СПОСОБ КОРРЕКЦИИ ЭНДОТЕЛИАЛЬНОЙ ДИСФУНКЦИИ
METHOD FOR CORRECTION OF ENDOTHELIAL DYSFUNCTION

Изобретение относится к области медицины, в частности кардиофармакологии, и может быть использовано для коррекции эндотелиальной дисфункции.
Из уровня техники известен способ коррекции эндотелиальной дисфункции смесью растворов гомеопатических разведений поликлональных антител к эндотелиальной синтазе оксида азота человека (RU 2306953 C1, A61K 39/395, 2007). Однако недостатком данного изобретения является то, что заявленный способ эффективен при эндотелиальной дисфункции, связанной с низким уровнем эндотелиальной NO-синтазы, и может не обеспечивать терапевтическую эффективность при эндотелиальной дисфункции с нормальной продукцией NO-синтазы.
Изобретение направлено на создание эффективного и безопасного способа коррекции эндотелиальной дисфункции, препятствующего возникновению воспаления стенки сосуда и развития эндотелиальной дисфункции.
Решение поставленной задачи обеспечивается тем, что в способе коррекции эндотелиальной дисфункции в организм вводят активированную-потенцированную форму антител к фактору роста сосудистого эндотелия.
Причем активированную-потенцированную форму антител к фактору роста сосудистого эндотелия используют в виде активированного-потенцированного водного или водно-спиртового раствора, активность которого обусловлена процессом многократного последовательного разведения в водном или водно-спиртовом растворителе в сочетании с внешним механическим воздействием - вертикальным встряхиванием каждого разведения.
Водный или водно-спиртовой раствор активированной-потенцированной формы антител к фактору роста сосудистого эндотелия может быть получен путем многократного последовательного разведения в сочетании с внешним механическим воздействием - вертикальным встряхиванием каждого разведения из матричного раствора антител к фактору роста сосудистого эндотелия с концентрацией 0,5÷5,0 мг/мл.
Причем активированную-потенцированную форму антител к фактору роста сосудистого эндотелия используют в виде смеси различных, преимущественно сотенных, разведений по гомеопатической технологии.
Заявленный способ может быть использован для коррекции L-Name-индуцированной эндотелиальной дисфункции у крыс самцов линии Wistar, вызванной внутрибрюшинным ежедневным введением 2 раза в сутки L-Name в дозе 12,5 мг/кг по 4,5 мл/кг (9 мл/кг/сут), путем введения внутрижелудочно активированной-потенцированной формы антител к фактору роста сосудистого эндотелия в виде смеси растворов гомеопатических разведений С12, С30, С200.
12
30
200
Кроме того, активированную-потенцированную форму антител к фактору роста сосудистого эндотелия используют в виде смеси различных разведений, приготовленных по гомеопатической технологии, преимущественно, в виде смеси трех растворов, приготовленных из матричного раствора, разведенного, соответственно, в 100, 100 и 100 раз, что эквивалентно сотенным разведениям С12, С30, С200, приготовленным по гомеопатической технологии.
Предложенная активированная-потенцированная форма антител к фактору роста сосудистого эндотелия (т.е. форма антител, приготовленная по гомеопатической технологии потенцирования путем многократного последовательного разведения в сочетании с внешним механическим воздействием - вертикальным встряхиванием каждого разведения (см., например, В.Швабе "Гомеопатические лекарственные средства", М., 1967 г., с.14-29), которая обладает активностью в фармакологических моделях и/или клинических методах коррекции эндотелиальной дисфункции), обеспечивает активацию eNOS, усиливает неоваскуляризацию ишемизированных тканей, в результате чего нормализуются сосудистый тонус и кровообращение, повышается толерантность к физической нагрузке, улучшается общее самочувствие.
