МЕЗЕНХИМАЛЬНЫЕ СТРОМАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ И СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК ИЗ ПУПОВИНЫ
MESENCHYMAL STROMAL CELLS AND METHODS FOR OBTAINING MESENCHYMAL STROMAL CELLS FROM THE UMBILICAL CORD

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Настоящее изобретение относится к способу получения стромальных клеток, в частности, стромальных клеток-предшественников. Стромальные клетки-предшественники, как правило, способы давать начало фенотипически и генотипически идентичным дочерним клеткам (самообновление), а также дифференцированным клеткам по меньшей мере одного типа. Некоторые стромальные клетки обладают способностью к самообновлению, и такие клетки в последние годы привлекают все больше внимания. Стромальные клетки по настоящему изобретению представляют собой не эмбриональные мезенхимальные стромальные клетки. Они могут быть получены путем выделения из пуповины способом по изобретению, который подробно описан в настоящем документе.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Мезенхимальные стромальные клетки (МСК) являются стромальными клетками, которые представляют особый интерес для научного сообщества, в частности, из-за их мультипотентности и низкой иммуногенности (Pittenger et al., 1999, Science, vol. 284, p. 143-147). Согласно современному уровню техники, мезенхимальные стромальные клетки (МСК) традиционно, как правило, получают из костного мозга, однако МСК также можно выделять из различных других источников животного происхождения, таких как жировая ткань, мышца, соединительная ткань, зубная пульпа, пуповинная кровь, плацента и амниотическая жидкость (Iudicone et al., 2014, J. Transl. Med., 12: 28). Из МСК наиболее хорошо изучены МСК взрослых, полученные из костного мозга (КМ-МСК) (например, WO 2008/042174 A2). В костном мозге МСК сосуществуют с клетками разных типов, включая более примитивные и подобные эмбриональным стволовые клетки, мезенхимальные стволовые клетки, коммитированные клетки-предшественники, а также зрелые клетки, такие как остеобласты и фибробласты, и были описаны разные способы выделения, например, МСК из костного мозга (смотри, например, Majore, Cell Commun. Signal., 2009, vol. 20; 7:6). В прошлом также были предприняты некоторые усилия для изучения альтернативных источников мезенхимальных стромальных клеток. Например, пуповина (ПК) была предложена в качестве подходящего резервуара различных типов клеток, некоторые из которых, как показано, обладают свойствами, подобными свойствам стволовых клеток. Пуповина представляет собой структуру у плацентарных млекопитающих, которая соединяет плаценту с развивающимся эмбрионом, тем самым обеспечивая питание плода. Она доступна после рождения без каких-либо инвазивных процедур и этических проблем (Hass et al., 2011, Cell. Commun. Signal., vol. 9:12). Пуповина содержит вартонов студень, студенистую, рыхлую слизистую соединительную ткань, богатую стромальными клетками, которая была названа в честь анатома Томаса Вартона. Вартонов студень содержит клетки, диспергированные в аморфном веществе, состоящем из протеогликанов, включая гиалуроновую кислоту и другие виды гликанов (смотри, например, WO 2004/072273 A1). Он считается примитивной мезенхимальной тканью преимущественно внеэмбрионального происхождения (Weiss, 1983, Histology, cell and tissue biology, New York, Elsevier Biomedical, p. 997-998), и был предложен в качестве многообещающего источника МСК (Wang et al., 2004, Stem Cells, vol. 22: p. 1330-1337).
3
Общепризнано, что стромальные клетки пуповины (ПК) являются гетерогенными по своей структуре, биологическим свойствам и локализации в ПК. Описано несколько способов получения клеток из вартонова студня (ВС) ПК, и были описаны клетки с МСК-подобными свойствами, находящиеся в, и происходящие из разных участков ПК. Пуповина человека содержит три сосуда, которые обычно организованы в виде спирали с левым поворотом (против часовой стрелки). В публикации Mitchell et al. (2003, Stem Cells, vol. 21, p. 50-60) описан способ удаления сосудов пуповины перед сбором оставшейся ткани. Эта оставшаяся ткань, которая содержит как часть ВС, так и амниотический эпителий, затем измельчают для получения небольших фрагментов ткани, которые переносят в планшеты для культивирования ткани; однако ферментативное расщепление пуповины или оставшейся ткани не предусмотрено. Скорее, фрагменты ткани впоследствии используют в качестве первичных эксплантатов, из которых клетки мигрируют за пределы образцов ткани на культуральный субстрат. В другой публикации (Romanov et al., 2003, Stem Cells, vol. 21, p. 105-110) описано, что подобные фибробластам МСК могут быть выделены из сосудистой сети пуповины путем расщепления пупочной вены коллагеназой, однако это приводит к получению смешанной популяции сосудистых эндотелиальных и субэндотелиальных клеток. В US 5919702 A (Purchio et al.) описан способ выделения, включающий разрезание в продольном направлении сегмента пуповины длиной примерно 2,5 см, удаление кровеносных сосудов и оболочки, и сбор ВС в стерильный контейнер, где его измельчают и культивируют. Например, описано, что клетки можно выделять, помещая секцию ВС размером 2-3 мм на предметное стекло на дне чашки Петри, накрывая ее другим предметным стеклом и культивируя ее в течение 10-12 дней, чтобы дать возможность некоторым клеткам («прехондроцитам») мигрировать наружу в культуральной чашке. Также упомянуто использование прехондроцитов для получения хряща.
Выделение происходящих из пуповинного матрикса клеток также было описано для ткани животного происхождения. Например, в публикации Lange-Consiglio et al., (2011, Open Tissue Engineer. Regen. Med. J., vol. 4, p. 120-133) описано выделение «клеток, происходящих из пуповинного матрикса» из «межсосудистых» и «околососудистых» областей пуповины лошади.
Масса человеческой пуповины при рождении ребенка в срок, составляющая примерно 40 г (Raio et al., 1999, Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol., vol. 83; p. 131-135; Conconi et al., 2011, Open Tissue Engineer. Regen. Med. J., vol. 4, p. 6-20), накладывает естественное верхнее ограничение на стартовый материал, доступный для выделения клеток с МСК-подобными свойствами. Согласно US 2004/0136967 A1 и Seshareddy et al. (2008, Meth. Cell Biol., vol. 86, p. 101-119), сложно получать большие количества нужных клеток из пуповины. Вследствие этого, авторы рекомендуют извлечение относительно большого количества клеток и описывают условия, оптимизированные для выделения относительно большого количества клеток; например, позволяющие выделять большие количества клеток. Они предлагают проводить относительно жесткую ферментативную обработку пуповины. Описаны разные зоны вартонова студня, но исключение конкретных зон происхождения извлекаемых клеток, например, околососудистой области, не рекомендуется специально, в соответствии с общей рекомендацией использовать большие количества клеток. После выделения клетки культивируют. Альтернативный подход описан в WO 2004/072273 A и Sarugaser et al. (Stem Cells, 2005, 23:220-229); в этих публикациях описано выделение клеток с МСК-подобными свойствами исключительно из околососудистой области пуповины. Так как эта область анатомически относительно ограничена, количество стартового материала является относительно низким, в сравнении со способами, в которых выделение начинают с целой пуповины. Кроме того, ввиду непосредственной близости к кровеносным сосудам нельзя исключать загрязнение клетками крови; вследствие этого описана отрицательная селекция на экспрессию CD45 во избежание загрязнения нежелательными клетками в культуре. Кроме того, в WO 2017/058003 A1 описаны способы выделения МСК из пуповины, зубной пульпы, крайней плоти полового члена, роговицы или других источников; способ выделения мезенхимальных стромальных клеток из пуповины предпочтительно осуществляют в стерильных условиях, и пуповину предпочтительно обрабатывают коллагеназой в течение относительно длинных периодов времени. Согласно публикации Conconi et al., 2011, Open Tissue Engineer. Regen. Med. J., vol. 4, p. 6-20, наиболее подходящие протоколы для усиления in vitro размножения и для хранения МСК еще не разработаны. Таким образом, сохраняется потребность в способах получения популяций, состоящих из клеток, которые характеризуются в значительной степени однородными свойствами, и которые способны надежно размножаться ex vivo; а также в надежных способах их обеспечения.
Проблема, требующая решения
Таким образом, цель настоящего изобретения заключается в устранении недостатков, присущих современному уровню техники. Конкретные задачи включают предложение надежного способа получения мезенхимальной стромальной клетки (МСК), и воспроизводимое предоставление с хорошим выходом мезенхимальных стромальных клеток (МСК) и популяций МСК, обладающих превосходными свойствами самообновления. Желательно, чтобы популяции были относительно однородными и не содержали нежелательные клетки, такие как апоптотические клетки, клетки гемопоэтической линии дифференцировки и так далее. Таким образом, иными словами, желательно получать мезенхимальные стромальные клетки способом, который имеет преимущества в отношении надежности и/или выхода в сравнении с известными и практикуемыми в настоящее время способами. Различные недостатки предшествующего уровня техники определяют следующие цели для усовершенствования, на достижение которых были направлены усилия авторов изобретения, и эти цели были достигнуты благодаря вкладу, описанному и заявленному в настоящем документе.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к способу получения мезенхимальных стромальных клеток (МСК), к соответствующим мезенхимальным стромальным клеткам (МСК) и к другим связанным с ними аспектам, все из которых описаны в настоящем документе. Основные аспекты и варианты осуществления изобретения описаны далее.
В первом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения мезенхимальной стромальной клетки. Способ включает (a) выделение стромального вартонова студня, или его части, из пуповины, и (b) ферментативную обработку стромального вартонова студня, или его части, с высвобождением за счет этого по меньшей мере одной клетки из стромального вартонова студня, или его части. Предпочтительно, клетка, полученная после этапа (b), является мультипотентной.
Помимо этапов (a) и (b) в способ по изобретению очень предпочтительно включать по меньшей мере один дополнительный этап. В частности, предпочтительно включать этап увеличения количества клеток, позволяющий использовать преимущества потенциала деления клеток, полученных на этапе (b). В таких предпочтительных вариантах осуществления за этапом (b) следует этап (c); где этап (c) включает размножение по меньшей мере одной клетки, полученной на этапе (b). Предпочтительно, клетки, полученные после этапа (c), являются мультипотентными.
Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что клетки, происходящие из стромы пуповины, обладают особыми преимуществами. Преимущества включают однородность клеточных популяций и свойства, подобные свойствам стволовых клеток. В частности, эти преимущества могут быть использованы в случае отсутствия сосудов пуповины. Таким образом, предпочтительно, если этап (a) выделения стромального вартонова студня, или его части, из пуповины включает этап физического удаления сосудов и околососудистой области из пуповины. Сосуды и околососудистую область можно удалять до этапа (a) или во время этапа (a). Один технически подходящий способ удаления сосудов и околососудистой области, который является предпочтительным по настоящему изобретению, заключается в отделении сосудов и околососудистой области от пуповины. Авторы изобретения установили, что отделение сосудов, например, путем вытягивания сосудов, также приводит к отделению околососудистой области.
Кроме того, авторы изобретения установили, что предпочтительно сегментировать пуповину перед указанным этапом физического удаления сосудов и околососудистой области. Сегментирование, как правило, производят физическими методами, например, при помощи ножниц или скальпеля. Предпочтительно, сегментирование производят перпендикулярно пуповине. Более предпочтительно, каждый из перпендикулярно нарезанных сегментов имеет длину от примерно 1 до примерно 4 см, предпочтительно от примерно 2 до примерно 3 см, и более предпочтительно примерно 2,5 см. В предпочтительном варианте осуществления сегмент(ы) сосудов удаляют из сегмента(ов) пуповины до этапа (b). В частности, предпочтительно удалять сосуды или, точнее, сегменты сосудов после - предпочтительно перпендикулярного - сегментирования пуповины.
Предпочтительно, ферментативная обработка на этапе (b) представляет собой обработку при помощи фермента коллагеназы. Авторы изобретения также установили, что степень активности коллагеназы имеет определенное значение. В предпочтительном варианте осуществления коллагеназа присутствует на этапе ферментативной обработки (b) при относительно низкой удельной активности, как подробно описано ниже.
В способе по настоящему изобретению быстрое выделение стромальных клеток из пуповины является предпочтительным. В предпочтительном варианте осуществления этапы (a) и (b) совместно проводят в общей сложности в течение менее 6 часов, более предпочтительно менее 5 часов, более предпочтительно менее 4 часов и наиболее предпочтительно менее 3 часов. Очевидно, что короткая совместная продолжительность этапов (a) и (b) также означает, что сам по себе этап (b) является коротким. В целом, короткая продолжительность этапа (b), то есть, быстрое выделение, в частности, короткая продолжительность ферментативной обработки, может вносить вклад в мягкость условий на этапе (b).
Удивительно, но авторы изобретения также обнаружили, что присутствие тромбоцитарного лизата в процессе ферментативного расщепления имеет определенные преимущества. Во-первых, авторы изобретения установили, что присутствие человеческого тромбоцитарного лизата не приводит к ингибированию или уменьшению, или блокированию, ферментативной активности фермента коллагеназы, по меньшей мере, не в такой степени, которая могла бы отрицательно влиять на желаемое ферментативное высвобождение клеток из окружающей ткани, например, из стромального матрикса. Известно, что плазма крови содержит многочисленные протеазы и, таким образом, существует определенное предубеждение в отношении добавления каталитического белка (такого как коллагеназа) в присутствии плазмы крови или ее компонентов, или наоборот, можно было бы ожидать, что каталитический белок (такой как коллагеназа) может деградировать с течением времени и, следовательно, его активность будет уменьшаться; удивительно, но авторы настоящего изобретения установили, что расщепление коллагеназой происходит эффективно даже в присутствии тромбоцитарного лизата. Во-вторых, авторы изобретения обнаружили, что клетки, получаемые путем расщепления в присутствии тромбоцитарного лизата в способе по настоящему изобретению, обладают превосходными пролиферативными свойствами (смотри, например, примеры 2B и 2C). Таким образом, предпочтительно, на этапе (b) стромальный вартонов студень, или его часть, подвергают ферментативной обработке в присутствии тромбоцитарного лизата млекопитающих (ТЛ), более предпочтительно человеческого тромбоцитарного лизата (чТЛ).
Помимо этого, тромбоцитарный лизат предпочтительно присутствует на этапе (c). Предпочтительно, на этапе (c) по меньшей мере одна клетка размножается в ростовой среде, содержащей тромбоцитарный лизат (ТЛ), предпочтительно человеческий тромбоцитарный лизат (чТЛ). Предпочтительно, по меньшей мере одна клетка размножается в ростовой среде, не содержащей какую-либо добавленную сыворотку, в частности, не содержащей эмбриональную бычью сыворотку (ЭБС).
В особенно предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере одна клетка размножается в конкретной ростовой среде, особенно подходящей для способа по изобретению, необязательно, содержащей добавки. Такая ростовая среда может содержать минимальную среду с определенным химическим составом и/или тромбоцитарный лизат.
Способ по изобретению приводит к получению клеток с конкретными свойствами, которые также описаны в настоящем документе. Таким образом, особенно предпочтительно, если клетка, получаемая способом по первому аспекту изобретения, представляет собой клетку, описанную во втором аспекте изобретения, приведенном далее.
Во втором аспекте настоящее изобретение относится к мезенхимальной стромальной клетке (МСК). МСК по изобретению также можно называть «клеткой по изобретению» или просто «клеткой». МСК по изобретению отличается тем, что она (a) экспрессирует ген APCDD1 и (b) не экспрессирует ген 3G5. Предпочтительно, клетка представляет собой выделенную клетку. Более предпочтительно, клетка происходит из стромального вартонова студня пуповины. Предпочтительно, клетка представляет собой клетку примата. Таким образом, клетка предпочтительно получена не от лошади, то есть, не является клеткой лошади. Также, клетка предпочтительно получена не от грызуна (например, мыши или крысы), то есть, не является клеткой грызуна (например, клеткой мыши или клеткой крысы). Наиболее предпочтительно, клетка представляет собой человеческую клетку.
В предпочтительном варианте осуществления клетка представляет собой человеческую клетку, которая происходит из стромального вартонова студня, и которая экспрессирует ген APCDD1.
В предпочтительном варианте осуществления клетка также экспрессирует ген PPARG. В другом, и не взаимоисключающем, предпочтительном варианте осуществления клетка также экспрессирует ген FLVCR2. В случае человеческой клетки предпочтительно, если человеческая клетка экспрессирует по меньшей мере один, предпочтительно по меньшей мере любое сочетание из двух, и наиболее предпочтительно все сочетания, человеческих лейкоцитарных антигенов HLA-A, HLA-B и HLA-C. Кроме того, в случае человеческой клетки предпочтительно, если клетка не экспонирует человеческие лейкоцитарные антигены HLA-DP и/или HLA-DQ. Необязательно, HLA-DR также не экспонируется. В одном варианте осуществления клетка не экспонирует никакой из человеческих лейкоцитарных антигенов HLA-DP, HLA-DR и HLA-DQ. Альтернативно, HLA-DR экспонируется на низких уровнях.
Клетка по настоящему изобретению, как правило, имеет меньший размер, чем некоторые МСК, которые были выделены разными способами предшествующего уровня техники. Например, клетка по настоящему изобретению может иметь меньший объем и/или меньшую площадь поверхности. Доступны разные методы определения объема или площади поверхности клетки, такие как проточная цитометрия для определения клеточного объема не прикрепляющихся клеток и определение клеточной поверхности под микроскопом для прикрепляющихся клеток. Такие методы описаны ниже в настоящем документе.
Предпочтительно, клетка не проявляет какую-либо теломеразную активность и/или не экспрессирует какую-либо теломеразу. Предпочтительно, клетка является мультипотентной. Более предпочтительно, клетка способна дифференцироваться в клетки разных типов. Особенно предпочтительно, если клетка имеет по меньшей мере все из следующих потенциалов дифференциации: (a) адипогенный; (b) хондрогенный;(c) остеогенный.
В предпочтительном варианте осуществления клетка представляет собой мезенхимальную стволовую клетку.
Клетка по второму аспекту изобретения представляет собой клетку, получаемую способом по первому аспекту изобретения. Предпочтительные варианты осуществления по первому аспекту изобретения можно комбинировать с предпочтительными вариантами осуществления по второму аспекту изобретения в каждом, и в любом, сочетании, если из контекста явно не следует иное. Альтернативно, клетка по настоящему изобретению, таким образом, может быть описана как клетка, получаемая способом по первому аспекту изобретения.
В третьем аспекте изобретение относится к популяции клеток. Популяция содержит по меньшей мере одну клетку по второму аспекту изобретения. Более предпочтительно, клеточная популяция содержит множество клеток, из которых по меньшей мере 80% (по числу клеток), предпочтительно по меньшей мере 90% (по числу клеток), более предпочтительно по меньшей мере 95%, например, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% (в каждом случае по числу клеток) представляют собой клетки по второму аспекту. Все предпочтительные варианты осуществления по второму аспекту применимы также и к третьему аспекту изобретения. Предпочтительно по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, например, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, наиболее предпочтительно 100%, от общего количества клеток представляют собой клетки по второму аспекту, и необязательно, по одному или более его предпочтительным вариантам осуществления, отдельно или в сочетании. Клеточная популяция является положительной по экспрессии гена APCDD1.
Предпочтительно, популяция представляет собой выделенную популяцию клеток.
Предпочтительно, клеточная популяция также характеризуется тем, что объем и/или площадь поверхности клеток в клеточной популяции являются сходными, или, альтернативно, тем, что высокая процентная доля клеток имеют небольшой объем и/или площадь поверхности, как подробно описано ниже. Объем обычно коррелирует с показателями прямого светорассеяния (FSC), определяемыми методом проточной цитометрии.
Предпочтительно, клеточная популяция также характеризуется тем, что по меньшей мере 70% клеток (по числу клеток), или более, являются жизнеспособными. Это является значительным преимуществом в сравнении со способами предшествующего уровня техники, в которых процентная доля жизнеспособных клеток является более низкой. Более предпочтительно, по меньшей мере 75% клеток (по числу клеток) являются жизнеспособными. Более предпочтительно, по меньшей мере 80% клеток (по числу клеток) являются жизнеспособными. В одном варианте осуществления жизнеспособность определяют непосредственно после выделения клеток, то есть, до проведения размножения.
В предпочтительном варианте осуществления клеточная популяция не содержит ни одной околососудистой клетки. Маркером околососудистых клеток является 3G5. Таким образом, данный вариант осуществления альтернативно может быть описан так, что клеточная популяция не содержит ни одной клетки, экспрессирующей маркер 3G5, и/или ни одной клетки, экспонирующей 3G5 на ее поверхности.
В предпочтительном варианте осуществления клеточная популяция не содержит ни одной эпителиальной клетки. Маркером эпителиальных клеток является адгезивная молекула эпителиальных клеток (EpCAM). Таким образом, данный вариант осуществления альтернативно может быть описан так, что клеточная популяция не содержит ни одной клетки, экспрессирующей маркер EpCAM, и/или ни одной клетки, экспонирующей EpCAM на ее поверхности.
В предпочтительном варианте осуществления клеточная популяция не содержит ни одной эндотелиальной клетки. Маркером эндотелиальных клеток является CD31. Таким образом, данный вариант осуществления альтернативно может быть описан так, что клеточная популяция не содержит ни одной клетки, экспрессирующей маркер CD31 и/или экспонирующей CD31 на ее поверхности.
Предпочтительно, клеточную популяцию получают способом по первому аспекту изобретения, в частности, с включением этапа (c), то есть, этапа размножения.
Альтернативно, клеточная популяция по настоящему изобретению, таким образом, может быть описана как клеточная популяция, получаемая способом по первому аспекту изобретения, включающим этап (c).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В следующем далее подробном описании раскрыты конкретные и/или предпочтительные варианты отдельных признаков изобретения. По настоящему изобретению также предусмотрены в качестве особенно предпочтительных вариантов осуществления такие варианты осуществления, которые возникают в результате объединения двух или более из конкретных и/или предпочтительных вариантов, описанных для двух или более признаков настоящего изобретения.
Специалист в данной области понимает, что изобретение, описанное в настоящем документе, может быть подвергнуто вариациям и модификациям, специально не описанным в настоящем документе. Таким образом, специалист в данной области понимает, что настоящее изобретение включает все такие вариации и модификации. Изобретение также включает все элементы, соединения, признаки, этапы, способы или композиции, упомянутые или указанные в данной спецификации, отдельно или коллективно, а также любые, и все, комбинации, или любые два или более, из указанных элементов, соединений, признаков, этапов, способов или композиций. Таким образом, если в настоящем документе специально не указано иначе, или из контекста не следует иное, ссылку на отдельный элемент, соединение, признак, этап, способ или композицию следует понимать, как включающую один или множество (то есть, более одного, например, два или более, три или более, или все) из этих элементов, соединений, признаков, этапов, способов или композиций.
Настоящее изобретение не ограничено в объеме конкретными вариантами осуществления, описанными в настоящем документе, которые приведены в настоящем документе для целей иллюстрации и в качестве примера. Функционально или иным образом эквивалентные элементы, соединения, признаки, этапы, способы или композиции входят в объем настоящего изобретения.
Каждый из документов, цитированных в настоящем документе (включая все патенты, патентные заявки, научные публикации, спецификации изготовителей, инструкции, презентации и так далее) выше или ниже, включен посредством ссылки в полном объеме. Ничто в настоящем документе не должно быть воспринято как признание того, что настоящее изобретение не имеет право на датирование задним числом изложенных конкретных идей.
Настоящий документ следует читать с желанием понять и с намерением разобраться в технической стороне изобретения. Все термины, используемые в настоящем документе, следует понимать, как имеющие то значение и охват, которые они обычно имеют в соответствующей области, если только в конкретных случаях в настоящем документе одному или более словам не придается особое значение путем четкого определения или иным образом. В том случае, если определения, приведенные в настоящем документе, будут частично или полностью отличаться от определений в некоторых, или во всех, литературных источниках, определения в настоящем документе должны иметь преимущественную силу.
Если специально не указано иначе, или иное не следует из контекста, каждый вариант осуществления, аспект и пример, раскрытый в настоящем документе, следует рассматривать как применимый, и сочетаемый с любым другим вариантом осуществления, аспектом или примером, описанным в настоящем документе.
Если специально не указано иначе, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют то значение, которое им обычно придают специалисты в данной области (например, в генетике, молекулярной биологии, экспрессии генов, клеточной биологии, культивировании клеток, стволовых клеток, стромальных клеток, неонатологии, регенеративной медицине, анатомии, гистологии, иммунологии, иммуногистохимии, белковой химии и биохимии). В учебной литературе и обзорных статьях, как правило, описан смысл терминов, обычно используемых специалистами в данной области.
Выражение «и/или», например, «X и/или Y», следует понимать, как означающее либо «X и Y», либо «X или Y», и следует воспринимать, как специально означающее «и», «или» и оба значения («и» или «или»).
При использовании в настоящем документе, если специально не указано иначе, все термины «примерно», «приблизительно» и «практически» означают «примерно» или «почти», и в контексте числового значения или диапазона, приведенного в настоящем документе, предпочтительно означают ± 10%, более предпочтительно ± 5%, от числового значения или диапазона, указанного или заявленного. Такие термины, как «практически нет», «практически отсутствует» и так далее, применительно к характеристикам клетки означают, что соответствующая характеристика не может быть обнаружена на клетке аналитическими методами, обычно используемыми в соответствующей области в соответствии с уровнем техники, и/или что практически все клетки в популяции, описанной таким образом, лишены соответствующей характеристики.
Если специально не указано иначе, термин «включать», или его вариации, такие как «включает» или «включающий», используют в контексте настоящего документа для указания на то, что дополнительные компоненты могут, необязательно, присутствовать в дополнение к компонентам из списка, предваряемого термином «включающий». Однако в качестве конкретного варианта осуществления настоящего изобретения предусмотрено, что термин «включающий» подразумевает вероятность того, что никакие дополнительные компоненты не присутствуют, то есть, для целей данного варианта осуществления термин «включающий» следует понимать, как имеющий значение «состоящий из».
Если специально не указано иначе, все указания на относительные количества в настоящем изобретении приведены на основе соотношения масс (масс/масс). Указание относительных количеств компонента, характеризуемого общим термином, должно относиться к общему количеству всех конкретных вариантов или представителей, охваченных указанным общим термином. Если специально указано, что конкретный компонент, определяемый общим термином, присутствует в конкретном относительном количестве, и если этот компонент дополнительно характеризуется как конкретный вариант или представитель, охваченный общим термином, это означает, что никакие другие варианты или представители, охваченные конкретным термином, дополнительно не присутствуют, так что общее относительное количество компонентов, охваченных общим термином, не превышает указанное относительное количество; более предпочтительно, любые другие варианты или представители, охваченные общим термином, отсутствуют полностью.
Термин «аллогенный» используют в настоящем документе для описания элемента, полученного от другого индивидуума того же биологического вида. Говорят, что два или более индивидуумов являются аллогенными друг для друга, когда их гены в одном или более локусах не являются идентичными.
Термин «площадь», или «площадь поверхности» или «клеточная площадь поверхности», применительно к клетке означают площадь поверхности клетки при взгляде сверху. В контексте настоящего изобретения 2-мерную площадь поверхности клетки определяют для прикрепляющихся клеток в культуре, то есть, клеток, прикрепленных к культуральному планшету. Для воспроизводимости определения предпочтительно считать, что клетки находятся в состоянии низкой конфлюэнтности, поскольку считается, что в состоянии низкой конфлюэнтности клетки в значительной степени не ингибируют друг друга за счет контактного ингибирования. Способы определения площади поверхности указаны ниже в настоящем документе.
Выражения «средняя площадь поверхности» и «средняя площадь» означают среднее значение площадей поверхностей двух или более отдельных клеток, при этом на первом этапе сначала определяют площадь каждой отдельной клетки, как описано выше, а затем на последующем втором этапе определяют среднюю площадь в виде среднего арифметического значения площадей отдельных клеток, определенных на первом этапе. Как правило, для определения средней площади первый и второй этап проводят для по меньшей мере 35 клеток; иными словами, среднее значение представляет собой среднее значение для по меньшей мере 35 клеток.
Термин «аутологичный» используют в настоящем документе для описания элемента, полученного от того же самого субъекта. В качестве примера, «аутологичная клетка» означает клетку, полученную от того же самого субъекта. Трансплантацию аутологичных клеток иногда считают предпочтительной, поскольку это позволяет преодолевать иммунологический барьер, который в противном случае приводит к отторжению.
Клетка представляет собой биологический объект, состоящий из цитоплазмы, заключенной в мембрану. Используемый в настоящем документе термин «клетка» предпочтительно относится к эукариотической клетке. Термин «клетка» может относиться к стволовой клетке или к клетке, лишенной свойств стволовой клетки, такой как окончательно дифференцированная клетка, или даже мертвая клетка. Как правило, клетка представляет собой клетку, происходящую из многоклеточного организма, или из его части. Предпочтительно, клетка выделена из указанного многоклеточного организма, то есть, физически не связана и/или с точки зрения питания независима от многоклеточного организма, из которого она происходит. Стромальная клетка является предпочтительной клеткой по изобретению.
Термины «клеточная популяция» и «популяция клеток» используются взаимозаменяемо и означают совокупность множества клеток. В самом ограниченном варианте осуществления клеточная популяция включает две клетки, но чаще множество клеток. Термин охватывает как популяции практически идентичных клеток, например, клеточные популяции, происходящие от одной клоногенной клетки, так и гетерогенные клеточные популяции, то есть, клетки, имеющие гетерогенное происхождение, и/или которые отличаются друг от друга по меньшей мере одной функциональной или структурной характеристикой. Термин охватывает популяции только суспензионных клеток, популяции только прикрепляющихся клеток, а также смешанные популяции суспензионных и прикрепляющихся клеток. Клеточная популяция может содержать как стволовые клетки, так и клетки, лишенные свойств стволовых клеток. В другом, но не взаимоисключающем, примере клеточная популяция включает как живые клетки, так и мертвые клетки.
Если из контекста не следует иное, термин «CD», как правило, используемый с номером (например, «CD34»), в настоящем документе означает «кластер дифференцировки».
Термин «клоногенность» означает способность клетки размножаться, тем самым давая начало множеству дочерних клеток, которые, как правило, являются генотипически идентичными. «Клоногенную» клетку также можно называть «колониеобразующей единицей», или «КОЕ».
Используемый в настоящем документе термин «коллагеназа» означает фермент (E.C. 3.4.24.7), способный разрушать пептидные связи в коллагене. Как правило, коллагеназа может способствовать разрушению внеклеточных структур. Термин не накладывает какие-либо конкретные ограничения на тип или происхождение коллагеназы, если специально не указано иначе. Коллагеназа может быть рекомбинантной или полученной из природного источника. Многие коммерчески доступные коллагеназы имеют и другие ферментативные активности, помимо E.C. 3.4.24.7. Такие коммерчески доступные коллагеназы являются подходящими в контексте настоящего изобретения (смотри примеры).
Термин «конфлюэнтность» используют в настоящем документе для описания пропорциональной части нижней поверхности емкости для культивирования, которая покрыта клетками, как правило, прикрепляющимися клетками. Конфлюэнтность, как правило, указывают как «% конфлюэнтности».
Термины «% конфлюэнтности» или «процентная конфлюэнтность» означают процентную долю нижней поверхности сосуда для культивирования, которая покрыта клетками, как правило, прикрепляющимися клетками, то есть, в сумме общую площадь клеток относительно поверхности сосуда для культивирования. Например, 50-процентная конфлюэнтность означает, что практически половина поверхности покрыта клетками, и все еще остается пространство для роста клеток. 100-процентная конфлюэнтность означает, что поверхность полностью покрыта клетками, и больше не остается места для роста клеток в виде монослоя. В контексте настоящего изобретения клетки, как правило, пересевают до достижения 100-процентной конфлюэнтности для оптимального поддержания их пролиферативного фенотипа.
Термин «низкая конфлюэнтность» означает процент конфлюэнтности, составляющий 50% или менее, как правило, 10-50%. Термины «субконфлюэнтные» и «субконфлюэнтность» означают процент конфлюэнтности, составляющий более 50%, но не более 80%.
Термин «культуральный сосуд», или «сосуд для культивирования клеток», как правило, означает сосуд, подходящий для культивирования клеток млекопитающих. Как правило, культуральные сосуды представляют собой флаконы, планшеты и пакеты (при этом пакеты, как правило, состоят из нескольких планшетов, установленных один поверх другого). Особенно подходящими культуральными сосудами в контексте настоящего изобретения являются культуральные сосуды, которые создают возможность для прикрепления клеток ко дну культурального сосуда; такими сосудами являются флаконы, планшеты и пакеты с плоской нижней поверхностью.
Применительно к культуральному сосуду термины «поверхность» или «нижняя поверхность» используются взаимозаменяемо и должны означать внутреннюю нижнюю поверхность культурального сосуда, то есть, поверхность, к которой прикрепляющиеся клетки обычно прикрепляются, когда они растут в культуральном сосуде. Как правило, указанная поверхность представляет собой внутреннее дно культурального сосуда и ограничена исключительно боковыми стенками культурального сосуда.
2
2
2
Термин «плотность», или «плотность клеток», означает число клеток в расчете на двумерную поверхность, например, в частности, число клеток на см, как правило, на см нижней поверхности сосуда для культивирования клеток, если из контекста явно не следует иное. Как правило, термин используют для указания количества клеток, высеваемых в культуральный сосуд, например, в начале конкретного пассажа. Общая нижняя поверхность указанного культурального сосуда и общее количество клеток, высеянных в этот культуральный сосуд, определяют плотность клеток на см указанного культурального сосуда в начале указанного пассажа. На практике, количество клеток, используемых в качестве инокулята в начале пассажа (I), предпочтительно определяют путем подсчета клеток до начала указанного пассажа; I, таким образом, зависит от плотности клеток и нижней поверхности емкости для культивирования. Если специально не указано иначе, «плотность клеток» означает среднюю плотность клеток на всей нижней поверхности культурального сосуда; тем не менее, по настоящему изобретению предпочтительно, если клетки распределены равномерно по всей нижней поверхности культурального сосуда.
Термин «диаметр», или «клеточный диаметр», применительно к клетке означает самый длинный диаметр клетки при взгляде сверху. В контексте настоящего документа диаметр клетки определяют, когда прикрепляющаяся клетка находится в культуре, то есть, клетка прикреплена к культуральному планшету. Важно, чтобы клетки находились в состоянии субконфлюэнтности. Субконфлюэнтность считается предпочтительной для воспроизводимости определения, поскольку считается, что субконфлюэнтные клетки практически не ингибируют друг друга за счет контактного ингибирования. Для определения диаметра одну или более клеток фотографируют, или иным образом визуально наблюдают или записывают, как правило, при помощи микроскопа, из положения, перпендикулярного (то есть, 90°) к поверхности культурального планшета, к которому клетка или клетки прикреплены. Границы области определяют вручную на графическом изображении (то есть, фотографии) клетки. Предпочтительно, культуральный сосуд не взбалтывают перед записью графического изображения. В случае биполярной клетки диаметр представляет собой расстояние между двумя полюсами клетки. В случае мультиполярных, например, треугольных, клеток диаметр представляет собой расстояние между теми двумя полюсами клетки, которые наиболее отдалены друг от друга. В каждом случае «расстояние» означает кратчайшую прямую линию, соединяющую соответствующие два полюса.
Термин «средний диаметр» означает среднюю величину диаметров двух или более отдельных клеток, при этом на первом этапе определяют диаметр каждой отдельной клетки, как описано выше, а затем на последующем этапе определяют средний диаметр в виде среднего арифметического значения диаметров клеток, определенных на первом этапе.
Используемые в настоящем документе термины «размножается» или «размножающаяся», как правило, означают пролиферацию клетки или популяции клеток. Как правило, в контексте настоящего изобретения размножение происходит in vitro или ex vivo. Как правило, размножение представляет собой активность или процесс, происходящий после выделения клеток. Как правило, в процессе размножения общее количество клеток увеличивается. Увеличение количества клеток может быть описано с указанием «совокупного удвоения(ий) популяции» или с указанием «числа пассажей («P»), или с указанием общего количества клеток на соответствующей стадии, и так далее.
Используемые в настоящем документе термины «экспрессировать», «экспрессированные», а также «экспрессия», «экспрессия гена», и тому подобные, относятся к использованию информации, заключенной в гене, в процессе синтеза функционального генного продукта. Экспрессия гена включает по меньшей мере транскрипцию и, необязательно, включает один или более дополнительных признаков, необязательно, выбранных из открытого списка, включающего редактирование РНК, трансляцию и посттрансляционную модификацию. При определении экспрессии гена определяют присутствие продукта экспрессии, такого как не редактированная или редактированная РНК, или даже закодированный белок. Приведенные выше термины в сочетании с указанием конкретного гена или локуса должны конкретно указывать на экспрессию генетической информации с гена или локуса; например, если указано, что экспрессируется APCDD1, это должно означать, что экспрессируется ген APCDD1.
Используемый в настоящем документе термин «экстракция» («экстракт») означает выделение из биологической среды. В зависимости от контекста термин может означать «экстрагировать» (глагол) или физический компонент, который был экстрагирован (например, клетку или клеточную популяцию, полученную путем экстракции из ее природного окружения). Например, когда клетки экстрагируют из пуповины, клетки выделяют из их исходной зоны расположения в пуповине и/или отделяют от других анатомических областей пуповины. Предпочтительно, экстрагированная клетка представляет собой клетку за пределами живого организма и/или физически отделенную от кровеносных сосудов, и/или физически отделенную от других клеток того же органа или ткани, и/или физически отделенную от неклеточных анатомических областей того же органа или ткани.
Используемый в настоящем документе термин «проточная цитометрия» означает лазерную или импедансную биофизическую технологию, подходящую для подсчета клеток, сортировки клеток, анализа свойств клеток и обнаружения биомаркеров (в частности, например, обнаружения молекул клеточной поверхности, таких как молекулы кластера дифференцировки (CD)). Для проточной цитометрии необходимо нахождение клеток в суспензии; для анализа прикрепляющихся клеток они должны быть отделены от субстрата, например, культурального сосуда, к которому они прикреплены, например, путем ферментативной обработки, например, при помощи трипсина, в результате чего они становятся клетками в суспензии. Клетки в суспензии, то есть, клетки в потоке жидкости, проходят через электронное обнаруживающее устройство (устройство для проточной цитометрии). Устройство для проточной цитометрии позволяет анализировать клетку, например, на основе специфического рассеяния света каждой клеткой. Можно использовать коммерческий прибор для проточной цитометрии, такой как проточный цитометр FACSAria III (BD Biosciences). Данные, полученные при помощи проточных цитометров, можно использовать для построения графиков в одном измерении, для построения гистограммы, или двумерных точечных диаграмм или даже графиков в трех измерениях. Графики можно строить, используя выбранную шкалу, например, линейную или логарифмическую шкалу. Области на этих графиках можно последовательно разделять на основании интенсивности флуоресценции, создавая серию подмножеств извлечений, называемых «гейтами».
Используемый в настоящем документе термин «активированная флуоресценцией сортировка клеток», или, взаимозаменяемо, «FACS», означает специализированный тип проточной цитометрии. FACS представляет собой метод сортировки гетерогенной смеси биологических клеток на две или более популяций на основании специфического светорассеяния и/или флуоресцентных характеристик каждой клетки. Тип флуорофора, используемый в качестве метки для FACS, не имеет конкретных ограничений; в некоторых вариантах осуществления флуорофоры присоединяют к антителу, которое узнает целевой признак, такой как клеточный поверхностный белок (в частности, например, обнаруживает молекулы клеточной поверхности, такие как молекулы кластера дифференцировки (CD)). Альтернативно, флуорофор может быть присоединен к химическому фрагменту с аффинностью для клеточной мембраны или другой клеточной структуры. Каждый флуорофор имеет характерный пик при определенной длине волны возбуждения и эмиссии, который обнаруживает устройство, подходящее для FACS. Можно использовать коммерческий прибор, такой как проточный цитометр FACSAria III (BD Biosciences).
Используемый в настоящем документе термин «гетерологичный» описывает нечто, состоящее из множества разных элементов. Например, клетка, перенесенная от одного индивидуума в организм другого индивидуума, представляет собой гетерологичный трансплантат. Гетерологичный ген представляет собой ген, происходящий из иного источника, чем конкретный субъект.
Используемые в настоящем документе термины «бессмертные» и «иммортализованные» относятся к клеткам, которые могут делиться без ограничений, накладываемых пределом Хейфлика (предел Хейфлика представляет собой момент, когда клетки больше не могут делиться вследствие повреждения ДНК или укорочения теломер). Бессмертные клетки, как правило, экспрессируют удлиняющий теломеры фермент теломеразу, но это не является строгим требованием.
Используемый в настоящем документе термин «инокулят» означает общее количество клеток, с которых начинается конкретная клеточная культура (пассаж) в конкретном культуральном сосуде.
«Выделенным» называют материал, который практически или в значительной степени свободен от примесей, обычно сопровождающих его в его естественном состоянии. Например, используемый в настоящем документе термин «выделенная клетка» означает клетку, которая была очищена от клеточного и внеклеточного окружения, такого как ткань, окружающего ее в ее естественном состоянии, например, мезенхимальную стромальную клетку, которая была извлечена из ткани пуповины, обычно находящейся вблизи клетки. Альтернативно, используемый в настоящем документе термин «выделенная клетка», и/или тому подобный, относится к in vitro выделению и/или очистке клетки из ее естественного клеточного окружения и из ассоциации с другими компонентами ткани, в которой клетка обычно находится. Если из контекста явно не следует иное, «выделенная клетка» не обязательно должна быть одиночной клеткой, отделенной от любых других клеток; напротив, даже популяция из двух или более клеток, например, нескольких клеток, может быть названа «выделенной», если указанная популяция клеток является выделенной в том смысле, что она практически или в значительной степени свободна от компонентов, обычно сопровождающих такую популяцию клеток в ее естественном состоянии. Например, популяция мезенхимальных стромальных клеток может быть названа «выделенной», если она была извлечена из исходной ткани, такой как пуповина. В соответствии с данным определением используемые в настоящем документе термины «выделенная» и «выделять» описывают активность, направленную на получение «выделенного» материала, такого как, например, выделенная клетка.
Используемый в настоящем документе термин «коммитированные» относится к потомству клетки, которое способно к митотическим делениям, но, как правило, неспособно к неограниченному числу митотических делений. В конце концов потомство коммитированной клетки должно дифференцироваться.
Используемый в настоящем документе термин «среда» означает водную смесь, подходящую для культивирования клеток, в частности, клеток млекопитающих. Водная смесь, как правило, представляет собой раствор, хотя термин также охватывает суспензии и коллоидные смеси. Среда, как правило, представляет собой жидкость, хотя некоторые среды также могут быть временно заморожены, например, с целью хранения; в любом случае среду используют для культивирования клеток, когда она является жидкой. Среда может быть либо «минимальной средой», которая представляет собой водную смесь определенного состава, либо «ростовой средой», которая представляет собой водную смесь, включающую минимальную среду и по меньшей мере одну добавку, и которая, как правило, обладает способностью поддерживать жизнеспособность клеток ex vivo и, необязательно, размножение клеток, также ex vivo. Если не указано специально, из контекста понятно, является ли среда минимальной средой или ростовой средой. Минимальная среда предпочтительно представляет собой среду с определенным химическим составом. Ростовая среда предпочтительно включает минимальную среду (как правило, от 85% до 99,5% по объему) плюс по меньшей мере одну добавку человеческого, животного или растительного происхождения, например, сыворотку, клеточный лизат или, в частности, в контексте настоящего изобретения, тромбоцитарный лизат.
Используемый в настоящем документе термин «мезенхимальная» относится к клетке, которая принадлежит к мезенхимальному типу клеток, например, жировой клетке, клетке соединительной ткани, кости, хряща, крови, лимфатических сосудов и кровеносных сосудов, а также к стромальной клетке или стволовой клетке, способной дифференцироваться в клетку мезенхимального типа. Без каких-либо ограничений для настоящего изобретения, мезенхимальные клетки in vivo иногда рыхло сгруппированы и находятся в студенистом межуточном веществе. Как правило, мезенхимальная клетка происходит из мезодермы (зародышевой мезодермы или внезародышевой мезодермы). В некоторых вариантах осуществления мезенхимальная клетка представляет собой стромальную клетку (мезенхимальную стромальную клетку) или стволовую клетку (мезенхимальную стволовую клетку), или клетку, происходящую от одной из этих клеток.
Используемый в настоящем документе термин «мезенхимальная стромальньная клетка», сокращенно «МСК», означает клетку мезенхимального происхождения, то есть, происходящую из стромы, в частности, например, из мезодермальной соединительной ткани. Тканевое происхождение «мезенхимальной стромальной клетки» не имеет дополнительных ограничений; однако в предпочтительных аспектах настоящего изобретения «мезенхимальная стромальная клетка» происходит из пуповины, точнее, из стромального вартонова студня пуповины, как подробно описано в настоящем документе. Мезенхимальная стромальная клетка, как правило, экспрессирует поверхностные маркеры CD105 и CD73, и обычно также CD90. Предпочтительно, «мезенхимальная стромальная клетка» по настоящему изобретению характеризуется экспрессией CD105 (известного как эндоглин), CD73 (известного как экто-5’-нуклеотидаза) и CD90 (также известного как Thy-1). Мезенхимальные стромальные клетки практически не экспрессируют гемопоэтические антигены, в частности, такие как CD45, CD34, CD14, CD19 или CD3. Как правило, МСК экспрессируют молекулы MHC класса I in vitro, но не молекулы класса II, не будучи стимулированы, например, интерфероном, в культуре ткани. Таким образом, типичный поверхностный маркерный фенотип МСК представляет собой CD105+, CD73+, CD90+, CD45-, CD34- CD14-, CD19-, CD3-, HLA DR-. При том, что данный профиль поверхностных маркеров позволяет однозначно идентифицировать МСК, он является сложным. Типичной характерной особенностью МСК является способность дифференцироваться in vitro в клетки разных типов, как правило, включая остеобласты, адипоциты и хондробласты. Как правило, МСК прикрепляются к пластику in vitro. Термин «мезенхимальная стромальная клетка» не обязательно подразумевает, что называемая так клетка является стволовой клеткой; тем не менее, как описано в настоящем документе, МСК по настоящему изобретению, или получаемая по настоящему изобретению, может иметь свойства, подобные свойствам стволовых клеток, в предпочтительных вариантах осуществления.
Термин «клетка-предшественник мезенхимальной линии дифференцировки» означает мезенхимальную стромальную клетку, обладающую способностью к самообновлению, при этом сохраняющую мультипотентность и способность к дифференциации в целый ряд типов клеток, либо мезенхимального происхождения, например, остеобласты, хондроциты, адипоциты, стромальные клетки, фибробласты и сухожилия, и возможно также в клетки не мезенхимального происхождения, например, нейрональные клетки и эпителиальные клетки. Таким образом, термин «клетка-предшественник мезенхимальной линии дифференцировки» означает клетку, которая способна дифференцироваться в клетки разных типов, хотя клетка является мультипотентной (в отличие от тотипотентной). Без связи с конкретной теорией, понятно, что «клетка-предшественник мезенхимальной линии дифференцировки» представляет собой клетку мезодермальной линии дефференцировки. Однако, если специально не указано иначе или из контекста не следует иное, термин «клетка-предшественник мезенхимальной линии дифференцировки» не накладывает никаких ограничений на тканевое происхождение соответствующей клетки. Таким образом, как правило, клетки, называемые «клетками-предшественниками мезенхимальной линии дифференцировки», не имеют ограничений в отношении конкретного тканевого происхождения и могут происходить, например, из костного мозга, пуповины, периферической крови взрослых, адипозной ткани, губчатой кости и зубной пульпы. В предпочтительных аспектах настоящего изобретения «клетка-предшественник мезенхимальной линии дифференцировки» происходит из пуповины, точнее, из вартонова студня пуповины, как подробно описано в настоящем документе. Термин «клетка-предшественник мезенхимальной линии дифференцировки» охватывает как родительские клетки, так и их недифференцированное потомство. Термин «клетка-предшественник мезенхимальной линии дифференцировки» также охватывает мезенхимальные клетки-предшественники, мультипотентные стромальные клетки, мезенхимальные стволовые клетки и их недифференцированное потомство. По настоящему изобретению в высокой степени предпочтительно, если «клетка-предшественник мезенхимальной линии дифференцировки» представляет собой стволовую клетку, описанную в настоящем документе, с тем ограничением, что стволовая клетка не является тотипотентной.
