ПРОДУКТЫ И СПОСОБЫ ДЛЯ УХОДА ЗА ПОЛОСТЬЮ РТА, СОДЕРЖАЩИЕ HLP
ORAL CARE PRODUCTS AND METHODS CONTAINING HLP

Уровень техники
Зубная эмаль представляет собой тонкий твердый слой кальцинированного материала, который покрывает коронки зубов. Основным минеральным компонентом зубной эмали является гидроксиапатит, кристаллическая форма фосфата кальция. Химическая эрозия зубной эмали может возникать из-за воздействия на зубы кислых пищевых продуктов и напитков или желудочного сока, появляющегося в результате желудочно-кишечного рефлюкса. Эрозия зубной эмали может привести к повышенной чувствительности зубов из-за увеличения воздействия на канальцы дентина и увеличения видимости дентина, что приводит к появлению более желтых зубов. Слюнная пелликула (тонкий слой слюнных гликопротеинов, расположенных на зубах) является неотъемлемой частью защиты зубов от поражения эрозией. В результате люди, которые испытывают ксеростомию, более подвержены повреждению кислотной эрозией.
Существующие методы, разработанные для предотвращения эрозии эмали, включают включение источника свободного фторида в композиции для ухода за полостью рта. Фторид уменьшает повреждение эмали путем образования фтор апатита, который растворяется при более низком значении рН, чем гидроксиапатит, и поэтому более устойчив к кислотному повреждению. Соли двухвалентного олова также были включены в композиции средства для чистки зубов для защиты поверхности эмали подобным образом, путем образования более устойчивого к кислоте минерального слоя. Полимеры также были описаны, которые покрывают и защищают поверхность эмали.
Кислоты также образуются в полости рта, когда бляшка, содержащая кариесогенные бактерии, метаболизирует углеводы. Поскольку бляшка образует барьер, контролирующий кинетику протонной и минеральной диффузии через эмаль, кислоты бляшки вызывают кариозные поражения. Включение фторидных ионов в композиции средства для чистки зубов является наиболее распространенным методом смягчения воздействия кислот бляшек. Фторид снижает скорость деминерализации и усиливает реминерализацию. Было также разработано несколько подходов для стабилизации фосфатных солей кальция или контроля значения рН бляшек для улучшения реминерализации.
Несмотря на то что были разработаны методы для смягчения воздействия небактериально и бактериально образованных кислот на зубах, все еще существует потребность в обеспечении улучшенных композиций для ухода за полостью рта, которые эффективно восстанавливают эмаль после воздействия кислотной эрозии и бактериальных кислот.
В WO 2011/157497 раскрывается вспениваемая композиция для ухода за полостью рта, содержащая менее 1.5% анионного поверхностно-активного вещества (из расчета на общую массу анионного поверхностно-активного вещества от общей массы композиции), абразивное очищающее средство и гидрофобии.
Сущность изобретения
Авторами настоящего изобретения неожиданно было обнаружено, что гидрофобин-подобные белки (HLP) эффективны для восстановления или смягчения эффектов зубной эрозии, способствуя зубной реминерализации, и усиливая противокариозные эффекты фторида.
2
Например, в одном варианте выполнения настоящего изобретения, HLP получают для введения в композицию с ингредиентами подходящего перорально приемлемого носителя, посредством разбавления в буфере, например, фосфатном буфере, таком как Na2HPO4 буфер (1.5 мМ) и CaCl (2.5 мМ), с обеспечением буферизованного раствора, имеющего почти нейтральное или слегка основное значение рН, например, рН 7-8, например, около рН 7.5, фильтрации и центрифугирования раствора с получением фильтрата, содержащего HLP. Биоцид (например, цетилпиридиния хлорид при 0.1%) и фторид могут быть добавлены в фильтрат.HLP зачем может быть объединен с компонентами перорально приемлемого носителя, например, основой зубной пасты или жидкости для полоскания рта, с обеспечением композиции для ухода за полостью рта для восстановления или смягчения эффектов зубной эрозии, способствуя зубной реминерализации, и усиливая противокариозные эффекты фторида.
Настоящее изобретение, таким образом, относится к композиции для ухода за полостью рта (Композиция 1), например, средству для чистки зубов, содержащей:
a) HLP;
b) перорально приемлемый носитель,
где HLP присутствует в композиции в количестве от 0.01 мас. % до 3 мас. % от общей массы композиции. Например, настоящее изобретение обеспечивает:
1.1. Композицию 1, в которой HLP имеет полипептидную последовательность SEQ ID NO: 22.
1.2. Любую вышеуказанную композицию, содержащую фторид.
1.3. Любую вышеуказанную композицию, в которой HLP был нейтрализован до почти нейтрального или слегка основного значения рН, например, рН 7-8, например, применяя фосфатный буфер.
1.4. Любую вышеуказанную композицию, в которой HLP содержит биоцид, например, цетилпиридиния хлорид (СРС), при эффективной концентрации, например, 0.1% по массе фильтрата.
1.5. Любую вышеуказанную композицию, в которой HLP присутствует в композиции в количестве от 0.1 мас. % до 3 мас. % от общей массы композиции, например, от 0.2 мас. % до 2 мас. %, например, около 0.2 мас. %, около 1 мас. %, около 1.5 мас. % или около 2 мас. % от общей массы композиции.
1.6. Любую вышеуказанную композицию, где композиция содержит эффективное количество фторида.
1.7. Любую вышеуказанную композицию, которая содержит количество фторида от 100 частей на миллион до 2500 частей на миллион, например, от 250 частей на миллион до 750 частей на миллион, например, около 500 частей на миллион фторид.
1.8. Любую вышеуказанную композицию, содержащую перорально приемлемую соль цинка или оксид, например, выбранный из оксида цинка, цитрата цинка, лактата цинка, фосфата цинка, ацетата цинка, хлорида цинка, комплексов цинка с аминокислотами, и смесей любого из вышеуказанного, например, в которой количество цинка составляет от 0.1 мас. % до 3 мас. %, например, от около 1 до около 2 мас. %, как вычислено на основе массы иона цинка.
2
2
1.9. Любую вышеуказанную композицию, содержащую перорально приемлемую соль двухвалентного олова, например, SnF или SnCl.
1.10. Любую вышеуказанную композицию, где композиция находится в форме, выбранной из средства для полоскания рта, зубной пасты, геля для ухода за зубами, зубного порошка, неабразивного геля, мусса, пены, средства для ароматизации рта в аэрозольной упаковке и таблетки, например, средства для чистки зубов, например, зубной пасты или средства для полоскания рта.
1.11. Любую вышеуказанную композицию, где композиция дополнительно содержит одно или более средств, выбранных из: абразивных материалов, рН-модифицирующих средств, поверхностно-активных веществ, модуляторов пены, загустителей, модификаторов вязкости, смачивающих средств, предупреждающих образование конкрементов средств или контролирующих образование зубного камня средств, подсластителей, ароматизаторов и красителей.
1.12. Любую вышеуказанную композицию, в которой композиция представляет собой зубную пасту.
1.13. Любую вышеуказанную композицию, содержащую одну или более растворимых фосфатных солей, например, где "растворимые фосфатные соли" означают перорально приемлемую фосфатную соль, имеющую растворимость в воде по меньшей мере 1 г/100 мл при 25°С; например, в которой одной или более растворимыми фосфатными солями являются натриевые и/или калиевые соли пирофосфатов и/или полифосфатов, например, Триполи фосфаты; например, в которой одна или более растворимых фосфатных солей содержат тетранатрия пирофосфат (TSPP), триполифосфат натрия (STPP) или комбинацию TSPP и STPP; например, где одна или более растворимые фосфатные соли присутствуют в количестве 1-20%, например, 2-8%, например, около 5%, по массе композиции.
1.14. Любую вышеуказанную композицию, в которой фторид обеспечивается посредством соли, выбранной из фторида двухвалентного олова, фторида натрия, фторида калия, монофторфосфата натрия, фторсиликата натрия, фторсиликата аммония, аминфторида (например, N'-октадецилтриметилендиамин-N,N,N'-трис(2-этанол)-дигидрофторид), аммония фторида, фторида титана, гексафторсульфата и их комбинаций.
1.15. Любую вышеуказанную композицию, которая представляет собой средство для чистки зубов, содержащее смачивающее средство, например, выбранное из глицерина, сорбитола, пропиленгликоля, полиэтиленгликоля, ксилита и их смесей, например содержащее по меньшей мере 30%, например, 40-50% глицерина, по массе композиции.
1.16. Любую вышеуказанную композицию, которая представляет собой средство для чистки зубов, содержащее одно или более поверхностно-активных веществ, например, выбранных из анионных, катионных, цвиттер-ионных и неионных поверхностно-активных веществ, и их смесей, например, где основа средства для чистки зубов содержит анионное поверхностно-активное вещество, например, поверхностно-активное вещество, выбранное из лаурилсульфата натрия, простоэфирного лаурилсульфата натрия и их смесей, например в количестве от около 0.3% до около 4.5 мас. %, например 1-2% лаурилсульфата натрия (SLS) по массе композиции.
1.17. Любую вышеуказанную композицию, которая представляет собой средство для чистки зубов, содержащее цвиттер-ионное поверхностно-активное вещество, например, бетаиновое поверхностно-активное вещество, например, кокамидопропилбетаин, например в количестве от около 0.1% до около 4.5 мас. %, например 0.5-2% кокамидопропилбетаина по массе композиции.
1.18. Любую вышеуказанную композицию, которая представляет собой средство для чистки зубов, содержащее модифицирующее вязкость количество одного или более из полисахаридных камедей, например, ксантановой камеди или каррагенана, кремнеземного сгустителя и их комбинаций.
1.19. Любую вышеуказанную композицию, которая представляет собой средство для чистки зубов, содержащее полоски или фрагменты камеди.
1.20. Любую вышеуказанную композицию, содержащую отдушку, ароматизатор и/или краситель.
1.21. Любую вышеуказанную композицию, которая представляет собой средство для чистки зубов, содержащее эффективное количество одного или более противомикробных средств, например, содержащее противомикробный агент, выбранный из галогенированного дифенилового простого эфира (например, триклозан), экстрактов трав и эфирных масел (например, экстракт розмарина, экстракт чая, экстракт магнолии, тимол, ментол, эвкалиптол, гераниол, карвакрол, цитраль, хинокитол, катехин, метилсалицилат, галлат эпигаллокатехина, эпигаллокатехин, галловая кислота, экстракт мисуака, экстракт облепихи крушиновидной, прополис), бигуанидных антисептиков (например, хлоргексидин, алексидин или октенидин), соединений четвертичного аммония (например, цетилпиридиний хлорид (СРС), бензалконий хлорид, тетрадецилпиридиний хлорид (ТРС), N-тетрадецил-4-этилпиридиний хлорид (TDEPC)), фенольных антисептиков, гексетидина, октенидина, сангвинарина, повидон-йода, делмопинола, салифтора, ионов металлов (например, соли цинка, например, цитрат цинка, соли олова, соли меди, соли железа), сангвинарина, прополиса и оксигенирующих средств (например, перекись водорода, забуференный пероксиборат или пероксикарбонат натрия), фталевой кислоты и ее солей, моноперфталевой кислоты и ее солей и сложных эфиров, аскорбилстеарата, олеилсаркозина, алкилсульфата, диоктилсульфосукцината, салициланилида, домифенбромида, делмопинола, октапинола и других производных пиперидина, препаратов ницина, хлоритных солей, а также смесей любых из вышеперечисленных; например, содержащее триклозан или цетилпиридиния хлорид.
1.22. Любую вышеуказанную композицию, которая представляет собой средство для чистки зубов, содержащее отбеливающее средство, например, выбранное из группы, состоящей из пероксидов, хлоритов металлов, перборатов, перкарбонатов, пероксикислот, гипохлоритов, а также их комбинаций; например, пероксид водорода или источник пероксида водорода, например, перекись мочевины или пероксидную соль или комплекс (например, такой как соли пероксифосфат, пероксикарбонат, перборат, пероксисиликат или персульфат, например пероксифосфат кальция, перборат натрия, перекись карбоната натрия, пероксифосфат натрия и персульфат калия).
1.23. Любую вышеуказанную композицию, которая представляет собой средство для чистки зубов, содержащее агент, которые вмешивается в прикрепление бактерий или препятствует ему, например, solbrol или хитозан.
1.24. Любую вышеуказанную композицию, которая представляет собой средство для чистки зубов, содержащее растворимую кальциевую соль, например, выбранную из сульфата кальция, хлорид кальция, нитрат кальция, ацетат кальция, лактат кальция и их комбинации.
1.25. Любую вышеуказанную композицию, которая представляет собой средство для чистки зубов, содержащее физиологически или перорально приемлемую калиевую соль, например, нитрат калия или хлорид калия, в количестве, эффективном для уменьшения чувствительности зубов.
1.26. Любую вышеуказанную композицию, которая представляет собой средство для чистки зубов, содержащее анионный полимер, например, синтетический анионный полимерный поликарбоксилат, например, в котором анионный полимер выбирают из от 1:4 до 4:1 сополимеров малеинового ангидрида или кислоты с другим полимеризуемым этиленненасыщенным мономером; например, в котором анионный полимер представляет собой сополимер метилвинилового простого эфира/малеинового ангидрида (PVM/MA), имеющий средневесовую молекулярную массу (M.W.) от около 30,000 до около 1,000,000, например от около 300,000 до около 800,000, например, в котором анионный полимер составляет около 1-5%, например, около 2%, от массы композиции.
1.27. Любую вышеуказанную композицию, которая представляет собой средство для чистки зубов, содержащее освежитель дыхания, отдушку или ароматизатор.
1.28. Любую из вышеуказанных композиций, в которой значение рН композиции является почти нейтральным, например, около рН 7.
1.29. Любую из вышеуказанных композиций для применения для уменьшения и ингибирования кислотной эрозии, очищения зубов, уменьшения бактериально-образованной биопленки и бляшки, уменьшения восстановления десен, ингибирования зубного кариеса и образования полостей, и уменьшения зубной гиперчувствительности.
1.30. Любую вышеуказанную композицию для применения для уменьшения, ингибирования или восстановления эрозии зубной эмали.
1.31. Любую вышеуказанную композицию для применения, чтобы промотировать зубную реминерализацию.
1.32. Любую вышеуказанную композицию для применения для усиления противокариозных эффектов фторида.
В конкретном варианте выполнения настоящего изобретения Композиция 1 представляет собой средство для чистки зубов, содержащее
a) HLP; например, содержащее сухое вещество в количестве по меньшей мере 20.0%, общий азот в количестве по меньшей мере 2.5%, имеющее значение рН 4.0-5.0, и содержание золы 1.0% или менее; в котором частично гидролизованный пшеничный белок был нейтрализован до почти нейтрального или слегка основного значения рН;
b) необязательно эффективное количество фторида;
c) перорально приемлемый носитель,
например, в котором количество HLP составляет от 0.1 мас. % до 2 мас. %, и
например, где фторид присутствует в количестве от 100 частей на миллион до 1000 частей на миллион, например, около 500 частей на миллион.
Одним объектом настоящего изобретения является любая из композиций 1 и последующих, для применения для восстановления или ингибирования зубной эрозии, способствуя реминерализации и/или усиливая противокариозные эффекты фторида; например, для применения в любом из следующих способов согласно способу 1 и последующим.
Другим объектом настоящего изобретения является способ (способ 1) восстановления или ингибирования зубной эрозии, способствуя зубной реминерализации, и/или усиливая противокариозные эффекты фторида, включающий нанесение на зубы композиции, например, любой из композиции 1 и последующих, например, композиции для ухода за полостью рта, содержащей:
a) HLP
b) перорально приемлемый носитель,
где HLP присутствует в композиции в количестве от 0.01 мас. % до 3 мас. % от общей массы композиции. Например, настоящее изобретение обеспечивает:
1.1. Способ 1, в котором HLP имеет полипептидную последовательность SEQ ID NO: 22.
1.2. Любой вышеуказанный способ, в котором HLP содержит фторид.
1.3. Любой вышеуказанный способ, в котором HLP содержит биоцид, например, цетилпиридиния хлорид (СРС) при эффективной концентрации, например, 0.1% по массе фильтрата.
1.4. Любой вышеуказанный способ, в котором HLP присутствует в композиции в количестве от 0.1 мас. % до 3 мас. % от общей массы композиции, например, от 0.2 мас. % до 2 мас. %, например, около 0.2 мас. %, около 1 мас. %, около 1.5 мас. % или около 2 мас. % от общей массы композиции.
1.5. Любой вышеуказанный способ, в котором композиция содержит эффективное количество фторида.
1.6. Любой вышеуказанный способ, в котором количество фторида составляет от 100 частей на миллион до 1000 частей на миллион, например, около 500 частей на миллион фторид.
1.7. Любой вышеуказанный способ, в котором композиция находится в форме, выбранной из средства для полоскания рта, зубной пасты, геля для ухода за зубами, зубного порошка, неабразивного геля, мусса, пены, средства для ароматизации рта в аэрозольной упаковке и таблетки.
1.8. Любой вышеуказанный способ, в котором композиция дополнительно содержит одно или более средств, выбранных из: абразивных материалов, рН-модифицирующих средств, поверхностно-активных веществ, модуляторов пены, загустителей, модификаторов вязкости, смачивающих средств, предупреждающий образование конкрементов или контролирующих образование зубного камня средств, подсластителей, ароматизаторов и красителей.
1.9. Любой вышеуказанный способ, в котором композиция представляет собой средство для чистки зубов, например, зубную пасту.
