Возможности ультрафильтрации при разделении антигенов Mycobacterium bovis

2. Бондаренко, В.М. Иммуностимулирующее действие лактобактерий, используемых в качестве основы препаратов пробиотиков / В.М. Бондаренко, Э.И. Рубакова,

B.А. Лаврова // Журн. микробиология. - 1998. - № 5. - С. 107-112.

3. Карпуть, И.М. Иммунология и иммунопатология болезней молодняка / И.М. Карпуть. - Минск: Ураджай, 1993. - 288 с.

4. Куваева, И.Б. Обмен веществ организма и кишечная флора / И.Б. Куваева. -М.: Медицина, 1976. - 248 с.

5. Лесных, В.И. Клинические данные и некоторые изменения крови у поросят-сосунов при желудочно-кишечных болезнях / В.И. Лесных, Н.М. Коновалов, В.И. Зайцев // Проблемы патологии обмена веществ в современном животноводстве: тр. ВНИ-ИНБЖ. - Воронеж, 1981. - С. 123-129.

6. Пальцев, А.Б. Микробная экология кишечника и ее коррекция / А.Б. Пальцев // Медицинская газета. - 2002. - № 69. - С. 7-10.

7. Пребиотики и пробиотики при нарушениях кишечного микробиоценоза у детей: пособие для врачей / Н.А. Коровина [и др.]. - М., 2004. - 52 с.

8. Пробиотики и механизмы их лечебного действия / В.М. Бондаренко [и др.] // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. - 2004. - № 3. - С. 83-87.

9. Сидоров, М.А. Нормальная микрофлора животных и ее коррекция пробиоти-ками / М.А. Сидоров, В.В. Субботин, Н.В. Данилевская // Ветеринария. - 2000. - № 1. -

C.17-22.

10. Тараканов, Б.В. Использование микробных препаратов и продуктов микробиологического синтеза в животноводстве / Б.В. Тараканов. - М., 1987. - 48 с.

11. Тимофеева, Л.М. Дисбактериоз кишечника у детей / Л.М. Тимофеева // Медицинская газета. - 2003. - № 24. - С. 8-9.

12. Т и м о ш к о , А . М . Бактериоценоз пищеварительного тракта поросят / А.М. Ти-мошко, В.Г. Холмецкая, Н.Ф. Бурсук. - Кишинев: Штиинца, 1987. - 56 с.

13. Шендеров, Б.А. Медицинская микробиологическая экология и функциональное питание / Б.А. Шендеров. - М.: Грантъ, 1998. - 288 с.

УДК 619:579.873.21

ВОЗМОЖНОСТИ УЛЬТРАФИЛЬТРАЦИИ ПРИ РАЗДЕЛЕНИИ АНТИГЕНОВ MYCOBACTERIUM BOVIS

А.Н. ПРИТЫЧЕНКО УО «Витебская ордена «Знак Почета» государственная академия ветеринарной медицины» г. Витебск, Республика Беларусь, 210026

Введение. Туберкулез в настоящее время приобрел масштабы пандемии. В Беларуси, наряду с устойчивым благополучием, ситуация не однозначна.

Проведение плановых противоэпизоотических мероприятий обеспечивает благополучие страны по туберкулезу [5, 6]. Эпизоотологиче-ский мониторинг в Беларуси осуществляется аллергическим методом с использованием туберкулина, очищенного для млекопитающих, производства УП «Витебская биофабрика». При аллергической диагностике туберкулеза применяют также ППД туберкулин для млекопитающих, который получают, осаждая туберкулопротеины культуральной жидкости трихлоруксусной кислотой (ТХУ) и сульфатом аммония (СА). Каждый этап осаждения повышает их специфичность и облегча-

263

ет стандартизацию [7]. Исследования белкового и антигенного состава ППД туберкулина показали, что глубокой биологической очистки в процессе изготовления препарата не происходит [4, 8, 10]. Использование этапов осаждения облегчает стандартизацию туберкулина, но удорожает технологию, ведет к денатурации молекул и низкому выходу целевого продукта. В связи с этим поиск путей совершенствования технологии, удешевления препарата, повышения его диагностических свойств является значимой проблемой [6].

