ПОЛУМЯГКИЕ ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩИЕ ОЛИГОНУКЛЕОТИДЫ С-КЛАССА
SEMI-SOFT C-CLASS IMMUNOSTIMULATORY OLIGONUCLEOTIDES

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Настоящее изобретение в целом относится к иммуностимулирующим олигонуклеотидам со сниженным воспалительным эффектом в отношении почек, к их композициям и способам использования иммуностимулирующих олигонуклеотидов. В частности, иммуностимулирующие олигонуклеотиды относятся к полумягким олигонуклеотидам С-класса, которые особенно эффективны для лечения аллергии, астмы, рака и инфекционных заболеваний.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Бактериальная ДНК оказывает иммуностимулирующее воздействие, активируя В-клетки и природные клетки-киллеры, тогда как ДНК позвоночных животных таким эффектом не обладает (Tokunaga, T., et al., 1988. Jpn. J. Cancer Res. 79: 682-686; Tokunaga, T., et al., 1984. JNCI 72: 955-962; Messina, J.P., et al., 1991, J. Immunol. 147: 1759-1764; и обзор (Krig, 1998, In: Applied Oligonucleotide Technology, C. A. Stein and A. M. Krig, (Eds.), John Wiley and Sons, Inc., New York, NY, pp. 431-448)). В настоящее время известно, что такие иммуностимулирующие эффекты бактериальной ДНК являются результатом наличия неметилированных динуклеотидов CpG в определенных положениях оснований (CpG мотивы), которые часто встречаются в бактериальной ДНК, но которые метилируются и в меньшей степени представлены в ДНК позвоночных организмов (Krig et al., 1995 Nature 374:546-549; Krig, 1999 Biochim. Biophys. Acta 93321:1-10). Иммуностимулирующие эффекты бактериальной ДНК могут повторять синтетические олигодезоксинуклеотиды (ODN), содержащие такие CpG мотивы. Указанные CpG ODN обладают высокоэффективным стимулирующим воздействием на лейкоциты человека и мышей, в том числе на пролиферацию В-клеток; секрецию цитокинов и иммуноглобулинов; литическую активность природных клеток-киллеров (NK) и на секрецию IFN-γ, а также на активацию дендритных клеток (ДК) и других антиген-презентирующих клеток, экспрессирующих ко-стимулирующие молекулы и секретируемые цитокины, особенно Тh1, которые важны для запуска развития Th1-подобных Т-клеточных ответов. Указанные иммуностимулирующие эффекты нативного фосфодиэфирного скелета CpG ODN высоко специфичны в отношении CpG в том смысле, что указанные эффекты резко снижаются, если CpG мотив метилируется, изменяется на GpC или устраняется или изменяется иным образом (Krig et al., 1995 Nature 374: 546-549; Hartmann et al., 1999. Proc. Natl. Acad. Sci USA 96: 9305-10).
В проведенных ранее исследованиях полагали, что иммуностимулирующий мотив CpG описывается формулой пурин-пурин-CpG-пиримидин-пиримидин (Krig et al., 1995 Nature 374:546-549; Pisetsky, 1996 J. Immunol. 156: 421-423; Hacker et al., 1998 ЕMBO J. 17: 6230-6240; Lipford et al., 1998 Trends in Microbiol. 6: 496-500). Однако в настоящее время известно, что лимфоциты мышей отвечают также хорошо на фосфодиэфирные CpG мотивы, которые имеют другую «формулу» (Yi et al., 1998 J. Immunol. 160: 5898-5906) и то же самое справедливо для В-клеток и дендритных клеток человека (Hartmann et al., 1999 Proc. Natl. Acad. Sci USA 96: 9305-10; Liang, 1996 J. Clin. Invest. 98: 1119-1129).
В последнее время было описано несколько разных классов CpG олигонуклеотидов. Один класс CpG эффективен для активации В-клеток, но обладает относительно слабой активностью в отношении индукции IFN-α и активации NK-клеток; этот класс был назван В-классом. CpG олигонуклеотиды В-класса, как правило, полностью стабилизированы и включают неметилированный CpG динуклеотид с определенным предпочтительным сочетанием оснований. См., например, патенты США 6194388; 6207646; 6214806; 6218371; 6239116 и 6339068. Представители другого класса CpG олигонуклеотидов активируют В-клетки и NK-клетки и индуцируют IFN-α; этот класс был обозначен как С-класс. CpG олигонуклеотиды C-класса, который был охарактеризован первым, как правило, полностью стабилизированы, включают последовательность В-класса и GC-обогащенный палиндром или близкую к палиндрому структуру. Этот класс был описан в совместно рассматриваемой заявке на патент США US 10/224523, поданной 19 августа 2002 года, и в родственной PCT заявке на патент PCT/US02/26468, опубликованной под номером международной публикации WO 03/015711.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Авторы обнаружили, что иммуностимулирующие свойства определенных CpG олигонуклеотидов С-класса, содержащих селективное включение одной или нескольких нестабилизированных связей между определенными нуклеотидами, обладают выраженной активностью и особенно эффективны для лечения аллергии и астмы. Нестабилизированные связи предпочтительно представляют собой природные связи, то есть фосфодиэфирные связи или связи, подобные фосфодиэфирным связям. Обычно нестабилизированная связь, хотя и необязательно, относительно чувствительна к расщеплению нуклеазами. Иммуностимулирующие олигонуклеотиды по настоящему изобретению включают по меньшей мере одну нестабилизированную связь, расположенную между 5'C и примыкающим 3'G, где и 5'C, и 3'G представляют собой внутренние нуклеотиды.
Иммуностимулирующие олигонуклеотиды по настоящему изобретению могут использоваться для индукции Тh1 иммунного ответа. Соответственно иммуностимулирующие олигонуклеотиды по настоящему изобретению могут использоваться в качестве адъювантов для проведения вакцинации, а также могут использоваться для лечения заболеваний, включая рак, инфекционные заболевания, аллергию и астму. Считается, что они особенно эффективны при тех состояниях, когда требуется пролонгированное или повторное введение иммуностимулирующего олигонуклеотида для любой цели, но особенно эффективны для лечения астмы и аллергических заболеваний, таких как аллергический ринит.
1
2
1
3
2
1
2
1
2
3
1
2
3
Настоящее изобретение также относится к иммуностимулирующим олигонуклеотидам, содержащим CpG. В одном из аспектов настоящее изобретение представляет собой олигонуклеотид формулы: 5' TC_GXC_GXNXC_GNCG 3' (SEQ ID NO: 26). Этот олигонуклеотид включает по меньшей мере две стабилизированных межнуклеотидных связи. Символ «_» обозначает фосфодиэфирную межнуклеотидную связь или межнуклеотидную связь фосфодиэфирного типа. N представляет собой последовательность длиной 0-3 нуклеотида, N представляет собой последовательность длиной 0-9 нуклеотидов, и N относится к любому нуклеотиду. X, X и X представляют собой любой нуклеотид. В некоторых вариантах X, X и X представляют собой Т.
1
1
1
1
1
1
В некоторых вариантах осуществления олигонуклеотид может содержать 5' TC_GTC_GTNTC_GGCGCNGCCG 3' (SEQ ID NO: 27). В одном из вариантов осуществления олигонуклеотид может содержать 5' T*C_G*T*C_G*T*N*T*C_G*G*C*G*CNG*C*C*G 3' (SEQ ID NO: 27). В некоторых вариантах N имеет длину из 3 или 2 нуклеотидов. В других вариантах N имеет длину из 0 нуклеотидов.
Иммуностимулирующий олигонуклеотид может содержать 5' T*C_G*T*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*С*G*C*C*G 3' (SEQ ID NO: 2), где символ «*» обозначает стабилизированную межнуклеотидную связь. Необязательно, в том случае, когда это особо оговаривается, 5' может относиться к свободному 5' концу олигонуклеотида и 3' может относиться к свободному 3' концу олигонуклеотида.
В других вариантах осуществления иммуностимулирующий олигонуклеотид может содержать 5' T*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*G*C*C*G 3' (SEQ ID NO: 3), где символ «*» обозначает стабилизированную межнуклеотидную связь. Необязательно, в том случае, когда это особо оговаривается, 5' может относиться к свободному 5' концу олигонуклеотида и 3' может относиться к свободному 3' концу олигонуклеотида.
1
2
3
3
В другом аспекте иммуностимулирующий олигонуклеотид имеет следующую формулу: TC_GXC_GXC_GXTC_GGCGC_GN 3' (SEQ ID NO: 28).
3
3
1
2
3
1
3
N представляет собой 1-5 нуклеотидов в длину, где N относится к любому нуклеотиду. В одном из вариантов осуществления N представляет собой 5 нуклеотидов. X, X и X обозначает любой нуклеотид. В некоторых вариантах осуществления X и X представляют собой T.
В одном из вариантов осуществления олигонуклеотид может содержать: 5' TC_GTC_GAC_GATC_GGCGC_GCGCCG 3' (SEQ ID NO: 4), где олигонуклеотид включает по меньшей мере две стабилизированных межнуклеотидные связи и символ «_» обозначает межнуклеотидную фосфодиэфирную связь или связь типа фосфодиэфирной. В одном из вариантов осуществления олигонуклеотид может содержать 5' T*C_G*T*C_G*A*C_G*A*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3' (SEQ ID NO: 4). Необязательно, в том случае, когда это особо оговорено, 5' может относиться к свободному 5' концу олигонуклеотида и 3' может относиться к свободному 3' концу олигонуклеотида.
2
1
1
3
1
1
2
3
1
3
Согласно другому аспекту настоящего изобретения иммуностимулирующий олигонуклеотид описывается следующей формулой: 5' TTC_GXC_GNX_GXC_GTT 3' (SEQ ID NO: 24). Олигонуклеотид включает по меньшей мере две стабилизированных межнуклеотидных связи и символ «_» обозначает межнуклеотидную фосфодиэфирную связь или связь типа фосфодиэфирной. N представляет собой 1-3 нуклеотида в длину и N относится к любому нуклеотиду. Х представляет собой пиримидин. X и X представляют собой любой нуклеотид. В некоторых вариантах осуществления X и X представляют собой T.
1
1
1
В одном из вариантов осуществления олигонуклеотид может содержать 5' TTC_GTC_GTTTX_GTC_GTT 3' (SEQ ID NO: 25). В другом варианте осуществления олигонуклеотид может содержать 5' T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*Х_G*T*C_G*T*T 3' (SEQ ID NO: 25). В некоторых вариантах осуществления X представляет собой T или С.
Олигонуклеотид может содержать 5' T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T 3' (SEQ ID NO: 5), где символ «*» обозначает стабилизированную межнуклеотидную связь. Необязательно, в том случае, когда это особо оговаривается, 5' может относиться к свободному 5' концу олигонуклеотида и 3' может относиться к свободному 3' концу олигонуклеотида.
Олигонуклеотид может содержать 5' T*T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T 3' (SEQ ID NO: 6), где символ «*» обозначает стабилизированную межнуклеотидную связь. Необязательно, в том случае, когда это особо оговаривается, 5' может относиться к свободному 5' концу олигонуклеотида и 3' может относиться к свободному 3' концу олигонуклеотида.
В некоторых аспектах осуществления настоящего изобретения олигонуклеотиды описываются одной из приведенных ниже формул: TCGTCGTTCGGCGCGCCG (SEQ ID NO: 3), TCGGTCGTCGTTCGGCGCGCGCCG (SEQ ID NO: 2), TCGTCGACGATCGGCGCGCGCCG (SEQ ID NO: 4), TTCGTCGTTTTGTCGTT (SEQ ID NO: 5) или TTTCGTCGTTTCGTCGTT (SEQ ID NO: 6).
В других аспектах осуществления настоящего изобретения олигонуклеотид описывается одной из следующих формул: TCGTCGTC, CGTCGTCG, GTCGTCGT, TCGTCGTT, CGTCGTTC, GTCGTTCG, TCGTTCGG, CGTTCGGC, GTTCGGCG, TTCGGCGC, TCGGCGCG, CGGCGCGC, GGCGCGCG, GCGCGCGC, CGCGCGCC или GCGCGCCG.
-
-
В других аспектах осуществления настоящего изобретения олигонуклеотид описывается одной из следующих формул: T*C_G*T*C_G*T*C, C_G*T*C_G*T*C_G, G*T*C_G*T*C_G*T, T*C_G*T*C_G*T*T, C-G*T*C_G*T*T*C, G*T*C_G*T*T*C_G, T*C_G*T*T*CG*G, C_G*T*T*C_G*G*C, G*T*T*C_G*G*C*G, T*T*CG*G*C*G*C, T*C_G*G*C*G*C_G, C_G*G*C*G*C_G*C, G*G*C*G*C_G*C*G, G*C*G*C_ G*C*G*C, C*G*C_G*C*G*C*C или G*C*_G*C*G*C*C*G.
В других аспектах осуществления настоящего изобретения олигонуклеотид, содержащий: T*C_G*T*C_G*T*C, где символ «*» обозначает стабилизированную межнуклеотидную связь и символ «_» обозначает межнуклеотидную фосфодиэфирную связь или межнуклеотидную связь типа фосфодиэфирной. Необязательно олигонуклеотид может представлять собой 5' T*C-G*T*C-G*T*C-G*T*T*C-G*G*C*G*C-G*C*G*C*C 3' (SEQ ID NO: 21), 5' T*C-G*T*C-G*T*C-G*T*T*C-G*G*C*G*C 3' (SEQ ID NO: 22) или 5' T*C-G*T*C-G*T*C-G*T*T*C-G*G*C*G*C-G*C*G*C 3' (SEQ ID NO: 23), где 5' может относиться к свободному 5' концу олигонуклеотида и 3' может относиться к свободному 3' концу олигонуклеотида.
В других аспектах осуществления настоящего изобретения описывается олигонуклеотид, содержащий: T*C_G*T*T*C_G*G*, где символ «*» обозначает стабилизированную межнуклеотидную связь и символ «_» обозначает фосфодиэфирную межнуклеотидную связь или межнуклеотидную связь типа фосфодиэфирной. Необязательно указанный олигонуклеотид может представлять собой: 5' C-G*T*C-G*T*C-G*T*T*C-G*G*C*G*C-G*C*G*C*C*G 3' (SEQ ID NO: 15), 5' G*T*С-G*T*C-G*T*T*C-G*G*C*G*C-G*C*G*C*C*G 3' (SEQ ID NO: 16), 5' T*C-G*T*C-G*T*T*C-G*G*C*G*C-G*C*G*C*C*G 3' (SEQ ID NO: 17), 5' С-G*T*C-G*T*T*C-G*G*C*G*C-G*C*G*C*C*G 3' (SEQ ID NO: 18), 5' G*T*C-G*T*T*C-G*G*C*G*C-G*C*G*C*C*G 3' (SEQ ID NO: 19) или 5' T*C-G*T*T*C-G*G*C*G*C-G*C*G*C*C*G 3' (SEQ ID NO: 20), где 5' может относиться к свободному 5' концу олигонуклеотида и 3' может относиться к свободному 3' концу олигонуклеотида.
Изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей олигонуклеотид по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель.
В некоторых вариантах осуществления композиция входит в состав небулайзера или ингалятора. Ингалятор может представлять собой ингалятор с отмеряемой дозой. Альтернативно, ингалятор представляет собой порошковый ингалятор.
В других вариантах осуществления фармацевтическая композиция может содержать химиотерапевтическое средство. В других вариантах композиция может содержать противовирусное средство.
Фармацевтическая композиция может содержать фармацевтически приемлемый носитель, введенный в состав композиции для подкожного введения, перорального введения или интраназального введения.
В одном из вариантов осуществления олигонуклеотид находится в составе фармацевтической композиции, необязательно содержащей фармацевтически приемлемый носитель. В некоторых вариантах олигонуклеотид входит в состав аэрозольной формы препарата.
В одном из вариантов осуществления олигонуклеотид также содержит адъювант или цитокин.
В одном из вариантов осуществления олигонуклеотид также содержит антиген, где указанный олигонуклеотид представляет собой адъювант для вакцины.
В одном из вариантов осуществления антиген выбран из группы, состоящей из вирусного антигена, бактериального антигена, грибкового антигена, паразитарного антигена и опухолевого антигена. В одном из вариантов осуществления антиген кодируется нуклеиновой кислотой вектора. В другом варианте осуществления антиген представляет собой пептидный антиген. В одном из вариантов осуществления антиген ковалентно связан с олигонуклеотидом или иммуностимулирующей молекулой нуклеиновой кислоты. В другом варианте осуществления антиген не связан ковалентной связью с олигонуклеотидом или иммуностимулирующей молекулой нуклеиновой кислоты.
В одном из вариантов осуществления фосфодиэфирная связь или связь типа фосфодиэфирной представляет собой фосфодиэфирную связь. В одном из вариантов осуществления связь, подобная фосфодиэфирной, представляет собой боранофосфонатную или диастереомерно чистую Rp фосфоротиоатную связь.
В одном из вариантов осуществления стабилизированный скелет содержит множество межнуклеотидных связей, выбранных из группы, состоящей из фосфоротиоата, фосфородитиоата, метилфосфоната, метилфосфоротиоата и любого их сочетания. В одном из вариантов осуществления стабилизированный скелет содержит множество фосфоротиоатных межнуклеотидных связей.
В одном из вариантов осуществления длина иммуностимулирующей молекулы нуклеиновой кислоты составляет 4-100 нуклеотидов.
В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения астмы путем введения индивидууму с риском развития астмы олигонуклеотида по настоящему изобретению в количестве, эффективном для лечения астмы.
В других аспектах настоящее изобретение относится к способу лечения аллергии путем введения индивидууму, страдающему аллергией или имеющему риск ее развития, олигонуклеотида по настоящему изобретению в количестве, эффективном для лечения аллергии. В еще одном из вариантов осуществления указанный индивидуум страдает аллергическим ринитом. В одном из вариантов осуществления олигонуклеотид наносят на поверхность слизистой. В других вариантах осуществления олигонуклеотид вводят в виде аэрозольной композиции. Необязательно, олигонуклеотид вводят интраназально.
В соответствии с другим аспектом настоящее изобретение относится к способу индукции образования цитокинов. Этот способ осуществляют путем введения индивидууму CpG олигонуклеотида по настоящему описанию в количестве, эффективном для индукции цитокина, выбранного из группы, состоящей из IL-6, IL-8, IL-12, IL-18, TNF, IFN-α, хемокинов и IFN-γ.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к композиции на основе CpG иммуностимулирующих олигонуклеотидов по настоящему описанию, в сочетании с антигеном или другим терапевтическим соединением, таким как противомикробное средство. Противомикробное средство может представлять собой, например, противовирусное средство, противопаразитарное средство, противобактериальное средство или противогрибковое средство.
В соответствии с другим аспектом настоящее изобретение относится к композиции с пролонгированным высвобождением, содержащей CpG иммуностимулирующие олигонуклеотиды по настоящему изобретению.
В составе композиции может необязательно присутствовать фармацевтический носитель, и/или композиция может быть введена в состав средства для доставки. В некоторых вариантах осуществления устройство для доставки выбрано из группы, состоящей из катионных липидов, проникающих в клетку белков, и средств с пролонгированным высвобождением. В одном из вариантов осуществления средство с пролонгированным высвобождением представляет биодеградируемый полимер или микрочастицу.
В соответствии с другим аспектом настоящее изобретение относится к способу стимуляции иммунного ответа. Этот способ включает введение индивидууму CpG иммуностимулирующего олигонуклеотида в количестве, эффективном для индукции иммунного ответа у индивидуума. Предпочтительно CpG иммуностимулирующий олигонуклеотид вводят перорально, применяют местно, вводят в составе средства для пролонгированного высвобождения, наносят на поверхность слизистой, применяют системно, вводят парентерально или внутримышечно. В том случае когда CpG иммуностимулирующий олигонуклеотид наносят на поверхность слизистой, он может доставляться в количестве, эффективном для индукции иммунного ответа на слизистой или для индукции системного иммунного ответа. В предпочтительных вариантах осуществления поверхность слизистой выбрана из группы, состоящей из поверхности ротовой полости, назальной, ректальной, вагинальной и глазной поверхности.
