ХАРАКТЕРИСТИКА ПРОБИОТИЧЕСКИХ ШТАММОВ ЛАКТОБАКТЕРИЙ – АНТАГОНИСТОВ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ИНФЕКЦИЙ ВЕРХНИХ ДЫХАТЕЛЬНЫХ ПУТЕЙ.

ХАРАКТЕРИСТИКА ПРОБИОТИЧЕСКИХ ШТАММОВ ЛАКТОБАКТЕРИЙ -АНТАГОНИСТОВ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ИНФЕКЦИЙ ВЕРХНИХ ДЫХАТЕЛЬНЫХ

ПУТЕЙ.

1Д.А. Амирсаидова, 2Г.А. Бекмуродова, 3Н.А.Элова, 4Ш.М. Миралимова,

5Ш.М.Маматраимова

1'2'3'4'5Институт микробиологии АН РУз https://doi.org/10.5281/zenodo.8372551

Аннотация. В статье отображены данные по сравнительному изучению антимикробной активности штаммов молочнокислых бактерий, выделенных из ротовой полости здоровых людей и штаммов лактобактерий, выделенных из различных экологических ниш. Определена способность штаммов лактобактерий к аутоагрегации и коагрегации. Исследованы 12 антагонистически активных штамма лактобактерий, относящихся к родам Pediococcus, Lactobacillus, Leuconostoc. Бактерии характеризовались средней степенью адгезии, высокой степенью аутоагрегации и высокой коагрегирующей активностью в отношении тест-штаммов Enterobacter cloacae 1, Acinetobacter pittii 1, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus 3, Staphylococcus epidermidis, Enterobacter bugandensis 22, выделенных от больных острым тонзиллитом. Выявлено, что данные свойства могут быть использованы для предварительного скрининга для выявления и отбора штаммов лактобактерий, которые могут быть использованы для создания новых пробиотиков с целью стабилизации нормофлоры полости рта.

Ключевые слова: аутоагрегация, коагрегация и штаммов лактобактерий, пробиотики, патогены, колонизации патогенными микроорганизмами, нормофлора полости рта.

Abstract. The article describes a comparative study of the antimicrobial activity of strains of lactic acid bacteria isolated from the oral cavity of healthy people and strains of lactobacilli isolated from various environments provided space. The ability of strains of lactobacilli to autoaggregation and coaggregation was determined. 12 antagonistically active strains of lactobacilli converted to the genera Pediococcus, Lactobacillus, Leuconostoc were studied. Bacteria have the character of medium level adhesion, high level of autoaggregation and high coagulation activity against test strains: Enterobacter cloacae 1, Acinetobacter pittii 1, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus 3, Staphylococcus epidermidis, Enterobacter bugandensis 22, isolated from patients with tonsillitis. It was found that these properties can be used for screening to identify and select strains of lactobacilli that can be used to create new probiotics in order to attract normoflora of oral cavity.

Keywords: autoaggregation, coaggregation and of lactobacillus strains, probiotics, pathogens, colonization by pathogenic microorganisms, normal flora of the oral cavity.

Микрофлора ротовой полости представляет собой очень сложную экосистему, включающую микробиом полости рта, анатомические структуры полости рта (зубы, периодонт, язык, слизистую оболочку полости рта и т.д.), слюну, куда также относятся взаимодействия между микроорганизмами микробиоты ротовой полости и микроорганизмами полости рта и организмом хозяина [1].

Ротовая полость находится в прямом контакте с внешней средой и постоянно подвергается воздействию микробных видов, присутствующих в окружающей среде и попадающих внутрь во время дыхания и приема пищи. Сложная анатомическая структура полости рта (а также стоматологические материалы), наличие слюны и другие физико-химические характеристики, такие как рН, содержание кислорода и температура окружающей среды, определяют микроорганизмы, которые оседают в ротовой микроэкосистеме [2].

Антибиотики используются для лечения инфекционных заболеваний, в том числе болезней полости рта, однако их использование следует ограничить, поскольку распространение устойчивых к антибиотикам бактерий стало серьезной проблемой. В результате чрезмерного и неправильного использования антибиотиков, а также появления штаммов, устойчивых к антибиотикам, постепенно стали применять пробиотическую терапию для предотвращения и облегчения инфекционных заболеваний [3]. Lactobacillus является одним из основных родов пробиотиков, который широко изучается в связи с его потенциальной ролью в здоровье полости рта. Имеющиеся данные показывают, что потребление молока, обогащенного Lactobacilllus rhamnosus GG, снижает риск развития кариеса у детей [4]. Точно также Lactobacillus reuteri снижает риск гингивита [5]. Следовательно, лактобациллы с пробиотическими свойствами могут предотвращать колонизацию оральных патогенов с помощью различных механизмов. Пробиотические штаммы продуцируют антимикробные компоненты, такие как бактериоцины, перекись водорода и молочная кислота, которые ингибируют рост оральных патогенов (например, Streptococcus mutans).