1.10. Любой вышеуказанный способ, в котором композицию выбирают из любой из Композиций 1 и последующих, указанных выше.
1.11. Любой вышеуказанный способ, который представляет собой способ для уменьшения, ингибирования или восстановления зубной эрозии, например, эрозии эмали, например, в котором композицию наносят на зуб пациента, идентифицированного как имеющий зубную эрозию или имеющий повышенный риск развития зубной эрозии.
1.12. Любой вышеуказанный способ, который представляет собой способ промотирования зубной реминерализации, например, реминерализации эмали, например, в котором композицию наносят на зуб пациента, идентифицированного как имеющий деминерализацию.
1.13. Любой вышеуказанный способ, который представляет собой способ усиления противокариозных эффектов фторида, например, в которой в котором композицию наносят на зуб пациента, идентифицированного как имеющий первые признаки зубного кариеса, например, начальный кариес эмали, или как имеющий активный кариес, или имеющий повышенный риск развития зубного кариеса.
1.14. Способ 1.15, в котором композиция содержит эффективное количество фторида и/или, в котором способ дополнительно содержит введение продукта для ухода за полостью рта, ополаскивателя для полости рта, содержащего эффективное количество фторида, или зубной пасты, содержащей эффективное количество фторида.
В другом варианте выполнения настоящего изобретения, настоящее изобретение обеспечивает применение HLP для получения композиции для ухода за полостью рта, например, согласно любой из композиций 1 и последующих, для восстановления или ингибирования зубной эрозии, способствуя реминерализации, и/или усиливая противокариозные эффекты фторида, например, в любом из способов 1 и последующих.
Другим объектом настоящего изобретения является способ (способ 2) получения продукта для ухода за полостью рта, например, продукта для ухода за полостью рта, полезного для восстановления или ингибирования зубной эрозии, способствуя зубной реминерализации, и/или усиливая противокариозные эффекты фторида, например, продукта в соответствии с любой из композиции 1 и последующих, включающий
a) нейтрализацию HLP посредством разбавления водным буферным раствором, например, фосфатным буферным раствором, с получением раствора, имеющего почти нейтральное или слегка основное значение рН, например, рН 7-8;
b) фильтрацию и центрифугирование раствора продукта согласно а) с получением фильтрата, содержащего HLP;
c) добавление фторида (например, в форме перорально приемлемой соли, содержащей фторид, например, фторид натрия или монофторфосфат натрия), и необязательно биоцида (например, цетилпиридиния хлорида в эффективном количестве, например, от 0.01 до 1%, например, около 0.1% по массе фильтрата) к фильтрату продукта b);
d) подмешивание продукта с) к компонентам перорально приемлемого носителя с получением композиции для ухода за полостью рта, содержащей HLP в количестве от 0.01 мас. % до 3 мас. % от общей массы композиции.
Например, настоящее изобретение обеспечивает композицию для ухода за полостью рта, содержащую HLP, например, композиция в соответствии с любой из композиции 1 и последующих, в которой композицию для ухода за полостью рта получают, или она является получаемой способом согласно способу 2 и последующим.
Другие области применимости настоящего изобретения станут очевидными на основании подробного описания, представленного ниже. Следует понимать, что подробное описание и конкретные примеры, с указанием предпочтительного варианта выполнения настоящего изобретения, предназначены только для иллюстрации и не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения.
Подробное описание изобретения
Нижеследующее описание предпочтительного варианта (вариантов) выполнения настоящего изобретения является просто иллюстративным по своей природе и никоим образом не предназначено для ограничения настоящего изобретения, его применения или использований.
Как применяется в настоящей заявке, диапазоны используются в качестве сокращения для описания каждого значения, находящегося в пределах диапазона. Любое значение в пределах диапазона может быть выбрано как конечная точка диапазона. Кроме того, все ссылки, приведенные в настоящей заявке, включены в настоящее описание посредством ссылки в полном объеме. В случае конфликта в определении в настоящей заявке и в процитированной ссылке настоящее описание преобладает.
Если не указано иное, все проценты и количества, приведенные в настоящей заявке и в другом месте в описании, следует понимать как относящиеся к процентам по массе. Указанные количества основаны на активной массе вещества.
Гидрофобин-подобные белки (HLP)
Гидрофобин-подобные белки (HLP) согласно настоящему изобретению представляют собой белки из организмов, таких как определенные грибы и бактерии, которые имеют либо аутентичную гидрофобиновую последовательность (=Гидрофобины), либо полипептидную последовательность, родственную аутентичному гидрофобину, которая сохраняет гидрофобин-подобные свойства, такие как изменение угла контакта, как описано далее.
Гидрофобины представляют собой небольшие белки из около 100 АА, которые характерны для мицелиальных грибов и которые не встречаются в других организмах. Недавно, гидрофобин-подобные белки были обнаружены в Streptomyces coelicolor, которые упоминаются как "Chaplins" и, подобным образом, имеют значительные поеврхностно-активные свойства. Chaplins способны к самосборке на границах раздела вода-воздух с образованием амилоидподобных фибрилл (Classen et al. 2003 Genes Dev 1714-1726; Elliot et al., 2003, Genes Dev. 17, 1727-1740).
Гидрофобины распространены в нерастворимой в воде форме на поверхности различных грибковых структур, таких как, например, гифы воздушного мицелия, споры, плодовые тела. Гены для гидрофобинов были выделены из аскомицетов, дейтеромицетов и базидиомицетов. Некоторые грибы содержат более одного гена гидрофобина, например, Schizophyllum commune, Coprinus cinereus, Aspergillus nidulans. По-видимому, различные гидрофобины участвуют в разных стадиях развития грибов. Указанные гидрофобины предположительно ответственны за различные функции (смотрите Wetter et al., 2000, Mol. Microbiol., 36, 201-210; Kershaw et al., 1998, Fungal Genet. Biol, 1998, 23, 18-33).
Биологическая функция гидрофобинов, которая описана в дополнение к уменьшению поверхностного натяжения воды для образования гифов воздушного мицелия, также состоит в гидрофобизации спор (Wösten et al., 1999, Curr. Biol., 19, 1985-88; Bell et al. 1992, Genes Dev., 6, 2382-2394). Кроме того, гидрофобины применяются для образования газовых каналов в плодовых телах лишайников и в качестве компонентов в системе идентификации поверхности растений патогенными грибами (Lugones et al. 1999, Mycol. Res., 103, 635-640; Hamer & Talbot 1998, Curr. Opinion Microbiol., Volume 1, 693-697).
Эксперименты по комплементарности продемонстрировали, что гидрофобины можно функционально заменить до некоторой степени в пределах одного класса. Ранее описанные гидрофобины могут быть получены только с умеренным выходом и чистотой с использованием обычных методов белковой химической очистки и выделения. Попытки обеспечить большее количество гидрофобинов с помощью генетических методов также не были успешными до сих пор.
HLP также относятся к полипептидам общей структурной формулы (I)
n
m
где X может представлять собой любую из 20 природных аминокислот (Phe, Leu, Ser, Tyr, Cys, Trp, Pro, His, Gln, Arg, Ile, Met, Thr, Asn, Lys, Val, Ala, Asp, Glu, Gly), и индексы при X показывают число аминокислот, причем индексы пит представляют собой числа от 0 до 500, предпочтительно от 15 до 300, и причем С представляет собой цистеин, при условии, что по меньшей мере одна из пептидных последовательностей, обозначенных как X или X представляет собой пептидную последовательность из по меньшей мере 20 аминокислот в длину, которая не связана с гидрофобином в природе, где полипептиды изменяют угол контакта на по меньшей мере 20° после нанесения в виде покрытия на стеклянную поверхность.
1
8
1
2
3
4
5
6
7
8
Цистеины, обозначенные как С-С, могут быть либо в редуцированной форме, либо образуют дисульфидные мостики друг с другом в белках согласно настоящему изобретению. Особенно предпочтительным является внутримолекулярное образование С-С мостиков, в частности цистеины имеют по меньшей мере один, предпочтительно 2, особенно предпочтительно 3, и наиболее предпочтительно 4, внутримолекулярных дисульфидных мостиков, выбранных из следующей группы: Сс С; С с С, С с С, С с С.
Если цистеины также применяются в положениях, обозначенных X, нумерация отдельных цистеиновых положений в общих формулах может изменяться соответствующим образом.
Особенно предпочтительными являются полипептиды общей формулы (II)
n
m
где X может представлять собой любую из 20 природных аминокислот (Phe, Leu, Ser, Tyr, Cys, Trp, Pro, His, Gln, Arg, Ile, Met, Thr, Asn, Lys, Val, Ala, Asp, Glu, Gly), и индексы при X показывают число аминокислот, причем индексы пит представляют собой числа от 2 до 300, и причем С представляет собой цистеин, при условии, что по меньшей мере одна из пептидных последовательностей, обозначенных как X или X представляет собой пептидную последовательность из по меньшей мере 35 аминокислот в длину, которая не связана с гидрофобином в природе, где полипептиды которой изменяют угол контакта на по меньшей мере 20° после нанесения в виде покрытия на стеклянную поверхность.
Наиболее предпочтительными являются полипептиды общей формулы
n
m
где X может представлять собой любую из 20 природных аминокислот (Phe, Leu, Ser, Tyr, Cys, Trp, Pro, His, Gln, Arg, Ile, Met, Thr, Asn, Lys, Val, Ala, Asp, Glu, Gly), и индексы при X показывают число аминокислот, причем индексы пит представляют собой числа от 0 до 200, и причем С представляет собой цистеин, при условии, что по меньшей мере одна из пептидных последовательностей, обозначенных как X или X, представляет собой пептидную последовательность из по меньшей мере 40 аминокислот в длину, которая не связана с гидрофобином в природе, где полипептиды изменяют угол контакта на по меньшей мере 20° после нанесения в виде покрытия на стеклянную поверхность.
Предпочтительными вариантами выполнения описываемого изобретения являются полипептиды, имеющие общую структурную формулу (I), (II) или (III), причем эта структурная формула содержит по меньшей мере один гидрофобии класса I, предпочтительно по меньшей мере один гидрофобин dewA, rodA, hypA, hypB, sc3, basf1, basf2, или их части или производные. Указанные гидрофобины структурно характеризуются приведенным далее перечне последовательностей. Также возможно, чтобы множество, предпочтительно 2 или 3, структурно идентичных или разных гидрофобинов были связаны друг с другом и с соответствующей подходящей полипептидной последовательностью, которая естественным образом не связана с гидрофобином.
Особенно предпочтительными вариантами выполнения настоящего изобретения являются новые белки, имеющие полипептидные последовательности согласно SEQ ID NO: 20, 22, 24, и последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие их, в частности последовательности согласно SEQ ID NO: 19, 21, 23. Особенно предпочтительными вариантами выполнения настоящего изобретения также являются белки, которые возникают в результате замещения, вставки или делеции по меньшей мере одной, до 10, предпочтительно 5, особенно предпочтительно 5% всех аминокислот, исходя из полипептидных последовательностей согласно SEQ ID NO: 22, 22 или 24, и которые все еще имеют по меньшей мере 50% биологического свойства исходных белков. Биологическое свойство белков в контексте настоящего изобретения означает изменение угла контакта, как описано в Примере 1.
Такие HLP и их получение описаны, например, в ЕР 1848733, который включен в настоящую заявку посредством ссылки.
n
m
Эти белки имеют в по меньшей мере одном положении, обозначенном X или X, полипептидную последовательность, содержащую по меньшей мере 20, предпочтительно по меньшей мере 35, особенно предпочтительно по меньшей мере 50, и в частности по меньшей мере 100, аминокислот (также упоминаемую далее в настоящей заявке как партнер слияния), которая в природе не связана с гидрофобином. Это предназначено для того, чтобы выразить тот факт, что белки согласно настоящему изобретению состоят из гидрофобинового фрагмента и части партнера слияния, которые не встречаются вместе в этой форме в природе.
n
m
n
m
Фрагмент партнера слияния может быть выбран из множества белков. Также возможно связать множество партнеров слияния с одним гидрофобным фрагментом, например, при аминоконце (X) и при карбоксильном конце (X) гидрофобинового фрагмента. Однако также можно связать, например, два партнера слияния с одним положением (X или X) белка согласно настоящему изобретению.
Особенно предпочтительными партнерами слияния являются те полипептидные последовательности, которые позволяют белку согласно настоящему изобретению покрывать стеклянные поверхности и делают поверхность, обработанную белком, устойчивой к обработке детергентами, как подробно описано в экспериментальной секции (пример 10) (например, 1% SDS/80°С/10 мин).
Особенно подходящими партнерами слияния являются полипептиды, которые встречаются в природе в микроорганизмах, в частности в Е. coli или Bacillus subtilis. Примерами таких партнеров слияния являются последовательности yaad (SEQ ID NO: 15 и 16), yaae (SEQ ID NO: 17 и 18) и тиоредоксин. Очень полезны также фрагменты или производные указанных последовательностей, которые содержат только часть, предпочтительно 70-99%, особенно предпочтительно 80-98%, указанных последовательностей, или в которых отдельные аминокислоты или нуклеотиды были заменены по сравнению с указанной последовательностью. Например, дополнительные аминокислоты, в частности, две дополнительные аминокислоты, предпочтительно аминокислоты Arg, Ser, могут быть присоединены к С-концу последовательностей yaad и уаае. Кроме того, возможно предпочтительно вставлять дополнительные аминокислоты, например, аминокислоту No. 2 (Gly) в SEQ ID NO: 17 и 18, в последовательность уаае по сравнению с последовательностью природного происхождения.
Кроме того, также возможно вставлять при соединениях двух партеров слияния дополнительные аминокислоты, которые являются результатом либо новообразования, либо инактивации сайтов распознавания для рестрикционных эндонуклеаз на уровне нуклеиновой кислоты.
Также возможно модифицировать полипептидную последовательность белков согласно настоящему изобретению, например, посредством гликозилирования, ацетилирования или также посредством химического сшивания, например, с помощью глутарового альдегида.
Одним из свойств белков согласно настоящему изобретению является изменение свойств поверхности, когда указанные поверхности покрыты указанными белками. Указанное изменение свойств поверхности можно определить экспериментально путем измерения угла контакта капли воды до и после покрытия поверхности белком согласно настоящему изобретению и определения разницы двух измерений.
Точные экспериментальные условия для измерения угла контакта приведены далее в экспериментальной части в Примере 1. В этих условиях белки согласно настоящему изобретению обладают свойством увеличивать угол контакта по меньшей мере на 20, предпочтительно 25, особенно предпочтительно на 30 градусов.
Положения полярных и неполярных аминокислот в гидрофобиновом фрагменте ранее описанных гидрофобинов сохраняются, что приводит к характерному графику гидрофобности. Различия в биофизических свойствах и гидрофобности приводили к тому, что ранее описанные гидрофобины были разделены на два класса: I и II (Wessels et al. 1994, Ann. Rev. Phytopathol., 32, 413-437).
Собранные члены гидрофобинов класса I нерастворимы в высокой степени (даже в отношении 1% SDS при повышенной температуре) и могут снова диссоциировать только посредством концентрированной трифторуксусной кислотой (TFA) или муравьиной кислоты. Напротив, собранные формы гидрофобинов класса II менее стабильны. Они могут снова растворяться даже посредством 60%-ного этанола или 1% SDS (при комнатной температуре).
3
4
Сравнение аминокислотных последовательностей выявило, что длина области между цистеином С и С значительно короче в гидрофобинах класса II, чем в гидрофобинах класса I.
Кроме того, гидрофобины класса II имеют более заряженные аминокислоты, чем класса I.
Настоящее изобретение, кроме того, относится к способам получения белков согласно настоящему изобретению. Эти полипептиды могут быть получены химически известными методами синтеза пептидов, например, твердофазным синтезом в соответствии с Меррифилдом.
Особенно полезными, однако, являются генетические способы, в которых две последовательности нуклеиновых кислот, в частности последовательности ДНК, кодирующие партнер слияния и гидрофобиновый фрагмент, соответственно, комбинируют таким образом, что экспрессия гена комбинированной последовательности нуклеиновой кислоты создает желаемый белок в организме-хозяине.
Подходящими организмами-хозяевами (организмы-производители) в контексте настоящего изобретения могут быть прокариоты (в том числе археи) или эукариоты, особенно бактерии, включая галобактерии и метанококки, грибы, клетки насекомых, растительные клетки и клетки млекопитающих, особенно предпочтительно Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Aspergillus oryzea, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Pichia pastoris, Pseudomonas spec, Lactobacillen, Hansenula polymorpha, Trichoderma reesei, SF9 (или родственные клетки), и другие.
Настоящее изобретение, кроме того, относится к экспрессионным конструкциям, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид согласно настоящему изобретению под генетическим контролем регуляторных последовательностей нуклеиновых кислот, а также векторы, содержащие по меньшей мере одну из указанных экспрессионных конструкций.
Предпочтение отдается таким конструкциям согласно настоящему изобретению, содержащим промотор 5' против хода транскрипции от конкретной кодирующей последовательности, и терминирующую последовательность 3' по ходу транскрипции, а также, при необходимости, дополнительные обычные регулирующие элементы, в каждом случае функционально связанные с указанной кодирующей последовательностью.
«Функциональная связь» означает последовательное расположение промотора, кодирующей последовательности, терминатора и, при необходимости, дополнительных регуляторных элементов таким образом, что каждый из регуляторных элементов способен выполнять свою функцию в соответствии с его предполагаемым использованием в связи с экспрессией кодирующей последовательности.
