Способ оценки активационных возможностей гемоконтактных препаратов (в том числе сорбентов) по скорости адгезии клеток крови
METHOD OF ASSESSING THE ACTIVATION CAPABILITIES OF BLOOD-BORNUS PREPARATIONS (INCLUDING SORBENTS) BASED ON THE RATE OF BLOOD CELL ADHESION

Изобретение относится к области биологии и медицины, в частности к исследованию клеточных популяций крови, и может быть использовано для определения способности у любых чужеродных материалов, контактирующих с кровью (в том числе сорбентов), активировать клеточные элементы крови при их контактном взаимодействии по адгезивным свойствам прилипающих клеток (тромбоциты, лейкоциты) для оценки возможной эффективности лечения больных методом малообъемной гемоперфузии (МОГ).
МОГ - метод лечебного пособия, при котором реализуются активационные (не сорбционные) механизмы лечебного действия гемоконтактной (сорбционной) процедуры. Контактное взаимодействие крови с гранулами сорбентов приводит к активации всех ее гуморальных и клеточных систем, результатом которой является изменение общего эффекторно-регуляторного потенциала крови, приводящее к изменению воздействия на патологический процесс [Кузнецов С.И. Эффекторные механизмы гемоперфузии // Эфферентная терапия. - 1998.- Т. 4, №4. - С. 28-31.]. Включение метода МОГ в схемы лечения больных с тяжелыми видами патологии (критическая ишемия нижних конечностей, термические поражения нижних конечностей, воспалительные и гнойно-некротические заболевания пальцев и кисти) продемонстрировало выраженный лечебный эффект [Нохрин С.П. Малообъемная гемоперфузия в лечении критической ишемии нижних конечностей у больных с дистальным типом поражения артерий // Хирургия. - 2006. - Т. 7. - С. 569-578.; Кузнецов С.И., Буркова Н.В., Эйсмонт Ю.А. и др. Реализация принципа твердофазной контактной гемомодуляции при лечении ожоговых ран // Клиническая патофизиология. - 2003. - №2. - С. 72-76.; Рутенбург Д.Г., Буркова Н.В., Кузнецов С.И. и др. Применение регионарной малообъемной гемоперфузии, светотерапии и лазерного излучения в комплексном лечении больных с гнойной патологией пальцев и кисти // Эфферентная терапия. - 2010. - Т. 16, №3. - С. 18-21.].
В качестве гемоконтактного препарата, который использовали при процедуре МОГ в выше указанных работах, был выбран углеродный гемосорбент СКТ-6А ВЧ, разрешенный для проведения лечебных мероприятий у больных. Этот сорбент применяли и при разработки данного способа оценки активационных свойств гемоконтактных препаратов по адгезии к их гранулам прилипающих клеток крови, то есть он был рассмотрен как некий активационный «стандарт» (эталон).
Процесс адгезии является показателем и одним из этапов активации клеток крови. Эволюция, очевидно, не допускала возможности контакта внутренней среды организма с такими чужеродными макросубстратами как пластик, уголь, стекло, кремнеземы и другими продуктами развития человеческой цивилизации в сфере медицины. Однако, она на всякий случай обеспечила универсальность реакции клеток (в частности клеток крови) на субстраты любой природы, снабдив их разнообразным набором адгезивных структур. В природе молекулы адгезии представлены в основном четырьмя классами: суперсемейство интегринов, семейство селектинов, суперсемейство иммуноглобулинов и семейство кадгеринов. Адгезивные структуры обеспечивают все разнообразие межклеточных, клеточно-матриксных и клеточно-субстрактных (чужеродные поверхности) взаимодействий. На мембране клеток крови адгезины, которые обеспечивают их фиксацию к субстрату, представлены в преобладающем количестве молекулами суперсемейства интегринов (для лейкоцитов - FLA-1 (CD11a/CD18), Мас-1 (CD11b/CD18), p150,95 (CD11c/CD18); для тромбоцитов - ГП IIb-IIIa (аIIbβ3-интегрин, CD41/CD61) и еще ряд β-интегринов, обеспечивающих адгезию к белковым структурам матрикса: к витронектину (avβ3-интегрин, CD51/CD61), к коллагену (а2β1-интегрин, CD49b/CD29), к ламинину (а6β1-интегрин, CD49f/CD29) и другие. По данным ряда авторов именно эти структуры обеспечивают главным образом адгезию клеток крови к чужеродным поверхностям, так как использование в эксперименте моноклональных антител против CD11b или CD18 полностью блокировало прилипание и распластывание нейтрофильных лейкоцитов на пластике [Schleiffenbaum В., Moser R., Patarroyo М., Fehr J. The cell surface glycoprotein Mac-1 (CD11b/CD18) mediates neutrophil adhesion and modulates degranulation independently of its quantitative cell surface expression // J. Immunol. - 1985. - V. 142, N10. - p. 3527-35-45.; Jaconi M.E., Theler J.M., Schlegel W., Lew P.D. Cytolic free Ca2+ signals in single adherent human neutrophils: generation and functional role // Eur. J. Pediatr. - 1993. - V. 152 Suppl 1. - p. 26-32.]