СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ РАКА ЯИЧНИКА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ У КРЫС
METHOD FOR MODELING OVARIAN CANCER EXPERIMENTALLY IN RATS

Изобретение относится к области медицины, а именно к экспериментальной онкологии, фармакологии, и может быть использовано для моделирования рака яичника в эксперименте у крыс.
Рак яичника занимает седьмое место в мире в структуре онкологической заболеваемости среди женщин и является причиной крайне высокой летальности среди всех онкогинекологических заболеваний [Bray F., Ferlay J., Soerjomataram I. et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 2018; 68(6):394-424. doi:10.3322/caac.21492.].
До 90% случаев рака яичника имеют эпителиальное происхождение, остальные - неэпителиальной природы [Momenimovahed Z., Tiznobaik А., Taheri S. et al. Ovarian cancer in the world: epidemiology and risk factors. Int J Womens Health. 2019; 11:287-299. Published 2019 Apr 30. doi:10.2147/IJWH.S197604]. Серозная карцинома высокой степени злокачественности (СКВСЗ) составляет более 70% всех случаев эпителиального рака яичника (ЭРЯ) и ассоциирована примерно с 90% случаями смерти от ЭРЯ. На момент установления диагноза только 15% пациентов имеют локализованную стадию заболевания и 5-летнюю общую выживаемость около 92% [Reid В.М., Permuth J.В., Sellers Т.А. Epidemiology of ovarian cancer: a review. Cancer Biol. Med. 2017 Feb; 14(1):9-32. PubMed: 28443200]. Из-за отсутствия специфических клинических симптомов на ранних стадиях около 80% больных с ЭРЯ диагностируются уже на стадии распространенного процесса. Внутрибрюшинная диссеминация опухоли является превалирующим путем метастазирования ЭРЯ [van Baal J.O.A.M., van Noorden C.J.F., Nieuwland R. et al. Development of Peritoneal Carcinomatosis in Epithelial Ovarian Cancer: A Review. J Histochem Cytochem. 2018; 66(2):67-83. doi:10.1369/0022155417742897]. 5-летняя общая выживаемость пациентов с ЭРЯ и перитонеальным канцероматозом (ПК) не превышает 25-29% [Helderman R.F.C.P.A.,  D.R., Kok Н.Р. et al. Variation in Clinical Application of Hyperthermic Intraperitoneal Chemotherapy: A Review. Cancers (Basel). 2019; 11(1):78. Published 2019 Jan 11. doi:10.3390/cancers11010078].
Стандартным подходом к лечению как первичного распространенного ЭРЯ, так и его рецидивов является выполнение циторедуктивных вмешательств в комбинации с внутривенной или внутрибрюшинной комбинированной химиотерапией препаратами платины и таксанами. Несмотря на высокую частоту опухолевого ответа, наблюдается высокая частота местных и системных рецидивов заболевания. Применение перфузионных технологий (в частности, гипертермической интраперитонеальной химиотерапия, HIPEC) пока возможно лишь в рамках клинических исследований [Cortez A.J., Tudrej P., Kujawa K.A. et al. Advances in ovarian cancer therapy. Cancer Chemother Pharmacol. 2018; 81(1):17-38. doi:10.1007/s00280-017-3501-8]. Учитывая неудовлетворительные мировые онкоэпидемиологические показатели для рака яичника, высокую долю больных с диссеминированными формами, их высокую летальность и частоту рецидивов, а также ограниченный арсенал противоопухолевых агентов, применяемых для лечения данной категории пациентов, необходим дальнейший поиск эффективных средств лечения и изучение биологии опухолевого роста данного злокачественного новообразования. Эти задачи возможно решить только при наличии адекватных экспериментальных моделей in vivo, обеспечивающих приемлемую предсказательность результатов доклинических исследований для перспективных противоопухолевых агентов с целью дальнейших клинических исследований.
Известны сингенные модели рака яичника на крысах и мышах. Они предполагают трансплантацию опухолевых клеток иммунокомпетентным животным, полученных от той же самой линии мышей или крыс.