Впервые использовать в качестве аллергена HCSM (heat culture syntetic medium) гретые культуральные фильтраты синтетической среды, на которых выращивали возбудителя туберкулеза, предложил Dorset [9]. Считается, что по диагностическим свойствам такой «без-альбумозный туберкулин» не уступает ППД туберкулину, а технология его производства значительно проще [2]. Туберкулин типа HCSM использовался наравне с ППД туберкулином, хотя отмечено, что его сенсибилизирующие свойства выше, а специфичность может быть на 8 % ниже, чем у препаратов типа ППД [11]. Поэтому поиск путей получения туберкулинов, сочетающих высокую активность, специфичность и дешевизну, является важной проблемой для ветеринарной практики [1, 3, 5, 6].

В биотехнологии все большее применение находит ультрафильтрация, позволяющая фракционировать большие объёмы биологически активных продуктов по размеру молекул с сохранением их свойств. В этой связи приоритетным направлением является выяснение диапазонов фракционирования, обеспечивающих получение наиболее активных и специфичных диагностикумов, а также развитие методов и средств стандартизации туберкулина, отражающих не только суммарные показатели активности и содержания белка, но и антигенный состав, а также видовую специфичность [5].

Наряду с этим, выпуск аллергена в Республике Беларусь важен с точки зрения импортозамещения и создания наукоемкого, экологически чистого производства, на базе которого возможно получение принципиально новых видоспецифичных диагностикумов.

Автоклавированные культуральные фильтраты M. bovis обладают сопоставимой активностью и не уступают по специфичности ППД туберкулину для млекопитающих. Вместе с тем в виду наличия в их составе высокомолекулярных антигенов и фрагментов клеточных стенок, полисахаридов и других продуктов аутолиза целесообразно было разработать простой и технологичный способ их очистки [5, 9].

Выделение индивидуальных антигенов обычно связано с многоэтапным фракционированием по размеру молекул и заряду или одно-этапной очисткой методом аффинной хроматографии. В обоих случаях выход очищенных антигенов невелик. Поэтому значительный интерес представляют методы разделения макромолекул, обеспечивающие фракционирование больших объемов исходного материала. В первую очередь это касается ультрафильтрации.

264

В связи с этим разработка простой и экономически выгодной технологии получения туберкулина, очищенного для млекопитающих, и совершенствование методов его очистки и контроля являются актуальной научной и практической проблемой.

Цель работы - изучить эффективность фракционирования негретого и автоклавированного культурального фильтрата M. bovis на мембранах Millipore, задерживающих молекулы с массой 10, 30, 100 кДа.

Материал и методика исследований. Работа выполнена на кафедре микробиологии и вирусологии УО «ВГАВМ», УП «Витебская биофабрика», в отделе зоонозов и разработки диагностических препаратов РУП «Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н. Вы-шелесского».

Культуру производственного штамма Mycobacterium bovis 8 выращивали 8 недель на среде Сотона при 37 °С. Часть посевов инактиви-ровали фенолом (3 %), часть автоклавировали 30 мин при 121 °С. Для удаления бакмассы культуральную жидкость фильтровали через бумажный фильтр и пластины «Владипор». Негретый и автоклавирован-ный фильтрат подвергали последовательной ультрафильтрации на установке Minitan 11S c мембранами, обеспечивающими задерживание молекул 100, 30 и 10 кДа.

На мембране 100 кДа собирали задерживаемую фракцию - ретен-тат (Р100) и фильтрат (Ф100). Часть фильтрата Ф100 подвергали ультрафильтрации на мембране 30 кДа, собирая ретентат 30 (Р30) и фильтрат 30 (Ф30). Из части Ф30 на мембране 10 кДа получены фракции Р10 и Ф10.

Содержание белка во фракциях определяли путем осаждения 20%-ным раствором трихлоруксусной кислоты и фотоколориметрией смеси при 560 нм в сравнении со стандартами, изготовленными из сухого ППД туберкулина, содержание гексоз определяли ортотолуидиновым методом.

