ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИ, ВКЛЮЧАЮЩИЕ ПОЛИМЕРНЫЕ СВЯЗУЮЩИЕ ВЕЩЕСТВА С НЕГИДРОЛИЗУЕМЫМИ КОВАЛЕНТНЫМИ СВЯЗЯМИ, И ПРИМЕНЕНИЕ УКАЗАННЫХ КОМПОЗИЦИЙ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ГЛЮТЕНОВОЙ БОЛЕЗНИ
PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS CONTAINING POLYMER BINDING SUBSTANCES WITH NONHYDROLYSED COVALENT LINKS, AND APPLICATION OF SAID COMPOSITIONS FOR CELIAC DISEASE

Ссылка на родственные заявки
По данной заявке испрашивается приоритет на предварительный патент по заявке США № 60/735820, поданной 14 ноября 2005 г. Все вышеуказанные документы полностью включены в качестве ссылки.
Область техники, к которой относится изобретение
Данное изобретение касается фармацевтических композиций, включающих полимерные связующие вещества, и способов применения указанных композиций. Более конкретно данное изобретение касается неусваиваемых синтетических полимеров для связывания глютена или глиадина и/или пептидов, образующихся при расщеплении глютена или глиадина, и способов применения указанных полимеров.
Обоснование изобретения
Глютеновая болезнь, известная также как глютеновая интолерантность, является синдромом, характеризующимся поражением слизистой оболочки тонкой кишки после воздействия либо глиадиновой фракции глютена пшеницы, либо соответствующих растворимых в спирте белков (проламинов) ячменя и ржи на генетически чувствительных субъектов. Глютеновая болезнь является общим аутоиммунным нарушением, имеющим генетические, экологические и иммунологические компоненты. Болезнь тесно связана с генами, которые кодируют лейкоцитарные антигены человека DQ2 и DQ8 [1]. Идентифицирован 33-мерный фрагмент α-глиадина, имеющий ряд характеристик, позволяющих предположить, что данный глиадин является возможным инициатором воспалительной реакции на глютен у пациентов с глютеновой болезнью [2].
Симптомы глютеновой болезни могут изменяться в диапазоне от легкой слабости, боли в костях и афтозного стоматита до хронической диареи, вздутия живота и прогрессирующей потери в весе [3]. По причине широкого ряда симптомов наличие глютеновой болезни диагностировать сложно. Зараженные данным заболеванием страдают от нарушений под действием кисломолочных продуктов (укорочение и ворсинчатое сглаживание) в собственной пластинке слизистой оболочки и криптовых участках кишечника [3]. Кроме того, гастроинтестинальная карцинома или лимфома развивается у 15 процентов пациентов с нелеченой или резистентной глютеновой болезнью [4]. Безглютеновая диета позволяет предупредить почти все осложнения заболевания [5]. Такая диета подразумевает исключение всех продуктов, содержащих пшеницу, рожь, ячмень или производных указанных зерновых. Задача трудная, поскольку многие скрытые источники глютена могут быть найдены в ингредиентах многих пищевых продуктов, подвергшихся технологической обработке.
До настоящего времени, не считая исключения из диеты глютенсодержащих продуктов, не существовало фармакологического лечения, пригодного для пациентов с глютеновой болезнью. Поразительно, что на сегодняшний день изучаются сравнительно немногочисленные терапевтические стратегии. Изучаются подходы, основанные на толерантности антитела и опосредованного T-клетками отклика на токсические пептиды глиадинов или на создании нейтрализующих антител против IL-15, блокирующих опосредованные IL-15 изменения в слизистой оболочке тонкой кишки [6]. Перспективное направление связано с открытием экзогенных ферментов, которые легко могут разлагать токсические пептиды in situ [7]. Однако высокая стоимость, связанная с крупномасштабным производством ферментов, и возможная утрата активности после перорального введения являются потенциальными ограничениями для промышленного выпуска указанных ферментов. Дополнительные подходы, имеющие целью воспрепятствовать активации глютенреактивных T-клеток, включают ингибирование связывания глютеновых пептидов с лейкоцитарным антигеном человека (HLA) DQ2 (или DQ8). Решающая роль HLA в развитии глютеновой болезни делает HLA прямым объектом терапевтического воздействия. Недавно раскрытая рентгеновская кристаллическая структура HLA-DQ2, комплексно связанного с дезаминированным глютеновым пептидом, дала важную информацию для разработки HLA-DQ2-блокирующего соединения [8]. Антагонисты зонулина также предложены в качестве терапевтического средства от глютеновой болезни. Зонулин представляет собой белок, вовлеченный в регуляцию межклеточных непроницаемых перегородок в тонком кишечнике. Обнаружено, что экспрессия зонулина возрастает во время острой фазы глютеновой болезни, клинического состояния, при котором кишечная проницаемость увеличивается [9].
В настоящее время исследуется разработка зерновых с низким содержанием или без содержания иммунотоксических последовательностей, но с приемлемым хлебопекарным качеством. Такие зерновые потенциально могут быть получены селекцией старых сортов пшеницы [10], посредством трансгенной технологии, включающей мутацию последовательностей, порождающих иммуностимулирующие последовательности [11] или включением нетоксичных глютеновых генов в безвредные организмы, такие как рис [12]. Хотя такие зерновые технически сложны для создания и существует возможность того, что перекрестное опыление с глютен-содержащими зерновыми может привести к реинтродукции иммунотоксических последовательностей, доступность таких зерновых может дать пациентам с глютеновой болезнью более питательную диету.
Полимерные связующие вещества
Ряд полимерных связующих веществ был использован для лечения или профилактики некоторых заболеваний.
Clostridium difficile
Классическим примером полимерного связующего вещества является холестирамин, катионная смола, которая образует комплекс с билиарными кислотами в кишке и, следовательно, снижает уровни холестерина в крови. Недавно севеламергидрохлорид, новое полимерное, не содержащее алюминий и кальций, фосфатное связующее вещество с незначительными побочными действиями было запущено в серийное производство для лечения гиперфосфатаземии у пациентов с диализом. Пожалуй, наиболее интересным открытием в данной области является анионный высокомолекулярный полимер, GT160-246, который, как установлено, нейтрализует активность A токсина  как in vitro, так и in vivo [13]. Данный эндотоксин является наиболее часто устанавливаемой причиной инфекционной нозокомиальной диареи. GT160-246 обеспечивает перспективный и безопасный неантибактериальный способ лечения и профилактики C. difficile колита у людей.
Предположение, что высокомолекулярные полимеры могут находить потенциальное применение при глютеновой болезни, вытекает из исследования Auricchio et al. [14], показывающего, что маннан (гомополисахарид маннозы) и олигомеры ацетилглюкозамина оказывают защитное действие на пробы слизистой оболочки кишки, взятые у пациентов с активной глютеновой болезнью [14]. Полученные данные указывают на то, что агглютинирующие и токсические пептиды связываются указанными карбогидратами. Secundo et al. (26) исследовали влияние другого полисахарида, декстрина, на вторичную структуру глиадинов и сделали предположение, что декстрин может быть использован для получения нетоксических производных продуктов питания для пациентов, страдающих глютеновой болезнью. Несмотря на приведенные интересные предварительные данные, дальнейшие исследования in vivo для подтверждения полученных результатов не проводились. Основным недостатком природных карбогидратов является способность к расщеплению в условиях in vivo, что может сделать указанные карбогидраты неактивными in situ.
Данное изобретение стремится изыскать решения, удовлетворяющие указанным и другим потребностям.
Данное описание ссылается на ряд документов, содержание которых полностью включено здесь в качестве ссылки.
Сущность изобретения
В частности, согласно аспекту настоящего изобретения разработана фармацевтическая композиция, содержащая полимерное связующее вещество, включающее высокомолекулярный синтетический полимер с основной цепью, образованной негидролизуемыми ковалентными связями, указанный полимер способен к образованию электростатических связей при pH ниже, чем изоэлектрическая точка глютена и пептидов, образующихся при расщеплении глютена, и способен к связыванию с глютеном или пептидами, образующимися при расщеплении глютена, в желудочно-кишечном тракте, и фармацевтически приемлемый носитель.