3
3
Известна асцитная опухоль яичника, перевиваемая внутрибрюшинно аутбредным крысам Wistar. Исходная опухоль была обнаружена случайно у 9-месячной крысы-самки Wistar, мать которой получала во время беременности и лактации 7,12-диметилбенз[а]антрацен. Опухоль обширно метастазировала по брюшине и в сальник, с формированием асцита. Полученная опухолевая взвесь и асцит (папиллярная аденокарцинома) были многократно перевиты крысам-самкам Wistar внутрибрюшинно. В последствии перевивали только асцитическую жидкость. 70-я генерация опухолевого штамма давала асцит на 5-6 день после перевивки, содержание клеток - 40000-70000 в 1 мм. Прививаемость составляла 100%. С 10 по 15 день количество асцитной жидкости достигает 50-70 мл. а содержание клеток постепенно снижается до 20000-30000 в 1 мм. Продолжительность жизни животных составляла 25-30 дней [Погосянц Е.Е., Пригожина Е.Л., Еголина Н.А. Перевиваемая асцитная опухоль яичника крысы (штамм ОЯ). Вопросы онкологии. 1962; Т. 8, №11: 29-36].
Недостатком этой модели является то, что изменения, характерные для поздних стадий ЭРЯ у женщин, воспроизводятся лишь частично.
5
Известна работа Sekiya S. с соавт., в которой описана внутрибрюшинная перевивка клеточной линии недифференцированной аденокарциномы яичника (ROT68/C1) новорожденным крысятам Sprague-Dawley (через 48 часов после рождения) по 5×10 клеток. У животных в 100% случаев развиваются метастазы в брюшной полости и легких [Sekiya S., Iwasawa Н., Takamizawa Н. Comparison of the intraperitoneal and intravenous routes of cisplatin administration in an advanced ovarian cancer model of the rat. Am J Obstet Gynecol. 1985; 153(1):106-111. doi:10.1016/0002-9378(85)90605-2].
Существенным недостатком этой модели является выбор в качестве животных-реципиентов новорожденных крыс.
6
6
Классическим примером сингенного рака яичника является мышиная клеточная линия ID8, полученная от мышей линии C57BL/6 в результате спонтанной трансформации клеток поверхностного эпителия яичника при многократном пассаже (более 20 пассажей) in vitro. Трансплантируется иммунокомпетентным мышам этой же линии по 5×10 клеток. Подкожные опухоли формируются в течение 4 месяцев и не метастазируют. При внутрибрюшинной трансплантация метастазирует в диафрагму, брюшину, брыжейку и сальник с формированием геморрагического асцита. Опухоли и асцит формируются примерно в течение 90 дней [Roby K.F., Taylor С.С., Sweetwood J.P. et al. Development of a syngeneic mouse model for events related to ovarian cancer. Carcinogenesis. 2000; 21(4):585-591. doi:10.1093/carcin/21.4.585]. Клеточная линия ID8 может трансплантироваться ортотопически под сумку яичника. Вводится по 1×10 клеток в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS). Через 90 дней у мышей линии C57BL/6 возникали массивные первичные опухоли яичника, ПК и геморрагический асцит. Наблюдалась гиперваскуляриризация опухолей и формирование описанного авторами серозного эпителиального канцероматоза [Greenaway J., Moorehead R., Shaw P. et al. Epithelial-stromal interaction increases cell proliferation, survival and tumorigenicity in a mouse model of human epithelial ovarian cancer. Gynecol Oncol. 2008; 108(2):385-394. doi:10.1016/j.ygyno.2007.10.035].
Недостатком модели является длительный период роста опухолей.
7
4
Известна сингенная опухоль яичника, которая была получена в результате спонтанной злокачественной трансформации клеточной линии М0505 поверхностного эпителия яичников мышей при многократном пассаже клеток. В результате была получена линия STOSE. Трансплантируется мышам линии FVB/N по 1×10 клеток внутрибрюшинно или по 4×10 под мембрану яичников. Прививаемость составляет 100%. При перевивке под мембрану сумки яичника наблюдались обширные внутрибрюшинные метастазы и асцит [McCloskey C.W., Goldberg R.L., Carter L.E. et al. A new spontaneously transformed syngeneic model of high-grade serous ovarian cancer with a tumor-initiating cell population. Front Oncol. 2014; 4:53. Published 2014 Mar 18. doi:10.3389/fonc.2014.00053.].
Недостаток способа: по гистологическому типу опухоль схожа с СКВСЗ, однако гистология является смешанной, включающей очаги муцинозных, недифференцированных и папиллярных серозных структур.