Активированную-потенцированную форму антител к фактору роста сосудистого эндотелия приготовляют следующим образом. Для приготовления активированной-потенцированной формы антител используют моноклональные или поликлональные антитела, которые могут быть получены по известным технологиям - методикам, описанным, например, в книге: Иммунологические методы, под ред. Г.Фримеля, М., «Медицина», 1987, с.9-33; или, например, в статье Laffly Е., Sodoyer R. Hum. Antibodies. Monoclonal and recombinant antibodies, 30 years after. - 2005 - Vol.14. - N 1-2. P.33-55.
Для получения антител к фактору роста сосудистого эндотелия в качестве иммуногена (антигена) для иммунизации кроликов может быть использован адъювант и цельная молекула фактора роста сосудистого эндотелия следующей последовательности:
Возможно для получения антител к фактору роста сосудистого эндотелия использование в качестве иммуногена (антигена) полипептидного фрагмента фактора роста сосудистого эндотелия, выбранного, например, из следующих последовательностей:
41-60:
71-91:
111-120:
191-210:
221-232:
Предпочтительным для приготовления активированной-потенцированной формы антител к фактору роста сосудистого эндотелия является использование антител к фактору роста сосудистого эндотелия, которые в качестве матричного (первичного) раствора с концентрацией 0,5÷5,0 мг/мл используют для последующего приготовления активированной-потенцированной формы.
Поликлональные антитела могут быть получены активной иммунизацией животных. Для этого по специально разработанной схеме животным делают серию инъекций требуемыми в соответствии с изобретением веществами-антигенами: фактором роста сосудистого эндотелия. В результате проведения такой процедуры получают моноспецифические антисыворотки с высоким содержанием антител, которые используют для получения активированных-потенцированных форм. При необходимости проводят очистку антител, присутствующих в антисыворотке, например, методом аффинной хроматографии путем применения фракционирования солевым осаждением или ионообменной хроматографии.
3
3
Перед отбором крови за 7-9 дней проводят 1-3 внутривенные инъекции для повышения уровня антител. В процессе иммунизации у кроликов отбирают небольшие пробы крови для оценки количества антител. Максимальный уровень иммунного ответа на введение большинства растворимых антигенов достигается через 40-60 дней после первой инъекции. После окончания первого цикла иммунизации кроликов в течение 30 дней дают восстановить здоровье и проводят реиммунизацию, включающую 1-3 внутривенные инъекции. Для получения антисыворотки из иммунизированных кроликов собирают кровь в центрифужную пробирку объемом 50 мл. С помощью деревянного шпателя удаляют со стенок пробирки образовавшиеся сгустки и помещают палочку в сгусток, образовавшийся в центре пробирки. Кровь помещают в холодильник (температура 4°С) на ночь. На следующий день удаляют сгусток, прикрепившийся к шпателю, и центрифугируют оставшуюся жидкость при 13000g в течение 10 мин. Супернатант (надосадочная жидкость) является антисывороткой. Полученная антисыворотка должна быть желтого цвета. Добавляют к антисыворотке 20% (весовая концентрация) NaN до конечной концентрации 0,02% и хранят до использования в замороженном состоянии при температуре -20°С (или без добавления NaN - при температуре -70°С). Для выделения из антисыворотки антител к фактору роста сосудистого эндотелия производят абсорбцию на твердой фазе в следующей последовательности:
2
4
1) 10 мл антисыворотки кролика разбавляют в 2 раза 0,15 М NaCl, добавляют 6,26 г NaSO, перемешивают и инкубируют 12-16 ч при 4°С;
2) выпавший осадок удаляют центрифугированием, растворяют в 10 мл фосфатного буфера и затем диализуют против того же буфера в течение ночи при комнатной температуре;
3) после удаления осадка центрифугированием раствор наносят на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенную фосфатным буфером;
4) фракцию антител определяют, измеряя оптическую плотность элюата при 280 нм.
Затем производят очистку антител, например, методом аффинной хроматографии путем прикрепления полученных антител к фактору роста сосудистого эндотелия, который находится на нерастворимом матриксе с последующим элюированием концентрированными растворами соли.
