Изучение влияния УФ-облучения и воздействия налидиксовой кислоты на индукцию RecA-белка в клетках Francisella tularensis 15/10

УДК 616.981.455

А.А.Лапин, Т.Б.Кравченко, А.Н.Мокриевич, Г.М.Вахрамеева, Т.И.Комбарова, И.А.Дятлов,

В.М.Павлов

изучение влияния уф-облучения и воздействия налидиксовой кислоты на индукцию RECA-БEЛKA в клетках РГАПС&ЕНА TULARENSIS 15/10

Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии, Оболенск

Изучено влияние УФ-облучения и налидиксовой кислоты на синтез RecA-белка Е Ш1агет1&' 15/10. Получена специфическая мышиная сыворотка к рекомбинантному RecA-белку. По данным иммуноблоттинга со специфической сывороткой, в клетках Е (и1агет'1&' 15/10 после воздействия повреждающих агентов количество RecA-белка не увеличивается.

Ключевые слова: Francisella tularensis, ген гесА, RecA-белок, индукция, гомологичная рекомбинация.

A.A.Lapin, T.B.Kravchenko, A.N.Mokrievich, G.M.Vakhrameeva, T.LKombarova, I.A.Dyatlov, V.M.Pavlov

Study of the UV Irradiation and Nalidicsic Acid Effect on the RecA-protein Induction in Francisella tularensis 15/10 cells

State Research Center for Applied Microbiology and Biotechnology, Obolensk

Studied is the UV irradiation and nalidicsic acid effect on the RecA-protein synthesis in Francisella tularensis 15/10 cells. Obtained is the specific murine serum to the recombinant RecA-protein. The results of immunoblotting with this specific serum demonstrate that the amount of RecA-protein in Francisella tularensis 15/10 cells is not increased after the exposure to these damaging factors.

Key words: Francisella tularensis, recA-gene, RecA-protein, induction, homologous recombination.

Ключевым ферментом, участвующим в процессе гомологичной рекомбинации и репарации ДНК, является белок ЯееА - продукт гена гесА - мульти-функциональный фермент, обладающий целым рядом свойств, среди которых ДНК- и АТФ-связывание, АТФ-азная и копротеазная активности [4]. Анализ генома Е tulaгensis LVS из базы данных NCBI (АМ233362) позволил обнаружить ген, сходный с геном гесА Е. соИ. Молекула ЯеоА-подобного белка Е tulaгensis LVS - продукта гесА--подобного гена -содержит 359 аминокислот в отличие от молекулы ЯееА Е. соИ (353 аминокислоты). Воздействие УФ-облучения способствует возникновению разрывов в молекуле ДНК и образованию тиминовых димеров, а воздействие налидиксовой кислоты подавляет репликацию ДНК путем прекращения ее полимеризации [4].

Целью настоящей работы является изучение влияния ультрафиолетового облучения и антибиотика налидиксовой кислоты на индукцию белка ЯееА в вакцинном штамме Е tulaгensis 15/10.

Материалы и методы

Использованные в работе штаммы и плазмиды представлены в таблице.

Штаммы Е. соИ культивировали при температуре 37 °С на жидкой и плотной питательной среде Лурье-Бертани LB и LA [7] с добавлением ампициллина (Ар) до концентрации 100 мкг/мл или без него. Штаммы Е tulaгensis культивировали при температуре 37 °С на плотной среде FT-агар (ФГУН ГНЦ ПМБ) и жидкой питательной среде ^ТВ) [1]

с добавлением полимиксина (Pm) до концентрации 100 мкг/мл. Штамм Y. pestis EV НИИЭГ культивировали при температуре 28 °С на плотной питательной среде Хоттингера, pH 7,2 (ФГУН ГНЦ ПМБ). Приготовление компетентных клеток и трансформацию клеток E. coli BL21(DE3) проводили по руководству [2].

