Штамм бактерий Pantoea agglomerans Ф19 для повышения урожайности зерновых культур
BACTERIAL STRAIN PANTOEA AGGLOMERANS F19 TO INCREASE THE PRODUCTIVITY OF GRAIN CROPS

Изобретение относится к биотехнологии, микробиологии и сельскому хозяйству и касается получения штаммов бактерий, обладающих фосфатмобилизирующей, фитопротекторной и ростостимулирующей активностью. Штамм перспективен для получения бактериальных препаратов для улучшения питания растений, оздоровления биоценоза и повышения урожая зерновых культур.
Одним из аспектов положительного влияния микроорганизмов на растения является улучшение их минерального питания. Поэтому способность к переводу труднорастворимых соединений макро- и микроэлементов в растворимую форму, пригодную для поглощения корнями, является важным фактором стимуляции роста и развития растений.
Известен штамм Pseudomonas species 181а В-6646 (п. РФ № 2451069, МПК C12N 1/20, A01N 63/00, C12R 1/38, опубл. 20.05.2012, бюл. №14), обладающий способностью высвобождать фосфаты из нерастворимого минерального сырья, активен против грибов рода Fusarium, стимулирует рост растений, повышает урожайность. Штамм не токсичен для растений и может быть рекомендован для создания на его основе биофосфорного удобрения с фунгицидными свойствами.
Штамм выделен из разрушающейся скальной породы, что может быть ограничивающим фактором при его использовании в почвах, кроме того, обладает узким спектром фунгицидной активности.
Известен фосфатмобилизующий штамм почвенных бактерий Lelliottia nimipressuralis ССМ 32-3, продуцент фитогормонов, депонированный во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ФГБУ ГосНИИгенетика под регистрационным номером ВКПМ В-12783, используемый для получения биопрепарата для оптимизации минерального питания растений, стимуляции их роста и повышения урожайности (п. РФ №2676926 C1, МПК C12N 1/20, A01N 63/02, C12R 1/01, опубл. 11.01.2019, бюл. №2).
Недостатками данного штамма являются его ограниченная способность выщелачивать фосфор и отсутствие фитопатогенной активности.
Известен штамм бактерий Bacillus megaterium var. phosphaticum BKM В-2357Д, мобилизирующий фосфор и кремний из объектов литосферы (п. РФ № 2327737, МПК C12N 1/20, С05А 11/08, С12R 1/11, опубл. 27.06.2008).
Однако данный штамм не обладает ростостимулирующей и фитопротекторной активностями.
Наиболее близким к заявляемому является почвенных фосфатрастворяющих бактерий Pseudomonas chlororaphis ssp chlororaphis Vsk-26a3, обладающий способностью подавлять фитопатогенные грибы и бактерии. Штамм Pseudomonas chlororaphis ssp chlororaphis Vsk-26a3 высвобождает фосфаты из нерастворимого минерального сырья, имеет широкий спектр действия против фитопатогенных грибов (подавляет 15 видов) и бактерий, а также стимулирует рост растений и повышает их урожайность. Штамм депонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» под номером В-7427 (п. РФ № 2603281 C1, МПК C12N 1/20, A01N 63/00, опубл. 27.11.2016, бюл. №33).
Недостатками известного штамма являются его ограниченная функциональная способность - выщелачивать фосфор и большая подверженность лизису колоний на скошенной агаризованной среде.
Таким образом, все известные штаммы, способные мобилизировать фосфор из труднорастворимых фосфатов или обладающие фитопротекторной и/или ростостимулирующей активностью, имеют ряд недостатков вследствие недостаточно высокой эффективности и трудоемкости способа получения биомассы, низким уровнем фосфатсолюбилизации и стимуляции роста растений. Кроме того, большинство известных штаммов, для достижения указанных свойств, используются, в основном, в составе консорциумов и не обладают самостоятельной фитопротекторной и ростостимулирующей активностью.
Технической проблемой, поставленной перед изобретением, является   расширение ассортимента штаммов, обладающих фосфатсолюбилизирущей,  фитопротекторной и ростостимулирующей активностью.
Поставленная техническая проблема решается выявлением нового природного штамма Pantoea agglomerans Ф19 ВКПМ В-13869, который обладает значительной фосфатсолюбилизирущей способностью, а также фитопротекторной и ростостимулирующей активностью.
Штамм Pantoea agglomerans Ф19 выделен в естественных условиях из почвы (Приморский край, Россия) путем прямого высева на агаризованную среду Пиковской при 22-25°С и депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ В-13869.
Штамм бактерий Pantoea agglomerans Ф19 ВКПМ В-13869 обладает фосфатсолюбилизирущей способностью. Активность солюбилизации фосфора определяли методом посева микроорганизмов штрихом на чашки с плотной агаризированной средой Пиковской. Активность выявляется при наличии зоны просветления (растворении труднорастворимых фосфатов кальция) вокруг выросших колоний микроорганизмов.
