АНТИТЕЛО, СПЕЦИФИЧЕСКИ СВЯЗЫВАЮЩЕЕСЯ С GLP-1R, И ЕГО СЛИТЫЙ С GLP-1 БЕЛОК
ANTIBODY SPECIFICALLY BINDING TO GLP-1R AND FUSION PROTEIN THEREOF WITH GLP-1

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к области техники, связанной с антителами, и особенно относится к антителу, специфически связывающемуся с GLP-1R, и его слитым с GLP-1 белкам.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Типичные симптомы диабета II типа включают следующие три аспекта: 1) периферическую инсулинорезистентность, проявляющуюся в основном снижением чувствительности костно-мышечными тканей к инсулину, приводящим к нарушению усвоения этими тканями глюкозы (Kahn and Goldfine, J Diabetes Complication (1993) 7:92-105; Weyer et al., J Clin Invest, (1999) 104:787-794); 2) гиперпродукцию глюкозы печенью, снижение чувствительности печеночных клеток к инсулину (Kahn and Goldfine, J Diabetes Complication (1993) 7:92-105, Lam et al., Am J Physiol Endocrinol Metab (2009) 11:375-378) и гиперсекрецию глюкагона (Unger and Orci, Arch Intern Med (1977) 137:482-491); и 3) расстройства островковых бета-клеток поджелудочной железы, когда на ранней стадии заболевания увеличивается пролиферация бета-клеток и повышается секретируемое количество инсулина, что компенсирует влияние инсулинорезистентности на уровень глюкозы в крови (Bonner-Weir, Trends Endocrinol Metab (2000) 11:375-378), но с течением времени и повышением уровня инсулинорезистентности происходит уменьшение числа бета-клеток, вследствие чего снижается секреция инсулина, тем самым приводя к развитию диабета II типа (DeFronzo, Diabetes (1988) 37:667-687; Kahn et al., J Nutr (2001) 131:354S-360S).
Глюкагоноподобный пептид 1 (GLP-1) представляет собой пептидный фрагмент, состоящий из 30 аминокислот. Он выделяется L-клетками кишечника в ответ на всасывание глюкозы (Orskov et al., Diabetes (1994) 43:535-539; Drucker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1987) 84:3431-3438). После секреции в ответ на стимуляцию, GLP-1 связывается с GLP-1R (рецептором глюкагоноподобного пептида 1) поджелудочной железы, что активирует сигнальный путь аденилатциклазы, имеющий целью стимулировать синтез и секрецию инсулина. Выделение GLP-1 замедляет опорожнение кишечника, тем самым снижая количество глюкозы, поступающее в систему кровообращения после переваривания пищи (Wettergren et al., Dig. Dis. Sci. (1993) 38: 665-673). У мышей и у пациентов с диабетом I и II типов действие GLP-1 повышает выделение инсулина и снижает концентрацию сахара в крови (Nauck et al., Diabetes. (1997) 105:187-195, Todd et al., Eur J Clin Invest. (1997) 27:533-536). Исследования показали, что GLP-1 также может препятствовать апоптозу бета-клеток поджелудочной железы и способствовать их пролиферации (Perfetti et al., Endocrinology (2000) 141:4600-4605, Hui et al., Endocrinology (2003) 144:1444-1455). Целесообразность и эффективность применения GLP-1 для лечения пациентов с диабетом была доказана клинически (Samson and Garber, Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes. USA (2013) 20:87-97). Также есть патенты (патент США № 5899883 и патент США № 6989148), в которых раскрыты способы лечения диабета с применением GLP-1 и его производных. Однако из-за короткого периода полувыведения GLP-1 из организма невозможно получить хороший терапевтический эффект.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Одной из целей настоящего изобретения является предложить антитела, специфически связывающиеся с GLP-1R.
Второй целью настоящего изобретения является предложить антитела, специфически связывающиеся с GLP-1R, и слитые с GLP-1 белки, которые могут продлить период полувыведения GLP-1 из организма с целью сохранения биологической активности молекул GLP-1. В то же самое время слитые белки, образованные на основе GLP-1 и антитела, специфически связывающегося с GLP-1R, обладают свойством нацеливания на молекулы, обусловленным антителами. Кроме того, иммуногенность антитела также ниже, чем иммуногенность других партнеров по слиянию.
Для решения технических проблем, обозначенных выше, в настоящем изобретении применены следующие решения:
Антитело, специфически связывающееся с GLP-1R, содержит аминокислотную последовательность согласно одному из нижеследующего:
(a) CDR3 последовательность легкой цепи, выбранную из группы, состоящей из:
CDR3 последовательностей легкой цепи, которые отличаются вставками, заменами и/или делециями не более чем трех аминокислот в одной из CDR3 последовательностей легкой цепи SEQ ID NO:46-53, выбранной из L1-L13; предпочтительно, CDR3 последовательностей легкой цепи, которые отличаются вставками, заменами и/или делециями не более чем двух аминокислот в одной из CDR3 последовательностей легкой цепи SEQ ID NO:46-53, выбранной из L1-L13; и более предпочтительно, CDR3 последовательностей легкой цепи, которые отличаются вставкой, заменой и/или делецией одной аминокислоты в одной из CDR3 последовательностей легкой цепи SEQ ID NO:46-53, выбранной из L1-L13;
(b) CDR3 последовательность тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из:
CDR3 последовательностей тяжелой цепи, которые отличаются вставками, заменами и/или делециями не более чем четырех аминокислот в одной из CDR3 последовательностей тяжелой цепи SEQ ID NO:20-27, выбранной из Н1-Н13; предпочтительно, CDR3 последовательностей тяжелой цепи, которые отличаются вставками, заменами и/или делециями не более чем трех аминокислот в одной из CDR3 последовательностей тяжелой цепи SEQ ID NO:20-27, выбранной из Н1-Н13; более предпочтительно, CDR3 последовательностей тяжелой цепи, которые отличаются вставками, заменами и/или делециями не более чем двух аминокислот в одной из CDR3 последовательностей тяжелой цепи SEQ ID NO:20-27, выбранной из Н1-Н13; и более предпочтительно, CDR3 последовательностей тяжелой цепи, которые отличаются вставкой, заменой и/или делецией всего одной аминокислоты в одной из CDR3 последовательностей тяжелой цепи SEQ ID NO:20-27, выбранной из Н1-Н13; и
(c) CDR3 последовательность легкой цепи подпункта (a) и CDR3 последовательность тяжелой цепи подпункта (b).
