Выявление фосфорилированного α-синуклеина в биопсийном материале слюнных желез при болезни Паркинсона

DOI: 10.24411/2071-5315-2018-12033

Выявление фосфорилированного а-синуклеина в биопсийном материале слюнных желез при болезни Паркинсона

В.Б. Соболев, Р.М. Худоерков, Р.Р. Богданов, И.А. Давыдов, С.Ю. Борисова, С.Н. Иллариошкин

Статья посвящена особенностям и ключевым техническим аспектам выявления фосфорилированного а-синуклеина в биоптатах слюнных желез у пациентов с болезнью Паркинсона. Проведено сравнение различных гистологических методов приготовления срезов перед иммуногистохимическим и иммунофлюоресцентным исследованиями. Обосновывается наиболее информативная методика выявления нервных волокон в биоптатах слюнных желез. Представлена верификация данных, получаемых при биопсии слюнных желез, с помощью результатов изучения гистологического материала черной субстанции пациента с болезнью Паркинсона, имеющего иммуноположительные тельца Леви. На основании полученного опыта выработан наиболее подходящий протокол работы с биопсийным материалом слюнных желез человека.

Ключевые слова: болезнь Паркинсона, слюнные железы, биопсия, иммуногистохимия, иммунофлюоресценция, протокол.

С молекулярной точки зрения болезнь Паркинсона (БП) относится к протеинопатиям. Это нейродегенеративное заболевание характеризуется наличием в цитоплазме гибнущих нейронов включений, основу которых составляет белок а-синуклеин (а-вуп) [1]. Исследование его специфических форм рассматривают как перспективное направление в разработке ранней диагностики БП, а сам а-вуп - как возможный биомаркер заболевания [2].

В группу синуклеинов помимо а-вуп входят р-, у-синук-леины и синоретин [3]. а-синуклеин впервые был идентифицирован в ткани мозга человека при ультраструктурном

Валерий Борисович Соболев - мл. науч. сотр. лаборатории функциональной морфохимии отдела исследований мозга ФГБНУ "Научный центр неврологии", Москва. Рудольф Михайлович Худоерков - докт. мед. наук, зав. лабораторией функциональной морфохимии отдела исследований мозга ФГБНУ "Научный центр неврологии", Москва.

Ринат Равильевич Богданов - докт. мед. наук, профессор кафедры неврологии ФУВ ГБУЗ МО "Московский областной научно-исследовательский институт им. М.Ф. Владимирского".

Илья Андреевич Давыдов - науч. сотр. отделения че-люстно-лицевой хирургии, ассистент кафедры челюст-но-лицевой хирургии и госпитальной хирургической стоматологии ФУВ ГБУЗ МО "Московский областной научно-исследовательский институт им. М.Ф. Владимирского".

Снежана Юрьевна Борисова - аспирант кафедры неврологии ФУВ ГБУЗ МО "Московский областной научно-исследовательский институт им. М.Ф. Владимирского". Сергей Николаевич Иллариошкин - член-корр. РАН, зам. директора по научной работе, рук. отдела исследований мозга ФГБНУ "Научный центр неврологии", Москва. Контактная информация: Соболев Валерий Борисович, sobolev@neurology.ru

исследовании амилоидных бляшек у пациентов с болезнью Альцгеймера в 1993 г. [4]. Было установлено, что основная изоформа включает 140 аминокислотных остатков, но есть и более короткие формы [5]. Однако только основная изо-форма проходит полную посттрансляционную модификацию, а более короткие ее формы не проходят и, вероятно, несут наибольшую опасность аномальной конформации и патологической агрегации [6].

Полная версия белка состоит из трех участков молекулы - ^концевой спирали, центрального участка и отрицательно заряженного С-участка [7]. ^концевой участок обеспечивает липофильные свойства, что способствует фиксации белка с мембранными структурами с образованием липопротеиновых комплексов. Центральный участок молекулы обеспечивает взаимодействие с другими молекулами а-вуп и формирование нерастворимых олигомерных и полимерных белковых образований [2]. Взаимодействие с этой областью потенциально может влиять на агрегацион-ные свойства белка [8].

