ВЫДЕЛЕНИЕ ГЛИКОЛИПИДНЫХ БИОСУРФАКТАНТОВ, ПРОДУЦИРУЕМЫХ БАКТЕРИЯМИ RHODOCOCCUS SP.3-2, МЕТОДОМ ЭКСТРАКЦИИ

УДК 579.222:579.6 DOI: 10.24412/2071-6176-2021-2-33-41

ВЫДЕЛЕНИЕ ГЛИКОЛИПИДНЫХ БИОСУРФАКТАНТОВ, ПРОДУЦИРУЕМЫХ БАКТЕРИЯМИ RHODOCOCCUS SP.3-2,

МЕТОДОМ ЭКСТРАКЦИИ

Т.И. Леонова, Е.В. Акатова, И.Ф. Пунтус

Исследована способность бактерий Rhodococcus sp.3-2 продуцировать глико-липидные биосурфактанты при росте на н-гексадекане в жидкой минеральной среде при 26 оС. Установлено, что эти микроорганизмы являются эффективными продуцентами биосурфактантов: через 7 сут культивирования выход гликолипидных био-сурфактантов достигает 0,86 г/л. Качественный анализ липидных компонентов, продуцируемых штаммом микроорганизмов, методом тонкослойной хроматографии позволил установить, что гликолипидные биосурфактанты относятся к клеточно-ассоциированным.

Ключевые слова: биодеградация, экстракция, гексадекан, гликолипидные био-ПАВ, Rhodococcus, трегалолипиды.

Введение

Биосурфактанты (биоПАВ) - это амфипатические поверхностно-активные соединения, основной функцией которых является снижение поверхностного натяжения на границе раздела двух фаз. Структура биоПАВ представлена двумя функциональными составляющими: гидрофобной неполярной и гидрофильной полярной, что даёт им возможность вступать во взаимодействие с соединениями различной полярности [1]. Биосурфактанты в сравнении с химически синтезированными сурфактантами имеют ряд преимуществ, такие как отсутствие токсичности, биоразлагаемость, высокая биологическая активность и др. [2]. В связи с этим биосурфактанты находят всё более широкое применение в разнообразных областях: биотехнология защиты окружающей среды, нефтедобывающая и нефтеперерабатывающая, химическая, пищевая, фармацевтическая промышленность, а также косметология и медицина.

По молекулярной массе среди биосурфактантов выделяют две основные группы. В первую группу входят низкомолекулярные соединения. К ним относят гликолипиды (глюколипиды, рамнолипиды, трегалозолипиды, софоролипиды) и липопептиды (сурфактины, стрептофактины, полимиксины). Их главная роль заключается в эффективном снижении поверхностного и межфазного натяжения [3]. Ко второй группе относят высокомолекулярные соединения, которые называют эмульсанами или биоэмульгаторами, обладающими высокой эмульгирующей активностью [4].

Наибольший интерес для изучения представляет класс гликолипидных биосурфактантов. Известно, что для микроорганизмов рода Rhodococcus характерно образование поверхностно-активных веществ гликолипидной природы в ответ на присутствие в питательной среде алканов [5, 6]. Такие вещества представляют собой один или два не восстанавливающих дисахарида трегалозы (С12Н22О11 (a-D-глюкопиранозил-1,1-а-0-глюкопираноза) ), связанных с миколовыми кислотами - длинноцепочечными а-разветвлёнными-Р-гидрокси-лированными жирными кислотами с различной длиной углеродной цепи [7]. Бактерии рода Rhodococcus продуцируют два основных типа трегалолипидных биоПАВ: клеточно-ассоциированные (эндо-тип) [8] и внеклеточные (экзо-тип) [9]. Имеются данные, что родококки продуцируют преимущественно клеточносвязанные биосурфактанты [10]. Следует отметить, что тип и строение биоПАВ зависят от вида и штамма бактерий, субстрата и условий культивирования [15].

