СПОСОБ БИОТЕСТИРОВАНИЯ АКТИВНОСТИ ПРЕПАРАТОВ, ПОЛУЧЕННЫХ ИЗ ДОЖДЕВЫХ ЧЕРВЕЙ
METHOD FOR BIOTESTING ACTIVITY OF PREPARATIONS DERIVED FROM EARTHWORMS

Изобретение относится к области этологии и медицины, в частности включает оценку эффективности полученных на основе дождевых червей фармацевтических, косметических препаратов и биологически активных добавок (БАД) - в процессе их производства, хранения с использованием поведенческой реакции олигохет.
На сегодняшний день в мире повышенный интерес вызывают фармацевтические препараты из дождевых червей. Эти препараты эффективны при лечении инфекций, геронтологических, онкологических, функциональных и многих других заболеваний. Своим лечебным действием они обязаны уникальной иммунной системе дождевого червя, сформировавшейся в ответ на экстремальные условия среды обитания. Иммунная система дождевого червя представлена антибиотической, ферментативной системой, комплексом специфических иммунных клеток и комплементарных белков, локализованных в основном в целомической жидкости. В связи с тем, что для производства препаратов используется живое сырье (дождевые черви), то количество и качество биологически активных агентов, входящих в его состав, сильно варьирует, завися от исходного физиологического состояния дождевых червей, условий производства, хранения и использования таких препаратов. Поэтому требуются различные способы экспрессной оценки эффективности препаратов на основе дождевых червей в сфере вермифармацевтики. Это важно еще и для выявления возможных подделок лекарственных средств и использования просроченных медикаментов как в сфере фармацевтики, так и косметики.
Известны методы биотестирования токсичности вод, основанные на регистрации изменения поведенческих и физиологических особенностей таких беспозвоночных, как инфузории, коловратки, дафнии, двустворчатые моллюски. В случае инфузорий критерием токсичности, химической или биологической активности агента служит изменение прироста численности клеток (темпа деления), уровень спонтанной двигательной активности; коловраток - выживаемость, нарушение фототаксиса; дафний - выживаемость, плодовитость, качество потомства; двустворчатых моллюсков - частота смыкания и размыкания створок [Крайнюкова А.Н. Методы биотестирования вод. / А.Н.Крайнюкова Л.П.Брагинский, Н.М.Болдырева, А.А.Буяновская, И.П.Ульянова. - Черноголовка, 1988. - С.37-60].
Известен способ биоиндикации среды [Патент РФ №2213350, G01N 33/24, G01N 33/18, 2003 г.], который включает выбор группы индикаторов, формирование эталонной среды с разбивкой ее по классам качества, определение видов индикаторов, способных существовать в диапазоне классов качества эталонной среды, извлечение из среды всех возможных видов из группы индикаторов. По каждому классу качества среды устанавливают виды индикаторов, способные существовать в диапазоне классов качества эталонной среды, и определяют класс качества среды по максимальному значению суммарной классовой значимости индикаторов. Осуществляют оценку возможности самоочищения среды путем дополнительных извлечений индикаторов из среды и определений суммарной классовой значимости индикаторов до момента расположения максимального значения суммарной классовой значимости и наибольшего после него значения в соседних областях классности качества среды. О возможности самоочищения судят при расположении наибольшего значения относительно максимального в области понижения классности среды. В качестве группы индикаторов используют группы почвенных беспозвоночных - нематод, дождевых червей, клещей, пауков, муравьев, жуков, моллюсков, многоножек, мокриц, чешуекрылых, двукрылых, прямокрылых.
Ближайшим аналогом является способ биотестирования загрязнителей с помощью олигохет [Потапов Д.С. Биотестирование загрязнителей с помощью олигохет / Д.С.Потапов, Д.И.Стом, Е.В.Антонова // Бюллетень ВСНЦ СОРАМН, Иркутск, 1998. - №2 (8). - С.156-159]. Авторы использовали разные виды олигохет: Eisenia fetida (красный калифорнийский гибрид), Ehchytraeus albidus (горшечный червь), Tubifex tubifex (водная олигохета), - для определения вермитоксичности твердых и жидких веществ. Для этого червей помещали в 30 мл испытуемого раствора. Основным критерием оценки служила выживаемость олигохет через 24 часа. При помещении червей в максимально недействующие концентрации соединений: их тело непрерывно сокращалось, и они пытались выползти из раствора.
Недостатком известного способа является его низкая чувствительность и длительность периода получения ответа, так как олигохеты погибают при длительном воздействии высоких концентраций.