Штамм идентифицировали помощью анализа 16S РН. Была проанализирована последовательность длинной 589 пар оснований. Для амплификации участка 16S рРНК образцов использовали пару праймеров BAK11w 5’-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3' и BAK2 5’-GGACTACHAGGGTATCTAAT-3’, которые оптимизированы для идентификации широкого спектра бактериальной ДНК (Zucol et al., 2006). Реакцию амплификации проводили с помощью термоциклера iCycler (Bio-Rad Laboratories, USA), программированном на следующие условия реакции: предварительная денатурация 96 °С — 1 мин, 30 циклов, включавших 96 °С — 10 сек, 55 °С — 20 сек, 72 °С — 30 сек и финальная элонгация 55 °С — 20 сек, 72 °С — 3 мин. Объем реакционной смеси составлял 25 мкл, содержащей по 0,3 мM праймеров BAK11w и BAK2, 0,2 мM каждого нуклеотида, 2,5 мкл 10X Encyclo буфера, 0,5 мкл 50X Encyclo полимеразы и 50 нг образца ДНК. Результат амплификации анализировали в 1 %-ном агарозном геле с добавлением бромида этидия. Полученный специфичный продукт размером 780 п.н. вырезали из геля, очищали и использовали в реакции секвенирования с помощью BigDye Terminator v3.1 согласно рекомендациям фирмы-производителя (Thermo Fisher Scientific, USA).
Культурально-морфологические и биохимические особенности штамма:
На агаризованной среде Пиковской штамм образует округлые, гладкие, выпуклые, блестящие колонии желтого цвета с ровными краями, центр не выражен. В мазке обнаруживаются палочки размером 0,5-1,0×1,0-3,0 мкм, грамотрицательные. Спор и цист не образуют. Каталазаположительные. Оксидазоотрицательные. Индол не образуют. Используют углеводы: Л-арабинозу, галактозу, ксилозу, мальтозу, маннитол, маннозу, Л-рамнозу, сахарозу и трегалозу. Глюкозу сбраживают с образованием кислоты без газа. Сероводород не образуют, мочевину не гидролизуют. Восстанавливают нитрат. Утилизируют цитрат натрия.
3
4
2
4
4
4
Для длительного хранения культуру бактерий засевают в пробирки с полужидкой средой Пиковской уколом петлей. Состав среды: Ca(PO) – 5,0 г, глюкоза – 20,0 г, NaCl – 0,2 г, MgSO – 0,1 г, MnSO – следы, FeSO – следы, агар-агар – 4,0 г. Через 3 дня заливают стерильным вазелиновым маслом слоем в 0,5-1 см. Затем культура помещается в холодильник при 4° С. (Метод хранения под вазелиновым маслом).
3
4
2
4
4
4
Для размножения штаммы высеваются в пробирки со скошенным агаром. Культивируются при комнатной температуре. Среда Пиковской (для выделения микроорганизмов, растворяющих труднорастворимые фосфаты кальция): Ca(PO) – 5,0 г, глюкоза – 20,0 г, NaCl – 0,2 г, MgSO – 0,1 г, MnSO – следы, FeSO – следы, агар-агар – 20,0 г.
7
Ферментацию штамма проводили следующим путем: в пробирки с суточной культурой бактерий добавляют стерильный питательный бульон так, чтобы он полностью покрывал поверхность плотной питательной среды. Через 1 час полученные таким образом бактериальные смывы используют для инокуляции колб с питательным бульоном. Инокулированные колбы инкубируют при 24°С в течение 7 дней с периодическим (2 раза в сутки) встряхиванием вручную до достижения численности бактерий не менее 1×10 м.кл./мл.
Пример 1. Солюбилизация фосфора культурой бактерий Pantoea agglomerans Ф19 ВКПМ В-13869 (качественная оценка).
3
4
2
4
4
4
3
4
2
Качественную оценку способности штамма Pantoea agglomerans Ф19 ВКПМ В-13869 мобилизовать труднодоступные соединения фосфора определяли методом посева микроорганизмов штрихом на чашки с плотной агаризированной средой Пиковской (состав: Ca(PO) – 5,0 г, глюкоза – 20,0 г, NaCl – 0,2 г, MgSO – 0,1 г, MnSO – следы, FeSO – следы, агар-агар – 20,0 г.). Источником нерастворимого фосфора служил Са(PO). Активность выявляли при наличии зоны просветления (растворении труднорастворимых фосфатов кальция) вокруг выросших колоний микроорганизмов. Диаметр зон растворенных фосфатов кальция в экспериментах с культурой бактерий Pantoea agglomerans Ф19 ВКПМ В-13869 составлял 16–21 см. В связи с этим можно сделать вывод о ярко выраженной способности штамма Pantoea agglomerans Ф19 ВКПМ В-13869 к мобилизации труднорастворимых фосфатов.
Пример 2. Солюбилизация фосфора культурой бактерий Pantoea agglomerans Ф19 ВКПМ В-13869 (количественная оценка).
7
Количественную оценку способности штамма Pantoea agglomerans Ф19 ВКПМ В-13869 мобилизовать труднодоступные соединения фосфора определяли в жидкой среде Пиковской (без добавления агара). Источником нерастворимого фосфора служил Са3(PO4)2. Среду разливали по 100 мл в колбы Эрленмейера (объем 250 мл). Посевной материал приготавливали, выращивая бактерии в течение 24 часов в пробирках на агаризованной среде Пиковской. 1 мл суспензии бактерий в концентрации 1×10 КОЕ/мл вносили в колбы с жидкой средой Пиковской. Контроль - среда Пиковской без инокуляции. Исследования проводили в трехкратной повторности.