Полученный таким образом буферный раствор поликлональных антител к фактору роста сосудистого эндотелия, с концентрацией 0,5÷5,0 мг/мл, предпочтительно 2,0÷3,0 мг/мл используют в качестве матричного (первичного) раствора для последующего приготовления активированной-потенцированной формы лекарственного средства.
Моноклональные антитела могут быть получены, например, с помощью гибридомной технологии, которая включает несколько этапов: последовательная иммунизация животных, предпочтительно мышей; выделение из иммунизированных животных антитело-продуцирующих В-лимфоцитов из лимфоидных органов животного (селезенка, лимфатические узлы); создание гибридом (антитело-продуцирующие В-лимфоциты гибридизируют с миеломными клетками); культивирование гибридом и отбор продуктивных гибридных клеток; скрининг секретируемых гибридомами антител; клонирование гибридомных клеток; выделение антител из культуральной жидкости и очистка моноклональных антител.
Мышам делают иммунизацию антигеном - фактором роста сосудистого эндотелия, смешанного с адъювантом. Через несколько дней у иммунизированных мышей выделяют лимфоидные органы и готовят взвесь клеток. Выбирают миеломные клетки для гибридизации с клетками иммунизированных животных.
Клетки иммунизированного животного и миеломные клетки смешивают и центрифугируют. После центрифугирования надосадочную жидкость удаляют, а к осадку добавляют полиэтиленгликоль (0,5 мл 50%-ного раствора ПЭГ) и инкубируют. Затем отмывают клетки от ПЭГ. Далее клетки с миеломными клетками помещали в ГАТ-среду и культивировали.
После культивирования выделяли выжившие гибридомные клетки миеломы с клетками иммунизированного животного, которые сохраняли способность синтезировать и секретировать антитела.
3
Далее проводили клонирование гибридом и отбор нужных клонов. Выжившие в ГАТ клетки рассевали в специальные пластиковые планшеты, содержащие обычно 96 лунок емкостью примерно по 0,2 см. В каждую лунку помещали в среднем по 10 гибридомных клеток и культивировали. После нескольких дней культивирования содержимое каждой лунки проверяли на присутствие антител нужной специфичности. Клетки из лунок, содержащих нужные антитела, клонировали, то есть повторно рассевали по таким же лункам, но из расчета 1 клетка на лунку, вновь культивировали и проверяли на присутствие нужных антител. Процедуру повторяли 1-2 раза. Таким образом, отбирали клоны, продуцирующие антитела только одной нужной специфичности, то есть моноклональные антитела.
После чего проводили выделение моноклональных антител из культуральной жидкости гибридомных клеток и проводили очистку моноклональных антител с помощью методов хроматографии, предпочтительно аффинной хроматографии.
Полученные таким образом моноклональные антитела к фактору роста сосудистого эндотелия, с концентрацией 0,5÷5,0 мг/мл, предпочтительно 2,0÷3,0 мг/мл используют в качестве матричного (первичного) раствора для последующего приготовления активированной-потенцированной формы лекарственного средства.
12
30
200
Предпочтительным для приготовления активированной-потенцированной формы антител к фактору роста сосудистого эндотелия является использование смеси трех водно-спиртовых разведении первичного матричного раствора антител, разведенных, соответственно, в 100, 100, и 100 раз, что соответствует сотенным разведениям С 12, С30 и С200, приготовленным по гомеопатической технологии.
Активированную-потенцированную форму антител к фактору роста сосудистого эндотелия готовят путем равномерного уменьшения концентрации в результате последовательного разведения 1 части упомянутого матричного раствора в 9 частях (для десятичного разведения D), или в 99 частях (для сотенного разведения С), или в 999 частях (для тысячного разведения М) нейтрального растворителя с многократным вертикальным встряхиванием ("динамизацией") каждого полученного разведения и использованием отдельных емкостей для каждого последующего разведения до получения требуемой потенции - кратности разведения по гомеопатическому методу (см., например, В.Швабе "Гомеопатические лекарственные средства", М., 1967 г., с.14-29).
Внешнюю обработку в процессе уменьшения концентрации также можно осуществлять ультразвуком, электромагнитным или иным физическим воздействием.
