СПОСОБ АДРЕСНОЙ КОВАЛЕНТНОЙ ИММОБИЛИЗАЦИИ БЕЛКОВ НА ПОВЕРХНОСТИ РАБОЧЕГО ЭЛЕКТРОДА
METHOD FOR TARGETED COVALENT IMMOBILISATION OF PROTEINS ON SURFACE OF WORKING ELECTRODE

Изобретение относится к способам иммобилизации рецепторного слоя электрохимических биосенсоров. Изобретение создано с целью совершенствования конструкций современных электрохимических биосенсоров, а именно: сокращения временных, материало- и трудозатрат, миниатюризации и автоматизации. Изобретение может быть использовано в микробиологии, биотехнологии, медицине, технологии изготовления биосенсорных устройств.
4
Известен способ ковалентной иммобилизации белковых молекул на поверхность предметного стекла посредством реакции CuAAC [P.-C. Lin, S.-H. Ueng, M.-C. Tseng, J.-L. Ko, K.-T. Huang, S.-C. Yu, A. K. Adak, Y.-J. Chen, C.-C. Lin / Site-Specific Protein Modification through CuI-Catalyzed 1,2,3-Triazole Formation and Its Implementation in Protein Microarray Fabrication// Angew. Chem. Int. Ed. 45 (2006) 4286-4290]. Предметное стекло функцианолизировали азидными группами, после чего проводили реакцию CuAAC катализируемую системой "CuSO-трис(карбоксиэтил)-фосфин" с алкин-функцианализированными белками, в течение 12 часов.
4
Описан метод [E. Sánchez-Tirado, A. González-Cortés, P. Yáñez-Sedeño, J. M. Pingarrón / Carbon nanotubes functionalized by click chemistry as scaffolds for the preparation of electrochemical immunosensors. Application to the determination of TGF-beta 1 cytokine // Analyst 14 (2016) 5730-5737] к иммобилизации антител на рабочий электрод посредством CuAAC реакции на поверхности азид-функционализированных углеродных нанотрубок. CuAAC реакция протекала в объеме суспензии, содержащей предварительно синтезированные конъюгаты антител с пропаргил-N-гидроксисукцинимидом, после чего на рабочий электрод капали нанотрубки с иммобиллизованными антителами. В качестве катализатора авторы применяли систему "CuSO-аскорбиновая кислота", время реакции составляло12 часов.
4
Известен способ адресной иммобилизации белков на поверхности силиконового носителя с использованием реакции CuAAC [T. Vrankena, E. S. Redeker, A. Miszta, B. Billena, W. Hermens, B. de Laat, P. Adriaensens, W. Guedensa, T. J. Cleij / In situ monitoring and optimization of CuAAC-mediated proteinfunctionalization of biosurfaces // Sensors and Actuators B 238 (2017) 992–1000]. В предложенном способе поверхность карбоксилированной силиконовой подложки модифицировали азидным линкером, белковую молекулу алкилиовали эфиром N-гидроксисукцинимида. После этого между азидной группой функционализированной подложки и ацетиленфункционализированным белком проводили реакцию CuAAC, катализируемую системой "CuSO-аскорбат натрия". Общее время иммобилизации превышало 4 часа.
4
Также известен метод [N. Meini, M. Ripert, C. Chaix, C. Farre, G. De Crozals, R. Kherrat, N. Jaffrezic-Renault / Label-free electrochemical monitoring of protein addressing through electroactivated “click” chemistry on gold electrodes // Materials Science and Engineering C 38 (2014) 286–291] адресной иммобилизации стрептавидина на поверхности золотого электрода. Поверхность электрода модифицировали гексинил-терминальным дитиол фософорамидитом, после чего между ацетиленовой группой данного соединения и предварительно синтезированным конъюгатом «азид-полиэтиленгликоль-биотин» проводили клик-реакцию, катализируемую ионами меди Cu(I), электрогенерируемыми из раствора CuSO. Далее модифицированный рабочий электрод инкубировали в суспензии стрептавидина. Общее время иммобилизации составило 2 часа 30 минут.
Другим известным техническим решением служит способ иммобилизации фермента пероксидазы хрена на поверхности рабочего электрода с использованием реакции CuAAC [G. Rydzek, T. G. Terentyeva, A. Pakdel, D. Golberg, J. P. Hill, K. Ariga / Simultaneous Electropolymerization and Electro-Click Functionalization for Highly Versatile Surface Platforms // American Chemical Society 5(2014) 5240-5248]. В предложенном способе на поверхности рабочего электрода из оксида индия-олова проводили реакцию электрополимеризации 4-азиданилина с одновременным протеканием реакции CuAAC, катализируемой ионами Cu(I), электровосстановленными из раствора сульфата меди в течении 450 циклов. В реакцию азид-алкинового циклоприсоединения вступали азидные группы электроосажденной пленки полимера и уницидиновая кислота, после чего посредством карбодиимидной сшивки происходила иммобилизация на электрод фермента. Существенным недостатком предложенного способа является длительность (более 4 часов) и многостадийность процедуры иммобилизации.
Недостатками вышеописанных методов и способов являются длительность и многостадийность процедуры иммобилизации, необходимость предварительного получения и очистки конъюгатов. Кроме того, присутствие ионов меди в растворе на стадии инкубирования белков может приводить к уменьшению аффинности иммунорецептора и, следовательно, ухудшить чувствительность и точность определения.