Примерами последовательностей, которые могут быть функционально связаны, являются нацеливающие последовательности, а также энхансеры, сигналы полиаденилирования и тому подобное. Другие регуляторные элементы содержат селектируемые маркеры, сигналы амплификации, точки начала репликации и т.п. Примеры подходящих регуляторных последовательностей описаны в Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990).
В дополнение к этим регуляторным последовательностям естественная регуляция этих последовательностей может все еще присутствовать против хода транскрипции от фактических структурных генов и, при необходимости, была генетически модифицирована, так что естественная регуляция была отключена, и экспрессия генов была увеличена.
Предпочтительная конструкция нуклеиновой кислоты предпочтительно также содержит одну или более упомянутых ранее энхансерных последовательностей, которые функционально связаны с промотором и обеспечивают увеличение экспрессии последовательности нуклеиновой кислоты. Дополнительные предпочтительные последовательности, такие как дополнительные регуляторные элементы или терминаторы, также могут быть вставлены при 3'-конце ДНК последовательностей.
Нуклеиновые кислоты согласно настоящему изобретению могут присутствовать в конструкции в количестве одной или более копий. Конструкция может содержать еще дополнительные маркеры, такие как антибиотические резистентности или гены, которые дополняют ауксотрофию, для селекции конструкции, если это необходимо.
Примеры регуляторных последовательностей, которые предпочтительны для способа согласно настоящему изобретению, представлены в промоторах, таких как cos, tac, trp, tet, trp-tet, Ipp, lac, Ipp-lac, laclq-T7, T5, T3, gal, trc, ara, rhaP(rhaPBAD) SP6, lambda-PR или lambda-P промотор, которые предпочтительно применяются в грамотрицательных бактериях. Другие примеры предпочтительных регуляторных последовательностей представлены в грамположительных промоторах amy и SP02, в промоторах дрожжей или грибов ADC1, MFalpha, АС, Р-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH. Также возможно использовать искусственные промоторы для регуляции.
Чтобы экспрессироваться в организме-хозяине, конструкцию нуклеиновой кислоты предпочтительно вставляют в вектор, такой как, например, плазмида или фаг, что позволяет генам оптимально экспрессироваться в хозяине. Помимо плазмид и фагов, векторы также означают любые другие векторы, известные специалисту, т.е., например, вирусы, такие как SV40, CMV, бакуловирусы и аденовирусы, транспозоны, элементы IS, фазмиды, космиды и линейные или циклические ДНК, а также систему Agrobacterium.
Эти векторы могут либо реплицироваться автономно в организме-хозяине, либо реплицироваться хромосомально. Эти векторы составляют другой вариант выполнения настоящего изобретения. Примерами подходящих плазмид являются pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHS1, pKK223-3, pDHE19.2, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III''3-B1, tgt11 или pBdCl в E. coli, pIJ101, pIJ364, pIJ702 или pIJ361 в Streptomyces, pUB110, pC194 или pBD214 в Bacillus, pSA77 или pAJ667 в Corynebacterium, pALS1, pIL2 или pBB116 в грибах, 2alpha, pAG-1, YEp6, YEp13 или pEMBLYe23 в дрожжах или pLGV23, pGHIac+, pBIN19, pAK2004 или pDH51 в растениях. Вышеуказанные плазмиды представляют собой небольшую часть возможных плазмид. Другие плазмиды также известны специалистам в данной области техники и раскрываются, например, в книге Cloning Vectors (Eds. Pouwels P.H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0444904018).
Предпочтительно конструкция нуклеиновой кислоты дополнительно содержит с целью экспрессии других присутствующих генов также 3'- и/или 5'-концевые регуляторные последовательности для усиления экспрессии, которые выбраны для оптимальной экспрессии в зависимости от организма-хозяина и выбранного гена или генов.
Эти регуляторные последовательности предназначены для того, чтобы обеспечить экспрессию генов и белков. В зависимости от организма-хозяина это может означать, например, что ген экспрессируется или сверхэкспрессируется только после индукции, или что он экспрессируется и/или сверхэкспрессируется немедленно.
В этом контексте, регуляторные последовательности или факторы могут предпочтительно оказывать благоприятное влияние на генную экспрессию введенных генов и тем самым увеличивать ее. Таким образом, регуляторные элементы могут преимущественно усиливаться на уровне транскрипции, посредством применения сильных сигналов транскрипции, таких как промоторы и/или энхансеры. Помимо этого, однако, также возможно усилить трансляцию путем улучшения стабильности мРНК, например.
В другом варианте выполнения вектора, вектор, содержащий конструкцию нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению или нуклеиновую кислоту согласно настоящему изобретению, также может быть предпочтительно введен в форме линейной ДНК в микроорганизмы и интегрирован в геном организма-хозяина посредством гетерологичной или гомологичной рекомбинации. Указанная линейная ДНК может состоять их линеаризованного вектора, такого как плазмида, или только из конструкции нуклеиновой кислоты или нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению.
Чтобы достичь оптимальной экспрессии гетерологичных генов в организмах, целесообразно модифицировать последовательности нуклеиновых кислот в соответствии с конкретной частотой использования кодона, применяемого в организме. Частоту использования кодона можно легко определить на основе компьютерных анализов других известных генов рассматриваемого организма.
Экспрессионную кассету согласно настоящему изобретению получают посредством слияния подходящего промотора с подходящей кодирующей нуклеотидной последовательностью и сигналом терминации или сигналом полиаденилирования. Для этой цели используются известные методы рекомбинации и клонирования, которые описаны, например, в Т. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989), а также в T.J. Silhavy, M.L. Berman and L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) и в Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987).
Для экспрессии в подходящем организме-хозяине конструкцию рекомбинантной нуклеиновой кислоты или генную конструкцию преимущественно вставляют в специфичный для хозяина вектор, который позволяет оптимально экспрессировать гены в хозяине. Векторы хорошо известны квалифицированному специалисту и могут быть найдены, например, в "Cloning Vectors" (Pouwels Р.Н. et al., Eds. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985).
Векторы согласно настоящему изобретению могут быть использованы для получения рекомбинантных микроорганизмов, которые трансформированы, например, по меньшей мере одним вектором согласно настоящему изобретению, и могут быть использованы для получения полипептидов согласно настоящему изобретению. Предпочтительно вышеописанные рекомбинантные конструкции согласно настоящему изобретению вводятся в и экспрессируются в подходящей системе-хозяине. Предпочтительным согласно настоящему изобретению является применение общих методов клонирования и трансфекции, известных квалифицированному специалисту, таких как, например, соосаждение, слияние протопластов, электропорация, ретровирусная трансфекция и тому подобное, с целью экспрессии указанных нуклеиновых кислот в конкретной экспрессионной системе. Подходящие системы описаны, например, в существующих на сегодняшний день протоколах в Molecular Biology, F. Ausubel et al., Eds. Wiley Interscience, New York 1997, или Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.
В соответствии с настоящим изобретением также возможно получение гомологично рекомбинантных микроорганизмов. С этой целью получают вектор, который содержит по меньшей мере одну часть гена согласно настоящему изобретению или кодирующей последовательности, в который, при необходимости, по меньшей мере одна аминокислотные деления, добавление или замещение были введены для того, чтобы модифицировать, например, функционально разрушить, последовательность согласно настоящему изобретению (нокаут вектор). Введенная последовательность может, например, также быть гомологом из родственного микроорганизма или быть получена из источника млекопитающих, дрожжей или насекомых. Вектор, используемый для гомологичной рекомбинации, альтернативно может быть сконструирован таким образом, что эндогенный ген мутирует или модифицируется каким-либо другим образом во время гомологичной рекомбинации, но все же кодирует функциональный белок (например, апстрим регуляторная последовательность быть модифицирована таким образом, который модифицирует экспрессию эндогенного белка). Модифицированный участок гена согласно настоящему изобретению находится в гомологичном рекомбинантном векторе. Конструкции подходящих векторов для гомологичной рекомбинации описана, например, в Thomas, K.R. and Capecchi, M.R. (1987) Cell 51: 503.
Любые прокариотические или эукариотические организмы в принципе пригодны для использования в качестве рекомбинантных организмов-хозяев для нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению или конструкции нуклеиновой кислоты. Предпочтительно используемые организмы-хозяева представляют собой микроорганизмы, такие как бактерии, грибы или дрожжи. Предпочтительно применяются грамположительные или грамотрицательные бактерии, предпочтительно бактерии семейства Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Rhizobiaceae, Streptomycetaceae или Nocardiaceae, особенно предпочтительно бактерии рода Escherichia, Pseudomonas, Streptomyces, Nocardia, Burkholderia, Salmonella, Agrobacterium или Rhodococcus.
В зависимости от организма-хозяина, организмы, используемые в способе согласно настоящему изобретению, выращиваются или культивируются способом, известным специалисту. Микроорганизмы обычно выращивают в жидкой среде, содержащей источник углерода, обычно в форме сахаров, источник азота, обычно в форме органических источников азота, таких как дрожжевой экстракт или соли, такие как сульфат аммония, микроэлементы, такие как соли железа, марганца, магния, и, при необходимости, витамины, при температуре от 0 до 100°С, предпочтительно между 10 и 60°С, при газировании кислородом. Значение рН питательной жидкости может поддерживаться или не поддерживаться в контексте настоящего изобретения при фиксированном значении, т.е. регулируется во время роста. Рост может происходить периодически, полунепрерывно или непрерывно. Питательные вещества могут вводиться изначально в начале ферментации или впоследствии подаваться полунепрерывно или непрерывно. Ферменты могут быть выделены из организмов с использованием способа, описанного в примерах, или могут быть использованы для реакции в виде неочищенного экстракта.
Кроме того, настоящее изобретение относится к способам рекомбинантного получения полипептидов согласно настоящему изобретению или их функциональных биологически активных фрагментов, где способы включают культивирование продуцирующего полипептид микроорганизма, при необходимости индукцию экспрессии указанных полипептидов и выделение их из культуры. Таким образом, полипептиды могут также быть получены в промышленном масштабе, если это необходимо. Рекомбинантный микроорганизм можно культивировать и ферментировать известными способами. Например, бактерии могут размножаться в среде ТВ или среде LB и при температуре от 20 до 40°С и при значении рН от 6 до 9.
Соответствующие условия культивирования подробно описаны, например, в Т. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989).
Если полипептиды не секретируются в культуральную среду, клетки затем разрушают, и продукт выделяют из лизата известными способами выделения белков. Клетки могут необязательно разрушаться посредством высокочастотного ультразвука, посредством высокого давления, например, в прессе Френча, посредством осмолиза, посредством действия детергентов, лизирующих ферментов или органических растворителей, с использованием гомогенизаторов, или посредством комбинации нескольких перечисленных способов.
Полипептиды могут быть очищены с помощью известных хроматографических методов, таких как хроматография на молекулярных ситах (гель-фильтрация), таких как хроматография на Q-сефарозе, ионообменная хроматография и гидрофобная хроматография, а также с помощью других обычных методов, таких как ультрафильтрация, кристаллизация, высаливание, диализ и нативный гель-электрофорез. Подходящие методы описаны, например, в Cooper, F.G., Biochemische Arbeitsmethoden [оригинальное название: The tools of biochemistry], Verlag Water de Gruyter, Berlin, New York или в Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin.
Для выделения рекомбинантного белка может быть предпочтительно использовать векторные системы или олигонуклеотиды, которые удлиняют кДНК с помощью конкретных нуклеотидных последовательностей и, таким образом, кодируют измененные полипептиды или слитые белки, которые облегчают очистку, например. Примерами таких подходящих модификаций являются «метки», действующие как якоря, например, модификация, известная как гексагистидиновый якорь, или эпитопы, которые могут быть распознаны антителами в качестве антигенов (описаны, например, в Harlow, Е. and Lane, D., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor (N.Y.) Press). Другими подходящими метками являются, например, НА, кальмодулин-BD, GST, MBD; хитин-BD, тег стрептавидина-BD-Avi метка, метка Flag, Т7 и т.д. Эти якоря могут использоваться для прикрепления белков к твердой подложке, такой как, например, полимерная матрица, которая может быть введена в хроматографическую колонку, например, или к микротитровальной пластине или любой другой подложке. Соответствующие протоколы очистки могут быть получены от поставщиков коммерческих аффинных меток.
В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения HLP присутствует в композиции в количестве от 0.01 мас. % до 3 мас. % от общей массы композиции. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения, HLP присутствует в композиции в количестве от 0.1 мас. % до 3 мас. %, или от 0.1 мас. % до 2 мас. %, или от 0.1 мас. % до 1 мас. % от общей массы композиции. В других вариантах выполнения настоящего изобретения, HLP присутствует в композиции в количестве от 0.05 мас. % до 1 мас. %, или от 0.1 мас. % до 0.5 от общей массы композиции. В других вариантах выполнения настоящего изобретения, HLP присутствует в композиции в количестве от 0.5 мас. % до 3 мас. %, или от 0.5 мас. % до 2 мас. %, или от 0.5 мас. % до 1 мас. % от общей массы композиции. В других вариантах выполнения настоящего изобретения, HLP присутствует в композиции в количестве от 1 мас. % до 3 мас. %, или от 1 мас. % до 2 мас. % от общей массы композиции.
Перорально приемлемый носитель и необязательные ингредиенты
Выражение «перорально приемлемый носитель», как используется в настоящей заявке, обозначает носитель, изготовленный из материалов, которые являются безопасными и приемлемыми для перорального применения в предназначенных количествах и концентрациях, например, веществ, которые можно найти в традиционной зубной пасте и жидкости для полоскания рта. Такие вещества включают воду или другие растворители, которые могут содержать смачивающее средство, такой как глицерин, сорбит, ксилит и тому подобное. В некоторых аспектах термин «перорально приемлемый носитель» охватывает все компоненты композиции для ухода за полостью рта, за исключением гидролизованного растительного белка и фторида. В других аспектах термин относится к инертным или неактивным ингредиентам, которые служат для доставки гидролизованного растительного белка, и/или любых других функциональных ингредиентов, в полость рта.
Перорально приемлемые носители для использования в настоящем изобретении включают обычные и известные носители, используемые при изготовлении ополаскивателей для полости рта или жидкостей для полоскания рта, зубных паст, гелей для ухода за зубами, зубного порошка, пастилок, жвачек, шариков, съедобных полосой, таблеток и тому подобного. Носители должны быть выбраны с точки зрения совместимости друг с другом и с другими ингредиентами композиции.
Приведены следующие неограничивающие примеры. В композиции зубной пасты носителем обычно является система вода/смачивающее средство, которая обеспечивает основную фракцию по массе композиции. Альтернативно, компонент носителя композиции зубной пасты может содержать воду, один или более смачивающих средств и другие функциональные компоненты, отличные от гидролизованного белка пшеницы или гидролизованного белка риса. В композиции ополаскивателя для полости рта или жидкости для полоскания рта носитель обычно представляет собой водно-спиртовую жидкую смесь, в которой гидролизованный белок пшеницы или гидролизованный белок риса растворяют или диспергируют. В растворяемой пастилке носитель обычно содержит твердый матричный материал, который медленно растворяется в полости рта. В жевательных резинах носитель обычно содержит гуммиоснову, тогда как в съедобной полосе носитель обычно содержит один или более пленкообразующих полимеров.
Композиции для ухода за полостью рта, представленные в настоящей заявке, могут дополнительно содержать один или более дополнительных ингредиентов, выбранных из абразивных материалов, рН-модифицирующих средств, поверхностно-активных веществ, модуляторов пены, загустителей, модификаторов вязкости, смачивающих средств, предупреждающих образование конкрементов или контролирующих образование зубного камня средств, подсластителей, ароматизаторов, красителей и консервантов. Эти ингредиенты также могут рассматриваться как материалы-носители. Ниже приведены неограничивающие примеры.
В одном варианте выполнения настоящего изобретения композиция согласно настоящему изобретению содержит по меньшей мере один абразивный материал, полезный, например, в качестве полирующего агента. Можно использовать любой перорально приемлемый абразивный материал, но тип, тонкость (размер частиц) и количество абразивного материала следует выбирать так, чтобы зубная эмаль не подвергалась чрезмерному стиранию при стандартном использовании композиции. Подходящие абразивные материалы включают, без ограничения, диоксид кремния, например, в виде силикагеля, гидратированного диоксида кремния или осажденного диоксида кремния, оксид алюминия, нерастворимые фосфаты, карбонат кальция, смолистые абразивные материалы, такие как продукты конденсации мочевиноформальдегида и тому подобное. Среди нерастворимых фосфатов, полезных в качестве абразивных материалов, упоминают ортофосфаты, полиметафосфаты и пирофосфаты. Иллюстративными примерами являются дигидрат дикальция ортофосфата, кальция пирофосфат, [бета]-кальция пирофосфат, трикальция фосфат, полиметафосфат кальция и нерастворимый полиметафосфат натрия. Один или более абразивных материалов необязательно присутствуют в композиции для ухода за полостью рта согласно настоящему изобретению в количестве от 1 мас. % до 5 мас. % от общей массы композиции. Средний размер частиц абразивного материала, если он присутствует, обычно составляет от 0,1 до 30 мкм и предпочтительно от 5 до 15 мкм.