Предпочтительно указанное антитело дополнительно содержит одну или несколько комбинаций аминокислотных последовательностей из нижеследующего:
(a) CDR1 последовательности легкой цепи, выбранной из одного из нижеследующего:
CDR1 последовательностей легкой цепи, которые отличаются вставками, заменами и/или делециями не более чем трех аминокислот в одной из CDR1 последовательностей легкой цепи SEQ ID NO:28-37, выбранной из L1-L13; предпочтительно, CDR1 последовательностей легкой цепи, которые отличаются вставками, заменами и/или делециями не более чем двух аминокислот в одной из CDR1 последовательностей легкой цепи SEQ ID NO:28- 37, выбранной из L1-L13; и более предпочтительно, CDR1 последовательностей легкой цепи, которые отличаются вставкой, заменой и/или делецией одной аминокислоты в одной из CDR1 последовательностей легкой цепи SEQ ID NO:28-37, выбранной из L1-L13;
(b) CDR2 последовательности легкой цепи, выбранной из одного из нижеследующего:
CDR2 последовательностей легкой цепи, которые отличаются вставками, заменами и/или делециями не более чем двух аминокислот в одной из CDR2 последовательностей легкой цепи SEQ ID NO:38-45, выбранной из L1-L13; и предпочтительно, CDR2 последовательностей легкой цепи, которые отличаются вставкой, заменой и/или делецией одной аминокислоты в одной из CDR2 последовательностей легкой цепи SEQ ID NO:38-45, выбранной из L1-L13;
(с) CDR1 последовательности тяжелой цепи, выбранной из одного из нижеследующего:
CDR1 последовательностей тяжелой цепи, которые отличаются вставками, заменами и/или делециями не более чем двух аминокислот в одной из CDR1 последовательностей тяжелой цепи SEQ ID NO:6-12, выбранной из Н1-Н13; и предпочтительно, CDR1 последовательностей тяжелой цепи, которые отличаются вставкой, заменой и/или делецией одной аминокислоты в одной из CDR1 последовательностей тяжелой цепи SEQ ID NO:6-12, выбранной из Н1-Н13; и
(d) CDR2 тяжелой цепи, выбранной из одного из нижеследующего:
CDR2 последовательностей тяжелой цепи, которые отличаются вставками, заменами и/или делециями не более чем трех аминокислот в одной из последовательностей тяжелой цепи SEQ ID NO:13-19, выбранной из Н1-Н13; предпочтительно, CDR2 последовательностей тяжелой цепи, которые отличаются вставками, заменами и/или делециями не более чем двух аминокислот в одной из CDR2 последовательностей тяжелой цепи SEQ ID NO:13-19, выбранной из Н1-Н13; и более предпочтительно, CDR2 последовательностей тяжелой цепи, которые отличаются вставкой, заменой и/или делецией одной аминокислоты в одной из CDR2 последовательностей тяжелой цепи SEQ ID NO:13-19, выбранной из Н1-Н13.
Антитело, специфически связывающееся с GLP-1R, содержит одно из нижеследующего:
(a) содержит вариабельный домен легкой цепи, выбранный из одного или нескольких из нижеследующих:
i. CDR1 последовательности легкой цепи, выбранной из одной из SEQ ID NO:28-37;
ii. CDR2 последовательности легкой цепи, выбранной из одной из SEQ ID NO:38-45; и
iii. CDR3 последовательности легкой цепи, выбранной из одной из SEQ ID NO:46-53;
(b) содержит вариабельный домен тяжелой цепи, выбранный из одного или нескольких из нижеследующих:
i. CDR1 последовательности тяжелой цепи, выбранной из одной из SEQ ID NO:6-12;
ii. CDR2 последовательности тяжелой цепи, выбранной из одной из SEQ ID NO:13-19; и
iii. CDR3 последовательности тяжелой цепи, выбранной из одной из SEQ ID NO:20-27; и
(c) последовательность вариабельного домена легкой цепи подпункта (a) и последовательность вариабельного домена тяжелой цепи подпункта (b).
Антитело, специфически связывающееся с GLP-1R, содержит аминокислотную последовательность согласно одному из нижеследующего:
(a) последовательность вариабельного домена легкой цепи, выбранную из одного из нижеследующего:
i. аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 80% идентична одной из последовательностей вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:105, выбранной из L1-L13; и
ii. аминокислотной последовательности, кодируемой полинуклеотидной последовательностью, которая по меньшей мере на 80% идентична одной из полинуклеотидных последовательностей SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:104, которая кодирует последовательность вариабельного домена легкой цепи, выбранную из L1-L13;
(b) последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, выбранную из следующих последовательностей:
i. аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 80% идентична одной из последовательностей вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, выбранной из Н1-Н13; и
ii. аминокислотной последовательности, кодируемой полинуклеотидной последовательностью, которая по меньшей мере на 80% идентична одной из полинуклеотидных последовательностей SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78, которая кодирует последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, выбранную из Н1-Н13;
(c) последовательность вариабельного домена легкой цепи подпункта (a) и последовательность вариабельного домена тяжелой цепи подпункта (b).
Предпочтительно, чтобы указанное антитело дополнительно содержало аминокислотную последовательность из одного из следующего:
(a) последовательность вариабельного домена легкой цепи из одной из последовательностей вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:105, выбранной из L1-L13;
(b) последовательность вариабельного домена тяжелой цепи из одной из последовательностей вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, выбранной из Н1-Н13; и
(c) последовательность вариабельного домена легкой цепи подпункта (a) и последовательность вариабельного домена тяжелой цепи подпункта (b).
Предпочтительно комбинацию последовательностей вариабельного домена легкой цепи подпункта (a) и последовательностей вариабельного домена тяжелой цепи подпункта (b) в схеме (c) выбирать из одного из следующего: L1H1, L2H2, L3H3, L4H4, L5H5, L6H6, L7H7, L8H8, L9H9, L10H10, L11H11, L12H12 и L13H13.
Предпочтительно, чтобы указанное антитело дополнительно содержало аминокислотную последовательность из одного из следующего:
(a) аминокислотную последовательность константной области легкой цепи, приведенную в SEQ ID NO:106;
(b) аминокислотную последовательность константной области легкой цепи, приведенную в SEQ ID NO:107;
(с) аминокислотную последовательность константной области тяжелой цепи, приведенную в SEQ ID NO:108;
(d) аминокислотную последовательность константной области тяжелой цепи, приведенную в SEQ ID NO:109;
(e) аминокислотную последовательность константной области легкой цепи, приведенную в SEQ ID NO:106, и аминокислотную последовательность константной области тяжелой цепи, приведенную в SEQ ID NO:108;
(f) аминокислотную последовательность константной области легкой цепи, приведенную в SEQ ID NO:107, и аминокислотную последовательность константной области тяжелой цепи, приведенную в SEQ ID NO:108;
(g) аминокислотную последовательность константной области легкой цепи, приведенную в SEQ ID NO:106, и аминокислотную последовательность константной области тяжелой цепи, приведенную в SEQ ID NO:109; и
(h) аминокислотную последовательность константной области легкой цепи, приведенную в SEQ ID NO:107, и аминокислотную последовательность константной области тяжелой цепи, приведенную в SEQ ID NO:109.
Предпочтительно указанное антитело выбирать из мышиного антитела, человеческого антитела, гуманизированного антитела, химерного антитела, моноклонального антитела, поликлонального антитела, рекомбинантного антитела, антигенсвязывающего фрагмента антитела, одноцепочечного антитела, двухцепочечного антитела, трехцепочечного антитела, четырехцепочечного антитела, Fab фрагмента, F(fa')x фрагмента, доменного антитела, IgD антитела, IgE антитела, IgM антитела, IgG1 антитела, IgG2 антитела, IgG3 антитела и IgG4 антитела.
Слитый с GLP-1 белок образуется путем слияния GLP-1 с антителом настоящего изобретения, где GLP-1 содержит аминокислотную последовательность, выбранную из одной из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:127.
r
Предпочтительно GLP-1 слит с легкой цепью и/или тяжелой цепью антитела по п. 1, или по п. 3, или по п. 4 посредством связей типа N'-R1-L-R2-C', N'-R2-L-R1-C' или N'-R2-R1-C',
где L представляет собой последовательность пептидного линкера, содержащего полноразмерную, частичную или повторяющуюся аминокислотную последовательность, выбранную из одной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:110, SEQ ID NO:111, SEQ ID NO:112;
R1 представляет собой аминокислотную последовательность GLP-1;
r
R1 представляет собой обратную аминокислотную последовательность GLP-1;
R2 представляет собой аминокислотную последовательность легкой цепи или тяжелой цепи антитела по п. 1, или по п. 3, или по п. 4;
C' представляет собой C-концевой аминокислотный остаток полипептидной цепи слитого с GLP-1 белка;
N' представляет собой N-концевой аминокислотный остаток полипептидной цепи слитого с GLP-1 белка;
Полинуклеотид кодирует слитый с GLP-1 белое настоящего изобретения.
