленными выше, и последующей стерилизации желательного типа, например, стерилизации фильтрацией. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных растворов для инъекций способы приготовления включают вакуумную сушку и сушку вымораживанием, которые дают порошок активного ингредиента плюс любой дополнительный желательный ингредиент, присутствующий в вышеуказанном растворе, стерилизованном фильтрацией. Может быть применен любой подходящий способ стерилизации, такой как стерилизация фильтрацией, например, через фильтр 0,22 микрона или нанофильтр, стерилизация гамма-лучами или электронным пучком.
В разных вариантах осуществления значение рН конечного раствора регулируют до приблизительно 4-9, приблизительно 5-7, приблизительно 5,5-6,5 или приблизительно 6. Значение рН композиции можно регулировать с помощью фармакологически приемлемых кислоты, основания или буфера.
Кроме того, композиции изобретения могут быть представлены в определенных дозах, содержащих заданное количество каждого активного ингредиента в дозе. Такая доза может быть предназначена для предоставления 0,1-100 мг гуманизированного антитела изобретения на 1 кг массы тела. Специфически, 0,1-10 мг/кг, 5-15 мг/кг, 10-30 мг/кг, 25-50 мг/кг, 40-80 мг/кг или 60-100 мг/кг. Более конкретно, упомянутая эффективная доза составляет приблизительно 0,01-100 мг/кг гуманизированных антител, приблизительно 0,1-90 мг/кг, приблизительно 0,3-8 мг/кг, приблизительно 0,4-70 мг/кг, приблизительно 0,5-60 мг/кг, приблизительно 0,7-50 мг/кг, приблизительно 0,8-40 мг/кг, приблизительно 0,9-30 мг/кг, приблизительно 1-20 мг/кг, специфически, приблизительно 1-10 мг/кг. Такие дозы могут быть представлены в одной дозе или как некоторое количество раздельных доз. Конечная доза будет зависеть от состояния, которое лечат, пути введения и возраста, массы тела и состояния пациента и будет определена по усмотрению врача.
Как сказано выше, в дополнение к парентеральному пути, композиции изобретения могут быть адаптированы для введения любым другим подходящим путем, например, пероральным (включая буккальный или сублингвальный), ректальным, назальным, топикальным (включая буккальный, сублингвальный или трансдермальный) или вагинальным путем. Такие композиции могут быть приготовлены любым способом, известным в фармацевтике, например, путем введения активного ингредиента в связь с носителем (носителями) или наполнителем (наполнителями).
Фармацевтические композиции, адаптированные для перорального введения, могут быть представлены как дискретные единицы, такие как капсулы или таблетки, порошки или гранулы, растворы или суспензии в водных или неводных жидкостях, съедобные вспененные или взбитые композициях, жидкие эмульсии масло в воде или жидкие эмульсии вода в масле.
Фармацевтические композиции, адаптированные для трансдермального введения могут быть представлены как дискретные частицы, предназначенные для нахождения в тесном контакте с эпидермисом пациента в течение пролонгированного периода времени.
Фармацевтические композиции, адаптированные для топикального введения, могут быть изготовлены как мази, кремы, суспензии, лосьоны, порошки, растворы, пасты, гели, спреи, аэрозоли или масла.
Для применения к глазам или другим внешним тканям, например, рту и коже, композиции предпочтительно наносят как топикальную мазь или крем. При изготовлении в форме мази активный ингредиент может быть использован или с парафином или с основой мази, смешиваемой с водой. Альтернативно, активный ингредиент может быть изготовлен в форме крема с основой масло в воде или основой вода в масле.
Фармацевтические композиции, адаптированные для топикального введения в глаза включают глазные капли, в которых активный ингредиент растворен или суспендирован в подходящем носителе, особенно в водном растворителе.
Фармацевтические композиции, адаптированные для топикального введения в рот, включают таблетки для рассасывания, пастилки и полоскания для рта.
Конкретные варианты осуществления предусматривают лечение кожных воспалительных состояний, специфически псориаза, путем топикального нанесения на пораженные участки кожи мази, крема, суспензий, пасты, лосьонов, порошков, растворов, масел, геля в капсулах, липосом, содержащих гуманизированное антитело изобретения, любых наночастиц, содержащих антитело, или распыляемого аэрозоля или паров, содержащих упомянутое антитело. Могут быть необходимы или желательны традиционные фармацевтические носители, водные, порошковые или масляные основы, загустители и т.д. Термин ″топикально наносимый″ или ″топикально вводимый″ означает, что мазь, крем, смягчающее средство, бальзам, лосьон, раствор, целебную мазь, линимент или любую другую фармацевтическую форму наносят на некоторую часть или весь участок кожи пациента, которые поражены псориазом или имеют один или больше симптомов псориаза.
В предпочтительных вариантах осуществления введение гуманизированного антитела изобретения для лечения кожных нарушений, специфически псориаза, осуществляется путем топикального накладывания. Термин ″накладывание″ означает нанесение на рану или место хирургии покрытия, обычно состоящего из ткани, синтетической мембраны, марли и т.п. Обычно это полимер-содержащая матрица, закрывающая некоторый участок кожи. Покрытие может или не может находиться в тесном контакте с кожей. Оно может быть, например, тканью или марлей, или оно может быть полимерным раствором, наносимым или распыляемым на кожу, причем полимер затвердевает на коже, когда растворитель высыхает и/или когда полимер сшивается. Покрытия также включают гели, обычно поперечно сшитые гидрогели, которые предназначены главным образом для того, чтобы закрывать и защищать раны, места хирургии и т.д.
Фармацевтические композиции, адаптированные для ректального введения, могут быть представлены как свечи или клизмы.
Фармацевтические композиции, адаптированные для назального введения, где носитель является твердым веществом, включают грубозернистый порошок, имеющий размер частиц, например, в диапазоне от 20 до 500 мкм, который вводят как понюшку, т.е., путем быстрого вдыхания через назальный проход, из контейнера с порошком, удерживаемого рядом с носом. Подходящие композиции, в которых носителем является жидкость, для введения как назальный спрей или назальные капли, включают водные или масляные растворы активного ингредиента.
Фармацевтические композиции, адаптированные для введения вдыханием, включают мелкозернистые пыли или туманы, которые могут быть созданы посредством разных типов аэрозолей под давлением, распылителей или порошковдувателем с дозируемой подачей.
Фармацевтические композиции, адаптированные для вагинального введения могут быть представлены как суппозитории, тампоны, кремы, гели, пасты, пены или спреи.
Предпочтительными композициями стандартных доз являются те, которые содержат суточную, полунедельную, недельную, для нескольких недель или месячную дозу или суб-дозу, как сказано выше, или ее подходящую долю, активного ингредиента. Необходимо сказать, что также существуют случаи, особенно при ВЗК, в которых большую болюсную дозу дают первоначально и затем эту дозу уменьшают для продолжения лечения.
Необходимо понимать, что в дополнение к ингредиентам, конкретно упомянутым выше, композиции также могут включать другие агенты, обычные в данной области в отношении соответствующего типа композиции, например, те, которые подходят для перорального введения, могут включать вкусовые агенты.
Еще один аспект изобретения предлагает способ для предотвращения, лечения, уменьшения симптомов или ингибирования иммунного нарушения. Способ изобретения включает этап введения нуждающемуся в этом пациенту терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного изолированного и очищенного гуманизированного антитела, которое специфически связывает полипептид, содержащий SEQ ID NO: 15 или композицию, включающую то же самое. Согласно одному варианту осуществления, гуманизированное антитело, используемое в способе изобретения, включает: (а) вариабельный участок тяжелой цепи, который включает Cys в положении Н22, Ser в Н23, Gly в Н26, Phe в Н27, Ser в Н28, Leu в Н29, Ser в Н30, Thr в Н31, Ser в Н32, Asn в Н33, Met в Н34, Gly в Н35, Val в Н35А, Gly в Н35 В, Leu в Н48, His в Н50, Ile в Н51, Leu в Н52, Trp в Н53, Asn в Н54, Asp в Н55, Ser в Н56, Lys в Н57, Tyr в Н58, Tyr в Н59, Asn в Н60, Pro в Н61, Ala в Н62, Leu в Н63, Lys в Н64, Ser в Н65, Cys в Н92, Met в Н95, Gly в Н96, Gly в Н97, Tyr в Н98, Tyr в Н99, Gly в Н100, Asn в Н100А, Tyr в Н100 В, Gly в Н100С, Tyr в H100D, Tyr в Н100Е, Ala в H100F, Met в H100G, Asp в Н101 и Tyr в H102 и, по выбору, по меньшей мере одну из Leu в Н49, Tyr в Н74, Ile в H11, Ser в H41 и Ser в Н108; и
(b) вариабельный участок легкой цепи, который включает Gln в положении L1, Cys в L23, Thr в L24, Ala в L25, Ser в L26, Ser в L27, Ser в L27A, Val в L28, Ser в L29, Ser в L30, Ser в L31, Tyr в L32, Leu в L33, His в L34, Trp в L47, Ser в L50, Thr в L51, Ser в L52, Asn в L53, Leu в L54, Ala в L55, Ser в L56, Tyr в L71, Cys в L88, His в L89, Gln в L90, Tyr в L91, His в L92, Arg в L93, Ser в L94, Pro в L95, Pro в L96 и Thr в L97 и, по выбору, по меньшей мере одну из Met в L21, He в L10 и Ala в L80 (положения определены согласно системе нумерации по Кабату).
Согласно одному варианту осуществления, в способе изобретения можно использовать любое из гуманизированных антител изобретения или любую содержащую его композицию, которая описана в изобретении. Один конкретный вариант осуществления относится к использованию по меньшей мере одного гуманизированного антитела, имеющего вариабельный участок тяжелой цепи SEQ ID NO. 21 и вариабельный участок легкой цепи SEQ ID NO. 26 (VH2/VK3).
Согласно одному варианту осуществления, способ изобретения может быть в частности применим для предотвращения, лечения, уменьшения симптомов или ингибирования иммунных нарушений, таких как аутоиммунные или воспалительные нарушения.
Согласно одному конкретному варианту осуществления способ изобретения в частности применим для лечения воспалительного артрита.
Согласно еще одному варианту осуществления, способ изобретения может быть использован для лечения воспалительного заболевания кишечника (ВЗК).
Согласно еще одному варианту осуществления, способ изобретения может быть использован для лечения псориаза.
В еще одном варианте осуществления способ изобретения может быть использован для лечения аутоиммунных нарушений, таких как диабет.
В еще одном варианте осуществления способ изобретения может быть использован для лечения МС (множественного склероза).
Используемый в настоящем описании и формуле изобретения термин ″лечить″ или ″лечение″ и их производные включает в сущности ингибирование, замедление или обращение прогрессирования состояния, в сущности уменьшая клинические симптомы состояния или в сущности предотвращая появление клинических симптомов состояния.
Используемые здесь термины ″заболевание″, ″болезнь″, ″нарушение″, ″состояние″ и т.д., когда они относятся к здоровью пациента, используются взаимозаменяемо и имеют значения, присвоенные каждому и всем таким терминам.
Используемый здесь термин ″пациент″ означает млекопитающее, которому вводят агент, такой как антитело, для целей лечения или исследования. Млекопитающие включают мышей, крыс, кошек, морских свинок, хомяков, собак, обезьян, шимпанзе и людей.
Изобретение кроме того охватывает использование антител изобретения для лечения любого состояния, относящегося к состояниям, описанным выше. При этом понимается, что взаимозаменяемо используемые термины ″связанный″ и ″относящийся″, когда они относятся в настоящем документе к патологиям, означают заболевания, болезни, нарушения, состояния или любые патологии, которые представляют по меньшей мере одно из: разделяют причины, сосуществуют в более высокой чем совпадающей частоте, или когда по меньшей мере одно заболевание, нарушение состояние или патология вызывает второе заболевание, нарушение, состояние или патологию.
Для артрита такие связанные или соотносимые состояния могут включать, для примера, все типы первичного воспалительного артрита, например, ревматоидный артрит, септический артрит, псориатический артрит, реактивный артрит (ReA), анкилозирующий спондилоартрит (ранее известный как болезнь Бехтерева, синдром Бехтерева), ювенильный идиопатический артрит (ЮИА) и подагру (метаболический артрит). В дополнение к всем указанным первичным формам артрита, состояние, которое лечится изобретением, может включать все вторичные формы артрита, например, красную волчанку, пурпуру Геноха-Шенлейна, гемохроматоз, гепатит, грануломатоз Вегенера (и многие другие синдромы васкулита), болезнь Лайма, фамильную средиземноморскую лихорадку, гипериммуноглобулинемию D с возвратной лихорадкой, периодический синдром, связанный с рецептором ФИО и воспалительное заболевание кишечника (включая болезнь Крона и язвенный колит).
Для ВЗК такие связанные или соотносимые состояния могут включать, для примера, болезнь Крона, язвенный колит, коллагеновый колит, лимфоцитарный колит, ишемический колит, воспаление в отключенной кишке, синдром Бехчета и недетерминированный колит.
Для псориаза такие связанные или соотносимые состояния могут включать, для примера, псориатический артрит, пузырчатку вульгарную, буллезный пемфигоид, дер-матомиозит, рубцовый пемфигоид, CREST-синдром, волчанку, дискоидную волчанку и витилиго.
Для диабета такие связанные или соотносимые состояния могут включать, например, осложнения, относящиеся к глазу (катаракта, глаукома, ретинопатия), невропатию, нефропатию, кардиомиопатию, удар, высокое кровяное давление, заболевание периферийных артерий и язвы.
Еще один аспект изобретения предлагает способ для увеличения экспрессии и уровней IL-10 у нуждающегося в этом пациента, причем способ включает этап введения упомянутому пациенту терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного изолированного и очищенного гуманизированного антитела, которое специфически связывает полипептид, включающий SEQ ID NO: 15 или композицию включающую то же самое. Согласно одному варианту осуществления, для упомянутого способа могут быть использованы любые из гуманизированных антител изобретения.
Согласно одному варианту осуществления, увеличение экспрессии и уровней IL-10 приводит к модуляции баланса клеток Th1/Th2 в сторону анти-воспалительной реакции Th2 у пациента, который страдает от иммунного нарушения.
Кроме того необходимо сказать, что изобретение предлагает использование описанных здесь гуманизированных антител, специфически вариант VH2/VK3, для приготовления композиций для предотвращения, лечения, уменьшения симптомов или ингибирования иммунного нарушения.
Настоящее изобретение демонстрирует использование нового гуманизированного анти-пептид-6 антитела в качестве иммуномодулирующего агента, применимого при лечении иммунных нарушений. Также необходимо понимать, что благоприятный иммуномодулирующий эффект упомянутых антител может быть усилен путем сочетания их с другими известными противовоспалительными агентами. Таким образом, изобретение кроме того предлагает любые сочетания или смеси антител изобретения с любым терапевтическим агентом, специфически противовоспалительным агентом. Поэтому, согласно некоторым вариантам осуществления, изобретение предлагает использование терапевтически эффективного количества сочетания по меньшей мере одного изолированного и очищенного гуманизированного антитела или любого его фрагмента, связывающего антиген, и по меньшей мере одного противовоспалительного агента, выбираемого из группы, состоящей из метилпреднизона (МПЗ), анти-ФНО агентов, этанерсепта (Энбрель), инфликсимаба (Ремикад), адалимумаба (Хумира) и цертолизумаб пегола (Цимзия), анти-IL-6 агентов, тоцилизумаба (Актемра), анти-IL-l-рецептор агентов, кинерета (Анакинра) CTLA-4-Ig, абатацепта (Оренсия), анти-CD20 агентов, ритуксимаба (MabThera; Ритуксан), метотрексата, любых производных кортикостероидов и любого другого противовоспалительного агента для лечения, предотвращения, уменьшения симптомов, уменьшения или задержки иммунного нарушения. Необходимо отметить, что такой дополнительный противовоспалительный агент может быть агентом, который индуцирует противовоспалительную реакцию посредством любого другого пути чем механизмы анти-пептид 6 антитела, которые включают путь, включающий индукцию IL-10.