12
Например, для приготовления 12-го сотенного разведения С 12 одну часть упомянутого матричного раствора антител к фактору роста сосудистого эндотелия с концентрацией 3,0 мг/мл разводят в 99 частях нейтрального водного или водно-спиртового растворителя и многократно (10 и более раз) вертикально встряхивают - потенцируют полученное 1-е сотенное С1 разведение. Из 1-го сотенного С 1 разведения приготовляют 2-е сотенное разведение С2. Данную операцию повторяют 11 раз, получая 12-е сотенное разведение С 12. Таким образом, 12-е сотенное разведение С 12 представляет собой раствор, полученный разбавлением последовательно в разных емкостях 12 раз 1-й части исходного матричного раствора антител к фактору роста сосудистого эндотелия с концентрацией 3,0 мг/мл в 99-ти частях нейтрального растворителя, раствор, приготовленный разведением матричного раствора в 100 раз. Аналогичные операции с соответствующей кратностью разведения проводят для получения разведении С30 и С200.
12
30
200
При использовании в качестве биологически активного жидкого компонента смеси различных, преимущественно сотенных, разведений действующего вещества, приготовленных по гомеопатической технологии, каждый компонент состава (например, С 12, С30, С200) приготовляют раздельно по описанной выше технологии до их предпоследнего разведения (соответственно, до получения С11, С29, С 199) и затем вносят в соответствии с составом смеси в одну емкость по одной части каждого компонента и смешивают с требуемым количеством растворителя (соответственно, с 97 частями для сотенного разведения). При этом получают активированную-потенцированную форму антител к фактору роста сосудистого эндотелия в сверхмалой дозе, полученной сверхразведением матричного раствора, соответственно, в 100, 100 и 100 раз, эквивалентной смеси сотенных разведений С12, С30 и С200, приготовленных по гомеопатической технологии.
Возможно использование действующего вещества в виде смеси других различных разведений, например десятичных и или сотенных, (D20, С30, С100 или С12, С30, С50 и т.д.), приготовленных по гомеопатической технологии, эффективность которых определяют экспериментально.
При потенцировании вместо встряхивания в процессе уменьшения концентрации также можно осуществлять внешнее воздействие ультразвуком, электромагнитным или иным физическим воздействием.
Для проведения экспериментальных исследований были использованы моноклональные антитела, приготовленные по заказу специализированной биотехнологической фирмой.
Пример 1. Для экспериментального исследования коррекции эндотелиальной дисфункции опыты проводили на белых крысах самцах линии Wistar массой 250-300 г, которые были разделены на 3 группы: 1 группа,контрольная, получала дистиллированную воду 9 мл/кг/сут (ежедневно, внутрижелудочное введение.), 2 группа получала L-NAME (12,5 мг/кг), 3 группа получала L-NAME (12,5 мг/кг) + смесь растворов гомеопатических разведений моноклональных антител к VEGF - С12, С30, С200 (9 мл/кг/сут)
Эндотелиальную дисфункцию у крыс вызывали (моделировали) путем внутрибрюшинного введения N-нитро-L-аргинин метилового эфира (L-NAME) в дозе 12,5 мг/кг/сут в течение 28 дней. На 29 день от начала эксперимента под наркозом (тиопентал - натрия 50 мг/кг) вводят катетер в левую сонную артерию для регистрации показателей артериального давления (АД), болюсное введение фармакологических агентов осуществляют в правую бедренную вену. Показатели гемодинамики: систолическое артериальное давление (САД), диастолическое артериальное давление (ДАД) и частоту сердечных сокращений (ЧСС) измеряют непрерывно посредством датчика TSD104A и аппаратно-программного комплекса МР100, производства Biopac System, Inc., США. Функциональные пробы: эндотелий зависимая вазодилатация (ЭЗВ) - внутривенное введение ацетилхолина (АХ) в дозе 40 мкг/кг, эндотелий независимая вазодилатация (ЭНЗВ) - внутривенное введение нитропруссида натрия (НП) в дозе 30 мкг/кг.