В другом варианте выполнения настоящего изобретения композиция для ухода за полостью рта согласно настоящему изобретению содержит по меньшей мере одну бикарбонатную соль, полезную, например, для придания «ощущения чистоты» зубов и десен из-за вспучивания и выделения углекислого газа. Можно использовать любой перорально приемлемый бикарбонат, включая, без ограничения, бикарбонаты щелочных металлов, такие как бикарбонаты натрия и калия, бикарбонат аммония и тому подобное. Одна или более бикарбонатных солей необязательно присутствуют в общем количестве от 1 мас. % до 10% по массе композиции.
В другом варианте выполнения настоящего изобретения композиция для ухода за полостью рта согласно настоящему изобретению содержит по меньшей мере один рН-модифицирующий агент. Такие агенты включают подкисляющие агенты для снижения значения рН, подщелачивающие агенты для повышения значения рН и буферные агенты для контроля значения рН в желаемом диапазоне. Например, одно или более соединений, выбранных из подкисляющих, подщелачивающих и буферных агентов, могут быть включены для обеспечения значения рН от 2 до 10 или в различных иллюстративных вариантах осуществления значения рН от 2 до 8, от 3 до 9, от 4 до 8, от 5 до 7, от 6 до 10 или от 7 до 9. Может быть использован любой перорально приемлемый рН-модифицирующий агент, включая, без ограничения, карбоновые, фосфорные и сульфоновые кислоты, кислотные соли (например, мононатрия цитрат, цитрат динатрия, мононатрия малат), гидроксиды щелочных металлов, такие как гидроксид натрия, карбонаты, такие как карбонат натрия, бикарбонаты, бораты, силикаты, фосфаты (например, мононатрия фосфат, тринатрия фосфат, пирофосфатные соли), имидазол и тому подобное. Одно или более рН-модифицирующих средств необязательно присутствуют в общем количестве, эффективном для поддержания композиции в перорально приемлемом диапазоне рН.
8
20
8-20
8-20
В другом варианте выполнения настоящего изобретения композиция согласно настоящему изобретению содержит по меньшей мере одно поверхностно-активное вещество, полезное, например, для обеспечения повышенной стабильности композиции и содержащихся в ней компонентов, чтобы помочь очистить поверхность зубов посредством действия моющих средств и для обеспечения пены при перемешивании (например, при чистке с помощью композиции средства для чистки зубов композиция согласно настоящему изобретению). Можно использовать любое перорально приемлемое поверхностно-активное вещество, в том числе анионное, неионное или амфотерное. Подходящие анионные поверхностно-активные вещества включают, без ограничения, растворимые в воде соли С-алкилсульфатов, сульфонированные моноглицериды С жирных кислот, саркозинаты, таураты и тому подобное. Подходящие неионные поверхностно-активные вещества включают, без ограничения, полоксамеры, полиоксиэтиленсорбитана жирные кислоты, этоксилаты жирных спиртов, алкилфенола этоксилаты, третичные амины, оксиды, третичные фосфиноксиды, диалкилсульфоксиды и тому подобное. Подходящие амфотерные поверхностно-активные вещества включают, без ограничения, производные С алифатических вторичных и третичных аминов, имеющих анионную группу, такую как карбоксилат, сульфат, сульфонат, фосфат или фосфонат. Подходящим примером является кокоамилопропилбетаин. Одно или более поверхностно-активные вещества необязательно присутствуют в общем количестве от 0.01 мас. % до 10 мас. %, например, от 0.05 мас. % до 5 мас. % или от 0.1 мас. % до 2 мас. % от общей массы композиции.
В другом варианте выполнения настоящего изобретения, композиция для ухода за полостью рта согласно настоящему изобретению содержит по меньшей мере один модулятор пены, полезный, например, чтобы увеличить количество, вязкость или стабильность пены, образуемой композицией при перемешивании. Может применяться любой перорально приемлемый модулятор пены, включая, без ограничения, полиэтиленгликоли (ПЭГ). Один или более ПЭГ необязательно присутствуют в общем количестве от 0.1 мас. % до 10 мас. % от общей массы композиции.
В другом варианте выполнения настоящего изобретения композиция для ухода за полостью рта согласно настоящему изобретению содержит по меньшей мере один загуститель, полезный, например, чтобы придать композиции желаемую консистенцию и/или ощущение во рту. Любой перорально приемлемый загуститель может быть использован, включая, без ограничения, карбомеры (карбоксивиниловые полимеры), каррагинаны, целлюлозные полимеры, такие как гидроксиэтилцеллюлоза, карбоксиметилцеллюлоза (CMC) и их соли, природные камеди, такие как камедь карайи, ксантановая камедь, гуммиарабик и трагакантовая камедь, коллоидный магния алюминия силикат, коллоидный диоксид кремния и тому подобное. Один или более загустителей необязательно присутствуют в общем количестве от 0,01 мас. % до 15 мас. %, от общей массы композиции.
В другом варианте выполнения настоящего изобретения композиция согласно настоящему изобретению содержит по меньшей мере один модификатор вязкости, полезный, например, для ингибирования осаждения или разделения ингредиентов или для содействия повторному диспергированию ингредиентов при перемешивании жидкой композиции. Любой перорально приемлемый модификатор вязкости может быть использован, включая, помимо прочего, минеральное масло, вазелин, глины, диоксид кремния и тому подобное. Один или более модификаторов вязкости необязательно присутствуют в общем количестве от 0,01 мас. % до 10 мас. % от общей массы композиции.
В другом варианте выполнения настоящего изобретения, композиция для ухода за полостью рта согласно настоящему изобретению содержит по меньшей мере одно смачивающее средство, которое может быть использовано для предотвращения затвердевания зубной пасты при воздействии воздуха. Может быть использован любое перорально приемлемое смачивающее средство, включая, помимо прочего, многоатомные спирты, такие как глицерин, сорбит, ксилит или низкомолекулярные ПЭГ. Большинство смачивающих средств также функционируют как подсластители. Одно или более смачивающих средств необязательно присутствуют в общем количестве от 1 мас. % до 50 мас. % от общей массы композиции.
В другом варианте выполнения настоящего изобретения, композиция для ухода за полостью рта согласно настоящему изобретению содержит по меньшей мере один подсластитель, который придает композиции вкус. Любой перорально приемлемый природный или искусственный подсластитель моно использовать, включая, без ограничения, декстрозу, сахарозу, мальтозу, декстрин, маннозу, ксилозу, рибозу, фруктозу, левулозу, галактозу, кукурузный сироп, частично гидролизованный крахмал, гидрогенизированный гидролизат крахмала, сорбит, маннит, ксилит, мальтит, изомальт, аспартам, неотам, сахарин и их соли, интенсивные подсластители на основе дипептида, цикламаты и тому подобное. Один или более подсластителей необязательно присутствуют в общем количестве от 0,005 мас. % до 5 мас. % от общей массы композиции.
В другом варианте выполнения настоящего изобретения, композиция для ухода за полостью рта согласно настоящему изобретению содержит по меньшей мере один ароматизатор, который усиливает вкус композиции. Любой перорально приемлемый природный или синтетический ароматизатор можно использовать, включая, но без ограничения, ванилин, шалфей, майоран, масло петрушки, масло мяты курчавой, коричное масло, масло грушанки (метилсалицилат), масло перечной мяты, масло гвоздики, лавровое масло, анисовое масло, эвкалиптовое масло, цитрусовые масла, фруктовые масла и эссенции и тому подобное. Также к ароматизаторам относятся ингредиенты, которые обеспечивают аромат и/или другие сенсорные эффекты во рту, включая эффекты охлаждения или потепления. Такие ингредиенты иллюстративно включают ментол, ментилацетат, ментиллактат, камфару, эвкалиптовое масло, эвкалиптол, эвгенол, кассию, оксанон, α-иризон, тимол, линалоол, бензальдегид, циннамальдегид, N-этил-п-ментан-3-карбоксамин, N,2,3-триметил-2-изопропилбутанамид, 3-(1-ментокси)-пропан-1,2-диол, глицерилацеталь коричного альдегида (CGA), ментон глицерин ацеталь (MGA) и тому подобное. Один или более ароматизаторов необязательно присутствуют в общем количестве от 0,01 мас. % до 5 мас. % от общей массы композиции.
В другом варианте выполнения настоящего изобретения, композиция для ухода за полостью рта согласно настоящему изобретению содержит по меньшей мере один краситель. Краситель может выполнять ряд функций. К ним относятся обеспечение окрашенного в белый или светлый цвет покрытия на поверхности зуба, что указывает на места на поверхности зуба, которые эффективно контактировали с композицией, и/или модификация внешнего вида композиции, чтобы повысить привлекательность для потребителя. Любой перорально приемлемый краситель может быть использован, включая, без ограничения, тальк, слюду, карбонат магния, карбонат кальция, силикат магния, магния алюминия силикат, диоксид кремния, диоксид титана, оксид цинка, оксид железа, железоаммониевый ферроцианид, марганцово-фиолетовый, титанированную слюду, оксихлорид висмута и тому подобное. Один или более красителей необязательно присутствуют в общем количестве от 0.001 мас. % до 20 мас. % от общей массы композиции.
В другом варианте выполнения настоящего изобретения, композиция для ухода за полостью рта согласно настоящему изобретению содержит консервант. Консервант может быть выбран из парабенов, сорбата калия, бензилового спирта, феноксиэтанола, полиаминопропилбигуанида, каприловой кислоты, бензоата натрия и цетилпиридиния хлорида. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения, консервант присутствует при концентрации от около 0.001 до около 1 мас. %, от общей массы композиции.
В другом варианте выполнения настоящего изобретения, композиция для ухода за полостью рта согласно настоящему изобретению представляет собой жевательную резинку, содержащую гуммиоснову, ароматизатор, подслащивающее вещество и HLP. Гуммиоснова присутствует в количестве от около 4,8% до около 90%, ароматизатор присутствует в количестве от около 0,1% до около 10%, подслащивающее вещество присутствует в количестве от около 0,1% до около 95%, и HLP присутствует в количестве от около 0,01% до около 0,5%.
Следующие примеры иллюстрируют композиции согласно настоящему изобретению и их использование. Приведенные примеры композиций являются иллюстративными и не ограничивают объем настоящего изобретения.
Примеры
Пример 1 - Изменение угла контакта
Покрытие/оценка поверхностей с помощью HLP
Стекло (оконное стекло,  Glas, Mannheim, Germany):
- концентрация HLP: 100 мкг/мл
- инкубация стеклянных пластин всю ночь (температура: 80°С) в 50 мМ ацетате натрия, рН 4,+0.1% Tween 20
- после покрытия, промывка дистиллированной водой
- после этого, инкубация в течение 10 минут при 80°С и 1% SDS растворе в дистиллированной воде
- промывка дистиллированной водой.
Образцы высушили на воздухе, и угол контакта (в градуса) капли воды 5 мкл определили.
Угол контакта измерили с помощью устройства Dataphysics Contact Angle System OCA 15+, Software SCA 20.2.0. (November 2002). Измерение осуществляли в соответствии с инструкциями производителя.
6
необработанное стекло давало угол контакта 30±5°; покрытие функциональным HLP согласно SEQ ID NO: 20 (yaad-dewA-his) дало угол контакта 75±5°.
Пример 2 - Шероховатость поверхности
Бычий зуб разрезали, измельчили и отполировали с получением блоков эмали, имеющих приблизительные размеры 3мм × 3мм × 2 мм. Толщина эмали составляет около от 1 до 2 мм, и толщина дентина составляет около 1 мм. Все измерения проводили на поверхности эмали.
2
4
2
Шероховатость поверхности блоков эмали измеряли до и после кислотного травления. Кислотное травление достигалось посредством помещения блоков эмали в 1% раствор лимонной кислоты (рН 3.8) до достижения шероховатости поверхности (Sq) 100-200. Это значение Sq приводилось как шероховатость поверхности вытравленной эмали. (Sq является стандартным измерением, проведенным в основном согласно ISO 25178, как среднеквадратичное значение высоты относительно среднеарифметического значения высоты измеряемой поверхности, поэтому оно соответствует среднему значению всех абсолютных расстояний профиля от диаметральной плоскости в пределах площади измерения, так что если оно более высокое, это означает, что на поверхности имеется более выраженные пики и точки минимума, т.е. поверхность является шероховатой, и если оно более низкое, то поверхность более гладкая.) HLP, например BioMin 145, разбавляют до конечной концентрации, применяя NaHPO буфер (1.5 мМ) и CaCl (2.5 мМ). После нейтрализации до рН 7.5, раствор фильтруют и центрифугируют. Протравленные кислотой блоки эмали затем инкубируют с раствором, содержащим BioMin 145 при концентрации 17 мкМ (2 мл раствора на блок) в течение 60 минут.
2
2
4
После периода инкубации в течение 60 минут, блоки эмали инкубируют в растворе искусственной слюны (AS) (0.4 г NaCl, 0.4 г KCl, 0.8 г CaCl, 0.69 г NaHPO, 1 г мочевины, 1 литр дистиллированной воды; рН 7 (установлено посредством применения 1М NaOH)) в течение 22 часов. Блоки эмали затем обрабатывают второй раз с помощью HLP BioMin 145, и инкубируют снова с искусственной слюной в течение 22 часов. Блоки затем промывают деионизированной водой (DI) и высушивают посредством воздуха перед измерением их шероховатости поверхности. Блоки эмали, обработанные с помощью 0.5% PBS, применяют в качестве отрицательного контроля для эксперимента. Результаты проиллюстрированы в Таблице 1. % восстановления представляет собой % уменьшения шероховатости поверхности (Sq), достигнутый посредством обработки белком, относительно шероховатости поверхности (необработанной) протравленной кислотой эмали.
Смотрите Фиг. 1: Восстанавливающая эффективность ВМ145, применяя анализ шероховатости
Как указано в Таблице 1, BioMin 145 эффективен для уменьшения шероховатости поверхности протравленных кислотой блоков эмали при концентрации f 17 мкМ.
Пример 3 - Наноиндентирование
Блоки эмали получили, как описано в Примере 1. Кислотное травление достигалось посредством помещения блоков эмали в 1% раствор лимонной кислоты (рН 3.8) на 15 минут. Твердость в нанодиапазоне и модуль Юнга на глубине 500 нм измеряли до и после протравливания. Протравленные блоки эмали инкубировали с раствором HLP, например BioMin 145, ри концентрации 20 мкМ в течение 30 минут (2 мл раствора/блок), с последующей инкубацией с AS раствором, как описано в Примере 1, в течение от 22 до 24 часов. HLP и AS стадии инкубации повторяли еще два раза, после чего блоки эмали промывали DI водой и высушивали посредством воздуха. Твердость в нанодиапазоне и модуль Юнга обработанных блоков эмали измеряли на глубине 500 нм для оценки эффектов восстановления эмали посредством HLP. Раствор 500 частей на миллион фторида применяли в качестве положительного контроля для эксперимента. Результаты проиллюстрированы в Таблицах 2 и 3.
Как можно увидеть в Таблицах 2 и 3, BioMin 145 эффективен для восстановления эмали, подвергнутой кислотной эрозии.
Пример 4 - Микротвердость
2
2
2
2
4
4
3
воссггановленная
протравленная
контроль
протравленная
Блоки эмали получили, как описано в Примере 1. Микротвердость измеряли, применяя прибор для определения твердости Micromet 6020 Micro с индентором с алмазным наконечником Кнупа и 50 г загрузкой (Buehler, Lake Bluff, IL, USA). Отбирали блоки с твердостью по Кнупу (KH) по меньшей мере 300. Блоки протравливали посредством погружения в 30% фосфорную кислоту на 15 секунд. КН на левой и правой сторонах блоков измеряли. Затем правые стороны блоков покрывали лентой перед обработкой блоком с помощью 20 мг/мл раствора HLP, например BioMin 93, причем каждый нейтрализован как описано в Примере 1, дважды, в течение 30 минут (лента на правой стороне блоков предотвращает воздействие на эту сторону раствора белка и служит в качестве внутреннего контроля). Блоки дважды промывали DI водой в течение 5 минут, 500 PRM между двумя обработками и после второй обработки. Затем ленту убирали, и блоки инкубировали в AS растворе (0.2 мМ MgCl, 1 мМ CaCl.HO, 20 мМ HEPES буфер, 4 мМ KHPO, 16 мМ KCl, 4.5 мМ NHCl, 300 частей на миллион NaF, 0.05 мас. % NaN, при рН 7 (установлено с помощью 1М NaOH)) в течение 7 дней. После промывки блоков эмали DI водой и сушки промытых блоков посредством воздуха, микротвердость измеряли снова. Восстановление микротвердости поверхности (SMHL, реминерализация %) в процентах вычисляют следующим образом ((Микротвердость - Микротвердость)/(Микротвердость-Микротвердость))*100. Результаты анализа микротвердости проиллюстрированы в Таблице 4.
Из Таблицы 4 можно увидеть, что BioMin 93 эффективен для реминерализации поверхности эмали протравленных кислотой блоков эмали. Необходимо отметить, что для всех тестов на микротвердость, процент реминерализации с правой стороны/стороны внутреннего контроля, которая была погружена в искусственную слюну и имела некоторое восстановление от искусственной слюны, исключали из результатов, так что данные показывают дифференциальный эффект HLP.