. С другой стороны, существует предположение, что адгезия и активация клеток на чужеродной поверхности опосредуется эндогенными белками (фибриноген, фибронектин и др.), которые в процессе контакта крови с искусственным субстратом сорбируются на его поверхности, обеспечивая дальнейшее специфическое взаимодействие с ними адгезинов клеточной поверхности [Мазуров А.В. Физиология и патология тромбоцитов.- М.: «Литтерра», 2011. - 480 с.]. Адгезия клеток крови к искусственным поверхностям зависит от ряда их характеристик: от гидрофильности (гидрофобные структуры обладают менее выраженной адгезивностью, чем гидрофильные) [Tomczok J., Sliva-Tomczok W., Klein C.L. et al. Biomaterial-induced alterations of human neutrophils under fluid shear stress: Scanning electron microscopical study in vitro // Biomaterials. - 1996. - V. 17, N14. - p. 1359-1367.]; от топографии поверхности (грубые поверхности обладают более выраженной адгезивностью, но и повреждающей способностью, чем гладкие) [Chang S., Popowich Y., Greco R.C., Haimovich В. Neutrophil survival on biomaterials is determined by surface topography // J. Vase. Surg. - 2003. - V. 37, N5. - p. 1082-1090.]. Адгезивные молекулы (в частности, Р2-интегрины) выполняют две основные функции: обеспечивают прилипание клеток к различным субстратам, т.е. обеспечивают непосредственно адгезию; и выполняют сигнальную функцию, т.е. передают сигнал внутрь клетки, включая активационные процессы (например, для гранулоцитов обеспечивают «дыхательный взрыв» и секреторные проявления), являясь в прямом смысле молекулами двойного назначения [Галкин А.А., Демидова B.C. Роль адгезии в активации нейтрофилов и цитотоксическом взаимодействии нейтрофилов с эндотелием // Успехи современной биологии. - 2011. - Т. 131, №1. - С. 62-78.]. Таким образом, адгезивные структуры имеют самое непосредственное отношение к активации клеток. Так как адгезивные процессы обладают способностью транедуцировать активационные сигналы внутрь клетки, то совершенно очевидно, что активация клеток будет усиливаться при возрастании эффективности действия адгезивных структур. Fehr J. и соавт. [Fehr J., Moser R., Leppert D., Groscurth P. Antiadhesive properties of biological surface are protective against stimulated granulocytes // J. Clin. Invest. - 1985. - V. 76. - p. 535-542.] вообще считают, что для нейтрофильных лейкоцитов адгезия клеток к субстрату, респираторный взрыв и дегрануляция азурофильных гранул представляют собой единую функциональную триаду, объединенную общими активационными механизмами. Таким образом, по развитию процесса адгезии можно судить об активации клеток крови, подвергшихся контакту с чужеродными поверхностями, и, следовательно, оценивать активационные возможности этих поверхностей.
В качестве аналогов можно рассмотреть ряд работ по изучению адгезии клеток крови. В работе Царевой М.И. и соавт. «Способ определения адгезивных свойств лейкоцитов крови» [Царева М.И., Ганнушкина И.В., Жирлова И.Г., Ларина И.В. Способ определения адгезивных свойств лейкоцитов. Патент РФ №2246728. - 2005.] оценивали степень адгезии лейкоцитов крови к пластику лунок микропланшета при их инкубации в нативном состоянии и при добавлении в реакцию аутосыворотки. Функциональные свойства клеток оценивали по индексу спонтанной адгезии, а эффект усиления или ослабления адгезии после введения в реакцию аутосыворотки по расчетному коэффициенту. По мнению авторов способ дает возможность получить объективные данные об адгезивных (функциональных) свойствах лейкоцитов крови, что позволит более эффективно проводить исследование и лечение пациентов с заболеваниями воспалительного, аутоиммунного и дегенеративного генезов.