Вектор содержит полинуклеотид настоящего изобретения.
Клетка-хозяин содержит вектор настоящего изобретения.
Фармацевтическая композиция содержит слитый с GLP-1 белок настоящего изобретения в смеси с фармацевтически приемлемым носителем.
Раскрыто применение фармацевтической композиции, содержащей или основанной на антителе или слитом с GLP-1 белке настоящего изобретения, в получении лекарственных средств, используемых для предотвращения или лечения инсулиннезависимого сахарного диабета.
С учетом того, что GLP-1R играет ключевую роль в применении глюкагоноподобного пептида 1 в регулировании и контролировании уровней глюкозы в крови у пациентов с диабетом II типа, и того, что его значимой терапевтической характеристикой является способность стимулировать секрецию инсулина без сопутствующего этому риска вызвать гипогликемию, в настоящем изобретении GLP-1 сливают с антителом, специфически связывающимся с GLP-1R, таким образом продлевая период полувыведения GLP-1 из организма и поддерживая биологическую активность молекул GLP-1. В то же самое время слитые белки, образованные на основе GLP-1 и антитела, специфически связывающегося с GLP-1R, обладают свойством нацеливания на молекулы, обусловленным антителом. Кроме того, иммуногенность антитела также ниже, чем иммуногенность других партнеров по слиянию.
Полезный эффект от данного изобретения является следующим: GLP-1 способен к слиянию в антителом, специфически связывающимся с GLP-1R, тем самым продлевается период полувыведения GLP-1 из организма и поддерживается биологическая активность молекул GLP-1. В то же самое время слитые белки, образованные на основе GLP-1 и антитела, специфически связывающегося с GLP-1R, обладают свойством нацеливания на молекулы, обусловленное антителом. Кроме того, иммуногенность антитела также ниже, чем иммуногенность других партнеров по слиянию.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В связи с тем, что GLP-1 в организме быстро инактивируется дипептидилпептидазой (DPP-IV), что является причиной его недостаточной эффективности, настоящее изобретение направлено на увеличение периода полувыведения и биоактивности GLP-1 путем его слияния с антителом к GLP-1R. Антитела, используемые для слияния, не препятствуют связыванию GLP-1 с рецептором, могут специфически способствовать биологической активности GLP-1, также способны в течение длительного времени увеличивать локальную концентрацию GLP-1 вокруг рецептора благодаря повышенному сродству к рецептору и стабильности, и, таким образом, значительно увеличить эффективное время и силу связывания с рецептором. В то же время, слияние с антителом увеличивает пространственные затруднения при распознавании или захвате GLP-1 дипептидилпептидазами-4 (DPP-IV), что уменьшает скорость инактивации GLP-1 в организме и увеличивает время действия GLP-1. Согласно опубликованным данным (Lin and Wang, J. Of Molecular Modeling (2009) 15:53-65), высвобождение сшивки между N-концевым внеклеточным участком GLP-1R и его трансмембранным доменом является важной стадией для допуска GLP-1 к сайту связывания с GLP-1R и проявления его биологической активности. Связывание указанного в настоящем изобретении антитела с GLP-1R в значительной степени распространяется на N-концевой внеклеточный участок рецептора, связывание его с рецептором помогает вышеуказанному высвобождению сшивки и способствует доступу GLP-1. Таким образом, слияние GLP-1 с антителом, направленным против GLP-1R, увеличивает период полувыведения и силу сродства GLP-1, что приводит к повышению его биоактивности, и тем самым является важным новаторством, которое значительно лучше терапии на основе GLP-1. Более того, некоторые антитела, используемые в данном изобретении, сами по себе имеют биологические особенности повышения GLP-1/GLP-1R активации при присутствии GLP-1. Исходя из вышеизложенных причин, GLP-1 слитые белки по настоящему изобретению являются более активным активатором GLP-1R по сравнению с GLP-1.
Существует серьезное опасение, что при регулярно повторяющемся введении в течение длительного периода времени слитый белок может вызывать антигенность. Это особенно вызывает опасение в случае терапии, использующей слитый с GLP-1 белок, поскольку с того момента как у пациента выявлено данное заболевание, его лечение становится пожизненным. Кроме того, если Fc участки иммуноглобулина сохраняют нежелательные эффекторные функции, терапия с использованием слитых с Fc белков может быть проблематичной. С помощью компьютерного 3D-моделирования структуры иммуноглобулина и оптимизации и гуманизации последовательности антитела были идентифицированы определенные слитые с GLP-1 белки, которые более не обладают эффекторной функцией и, таким образом, понижается риск вызвать иммунный ответ после регулярно повторяющегося и длительного терапевтического применения. Как обсуждается в настоящем изобретении, аминокислоты частицы GLP-1 предпочтительно слиты с легкой и тяжелой цепями антител через пептидный линкер с повышенным содержанием глицина и серина. Благодаря меньшему размеру боковых цепей глицин и серин позволяют последовательности пептидного линкера быть достаточно гибкой, снижая жесткость соединения между GLP-1 и соответствующими положениями антитела, так, GLP-1 может свободно взаимодействовать с GLP-1R. В то же время наличие пептидного линкера отделяет GLP-1 от антитела, тем самым позволяя избежать взаимодействия их доменов. Попеременное расположение глицина и серина позволяет избежать чрезмерно повторения, чтобы не вызвать нежелательной иммуногенности к слитому белку, однако, пептидный линкер неизбежно повышает иммуногенность слитого белка в организме, и поэтому очень большое значение имеет выбор длины пептидного линкера, которая позволила бы уравновесить гибкость структуры и иммуногенность. Соответственно, настоящее изобретение также предлагает три различные длины пептидных линкеров для слияния. В то же время, настоящее изобретение предлагает различные способы связывания GLP-1 с антителом путем использования пептидных линкеров для слияния, а структуры полученных слитых с GLP-1 белков содержат:
1) слитый белок, содержащий GLP-1 и легкую цепь, связанные линкерной структурой типа N'-R1-L-R2-C';
2) слитый белок, содержащий GLP-1 и легкую цепь, связанные линкерной структурой типа N'-R2-L-R1-C';
r
3) слитый белок, содержащий GLP-1 и легкую цепь, связанные линкерной структурой типа N'-R2-L-R1-C';
4) слитый белок, содержащий GLP-1 и тяжелую цепь, связанные линкерной структурой типа N'-R1-L-R2-C';
5) слитый белок, одновременно содержащий 1) и 4);
6) слитый белок, одновременно содержащий 2) и 4); и
7) слитый белок, одновременно содержащий 3) и 4).