К общим недостаткам сингенных моделей на мышах следует также отнести дороговизну используемых линий мышей и ограниченную доступность указанных сингенных штаммов рака яичника в Российской Федерации. Кроме того, ввиду крайне малых размеров яичников у мышей ортотопическая трансплантация требует наличия оптических приборов (микроскопов) и высокой квалификации персонала, осуществляющего трансплантацию.
Техническим результатом изобретения является моделирование в эксперименте in vivo ЭРЯ высокой степени злокачественности у аутбредных крыс-самок Wistar, снижение затрат на проведение эксперимента.
6
Указанный технический результат достигается в способе моделирования экспериментального рака яичника путем ортотопической трансплантации культуры опухолевых клеток, в котором половозрелым крысам-самкам Wistar однократно под мембрану сумки обоих яичников вводят 25 мкл асцитной сингенной карциномы яичника, содержащей 4,4±0,4×10 (mean±SD) опухолевых клеток.
Изобретение иллюстрируется фиг. 1-17, где:
на фиг. 1 изображена половозрелая аутбредная крыса-самка Wistar разводки питомника «Рапполово» РАН (Ленинградская область);
на фиг. 2 - мазок исходной сингенной асцитной опухоли яичника. Окраска по Паппенгейму, ув. ×1000;
на фиг. 3 - метафазная пластинка клетки исходной сингенной асцитной опухоли яичника. Окраска 4',6-диамиидно-2-фенилиндолом (DAPI), флуоресцентная детекция;
на фиг. 4 - процедура трансплантации асцитической жидкости (25 мкл) под мембрану сумки левого яичника;
на фиг. 5 - кривая общей выживаемости (Каплана-Майера) крыс после ортотопической трансплантации асцитной опухоли в оба яичника;
на фиг. 6 - ПК и геморрагический асцит после ортотопической трансплантации асцитной опухоли в оба яичника;
на фиг. 7 - макроскопическая картина ПК;
на фиг. 8, 9 - макропрепараты опухолей яичника после ортотопической трансплантации: фиг. 8 - опухоль размером 2,2. см в наибольшем измерении одного из яичников; фиг. 9 - опухоль яичника с распространением на тело матки, рога матки, парагонадную клетчатку;
на фиг. 10-17 микроскопическая картина опухолевого поражения различных органов после ортотопической транпслантации сингенной асцитной опухоли в оба яичника: фиг. 10 - фокус серозной карциномы high-grade, гематоксилин/эозин, ×400; фиг. 11 - тотальное замещение опухолью ткани одного из яичников, гематоксилин/эозин, ×100; фиг. 12 - опухоль в яйцеводе, гематоксилин/эозин, ×40; фиг. 13 - инвазия опухоли в тело и рога матки, гематоксилин/эозин, ×5; фиг. 14 - опухоль в серозной оболочке стенки тонкой кишки, гематоксилин/эозин, ×200; фиг. 15 - фрагмент большого сальника с инфильтрацией опухолью, гематоксилин/эозин, ×40; фиг. 16 - субтотальное замещение опухолью ткани яичника с инвазией в капсулу, гематоксилин/эозин, ×40; фиг. 17 - опухоль яичника и яйцевода, гематоксилин/эозин, ×40.
6
Способ отличается тем, что в качестве животных-реципиентов используются иммунокомпетентные животные - аутбредные половозрелые крысы-самки Wistar (см. фиг. 1), которым после выполнения срединной лапаротомии и получения доступа к обоим яичникам выполняется ортотопическая трансплантация асцитической жидкости под мембрану сумки яичников в объеме 25 мкл, содержащей 4,4±0,4×10 (mean±SD) опухолевых клеток.
7
В качестве трансплантата используется ранее полученная сингенная асцитная карцинома яичника, возникшая в результате спонтанного канцерогенеза у 9-ти месячной дочери крысы Wistar, мать которой подвергалась воздействию в период беременности и лактации канцерогена 7,12-диметилбенз[а]антрацена (см. фиг. 2 и фиг. 3). Суммарная доза канцерогена составила около 34 мг. Опухоль для ортотопической трансплантации поддерживается на крысах-самках Wistar путем постоянных внутрибрюшинных пассажей асцитической жидкости, содержащей 1×10 клеток [Погосянц Е.Е., Пригожина Е.Л., Еголина Н.А. Перевиваемая асцитная опухоль яичника крысы (штамм ОЯ). Вопросы онкологии. 1962; Т. 8, №11: 29-36].
