METHOD OF DIAGNOSTICS OF VASCULAR CALCIFICATION OF CARDIOVASCULAR SYSTEM
Способ диагностики кальциноза сосудов сердечно-сосудистой системы

Изобретение относится к области биотехнологии и, в частности, к способу диагностики кальциноза сосудов сердечно-сосудистой системы.
Патологический кальциноз представляет собой скопление солей кальция и образование остеоподобных структур в мягких тканях. Его можно обнаружить в мягких тканях опухоли (K.М. Olsen and F.S. Chew, "Tumoral Calcinosis: Pearls, Polemics, and Alternative Possibilities," RadioGraphics, vol. 26, no. 3, pp. 871-885, 2006.), в базальных ганглиях и коре головного мозга (синдром Фара) (S. Saleem, Н.М. Aslam, М. Anwar, S. Anwar, М. Saleem, А. Saleem, and М.А.K. Rehmani, "Fahr's syndrome: literature review of current evidence," Orphanet J Rare Dis, vol. 8, no. 1, p. 156, 2013.), в коже (Q. Li, Q. Jiang, and J. Uitto, "Ectopic mineralization disorders of the extracellular matrix of connective tissue: Molecular genetics and pathomechanisms of aberrant calcification," Matrix Biol., vol. 33, pp. 23-28, Jan. 2014.), в сердечно-сосудистой системе и в легких (Q. Li, Q. Jiang, and J. Uitto, "Ectopic mineralization disorders of the extracellular matrix of connective tissue: Molecular genetics and pathomechanisms of aberrant calcification," Matrix Biol., vol. 33, pp. 23-28, Jan. 2014.; P.A. McCullough, V. Agrawal, E. Danielewicz, and G.S. Abela, "Accelerated Atherosclerotic Calcification and Monckeberg's Sclerosis: A Continuum of Advanced Vascular Pathology in Chronic Kidney Disease," Clin. J. Am. Soc. Nephrol., vol. 3, no. 6, pp. 1585-1598, Oct. 2008.; L. Wexler, B. Brundage, J. Crouse, R. Detrano, V. Fuster, J. Maddahi, J. Rumberger, W. Stanford, R. White, K. Taubert, and A.H.A. Staff, "Coronary Artery Calcification: Pathophysiology, Epidemiology, Imaging Methods, and Clinical Implications: A Statement for Health Professionals From the American Heart Association," Circulation, vol. 94, no. 5, pp. 1175-1192, 1996.).
Однако кальциноз восходящего отдела аорты (BOA), коронарных сосудов и аортального клапана (АК) является наиболее распространенным.
Кальциноз BOA и АК различной степени встречается у каждого второго человека старше 40 лет (L. Wexler, В. Brundage, J. Crouse, R. Detrano, V. Fuster, J. Maddahi, J. Rumberger, W. Stanford, R. White, K. Taubert, and A.H.A. Staff, "Coronary Artery Calcification: Pathophysiology, Epidemiology, Imaging Methods, and Clinical Implications: A Statement for Health Professionals From the American Heart Association," Circulation, vol. 94, no. 5, pp. 1175-1192, 1996) и связан с патогенезом таких распространенных заболеваний, как атеросклероз (Т.М. Doherty, K. Asotra, L.A. Fitzpatrick, J.-H. Qiao, D.J. Wilkin, R.C. Detrano, C.R. Dunstan, P.K. Shah, and Т.B. Rajavashisth, "Calcification in atherosclerosis: bone biology and chronic inflammation at the arterial crossroads," Proc. Natl. Acad. Sci., vol. 100, no. 20, pp. 11201-11206, 2003), хроническая почечная недостаточность (P.A. McCullough, V. Agrawal, E. Danielewicz, and G.S. Abela, "Accelerated Atherosclerotic Calcification and Monckeberg's Sclerosis: A Continuum of Advanced Vascular Pathology in Chronic Kidney Disease," Clin. J. Am. Soc. Nephrol., vol. 3, no. 6, pp. 1585-1598, Oct. 2008), диабет и остеопороз (R.W. Jayalath, S.H. Mangan, and J. Golledge, "Aortic Calcification," Eur. J. Vase. Endovasc. Surg., vol. 30, no. 5, pp. 476-488, Nov. 2005). Кальциноз приводит к потере эластичности BOA и АК, в результате чего они теряют функциональность, у пациентов развивается гипертрофия левого желудочка и дестабилизируется атеросклеротическая бляшка. В результате у пациентов с кальцинозом BOA и АК при атеросклерозе риск сердечного приступа в 2-4 раза выше (R.W. Jayalath, S.