Антигенную нагрузку фракций изучали в ракетном иммуноэлек-трофорезе (РИЭФ) с бычьей референс-антисывороткой к комплексу негретых антигенов M. bovis Vallee (А.П. Лысенко, 1994). При проведении РИЭФ в агарозу вносили антисыворотку M. bovis Vallee (60 мкл/мл), 3 V/см в течение 12 ч.

Специфическую и перекрёстную активность фракций определяли в непрямом варианте ИФА на панелях Sarstedt, сенсибилизированных исходным препаратом и фракциями (1-5 мкг белка на лунку). Антисыворотки к комплексу негретых антигенов M. bovis Vallee и к смеси антигенов НТМБ использовали в разведениях 1:100 - 1:12800. Комплекс антиген - антитело выявляли пероксидазным конъюгатом анти-IgG быка (Sigma). В качестве контроля в ИФА применяли ППД туберкулин для млекопитающих Курской биофабрики.

Аллергическую активность и специфичность фракций определяли на 12 морских свинках, сенсибилизированных вакциной БЦЖ

265

(0,5 мг в/к), и 10 морских свинках, зараженных подкожно смесью НТМБ. Пять интактных животных служили контролем.

В качестве контроля животным вводили стандартный раствор ППД туберкулина для млекопитающих Курской биофабрики серии 29 (25 МЕ в 0,1 мл), а исследуемые фракции - в дозе, эквивалентной по белку 25 МЕ.

Для биохимической характеристики определяли содержание белка, гексоз в культуральных фильтратах серий 1-98, 2-98, 3-99 и в их фракциях, в ППД туберкулинах серий 47, 2, 29 (производства Курской биофабрики), ППД Sanofi, ППД Bioveta (7500МЕ в 0,2 мл).

Результаты исследований и их обсуждение. Как известно, степень очистки характеризует содержание гексоз. В табл. 1 приведены сравнительные данные по количеству гексоз, определяемых ортотолу-идиновым методом в туберкулинах и их фракциях.

Таблица 1. Содержание гексоз в туберкулинах, культуральных фильтратах и ультрафильтрационных фракциях (УФ) с различной молекулярной массой

Препарат Гексозы, мг/% Гексозы, мкг/1мг белка

ППД туберкулин сер.47 7,3 112

ППД туберкулин сер.2 7,3 121

Автоклавированный культуральный фильтрат серии 1-98 30,9 281

Автоклавированный культуральный фильтрат серии 3-99 18,2 202

Неконцентрированный, негретый культуральный фильтрат 5,4 27

УФ фракция Р100н 16,3 82

Ф100н 5,4 30

Р30н 8,2 48

Ф30н 2,2 15,7

Р10н 0,5 20

Ф10н 16,3 2716

УФ фракции гретого неконцентрированного культурального фильтрата

Р100 12 85,7

Ф 100 11 117

Р30 15,2 203

Ф30 6,5 38,2

Р10 11 122,2

Ф10 2,7 90

Примечание: Р - ретентат, Ф - фильтрат; цифра - предел задержания или пропускания (кДа).

Как видно из табл. 1, содержание гексоз в автоклавированных культуральных фильтратах было в 2,5-4,2 раза выше, чем в ППД туберкулинах. При пересчете на 1 мг белка этот показатель был в 2,3-2,5 раза выше, чем в ППД туберкулине.

При ультрафильтрации негретого культурального фильтрата удавалось достаточно эффективно отделить высокомолекулярные и низко-

266

молекулярные гексозы с фракциями Р100 и Ф10. Однако после авто-клавирования такого эффективного разделения не наблюдалось.

При исследовании в РИЭФ негретого и автоклавированного куль-турального фильтрата и их фракций, полученных с помощью ультрафильтрации, установлено, что негретый препарат образовывал до 15 четких преципитатов, которые в разной степени были представлены в Р100, Ф100 и Р30. В составе Ф30 в незначительной концентрации обнаружены только 2 антигена, Ф10 преципитатов не формировал.

