ПРОИЗВОДНОЕ 5-ОКСИПИРИМИДИНА, ОБЛАДАЮЩЕЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТЬЮ
5-OXYPYRIMIDINE DERIVATIVE POSSESSING ANTINEOPLASTIC ACTIVITY

Изобретение относится к новому производному 5-оксипиримидина, которое может быть использовано при лечении онкологических заболеваний для адъювантной противоопухолевой иммунотерапии и для восстановления костномозгового кроветворения после применения лучевой терапии.
Современная медицина располагает широким спектром препаратов для лечения онкологических заболеваний. Внедрение в клиническую практику противоопухолевых моноклональных антител (МАТ) и низкомолекулярных ингибиторов тирозинкиназ явилось важным шагом в направлении создания мишень-направленных (таргетных) средств [Yang Е.В., Guo Y.J., Zhang К. et al. Butein, a specific protein tyrosine kinase inhibitor // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1998. - Vol.245. - №2. - P.435-438. Yang E.B., Guo Y.J., Zhang K. et al. Inhibition of epidermal growth factor receptor tyrosine kinase by chalcone derivatives // Biochem. Biophys. Acta. - 2001. - Vol.1550. - №2. - P.144-152.].
Применение «таргетных» средств в клинической онкологии явилось прорывом в лечении определенных опухолей (например, в онкогематологии), но во многих случаях их эффективность оказывается ниже ожидаемой, кроме того, моноклональные антитела обладают широким спектром серьезных побочных эффектов (Корман Б.Д. Основы противоопухолевой химиотерапии. - М. 2006, с.9-359; Проценко С.А. Поиски путей индивидуализации противоопухолевой терапии. Практическая онкология. 2007, т.8, №4, с.173-181). Внедрение новых препаратов не решило и проблему формирования лекарственной резистентности опухолей. В последние годы, кроме таргетной, активно развиваются современные методы иммунотерапии в онкологии - для борьбы с различными опухолями и облегчения выраженных побочных эффектов при применении цитостатиков.
У больных с онкологическими заболеваниями рост большинства злокачественных новообразований сопровождается выраженными нарушениями иммунного ответа. В связи с этим одним из наиболее важных направлений является разработка новых современных препаратов для иммунотерапии рака.
Основные задачи современной иммунотерапии опухолей:
1) снижение побочных эффектов традиционной противоопухолевой терапии (миело- и иммуносупрессии);
2) профилактика рецидивов опухоли;
3) непосредственный противоопухолевой эффект.
В настоящее время доказана эффективность применения цитокинов [интерферона-альфа, интерлейкина-2 (ронколейкина), фактора некроза опухолей] при различных злокачественных новообразованиях как в режиме монотерапии, так и в сочетании с химиотерапией. Однако малые дозы часто бывают недостаточными, а высокие - токсичными. В частности, рекомбинантный человеческий интерлейкин-2 (ронколейкин), получаемый с помощью технологии рекомбинантной ДНК, с использованием штамма E.coli, содержащего модифицированный ген человеческого ИЛ-2. (Механизм действия СНК-411 подобен ронколейкину). Ронколейкин стимулирует эндогенную иммунную защиту, активирует Т-лимфоциты и естественные киллерные клетки, способствует продукции антител В-клетками, стимулирует клеточную секрецию вторичных цитокинов, запускает механизмы высвобождении гормонов. Показания - гипернефроидный рак почки, метастатическая меланома. Однако высокодозная иммунотерапия ИЛ-2 имеет в основном историческое значение и практически не используется из-за возникающих осложнений, вызванных токсичностью препарата (Руководство по химиотерапии опухолевых заболеваний. Под редакцией Н.И. Переводчиковой. - М. 2013 г., стр.49-54).
Изыскание новых средств для лечения опухолевых заболеваний, их синтез и использование является актуальной задачей.
