Количественное ультраструктурное исследование сперматозоидов человека при нарушении фертильности

галтеров для выявления причин нерационального расходования средств и ресурсов. При высоком риске ухудшения состояния и социально значимого состояния пациента необходимо активизировать работу КЭК и заместителей врачей по экспертизе, также провести мероприятия по повышению квалификации персонала, проанализировать возможности переоснащения, дооснащения диагностической аппаратурой и т. д. Несомненно, все выводы должны быть сделаны при учете особенностей ситуации в каждом конкретном лечебном учреждении.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

Лечебные учреждения Тульской области

Риск возникновения Вр Ош

Риск ухудшения состояния пациента

Риск социально значимого ухудшения состояния пациента

Риск неоптимального использования ресурсов

Рис. 1. Количественные показатели КМП в лечебных учреждениях, оказывающих медицинскую помощь больным с ЦВЗ Туле и ряде районов Тульской области

С помощью автоматизированной методики анализа качества оказания медицинской помощи в лечебных учреждениях Тулы и Тульской области сотрудникам медицинской дирекции МСК «Вирмед» удалось оптимизировать свою работу за счет того что данная система позволила представить каждое ЛПУ в виде системы с различными характеристиками. Одни системы были стабильно плохими и ли стабильно хорошими. Другие напротив были нестабильными. В зависимости от этого можно было прогнозировать перспективы дальнейшей экспертной работы в этих ЛПУ - предполагать улучшение состояния КМП после проведенной экспертизы и принятия управленческих решений по ее результатам, либо бесперспективность экспертной работы. Одни учреждения были хорошими и улучшать КМП не имело смысла, другие - стабильно плохие и требовали жестких управленческих решение на радикальные изменения системы руководства, финансирования и комплектования кадрами. К сожалению, это не возможно осуществить только проводя экспертизу КМП.

Выводы. Система автоматизированной медицинской статистики может стать еще большим подспорьем в управлении здравоохранением и здоровьем населения. Даже относительно простые методы анализа содержащейся в ней информации, связанные с группировкой, ранжированием материала, не говоря уже о более сложных методах математического моделирования и прогнозирования, позволяют выявить нетривиальные факты и зависимости, касающиеся состояния и динамики здоровья населения, оценить качество оказания медицинской помощи , получить разного рода прогнозные оценки, и, в конечном итоге, разработать систему эффективных управленческих действий.

Литература

14. Автоматизированная технология экспертизы качества медицинской помощи и правила ее применения в учреждениях здравоохранения: Пос. для врачей / Чавпецов В. Ф. и др.- С.Пб., 1998.- 30 с

15.Аудит эффективности использования государственных ресурсов в здравоохранении/ Под ред. В.П.Горегляда.- М.: ТЭО-ТАР- Медиа, 2006.- 239 с.

16. Бочоришвили М. Л. и др. // Прикладные задачи моделирования и оптимизации: Межвуз. сб. науч. тр.- Воронеж: ВГТУ, 2002.- С. 92-99

17. Воробьев П А., Аксюк З.Н. // Проблемы стандарт. в здра-воохр .-1999.- №1.- С.14-15.

18. Вялков А.И. и др. Моделирование и прогнозирование

здоровья населения и стратегия управления здравоохранением.-Воронеж: Истоки, 2004.- 127с.

19. Здоровцов Г. И. и др. Использование результатов экспертизы качества медицинской помощи для управления лечебным процессом.- Бел ГУ, 2006.

20. Капитоненко Н. А. и др. / Пробл. стандарт. в здраво-охр.- М, 1999.- №2.- С.44-46.

21. Карачевцева М. А. и др. // Обеспечение качества медицинской помощи. Проблемы и перспективы их решения: Сб. докл. IV межрегион. научно-практ. конф. (г. Белгород, 1-2 декабря 1999 г.).- Белгород, 2006.- С.135-145.