Степень развития эндотелиальной дисфункции оценивали с помощью коэффициента эндотелиальной дисфункции, являющегося отношением площади треугольника над трендом реакции восстановления артериального давления (АД) в ответ на введение нитропруссида (НП) к площади треугольника над трендом реакции восстановления АД в ответ на введение ацетилхолина (АХ).
При статистической обработке данных рассчитывали среднее значение, величину стандартного отклонения. Различия считали достоверными при p<0,05.
Обработка полученных экспериментальных данных при проведении функциональных проб на эндотелийзависимое (ацетилхолин 40 мкг/кг в/в) и эндотелийнезависимое (нитропруссид 30 мг/кг в/в) расслабление сосудов у экспериментальных животных позволили установить, что внутрибрюшинное введение L-Name в дозе 12,5 мг/кг в течение 28 дней вызывает повышение коэффициента эндотелиальной дисфункции до 3,5±0,5 усл.ед. (Таблица 1), тогда как в контрольной группе животных (внутрижелудочное введение дистиллированной воды в дозе 9 мл/кг/сут) КЭД составил 1,2±0,1 усл.ед.
В группе животных, которым в течение 28 дней вводили L-Name в дозе 12,5 мг/кг и внутрижелудочно смесь растворов гомеопатических разведений моноклональных антител к VEGF - С 12, С30, С200 КЭД составил 1,7±0,1 усл.ед., что достоверно ниже, чем в группе животных, которым вводили L-Name.
Таким образом, полученные результаты подтверждают возможность коррекции L-Name-индуцированной эндотелиальной дисфункции у крыс, вызванной введением L-Name в дозе 12,5 мг/кг, путем введения внутрижелудочно смеси растворов гомеопатических разведений антител к VEGF - С12, С30, С200 в дозе 9 мл/кг, что выражается в снижении КЭД в данной группе животных до уровня 1,7±0,1 усл.ед., близкого к уровню КЭД в контрольной группе животных - 1,2±0,1 усл.ед.
Таблица 1
Динамика показателей АД и коэффициента эндотелиальной дисфункции при моделировании L-Name-индуцированной эндотелиальной дисфункции и ее коррекции смесью растворов гомеопатических разведений моноклональных антител к VEGF - С 12, С30, С200 в дозе 9 мл/кг/сут
Группы животных
Функциональная проба
САД, мм рт.ст.
ДАД, мм рт.ст
S сосудистой реакции при проведении ЭЗВД с АХ и ЭНВД с НП, усл.ед.
КЭД, усл. ед.
Контрольная (ежедневное внутрижелудочное введение дистиллированной воды 9 мл/кг/сут)
Исходные
159,2±5,4
124,2±4,7
1,2±0,1
АХ
96,9±6,7
52,0±3,0
3071,2±501,1
НП
113,8±6,1
55±2,4
3617,2±560,1
Получавшие L-NAME (12,5 мг/кг)
Исходные
204,8±10*
164,2±5,9*
3,5±0,5*
АХ
111,3±7,4
64,7±4,3*
3700,2±536,9
НП
118,2±9,9
61,4±4,4
11922,8±1838,9*
L-NAME (12,5 мг/кг) + смесь растворов гомеопатических разведений моноклональных антител к VEGF - С12, С30, С200 (9 мл/кг/сут)
Исходные
212,6±9,4,*
167,0±6,9*
1,7±0,1**
АХ
122,4±7,5*
72,3±4,2*
3643,3±309,7
НП
106,8±8,5
53,8±2,2
6119,4±486,6**
Примечание: * - p<0,05 в сравнении с контрольной группой; ** - p<0,05 в сравнении с группой L-NAME. САД - систолическое артериальное давление, ДАД - диастолическое артериальное давление, S - площадь над кривой восстановления артериального давления при проведении фармакологических проб, КЭД - коэффициент эндотелиальной дисфункции.
Полученные данные позволяют сделать вывод о возможности эффективной коррекции эндотелиальной дисфункции и у людей.