В особом варианте осуществления фармацевтической композиции полимерное связующее вещество способно к гидрофобным взаимодействиям с глютеном или пептидами, образующимися при расщеплении глютена. В другом специфическом варианте осуществления фармацевтической композиции полимерное связующее вещество способно к образованию водородных связей. В ином специфическом варианте осуществления фармацевтической композиции полимерное связующее вещество способно к специфическому связыванию с глютеном или пептидами, образующимися при расщеплении глютена, в желудочно-кишечном тракте. В еще одном специфическом варианте осуществления фармацевтической композиции полимерное связующее вещество способно к связыванию с глютеном или пептидами, образующимися при расщеплении глютена, в кишечнике. В другом специфическом варианте осуществления фармацевтической композиции полимерное связующее вещество представляет собой сополимер гидроксиэтилметакрилата (HEMA) и гидрата натриевой соли 4-стиролсульфоновой кислоты (SStNa). В еще одном специфическом варианте осуществления фармацевтической композиции полимерное связующее вещество представляет собой полимер гидрата натриевой соли 4-стиролсульфоновой кислоты (SStNa). В другом специфическом варианте осуществления фармацевтической композиции полимерное связующее вещество представляет собой полимер калиевой соли сульфопропилметакрилата (SPMAK).
В другом специфическом варианте осуществления фармацевтической композиции полимерное связующее вещество является линейным. В еще одном специфическом варианте осуществления фармацевтической композиции полимерное связующее вещество является звездообразным. В другом специфическом варианте осуществления фармацевтической композиции полимерное связующее вещество является 3-18-лучевым звездообразным сополимером. В другом специфическом варианте осуществления фармацевтической композиции полимерное связующее вещество является 5-18-лучевым звездообразным сополимером. В еще одном специфическом варианте осуществления фармацевтической композиции полимерное связующее вещество является 5-лучевым звездообразным сополимером. В другом специфическом варианте осуществления фармацевтической композиции полимерное связующее вещество является 8-лучевым звездообразным сополимером. В другом специфическом варианте осуществления фармацевтической композиции полимерное связующее вещество является 18-лучевым звездообразным сополимером. В другом специфическом варианте осуществления фармацевтической композиции полимерное связующее вещество представляет собой сополимер HEMA и SStNa и имеет молярное процентное соотношение HEMA/SStNa приблизительно в пределах от 93,5/6,5 до 1/99. В еще одном специфическом варианте осуществления фармацевтической композиции сополимер является линейным HEMA/SStNa (51,5/48,5 мол.%). В другом специфическом варианте осуществления фармацевтической композиции сополимер является линейным HEMA/SStNa (43/57 мол.%). В другом специфическом варианте осуществления фармацевтической композиции сополимер имеет молярное процентное соотношение HEMA/SPMAK приблизительно в пределах от 93,5/6,5 до 1/99%). В другом специфическом варианте осуществления фармацевтической композиции сополимер имеет молярное процентное соотношение HEMA/SPMAK приблизительно в пределах от 86/14 до 1/99%.
В другом специфическом варианте осуществления фармацевтической композиции сополимер является линейным HEMA/SPMAK (45/55 мол.%).
В другом специфическом варианте осуществления фармацевтическая композиция по настоящему изобретению дополнительно включает антагонист зонулина или HLA-DQ2-ингибитор.
Согласно другому аспекту настоящего изобретения разработан способ применения полимерного связующего вещества по данному изобретению, включающий введение пациенту, страдающему глютеновой болезнью, фармацевтически эффективного количества указанного полимерного связующего вещества.
В специфическом варианте осуществления способ по настоящему изобретению предназначен для связывания глютена или пептида, образующегося при расщеплении глютена, в организме пациента.
В другом специфическом варианте осуществления способ по настоящему изобретению предназначен для снижения расщепления глютена до токсических пептидов в организме пациента.
В еще одном специфическом варианте осуществления способ по настоящему изобретению предназначен для снижения взаимодействия глютена или пептидов, образующихся при расщеплении глютена, со слизистой оболочкой желудочно-кишечного тракта пациента.
В другом специфическом варианте осуществления способа по настоящему изобретению указанное введение осуществляют до или во время приема глютен-содержащей пищи указанным пациентом. В еще одном специфическом варианте осуществления способа по настоящему изобретению указанное введение осуществляют после приема глютенсодержащей пищи указанным пациентом.
Согласно другому аспекту настоящего изобретения предусматривается применение полимерного связующего вещества по настоящему изобретению для изготовления лекарственного средства.
Согласно другому аспекту настоящего изобретения предусматривается применение полимерного связующего вещества по настоящему изобретению для связывания глютена или пептида, образующегося при расщеплении глютена, в желудочно-кишечном тракте нуждающегося в таком лечении пациента.
Согласно другому аспекту настоящего изобретения предусматривается применение полимерного связующего вещества по настоящему изобретению в целях изготовления лекарственного средства, предназначенного для связывания глютена или пептида, образующегося при расщеплении глютена, в желудочно-кишечном тракте нуждающегося в таком лечении пациента.
Согласно другому аспекту настоящего изобретения предусматривается применение полимерного связующего вещества по настоящему изобретению для снижения взаимодействия глютена или пептидов, образующихся при расщеплении глютена, со слизистой оболочкой желудочно-кишечного тракта нуждающегося в таком лечении пациента.
Согласно другому аспекту настоящего изобретения предусматривается применение полимерного связующего вещества по настоящему изобретению в целях изготовления лекарственного средства, предназначенного для снижения взаимодействия глютена или пептидов, образующихся при расщеплении глютена, со слизистой оболочкой желудочно-кишечного тракта нуждающегося в таком лечении пациента.
Согласно другому аспекту настоящего изобретения предусматривается применение полимерного связующего вещества по настоящему изобретению для снижения расщепления глютена на токсические пептиды в желудочно-кишечном тракте нуждающегося в таком лечении пациента.
Согласно другому аспекту настоящего изобретения предусматривается применение полимерного связующего вещества по настоящему изобретению в целях изготовления лекарственного средства, предназначенного для снижения расщепления глютена на токсические пептиды в желудочно-кишечном тракте нуждающегося в таком лечении пациента.
В специфическом варианте применения по настоящему изобретению пациент страдает глютеновой болезнью.
Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложена пища, включающая полимерное связующее вещество по настоящему изобретению.
В специфическом варианте пищи по настоящему изобретению, указанная пища является глютенсодержащей пищей. В конкретном варианте пищи по настоящему изобретению указанная пища представляет собой хлеб.
Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложен способ употребления пищи по настоящему изобретению, включающий введение указанной пищи пациенту, страдающему глютеновой болезнью, во время приема пищи пациентом. В специфическом варианте осуществления, способ по настоящему изобретению предназначен для связывания глютена или пептида, образующегося при расщеплении глютена, содержащихся в еде пациента. В другом специфическом варианте осуществления, способ по настоящему изобретению предназначен для снижения расщепления на токсические пептиды глютена, содержащегося в еде пациента. В специфическом варианте осуществления, способ по настоящему изобретению предназначен для снижения взаимодействия глютена или пептидов, образующихся при расщеплении глютена, со слизистой оболочкой желудочно-кишечного тракта пациента.
Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложен способ приготовления пищи для пациента, страдающего глютеновой болезнью, включающий введение в указанную пищу полимерного связующего вещества по настоящему изобретению. В специфическом варианте осуществления способа по настоящему изобретению, указанная пища является глютенсодержащей пищей.
Настоящее изобретение касается высокомолекулярного инертного и невсасывающегося полимерного связующего вещества, используемого для адсорбции глютена и/или продуктов расщепления глютена. Такая система помогает предупредить или снизить вредные действия глютена на слизистую оболочку желудочно-кишечного тракта. Не в порядке ограничения предполагается, что пептидное связывание с полимером имеет двойной эффект. Во-первых, ферментативное расщепление и генерация токсических фрагментов замедляются в результате адсорбции глютена и/или продуктов расщепления глютена на инертном носителе. Во-вторых, образование комплекса с высокомолекулярным полимером снижает пептидное всасывание и последующую иммунную реакцию. Таким образом, данная система обеспечивает профилактическое вспомогательное средство для пациентов, сталкивающихся с ситуациями, когда нельзя удостовериться в отсутствии глютеновых остатков или когда нельзя достать безглютеновую пищу.
Хотя специфические неусваиваемые синтетические полимеры описаны здесь, изобретение не ограничивается указанными примерами. Как использован здесь, подразумевается, что термин "неусваиваемый", когда применяется для определения полимеров по настоящему изобретению, означает полимер с основной цепью, состоящей из негидролизуемых ковалентных связей. Предполагается, что специалист в данной области может легко установить другие неусваиваемые синтетические полимеры, которые могут быть использованы согласно данному изобретению. Подобным образом полимеры, конкретно описанные здесь, могут быть оптимизированы для обеспечения максимального сродства к глютену и продуктам расщепления глютена и сведения к минимуму связывания с другими белками. Конечно, некоторая доля таких белков/пептидов избежит адсорбции на полимерах по настоящему изобретению, но считается, что суточное потребление глиадина в количестве 4-14 мг не вызывает нарушения слизистой оболочки тонкого кишечника у пациентов с глютеновой болезнью [15]. Такая система ни в коем случае не заменяет безглютеновую диету в качестве основного лечения. Однако указанная система может иногда быть использована как профилактическое вспомогательное средство, когда пациент сталкивается с ситуациями, где нельзя удостовериться в отсутствии глютеновых остатков или когда нельзя достать безглютеновую пищу.