а-синуклеин составляет до 1% от общего белка цитозо-ля, чем, предположительно, можно объяснить большое его значение во внутриклеточных процессах [9]. Однако функции а-вуп до сих пор не выяснены. Предполагается, что а-вуп участвует в стабилизации мембран, везикулярном транспорте и пресинаптической сигнализации [10-12]. Установлено, что в нормальных условиях а-вуп существует преимущественно в мономерном состоянии, но в условиях стресса он может формировать физиологически альтернативные конформации (мономерные и димерные). Патологические димерные и полимерные формы образуют фибриллы и превращающиеся в цитоплазматические включе-

Л

ния - тельца и нейриты Леви [12-14]. Последние рассматриваются как патоморфологические маркеры БП [2].

Нейротоксины, тяжелые металлы и другие факторы окружающей среды, как и мутации гена БЫСЛ, повышают склонность белка к полимеризации и агрегации [12]. Предполагаемые механизмы нейротоксичности измененного а-вуп и его агрегатов связаны с митохондриальной дисфункцией, протеолитическим стрессом, оксидативным повреждением и др. [11].

Тельца Леви как патоморфологический маркер БП наиболее характерны для черной субстанции среднего мозга, но также обнаруживаются в двигательных ядрах блуждающего нерва, базальных ядрах Мейнерта, голубом пятне и располагаются диффузно в других структурах на более поздних сроках болезни [14-16]. Однако агрегаты а-вуп могут быть маркерами и других нейродегенеративных заболеваний - деменции с тельцами Леви, мультисистемной атрофии, нейродегенераций с накоплением железа и др. При БП и деменции с тельцами Леви агрегаты выявляются не только в телах клеток, но и в отростках нейронов и глии [7, 14]. При мультисистемной атрофии агрегаты а-вуп видны как цитоплазматические включения в нейронах и клетках глии. При нейроаксональной дистрофии (нейродегене-рации с накоплением железа II типа) эти включения встречались в виде аксональных сфероидов [14].

При БП локализация агрегатов а-вуп не ограничивается структурами центральной нервной системы. Они обнаруживаются также в периферических тканях и органах, что может иметь большое значение для верификации патологического процесса в наиболее ранней (латентной) стадии, т.е. еще до дебюта классических (моторных) признаков заболевания и гибели большей части нейронов черной субстанции [10, 17]. Выявление ранних патологических синуклеинположительных включений, телец и нейритов Леви легло в основу известной гипотезы Браака, предполагающей периферическое начало нейродегенеративного процесса при БП [10]. В поддержку этой гипотезы получено большое количество данных о периферической локализации иммуногистохимических маркеров, что также подтверждается работами на основе метаанализа [2].

В аутопсийном материале обонятельных луковиц агрегаты а-вуп выявляли у 95% лиц с БП и лишь у 7% пожилых неврологически здоровых лиц [18].

На биопсийном материале слизистой оболочки толстой кишки была установлена 100% специфичность фосфори-лированного а-вуп как маркера БП, но чувствительность этого метода не превышала 70-80% [19]. По данным других исследователей, выявляемость а-вуп в слизистом и подслизистом слоях кишечника у больных БП составила 55%, в то время как в контроле проба была положительной у 1 из 10 индивидуумов [20]. Включения а-вуп обнаруживались в метасимпатической нервной системе кишечника

даже на ранних стадиях БП, при этом а-вуп также выявлялся в дорсальном моторном ядре блуждающего нерва [10].

При исследовании биоптатов малых слюнных желез в полости рта а-вуп находили в 60% случаев при БП и в 30% случаев в группе контроля [21]. Согласно другим оценкам, при исследовании слюнных желез специфичность и чувствительность иммуногистохимического метода выявления а-вуп при БП достигали 100% [2]. В нервах гортани при БП плотность положительных включений и волокон, содержащих а-вуп, была выше у пациентов с дисфагией [22]. В образцах биопсий кожи а-вуп регистрировали лишь в 20% случаев при специфичности примерно 80% [2].

Помимо этого а-вуп в мономерной и олигомерной форме представлен в эритроцитах, цереброспинальной жидкости, плазме крови, слюне, что плохо укладывается в концепцию исключительно внутриклеточной локализации белка [17, 23-26]. До настоящего времени исследование биологических жидкостей (ликвора и плазмы крови) на различные изоформы а-вуп не давало надежных результатов с точки зрения выявления нейродегенеративного процесса [2, 22, 25, 27]. На этом фоне поиск а-вуп в тканях, иннер-вируемых вегетативной нервной системой, выглядит более перспективным [28, 29].