Настоящее изобретение относится к новому средству адъювантной противоопухолевой иммунотерапии, представляющему собой производное 5-оксипиримидина, в частности 2-изобутил-4,6-диметил-5-оксипиримидина (1, СНК-411) указанной ниже структурной формулы:
Ранее указанное соединение было зарегистрировано как соединение с RN890641-03-9 в БД ACS on STN REGISTRY. Способ получения этого соединения и его использование не были известны. 2-Изобутил-4,6-диметил-5-оксипиримидин (1, СНК-411) синтезирован в отделе химии ФГБУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» РАМН. Противоопухолевое действие соединения указанной формулы и активирующее действие на костномозговое кроветворение предполагают применение этого соединения для противоопухолевой иммунотерапии в медицине.
Синтез основан на том, что амид изо-капроновой кислоты взаимодйствует в ледяной уксусной кислоте с хлорацетилацетоном с образованием соответствующего оксазола. Взаимодействие оксазола с водным раствором аммиака в автоклаве приводит к образованию заявляемого соединения.
Пример 1. 11,4 г (0,063 моль) 2-изобутил-4-метил-5-ацетил оксазола нагревают на масляной бане с десятикратным избытком 33% водного раствора аммиака в автоклаве при температуре 170°-180°C в течение 10 часов, охлаждают реакционную массу, затем выливают раствор в колбу и упаривают в вакууме водоструйного насоса и перекристаллизовывают из воды. Получают 7,0 г (62%) 2-изобутил-4,6-диметил-5-оксипиримидина с температурой плавления 118-120°C.
10
16
2
1
Найдено, %: С 66,3; Н 8,90; N 15,42. CHNO.
6
3
2
3
2
Вычислено, %: С 66,67%; Н 8,87%; N 15,56; ПМР - спектр (ДМСО - d), б.м.д.: 0,84 (6Н, g, J 6,6 (СН)); 2,10 (1H, Н, СН); 2,31 (6Н, С, СН); 2,53 (2Н, g, J 7,0 СН); 8,90 (1Н, С, ОН).
Фармакологическое изучение полученного соединения
При изучении соединения 1 (СНК-411) были выявлены различные свойства, в частности в результате терапии препаратом 1 мышей, несущих трансплантаты карциномы легких Льюиса, обнаружено выраженное торможение роста опухоли без признаков токсического воздействия на соматические показатели мышей-опухоленосителей. Противоопухолевое действие препарата было подтверждено модуляцией активности естественных киллеров человека и мышей. Важной особенностью препарата является его активирующее действие на пролиферацию и миграцию стволовых кроветворных клеток (СКК). Усиление пролиферации СКК под действием 1 может быть использовано в медицинской практике при восстановлении лимфогемопоэза от лучевых, химиотерапевтических воздействий, а также при иммуносупрессии при онкологических заболеваниях. Указанные свойства соединения 1 свидетельствуют о перспективности его изучения в качестве противоопухолевого средства и для восстановления костномозгового кроветворения после применения лучевой терапии.
5
Пример 2. Острая токсичность соединения I определена в опыте на 50 белых беспородных мышах самцах массой 18-20 г при внутрибрюшинном введении. ЛДО составила 474 (416-540) мг/кг при расчете по Литчфилду и Уилкоксону. По классификации К.К. Сидорова соединение 1 относится к малотоксичным фармакологически эффективным веществам.
1
1
5
Пример 3. Изучено влияние соединения 1 на соматические показатели, число лейкоцитов и рост экспериментального опухолевого штамма - карциномы легких Льюиса (полученного из лаборатории штаммов ВОНЦ им. Н.Н. Блохина) у мышей F(СВА×С57В1/б), а также на противоопухолевую эффективность отечественного фторпиримидина фторафура, используемого в медицинской практике для лечения солидных опухолей. Опухоли от мышей C57BL/6 в эксперименте прививали подкожно мышам F(СВА×С57В1/б) в область подмышечной впадины по 0,5 мл опухолевой взвеси. Противоопухолевой эффект регистрировали по размеру опухоли в момент забоя. Эффект соединения 1 на состояние мышей-опухоленосителей (C57BL/6) и рост опухолей оценивали после ранней (2-8 дни), отсроченной терапии (9-15 дни), дробным введением в/б соединения 1 в дозе 50 мг/кг один раз в сутки в течение 7 дней (суммарная доза равна 3/4 ЛДО) и однократного введения суммарной дозы на 8-ой день после инокуляции опухоли (таблицы 1 и 2).