Поскольку ещё не имеется единого методологического подхода по выделению и обнаружению поверхностно-активных веществ, продуцируемых микроорганизмами, необходимо изучение и осуществление подбора эффективных методик для конкретного штамма родококков. Rhodococcus sp.3-2 был выделен из загрязненной почвы, взятой на территории нефтяного месторождения Ямало-Ненецкого автономного округа (ЯНАО). Штамм способен расти в среде с гексадеканом, дизельным топливом и нефтью в качестве единственных источников углерода. При росте в среде с гексадеканом эффективно снижает поверхностное натяжение за счет продукции биосурфактантов.

Целью данной работы является разработка эффективной методики выделения гликолипидных биосурфактантов, продуцируемых бактериями Rhodococcus sp.3-2.

Экспериментальная часть

Объект исследования. Штамм бактерий Rhodococcus sp. 3-2 взят из коллекции лаборатории биологии плазмид ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН г. Пущино.

Условия культивирования. Микроорганизмы культивировали на жидкой минеральной среде Эванса следующего состава (на 1 л): K2HPO4 -8,71 г; 5М NH4CI -1 мл; 0,1 М Na2SO4 - 1 мл; 62 мМ MgCb - 1 мл; 1 мМ CaCl2 - 1 мл; 0,005 мМ (NH4)6Mo7O24 - 1 мл; микроэлементы (состав в 1% растворе HCl, г/л: ZnO - 0,41; FeCb -2,9; MnCb - 1,28; CuCb - 0,13; C0CI2 - 0,26; H3BO3 - 0,06). Готовую среду Эванса титровали 1М HCl до рН=7,0; стерилизовали в течение 30 мин при 121 °С. Бактерии выращивали на жидкой минеральной среде Эванса в течение 48 ч для получения инокулята. Культивирование микроорганизмов проводили в колбах Эрленмейера объемом 750 мл на орбитальной качалке (при 26 °С, n = 180

об/мин) в течение 7 сут в присутствии н-гексадекана (2% от об.) как единственного источника углерода и энергии.

Рост микроорганизмов и продуцирование биосурфактантов. Для отслеживания динамики продукции микроорганизмов и проведения количественного анализа снимали кривые роста. н-Гексадекан (2 % от об.) добавляли к среде Эванса перед автоклавированием. В конические колбы, содержащие 100 мл питательной среды, вносили 2 мл тщательно перемешанного инокулята. Колбы помещали в термостатируемую орбитальную качалку «Excella 25» (Eppendorf, Германия). Культивирование проводили при температуре 26 оС и аэрации с частотой вращения 180 об/мин. Через определённый промежуток времени из колб отбирали по 2 мл суспензии и измеряли оптическую плотность при длине волны 590 нм на спектрофотометре «Эксперт-003» (Эконикс-Эксперт, Россия). Время каждого измерения фиксировали. Для дальнейшего анализа были взяты три точки, соответствующие трём периодам стационарной фазы.

Определение биосурфактантов фенольно-серным методом. Для

определения содержания трегалолипидов из культуральной жидкости предварительно удаляли клетки центрифугированием в течение 10 мин при 10 000 об/мин. Содержание биосурфактанта оценивали по концентрации сахаров в пробеспектрофотометрически фенольно-серным методом [13], предварительно построив градуировочную зависимость по соответствующему дисахариду трегалозе.

Выделение гликолипидных биосурфактантов. Гликолипидные биоПАВ выделяли из бесклеточного супернатанта и культульной жидкости экстракцией следующими растворителями: этилацетат, система хлороформ:метанол (3:1), хлороформ. Бесклеточный супернатант получали центрифугированием культуральной среды при 10 000 g в течение 10 мин. Пробы, экстрагируемые системой хлороформ:метанол, подкисляли до рН 2 и оставляли на 12 ч при 4 °С. Пробы, экстрагируемые хлороформом и этилацетатом, подкисляли до рН 3,5. Все пробы насыщали NaCl. Соотношение пробы и растворителя 3:1. Отбирали органический слой, растворитель удаляли на ротационном испарителе ИР - 1 ЛТ, Labtex при 36 °С и давлении 0,2 атм. Незадолго перед окончанием упаривания добавляли бензол для получения азеотропа и лучшего удаления следов воды, и упаривали досуха.