Н. Mangan, and J. Golledge, "Aortic Calcification," Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg., vol. 30, no. 5, pp. 476-488, Nov. 2005.; F. Bastos Goncalves, M.T. Voute, S.E. Hoeks, M.B. Chonchol, E.E. Boersma, R.J. Stolker, and H.J.M. Verhagen, "Calcification of the abdominal aorta as an independent predictor of cardiovascular events: a meta-analysis," Heart, vol. 98, no. 13, pp. 988-994, Jul. 2012.; A. Eisen, A. Tenenbaum, N. Koren-Morag, D. Tanne, J. Shemesh, M. Imazio, E.Z. Fisman, M. Motro, E. Schwammenthal, and Y. Adler, "Calcification of the Thoracic Aorta as Detected by Spiral Computed Tomography Among Stable Angina Pectoris Patients: Association With Cardiovascular Events and Death," Circulation, vol. 118, no. 13, pp. 1328-1334, Sep. 2008), и в 2,5-4 раза выше среди пациентов с хронической почечной недостаточностью (ХПН).
Несмотря на широкое распространение заболевания и повышенный риск инфаркта, единственное лечение, которое могут предложить врачи во всем мире пациенту с кальцинозом - хирургическая операция (N.М. Rajamannan, "Bicuspid aortic valve disease: the role of oxidative stress in Lrp5 bone formation," Cardiovasc. Pathol., vol. 20, no. 3, pp. 168-176, May 2011.).
Эффект статинов, аналогов витамина D, бисфосфонатов, хилаторов кальция и фосфата на кальциноз ССС непредсказуем на больших группах пациентов, и иногда приводит к увеличению кальциноза и к повышению уровня смертности от ССЗ (D. Hansen, "A randomised clinical study of alfacalcidol and paricalcitol," Nephrol Dial Transpl., 2011).
Поиск единого эффективного протокола лечения затрудняется разнообразием молекулярных механизмов, приводящих к развитию кальциноза ССС (G. Niccoli, G. Liuzzo, R.A. Montone, and F. Crea, "Advances in mechanisms, imaging and management of the unstable plaque.," Atherosclerosis, vol. 233, no. 2, pp. 467-477, Apr. 2014).
Они включают накопление NO и окислительный стресс (N.М. Rajamannan, "Bicuspid aortic valve disease: the role of oxidative stress in Lrp5 bone formation," Cardiovasc. Pathol, vol. 20, no. 3, pp. 168-176, May 2011; Y. Abramowitz, H. Jilaihawi, T. Chakravarty, M.J. Mack, and R.R. Makkar, "Porcelain Aorta A Comprehensive Review," Circulation, vol. 131, no. 9, pp. 827-836, 2015), разрушение межклеточного матрикса (Y. Abramowitz, H. Jilaihawi, T. Chakravarty, M.J. Mack, and R.R. Makkar, "Porcelain Aorta A Comprehensive Review," Circulation, vol. 131, no. 9, pp. 827-836, 2015), активацию Notch1/LRP5/Wnt сигнального пути (N.M. Rajamannan, "Bicuspid aortic valve disease: the role of oxidative stress in Lrp5 bone formation," Cardiovasc. Pathol., vol. 20, no. 3, pp. 168-176, May 2011), нарушение метаболизма ионов кальция и фосфата, связанные с нарушением в работе FGF23/Klotho (P.A. McCullough, V. Agrawal, E. Danielewicz, and G.S. Abela, "Accelerated Atherosclerotic Calcification and Monckeberg's Sclerosis: A Continuum of Advanced Vascular Pathology in Chronic Kidney Disease," Clin. J. Am. Soc. Nephrol., vol. 3, no. 6, pp. 1585-1598, Oct. 2008; E. Neven and P.C. D’Haese, "Vascular Calcification in Chronic Renal Failure: What Have We Learned From Animal Studies?," Circ. Res., vol. 108, no. 2, pp. 249-264, Jan. 2011), нарушение обмена витамина К при приеме варфарина (С. Palaniswamy, A. Sekhri, W.S. Aronow, A. Kalra, and S.J. Peterson, "Association of warfarin use with valvular and vascular calcification: a review.," Clin. Cardiol., vol. 34, no. 2, Feb. 2011). Также к кальцинозу ССС приводят генетические мутации, затрагивающие гены из нескольких независимых сигнальных путей (Q. Li and J. Uitto, "Mineralization/anti-mineralization networks in the skin and vascular connective tissues," Am. J. Pathol., vol. 183, no. 1, pp. 10-18, 2013).