В другой работе «Способ измерения адгезии тромбоцитов» [Михайлова М.А., Иванов В.И., Казеннова Н.И. Способ измерения адгезии тромбоцитов. Патент РФ №2143920. - 2000.] предложен простой, но требующий определенной аппаратуры, вариант оценки адгезии тромбоцитов к коллагену (естественный субстрат) в образцах цельной крови по регистрации амплитуды изменения модуля комплексного сопротивления пробы крови под влиянием активатора с помощью импедансного агрегометра. Способ позволяет просто и эффективно (при наличие соответствующего приборного обеспечения) контролировать лечение заболеваний, связанных с нарушениями в системе гемостаза.
Еще одним из вариантов для оценки адгезивной активности тромбоцитов можно использовать метод пропускания крови или обогащенной тромбоцитами плазмы через специальные колонки, заполненные стеклянными шариками определенного диаметра (D=1-2 мм) [Yardumian D.A., Mackie I.J., Machin S.J. Laboratory investigation of platelet function: a review of methodology // J. Clin. Pathol. - 1986. - V. 39. - р. 702-712]. Результат оценивают по подсчету числа тромбоцитов до и после прохождения крови через колонку. Авторы считают, что данный метод достаточно грубый, обладает значительной вариабельностью, зависит от множества гуморальных факторов, содержащихся в плазме крови и, что самое главное, не позволяет достоверно судить о дефектах тромбоцитов. Поэтому он не получил достаточно широкого распространения, хотя является наиболее простым по исполнению.
Таким образом, методов исследования адгезии клеток крови достаточно много. Хотелось бы обратить внимание на тот факт, что все они направлены на изучение свойств самих клеток, их функциональной активности, экспрессии на их плазмолемме белковых структур, изменения развития метаболических процессов, активации внутренних каскадов и т.д.
Наиболее близкой к данному исследованию работой-прототипом является «Способ оценки индивидуальной чувствительности больных к гемоконтактным препаратам для гемосорбционных процедур» [патент РФ №2122734 - 1998. авт. Кузнецов С.И., Янковский О.Ю., Рынцин О.В. и др.]. Для получения результата в работе-прототипе проводили контактное взаимодействие венозной гепаринизированной крови больного с гемоконтактными препаратами (сорбентами) различной химической структуры в течение 60 мин. Реакцию клеток крови (в основном гранулоцитов, которые имеют специализированные системы генерации активных форм кислорода (АФК)) на контактное взаимодействие оценивали индексом люминол-зависимой хемилюминесценции (ХЛ), который представляет собой отношение светосуммы ХЛ к количеству гранулоцитов в пробе, умноженное на 1000. Описанный способ позволяет судить об индивидуальной реакции больных на исследуемые сорбенты. Он регистрирует эффективность активации клеток крови на каждом из сорбентов, т.к. индукция генерации АФК гранулоцитами представляет собой стереотипный ответ этих клеток на любое раздражение и является одним из признаков активации клеток.
К недостаткам данного способа оценки активации клеток крови на контактное взаимодействие можно отнести следующее:
- избирательность оценки активации только тех клеток крови, которые несут специализированные системы генерации АФК (гранулоциты, в основном нейтрофилы как самая многочисленная лейкоцитарная субпопуляция);
- отсутствие возможности регистрации активности огромной популяции клеток крови - тромбоцитов, как клеток, несущих значительные запасы готовых к применению биоактивных молекул, так и способных запустить их синтез de novo при активации клеток;
- необходимость наличия помимо гематологического анализатора еще и специализированного оборудования для регистрации хемилюминесценции и соответствующих реагентов к нему, что значительно удорожает процесс исследования.
Предлагаемое изобретение решает задачу создания способа оценки активационных возможностей гемоконтактных препаратов (в том числе сорбентов) по скорости адгезии прилипающих клеток крови, позволяющего использовать прилипающие клетки крови как инструмент (оценочный индикатор) для регистрации активационных возможностей гемоконтактных препаратов и любых других чужеродных материалов, контактирующих с кровью.
Получаемый при использовании заявленного способа технический результат состоит в повышении его информативности за счет получения возможности более полно оценивать все клеточные элементы крови, экспрессирующие адгезивные структуры. Кроме того осуществление заявленного способа происходит без использования дополнительной дорогостоящей аппаратуры для достижения конечного результата -получения информации об активационных способностях гемоконтактных препаратов.