Полимерные связующие вещества по настоящему изобретению могут успешно снижать пероральное всасывание глютена и образующихся из глютена пептидов. Такие полимерные связующие вещества действуют в желудочно-кишечном тракте, без абсорбции в кровяное русло, тем самым сводится к минимуму возможность нежелательного действия, оказываемого самим полимером. При pH ниже изоэлектрической точки глютена и образующихся из глютена пептидов полимерные связующие вещества отрицательно заряжены, тогда как указанные белки и пептиды заряжены положительно, что делает возможным возникновение электростатических взаимодействий. Такие полимерные связующие вещества могут также вступать в гидрофобные взаимодействия с указанными белками и пептидами. В отдельных вариантах осуществления, полимерные связующие вещества по настоящему изобретению могут также быть способны к образованию водородных связей. Хотя последняя характеристика может быть желательной, показано, что данная характеристика является несущественной, поскольку некоторые полимеры по настоящему изобретению, например, гомополимер калиевой соли сульфопропилметакрилата (SPMAK), который не обладает указанной характеристикой, как обнаружено, способны к связыванию глютена. Такие полимерные связующие вещества могут быть синтезированы с помощью мономеров, приведенных ниже в таблице 1, не рассматриваемых как ограничивающие. Специалисты в данной области техники могут выбрать комбинации из одного или более указанных (или других) мономеров для получения полимерных связующих веществ по настоящему изобретению:
Производные стирола:
- Стиролсульфонат.
- Стиролсульфат.
- Стиролсульфанилат.
- Сульфофенилаланин.
- Тирозинсульфат.
- Сульфофенетилакриламид.
- Сульфофенетилметакриламид.
- Винилнафталинсульфонат.
- Винилнафталинсульфат.
- Винилбифенилсульфонат.
- Винилбифенилсульфат.
- Анетолсульфонат.
- Стиролы с краун-эфирными составляющими.
- Стиролы, замещенные N,N-диалкиламидогруппами.
- 4-метоксистирол.
- 4-(2-(N,N-диметиламино)этил)стирол.
- 4-(2-(N,N-диметиламино)метил)стирол.
- 4-(2-(N,N-диэтиламино)этил)стирол.
- 4-бис(N,N-диэтиламино)фосфино-α-метилстирол.
- 4-винилфенол.
- 3-винилкатехол.
- 4-винилацетофенон.
- 4-винилбензойная кислота.
- 3-винилбензойная кислота
- 2-(4-винилфенил)-1,3-диоксолан.
- 2-(4-винилфенил)-1,3-диоксан.
- 4-диметоксиметилстирол-(4-винилбензальдегиддиметилацеталь).
- 2-(2-винилфенил)-1,3-диоксолан.
- 2-(3-винилфенил)-1,3-диоксолан.
- 1-(4-винилфенил)-4-метил-2,6,7-триоксабицикло[2.2.2.]октан.
- 4-(2-гидроксиэтил)стирол.
- 4-(3-гидроксипропил)стирол.
- 4-{[4-(4-винилфенил)бутокси]метил}-1-метил-2,6,7-триоксабицикло[2.2.2.]октан.
- 4-винилтиофенол.
- 4-(2-меркаптоэтил)стирол.
- 2-(4-винилфенил)-2-оксазолин.
- N,N-диэтил-4-винилбензолсульфонамид.
- N-метил-N-[(4-винилфенил)сульфонил]пиперазин.
- 4-аминостирол.
- 3-аминостирол.
- 4-аминометилстирол.
- 3-аминометилстирол.
- 4-(2-аминоэтил)стирол.
Стирол, содержащий гидроксильную группу (гидроксильные группы):
- (п-Винилбензамидо)-β-хитобиоза.
- (п-Винилбензамидо)-β-лактоза.
- N-(п-винилбензил)-L-гулонамид.
- N-(п-винилбензил)-6-D-глюкарамид.
- N-(п-винилбензил)-6-D-глюкарамид-1-ат.
- 4-Акриламидофенил-β-лактозид.
- N-(п-винилбензил)-D-глюкоронамид.
- 4-винилбензил-D-глюко(D-манно)гексит.
- п-[2-[N-(п-винилбензил)карбамоил]этил]фенил-α-D-маннопиранозид.
- п-[2-[N-(п-винилбензил)карбамоил]этил]фенил-β-D-маннопиранозид.
- N-(п-винилбензил)-5-[O-β-D-галактопиранозил-(1→4)]-D-глюконамид.
- α-маннопиранозид.
- β-маннопиранозид.
Акриловые мономеры:
- Глицидилакрилат.
- 2-Гидроксиэтилакрилат.
- 2-Гидроксиэтилметакрилат.
- Гидроксипропилметакрилат.
- 2-(N,N-Диметиламино)этилметакрилат.
- 2-(N,N-Диэтиламино)этилметакрилат.
- 3-Сульфопропилметакрилат.
- Тетрагидропиранилметакрилат.
- Бензилметакрилат.
- 2-глюконамидоэтилметакрилат.
- 2-лактобионамидоэтилметакрилат.
- 2-(2',3',4',6'-тетра-O-ацетил-β-D-глюкопиранозилокси)этилакрилат.
- (4,5-дигидрокси-6-гидроксиметил-3-метилкарбоксамидотетрагидро-2H-2-пиранилокси)этилакрилат.
Сульфатизированные мономеры:
- Винилсульфат.
- Пропенсульфат.
- Бутенсульфат.
- Пентенсульфат.
- Гексенсульфат.
- Гептенсульфат.
- Октенсульфат.
- Ноненсульфат.
- Деценсульфат.
- Ундеценсульфат.
- Додеценсульфат.
Сульфонированные мономеры:
- Винилсульфонат.
- Пропенсульфонат.
- Бутенсульфонат.
- Пентенсульфонат.
- Гексенсульфонат.
- Гептенсульфонат.
- Октенсульфонат.
- Ноненсульфонат.
- Деценсульфонат.
- Ундеценсульфонат.
- Додеценсульфонат.
Фосфатированные мономеры:
- Винилфосфат.
- Пропенфосфат.
- Бутенфосфат.
- Пентенфосфат.
- Гексенфосфат.
- Гептенфосфат.
- Октенфосфат.
- Ноненфосфат.
- Деценфосфат.
- Ундеценфосфат.
- Додеценфосфат.
Другие:
- Малеиновый ангидрид.
x
- N-акрилoилированный 3'-сульфоЛьюис-Glc мономер.
- α-сиалозидакриламид.
- N-винилпиридин.
- N-винилпирролидинон.
- Винилимидазол.
- 1,3-Диметил-2-(4-винилфенил)имидазолидин.
- 3-(N-акрилоиламино)пропил-O-(β-D-галактопиранозил)-(1→4)-2-ацетамидо-2-деокси-β-D-глюкопиранозид.
- 6-(N-акрилоиламино)гексил-O-(β-D-галактопиранозил)-(1→4)-2-ацетамидо-2-деокси-β-D-глюкопиранозид.
- 3-(N-акрилоиламино)пропил-2-ацетамидо-2-деокси-β-D-глюкопиранозид.
- 6-(N-акрилоиламино)гексил-2-ацетамидо-2-деокси-β-D-глюкопиранозид.
- н-пентенил-β-D-галактопиранозид.
- н-пентенил-O-(2-ацетамидо-2-деокси-β-D-глюкопиранозил)-(1→4)-2-ацетамидо-2-деокси-β-D-глюкопиранозид.
- н-пентенил-O-(β-D-галактопиранозил)-(1→4)-2-ацетамидо-2-деокси-β-D-глюкопиранозид.
- н-пентенил-O-(β-D-галактопиранозил)-(1→4)-β-D-глюкопиранозид.
- н-пентенил-O-(β-D-галактопиранозил)-(1→4)-[O-(α-L-фукопиранозил)-(1→3)]-2-ацетамидо-2-деокси-β-D-глюкопиранозид.
- н-пентенил-O-(β-D-галактопиранозил)-(1→6)-2-ацетамидо-2-деокси-β-D-глюкопиранозид.
- н-пентенил-O-(β-D-галактопиранозил)-(1→3)-2-ацетамидо-2-деокси-β-D-глюкопиранозид.
