Создание рекомбинантного аденовируса, кодирующего кодон-оптимизированный ген дисферлина, и анализ экспрессии рекомбинантного белка в культуре клеток in vitro

оригинальные исследования

Создание рекомбинантного аденовируса, кодирующего кодон-оптимизированный ген дисферлина, и анализ экспрессии рекомбинантного белка в культуре клеток in vitro

И.Г. Старостина 1, В.В. Соловьева 1, К.Г. Шевченко 2, Р.В. Деев 2, А.А. Исаев 2, А.А. Ризванов 1

1 Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань

2 Институт стволовых клеток человека, Москва

Formation of the recombinant adenovirus encoding codon-optimized dysferlin gene and analysis of the recombinant protein expression in cell culture in vitro

I.G. Starostina 1, V.V. Solovyeva 1, K.G. Shevchenko 2, R.V. Deev2, A.A. Isaev2, A.A. Rizvanov1

1 Kazan (Volga region) federal university, Kazan

2 Human Stem Cells Institute, Moscow

Дисферлинопатии человека относят к нейромышеч-ным заболеваниям, связанным с нарушением экспрессии и/или функции белка дисферлина (dystrophy-associated fer-1-like, DYSF) в скелетной мышце, что обусловлено мутациями в гене dysf. Вследствие большого размера кодон-оптимизированного гена dysf (6243 п.н.) для создания генетических конструкций подходят аденовирусные векторы, которые способны доставлять большой объем рекомбинантной генетической информации как в делящиеся, так и в неделящиеся клетки, а также обеспечивают высокий уровень экспрессии трансгенов.

Нами получен рекомбинантный аденовирус серотипа 5, кодирующий кодон-оптимизированный ген дисферлина человека (Ad5-DysfJ и проведен анализ экспрессии рекомбинантного белка in vitro в культуре клеток HEK-293T.

Ключевые слова: рекомбинантный аденовирус, дис-ферлин, кодонная оптимизация, генная терапия.

Dysferlinopathies belong to neuromuscular diseases associated with aberrant expression and/or function of dysferlin protein in skeletal muscle, which is caused by mutations in the dysf (dystrophy-associated fer-1-like, DYSF) gene. Because of the large size of the codon-optimized dysf coding region (6243 bp), adenoviral vectors are suitable for the creation of genetic constructs, which are capable of delivering a large amount of recombinant genetic information into both dividing and non-dividing cells, as well as provide a high level of transgene expression.

We generated a recombinant adenovirus serotype 5 encoding a codon-optimized gene for human dysferlin (Ad5-Dysf) and analysed recombinant protein expression in vitro in HEK-293T cell line.

Key words: Recombinant adenovirus, dysferlin, codon optimization, gene therapy.

Дисферлинопатии относят к нейромышечным заболеваниям человека аутосомно-рецессивного типа наследования при которых происходит нарушение экспрессии и(или) функции белка дисферлина в скелетной мышце [1]. Дисферлин — трансмембранный белок, который содержит семь С2 доменов и состоит из 2080 аминокислот (231кДа) [2, 3]. Мутации в любом из пяти С2 доменах дисферлина (С2А, В, й, Е и G) могут привести к формированию аномальной трёхмерной структуры белка или к его деградации, что служит причиной развития мышечной дистрофии [4, 5]. С2А области дисферлина связывают фосфолипиды Са2+-зависимым способом [6], что, по-видимому, связано с ролью белка в восстановлении мембран скелетных мышц [7, 8].

Мутациями в гене dysf, находящимся в хромосоме 2р12-14, обусловлено развитие конечностно-поясной миодистрофии типа 2В и миопатии Миоши

[9]. Ген dysf охватывает более 150 тыс. пар нуклеотидов (т.п.н.) геномной ДНК и состоит из 55 экзонов

[10]. На интронном уровне обнаружено более 300 различных мутаций, большинство из которых пред-

е-таП: rizvanov@gmail.com

ставляют собой однонуклеотидные полиморфизмы

[11]. Возможность восстановления дефектного белка мышц путем введения в клетку функционального гена дикого типа является перспективным методом генной терапии мышечных дистрофий.

