Hepatic stellate cells stimulate hepatocyte differentiation of rat's bone marrow derived mesenchymal stem cells in vitro

Звёздчатые клетки печени стимулируют дифференцировку мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга крысы в гепатоциты in vitro

А.А. Гумерова, А.К. Шафигуллина, А.А. Трондин, И.М. Газизов, Д.И. Андреева,

М.С. Калигин, А.А. Ризванов, А.П. Киясов

Казанский государственный медицинский университет, Казань

Hepatic stellate cells stimulate hepatocyte differentiation of rat's bone marrow derived mesenchymal stem cells in vitro

A.A. Gumerova, A.K. Shafigullina, A.A. Trondin, I.M. Gazizov, D.I. Andreeva, M.S. Kaligin, A.A. Rizvanov, A.P. Kiasov Kazan State Medical University, Kazan

Широкое распространение хронических гепатитов и недостаточная эффективность их лечения требуют разработки новых подходов к терапии данной патологии. Одно из перспективных направлений поиска связано с использованием для стимуляции дифференцировки мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) в гепатоциты фактора роста фибробластов 4 и фактора роста гепатоцитов, определяющих первичную дифференцировку эпителиальных клеток передней кишки в гепатоциты в ходе пренатального онтогенеза млекопитающих. Известно, что естественным источником данных факторов в печени являются звёздчатые клетки печени (ЗКП), выполняющие роль микроокружения, необходимого для дифференцировки эпителиальных клеток печени в онтогенезе и при регенерации органа. Целью настоящего исследования стало изучение возможности стимуляции гепатоцитарной дифференцировки ММСК костного мозга крысы путём культивирования в среде, кондиционированной звёздчатыми клетками печени. ММСК культивировали в различных режимах: 1) в свободной от ростовых факторов среде; 2) в среде с последовательным добавлением факторов роста; 3) в культуральной среде, кондиционированной ЗКП; 4) совместно с ЗКП, отделёнными от ММСК полупроницаемой мембраной; 5) в смешанной культуре ММСК+ЗКП. Результаты исследования показали, что вырабатываемые ЗКП в культуральную среду факторы роста и цитокины оказывают выраженное воздействие на ММСК, индуцируя их дифференцировку в гепатобласты и гепатоциты, стойко (в отличие от ММСК, культивированных с факторами роста) сохраняющие экспрессию эпителиальных маркёров и альфа-фетопротеина. Непосредственные межклеточные контакты ММСК и ЗКП в ко-культуре стимулируют более массовую и выраженную экспрессию гепатоцитарных маркёров в культивируемых клетках по сравнению с монокультурой, однако при этом феномена слияния клеток двух популяций не выявлено. Таким образом, результаты проведённого исследования подтверждают гипотезу о роли ЗКП как важнейшего фактора микроокружения, обеспечивающего реализацию потенций ММСК к дифференцировке по гепатоцитарному пути в условиях in vitro.

Ключевые слова: звёздчатые клетки печени, мезенхимальные стволовые клетки, гепатоциты, дифференци-ровка, факторы роста, микроокружение.

Хронические заболевания печени различной этиологии — чрезвычайно актуальная проблема современной медицины. Около 500 миллионов людей в мире страдают только от вирусных гепатитов, ежегодная смертность от хронических гепатитов достигает одного миллиона человек, этот показатель входит в первую десятку среди всех причин смерти и лидирует в гастроэнтерологии [1]. К сожалению, существующие

e-mail:anissagum@mail.ru

Wide dissemination of chronic hepatitis and low efficiency of their medication require development of new approaches for treatment of this pathology. One of the most perspective search directions is connected with stimulation of mesenchymal stem cells differentiation into hepatocytes by applying fibroblast growth factor 4 (FGF-4) and hepatocyte growth factor (HGF), which determine primary differentiation of anterior gut epithelial cells into hepatocytes during prenatal ontogenesis in mammals. It is known that hepatic stellate cells (HSC) are the natural source of these growth factors in the liver and they are essential component of microenvironment for differentiating epithelial cells during liver ontogenesis and regeneration. The aim of this survey was to study the ability of stimulation of bone marrow derived multipotent mesenchymal cells (MMSC) hepatic differentiation by cultivation in the hepatic stellate cells conditioned media. MMSC were cultivated in various models: 1) in the media free of growth factors;

2) in the media by sequential exposure of growth factors;

3) in HSC conditioned media; 4) co-cultivation together with HSC separated by semipermeable membrane on the boyden chambers; 5) in the mixed co-culture. Results of the survey showed that factors and cytokines, produced by HSC in the media render significant effect on MMSC and lead to their differentiation into hepatoblasts and hepatocytes with stable expression (unlike expression of MMSC cultivated with growth factors) of epithelial markers and a-fetoprotein. Direct intercellular contacts between MMSC and HSC in the mixed co-culture stimulate bulk and apparent expression of hepatic markers unlike in monoculter, but the phenomenon of cell fusion was not detected. Thus, results of this study confirm the hypothesis of the HSC role as an important element of microenvironment for MMSC hepatic differentiation in vitro.

Key words: hepatic stellate cells, mesenchymal

stem cells, hepatocytes, differentiation, growth factors, microenvironment.

методы терапии заболеваний печени, несмотря на определённые успехи в лечении вирусных гепатитов, остаются недостаточно эффективными, что приводит к высокой частоте развития фиброза/цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы в исходе данных заболеваний. В этом случае единственным методом лечения остается трансплантация печени. Однако существующий дефицит донорской печени, большие

листы ожидания, высокая стоимость трансплантации и необходимость последующей иммуносупрессивной терапии диктуют необходимость поиска новых подходов к терапии данной группы заболеваний. Одним из наиболее перспективных путей решения данной проблемы на сегодняшний день является разработка методов клеточной терапии с использованием стволовых клеток.