4
В объем настоящего изобретения входят: ДНК, кодирующая GLP-1, которая связана с полноразмерной/вариабельным участком/фрагментом легкой цепи или полноразмерной/вариабельным участком/полноразмерной тяжелой цепью ДНК указанного антитела, с помощью ДНК, кодирующей последовательность пептидного линкера, образующего слитую легкую цепь или слитую тяжелую цепь ДНК, кроме того, со стороны 5' конца легкой цепи ДНК также вводится ДНК, кодирующая сигнальный пептид, с образованием гена, на основе которого мутант/дикого типа GLP-1 может быть соединен с последовательностью антитела. В настоящем изобретении последовательность GLP-1, полученная способом генного синтеза, связана как с пептидным линкером, так и с легкой или тяжелой цепью ДНК антитела с помощью методики ПЦР. Последовательности вариабельного участка легкой или тяжелой цепей антител к GLP-1R получают из определенных клеток гибридомы с помощью методики ПЦР с последующим присоединением к константному участку ДНК или определенному подтипу антитела. Константный участок ДНК антитела дикого типа можно получать из определенной библиотеки клонов и использовать в качестве основы для оптимизации последовательности. После клонирования в вектор для экспрессии, гены, используемые для экспрессии описанных здесь слитых белков, используют для получения и экспрессии слитых белков. После образования пар векторов для экспрессии легкой цепи и тяжелой цепи в ходе экспрессии, несущие ДНК гены одновременно трансфицируют или переносят в клетку-хозяина. Промотор индуцируют путем оптимальной адаптации. Трансформанты или гены для амплификации желаемых последовательностей культивируют в подходящей среде при соответствующих рН и температуре. ДНК обычно вводят, используя широко известные способы, такие как CaPO, электропорация и PEI (полиэтиленимин) и т.п.
Подходящие клетки-хозяева, пригодные для экспрессии нуклеиновых кислот в пределах описанного здесь вектора, включают высшие эукариотические клетки, а примеры клеточных линий млекопитающих для экспрессии включают клеточные линии яичника китайского хомячка (CHO) и эмбриональную клетку почки человека (клеточная линия HEK293 или HEK293, культивируемые в суспензии), а сигнальный пептид на N-конце легкой цепи направляет секрецию рекомбинантных слитых белков из линий клеток-хозяев млекопитающих. Вектор для экспрессии или клонирования несет в себе селективный маркер, который позволяет осуществлять его постоянную репликацию в клетках-хозяевах и используется для скрининга клеток, способных включать в себя кодирующую слитый белок нуклеиновую кислоту, и промотор, который эффективно связывается с кодирующей слитый белок последовательностью и направляет синтез мРНК. Одним примером служит использование вектора, несущего в себе устойчивость к антибиотикам и вирус гепатита В и обезьяний вирусный промотор (SV40), для отбора клеток-хозяев CHO, стабильно экспрессирующих слитые белки.
После экспрессии клетками-хозяевами слитых белков в настоящем изобретении применяется метод афинной хроматографии для очистки части, экспрессированной таким образом в надосадочную жидкость клеточной культуры. В примере данного изобретения слитый белок, слитый с полноразмерным антителом улавливается афинной хроматографической колонкой для белка G, а затем его элюируют из хроматографической колонки, используя низкий рН с последующим сбором. Мягкие условия при элюировании помогают избежать денатурации белка.
Слитый белок данного изобретения можно составлять с одним или несколькими наполнителями. Слитый белок настоящего изобретения можно объединять с фармацевтически приемлемым буферным раствором, в котором рН подобран таким образом, чтобы обеспечивать пригодную стабильность, и который пригоден для терапевтического введения (такого, как парентеральное введение). По выбору можно добавлять один или несколько фармацевтически приемлемых противомикробных средств. Предпочтительными фармацевтически приемлемыми противомикробными средствами являются м-крезол и фенол. Можно добавлять один или несколько фармацевтически приемлемых растворов, чтобы подобрать ионную силу или напряжение. Можно добавлять один или несколько разбавителей, чтобы дополнительно подобрать изотоничность состава. Примером разбавителя для подгонки изотоничности является глицерин. "Фармацевтически приемлемый" означает, что вещество является приемлемым для введения человеку или другим животным, и, следовательно, не содержит токсичных ингридиентов или нежелательных примесей и не влияет на активность активных ингредиентов состава.
Слитый белок данного изобретения можно получать в виде растворенного состава или лиофилизованного порошка, который можно восстанавливать, используя подходящий разбавитель. Лиофилизованная лекарственная форма представляет собой один из видов составов, в которых слитый белок стабилен, при наличии или без наличия буферирующей способности для поддержания рН в течение предполагаемого срока хранения восстановленного продукта. Раствор, содержащий обсуждаемые здесь слитые белки, предпочтительно является изотоническим перед лиофилизацией для того, чтобы осуществлять получение изотонического раствора после восстановления.
Фармацевтически приемлемая форма соли слитых белков настоящего изобретения также входит в объем настоящего изобретения. Широко используемыми кислотами для образования солей присоединения кислот являются неорганические кислоты, такие как хлористоводородная кислота, бромистоводородная кислота, йодистоводородная кислота, серная кислота и фосфорная кислота; и органические кислоты, такие как п-толуолсульфокислота, углекислота, янтарная кислота, лимонная кислота, бензойная кислота и уксусная кислота. Предпочтительными солями присоединения кислот являются те, которые образованы с неорганическими кислотами, такими как хлористоводородная кислота и бромистоводородная кислота.
Соли присоединения основания включают те, которые получены из неорганических оснований, таких как гидроксиды аммония, основных металлов или щелочно-земельных металлов, карбонаты и бикарбонаты. Такие основания, полезные в приготовлении раствора соли по данному изобретению, таким образом, включают гидроксид натрия, гидроксид калия, гидроксид аммония, карбонат калия и подобные им.
in vitro
in vivo
in vitro
in vitro
in vitro
in vivo
Слитые белки настоящего изобретения обладают биологической активностью. Термин "биологически активный" обозначает способность слитых белков связываться с GLP-1R и активировать его в организме и стимулировать стрессовый ответ. Ответные реакции включают, но не ограничиваются ими, повышенную секрецию инсулина, подавление выделения глюкагона, угнетение аппетита, потерю веса, вызов чувства насыщения, подавление апоптоза и индуцирование пролиферации бета клеток поджелудочной железы и дифференциации бета клеток поджелудочной железы. Несколько показательных белков, слитых с GLP-1, исследовали с точки зрения из активности  и . Сначала на стадии 4 (Фигура 1) с помощью анализа флуоресцентного обнаружения получали данные о взаимодействии слитого белка с GLP-1R. Затем на стадии 5 с помощью исследование активности  получали данные о взаимодействии слитого белка и активации им человеческого GLP-1R. В этих экспериментах использовали клетки CHO, сверхэкспрессирующие человеческий GLP-1R. Активация GLP-1R в этих клетках вызывает активацию аденилилциклазы, которая в свою очередь индуцирует экспрессию гена-репортера, приводимого в действие цАМФ-восприимчивым элементом (CRE). На стадии 12 (Фигура 2) получают данные о том, где ген-репортер представляет собой люциферазу. Экспериментальные данные  указывают на то, что слитые белки способны связываться с GLP-1R и активировать его и демонстрируют более высокую эффективность  по сравнению с нативным GLP-1. На стадии 13 (Фигура 3) получают данные об изменении концентрации глюкозы в крови мышей через 16 часов (ч) после внутрибрюшинного введения одного из слитых белков настоящего изобретения. Данные исследования на мышах из стадии 13 продемонстрировали наличие активности у слитого белка и его более продолжительный период полувыведения по сравнению с нативным GLP-1.