Данное исследование направлено на скрининг новых пробиотиков-кандидатов из оральных изолятов, полученных от здоровых людей и из штаммов лактобактерий, выделенных из источников растительного и животного происхождения, путем оценки антибактериальной активности против патогенных бактерий, участвующих при развитии и течении острого тонзиллита.

МЕТОДЫ.

Материалы и методы. 32 здоровых добровольца (21 мужчина, 11 женщин, в возрасте от 26 до 66 лет) были включены в исследование для выделения бактерий ротовой полости.

Сбор образцов из полости рта и выделение лактобактерий из полости рта. Образцы со слизистой оболочки горла, щек и поверхности языка собирали у каждого субъекта, смешивали и разбавляли в анаэробной транспортной среде. Сразу после отбора пробы сеяли на чашки с агаром де Мана, Рогозы и Шарпа (МРС-агар) (HiMedia, India).

Для быстрой выборочной идентификации микроорганизмов использовали программно-аппаратный комплекс MALDI Biotyper. Масс-спектрометрический анализ проводили с использованием MALDI-TOF масс-спектрометра Microflex («BrnkerDaltonics», Германия).

Все выделенные изоляты хранятся в замороженном состоянии при -80оС в музее культур лаборатории «Микробиом человека» Института микробиологии АН РУз.

Антимикробная активность штаммов лактобактерий. Антимикробную активность пробиотических штаммов-кандидатов, выделенных из ротовой полости и

штаммов лактобактерий, хранившихся в коллекции лаборатории, определяли методом пятен на агаре [6].

Определение антибиотикочувствительности изолятов.

Антибиотикочувствительность лактобактерий определяли диско-диффузионным методом с использованием следующих антибиотиков, адсорбированных на бумажных дисках (HiMedia): цефазолину, канамицину, эритромицину, рифампицину, ципрофлоксацину, цефатоксиму, левофлоксацину, амикацину, ванкомицину, амоксиклаву, гентамицину, офлоксацину[7].

Определение агрегационной способности. Агрегационная способность штаммов МКБ изучали методом, описанным Collado et al. (2008), с некоторой модификацией [8].

Определение коагрегационной способности штаммов МКБ. Штаммы условно-патогенных микроорганизмов: Enterobacter cloacae 1, Acinetobacter pittii 1, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus 3, Staphylococcus epidermidis, Enterobacter bugandensis 2, Shewanellaputrefaciens 1, Echerichia coli 1 служили в качестве тест-культур.

Смеси инкубировали при 37°C без перемешивания и измеряли оптическую плотность (OD 600 нм) через 24 часа при 37°C. Процент совместной агрегации рассчитывали как [(Апат-Алакт)/2(Асмесь)/(Апат-Алакт)/2] 100, где Апат и Адакт представляют собой поглощение в пробирках, содержащих только патоген или штамм лактобактерий, соответственно, а Асмесьпредставляет собой поглощение смеси через 24 часа [9].

Результаты и обсуждение.

Выделение штаммов молочнокислых бактерий из ротовой полости человека.

Всего было получено 100 пероральных изолятов молочнокислых бактерий от 32 здоровых добровольцев. Изоляты были депонированы в виде пероральной бактериальной библиотеки для применения на следующих этапах исследований.

При идентификации микроорганизмов с использованием масс-спектрометрического анализа на MALDI-TOF масс-спектрометре Microflex («Bruker Daltonics», Германия) выявлены 17 культур: Pediococcus acidilactici (4 штамма), Lactobacillus rhamnosus (3 штамма), Lactobacillus paracasei (3 штамма), Lactobacillus brevis (1 штамм), Lactobacillus fermentum (2 штамма), Lactobacillus gasseri (1 штамм), Lactobacillus delbrueckii (1 штамм), Lactobacillus salivarius (1 штамм), Enterococcus durans (1 штамм).