В настоящее время генную терапию на основе аденовирусов считают возможным методом лечения различных заболеваний человека [12], в том числе мышечных дистрофий [13, 14]. Аденовирусные векторы способны инфицировать широкий спектр клеток человека, обеспечивая высокий уровень экспрессии трансгена, не интегрируются в геном клетки хозяина (онкологическая безопасность) и могут переносить большие фрагменты рекомбинантной ДНК (до 7,5 т.п.н.) [15].

Целью работы явилось создание рекомбинантного аденовируса, кодирующего кодон-оптимизированный ген дисферлина человека, и анализ экспрессии рекомбинантного белка в культуре клеток in vitro. Выбор аденовирусного вектора обусловлен большим размером кодон-оптимизированной нуклеотидной последовательности гена dysf.

Материал и методы

В работеиспользовалиськодон-оптимизированный ген дисферлина, клонированный в плазмидный вектор-донор pDONR221 (Invitrogen, США) и аденовирусный плазмидный экспрессионный вектор-реципиент pAd/CMV/V5-DEST (Invitrogen, США). Для оптимизации кодонного состава гена дисферлина dysf использовали алгоритм OptimumGene, который учитывает различные факторы, влияющие на уровни экспрессии генов, такие как смещение кодонов, GC-состав, содержание CpG-динуклеотидов, вторичную структуру мРНК, тандемные повторы, сайты рестрикции, которые могут помешать клонированию, преждевременные сайты полиаденилирования, дополнительные минорные сайты связывания с рибосомой. В качестве матрицы для кодонной оптимизации была взята нуклеотидная последовательность мРНК гена dysf (GeneBank # NM_003494). Синтез de novo оптимизированной нуклеотидной последовательности гена dysf осуществляла фирма GenScript (США).

Рекомбинационное клонирование между вектором-донором pDONR221 со вставкой гена dysf и вектором-реципиентом pAd/CMV/V5-DEST проводили по технологии Gateway (Invitrogen, США) с помощью LR-рекомбинации по методике, рекомендуемой производителем. Полученная таким образом рекомбинантная плазмида, кодирующая аденовирусный геном со вставкой гена dysf (pAd-DYSF), позволяет получить рекомбинантный аденовирус, содержащий необходимый нам трансген.

Трансформацию компетентных клеток Escherichia coli штамма T0P10 (Invitrogen, США) плазмидой pAd-DYSF проводили согласно стандартной схеме с применением CaCl2 метода [16]. Выросшие колонии проверяли на наличие адевирусного вектора со вставкой гена dysf (pAd-Dysf) с помощью ПЦР-скринига по стандартной методике [17] с использованием геноспецифичных праймеров.

Дальнейшую работу проводили с ПЦР позитивными колониями, содержащими рекомбинантный аденовирусный вектор с интересующей нас вставкой. Плазмидную ДНК выделяли с помощью набора QIAfilter Plasmid Midi Purification Kit (QIAGEN, США) по методике, рекомендуемой производителем. Правильность сборки генетической конструкции проверяли ДНК-секвенированием, результаты которого обрабатывали с помощью программы SeqScanner (Applied Biosystems, США) и программного пакета Lasergene 5.03 (программа SeqMan, DNA STAR, Inc., США).