Впервые вопрос о стволовой клетке печени был поднят в 1958 г. Дж. Вильсоном и Е. Ледуком, которые установили, что целостность ткани печени может восстанавливаться, несмотря на отсутствие пролиферации гепатоцитов [2]. В последующем такая возможность была подтверждена на различных моделях химического повреждения печени веществами, одновременно с повреждением блокирующими пролиферацию гепатоцитов [3—8]. Появляющиеся при этом в перипортальных областях интенсивно пролиферирующие мелкие клетки с узким ободком цитоплазмы и овальным ядром были названы овальными клетками, которые расцениваются как бипо-тентные эпителиальные предшественники гепатоци-тов и холангиоцитов [9]. Именно на изучении этих клеток сфокусировано большинство исследований стволовых клеток печени.

Однако результаты работ, опубликованных в последние годы, внесли существенный диссонанс в общепринятую теорию, рассматривающую овальные клетки как стволовые клетки печени. Так, в 1999 г. впервые было показано, что гепатоциты могут развиваться из кроветворной стволовой клетки, то есть клетки не энто-, а мезодермальной [10]. Сегодня возможность гепатоцитарной дифференцировки кроветворных стромальных клеток [11—15] и мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток (ММСК] [13, 16—19] продемонстрирована во многих экспериментах, что требует изучения механизмов диффе-ренцировки кроветворных стволовых клеток и ММСК в гепатоциты и возможностей управления данным процессом с помощью различных факторов, а также обосновывает поиск региональной стволовой клетки среди мезенхимальных клеток печени.

Одно из перспективных направлений поиска связано с использованием для стимуляции диффе-ренцировки ММСК в гепатоциты факторов роста, определяющих первичную дифференцировку эпителиальных клеток передней кишки в гепатоциты в ходе пренатального онтогенеза млекопитающих. Наиболее значимыми среди них являются фактор роста фибробластов 4 (FGF-4), необходимый на начальном этапе дифференцировки для формирования зачатка печени in vivo [20—23] и фактор роста гепатоцитов (HGF), имеющий важное значение на средних этапах дифференцировки и поддерживающий фетальные гепатоциты [23—25].

Применение данных факторов и их комбинаций уже позволило получить ряд важных результатов. Так, ММСК из разных источников (костного мозга крысы, пуповинной крови человека] при определённых условиях культивирования с использованием дексаметазона, эпидермального фактора роста (EGF), HGF, FGF-1, FGF-4 и онкостатина М в течение трёх недель приобретали морфологию и фенотип ге-патоцитов и начинали выполнять ряд специфических для них функций, таких, как синтез мочевины, секреция альбумина, индукция цитохрома р450 [26—31]. При этом важным оказалось применение при культи-

вировании комбинации FGF-4 и HGF [32—35] — в этом случае отмечены более высокие уровни экспрессии а-фетопротеина (а-ФП), альбумина и цитокератина 18 культивируемыми клетками. Большой интерес вызывает также работа Снайкерса с коллегами [36], в которой было установлено, что добавление FGF-4 и HGF в последовательности, характерной для нормального развития печени, вызывает более быструю и эффективную дифференцировку ММСК в гепатоциты, чем применение обоих факторов одновременно [23].

Полученные данные привели к закономерному вопросу: если гепатоцитарная дифференцировка ММСК наилучшим образом происходит в условиях, имитирующих эмбриональное развитие печени, то не будет ли ещё более оптимальным помещение культивируемых клеток в среду, воспроизводящую их естественное микроокружение в процессе пренатального развития? Известно, что микроокружение клеток формируется главным образом благодаря непосредственным межклеточным контактам с популяцией стромальных клеток и секретируемым ими факторам роста [37]. Какие же клетки могут играть роль такого микроокружения?

По нашему мнению, таким клеточным типом являются звёздчатые клетки печени (ЗКП). Именно они создают микроокружение как для фетального печёночного гемопоэза, так и для дифференцировки гепатоцитов и холангиоцитов в ходе пренатального развития [38—41]. Более того, именно эти клетки являются важнейшим участником восстановления массы клеток паренхимы в ходе регенерации печени, как за счёт вырабатываемых ими макромолекул межклеточного матрикса и его ремоделирования [42], так и за счёт продукции факторов роста [43]. ЗКП продуцируют значительное число морфогенных цитокинов — фактор роста гепатоцитов [44, 45], эпидермальный фактор роста [46—48], мезенхимальный морфогенный протеин эпиморфин [49], плейо-трофин [50], эритропоэтин [51, 52], нейротрофин [53], оказывающих влияние на дифференцировку как эпителиальных клеток печени, так и кроветворных стволовых клеток [43]. Они также экспрессируют потенциальный хемоаттрактант для кроветворных стволовых клеток стромальный фактор SDF-1a, стимулирующий их миграцию к месту гемопоэза [54], и Homebox protein Hlx [55], в случае дефекта которого нарушается как развитие самой печени, так и печёночный гемопоэз [56]. Ретиноиды, накапливаемые ЗКП, также являются важным фактором морфогенеза для кроветворных клеток [57] и эпителиев [58].

Исходя из этого, нами была выдвинута гипотеза, что звёздчатые клетки печени могут служить клеточным компонентом микроокружения, необходимым и детерминирующим дифференцировку ММСК в гепатоциты. При этом важно установить, какие именно факторы со стороны ЗКП — растворимые и (или) контактные — оказывают наибольшее влияние на такую дифференцировку. В связи с этим ММСК костного мозга крысы мы культивировали в различных режимах: 1) в свободной от ростовых факторов среде;

2) в среде с последовательным добавлением FGF-4, HGF и инсулин-трансферин-селенит натрия (ITS) и дексаметазона, которые запускают окончательные этапы дифференцировки клеток по гепатоцитарному пути [13, 36]; 3) в культуральной среде, кондиционированной ЗКП; 4) совместно с ЗКП, отделёнными от ММСК полупроницаемой мембраной (boyden cham-

bers) 5) в смешанной культуре ММСК+ЗКП (между ко-культивируемыми клетками осуществляются как химические, так и контактные межклеточные взаимодействия).

Материал и методы

Эксперименты были проведены на культурах клеток, выделенных из белых беспородных лабораторных крыс рода Вистар весом 250—300 г, находившихся на стандартном рационе вивария и имевших свободный доступ к воде. Содержание и использование лабораторных животных соответствовало правилам и требованиям, принятым в учреждении, рекомендациям локального этического комитета и национальным законам. При проведении экспериментов животные были наркотизированы 6,4% раствором хлоралгидрата из расчёта 860 мкл на 100 г массы животного. Объектом исследования были культуры ЗКП и ММСК костного мозга крысы.