В некоторых вариантах осуществления способ по настоящему изобретению включает воздействие на индивидуума антигеном, где иммунный ответ представляет собой антиген-специфический иммунный ответ. В некоторых вариантах антиген выбран из группы, состоящей из опухолевого антигена, вирусного антигена, бактериального антигена, паразитарного антигена и пептидного антигена.
in vivo, in vitro
ex vivo
ex vivo
CpG иммуностимулирующие олигонуклеотиды способны провоцировать широкий спектр иммунных ответов. Например, эти CpG иммуностимулирующие олигонуклеотиды могут использоваться для переадресации иммунного ответа с Th2 на Th1 вариант. CpG иммуностимулирующие олигонуклеотиды могут также использоваться для активации иммунной клетки, такой как лимфоцит (например, В- и Т-клетки), дендритная клетка и NK-клетка. Активация может быть осуществлена  или , например, путем выделения иммунной клетки из организма индивидуума, приведения указанной иммунной клетки в контакт с эффективным количеством CpG иммуностимулирующего олигонуклеотида для активации иммунной клетки и повторного введения активированной иммунной клетки индивидууму. В некоторых вариантах осуществления дендритная клетка презентирует раковый антиген. На дендритную клетку можно воздействовать раковым антигеном .
Иммунный ответ, продуцируемый CpG иммуностимулирующими олигонуклеотидами, также может привести к индукции образования цитокинов, например, к продукции IL-6, IL-8, IL-12, IL-18, TNF, IFN-α, хемокинов и IFN-γ.
В еще одном варианте осуществления CpG иммуностимулирующие олигонуклеотиды применяются для лечения рака. CpG иммуностимулирующие олигонуклеотиды также могут использоваться, в соответствии с другими аспектами настоящего изобретения, для профилактики рака (например, для снижения риска развития рака) у индивидуума, имеющего риск возникновения рака. Рак может быть выбран из группы, состоящей из рака желчных путей, рака молочной железы, рака шейки матки, хориокарциномы, рака толстой кишки, рака эндометрия, рака желудка, внутриэпителиальных неоплазм, лимфом, рака печени, рака легкого (например, многоклеточного и немелкоклеточного рака), меланомы, нейробластом, рака ротовой полости, рака яичника, рака поджелудочной железы, рака предстательной железы, рака прямой кишки, саркомы, рака щитовидной железы и рака почки, а также из других видов карцином и сарком. В некоторых важных аспектах осуществления настоящего изобретения рак выбран из группы, состоящей из рака кости, рака мозга и ЦНС, рака соединительной ткани, эзофагеального рака, рака глаза, лимфомы Ходжкина, рака гортани, рака ротовой полости, рака кожи и рака яичек.
in vitro
CpG иммуностимулирующие олигонуклеотиды также могут использоваться для повышения чувствительности раковой клетки на терапию рака (например, противораковую терапию) в том случае, когда CpG иммуностимулирующий олигонуклеотид вводят в составе курса противораковой терапии. Противораковая терапия может представлять собой химиотерапию, вакцинотерапию (например, при использовании вакцины на основе примированных  дендритных клеток или вакцины на основе ракового антигена) или терапию антителами. Последний вид терапии может также включать введение антитела, специфичного для антигена клеточной поверхности, например, раковой клетки, где указанный иммунный ответ приводит к антителозависимой клеточной токсичности (ADCC). В одном из вариантов осуществления антитело выбрано из группы, состоящей из Ributaxin, Herceptin, Quadrament, Panorex, IDEC-Y2B8, BEC2, C225, Oncolym, SMART M195, ATRAGEN, Ovarex, Bexxar, LDP-03, ior t6, MDX-210, MDX-11, MDX-22, OV103, 3622W94, анти-VEGF, Zenаpax, MDX-220, MDX-447, MELIMMUNE-2, MELIMMUNE-1, CEACIDE, Pretarget, NovoMAb-G2, TNT, Gliomab-H, GNI-250, EMD-72000, LymphoCide, CMA 676, Monopharm-C, 4B5, ior egf.r3, ior c5, BABS, анти-FLK-2, MDX-260, ANA Ab, SMART 1D10 Ab, SMART ABL 364 Ab и ImmuRAIT-CEA.
Таким образом, в соответствии с некоторыми аспектами настоящего изобретения индивидууму, страдающему раком или имеющему риск развития рака, вводят CpG иммуностимулирующий олигонуклеотид и проводят противораковую терапию. В некоторых вариантах осуществления препарат для проведения противораковой терапии выбран из группы, состоящей из химиотерапевтического средства, иммунотерапевтического средства и противораковой вакцины. В некоторых вариантах осуществления лекарственное средство для лечения рака представляет собой таксол или сочетание карбоплатины и паклитаксела.
В другом варианте осуществления способов, направленных на профилактику или лечение рака, индивидууму может также вводиться интерферон-α.
В других аспектах настоящее изобретение относится к способам профилактики заболевания у индивидуума. Этот способ включает введение индивидууму CpG иммуностимулирующего олигонуклеотида на регулярной основе для усиления чувствительности иммунной системы с целью предупреждения заболевания у индивидуума. Примеры заболеваний или состояний, профилактика которых может проводиться при использовании профилактических способов по настоящему изобретению, включают микробные инфекции (например, болезни, передаваемые половым путем) и анафилактический шок, развивающийся в результате пищевой аллергии.
В других аспектах настоящее изобретение относится к способу индукции врожденного иммунного ответа путем введения индивидууму CpG иммуностимулирующего олигонуклеотида в количестве, эффективном для активации врожденного иммунного ответа.
В соответствии с другим аспектом осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения или профилактики вирусной или ретровирусной инфекции. Указанный способ включает введение индивидууму с вирусной или ретровирусной инфекцией или имеющему риск ее развития любой композиции по настоящему изобретению в количестве, эффективном для лечения или профилактики вирусной или ретровирусной инфекции. В некоторых вариантах вирусное заболевание вызвано вирусом гепатита, например гепатита В, гепатита С, HIV, вирусом герпеса или папилломавирусом.
В соответствии с другим аспектом настоящее изобретение относится к способу лечения или предупреждения бактериальной инфекции. Этот способ включает введение индивидууму с бактериальной инфекцией или имеющему риск ее развития любой композиции по настоящему изобретению в количестве, эффективном для предупреждения бактериальной инфекции. В одном из вариантов осуществления бактериальная инфекция развивается за счет внутриклеточных бактерий.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения или профилактики паразитарной инфекции путем введения индивидууму, страдающему паразитарной инфекцией или имеющим риск ее развития, любой композиции по настоящему изобретению в количестве, эффективном для лечения или предупреждения паразитарной инфекции. В одном из вариантов осуществления паразитарная инфекция развивается за счет внутриклеточного паразита. В другом варианте паразитарная инфекция развивается за счет паразита негельминтной природы.
В некоторых вариантах осуществления индивидуум представляет собой человека, и в других вариантах указанный индивидуум представляет собой позвоночный организм, отличный от человека, выбранный из группы, состоящей из собаки, кошки, лошади, коровы, свиньи, индейки, козы, рыбы, обезьяны, курицы, крысы, мыши и овцы.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу индукции Th1 иммунного ответа путем введения индивидууму любой композиции по настоящему изобретению в количестве, эффективном для продукции Th1 иммунного ответа.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения аутоиммунного заболевания путем введения индивидууму, страдающему аутоиммунным заболеванием или имеющему риск его развития, любой композиции по настоящему изобретению в количестве, эффективном для лечения или профилактики аутоиммунного заболевания.
В других вариантах осуществления настоящего изобретения олигонуклеотид вводят индивидууму в количестве, эффективном для индукции экспрессии цитокинов. Цитокин необязательно может быть выбран из группы, состоящей из IL-6, TNFα, IFNα, IFNγ и IP-10. В других вариантах осуществления настоящего изобретения олигонуклеотид вводят индивидууму в количестве, эффективном для сдвига иммунного ответа в направлении Th1 от Тh2 ответа.
В некоторых аспектах изобретение относится к способу лечения путем ремоделирования дыхательных путей, включающего введение индивидууму олигонуклеотида, включающего CG динуклеотид в количестве, эффективном для ремоделирования дыхательных путей у индивидуума. В одном из вариантов осуществления указанный пациент имеет астму, хроническую обструктивную болезнь легких или является курильщиком. В других вариантах осуществления указанный индивидуум не имеет симптомов астмы.
В качестве одного из аспектов настоящего изобретения предлагается использование олигонуклеотида по изобретению для стимуляции иммунного ответа.
Предлагается также использование олигонуклеотида по настоящему изобретению для производства лекарственного средства для стимуляции иммунного ответа и осуществления любого из способов по настоящему изобретению.
Каждый ограничивающий пункт изобретения может иметь различные варианты осуществления изобретения. В этой связи понятно, что каждое такое ограничение изобретения, включающее любой элемент или сочетание элементов, может относиться к каждому из аспектов настоящего изобретения.
Краткое описание чережей
На фиг.1 показана серия графиков, отражающих индукцию INF-альфа РВМС человека, обработанных CpG ODN.
На фиг.2 показана серия графиков, отражающих эффекты CpG олигодезоксинуклеотида SEQ ID NO: 7 против антиген-индуцированного повышения назальной резистентности у морских свинок при введении дозы (А) 1 мг/кг и (В) (0,03 мг/кг). Результаты представлены в виде среднего значения ±СКО ((A)=n=5-8; (B)=n=14-15). Значение *P<0,05 дано в сравнении с группой, которой после провокации антигеном вводили исследуемый носитель (t-тест).
На фиг.3 показана серия графиков, отражающих эффекты CpG олигодезоксинуклеотида SEQ ID NO: 7 на антиген-индуцированный насморк (3А) и заложенность носа (3В) на модели мышей с аллергическим ринитом. Результаты представлены в виде среднего значения ±СКО (n=10). Значение *P<0,05 дано в сравнении с группой, которой вводили носитель (тест Манн-Уитни).
50
На фиг.4 показан график, демонстрирующий результаты титрования вируса гриппа и определения временных параметров развития инфекции. Показанное количество клеток бронхоальвеолярного лаважа. Результаты представлены в виде среднего значения ±СКО (n=5). Мышей, инфицированных дозой 500 EID, умерщвляют через 6 дней из-за потери веса.
На фиг.5 показан график, демонстрирующий защитные эффекты CpG ODN на вирусную нагрузку в легких. Вирусную нагрузку оценивают методом ферментативного иммуноанализа. Результаты представлены в виде среднего значения ±СКО (n=5-10). Значение *P<0,05 дано в сравнении с группой В (тест Крускала-Валлиса (Kruskal-Wallis), пост-тест Данна (Dunn)). n.d = нет данных.
На фиг.6 показана серия графиков, отражающих защитные эффекты CpG ODN на индуцируемое вирусом воспаление дыхательных путей, по результатам определения общего числа лейкоцитов (6А), общего числа нейтрофилов (6В) и общего числа мононуклеарных клеток (6С). Показано число клеток в бронхоальвеолярном лаваже. Результаты представлены в виде среднего значения ±СКО (n=10). Значение *P<0,05 дано в сравнении с группой В (тест Крускала-Валлиса, пост-тест Данна).
На фиг.7 показана серия графиков, отражающих защитные эффекты CpG ODN на число клеток при антиген-индуцированном воспалении дыхательных путей, по числу эозинофилов (7А) и нейтрофилов (7В). Результаты представлены в виде среднего значения ±СКО (n=10-14). Значение *P<0,05 дано в сравнении с группой, которой после провокации антигеном вводили носитель (множественный тест сравнения Крускала-Валлиса, пост-тест Данна).
+
+
+
На фиг.8 показана серия графиков, отражающих защитные эффекты CpG ODN на число клеток CD3 (8A) и СD3СD4 (8В) при воспалении дыхательных путей, индуцированном антигеном. Результаты представлены в виде среднего значения ±СКО (n=8). Значение *P<0,05 дано в сравнении с группой, которой после провокации антигеном вводили носитель (множественный тест сравнения Крускала-Валлиса, пост-тест Данна).
На фиг.9 показана серия графиков, отражающих число клеток в бронхоальвеолярном лаваже через 8 часов после введения дозы 0,1 мг/кг ODN (9А); через 15 часов после введения дозы 0,1 мг/кг ODN (9В); через 8 часов после введения дозы 1 мг/кг ODN (9С); и через 15 часов после введения дозы 1 мг/кг ODN (9D). Результаты представлены в виде среднего значения ±СКО (n=10).
На фиг.10 показана серия графиков, отражающих концентрации IFN-альфа в бронхоальвеолярном лаваже через 8 часов после введения дозы 0,1 мг/кг ODN (10А); через 15 часов после введения дозы 0,1 мг/кг ODN (10В); через 8 часов после введения дозы 1 мг/кг ODN (10С); и через 15 часов после введения дозы 1 мг/кг ODN (10D).
На фиг.11 показана серия графиков, демонстрирующих концентрации IFN-гамма в бронхоальвеолярном лаваже через 8 часов после введения дозы 0,1 мг/кг ODN (11А); через 15 часов после введения дозы 0,1 мг/кг ODN (11В); через 8 часов после введения дозы 1 мг/кг ODN (11С); и через 15 часов после введения дозы 1 мг/кг ODN (11D).
На фиг.12 показана серия графиков, демонстрирующих концентрации IP-10 в бронхоальвеолярном лаваже через 8 часов после введения дозы 0,1 мг/кг ODN (12А); через 15 часов после введения дозы 0,1 мг/кг ODN (12В); через 8 часов после введения дозы 1 мг/кг ODN (12С); и через 15 часов после введения дозы 1 мг/кг ODN (12D).
На фиг.13 показана серия графиков, демонстрирующих концентрации IL-12p40 в бронхоальвеолярном лаваже через 8 часов после введения дозы 0,1 мг/кг ODN (13А); через 15 часов после введения дозы 0,1 мг/кг ODN (13В); через 8 часов после введения дозы 1 мг/кг ODN (13С); и через 15 часов после введения дозы 1 мг/кг ODN (13D).
На фиг.14 показана серия графиков, демонстрирующих концентрации IL-6 в бронхоальвеолярном лаваже через 8 часов после введения дозы 0,1 мг/кг ODN (14А); через 15 часов после введения дозы 0,1 мг/кг ODN (14В); через 8 часов после введения дозы 1 мг/кг ODN (14С); и через 15 часов после введения дозы 1 мг/кг ODN (14D).
На фиг.15 показана серия графиков, демонстрирующих концентрации TNF-альфа в бронхоальвеолярном лаваже через 8 часов после введения дозы 0,1 мг/кг ODN (15А); через 15 часов после введения дозы 0,1 мг/кг ODN (15В); через 8 часов после введения дозы 1 мг/кг ODN (15С); и через 15 часов после введения дозы 1 мг/кг ODN (15D).
На фиг.16 показана серия графиков, демонстрирующих концентрации IFN-гамма в сыворотке крови через 8 часов после введения дозы 0,1 мг/кг ODN (16А); через 15 часов после введения дозы 0,1 мг/кг ODN (16В); через 8 часов после введения дозы 1 мг/кг ODN (16С); и через 15 часов после введения дозы 1 мг/кг ODN (16D).
На фиг.17 показана серия графиков, демонстрирующих концентрации IL-6 в сыворотке крови через 8 часов после введения дозы 0,1 мг/кг ODN (17А); через 15 часов после введения дозы 0,1 мг/кг ODN (17В); через 8 часов после введения дозы 1 мг/кг ODN (17С); и через 15 часов после введения дозы 1 мг/кг ODN (17D).
На фиг.18 показана серия графиков, демонстрирующих концентрации TNF-альфа в сыворотке крови после через 8 часов после введения дозы 0,1 мг/кг ODN (18А); через 15 часов после введения дозы 0,1 мг/кг ODN (18В); через 8 часов после введения дозы 1 мг/кг ODN (18С); и через 15 часов после введения дозы 1 мг/кг ODN (18D).
На фиг.19 показана серия графиков, демонстрирующих эффекты CpG олигодезоксинуклеотидов ODN SEQ ID NO: 2 и ODN SEQ ID NO: 7 на продукцию антиген-индуцированного IgE (19A) и IgG2a (19B) у мыши. Результаты представлены в виде среднего значения ±СКО (n=10). Значение *P<0,05 дано в сравнении с группой животных, которых подвергли сенсибилизации антигеном и лечению носителем (тест Крускала-Валлиса (Kruskal-Wallis) с пост-тестом Данна (Dunn)).
На фиг.20 показана серия графиков, демонстрирующих эффекты ODN SEQ ID NO: 2 против обострения аллергического воспаления дыхательных путей у мышей, индуцированного гриппом, по общему числу лейкоцитов (20А), эозинофилов (20В), нейтрофилов (20С), мононуклеарных клеток (20D) и по весу тела (20Е).
На фиг.21 описан протокол AHR, использованный в экспериментах на морских свинках.
На фиг.22 показана серия графиков, демонстрирующих эффект SEQ ID NO: 7 на резистентность дыхательных путей и эластичность легких. Для каждого животного построена кривая зависимости доза-ответ, и реактивность дыхательных путей оценивается количественно в виде площади под кривой. Морским свинкам вводят внутриназально либо носитель (солевой раствор), либо один OVA, либо в/т SEQ ID NO: 7 в дозах 10 мкл/кг, 30 мкл/кг, 100 мкл/кг или 300 мкл/кг. Приведенные данные показывают, что SEQ ID NO: 7 вызывает зависимое от дозы снижение AUC-резистентности. На фиг. 22А и 22В показано высвобождение гистамина в виде функции повышенной резистентности дыхательных путей (22А) или снижения эластичности легких (22B). На фиг. 22С и 22D показаны диаграммы, демонстрирующие повышение резистентности дыхательных путей (22С) или снижение эластичности легких (22В) в результате лечения солевым раствором, OVA или SEQ ID NO: 7 в указанных дозировках.
На фиг.23 приведено краткое описание протокола статистического анализа, примененного в настоящем изобретении (фиг.22) для оценки резистентности дыхательных путей (23А) и эластичности легких (23В).
На фиг.24 показана серия графиков, демонстрирующих эффект SEQ ID NO: 2 на резистентность дыхательных путей и эластичность легких. Для каждого животного построен график зависимости доза-ответ, и реактивность дыхательных путей оценивают количественно в виде площади под кривой. Морским свинкам вводят интраназально либо носитель (солевой раствор), либо один OVA, либо в/т SEQ ID NO: 2 в дозах 10 мкл/кг, 30 мкл/кг, 100 мкл/кг или 300 мкл/кг. Приведенные данные показывают, что SEQ ID NO: 2 вызывает зависимое от дозы снижение AUC-резистентности. На фиг. 24А и 24В показано высвобождение гистамина в виде функции повышенной резистентности дыхательных путей (24А) или снижения эластичности легких (24B). На фиг. 24С и 24D показаны диаграммы, демонстрирующие повышение резистентности дыхательных путей (24С) или снижение эластичности легких (24D) в результате лечения солевым раствором, OVA или SEQ ID NO: 2 в указанных дозировках.
На фиг.25 приведено краткое описание использованного в данном изобретении статистического анализа (фиг.24) для оценки резистентности дыхательных путей (25А) и эластичности легких (25В).
На фиг.26 приведено краткое описание графиков на фиг. 22 и 24. Фиг. 26A и 26B соответствуют фиг. 22C и 22D. Фиг. 26C 26D соответствуют фиг. 24C и 24D.
На фиг.27 показана серия графиков, демонстрирующих уровни IL-10 (пг/мл) секретированных из человеческих РВМС (3 донора) после экспонирования этих клеток в течение 48 часов с олигонуклеотидами, перечисленными как SEQ ID NO внизу на оси Х графика (приведенные данные для 3 доноров обозначены как ,  и x). Исследованные олигонуклеотиды, показанные на фиг.27, включают SEQ ID NO: 10, 9, 13, 14, 1 и 2. Концентрация олигонуклеотида, соответствующая конкретному значению на графике, показана на оси Х (мкМ). Собирают супернатанты и уровень IL-10 определяют методом ИФТФА. Приведенные данные представляют собой среднее количество цитокинов, полученное для всех доноров.