Используемые в настоящем документе термины «мульти» и «множественные» означают множественное число, то есть, любое количество из двух или более.
Используемый в настоящем документе термин «мультипотентная» относится к клетке, которая способна давать начало любому из нескольких типов зрелых клеток. Термин «мультипотентные» охватывает клетки-предшественники и все потомство таких клеток, которое все еще является мультипотентным. Термин «мультипотентная» относится к клетке-предшественнику, обладающей способностью к дифференциации в клетки более чем одного дискретного типа. Без связи с конкретной теорией, понятно, что мультипотентная стволовая клетка находится на вершине в иерархии линий дифференцировки и может давать начало дифференцированным клеткам нескольких типов. Без ограничения, мультипотентные клетки могут находиться в пуповине, адипозной ткани, сердечных клетках, костном мозге и зубной пульпе. В некоторых вариантах осуществления мультипотентные клетки являются плюрипотентными.
Используемый в настоящем документе термин «околососудистая», или «околососудистая зона», или «околососудистая область», относится к физической области или зоне вблизи сосуда, такого как кровеносный сосуд. «Околососудистая зона», или «околососудистая область», обозначена номером 5 на фигуре 1. В частности, околососудистая зона/область пуповины (5) представляет собой любую зону/область вокруг каждого кровеносного сосуда пуповины. Околососудистая зона/область может быть определена как пространство, простирающееся на расстояние до 3 мм от внешних стенок каждого сосуда пуповины (WO 2004/072273 A1). В качестве примера, околососудистая зона/область описана в публикации Takechi et al., 1993 (Placenta vol. 14; p. 235-245).
Термин «тромбоцитарный лизат» означает препарат, получаемый из тромбоцитов крови (также называемых кровяными пластинками). Тромбоциты могут быть получены от донора, предпочтительно донора-человека, либо путем выделения из общего пула единиц цельной крови и объединения, либо путем сбора тромбоцитов при аферезе: кровь собирают от донора и пропускают через устройство, удаляющее тромбоциты. После их выделения тромбоциты, например, (ре)суспендированные в плазме, как правило, лизируют, например, используя один или более циклов замораживания/размораживания. Тромбоцитарный лизат доступен от многих коммерческих поставщиков, например, Macropharma (Mouvaux, France), из клинических банков крови, например, банка крови поликлиники в г. Модена (Италия), но также может быть получен непосредственно из тромбоцитов крови, как описано, например, в публикации Naaijkens et al., Cell Tissue Res., 2012, vol. 348, p. 119-130 и WO 2013/042095 A1.
Используемый в настоящем документе термин «плюрипотентная» относится к клетке, которая обладает потенциалом дифференциации в любой из трех зародышевых слоев (эндодерму, мезодерму, эктодерму), но не в клетки зародышевой линии. Как правило, плюрипотентная клетка может дифференцироваться во все типы клеток взрослого организма, за исключением клеток зародышевой линии. В одном варианте осуществления плюрипотентная клетка представляет собой клетку, способную дифференцироваться в любой тип клеток организма млекопитающего - без связи с конкретной теорией, это может составлять примерно 260 типов клеток. Плюрипотентная клетка может быть самообновляющейся, и может оставаться покоящейся или неактивной в составе ткани. Плюрипотентная клетка предпочтительно имеет следующие характеристики: (i) способность к пролиферации в недифференцированном состоянии, (ii) сохранение нормального кариотипа при длительном культивировании и (iii) сохранение способности к дифференциации в любой из трех зародышевых слоев (эндодерму, мезодерму, эктодерму) даже после продолжительного культивирования.
Термин «номер пассажа», сокращенно «P», с указанием номера (например, «P1») означает число раз, когда культура клеток была субкультивирована. Таким образом, термин «номер пассажа» является термином, полезным для описания статуса в процессе размножения клеток.
0
0+x
0
Термин «удвоение популяции», сокращенно «УП», используют в настоящем документе для описания того, что число клеток удвоилось, например, за временной интервал с ранней временной точки t до более поздней временной точки t. В этом случае x обозначает временной интервал, в течение которого число клеток удвоилось. Например, t может представлять собой временную точку исходного выделения, или временную точку, в которой был начат определенный пассаж. Таким образом, термин «удвоение популяции» представляет собой термин, который относится к размножению клеток. Термин, как правило, относится к удвоению числа клеток in vitro. Удвоение популяции (УП) рассчитывают по формуле:
0
УП=log(N/N)/log2
0
где N представляет собой число высеянных клеток и
N представляет собой число собранных клеток
(Purpura et al., 2004, Stem Cells. Vol. 22, p. 39-50).
Термин «совокупное удвоение популяции» используют в настоящем документе для указания общего числа раз, когда количество клеток в клеточной популяции удваивалось in vitro с конкретной временной точки, например, с их исходного выделения. Таким образом, термин «совокупное удвоение популяции» также является термином, относящимся к размножению клеток, как правило, in vitro. Соответственно, совокупное УП определяют для каждого пассажа. Значение совокупного УП рассчитывают по формуле:
0
n=log(N/N)/log2+X
где n=значение совокупного УП,
0
N=число высеянных клеток (то есть, в начале пассажа),
N=число собранных клеток (то есть, в конце указанного пассажа),
X=значение совокупного УП в начале указанного пассажа.
0
0
N определяют, подсчитывая клетки перед началом пассажа; N зависит от плотности клеток и нижней поверхности емкости для культивирования. N определяют, подсчитывая клетки после отделения их от субстрата, например, после обработки трипсином, в конце пассажа.
0
Совокупное УП является аддитивной величиной (то есть, X в приведенной выше формуле); например, когда клетки прошли через 5 совокупных УП во время первого пассажа P1, и еще 5 совокупных УП во время последующего второго пассажа P2, тогда клетки прошли через 10 совокупных УП на протяжении P1 плюс P2. Свежевыделенные клетки имеют совокупное УП=0 по определению. Таким образом, в начале P0 X=0. Поскольку иногда трудно определять N до P0 (и, следовательно, определять n для P0), число совокупных удвоений популяции, необязательно, определяют только начиная с P1 и далее; однако в этом случае это специально указано в настоящем документе.
Можно указывать совокупное УП в виде значения, округленного до ближайшего целого числа. В случае использования определенных условий культивирования можно арифметически преобразовывать число пассажей в значение совокупного УП, и наоборот.
Термин «клетка-предшественник» используют в настоящем документе для обозначения клетки, которая может представлять собой стволовую клетку и/или потомка стволовой клетки. Предшественники, как правило, являются потомками стволовых клеток, они лишь более ограничены в своем потенциале дифференциации или способности к самообновлению. Клетки-предшественники могут быть, например, мультипотентными или унипотентными.
Термины «секретировать» или «высвобождать» при использовании в настоящем документе применительно к клетке, как правило, относятся к любому материалу, который выходит за пределы клетки во внешнюю среду. Указанный материал, как правило, был продуцирован и/или модифицирован клеткой, хотя и не обязательно. Например, некоторые клетки секретируют белки и/или регуляторные молекулы, такие как гормоны, простагландины и нейротрансмиттеры, и/или микровезикулы и/или экзосомы, в их соответствующую внешнюю среду. Например, простагландин, продуцируемый клеткой, может быть выведен в окружающую среду клетки. Указанные термины, используемые в настоящем документе, не ограничены ни ситуацией in vivo секреции/in vivo среды, ни ситуацией in vitro секреции/in vitro среды, если из контекста явно не следует иное.
Термин «клеточный объем», или просто «объем», применительно к клетке означает клеточный объем, определяемый методом проточной цитометрии, в частности, в анализе FACS, более конкретно, путем определения прямого светорассеяния (FSC). В контексте настоящего изобретения объем клетки определяют, когда клетка, например, открепившаяся клетка, такая как обработанная трипсином клетка (из прикрепляющейся культуры), или высвобожденная при помощи коллагеназы клетка (после выделения из ткани), находится в суспензии, то есть, клетка не прикреплена к культуральному планшету или к ткани. Определение SSC и, необязательно, клеточного объема описано ниже в настоящем документе.
Термин «средний объем», или «средний клеточный объем», означает средний объем двух или более отдельных клеток, при этом на первом этапе определяют объем каждой отдельной клетки методом проточной цитометрии, как описано в настоящем документе, а затем на последующем втором этапе определяют средний объем в виде среднего арифметического значения клеточных объемов отдельных клеток, определенных на первом этапе. Как правило, для определения среднего клеточного объема первый и второй этап проводят для по меньшей мере 1000 клеток; иными словами, среднее значение представляет собой среднее значение для по меньшей мере 1000 клеток.
Используемый в настоящем документе термин «стволовая клетка» означает эукариотическую клетку, способную давать начало фенотипически и генотипически идентичным дочерним клеткам («самообновление»), а также клеткам по меньшей мере одного окончательного клеточного типа (например, окончательно дифференцированным клеткам). Термин «стволовая клетка» означает клетку, которая может быть тотипотентной, плюрипотентной или мультипотентной, а также прародителем и/или клеткой-предшественником, образовавшейся в результате ее дифференциации, и/или коммитированной клеткой-потомком. Как правило, термин «стволовая клетка» может относиться к взрослой стволовой клетке или к эмбриональной стволовой клетке. Термин «стволовая клетка» может, необязательно, относиться к индуцированной стволовой клетке, такой как индуцированная плюрипотентная стволовая клетка, но более предпочтительно относится к клетке, которая не была индуцирована.
Термины «стволовость» или «свойство, подобное свойству стволовой клетки/свойства, подобные свойствам стволовых клеток»» используют взаимозаменяемо для обозначения свойства клетки, в частности, способности к самообновлению и способности к образованию дифференцированных клеток. Точнее, клетки, имеющие свойства, подобные свойствам стволовых клеток, могут давать начало дочерним клеткам, идентичным материнской клетке (самообновление), а также продуцировать потомство с более ограниченным потенциалом, такое как дифференцированные клетки. Клетки со свойствами, подобными свойствам стволовых клеток, характеризуются определенной степенью потенции, то есть, способностью к продуцированию дифференцированного потомства. Некоторые клетки со свойствами, подобными свойствам стволовых клеток, могут быть способны к образованию дифференцированных клеток нескольких типов (например, «мультипотентные» или «плюрипотентные»), в то время как другие могут быть способны к продуцированию дифференцированных клеток одного типа («унипотентные»). Хотя клетки со свойствами, подобными свойствам стволовых клеток, обладают способностью к самообновлению, большинство соматических клеток, включая клетки со свойствами, подобными свойствам стволовых клеток, при культивировании in vitro способны размножаться в течение конечного числа совокупных удвоений популяции до наступления остановки репликации, или старения. В предпочтительных вариантах осуществления мезенхимальные стромальные клетки по настоящему изобретению представляют собой мезенхимальные стромальные клетки со свойствами, подобными свойствам стволовых клеток.
Как правило, «строма» является частью ткани или органа человека или животного, которая выполняет функцию механической поддержки ткани, например, предоставляя соединительную, структурную поддержку, и/или (предпочтительно и) функциональной поддержки ткани. Таким образом, в живом организме строма представляет собой обеспечивающий соединительную и функциональную поддержку каркас биологической ткани или органа (в отличие от паренхимы, которая представляет собой функциональный аспект ткани). Используемый в настоящем документе термин «строма» означает клетки соединительной ткани в любом органе, например, без ограничения, в пуповине, слизистой оболочке матки (эндометрии), предстательной железе, костном мозге, лимфатических узлах и яичниках. В соответствующем органе строма поддерживает функцию паренхимных клеток этого органа. Таким образом, строма состоит из всех частей, которые не выполняют специфические функции органа, например, соединительная ткань, кровеносные сосуды, нервы, протоки и так далее. Таким образом, строма пуповины представляет собой матрикс, составляющий пуповину, за исключением сосудов, околососудистой области и амниотического эпителия. Термин «строма» может относиться к строме целого органа или к ее конкретной анатомической области. В частности, термин «строма» может относиться к строме целой пуповины или к ее конкретной анатомической области, то есть, строме, содержащейся в конкретной секции пуповины.
Используемый в настоящем документе термин «стромальный» относится к материалу, присутствующему в строме или полученному из стромы. Термин не имеет ограничений в отношении локализации «стромального» материала (например, стромальной клетки) внутри стромы, он также относится к материалу (например, клетке), который находился в строме в органе живого человека или животного, но впоследствии был извлечен или выделен из органа, так что он более не присутствует в органе живого человека или животного. Иными словами, термин «стромальный» указывает на конкретное in vivo происхождение материала (например, клетки), независимо от того, был ли материал (например, клетка) извлечен или выделен. Материал (например, клетка), который был извлечен или выделен из стромы, в настоящем документе также может быть назван «происходящим из стромы», «полученным из стромы», или тому подобным. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения стромальный материал (например, стромальная клетка) является, или был, извлеченным или выделенным, так что он не, или более не, присутствует в органе живого человека или животного.
Таким образом, «стромальная клетка» представляет собой биологическую клетку, которая находится в строме или получена из стромы, то есть, извлечена или выделена, так что она не, или более не, присутствует в органе живого человека или животного. Стромальная клетка является живой, если не указано иначе, или иное не следует из контекста. Во многих органах фибробласты и перициты входят в число наиболее распространенных типов стромальных клеток. В качестве иллюстративного примера, стромальная клетка может представлять собой клетку, находящуюся в строме (например, строме пуповины), или клетку, которая была выделена (например, извлечена) - и необязательно размножена - из стромы (например, стромы пуповины). Стромальные клетки, как правило, являются не злокачественными клетками.
Термин «сингенный» используют в настоящем документе для описания элемента, полученного от индивидуумов или клеток, имеющих идентичные генотипы, например, идентичных близнецов или животных одной и той же инбредной линии, или их клеток.
Используемый в настоящем документе термин «тотипотентная» относится к клетке, которая способна делиться и продуцировать все из дифференцированных клеток в организме. Как правило, тотипотентная клетка способна давать начало целому эмбриону. У млекопитающих, как правило, только зигота и последующие бластомеры являются тотипотентными.
Термин «пуповина», или «пупочный канатик», означает канал между новорожденным и плацентой у плацентарных животных. В процессе пренатального развития пуповина является физиологически и генетически частью плода. Хотя пуповина присутствует на всем протяжении эмбриогенеза, соединяя плаценту с развивающимся эмбрионом или плодом, в настоящей спецификации термин означает конкретно пуповину ребенка, который уже родился. У человека пуповина обычно содержит три кровеносных сосуда, то есть, две артерии (пупочные артерии) и одну вену (пупочную вену). Три кровеносных сосуда, как правило, погружены в вартонов студень. Ни плацента, или ее части, ни новорожденный, или его части, не являются частью пуповины; данный термин относится исключительно к каналу.
Термин «унипотентная» относится к клетке со свойствами, подобными свойствам стволовых клеток, которая может производить дифференцированное потомство только одного типа. Такую унипотентную клетку также можно называть клеткой-предшественником.
Используемый в настоящем документе термин «жизнеспособная» применительно к клетке означает, что клетка является живой клеткой. Живые клетки, как правило, метаболически активны. Хотя можно использовать несколько разных окрашивающих средств и флуорохромов для окрашивания нежизнеспособных клеток, в настоящем документе предпочтение отдано окрашиванию 7-амино-актиномицином D (7-AAD). 7-AAD представляет собой не проникающий через мембрану краситель, который, как правило, не проникает в жизнеспособные клетки. Он связывается с двухцепочечной ДНК путем интеркаляции между парами оснований в богатых G-C областях. 7-AAD может возбуждаться при длине волны 488 нм, например, аргоновым лазером, и испускает флуоресценцию при максимальной длине волны 647 нм. Используя 7-AAC, можно определять жизнеспособность клеток методом проточной цитометрии, в частности, FACS (активированная флуоресценцией сортировка клеток).
Используемый в настоящем документе термин «сосуд» (не путать с «культуральным сосудом» - смотри выше), как правило, означает трубку или канал (например, вену или артерию), в котором заключена и перемещается, или циркулирует, жидкость организма (например, кровь). Если из контекста явно не следует иное, термин «сосуд» в настоящем документе также используют для конкретного обозначения сосудов пуповины. У человека и многих других млекопитающих пуповина обычно содержит три кровеносных сосуда, то есть, одну вену, которая in vivo переносит оксигенированную, богатую питательными веществами кровь к плоду, и две артерии, которые in vivo уносят лишенную кислорода, истощенную по питательным веществам кровь; хотя сообщалось о редких случаях, когда в пуповине находились лишь два сосуда (одна вена и одна артерия).
Термин «вартонов студень», сокращенно «ВС», означает студенистое вещество плаценты животных, которое содержит клетки. Как правило, вартонов студень содержит стромальные клетки, более конкретно, мезенхимальные стромальные клетки. Кроме того, вартонов студень, как правило, содержит мукополисахариды, такие как гиалуроновая кислота и хондроитин сульфат, а также воду. Хотя вартонов студень также был описан в жидкости стекловидного тела глазного яблока, в настоящем документе настоятельно рекомендуется рассматривать вартонов студень как часть пуповины новорожденного плацентарного животного, предпочтительно млекопитающего, такого как человек. В этом случае вартонов студень также можно называть студенистой субстанцией пупочного канатика. Иными словами, настоятельно рекомендуется считать, что вартонов студень, описанный в настоящем документе, происходит из пуповины, даже более предпочтительно, происходит из пуповины человека. Как описано далее, пуповина обычно содержит вартонов студень в околососудистой области (5), в межсосудистой области (4) и в субамниотической области (1b).
Термины «околососудистый вартонов студень» или «ОСВС», или «ВСВС», являются синонимами и означают вартонов студень конкретной анатомической области пуповины, а именно, область вартонова студня, анатомически расположенную вокруг сосудов пуповины (5). В случае человеческой пуповины, которая представляет собой предпочтительный вариант осуществления, ОСВС расположен в области, простирающейся от внешней поверхности сосуда на расстояние 3,0 мм или менее (для обзора смотри Davies et al., Stem Cells Translational Medicine, 2017, vol. 6, p. 1620-1630). Таким образом, когда область, расположенную в пределах 3,0 мм от внешней стороны сосудов человеческой пуповины, полностью удаляют, то полностью удаляют околососудистую зону и, следовательно, весь находящейся в ней околососудистый вартонов студень, соответственно. Для иллюстрации смотри также фигуру 1. Сокращения «ОСВС» и «ВСВС» также используются в настоящем документе в качестве синонимов и означают клетки, происходящие из околососудистой зоны, включая «околососудистый вартонов студень», соответственно, например, в подписях к фигуре. Полученные из околососудистого вартонова студня (ОСВС) мезенхимальные стромальные клетки также можно называть «происходящими из околососудистой зоны мезенхимальными стромальными клетками».
Термин «субамниотическая строма» означает зону (1b), непосредственно примыкающую к амниотическому эпителию (1a) пуповины. В случае человеческой пуповины, которая представляет собой предпочтительный вариант осуществления, субамниотическая строма расположена в области, простирающейся от внутренней поверхности амниотического эпителия внутрь на 3,0 мм или менее.
Термин «субамниотический вартонов студень» означает вартонов студень в субамниотической строме (1b), непосредственно примыкающей к амниотическому эпителию (1a) пуповины. В случае человеческой пуповины, которая представляет собой предпочтительный вариант осуществления, субамниотический вартонов студень расположен в области, простирающейся от внутренней поверхности амниотического эпителия внутрь на 3,0 мм или менее.
Используемый в настоящем документе термин «стромальный вартонов студень», сокращенно «СВС», означает вартонов студень пуповины, за исключением околососудистой области (4). Таким образом, термин «стромальный вартонов студень» не включает околососудистую область (4) и, следовательно, не включает клетки из околососудистой области (4). При том, что в данной области были дебаты о том, содержит или не содержит околососудистая область мезенхимальные стромальные клетки, такие дебаты не важны для настоящего изобретения, по меньшей мере потому, что по настоящему изобретению не предусмотрено выделение мезенхимальных стромальных клеток из околососудистой области, по меньшей мере по той причине, что околососудистая область не является источником клеток по настоящему изобретению. Если специально не указано иначе, субамниотическая строма (1b) содержится в строме, упомянутой в настоящем документе. Если специально не указано иначе, субамниотический вартонов студень содержится в вартоновом студне, называемом в настоящем документе «стромальный вартонов студень». Субамниотический вартонов студень содержится в субамниотической строме. Сокращение «СВС» также используют в настоящем документе для обозначения клеток, происходящих из «стромального вартонова студня», например, в подписях к фигуре. Таким образом, со ссылкой на фигуру 1, строма (и, таким образом, источник вартонова студня) в самом широком определении включает все те области пуповины, которые не являются частью чего-либо из следующего: (1a) амниотический (или эпителиальный) слой; (2) пупочная вена; (3) пупочные артерии; (5) околососудистая область; (7): пуповинная кровь. Иными словами, в этом самом широком определении строма (и, таким образом, источник вартонова студня) включает (6) вартонов студень в просвете пуповины плюс (1b) субамниотический (или мезенхимальный) слой); плюс (4) межсосудистую область. Если специально не указано иначе, предпочтительно, если субамниотический вартонов студень (1b) входит в вартонов студень, называемый в настоящем документе «стромальный вартонов студень». Предпочтительно, (4) межсосудистая область входит в вартонов студень, называемый в настоящем документе «стромальный вартонов студень». Таким образом, строма (и, таким образом, источник вартонова студня) в самом широком определении включает все те области пуповины, которые схематически обозначены 1b, 4 и 6 на фигуре 1. В случае, если анатомические определения, приведенные в настоящем документе применительно к пуповине, частично или полностью отличаются от определений в некоторых, или во всех, литературных источниках, определения, приведенные в настоящем документе, должны иметь преимущественную силу.
В литературе было высказано предположение (Davies et al., Stem Cells Translational Medicine, 2017, vol. 6, p. 1620-1630), что с прагматической точки зрения только (1a) выстилку пуповины и (5) околососудистый вартонов студень можно четко отсекать от остальных областей или зон. В одном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрено это четкое отсечение, то есть, отделение стромального вартонова студня от (1a) выстилки пуповины и (5) околососудистой зоны, содержащей околососудистый вартонов студень.
Настоящее изобретение основано на нескольких фактах, которые взаимосвязаны и, таким образом, привели к разработке авторами изобретения различных аспектов изобретения, все из которых будут далее описаны подробно. Таким образом, все аспекты, описанные в данной спецификации, могут сочетаться друг с другом, даже если это не указано специально, если только из контекста явно не следует иначе. Все аспекты настоящего изобретения основаны, в частности, на том факте, что стромальный вартонов студень пуповины содержит клетки с уникальными свойствами, в частности, в компетентном для размножения состоянии, и что определенный способ выделения позволяет надежно получать эти потенциально мультипотентные стромальные клетки, так что они могут поддерживаться и размножаться в культуре.
Ни один человеческий эмбрион не подвергается, или не подвергался, уничтожению в контексте настоящего изобретения. В частности, ни один способ, или клетка, или клеточная популяция по настоящему изобретению не требует гибели человеческого эмбриона.
Способ получения мезенхимальной стромальной клетки
В первом аспекте изобретение относится к способу получения мезенхимальной стромальной клетки. Способ включает (a) выделение стромального вартонова студня, или его части, и (b) ферментативную обработку стромального вартонова студня, или его части, с высвобождением за счет этого по меньшей мере одной клетки из стромального вартонова студня, или его части.
В частности, со ссылкой на фигуру 1, которая представляет поперечный срез (человеческой) пуповины и схематическое изображение секций (анатомических областей) (человеческой) пуповины, способ может быть описан как способ получения мезенхимальной стромальной клетки, включающий (a) выделение стромального вартонова студня (1b, 4, 6), или его части, и (b) ферментативную обработку указанного стромального вартонова студня, или его части, с высвобождением за счет этого по меньшей мере одной клетки из стромального вартонова студня, или его части.
Клетка, полученная после этапа (b), может быть плюрипотентной или, чаще, мультипотентной. Необязательно, но предпочтительно, включены дополнительные этапы, в частности, этап размножения, который подробно описан ниже.
В способе по настоящему изобретению вартонов студень выделяют из пуповины. Это является изменением парадигмы, относящейся к общей тенденции в данной области, согласно которой полученные из костного мозга (КМ) мезенхимальные стромальные клетки (МСК) являются наиболее изученной популяцией взрослых МСК и считаются золотым стандартом для вариантов применения на основе МСК (например, Batsali et al., Blood, 2013 vol. 122, p. 1212). Однако аспирация костного мозга, как правило, является инвазивной и болезненной процедурой. Большим преимуществом способа по настоящему изобретению перед выделением из костного мозга (КМ) является то, что пуповина легкодоступна при рождении млекопитающего, в то время как хирургическая операция, необходимая для получения костного мозга, как правило, является инвазивной и болезненной. Вследствие этого пациенты, доноры и профессионалы в области медицины неохотно используют полученные из костного мозга МСК и, вероятно, будут еще менее расположены к этому, если только будут доступные надежные альтернативные способы.
Таким образом, преимуществом способа по настоящему изобретению является то, что способ представляет собой ex vivo способ. Предпочтительно, инвазивная процедура для живого человека или животного полностью исключена. Таким образом, способ по настоящему изобретению предпочтительно не является способом лечения человека или животного методами хирургии или терапии. Вследствие этого, проблемы, связанные с болью, хирургическим вмешательством и этическими аспектами, успешно устранены, в сравнении со способом выделения из костного мозга, описанным в литературе.
Следующим ключевым отличием от некоторых ранних исследований и отчетов является то, что в соответствии с предшествующим уровнем техники МСК могут быть эффективно выделены из соединительной ткани, окружающей сосуды пуповины (например, Batsali et al., Blood, 2013 vol. 122, p. 1212), в то время как в соответствии с настоящим изобретением МСК выделяют из области, не включающей околососудистую зону, и, следовательно, околососудистый вартонов студень. Таким образом, авторы настоящего изобретения установили, что определенная анатомическая область пуповины должна быть целенаправленно выделена для достижения преимуществ, описанных в настоящем документе. Более конкретно, способ по настоящему изобретению отличается конкретной анатомической областью происхождения клеток и/или определенным разделением на секции и сегментированием пуповины, и/или конкретным этапом выделения, и/или, необязательно, конкретным этапом размножения, все из перечисленного подробно описано ниже и проиллюстрировано примерами. Важно, что предпочтительные и/или необязательные варианты осуществления и особенности конкретной анатомической области происхождения клеток, определенное разделение на секции и сегментирование пуповины, конкретный этап выделения и, необязательно, конкретный этап размножения могут быть скомбинированы друг с другом по настоящему изобретению в каждом, и в любом, сочетании, если из контекста явно не следует, что конкретное сочетание невозможно или нежелательно по настоящему изобретению.
В способе по настоящему изобретению быстрое выделение стромальных клеток из пуповины является предпочтительным. В предпочтительном варианте осуществления этапы (a) и (b) проводят в общей сложности в течение менее 6 часов, более предпочтительно менее 5 часов, более предпочтительно менее 4 часов и наиболее предпочтительно менее 3 часов. Срок менее 3 часов включает временные интервалы от 0,5 до 2,5 часов и от 1 до 2 часов. Очевидно, что короткая совместная продолжительность этапов (a) и (b) также означает, что временной интервал для этапа (a) сам по себе является коротким.
Если специально не указано иначе, все реагенты, ингредиенты, культуральные сосуды, контейнеры и материалы, которые непосредственно или опосредованно контактируют с клетками, предпочтительно являются стерильными, и более предпочтительно имеют категорию GMP.
Далее следует подробное описание способа и его вариантов осуществления.
Источник ткани
Первый этап способа по изобретению представляет собой этап (a), заключающийся в выделении стромального вартонова студня, или его части, из пуповины. Этап (a) предпочтительно представляет собой механический этап, то есть, при этом обычно не используют химические или ферментные реактивы для выделения. Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления на этапе (a) никакие ингредиенты с ферментативной активностью не добавляют в течение этапа (a). Как дополнительно описано ниже, ферментативная обработка, однако, важна для последующего этапа (b).
Термин «часть» при использовании в сочетании с термином «стромальный вартонов студень» не имеет конкретных ограничений и, как правило, означает, что в некоторых вариантах осуществления менее 100% общего количества стромального вартонова студня пуповины может быть использовано в способе по изобретению. Например, в некоторых вариантах осуществления может быть использовано 10-99%, например, 20-90%, 30-80%, 40-60%, от общего количества стромального вартонова студня. Причины для использования менее 100% в некоторых вариантах осуществления могут быть множественными и могут быть связаны с экспериментальными ограничениями для извлечения 100% стромального вартонова студня пуповины, или это может быть сделано намеренно, например, когда желательно использовать часть стромального вартонова студня для сравнительных экспериментов. Тем не менее, предпочтительно стараться использовать настолько большую часть, насколько это возможно, то есть, 80% или более, стромального вартонова студня, предпочтительно, 90% или более. Выраженные в % значения, если нет иных указаний, относятся к % доле общего объема стромального вартонова студня, содержащегося в одной пуповине.
Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением клетки выделяют из пуповины. Пуповину получают от плацентарного животного, однако предпочтительно пуповину получают от млекопитающего. У плацентарных млекопитающих пуповина представляет собой структуру, соединяющую плаценту с развивающимся плодом и, сразу после рождения, с новорожденным. Ни плацента, ни новорожденный не являются частью пуповины; пуповина является лишь соединительной трубкой между плацентой и новорожденным.
Пуповину получают после рождения. Предпочтительно, пуповину получают через 24 часа или менее после рождения, например, через 12 часов или менее после рождения, 6 часов или менее после рождения, 3 часа или менее после рождения, например, 2 часа или менее после рождения, и предпочтительно 1 час или менее после рождения. Таким образом, пуповину можно хранить, предпочтительно в течение максимум 24 часов после рождения, предпочтительно при низких температурах 0-10°C, предпочтительно 2-8°C, до выделения клеток. Однако пуповину не замораживают перед выделением клеток. Необязательно, пуповину промывают стерильной водой или стерильным буферным водным раствором перед выделением клеток.
Пуповину предпочтительно хранят и обрабатывают в стерильных условиях до, и в процессе, выделения клеток. Необязательно, пуповину можно дополнительно поверхностно стерилизовать быстрой обработкой поверхности пуповины, например, водным (70% об/об) раствором этанола или бетадином, с последующим промыванием стерильной водой.
Предпочтительно, клетки выделяют из человеческой пуповины. Человеческая пуповина (ПК) при рождении ребенка в срок имеет массу примерно 40 г и средний диаметр примерно 1,5 см (Raio et al., 1999, Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol., vol. 83; p. 131-135). Таким образом, предпочтительно, пуповина, используемая по настоящему изобретению, представляет собой человеческую пуповину. Человеческая пуповина, используемая в способе по настоящему изобретению, предпочтительно имеет длину примерно 40-65 см, например, 44-51 см.
Как правило, пуповину получают после рождения здорового младенца от здоровой матери, предпочтительно женщины-матери. Предпочтительно, указанная мать воздерживалась от курения, употребления спиртных напитков и приема психотропных фармацевтических препаратов в течение по меньшей мере одного месяца до родов.
Когда говорят, что стромальный вартонов студень, или его часть, выделяют из пуповины, это предпочтительно означает, что в качестве стартового материала используют не более одной пуповины. Однако также можно использовать более одной пуповины в качестве стартового материала. В одном варианте осуществления в способе по настоящему изобретению используют одну пуповину в качестве стартового материала. В данном варианте осуществления весь стартовый материал является аутологичным, то есть, никакой аллогенный материал пуповины не является частью стартового материала, и, следовательно, все клетки, получаемые способом по настоящему изобретению, получают от одного донора при каждом использовании способа.
Можно использовать всю пуповину в качестве стартового материала, однако также можно использовать часть одной пуповины в качестве стартового материала. Когда одну целую пуповину используют в качестве стартового материала в способе по настоящему изобретению, можно сказать, что способ используют в «полном масштабе». Соответственно, способ в предпочтительном аспекте настоящего изобретения, включающий этапы (a), (b) и, необязательно, (c), называют «полномасштабным» циклом, когда одну целую пуповину используют в качестве стартового материала. В данном контексте слово «целая» не исключает того, что незначительные части пуповины, например, два конца пуповины, отделяют или отрезают и, таким образом, не используют в качестве стартового материала; оно также не исключает того, что пуповину нарезают на секции и/или сегментируют в способе, описанном в настоящем документе; оно скорее означает, что практически всю пуповину используют в качестве стартового материала. В случае человеческой пуповины при рождении ребенка в срок, целая пуповина, как правило, имеет массу от 35 до 40 грамм, или точнее, примерно 40 грамм. В одном варианте осуществления полномасштабный цикл начинают с 35-45 грамм пуповины от одного донора. Количество стартового материала, то есть, пуповины, безусловно, влияет на общее количество клеток, полученных в последующих фазах способа по настоящему изобретению. Если специально не указано иначе, все количества (например, количества клеток), приведенные в настоящем документе, относятся к полномасштабному циклу. Термин «полномасштабный» не противоречит термину «часть» стромального вартонова студня при условии, что прилагаются разумные усилия для извлечения максимально возможного количества стромального вартонова студня из одной пуповины.
Самый внешний слой пуповины (также называемый выстилкой пуповины, пуповинной тканью или выстилающей оболочкой пуповины, отмеченный 1a на схеме фигуры 1) не является желательным источником клеток в способе по изобретению. Поскольку сама пуповина является продолжением плаценты, выстилающая оболочка пуповины является продолжением амниотической оболочки, покрывающей плаценту. Выстилающая оболочка пуповины имеет два слоя: амниотический (или эпителиальный) слой (также называемый выстилающей оболочкой пуповины) и субамниотический (или мезенхимальный) слой. Человеческая пуповина, например, покрыта одним/несколькими слоем/слоями плоскоклеточно-кубовидных эпителиальных клеток (Copland et al., Placenta, 2002; vol. 23, p. 311-321; Mizoguchi et al., J. Dermatol. Sci., 2004, vol. 35, p. 199-206); эти клетки нежелательно выделять в способе по изобретению. В одном варианте осуществления способа по изобретению желательно не выделять ни клетки из амниотического слоя, ни клетки из субамниотического слоя, и, следовательно, такие клетки не используют в качестве стартового материала при следующем далее необязательном размножении клеток.
Архитектура внутренней ткани пуповины состоит из двух артерий и одной вены, а также окружающего матрикса из слизистой соединительной ткани (стромального вартонова студня). Описано, что вартонов студень содержит подобные фибробластам клетки (Parry, 1970, J. Anatomy, vol. 107, p. 505-518) и иногда тучные клетки. Кроме того, вартонов студень содержит аморфное основное вещество, богатое протеогликанами, преимущественно гиалуроновой кислотой.
Предпочтительно, пуповину, используемую в способе по настоящему изобретению, получают при своевременных родах, также называемых «родами в срок». Точнее, человеческую пуповину, используемую в способе по настоящему изобретению, получают при родах, происходящих в пределах 38-42 недель беременности, более предпочтительно в пределах 39-41 недель беременности. В одном варианте осуществления человеческую пуповину получают при нормальных (вагинальных) родах; в альтернативном варианте осуществления человеческую пуповину получают при неестественных родах, например, при кесаревом сечении.
В одном варианте осуществления сбор пуповины при рождении человека или животного не является частью настоящего изобретения. В данном варианте осуществления способ по изобретению начинают применять после того, как пуповина была получена. Иными словами, способ по изобретению применяют на практике с использованием в качестве стартового материала пуповины, которая была получена до этапа (a).
Сегментирование пуповины
Кроме того, авторы изобретения установили, что предпочтительно механически разделять пуповину, как описано в настоящем документе. Разделение предпочтительно включает сегментирование и разделение на секции, как описано в настоящем документе.
На первом этапе предпочтительно сегментировать пуповину, как описано в настоящем документе. Сегментирование является не обязательным, но предпочтительным. В частности, сегментирование облегчает проведение последующих этапов и способствует надежной воспроизводимости. Кроме того, сегментирование повышает эффективность выделения стромального вартонова студня на последующем этапе разделения на секции. Таким образом, сегментирование предпочтительно проводят до описанного ниже этапа разделения пуповины на секции (сегменты).
Сегментирование по настоящему изобретению, как правило, производят физическими методами, например, при помощи ножниц или скальпеля. Путем сегментирования пуповины получают сегменты пуповины (для иллюстрации смотри, например, пример 1). Используемый в настоящем документе термин «сегменты» означает такие нарезанные кусочки пуповины. Предпочтительно, сегментирование производят перпендикулярно пуповине. Используемый в настоящем документе термин «перпендикулярно» применительно к пуповине означает, что направление разреза пуповины находится под углом примерно 90° относительно направления пуповины. Для определения угла пуповину предпочтительно размещают в вытянутом состоянии, то есть, без завитков или изгибов. «Примерно 90°» означает 75°-105°, предпочтительно 80°-100°, более предпочтительно 85°-95°. Квалифицированный специалист сможет разрезать пуповину перпендикулярно даже без устройства для измерения углов, на основании собственного опыта. Тем не менее, для определения угла можно использовать устройство, при желании.
Более предпочтительно, если каждый нарезанный перпендикулярно сегмент имеет длину от примерно 1 до примерно 4 см, предпочтительно от примерно 2 до примерно 3 см, и более предпочтительно примерно 2,5 см. В предпочтительном варианте осуществления сегмент(ы) сосудов удаляют из сегмента(ов) пуповины до этапа (b). В частности, предпочтительно удалять сосуды, или точнее, сегменты сосудов, после - предпочтительно перпендикулярного - сегментирования пуповины.
Сегментирование является не обязательным, но предпочтительным, и, таким образом, оно предпочтительно является частью способа по изобретению. Сегментирование предпочтительно проводят в стерильных условиях.
Разделение на секции для получения стромального вартонова студня
Как правило, пуповина млекопитающих и, в частности, человеческая пуповина, отличается компартментализацией тканей, с отличающимися клеточными характеристиками и элементами внеклеточного матрикса. На основании данных структурных и функциональных исследований описано по меньшей мере шесть отдельных зон или секций (смотри также фигуру 1): здесь они перечислены в порядке от внешней стороны к внутренней стороне, при этом номера соответствуют номерам на фигуре 1: выстилка пуповины (включающая амниотический эпителий и субамниотические клетки) (1), (межсосудистая) строма (классическое название стромальный вартонов студень), межсосудистая строма (4), околососудистая строма (5), сосуды (2 и 3), субамниотическая строма (1b), расщелины (не показано).
В настоящей области было принято считать, учитывая гипотезу, согласно которой околососудистые клетки, как правило, мигрируют от областей, близких к сосудистой сети, что большинство МСК в вартоновом студне происходит из околососудистой области (Davies et al., Stem Cells Translational Medicine, 2017, vol., 6, p. 1620-1630).
Однако авторы изобретения неожиданно обнаружили, что секционный подход является предпочтительным для извлечения МСК из ПК, и что секцией, содержащей МСК с превосходными свойствами, является стромальный вартонов студень. Авторы изобретения с удивлением обнаружили, что клетки, полученные из стромального вартонова студня, или его части, обладают превосходными свойствами. Таким образом, необходимым этапом способа по настоящему изобретению является выделение стромального вартонова студня, или его части.
Перед выделением стромального вартонова студня важно промыть пуповину, или, в частности, сегменты пуповины. Для промывания подходит водный раствор, в идеале, забуференный при, или примерно при, физиологическом значении pH, и изотонический, необязательно, с добавлением антибиотиков. Например, подходящим является HEPES-буферный солевой раствор (HBSS) или фосфатно-солевой буфер (PBS), предпочтительно HBSS, содержащий 300 мкг/мл гентамицина и 0,15 мкг/мл амфотерицина B. Обычное время промывания может составлять предпочтительно 1-30 минут, предпочтительно примерно 10 минут. В течение этого времени используют механическое движение, например, встряхивание, для надлежащего промывания пуповины или, предпочтительно, сегментов пуповины, водным промывающим раствором. В частности, после сегментирования пуповины промывание является важным, поскольку оно позволяет удалять остатки крови на границах сегментов, полученных при сегментировании.
Затем для выделения стромального вартонова студня проводят разделение на секции, предпочтительно, пуповины, или более предпочтительно, сегмента(ов) пуповины, как описано в настоящем документе. Таким образом получают нужный стромальный вартонов студень. И другие пути получения стромального вартонова студня являются подходящими в качестве альтернативы разделению на секции, описанному в настоящем документе, и также являются частью настоящего изобретения. Однако предпочтительно, если стромальный вартонов студень получают путем разделения на секции, как описано в настоящем документе.
Оказалось, что для выделения нужного вартонова студня предпочтительным является боковое разрезание пуповины или сегмента(ов) пуповины. Предпочтительно, пуповину или сегмент(ы) пуповины разрезают продольно, например, скальпелем. «Продольно» означает параллельно длине пуповины. Один продольный разрез на сегмент предпочтительнее нескольких разрезов. Боковое разрезание или, более конкретно, продольное разрезание, позволяет впоследствии эффективно разделять разные секции пуповины, в частности, позволяет выделять стромальный вартонов студень, как описано далее.
Как подробно описано в настоящем документе и проиллюстрировано в примерах, приведенных в настоящем документе, клетки из стромального вартонова студня, как оказалось, обладают большими преимуществами. Таким образом, для получения вартонова студня, который предстоит разделять на секции и выбирать для дальнейшей обработки по настоящему изобретению, исключают околососудистую зону и, следовательно, исключают любой околососудистый вартонов студень. Иными словами, вартонов студень, который предстоит разделять на секции и выбирать для дальнейшей обработки по настоящему изобретению, представляет собой стромальный вартонов студень. Тот факт, что клетки из стромального вартонова студня, выделенные в соответствии с настоящим изобретением, обладают превосходными свойствами, является удивительным открытием авторов настоящего изобретения. Ранее путем подробных структурных, иммуногистохимических (например, Akerman et al., Gynecol. Endocrinol., 2002, vol. 16, p. 299-306 и Karahuseyinoglu et al., Stem Cells, 2007, vol. 25, p. 319-331) и in vitro функциональных исследований (Sarugaser et al., 2005, Stem Cells, vol. 23, p. 220-229; Karahuseyinoglu et al., Stem Cells, 2007, vol. 25, p. 319-331) было установлено, что существуют отличия в количествах и природе клеток между субамниотической (1b), межсосудистой (4) и околососудистой (5) областями, и что плотность клеток в конкретном пространстве отличается в субамниотической, межсосудистой и околососудистой областях: плотность клеток значительно ниже в субамниотических областях, при этом в околососудистых областях плотность клеток максимальная (Takechi et al., 1993, Placenta; vol. 14, p. 235-245; Karahuseyinoglu et al., 2007, Stem Cells, vol. 25, p. 319-331). Следует отметить, что в данном параграфе термин «плотность клеток» использован не общепринятым образом применительно к трехмерному пространству, поскольку в остальной части настоящего документа данный термин используют применительно к двумерной площади. Например, в более ранних исследованиях участки, прилегающие к серозной оболочке и прилегающие к сосудам, были предложены в качестве источника для получаемых из пуповины стромальных клеток (например, US 2004/0136967 A1). Хотя ранее показано, что клетки могут быть выделены из вартонова студня, и что разные клеточные популяции существуют в вартоновом студне, определенный выбор стромального вартонова студня по настоящему изобретению является более конкретным выбором, чем в ранее опубликованных подходах (например, US 2004/0136967 A1), и отличается от выбора, предложенного другими исследователями (например, WO 2004/072273 A). Таким образом, разделение на секции перед физическим извлечением клеток резко отличается от предложений в литературе, согласно которым ткань обычно не выбирают тщательно и не разделяют на секции перед выделением клеток, но нужные клетки выделяют из клеточной популяции, например, путем избирательного уничтожения нежелательных клеток (отрицательная селекция, смотри, например, US 2004/0136967 A1). Насколько известно авторам настоящего изобретения, конкретно не было известно, что клетки, получаемые из стромального вартонова студня пуповины, превосходят околососудистые клетки по однородности, размеру (объему и площади поверхности, соответственно), потенциалу дифференциации и стволовости. Таким образом, в отличие от принятого в данной области мнения, авторы настоящего изобретения установили, что клетки, полученные из стромального вартонова студня, являются превосходными во многих аспектах. Некоторые из этих аспектов проиллюстрированы в экспериментальных примерах в настоящем документе. Как правило, можно предполагать, что клеточные популяции с однородными морфологическими и функциональными свойствами могут быть подходящими для разработки относительно единообразного клеточного продукта. Без связи с конкретной теорией, возможно, что единообразие можно объяснить тем фактом, что стромальный вартонов студень, как правило, содержит меньше перицитов и эндотелиальных клеток, чем околососудистая область, если вообще их содержит.
Авторы изобретения с удивлением обнаружили, что клетки, происходящие из стромального вартонова студня пуповины, имеют особенно много преимуществ. Субамниотическая строма (как правило, содержащая вартонов студень) (1b) может быть получена путем выскабливания внутренней поверхности амниотического эпителия (1a) механическими средствами; однако следует принимать меры предосторожности, чтобы избежать разрыва или фракционирования амниотического эпителия, что может приводить к нежелательному захвату части амниотического эпителия.
Преимущества включают однородность клеточных популяций и свойства, подобные свойствам стволовых клеток. В частности, эти преимущества могут быть достигнуты в случае отсутствия сосудов и околососудистой зоны пуповины, и, следовательно, в случае отсутствия клеток из сосудов и околососудистой зоны пуповины.
Таким образом, предпочтительно, если этап (a) выделения стромального вартонова студня, или его части, из пуповины включает разделение на секции пуповины, или ее сегментов. Предпочтительно, он включает разделение на секции сегментов пуповины. В процессе этапа разделения на секции нужный стромальный вартонов студень отделяют от сосудов с околососудистой зоной, которая может содержать околососудистый вартонов студень. В процессе этапа разделения на секции стромальный вартонов студень также отделяют от по меньшей мере амниотического эпителия. Следует принимать меры предосторожности, чтобы избежать разрыва или фракционирования амниотического эпителия, что может приводить к нежелательному захвату части амниотического эпителия.
Разделение на секции предпочтительно проводят в стерильных условиях.
Разделение на секции является необходимой частью этапа (a) способа по настоящему изобретению, то есть, этапа выделения стромального вартонова студня, или его части, из пуповины. Таким образом, в одном варианте осуществления выделение стромального вартонова студня, или его части, из пуповины осуществляют, подвергая пуповину физическому разделению, при этом сосуды и околососудистую область пуповины, а также по меньшей мере амниотический слой выстилки пуповины, отбрасывают, а стромальный вартонов студень, или его часть, сохраняют.
Оказалось, что для разделения на секции, или точнее, разделения на секции путем механического отделения, очень полезно, если пуповина была предварительно сегментирована, как описано выше, и, кроме того, разрезана продольно, как описано выше. Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения этап (a) способа включает как этап сегментирования, описанный выше, так и описанный этап разделения на секции.
Подходящий способ выделения стромального вартонова студня, или его части, из пуповины включает удаление кровеносных сосудов и околососудистой области из пуповины. Предпочтительно, околососудистую зону, которая, согласно литературным данным, содержит околососудистый вартонов студень, также отделяют от выстилки пуповины, в частности, по меньшей мере амниотического слоя выстилки пуповины.