Выделение ЗКП проводили методом последовательной перфузии печени следующими растворами [59]: 80 мл GBSS, скорость перфузии 10 мл/мин; 80 мл GBSS в комбинации с 0,264 г проназы (Pronase E, Sigma), скорость перфузии 10 мл/мин; 100 мл GBSS в комбинации с 0,08 г проназы и 0,16 г коллагеназы (Collagenase Type I, Sigma), скорость перфузии 3,33 мл/мин. Далее печень была извлечена, измельчена и инкубирована в растворе GBSS в комбинации с 0,04 г проназы Е, 0,048 г коллагеназы I и 0,08 г ДНК-азы в течение 30 мин. Полученная суспензия непаренхиматозных клеток была разделена в градиенте плотности гистоденза (Histodenz, Sigma), ЗКП локализовались в верхнем слое. После промывки от гистоденза клетки были вы-

Антитела, использованные в работе

сеяны на культуральные чашки (12S тыс. кл/мл).

Одновременно из костного мозга крыс путём селективной адгезии к пластику выделяли аутогенные стромальные ММСК. Для этого были выделены бедренные кости, срезаны эпифизы и костный мозг был вымыт из диафизов фосфатно-солевым раствором Дальбекко (DPBS без ионов Ca2+ и Mg2 + , ПанЭко). После однократной промывки клеточная суспензия была высеяна на культуральную чашку. Замену питательной среды проводили через каждые 2 сут.

Все работы с культурами клеток проводились в асептических условиях в ламинарном шкафу второго уровня защиты с соблюдением общепринятых правил работы. Культивирование ММСК и ЗКП было проведено в питательной среде DMEM (Sigma, США] с 10% содержанием фетальной бычьей сыворотки (Sigma, США) и 100 Ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина (Sigma) в инкубаторе при З7°С и содержании 5% СО2 во влажной атмосфере.

Для проверки нашей гипотезы мы провели культивирование ММСК в S различных режимах:

1) культивирование ММСК в среде, свободной от ростовых факторов — отрицательный контроль;

2) культивирование ММСК в питательной среде с последовательным добавлением факторов роста по схеме [З6]: 1 сут. — FGF-4, 10 нг/мкл; З сут. — HGF, 20 нг/мкл, далее через каждые З сут. была проведена замена питательной среды с добавлением смеси HGF (20 нг/мкл), ITS и дексаметазон (20 нг/л);

3) культивирование ММСК в кондиционированной среде ЗКП;

4) культивирование ММСК совместно с ЗКП на внутрилуночковых вставках (boyden chambers — полупроницаемые мембраны, отделяющие культуры

Антиген Клон,разведение Фирма- производитель

Виментин - белок промежуточных филаментов цитоскелета мезодермальных клеток 3В4, 1:75 Dako

Десмин - белок промежуточных филаментов цитоскелета мышечных клеток, маркёр звёздчатых клеток печени D33, 1:30 Dako

а-ГМА - альфа-гладкомышечный актин, маркёр миофибробластов, гладкомышечных клеток 1A4, 1:50 Dako

РСІЧІД - ядерный антиген пролиферирующих клеток PC10, 1:50 Dako

С-кгї (С0117) - рецептор к фактору стволовых клеток, маркёр стволовых и прогениторных клеток T595, 1:400 Novocastra

ЕБД - эпителиальный специфический антиген VU-1DQ, 1:10 Novocastra

ЕМД - эпителиальный мембранный антиген GF1.4, 1:100 Novocastra

С-те! - рецептор к фактору роста гепатоцитов, рассеивающий фактор BF11, 1:15 Novocastra

Цитокератин 18 - белок промежуточных филаментов цитоскелета эпителиальных клеток (гепатоциты, холангиоциты) DC10, 1:20 Dako

Цитокератин 19 - белок промежуточных филаментов цитоскелета эпителиальных клеток (холангиоциты, гепатобласты, овальные клетки) BA17, 1:20 Dako

Вс1-2 - антиапоптотический протеин, маркёр стволовых и прогениторных клеток 124, 1:30 Dako

А-фетопротеин - секреторный протеин гепатобластов С3, 1:200 Novocastra

ИБД - специфический антиген гепатоцитов OCH1E5, 1:30 Novocastra

клеток друг от друга и обеспечивающие циркуляцию питательной среды между ними);

5) культивирование ММСК и ЗКП в контактной ко-культуре (соотношение ММСК:ЗКП = 1:1). Для дифференциации двух клеточных популяций было проведено витальное мечение клеток флуоресцентными красителями: зелёным PKH67 (Sigma) для ЗКП и красным PKH26 (Sigma, США) для ММСК согласно методике фирмы-производителя (трипсинизиро-ванная культура клеток была отмыта от сыворотки в бессывороточной питательной среде, ресуспендиро-вана в специализированном буфере Diluent C (Sigma, США), инкубирована с красителем (5 мкл красителя на 2,5 млн клеток) в течение двух минут, после чего действие красителя было прекращено путём добавления сыворотки, окрашенная культура была рассеяна на чашку).

Морфологические признаки клеток оценивали методами фазово-контрастной, флуоресцентной и световой микроскопии. Для исследования влияния факторов ЗКП на фенотип ММСК и возможность дифференцировки ММСК в гепатоциты было выполнено иммуноцитохимическое окрашивание опытных и контрольных культур на разных сроках культивирования. В работе были использованы коммерческие моноклональные антитела фирм DAKO (Denmark) и Novocastra (UK) к различным мезенхимальным, эпителиальным, в том числе гепатоци-тарным маркёрам, а также к маркёрам стволовых и прогениторных клеток (табл.). Иммуноцитохи-мическое окрашивание было выполнено методом меченых полимеров и стрептавидин-биотиновым методом в различных модификациях с использованием коммерческих визуализационных систем тех же производителей.