Автоклавированный культуральный фильтрат при анализе в РИЭФ образовывал до трех диффузных преципитатов. В Р100 достаточно четко был выражен преципитат, охватывающий лунку и характерный для полисахаридных компонентов клеточной стенки. В Ф100 просматривалось два преципитата, которые были хорошо выражены в Р30, Ф30 и Ф10 преципитатов практически не давали.

При исследовании исходных препаратов и их фракций в ИФА определили средний индекс специфической активности (отношение оптической плотности в лунках с антисывороткой к М. bovis, к таковому показателю в лунках с антисывороткой, к смеси антигенов НТМБ) (табл. 2).

Таблица 2. Индекс специфической активности в ИФА негретого культурального фильтрата и его фракций

Разведение антисыворотки ППД туберкулин Негретый культуральный фильтрат Р 100 Ф 100 Р 30 Ф 30 Р 10 Ф 10

1:200 1,3 1,2 1,0 1,2 1,3 1,7 1,3 0,8

1:400 1,5 1,6 1,3 1,5 1,4 2,6 1,7 -

1:800 1,5 2,0 1,6 1,6 1,8 3,6 - -

1:1600 1,2 2,6 2,2 2,7 2,2 2,2 - -

1:3200 1,4 3,8 3,2 4,0 3,2 2,3 - -

1:6400 1,4 5,1 3,8 4,4 3,5 2,1 - -

1:12800 1,2 4,2 8,2 5,4 4,1 1,7 - -

М 1,4±0,1 2,9±0,6 3,0±0,8 3,0±0,7 2,5±0,5 2,3±0,2 1,5±0,3 -

Как видно из табл. 2, специфическая активность фракций Р100 и Ф 100 была выше, чем у исходного негретного культурального фильтрата.

Результаты испытания автоклавированного культурального фильтрата и его фракций в ИФА представлены в табл. 3. Как видно, по суммарной специфической активности ни одна из полученных фракций не превосходила исходный культуральный фильтрат и ППД туберкулин.

Как видно из табл. 4, у морских свинок, сенсибилизированных ми-кобактериями бычьего вида, аллергическая активность негретых фракций Р100, Ф100, Р30 достоверно не отличалась от исходного препарата, а у Ф30 она была достоверно ниже. Фракции с массой менее 10 кДа не обладали заметной аллергической активностью.

Другая закономерность распределения активности была у фракций автоклавированного препарата, у которых относительно низкий показатель отмечен у Ф100 и Р30 и более высокий - у Ф30. Перекрестная аллергическая активность снижалась с уменьшением размеров молекул, и лучшие показатели различия интенсивности реакций получены у Ф30 гретого препарата.

Таблица 3. Индекс специфической активности в ИФА автоклавированного фильтрата и его фракций

Разведение антисыворотки ППД туберкулин Культуральный фильтрат Р 100 Ф 100 Р 30 Ф 30 Р 10 Ф 10

1:200 1,1 1,1 1,1 1,2 1,0 1,1 1,2 0,9

1:400 1,3 1,2 1,2 1,2 1,1 1,1 1,2 0,9

1:800 1,5 1,3 1,3 1,5 1,3 1,1 1,3 1,0

1:1600 1,4 2,0 1,4 1,5 1,4 1,3 2,0 1,1

1:3200 1,8 1,5 1,4 1,6 1,5 1,2 1,0 1,1

1:6400 1,9 1,5 1,4 1,4 1,6 1,1 1,0 1,1

1:12800 2,0 1,7 1,3 1,2 1,3 1,2 1,0 1,1

М 1,6±0,14 1,5±0,1 1,3±0,04 1,4±0,1 1,3±0,1 1,2±0,03 1,2±0,1 1,0±0,1

Результаты испытания аллергической активности и специфичности фракций на морских свинках представлены в табл. 4.