Таким образом, разделение на секции по настоящему изобретению характеризуется физическим удалением сосудов и околососудистой области из пуповины. В соответствии с настоящим изобретением сосуды и околососудистую область можно удалять до этапа (a) или в виде части этапа (a), что предпочтительнее. Одним технически удобным способом удаления сосудов и околососудистой области, который является предпочтительным по настоящему изобретению, является отделение сосудов и околососудистой области от пуповины. Например, кровеносные сосуды пуповины (две вены и артерию) отделяют при помощи стерильного пинцета.
Авторы изобретения установили, что отделение сосудов, например, путем вытягивания сосудов, также приводит к отделению околососудистой области. В предпочтительном варианте осуществления околососудистую область удаляют полностью; это означает, что никакие клетки, принадлежащие околососудистой области, не остаются в пуповине (сегментах) после удаления сосудов. Любой другой способ подходит в равной степени при условии, что околососудистую область полностью удаляют. Зона, проксимальная к внешней стенке сосудистой сети пуповины, представляет собой околососудистую зону. Околососудистая зона находится, как правило, внутри зоны, простирающейся на расстояние до примерно 3 мм, или менее, от внешней стенки сосудов. Околососудистую зону удаляют вместе с сосудами, когда отделяют сосуды. Любой вартонов студень, который может находиться в околососудистой области, проксимальной к внешней стенке сосудистой сети пуповины, можно называть околососудистым вартоновым студнем. Околососудистый вартонов студень, как правило, находится в зоне, простирающейся на расстояние до примерно 3 мм, или менее, от внешней стенки сосудов. Любой околососудистый вартонов студень удаляют вместе с сосудами, когда отделяют сосуды.
Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления сосуды отделяют от пуповины или сегмента(ов) пуповины. Отделение можно проводить путем захвата сосуда(ов) механическими средствами, такими как пинцет или любое другое подходящее для этой цели средство, и вытягивания сосуда(ов). Предпочтительно, сосуды вытягивают один за другим, но это не обязательное требование. При отделении сосудов пуповину, или ее сегмент, как правило, фиксируют, например, придерживая ее механическими средствами, такими как пинцет или любое другое подходящее для этой цели средство. Таким образом, можно применять механическую силу и удалять сосуды. Удаление следует производить с осторожностью в том смысле, что следует избегать открытия сосудов и/или потери сосудистых или околососудистых клеток. Удаление следует производить с осторожностью в том смысле, что следует избегать вытягивания матрикса пуповины или, альтернативно, сводить его к минимуму.
Предпочтительно, после этапа удаления сосудов пуповину, или соответствующий сегмент(ы), повторно осматривают, чтобы убедиться, что сосуды (и, таким образом, также ОСВС) были полностью удалены.
Сосуды, включая любую ткань, примыкающую к ним, после отделения отбрасывают. Это означает, что сосуды, включая любую ткань, примыкающую к ним, после отделения далее не подвергают последующему этапу ферментативной обработки. В способе по настоящему изобретению вартонов студень околососудистой зоны не используют в качестве источника для выделения клеток. Таким образом, никакой околососудистый вартонов студень не используют в качестве источника для выделения клеток. Для иллюстративных целей на фигурах 1 и 2 показан околососудистый вартонов студень (5 на фигуре 1).
В соответствии с настоящим изобретением сосуды и область вокруг сосудов отбрасывают. Область вокруг сосудов имеет диаметр по меньшей мере примерно 2,0 мм, при этом измеряют расстояние вдаль от внешней поверхности сосуда (смотри фигуру 2), например, диаметр 2,0 мм, предпочтительно, диаметр 2,5 мм, и более предпочтительно 3,0 мм. Таким образом, по меньшей мере область на расстоянии примерно 2,0 мм, например, 2,0 мм, предпочтительно, 2,5 мм, и более предпочтительно 3,0 мм вокруг сосудов пуповины не используют в качестве стартового материала для выделения клеток по настоящему изобретению. Предпочтительным способом удобного выполнения этого является физическое удаление («отделение») сосудов из пуповины, или точнее, сегментов сосудов из сегментов пуповины, как описано в настоящем документе. Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления сосуды удаляют физически из пуповины, или сегменты сосудов физически удаляют из сегментов пуповины. Последний вариант является предпочтительным; для этого необходимо сегментирование пуповины, как описано в настоящем документе, перед удалением сосудов из сегментов.
После удаления сосудов и околососудистой области стромальный вартонов студень получают из лишенной сосудов пуповины, или лишенных сосудов секций пуповины, следующим образом: предпочтительно, выделение стромального вартонова студня, или его части, также включает этап физического отделения субамниотической стромы (1b) от выстилающей оболочки пуповины (1a). Это может включать отделение вартонова студня от выстилающей оболочки пуповины, в частности, по меньшей мере от эпителиального слоя выстилающей оболочки пуповины. Таким образом получают строму (содержащую стромальный вартонов студень), свободную от соответствующего выстилающего пуповину материала. Предпочтительно, этап физического отделения стромы (возможно включающей вартонов студень) от выстилающей оболочки пуповины, в частности, по меньшей мере от эпителиального слоя выстилающей оболочки пуповины, также выполняют на сегментах, получаемых, как описано выше. Из практических соображений этап обычно выполняют на сегментах по очереди (то есть, один сегмент после другого), хотя быстрое проведение данного этапа является предпочтительным.
Стромальный вартонов студень, как правило, имеет относительно рыхлую желеобразную консистенцию; таким образом, его можно механически отделять от лишенной сосудов пуповины или, предпочтительно, лишенных сосудов сегментов пуповины.
Механическое отделение предпочтительно представляет собой соскабливание. Для соскабливания можно использовать любой инструмент, предпочтительно механический инструмент, подходящий или разработанный для этой цели. Удаление предпочтительно производят механическими средствами; подходящие механические средства описаны в данной области, например, в US20080181967 A1, WO2008146992 A1 и WO2007080591 A2. В одном варианте осуществления механические средство используют для отрезания кусочков ткани матрикса от сегментов ПК. В одном варианте осуществления внутреннюю поверхность пуповины (сегментов) скоблят при помощи механических средств. В одном варианте осуществления амниотическую эпителиальную мембрану удаляют механически, например, при помощи механических средств. Если соскабливание производят осторожно, что предпочтительно, эпителиальный слой не повреждается и, таким образом, никакие клетки эпителиального слоя не захватываются при соскабливании.
Важно не включать фрагменты амниотической эпителиальной мембраны при сборе ткани матрикса. Для этого следует избегать разрезания выстилки пуповины, или минимизировать его. В частности, физическое отделение стромального вартонова студня от выстилающей оболочки пуповины предпочтительно заключается в соскабливании вартонова студня, предпочтительно без механического рассекания выстилки пуповины, или с рассеканием выстилки пуповины лишь в минимальной степени. «Механическое рассекание» включает разрезание, сдавливание или иное нарушение целостности ткани за счет применения механического усилия. В предпочтительном варианте осуществления «минимальная степень» означает один единственный продольный разрез, предпочтительно по длине пуповины. За счет этого пуповина, или сегмент пуповины, в зависимости от обстоятельств, открывают в продольном направлении, обеспечивая доступ к внутренней части пуповины.
Необязательно, также не получают клетки из субамниотического слоя. Для достижения этого соскабливание выполняют с большой осторожностью, без применения лишних механических усилий вблизи выстилающей оболочки пуповины. В данном варианте осуществления нежелательной является вся выстилка пуповины (включающая амниотический слой и субамниотический мезенхимальный слой).
Во всяком случае, амниотический (эпителиальный) слой является нежелательным. Любой нежелательный материал выстилки пуповины, остающийся после механического удаления нужного стромального вартонова студня, отбрасывают.
Таким образом получают ткань стромального вартонова студня.
Исходя из полезных свойств клеток, выделенных по настоящему изобретению, авторы изобретения делают вывод, однако без связи с какой-либо конкретной теорией, что менее зрелые клетки с полезной способностью к пролиферации расположены относительно далеко от сосудов и, таким образом, ближе к амниотической поверхности, в то время как более дифференцированные клетки находятся ближе к сосудам пуповины. В заключение авторы изобретения выбрали стромальный вартонов студень в качестве исходной области для выделения клеток по настоящему изобретению.
В предпочтительном варианте осуществления этап (a) выделения стромального вартонова студня, или его части, из пуповины включает этап разделения на секции, описанный в настоящем документе, и этап измельчения, описанный ниже.
В более предпочтительном варианте осуществления этап (a) выделения стромального вартонова студня, или его части, из пуповины включает этап сегментирования, описанный выше, этап разделения на секции, описанный в настоящем документе, а также этап измельчения, описанный ниже.
Уменьшение размера фрагментов ткани путем механической обработки
Предпочтительно, стромальный вартонов студень, полученный путем разделения на секции, впоследствии подвергают механической обработке, целью которой является уменьшение размера фрагментов ткани. Механическая обработка направлена на разрушение физических связей в стромальном вартоновом студне, так что размер фрагментов стромального вартонова студня уменьшается. Механическая обработка полезна для последующей ферментативной обработки, описанной ниже. Относительно небольшие и относительно однородные размеры фрагментов стромального вартонова студня связаны с несколькими преимуществами: с увеличенной площадью поверхности и, таким образом, с доступностью материала для фермента(ов), используемого для ферментативной обработки, а также с возможностью нахождения тромбоцитарного лизата, который, как известно, содержит факторы роста и другие элементы, подходящие для МСК, в непосредственно близости к практически всему выделенному вартонову студню.
Предпочтительно, механическую обработку проводят путем тонкого измельчения фрагментов с помощью ножниц и/или скальпеля, однако можно использовать и любые другие средства, подходящие для механического измельчения фрагментов, при условии, что клетки практически на повреждаются или не разрушаются механически. Например, соответствующие инструменты доступны от компании Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Germany). Во всяком случае, механическую обработку предпочтительно проводят в стерильный условиях.
Механически обработанную (например, измельченную) ткань, необязательно, добавляют в водный раствор и диспергируют в нем для предотвращения высыхания указанной ткани. Водный раствор представляет собой водный раствор, в идеале, забуференный при, или примерно при, физиологическом значении pH, и изотонический, необязательно, с добавлением антибиотиков. Например, подходящим является HEPES-буферный солевой раствор (HBSS) или фосфатно-солевой буфер (PBS), предпочтительно HBSS. Необязательно, водный раствор содержит антибиотики в соответствующих концентрациях.
Предпочтительно, механически обработанную (например, измельченную) ткань впоследствии собирают (объединяют) в соответствующей стерильной чашке, такой как чашка Петри. После выделения ткани, и до ферментативного расщепления, которое будет описано ниже, общая масса измельченной ткани, получаемой в полномасштабном цикле, обычно составляет 14 грамм или более, например, 16 грамм или более, или 18 грамм или более.
Ферментативная обработка
В соответствии с настоящим изобретением клетки высвобождаются из пуповины, или ее сегментов, или ее секций, или полученной из нее измельченной ткани, путем ферментативной обработки. В отличие от более ранних учений (например, Conconi et al., 2011, Open Tissue Engineer. Regen. Med. J., vol. 4, p. 6-20), авторы настоящего изобретения обнаружили, что ферментативная обработка, особенно проводимая в условиях, описанных, как предпочтительные, в настоящем документе, то есть, мягких условиях, приводит к получению подходящих МСК, лишенных признаков повреждения клеток.
Вариант осуществления с измельчением ткани является предпочтительным. Таким образом, предпочтительно, клетки высвобождаются в результате ферментативной обработки из измельченной ткани, полученной из пуповины, или ее сегментов, или ее секций.
В частности, на этапе (b) способа по изобретению стромальный вартонов студень, или его часть, подвергают ферментативной обработке, с высвобождением за счет этого по меньшей мере одной клетки из стромального вартонова студня, или его части. Как правило, высвобождается множество клеток. Стромальный вартонов студень, или его часть, подвергают ферментативному расщеплению. В частности, клетки высвобождаются из стромального вартонова студня, который представляет собой специфическую секцию пуповины, и который может быть получен во время предшествующего этапа (a), описанного выше. Этап способа по настоящему изобретению, который включает ферментативную обработку, можно называть «ферментативной обработкой», «ферментативным расщеплением», или тому подобными терминами, или просто «этапом (b)».
Ферментативная обработка может происходить, необязательно, параллельно и/или последовательно с физическим выделением стромального вартонова студня из пуповины; однако последовательный вариант является более предпочтительным. Точнее, предпочтительно, если этап (b) способа по изобретению следует за этапом (a) способа по изобретению. В таком варианте осуществления этап (b) является единственным этапом в способе по настоящему изобретению, во время которого используют ферментативную активность.
Подход, используемый по настоящему изобретению, для высвобождения клеток из ткани пуповины, в частности, стромального вартонова студня, заметно отличается от подходов предшествующего уровня техники, в которых ткань пуповины культивируют как таковую, и клетки растут из культуры, например, в результате миграции из нее или деления клеток, или и того, и другого (US 2004/0136967 A1). Однако в соответствии с настоящим изобретением по меньшей мере одна клетка или, предпочтительно, большинство клеток, содержащихся в стромальном вартоновом студне, высвобождается/высвобождаются за счет ферментативной обработки, а не за счет миграции из пуповины или деления клеток. Это является значительным преимуществом с точки зрения времени выделения: вместо нескольких дней (например, 2004/0136967 A1), клетки могут быть выделены из пуповины в течение нескольких часов, как подробно описано ниже.
Ферментативная обработка представляет собой обработку, в результате которой клетки высвобождаются из пуповины, или ее сегментов, или ее секций при обработке по меньшей мере одним ферментом. Подходящим ферментом является протеаза. Таким образом, клетки предпочтительно высвобождаются из пуповины, или ее сегментов, при обработке по меньшей мере одной протеазой. Протеаза (также называемая пептидазой или протеиназой) представляет собой любой фермент, который осуществляет протеолиз; катаболизм белка путем гидролиза пептидных связей. Предпочтительно, протеаза способна расщеплять по меньшей мере один белок внеклеточного матрикса, предпочтительно коллаген. Наиболее предпочтительно, ферментативная обработка на этапе (b) представляет собой обработку, включающую воздействие фермента коллагеназы. Иными словами, по меньшей мере одна протеаза предпочтительно представляет собой коллагеназу. Также, необязательно, присутствуют и другие протеазы. В одном варианте осуществления не присутствует практически ни одна другая протеаза, кроме коллагеназы. «Практически ни одна другая протеаза» означает, что добавляемый препарат коллагеназы был очищен до максимально возможной разумной степени, и/или что активность других протеаз в препарате коллагеназы не может быть обнаружена обычными лабораторными методами.
Особенно подходящим и, таким образом, предпочтительным ферментом для экстрагирования клеток по настоящему изобретению является коллагеназа (EC 3.4.24.7). Термин «коллагеназа» относится к ферментативной активности, способной разрушать (более конкретно, гидролизовать) пептидные связи в белке внеклеточного матрикса коллагене. Коллаген присутствует в внеклеточном матриксе разных тканей, включая пуповину. Коллагеназа способствует разрушению внеклеточных структур. Доступна коллагеназа как эукариотического, так и прокариотического происхождения, хотя протеаза прокариотического происхождения, в частности, из бактерий, таких как Clostridium sp., является предпочтительной по настоящему изобретению. Коллагеназа может быть выделена из ее естественного источника, или получена рекомбинантными методами, например, в E. coli. В некоторых вариантах осуществления коллагеназа из ее естественного источника, например, Clostridium sp., является предпочтительной. Например, коллагеназа может быть получена из Clostridium histolyticum.
Если из контекста явно не следует иное, «коллагеназа» в настоящем документе означает ферментативную активность, в то время как «препарат коллагеназы» означает продукт, коммерческий или нет, который имеет активность коллагеназы. Активность коллагеназы обеспечивает фермент коллагеназа - чистый или нет - присутствующий в препарате коллагеназы.
Препараты коллагеназы коммерчески доступны. В некоторых вариантах осуществления используемый препарат коллагеназы является стерильным или категории GMP. Предпочтительно, препарат коллагеназы представляет собой препарат коллагеназы NB4 или препарат коллагеназы NB5, или препарат коллагеназы NB6, все от компании SERVA (Heidelberg, Germany), или любой другой препарат коллагеназы, эквивалентный любому из перечисленных. Эквивалентность можно определять при помощи метода, описанного в примере 2A, параллельно с препаратом коллагеназы NB4/NB6 и с препаратом коллагеназы, для которого предстоит определять эквивалентность, необязательно, в эксперименте титрования для определения эквивалентной активности расщепления коллагена.
Необязательно, используемый препарат коллагеназы не содержит какую-либо ферментативную активность, кроме активности коллагеназы. В частности, предпочтительно, если отсутствует какая-либо активность гиалуронидазы. В других вариантах осуществления активность гиалуронидазы присутствует. Ранее сообщалось, что сочетание коллагеназы с гиалуронидазой может иметь преимущества (например, Bailey et al., Tissue Eng., 2007, vol. 13, p. 2003-2010). Однако в экспериментальных примерах по настоящему изобретению удовлетворительные результаты были получены без добавления гиалуронидазы. Таким образом, по настоящему изобретению предпочтительно, если дополнительная активность гиалуронидазы отсутствует в процессе ферментативного расщепления.
В некоторых вариантах осуществления отсутствует активность какой-либо протеазы, кроме коллагеназы. В других вариантах осуществления присутствует активность одной или более протеаз, не являющихся коллагеназой. Другие протеазы могут представлять собой специфические протеазы или неспецифические протеазы, эндо- или экзопептидазы. Таким образом, необязательно, другие ферментативные активности, например, активности других протеаз, в частности, можно использовать в дополнение к коллагеназе. Такие другие ферментативные активности могут либо присутствовать в препарате коллагеназы, либо могут быть добавлены отдельно. Например, может присутствовать клострипаин (EC 3.4.22.8, также называемый клостридиопептидазой B, протеазой B Clostridium histolyticum, альфа-клостридипаином, клостридиопептидазой, эндопротеазой Arg-C), протеаза, которая расщепляет белки по карбоксильной пептидной связи аргинина, или эквивалентный фермент. В другом, не взаимоисключающем, примере может присутствовать казеиназа c (EC 3.4.24). В другом, не взаимоисключающем, варианте осуществления может присутствовать трипсин (EC 3.4.21.4), сериновая протеаза.
Необязательно, используемый препарат коллагеназы не имеет никакой ферментативной активности, кроме протеолитической активности, то есть, активности коллагеназы и протеолитической активности, отличной от активности коллагеназы. Однако в одном варианте осуществления ферментативную обработку проводят также в присутствии гиалуронидазы, но присутствие гиалуронидазы является необязательным.
Соответственно, готовят водный раствор, содержащий воду, фермент для расщепления, то есть, протеазу, более конкретно, коллагеназу, и, необязательно, но предпочтительно, буферное средство. Буферное средство обеспечивает поддержание значения pH в нужном диапазоне pH. Можно использовать любое буферное средство, которое подходит для поддержания значения pH в нужном диапазоне.
Водный раствор, содержащий фермент, буферное средство и воду, а также, необязательно, дополнительные ингредиенты, называют расщепляющим буфером. В некоторых вариантах осуществления расщепляющий буфер не содержит хелатирующее металл средство, такое как ЭДТА или ЭГТА.
Предпочтительно, расщепляющий буфер имеет значение pH 6,0-9,0, более предпочтительно 7,0-8,0. Это значение не только близко к физиологическому значению pH, но также было описано, что соответствующие ферменты имеют оптимум pH в диапазоне от pH 7,0 до pH 8,0. Таким образом, расщепление предпочтительно проводят в данном диапазоне pH. Значение pH предпочтительно определять при температуре, при которой будет происходить расщепление.
Необязательно, в расщепляющем буфере присутствуют ионы кальция; например, водорастворимую соль кальция, такую как хлорид кальция, можно добавлять в процессе приготовления расщепляющего буфера. Например, когда ферментативная обработка представляет собой обработку коллагеназой, присутствие ионов кальция является полезным и, следовательно, предпочтительным.
Необязательно, в расщепляющем буфере присутствует гепарин. Известно, что гепарин является подходящей добавкой для содержащих тромбоцитарный лизат жидких композиций во избежание закупорки (например, Lohmann et al., 2012, PLoS ONE, vol. 7e37839). Подходящими концентрациями гепарина в расщепляющем буфере по настоящему изобретению являются 0,1-100 Ед/мл, например, 1-10 Ед/мл, например, 2 Ед/мл гепарина. Количество мл относится к общему объему расщепляющего буфера. Одна единица гепарина («единица Хауэлла») представляет собой количество, примерно эквивалентное 0,002 мг чистого гепарина, которое представляет собой количество, необходимое для поддержания 1 мл кошачьей крови в жидком состоянии в течение 24 часов при 0°C («Online Medical Dictionary», 2000, Centre for Cancer Education).
Для начала расщепления расщепляющий буфер добавляют к расщепляемой ткани - или наоборот. Важно смешать содержащий фермент водный раствор, то есть, расщепляющий буфер, и ткань. Предпочтительно, смесь расщепляющего буфера и ткани сразу же осторожно встряхивают для гарантии надлежащего смешивания. При добавлении буфера начинается ферментативная обработка.
Предпочтительно, ранее выделенную ткань из стромального вартонова студня и расщепляющий буфер смешивают в определенном соотношении. Это связано, в частности, с преимуществами воспроизводимости способа и расщепления в мягких условиях, при необходимости.
Соотношение=X мг ткани/1 мл расщепляющего буфера
Поскольку измельченную ткань непосредственно перед смешиванием с расщепляющим буфером, необязательно, хранят в буферном солевом растворе (предпочтительно HEPES-буферном солевом растворе, HBSS) для предотвращения высыхания ткани, конкретное соотношение в данном варианте осуществления определяют следующим образом:
Соотношение=X мг (ткань+буферный солевой раствор) / 1 мл расщепляющего буфера
(«Солевой буферный раствор» не следует путать с «расщепляющим буфером». «Солевой буферный раствор», как правило, не содержит расщепляющий фермент, в частности, не содержит коллагеназу.)
В обеих приведенных выше формулах X предпочтительно находится в диапазоне 10-1000, предпочтительно 50-500, более предпочтительно 80-200, и наиболее предпочтительно практически 100. Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления 100 мг измельченной ткани/HBSS смешивают с 1 мл расщепляющего буфера.
Если не указано иначе, обработку коллагеназой, как правило, проводят при температуре 35-39°C, более предпочтительно 36-38°C, и наиболее предпочтительно при температуре примерно 37°C. Таким образом, предпочтительно, ферментативное расщепление проводят при температуре 35-39°C, например, 38-38°C, предпочтительно 37°C. Ткань из пуповины, описанную в настоящем документе, подвергают обработке коллагеназой в течение определенного временного интервала (продолжительность). Подходящие временные интервалы описаны в настоящем документе.
Предпочтительно, ферментативное расщепление проводят при перемешивании. Например, установлено, что постоянное осторожное перемешивание при примерно 50-100 об/мин, например, на орбитальном шейкере, подходит для расщепления.
В наиболее предпочтительном варианте осуществления расщепление протеазой проводят в мягких условиях. Авторы настоящего изобретения с удивлением обнаружили, что в одном варианте осуществления подходящим временем расщепления является 1 час. В более общем смысле, в отличие от результатов нескольких более ранних исследований, относительно мягкие условия подходят для расщепления в способе по настоящему изобретению. В числе более ранних исследований для иллюстративных целей можно упомянуть WO 2004/072273 A и Sarugaser et al., 2005, Stem Cells, vol. 23, p. 220-229: в соответствии с WO 2004/072273 A, рекомендуется использовать коллагеназу неуточненного происхождения и концентрации, например, в концентрации 0,1 мг/мл или 1 мг/мл; рекомендованное время расщепления коллагеназой составляет 12-36 часов, например, примерно 24 часа; в соответствии с Sarugaser et al. (выше), используют 1 мг/мл коллагеназы от Sigma, C-0130); время расщепления коллагеназой составляет 18-24 часа. Таким образом, мягкие условия, используемые в контексте настоящего изобретения, отличаются от условий, описанных в более ранних литературных источниках.
Используемый в настоящем документе термин «мягкие условия», или «щадящие условия», означает, что по меньшей мере любые два, но наиболее предпочтительно все три из следующих условий: (1) время расщепления, (2) ферментативная активность и (3) тромбоцитарный лизат являются такими, как описано ниже. Ферментативная активность, безусловно, связана с типом используемого фермента и количеством используемого фермента относительно объема, в котором его используют (концентрация фермента), или относительно количества ткани, подвергаемой расщеплению.
Если из контекста явно не следует иное, все варианты осуществления (1) времени расщепления, (2) ферментативной активности и (3) тромбоцитарного лизата могут быть скомбинированы друг с другом. Таким образом, в целом, факторы, определяющие мягкие условия: короткое время расщепления ферментом, низкая концентрация фермента и присутствие чТЛ.
В одном варианте осуществления короткое время расщепления ферментом, описанное ниже, комбинируют с низкой ферментативной активностью, описанной ниже. Предпочтительные варианты осуществления короткого времени расщепления ферментом, описанные ниже, также можно комбинировать с предпочтительными вариантами осуществления низкой ферментативной активности, описанными ниже.
В одном варианте осуществления короткое время расщепления ферментом, описанное ниже, комбинируют с присутствием тромбоцитарного лизата, описанного ниже. Предпочтительные варианты осуществления короткого времени расщепления ферментом, описанные ниже, также можно комбинировать с предпочтительными вариантами осуществления тромбоцитарного лизата, описанными ниже.
В одном варианте осуществления низкую ферментативную активность, описанную ниже, комбинируют с присутствием тромбоцитарного лизата, описанного ниже. Предпочтительные варианты осуществления низкой ферментативной активности, описанные ниже, также можно комбинировать с предпочтительными вариантами осуществления тромбоцитарного лизата, описанными ниже.
В особенно предпочтительном варианте осуществления короткое время расщепления ферментом, описанное ниже, комбинируют с низкой ферментативной активностью, описанной ниже, и также с присутствием тромбоцитарного лизата, описанного ниже. Предпочтительные варианты осуществления короткого времени расщепления ферментом, описанные ниже, предпочтительные варианты осуществления низкой ферментативной активности, описанные ниже, и предпочтительные варианты осуществления тромбоцитарного лизата, описанные ниже, также можно комбинировать друг с другом. Данный вариант осуществления реализован в примере 2A.
Вариации конкретных значений (1) времени расщепления, указанного в настоящем документе, (2) ферментативной активности, указанной в настоящем документе, и (3) тромбоцитарного лизата, указанного в настоящем документе, также возможны без отклонения от объема настоящего изобретения. Например, можно уменьшать время расщепления, указанное в настоящем документе, например, на 50%, совместно с увеличением ферментативной активности, указанной в настоящем документе, например, на 50%. Квалифицированный специалист может предвидеть и использовать на практике такие вариации, исходя из собственного опыта и на основании общих принципов ферментативной кинетики, согласно которым более низкая ферментативная активность может все еще быть достаточной для расщепления конкретного количества субстрата при соответствующем увеличении времени расщепления, и наоборот. Например, можно увеличивать время расщепления, указанное в настоящем документе, например, на 50%, совместно с уменьшением ферментативной активности, указанной в настоящем документе, например, на 50%. Соответствующие измененные условия все еще могут быть названы мягкими условиями. Коллагеназа обычно не является аутокаталитической; таким образом, вариации возможны, как правило, без вызывания уменьшения количества коллагеназы в дополнительное время расщепления.
За счет применения мягких условий можно в значительной степени избегать серьезных повреждений выделяемых МСК. Мягкие условия позволяют получать намного большую пропорциональную долю жизнеспособных клеток, чем в используемых ранее способах.
Хотя способ по настоящему изобретению в типичных вариантах осуществления приводит к получению более низкого общего количества клеток, чем эталонный способ (смотри фигуру 4B и 4C), клетки, выделенные способом по изобретению, в типичных вариантах осуществления характеризуются низким процентным содержанием апоптотических клеток (смотри фигуру 4B и 4D). Это является преимуществом, например, для необязательного размножения, которое будет описано ниже.
(1) Авторы настоящего изобретения обнаружили, что короткое время ферментативного расщепления является предпочтительным в способе по изобретению. В одном из примеров, как исходно было установлено авторами настоящего изобретения, короткое время ферментативного расщепления составляет 1 час. На основании этого, в общих чертах, в предпочтительном варианте осуществления этап (b) проводят в общей сложности в течение менее 5 часов, более предпочтительно менее 4 часов и наиболее предпочтительно менее 3 часов. Срок менее 3 часов включает временные интервалы от 0,5 до 2,5 часов и от 1 до 2 часов, а также любой временной интервал с верхним пределом менее 3 часов, например, 2,5 часа, 2,6 часа, 2,7 часа, 2,8 часа, 2,9 часа и 2,95 часа. Все такие временные интервалы могут быть названы «быстрыми» или «короткими», хотя «быстрые» и «короткие» также являются относительными терминами, например, срок 2 часа, безусловно, проходит быстрее/является короче, чем 4 часа. Быстрое проведение ферментативной обработки позволяет избегать проблем с обезвоживанием и других возможных проблем, связанных с воздействием на клетки неестественной среды в течение длительных периодов времени; быстрое проведение ферментативной обработки также позволяет преодолевать сложности, описанные в публикации Seshareddy et al. (2008, Meth. Cell Biol., vol. 86, p. 101-119).
Было высказано предположение, что короткие временные интервалы ферментативной обработки могут иметь преимущества, в частности, в случае совместного расщепления гиалуронидазой и коллагеназой (Can et al., Stem Cells, 25:2886-2895, 2007). Несколько удивительно, но в настоящем изобретении короткое время обработки также имеет преимущества в отсутствие гиалуронидазы. Это замечательно в двух отношениях: во-первых, в отсутствие гиалуронидазы можно обычно не ожидать какого-либо нежелательного эффекта гиалуронидазы, такого как обширное нежелательное расщепление направленных в сторону внеклеточного окружения клеточных поверхностей; во-вторых, без связи с конкретной теорией, понятно, что коллагеназа действует только на внеклеточный матрикс, а не на сами нужные клетки. Тем не менее, преимущества мягкой обработки, включая короткую продолжительность обработки, для жизнеспособности клеток являются весьма заметными. В одном варианте осуществления ферментативное расщепление представляет собой ферментативное расщепление в мягких условиях без добавления гиалуронидазы. В одном варианте осуществления ферментативное расщепление представляет собой ферментативное расщепление в мягких условиях в отсутствие гиалуронидазы. В предпочтительном варианте осуществления этап (b) проводят в общей сложности в течение менее 5 часов, более предпочтительно менее 4 часов и наиболее предпочтительно менее 3 часов, и без добавления гиалуронидазы, или предпочтительно в отсутствие гиалуронидазы.
В идеале, оба этапа (a) и (b) проводят быстро. Таким образом, клетки из пуповины могут быть получены за короткое время. Это имеет преимущество перед некоторыми более ранними исследованиями, в которых были использованы либо длительные временные интервалы для ферментативного расщепления ткани пуповины, либо рост клеток из ткани пуповины, или и то, и другое. В предпочтительном варианте осуществления этапы (a) и (b) в совокупности проводят в общей сложности в течение менее 6 часов, более предпочтительно менее 5 часов, более предпочтительно менее 4 часов и наиболее предпочтительно менее 3 часов. Срок менее 3 часов включает временные интервалы от 0,5 до 2,5 часов и от 1 до 2 часов, а также любой временной интервал с верхним пределом менее 3 часов, например, 2,5 часа, 2,6 часа, 2,7 часа, 2,8 часа, 2,9 часа и 2,95 часа. Очевидно, что короткая совместная продолжительность этапов (a) и (b) также означает, что сам по себе этап (b) является коротким. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что в одном варианте осуществления время расщепления, составляющее примерно 1 час, является предпочтительным.
(2) Авторы изобретения также установили, что степень ферментативной активности имеет значение. Ферментативная активность, безусловно, связана с типом используемого фермента и количеством используемого фермента относительно объема, в котором его используют (концентрация фермента), или относительно количества ткани, подвергаемой расщеплению.
В частности, авторы изобретения показали, что степень активности коллагеназы имеет значение. Для целей описания настоящего изобретения активность коллагеназы указана в единицах Вунша. 1 единица (Ед) по Вуншу (единица Вунша, или единица PZ) катализирует гидролиз 1 мкмоля 4-фенилазобензилоксикарбонил-L-пролил-L-лейцилглицил-L-пролил-D-аргинина в минуту при 25°C, pH 7,1 (Wünsch et al., 1963, Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 333, 149-51).
Способ по настоящему изобретению, как правило, отличается относительно низкой активностью коллагеназы на этапе ферментативной обработки (b). В настоящем документе указанная степень активности коллагеназы указана для временной точки, в которой добавляют коллагеназу. Например, если коллагеназа теряет активность с течением времени на этапе (b), коллагеназу дополнительно не добавляют. Однако коллагеназа обычно не расщепляет саму себя и, таким образом, является относительно стабильной, и можно обоснованно предполагать, что после добавления коллагеназа присутствует в течение всего этапа ферментативной обработки (b).
Активность коллагеназы удобно указывать относительно общего объема расщепляющего буфера. В одном варианте осуществления расщепляющий буфер содержит коллагеназу с удельной активностью от 0,01 Ед Вунша/мл до 10 Ед Вунша/мл, предпочтительно от 0,05 Ед Вунша/мл до 5 Ед Вунша/мл, предпочтительно от 0,1 Ед Вунша/мл до 1 Ед Вунша/мл, предпочтительно от 0,15 Ед Вунша/мл до 0,5 Ед Вунша/мл, предпочтительно, например, примерно 0,1 Ед Вунша/мл или примерно 0,2 Ед Вунша/мл. В одном варианте осуществления нижний предел активности коллагеназы конкретно не определен при условии, что добавленная активность коллагеназы является достаточной для высвобождения мезенхимальных стромальных клеток из ткани в течение 5 часов или менее. В этом и других вариантах осуществления верхний предел активности коллагеназы может быть определен, как не более 0,5 Ед Вунша/мл, более предпочтительно не более 0,25 Ед Вунша/мл и конкретно 0,18 Ед Вунша/мл или 0,09 Ед Вунша/мл.
В предпочтительном варианте осуществления коллагеназа присутствует во время этапа ферментативной обработки (b) с удельной активностью не более 0,5 Ед Вунша/мл, более предпочтительно не более 0,25 Ед Вунша/мл и конкретно 0,18 Ед Вунша/мл относительно расщепляющего буфера. Даже более предпочтительно, используемая активность коллагеназы на этапе (b) способа по настоящему изобретению находится в диапазоне 0,18-0,09 Ед Вунша/мл расщепляющего буфера (смотри также пример 1). Эта активность отличается от активности коллагеназы, используемой в соответствии с WO 2004/072273 A и Sarugaser et al., 2005, Stem Cells, vol. 23, p. 220-229. Действительно, в одном варианте осуществления активность коллагеназы на этапе (b) способа по настоящему изобретению можно определять, как более низкую, чем активность коллагеназы, описанная в WO 2004/072273 A и Sarugaser et al. (выше).
Альтернативно, активность коллагеназы удобно указывать относительно массы расщепляемой ткани. (Массу указанной ткани можно соответствующим образом определять путем взвешивания контейнера, в котором она находится, до и после добавления в него указанной ткани). Указанная ткань, необязательно содержащаяся в контейнере, необязательно включает буферный солевой раствор (например, HBSS). В одном варианте осуществления подходящее соотношение находится в диапазоне 0,01-10 Ед Вунша коллагеназы/100 мг ткани, предпочтительно 0,05-5 Ед Вунша коллагеназы/100 мг ткани, предпочтительно 0,1-1 Ед Вунша коллагеназы/100 мг ткани, предпочтительно 0,15-0,5 Ед Вунша коллагеназы/100 мг ткани, предпочтительно, например, примерно 0,1 Ед Вунша коллагеназы/100 мг ткани или примерно 0,2 Ед Вунша коллагеназы/100 мг ткани. В одном варианте осуществления нижний предел активности коллагеназы конкретно не определен при условии, что добавленная активность коллагеназы является достаточной для высвобождения мезенхимальных стромальных клеток из ткани в течение 5 часов или менее. В этом и других вариантах осуществления верхний предел активности коллагеназы может быть определен, как не более 0,5 Ед Вунша коллагеназы/100 мг ткани, более предпочтительно не более 0,25 Ед Вунша коллагеназы/100 мг ткани и конкретно примерно 0,16 Ед Вунша коллагеназы/100 мг ткани или примерно 0,08 Ед Вунша коллагеназы/100 мг ткани, или любое значение в предпочтительном диапазоне. По настоящему изобретению предпочтительно, если соотношение активности коллагеназы и общей массы ткани является более низким, чем для активности коллагеназы, описанной в WO 2004/072273 A и Sarugaser et al., 2005, Stem Cells, vol. 23, p. 220-229.
1
(3) Авторы изобретения дополнительно установили, что присутствие тромбоцитарного лизата в процессе ферментативного расщепления имеет преимущества. Это явилось удивительным открытием авторов изобретения. В данной области существует определенное предубеждение, что коллагеназа не действует надлежащим образом в присутствии тромбоцитарного лизата. Например, ранее было описано, что коллагенолитическая активность ингибируется нормальной человеческой плазмой из-за таких ингибиторов, как α-антитрипсин (Chesney et al., J. Clin. Invest., 1974, vol. 53, p. 1647-1654). Однако авторы изобретения обнаружили, что расщепление коллагеназой является эффективным даже в присутствии тромбоцитарного лизата. Фактически, расщепление коллагеназой является эффективным даже при очень низких количествах коллагеназы, предпочтительных по настоящему изобретению (смотри выше). Таким образом, предпочтительно, тромбоцитарный лизат присутствует в процессе ферментативной обработки. Тромбоцитарный лизат может быть получен из коммерческих источников или приготовлен самостоятельно. Во многих больницах, банках крови и исследовательских институтах имеются разработанные протоколы для изготовления тромбоцитарного лизата, и такие лизаты, как правило, являются подходящими в контексте изобретения. Например, лизат может быть получен методом замораживания/размораживания. Такие лизаты можно получать путем замораживания суспензии тромбоцитов, с последующим размораживанием материала, хотя и другие режимы замораживания/размораживания также являются подходящими при условии, что они приводят к цитолизу тромбоцитов. При использовании замораживания/размораживания этот метод вызывает набухание и разрушение клеток, предположительно, вследствие образования кристаллов льда, с последующим сокращением при размораживании. Таким образом, циклическое набухание и сокращение в итоге вызывает разрыв клеток. Может быть предпочтительным использование нескольких циклов для более полного цитолиза, однако «более полный» цитолиз не обязательно нужен. Может иметь место различная степень цитолиза тромбоцитов, например, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 90%, или вплоть до 100% цитолиза, по количеству тромбоцитов. Необязательно, нелизированный материал и другой детрит удаляют из тромбоцитарного лизата перед использованием.
Предпочтительно, тромбоцитарный лизат содержит лизированные тромбоциты млекопитающего и, необязательно, плазму млекопитающего. Во втором случае тромбоцитарный лизат представляет собой композицию, содержащую тромбоцитарный лизат и плазму. Причины, по которым может содержаться плазма, включают варианты осуществления, в которых тромбоциты не были полностью отделены от плазмы до проведения их лизиса, и/или в которых тромбоциты были (ре)суспендированы в плазме перед проведением их лизиса. Предпочтительно, концентрация плазмы млекопитающего в композиции составляет менее примерно 30%, менее примерно 20% или менее примерно 10% от общего объема. Предпочтительно, концентрация плазмы млекопитающего в тромбоцитарном лизате составляет от примерно 0% до примерно 10%, например, от примерно 1% до примерно 10%. Необязательно, тромбоцитарный лизат содержит концентрированные тромбоциты. Предпочтительно, тромбоцитарный лизат млекопитающего представляет собой человеческий тромбоцитарный лизат. Предпочтительно, тромбоцитарный лизат практически не содержит мембраны тромбоцитов млекопитающего.
Тромбоцитарный лизат может быть получен от одного донора или может представлять собой лизат объединенных донорских тромбоцитов, выделенных из цельной крови или путем афереза. Предпочтительно, аферез основан на разделении веществ, имеющих разную плотность, например, центрифугированием, и/или аферез включает адсорбцию на гранулах, покрытых адсорбирующим материалом, и фильтрование.
8
9
8
9
8
Необязательно, тромбоцитарный лизат, используемый по настоящему изобретению, может быть получен путем лизиса содержащей тромбоциты суспензии, при этом тромбоциты, необязательно, суспендированы в плазме. Указанная содержащая тромбоциты суспензия предпочтительно содержит от 1×10 тромбоцитов/мл до 5×10 тромбоцитов/мл, предпочтительно от 3,8×10 тромбоцитов/мл до 1,2×10 тромбоцитов/мл, в среднем примерно 7,9×10 тромбоцитов/мл.
Также предусмотрено, что присутствие тромбоцитарного лизата вносит определенный вклад в мягкость условий ферментативного расщепления. Удивительно, но авторы изобретения обнаружили, что присутствие тромбоцитарного лизата не оказывает отрицательное действие на расщепление клеток (для иллюстрации смотри примеры 2A и 3), хотя ранее сообщалось, что тромбоцитарный лизат отрицательно влияет на активность некоторых ферментов, включая протеазы. Таким образом, важным краеугольным камнем способа по настоящему изобретению является то, что ферментативная обработка, точнее, расщепление коллагеназой, может происходить в присутствии тромбоцитарного лизата.
Предпочтительно, тромбоцитарный лизат присутствует в процессе ферментативного расщепления в процентном объеме от 0,01% до 30%, например, от 0,05% до 20%, предпочтительно от 0,1% до 10%, более предпочтительно от 0,5% до 5%, более предпочтительно от 0,8% до 2% и наиболее предпочтительно примерно 1%. «Процентный объем» означает общий объем тромбоцитарного лизата, присутствующий в общем объеме расщепляющего буфера.
Авторы изобретения обнаружили, что присутствие тромбоцитарного лизата, или его производных, в процессе ферментативного расщепления, в частности, в указанном выше соотношении, является полезным.
Термин «тромбоцитарный лизат» при использовании в настоящем документе охватывает как тромбоцитарный лизат, непосредственно получаемый путем лизиса тромбоцитов, так и его производные, такие как инактивированный нагреванием тромбоцитарный лизат, стерилизованный фильтрованием тромбоцитарный лизат и так далее. В некоторых случаях использование производных может быть необходимым или рекомендуемым, например, с учетом нормативных соображений. В более предпочтительном варианте осуществления тромбоцитарный лизат практически не содержит загрязняющие вещества. Тромбоцитарный лизат, практически не содержащий загрязняющие вещества, определяют в настоящем документе как стерильный препарат тромбоцитов, практически не содержащий инфекционные агенты, такие как вирусы (инкапсулированные и не инкапсулированные), паразиты, бактерии и эндотоксины, то есть, тромбоцитарный лизат, содержащий такие инфекционные агенты в количестве, которое не поддается обнаружению при помощи культуральных, серологических или молекулярных систем идентификации, или при помощи теста LAL (эндотоксины). Настоятельно рекомендуется использовать инактивированный в отношении патогенов тромбоцитарный лизат (PI-PL), смотри, например, WO 2013/042095 A1 и Iudicone et al., 2014, J. Transl. Med., 12: 28.
Существуют несколько преимуществ, связанных с присутствием тромбоцитарного лизата в процессе ферментативной обработки, которые были неожиданными, и которые описаны далее.
Во-первых, авторы изобретения обнаружили, что присутствие человеческого тромбоцитарного лизата не приводит к блокированию ферментативной активности фермента коллагеназы, по меньшей мере не до такой степени, которая будет препятствовать желаемому ферментативному высвобождению клеток из стромального матрикса.
Во-вторых, авторы изобретения обнаружили, что клетки, получаемые путем расщепления в присутствии тромбоцитарного лизата, или его производных, отличаются превосходной жизнеспособностью (смотри, например, фигуру 4A).
В-третьих, авторы изобретения обнаружили, что клетки, получаемые путем расщепления в присутствии тромбоцитарного лизата, или его производных, в способе по настоящему изобретению, имеют превосходные пролиферативные свойства. Таким образом, предпочтительно, на этапе (b) стромальный вартонов студень, или его часть, подвергают ферментативной обработке в присутствии тромбоцитарного лизата млекопитающих (ТЛ), или его производных, более предпочтительно, человеческого тромбоцитарного лизата (чТЛ), или его производных.
При том, что тромбоциты содержат биоактивные молекулы и факторы роста, такие как факторы свертывания крови, молекулы адгезии и протеогликаны, основной фактор роста фибробластов (bFGF), эпидермальный фактор роста (EGF), HGF, фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), инсулиноподобный фактор роста 1 (IGF-1), TGF-β1 и другие, также известно, что они содержат ингибиторы протеаз (Astori et al., Stem Cell. Res. Ther., 2016, vol. 7, 93). С учетом этой информации, вывод о том, что тромбоцитарный лизат может соответствующим образом присутствовать в процессе ферментативной обработки, является удивительным.
В целом, определенные условия экстракции, которые отличаются от протоколов предшествующего уровня техники для расщепления коллагеназой, как показано, могут являться полезными для жизнеспособности клеток и извлечения клеток, и, таким образом, обеспечивают на удивление успешный способ выделения. В частности, способом выделения по настоящему изобретению можно получать клетки с более высоким выходом, чем способом, описанным в публикации Seshareddy et al. (2008, Meth. Cell Biol., vol. 86, p. 101-119). Более конкретно, в соответствии с настоящим изобретением можно добиваться выхода клеток, который в 10-25 раз выше, чем выход клеток, описанный в публикации Seshareddy et al. (выше). Благодаря превосходной жизнеспособности клеток, выделенных по настоящему изобретению, клетки могут быть эффективно размножены in vitro, при необходимости.
Предпочтительно, только один этап расщепления коллагеназой проводят в способе по настоящему изобретению. Это означает, что ткань, полученную из пуповины, как описано в настоящем документе, подвергают обработке коллагеназой в течение определенного периода времени, и после завершения этого периода времени клетки, физически выделенные или открепленные от ткани, извлекают, однако оставшуюся ткань не подвергают одному или более дополнительным раундам расщепления коллагеназой. Скорее, ее предпочтительно отбрасывают после завершения периода времени и извлечения клеток.
В конце периода расщепления смесь для расщепления можно разбавлять содержащим белок раствором, таким как минимальная среда с добавлением тромбоцитарного лизата. Момент добавления содержащего белок раствора определяет окончание времени расщепления. Тип минимальной среды не имеет конкретных ограничений при условии, что среда подходит для культивирования клеток млекопитающих, предпочтительно, однако, мезенхимальных стволовых клеток и/или мезенхимальных стромальных клеток. Содержащий белок раствор предпочтительно содержит гепарин.
Предпочтительной минимальной средой является MSCBM CD (минимальная среда с определенным химическим составом для мезенхимальных клеток, Lonza), и предпочтительной добавкой является 5% (об/об) человеческий тромбоцитарный лизат (чТЛ).
Считается, что добавление содержащего белок раствора, такого как человеческий тромбоцитарный лизат, приводит к ингибированию ферментативной активности. Без связи с данной конкретной теорией, добавление также приводит к разбавлению фермента. Предпочтительно, добавляют по меньшей мере 1 объем содержащего белок раствора относительно объема смеси для расщепления. Содержащий белок раствор, безусловно, должен представлять собой раствор, который подходит для целей культивирования клеток, то есть, иллюстративно, он должен быть стерильным, необязательно, категории GMP и так далее.