УДК 576.315.42

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ УЛЬТРАСТРУКТУРНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ СПЕРМАТОЗОИДОВ ЧЕЛОВЕКА ПРИ НАРУШЕНИИ ФЕРТИЛЬНОСТИ

Е.Н.БОЧАРОВА*, Е.Е. БРАГИНА**, Ю.К. ГУСАК***

Бесплодие поражает примерно 15% супружеских пар, и у половины из них основным или сопутствующим фактором является инфертильность мужчин [10]. Изучение показателей спермо-граммы по сей день остается краеугольным камнем обследования мужчин при нарушениях фертильности. Основными показателями, отражающими оплодотворяющую способность спермы, считаются концентрация сперматозоидов (их общее количество), подвижность и содержание сперматозоидов нормальной (типичной) морфологии [14]. Хотя у фертильных мужчин эти показатели в общем выше, тем не менее, в группах фертильных и бесплодных мужчин эти показатели могут значительно перекрываться, позволяя предполагать наличие неких других факторов, влияющих на фертильность [8]. Основываясь на показателях спермиологического обследования, нельзя дать достоверный прогноз фертильности, учитывающий не только возможность зачатия, но и исход наступившей беременности [15]. В последние годы появились сведения о том, что на фертильность мужчин могут влиять факторы, не выявляющиеся при традиционном спермиологическом обследовании. Таким фактором может быть внутригаметное вирусное инфицирование сперматозоидов [2].

Другим фактором, влияющим на фертильность мужчин, может быть состояние ДНК сперматозоидов. В ряде исследований показано выраженное различие в содержании сперматозоидов с поврежденной ДНК между группами фертильных и инфер-тильных мужчин [9]. Степень оплодотворения может быть близка к нулевой, если доля сперматозоидов с повреждением ДНК превышает 30% клеток как при естественном зачатии [8], так и при внутриматочной инсеминации [6]. В группе мужчин, у жен которых в анамнезе имеются указания на повторную спонтанную потерю беременности, содержание сперматозоидов с повреждениями ДНК, значимо выше, чем в общей популяции или у фертильных доноров [7, 8]. Авторы указывают на высокую предиктивную возможность методов выявления повреждений ДНК на исход беременности. Единичные сведения имеются о связи между нарушением упаковки хроматина и повреждением ДНК. Положительная корреляция этих показателей показана в сперматозоидах лиц с идиопатическим бесплодием при нормальных показателях спермиологического обследования [11], а также у экспериментальных животных - нокаутных мышей, у которых не экспрессируется какой-либо транзитный белок или протамин [12].

Цель работы - количественное ультраструктурное исследование сперматозоидов пациентов с нарушениями фертильности (отсутствие зачатия и спонтанное прерывание беременности у жен пациентов), выявляя нарушения компактизации хроматина и внутриклеточные капсиды вируса простого герпеса (ВПГ).

Материалы и методы. В настоящей работе исследовали сперматозоиды 26 пациентов, у жен которых беременность закончилась спонтанным абортом - в 18 случаях после естествен-

123098 Москва, ул. Гамалеи, д.16, лаборатория клеточной инженерии НИИ вирусологии имени Д.И. Ивановского РАМН, тел. (499) 190-3049, Е*-таі1: belnick@mail.ru

119992, Москва, ул. Хохлова, стр . 4, отд. электронной микроскопии Института физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, МГУ, І**таі1: ~Ьга20г@таі1.ги

390044, Рязань, ул. Крупской, д. 26, блок Б, Центр планирования семьи и репродукции, тел. (4912) 55-3135, Е-таі1: cpsir@mai1.ryazan.ru

ного зачатия, в 8 случаях - после внутриматочной инсеминации (группа 1). В качестве групп сравнения исследовали сперматозоиды 27 инфертильных пациентов (отсутствие зачатия в течение >1 года - группа 2) и 10 пациентов, обратившихся для профилактического обследования (группа 3). В исследуемые группы были включены пациенты, у которых при спермиологическом обследовании, проводимом по рекомендациям ВОЗ [14], выявлена нор-мозооспермия или слабые отклонения от нормативных показателей. Для выявления лиц с результатами спермиологического обследования, незначительно отличающимися от нормативных, нами был введен показатель, характеризующий общее количество подвижных сперматозоидов нормальной морфологии - индекс нормальных подвижных сперматозоидов (НПС). Индекс НПС вычисляется как произведение объема эякулята (V), концентрации сперматозоидов (C), процентное содержание сперматозоидов с прогрессивной подвижностью (P) и сперматозоидов с типичной морфологией (M). По рекомендациям руководства ВОЗ, нормативные показатели имеют значения: V=2 мл, С=20 млн/мл, Р=50%, М=30%. В этом случае индекс НПС=2х20х50х30=6х104. В исследуемую группу были включены пациенты, у которых при спермиологическом обследовании определяли индекс НПС>6х104. У пациентов было получено информированное согласие на проведение исследований.

