Поиск синтетических антикоагулянтов ингибиторов сериновых протеаз: сочетание in silico и in vitro методов

Биомедицина • № 2, 2014, C. 4-24

8 НОВЫЕ БИОМЕДИЦИНСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ

Высокоспецифичные видовые праймеры к генам Nat1 и Nat2 для сравнительных исследований у человека и лабораторных животных

Н.Н.Каркищенко, Н.В.Петрова, В.В.Слободенюк

ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий ФМБА России», Московская область Контактная информация: Каркищенко Николай Николаевич scbmt@yandex.ru

Работа посвящена изучению N-ацетиляционного полиморфизма, определяющего устойчивость к токсичности лекарств и онкологическим процессам, связанным с ароматическими и гетероциклическими аминами. Осуществлен биоинформационный анализ последовательностей генов NAT1 и NAT2 у людей, а также лабораторных животных. Сконструированы наиболее перспективные нуклеотидные последовательности мишеней, для использования в синтезе видоспецифичных праймеров для ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). Проведены молекулярно-генетические исследования экспрессии генов NAT1 и NAT2 на уровне мРНК у людей пяти разных популяционных групп, а также мышей, крыс и кроликов методом ОТ-ПЦР. Получены видоспецифичные праймеры для ОТ-ПЦР у людей и лабораторных животных для оптимизации экстраполяционных биомоделей полиморфизма по NAT1 и NAT2, а также для изучения механизмов сегрегации индивидуумов в медленные, средние или быстрые ацетиляторные фенотипы людей. В проведенной ПЦР мышей, крыс и кроликов было выявлено наличие высокоспецифичных участков гена и NAT1 и NAT2. Первым этапом настоящих исследований стало получение реальных биомоделей и создание высокоспецифичных видовых праймеров к генам NAT1 и NAT2. Это позволяет создать фундамент для экстраполяции получаемых в эксперименте данных в отношении человека.

Ключевые слова: N-ацетилтрансфераза (NAT1, NAT2), экспрессия генов NAT1 и NAT2, олигонук-леотидные праймеры, биомодели ацетиляторного полиморфизма человека, лабораторные модели.

Процессы ферментативного аце-тилирования ароматических аминов как у прокариотов, так и у эукариотов осуществляется с помощью N-аце-тилтрансфераз (NAT). Этот процесс заключается в переносе ацетильных групп либо на амидную группу, либо на ОН-группу молекул субстратов. Абсолютное количество субстратов NAT является ксенобиотиками, мно-

гие из которых используются в качестве лекарственных средств. Чуть ли не единственным эндогенным субстратом NAT1 является пара-аминобензо-илглутамат, являющийся продуктом катаболизма фолиевой кислоты [7, 15, 16, 22].

Ферментативная активность NAT может изменяться в результате химической модификации находяще-

invitrogen.com/site/us/en/home.html), DNASTAR, BLAST (http:// blast.ncbi. nlm.nih.gov/Blast.cgi/).

Экстракцию РНК из плазмы крови людей, а также лабораторных животных проводили с помощью комплекта реагентов для экстракции РНК/ДНК из клинического материала «Ампли-Прайм РИБО-сорб» (АмплиСенс, г. Москва). Для реакции обратной транскрипции применяли комплект реагентов для получения кДНК на матрице РНК «РЕВЕРТА-L» (Ампли-Сенс, г. Москва).

Синтез олигонуклеотидных прай-меров и детекция экспрессии генов. Для детекции экспрессии генов NAT1 и NAT2 на уровне мРНК у людей и разных видов лабораторных животных использовали специфические олигонуклеотид-ные праймеры (табл.1-3).

Синтез праймеров осуществлялся на автоматическом синтезаторе ДНК ASM-800 амидофосфитным методом.

Амплификация генов Natl и Nat2. Стадию амплификации проводили в 25 мкл смеси: ПЦР Буфер (*10): 700 mM Трис-HCl, pH 8,6 / 25 oC, 166 mM (NH4)2SO4 25 mM MgCl2 0,2 mM dNTPs, Taq - полимераза, на ам-плификаторе «Терцик» (ДНК-технология, Россия).

Для амплификации фрагментов гена NAT1 применяли условия проведения реакции: 95 °C - 15 мин., затем 35 циклов: 94 °C - 30 сек., 54 °C - 30 сек., 72 °C - 30 сек., в конце 72 °C - 5 мин. и охлаждение до 6 °C с последующим хранением при 10 °C.

Для амплификации фрагментов NAT2 гена применяли условия проведения реакции: 95 °C - 15 мин., затем 35 циклов: 94 °C - 30 сек., 52 °C - 30 сек.,

72 °C - 30 сек., в конце 72 °C - 5 мин. и охлаждение до 6°C с последующим хранением при 10 °C.

После амплификации 6 мкл образца смешивали с 6 кратным буфером для загрузки и вносили в 2% агарозный гель (0,5 мкг/мл ЭБР). Электрофорез проводили при 50 А, 100 В на 1 см2 в течение 30 минут. Продукты амплификации визуализировали при помощи системы ChemiDoc MP (Bio-Rad, США).

Результаты исследований

В результате проведенных исследований по биоинформационному анализу олигонуклеотидных последовательностей генов NAT1 и NAT2, депонированных в электронной базе данных NCBI Gen Bank были отобраны наиболее перспективные последовательности праймеров для мишеней. Исследование будущей структуры оли-гонуклеотидных праймеров для ПЦР проводили на отсутствие внутренней вторичной структуры (отсутствие само- и взаимнокомплиментарности), отсутствие комплиментарности между 3'-концами (праймер-димеров, шпилек).

Для подбора и исследования оптимальных концентраций компонентов, учитывая их стоковые концентрации и параметры синтезированных оли-гонуклеотидных праймеров, была проведена компоновка вариантов реакционных смесей ПЦР с термостабильной Taq-полимеразой. Исследование концентраций реакционных смесей позволило установить оптимальный вариант, в котором концентрация фермента составила 1,5 ед. на пробу. Такая концентрация лежит

Высокоспецифичные видовые праймеры к генам Nat1 и Nat2 для сравнительных исследований у человека и лабораторных животных

в диапазоне 0,5-5,0 ед., что не приводит к уменьшению специфичности реакции. Концентрация праймеров от 10 до 15 пМ, что уменьшает вероятность возникновения неспецифического отжига праймеров и накоплению неспецифического продукта.