Культуры клеток F. tularensis 15/10 и E. coli для индукции RecA белка под действием налидиксовой кислоты растили в жидкой питательной среде до ОП595 1 ед. затем вносили налидиксовую кислоту (Nal) до конечной концентрации 40 мкг/мл и культивировали в течение 90 мин при температуре 37 °С [11].

Для индукции RecA белка под действием ультрафиолетового облучения ночную агаровую культуру F. tularensis 15/10 суспендировали в забуфе-ренном физиологическом растворе (ЗФР) до ОП595 0,2 ед. Полученную суспензию обрабатывали в чашке Петри на УФ-излучателе («Cole Parmer», США) при длине волны 254 нм и постоянном перемешивании. Облучение проводили в течение 10 и 80 с. После обработки отобранную на каждой временной точке суспензию клеток центрифугировали при 12000 об./мин и отмывали в ЗФР. Осадки бактериальных клеток переносили в свежую жидкую питательную среду и культивировали при 37 °С в течении 4 ч без перемешивания.

Стандартные генно-инженерные манипуляции проводили, как описано [2] и согласно инструкции производителей. Ферменты для рестрикции и лигирования были приобретены в фирме «Fermentas» (Литва). Праймеры были синтезированы компанией ЗАО «Синтол». Расчет праймеров проводили с ис-

Зб

Штаммы и плазмиды

Название

Характеристика

Источник

E. coli Bl21

Y. pestis EV НИИЭГ F tularensis 15/1G F tularensis 15/1GArecA

pET23(b)+

pET23(b)+/RecA-(His)6

E. coli Bl21 pET23(b)+/RecA-(His)6

F- dcm ompT hsdS^- тв-) gal X

Вакцинный штамм

Pmr, вакцинный штамм

Pmr, вакцинный штамм с инактивированным геном recA

Apr , T7^Tag, His^Tag

Apr , T7^Tag, His^Tag ген recA F. tularensis 15/10

F- dcm ompT hsdS^- mB-) gal X (DE3) Apr , T7^Tag, His^Tag ген recA F. tularensis 15/10

Stratagen, США Государственная коллекция микроорганизмов «ГКПМ» Государственная коллекция микроорганизмов «ГКПМ» Государственная коллекция микроорганизмов «ГКПМ»

Novagen, США Данная работа Данная работа

пользованием нуклеотидной последовательности генома F. tularensis LVS (AM233362) из банка генов NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov) и пакета компьютерных программ Vector NTI, 10.0 (США). Сиквенс ДНК проводили на секвенаторе ALF express II (Amersham Pharmacia Biotech, США).

ПЦР проводили на термоциклере Gene Ap pCr System 2700 (Applied Biosystems. США) с помощью высокоточной полимеразы («Fermentas», Литва) с праймерами Nde-recAF1 (CCCCCATATGAGTAAAGAAAAGGCGCTAGA ATCAG) и R1RecAorf(XhoI) (AACTCGAGGATAA GCTCATCTTGAGTAACTGCTGG). Продукты реакции разделяли электрофорезом в 0,7 % агарозном геле с использованием 0,04 M Трис-ацетатного буфера с добавлением ЭДТА до 0,002 M (pH 8,0).

Экспрессию рекомбинантного RecA белка проводили согласно инструкции производителя вектора pET23b(+). Синтез клонированного белка индуцировали добавлением в культуральную среду изопропил-P-D-галактопиранозида (ИПТГ) (Amersham Pharmacia Biotech Inc., США) до конечной концентрации 1 мМ с последующим культивированием в течение 2,5 ч. Уровень индукции контролировали с помощью электрофореза в 12,5 % полиакриламидном геле (ПААГ) в денатурирующих условиях по методу Лэммли [5].

Очистку рекомбинантного белка из цитоплазматической фракции штамма-продуцента E. coli Bl21 pET23(b)+/RecA-(His)6 проводили металл-хе-латирующей хроматографией в неденатурирующих условиях на носителе Ni2+NTAHisBind Superflow™ (Pharmacia Biotech, Швеция). Полученные фракции анализировали электрофорезом в 12,5 % ПААГ, объединяли, диализовали против 20 мМ Трис-HCl-буфера (рН 8,0) в присутствии 5 мМ ДТТ при комнатной температуре и хранили при температуре 14 °С.

