Зависимость дифференцировки макрофагов от структуры имплантируемого материала

«Дни иммунологии в СПб 2017» Immunology Days in St. Petersburg 2017

Медицинская Иммунология Medical Immunology (Russia)/Meditsinskaya Immunologiya

дермией. Бактерии выращивали в течение 24 часов в мя-сопептонном бульоне (МПБ) с синтетическим пептидом активного центра GM-CSF (в конечной концентрации 10 мкг/мл) и без него, после чего культуры центрифугировали при 3000 об/мин в течение 30 минут и отбирали надо-садочную жидкость (супернатант).

Наличие в супернатантах бактерий цитокинов (ЦПВ) и их уровень определяли на приборе MAGPIX-100 (USA) с использованием тест-системы мультиплексного анализа (Multiplex) компании Luminex (USA) для определения 15 цитокинов (G-CSF, GM-CSF, IFNy, IL-10, IL-12p70, IL-13, IL-17A, IL-1ß, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, MCP-1,MIP-1ß, TGF-a); контролем служил МПБ без бактерий. Опыты проводили в двух повторностях; результаты измерений округляли до 0,1 пкг/мл; при регистрации в супернатанте цитокинов в концентрации меньше 3 пкг/мл считали, что в образце ЦПВ отсутствуют. Данные обработаны методами вариационной статистики. О достоверности отличий между опытными и контрольными группами судили по критерию Стьюдента — t (p < 0,05).

Результаты. Добавление в МПБ синтетического пептида активного центра GM-CSF по-разному влияло на продукцию ЦПВ бактериями в зависимости от их видовой/родовой принадлежности. Так, при наличии в среде данного пептида у всех культур энтерококков регистрировалось снижение в супернатантах уровня продуцируемых ими ЦПВ (G-CSF, IFNy, IL-12p70, IL-17A) на 58,5-98,3%, тогда как у энтеробактерий (K. pneumoniae и E. coli) уменьшение концентрации G-CSF наблюдалось только у 33,3% культур, а у остальных изолятов фиксировалось повышение уровня указанного ЦПВ в 2,2-2,5 раза. Среди изоля-тов S. aureus реакция на синтетический пептид GM-CSF была еще более вариабельной и касалась всех продуцируемых ими ЦПВ (G-CSF, GM-CSF, IFNy, IL-10, IL-12p70, IL-13, IL-17A, IL-1ß, IL-2, IL-4, IL-6, MCP-1, MIP-1ß). С учетом изменения под действием пептида концентрации ЦПВ в супернатантах культур S. aureus выделено 3 группы изолятов: 1 — 7,1-42,9% штаммов, у которых наблюдалось снижение продукции указанных ЦПВ (в среднем на 15,065,8%); 2 — 7,1-57,1% штаммов, у которых уровень ЦПВ существенно не изменялся (±10% от контроля — индифферентность); 3 — 35,7-64,3% штаммов, у которых фиксировалось повышение концентрации ЦПВ (в 1,4-3,6 раза; p < 0,05). Эта же закономерность касалась и тех ЦПВ (G-CSF, IFNy, IL-12p70, IL-17A), которые секретирова-лись S. aureus в контроле на относительно высоком уровне (> 20 пкг/мл) — их продукция под действием синтетического пептида GM-CSF у одних изолятов бактерий стимулировалась в 1,4-2,3 раза, у других — ингибировалась на 15,0-32,6%.

Заключение. Анализ полученных данных свидетельствует, что присутствие в питательной среде синтетического пептида активного центра GM-CSF отражается на способности грампозитивных и грамнегативных бактерий продуцировать цитокиноподобные вещества (ЦПВ), а направленность и выраженность этой реакции на пептид характеризуются не только видовой/родовой детерминированностью, но и штаммовой вариабельностью. Следует отметить, что большинство изолятов S. aureus, у которых под влиянием пептида наблюдалась стимуляция выработки ЦПВ, были выделены из ран у больных с синдромом диабетической стопы. Изучение механизмов продукции бактериями ЦПВ и её регуляции синтетическим пептидом активного центра GM-CSF должно стать предметом дальнейших исследований.

ЗАВИСИМОСТЬ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ МАКРОФАГОВ ОТ СТРУКТУРЫ ИМПЛАНТИРУЕМОГО МАТЕРИАЛА

Калмыкова Н.В., Демьяненко И.А., Хац Ю.С., Суслов А.П.