На фиг.28 показана группа графиков, демонстрирующих уровни TNF-альфа (28А), интерферона-гамма (28B) и IL-6 (28C) (мкМ), секретированных из человеческих РВМС после воздействия на эти клетки олигонуклеотидов, перечисленных в виде SEQ ID NO в пояснении к каждому графику. Каждая приведенная точка представляет собой расчетное среднее значение цитокина для 3 доноров. РВМС инкубируют с указанными концентрациями ODN. Супернатанты собирают и уровень цитокинов определяют методом ИФТФА. Приведенные данные представляют собой среднее значение количества цитокинов для всех доноров.
На фиг.29 показана группа графиков, демонстрирующих уровни TNF-альфа (пг/мл), секретированных из человеческих РВМС после воздействия на эти клетки олигонуклеотидов в течение 16 часов, которые перечислены в виде SEQ ID NO внизу по оси Х графика. Показанные на фиг.29 олигонуклеотиды включают SEQ ID NO: 9, 13, 10, 14, 2, 1, 11, 12 и 3. Концентрация олигонуклеотида, соответствующая конкретному значению на графике, показана на оси Х (мкМ). Показанные данные отражают значения для трех доноров. Внизу даны обозначения SEQ ID NO применительно к классу ODN. Сss = полумягкий С-класс, С = С-класс, B = B-класс, не-CpG = ODN без неметилированного CpG. Супернатанты собирают и уровень IL-6 определяют методом ИФТФА. Приведенные данные представляют собой среднее значение количества цитокинов для всех доноров.
На фиг.30 показана группа графиков, демонстрирующих уровни IL-6 (пг/мл), секретированных из человеческих РВМС после воздействия на эти клетки олигонуклеотидов в течение 24 часов, которые перечислены внизу вдоль оси Х графика в виде SEQ ID NO. Олигонуклеотиды, показанные на фиг.30, включают SEQ ID NO: 9, 13, 10, 14, 2, 1, 11, 12 и 3. Концентрация олигонуклеотида, соответствующая конкретному значению на графике, показана на оси Х (мкМ). Приведенные данные отражают значения для трех доноров. Ниже даны обозначения SEQ ID NO. применительно к классу ODN. Сss = полумягкий С-класс, С = С-класс, B = B-класс, не-CpG = ODN без неметилированного CpG.
На фиг.31 показана группа графиков, демонстрирующих уровни IFN-гамма (пг/мл), секретированных из человеческих РВМС после воздействия на эти клетки в течение 48 часов олигонуклеотидов, которые перечислены в виде SEQ ID NО на оси Х. Олигонуклеотиды, показанные на фиг.31, включают SEQ ID NO: 9, 13, 10, 14, 2, 1, 11, 12 и 3. Концентрация олигонуклеотида, соответствующая конкретному значению на графике, показана на оси Х (мкМ). Приведенные данные отражают значения для трех доноров. Ниже даны обозначения SEQ ID NO. применительно к классу ODN. Сss = полумягкий С-класс, С = С-класс, B = B-класс, не-CpG = ODN без неметилированного CpG. Супернатанты собирают и определяют уровень IFN-гамма методом ИФТФА. Приведенные данные представляют собой среднее значение количества цитокинов для всех доноров.
На фиг.32 показана группа графиков, демонстрирующих уровни экспрессии CD69 (MFI, среднекратный прирост) на NK-клетках, в качестве показателя активации NK-клеток (32A) и экспрессии CD80 (32B) и CD86 (32C) на В-клетках после экспозиции данных клеток в течение 24 или 48 часов с олигонуклеотидами, которые перечислены в пояснении к графику в виде SEQ ID NO. Каждое приведенное значение представляет собой среднее значение интенсивности флуоресценции для трех доноров. Клетки инкубируют с указанными концентрациями ODN в течение 24 часов или 48 часов. Далее клетки окрашивают и анализируют методом проточной цитометрии.
На фиг.33 показана группа графиков, демонстрирующих уровни экспрессии CD69 на NK-клетках, в качестве показателя активации NK-клеток после экспозиции данных клеток в течение 24 часов с олигонуклеотидами, перечислены ниже по оси Х графика в виде SEQ ID NO. Олигонуклеотиды, показанные на фиг.33, включают SEQ ID NO: 9, 13, 10, 14, 2, 1, 11, 12 и 3. Концентрация олигонуклеотида, соответствующая конкретному значению на графике, показана на оси Х (мкМ). Приведенные данные отражают значения для трех доноров. Ниже приведено обозначение SEQ ID NO применительно к классу ODN. Сss = полумягкий С-класс, С = С-класс, B = B-класс, не-CpG = ODN без неметилированного CpG. Далее клетки окрашивают антителами против CD3, CD56 и CD69 и анализируют методом проточной цитометрии. Приведенные данные представляют собой среднее значение интенсивности флуоресценции.
На фиг.34 показана группа графиков, демонстрирующих экспрессию CD86 на человеческих РВМС после экспозиции данных клеток в течение 48 часов с олигонуклеотидами, перечисленными ниже, по оси Х графика в виде SEQ ID NO. Олигонуклеотиды, показанные на фиг.34, включают SEQ ID NO: 9, 13, 10, 14, 2, 1, 11, 12 и 3. Концентрация олигонуклеотида, соответствующая конкретному значению на графике, показана на оси Х (мкМ). Приведенные данные отражают значения для трех доноров. Под SEQ ID NO. приведено обозначение применительно к классу ODN. Сss = полумягкий С-класс, С = С-класс, B = B-класс, не-CpG = ODN без неметилированного CpG. Далее клетки окрашивают антителами против CD86, CD80, CD19 и CD14 и анализируют методом проточной цитометрии. Приведенные данные представляют собой среднее значение интенсивности флуоресценции.
На фиг.35 показана группа графиков, демонстрирующих экспрессию CD86 на человеческих РВМС после экспозиции данных клеток в течение 48 часов с олигонуклеотидами, перечисленными ниже по оси Х графика в виде SEQ ID NO. Олигонуклеотиды, показанные на фиг.35, включают SEQ ID NO: 9, 13, 10, 14, 2, 1, 11, 12 и 3. Концентрация олигонуклеотида, соответствующая конкретному значению на графике, показана на оси Х (мкМ). Показанные данные отражают значения для трех доноров. Под SEQ ID NO приведено обозначение применительно к классу ODN. Сss = полумягкий С-класс, С = С-класс, B = B-класс, не-CpG = ODN без неметилированного CpG. Далее клетки окрашивают антителами против CD86, CD80, CD19 и CD14 и анализируют методом проточной цитометрии. Приведенные данные представляют собой среднее значение интенсивности флуоресценции.
На фиг.36 приведена группа графиков, демонстрирующих уровень экспрессии CD86 на плазмоцитоидных дендритных клетках (36A) и экспрессии CD80 (36B) и CD86 (36C) на моноцитах после экспозиции данных клеток с олигонуклеотидами, перечисленными ниже по оси Х графика в виде SEQ ID NO. Каждое приведенное значение представляет собой вычисленное среднее значение интенсивности флуоресценции для трех доноров. Клетки инкубируют с указанными концентрациями ODN в течение 48 часов. Далее клетки окрашивают и анализируют методом проточной цитометрии.
На фиг.37 показана группа графиков, демонстрирующих уровни экспрессии CD86 на моноцитах после экспозиции данных клеток в течение 48 часов с олигонуклеотидами, перечисленными ниже по оси Х графика в виде SEQ ID NO. Олигонуклеотиды, показанные на фиг.37, включают SEQ ID NO: 9, 13, 10, 14, 2, 1, 11, 12 и 3. Концентрация олигонуклеотида, используемого для продуцирования конкретного значения, показана вдоль оси Х (мкМ). Показанные данные отражают значения для трех доноров. Под SEQ ID NO приведено обозначение применительно к классу ODN. Сss = полумягкий С-класс, С = С-класс, B = B-класс, не-CpG = ODN без неметилированного CpG. Далее клетки окрашивают антителами против CD86, CD80, CD19 и CD14 и анализируют методом проточной цитометрии. Приведенные данные представляют собой среднее значение интенсивности флуоресценции.
На фиг.38 показана группа графиков, демонстрирующих экспрессию CD80 на моноцитах после экспозиции данных клеток в течение 48 часов с олигонуклеотидами, перечисленными ниже по оси Х графика в виде SEQ ID NO. Олигонуклеотиды, показанные на фиг.38, включают SEQ ID NO: 9, 13, 10, 14, 2, 1, 11, 12 и 3. Концентрация олигонуклеотида, соответствующая конкретному значению на графике, показана на оси Х (мкМ). Показанные данные отражают значения для трех доноров. Под SEQ ID NO приведено обозначение применительно к классу ODN. Сss = полумягкий С-класс, С = С-класс, B = B-класс, не-CpG = ODN без неметилированного CpG. Далее клетки окрашивают антителами против CD86, CD80, CD19 и CD14 и анализируют методом проточной цитометрии. Приведенные данные представляют собой среднее значение интенсивности флуоресценции.
На фиг.39 показана группа графиков, демонстрирующих экспрессию CD80 на плазмацитоидных дендритных клетках после экспозиции данных клеток в течение 48 часов с олигонуклеотидами, перечисленными по оси Х графика в виде SEQ ID NO. Олигонуклеотиды, показанные на фиг.39, включают SEQ ID NO: 9, 13, 10, 14, 2, 1, 11, 12 и 3. Концентрация олигонуклеотида, соответствующая конкретному значению на графике, показана на оси Х (мкМ). Показанные данные отражают значения для трех доноров. Под SEQ ID NO приведено обозначение применительно к классу ODN. Сss = полумягкий С-класс, С = С-класс, B = B-класс, не-CpG = ODN без неметилированного CpG. Далее клетки окрашивают антителами против CD86, CD11с, CD123 и HLA-DR и анализируют методом проточной цитометрии. Приведенные данные представляют собой среднее значение интенсивности флуоресценции.
На фиг.40 показана группа графиков, демонстрирующих уровни экспрессии внутриклеточного IP-10 в B-клетках (40В) и моноцитах (40А) после экспозиции данных клеток в течение 24 часов с олигонуклеотидами, перечисленными в пояснениях к графику в виде SEQ ID NO. Каждое значение представляет собой вычисленное среднее значение интенсивности флуоресценции для трех доноров. Клетки инкубируют с указанными концентрациями ODN в течение 24 часов. Далее клетки окрашивают и анализируют методом проточной цитометрии.
На фиг.41 показана группа графиков, демонстрирующих уровни экспрессии внутриклеточного IP-10 в моноцитах после экспозиции данных клеток в течение 24 часов с олигонуклеотидами, перечисленными по оси Х графика в виде SEQ ID NO. Олигонуклеотиды, показанные на фиг.41, включают SEQ ID NO: 9, 13, 10, 14, 2, 1, 11, 12 и 3. Концентрация олигонуклеотида, соответствующая конкретному значению на графике, показана на оси Х (мкМ). Показанные данные отражают средние значения для трех доноров. Под SEQ ID NO приведено обозначение применительно к классу ODN. Сss = полумягкий С-класс, С = С-класс, B = B-класс, не-CpG = ODN без неметилированного CpG. Далее клетки окрашивают антителами против CD14, CD19 и IP-10 и анализируют методом проточной цитометрии. Приведенные данные представляют собой среднее значение интенсивности флуоресценции.
На фиг.42 показана группа графиков, демонстрирующих уровни экспрессии внутриклеточного IP-10 в В-клетках после экспозиции данных клеток в течение 24 часов с олигонуклеотидами, перечисленными по оси Х графика в виде SEQ ID NO. Олигонуклеотиды, показанные на фиг.42, включают SEQ ID NO: 9, 13, 10, 14, 2, 1, 11, 12 и 3. Концентрация олигонуклеотида, соответствующая конкретному значению на графике, показана на оси Х (мкМ). Показанные данные отражают средние значения для трех доноров. Под SEQ ID NO приведено обозначение применительно к классу ODN. Сss = полумягкий С-класс, С = С-класс, B = B-класс, не-CpG = ODN без неметилированного CpG. Далее клетки окрашивают антителами против CD14, CD19 и IP-10 и анализируют методом проточной цитометрии. Приведенные данные представляют собой среднее значение интенсивности флуоресценции.
На фиг.43 показана группа графиков, демонстрирующих сравнение способностей SEQ ID NO: 2 и ее фрагментов (SEQ ID NO: 15-17) индуцировать секрецию цитокинов из спленоцитов мышей. Анализированные цитокины включают IFNα (43A), IFNγ (43B), IP-10 (43C), IL-6 (43D), IL-10 (43E) и THFα (43F).
На фиг.44 показана группа графиков, демонстрирующих сравнение способностей SEQ ID NO: 2 и ее фрагментов (SEQ ID NO: 18-20) индуцировать секрецию цитокинов из спленоцитов мышей. Анализированные цитокины включают IFNα (44A), IFNγ (44B), IP-10 (44C), IL-6 (44D), IL-10 (44E) и THFα (44F).
На фиг.45 показана группа графиков, демонстрирующих сравнение способностей SEQ ID NO: 2 и ее фрагментов (SEQ ID NO: 21-23) индуцировать секрецию цитокинов из спленоцитов мышей. Анализированные цитокины включают IFNα (45A), IFNγ (45B), IP-10 (45C), IL-6 (45D), IL-10 (45E) и THFα (45F).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
В настоящем изобретении описывается подгруппа полумягких иммуностимулирующих олигонуклеотидов С-класса. Иммуностимулирующие олигонуклеотиды по настоящему изобретению в некоторых вариантах его реализации обладают улучшенными свойствами, в том числе сходной или повышенной эффективностью, сниженным системным воздействием на почки, печень и селезенку и могут обладать пониженной реактогенностью в местах инъекции. Хотя заявители не ограничиваются каким-либо механизмом действия, вероятно, указанные улучшенные свойства связаны со стратегически правильным размещением в иммуностимулирующих олигонуклеотидах фосфодиэфирных или подобных фосфодиэфирным «межнуклеотидных связей». Термин «межнуклеотидная связь» в контексте настоящего описания относится к ковалентному скелету, соединяющему два соседних нуклеотида в молекуле нуклеиновой кислоты. Ковалентная скелетная связь, как правило, представляет собой модифицированную или немодифицированную фосфатную связь, но возможны также и другие модификации. Так, например, линейный олигонуклеотид, который содержит в длину n нуклеотидов, имеет всего n-1 межнуклеотидных связей. Указанные ковалентные скелетные связи могут быть модифицированными или немодифицированными в иммуностимулирующих олигонуклеотидах по настоящему изобретению.
В частности, фосфодиэфирные или подобные фосфодиэфирным межнуклеотидные связи включают «внутренние динуклеотиды». Термин «внутренний динуклеотид» в основном означает любую пару соседних нуклеотидов, соединенных межнуклеотидной связью, где ни один из нуклеотидов данной пары нуклеотидов не представляет собой конечный нуклеотид, то есть ни один из нуклеотидов в данной паре нуклеотидов не представляет собой нуклеотид, определяющий 5' или 3' конец олигонуклеотида. Так, линейный олигонуклеотид, который содержит в длину n нуклеотидов, включает в целом n-1 динуклеотидов и только n-3 внутренних динуклеотидов. Каждая межнуклеотидная связь во внутреннем динуклеотиде представляет собой внутреннюю межнуклеотидную связь. Так, линейный олигонуклеотид, который включает в длину n нуклеотидов, содержит в целом n-1 межнуклеотидных связей и только n-3 внутренних межнуклеотидных связей. Стратегически размещенные фосфодиэфирные или подобные фосфодиэфирным межнуклеотидные связи исходя из этого относятся к фосфодиэфирным или подобным фосфодиэфирным межнуклеотидным связям, расположенным между любой парой нуклеотидов в последовательности нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах фосфодиэфирные или подобные фосфодиэфирным межнуклеотидные связи не располагаются между парой нуклеотидов, ближайших к 5' или 3' концу.
Настоящее изобретении основано, по меньшей мере в некоторых своих аспектах, на неожиданном открытии того факта, что специфические полумягкие олигонуклеотиды С-класса, описанные в настоящем документе, обладают иммуностимулирующей активностью и предпочтительно могут использоваться при лечении аллергии и астмы. В большинстве случаев указанные молекулы обладают по меньшей мере такой же или чаще более высокой иммуностимулирующей активностью, чем соответствующие полностью стабилизированные иммуностимулирующие олигонуклеотиды, имеющие такую же нуклеотидную последовательность.
Полумягкий олигонуклеотид представляет собой иммуностимулирующий олигонуклеотид с частично стабилизированным скелетом, в котором фосфодиэфирные или подобные фосфодиэфирным межнуклеотидные связи находятся только в составе по меньшей мере одного внутреннего пиримидин-пуринового (YZ, предпочтительно CG) динуклеотида. Полумягкие олигонуклеотиды в основном характеризуются повышенной иммуностимулирующей активностью по сравнению с соответствующими полностью стабилизированными иммуностимулирующими олигонуклеотидами. В связи с повышенной эффективностью полумягких олигонуклеотидов указанные полумягкие олигонуклеотиды могут использоваться в более низких эффективных концентрациях и могут иметь пониженные эффективные дозы, чем обычно использующиеся полностью стабилизированные иммуностимулирующие олигонуклеотиды, для достижения желательного биологического эффекта.
Тогда как полностью стабилизированные иммуностимулирующие олигонуклеотиды могут демонстрировать максимальный пик в кривой доза-ответ, полумягкие олигонуклеотиды по настоящему изобретению, по всей видимости, характеризуются монотонно возрастающими кривыми доза-ответ (при оценке по TLR9 стимуляции), которые поднимаются до более высоких концентраций относительно оптимальной концентрации соответствующих полностью стабилизированных иммуностимулирующих олигонуклеотидов. Так, можно полагать, что полумягкие олигонуклеотиды по настоящему изобретению могут индуцировать повышенную иммуностимуляцию в отличие от полностью стабилизированных иммуностимулирующих олигонуклеотидов.
В то время как полностью стабилизированные иммуностимулирующие олигонуклеотиды длиной менее 20 нуклеотидов могут обладать умеренной иммуностимулирующей активностью в сравнении с более длинными (например, содержащими в длину 24 нуклеотида) полностью стабилизированными олигонуклеотидами, полумягкие нуклеотиды, содержащие до 16 нуклеотидов в длину, как было показано, имеют иммуностимулирующую активность, по меньшей равную иммуностимулирующей активности полностью стабилизированных иммуностимулирующих олигонуклеотидов длиной свыше 20 нуклеотидов.
В некоторых случаях замена в 6-членном фосфоротиоатном олигонуклеотиде, который не обладает иммуностимулирующей активностью, даже одной фосфодиэфирной внутренней CG межнуклеотидной связью фосфоротиоатной связи приводит к появлению у соответствующего 6-членного нуклеотида иммуностимулирующей активности.
Таким образом, размер (то есть число нуклеотидных остатков в длине олигонуклеотида) иммуностимулирующего олигонуклеотида может также влиять на поддержание иммуностимулирующей активности олигонуклеотида. Минимальная длина иммуностимулирующих нуклеотидов, которая способствовала бы процессу поглощения клетками, может составлять 6 нуклеотидных остатков. Олигонуклеотиды любого размера более чем 6 нуклеотидов (даже с длиной, включающей много т.н.), обладают способностью индуцировать иммунный ответ по настоящему изобретению, если в них присутствует достаточное количество иммуностимулирующих мотивов, поскольку более крупные нуклеиновые кислоты разлагаются внутри клеток. Авторы настоящего изобретения полагают, что полумягкие олигонуклеотиды длиной до 4 нуклеотидов также будут обладать иммуностимулирующей активностью, если они смогут быть доставлены во внутреннюю часть клетки. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения иммуностимулирующие олигонуклеотиды имеют в длину от 4 до 100 нуклеотидов. В характерных вариантах осуществления настоящего изобретения иммуностимулирующие олигонуклеотиды имеют длину от 6 до 40 или от 10 до 40 нуклеотидов. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения иммуностимулирующие олигонуклеотиды имеют длину от 6 до 19 или от 6 до 24 нуклеотидов.