Тонкослойная хроматография (ТСХ). Разделение компонентов проводили на пластинах TLC Silica gel 60 F254 («Merck», Germany). В качестве подвижной фазы использовали систему хлороформ:метанол:вода (65 : 15 : 2 об/об/об). Для обнаружения гликолипидов пластины обрабатывали нафтольным реагентом (0,25 г а-нафтола в 50 мл смеси метанол:вода (1:1, об/об), затем 10 %-ной серной кислотой, и нагревали

при 110 °С до максимального проявления окраски. Гликолипиды проявлялись в виде сине-фиолетовых пятен.

Обсуждение результатов

Штамм Rhodococcus sp. 3-2 культивировали при 26 оС на минеральной среде Эванса, содержащей н-гексадекан в количестве 2 % от объёма. Рост микроорганизмов наблюдался преимущественно на поверхности питательной среды в виде биоплёнки, что может свидетельствовать о продуцировании биоПАВ эндо-типа [15]. Для выявления динамики роста бактерий измеряли оптическую плотность культуры через определённые промежутки времени (рис. 1). Это было необходимо для количественного определения выхода биосурфактантов на различных этапах роста.

0 50 100 150

Время культивирования, ч

Рис. 1. Кривая роста бактерий Rhodococcus sp. 3-2 на н-гексадекане

в периодической культуре

Следует отметить, что длительность роста и время выхода культуры на стационарную фазу у штамма Rhodococcus sp. 3-2 выше, чем у других родоккоков-нефтедеструкторов R. erythropolis 867 и R. erytropolis X5 из коллекции лаборатории биологии плазмид РАН [12].

Количественный анализ биосурфактантов по фенольно-серному методу. Количество продуцируемых трегалолипидов определяли в начале стационарной фазы и по мере её развития спектрофотометрически фенольно-серным методом. Определение биосурфактантов проводили по измерению содержания трегалозы в образце бесклеточного супернатанта и делали дальнейший пересчёт на трегалолипиды.

Количество продуцируемых Rhodococcus 8р. 3-2 биосурфактантов увеличивается во времени (4-е, 6-е и 8-е сутки) и составляет от 0,24 до 0,87 г/л в конце культивирования, т.е. для целенаправленного получения биоПАВ необходимо культивировать культуру более семи суток. Штамм Rhodococcus 8р. 3-2 является лучшим продуцентом трегалолипидов (0,87 г/л) по сравнению с R. erythropolis Х5 и R. erythropolis 8867 (при 26 °С около

0,3 г/л для обоих штаммов), а также со штаммом Я. sp. PLM026 (при 19 °С около 0,3 г/л) (рис. 2).

аа

<

С о я

1С

и

и =1 о

и

1

0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 ОД 0

0,864

-

-

-

-

0,376

з:

-

-

74

Время культивирования, ч

Рис. 2. Динамика продукции биоПАВ в период стационарной фазы

штамма Rhodococcus sp. 3-2

Качественный анализ методом тонкослойной хроматографии.

Выделение гликолипидных биосурфактантов из двух фракций проводили экстракцией различными растворителями. Выделенные компоненты разделяли методом тонкослойной хроматографии. Для обнаружения на хроматограмме гликолипидов применяли нафтольный реагент -специфический проявитель для сахаров, который позволяет идентифицировать гликолипиды среди других липидных компонентов.

На хроматограммах проб культуральной жидкости, экстрагированных этилацетатом и системой хлороформ:метанол, наблюдали по одному интенсивно окрашенному размытому пятну и два менее интенсивных и меньших по размеру пятна в каждом из образцов (рис. 3а, 3в). На хроматограммах культуральной жидкости, экстрагированной хлороформом, наблюдали проявление одного слабо окрашенного сине-фиолетового пятна. Также было обнаружено пятно на линии старта, что связано с присутствием воды в образце, которую не удалось полностью удалить из пробы с помощью сульфата натрия, вследствие чего чёткого разделения компонентов не было достигнуто (рис. 3д).