При всех режимах введения соединения 1 мышам-опухоленосителям регистрировалось достоверное торможение роста опухоли.
Действие соединения
2-8 дни
8 день
9-15 дни
Торможение лейкоцитоза
43% Р<0,01
29% Р<0,01
4% Р>0,05
Торможение роста опухоли
39% Р<0,01
23% Р<0,05
27% Р<0,05
Лимфотропный потенциал соединения 1, оцениваемый по увеличению веса тимуса мышей-опухоленосителей, также наиболее выражен при этом режиме и ранней терапии опухоли.
Соединение 1 частично корригирует лейкемоидную реакцию, индуцируемую ростом опухоли, уменьшая число кариоцитов в периферической крови и рост опухоли. Коррекция лейкоцитоза и роста опухоли соединением 1 наиболее выражена при ранней терапии. Соединение 1 не оказывает влияния на вес тела и состояние ретикулоэндотелиальных органов (селезенка, печень) мышей-опухоленосителей. Учитывая имеющиеся литературные данные о существовании повышенной противоопухолевой эффективности фторафура при сочетании с природным пиримидиновым метаболитом урацилом, изучена возможность сочетания соединения 1 с фторафуром с целью потенцирования и повышения его противоопухолевой эффективности (таблица). Терапию фторафуром в дозе 400 мг/кг однократно проводили на 8 сутки после инокуляции опухоли при достижении расчетной массы опухоли 1,5-2,5% от веса тела. Соединение 1 (50 мг/кг, один раз в сутки в/б в течение 7 дней) вводили до (2-8 сутки) и после (9-15 сутки) терапии фторафуром или однократно в той же суммарной дозе одновременно с фторафуром на 8-й день после инокуляции опухоли. Однако ни при одном из использованных режимов не обнаружено значительного снижения токсичности и потенцирования противоопухолевой эффективности фторафура. Таким образом, в результате монотерапии соединением 1 мышей, несущих сингенные трансплантаты карциномы легких Льюиса, обнаружено выраженное торможение роста опухоли без признаков токсического воздействия на соматические показатели мышей-опухоленосителей. Не выявлено значительного снижения токсичности и потенцирования противоопухолевой эффективности цитостатика фторпиримидинового ряда - фторафура при комбинированном применении с соединением 1.
3
Пример 4. Для подтверждения противоопухолевой активности соединения 1 было изучено его влияние на активность естественных киллерных клеток человека (ЕКК). Цитотоксическую активность ЕКК определяли с использованием радиометрической методики против меченных Н-уридином клеток человеческой эритромиелолейкозной линии К-562 во взвеси мононуклеаров периферической крови. При этом получали суспензию мононуклеарных клеток периферической гепаринизированной крови нормальных (здоровых) доноров, вносили в нее препарат в разных концентрациях на 1 час, после чего препарат удаляли центрифугированием. Установлено, что соединение 1 обладает дозозависимым модулирующим действием на активность ЕКК (таблица 3).
Выявлена иммуномодулирующая активность. Наиболее сильным стимулирующим действием (увеличение на 50%) обладала доза 2 мкг/мл, дозы 0,2 и 20 мкг/мл стимулировали ЕКК на 20%, а доза 200 мкг/мл не работала. Таким образом, соединение 1 обладает выраженным модулирующим действием на активность ЕКК человека.
Пример 5. Действие соединения 1 на пролиферацию стволовых кроветворных клеток (СКК) костного мозга и образование эндогенных колоний в селезенке мышей
Мышам F1 (С57В1/6хСВА) вводили внутрибрюшинно соединение 1 в интервале доз 0,1-100 мкг/мышь. Через 1 сутки мышей облучали в сублетальной дозе 6,0 Грей, после которой выживает около 1% стволовых кроветворных клеток. Еще через 8 суток мышей забивали, фиксировали селезенки в растворе Буша и подсчитывали количество макроскопически видимых эндогенных колоний под лупой. В результате установлено (таблица 4), что в интервале доз 0,1-100 мкг/мышь препарат оказывал стимулирующее действие на образование эндогенных колоний через 8 суток после облучения. Стимулирующий эффект наиболее выражен в дозах 0,1 и 10 мкг/мышь (0,005 и 0,5 мг/кг).
