СПОСОБ СНИЖЕНИЯ ГРАМПОЛОЖИТЕЛЬНОЙ МИКРОФЛОРЫ В КИШЕЧНИКЕ ПТИЦЫ
METHOD FOR REDUCING GRAM-POSITIVE AVIAN GUT MICROBIOTA

Изобретение относится к сельскому хозяйству, к композициям и способам профилактики и лечения заболеваний сельскохозяйственной птицы, вызываемых грамположительными бактериями.
Известно, что микробном кишечника в настоящее время признан важным компонентом кишечной экосистемы и упоминается как забытый орган, который способствует благополучию животного-хозяина в целом ряде аспектов, особенно в отношении питания и устойчивости к болезням [1].
Желудочно-кишечный тракт домашней птицы густо заселен микроорганизмами, которые тесно и интенсивно взаимодействуют с хозяином, а также потребляемым кормом. Микробном кишечника приносит пользу хозяину, обеспечивая его питательными веществами из-за плохо используемых пищевых субстратов, модулируя развитие и функцию пищеварительной, иммунной системы. В свою очередь, хозяин обеспечивает благоприятную среду обитания и питательные вещества для бактериальной колонизации, и роста. Микробном кишечника зависит от диеты, и производители птицы используют различные диетические вмешательства для усиления роста, снижения риска кишечной инфекции патогенными микроорганизмами [2].
Кроме того, иммунная система кишечника играет важнейшую роль в поддержании иммунной защиты организма, поскольку представляет собой передовую линию столкновения с различными патогенами, поступающими с кормом и способными колонизировать клетки ткани хозяина. При этом роль защитных механизмов кишечника трудно переоценить. Процессы обучения распознаванию «свой-чужой», происходящие в кишечнике, относятся к основополагающим для выработки как эффективной иммунной защиты, так и толерантности к различным нутриентам. При этом микроструктурные изменения в кишечнике, в частности в слизистой, отвечают за снижение ассимиляции нутриентов. Следовательно, его состояние определяет здоровье птицы, эффективность использования питательных и биологически активных веществ, что, в свою очередь, связано с ростом и развитием, конверсией корма и другими важными промышленными показателями в птицеводстве [3].
У птиц пищеварительная система по своей структуре и функции приспособлена к приему и перевариванию корма растительного происхождения. Большая роль в этом отводится слепым отросткам. Значительная величина их свидетельствует о том, что этот отдел пищеварительного тракта имеет особое значение в пищеварении. Слепые отростки вовлечены во многие гомеостатические механизмы, такие как осморегуляция, иммунная реакция. В результате содержания микрофлоры, а здесь содержится наибольшее ее количество по сравнению с другими отделами пищеварительной системы, слепые отростки являются основным местом разрушения клетчатки и образования летучих жирных кислот, а также протекания различных ферментативных процессов.
Развитие бактерий, устойчивых к лекарственным средствам, является основной проблемой в медицине, ветеринарии, так как все больше антибиотиков используется для профилактики, лечения самых разных заболеваний и других состояний. Использование большего количества антибиотиков и количества бактерий, проявляющих устойчивость, привело к увеличению продолжительности лечения. Кроме того, широкие неспецифические антибиотики, некоторые из которых оказывают вредное воздействие на организм, в настоящее время используются чаще. С этим расширением применения связана проблема, заключающаяся в том, что многие антибиотики не проникают в слизистую оболочку. В частности, грамположительные бактерии окружены клеточной стенкой, содержащей полипептиды и полисахариды. Грамположительные бактерии включают роды Actinomyces, Bacillus, Listeria, Lactococcus, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Mycobacterium, Corynebacterium и Clostridium, но не ограничиваются ими. С медицинской и ветеринарной точки зрения соответствующие виды включают опасные патогены Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus и Enterococcus faecalis. Виды Bacillus, которые образуют споры, вызывают сибирскую язву и гастроэнтерит. Известны и грамотрицательные бактерии, вызывающие особо опасные заболевания, относящиеся к классу гамма-протеобактериям, семейству энтеробактерии (Enterobacteriaceae), это Salmonella, Shigella и др.