- н-Алкенил-2-ацетамидо-2-деокси-α-D-глюкопиранозиды (и сульфатизированные производные);
- 2-N-акрилоиламиноэтоксилированный 4-O-(β-D-галактопиранозил)-β-D-глюкопиранозид (и сульфатизированные производные).
- натриевая соль N-малеиновой амидо-2-деоксиглюкозы.
- натриевая соль N-малеинового амидо-1-деоксилактитола.
- Фукоза-7-оксанорборнен-производное.
- C-Glc-7-оксанорборнен-производное.
- C-Man-7-оксанорборнен-производное.
- Несимметричная глюкоза, включающая 7-оксанорборнен-производное.
- O-Glc-7-оксанорборнен-производное.
- O-Man-7-оксанорборнен-производное.
- Несимметричная манноза, включающая 7-оксанорборнен-производное.
- O-Man-7-оксанорборнен-производное.
- поли(7-оксанорборнен)ы на основе производных сахаров.
- поли(норборнен)ы на основе производных сахаров.
Хотя полимерные связующие вещества по настоящему изобретению содержат основную цепь, образованную негидролизуемыми ковалентными связями, указанные полимерные связующие вещества могут также включать боковые цепи, содержащие гидролизуемые ковалентные связи.
Термин "глютен" означает белковую группу, обнаруженную в различных зерновых. Глютен может быть разделен на фракции этанол-растворимых проламинов и этанол-нерастворимых глютенинов. Спирторастворимые проламины пшеницы, ржи, ячменя и, возможно, овса являются токсическими для организма пациентов с глютеновой болезнью. Общим свойством проламина пшеницы является высокое содержание глутамина (>30%) и пролина (>15%). Проламины пшеницы подразделяются на α/β-, γ- и ω-глиадины, содержащие одинаковые или периодически повторяющиеся глутамин- и пролин-обогащенные пептидные эпитопы, которые, очевидно, ответственны за наблюдаемую токсичность глютена.
Термин "пептид, образующийся при расщеплении глютена" означает любой пептид, образующийся при расщеплении глютена, который требуется связать полимерами по настоящему изобретению после всасывания глютена. Указанный термин включает, но не в порядке ограничения, все пептиды, перечисленные в Ciccocioppo [23].
Термин "высокомолекулярный полимер" означает полимер с молекулярной массой в пределах от 5,000 до 5,000000 г/моль.
Термин "фармацевтически приемлемый носитель" означает раствор, суспензию, эмульсию, таблетку или капсулу, полученные с общеупотребимыми наполнителями, такими как описаны в Modern Pharmaceutics [27].
Термин "фармацевтически эффективное количество" полимера по настоящему изобретению означает количество, являющееся эффективным для снижения взаимодействия глютена или пептидов, образующихся при расщеплении глютена, со слизистой оболочкой желудочно-кишечного тракта после всасывания глютена у нуждающегося в таком лечении пациента. Эффективное количество полимера по настоящему изобретению может составлять приблизительно в пределах от 200 мг до 15 г в день (например, 200 мг; 250 мг; 300 мг; 500 мг; 750 мг; 1 г; 1,5 г; 2 г; 2,5 г; 3 г, 5 г; 7,5 г).
Термин "специфически связывается" в выражении "полимерное связующее вещество, которое специфически связывается с глютеном или пептидами, образующимися при расщеплении глютена", означает способность полимера связываться в желудочно-кишечном тракте с белками или пептидами, образующимися при всасывании пищи, которые являются гидрофобными, такими как глютен и образующиеся из глютена пептиды, в большей степени, чем глютен и указанные пептиды связываются с другими белками пищи, такими как казеин и/или альбумин.
Настоящее изобретение охватывает линейные и звездообразные полимеры. Звездообразные полимеры согласно специфическим вариантам осуществления настоящего изобретения имеют 3-18 лучей.
Термин "нуждающийся в таком лечении пациент" означает человека, страдающего глютеновой болезнью, съедающего или съевшего глютенсодержащую пищу.
Термины "включающий" и "содержащий" означают и употребляются наравне с фразами "включающий, но не ограниченный указанным" и "содержащий, но не ограниченный указанным".
Термин "такой как" означает и является взаимозаменяемым фразе "такой как, но не ограниченный указанным".
Другие объекты, преимущества и отличительные признаки настоящего изобретения станут более очевидными по прочтении следующего неограничительного описания специфических вариантов осуществления, приведенных в качестве примеров, только со ссылкой на сопровождающие чертежи.
Краткое описание чертежей
В приложенных чертежах:
Фиг.1 представляет химические структуры линейных и многофункциональных инициаторов ATRP, используемых для синтеза описанных здесь полимеров, (i) PEG-диброммакроинициатора; (ii) 1,2,3,4,6-пента-O-изобутирилбромид-R-D-глюкозы; (iii) октадека-O-изобутирилбромид-R-циклодекстрина; (iv) окта-O-изобутирилбромидсахарозы;
Фиг.2 представляет SDS-PAGE связывания альбумина и α-глиадина с сополимером (HEMA-SStNa) (пример 10) при pH 6,8, в трипликате: (A) белковые стандарты; (B) смесь альбумина и α-глиадина; (C) смесь альбумина (40 мг/л), α-глиадина (40 мг/л) и сополимера (HEMA-SStNa) (160 мг/л);
Фиг.3 представляет профиль связывания линейного сополимера (HEMA-SStNa) с глиадином, альбумином и казеином при pH 1,2 и 6,8, где каждая точка соответствует полимеру по каждому из примеров 5-10 и 12-13;
Фиг.4 представляет профиль связывания линейного сополимера (HEMA-SPMAK) с глиадином и альбумином при pH 1,2 и 6,8, где каждая точка соответствует полимеру по каждому из примеров 17-21;
Фиг.5 графически представляет влияние структуры полимера на связывание глиадина при нейтральном pH (SStNa=25-31 мол.%; см. примеры 9, 14, 15 и 16);
Фиг.6 графически представляет влияние структуры полимера на связывание глиадина при нейтральном pH (SPMAK=16-19 мол.%; см. примеры 18, 22, 23 и 24);
Фиг.7 представляет влияние полимера по изобретению на пищеварительное расщепление глиадина в моделируемых интестинальных условиях. Сравнительные ВЭЖХ-профили глиадина, расщепляемого под действием пепсина, трипсина и химотрипсина (PTC) в отсутствие (a) и в присутствии (b) полимера. Хроматограмма (c) соответствует исходному α-глиадину;
n
w
Фиг.8 представляет изменение трансэпителиального электрического сопротивления (TEER) Caco-2 монослоя после инкубации с растворами PEG (M: 35,000; белые кружки), PVP (M: 58,000; черные квадраты), сополимера (HEMA-SStNa) (пример 10; белые треугольники) и полной средой (черные звездочки) в качестве контроля. Клетки поддерживают в DMEM клеточной культуральной среде, пополненной 10% FBS. Концентрация полимера имеет фиксированное значение, равное 1 г/л; и
Фиг.9 представляет профиль связывания двух линейных сополимеров (HEMA-SStNa), содержащих около 50% SStNa и имеющих две различных молекулярных массы (примеры 10 и 11), с глиадином и альбумином при pH 1,2 и 6,8.
Описание иллюстративных вариантов осуществления
Материалы
α-Глиадин любезно предоставлен институтом Institut National de Ia Recherche Agronomique (Nantes, France). α-Глиадин получают из мягкой пшеницы, как описано Popineau et al. (16-21). Вкратце, после экстракции сырого глиадина из глютена (выделенного из муки), подгруппы глиадина разделяют и очищают последовательно ионообменной хроматографией, гель-хроматографией и, наконец, хроматографией гидрофобного взаимодействия.
n
Альбумин сыворотки теленка закупают у Serological Proteins (Kankakee, IL). α-Казеин (из коровьего молока), SStNa, HEMA, SPMAK, R-D-глюкозу, α-циклодекстрингидрат, сахарозу (98%), поли(этиленгликоль) (PEG) (M 2000), 2-бромизобутирилбромид, бромид меди Cu(I)Br и 2,2'-дипиридил, все закупают у Sigma-Aldrich (St Louis, MO) и используют в состоянии поставки. Пробирки Эппендорфа, микродозаторы и 96-луночные планшеты (максимальное извлечение) получены от Axygen Scientific (Union City, CA).
Синтез инициаторов
Инициаторы радикальной полимеризации с переносом атома (ATRP) (фиг.1) получают из PEG, R-D-глюкозы, сахарозы и α-циклодекстрина. Бромидную функционализацию последних трех молекул осуществляют по методике, описанной Stenzel-Rosenbaum'ом и сотрудниками [22].
