Влияние статинов на антигенспецифическую активацию лимфоцитов больных ревматоидным артритом — исследование in vitro

Медицинская Иммунология 2008, Т. 10, № 1, стр. 77-80 © 2008, СПб РО РААКИ

Краткие сообщения

ВЛИЯНИЕ СТАТИНОВ НА АНТИГЕНСПЕЦИФИЧЕСКУЮ АКТИВАЦИЮ ЛИМФОЦИТОВ БОЛЬНЫХ РЕВМАТОИДНЫМ

артритом - исследование

IN VITRO

Ширинский И.В., Ширинский В.С.

Государственное учреждение научно-исследовательский институт клинической иммунологии СО РАМН, Лаборатория клинической иммунофармакологии, г. Новосибирск

Резюме. К числу кандидатных аутоантигенов, инициирующих развитие ревматоидного артрита (РА), относится коллаген II типа (CII). Показано, что статины обладают противовоспалительными и иммуномодулирующими свойствами. Механизмы действия статинов на индуцированную аутоантигенами активацию Т-лимфоцитов у больных РА остаются неясными. Целью настоящего исследования была оценка влияния мевастатина на CII и CD3-индуцированную активацию мононуклеаров периферической крови (МНК ПК) больных РА. МНК ПК, выделенные от больных активным (DAS28 — 6,6±0,64) РА, были стимулированы антителами к CD3 (анти-CD3) или CII. В культуры добавлялись мевастатин в различных концентрациях, мевалоновая кислота, геранилгеранил пирофосфат (GGpp) и фарнезил пирофосфат (Fpp). Мевастатин в концентрации 10 рМ статистически значимо уменьшал CII-индуцированную пролиферацию МНК ПК и продукцию IFNy. Эти эффекты мевастатина были частично обратимы при добавлении в культуры мевалоната кислоты, GGpp и Fpp. Мевастатин не оказывал влияния на стимулированную анти-CD3 стимуляцию МНК ПК. Заключается, что мевастатин способен ингибировать антигенспецифическую стимуляцию Т-лимфоцитов у больных РА благодаря снижению синтеза метаболитов мевалоновой кислоты.

Ключевые слова:ревматоидный артрит, 3-гидрокси-3-метилглутарил-КоА-редуктаза, статины, in vitro.

Shirinsky I.V., Shirinsky V.S.

EFFECTS OF STATINS UPON ANTIGEN-SPECIFIC LYMPHOCYTE ACTIVATION IN PATIENTS WITH RHEUMATOID Arthritis: AN IN YITBD STuDY

Abstract. Collagen type II (Col II) is among the proposed candidate autoantigens initiaiting rheumatoid arthritis (RA). Statins have been shown to have anti-inflammatory and immunomodulating properties. Mechanisms of statin effects upon the autoantigen-induced T lymphocyte activation in RA patients are still unknown. The aim of present study was to evaluate the effects of mevastatin upon Col II- and anti-CD3-induced (PBMC) activation of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from RA patients. PBMC from active RA patients (DAS28 — 6.6±0.64) were stimulated with antibodies specific for either anti-CD3 or anti-Col

II. The cultured cells were treated with mevastatin at different concentrations. Mevalonic acid, geranylgeranyl pyrophosphate (GGpp) and farnesyl pyrophosphate (Fpp) were added to cultures. Mevastatin at concentration of 10 pM caused significant reduction of Col II-induced PBMC proliferation and of IFNy production. These

mevastatin effects were partially reversible by addition of mevalonic acid, GGpp, and Fpp. Mevastatin did not influence the anti-CD3 induced PBMC activation. In conclusion, mevastatin is able to suppress antigen-specific T-cell stimulation in RA patients, due to decreased production of mevalonic acid metabolites.

Адрес для переписки:

Ширинский Валерий Степанович Лаборатория клинической иммунофармакологии ГУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН. 630099, г. Новосибирск, Ядринцевская 14. Тел./факс: 7(383) 228-25-47.

E-mail: ishirinsky@mail.ru

77

Ширинский И.В., Ширинский В.С.