Результаты и обсуждение

Культура ММСК

В контрольной культуре ММСК на ранних сроках все клетки экспрессировали виментин. Рецептор к фактору стволовых клеток C-kit присутствовал в большинстве клеток в первые недели культивирования, и в динамике его экспрессия незначительно уменьшалась. Экспрессия десмина на начальных сроках культивирования была выявлена лишь в единичных клетках, к 21-му дню культивирования число позитивных клеток возрастало — практически все ММСК становились десмин-позитивными (рис. 1А). Позднее число десмин-позитивных клеток снижалось. Экспрессия а-ГМА имела похожую динамику, на поздних сроках культивирования число позитивных клеток несколько снижалось (рис. 1Б).

Что касается эпителиальных маркёров, то первые признаки экспрессии цитокератинов (СК) 18 и 19 можно видеть в начале третьей недели эксперимента (16 сут.). Интенсивность экспрессии цитокератинов далее нарастала, позитивные клетки располагались в основном в небольших группах плотноупакован-ных мелких клеток, и именно в них экспрессия была максимальна (рис. 1В). К 28-м сут. эксперимента практически все клетки экспрессировали СК19 и, несколько слабее, СК18. В эти же сроки единичные клетки позитивно окрашивались с антителами к специфическому эпителиальному антигену ESA. Экспрессия специфических гепатоцитарных маркёров а-ФП и HSA не была выявлена ни на одном сроке эксперимента.

Результаты этой серии экспериментов позволили нам впервые показать возможность спонтанной эпителиальной дифференцировки ММСК костного мозга крысы, о чём свидетельствовало появление в них цитокератинов и ESA. Однако данные белки не являются специфичными только для эпителиальных клеток печени, поэтому в данном случае говорить о дифференцировке ММСК именно в клетки гепатоци-тарного ряда нельзя, хотя её можно предполагать.

А V

Я

i W *

0

#

1 Hr ж

i  *

*1 ф

• • <# - #

% А • Ш

*

Яг

§

ШШ

ш

s

ш

да

>

Kvi

WT

УЯшЛшг

я Г Ак

¥

В

'X*

* % *

Рис. 1. Монокультура ММСК (группа 1):

А - экспрессия десмина, 21-е сут. культивирования; Б - экспрессия а-ГМА, 14 сут.;

В - экспрессия СК18,22 сут.

Ув.: А, Б х20; В х10

Культура ММСК с последовательным добавлением факторов роста

В данной группе отмечено более раннее формирование монослоя по сравнению с контролем (8-й день эксперимента, 5-й день после добавления ИЭР). Интересно, что часть клеток монослоя имела два ядра, что является одним из характерных признаков гепатоцитов [60].

Первую неделю культивирования под действием РЭР-4 лишь очень немногие клетки экспрессировали десмин и а-ГМА. После добавления ИЭР число десмин-позитивных ММСК возрастало, и при культивировании в смеси ИЗР-ИБ-йех они группировались в островки (11-й день эксперимента). Также были видны и отдельно лежащие десмин-позитивные клетки (рис. 2А). После добавления ИЭР экспрессия а-ГМА также несколько нарастала, а затем снижалась при культивировании в смеси ИЗР-ИБ-йех (так же, как это происходило и в контроле). При этом единичные а-ГМА-позитивные клетки располагались на периферии описанных клеточных островков.

Добавление факторов роста к культуре ММСК приводило к более раннему началу экспрессии эпителиальных маркёров — уже через 5 дней культивирования в единичных клетках появлялся СК19. Более того, в эти же сроки в клетках можно было видеть

и а-ФП (рис. 2Б). Экспрессия эпителиальных маркёров нарастала после добавления ИЭР: СК19 присутствовал почти во всех клетках, экспрессия была более выражена в мелких отростчатых и округлых клетках (рис. 2В), начиналась экспрессия СК18, дающая паттерн окрашивания, подобный СК19, но менее интенсивный. Также нарастала экспрессия а-ФП. Во время культивирования в смеси ИЗР-ИБ-йех число мелких округлых клеток с наиболее выраженной экспрессией цитокератинов возрастало, и они были сгруппированы в островки (рис. 2Г). На третьей неделе экспрессия а-ФП начинала снижаться, а к концу эксперимента снижалась и экспрессия цитокератинов.

Паттерн экспрессии маркёров стволовых клеток мало чем отличался от контроля — ММСК экспрессировали только С-кЛ с тенденцией к снижению по мере дифференцировки клеток в ходе эксперимента.

Таким образом, добавление факторов роста в культуральную среду по предложенной схеме [36] действительно ускоряет и стимулирует дифферен-цировку ММСК не только в эпителиальные клетки, как это было в контроле, но и в гепатобласты, на что указывает появление в клетках а-ФП — секреторного белка, характерного для низкодифференцированных клеток ткани печени (гепатобластов).

А

Ж

Б

V-

ф * *

* V

р‘ 0*

* Л

В - ,

/ / -/  I  < I

' 1 ф *

- >1 #

г . * ^

\

*ж *

1в ъ ✓ 0 4

г «с * * * , ,1’  •• V ' 1 N

4 * Ч '

ь* » г , 1 * *' ш 1 \ 1 J * \ ' ' ' ' ' «ч '

ц *  V * <>* * 1 ' -** , 1 *" 1 ' - /А 1 • V С • ’ * • "> V , V

* 1 \

* • ъ. ;* /1.

9

Г

Л

♦

* * *

I

*

/ •

\

#

•• * ч

* *

Фа

Рис. 2. Культура ММСК с последовательным добавлением факторов роста (группа 2):

А - экспрессия десмина в клеточных островках и отдельных клетках, 11 сут. культивирования; Б - экспрессия а-ФП, 5 сут.; В - экспрессия СК19, более выраженная в мелких отростчатых и округлых клетках, 5 сут., Г - нарастание числа СК19-позитивных клеток после добавления к культуре смеси НБР-ГГБ-Дексаметазон, 11 сут. Ув.: А, В х10; Б, Г х20

Культура ММСК-КМ в кондиционированной

среде ЗКП

Результаты исследования паракринных влияний со стороны ЗПК на ММСК костного мозга крысы показали, что при культивировании ММСК в кондиционированной ЗПК среде происходит изменение морфологии ММСК уже на второй день культивирования — клетки уменьшались в размерах, приобретали округлую форму, отростки их укорачивались (рис. 3А). К пятым суткам культивирования можно было наблюдать значительное возрастание числа ММСК по сравнению с контролем (группа 1).