В животноводстве продолжительное время используются ростостимулирующие антибиотики (в том числе тетерациклинового ряда), способствующие, в том числе, профилактике заболеваний. Но в связи с развитием антибиотикорезистентности эффективность их использования остается под вопросом. Так тетрациклины считаются препаратами с широким спектром антимикробной активности, однако в процессе их многолетнего использования многие бактерии приобрели к ним резистентность. Среди грамположительных кокков наиболее чувствителен пневмококк. В то же время устойчивы более 50% штаммов S. pyogenes, более 70% нозокомиальных штаммов стафилококков и подавляющее большинство энтерококков. Среди анаэробной флоры к тетрациклинам чувствительны клостридии (кроме С. difficile), фузобактерии, P. acnes [4].
В этой связи регулирование состава микробиома в кишечнике животных (в нашем случае в слепой кишке) является важной практической задачей для птицеводства.
Так известна комбинация лизина и антибиотика бактериофага против грамположительных бактерий [5]. Изобретение относится к композициям и способам профилактики, улучшения и лечения грамположительных бактерий, в частности стафилококковых, с комбинациями лизина, в частности стрептококкового лизина, в частности лизина PlySs2, и одним или несколькими антибиотиками, включая даптомицин, ванкомицин, оксациллин, линезолид или родственные антибиотики. В соответствии с изобретением лизин PlySs2, который демонстрирует широкую антимикробную активность против множества бактерий, в частности грамположительных бактерий, включая штаммы бактерий Staphylococcus и Streptococcus, обеспечивает синергию в комбинации с антибиотиком(ами) и может значительно снижать эффективные дозы MIC требуемых для антибиотика(ов).
Известен способ уничтожения грамотрицательных бактерий [6]. Установлено, что при удалении примесей из коммерчески доступного препарата низина, в частности хлорид натрия, низин в среде, имеющей рН от около 5,5 до около 6,5, является эффективным бактерицидным средством против грамотрицательных бактерий.
Известен способ инактивации важных с медицинской точки зрения грамположительных бактерий, включая метициллин - резистентный золотистый стафилококк, коагулазонегативный стафилококк, стрептококк, энтерококк и клостридий, включающий воздействие видимым светом и, в частности, светом в диапазоне длин волн 400-500 нм [7].
Известен способ ингибирования роста пищевых патогенов, нозокомиальных патогенов и микроорганизмов, вызывающих порчу [8]. Этот способ включает стадии: контактирование по меньшей мере с одним штаммом молочнокислых бактерий, выбранных из группы, состоящей из Lactobacillus salivarius (L14, L28 и FS56), их смесь; или сыворотку, полученную в результате ферментации штамма молочнокислых бактерий с микроорганизмами. Микроорганизмы могут быть выбраны из группы, состоящей из грамположительных и грамотрицательных бактерий. Грамположительные бактерии выбраны из группы, состоящей из Staphylococcus aureus, Listeria innocua, Listeria monocytogenes, Enterococcus faecium и Enterococcus faecalis.
Известна фармацевтическая композиция для профилактики и/или лечения заболевания, вызываемого бактерией, включающей экстракт жимолости, содержащий секологановую кислоту в определенном количестве и антибиотик. Фармацевтический набор для профилактики и/или лечения заболевания, вызываемого бактерией, включающий экстракт жимолости, содержащий иридоидные соединения и антибиотик. Применение фармацевтической композиции или набора для получения препаратов с целью профилактики и/или лечения заболевания, вызываемого бактерией. Применение экстракта жимолости, содержащего иридоидные соединения, для получения лекарственных средств для реверсии резистентности бактерий, где экстракт жимолости содержит секологановую кислоту в определенном количестве. Вышеописанные композиция и набор эффективны для профилактики и/или лечения заболевания, вызываемого бактерией, реверсируют резистентность бактерий [9].
Сущность предлагаемого изобретения: использование 4-гидрокси-3-метоксибензойной кислоты (97% в дозировке 0,13 г/кг ж.м.) в комбинации с гамма-окталактоном (в дозировке 0,1 мл/кг ж.м.), способствующего снижению грамположительных микроорганизмов филума Firmicutes, класса Clostridia, в слепом отделе кишечника цыплят-бройлеров.
Ранее уже было доказано, что экстракт коры дуба [10] эффективно подавляет зоопатогенные бактерии, в то же время фитохимический состав в зависимости от географии произрастания, и времени взятия первоначального сырья может значительно варьироваться, а влияние отдельных фитохимических веществ, входящих в его состав мало изучена.
