ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ТЕСТ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АУТОАНТИТЕЛ ПРОТИВ АНТИГЕНОВ СЕМЕННИКОВ
IMMUNOLOGICAL TEST FOR DETERMINING AUTOANTIBODIES AGAINST TESTICULAR ANTIGENS

Настоящее изобретение относится к иммунологическому тесту для обнаружения аутоантител против антигенов семенников, которые идентифицированы как очень значимые при иммунологически обусловленных и связанных с инфекцией формах бесплодия у самцов млекопитающих.
Тест применяют для постановки диагноза и контроля лечения заболеваний, которые сопровождаются повышением количества аутоантител против антигенов семенников, таких как связанные с воспалением нарушения мужской фертильности, например, скрытых, но протекающих симптоматически воспалениях в семенниках и сопутствующих мужских половых органах.
Предшествующий уровень техники.
Примерно каждую седьмую пару в Германии затрагивает проблема нежелательной неспособности иметь детей, причиной которой в половине случаев является мужчина, а в половине случаев женщина. У мужчин к основным причинам идиопатической стерильности (примерно 30%) причисляют урогенитальные инфекции или другие иммунологические факторы (в общем, примерно 12-15%) ограниченной фертильности. Системные острые и хронические воспалительные заболевания, а также местные инфекции и воспаления мужского урогенитального тракта играют важную роль сами по себе или как сопутствующие причины мужских нарушений фертильности. Хронические воспалительные изменения в семенниках (воспаление семенников или орхит) могут привести к остановке сперматогенеза, а также к существенным изменениям в количестве сперматозоидов и их качестве. В сочетании с ним в виде эпидидимоорхита, часто обнаруживается воспалительный процесс рядом с семенником (эпидидимит), частота которого, например, в США, составляет более чем 600000 случаев в год. Клинически важными при нарушениях фертильности также являются иммобилизованные на сперматозоидах и/или агглютинированные аутоантитела. Оценка важности иммунологически обусловленной мужской стерильности и ее последствий затрудняется в особенности тем, что ее течение с высокой долей вероятности будет бессимптомным.
Диагностика инфекций в семявыносящих каналах является неудовлетворительной. В основе ее лежит обнаружение возбудителей, повышенное содержание лейкоцитов и/или медиаторов воспаления в эякуляте, а также пониженная секреция добавочных желез. Бессимптомные воспалительные повреждения семенников, как правило, можно диагностировать только путем биопсии семенника, и поэтому они часто остаются нераспознанными в качестве причины или кофакторов нарушений фертильности. Поэтому предполагают, что воспаления имеют место у большой части пациентов с идиопатической стерильностью, и воспалительные причины приобрели большее значение, чем раньше.
Поэтому существует необходимость в тесте, который подходит для того, чтобы идентифицировать в жидкости организма или биологической пробе нарушения фертильности у мужчин, обусловленных воспалением, таких как, например, скрытые, однако симптоматически протекающие воспаления в семенниках и окружающих их гениталиях, таким образом, чтобы можно было избежать проведения биопсии семенника. К сожалению эластаза гранулоцитов и ИЛ-6 не являются специфичными, и поэтому они не подходят в качестве маркеров. До сих пор не известны подходящие маркеры, которые подходят в качестве специфических индикаторов, связанных с воспалением нарушений фертильности у мужчин, и которые можно использовать в каком-либо тесте.
Задачи изобретения
Задачей настоящего изобретения является приготовление маркера, который подходит в качестве специфического индикатора нарушений фертильности мужчин, связанных с воспалением, а также простой в исполнении и неинвазивный способ, с помощью которого этот маркер будет обнаруживаться в биологическом образце. Еще одной задачей является изготовление набора для осуществления этого способа.
Решение задач
Эта задача была решена в соответствии с настоящим изобретением с помощью иммунологического теста к индикатору и специфического определения аутоантител против антигена семенников, которые специфичны в отношении связанных с воспалением нарушений фертильности у мужчин, в биологическом образце согласно формуле изобретения.