Рабочая концентрация свободных ионов Mg2+ составляет 2,5 mM в реакции, при данной концентрации не происходит ингибирование фермента полимеразы на 40-50% и не наблюдается неспецифических продуктов амплификации. Концентрация каждого dNTP в пределах 80 цМ. Уменьшение концентрации dNTP до такого предела допустимо, при котором происходит сохранение свободных ионов Mg2+, поддерживающих активность фермента полимеразы на должном уровне, что, в свою очередь, не приводит к снижению отжига олигонуклео-тидных праймеров и, как следствие, уменьшению выхода специфического продукта.

При проведении подбора расчетным путем оптимальной температуры отжига олигонуклеотидных праймеров и зондов, согласно соотношению оснований G/C и A/T их нуклеотидной последовательности для ПЦР была установлена средняя температура отжига праймеров для гена NAT1 - 54 °C; для NAT2 - 52 °C.

Учитывая размер амплифицируемых фрагментов в ПЦР было подобрано оптимальное время продолжительности этапов денатурации, отжига и элонгации - 30 сек, 30 сек и 30 сек соответственно.

Для молекулярно-генетического исследования экспрессии генов NAT1 и NAT2 на уровне мРНК нами производилось выделение тотальной РНК из

образцов материала лабораторных животных: кроликов, крыс и мышей. Полученную тотальную РНК подвергали реакции обратной транскрипции для получения кДНК, применяемой в дальнейшей реакции ПЦР со специфическими праймерами (табл. 1-4). По истечении амплификации 10 мкл ампликонов смешивали с 6 кратным буфером для загрузки и вносили в 2% агарозный гель (0,5 мкг/мл ЭБР). Размер амплифициру-емого продукта определяли с помощью маркера длин фрагментов 1000-50 п.н. в концентрации 0,5 мкг/мкл в буфере для нанесения на гель.

Специфичность ПЦР оценивалась по соответствию размера продуктов амплификации с размером, определенным каждой паре праймеров генов NAT1 и NAT2 конкретного лабораторного животного.

Видовые праймеры к генам Natl и Nat2 у лабораторных мышей

Таблица 1 Праймеры для видового типирование генов NAT1 и NAT2 у мышей

Олигонуклеотидные праймеры мыши Размер продукта

NlmusF GTYTRCTTTMAWTCTGHTTG NlmusR CACYATCMACCWCTYTTCTT 433

N2musF TTGWGAGRAAGAAGYGGRGT N2musR TGYCRAACGGAAGWTGGCAG 484

На рис.1 представлена электрофоре-грамма продуктов амплификации участков генов NAT1 и NAT2 у мышей.

1níi> ЙЙП ЗгШ 4пд! 1 5пцП (¡гд11 К 2rtf2 Ünjlí

- na¿1 "al?

Рис. 1. Электрофоретический спектр продуктов амплификации с праймерами Nlmus и N2mus. Обозначения: М - маркер длин фрагментов от 50 до 1000 пар нуклеотидов; 1nat1-6nat1 треки продуктов амплификации гена NAT1 мышей с соответствующими праймероми N1musF/N1musR; К-natl, K-nat2 - отрицательные контроли; 1nat2-6nat2 - треки продуктов амплификации гена NAT2 мышей с соответствующими праймерами N2musF/N2musR.

Для нас существенно важным было установление отсутствия неспецифических продуктов реакции. Важно также то, что амплификация проходила только с наработкой специфических фрагментов, соответствующих заявленным размерам (табл. 1). Это говорит о высокой видовой специфичности подобранных праймеров к генам NAT1 и NAT2 исследованных линий мышей. В то же время было выявлено наличие специфичных участков гена NAT1 и NAT2 у каждой мыши, вне зависимости от того, к какой линии они относились.

Видовые праймеры к генам Natl и Nat2 у лабораторных крыс

На рис.2 представлена электрофоре-грамма продуктов амплификации участков генов NAT1 и NAT2 у крыс.

Проведенные ПЦР-исследования не выявили у крыс неспецифических продуктов реакции. В амплификации нарабатывались исключительно специфические фрагменты (табл. 2). Индивидуальные показатели каждой из крыс выявили специфичные участки генам NAT1 и NAT2. Это также подтверждает

W 11-J:J 2п..\- Si к. Г Нгы'1 5'j 1 Kull U í ijí2 2-uí2 Эти! 2 Lnai? 5fuL 2 < rul2

Рис 2. Электрофоретический спектр продуктов амплификации с праймерами Nlrat и N2rat. Обозначения: М - маркер длин фрагментов от 50 до 1000 пар нуклеотидов; 1nat1-5nat1 треки продуктов амплификации гена NAT1 крыс с соответствующими праймероми N1ratF/ N1ratR; K-nat1, K-nat2 - отрицательные контроли; 1nat2-5nat2 - треки продуктов амплификации гена NAT2 крыс с соответствующими праймерами N2ratF/N2ratR.

М 1ngttZnit1 Эп«1вп«1 5паМ К- М 1ml2 Jnaü 3natí ínattírcaG K-

nat.1 na(2

Рис. 4. Электрофоретический спектр продуктов амплификации с праймерами Nlhom и N2hom. Обозначения: М - маркер длин фрагментов от 50 до 1000 пар нуклеотидов; 1nat1-5nat1 треки продуктов амплификации гена NAT1 человека с соответствующими праймероми N1homF/N1homR; К-natl, K-nat2 - отрицательные контроли; 1nat2-5nat2 - треки продуктов амплификации гена NAT2 человека с соответствующими праймерами N2homF/N2homR.

Таблица 4 Праймеры для типирование генов NAT1 и NAT2 у человека

to

Олигонуклеотидные праймеры N

человека еу 5o a. аа a.

NlhomF AAGYTGTGMGAAGAAMTCGG 333

NlhomR ACTGTTCCCTTCTGATTTGG

N2homF GRACCWAAYCAGGAGARAGC 227

N2homR AGSCCACCAWACAGYAAACC

Важная роль феномена ацетилиро-вания у людей при различных социально-значимых болезнях, применении лекарственных средств различных групп и показаний, а также выявление роли ксенобиотиков на здоровье специальных контингентов и населения в целом делает проблему изучения роли ^аце-тилтрансфераз весьма актуальной и животрепещущей.