В то время как конкретные варианты выполнения настоящего изобретения были проиллюстрированы и описаны, специалисту в данной области техники должно быть очевидно, что различные изменения и модификации могут быть сделаны без отклонения от объема настоящего изобретения, как определено в приложенной формуле изобретения.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  BASF SE
<120>  ПРОДУКТЫ И СПОСОБЫ ДЛЯ УХОДА ЗА ПОЛОСТЬЮ РТА,
СОДЕРЖАЩИЕ HLP
<130>  0000078605
<150>  62246161
<151>  26 October 2015
<160>  24
<170>  PatentIn version 3.1
<210>  1
<211>  405
<212>  ДНК
<213>  basf-dewA
<220>
<221>  CDS
<222>  (1)..(405)
<223>
<400>  1
atg cgc ttc atc gtc tct ctc ctc gcc ttc act gcc gcg gcc acc gcg       48
Met Arg Phe Ile Val Ser Leu Leu Ala Phe Thr Ala Ala Ala Thr Ala
1               5                   10                  15
acc gcc ctc ccg gcc tct gcc gca aag aac gcg aag ctg gcc acc tcg       96
Thr Ala Leu Pro Ala Ser Ala Ala Lys Asn Ala Lys Leu Ala Thr Ser
20                  25                  30
gcg gcc ttc gcc aag cag gct gaa ggc acc acc tgc aat gtc ggc tcg      144
Ala Ala Phe Ala Lys Gln Ala Glu Gly Thr Thr Cys Asn Val Gly Ser
35                  40                  45
atc gct tgc tgc aac tcc ccc gct gag acc aac aac gac agt ctg ttg      192
Ile Ala Cys Cys Asn Ser Pro Ala Glu Thr Asn Asn Asp Ser Leu Leu
50                  55                  60
agc ggt ctg ctc ggt gct ggc ctt ctc aac ggg ctc tcg ggc aac act      240
Ser Gly Leu Leu Gly Ala Gly Leu Leu Asn Gly Leu Ser Gly Asn Thr
65                  70                  75                  80
ggc agc gcc tgc gcc aag gcg agc ttg att gac cag ctg ggt ctg ctc      288
Gly Ser Ala Cys Ala Lys Ala Ser Leu Ile Asp Gln Leu Gly Leu Leu
85                  90                  95
gct ctc gtc gac cac act gag gaa ggc ccc gtc tgc aag aac atc gtc      336
Ala Leu Val Asp His Thr Glu Glu Gly Pro Val Cys Lys Asn Ile Val
100                 105                 110
gct tgc tgc cct gag gga acc acc aac tgt gtt gcc gtc gac aac gct      384
Ala Cys Cys Pro Glu Gly Thr Thr Asn Cys Val Ala Val Asp Asn Ala
115                 120                 125
ggc gct ggt acc aag gct gag                                          405
Gly Ala Gly Thr Lys Ala Glu
130                 135
<210>  2
<211>  135
<212>  PRT
<213>  basf-dewA
<400>  2
Met Arg Phe Ile Val Ser Leu Leu Ala Phe Thr Ala Ala Ala Thr Ala
1               5                   10                  15
Thr Ala Leu Pro Ala Ser Ala Ala Lys Asn Ala Lys Leu Ala Thr Ser
20                  25                  30
Ala Ala Phe Ala Lys Gln Ala Glu Gly Thr Thr Cys Asn Val Gly Ser
35                  40                  45
Ile Ala Cys Cys Asn Ser Pro Ala Glu Thr Asn Asn Asp Ser Leu Leu
50                  55                  60
Ser Gly Leu Leu Gly Ala Gly Leu Leu Asn Gly Leu Ser Gly Asn Thr
65                  70                  75                  80
Gly Ser Ala Cys Ala Lys Ala Ser Leu Ile Asp Gln Leu Gly Leu Leu
85                  90                  95
Ala Leu Val Asp His Thr Glu Glu Gly Pro Val Cys Lys Asn Ile Val
100                 105                 110
Ala Cys Cys Pro Glu Gly Thr Thr Asn Cys Val Ala Val Asp Asn Ala
115                 120                 125
Gly Ala Gly Thr Lys Ala Glu
130                 135
<210>  3
<211>  471
<212>  ДНК
<213>  basf-rodA
<220>
<221>  CDS
<222>  (1)..(471)
<223>
<400>  3
atg aag ttc tcc att gct gcc gct gtc gtt gct ttc gcc gcc tcc gtc       48
Met Lys Phe Ser Ile Ala Ala Ala Val Val Ala Phe Ala Ala Ser Val
1               5                   10                  15
gcg gcc ctc cct cct gcc cat gat tcc cag ttc gct ggc aat ggt gtt       96
Ala Ala Leu Pro Pro Ala His Asp Ser Gln Phe Ala Gly Asn Gly Val
20                  25                  30
ggc aac aag ggc aac agc aac gtc aag ttc cct gtc ccc gaa aac gtg      144
Gly Asn Lys Gly Asn Ser Asn Val Lys Phe Pro Val Pro Glu Asn Val
35                  40                  45
acc gtc aag cag gcc tcc gac aag tgc ggt gac cag gcc cag ctc tct      192
Thr Val Lys Gln Ala Ser Asp Lys Cys Gly Asp Gln Ala Gln Leu Ser
50                  55                  60
tgc tgc aac aag gcc acg tac gcc ggt gac acc aca acc gtt gat gag      240
Cys Cys Asn Lys Ala Thr Tyr Ala Gly Asp Thr Thr Thr Val Asp Glu
65                  70                  75                  80
ggt ctt ctg tct ggt gcc ctc agc ggc ctc atc ggc gcc ggg tct ggt      288
Gly Leu Leu Ser Gly Ala Leu Ser Gly Leu Ile Gly Ala Gly Ser Gly
85                  90                  95
gcc gaa ggt ctt ggt ctc ttc gat cag tgc tcc aag ctt gat gtt gct      336
Ala Glu Gly Leu Gly Leu Phe Asp Gln Cys Ser Lys Leu Asp Val Ala
100                 105                 110
gtc ctc att ggc atc caa gat ctt gtc aac cag aag tgc aag caa aac      384
Val Leu Ile Gly Ile Gln Asp Leu Val Asn Gln Lys Cys Lys Gln Asn
115                 120                 125
att gcc tgc tgc cag aac tcc ccc tcc agc gcg gat ggc aac ctt att      432
Ile Ala Cys Cys Gln Asn Ser Pro Ser Ser Ala Asp Gly Asn Leu Ile
130                 135                 140
ggt gtc ggt ctc cct tgc gtt gcc ctt ggc tcc atc ctc                  471
Gly Val Gly Leu Pro Cys Val Ala Leu Gly Ser Ile Leu
145                 150                 155
<210>  4
<211>  157
<212>  PRT
<213>  basf-rodA
<400>  4
Met Lys Phe Ser Ile Ala Ala Ala Val Val Ala Phe Ala Ala Ser Val
1               5                   10                  15
Ala Ala Leu Pro Pro Ala His Asp Ser Gln Phe Ala Gly Asn Gly Val
20                  25                  30
Gly Asn Lys Gly Asn Ser Asn Val Lys Phe Pro Val Pro Glu Asn Val
35                  40                  45
Thr Val Lys Gln Ala Ser Asp Lys Cys Gly Asp Gln Ala Gln Leu Ser
50                  55                  60
Cys Cys Asn Lys Ala Thr Tyr Ala Gly Asp Thr Thr Thr Val Asp Glu
65                  70                  75                  80
Gly Leu Leu Ser Gly Ala Leu Ser Gly Leu Ile Gly Ala Gly Ser Gly
85                  90                  95
Ala Glu Gly Leu Gly Leu Phe Asp Gln Cys Ser Lys Leu Asp Val Ala
100                 105                 110
Val Leu Ile Gly Ile Gln Asp Leu Val Asn Gln Lys Cys Lys Gln Asn
115                 120                 125
Ile Ala Cys Cys Gln Asn Ser Pro Ser Ser Ala Asp Gly Asn Leu Ile
130                 135                 140
Gly Val Gly Leu Pro Cys Val Ala Leu Gly Ser Ile Leu
145                 150                 155
<210>  5
<211>  336
<212>  ДНК
<213>  basf-HypA
<220>
<221>  CDS
<222>  (1)..(336)
<223>
<400>  5
atg atc tct cgc gtc ctt gtc gct gct ctc gtc gct ctc ccc gct ctt       48
Met Ile Ser Arg Val Leu Val Ala Ala Leu Val Ala Leu Pro Ala Leu
1               5                   10                  15
gtt act gca act cct gct ccc gga aag cct aaa gcc agc agt cag tgc       96
Val Thr Ala Thr Pro Ala Pro Gly Lys Pro Lys Ala Ser Ser Gln Cys
20                  25                  30
gac gtc ggt gaa atc cat tgc tgt gac act cag cag act ccc gac cac      144
Asp Val Gly Glu Ile His Cys Cys Asp Thr Gln Gln Thr Pro Asp His
35                  40                  45
acc agc gcc gcc gcg tct ggt ttg ctt ggt gtt ccc atc aac ctt ggt      192
Thr Ser Ala Ala Ala Ser Gly Leu Leu Gly Val Pro Ile Asn Leu Gly
50                  55                  60
gct ttc ctc ggt ttc gac tgt acc ccc att tcc gtc ctt ggc gtc ggt      240
Ala Phe Leu Gly Phe Asp Cys Thr Pro Ile Ser Val Leu Gly Val Gly
65                  70                  75                  80
ggc aac aac tgt gct gct cag cct gtc tgc tgc aca gga aat caa ttc      288
Gly Asn Asn Cys Ala Ala Gln Pro Val Cys Cys Thr Gly Asn Gln Phe
85                  90                  95
acc gca ttg att aac gct ctt gac tgc tct cct gtc aat gtc aac ctc      336
Thr Ala Leu Ile Asn Ala Leu Asp Cys Ser Pro Val Asn Val Asn Leu
100                 105                 110
<210>  6
<211>  112
<212>  PRT
<213>  basf-HypA
<400>  6
Met Ile Ser Arg Val Leu Val Ala Ala Leu Val Ala Leu Pro Ala Leu
1               5                   10                  15
Val Thr Ala Thr Pro Ala Pro Gly Lys Pro Lys Ala Ser Ser Gln Cys
20                  25                  30
Asp Val Gly Glu Ile His Cys Cys Asp Thr Gln Gln Thr Pro Asp His
35                  40                  45
Thr Ser Ala Ala Ala Ser Gly Leu Leu Gly Val Pro Ile Asn Leu Gly
50                  55                  60
Ala Phe Leu Gly Phe Asp Cys Thr Pro Ile Ser Val Leu Gly Val Gly
65                  70                  75                  80
Gly Asn Asn Cys Ala Ala Gln Pro Val Cys Cys Thr Gly Asn Gln Phe
85                  90                  95
Thr Ala Leu Ile Asn Ala Leu Asp Cys Ser Pro Val Asn Val Asn Leu
100                 105                 110
<210>  7
<211>  357
<212>  ДНК
<213>  basf-HypB
<220>
<221>  CDS
<222>  (1)..(357)
<223>
<400>  7
atg gtc agc acg ttc atc act gtc gca aag acc ctt ctc gtc gcg ctc       48
Met Val Ser Thr Phe Ile Thr Val Ala Lys Thr Leu Leu Val Ala Leu
1               5                   10                  15
ctc ttc gtc aat atc aat atc gtc gtt ggt act gca act acc ggc aag       96
Leu Phe Val Asn Ile Asn Ile Val Val Gly Thr Ala Thr Thr Gly Lys
20                  25                  30
cat tgt agc acc ggt cct atc gag tgc tgc aag cag gtc atg gat tct      144
His Cys Ser Thr Gly Pro Ile Glu Cys Cys Lys Gln Val Met Asp Ser
35                  40                  45
aag agc cct cag gct acg gag ctt ctt acg aag aat ggc ctt ggc ctg      192
Lys Ser Pro Gln Ala Thr Glu Leu Leu Thr Lys Asn Gly Leu Gly Leu
50                  55                  60
ggt gtc ctt gct ggc gtg aag ggt ctt gtt ggc gcg aat tgc agc cct      240
Gly Val Leu Ala Gly Val Lys Gly Leu Val Gly Ala Asn Cys Ser Pro
65                  70                  75                  80
atc acg gca att ggt att ggc tcc ggc agc caa tgc tct ggc cag acc      288
Ile Thr Ala Ile Gly Ile Gly Ser Gly Ser Gln Cys Ser Gly Gln Thr
85                  90                  95
gtt tgc tgc cag aat aat aat ttc aac ggt gtt gtc gct att ggt tgc      336
Val Cys Cys Gln Asn Asn Asn Phe Asn Gly Val Val Ala Ile Gly Cys
100                 105                 110
act ccc att aat gcc aat gtg                                          357
Thr Pro Ile Asn Ala Asn Val
115
<210>  8
<211>  119
<212>  PRT
<213>  basf-HypB
<400>  8
Met Val Ser Thr Phe Ile Thr Val Ala Lys Thr Leu Leu Val Ala Leu
1               5                   10                  15
Leu Phe Val Asn Ile Asn Ile Val Val Gly Thr Ala Thr Thr Gly Lys
20                  25                  30
His Cys Ser Thr Gly Pro Ile Glu Cys Cys Lys Gln Val Met Asp Ser
35                  40                  45
Lys Ser Pro Gln Ala Thr Glu Leu Leu Thr Lys Asn Gly Leu Gly Leu
50                  55                  60
Gly Val Leu Ala Gly Val Lys Gly Leu Val Gly Ala Asn Cys Ser Pro
65                  70                  75                  80
Ile Thr Ala Ile Gly Ile Gly Ser Gly Ser Gln Cys Ser Gly Gln Thr
85                  90                  95
Val Cys Cys Gln Asn Asn Asn Phe Asn Gly Val Val Ala Ile Gly Cys
100                 105                 110
Thr Pro Ile Asn Ala Asn Val
115
<210>  9
<211>  408
<212>  ДНК
<213>  basf-sc3
<220>
<221>  CDS
<222>  (1)..(408)
<223>
<400>  9
atg ttc gcc cgt ctc ccc gtc gtg ttc ctc tac gcc ttc gtc gcg ttc       48
Met Phe Ala Arg Leu Pro Val Val Phe Leu Tyr Ala Phe Val Ala Phe
1               5                   10                  15
ggc gcc ctc gtc gct gcc ctc cca ggt ggc cac ccg ggc acg acc acg       96
Gly Ala Leu Val Ala Ala Leu Pro Gly Gly His Pro Gly Thr Thr Thr
20                  25                  30
ccg ccg gtt acg acg acg gtg acg gtg acc acg ccg ccc tcg acg acg      144
Pro Pro Val Thr Thr Thr Val Thr Val Thr Thr Pro Pro Ser Thr Thr
35                  40                  45
acc atc gcc gcc ggt ggc acg tgt act acg ggg tcg ctc tct tgc tgc      192
Thr Ile Ala Ala Gly Gly Thr Cys Thr Thr Gly Ser Leu Ser Cys Cys
50                  55                  60
aac cag gtt caa tcg gcg agc agc agc cct gtt acc gcc ctc ctc ggc      240
Asn Gln Val Gln Ser Ala Ser Ser Ser Pro Val Thr Ala Leu Leu Gly
65                  70                  75                  80
ctg ctc ggc att gtc ctc agc gac ctc aac gtt ctc gtt ggc atc agc      288
Leu Leu Gly Ile Val Leu Ser Asp Leu Asn Val Leu Val Gly Ile Ser
85                  90                  95
tgc tct ccc ctc act gtc atc ggt gtc gga ggc agc ggc tgt tcg gcg      336
Cys Ser Pro Leu Thr Val Ile Gly Val Gly Gly Ser Gly Cys Ser Ala
100                 105                 110
cag acc gtc tgc tgc gaa aac acc caa ttc aac ggg ctg atc aac atc      384
Gln Thr Val Cys Cys Glu Asn Thr Gln Phe Asn Gly Leu Ile Asn Ile
115                 120                 125
ggt tgc acc ccc atc aac atc ctc                                      408
Gly Cys Thr Pro Ile Asn Ile Leu
130                 135
<210>  10
<211>  136
<212>  PRT
<213>  basf-sc3
<400>  10
Met Phe Ala Arg Leu Pro Val Val Phe Leu Tyr Ala Phe Val Ala Phe
1               5                   10                  15
Gly Ala Leu Val Ala Ala Leu Pro Gly Gly His Pro Gly Thr Thr Thr
20                  25                  30
Pro Pro Val Thr Thr Thr Val Thr Val Thr Thr Pro Pro Ser Thr Thr
35                  40                  45
Thr Ile Ala Ala Gly Gly Thr Cys Thr Thr Gly Ser Leu Ser Cys Cys
50                  55                  60
Asn Gln Val Gln Ser Ala Ser Ser Ser Pro Val Thr Ala Leu Leu Gly
65                  70                  75                  80
Leu Leu Gly Ile Val Leu Ser Asp Leu Asn Val Leu Val Gly Ile Ser
85                  90                  95
Cys Ser Pro Leu Thr Val Ile Gly Val Gly Gly Ser Gly Cys Ser Ala
100                 105                 110
Gln Thr Val Cys Cys Glu Asn Thr Gln Phe Asn Gly Leu Ile Asn Ile
115                 120                 125
Gly Cys Thr Pro Ile Asn Ile Leu
130                 135
<210>  11
<211>  483
<212>  ДНК
<213>  basf-BASF1
<220>
<221>  CDS
<222>  (1)..(483)
<223>
<400>  11
atg aag ttc tcc gtc tcc gcc gcc gtc ctc gcc ttc gcc gcc tcc gtc       48
Met Lys Phe Ser Val Ser Ala Ala Val Leu Ala Phe Ala Ala Ser Val