Антимикробная активность штаммов молочнокислых бактерий. Одним из важных критериев при оценке перспективности использования штаммов микроорганизмов для создания на их основе нового пробиотика является способность бактерий подавлять рост и размножение условно-патогенных микроорганизмов, участвующих при развитии и течении острого тонзиллита. Анализ данных антагонистической активности основных групп лактобактерий, свидетельствует о том, что все исследуемые штаммы лактобацилл обладают выраженной антагонистической активностью в отношении условно-патогенных микроорганизмов. Наиболее значимые показатели были получены в отношении штаммов Pediococcus acidilactici (4 штамма).

При сравнительном анализе антимикробной активности штаммов рода Pediococcus, выделенных из ротовой полости здоровых людей и штаммов, выделенных ранее из других источников установлено, что штаммы, выделенные из ротовой полости эффективнее чем штаммы из неиндигенной микрофлоры подавляют рост Enterobacter bugandensis (1

штамм), Escherichia coli (3 штамма), Klebsiella pneumoniae (1 штамм), Staphylococcus aureus (3 штамма^, Rothia mucilaginosа(2 штамма), Shewanella putrifaciens (1 штамм), Candida albicans (2 штамма).

Штаммы L. rhamnosus, выделенные из неиндигенной микрофлоры эффективнее чем штаммы, из ротовой полости подавляют рост штаммов Acinetobacter pittii, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Rothia mucilaginosа, Candida albicans. Штаммы Lactobacillus fermentum обладают менее выраженной антагонистической активностью. Среди исследованных видов лактобактерий, штаммы Lactobacillus brevisпоказали самую низкую антагонистическую активность. Штаммы, L. brevis выделенные из индигенной микрофлоры ротовой полости подавляют рост штаммов Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus epidermidis, Neisseria subflava,Rothia mucilaginosа. Установлено, что грибковая микрофлора при воспалительных заболеваниях верхних дыхательных путей чаще всего представлена родом Candida - наиболее часто выделяемым условным патогеном ротовой полости. Pediococcus acidilactici показали высокую антимикробную активность против выделенных изолятов рода Candida, устойчивых к нистатину (100 U/диск).

Для борьбы с эндогенной оппортунистической инфекцией рекомендуется применение пробиотиков, действующим началом которых являются представители нормальной микрофлоры организма, в частности, бифидобактерии и лактобациллы. Наибольшей активностью против патогенных микроорганизмов обладают лактобациллы, которые продуцируют различные антибактериальные вещества, такие как органические кислоты, перекись водорода, мурамидазу, бактериоцины, микроцины и др., что обусловливает их антагонистическую активность[10, 11, 12, 13]. Лактобациллы обеспечивают устойчивость слизистых оболочек организма к колонизации аллохтонной микрофлорой.

Чувствительность штаммов лактобактерий к антибиотикам. Результаты показали, что все культуры чувствительны к гентамицину. Все культуры устойчивы к офлоксацину: устойчивы 8 штаммов, умеренно-устойчив - 1 штамм и 1 штамм-LactobacillusrhamnosusOC1 обладает чувствительностью. Выявлено, что 9 культур из 10 обладают устойчивостью или умеренной устойчивостью к стрептомицину L. salivariusOC1.

Исследованные штаммы лактобактерий демонстрировали устойчивость к стрептомицину и ципрофлоксацину, чувствительность к этому антибиотику выявлена только у штамма Lactobacillus rhamnosus OC1. При том, что к гентамицину, который тоже относится к аминогликозидным антибиотикам, проявили умеренную устойчивость (диаметры зон подавления роста от 10 до 18 мм). Пониженная чувствительность лактобактерий к аминогликозидам также считают природной и связывают с низкой проницаемостью антибиотиков этой группы через мембраны лактобацилл [14]. Потенциальная мобильность генетических детерминант устойчивости к офлоксацину и аминогликозидам точно не установлены [15]. Согласно М. Danielsen, A. Wind, горизонтальному транспорту особенно подвержены гены устойчивости к хлорамфениколу и эритромицину [16]. Бактерии рода Lactobacillus чувствительны к этим антибиотикам [14] и в целом к ингибиторам биосинтеза белка. Изученные в нашем исследовании лактобациллы показали высокую чувствительность к эритромицину. В целом, результате

изучения антибиотикочувствительности у лактобацилл не обнаружено вызывающей опасения устойчивости к антимикробным препаратам и по этим показателям противопоказаний к их применению не обнаружено.