Обсуждение результатов

Наиболее широко в литературе представлены данные исследований, посвященных изучению роли полиморфизма ацетилирования при развитии онкологических заболеваний легких и кишечника [8, 28], ревматоидном артрите [2323], а также при анализе фармакокинетики и гепатотоксичности различных препаратов [17, 20]. Известно, что в зависимости от особенностей фенотипа ацетилирова-ния люди делятся на 3 типа: «быстрые» ацетиляторы, «промежуточные» и «медленные» [14]. У «медленных» ацетиля-торов обнаруживается повышенная чувствительность не только к изониазиду, но и к сульфаниламидам, ариламинам, гидразинам, к некоторым антиаритмическим и другим препаратам.

Механизм токсического действия препаратов связан с медленным выведением лекарств из-за сниженной скорости ацетилирования, а, следовательно, и выведения препарата, происходит накопление препарата. При носительстве двух «медленных» аллелей гена ЫЛТ2 продуцируется фермент с пониженной

Высокоспецифичные видовые праймеры к генам Nat1 и Nat2 для сравнительных исследований у человека и лабораторных животных

активностью, вследствие чего повышена чувствительность организма к воздействию ароматических аминов.

При носительстве хотя бы одного «быстрого» аллеля продуцируется фермент с повышенной активностью, из-за чего повышена чувствительность к воздействию гетероциклических аминов. При носительстве двух «медленных» аллелей гена NAT2 увеличен риск развития онкологических заболеваний, вызываемых воздействием ароматических аминов, особенно рака мочевого пузыря, а также повышается риск побочных эффектов при приеме стандартных доз прокаинамида.

Вызывает удивление, что вопросам выяснения механизмов нарушения и даже особенностей NAT-ацетилирования уделяется столь малое значение. Отсутствие реальных биологических моделей этих процессов, протекающих у человека, серьезно тормозит дальнейший прогресс в распознавании интимных процессов, протекающих при развитии онкологических заболеваний, гепатотоксичности, ревматоидных болезнях, заболеваний дыхательной и гастродуоденальной системы. Поэтому первым этапом настоящих исследований стало получение реальных биомоделей и создание высокоспецифичных видовых праймеров к генам NAT1 и NAT2. Эти исследования были бы неполными без оценки соответствующих процессов у людей. Только сочетание этих исследований позволяет создать фундамент для экстраполяции получаемых в эксперименте данных в отношении человека.

В соответствии с целями и задачами, определенными в данной работе, нами установлено следующее. В результате

проведенной ПЦР неспецифических продуктов реакции не наблюдалось, амплификация проходила только с наработкой специфических фрагментов, что говорит о высокой видовой специфичности подобранных праймеров к генам NAT1 и NAT2 исследуемых лабораторных животных (мыши, крысы, кролики). У каждого лабораторного животного было выявлено наличие специфичных участков гена NAT1 и NAT2. Аналогичные данные получены у 27 пациентов, не имеющих генетических патологий и относящихся к разным популяционным группам.

Нашим дальнейшим движением в этом направлении является изучение генов N-ацетилтрансферазы (Natl и Nat2) у различных лабораторных животных с целью исследования полиморфизма генов, с использованием метода ПЦР-ПДРФ (полиморфизм длины рестрикционных фрагментов ДНК), что позволит потенциально выявить ферментативную активность на уровне целостного организма. Мы надеемся, что это позволит выявить у животных некоторые аллели, наиболее близкие к таковым у человека.

Список литературы

1. Каркищенко В.Н., Мартынов В.В.

Фармакология, генополиморфизм и клонирование генов NAT у человека и животных-моделей // Биомедицина, № 4 2006, с. 85.

2. Aguiar F.A., Malvar Ddo C., Vaz Ade L., Calixto L.A., Clososki G.C., de Gaitani C.M., de Souza G.E., Jabor V.A. Simultaneous determination of dipyrone metabolites in rat hypothalamus, cerebrospinal fluid and plasma samples by LC-MS/MS //

Bioanalysis. 2013. 21: 2631-2645.

3. AtmaneN., Dairou J., Paul A., Dupret J.M., Rodrigues-Lima F. Redox regulation of the human xenobiotic metabolizing enzyme arylamine Nacetyltransferase 1 (NAT1). Reversible inactivation by hydrogen peroxide // J Biol Chem. 2003. 278: 35086-35092.

4. Bell D.A., Stephens E.A., Castranio T., Umbach D.M., Watson M., Deakin M., Elder J., Hendrickse C., Duncan H., Strange R.C. Polyadenylation polymorphism in the acetyltransferase 1 gene (NAT1) increases risk of colorectal cancer // Cancer Res. 1995. 55:3537-3542.

5. Bell D.A., Taylor J.A., Butler M.A., Stephens E.A., Wiest J., Brubaker L.H., Kadlubar F.F., Luder G.W. Genotype/phenotype discordance for human arylamine N-acetyltransferase (NAT2) reveals a new slow-acetylator allele common in African-Americans // Carcinogenesis. 1993. 14 (8): 1689-1692.

6. Bosze Zs., Houdebine L.M. Applications of Rabbits in Biomedical Research: Review. // World Rabbit Sci., 2006, 14, 1-14. WRSA, UPV, 2003.

7. ButcherN.J., Minchin R.F. Arylamine N-Acetyltransferase 1: A Novel Drug Target in Cancer Development // Pharmacol Rev. 2012. 64:147-165.

8. Cai J., Zhao Y., Zhu C.L. et al. The association of NAT1 polymorphisms and colorectal carcinoma risk: evidence from 20 000 subjects. Mol. Biol. Rep. 2012; 39 (7): 7497-7503.

9. Cascorbi I., Roots I., Brockmoller J.Association of NAT1 and NAT2 Polymorphisms to Urinary Bladder Cancer: Significantly Reduced Risk in Subjects with NAT1*10 // Cancer

Reserch. 2001. V. 61. P. J№ 1. 5051-5056.