Введение слитого белка можно проводить любым путем, об эффективности которого известно лечащему врачу - специалисту в данной области. Периферическое парентеральное введение является одним из таких способов. Термин "парентеральное введение" обычно в медицинской литературе используют, когда имеют в виду инъекцию лекарственной формы в организм с помощью стерильного шприца или другого механического приспособления, такого как инфузионный насос. Периферические парентеральные пути введения включают внутривенное, внутримышечное, подкожное и внутрибрюшинное введение.
Слитые белки настоящего изобретения можно также вводить перорально, ректально, назально или через нижние дыхательные пути, которые не являются парентеральными. Среди этих не парентеральных путей предпочтительными являются введение через нижние дыхательные пути и пероральный путь.
Слитые белки настоящего изобретения можно применять для лечения разнообразных заболеваний и состояний. Слитые белки настоящего изобретения прежде всего проявляют свое биологическое действие путем воздействия на GLP-1R. Субъекты с заболеваниями и/или состояниями, которые благоприятным образом реагируют на стимуляцию GLP-1R или на введение соединений GLP-1, можно лечить с использованием слитых с GLP-1 белков настоящего изобретения. На таких субъектов ссылаются как на субъектов, "нуждающихся в лечении соединениями GLP-1" или "нуждающихся в стимуляции с использованием GLP-1R". Включены субъекты с выявленным инсулиннезависимым сахарным диабетом, инсулинзависимым сахарным диабетом, инсультом (см. WO 00/16797), инфарктом миокарда (см. WO 98/08531), ожирением (см. WO 98/19698), катаболическими изменениями после операции (см. патент США № 6,006,753), функциональной диспепсией и синдромом раздраженного кишечника (см. WO 99/64060). Также включены субъекты, которым показано профилактическое лечение соединениями GLP-1, например, субъекты с высоким риском развития у них инсулиннезависимого сахарного диабета (см. WO 00/07617). Высокий риск развития инсулиннезависимого сахарного диабета характерен для субъектов с нарушенной переносимостью глюкозы или с нарушением уровней глюкозы натощак, субъектов, вес тела которых на примерно 25% превышает нормальный вес для роста субъекта и жидкости в организме, субъектов, перенесших частичную резекцию поджелудочной железы, субъектов, один или оба родителя которых страдают от инсулиннезависимого сахарного диабета, субъектов с выявленным диабетом при беременности и субъектов, перенесших острый панкреатит или страдающих хроническим панкреатитом Эффективное количество слитых белков, описанных здесь, представляет собой дозу, которая приводит к желаемому терапевтическому и/или профилактическому эффекту и не вызывает неприемлемых побочных явлений при введении субъекту, нуждающемуся в стимуляции рецептора GLP-1. Термин "желаемый терапевтический эффект" включает в себя следующее: облегчение симптома(ов), связанных с заболеванием или состоянием; задержку появления симптомов, связанных с заболеванием или состоянием; увеличение продолжительности жизни по сравнению с таковой в отсутствие лечения; и улучшенное качество жизни по сравнению с таковым в отсутствие лечения. Термин "эффективное количество" слитого с GLP-1 белка для лечения сахарного диабета представляет собой количество, которое приводит к улучшенному контролированию концентрации глюкозы в крови по сравнению с таковой в отсутствие лечения, тем самым задерживая появление таких осложнений, связанных с диабетом, как ретинопатия, нейропатия или заболевания почек. "Эффективное количество" слитого с GLP-1 белка для профилактики сахарного диабета представляет собой количество, которое, по сравнению с ситуацией в отсутствие лечения, приводит к отложенному появлению повышенных уровней глюкозы в крови, которое требует лечения такими антигипергликемическими препаратами, как сульфонилмочевина, тиазолидиндион, инсулин и/или бисгуанидин. Дозирование слитых белков, эффективное для нормализации уровней глюкозы в крови пациента, будет зависеть от нескольких факторов, среди которых, без ограничения, пол субъекта, вес и возраст, насколько трудно регулировать уровень глюкозы в крови, путь введения и биодоступность, фармакокинетический профиль слитого белка, действенность и состав препарата. Дозы могут быть в интервале от 0,01 до 1 мг/кг массы тела, предпочтительно в интервале от 0,05 до 0,5 мг/кг массы тела. Предпочтительно, чтобы слитые белки настоящего изобретения вводили либо раз в неделю, либо дважды в неделю. В зависимости от заболевания, требующего лечения, может быть необходимо вводить слитый белок чаще, например, три или более раз в неделю.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
На Фигуре 1 показано определение с помощью проточной цитометрии (FACS) специфического связывания рекомбинантного экспрессированного слитого с GLP-1 белка (GLP-1(A8G)-LK-L13H13) с человеческим GLP-1R (hGLP-1R), стабильно экспрессированным в клеточной линии яичника китайского хомячка (пик на сплошной линии, обозначенный звездочкой *), по сравнению с собственно клеточной линией яичника китайского хомячка (пик на прерывистой линии).
Фигура 2 получена на основе исследования с использованием гена-репортера и представляет собой кривую активации GLP-1 дикого типа (кружки) и GLP-1(A8G)-LK-L13H13 (треугольники) к GLP-1R, стабильно экспрессированному в клеточной линии яичника китайского хомячка.
Фигура 3 получена в результате пробы на толерантность к глюкозе у мышей (ICR), на которой показана толерантность к глюкозе у мышей натощак через 16 ч после одноразовой в.б. инъекции GLP-1(A8G)-LK-L13H13 в количестве 5 микрограмм на мышь (квадратики) и 15 микрограмм на мышь (треугольники).
Фигура 4 получена в результате пробы на толерантность к глюкозе у мышей (C57BL), на которой видно, что толерантность к глюкозе у мышей натощак через 40 ч после одноразовой в.б. инъекции GLP-1(A8G)-LK-L13H13 в количестве 15 микрограмм на мышь (треугольники).
На Фигуре 5 приведена кривая зависимости концентрации глюкозы в крови от времени у мышей с сахарным диабетом II типа (мыши db/db), которая показывает изменение концентрации глюкозы в крови в продолжительность эксперимента у мышей с сахарным диабетом II типа после одноразовой в.б. инъекции GLP-1(A8G)-LK-L13H13 при концентрации, равной 10 нмоль/кг (перевернутые треугольники).
На Фигуре 6 приведена кривая зависимости дневного потребления пищи от времени у мышей с сахарным диабетом II типа (мыши db/db), которая показывает изменение в дневного потреблении пищи мышами с сахарным диабетом II типа после в.б. инъекции GLP-1(A8G)-LK-L13H13 в количестве 10 нмоль/кг (перевернутые треугольники), в течение периода от 3 дней до инъекции слитого белка до 5 дней после инъекции. На Фигуре 6 и Фигуре 5 приведены результаты двух параллельных экспериментов.
КОНКРЕТНЫЕ ВАРИАНТЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Последующие конкретные варианты осуществления в комбинации с фигурами дополнительно иллюстрируют технические решения настоящего изобретения.
В данном изобретении, если не указано иное, применяются исходные материалы, оборудование и подобное, которые можно приобрести у поставщиков или которые широко используются в данном уровне техники. Методы в последующих вариантах изобретения, если не указано иное, все являются традиционными методами в данном уровне техники.
Стадия 1: Конструирование стабильной клеточной линии антигена для иммунизации.