Медицинская Иммунология

Введение

Основным патогенетическим звеном ревматоидного артрита (РА) считается персистирующая активация Т-лимфоцитов, вызванная аутоантигенами [5]. К числу кандидатных аутоантигенов, способных инициировать иммунный ответ у больных РА, относится коллаген II типа (СП) [15]. Показано, что повышение уровня пролиферации Т-клеток в ответ на CII ассоциировано с активностью РА и выраженностью повреждения суставов [4].

Недавно открытые противовоспалительные и иммуномодулирующие свойства ингибиторов 3-гидрокси-3-метилглютарил-КоА-редуктазы (статинов) позволили использовать эти препараты при аутоиммунных заболеваниях [8, 12]. Механизмы действия статинов на индуцированную аутоантигенами активацию Т-лимфоцитов у больных аутоиммунными заболеваниями остаются неясными. Можно предположить, что действие статинов опосредовано уменьшением содержания метаболитов мевалоната.

Целью настоящего исследования была оценка влияния мевастатина на CII и CD3-индуцированную активацию мононуклеаров периферической крови (МНК ПК) больных активным РА.

Материалы и методы

Проведение исследования было одобрено локальным этическим комитетом, и все больные подписали форму добровольного информированного согласия. У двенадцати больных РА, удовлетворявших критериям Американской коллегии ревмато-

логов [1], оценивали уровень пролиферации в ответ на CII в семидневных культурах МНК ПК. Наличие пролиферативного ответа определялось, если индекс стимуляции был > 1,5. По результатам скрини-га в исследование было включено четверо пациентов (все женщины, средний возраст 57,1±0,87 лет, средняя продолжительность болезни 12,6±2,6 лет) с активным РА со средним индексом активности болезни (disease activity score, DAS28 [10]) 6,6±0,64 балла. У каждого больного было забрано по 16 мл венозной крови в обработанные гепарином пробирки (Vacuette, Greiner Labortechnik, Kremsmiinster, Austria). МНК ПК выделялись на градиенте плотности фиколл-верографин в соответствии с методом Boyum [2]. Далее МНК ПК (1 х 106/мл) культивировали в среде RPMI-1640 (Sigma, США), дополненной 0,3 мг/мл L-глютамина, 5мМ HEPES-буфера, 100 мкг/мл гентамицина и 10% фетальной сыворотки телят (Sigma, США) в присутствии 0, 0,1, 1 и 10 рМ мевастатина (Sigma, США) в течение трех дней для анализа продукции цитокинов и анти-CD3-индуцированной пролиферации и семи дней для учета CII-индуцированной пролиферации. Для стимуляции использовались моноклональные анти-CD3-антитела ICO-90 (анти-CD3, «Медбиоспектр», Москва) в концентрации 1 мкг/мл и человеческий CII (Chemicon, США) в концентрации 5 мкг/мл. Для оценки влияния изопреноидов на действие мевастатина в культуры вносились L-мевалонат (Sigma, США) в концентрации 100 рМ, геранил-геранил пирофосфат (GGPP) (MP Biomedicals, США) в концентрации 10 рМ и фарнезил пирофосфат (FPP) (Sigma, США) в концентрации 10 рМ. Интенсивность пролиферации оценивали

Концентрация мевастатина, рМ

Рисунок 1. Влияние мевастатина в различных концентрациях на CD3 и CII-индуцированную пролиферацию МНК ПК при добавлении мевалоната (мвл), Fpp и GGpp

Примечание: * - p < 0,05 по сравнению с 0 рМ мевастатина.

78

2008, Т. 10, № 1

Статины и МНК ПК больных РА

по инкорпорации 3Н-тимидина (1 мкКи/лунку), вносимого за 18 часов до окончания культивирования. Содержание TNFa, IFNy, IL-8, IL-6 в супернатантах культур МНК ПК определялось методом ELISA с использованием реагентов фирмы «Вектор-Бест» в соответствии с инструкциями производителя. Достоверность различий оценивалась с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни. Статистическая обработка материалов исследования и построение графиков проводилось с помощью программы GraphPad Prism 4, США.

Результаты

Пролиферация МНК ПК, вызванная добавлением CII, была в 2-2,5 раза менее интенсивной, чем при стимуляции анти-CDS. Меваста-тин в концентрациях 0,1 и 1 цМ не влиял на CII и анти-CD3-индуцированную пролиферацию МНК ПК. При увеличении концентрации препарата до 10 цМ было зарегистрировано статистически значимое подавление пролиферации, вызванной CII, но не антителами к CD3. Этот эффект мевастатина был частично обратим при добавлении мевалоновой кислоты, но не ее метаболитов (рис. 1).