4
Для определения пролиферации СКК костного мозга у мышей через 1 сутки после введения соединения 1 извлекали бедренные кости, вымывали костный мозг и культивировали клетки 1,5 часа в присутствии 1 мг/мл оксимочевины, инактивирующей пролиферирующие клетки. После инкубации клетки, обработанные оксимочевиной и необработанные (контроль), вводили по 5×10/0,5 мл среды сингенным реципиентам, облученным в летальной дозе (таблица 5). Через 8 суток мышей забивали, фиксировали селезенки и просчитывали число колоний, как выше. Содержание СКК в 8-фазе клеточного цикла рассчитывали по формуле:
где А - число СКК в S-фазе (в %),
а - число колоний из костного мозга, инкубировавшегося без оксимочевины,
б - число колоний из клеток костного мозга, инкубировавшегося с оксимочевиной.
В результате исследования установлено (таблица 5), что соединение 1 обладает дозозависимой способностью стимулировать пролиферацию СКК.
Таким образом, соединение 1 индуцирует выраженную пролиферацию СКК костного мозга (тестируемой по самоубийству оксимочевиной) в дозах 0,1 и 1 мкг/мышь (0,005 и 0,05 мг/кг, уровень пролиферации составлял, соответственно 51 и 35%, в контроле - 13%). Дозы 10 и 100 мкг/мышь не повышали пролиферацию СКК.
Пример 6. Действие соединения 1 на миграцию СКК.
В разные сроки после введения соединения 1 у мышей определяли содержание СКК в периферической крови, отражающее и уровень миграции СКК. С этой целью гепаринизированную кровь разводили в 2 раза физиологическим раствором и вводили по 0,2 мл внутривенно сингенным мышам, облученным в летальной дозе.
В результате установлено (таблица 6), что соединение 1 в дозе 1 мкг/мышь (0,05 мг/кг) обладает выраженной способностью индуцировать выброс СКК в периферическую кровь, особенно через 3 дня. Через 1 сутки содержание СКК составляло 72,2/мл (контроль 17,8), а через 3 суток - 233/мл (контроль - 13,3).
Для иммунотерапии опухолей наиболее важными показателями являются активация противоопухолевого иммунного ответа - НК-клеток и цитотоксических Т-киллеров. Была проведена оценка популяционного состава лимфоцитов крови, селезенки и тимуса мышей C57BL/6 методом четырехцветного цитометрического анализа на проточном лазерном цитометре EPICS XL 4 color (Beckman Coulter, США).
При изучении влияния СНК-411 на количество NK-клеток в крови и органах у мышей линии C57/BL6 были получены следующие результаты:
CD335+(NKp46) - основной маркер NK-клеток у мышей, NKp46 экспрессируется на поверхности только активированных NK-клеток, а также литическая активность НК-клетки, главным образом, связаны с этим рецептором.
Введение только СНК-411 в дозе 50 мг/кг наиболее значимо стимулировало NK-клетки в 2,9, 1,9, 2,5 раза в крови, селезенке и печени, соответственно, в сравнении с контролем. Совместное введение ЦФ и исследуемого соединения вызывало только в крови значимую стимуляцию NK в 3,9 раза в сравнении с группой, получившей ЦФ (таблица 7).
При изучении влияния СНК-411 на содержание цитотоксических Т-лимфоцитов в крови и органах у мышей линии C57/BL6 введение СНК-411 в дозе 25 мг/кг наиболее значимо стимулировало Т-киллеры в 2,3 раза в крови и снижало в 2,7 раз в селезенке в сравнении с контролем, а в тимусе и печени наблюдалась тенденция к увеличению Т-киллеров. Введение СНК-411 в дозе 50 мг/кг значимо стимулировало содержание Т-киллеров в 3,3, 1,4 раза в печени и тимусе, соответственно, по сравнению с контролем. В крови и селезенке наблюдалась тенденция к увеличению Т-киллеров (таблица 8).
При использовании МТТ-теста начато исследование цитотоксического эффекта соединения СНК-411 in vitro.
