Прогнозирование развития распространенных форм инфильтративного эндометриоза на основании оценки экспрессии CD15 в биоптатах эндометрия
PREDICTION OF DEVELOPMENT OF COMMON FORMS OF INFILTRATIVE ENDOMETRIOSISS BASED ON EVALUATION OF CD15 EXPRESSION IN ENDOMETRIC BIOPSY MATERIALS

Изобретение относится к медицине, а именно к гинекологии, хирургии и патологической анатомии, предназначено для ранней диагностики и прогнозирования распространенных форм инфильтративного эндометриоза.
В настоящее время распространенность эндометриоза у женского населения составляет 10-15% (Bulun SE, 2009, Guidice LC, 2010). У женщин репродуктивного возраста он составляет 5-15%, в постменопаузе - от 3 до 5% (Modesitt SC, Tortolero-Luna G., Robinson JB, Gershenson DM, Wolf JK., 2002).
Глубокий инфильтративный эндометриоз, по данным разных авторов, встречается у 20-50% больных с генитальным эндометриозом (Cornilhe F.J., 1990; Konickx P., 1994; Martin D., 1996).
Поражение мочевыделительной системы эндометриозом встречается редко и составляет 1-2% из всех случаев эндометриоза (Donnez J, Spada F, Squifflet J, Nisolle M 2000; Vitagliano G, Villeta M, Castillo О, 2006). Чаще всего поражается мочевой пузырь (84%), поражение мочеточников составляет 10%, причем левый мочеточник поражается чаще, чем правый (Vercellini, P., Pisacreta, A., Pesole, A., Vincentini, S., Stellato, G. and Crosignani, E., 2000), почки - 4%, a уретра поражается в 2% наблюдений. По литературным данным, за последние годы увеличилась частота заболеваемости (0,3-12%).
До настоящего времени не существует теории или комплекса теорий, полностью объясняющих патогенез эндометриоза. В патогенезе эндометриоза мочевыводящих путей авторы поддерживают все гипотетические механизмы патогенеза эндометриоза, включающие ретроградную менструацию, метастатическое (лимфатическое и сосудистое) распространение, а также ятрогенную имплантацию клеток эндометрия, целомическую метаплазию/индуцированную мезенхимальную дифференцировку клеток, и развитие эндометриоидной ткани из остатков эмбриональных тканей.
В последнее время исследователи интенсивно изучают стволовые клетки эндометрия и их роль в возникновении эктопических эндометриоидных очагов. (Isaac Е. Sassona and Hugh S. Taylora, b Stem Cells and the Pathogenesis of EndometriosisAnn N Y Acad Sci. 2008 Apr; 1127: 106-115.) Многочисленные эксперименты показали, что клетки, выделенные из эндометрия, способны перерасти в эндометриоидные имплантаты (Seli Е, et al. Pathogenesis of endometriosis. Obstet Gynecol Clinics North Am. 2003; 30:61. [PubMed]; TeLinde RW, Scott RB. Experimental endometriosis. Am J Obstet Gynecol. 1950; 60:1173. [PubMed]; D’Hooghe TM, et al. Intrapelvic injection of menstrual endometrium causes endometriosis in baboons (Papio cynocephalus and Papio anubis) Am J Obstet Gynecol. 1995; 173:134. [PubMed]; Ridley JH, Edwards IK. Experimental endometriosis in the human. Am J Obstet Gynecol. 1958; 76:790. [PubMed].