Настоящее изобретение поэтому в частности относится к аддитивным и синергичным комбинациям из по меньшей мере одного изолированного и очищенного гуманизированного антитела или любого его фрагмента, связывающего антиген, и по меньшей мере одного противовоспалительного агента, выбираемого из группы, состоящей из метилпреднизона (МПЗ), анти-ФНО агентов, этанерцепта (Энбрель), инфликсимаба (Ремикад), адалимумаба (Хумира) и цертолизумаб пегола (Цимзия), анти-IL-6 агентов, тоцилизумаба (Актембра), анти-IL-1-рецептор агентов, кинерета (Анакинра), CTLA-4-Ig, абатацепта (Оренция), анти-CD20 агентов, ритуксимаба (MabThera; Ритуксан), метотрексата, любых производных кортикостероидов и любого противовоспалительного агента, индуцирующего любой сигнальный путь, который отличается от пути анти-пептида 6, посредством чего эти аддитивные и синергичные комбинации могут быть использованы при лечении пациентов, страдающих иммунным нарушением, например, артритом, ВЗК, псориазом или диабетом. Синергичные и аддитивные композиции изобретения также могут быть использованы для лечения пациентов, имеющих симптомы или признаки таких нарушений.
Под синергичной комбинацией понимается, что совместный эффект изолированного и очищенного гуманизированного антитела или любого его фрагмента, связывающего антиген, и по меньшей мере одного противовоспалительного агента, выбираемом из группы, состоящей из метилпреднизона (МПЗ), анти-ФНО агентов, этанерцепта (Энбрель), инфликсимаба (Ремикад), адалимумаба (Хумира) и цертолизумаб пегола (Цимзия), анти-IL-6 агентов, тоцилизумаба (Актемра), анти-IL-1-рецептор агентов, кинерета (Анакинра), CTLA-4-Ig, абатацепта (Оренция), анти-CD20 агентов, ритуксимаба (MabThera; Ритуксан), метотрексата и любых кортикостероидных производных или любого другого противовоспалительного агента, больше суммы терапевтических эффектов при введении любого из этих соединений по отдельности, как единственное лечение. Более конкретно, дополнительный противовоспалительный агент может индуцировать путь, который отличается от путей, индуцируемых анти-пептид 6 антителом, например, любого пути, вовлеченного в индукцию IL-10.
Объединенные соединения настоящего изобретения обычно вводят в форме фармацевтической композиции, включающей соединения настоящего изобретения вместе с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем. Однако, согласно некоторым вариантам осуществления, соединения могут вводиться по отдельности. Таким образом, соединения, используемые настоящим изобретением, могут быть введены или индивидуально в наборе, или вместе в любой традиционной пероральной или мукозальной лекарственной форме.
Более конкретно, поскольку настоящее изобретение относится к лечению заболеваний и состояний с помощью комбинации активных ингредиентов, которые могут быть введены по отдельности, изобретение также относится в еще одном аспекте к объединению отдельных фармацевтических композиций в форму набора. Набор включает по меньшей мере две отдельные фармацевтические композиции: (i) изолированное и очищенное гуманизированное антитело или любой его фрагмент, связывающий антиген, в частности любое из гуманизированных антител изобретения, по выбору в первой лекарственной форме, и (ii) по меньшей мере один противовоспалительный агент, выбираемый из группы, состоящей из метилпреднизона (МПЗ), анти-ФНО агентов, этанерцепта (Энбрель), инфликсимаба (Ремикад) адалимумаба (Хумира) и цертолизумаб пегола (Цимзия), анти-IL-6 агентов, тоцилизумаба (Актемра), анти-IL-1-рецептор агентов, кинерета (Анакинра), CTLA-4-Ig, абатацепта (Оренция), анти-CD20 агентов, ритуксимаба (MabThera; Ритуксан), метотрексата, любых кортикостероидных производных и любого противовоспалительного агента индуцирующего любой другой путь, который отличается от пути анти-пептида 6, по выбору, во второй лекарственной форме.
Набор изобретения также может включать (iii) контейнерное средство для содержания упомянутых первой и второй лекарственных форм.
Более конкретно, набор включает контейнерное средство для содержания обеих отдельных композиций, такое как разделенная бутылочка или разделенный пакет из фольги. Однако, эти отдельные композиции могут также содержаться в одном неразделенном контейнере. Обычно набор включает указания по введению отдельных компонентов. Форма набора особенно выгодна, когда раздельные компоненты предпочтительно вводят в разных лекарственных формах (например, парентеральных), вводят в разных интервалах между дозами, или когда выписавший врач предпочел титрование отдельных компонентов комбинации.
Достижением терапевтического эффекта считается, например, когда набор предназначен для лечения конкретного нарушения, замедление прогрессирования соответствующего состояния.
Следует понимать, что оба компонента набора, изолированное и очищенное гуманизированное антитело изобретения, по выбору, в первой лекарственной форме и по меньшей мере один противовоспалительный агент, выбираемый из группы, состоящей из метилпреднизона (МПЗ), анти-ФНО агентов, этанерцепта (Энбрель), инфликсимаба (Ремикад), адалимумаба (Хумира) и цертолизумаб пегола (Цимзия), анти-IL-6 агентов, тоцилизумаба (Актемра), анти-IL-1-рецептор агентов, кинерета (Анакинра), CTLA-4-Ig, абатацепта (Оренция), анти-CD20 агентов, ритуксимаба (MabThera; Ритуксан), метотрексата, любых кортикостероидных производных и любого противовоспалительного агента, индуцирующего любой другой путь, который отличается от пути антипептида 6, по выбору, во второй лекарственной форме могут быть введены одновременно.
Альтернативно, упомянутое первое соединение или лекарственная форма и упомянутое второе соединение или лекарственная форма вводятся последовательно в любом порядке.
Композиции, включающие настоящие гуманизированные антитела или любую их комбинацию, смесь или коктейль, могут быть введены в профилактических и/или терапевтических целях. При терапевтическом применении композиции вводят пациенту, уже имеющему иммунное нарушение (например, артрит, ВЗК, псориаз, МС и диабет), в количестве, достаточном для излечения или по меньшей мере частичного прекращения состояния и его последствий. Количество, адекватное для выполнения этой задачи, определено как ″терапевтически эффективная доза″. Количества, эффективные для такого использования, будут зависеть от тяжести состояния и общего состояния иммунной системы пациента, но обычно составляют приблизительно от 0,01 до 100 мг гуманизированных антител на кг в дозе, при более часто используемых дозировках от 0,1 до 50 мг и от 1 до 10 мг на кг массы тела. Более конкретно, упомянутая эффективная доза составляет приблизительно от 0,01 до 100 мг гуманизированных антител на кг, приблизительно от 0,1 до 90 мг/кг, приблизительно от 0,3 до 8 мг/кг, приблизительно от 0,4 до 70 мг/кг, приблизительно от 0,5 до 60 мг/кг, приблизительно от 0,7 до 50 мг/кг, приблизительно от 0,8 до 40 мг/кг, приблизительно от 0,9 до 30 мг/кг, приблизительно от 1 до 20 мг/кг, специфически, приблизительно от 1 до 10 мг/кг. Однократные или многократные введения при суточном, полунедельном, недельном, каждые несколько недель или месячном графике могут быть выполнены с уровнями дозы и моделью, выбранными лечащим врачом.
При профилактическом применении композиции, включающие гуманизированные антитела или любую их комбинацию, смесь или коктейль вводят пациенту, который имеет риск развития болезненного состояния, для усиления резистентности пациента. Такое количество определено как ″профилактически эффективная доза″. При таком использовании точные количества снова зависят от здоровья и общего уровня иммунитета пациента, но обычно составляют от 0,1 до 100 мг на дозу, особенно от 1 до 10 мг на кг массы тела. Более конкретно, упомянутая эффективная доза составляет приблизительно от 0,01 до 100 мг гуманизированных антител на кг, приблизительно от 0,1 до 90 мг/кг, приблизительно от 0,3 до 8 мг/кг, приблизительно от 0,4 до 70 мг/кг, приблизительно от 0,5 до 60 мг/кг, приблизительно от 0,7 до 50 мг/кг, приблизительно от 0,8 до 40 мг/кг, приблизительно от 0,9 до 30 мг/кг, приблизительно от 1 до 20 мг/кг, специфически, приблизительно от 1 до 10 мг/кг.
Однократное или многократные введения композиций назначают в зависимости от дозы и частоты, которые требуются пациенту и переносятся им. В любом случае, композиция должна обеспечивать достаточное количество гуманизированных антител настоящего изобретения для эффективного лечения пациента. Предпочтительно, желательно однократное введение, когда дозу назначают один раз. Однако, в большинстве случаев дозу назначают периодически до достижения терапевтического эффекта и поддержания терапевтического эффекта или до тех пор, пока побочные эффекты не потребуют прерывания терапии. Обычно дозы достаточно для лечения или уменьшения симптомов или признаков заболевания без создания неприемлемой токсичности для пациента.
Парентеральные составы контролируемого высвобождения иммуноконъюгатных композиций настоящего изобретения могут быть выполнены как импланты, масляные инъекции или как системы твердых частиц.
Системы твердых частиц включают микросферы, микрочастицы, микрокапсулы, нанокапсулы, наносферы и наночастицы. Микрокапсулы содержат терапевтический белок в качестве центральной основы. В микросферах лекарство диспергировано в частице. Частицы, микросферы и микрокапсулы размером меньше приблизительно 1 мкм обычно называют наночастицами, наносферами и нанокапсулами, соответственно. Капилляры имеют диаметр приблизительно 5 мкм, так что только наночастицы вводят внутривенно.
Микрочастицы имеют обычно около 100 мкм в диаметре и вводятся подкожно или внутримышечно.
Полимеры можно использовать для ион-контролируемого высвобождения композиций гуманизированного анти-пептид-6 антитела настоящего изобретения. Разные разлагаемые и неразлагаемые полимерные матрицы для использования при контролируемой доставке лекарства известны в данной области.
В еще одном вариант осуществления липосомы используют для контролируемого высвобождения, а также целевой доставки липид-капсулированного лекарства.
Еще один аспект изобретения относится к линиям клеток-хозяев, трансформированных или трансфектированных экспрессирующим вектором, кодирующим гуманизированное антитело изобретения. В одном конкретном варианте осуществления этот экспрессирующий вектор кодирует и вариабельную тяжелую, и вариабельную легкую цепи.
В некоторых вариантах осуществления такая клеточная линия экспрессирует гуманизированное антитело, имеющее вариабельный участок тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность, обозначенную SEQ ID NO: 21, и вариабельный участок легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность, обозначенную SEQ ID NO: 26.
В одном конкретном варианте осуществления клеточная линия изобретения описана в примерах 23-26 и депонирована под номером доступа CNCM I-4356.
Используемый здесь термин ″клетка-хозяин″ относится к клеткам, которые могут быть рекомбинантно трансформированы векторами, сконструированными с использованием методов рекомбинантной ДНК. Резистентность к лекарству или другой выбираемый маркер предназначен отчасти для облегчения выбора трансформантов. Помимо этого, присутствие выбираемого маркера, такого как маркер резистентности к лекарству, можно использовать для предотвращения размножения загрязняющих микроорганизмов в культуральной среде. Такая чистая культура трансформированной клетки-хозяина может быть получена культивированием клеток в условиях, которые требуют индуцированного фенотипа для выживания.
″Клетки″, ″клетки-хозяева″ или ″рекомбинантные клетки″ являются терминами, используемыми здесь взаимозаменяемо. При этом понимается, что такие термины относятся не только к клеткам конкретного пациента, но и к потомству или потенциальному потомству такой клетки. Поскольку определенная модификация может произойти в последующем поколении из-за мутации или окружающего влияния, такое потомство не может, фактически, быть идентичным родительской клетке, но все же включена в объем используемого здесь термина.
Используемый здесь термин ″трансфекция″ означает введение нуклеиновой кислоты, например, экспрессирующего вектора, в клетку-реципиент путем опосредованной нуклеиновой кислотой передачи гена. Используемый здесь термин ″трансформация″ относится к процессу, при котором генотип клетки изменяется в результате клеточного поглощения экзогенной ДНК или РНК.
Изобретение кроме того предлагает экспрессирующий вектор для экспрессии гуманизированного антитела, имеющего вариабельный участок тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность, обозначенную SEQ ID NO: 21, и вариабельный участок легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность, обозначенную SEQ ID NO: 26.
В конкретных вариантах осуществления изобретение предлагает экспрессирующий вектор для экспрессии гуманизированного вариабельного участка тяжелой цепи, включающего аминокислотную последовательность, обозначенную SEQ ID NO: 21. Одним примером такого вектора является вектор pANTVhG1/4, показанный на Фиг. 2 и в Примере 2.
В других вариантах осуществления изобретение предлагает экспрессирующий вектор для экспрессии гуманизированного вариабельного участка легкой цепи, включающего аминокислотную последовательность, обозначенную SEQ ID NO: 26. Одним примером такого вектора является вектор pANTVK, показанный на Фиг. 2 и в Примере 2.
Наиболее предпочтительно, изобретение предлагает экспрессирующий вектор для экспрессии гуманизированного антитела, имеющего вариабельный участок тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность, обозначенную SEQ ID NO: 21, и вариабельный участок легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность, обозначенную SEQ ID NO: 26. Одним примером такого вектора является вектор pPR014, показанный на Фиг. 26 и в Примере 22.
Одним специфически предпочтительным экспрессирующим вектором может быть плазмида экспрессии млекопитающих pPR014, показанная на Фиг. 26. Другими предпочтительными экспрессирующими векторами являются векторы экспрессии млекопитающих pANTVK и pANTVhG1/4, показанные на Фиг. 2.
Экспрессирующими векторами обычно являются самореплицирующиеся конструкты ДНК или РНК, содержащие желательный ген или его фрагменты, и оперативно связанные генетические контрольные элементы, которые признаны в подходящей клетке-хозяине и осуществляют экспрессию желательных генов. Эти контрольные элементы способны осуществлять экспрессию в подходящем хозяине. Обычно генетические контрольные элементы могут включать систему прокариотического промотера или контрольную систему экспрессии эукариотического промотера. Это типично включает транскрипционный промотер, необязательный оператор для контроля наступления транскрипции, энхансеры транскрипции для подъема уровня экспрессии РНК, последовательность, которая кодирует подходящий сайт связывания рибосомы, места соединения при сплайсинге РНК, последовательности, которые прекращают транскрипцию и трансляцию и т.д. Экспрессирующие векторы обычно включают источник репликации, который позволяет вектору реплицироваться независимо от клетки-хозяина.
Вектор может дополнительно включать подходящие сайты рестрикции, резистентности к антибиотикам или другие маркеры для выбора вектор-содержащих клеток. Плазмиды являются наиболее широко используемой формой вектора, но другие формы векторов, которые выполняют эквивалентную функцию и которые известны в данной области подходят для использования в настоящем изобретении. Смотрите, например, публикации: Pouwels et al., Cloning Vectors: a Laboratory Manual (1985, с дополнениями), Elsevier, N.Y.; and Rodriquez, et al. (eds.) Vectors: a Survey of Molecular Cloning Vectors and their Uses, Buttersworth, Boston, Mass (1988), которые включены в настоящий документ путем ссылки.
Необходимо отметить, что изобретение кроме того охватывают химерные антипептид-6 антитела, кодированные SEQ ID NO. 9, 10 и 11. Эти антитела имеют вариабельный участок тяжелой цепи SEQ ID NO. 1 и вариабельный участок легкой цепи SEQ ID NO. 2. Необходимо отметить, что эти антитела несут мышиный вариабельный участок и человеческий постоянный участок и также называются контрольными или родительскими антителами. Согласно определенным вариантам осуществления, мышиное анти-пептид-6 антитело, химерные или гуманизированные антитела изобретения включают вариабельные участки тяжелой и легкой цепей, которые описаны здесь, при условии, что антитело не идентично мышиному моноклональному антителу, обозначенному MF9 в патенте США №7,488,476.
Химерные антитела могут быть получены методами рекомбинантной ДНК, известными в данной области. Например, ген, кодирующий постоянный участок Fc молекулы мышиного (или других видов) моноклонального антитела расщепляется ре-стрикционными ферментами для удаления участка, кодирующего мышиный Fc, и эквивалентная часть гена, кодирующего человеческий постоянный участок Fc замещается.
Таким образом, согласно еще одному аспекту, настоящее изобретение предлагает химерное мышиное моноклональное антитело, которое специфически связывает полипептид, включающий SEQ ID NO: 15, причем упомянутое антитело включает постоянный участок человеческого иммуноглобулина и вариабельный участок мышиного иммуноглобулина, при этом упомянутый вариабельный участок включает вариабельный участок легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность, обозначенную SEQ ID NO. 2, и вариабельный участок тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность, обозначенную SEQ ID NO. 1.
Согласно некоторым вариантам осуществления, изобретение предлагает композицию, включающую в качестве активного ингредиента эффективное количество по меньшей мере одного изолированного и очищенного химерного моноклонального антитела согласно изобретению, которое специфически связывает полипептид, включающий SEQ ID NO: 15.