Агрегационная способность штаммов. Для первичного скрининга пробиотического потенциала штаммов и определения корреляции между показателями клеточной поверхности и адгезией мы испытали аутоагрегационную и коагрегационную способности 12 штаммов лактобактерий.

Установлено, что аутоагрегационная способность (АС) 12 штаммов лактобактерий, выделенных из ротовой полости, колеблется от 26 до 52% после 5 ч инкубации при 37°C. Исходя от % АС, штаммы можно разделить на три группы: высокая степень аутоагрегационная способность (ВАС) >70%, средняя степень аутоагрегационной способности (САС) 20-70 % и низкая степень аутоагрегационной способности (НАС) <20% [17].

Штаммы Leuconostoc lactis Sh и Lactobacillus fermentum F проявили самую низкую аутоагрегационную активность, 29% и 26%, соответственно. Наблюдаемая способность тестируемых штаммов МКБ к аутоагрегации имеет штаммовую зависимость и может быть связана с компонентами клеточной поверхности, так как она не теряется после промывания и суспендирования клеток в фосфатном буфере.

Коагрегационная способность. Результаты представлены как процент снижения абсорбции смешанной суспензии в сравнении с отдельной суспензией. Все исследованные штаммы показали коагрегационную способность с условно-патогенными микроорганизмами, выделенные при остром тонзиллите. Но это свойство имеет штаммовую специфичность. Среди исследованных штаммов рода Pediococcus штамм Р.acidilactici OC1 показал сильную коагрегационную способность в отношении 3 штаммов исследованных условно-патогенных микроорганизмов: Enterobacter cloacae 1, Staphylococcus aureus 3, Enterobacter bugandensis 22. % коагрегации через 24 часа составляет 26%, 28% и 32 %, соответственно.

Установлено, что штаммы, обладающие наиболее высокой аутоагрегационной способностью (P. acidilacticiOC1,L. rhamnosusOCl, L. plantarummal, L. fermentumX) проявляют сильное коагрегационное взаимодействие по отношению условно-патогенных микроорганизмов.

Штаммы Lactobacillus могут формировать барьер, который предотвращает колонизацию патогенными бактериями через коагрегацию [18, 19]. Коагрегация штаммов лактобактерий с потенциальными патогенами способствует продукции антимикробных соединений при очень тесном взаимодействии с ними. Агрегационные свойства вместе с коагрегационной способностью может использоваться при первичном отборе пробиотических бактерий [18, 20,].

Заключение.Таким образом, показано, что исследованные штаммы лактобактерий обладают высокой антимикробной активностью по отношению к изолятам условно-патогенной микрофлоры больных острым тонзиллитом. Следует особо отметить, что их антимимкробная активность распространяется и на полирезистентные штаммы условно-патогенных микроорганизмов, участвующих в развитии инфекций верхних дыхательных путей. В связи с этим, изученные штаммы являются перспективными для дальнейшего исследования их свойств с целью рекомендации в качестве компонентов эффективных и

безопасных пробиотических препаратов для профилактики и лечения острых инфекций

верхних дыхательных путей человека.

REFERENCES

1. Oo KM, Lwin AA, Kyaw YY, Tun WM, Fukada K, Goshima A. Safety and long-term effect of the probiotic FK-23 in patients with hepatitis C virus infection// BiosciMicrobiota Food Health. —2016; —35(3): —P. 123-8.

2. Michalickova D, Minic R, Dikic N, Andjelkovic M, Kostic-Vucicevic M, Stojmenovic T, et al. Lactobacillus helveticusLafti L10 supplementation reduces respiratory infection duration in a cohort of elite athletes: a randomized, double-blind, placebo-controlled trial// ApplPhysiolNutrMetab. —2016; —41(7): —P. 782-9.

3. Karlsson M, Scherbak N, Khalaf H, Olsson PE, Jass J. Substances released from probiotic Lactobacillus rhamnosus GR-1 potentiate NF-kappa B activity in Escherichia coli-stimulated urinary bladder cells// FEMS Immunol Med Microbiol.—2012; —66(2): — P.147-156.

4. Nase L, Hatakka K, Savilahti E, Saxelin M, Ponka A, Poussa T, et al. Effect of long-term consumption of a probiotic bacterium, Lactobacillus rhamnosus GG, in milk on dental caries and caries risk in children//Caries Res. —2001; —35(6): —P. 412-20.