Неожиданно в собственных экспериментах авторы изобретения обнаружили в биологических образцах особые аутоантитела против антигенов семенников, которые были идентифицированы как очень значимые при иммунологически опосредованной стерильности мужчин.
Эти результаты показали, что в биологических образцах, таких как, например, сыворотки пациентов с различными формами воспалений семенников, очень часто обнаруживается повышенный титр антител ER-60 и титр антител к трансферрину, и таким образом можно отделить их от здоровых испытуемых или мужчин, имеющих нарушения сперматогенеза не воспалительного характера (например, синдром клеток Сертоли, задержка сперматогенеза, олиго-атено-тератозооспермия).
Также проводили разделение экстракта семенников пациентов с нормальным сперматогенезом с помощью известного специалистам в данной области 2D-SDS-PAGE электрофореза и переносили на нитроцеллюлозную мембрану, как опубликовано, например, в Journal of Pathology (2005; 207, 127-138). Мембраны для иммуноблота инкубировали с контрольными сыворотками, полученными у женщин, у здоровых испытуемых, или с сыворотками пациентов, у которых после андрологического обследования были диагностированы различные формы очаговых или, реже, полностью развитых воспалений семенников. Аутореактивные пятна исследовали путем масс-спектрометрии (MALDI-MS) и идентифицировали белки, против которых в сыворотках мужчин, страдающих от стерильности, обусловленной воспалением, часто вырабатываются аутоантитела:
Количество положительных сывороток / общее количество сывороток (% реактивности)
Идентифицированные белки
12/13 (92%)
Дисульфид изомера ER-60 (синонимы Erp60, ERp57)
8/13 (61%)
Трансферрин (сидерофилин)
В контрольных сыворотках не развивалась реакция ни с одним из идентифицированных белковых пятен.
Неожиданно белок дисульфидизомераза ER-60 (синонимы: ERp57, р58, идентификатор: PDIA3_HUMAN) показал сильную специфическую аутореактивность 92%, а трансферрин (сидерофилин) показал сильную специфическую аутореактивность 61% с сыворотками пациентов с различными формами воспаления семенников.
Поэтому белки дисульфидизомераза ER-60 (синонимы: ERp57, р58, идентификатор: PDIA3_HUMAN) и трансферрин (сидерофилин) идентифицированы как специфические маркеры воспалений семенников у самцов млекопитающих. При проведении анализа последовательности нуклеиновых кислот и/или последовательности аминокислот этих белковых маркеров был изготовлен иммунологический тест, с помощью которого в биологических образцах специфически обнаруживали аутоантитела против антигенов семенников, в особенности аутоантитела к ER-60 и/или аутоантитела к трансферрину, которые обнаруживаются при нарушениях фертильности у мужчин, связанных с воспалением. Иммунологический тест для оценки и специфического определения аутоантител к антигенам семенников, которые сопутствуют нарушениям фертильности у мужчин, связанных с воспалением, в биологическом образце включает связывание аутоантитела с антигенами семенников, в частности аутоантител к ER-60 и/или аутоантител к трансферрину, со специфическим антигеном семенника, в частности ER-60 или трансферрином.
Тест по настоящему изобретению применяют для диагностики и терапевтического контроля скрытых, но протекающих симптоматически воспалений в семенниках и гениталиях самцов млекопитающих.
Для этого в биологических образцах самцов млекопитающих определяют количество аутоантител против антигенов семенников, в частности аутоантител к ER-60 и/или аутоантител к трансферрину, которые очень часто встречаются у пациентов с различными формами воспалительных процессов в семенниках. Определенное в образце содержание аутоантител к антигенам семенников затем сравнивают с неким референсным значением.
Согласно предпочтительному воплощению изобретения тест по изобретению включает определение содержания аутоантител к ER-60 в биологическом образце, в частности в сыворотке. Для этого в качестве маркера антигена семенников получали, в частности, рекомбинантный белок ER-60. Это успешно осуществляли с использованием последовательности нуклеиновой кислоты белка ER-60, которая представлена на Seq ID No.1, с помощью общеизвестных молекулярно-биологических способов рекомбинации, например, путем экспрессии в Е. соli, и как общепринято в данной области техники, например, очистки с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
Согласно настоящему изобретению на Seq ID No.1 приведена последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей белок дисульфидизомеразу ER-60 (синонимы: ERp57, р58, идентификатор: PDIA3_HUMAN), также содержащая белки, которые можно создать путем незначительных изменений в последовательности нуклеиновой кислоты, таких как добавки, делеции и/замены, если это не повлияет на функцию связывания аутоантител ER-60 в транслируемом белке.