Считается также, что указанные выше свойства полумягких нуклеотидов в основном усиливаются при повышении «дозы» фосфордиэфирных или подобных фосфордиэфирным межнуклеотидных связей, включающих внутренние CG динуклеотиды. Таким образом, считается, например, что в основном для данной олигонуклеотидой последовательности, включающей пять внутренних CG динуклеотидов, олигонуклеотид с пятью внутренними фосфодиэфирными или подобными фосфодиэфирным CG межнуклеотидными связями обладают большей иммуностимулирующей активностью, чем олигонуклеотиды с четырьмя внутренними фосфодиэфирными или подобными фосфодиэфирным CG межнуклеотидными связями, которые, в свою очередь, будут обладать большей иммуностимулирующей активностью, чем олигонуклеотид с тремя внутренними фосфодиэфирными или подобными фосфодиэфирным CG межнуклеотидными связями, и которые, в свою очередь, будут обладать большей иммуностимулирующей активностью, чем олигонуклеотид с двумя внутренними фосфодиэфирными или подобными фосфодиэфирным CG межнуклеотидными связями, и которые, в свою очередь, будут обладать большей иммуностимулирующей активностью, чем олигонуклеотид с одной внутренней фосфодиэфирной или подобной фосфодиэфирной CG межнуклеотидной связью. Важен тот факт, что включение даже одной внутренней фосфодиэфирной или подобной фосфодиэфирной CG межнуклеотидной связи, как считается, будет превышать эффект по сравнению с отсутствием внутренней фосфодиэфирной или подобной фосфодиэфирной CG межнуклеотидной связи. Кроме числа фосфодиэфирных или подобных фосфодиэфирным межнуклеотидных связей, на эффективность влияет также их положение в олигонуклеотиде по его длине.
Иммуностимулирующие олигонуклеотиды по настоящему изобретению в основном защищены от быстрой деградации в сыворотке крови. Иммуностимулирующие олигонуклеотиды по настоящему изобретению также в основном защищены от быстрой деградации в большинстве тканей за исключением некоторых тканей, обладающих специфической или избыточной нуклеазной активностью, которая способна деградировать иммуностимулирующий олигонуклеотид. Указанная деградация приводит к снижению количества иммуностимулирующих олигонуклеотидов в таких специфических тканях, и накопление их может вести к нежелательным эффектам в ходе длительной терапии с использованием резистентных к деградации олигонуклеотидов. Олигонуклеотиды по настоящему изобретению в основном содержат кроме фосфодиэфирных или подобных фосфордиэфирных межнуклеотидных связей модификации в предпочтительных внутренних положениях 5' и 3' концов, которые становятся резистентными к деградации. Такие резистентные к деградации концы могут включать любую приемлемую модификацию, приводящую к повышению резистентности против нуклеазного расщепления по сравнению с немодифицированными концами. Так, например, 5' и 3' концы могут быть стабилизированы за счет включения в них по меньшей мере одной фосфатной модификации структуры скелета. В предпочтительном варианте по меньшей мере одна фосфатная модификация структуры скелета по каждому концу представляет собой независимо фосфоротиоатную, фосфородитиоатную, метилфосфонатную или метилфосфоротиоатную межнуклеотидную связь. В другом варианте резистентный к деградации конец включает одну или несколько нуклеотидных единиц, соединенных пептидной или амидной связью по 3' концу. Другие формы стабилизированных концов, включающие, без ограничения, указанные ниже варианты, также входят в состав настоящего изобретения.
Как указывалось выше, олигонуклеотиды по настоящему изобретению включают фосфодиэфирные или подобные фосфодиэфирным межнуклеотидные связи внутри скелета и, необязательно, вблизи внутренних CG динуклеотидов. Такие CG динуклеотиды зачастую представляют собой часть иммуностимулирующих мотивов. Однако олигонуклеотид необязательно будет содержать фосфодиэфирные или подобные фосфордиэфирным связи в каждом иммуностимулирующем мотиве. Дополнительные фосфодиэфирные или подобные фосфодиэфирным связи эффективны также в тех случаях, когда в другом варианте «стабилизированные олигонуклеотиды» подвергаются еще более быстрой деградации в почках.
Фосфодиэфирная межнуклеотидная связь представляет собой тип связи, характерный для природных нуклеиновых кислот. Указанная фосфодиэфирная межнуклеотидная связь содержит атом фосфора, фланкированный двумя мостикообразующими атомами кислорода, и связывается также двумя дополнительными атомами кислорода, один из которых заряжен, а второй не заряжен. Фосфодиэфирная межнуклеотидная связь особенно предпочтительна в том случае, когда важно снизить период полувыведения олигонуклеотида из ткани.
J. Am. Chem. Soc
Межнуклеотидная связь фосфодиэфирного типа представляет собой фосфоросодержащую мостиковую группу, которая химически и/или диастереомерно аналогична фосфодиэфирной. Степени сходства с фосфодиэфирной группой включают чувствительность к нуклеазному расщеплению и способность активировать РНКазу Н. Так, например, фосфодиэфирные, но не фосфоротиоатные, олигонуклеотиды чувствительны к нуклеазному расщеплению, тогда как оба нуклеотида: и фосфодиэфирный, и фосфоротиоатный, активируют РНКазу Н. В предпочтительном варианте межнуклеотидная связь, подобная фосфодиэфирной, представляет собой боранофосфатную (или эквивалентно боранофосфонатную) связь. (патент США Nо. 5177198; патент США Nо. 5859231; патент США Nо. 6160109; патент США Nо. 6207819; Sergueev et al., (1998)  120:9417-27). В другом предпочтительном варианте подобная фосфодиэфирной межнуклеотидная связь представляет собой диастереомерно чистый Rp фосфоротиоат. Считается, что диастеромерно чистый Rp фосфоротиоат более чувствителен к нуклеазному расщеплению и имеет лучшие характеристики по активации РНКазы Н, чем смешанный или диастереомерно чистый Sp фосфоротиоат. Следует также отметить, что в контексте настоящего описания термин «подобная фосфодиэфирной межнуклеотидная связь» специфически исключает фосфородитиоатные и метилфосфонатные межнуклеотидные связи.
in vivo
Иммуностимулирующие молекулы олигонуклеотида по настоящему изобретению имеют химерный скелет. В контексте настоящего описания химерный скелет относится к частично стабилизированному скелету, где по меньшей мере одна межнуклеотидная связь представляет собой фосфодиэфирную или подобную фосфодиэфирной связь и где по меньшей мере одна другая межнуклеотидная связь представляет собой стабилизированную межнуклеотидную связь, где по меньшей мере одна фосфодиэфирная или подобная фосфодиэфирной связь и по меньшей мере одна стабилизированная связь различаются. Поскольку сообщается, что боранофосфатные связи являются более стабилизированными по сравнению с фосфодиэфирными связями, то в связи с химерной природой скелета боранофосфанатные связи могут быть классифицированы как связи, подобные фосфодиэфирной или как стабилизированные, в зависимости от контекста. Например, химерный скелет по настоящему изобретению может в одном из вариантов осуществления включать по меньшей мере одну фосфодиэфирную (фосфодиэфирную или подобную фосфодиэфирной) связь и по меньшей мере одну боранофосфонатную (стабилизированную) связь. В другом варианте осуществления химерный скелет по настоящему изобретению может включать боранофосфонатные (фосфодиэфирные или подобные фосфодиэфирным) и фосфоротиоатные (стабилизированные) связи. Термин «стабилизированная межнуклеотидая связь» означает межнуклеотидную связь, которая относительно устойчива к разложению  (например, через воздействие экзо- или эндонуклеаз) по сравнению с фосфодиэфирной межнуклеотидной связью. Предпочтительные стабилизированные межнуклеотидые связи включают, без ограничения, фосфоротиоатные, фосфородитиоатные, метилфосфонатные и метилфосфоротиоатные связи. Другие стабилизированные межнуклеотидые связи включают, без ограничения, пептидные, алкильные, дефосфо- и другие связи, описанные выше.
Chеm rev
Bioconjugate Chem
Модифицированные скелеты, такие как фосфородитиоаты, могут быть синтезированы с использованием автоматизированных методик с помощью методов фосфорамидатной или Н-фосфонатной химии. Арил- и алкилфосфонаты могут быть получены, например, по процедуре, описанной в патенте США Nо. 4469863; и алкилфосфотриэфиры (в которых заряженный кислородный фрагмент алкилирован в соответствии с описанием патента США Nо. 5023243 и европейского патента Nо. 092574) могут быть получены по методам автоматизированного твердофазного синтеза с использованием коммерчески доступных реактивов. Способы создания других модификаций в скелете ДНК и введения замещений также описаны в литературе (Uhlmann E et al. (1990)  90: 544; Goodchild J (1990)  1: 165). Способы получения химерных олигонуклеотидов также известны. Например, патенты, выданные Ульманну с соавт. (Uhlmann et al), включают описания таких методик.
IRL Press, Oxford, UK
Tetrahedron Lett. 21
J. Am. Chem. Soc. 112
2
4
2
4
Модифицированные ODN со смешанным скелетом могут быть синтезированы с использованием коммерчески доступного синтезатора ДНК в соответствии со стандартными методами фосфорамидатной химии (F.E. Eckstein, «Oligonucleotides and Analogues - A Ptactical Approach» , 1991, и M.D. Matteucci and M.H. Caruthers, , 719 (1980)). После связывания вводят PS связи через реакцию сульфуризации с использованием реактива Бекожа (Becauge) (R.P. Iyer, W. Egan, J.B. Regan and S.L. Beaucage, , 1253 (1990)) (0,075M в ацетонитриле) или с использованием фенилацетилдисульфида (PADS) с последующим кэппингом с использованием уксусного ангидрида, 2,6-лютидина в тетрагидрофуране (1:1:8; объем:объем:объем) и N-метилимидазола (16% в тетрагидрофуране). Стадию кэппинга проводят после реакции сульфуризации для минимизации образования нежелательных фосфодиэфирных (PO) связей в тех положениях, где должны быть расположены фосфоротиоатные связи. В случае введения фосфодиэфирных связей, например в CpG динуклеотиде, промежуточный фосфор-III окисляют путем обработки раствором йода в воде/пиридине. После отщепления от твердой подложки и удаления на конечной стадии защитной группы путем обработки концентрированным аммиаком (15 часов при температуре 50°С) ODN анализируют по методу ВЭЖХ на колонке Gen-Pak Fax (Millipоre-Waters) с использованием градиента NaCl (например: буфера А: 10 мМ NaHPO в ацетонитриле/воде = 1:4/объем:объем; pH 6,8; буфера B: 10 мМ NaHPO, 1,5 NaCl в ацетонитриле/воде = 1:4/объем:объем; 5-60% В в течение 30 минут со скоростью 1 мл/мин) или при проведении капиллярного гель-электрофореза. ODN могут быть очищены методом ВЭЖХ или ЖХБР на колонке Sourсe High (Amersham Pharmacia). Гомогенные фракции после ВЭЖХ объединяют и обессоливают на колонке C18 или путем ультрафильтрации. ODN анализируют с использованием метода масс-спектрометрии в режиме MALDI-TOF для подтверждения расчетной массы.
Олигонуклеотиды по настоящему изобретению могут также включать другие модификации. Такие модификации включают неионные аналоги ДНК, такие как алкил- и арилфосфаты (в которых заряженный фосфонатный кислород замещен алкильной или арильной группой), фосфодиэфиры и алкилфосфотриэфиры, в которых заряженная кислородная группировка алкилирована. Как было показано, олигонуклеотиды, которые содержат диол, такие как тетраэтиленгликоль или гексаэтиленгликоль, на одном или обоих концах, также могут обладать выраженной резистентностью к деградации нуклеазами.
Олигонуклеотиды по настоящему изобретению представляют собой нуклеиновые кислоты, которые содержат специфические последовательности, демонстрирующие иммунный ответ. Такие специфические последовательности, которые демонстрируют иммунный ответ, названы как «иммуностимулирующие мотивы», и олигонуклеотиды, которые содержат иммуностимулирующие мотивы, в настоящем описании обозначены как «иммуностимулирующие молекулы нуклеиновой кислоты» и эквивалентно «иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты» или «иммуностимулирующие олигонуклеотиды». Иммуностимулирующие олигонуклеотиды по настоящему изобретению включают, следовательно, по меньшей мере один иммуностимулирующий мотив. В предпочтительном варианте осуществления иммуностимулирующий мотив представляет собой «внутренний иммуностимулирующий мотив». Термин «внутренний иммуностимулирующий мотив» относится к положению последовательности мотива в составе более длинной последовательности нуклеиновой кислоты, которая превосходит в длину последовательность мотива по меньшей мере на один нуклеотид, присоединенный к обоим, 5' и 3' концам, последовательности иммуностимулирующего мотива.
Иммуностимулирующие олигонуклеотиды включают иммуностимулирующие мотивы, которые представляют собой «CpG динуклеотиды». CpG динуклеотид может быть метилированным или неметилированным. Иммуностимулирующий олигонуклеотид, содержащий по меньшей мере один неметилированный CpG динуклеотид, представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, которая содержит неметилированную последовательность динуклеотида цитозин-гуанин (например, неметилированный 5'-цитидин, за которым следует 3'-гуанозин, присоединенный фосфатной связью), и которая способна активировать иммунную систему, например иммуностимулирующий олигонуклеотид, представляющий собой CpG олигонуклеотид. CpG олигонуклеотиды были описаны в большом числе патентов, опубликованных патентных заявок и других публикаций, включая патенты США No. 6194388; 6207646; 6214806; 6218371; 6239116 и 6339068. Иммуностимулирующий олигонуклеотид, содержащий по меньшей мере один метилированный CpG динуклеотид, представляет собой олигонуклеотид, который содержит метилированную последовательность динуклеотида цитозин-гуанин (например, метилированный 5'-цитидин, за которым следует 3'-гуанозин, присоединенный фосфатной связью), и который активирует иммунную систему.
Недавно появилось сообщение о том, что имеются разные классы CpG олигонуклеотидов. Один класс включает мощные средства активации В-клеток, которые, однако, являются относительно слабыми с точки зрения индукции активации IFN-α и NK-клеток, и этот класс был назван B-классом. CpG олигонуклеотиды B-класса, как правило, полностью стабилизированы и включают неметилированный CpG олигонуклеотид внутри определенной предпочтительной группы оснований. См., например, патенты США No. 6194388; 6207646; 6214806; 6218371; 6239116 и 6339068. Другой класс включает средства, которые являются эффективными для индукции активации IFN-α и NK-клеток, но относительно слабыми по стимуляции В-клеток, и этот класс был обозначен как А-класс. CpG олигонуклеотиды А-класса, как правило, содержат стабилизированные поли-G последовательности на 5' и 3' концах и центральную палиндромную последовательность, включающую CpG олигонуклеотид и фосфодиэфирные связи, длиной по меньшей мере 6 нуклеотидов. См, например, опубликованную патентую заявку PCT/US00/26527 (WO 01/22990).
Еще один класс CpG олигонуклеотидов включает агенты, которые активируют В-клетки и NK-клетки и индуцируют IFN-α; данный класс был обозначен как С-класс. CpG олигонуклеотиды С-класса, как они были изначально охарактеризованы, как правило, полностью стабилизированы, включают последовательность типа B-класса и GC-обогащенный палиндром или близкую к палиндрому структуру. Данный класс был описан в совместно рассматриваемой заявке на патент США 10/224523, зарегистрированной 19 августа 2002 года и опубликованной под номером US 2003/0148976, и в заявке US 10/978283, зарегистрированной 29 октября 2004 года, а также в родственной PCT заявке, опубликованной как WO 2005/042018, полное содержание которых включено в настоящее описании в качестве ссылок.
Олигонуклеотиды С-класса также обозначаются как CpG ODN С-типа. В некоторых вариантах CpG ODN С-типа включают такие сочетания мотивов, в которых один мотив представляет собой CG-обогащенный палиндром или нейтрализующий мотив, а другой мотив представляет собой стимулирующий мотив, например CpG мотив или последовательность TCGTCG.
1
2
1
2
1
2
CpG ODN С-типа может иметь формулу: 5' XDCGHX 3'. X и X представляют собой независимо любую последовательность длиной 0-10 нуклеотидов. D обозначает нуклеотид, отличный от С. С обозначает цитозин. G обозначает гуанин. H обозначает нуклеотид, отличный от G. Последовательность нуклеиновой кислоты также включает последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из группы, состоящей из P и N, расположенных сразу в направлении 5' от X или сразу в направлении 3' от X. N обозначает нейтрализующую последовательность для B-клеток, которая начинается с CGG тринуклеотида и имеет в длину по меньшей мере из 10 нуклеотидов. P обозначает GC-обогащенный палиндром, содержащий последовательность с длиной по меньшей мере 10 нуклеотидов.
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
3
1
3
2
3
2
3
3
3
В некоторых вариантах осуществления иммуностимулирующая нуклеиновая кислота представляет собой 5' NXDCGHX 3', 5' XDCGHXN 3', 5' PXDCGHX 3', 5' XDCGHXP 3', 5' XDCGHXPX 3', 5' XDCGHPX 3', 5' DCGHPX 3', 5' TCGHXPX 3' или 5' DCGHPX 3'. Х представляет собой любую последовательность длиной 0-10 нуклеотидов. В других вариантах иммуностимулирующая нуклеиновая кислота представляет собой 5' DCGHР 3'.
Необязательно D и/или H обозначают тимин (T).
2
В других вариантах H обозначает T и X представляет собой CG, CGT, CGTT, CGTTT или CGTTTT.
2
В соответствии с другими вариантами H представляет собой T и X представляет собой CG или CGTTTT.
В соответствии с другими вариантами С не метилирован.
В некоторых вариантах осуществления изобретения N включает по меньшей мере четыре CG динуклеотида и не более чем два CCG тринуклеотида.
Необязательно P включает по меньшей мере один инозин.
Нуклеиновая кислота может также включать поли-T-последовательность на 5' конце или на 3' конце.
1
2
1
1
1
1
Альтернативно CpG ODN С-типа могут иметь формулу: 5' NPyGNP 3'. G обозначает гуанин. N обозначает любую последовательность длиной 1-6 нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления N включает по меньшей мере 50% пиримидинов и предпочтительно по меньшей мере 50% Т. В других вариантах осуществления N включает по меньшей мере один CG мотив, по меньшей мере один TCG мотив, по меньшей мере один CI мотив, по меньшей мере один TCI мотив, по меньшей мере один IG мотив или по меньшей мере один TIG мотив. В других вариантах осуществления N обозначает TCGG или TCGH. H обозначает нуклеотид, отличный от G.
Py обозначает пиримидин. В других вариантах Py обозначает неметилированный C.
2
2
2
N обозначает любую последовательность длиной 0-30 нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления N включает по меньшей мере 50% пиримидинов и по меньшей мере 50% Т. В других вариантах N не включает какие-либо поли-G или поли-A мотивы.
P обозначает GC-обогащенный палиндром, содержащий последовательность длиной по меньшей мере 10 нуклеотидов. В некоторых вариантах P представляет собой полностью палиндромную последовательность. В других вариантах осуществления P обозначает палиндром, включающий от 1 до 3 последовательных вставочных нуклеотидов. Необязательно вставочные нуклеотиды могут представлять собой TG. В других вариантах осуществления P включает по меньшей мере 3, 4 или 5 C и по меньшей мере 3, 4 или 5 G нуклеотидов. В соответствии с другими вариантами P включает по меньшей мере один инозин.
В одном из вариантов осуществления GC-обогащенный палиндром характеризуется составом оснований, включающим по меньшей мере на две третьих G и C. В другом варианте осуществления GC-обогащенный палиндром характеризуется составом оснований, где по меньшей мере 81% представлен G и C. В некоторых вариантах осуществления GC-обогащенный палиндром имеет в длину примерно 12 нуклеотидов. GC-обогащенный палиндром может состоять исключительно из С и G. В некоторых вариантах GC-обогащенный палиндром может включать по меньшей мере один нуклеотид, который не является ни С, ни G.
В некоторых вариантах осуществления GC-обогащенный палиндром включает по меньшей мере один CGG тример, по меньшей мере один CCG тример или по меньшей мере один CGCG тетрамер. В некоторых вариантах осуществления GC-обогащенный палиндром включает по меньшей мере четыре CG динуклеотида. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления GC-обогащенный палиндром содержит центральный СG динуклеотид.