Изучение фенотипа клеток позволило выявить, что растворимые факторы роста, выделяемые ЗКП, стимулируют ММСК к интенсивной экспрессии маркёров стволовых клеток — C-kit во всех клетках на всех сроках культивирования (рис. 3Б), на поздних сроках (28 дней) — рецептора к фактору роста гепатоцитов C-met и Bcl-2 в единичных клетках. Интересно, что при культивировании ММСК со средой ЗКП поздних пассажей Bcl-2 появляется в этих клетках раньше (в середине 3-й нед.) и в значительно большем числе клеток.

С другой стороны, экспрессия десмина и а-ГМА была существенно подавлена — на первой неделе экспрессия этих протеинов была выявлена в единичных клетках, далее постепенно их число росло, и наибольшее количество позитивных клеток было отмечено на 14-е сут. (рис. 3В, Г).

Самым же важным является то, что в процессе культивирования (на 3—4 неделях) в ММСК не только начинается экспрессия ESA и цитокератинов, которая по сравнению с контролем была более выражена, особенно в мелких клетках, число которых росло по ходу эксперимента (рис. 3Д, Е), но и практически во всех клетках появлялся а-ФП (рис. 3Ж), а в единичных клетках на 28-й день культивирования — специфический антиген гепатоцитов HSA (рис. 33).

Результаты проведенного эксперимента позволяют сделать вывод о возможности дифференцировки ММСК в гепатобласты и гепатоциты, и этот путь диф-ференцировки не запускается спонтанно, а становится возможным под воздействием паракринных факторов со стороны ЗКП. Очень важно, что в данном случае абсолютно исключена возможность слияния клеток двух популяций, что свидетельствует о возможности прямой дифференцировки ММСК в клетки гепатоцитарного ряда. При этом правомочно говорить о фенотипе не только гепатобластов, экспрессирующих а-ФП, но и гепатоцитов, поскольку в конце эксперимента отдельные культивируемые клетки начинали экспрессировать маркёр зрелых гепатоцитов — специфический маркёр гепатоцитов HSA. Таким образом, вырабатываемые ЗКП в культуральную среду факторы роста и цитокины несомненно оказывают выраженное воздействие на ММСК, повышая их потенции стволовых/прогенитор-ных клеток и стимулируя их дифференцировку в гепатобласты и гепатоциты. При этом важно отметить, что по мере культивирования и пассирования самих ЗКП очевидно меняется не только их фенотип, но и композиция вырабатываемых ими факторов, на что указывает изменение паттерна экспрессии Bcl-2 ММСК, культивируемых в среде ЗПК поздних пассажей.

Сравнение же результатов данного эксперимента с результатами, полученными при культивировании ММСК с добавлением факторов роста (группа 2), позволят сказать, что они имеют ряд серьёзных отличий. Во-первых, добавление факторов роста не

позволило получить клетки, стойко сохраняющие экспрессию эпителиальных маркёров и а-ФП — к концу эксперимента она существенно снижалась. Во-вторых, в этой группе не удалось получить даже единичных клеток, экспрессирующих маркер зрелых гепатоцитов HSA, тогда как такие клетки были выявлены в культуре ММСК при культивировании в среде, переработанной ЗКП.

Ко-культура ММСК+ЗКП, разделённых полупроницаемой мембраной (группа 4) Ко-культивирование ММСК с ЗКП на внутрилу-ночковых вставках (Boyden chambers) показало, что в этом случае с морфологией клеток происходят изменения, подобные описанным для ММСК, культивируемым в кондиционированной среде ЗКП. При этом, однако, выявлены определённые отличия между клетками данных серий экспериментов. Так, в группе 4 экспрессия десмина была достаточно выраженная и сохранялась на всех сроках эксперимента, позитивные клетки располагались вокруг островов.

Экспрессия цитокератинов была выявлена на 3—4-й нед. эксперимента и нарастала в динамике по интенсивности и числу окрашенных клеток. Позитивные клетки преимущественно располагались внутри островков. В эти же сроки отмечена экспрессия а-ФП, однако этот белок присутствовал лишь в единичных клетках. HSA-позитивных клеток не было выявлено ни на одном из сроков эксперимента.

По всей вероятности, обнаруженные отличия между группами 3 и 4 объясняются тормозящими па-ракринными влияниями со стороны ММСК на звёздчатые клетки печени, что приводит к недостаточному функционированию последних в качестве фактора микроокружения, необходимого для гепатоцитарной дифференцировки ММСК, и процесс этой дифферен-цировки останавливается на стадии гепатобластов.

Контактная ко-культура ММСК+ЗКП (группа 5) Результаты флуоресцентной и фазово-контрастной микроскопии показали отсутствие слияния клеток двух ко-культивируемых культур (рис. 4 А—В).

Совместное культивирование ММСК и ЗКП позволило установить, что все клетки смешанной культуры в начале эксперимента экспрессировали виментин, но по ходу эксперимента экспрессия виментина снижалась. Большинство клеток первые две недели также активно экспрессировало десмин и а-ГМА, далее число позитивных клеток уменьшалось, и десмин-позитивные клетки были расположены вокруг десмин-негативных клеточных островков (рис. 4Г).

Как и в других вариантах культивирования, наиболее стабильной была экспрессия C-kit, на ранних сроках весьма интенсивная и далее постепенно снижающаяся к 3-4-й нед. В смешанной культуре также была отмечена экспрессия и других маркёров стволовых клеток: на 3-й неделе все клетки слабо экспрессировали C-met и Bcl-2, и далее экспрессия последнего, в отличие от C-kit и C-met, нарастала.

Первые эпителиальные маркеры появлялись к концу третьей недели — почти все клетки с разной интенсивностью экспрессировали ESA, СК18, СК19 (рис. 4Д). Экспрессия цитокератинов далее нарастала и была более яркой у СК18. В эти же сроки практически у всех клеток выявлена строгая экспрессия а-ФП (рис. 4Е), однако клеток, экспрессирующих HSA, выявить не удалось.