Известен способ применения гамма-окталактона в качестве ингибитора системы "кворум сенсинга" luxI/luxR типа у бактерий [11].
Известно, что 4-гидрокси-3-метоксибензойная кислота (ванильная кислота), не токсична, является ароматизатором, обладает антибактериальной активностью [12, 13].
Таким образом, по сравнению с упомянутыми выше техническими решениями (1-5) заявляемое изобретение имеет ряд существенных отличий, отвечающих требованию новизны.
1. Изобретение относится к сельскому хозяйству;
2. В предлагаемом изобретении используется химически чистые вещества - 4-гидрокси-3-метоксибензойная кислота, обнаруженная в экстракте Quercus cortex и гамма-окталактон;
3. Композиция направлена на ингибирование развития грамположительных бактерий в слепом отделе кишечника бройлеров, в частности филума Firmicutes;
4. Механизм действия композиции основан на антимикробной активности и подавлении полостно-зависимой коммуникации зоопатогенных бактерий;
Пример
В эксперименте на модели цыплят-бройлеров (возраст 7 дн.) изучено влияние действия очищенного сухого экстракта Quercus cortex, содержащего природные ингибиторы «чувства кворума», ванилиновой кислоты, обнаруженной в экстракте Quercus cortex с добавлением гамма-окталактона на микробиоценоз желудочно-кишечного тракта цыплят-бройлеров.
Исследование проведено на 3 группах: контрольная группа - основной рацион (OP); I опытная – ОР + экстракт Quercus cortex (2,0 мл/кг ж.м.); II опытная – ОР + гамма-окталактон + ванилиновая кислота. Период проведения эксперимента составил 35 дней (возраст 42 дня).
Приготовление сухого экстракта Qurcus cortex включало следующие стадии: помещение 50 г измельченной коры (лекарственной формы) в жаростойкую посуду с 500 мл горячей (70°С) дистиллированной воды, нагревание на водяной бане (30 мин), с последующим охлаждением, фильтрацией (обеззоленные фильтры «Белая лента», d 70 мм APEXLAB) и высушиванием (60°С).
Вещества: 4-гидрокси-3-метоксибензойная кислота 97% (Acros Organics); γ-Октановый лактон 97% (Acros Organics).
Морфологический состав крови бройлеров проводился с использованием автоматического гематологического анализатора для ветеринарии ВС-2900 Vet (Mindray).
Оценка микробного биоразнообразия осуществлялась на 42 сутки и включала: отбор проб, выделение, очистку, измерение концентраций ДНК, проведение полимеразная цепная реакция (ПЦР), валидацию и нормализацию библиотек с последующим секвенированием на платформе высокопроизводительного секвенатора второго поколения MiSeq Illumina, США. Биоинформатическая обработка результатов осуществлялась с использованием программы PEAR (2015).
По результатам гематологического состава крови значительных изменений в сравнении с контрольной группой не установлено (табл. 1).
Результаты исследований показали, что в образцах контрольной группы бактерии составляют - 99,9%, не классифицировано - 0,1%. По данным метагеномного секвенирования 16S классифицировано 425 операционных таксономических единиц (ОТЕ). Сравнение с базой данных SILVA показало, что 425 ОТЕ принадлежали к 19 типам, 34 классам, 71 порядку, 146 семействам, 247 родам и 297 видам. В образцах I опытной группы бактерии составляют - 99,8%, не классифицировано - 0,2%. По данным метагеномного секвенирования 16S классифицировано 389 ОТЕ, 2 ОТЕ было удалено после сравнения с базой загрязнений. Сравнение с базой данных SILVA показало, что 387 ОТЕ принадлежали к 19 типам, 30 классам, 64 порядку, 130 семействам, 227 родам и 310 видам. В образцах II опытной группы бактерии составляют - 99,8%, не классифицировано - 0,2%. По данным метагеномного секвенирования 16S классифицировано 277 ОТЕ. Сравнение с базой данных SILVA показало, что 277 ОТЕ принадлежали к 21 типам, 38 классам, 74 порядку, 145 семействам, 230 родам и 284 видам.