Настоящее изобретение иллюстрируется более подробно следующими неограничивающими примерами.
ПРИМЕР 1
Синтез PEG-диброммакроинициатора (i)
n
Раствор HO-PEG-OH (M 2000, 10 г, 5 ммоль) и триэтиламина (10 г, 0,1 моль) в 70 мл безводного толуола слегка охлаждают на бане лед-вода. Затем к реакционной смеси медленно добавляют 2-бромизобутирилбромид (4,91 мл, 0,04 моль). Раствор нагревают до комнатной температуры и перемешивают в течение 48 ч. Смесь фильтруют, половину раствора выпаривают и PEG-макроинициатор осаждают в охлажденный диэтиловый эфир (фиг.1 (i)).
1
3
Выход: 90%, после осаждения. Белое твердое вещество. Н ЯМР (δ, м.д., СDCl): 3,50 (188H), 1,80 (12H, c).
ПРИМЕР 2
Синтез 1,2,3,4,6-Пента-O-изобутирилбромид-R-D-глюкозы (ii)
4
2-бромизобутирилбромид (50 г, 0,22 моль) медленно добавляют к раствору R-D-глюкозы (5,0 г, 0,028 моль) в безводной смеси из хлороформа (100 мл) и пиридина (50 мл). Раствор нагревают до температуры кипения с обратным холодильником в течение 3 ч, сохраняя сухую атмосферу, и затем перемешивают при комнатной температуре еще 12 ч. После чего промывают последовательно охлажденной льдом водой, NaOH (0,1 M) и водой, и сушат над безводным MgSO. Сырой продукт перекристаллизовывают из метанола, получая белые кристаллы (фиг.1 (ii)).
1
3
Выход: 70%. Н-ЯМР (СDCl): 1,85-2,04 (м, 30Н, Н-7), 6,42 (д, 1Н, Н-1), 5,25 (дд, 1Н, Н-2), 5,69 (т, 1Н, Н-3), 5,35 (т, 1Н, Н-4), 4,38 (м, 3Н, Н-5/6).
ПРИМЕР 3
Синтез октадека-O-изобутирилбромид-R-циклодекстрина (iii)
4
2
Октадека-O-изобутирилбромид-R-циклодекстрин синтезируют путем медленного добавления 2-бромизобутирилбромида (50 г, 0,22 моль) к раствору R-циклодекстрина (5,0 г, 0,005 моль) в безводном пиридине (150 мл). Раствор перемешивают в течение 24 ч в сухой атмосфере при комнатной температуре. Затем промывают охлажденной льдом водой, NaOH (0,1 M) и водой, в указанном порядке, после чего сушат над безводным MgSO. Сырой продукт перекристаллизовывают из смеси метанол/HO (3:1, о/о), получая белые кристаллы (фиг.1 (iii)).
1
3
Выход: 55%. Н-ЯМР (СDCl): 1,95 (м, 108Н, Н-7), 5,84 (д, 12Н, Н-1), 4,46 (дд, 6Н, Н-2), 5,7 (м, 6Н, Н-3), 5,13/5,38 (т/дд, 6Н, Н-4), 4,78 (дд, 6Н, Н-5), 4,45 (м, 6Н, Н-6).
ПРИМЕР 4
Синтез окта-O-изобутирилбромидсахарозы (iv)
4
2
Окта-O-изобутирилбромидсахарозу синтезируют путем медленного добавления 2-бромизобутирилбромида (50 г, 0,22 моль) к раствору сахарозы (5,0 г, 0,014 моль) в безводном пиридине (150 мл). Раствор перемешивают в течение 24 ч в сухой атмосфере при комнатной температуре. Затем промывают охлажденной льдом водой, NaOH (0,1 M) и водой, после чего сушат над безводным MgSO. Сырой продукт перекристаллизовывают из смеси метанол/HO (3:1, о/о), получая белые кристаллы (фиг.1 (vi)).
1
3
Выход: 50%. Н-ЯМР (СDCl): 1,99 (м, 48Н, Н-7), 4,15 (д, 1Н, Н-5'), 4,46 (м, 5Н, Н-6'/1'/5'), 4,68 (дт, 2Н, Н-6), 4,81 (д, 1Н, Н-3'), 5,13 (дд, 1Н, Н-2), 5,38 (т, 1Н, Н-4'), 5,67 (т, 1Н, Н-4), 5,76 (т, 1Н, Н-3), 5,85 (д, 1Н, Н-1).
ПРИМЕР 5
Синтез линейного сополимера гидроксиэтилметакрилат (HEMA)/гидрат натриевой соли 4-стиролсульфоновой кислоты (SStNA) (93,5/6,5 мол.% после очистки)
2
w
w
n
TM
Инициатор ATRP i (фиг.1) (50 мг), SStNa (0,375 г) и HEMA (7,12 г) растворяют в 46 мл смеси метанол/вода (1/4) и дегазируют аргоном в течение 15 мин. Затем добавляют при перемешивании и при 20°C Bpy (20,28 мг), Cu(I)Br (7,2 мг) и Cu(II)Br (3,35 мг). Спустя 24 ч раствор подвергают воздействию воздуха, и темно-коричневый раствор становится синим, что указывает на окисление Cu(I) до Cu(II). Полимер очищают, пропуская раствор метанол/вода через колонку с силикагелем, который удаляет катализатор Cu(II). Полимеры подвергают диализу (Spectra/Por № 1, MW в пределах 6000-8000, Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, CA) против воды в течение 48 ч и затем высушивают сублимацией перед употреблением. M=318 700 г/моль; M/M=2,54.
ПРИМЕР 6
Синтез линейного сополимера гидроксиэтилметакрилат/гидрат натриевой соли 4-стиролсульфоновой кислоты (90,3/9,7 мол.% после очистки)
2
w
w
n
Инициатор ATRP i (фиг.1) (50 мг), SStNa (0,375 г) и HEMA (7,12 г) растворяют в 46 мл смеси метанол/вода (1/4) и дегазируют аргоном в течение 15 мин. Затем добавляют при перемешивании и при 20°C Bpy (21,84 мг), Cu(I)Br (7,2 мг) и Cu(II)Br (4,48 мг). Спустя 24 ч раствор подвергают воздействию воздуха, и полимер очищают, как указано в примере 5. M=331 528, M/M=2,9.
ПРИМЕР 7
Синтез линейного сополимера гидроксиэтилметакрилат/гидрат натриевой соли 4-стиролсульфоновой кислоты (87,8/12,2 мол.% после очистки)
w
w
n
Инициатор ATRP i (фиг.1) (50 мг), SStNa (0,75 г) и HEMA (6,747 г) растворяют в 46 мл смеси метанол/вода (1/4) и дегазируют аргоном в течение 15 мин. Затем добавляют при перемешивании и при 20°C Bpy (15,6 мг) и Cu(I)Br (7,2 мг). Спустя 24 ч раствор подвергают воздействию воздуха и полимер очищают, как указано в примере 5. M=283 600 г/моль, M/M=2,57.
ПРИМЕР 8
Синтез линейного сополимера гидроксиэтилметакрилат/гидрат натриевой соли 4-стиролсульфоновой кислоты (82,4/17,6 мол.% после очистки)
w
w
n
Инициатор ATRP i (фиг.1) (50 мг), SStNa (1,125 г) и HEMA (6,426 г) растворяют в 46 мл смеси метанол/вода (1/4) и дегазируют аргоном в течение 15 мин. Затем добавляют при перемешивании и при 20°C Bpy (15,6 мг) и Cu(I)Cl (5 мг). Спустя 24 ч раствор подвергают воздействию воздуха и полимер очищают, как указано в примере 5. M=275 500 г/моль, M/M=2,5.
ПРИМЕР 9
Синтез линейного сополимера гидроксиэтилметакрилат/гидрат натриевой соли 4-стиролсульфоновой кислоты (69/31 мол.% после очистки)
w
w
n
(ЯМР)
Инициатор ATRP i (фиг.1) (50 мг), SStNa (1,5 г) и HEMA (5,99 г) растворяют в 46 мл смеси метанол/вода (1/4) и дегазируют аргоном в течение 15 мин. Затем добавляют при перемешивании и при 20°C Bpy (15,6 мг) и Cu(I)Cl (5 мг). Спустя 24 ч раствор подвергают воздействию воздуха и полимер очищают, как указано в примере 5. M=NA; M/M=NA. Mn=58 100 г/моль.