10. Dairou J., Atmane N., Dupret J.M., Rodrigues-Lima F. Reversible inhibition of the human xenobiotic-metabolizing enzyme arylamine N-acetyltransferase 1 by S-nitrosothiols // Biochem Biophys Res Commun. 2003. 307:1059-1065.

11. Dairou J., Atmane N., Rodrigues-Lima F., Dupret J.M. Peroxynitrite irreversibly inactivates the human xenobiotic-metabolizing enzyme arylamine Nacetyltransferase 1 (NAT1) in human breast cancer cells: a cellular and mechanistic study // J Biol Chem. 2004. 279: 7708-7714.

12. Dairou J., Malecaze F., Dupret J.M., Rodrigues-Lima F. The xenobioticmetabolizing enzymes arylamine N-acetyltransferases in human lens epithelial cells: inactivation by cellular oxidants and UVB-induced oxidative stress // Mol Pharmacol. 2005.67: 1299-1306.

13. Deitz A.C., Zheng W., Leff M.A., Gross M., Wen W.Q., DollM.A., Xiao G.H., Folsom A.R., Hein D.W. N-Acetyltransferase-2 Genetic Polymorphism, Well-done Meat Intake, and Breast Cancer Risk among Postmeno-pausal Women // Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention. 2000. 9: 905-910.

14. Hein D.W., Doll M.A. Accuracy of various human NAT2 SNP genotyping panels to infer rapid, intermediate and slow acetylatorphenotypes. Pharma-cogenomics. 2012; 13 (1): 31-41.

15. Jensen L.E., Hoess K., Mitchell L.E., Whitehead A.S. Loss of function polymorphisms in NAT1 protect against spina bifida // Hum Genet. 2006. 120:52-57.

EHOMeg^HHa • № 2, 2014 14

Биомедицина • № 2, 2014, C. 17-24

Поиск синтетических антикоагулянтов -ингибиторов сериновых протеаз: сочетание in silico и in vitro методов

Н.И. Баранова, П.А. Алексеева, К.С. Чистяков, В.Н. Юсковец, С.В. Оковитый, А.В. Бурякина, Е.В. Федорова

ГБОУ ВПО Санкт-Петербургская химико-фармацевтическая академия, Санкт-Петербург

Контактная информация: к.х.н. Федорова Елена Викторовна, elena.fedorova@pharminnotech.com

В работе представлен модельный подход, основанный на интеграции расчётной теории (in silico-экспериментов) и экспериментов, поставленных in vitro к поиску, оптимизации и созданию новых молекул, обладающих сродством к семейству сериновых протеаз.

Авторы выражают признательность компании Novartis AG за помощь в проведении экспериментов in vitro в рамках программы «Novartis in-kind collaborations», а также персональную благодарность их научным сотрудникам-биологам Ulrich Hassiepen и Gabriela Monnet.

Ключевые слова: количественные соотношения структура-активность (QSAR), молекулярный докинг, ингибиторы сериновых протеаз, каскад свертывания, высокопроизводительный скрининг.

Цель

Применение комбинированного подхода, основанного на сочетании in silico и in vitro методов при поиске потенциальных ингибиторов сериновых протеаз.

Введение

Сердечно-сосудистые заболевания и их осложнения занимают первое место в мире среди причин смерти людей. Одним из основных компонентов схем лечения ишемической болезни сердца, острого коронарного синдрома, тромбозов при травмах, трансплантации, крупных хирургических вмешательствах является антикоагу-лянтная терапия.

Среди мишеней для действия потенциальных антикоагулянтов одними из наиболее перспективных являются

сериновые протеазы системы свертывания крови. В клинической практике широко применяются пероральные ингибиторы Xa фактора (ривароксабан, апиксабан) и На фактора (дабигатрана этексилат). Интерес также представляет поиск новых антикоагулянтов в ряду ингибиторов таких сериновых протеаз, как фактор VIIa, IXa, XIa, XIIa, калликреин.

Сочетание in silico и in vitro методов на ранних этапах скрининга активных молекул значительно повышает результативность поиска новых лекарственных средств. [1]. Поскольку методы прогнозирования требуют подтверждения их достоверности с помощью исследования на биообъектах, например, с помощью высокопроизво-

дительного скрининга на изолированных ферментах [2]. Совместное использование хемоинформатических и биологических методов скрининга позволяет снизить расходы на синтетические и аналитические исследования, так как дает возможность исследовать соединения уже на этапе виртуальных молекул.

В настоящей работе использован рациональный модельный подход, основанный на интеграции расчётной теории и эксперимента in vitro для поиска новых синтетических ингибиторов сериновых протеаз каскада свертывания.

Материалы и методы

Объекты исследования

Объектами исследования служили органические соединения, синтезированные на кафедрах неорганической химии (Баранова Н.С., заведующий кафедрой - профессор Москвин А.В.) и органической химии (Юсковец В.Н., заведующий кафедрой - профессор Яковлев И.П.), относящиеся к производным пиримидинов, арил- и алкиламидинов и 1,3,4-оксадиазолов.

Дизайн эксперимента

Компьютерное выявление активных структур проводили, используя комбинированный in silico/in vitro подход, включавший следующие этапы:

• препроцессинг собственной базы соединений - удаление структур, не удовлетворяющих правилу Липин-ского (drug likeness) [3];

• постпроцессинг соединений с использованием неспецифических моделей активностей соединений на базе PASS online и их токсичности на базе GUSAR online;

• скрининг потенциальных лиган-дов на специфическую активность (ингибирование IIa, VIIa, IXa, Xa, XIa, XIIa факторов и калликреина) с помощью QSAR-моделей;

• молекулярный докинг структур с оценкой значения скоринг-функции и характера взаимодействия белок-лиганд;

• высокопроизводительный скрининг in vitro на изолированных компонентах свертывания крови человека (факторы свертывания IIa, VIIa, IXa, Ха, XIa, XIIa, кал-ликреин) с помощью хромогенных субстратов;

• выбор соединений-лидеров.

Исследование in silico

Для прогнозирования профилей биологической активности в виде MOL-файлов были представлены структурные формулы 1104 химических соединений, относящиеся к производным пиримиди-нов, арил- и алкиламидинов и 1,3,4-ок-садиазолов.