Рис. 3. Культура ММСК в кодиционированной среде ЗКП (группа 3): А - изменение морфологии клеток, 2 сут. культивирования; Б - экспрессия C-kit, 14 сут.; В - экспрессия десмина, 14 сут.; Г - экспрессия а-ГМА, 14 сут.;

Д - экспрессия ESA, 25 сут.; Е - экспрессия СК19,21 сут.; Ж - экспрессия а-ФП, 28 сут.; З - экспрессия HSA, 28 сут. Ув.: А-Д х10; Е-З х40

Д

\

**•

г *

Рис. 4. Контактная ко-культура ЗКП+ММСК (группа 5]:

А - ММСК красного цвета; Б - ЗКП зелёного цвета;

В - наложение рис. А и Б; Г - экспрессия десмина, десмин-позитивные клетки располагаются вокруг десмин-негативных клеточных островков,

PS сут. культивирования;

Д - экспрессия СК19, PS сут.;

Е - экспрессия a-ФП, PS сут.

Ув.: А-Г х10; Д, Е xPQ

Результаты данной серии позволят сделать вывод, что непосредственные межклеточные контакты несомненно являются важным фактором для диффе-ренцировки обеих популяций клеток. Если сравнивать данный эксперимент с культивированием ММСК в среде ЗКП (группа 3), то в целом закономерности изменений фенотипа клеток похожи, однако обращает на себя внимание более яркий и массовый паттерн экспрессии гепатоцитарных маркёров. Вполне вероятно, что в данном случае в гепатобласты дифференцируются не только ММСК, но и сами ЗКП (возможность такой дифференцировки ЗКП в монокультуре была показана нами ранее [61]). Однако маркёр зрелых ге-патоцитов в клетках при этом не появлялся, что, возможно, связано с конкуренцией клеток в смешанной культуре. С другой стороны, в данном случае в среде присутствовали растворимые факторы, вырабатываемые не только ЗКП, но и ММСК, которые, так же, как и в группе 4, могли препятствовать завершающим этапам гепатоцитарной дифференцировки. Интересно, что экспрессия маркёров стволовых/прогенитор-ных клеток в этом эксперименте оказалась сходной с таковой для ММСК, культивированных в среде ЗКП (группа 3).

В 2008 г. была опубликована статья, в которой было показано, что ЗКП, активированные клетками Купфера, стимулируют ММСК костного мозга к дифференцировке в гепатоциты при контактном ко-культивировании [62]. Однако результаты нашего исследования показали, что не только активированные, но и покоящиеся ЗКП обладают такой способностью. Более того, такая дифференцировка осуществляется при культивировании ММСК не только совместно с ЗКП, но и просто в среде, переработанной этими клетками, что свидетельствует о важности именно паракринных влияний со стороны ЗКП на ММСК для реализации ими программы гепатоцитарной диффе-ренцировки.

Нельзя не отметить, что сама вероятность прямой дифференцировки ММСК в гепатобласты/гепатоци-ты до сих пор вызывает споры. В настоящее время опубликованы работы, как подтверждающие [19, 28, 36], так и отрицающие [63] такую возможность. Результаты нашей работы указывают на реализацию

ЛИТЕРАТУРА:

1. Hu D.J., Bower W.A., Ward J.W. Viral hepatitis. In: Morse S, Moreland AA, Holmes KK, eds. Atlas of sexually transmitted diseases and AIDS. London, England. Elsevier; 2010: 2o3—29.

2. Wilson J.W., Leduc E.H. Role of cholangioles in restoration of the liver of the mouse after dietary injury. J. Pathol. Bacteriol. 1958; 76: 441-49.

3. Dabeva M.D., Shafritz D.A. Activation, proliferation, and differentiation of progenitor cells into hepatocytes in the D-galactosamine model of liverregeneration. Am. J. Pathol. 1993; 143(6): 1606-20.

4. Урываева И.В. Модель репопуляции печени, поврежденной дипином. Бюлл. экспер. биол. мед. 1997; 124(10): 364-8.

5. Factor V.M., Radaeva S.A., Thorgeirsson S.S. Origin and fate of oval cells in dipin-induced hepatocarcinogenesis in the mouse. Am. J. Pathol. 1994; 145: 409-22.

6. Braun K.M., Sandgren E.P. Cellular Origin of Regenerating parenchyma in a Mouse Model of Severe Hepatic Injury Am. J. of Pathol. 2000; 157: 561-9.

7. Evarts R.P., Nakatsukasa H., Marsden E.R. et al. Cellular and molecular changes in the early stages of chemical hepatocarcinogenesis in the rat. Cancer Res. 1990; 50: 3439-44.

8. Sarraf C., Lalani E.-N., Golding M. et al. Cell behavior in the acetylaminofluorenetreated regenerating rat liver. Am. J. Pathol. 1994; 145: 1114-26.

9. Sigal S.H., Brill S., Fiorino A.S. et al. The liver as a stem cell and lineage system. Am. J. Physiol. 1992; 263: 139-48.

такой дифференцировки под влиянием как добавленных в среду факторов роста, так и под действием растворимых факторов, вырабатываемых ЗКП.

Также существуют опасения, что трансплантированные мезенхимальные и кроветворные стволовые клетки могут дифференцироваться в миофибробла-сты и таким образом способствовать фиброзирова-нию печени [64]. По нашим данным, исключить такую возможность нельзя, но число а-ГМА-позитивных миофиброластов в изученных культурах имеет тенденцию к снижению в процессе эксперимента, в связи с чем вряд ли целесообразно пренебрегать данными клеточными источниками получения гепа-тоцитов.

Еще один вопрос, не дающий покоя исследователям, - это механизм появления гепатоцитов из кроветворных стволовых клеток и ММСК. Происходит ли это в результате слияния клеток, или имеет место прямая дифференцировка? Многие склонны считать, что новые гепатоциты появляются в результате слияния ММСК и кроветворных стволовых клеток с полиплоидными эпителиальными клетками [65], однако нам удалось показать в монокультурах всех изученных клеток возможность прямой дифферен-цировки ММСК в гепатобласты/гепатоциты. Кроме того, факт слияния не был подтвержден и в смешанных культурах клеток при использовании флуоресцентного мечения.