В разных ганглиях и сплетениях периферической нервной системы отмечена разная частота выявления а-вуп. Так, при исследовании симпатических ганглиев агрегаты а-вуп находили в 80% случаев, при исследовании блуждающего нерва - в 73%, седалищного нерва - в 50%, желудочно-кишечного тракта - в 65%, дыхательных путей (гортани, первичных бронхов, легких) - в 12,5%, эндокринных органов - в 22%, мочеполовой системы - в 12,5% [2, 18]. По данным биопсии кожи при паркинсонизме (БП и мультисистемная атрофия) продемонстрирована широкая вариабельность частоты включений а-вуп - от низкой до 70% [30-32]. В биоптатах кожи спины (на уровне нижнего грудного и верхнего поясничного позвонков) а-вуп выявлялся в 16 (52%) из 31 пробы, в биоптатах кожи проксимального отдела ноги (внутренняя поверхность бедра) -в 6, в дистальном отделе - в 4, на указательном пальце ноги - в 5 [30].

Включения а-вуп локализуются в основном в немие-линизированных нервных волокнах [10, 33]. Показана преимущественная выявляемость а-вуп в нейронах и их отростках, положительно окрашиваемых на субстанцию Р (ЭР) и тирозингидроксилазу (ТН) [2, 30]. Также накопления а-вуп встречаются в волокнах, положительных на ва-зоактивный интестинальный пептид и кальцитонин-ген-связанный пептид. Предполагают, что выявление а-вуп в ЭР-положительных структурах может быть признаком ранних этапов развития заболевания [10, 30, 34].

Тельца Леви - конечная стадия агрегации патологической формы а-вуп в нейронах - имеют диаметр до 25 мкм и приобретают насыщенный цвет хромогена при иммуно-

Таблица 1. Результаты иммуногистохимического исследования и сравнение систем детекции и мечения

Проводка, системы детекции Условия

без обработки Трис-ЕДТА цитратный буфер муравьиная кислота

Результаты иммуногистохимического исследования в зависимости от проводки и условий обработки биопсийного материала

Хлороформ - - + ++

Изопропиловый спирт - + + +++

Сравнение систем детекции и мечения в зависимости от условий демаскировки антигена

EXTRA-3 - + + +++

TL-012 (MARH/MHRA) - + ++ +++

Иммунофлюоресценция - - + +++

Примечание. Была использована система вторичной детекции Т_-012 МШРН в виде балльной шкалы. Обозначения: "-" - положительное окрашивание не выявлено ни в одной партии, либо оно единично; "+" - положительное окрашивание встречается в меньшей части партий препаратов; "++" - положительное окрашивание встречается в половине и более партий препаратов; "+++" - положительное окрашивание встречается в большинстве партий препаратов.

гистохимическом окрашивании. Известно, что a-syn в составе телец Леви или в виде неоформленных агрегатов может выявляться и у небольшой части здоровых пожилых лиц; это было установлено на аутопсийном материале в нейронах центральной нервной системы у неврологически здоровых лиц старше 60 лет [16, 35]. Возможно, это маркер пресимптоматической стадии синуклеинопатии.

Таким образом, задача совершенствования методов выявления агрегатов a-syn в периферических тканях весьма актуальна как с теоретической, так и с практической точки зрения.

Целью исследования была отработка оптимальных условий иммуногистохимического выявления фосфорили-рованного a-syn в биопсийном материале слюнных желез человека (n = 7).

Материал и методы

Объектом исследования служили нервные волокна в биоптатах слюнных желез человека, которые фиксировали в 10% нейтральном формалине, промывали проточной водой, затем часть образцов дегидратировали для заливки в парафин, сравнивая два варианта проводки - через хлороформ и изопропанол [36]. Парафиновые срезы толщиной от 10 до 40 мкм готовили на санном микротоме Leica SR2000. Первую партию образцов делили на две части, одну часть проводили по вышеописанной методике, другую - через 15 и 30% растворы сахарозы, а затем пропитывали средой O.C.T. (Tissue-Tek), после этого образцы замораживали и раскладывали на срезы при помощи замораживающего микротома (Sakura Tissue-Tek). В работе использовали мо-ноклональные мышиные антитела к фосфорилированному a-syn (a-syn-p129) двух разных производителей - Wako и BioLegend. Для работы на световом микроскопе светлого поля использовали полимерную систему двойной детекции MultiVision TL-012-MARH (Thermo Fisher) и отдельный набор для пероксидазного метода детекции EXTRA 3 Kit (Sigma). Для флюоресцентной микроскопии в качестве вторичных антител брали меченные флюорохромами антитела фир-

мы Sigma - sab4600060 (CF555) и sab4600045 (CF488). Для раскрытия эпитопа антигена проводили демаскировку, используя разные способы обработки срезов: их нагревание в кислом и щелочном буферных растворах (цитратный буфер, pH 6,0, и буфер Трис-ЭДТА, pH 9,0-9,2) в условиях микроволнового излучения (600 Вт, до 10 мин); проводили также обработку в концентрированной муравьиной кислоте с разной длительностью воздействия.

