Композиция для профилактики заболеваний, вызываемых цитомегаловирусной инфекцией
COMPOSITION FOR PREVENTION OF DISEASES CAUSED BY CMV INFECTION

Изобретение относится к области медицины, а именно к средствам для профилактики заболеваний, вызываемых цитомегаловирусной инфекцией.
Известен состав и способ лечения цитомегаловирусной инфекции, включающий применение живой, ослабленной цитомегаловирусной (ЦМВ) вакцины, полученной при пересадке органов от доноров (US 4689225, А61K 39/12, 1987). Недостатком этой вакцины является использование живого вируса в ее составе, что создает возможность реактивации или обострения клинического течения инфекции при рекомбинации ослабленного штамма с «диким» вариантом ЦМВ, персистирующим в организме больного ЦМВ инфекцией, кроме того, не доказано отсутствие онкогенных свойств этого штамма.
Субъединичные цитомегаловирусные вакцины, разработанные ранее исследователями в Европе (ЕРА 0180288, МПК А61К 39/245, 1986; ЕРА 0236145, МПК С12N 15/100, 1987), и рекомбинантные цитомегаловирусные вакцины ЕРА 0389286, МПК А61К 39/245, С12N 15/38, 1990), содержащие гликопротеиды ЦМВ, оказались малоиммуногенными и чрезвычайно дорогими и поэтому в практику здравоохранения внедрены не были.
Наиболее близким аналогом заявляемого изобретения является способ лечения цитомегаловирусной инфекции с применением вирионной цитомегаловирусной композиции (патент РФ №2181295) на основе инактивированной суспензии цитомегаловируса штамма АД-169, которая дополнительно содержит полиоксидоний, гиалуроновую кислоту и суппозиторную основу. В этом изобретении также представлен способ получения композиции, включающий культивирование чувствительных к вирусу клеток человека или животных, внесение инфицирующего материала ЦМВ - штамма АД-169, его адсорбцию на этих клетках, инкубацию инфицированных клеток в среде поддержки, отделение структур разрушенных клеток низкоскоростным центрифугированием и инактивацию вируса в культуральной жидкости, отличающийся тем, что в качестве чувствительных клеток используют диплоидные клетки человека культуры М-22 или клетки ночек зеленых мартышек Vero-B, которые предварительно культивируют при температуре 36-38°С в течение 48 час, инкубацию инфицированных клеток осуществляют в течение 6-7 суток, а инактивацию вируса в культуральной жидкости проводят формалином в концентрации 1:2000 при температуре 35-37°С в течение 72 час, а затем при 3-5°С в течение 10 дней или кобальтом-60 в количестве 15-20 кГр температуре 19-21°С в течение 2 час; в полученную суспензию последовательно вводят полиоксидоний, гиалуроновую кислоту и суппозиторную основу. Способ позволяет увеличить иммуногенность и тем самым снизить дозу вакцины.
Недостатками прототипа является то обстоятельство, что применяемый штамм АД-169 цитомегаловируса, характеризуется высокой продуктивностью, но не обеспечивает стабильного получения необходимого качества антигена, обладающего адекватной для использования в вакцине иммуногенностью; в процессе культивирования этого штамма могут возникать мутации, изменяющие свойства антигена и повышающие его токсичность; контроль за возникновением мутаций в случае высокой продуктивности штамма практически невозможен. Более того, при превышении определенного уровня содержания вируса может нарушаться процесс инфицирования в культуре клеток, что приводит к снижению его количества на выходе, ослаблению биологической активности и усложняет процесс очистки продукта.
Для устранения указанных недостатков предлагается композиция вакцины для профилактики заболеваний, вызываемых цитомегаловирусной инфекцией.
В частном случае осуществления изобретения, разработанную композицию возможно применять в двух лекарственных формах: жидкая форма - для внутримышечных и подкожных инъекций или в форме ректальных суппозиториев.
Предлагаемая композиция для профилактики заболеваний, вызываемых цитомегаловирусной инфекцией, включает:
- инактивированную суспензию Human herpesvirus 5 АТСС VR-1788™,
- полиоксидоний,
- гиалуроновую кислоту,
- глицирризиновую кислоту.
В частном случае осуществления изобретения - в виде суппозитория композиция для профилактики заболеваний, вызываемых цитомегаловирусной инфекцией включает:
- инактивированную суспензию Human herpesvirus 5 АТСС VR-1788™
6
- 2,0 мл (10 тканевых цитопатогенных доз ЦМВ);
- полиоксидоний - 0,02 г;
- гиалуроновую кислоту - 1,0 г;
- глицирризиновую кислоту - 0,1 г;
- суппозиторную основу - до 100 г (для лекарственной формы суппозиторий).
В частном случае осуществления изобретения - в виде состава для инъекций композиция для профилактики заболеваний, вызываемых цитомегаловирусной инфекцией включает:
- инактивированную суспензию Human herpesvirus 5 АТСС VR-1788™
6
- 2,0 мл (10 тканевых цитопатогенных доз ЦМВ);
- полиоксидоний - 0,02 г;
- гиалуроновую кислоту - 1,0 г;
- глицирризиновую кислоту - 0,1 г;
- воду - до 100 г.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является повышение эффективности лечения заболеваний, вызванных цитомегаловирусной инфекцией за счет создания высокоиммуногенной, нетоксичной, не обладающей побочными эффектами вакцины для профилактики цитомегаловирусной инфекции, содержащей в качестве антигена вирусоспецифические белки.