Молекулярную массу белков определяли по сканированному изображению электрофореграммы с помощью программы PhotoCaptMW с использованием набора стандартных маркеров молекулярной массы для электрофореза («Fermentas», Латвия). Количество белка оценивали по методу Лоури с использованием бычьего сывороточного альбумина в качестве стандарта [6]. Вестерн-блоттинг проводили по методу [10]. Иммуноферментный анализ (ИФА) проводили согласно руководству [8].

Мышиные антисыворотки к рекомбинантному белку RecA были получены трехкратной подкожной иммунизацией белых нелинейных мышей 20 мкг белка RecA-(His)6 с интервалом в 21 день.

Результаты и обсуждение

Ампликон с геном recA получали с использованием праймеров Nde-recAF1 и R1RecAorf(XhoI) и ДНК F. tularensis 15/10 в качестве матрицы. Ампликон размером 1077 п.о. обрабатывали рестриктазами NdeI и XhoI и встраивали в линеаризованную векторную плазмиду pET23(b+). Полученную рекомбинантную плазмиду pET23(b)+/RecA-(His)6 переносили в клетки штамма E. coli BL21 методом кальциевой трансформации. Отбор трансформированных клеток E. coli BL21, несущих плазмиду (pET23(b)+/ RecA-(His)6), проводили по признаку устойчивости к ампициллину и наличию фрагмента хромосомной ДНК F. tularensis 15/10 с копией гена recA с помощью ПЦР, используя праймеры Nde-recAF1 и R1RecAorf(XhoI).

Клонированный ген recA секвенировали для проверки ошибок в открытой рамке считывания, возникающих в процессе ПЦР-амплификации и клонирования в вектор, биоинформационный анализ транслированной рамки считывания секвенирован-ного гена recA F. tularensis 15/10 не выявил изменений по отношению к гену recA F. tularensis LVS (AM233362). Молекулярная масса рекомбинантного RecA белка, рассчитанная с использованием пакета программ Vector NTI 10.0, составляла 39801,94 Да.

Анализ уровня синтеза рекомбинантно-

го белка RecA-(His)6 в полученных клонах E. coli BL21(pET23(b)+/RecA-(His)6 после индукции ИПТГ показал наличие основной белковой полосы с кажущейся молекулярной массой около 42 кДа (рис. 1 А, показано стрелками).

Клон E. coli BL21(pET23(b)+/RecA-(His)6 после секвенирования гена recA использовали для получения белка RecA-(His)6. Выделенный и очищенный металл-хелатирующей хроматографией в не денатурирующих условиях гомогенный препарат белка с кажущейся молекулярной массой (42,9±1,9) кДа и чистотой около 80 % (рис. 1, Б) использовали для получения специфической антисыворотки. Средний

Рис. 1. Электрофореграмма клеточных лизатов E. соН BL21(pET23(b)+/RecA-(ffis)6 до и после внесения ИПТГ для индукции синтеза рекомбинантного белка RecA-(His)6:

А. М - набор стандартных белков <^егтейа§» (66, 45, 24, 18,4 и 14,4 кДа); 1-4 - E. coli ВЬ21(рЕТ23(Ь)+/ЯесА-(Ш8)6 до индукции;

5 - E. соИ ВЬ21; 6-9 - E. соИ ВЬ21(рЕТ23(Ь)+/ЯесА-(Ш8)6 после индукции. Б. Очищенный рекомбинантный белок ЯесА-(Ш§)6

титр антител к рекомбинантному белку ЯесА-(Н18)6 составлял 1:3016.

