СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ ИММУННЫХ СВЯЗЫВАЮЩИХ ВЕЩЕСТВ ПОВЕРХНОСТНЫХ АНТИГЕНОВ КЛЕТКИ

1. Способ идентификации иммунного связующего вещества, который специфически связывается с мишеневым антигеном на поверхности клетки, который предусматривает:
(а) наличие множества экспрессирующих иммунные связующие вещества клеток, функционально связанных с первой сортируемой меткой;
(b) наличие множества антиген-экспрессирующих клеток, функционально связанных со второй сортируемой меткой, где мишеневый антиген находится на поверхности экспрессирующей антиген клетки;
(с) взаимодействие антиген-экспрессирующих клеток с клетками, экспрессирующими иммунные связующие вещества; и
(d) отделение от множества клеток, экспрессирующих иммунные связующие вещества, одной или нескольких клеток, экспрессирующих иммунные связующие вещества, которые могут специфически связываться с антиген-экспрессирующими клетками, используя клеточный сортер, где присутствие первой и второй сортируемой метки в одном клеточном комплексе является индикатором связывания клетки, экспрессирующей иммунное связующее вещество, с антиген-экспрессирующей клеткой, тем самым идентифицируя иммунное связующее вещество, которое связывается с мишеневым антигеном.
2. Способ по п.1, дополнительно включающий клональное выделение клеток, экспрессирующих иммунные связующие вещества, полученные на стадии (d), за которым следует, в некоторых случаях, клональная экспансия клонально выделенных клеток.
3. Способ по п.2, дополнительно включающий получение последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей иммунное связующее вещество, из выделенных клеток, экспрессирующих иммунное связующее вещество.
4. Способ по п.3, где последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая иммунное связующее вещество, получена способом ПЦР.
5. Способ по п.4, где ПЦР представляет собой ПЦР одной клетки.
6. Способ по п.2, дополнительно включающий проведение клеточного анализа для функциональной характеристики иммунного связующего вещества выделенных клеток, экспрессирующих иммунное связующее вещество.
7. Способ по п.6, где клеточный анализ представляет собой CELISA.
8. Способ по п.1, где клеточный комплекс образуется между антигеном и В-клеточным рецептором.
9. Способ по любому из предшествующих пунктов, где иммунное связующее вещество представляет собой антитело.
10. Способ по п.9, где антитело выбрано из группы, состоящей из мышиных, кроличьих, куриных, верблюжьих, человеческих, гуманизированных и химерных антител.
11. Способ по п.9, где антитело выбрано из группы, состоящей из полноразмерного иммуноглобулина, Fab, Dab и Нанотела.
12. Способ по п.9, где антитело представляет собой scFv.
13. Способ по п.1, где мишеневый антиген экспрессируется с экзогенного гена.
14. Способ по п.1, где мишеневый антиген представляет собой созданный способами генной инженерии антиген.
15. Способ по любому из пп.1, 13 или 14, где мишеневый антиген представляет собой интегральный мембранный белок.
16. Способ по п.15, где интегральный мембранный белок представляет собой GPCR.
17. Способ по п.15, где интегральный мембранный белок выбран из группы, состоящей из CXCR2, CXCR1, CXCR3, CXCR4, CXCR6, CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR8, CFTR, CIC-1, CIC-2, CIC-4, CIC-5, CIC-7, CIC-Ka, CIC-Kb, бестрофинов, TMEM16A, рецептора GABA, рецептора глицина, АВС переносчиков, NAV1.1, NAV1.2, NAV1.3, NAV1.4, NAV1.5, NAV1.6, NAV1.7, NAV1.8, NAV1.9, рецептора сфингозин-1-фосфата (S1P1R) и канала NMDA.
18. Способ по п.15, где интегральный мембранный белок представляет собой ионный канал.
19. Способ по п.1, где первая или вторая сортируемая метка является флуоресцентной меткой.
20. Способ по п.19, где флуоресцентная метка выбрана из группы, состоящей из флуоресцентного белка, конъюгата антитело/фтор и флуоресцентной клеточной метки.