Для анализа экспрессии белка дисферлина использовали клеточную линию HEK-293T (ATCC, CRL-11268), которую трансфицировали кольцевой плазмидой pAd-Dysf с использованием трансфек-ционного агента TurboFect (Fermentas Inc., Канада). Иммунофлуоресцентный анализ проводили с использованием первичных поликлональных антител кролика к дисферлину (Abcam plc., #ab15108, Великобритания), вторичных антител осла к иммуноглобулину класса G кролик, конъюгированных с флуоресцентной меткой Alexa-555 (Invitrogen, #A31572, США), и флуоресцентного красителя DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole; Invitrogen, США). Результаты анализировали на инвертированном флуоресцентном микроскопе Axio0berver.Z1 (Carl Zeiss, Германия). Электрофорез белков лизатов клеток HEK-293Т, трансфицированных плазмидой pAd-Dysf, в по-

лиакриламидном геле проводили по методу Лэммли в денатурирующих условиях (SDS-PAGE) [18]. Вестерн-блот анализ белков проводили с применением первичных поликлональных антител кролика к дисфер-лину (Abcam plc., #ab15108, Великобритания) и вторичных поликлональных антител козы к иммуноглобулину класса G кролика, конъюгированные с пероксидазой хрена (Sigma, #A6154, США). Визуализацию иммунного преципитата проводили с помощью набора для хемилюминесцентной детекции белка Amersham™ ECL™ Prime Western Blotting Detection Reagent (GE Healthcare Bio-Sciences AB, #RPN2232). Детекцию люминесценции проводили на приборе ChemiDoc™ XRS+ System (Bio-Rad, Сингапур).

Для получения рекомбинантного аденовируса Ad5-Dysf полученный аденовирусный плазмидный вектор pAd-Dysf переводили из кольцевой в линейную форму с помощью рестрикции ферментом PacI (Fermentas Inc., Канада). Расщепление вектора способствует взаимодействию левого и правого инвертированных концевых повторов и удалению бактериальных последовательностей (а именно, участка начала репликации pUC и гена устойчивости к ампициллину). Сборка и репликация рекомбинантного аденовируса происходит в клетках линии HEK-293A (Invitrogen, США) — иммортализированная линия первичных человеческих эмбриональных клеток почки, трансформированные фрагментами ДНК аденовируса серотипа 5. Клеточная линия содержит стабильно интегрированную в геном копию гена el, который экспрессирует белки Е1, необходимые для получения рекомбинантного аденовируса [19—20]. Трансфекцию клеток линии НЕК-293А линейной плазмидой pAd-Dysf проводили трансфек-ционным агентом TurboFect (Fermentas Inc., Канада) по методике, рекомендуемой производителем. Вирусный сток был получен путем криолиза (2—3 циклов замораживания/оттаивания) клеточной суспензии с последующим центрифугированием для удаления обломков клеток.

Результаты и обсуждение

Одним из методов усиления экспрессии рекомбинантных генов и биосинтеза терапевтических белков является кодонная оптимизация кодирующей последовательности. Кодонная оптимизация основана на вырожденности генетического кода, при этом в качестве оптимальных кодонов используют наиболее часто встречающиеся синонимические кодоны вырожденного генетического кода. Чем выше частота встречаемости того или иного кодона, используемого для кодирования аминокислоты в организме, тем с большей скоростью он будет транслироваться рибосомами вследствие высокой внутриклеточной концентрации тРНК, узнающей такой кодон. Помимо оптимизации трансляции за счет использования определенных нуклеотидных триплетов, в процессе кодонной оптимизации можно нарушать последовательности нуклеотидов структуры стеблевой петли (англ. Stem-loop), влияющие на стабильность мРНК и связывание с рибосомой, потенциальные сайты альтернативного сплайсинга, снижающие выход целевых полноразмерных мРНК, и др. Таким образом кодонная оптимизация повышает эффективность трансляции мРНК в полипептиды. Оптимизация ко-донного состава реализуется с помощью сайт направленного мутагенеза или химического синтеза нуклеотидной последовательности de novo.