Согласно более конкретным вариантам осуществления, изобретение предлагает фармацевтическую композицию для лечения, профилактики, уменьшения симптомов или задержки начала иммунного нарушения, причем упомянутая композиция включает в качестве активного ингредиента терапевтически эффективное количество по меньшей мере одного изолированного и очищенного химерного моноклонального антитела согласно изобретению, которое специфически связывает полипептид, включающий SEQ ID NO: 15.
Изобретение также предусматривает способ для лечения, профилактики, уменьшения симптомов или задержки начала иммунного нарушения, включающий этап введения нуждающемуся в этом пациенту терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного изолированного и очищенного химерного моноклонального антитела согласно изобретению, которое специфически связывает полипептид, включающий SEQ ID NO: 15.
Согласно другим вариантам осуществления, изобретение предлагает объединенную композицию, включающую по меньшей мере одно изолированное и очищенное химерное моноклональное антитело согласно изобретению, которое специфически связывает полипептид, включающий SEQ ID NO: 15, и по меньшей мере один противовоспалительный агент, выбираемый из группы, состоящей из метилпреднизона (МПЗ), анти-ФНО агентов, этанерцепта (Энбрель), инфликсимаба (Ремикад), адалимумаба (Хумира) и цертолизумаб пегола (Цимзия), анти-IL-6 агентов, тоцилизумаба (Актемра), анти-IL-1-рецептор агентов, кинерета (Анакинра), анти-IL-1-рецептор агентов, анакинра (Кинерета), CTLA-4-Ig, абатацепта (Оренция), анти-CD20 агентов, ритуксимаба (MabThera; Ритуксан), метотрексата, любых кортикостероидных производных и любого противовоспалительного агента, индуцирующего любой сигнальный путь, специфически путь, который отличается от путей, индуцируемых анти-пептидом 6, например, любой путь, вовлеченный в индукцию IL-10.
Согласно конкретным вариантам осуществления, изобретение предусматривает использование терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного изолированного и очищенного химерного моноклонального антитела согласно изобретению, которое специфически связывает полипептид, включающий SEQ ID NO: 15, при подготовке композиции для лечения, профилактики, задержки начала или уменьшения симптомов иммунного нарушения.
Кроме того, изобретение предлагает использование описанного здесь химерного антитело в наборах, а также для диагностического применения.
Авторы настоящего изобретения ранее продемонстрировали, что серологический титр анти-пептид-6 антитела был значительно ниже у пациентов с ревматоидным артритом по сравнения с здоровыми пациентами. Таким образом, авторы настоящего изобретения предусматривают использование серологического анти-пептида 6 в качестве маркера для ревматоидного артрита, или, в действительности, для воспалительных нарушений в общем.
Поэтому, в еще одном аспекте настоящее изобретение предлагает диагностические наборы и способы для детектирования и мониторинга иммунного нарушения у млекопитающего пациента, специфически, иммунных нарушений, включая те, которые влекут снижение экспрессии противовоспалительного цитокина, в частности, экспрессии IL-10. Такие иммунные нарушения включают артрит, ВЗК (например, болезнь Крона и язвенный колит), псориаз, диабет и МС. Более конкретно, диагностические способы и наборы, предлагаемые изобретением, используют в качестве маркера для иммунных нарушений уровень анти-пептид-6 антитела в проверяемой биологической пробе. Пониженные уровни анти-пептид-6 антитела в проверяемой пробе по сравнению с уровнями у здорового контроля, указывают, что проба относится к пациенту, страдающему иммунным нарушением. Следует понимать, что диагностические наборы и способы изобретения кроме того предусматривают инструмент для персонализированной терапии путем идентификации пациентов, страдающих специфическим воспалительным заболеванием, которые вероятно выиграют от лечения гуманизированным анти-пептид-6 антителом.
Понимается, что диагностические способы и наборы, предлагаемые изобретением, составляют конкурентный анализ связывания антителом, причем количество антипептид-6 антитела, включаемое в соответствующую, специфически, серологическую пробу, определяется путем инкубации упомянутой пробы с известным количеством изолированного и очищенного пептида 6, за которым следует инкубация того же пептида 6 с известным количеством гуманизированного анти-пептид-6 антитела изобретения, по выбору, помеченного детектируемой средой или меткой. Таким образом, количество анти-пептид-6 антитела в упомянутой соответствующей пробе пропорционально снижению в пептиде 6, связанном помеченным анти-пептид-6 антителом.
Согласно одному варианту осуществления, изобретение предлагает диагностический способ для детектирования и мониторинга иммунного нарушения, которое вероятно будет реагировать на лечение гуманизированным анти-пептид-6 антителом у млекопитающего пациента, включающий этапы: (а) контакт проверяемой пробы с заданным количеством изолированного пептида 6 (SEQ ID NO. 15) в подходящих условиях, позволяющих связывать упомянутый пептид с анти-пептид-6 антителом; (b) добавление к смеси пробы пептида 6 (а) заданного количества гуманизированного антипептид-6 антитела изобретения, по выбору помеченного детектируемой меткой. Следует понимать, что этапы (а) и (b) могут быть выполнены или последовательно, или одновременно; (с) определение связывания гуманизированного анти-пептид-6 антитела с пептидом-6 в пробе подходящими средствами; поскольку связывание анти-пептид-6 антитела в пробе конкурирует со связыванием гуманизированного анти-пептид-6 антитела изобретения с пептидом-6, вытеснение гуманизированного анти-пептид-6 антитела анти-пептид-6 антителом в пробе отражается уменьшением связывания пептида 6 с гуманизированным антителом;
(d) оценка количества анти-пептид-6 антитела в проверяемой пробе путем экстраполяции из стандартной кривой, установленной путем вытеснения последовательных разбавлений пептида 6 и помеченного гуманизированного антитела изобретения последовательными разбавлениями анти-пептид-6 антитела. Пониженные количества анти-пептид-6 антитела в проверяемой пробе указывают, что проба относится к пациенту, страдающему иммунным нарушением, которому вероятно поможет лечение гуманизированным анти-пептид-6 антителом.
Согласно одному конкретному варианту осуществления, пробу инкубируют с заданным количеством изолированного пептида 6, прикрепленным к твердому носителю, после чего добавляют заданное количество гуманизированного анти-пептид-6 антитела изобретения, помеченного детектируемой меткой.
Термин ″проба″ в настоящем описании и формуле изобретения включает биологические пробы. Биологические пробы могут быть получены от млекопитающего, специфически, у человека, и включают жидкость, твердое вещество (например, экскременты) или ткань. Термин ″проба″ также может включать жидкости организма, такие как сыворотка, моча, кровь, молоко, спинномозговая жидкость, жидкость после промывки полостей тела, мокрота, гной. Некоторые пробы, которые априори не жидкие, вводят в контакт с жидкими буферами, которые затем используют согласно диагностическому способу изобретения.
Биологические пробы могут быть получены от всех разных семейств домашних животных, а также диких животных, включая, но без ограничения, таких животных как копытные, медведь, рыбы, лагаморфы, грызуны и т.д. Предпочтительно, проба является жидкой, специфически, пробой жидкости организма, наиболее предпочтительно пробой сыворотки, и от млекопитающего источника, специфически, человека.
Изобретение кроме того предлагает набор для детектирования и мониторинга иммунного нарушения у млекопитающего пациента. Набор изобретения может кроме того давать информацию относительно потенциальной реактивности исследуемого пациента на лечение с использованием анти-пептид-6 антитела изобретения. Набор изобретения может включать: (а) средства для получения биологической пробы от проверяемого пациента; (b) гуманизированное анти-пептид-6 антитело, помеченное детектируемой средой; (с) изолированный пептид-6, по выбору прикрепленный к твердому носителю; (d) средства для детектирования количества иммунокомплекса, сформированного между помеченным гуманизированным анти-пептид-6 антителом и пептидом 6, прикрепленным к твердому носителю; (е) стандартную кривую, установленную путем вытеснения последовательных разбавлений пептида 6 и помеченного гуманизированного антитела изобретения путем последовательного разбавления непомеченного анти-пептид-6 антитела; (f) инструкции по осуществлению детектирования присутствия и количества анти-пептид-6 антитела в упомянутой пробе, предпочтительно, способом изобретения, описанным выше.
При этом понимается, что упомянутый твердый носитель, который может подходить для использования в наборах настоящего изобретения обычно в сущности нерастворим в жидких фазах. Твердые носители настоящего изобретения не ограничены каким-то конкретным типом носителя. Скорее, доступно большое число носителей, которые известны среднему специалисту в данной области. Таким образом, подходящие твердые носители включают твердые матрицы, такие как аэрогели и гидрогели, смолы, гранулы, биочипы (включая биочипы, покрытые тонкой пленкой), микрофлюидный чип, кремниевый чип, предпочтительно, пластинки с многими лунками (также называемые микротитровальные планшеты или микропланшеты).
Необходимо отметить, что для описанного здесь диагностического применения гуманизированные антитела изобретения могут быть конъюгированы с детектируемой меткой. Один из способов, которым антитело в соответствии с настоящим изобретением может быть детектируемо помечено, заключается в связывании его с ферментом и использовании в иммуноферментном анализе (ИФА). Этот фермент, в свою очередь, при последующем открытии для действия подходящего субстрата будет реагировать с этим субстратом таким образом, чтобы дать химическую среду, которую можно детектировать, например, спектрофотометрическими, флуорометрическими или визуальными средствами. Ферменты, которые можно использовать для детектируемой метки антитела, включают, но без ограничения, малат-дегидрогеназу, стафилококковую нуклеазу, дельта-5-стероид-изомеразу, дрожжевую спиртовую дегидрогеназу, альфа-глицерофосфат дегидрогеназу, триоз-фосфат изомеразу, пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, аспарагиназу, глюкозооксидазу, бета-галактосидазу, рибонуклеазу, уреазу, каталазу, глюкозо-6-фосфат дегидрогеназу, глюкоамилазу и ацетилхолин-эстеразу. Детектирование может быть осуществлено колориметрическими способами, в которых используют хромогенный субстрат для фермента. Детектирование также может быть осуществлено путем визуального сравнения степени ферментной реакции субстрата в сравнении со стандартами, приготовленными таким же образом.
Детектирование может быть осуществлено путем использования любого из разных иммуноанализов. Например, путем радиоактивного мечения антитела изобретения или фрагментов антитела можно детектировать уровни анти-пептид-6 антитела в пробе через использование радиоиммуноанализа (РИА). Радиоактивный изотоп можно детектировать такими средствами, как использование гамма-счетчика или сцинтилляционного счетчика или ауторадиографией.
Альтернативно, также можно пометить антитело в соответствии с настоящим изобретением флуоресцентным соединением, металлами, излучающими флуоресценцию, черни-люминисцентным соединением или биолюминисцентным соединением.
При этом понимается, что и при диагностике, и в способе изобретения, по выбору используются подходящие буферы и растворы для взаимодействия антитела изобретения и антител, содержащихся в проверяемой пробе с пептидом 6, и для анализа конкурентного связывания этих двух антител. Буферы также подходят для растворения твердых и полутвердых проб перед анализом пробы согласно способу изобретения.
Конкурентное связывание антитела изобретения и антитела, присутствующего в соответствующей пробе, согласно диагностическим наборам и способам изобретения обычно требуют поддержания конкретного значения рН и условий осмотической концентрации раствора. Присутствие или отсутствие некоторых детергентов и растворителей также может изменять эффективность связывания. Значение рН обычно поддерживают на относительно нейтральном уровне, таком как приблизительно от 6 до 9, и в некоторых вариантах осуществления приблизительно 7. Осмотическую концентрацию обычно регулируют путем добавления солей, таких как, например, хлорида натрия, хлорида калия, хлорида магния и других. Некоторые не ограничивающие примеры детергентов и растворителей, которые могут быть использованы для регулирования условий связывания, включают Tween-20, Triton X100, PEG, DMSO, Nonidet P-40 и другие. Некоторые не ограничивающие примеры биологически совместимых буферов, которые могут быть использованы для поддержания желательного рН и осмотической концентрации раствора, включают боратные буферы, фосфатный физраствор (ФБР), 2-(N-морфолино) этан сульфоновую кислоту (″МЕС″), трис-гидроксиметиламинометан (″Трис″), цитратные буферы и т.д.
Все научные и технические термины, использованные в настоящем документе, имеют значения, обычно используемые в данной области, если не указано иное. Представленные здесь определения предназначены для облегчения понимания некоторых часто используемых здесь терминов и не предназначены для ограничения объема настоящего раскрытия.
Изобретение будет описано более подробно на основе следующих Примеров, которые являются только иллюстративными и никоим образом не ограничивают изобретение. В свете изложенного возможны многие модификации и изменения настоящего изобретения. Поэтому понимается, что в рамках объема прилагаемой формулы изобретения изобретение может быть осуществлено на практике иначе чем конкретно описано.
Необходимо понимать, что раскрытое и описанное настоящее изобретение не ограничено раскрытыми здесь конкретными примерами, этапами способов и композициями как таковыми, этапы способов и композиции могут в чем-то быть изменены. Также необходимо понимать, что использованная здесь терминология используется только для цели описания конкретных вариантов осуществления и не предусматривается как ограничивающая, поскольку объем настоящего изобретения будет ограничен только пунктами прилагаемой формулы изобретения и их эквивалентами.
Следует сказать, что в настоящем описании и прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа включают объекты множественного числа, если только из контекста явно не следует иное.
В тексте настоящего описания изобретения, Примеров и формуле изобретения ниже, если только контекст не требует иного, слово ″включать″ и его вариации, такие как ″включает″ и ″включая″ будут пониматься как подразумевающие включение указанного целого числа, или этапа, или группы целых чисел, или этапов, но не исключение любого другого целого числа, или этапа, или группы целых чисел, или этапов.
Следующие примеры представляют методы, примененные авторами настоящего изобретения при осуществлении аспектов настоящего изобретения. Следует понимать, что, хотя эти методы являются примерами предпочтительных вариантов осуществления изобретения на практике, специалисты в данной области поймут, что в свете настоящего раскрытия могут быть сделаны многочисленные модификации без нарушения сущности и намеченного объема изобретения.
Примеры
Порядок проведения экспериментов
Без дальнейшего уточнения можно полагать, что специалист в данной области, используя вышеприведенное описание, сможет использовать настоящее изобретение в его самом полном объеме. Следующие предпочтительные конкретные варианты осуществления поэтому должны истолковываться как чисто иллюстративные, а не ограничивающие заявленное изобретение каким-либо образом.
Стандартные протоколы молекулярной биологии, известные в данной области, которые здесь конкретно не описаны, обычно в сущности выполняют так, как сказано в публикациях: Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Springs Harbor Laboratory, New-York (1989, 1992) и Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1988).
Стандартные протоколы органического синтеза, известные в данной области, которые здесь конкретно не описаны, обычно в сущности выполняют так, как сказано в публикациях: Vol. 1-79, editors vary, J. Wiley, New York, (1941-2003); Gewert et al., Organic synthesis workbook, Wiley-VCH, Weinheim (2000); Smith & March, Advanced Organic Chemistry, Wiley-Interscience; 5th edition (2001).
Стандартные способы медицинской химии, известные в данной области, которые здесь конкретно не описаны, обычно в сущности выполняют так, как сказано в серии публикаций ″Comprehensive Medicinal Chemistry″ разных авторов и под разной редакцией, опубликованной издательством Pergamon Press.
Без дальнейшего уточнения можно полагать, что специалист в данной области, используя вышеприведенное описание, сможет использовать настоящее изобретение в его самом полном объеме. Следующие предпочтительные конкретные варианты осуществления поэтому должны истолковываться как чисто иллюстративные, а не ограничивающие заявленное изобретение каким-либо образом.
Стандартные протоколы молекулярной биологии, известные в данной области, которые здесь конкретно не описаны, обычно в сущности выполняют так, как сказано в публикации: Vanderkerken K The 5Т2ММ murine model of multiple myeloma: maintenance and analysis. [Methods Mol. Med. 113:191-205 (2005); Epstein J. The SCID-hu myeloma model. Methods Mol. Med. 113:183-90 (2005)].
Антитела
*Мышиное анти-пептид-6 антитело является мышиным моноклональным антителом, развившимся из пептид-6-иммунизированных Balb/C мышей гибридомным методом и относится к изотипу IgM.
*Химерные анти-пептид-6 IgG1 мышиные антитела были разработаны компанией Antitope Ltd. с использованием метода химеризации, который описан в Примере 1. Полученные химерные антитела состоят из мышиного вариабельного участка мышиного антитела (обозначенного SEQ ID NO. 1 и 2, и Фиг. 1А, 1В) и человеческого постоянного участка изотипа IgG1.