1               5                   10                  15
gcc gcc ctc cct cag cac gac tcc gcc gcc ggc aac ggc aac ggc gtc       96
Ala Ala Leu Pro Gln His Asp Ser Ala Ala Gly Asn Gly Asn Gly Val
20                  25                  30
ggc aac aag ttc cct gtc cct gac gac gtc acc gtc aag cag gcc acc      144
Gly Asn Lys Phe Pro Val Pro Asp Asp Val Thr Val Lys Gln Ala Thr
35                  40                  45
gac aag tgc ggc gac cag gcc cag ctc tcc tgc tgc aac aag gcc acc      192
Asp Lys Cys Gly Asp Gln Ala Gln Leu Ser Cys Cys Asn Lys Ala Thr
50                  55                  60
tac gcc ggc gac gtc ctc acc gac atc gac gag ggc atc ctc gcc ggc      240
Tyr Ala Gly Asp Val Leu Thr Asp Ile Asp Glu Gly Ile Leu Ala Gly
65                  70                  75                  80
ctc ctc aag aac ctc atc ggc ggc ggc tcc ggc tcc gag ggc ctc ggc      288
Leu Leu Lys Asn Leu Ile Gly Gly Gly Ser Gly Ser Glu Gly Leu Gly
85                  90                  95
ctc ttc gac cag tgc gtc aag ctc gac ctc cag atc tcc gtc atc ggc      336
Leu Phe Asp Gln Cys Val Lys Leu Asp Leu Gln Ile Ser Val Ile Gly
100                 105                 110
atc cct atc cag gac ctc ctc aac cag gtc aac aag cag tgc aag cag      384
Ile Pro Ile Gln Asp Leu Leu Asn Gln Val Asn Lys Gln Cys Lys Gln
115                 120                 125
aac atc gcc tgc tgc cag aac tcc cct tcc gac gcc acc ggc tcc ctc      432
Asn Ile Ala Cys Cys Gln Asn Ser Pro Ser Asp Ala Thr Gly Ser Leu
130                 135                 140
gtc aac ctc ggc ctc ggc aac cct tgc atc cct gtc tcc ctc ctc cat      480
Val Asn Leu Gly Leu Gly Asn Pro Cys Ile Pro Val Ser Leu Leu His
145                 150                 155                 160
atg                                                                  483
Met
<210>  12
<211>  161
<212>  PRT
<213>  basf-BASF1
<400>  12
Met Lys Phe Ser Val Ser Ala Ala Val Leu Ala Phe Ala Ala Ser Val
1               5                   10                  15
Ala Ala Leu Pro Gln His Asp Ser Ala Ala Gly Asn Gly Asn Gly Val
20                  25                  30
Gly Asn Lys Phe Pro Val Pro Asp Asp Val Thr Val Lys Gln Ala Thr
35                  40                  45
Asp Lys Cys Gly Asp Gln Ala Gln Leu Ser Cys Cys Asn Lys Ala Thr
50                  55                  60
Tyr Ala Gly Asp Val Leu Thr Asp Ile Asp Glu Gly Ile Leu Ala Gly
65                  70                  75                  80
Leu Leu Lys Asn Leu Ile Gly Gly Gly Ser Gly Ser Glu Gly Leu Gly
85                  90                  95
Leu Phe Asp Gln Cys Val Lys Leu Asp Leu Gln Ile Ser Val Ile Gly
100                 105                 110
Ile Pro Ile Gln Asp Leu Leu Asn Gln Val Asn Lys Gln Cys Lys Gln
115                 120                 125
Asn Ile Ala Cys Cys Gln Asn Ser Pro Ser Asp Ala Thr Gly Ser Leu
130                 135                 140
Val Asn Leu Gly Leu Gly Asn Pro Cys Ile Pro Val Ser Leu Leu His
145                 150                 155                 160
Met
<210>  13
<211>  465
<212>  ДНК
<213>  basf-BASF2
<220>
<221>  CDS
<222>  (1)..(465)
<223>
<400>  13
atg aag ttc tcc gtc tcc gcc gcc gtc ctc gcc ttc gcc gcc tcc gtc       48
Met Lys Phe Ser Val Ser Ala Ala Val Leu Ala Phe Ala Ala Ser Val
1               5                   10                  15
gcc gcc ctc cct cag cac gac tcc gcc gcc ggc aac ggc aac ggc gtc       96
Ala Ala Leu Pro Gln His Asp Ser Ala Ala Gly Asn Gly Asn Gly Val
20                  25                  30
ggc aac aag ttc cct gtc cct gac gac gtc acc gtc aag cag gcc acc      144
Gly Asn Lys Phe Pro Val Pro Asp Asp Val Thr Val Lys Gln Ala Thr
35                  40                  45
gac aag tgc ggc gac cag gcc cag ctc tcc tgc tgc aac aag gcc acc      192
Asp Lys Cys Gly Asp Gln Ala Gln Leu Ser Cys Cys Asn Lys Ala Thr
50                  55                  60
tac gcc ggc gac gtc acc gac atc gac gag ggc atc ctc gcc ggc ctc      240
Tyr Ala Gly Asp Val Thr Asp Ile Asp Glu Gly Ile Leu Ala Gly Leu
65                  70                  75                  80
ctc aag aac ctc atc ggc ggc ggc tcc ggc tcc gag ggc ctc ggc ctc      288
Leu Lys Asn Leu Ile Gly Gly Gly Ser Gly Ser Glu Gly Leu Gly Leu
85                  90                  95
ttc gac cag tgc gtc aag ctc gac ctc cag atc tcc gtc atc ggc atc      336
Phe Asp Gln Cys Val Lys Leu Asp Leu Gln Ile Ser Val Ile Gly Ile
100                 105                 110
cct atc cag gac ctc ctc aac cag cag tgc aag cag aac atc gcc tgc      384
Pro Ile Gln Asp Leu Leu Asn Gln Gln Cys Lys Gln Asn Ile Ala Cys
115                 120                 125
tgc cag aac tcc cct tcc gac gcc acc ggc tcc ctc gtc aac ctc ggc      432
Cys Gln Asn Ser Pro Ser Asp Ala Thr Gly Ser Leu Val Asn Leu Gly
130                 135                 140
aac cct tgc atc cct gtc tcc ctc ctc cat atg                          465
Asn Pro Cys Ile Pro Val Ser Leu Leu His Met
145                 150                 155
<210>  14
<211>  155
<212>  PRT
<213>  basf-BASF2
<400>  14
Met Lys Phe Ser Val Ser Ala Ala Val Leu Ala Phe Ala Ala Ser Val
1               5                   10                  15
Ala Ala Leu Pro Gln His Asp Ser Ala Ala Gly Asn Gly Asn Gly Val
20                  25                  30
Gly Asn Lys Phe Pro Val Pro Asp Asp Val Thr Val Lys Gln Ala Thr
35                  40                  45
Asp Lys Cys Gly Asp Gln Ala Gln Leu Ser Cys Cys Asn Lys Ala Thr
50                  55                  60
Tyr Ala Gly Asp Val Thr Asp Ile Asp Glu Gly Ile Leu Ala Gly Leu
65                  70                  75                  80
Leu Lys Asn Leu Ile Gly Gly Gly Ser Gly Ser Glu Gly Leu Gly Leu
85                  90                  95
Phe Asp Gln Cys Val Lys Leu Asp Leu Gln Ile Ser Val Ile Gly Ile
100                 105                 110
Pro Ile Gln Asp Leu Leu Asn Gln Gln Cys Lys Gln Asn Ile Ala Cys
115                 120                 125
Cys Gln Asn Ser Pro Ser Asp Ala Thr Gly Ser Leu Val Asn Leu Gly
130                 135                 140
Asn Pro Cys Ile Pro Val Ser Leu Leu His Met
145                 150                 155
<210>  15
<211>  882
<212>  ДНК
<213>  basf-yaad
<220>
<221>  CDS
<222>  (1)..(882)
<223>
<400>  15
atg gct caa aca ggt act gaa cgt gta aaa cgc gga atg gca gaa atg       48
Met Ala Gln Thr Gly Thr Glu Arg Val Lys Arg Gly Met Ala Glu Met
1               5                   10                  15
caa aaa ggc ggc gtc atc atg gac gtc atc aat gcg gaa caa gcg aaa       96
Gln Lys Gly Gly Val Ile Met Asp Val Ile Asn Ala Glu Gln Ala Lys
20                  25                  30
atc gct gaa gaa gct gga gct gtc gct gta atg gcg cta gaa cgt gtg      144
Ile Ala Glu Glu Ala Gly Ala Val Ala Val Met Ala Leu Glu Arg Val
35                  40                  45
cca gca gat att cgc gcg gct gga gga gtt gcc cgt atg gct gac cct      192
Pro Ala Asp Ile Arg Ala Ala Gly Gly Val Ala Arg Met Ala Asp Pro
50                  55                  60
aca atc gtg gaa gaa gta atg aat gca gta tct atc ccg gta atg gca      240
Thr Ile Val Glu Glu Val Met Asn Ala Val Ser Ile Pro Val Met Ala
65                  70                  75                  80
aaa gcg cgt atc gga cat att gtt gaa gcg cgt gtg ctt gaa gct atg      288
Lys Ala Arg Ile Gly His Ile Val Glu Ala Arg Val Leu Glu Ala Met
85                  90                  95
ggt gtt gac tat att gat gaa agt gaa gtt ctg acg ccg gct gac gaa      336
Gly Val Asp Tyr Ile Asp Glu Ser Glu Val Leu Thr Pro Ala Asp Glu
100                 105                 110
gaa ttt cat tta aat aaa aat gaa tac aca gtt cct ttt gtc tgt ggc      384
Glu Phe His Leu Asn Lys Asn Glu Tyr Thr Val Pro Phe Val Cys Gly
115                 120                 125
tgc cgt gat ctt ggt gaa gca aca cgc cgt att gcg gaa ggt gct tct      432
Cys Arg Asp Leu Gly Glu Ala Thr Arg Arg Ile Ala Glu Gly Ala Ser
130                 135                 140
atg ctt cgc aca aaa ggt gag cct gga aca ggt aat att gtt gag gct      480
Met Leu Arg Thr Lys Gly Glu Pro Gly Thr Gly Asn Ile Val Glu Ala
145                 150                 155                 160
gtt cgc cat atg cgt aaa gtt aac gct caa gtg cgc aaa gta gtt gcg      528
Val Arg His Met Arg Lys Val Asn Ala Gln Val Arg Lys Val Val Ala
165                 170                 175
atg agt gag gat gag cta atg aca gaa gcg aaa aac cta ggt gct cct      576
Met Ser Glu Asp Glu Leu Met Thr Glu Ala Lys Asn Leu Gly Ala Pro
180                 185                 190
tac gag ctt ctt ctt caa att aaa aaa gac ggc aag ctt cct gtc gtt      624
Tyr Glu Leu Leu Leu Gln Ile Lys Lys Asp Gly Lys Leu Pro Val Val
195                 200                 205
aac ttt gcc gct ggc ggc gta gca act cca gct gat gct gct ctc atg      672
Asn Phe Ala Ala Gly Gly Val Ala Thr Pro Ala Asp Ala Ala Leu Met
210                 215                 220
atg cag ctt ggt gct gac gga gta ttt gtt ggt tct ggt att ttt aaa      720
Met Gln Leu Gly Ala Asp Gly Val Phe Val Gly Ser Gly Ile Phe Lys
225                 230                 235                 240
tca gac aac cct gct aaa ttt gcg aaa gca att gtg gaa gca aca act      768
Ser Asp Asn Pro Ala Lys Phe Ala Lys Ala Ile Val Glu Ala Thr Thr
245                 250                 255
cac ttt act gat tac aaa tta atc gct gag ttg tca aaa gag ctt ggt      816
His Phe Thr Asp Tyr Lys Leu Ile Ala Glu Leu Ser Lys Glu Leu Gly
260                 265                 270
act gca atg aaa ggg att gaa atc tca aac tta ctt cca gaa cag cgt      864
Thr Ala Met Lys Gly Ile Glu Ile Ser Asn Leu Leu Pro Glu Gln Arg
275                 280                 285
atg caa gaa cgc ggc tgg                                              882
Met Gln Glu Arg Gly Trp
290
<210>  16
<211>  294
<212>  PRT
<213>  basf-yaad
<400>  16
Met Ala Gln Thr Gly Thr Glu Arg Val Lys Arg Gly Met Ala Glu Met
1               5                   10                  15
Gln Lys Gly Gly Val Ile Met Asp Val Ile Asn Ala Glu Gln Ala Lys
20                  25                  30
Ile Ala Glu Glu Ala Gly Ala Val Ala Val Met Ala Leu Glu Arg Val
35                  40                  45
Pro Ala Asp Ile Arg Ala Ala Gly Gly Val Ala Arg Met Ala Asp Pro
50                  55                  60
Thr Ile Val Glu Glu Val Met Asn Ala Val Ser Ile Pro Val Met Ala
65                  70                  75                  80
Lys Ala Arg Ile Gly His Ile Val Glu Ala Arg Val Leu Glu Ala Met
85                  90                  95
Gly Val Asp Tyr Ile Asp Glu Ser Glu Val Leu Thr Pro Ala Asp Glu
100                 105                 110
Glu Phe His Leu Asn Lys Asn Glu Tyr Thr Val Pro Phe Val Cys Gly
115                 120                 125
Cys Arg Asp Leu Gly Glu Ala Thr Arg Arg Ile Ala Glu Gly Ala Ser
130                 135                 140
Met Leu Arg Thr Lys Gly Glu Pro Gly Thr Gly Asn Ile Val Glu Ala
145                 150                 155                 160
Val Arg His Met Arg Lys Val Asn Ala Gln Val Arg Lys Val Val Ala
165                 170                 175
Met Ser Glu Asp Glu Leu Met Thr Glu Ala Lys Asn Leu Gly Ala Pro
180                 185                 190
Tyr Glu Leu Leu Leu Gln Ile Lys Lys Asp Gly Lys Leu Pro Val Val
195                 200                 205
Asn Phe Ala Ala Gly Gly Val Ala Thr Pro Ala Asp Ala Ala Leu Met
210                 215                 220
Met Gln Leu Gly Ala Asp Gly Val Phe Val Gly Ser Gly Ile Phe Lys
225                 230                 235                 240
Ser Asp Asn Pro Ala Lys Phe Ala Lys Ala Ile Val Glu Ala Thr Thr
245                 250                 255
His Phe Thr Asp Tyr Lys Leu Ile Ala Glu Leu Ser Lys Glu Leu Gly
260                 265                 270
Thr Ala Met Lys Gly Ile Glu Ile Ser Asn Leu Leu Pro Glu Gln Arg
275                 280                 285
Met Gln Glu Arg Gly Trp
290
<210>  17
<211>  591
<212>  ДНК
<213>  basf-yaae
<220>
<221>  CDS
<222>  (1)..(591)
<223>
<400>  17
atg gga tta aca ata ggt gta cta gga ctt caa gga gca gtt aga gag       48
Met Gly Leu Thr Ile Gly Val Leu Gly Leu Gln Gly Ala Val Arg Glu
1               5                   10                  15
cac atc cat gcg att gaa gca tgc ggc gcg gct ggt ctt gtc gta aaa       96
His Ile His Ala Ile Glu Ala Cys Gly Ala Ala Gly Leu Val Val Lys
20                  25                  30
cgt ccg gag cag ctg aac gaa gtt gac ggg ttg att ttg ccg ggc ggt      144
Arg Pro Glu Gln Leu Asn Glu Val Asp Gly Leu Ile Leu Pro Gly Gly
35                  40                  45
gag agc acg acg atg cgc cgt ttg atc gat acg tat caa ttc atg gag      192
Glu Ser Thr Thr Met Arg Arg Leu Ile Asp Thr Tyr Gln Phe Met Glu
50                  55                  60
ccg ctt cgt gaa ttc gct gct cag ggc aaa ccg atg ttt gga aca tgt      240
Pro Leu Arg Glu Phe Ala Ala Gln Gly Lys Pro Met Phe Gly Thr Cys
65                  70                  75                  80
gcc gga tta att ata tta gca aaa gaa att gcc ggt tca gat aat cct      288
Ala Gly Leu Ile Ile Leu Ala Lys Glu Ile Ala Gly Ser Asp Asn Pro
85                  90                  95
cat tta ggt ctt ctg aat gtg gtt gta gaa cgt aat tca ttt ggc cgg      336
His Leu Gly Leu Leu Asn Val Val Val Glu Arg Asn Ser Phe Gly Arg
100                 105                 110
cag gtt gac agc ttt gaa gct gat tta aca att aaa ggc ttg gac gag      384
Gln Val Asp Ser Phe Glu Ala Asp Leu Thr Ile Lys Gly Leu Asp Glu
115                 120                 125
cct ttt act ggg gta ttc atc cgt gct ccg cat att tta gaa gct ggt      432
Pro Phe Thr Gly Val Phe Ile Arg Ala Pro His Ile Leu Glu Ala Gly
130                 135                 140
gaa aat gtt gaa gtt cta tcg gag cat aat ggt cgt att gta gcc gcg      480
Glu Asn Val Glu Val Leu Ser Glu His Asn Gly Arg Ile Val Ala Ala
145                 150                 155                 160
aaa cag ggg caa ttc ctt ggc tgc tca ttc cat ccg gag ctg aca gaa      528
Lys Gln Gly Gln Phe Leu Gly Cys Ser Phe His Pro Glu Leu Thr Glu
165                 170                 175
gat cac cga gtg acg cag ctg ttt gtt gaa atg gtt gag gaa tat aag      576