CHO-DHFR минус клетки переносят в 6-и луночный планшет и трансфицируют pYS плазмидой, несущей ген hGLP-1R (нуклеотидную последовательность см. в SEQ ID NO:113, а аминокислотную последовательность см. в SEQ ID NO:114) после 24 ч культивирования. Среду меняют перед проведением трансфекции, которую проводят с использованием рекомендованных производителем Lipofectamine 2000 (Invitrogen) условий. Через 48 часов после трансфекции среду в культуре заменяют на полную среду, содержащую 10 гМ MTX. Среду меняют каждые 3 дня в течение примерно двух недель до появления стабильных слонов. Рассеянные колонии клеток отделяют от планшета и собирают. После того, как растущие клетки достигли примерно 50%-ного слияния, постепенно повышающиеся концентрации MTX (вплоть до концентрации, равной 10 мкM MTX) вводят для селекции под давлением. Сконструированные стабильные клеточные линии анализируют с помощью FACS, используя антитела (Abcam) к hGLP-1R для идентификации клонов клеток после селекции под давлением. Наблюдали значительный уровень экспрессии hGLP-1R в мембране отобранных CHO-DHFR-hGLP-1R клеток после селекции с использованием 10 мкM MTX. Наконец, шесть стабильных клеточных линий hGLP-1R с высоким уровнем экспрессии идентифицировали с помощью субклонирования.
Стадия 2: Приготовление антител.
6
Эмульгированные в адъюванте Фрейнда полные клетки CHO DHFR-hGLP-1R используют в дозировке 2×10 клеток/мышь для подкожного введения в мышей BALB/c (6-8 недель). Через 2 недели привитые мыши получают бустер, используя неполный эмульгированный в адъюванте Фрейнда иммуноген, и после этого - каждую неделю. Образцы крови собирают из среза на конце хвоста и центрифугируют, собирая сыворотку для определения титров сыворотки, используя анализ FACS. После получения приемлемого титра антител мышей умерщвляют и клетки их селезенки собирают в асептических условиях. Клетки SP2/0 собирают в логарифмической фазе роста при 3 мин центрифугирования при 2000 об/мин. Осадок снова суспендируют в культуральной среде, не содержащей сыворотки, затем центрифугируют и еще раз суспендируют, и считают. Клетки сплина и клетки SP2/0 смешивают в соотношении клетки SP2/0: клетки сплина ≥1:1, а затем трижды проводят цикл промывка-центрифугирование. После отделения осадка из последнего центрифугирования по каплям добавляют 1 мл PEG-1350 (предварительно нагретого до 37°C) (за 30 сек), после перемешивания пипеткой в течение 1 мин, медленно добавляют 30 мл (предварительно нагретого до 37°C) среды, не содержащей сыворотку (Invitrogen), чтобы прекратить слияние с PEG. После 5 мин центрифугирования при 1500 об/мин осадок в пробирке, состоящий из клеток, повторно суспендируют и добавляют RPMI1640 (Invitrogen), содержащий HAT (сахарин, аметоптерин и тимидин; Invitrogen) и 20% FBS (Bioind) в качестве среды для слияния. 20000 клеток сплина и 5000 клеток фидерного слоя в 100 мкл объеме помещают в каждую лунку 96-и луночного планшета. Слитые клетки гибридомы и клетки фидерного слоя совместно культивируют в 96-и луночном планшете с выбором HAT для удаления неслитых клеток. Через 10 дней надосадочную жидкость клеток гибридомы в планшетах для культивирования собирают для проведения исследования методом ELISA (ИФА).
Стадия 3: Скрининг полных клеток методом ELISA
2
2
2
4
Клетки CHO-DHFR-hGLP-1R, сверхэкспрессирующие hGLP-1R и CHO-DHFR минус клетки, не экспрессирующие hGLP-1R, отдельно переносили в 96-и луночный планшет и продолжали рост до 90% слияния. Надосадочную жидкость культуральной среды удаляют и прикрепившиеся клетки дважды промывают, используя PBS, затем добавляют 100 мкл 100%-го метанола для фиксирования клеток в течение 10 мин при 4°C. Затем добавляют 100 мкл свежеприготовленного 0,6%-ного HO-PBS и после инкубирования при комнатной температуре в течение 20 мин клетки дважды промывают, используя PBS. После блокирования с использованием раствора PBS-1% BSA добавляют надосадочную жидкость гибридомы и инкубируют в течение 90 мин при 4°C. После нескольких промывок добавляют 100 мл вторичного антитела GxM-HRP-Fc (Sigma-Aldrich) (разбавленного в 5000 раз) и вносят в каждую лунку, затем инкубируют при 37°C в течение 0,5 ч. После промывки (5 раз) в каждую лунку вводят 100 мкл субстрата хромогенного TMB и инкубируют при 37°C в течение 15 мин, а затем добавляют 2M HSO для прекращения реакции и считывания значений OD450. Положительный контроль представляет собой мышиную сыворотку после иммунизации; отрицательный контроль представляет собой надосадочную жидкость клеточной культуры. Клоны гибридомы, секретирующие антитело к антигену hGLP-1R, подвергают скринингу и стабильные секретирующие клеточные линии против hGLP-1R получают после клонирования. Наконец, надосадочную жидкость антител, секретированную гибридомой, подтверждают, используя анализ FACS.
Стадия 4: Проточный анализ (FACS) надосадочной жидкости положительных клеток гибридомы
5
PBS, содержащий 10 мM EDTA, используют для отделения и сбора 10 клеток CHO DHFR-hGLP-1R в ЕР пробирку объемом 1,5 мл. Надосадочную жидкость удаляют после центрифугирования и отрицательный контрольный образец повторно суспендируют в загрузочном буфере (PBS, 2% FBS). Для положительного контроля добавляют 200 мкл надосадочной жидкости антитела, чтобы повторно суспендировать клетки, инкубируя при комнатной температуре; затем клетки центрифугируют при 1500 об/мин для удаления надосадочной жидкости, промывают загрузочным буфером и снова центрифугируют. Клетки повторно суспендируют с добавлением меченого FITC флуоресцентного козлиного антитела к мышиному антигену при разведении 1:50 (BD Pharmingen, 200 мкл/лунку) и инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин в темноте. Надосадочную жидкость удаляют после центрифугирования, клетки промывают загрузочным буфером, снова центрифугируют и повторно суспендируют в загрузочном буфере для анализа. Надосадочная жидкость гибридомы и клетки CHO-DHFR-hGLP-1R демонстрируют специфичное связывание: серый пик и пик на прерывистой линии представляют собой отрицательные контрольные эксперименты; пик на сплошной линии (отмеченной звездочкой *), соответствующий надосадочной жидкости гибридомы, сдвигается очевидно вправо (Фигура 1).
Стадия 5: Клонирование и субклонирование генов антител.