Предпочтительно, жидкость, содержащую ткань, подвергнутую расщеплению (жидкость после расщепления), впоследствии подвергают разделению. Используемый в настоящем документе термин «разделение» применительно к указанной жидкости после расщепления не имеет конкретных ограничений и, в целом, означает, что клетки могут быть отделены от нерасщепленной ткани, не полностью расщепленной ткани и другого детрита, соответствующими методами, включая фильтрование и центрифугирование. В одном варианте осуществления указанную жидкость после расщепления фильтруют для отделения высвобожденных клеток от нерасщепленной ткани, не полностью расщепленной ткани и другого детрита, например, путем фильтрования, например, фильтрования через 120-мкм сетку или фильтрования через марлю, как описано ранее (например, Del Bue at al., 2007, Veterin. Res. Comm, vol. 31, p. 289-292). Например, подходящим является размер пор фильтра (ячеек сети), составляющий 50-150 мкм, например, 70-100 мкм. Необязательно, материалом фильтра является марля; можно использовать несколько слоев марли. Таким образом, предпочтительно, жидкость, содержащую ткань, подвергнутую расщеплению, фильтруют через марлю. Фильтрат называют «расщепленной смесью». Другим подходящим методом разделения является низкоскоростное центрифугирование; в этом случае клетки остаются в супернатанте, в то время как нерасщепленная ткань, не полностью расщепленная ткань и другой детрит оседают на дно; в этом случае супернатант называют «расщепленной смесью». Необязательно, фильтрование и низкоскоростное центрифугирование можно комбинировать в любом порядке. Альтернативно, разделение осуществляют либо только фильтрованием, либо только низкоскоростным центрифугированием, при этом предпочтительным является только фильтрование.
Предпочтительно, расщепленную смесь впоследствии центрифугируют, предпочтительно после фильтрования. Квалифицированный специалист может корректировать условия центрифугирования для достижения условий, подходящих для осаждения мезенхимальных стромальных клеток без отрицательного влияния на их пролиферативные свойства и жизнеспособность. Например, расщепленную смесь можно центрифугировать при 680 x g в течение 15 минут с использованием 250-мл центрифужных пробирок. По окончании центрифугирования супернатант удаляют, и осадок, содержащий нужные клетки, ресуспендируют. В идеале, в вариантах осуществления, в которых способ по настоящему изобретению включает один или более этапов размножения, осадок клеток ресуспендируют в той же ростовой среде, которую используют на (первом) этапе размножения. Размножение по настоящему изобретению будет описано более подробно далее.
Обычно расщепленная смесь содержит множество клеток, то есть, клеточную популяцию. Предпочтительно, клеточную популяцию, полученную путем ферментативной обработки, описанной в настоящем документе, используют непосредственно в таком виде, в каком она получена, то есть, без какой-либо отрицательной селекции (избирательного уничтожения нежелательных клеток). Надлежащее, но не обязательное, использование заключается в размножении клеток, которое описано ниже.
Иллюстративный пример способа выделения приведен в примере 2A. Как показано в примере 3, использование тромбоцитарного лизата не влияет отрицательно на активность коллагеназы, обеспечивающую высвобождение клеток, и на их жизнеспособность. Это является удивительным фактом, поскольку ранее сообщалось, что тромбоцитарный лизат отрицательно влияет на активность некоторых ферментов, включая протеазы.
Ферментативную обработку предпочтительно проводят в стерильных условиях.
Выделение отдельной клетки, при необходимости, можно осуществлять, например, путем серийного разведения. Таким образом можно получать выделенную отдельную клетку. Серийное разведение является необязательным этапом после этапа (b); однако получение одиночной выделенной клетки не является основной целью изобретения; скорее, предпочтительно, если за этапом (b) следует этап (c) размножения клетки(клеток), как описано далее.
Размножение
Клетки, полученные при выделении, в частности, на этапах (a) и (b) способа по изобретению, можно размножать (то есть, проводить размножение). Клетки размножают ex vivo. Размножение ex vivo позволяет квалифицированному специалисту выбирать определенные условия культивирования. Они описаны далее.
Целью размножения является увеличение количества клеток, выделенных ранее, которые имеют полезные свойства. Как принято в данной области, размножение происходит в среде для культивирования. Если специально не указано иначе, условия, подходящие для размножения, включают условия, как правило, известные для культивирования клеток млекопитающих, более конкретно, для размножения клеток млекопитающих.
Размножение представляет собой период процесса культивирования/продуцирования клеток, который в основном характеризуется высокой степенью роста и высокой митотической активностью. В соответствии с настоящим изобретением размножение служит, в частности, целям увеличения количества клеток, что означает получение повышенного количества клеток, которые предпочтительно являются митотически активными, и более предпочтительно, в экспоненциальной фазе роста. За счет размножения могут быть получены более крупные клеточные популяции. Этап размножения клеток по настоящему изобретению может представлять собой один этап, на котором клеткам дают возможность пролиферировать в соответствующих условиях: однако более предпочтительно, размножение по настоящему изобретению включает несколько пассажей, как дополнительно описано ниже.
Размножение, как правило, проводят в стерильных условиях, и как правило, также в условиях, необходимых или полезных, или рекомендованных для культивирования клеток млекопитающих.
Данный вариант осуществления изобретения основан на том факте, что конкретная секция вартонова студня, то есть, стромальный вартонов студень, содержит клетки, которые могут быть выделены эффективно и надежно, и впоследствии размножены эффективно и надежно. Таким образом, после выделения клеток их популяцию размножают за счет митоза.
Таким образом, необязательно и в самом общем смысле, способ по настоящему изобретению включает один или более дополнительных этапов. В частности, в предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения включен этап увеличения количества клеток, с использованием способности к делению у клеток, полученных на этапе (b). В таких предпочтительных вариантах осуществления за этапом (b) следует этап (c); этап (c) включает размножение по меньшей мере одной клетки, полученной на этапе (b). Этап (c) в настоящем документе также называют «этапом размножения» или просто «размножением».
Условия для размножения выбирают так, чтобы они были подходящими для ex vivo роста и клеточного деления мезенхимальных стромальных клеток. Таким образом получают культуру, обогащенную мезенхимальными стромальными клетками. Без связи с конкретной теорией, можно предвидеть, что, или условия культивирования способствуют выбору конкретного подмножества выделенных клеток, тем самым их обогащению, или же клетки изменяют свой фенотип.
Размножение по настоящему изобретению с выделением по изобретению приводят к синергичным результатам, как описано далее: хотя общее количество клеток, выделенных в предпочтительных мягких условиях по настоящему изобретению, может быть (и, как правило, является) ниже, чем общее количество клеток, экстрагируемых способом, предложенным в US 2004 0136967 A1 и Seshareddy et al., Meth. Cell Biol., 86:101-119, 2008, авторы изобретения обнаружили, что клетки, выделенные в предпочтительных мягких условиях по настоящему изобретению, являются особенно подходящими для размножения, например, ввиду их высокой жизнеспособности (для иллюстрации смотри фигуру 4B), а также ввиду их высокого пролиферативного потенциала (для иллюстрации смотри фигуру 9), и, таким образом, большие количества клеток могут быть получены путем размножения происходящих из СВС клеток, выделенных в соответствии с настоящим изобретением. Иными словами, предпочтительный способ выделения по настоящему изобретению совместно с размножением по настоящему изобретению обладают синергетическим преимуществом, заключающемся в том, что меньшее количество стартового материала и/или меньшее число пассажей требуется для достижения конкретного желаемого количества клеток, поскольку большинство размножающихся клеток являются жизнеспособными, и они пролиферируют особенно эффективно.
Предпочтительно, клетки из пуповины, полученные в соответствии с настоящим изобретением, являются единственными клетками, которые переводят в этап размножения. В таких вариантах осуществления особенно предпочтительно, если никакие питающие клетки не присутствуют во время этапа размножения.
Размножение, как правило, происходит в культуральном сосуде. Точнее, клетки, предназначенные для размножения, высевают в культуральный сосуд. Типичными культуральными сосудами являются флаконы, планшеты и пакеты (при этом пакеты, как правило, состоят из нескольких планшетов, установленных один поверх другого). Особенно подходящими культуральными сосудами в контексте настоящего изобретения являются культуральные сосуды, которые создают возможность для прикрепления клеток ко дну культурального сосуда; такими сосудами являются флаконы, планшеты и пакеты с плоской нижней поверхностью. Предпочтительно, культуральный сосуд имеет по меньшей мере пластиковую нижнюю поверхность. Более предпочтительно, культуральный сосуд представляет собой пластиковый культуральный сосуд. Культуральный сосуд предпочтительно имеет плоскую нижнюю поверхность («плоскодонный»).
Тип пластика не имеет конкретных ограничений при условии, что он подходит для культивирования клеток; однако гидрофобные полимеры, такие как, в частности, полистирол, необязательно, с модифицированной поверхностью, являются предпочтительными. Модификацию поверхности можно осуществлять плазменным методом, который создает доступность различных функциональных химических групп на полистирольной поверхности, и который подходит для обеспечения прикрепления клеток, как правило. Такие методы известны в данной области, и пластиковые сосуды с модифицированной поверхностью для культивирования прикрепляющихся клеток коммерчески доступны.
Предпочтительно, однако, если поверхность сосуда для культивирования клеток не покрывают белком перед использованием. В частности, ее не покрывают белками, например, белками клеточного матрикса, такими как коллаген и полилизин.
Предпочтительно, размножение проводят с использованием нескольких пассажей. Подробная информация о пассажах приведена ниже.
Ростовая среда
Ростовая среда для размножения по настоящему изобретению, как правило, будет содержать минимальную среду и одну или более добавок. В широком смысле, тип используемой минимальной среды не имеет конкретных ограничений. Типичные минимальные среды имеют водную основу и определенный химический состав. «Определенный химический состав» означает, что минимальная среда состоит из конкретных ингредиентов в конкретных количествах; преимущество минимальной среды с определенных химическим составом заключается в том, что ее можно готовить воспроизводимо, без вариаций вследствие экспериментальных условий, разных лабораторий, и так далее. Минимальная среда, как правило, является стерильной. Минимальные среды для роста клеток млекопитающих коммерчески доступны от разных коммерческих поставщиков.
12
Как правило, минимальная среда содержит ингредиенты, включающие аминокислоты, соли (такие как хлорид кальция, хлорид калия, сульфат магния, хлорид натрия и монофосфат натрия), глюкозу и витамины (такие как фолиевая кислота, никотинамид, рибофлавин, B), по меньшей мере одно буферное средство (такое как, например, HEPES) и, как правило, также краситель (например, феноловый красный); однако это необязательно. Большинство коммерчески доступных минимальных сред включают феноловый красный в качестве индикатора pH (краситель), позволяющего постоянно контролировать pH.
Предпочтительно, минимальная ростовая среда представляет собой среду, которая не требует добавления матрицы прикрепления для высевания клеток.
Предпочтительно, минимальная среда является бессывороточной. «Бессывороточная» означает, что она не содержит ни человеческую, ни животную, сыворотку. Более предпочтительно, минимальная среда представляет собой минимальную среду с определенным химическим составом, которая является бессывороточной.
Предпочтительно, минимальная среда имеет определенный химический состав. Минимальная среда с определенным химическим составом представляет собой минимальную среду, подходящую для in vitro культивирования человеческих или животных клеток, в которой известны все химические компоненты. В частности, в среде с определенным химическим составом все компоненты должны быть идентифицированы и иметь известные концентрации. Таким образом, среда с определенным химическим составом должна быть полностью свободна от компонентов животного происхождения и не может содержать сыворотку или сывороточные белки, например, эмбриональную бычью сыворотку, бычий сывороточный альбумин или человеческий сывороточный альбумин. Минимальная среда с определенным химическим составом включает только рекомбинантные белки и/или гормоны. Для достижения этого среда с определенным химическим составом не содержит компоненты человеческого или животного происхождения, такие как белки и/или факторы роста; в частности, она не содержит альбумин человеческого или животного происхождения, или факторы роста человеческого или животного происхождения. Предпочтительно, она содержит рекомбинантный альбумин и/или рекомбинантные факторы роста, как правило, полученные из источников, отличных от человека и животных, например, из растительных клеток и бактерий, и/или синтетические химические вещества, такие как, например, поливиниловый спирт.
В некоторых вариантах осуществления минимальная среда с определенным химическим составом содержит
(a) обычную минимальную среду (такую как DMEM, F12 или RPMI 1640, содержащая аминокислоты, витамины, неорганические соли, буферы, антиоксиданты и источники энергии),
и
(b) один или более заменяющих сыворотку ингредиентов, необязательно, выбранных из, но без ограничения, следующего открытого списка: рекомбинантный альбумин, липид(ы) с определенным химическим составом, рекомбинантный инсулин и/или ион(ы) металла, такого как цинк, рекомбинантный трансферрин или железо, селен, а также антиоксидант тиол, такой как 2-меркаптоэтанол или 1-тиоглицерин.
Минимальную среду можно, например, выбирать из списка, включающего, но без ограничения, минимальную поддерживающую среду Игла (EMEM), модифицированную по способу Дульбекко среду Игла (DMEM), альфа-MEM, RPMI-1640, IMDM и другие. В случае необходимости в данные среды добавляют один или более заменяющих сыворотку ингредиентов. Таким образом получают бессывороточную минимальную среду.
Более предпочтительно, минимальная среда представляет собой минимальную среду, подходящую для культивирования мезенхимальных стромальных клеток и/или мезенхимальных стволовых клеток. Предпочтительно, минимальная ростовая среда подходит для нескольких пассажей при размножении МСК, в частности, человеческих МСК, более конкретно, полученных из стромального вартонова студня (предпочтительно человеческого) МСК.
Среды, подходящие для культивирования мезенхимальных стромальных клеток и/или мезенхимальных стволовых клеток, коммерчески доступны, и некоторые из них специально продают для этой цели. Например, TheraPEAK™ MSCBM CD (в тексте настоящего документа для простоты называемая MSCBM CD) представляет собой минимальную среду с определенным химическим составом, которая является подходящей для мезенхимальных стволовых клеток, согласно описанию ее производителя Lonza (Wakersville, MD, USA; каталожный № 95062-688). Действительно, авторы настоящего изобретения установили, что данная минимальная среда является особенно подходящей. Таким образом, MSCBM CD является предпочтительной минимальной средой для использования по настоящему изобретению.
В равной степени являются предпочтительными все минимальные среды, практически эквивалентные MSCBM CD. Термин «практически эквивалентные» разъяснен ниже. Сходство состава минимальной среды в отношении ингредиентов и их относительных количеств можно проверять, используя сочетание хроматографических и/или спектрометрических методов, или тому подобного.
Как правило, выбор подходящей культуральной среды очень важен для общих показателей эффективности культивирования клеток. Этот вопрос был решен путем выбора MSCBM CD и минимальных сред, практически эквивалентных ей, в качестве особенно подходящей минимальной среды по настоящему изобретению. MSCBM CD представляет собой минимальную среду с определенным химическим составом для мезенхимальных клеток и коммерчески доступна от Lonza (Lonza, Wakersville, MD, USA, каталожный № 95062-688). Вариации MSCBM CD, такие как, в частности, минимальные среды, состоящие из, или содержащие те же компоненты, что и MSCBM CD, хотя, например, в других количествах или пропорциях, или минимальные среды, состоящие из, или содержащие компоненты, частично или полностью отличающиеся от компонентов MSCBM CD, но оказывающие практически эквивалентное действие на рост МСК, при использовании, как описано в настоящем документе, в равной степени можно использовать по настоящему изобретению.
Другие минимальные среды также подходят для размножения МСК в способе по настоящему изобретению. Например, авторы изобретения обнаружили, что DMEM является минимальной средой, которую также можно использовать, когда она входит в состав ростовой среды, также содержащей по меньшей мере одну добавку(и), описанную ниже (данные не представлены).
В важных вариантах осуществления настоящего изобретения ростовая среда включает минимальную среду и по меньшей мере одну добавку(и), в частности, тромбоцитарный лизат. Таким образом, предпочтительно, по меньшей мере одна клетка размножается в ростовой среде, имеющей в основе минимальную среду и содержащей по меньшей мере одну добавку. Тромбоцитарный лизат является предпочтительной добавкой.
Термин «имеет в основе» означает, что минимальная среда, например, MSCBM CD, дополнена по меньшей мере одной добавкой. Если добавки добавляют в жидкой форме, то минимальная среда становится слегка разбавленной за счет добавления по меньшей мере одной добавки; однако легкое разбавление не создает никаких проблем. В предпочтительном варианте осуществления добавки можно выбирать из списка, включающего человеческую или животную сыворотку, человеческий или животный тромбоцитарный лизат, лизат человеческих или животных, или растительных клеток, один или более антибиотиков, гепарин, вспомогательные факторы роста, такие как инсулин или гидрокортизон, аминокислоты, такие как глутамин или его олигомеры.
Предпочтительно, ростовая среда содержит гепарин в качестве добавки. Подходящие концентрации гепарина в ростовой среде составляют 0,1-100 Ед/мл, например, 1-10 Ед/мл, например, 2 Ед/мл. Ед означает единицу (единицу Хауэлла) гепарина, описанную выше. Гепарин можно добавлять в минимальную среду.
В особенно предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере одна клетка размножается в ростовой среде, имеющей в основе минимальную среду MSCBM CD (Lonza, Wakersville, MD, USA; каталожный № 95062-688), или минимальную среду, практически эквивалентную ей. Используемая по настоящему изобретению MSCBM CD, например, как оказалось, является особенно полезной для достижения высоких показателей совокупного удвоения популяций/высоких количеств клеток.
Являются или не являются две минимальные среды практически эквивалентными друг другу, для целей настоящего изобретения тестируют путем выращивания клеток, в идеале, выделенных из одной и той же пуповины, в ростовой среде, имеющей в основе указанную минимальную среду, в практически одинаковых условиях, то есть, с одинаковыми добавками (например, тромбоцитарным лизатом), в одинаковых количествах, в одинаковых культуральных чашках при одной и той же температуре, и так далее, в идеале, параллельно. Иными словами, для проверки того, являются ли указанные две минимальные среды практически эквивалентными друг другу, единственной переменной в тесте с ростом клеток является сама минимальная среда. Клетки предпочтительно представляют собой полученные из стромального вартонова студня МСК, выделенные, как в примерах 1 и 2A и субкультивированные («P0»), как в примере 2B. Клетки из P0 после обработки трипсином выращивают параллельно в ростовой среде, имеющей в основе первую минимальную среду (например, MSCBM CD), и в ростовой среде, имеющей в основе вторую минимальную среду (тестируемую на наличие существенной эквивалентности). Две минимальные среды считают практически эквивалентными, когда имеют место оба из следующих условий: показатели среднего совокупного удвоения популяции на посев (P1-P8) являются практически одинаковыми (максимальное различие 10% ± отклонение) и степень старения клеток, полученных после пассажа 8 (для информации смотри пример 11), является практически одинаковой (максимальное различие 10% ± отклонение).
В альтернативном варианте осуществления ростовая среда имеет в основе минимальную среду, которая, хотя практически и не эквивалентна MSCBM CD, характеризуется следующими показателями: среднее совокупное удвоение популяции на посев (P1-P8) составляет по меньшей мере 70% в сравнении с ростом в ростовой среде, в остальном практически идентичной, но имеющей в основе минимальную среду МСКMB CD, и степень старения клеток, полученных после пассажа 8 (для информации смотри пример 11), составляет 150% или менее в сравнении со степенью старения клеток, растущих параллельно в ростовой среде, в остальном практически идентичной, но имеющей в основе минимальную среду МСКMB CD. DMEM (коммерчески доступная от многих поставщиков) может являться вариантом осуществления такой минимальной среды.
Предпочтительно, ростовая среда поддерживает многолинейную дифференциацию МСК, в частности, МСК по изобретению. При необходимости, минимальную среду дополняют добавками для направления дифференциации клеток в сторону конкретной линии. Тесты на многолинейную дифференциацию описаны ниже.
Предпочтительно, тромбоцитарный лизат, или его производное, присутствует в ростовой среде. Таким образом, ростовая среда, полезная по настоящему изобретению, предпочтительно содержит тромбоцитарный лизат. Более конкретно, авторы настоящего изобретения показали, что сочетание минимальной среды MSCBM CD, или минимальной среды, практически эквивалентной ей, с дополнительным тромбоцитарным лизатом является особенно подходящим, и такая ростовая среда является наиболее предпочтительной. Предпочтительно, в случае присутствия тромбоцитарного лизата какая-либо человеческая или животная сыворотка отсутствует в ростовой среде, и более предпочтительно, отсутствует какой-либо лизат человеческих, животных или растительных клеток, кроме тромбоцитарного лизата. Использование тромбоцитарного лизата в ростовой среде по настоящему изобретению вместо человеческой или животной сыворотки решает проблемы, связанные с традиционным использованием животных сывороток, с точки зрения передачи прионов, вирусов или индукции иммунологических реакций у реципиентов после инфузии, а также нормативными ограничениями в соответствии с требованиями надлежащей производственной практики (GMP).
Если тромбоцитарный лизат присутствует в ростовой среде или, точнее, был добавлен к минимальной среде (такой как MSCBM CD от Lonza, например, или минимальной среде, практически эквивалентной ей), тогда тромбоцитарный лизат также можно называть добавкой к минимальной среде.
Тромбоцитарный лизат, подходящий в качестве добавки в данном варианте осуществления, в целом, соответствует тромбоцитарному лизату, описанному для варианта осуществления с добавлением тромбоцитарного лизата в процессе ферментативного расщепления, который описан выше, однако, в идеале, также выполняют следующие четыре дополнительных более предпочтительных варианта осуществления, отдельно или в сочетании:
В первом особенно предпочтительном варианте осуществления тромбоцитарный лизат получен от того же биологического вида (однако, как правило, не от того же индивидуума), что и пуповина. Преимущество, связанное с культивированием в присутствии тромбоцитарного лизата от того же биологического вида, является удивительным, в частности, с точки зрения существующего в данной области предубеждения против использования тромбоцитарного лизата от того же биологического вида для культивирования стромальных клеток: например, сообщалось, что лошадиный тромбоцитарный лизат, как правило, не является полезным для культивирования лошадиных мезенхимальных стромальных клеток (Russell et al., 2016, Equine Vet. J., vol. 48, p. 261-264), и что собачий тромбоцитарный лизат уступает по результатам эмбриональной бычьей сыворотке при выделении и размножении собачьих мезенхимальных стромальных клеток (Russell et al., PLOS One, 2015, vol. Vol. 10, e0136621). Особенно предпочтительно, если используемый тромбоцитарный лизат содержит тромбоциты от нескольких доноров, включенные в такой препарат для компенсации индивидуальной вариабельности и для получения более стандартизированного и воспроизводимого препарата тромбоцитарного лизата; объединение тромбоцитов, полученных из лейкоцитарных пленок цельной крови, является стандартизированной процедурой, смотри, например, Iudicone et al., 2014, J. Transl. Med., 12: 28. Предпочтительно, тромбоцитарный лизат получают из крови млекопитающих. В зависимости от цели соответствующее млекопитающее можно выбирать в качестве источника крови. Млекопитающие, которые предназначены для использования по настоящему изобретению, могут, в принципе, быть любыми животными, молодыми или взрослыми, от которых можно получать необходимое и разумное количество тромбоцитов. В некоторых вариантах осуществления в основном используют взрослых млекопитающих. Примерами не являющихся людьми животных являются выращиваемые на убой животные, другие сельскохозяйственные животные, такие как крупный рогатый скот, свиньи, овцы или домашняя птица. Тромбоцитарный лизат млекопитающих является предпочтительным, человеческий тромбоцитарный лизат (сокращенно «чТЛ») является особенно предпочтительным. В некоторых вариантах осуществления млекопитающее является человеком. Как правило, добавляемый тромбоцитарный лизат предпочтительно получен от того же биологического вида, что и пуповина/клетки. В частности, для культивирования клеток, полученных из человеческой пуповины, предпочтительно добавлять человеческий тромбоцитарный лизат. Тромбоцитарный лизат, как правило, является аллогенным для клеток. В некоторых вариантах осуществления доноры крови являются здоровыми и соответствуют требованиям, разработанным соответствующими органами государственного регулирования. Например, кровь может соответствовать требованиям, которые государственные агентства по контролю качества пищевых продуктов и медикаментов предъявляют к продуктам, предназначенным для употребления в пищу или для медицинского применения, или удовлетворять соответствующим нормативам в географической зоне, в которой применяют настоящее изобретение. Человеческий тромбоцитарный лизат может полностью или частично (предпочтительно полностью) заменять эмбриональную бычью сыворотку. В наиболее предпочтительных вариантах осуществления тромбоцитарный лизат получен от людей-доноров. В данных вариантах осуществления предпочтительно, если доноры имеют возраст примерно 50 лет, примерно 45 лет, примерно 40 лет или менее.
Во втором особенно предпочтительном варианте осуществления тромбоцитарный лизат оказывает стимулирующее повышенный рост действие на клетки, в частности, на полученные из вартонова студня МСК по настоящему изобретению, при использовании в качестве добавки в среде для культивирования клеток, в сравнении с бычьей сывороткой, в частности, эмбриональной бычьей сывороткой (ЭБС) в той же концентрации. В некоторых вариантах осуществления композиция оказывает действие, стимулирующее увеличение по меньшей мере на 20% роста клеток, в сравнении с эмбриональной бычьей сывороткой (ЭБС) в той же концентрации.
В третьем особенно предпочтительном варианте осуществления концентрация тромбоцитарного лизата в ростовой среде составляет от примерно 0,1% (об/об) до примерно 20% (об/об), предпочтительно от примерно 0,5% (об/об) до примерно 10% об/об), более предпочтительно от примерно 1% (об/об) до примерно 5% об/об), например, 1% (об/об), 2% (об/об), 3% (об/об), 4% (об/об) или 5% (об/об). Как оказалось, концентрация примерно 5% (об/об) является особенно полезной (смотри примеры в настоящем документе) и, следовательно, предпочтительной, в частности, в сочетании с минимальной средой с определенным химическим составом, подходящей для мезенхимальных стволовых клеток, такой как MSCBM CD (Lonza), или минимальная среда, практически эквивалентная ей.
В четвертом особенно предпочтительном варианте осуществления тромбоцитарный лизат, который добавляют к ростовой среде, содержит производные тромбоцитов. Альтернативно, тромбоцитарный лизат практически не содержит мембраны тромбоцитов млекопитающих и/или другой клеточный детрит. При использовании в настоящем документе «практически не содержит» означает, что присутствует лишь не поддающееся обнаружению количество мембран тромбоцитов, или количество мембран тромбоцитов не может быть дополнительно уменьшено каким-либо разумным, коммерчески обоснованным методом, или количество мембран тромбоцитов практически не препятствует использованию тромбоцитарного лизата. Мембраны тромбоцитов можно отделять от тромбоцитарного лизата любыми подходящими методами, известными в данной области, например, центрифугированием в градиенте плотности.
Некоторые полезные варианты осуществления описаны в примерах 0 и 2.
Предпочтительно, тромбоцитарный лизат, или его производные, присутствует/присутствуют в течение всего, или части, этапа размножения (c). Таким образом, предпочтительно, на этапе (c) по меньшей мере одна клетка размножается в ростовой среде, содержащей тромбоцитарный лизат (PL), или его производные, предпочтительно человеческий тромбоцитарный лизат (чТЛ), или его производные.
Без связи с конкретной теорией, предполагается, что присутствие тромбоцитарного лизата обеспечивает питательные вещества и факторы роста, а также вносит определенный вклад в окружение, который позволяет клеткам эффективно размножаться. Без связи с конкретной теорией, также можно предположить, что присутствие тромбоцитарного лизата способствует нейтрализации или ингибированию любой ферментативной активности, остающейся после ферментативной экстракции, и, таким образом, мягкости условий во время последующей фазы размножения. Человеческий тромбоцитарный лизат (чТЛ) является предпочтительным для использования с человеческими МСК.
Таким образом, в настоящем изобретении тромбоцитарный лизат (ТЛ) может служить альтернативой животной сыворотке при культивировании мезенхимальных стромальных клеток (для иллюстрации и более подробной информации смотри также WO 2013/042095 A1). Известно, что тромбоциты являются богатым источником многочисленных факторов роста, таких как PDGF (тромбоцитарный фактор роста), b-FGF (основной фактор роста фибробластов), VEGF (фактор роста эндотелия сосудов) и TGF-β (трансформирующий фактор роста β).
Необязательно, в ростовой среде присутствуют один или более антибиотиков. В этом случае, один или более антибиотиков могут дополнять минимальную среду в качестве добавок. Подходящие антибиотики в контексте настоящего изобретения включают, например, амфотерицин и гентамицин, в числе прочих. Концентрации одного или более антибиотиков в ростовой среде предпочтительно находятся в диапазонах концентраций, обычно используемых в данной области. Альтернативно, в ростовой среде отсутствуют добавленные антибиотики.
Предпочтительно, к минимальной среде не добавляют никакие дополнительные ингредиенты, кроме тех, которые перечислены выше. В частности, особенно предпочтительно, если по меньшей мере одна клетка размножается в ростовой среде, не содержащей какую-либо добавленную сыворотку, в частности, не содержащей бычью сыворотку, такую как эмбриональная бычья сыворотка (ЭБС). Для целей данного варианта осуществления тромбоцитарный лизат не попадает под определение сыворотки; иными словами, даже если небольшое количество сыворотки, или следовые количества сыворотки, могут содержаться в тромбоцитарном лизате, добавленном к ростовой среде, можно говорить, что ростовая среда не содержит «добавленную сыворотку», это является уточнением того, что сыворотка не добавлена в качестве ингредиента для культивирования клеток в классическом смысле. В контексте настоящего изобретения ЭБС является нежелательной добавкой, например, из-за того, что она несет риск передачи вирусных и прионных заболеваний. Напротив, способ по настоящему изобретению является эффективным в присутствии тромбоцитарного лизата, например, в качестве замены ЭБС. Для роста человеческих МСК человеческий тромбоцитарный лизат является более предпочтительным в качестве добавки, чем ЭБС.
Предпочтительно, никакая матрица прикрепления не добавлена, или не присутствует, при пассаже клеток для роста на планшете. Таким образом, никакая матрица прикрепления не добавлена, или не присутствует, при высеве клеток, и/или никакую матрицу прикрепления не вносят в качестве добавки в минимальную среду.
Пассажи
В предпочтительном варианте осуществления клетки размножают на протяжении одного или более пассажей.
Термин «пассаж» относится к культуре клеток в культуральном сосуде (определенного типа), в который клетки высевают для начала соответствующего пассажа. Обычно клетки прикрепляются к указанному культуральному сосуду в процессе их культивирования, и клетки обычно размножаются в указанном культуральном сосуде в процессе их культивирования. Концом пассажа является открепление обычно прикрепленных клеток (например, путем обработки трипсином). Затем клетки, необязательно, высевают в новый культуральный сосуд такого же, или иного, типа; высевание в новый культуральный сосуд является началом следующего пассажа. Таким образом, когда клетки после такого размножения переносят из культурального сосуда в другой культуральный сосуд, то клетки, присутствующие в этом другом культуральном сосуде, представляют новый пассаж.
Термин «сбор клеток» означает процесс получения практически всех клеток, выросших в культуральном сосуде до конца пассажа.
Для каждого пассажа можно использовать один культуральный сосуд; более предпочтительно, однако, использовать несколько культуральных сосудов параллельно для каждого пассажа. Затем клетки культивируют параллельно в нескольких культуральных сосудах в практически идентичных условиях и в течение практически одного и того же времени. Предпочтительно, плотность посева в нескольких культуральных сосудах является практически одинаковой.
В начале каждого пассажа клетки (не прикрепленные/выделенные, предпочтительно при нужном количестве/плотности) добавляют в культуральный сосуд, содержащий ростовую среду.
Хотя антибиотики не являются необходимыми для роста клеток, их часто используют для контроля роста бактериальных и грибковых загрязнений. Это является особенно предпочтительным в ранних пассажах, но не является предпочтительным в более поздних пассажах, например, начиная с P2 и далее, или начиная с P1 и далее. Таким образом, даже если антибиотики присутствуют в первом пассаже после выделения клеток («P0»), антибиотики предпочтительно перестают использовать во всех пассажах после P0; иными словами, ростовую среду без добавления антибиотиков можно использовать для P1 и всех последующих пассажей. Таким образом, в настоящем изобретении антибиотики предпочтительно присутствуют в качестве добавки в первой культуральной среде (например, P0) после выделения клеток из пуповины, но не в более поздних клеточных культурах, то есть, субкультурах P0.
В конце каждого пассажа, когда клетки достигли процентной конфлюэнтности, отвечающей критерию 3 в таблице, приведенной ниже, клетки собирают. Для этой цели ростовую среду (и любые не прикрепленные клетки, содержащиеся в ней, при их наличии) удаляют аспирацией, прикрепленные клетки, необязательно, промывают соответствующим стерильным буфером и, необязательно, но предпочтительно, отделяют при помощи фермента, например, путем обработки трипсином, необязательно, подсчитывают, необязательно, но предпочтительно, концентрируют центрифугированием, и необязательно, но предпочтительно, ресуспендируют, предпочтительно в ростовой среде, подходящей для МСК, описанной в настоящем документе. Ресуспендированные не прикрепленные клетки затем, необязательно, используют для инициации культивирования в последующем пассаже.
Пассажи последовательно нумеруют, как подробно описано ниже в настоящем документе, начиная с пассажа 0 (P0). P0 является первым пассажем после получения клеток, предпочтительно путем ферментативного расщепления, описанного выше. Таким образом, P0 можно называть «первичной культурой». Клетки для инокуляции первичной культуры происходят из вартонова студня пуповины, из механически и/или при помощи фермента диссоциированной ткани, как описано выше, или - альтернативно, но намного менее предпочтительно - в результате роста клеток, мигрировавших из ткани стромального вартонова студня.
При росте клеток в разных пассажах клетки могут размножаться до более высоких количеств клеток и/или более высокой однородности и/или меньшего загрязнения нежелательными клетками, чем это было бы возможно при использовании только одного пассажа. Клетки можно размножать в определенных условиях или иных желательных условиях.
Принято считать, что стромальные клетки пуповины (ПК) являются гетерогенными в отношении структуры, биологических свойств и локализации в ПК. Например, на фигуре 7A показано, что свежевыделенные из ПК клетки, как в соответствии с настоящим изобретением, так и в соответствии с современным уровнем техники, являются гетерогенными в отношении экспонирования определенных поверхностных маркеров.
Как правило, не все клетки, выделенные из стромального вартонова студня (или из любой другой области пуповины), являются клоногенными. Иными словами, не все выделенные клетки представляют собой колониеобразующие единицы (КОЕ). Однако при выращивании клеток, выделенных в соответствии с настоящим изобретением, в течение нескольких пассажей можно добиться обогащения по нужным мезенхимальным стромальным клеткам, которые являются клоногенными. Таким образом, в одном варианте осуществления размножение по настоящему изобретению характеризуется тем, что процентное содержание МСК увеличивается с течением времени. Например, процентное содержание МСК в конце P0 может быть, как правило, выше, чем процентное содержание МСК в начале P0.
В настоящем изобретении несколько пассажей культивирования имеют то преимущество, что может быть достигнуто обогащение по МСК относительно других (нежелательных или примесных) клеток, таких как эритроциты, поскольку (a) не прикрепленные (и, следовательно, не-МСК) клетки удаляются вместе с ростовой средой в конце пассажа культивирования, (b) клетки с пролиферативными свойствами, уступающими свойствам МСК, практически не будут пролиферировать так хорошо, как МСК, и, таким образом, в течение нескольких совокупных пассажей клеточная популяция становится обогащенной по МСК, и в итоге (обычно начиная с P1 и далее) практически чистой в отношении МСК.
Как правило, можно арифметически преобразовывать число пассажей в показатели совокупного удвоения популяции, в случае использования определенных или иных хорошо известных условий.
Клетки предпочтительно размножают в течение нескольких пассажей, предпочтительно, от более одного до менее четырнадцати пассажей. Например, клетки культивируют в течение трех-шести пассажей.
В одном конкретном варианте осуществления свежевыделенные клетки после ферментативного расщепления сначала проходят первичный пассаж культивирования (для примерной иллюстрации смотри пример 2B) - первичный пассаж культивирования можно называть P0; необязательно, размножение повторяют в новом пассаже в условиях для P0 (повторный пассаж культивирования затем обозначают P0+). Последующие пассажи, то есть, следующие непосредственно после P0, или после P0+, нумеруют как P1, P2 и так далее. В предпочтительном варианте осуществления клетки размножают по меньшей мере до P2 и не дольше, чем P6. В наиболее предпочтительном варианте осуществления клетки размножают до P4.
Что касается совокупных удвоений популяции, как правило, трудно бывает определять показатели совокупного удвоения популяции в P0. Основной причиной является то, что по опыту авторов настоящего изобретения не все клетки, высеянные в начале P0, размножаются. Для определения показателей совокупного удвоения популяции в P0 потребовалось бы определять количество, или часть, клоногенных клеток в начале P0, то есть, тех клеток, которые способны размножаться, давая начало дочерним клеткам. Хотя такое определение само по себе не является абсолютно неосуществимым, оно не требуется для способа по настоящему изобретению; вместо этого, в таких вариантах осуществления показатели совокупного удвоения популяции определяют для всех пассажей, кроме P0. Хотя клетки, исходно выделенные из пуповины, как правило, включают МСК, которые являются клоногенными, а также другие клетки (например, эритроциты), которые не являются клоногенными, другие клетки практически будут отсутствовать после P0, как описано ниже, в частности, потому, что такие не клоногенные клетки не производят потомство в P0.
В одном варианте осуществления клетки размножают на протяжении 5-30 совокупных удвоений популяции (не считая совокупные удвоения популяции в процессе P0), например, 8-25 совокупных удвоений популяции (не считая совокупные удвоения популяции в процессе P0). В одном предпочтительном варианте осуществления клетки размножают на протяжении всего лишь 5-14 совокупных удвоений популяции (не считая совокупные удвоения популяции в процессе P0). Такой вариант осуществления подходит для создания первичного клеточного банка.
В альтернативном предпочтительном варианте осуществления клетки размножают на протяжении 14-25 совокупных удвоений популяции (не считая совокупные удвоения популяции в процессе P0). Такой вариант осуществления подходит для создания вторичного клеточного банка.
По опыту авторов изобретения показатели совокупного удвоения популяции в течение P1 и P2 (в совокупности P1 плюс P2, но не включая P0), в самом общем случае, обычно находятся в диапазоне 7-15, предпочтительно 9-13. По опыту авторов изобретения показатели совокупного удвоения популяции в течение P3 и P4 (в совокупности P3 плюс P4, но не включая P0, P1 и P2), в самом общем случае, обычно находятся в диапазоне 4-12, предпочтительно 6-10. Следовательно, показатели совокупного удвоения популяции в течение P1, P2, P3 и P4 (в совокупности P1 плюс P2 плюс P3 плюс P4, но не включая P0), в самом общем случае, обычно находятся в диапазоне 9-27, предпочтительно в диапазоне 15-23. Эти числа не включают показатели совокупного удвоения популяции в процессе P0.
В начале каждого пассажа клетки переносят в сосуд для культивирования клеток. Предпочтительно, клетки переносят в определенном количестве клеток на сосуд для культивирования. Количество предпочтительно определяют в зависимости от двумерной поверхности сосуда для культивирования клеток. Таким образом, можно начинать пассаж с определенной плотности клеток. Плотности клеток для начала пассажей культивирования в контексте настоящего изобретения являются следующими:
Для начала P0 и P0+
Для начала P1 и всех пассажей, следующих за P1
Подходящий диапазон
1000-50000 клеток/см<sup>2</sup>
200-50000 клеток/см<sup>2</sup>
Предпочтительный диапазон
8000 клеток/см<sup>2</sup> или более
2000-3000 клеток/см<sup>2</sup>
Определенное значение
Не применимо
2500 клеток/см<sup>2</sup>
2
В начале каждого из P0 и P0+ (при наличии) высевают все доступные клетки. Таким образом, точная плотность клеток для начала P0 и P0+ (при наличии) не была определена. Во всяком случае, плотность клеток для начала P0 и P0+ (при наличии) должна составлять 8000 клеток/см или выше.
Как это свойственно мезенхимальным стромальным клеткам, клетка по изобретению, как правило, представляет собой прикрепляющуюся клетку, когда растет в культуральном сосуде, в частности, в культуральном сосуде с пластиковой нижней поверхностью. Предпочтительно, клетка является прикрепляющейся, независимо от выбора ростовой среды. Во всяком случае, наиболее предпочтительно, если клетка является прикрепляющейся при культивировании в предпочтительной ростовой среде по настоящему изобретению.
В конце каждого пассажа клетки собирают. Для этого их, необязательно, но предпочтительно, отделяют при помощи фермента, например, путем обработки трипсином. Как известно, трипсин представляет собой коммерчески доступный фермент, подходящий для протеолитического расщепления молекул клеточной адгезии и, за счет этого, отделения прикрепляющихся клеток от культурального сосуда и друг от друга. Таким образом, «обработка трипсином» означает воздействие трипсином - или любым другим ферментом с паттерном расщепления, подобным паттерну трипсина - в условиях, подходящих для такого расщепления. Стандартные методы обработки трипсином клеток млекопитающих, в частности, мезенхимальных клеток, также подходят для обработки трипсином клеток, полученных по настоящему изобретению. Препараты трипсина для таких целей коммерчески доступны и могут быть использованы в соответствии с инструкциями производителя. Альтернативно, отделение при помощи фермента производят, используя подходящий фермент, отличный от трипсина.
После отделения при помощи фермента, например, после обработки трипсином, необязательно, но предпочтительно, определяют общее количество клеток (на флакон или на планшет, или на пакет, или на общее количество культуральных сосудов, используемых в соответствующем пассаже).
Когда в настоящем документе говорится, что клетки размножают до определенного пассажа, например, до P4, это означает, что размножение клеток далее не продолжают или прерывают после соответствующего пассажа.
После каждого пассажа предпочтительно оценивают следующие критерии приемлемости: 1 - выход, 2 - жизнеспособность, 3 - конфлюэнтность, 4 - морфология. Определение критериев приемлемости 3 и 4 производят до ферментативного отделения клеток. Определение критериев приемлемости 1 и 2 производят после ферментативного отделения клеток. Подробная информация приведена далее.
Критерий приемлемости
После P0 и P0+
После P1 и всех пассажей, следующих за P1
Тест
1
Выход(полномасштабный цикл)
Смотри пример 2B
Смотри пример 2C
Подсчет клеток после ферментативного отделения
2
Жизнеспособность
Более 80% жизнеспособных клеток
Более 80% жизнеспособных клеток
Окрашивание 7-амино-актиномицином D (7-AAD) после ферментативного отделения
3
Конфлюэнтность
По меньшей мере 80%, предпочтительно 80-90% конфлюэнтность
По меньшей мере 80%, предпочтительно 80-90% конфлюэнтность
Определение под микроскопом
4
Морфология
Большинство клеток мелкие, веретеновидные и в четких колониях
Большинство клеток мелкие, веретеновидные и в четких колониях
Определение под микроскопом
Предпочтительно, все четыре критерия приемлемости должны быть соблюдены.
Определение под микроскопом конфлюэнтности направлено на определение процента площади поверхности сосуда для культивирования клеток, покрытой прикрепленными к ней клетками.
Если критерий конфлюэнтности не соблюден, клетки размножают далее, и регулярно проводят наблюдение для определения момента времени, когда критерий конфлюэнтности будет соблюден.

Для определения выхода клетки отделяют при помощи фермента, например, проводят обработку трипсином, и в определенной части содержащей клетки суспензии проводят автоматизированный подсчет клеток, например, при помощи NucleoCounter. Затем на основании результатов для части арифметически определяют общее количество клеток.
Определение под микроскопом морфологии (то есть, клеточной морфологии) направлено на определение формы клеток, прикрепленных к нижней поверхности сосуда для культивирования клеток. Для МСК типично, если большинство клеток имеют форму веретена. Для иллюстративных целей фотография нижней поверхности чашки для культивирования клеток, содержащей такие клетки, приведена на фигуре 5C, панель, называемая «СВС».
Определение жизнеспособности гарантирует, что клетки, используемые в создании клеточного банка и/или в последующем пассаже, подходят для дальнейшего размножения (после замораживания и размораживания, в зависимости от обстоятельств). Клетки по настоящему изобретению имеют превосходную жизнеспособность в сравнении с МСК, выделенными способами современного уровня техники. За счет этого, и за счет размножения по настоящему изобретению, большие клеточные популяции могут быть получены, даже когда общее количество клеток, исходно выделенных из стромального вартонова студня пуповины, является относительно низким. Таким образом, клетки, получаемые по настоящему изобретению, являются превосходными по своему пролиферативному потенциалу.
Замораживание
Клетки могут быть заморожены, например, быстро заморожены в жидком азоте, стандартными методами. Вполне возможно размораживать такие замороженные клетки и, например, подвергать их дальнейшим пассажам культивирования после размораживания. Можно замораживать либо всю партию, либо аликвоты.
Когда в настоящем документе говорится, что клетки размножают до определенного пассажа, например, до P4, это означает, что размножение клеток далее не продолжают или прерывают после соответствующего пассажа. В иллюстративном, но типичном, варианте осуществления клетки замораживают после соответствующего пассажа. Повторное замораживание после повторных пассажей возможно. Например, клетки можно замораживать после P2 и/или после P4. Предпочтительно, клетки замораживают после P2 и после P4.
Замороженные клетки и популяции замороженных клеток также являются объектом настоящего изобретения. Популяции замороженных клеток можно называть клеточными банками. Подходящие клеточные банки, которые могут быть получены в контексте настоящего изобретения, будут описаны ниже.
В одном варианте осуществления клетки замораживают после 5-30 совокупных удвоений популяции (не считая совокупные удвоения популяции в процессе P0), например, 8-25 совокупных удвоений популяции (не считая совокупные удвоения популяции в процессе P0). В одном предпочтительном варианте осуществления клетки замораживают после всего лишь 5-14 совокупных удвоений популяции (не считая совокупные удвоения популяции в процессе P0). Такой вариант осуществления подходит для создания первичного клеточного банка. В альтернативном предпочтительном варианте осуществления клетки замораживают после 14-25 совокупных удвоений популяции (не считая совокупные удвоения популяции в процессе P0). Такой вариант осуществления подходит для создания вторичного клеточного банка.
Стандартные методы замораживания клеток млекопитающих, в частности, мезенхимальных клеток, подходят для замораживания клеток, полученных по настоящему изобретению. Предпочтительно, клетки замораживают при температурах -70°C или менее (например, -80°C), необязательно, с предварительным быстрым замораживанием при температурах -190°C или менее. В одном варианте осуществления клетки замораживают в жидком азоте.
Замороженные клетки, необязательно, но предпочтительно, можно хранить в замороженном состоянии. Стандартные методы хранения клеток млекопитающих, в частности, мезенхимальных клеток, подходят для хранения клеток, полученных по настоящему изобретению. Предпочтительно замораживать клетки во флаконах. В одном варианте осуществления замороженные клетки хранят в жидком азоте.
В предпочтительном варианте осуществления клетки разделяют на аликвоты перед замораживанием. Подходящими контейнерами для содержания аликвот клеток, получаемых в соответствии с настоящим изобретением, являются все контейнеры, подходящие для вмещения соответствующих количеств (аликвот) клеток и для хранения при низких температурах, в частности, флаконы. Флакон (также известный как матрас) представляет собой небольшой стеклянный или пластиковый сосуд, или бутыль, подходящий для культивирования клеток. Природа флакона, подходящего для настоящего изобретения, не имеет конкретных ограничений при условии, что он позволяет содержать клетки в среде в соответствии с указаниями, и при условии, что он подходит для замораживания в условиях, в которых клетки сохраняются в состоянии, допускающем их последующее размораживание и субкультивирование. Таким образом, для этой цели флаконы должны быть совместимыми с замораживанием (криофлаконы). Флаконы могут быть выполнены из любого подходящего материала, хотя стеклянные флаконы и флаконы, выполненные из пластика, такого как полипропилен, является наиболее типичными. Флакон может быть закрыт, для этого он, как правило, имеет крышку, и криофлакон, подходящий для использования по настоящему изобретению, предпочтительно подходит для замораживания при температурах - 196°C или менее. Варианты имеющих крышки флаконов включают винтовые флаконы (закрытые завинчивающейся крышкой или капельницей/пипеткой), закупориваемые флаконы (закрытые пробкой или пластиковой заглушкой) и закатываемые флаконы (закрытые резиновой пробкой и металлической крышкой) или, в случае пластиковых флаконов, также флаконы с «шарнирными крышками» (защелкивающимися крышками), которые защелкиваются при нажиме. Дно флакона предпочтительно является плоским, хотя это и не строгое требование. Предпочтительно, все флаконы, используемые в одном конкретном процессе выделения/размножения, идентичны друг другу и заполнены идентичными объемами содержащей клетки жидкости (клетки в среде, как правило, в суспензии, но не обязательно).