-8
-7
-6
-5
сравнения
Оценку прямого цитотоксического эффекта соединения СНК-411 проводили методом МТТ-теста с использованием человеческой эритромиелоидной линии К-562 в сравнении с гидрохлоридом доксорубицина и тегафуром (фторафуром). Соединения тестировали в 4 параллельных измерениях при 4-х концентрациях - 10 М, 10 М, 10 М, 10 М. Оценку результатов проводили колориметрически. Оптическую плотность измеряли на фотометре для многолуночных планшетов при λ=545 нм при λ=630 нм. Далее вычисляли % выживаемости клеток по сравнению с контролем. Статистический анализ полученных данных проводили с использованием программы Statistica 6.0 по t-критерию Стьюдента. Различия считали статистически значимыми при р<0,05.
-5
-8
-7
Наиболее выраженное цитостатическое действие соединение СНК-411 проявило в концентрации 10 М, что сопоставимо с действием доксорубицина г/хл в концентрации 10 М и тегафура в концентрации 10 М. Таким образом, согласно начатым исследованиям соединение СНК-411 обладает мягким цитотоксическим эффектом на человеческую эритромиелоидную линию К-562.
Таким образом, при изучении соединения 1 (СНК-411) были выявлены различные свойства, в частности в результате терапии соединением 1 мышей, несущих трансплантаты карциномы легких Льюиса, обнаружено выраженное торможение роста опухоли без признаков токсического воздействия на соматические показатели мышей-опухоленосителей. Противоопухолевое действие препарата было подтверждено модуляцией активности естественных киллеров человека и мышей. Важной особенностью препарата является его активирующее действие на пролиферацию и миграцию стволовых кроветворных клеток (СКК) и противоопухолевая активность. Усиление пролиферации СКК под действием 1 может быть использовано в медицинской практике при восстановлении лимфогемопоэза от лучевых, химиотерапевтических воздействий, а также при иммуносупрессии при онкологических заболеваниях. Указанные свойства соединения 1 свидетельствуют о перспективности его использования в качестве противоопухолевого средства и для восстановления костномозгового кроветворения. Соединение 1 может быть также использовано для повышения защитных функций организма после применения лучевой терапии.
Полученные результаты указывают на перспективность использования соединения СНК-411 в качестве средства адъювантной противоопухолевой иммунотерапии.
Таблица 1
Влияние соединения I на соматические показатели и рост карциномы легких Lewis при различных режимах введения (М+m)
Группы животных
Число животных
Вес тела
Лейкоциты, тыс. в мм<sup>3</sup>
Печень, г
Селезенка, мг
Тимус, мг
Вес опухоли, г
до терапии
после терапии
контроль роста опухоли
19
24,03±0,71
22,90±0,49
24,0±1,85
1,50±0,05
337±16,2
35,60±2,20
2,71±0,22
соединение I, 50 мг/кг (2-8 дни)
10
23,29±0,85
23,97±0,92
13,70±0,54 Р<0,01
1,42±0,07
329±14,4
42,50±2,83
1,65±0,26 Р<0,01
соединение I, 50 мг/кг (9-15 дни)
10
23,73±0,63
23,08±0,67
23,10±2,08
1,47±0,04