Для детекции стволовых клеток эндометрия и эндометриоидных очагов авторы использовали разные маркеры. Oct-4 является фактором транскрипции, играет большую роль в поддержке клеточной плюрипотентности в эмбриональных и взрослых стволовых клетках, зародышевых клетках и целых эмбрионах на разных стадиях развития. Авторы также сообщили, что данный маркер был выявлен в половине исследуемых образцов эндометрия. (Matthai, Хорват и др., 2006). Экспрессия мРНК Oct4 была обнаружена во всех экспериментальных образцах эндометрия у женщин в фолликулярной или лютеиновой фазе менструального цикла (Bentz, Kenning et al., 2010). Экспрессия других маркеров стволовых клеток, таких как Вс1-2, С-комплект (CD117) и CD34, также были обнаружены в стволовых клетках эндометрия (Cho, Park et al., 2004). Экспрессия Musashi-1 (РНК-связывающего белка) была выявлена в образцах эндометрия, эндометриоидных очагах и эндометриоидной карциномы (Gotte, Wolf et al., 2008). Экспрессия Musashi-1 была обнаружена в эпителиальных и стромальных клетках пролиферативного эндометрия. В клетках эндометрия количество Musashi-1 положительных клеток базального слоя в стромальном компоненте в 1,5 раза и в эпителиальном компоненте в 3 раза выше, чем в функциональном слое. В эндометриоидных и раковых клетках эндометрия также выявлены высокие уровни Musashi-1 (Gotte, Wolf et al., 2008) Като и соавторы использовали два маркера для дифференцировки эпителиальных (CD13) и стромальных (CD9) стволовых клеток эндометрия (Kato, Yoshimoto et al., 2007).
Song и соавторы изучили транскрипцию факторов плюрипотентности (SOX2, NANOG (Nanog homeobox) и ОСТ4 у жешцин репродуктивного возраста, страдающих эндометриозом яичников, и у женщин без данной патологии. Результаты исследования показали, что в эндометрии у женщин с эндометриозом яичников указанные маркеры были значительно выше, чем в эндометрии у женщин без эндометриоза. Кроме того, было выявлено, что в очагах эндометриоза экспрессия данных маркеров значительно превышала показатели эутопического эндометрия (Song Y, Xiao L, Fu J, Huang W, Wang Q, ZhangX, Yang S. Increased expression of the pluripotency markers sex-determining region Y-box 2 and Nanog homeobox in ovarian endometriosis. Reprod Biol Endocrinol, 2014; 12: 42). Также установлено, что стволовые клетки/клетки-предшественники костного мозга при внедрении в эндометрий способствуют ремоделированию сосудов (Pittatore G, Moggio A, Benedetto С, Bussolati В, Revelli A. Endometrial adult/progenitor stem cells: pathogenetic theory and new antiangiogenic approach for endometriosis therapy. Reprod Sci (2014) 21(3):296-304. doi:10. 1177/1933719113503405) или могут трансдифференцироваться в клетки эндометрия (Du Н, Taylor HS. Stem cells and reproduction. Curr Opin Obstet Gynecol (2010) 22(3):235-41. doi:10.1097/GCO.0b013e328338c152; 8 Zhang WB, Cheng MJ, Huang YT, Jiang W, Cong Q, Zheng YF, et al. A study in vitro on differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into endometrial epithelial cells in mice. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol (2012) 160(2): 185-90. doi:10.1016/j.ejogrb.2011.10.012). Выявлено также, что регенеративные клетки эндометрия, выделенные из менструальной крови, могут дифференцироваться в различные клеточные линии, такие как клетки, синтезирующие инсулин (Li, Chen et al., 2010), остеобласты (Ai, Mehrabani, 2010), одонтобласты (Ai, Tabatabaei et al. 2009), и нейроны (Wolff, Gao et al., 2011 and Ai, Esfandiari et al., 2009a). Эндометриальные стволовые клетки (ЭнСК) были недавно использованы для замены дофаминергических нейронов в мышиной модели болезни Паркинсона (Wolff, Gao et al. 2011). Hida и соавторы изучали кардиогенный потенциал ЭнСК (Hida, Nishiyama et al. 2008). Также известен ангиогенный потенциал ЭнСК, чем обусловлена высокая регенеративность эндометрия (Esfandiari, Ai et al. 2007; Esfandiari, Khazaei et al. 2007; Esfandiari, Ai et al. 2008 and Ai, Esfandiari et al 2009a and 2009b). Антиогенез может играть не только ключевую роль в процессе регенерации эндометрия, но и может участвовать в формировании и развитии очагов эндометриоза (Donnez, Smoes et al., 1998; Fujishita, Hasuo et al., 2000).
Теория ретроградной менструации и стволовых клеток указывают на связь между эндометрием и эндометриоидными очагами.