Препроцессинг баз данных был основан на допустимых значениях оценок физико-химических свойств (так называемый drug-likeness) - липофильности, допустимому интервалу молекулярной массы, количеству доноров и акцепторов водородной связи, значению молярной рефракции (правило Липинского), а также числу свободных ротационных связей.

Постпроцессинг осуществляли, анализируя предсказанные спектры активности и токсичности соединений с использованием Интернет-ресурсов PASS-online и GUSAR-online (Pharmaexpert.ru). Соединения отбрасывали в том случае, если Pa>Pt

для нежелательных эффектов (мутагенность, тератогенность, канцеро-генность, раздражающее действие), а также расчётное значение LD50 составляло менее 15 мг/кг для перо-рального введения.

На следующем этапе проводили скрининг потенциальных лигандов на специфическую активность с помощью QSAR-моделей в программе GUSAR (General Unrestricted Structure-Activity Relationships), созданной с использованием среды программирования Delphi 5.0 Professional. Нами были созданы модели количественного соотношения между химической структурой и значением полуингиби-рующей концентрации на следующие мишени: IIa, VIIa, IXa, Xa, XIa, XIIa факторы свертывания и калликреин. Устойчивость и репрезентативность моделей оценивали по объёму (V>5) и значениям коэффициентов корреляции (R2>0,7 и Q2>0,6).

Молекулярный докинг проводили, используя программу предсказания белок-лигандных взаимодействий FlexX [4]. Критерием оценки взаимодействия между исследуемыми соединениями и мишенью служила величина оценочной функции (скоринг-функция), выраженная в ккал/моль и определяемая как энергия взаимодействия лиганда с ферментом. Также учитывали пространственный характер связывания вещества с мишенью посредством образования связей с ключевыми аминокислотами в сравнении с известными агонистами или антагонистами.

Исследование in vitro

В экспериментах были использованы IIa и Xa факторы (Hematologic Technolo-

gies Inc., США), фактор VIIa (Novo Nor-disk Pharma AG, Швейцария), факторы XIa, XIIa и калликреин плазмы (Kordia, Нидерланды), фактор IXa (Cellscience, США).

Все растворы белков и пептидов хранили в силиконизированных пробирках (Life Systems Design, Швейцария). Растворы исследуемых соединений переносили в 384-луночные планшеты с общим объемом лунки 25,25 мкл (Labsystems Oy, Финляндия) с помощью CyBi-Hummingwell дозатора (CyBio AG, Германия). Растворы ферментов и субстратов добавляли в планшеты с помощью CyBi-well 384-канального дозатора (CyBio AG, Германия).

Измерение проводили при комнатной температуре в 384-луночных планшетах. Исследуемые вещества растворяли в смеси ДМСО-вода в соотношении 9:1. Предварительно в каждую лунку помещали по 250 нл раствора исследуемого вещества и 12,5 мкл раствора фермента в буфере. После преинкубации в течение 70 мин при комнатной температуре реакцию запускали добавлением 12,5 мкл раствора соответствующего субстрата. Влияние вещества на активность фермента определяликаклинейнуючастьлогариф-мической кривой и фиксировали через 1 час. Конечные концентрации исследуемых веществ в растворе составляли от 1 нМ до 100 мкМ

Измерение проводили на планшетном спектрофотометре Ultra reader (TECAN, Швейцария). Для возбуждения флуоресценции красителя Rh110 использовали фильтр с длиной волны 485 нм, испускаемое свечение регистрировали при длине

волны 535 нм. Для повышения соотношения сигнал-шум использовали дихроические зеркала. Все флуоро-форы возбуждали тремя вспышками на одно измерение.

Значения 1С50 рассчитывали как отношение процента ингибирования к ин-гибирующей концентрации по следующей формуле:

у = А2 + (А1 - А2) / (1 + (х/ 1С5) Л р),

Условия пров

где Y - процент ингибирования при ингибирующей концентрации x

A1 - минимальное значение ингиби-рования

А2 - максимальное значение ингиби-рования

р - коэффициент Хилла Расчёт и обработку кривых производили методом нелинейной регрессии с использованием программного обеспечения Helios.

Таблица 1

iciiiiíi анализа

Мишень Фермент Субстрат Концентрация фермента, нМ Концентрация субстрата, мкМ Состав буферного раствора

Фактор IIa Тромбин человека (фактор IIa) Bz-Val-Pro-Arg-Rh110-D-Pro 0,4 0,5 50 мМ HEPES, 50 мМ NaCl, 0,05 % (м/о) CHAPS, pH 7,4

Фактор VIIa Фактор VIIa, человека, рекомбинантный dPhe-Pro-Arg-Rh110-D-Pro 15 0,5 100 мМ HEPES, 140 мМ NaCl, 5 мМ CaCl2, 0,05 % (м/о) CHAPS, pH 7,4

Фактор IXa Нативный фактор IXa, очищенный, из плазмы человека dLeu-Gly-Arg-Rh110-D-Pro 20 0,5 50 мМ Трис, 125 мМ NaCl, 5 мМ CaCl2, 0,05 % (м/о) CHAPS, pH 7,4

Фактор Xa Фактор Xa человека Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-Rh110-yGlu 0,625 0,5 50 мМ HEPES, 50 мМ NaCl, 0,05 % (м/о) CHAPS, pH 7,4

Фактор XIa Фактор XIa человека dLeu-Pro-Arg-Rh110-yGlu 0,5 0,5 50 мМ HEPES, 125 мМ NaCl, 5 мМ CaCl2, 0,05 % (м/о) CHAPS, pH 7,4

Фактор XIIa Фактор XIIa человека dPro-Phe-Arg-Rh110-yGlu 1,5 0,5 50 мМ HEPES/NaOH, 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 0,05 % (м/о) CHAPS, pH 7,8

Каллик-реин Калликреин плазмы человека dPro-Phe-Arg-Rh110- yGlu 0,025 0,5 50 мМ Hepes/HCl, 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 0,05 % (м/о) CHAPS, pH 7,8

Примечание: HEPES - 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота, CHAPS - 3-[(3-холамидопропил)диметиламмония]-1-пропансульфонат.