С целью верификации результатов иммунной реакции для каждого типа обработки использовали срезы среднего мозга человека на уровне черной субстанции. Выявление телец и нейритов Леви служило критерием удачно проведенной реакции.

Результаты

При подготовке образцов к заливке в парафин наилучшие результаты были получены с применением изопропи-лового спирта (табл. 1). В работе с парафиновыми и крио-томными срезами мы отдали предпочтение первым, так как на криотомных срезах наблюдается высокий уровень неспецифического окрашивания в слюнной железе при использовании антител, меченных щелочной фосфатазой. При сравнении разных наборов детекции полимерный набор (с включением модификаций MARH и MHRA) продемонстрировал наибольшие чувствительность и воспроизводимость результатов (см. табл. 1).

Условия демаскировки антигена существенно влияли на связывание антител фирмы Wako, тогда как антитела фирмы BioLegend были менее чувствительны к способу предварительной обработки материала (табл. 2). Если демаскировку антигена не проводили, то антитела от обоих производителей демонстрировали слабую иммунореак-тивность. Демаскировка антигена в кислой среде была более эффективна, чем в щелочной, при этом антитела фирмы Wako давали лучшие результаты (см. табл. 2).

Результаты обработки срезов концентрированной муравьиной кислотой в значительной степени зависят от длительности обработки: так, при инкубации срезов на

Л

Таблица 2. Влияние условий обработки на выявление фосфорилированного а-вуп разных производителей

Производитель Вариант гистологической проводки Процедура восстановления антигена Система детекции Разведение первичных антител Оценка результата

BioLegend Изопропиловый спирт Цитратный буфер, рН 6,0 IF 1 : 500 +

EXTRA 3 1 : 500 -

MultiVision 1 : 500 +

Трис-ЭДТА, рН 9,2 IF 1 : 500 +

EXTRA 3 1 : 500 -

MultiVision 1 : 500 -

Муравьиная кислота, 10 мин IF 1 : 500 +++

EXTRA 3 1 : 500 +++

MultiVision 1 : 500 +++

IF 1:1000 +++

EXTRA 3 1:1000 +++

MultiVision 1:1000 +++

Хлороформ Цитратный буфер, рН 6,0 EXTRA 3 1 : 500 -

MultiVision 1 : 500 +

Трис-ЭДТА, рН 9,2 EXTRA 3 1 : 500 -

MultiVision 1 : 500 -

Муравьиная кислота, 10 мин EXTRA 3 1 : 500 +++

MultiVision 1 : 500 +++

Wako Изопропиловый спирт Цитратный буфер, рН 6,0 IF 1:1000 +

EXTRA 3 1:1000 -

MultiVision 1:1000 +

Трис-ЭДТА, рН 9,2 IF 1:1000 -

EXTRA 3 1:1000 -

MultiVision 1:1000 -

Муравьиная кислота, 10 мин IF 1:1000 +++

EXTRA 3 1:1000 +++

MultiVision 1:1000 +++

IF 1:1000 +++

EXTRA 3 1 :2000 ++

MultiVision 1 :2000 +++

Хлороформ Цитратный буфер, рН 6,0 EXTRA 3 1 :1000 -

MultiVision 1 :1000 +

Трис-ЭДТА, рН 9,2 EXTRA 3 1 :1000 -

MultiVision 1 :1000 -

Муравьиная кислота, 10 мин EXTRA 3 1 :1000 +++

MultiVision 1 :1000 +++

Примечание. Представлены результаты идентификации фосфорилированного по серину-129 a-syn. Обозначения: MultiVision - MultiVision Polymer Detection System TL-012-MARH (Thermo Fisher); EXTRA 3 - EXTRA 3 Kit (Sigma); "+" -окрашивание слабое, антиген локализуется преимущественно в пучках крупных сосудов; "++" - окрашивание среднее, антиген локализуется в пучках волокон, иннервирующих сосуды разного калибра; "+++" - окрашивание сильное, интенсивно выявляются пучки нервных волокон разного калибра.