Заявляемый способ воспроизводит поздние стадии (III-IV стадии) ЭРЯ у женщин. При данном способе обеспечивается достаточный объем опухолевой массы в самих яичниках с экстракапсулярным распространением опухоли и формированием ПК с геморрагическим асцитом. Модель может быть использована для поиска и доклинической оценки эффективности средств химиотерапии, таргетной терапии и иммунотерапии распространенного рака яичника, а также для изучения взаимодействия опухоли с ее микроокружением, противоопухолевого иммунного ответа и процессов васкуляризации опухоли.
Основанием для заявляемого способа являются результаты экспериментального исследования, выполненного на 10 аутбредных половозрелых крысах-самках Wistar. Планирование и проведение исследования выполнялось в соответствии с ГОСТ 33044-2014 (Принципы надлежащей лабораторной практики). Содержание, уход и все манипуляции с животными выполнялись в соответствии с Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (ETS N 123); Директивой Европейского парламента и Совета Европейского Союза 2010/63/ЕС по охране животных, используемых в научных целях. Исследование было одобрено локальным этическим комитетом ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Петрова» Минздрава России.
Среднее время процедуры ортотопической трансплантации одной крысе составляет 34±2 мин (mean±SD). В 100% случаев при гистологическом анализе в обоих яичниках определялась high-grade карцинома, субтотально или тотально замещающая нормальную ткань яичника, с инвазией в окружающие ткани. В 100% случаев у крыс наблюдалось формирование ПК с геморрагическим асцитом. Средняя масса асцита составляет 78,0±27,2 г (mean±SD). Опухолеспецифическая смертность составляет 100%. Средняя продолжительность жизни животных после трансплантации опухоли составляет 30±4 дня (mean±SD). Медиана общей выживаемости - 29 дней (см. фиг. 5).
Способ осуществляют, например, следующим образом.
7
6
Асцитическую жидкость для ортотопической трансплантации получают от крыс-самок Wistar, на которых поддерживается штамм путем постоянных внутрибрюшинных пассажей асцита, содержащего 1×10 клеток в 0,5 мл физиологического раствора на крысу. Для ортотопической трансплантации асцит забирают на 9-14 день после внутрибрюшинной перевивки. После прокола передней брюшной стенки аспирируют одноразовым шприцом 1-2 мл асцитической жидкости. Подсчитывают содержание клеток в 1 мл асцита. До трансплантации полученный асцит хранится на охлаждающих элементах. Далее переходят непосредственно к ортотопической трансплантации асцитической жидкости. Для профилактики болевого синдрома за 30 минут до процедуры животным-реципиентам подкожно вводят мелоксикам 5 мг/кг (далее 2 раза в сутки в течение двух дней после операции). Животным дают ингаляционный наркоз изофлюраном (индукционный - 5%, поддерживающий - 2,5%). Операционное поле подвергают эпиляции и обрабатывают йодно-спиртовым раствором. Выполняют срединную лапаротомию разрезом 6-8 см, отступая на 1 см от мечевидного отростка. Обеспечивают доступ к обоим яичникам. Трансплантацию асцитической жидкости, содержащей 4,4±0,4×10 (mean±SD) опухолевых клеток, осуществляют при помощи инсулинового шприца с иглой 29G прямо под мембрану сумки левого и правого яичников (см. фиг. 4). Объем введения составляет 25 мкл. После инъекции для предотвращения попадания опухолевых клеток в брюшную полость иглу очень быстро вынимают. Далее переднюю брюшную стенку ушивают простым узловым швом рассасывающейся нитью (3-0), на кожу накладывают непрерывный матрацный шов из нерассасывающегося шовного материала (3-0). Дополнительно рану укрепляют клеем БФ-6. Сразу после ушивания раны для профилактики дегидратации подкожно вводят 8 мл физиологического раствора. Внутримышечно вводят цефепим 60 мг/кг (далее в течение 4 дней раз в сутки). Животное помещают на впитывающую простыню в пластиковой клетке. Под половину клетки с целью профилактики гипотермии подкладывают нагревательную платформу (температура 40°С). Для уменьшения стресса в клетку помещают картонную «норку-домик». Первые пять суток послеоперационную рану обрабатывают мазью «Левомеколь». Наблюдение за животными-реципиентами осуществляют в течение всего периода жизни. Оценивают среднюю продолжительность жизни крыс и медиану общей выживаемости (день трансплантации принимается за нулевой день). Павших животных подвергают полной аутопсии. Оценивают массу асцита в брюшной полости. Оба яичника каждой крысы, яйцеводы, матка, а также органы и ткани с макроскопическими признаками ПК подвергают стандартному гистологическому исследованию при световой микроскопии после окраски гематоксилином и эозином. Готовят цитологические мазки асцита с окраской по Паппенгейму.