Таблица 4. Аллергическая активность и специфичность фракций культурального фильтрата M. Bovis

Вид микобактерий ППД туберкулин Культуральный фильтрат Р 100 Ф 100 Р 30 Ф 30 Р 10

M. bovis 10±0,4 9,4±0,4 8,8±0,4 9,5±0,4 8,2±0,7 6,9±0,6 -

9,3±1,1 8,9±0,7 7,7±0,7 6,0±0,3 8,6±1,1 6,6±0,4

I - IV 6,4±0,4 8,2±0,6 7,4±0,5 6,6±0,7 5,6±0,5 5,1±0,3 -

7,1±0,5 6,8±0,5 5,7±0,5 6,4±0,5 5,2±0,4 5,2±0,3

Примечание: в числителе - негретый культуральный фильтрат и его фракции; в знаменателе - автоклавированный культуральный фильтрат и его фракции.

Результаты РИЭФ негретых препаратов достаточно четко показали, что при ультрафильтрации с использованием мембран, задерживающих молекулы с массой 100 кДа, достаточно четкого разделения не происходит. В Р100 и Ф100 набор и концентрация антигенов практически не различались от исходного препарата. Заметный эффект был установлен при использовании мембран с пределом задержания 30 кДа. В Р30 отмечена более высокая концентрация отдельных антигенов и наличие компонентов, не встречающихся в высокомолекулярных фракциях. Необходимо отметить, что указанный ультрафильтр задерживал основную массу антигенов, за исключением двух, по-видимому, обладающих высокой видовой специфичностью.

Результаты ИФА коррелировали с данными РИЭФ. Так, фракции Р100 и Ф100 с близким антигенным составом имели примерно одинаковый средний показатель специфической активности.

Наименьшей перекрестной активностью обладала Ф 30, имевшая спектр из 2 антигенов. По-видимому, один из них можно было отнести к МРВ 70 (Harboe et al, 1991) или антигену 15 (А.П. Лысенко, 1994), так как масса этого антигена 24 кДа и он отличался высокой видовой специфичностью. Тем не менее основная часть этого антигена все же задерживалась фильтром, вероятно, из-за возможного образования агломератов.

Наблюдалась определенная зависимость между молекулярной массой и антигенным спектром фракций. Так, чем больше была молекулярная масса фракций, тем выше была их активность с большими разведениями сывороток. Низкомолекулярные Р10 и Ф10 практически не обладали серологической активностью. Чем уже был антигенный спектр, тем меньшей активностью в ИФА обладал препарат.

Сопоставление данных табл. 2 и 3 показывает, что специфическая активность негретого культурального фильтрата и его фракций была в 2-2,5 раза выше, чем у ППД туберкулина и автоклавированных препаратов. По всей вероятности, это связано с тем, что антитела преимущественно распознают конформационные эпитопы, разрушающиеся в процессе автоклавирования.

Результаты ИФА негретых и автоклавированных препаратов не коррелировали. По-видимому, это происходило из-за значительной деструкции молекул большой массы и образования мелких пептидов, проходивших через мембраны. Тем не менее с помощью выбранных диапазонов ультрафильтрации удалось получить фракцию автоклавированного культу-рального фильтрата с массой молекул 10 - 30 кДа, обладающую достаточно высокой аллергической активностью у животных, сенсибилизированных возбудителем туберкулеза, но дающую минимальные перекрестные реакции у морских свинок, зараженных нетуберкулезными микобак-териями. Этот результат подтверждают данные Moulton, Dietz, Marcus (1972), выделившие с помощью гель-фильтрации фракцию ППД туберкулина с массой 40 - 10 кДа, не дававшую перекрестных реакций у морских свинок, сенсибилизированных НТМБ.

Заключение. Ультрафильтрацию на мембранах с пределом задержания 100 кДа можно использовать для концентрирования высокоактивных в серологических реакциях антигенов возбудителя туберкулеза. Мембрана с пределом задержания 30 кДа позволяет выделить фракцию, дающую в серологических и аллергических тестах минимальную перекрестную активность. Фракция M. bovis с массой менее 10 кДа не обладает заметной серологической и аллергической активностью. Автоклавирование ухудшает возможности фракционирования, резко снижает серологическую активность и специфичность антигенов возбудителя туберкулеза, но существенно не влияет на эти показатели в аллергической пробе.