В связи с разнообразием механизмов развития кальциноза и отсутствием эффективного протокола лечения необходим персонализированный подход в подборе стратегии его профилактики и предупреждения на ранней стадии развития.
Из уровня техники известен патент РФ RU 2585491 С2, который раскрывает способ лечения метаболического расстройства у субъекта, нуждающегося в этом, при котором вводят субъекту ингибитор miR-378 и/или miR-378*, где экспрессия или активность miR-378 и/или miR-378* в клетках субъекта понижается после введения, где ингибитор представляет собой антисмысловой олигонуклеотид, который имеет последовательность, которая по меньшей мере на 90% комплементарна SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2, где метаболическое расстройство представляет собой метаболический синдром, ожирение, сахарный диабет, диабетическую нефропатию, резистентность к инсулину, атеросклероз, нарушение липидного обмена, гликогеноз, недостаточность среднецепочечной ацил-коэнзим А дегидрогеназы или нарушенное поглощение и/или утилизацию глюкозы.
Недостатком данного технического решения является то, что изобретение не применяется для диагностики кальциноза сосудов сердечно-сосудистой системы.
Из заявки на патент РФ RU 2013146856 А1 известен способ обнаружения патологии системы органов у субъекта, причем указанный способ включает:
a) измерение уровня по меньшей мере одной микроРНК, характеризующейся повышенным содержанием в указанной системе органов, в образце биологической жидкости, полученном у субъекта;
b). измерение уровня нормирующей микроРНК в том же образце биологической жидкости, полученном у субъекта;
c) расчет отношения уровней микроРНК, измеренных на этапах (а) и (b);
d) сравнение отношения уровней микроРНК, рассчитанного на этапе (c), с соответствующим контрольным отношением,
(i) идентификацию субъекта как имеющего патологию указанной системы органов, в случае когда отношение уровней микроРНК, рассчитанное на этапе (с), выше, чем соответствующее контрольное отношение, или (ii) идентификацию указанного субъекта как не имеющего патологии указанной системы органов, в случае когда отношение уровней микроРНК, рассчитанное на этапе (с), не выше, чем соответствующее контрольное соотношение.
Недостатком данного технического решения является то, что изобретение не применяется для диагностики кальциноза сосудов сердечно-сосудистой системы.
Из заявки США WO 201471205 А1 известно изобретение, относящееся к определенным микроРНК, одним из которых является mir-382.
Недостатком данного технического решения является то, что изобретение не применяется для диагностики кальциноза сосудов сердечно-сосудистой системы.