ФГБУ«Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения РФ, Москва, Россия

При контакте макрофагов с имплантируемым материалом происходит их активация и последующая поляризация на два подтипа — классически активированных М1 и альтернативно активированных М2. Так как одной из основных проблем регенеративной медицины и трансплантологии является ответ организма хозяина на введенный материал, то поляризация макрофагов крайне важна, так как именно соотношение подтипов М1/М2 в зоне введения определяет выраженность воспаления, деградацию материала и скорость регенерации ткани. В литературе имеется множество данных о связи поляризации иммуногенеза с физическими и механическими свойствами имплантируемого, но мало известно о зависимости поляризации от морфологической структуры. В настоящей работе было изучено влияние структуры имплантируемого материала на вызываемый им макрофагальный ответ, а именно на соотношение М1 и М2 подтипов макрофагов.

Цель. Исследовать дифференцировку макрофагов на подтипы М1 и М2 при имплантации разных структурных форм биоматериала на основе очищенного внеклеточного матрикса (ВКМ), полученного методом щелочной обработки дермы быка домашнего.

Для анализа тканевой реакции мышам (п = 48) делали подкожные инъекции исследуемых образцов в область спины. Животным опытной группы вводили биоматериал на основе очищенного ВКМ в форме геля и в форме порошка с жидким компонентом глюкозой для удобства введения. Гель представляет собой солюбилизированный ма-трикс, а порошок — измельченный матрикс с сохраненной структурой пучков волокон и волокон с размером частиц не более 500 мкм. Животным контрольной группы вводили аналогичный объем 10% раствора глюкозы. На 1-е и 5-е сутки после инъекций мышей выводили из эксперимента и проводили иссечение участков кожного лоскута, содержавших имплантированный образец. На срезах кожного лоскута проводили иммуногистохимическое выявление специфического макрофагального антигена £4/80, а также антигенов, характерных для различных подтипов макрофагов: для М1 — CCR7, для М2 — CD163, при этом характеризовали соединительную ткань, располагающуюся между panniculus carnosus и имплантатом и дерму. Исследовали по 20 полей зрения для каждого животного.

Результаты исследования показали, что количество М1 макрофагов в соединительной ткани зоны имплантации порошка ВКМ статистически достоверно больше, как на 1-е, так и на 5-е сутки после введения, по сравнению с контрольной группой. Также было обнаружено увеличение числа М2 макрофагов на 5-е сут в дерме прилежащей кожи в той же группе. Кроме того, было выявлено статистически достоверное увеличение соотношения М1/М2 на 1-е сутки в соединительной ткани, окружающей порошок ВКМ. Количество макрофагов в группе имплантации геля статистически не отличалось от контроля на обоих исследованных сроках.

2017, Т. 19, Специальный выпуск 2017, Vol. 19, Special Issue

Экспериментальные модели Experimental models

Полученные данные свидетельствуют об интенсификации макрофагальной реакции в коже при субдермаль-ном введении ВКМ в форме порошка.

ПЕРСПЕКТИВЫ РЕКОМБИНАНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ИММУНОПРОФИЛАКТИКИ ИНФЕКЦИЙ, ВЫЗЫВАЕМЫХ PSEUDOMONAS AERUGINOSA

Калошин А.А., Солдатенкова А.В., Зимина Е.М., Михайлова Н.А.

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова», Москва, Россия

Одним из наиболее серьезных возбудителей оппортунистических инфекций является синегнойная палочка (Pseudomonas aeruginosa). Этот микроорганизм характеризуется высокой способностью к быстрому развитию резистентности к антибиотикам, что делает неэффективными общепринятые методы лечения. Поэтому актуальным является разработка иммунобиологических препаратов для борьбы с синегнойными инфекциями. Создание вакцин на основе протективных антигенов возбудителя пока не увенчалось положительными результатами из-за технологических трудностей выделения целевых антигенов, что преодолимо с использованием генно-инженерных методов.

Ранее показано, что рекомбинантный белок F наружной мембраны (OprF) P. aeruginosa и делеционная форма экзотоксина А (анатоксин) P. aeruginosa способствовали защите иммунизированных мышей от экспериментальной внутрибрюшинной синегнойной инфекции. При этом комплексное введение обоих белков приводило к увеличению защитных свойств. Поэтому представляло интерес получение слитного рекомбинантного белка, включающего аминокислотные последовательности OprF и анатоксина. С этой целью ген, кодирующий белок OprF, встраивали в рекомбинантную конструкцию на базе плазмиды рЕТ28Ь+, несущей ген анатоксина. В результате экспрессии в клетках E. coli штамма BL21(DE3) созданной конструкции был синтезирован слитый рекомби-нантный белок OprF-анатоксин, который хроматогра-фически очищали на никель-активированном сорбенте. В иммуноблоттинге этот белок специфично реагировал с иммунными сыворотками к отдельным рекомбинант-ным белкам (OprF и анатоксину). Далее с целью увеличения спектра антигенных детерминант в плазмидную конструкцию был встроен ген еще одного мембранного белка P. aeruginosa (OprI). В результате получен слитый рекомбинантный белок OprF-анатоксин-Орг! с молекулярной массой 107,2 кДа, специфично реагирующий в имму-ноблоттинге с сыворотками к рекомбинантным белкам OprF, OprI и анатоксину. Содержание целевого рекомби-нантного продукта в очищенном препарате, составляло 96,4%, что подтверждено капиллярным электрофорезом.