ПРИМЕР 10
Синтез линейного сополимера гидроксиэтилметакрилат/гидрат натриевой соли 4-стиролсульфоновой кислоты (51,5/48,5 мол.% после очистки)
w
w
n
Инициатор ATRP i (фиг.1) (50 мг), SStNa (3,2 г) и HEMA (3,95 г) растворяют в 46 мл смеси метанол/вода (1/4) и дегазируют аргоном в течение 15 мин. Затем добавляют при перемешивании и при 20°C Bpy (15,6 мг) и Cu(I)Br (7,2 мг). Спустя 24 ч раствор подвергают воздействию воздуха и полимер очищают, как указано в примере 5. M=122 000 г/моль; M/M=2,23.
ПРИМЕР 11
Синтез линейного сополимера гидроксиэтилметакрилат/гидрат натриевой соли 4-стиролсульфоновой кислоты (43/57 мол.% после очистки)
(ЯМР)
Инициатор ATRP i (фиг.1) (50 мг), SStNa (2,4 г) и HEMA (1 г) растворяют в 23 мл смеси метанол/вода (1/4) и дегазируют аргоном в течение 15 мин. Затем добавляют при перемешивании и при 20°C Bpy (15,6 мг) и Cu(I)Br (7,2 мг). Спустя 24 ч раствор подвергают воздействию воздуха и полимер очищают, как указано в примере 5. Mn=55 000 г/моль.
ПРИМЕР 12
Синтез линейного сополимера гидроксиэтилметакрилат/гидрат натриевой соли 4-стиролсульфоновой кислоты (28/72 мол.% после очистки)
w
w
n
Инициатор ATRP i (фиг.1) (50 мг), SStNa (4,8 г) и HEMA (1, 975 г) растворяют в 46 мл смеси метанол/вода (1/4) и дегазируют аргоном в течение 15 мин. Затем добавляют при перемешивании и при 20°C Bpy (15,6 мг) и Cu(I)Br (7,2 мг). Спустя 24 ч раствор подвергают воздействию воздуха и полимер очищают, как указано в примере 5. M=65 200 г/моль; M/M=1,95.
ПРИМЕР 13
Синтез линейного поли(гидрата натриевой соли 4-стиролсульфоновой кислоты)
w
w
n
(ЯМР)
Инициатор ATRP i (фиг.1) (50 мг) и SStNa (6,4 г) растворяют в 46 мл воды и дегазируют аргоном в течение 15 мин. Затем добавляют при перемешивании и при 20°C Bpy (15,6 мг) и Cu(I)Br (7,2 мг). Спустя 24 ч раствор подвергают воздействию воздуха и полимер очищают, как указано в примере 5. M=NA; M/M=NA. Mn=20 000 г/моль.
ПРИМЕР 14
Синтез линейного поли(гидрата натриевой соли 4-стиролсульфоновой кислоты)
w
w
n
n(ЯМР)
Инициатор ATRP i (фиг.1) (50,3 мг) и SStNa (1,56 г) растворяют в 20 мл воды и дегазируют аргоном в течение 15 мин. Затем добавляют при перемешивании и при 20°C Bpy (15,6 мг) и Cu(I)Br (7,2 мг). Спустя 24 ч раствор подвергают воздействию воздуха и полимер очищают, как указано в примере 5. M=NA; M/M=NA. M=57 500 г/моль.
ПРИМЕР 15
Синтез сополимера гидроксиэтилметакрилат/гидрат натриевой соли 4-стиролсульфоновой кислоты (69/31 мол.% после очистки) в форме 5-лучевой звезды
w
w
n
Инициатор ATRP ii (фиг.1) (142,6 мг), SStNa (1,55 г) и HEMA (4,616 г) растворяют в 30 мл смеси метанол/вода (8/1) и дегазируют аргоном в течение 15 мин. Затем добавляют при перемешивании и при 20°C Bpy (230,75 мг) и Cu(I)Br (106 мг). После 1 ч взаимодействия добавляют 10 мл воды и затем раствор выдерживают при комнатной температуре в течение 24 ч. Соответствующий сополимер окончательно очищают, как указано в примере 5. M=85 000 г/моль; M/M=1,79.
ПРИМЕР 16
Синтез сополимера гидроксиэтилметакрилат/гидрат натриевой соли 4-стиролсульфоновой кислоты (75/25 мол.% после очистки) в форме 8-лучевой звезды
w
w
n
Инициатор ATRP iv (фиг.1) (141 мг), SStNa (1,5 г) и HEMA (4,616 г) растворяют в 30 мл смеси метанол/вода (8/1) и дегазируют аргоном в течение 15 мин. Затем добавляют при перемешивании и при 20°C Bpy (230,8 мг) и Cu(I)Br (106 мг). После 1 ч взаимодействия добавляют 10 мл воды и затем раствор выдерживают при комнатной температуре в течение 24 ч. Соответствующий сополимер окончательно очищают, как указано в примере 5. M=210 000 г/моль; M/M=2,03.
ПРИМЕР 17
Синтез сополимера гидроксиэтилметакрилат/гидрат натриевой соли 4-стиролсульфоновой кислоты (69/31 мол.% после очистки) в форме 18-лучевой звезды
w
w
n
Инициатор ATRP iii (фиг.1) (153,5 мг), SStNa (1,5 г) и HEMA (4,62 г) растворяют в 30 мл смеси метанол/вода (8/1) и дегазируют аргоном в течение 15 мин. Затем добавляют при перемешивании и при 20°C Bpy (230,75 мг) и Cu(I)Br (106 мг). После 1 ч взаимодействия добавляют 10 мл воды и затем раствор выдерживают при комнатной температуре в течение 24 ч. Соответствующий сополимер окончательно очищают, как указано в примере 5. M=206 000 г/моль; M/M=2,6.
ПРИМЕР 18
Синтез линейного сополимера гидроксиэтилметакрилат (HEMA)/калиевая соль сульфопропилметакрилата (SPMAK) (86/14 мол.% после очистки)
w
w
n
(ЯМР)
Инициатор ATRP i (фиг.1) (100,3 мг), SPMAK (1,85 г) и HEMA (5,62 г) растворяют в 30 мл метанола и дегазируют аргоном в течение 15 мин. Затем добавляют при перемешивании и при 20°C Bpy (31,96 мг) и Cu(I)Br (15,1 мг). После 24 ч раствор подвергают воздействию воздуха и полимер очищают, как указано в примере 5. M=NA; M/M=NA. Mn=66 500 г/моль.
ПРИМЕР 19
Синтез линейного сополимера гидроксиэтилметакрилат (HEMA)/калиевая соль сульфопропилметакрилата (SPMAK) (83/17 мол.% после очистки)
w
w
n
n(ЯМР)
Инициатор ATRP i (фиг.1) (102,1 мг), SPMAK (1,90 г) и HEMA (5,62 г) растворяют в 30 мл метанола и дегазируют аргоном в течение 15 мин. Затем добавляют при перемешивании и при 20°C Bpy (31,24 мг) и Cu(I)Br (14,34 мг). После 24 ч раствор подвергают воздействию воздуха и полимер очищают, как указано в примере 5. M=NA; M/M=NA. M=84 000 г/моль.
ПРИМЕР 20
Синтез линейного сополимера гидроксиэтилметакрилат/калиевая соль сульфопропилметакрилата (74/26 мол.% после очистки)
w
w
n
n(ЯМР)
Инициатор ATRP i (фиг.1) (100,5 мг), SPMAK (3,75 г) и HEMA (5,622 г) растворяют в 46 мл смеси метанол/вода (1/1) и дегазируют аргоном в течение 15 мин. Затем добавляют при перемешивании и при 20°C Bpy (32 мг) и Cu(I)Br (15,1 мг). После 24 ч раствор подвергают воздействию воздуха и полимер очищают, как указано в примере 5. M=NA; M/M=NA. M=119 000 г/моль.
ПРИМЕР 21
Синтез линейного сополимера гидроксиэтилметакрилат/калиевая соль сульфопропилметакрилата (45/55 мол.% после очистки)
w
w
n
(ЯМР)
Инициатор ATRP i (фиг.1) (100,7 мг), SPMAK (5,64 г) и HEMA (1,752 г) растворяют в 46 мл смеси метанол/вода (1/1) и дегазируют аргоном в течение 15 мин. Затем добавляют при перемешивании и при 20°C Bpy (32 мг) и Cu(I)Br (15,1 мг). После 24 ч раствор подвергают воздействию воздуха и полимер очищают, как указано в примере 5. M=NA; M/M=NA. Mn=108 500 г/моль.