Дикий тип нуклеотидной последовательности кодирующей части гена dysf состоит из 6243 п.н. и содержит тандем редких кодонов, которые могут остановить трансляцию или снизить ее эффективность. При оптимизации кодонного состава дикого типа гена dysf был улучшен индекс адаптации кодонов CAI (англ. Codon Adaptation Index) с 0,83 до 0,88. Для увеличения стабильности мРНК был оптимизирован GC-состав и удалены протяженные участки с высоким сожержанием GC-пар. Кроме того, процесс оптимизации удалил потенциальные цис-действующие сайты. Таким образом, получена плазмида (pD0NR221-Dysf), кодирующая оптимизированную по кодонам последовательность гена dysf. В результате кодон-ной оптимизации аминокислотная последовательность дисферлина не изменилась и составила 2080 аминокислотных остатков.

Субклонированием гена дисферлина из плазмиды pD0NR221-Dysf в вектор pAd/CMV/V5-DEST получена экспрессионная плазмидная конструкция pAd-Dysf, которую трансформировали в компетентные клетки E. coliT0P10. В дальнейшей работе ПЦР-позитивные колонии использовали для выделения плазмидной ДНК pAd-Dysf. Правильность сборки

полученной генетической конструкции проверяли секвенированием. В результате анализа сиквенсных хроматограмм, полученные нуклеотидные последовательности идентифицированы как фрагменты кодон-оптимизированной последовательности гена dysf. Было определено 23 фрагмента, получено полное покрытие открытой рамки считывания гена dysf. Анализ нуклеотидных последовательностей показал отсутствие мутаций на протяжении всей нуклеотидной последовательности гена дисферлина. После трансфекции клеток линии НЕК-293Т полученной генетической конструкцией, анализ экспрессии рекомбинантного белка проводили с помощью имму-нофлуоресцентного и вестерн-блот анализов.

Иммунофлуоресцентный анализ выявил положительную реакцию с поликлональными антителами кролика к дисферлину (рис. 1). Вестерн-блот анализ белковых лизатов клеток НЕК-293Т показал наличие выраженной специфичной полосы иммунопреципитата, соответствующей ожидаемой молекулярной массе белка дисферлина (231 кДа) (рис. 2). Таким образом, показана экспрессия белка дисферлина полученной генетической конструкцией pAd-Dysf.

Б

М 1 2

Рис. 1. Клетки линии НЕК-293Т:

А — нетрансфицированные клетки;

Б — клетки, трансфицированные плазмидой pAd-Dysf, экспрессирующие дисферлин, 48 ч после трансфекции. Иммунофлуоресцентный анализ с помощью антител к дисферлину.

Докраска ядер: DAPI

Рис. 2. Вестерн-блот анализ экспресии белка DYSF в генетически модифицированных клетках НЕК-293Т:

1 — клетки, трансфицированные кольцевой плазмидой pAd-Dysf;

2 — нетрансфицированные клетки НЕК-293Т;

M — маркер Prestained Protein Molecular Weight Marker. Электрофорез в 8% SDS-PAGE геле по системе Лаэмли

С помощью рестрикции ферментом PacI была получена линейная плазмида pAd-Dysf, которой трансфицировали клетки HEK-293A для сборки и репликации аденовируса. После получения неочищенного вирусного лизата для повышения вирусного титра проводили амплификацию аденовируса pAd5-Dysf в клетках HEK-293A. Через 2 дня после заражения в культуре клеток наблюдался цитопатический эффект, что указывает на то, что клетки продуцируют вирусные частицы.

Таким образом, нами получен рекомбинантный аденовирус серотипа 5, кодирующий кодон-оптимизированный ген дисферлина человека (Ad5-Dysf). С помощью иммунологических методов

показана эффективная экспрессия рекомбинантного белка дисферлина in vitro. Полученные плазмидные и вирусные конструкции будут использованы в дальнейших исследованиях по разработке методов генной терапии дисферлинопатии человека.

Благодарности

Работа финансировалась Институтом Стволовых Клеток Человека. Исследование выполнено на оборудовании Федерального центра коллективного пользования физико-химических исследований веществ и материалов (ФЦКП ФХИ) и Научнообразовательного центра фармацевтики Казанского [Приволжского) федерального университета.