Раскрытая согласно настоящему изобретению последовательность нуклеиновой кислоты белка дисульфидизомеразы ER-60 также включает синонимичные и гомологичные белки, такие как, например ERp57, р58, идентификатор: PDIA3_HUMAN.
Биологический образец представляет собой любой материал, полученный у млекопитающего, в частности у человека, содержащий аутоантитела, например биологические жидкости организма, такие как цельная кровь, сыворотка или плазма, семенная жидкость, спинно-мозговая жидкость, перитонеальная жидкость, слюна, слезная жидкость или моча, за исключением материала биопсии или ткани.
Находящиеся в биологическом образце аутоантитела к антигенам семенников, в частности аутоантитела к ER-60 и/или аутоантитела к трансферрину, обнаруживают с помощью специфического связывания с соответствующим антигеном семенника, в частности с белком ER-60 или трансферрином, и последующей детекции с помощью подходящего способа определения.
В соответствии с предпочтительным воплощением настоящего изобретения определение аутоантител к антигенам семенников, в особенности определение аутоантител к ER-60 и/или аутоантител к трансферрину, проводят с помощью иммунологических способов. В особенности подходящим является иммуноцитохимический способ, определение путем радиоиммунологического анализа (RIA - radioimmunoassay) или определение путем иммуноферментного анализа (ИФА, ELISA - Enzyme linked immunosorbent assay). Альтернативу представляет собой тест на каком-либо носителе с возможностью нанесения как можно меньшего объема, например тестовые полоски.
Проведение иммунологического теста включает приведение в контакт образца крови или другого биологического образца самца млекопитающего, в котором необходимо определить содержание аутоантител к антигенам семенника, с адсорбированным специфическим антигеном семенника, по меньшей мере одну отмывку для удаления неадсорбировавшихся компонентов и обнаружение адсорбировавшихся, связавшихся с антигеном аутоантител с помощью препарата lgG-антител, которые являются видоспецифичными для исследуемого самца млекопитающего и могут видоспецифично связываться с аутоантителами; например, в случае человека получают античеловеческие lgG-антитела, которые помечены таким образом, что их можно обнаружить с помощью каскада реакций типа биотин-стрептавидин-пероксидаза или -щелочная фосфатаза.
В предпочтительном воплощении связывания маркерных белков, в частности антигена семенников, например белок ER-60 или трансферрин, являются иммобилизованными на некой поверхности, например на планшете для титрования, слое поливинилхлорида, или слое какой-либо подходящей ткани, или тестовой полоске, и при этом осуществляют насыщение неспецифических связываний. Затем туда добавляют исследуемый биологический образец в жидкой форме, чтобы содержащиеся там аутоантитела связались с антигеном семенников, например аутоантитела к ER-60 связываются с иммобилизованным белком ER-60, а аутоантитела к трансферрину связываются с иммобилизованным трансферрином. Альтернативным является тест с аутоантителами к ER-60 и аутоантителами к трансферрину, в котором белок ER-60 или трансферрин иммобилизованы на какой-либо поверхности. После по меньшей мере одной стадии отмывки туда добавляют аутоантитела к вторичным антителам к антигену семенников, которые коньюгированы с ферментом, например щелочной фосфатазой или пероксидазой. После по меньшей мере одной повторной отмывки к образцу добавляют бесцветный или нефлюоресцирующий субстрат для связанного с вторичными антителами фермента. Этот фермент преобразует субстрат в цветной или флюоресцирующий продукт, концентрация которого может быть определена с помощью подходящего детектора, например фотометра.