Стимуляция МНК ПК CII была ассоциирована с повышением содержания IFNy в супернатантах культур в среднем до 45 пг/мл. Внесение в культуры мевастатина в концентрациях 0,1 и 1 цМ не действовало на синтез IFNy. При повышении концентрации мевастатина до 10 цМ CII-стимулированная продукция IFNy тормозилась. Продукты метаболизма мевалоната FPP и GGPP предотвращали это действие препарата, не восстанавливая синтез IFNy до значений, достигнутых в контроле (рис. 2). Влияния мевастатина

на индуцированную CII продукцию IL-6, IL-8 и TNFa зарегистрировано не было.

Обсуждение

В настоящем исследовании показано ингибирующее действие мевастатина на вызванную CII пролиферацию МНК ПК и синтез IFNy, которое было частично обратимо при внесении в культуры изопреноидов.

Предполагается, что иммуномодулирующее действие статинов обусловлено двумя основными механизмами - подавлением прениляции белков и непосредственным взаимодействием статинов с биологически активными молекулами, например LFA-1 [3]. Прениляцией называется процесс присоединения к протеинам промежуточных продуктов метаболизма холестерина - FPP и GGPP. В результате прениляции молекула белка становится липофильной и приобретает способность интегрироваться в клеточную мембрану. Последнее необходимо для нормального функционирования ряда протеинов, участвующих в транс-дукции внутриклеточного сигнала и играющих важную роль в активации лимфоидных клеток [9], презентации антигена [6] и хемотаксисе [11].

Наши результаты согласуются с данным экспериментальных работ, показавших снижение продукции IFNy in vitro МНК ПК мышей с CII-индуцированным артритом при использовании симвастатина [7]. Недавно была продемонстрирована способность симвастатина подавлять TNFa-индуцированную активацию синовиальных фибробластов больных РА в результате снижения синтеза геранил-геранил пирофосфата и фарне-зил пирофосфата [14]. В этой экспериментальной модели симвастатин уменьшал продукцию IL-6,

Рисунок 2. Влияние мевастатина в различных концентрациях на CII-индуцированный синтез IFNy в культурах МНК ПК при добавлении мевалоната (мвл), Fpp и GGpp.

Примечание: * - p < 0,05 по сравнению с 0 рМ мевастатина.

79

Ширинский И.В., Ширинский В.С.

Медицинская Иммунология

IL-8 и TNFa. В нашей работе выявлено подавление мевастатином синтеза IFNy, но не провоспалительных цитокинов. Можно предположить, что различия в результатах обусловлены типом клеток и способом их стимуляции.

В исследовании Leung B.P et al. было показано, что симвастатин уменьшает антигенспецифический иммунный ответ in vitro и in vivo у мышей с CII-индуцированным артритом [7]. Это соответствует полученным нами результатам у больных РА. Преимущественное действие ста-тинов на антигенспецифическую стимуляцию Т-лимфоцитов может быть объяснено влиянием статинов на экспрессию MHC II [6].

В отличие от данных Yokota K. et al., в нашей экспериментальной модели подавление мевастатином CII-индуцированной активации Т-лимфоцитов было лишь частично обратимо при добавлении изопреноидов. Можно предположить, что действие статинов на антигенспецифическую стимуляцию Т-лимфоцитов больных активным РА обусловлено не только снижением прениляции, но и другими механизмами, например блокадой LFA-1 [13].

Таким образом, результаты нашего исследования свидетельствуют о том, что мевастатин способен ингибировать антигенспецифическую стимуляцию Т-лимфоцитов у больных РА благодаря снижению синтеза метаболитов мевало-новой кислоты. Подавление прениляции белков при использовании статинов или специфических антагонистов изопреноидов может быть эффективным подходом к лечению РА и других аутоиммунных заболеваний.

Благодарности

Авторы благодарят к.м.н. Иванову И.П. за техническую помощь в работе.

Список литературы

1. Arnett F.C., Edworthy S.M., Bloch D.A., McShane D.J., Fries J.F., Cooper N.S., Healey L.A., Kaplan S.R., Liang M.H., Luthra H.S., et al. The American Rheumatism Association 1987 revised criteria for the classification of rheumatoid arthritis // Arthritis Rheum. — 1988. — ЛЫ. 31. — P. 315-324.