0
0
4
Предлагаемый способ адресной ковалентной иммобилизации белков на поверхности углеродсодержащего рабочего электрода, характеризуется  погружением электрода в электрохимическую ячейку, содержащую 25% раствор винилбензилазида в диметилформамиде, наложением шести циклических разверток потенциала в диапазоне -0,5 В до -3 В для формирования на электроде пленки поливинилбензилазида, электрохимическим осаждением частиц Cu в пленку поливинилбензилазида из раствора соли меди (II), перемещением электрода в водный раствор эфира пропаргил-N-гидроксисукцинимида, наложением трех линейных разверток потенциала в диапазоне от 0 В до 1 В при перемешивании, инкубированием электрода в водной суспензии белка в течение 30 минут. Частицы Cu электрохимически осаждают либо одновременно с формированием на электроде пленки поливинилбензилазида, добавляя в электрохимическую ячейку гексафторацетилацетонат меди (II), либо в заранее сформированную на электроде пленку поливинилбензилазида из водного раствора 0,01 М CuSO при потенциале -1 В в течение 120 секунд.
Общая схема процедуры иммобилизации и уравнения соответствующих химических реакций приведены в приложении 1.
1+
Электрополимеризация винилбензилазида и электрохимическое осаждение частиц меди позволяет сформировать на поверхности электрода пленку, пригодную для последующего проведения реакции CuAAC при минимальных временных, материало- и трудозатратах, поскольку катализатор – ионы Cu генерируется и локализуется непосредственно в области протекания реакции - приэлектродном слое, винилбензилазид иммобилизован на электроде, а эфир пропаргил-N-гидроксисукцинимида содержится в растворенном виде и непрерывно доставляется к электроду посредством перемешивания раствора. Адресность иммобилизации белка достигается за счет электрополимеризации винилбензилазида, а уменьшение числа материало- и трудозатрат - отсутствием стадии синтеза и очистки конъюгатов белков с пропаргил-N-гидроксисукцинимидом. Общее иммобилизации не превышает 60 минут, 30 минут из которых требуется для инкубации модифицированного электрода в суспензии белка. Иммобилизация белка в предложенном способе протекает в одну стадию без непосредственного контакта с ионами меди, что способствует сохранению нативной структуры белка.
Таким образом, предлагаемое техническое решение направлено создание на поверхности рабочего электрода адресно локализованного функционального покрытия для ковалентного связывания с белком посредством реакции CuAAC. Это позволит уменьшить число стадий и сократить длительность процедуры иммобилизации.
Способ иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1
3
6
4
6
Стеклоуглеродный дисковый электрод помещают в раствор диметилформамида, содержащий 25% винилбензилазида, 0,01 М гексафторацетилацетоната меди и 0,1 М перхлората лития в качестве фонового электролита. Производят шестикратную циклическую развертку потенциала в диапазоне от -0,5 В до -3 В. Модифицированный электрод помещают в водный раствор, содержащий 0,1 М эфира пропаргил-N-гидроксисукцинимида и 0,1 М хлорида калия и производят трехкратную линейную развертку потенциала от 0 В до 1 В. После этого рабочий электрод инкубируют в растворе, содержащем антитела против карциноэмбрионального антигена в концентрации 0,1 мг/мл. О присутствии на электроде иммобилизованного белка судят по различию в величине переноса заряда на годографе электрохимического импеданса, зарегистрированном в водном растворе, содержащем 1 мМ K[Fe(CN)]/K[Fe(CN)], до (1) и после (2) инкубирования электрода в суспензии белка (фигура 1).
На фигуре 1 приведены годографы электрохимического импеданса, зарегистрированные на стеклоуглеродном дисковом электроде до (1) и после (2) проведения процедуры иммобилизации антител против карциноэмбрионального антигена.
Пример 2
4
3
6
4
6
Толстопленочный графитсодержащий электрод помещают в раствор диметилформамида содержащий 25 % винилбензилазида и 0,1 М перхлората лития в качестве фонового электролита. Производят шестикратную циклическую развертку потенциала в диапазоне от -0,5 В до -3 В. Электрод помещают в водный раствор, содержащий 0,01 М CuSO и выдерживают при потенциале -1 В в течение 120 секунд. Модифицированный электрод помещают в раствор, содержащий 0,1 М эфира пропаргил-N-гидроксисукцинимида и 0,1 М хлорида калия, и производят трехкратную линейную развертку потенциала в диапазоне от 0 В до 1 В. После этого рабочий электрод инкубируют в суспензии бычьего сывороточного альбумина с концентрацией 1 мг/мл. О присутствии на электроде иммобилизованного белка судят по различию в величине сопротивления переноса заряда на годографе электрохимического импеданса, зарегистрированном в водном растворе, содержащем 1 мМ K[Fe(CN)]/K[Fe(CN)], до (3) и после (4) инкубирования электрода в суспензии белка (фигура 2).
На фигуре 2 приведены годографы электрохимического импеданса, зарегистрированные на толстопленочном графитсодержащем электроде до (3) и после (4) проведения процедуры иммобилизации бычьего сывороточного альбумина.