21. Способ по п.1, где клеточный сортер представляет собой клеточный сортер с возбуждением флуоресценции.
22. Способ по п.1, где антиген-экспрессирующие клетки представляют собой дрожжевые клетки, дрожжевые сферобласты или клетки млекопитающих.
23. Способ по п.22, где антиген-экспрессирующие клетки представляют собой клетки человека.
24. Способ по любому из пп.1 или 22, 23, где антиген-экспрессирующие клетки экспрессируют экзогенный антиген.
25. Способ по п.1, где антиген-экспрессирующие клетки трансфицируют экспрессионным вектором.
26. Способ по п.1, где клетки, экспрессирующие иммунные связующие вещества, представляют собой дрожжевые клетки или клетки млекопитающих.
27. Способ по п.1 или 26, где клетки, экспрессирующие иммунные связующие вещества, представляют собой В-клетки.
28. Способ по п.27, где В-клетки представляют собой кроличьи В-клетки.
29. Способ по п.27, где В-клетки выделяют из иммунизированного животного.
30. Способ по п.29, где животное иммунизируют ДНК-вакцинацией.
31. Способ по п.1, где клетки, экспрессирующие иммунные связующие вещества, содержат иммунное связующее вещество, экспрессирующееся с экспрессионного вектора.
32. Способ по п.27, где В-клетки окрашены меченными анти-IgG и анти-IgM антителами.
33. Способ по п.32, где отбирают В-клетки, которые на своей поверхности экспрессируют IgG, но не экспрессируют IgM.
34. Способ по п.32 или 33, где анти-IgG антитела мечены APC, а анти-IgM антитела мечены FITC.
35. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая иммунное связующее вещество, отобранное способом по п.1.
36. Способ получения иммунного связующего вещества, способного связывать мишеневый антиген, включающий введение кодирующей иммунное связующее вещество последовательности нуклеиновой кислоты по п.32 в экспрессионную среду так, чтобы происходил синтез кодируемого иммунного связующего вещества.
37. Иммунное связующее вещество, получаемое способом по п.36.
38. Способ по п.1, дополнительно предусматривающий стадию идентификации CDR указанного иммунного связывающего вещества и введение CDR в каркас акцепторного антитела.
39. Способ по п.38, где каркас акцепторного антитела содержит:
(i) каркас вариабельного домена тяжелой цепи, который по меньшей мере на 70% идентичен SEQ ID NO:1; и/или
(ii) каркас вариабельного домена легкой цепи, который по меньшей мере на 70% идентичен SEQ ID NO:2.
40. Способ по п.38, где каркас акцепторного антитела содержит:
(i) каркас вариабельного домена тяжелой цепи, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:6; и/или
(ii) каркас вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:9.
41. Способ по п.38, дополнительно содержащий стадию введения:
(а) серина (S) в положение 12 тяжелой цепи (нумерация по AHo);
(b) серина (S) или треонина (Т) в положении 103 тяжелой цепи (нумерация по AHo); и/или
(с) серина (S) или треонина (Т) в положении 144 тяжелой цепи (нумерация по AHo).
41. Иммунное связывающее вещество, полученное способом по любому из пп.38-41.
42. Способ идентификации В-клеточного клона, который специфически связывается с мишеневым антигеном на поверхности клетки, который предусматривает:
(а) иммунизирование животного ДНК, кодирующей поверхностный антиген клетки;
(b) выделение В-клеток из иммунизированного животного;
(c) мечение В-клеток первой сортируемой меткой;
(d) наличие множества антиген-экспрессирующих клеток, функционально связанных со второй сортируемой меткой, где мишеневый антиген представлен на поверхности экспрессирующей антиген клетки;
(e) взаимодействие антиген-экспрессирующих клеток с В-клетками и
(f) отделение от множества В-клеток одной или нескольких В-клеток, которые могут специфически связываться с антиген-экспрессирующими клетками, используя клеточный сортер, где присутствие первой и второй сортируемой метки в одном клеточном комплексе является индикатором связывания В-клетки с антиген-экспрессирующей клеткой, тем самым идентифицируя В-клеточный клон, который связывается с мишеневый антигеном.