*Гуманизированные анти-пептид-6 антитела, основанные на мышином контрольном антителе, были продуцированы компанией Antitope Ltd. с использованием метода Composite Human Antibody™ (описанного в документе WO 2006/082406), который описан в Примере 2.
Флуоресцентно (FITC) помеченные гуманизированные антитела были использованы для FACS-анализа.
В некоторых вариантах осуществления термин Proximab может быть использован для описания моноклональных антител против пептид-6 эпитопа МТ HSP65.
* Анти-CD 14-РЕ (Sigma)
* Анти-CD 14-АРС (Miltenyi Biotech)
* HRP-помеченные мышиные анти-человеческие kappa легкие цепи (Sigma, каталожный №А7164)
* козья анти-мышиная IgM пероксидаза (Sigma, каталожный №А8786)
* козья анти-человеческая IgG пероксидаза (Sigma, каталожный №А7164)
Клеточные линии
*СНО dhfr-(ЕСАСС Кат. №94060607, Партия №05G020)
* ТНР-1 (АТСС Number TIB-202) моноцитарные клетки
* RAW мышиные макрофаги
* NSO клетки (ЕСАСС 85 110503, Porton, UK)
Рестрикционные ферменты
* BssH II (New England Biolabs Кат. № R0199)
* BamH I (New England Biolabs Кат. № R0136)
* Mlu I (New England Biolabs Кат. № R0198)
* Hind III (New England Biolabs Кат. № R0140)
* SspI (New England Biolabs Кат. № R0132)
Культуральная среда и дополнения
* CD DG44 (Invitrogen, Кат. №12610-010)
* Glutamax (Invitrogen, Кат. №35050))
* DMEM (Invitrogen, Кат. №41966)
* Диализованная эмбриональная телячья сыворотка (FBS) (Invitrogen, Кат. №26400)
* Н/Т (Invitrogen, Кат. №11067)
* CD-OptiCHO (Invitrogen, Кат. №12681-029)
* FBS (Сверхнизкий IgG, Кат. №16250-078 Invitrogen, Paisley UK)
* Пенициллин/Стрептомицин (Invitrogen, Paisley UK)
* DMSO (Sigma, Кат. № D2650)
* Метотрексат (Sigma, Кат. № A6770)
Реагенты и наборы
* Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Кат. №11668027)
* Субстрат ТМВ (Invitrogen Кат. №00-2023) или (Sigma Кат. № Т0440)
* Набор для детектирования микоплазмы Minerva Biolabs Venor GeM″ (Кат. №11-1050)
* Белок А сефарозная колонка (GE Healthcare Кат. №110034-93)
* ИФА для детектирования Fc захвата/kappa цепи (Sigma Кат. №16260 и А7164) против стандарта человеческого IgG1/kappa или IgG4/kappa (Sigma Кат. №15154 и 14631)
Оборудование
* Инкубатор Binder СВ150
* Планшет-ридер Dynex Technologies MRX ТС II
* Счетчик Vi-CELL™ XR (Beckman Coulter)
* Планшеты для культивирования тканей с 6 лунками (Corning, Кат.№3516)
* Микротитровальный планшет с плоским дном MaxiSorp 96 (Fisher, Кат. № DIS-971-030J)
* Колбы Эрленмейера (Corning, Кат. №431407)
Животные
* Для модели адъювантно-индуцированного артрита инбредным самкам крыс Льюиса возраста от шести до восьми недель (Harlan Laboratories, Израиль) были сделаны интрадермальные инъекции 1 мг микобактерий туберкулеза H37Ra (МТ) (Difco, Детройт, штат Мичиган, США) в основание хвоста в среде CFA (Difco)
* Для модели коллаген-индуцированного артрита использовали старых самцов мышей возраста девять недель DBA/1 (Harlan Laboratories, Израиль). Мышам сделали подкожную инъекцию 200 мкг коллагена типа II, эмульгированного в среде CFA (Difco). Через три недели мышам сделали дополнительную подкожную инъекцию коллагена II той же концентрации.
* Для модели колита TNBS мышей Balb/C сенсибилизировали 160 мкл гаптени-лирующего агента TNBS (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, штат Миссури, США) в концентрации 2,5% в 50% этаноле путем окрашивания кожи.
* Самцов крыс Sprague-Dawley (SD), купленных в компании Harlan-Israel, лечили стрептозотоцином (70 мг/кг) для использования в качестве модели диабета типа I.
* Самкам крыс C57BL/6 возраста 8 недель сделали подкожную инъекцию 125 мкг миелин-олигодендроцит гликопротеин 35-55 пептида (MOG35-55), эмульгированного в полном адъюванте Фройнда (CFA), содержащем 5 мг/мл убитых теплом Mycobacterium tuberculosis в левый поясничный участок для использования в качестве модели МС.
Клонирование Cap1
Cap1 был ПЦР-амплифицирован из ТНР-1 кДНК с праймерами Cap1 bamF (GCGTAGTCGGATCCATGGCTGACATGCAAAATCTGG, SEQ ID NO. 99) и cap1xhoyeshstopR (GCGTAGTCCTCGAGTTATCCAGCAATTTCTGTCACTGTGGTGACC, SEQ ID NO. 100). Полученные 1400 по ПЦР-продукта ввели в вектор PGEMT (Promega) и получили Cap1 с терминирующим кодоном в PGEMT. (Результаты секвенсирования показывают превосходную последовательность).
Далее, Cap1 был вырезан из вектора pGEMT с BamHI и XhoI. Полоса 1400 по была лигирована с модифицированным вектором Pet22b (Novagen), вырезанным с тем же, давая Cap1, фланкированный 6xHIS в N-терминале и терминирующий кодон в конце гена.
Генерация мышиных гибридом, продуцирующих мышиный анти-пептид-6
Самкам мышей Balb/c возраста шесть недель или крысам Льюиса была сделана подкожная инъекция с 100 мкг пептида-6 (GPKGRNVVLEKKWGAP, обозначенный SEQ ID NO. 15), суспендированного в полном адъюванте Фройнда (CFA). Животным сделали инъекции этого пептида в неполном адъюванте Фройнда (IFA) еще 2 раза с трехнедельными интервалами. Сыворотку собрали для измерения уровней антипептид-6 антитела с помощью ИФА, и животных с самыми высокими уровнями лечили 2 последовательными внутрибрюшинными инъекциями 50 мкг пептида в ФБР. На следующий день селезенки соединили с BALB/c Ig-несекретирующей миеломой NSO. Присутствие антител, специфически распознающих пептид-6 (SEQ ID NO. 15), было детектировано в супернатантах специфическим ИФА-анализом, и были выращены положительные клоны.
Анти-пептид-6 антитела были очищены от супернатантов гибридомных клеток. Очистку выполнили тиоадсорбцией, после чего выполнили хроматографию G-белка (Adar Biotech, Израиль). Чистоту антител подтвердили SDS-PAGE.
2
Приготовление фрагмента F(ab) гуманизированного анти-пептид-6 антитела
2
2
2
Фрагменты F(ab) гуманизированного VH2/VK3 анти-пептид-6 антитела были созданы с использованием набора для приготовления F(ab), основанного на расщеплении пепсина (Pierce; согласно инструкциям изготовителя). Фрагменты F(ab) были помечены FITC с использованием набора для мечения антител Dylight™ (Pierce; согласно инструкциям изготовителя).
Приготовление человеческих периферийных кровяных одноядерных клеток (ПКОК)
6
Венозную кровь человека взяли у здорового донора и нанесли на градиент Фикола для разделения и обогащения фракции лейкоцитов. После центрифугирования (1800 об/мин, в течение 30 минут) мононуклеарную полосу собрали, перенесли в новую пробирку, промыли 20 мл фосфатного физраствора (ФБР) и центрифугировали при 1100 об/мин в течение 10 минут. Клетки нанесли на культуральные планшеты с 24 лунками в концентрации 1,5×10 клеток/лунка в 1 мл RPMI, дополненном 2 мМ глютамина, 100 мг/мл стрептомицина, 100 U/мл пенициллина (все реагенты от Biological Industries, Израиль) и 10% человеческой сыворотки (Sigma).
Флуоресцентный анализ сортировки клеток (FACS)
6
6
2
10 клеток ПКОК поместили в микропробирки типа Эппендорф (10 клеток/100 мкл 1% БСА и 1% козьей сыворотки (Sigma) в фосфатном буфере (ФБР)). Клетки затем инкубировали в течение 1 часа при 4°C с анти-CD 14 антителами отдельно или вместе с гуманизированными цельными или F(ab) анти-пептид-6 антителами. Затем клетки промыли фосфатным буфером и определили окрашивание с помощью проточного питометра (BD) LSRII. Данные анализировали, используя программу FCS express 3 (De novo).
ИФА - Связывание вариантных составных антител с пептидом-6
Микротитровальные планшеты с плоским дном на 96 лунок Immulon MaxiSorp (Fisher, Кат. № DIS-971-030J) были предварительно обработаны 5% глутаральдегидом в ФБР (100 мкл/лунка) в темноте в течение ночи при комнатной температуре и затем покрыты пептидом-6 (SEQ ID NO. 15) при расходе 10 мкг/мл в ФБР в течение ночи при 4°C. Планшеты промыли ФБР/0,05% Tween 20 и затем блокировали в течение 1 часа с помощью 2% БСА/ФБР. Антитела разбавили в 2% БСА/ФБР до начальной концентрации 100 мкг/мл. Провели повторные разбавления, и затем планшеты инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре.
Каждый ИФА-планшет включал химерное анти-пептид-6 антитело в качестве положительного контроля. Планшеты промыли и в каждую лунку добавили 100 мкл козьего анти-человеческого IgG kappa конъюгата пероксидазы (Sigma, кат. № А7164), разбавленного 1:1000 в ФБР/0,05% Tween 20. После 1 часа инкубации при комнатной температуре планшеты промыли и анализ продолжили путем добавления 100 мкл/лунка субстрата ТМВ (Sigma, Кат. № А0440). Реакцию остановили путем добавления 50 мкл/лунка 3М HCl. Спектральную поглощательную способность измерили на 450 нм (планшетный ридер Dynex MRX ТСП) и нанесли на график против концентрации антитела.
ИФА - Оценка уровней цитокинов
Оценка уровней цитокинов в культуре клеток или в сыворотке животных была выполнена с использованием специфических наборов от компании R&D SYSTEMS, Миннеаполис, штат Миннесота. США (согласно инструкциям изготовителя).
Индукция и клиническая оценка адъювант-индуцированного артрита
Самкам инбредных крыс Льюиса возраста от шести до восьми недель (Harlan Laboratories, Израиль) в основание хвоста была сделана инъекция 1 мг Mycobacterium tuberculosis (МТ) H37Ra (Difco, Детройт, Мичиган) в CFA (Difco). Тяжесть артрита (артритный показатель) оценивалась через один день независимым наблюдателем следующим образом: 0, артрита нет; 1, покраснение сустава; 2, покраснение и набухание сустава. Оценивали коленный и тарзальный - метатарзальный суставы каждой лапы. Максимальная оценка, которая может быть получена, 16.
Оценка гистопатологии при адъювант-индуцированном артрите
Крыс умертвили и задние ноги удалили и зафиксировали в формалине. Суставы окрасили гематоксилином и эозином (Н&Е), после чего их оценил ветеринарный патолог.
Индукция и клиническая оценка коллаген-индуцированного артрита
Самцам мышей DBA/1 возраста девять недель (Harlan Laboratories, Израиль) в основание хвоста была сделана инъекция 200 мкг коллагена типа II, эмульгированного в CFA (Difco). Через три недели мышам подкожно ввели ту же концентрацию коллагена И. Тяжесть артрита оценивали ежедневно путем измерения штангенциркулем диаметра задних и передних лап, что выполнял независимый наблюдатель. В качестве контрольных авторы настоящего изобретения измеряли 4 мышей приблизительно того же возраста, которым не была сделана инъекция коллагена. Среднее значение здоровых мышей служило в качестве контрольного измерения. Начиная с дня 5 после дополнительной инъекции, каждая мышь с оценкой выше среднего здоровых мышей (по одной или нескольким лапам) переводили в одну из групп лечения.
Индукция и клиническая оценка гаптен-опосредованного (TNBS) колита
Мышей Balb/C сенсибилизировали 160 мкл гаптенилирующим агентом TNBS (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури) в концентрации 2,5% в 50% этаноле путем окрашивания кожи. Через одну неделю 120 мкл 1% TNBS в 50% этаноле ввели интрарек-тально через катетер 3,5 по французской шкале. Мышей умертвили через 3 суток после интраректального введения TNBS. Животных взвесили во время сенсибилизации, интраректального введения и ежедневно до момента умерщвления. Клиническую оценку выполнили путем оценки потери веса и гистопатологии ткани толстой кишки после смерти.
Оценка гистопатологии при TNBS-колите
Ткани зафиксировали в фосфатном физрастворе, содержащем 4% формалина, и поместили в парафин. Срезы (5 мкм) окрасили гематоксилином и эозином. Степень воспаления оценивал независимый патолог, используя следующую систему оценки от 0 до 4:0, признаков воспаления нет; 1, низкий уровень инфильтрации лейкоцитов; 2, умеренный уровень инфильтрации лейкоцитов; 3, высокий уровень инфильтрации лейкоцитов, высокая плотность сосудов, утолщение стенки кишечника; 4, трансмуральные инфильтрации, потеря бокаловидных клеток, высокая плотность сосудов, сильное утолщение стенки кишечника, отек.
Фармакокинетический анализ серологического гуманизированного анти-пептида 6 после подкожной и интраперитонеальной инъекций
Восемнадцать самцов мышей DBA/1 (возраста 7-8 недель) разделили на две группы по девять мышей в каждой. Первую группу ввели 500 мкг VH2/VK3 интраперитонеально, и второй группе ввели 500 мкг VH2/VK3 подкожно, обеим группам в сутки 0. Каждую группу разделили на три подгруппы по 3 мыши в каждой, причем у всех мышей в каждой подгруппе наблюдали кровотечение из глаз в одни и те же дни после введения антитела. В подгруппе 1 кровотечение наблюдали в день 0, 3 и 8, в подгруппе 2 в день 1, 4 и 10 и в подгруппе 3 в день 2 и 11. В конце эксперимента мышей умертвили, слили кровь и взяли органы (сердце, селезенку, почку, легкое и печень) и инкубировали в 4% формалине в течение 24 часов, затем перевели в 80% этанол (который оптимален для подготовки слайдов для иммунофлуоресценции). Собрали сыворотку и хранили при -20°C для определения содержания IL-10 и VH2/VK3.
Модель ЭАЭ для МС-ЭАЭ индуцировали у самок мышей C57BL/6 возраста 8 недель путем подкожной инъекции в левую поясничную область 125 мкг миелин-олигодендроцит-гликопротеин 35-55 пептида (MOG35-55), эмульгированного в полном адъюванте Фройнда (CFA), содержащем 5 мг/мл убитых теплом Mycobacterium tuberculosis. Сразу же после и затем через 48 часов мышей инокулировали интраперитонеально 0,5 мл токсина коклюша (400 нг). Через 7 суток мышам сделали дополнительную инъекцию пептида MOG35-55 в CFA в правую поясничную область. Мышей лечили гуманизированным анти-пептид-6 антителом изобретения, Ритуксимабом или средой (ФБР) по показаниям.
Клиническую оценку ЭАЭ осуществляли следующим образом:
0 - без клинического заболевания;
1 - слабость хвоста;
2 - слабость задних конечностей, достаточная для ухудшения выпрямления;
3 - паралич одной конечности;
4 - параплегия со слабостью передних конечностей;
5 - паралич четырех конечностей;
6 - смерть.
Пример 1
Генерация химерных анти-пептид-6 антител
Химерные антитела, в которых последовательности вариабельных участков тяжелой и легкой цепей (VH и VL) получены из мышиного анти-пептид-6 моноклонального антитела, были сконструированы как первый этап в создании анти-пептид-6 гуманизированных антител. Были определены последовательности вариабельных участков тяжелой и легкой цепей (VH и VL) мышиного антитела, и были продуцированы химерные анти-пептид-6 антитела, включающие мышиные вариабельные участки и человеческие постоянные участки IgG1 или IgG4/kappa.