Исследование микробного разнообразия цыплят-бройлеров показало, что в слепом отделе кишечника представители филума Firmicutes на фоне ОР + 4-гидрокси-3-метоксибензойная кислота + гамма-окталактон, снизились на 30,8% (р≤0,05) в сравнении с контрольной группой (за счет класса Clostridi и семейства Clostridiaceae) и на 50,73% (р≤0,05) в сравнении с I опытной группой, в то же время количество микроорганизмов филума Bacteroidetes наоборот увеличилось - на 37,8% (р≤0,05) в сравнении с контролем (за счет класса Bacteroidia и семейства Rikenellaceae). Отмечено снижение представителей филума Proteobacteria, в сравнении с контролем и I опытной группой.
Таким образом, совместное использование 4-гидрокси-3-метоксибензойной кислоты (97% в дозировке 0,13 г/кг ж.м.) и гамма-окталактона (в дозировке 0,1 мл/кг ж.м.), способствует снижению грамположительных бактерий филума Firmicutes класса Clostridia в слепом отделе кишечника цыплят-бройлеров.
Список литературы
1. O’Hara AM, Shanahan F. The gut flora as a forgotten organ. EMBO Rep. 2006;7:688-93. doi: 10.1038/sj.embor.7400731.
2. Deng Pan, Zhongtang Yu. Intestinal microbiome of poultry and its interaction with host and diet. Gut Microbes. 2014 Jan 1; 5(1): 108-119. doi: 10.4161/gmic.26945.
3. Фисинин В.И. Кишечный иммунитет у птиц: факты и размышления (обзор) / В.И. Сурай // Сельскохозяйственная биология. - 2013. - №4. - С. 3-25.
4. Практическое руководство по антиинфекционной химиотерапии. Под редакцией: Л.С. Страчунского, Ю.Б. Белоусова, С.Н. Козлова http://www.antibiotic.ru/ab/047-49.shtml.
5. US Patent 9889181 for Bacteriophage lysin and antibiotic combinations against gram positive bacteria / B. Schneider, H. Lee, M. Witteking, R. Schuch, R.C. Nowinski: published 13.02.2018.
6. Patent WO 2007012875 A1 Inactivation of gram-positive bacteria / J.G. Anderson, M. Maclean, G.A. Woolsey, S.J. MacGregor: published 01.02.2007.
7. Patent 0453860 A1 A method of killing gram negative bacteria / B. Nancy, B.J. Michael: published 29.06.1994.
8. Patent WO 2018005604 A1 Method and composition for reducing pathogens in rendered food products using lactic acid bacteria / M.M. Brashears, D. Campos, K. Nightingale, G. Loneragan, M.F. Miller: published 04.01.2018.
9. Патент на изобретение RU №2571281 Фармацевтическая композиция, содержащая экстракт жимолости и антибиотик, фармацевтический набор и применение экстракта жимолости для получения лекарственных препаратов / Т. Чжан, Ц. Ши, Х.Мэн, Ф. Хань, С.Ма, Ч. Ли: опубл. 20.12.2015, Бюл. №35.
10. Патент на изобретение RU №2649812 Способ экстракции из твердого растительного сырья композиции химических соединений для подавления зоопатогенных бактерий / Д.Г. Дерябин, А.А. Галаджиева, С.А. Мирошников, Г.К. Дускаев, Б.Г. Рогачев, Л.Н. Павлов: опубл. 04.04.2018, Бюл. №10.
11. Патент на изобретение RU №2691634 Способ применения гамма-окталактона в качестве ингибитора системы "кворум сенсинга" luxI/luxR типа у бактерий / Д.Г. Дерябин, А.А. Галаджиева, К.С.Инчагова, Г.К. Дускаев: опубл. 17.06.2019, Бюл. №17.
12. Qian W, Fu Y, Liu Μ, et al. In Vitro Antibacterial Activity and Mechanism of Vanillic Acid against Carbapenem-Resistant Enterobacter cloacae. Antibiotics (Basel). 2019;8(4):220. Published 2019 Nov 13. doi: 10.3390/antibiotics8040220.
13. Keman D, Soyer F. Antibiotic-Resistant Staphylococcus aureus Does Not Develop Resistance to Vanillic Acid and 2-Hydroxycinnamic Acid after Continuous Exposure in Vitro. ACS Omega. 2019;4(13):15393-15400. Published 2019 Sep 10. doi: 10.1021/acsomega.9b01336.