В некоторых вариантах осуществления GC-обогащенный палиндром представляет собой CGGCGCGCGCCG (SEQ ID NO: 58), CGGCGGCCGCCG (SEQ ID NO: 59), CGACGATCGTCG (SEQ ID NO: 60) или CGACGTACGTCG (SEQ ID NO: 61).
В некоторых вариантах осуществления GC-обогащенный палиндром представляет собой CGCGCGCGCGCG (SEQ ID NO: 62), GCGCGCGCGCGC (SEQ ID NO: 63), CCCCCCGGGGGG (SEQ ID NO: 64), GGGGGGCCCCCC (SEQ ID NO: 65), CCCCCGGGGG (SEQ ID NO: 66) или GGGGGCCCCC (SEQ ID NO: 67).
1
2
В некоторых вариантах NPyGN представляет собой последовательность, выбранную из группы, состоящей из TTTTTCG, TCG, TTCG, TTTCG, TTTTCG, TCGT, TTCGT, TTTCGT и TCGTCGT.
1
2
В соответствии с другими аспектами настоящего изобретения рассматривается иммуностимулирующая нуклеиновая кислота длиной 13-100 нуклеотидов. Нуклеиновая кислота имеет формулу: 5' NPyG/INP 3'. G/I относится к единственному нуклеотиду, который представляет собой G или I. G обозначает гуанин, а I обозначает инозин.
1
2
N представляет собой любую последовательность длиной 1-6 нуклеотидов. Py обозначает пиримидин. N обозначает любую последовательность длиной 0-30 нуклеотидов.
P обозначает палиндром, содержащий последовательность длиной по меньшей мере 10 нуклеотидов. В некоторых вариантах P обозначает GC-обогащенный палиндром. В других вариантах P обозначает IC-обогащенный палиндром.
1
2
NPyIN в некоторых вариантах обозначает TCITCITTTT (SEQ ID NO: 62).
in vitro
Класс олигонуклеотидов, обозначаемый в контексте настоящего описания как олигонуклеотиды модифицированного С-класса, характеризуется тем, что в растворе представлены мономерной формой. Считается, что указанные молекулы нуклеиновой кислоты могут образовывать межмолекулярные дуплексные структуры , что придает им стабильность против нуклеазного расщепления. Считается также, что те же самые указанные молекулы нуклеиновой кислоты могут образовывать межмолекулярные дуплексные структуры и, возможно, даже структуры более высокого порядка в интраэндосомальном пространстве, где, как считается, они проявляют свою биологическую активность.
Олигонуклеотиды модифицированного С-класса описываются 3 основными формулами:
Формула 1
1
1
1
1
2
2
2
K
2
P
1
q
n
2
1
2
1#
2#
n#
3
Z[XYR]N(XYR) Z] (S)N'(N)…(N)(N)S (N)(N)…(N)Z
1
2
3
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
n
1#
2#
n#
1
1#
2
2#
n
n#
n
2
1
2
1#
2#
n#
2
2
n
2
1
2
1#
2#
n#
где каждый из Z, Z и Z представляет собой независимо любую последовательность длиной 0-12 нуклеотидов, которая необязательно включает ненуклеотидный линкер или не содержащий основания безосновный d-спейсер; каждый из Х и Х представляет собой независимо тимидин, дезоксиуридин, дезоксиаденозин или 5-замещенный дезоксиуридин; каждый из Y и Y представляет собой независимо цитозин (С) или модифицированный цитозин; каждый из R и R, независимо представляет собой гуанин (G) или модифицированный гуанин; каждый из N и N' представляет собой независимо любую последовательность длиной 0-12 нуклеотидов, которая необязательно включает ненуклеотидный линкер или не содержащий основания d-спейсер; S представляет собой ненуклеотидный линкер, не содержащий основания линкер (d-спейсер), триэтиленгликолевые единицы или гексаэтиленгликолевые единицы, которые необязательно могут обеспечивать образование 2'5'-, 5'5'-, 3'3'-, 2'2'- или 2'3'-межнуклеодиных связей; S представляет собой любую непалиндромную последовательность длиной 1-10 нуклеотидов или ненуклеодиный линкер, не содержащий основания линкер (d-спейсер), триэтиленгликолевые единицы или гексаэтиленгликолевые единицы; каждый из N, N, … (N) и N, N … N обозначает нуклеотид или модифицированный нуклеотид, где Nспаривается по основанию с N, N спаривается по основанию с N... и N спаривается по основанию с N; k равно целому числу от 1 до 5; n равно целому числу от 2 до 16; p равно целому числу от 1 до 6; q равно целому числу от 0 до 10, и где N…(N)(N)S(N)(N)…(N) включает в длину от 10 до 42 нуклеотидов, S имеет в длину 4-10 нуклеотидов, S включает ненуклеотидный линкер, не содержащий основания линкер (d-спейсер), триэтиленгликолевые единицы или гексаэтиленгликолевые единицы, и/или N…(N)(N)S(N)(N)…(N) характеризуется GС содержанием менее чем на 2/3.
1
2
n
1#
2#
n#
В одном из вариантов осуществления каждый из N, N, … (N) и N, N, … N выбран из С, G или их модификаций, где С спаривается по основанию с G.
1
2
n
1#
2#
n#
В одном из вариантов осуществления каждый из N, N, … (N) и N, N, … N выбран из Т, А или их модификаций, где Т спаривается по основанию с А.
В указанных и других вариантах осуществления каждый из C, G, А и Т может относиться к дезоксинуклеотидам и к соответствующим основаниям цитозину, гуанину, аденину и тимину.
1
2
n
1#
2#
n#
В одном из вариантов осуществления каждый из N, N, … (N) и N, N, … N выбран из С, T, A, G или их модификаций, где С спаривается по основанию с G, T спаривается по основанию с G, A спаривается по основанию с T и A спаривается по основанию с G.
1
2
n
1#
2#
n#
В одном из вариантов осуществления каждый из N, N, … (N) и N, N, … N выбран из немодифицированных или модифицированных нуклеотидов, которые образуют пары оснований, соответствующих формуле Уотсона-Крика.
1
2
n
1#
2#
n#
В одном из вариантов осуществления каждый из N, N, … (N) и N, N, … N выбран из немодифицированных или модифицированных нуклеотидов, которые образуют пары оснований, не соответствующих формуле Уотсона-Крика.
В одном из вариантов осуществления иммуностимулирующая молекула нуклеиновой кислоты включает частично стабилизированный скелет, включающий по меньшей мере одну фосфодиэфирную связь.
В одном из вариантов осуществления иммуностимулирующая молекула нуклеиновой кислоты включает скелет, включающий по меньшей мере одну стабилизированную межнуклеотидную связь.
В одном из вариантов осуществления все межнуклеотидные связи в олигонуклеотиде являются фосфоротиоатными связями.
1
1
2
2
В одном из вариантов осуществления иммуностимулирующая молекула нуклеиновой кислоты включает частично стабилизированный скелет, содержащий фосфодиэфирную связь, соединяющую по меньшей мере один из YR или YR.
1
В одном из вариантов осуществления Y обозначает С.
1
В одном из вариантов осуществления R обозначает G.
1
1
В одном из вариантов осуществления Y обозначает С и R обозначает G.
1
2
В одном из вариантов осуществления X или X обозначает T.
1
2
1
1
В одном из вариантов осуществления X обозначает T, X обозначает T, Y обозначает С, R обозначает G и k равно 1.
1
2
1
1
3
2
В одном из вариантов осуществления X обозначает T, X обозначает T, Y обозначает С, R обозначает G, k равно 1, p равно 1, N и N' и Z, каждый, содержит нулевое число нуклеотидов и Z обозначает TTTT или d(UUUU).
2
В одном из вариантов осуществления S обозначает ненуклеотидный линкер.
2
В одном из вариантов осуществления S содержит по меньшей мере один не содержащий основания d-спейсерный остаток.
В одном из вариантов осуществления олигонуклеотид включает по меньшей мере одну разветвленную ненуклеозидную связь.
В одном из вариантов осуществления иммуностимулирующая молекула нуклеиновой кислоты включает по меньшей мере одну сдвоенную единицу, по меньшей мере одну строенную единицу, или по меньшей мере одну сдвоенную и по меньшей мере одну строенную единицу.
1
В одном из вариантов осуществления S обозначает сдвоенную единицу или строенную единицу.
В одном из вариантов осуществления олигонуклеотид включает по меньшей мере одну 2'5'-, 5'5'-, 3'3'-, 2'2'- или 2'3'-межнуклеотидную связь.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к иммуностимулирующей молекуле нуклеиновой кислоты формулы II:
Формула II
1
1
n-1
2
1
2
1#
2#
n-1#
n#
1
q
3
1
1
1
2
2
2
K
2
P
Z[N)(N)…(N)(N)S(N)(N)…(N) (N)(S)Z[(XYR)N(XYR)Z]
1
2
3
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
n-1
1#
2#
n-1#
n#
1
1#
2
2#
n-1
n-1#
n
n#
n
2
1
2
1#
2#
n#
2
2
n
2
1
2
1#
2#
n#
где каждый из Z, Z и Z обозначает независимо любую последовательность длиной 0-12 нуклеотидов, которая необязательно включает ненуклеотидный линкер или не содержащий основания d-спейсер; каждый из Х и Х обозначает независимо тимидин, дезоксиуридин, дезоксиаденозин или 5-замещенный дезоксиуридин; каждый из Y и Y обозначает независимо цитозин (С) или модифицированный цитозин; каждый R и R независимо обозначает гуанин (G) или модифицированный гуанин; N обозначает любую последовательность длиной 0-12 нуклеотидов, которая необязательно включает ненуклеотидный линкер или не содержащий основания d-спейсер; S обозначает ненуклеотидный линкер, не содержащий основания линкер (d-спейсеры), триэтиленгликолевые единицы или гексаэтиленгликолевые единицы, которые необязательно могут обеспечивать образование 2'5'-, 5'5'-, 3'3'-, 2'2'- или 2'3'-межнуклеодиных связей; S обозначает любую непалиндромную последовательность длиной 1-10 нуклеотидов или ненуклеодиный линкер, не содержащий основания линкер (d-спейсеры), триэтиленгликолевые единицы или гексаэтиленгликолевые единицы; каждый из N, N, … N и N, N … N, (N) обозначает нуклеотид или модифицированный нуклеотид, где Nспаривается по основанию с N, N спаривается по основанию с N,… N спаривается по основанию с N; и N спаривается по основанию с N; k равно целому числу от 1 до 5; n равно целому числу от 2 до 16; p равно целому числу от 1 до 6; q равно целому числу от 0 до 10 и где в том случае, когда N…(N)(N)S(N)(N)…(N) включает в длину от 10 до 42 нуклеотидов, S включает в длину 4-10 нуклеотидов, S включает ненуклеотидный линкер, не содержащий основания линкер (d-спейсеры), триэтиленгликолевые единицы или гексаэтиленгликолевые единицы и/или N…(N)(N)S(N)(N)…(N) характеризуется GС содержанием менее чем на 2/3.
1
n
n-1
В одном из вариантов осуществления Z(N)(N) обозначает TYR, где Y обозначает цитозин или модифицированный цитозин и R обозначает гуанин или модифицированный гуанин.
1
2
n-1
n
1#
2#
n-1#
n#
В одном из вариантов осуществления каждый из N, N, … N, N и N, N, … N, N выбран из С, G или их модификаций, где С спаривается по основанию с G.
1
2
n-1
n
1#
2#
n-1#
n#
В одном из вариантов осуществления каждый из N, N, … N, N и N, N, … N, N выбран из Т, А или их модификаций, где Т спаривается по основанию с А.
В указанных и других вариантах каждый C, G, А или Т может относиться к дезоксинуклеотидам и соответствующим основаниям цитозину, гуанину, аденину и тимину.
1
2
n-1
n
1#
2#
n-1#
n#
В одном из вариантов осуществления каждый из N, N, … N, N и N, N, … N, N выбран из С, T, A, G или их модификаций, где С спаривается по основанию с G, T спаривается по основанию с G, A спаривается по основанию с T и A спаривается по основанию с G.
1
2
n-1
n
1#
2#
n-1#
n#
В одном из вариантов осуществления каждый из N, N, … N, N и N, N, … N, N выбран из немодифицированных или модифицированных нуклеотидов, которые образуют пары оснований, соответствующие формуле Уотсона-Крика.
1
2
n-1
n
1#
2#
n-1#
n#
В одном из вариантов осуществления каждый из N, N, …N, N и N, N, … N, N выбирают из немодифицированных или модифицированных нуклеотидов, которые образуют пары оснований, не соответствующие формуле Уотсона-Крика.
В одном из вариантов осуществления иммуностимулирующая молекула нуклеиновой кислоты содержит частично стабилизированный скелет, включающий по меньшей мере одну фосфодиэфирную связь.
В одном из вариантов осуществления иммуностимулирующая молекула нуклеиновой кислоты включает скелет по меньшей мере с одной стабилизированной межнуклеотидной связью.
В одном из вариантов осуществления все межнуклеотидные связи в олигонуклеотиде являются фосфоротиоатными связями.
1
1
2
2
В одном из вариантов осуществления иммуностимулирующая молекула нуклеиновой кислоты включает частично стабилизированный скелет, содержащий фосфодиэфирную связь, соединяющую по меньшей мере один из YR или YR.
1
В одном из вариантов осуществления Y обозначает С.
1
В одном из вариантов осуществления R обозначает G.
1
1
В одном из вариантов осуществления Y обозначает С и R обозначает G.
1
2
В одном из вариантов осуществления X или X обозначает T.
1
2
1
1
В одном из вариантов осуществления X обозначает T, X обозначает T, Y обозначает С, R обозначает G и k равно 1.
1
2
1
1
3
2
В одном из вариантов осуществления X обозначает T, X обозначает T, Y обозначает С, R обозначает G, k равно 1, p равно 1, N и N' и Z, каждый, содержит нулевое число нуклеотидов и Z обозначает TTTT или d(UUUU).
2
В одном из вариантов осуществления S обозначает ненуклеотидный линкер.
2
В одном из вариантов осуществления S содержит по меньшей мере один не содержащий основания d-спенсерный остаток.
В одном из вариантов осуществления олигонуклеотид включает по меньшей мере одну разветвленную ненуклеозидную связь.
В одном из вариантов осуществления иммуностимулирующая молекула нуклеиновой кислоты включает по меньшей мере одну сдвоенную единицу, по меньшей мере одну строенную единицу или по меньшей мере одну сдвоенную и по меньшей мере одну строенную единицу.
1
В одном из вариантов осуществления S обозначает сдвоенную единицу или строенную единицу.
В одном из вариантов осуществления олигонуклеотид включает по меньшей мере одну 2'5'-, 5'5'-, 3'3'-, 2'2'- или 2'3'-межнуклеотидную связь.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к иммуностимулирующей молекуле нуклеиновой кислоты формулы III:
Формула III
m
3
3
(U)Z(S)
1
1
1
1
2
2
2
K
2
P
1
q
n
3
2
1
2
1#
2#
3#
n#
1
2
3
1
2
1
2
1
2
1
2
3
1
2
n
1#
2#
n#
1
1#
2
2#
3
3#
n
n#
где U обозначает Z[(XYR)N(XYR)Z](S)N'(N)…(N)(N)(N)S(N)(N)(N)…(N); каждый из Z, Z и Z обозначает независимо любую последовательность длиной 0-12 нуклеотидов, которая необязательно включает ненуклеотидный линкер или не содержащий основания d-спейсер; каждый из Х и Х обозначает независимо тимидин, дезоксиуридин, дезоксиаденозин или 5-замещенный дезоксиуридин; каждый из Y и Y обозначает независимо цитозин или модифицированный цитозин; R и R, каждый, независимо обозначает гуанин или модифицированный гуанин; N и N', каждый, обозначает независимо любую последовательность длиной 0-12 нуклеотидов, которая необязательно включает ненуклеотидный линкер или не содержащий основания d-спейсер; S обозначает ненуклеотидный линкер, не содержащий основания линкер (d-спейсеры), триэтиленгликолевые единицы или гексаэтиленгликолевые единицы, которые необязательно могут обеспечивать образование 2'5'-, 5'5'-, 3'3'-, 2'2'- или 2'3'-межнуклеодиных связей; S обозначает любую непалиндромную последовательность длиной 1-10 нуклеотидов или ненуклеотидный линкер, не содержащий основания линкер (d-спейсеры), триэтиленгликолевые единицы или гексаэтиленгликолевые единицы; S обозначает направленную или ненаправленную 2'5'-, 5'5'-, 3'3'-, 2'2'- или 2'3'-межнуклеотидную связь или ненуклеотидный линкер, где указанный ненуклеотидный линкер включает не содержащие основания линкеры (d-спейсеры), триэтиленгликолевые единицы или гексаэтиленгликолевые единицы, облегчающие объединение через 2'5'-, 5'5'-, 3'3'-, 2'2'- или 2'3'-связи m пар в последовательности, каждый из N, N, … N и N, N, … N обозначает любой нуклеотид или модифицированный нуклеотид, где Nспаривается по основанию с N, N спаривается по основанию с N, N спаривается по основанию с N,... и N спаривается по основанию с N; k равно целому числу от 1 до 5; m равно целому числу от 2 до 10; n равно целому числу от 2 до 16; p равно целому числу от 1 до 6; и q равно целому числу от 0 до 10.
1
1
1
1
2
2
2
K
2
P
1
q
В некоторых вариантах Z[(XYR)N(XYR)Z](S) обозначает непалиндромную последовательность.
1
1
1
1
2
2
2
K
2
P
1
q
В некоторых вариантах Z[(XYR)N(XYR)Z](S) обозначает TCGTCGTTTT (SEQ ID NO: 29), TCGTCGTTDD (SEQ ID NO: 30), TCGA, TCGAC, TCGACGTC или TCGACGTCG, где D обозначает d-спейсер.
1
1
1
1
2
2
2
K
2
P
1
q
В некоторых вариантах Z[(XYR)N(XYR)Z](S) обозначает палиндромную последовательность.
1
1
1
1
2
2
2
K
2
P
1
q
В некоторых вариантах Z[(XYR)N(XYR)Z](S) обозначает TCGACGTCGA (SEQ ID NO: 31) или TCGTCGACGA (SEQ ID NO: 32).
1
1
1
1
2
2
2
K
2
P
1
q
В некоторых вариантах Z[(XYR)N(XYR)Z](S) обозначает TCGCGACGTT (SEQ ID NO: 33) или TCGCGTCGTT (SEQ ID NO: 34).
n
2
1
2
1#
2#
n#
3
В одном из вариантов осуществления (N)…(N)(N)S(N)(N)…(N)Z включает последовательность AGCGAAGCT, CAATАTTTАTTG (SEQ ID NO: 35), CCGTTTTGTGG (SEQ ID NO: 36), CGGCGCCGTGCCG (SEQ ID NO: 37), CGGCGCCGTTGCCG (SEQ ID NO: 38), CGGCGDDCGCCG (SEQ ID NO: 39), CGGCGDDDTGCCG (SEQ ID NO: 40), CGGCGGDDCCGCCG (SEQ ID NO: 41), CGGCGTCGCCGCCG (SEQ ID NO: 42), CGTCGACGGGACGGG (SEQ ID NO: 43), CGTCGACGTGACGGG (SEQ ID NO: 44), GAGAGTTGGGCTCTC (SEQ ID NO: 45), GTCGAGGAGGT (SEQ ID NO: 46), TAATADDTATTA (SEQ ID NO: 47), TAATATCCATTA (SEQ ID NO: 48) или TAATATTTATTA (SEQ ID NO: 49), где D обозначает d-спейсер.
n
2
1
2
1#
2#
n#
В одном из вариантов осуществления (N)…(N)(N)S(N)(N)…(N) включают последовательность GGCGCGCTGCCG (SEQ ID NO: 50).
n
1
2
D
D
В одном из вариантов осуществления 5' конец нуклеиновой кислоты начинается с иммуностимулирующего мотива, выбранного из (TCG)N и RCGYYN. T обозначает тимидин, C обозначает неметилированный цитозин, G обозначает гуанин, R обозначает пурин,  не обозначает C, каждый из Y1 и Y2 независимо обозначает пиримидин, n равно целому числу от 1 до 4, включительно, и N обозначает любую последовательность, включающую в длину 0-12 оснований.