5. Krasse P, Carlsson B, Dahl C, Paulsson A, Nilsson A, Sinkiewicz G. Decreased gum bleeding and reduced gingivitis by the probiotic Lactobacillus reuteri//Swed Dent J. — 2006; —30(2): —P.55-60.

6. Harris LJ, Daeschel MA, Stiles ME, Klaenhammer TR. Antimicrobial activity of lactic acid bacteria against Listeria monocytogenes// J. Food Prot. —1999; —52: —P. 384-87.

7. МУК 4.2.1890-04 Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам // Клин. Микробиол. Антимикроб. Химиотер. — 2004. — №6. — С.306-359.

8. Collado, M. C., J. Meriluoto, and S. Salminen. 2008. Adhesion and aggregation properties of probiotic and pathogen strains. Eur. Food Res. Technol. 226:1065-1073.

9. HandleyP.S., Harty D.W.S., Wyatt J.E., Brown C.B., Doran J.P., Gibbs A C. A Comparison of the Adhesion, Coaggregation and Cell-surface Hydrophobicity Properties of Fibrillar and Fimbriate Strains of Streptococcus salivarius// Journal of General Microbiology (1987), 133, 3207-321.

10. Burton JP, Chilcott CN, Moore C, Speiser G, Tagg JR.A preliminary study of the effect of probiotic Streptococcus salivarius K12 on oral malodour parameters//J ApplMicrobiol. — 2006; —100: —P.754-764. PMID: 16553730 12.

11. Zahradnik RT, Magnusson I, Walker C, McDonell E, Hillman CH, Hillman JD. Preliminary assessment of safety and effectiveness in humans of ProBiora3, a probiotic mouthwash // J ApplMicrobiol. —2009; —107: —P. 682-690.doi: 10.1111/j.1365-2672.2009.04243.x PMID: 19486429

12. Caglar E, Kuscu OO, SelviKuvvetli S, KavalogluCildir S, Sandalli N, Twetman S. Short-term effect of ice-cream containing Bifidobacteriumlactis Bb-12 on the number of salivary mutans streptococci and lactobacilli//ActaOdontol Scand. —2008; —66: —P.154-158. doi: 10.1080/00016350802089467 PMID: 18568474

13. Amirsaidova D.A., Bekmurodova G. A., Elova N. A., Miralimova Sh. M. Antimicrobial activity of lactobacteria against opportunitical microorganisms of the oral cavity //Journal of Pharmaceutical Negative Results 13 (4), 1096-1102.

14. Kirtzalidou E., Pramateftaki P., Kotsou M., Kyriacou A. Screening for lactobacilli with probiotic properties in the infant gut microbiota//Anaerobe. —2011; —17: —P. 6: 578-585.

15. Rojo-Bezares B., G de Los Reyes-Gavilan C., Margolles A. Assessment of antibiotic susceptibility within lactic acid bacteria strains isolated from wine// Int J Food Microbiol; — 2006; —111: 3: —P. 234-240.

16. Danielsen M., Wind A. Susceptibility of Lactobacillus spp. to antimicrobial agents//Int. J. Food Microbiol. —2003; —82; —P. 1:1-11.Katla A.K., Kruse, Johnsen G., Herikstad H. Antimicrobial susceptibility of starter culture bacteria used in Norwegian dairy products//Int. J.Food Microbiol. —2001; —67: 1-2: —P. 147-152.

17. RahmanMorshedur, Kim Woan-Sub, KumuraHaruto, Shimazaki Kei-ichi. Autoaggregation and surface hydrophobicity of bifidobacteria// World Journal of Microbiology and Biotechnology. - 2008. 24:1593-1598 DOI: 10.1007/s11274-007-9650-x.

18. Ferreira C.L.,Grzeskowiak L.,Collado M.C.,Salminen S. In vitro evaluation ofLactobacillus gasseristrains of infant origin on adhesion and aggregation of specific pathogens//J. Food Prot, 74 (2011), pp.1482-1487

19. Manvelyan A., Balayan M., Miralimova S., Chistyakov V., Pepoyan A. Biofilm formation and auto-aggregation abilities of novel targeted aqua-probiotics //Functional Foods in Health and Disease 13 (4), 179-190

20. Bernardeau M, Gueguen M. , Smith D.G.E., Corona-Barrera E., Vernoux J.P. In vitro antagonistic activities of lactobacillus spp. against Brachyspirahyodysenteriae and B. pilosicoli//Veterinary Microbiology. 2009 Jul 2;138(1-2):184-90. doi: 10.1016/j.vetmic.2009.03.020.