Результаты и их обсуждение

Исходная база соединений содержала 1104 объекта, принадлежащих к классам гетеро- и алициклических органических соединений - производных, арил- и алкиламидинов и 1,3,4-оксади-азолов. Выявления активных структур компьютерными методами проводили, применяя комбинированный in silico/in vitro подход, который включал в себя несколько этапов (рис. 1).

После первичного скрининга с использованием правила Липинского было отобрано 48 соединений. Пример

процедуры препроцессинга представлен в таблице 2.

Соединение с шифром 122.NB.0114 не удовлетворяет правилу Липинского по параметру «число акцепторов водородной связи», которое не должно превышать 5. Анализ данных постпро-цессинга позволил отсеять потенциально токсичные вещества [5]. Пример данных постпроцессинга представлен в таблице 3.

В таблице указаны два соединения, отсеянные на этапе постпроцессинга: с шифрами 247.NB.0114 и 018.NB.0114,

Рис. 1. Блок-схема этапов комбинированного in silico/in vitro подхода.

Пример анализа данных при препроцессинге

Таблица 2

Вещество Число свободных ротационных связей logP Число доноров водородной связи Число акцепторов водородной связи Молярная масса, г/моль Молярная рефракция, см2

247.NB.1213 1 3,82 1 3 247,1 57,3

122.NB.0114 2 0,875 1 6 223,2 54,796

093.NB.0114 2 2,52 2 3 194,2 49,4

Таблица 3

Пример анализа данных при постпроцессинге

Вещество ld50 gusar, мг/кг, крысы п/о Вероятность возникновения нежелательных эффектов PASS, Pa/P

Мутагенность Канцеро-генность Терато-генность Раздражающее действие

247.NB.0114 1514 - - - 0,470/0,025

122.EV.0114 1320 - - - -

018.NB.0114 302.4 0,334/0,04 0,415/0,003 0,230/0,120 -

не удовлетворяющие по токсикологическим свойствам. В итоге, по результатам неспецифического постпроцессинга были выбраны 43 вещества.

Таблица 4 Прогностические результаты полуингибирующей концентрации на Xa фактор для некоторых соединений

Объект IC50

931.NB.1213 3,04'10-6

105.NB.1213 1,1110-4

247.NB.1213 2,05'10-6

093.NB.0114 6,50'10-6

177.VY.1213 1,210-9

277.VY. 1213 5,6-10-8

Ранее было показано, что пороговым значением для отбора соединений на указанных моделях является 1С50 больше 1-10-5. Поэтому по результатам GUSAR-анализа на специфические мишени для дальнейшего молекулярного докинга отобрали 16 соединений.

Для всех исследуемых соединений, при проведении молекулярного докин-га, значения оценочной функции (ОФ) было удовлетворительно и приближалось к таковому для соединений сравнения (дабигатрана этексилат) (табл.5). Примеры образования белок-лигандных комплексов отобранных соединений с мишенями представлены на рисунке 2.

Таблица 5 Взаимодействие веществ с характеристическими аминокислотами активного центра тромбина

Аминокислоты Соединение сравнения -дабигатран

His57 + - + -

Trp215 + - - -

Gly216 + + + +

Gly219 + + + +

Glu192 + + + -

Leu99 + + - +

Trp60D + + - -

По результатам молекулярного до-кинга отобрали 10 соединений, продемонстрировавших связывание более чем с 50% ключевых аминокислот. Отобранные по результатам in silico подхода химические соединения далее были отправлены на скрининг in vitro. Два соединения 177.VY.1213 и 277.VY.1213 показали неспецифическую активность в отношении сериновых протеаз каскада свертывания, при этом наиболее выра-

FXIIa FXa

Рис. 2. Белок-лигандные комплексы.

IIa

женное влияние наблюдали на энзима-тическую функцию XIIa фактора. Тогда как соединения из класса 1,3,4-оксади-азолов оказались неактивны, а одно из веществ, наоборот, проявило индукторное влияние на активность XIIa фактора свертывания (табл. 6).

Таким образом, по результатам комбинированного in silico/in vitro подхода было отобрано два соединения (177. VY.1213 и 277.VY.1213), перспективных для дальнейшей оптимизации (hit to lead optimization), расширения и идентификации соединений значительно более активных, чем 177.VY.1213 и 277.VY.12. В отношении 8-ми соединений из класса 1,3,4-оксадиазолов, оказавшихся неактивными в результате in vitro скрининга, требуется эксперимен-

тальная проверка их активности in vivo с целью исключения ложноотрицательно-го результата, полученного в результате применения in silico метода.

Выводы

Проделанная работа является примером интеграции расчётной теории in silico-экспериментов и экспериментов, поставленных на in vitro, позволившая идентифицировать биологически активные молекулы по отношению к ферментам из класса сериновых про-теаз. С целью уменьшения процента ложноположительных и исключения ложноотрицательных результатов рекомендуется дополнять использованный комбинированный подход данными in v/vo-экспериментов.

Фактор Vila Фактор IXa Фактор Xa Фактор Xla Фактор XIIa Калликреин Тромбин

Соединение IC50, мШ го и X -è о сс и н а m о -р s б и IC50, мШ го и X -è о сс и н а m о -р s б и IC50, мШ го и X -è о СБ и н го со о ср о и IC50, мШ го и X -è о СБ и н го со о ср s о и IC50, мШ го и X -è о СБ и н го со о ср о и IC50, мШ го и X -è о сс и н а m о -р s б и IC50, мШ го и X -è о СБ и н го со о ср s о и