6
9
6
6
6
Предпочтительные флаконы имеют размер, подходящий для содержания 2-10 мл клеток в среде (как правило, в суспензии, но не обязательно), например, 3-8 мл клеток в среде, и наиболее предпочтительно примерно 4 мл клеток в среде. Предпочтительные флаконы имеют размер, подходящий для содержания 10-10 клеток в среде, например, от 10×10 до 100×10клеток в среде, и наиболее предпочтительно примерно 20×10 клеток в среде.
Замороженные и/или хранящиеся клетки можно, необязательно, но предпочтительно, размораживать. После размораживания клетки можно, необязательно, далее культивировать (субкультивировать), в том числе, размножать. Стандартные методы размораживания и, необязательно, субкультивирования, в частности, мезенхимальных клеток, подходят для размораживания клеток, полученных по настоящему изобретению. Для дальнейшего культивирования или субкультивирования подходят способы, описанные в настоящем документе, включая ростовую среду и так далее.
В предпочтительном варианте осуществления клетки замораживают после пассажа 2 (P2). Клетки, полученные и замороженные после P2, в настоящем документе называют «первичным клеточным банком» или «ПКБ», или, альтернативно, «клеточным мастер-банком». В одном предпочтительном варианте осуществления первичный клеточный банк содержит, или состоит из клеток, которые были заморожены после 5-14 совокупных удвоений популяции (не считая совокупные удвоения популяции в процессе P0).
В другом предпочтительном варианте осуществления клетки замораживают после пассажа 4 (P4). Клетки, полученные и замороженные после P4, в настоящем документе называют «вторичным клеточным банком» или «ВКБ», или, альтернативно, «рабочим клеточным банком». В предпочтительном варианте осуществления вторичный клеточный банк содержит, или состоит из клеток, которые были заморожены после 14-25 совокупных удвоений популяции (не считая совокупные удвоения популяции в процессе P0).
Предпочтительно, вариант осуществления ПКБ и вариант осуществления ВКБ связаны, так что клетки сначала замораживают в виде ПКБ, затем весь, или часть, ПКБ размораживают и субкультивируют, а затем получают ВКБ после двух следующих пассажей (всего P4). Предпочтительно, не все клетки, полученные и замороженные после P2, например, не весь ПКБ, размораживают и субкультивируют совместно. Скорее, наиболее предпочтительно, один контейнер (как правило, один флакон), полученный и замороженный в виде ПКБ, размножают и субкультивируют, при этом остальные контейнеры (флаконы) оставляют замороженными в виде ПКБ.
Важно отметить, что в настоящем документе ссылки на отдельные пассажи приведены в справочных целях. Например, также можно получать ПКБ после иного пассажа, чем P2. Предпочтение для получения ПКБ после P2 и ВКБ после P4 основано на опыте выращивания клеток в среде, имеющей в основе минимальную среду MВКБM CD, или минимальную среду, практически эквивалентную ей, в условиях культивирования, специально описанных в экспериментальных примерах (в частности, примере 2). При использовании других условий культивирования, которые в равной степени приемлемы в контексте настоящего изобретения, ПКБ и ВКБ, в идеале, получают после совокупных удвоений популяции, соответствующих совокупным удвоениям популяции, наблюдаемым после P2 и P4, соответственно, в экспериментальных примерах, описанных в настоящем документе, в частности, примере 2C.
Выделение отдельной клетки, при необходимости, можно осуществлять, например, путем серийного разведения, до или после размножения. Если такое выделение специально не выполняют, способ по изобретению приводит к получению популяции мезенхимальных стромальных клеток. Как описано далее, выход может быть относительно высоким, в сравнении с известными способами, в частности, ввиду превосходной жизнеспособности и способности к размножению клеток по настоящему изобретению.
Выход
Способ по настоящему изобретению, включающий этап (c), приводит к получению популяции мезенхимальных стромальных клеток. Такая популяция мезенхимальных стромальных клеток описана в настоящем документе. Предпочтительно, способ по настоящему изобретению обеспечивает получение клеточной популяции, лишенной клеток крови. Дополнительные аспекты клеточной популяции, полученной в способе по изобретению, описаны в третьем аспекте изобретения.
В предпочтительном варианте осуществления клетки, полученные в процессе размножения клеток по настоящему изобретению, разделяют на аликвоты и, необязательно, замораживают. Подходящим моментом времени для разделения на аликвоты и замораживания клеток является момент после завершения любого пассажа и последующего ферментативного отделения клеток, например, путем обработки трипсином, центрифугирования и ресуспендирования в ростовой среде. Клетки (клеточную популяцию), полученные таким образом и хранящиеся в замороженном состоянии, предпочтительно в аликвотах, также можно называть клеточным банком.
В одном предпочтительном варианте осуществления клетки замораживают после P2. Клетки (клеточную популяцию), полученные таким образом и хранящиеся в замороженном состоянии, предпочтительно в аликвотах, также можно называть первичным клеточным банком. В одном предпочтительном варианте осуществления первичный клеточный банк содержит, или состоит из клеток, которые были заморожены после 5-14 совокупных удвоений популяции (не считая совокупные удвоения популяции в процессе P0).
В одном дополнительном, но не взаимоисключающем, предпочтительном варианте осуществления клетки замораживают после P4. Клетки (клеточную популяцию), полученные таким образом и хранящиеся в замороженном состоянии, предпочтительно в аликвотах, также можно называть вторичным клеточным банком. В предпочтительном варианте осуществления вторичный клеточный банк содержит, или состоит из клеток, которые были заморожены после 14-25 совокупных удвоений популяции (не считая совокупные удвоения популяции в процессе P0).
Полученные таким образом замороженные аликвоты из соответствующего клеточного банка могут быть разморожены индивидуально в нужный момент времени. Иными словами, нет необходимости - и, как правило, нежелательно - размораживать все аликвоты клеточного банка одновременно. Напротив, разделение на аликвоты и индивидуальное замораживание аликвот обеспечивает то преимущество, что отдельные аликвоты можно доставать из морозильной камеры, размораживать и проводить дальнейшее культивирование (субкультивирование, дальнейшее размножение) в разные отдельные желательные моменты времени.
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
Полномасштабный цикл, начинающийся с человеческой пуповины, включающий этап (c) и продолжающийся до пассажа P2, как правило, приводит к получению первичного клеточного банка (ПКБ) из по меньшей мере 1×10 клеток, более предпочтительно по меньшей мере 2×10 клеток, более предпочтительно по меньшей мере 3×10 клеток, более предпочтительно по меньшей мере 4×10 клеток, более предпочтительно по меньшей мере 5×10 клеток, более предпочтительно по меньшей мере 6×10 клеток, более предпочтительно по меньшей мере 7×10 клеток, более предпочтительно по меньшей мере 8×10 клеток, более предпочтительно по меньшей мере 9×10 клеток, и в некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 10×10 клеток. В одном предпочтительном варианте осуществления первичный клеточный банк содержит, или состоит из клеток, которые были заморожены после 5-14 совокупных удвоений популяции (не считая совокупные удвоения популяции в процессе P0).
12
Благодаря превосходным пролиферативным свойствам клеток по изобретению клетки, однако, можно культивировать намного дольше, чем P2. Это можно осуществлять, либо перенося некоторые, или все, клетки, полученные в течение P2, после ферментативного отделения клеток (например, путем обработки трипсином) в следующий пассаж (P3), или путем создания первичного клеточного банка после P2, с последующим размораживанием одного или более флаконов клеток из первичного клеточного банка в нужный момент времени для инициации следующего пассажа (P3). В любом случае, после P3 могут следовать один или более дополнительных пассажей и, необязательно, можно создавать вторичный клеточный банк, например, после P4. Благодаря превосходным пролиферативным свойствам общее количество клеток после более позднего пассажа, например, P4, как правило, будет значительно выше, чем общее количество клеток после P2, для которого типичный выход указан выше. Например, после P4 общий выход клеток может быть по меньшей мере в 10 раз выше, чем после P2, но, более конкретно, по меньшей мере в 100 раз или по меньшей мере в 1000 раз выше, чем после P2. В некоторых вариантах осуществления после P4 общий выход может составлять по меньшей мере 10×10 клеток в одном полномасштабном цикле. Необязательно, вторичный клеточный банк получают после P4. В предпочтительном варианте осуществления такой вторичный клеточный банк содержит, или состоит из клеток, которые были заморожены после 14-25 совокупных удвоений популяции (не считая совокупные удвоения популяции в процессе P0).
Необязательно, выход можно дополнительно увеличивать путем дальнейшего субкультивирования, например, до пассажа P5 и далее.
Потенциал дифференциации
Потенциал клеток по изобретению можно оценивать экспериментально. Как правило, это осуществляют, помещая клетки в условия, которые благоприятны для дифференциации в один или более конкретных клеточных типов.
Предпочтительно, клетка(и), полученная после этапа (c), является по меньшей мере мультипотентной и, необязательно, плюрипотентной. В типичном варианте осуществления клетки, полученные после этапа (c), являются мультипотентными. Мультипотентность можно тестировать в анализах дифференциации, как известно в данной области. В определенных условиях мультипотентная клетка будет дифференцироваться в ткани (адипогенную, хондрогенную и остеогенную). В примерах 12, 13 и 14 показано, что клетки по настоящему изобретению обладают такими способностями. В определенных условиях клетка будет дифференцироваться в разные ткани (адипогенную, хондрогенную и остеогенную). Предпочтительно, мультипотентная клетка, получаемая способом по изобретению, имеет по меньшей мере все из следующих потенциалов дифференциации: (a) адипогенный; (b) хондрогенный; (c) остеогенный. В примерах 12, 13 и 14 показано, что клетка по настоящему изобретению обладает такими способностями. В данных примерах, в частности, в примере 12, описаны конкретные условия, допускающие дифференциацию, несмотря на быстрое размножение полученных из стромального вартонова студня клеток по изобретению.
Необязательно, клетка имеет дополнительные потенциалы дифференциации, выбранные из потенциалов дифференциации, типичных для мезенхимальных стромальных клеток. Однако, как характерно для мезенхимальных стромальных клеток, клетка по изобретению, как правило, не является тотипотентной.
Однако клетка по изобретению, как правило, не является тотипотентной. Тем не менее, клетку можно, необязательно, подвергать генетической манипуляции и/или ядерному перепрограммированию, что может оказывать влияние на потенциал дифференциации.
Связь с другими аспектами изобретения
Способом по изобретению может быть получена клетка, подробно описанная во втором аспекте изобретения. Способом по изобретению может быть получена клеточная популяция, подробно описанная в третьем аспекте изобретения. Например, способом по изобретению может быть получен клеточный банк. В одном варианте осуществления клеточный банк может быть получен способом по первому аспекту изобретения. В данном варианте осуществления за этапом (c) способа по изобретению, необязательно, следует этап (d) разделения на аликвоты клеток и этап (e) хранения клеток. Клетки можно хранить в любых подходящих условиях, хотя наиболее типичным способом является замораживание при температурах 180°C или менее. Клетки можно замораживать, предпочтительно, быстро замораживая их в жидком азоте. Перед замораживанием можно добавлять криопротектор.
Поскольку аспекты настоящего изобретения связаны друг с другом, варианты осуществления, описанные применительно к второму и третьему аспектам, также можно применять к первому аспекту, и наоборот. Например, за счет демонстрации существенного отсутствия эндотелиальных белков-маркеров путем определения профиля экспрессии или определения поверхностных маркеров, как описано во втором аспекте изобретения, можно экспериментально подтверждать, что аспект способа по первому аспекту изобретения, а именно, удаление эпителия, был выполнен надлежащим образом.
Особенно предпочтительно, если клеточная популяция, получаемая способом по первому аспекту изобретения, представляет собой клеточную популяцию, описанную ниже в третьем аспекте изобретения. Также особенно предпочтительно, если способ получения клетки по первому аспекту изобретения приводит к получению клетки, описанной во втором аспекте изобретения; таким образом, все варианты осуществления и признаки, описанные в настоящем документе, как относящиеся к клетке по второму аспекту настоящего изобретения, также подходят для описания характеристик способа получения клетки по первому аспекту настоящего изобретения. Также особенно предпочтительно, если клетка, получаемая способом по первому аспекту изобретения, представляет собой клетку, описанную во втором аспекте изобретения, приведенном далее.
Мезенхимальная стромальная клетка
Во втором аспекте настоящее изобретение относится к мезенхимальной клетке. Точнее, мезенхимальная клетка представляет собой мезенхимальную стромальную клетку (МСК). Признаки и варианты осуществления клетки описаны далее.
Некоторые признаки и варианты осуществления клетки по настоящему изобретению, описанные далее, связаны с физическими характеристиками клеток по изобретению. Исключительно для иллюстрации, и независимо от деталей, раскрытых в других разделах настоящего документа, физические характеристики включают такие характеристики, которые могут быть непосредственно определены физическими методами, например, экспрессию гена, размер, форму, и так далее, клетки. Некоторые признаки и варианты осуществления клетки по настоящему изобретению, описанные далее, связаны со способом, которым клетка по изобретению может быть получена, или получена. Исключительно для иллюстрации, и независимо от деталей, раскрытых в других разделах настоящего документа, характеристики клетки, связанные со способом, которым клетка по изобретению может быть получена, или получена, могут включать (a) анатомическое происхождение клетки, в частности, пуповина и стромальный вартонов студень в качестве ее предпочтительной секции, (b) условия, используемые для выделения клетки, и, необязательно, но предпочтительно, также (c) условия, используемые для размножения клетки.
Выделенная клетка
Предпочтительно, клетка по настоящему изобретению представляет собой выделенную клетку, в частности, выделенную мезенхимальную стромальную клетку. В частности, мезенхимальная стромальная клетка по изобретению предпочтительно представляет собой выделенную мезенхимальную стромальную клетку, полученную из межсосудистой области (для иллюстрации смотри фигуру 1) пуповины, или происходящую от такой клетки. Выделенная стромальная клетка может быть получена из стромы способом, включающим выделение, описанное в настоящем документе. Клетка может быть получена из такой клетки в результате размножения. Таким образом, как правило, когда говорят, что конкретная клетка «происходит от» другой клетки, имеют в виду, что конкретная клетка происходит от указанной другой клетки путем размножения (деления клеток) и/или дифференциации.
В одном варианте осуществления клетка представляет собой выделенную клетку, находящуюся за пределами тела человека или животного. Выделенная клетка, как правило, представляет собой клетку, находящуюся за пределами ее физиологического in vivo окружения. Предпочтительно, клетка представляет собой ex vivo клетку. В частности, ex vivo клетка предпочтительно находится за пределами пуповины. В частности, ex vivo клетка предпочтительно не находится в контакте с кровеносными сосудами, как в прямом контакте, так и в опосредованном контакте. В одном варианте осуществления ex vivo клетка находится в культуральном сосуде. В одном варианте осуществления ex vivo клетка находится в подходящем для хранения контейнере, таком как флакон. В одном варианте осуществления ex vivo клетка находится при температуре от примерно 35°C до 39°C, предпочтительно в культуральном сосуде. В одном варианте осуществления ex vivo клетка находится в подходящем для криоконсервации контейнере, например, в криофлаконе, предпочтительно при температуре -180°C или менее. В одном варианте осуществления ex vivo клетка находится в культуральном сосуде. В одном варианте осуществления ex vivo клетка является метаболически активной клеткой. В одном варианте осуществления ex vivo клетка является замороженной клеткой.
В одном варианте осуществления клетка характеризуется по меньшей мере одним признаком - структурным или функциональным - который обычно отсутствует у клетки из человеческой пуповины. Например, таким признаком может быть признак, характерный для способа, которым клетка по изобретению может быть получена. Такой структурный или функциональный признак может быть выбран из признаков, конкретно описанных в настоящем документе, и/или из признаков, не описанных конкретно в настоящем документе, но присущих клетке по изобретению, например, свойственных клетке, получаемой способом по изобретению. В одном варианте осуществления клетка представляет собой прикрепляющуюся клетку, например, прикрепляющуюся к культуральному сосуду, такому как культуральный сосуд с пластиковой нижней поверхностью.
Выделенная стромальная клетка по настоящему изобретению может быть размножена in vitro путем культивирования. Таким образом может быть получена производная клетка. Производная клетка также представляет собой клетку по изобретению при условии, что она соответствует заявленным характеристикам, определяющим клетку по изобретению. Таким образом, благодаря свойствам клетки по изобретению, подобным свойствам стволовых клеток, настоящее изобретение может охватывать многие поколения клеток. Многие поколения могут быть получены путем размножения, описанного в настоящем документе. Действительно, конкретный вариант осуществления клетки по настоящему изобретению включает размножение клетки ex vivo. Таким образом, хотя клетка является выделенной, она способна давать начало таким же, или аналогичным, клеткам и, таким образом, создавать клеточную популяцию. Такая клеточная популяция описана в третьем аспекте изобретения. Подходящие условия культивирования не имеют конкретных ограничений, но включают те, которые описаны в первом аспекте изобретения.
Подходящий неограничивающий способ выделения клетки, включающий ферментативную обработку, описан в настоящем документе в контексте первого аспекта настоящего изобретения. Выделение отдельных клеток, при необходимости, можно осуществлять, например, методом серийных разведений. Таким образом, предпочтительно, клетка по изобретению представляет собой клетку в ex vivo окружении, например, in vitro. Различные методы культивирования клеток in vitro может использовать на практике квалифицированный специалист, включая те, которые описаны применительно к первому аспекту настоящего изобретения.
Как правило, мезенхимальная стромальная клетка может происходить из разных тканей, таких как костный мозг, жировая ткань и пуповина. Предпочтительно, клетка по настоящему изобретению происходит, или получена, из пуповины, более предпочтительно из стромального вартонова студня пуповины. Однако клетка по изобретению не получена из пуповинной крови. Клетка также не является ни эпителиальной, ни эндотелиальной клеткой.
В одном варианте осуществления клетка по изобретению представляет собой свежевыделенную клетку. Свежевыделенная клетка представляет собой клетку, которая была непосредственно получена путем выделения из ткани, из которой она происходит, например, способом, описанным выше. Более предпочтительно, однако, если клетка по изобретению представляет собой клетку, которая получена из свежевыделенной клетки, в основном, как правило, путем размножения in vitro. Ограничения, как таковые, отсутствуют в отношении числа пассажей или совокупных удвоений популяции in vitro сразу после выделения клетки; однако, как правило, клетка по изобретению получена из свежевыделенной клетки путем размножения in vitro в течение 12 пассажей или менее, или эквивалентного числа совокупных удвоений популяции. В целом, любая клетка, соответствующая заявленным ограничениям, представляет собой клетку по изобретению, независимо от количества пассажей или совокупных удвоений популяции, в результате которых она получена после выделения из исходной ткани.
Как это свойственно мезенхимальным стромальным клеткам, клетка по изобретению, как правило, представляет собой прикрепляющуюся клетку при выращивании в культуральном сосуде, в частности, культуральном сосуде с пластиковой нижней поверхностью. Таким образом, в одном варианте осуществления мезенхимальная стромальная клетка по изобретению представляет собой прикрепляющуюся к поверхности клетку, в частности, прикрепляющуюся к пластику in vitro клетку. При необходимости, прикрепляющуюся к пластику клетку можно отделять от культурального сосуда, например, путем обработки трипсином. Таким образом можно получать не прикрепленные клетки. Изобретение также включает такую не прикрепленную клетку.
В одном варианте осуществления мезенхимальная стромальная клетка по изобретению имеет форму веретена. Это обычно имеет место, когда мезенхимальная стромальная клетка прикреплена к культуральному сосуду, такому как культуральный сосуд с пластиковой нижней поверхностью. В частности, в популяции мезенхимальных стромальных клеток большинство клеток, например, 50% или более по числу клеток, обычно имеют форму веретена, в частности, когда они прикреплены к пластиковой поверхности in vitro.
Когда клетка по изобретению не прикреплена, например, когда она была отделена при помощи фермента, например, путем обработки трипсином, например, когда она находится в первичном или вторичном клеточном банке, необязательно в замороженном состоянии, клетка обычно не имеет форму веретена. Таким образом, веретенообразная форма конкретно связана с прикреплением к поверхности в условиях культивирования.
В одном варианте осуществления клетка по изобретению может быть получена способом, описанным в первом аспекте изобретения. В данном варианте осуществления клетку по изобретению предпочтительно выбирают из свежевыделенной клетки, то есть, клетки, которую не подвергали ex vivo размножению, или размноженной клетки, то есть, клетки, получаемой путем ex vivo размножения ранее свежевыделенной клетки.
Экспрессия гена и экспонирование поверхностных антигенов
Клетка по настоящему изобретению может быть охарактеризована паттерном экспрессии генов. Используемый в настоящем документе термин «паттерн экспрессии генов» означает, что по меньшей мере один ген экспрессируется, или не экспрессируется, или экспрессируется на определенном уровне, в зависимости от обстоятельств. Таким образом, тот факт, что данный конкретный ген экспрессируется, или не экспрессируется, или экспрессируется на определенном уровне, характеризует клетку по изобретению, например, с целью отличать ее от эталонной клетки. То же самое относится к экспрессии более чем одного гена, например, двух генов, трех генов, четырех генов, пяти генов, шести генов, семи генов, восьми генов, девяти генов, десяти генов и так далее. Когда клетка по изобретению характеризуется экспрессией одного или более генов, нежелательно делать конкретное заявление об экспрессии любого другого гена, не упомянутого в данном контексте. В качестве иллюстративного примера, когда в настоящем документе указано, что клетка по изобретению экспрессирует APCDD1, это не следует воспринимать как заявление о том, что какой-либо конкретный другой ген также экспрессируется, или не экспрессируется, или экспрессируется на определенном уровне, если из контекста явно не следует иное.
Как правило, экспрессию гена можно тестировать различными методами, как на уровне нуклеиновой кислоты, так и на уровне белка. Экспрессию гена относительно часто тестируют в области молекулярной биологии, биохимии и клеточной биологии; любой метод, известный или подходящий для этого, может быть использован в контексте настоящего изобретения. Некоторые методы описаны ниже. Методы, связанные с экспрессией генов, также можно называть транскриптомными методами. Таким образом, профиль экспрессии генов клетки также можно называть транскриптомом. В одном варианте осуществления клетку по изобретению характеризуют на основании ее профиля экспрессии генов.
Можно использовать разные термины для описания анализа экспрессии гена: например, можно говорить, что экспрессию тестируют, анализируют, оценивают, исследуют, измеряют, определяют и так далее. Эти термины включают как качественное определение, то есть, ответ на вопрос экспрессируется ли соответствующий ген, так и количественное определение, то есть, ответ на вопрос на каком уровне соответствующий ген экспрессируется.
Как правило, для определения экспрессии гена образец, включающий одну клетку или множество клеток (что предпочтительнее), отбирают из клеточной популяции, и затем в данном образце анализируют экспрессию гена, при этом клетки в данном образце могут быть уничтожены или не уничтожены, в зависимости от обстоятельств. Поскольку клеточная популяция по настоящему изобретению обычно является однородной, то есть, практически все отдельные клетки, составляющие ее, являются очень похожими или аналогичными, факты, относящиеся к экспрессии гена в клетках, находящихся в образце, отобранном из клеточной популяции (репрезентативном образце), как правило, также будут относиться и к остальным клеткам в данной популяции, кроме тех случаев, когда из контекста явно следует иное и/или клеточная популяция не выглядит практически однородной.
Определение экспрессии какого-либо соответствующего гена может быть либо ненаправленным определением, то есть, когда экспрессию гена анализируют, как правило (например, путем широкого подхода, например, при помощи микрочипов), без сосредоточения на одном гене, или направленным определением, когда специально тестируют, экспрессируется ли конкретный ген. Во втором случае, в частности, соответствующий ген также можно называть «интересующим геном».
Можно использовать несколько транскриптомных технологий для получения данных с целью анализа экспрессии генов. Например, при помощи ДНК-микрочипов измеряют относительную активность ранее идентифицированных целевых генов. Методы, основанные на определении последовательности, такие как РНК-сек, предоставляют информацию о последовательностях генов в дополнение к уровню их экспрессии.
Клетка по изобретению представляет собой клетку плацентарного животного, предпочтительно млекопитающего, предпочтительно примата, более предпочтительно человека. Таким образом, в одном варианте осуществления мезенхимальные стромальные клетки (МСК) по изобретению представляют собой клетки млекопитающего. Таким образом, если специально не указано иначе, все указания на конкретный ген относятся к соответствующему гену млекопитающего.
Более предпочтительно, мезенхимальная стромальная клетка по изобретению представляет собой клетку примата, более конкретно, клетку человека. Таким образом, более предпочтительно, мезенхимальные стромальные клетки (МСК) по изобретению представляют собой человеческие клетки. Таким образом, в данном варианте осуществления все указания на конкретный ген относятся к соответствующему гену человека. В некоторых случаях это очевидно из контекста, например, в случае с человеческими лейкоцитарными антигенами (HLA), в других случаях это конкретно не указано в контексте, но очевидно: например, применительно к клетке человека экспрессия APCDD1 означает экспрессию человеческого APCDD1, и так далее. Поскольку клетка по изобретению в одном предпочтительном варианте осуществления представляет собой клетку человека, предпочтительно, если клетка по настоящему изобретению в данном варианте осуществления экспрессирует человеческий APCDD1.
Предпочтительно, клетка по изобретению не является трансгенной клеткой. Таким образом, в данном варианте осуществления все указания, относящиеся к экспрессии конкретного гена, означают, что соответствующий ген экспрессируется с генома, в котором он закодирован, более конкретно, в котором он закодирован по менделевскому принципу наследования. Однако в некоторых альтернативных вариантах осуществления клетка по изобретению представляет собой трансгенную клетку.
Предпочтительно, экспрессию генов тестируют по меньшей мере в дублированных образцах, предпочтительно по меньшей мере в трехкратно повторенных образцах. В некоторых случаях клетки, подвергнутые тестированию, погибают, попадают в нестерильные условия или иным образом повреждаются при проведении анализа и не могут быть использованы для культивирования; тем не менее, информация, полученная от этих погибших, утративших стерильность или иным образом поврежденных клеток, все еще является ценной, особенно, когда клетки происходят из однородной клеточной популяции; разумно предполагать, что полученная таким образом информация, в частности, информация, касающаяся экспрессии генов, может быть применима не только к погибшим, утратившим стерильность или иным образом поврежденным анализируемым клеткам, но также к другим клеткам в популяции, из которой происходят соответствующие анализируемые клетки. Можно предполагать, что такая информация применима как к самой клеточной популяции, так и к любой отдельной клетке, содержащейся в такой клеточной популяции. В данном контексте «однородная» означает, что практически все клетки являются очень похожими или аналогичными.
Образец может состоять из одной клетки или, альтернативно, он может содержать множество клеток. Не существует четкого верхнего предела общего количества клеток, содержащихся в образце; однако это количество, как правило, намного меньше, чем общее количество клеток, содержащихся в клеточной популяции; например, оно составляет 1/100 или менее, 1/100 или менее, 1/1000 или менее, 1/10000 или менее, 1/100000 или менее, 1/1000000 или менее, от количества клеток, содержащихся в клеточной популяции.
В самых общих чертах, экспрессию гена можно тестировать непосредственно, например, как правило, методами молекулярной биологии, включая определение присутствия и, при необходимости или желании, уровней генного продукта, такого как конкретная матричная РНК (мРНК), либо ее предшественник или продукт деградации; или, альтернативно, экспрессию гена можно тестировать опосредованно, например, как правило, биохимическими методами, включая определение присутствия и, при необходимости или желании, уровней белка, закодированного конкретным геном, например, конкретного белка клеточной поверхности, либо его предшественника или продукта деградации. Подходящие поверхностные белки для характеризации клетки по изобретению включают, в частности, кластеры дифференцировки (CD).
Любой известный метод тестирования экспрессии гена также можно использовать по настоящему изобретению. Подходящие методы включают методы, выбранные из списка, включающего, но без ограничения, профилирование экспрессии генов, полимеразную цепную реакцию, такую как ПЦР, например, предпочтительно, количественная ПЦР (кПЦР), включая ОТ-кПЦР, секвенирование продуктов транскрипции, любой тип транскриптомного анализа и другие. На уровне нуклеиновой кислоты предпочтительные методы включают использование микрочипов и кПЦР.
В одном варианте осуществления экспрессию генов определяют путем профилирования экспрессии генов. В области молекулярной биологии профилирование экспрессии генов означает измерение экспрессии нескольких, часто тысяч, генов, как правило, всех одновременно, для получения глобальной картины клеточной экспрессии генов. Например, профилирование экспрессии генов представляет собой измерение экспрессии нескольких, как правило, но не обязательно, тысяч, генов одновременно, для получения глобальной картины клетки. Профилирование экспрессии генов позволяет, например, различать клетки по изобретению и другие клетки. Возможно даже одновременно определять экспрессию всего генома, то есть, каждого гена, присутствующего в конкретной клетке. Во многих экспериментах такого типа производят измерения одновременно для всего генома, то есть, для каждого гена, присутствующего в конкретной клетке. Можно использовать некоторые транскриптомные технологии для получения необходимых для анализа данных. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предпочтительным является использование микрочипов. Микрочипы позволяют определять относительную экспрессию генов, включая один или более интересующих генов, таких как, например, APCDD1. Без связи с какой-либо конкретной теорией, понятно, что в настоящее время профилирование экспрессии генов обеспечивает получение максимально возможной глобальной картины экспрессии генов в одном эксперименте.
Как правило, анализ с использованием микрочипов является подходящим методом профилирования экспрессии генов. Действительно, микрочип предпочтительно используют для этой цели в настоящем изобретении. Как известно, анализ с микрочипами показывает, экспрессируются ли дифференциально некоторые конкретные гены в клетке, в сравнении, например, с клеткой, полученной способом предшествующего уровня техники. Микрочипы коммерчески доступны и могут быть использованы в контексте настоящего изобретения.
В одном варианте осуществления экспрессию генов определяют в эксперименте с высокой пропускной способностью. В альтернативном варианте осуществления экспрессию генов определяют в эксперименте, который не является экспериментом с высокой пропускной способностью, например, в конкретном эксперименте, направленном на определение конкретного гена. В одном варианте осуществления экспрессию генов определяют как в эксперименте с высокой пропускной способностью, так и в эксперименте, который не является экспериментом с высокой пропускной способностью; в таком случае эксперимент с высокой пропускной способностью, как правило, проводят первым; и эксперимент, который не является экспериментом с высокой пропускной способностью, проводят впоследствии на более позднем этапе, например, для подтверждения результатов, полученных в эксперименте с высокой пропускной способностью. Например, за анализом с использованием микрочипов (с высокой пропускной способностью) может следовать, например, с целью валидации или подтверждения экспрессии конкретных генов, кПЦР (не с высокой пропускной способностью).
Основанные на определении последовательности методы, включая секвенирование с высокой пропускной способностью, такое как секвенирование следующего поколения (NGS), можно использовать для определения экспрессии генов по настоящему изобретению. Например, РНК-сек (секвенирование РНК), также называемое секвенированием методом дробовика всего транскриптома, может обеспечивать информацию о последовательностях генов, помимо их уровня экспрессии. В методе РНК-сек используют секвенирование следующего поколения (NGS) для определения присутствия и количества РНК в биологическом образце в конкретный момент времени. В одном варианте осуществления экспрессию гена определяют методом, основанным на последовательности, таким как РНК-сек или ПЦР и любые их вариации.
Экспрессию некоторых, или всех, генов, например, определенную методом профилирования экспрессии генов, например, с использованием микрочипов, затем можно подтверждать методом количественной ОТ-ПЦР (кОТ-ПЦР).
Как известно, количественная полимеразная цепная реакция (кПЦР, также известная как полимеразная цепная реакция в реальном времени (ПЦР в реальном времени)), является лабораторным методом, основанным на полимеразной цепной реакции (ПЦР), который подходит для определения количества нуклеиновой кислоты. В частности, для определения количества транскрипта (например, мРНК) предпочтительным методом является количественная полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (кОТ-ПЦР). В сравнении с другими методами количественного определения РНК, такими как нозерн-блоттинг, кОТ-ПЦР обычно считают более эффективным, чувствительным и количественным анализом для определения уровней РНК и, следовательно, он является предпочтительным по настоящему изобретению. Метод кОТ-ПЦР также является намного более чувствительным методом для определения экспрессии генов, чем опосредованное определение продукта экспрессии генов на уровне белка, такое как иммунологическое определение, например, путем связывания флуоресцентных первичных или вторичных антител и проточной цитометрии. Для кОТ-ПЦР, как правило, необходимы специфические праймеры для соответствующей нуклеиновой кислоты, последовательность которой, однако, обычно доступна из базы данных о последовательностях, например, для человеческих генов, или которые могут быть спроектированы квалифицированным специалистом на основании такой информации. Доступны коммерческие наборы и приборы для кОТ-ПЦР, и их можно использовать по настоящему изобретению. Нуклеиновая кислота, которая служит матрицей (также называемая «целевой нуклеиновой кислотой») для определения экспрессии гена в кОТ-ПЦР, представляет собой продукт транскрипции, как правило, мРНК.
кПЦР, как правило, проводят всего в течение 35-45 последовательных циклов, более предпочтительно 38-42 циклов и наиболее предпочтительно 40 циклов. Если флуоресценция отсутствует даже после завершения всего количества циклов, делают вывод о том, что целевая нуклеиновая кислота отсутствует в анализируемом образце.
Предпочтительно, экспрессию генов определяют методом кПЦР (предпочтительно кОТ-ПЦР), при этом определяют уровни экспрессии интересующего гена и предпочтительно сравнивают с уровнями экспрессии гена «домашнего хозяйства». Для этой цели предпочтительным геном «домашнего хозяйства» является ген бета-актина (смотри, например, фигуру 8).
Как стандартно принято в данной области, паттерны экспрессии генов при определении методом кОТ-ПЦР имеют показатели Ct и dCt, соответственно: как правило, в кПЦР Ct (пороговое число циклов) определяют как число циклов, необходимое для того, чтобы флуоресцентный сигнал пересек порог (то есть, превысил фоновый уровень). Как правило, значение Ct обратно пропорционально количеству соответствующей (целевой) нуклеиновой кислоты в образце (то есть, чем ниже значение Ct, тем больше количество соответствующей (целевой) нуклеиновой кислоты в образце). Значение Ct является специфическим для экспрессии одного гена. Дельта Ct (dCt) показывает разницу в экспрессии 2 генов, как правило, интересующего гена и гена «домашнего хозяйства», такого как ген бета-актина (смотри, например, фигуру 8).
Предпочтительно, клетка по изобретению экспрессирует по меньшей мере один ген, специфический для мезенхимальных стромальных клеток.
Клетка по изобретению характеризуется, в частности, тем, что она экспрессирует APCDD1. В частности, клетка экспрессирует APCDD1. Авторы изобретения обнаружили, что гены, специфические для мезенхимальных стромальных клеток по настоящему изобретению, входят в список, включающий, но без ограничения, APCDD1 и PPARG, и, необязательно, FLVCR2. Более предпочтительно, указанный по меньшей мере один ген, специфический для стромальных клеток, экспрессируется на высоких уровнях относительно гена «домашнего хозяйства» бета-актина, в сравнении с соотношением экспрессии или соотношением указанного по меньшей мере одного гена и гена бета-актина в эталонных клетках. Пример такого фенотипа приведен в примере 8.
Хотя ранее в литературе были высказаны сомнения относительно того, отличаются ли не околососудистые МСК от околососудистых МСК (например, Davies et al., Stem Cells Translational Medicine, 2017, vol. 6, p. 1620-1630), настоящее изобретение предоставляет доказательства (например, пример 8) того, что клетки из стромального вартонова студня, полученные по настоящему изобретению, отличаются от околососудистых МСК.
В одном варианте осуществления экспрессию генов определяют опосредованно, то есть, не путем определения первичного продукта транскрипции, мРНК, либо ее предшественника или продукта ее деградации, но путем определения последующего образующегося специфического продукта. Как правило, последующий образующийся специфический продукт представляет собой белок, закодированный мРНК; однако это также может быть любой другой специфический продукт, такой как, например, метаболит, специфический для присутствия конкретного, например, ферментативно активного, белка.
Предпочтительно определяют присутствие белка. Более предпочтительно определяют присутствие белка на клеточной поверхности. Иными словами, определяют, экспонирован ли белок на клеточной поверхности.
Клетки, экспонирующие конкретный белок на клеточной поверхности, могут быть проанализированы, например, при помощи иммунологически активных молекул, таких как специфические антитела и другие иммунореактивные молекулы. Термин «клеточная поверхность» используется в настоящем документе в соответствии с его обычным значением в данной области и, таким образом, конкретно включает внешнюю сторону клетки, доступную для связывания белками и другими молекулами. Белок экспонируется на поверхности клетки, если он, по меньшей мере частично, расположен на поверхности указанной клетки и доступен для связывания антигенсвязывающими молекулами, такими как специфические для антигена антитела, добавленные к клетке. В одном варианте осуществления белок, экспонируемый на поверхности клетки, представляет собой интегральный мембранный белок, имеющий внеклеточную часть, которую может узнавать антитело. Термин «внеклеточная часть», или «экзодомен», в контексте настоящего изобретения означает часть молекулы, в частности, белок, который направлен во внеклеточное пространство клетки и предпочтительно доступен на внешней стороне указанной клетки, например, для связывающих молекул, таких как антитела, находящиеся за пределами клетки. Предпочтительно, термин относится к одной или более внеклеточным петлям, или доменам, или их фрагментам. Термин «часть» используют в настоящем документе для обозначения непрерывного или прерывистого элемента структуры, такой как аминокислотная последовательность. Часть, или фрагмент, белковой последовательности предпочтительно содержит по меньшей мере 5, в частности, по меньшей мере 8, по меньшей мере 12, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 30, по меньшей мере 50 или по меньшей мере 100 последовательных и/или не последовательных аминокислот аминокислотной последовательности, составляющей белок.
Белок, который может быть обнаружен антителом, или другой иммунореактивной молекулой, также можно называть антигеном. В некоторых вариантах осуществления клетка по изобретению может характеризоваться экспонированием - или не экспонированием - одного или более специфических антигенов. В контексте настоящего изобретения такой антиген предпочтительно экспонируется на поверхности клетки. Такой антиген также может быть назван «поверхностным антигеном». Примеры их приведены в примере 7.
В соответствии с общими принципами клеточной биологии, если антиген экспонируется на поверхности клетки, то ген, кодирующий антиген, экспрессируется в клетке. Таким образом, обнаружение антигена, который экспонирован на поверхности клетки, является опосредованным способом демонстрации того, что ген, кодирующий антиген, экспрессируется. Например, когда в настоящем документе указано, что клетка экспрессирует конкретный ген, кодирующий антиген, экспрессируемый на поверхности клетки, тогда экспрессию указанного гена можно либо тестировать непосредственно на уровне экспрессии генного продукта (такого как мРНК), либо опосредованно на уровне белка, экспонированного на поверхности клетки. Хотя слово «экспрессирует» в прямом смысле означает, что ген экспрессируется, слово «экспрессирует» также может означать, что белок, в частности, белок клеточной поверхности, который закодирован указанным геном, экспонируется на клетке.
В соответствии с изобретением, антиген экспонируется на клетке, если уровень экспрессии выше предела обнаружения, и/или если уровень экспрессии является достаточно высоким, чтобы допустить связывание специфическими для антигена антителами, добавленными к клетке. В соответствии с изобретением, говорят, что антиген не экспрессируется на клетке, если уровень экспрессии ниже предела обнаружения, и/или если уровень экспрессии является слишком низким, чтобы допустить связывание специфическими для антигена антителами, добавленными к клетке. Предпочтительно, антиген, экспрессируемый в клетке, экспрессируется или экспонируется, то есть, присутствует, на поверхности указанной клетки и, таким образом, доступен для связывания специфическими для антигена молекулами, такими как антитела, или другие иммунореактивные молекулы, добавленными к клетке. В некоторых случаях также добавляют вторичную молекулу, которая способствует обнаружению, такую как, например, необязательно, меченое вторичное антитело.
Антитело, или другая иммунореактивная молекула, может узнавать эпитоп на клетке. Термин «эпитоп» означает антигенную детерминанту в такой молекуле, как антиген, то есть, часть, или фрагмент, молекулы, которую узнает, то есть, связывает, компонент иммунной системы, например, которую узнает антитело, или другая иммунореактивная молекула. Обнаружение эпитопа, специфического для какого-либо конкретного антигена, как правило, позволяет сделать вывод о том, что данный конкретный антиген экспрессируется на анализируемой клетке.
В одном варианте осуществления клетка по изобретению может быть охарактеризована иммунофенотипированием. «Иммунофенотипирование», как правило, означает, что клетка может быть охарактеризована при помощи специфических для антигена молекул, таких как антитела, или другие иммунореактивные молекулы, которые добавляют к клетке для определения того, экспрессируется ли антиген на клетке. Иммунофенотипирование включает сортировку клеток различными методами, в том числе, методом проточной цитометрии.
Предпочтительным методом иммунофенотипирования является проточная цитометрия, в частности, FACS. Аналит, в частности, белок клеточной поверхности, узнается, как правило, антителом, или другой иммунореактивной молекулой. Антитело, или другая иммунореактивная молекула, либо само является меченым флуорофором, либо его узнает меченое флуорофором вторичное антитело, или другая иммунореактивная молекула, которое добавляют для этой цели.
Предпочтительными аналитами, подходящими для иммунофенотипирования в контексте настоящего изобретения, являются молекулы, принадлежащие к кластеру дифференцировки (также известному как кластер дифференциации или детерминанта классификации, и в настоящем документе сокращенно обозначаемому CD). CD является термином, используемым для идентификации и изучения молекул клеточной поверхности методом иммунофенотипирования клеток. Некоторые примеры кластеров дифференцировки, подходящих для характеризации вариантов осуществления клетки по изобретению, описаны в настоящем документе. Если из контекста явно не следует иное, при упоминании какой-либо молекулы кластера дифференцировки (CD) подразумевают, что экспрессию соответствующей молекулы CD предпочтительно определяют иммунофенотипированием; однако также возможно определение на уровне нуклеиновой кислоты. В настоящем документе ссылка на конкретные молекулы CD применительно к человеческим клеткам должна означать соответствующую конкретную молекулу CD, соответствующую определениям, принятым на Рабочих совещаниях I-IX по дифференцирующим антигенам лейкоцитов человека. В примере 7 приведено иллюстративное и полезное описание иммунофенотипирования по настоящему изобретению.
С другой стороны, если из контекста явно не следует иное, когда в настоящем документе упоминается экспрессия какого-либо гена, не являющегося молекулой кластера дифференцировки (CD) или нуклеиновой кислотой, кодирующей ее, подразумевается, что экспрессию соответствующего гена предпочтительно определяют на уровне нуклеиновой кислоты, предпочтительно, способом, упомянутым или описанным выше.
Во-первых, МСК по изобретению характеризуются тем, что она (a) экспрессирует APCDD1. Экспрессию APCDD1 предпочтительно определяют по уровню экспрессии гена, наиболее предпочтительно методом кОТ-ПЦР. Пример приведен на фигуре 8.
Без связи с какой-либо конкретной теорией, считается, что APCDD1 важен для способности клеток к самообновлению: ранее показано, что генный продукт способствует поддержанию высоких уровней бета-катенина, и высокий уровень бета-катенина способствует поддержанию стволовости клеток, в частности, МСК (Viale-Bouroncle et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 2015 vol. 457, p. 314-317; Yu, Cell Transplant., 2017, vol. 26, p. 365-377). Как показано в примере 8, клетки по настоящему изобретению отличаются от клеток, происходящих из ОСВС, в частности, экспрессией APCDD1. Таким образом, APCDD1-экспрессирующая клетка по настоящему изобретению четко отличается от МСК, описанной в предшествующем уровне техники, смотри, в частности, WO 2004/072273 A и Sarugaser et al., 2005, Stem Cells, vol. 23, p. 220-229.
Однако МСК по настоящему изобретению не экспрессирует 3G5. 3G5 представляет собой маркер околососудистых клеток. Таким образом, клетка по изобретению не является околососудистой клеткой. Таким образом, предпочтительно, клетка по изобретению не экспрессирует какой-либо маркер околососудистой клетки, который в то же время не является также маркером мезенхимальной клетки и/или стволовой клетки.
Предпочтительно, клетка экспрессирует по меньшей мере один ген, специфический для стромальных клеток, более конкретно, для мезенхимальных стромальных клеток. Предпочтительно, клетка экспонирует по меньшей мере один поверхностный маркер, специфический для стромальных клеток, более конкретно, для мезенхимальных стромальных клеток, на ее поверхности.
В одном варианте осуществления по меньшей мере один поверхностный маркер, специфический для стромальных клеток, более конкретно, для мезенхимальных стромальных клеток, выбирают из списка, включающего, но без ограничения, мембранный кофакторный белок (CD46), фактор ускорения распада или CD55, и MAC-ингибирующий белок (CD59). Все три маркера, как описано ранее, связаны с каскадом комплемента. Как показано на фигуре 7B, клетки, описанные в настоящем документе, экспонируют эти маркеры на своей поверхности. Без связи с какой-либо конкретной теорией, считается, что один или более из этих поверхностных маркеров играют определенную роль в защите клеток от опосредованного комплементом лизиса клеток in vivo. Предпочтительно, клетка экспрессирует по меньшей мере один из CD46, CD55 и CD59, более предпочтительно по меньшей мере любые два из CD46, CD55 и CD59, и наиболее предпочтительно все из CD46, CD55 и CD59. Насколько известно авторам изобретения, CD46, CD55 и CD59 ранее не были описаны в специфических полученных из ПК МСК, хотя, безусловно, нельзя исключать, что некоторые клетки действительно экспрессируют одну или более из этих поверхностных молекул.
Предпочтительно, клетка по настоящему изобретению экспрессирует CD73. CD73 также известен как экто-5’-нуклеотидаза и является маркером мезенхимальных стромальных клеток (МСК), смотри Dominici et al., 2006 (Cytotherapy, vol. 8, p. 315-317).
Предпочтительно, клетка по настоящему изобретению экспрессирует CD105. CD105 (также известный как эндоглин) также является маркером мезенхимальных стромальных клеток (МСК), смотри Dominici et al., 2006 (Cytotherapy, vol. 8, p. 315-317).
Предпочтительно, клетка по настоящему изобретению экспрессирует CD90. CD90 (также известный как Thy-1) также является маркером мезенхимальных стромальных клеток (МСК), смотри Dominici et al., 2006 (Cytotherapy, vol. 8, p. 315-317).
В наиболее предпочтительном варианте осуществления клетка по настоящему изобретению экспрессирует как CD105, так и CD73. В дополнение к общим методам, описанным выше, эти кластеры дифференцировки можно обнаруживать, например, при помощи антител SH2 и SH3 (Horwitz et al., Curr. Opin. Hematol., 2006, vol. 13, p. 419-425). Обычно мезенхимальная стромальная клетка по настоящему изобретению экспрессирует как CD105, так и CD73, и предпочтительно также CD90. Таким образом, экспрессия CD105 и/или CD73, и/или CD73 может быть предпочтительной в качестве признака, позволяющего отличать клетки по изобретению от некоторых других клеток. Более предпочтительно, клетка экспрессирует, в дополнение к любому одному или более из CD105 и/или CD73, и/или CD73, также по меньшей мере один из CD46, CD55 и CD59, более предпочтительно по меньшей мере любые два из CD46, CD55 и CD59, и наиболее предпочтительно все из CD46, CD55 и CD59.