В нашей работе мы провели морфологическое исследование, анализ экспрессии иммуногистохимических маркеров стволовости клеток в эндометрии у женщин с эндометриозом мочевыводящих путей и в эндометрии здоровых женщин. Эти исследования были проведены в рамках научно исследовательских работ, проводимых в НЦАГиП им. Кулакова
Реализацией изобретения является прогнозирование развития распространенных форм инфильтративного эндометриоза по интенсивности экспрессии иммуногистохимического маркера CD15 в биоптате эндометрия.
Исследование проводилось на клинической базе 1 патологоанатомического отделения ФГБУ «НЦ АГиП им. В.И. Кулакова» Минздрава России и кафедры акушерства, гинекологии, репродуктологии и перинатологии ГБОУ ВПО Первого МГМУ им. И.М. Сеченова,
В исследование были включены пациентки, проходившие обследование и лечение в НЦАГиП имени В.И. Кулакова по поводу инфильтративнного эндометриоза с поражением мочевыводящих путей. Возраст пациенток в обеих группах находился в пределах от 23 до 42 лет, средний возраст составил 34±1  года. Пациентки были разделены на две группы. I группу составили пациентки с инфильтративным эндометриозом мочевыводящих путей. II контрольную группу составили здоровые женщины (суррогатные матери). Критерием включения в I группу являлось наличие инфильтративного эндометриоза с вовлечением мочевыводящих путей. Критериями исключения являлись отсутствие инфильтративного эндометриоза с поражением мочевыводящих путей и злокачественные образования. Критерием включения во II группу являлось отсутствие эндометриоза и каких-либо гинекологических и соматических заболеваний. Критериями исключения являлись наличие гинекологических и соматических заболеваний.
Пациентки I и II группы проходили физикальное обследование, были проведены все необходимые клинико-лабораторные и инструментальные исследования для уточнения наличия эндометриоза и подготовки к оперативному лечению у пациенток из I группы и для исключения каких либо заболеваний у пациенток из II группы.
Для данного исследования использовали соскобы эндометрия, взятые у пациенток с эндометриозом мочевыводящих путей, и эндометрий, взятый у суррогатных матерей.
Материал для гистологического исследования фиксировали в забуферном (фосфатном) 10%-ном нейтральном формалине, затем образцы были обработаны по общепринятой стандартной методике и заключены в парафин. Для морфологических исследований с каждого блока делали не менее 10 ступенчатых срезов толщиной 4 мкм, после чего проводили окрашивание гемотоксилином и эозином по общепринятой методике, далее ставили иммуногистохимические реакции.
Иммуногистохимическое исследование проведено у 20 пациенток - у 10 в каждой группе.
Иммуногистохимическое исследование проводили на депарафинированных срезах толщиной 4-5 мкм по общепринятым протоколам (DAKO protocols).
Иммуногистохимическим методом выявляли маркеры стволовости CD15-monoclonal mouse antibody(clone ММА), 1:50, Cell Marque, Aldh1-rabbit monoclonal antibody (clone EP1933Y), 1:400, GeneTex, SOX2 - rabbit monoclonal antibody (clone SP76), 1:100, Cell Marque с помощью моноклональных антител. В качестве вторичных антител и агентов для детекции ставили положительные и отрицательные контрольные реакции.
Результаты ИГХ реакции оценивали полуколичественным методом в баллах по общепринятой методике: отсутствие иммуноокрашенных клеток (-) - 0 баллов; менее 5% иммуноокрашенных клеток (+) - 0,5 балла, менее 20% иммуноокрашенных клеток (+) - 2 балла; от 20 до 40% окрашенных клеток (++) - 4 балла; более 40% окрашенных клеток (+++) - 6 баллов.
Полученные данные были статистически обработаны.
Все полученные данные были обработаны на персональном компьютере с использованием программы Statistica for Windows v.8.0, StatSoft Inc. (США). Для каждого количественного параметра были определены: среднее значение (М), среднеквадратическое отклонение (δ), ошибка среднего (m), 95% доверительный интервал, медиана (Me), интерквартильный размах (Q1-Q3), для качественных данных - частота (%).