ЛИТЕРАТУРА

1. Безгин, В.М. Совершенствование промышленной технологии (ППД) туберкулина и его биохимическая характеристика: автореф. дис. ... канд. вет. наук: 16. 00.03 / В.М. Безгин; ВАСХНИЛ. - М., 1990. - 27 с.

2. Евглевский, А. А. Научные основы и практические подходы к разработке новых средств аллергической диагностики и специфической профилактики туберкулеза крупного рогатого скота: автореф. дис. ... д-ра вет. наук: 16.00.03 / А.А. Евглевский; Санкт-Петербургская акад. вет. мед. - СПб., 1997. - 40 с.

3. Козлов, В.Е. Аллергены для диагностики туберкулеза: совершенствование производства и стандартизация: автореф. дис. ... д-ра биол. наук: 16.00.03, 03.00.23 / В.Е. Козлов; ФГУ «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов». - М., 2007. - 43 с.

4. Лысенко, А.П. Антигены Mycobacterium bovis и атипичных микобактерий, изучение и применение для дифференциальной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота: автореф. дис. ... д-ра вет. наук / А.П. Лысенко. - Минск, 1994. - 35 с.

5. Лысенко, А.П. Туберкулез животных и человека в свете новых данных о возбудителе болезни / А.П. Лысенко // Ветеринарная наука - производству: науч. тр. РНИУП ИЭВ. - 2005. - Т. 37. - C. 73-78.

6. Притыченко, А.Н. Туберкулин, очищенный для млекопитающих (оптимизация очистки, диагностические и иммунохимические свойства): автореф. дис. ... канд. вет. наук: 16.00.03 / А.Н. Притыченко; БНИИ экспериментальной ветеринарии им. С.Н. Вышелесского. - Минск, 2002. - 17 с.

7. Шаров, А.Н. Аллергическая диагностика туберкулеза у животных: повышение ее эффективности: автореф. дис. ... д-ра вет. наук / А.Н. Шаров. - М., 1989. - 29 с.

8. Daniel, T.M. Mycobacterial antigens: a review of their isolation, chemistry, and immunological properties / T.M. Daniel, B.W. Janicki // Microbiol Rev. - 1978. - Vol. 42. -№ 1. - P. 84-113.

9. Dorset, М. A Comparison of Koch's old Tuberculin with a New Synthetic Medium Tuberculin. // J. Amer. Vet. Med. Ass. - V. 84. - 1934. - P. 439-449.

10. Harboe, M. Antigens of old tuberculin and autoclaved Mycobacterium bovis BCG // Amer.Rev.Resp.Dis. - 1984. - Р.124-127.

11. Monaghan, M.L. The tuberculin test / M.L. Monaghan, M.L. Doherty, J.D. Collins [et al.] // Vet. Microbiol. - № 40 (1-2). - 1994. - P. 111-124.

УДК 636.2:612.64.089.67

ВЛИЯНИЕ ВИДОВ И РЕЖИМОВ МОЦИОНА СУХОСТОЙНЫХ КОРОВ НА ИХ ВОСПРОИЗВОДИТЕЛЬНУЮ СПОСОБНОСТЬ

Ю.А. ГОРБУНОВ, Н.Г. МИНИНА, В.М. ДОБРУК УО «Гродненский государственный аграрный университет» г. Гродно, Республика Беларусь, 230005

Введение. В последние годы в Республике Беларусь принят курс на строительство молочно-товарных комплексов промышленного типа, на которых все технологические процессы механизированы и автоматизированы. Одновременно с этим целью Республиканской программы на период 2011-2015 гг. является совершенствование базы племенного животноводства и достижение уровня, соответствующего показателям развития животноводства европейских стран. Окончательная задача настоящей программы - получение на 100 маток крупного рогатого скота 95 телят [4].

Одним из важнейших условий увеличения валового производства молока при одновременном снижении его себестоимости является по-

270