В предпочтительном варианте осуществления клетка также экспрессирует PPARG. Пример приведен на фигуре 8. Без связи с какой-либо конкретной теорией, считается, что продукт гена PPARG способен поддерживать у клеток, в частности МСК, мультипотентный фенотип, в частности для предотвращения дифференциации в костную ткань. Для получения подробной информации смотри, например, Xu et al. (Curr. Stem Cell Res. Ther., 2016, vol. 11, p. 247-254).
В другом, и не взаимоисключающем, предпочтительном варианте осуществления клетка также экспрессирует ген FLVCR2. Пример приведен на фигуре 8. Аббревиатура FLVCR2 означает представитель 2 семейства клеточных рецепторов подгруппы С вируса лейкемии кошек. Закодированный FLVCR2 белок представляет собой трансмембранный белок, представитель суперсемейства мембранных транспортеров, который действует в качестве переносчика кальция. В живых организмах закодированный белок, как описано ранее, играет определенную роль в развитии клеток эндотелия сосудов головного мозга.
В предпочтительном варианте осуществления клетка не экспрессирует CD117. CD117 представляет собой клеточный поверхностный маркер, специфический для некоторых типов гемопоэтических (кровяных) клеток-предшественников, например, в костном мозге. Клетка по изобретению не является клеткой крови, и предпочтительно также не является клеткой костного мозга. CD117 также связан с некоторыми видами рака; однако клетка по изобретению обычно не является раковой клеткой. Иными словами, раковые клетки не называют в настоящем документе клетками по изобретению.
Клетка по изобретению предпочтительно экспрессирует MHC I. В случае человеческой мезенхимальной стромальной клетки предпочтительно, если человеческая клетка экспрессирует по меньшей мере один, предпочтительно по меньшей мере любое сочетание из двух, и наиболее предпочтительно все из человеческих лейкоцитарных антигенов HLA-A, HLA-B и HLA-C.
В некоторых вариантах осуществления клетка по изобретению не экспрессирует MHC II, или экспрессирует MHC II на низких уровнях. «Низкие уровни» является сравнительным выражением, указывающим на то, что уровни экспрессии являются более низкими, чем уровни в антигенпредставляющих клетках от того же индивидуума, например, дендритных клетках, мононуклеарных фагоцитах и B-клетках от того же индивидуума. В одном варианте осуществления клетка практически не экспрессирует MHC II. В частности, в случае человеческой мезенхимальной стромальной клетки предпочтительно, если клетка не экспрессирует какой-либо один или более из человеческих лейкоцитарных антигенов HLA-DP и/или HLA-DQ. Необязательно, HLA-DR также не экспрессируется; альтернативно, HLA-DR экспрессируется на низких уровнях. Отсутствие экспрессии этих человеческих лейкоцитарных антигенов (HLA), или экспрессия на низких уровнях, делает клетку по изобретению иммунологически привилегированной, что делает возможным, например, совместное культивирование с клетками от несовпадающих по HLA индивидуумов, и даже клетками от других биологических видов, включая клетки иммунной системы. Экспрессию этих человеческих лейкоцитарных антигенов можно тестировать, например, путем поверхностного окрашивания специфическими антителами, или методом кОТ-ПЦР.
В одном варианте осуществления клетка по изобретению является отрицательной по поверхностным маркерам CD34 и/или CD45. Это означает, что клетка не экспонирует CD34 и/или CD45.
В одном варианте осуществления клетка по изобретению продуцирует простагландин E2 (PGE2). Как известно, простагландин E2 (PGE2), также известный как динопростон, представляет собой природный простагландин, описанный в качестве активатора сигнального пути Wnt (Goessling et al., Cell, 2009, vol. 136, p. 1136-1147). Несколько коммерческих продуктов, в частности, наборы для ELISA, доступны для определения продуцирования PGE2. Обнаружение можно проводить с использованием или клеточного супернатанта, или клеточного лизата, либо их сочетания, в качестве образца.
В одном варианте осуществления клетка по изобретению экспрессирует один или более маркеров стволовых клеток. Такие маркеры стволовых клеток могут включать, как правило, маркеры, выбранные из, но без ограничения, Oct-4 и Nanog.
Размер клеток
Помимо других признаков и вариантов осуществления, описанных в настоящем документе, клетка по настоящему изобретению предпочтительно также характеризуется относительно небольшим размером. Размер может быть описан, например, на основании клеточного объема, клеточного диаметра или клеточной площади поверхности, или на основании параметра, который коррелирует с клеточным объемом, с клеточным диаметром или с клеточной площадью поверхности. Размер также может быть описан на основании сочетания любых из перечисленных параметров. «Относительно» означает в сравнении с другими клетками, в частности, в сравнении с мезенхимальными стромальными клетками из других источников и/или выделенными другими способами. «Другие источники» означает другие анатомические области, такие как, например, другие органы, например, костный мозг, но также и другие секции пуповины, такие как околососудистая зона, а также любой околососудистый вартонов студень.
Без связи с какой-либо конкретной теорией, считается, что в некоторых вариантах осуществления более мелкие клетки (например, клетки с меньшим диаметром и/или клетки с меньшей площадью поверхности) являются более ранними в клеточном цикле. Методы определения состояния клеточного цикла МСК опубликованы (например, Achille et al., J. Cell. Biochem., 2011, vol. 112, p. 1817-1821) и могут быть применены к клеткам по настоящему изобретению, например, для аналитических целей.
В соответствии с настоящим изобретением, значение прямого светорассеяния (FSC), определенное для отдельной клетки методом проточной цитометрии, коррелирует с клеточным объемом. Более крупные клетки, то есть, в частности, клетки с большим объемом, характеризуются более высокими значениями FSC, и наоборот. Как известно, значение FSC является безразмерным числом. Для определения FSC одну или более клеток анализируют методом проточной цитометрии. Как правило, значения FSC, определенные методом проточной цитометрии, зависят от используемого прибора, в частности, характеристик лазера и мощности фотоумножителей в разных приборах. Следовательно, не существует абсолютного значения FSC, значение, как правило, зависит от используемого прибора и лазера. Таким образом, для гарантии воспроизводимости следующие детали, в сочетании, являются предпочтительными в контексте настоящего изобретения.
В настоящем изобретении при определении значения FSC методом проточной цитометрии длина волны возбуждения предпочтительно находится в диапазоне 470-500 нм, наиболее предпочтительно 488 нм, и определяют прямое светорассеяние (FSC). Сама клетка не обязательно должна быть флуоресцентной для определения FSC. Для такого определения методом проточной цитометрии, как правило, используют коммерческий прибор для проточной цитометрии. В предпочтительном варианте осуществления используют проточный цитометр FACSAria III (BD Biosciences) с длиной волны возбуждения 488 нм. Все конкретные числовые значения FSC, приведенные далее, предпочтительно относятся к указанным условиям, то есть, указанному цитометру и указанной длине волны. Предпочтительно, клетка по изобретению характеризуется значением FSC, составляющим 60 или менее, например, 59 или менее, например, 58 или менее, например, 57 или менее, например, 56 или менее, например, 55 или менее, например, 54 или менее, например, 53 или менее, например, 52 или менее, например, 51 или менее, или даже 50 или менее. В некоторых вариантах осуществления клетка по изобретению характеризуется значением FSC, составляющим 32-58, например, 33-57, например, 34-56, например, 35-55, например, 36-54, например, 37-53, например, 38-52, например, 39-51, например, 40-50, например, 41-49, например, 42-48, например, 43-47, например, 44-46. В предпочтительном варианте осуществления значение FSC составляет примерно 45. Эти конкретные числовые значения FSC относятся к определению с использованием проточного цитометра FACSAria III в условиях, описанных выше.
Предпочтительно, клетка по изобретению характеризуется значением FSC, которое меньше, чем значение FSC происходящей из ОСВС клетки. Предпочтительно, значение FSC клетки по изобретению значительно меньше, чем значение FSC происходящей из ОСВС клетки, смотри, например, пример 4.
Предпочтительно, клетка по изобретению имеет меньший клеточный объем, чем объем происходящей из ОСВС клетки. Более предпочтительно, клетка по изобретению имеет значительно меньший клеточный объем, чем объем происходящей из ОСВС клетки. Клеточный объем можно опосредованно определять путем определения значения FSC методом проточной цитометрии (подробную информацию по определению значения FSC смотри выше). Затем, для сравнительных целей, гранулу известного размера, необязательно, подвергают проточной цитометрии в идентичных условиях; таким образом можно определять клеточный объем на основании экспериментально определенного значения FSC для клетки и экспериментально определенного значения FSC для гранулы, а также известного объема гранулы. Используемая гранула предпочтительно имеет коэффициент преломления, аналогичный или практически идентичный коэффициенту преломления МСК. Коммерчески доступна программа для расчета клеточного объема на основании экспериментально определенного значения FSC. Предпочтительными инструментами для определения клеточного объема являются FACS ARIA III и FACS DIVA (оба от компании Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA). Анализ данных выполняют с использованием программы FACS DIVA версии 6.0, которая обычно прилагается к FACS ARIA III. Используют стандартную конфигурацию FACS DIVA. Для сравнения нескольких образцов, или клеток, на основании значений FSC необходимо всегда использовать один и тот же инструмент и всегда с одними и теми же настройками для фотоумножителей FSC.
FSC и, таким образом, клеточный объем, можно определять как для свежевыделенных клеток, так и для культивируемых и отделенных при помощи фермента - например, трипсина - клеток. Однако FSC и клеточный объем предпочтительно определяют для не прикрепленных клеток. Для проведения проточной цитометрии любую прикрепляющуюся клетку перед определением клеточного объема необходимо отделять от поверхности культурального сосуда, к которой она прикреплена, как правило, путем ферментативной обработки, более конкретно, путем обработки трипсином. Более конкретно, FSC, как правило, определяют, подвергая не прикрепленные клетки проточной цитометрии и определяя прямое светорассеяние (FSC). Коммерчески доступна программа для определения клеточного объема на основании экспериментально определенного значения FSC. Предпочтительной коммерческой программой для определения клеточного объема по настоящему изобретению является программа BD FACSDiva (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA).
Хотя авторы изобретения показали, что клетки по настоящему изобретению являются относительно однородными, как правило, имеют место некоторые вариации, как и во всех биологических продуктах, в том числе и в отношении клеточного объема. Вследствие этого, клеточный объем также можно описывать как средний клеточный объем. В популяции из множества клеток средний клеточный объем предпочтительно представляет собой клеточный объем, соответствующий клеточному объему клеток, полученных, как описано в примере 1 и примере 2A для экспериментального определения FSC. В примере 4 описано иллюстративное определение FSC множества клеток методом проточной цитометрии и прямого светорассеяния. «Средний объем» представляет собой среднее арифметическое значение экспериментально определенных объемов отдельных клеток. Как правило, «средний объем» представляет собой среднее арифметическое значение объемов по меньшей мере 1000 отдельных событий, например, по меньшей мере 5000 отдельных событий, например, по меньшей мере 10000 отдельных событий, в некоторых вариантах осуществления 100-100000000 отдельных событий. Каждое событие, определяемое методом проточной цитометрии, как правило, соответствует одной клетке. Поскольку определение клеточного объема методом проточной цитометрии представляет собой метод с высокой пропускной способностью, среднее значение для таких количеств отдельных клеток, как правило, можно определять без необоснованных затрат времени и усилий.
В одном варианте осуществления определяют не сам клеточный объем, а определяют значение FSC. Обычно, когда конкретная клетка имеет значение FSC ниже значения FSC эталонной клетки, то конкретная клетка также будет иметь меньший клеточный объем, чем объем эталонной клетки; таким образом, определение FSC позволяет опосредованно делать вывод об объеме клетки.
2
2
2
2
2
Предпочтительно, клетка по изобретению имеет площадь поверхности не более 3500 мкм. Предпочтительно, клетка имеет площадь поверхности не более 3000 мкм. Предпочтительно, клетка имеет площадь поверхности не более 2500 мкм. Предпочтительно, клетка имеет площадь поверхности не более 2100 мкм. В некоторых вариантах осуществления клетка имеет площадь поверхности не более 2000 мкм. «Площадь поверхности» означает 2-мерную площадь поверхности клетки.
В контексте настоящего изобретения 2-мерную площадь поверхности клетки определяют, когда клетка находится в прикрепляющейся культуре, то есть, клетка прикреплена к культуральному планшету. Важно, чтобы клетки находились в состоянии низкой конфлюэнтности. Субконфлюэнтность считают предпочтительным состоянием для воспроизводимости результатов определения, поскольку считается, что субконфлюэнтные клетки практически не ингибируют друг друга за счет контактного ингибирования. Для определения площади поверхности одну или более клеток фотографируют, или иным образом визуально наблюдают или записывают, как правило, при помощи микроскопа, из положения, перпендикулярного (то есть, 90°) к поверхности культурального планшета, к которому клетка или клетки прикреплены. Границы области определяют вручную на графическом изображении (то есть, фотографии) клетки. Предпочтительно избегать взбалтывания планшетов перед получением указанного графического изображения, или сохранять его на минимальном уровне. Методы и программы для определения площади поверхности не имеют конкретных ограничений, и соответствующая программа доступна от нескольких коммерческих поставщиков, например, Carl Zeiss (Jena, Germany). Для результатов определения, приведенных на фигуре 6, использовали Axiovision LE 4.8 от компании Carl Zeiss (Jena, Germany). В качестве примера, методы определения площади поверхности клеток, растущих в культуральной чашке, описаны в публикации Agley et al., 2012, J. Histochem. Cytochem., vol. 60, p. 428-438, в числе прочих.
2
2
2
2
Хотя авторы изобретения показали, что клетки по настоящему изобретению являются относительно однородными, как правило, имеют место некоторые вариации, как и во всех биологических продуктах, в том числе и в отношении клеточной площади поверхности. Таким образом, клеточную площадь поверхности также можно описывать как среднюю клеточную площадь поверхности. В этом случае, предпочтительно, клетка имеет среднюю площадь поверхности не более 3000 мкм. Предпочтительно, клетка имеет среднюю площадь поверхности не более 2500 мкм. Предпочтительно, клетка имеет среднюю площадь поверхности не более 2100 мкм. В некоторых вариантах осуществления клетка имеет площадь поверхности не более 2000 мкм. В популяции из множества клеток средняя площадь поверхности предпочтительно находится в пределах, указанных в настоящем документе. «Средняя площадь» представляет собой среднее арифметическое значение экспериментально определенных площадей отдельных клеток. Как правило, «средняя площадь» представляет собой среднее арифметическое значение площадей по меньшей мере 35 отдельных клеток, например, по меньшей мере 50 отдельных клеток, например, по меньшей мере 100 отдельных клеток, в некоторых вариантах осуществления 35-200 отдельных клеток.
Как показано на фигуре 6, клетка по настоящему изобретению предпочтительно имеет площадь поверхности, которая значительно меньше, чем площадь поверхности происходящей из костного мозга МСК. В некоторых вариантах осуществления клетка по настоящему изобретению также имеет площадь поверхности, которая меньше, чем площадь поверхности происходящих из околососудистого вартонова студня (ОСВС) мезенхимальных стромальных клеток, таких как те, которые описаны в WO 2004/072273 A и Sarugaser et al., 2005, Stem Cells, vol. 23, p. 220-229. Происходящие из околососудистого вартонова студня (ОСВС) мезенхимальные стромальные клетки также можно называть «происходящими из околососудистой зоны мезенхимальными стромальными клетками».
Предпочтительно, средний объем и/или площадь поверхности клеток по настоящему изобретению меньше, чем средний объем и/или площадь поверхности происходящих из костного мозга МСК (фигура 6), и меньше, чем у происходящих из околососудистой области пуповины МСК (фигура 5B). В литературе меньший клеточный объем МСК считают предпочтительным по разным причинам (смотри, например, Ge et al., Stem Cell Rev., 2014, vol. 10, p. 295-303). Благодаря настоящему изобретению, клетки с такими предпочтительными свойствами теперь легко доступны.
Предпочтительно, внутренняя комплексность клеток по настоящему изобретению ниже, чем внутренняя комплексность происходящих из ОСВС МСК. Внутреннюю комплексность, как правило, определяют в анализе бокового светорассеяния (SSC). Как правило, клетки с более сложной внутренней структурой выглядят более яркими/светлыми в анализе бокового светорассеяния, из-за внутренних структур, смотри, например, пример 4A. Без связи с какой-либо конкретной теорией, низкая внутренняя комплексность может быть связана со стволовостью. Для сравнения нескольких образцов на основании значений SSC необходимо всегда использовать один и тот же инструмент и всегда с одними и теми же настройками для фотоумножителей FSC и SSC, поскольку значения SSC, как и значения FSC, определяемые методом проточной цитометрии, зависят от используемого прибора, в частности, характеристик лазера и мощности фотоумножителей в разных приборах. Прибор для проточной цитометрии, лазер и настройки, а также программы, используемые по настоящему изобретению для определения значений SSC, предпочтительно являются такими же, как те, которые описаны выше для определения значений FSC.
В одном варианте осуществления происходящие из СВС клетки по настоящему изобретению характеризуются более низкой внутренней комплексностью (как показано на основании SSC), чем происходящие из ОСВС клетки.
В предпочтительном варианте осуществления указанные происходящие из СВС клетки характеризуются как меньшим клеточным объемом (как показано на основании FSC), так и более низкой внутренней комплексностью (как показано на основании SSC), чем происходящие из ОСВС клетки. Происходящие из ОСВС клетки могут быть получены, например, как описано в сравнительных примерах в настоящем документе.
Биологические свойства клетки: потенциал дифференциации, старение и бессмертие
Как правило, потенциал дифференциации, старение и бессмертие в совокупности можно называть «биологическими свойствами клетки». Безусловно, клетка по изобретению имеет дополнительные биологические свойства клетки, которые могут быть проанализированы специалистом в данной области. Используемый в настоящем документе термин «биологические свойства клетки» является открытым термином, также включающим дополнительные свойства клетки, которые можно определять в биологическом анализе, даже если эти дополнительные свойства явно не указаны в настоящем документе.
Клетка по изобретению представляет собой мезенхимальную клетку, в частности, мезенхимальную стромальную клетку (МСК). Указанная МСК обычно является клоногенной, если из контекста явно не следует иное. Таким образом, даже одиночная клетка по изобретению представляет собой колониеобразующую единицу (КОЕ), дающую начало множеству дочерних клеток.
Клетку по изобретению также можно называть «стромальной клеткой-предшественником». В целом, стромальная клетка-предшественник, как правило, способна давать начало фенотипически и генотипически идентичным дочерним клеткам («самообновление»), а также клеткам по меньшей мере одного окончательного клеточного типа. В одном варианте осуществления клетка по настоящему изобретению не является коммитированной.
Таким образом, предпочтительно, клетка не является окончательно дифференцированной. В одном варианте осуществления клетка не дифференцируется далее, оставаясь мезенхимальной клеткой. Предпочтительно, клетка способна дифференцироваться в клетки разных типов. В некоторых вариантах осуществления дифференциация в клетки одного или более из этих разных типов является индуцируемой, например, внешними стимулами и/или определенными условиями культивирования.
В предпочтительном варианте осуществления клетка является по меньшей мере мультипотентной. Мультипотентность можно тестировать, демонстрируя, что клетка способна дифференцироваться в клетки нескольких, по меньшей мере двух, разных типов. Отсутствуют конкретные ограничения в отношении анализа, подходящего для такой демонстрации. Однако, как правило, демонстрацию производят in vitro. Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления МСК по изобретению представляет собой клетку, имеющую мультипотентную способность к дифференциации in vitro. Примеры разных типов дифференциации приведены в примерах 12, 13 и 14. Например, остеогенный потенциал дифференциации можно определять, как описано в примере 12, хотя можно использовать альтернативные известные методы. Анализ на остеогенный потенциал дифференциации, описанный в примере 12, был специально разработан в контексте настоящего изобретения. В сравнении с существующими анализами на остеогенный потенциал, многие из которых были разработаны с происходящими из костного мозга МСК, анализ в примере 12 допускает относительно медленное размножение клеток; это, в свою очередь, позволяет (происходящим из пуповины) клеткам прикрепляться к культуральному сосуду, что обычно является необходимым условием для анализа остеогенного протенциала.
Например, адипогенный потенциал дифференциации можно определять, как описано в примере 13, хотя можно использовать и другие известные методы. Например, хондрогенный потенциал дифференциации можно определять, как описано в примере 14, хотя можно использовать и другие известные методы. «Потенциал дифференциации» означает, что конкретная клетка способна дифференцироваться в клетку конкретной линии дифференцировки.
Предпочтительно, клетка способна дифференцироваться в клетку остеогенной линии дифференцировки. Предпочтительно, клетка способна дифференцироваться в клетку хондрогенной линии дифференцировки. Предпочтительно, клетка способна дифференцироваться в клетку адипогенной линии дифференцировки. Предпочтительно, клетка способна дифференцироваться в клетку остеогенной линии дифференцировки и в клетку хондрогенной линии дифференцировки. Предпочтительно, клетка способна дифференцироваться в клетку остеогенной линии дифференцировки и в клетку адипогенной линии дифференцировки. Предпочтительно, клетка способна дифференцироваться в клетку остеогенной линии дифференцировки и в клетку адипогенной линии дифференцировки. Наиболее предпочтительно, клетка способна дифференцироваться в клетку остеогенной линии дифференцировки и в клетку хондрогенной линии дифференцировки, и в клетку адипогенной линии дифференцировки. Если клетка способна дифференцироваться в клетку конкретной линии дифференцировки, это должно означать, что клетка будет дифференцироваться соответствующим образом в том случае, если она будет находиться в соответствующих условиях. Например, особенно предпочтительные условия для дифференциации в клетку остеогенной линии дифференцировки указаны в примере 12. Альтернативно, можно использовать коммерческий набор, подходящий для дифференциации мезенхимальной стромальной клетки в клетку остеогенной линии дифференцировки, при условии, что набор допускает прикрепление клеток к культуральному сосуду, для тестирования того, способна ли какая-либо конкретная клетка (мезенхимальная стромальная клетка) дифференцироваться в клетку остеогенной линии дифференцировки; одним из наборов, описанным для такого анализа, является набор для остеогенной дифференциации чМСК мезенхимальных стволовых клеток BulletKit™ от компании Lonza (Wakersville, MD, USA). Например, соответствующие условия для дифференциации в клетку хондрогенной линии дифференцировки описаны в примере 14. Альтернативно, можно использовать коммерческий набор, подходящий для дифференциации мезенхимальной стромальной клетки в клетку хондрогенной линии дифференцировки, для тестирования того, способна ли какая-либо конкретная клетка (мезенхимальная стромальная клетка) дифференцироваться в клетку хондрогенной линии дифференцировки; одним из подходящих наборов является набор для хондрогенной дифференциации чМСК мезенхимальных стволовых клеток BulletKit™ от компании Lonza (Wakersville, MD, USA). Например, соответствующие условия для дифференциации в клетку хондрогенной линии дифференцировки описаны в примере 14. Альтернативно, можно использовать коммерческий набор, подходящий для дифференциации мезенхимальной стромальной клетки в клетку хондрогенной линии дифференцировки, для тестирования того, способна ли какая-либо конкретная клетка (мезенхимальная стромальная клетка) дифференцироваться в клетку хондрогенной линии дифференцировки; одним из подходящих наборов является набор для хондрогенной дифференциации чМСК мезенхимальных стволовых клеток BulletKit™ от компании Lonza. Например, соответствующие условия для дифференциации в клетку адипогенной линии дифференцировки описаны в примере 13. Альтернативно, можно использовать коммерческий набор, подходящий для дифференциации мезенхимальной стромальной клетки в клетку адипогенной линии дифференцировки, для тестирования того, способна ли какая-либо конкретная клетка (мезенхимальная стромальная клетка) дифференцироваться в клетку адипогенной линии дифференцировки; одним из подходящих наборов является набор для адипогенной дифференциации чМСК мезенхимальных стволовых клеток BulletKit™ от компании Lonza.
Необязательно, клетка даже является плюрипотентной, однако она не является тотипотентной. Потенциал дифференциации можно определять, подвергая клетку воздействию определенных условий. Трансдифференциация описана в данной области и, таким образом, можно тестировать, способна ли какая-либо конкретная клетка, такая как МСК, дифференцироваться в конкретную эктодермальную клетку или эндодермальную клетку.
Необязательно, клетка обладает дополнительными потенциалами дифференциации. Такие дополнительные потенциалы дифференциации выбирают из потенциалов дифференциации, типичных для мезенхимальных стромальных клеток. Однако, как это свойственно мезенхимальным стромальным клеткам, клетка по изобретению, как правило, не является тотипотентной.
rd
В предпочтительном варианте осуществления клетка по изобретению представляет собой мезенхимальную стволовую клетку. Таким образом, в таком варианте осуществления мезенхимальная стромальная клетка представляет собой мезенхимальную стволовую клетку. Иными словами, предпочтительно, если клетка имеет свойства, подобные свойствам стволовых клеток. Свойства, подобные свойствам стволовых клеток, и их маркеры описаны, например, в публикации Melton, в: Chapter 2 of Lanza and Atala (eds.), Essentials of Stem Cell, Biology, 3 ed., Elsevier, 2014.
Предпочтительно, клетка по настоящему изобретению не проявляет аномально высокие уровни теломеразной активности. «Теломеразная активность» означает ферментативную активность фермента теломеразы. Как известно, теломераза представляет собой фермент, который удлиняет теломеры в цепях ДНК, тем самым позволяя стареющим клеткам, которые иначе стали бы постмитотическими и подверглись апоптозу, преодолевать предел Хейфлика и в некоторых случаях становиться бессмертными. В некоторых альтернативных вариантах осуществления клетка по изобретению проявляет теломеразную активность, однако на низких уровнях. Теломеразную активность, как правило, определяют путем определения ферментативной активности; более конкретно, ее, как правило, определяют путем определения ферментативной активности теломеразной обратной транскриптазы (сокращенно TERT, или чTERT у человека), которая представляет собой каталитическую субъединицу фермента теломеразы. Пример описан в примере 10. Теломеразную активность можно определять при помощи набора TeloTAGGG Telomerase PCR ELISA PLUS kit (Roche Diagnostics) для фотометрического иммуноферментного анализа для количественного определения теломеразной активности. Для иллюстрации смотри, например, пример 10. Говорят, что теломеразная активность является низкой, если при использовании набора в соответствии с инструкциями производителя анализируемые клетки проявляют 10% или менее, например, предпочтительно 5% или менее, теломеразной активности в сравнении с активностью положительного контроля, предоставленного в указанном наборе TeloTAGGG Telomerase PCR ELISA PLUS kit (принимаемой за 100%). Процентная доля, то есть, 10% или менее, например, предпочтительно 5% или менее, относится к среднему количеству клеток, то есть, это означает, что анализируемые клетки проявляют в среднем 10% или менее, например, предпочтительно 5% или менее, теломеразной активности в сравнении с указанным контролем. Несколько альтернативных реагентов и наборов для определения теломеразной активности коммерчески доступны, и их можно альтернативно использовать в контексте настоящего изобретения.
Альтернативно, клетка по изобретению совсем не экспрессирует теломеразу. Иными словами, в данном варианте осуществления клетка по настоящему изобретению не проявляет никакой теломеразной активности. Точнее, такая клетка характеризуется отсутствием поддающейся обнаружению экспрессии теломеразы. Экспрессию гена можно определять непосредственно или опосредованно путем обнаружения белка, транскрибированного с продукта экспрессии. Отсутствие какой-либо поддающейся обнаружению теломеразы на уровне ферментативной активности, уровне белка или уровне экспрессии гена, может быть подходящим для конкретной дополнительной характеризации клеток по изобретению, также относительно других МСК, описанных в литературе (например, US 2004/0136967 A1). «Совсем не экспрессирует теломеразу» означает, что экспрессия теломеразы не может быть обнаружена в клетке современными методами, доступными на дату вступления в силу настоящего документа, такими как, в частности, кОТ-ПЦР. Как правило, это означает, что активность TERT (активность чTERT в случае человеческих клеток) не может быть обнаружена. Для определения экспрессии гена, кодирующего теломеразу, можно использовать, например, ПЦР-праймеры, специфические для гена чTERT (Nekani et al., 2010, Stem Cell Res., vol. 3, p. 244-254).
Когда в клетках отсутствует экспрессия теломеразы и/или теломеразная активность, они не могут поддерживаться в культуре постоянно; в таких вариантах осуществления клетка по изобретению не является бессмертной; тем не менее, клетка по изобретению подходит для культивирования в условиях, описанных в экспериментальных примерах, в течение по меньшей мере 12 пассажей, или эквивалентного числа удвоений популяции.
В предпочтительном варианте осуществления клетка по изобретению не является бессмертной. Например, как показано в примере 10, теломеразная активность в клетках по изобретению является относительно низкой. Клетки в примере 10, таким образом, не считают бессмертными.
Клетка по изобретению, присутствующая в соответствующей ростовой среде в соответствующих условиях, предпочтительно является митотически активной. Более предпочтительно, клетка находится в экспоненциальной фазе роста, это применимо, когда клетка находится в соответствующей ростовой среде в соответствующих условиях. Понятно, что замороженная клетка не является митотически активной; однако, когда замороженные клетки по изобретению размораживают и помещают в соответствующую ростовую среду в соответствующих условиях, они могут становиться митотически активными и, предпочтительно, расти в экспоненциальной фазе роста. Например, когда замороженные клетки первичного клеточного банка (подробно описанного ниже) размораживают и помещают в соответствующую ростовую среду в соответствующих условиях, они становятся митотически активными и дают начало множеству дочерних клеток, которые, в свою очередь, могут, необязательно, быть использованы для получения вторичного клеточного банка.
Клетка по изобретению не является эпителиальной клеткой, такой как амниотическая эпителиальная клетка.
Клетка по изобретению не является эндотелиальной клеткой.
Клетка по изобретению, несмотря на ее превосходные пролиферативные свойства, не является раковой клеткой.
Заявленная по настоящему изобретению клетка не является эмбриональной клеткой. В частности, заявленная клетка не является эмбриональной стволовой клеткой. Повреждение или уничтожение эмбрионов (включая человеческие эмбрионы) не предусмотрено по настоящему изобретению и не было использовано при проведении исследования, лежащего в основе настоящего изобретения.
В предпочтительном варианте осуществления мезенхимальная стромальная клетка по изобретению практически свободна от крови или ее производных, в частности, от пуповинной крови. Хотя некоторые МСК являются компонентом стромального каркаса костного мозга, который обеспечивает физическую и функциональную поддержку в процессе гемопоэза, клетка по настоящему изобретению не является гемопоэтической клеткой. В частности, клетка по изобретению не является клеткой крови. Более конкретно, клетка не является ни гемопоэтической стволовой клеткой (HSC), ни мультипотентной клеткой-предшественником гемопоэтической системы (MPP), ни обычной миелоидной клеткой-предшественником (CMP).
В одном варианте осуществления клетка по изобретению не является стареющей. В другом варианте осуществления клетка по изобретению характеризуется низким уровнем старения. Как известно, фермент β-галактозидаза является особенно активным в стареющих клетках, где он катализирует гидролиз β-галактозидов в моносахариды. Без связи с какой-либо конкретной теорией, считается, что β-галактозидазная активность обеспечивается эндогенной лизосомальной бета-галактозидазой, в частности, в стареющих клетках. Без связи с какой-либо конкретной теорией, ее активность саму по себе не считают необходимой для старения. Однако β-галактозидазная активность легко может быть обнаружена надежным методом, как in situ, так и in vitro. В настоящем изобретении β-галактозидазную активность определяют способами, обычными в данной области (смотри, например, Lee et al., Aging Cell, vol. 5, p.187-195. Синонимом термина «стареющая клетка» является «увядающая клетка».
В одном варианте осуществления клетка по изобретению представляет собой клетку, которая была выращена до пассажа P11 или менее, более предпочтительно до пассажа P10 или менее, более предпочтительно до пассажа P9 или менее, более предпочтительно до пассажа P8 или менее, более предпочтительно до пассажа P7 или менее, более предпочтительно до пассажа P6 или менее, более предпочтительно до пассажа P5 или менее, и наиболее предпочтительно до пассажа P4 или менее. Как показано в примере 9, клетки по изобретению обладают превосходными пролиферативными свойствами на протяжении многих пассажей, и, как показано в примере 11, клетки по изобретению обычно не являются стареющими, или являются стареющими лишь в минимальной степени, в течение многих совокупных удвоений популяции.
В одном варианте осуществления клетка по изобретению остается мультипотентной на протяжении по меньшей мере 16 совокупных удвоений популяции, например, по меньшей мере 18 совокупных удвоений популяции, по меньшей мере 20 совокупных удвоений популяции, после выделения. В одном варианте осуществления клетка по изобретению остается мультипотентной на протяжении по меньшей мере 12 пассажей после выделения.
В одном варианте осуществления клетка по изобретению остается недифференцированной на протяжении по меньшей мере 16 совокупных удвоений популяции после выделения. В одном варианте осуществления клетка по изобретению остается недифференцированной на протяжении по меньшей мере 12 пассажей после выделения.
Клетки, получаемые способом по изобретению
Клетка по второму аспекту изобретения также может быть охарактеризована способом, которым она может быть получена. Это возможно, поскольку клетка по настоящему изобретению обладает свойствами, отличающимися от свойств клеток, получаемых описанными ранее способами (смотри примеры и сравнительные примеры в настоящем документе), и, таким образом, способ получения клетки по настоящему изобретению позволяет получать клетку с уникальными свойствами. В частности, клетка по второму аспекту может быть охарактеризована, как клетка, получаемая способом по первому аспекту изобретения.
В другом, и не взаимоисключающем, варианте осуществления клетка по второму аспекту может быть получена способом по первому аспекту изобретения. В данном варианте осуществления способ по первому аспекту изобретения вносит определенный вклад в определение клетки за счет придания определенных свойств клетке, таких как, например, получение из стромального вартонова студня пуповины и/или жизнеспособность, и/или объем и площадь поверхности, связанные с процедурой выделения и размножения, в качестве лишь нескольких признаков для иллюстративных целей.
Предпочтительные варианты осуществления первого аспекта изобретения могут быть объединены с предпочтительными аспектами второго аспекта изобретения в каждом, и в любом, сочетании, если из контекста явно не следует иное. Таким образом, способ по первому аспекту изобретения также определяет, в некоторых вариантах осуществления, продукт, непосредственно получаемый данным способом. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления клетка по настоящему изобретению может быть описана как клетка, получаемая способом по первому аспекту изобретения. Признаки продукта, характеризуемого способом его получения, являющиеся следствием способа по первому аспекту настоящего изобретения, как правило, могут быть объединены с признаками продукта по второму и третьему аспектам настоящего изобретения.
Настоящее изобретение также относится к клетке, получаемой способом по второму аспекту изобретения. В этом отношении, способ по второму аспекту определяет и характеризует клетку, полученную данным способом. Предпочтительно, мезенхимальная стромальная клетка может быть получена путем выделения и, необязательно, но предпочтительно, размножения, как описано в настоящем документе.
Клетка, производная от мезенхимальной стромальной клетки
Кроме того, благодаря ее потенциалу дифференциации, клетка по изобретению может быть использована для продуцирования зрелых клеток или линий клеток. Зрелая клетка представляет собой клетку, которая не обладает свойствами, подобными свойствам стволовых клеток. Дифференциация мезенхимальных стромальных клеток в зрелые клетки может быть инициирована определенными условиями, например, добавлением определенных экзогенных факторов роста в культуральную среду, для иллюстрации смотри примеры 12, 13 и 14.
В одном варианте осуществления изобретение относится к клетке, производной от мезенхимальной клетки по изобретению. В одном варианте осуществления производная клетка является унипотентной или окончательно дифференцированной. В одном варианте осуществления производная клетка не является бессмертной. Предпочтительные типы производных клеток включают клетки остеогенной линии дифференцировки, адипогенной линии дифференцировки и хондрогенной линии дифференцировки.
Клеточная популяция
В третьем аспекте изобретение относится к популяции клеток (клеточной популяции). Клеточная популяция содержит по меньшей мере одну клетку по второму аспекту изобретения.
В одном варианте осуществления клеточная популяция по изобретению представляет собой клеточную популяцию, непосредственно получаемую путем выделения клеток из стромального вартонова студня пуповины, как описано в настоящем документе. Наиболее предпочтительно, однако, клеточная популяция по изобретению представляет собой клеточную популяцию, получаемуюe путем ex vivo размножения клеток, которые ранее были выделены из стромального вартонова студня пуповины, как описано в настоящем документе.
Некоторые признаки и варианты осуществления клеточной популяции по настоящему изобретению, описанные далее, связаны с физическими характеристиками клеточной популяции, в частности, клеток, содержащихся в популяции. Исключительно для иллюстрации, и независимо от деталей, раскрытых в других разделах настоящего документа, физические характеристики включают такие характеристики, которые могут быть непосредственно определены физическими методами, например, экспрессию гена, объем или площадь поверхности, форму, и так далее, клеток, соотношение и распределение любых этих свойств в клеточной популяции. Некоторые признаки и варианты осуществления клеточной популяции, которые описаны далее, связаны со способом, которым клеточная популяция может быть получена или была получена. Исключительно для иллюстрации, и независимо от деталей, раскрытых в других разделах настоящего документа, характеристики клеточной популяции, связанные со способом, которым клеточная популяция может быть получена или была получена, могут включать (a) анатомическое происхождение клеток, в частности пуповину и стромальный вартонов студень в качестве ее предпочтительной секции, (b) условия, используемые для выделения клеток, и (c) условия, используемые для размножения клеток, с получением при этом клеточной популяции.
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
Клеточная популяция по изобретению содержит множество клеток. Так, клеточная популяция содержит по меньшей мере две клетки, однако обычно будет содержать гораздо больше, чем две клетки. Хотя не существует четкого верхнего предела количества клеток, содержащихся в клеточной популяции, естественный верхний предел в типичном варианте осуществления представляет собой общее количество клеток, получаемое в полномасштабном цикле, если только не используют более одной пуповины в качестве стартового материала. Полномасштабный цикл, начинающийся с человеческой пуповины, включающий этап (c) и продолжающийся до пассажа P2, как правило, приводит к получению по меньшей мере 1×10 клеток, более предпочтительно по меньшей мере 2×10 клеток, более предпочтительно по меньшей мере 3×10 клеток, более предпочтительно по меньшей мере 4×10 клеток, более предпочтительно по меньшей мере 5×10 клеток, более предпочтительно по меньшей мере 6×10 клеток, более предпочтительно по меньшей мере 7×10 клеток, более предпочтительно по меньшей мере 8×10 клеток, более предпочтительно по меньшей мере 9×10 клеток, и в некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 10×10 клеток. Большее количество клеток может быть получено в более поздних пассажах.
Клеточная популяция содержит по меньшей мере одну клетку, экспрессирующую APCDD1. Как правило, это можно подтверждать путем демонстрации того, что образец клеточной популяции является положительным в отношении экспрессии APCDD1. Иными словами, клеточная популяция характеризуется экспрессией гена APCDD1. В одном варианте осуществления большинство клеток в клеточной популяции экспрессируют ген APCDD1. Предпочтительно, по меньшей мере 80% (по числу клеток), предпочтительно по меньшей мере 90% (по числу клеток), более предпочтительно по меньшей мере 95%, например, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% (в каждом случае по числу клеток) клеток, содержащихся в клеточной популяции, экспрессируют APCDD1.
Необязательно, клетка включает по меньшей мере одну дополнительную клетку, то есть, одну или более дополнительных клеток, которые отличаются от клетки по изобретению, в частности, клетки по второму аспекту изобретения. В частности, в данном варианте осуществления по меньшей мере одна дополнительная клетка отличается по меньшей мере одним признаком, обязательным или необязательным (предпочтительным), от клетки по второму аспекту изобретения. Предпочтительно, однако, если по меньшей мере одна дополнительная клетка является сингенной, более предпочтительно аутологичной, для клетки по изобретению.
В одном варианте осуществления все клетки клеточной популяции представляют собой МСК. Клетки по данному варианту осуществления, как правило, могут быть получены путем культивирования после начального пассажа («P0»). При том, что в некоторых вариантах осуществления клетки, исходно выделенные из пуповины, включают МСК, а также другие клетки (например, эритроциты), другие клетки практически не будут присутствовать после пассажа P0, поскольку (a) не прикрепляющиеся клетки бывают удалены вместе с ростовой средой в конце P0, (b) используемая ростовая среда, предпочтительно, является особенно подходящей для размножения МСК, и (c) клетки с пролиферативными свойствами, уступающими свойствам МСК, практически не будут размножаться так же хорошо, как МСК, и, таким образом, на протяжении нескольких совокупных удвоений популяции клеточная популяция становится обогащенной по МСК.
В другом варианте осуществления клеточная популяция содержит МСК, а также не-МСК. Клетки по данному варианту осуществления, как правило, могут быть получены сразу же после выделения, например, до, или в процессе, начального пассажа («P0»), и/или путем объединения по меньшей мере одной клетки по изобретению с по меньшей мере одной другой клеткой.
Предпочтительно, все клетки в клеточной популяции получены от одного и того биологического вида. Более предпочтительно, все клетки в клеточной популяции представляют собой человеческие клетки. Предпочтительно, все клетки в клеточной популяции являются сингенными друг для друга; более предпочтительно, все клетки, содержащиеся в клеточной популяции, являются аутологичными друг для друга. Даже более предпочтительно, все клетки в клеточной популяции получены от одного и того же индивидуума. Такая клеточная популяция может быть получена с использованием одной пуповины, или ее части, в качестве стартового материала.
Предпочтительно, клеточная популяция не содержит МСК, происходящих из тканей, отличных от пуповины. Более предпочтительно, клеточная популяция не содержит поддающиеся обнаружению количества МСК, происходящих из секций пуповины, отличных от стромального вартонова студня. Клеточная популяция соответствует указанному признаку, когда специфический для эндотелиальных клеток маркер (например, 3G5) и специфический для эпителиальных клеток маркер (например, EpCAM) не могут быть обнаружены в клеточной популяции.
Предпочтительно, клеточная популяция содержит множество клеток, из которых по меньшей мере 80% (по числу клеток), предпочтительно по меньшей мере 90% (по числу клеток), более предпочтительно по меньшей мере 95%, например, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% (в каждом случае по числу клеток) представляют собой клетки по второму аспекту. Все предпочтительные варианты осуществления по второму аспекту также применимы к третьему аспекту изобретения. Предпочтительно по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, например, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 99% или по меньшей мере 99%, наиболее предпочтительно 100%, от общего количества клеток представляют собой клетки по второму аспекту и, необязательно, по одному или более его предпочтительным вариантам осуществления, отдельно или в сочетании. В одном варианте осуществления клеточная популяция состоит в основном из клеток по второму аспекту. В одном варианте осуществления клеточная популяция состоит исключительно из клеток по второму аспекту.
Предпочтительно, популяция представляет собой выделенную популяцию клеток. В одном варианте осуществления клеточная популяция находится вне тела человека или животного. Выделенная клеточная популяция, как правило, представляет собой клеточную популяцию вне ее физиологического in vivo окружения. Предпочтительно, клеточная популяция представляет собой ex vivo клеточную популяцию. В частности, ex vivo клеточная популяция предпочтительно находится вне пуповины. В частности, ex vivo клеточная популяция предпочтительно свободна от кровеносных сосудов. В одном варианте осуществления ex vivo клеточная популяция находится в культуральном сосуде. В одном варианте осуществления ex vivo клеточная популяция находится в подходящем для хранения контейнере, таком как флакон. В одном варианте осуществления ex vivo клеточная популяция находится при температуре примерно 35°C - 39°C, предпочтительно примерно 36°C - 38°C, например, примерно 37°C. В одном не взаимоисключающем варианте осуществления ex vivo клеточная популяция находится в культуральном сосуде или в подходящем для хранения контейнере. Предпочтительно, подходящий для хранения контейнер подходит для транспортировки клеток при диапазонах температур, указанных выше. В одном варианте осуществления ex vivo клеточная популяция находится в подходящем для криоконсервирования контейнере, например, в криофлаконе, предпочтительно при температуре -180°C или менее. В одном варианте осуществления ex vivo клеточная популяция находится в культуральном сосуде. В одном варианте осуществления ex vivo клеточная популяция является метаболически активной, предпочтительно размножающейся, клеточной популяцией.
Некоторые из признаков клеточной популяции могут быть описаны на основании физических свойств. Для определения физических свойств, как правило, можно отбирать образец клеточной популяции и определять физические свойства для всех или части клеток, содержащихся в образце клеточной популяции. Поскольку популяции клеток по настоящему изобретению, как правило, являются однородными и/или характеризуются тем, что отдельные клетки, составляющие их, являются аналогичными или очень похожими, то результаты для конкретных свойств, таких как, например, экспрессия гена, объем или площадь поверхности, форма, и так далее, клеток, содержащихся в образце, как правило, также будут применимы к остальным клеткам в данной популяции, если из контекста явно не следует иное и/или если иное не указывает на то, что конкретная клеточная популяция содержит клетки, явно отличающиеся друг от друга генотипически и/или фенотипически. «Однородные» в данном контексте означает, что практически все клетки являются очень похожими или аналогичными.
Клеточная популяция предпочтительно также характеризуется тем, что все клетки имеют практически единообразные физические характеристики. «Практически единообразные» означает, что по меньшей мере 90% клеток, например, по меньшей мере 91% клеток, например, по меньшей мере 92% клеток, например, по меньшей мере 93% клеток, например, по меньшей мере 94% клеток, например, по меньшей мере 95% клеток, например, по меньшей мере 96% клеток, например, по меньшей мере 97% клеток, например, по меньшей мере 98% клеток, и предпочтительно по меньшей мере 91% клеток, имеют одну или более нужных физических характеристик. Особенно желательно, если клеточный объем, который коррелирует с показателями прямого светорассеяния (FSC) в анализе проточной цитометрии, как описано выше, является физической характеристикой, которая практически единообразна в клеточной популяции по изобретению.
Предпочтительно, средний объем клеток, содержащихся в популяции по настоящему изобретению, меньше, чем средний объем происходящих из ОСВС МСК. Происходящие из ОСВС МСК могут быть получены, например, как описано в сравнительных примерах в настоящем документе. После определения клеточного объема отдельной клетки, можно арифметически определять средний клеточный объем. Способы определения клеточного объема не имеют конкретных ограничений, хотя метод на основе FACS, в частности, подробно описанный выше для отдельной клетки, является предпочтительным.
Клеточная популяция также предпочтительно характеризуется тем, что объемы и/или площади поверхности клеток в клеточной популяции являются сходными, или, альтернативно, тем, что для высокой процентной доли клеток характерен небольшой объем и/или площадь поверхности.
Предпочтительно, клеточная популяция по изобретению характеризуется средним значением FSC, составляющим 60 или менее, или предпочтительными значениями в указанном диапазоне, описанном выше для отдельной клетки. Например, клеточная популяция может характеризоваться средним значением FSC, составляющим 55 или менее, например, 50 или менее. В конкретном варианте осуществления по меньшей мере 90% клеток в клеточной популяции характеризуются значением FSC, составляющим 45 ± 10. В более конкретном варианте осуществления значение FSC всех клеток в популяции составляет 45 ± 10. В предпочтительном варианте осуществления среднее значение FSC по меньшей мере 90% клеток в клеточной популяции составляет примерно 45. В более предпочтительном варианте осуществления среднее значение FSC всех клеток в популяции составляет примерно 45. Предпочтительно, клетка по изобретению характеризуется значением FSC, которое меньше, чем значение FSC происходящей из ОСВС клетки.
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
Предпочтительно, средняя площадь поверхности клеток в клеточной популяции составляет не более 3000 мкм. Предпочтительно, клетка имеет площадь поверхности не более 2500 мкм. Предпочтительно, клетка имеет площадь поверхности не более 2100 мкм. В некоторых вариантах осуществления клетка имеет площадь поверхности не более 2000 мкм. В популяции из множества клеток средняя площадь поверхности предпочтительно находится в пределах, указанных в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления средняя площадь поверхности клеток в клеточной популяции составляет предпочтительно 1000-300 мкм, предпочтительно 1100-2700 мкм, предпочтительно 1200-2500 мкм, предпочтительно 1300-2200 мкм, предпочтительно 1400-2000 мкм, предпочтительно 1500-1900 мкм, более предпочтительно 1600-1800 мкм и наиболее предпочтительно примерно 1700 мкм.