С помощью этого иммунологического теста ИФА можно быстро и достоверно определить крайне малые количества аутоантител к антигенам семенников, в частности аутоантитела к ER-60 и/или аутоантитела к трансферрину. Еще одно преимущество данного теста заключается в том, что тест работает при использовании общепринятых приборов для ИФА и имеющихся в продаже микропланшетов 96-луночного, 256-луночного или даже 1024-луночного формата, чтобы одновременно проводить большое количество анализов.
При способе RIA проводят принципиально такие же стадии, как при ИФА анализе, но вместо вторых антител, конъюгированных с подходящим ферментом, применяют радиоактивно меченные вторые антитела. Количественное определение в данном случае осуществляют с помощью, например, счетчиков сцинтилляции.
Помимо вышеописанных способов определение аутоантител к антигенам семенников могут проводить качественно и количественно с помощью связывания маркерного протеина, т.е. связывания аутоантител к ER-60 с иммобилизованным белком ER-60 или связывания аутоантител к трансферрину с иммобилизованным трансферрином, а также другими известными специалистам в данной области техники иммунологическими способами, среди которых можно упомянуть, например, вестерн-блоттинг или способ дот-блот гибридизации.
Альтернативой является антиген семенника, в частности белок ER-60 и/или трансферрин, нанесенный в как можно меньшем количестве на какой-либо носитель, например на тестовые полоски с одной или более чем одной гигроскопичной матрицей на подходящем материале, который приводят в контакт с биологическим образцом, по возможности, в жидкой форме, таким образом, чтобы содержащиеся там аутоантитела к антигенам семенников оказались связанными и могли быть определены с помощью подходящей системы оценки, например с помощью построения визуальной линии.
Предпочтительно проводят качественное или количественное определение находящихся в жидкостях организма, таких как сыворотка или плазма индивидуума, аутоантител к антигенам семенников, в частности связывания аутоантител к ER-60 с иммобилизованным белком ER-60 или связывания аутоантител к трансферрину с иммобилизованным трансферрином, где значение связывания измеряют как флюоресценцию, например, в единицах оптической плотности (OD) при длине волны 450 и 570 нм. Значение абсорбции рассчитывают как разницу между значениями, полученными при длине волны 450 нм и 570 нм.
Это значение сравнивают с референсным значением. Референсное значение получают, например, на основании данных измерений биологических образов здоровых самцов млекопитающих и/или самцов млекопитающих с диагностированным орхитом.
Альтернативой является образец с определенной концентрацией антигена семенника, в частности ER-60 или трансферрина, а референсное значение устанавливают, например, путем получения сравнительных кривых или сравнительных таблиц или получают в виде сравнительных значений.
Предпочтительно референсное значение устанавливают параллельно с анализом образца. В качестве альтернативы возможно двойное определение референсного значения и образца. Например, референсное значение устанавливают на основании данных измерений биологических образцов здорового донора, при этом референсное значение предпочтительно должно составлять свыше 0,35 ОЕ. Например, референсное значение рассчитывают на основании данных измерений биологического образца донора с диагностированным скрытым или протекающим симптоматически орхитом, при этом референсное значение составит более 0,35 ОЕ, предпочтительно более 0,4.
Если содержание аутоантител к антигенам семенников, в особенности аутоантител к ER-60 и/или аутоантител к трансферрину, в биологическом образце составляет более 0,35 ОЕ, предпочтительно более 0,4, это является признаком наличия нарушений фертильности, связанных с воспалительным процессом. Иммунологический тест делает возможным улучшение диагностики без хирургического вмешательства, в особенности в биологических образцах пациентов со скрытыми или протекающими симптоматически нарушениями фертильности, связанными с воспалительными процессами, и позволяет избежать проведения биопсии яичка.
В частности, с помощью иммунологического теста по настоящему изобретению можно обнаружить аутоантитела к ER-60 и/или аутоантитела к трансферрину. На основании этого возможно разграничить диагнозы воспаления семенников и нарушений сперматогенеза воспалительного характера (синдром клеток Сертоли). Требуются новые систематические анализы, при которых будут учитываться даже отдельные изменения, такие как диссеминированные и встречающиеся в малом количестве лимфоциты. Иммунологический тест согласно настоящему изобретению также можно применять для проверки успешности применения терапии нарушений фертильности, связанных с воспалением.