Собирают клетки гибридомы, секретирующей антитела. Гибридому мРНК экстрагируют согласно протоколу производителя набора QIAGEN для экстракции мРНК. Затем экстрагированную мРНК обратно транскрибируют в цДНК. Праймеры обратной транскрипции представляют собой специфические праймеры для константных участков легкой и тяжелой цепей мыши, причем праймер обратной транскрипции тяжелой цепи представляет собой (5'-TTTGGRGGGAAGATGAAGAC-3') (SEQ ID NO:115), праймер обратной транскрипции легкой цепи представляет собой (5'-TTAACACTCTCCCCTGTTGAA-3') (SEQ ID NO:116) и (5'-TTAACACTCATTCCTGTTGAA-3') (SEQ ID NO:117). ОТ-ПЦР проводят в следующих условиях: 25°C в течение 5 мин, 50°C в течение 60 мин и 70°C в течение 15 мин. Обратно транскрибированную цДНК разбавляют, используя 0,1 мM TE до 500 мкл, вносят в ультрафильтрационную центрифужную пробирку (Amicon Ultra-0.5) и центрифугируют при 2000 g в течение 10 мин. Фильтрат удаляют, добавляют 500 мкл 0,1 мМ TE и центрифугируют при 2000 g в течение 10 мин. Фильтрат удаляют и трубку состава помещают в обратном порядке в новую центрифужную пробирку и центрифугируют при 2000 g в течение 10 мин с получением очищенной цДНК. 10 мкл очищенной цДНК используют в качестве матрицы. Добавляют 4 мкл 5x хвостового буфера, 4 мкл dATP (1 мМ) и 10 Ед концевой трансферазы (Promega), тщательно перемешивают и инкубируют при 37°C в течение 5 мин и при 65°C в течение 5 мин. PolyA хвост цДНК использую в качестве матрицы и проводят ПЦР PCR для амплификации генов вариабельных участков легкой и тяжелой цепей антител. Идущие ранее праймеры - все представляют собой OligodT, при этом находящейся далее праймеры тяжелой цепи представляют собой (5'-TGGACAGGGATCCAGAGTTCC-3') (SEQ ID NO:118) и (5'-TGGACAGGGCTCCATAGTTCC-3') (SEQ ID NO:119), и находящийся далее праймер легкой цепи представляет собой (5'-ACTCGTCCTTGGTCAACGTG-3') (SEQ ID NO:120). ПЦР проводят в следующих условиях: 95°C в течение 5 мин; 95°C в течение 30 сек, 56°C в течение 30 сек, 72°C в течение 1 мин, 40 циклов; 72°C в течение 7 мин. Продукты ПЦР соединены с вектором PMD 18-T для сквенирования. Полученные последовательности вариабельных участков легкой и тяжелой цепей антитела после сквернирования приводят в приложенном перечне последовательностей.
Праймеры ПЦР конструируют на основе сквернированных последовательностей ДНК антитела, таким образом полная легкая цепь, сигнальные пептиды тяжелой цепи и вариабельные домены и константные участки IgG1 соединены с вектором pTM5 для экспрессии.
Стадия 6: Промежуточная экспрессия антител к антигену GLP-1R в суспензии клеточной линии HEK293.
Суспензию экспрессирующей клеточной линии HEK293 или CHO вносят в колбу шейкера, и после 24 ч вращения при 37°C клетки готовы для трансфекции. Полиэтиленимин (PEI) используют в качестве агента трансфекции в ходе трансфекции и его смесь с ДНК вносят в клеточную культуру. Оптимизированное соотношение PEI к DNA при смешивании составляет от 1:1 до 5:1. Обработанные смесью PEI/ДНК клетки вращают в течение более 96 ч при 37°C с целью осуществления экспрессии антигенсвязывающего белка, тем временем в клеточную культуру добавляют 0,5% трипсина в качестве источника аминокислот, необходимых для экспрессии, и наконец, клеточную надосадочную жидкость собирают для очистки и отделения антигенсвязывающего белка.
Стадия 7: Гуманизация и оптимизация антитела
Сначала последовательности вариабельных участков легкой и тяжелой цепей прошедшего скриннинг мышиного антитела подвергают выравниванию с гомологичными антителами, используя он-лайн NCBI инструмент (Ig Blast) для выравнивания последовательностей вариабельных участков антитела с целью поиска генных последовательностей зародышевой линии гуманизированного антитела (последовательность Ig Germline Gene), гомологичных последовательности вариабельных участков отобранных антител для гуманизации, и последовательности гуманизированных генов с наивысшей гомологичностью, за исключением последовательностей CDR, используют в качестве матрицы для прививания CDR с целью получения последовательноствей вариабельных участков гуманизированного антитела и синтеза генов легкой и тяжелой цепей гуманизированного антитела. В соответствии с последовательностью праймеры ПЦР конструируют со стороны 5'-конца и 3'-конца синтетической последовательности, вводя подходящие сайты ферментов рестрикции. С помощью ПЦР амплифицируют вариабельные участки гуманизированного антитела, а затем объединяют с последовательностью константного участка человеческого IgG2 или IgG4, получая полную последовательность рекомбинантного человеческого антитела. Экспрессии рекомбинантных антител добиваются в соответствии со стадией 6, и их сродство к GLP-1R подтверждают с помощью анализа FACS, как описано в стадии 4. Лучшего кандидата гуманизированного антитела, сохранившего сродство к GLP-1R, выбирают из их группы и с помощью сайт-специфичного мутагенеза дополнительно улучшают последовательность его вариабельного участка с целью усиления сродства к GLP-1R.
Стадия 8: Клонирование и субклонирование генов гуманизированного слитого белка GLP-1
Оптимизированное гуманизированное антитело сливают с GLP-1 или его производной последовательностью с N-концом и С-концом легких цепей с образованием слитого с GLP-1 белка, и их последовательности соединяют с помощью последовательности пептидного линкера (LK). Нуклеотидная последовательность сигнальный пептид-GLP-1-пептидный линкер была синтезирована компанией Genscript Biotechnology CO., LTD. Используя синтетический ген в качестве матрицы, ПЦР амплифицирует последовательность части "сигнальный пептид-GLP1-линкер", при этом идущий ранее при ПЦР праймер представляет собой (5'-CCACCATGGACTTTGGGCTGAGC-3') (SEQ ID NO:121), находящийся далее при ПЦР праймер представляет собой (5'- AGAGCCGGTGGCAGAGCCAG-3') (SEQ ID NO: 122). ПЦР проводят в следующих условиях: 95°C в течение 5 мин; 95°C в течение 30 сек, 56°C в течение 30 сек, 72°C в течение 30 сек, 35 циклов; 72°C в течение 7 мин. Помимо этого, используя нуклеотидные последовательности гуманизированного антитела в качестве матрицы, амплифицировали последовательность части антитела последовательности слитого белка.
Идущий ранее при ПЦР праймер представляет собой (5'-CTGGCTCTGCCACCGGCTCTGCCATCCAGATGACCCAGTCTCC-3') (SEQ ID NO:123), а находящийся далее при ПЦР праймер представляет собой (5'- ACACTCTCCCCTGTTGAAGCTC-3') (SEQ ID NO:124). ПЦР проводят в следующих условиях: 95°C в течение 5 мин; 95°C в течение 30 сек, 56°C в течение 30 сек, 72°C в течение 1 мин, 35 циклов; 72°C в течение 7 мин. Затем с помощью перекрывающейся ПЦР часть "сигнальный пептид-GLP-1-пептидный линкер" последовательность нуклеиновой кислоты слитого белка соединяют с частью антитела, вводя два сайта ферментов рестрикции - Nhe1 и Not1 - в оба конца праймеров, и таким образом полная последовательность слитого белка и вектор для экспрессии pTM5 связываются вместе. Перекрывающийся идущий ранее при ПЦР праймер представляет собой (5'-CCGGCTAGCCACCATGGACTTTGGGCTGAGC-3') (SEQ ID NO:125), а находящийся далее праймер представляет собой (5'- AGTGCGGCCGCTCAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTC-3') (SEQ ID NO:126). ПЦР проводят в следующих условиях: 95°C в течение 5 мин; 95°C в течение 30 сек, 56°C в течение 30 сек, 72°C в течение 1 мин, 35 циклов; 72°C в течение 7 мин. Продукты ПЦР соединены с вектором PTM5 для сквенирования.
Стадия 9: Промежуточная экспрессия слитого с GLP-1 белка в суспензии клеточной линии HEK293.