ПРИМЕР 22
Синтез линейного поли(калийсульфопропилметакрилат)а
Инициатор ATRP i (фиг.1) (100,7 мг) и SPMAK (7,5 г) растворяют в 46 мл смеси метанол/вода (1/1) и дегазируют аргоном в течение 15 мин. Затем добавляют при перемешивании и при 20°C Bpy (32 мг) и Cu(I)Br (15,1 мг). После 24 ч раствор подвергают воздействию воздуха и полимер очищают, как указано в примере 5. Mw=NA; Mw/Mn=NA. Mn(ЯМР)=120 000 г/моль.
ПРИМЕР 23
Синтез сополимера гидроксиэтилметакрилат/калийсульфопропилметакрилат (82,4/17,6 мол.% после очистки) в форме 5-лучевой звезды
w
w
n
Инициатор ATRP ii (фиг.1) (143 мг), SPMAK (1,87 г) и HEMA (4,61 г) растворяют в 60 мл смеси метанол/вода (8/1) и дегазируют аргоном в течение 15 мин. Затем добавляют при перемешивании и при 20°C Bpy (230,6 мг) и Cu(I)Br (108 мг). После 24 ч раствор подвергают воздействию воздуха и полимер очищают, как указано в примере 5. M=161 000 г/моль; M/M=2,4.
ПРИМЕР 24
Синтез сополимера гидроксиэтилметакрилат/калийсульфопропилметакрилат (81/19 мол.% после очистки) в форме 8-лучевой звезды
w
w
n
Инициатор ATRP iv (фиг.1) (70,5 мг), SPMAK (0,935 г) и HEMA (2,3 г) растворяют в 60 мл смеси метанол/вода (8/1) и дегазируют аргоном в течение 15 мин. Затем добавляют при перемешивании и при 20°C Bpy (115,8 мг) и Cu(I)Br (53,9 мг). После 24 ч раствор подвергают воздействию воздуха и полимер очищают, как указано в примере 5. M=227 000 г/моль; M/M=2,27.
ПРИМЕР 25
Синтез сополимера гидроксиэтилметакрилат/калийсульфопропилметакрилат (82,4/17,6 мол.% после очистки) в форме 18-лучевой звезды
w
w
n
Инициатор ATRP iii (фиг.1) (75,3 мг), SPMAK (0,923 г) и HEMA (2,31 г) растворяют в 60 мл смеси метанол/вода (8/1) и дегазируют аргоном в течение 15 мин. Затем добавляют при перемешивании и при 20°C Bpy (115,8 мг) и Cu(I)Br (53,9 мг). После 24 ч раствор подвергают воздействию воздуха и полимер очищают, как указано в примере 5. M=342 000 г/моль; M/M=2,28.
ПРИМЕР 26
Оценка связывания полимер-глиадин
Селективность связывания и сродство глиадина к синтезированным полимерам оценивают путем электрофореза в геле натрийдодецилсульфат-полиакриламид (SDS-PAGE), используя 15% (м/о) разделяющий гель. Вдобавок отдельно проводят скрининг полимеров на реакционную способность в отношении контрольных белков, а именно альбумина сыворотки теленка и/или казеина сыворотки теленка. Изучения связывания проводят при pH 1,2 и 6,8, используя солянокислый и фосфатный буферы соответственно. Полимер (80 мг/л) и белок (40 мг/л) смешивают вместе при значениях pH 1,2 и 6,8 и инкубируют в течение 2 ч. Затем растворы центрифугируют при 15000×g в течение 30 мин в целях отделения нерастворимого комплекса от свободного белка, который остается в растворе. Затем супернатант анализируют методом SDS-PAGE для оценки количества свободного белка.
ПРИМЕР 27
Селективность связывания сополимера (HEMA-SStNa) с глиадином
Сродство к связыванию глиадина по отношению к различным линейным сополимерам (HEMA-SStNa) (синтезы, приведенные в примерах 5-10 и 12-14) оценивают методом SDS-PAGE, как описано в примере 26, и сравнивают с соответствующей величиной для альбумина и казеина (фиг.3, иллюстрирующая примеры 5-10 и 12-13) при значениях pH кишечника (6,8) и желудка (1,2). В общем полимер обладает большим сродством к глиадину по сравнению с контрольными белками при обоих значениях pH. Следует отметить, что образование комплекса с казеином не изучено при pH 1,2 по причине нерастворимости указанного белка в кислых условиях. Как показано на фиг.3, образование комплекса с глиадином можно модулировать с помощью состава сополимера. Фиг.2 также демонстрирует селективное связывание на SDS-PAGE между глиадином и линейным сополимером (HEMA-SStNa) (пример 10), тогда как альбумин остается свободным в растворе при инкубации сополимера с обоими белками. Сродство к связыванию глиадина по отношению к линейному сополимеру (HEMA-SStNa), полимеру по примеру 14, оценивают методом SDS-PAGE, как описано в примере 26, и сравнивают с соответствующей величиной для альбумина. Результаты следующие: комплексообразование с альбумином при значениях pH 1,2 и 6,8 составляет 78,8% и 11,23% соответственно; комплексообразование с глиадином при значениях pH 1,2 и 6,8 составляет 100% и 71,3% соответственно.
ПРИМЕР 28
Селективность композиционного связывания сополимеров (HEMA-SPMAK) с глиадином
Сродство к связыванию глиадина по отношению к различным линейным сополимерам (HEMA-SPMAK) (синтезы, приведенные в примерах 18-22) оценивают методом SDS-PAGE, как описано в примере 26, и сравнивают с соответствующей величиной для альбумина (фиг.4) при значениях pH кишечника (6,8) и желудка (1,2). Меньшее связывание с глиадином наблюдается при замене мономера SStNa на SPMAK, в особенности при pH 6,8 (фиг.4). Оптимальное комплексообразование с глиадином достигается для соотношений SPMAK в пределах от 50 до 100 мол.%.
ПРИМЕР 29
Влияние структуры сополимера на связывание с глиадином
Сополимеры (HEMA-SStNa) (примеры 15-17) и сополимеры (HEMA-SPMAK) (примеры 23-25) в форме пяти-, восьми- и восемнадцатилучевых звезд, синтезируют, используя инициаторы, полученные из глюкозы, сахарозы и циклодекстрина соответственно. Способность указанных сополимеров к связыванию глиадина сравнивают с линейными эквивалентами (примеры 9 и 18 соответственно). Результаты представлены на фиг.5 и 6. Для фиксированного процентного содержания SStNa, порядка 30 мол.%, эффективность связывания сополимера (HEMA-SStNa) в форме восьмилучевой звезды выше, чем линейного или других звездчатых сополимеров (фиг.5). При фиксированном соотношении SPMAK, равном 17 мол.%, не наблюдается существенного различия в связывании глиадина с линейным или звездчатым сополимером (HEMA-SPMAK) (фиг.6).
Выводы
Установлено, что линейные и звездообразные статистические сополимеры HEMA и SStNa или SPMAK связывают α-глиадин в условиях pH, имитирующих желудочно-кишечный тракт.
ПРИМЕР 30
Влияние молекулярной массы сополимера на связывание глиадина
Два линейных сополимера (HEMA-SStNa) с различными массами (примеры 10 и 11), содержащих около 50% SStNa, исследуют на связывание глиадина и альбумина при обоих значениях pH, 1,2 и 6,8. В данном эксперименте каждый белок тестируют отдельно. Результаты представлены на фиг.9. Установлено, что связывание глиадина и селективность связывания зависят от молекулярной массы полимера.
ПРИМЕР 31
Предотвращение ферментативного расщепления глиадина с помощью сополимера
Получение пептических-триптических гидролизатов глиадина
Ступенчатый ферментативный гидролиз α-глиадина осуществляют с помощью пепсина (Sigma P0609; St Louis, Missouri, USA) и трипсина (Sigma T1763), которые оба нанесены на агарозу, равно как α-химотрипсин из поджелудочной железы теленка (Sigma C4129). α-Глиадин (10 мг) растворяют в 5 мл солянокислого буфера с pH 1,2 (10 мМ) и добавляют пепсин (38 Ед.). Смесь перемешивают с помощью магнитной мешалки при 37°C в течение 2 часов, по достижении указанного момента pH доводят до 6,8 с помощью 0,1 моль/л NaOH и трипсина (0,75 Ед.), а также добавляют α-химотрипсин (0,5 Ед.). Гидролизат центрифугируют в течение 30 мин при 20°C и 6000 g. После чего пептиды глиадина собирают в супернатант и фильтруют через GHP-фильтры в 0,2 мкм.