Asp His Arg Val Thr Gln Leu Phe Val Glu Met Val Glu Glu Tyr Lys
180                 185                 190
caa aag gca ctt gta                                                  591
Gln Lys Ala Leu Val
195
<210>  18
<211>  197
<212>  PRT
<213>  basf-yaae
<400>  18
Met Gly Leu Thr Ile Gly Val Leu Gly Leu Gln Gly Ala Val Arg Glu
1               5                   10                  15
His Ile His Ala Ile Glu Ala Cys Gly Ala Ala Gly Leu Val Val Lys
20                  25                  30
Arg Pro Glu Gln Leu Asn Glu Val Asp Gly Leu Ile Leu Pro Gly Gly
35                  40                  45
Glu Ser Thr Thr Met Arg Arg Leu Ile Asp Thr Tyr Gln Phe Met Glu
50                  55                  60
Pro Leu Arg Glu Phe Ala Ala Gln Gly Lys Pro Met Phe Gly Thr Cys
65                  70                  75                  80
Ala Gly Leu Ile Ile Leu Ala Lys Glu Ile Ala Gly Ser Asp Asn Pro
85                  90                  95
His Leu Gly Leu Leu Asn Val Val Val Glu Arg Asn Ser Phe Gly Arg
100                 105                 110
Gln Val Asp Ser Phe Glu Ala Asp Leu Thr Ile Lys Gly Leu Asp Glu
115                 120                 125
Pro Phe Thr Gly Val Phe Ile Arg Ala Pro His Ile Leu Glu Ala Gly
130                 135                 140
Glu Asn Val Glu Val Leu Ser Glu His Asn Gly Arg Ile Val Ala Ala
145                 150                 155                 160
Lys Gln Gly Gln Phe Leu Gly Cys Ser Phe His Pro Glu Leu Thr Glu
165                 170                 175
Asp His Arg Val Thr Gln Leu Phe Val Glu Met Val Glu Glu Tyr Lys
180                 185                 190
Gln Lys Ala Leu Val
195
<210>  19
<211>  1329
<212>  ДНК
<213>  basf-yaad-Xa-dewA-his
<220>
<221>  CDS
<222>  (1)..(1329)
<223>
<400>  19
atg gct caa aca ggt act gaa cgt gta aaa cgc gga atg gca gaa atg       48
Met Ala Gln Thr Gly Thr Glu Arg Val Lys Arg Gly Met Ala Glu Met
1               5                   10                  15
caa aaa ggc ggc gtc atc atg gac gtc atc aat gcg gaa caa gcg aaa       96
Gln Lys Gly Gly Val Ile Met Asp Val Ile Asn Ala Glu Gln Ala Lys
20                  25                  30
atc gct gaa gaa gct gga gct gtc gct gta atg gcg cta gaa cgt gtg      144
Ile Ala Glu Glu Ala Gly Ala Val Ala Val Met Ala Leu Glu Arg Val
35                  40                  45
cca gca gat att cgc gcg gct gga gga gtt gcc cgt atg gct gac cct      192
Pro Ala Asp Ile Arg Ala Ala Gly Gly Val Ala Arg Met Ala Asp Pro
50                  55                  60
aca atc gtg gaa gaa gta atg aat gca gta tct atc ccg gta atg gca      240
Thr Ile Val Glu Glu Val Met Asn Ala Val Ser Ile Pro Val Met Ala
65                  70                  75                  80
aaa gcg cgt atc gga cat att gtt gaa gcg cgt gtg ctt gaa gct atg      288
Lys Ala Arg Ile Gly His Ile Val Glu Ala Arg Val Leu Glu Ala Met
85                  90                  95
ggt gtt gac tat att gat gaa agt gaa gtt ctg acg ccg gct gac gaa      336
Gly Val Asp Tyr Ile Asp Glu Ser Glu Val Leu Thr Pro Ala Asp Glu
100                 105                 110
gaa ttt cat tta aat aaa aat gaa tac aca gtt cct ttt gtc tgt ggc      384
Glu Phe His Leu Asn Lys Asn Glu Tyr Thr Val Pro Phe Val Cys Gly
115                 120                 125
tgc cgt gat ctt ggt gaa gca aca cgc cgt att gcg gaa ggt gct tct      432
Cys Arg Asp Leu Gly Glu Ala Thr Arg Arg Ile Ala Glu Gly Ala Ser
130                 135                 140
atg ctt cgc aca aaa ggt gag cct gga aca ggt aat att gtt gag gct      480
Met Leu Arg Thr Lys Gly Glu Pro Gly Thr Gly Asn Ile Val Glu Ala
145                 150                 155                 160
gtt cgc cat atg cgt aaa gtt aac gct caa gtg cgc aaa gta gtt gcg      528
Val Arg His Met Arg Lys Val Asn Ala Gln Val Arg Lys Val Val Ala
165                 170                 175
atg agt gag gat gag cta atg aca gaa gcg aaa aac cta ggt gct cct      576
Met Ser Glu Asp Glu Leu Met Thr Glu Ala Lys Asn Leu Gly Ala Pro
180                 185                 190
tac gag ctt ctt ctt caa att aaa aaa gac ggc aag ctt cct gtc gtt      624
Tyr Glu Leu Leu Leu Gln Ile Lys Lys Asp Gly Lys Leu Pro Val Val
195                 200                 205
aac ttt gcc gct ggc ggc gta gca act cca gct gat gct gct ctc atg      672
Asn Phe Ala Ala Gly Gly Val Ala Thr Pro Ala Asp Ala Ala Leu Met
210                 215                 220
atg cag ctt ggt gct gac gga gta ttt gtt ggt tct ggt att ttt aaa      720
Met Gln Leu Gly Ala Asp Gly Val Phe Val Gly Ser Gly Ile Phe Lys
225                 230                 235                 240
tca gac aac cct gct aaa ttt gcg aaa gca att gtg gaa gca aca act      768
Ser Asp Asn Pro Ala Lys Phe Ala Lys Ala Ile Val Glu Ala Thr Thr
245                 250                 255
cac ttt act gat tac aaa tta atc gct gag ttg tca aaa gag ctt ggt      816
His Phe Thr Asp Tyr Lys Leu Ile Ala Glu Leu Ser Lys Glu Leu Gly
260                 265                 270
act gca atg aaa ggg att gaa atc tca aac tta ctt cca gaa cag cgt      864
Thr Ala Met Lys Gly Ile Glu Ile Ser Asn Leu Leu Pro Glu Gln Arg
275                 280                 285
atg caa gaa cgc ggc tgg aga tcc att gaa ggc cgc atg cgc ttc atc      912
Met Gln Glu Arg Gly Trp Arg Ser Ile Glu Gly Arg Met Arg Phe Ile
290                 295                 300
gtc tct ctc ctc gcc ttc act gcc gcg gcc acc gcg acc gcc ctc ccg      960
Val Ser Leu Leu Ala Phe Thr Ala Ala Ala Thr Ala Thr Ala Leu Pro
305                 310                 315                 320
gcc tct gcc gca aag aac gcg aag ctg gcc acc tcg gcg gcc ttc gcc     1008
Ala Ser Ala Ala Lys Asn Ala Lys Leu Ala Thr Ser Ala Ala Phe Ala
325                 330                 335
aag cag gct gaa ggc acc acc tgc aat gtc ggc tcg atc gct tgc tgc     1056
Lys Gln Ala Glu Gly Thr Thr Cys Asn Val Gly Ser Ile Ala Cys Cys
340                 345                 350
aac tcc ccc gct gag acc aac aac gac agt ctg ttg agc ggt ctg ctc     1104
Asn Ser Pro Ala Glu Thr Asn Asn Asp Ser Leu Leu Ser Gly Leu Leu
355                 360                 365
ggt gct ggc ctt ctc aac ggg ctc tcg ggc aac act ggc agc gcc tgc     1152
Gly Ala Gly Leu Leu Asn Gly Leu Ser Gly Asn Thr Gly Ser Ala Cys
370                 375                 380
gcc aag gcg agc ttg att gac cag ctg ggt ctg ctc gct ctc gtc gac     1200
Ala Lys Ala Ser Leu Ile Asp Gln Leu Gly Leu Leu Ala Leu Val Asp
385                 390                 395                 400
cac act gag gaa ggc ccc gtc tgc aag aac atc gtc gct tgc tgc cct     1248
His Thr Glu Glu Gly Pro Val Cys Lys Asn Ile Val Ala Cys Cys Pro
405                 410                 415
gag gga acc acc aac tgt gtt gcc gtc gac aac gct ggc gct ggt acc     1296
Glu Gly Thr Thr Asn Cys Val Ala Val Asp Asn Ala Gly Ala Gly Thr
420                 425                 430
aag gct gag gga tct cat cac cat cac cat cac                         1329
Lys Ala Glu Gly Ser His His His His His His
435                 440
<210>  20
<211>  443
<212>  PRT
<213>  basf-yaad-Xa-dewA-his
<400>  20
Met Ala Gln Thr Gly Thr Glu Arg Val Lys Arg Gly Met Ala Glu Met
1               5                   10                  15
Gln Lys Gly Gly Val Ile Met Asp Val Ile Asn Ala Glu Gln Ala Lys
20                  25                  30
Ile Ala Glu Glu Ala Gly Ala Val Ala Val Met Ala Leu Glu Arg Val
35                  40                  45
Pro Ala Asp Ile Arg Ala Ala Gly Gly Val Ala Arg Met Ala Asp Pro
50                  55                  60
Thr Ile Val Glu Glu Val Met Asn Ala Val Ser Ile Pro Val Met Ala
65                  70                  75                  80
Lys Ala Arg Ile Gly His Ile Val Glu Ala Arg Val Leu Glu Ala Met
85                  90                  95
Gly Val Asp Tyr Ile Asp Glu Ser Glu Val Leu Thr Pro Ala Asp Glu
100                 105                 110
Glu Phe His Leu Asn Lys Asn Glu Tyr Thr Val Pro Phe Val Cys Gly
115                 120                 125
Cys Arg Asp Leu Gly Glu Ala Thr Arg Arg Ile Ala Glu Gly Ala Ser
130                 135                 140
Met Leu Arg Thr Lys Gly Glu Pro Gly Thr Gly Asn Ile Val Glu Ala
145                 150                 155                 160
Val Arg His Met Arg Lys Val Asn Ala Gln Val Arg Lys Val Val Ala
165                 170                 175
Met Ser Glu Asp Glu Leu Met Thr Glu Ala Lys Asn Leu Gly Ala Pro
180                 185                 190
Tyr Glu Leu Leu Leu Gln Ile Lys Lys Asp Gly Lys Leu Pro Val Val
195                 200                 205
Asn Phe Ala Ala Gly Gly Val Ala Thr Pro Ala Asp Ala Ala Leu Met
210                 215                 220
Met Gln Leu Gly Ala Asp Gly Val Phe Val Gly Ser Gly Ile Phe Lys
225                 230                 235                 240
Ser Asp Asn Pro Ala Lys Phe Ala Lys Ala Ile Val Glu Ala Thr Thr
245                 250                 255
His Phe Thr Asp Tyr Lys Leu Ile Ala Glu Leu Ser Lys Glu Leu Gly
260                 265                 270
Thr Ala Met Lys Gly Ile Glu Ile Ser Asn Leu Leu Pro Glu Gln Arg
275                 280                 285
Met Gln Glu Arg Gly Trp Arg Ser Ile Glu Gly Arg Met Arg Phe Ile
290                 295                 300
Val Ser Leu Leu Ala Phe Thr Ala Ala Ala Thr Ala Thr Ala Leu Pro
305                 310                 315                 320
Ala Ser Ala Ala Lys Asn Ala Lys Leu Ala Thr Ser Ala Ala Phe Ala
325                 330                 335
Lys Gln Ala Glu Gly Thr Thr Cys Asn Val Gly Ser Ile Ala Cys Cys
340                 345                 350
Asn Ser Pro Ala Glu Thr Asn Asn Asp Ser Leu Leu Ser Gly Leu Leu
355                 360                 365
Gly Ala Gly Leu Leu Asn Gly Leu Ser Gly Asn Thr Gly Ser Ala Cys
370                 375                 380
Ala Lys Ala Ser Leu Ile Asp Gln Leu Gly Leu Leu Ala Leu Val Asp
385                 390                 395                 400
His Thr Glu Glu Gly Pro Val Cys Lys Asn Ile Val Ala Cys Cys Pro
405                 410                 415
Glu Gly Thr Thr Asn Cys Val Ala Val Asp Asn Ala Gly Ala Gly Thr
420                 425                 430
Lys Ala Glu Gly Ser His His His His His His
435                 440
<210>  21
<211>  1395
<212>  ДНК
<213>  basf-yaad-Xa-rodA-his
<220>
<221>  CDS
<222>  (1)..(1395)
<223>
<400>  21
atg gct caa aca ggt act gaa cgt gta aaa cgc gga atg gca gaa atg       48
Met Ala Gln Thr Gly Thr Glu Arg Val Lys Arg Gly Met Ala Glu Met
1               5                   10                  15
caa aaa ggc ggc gtc atc atg gac gtc atc aat gcg gaa caa gcg aaa       96
Gln Lys Gly Gly Val Ile Met Asp Val Ile Asn Ala Glu Gln Ala Lys
20                  25                  30
atc gct gaa gaa gct gga gct gtc gct gta atg gcg cta gaa cgt gtg      144
Ile Ala Glu Glu Ala Gly Ala Val Ala Val Met Ala Leu Glu Arg Val
35                  40                  45
cca gca gat att cgc gcg gct gga gga gtt gcc cgt atg gct gac cct      192
Pro Ala Asp Ile Arg Ala Ala Gly Gly Val Ala Arg Met Ala Asp Pro
50                  55                  60
aca atc gtg gaa gaa gta atg aat gca gta tct atc ccg gta atg gca      240
Thr Ile Val Glu Glu Val Met Asn Ala Val Ser Ile Pro Val Met Ala
65                  70                  75                  80
aaa gcg cgt atc gga cat att gtt gaa gcg cgt gtg ctt gaa gct atg      288
Lys Ala Arg Ile Gly His Ile Val Glu Ala Arg Val Leu Glu Ala Met
85                  90                  95
ggt gtt gac tat att gat gaa agt gaa gtt ctg acg ccg gct gac gaa      336
Gly Val Asp Tyr Ile Asp Glu Ser Glu Val Leu Thr Pro Ala Asp Glu
100                 105                 110
gaa ttt cat tta aat aaa aat gaa tac aca gtt cct ttt gtc tgt ggc      384
Glu Phe His Leu Asn Lys Asn Glu Tyr Thr Val Pro Phe Val Cys Gly
115                 120                 125
tgc cgt gat ctt ggt gaa gca aca cgc cgt att gcg gaa ggt gct tct      432
Cys Arg Asp Leu Gly Glu Ala Thr Arg Arg Ile Ala Glu Gly Ala Ser
130                 135                 140
atg ctt cgc aca aaa ggt gag cct gga aca ggt aat att gtt gag gct      480
Met Leu Arg Thr Lys Gly Glu Pro Gly Thr Gly Asn Ile Val Glu Ala
145                 150                 155                 160
gtt cgc cat atg cgt aaa gtt aac gct caa gtg cgc aaa gta gtt gcg      528
Val Arg His Met Arg Lys Val Asn Ala Gln Val Arg Lys Val Val Ala
165                 170                 175
atg agt gag gat gag cta atg aca gaa gcg aaa aac cta ggt gct cct      576
Met Ser Glu Asp Glu Leu Met Thr Glu Ala Lys Asn Leu Gly Ala Pro
180                 185                 190
tac gag ctt ctt ctt caa att aaa aaa gac ggc aag ctt cct gtc gtt      624
Tyr Glu Leu Leu Leu Gln Ile Lys Lys Asp Gly Lys Leu Pro Val Val
195                 200                 205
aac ttt gcc gct ggc ggc gta gca act cca gct gat gct gct ctc atg      672
Asn Phe Ala Ala Gly Gly Val Ala Thr Pro Ala Asp Ala Ala Leu Met
210                 215                 220
atg cag ctt ggt gct gac gga gta ttt gtt ggt tct ggt att ttt aaa      720
Met Gln Leu Gly Ala Asp Gly Val Phe Val Gly Ser Gly Ile Phe Lys
225                 230                 235                 240
tca gac aac cct gct aaa ttt gcg aaa gca att gtg gaa gca aca act      768
Ser Asp Asn Pro Ala Lys Phe Ala Lys Ala Ile Val Glu Ala Thr Thr
245                 250                 255
cac ttt act gat tac aaa tta atc gct gag ttg tca aaa gag ctt ggt      816
His Phe Thr Asp Tyr Lys Leu Ile Ala Glu Leu Ser Lys Glu Leu Gly
260                 265                 270
act gca atg aaa ggg att gaa atc tca aac tta ctt cca gaa cag cgt      864
Thr Ala Met Lys Gly Ile Glu Ile Ser Asn Leu Leu Pro Glu Gln Arg
275                 280                 285
atg caa gaa cgc ggc tgg aga tct att gaa ggc cgc atg aag ttc tcc      912
Met Gln Glu Arg Gly Trp Arg Ser Ile Glu Gly Arg Met Lys Phe Ser
290                 295                 300
att gct gcc gct gtc gtt gct ttc gcc gcc tcc gtc gcg gcc ctc cct      960
Ile Ala Ala Ala Val Val Ala Phe Ala Ala Ser Val Ala Ala Leu Pro
305                 310                 315                 320
cct gcc cat gat tcc cag ttc gct ggc aat ggt gtt ggc aac aag ggc     1008