Наиболее близким аналогом к заявленному техническому решению является патент РФ RU 2306104 С1, из которого известно изобретение, относящееся к области медицины и нашедшее применение в ультразвуковой диагностике кальциноза аортального клапана. Осуществляют ультразвуковую денситометрию. При выполнении ультразвукового исследования сердца на диагностической системе Nemio 35 (TOSHIBA) для визуализации используют стандартную кардиальную программу (IHeartA), кардиальный датчик - фазированную решетку и стандартные заводские настройки получения изображения: уровень Gain - 80, частоту инсонации датчика - 2,5 МГц без применения 2-й гармоники. Изображение аортального клапана выводят из парастернальной позиции датчика с сечением по короткой оси. Аортальный клапан контурируют, включая клапанное кольцо по методу эллипса. После проведения ультразвуковой денситометрии с использованием программы 2D-гистограммы оценивают значение показателя Mean: значение ≤10 указывает на отсутствие кальциноза аортального клапана - степень 0, значение Mean >10 и ≤13 свидетельствует о незначительном кальцинозе аортального клапана - степень 1, значение Mean >13-≤17 - об умеренном кальцинозе аортального клапана - степень 2, а значение Mean >17 - о значительном кальцинозе аортального клапана - степень 3. Способ позволяет повысить информативность и достоверность диагностики кальциноза аортального клапана.
Недостатком ближайшего аналога является его трудоемкость и необходимость применения дорогостоящих приборов.
Техническим результатом заявленного изобретения является простота и быстрота осуществления диагностики кальциноза сердечно-сосудистой системы.
Технический результат заявленного изобретения достигается за счет реализации способа диагностики кальциноза сердечно-сосудистой системы, включающего:
- получение образца крови пациента с ишемической болезнью сердца (ИБС);
- изменение уровня продуктов генов mir-199a-5p и mir-382 в образцах крови пациента с ИБС с помощью методов оценки количества РНК;
- сравнение уровня продукции генов mir-199a-5p и mir-382 в тестируемых образцах с контрольными;
- предсказание наличия кальциноза у пациентов с ИБС: если уровень продукции генов mir-199a-5p и mir-382 повышен в тестируемых образцах по сравнению с контрольными образцами, то у пациентов с ИБС предсказывается наличие кальциноза.
Данные об относительном уровне микроРНК в крови у пациентов с ишемической болезнью сердца представлены в Таблице 1.
Рисунки иллюстрируют изобретение в наглядном виде:
На Рисунке 1 представлена интенсивность сигнала на микроматрице от микроРНК 199а-5р у пациентов с коронарной болезнью сердца и здоровых пациентов.
На Рисунке 2 представлена интенсивность сигнала на микрочипе от микроРНК 382 у пациентов с коронарной болезнью сердца и здоровых пациентов.
На Рисунке 3 представлены значения относительной интенсивности сигнала микроРНК 382 и микроРНК 199а-5р у пациентов с коронарной болезнью сердца относительно здоровых пациентов.
Кроме того, изобретение можно проиллюстрировать следующим примером:
Определение уровней микроРНК в крови
36 субъектов было включено в разработку способа, заявленного в настоящем изобретении, среди которых было 18 пациентов с ишемическим болезнью сердца и кальцинозом и 18 здоровых людей. Уровень микроРНК измерялся в крови, в анализ входили уровни тотальной микроРНК, в том числе уровень зрелых mir-382 и уровень зрелых mir-199a-5p.
Уровень микроРНК в крови измеряли следующим образом: нормализовали данные микроматриц производства Illumina для анализа тотальной микроРНК скриптом, написанным на языке R с использованием пакета lumi. Далее считали отношение нормализованного логарифмически трансформированного значения уровня сигнала каждого образцы пациентов с ишемической болезнью сердца к нормализованным логарифмически трансформированным значениям уровня сигнала здоровых пациентов программой методом SAM программного продукта J-Express Pro. Важно отметить, что сравнение сигнала в опытных образцах проводилась отдельно для каждого из 18 пациентов, после чего данные объединялись. Из полученных данных с отношением уровня сигнала от микроРНК в образцах крови пациентов с ишемической болезнью сердца к уровню сигнала у здоровых людей отбрасывали данные с q-value<0.01 как статистически незначимые. Список из 18 оставшихся микроРНК сверяли с базой данных Pubmed на наличие опубликованных подтверждений их связи с сердечно-сосудистыми заболеваниями. Мы обнаружили, что для двух микроРНК, статистически значимо измененных в нашем анализе, ранее была показана связь с кальцинозом сердечно-сосудистой системы - mir-199a-5p и mir-382.