18
Полученный пептический-триптический-химотриптический гидролизат глиадина анализируют, используя систему для высокоэффективной жидкостной хроматографии, ВЭЖХ, Waters™, снабженную насосом 1525 Binary pump, двухволновым абсорбционным детектором 2487 и программным обеспечением Breeze Chromatography Software™ (Waters, Midford, MA). Пробы элюируют при 36°C и скорости потока, длине волны детектирования и объеме впрыска, равных 1 мл/мин, 215 нм и 50 мкл соответственно. Трифторуксусную кислоту используют в качестве агента для образования пары ионов и элюирование осуществляют с линейным градиентом, изменяющимся в диапазоне от 100% буфера A до 100% буфера B за 60 мин. Буфер A состоит из 0,1% трифторуксусной кислоты, 95% воды и 5% ацетонитрила, и буфер B состоит из 0,1% трифторуксусной кислоты, 5% воды и 95% ацетонитрила. Часть супернатанта каждой пробы разбавляют водой и анализируют на C-колонке для обращенно-фазовой хроматографии (Waters Nova-pack™ C18, 60 Å, 4 мкм, 3,9×300 мм).
Ферментативное расщепление комплекса глиадин-полимер
Сополимер (HEMA-SStNa) (пример 10) (4 г/л) и глиадин (2 г/л) смешивают вместе при pH 2 и инкубируют в течение 2 ч. Затем ступенчатое ферментативное расщепление комплекса глиадин-полимер осуществляют, как описано выше. Влияние полимерного связующего вещества на расщепление глиадина анализируют, используя ВЭЖХ, как указано выше (фиг.7).
Значительно меньше продуктов расщепления обнаруживается, когда глиадин комплексно связан с полимером (фиг.7).
ПРИМЕР 32
Влияние полимера на целостность монослоя Caco-2
5
2
2
Оценивают влияние сополимера (HEMA-SStNa) (пример 10) на целостность монослоя клеток Caco-2 и сравнивают с соответствующей величиной для PEG (35 кДа) и PVP (58 кДа) (фиг.8). Производят посев клеток на 12-луночные поликарбонатные фильтры Transwell (Corning, Acton, MA) при плотности посева 2,5×10 клетки/см. Caco-2 выращивают в модифицированной по способу Дульбекко эссенциальной среде (DMEM), пополненной 10% (о/о) сывороткой плода теленка, раствором заменимых аминокислот (0,1 мМ), Hepes буфером с pH 7,4 (10 мМ) и смесью пенициллин-стрептомицин (экв. 100 Ед/мл и 100 мкг/мл). Среду обновляют каждые 72 ч. Клетки выращивают в течение 21-28 дней при 37°C, 5% CO, для получения дифференцированного монослоя перед началом экспериментов. Исследования на токсичность осуществляют в полной DMEM среде. Считывание трансэпителиального электрического сопротивления (TEER) производят в заранее определенные моменты времени, используя систему для определения электрического сопротивления Millicell™ Electrical Resistance System (Millipore Corp. Bedford, MA) с одним электродом (World Precision Instruments, Sarasota, FL).
В обоих случаях, как для сополимера (HEMA-SStNa), так и для контрольных полимеров (PVP, PEG), TEER, измеренное спустя 24 часа, дает снижение на 10% исходной величины (фиг.8). Полученные результаты указывают на то, что сополимер (HEMA-SStNa), видимо, не может сильно нарушать целостность монослоя клеток Caco-2.
ПРИМЕР 33
Исследование влияния полимерного связующего вещества на снижение токсичности глиадина и продуктов расщепления глиадина in vivo
Способность полимера снижать токсичность глютена оценивают in vivo, определяя иммунную реакцию животных, сенсибилизированных в отношении глютена или продуктов расщепления глютена. Иммунную реакцию оценивают на трансгенных мышах, экспрессирующих HLA-DQ8 (24) после перрорального введения глютена или продуктов расщепления глютена в присутствии или отсутствие полимерного связующего вещества.
ПРИМЕР 34
Включение полимерного связующего вещества в пищу
Полимерное связующее вещество может быть включено в глютенсодержащую пищу, предназначенную индивидуумам, страдающим глютеновой болезнью. Полимерное связующее вещество в такой пище может затем препятствовать вредным воздействиям глютена, содержащегося в пище, при проглатывании. Такая пища включает, но не в порядке ограничения, быстро развариваемые кушанья, изделия из дробленого зерна, хлебобулочные изделия, такие как хлеб, пирожные, пироги, торты, сдоба, печенье и т.д. Такая пища может включать полимерное связующее вещество в концентрации от 0,01% до 10% (м/м). Полимерное связующее вещество может также быть включено в не содержащую глютен пищу, потребляемую с глютенсодержащей пищей. Не в порядке ограничения, такая не содержащая глютен пища включает пищевые продукты мажущей консистенции, такие как сыр, джем, масло, или любую пищу, которая может быть намазана на глютенсодержащую пищу или съедена с глютенсодержащей пищей.
Хотя данное изобретение раскрыто здесь с помощью специфических вариантов осуществления, возможна модификация, не выходящая за сущность и предмет рассматриваемого изобретения, определяемых приложенными пунктами формулы изобретения.
ССЫЛКИ
Nat Rev Immunol 2,
1. Sollid L.M. (2002)  647-655.
2. Shan L, Molberg О, Parrot I., Hausch F., Filiz F., Gray G.M., Sollid L.M., Kholsa C. (2002) Science 297, 2275-2279.
New England Journal of Medicine,
3. Charles H. Halsted, M.D, "The Many Faces of Celliac Disease" (1996)  May 2, 1996 - Volume 334, Number 18.
N England J Med;
4. Trier JS. Celiac sprue. (1991);  325; 1709-1719.
Digestion
5. Ciacci, С., Сirillo, M., Cavallaro, R. & Mazzacca, G. (2002)  66, 178-185.
Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Phyiol.
6. F., Shan, L., Santiago, N. A., Gray, G. M. & Khosla, C. (2002)  283, G996-G1003.
PNAS
8. Kim C. Y., Quarsten H., Bergseng E., Kholsa C., Sollid L.M. (2004) 101, 12, 4175-4179.
The Lancet
9. Fasano A., Not Т., Wang W., Uzzau S., Berti I., Tommasini A., Goldblum S.E. (2000),  355, 1518-1519.
Gastroenterology,
10. Molberg et al., (2005)  128, 393-401.
Gastroenterology,
11. Vader L.W. et al. (2003)  125, 1105-1113.
Nat Clin Pract Gastroenterol Hepatol.
12. Sollid L.M., Kholsa C. (2005)  2 (3), 140-147.
Antimicrob. Agents Chemother.
13. Kurtz, С. В., Cannon, E. P., Brezzani, A., Pitruzello, M., Dinardo, C., Rinard, E., Acheson, D. W.K., Fitzpatrick, R., Kelly, P., Shackett, K., Papoulis, А. Т., Goddard, P. J., Barker Jr, R. H., Palace, G. P. & Klinger, J. D. (2001)  45, 2340-2347.
Gastroenterology
14. Auricchio, S., De Ritis, G., De Vincenzi, M., Magazzù, G., Maiuri, L., Mancini, E., Minetti, M., Sapora, О. & Silano, V. (1990) 99, 973-978.
Eur. J. Gastroenterol. Hepatol.
15. Mothes, Т. & Stern, M. (2003)  15, 461-463.
Ann Technol. Agric.
16. Popineau, Y., Lefebvre, J., Godon, В., (1980)  29 (2), 191-204.
Chemistry
17. Popineau, Y., Godon, В., (1982) Cereal  59 (1), 55-62.
Plant Foods Hum. Nutr
,
18. Godon, В., Leblanc, M.P., Popineau, Y., (1983) Qual. 33161-168.
Cereal Sci,
19. Popineau, Y., (1985) J  3, 29-38.
Lebensm-Wiss.u.Technol.
20. Popineau, Y., Pineau, F., (1985)  18, 133-135.
Cereal Sci,
21. Popineau, Y., Le Guerroue, J.L., (1991) J  14, 231-241.
Macromolecules
22. Stenzel-Rosenbaum, M., Davis, T.P., Chen, V., Fane, A.G. (2001)  34, 5433-5438.
Clin. Exp. Immunol.,
23. Ciccocioppo, R., et al. (2005)  140:408-416.
(2003) Immunol. Lett.
24. Senger S., Luongo D.,  88, 2, 127-134.
Clin Chim Acta
25. Bolte G., Osman A., Mothes T, et al. (1996)  247, 59-70.
J. Agric. Food Chem.
26. Secundo F., Guerrieri N. (2005)  53, 1757-1764.
27. Modern Pharmaceutics, 4th edition. Banker GS and Rhodes CT (eds) Marcel Dekker, NY, 2002.