Перед проведением сравнительного анализа количественных данных в исследуемых группах определяли вид распределения данных (тест Колмогорова-Смирнова). При нормальном виде распределения данных для оценки различий в группах использованы методы параметрической статистики (критерий Стьюдента). При отсутствии нормального распределения данных применялись методы непараметрической статистики - тест Манна-Уитни для сравнения данных в группах.
Для сравнения числовых данных (после проверки количественных данных на нормальное распределение) использовали t-критерий Стьюдента для 2 независимых выборок: ,
1
2
1
2
1
2
где M, М - средние арифметические; σ и σ - стандартные отклонения; N, N - размеры выборок.
В случае несоответствия закону нормального распределения или при сравнения в малых выборках сравнение числовых показателей между двумя группами осуществляли с помощью критерия Манна-Уитни для несвязанных совокупностей:
1
2
x
x
где n - количество единиц в первой выборке; n- количество единиц во второй выборке; T - большая из двух ранговых сумм, соответствующая выборке с n - единиц.
Статистически значимыми считались отличия при р<0,05 (95% уровень значимости) и при р<0,01 (99% уровень значимости).
При изучении результатов иммуногистохимических исследований обнаружены особенности экспрессии всех 3 маркеров CD15, Aldh А1 и SOX2 в аутологичном эндометрии у больных с эндометриозом.
Aldh А1 определяли в цитоплазме и в ядрах клеток эпителиальных и стромальных компонентов эндометриоидной ткани и аутологичного эндометрия (I группы). В контрольной II группе экспрессия данного маркера не выявлена. Несмотря на отсутствие экспрессии в контрольной группе, статистически достоверных различий между группами не обнаружено.
Экспрессия SOX2 обнаружена в ядрах клеток очагов эндометриоза и в незначительном количестве аутологичного эндометрия (I группа). В контрольной II группе экспрессии SOX2 не выявлено. Экспрессия в основном выявлена в эпителиальных компонентах. В стромальном компоненте данный маркер в незначительных количествах определяли только в очагах эндометриоза. В аутологичном эндометрии экспрессия была оценена на 1-2 балла. Между группами статистически значимого различия не обнаружено
Экспрессия CD15 выявлена только в эпителиальных клетках очагов эндометриоза, аутологичном эндометрии (I группа) и не выявлена в контрольном эндометрии (II группа). Экспрессия в аутологичном эндометрии была оценена от 2 до 6 баллов. При сравнении между группами выявлено статистический значимое различие (р=0,0174) (фигура 1)
Таким образом, статистически значимая разница экспрессии CD15 между группами позволила разработать способ прогнозирования развития распространенных форм инфильтративного эндометриоза с помощью определения экспрессии маркера CD15 в образцах ткани эндометрия, полученных при пайпель биопсии или при диагностических выскабливаниях.
Клинический пример 1
Больная С., 40 лет, обратилась с жалобами на, боли внизу живота и поясничной области слева, обильные болезненные менструации.
Из анамнеза: 2011 г. По месту жительства проведена диагностическая лапаротомия биопсия образования ретроцервикальной области (гистологическое заключение - эндометриоз РЦ области). Была назначена гормональная терапия - диферилин 3,75 мг №6, затем терапия была продолжена жанином по контрацептивной схеме. В 2013 г была выявлена стриктура левого мочеточника и гидронефротические изменения левой почки, в связи с чем проведено стентирование левого мочеточника. При обращении 2014 г. в НЦАГиП был диагностирован                                                                                                                                                                                             инфильтративный эндометриоз клетчатки боковой стенки таза с вовлечением левого мочеточника. Гидронефроз левой почки I ст. Аденомиоз II ст. Проведена лапароскопия - иссечение эндометриоидного инфильтрата, уретеролиз слева, гистеректомия без придатков.
При гистологическом исследовании эндометрий соответствовал пролиферативной фазе.
Иммуногистохимическое исследование: Aldh А1 определяли в цитоплазме и в ядрах клеток эпителиальных и стромальных компонентов. Экспрессия Aldh А1 в эпителиальных и стромальных компонентах эндометрия оценена в 6 баллов. Экспрессия SOX2 обнаружена в ядрах клеток. В эпителиальном компоненте эндометрия интенсивность экспрессии оценена в 4 балла, а в стромальном компоненте экспрессии данного маркера не обнаружено. Экспрессия CD15 выявлена только в эпителиальных компонентах эндометрия и оценена в 6 баллов.