Вкратце, мышиные клетки были успешно оживлены из замороженного сосуда, и мРНК была извлечена из гибридомных клеток с использованием набора для экстракции мРНК согласно инструкциям изготовителя (Promega, Кат. № Z5400). РТ-ПЦР была выполнена с использованием пулов дегенеративных праймеров для мышиной сигнальной последовательности с праймером одного постоянного участка. Вариабельный участок тяжелой цепи мРНК был амплифицирован с использованием набора из шести пулов дегенеративных праймеров (праймеры 5′: MuIgVH5′ - А-F, и праймеры 3′: MuIgMVH3′ - 1 и MuIgGVH3′ - 2, как показано в Таблице 1), и вариабельный участок легкой цепи мРНК был амплифицирован с использованием набора из восьми пулов дегенеративных праймеров (праймеры 5′: MuIGkVL5′ - A-kG и MuIGγVL5′ - A, и праймеры 3′: MuIgkVL3′ - l and MuIgγVL3′ - l, как показано в Таблице 1). 50 мкл реакционной смеси содержали 36,25 мкл воды сорта ПЦР, 5 мкл буфера 10xNovaTaq, 5,25 мкл dNTP (конечная концентрация 0,2 мМ), 2,5 мкл праймеров (10 пмоль/мкл) и 1 мкл (1,25 U) ДНК-полимеразы NovaTaq (Кат. №7103-3). Условиями реакции были 30-40 циклов денатурирования в течение 1 минуты при 94°C, ренатурация в течение 1 минуты при 50°C, увеличение в объеме в течение 2 минут при 72°C и конечное увеличение в объеме в течение 6 минут при 72°C. Продукты амплификации были получены с пулами праймеров тяжелой цепи и k легкой цепи, но не с пулом у праймера. Поэтому легкая цепь в каждом случае из k-кластера. Необходимо отметить, что для цели клонирования гены VH-участка были амплифицированы праймерами, использующими ПЦР, которые были разработаны для инжиниринга в сайтах рестрикционных ферментов 5′ MluI и 3′ HindIII. Участки VL были амплифицированы с использованием праймеров, которые были разработаны для инжиниринга в сайтах рестрикционных ферментов BssHII и BamHI.
Продукты амплификации клонировали в полностью слепой набор для клонирования pSTBlue-1 (ТВ183, Кат. №70191) или набор ″Single dA Tailing Kit″ (TB059, Кат. №69282-3) и набор для клонирования вектора pSTBlue AccepTor (ТВ248, Кат. №70595-3) и секвенсировали. Полученные аминокислотные последовательности мышиных VH (SEQ ID NO. 1) и VL (SEQ ID NO. 2) показаны на Фиг. 1А-1В. Краткий анализ последовательностей, представленный в Таблице 2, показывает, что ни одна из последовательностей вариабельных участков не является необычной.
Экспрессия химерного антитела
dhfr
Мышиные вариабельные участки были впоследствии перенесены в систему экспрессирующего вектора для тяжелых цепей IgG1 и IgG4. Более конкретно, продукты ЦРП VH и VL участков были клонированы в векторы pANTVhG1/4 и pANTVK, соответственно (Фиг. 2), в сайты MluI/HindIII и BssHII/BamHI, соответственно. И pANTVhG1/4, и pANTVK являются плазмидами на основе рАТ153, содержащими кассету экспрессии человеческого Ig. Кассета тяжелой цепи в pANTVhG1/4 состоит из гена постоянного участка IgG1 генома человека, возбуждаемого промотером hCMV, с последующим полиА-участком человеческого IgG4. pANTVhG1/4 также содержит ген хомяка , возбуждаемый промотером SV40 с последующим полиА-участком SV40.
Кассета легкой цепи pANTVK включает kappa-постоянный участок генома человека с последующим полиА-участком легкой цепи. Сайты клонирования между лидерной последовательностью Ig человека и этими постоянными участками позволяют вводить гены вариабельных участков.
Клетки NSO (ЕСАСС 85 110503, Портон, Великобритания) были совместно трансфектированы с этими двумя плазмидами посредством электрополяции, и селекция была выполнена в DMEM (Invitrogen, Paisley UK) + 5% ФБР (Сверхнизкий IgG Кат. №16250-078, Invitrogen, Пейсли, Великобритания) + пенициллин/стрептомицин (Invitrogen, Пейсли, Великобритания) + 100 нМ метотрексата (Sigma, Пуль, Великобритания). Было определено количество колоний, резистентных к метотрексату, и клеточные линии, положительные для экспрессии IgG были увеличены в объеме. Помимо этого, клетки СНО-K1 были кратковременно трансфектированы посредством системы доставки на основе липидов. Через 72 часа после трансфекции клеточные среды были собраны для очистки антител. Химерные мышиные антитела были очищены от супер-натантов культур клеток на сефарозной колонке с Белком A (GE Healthcare, Кат. №110034-93) и квантифицированы с использованием ИФА для детектирования захвата Fc/kappa-цепи (Sigma, Кат. №16260 и А7164) против человеческого стандарта IgG1/kappa или IgG4/kappa (Sigma, Кат. №15154 и 14631) соответственно. Полные векторные нуклеинокислотные последовательности химерных мышиных-человеческих Vk, VH IgG4 и VH IgG1 обозначены как SEQ ID NO. 9, 10 и 11, соответственно.
Связывание химерного антитела с пептидом-6
Связывание химерного антитела IgG1 мыши с пептидом-6 (SEQ ID NO. 15) относительно контрольных мышиных моноклональных антител было оценено с помощью ИФА. Антитела разбавили в 2% БС А/ФБР до начальной концентрации 300 мкг/мл (30 мкг/лунка) и затем дважды разбавили в планшете. Эти разбавления антитела инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре на микротитровальных планшетах с плоским дном Nunc Immuno MaxiSorp 96 (Fisher, Кат. № DIS-971-030J), предварительно покрытых 10 мг/мл (100 мкл/лунка) пептидом 6. Соответствующие вторичные антитела были добавлены в количестве 100 мкл/лунка: козья анти-мышиная IgM пероксидаза, или козья анти-человеческая IgG пероксидаза. Еще через один час инкубации при комнатной температуре анализ был продолжен путем добавления субстрата ТМВ в количестве 100 мкл/лунка (Sigma, Кат. № Т0440). Реакция была остановлена путем добавления 50 мкл/лунка 3М HCl.
Спектральная поглощательная способность была измерена на 450 нм (Dynex MRX TCII) и нанесена на график против концентрации антитела. Как показано на Фиг. 3, кривая связывания химерного мышиного антитела не имеет плато в самых высоких концентрациях, и поэтому точное значение ED50 не было определено. Однако, сравнение со связыванием мышиного моноклонального контрольного антитела (Фиг. 3А) показало, что химерное мышиное антитело (Фиг. 3В) связывается с большей эффективностью чем контрольное антитело. Кроме того, как кажется, не было снижения эффективности связывания в результате преобразования из пентамерного IgM в мономерный IgG.
Пример 2
Генерация составных человеческих вариантных антител мышиного антипептид-6 антитела
Далее анти-пептид-6 составные человеческие антитела были генерированы для мышиных моноклональных антител. В общем, сегменты последовательности человеческого вариабельного участка (V-участок) были получены из несвязанных баз данных последовательностей человеческих антител. Каждый выбранный сегмент последовательности (а также места соединений между сегментами) были проверены на потенциал связывания с МНС класс II, и все конечные варианты последовательности составного человеческого антитела были выполнены так, чтобы избежать эпитопов Т-клеток. Гены V-участка составного человеческого антитела были созданы с использованием синтетических олигонуклеотидов, кодирующих комбинации сегментов человеческих последовательностей. Затем они были клонированы в векторы, содержащие человеческие постоянные участки, и антитела были продуцированы и проверены на связывание с целевыми антигенами конкурентным ИФА-анализом.
Конструирование последовательностей вариабельных участков составного человеческого антитела
Составные человеческие VH и VL последовательности были сконструированы путем сравнения мышиной последовательности и фрагментов разных встречающихся в природе человеческих VH и VL последовательностей и выбора таких человеческих фрагментов, чтобы построить составные человеческие последовательности. Более конкретно, структурные модели В-участков мышиного моноклонального антитела были получены с использованием швейцарского банка данных белков и проанализированы, чтобы идентифицировать важные ″ограничивающие″ аминокислоты в мышиных В-участках, которые вероятно будут вовлечены в связывание антител с антигеном. Выбор фрагментов человеческих VH и VL последовательностей таким образом был ограничен для присутствия определенных аминокислот в соответствующих положениях в контрольном мышином антителе, которые, как считается, будут потенциально вовлечены в связывание антитела. Остатки, содержащиеся в CDR (при использовании определений Кабата и Чотиа), вместе с некоторым количеством остатков FR (каркаса), были сочтены релевантными. Более конкретно, для VH, ограничивающими аминокислотами являются: Cys в положении Н22, Ser в Н23, Gly в Н26, Phe в Н27, Ser в Н28, Leu в Н29, Ser в Н30, Thr в Н31, Ser в Н32, Asn в Н33, Met в Н34, Gly в Н35, Val в Н35А, Gly в Н35 В, Leu в Н48, His в Н50, Ile в Н51, Leu в Н52, Trp в Н53, Asn в Н54, Asp в Н55, Ser в Н56, Lys в Н57, Tyr в Н58, Tyr в Н59, Asn в Н60, Pro в Н61, Ala в Н62, Leu в Н63, Lys в Н64, Ser в Н65, Cys в Н92, Met в Н95, Gly в Н96, Gly в Н97, Tyr в Н98, Tyr в Н99, Gly в Н100, Asn в Н100А, Tyr в Н100 В, Gly в Н100С, Tyr в H100D, Tyr в Н100Е, Ala в H100F, Met в H100G, Asp в H101 и Tyr в H102 и, по выбору, по меньшей мере одну из Leu в Н49, Tyr в Н74, Ile в H11, Ser в Н41 и Ser в Н108. Для VK ограничивающими аминокислотами являются: Gln в положении L1, Cys в L23, Thr в L24, Ala в L25, Ser в L26, Ser в L27, Ser в L27A, Val в L28, Ser в L29, Ser в L30, Ser в L31, Tyr в L32, Leu в L33, His в L34, Trp в L47, Ser в L50, Thr в L51, Ser в L52, Asn в L53, Leu в L54, Ala в L55, Ser в L56, Tyr в L71, Cys в L88, His в L89, Gln в L90, Tyr в L91, His в L92, Arg в L93, Ser в L94, Pro в L95, Pro в L96 и Thr в L97, и, по выбору, по меньшей мере одну из Met в L21, Ile в L10 и Ala в L80 (нумерация по Кабату). VH и VK последовательности контрольного мышиного антитела содержат некоторое количество типичных человеческих фрагментов FR остатков рядом с CDR, тогда как мотивы CDR 1 и 2 обеих цепей были определены как сравнимые с многими мышиными антителами. В общем, из вышеуказанного анализа был сделан вывод, что составные человеческие последовательности для гуманизированного антитела могут быть созданы с широким диапазоном альтернатив вне участков CDR, но только с узким меню возможных альтернативных остатков в CDR последовательности. Предварительный анализ показал, что соответствующие сегменты последовательности из нескольких человеческих антител могут быть объединены, чтобы создать участки CDR сходные или идентичные таким участкам в мышиной последовательности. Для участков вне и фланкирующих участки CDR сегменты человеческой последовательности широкой гаммы были идентифицированы как возможные компоненты вариабельных участков нового составного человеческого антитела.
Избежание эпитопов и конструирование вариантов
На основе вышеописанного анализа большой предварительный набор сегментов последовательностей, которые могут быть использованы для создания вариантов составного человеческого анти-пептид-6 антител на мышиной основе, был выбран и проанализирован с использованием технологии iTope™ (описана в PCT/GB2007/000736) для анализа связывания пептида с человеческими аллелями МНС класса II и с использованием базы данных TCED™ (база данных эпитопов Т-клеток, компания Antitope Ltd.) по известным эпитопам Т-клеток, относящимся к последовательностям антител. Были идентифицированы значащие сегменты последовательностей нечеловеческих связывающих пептидов МНС класса II, а те, которые показали значительное отличие от базы данных TCED™, были отброшены. Это привело к уменьшенному набору сегментов, и их комбинации были снова проанализированы, как сказано выше, для обеспечения того, чтобы места соединений между сегментами не содержали потенциальных эпитопов Т-клеток. Выбранные сегменты, которые представлены в Таблице 3, затем были объединены, чтобы продуцировать последовательности вариабельных участков тяжелой и легкой цепей для синтеза, как также показано на Фиг. 4.
Конструирование вариантов составного человеческого антитела (Composite Human Antibody™)
Гены участков VH и VK составного человеческого антитела начального варианта 1 были синтезированы с использованием серии перекрывающихся олигонуклеотидов, которые были отожжены, лигированы и ЦРП-амплифицированы для получения синтетических В-участков полной длины. Последующие варианты последовательностей составного человеческого антитела были сконструированы с использованием длинных перекрывающихся олигонуклеотидов и ПЦР, причем начальный вариант 1 использовали в качестве шаблона. Фланкирующие нуклеотидные последовательности были также добавлены на оба конца генов, чтобы включить сайты рестриктазы для клонирования. Гены VH включали дополнительные короткие 5′ и 3′ последовательности, содержащие рестрикционные сайты MluI и HindIII, соответственно. Сайт MluI расположен в сигнальной последовательности, и сайт HindIII расположен в первом интроне сразу же после донорного сайта сплайсинга гена VH. Гены VK, включенные в дополнительную короткую 5′ последовательность, содержащую рестрикционный сайт BssHII, и увеличенную в объеме 3′ последовательность, включающую рестрикционный сайт BamHI. Сайт BssHII расположен в сигнальной последовательности, и сайт BamHI расположен в 32 нуклеотидах интрона после донорного сайта сплайсинга гена VK. Фланкирующие последовательности показаны на Фиг. 5 и схемах векторов на Фиг. 2. Были сконструированы четыре тяжелые цепи и три легкие цепи. На Фиг. 6 представлена аминокислотная последовательность, а также кодирующие нуклеинокислотные последовательности этих вариантов [вариабельные участки тяжелых цепей VH1-4, обозначенные SEQ ID NO. 20, 21, 22 и 23 (аминокислотная последовательность) и 27, 28, 29 и 30, соответственно (нуклеинокислотная последовательность), вариабельные участки легких цепей VK1-3, обозначенные SEQ ID NO. 24, 25, 26 (аминокислотная последовательность) и 31, 32, 33 (нуклеинокислотная последовательность), соответственно.
Синтезированные гены были клонированы в Т/А клонирующий вектор для подтверждения и распространения последовательности. Очищенная векторная ДНК гена VH была расщеплена с помощью MluI и HindIII, и очищенная векторная ДНК гена VK была расщеплена с помощью BssHII и BamHI, и полученные фрагменты были разделены на агарозном геле. Генные полосы вариантов были извлечены из геля, очищены и лигированы с подобным же образом расщепленной и очищенной экспрессирующей векторной ДНК. После трансформации в Е. coli XL 1-blue, колонии были подвергнуты ПЦР-скринингу на присутствие вставки. Положительные колонии были отобраны, выращены и очищены и секвенсированы векторной ДНК для подтверждения идентичности вставленных генов. Препараты ДНК с подтвержденными VH и VK были подготовлены для трансфекции в клетки NS0 путем смешивания в совокупности 30 мкг ДНК в молярном отношении 1:2 и линеаризации путем расщепления рестрикционным ферментом SspI. Расщепленную ДНК осадили в этаноле и повторно суспендировали в 50 мкл ФБР с рН 7,4.
Экспрессия и очистка вариантных антител
Все сочетания составных тяжелых (VH1-4) и легких (Vk1-3) цепей (т.е., в совокупности 12 спариваний) были стабильно трансфектированы в клетки NS0 посредством электрополяции и выбраны с использованием 200 нМ метотрексата (Sigma, Кат. № M8407-500MG). Колонии, резистентные к метотрексату, для каждого конструкта были проверены на уровни экспрессии IgG, и лучшие экспрессирующие линии были выбраны и заморожены с использованием жидкого азота.
(0,1%)
Варианты IgG1 были очищены от супернатантов клеточных культур на Белок-А сефарозной колонке (GE Healthcare, Кат. №110034-93) и количественно определены путем измерения OD на 280 нм с использованием коэффициента экстинкции, Ec на основе прогнозируемой аминокислотной последовательности, как показано в Таблице 4. Больше чем 2 мг каждого антитела были очищены и проанализированы с помощью SDS PAGE. Полосы, соответствующие прогнозируемым размерам тяжелых и легких цепей, наблюдали без доказательств какого-либо загрязнения (не показано).
Связывание вариантных антител с пептидом-6
50
Связывание каждого из вариантов гуманизированного IgG1 с пептидом-6 относительно химерного мышиного-человеческого было оценено с помощью ИФА, как указано в разделе ″Порядок проведения экспериментов″. Как показано на Фиг. 7, все варианты антител связались с пептидом-6 по меньшей мере также хорошо, как и химерное мышиное-человеческое антитело, а некоторые, кажется, связались значительно лучше. Как показано на Фиг. 7, связывание химерного антитела и гуманизированных вариантов нельзя вычислить количественно путем вычисления значений ED, поскольку в большинстве случаев плато кривой достигнуто не было, и для некоторых антител значение 50% максимального сигнала получено не было.