Предпочтительно, клеточная популяция также характеризуется тем, что по меньшей мере 70% клеток (по числу клеток), предпочтительно по меньшей мере 80% (по числу клеток), предпочтительно по меньшей мере 90% (по числу клеток), более предпочтительно по меньшей мере 95%, например, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% (в каждом случае по числу клеток) являются жизнеспособными. Термин «жизнеспособная» относится к клетке, которая не является апоптотической. Таким образом, в свою очередь, клеточная популяция содержит апоптотические клетки в количестве 30% или менее от общего количества клеток, предпочтительно 20% или менее от общего количества клеток, более предпочтительно 10% или менее от общего количества клеток, и наиболее предпочтительно 5% или менее от общего количества клеток. В одном варианте осуществления клеточная популяция совсем не содержит апоптотические клетки. Подходящим маркером для апоптотических клеток является 7AAD (смотри, например, пример 3). В одном варианте осуществления жизнеспособность определяют сразу после выделения клеток, то есть, до размножения. Высокая жизнеспособность, в процентах, является преимуществом, в сравнении с ранее описанными популяциями МСК.
Предпочтительно, клеточная популяция также характеризуется тем, что по меньшей мере 60% клеток (по числу клеток), по меньшей мере 70% клеток (по числу клеток), предпочтительно по меньшей мере 80% (по числу клеток), предпочтительно по меньшей мере 90% (по числу клеток), более предпочтительно по меньшей мере 95%, например, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% (в каждом случае по числу клеток) являются мультипотентными.
В одном варианте осуществления клеточная популяция содержит тучные клетки в количестве 2% или менее от общего количества клеток, предпочтительно 1% или менее от общего количества клеток. Наиболее предпочтительно, клеточная популяция не содержит тучные клетки.
В одном варианте осуществления клеточная популяция содержит фибробласты в количестве 2% или менее от общего количества клеток, предпочтительно 1% или менее от общего количества клеток. Наиболее предпочтительно, клеточная популяция не содержит фибробласты. В данном варианте осуществления термин «фибробласты» следует понимать в узком смысле, как относящийся к клеткам, которые уже дифференцировались в фибробласты, и не относящийся к клеткам, которые являются мультипотентными и просто обладают способностью дифференцироваться в фибробласты.
В одном варианте осуществления клеточная популяция содержит клетки гемопоэтической линии дифференцировки в количестве 2% или менее от общего количества клеток, предпочтительно 1% или менее от общего количества клеток. Наиболее предпочтительно, клеточная популяция не содержит клетки гемопоэтической линии дифференцировки. В предпочтительном варианте осуществления клетки не включают клетки крови, такие как клетки крови из пуповинной крови. Несколько маркеров известны для клеток крови и, таким образом, соответствие данному предпочтительному варианту осуществления может быть с легкостью протестировано.
В одном варианте осуществления клеточная популяция содержит околососудистые клетки в количестве 2% или менее от общего количества клеток, предпочтительно 1% или менее от общего количества клеток. Наиболее предпочтительно, клеточная популяция не содержит околососудистые клетки. Маркером для околососудистых клеток является 3G5. Таким образом, данный вариант осуществления альтернативно может быть охарактеризован тем, что клеточная популяция не содержит клетки, которые экспрессируют маркер 3G5, и/или клетки, которые экспонируют 3G5 на своей поверхности. В одном варианте осуществления клеточная популяция не загрязнена околососудистыми клетками. Экспрессия 3G5 также была описана для происходящих из костного мозга МСК (Khan et al., J. Orthop. Res., 2010, vol. 28, p. 834-40). Таким образом, отсутствие экспрессии 3G5 также может быть подходящим признаком, позволяющим отличать клеточную популяцию по настоящему изобретению от происходящих из костного мозга популяций МСК. В одном варианте осуществления клеточная популяция не загрязнена околососудистыми клетками. В одном варианте осуществления клеточная популяция не содержит происходящие из костного мозга МСК.
В одном варианте осуществления клеточная популяция содержит эпителиальные клетки в количестве 2% или менее от общего количества клеток, предпочтительно 1% или менее от общего количества клеток. Наиболее предпочтительно, клеточная популяция не содержит эпителиальные клетки. Маркером для эпителиальных клеток является адгезивная молекула эпителиальных клеток (EpCAM). Таким образом, данный вариант осуществления альтернативно может быть охарактеризован тем, что клеточная популяция не содержит клетки, которые экспрессируют маркер EpCAM, и/или клетки, которые экспонируют EpCAM на своей поверхности. В одном варианте осуществления клеточная популяция не загрязнена эпителиальными клетками.
В одном варианте осуществления клеточная популяция содержит эндотелиальные клетки в количестве 2% или менее от общего количества клеток, предпочтительно 1% или менее от общего количества клеток. Наиболее предпочтительно, клеточная популяция не содержит эндотелиальные клетки. Маркером эндотелиальных клеток является CD31. Таким образом, данный вариант осуществления альтернативно может быть охарактеризован тем, что клеточная популяция не содержит клетки, которые экспрессируют маркер CD31, и/или которые экспонируют CD31 на своей поверхности. В одном варианте осуществления клеточная популяция не загрязнена эндотелиальными клетками.
В одном варианте осуществления клеточная популяция содержит эритроциты в количестве 2% или менее от общего количества клеток, предпочтительно 1% или менее от общего количества клеток. Наиболее предпочтительно, клеточная популяция не содержит эритроциты. Маркерами эритроцитов являются глобин и BGP1. Таким образом, данный вариант осуществления альтернативно может быть охарактеризован тем, что клеточная популяция не содержит клетки, которые экспрессируют BGP1 и/или глобин. В одном варианте осуществления клеточная популяция не загрязнена эритроцитами.
Предпочтительно менее 10% клеток, содержащихся в клеточной популяции, проявляют теломеразную активность, более предпочтительно менее 5% клеток, содержащихся в клеточной популяции, проявляют теломеразную активность, и наиболее предпочтительно менее 2,5% клеток, содержащихся в клеточной популяции, проявляют теломеразную активность. Определение теломеразной активности и аспекты, связанные с ней, описаны выше и также применимы к данному третьему аспекту изобретения. Соответствующие клеточные популяции можно отличать от других клеточных популяций, описанных ранее (например, US 2004/0136967 A1).
В одном варианте осуществления клеточная популяция также характеризуется тем, что ни одна содержащаяся в ней клетка, или, более конкретно и предпочтительно, никакая содержащаяся в ней МСК, не экспонирует MHC II на ее поверхности, или не экспрессирует MHC II. Таким образом, предпочтительно, ни одна МСК клеточной популяции не экспрессирует MHC II. В одном варианте осуществления экспрессия MHC II может быть подходящим признаком, позволяющим отличать клеточную популяцию по настоящему изобретению от других содержащих МСК клеточных популяций (смотри, например, Sarugaser et al., 2005, Stem Cells, vol. 23, p. 220-229).
Предпочтительно, клеточная популяция может быть получена способом по первому аспекту изобретения, в частности, с включением этапа (c), то есть, этапа размножения. Таким образом, способ по настоящему изобретению, включающий этап (c), может приводить к получению популяции мезенхимальных стромальных клеток. Признаки продукта, характеризуемого способом его получения, являющиеся следствием способа по первому аспекту настоящего изобретения, как правило, могут быть объединены с признаками продукта по второму и третьему аспектам настоящего изобретения. Альтернативно или дополнительно, клеточная популяция по настоящему изобретению, таким образом, может быть описана как клеточная популяция, получаемая способом по первому аспекту изобретения, включающим этап (c).
Предпочтительно, стромальная клеточная популяция по настоящему изобретению практически не содержит загрязняющие средства. Стромальную клеточную популяцию, практически не содержащую загрязняющие средства, определяют в настоящем документе как клеточную популяцию, практически не содержащую инфекционные агенты, такие как вирусы (инкапсулированные и не инкапсулированные), паразиты, бактерии и эндотоксины, то есть, как клеточную популяцию, содержащую такие инфекционные агенты в количестве, которое не поддается обнаружению при помощи культуральных, серологических или молекулярных систем идентификации, или при помощи теста LAL (эндотоксины).
Предпочтительно, клеточная популяция по изобретению практически не содержит антибиотики. Клеточная популяция, практически не содержащая антибиотики, может быть получена путем выращивания клеток в течение по меньшей мере одного пассажа без антибиотиков. Например, даже если антибиотики присутствуют в первом пассаже после выделения клеток («P0»), антибиотики предпочтительно прекращают добавлять на протяжении всех пассажей после P0; иными словами, например, ростовая среда MSCBM CD с 5% чТЛ может быть использована без добавления антибиотиков в P1 и всех последующих пассажах.
В одном варианте осуществления ex vivo клеточная популяция является замороженной. Замороженные клетки, как правило, стабильны при хранении в условиях температур -180°C или менее, хотя любые условия, подходящие для хранения клеток, являются подходящими в данном варианте осуществления. Клетки могут быть заморожены, предпочтительно быстро заморожены в жидком азоте. Перед замораживанием можно добавлять криопротектор. В одном варианте осуществления клеточную популяцию хранят в жидком азоте. В предпочтительном варианте осуществления замороженная клеточная популяция представляет собой клеточный банк. Данный вариант осуществления далее описан более подробно.
Клеточный банк
Как показано, например, в примере 6, клетки по настоящему изобретению устойчиво характеризуются определенным фенотипом при разных выделениях из отдельных пуповин, и сохраняют определенный фенотип на протяжении нескольких совокупных удвоений популяции. Таким образом, клетки, получаемые по изобретению, или иным образом относящиеся к настоящему изобретению, устойчиво имеют определенный фенотип и сохраняют данный фенотип при размножении на протяжении многих пассажей. Таким образом, клетки по изобретению являются особенно подходящими для создания клеточного банка.
Действительно, предпочтительно, клеточная популяция по настоящему изобретению представляет собой клеточный банк. Так, клеточная популяция по изобретению может иметь форму клеточного банка. Клеточный банк содержит происходящие из СВС клетки. Если специально не указано иначе, клеточная популяция, входящая в состав клеточного банка, в целом, соответствует клеточной популяции, описанной выше. Предпочтительно, клеточный банк содержит множество клеток, из которых по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, например, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 99% или по меньшей мере 99%, наиболее предпочтительно 100%, от общего количества клеток представляют собой клетки, описанные во втором аспекте изобретения, и, необязательно, одном или более его предпочтительных вариантах осуществления, отдельно или в сочетании.
Клеточный банк по изобретению может быть получен способом, включающим размножение происходящих из СВС клеток по изобретению. Альтернативно, можно сохранять клеточный банк свежевыделенных клеток (не размноженных клеток), из которого размноженные клетки могут, необязательно, быть получены на более поздней стадии. Предпочтительно, однако, клеточный банк содержит размноженные клетки, то есть, клетки, получаемые способом по изобретению, включающим этап (c).
Клеточный банк предпочтительно содержит не прикрепляющиеся клетки. Такой клеточный банк может быть получен способом, включающим отделение при помощи фермента, например, путем обработки трипсином, прикрепляющихся клеток перед созданием клеточного банка. Ферментативное отделение клеток можно выполнять общепринятыми методами.
В одном варианте осуществления клеточный банк получают после того, как клетки были выращены в течение 5-30 совокупных удвоений популяции (не считая совокупные удвоения популяции в процессе P0), например, 8-25 совокупных удвоений популяции (не считая совокупные удвоения популяции в процессе P0).
Клеточный банк поддерживают, так что некоторые, или все, клетки могут быть отобраны из клеточного банка и/или использованы, например, для последующего культивирования, в нужный момент времени, например, в момент времени в будущем.
Когда клеточную популяцию «поддерживают», это можно выполнять в любых условиях, которые не препятствуют будущему культивированию клеточной популяции; клеточные популяции можно поддерживать в замороженной и не замороженной форме; для клеточного банка по изобретению, однако, поддержание в замороженной форме является предпочтительным.
Предпочтительно, клеточный банк по настоящему изобретению представляет собой замороженный клеточный банк. Замороженные клетки, как правило, стабильны при хранении в условиях температур -180°C или менее, хотя любые условия, подходящие для хранения клеток, являются подходящими в данном варианте осуществления. Клетки могут быть заморожены, предпочтительно быстро заморожены в жидком азоте. Перед замораживанием можно добавлять криопротектор. Клетки можно хранить в любых подходящих условиях, хотя замораживание при температурах -180°C или менее является наиболее типичным.
Клеточный банк, как правило, содержит клетки, находящиеся во множестве отдельных аликвот, например, во множестве отдельных флаконов. Предпочтительно, каждый флакон содержит суспензию клеток. Любая жидкость, подходящая для суспендирования мезенхимальных стромальных клеток, в частности, ростовая среда, и предпочтительно ростовая среда, которая является подходящей по настоящему изобретению, подходит для ресуспендирования клеток по настоящему изобретению. В предпочтительном варианте осуществления клеточный банк содержит жидкость, содержащую минимальную среду для культивирования мезенхимальных стромальных клеток, такую как, например, MSCBM CD, или минимальную среду, практически эквивалентную ей. Предпочтительно, жидкость, в которой суспендированы клетки клеточного банка, также содержит тромбоцитарный лизат, например, 5% (об/об) тромбоцитарный лизат (ТЛ), и в случае человеческих клеток, человеческий тромбоцитарный лизат (чТЛ).
Клеточные банки, или их аликвоты, можно использовать в будущем, например, для инокуляции субкультуры, например, в производственном биореакторе.
Типичные варианты осуществления клеточного банка по изобретению включают первичный клеточный банк (ПКБ) и вторичный клеточный банк (ВКБ). Таким образом, клеточный банк по изобретению предпочтительно выбирают из первичного клеточного банка (ПКБ) и вторичного клеточного банка (ВКБ).
В самом широком смысле термин «первичный клеточный банк» относится к первому клеточному банку, более предпочтительно первому замороженному клеточному банку, создаваемому после выделения клеток из пуповины.
В одном варианте осуществления первичный клеточный банк создают после того, как клетки растут в течение 5-14 совокупных удвоений популяции (не считая совокупные удвоения популяции в процессе P0).
Первичный клеточный банк (ПКБ), как правило, находится в аликвотах. Аликвоты готовят после соответствующего предшествующего пассажа (например, P2) и ферментативного отделения клеток, например, путем обработки трипсином, центрифугирования и ресуспендирования. Предпочтительно, клетки для первичного клеточного банка разделяют на аликвоты в 100-300 флаконов, например, 150-200 флаконов, например, 160-180 флаконов, или точнее, 165-175 флаконов.
6
7
6
6
6
6
6
6
6
6
6
Предпочтительно, каждый флакон первичного клеточного банка содержит от 1×10 клеток до 1×10 клеток, предпочтительно 5×10 клеток до 500×10 клеток, предпочтительно от 10×10 клеток до 100×10 клеток, предпочтительно от 15×10 клеток до 50×10 клеток, предпочтительно от 18×10 клеток до 30×10 клеток, например, примерно 20×10 клеток.
Предпочтительно, объем, содержащийся в каждом флаконе, составляет 1-100 мл, например, 2-20 мл, предпочтительно 3-10 мл, и наиболее предпочтительно примерно 4 мл.
6
В одном иллюстративном варианте осуществления первичный клеточный банк, полученный после полномасштабного цикла, состоит из 150-200 флаконов, каждый из которых содержит 20×10 клеток, и каждый из которых содержит 4 мл (замороженной) жидкости, содержащей клетки.
Также можно помещать суспензию клеток, предназначенную для создания вторичного клеточного банка, во флаконы или контейнеры разного размера или содержащие разное количество клеток или клетки в разных концентрациях. Тем не менее, вышеуказанные количества являются показателями того, что, как правило, может быть получено в полномасштабном цикле, и может быть произведен пересчет на флаконы или контейнеры разного размера или содержащие разное количество клеток или клетки в разных концентрациях.
В самом широком смысле термин «вторичный клеточный банк» относится ко второму клеточному банку, более предпочтительно второму замороженному клеточному банку, создаваемому после выделения клеток из пуповины; иными словами, к первому клеточному банку, более предпочтительно первому замороженному клеточному банку, создаваемому из всех, или части, клеток, содержащихся в первичном клеточном банке.
В одном варианте осуществления вторичный клеточный банк создают после того, как клетки растут в течение 14-25 совокупных удвоений популяции (не считая совокупные удвоения популяции в процессе P0).
Поскольку первичный клеточный банк обычно содержит множество аликвот клеток, которые могут быть использованы в один и тот же, или в разные моменты времени для дальнейшего культивирования, можно создавать несколько вторичных клеточных банков, одновременно или последовательно, из одного первичного клеточного банка.
Например, из каждого флакона, входящего в первичный клеточный банк, можно создавать один вторичный клеточный банк. Например, можно создавать, начиная с одного первичного клеточного банка, 100-300 вторичных клеточных банков, например, 150-200 вторичных клеточных банков, например, 160-180 вторичных клеточных банков, или точнее, 165-175 вторичных клеточных банков.
Вторичный клеточный банк (ВКБ), как правило, находится в аликвотах. Аликвоты готовят после соответствующего предшествующего пассажа (например, P4) и ферментативного отделения клеток, например, путем обработки трипсином, центрифугирования и ресуспендирования. Предпочтительно, клетки для вторичного клеточного банка разделяют на аликвоты в 100-300 флаконов, например, 150-200 флаконов, например, 160-180 флаконов, или точнее, 165-175 флаконов.
6
7
6
6
6
6
6
6
6
6
6
Предпочтительно, каждый флакон вторичного клеточного банка содержит от 1×10 клеток до 1×10 клеток, предпочтительно от 5×10 клеток до 500×10 клеток, предпочтительно от 10×10 клеток до 100×10 клеток, предпочтительно от 15×10 клеток до 50×10 клеток, предпочтительно от 18×10 клеток до 30×10 клеток, например, примерно 20×10 клеток.
Предпочтительно, объем, содержащийся в каждом флаконе вторичного клеточного банка, составляет 1-100 мл, например, 2-20 мл, предпочтительно 3-10 мл, и наиболее предпочтительно примерно 4 мл.
Также можно помещать суспензию клеток, предназначенную для создания вторичного клеточного банка, во флаконы или контейнеры разного размера или содержащие разное количество клеток или клетки в разных концентрациях. Тем не менее, вышеуказанные количества являются показателями того, что, как правило, может быть получено в полномасштабном цикле, и может быть произведен пересчет на флаконы или контейнеры разного размера или содержащие разное количество клеток или клетки в разных концентрациях.
Промышленная применимость
Клетки млекопитающих, обладающие пролиферативными свойствами, и соответствующие клеточные популяции, представляют ценность для не коммерческой и коммерческой деятельности, например, для исследований. Клетки по настоящему изобретению являются особенно привлекательными для подобных целей, в частности, ввиду хорошей воспроизводимости способа, превосходных пролиферативных свойств и высокого выхода клеток, в числе прочего. Клеточные популяции по изобретению могут быть подходящими для производства клеточных продуктов, например, для исследовательского или коммерческого применения. Например, можно в промышленных масштабах получать первичный клеточный банк или вторичный клеточный банк и использовать коммерчески такой клеточный банк, или более конкретно, отдельные аликвоты из него, продавая их для использования в исследованиях, таких как например, in vitro клеточные анализы.
Помимо этого, можно применять весь способ, или его часть, по изобретению в автоматическом режиме, используя приборы, в том числе, роботы, для проведения одного или более этапов способа. Таким образом, способ по изобретению также может найти промышленное применение.
В некоторых вариантах осуществления клетки по изобретению можно культивировать и размножать in vitro, например, для исследовательских или производственных целей. Например, клетку по изобретению, или происходящие от нее клетки, можно использовать для проведения скрининга на эффективность и/или цитотоксичность, и/или механизм действия фармацевтических соединений и композиций, и/или для изучения механизма некоторых заболеваний, и/или для in vitro переноса генов, и/или для продуцирования биомолекул, таких как белки, включая терапевтически активные белки.
Клетки по изобретению можно культивировать в виде чистой культуры, или культивировать совместно с другими линиями клеток, первичными или вторичными.
Кроме того, благодаря их потенциалу дифференциации, клетки можно использовать для получения зрелых клеток или линий клеток. Дифференциацию мезенхимальных стромальных клеток в зрелые клетки можно инициировать, используя определенные условия, например, добавление определенных экзогенных факторов роста в культуральную среду.
Следующие далее примеры и фигуры предназначены исключительно для иллюстративных целей и не должны ограничивать изобретение, объем которого определяет прилагаемая формула изобретения.
ПРИМЕРЫ
Пример 0: Материалы и методы, общие для разных аспектов изобретения
Во всех экспериментальных примерах, если нет иных указаний, используют MSCBM CD или минимальную среду, практически эквивалентную ей. Иллюстративные среды описаны далее.
Минимальная среда MSCBM CD и содержащая ее ростовая среда
Минимальная среда MSCBM CD коммерчески доступна от компании Lonza (Wakersville, MD, USA; каталожный № 95062-688). Согласно информации от производителя, она представляет собой бессывороточную среду, оптимизированную для размножения в течение многих пассажей всех типов человеческих мезенхимальных стволовых клеток, поддерживающую многолинейную дифференциацию и не требующую матрицы прикрепления для высевания клеток. Минимальные среды, практически эквивалентные MSCBM CD, также являются подходящими.
«MSCBM CD/GA» готовят следующим образом:
- 500 мл MSCBM CD (Lonza)
- 0,5 мл GA1000 (Lonza; согласно информации от производителя, GA1000 содержит 30 мг/мл гентамицина и 15 мкг/мл амфотерицина)
8
9
8
«MSCBM CD/чТЛ» - если специально не указаны иные количества или соотношения - содержит 5% (об/об) человеческого тромбоцитарного лизата (чТЛ) и 2 Ед/мл гепарина, оба из которых добавлены в MSCBM CD (то есть, без антибиотиков гентамицина и амфотерицина). чТЛ предпочтительно готовят из композиции, содержащей от 3,8×10 тромбоцитов/мл до 1,2×10 тромбоцитов/мл, в среднем примерно 7,9×10 тромбоцитов/мл); такой тромбоцитарный лизат может быть получен, например, из банка крови поликлиники в Модене, Италия, или от любого другого поставщика.
«MSCBM CD/GA/чТЛ» - если специально не указаны иные количества или соотношения - содержит 5% (об/об) человеческого тромбоцитарного лизата (чТЛ) и 2 Ед/мл гепарина, оба из которых добавлены в MSCBM CD/GA (то есть, с антибиотиками гентамицином и амфотерицином).
Факторы роста (помимо тех, которые в итоге содержатся в чТЛ и/или в минимальной среде) не добавляют, если специально не указано иначе.
Вышеприведенные среды особенно подходят для размножения клеток по настоящему изобретению.
Подсчет клеток

Для определения количества клеток, если нет иных указаний, клетки подсчитывают при помощи автоматических счетчиков клеток, таких как, в частности, NucleoCounter. При необходимости, клетки отделяют при помощи фермента, например, путем обработки трипсином, перед подсчетом клеток. Если подсчет эритроцитов не желателен, подсчет клеток производят после того, как клеточную популяцию подвергают обработке хлоридом аммония; известно, что такая обработка приводит к лизису эритроцитов. В результате, можно определять общее количество клеток в популяции, за исключением эритроцитов. Для этой цели используют раствор хлорида аммония, рекомендованный для лизиса эритроцитов, который коммерчески доступен от многих поставщиков (например, STEMCELL Technologies). Такой раствор можно добавлять и использовать в соответствии с инструкциями производителя.
Пример 1: Сегментирование и разделение на секции пуповины, и получение измельченного стромального вартонова студня
Получают человеческую пуповину после рождения в срок ребенка. Используют пуповину, если ее общая масса составляет 40 г или более. Сегментируют пуповину, нарезая ее в перпендикулярном направлении на сегменты длиной примерно 2,5 см при помощи острого стерильного скальпеля. Промывают сегменты пуповины HEPES-буферным солевым раствором (HBSS) + 300 мкг/мл гентамицина и 0,15 мкг/мл амфотерицина B в общей сложности в течение 10 мин. Механически встряхивают для смывания остатков крови с ткани.
Из каждого полученного таким образом сегмента продолжают получение секции стромального вартонова студня следующим образом: разрезают пуповину в продольном направлении, удаляют сосуды с матриксом, окружающим их, как правило, на расстоянии 3 мм (сосудистая-околососудистая зона, также называемая сосудистым-околососудистым вартоновым студнем - ОСВС), и отбрасывают. Удаление следует производить с осторожностью в том смысле, что следует избегать разрыва сосудов и/или потери сосудистых или околососудистых клеток. Избегают вытягивания матрикса пуповины.
Перед сбором ткани матрикса визуально изучают каждый сегмент ткани, чтобы убедиться, что ОСВС был полностью удален. Ни сосуды, ни фрагменты сосудов, не должны оставаться в сегменте.
После удаления ОСВС из сегментов пуповины, отрезают кусочки ткани матрикса от сегментов пуповины, используя острые ножницы. Выскребают внутреннюю поверхность сегментов пуповины острым скальпелем для получения оставшейся ткани матрикса. Тонкую амниотическую эпителиальную мембрану, остающуюся после отскабливания, очень осторожно удаляют и отбрасывают. Субамниотический (или мезенхимальный) слой выстилки пуповины включают в ВС, который выделяют. Это достигается путем тщательного соскабливания ткани с амниотического эпителия; важно проявлять осторожность, чтобы не включать кусочки амниотической эпителиальной мембраны при сборе указанной ткани. Полученная таким образом ткань представляет собой чистый стромальный вартонов студень (СВС).
Осторожно измельчают полученный таким образом (обрезанный и соскобленный) СВС острыми ножницами и/или скальпелем. Добавляют HEPES-буферный солевой раствор (HBSS) к измельченной ткани. Объединяют измельченную ткань в чашке Петри.
При экстрагировании СВС принимают меры предосторожности во избежание экстрагирования клеток ПК крови, эпителиальных или эндотелиальных клеток и клеток из сосудистых структур. С целью контроля (необязательно, но рекомендуется, особенно при воспроизведении данного примера в первый раз), маркером для эндотелиальных клеток является CD31; маркером для эпителиальных клеток является адгезивная молекула эпителиальных клеток (EpCAM), маркером для околососудистых клеток является 3G5.
Этапы примера 1 представлены на фигуре 3.
Способ по настоящему изобретению, описанный в примере 1, приводит к получению чистого вартонова студня путем полного удаления и устранения из секций не являющихся ВС компонентов пуповины (таких как выстилающая оболочка пуповины/амниотическая оболочка, сосуды и кровь), позволяет избегать экстрагирования клеток ПК крови, эпителиальных или эндотелиальных клеток и клеток из сосудистых структур. Он позволяет получать чистую ткань вартонова студня (ВС ткань). Вследствие ее происхождения, эта конкретная ВС ткань является стромальной ВС тканью.
Пример 2A: Ферментативная обработка
Материалы и методы: ВС ткань, полученную, как описано в примере 1, использовали для выделения происходящих из ВС первичных клеток следующим образом: смесь измельченной ткани/HBSS суспендировали в расщепляющем буфере (смотри Таблицу) в соотношении 100 мг смеси измельченной ткани/HBSS на 1 мл расщепляющего буфера (смотри Таблицу ниже) в 250-мл конической пробирке. Расщепляющий буфер содержит фермент, подходящий для высвобождения МСК из выделенной ткани.
Таблица: Формулирование 100 мл расщепляющего буфера (все ингредиенты стерильны)
8
9
8
- 1 мл чТЛ, например, из банка крови поликлиники в Модене, Италия (полученного из композиции, содержащей от 3,8×10 тромбоцитов/мл до 1,2×10 тромбоцитов/мл, в среднем примерно 7,9×10 тромбоцитов/мл)
- гепарин до конечной концентрации 2 Ед/мл
- 1 мл пирувата натрия (из 100 мМ стока)
2
- 36 мкл 1M CaCl
- препарат коллагеназы NB4 или NB6 (оба от компании SERVA) до конечной активности 0,18 Ед Вунша/мл расщепляющего буфера
- минимальная среда (коммерческая ростовая среда для клеток млекопитающих, такая как DMEM или MSCBM CD) - до 100 мл
Использовали препарат коллагеназы от компании SERVA (NB4, NB6), как правило, NB4. Согласно информации от производителя, препарат коллагеназы NB4/NB6 представляет собой естественный продукт, полученный из продуцирующего коллагеназу штамма Clostridium histolyticum, и представляет собой препарат коллагеназы, который не токсичен и который содержит коллагеназу и другие протеазы. Согласно информации от производителя, препарат NB4 стандартной категории (17454.02 и 17454.01 (оба от компании SERVA)) предназначен для диссоциации разных тканей для выделения клеток разных типов, например, хондроцитов, мышечных клеток, эпителиальных клеток, кожных фибробластов, гепатоцитов, адипоцитов, которые используют для исследовательских целей. Согласно информации от производителя, препарат коллагеназы NB4 также можно использовать в качестве более дешевой альтернативы препарату коллагеназы NB6 при разработке методов. Согласно информации от производителя, препарат коллагеназы NB6 категории GMP (NB6 GMP grade, 17454.02 (SERVA)) специально предназначен для выделения клеток для некоторых конкретных случаев трансплантации. Во всех экспериментах, описанных в настоящем документе, использовали NB4, если специально не указано иначе. Согласно информации от компании SERVA, производителя препарата коллагеназы, используемого в данном эксперименте, SERVA указывает активность коллагеназы в единицах PZ (PZ-U) по Вуншу (в настоящем документе используют синоним «единицы Вунша»).
Известно, что гепарин является подходящей добавкой для содержащих тромбоцитарный лизат жидких композиций во избежание слипания (например, Lohmann et al., 2012, PLoS ONE, vol. 7e37839).
Расщепляющие буферы с более высокой активностью коллагеназы (конечная концентрация выше 0,18 Ед Вунша/мл) сначала также были протестированы, исходя из активности коллагеназы, которая ранее была описана для ферментативного расщепления адипозной ткани, однако расщепление в присутствии более высокой активности коллагеназы не создавало преимуществ (данные не представлены).
Измельченную ткань (пример 1) помещали в стерильные пробирки. Добавляли расщепляющий буфер (смотри выше). Эти пробирки, содержащие измельченную ткань и расщепляющий буфер (гидролизат), инкубировали при 37±1°C в течение временного интервала для расщепления, составляющего 3 часа, с постоянным осторожным перемешиванием со скоростью 75 об/мин на орбитальном шейкере для расщепления. «Гидролизат» означает совокупность расщепляемой ткани и расщепляющего буфера.
После завершения временного интервала для расщепления гидролизат разбавляли путем добавления 2 объемов MSCBM CD, содержащей 1% (об/об) человеческого тромбоцитарного лизата (чТЛ), и пропускали через два слоя одной стерильной марлевой прокладки для отделения от нерасщепленной ткани/частично расщепленной ткани. Фильтрат был назван «расщепленной смесью».
Расщепленную смесь центрифугировали при 680 x g в течение 15 минут в 250-мл центрифужных пробирках. По окончании центрифугирования супернатант удаляли, и осадок (содержащий свежевыделенные мезенхимальные стромальные клетки из вартонова студня пуповины) ресуспендировали в 1-2 мл MSCBM CD/GA/чТЛ (смотри пример 0).
Затем определяли общее количество клеток. Чаще всего, не все клетки, содержащиеся в расщепленной смеси, представляют собой МСК.
Пример 2B: Первое культивирование (P0 и, необязательно, P0+)

2
2
Ресуспендированные клетки из примера 2A высевают в культуральные флаконы T-225 (Falcon, марка компании Corning, Corning, NY, USA) в MSCBM CD/GA с 5% чТЛ (смотри пример 0; 50 мл среды на флакон T-225) для инициации первой in vitro культуры клеток, происходящих из стромального вартонова студня. Данную клеточную культуру называют «P0». День инициации культуры P0 называют «день 0», и далее дни считают в восходящем порядке. Плотность клеток в начале P0 составляет 8000 клеток/см или более. Размерность см относится к нижней поверхности флакона, покрытой ростовой средой в процессе культивирования клеток в P0.
Подпитывают клетки каждые 3 дня, начиная с дня 5, свежей средой MSCBM CD/GA/чТЛ. Альтернативно, также можно культивировать клетки в процессе P0 в пакетах, вместо флаконов: в этом случае используют 150 мл MSCBM CD/GA/чТЛ на 1×1 пакет для инициации первой культуры клеток; однако, если специально не указано иначе, культивирование P0 проводят в культуральных флаконах T-225.
Клетки культивируют в P0, как описано, до достижения 80-90% конфлюэнтности клеток. Это, как правило, происходит через 5-12 дней. Затем клетки обрабатывают трипсином. Клетки подсчитывают после обработки трипсином по окончании пассажа.
Оценивают следующие критерии приемлемости: 1 - выход, 2 - жизнеспособность, 3 - конфлюэнтность, 4 - морфология. Определение критериев приемлемости 1 и 2 производят после обработки клеток трипсином. Подробности приведены далее.
Критерий приемлемости
После P0 и P0+
Тест
1
Выход
По меньшей мере 8 миллионов клеток
Подсчет клеток после обработки трипсином
2
Жизнеспособность
Более 80% жизнеспособных клеток
Окрашивание 7-амино-актиномицином D (7-AAD)
3
Конфлюэнтность
По меньшей мере 80%, предпочтительно 80-90% конфлюэнтность
Определение под микроскопом
4
Морфология
Большинство клеток мелкие, веретеновидные и в четких колониях
Определение под микроскопом
В данном экспериментальном примере все четыре критерия приемлемости должны быть соблюдены. Кроме того, при инспекции морфологии также визуально проверяют, являются ли размеры и формы клеток относительно единообразными. Предпочтительно, проверка это подтверждает.
В случае, если какой-либо один или более из критериев 2, 3 или 4 не соблюдается, всю клеточную культуру отбрасывают. Авторы настоящего изобретения установили, что критерии 2, 3 и 4 обычно соблюдаются, и, следовательно, в отбрасывании нет необходимости. Однако возможность отбрасывания культуры в случае несоответствия критериям гарантирует, что последующие пассажи проводят только в том случае, если соблюдены критерии приемлемости.
В случае, если общее количество клеток после P0 превышает 8 миллионов клеток (при условии также соблюдения критериев 2, 3 и 4), продолжают в соответствии с примером 2B.
В случае, если общее количество клеток после P0 не превышает 8 миллионов клеток (однако при условии соблюдения критериев 2, 3 и 4), проводят дополнительный этап субкультивирования, называемый «P0+» или «P0 плюс». (Во избежание сомнений, в тексте настоящего документа специально указано, если некоторые клетки субкультивируют в этапе «P0+»; иными словами, в отсутствие такого специального указания, клетки переносят из P0 непосредственно в P1 (пример 2B)). Условия P0 точно соответствуют условиям P0, описанным выше, за исключением того, что ресуспендированные клетки подвергают P0+ после P0, не непосредственно из примера 2A.
Клетки культивируют в P0+ до достижения 80-90% конфлюэнтности клеток. Затем клетки обрабатывают трипсином. Оценивают вышеуказанные критерии приемлемости: 1 - выход, 2 - жизнеспособность, 3 - конфлюэнтность, 4 - морфология. Если все критерии соблюдены, продолжают в соответствии с примером 2B. Если один или более критериев не соблюдены (за исключением выхода), отбрасывают клетки. В частности, клетки отбрасывают, если общее количество клеток после P0+ не составляет по меньшей мере 8 миллионов клеток.
Общие количества клеток в данном примере указаны в расчете на целую человеческую пуповину в качестве стартового материала (полномасштабный цикл). Если количество стартового материала является иным (например, только половина человеческой пуповины), то общее количество клеток для критерия приемлемости 1 арифметически корректируют соответствующим образом.
В зависимости, в частности, от выхода клеток, который варьируется в некоторой степени в разных полномасштабных циклах, а также ввиду вариаций биологического материала от разных индивидуумов, совокупные удвоения популяции в процессе P0 также подвержены вариациям.
Пример 2C: Дальнейшее размножение (P1 и последующие пассажи)
Обработанные трипсином клетки из P0 (или P0+, но только в случае, если это специально указано) в примере 2B, описанном в настоящем документе, получают и субкультивируют в течение одного или более пассажей следующим образом.
Первую субкультуру называют «P1». После завершения P1 клетки вновь обрабатывают трипсином и субкультивируют. Этот цикл субкультивирования/обработки трипсином выполняют предпочтительно в течение 4 пассажей (P1 считают «первым пассажем»), хотя в некоторых случаях выполняют в течение вплоть до 12 пассажей. Каждый пассаж нумеруют последовательно, то есть, P1 следует за P0, P2 следует за P1, и так далее. Если специально не указано иначе, клетки выращивают и субкультивируют до пассажа 4 (P4).
Для каждого пассажа, начиная с P1 и далее, все культуральные планшеты имеют один и тот же определенный размер. В частности, для каждого пассажа культуральный сосуд состоял из пакета культуральных планшетов CS5, CS10 или CS20 (Corning, Corning, NY, USA). Для каждого пассажа, начиная с P1 и далее, клетки выращивают в MSCBM CD с 5% чТЛ без антибиотиков (смотри пример 0; 50 мл MSCBM CD/чТЛ на флакон T-225). Если специально не указано иначе, антибиотики прекращают добавлять в данном примере во всех пассажах после P0; иными словами, в данном примере используют MSCBM CD/чТЛ без добавления антибиотиков в P1 и всех последующих пассажах.
2
Плотность клеток в начале каждого пассажа составляет 2500 клеток/см.
После каждого пассажа клетки обрабатывают трипсином. Клетки подсчитывают в конце каждого пассажа, после обработки трипсином.
Исходя из плотности клеток в момент инокуляции, нижней поверхности сосуда для культивирования клеток (что в совокупности определяет общее количество клеток в начале пассажа) и общего количества клеток после завершения пассажа, можно арифметически определять количество совокупных удвоений популяции.
По опыту авторов изобретения количество совокупных удвоений популяции в течение P1 и P2 (в совокупности P1 плюс P2, но не включая P0), чаще всего, как правило, находится в диапазоне 9-13.
По опыту авторов изобретения количество совокупных удвоений популяции в течение P3 и P4 (в совокупности P3 плюс P4, но не включая P0, P1 и P2), чаще всего, как правило, находится в диапазоне 6-10. Следовательно, количество совокупных удвоений популяции в течение P1, P2, P3 и P4 (в совокупности P1 плюс P2 плюс P3 плюс P4, но не включая P0), чаще всего, как правило, находится в диапазоне 15-23.
Необязательно - если специально указано в настоящем документе - клетки замораживают после определенного пассажа, например, P2. Клетки могут быть заморожены стандартными методами, например, путем быстрого замораживания в жидком азоте. Вполне возможно размораживать такие замороженные клетки и, например, подвергать их культивированию в следующих пассажах после размораживания. Замораживать клетки можно или в виде целой партии, или в виде аликвот. Замораживание в аликвотах, предпочтительно во флаконах, более предпочтительно и, как правило, было использовано в данном примере, если специально не указано иначе.
Когда клетки замораживают и размораживают после определенного пассажа, нумерацию пассажей продолжают после размораживания. Например, если клетки замораживают после P2, следующим пассажем после размораживания становится P3. Предпочтительно, если нет иных указаний, подсчет количества совокупных удвоений популяции продолжают после размораживания.
В предпочтительном варианте осуществления клетки разделяют на аликвоты и замораживают после P2. Полученные таким образом замороженные аликвоты доступны для размораживания индивидуально в нужный момент времени. Замороженные клетки, предпочтительно в аликвотах, можно называть первичным клеточным банком (ПКБ). Иными словами, не требуется - и, как правило, нежелательно - размораживать все аликвоты ПКБ в один и тот же момент времени. Напротив, разделение на аликвоты и индивидуальное замораживание аликвот обладает тем преимуществом, что отдельные аликвоты можно извлекать после замораживания, размораживать и подвергать дальнейшему культивированию (субкультивированию, дальнейшему размножению) в отдельные, и желательные, моменты времени.
6
6
В конкретном примере полномасштабного цикла 168 флаконов (каждый из которых содержит 20×10 клеток в объеме 4 мл) получали после P2, начиная с одной человеческой пуповины в качестве стартового материала. Каждый из флаконов можно замораживать, и отдельные флаконы можно размораживать в отдельные моменты времени для дальнейшего субкультивирования, например, P3 и далее. В одном конкретном примере полномасштабного цикла один флакон, полученный и замороженный после P2, размораживают, и содержащиеся в нем клетки подвергают P3 и P4. В данном конкретном примере после P4 были получены 168 флаконов (каждый из которых содержит 20×10 клеток в объеме 4 мл).
Клетки культивируют в каждом пассаже, как описано, до достижения 80-90% конфлюэнтности клеток. Это, как правило, происходит через примерно 3-4 дня. Затем предпочтительно оценивают следующие критерии приемлемости: 1 - выход, 2 - жизнеспособность, 3 - конфлюэнтность, 4 - морфология. Определение критериев приемлемости 1 и 2 производят после обработки клеток трипсином. Подробности приведены далее.
Критерий приемлемости
После P1 и всех пассажей, следующих за P1
Тест
1
Выход (полномасштабный цикл)
После P1: по меньшей мере 225×10<sup>6</sup> клеток
Подсчет клеток после обработки трипсином
После P2: по меньшей мере 7×10<sup>9</sup> клеток (*)
После P3: по меньшей мере 250×10<sup>6</sup> клеток (*)
После P4: по меньшей мере 7×10<sup>9</sup> клеток (*)
2
Жизнеспособность
Более 80% жизнеспособных клеток
Окрашивание 7-амино-актиномицином D (7-AAD)
3
Конфлюэнтность
По меньшей мере 80%, предпочтительно 80-90% конфлюэнтность
Определение под микроскопом
4
Морфология
Большинство клеток мелкие, веретеновидные и в четких колониях
Определение под микроскопом
6
(*) После P2 клетки можно замораживать в аликвотах для создания первичного клеточного банка (ПКБ). Количество клеток для P3 и P4 указано, исходя из сценария, когда P3 начинают с одного флакона из ПКБ, который содержит 20×10 клеток.
Важно отметить, что выходы клеток, достигаемые путем размножения по настоящему изобретению, являются очень высокими в сравнении с ранее известными способами получения и размножения мезенхимальных стволовых клеток.
В данном примере все четыре критерия приемлемости должны быть соблюдены: если один из критериев не будет соблюден, всю клеточную культуру из соответствующего пассажа отбрасывают. Авторы настоящего изобретения установили, что все из критериев 1, 2, 3 и 4, как правило, соблюдаются, и, следовательно, в отбрасывании нет необходимости. Однако возможность отбрасывания культуры в случае несоответствия критериям гарантирует, что последующие пассажи проводят только в том случае, если соблюдены критерии приемлемости.
Подводя итог, в примере 2 показано, что стромальный вартонов студень содержит компетентные для размножения клетки. Клетки из стромального вартонова студня были определены в качестве удобного источника потенциально мультипотентных стромальных клеток, которые можно поддерживать и размножать в культуре.
Сравнительные примеры
Для целей сравнения клетки выделяли, как описано в WO 2004/072273 A и Sarugaser et al., 2005, Stem Cells, vol. 23, p. 220-229, в частности, как описано в следующих сравнительных примерах 1, 2A, 2B и 2C.
Сравнительный пример 1
Сосуды выделяли из человеческой пуповины. Разрезанные сосуды сшивали для создания петли, блокирующей перетекание жидкости в сосуд или из сосуда.
Сравнительный пример 2A
2+
2+
Петлю (сравнительный пример 1) немедленно помещали в 50-мл пробирку, содержащую 1 мг/мл раствор коллагеназы Sigma C-0130 в PBS (без Mg и Ca) при 37°C. В соответствии с литературой, коллагеназа Sigma C-0130 имеет удельную активность 0,25-1,0 единиц FALGPA/мг твердого вещества. Для информации, единицы FALGPA не могут быть напрямую арифметически переведены в единицы Вунша, поскольку соответствующие единицы относятся к разным анализам с разными субстратами; однако в данной области есть некоторое общее мнение относительно того, каким образом единицы Вунша соотносятся с единицами FLGPA. На основании этого общего мнения можно сделать вывод о том, что общая активность коллагеназы, используемой в сравнительном примере 2, гораздо выше, чем общая активность коллагеназы, используемой в примере 2.
4
3
После 18-20 часов инкубации с коллагеназой расщепление в растворе останавливали добавлением 2 объемов PBS и 1 мл эмбриональной бычьей сыворотки (ЭБС). Таким образом, общая продолжительность обработки коллагеназой в сравнительном примере 2 намного больше, чем общая продолжительность обработки коллагеназой, используемая в примере 2. Расщепленные образцы фильтровали для удаления нерасщепленной ткани и центрифугировали при 1800 об/мин (Beckham Coulter Allegra™ 25R) в течение 15 минут. Клетки ресуспендировали в 75% среде α-MEM, 15% определенной ЭБС, 10% антибиотиков. Для лизиса клеток крови использовали раствор хлорида аммония (NHCl), бикарбоната калия (KHCO) и ЭДТА в соотношении 1:3 об/об с клеточной суспензией в течение 5-10 минут на льду при осторожном перемешивании. После центрифугирования при 500 x g в течение 10 минут клетки ресуспендировали и подсчитывали при помощи красителя трипанового синего (0,4%).
Сравнительный пример 2B
2
2
Происходящие из околососудистого вартонова студня клетки (ОСВС), полученные, как описано в сравнительном примере 2A, высевали при плотности 6000-8000 клеток/см и инкубировали при 37°C в α-MEM (без нуклеозидов, Life Technologies, Waltham, MA, USA, № 22561-021) с добавлением 15% определенной ЭБС (HyClone, GE Healthcare, USA, № SH30070.03) и антибиотиков в инкубаторе с 5% CO, 95% влажности, инициируя культуру «P0».
Среду заменяли в первый раз через 5-6 дней, затем обновляли каждые 2 дня. Через 6-10 дней культивирования клетки достигали конфлюэнтности. В конце P0, через 6-10 дней, клетки достигали конфлюэнтности. Затем их обрабатывали трипсином. Общее количество клеток определяли при помощи красителя трипанового синего (0,4%).
Сравнительный пример 2C
2
Обработанные трипсином клетки, полученные в сравнительном примере 1B, получали и субкультивировали следующим образом. Начиная с пассажа 1 культивирования («P1») и далее, клетки высевали при плотности 3500-4000 клеток/см в α-MEM с 15% определенной ЭБС. Антибиотики должны отсутствовать после P0; иными словами, ростовую среду используют без добавления антибиотиков. Клетки называют происходящими из околососудистого вартонова студня клетками («ОСВС»). Происходящие из околососудистого вартонова студня (ОСВС) мезенхимальные стромальные клетки также можно называть «происходящими из околососудистой зоны мезенхимальными стромальными клетками». Если специально не указано иначе, клетки выращивали и субкультивировали до пассажа 4 (P4).
Необязательно - но только когда специально указано - клетки замораживали после определенного пассажа, например, P2. Вполне возможно размораживать (оттаивать) такие замороженные клетки и, например, подвергать их культивированию в следующих пассажах после размораживания.
Пример 3: Анализ клеток после расщепления
Клетки, полученные, как описано в примере 2A (то есть, после этапа расщепления, с добавлением, или без добавления, тромбоцитарного лизата (ТЛ)), называют происходящими из стромального вартонова студня клетками, или «СВС». Их сравнивают с происходящими из ОСВС контрольными клетками («ОСВС», сравнительный пример 2A). СВС и ОСВС окрашивали 7-амино-актиномицином D (7AAD) (Via Probe; BD Biosciences; использовали в соответствии с инструкциями производителя) для обнаружения апоптоза в анализе FACS. Неокрашенный образец использовали для обнаружения собственной флуоресценции образца и устанавливали фотоумножительные трубки (PMT; сенсоры FACS) для всех необходимых каналов. Компенсационные настройки были установлены за счет использования одноцветных трубок. Собранные данные анализировали с использованием программы Diva (BD Biosciences). Для статистического анализа использовали критерий Стьюдента. Результаты представлены на фигуре 4A.