При проявлении хроматограмм проб бесклеточного супернатанта, экстрагированных хлороформом и системой хлороформ:метанол наблюдали проявление одного слабоокрашенного пятна в средней части хроматограммы, в пробе с этилацетатом проявление пятен не было обнаружено (рис. 3б, 3г, 3е).

Полученные данные подтверждают наличие углеводной части молекулы, соединения, проявленные в виде сине-фиолетовых пятен, относятся к гликолипидным биоПАВ. Пятна, обнаруживаемые у линии финиша, не относятся к гликолипидам, однако могут проявляться при

использовании реагента а-нафтола. Для полученных хроматограмм по наиболее проявленным пятнам были определены величины удерживания Rf , которые представлены в таблице.

Фронт

ЯД % —» Кп —> О

Старт

а б в г д е

Рис. 3. Хроматограммы неочищенных липидных экстрактов бактерий Rhodococcus sp. 3-2: а - культуральная жидкость; б - бесклеточный супернатант

Значения величин удерживания Rf гликолипидов по результатам ТСХ

Штамм м/о Экстрагент Экстракт Rfl Rf2 Rfз

Rh. sp. 3-2 Этилацетат Культуральная жидкость 0,38 0,58 0,63

Rh. sp. 3-2 Смесь хлороформ-метанол (3:1) Культуральная жидкость 0,35 0,53 0,56

Вещества с величиной удерживания 0,35 и 0,38 являются наиболее окрашенными и обнаружены только в пробах культуральной жикости, а соединения с Rf 0,56-0,63 обнаруживаются как в культуральных, так и в бесклеточных экстрактах, таким образом, у бактерий Rhodococcus sp. 3-2 преобладают гликолипидные компоненты эндо-типа (связанные с

клеточной стенкой). Компоненты могут иметь структурные различия, однако все содержат углеводы.

Сравнение полученных данных с данными других авторов [11, 14], позволяет заключить, что штаммы бактерий Rhodococcus дают разные хроматограммы с различным количеством пятен и величинами удерживания, однако одно вещество (с Rf 0,35-0,39), которое проявляется, как наиболее окрашенное крупное пятно, присутствует в культуральной среде всех исследуемых в нашей научной группе родоккоков.

Заключение

Бактерии рода Rhodococcus являются эффективными продуцентами биосурфактантов через 7 суток культивирования выход биоПАВ составляет 0,87 г/л. На основании полученных хроматограмм гликолипидные компоненты были обнаружены во всех экстрактах, наиболее эффективными экстрагентами являются этиловый эфир уксусной кислоты и система растворителей хлороформ:метанол. В результате ТСХ три наиболее интенсивно окрашенных сигнала свидетельствуют о присутствии нескольких гликолипидных веществ различных по структуре и об их ассоциации с клеточной стенкой бактерий, поскольку большая часть сигналов обнаружена в экстрактах культуральной жидкости.

Список литературы

1. Елисеев С.А., Кучер Р.В. Поверхностно-активные вещества и биотехнология. Киев: Наукова думка, 2001. 260 с.

2. Soberon-Chavez G., Maier R.M. Biosurfactants: a general overview. Berlin, Heidelberg: Biosurfactants, microbiology monographs, 2011. 123 p.

3. Ron E.Z., Rosenberg E. Natural roles of biosurfactants. Environ Microbiol, 2001. V. 3. № 4. 36 p.

4. Isolation and Analysis of Lipopeptides and High Molecular Weight Biosurfactants / T.J.P. Smyth, A. Perfemo, I.M. Banat [et al.] // Springer Berlin Heidelberg: Berlin. 2010. P. 3687-3704.

5. Niescher S., Lang S., Kaschabek S.R, Schlomann M. Identification and structural characterization of novel trehalose dinocardiomycolates from n- alkane - grown Rhodococcus opacus 1CP // Appl Microbiol Biotechnol. 2006. V. 70. P. 605-611.

6. Recovery of Rhodococcus biosurfactants using methyl tertiary-butyl ether extraction / M. S. Kuyukina, I. B. Ivshina, J. C. Philp [et al.] // Journal of Microbiological Methods. 2001. V. 46. I. 2. P. 149-156.