Существенное отличие нашего способа заключается в том, что в нашем случае в качестве токсиканта олигохет выступает препарат из дождевых червей - фармпрепарат, используемый для лечения широкого спектра заболеваний человека, домашних животных. Но в отношении олигохет препарат приводит к конвульсивным сокращениям их тел и обездвиживанию (минимальная нечувствительная доза - 1 мг/мл воды). Специфика нашего способа в том, что активный препарат, приготовленный по традиционной методике из дождевых червей, приводит к нарушению сборки в клубок, обездвиживанию в отличие от данных, взятых из указанных выше источников, где в токсиканте или обедненной кислородом среде происходит сборка олигохет в клубок. Сборка в клубок наблюдалась лишь в контроле и в растворе инактивированного нагреванием препарата, который заведомо обладает более низкой активностью, чем стандартный препарат, подобная реакция наблюдается также при наличии нефти в водной среде и отсутствии кислорода, цитируя источники, приведенные выше. Вывод: поведенческая реакция в присутствии специфического токсиканта - нашего препарата - отличается от уже известных.
Задачей предлагаемого изобретения является повышение чувствительности и экспрессности способа биотестирования активности препаратов из дождевых червей с использованием поведенческой реакции олигохет.
Поставленная задача достигается тем, что в способе биотестирования активности препаратов из дождевых червей с помощью олигохет, включающий смешивание препарата с водой, помещение олигохет в полученный раствор, выдерживание в течение 30 минут с последующим определением активности препарата по поведенческой реакции олигохет, об активности препарата судят по отсутствию сползания олигохет в клубок в присутствии активного препарата.
Отличие способа заключается в том, что предлагается для диагностики активности препарата на основе дождевых червей использовать конкретную поведенческую реакцию сползания олигохет, а не их выживаемость. Поведенческая реакция олигохет всегда более чувствительна, чем ответ по летальности.
Способ осуществляется следующим образом.
Берут навеску препарата (мелкодисперсного сухого порошка из дождевого червя) и смешивают в магнитной мешалке с отстоянной водой в массовых единицах 100:1 в течение 1 часа. Затем суспензию освобождают от крупных частичек препарата центрифугированием в течение 5 минут при 4000 об/мин. Температура суспензии 10-15°С. В чашку Петри приливают 10 мл суспензии, туда же помещают несколько десятков мелких пресноводных олигохет. Обязателен контроль. В контроле используется отстоянная вода без смешивания с препаратом. Рекомендуем использовать олигохет желательно мелких размеров, например олигохет Mesenchytraeus bungei, обитающих в водоемах у самого уреза воды, и Tubifex tubifex.
Для получения инактивированного вермипрепарата сухой порошок из дождевых червей прогревали в течение 30 минут при температуре 150°С.
Спустя 30 минут, в течение которых проводим мониторинг поведенческих реакциями олигохет, фиксируем изменения.
Если большая часть олигохет сползлась вместе и переплелась друг с другом, образуя характерный комочек, как и в контроле - вермипрепарат обладает пониженной активностью или не обладает ей вообще.
На фотографиях в качестве примеров показана поведенческая реакция мелких олигохет - в контроле при использовании отстоянной воды без смешивания с вермипрепаратом, под действием инактивированного вермипрепарата и под действием вермипрепарата.
Если движения тела олигохет в сравнении с контролем значительно не изменилась и олигохеты взаимопереплелись, образуя живой комочек, как и в контрольных условиях, - это значит, что вермипрепарат обладает пониженной активностью и не влияет на поведенческие реакции олигохет, как показано на фотографиях:
- сползание олигохеты Mesenchytraeus bungei в клубок (контроль) - Фиг.1,
- сползание олигохеты Mesenchytraeus bungei в клубок под действием инактивированного вермипрепарата (навеска 150 мг/15 мл) - Фиг 1а,
- сползание олигохеты Tubifex tubifex (контроль) - Фиг.2,
- сползание олигохеты Tubifex tubifex под действием инактивированного вермипрепарата (навеска 150 мг/15 мл) - Фиг.2а.
Если олигохеты престают двигаться, не собираются в комочек, тела олигохет конвульсивно сокращаются, в сравнении с контролем, - это значит, что вермипрепарат активен - это показано на фотографиях:
- поведение олигохеты Mesenchytraeus bungei под действием вермипрепарата (навеска 150 мг/15 мл) - Фиг.3;
- поведение олигохеты Tubifex tubifex под действием вермипрепарата (навеска 150 мг/15 мл) - Фиг.4.
Предлагаемая методика более экспрессная - 30 минут, и более чувствительная. Она более щадящая, так как не требует гибели тест-объектов и за основу взята не смертность-выживаемость тест-объектов, а всего лишь изменение их конкретной поведенческой реакции.