Использование иммуноферментного анализа в изучении динамики антител в процессе лечения атопического дерматита у детей

© АСИРЯН Е.Г., 2013

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА В ИЗУЧЕНИИ ДИНАМИКИ АНТИТЕЛ В ПРОЦЕССЕ ЛЕЧЕНИЯ АТОПИЧЕСКОГО ДЕРМАТИТА У ДЕТЕЙ

АСИРЯН Е.Г.

УО ««Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет»,

кафедра педиатрии

Резюме. Целью нашего исследования явилось изучение особенностей выявления антител класса Е, О к пищевым аллергенам (коровье молоко, белок куриного яйца, треска, мандарин) в сыворотке крови при атопическом дерматите у детей, а также их динамики после проведенного лечения. В ходе работы обследовано 68 детей с атопическим дерматитом. Антитела к пищевым аллергенам в сыворотке крови определяли методом иммуноферментного анализа до и после проведенного лечения. В результате проведенной работы были выявлены особенности распределения антител по классам у детей с атопическим дерматитом, а также изучен характер изменения антител Е, О в процессе лечения.

Ключевые слова: атопический дерматит, антитела, пищевые аллергены, иммуноферментный анализ.

Abstract. The aim of our study was to determine the features for the detection of antibodies of E, G class to food allergens (cow’s milk, hen’s egg-white, cod, tangerine) in blood serum in atopic dermatitis in children as well as their dynamics after the provided treatment. During our research we examined 68 children with atopic dermatitis. Antibodies to food allergens in blood serum were determined by ELISA before and after treatment. As a result of the done work we identified the features of antibodies classification in children with atopic dermatitis and also studied the variation of E, G antibodies in the treatment process.

Keywords: atopic dermatitis, antibodies, food allergens, enzyme-linked immunosorbent analysis.

Атопический дерматит - это хроническое рецидивирующее заболевание воспалительно-аллергического генеза, для которого характерен комплекс признаков атопии, а также вегетативно-сосудистые расстройства с зудом, сухостью и лихенификацией кожи [1]. Распространенность атопического дерматита неуклонно растет. В настоящее время заболеваемость составляет от 6% до 25% в разных странах мира [2], а в России - до 35%. Изменился

Адрес для корреспонденции: 210040, г. Витебск, ул. Гагарина, д.162, к.2., кв.43. Моб.тел.: +375 (029) 51504-86 - Асирян Елена Геннадьевна.

патоморфоз атопического дерматита у детей. Отмечена более ранняя манифестация заболевания в детском возрасте, увеличилась частота тяжелых форм с расширением площади поражения кожи, значительно возросло число больных с хроническим непрерывно рецидивирующим течением [3].

Большинство исследователей выделяют три пищевых продукта, сенсибилизация к аллергенам которых наиболее часто выявляется у детей с АД: коровье молоко, куриное яйцо, пшеница [4, 5]. По результатам данных исследований, при АД частота сенсибилизации к белкам коровьего молока составляет 39-45%, к аллергенам ку-

риного яйца - 28-72%, к пшенице - 4-12%. Частыми пищевыми аллергенами также являются рыба (52%), говядина (36%), бананы (32%), белки сои (29%). Таким образом, ПА является стартовой сенсибилизацией, на фоне которой формируется гиперчувствительность к другим аллергенам путем перекрестных реакций [6].

В лечении атопического дерматита следует учитывать возрастную стадию, клинические проявления и сопутствующую патологию. В острый период назначается интенсивная терапия для снятия остроты процесса (глюкокортикостероиды, антигистаминные препараты, плазма-ферез), в период затихания применяется поддерживающая и превентивная терапия (мембраностабилизаторы, иммуномодуляторы, физиотерапия, энтеросорбенты). В ремиссии проводят профилактические противорецидивные мероприятия (дезал-лергизация быта больного, специфическую иммунотерапию, курсы гистаглобу-лина и др.) [7].

Методы

В ходе работы обследовано 68 детей с атопическим дерматитом в возрасте от 5 до 15 лет, находившихся на лечении в аллергологическом отделении Витебской детской областной клинической больницы. Диагноз атопического дерматита установлен на основании данных клинического и аллергологического обследования. Степень тяжести атопического дерматита определяли по шкале SCORAD: тяжелое течение (SCORAD 48±0,9) имели 8 детей, средней степени тяжести (SCORAD 27±0,8) - 39 детей, легкое течение (SCORAD 13±0,5) - 21 ребенок.