Предлагаемое изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Приготовление композиции
Вирус выращивается на монослое клеток HEL 299 (5АТСС VR-1788™). Предварительно подготовленный клеточный монослой промывают для удаления слабо прикрепленных клеток и затем вносят инфицирующую дозу вируса. Предпочтительным является использование взвеси посевного вируса второго пассажа при множественности инфекции 0,001-0,01 ВОЕ/кл, так как это предотвращает накопление дефектных вирионов. Для выращивания клеток используется среда ИГЛА MEM с 10% фетальной бычьей сыворотки. Инфицирующую дозу вируса, содержащуюся в небольшом объеме питательной среды, достаточном для покрытия монослоя клеток, адсорбируют на монослое клеток в течение 1 часа. Зараженные клетки инкубируют при 37°С 3-4 дня, после максимального проявления признаков цитопатогенного действия вируса на клетки собирают культуральную жидкость, содержащую вирус и проводят ее очистку от компонентов культуры клеток.
Клеточный лизат освобождают от ядер центрифугированием при 1700 g и температуре 4°С в течение 10 минут. Надосадочную жидкость осветляют центрифугированием при 13000 g и температуре 4°С в течение 15 минут и подвергают очистке от балластных высокомолекулярных клеточных компонентов в режиме ультрацентрифугирования (ротор SW-28 на ультрацентрифуге «Beckman»), пропуская ее через трехслойную сахарозную подушку, состоящую из 10, 20 и 30% пятимиллилитровых слоев сахарозы при скорости вращения ротора 80000 g в течение 12 часов. К полученному указанным способом первичному концентрату вируссодержащей жидкости при постоянном перемешивании приливают 25% раствор стрептомицина сульфата до его конечной концентрации 0,5% и выдерживают при температуре 4°С 15 минут; осветляют концентрат центрифугированием при 13000 g и температуре 4°С в течение 15 мин на роторе SA-20. Осадок удаляют, концентрат фильтруют через стерилизующий набор фильтров с завершающим диаметром пор 0,2 мкм.
В результате очистки из лизата культивируемых клеток удаляется основная масса балластных белков, а при концентрировании получают оптимальное содержание вируса в суспензии. Полученный вируссодержащий материал подвергается инактивации в присутствии 0,1% раствора формальдегида при температуре 37°С в течение 14 суток. Полученный препарат вирусной суспензии проверяют на полноту инактивации (специфическую безвредность).
6
На каждые 2,0 мл инактивированной суспензии цитомегаловируса (что соответствует 10 тканевых цитопатических доз ЦМВ) добавляют полиоксидоний - 0,02 г, гиалуроновую кислоту - 1,0 г глицирризиновую кислоту (0,1%) и воду бидистиллированную апирогенную до общего объема 100,0 мл - получают жидкую форму вакцины для инъекций. Для получения лекарственной формы в виде ректальных суппозиториев в вышеуказанную композицию вместо бидистиллированной воды дополнительно вводят суппозиторную основу, в которую входят кондитерский жир, парафин, эмульгатор до общей массы 100,0 г; из полученной массы известным способом изготавливают свечи с указанным соотношением ингредиентов.
Каждая свеча имеет массу от 1,5 г до 2,0 г и содержит до 500 мкг/г белка, имеет температуру плавления не более 37°С, рН от 6,8 до 7,2, специфически безопасна и способна индуцировать синтез специфических антител у лабораторных животных, которые нейтрализуют не менее 2 lg ТЦД 50/мл в исходной суспензии цитомегаловируса.
Пример 2.
Испытания эффективности предлагаемого препарата были проведены на 40 мышах породы BALB/c, которых разделили на 2 группы. Первую группу (n=20) иммунизировали с помощью заявляемой нами композиции в жидкой форме подкожно в области спины в дозе 20 мкг, что соответствует терапевтической дозе для человека. Во второй группе (n=20) использовалась композиция, содержащая инактивированную суспензию Human herpesvirus, изготовленную в соответствии с описанием по Патенту РФ №2181295 (прототип; введение препарата осуществляли так же, как и в первой группе. Через 10 и 15 дней в обеих группах анализировался специфический ответ IgG против ЦМВ, для этого у мышей получали образцы периферической крови из надреза кожи в концевой части хвоста. Содержание специфических антител определяли в ИФА с видоспецифическим конъюгатом против IgG мыши.
Установлено статистически достоверное повышение содержания анти-ЦМВ антител класса IgG (р>0,05) в группе лабораторных животных на 15 и 20% в ответ на введение композиции по заявляемому изобретению, по сравнению с использованием препарата, соответствующего прототипу.
Кроме того, заявляемая композиция обладала более низким порогом токсичности, что было подтверждено при исследовании приготовленных опытных серий композиции с набором реагентов на основе люминесцирующих бактерий «Эколюм» (ЗАО "НВО Иммунотех", ТУ 6-09-20-236-01, свидетельство о метрологической аттестации (4/7-93)) на портативном измерительном приборе - люминометре «Биотоке-10».
Полученные результаты свидетельствуют о более высокой иммуногенности вакцины, получаемой согласно заявляемому изобретению.