3' конец нуклеиновой кислоты заканчивается инвертированным повтором, способным к образованию шпилечной структуры или структуры типа «ствол-петля». Термин «заканчивается» используется применительно к структуре, находящейся на 3' конце или вблизи него. Так, конец вблизи палиндрома может быть расположен именно на 3' конце молекулы или, альтернативно, 3' конец может включать 1 или несколько дополнительных нуклеотидов, которые не являются частью инвертированной повторяющейся структуры. Предпочтительно 3' конец молекулы включает 3 или меньше нуклеотидов, которые не образуют части инвертированной повторяющейся структуры.
В одном из вариантов осуществления «инвертированный повтор», способный к образованию шпилечной структуры или структуры «ствол-петля», в контексте настоящего описания относится к последовательности нуклеотидов, которые образуют GC-обогащенную структуру ствола или шпильки, которые включают в длину 2-10 последовательных пар оснований и по меньшей мере одно неспаренное или некорректно спаренное основание. В отдельных вариантах GC-обогащенный ствол включает 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 последовательных пар оснований в длину. В некоторых вариантах GC-обогащенный ствол включает по меньшей мере 2, 3 или 4 G-C пар оснований.
В одном из вариантов осуществления «инвертированный повтор», способный к образованию шпилечной структуры или структуры «ствол-петля», в контексте настоящего описания относится к последовательности нуклеотидов, которая образуют АТ-обогащенную структуру ствола или шпильки, включающих 2-10 последовательных пар оснований в длину и по меньшей мере одно неспаренное или некорректно спаренное основание. В отдельных вариантах АТ-обогащенный ствол включает 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 последовательных пар оснований в длину. В некоторых вариантах АТ-обогащенный ствол включает по меньшей мере 2, 3 или 4 А-Т пар оснований.
В некоторых примерах по меньшей мере одно неспаренное или некорректно спаренное основание соединяет мостиком концы ствола или шпильки. Это может способствовать формированию вторичной структуры за счет обеспечения гибкой точки в молекуле, позволяющей осуществить спаривание стволов по основаниям и образование шпильки. Альтернативно неспаренные или некорректно спаренные одно или несколько оснований могут находиться внутри ствола. Предпочтительно, если некорректно спаренное основание находится внутри ствола, то ствол включает по меньшей мере 3 пары оснований в длину. Неспаренные или некорректно спаренные одно или несколько оснований могут представлять собой любой нуклеотид. В некоторых вариантах осуществления неспаренное или некорректно спаренное основание представляет собой Т. Неспаренные нуклеотиды на конце двухцепочечной структуры также известны как выступающие нуклеотиды или висящие концы, которые могут в значительной мере стабилизировать образование дуплекса или образование шпилечной структуры (Freier SM et al., (1983) Effects of 3' dangling end stacking on the stability of GGCC and CCGG double helixes. Biochemistry 22: 6198-206).
Нуклеиновая кислота также включает частично стабилизированный скелет, включающий по меньшей мере одну фосфодиэфирную 5'-CpG-3'связь.
В некоторых случаях двухцепочечная часть молекулы может также содержать неприродные (нестандартные) пары оснований (например, диаминопиридин, спаренный с ксантозином). (Lutz MJ et al., (1998) Recognition of a non-standard base pair by thermostable DNA polymerases. Bioorg Med Chem Lett 8: 1149-52).
Приведенные формулы определяют подмножества классов CpG олигонуклеотидов, которые демонстрируют прекрасные иммуностимулирующие свойства. В указанных формулах 5' относится к свободному 5' концу олигонуклеотида и 3' относится к свободному 3' олигонуклеотида.
D
D
1
2
2
1
n
n
Олигонуклеотиды могут содержать один или несколько доступных 5' или 3' концов. В некоторых вариантах осуществления 3' может быть соединен с другим 3' концом. Поскольку важность 5' и 3' мотивов была продемонстрирована и описана авторами настоящего изобретения, возможно также создать модифицированные олигонуклеотиды, содержащие два таких 5' или 3' конца. Это может быть достигнуто, например, за счет присоединения двух олигонуклеотидов через 3'-3'-связь с образованием олигонуклеотида, содержащего один или два доступных 5' конца. Такая структура может иметь формулу, например, 5'-RCGYYN-NYYGCR-5' (где D обозначает не С; SEQ ID NO: 51) или 5'-(TCG)N-N(GCT)-5' (SEQ ID NO: 52). 3'3'- или 5'5'-связь может быть фосфодиэфирной, фосфоротиоатной или любой другой модифицированной межнуклеотидной мостиковой связью. Методы образования таких связей известны в данной области. Например, образование указанных связей описано в работе Селигера с соавт. (Seliger H et al., (1991) Oligonucleotide analogs with terminal 3'3'- and 5'5'-internucleotidic linkages as antisense inhibitors of viral gene expression, Nucleosides & Nucleotides 10: 469-77 and Jiang Z et al. (1999) Pseudo-cyclic oligonucleotides: in vitro and in vivo properties, Bioorg Med Chem 7: 2727-35).
В некоторых вариантах олигонуклеотид имеет одну из приведенных ниже структур: TCGTCGTTTTA (SEQ ID NO: 53), CGGCGCCGTGCCG (SEQ ID NO: 54), CGGCGTCGTGCCG (SEQ ID NO: 55), TCGTCGTTTTACGGCGCCGTGCCG (SEQ ID NO: 56), TCGTCGTTTTACGGCGTCGTGCCG (SEQ ID NO: 57).
В одном своем аспекте настоящее изобретение относится к открытию того факта, что специфический подкласс С-класса СpG иммуностимулирующих олигонуклеотидов, имеющих химерный скелет, обладает высокой эффективностью в качестве соединений, опосредующих иммуностимулирующие эффекты. Указанные СpG олигонуклеотиды используются терапевтически и профилактически для стимуляции иммунной системы при лечении рака, инфекционных заболеваний, аллергии, астмы, аутоиммунного заболевания и других расстройств, и как вспомогательное средство профилактики инфекций условно патогенными микроорганизмами после проведения противораковой химиотерапии. Сильные, но сбалансированные клеточные и гуморальные иммунные эффекты, возникающие в результате стимуляции под действием СpG, отражают собственную природную систему защиты организма против внедряющихся патогенов и раковых клеток.
Настоящее изобретение включает в одном своем аспекте открытие того факта, что подмножество СpG иммуностимулирующих олигонуклеотидов обладает улучшенными иммуностимулирующими свойствами и сниженным воспалительным воздействием на почки. В некоторых случаях воспаление почек наблюдалось у индивидуумов, которым вводили полностью фосфоротиоатные олигонуклеотиды. Считается, что химерные олигонуклеотиды по настоящему изобретению в меньшей степени вызывают воспаление почек, чем полностью фосфоротиоатные олигонуклеотиды. Дополнительно указанные олигонуклеотиды характеризуются высокой эффективностью с точки зрения стимуляции иммунного ответа. Так, фосфодиэфирный участок молекулы не снижает ее эффективности.
Предпочтительные СpG иммуностимулирующие олигонуклеотиды описываются одной из приведенных ниже 7 основных формул:
2
1
1
3
1
1
2
3
5' TTC_GXC_GNX_GXC_GTT 3' (SEQ ID NO: 24), где N включает 1-3 нуклеотидов в длину и где N относится к любому нуклеотиду, X обозначает пиримидин, X и X обозначают любой нуклеотид.
1
1
5' TTC_GTC_GTTTX_GTC_GTT 3' (SEQ ID NO: 25), где X обозначает пиримидин.
1
1
5' T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*X_G*T*C_G*T*T* 3' (SEQ ID NO: 25), где Х обозначает пиримидин.
1
2
1
3
2
1
2
1
2
3
5' TC_GXC_GXN XC_GNCG 3' (SEQ ID NO: 26), где N включает 0-3 нуклеотидов в длину, N включает 0-9 нуклеотидов в длину, N относится к любому нуклеотиду и X, X и X обозначают любой нуклеотид.
1
1
1
5' TC_GTC_GTNTC_GGCGCNGCCG 3' (SEQ ID NO: 27), где N включает 0-3 нуклеотидов в длину.
1
1
1
5' T*C_G*T*C_G*T*N*T*C_G*G*C*G*CNG*C*C*G 3' (SEQ ID NO: 27), где N включает 0-3 нуклеотидов в длину.
1
2
3
3
3
1
2
3
5' TC_GXC_GXC_GXTC_GGCGC_GN  3' (SEQ ID NO: 28), где N включает 1-5 нуклеотидов в длину, N относится к любому нуклеотиду и X, X и X обозначают любой нуклеотид.
Необязательно, в указанных формулах 5' относится к свободному 5' концу олигонуклеотида и 3' относится к свободному 3' концу олигонуклеотида.
Символ *, используемый в формулах, относится к наличию стабилизированной межнуклеотидной связи. Символ _ в данных структурах относится к наличию фосфодиэфирной межнуклеотидной связи. Межнуклеотидные связи, не маркированные знаком *, могут быть стабилизированными или нестабилизированными, тогда как олигонуклеотид включает по меньшей мере 2-3 фосфодиэфирных или подобных фосфодиэфирным межнуклеотидных связей. В некоторых вариантах предпочтительно, чтобы олигонуклеотиды включали 3-6 фосфодиэфирных или подобных фосфодиэфирным межнуклеотидных связей. В некоторых случаях связи между CG мотивами являются фосфодиэфирными и в других случаях они являются фосфоротиоатными или другими стабилизированными связями.
В некоторых вариантах олигонуклеотид имеет одну из следующих структур:
T*C_G*T*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G (SEQ ID NO: 2)
T*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*G*C*C*G (SEQ ID NO: 3)
TC_GTC_GAC_GATC_GGCGC_GCGCCG (SEQ ID NO: 4)
T*C_G*T*C_G*A*C_G*A*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G (SEQ ID NO: 4)
T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 5)
T*T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T* (SEQ ID NO: 6)
TCGTCGTTCGGCGCGCCG (SEQ ID NO: 3)
TCGTCGTCGTTCGGCGCGCGCCG (SEQ ID NO: 2)
TCGTCGACGATCGGCGCGCGCCG (SEQ ID NO: 4)
TTCGTCGTTTTGTCGTT (SEQ ID NO: 5)
TTTCGTCGTTTCGTCGTT (SEQ ID NO: 6)
TCGTCGTC
CGTCGTCG
GTCGTCGT
TCGTCGTT
CGTCGTTC
GTCGTTCG
TCGTTCGG
CGTTCGGC
GTTCGGCG
TTCGGCGC
TCGGCGCG
CGGCGCGC
GGCGCGCG
GСGCGCGC
CGCGCGCC
GCGCGCCG
T*C_G*T*C_G*T*C
C_G*T*C_G*T*C_G
G*T*C_G*T*C_G*T
T*C_G*T*C_G*T*
C*G*T*C_G*T*T*C
G*T*C*_G*T*T*C_G
T*C_G*T*T*C_G*G
C_G*T*T*C_G*G*C
G*T*T*C_G*G*C*G
T*T*C_G*G*C*G*C
T*C*_G*G*C*G*C_G
C_G*G*C*G*C_G*C
G*G*C*G*C_G*C*G
-
G*C*G*CG*C*G*C
C*G*C_G*C*G*C*C
G*C_G*C*G*C*C*G
Термины «нуклеиновая кислота» и «олигонуклеотид» также охватывают нуклеиновые кислоты и олигонуклеотиды с замещениями или модификациями, такими как замещения и модификации в составе оснований и/или сахаров. Например, к ним относятся олигонуклеотиды, содержащие сахарные скелеты, которые ковалентно присоединены к низкомолекулярным органическим группам, отличным от гидроксильной группы в 2' положении и отличным от фосфатной группы или гидроксигруппы в 5' положении. Так, модифицированные олигонуклеотиды могут включать 2'-О-алкилированную рибозную группу. Кроме того, модифицированные олигонуклеотиды могут включать вместо рибозы такие сахара, как арабиноза или 2'-фторарабиноза. Таким образом, указанные олигонуклеотиды могут быть гетерогенными по составу скелета, что определяет наличие любых возможных комбинаций полимерных единиц, соединенных вместе, таких как пептид-нуклеиновые кислоты (которые имеют аминокислотный скелет с включением оснований нуклеиновых кислот).
Нуклеиновые кислоты также включают замещенные пурины и пиримидины, такие как С-5 пропиновый пиримидин и 7-деаза-7-замещенные модифицированные пуриновые основания (Wagner RW et al. (1996) Nat Biotechnol 14: 840-4). Пурины и пиримидины включают, без ограничения, аденин, цитозин, гуанин, тимин, 5-метилцитозин, 5-гидроксицитозин, 5-фторцитозин, 2-аминопурин, 2-амино-6-хлорпурин, 2,6-диаминопурин, гипоксантин и другие природные и неприродные основания нуклеиновых кислот, замещенные и незамещенные ароматические фрагменты. Другие такие модификации также известны специалистам в данной области.
Иммуностимулирующие олигонуклеотиды по настоящему изобретению могут включать различные химические модификации и замещения в сравнении с природной РНК и ДНК и включают фосфодиэфирные межнуклеотидные мостиковые связи, β-D-рибозную единицу и/или природное нуклеотидное основание (аденин, гуанин, цитозин, тимин, урацил). Примеры химических модификаций известны специалистам в данной области и описаны в литературе (см., например, Uhlmann E et al., (1990) Chem Rev 90: 543; «Protocols for Oligonucleotides and Analogs» Synthesis and Properties & Synthesis and Analytical Techniques, S. Agrawal, Ed, Humana Press, Totowa, USA 1993; Crooke ST et al. (1996) Annu Rev Pharmacol Tоxicol 36: 107-129; и Hunziker J et al (1995) Mod Synth Methods 7: 331-417). Олигонуклеотид по настоящему изобретению может содержать одну или несколько модификаций, где каждая модификация расположена в положении определенного фосфодиэфирного межнуклеотидного мостика и/или определенной β-D-рибозной единицы и/или определенного природного основания относительно олигонуклеотида с последовательностью, соответствующей природным ДНК или РНК.
Например, настоящее изобретение относится к олигонуклеотиду, который может включать одну или несколько модификаций и где каждая модификация независимо выбирается из следующего перечня:
а) замещение фосфодиэфирного межнуклеотидного мостика, расположенного на 3' и/или 5' конце нуклеотида, модифицированным межнуклеотидным мостиком,
b) замещение фосфодиэфирного мостика, расположенного на 3' и/или 5' конце нуклеотида, дефосфо-мостиком,
c) замещение сахарофосфатной единицы из сахарофосфатного скелета другой единицей,
d) замещение β-D-рибозной единицы межнуклеотидной сахарной единицей и
e) замещение природного нуклеотидного основания модифицированным нуклеотидным основанием.
Ниже на примерах иллюстрируются более подробно химические модификации олигонуклеотидов.
1
2
1
2
1
2
1
21
6
12
1
21
1
8
6
12
7
12
6
12
6
20
6
14
1
18
6
20
6
14
1
8
1
8
1
4
Фосфодиэфирный межнуклеотидный мостик, расположенный на 3' и/или 5' конце нуклеотида, может быть замещен модифицированным межнуклеотидным мостиком, где указанный модифицированный межнуклеотидный мостик выбирают, например, из фосфоротиоата, фосфородитиоата, NRR-фосфорамидата, боранофосфата, α-гидроксибензилфосфоната, фосфат-(C-C)-О-алкилового сложного эфира, фосфат-[(C-C)арил-(C-C)-О-алкил]сложного эфира, (C-C)алкилфосфонатного и/или (C-C)арилфосфонатного мостиков, (C-C)-α-гидроксиметиларила (например, описанного в WO 95/01363), где (C-C)арил, (C-C)арил и (C-C)арил необязательно могут быть замещены галогеном, алкилом, алкокси, нитро, циано, и где R и R обозначают независимо друг от друга водород, (C-C)алкил, (C-C)арил, (C-C)арил-(C-C)алкил, предпочтительно водород, (C-C)алкил, предпочтительно (C-C)алкил и/или метоксиэтил, или R и R образуют вместе с атомом азота, содержащего их, 5-6-членное гетероциклическое кольцо, которое может дополнительно включать другой гетероатом, выбранный из группы O, S и N.
Замещение фосфодиэфирного мостика, расположенного на 3' и/или 5' конце нуклеотида, дефосфо-мостиком (дефосфо-мостики описаны, например, в работе Uhlmann E and Peyman A «Methods in Molecular Biology», Vol. 20, «Protocols for Oligonucleotides and Analogs», S. Agrawal, Ed, Humana Press, Totowa 1993; Chapter 16, pp. 355 ff), где дефосфо-мостик выбирают, например, из дефосфо-мостиков на основе формацеталя, 3'-тиоформацеталя, метилгидроксиламино, оксима, метилендиметилгидразо, диметиленсульфоновых и/или силильных групп.
Сахарофосфатная единица (например, β-D-рибоза и фосфодиэфирный межнуклеотидный мостик, образующие вместе сахарофосфатную единицу) из сахарофосфатного скелета (например, сахарофосфатного скелета, состоящего из сахарофосфатных единиц) может быть замещена другой единицей, где другая единица подходит, например, для образования «морфолино-производного» олигомера (описанного, например, в работе Stirchak EP et al. (1989) Nucleic Acid Res 17: 6129-41), например, в результате замещения морфолино-производной единицей; или для образования полиамидной нуклеиновой кислоты (PNA, описанной, например, в работе Nielsen PE et al. (1994) Bioconjug Chem 5:3-7), например, в результате замещения единицы PNA скелета, осуществляемого, в частности, с использованием 2-аминоэтилглицина.
1
6
1
6
2
6
1
6
1
6
2
β-рибозная единица или β-D-2'-дезоксирибозная единица может быть замещена модифицированной сахарной единицей, где модифицированную сахарную единицу выбирают, например, из β-D-рибозы, α-D-2'-дезоксирибозы, L-2'-дезоксирибозы, 2'-F-2'-дезоксирибозы, 2'-F-арабинозы, 2'-О-(C-C)алкилрибозы, предпочтительно, 2'-О-(C-C)алкилрибоза представляет собой 2'-О-метилрибозу, 2'-О-(C-C)алкенилрибозу, 2'-[О-(C-C)алкил-О-(C-C)алкил]рибозу, 2'-NH-2'-дезоксирибозу, β-D-ксилофуранозу, α-арабинофуранозу, 2,4-дидезокси-β-D-эритрогексопиранозу и карбоциклическую группу (как описано, например, в работе Froehler J (1992) Am Chem Soc 114: 8320) и/или сахарных аналогов с раскрытой цепью (как описано, например, в работе Vandendriessche et al. (1993) Tetrahedron 49: 7223) и/или дициклосахарных аналогов (как описано, например, в работе Tarkov M et al., (1993) Helv Chim Acta 76: 481).
В некоторых предпочтительных вариантах сахар представляет собой 2'-О-метилрибозу, в особенности для случая одного или обоих нуклеотидов, соединенных фосфодиэфирной или подобной фосфодиэфирной межнуклеотидной связью.
1
6
2
6
2
6
1
6
2
6
2
6
2
Модифицированное основание представляет собой любое основание, которое химически отличается от природных оснований, обычно встречающихся в ДНК и РНК, таких как T, C, G, A и U, но которые имеют общую базовую химическую структуру с природными основаниями. Модифицированные нуклеотидные основания могут быть выбраны, например, из гипоксантина, урацила, дигидроурацила, псевдоурацила, 2-тиоурацила, 4-тиоурацила, 5-аминоурацила, 5-(C-C)алкилурацила, 5-(C-C)алкенилурацила, 5-(C-C)алкинилурацила, 5-(гидроксиметил)урацила, 5-хлорурацила, 5-фторурацила, 5-бромурацила, 5-гидроксицитозина, 5-(C-C)алкилцитозина, 5-(C-C)алкенилцитозина, 5-(C-C)алкинилцитозина, 5-хлорцитозина, 5-фторцитозина, 5-бромцитозина, N-диметилгуанина, 2,4-диаминопурина, 8-азапурина, замещенного 7-деазапурина, предпочтительно 7-деаза-7-замещенного и/или 7-деаза-8-замещенного пурина, 5-гидроксиметилцитозина, N4-алкилцитозина, например N4-этилцитозина, 5-гидроксидезоксицитидина, 5-гидроксиметилдезоксицитидина, N4-алкилдезоксицитидина, например, N4-этилдезоксицитидина, 6-тиодезоксигуанозина и дезоксирибонуклеотидов нитропиррола, С5-пропинилпиримидина и диаминопурина, например 2,6-диаминопурина, инозина, 5-метилцитозина, 2-аминопурина, 2-амино-6-хлорпурина, гипоксантина или других модификаций природных нуклеотидных оснований. Список является лишь иллюстративным, и его не следует трактовать как ограничивающий.