Определение IgE и IgG-антител в сыворотке крови к пищевым аллергенам проводили методом иммуноферментного анализа (ИФА). Сущность метода состоит в том, что при добавлении исследуемой сыворотки, содержащей специфические антитела к аллергену, связанному с полисти-роловой поверхностью микропланшета, образуется комплекс аллерген - антитело.

Количество связавшихся антител определяют с помощью меченных ферментом антител [8, 9]. Наборы для ИФА по выявлению IgE и IgG-антител включали диагностику на основные пищевые аллергены: коровье молоко, белок куриного яйца, треска, мандарин. Обследовали детей до и после курса аутосеротерапии.

Так как уровень активности имму-ноферментной реакции зависит не только от концентрации антител, но и от их аффинности, отбирались разведения, при которых значения активности антител в иммуноферментной реакции попадают на средний участок кривой титрования (а=95%, р<0,05), где измерение наиболее достоверно. В сыворотке крови они составили 1:4 для IgE-антител, 1:100 для IgG-антител [9].

Для получения сопоставимых результатов различных серий опытов и исключения зависимости от активности компонентов иммуноферментной реакции результаты ИФА выражали в условных единицах (EU, Elisa Units) [8, 9]. Полученные результаты антител в EU переводили в классы соответственно уровню: 0 уровень - до 300 EU, I уровень - от 300 до 600 EU, II уровень - от 600 до 900 EU, III уровень - от 900 до 1200 EU, IV уровень -более 1200 EU.

Результаты и обсуждение

При определении IgE и IgG-антител в сыворотке крови к пищевым аллергенам (коровье молоко, белок куриного яйца, треска и мандарин) методом иммунофер-ментного анализа были получены следующие результаты.

При выявлении уровня IgE-антител в сыворотке крови к коровьему молоку было установлено, что II-IV уровень определялся у 41,2% (28) обследованных детей, у 30,9% (21) определялся I уровень. Среди положительных результатов IV уровень присутствовал у 5,9% (4) детей, III уровень - у 5,9% (4). 29,4% (20) детей имели II уровень IgE-антител к данному аллергену (табл. 1).

Таблица 1

Структура уровней IgE-антител к пищевым аллергенам в сыворотке крови при атопическом дерматите у детей

II уровень III уровень IV уровень

Коровье молоко 29,4%

Белок куриного яйца 17,7%

Треска 17,7%

Мандарин 35,3%

Примечание: * - достоверные отличия между частотой встречаемости различных уровней антител р<0,05.

При выявлении ^Е-антител к аллергену белка куриного яйца IV уровень определялся у 7,4% (5) детей, у 4,4% (3) детей установлен III уровень. II уровень выявлялся достоверно чаще и присутствовал у 17,6% (12) детей (р<0,05). П-^ уровень ^Е-антител установлен у 29,4% (20) детей,

I уровень определялся у 33,8% (23) детей (табл. 1).

У 17,7% (12) детей выявлен II уровень ^Е-антител к аллергену трески, 19,1% (13) детей имели III уровень, только у 1,5% (1) наблюдался IV уровень. Таким образом, П-^ уровень ^Е-антител установлен у 38,2% (26) детей, I уровень - у 30,9% (21) детей (табл. 1).

Определяя ^Е-антитела к аллергену мандарина, у 54,4%

- III уровень, у 7,4% (5) - IV уровень (табл. 1). Таким образом, в сыворотке крови при атопическом дерматите у детей достоверно чаще выявлялся II уровень ^Е-антител ко всем используемым пищевым аллергенам, а также III уровень ^Е-антител к треске (р<0,05).

^О-антитела П-^ уровня к коровьему молоку определялись у 47,1% (32) детей, I уровень был установлен у 33,8% (23) детей. Среди положительных результатов у наибольшего количества детей опреде-

лялся II уровень - 41,2% (28) детей, лишь 5,9% (4) обследованных имели III уровень антител данного класса в сыворотке крови (табл. 2).

II-IV уровень IgG-антител к белку куриного яйца имели 33,8% (23) детей, I уровень - 50% (34) пациентов. Достоверно чаще наблюдался II уровень IgG-антител к данному аллергену, он присутствовал у 25% (17) детей. III уровень антител определялся у 2,9% (2) детей, IV уровень - у 5,9%

(4) детей (табл. 2).