2. Boyum A. Isolation of leucocytes from human blood. A two-phase system for removal of red cells with methylcellulose as erythrocyte-aggregating agent // Scand. J. Clin. Lab. Invest. Suppl. — 1968. — Vol. 97. - P 9-29.

3. Greenwood J., Steinman L., Zamvil S.S. Statin therapy and autoimmune disease: from protein prenylation to immunomodulation // Nat. Rev. Immunol. - 2006. - Vol. 6. - P. 358-370.

4. Kim WU.,Kim K.J. T cell proliferative response to type II collagen in the inflammatory process and joint damage in patients with rheumatoid arthritis // J. Rheumatol. - 2005. - Vol. 32. - P. 225-230.

5. Koopman WJ., Arthritis and allied conditions: a textbook of rheumatology. - Philadelphia: Lippincot Williams and Wilkins, 2001. - P 1091-1094.

6. Kwak B., Mulhaupt F., Myit S., Mach F. Statins as a newly recognized type of immunomodulator // Nat. Med. - 2000. - Vol. 6. - P 1399-1402.

7. Leung B.P, Sattar N., Crilly A., Prach M., McCarey DW, Payne H., Madhok R., Campbell C., Gracie J.A., Liew F.Y., McInnes I.B. A novel antiinflammatory role for simvastatin in inflammatory arthritis // J. Immunol. - 2003. - Vol. 170. -P 1524-1530.

8. McCarey DW, McInnes I.B., Madhok R., Hampson R., Scherbakov O., Ford I., Capell H.A., Sattar N. Trial of Atorvastatin in Rheumatoid Arthritis (TARA): double-blind, randomised placebo-controlled trial // Lancet. - 2004. - Vol. 363. -P 2015-2021.

9. Neuhaus O., Strasser-Fuchs S., Fazekas F., Kieseier B.C., Niederwieser G., Hartung H.P, Arche-los J.J. Statins as immunomodulators: comparison with interferon-beta 1b in MS // Neurology. - 2002. -Vol. 59. - P. 990-997.

10. Prevoo M.L., van't Hof M.A., Kuper H.H., van Leeuwen M.A., van de Putte L.B., van Riel PL. Modified disease activity scores that include twenty-eight-joint counts. Development and validation in a prospective longitudinal study of patients with rheumatoid arthritis // Arthritis Rheum. - 1995. -Vol. 38. - P. 44-48.

11. Veillard N.R., Braunersreuther V, Arnaud C., Burger F., Pelli G., Steffens S., Mach F. Simvastatin modulates chemokine and chemokine receptor expression by geranylgeranyl isoprenoid pathway in human endothelial cells and macrophages // Atherosclerosis. - 2006. - Vol. 188. - P 51-58.

12. Vollmer T., Key L., Durkalski V., Tyor W., Cor-boy J., Markovic-Plese S., Preiningerova J., Rizzo M., Singh I. Oral simvastatin treatment in relapsing-remitting multiple sclerosis // Lancet. - 2004. -Vol. 363. - P 1607-1608.

13. Weitz-Schmidt G., Welzenbach K., Brinkmann V, Kamata T., Kallen J., Bruns C., Cottens S., Takada Y, Hommel U. Statins selectively inhibit leukocyte function antigen-1 by binding to a novel regulatory integrin site // Nat. Med. - 2001. - ЛЫ. 7. -P. 687-692.

14. Yokota K., Miyazaki T., Hirano M., Akiya-ma Y., Mimura T. Simvastatin inhibits production of interleukin 6 (IL-6) and IL-8 and cell proliferation induced by tumor necrosis factor-alpha in fibroblastlike synoviocytes from patients with rheumatoid arthritis // J. Rheumatol. - 2006. - Vol. 33. -P. 463-471.

15. Yoshida M., Tsuji M., Kurosaka D., Kuro-saka D., Yasuda J., Ito Y., Nishizawa T., Yamada A. Autoimmunity to citrullinated type II collagen in rheumatoid arthritis // Mod. Rheumatol. - 2006. -Vol. 16. - P 276-281.

поступила в редакцию 30.05.2007 принята к печати 13.07.2007

80