протяжении 10 мин отмечались хорошие солюбилизирую-щие свойства реагента и увеличение выявляемости а-вуп, а инкубация срезов на протяжении 1-2 мин давала слабые

результаты, которые были сравнимы с таковыми при тепловой обработке срезов в кислом и щелочном буферных растворах.

ф

Рис. 1. Положительная реакция на а-вуп. а - положительный контроль с выявлением а-вуп в тельцах Леви (стрелка) в черной субстанции мозга у больного БП; б - положительные на фосфорилированный а-вуп крупные волокна (стрелки) при использовании вторичных антител с флюорохромом; в - окрашиваемые на фосфорилированный а-вуп включения в ТН-положительном нервном волокне (окрашенное волокно указано стрелками) в стенке сосуда. Размер линейки 25 мкм.

Рис. 2. Положительная реакция на а-вуп (стрелки) при его выявлении методом иммунофлюоресценции при предобработке: а - в цитратном буфере; б - в муравьиной кислоте; в - в буфере Трис-ЭДТА. Размер линейки 100 мкм.

Полученные нами данные о специфичности и чувствительности обнаружения в слюнных железах человека фос-форилированного a-syn в качестве биомаркера нейродеге-неративного процесса "паркинсонического" типа сходны с таковыми, описанными ранее в литературе (рис. 1, 2) [37].

При работе с системой детекции MultiVision TL-012-MARH с целью надежного выявления фосфорили-рованного a-syn в нервных волокнах и исключения неспецифического окрашивания, связанного с эндогенной активностью щелочной фосфатазы (служившей ферментной меткой для вторичных антител), лучше проводить совместное выявление на одном срезе фосфорилирован-ного a-syn с нейрональным ферментом (в нашем случае с TH). Их совместная локализация является свидетельством накопления a-syn в моноаминергических нервных волокнах (см. рис. 1).

Представленные данные в виде таблиц с балльной оценкой эффективности разных протоколов (+, ++, +++) имеют важное преимущество перед другими работами, посвященными различным протоколам обработки материала

при оценке биоптатов методами иммуногистохимии и им-мунофлюоресценции.

Методическая работа, выполненная нами для поиска оптимального иммуногистохимического протокола выявления a-syn-ассоциированного маркера БП, может найти применение в клинической практике, поскольку внедрение информативных биомаркеров БП чрезвычайно важно для своевременной диагностики заболевания и, в перспективе, проведения ранней нейропротекторной терапии [38-40]. Нами предложена значимая модификация иммуногистохи-мической методики, повышающая надежность локализации фосфорилированного a-syn в нервных волокнах слюнных желез, которая снижает неспецифическое окрашивание и позволяет выявлять на одном срезе фосфорилированный a-syn и нервные волокна определенных типов.

Развитие этих исследований может открыть новую страницу в превентивной неврологии.

Список литературы

1. Kiely AP, Asi YT, Kara E, Limousin P, Ling H, Lewis P, Proukakis C,

Quinn N, Lees AJ, Hardy J, Revesz T, Houlden H, Holton JL. Al-

pha-synucleinopathy associated with G51D SNCA mutation: a link between Parkinson's disease and multiple system atrophy? Acta Neuropathology 2013 May;125:753-69.

2. Malek N, Swallow D, Grosset KA, Anichtchik O, Spillantini M, Grosset DG. Alpha-synuclein in peripheral tissues and body fluids as a biomarker for Parkinson's disease - a systematic review. Acta Neu-rologica Scandinavica 2014 Aug;130:59-72.

3. Ninkina N, Peters OM, Connor-Robson N, Lytkina O, Sharfeddin E, Buchman VL. Contrasting effect of a-synuclein and y-synuclein on the phenotype of cysteine string protein a (CSPa) null mutant mice suggest distinct function of these proteins in neuronal synapses. Journal of Biological Chemistry 2012 Dec;287(53):44471-7.

4. Ueda K, Fukushima H, Masliah E, Xia Y Iwai A, Yoshimoto M, Otero DA, Kondo J, Ihara Y, Saitoh T. Molecular cloning of cDNA encoding an unrecognized component of amyloid in Alzheimer disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 1993 Dec;90(23):11282-6.

5. Beyer K, Ariza A. Alpha-synuclein posttranslational modification and alternative splicing as a trigger for neurodegeneration. Molecular Neurobiology 2013 Apr;47(2):509-24.