Способность антисыворотки к рекомбинантному белку ЯесА-(Н18)6 специфически связываться с нативным белком ЯесА оценивали иммуноблот-тингом с использованием клеточных лизатов родительского и мутантного штаммов Е tularensis 15/10 и Е tularensis 15/10АгесА, а также Е. соИ и У. pestis. Иммуноблотинг показал (рис. 2), что полученная нами антисыворотка к рекомбинантному белку ЯесА-(№8)6 выявляет по одной основной полосе в препаратах рекомбинантного белка ЯесА-(Н1Б)6 (молекулярная масса ~ 44 кДа) и в лизате клеток исходного штамма Е tularensis 15/10 (молекулярная масса), свидетельствуя о специфичном распознавании соответствующих эпитопов в молекуле нативного туля-ремийного белка ЯесА. Следует отметить некоторое расхождение между рассчитанной (38831,12 Да) и кажущейся (~ 43 кДа) молекулярными массами нативного белка ЯесА.

Кроме того, отсутствие видимых полос в треке штамма Е tularensis 15/10АгесА с удаленным геном гесА подтверждает неспособность бактериальных клеток к синтезу белка ЯесА, обусловленное деле-цией гена гесА. Обращает на себя внимание наличие полос молекулярной массы ~ 38 кДа в лизатах клеток Е. соИ и У. pestis (рис. 2, линии 1 и 4), что может свидетельствовать о том, что в молекулах ЯесА белков Е. соИ и У. pestis присутствуют общие с белком ЯесА туляремийного микроба эпитопы, поскольку рассчитанные молекулярные массы ЯесА белков Е. соИ и У. pestis составляют 37971,18 и 37854,10 Да соответственно.

Влияние УФ-облучения на индукцию синте-

Рис. 2. Специфичность антисыворотки к рекомбинантному белку RecA-(His)6 (10 % Ds-Na-ПААГ):

1 - У. pestis ЕУ; 2 - Е Шагет1$ 15/10; 3 - Е Шагет1$ 15/10АгесА;

4 - Е. соИ ВЬ21; 5 - рекомбинантный белок ЯесА^Шв^;

6 - окрашенные маркеры <^егтеПав»

за ЯесА белка в клетках Е tularensis 15/10 изучали воздействием ультрафиолетового облучения при двух вариантах экспозиции - 10 и 80 с. По результатам высевов выживаемость клеток после облучения в течение 10 с составила 90 %, а при экспозиции 80 с - всего 10 %. Уровень индукции синтеза белка ЯесА в пробах, отобранных в различные временные интервалы в диапазоне 0-4 ч после облучения, был оценен с помощью иммуноблоттинга с полученной поликлональной мышиной антисывороткой к рекомбинантному ЯесА белку. На рис. 3 (А) приведен иммуноблоттинг проб, полученных при экспозиции 80 с. Визуальная оценка интенсивности окраски соответствующих треков для проб, отобранных в разные временные интервалы после воздействия УФ-облучения, не позволяет выявить в них явных отличий, что может свидетельствовать об отсутствии детектируемого уровня индукции белка ЯесА.

Уровень синтеза белка ЯесА при воздействия N1 в течение 90 мин оценивали с помощью имму-ноблоттинга с той же мышиной антисывороткой (рис. 3, Б). Анализ данных позволяет считать, что в клетках Е tularensis синтез белка ЯесА не индуцируется. Интенсивность окраски соответствующей белковой полосы до обработки (рис. 3, Б, линия 3) не отличается от таковой после воздействия №1 (рис. 3, Б, линия 4).

Результаты, полученные с помощью иммуно-блоттинга, свидетельствуют о том, что синтез белка ЯесА в клетках Е tularensis, по-видимому, является конститутивным и не индуцируется под воздействи-

Рис. 3. Индукция белка RecA под действием УФ-облучения (А) и налидиксовой кислоты (Б) (10 % Ds-Na-ПААГ):

А. Клетки F tularensis 15/10: линия 1 - 0 с, 2 - 30 мин, 3 - 1 ч, 4 - 2 ч,

5 - 4 ч; 6 - белок RecA-(His)6 . Б. 1 и 2 - клетки F. tularensis 15/10 до и после воздействия налидиксовой кислоты; 3 - белок RecA-(His)6