Тем не менее, различие между вариантами было сделано после явного связывания. Авторы настоящего изобретения отметили, что варианты, включающие VH1, дали стабильно высокое фоновое связывание и поэтому не могут считаться предпочтительными вариантами. С учетом и связывания (Фиг. 7), и данных по последовательности, четырьмя ведущими кандидатами являются VH2/VK1, VH2/VK2, VH2/VK3 и VH3/VK2. Из них VH2/VK2 и VH2/VK3 явно были наилучшими связующими, причем вариант VH2/VK3 маргинально дал наилучшее связывание в последующих экспериментах при прямом сравнении с VH2/VK2 на одном и том же планшете (данные не показаны).
Вкратце, как показано в настоящем изобретении, составные человеческие антитела, специфические для пептида-6, были сконструированы из сегментов аминокислотной последовательности, полученных полностью из несвязанных вариабельных участков человеческого антитела. Все участки CDR и каркаса в составных человеческих вариантах антител содержали больше одного несвязанного сегмента человеческой последовательности (источник - базы данных по человеческим последовательностям), и все составные человеческие антитела были сконструированы специфически, чтобы избежать эпитопов Т-клеток. Были выбраны четыре варианта поколений, и было продемонстрировано, что некоторые из них имеют повышенное связывание по сравнению с химерным контрольным антителом.
Пример 3
Химерное моноклональное анти-пептид-6 IgG антитело индуцирует секрецию IL-10 из человеческих ПКОК
Показав, что химерное мышиное-человеческое анти-пептид-6 IgG антитело связывается с пептидом-6 (Фиг. 3) и индуцирует секрецию IL-10 в ПКОК (Фиг. 8), авторы настоящего изобретения далее проанализировали зависимость секреции IL-10 от дозы in-vitro. Человеческие ПКОК были взяты у здорового донора и их инкубировали с разными дозами химерного мышиного-человеческого анти-пептид-6 антитела в течение 48 часов. Необработанные клетки служили в качестве контрольной группы. Супернатант собирали и анализировали с помощью набора для ИФА-детектирования IL-10 (R&D Systems). Как показано на Фиг. 8, существует значительное увеличение IL-10, секретированного из клеток, обработанных химерным анти-пептид-6 антителом, по сравнению с необработанными клетками, и, кроме того, показано воздействие реакции на начальную дозу (20 и 50 мкг/мл).
Пример 4
Химерные моноклональные анти-пептид-6 IgG антитела подавляют установленный адъювант-индуцированный артрит (АА)
Авторы настоящего изобретения далее исследовали in vivo эффекты химерного мышиного-человеческого анти-пептид-6 IgG антитела на экспериментальной модели установленного артрита. Пятьдесят крыс Льюиса иммунизировали в сутки 0 с помощью МТ в CFA для индукции артрита, и тяжесть артрита измеряли клинической оценкой. Из 50 крыс, которым была сделана инъекция МТ, у 43 развился артрит. На сутки 16 животные с самой высокой оценкой артрита были объединены в 5 групп (4 группы по 6 крыс и 1 группа из 7 крыс), в которых средняя тяжесть заболевания составляла от 6,16 до 6,7.
После пика заболевания крыс лечили следующим: а. мышиное анти-пептид-6 антитело (IgM); b. химерное мышиное-человеческое анти-пептид-6 антитело (химерное мышиное-человеческое, SEQ ID NO. 1 и 2). Контрольных крыс лечили физраствором и Ритуксимабом (химерное антитело, нацеленное на молекулу, у крыс не присутствует, F. Hoffmann-La Roche Ltd). Антитела вводили интраперитонеально (i.p.) в дозе 5 мг/кг на сутки 17 (непосредственно перед достижением пика заболевания) и 21.
В конце эксперимента крыс умертвили, и задние лапы контрольной крысы и крысы, получавшей химерное мышиное-человеческое анти-пептид-6 антитело, удалили для анализа патологии.
Как можно видеть на Фиг. 9, и мышиный IgM, и химерные мышиные-человеческие IgG1 анти-пептид-6 антитела значительно снизили тяжесть АА. Контрольный химерный Ритуксимаб не оказал действия на АА, таким образом действие, оказываемое посредством человеческого Fc фрагмента антитела можно исключить.
Кроме того, на Фиг. 10 показаны данные по патологии суставов крыс, получавших химерное мышиное-человеческое анти-пептид-6 антитело, по сравнению с крысами, получавшими контрольное антитело Ритуксимаб. Тогда как суставы крыс, получавших химерное анти-пептид-6 антитело, имеют нормальные структуры (Фиг. 10В), суставы крыс, получавших Ритуксимаб, показывают выраженный фиброз и образование реактивной надкостницы (Фиг. 10А). Реактивная надкостница формирует дольки, окруженные волокнистой соединительной тканью, формирующей сплошную волокнисто-костную массу.
Пример 5
Химерное анти-пептид-6 антитело подавляет установленный адъювант-индуцированный артрит подобно Энбрелю и метилпреднизону (МПЗ), с показаниями синергичного эффекта с МПЗ
Иммуномодулирующий эффект анти-пептид-6 антител является основой для их терапевтического потенциала. Поэтому необходимо понимать, что эти анти-пептид-6 антитела могут быть использованы в качестве единственного средства лечения или в сочетании с другими противовоспалительными агентами. Так, авторы настоящего изобретения оценили воздействия химерного анти-пептид-6 антитела с/без противовоспалительных агентов, таких как этанерцепт (Энбрель) или метилпреднизон (МПЗ) на АА у крыс Льюиса.
Крыс Льюиса иммунизировали с помощью MT/CFA в сутки 0. На сутки 16 крыс разделили на 6 групп по 6 крыс в каждой. На сутки 17 крыс лечили следующим образом: Группа 1. ФБР (интраперитонеально), Группа 2. химерное мышиное-человеческое анти-пептид-6 антитело (интраперитонеально, 5 мг/кг), Группа 3. Энбрель (подкожно, (0,5 мг/кг), Группа 4. метилпреднизолон (МПЗ) (подкожно, 5 мг/кг), Группа 5. химерное мышиное-человеческое анти-пептид-6 антитело (интраперитонеально, 5 мг/кг) и Энбрель (подкожно, 0,5 мг/кг) и Группа 6. химерное мышиное-человеческое антипептид-6 антитело (интраперитонеально, 5 мг/кг) и МПЗ (подкожно, 5 мг/кг).
Как можно видеть на Фиг. 11, все режимы лечения были эффективными в подавлении тяжести артрита. Химерное мышиное-человеческое анти-пептид-6 антитело было эффективным подобно МПЗ или Энбрелю при назначении только его. Кроме того, если вводить химерное анти-пептид-6 антитело вместе с высокими дозами МПЗ, достигается более высокий уровень подавления заболевания, что предполагает потенциальный синергичный эффект этого сочетания или обоих.
Пример 6
Гуманизированное анти-пептид-6 антитело связывается с макрофагами человека (клетки CD14+)
6
Показав, что варианты гуманизированных анти-пептид-6 антител, описанных в Примере 2, имеют значительное связывание с пептидом-6 (Фиг. 7), авторы настоящего изобретения далее проанализировали действие наиболее эффективного варианта (VH2/VK3) при связывании с макрофагами человека. Человеческие ПКОК (10) были взяты у здорового донора и окрашены только анти-CD 14 антителом (АРС-конъюгированным) или дважды окрашены гуманизированным VH2/VK3 анти-пептид-6 антителом (FITC-конъюгированным; 10 мкг). Затем клетки анализировали с помощью FACS-анализа на связывание антител. Маркер CD14 присутствует на макрофагах, и поэтому окрашивание CD14-положительных клеток указывает на окрашивание макрофагов человека.
Результаты, представленные на графиках плотности на Фиг. 12А и 12В, показывают, что гуманизированное VH2/VK3 анти-пептид-6 антитело связывается с большинством CD14-положительных клеток (макрофаги составляют ~10% от изолированной популяции клеток, нижний правый квадрант на Фиг. 12А). Эти результаты подобны связыванию оригинального мышиного моноклонального антитела (IgM) с макрофагами человека (данные не показаны). Результаты на гистограммах на Фиг. 12С отражают процент клеток из CD14+ популяции, которые были окрашены FITC (без антипептид-6 антитела - черные, с анти-пептид-6 антителом - белые), показывая, что гуманизированное анти-пептид-6 антитело связывает большой процент популяции CD14+.
Пример 7
Гуманизированное анти-пептид-6 антитело связывает аденилил-циклаза-ассоциированный белок 1 (САР1)
В предыдущей патентной заявке IL2010/000231 (еще не опубликована) авторы настоящего изобретения показали, что анти-пептид-6 антитело распознает белок гидрофильной мембраны на поверхности макрофагов. Масс-спектрометрический анализ определил этот целевой белок как аденилил-циклаза-ассоциированный белок 1 (САР1).
Эти результаты были подкреплены задержанием анти-CAP1-признанным белком на аффинной колонке с анти-пептидом-6 (но не на контрольной колонке с Ритуксимабом).
Для проверки того, что гуманизированное анти-пептид-6 вариант антитело распознает САР1 как химерное анти-пептид-6 антитело, авторы настоящего изобретения выполнили вестерн-блоттинг анализ, используя гуманизированный вариант VH2/VK3. Человеческий САР1, соединенный с His tag на N-конце, был клонирован и экспресси-рован в Е. Coli BL21. Белок был обогащен из супернатанта бактериального лизата путем аффинной хроматографии на Ni-сефарозной колонке. Элюат использовали для SDS-PAGE, после чего выполнили вестерн-блоттинг анализ вместе с контрольным, нерелевантным His-меченым белком (His CREB). Три сходных блота были подготовлены и использованы для детектирования со следующими антителами: коммерческий мышиный анти-человеческий САР1, коммерческий мышиный анти-His и гуманизированные анти-пептид-6 антитела изобретения. Как можно видеть на Фиг. 13, гуманизированное VH2/VK3 антитело специфически распознало His-помеченный САР1 белок, давая еще одно указание того, что этот специфический вариант сохраняет способность связывания и потенциального сигнала через САР1.
Пример 8
Вариант гуманизированного VH2/VK3 анти-пептид-6 антитела значительно индуцирует секрецию IL-10 из человеческих ПКОК
С учетом того, что вариант VH2/VK3 (включающий вариабельный участок тяжелой цепи SEQ ID NO. 21 и вариабельный участок легкой цепи SEQ ID NO. 26) был наиболее эффективен в связывании с пептидом-6 (Фиг. 7) и также показал значительное связывание с макрофагами человека (Фиг. 12), авторы настоящего изобретения далее проанализировали активность этого антитела в in vitro биологическом анализе секреции IL-10. Авторы настоящего изобретения кроме того проанализировали секрецию IL-10 дополнительным вариантом гуманизированного анти-пептид-6 антитела, который был эффективен в связывании с пептидом-6 (VH2/VK1). Человеческие ПКОК были взяты у здорового донора и инкубированы с 200 мкг или гуманизированного антипептид-6 варианта VH2/VK1 или VH2/VK3 в течение 48 часов. Необработанные клетки служили в качестве контрольной группы. Супернатант собирали и анализировали с помощью набора для ИФА-детектирования IL-10 (R&D Systems).
Как четко показано на Фиг. 14, существует значительное увеличение в IL-10, секретированном из клеток, обработанных гуманизированным VH2/VK3 анти-пептид-6 антителом, по сравнению с вариантом VH2/VK1 гуманизированного анти-пептид-6 антитела или необработанными клетками. Результаты для варианта VH2/VK3 сходны с ранее полученными данными для химерного анти-пептид-6 антитела (Фиг. 8). Текущие результаты показывают, что эта биологическая активность анти-пептид-6 антитела сохранена вариантом VH2/VK3, но не вариантом VH2/VK1.
Пример 2 (Фиг. 7) продемонстрировал кинетику связывания пептида-6 разными вариантами VH и VK гуманизированного антитела. В своем следующем эксперименте авторы настоящего изобретения постарались оценить корреляцию между сродством связывания пептида-6 вариантами антител и индукцией IL-10. Авторы настоящего изобретения использовали покрытые пептидом-6 ИФА-планшеты (как в Примере 2), чтобы оценить сродство пептида-6 для VH3/VK2, VH2/VK3, VH2/VK1 и VH2/VK2, и собранные супернатанты с культур ПКОК инкубировали или с 33, или с 100 мкг/мл каждого из вариантов антител, чтобы определить индукцию IL-10. На Фиг. 15А показано, что в общем 100 мг/мл антитела индуцировали более сильную экспрессию IL-10 чем 33 мкг/мл, и что вариант VH2/VK3 индуцировал более сильную экспрессию IL-10 чем другие варианты. На Фиг. 15В показано сродство связывания с пептидом-6 разных вариантов, причем наивысшее сродство также было показано вариантом VH2/VK3. Однако, неожиданно, в случае других вариантов, связывание с пептидом-6 и индукция IL-10 точно не коррелируются.
Как показавший наилучшую индукцию IL-10, вариант VH2/VK3 был выбран в качестве лидерного антитела для дальнейших экспериментов in vivo.
Пример 9
2
Фрагмент F(ab) гуманизированного VH2/VK3 анти-пептид-6 антитела связывается с макрофагами человека (клетки CD14+) и индуцирует секрецию IL-10 из человеческих ПКОК
2
Для того, чтобы подтвердить, что эффекты, показанные VH2/VK3 антителом, не опосредуются через часть Fc антитела, авторы настоящего изобретения подготовили фрагмент F(ab) VH2/VK3 анти-пептид-6 антитела и оценили влияние на связывание с макрофагами человека и индукцию секреции IL-10.
6
2
2
Человеческие ПКОК (10) были взяты у здорового донора и окрашены или только анти-CD14 антителом (РЕ-конъюгированным) или дважды окрашены фрагментом F(ab) гуманизированного VH2/VK3 анти-пептид-6 антитела (FITC-конъюгированного; 10 мкг). Клетки затем были подвергнуты FACS-анализу на связывание антител. В отдельном эксперименте человеческие ПКОК были взяты у здорового донора и инкубированы с 150 мкг фрагмента F(ab) гуманизированного анти-пептид-6 VH2/VK3 антитела в течение 48 часов. Необработанные клетки служили в качестве контрольной группы. Супернатант собирали и анализировали с помощью набора для ИФА-детектирования IL-10 (R&D Systems).
2
2
2
2
Результаты, представленные на графиках плотности на Фиг. 16А и 16В, показывают, что фрагмент F(ab) гуманизированного VH2/VK3 анти-пептид-6 антитела связывается с CD14+ клетками (макрофаги, составляющие ~11% от популяции изолированных клеток донора, нижний правый квадрант на Фиг. 16А). Эти результаты сходны со связыванием всего VH2/VK3 анти-пептид-6 антитела с макрофагами человека (Фиг. 12В). Результаты на гистограммах на Фиг. 16С отражают процент клеток из популяции CD14+, которые был окрашены FITC (без фрагмента F(ab) анти-пептид-6 антитела - черный, с фрагментом F(ab) анти-пептид-6 антитела - белый), показывая, что фрагмент F(ab) гуманизированного анти-пептид-6 антитела связывается с большим процентом популяции CD14+.
2
2
Как показано на Фиг. 17, существует значительное увеличение в IL-10, секретированном из клеток, обработанных фрагментом F(ab) гуманизированного VH2/VK3 анти-пептид-6 антитела по сравнению с необработанными клетками. Эти результаты подобны вышеописанным результатам, отражающим увеличение секреции IL-10 всем VH2/VK3 анти-пептид-6 антителом (Фиг. 14). Эти данные четко показывают и подтверждают, что функциональные характеристики VH2/VK3 анти-пептид-6 антитела соотнесены с антиген-связывающими участками части F(ab) молекулы.
Пример 10
Гуманизированное VH2/VK3 анти-пептид-6 антитело подавляет установленный адъювант-индуцированный артрит
Авторы настоящего изобретения далее исследовали in vivo эффекты гуманизированного VH2/VK3 анти-пептид-6 антитела на экспериментальной модели установленного артрита. Крыс Льюиса иммунизировали с помощью MT/CFA на сутки 0 для индукции артрита, и тяжесть артрита измерили путем клинической оценки. На сутки 14 крысы были разделены на три группы. На сутки 15, к пику заболевания, крыс лечили следующим образом: Группа 1. ФБР (интраперитонеально); Группа 2; гуманизированное VH2/VK3 (интраперитонеально, 2,5 мг/кг) и Группа 3. химерное мышиное-человеческое анти-пептид-6 антитело (интраперитонеально, 5 мг/кг).