6. Levitan K, Chereau D, Cohen SI, Knowles TP, Dobson CM, Fink AL, Anderson JP, Goldstein JM, Millhauser GL. Conserved C-terminal charge exerts a profound influence on the aggregation rate of alpha-synuclein. Journal of Molecular Biology 2011 Aug;411(2):329-33.

7. Uversky VN. Neuropathology, biochemistry, and biophysics of alpha-synuclein aggregation. Journal of Neurochemistry 2007 Oct;103(1):17-37.

8. Bernstein SL, Liu D, Wyttenbach T, Bowers MT, Lee JC, Gray HB, Winkler JR. Alpha-synuclein: stable compact and extended monomeric structures and pH dependence of dimer formation. Journal of the American Society for Mass Spectrometry 2004 Oct;15(10):1435-43.

9. Iwai A, Masliah E, Yoshimoto M, Ge N, Flanagan L, de Silva HA, Kittel A, Saitoh T. The precursor protein of non-A beta component of Alzheimer's disease amyloid is a presynaptic protein of the central nervous system. Neuron 1995 Feb;14(2):467-75.

10. Braak H, de Vos RA, Bohl J, Del Tredici K. Gastric alpha-synuclein immunoreactive inclusions in Meissner's and Auerbach's plexuses in cases staged for Parkinson's disease-related brain pathology. Neuroscience Letters 2006 Mar;396(1):67-72.

11. Braak H, Del Tredici K. Neuropathological staging of brain pathology in sporadic Parkinson's disease: separating the wheat from the chaff. Journal of Parkinson's Disease 2017;7(Suppl 1):S71-S85.

12. Bennett MC. The role of alpha-synuclein in neurodegenerative diseases. Pharmacology & Therapeutics 2005 Mar;105(3):311-31.

13. Breydo L, Wu JW, Uversky VN. Alpha-synuclein misfolding and Parkinson's disease. Biochimica et Biophysica Acta 2012 Feb;1822(2):261-85.

14. Jellinger KA. Neuropathological spectrum of synucleinopathies. Movement Disorders 2003 Sep;18(Suppl 6):S2-12.

15. Jellinger KA, Korczyn AD. Are dementia with Lewy bodies and Parkinson's disease dementia the same disease? BMC Medicine 2018 Mar;16(1):34.

16. Forno LS. Neuropathology of Parkinson's disease. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology 1996 Mar;55(3):259-72.

17. Lewczuk P, Riederer P, O'Bryant SE, Verbeek MM, Dubois B, Visser PJ, Jellinger KA, Engelborghs S, Ramirez A, Parnetti L, Jack CR Jr, Teunissen CE, Hampel H, Lleo A, Jessen F, Glodzik L, de Leon MJ, Fagan AM, Molinuevo JL, Jansen WJ, Winblad B, Shaw LM, Andreasson U, Otto M, Mollenhauer B, Wiltfang J, Turner MR, Zerr I, Handels R, Thompson AG, Johansson G, Ermann N, Trojanowski JQ, Karaca I, Wagner H, Oeckl P, van Waalwijk van Doorn L, Bjerke M, Kapogiannis D, Kuiperij HB, Farotti L, Li Y Gordon BA, Epelbaum S, Vos SJB, Klijn CJM, Van Nostrand WE, Minguillon C, Schmitz M, Gallo C, Lopez Mato A, Thibaut F, Lista S, Alcolea D, Zetterberg H, Blennow K, Kornhuber J; Members of the WFSBP Task Force Working on this Topic: Peter Riederer, Carla Gallo, Dimitrios Kapogiannis, Andrea Lopez Mato, Florence Thiba-

ut. Cerebrospinal fluid and blood biomarkers for neurodegenerative dementias: an update of the Consensus of the Task Force on Biological Markers in Psychiatry of the World Federation of Societies of Biological Psychiatry. The World Journal of Biological Psychiatry 2018 Jun;19(4):244-328.

18. Caviness JN. Presymptomatic Parkinson's disease: the Arizona experience. Parkinsonism & Related Disorders 2012 Jan;18(Suppl 1):S203-6.

19. Beach TG, Adler CH, Sue LI, Vedders L, Lue L, White lii CL, Aki-yama H, Caviness JN, Shill HA, Sabbagh MN, Walker DG; Arizona Parkinson's Disease Consortium. Multi-organ distribution of phos-phorylated alpha-synuclein histopathology in subjects with Lewy body disorders. Acta Neuropathologica 2010 Jun;119(6):689-702.