ЛИТЕРАТУРА

1. Bushby K.M. Making sense of the limb-girdle muscular dystrophies. Brain 1999; 122: 1403—20.

2. Liu J., Aoki M., Illa I. et al. Dysferlin, a novel skeletal muscle gene, is mutated in Miyoshi myopathy and limb girdle muscular dystrophy. Nat. Genet. 1998; 20(1): 31-6.

3. Bashir R., Strachan T., Keers S. et al., A gene for autosomal recessive limb-girdle muscular dystrophy maps to chromosome 2p. Hum. Mol. Genet. 1994; 3(3): 455-7.

4. Therrien C., Dodig D., Karpati G. et al. Mutation impact on dysferlin inferred from database analysis and computer-based structural predictions. J. Neurol. Sci. 2006; 250(1-2): 71-8.

5. Fujita E., Kouroku Y., Isoai A. et al., Two endoplasmic reticulum-associated degradation (ERAD) systems for the novel variant of the mutant dysferlin: ubiquitin/proteasome ERAD(I) and autophagy/ lysosome ERAD(II). Hum. Mol. Genet. 2007; 16(6): 618-29.

6. Davis D.B., Doherty K.R., Delmonte A.J. et al. Calcium-sensitive phospholipid binding properties of normal and mutant ferlin C2 domains. J. Biol. Chem. 2002; 277(25): 22883-8.

7. Bansal D., Miyake K., Vogel S.S. et al., Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy. Nature 2003; 423(6936): 168-72.

8. Lennon N.J., Kho A., Bacskai B.J. et al., Dysferlin interacts with annexins A1 and A2 and mediates sarcolemmal wound-healing. J. Biol. Chem. 2003; 278(50): 50466-73.

9. Bashir R., Britton S., Strachan T. et al. A gene related to Caenorhabditis elegans spermatogenesis factor fer-1 is mutated in limb-girdle muscular dystrophy type 2B. Nat. Genet. 1998; 20(1): 37-42.

10. Aoki M., Liu J., Richard I. et al. Genomic organization of the dysferlin gene and novel mutations in Miyoshi myopathy. Neurology 2001; 57(2): 271-8.

11. Guglieri M., Magri F., D'Angelo M.G. et al. Clinical, molecular, and protein correlations in a large sample of genetically diagnosed Italian limb girdle muscular dystrophy patients. Hum. Mutat. 2008; 29(2): 258-66.

12. Vetrini F., Ng P. Gene therapy with helper-dependent adenoviral vectors: current advances and future perspectives. Viruses 2010; 2(9): 1886-917.

13. Dudley R.W., Lu Y., Gilbert R. et al. Sustained improvement of muscle function one year after full-length dystrophin gene transfer into mdx mice by a gutted helper-dependent adenoviral vector. Hum. Gene Ther. 2004; 15(2): 145-56.

14. Jiang Z., Feingold E., Kochanek S. et al. Systemic delivery of a high-capacity adenoviral vector expressing mouse CTLA4Ig improves skeletal muscle gene therapy. Mol. Ther. 2002; 6(3): 369-76.

15. Roth J.A., Cristiano R.J. Gene therapy for cancer: what have we done and where are we going? J. Natl. Cancer Inst. 1997; 89(1): 21-39.

16. Cohen S.N., Chang A.C., Hsu L. Nonchromosomal antibiotic resistance in bacteria: genetic transformation of Escherichia coli by R-factor DNA. PNAS USA 1972; 69(8): 2110-4.

17. Sambrook J., Russell D.W. Molecular cloning: a laboratory manual. 3 ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2001.

18. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 1970; 227(5259): 680-5.

19. Graham F.L., Smiley J., Russell W.C. et al. Characteristics of a human cell line transformed by DNA from human adenovirus type 5. J. Gen. Virol. 1977; 36(1): 59-74.

20. Harrison T., Graham F., Williams J. Host-range mutants of adenovirus type 5 defective for growth in HeLa cells. Virology 1977; 77(1): 319-29.