Олигонуклеотиды могут содержать один или несколько доступных 5' концов. Возможно создать модифицированные олигонуклеотиды, содержащие два таких 5' конца. Этого можно достичь, например, путем объединения двух олигонуклеотидов через 3'-3' связь с образованием олигонуклеотида, содержащего один или два доступных 5' конца. 3'3'-связь может быть фосфодиэфирной, фосфоротиоатной или любой другой модифицированной межнуклеотидной мостиковой связью. Методы создания таких связей известны в данной области. Например, такие связи описаны в работе Селигера с соавт. и Джианга с соавт. (Seliger, H et al. Oligonucleotide analogs with terminal 3'-3'- аnd 5'-5'-internucleotidic linkages as antisense inhibitors of viral gene expression, Nucleotides & Nucleotides (1991), 10(1-3), 469-77; и Jiang, et al., Pseudo-cyclic oligonucleotides: in vitro and in vivo properties, Bioorganic & Medicinal Chemistry (1999), 7(12), 2727-2735).
Дополнительно, 3'-3'-связанные олигонуклеотиды, где связь между 3'-концевыми олигонуклеотидами не является фосфодиэфирной, фосфоротиоатной или другой модифицированной мостиковой связью, может быть получена с использованием дополнительного спейсера, такого как три- или тетра-этиленгликольфосфатный фрагмент (Durand, M. et al., Triple-helix formation by an oligonucleotide containing one (dA)12 and two (dT)12 sequences bridges by two hexaethylene glycol chains, Biochemistry (1992), 31(38), 9197-204, патент США No. 5658738 и патент США No. 5668265). Альтернативно ненуклеотидный линкер может быть получен из этандиола, пропандиола и из единицы, состоящей из дезоксирибозы, без основания (d-спейсер) (Fontanel, Marie Laurence et al., Sterical recognition by T4 polynucleotide kinase of non-nucleosidic moieties 5'-attached to oligonucleotides; Nucleic Acids Research (1994), 22(11), 2022-7), с использованием стандартных методов фосфорамидитной химии. Ненуклеотидные связи могут быть включены один или много раз или объединены друг с другом, что позволяет создать желательные расстояния между 3'-концами двух связываемых ODN.
Недавно появилось сообщение о том, что CpG олигонуклеотиды, по всей видимости, проявляют свой иммуностимулирующий эффект посредством взаимодействия с Toll-подобным рецептором 9 (TLR9) (Hemmi H et al., (2000) Nature 408: 740-5). Так, TLR9-сигнальная активность может быть определена в ответ на воздействие CpG олигонуклеотида или другого иммуностимулирующего олигонуклеотида путем измерения NF-κB, NF-κB-родственных сигналов, соответствующих событий и промежуточных продуктов, в направлении против и по пути считывания информации для NF-κB.
22
27
14
27
29
Для целей настоящего изобретения описываемые в нем олигонуклеотиды могут быть синтезированы de novo с использованием множества известных в данной области процедур. Например, такой процедурой может быть метод b-цианоэтилфосфорамидатной химии (Beaucage, S.L. and Caruthers, M. H., Tet. Let. :1859, 1981); нуклеотидный Н-фосфонатный метод (Garegg et al., Tet. Let. : 4051-4054, 1986; Froehler et al., Nucl. Acid. Res. : 5399-5407, 1986; Garegg et al., Tet. Let. : 4055-4058, 1986; Gaffney et al., Tet. Let. : 2619-2622, 1988). Указанные химические методы могут быть осуществлены с использованием большого числа автоматизированных синтезаторов нуклеиновых кислот, доступных на рынке. Получаемые таким образом олигонуклеотиды считаются синтетическими олигонуклеотидами. Фраза «выделенный олигонуклеотид» обычно используется применительно к олигонуклеотиду, который был отделен от компонентов, с которыми он в норме ассоциирован в природе. Соответствующий пример изолированного олигонуклеотида включает олигонуклеотид, который был выделен из клетки, из ядра, из митохондрий или из хроматина.
Олигонуклеотиды частично резистентны к деградации (например, стабилизированные). Фраза «стабилизированная молекула олигонуклеотида» используется применительно к олигонуклеотиду, который относительно устойчив к деградации in vivo (например, осуществляемой посредством экзо- или эндонуклеаз). Стабилизация нуклеиновых кислот может быть достигнута за счет модификации скелета. Олигонуклеотиды, содержащие фосфоротиоатные связи, обладают максимальной активностью и защищают олигонуклеотид от деградации внутриклеточными экзо- и эндонуклеазами. Другие модифицированные олигонуклеотиды включают олигонуклеотиды с модифицированными фосфодиэфирными связями, сочетание олигонуклеотидов с фосфодиэфирными и фосфоротиоатными связями, олигонуклеотиды с метилфосфонатными, метилфосфоротиоатными, фосфородитиоатными, п-этокси связями и их сочетания.
90
1
Модифицированные скелеты, такие как фосфоротиоаты, могут быть синтезированы с помощью автоматизированных методик, использующих методы фосфорамидатной или Н-фосфонатной химии. Арил- и алкилфосфонаты могут быть получены, например, по методике, описанной в патенте США No. 4469863; и алкилфосфотриэфиры (в которых заряженный кислородный фрагмент алкилирован, как описано в патенте США No. 5023243 и в Европейском патенте No. 092574) могут быть получены методами автоматизированного твердофазного синтеза с использованием коммерчески доступных реактивов. Способы получения других модификаций скелета ДНК и введения в них замещений также были описаны (см., например, Uhlmann, E and Peyman, A., Chem. Rev. : 544, 1990; Godchild, J., Bioconjugate Chem. : 165, 1990).
Другие стабилизированные олигонуклеотиды включают неионные аналоги ДНК, такие как алкил- и арилфосфаты (в которых заряженный фосфонатный кислород замещен алкильной или арильной группой), фосфодиэфиры и алкилфосфотриэфиры, в которых заряженный кислородный фрагмент алкилирован. Олигонуклеотиды, которые содержат диол, такие как тетраэтиленгликоль или гексаэтиленгликоль, на одном или обоих концах, как было показано, также обладают выраженной резистентностью к деградации нуклеазами.
Авторами настоящего изобретения было обнаружено, что подмножество CpG иммуностимулирующих олигонуклеотидов обладает очень сильным иммуностимулирующим воздействием на человеческие клетки, такие как РВМС-клетки, что позволяет полагать, что указанные CpG иммуностимулирующие олигонуклеотиды представляют собой эффективные терапевтические средства для проведения вакцинации людей, для иммунотерапии рака, иммунотерапии астмы, для общего повышения иммунитета, усиления гематопоэза после облучения или химиотерапии, аутоиммунного заболевания и для других вариантов иммуномодулирующего воздействия. Было также показано, что подмножество CpG иммуностимулирующих олигонуклеотидов полезно in vivo для целей лечения астмы и аллергического ринита.
Индивидуум, страдающий аллергией, является индивидуумом, у которого имеется аллергическая реакция или который предрасположен к ее развитию в ответ на воздействие аллергена. Термин «аллергия» относится к приобретенной гиперчувствительности к веществу (аллергену). Аллергические состояния включают, без ограничения, экзему, аллергический ринит или насморк, сенную лихорадку, конъюнктивит, бронхиальную астму, крапивницу (сыпь) и пищевую аллергию, а также другие атопические состояния.
Аллергия в основном вызывается образованием IgE антитела против безвредных антигенов. Цитокины, которые индуцируются системным или введением через слизистую CpG иммуностимулирующих олигонуклеотидов, преимущественно относятся к классу, получившему название Th1 (примеры его представителей включают IL-12, IP-10, IFN-α и IFN-γ), и характеризуются тем, что индуцируют гуморальный и клеточный иммунные ответы. Другой основной тип иммунной реакции, который в основном ассоциирован с образованием IL-4 и IL-5 цитокинов, носит название Th2 иммунного ответа. В целом, он появляется при тех аллергических заболеваниях, которые опосредованы иммунными ответами Th2 типа. На основании способности CpG иммуностимулирующих олигонуклеотидов сдвигать иммунный ответ у индивидуума от доминирования Th2 (который ассоциирован с образованием IgE антител и аллергии) в сторону к сбалансированному Th2/Th1 ответу (который обладает защитным действием против аллергических реакций) индивидууму может быть введена доза CpG иммуностимулирующего олигонуклеотида как основной единственной терапии без аллергена или в сочетании с аллергеном, эффективная для индукции иммунного ответа, с целью лечения или профилактики астмы или аллергии.
Таким образом, CpG иммуностимулирующие олигонуклеотиды имеют важную терапевтическую значимость для лечения аллергических состояний, таких как астма и аллергический ринит. Уровни Th2 цитокинов, в особенности IL-4 и IL-5, повышаются в дыхательных путях у индивидуума с астмой. Указанные цитокины ускоряют важные составляющие воспалительного ответа при астме, включая переключение на IgE изотоп, эозинофильный хемотаксис и активацию и рост тучных клеток. Th1 цитокины, в особенности IFN-γ и IL-12, могут подавлять образование Th2 клонов и продукцию Th2 цитокинов. Астма относится к расстройству дыхательной системы, характеризующемуся воспалением, сужением дыхательных путей и повышенной реактивностью дыхательных путей на вдыхаемые агенты. Астма зачастую, хотя и не всегда, ассоциирована с атопическими или аллергическими симптомами.
Астма может быть утяжелена вирусными инфекциями. Сочетание астмы и вирусных инфекций существенно обостряет симптомы у индивидуума. Олигонуклеотиды, используемые в соответствии с настоящим изобретением, обеспечивают значимый полезный эффект при лечении обострения астмы, индуцированного вирусной инфекцией. Некоторые примеры такого вида терапии представлены ниже.
Аллергический ринит представляет собой расстройство, возникающее при воспалении слизистой носа, вызванное аллергенами, такими как пыльца или пыль. Данный термин включает медикаментозный ринит, сухой ринит и атопический ринит. Выделяют два основных типа аллергического ринита, сезонный и хронический. Сезонный аллергический ринит обычно называют сенной лихорадкой и он вызывается плесенью или пыльцой. Хронический аллергический ринит обычно вызывается врожденной чувствительностью или несколькими типами аллергена. Это состояние обычно продолжается в течение года или в течение того времени, когда на пациента воздействует аллерген. Оба типа аллергического ринита вовлекают реакцию гиперчувствительности типа I (IgЕ-опосредованную), которая ведет к воспалению. Считается, что такое воспаление вызывается избыточной дегрануляцией тучных клеток и образованных в крови базофилов в ответ на определенные аллергены. Это, в свою очередь, ведет к повышению уровней IgE и сопутствующему высвобождению воспалительных медиаторов, таких как гистамин, и хемотаксических факторов, таких как цитокины, простагландины и лейкотриены, что приводит к развитию локализованной воспалительной реакции.
Иммуностимулирующие олигонуклеотиды могут вводиться в виде основной единственной терапии без дополнительных антиаллергических/противоастматических лекарственных препаратов или соответствующего метода терапии, или в сочетании с такой терапией или лекарственным препаратом. Типичные противоаллергические/противоастматические лекарственные препараты и соответствующие методы терапии включают использование интраназальных сосудосуживающих препаратов, интраназальных и системных антигистаминных препаратов, интраназальных глюкокортикоидов, стабилизаторов тучных клеток, таких как соединения кромолина, и пероральных отхаркивающих препаратов.
Canine (Canis familiaris); Dermatophagoides
Dermatophagoides farinae); Felis (Felis domesticus); Ambrosia (Ambrosia artemiisfolia); Lolium
Lolium perenne
Lolium
multiflorum; Cryptomeria (Cryptomeria japonica); Alternaria (Alternaria alternata); Alder; Alnus (Alnus gultinoasa); Betula (Betula verrucosa); Quercus (Quercus alba); Olea (Olea europa); Аrtemisia (Artemisia vulgaris); Plantago
Plantago lanceolata); Parietaria (
Parietaria officinalis
Parietaria judaica); Blattella
, Blattella germanica); Apis
Apis multiflorum); Cupressus
Cupressus sempervirens, Cupressus arizonica
Cupressus macrocarpa); Juniperus
Juniperus sabinoides, Juniperus virginiana, Juniperus communis
Juniperus ashei); Thuya
Thuya orientalis); Chamaecyparis
Chamaecyparis obtusa); Periplaneta
Periplaneta americana); Agropyron
Agropyron repens); Secale
Secale cereale); Triticum
Triticum
aestivum); Dactylis
Dactylis glomerata); Festuca
Festuca elatior); Poa
Poa pratensis
Poa compressa); Avena
Avena sativa); Holcus
Holcus lanatus); Anthoxanthum
Anthoxanthum odoratum); Arrhenatherum (например, Arrhenatherum elatius); Agrostis
Agrostis alba); Phleum
Phleum pratense); Phalaris
Phalaris arundinacea); Paspalum
Paspalum notatum); Sorghum
Sorghum halepensis); и Bromus
Bromus inermis).
Аллерген относится к веществу (антигену), которое может индуцировать аллергическую или астматическую реакцию у чувствительного индивидуума. Перечень аллергенов огромен и может включать пыльцу, яд насекомых, перхоть животных, споры грибов и лекарственные средства (например, пенициллин). Примеры природных аллергенов животного и растительного происхождения включают, без ограничения, белки, специфичные для следующих родов: (например,(например,или(например,например, или (например(например,(например,и(например,и(например,(например,(например,(например,(например,(например,(например,(например,(например,или (например,(например,(например,(например,(например,(например,(например,(например,(например,
Олигонуклеотиды также могут использоваться для изменения направления иммунного ответа от Th2 иммунного ответа к Th1 иммунному ответу. Это приводит к созданию относительно сбалансированной Th1/Th2 среды. Изменение направления иммунного ответа от Th2 к Th1 иммунному ответу может быть оценено путем измерения уровней цитокинов, образуемых в ответ на введенную нуклеиновую кислоту (например, путем индукции моноцитарных клеток и других клеток образования Th1 цитокинов, включая IL-12, IFN-γ, ГМ-КСФ). Достичь изменения направления заново устанавливаемого баланса иммунного ответа от Th2 к Th1 ответу особенно эффективно при лечении или профилактике астмы. Например, эффективное количество для лечения астмы может представлять собой то количество, которое используется для переориентации Th2-типа иммунного ответа, который ассоциированный с астмой, на Th1-тип ответа, или на достижение сбалансированной Th1/Th2 среды. Уровень Th2 цитокинов, в особенности IL-4 и IL-5, повышается в дыхательных путях у индивидуума с астмой. CpG иммуностимулирующие олигонуклеотиды по настоящему изобретению вызывают повышение уровня Th1 цитокинов, что помогает достичь восстановления иммунного баланса, препятствуя или снижая, тем самым, неблагоприятные эффекты, ассоциированные с доминированием Th2 иммунного ответа.
CpG иммуностимулирующие олигонуклеотиды кроме варианта их применения при аллергии или при астме также могут использоваться в других аспектах изобретения в качестве вакцины для лечения индивидуумов с риском развития инфекции инфицирующим организмом или рака, для которого был идентифицирован специфический раковый антиген. CpG иммуностимулирующие олигонуклеотиды могут также вводиться без антигена или аллергена с целью защиты против инфекции, аллергии или рака, и в этом случае повторно вводимые дозы могут оказывать более длительную защиту. В контексте настоящего описания индивидуум с риском представляет собой такой индивидуум, который имеет любой риск воздействия патогена, вызывающего инфекцию или рак, или аллергена, или это индивидуум, который имеет риск развития рака. Например, индивидуумом с риском может быть индивидуум, который планирует поехать в зону, где выявляется определенный тип инфицирующего агента, или он может быть индивидуумом, который в результате своего образа жизни или под воздействием определенных медицинских процедур подвергает свой организм воздействию жидкостями, которые могут содержать инфицирующие организмы, или который может непосредственно подвергаться воздействию организма или индивидуума, живущего в зоне, где был идентифицирован тот или иной инфицирующий организм или аллерген. Индивидуумы с риском развития инфекции включают крупные группы населения, в отношении которых медицинские ведомства рекомендуют проведение вакцинации антигеном конкретного инфицирующего организма. Если антиген представляет собой аллерген и у индивидуума развиваются аллергические реакции к данному антигену, когда индивидуум может подвергаться воздействию антигена, например в период распространения пыльцы, то данный индивидуум имеет риск воздействия данного антигена. Индивидуумы с риском развития аллергии до астмы включают такие индивидуумы, которые были идентифицированы как имеющие аллергию или астму, но у которых еще не развилось активное заболевание в ходе лечения CpG иммуностимулирующим олигонуклеотидом, а также индивидуумы, которые рассматриваются как имеющие риск развития данных заболеваний в связи с наличием у них генетической предрасположенности или за счет действия определенных экологических факторов.
Индивидуум с риском развития рака представляет собой такой индивидуум, который имеет высокую вероятность развития рака. Такие индивидуумы включают, например, индивидуумов с генетическими аномалиями, наличие которых, как было показано, коррелирует с высокой вероятностью развития рака, а также индивидуумов, подвергающихся воздействию агентов, вызывающих рак, таких как табак, асбест или другие химически токсины, или тех индивидуумов, которые ранее подвергались лечению по поводу рака и находятся в состоянии выраженной ремиссии. В том случае, когда в случае индивидуума с риском развития рака используют для лечения антиген, специфичный для того типа рака, к которому у индивидуума имеется риск развития, а также CpG иммуностимулирующий олигонуклеотид, то данный индивидуум приобретает способность уничтожать раковые клетки при их развитии. При этом как только у такого индивидуума начинает формироваться опухоль, то будет вырабатываться специфический иммунный ответ против опухолевого антигена.
В настоящем изобретении кроме использования CpG иммуностимулирующих олигонуклеотидов для профилактического лечения также описывается вариант применения CpG иммуностимулирующих олигонуклеотидов для лечения индивидуума с инфекцией, аллергией, астмой или раком.
Индивидуум с инфекцией представляет собой такой индивидуум, который подвергся воздействию инфицирующего патогена и имеет выявляемые в острой форме или в хронической форме уровни патогена в организме. CpG иммуностимулирующие олигонуклеотиды могут использоваться вместе с антигеном или без антигена для усиления антиген-специфического системного иммунного ответа или иммунного ответа слизистой, который способен снизить уровень поражения или способствовать устранению инфицирующего патогена. Инфекционное заболевание в контексте настоящего изобретения представляет собой заболевание, возникающее в связи с наличием чужеродного микроорганизма в теле человека. Особенно важно разработать эффективную стратегию вакцинации или лечения для защиты слизистых оболочек организма, которые являются первичным сайтом входа патогенов.
Индивидуум, имеющий рак, представляет собой такой индивидуум, у которого выявляются раковые клетки. Рак может представлять собой злокачественный или незлокачественный вид. Рак или опухоль включает, без ограничения, рак желчных путей, рак головного мозга, рак молочной железы, цервикальный рак, хориокарциному, рак ободочной кишки, рак эндометрия, эзофагеальный рак, рак желудка, внутриэпителиальные неоплазмы, лимфомы, рак печени, рак легкого (например, мелкоклеточный и немелкоклеточный рак), меланому, нейробластомы, рак ротовой полости, рак яичников, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, рак прямой кишки, саркомы, рак кожи, рак яичек, рак щитовидной железы и рак почек, а также другие виды карцином и сарком. В одном из вариантов осуществления описываемый рак представляет собой лейкемический ретикулез, хронический миелогенный лейкоз, кожный Т-клеточный лейкоз, множественную меланому, фолликулярную лимфому, злокачественную меланому, плоскоклеточную карциному, карциному клеток почки, карциному предстательной железы, карциному клеток мочевого пузыря или карциному ободочной кишки.