Как можно видеть на Фиг. 18, гуманизированное VH2/VK3 анти-пептид-6 антитело было эффективным в значительном подавлении тяжести установленного АА подобно химерному мышиному-человеческому анти-пептид-6 антителу и по сравнению с животными, получавшими ФБР.
Пример 11
Гуманизированное VH2/VK3 анти-пептид-6 антитело индуцирует секрецию IL-10 в сыворотке крыс с установленным адъювант-индуцированны артритом
Авторы настоящего изобретения кроме того оценили in vivo влияния гуманизированного анти-пептид-6 антитела на индукцию секреции IL-10 в сыворотке животных, имеющих установленный артрит. Крыс Льюиса иммунизировали с помощью MT/CFA на сутки 0. Крысам вводили на сутки 11 и 15 гуманизированное VH2/VK3 антитело (интраперитонеально, 1 мг/кг) или ФБР для сравнения. Тяжесть артрита оценивали клинической оценкой, животных умертвили на сутки 19, и серологические уровни разных цитокинов измерили с помощью ИФА (R&D Systems). Сыворотка здоровых необработанных животных служила в качестве контрольной.
Как можно видеть на Фиг. 19, существует четкая индукция уровней IL-10 у животных с адъювант-индуцированным артритом, получавших гуманизированное VH2/VK3 антитело. Эти данные коррелируются с уменьшением тяжести артрита после лечения гуманизированным VH2/VK3 антителом (Фиг. 18).
Кроме того, после введения VH2/VK3 существует снижение уровней других цитокинов, таких как IL-6 и IFN-γ, которые были повышены у артритных животных, тогда как уровни других цитокинов, таких как IL-4, IL-17, IL-1 и TNFα, остаются пренебрежимо малыми во всех группах,
Пример 12
Гуманизированное VH2/VK3 анти-пептид-6 антитело подавляет коллаген-индуцированный артрит
Авторы настоящего изобретения далее исследовали in vivo эффекты гуманизированного VH2/VK3 анти-пептид-6 антитела на дополнительной экспериментальной модели артрита, модели коллаген-индуцированного артрита (КИА) у мышей. Самцы мышей DBA/1 были иммунизированы на сутки 0 коллагеном типа II, эмульгированном в CFA, чтобы индуцировать артрит, и дополнительную дозу ввели на сутки 21. У 85% мышей развился КИА в течение 2,5 недель после дополнительной инъекции. После клинических признаков заболевания мышам ввели одну дозу или гуманизированного VH2/VK3 анти-пептид-6 антитела (интраперитонеально, 200 мкг) или трис-буферного физраствора (TBS).
Как можно видеть на Фиг. 20, гуманизированное VH2/VK3 анти-пептид-6 антитело было эффективным в значительном подавлении тяжести установленного КИА, по сравнению с контрольным TBS.
Пример 13
Гуманизированное анти-пептид-6 антитело индуцирует секрецию IL-10 из ПКОК пациентов с ревматоидным артритом
В продолжение Примера 8, где было показано, что гуманизированное антипептид-6 антитело индуцирует экспрессию IL-10 в ПКОК здорового донора, и Примера 11, показывающего, что лечение гуманизированным антителом индуцирует повышенные уровни IL-10 в сыворотке крыс с АА, авторы настоящего изобретения оценили эффективность варианта VH2/VK3 для индукции IL-10 в ПКОК, взятых у пациентов с ревматоидным артритом (РА). ПКОК были взяты у двух пациентов с РА и инкубированы в течение 48 часов с или без 200 мкг гуманизированного анти-пептид-6 антитела (VH2/VK3). Затем супернатанты анализировали на содержание секретированного IL-10. Как четко видно на Фиг. 21, вариант VH2/VK3 индуцировал резкое увеличение количества IL-10, секретируемого обработанными ПКОК.
Пример 14
Гуманизированное VH2/VK3 анти-пептид-6 антитело уменьшает симптомы TNBS колита, животная модель воспалительного заболевания кишечника (ВЗК)
На основе уникального противовоспалительного механизма анти-пептид-6 антитела авторы настоящего изобретения оценили эффекты гуманизированного VH2/VK3 анти-пептид-6 антитела на дополнительной экспериментальной модели аутоиммунного воспалительного заболевания. Упомянутой здесь моделью является модель TNBS колита, животная модель ВЗК.
Двадцать мышей Balb/C сенсибилизировали посредством окрашивания кожи TNBS (назначенный день -7), через неделю после чего выполнили интраректальное введение TNBS (назначенный день 0). Гуманизированное VH2/VK3 антитело (200 мкг) вводили в три временные точки (-6, -2, +1) путем интраперитонеальной инъекции обрабатываемым животным, которых сравнивали с необработанными контрольными животными. Всех животных взвешивали во время сенсибилизации, интраректального введения и ежедневно после этого. Животные были умерщвлены через три дня после интраректального введения (назначенный день +3) после значительной потери массы тела (>5%) в контрольной группе, и ткань толстой кишки была удалена и направлена на гистопатологический анализ.
Как можно видеть на Фиг. 22 и 23, гуманизированное VH2/VK3 антитело эффективно подавляло потерю массы тела и воспалительную реакцию, связанную с заболеванием. Это можно видеть по общей микроскопной оценке заболевания по группам (*p<0,05 по сравнению с контрольными мышами) и представительной гистологической картине (увеличение ×100). Минимальная воспалительная реакция видна в толстой кишке мышей, получавших VH2/VK3, против значительного воспаления, видимого в толстой кишке контрольных мышей.
Пример 15
Гуманизированное VH2/VK3 анти-пептид-6 антитело уменьшает тяжесть TNBS колита по сравнению с контрольными антителами
Авторы настоящего изобретения показали в Примере 14, что вариант VH2/VK3 уменьшает вредные влияния, оказываемые гаптенилирующим агентом TNBS на модель ВЗК мыши. Для подкрепления этих результатов авторы настоящего изобретения выполнили сходный эксперимент, сравнив действие гуманизированного VH2/VK3 анти-пептид-6 антитела с Ритуксимабом отрицательным контрольным mAb и ФБР (наполнитель).
Мышей Balb/C сенсибилизировали посредством окрашивания кожи TNBS (день -7), через неделю после чего было выполнено интраректальное введение TNBS (обозначено как день 0). Вариант VH2/VK3 (8 мг/кг), Ритуксимаб (8 мг/кг) или ФБР вводили после сенсибилизации и на сутки 1 после интраректальной индукции. Мышей взвешивали во время сенсибилизации, интраректального введения и каждый день после этого. Животных умертвили через 3 дня после интраректального введения (день 3) после значительной потери массы тела в контрольных группах.
На Фиг. 24 четко показано, что гуманизированный анти-пептид-6 VH2/VK3 вариант эффективно подавлял потерю массы тела, снижая TNBS-индуцированную потерю массы тела до 3,5% по сравнению с 15% потери массы тела у животных, получавших ФБР и 14% у животных на Ритуксимабе.
Пример 16
Гуманизированное VH2/VK3 анти-пептид-6 антитело для лечения диабета с использованием модели мыши с диабетом
Поощренные положительным действием антитела изобретения на воспалительное состояние, продемонстрированным на моделях артрита и ВЗК, авторы настоящего изобретения далее исследовали потенциальный положительный эффект гуманизированного анти-пептид-6 антитела на другое иммунное нарушение, используя модели мышей с диабетом. Таким образом, далее было исследовано возможное использование варианта VH2/VK3 для профилактики и/или уменьшении симптомов диабета с использованием мыши NOD как модели для диабета.
Авторы настоящего изобретения исследовали эффект гуманизированного VH2/VK3 анти-пептид-6 антитела, используя мышей NOD, путем введения внутривенно мышам NOD (8 в группе) 8 мг/кг гуманизированного VH2/VK3 анти-пептид-6 антитела в недели 8 и 12. Контрольные мыши получали ФБР. Мышей контролировали через каждую неделю на уровни глюкозы в крови и массу тела.
Пример 17
Гуманизированное VH2/VK3 анти-пептид-6 антитело для лечения псориаза
Эксперименты были выполнены на выборке из 20 пациентов, 10 мужчин и 10 женщин в возрасте от 17 до 71 года. Была представлена каждая форма псориаза: бляшковидный псориаз, псориаз головы, каплеобразный псориаз, эритродермический псориаз и возвратный псориаз.
Лечение заключалось в внутривенной инъекции варианта VH2/VK3 5 мг/кг массы тела один раз в две недели в течение одного месяца (3 инъекции).
В ходе этого исследования не использовался ни один из обычных режимов лечения псориаза, так что полученные результаты могут быть отнесены только к варианту VH2/VK3.
Далее исследовали влияние топикального нанесения гуманизированного антипептид-6 антитела. Так, или 500 мкл плацебо (ФБР) или 500 мкл (10 мг/мл) варианта VH2/VK3 поместили на водонепроницаемые окклюзионные повязки. Затем окклюзионные повязки поместили на левый локоть (вариант VH2/VK3) и правый локоть (ФБР) пациента, страдающего псориазом, причем упомянутый пациент имел большие видимые псориатические бляшки на обоих локтях на время начала лечения.
Окклюзионные повязки меняли ежедневно. При смене повязок остатки старого вещества удаляли и оценивали токсикологию перед тем как поместить свежую окклю-зионную повязку со свежим вариантом VH2/VK3 анти-пептида-6 или ФБР. Состояние локтей и коленей документировали путем цифровой фотографии с автоматической простановкой времени на всех фотоснимках.
Лечение проводили в течение 4 дней и контролировали смягчение псориатических бляшек, а также излечение с нормально смотрящейся кожей.
Пример 18
Гуманизированное VH2/VK3 анти-пептид-6 антитело в лечении и предотвращении экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (ЭАЭ) у мышей
Для дальнейшего исследования влияния гуманизированного VH2/VK3 антипептид-6 антитела на иммунные нарушения затем использовали ЭАЭ в качестве модели для множественного склероза (МС). ЭАЭ индуцировали у 8-недельных самок мышей C57BL/6 путем инъекции миелин-олигодендроцит-гликопротеин 35-55 пептида (MOG35-55) в первый и седьмой дни эксперимента. Мышей далее инокулировали токсином коклюша в первый и второй дни эксперимента, как сказано в разделе ″Порядок проведения экспериментов″. Четыре группы мышей (по 10 мышей в каждой) оценивали по клинической оценке, детально описанной в разделе ″Порядок проведения экспериментов″. Первая группа (А) для изучения потенциального предотвращающего и защитного эффекта гуманизированного анти-пептид-6 антитела получала еженедельно вариант VH2/VK3 (200 мкг), начиная за три до инъекции MOG и заканчивая на сутки 37, после чего лечили наполнителем с суток 37 до суток 52. Мыши второй группы (В) еженедельно получали вариант VH2/VK3 (200 мкг), начиная с седьмого дня после инъекции MOG и до конца эксперимента на 52 сутки. Третья группа (С) еженедельно получала вариант VH2/VK3 (200 мкг), начиная с первого дня до конца эксперимента на сутки 52. Контрольная группа (D) получала наполнитель (ФБР) с первого дня до конца эксперимента на сутки 52. Мышей клинически оценили согласно критериям, изложенным в разделе ″Порядок проведения экспериментов″.
Пример 19
Гуманизированное VH2/VK3 анти-пептид-6 антитело не оказывает какого-либо значащего патологического влияния в повышенных дозах
Авторы настоящего изобретения далее оценили безопасность введения увеличивающихся доз гуманизированного VH2/VK3 анти-пептид-6 антитела на животных. Десять самцов мышей Balb/C (возраста 7 недель) разделили на 5 групп по 2 мыши в каждой и вводили им интраперитонеально увеличивающиеся дозы мышиного антипептид-6 IgM антитела или гуманизированного VH2/VK3 антитела (в двух раздельных экспериментах) следующим образом:
Мыши 1 и 2 - физраствор (контрольные)
Мыши 3 и 4 - 5 мг/кг массы тела (МТ)
Мыши 5 и 6 - 10 мг/кг МТ
Мыши 7 и 8 - 20 мг/кг МТ
Мыши 9 и 10 - 40 мг/кг МТ
Мышей наблюдали через день на изменения в массе тела, поведении, а также любые другие аномальные признаки. Через 2 недели мышей умертвили, сердце, печень, легкие, селезенку и почки удалили для анализа патологии. Результаты были следующими.
1. Наблюдение за поведением
Мышей наблюдали через день. Их поведение было нормальным, во внешнем виде изменений не было, включая шерсть, кожу и глаза. Изменения не были найдены в потреблении ими пищи, и их масса тела увеличивалась с временем.
2. Данные по патологии
Значащих данных по патологии не было даже при наивысшей дозе 40 мг/кг, что дало исходные данные относительно безопасности введения анти-пептид-6 антитела, специфически, гуманизированного VH2/VK3.
Пример 20
Фармакокинетический профиль гуманизированного VH2/VK3 анти-пептид-6 антитела
Важным применением настоящего изобретения является лечение пациентов с использованием антитела изобретения. Для этой цели период полураспада антитела in vivo должен быть профилирован. Авторы настоящего изобретения таким образом определили уровни введенного инъекциями гуманизированного антитела (вариант VH2/VK3), остающиеся в крови мышей с течением времени. Одна группа мышей DBA/1 возраста 7-8 недель получила 500 мкг VH2/VK3 интраперитонеально на сутки 0, и вторая группа получила 500 мкг VH2/VK3 подкожно на сутки 0. Эти две группы затем разделили на три группы каждую, причем кровь в каждой группе брали ретроорбитально в разные дни после инъекции, т.е. в подгруппе 1: дни 0, 3 и 8, в подгруппе 2: дни 1, 4 и 10 и в подгруппе 3; дни 2 и 11. Сыворотку брали и хранили при -20°С для определения VH2/VK3. На Фиг. 25 показано содержание VH2/VK3 в сыворотке в течение 11-дневного периода, полураспад в сыворотке при интраперитонеальном и подкожном введении составляет приблизительно 10 суток.
Пример 21
Конструирование экспрессирующего вектора PRO01 VH2/VK3
Для того, чтобы использовать гуманизированное VH2/VK3 анти-пептид-6 антитело для лечения пациентов потребуются большие количества антитела и поэтому, чтобы повысить выход антитела при изготовлении, была продуцирована бицисторная экспрессирующая плазмида, включающая легкую и тяжелую цепи антитела.
Вектор pANTVhG1 тяжелой цепи был модифицирован путем введения короткого линкера перед CMV-промотером экспрессирующей кассеты тяжелой цепи, который содержал сайты рестриктазы, совместимые с таковыми на каждом конце экспрессирующей кассеты легкой цепи (Spe I и Pci I). Экспрессирующая кассета легкой цепи затем была изъята из экспрессирующего вектора pANTVK легкой цепи и перенесена в модифицируемый экспрессирующий вектор тяжелой цепи для создания двойного экспрессирующего вектора pANT18. Этот экспрессирующий вектор также содержит рМВ1 источник репликации для распространения в прокариотических клетках и ген β-лактамазы (ApR) для прокариотической селекции.
Двойной экспрессирующий вектор pANT18 (который описан выше) и PRO01 варианта VK3 легкой цепи были расщеплены рестрикционными ферментами BssHII и BamHI. Расщепленные фрагменты были очищены на геле и лигированы между собой. Эта новая плазмида вместе с PRO01 вариантом тяжелой цепи были расщеплены с помощью рестрикционных ферментов MluI и HindIII, и очищенные на геле и лигированные между собой расщепленные фрагменты для формирования PRO01 двойного экспрессирующего вектора pPR014 показаны на Фиг. 26.