Поскольку иммунологический тест согласно настоящему изобретению можно легко стандартизировать, его можно применять в медицине человека, в особенности при мониторинге оплодотворения in vitro, или при установлении оплодотворения и экспертизе оплодотворения, а также в рамках современного животноводства.
Биологический образец по настоящему изобретению получают у самца млекопитающего, наиболее предпочтительно у мужчины.
Иммунологический тест по настоящему изобретению простым способом может быть изготовлен в форме готового для применения «набора», который содержит антиген ER-60 и/или трансферрин, абсорбированные на носителе, и препарат lgG-антител, которые являются видоспецифичными для разных млекопитающих, и могут видоспецифично связываться аутоантителами, например, раствор для применения у людей содержит античеловеческие IgG-антитела, помеченные таким образом, что они выявляются в ходе каскада реакций типа биотин-стрептавидин-пероксидаза или -щелочная фосфатаза.
Альтернативно, набор содержит носитель, а также буфер и реагенты, например реактивы, за счет которых проявляется окрашивание, для оценки того, прошла ли реакция успешно, такие как, например, стрептавидин, коньюгированный с какой-либо меткой.
Альтернативно, набор дополнительно содержит стандартный образец антител к ER-60 или антител к трансферрину для калибровки набора, где для оценки аутоантител к ER-60 добавлен стандартный образец антител к ER-60, а для оценки аутоантител к трансферрину добавлен стандартный образец анител к трансферрину.
Примеры осуществления
Пример I. Приготовление ER-60
Предпочтительно готовят рекомбинантный, экспрессирующийся в Е. coli белок дисульфидизомеразу ER-60 (синонимы: ERp57, р58, идентификатор: PDIA3_HUMAN). Его получают, например, из экспрессирующего клона, который несет в себе последовательность ДНК человеческого ER-60, например, экспрессирующий клон pET-hER-60, как описано, например, у Urade et al., J. Biochem. 122, 834-842; 1997. Осуществляют экспрессию этого белка, например, в Е.coli BL21 (DE3), например, в соответствии с протоколом, приведенным у Urade et al. J Biol Chem. 267 (21):15152-15159), и очищают, например, путем ВЭЖХ.
600нм
600нм
Затем E.coli BL21(DE3) трансформируют экспрессирующей плазмидой pET-hER60 и культивируют в подходящих условиях, например, в присутствии ампициллина (500 мкг/мл) в 400 мл среды, например среды LB (1% триптон, 0,5% экстракта дрожжей, 1% NaCl; рН 7,0) при 30°C. Экспрессия белка индуцируется при подходящем значении ОЕ, например при значении OE=0,5, например, при добавлении 0,5 мМ изопропил-1-THO-β-D-галактопиранозида (IPTG) при 30°C в течение приблизительно 2 ч. Затем бактериальную культуру собирают в подходящих условиях и осаждают, например, в 10 мл буфера, ресуспендируют, например, в 20 мМ N-2-гидроксифенил-пиперазин-N-2-эталсульфоновой кислоты-КОН (HEPES-KOH) (рН 6,8), 50 мМ KCl, 5 мМ этилендиамин тетрауксусной кислоты EDTA (рН 8,0), 1 мМ фенилметилсульфонил-фторида (PMSF) и обрабатывают ультразвуком. Клеточный лизат центрифугируют приблизительно в течении 30 мин при 4°C при 5000g, а супернатант осаждают 60 и 70%-ным насыщенным сульфатом аммония в течение 30 мин при 4°C и затем центрифугируют при 5000g в течение 30 мин. Белковый осадок суспендируют в 500 мкл буфера, например, 20 мМ HEPES-KOH (рН 6,8), 50 мМ KCl, 5 мМ EDTA (рН 8,0), 1 мМ дихлордифенилтрихлорэтана (DTT), и очищают, например, путем гель-фильтрации (Super-dex 200 HR) на ВЭЖХ. На альтернативной стадии фракции, содержащие hER-60, очищают дополнительно, например, с помощью Mono Q колонки, например, в 10 мл буфера, например в 20 мМ HEPES-KOH (рН 6,8), 50 мМ KCl, 5 мМ EDTA (рН 8,0), 1 мМ DTT.