FACS анализ свежевыделенных образцов показал, что в случае обоих протоколов расщепления с использованием препарата коллагеназы NB4 (с добавлением и без добавления тромбоцитарного лизата (ТЛ), смотри фигуру 4A) авторы изобретения определяли, что жизнеспособные клетки составляли более 97% общей клеточной популяции. В частности, после расщепления с использованием препарата коллагеназы NB4 без ТЛ (3-часовое расщепление) они наблюдали степень апоптоза, составляющую 1,5% ± 1,3%, и после расщепления с использованием препарата коллагеназы NB4 с 1% ТЛ (3-часовое расщепление), апоптотические клетки составляли лишь 1,45% ± 0,3% от общего количества выделенных клеток. Однако 30,6% ± 9,6% от общего количества выделенных в соответствии с сравнительным примером 1 ОСВС окрашивались 7AAD (фигура 4A, более высокий заштрихованный столбик справа). Таким образом, можно видеть, что образцы, обработанные препаратом коллагеназы NB4 (SERVA) в течение 3 часов, были более жизнеспособными, чем клетки, выделенные, как описано в сравнительном примере 1. Это свидетельствует о том, что протокол, используемый в сравнительном примере 1, более вреден для клеток, чем протокол по настоящему изобретению; то есть, при том, что протокол, используемый в сравнительном примере 1, приводит к выделению большего количества клеток, большинство из них являются апоптотическими клетками. Апоптотические клетки не подходят для размножения.
Кроме того, сравнивая использование тромбоцитарного лизата (да/нет) и не наблюдая существенной разницы в процентной доле AAD7-положительных клеток (фигура 4A), авторы изобретения смогли продемонстрировать, что тромбоцитарный лизат не влияет отрицательно на активность коллагеназы по высвобождению клеток и на их жизнеспособность. Удивительно, но присутствие тромбоцитарного лизата (обычно содержащего плазму) не оказывало отрицательного влияния на расщепление, или более конкретно, на выход клеток, хотя ранее сообщалось, что тромбоцитарный лизат отрицательно влияет на активность некоторых ферментов, включая протеазы (Chesney et al., J. Clin. Invest., 1974, vol. 53, p. 1647-1654).
Пример 4A: Анализ физических свойств происходящих из СВС клеток, выделенных в соответствии с настоящим изобретением, в сравнении с происходящими из ОСВС клетками
Затем авторы изобретения решили оценить общее количество клеток и физические свойства происходящих из СВС клеток, выделенных в соответствии с настоящим изобретением (пример 1 и пример 2A), в сравнении с происходящими из ОСВС клетками, полученными с использованием протокола в сравнительном примере 1 и сравнительном примере 2A). Данное сравнительное исследование заключалось в оценке эффективности коллагеназы и физических параметров (методом FACS) соответствующих свежевыделенных клеток.
Во-первых, что касается общего количества свежевыделенных клеток, авторы изобретения получили больше происходящих из ОСВС клеток способом, используемым в сравнительном примере 1, чем они получили происходящих из СВС клеток способом по настоящему изобретению, описанным в примере 1.
Во-вторых, анализ физических параметров методом проточной цитометрии, а именно, путем определения прямого светорассеяния (FSC) и бокового светорассеяния (SSC), показал, что происходящие из СВС клетки имеют более низкие значения FSC и SSC в сравнении с происходящими из ОСВС клетками, выделенными способом, описанным в сравнительном примере 1. Результаты приведены в следующей далее таблице и визуально представлены на фигуре 5A.
Таблица. Экспериментально определенные значения SSC и FSC
Клетки
FSC
SSC
Происходящие из ОСВС клетки в соответствии с сравнительным примером 2A
Среднее из шести образцов
75,42166667
64,65666667
ST-DEV
18,66791951
15,1647779
SEM
7,75
6,19
Происходящие из СВС клетки в соответствии с сравнительным примером 2A
Среднее из четырех образцов
46,1925
50,795
ST-DEV
9,660766986
21,28367273
SEM
5,58
12,29
Критерий Стьюдента
0,025231608
0,296671217
В среднем, происходящие из СВС клетки имеют меньший клеточный объем (определяемый на основании FSC) с более низкой внутренней комплексностью (определяемой на основании SSC), чем происходящие из ОСВС клетки. Различия в показателях FSC являются статистически значимыми. В частности, происходящие из СВС клетки (по настоящему изобретению n=4) имеют более низкие значения FSC и SSC в сравнении с происходящими из ОСВС клетками, выделенными способом, описанным в сравнительных примерах 1 и 2A (ОСВС, n=6). Эти результаты анализа методом проточной цитометрии указывают на то, что происходящие из СВС клетки, выделенные способом по настоящему изобретению, представляют собой более однородные небольшие клетки с низкой цитоплазматической комплексностью, в то время как происходящие из ОСВС клетки представляют собой гетерогенную популяцию с большим средним объемом и большей цитоплазматической комплексностью. «Однородные» в данном контексте означает, что практически все клетки являются очень похожими или аналогичными. Меньший объем и более низкая внутренняя комплексность являются признаками, свидетельствующими о стволовости и эффективности (смотри, например, Wagner et al., 2008, PLoS One, 2008, 3: e2213). Как правило, клетки с более сложной внутренней структурой выглядят более яркими/светлыми в анализе бокового светорассеяния, из-за внутренних структур.
Пример 4B: Морфологический фенотип свежевыделенных клеток: выделенные из ОСВС клетки отличаются от клеток, выделенных в соответствии с настоящим изобретением
Сравнивали морфологию выделенных из СВС клеток и выделенных из ОСВС клеток. Для обеспечения высокой степени сопоставимости, одну пуповину делили на две части: одну часть обрабатывали способом, описанным в примерах 1, 2A и 2B, другую часть обрабатывали способом, описанным в сравнительных примерах 1, 2A и 2B, однако в обоих случаях клетки анализировали точно через два или три дня после высевания культуры в пассаже 1 (P1), (исходное увеличение 100X).
Авторы изобретения обнаружили, что клетки, полученные из чистого стромального вартонова студня, по настоящему изобретению (СВС) являются однородными, мелкими и веретеновидными (фигура 5B, слева), в то время как клетки, происходящие из околососудистого вартонова студня (ОСВС), являются крупными и имеют заметный цитоскелет (фигура 5B, справа). Происходящие из околососудистого вартонова студня (ОСВС) мезенхимальные стромальные клетки также можно называть «происходящими из околососудистой зоны мезенхимальными стромальными клетками».
Пример 4C: Образование колоний свежевыделенными клетками: выделенные из ОСВС клетки отличаются от клеток, выделенных в соответствии с настоящим изобретением
Затем был изучен колониеобразующий потенциал клеток по настоящему изобретению. Это было выполнено следующим образом: СВС получали, как описано в примерах 1 и 2A, ОСВС получали, как описано в сравнительном примере 1. Затем при помощи стерильной воронки содержащий клетки экстракт фильтровали через два слоя одной стерильной марлевой прокладки для удаления нерасщепленной ткани. Центрифугировали при 680 x g в течение 15 минут в 250-мл центрифужных пробирках. Супернатант отбрасывали (сливали или отбирали аспирацией с использованием низкого вакуума). Осадок ресуспендировали в 1-2 мл MSCBM CD/GA/чТЛ (смотри пример 0). Высевали ресуспендированные клетки в 3 x флакона T225 или 1×1 пакет в среде MSCBM CD/GA/чТЛ (смотри пример 0; 50 мл среды на флакон T-225 или 150 мл на 1×1 пакет) для инициации культуры P0. Культуру P0 нельзя перемещать в течение первых 5 дней после высева. Среду меняли через 5 дней. После этого каждые 3 дня проводили подпитку средой MSCBM CD/GA/чТЛ. Собирали клетки P0 в день 12, используя 3 Ед/мл трипсина, и нейтрализовали MSCBM+1% чТЛ. Результаты представлены на фигуре 5C. Эти результаты показывают, что протокол выделения клеток по настоящему изобретению приводит к получению более однородной клеточной популяции, способной к образованию более компактных колоний после начального высева (пассаж 0).
Пример 5: Сравнение происходящих из СВС клеток по настоящему изобретению с происходящими из костного мозга клетками (КМ).
2
2
Происходящие из костного мозга МСК (КМ-МСК, полученные, как описано в публикации Grisendi et al., Cytotherapy, 2010, vol., 12, p. 466-477), высевали при плотности 6000 клеток/см. Происходящие из СВС клетки по настоящему изобретению (примеры 1, 2A, 2B и 2C, в частности, культивируемые до пассажа 5 (P5), высевали при плотности 2800 клеток/см. После 2-3 дней культивирования клетки были субконфлюэнтными, и для клеток обоих типов получали по пять репрезентативных изображений. В частности, прикрепляющиеся к пластику МСК визуализировали при помощи микроскопа Axioskop-Observer-1 (Zeiss) с объективом 10x, оснащенного камерой Axiocam. Изображения получали и обрабатывали при помощи программы AxioVision 4.8.2 для оценки площади клеток. (Moore et al., Exp. Eye Res. 2013, vol. 115, p. 178-188; Zeilbeck et al., PLoS One., 2014; vol. 9(4), e95546).
Результаты представлены на фигуре 6. Было установлено, что происходящие из СВС клетки по настоящему изобретению имеют меньшую среднюю площадь поверхности, чем МСК, извлеченные из КМ.
Пример 6: Клеточные поверхностные маркеры свежевыделенных клеток
Материалы и методы: Три пуповины обрабатывали двумя разными способами (современным способом, описанным в сравнительных примерах 1 и 2A, «ОСВС», в сравнении способом получения клеток по настоящему изобретению, смотри примеры 1 и 2A, «СВС»).
Сразу после выделения ОСВС/происходящие из СВС клетки подсчитывали и ресуспендировали в 1 мл 1X PBS в полипропиленовых пробирках для проведения анализа методом активированной флуоресценцией сортировки клеток (FACS) (200000 клеток/пробирку). Клетки инкубировали в 100 мкл блокирующего буфера, содержащего модифицированную по способу Дульбекко среду Игла (DMEM), 10% эмбриональной бычьей сыворотки (ЭБС), 0,1 M азид натрия и 66,6 мг/мл человеческого иммуноглобулина G, в течение 20 минут на льду. Затем их промывали в 1 мл 1x PBS и центрифугировали при 300 g в течение 5 минут.
Затем образцы обрабатывали в течение 30 мин на льду первичными антителами в 90 мкл PBS с 0,5% бычьего сывороточного альбумина (BSA; Sigma) и анализировали на проточном цитометре FACSAria III (BD Biosciences), оснащенном двумя лазерами с воздушным охлаждением, имеющими длины волн 488 и 633 нм. Для непрямого окрашивания (только на анти-GD2) использовали вторичное антитело крысы против иммуноглобулинов мыши, конъюгированное с аллофикоцианином (APC) (BD Pharmingen). Результаты окрашивания 7-амино-актиномицином D (7AAD) (ViaProbe; BD Biosciences; используемого в соответствии с инструкциями производителя) оценивали методом проточной цитометрии для обнаружения апоптоза. Использовали неокрашенный образец для определения собственной флуоресценции образца и устанавливали PMT для всех необходимых каналов; уровень перекрестных помех флуоресценции контролировали путем компенсационной корректировки. Компенсационные настройки были установлены за счет использования одноцветных трубок. Собранные данные анализировали с использованием программы Diva (BD Biosciences).
Результаты: Иммунофенотипический анализ свежевыделенных образцов показал, что при использовании обоих способов выделения авторы изобретения обнаружили CD105, CD73 и CD90, которые представляют собой типичные экспрессируемые поверхностные антигены МСК. Аналогично, рецептор β тромбоцитарного фактора роста (CD140b) был обнаружен при использовании обоих способов выделения. HLA-DR не был обнаружен ни в одном из образцов, однако было установлено, что происходящие из ОСВС клетки экспрессируют 3G5, в отличие от происходящих из СВС клеток, это указывает на то, что способ по настоящему изобретению не приводит к выделению околососудистых клеток, что соответствует происхождению клеток из стромального вартонова студня. Относительное экспонирование некоторых поверхностных маркеров показано на фигуре 7A, левой панели. На фигуре 7A, правой панели, указаны некоторые поверхностные маркеры, которые экспрессируются/не экспрессируются в большинстве клеток.
Клеточные поверхностные маркеры также анализировали после продолжительного культивирования клеток. Анализировали клеточные культуры, полученные в двух независимых выделениях и с разными совокупными удвоениями популяции. Было установлено следующее: отсутствуют существенные различия в экспонировании CD105, CD90 и CD73 (положительные маркеры МСК) при разных выделениях клеток. CD105, CD90 и CD73 также имели аналогично высокие уровни при разных совокупных удвоениях популяции (сУП). Напротив, CD45, CD14, CD34, CD19 и HLA-DR (известные как отрицательные маркеры МСК) экспрессируются на очень низких уровнях в клетках, полученных при обоих выделениях и при разных совокупных удвоениях популяции (смотри Таблицу ниже).
Таблица: Фенотипические характеристики, определенные методом проточной цитометрии (% положительных клеток). сУП=совокупное удвоение популяции
CD45
CD73
HL-DR
CD14
CD34
CD90
CD105
CD19
Партия 1 после 8 сУП
3,8
98,9
-0,6
0,0
1,1
99,2
99,1
-0,5
Партия 1 после 16 сУП
4,1
99,1
-0,7
-0,2
1,7
99,2
99,1
-0,8
Партия 2 после 8 сУП
1,4
99,2
-0,3
0,1
2,6
99,2
99,1
-0,2
Партия 2 после 16 сУП
0,8
99,1
-0,2
0,7
4,2
99,1
99,10
-0,1
Эти данные показывают, что условия размножения происходящих из стромального ВС клеток в способе по настоящему изобретению могут приводить к получению популяций чистых происходящих из стромального ВС клеток с высоким выходом и со стабильным фенотипом на протяжении нескольких совокупных удвоений популяции. Таким образом, клетки по изобретению подходят для создания клеточного банка.
Пример 7: Клеточные поверхностные маркеры на размноженных клетках
Материалы и методы: Для характеризации поверхностных антигенов на происходящих из ОСВС клетках и происходящих из СВС клетках проводили FACS анализ с клетками, содержащимися в клеточном банке, которые были получены из одной и той же пуповины разными способами (примеры 1 и 2A, 2B и 2C против сравнительных примеров 1 и 2A, 2B и 2C). Клетки размораживали после P2 (пример 2C/сравнительный пример 2C) и размножали до P4 (пример 2C/сравнительный пример 2C) для проведения FACS анализа. После отделения при помощи раствора для отделения клеток с протеолитическими и коллагенолитическими ферментами (аккутаза, Thermo Fisher) клетки центрифугировали при 500 x g в течение 10 минут. Осадок ресуспендировали в культуральной среде (MSCBM CD/чТЛ для СВС или α-MEM с 15% определенной ЭБС для ОСВС) и подсчитывали с использованием 0,4% раствора красителя трипанового синего. Клетки промывали в 1X PBS и центрифугировали при 300X g в течение 5 минут. Клетки ресуспендировали в окрашивающем буфере BD Pharmingen+ЭДТА, и 250000 клеток/лунку высевали в 96-луночные планшеты. Скрининг методом проточной цитометрии проводили в соответствии с техническим описанием к панели поверхностных маркеров человеческих клеток (BD Lyoplate™, BD Biosciences) в соответствии с инструкциями производителя. Результаты представлены на фигуре 7B.
Тестировали конкретно, экспрессируют ли свежевыделенные клетки по настоящему изобретению (примеры 1, 2A) CD46, CD55 и CD59. Как показано на фигуре 7B, как происходящие из ОСВС клетки, так и происходящие из СВС клетки, экспрессируют эти поверхностные регуляторы комплемента. Это согласуется с результатами, описанными ранее, например, в публикациях Ignatius et al., J. Cell. Biochem., 2011, vol. 112, p. 2594-2605 и Schraufstatter et al., World J. Stem Cells, 2015, vol. 7, p. 1090-1108, которые показали, что происходящие из костного мозга МСК экспрессируют на клеточной поверхности регуляторы комплемента, и считается, что МСК, генетически модифицированные для повышения экспрессии CD46, CD55 и CD59, приобретают защиту от опосредованного комплементом лизиса клеток in vitro и in vivo. На фигуре 7B показано, что клетки по настоящему изобретению также имеют данный конкретный экспрессионный фенотип.
Пример 8: Экспрессия генов в клетках по настоящему изобретению при определении методом количественной ПЦР с обратной транскриптазой (кОТ-ПЦР).

Материалы и методы: Клетки, полученные в соответствии с настоящим изобретением (пример 2C), в частности, после пассажа 4, были использованы для данного анализа. Суммарную клеточную РНК выделяли одноэтапным методом с TRIzol (Life Technologies) в соответствии с инструкциями производителя. Первую цепь комплементарной кДНК синтезировали с 1 мкг суммарной РНК с использованием набора revertAid H minus first-strand cDNA synthesis kit (Thermo Scientific) в соответствии с инструкциями производителя. Количество одноцепочечной кДНК определяли на спектрофотометре (Beckman Coulter DU 730) с целью использования 10 нг кДНК в каждой лунке для ПЦР в реальном времени.

Количественную ПЦР в реальном времени проводили с использованием системы Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System и реагента Fast SYBR Green Master Mix. Количественное определение экспрессии генов для каждого целевого гена и эталонного гена проводили в отдельных пробирках. Прямые и обратные праймеры были разработаны с использованием IDT PrimerQuest (доступно онлайн на сайте http://eu.idtdna.com/PrimerQuest/Home/Index), принимая меры для охвата ими последовательности интрона, чтобы они были специфичными для мРНК, а не для геномной ДНК. Относительный уровень экспрессии целевого гена нормировали на уровень экспрессии эндогенного эталонного гена β-актина.
Результаты представлены на фигуре 8. На фигуре 8 показано, что, например, APCDD1, PPARG и FLVCR2 экспрессируются в происходящих из СВС клетках. Экспрессия была сопоставимой в разных происходящих из СВС клеточных популяциях, полученных в соответствии с настоящим изобретением. Этот общий паттерн экспрессии указывает на стабильность клеток по настоящему изобретению с точки зрения генной экспрессии.
Примечательно, однако, что паттерн экспрессии данных генов значительно отличается от такового у происходящих из ОСВС клеток, выделенных используемым в настоящее время способом. В частности, APCDD1 совершенно не экспрессируется в происходящих из ОСВС клетках. Этот вывод был сделан на основании того факта, что амплификация гена APCDD1 отсутствовала во всех образцах происходящих из ОСВС клеток. Авторы изобретения заключают, что экспрессия APCDD1 методом ПЦР в реальном времени может быть обнаружена только в происходящих из СВС клетках по настоящему изобретению, но не поддается обнаружению в происходящих из ОСВС клетках. Таким образом, экспрессия APCDD1 позволяет четко отличать клетки по настоящему изобретению от происходящих из ОСВС клеток.
При том, что ранее в литературе отсутствовало единое мнение о том, отличаются ли не околососудистые МСК от околососудистых МСК (например, Davies et al., Stem Cells Translational Medicine, 2017, vol. 6, p. 1620-1630), в данном примере предоставлены доказательства того, что происходящие из стромального вартонова студня клетки, полученные в соответствии с настоящим изобретением, отличаются от околососудистых МСК.
Пример 9: Пролиферативный потенциал клеток по настоящему изобретению в сравнении с эталонными клетками
2
Материалы и методы: Культура клеток: происходящие из стромального вартонова студня клетки (СВС) по настоящему изобретению, полученные, как описано в примерах 1, 2A, 2B и 2C, после P1, или происходящие из околососудистого вартонова студня клетки (ОСВС), полученные, как описано в сравнительных примерах 1, 2A, 2B и 2C, обе клеточные популяции получены из одной и той же пуповины, высевали в среде MSCBM CD с 5% чТЛ (смотри пример 0) без факторов роста и помещали в инкубатор при 37°C, 5% CO, с уровнем влажности 95%. Через три дня после высева, и каждые 3 после этого, проводили подпитку культур клеток. В день 4 или 5 каждого пассажа клетки обрабатывали трипсином и подсчитывали.
Подсчет клеток: клетки подсчитывали с использованием 0,4% раствора красителя трипанового синего в счетной камере Бюркера, и совокупное удвоение популяции (СУП) рассчитывали, как описано выше.
Результаты представлены на фигуре 9. У происходящих из СВС клеток наблюдали большее число удвоений популяции (УП) на пассаж, чем у происходящих из ОСВС клеток (фигура 9A). Таким образом, УП у происходящих из СВС клеток по настоящему изобретению происходит быстрее, чем у происходящих из ОСВС клеток. Статистически значимое увеличение количества удвоений популяции имело место у происходящих из СВС клеток и в пассажах 2, 3 и 4, в сравнении с происходящими из ОСВС клетками (на основании критерия Стьюдента).
Происходящие из СВС клетки имеют более высокий пролиферативный потенциал, который сохраняется в течение по меньшей мере 9 пассажей в используемых условиях культивирования (ростовая среда MSCBM CD с 5% чТЛ). В этих условиях культивирования, как экспериментально определено для двух независимых изолятов происходящих из СВС клеток, у происходящих из СВС клеток старение наступит между пассажем 10 и пассажем 12, как показано в следующей далее Таблице.
Таблица: Рост происходящих из СВС клеток по изобретению
Пассаж
Выделение 1
Выделение 2
1
5,89
4,99
Количество удвоений популяции на пассаж
2
5,00
5,47
3
5,04
4,76
4
5-02
4,24
5
4,58
5,03
6
4,95
5,30
7
5,40
4,69
8
5,22
4,63
9
4,92
4,54
10
4,83
1,81
11
4,58
н/п
12
3,27
н/п
Всего
58,70
45,44
Совокупное удвоение популяции
Данный пример предоставляет дополнительные доказательства того, что условия выделения и размножения происходящих из стромального вартонова студня клеток (происходящих из СВС клеток) по настоящему изобретению позволяют получать большие клеточные популяции происходящих из СВС клеток. Данный пример также предоставляет дополнительные доказательства того, что происходящие из СВС клетки отличаются от происходящих из ОСВС клеток и имеют более высокий пролиферативный потенциал.
Высокий пролиферативный потенциал и увеличение количества удвоений популяции (УП) на пассаж приводят к увеличению выхода клеток для клеточного банка и/или уменьшению времени для получения клеточного банка, соответственно, в сравнении с эталонными МСК, такими как происходящие из ОСВС клетки. Это является преимуществом с точки зрения производства.
Пример 10: Теломеразная активность
Для данного анализа 200000-500000 происходящих из вартонова студня стромальных клеток (СВС) по настоящему изобретению разделяли на аликвоты в 1-мл пробирки Eppendorf, а затем центрифугировали при 1200 об/мин (Beckham Coulter Allegra™ 25R) в течение 10 минут при +4°C. Супернатант удаляли, и клетки ресуспендировали в 1X PBS. После второго этапа центрифугирования сухие осадки хранили при -80°C. Для проведения анализа использовали набор TeloTAGGG Telomerase PCR ELISA PLUS kit (Roche Diagnostics) в соответствии с инструкциями производителя. Результаты представлены на фигуре 10. В анализируемых образцах наблюдали в среднем 2,4 ± 1,7% теломеразной активности в сравнении с положительным контролем, предоставленном в наборе (принимаемым за 100%). Это подтверждает, что более высокая способность к пролиферации происходящих из СВС клеток не коррелирует с аномально высокой теломеразной активностью.
Пример 11: Старение
2
2
2
Материалы и методы: Происходящие из вартонова студня стромальные клетки (СВС) по настоящему изобретению, обработанные трипсином (для информации о происхождении клеток смотри примеры 1 и 2A; для информации о пассажах смотри примеры 2B и 2C) после пассажа 6 (P6), пассажа 8 (P8) или пассажа 11 (P11), пассажа 12 (P12), высевали в шесть многолуночных планшетов при плотности 3000 клеток/см в 3 мл культуральной среды (DMEM с 5% чТЛ или MSCBM CD с 5% чТЛ) и культивировали в течение 4-5 дней при 37°C в инкубаторе с 5% CO и уровнем влажности 95%, в трех повторах, если не указано иначе. Затем клетки промывали 1X фосфатно-солевым буфером (PBS) и фиксировали в течение 10 минут при комнатной температуре в смеси 2% формальдегида/0,2% глутаральдегида. Культуральный планшет промывали два раза 1X PBS и добавляли 1 мл свежего β-Gal окрашивающего раствора (1 мг 5-бром-4-хлор-3-индолил-βD-галактозидазы/100 мкл диметилформамида, 40 мМ лимонная кислота/фосфат натрия, pH 6,0, 5 мМ ферроцианид калия, 5 мМ феррицианид калия, 150 мМ NaCl и 2 мМ MgCl) (использовали в соответствии с инструкциями производителя). Клетки инкубировали в течение ночи при 37°C, и окраска развивалась в свете инвертированного микроскопа, как описано в инструкциях, предоставленных производителем (Cell Signaling Technology). Положительно окрашенные клетки имели сине-зеленый цвет цитоплазмы. Окрашенные образцы промывали 1X PBS и наблюдали под 2,5X объективом инвертированного микроскопа (Zeiss). Положительно окрашенные клетки (в каждом поле) подсчитывал один наблюдатель, и по меньшей мере 8 полей зрения анализировали для каждого донора (если не указано иначе).
Результаты: В ранних пассажах культивирования (P6-P8) лишь несколько клеток были слабо положительными при β-галактозидазном окрашивании (данные не представлены), это указывало на то, что даже при очень низкой плотности посева происходящие из СВС клетки по настоящему изобретению имеют тенденцию к незначительному старению. Без связи с какой-либо теорией, возможно, что тромбоцитарный лизат содержит добавки, которые создают преимущества для роста клеток ex vivo, например, факторы роста.
Пример 12: Остеогенный потенциал дифференциации
2
Описание метода: Происходящие из СВС клетки из пассажа 5 (пример 2C) были индуцированы для дифференциации в клетки остеогенной линии дифференцировки. Вкратце, происходящие из СВС клетки высевали при плотности 10000 клеток/см в среде MSCBM CD с 5% чТЛ в 6-луночные (6-MW) планшеты. Эти 6-MW планшеты предварительно покрывали 0,1% раствором желатина. После уравновешивания в течение 3-4 дней поддерживающую среду удаляли и заменяли остеогенной средой. Остеогенная среда состояла из MSCBM CD с 5% чТЛ, с добавлением 10 мМ бета-глицерофосфата, 0,1 мМ аскорбиновой кислоты 2-фосфата и 10 нМ дексаметазона, плюс также 100 нг/мл rhBMP-2 (костный морфогенный белок 2), начиная с 7-го дня индукции и далее. Остеогенную дифференциацию подтверждали путем окрашивания методом фон Косса (при этом костный матрикс окрашивается в темный цвет) в сочетании с анализом кПЦР в реальном времени (описанным ниже).
Через 2 недели культуры в остеогенной среде (смотри выше) и параллельные контрольные культуры (растущие параллельно в среде MSCBM CD плюс 5% чТЛ, то есть, среде, которая не индуцирует остеогенез) фиксировали и окрашивали для обнаружения отложений органического кальция. Для окрашивания методом фон Косса образцы фиксировали в ледяном метаноле в течение 2 мин, затем промывали дважды в дистиллированной воде и инкубировали под ультрафиолетовой (УФ) лампой с нитратом серебра в воде в течение 30 мин. После двух дополнительных промываний в дистиллированной воде рассматривали 10 полей при высоком увеличении, используя 10X увеличение (инвертированный микроскоп Axioskop-Observer-1; Zeiss). Цифровые изображения анализировали с использованием программы ImageJ (National Institute of Health, USA), избирательно подсчитывая темные положительно окрашенные области отложения органического кальция. Эксперименты проводили в трех повторах.
Результаты: Результаты представлены на фигуре 12. Как показано, после 14 дней обработки остеогенной средой морфология контрольных образцов отличалась от морфологии индуцированных остеогенной средой образцов, и окрашивание методом фон Косса фосфата кальция приводило к появлению темного положительного окрашивания (фигура 12A). Разница между положительно окрашенными областями в контроле и в индуцированных образцах была статистически значимой (на основании критерия Стьюдента) (фигура 12B). Для дополнительного подтверждения остеогенных признаков проводили молекулярный анализ методом ПЦР в реальном времени (фигура 12C). Относительный уровень экспрессии гена остеогенного биомаркера был нормирован на уровень экспрессии эндогенного эталонного гена бета-актина. Кратность индукции мРНК рассчитывали относительно культуры происходящих из СВС клеток в стандартных условиях (MSCBM CD плюс 5% чТЛ), которые были определены как не индуцированные и субконфлюэнтные клетки. Все протестированные гены отличались значительной повышающей регуляцией относительно культуры в стандартных условиях (p≤0,05, на основании критерия Стьюдента). Авторы изобретения установили, что щелочная фосфатаза (ALPL) и некоторые матриксные белки, такие как бигликан (BGN), коллаген (COL1A1), декорин (DCN) и эластин (ELN), были наиболее индуцированными биомаркерами. Сочетание этих маркеров характерно для клеток остеогенной линии дифференцировки (Murgia et al., PLoS One. 2016, vol. 11: e0163629). Данный профиль экспрессии подтверждает начальное остеогенное коммитирование клеток.
Пример 13: Адипогенный потенциал дифференциации
2
Описание метода: Для адипогенной дифференциации происходящие из СВС клетки (примеры 1, 2A, 2B, 2C) из пассажа 5 культивирования высевали при плотности 10000 клеток/см в среде MSCBM CD с 5% чТЛ в 6-луночные (6-MW) планшеты, и через 3 дня среду заменяли адипогенной индукционной средой. Адипогенная среда состояла из MSCBM CD с 5% чТЛ, с добавлением 1 мкМ дексаметазона, 60 мкМ индометацина, 10 мкМ инсулина, 0,5 мМ 3-изобутил-1-метилксантина (IBMX), 10% кроличьей сыворотки, 5% лошадиной сыворотки, 1% L-глутамина и 1% смеси пенициллин/стрептомицин. Контрольные клетки культивировали в среде MSCBM CD с 5% чТЛ. Клетки высевали в технических дубликатах для каждого условия.
Через 10 дней клетки окрашивали красителем Oil Red O (коммерчески доступным красителем для адипоцитов) для подтверждения дифференциации следующим образом: клетки быстро промывали 1x PBS, фиксировали парами 37% раствора формальдегида в течение 10 минут, а затем промывали водой в течение 2 минут. Окрашивание осуществляли, добавляя раствор Oil Red O (10 мг/мл Oil Red O в этаноле 70% и ацетоне) на 3 минуты в лунки. Проводили контрастное окрашивание клеток гематоксилином Харриса (Bio-Optica, Milan, Italy) в течение 3 минут. После обработки дифференцированные клетки и контроли анализировали под микроскопом (Axio Observer A1 с цветной камерой Axiocam MRC5 и программа Axiovision 4.82; все от компании Zeiss).
Результаты представлены на фигуре 13. Происходящие из СВС клетки после 10 дней обработки были способны продуцировать круглые липидные капли внутри клеток, что подтверждало адипозное коммитирование клеток. Липидные вакуоли были в большом количестве обнаружены в индуцированных образцах, но не в не индуцированных контролях (фигура 13).
Пример 14: Хондрогенный потенциал дифференциации
2
4
2
4
Описание метода: Для хондрогенной дифференциации 200000-500000 происходящих из СВС клеток (примеры 1, 2A, 2B, 2C) из пассажа 5 культивирования разделяли на аликвоты в 15-мл пробирки и центрифугировали при 1200 об/мин (Beckham Coulter Allegra™ 25R) в течение 10 минут. Клетки поддерживали в осадке в ростовой среде при 37°C с открытой крышкой. После 2 дней инкубации ростовую среду заменяли индукционной средой, состоящей из MSCBM CD с 5% человеческого тромбоцитарного лизата (чТЛ), с добавлением: 500 нг/мл rhBMP-6, 10 нг/мл трансформирующего фактора роста β, 50 мг/мл смеси ITS+ Premix (содержащей инсулина 6,25 мкг/мл, трансферрина 6,25 мкг/мл, селеновой кислоты 6,25 нг/мл, БСА 1,25 мг/мл и линолевой кислоты 5,35 мкг/мл), 100 нМ дексаметазона, 0,2 мМ L-аскорбиновой кислоты 2-фосфата, 100 мкг/мл пирувата натрия, 40 мкг/мл пролина. Среду заменяли каждые три дня. До и после каждой замены среды пробирки центрифугировали при 1200 об/мин в течение 10 минут, как описано выше. Во время периода инкубации клетки оставались в осадке с открытыми крышками пробирок. Индукция продолжалась 21 день, образцы фиксировали в течение 1 часа в 10% растворе формальдегида, а затем обезвоживали путем серийного проведения через растворы этанола в возрастающих концентрациях, от 70% (об/об) до 100%. Затем образцы заключали в парафиновые блоки, получали срезы, которые помещали на предметные стекла микроскопа для окрашивания альциановым синим. Слайды депарафинировали при помощи очищающего реагента Histo-C и регидратировали путем проведения через растворы этанола в понижающихся концентрациях (от 100% этанола до 70% этанола) (об/об). Срезы образцов затем инкубировали с 0,5 мг/мл раствором гиалуронидазы в буферном фосфатном растворе (8 г/л NaCl, 2 г/л NaHPO и 0,3 г/л NaHPO) с 10 мг/мл БСА. Слайды промывали водой в течение 5 минут, а затем погружали в 3% (об/об) раствор уксусной кислоты на несколько секунд. Срезы окрашивали 10 мг/мл раствором альцианового синего (коммерческий краситель) в 3% растворе уксусной кислоты (pH 2,5), оставляли в этом растворе на 30 минут и, после этапа промывания водой, проводили контрастное окрашивание в течение 5 минут раствором ядерного быстрого красного (коммерческий краситель).
Результаты представлены на фигуре 14. После 21 дня обработки у происходящих из СВС клеток развилась многослойная богатая матриксом морфология. Индуцированные происходящие из СВС клетки имели меньший объем клеточного содержимого и меньшее количество гликозаминогликанов во внеклеточном матриксе. Контрольные происходящие из СВС клетки имели большое количество клеточного содержимого и слаборазвитый матриксный компонент.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фигура 1:
Поперечный срез (человеческой) пуповины и схематическое изображение секций (анатомических областей) (человеческой) пуповины. Два внешних эллипса в серых тонах (1a и 1b) вместе образуют выстилающую оболочку пуповины (содержащую два слоя: 1a (окружность темно-серого цвета снаружи), амниотический (или эпителиальный) слой, также называемый выстилающей оболочкой пуповины; и 1b (изображенный светло-серой окружностью внутри): субамниотический (или мезенхимальный) слой); 2: пупочная вена; 3: пупочные артерии; 4: межсосудистая область; 5: околососудистая область (изображена серым цветом); 6: иллюстративный пример расположения вартонова студня; 7: пуповинная кровь (в просвете сосуда). Если специально не указано иначе, субамниотическая строма (1b) содержится в «строме», описанной в настоящем документе. Если специально не указано иначе, субамниотический вартонов студень содержится в вартоновом студне, описанном в настоящем документе как «стромальный вартонов студень».
Фигура 2: Иммуногистохимическое определение различных областей человеческой пуповины. ВС: вартонов студень; МС: многослойная стенка; ОС: околососудистая зона; С: сосуд; П: просвет. Стромальный ВС: ВС на расстоянии по меньшей мере 3 мм от внешней стенки сосудов пуповины, и внутрь от амниотического эпителия.
: Околососудистая область на расстоянии примерно 2,00 мм, включающая ВС+перициты+эндотелиальные клетки.
Материалы и методы: Образец человеческой пуповины фиксировали в формалине и заливали парафином. Фрагменты выделяли и нарезали на 5-мкм срезы для дальнейшего окрашивания. Видно разное окрашивание в разных областях, представляющих стромальный вартонов студень и околососудистую область. Околососудистая область имеет более сложный гисто-морфологический паттерн с сосудами (С), околососудистыми клетками (ОС), находящимися на границе областей ВС. Сложность также связана с клетками разных типов, представленными в околососудистой области. Напротив, стромальный вартонов студень гистологически выглядит как относительно более однородная область с более однородными клеточными элементами, рассеянными в матриксе стромальной ткани. Выделенные клетки экспрессируют маркеры, обычно встречающиеся в популяциях МСК ex vivo, такие как CD10, CD140b, GD2, CD73 (не показано на данной фигуре). Паттерны иммуногистохимического окрашивания для этих маркеров также отличаются в этих двух областях. На фигуре 2B гистологические отличия более очевидны между областью сосудов пуповины и стромальным вартоновым студнем. В сосудах (С) четко виден просвет (П) и клетки (стрелки), представляющие эндотелиальный слой (CD31) и субэндотелиальный слой (CD146, CD271, GD2). Также установлено, что CD140b экспрессируется во внутрипросветной части сосуда. CD73-положительное окрашивание имеет место в субэндотелиальном слое, с интенсивностью, возрастающей в направлении матрикса вартонова студня (Rasini et al., 2013, Cytotherapy, vol. 15, p. 292-306).
Фигура 3: Разрезание (разделение на секции) и экстрагирование клеток - для получения подробной информации смотри пример 1.
Фигура 4: Результаты, полученные в примере 4, подтверждающие, что способ по изобретению приводит к значительно более высокой жизнеспособности клеток. Для получения подробной информации смотри пример 4.
*ОСВС: клетки, полученные общепринятым способом, смотри сравнительные примеры. СВС: клетки, выделенные в соответствии с настоящим изобретением.
6
6
A: Апоптотические клетки: эффект тромбоцитарного лизата и сравнение с общепринятым способом. Что касается количества свежевыделенных клеток, авторы изобретения получали больше клеток (ОСВС) при использовании протокола, описанного в сравнительном примере 1, (4,15 ± 1,28×10), чем при использовании протокола по настоящему изобретению (1,49 ± 0,35×10). График представляет средние значения и стандартную ошибку среднего (SEM) для апоптотических клеток при трех расщеплениях (n=3). 30,6% ± 9,6% от общего количества выделенных в соответствии с сравнительным примером 1 происходящих из ОСВС клеток были положительными по 7AAD (фигура 4A, более высокий заштрихованный столбик справа). Напротив, процентная доля происходящих из СВС клеток, положительных по 7AAD, как в присутствии, так и в отсутствие, чТЛ, намного ниже. Таким образом, авторы изобретения установили, что клетки, полученные в соответствии с настоящим изобретением, имеют более высокую степень жизнеспособности, чем клетки, полученные общепринятым в настоящее время способом.
B: FACS анализ образцов свежевыделенных клеток. 4 графика FACS представляют физические параметры (справа) и окрашивание 7AAD (то есть, апоптоз, слева) происходящих из СВС клеток (верх) и происходящих из ОСВС клеток (низ), соответственно. В графиках справа живые клетки находятся слева от вертикальной линии.
C: Графическое представление общего количества клеток при определении методом проточной цитометрии (фигура 4B). График представляет средние значения и стандартную ошибку среднего (SEM) для апоптотических клеток в трех расщеплениях (n=3 для обеих клеточных популяций).
D: Графическое представление процентной доли апоптотических клеток при определении методом проточной цитометрии (фигура 4B). FACS анализ образцов свежевыделенных клеток показал, что происходящие из СВС клетки по настоящему изобретению имеют более 79% жизнеспособных клеток во всей клеточной популяции. Напротив, 52,9% ± 2,6% от общего количества клеток, выделенных в соответствии с протоколом, описанным в сравнительном примере 1, (происходящие из ОСВС клетки) были положительными при окрашивании 7AAD. C: Эффективность выделения клеток в образцах СВС (n=5) и ОСВС (n=9). D: График представляет средние значения и стандартную ошибку среднего (SEM) для апоптотических клеток в трех расщеплениях (n=3 для обеих клеточных популяций).
Фигура 5: Морфология и образование колоний
A: Представлены физические параметры, определенные методом проточной цитометрии, то есть, путем определения прямого светорассеяния (FSC) и бокового светорассеяния (SSC), свежевыделенных клеток из пуповины (график FACS слева). График представляет средние значения и SEM для физических параметров. Выделенная происходящая из СВС клеточная популяция (в соответствии с примерами 1 и 2A) характеризуется значительно более низкими значениями FSC, чем выделенная происходящая из ОСВС клеточная популяция (в соответствии с сравнительными примерами 1 и 2A; p=0,02 на основании критерия Стьюдента). SSC: происходящие из СВС клетки имеют более низкую цитоплазматическую комплексность, чем клетки из ОСВС. Для получения подробной информации смотри пример 4A.
B: Изучение морфологии в пассаже 1 культивирования (n=3). После размножения происходящие из СВС клетки (пример 2C) характеризовались мелкими и веретенообразными клетками в клеточной популяции, в то время как происходящие из ОСВС клетки (в соответствии с сравнительным примером 2C) характеризовались крупными клетками и наличием выраженного цитоскелета. Два изображения представляют морфологию происходящих из СВС клеток (слева) в сравнении с происходящими из ОСВС клетками (справа) через два или три дня после высевания в пассаже 1 (P1) культивирования в репрезентативном образце (оригинальное увеличение 100X).
C: Образование колоний происходящими из СВС клетками и происходящими из ОСВС клетками. Для получения подробной информации смотри пример 4C. Клетки окрашивали кристаллическим фиолетовым перед получением изображения, показанного внизу. Культуры происходящих из СВС клеточных популяций состоят из клеток с небольшой площадью поверхности; эти клетки имеют тенденцию к образованию колоний, в то время как происходящие из ОСВС клеточные популяции состоят из клеток с разными площадями поверхности, также включающих крупные клетки. Таким образом, происходящие из СВС клетки выглядят более однородными; «однородные» в данном контексте означает, что клетки выглядят практически очень похожими или аналогичными. Более крупные происходящие из ОСВС клетки имеют тенденцию к относительно более медленному росту (данные не представлены).
2
2
-7
Фигура 6: Количественное определение клеточной площади поверхности: происходящие из СВС клетки в сравнении с происходящими из костного мозга мезенхимальными стромальными клетками (КМ, или КМ-МСК). Прикрепляющиеся к пластику МСК из костного мозга и из стромального вартонова студня (КМ и СВС, соответственно) визуализировали во время пассажа 5 (P5) культивирования. Получали по пять изображений для каждого образца, и 34 КМ-МСК и 33 СВС клетки были оптически идентифицированы. Клетки графически очерчивали вручную при визуальном осмотре. Происходящие из КМ клетки отличались большей средней клеточной площадью поверхности (4300,5 ± 2486,5 мкм) в сравнении с происходящими из СВС клетками (1701,2 ± 1137,3 мкм) (p=5,15X10, на основании ANOVA). Таким образом, был сделан вывод о том, что происходящие из СВС МСК по настоящему изобретению имеют меньший размер, чем происходящие из КМ МСК.
Фигура 7: Результаты, полученные в примере 7. График слева представляет средние значения и SEM для поверхностных маркеров в происходящих из ОСВС клетках и происходящих из СВС клетках, в обоих случаях свежевыделенных из трех пуповин двумя разными способами выделения (СВС: в соответствии с примерами 1 и 2A; ОСВС: в соответствии с сравнительными примерами 1 и 2A). Иммунофенотипический анализ свежевыделенных обоими способами образцов показал наличие CD105, CD73 и CD90, типичных поверхностных антигенов, экспонируемых на МСК. Аналогично, наличие на поверхности рецептора β тромбоцитарного фактора роста (CD140b) было обнаружено после применения обоих способов. Экспрессия HLA-DR отсутствовала в обоих образцах. Однако наличие на поверхности 3G5 было обнаружено только в популяции происходящих из ОСВС клеток, это указывало на то, что способ по настоящему изобретению особенно подходит для выделения популяции происходящих из СВС МСК, которые не содержат околососудистые клетки.
A: График слева представляет средние значения и SEM для поверхностных маркеров в происходящих из ОСВС и СВС свежевыделенных клетках из трех пуповин, обработанных двумя разными способами расщепления (сравнительный пример 1, «ОСВС», в сравнении с клетками по настоящему изобретению, «СВС»). На панели справа показаны некоторые поверхностные маркеры, которые экспрессируются/не экспрессируются в большинстве клеток.
B: График представляет среднюю процентную долю клеток, экспонирующих специфические поверхностные маркеры, в свежевыделенных клетках из пуповин двумя разными способами (сравнительный пример 1, «ОСВС», в сравнении с клетками по настоящему изобретению, «СВС»).
Фигура 8: Количественное определение экспрессии генов в клетках по настоящему изобретению методом ПЦР в реальном времени (ОТ-ПЦР). Проводили ОТ-ПЦР анализ двух независимых клеточных популяций, выделенных по настоящему изобретению; результаты для обеих показаны на фигуре 8 в сравнении с результатами для контрольных происходящих из ОСВС клеток. График показывает различия в экспрессии (дельта Ct) между 2 генами (интересующий ген против гена бета-актина, гена «домашнего хозяйства»).
Экспрессия APCDD1 не была обнаружена в контрольных клетках.
Фигура 9: Пролиферативный потенциал: График представляет средние значения и SEM (стандартную ошибку среднего) для количества совокупных удвоений популяции происходящих из ОСВС клеток (n=9) и происходящих из СВС клеток (n=7) в четырех проанализированных пассажах культивирования (от P1 до P4). Большее количество удвоений популяции (УП) на пассаж наблюдали у происходящих из СВС клеток, в сравнении с происходящими из ОСВС клетками. Для получения подробной информации смотри пример 9.
Фигура 10: Экспрессия теломеразы в разных лотах происходящих из СВС клеток. Для получения подробной информации смотри пример 10.
Фигура 11: Старение в разных лотах происходящих из СВС клеток. CAKE2 является аббревиатурой для минимальной среды, практически эквивалентной MSCBM CD; 5ТЛ является аббревиатурой для 5% (об/об) человеческого тромбоцитарного лизата. Для получения подробной информации смотри пример 11.
Фигура 12: Остеогенный потенциал происходящих из ВС клеточных популяций. Прерывание столбиков указывает на изменение шкалы. CAKE2 является аббревиатурой для минимальной среды, практически эквивалентной MSCBM CD; 5ТЛ является аббревиатурой для 5% (об/об) человеческого тромбоцитарного лизата. Для получения подробной информации смотри пример 12.
Фигура 13: Адипогенный потенциал происходящих из ВС клеточных популяций. Для получения подробной информации смотри пример 13. Происходящие из СВС клетки продуцируют круглые липидные капли внутри клеток (верхняя и нижняя панели справа), что подтверждает адипозное коммитирование клеток. Липидные вакуоли были в большом количестве обнаружены в индуцированных образцах, но не в не индуцированных контролях. CAKE2 является аббревиатурой для минимальной среды, практически эквивалентной MSCBM CD; 5ТЛ является аббревиатурой для 5% (об/об) человеческого тромбоцитарного лизата.
Фигура 14: Хондрогенная дифференциация происходящих из СВС клеточных популяций. Для получения подробной информации смотри пример 14. После 21 дня обработки у не индуцированных происходящих из СВС клеток (контроль) развилась многослойная богатая матриксом морфология (две панели слева). Индуцированные происходящие из СВС клетки (две панели справа) имели меньший объем клеточного содержимого и меньшее количество гликозаминогликанов во внеклеточном матриксе (темные области, соответствующие сильно окрашенным в синий цвет областям на оригинальном цветном изображении). CAKE2 является аббревиатурой для минимальной среды, практически эквивалентной MSCBM CD; 5ТЛ является аббревиатурой для 5% (об/об) человеческого тромбоцитарного лизата.