Бактерии Pantoea agglomerans Ф19 ВКПМ В-13869 культивировали в течение 3 суток при 24°С в периодических условиях на качалках (230 об/мин). После окончания  культивирования опытные образцы центрифугировали в течение 10 минут при 6000 об/мин. Концентрацию растворимого фосфора определяли колориметрически с использованием молибденово-кислого аммония и аскорбиновой кислоты в качестве восстановителя. Содержание водорастворимого фосфора, накапливаемого культурой исследуемых баткерий, рассчитывали по разнице его концентрации в опытном (инокулированном) и контрольном (стерильном) вариантах. Результаты исследований свидетельствуют о том, что бактерии Pantoea agglomerans Ф19 ВКПМ В-13869  активно мобилизует фосфаты из труднорастворимых неорганических (Са3(PO4)2) соединений. Выявлено, что в опытных образцах содержание растворимого фосфора колебалось в пределах 161-204 мг/л, а в контроле - 17,7-20,0 мг/л.
Ростостимулирующее и фитопротекторное действие  изучали посредством выявления потенциального эффекта исследуемых бактерий при воздействии на прорастание семян злаковых растений.
Пример 3. Оценка воздействия штамма Pantoea agglomerans Ф19 ВКПМ В-13869 на энергию прорастания семян злаковых культур
9
Готовили рабочий раствор: Pantoea agglomerans Ф19 ВКПМ В-13869 подращивали на жидкой питательной среде при 23-25°С в течении 5-7 суток до достижения концентрации 1*10 КОЕ/мл.  Семена растений, в количестве 100 штук каждого сорта, замачивали в  рабочем растворе, время экспозиции составляло 30 минут. Затем все семена раскладывали по 10 штук на поверхность фильтровальной бумаги, смоченной стерильной водой, в стерильных чашках Петри для прорастания. Семена проращивали при 23° С. На 3-и сутки определяли энергию прорастания. В результате воздействия препарата наблюдали увеличение энергии прорастания семян пшеницы в среднем на 18%, семян ячменя — в среднем на 20% по сравнению с необработанным контролем.
Пример 4. Оценка воздействия штамма Pantoea agglomerans Ф19 ВКПМ В-13869на лабораторную всхожесть семян злаковых культур.
9
Готовили рабочий раствор: штамм Pantoea agglomerans Ф19 ВКПМ В-13869 подращивали на жидкой питательной среде при 23-25°С в течении 5-7 суток до достижения концентрации 1*10 КОЕ/мл.  Семена растений, в количестве 100 штук каждого сорта, замачивали в  рабочем растворе, время экспозиции составляло 30 минут. Затем все семена раскладывали по 10 штук на поверхность фильтровальной бумаги, смоченной стерильной водой, в стерильных чашках Петри для прорастания. Семена проращивали при 23° С. На 7-е сутки оценивали лабораторную всхожесть семян. В результате воздействия препарата наблюдали увеличение лабораторной всхожести семян ярового ячменя на 16%, яровой пшеницы – на 18%.
Пример 5. Оценка воздействия штамма Pantoea agglomerans Ф19 ВКПМ В-13869 на длину побега и длину корней проростков семян злаковых культур.
9
Готовили рабочий раствор: штамм Pantoea agglomerans Ф19 ВКПМ В-13869 подращивали на жидкой питательной среде при 23-25°С в течении 5-7 суток до достижения концентрации 1*10 КОЕ/мл.  Семена растений, в количестве 100 штук каждого сорта, замачивали в рабочем растворе, время экспозиции составляло 30 минут. Затем все семена раскладывали по 10 штук на поверхность фильтровальной бумаги, смоченной стерильной водой, в стерильных чашках Петри для прорастания. Семена проращивали при 23° С. На 7-е оценивали длину побега и длину корней проростков. В результате воздействия препарата наблюдали увеличение длины надземной части ярового ячменя на 22 %, яровой пшеницы – на 7%; увеличение длины корня ярового ячменя на 30%, яровой пшеницы – на 65%.
Пример 6. Протравка семян ячменя и пшеницы перед посевом штаммом бактерий Pantoea agglomerans Ф19 ВКПМ В-13869.
4
Семена опрыскивали из пульверизатора культурой бактерий Pantoea agglomerans Ф19 ВКПМ В-13869 в концентрации 1×10 КОЕ/мл из расчета 100 мл на 1 кг семян. Обработанные таким образом семена ячменя и пшеницы раскладывали, соблюдая стерильность, на чашки Петри с плотной средой Чапека. На одну чашку выкладывали 10 семян. Всего в эксперимент брали 100 семян ячменя и 100 семян пшеницы. Контроль – необработанные семена. В результате эксперимента наблюдали 100% фунгицидную и бактерицидную активность бактерий Pantoea agglomerans Ф19 ВКПМ В-13869.