Указанный технический результат при реализации изобретения достигается тем, что в способе оценки активационных возможностей гемоконтактных препаратов (в том числе сорбентов) по скорости адгезии клеток крови, при котором осуществляют контакт гепаринизированной донорской крови с гемоконтактным препаратом in vitro и инкубируют ее в динамическом режиме, в процессе инкубирования через установленные интервалы времени берут пробы крови, регистрируют гематограммы в этих же временных точках, определяют количество фиксированных к субстрату клеток по их числу, оставшихся в жидкой фазе крови, и рассчитывают скорость адгезии клеток за каждый временной интервал, по формуле:
V=(A-B)/t,
где:
V - скорость адгезии;
А - количество клеток в единице объема крови в предыдущей пробе;
В - количество клеток в единице объема крови в последующей пробе;
t - время между точками проведения анализа,
по полученным результатам оценивают активационные свойства исследуемых препаратов.
Способ осуществляется следующим образом.
У донора из локтевой вены забирают кровь в вакуумную пробирку с гепарином лития.
Из 10-20 мл шприца готовят гемоконтактную колонку, для чего в торцовую часть шприца помещают фильтр, сетку и плотно фиксируют их прижимным кольцом.
В колонку загружают 1,8-2,0 мл углеродного гемосорбента, например, СКТ-6А ВЧ.
Колонку с сорбентом заполняют донорской гепаринизированной кровью из расчета гемосорбент : кровь - 1:4.
Колонку помещают на роторную мешалку в горизонтальном положении и при комнатной температуре вращают в течение 60 минут.
Через определенные интервалы времени (0 [проба «до»], 5, 20, 40, 60 мин) из колонки забирают пробы крови и регистрируют гематограмму для оценки изменения количества прилипающих клеток в пробах в каждой из временных точек.
Учет клеточных популяций крови проводят на любом гематологическом анализаторе. В данном исследовании использовали анализатор крови SySmex XT - 18001 (26 параметров).
Расчет скорости адгезии (прилипания) клеток в гемоконтактной системе проводили по количеству клеток (лейкоциты, тромбоциты), находящихся в каждой временной точке исследования в жидкой фазе крови. Скорость адгезии клеток определяли по формуле:
где:
А - количество клеток в единице объема крови в предыдущей пробе;
В - количество клеток в единице объема крови в последующей пробе;
t - время между временными точками проведения анализа;
в случае, когда в гемоконтактной системе начинают преобладать процессы отлипания (ухода клеток крови с субстрата в жидкую фазу), аналогичным образом может быть рассчитана и скорость отлипания клеток от субстрата, только по формуле:
где:
А - количество клеток в единице объема крови в предыдущей пробе;
В - количество клеток в единице объема крови в последующей пробе;
t - время между точками проведения анализа.
Во втором случае - в формуле 2 временные точки менялись местами (из значений последующей вычитали значения предыдущей). Скорость взаимодействия клеток с гранулами гемосорбента выражали в количестве клеток в единице объема в мин (кл / мкл / мин). Данные величины дают возможность судить какие процессы (прилипания или отлипания) преобладают в системе и какое количество клеток в минуту прилипает к субстрату или уходит с него в жидкую фазу.
Статистический обработку полученных результатов проводили с использованием прикладных пакетов Statistica 7.0 for Windows и Excel 2013. Диаграммы строили с учетом средних показателей по группам. Рассчитывали скорости адгезии и отлипания тромбоцитов и лейкоцитов (и их субпопуляций: гранулоцитов и агранулоцитов) на всех исследованных временных интервалах.
Заявленный способ иллюстрируется следующими диаграммами:
на фиг. 1 - представлена диаграмма скорости адгезии и отлипания тромбоцитов при контакте крови с гемосорбентом СКТ-6А ВЧ;
на фиг. 2 - представлена диаграмма скорости адгезии и отлипания лейкоцитов при контакте крови с гемосорбентом СКТ-6А ВЧ;
на фиг. 3 - представлена диаграмма скорости адгезии и отлипания различных субпопуляций лейкоцитов (гранулоцитов и агранулоцитов) при контакте крови с гемосорбентом СКТ-6А ВЧ.
Расчеты произведены по количеству клеток, остающихся в жидкой фазе крови во временных точках в течение всего времени контакта. Столбики вниз - количество клеток в крови уменьшается (прилипание преобладает над отлипанием); столбики вверх - количество клеток в крови возрастает (отлипание преобладает над прилипанием).