ем УФ-облучения и налидиксовой кислоты,

Как известно, белок RecA является центральным компонентом системы SOS индукции, способствующей восстановлению поврежденной ДНК бактериальной клетки, не только из-за непосредственного участия в процессе репарации ДНК, но и в экспрессии других генов, функции которых направлены на сохранение жизнеспособности бактерий после любого повреждающего воздействия. Показано, что при повреждении ДНК микобактерий индукция экспрессии гена белка RecA проходила с разной скоростью и была значительно замедлена у Mycobacterium tuberculosis по сравнению с M. smegmatis. Авторы считают, что замедление индукции может быть обусловлено вовлечением других факторов, и такой механизм обусловливает адаптационное преимущество патогенному микроорганизму в обеспечении более длительной защиты от агрессивного противодействия иммунной системы макроорганизма [9]. Возможно, что подобный механизм, являющийся объектом нашего дальнейшего исследования, лежит и в основе выявленного нами отсутствия индукции белка RecA

в клетках F. tularensis. Кроме того, представляет интерес и изучение причин расхождения рассчитанной и кажущейся молекулярных масс нативного белка RecA, которое может быть обусловлено его постран-сляционной модификацией [3].

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Лапин А.А., Павлов В.М., Мокриевич А.Н., Домотенко Л.В., Храмов М.В. Простая жидкая питательная среда для молекулярно-генетических исследований Francisella tularensis. Пробл. особо опасных инф. 2009; 4(102):66-7.

2. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Изд-во Мир; 1984. 480 с.

3. Fischer W., Haas R. The RecA protein of Helicobacter pylori requires a posttranslational modification for full activity. J. Bacteriol. 2004; 186(3):777-84

4. Kowalczykowski S.C., Dixon D.A., Eggleston A.K., Lauder S.D., Rehrauer W.M. Biochemistry of homologous recombination in Escherichia coli. Microbiol. Rev. 1994; 58(3):401-65

5. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nalure(London). 1970; 227:680-685

6. Lowry O.H., Rosenbrough N.R., Farr A.L., Randall RJ. Protein measurement with the folin phenol. J. Biol. Chem. 1951; 193:115-9.

7. Miller J.H. Experiments in Molecular Genetics. N.Y: Gold Harbor Laboratory; 1972.

8. Ngo T.T., Lenhoff H.M., editor. Enzyme-mediated immunoassay. New York, London: Plenum Press; 1988. 444p.

9. Papavinasasundaram K.G., Anderson C., Brooks P.C., Thomas N.A., Movahedzadeh F., Jenner P.J. et al. Slow induction of RecA by DNA damage in Mycobacterium tuberculosis. Microbiology. 2001; 47:3271-9.

10. Towbin H., Staenelin T., Gordon J. Electroforetic transfer of proteins from polyacrilamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979; 76(9):4350-4.

11. Weinstock G.M., McEntee K.M., Lehman I.R. ATP-dependent renaturation of DNA catalyzed by the recA protein of Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979; 76(1):126-30.

References

1. Lapin A.A., Pavlov VM., Mokrievich A.N., Domotenko L.V., Khramov M.V [Simple liquid nutrient medium for molecular-genetic investigations of Francisella tularensis]. Probl. Osobo Opasn. Infek. 2009; 4(102):66-7.

2. Maniatis T.,FrichE., SembrukG., [Methods of Genetic Engineering. Molecular Cloning]. Moscow: Izd. “Mir”; 1984. 480 p.

Authors:

Lapin A.A., Kravchenko T.B., Mokrievich A.N., Vakhrameeva G.M., Kombarova T.I., DyatlovI.A., Pavlov V.M. State Research Center for Applied Microbiology and Biotechnology. Obolensk, Moscow Region, 142279, Russia. E-mail: info@obolensk.org

Об авторах:

Лапин А.А., Кравченко Т.Б., Мокриевич А.Н., Вахрамеева Г.М., Комбарова Т.И., Дятлов И.А., Павлов В.М. Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии. 142279, Оболенск, Московская обл. E-mail: info@obolensk.org

Поступила 13.05.11.