СПОСОБ ТРАНСПЛАНТАЦИИ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МИКРОТРАНСПЛАНТАТОВ (МКТ), СОСТОЯЩИХ ИЗ НИТЧАТОГО ПОЛИГЛИКОЛЕВОГО МИКРОНОСИТЕЛЯ И ПРИКРЕПИВШИХСЯ К НЕМУ ФИБРОБЛАСТОПОДОБНЫХ КЛЕТОК
METHOD FOR TRANSPLANTATION OF HUMAN CELL WITH APPLICATION OF MICROTRANSPLANTS (MCT), CONSISTING OF FIBROUS POLYGLYCOLIC MICROCARRIER AND FIBROBLAST-LIKE CELLS ATTACHED TO IT

Область техники, к которой относится изобретение
Медицина, биотехнология, медицинская трансплантология, косметическая трансплантология.
Уровень техники
Под микротрансплантатом (MKT) мы понимаем микроноситель вместе с прикрепленными к нему клетками (клеткой). Размер микроносителя определяется с одной стороны тем, чтобы он позволял клетке находиться в естественном прикрепленном состоянии, с другой стороны он должен быть таким, чтобы введение клеток можно было бы производить обычного размера иглой. Применение микротрансплантатов - это удобный способ введения клеток в организм, при котором вместе с клетками частично вводится их микроокружение. Показано, что такой способ введения может принципиально изменить результат трансплантации клеток. Наиболее близким аналогом нашего изобретения является MKT, описанный в [Choi Y.S., Cha S.M., Lee Y.Y., S.W. Kwon, Park C.J., Kim M.J. Adipogenic differentiation of adipose tissue derived adult stem cells in nude mouse. Biochemical and Biophysical Research Communications 345 (2006), 631-637]. В этом случае микроноситель представлял собой микросферы из полилактид-полигликолид сополимера. При его использовании удавалось получать новообразованную жировую ткань, в то время как при применении одних клеток без носителей ткань не образовывалась.
Клетки, суспендированные в растворе, после трансплантации лишены привычных для них контактов и метаболического снабжения, в результате чего существенная их доля погибает. Для прикрепляющихся клеток сам факт отсутствия прикрепления, а также характер субстрата являются сильнейшим сигналом, способным запустить анойкис, т.е. апоптоз от невозможности прикрепления. Возможно более существенным вопросом, чем жизнеспособность клеток после введения является вопрос о функционировании клетки в новом микроокружении. Существенно изменившиеся условия меняют работу генов, что препятствует нормальному функционированию и способствует развитию воспалительных изменений. Мы полагаем, что MKT позволяет клетке (например, фибробласту) сохранять после введения прикрепленное и даже напряженное состояние, что должно положительно сказываться на их функционировании, прежде всего на синтезе коллагена и активности металлопротеиназ [Varani J., Dame М.К., Rittie L., Fligiel S.E.G., Kang S., Fisher G.J., Voorhees J.J. Decreased Collagen Production in Chronologically Aged Skin. Roles of Age-Dependent Alteration in Fibroblast Function and Defective Mechanical Stimulation. American Journal of Pathology, Vol. 168, No. 6, June 2006, 1861-1868].
Существенное значение в дизайне MKT имеет форма микроносителя. Она важна как для адгезии клеток к носителю, так и для взаимодействия MKT между собой и тканью. Соотношение поверхность/объем также сильно меняет свойства микроносителя в процессе его резорбции. Показано, что прикрепление клеток к микроносителю сильно зависит от его локальной кривизны; волокна диаметром менее 3 мкм аккумулируют значительно большее количество клеток, чем более толстые [Tian F., Hosseinkhani Н., Hosseinkhani М., Khademhosseini A., Yokoyama Y., Estrada G. G., Kobayashi H. Quantitative analysis of cell adhesion on aligned micro- and nanofibers. Journal of Biomedical Materials Research 84A: 291-299, 2008].
Материал микроносителя должен резорбироваться с определенной скоростью, но при этом не должен выделять токсических продуктов, как, например, значительных количеств лактата, которые появляются при разложении полилактата. И, наконец, материал должен хорошо сочетаться с клетками, быть в меру гидрофильным, иметь определенную микропористость, способность вступать или не вступать в химические реакции и т.п. [Edwards S.L., Mitchell W., Matthews J.B., Ingham E., Russell S.J. Design of nonwoven scaffold structures for tissue engineering of the anterior cruciate ligament. AUTEX Research Journal, Vol. 4, No2, June 2004].