У 36,8% (25) детей был выявлен II-IV уровень IgG-антител к треске, I уровень

- у 42,6% (29) пациентов. II уровень IgG-антител определялся у 22% (15) детей. 7,4%

(5) детей имели III уровень, у такого же количество детей установлен IV уровень IgG-антител к данному аллергену (табл. 2).

II-IV уровень IgG-антител к мандарину обнаружен у 42,6% (29) детей, I уровень

- у 33,8% (23) детей. Среди положительных результатов были получены следующие цифры: 25% (17) детей имели II уровень; 7,4% (5) детей - III уровень; 10,3% (7) детей

- IV уровень (табл. 2).

При выявлении IgG-антител достоверно чаще в сыворотке крови присутствовал II уровень антител ко всем используемым в обследовании пищевым аллергенам (p<0,05).

Наблюдаемые дети получали стандартное лечение согласно протоколам по поводу АД и сопутствующей патологии.

Таблица 2

Структура уровней IgG-антител к пищевым аллергенам в сыворотке крови при атопическом дерматите у детей

II уровень III уровень IV уровень

Коровье молоко 41,2% (28)* 5,9% (4) -

Белок куриного яйца 25%

Треска 22%

Мандарин 25%

Примечание: * - достоверные отличия между частотой встречаемости различных уровней антител р<0,05.

Таблица 3

Изменение уровней антител IgE, IgG

Аллер- гены Коровье молоко Белок куриного яйца Треска Мандарин

Изоти- пы антител Сниже- ние Увели- чение Сниже- ние Увели- чение Сниже- ние Увели- чение Сниже- ние Увели- чение

39,3%

ДО 32,1%

Примечание: * - достоверные отличия в динамике антител до и после проведенного лечения (р<0,05).

В острый период проводилась терапия для снятия остроты процесса: антиги-стаминные препараты, антимедиаторы, мембраностабилизаторы, по показаниям антимикробные и/или антигрибковые препараты, при затихании - поддерживающая и превентивная терапия - мембраностабилизаторы, витамины, энтеросорбенты. В период ремиссии дети получали курсы аутосеротерапии. Во все периоды назначалась гипоаллергенная и элиминационная диета. В комплекс лечения атопического дерматита включалась местная терапия. У 28 детей забор крови на исследование про-

водился при поступлении в стационар, повторное обследование назначалось после курса лечения.

При изучении динамики антител к пищевым аллергенам у детей с АД были выявлены следующие особенности. При определении антител к коровьему молоку после лечения достоверно чаще наблюдалось снижение уровня ^Е-антител

- у 39,3% (11) детей (р<0,05). Установлено также снижение уровня ^О-антител к коровьему молоку - у 32,1% (9) детей (р<0,05) (3). При выявлении ^Е-антител к белку куриного яйца у 21,4% (6) детей наблюда-

лось снижение уровня антител (р<0,05). У 25% (7) детей было обнаружено увеличение уровня 1^0-антител к данному аллергену, что также достоверно чаще (р<0,05) (табл. 3).

Антитела 1^Е к треске снижались у

11 (39,3%) детей, повышение же наблюдалось лишь у 3 (10,7%) детей. Таким образом, достоверно чаще в процессе лечения выявлялось снижение 1^Е-антител к треске (р<0,05). При определении 1^0-антител снижение уровня установлено у 7 (25%) детей (р<0,05) (табл. 3).

Антитела к мандарину после лечения изменялись следующим образом. Достоверно чаще наблюдалось снижение 1^Е-антител - у 42,9% (12) детей (р<0,05), а также снижение 1^А-антител - у 32,1% (9) детей (р<0,05) (табл. 3).

Таким образом, анализируя полученные данные, следует отметить, что после лечения ко всем используемым пищевым аллергенам наблюдалось достоверно чаще снижение уровня 1^Е-антител. Снижение 1^0-антител достоверно чаще было найдено при выявлении антител к коровьему молоку и треске, тогда как к белку куриного яйца достоверно чаще установлено повышение уровня антител.