Для ультраструктурного исследования сперматозоиды фиксировали 2,5% раствором глютарового альдегида на 0,1% како-дилатном буфере и 1% растворе осмиевой кислоты, заливали в смесь «эпон - аралдит». Ультратонкие срез получали на ультрамикротоме Reichert UltraCut III, докрашивали цитратом свинца и просматривали в электронном микроскопе Hitachi 11B. Проводили подсчет сперматозоидов с головками, содержащими компактный «зрелый» хроматин и гранулярный «незрелый» хроматин. В каждом образце производили подсчет >100 клеток. Для статистической обработки результатов по программам STATISTICA 6. Гипотезы о нормальном распределении исследуемых признаков в группах были отклонены при проверке с помощью критерия Шапиро - Уилка. Уровень значимости межгрупповых различий по количественным признакам определяли по методу Манна -Уитни. Анализ различия частот встречаемости исследуемых признаков в группах пациентов проводили с помощью точного критерия Фишера (двусторонний тест). Статистические гипотезы проверяли при уровне значимости p=0,05.

Результаты. Хроматин зрелых сперматозоидов имеет плотную консистенцию, в которой не выявляются отдельные гранулы и фибриллы. При нарушении компактизации хроматина в ядре видны фибриллярно-гранулярные структуры 01000 нм (рис. 1). Количество головок сперматозоидов, содержащих гранулярный хроматин, у фертильных мужчин <25-30% [15].

Рис. 1. Трансмиссионная электронная микроскопия. Головка сперматозоида с гранулярным «незрелым» хроматином (Хр), А - акросома.

Результаты количественного ультраструктурного анализа содержания (%) головок сперматозоидов с гранулярным хроматином в образцах оказались следующими: в группе пациентов, у жен которых беременность закончилась спонтанным абортом (группа 1) - медиана 46% (минимум=10%, интерквартильный размах от 23 до 58%, максимум=85%), в группе инфертильных пациентов, у жен которых не наступала беременность более 1

года (группа 2) - медиана 23% (минимум=6%, интерквартильный размах от 13 до 56%, максимум=88%), в группе пациентов, обратившихся для профилактического обследования (группа 3) -медиана 18% (минимум=7%, интерквартильный размах от 15 до 30%, максимум=30%). Содержание головок с гранулярным хроматином в группе 1 было статистически значимо более высоким, чем в группе лиц, обратившихся для профилактического обследования (р=0,0016). В группе 2 отличие по содержанию головок сперматозоидов с гранулярным хроматином по сравнению с группой 3 не было значимым (уровень значимости р=0,2157). Различие по содержанию головок с незрелым хроматином у пациентов группы 1 и группы 2 также не было значимым (р=0,1159). Проводили анализ различий частоты встречаемости в исследуемых группах пациентов с повышенным содержанием головок с гранулярным хроматином (рис. 2).

количество пациентов

Онх Озх

Рис. 2. Число лиц с повышенным содержанием головок сперматозоидов с гранулярным хроматином. НХ - доля лиц с «незрелым» хроматином;

ЗХ - доля лиц с гранулярным хроматином <30%.

В группе 1 повышенное содержание головок сперматозоидов с гранулярным хроматином наблюдали у 15 (58%) из 26 пациентов, в группе 2 - у 10 (37%) из 27 обследованных. В группе 3 не выявили пациентов с такой патологией. При сравнении групп по частоте изучаемого признака выявили различие между 1-й и 2й с уровнем значимости р=0,0307, между 1-й и 3-й группами -различие с уровнем значимости р=0,0018,. Между 2-й и 3-й группами различия не были статистически значимыми (р=0,1320). У фертильных мужчин при УЗИ наблюдали >40% головок сперматозоидов с акросомами, имеющими типичное строение. Проводили анализ содержания сперматозоидов с головками, имеющими акросомы типичного строения в образцах пациентов, у жен которых беременность закончилась спонтанным абортом, инфертиль-ных пациентов и лиц, обратившихся для профобследования