20. Lebouvier T, Neunlist M, Bruley des Varannes S, Coron E, Drouard A, N'Guyen JM, Chaumette T, Tasselli M, Paillusson S, Flamand M, Galmiche JP, Damier P, Derkinderen P. Colonic biopsies to assess the neuropathology of Parkinson's disease and its relationship with symptoms. PLoS One 2010 Sep;5(9):e12728.

21. Pouclet H, Lebouvier T, Coron E, Des Varannes SB, Neunlist M, Derkinderen P. A comparison between colonic submucosa and mucosa to detect Lewy pathology in Parkinson's disease. Neuro-gastroenterology and Motility 2012 Apr;24(4):e202-5.

22. Cersosimo MG, Perandones C, Micheli FE, Raina GB, Beron AM, Nasswetter G, Radrizzani M, Benarroch EE. Alpha-synuclein immu-noreactivity in minor salivary gland biopsies of Parkinson's disease patients. Movement Disorders 2011 Jan;26(1):188-90.

23. Сальков В.Н., Худоерков Р.М., Воронков Д.Н., Иванов М.В. Морфометрические изменения нейроглии в черном веществе мозга человека при старении и болезни Паркинсона. Клиническая и экспериментальная морфология 2017;4:26-30.

24. Mu L, Sobotka S, Chen J, Su H, Sanders I, Nyirenda T, Adler CH, Shill HA, Caviness JN, Samanta JE, Sue LI, Beach TG; Arizona Parkinson's Disease Consortium. Parkinson disease affects peripheral sensory nerves in the pharynx. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology 2013 Jul;72(7):614-23.

25. Lee HJ, Patel S, Lee SJ. Intravesicular localization and exocytosis of alpha-synuclein and its aggregates. The Journal of Neuroscience 2005 Jun;25(25):6016-24.

26. Lee PH, Lee G, Park HJ, Bang OY Joo IS, Huh K. The plasma alpha-synuclein levels in patients with Parkinson's disease and multiple system atrophy. Journal of Neural Transmission 2006 0ct;113(10):1435-9.

27. Nakai M, Fujita M, Waragai M, Sugama S, Wei J, Akatsu H, Ohta-ka-Maruyama C, Okado H, Hashimoto M. Expression of alpha-syn-uclein, a presynaptic protein implicated in Parkinson's disease, in erythropoietic lineage. Biochemical and Biophysical Research Communications 2007 Jun;358(1):104-10.

28. Mata IF, Shi M, Agarwal P, Chung KA, Edwards KL, Factor SA, Ga-lasko DR, Ginghina C, Griffith A, Higgins DS, Kay DM, Kim H, Lev-erenz JB, Quinn JF, Roberts JW, Samii A, Snapinn KW, Tsuang DW, Yearout D, Zhang J, Payami H, Zabetian CP. SNCA variant associated with Parkinson disease and plasma alpha-synuclein level. Archives of Neurology 2010 Nov;67(11):1350-6.

29. Spillantini MG, Crowther RA, Jakes R, Hasegawa M, Goedert M. Alpha-synuclein in filamentous inclusions of Lewy bodies from Parkinson's disease and dementia with Lewy bodies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 1998 May;95(11):6469-73.

30. Goedert M. Neurodegeneration. Alzheimer's and Parkinson's diseases: the prion concept in relation to assembled Ap, tau, and a-synuclein. Science 2015 Aug;349(6248):1255555.

31. Doppler K, Ebert S, Ufeyler N, Trenkwalder C, Ebentheuer J, Volkmann J, Sommer C. Cutaneous neuropathy in Parkinson's disease: a window into brain pathology. Acta Neuropathologica 2014 Jul;128(1):99-109.

32. Michell AW, Luheshi LM, Barker RA. Skin and platelet alpha-synuc-lein as peripheral biomarkers of Parkinson's disease. Neuroscience Letters. Supplement 2005 Jun;381(3):294-8.

33. Zange L, Noack C, Hahn K, Stenzel W, Lipp A. Phosphorylated a-synuclein in skin nerve fibres differentiates Parkinson's disease from multiple system atrophy. Brain 2015 Aug;138(Pt 8):2310-21.

34. Witt M, Bormann K, Gudziol V, Pehlke K, Barth K, Minovi A, Hähner A, Reichmann H, Hummel T. Biopsies of olfactory epithelium in patients with Parkinson's disease. Movement Disorders 2009 Apr;24(6):906-14.