Поводя итог, можно сказать, что результаты проведённого исследования подтверждают гипотезу о роли ЗКП как важнейшего фактора микроокружения, необходимого для поддержания жизнеспособности ММСК и обеспечивающего реализацию их потенций к дифференцировке по гепатоцитарному пути в условиях in vitro, что диктует необходимость продолжения исследований в данном направлении с целью разработки методик получения из ММСК максимального числа функционально активных гепатоцитов и применения полученных клеток в терапии заболеваний печени.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (грант 09-04-97013-р_поволжье_а) и Министерства образования и науки РФ (грант МК-7805.2010.7).

10. Petersen B.E., Bowen W.C., Patrene K.D. et al. Bone marrow as a potential source of hepatic oval cells. Science 1999; 284: 1168—70.

11. Theise N.D., Badve S., Saxena R. et al. Derivation of hepatocytes from bone marrow cells in mice after radiation-induced myeloablation. Hepatology 2000; 31: 235—40.

12. Lagasse E., Connors H., Al-Dhalimy M. et al. Purified hematopoietic stem cells can differentiate into hepatocytes in vivo. Nat. Med. 2000; 6(11): 1229-34.

13. Schwartz R.E., Reyes M., Koodie L. et al. Multipotent adult progenitor cells from bone marrow differentiate into functional hepatocyte-like cells. J. Clin. Invest. 2002; 109: 1291-302.

14. Fiegel H.C., Lioznov M.V., Cortes-Dericks L. et al. Liver-specific gene expression in cultured human hematopoietic stem cells. Stem Cells 2003; 1: 98-104.

15. Zhang F.T., Fang J.Z., Yu J. et al. Conversion of mononuclear cells from human umbilical cord blood into hepatocyte-like cells. Junyi Daxue Xuebao. 2006; 21: 358-64.

16. Sato Y., Araki H., Kato J. et al. Human mesenchymal stem cells xenografted directly to rat liver are differentiated into human hepatocytes without fusion. Blood 2005; 106: 756-63.

17. Talens-Visconti R., Bonora A., Jover R. et al. Hepatogenic differentiation of human mesenchymal stem cells from adipose tissue in comparison with bone marrow mesenchymal stem cells. World J. Gastroenterol. 2006; 12(36): 5834-45.

18. Lange C., Bruns H., Kluth D. et al. Hepatocytic differentiation of mesenchymal stem cells in cocultures with fetal liver cells. World J. Gastroenterol. 2006; 12(15): 2394-7.

i9. Sgodda M., Aurich H., Kleist S. et al. Hepatocyte differentiation of mesenchymal stem cells from rat peritoneal adipose tissue in vitro and in vivo. Exp. Cell Res. ЗООУ; 313(13): 2ВУ5—Вв.

ЗО. Jung J., Zheng M., Goldfarb M. et al. Initiation of mammalian liver development from endoderm by fibroblast growth factors. Scienc i999; гВ4: 199В-2003.

Si. Duncan S.A. Transcriptional regulation of liver development. Dev. Dyn. гООО; г19: 131-42.

ЗЗ. Wells J.M., Melton D.A. Early mouse endoderm is patterned by soluble factors from adjacent germ layers. Development ЗООО; ^УСВ): 1563—72.

33. Schwartz R.E., Reyes M., Koodie L. et al. Multipotent adult progenitor cells from bone marrow differentiate into functional hepatocyte-like cells. J. Clin. Invest. ЗООЗ; 1О9: 1291—302.

34. McLin V.A., Zorn. A.M. Molecular Control of Liver Development. Clin. Liver Dis. 2006; 1О: 1-З5.

35. Zaret K.S. Regulatory phases of early liver development: paradigms of organogenesis. Nat. Rev. Genet. ЗООЗ; 3: 499—51З.

36. Jiang Y., Jahagirdar B.N., Reinhardt R.L. et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature ЗООЗ; 41В: 41-9.

ЗУ. Lee K.D., Kuo T.K., Whang-Peng J. et al. In vitro hepatic differentiation of human mesenchymal stem cells. Hepatology ЗОО4; 4О: 1гУ5-В4.

ЗВ. Kang X.Q., Zang W.J., Bao L.J. et al. Fibroblast growth factor-4 and hepatocyte growth factor induce differentiation of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells into hepatocytes. World J. Gastroenterol. ЗОО5; 11(4У): 7461—5.

З9. Grompe M. Adult liver stem cells. Essentials of stem cell biology. Elsevier ЗОО9; З4: ЗВ5-9В.

30. Lee K.-D., Kuo T.K.-C., Whang-Peng J. et al. In vitro hepatic differentiation of human mesenchymal stem cells. Hepatology ЗОО4; 40(6): 1гУ5-В4.

31. Wang P.P., Wang J.H., Yan Z.P. et al. Expression of hepatocyte-like phenotypes in bone marrow stromal cells after HGF induction. Biochem. Biophys. Res. Commun. ЗОО4; ЗЗО(З): У1З—6.

ЗЗ. Oh S.H., Miyazaki M., Kouchi H. et al. Hepatocyte growth factor induces differentiation of adult rat bone marrow cells into a hepatocyte lineage in vitro. Biochem. Biophys. Res. Commun. ЗООО; гУ9: 5ОО-4.

33. Suzuki A., Iwama A., Miyashita H. et al. Role for growth factors and extracellular matrix in controlling differentiation of prospectively isolated hepatic stem cells. Development ЗООЗ; 1ЗО: 2513—24.

34. Xie J.M., Chen J.F., Gao Y. et al.Hepatocyte growth factor and fibroblast growth factor-4-induced differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells into hepatocyte-like cells in vitro. Nan. Fang. Yi. Ke. Da. Xue. Xue. Bao. ЗОО6; 26(10): 14З9-4З.

35. Banas A., Teratani T., Yamamoto Y. et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells as a source of human hepatocytes. Hepatology ЗООУ; 46: З^-ЗВ.

36. Snykers S., Vanhaecke T., Papeleu P. et al. Sequential exposure to cytokines reflecting embryogenesis: The key for in vitro differentiation of adult bone marrow stem cells into functional hepatocyte-like cells. Toxicol. Sci. ЗОО6; 94: ЗЗ5-9.