Результаты количественного ультраструктурного анализа содержания (%) головок сперматозоидов, имеющими типичное строение акросомы, оказались следующими: в группе 1 - медиана 65% (минимум=10%, интерквартильный размах от 45 до 78%, максимум=92%), в группе 2 - медиана 52% (минимум=16%, ин-терквартильный размах от 35 до 70%, максимум=88%), в группе 3 - медиана 73% (минимум=50%, интерквартильный размах от 56 до 80%, максимум=84%). Содержание головок сперматозоидов, имеющих типичное строение акросомы, не отличалось статистически значимо у лиц группы 1 и группы 3 (р=0,3738). В эякуляте пациентов группы 2 содержание головок с типичным строением акросомы было статистически значимо ниже, чем в группе 3 (уровень значимости р=0,0309). Различие по содержанию головок сперматозоидов с типичным строением акросомы в эякуляте пациентов группы 1 и группы 2 не было значимым (р=0,1336). Проводили анализ различий частоты встречаемости в исследуемых группах пациентов со сниженным содержанием головок сперматозоидов, имеющих типичное строение акросомы (рис. 3).

В группе 1 у 5 (19,2%) из 26 пациентов наблюдали снижение содержания головок сперматозоидов, имеющих акросому типичного строения, в группе 2 - у 8 (29,6%) из 27 обследованных. В группе 3 не выявили пациентов с такой патологией. При сравнении групп по частоте изучаемого признака статистически значимого различия между 1-й и 3-й группами, а также между 1-й и 2-й группами не выявлено (р=0,2931 и р=0,5256, соответствен-

но). Между группой 2 и группой 3 возможны различия на уровне статистической тенденции (уровень значимости р=0,0786).

исследуем ые группы

группа 3, n

количество пациентов

Рис. 3. Число лиц со сниженным содержанием головок сперматозоидов, имеющих акросому типичного строения. АА - доля лиц, в образцах от которых содержание головок сперматозоидов с акросомой типичного строения <40%; ТА - доля лиц с акросомой типичного строения >40%.

Капсиды ВПГ [3, 4] были идентифицированы у 17 (65%) из 26 пациентов группы 1, а в группе 2 - у 1 (3,7%) из 27 пациентов (рис. 4). В группе 3 ни в одном образце капсиды ВПГ не обнаружены. При сопоставлении групп по частоте изучаемого признака определены статистически значимые различия между первой группой и обеими группами сравнения (р=0,0004 и р<0,0000, соответственно). Между 1 и 2 группами пациентов не выявлено статистически значимых различий (р=0,5415) по частоте выявления капсидов методом электронной микроскопии.

Рис. 4. Трансмиссионная электронная микроскопия. Капсиды ВПГ (К) в цитоплазматической капле сперматозоида. А - аксонема жгутика, М -митохондрии. Масштаб: стрелка - 0,2 мкм.

Компактизация хроматина происходит во время спермиоге-неза и визуализируется как появление и прогрессивное возрастание гранулярного характера хроматина, который в зрелых сперматозоидах достигает плотной, компактной консистенции, в которой индивидуальные гранулы не различаются. При нарушениях компактизации хроматина в ядрах головок сперматозоидов выявляются гранулярно-фибриллярные или гранулярные структуры, повышается чувствительность к повреждающим факторам внешней среды (окисление или повышение температуры в женском генитальном тракте) [15].

Повреждение ДНК, выявленное прямыми методами (SCSA, TUNEL), более чем в 30% сперматозоидов, коррелирует с неблагоприятным исходом наступившей беременности [13]. Результаты настоящей работы, полученные с помощью количественного ультраструктурного анализа, соответствуют результатам прямого измерения повреждений ДНК. Мы показали, что в группе пациентов, у жен которых наблюдали прерывание беременности, повышенное (>30%) содержание сперматозоидов с недостаточно конденсированным незрелым хроматином выявлено у 58% обследованных. Это статистически значимо отличается от числа выявленных случаев повышенного содержания незрелого хроматина в группе лиц с отсутствием зачатия (37%) и в группе лиц, обратившихся для профилактического обследования (не обнару-

жено). Нарушение конденсации хроматина, наряду с повреждением ДНК сперматозоидов, является фактором, ведущим к аномальному течению беременности и ее спонтанному прерыванию.