Оценку защитных свойств полученных слитых реком-бинантных белков проводили при двукратном, с двухнедельным интервалом, внутрибрюшинном введении мышам в дозах 50 и 100 мкг на животное. В качестве препарата сравнения использовали комплекс из отдельных рекомбинантных белков: OprF и анатоксина.

Через две недели после курса иммунизации мышей заражали живой вирулентной культурой P. aeruginosa штамма РА103 и далее в течение недели проводили подсчет погибших особей. Для животных, иммунизированных слитым белком OprF-анатоксин в дозе 50 мкг, ЛД50 составила 40,61 млн м.к. (млн микробных клеток), а в дозе 100 мкг —

32,99 млн м.к. В группах животных, иммунизированных слитым белком Ор^-анатоксин-Орг1 в дозе 50 мкг, ЛД50 составила 53,59 млн м.к., а в дозе 100 мкг — 35,36 млн м.к. Для мышей, иммунизированных комплексом двух ре-комбинантных белков, значение ЛД50 соответствовало 46,65 млн м.к., а для контрольных животных ЛД50 соответствовала 15,39 млн м.к.

Таким образом, полученные результаты открывают перспективы для создания иммунобиологических препаратов на основе рекомбинантных белков. В дальнейшем для выбора наиболее эффективной вакцины целесообразно более глубокое изучение влияния рекомбинант-ных препаратов на индукцию специфического иммунного ответа.

КРАТКОСРОЧНОЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ МОНОНУКЛЕАРНЫХ ЛЕЙКОЦИТОВ С РЕЛЬЕФНЫМ КАЛЬЦИЙ-ФОСФАТНЫМ ВЛИЯНИЕМ ОПСОНИЗАЦИИ НА ФАГОЦИТОЗ МИКРОБАКТЕРИЙ МАКРОФАГАМИ У МЫШЕЙ С РАЗНОЙ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬЮ К ТУБЕРКУЛЕЗУ

Капина М.А., Рубакова Э.И., Логунова Н.Н., Майоров К.Б., Апт А.С.

ФГБНУ «Центральный научно-исследовательский институт туберкулеза», Москва, Россия

Опсонизация — это биологический процесс прикрепления опсонинов, которыми являются белки плазмы крови или их фрагменты, к поверхности бактерий или вирусов, что обусловливает более легкое распознавание и захват их фагоцитами. К опсонинам, в частности, относятся молекулы антител (преимущественно, IgG и IgM), фрагменты компонентов комплемента, С-реактивный белок. Важность опсонизации при фагоцитозе микобак-терий была показана в работах с антителами к арабино-маннану: инкубация микобактерий с антителами перед заражением животных снижала тяжесть течения инфекции (Hamasur B. et.al., 2004).

В нашей работе мы исследовали влияния опсонинов крови мышей генетически чувствительных и резистентных к туберкулезу (ТБ) линий на способность макрофагов фагоцитировать M. tuberculosis H37Rv. При отработке методов сыворотку крови здоровых и зараженных микобак-териями H37Rv мышей резистентной линии B6 в разных процентных соотношениях (от 20 до 1,25 %) добавляли к микобактериям и инкубировали в течение 30 минут при 4 °С. После инкубации микобактерии добавляли к культуре выделенных из брюшной полости макрофагов в соотношении 1:5 (одна бактерия на 5 макрофагов) и оценивали фагоцитарную активность под микроскопом по окраске аурамином микобактерий, захваченных макрофагами. Результат оценивали по подсчету фагоцитарного числа (процент инфицированных клеток) и фагоцитарного индекса (среднее число микобактерий на инфицированный макрофаг). Наивысшие значения были получены при содержании сыворотки 1,5 — 5%, как от здоровых, так и от инфицированных мышей. В последующих экспериментах для опсонизации использовали 3-процентное содержание сыворотки. Помимо этого, мы оценили влияние опсонизации на жизнеспособность фагоцитированных бактерий по включению радиоактивного ура-цила микобактериями. При опсонизации 3-процентной сывороткой включение урацила было самым низким, что подтверждает благоприятное значение опсонизации для