Клинический пример 2
Больная И., 32 года, обратилась по поводу общей слабости, болей внизу живота во время менструации, отсутствие беременности, затрудненное мочеиспускание в период менструации.
Из анамнеза: впервые эндометриоидная киста правого яичника диагностирована в 2010 г. В 2012 г. при подготовке к ЭКО проведена ЛС, сальпингоовариолизис, удаление эндометриоидных кист обоих яичников. После операции появились указанные жалобы. В 2014 г. был диагностирован РЦ эндометриоз, в связи с чем была направлена в НЦАГиП.
После проведения полного клинико-лабораторного и инструментального обследования был поставлен диагноз: распространенная форма НГЭ:РЦ эндометриоз с прорастанием и стенозом прямой кишки, ректо-сигмоидного отдела толстой кишки. Эндометриоз KMC, клечатки малого таза. Эндометриоз мочевого пузыря. Эндометриоидная киста правого яичника. Спаечный процесс брюшной полости.
Была выполнена гистероскопия, диагностическое выскабливание эндометрия. Цистоскопия. Лапароскопия, резекция правого яичника, иссечение инфильтративного эндометриоза малого таза, «шейвинг» прямой кишки, дисковидная резекция ректо-сигмоидного отдела толстой кишки, иссечение эндометриоза пузырноматочной складки, резекция мочевого пузыря, сальпингоовариолизис.
При гистологическом исследовании эндометрий соответствовал пролиферативной фазе.
Экспрессия иммуногистохимических маркеров в эндометрии: экспрессия Aldh A1 обнаружено только в эпителиальном компоненте эндометрия и оценена на 2 балла. SOX2 также обнаружен только в эпителиальном компоненте и оценен в 2 балла. Экспрессия CD15 в эпителиальном компоненте оценена в 4 балла.
Клинический пример 3
Больная Е., 42 года, обратилась по поводу альгоменореи, болей в правой подвздошной области, выделения крови из прямой кишки в первые 2 дня менструации, и выделение слизи до 10 дня менструации, диспареунии. Указанные жалобы беспокоили в течение 3 лет. После проведения клинико-лабораторных и инструментальных методов исследования был поставлен диагноз: распространенная форма наружного генитального эндометриоза: ретроцервикальный эндометриоз с прорастанием в задний свод влагалища, прямую кишку, эндометриоз крестцово-маточных связок и тазовой брюшины, эндометриоидные кисты яичников, инфильтративный эндометриоз правого параметрия, стенки малого таза с признаками вовлечения в процесс правого запирательного нерва, дистального отдела правого мочеточника, гидронефротическая трансформация правой почки III стадии с правосторонним гидроуретерем. Выраженный спаечный процесс в полости малого таза. Миома матки небольших размеров. При нефросцинтиграфии было диагностировано отсутствие накопительной и выделительной функции правой почки.
Была проведена средненижнесрединная лапаротомия. Правосторонняя нефрэктомия. Аппендэктомия. Гистерэктомия с правыми придатками, резекция заднего свода влагалища, резекция левого яичника. Низкая передняя резекция прямой кишки. Иссечение эндометириоидного инфильтрата правой боковой стенки таза. Невролиз правого запирательного нерва. Налажение трансверзостомы.
При гистологическом исследовании эндометрий был в стадии пролиферации.
Экспрессия имуногистохимических маркеров в эндометрии обнаружена только в эпителиальном компоненте. Экспрессия Aldh А1 оценена в 1 балл, SOX2 в 1 балл и CD15 на 2 балла.
Клинический пример 4
Больная А., 32 лет, проходила обследование для вступления в программу суррогатного материнства. При обследовании соматической и гинекологической патологий не выявлено.
В биоптате эндометрия экспрессии имуногистохимических маркеров CD15, Aldh A1, SOX2 в эпителиальном и стромальном компонентах не обнаружено.