310±18,2
30,70±1,56
1,99±0,17 Р<0,05
соединение I, 360 мг/кг (1 раз на 8 день)
10
23,08±0,43
22,63±0,43
17,05±1,31 Р<0,01
1,42±0,03
310±14,5
37,10±1,41
2,10±0,20 Р<0,05
Примечание: 1 день опыта - инокуляция опухолевого штамма
Таблица 2
Влияние соединения I и фторафура на соматические показатели и рост карциномы легких Lewis при различных режимах введения (М+m)
Группы животных
Число животных
Вес тела
Лейкоциты, тыс. в мм<sup>3</sup>
Печень, г
Селезенка, мг
Тимус, мг
Вес опухоли, г
до терапии
после терапии
контроль роста опухоли
19
24,03±0,71
22,90±0,79
24,0±1,85
1,50±0,05
337±16
35,60±2,20
2,71±0,22
соединение I, 50 мг/кг+Фторафур, 400 мг/кг (2-8 дни)
10
23,29±0,6
21,90±0,74
14,12±0,85 Р<0,01
1,42±0,08
365±26
2I,30±1,01
1,54±0,16 Р<0,05
соединение I, 50 мг/кг+Фторафур, 400 мг/кг (9-15 дни)
10
23,80±0,33
22,74±0,45
17,93±1,39
1,42±0,06
345±26
16,56±1,06
1,81±0,17 Р<0,05
Физ. раствор+Фторафур, 400 мг/кг(2-8 дни)
10
23,05±0,78
21,63±0,91
15,96±1,51 Р<0,05
1,51±0,08
393±55
26,44±1,76
2,33±0,24
соединение I, 300 мг/кг+Фторафур, 400 мг/кг (1 раз на 8 день)
10
24,10±0,4
23,88±0,42
21,17±2,14
1,59±0,05
422±13,6
33,60±1,42
2,69±0,28
Таблица 3
Влияние соединения 1 на активность ЕКК человека
Доза 1 (мкг/мл)
Стимуляция активности ЕКК (в %)
Р
0,2
21,4*
<0,05
2,0
50,4*
<0,05
20,0
19,8
>0,05
200,0
0
Таблица 4
Влияние соединения 1 на образование эндогенных колоний в селезенке
доза соединения 1 (мкг/мышь)
число колоний
индекс стимуляции
-
2,9±1,0
1,0
0,1
9,8±2,7
3,4
1,0
4,3±1,2
1,5
10,0
8,6+3,1
3,0
100,0
4,5±1,0
1,6
Таблица 5
Влияние соединения 1 на пролиферацию СКК костного мозга через 1 сутки после введения
Доза соединения 1 (мкг/мышь)
число колоний в селезенке
число СКК в 8-фазе, %
без оксимочевины
с оксимочевиной
-
9,71
8,42
0,1
14,5
7,0
51,7
1,0
9,0
5,84
35,2
10,0
8,43
7,6
9,9
100,0
10,4
10,5
0
Таблица 6
Влияние соединения 1 на содержание СКК в периферической крови
Доза соединения 1 (мкг/мышь)
число СКК в 1 мл крови
через 1 сутки
через 3 суток
-
17,8
13,3
0,1
52,5
23,3
1,0
722
233,0
10,0
35,7
20,0
100,0
45,7
20,0
Таблица 7
CD335+(NKp46)
Кровь
Селезенка
Печень
Контроль
7,7±1,1
12,4±3,8
11,6±1,0
ЦФ, 200 мг/кг
10,3±1,0
10,6±3,9
36,9±1,7**↑в 3,2 р
СНК-411, 25 мг/кг
3,5±0,2**↓в 2,2 р
10,1±0,4
18,2±2,4*↑в 1,6 р
СНК-411, 50 мг/кг
23,4±2,2**↑в 2,9 р
24,0±1,9**↑в 1,9
28,7±2,8**↑2,5 р
ЦФ+СНК, 25 мг/кг
33,2±3,3**↑в 4,3 р
12,4±1,0
23,7±2,6**↑в2,0 р
ЦФ+СНК, 50 мг/кг
39,0±2,3**↑в 5,0 р
14,4±0,9
39,3±3,0** ↑ 3,4 р
Таблица 8
CD8+
Кровь
Селезенка
Печень
Тимус
Контроль
6,4±0,7
14,8±3,4
6,5±1,1
4,3±0,5
ЦФ, 200 мг/кг
23,0±1,4**↑в 3,6 р
18,2±1,8
30,1±1,9**↑4,6
20,7±0,9**↑в 4,8 р
СНК-411, 25 мг/кг
14,4±0,9**↑в 2,3 р
5,5±0,7**↓2,7 р
11,5±2,1 (Р=0,07)
5,8±0,6
СНК-411, 50 мг/кг
8,6±0,8 (р=0,06)
12,4±0,9
21,2±2,2**↑3,3 р
6,2±0,4**↑в 1,4 р
ЦФ+СНК, 25 мг/кг
18,1±2,7**↑в 2,8 р
19,1±1,8
24,0±2,5**↑3,7 р
18,1±0,5**↑в 4,2 р
ЦФ+СНК, 50 мг/кг
23,8±1,4**↑в 3,7 р
14,9±0,6
11,3±2,6 (р=0,15)
19,8±1,2**↑в 4.6 р