Pro Ala His Asp Ser Gln Phe Ala Gly Asn Gly Val Gly Asn Lys Gly
325                 330                 335
aac agc aac gtc aag ttc cct gtc ccc gaa aac gtg acc gtc aag cag     1056
Asn Ser Asn Val Lys Phe Pro Val Pro Glu Asn Val Thr Val Lys Gln
340                 345                 350
gcc tcc gac aag tgc ggt gac cag gcc cag ctc tct tgc tgc aac aag     1104
Ala Ser Asp Lys Cys Gly Asp Gln Ala Gln Leu Ser Cys Cys Asn Lys
355                 360                 365
gcc acg tac gcc ggt gac acc aca acc gtt gat gag ggt ctt ctg tct     1152
Ala Thr Tyr Ala Gly Asp Thr Thr Thr Val Asp Glu Gly Leu Leu Ser
370                 375                 380
ggt gcc ctc agc ggc ctc atc ggc gcc ggg tct ggt gcc gaa ggt ctt     1200
Gly Ala Leu Ser Gly Leu Ile Gly Ala Gly Ser Gly Ala Glu Gly Leu
385                 390                 395                 400
ggt ctc ttc gat cag tgc tcc aag ctt gat gtt gct gtc ctc att ggc     1248
Gly Leu Phe Asp Gln Cys Ser Lys Leu Asp Val Ala Val Leu Ile Gly
405                 410                 415
atc caa gat ctt gtc aac cag aag tgc aag caa aac att gcc tgc tgc     1296
Ile Gln Asp Leu Val Asn Gln Lys Cys Lys Gln Asn Ile Ala Cys Cys
420                 425                 430
cag aac tcc ccc tcc agc gcg gat ggc aac ctt att ggt gtc ggt ctc     1344
Gln Asn Ser Pro Ser Ser Ala Asp Gly Asn Leu Ile Gly Val Gly Leu
435                 440                 445
cct tgc gtt gcc ctt ggc tcc atc ctc gga tct cat cac cat cac cat     1392
Pro Cys Val Ala Leu Gly Ser Ile Leu Gly Ser His His His His His
450                 455                 460
cac                                                                 1395
His
465
<210>  22
<211>  465
<212>  PRT
<213>  basf-yaad-Xa-rodA-his
<400>  22
Met Ala Gln Thr Gly Thr Glu Arg Val Lys Arg Gly Met Ala Glu Met
1               5                   10                  15
Gln Lys Gly Gly Val Ile Met Asp Val Ile Asn Ala Glu Gln Ala Lys
20                  25                  30
Ile Ala Glu Glu Ala Gly Ala Val Ala Val Met Ala Leu Glu Arg Val
35                  40                  45
Pro Ala Asp Ile Arg Ala Ala Gly Gly Val Ala Arg Met Ala Asp Pro
50                  55                  60
Thr Ile Val Glu Glu Val Met Asn Ala Val Ser Ile Pro Val Met Ala
65                  70                  75                  80
Lys Ala Arg Ile Gly His Ile Val Glu Ala Arg Val Leu Glu Ala Met
85                  90                  95
Gly Val Asp Tyr Ile Asp Glu Ser Glu Val Leu Thr Pro Ala Asp Glu
100                 105                 110
Glu Phe His Leu Asn Lys Asn Glu Tyr Thr Val Pro Phe Val Cys Gly
115                 120                 125
Cys Arg Asp Leu Gly Glu Ala Thr Arg Arg Ile Ala Glu Gly Ala Ser
130                 135                 140
Met Leu Arg Thr Lys Gly Glu Pro Gly Thr Gly Asn Ile Val Glu Ala
145                 150                 155                 160
Val Arg His Met Arg Lys Val Asn Ala Gln Val Arg Lys Val Val Ala
165                 170                 175
Met Ser Glu Asp Glu Leu Met Thr Glu Ala Lys Asn Leu Gly Ala Pro
180                 185                 190
Tyr Glu Leu Leu Leu Gln Ile Lys Lys Asp Gly Lys Leu Pro Val Val
195                 200                 205
Asn Phe Ala Ala Gly Gly Val Ala Thr Pro Ala Asp Ala Ala Leu Met
210                 215                 220
Met Gln Leu Gly Ala Asp Gly Val Phe Val Gly Ser Gly Ile Phe Lys
225                 230                 235                 240
Ser Asp Asn Pro Ala Lys Phe Ala Lys Ala Ile Val Glu Ala Thr Thr
245                 250                 255
His Phe Thr Asp Tyr Lys Leu Ile Ala Glu Leu Ser Lys Glu Leu Gly
260                 265                 270
Thr Ala Met Lys Gly Ile Glu Ile Ser Asn Leu Leu Pro Glu Gln Arg
275                 280                 285
Met Gln Glu Arg Gly Trp Arg Ser Ile Glu Gly Arg Met Lys Phe Ser
290                 295                 300
Ile Ala Ala Ala Val Val Ala Phe Ala Ala Ser Val Ala Ala Leu Pro
305                 310                 315                 320
Pro Ala His Asp Ser Gln Phe Ala Gly Asn Gly Val Gly Asn Lys Gly
325                 330                 335
Asn Ser Asn Val Lys Phe Pro Val Pro Glu Asn Val Thr Val Lys Gln
340                 345                 350
Ala Ser Asp Lys Cys Gly Asp Gln Ala Gln Leu Ser Cys Cys Asn Lys
355                 360                 365
Ala Thr Tyr Ala Gly Asp Thr Thr Thr Val Asp Glu Gly Leu Leu Ser
370                 375                 380
Gly Ala Leu Ser Gly Leu Ile Gly Ala Gly Ser Gly Ala Glu Gly Leu
385                 390                 395                 400
Gly Leu Phe Asp Gln Cys Ser Lys Leu Asp Val Ala Val Leu Ile Gly
405                 410                 415
Ile Gln Asp Leu Val Asn Gln Lys Cys Lys Gln Asn Ile Ala Cys Cys
420                 425                 430
Gln Asn Ser Pro Ser Ser Ala Asp Gly Asn Leu Ile Gly Val Gly Leu
435                 440                 445
Pro Cys Val Ala Leu Gly Ser Ile Leu Gly Ser His His His His His
450                 455                 460
His
465
<210>  23
<211>  1407
<212>  ДНК
<213>  basf-yaad-Xa-BASF1-his
<220>
<221>  CDS
<222>  (1)..(1407)
<223>
<400>  23
atg gct caa aca ggt act gaa cgt gta aaa cgc gga atg gca gaa atg       48
Met Ala Gln Thr Gly Thr Glu Arg Val Lys Arg Gly Met Ala Glu Met
1               5                   10                  15
caa aaa ggc ggc gtc atc atg gac gtc atc aat gcg gaa caa gcg aaa       96
Gln Lys Gly Gly Val Ile Met Asp Val Ile Asn Ala Glu Gln Ala Lys
20                  25                  30
atc gct gaa gaa gct gga gct gtc gct gta atg gcg cta gaa cgt gtg      144
Ile Ala Glu Glu Ala Gly Ala Val Ala Val Met Ala Leu Glu Arg Val
35                  40                  45
cca gca gat att cgc gcg gct gga gga gtt gcc cgt atg gct gac cct      192
Pro Ala Asp Ile Arg Ala Ala Gly Gly Val Ala Arg Met Ala Asp Pro
50                  55                  60
aca atc gtg gaa gaa gta atg aat gca gta tct atc ccg gta atg gca      240
Thr Ile Val Glu Glu Val Met Asn Ala Val Ser Ile Pro Val Met Ala
65                  70                  75                  80
aaa gcg cgt atc gga cat att gtt gaa gcg cgt gtg ctt gaa gct atg      288
Lys Ala Arg Ile Gly His Ile Val Glu Ala Arg Val Leu Glu Ala Met
85                  90                  95
ggt gtt gac tat att gat gaa agt gaa gtt ctg acg ccg gct gac gaa      336
Gly Val Asp Tyr Ile Asp Glu Ser Glu Val Leu Thr Pro Ala Asp Glu
100                 105                 110
gaa ttt cat tta aat aaa aat gaa tac aca gtt cct ttt gtc tgt ggc      384
Glu Phe His Leu Asn Lys Asn Glu Tyr Thr Val Pro Phe Val Cys Gly
115                 120                 125
tgc cgt gat ctt ggt gaa gca aca cgc cgt att gcg gaa ggt gct tct      432
Cys Arg Asp Leu Gly Glu Ala Thr Arg Arg Ile Ala Glu Gly Ala Ser
130                 135                 140
atg ctt cgc aca aaa ggt gag cct gga aca ggt aat att gtt gag gct      480
Met Leu Arg Thr Lys Gly Glu Pro Gly Thr Gly Asn Ile Val Glu Ala
145                 150                 155                 160
gtt cgc cat atg cgt aaa gtt aac gct caa gtg cgc aaa gta gtt gcg      528
Val Arg His Met Arg Lys Val Asn Ala Gln Val Arg Lys Val Val Ala
165                 170                 175
atg agt gag gat gag cta atg aca gaa gcg aaa aac cta ggt gct cct      576
Met Ser Glu Asp Glu Leu Met Thr Glu Ala Lys Asn Leu Gly Ala Pro
180                 185                 190
tac gag ctt ctt ctt caa att aaa aaa gac ggc aag ctt cct gtc gtt      624
Tyr Glu Leu Leu Leu Gln Ile Lys Lys Asp Gly Lys Leu Pro Val Val
195                 200                 205
aac ttt gcc gct ggc ggc gta gca act cca gct gat gct gct ctc atg      672
Asn Phe Ala Ala Gly Gly Val Ala Thr Pro Ala Asp Ala Ala Leu Met
210                 215                 220
atg cag ctt ggt gct gac gga gta ttt gtt ggt tct ggt att ttt aaa      720
Met Gln Leu Gly Ala Asp Gly Val Phe Val Gly Ser Gly Ile Phe Lys
225                 230                 235                 240
tca gac aac cct gct aaa ttt gcg aaa gca att gtg gaa gca aca act      768
Ser Asp Asn Pro Ala Lys Phe Ala Lys Ala Ile Val Glu Ala Thr Thr
245                 250                 255
cac ttt act gat tac aaa tta atc gct gag ttg tca aaa gag ctt ggt      816
His Phe Thr Asp Tyr Lys Leu Ile Ala Glu Leu Ser Lys Glu Leu Gly
260                 265                 270
act gca atg aaa ggg att gaa atc tca aac tta ctt cca gaa cag cgt      864
Thr Ala Met Lys Gly Ile Glu Ile Ser Asn Leu Leu Pro Glu Gln Arg
275                 280                 285
atg caa gaa cgc ggc tgg aga tct att gaa ggc cgc atg aag ttc tcc      912
Met Gln Glu Arg Gly Trp Arg Ser Ile Glu Gly Arg Met Lys Phe Ser
290                 295                 300
gtc tcc gcc gcc gtc ctc gcc ttc gcc gcc tcc gtc gcc gcc ctc cct      960
Val Ser Ala Ala Val Leu Ala Phe Ala Ala Ser Val Ala Ala Leu Pro
305                 310                 315                 320
cag cac gac tcc gcc gcc ggc aac ggc aac ggc gtc ggc aac aag ttc     1008
Gln His Asp Ser Ala Ala Gly Asn Gly Asn Gly Val Gly Asn Lys Phe
325                 330                 335
cct gtc cct gac gac gtc acc gtc aag cag gcc acc gac aag tgc ggc     1056
Pro Val Pro Asp Asp Val Thr Val Lys Gln Ala Thr Asp Lys Cys Gly
340                 345                 350
gac cag gcc cag ctc tcc tgc tgc aac aag gcc acc tac gcc ggc gac     1104
Asp Gln Ala Gln Leu Ser Cys Cys Asn Lys Ala Thr Tyr Ala Gly Asp
355                 360                 365
gtc ctc acc gac atc gac gag ggc atc ctc gcc ggc ctc ctc aag aac     1152
Val Leu Thr Asp Ile Asp Glu Gly Ile Leu Ala Gly Leu Leu Lys Asn
370                 375                 380
ctc atc ggc ggc ggc tcc ggc tcc gag ggc ctc ggc ctc ttc gac cag     1200
Leu Ile Gly Gly Gly Ser Gly Ser Glu Gly Leu Gly Leu Phe Asp Gln
385                 390                 395                 400
tgc gtc aag ctc gac ctc cag atc tcc gtc atc ggc atc cct atc cag     1248
Cys Val Lys Leu Asp Leu Gln Ile Ser Val Ile Gly Ile Pro Ile Gln
405                 410                 415
gac ctc ctc aac cag gtc aac aag cag tgc aag cag aac atc gcc tgc     1296
Asp Leu Leu Asn Gln Val Asn Lys Gln Cys Lys Gln Asn Ile Ala Cys
420                 425                 430
tgc cag aac tcc cct tcc gac gcc acc ggc tcc ctc gtc aac ctc ggc     1344
Cys Gln Asn Ser Pro Ser Asp Ala Thr Gly Ser Leu Val Asn Leu Gly
435                 440                 445
ctc ggc aac cct tgc atc cct gtc tcc ctc ctc cat atg gga tct cat     1392
Leu Gly Asn Pro Cys Ile Pro Val Ser Leu Leu His Met Gly Ser His
450                 455                 460
cac cat cac cat cac                                                 1407
His His His His His
465
<210>  24
<211>  469
<212>  PRT
<213>  basf-yaad-Xa-BASF1-his
<400>  24
Met Ala Gln Thr Gly Thr Glu Arg Val Lys Arg Gly Met Ala Glu Met
1               5                   10                  15
Gln Lys Gly Gly Val Ile Met Asp Val Ile Asn Ala Glu Gln Ala Lys
20                  25                  30
Ile Ala Glu Glu Ala Gly Ala Val Ala Val Met Ala Leu Glu Arg Val
35                  40                  45
Pro Ala Asp Ile Arg Ala Ala Gly Gly Val Ala Arg Met Ala Asp Pro
50                  55                  60
Thr Ile Val Glu Glu Val Met Asn Ala Val Ser Ile Pro Val Met Ala
65                  70                  75                  80
Lys Ala Arg Ile Gly His Ile Val Glu Ala Arg Val Leu Glu Ala Met
85                  90                  95
Gly Val Asp Tyr Ile Asp Glu Ser Glu Val Leu Thr Pro Ala Asp Glu
100                 105                 110
Glu Phe His Leu Asn Lys Asn Glu Tyr Thr Val Pro Phe Val Cys Gly
115                 120                 125
Cys Arg Asp Leu Gly Glu Ala Thr Arg Arg Ile Ala Glu Gly Ala Ser
130                 135                 140
Met Leu Arg Thr Lys Gly Glu Pro Gly Thr Gly Asn Ile Val Glu Ala
145                 150                 155                 160
Val Arg His Met Arg Lys Val Asn Ala Gln Val Arg Lys Val Val Ala
165                 170                 175
Met Ser Glu Asp Glu Leu Met Thr Glu Ala Lys Asn Leu Gly Ala Pro
180                 185                 190
Tyr Glu Leu Leu Leu Gln Ile Lys Lys Asp Gly Lys Leu Pro Val Val
195                 200                 205
Asn Phe Ala Ala Gly Gly Val Ala Thr Pro Ala Asp Ala Ala Leu Met
210                 215                 220
Met Gln Leu Gly Ala Asp Gly Val Phe Val Gly Ser Gly Ile Phe Lys
225                 230                 235                 240
Ser Asp Asn Pro Ala Lys Phe Ala Lys Ala Ile Val Glu Ala Thr Thr
245                 250                 255
His Phe Thr Asp Tyr Lys Leu Ile Ala Glu Leu Ser Lys Glu Leu Gly
260                 265                 270
Thr Ala Met Lys Gly Ile Glu Ile Ser Asn Leu Leu Pro Glu Gln Arg
275                 280                 285
Met Gln Glu Arg Gly Trp Arg Ser Ile Glu Gly Arg Met Lys Phe Ser
290                 295                 300
Val Ser Ala Ala Val Leu Ala Phe Ala Ala Ser Val Ala Ala Leu Pro
305                 310                 315                 320
Gln His Asp Ser Ala Ala Gly Asn Gly Asn Gly Val Gly Asn Lys Phe
325                 330                 335
Pro Val Pro Asp Asp Val Thr Val Lys Gln Ala Thr Asp Lys Cys Gly
340                 345                 350
Asp Gln Ala Gln Leu Ser Cys Cys Asn Lys Ala Thr Tyr Ala Gly Asp
355                 360                 365
Val Leu Thr Asp Ile Asp Glu Gly Ile Leu Ala Gly Leu Leu Lys Asn
370                 375                 380
Leu Ile Gly Gly Gly Ser Gly Ser Glu Gly Leu Gly Leu Phe Asp Gln
385                 390                 395                 400
Cys Val Lys Leu Asp Leu Gln Ile Ser Val Ile Gly Ile Pro Ile Gln
405                 410                 415
Asp Leu Leu Asn Gln Val Asn Lys Gln Cys Lys Gln Asn Ile Ala Cys
420                 425                 430
Cys Gln Asn Ser Pro Ser Asp Ala Thr Gly Ser Leu Val Asn Leu Gly
435                 440                 445
Leu Gly Asn Pro Cys Ile Pro Val Ser Leu Leu His Met Gly Ser His
450                 455                 460
His His His His His
465
<---