35. Ubeda-Bañon I, Saiz-Sanchez D, de la Rosa-Prieto C, Martinez-Marcos A. a-Synuclein in the olfactory system in Parkinson's disease: role of neural connections on spreading pathology. Brain Structure & Function 2014 Sep;219(5):1513-26.

36. Mori F, Tanji K, Yoshimoto M, Takahashi H, Wakabayashi K. Demonstration of alpha-synuclein immunoreactivity in neuronal and glial cytoplasm in normal human brain tissue using protein-ase K and formic acid pretreatment. Experimental Neurology 2002 Jul;176(1):98-104.

37. Викторов И.В., Прошин С.С. Применение изопропилового спирта в гистологических методах: обезвоживание и заливка ткани в парафин, обработка парафиновых срезов. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины 2003;7:119-20.

38. Del Tredici K, Hawkes CH, Ghebremedhin E, Braak H. Lewy pathology in the submandibular gland of individuals with incidental Lewy body disease and sporadic Parkinson's disease. Acta Neuropathology 2010 Jun;119(6):703-13.

39. Федотова Е.Ю., Чечеткин А.О., Абрамычева Н.Ю., Чигалей-чик Л.А., Федин П.А., Полькина Н.В., Кравченко М.А., Но-дель М.Р., Иллариошкин С.Н. Идентификация лиц в латентной стадии болезни Паркинсона (исследование ПАРКИНЛАР): первые результаты и оптимизация алгоритма. Журнал неврологии и психиатрии им. C.C. Корсакова 2015;6:4-11.

40. Иллариошкин С.Н., Чечеткин А.О., Федотова Е.Ю. Транскраниальная сонография при экстрапирамидных заболеваниях. М.: ООО "АТМО"; 2014. 176 с. >

Identification of Phosphorylated a-synuclein in Salivary Gland Biopsy Samples in Parkinson's Disease

V.B. Sobolev, RKhudoerkov, R.R. Bogdanov, I.A. Davydov, S.Y. Borisova, and S.N. Illarioshkin

The article is devoted to key technical aspects of identification of phosphorylated a-synuclein in the biopsy samples of salivary glands in patients with Parkinson's disease. Comparative analysis of different histological methods of preparation of the samples before immunohistochemical and immunofluorescent studies is presented. The scientific background is provided for the most informative method of revealing nervous fibers in the salivary biopsies. The results of the biopsy of salivary glands were verified using the data from the s. nigra histology studies obtained from the subject with Parkinson's disease and immunopositive Lewy bodies. Based on this experience, optimal protocol for the processing of human salivary glands biopsy samples has been designed.

Key words: Parkinson's disease, salivary glands, biopsy, immunohistochemistry, immunofluorescence, protocol.

НОВЫЕ МОНОГРАФИИ ИЗДАТЕЛЬСТВА "АТМОСФЕРА*

ЛЕГОЧНАЯ РЕАБИЛИТАЦИЯ

Болезни плевры. Авторы А.Г. Чучалин, Я.Н. Шойхет, М.М. Абакумов

В монографии фундаментальной серии Российского респираторного общества представлены актуальные аспекты диагностики и лечения поражений плевры, в частности плевральных выпотов различной этиологии. Наряду с данными физиологии, патофизиологии, патоморфоло-гии и клиническими проявлениями описаны рентгенологические и биохимические показатели, представлена дифференциальная диагностика транссудативных и экссудативных выпотов при разных заболеваниях, в том числе хилотораксе, гемотораксе. Изложены диагностические и терапевтические методики, особенности систем дренирования плевральной полости. Для терапевтов, пульмонологов, фтизиатров, хирургов, онкологов, реаниматологов.

Легочная реабилитация / Под ред. А.С. Белевского, И.И. Мещеряковой

В монографии фундаментальной серии Российского респираторного общества представлены основные понятия и методы реабилитации пациентов с заболеваниями органов дыхания. Особого внимания заслуживают главы, посвященные психосоциальной реабилитации, программам легочной реабилитации и подходам в зависимости от патологии, а также обучению больных методам физических тренировок.

Для пульмонологов, терапевтов, врачей общей практики, специалистов по физической реабилитации и адаптивной физкультуре.

Эти и другие книги издательства "Атмосфера" вы можете купить на сайте http://atm-press.ru

или по телефону: (495) 730-63-51