Суспендированные клетки HEK293 засевают в колбу шейкера и культуральную среду меняют перед трансфекцией. Векторы, содержащие ген легкой/тяжелой цепи белка в концентрации от 0,5 до 1,5 мкг/мл в пересчете на суммарное количество ДНК, смешивают с 1,5-7,5 мкг/мл полиэтиленимина (PEI), и после выдерживания в течение 15-25 минут смесь вносят в клеточную культуральную среду. Через 24 ч, в клеточную культуральную среду добавляют 0,5-1% Trypton N1. Надосадочную жидкость, содержащую выделенный слитый с GLP-1 белок, собирают после культивирования в течение 5-10 дней.
Стадия 10: Стабильная экспрессия слитого с GLP-1 белка в суспензии клеточной линии CHO.
Суспендированные клетки CHO засевают в 6-и луночный планшет и проводят трансфекцию вектора для экспрессии слитого белка, применяя условия для трансфекции из стадии 1. Через 48 ч, вносят 300 мг/мл гигромицина (тяжелая цепь) и 6 мг/мл пуромицина (легкая цепь) для параллельной селекции. После достижения количественного уровня апоптоза (уровень гибели >90%), концентрацию антибиотика постепенно снижают, чтобы позволить восстановиться оставшимся клеткам, и переносят в колбу шейкера для осуществления роста культуры, затем убеждаются, что экспрессия антитела в надосадочной жидкости произошла. Вслед за этим в среде поддерживают половинную концентрацию антибиотика, чтобы позволить осуществиться стабильной экспрессии слитого с GLP-1 белка в клетках.
Стадия 11: Очистка и приготовление слитого с GLP-1 белка из надосадочной жидкости клеточной культуры.
Клетки удаляют из культуры после центрифугирования и надосадочную жидкость пропускают сквозь аффинную хроматографическую колонку для связывания белка G. Экспрессированный слитый с GLP-1 белок элюируют из хроматографической колонки, используя элюент с pH примерно 2,5-3,5. Низкий рН элюента нейтрализуют немедленно, используя нейтрализующий буфер, предоставленный в тубе с элюентом. Раствор белка собирают после элюирования и затем проводят диализ против PBS (фосфатно-солевого буфера).
in vitro
Стадия 12: Исследование  с помощью гена-репортера слитого с GLP-1 белка с точки зрения его действия при активации GLP-1R (см. Фигуру 2).
CHO-DHFR минус клетки коэкспрессирующие hGLP1R-CRE-люциферазу помещали в 96-и луночный планшет для клеточной культуры, внося 20000 клеток на лунку, и культивировали при 37°C с течение ночи. На следующий день удаляют культуральную надосадочную жидкость. Поверхность клеток дважды промывают средой, не содержащей сыворотку, и остаточную жидкость также удаляют, затем добавляют 100 мкл средой, не содержащей сыворотку, в целях разбавления и очистки антител или GLP-1 и инкубируют при 37°C в течение 4 ч. После стимуляции добавляют 100 мкл Bright Glo хемолюминисцентного субстрата Promega. Наконец, лизаты клеток переносят в 96-и луночный планшет и записывают относительную интенсивность люминесценции, используя микропланшетное считывающее устройство SpectraMax L производства Molecular Devices.
Стадия 13: Проба на толерантность к глюкозе у мышей ICR натощак.
Определение толерантности к глюкозе в вене у мышей проводят для оценки действенности слитых с GLP-1 белков (предпочтительно антитела к GLP-1 (A8G)-LK-L13H13), раскрываемых в данном патенте. В эксперименте использовали четыре группы мышей, и в каждой группе было не менее трех-пяти мышей. Группа I представляет собой контрольную группу, которая получала внутрибрюшинную инъекцию такого же объема PBS. Группа II получала одну внутрибрюшинную инъекцию 15 мкг на каждую мышь. Группа III получала одну внутрибрюшинную инъекцию 5 мкг на каждую мышь. После инъекции мышей не кормили в течение 6-16 часов и по завершении голодания отбирали образцы крови мышей для определения базальной концентрации глюкозы в крови. Затем мышам через желудочный зонд вводили глюкозу с концентрацией 1,5 г/кг и через 15, 30, 60 и 90 минут после введения через зонд отбирали образцы крови для определения концентрации глюкозы в крови, как показано на Фигуре 3.
Стадия 14: Проба на толерантность к глюкозе у мышей (C57BL) с применением слитого с GLP-1 белка с целью определения долговременной действенности (40 ч).
Определение толерантности к глюкозе в вене у мышей проводят для оценки долговременной действенности слитых с GLP-1 белков (предпочтительно антитела к GLP-1 (A8G)-LK-L13H13), раскрываемых в данном патенте. В эксперименте использовали две группы мышей, и в каждой группе было не менее трех-пяти мышей. Группа I представляет собой контрольную группу, которая получала внутрибрюшинную инъекцию такого же объема PBS. Группа II получала одну внутрибрюшинную инъекцию 15 мкг на каждую мышь. Через 24 после инъекции мышей не кормили в течение 16 часов, и по завершении голодания отбирали образцы крови мышей для определения базальной концентрации глюкозы в крови. Затем мышам через желудочный зонд вводили глюкозу с концентрацией 1,5 г/кг и через 15, 30, 60 и 90 минут после введения через зонд отбирали образцы крови для определения концентрации глюкозы в крови, как показано на Фигуре 4.
Стадия 15: Исследование долговременной (72 ч) действенности в отношении снижения концентрации глюкозы в крови у мышей с сахарным диабетом 2 типа (мыши db/db) при применении слитого с GLP-1 белка.
Концентрацию глюкозы в крови у мышей с сахарным диабетом 2 типа определяли в различные моменты времени для оценки долговременной (72 ч) действенности слитого с GLP-1 белка (предпочтительно, антитела к GLP-1 (A8G)-LK-L13H13), раскрываемого в данном патенте, в отношении снижения концентрации глюкозы в крови у мышей с сахарным диабетом 2 типа. В эксперименте использовали две группы мышей, и в каждой группе было не менее шести мышей. Перед началом инъекции отбирали пробы крови мышей для определения базальной концентрации глюкозы в крови. Позже Группа I (контрольная группа) получала внутрибрюшинную инъекцию такого же объема PBS. Группа II получала одну внутрибрюшинную инъекцию с концентрацией 10 нмоль/кг. Через 1, 4, 6, 24, 48 и 72 ч после инъекции отбирали образцы их крови для соответственного определения концентрации глюкозы в крови в двух группах мышей, как показано на Фигуре 5.
Стадия 16: Исследование долговременной (120 ч) действенности в отношении снижения дневного потребления пищи мышами с сахарным диабетом 2 типа (мыши db/db) при применении слитого с GLP-1 белка.
Изменения в потреблении пищи мышами с сахарным диабетом 2 типа определяли для оценки долговременной действенности слитого с GLP-1 белка (предпочтительно, антитела к GLP-1 (A8G)-LK-L13H13), раскрываемого в данном патенте, в отношении снижения уровня потребления пищи мышами с сахарным диабетом 2 типа. Эту стадию проводили одновременно со стадией 15 на той же партии мышей синхронно. В эксперименте использовали две группы мышей, и в каждой группе было не менее шести мышей. Начиная от 3-х дней до инъекции в стадии 15 до 5 дней после инъекции (120 ч), каждое утро и в одно и то же время взвешивали потребляемую мышами за день пищу, как показано на Фигуре 6.