Известно, что клетки на полигликолевом матриксе хорошо синтезируют коллагены [Reichardt A., Arshi A., Schuster P., Polchow В., Shakibaei М., Gries Т., Henrich W., Hetzer R., Lueders С.Custom-Made Generation of Three-Dimensional Nonwovens Composed of Polyglycolide or Polylactide for the Cardiovascular Tissue Engineering. Journal of Biomaterials and Tissue Engineering. Vol. 2, 322-329, 2012]. Недавно описано приготовление прозрачного трансплантанта роговицы на полигликолевых нитях с диаметром 15 мкм [Hu X., Lui W., Cui L., Wang M., Cao Y. Tissue engineering of nearly transparent corneal stroma. Tissue engineering 2005, 11, 1710-1717].
Сведения, раскрывающие сущность изобретения
При посеве фибробластоподобных клеток на тонкие ПГА нити происходит селекция против стареющих и поврежденных клеток. Поэтому в состав MKT входят только сравнительно молодые клетки, что увеличивает их терапевтическую эффективность. Введение прикрепленных клеток позволяет им сохранять это прикрепленное состояние в новом микроокружении, что существенно влияет на профиль генной экспрессии, который соответствует нормально функционирующим клеткам, а не изменяется в сторону воспалительных изменений, что происходит при введении неприкрепленных клеток. MKT по сути является промежуточным вариантом между клеточной трансплантацией и тканевой инженерией.
Осуществление изобретения
Исходным материалом для изготовления микроносителя служила хирургическая плетеная полигликолидная нить ПГА USP 5/0. Нить инкубировали в 0,1 М растворе ЭДТА 30 мин при комнатной температуре, после чего трижды промывали дистиллированной водой. Для формирования микроносителей, представляющих из себя отдельные волокна, нить измельчали ножницами до фрагментов, длиной от 100 до 1000 мкм. Для формирования микроносителей, представляющих из себя группы волокон, на хирургической плетеной полигликолидной нити завязывали узлы, удерживающие волокна вместе, и ножницами обрезали нить с двух сторон от узла. Отрезки нити трижды промывали 70% этиловым спиртом. После разрезания нить сама расплеталась до составляющих ее волокон с диаметром до 20 мкм. Перед употреблением микроносители промывали раствором Хенкса.
2
Суспензию фибробластов кожи человека смешивали с волокнами в 50 мл полипропиленовых пробирках, которые ставили в термостат в наклоненном положении. Клетки росли в среде DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 2 мМ L-глютамина и 40 мкг/мл гентамицина при 37°C и 5% CO.
Изучали способность клеток образовывать колонии. По 150 клеток (подсчет производили в камере Горяева) высевали в пластиковые 10 см чашки Петри в среде DMEM с 15% ЭТС. Через 7 дней клетки фиксировали этанолом и окрашивали метиленовым синим. В качестве контроля и опыта исследовали по шесть чашек. Производили подсчет колоний и количества клеток в колониях. Количество подсчитанных клеток округляли по разрядам двоичной системы. Например, если группа клеток состояла из трех или четырех клеток, то в зачет шла цифра 4, если в группе было от 5 до 8 клеток - 8 и т.д.
Количество колоний размером от 4 до 64 клеток, образованных клетками, снятыми с микроносителя, было достоверно выше чем образованных контрольными клетками, снятыми с культурального пластика.
С помощью предлагаемого метода была проведена трансплантация фибробластов. Клетки после 24 ч инкубации на нитях были отмыты физиологическим раствором и с помощью шприца с толстой иглой были введены под кожу мышей C57 Black/6. Последующий анализ показал, что клетки частично сохраняются на нитях и частично мигрируют в ткань. Сравнение с инъекцией только клеток показало, что через 15 дней после введения клетки в составе MKT имеют большую численность в месте введения.
Изобретение поясняется графиком:
повышение способности к колониеобразованию фибробластов кожи человека, снятых с микроносителя (фиг. 1).