7. Asselineau C., Asselineau J. Trehalose-containing glycolipids // Progress in the Chemistry of Fats and other Lipids. 1978. V. 16. P. 59-99.

8. Cirigliano M.C., Carman G.M. Purification and Characterization of Liposan, a Bioemulsifier from Candida lipolytica //Appl. Environ. Microbiol, 1985 V. 50. № 4. P. 846-50.

9. Singer M.E.V., Finnerty W.R. Physiology of biosurfactant synthesis by Rnodococcus species H13-A // Can. J. Microbiol, 1990.V.36. P.741-745.

10. Formation, isolation and characterization of trehalose dimycolates from Rhodococcus erythropolis grown on n-alkanes / P. Rapp, H. Bock, V. Wray [et al.] // Microbiology, 1979. Т. 115. №. 2. Р. 491-503.

11. Бактерии-нефтедеструкторы рода Rhodococcus-потенциальные продуценты биосурфактантов / Т. М. Лыонг, И.А. Нечаева, К.В. Петриков [и др.] // Известия вузов. Прикладная химия и биотехнология. 2016. №. 1 (16).

12. Дмитриева Е. Д., Леонтьева М. М., Каримова В. Т. Влияние гуминовых веществ торфов на ростовые параметры микроорганизмов нефтедеструкторов рода Rhodococcus в присутствии гексадекана // Ученые записки Крымского федерального университета имени В.И. Вернадского. Биология. Химия. 2018. Т. 4. №. 2. Р. 43-56.

13. Colorimetric method for determination of sugars and related substances / М. DuBois, К.А. Gilles, J.K. Hamilton [et al.] // Anal. Chem. 1956. V. 28. № 3. Р. 350-356.

14. Characterization of biosurfactants produced by the oil-degrading bacterium Rhodococcus erythropolis S67 at low temperature / T.M. Luong, O.N. Ponamoreva, I.A. Nechaeva [et al.] // World Journal of Microbiology and Biotechnology. 2018. V. 34. I. 2. Р. 1-10.

15. Влияние пониженной температуры на биодеградацию гексадекана бактериями-нефтедеструкторами Rhodococcus sp. Х5, продуцирующими гликолипидные биологические поверхностно-активные вещества / Т.М. Лыонг, И.А. Нечаева, О.Н. Понаморева [и др.] //Биотехнология. 2017. Т. 33. №. 6. С. 49-56.

Леонова Татьяна Игоревна, студентка, tatyanka-leonova-99@mail.ru, Россия, Тула, Тульский государственный университет,

Акатова Екатерина Валентиновна, канд. биол. наук, доц., katiaakatova@gmail.com, Россия, Тула, Тульский государственный университет,

Пунтус Ирина Филипповна, канд. биол. наук, с.н.с, доц., puntus66(@mail.ru, Россия, Пущино, Московская область, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН

ISOLATION OF GLYCOLIPID BIOSURFACTANTS PRODUCED BY BACTERIA RHODOCOCCUS SP. 3-2 BY EXTRACTION METHOD

T.I. Leonova, E.V. Akatova, I.F. Puntus

The ability of bacteria Rhodococcus sp. 3-2 to produce glycolipid biosurfactants during growth on n-hexadecane in a liquid mineral medium at 26 ° C was studied. It was found that these microorganisms are effective producers of biosurfactants: after 7 days of cultivation, the yield of glycolipid biosurfactants reaches 0.86 g/l. A qualitative analysis of lipid components produced by a strain of microorganisms by thin layer chromatography made it possible to establish that glycolipid biosurfactants are cell-associated.

Keywords: biodegradation, extraction, hexadecane, glycolipid bio-surfactants, Rhodococcus, trehalolipids.

Leonova Tatiana Igorevna, student, tatyanka-leonova-99@mail. ru, Russia, Tula, Tula State University,

Akatova Ekaterina Valentinovna, candidate of biological sciences, associate professor, katiaakatova@gmail. com, Russia, Tula, Tula State University,

Puntus Irina Filippovna, candidate of biological sciences, research associate, associate professor, puntus66(@,mail. ru, Russia, Pushchino, Moskovskaya oblast, Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms named after G.K. Scriabin RAS