Пример №1. Изменение скорости адгезии и отлипания тромбоцитов при контакте крови с гемосорбентом СКТ-6А ВЧ (фиг. 1).
3
3
В течение первых 5-ти минут скорость прилипания тромбоцитов к гранулам была максимальной и составляла 18×10 кл/мкл в мин. Следующий временной интервал (5-20 мин) характеризовался снижением скорости адгезии тромбоцитов до 5×10 кл/мкл в мин и в данный период еще преобладало прилипание клеток к гранулам над их отлипанием. Начиная с 20-ой мин контактного взаимодействия, в системе кровь-сорбент начинают преобладать процессы отлипания клеток от субстрата. Причем с течением времени скорость отлипания тромбоцитов возрастает. Учитывая незначительную скорость отлипания клеток, но длительное время преобладания данного процесса можно полагать, что существенное количество тромбоцитов переходит обратно в жидкую фазу крови к концу периода контактного взаимодействия в активированном состоянии. Агрегации тромбоцитов при этом не наблюдается.
Пример №2. Изменение скорости адгезии и отлипания лейкоцитов при контакте крови с гемосорбентом СКТ-6А ВЧ (фиг. 2).
Диаграмма скорости взаимодействия лейкоцитов с гемосорбентом СКТ-6А ВЧ напоминает диаграмму реакции тромбоцитов на контактное взаимодействие. Максимальная скорость адгезии в первые 5 минут, до 20-ти мин преобладают процессы адгезии, затем (20-40 мин) превалирует процесс отлипания клеток. Но можно выделить и некоторые отличия. Во-первых, скорость адгезии лейкоцитов в первые 5 мин значительно ниже, чем скорость прилипания тромбоцитов, что может быть связано с размером и количеством клеток в единице объема крови. Во-вторых, соотношение скорости адгезии тромбоцитов в периоды 0-5/5-20 составляет 3,60, в то время как для лейкоцитов этот показатель равен 12,10. В-третьих, начиная с 20-ой минуты процесс отлипания клеток начинает преобладать, но его скорость (в отличие от тромбоцитов) выше в период 20-40 мин, а в следующий временной интервал (40-60 мин) уменьшается.
Пример №3. Изменение скорости адгезии и отлипания различных субпопуляций лейкоцитов (гранулоцитов и агранулоцитов) при контакте крови с гемосорбентом СКТ-6А ВЧ (фиг. 3).
Диаграмма, характеризующая скорости адгезии и отлипания различных субпопуляций лейкоцитов к гранулам сорбентов по форме повторяют динамику поведения общей популяции лейкоцитов. Обращает на себя внимание, что скорость адгезии гранулоцитов значительно выше, чем у агранулоцитов, что может быть связано с существенно более развитым адгезивным аппаратом у этих клеток. Скорость отлипания в последнем временном интервале (40-60 мин) у гранулоцитов выше скорости отлипания в предыдущий период (20-40 мин), в то время как для агранулоцитов этот показатель примерно в 2 раза ниже.
Использование заявленного способа показало, что получены «классические» показатели изменения скорости адгезии при контакте гепаринизированной крови человека с гранулами углеродного гемосорбента СКТ-6А ВЧ. Так как это пока единственный препарат, который прошел клиническую апробацию с использованием метода МОГ при ряде тяжелых заболеваний с явно выраженным лечебным эффектом, он может служить ориентиром для сравнения его активационных способностей с другими гемоконтактными препаратами. При увеличении или снижении скорости адгезии на других сорбентах либо изменении характера реакции (удлинение или укорочение времени максимума адгезии) можно ожидать усиление либо снижение эффективности лечебного действия того или иного твердофазного гранулированного гемоконтактного препарата при проведении малообъемной гемоперфузии.
Таким образом, заявленное изобретение позволяет расширить функциональные возможности и повысить его информативность и эффективность за счет включения в исследование и оценки взаимодействия дополнительных клеточных элементов крови по сравнению с прототипом.
Способ позволяет регистрировать запуск активационных процессов в прилипающих клетках крови по скорости их адгезии к субстрату и оценивать активационные свойства любых чужеродных материалов, контактирующих с кровью.
Заявитель просит рассмотреть представленные материалы заявки «Способ оценки активационных возможностей гемоконтактных препаратов (в том числе сорбентов) по скорости адгезии клеток крови» на предмет выдачи патента РФ на изобретение.