ЗУ. Zhang J., Niu C., Ye L. et al. Identification of the haematopoietic stem cell niche and control of the niche size. Nature ЗООЗ; 4З5: 836-41.

ЗВ. Vassy J., Rigaut J.P., Briane D. et al.Confocal microscopy immunofluorescence localization of desmin and other intermediate filament proteins in fetal rat livers. Hepatology 1993; 1У: З9З-ЗОО.

39. Kiassov A.P., van Eyken P., van Pelt J.F. et al. Desmin expressing nonhematopoietic liver cells during rat liver development: an immunohistochemical and morphometric study. Differentiation 1995; 59: З5З-8.

40. Киясов A.ri., Гумерова A.A., Билалов М.М. Экспрессия цитокератинов в пре- и постнатальном онтогенезе печени крыс. Онтогенез 199У; 58(5): 389-93.

41. Гумерова A.A., Киясов A.I1., Калигин М.С. и др. Участие клеток Ито в гистогенезе и регенерации печени. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия ЗООУ; 4: 39-46.

4З. Kim T.H., Mars W.M., Stolz D.B. et al. Extracellular matrix remodeling at the early stages of liver regeneration in the rat. Hepatology 199У; 26С4): 896-9О4.

43. Friedman S.L. Hepatic stellate cells: protean, multifunctional, and enigmatic cells of the liver. Physiol. Rev. 2008; 88: 125-72.

44. Schirmacher P., Geerts A., Piertrangelo A. et al. Hepatocyte growth factor/hepatopoietin A is expressed in fat-storing cells from rat liver but not myofibroblastlike cells derived from fat-storing cells. Hepatology 1992; 15: 5-11.

45. Maher J.J. Cell-specific expression of hepatocyte growth factor in liver - upregulation in sinusoidal endothelial cells after carbon tetrachloride. J. Clin. Invest. 1993; 91: 2244-52.

46. Meyer D.H., Bachem M.G., Gressner A.M. Modulation of hepatic lipocyte proteoglycan synthesis and proliferation of Kupffer cell-derived transforming growth factor type beta 1 and type alpha. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1990; 171: 1122-9.

47. Bachem M.G., Meyer D., Melchior R. et al. Activation of rat liver perisinusoidal lipocytes by transforming growth factors derived from myofibroblastlike cells. A potential mechanism of self perpetuation in liver fibrogenesis. J. Clin. Invest.1992; 89: 19-27.

48. Mullhaupt B., Feren A., Fodor E., Jones A. Liver expression of epidermal growth factor RNA. Rapid increases in immediate-early phase of liver regeneration. J. Biol. Chem.1994; 269: 19667-70.

49. Yoshino R., Miura K., Segawa D. et al. Epimorphin expression and stellate cell status in mouse liver injury. Hepatol. Res. 2006; 34: 238-49.

50. Asahina K., Kawada N., Kristensen D.B. et al. Characterization of human stellate cell activation-associated protein and its expression in human liver. Biochim. Biophys. Acta. 2002; 1577: 471-5.

51. Maxwell P.H., Fergusson D.J.P., Osmond M.K. et al. Expression of homologously recombined erythropoietin SV 40T antigen fusion gene in mouse liver: evidence for erythropoetin production by Ito cells. Blood 1994; 84: 1823-30.

52. Eckardt K.U. Erythropoietin production in liver and kidneys. Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 1996; 5(1): 28-34.

53. Passino M.A., Adams R.A., Sikorski S.L. et al. Regulation of hepatic stellate cell differentiation by the neurotrophin receptor p75NTR. Science 2007; 315: 1853-6.

54. Wright D.E., Bowman E.P., Wagers A.J. et al. Hematopoietic stem cells are uniquely selective in their migratory response to chemokines. J. Exp. Med. 2002; 195: 1145-54.

55. Kubota H., Yao H., Reid L.M. Identification and characterization of vitamin-A storing cells in fetal liver: implication of functional importance of hepatic stellate cells in development and hematopoiesis. Stem Cells 2007; 25: 2339-49.

56. Lints T.J., Hartley L., Parsons L.M. et al. Mesoderm-specific expression of the divergent homeobox gene Hlx during murine embryogenesis. Dev. Dyn. 1996; 205: 457-70.

57. Tocci A., Parolini I., Gabbianelli M. et al. Dual action of retinoic acid on human embryonic/fetal hematopoiesis: blockade of primitive progenitor proliferation and shift from multipotent/erythroid/ monocytic to granulocytic differentiation program. Blood 1996; 88(8): 2878-88.

58. Evarts R.P., Hu Z., Omori N. et al. Effect of vitamin A deficiency on the integrity of hepatocytes after partial hepatectomy. Am. J. Pathol. 1995; 147(3): 699-706.

59. Knook D.L., Seffelaar A.M., de Leeuw A.M. Fat-storing cells of the rat liver. Exp. Cell Res. 1982; 132: 468-71.

60. MacSween R.N.M., Scothorne R.F. Developmental anatomy and normal structure. In: MacSween R.N.M., Anthony P.P., Scheuer P.J., Burt A.B., Portmann B.C. editors. Pathology of the liver. 3rd ed. Edinburgh: Churchill Livingstone. 1994: 1-49.

61. Киясов А.П., Гумерова А.А., Титова М.А. Мезенхимальноэпителиальная трансформация клеток Ито in vitro. Клеточные технологии в биологии и медицине 2006; 3: 150-3.

62. Deng X., Chen Y.-X., Zhang X. et al. Hepatic stellate cells modulate the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into hepatocyte-like cells. J.Cellular Physiol. 2008; 217: 138-44.

63. Popp F.C., Slowik P., Eggenhofer E. et al. No contribution of multipotent mesenchymal stromal cells to liver regeneration in a rat model of prolonged hepatic injury. Stem Cells 2007; 25: 639-45.

64. Kisseleva T., Brenner D.A. Hepatic stellate cells and the reversal of fibrosis. J. Gastroenterol. Hepatol. 21 Suppl. 2006; 3: 84-7.

65. Terada N., Hamazaki T., Oka M. et al. Bone marrow cells adopt the phenotype of other cells by spontaneous cell fusion. Nature 2002; 416: 542-5.

Поступила OBOGPOII