Способ подтверждается следующими примерами.
6
Пример 1. Половозрелая крыса-самка Wistar, начальная масса 285 г. Ортотопическая трансплантация асцитической жидкости, содержащей 4,8×10 клеток под капсулу сумки обоих яичников. Гибель животного наступила на 36 день после трансплантации. На аутопсии в брюшной полости определяется большой объем асцитической жидкости с выраженной геморрагией. Масса асцита 103,7 г. Классическая картина ПК (см. фиг. 6). Оба яичника макроскопически изменены, бугристы. Опухолевое поражение рогов и тела матки, парагонадной клетчатки (см. фиг. 9). Большой сальник выглядит набухшим из-за опухолевой инфильтрации. Множественные узлы в брыжейке кишечника (см. фиг. 7). Опухолевые массы в воротах печени, узлы в куполе диафрагмы. Органы грудной клетки без видимых патологических изменений. Гистологическое исследование аутопсийного материала: во всех образцах тканей крыс обнаруживаются поля инвазивной злокачественной опухоли папиллярно-солидного строения, состоящей из округлых клеток со скудной эозинофильной или оптически пустой цитоплазмой, с крупными резко атипичными полиморфными ядрами, с высоким ядерно-цитоплазматическим соотношением. Опухоль инфильтрирует ткань большого сальника, субтотально замещает ткань яичника с распространением на яйцевод, рога и тело матки на фоне выраженной смешанно-клеточной воспалительной инфильтрации и множественных фокусов некроза. Аналогичные множественные фокусы опухоли в серозной оболочке стенки кишки и брюшине диафрагмы с инвазией в мышечный слой (см. фиг. 10-17). Данная гистологическая картина характерна для серозной карциномы high-grade.
Мазок асцитической жидкости (окраска по методу Паппенгейма): обширные поля клеток карциномы high-grade (клетки полиморфные, резко атипичные с крупными ядрами с ядрышками и высоким ядерно-цитоплазматическим соотношением), дискретно лежащие среди полей клеток моноцитарного ряда.
6
Пример 2. Половозрелая крыса-самка Wistar, начальная масса 279 г. Ортотопическая трансплантация асцитической жидкости, содержащей 3,8×10 клеток под капсулу сумки обоих яичников. Гибель животного наступила на 30 день после трансплантации. На аутопсии в брюшной полости геморрагический асцит массой 98,3 г. Левый яичник изменен, с бугристой поверхностью, размером 2,2 см в наибольшем измерении (см. фиг. 8). В брюшной полости макроскопическая картина ПК. Гистологическое исследование: серозная карцинома high-grade в виде множественных фокусов опухоли в серозной оболочке и мышечном слое стенки яйцевода, в миометрии тела матки и строме шейки матки с множественными опухолевыми эмболами в лимфатических сосудах. Ткань яичника в материале не определяется, вероятно, тотально замещена опухолью. Опухоль представлена полями полигональных клеток со скудной эозинофильной цитоплазмой и крупными ядрами с выраженным полиморфизмом, низким ядерно-цитоплазматическим соотношением и заметными эозинофильными ядрышками. Опухоль с высокой митотической активностью (12 митозов в 10 hpf), наличием множественных апоптотических телец и обширными некрозами, составляющими до 30% от опухоли (см. фиг. 11).
Заявляемый способ позволяет воспроизводить поздние стадии (III-IV стадии) ЭРЯ в эксперименте у крыс с высокой вероятностью (100%), снижает затраты на проведение эксперимента.