Пример 22
Трансфекция PRO01 VH2/VK3 экспрессирующего вектора, выбор начальной клеточной линии и адаптация к суспензионной культуре в химически определенной среде
dhfr-
2
2
Плазмида pPR014, которая имеет один сайт распознавания SspI, расположенный в гене бета-лактамазы, была линеаризована с использованием этого рестрикционного фермента. Линеаризованная плазмидная ДНК была трансфектирована в клетки СНО , взятые из Главного клеточного банка, который был проверен и сертифицирован как не содержащий бактерий, грибов, микоплазмы и побочных агентов в соответствии с действующими правилами (выполнено ЕСАСС, Агентством по защите здоровья, Портон-Даун, Великобритания). Клеточные культуры содержали в химически определенной среде (CD DG44), дополненной 40 мл/л глутамакса в встряхиваемом инкубаторе (Kuhner Climo-shaker ISF1-X), установленном на 100 об/мин, в перегородчатых колбах Эрленмейера при 8% СО и 37°C. За 48 часов до трансфекции клетки поместили в планшеты для культивирования тканей с 6 лунками в DMEM-среде, дополненной 1% диализированным ФБР, глутамаксом и Н/Т. Плазмидную ДНК ввели путем липид-опосредованной трансфекции, используя Липофектамин 2000. Через 24 часа после трансфекции клетки развели в 100 мл DMEM + 1% ФБР + Глутамакс, добавляемой по 10 мл/л (без добавки Н/Т) и распределили по 100 мкл/лунка в 96-луночные планшеты для культивирования тканей с плоским дном. Затем клетки инкубировали в увлажненной атмосфере при 8% СО и 37°C (связующее СВ150). Еще после 24 часов среду DMEM удалили и заменили средой CD-OptiCHO в количестве 100 мкл/лунка, дополненной 40 мл/л глутамакса. Планшеты вернули в инкубатор и регулярно сканировали, используя устройство регистрации изображений Genetix Clone Select Imager для отслеживания роста клеток в каждой лунке. Свежую селекционную среду добавляли с регулярными интервалами в течение времени инкубации для обеспечения постоянных уровней питательных веществ.
Через несколько недель было идентифицировано большое количество лунок, которые содержали активно растущие колонии клеток. Супернатанты из этих лунок были взяты на анализ и проанализированы на титры человеческого IgG с использованием ИФА для детектирования Fc захвата/Kappa легкой цепи человеческого IgG1. На основании результатов этого анализа в совокупности 46 колоний были перенесены в 24-луночные планшеты, содержащие 0,5 мл/лунка среды CD OptiCHO, дополненной 40 мл/л глутамакса. Когда клетки в лунках были почти конфлюэнтными, супернатант из каждой из этих 46 лунок был взят для анализа и проанализирован на титр IgG. На основании этих результатов 29 лучших экспрессирующих клеточных линий были отобраны для увеличения в объеме в колбы Т-25. Эти клеточные линии снова выращивали почти до конфлюэнции, и в этот момент супернатанты брали для анализа и анализировали на IgG титр, как сказано выше. На основании этих результатов 20 лучших экспрессирующих клеточных линий были переведены в колбы Т-75. Супернатанты клеточных культур из конфлюэнтных колб Т-75 были взяты для анализа, и титры IgG были определены, как сказано выше. Результаты всех этих анализов представлены в Таблице 5. Сравнение уровней экспрессии этих 20 клеточных линий позволило идентифицировать 12 лучших экспрессирующих клеточных линий (в Таблице 5 выделены жирным курсивом), чтобы взять их для дальнейшего анализа и развития.
Колонии, выбранные для первого этапа амплификации генов выделены жирным курсивом.
Анализ показателя удельной продуктивности (ПУП) был выполнен для каждой из этих 12 клеточных линий, и удельная продуктивность выражена в пг/клетка/сутки. Результаты представлены в Таблице 6.
6
6
Показатели удельной продуктивности (ПУП) по 12 начальным лучшим клеточным линиям. ПУП вычислили как (пг/клетка/сутки) = ((Th-Ti)/((Vh+Vi)/2))/время, где: Th = титр при сборе (мкг), Ti = начальный титр (мкг) = 0, Vh = количество жизнеспособных клеток при сборе (×10 клеток), Vi = начальное количество клеток (×10 клеток) и время = прошедшее время (в сутках) между Ti и Th.
Выбранные 12 клеточных линий, показанные в Таблице 6 были прогрессированы в первый этап амплификации генов. Процесс амплификации генов происходит в результате селективного давления при повышающейся концентрации метотрексата (МТХ). Для первого этапа амплификации генов культуры из колб Т75 были посеяны в 12-луночные планшеты, где каждая лунка содержала увеличивающуюся концентрацию МТХ. Среду в каждой лунке изменяли еженедельно до конфлюэнции клеток. Через две недели супернатант с каждой культуры с увеличивающимися уровнями МТХ (0,05-50,0 мкМ) был взят для анализа и проанализирован на титр IgG. Результаты для каждой из 12 клеточных линий приведены в Таблице 7. Эти результаты продемонстрировали, что в некоторых случаях увеличение титра антитела наблюдалось при определенных уровнях МТХ по сравнению с лункой, где МТХ отсутствовал (лунка А1). Выбранные лунки для каждой клеточной линии прогрессировали для оценки ПУП.
Был выполнен анализ ПУП, и продуктивность выразили в пг/клетка/сутки. Сделали сравнения между культурами, растущими в разных концентрациях МТХ, для всех клеточных линий, и результаты приведены в Таблице 7.
Двенадцать клеточных линий, показавших оптимальные ПУП (смотрите Таблицу 6), были посеяны в 12-луночном формате и инкубированы в указанном диапазоне МТХ. Пробы супернатанта на титр антитела брали каждые две недели. ПУП анализировали для детектирования амплификации генов при селективном давлении МТХ.
В Таблице 7 показано, что существует четкое увеличение продуктивности для ряда культур при возрастающих концентрациях МТХ. В частности, клеточная линия PRO01-B-14-524-0.8, содержащая 0,8 мкМ МТХ показала почти четырехкратное увеличение удельной продуктивности. Культуры, выделенные жирным курсивом в Таблице 7, были выбраны для перевода на второй этап амплификации генов.
Был выполнен второй этап амплификации генов в присутствии МТХ. Каждую неделю среду меняли в каждой лунке 12-луночного планшета до конфлюэнции клеток. Спустя две - четыре недели брали пробу супернатанта с каждой культуры с возрастающими уровнями МТХ и анализировали на титр IgG. Результаты для каждой из этих клеточных линий приведены в Таблице 8. Данные по начальному титру с 12-луночньгх планшетов показали, что в большинстве лунок амплификации не произошло; однако 14 лунок были подвергнуты оценке ПУП (Таблица 8). Результаты этого анализа ПУП продемонстрировали, что дальнейшая амплификация генов не произошла в использованных увеличенных концентрациях МТХ. На этой стадии клетки с второго этапа амплификации были заморожены и хранились в паровой фазе жидкого азота.
Показатели удельной продуктивности (ПУП) после второго этапа амплификации. Значения ПУП вычислены как для Таблицы 6.
Из-за отсутствия повышенной экспрессии hIgG после второго этапа амплификации генов лучшая экспрессирующая клеточная линия с первого этапа, PRO01-B-14-524-0.8, была выбрана для прогрессирования в клонировании при ограниченном разбавлении в отсутствие МТХ. После одних суток инкубации планшеты исследовали, используя устройство получения изображений Genetix Clone Select Imager. После этого фотоснимки каждого планшета делали дважды в неделю. Планшеты оценили для идентификации генетически однородных колоний. Это было выполнено независимо двумя исследователями, и колонии, оцененные как генетически однородные обоими исследователями, были увеличены в объеме. В результате, 84 лунки были сочтены как содержащие клональные клеточные линии, полученные от одной клетки. Были взяты пробы из всех 84 лунок и проанализированы на титр hIgG1. На основании этих результатов лучшие 57 клонов были увеличены в объеме в 24 луночных планшетах. Увеличение в объеме прогрессировало в 6 луночных планшетах, колбах Т-25 и колбах Т-75 в отсутствие МТХ. На каждой стадии перед увеличением в объеме супернатанты клеток анализировали на титр hIgG1. Из-за низких титров IgG несколько клонов были удалены на каждой стадии, так что осталось 38 клонов к времени, когда они были переведены в колбы Т-75. Каждый из 38 выбранных клонов затем был подвергнут анализу на ПУП. Результаты этого анализа можно видеть в Таблице 9.
На основании этих результатов 13 клональных клеточных линий были идентифицированы как имеющие наивысшую продуктивность: PRO01-D-14-524-AG, PRO01-D-14-524-AJ PRO01-D-14-524-AO PRO01-D-14-524-AR PRO01-D-14-524-AW PRO01-D-14-524-AZ PRO01-D-14-524-BE PRO01-D-14-524-BH PRO01-D-14-524-BIPRO01-D-14-524-BJ PRO01-D-14-524-BN PRO01-D-14-524-CA и PRO01-D-14-524-CD. Эти клоны были затем увеличены в объеме, и небольшой запас заморозили и хранили в паровой фазе жидкого азота. Эти клеточные линии адаптировали к суспензионной культуре.
Показатели удельной продуктивности (ПУП) клональных клеточных линий после клонирования с разбавлением. Клеточные линии, выделенные жирным курсивом, были выбраны для перехода на суспензионную адаптацию. Значения ПУП вычислены как для Таблицы 6.
7
7
7
2
Вышеуказанные культуры адаптировали к суспензионной культуре в химически определенной среде (CD OptiCHO, дополненной 40 мл/л глутамакса). Культуры активно делящихся клеток, растущих в колбах Т-75 для культивирования тканей, как частично сросшиеся культуры отсоединяли от пластика путем слабого постукивания. Суспензии были подсчитаны, и 2×10 клеток были посеяны в 250-мл перегородчатые колбы Эрленмейера, содержащие 65 мл питательной среды CD OptiCHO. Колбы затем дополнили 5 мл кондиционированной среды, сохраненной из культуры в Т-колбе. Культуры поместили на увлажненную вибрирующую платформу (Kuhner Climo-shaker ISF1-X), установленную на 100 об/мин при 8% СО и 37°C. Через каждые 2-3 суток плотность жизнеспособных клеток культуры определяли, используя счетчик Vi-CELL™ XR. Когда плотности клеток удвоились, пересеяли, разделив 1:1, в свежую среду. После второго пересева засеяли дублирующую колбу и использовали ее для заморозки небольшого количества клеток из двух 2 пробирок (1×10 клеток/пробирка). Клетки претерпели дальнейшие пересевы и были сочтены адаптированными к суспензионной культуре после того, как плотность клеток удваивалась каждые 2-3 суток и жизнеспособность клеток могла поддерживаться приблизительно на уровне 95%. После адаптации каждой клеточной линии к суспензионной культуре в химически определенной питательной среде запас клеток был криоконсервирован (1×10 клеток/пробирка) в жидком азоте.
Пример 23
Определение характеристик роста, показателей удельной продуктивности и стабильности суспензионных культур
7
Был определен ПУП для клеточных линий, адаптированных к суспензионной культуре, в химически определенной среде. Коротко, 3x10 клеток от здоровой культуры использовали для посева в 250-мл перегородчатой колбе Эрленмейера в совокупном объеме 70 мл химически определенной среды. Подсчет клеток и взятие проб на титр IgG осуществляли ежедневно в течение двух недель, и титры IgG количественно определяли ИФА-анализом. Результаты подсчетов клеток и ИФА-анализа IgG нанесли на график против времени, и ПУП время удвоения клеток вычислили следующим образом:
2
Время удвоения клеток = (Время × 24)/(Log(Vh/Vi)
ПУП (пг/клетка/сутки) = ((Th-Ti)/((Vh+Vi)/2))/время
Где:
Th = титр при сборе, мкг/мл
Ti = начальный титр, мкг/мл
6
Vh = Подсчет жизнеспособных клеток при сборе (×10 клеток/мл)
6
Vi = Начальный подсчет жизнеспособных клеток (×10 клеток/мл)
Время = прошедшее время (суток) между Ti и Th
ПУП вычислили за интервалы в 3 суток. Пиковые значения, полученные из этой оценки, приведены в Таблице 10 вместе с оцененным временем удвоения, максимальными плотностями клеток и пиками титров IgG для каждого из 12 клонов, адаптированных к суспензии. На основании этих значений четыре клона выбрали как лидерных кандидатов: PRO01-SF-14-524-AJ, PRO01-SF-14-524-АО, PRO01-SF-14-524-AZ и PRO01-SF-14-524-BE. Эти четыре линии содержали в непрерывной культуре, и взяли дальнейшую пробу на ПУП, чтобы получить профиль стабильности для 10 поколений. Кривые продуктивности для обоих исследований показаны на Фиг. 27-30, и результаты суммированы в Таблице 11.
Характеристики роста и продуктивности клеточных линий, адаптированных к суспензии.
Для всех четырех клеточных линий совокупное время в культуре уменьшили с 9 суток до 8 суток перед прекращением исследования. Это отразилось в том факте, что время удвоения клеток уменьшилось между двумя исследованиями, указывая что не все эти клеточные линии были полностью адаптированы к культивированию в встряхиваемой колбе. Для клеточной линии PRO01-SF-14-524-АО показатель удельной продуктивности уменьшился между двумя исследованиями, хотя и остался высоким. Для трех других клеточных линий: PRO01-SF-14-524-AJ, PRO01-SF-14-524-AZ и PRO01-SF-14-524-BE, удельная продуктивность осталась очень сходной между двумя исследованиями, указывая, что продуктивность за десять поколений на клетку стабильная.
6
7
Эти четыре лидерные клеточные линии были увеличены в объеме и был подготовлен банк клеток для посева. Коротко, клетки были увеличены в объеме до совокупного объема 300 мл и собраны, когда плотность клеток превысила 0,85×10 клеток/мл и жизнеспособность составила >90% клеток. Клетки собрали путем центрифугирования и повторно суспендировали в подходящем объеме замораживающей среды, чтобы получить клеточную суспензию 1×10 клеток/мл. Ее распределили аликвотами по 1 мл в 2-мл стерильные криопробирки. Пробирки заморозили с контролируемой скоростью 1°C/мин до -80°C. Банк клеток затем перенесли в паровую фазу жидкого азота для длительного хранения. Перечень замороженных запасов лидерных клеточных линий приведен в Таблице 12.
Проверка размораживанием в химически определенной среде Opti-CHO была выполнена для каждой клеточной линии, адаптированной к суспензионным культурам. Одну пробирку из каждого банка клеток удалили из жидкого азота и разморозили в 70 мл химически определенной питательной среде. Плотность и жизнеспособность клеток контролировали ежедневно в течение пяти суток после размораживания. Сводные данные приведены в Таблице 13. Эти данные демонстрируют, что банк клеток для посева жизнеспособен и растущие культуры можно удалять из жидкого азота.
Пример 24
Клеточная линия продуцировала связывание антитела с целевым антигеном
Связывание антитела, секретированного лидерными клеточными линиями (после адаптации к химически определенной среде), с пептидом-6 было подтверждено ИФА. Коротко, антитело было очищено от супернатантов клеточных культур с использованием аффинной колонки с белком А. Очищенное антитело затем было помещено в 10 мМ буферного раствора ацетата натрия, рН 5,5, и хранилось при +4°C. Обработанные глутаральдегидом микротитровальные планшеты Nunc MaxiSorp на 96 лунок с плоским дном были покрыты раствором 10 мкг/мл пептида-6 в ФБР по 100 мкл на лунку при 4°C на ночь. Была подготовлена серия разбавлений каждого антитела с 400 мкг/мл до 6,25 мкг/мл, и 100 мкл/лунка добавили на покрытые планшеты и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. Связывание антитела определяли путем инкубации в течение 1 часа при комнатной температуре с 100 мкл на лунку разбавления 1/1000 помеченных HRP (пероксидаза хрена) мышиных анти-человеческих каппа-легких цепей, после чего детектировали с помощью 100 мкл/лунка субстрата ТМВ. После остановки реакции с помощью 50 мкл/лунка 3 М HCl, измерили спектральную поглощательную способность на 450 нм. На Фиг. 31 показано, что каждое из антител из супернатантов лидерных клеточных линий связывается с пептидом-6, имея сходные кривые связывания и подобно химерным и гуманизированным антителам, продуцированным из клеток NS0.
Пример 25
Проверка продуцирующих антитела клеточных линий на микоплазму и стерильность
Супернатанты культур из материала банков клеток были проверены собственными силами на микоплазму с использованием набора для детектирования микоплаз-мы Minerva Biolabs Venor GeM. Этот набор использует ЦРП для детектирования 16S РНК из 79 видов микоплазмы при пределе детектирования 3 микоплазмы на пробу. Положительный контроль массой 191 бп был включен в каждую пробу, который продемонстрировал, что реакции работают и пробы, положительные на микоплазму, дают полосу 265-278 бп. Агарозные гели реакций ЦРП для клеточных линий PRO01-D-14-524-AJ, PRO01-D-14-524-AO, PRO01-D-14-524-AZ и PRO01-D-14-524-BE не дали доказательства специфической полосы микоплазмы.
Клеточная линия PRO01-D-14-524-AJ была депонирована согласно Будапештскому договору под регистрационным номером и номером доступа CNCM1-4356. Депонирование клеток было выполнено в соответствии с положениями Будапештского договора.