Акросома сперматозоидов, или ядерная шапочка, содержит ферменты, необходимые для растворения оболочек яйцеклетки. При проведении количественного ультраструктурного анализа снижение количества сперматозоидов с типичным строением акросомы в эякуляте выявили у 19,2% пациентов, у жен которых наблюдали спонтанное прерывание беременности и у 29,6% инфертильных пациентов. В группе пациентов, обратившихся для профилактического обследования, не обнаружено образцов эякулята со сниженным количеством нормальных акросом сперматозоидов. Однако в группе пациентов, у которых оплодотворение не происходит, можно отметить тенденцию к снижению содержания в эякуляте сперматозоидов с нормальным строением акро-сомы. Эти данные не противоречат результатам, получаемым при проведении акросомной реакции, которые свидетельствуют о том, что аномалии строения акросомы приводят к нарушению оплодотворяющей способности сперматозоидов [5].

Угроза прерывания беременности считается одним из тяжелых осложнений беременности у пациенток с различными формами генитального герпеса. Имеются сведения о выделении ВПГ из материала спонтанно абортированных плодов человека, причем инфицирование эмбриона при спонтанных выкидышах может быть достоверно выше частоты инфицирования матери [1], что позволяет предполагать возможность привнесения вируса с отцовским материалом. Ранее нами было продемонстрировано, что в группе пациентов, у жен которых в анамнезе имелось спонтанное прерывание беременности, инфекционная активность ВПГ в эякуляте выявлялась достоверно чаще, чем при первичном бесплодии или у лиц, у которых не возникало проблем фертильности [2]. В настоящей работе мы показали, что внутригаметное герпетическое инфицирование сперматозоидов в группе пациентов, у жен которых в анамнезе имеется спонтанное прерывание беременности, встречается статистически значимо чаще, чем в группе пациентов, обратившихся для профилактического обследования и при отсутствии зачатия.

Причинами спонтанного прерывания беременности могут быть не только патологические изменения различного генеза в организме беременных. Спонтанное прерывание беременности может быть связано с аномалиями сперматогенеза, ведущими к нарушению конденсации хроматина у мужчин с нормальными (нормативными) показателями спермиологического обследования. Внутригаметное герпетическое инфицирование сперматозоидов обнаружено у 65% мужчин, жены которых имели в анамнезе спонтанное прерывание беременности. Необходимы дальнейшие исследования, позволяющие выяснить роль нарушений строения сперматозоидов в развитии патологии беременности.

Литература

1. Барановская Е.И. и др. // Акушерство и гинекол.- 2004.-№ 5.- С. 49-50.

2. Бочарова ЕН. и др. // Андрол. и генит. хирургия.- 2006.-№ 1.- С. 59-65.

3. Бочарова ЕН. и др. // ДАН.- 2003.- Т. 391, № 6.- С. 836.

4. Брагина ЕЕ. и др. // Вест. дерматол.венерол.- 2000.- №5.-С. 18-22

5. AUgeyerM. et al. // Andrologia.- 2006.- № 3.- P. 99-105.

6. Bungum M. et al. // Hum. Reprod.- 2004.- Vol. 19, № 6.-P. 1401-1408.

7. Carrell D.T. et al. // Arch. Androl.- 2003.- Vol. 49, № 1.-P. 49-55.

8. Evenson D.P. et al. // Hum. Reprod.- 1999.- Vol.14.-P. 1039-1049.

9. Larson-Cook K.L. et al. // Fertil. Steril.- 2003.-. Vol. 80.-P. 895-902.

10. Oehninger S. // Semin. Reprod. Med.- 2001.- №3.- P. 231.

11. Piasecka M. et al. // Folia Histochem. Cytobiol.- 2006.-Vol. 44, № 2.- P. 117-122.

12. Shirley C.R. et al. // Biol..Reprod.- 2004.- № 4.- P. 1220.

13. VirroM.R. et al. // Fertil. Steril.- 2004.- № 5.- P.1289.

14. WHO laboratory manual for the examination of human semen and sperm-cervical mucus interaction.- 4-th ed.- Cambridge, 2000.

15 .Zini A. et al.. // CMAJ.- 2006.- Vol. 175, № 5.- P. 495-500.

АА

ТА