ин äää ин äää и н и ^ и ин äää н и ^

112.NB.1213 >100 0 -1,4 >100 0 2,1 >100 0 -1,6 >100 0 0,7 >100 0 2,7 >100 0 -2,1 >100 0 1,3

117.VY 1213 >100 0 -0,3 >100 0 -5,5 >100 0 -8,4 >100 0 -2,0 >100 0 -8,5 >100 0 -4,5 >100 0 -0,8

177.VY 1213 >100 1.2 48,6 >100 0 1,4 >100 1,3 34,7 >100 0 21,8 23,8 1,8 92,7 >100 0,6 42,7 >100 0,9 45,5

178.NB.1213 >100 0 -0,3 >100 0 -0,2 >100 0 -4,1 >100 0 -0,5 >100 0 5,4 >100 0 -2,7 >100 0 1,7

191.NB.1213 >100 0 -0,9 >100 0 -2,0 >100 0 -5,3 >100 0 -2,8 >100 0 -3,3 >100 0 -1,6 >100 0 -1,5

193.NB.1213 >100 0 0,0 >100 0 -0,4 >100 0 0,6 >100 0 -2,8 >100 0 5,3 >100 0 -2,1 >100 0 0,1

233.VY1213 >100 0 -2,2 >100 0 0,9 >100 0 -1,1 >100 0 2,5 >100 0 5,0 >100 0 -1,8 >100 0 1,4

247.NB.1213 >100 0 -1,1 >100 0 -11,1 >100 0 -10,8 >100 0 -6,6 >100 0 -20,5 >100 0 -5,0 >100 0 -4,7

277.VY1213 >100 25,4 >100 0 -4,2 >100 0 -6,2 >100 0 85,1 85,1 2,4 56,1 >100 0 -1,2 >100 20,8

931.NB.1213 >100 0 -44,6 >100 0 -2,2 >100 0 -3,5 >100 0 -2,1 >100 0 -1,4 >100 0 -0,6 >100 0 0,2

Таблица 6

Значение полуингибирующих концентраций ведущих соединений

Список литературы

1. Баскин И.И., Палюлин В.А., Зефиров Н.С.. Молекулярное моделирование рецепторов физиологически активных веществ для целей медицинской химии // Успехи химии.

2009. Т. 78. № 6. C. 539-557.

2. Хёльтье Х.Д., Зиппль В., Ро-ньян Д., Фолькерс Г. Молекулярное моделирование (теория и практика)/ Под редакцией В.А. Палюлина и Е.В. Радченко.- М.: БИНОМ. Лаборатория знаний.

2010. 318 с.

3. Lipinski, F. Lombardo, B.W. Dominy, P.J. Feeney Experimental and computational approaches to estimate solubility and permeability in drug discovery

and development settings /C.A. Lipinski et al.// Advanced Drug Delivery Reviews.-2001. Vol.46. №1-3. P. 3-26.

4. Авенирова Е.Л., Алексеева П.А., Баранова Н.И., Басс М.С., Буряки-на А.В., Питухина Н.Н., Федорова Е.В.. Молекулярные аспекты создания лекарственных препаратов: использование методов компьютерного моделирования с целью создания нового противоишемического средства // Биомедицина. 2014. №1.

C.4-10.

5. Lagunin A., Zakharov А., Filimonov

D., Poroikov V. QSAR Modellingof rat acute toxicity on the basis of PASS prediction // Mol. Informatics. 2011. Vol.30, №2-3. P. 241-250.

Development of synthetic anticoagulants -

inhibitors of serine proteases: combining in silico and in vitro aproaches

N.I. Baranova, P.A. Alekseeva, K.S. Chistyakov, V.N. Yuskovets, S.V. Okovityi, A.V. Buryakina, E.V. Fedorova

The aim of this study was to presents a model-based approach based on the integration of computational theory (in «'/¿co-experiments) and experiments performed (in vitro) to search, optimization and development of new anticoagulants molecules with affinity to the family of serine proteases.

The authors gratefully acknowledges to Novartis AG for assistance in the in vitro experiments in the framework of the program "Novartis in-kind collaborations", as well as the personal gratitude for their researchers and biologists Ulrich Hassiepen and Gabriela Monnet.

Key words: quantitative structure-activity relationship, molecular docking, serine protease inhibitors, in silico and in vitro experiments.

Высокоспецифичные видовые праймеры к генам Nat1 и Nat2 для сравнительных исследований у человека и лабораторных животных

гося в активном центре цистеина. Например, физиологические концентрации перекиси водорода быстро ингибируют NAT1 [3]. Это ингиби-рование является обратимым и снимается глютатионом. Также NAT1 может обратимо ингибироваться ни-трозотиолами, в частности S-нитрозо-N-ацетил-DL-пеницилламином и

S-нитрозоглутатионом, которые образуют дисульфидные связи с цистеи-ном68 [10]. Сильный сульфгидрильный окислитель пероксинитрит быстро и необратимо инактивирует NAT1 путем необратимой модификации цистеина активного центра [11, 12].

Гены NAT обладают полиморфизмом первичной структуры. В настоящее время известно четыре изоформы NAT, соответственно, NAT1, NAT2, NAT3, NAT4. У изоформ NAT1 и NAT2 было обнаружено много аллельных вариантов. Данные об аллельном полиморфизме генов NAT1 и NAT2 позволили выделить в человеческой популяции носителей мутаций, обладающих фенотипом медленных и быстрых ацетиляторов.

У медленных ацетиляторов, контактирующих с ароматическими аминами (в-нафтиламин, бензидин), повышен риск заболеваемости раком мочевого пузыря (и вероятно рака молочной железы, печени и легких) [4, 9, 13, 21, 24], что обусловлено накоплением в моче неконъ-югированных N-гидроксипроизводных. У быстрых ацетиляторов скорость инактивации и выведения канцерогенных метаболитов существенно выше, но у них чаще регистрируется рак толстого кишечника, вызванный гетероциклическими аминами, образующимися при термической обработке пищи (в основ-

ном мяса) и активирующимися изофе-ментом NAT2 [13].

Критическим моментом является изучение системы генов NAT, кодирующих целый комплекс ферментов II фазы детоксикации - ацетилирование ароматических и гетероциклических аминов фармакологической или токсической природы (ксенобиотиков, в том числе лекарств - сульфаниламидов, изониазида, кофеина и др.). NAT1 не обладает широким генетическим полиморфизмом и ацетилирует лишь небольшое количество ариламинов. NAT2, в отличие от NAT1, генетически полиморфен и является ферментом ацетилирования многих лекарственных средств и ксенобиотиков. Суб-стратспецифичный профиль и тканевая экспрессия генов NAT определяют их функциональную роль как антиок-сидантной системы [2, 5, 26].