Чистоту белка проверяют, например, в полиакриламидном геле с додецил сульфатом натрия.
2. Иммунологический тест
2
4
В планшет для иммуноферментного анализа (ИФА), например планшет для ИФА анализа MaxiSorp (Nunc), наносят рекомбинантный ER-60, например, 2,5 мкг/мл в течение ночи при 4°C в 0,1 М карбонате натрия, рН 9,5, промывают подходящим буфером, например фосфатным буфером (PBS, рН 7,2+0,05% Tween-20), и блокируют, например, 2%-ным сухим обезжиренным молоком в PBS при комнатной температуре (КТ) в течение 2,5 ч. После блокирования наносят неспецифические сайты связывания на каждый контрольный образец и тестовый образец сыворотки в серии разведений (от неразведенного до разведения 1:1000 в блокирующем растворе) в дублированном количестве на планшет с нанесенным рекомбинантным белком ER-60 и инкубируют в течение 1 ч при КТ. После окончания инкубации лунки отмывают, по меньшей мере, один раз, и затем инкубируют со вторыми видоспецифичными антителами, например, с античеловеческими биотинилированными IgG (1:100000 в блокирующем растворе), по меньшей мере, в течение одного часа при комнатной температуре. После, по меньшей мере, однократной отмывки образцы инкубируют с стрептавидином - пероксидазой хрена (GE Healthcare) в разведении 1:4000 в промывочном буфере в течение 20 мин при комнатной температуре. После, по меньшей мере, однократной отмывки в течение 20 мин развивается цветовая реакция, например, с ТМВ (3,3',5,5'-тетраметилбензидином; BD Biosciences). Цветовую реакцию останавливают, например, 2N HSO. Абсорбцию (значение ОЕ) измеряют при длине волны 450 и 570 нм. Значение абсорбции представляет собой разницу между значением, полученным при длине волны 450 нм, и значением, полученным при длине волны 570 нм.
3. Применение
Предпочтительно иммунологический тест применяют для определения количества аутоантител к ER-60 в биологических образцах, предпочтительно в сыворотке или плазме. Полученное при измерении значение сравнивают с референсным значением. Референсное значение получают, например, на основании данных измерений образцов здорового донора, и оно предпочтительно составляет около 0,35 ОЕ. Альтернативно, референсное значение получают на основании данных измерений образцов доноров с диагностированным орхитом, и тогда референсное значение составляет более 0,35 ОЕ, предпочтительно более 0,4. Альтернативно, в набор добавляют образец с определенной концентрацией ER-60, и референсное значение получают на основании сравнительных кривых, или сравнительных таблиц, или в виде сравнительных значений. Предпочтительно референсное значение определяют параллельно с анализом образца.
Если содержание аутоантител к ER-60 в образце составляет более 0,35 ОЕ, предпочтительно более 0,4, это является признаком наличия нарушений оплодотворения, связанных с воспалительным процессом у самцов млекопитающих.
4. Текущий контроль
Для контроля иммунологического теста по настоящему изобретению проводили многочисленные серии исследований, в которых сравнивали содержание аутоантител к ER-60 в контрольной группе в сыворотках людей, не страдающих андрологическими заболеваниями, а также в нормальном эякуляте, с различными группами пациентов. Группы пациентов составляли следующим образом
1. Сыворотки мужчин с нарушениями оплодотворения. Критерием для включения в эту группу служила концентрация сперматозоидов менее 10 миллионов/мл, у которых не было никаких признаков инфекций или воспалений.
2. Сыворотки мужчин, у которых на основании исследования эякулята обнаруживались признаки воспаления семявыносящих протоков.
3. Сыворотки мужчин, у которых при биопсии яичка были обнаружены признаки воспаления семенников.
4. Сыворотки мужчин, у которых воспаление семенников или воспаление семявыносящих протоков лечили диклофенаком для того, чтобы проверить, коррелирует ли концентрация аутоантител к ER-60 с успешным лечением.