Роль 1^0-антител в патогенезе атопического дерматита остается до конца не изученной. 1^0-антитела к аллергенам пищи выявляются у атопических и у неатопических детей. Известно, что 1^0 состоит из 4 подклассов, 1^01-4, из которых 1^01 и 1^04 являются доминантными субклассами к пищевым аллергенам [10]. В ряде исследований сообщается, что высокий уровень специфических 1^04 -антител, а также соотношения 1^04-/1^Е-антител к пищевым аллергенам препятствуют развитию пищевой аллергии. Предыдущие исследования с пыльцевыми аллергенами указывают на защитную роль антител 1^04, так как наблюдалось увеличение уровня этих антител во время специфической иммунотерапии. Однако есть мнение, что аллергические признаки и повышение чувствительности связаны с высокими уровнями определенного подкласса 1^0-антител к аллергенам,

особенно IgG4 [11]. Следовательно, после лечения у детей с атопическим дерматитом наблюдаются изменения спектра антител к пищевым аллергенам.

Заключение

1. В сыворотке крови у детей с атопическим дерматитом определяются IgE и IgG-антитела к пищевым аллергенам (коровье молоко, белок куриного яйца, треска, мандарин). Достоверно чаще выявляется II уровень IgE и IgG-антител ко всем используемым аллергенам (коровье молоко, белок куриного яйца, треска, мандарин), а также III уровень IgE-антител к треске (p<0,05).

2. В процессе лечения достоверно чаще наблюдалось снижение IgE-антител ко всем используемым в обследовании пищевым аллергенам (p<0,05).

3. Изменение IgG-антител носило разнонаправленный характер. Достоверно чаще наблюдалось повышение антител этого класса после проведенного лечения к белку куриного яйца (p<0,05), снижение наблюдалось к коровьему молоку и треске.

Литература

1. Новикова, Н.Д. Спектр антител к бытовым и эпидермальным аллергенам в слюне и сыворотке крови детей с бронхиальной астмой / Н.Д. Новикова, П.Д. Новиков // Иммунопатология, аллергология, инфектология. - 2003. - № 4. - C. 46-51.

2. The incidence of atopic dermatitis in school entrants is associated with individual life-style factors but not with local environmental factors in Hannover, Germany / S. Werner [et al.] // Br. J. Dermatol. - 2002. - Vol. 147. - P. 95-104.

3. Hanifin, J.M. Epidemiology of atopic dermatitis / J.M. Hanifin // Immunol. Allergy Clin. NA. -2002. - Vol. 22. - Р. 1-24.

4. Guidelines for Diagnosis and Management of Pediatric Food Allergy in Japan / T. Mukoyama [et al.] // Allergology International. - 2007. - Vol. 56. - P. 349-361.

5. The role of cow milk allergy in increasing severity of atopic dermatitis / Z. Pourpak [et al.] // Immunol. Invest. - 2004. - Vol. 33. - P. 69-79.

6. Sampson, H.A. AGA technical Review on the evaluation of food allergy in gastrointestinal

disorders / H.A. Sampson, S.H. Sicherer, A.H. Birnbaum // American Gast. Association. Gastroenterology. - 2001. - Vol. 120. - P. 102б-1040.

7. Сергеев, Ю.В. Атопический дерматит: от патогенеза к эффективной терапии / Ю.В. Сергеев // Иммунопатология, аллергология, инфектоло-гия. - 2004. - № 3. - С. 47-53.

8. Новиков, П.Д. Выявление IgE- и IgG- аитител к пищевому красителю тартразину в сыворотке крови больных / П. Д. Новиков, Н.Д. Титова // Иммунопатология, аллергология, инфектоло-гия. - 200б. - № 1. - С. 3б-41.

9. Егоров, А.М. Теория и практика иммунофер-ментного анализа / А.М. Егоров, А.П. Осипов, Е.Б. Дзантиев. - М.: Высшая школа, 1991. - 285 с.

10. Jenmalm, M.C. Development ofimmunologlobulin G subclass antibodies to ovalbumin, birch and cat during the first eight years of life in atopic and non-atopic children / M.C. Jenmalm, B. Bjorksten // Pediatr. Allergy Immunol. - 1999. - Vol. 10. - P. 112-121.

11. Clinical and immunological effects of sublingual immunotherapy in asthmatic children sensitized to mites: a double-blind, randomized, placebo-controlled study / K.H. Lue [ct al.] // Pediatr. Allergy Immunol. - 2006. - Vol. 17. - P. 408-415.

Поступила 29.01.2013 г. Принята в печать 04.03.2013 г.

Сведения об авторах:

Асирян Е.Г. - к.м.н., доцент кафедры педиатрии УО «ВГМУ».