В Научном центре биомедицинских технологий на протяжении последних 8 лет ведется работа по изучению полиморфизма, в том числе генов NAT и связи этого полиморфизма с функцией ацетилирования у мини-свиней и мышей различных инбредных линий [8]. При помощи праймеров, распознающих консервативные участки в генах NAT, нами были амплифицированы, и впоследствии клонированы фрагменты геномной ДНК мышей линий DBA2 и BALB/c и мини-свиней светлогорской популяции. Сравнение нуклеотидных последовательностей этих фрагментов с уже известными последовательностями генов NAT1 и NAT2 показало, что полученные фрагменты принадлежат генам семейства NAT у исследованных животных. При этом в случае мини-свиней полученный ген оказался геном

NAT1, а в случае мышей геном NAT2, соответствующие подобным генам человека.

Ацетиляционный полиморфизм связан не только с различными устой-чивостями к токсичности лекарств, но и раковыми заболеваниями, связанными с ароматическими и гетеро-цикличными аминами. N-ацетиляция является катализом двух цитозольных N-ацетилтрансфераз (NAT1 и NAT2), которые обезвреживают многие карци-ногенные ароматические амины. NAT1 и NAT2 также активируют N-гидрок-силметаболиты ароматических и гете-роцикличных аминных карциногенов до составляющих, которые влияют на ДНК и инициируют рак. Классический N-ацетиляционный полиморфизм регулируется локусом NAT2, который сегрегирует индивидуумов в быстрые, средние и медленные ацетиляторные фенотипы.

Некоторые эпидемиологические исследования на людях связаны с медленными и быстрыми ацетиляторны-ми фенотипами с повышением чувствительности в мочевом пузыре и колоректальным раком, соответственно. Ацетилационный полиморфизм был охарактеризован в трех типах грызунов и у мини-свиней для проверки связи между ацетилятором фенотипа NAT2 и восприимчивостью к ракам, вызванным ароматическими и гетероцикличными аминами в различных целевых органах опухоли. Были клонированы и последовательно представлены NAT1 и NAT2 из быстрых и медленных ацетиляторных мышей, сирийского хомяка и крысы. Ре-комбинанты NAT1 и NAT2 энзимов раскодированы, коды этих генов характеризовали их каталитическую активность

по активации (О-ацетиляция) и деактивации (N-ацетиляция) ароматических и гетероцикличных аминных карцино-генов. Ацетиляторный полиморфизм у мини-свиней, мышей, сирийского хомячка и крысы может быть описан как модель ацетиляционного полиморфизма человека [1].

Несмотря на имеющиеся литературные сообщения [2, 6, 18, 19, 25, 27, 29, 30] до настоящего времени не было предложено ни одной оптимальной биомодели, включая лабораторных животных, которая могла бы быть применима для изучения и описания ацеляторного полиморфизма человека.

Цель нашего исследования заключалась в сравнительном изучении генов NAT1 и NAT2 у людей разных по-пуляционных групп и различных видов лабораторных животных. На первоначальном этапе нами были обозначены следующие задачи:

• провести биоинформационный анализ последовательностей генов NAT1 и NAT2 у людей, а также мышей, крыс, кроликов для отбора наиболее перспективных нук-леотидных последовательностей мишеней, для использования в синтезе видоспецифичных прай-меров для полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР);

• подобрать и исследовать оптимальные конечные концентрации дезок-синуклеотидтрифосфатов, ионов магния (Mg2+) и олигонуклеотидных праймеров, подобрать расчетным и эмпирическим путем оптимальную температуру отжига олигонуклео-тидных праймеров, согласно соотношению оснований G/C и A/T их

Высокоспецифичные видовые праймеры к генам Nat1 и Nat2 для сравнительных исследований у человека и лабораторных животных

нуклеотидной последовательности, для полимеразной цепной реакции в реальном времени, оптимизировать количество повторяющихся циклов, при которых происходит наработка продуктов амплификации;

• провести молекулярно-генетиче-ские исследования экспрессии генов NAT1 и NAT2 на уровне мРНК у людей пяти разных популяционных групп, а также мышей, крыс и кроликов методом ОТ-ПЦР;

• сравнить видоспецифичные прайме-ры для ОТ-ПЦР у людей и лабораторных животных для последующей оптимизации экстраполяционных биомоделей ацетиляционного полиморфизма по NAT1 и NAT2, а также для изучения механизмов сегрегации индивидуумов в медленные, средние или быстрые ацетилятор-ные фенотипы.

Материалы и методы

Объектом исследования служили мыши линии Balb/c, C57BL/6, CBA/ lac, DBA/2, B10.GFP, крысы Wistar, August, WAG, кролики породы «Советская шиншилла». Материалом исследования от животных служила плазма крови. Всего было исследовано 300 мышей, 60 крыс, которых содержали в микроизоляторной системе Rair IsoSystem по 10 голов. Животные соответствовали категории SPF. Кролики содержались в индивидуальных клетках батарейного типа на решетчатых полах. В качестве подстила для всех видов животных использовали стерильные древесные опилки.

Для мелких лабораторных животных использовали стандартный комбикорм гранулированный полнораци-

онный для лабораторных животных (экструдированный) ПК-120 ГОСТ Р 51849-2001 Р.5. Водопроводная очищенная вода всем животным давалась вволю в стандартных поилках. Животные содержались в контролируемых условиях окружающей среды: температура воздуха 18-22°С и относительная влажность 60-70%. Освещение в помещениях - естественно-искусственное. Вновь прибывшие животные находились на карантине 7 дней в клетках.

Нами были исследованы образцы крови 27 человек различных популяци-онных групп. Образцы крови забирались из вены в процессе плановых углубленных медицинских обследований. Поскольку в настоящей работе стояла задача создания и использования высокоспецифичных видовых праймеров к NAT1 и NAT2, этническая и национальная принадлежность пациентов не учитывалась. В процессе углубленного и специального медицинского обследования у пациентов генетических нарушений не установлено.

Этапы эксперимента:

1. Выделение ДНК/РНК из пробы плазмы крови.

2. Амплификация геномной ДНК.

3. Идентификация ПЦР продуктов методом горизонтального электрофореза. Наличие в геле полоски ДНК соответствующего размера свидетельствовало о наличии в образце искомого гена.

Конструирование специфичных праймеров. С этой целью к генам NAT1 и NAT2 применяли биоинформационный анализ с помощью комплекса компьютерных программ Vector NTI Advance 9.0 (PC) (http://www.