Индивидуум может обозначать человека или позвоночное животное, включающее, без ограничения, собаку, кошку, лошадь, корову, свинью, овцу, козу, индейку, курицу, примата, например, обезьяну, и рыбу (виды, используемые в аквакультуре), например лосося. Таким образом, настоящее изобретение может также использоваться для лечения рака и опухолей, инфекций и аллергии/астмы у индивидуумов, отличных от человека. Рак представляет собой лидирующую причину смерти у домашних животных (например, у кошек и собак).
В контексте настоящего описания термины «лечение, подвергающийся лечению или в процессе лечения», при их использовании применительно к расстройству, такому как инфекционное заболевание, рак, аллергия или астма, относятся к профилактическому лечению, которое повышает устойчивость индивидуума к развитию заболевания (например, к инфекции патогеном) или, иными словами, снижает вероятность того, что у индивидуума разовьется заболевание (например, он будет инфицирован патогеном), а также относятся к варианту лечения после того, как у индивидуума уже развилось заболевание, для борьбы с таким заболеванием (например, для снижения или устранения инфекции) и с целью предупреждения обострения заболевания.
В тех случаях, когда CpG иммуностимулирующие олигонуклеотиды вводят вместе с антигеном, индивидуум может подвергаться воздействию антигеном. В контексте настоящего описания термин «подвергаться воздействию» относится либо к активной стадии контакта индивидуума с антигеном, либо к пассивному влиянию антигена на индивидуум in vivo. Методы активного воздействия на индивидуум антигеном хорошо известны в данной области. В целом они сводятся к тому, что антиген вводят индивидууму непосредственно посредством внутривенного, внутримышечного, перорального, трансдермального, чресслизистого, интраназального, интратрахеального или подкожного введения. Антиген может вводиться системно или местно. Способы введения антигена и CpG иммуностимулирующиго олигонуклеотида ниже описаны более детально. Индивидуум подвергается пассивному влиянию антигена, если антиген становится доступным для воздействия на иммунную систему организма. Индивидуум может подвергаться пассивному влиянию антигена, например, в случае поступления чужеродного антигена в организм или при развитии опухолевых клеток, экспрессирующих чужеродный антиген на свой поверхности.
Способы, посредством которых пациент может подвергаться пассивному воздействию антигена, зависят, в частности, от времени введения CpG иммуностимулирующего олигонуклеотида. Например, в случае индивидуума с риском развития рака или инфекционного заболевания или аллергического/астматического ответа указанному индивидууму может вводиться CpG иммуностимулирующий олигонуклеотид на регулярной основе, когда риск развития заболевания является наивысшим, например, во время сезонной аллергии или после воздействия агента, вызывающего рак. Дополнительно CpG иммуностимулирующий олигонуклеотид может вводиться путешественникам перед поездкой в те зарубежные страны, где он будет иметь риск воздействия инфекционных агентов. Аналогично CpG иммуностимулирующий олигонуклеотид может вводиться солдатам или гражданским лицам при угрозе применения биологического оружия с целью индукции системного иммунного ответа или иммунного ответа слизистой на антиген и если данный индивидуум подвергается его воздействию.
Антиген в контексте настоящего описания представляет собой молекулу, способную провоцировать иммунный ответ. Антигены включают, без ограничения, клетки, клеточные экстракты, белки, полипептиды, пептиды, полисахариды, полисахаридные конъюгаты, пептидные и непептидные миметики полисахаридов и других молекул, малые молекулы, липиды, гликолипиды, углеводы, вирусы и вирусные экстракты и многоклеточные организмы, такие как паразиты, и аллергены. Термин «аллерген» используется в широком смысле и включает любой тип молекулы, которая распознается иммунной системой организма хозяина как чужеродная. Антигены включают, без ограничения, раковые антигены, микробные антигены и аллергены.
Раковый антиген в контексте настоящего описания представляет собой соединение, такое как пептид или белок, ассоциированное с опухолью или поверхностью раковой клетки, которое способно провоцировать иммунный ответ при экспрессии на поверхности антиген-презентирующей клетки в молекуле ГКГ. Раковые антигены могут быть выделены из раковых клеток из неочищенных экстрактов раковых клеток, например, как описано в работе Коэна с соавт. (Cohen, et al., 1994, Cancer Research, 54: 1055), получаемых при частичной очистке антигенов, с использованием методов рекомбинантной технологии или путем синтеза de novo известных антигенов. Раковые антигены включают, без ограничения, антигены, которые экспрессируются в рекомбинантных системах, их иммуногенную часть или целиком опухоль или рак. Такие антигены могут быть выделены или получены рекомбинантными методами или с использованием других известных в данной области стратегий.
Микробный антиген в контексте настоящего описания представляет собой антиген микроорганизма и включает, без ограничения, антиген вируса, бактерий, паразитов и грибов. Такие антигены включают интактные микроорганизмы, а также его природные изоляты и фрагменты или его производные, а также синтетические соединения, которые идентичны или аналогичны природным антигенам микроорганизмов и индуцируют иммунный ответ, специфичный для данного микроорганизма. Соединение считается аналогичным природному антигену микроорганизма, если оно индуцирует иммунный ответ (гуморальный и/или клеточный) на природный антиген микроорганизма. Такие антигены используются традиционно в данной области и известны специалистам.
Термин «по существу очищенный» в контексте настоящего описания относится к полипептиду, который по существу не содержит других белков, липидов, углеводов или других материалов, с которыми он ассоциирован в природном состоянии. Специалист в данной области может очистить вирусный или бактериальный полипептид с использованием стандартных процедур очистки белков. По существу чистый полипептид, как правило, дает одну широкую полосу в полиакриламидном геле при анализе в невосстановительных условиях. В случае частично гликозилированных полипептидов или полипептидов, имеющих несколько старт-кодонов они могут давать несколько полос в полиакриламидном геле при анализе в невосстановительных условиях, но будут демонстрировать характерные картины для данного полипептида. Чистота вирусного или бактериального полипептида может быть также определена секвенированием аминокислот по аминоконцу. Другие типы антигенов, не кодируемых векторной нуклеиновой кислотой, такие как полисахариды, малые молекулы, миметики и т.п., также включаются в область настоящего изобретения.
Олигонуклеотиды по настоящему изобретению могут вводиться индивидууму вместе с противомикробным средством. Противомикробное средство в контексте настоящего описания относится к природному или синтетическому соединению, которое способно уничтожить или подавить инфицирующие микроорганизмы. Тип противомикробного средства, используемого в соответствии с настоящим изобретением, зависит от типа микроорганизма, которым индивидуум уже инфицирован или имеет риск быть инфицированным. Противомикробные средства включают, без ограничения, противобактериальные средства, противовирусные средства, противогрибковые средства и противопаразитарные средства. Фразы, такие как «противоинфекционное средство», «противобактериальное средство», «противовирусное средство», «противогрибковое средство», «противопаразитарное средство» и «паразитоцид» используются в общепринятых значениях, известных специалистам в данной области и определенных в стандартных медицинских руководствах. Вкратце можно отметить, что антибактериальные агенты уничтожают или подавляют бактерии и включают антибиотики, а также другие синтетические или природные соединения, обладающие аналогичными функциями. Антибиотики представляют собой низкомолекулярные молекулы, которые продуцируются как вторичные метаболиты клетками, такими как микроорганизмы. В основном антибиотики препятствуют проявлению одной или нескольких бактериальных функций или структур, которые специфичны для микроорганизма и которые не присутствуют в хозяйских клетках. Противовирусные средства могут быть выделены из природных источников или могут быть синтезированы и далее использованы для уничтожения или подавления вирусов. Противогрибковые средства используются для лечения поверхностных грибковых инфекций, а также условно патогенных и первичных системных грибковых инфекций. Противопаразитарные средства уничтожают или подавляют паразитов.
Примеры противопаразитарных средств, также называемых паразитоцидами, используемых для введения человеку, включают, без ограничения, альбендазол, амфотерицин В, бензнидазол, битионол, хлорохин-HCl, хлорохина фосфат, клиндамицин, дегидроэметин, диэтилкарбамазин, дилоксанида фуроат, эфлорнитин, фуразолидаон, глюкокортикоиды, галофантрин, иодохинол, ивермектин, мебендазол, мефлохин, меглумина антимониат, меларсопрол, метрифонат, метронидазол, никлозамид, нифуртимокс, оксамнихин, парамомицин, пентамидина изетионат, пиперазин, празиквантел, прамахина фосфат, прогуанил, пирантела памоат, пириметанмин-сульфонамиды, пириметанмин-сульфадоксин, хинакрин-HCl, хинина сульфат, хинидина глюконат, спирамицин, стибоглюконат натрия (глюконат натрия-сурьмы), сурамин, тетрациклин, доксициклин, тиабендазол, тинидазол, триметроприм-сульфаметоксазол и трипарсамид, некоторые из которых используются поодиночке или в сочетании с другими.
Антибактериальные средства уничтожают или подавляют рост или функцию бактерий. Крупный класс антибактериальных средств включает антибиотики. Антибиотики, которые эффективны для уничтожения или подавления широкого перечня бактерий, также известны как антибиотики широкого спектра действия. Другие типы антибиотиков обладают преимущественной эффективностью против грамположительных или грамотрицательных бактерий. Указанные типы антибиотиков относятся к антибиотикам узкого спектра действия. Другие антибиотики, которые эффективны против одного организма или заболевания и не действуют против других типов бактерий, классифицируют как антибиотики ограниченного спектра действия. Антибактериальные средства иногда классифицируют на основе первичного способа их действия. В основном антибактериальные средства представляют собой ингибиторы синтеза клеточной стенки, ингибиторы клеточной мембраны, ингибиторы синтеза белка, синтеза нуклеиновой кислоты или функциональные ингибиторы и конкурентные ингибиторы.
Противовирусные средства представляют собой соединения, которые препятствуют инфицированию клеток вирусами или репликации вируса внутри клетки. Имеется значительно меньше антивирусных лекарственных средств, чем антибактериальных лекарственных средств, поскольку процесс вирусной репликации тесно связан с репликацией ДНК внутри хозяйской клетки, так что неспецифические противовирусные средства по существу являются токсичными для хозяйского организма. Имеется несколько стадий в процессе вирусной инфекции, которые могут быть заблокированы или ингибированы противовирусными средствами. Эти стадии включают присоединение вируса к хозяйской клетке (иммуноглобулин или связывающие пептиды), снятие оболочки с вирусов (например, амантадин), синтез или трансляция вирусной мРНК (например, интерферон), репликация вирусной РНК или ДНК (например, нуклеотидные аналоги), созревание новых вирусных белков (например, ингибиторы протеазы) и отпочкование и высвобождение вирусов.
Нуклеотидные аналоги представляют собой синтетические соединения, которые аналогичны нуклеотидам, но которые имеют неполную или аномальную дезоксирибозную или рибозную группу. Как только нуклеотидные аналоги оказываются в клетке, они фосфорилируются, образуя трифосфат, который конкурирует с нормальными нуклеотидами за включение в состав вирусной ДНК или РНК. Как только трифосфатная форма нуклеотидного аналога включается в растущую цепь нуклеиновой кислоты, она вызывает необратимую ассоциацию с вирусной полимеразой и таким образом вызывает прерывание цепи. Нуклеотидные аналоги включают, без ограничения, ацикловир (используемый для лечения инфекции простым вирусом герпес и вирусом ветряной оспы), ганцикловир (используемый для лечения цитомегаловируса), идоксуридин, рибавирин (используемый для лечения респираторно-синцитиального вируса), дидезоксиинозин, дидезоксицитидин, цидовудин (ацидотимидин), имихимод и резимихимод.
Интерфероны представляют собой цитокины, которые секретируются клетками, инфицированными вирусом, а также иммунными клетками. Интерфероны функционируют путем связывания со специфическими рецепторами на клетках, ближайших к инфицированным клеткам, вызывая изменения в клетке, которые защищают их от инфекции вирусом. α- и β-интерфероны также индуцируют экспрессию молекул ГКГ класса I и класса II на поверхности инфицированных клеток, что приводит к повышению антиген-презентирования для нормального распознавания клетками иммунной системы. α- и β-интерфероны доступны в виде рекомбинантных форм и используются для лечения хронической инфекции гепатитом В и С. В дозировках, которые эффективны для антивирусной терапии, интерфероны оказывают выраженные побочные эффекты, такие как лихорадка, общее недомогание и потеря веса.
Противовирусные средства, используемые в настоящем изобретении, включают, без ограничения, иммуноглобулины, амантадин, интерфероны, нуклеотидные аналоги и ингибиторы протеаз. Конкретные примеры противовирусных средств включают, без ограничения, ацеманнан, ацикловир, натрий-ацикловир, адефовир, аловудин, алвирцепт-судотокс, амантадина гидрохлорид, аранотин, арилдон, атавирдина мезилат, авридин, цидофовир, ципамфиллин, цитарабина гидрохлорид, делавирдина мезилат, десцикловир, диданозин, дисоксарил, эдоксудин, энвираден, энвироксим, фамцикловир, фамотина гидрохлорид, фиацитабин, фиалуридин, фозарилат, натрий-фоскарнет, натрий-фосфонет, ганцикловир, натрий-ганцикловир, идоксуридин, кетоксал, ламивудин, лобукавир, мемотина гидрохлорид, метизазон, невирапин, пенцикловир, пиродавир, рибавирин, римантадина гидрохлорид, саквинавира мезилат, сомантадина гидрохлорид, соривудин, статолон, ставудин, тилорона гидрохлорид, трифлуридин, валацикловира гидрохлорид, видарабин, видарабина фосфат, натрий-видарабина фосфат, вироксим, залцитабин, зидовудин и зинвироксим.
Противогрибковые средства используются для лечения и профилактики инфицирующих грибов. Противогрибковые средства иногда классифицируют по механизму их действия. Некоторые противогрибковые средства функционируют как ингибиторы клеточной стенки путем ингибирования глюкозосинтазы. Указанные средства включают, без ограничения, басиунгин/ECB. Другие противогрибные средства функционируют посредством дестабилизации целостности мембраны. Такие средства включают, без ограничения, имидазолы, такие как клотримазол, сертаконзол, флуконазол, итраконазол, кетоконазол, миконазол и вориконазол, а также FK 463, амфотерицин B, BAY 38-9502, MK 991, прадимицин, UK 292, бутенафин и тербинафин. Другие противогрибные средства функционируют путем расщепления хитина (например, за счет хитиназы) или путем иммуносупрессии (крем 501).
CpG иммуностимулирующие олигонуклеотиды могут быть объединены с другими терапевтическими средствами, такими как адъюванты, для усиления иммунных ответов. CpG иммуностимулирующие олигонуклеотиды и другое терапевтическое средство могут вводиться одновременно или последовательно. В том случае когда другие терапевтические средства вводят одновременно, они могут вводиться в виде одной или разных композиций, но в одно и то же время. Другие терапевтические средства вводят последовательно друг за другом и относительно CpG иммуностимулирующего олигонуклеотида в том случае, когда введение других терапевтических средств и CpG иммуностимулирующего олигонуклеотида должно быть разделено по времени. Разделение по времени между введением указанных соединений может составлять порядка нескольких минут или может быть длиннее. Другие терапевтические средства включают, без ограничения, адъюванты, цитокины, антитела, антигены и т.п.
Композиции по настоящему изобретению могут также вводиться вместе с адъювантами, отличными от нуклеиновой кислоты. Адъювант, отличный от нуклеиновой кислоты, представляет собой любую молекулу соединения за исключением CpG иммуностимулирующих олигонуклеотидов, приведенных в настоящем описании, которая может стимулировать гуморальный и/или клеточный иммунный ответ. Адъюванты, отличные от нуклеиновой кислоты, включают, например, адъюванты, которые создают депо-эффект, иммуностимулирующие адъюванты и адъюванты, которые и создают депо-эффект, и стимулируют иммунную систему.
CpG иммуностимулирующие олигонуклеотиды также полезны в качестве адъювантов для слизистой. Ранее было показано, что и системный, и слизистый варианты иммунитета индуцируются путем доставки через слизистую CpG иммуностимулирующих олигонуклеотидов. Таким образом, олигонуклеотиды могут вводиться в сочетании с другими адъювантами для слизистой.
Иммунные ответы также могут быть индуцированы или усилены путем совместного введения или путем колинеарной экспрессии цитокинов (Bueler & Mulligan, 1996; Chow et al., 1997; Geissler et al., 1997; Iwasaki et al., 1997; Kim et al., 1997) или В-7 ко-стимулирующих молекул (Iwasaki et al., 1997; Tsuji et al., 1997) с CpG иммуностимулирующими олигонуклеотидами. Термин «цитокин» используется как родовой термин для разнородной группы растворимых белков и пептидов, которые действуют как гуморальные регуляторы в концентрациях от нано- до пикомолярных значений и которые в нормальных или в патологических условиях модулируют функциональную активность индивидуальных клеток и тканей. Указанные белки также вовлекаются в непосредственные взаимодействия между клетками и регулируют процессы, происходящие во внеклеточной среде. Примеры цитокинов включают, без ограничения, IL-1, IL-2, IL-4, L-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, IL-18, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (Г-КСФ), интерферон γ (γ-IFN), IFN-α, фактор некроза опухолевой ткани (TNF), TGF-β, лиганд FLT-3 и лиганд CD40.
Олигонуклеотиды также полезны для повышения выживаемости, дифференцировки, активации и созревания дендритных клеток. CpG иммуностимулирующие олигонуклеотиды обладают уникальной способностью содействовать выживанию клеток, дифференцировке, активации и созреванию дендритных клеток.
CpG иммуностимулирующие олигонуклеотиды также повышают литическую активность естественных клеток-киллеров и антителозависимую клеточную токсичность (ADCC). ADCC может быть осуществлена с помощью CpG иммуностимулирующих олигонуклеотидов в сочетании с антителом, специфичным для клетки-мишени, такой как раковая клетка. В том случае когда CpG иммуностимулирующий олигонуклеотид вводят индивидууму в сочетании с антителом, иммунная система индивидуума индуцируется в направлении уничтожения опухолевой клетки. Антитела, используемые в процедуре ADCC, включают антитела, которые взаимодействуют с клеткой в организме. Многие такие антитела, специфичные для клеток-мишеней, были описаны в настоящей области и многие являются коммерчески доступными.
CpG иммуностимулирующие олигонуклеотиды могут также вводиться в сочетании с проведением противораковой терапии. Виды противораковой терапии включают противораковые лекарственные средства, облучение и хирургические процедуры. В контексте настоящего описания «противораковое лекарственное средство» используется применительно к агенту, который вводится индивидууму для лечения рака. В контексте настоящего описания термин «лечение рака» включат профилактику развития рака, ослабление симптомов рака и/или подавление роста установленного рака. В других аспектах противораковое лекарственное средство вводят индивидууму, имеющему риск развития рака, с целью снижения риска развития рака. Различные типы лекарственных средств, применяемых для лечения рака, приведены в настоящем описании. В контексте настоящего изобретения противораковые лекарственные средства классифицируют как химиотерпевтические средства, иммунотерапевтические средства, противораковые вакцины, средства для гормональной терапии и модификаторы биологического ответа.
В одном из вариантов осуществления противораковое лекарственное средство представляет собой химиотерапевтическое средство, выбранный из группы, состоящей из метотрексата, винкристина, адриамицина, цисплатины, хлорэтилнитрозомочевин, содержащих несахарные фрагменты, 5-фторурацила, митомицина С, блеомицина, доксорубицина, дакарбазина, таксола, фрагилина, мегламина GLA, вальрубицина, кармустаина и полиферпозана, MMI270, BAY 12-9566, ингибитора RAS-фамезилтрансферазы, ингибитора фамезилтрансферазы, MMP, MTA/LY231514, LY264618/лометексола, гламолека, CI-994, TNP-470, гикамтина/топотекана, РКС412, валсподара/PSC833, новантрона/митроксантрона, метарета/сурамина, батимастата, E7070, BCH-4556, CS-682, 9-AC, AG3340, AG3433, инцела/VX-710, VX-853, ZD0101, ISI641, ODN 698, TA 2516/мармистата, BB2516/мармистата, CDP 845, D2163, PD183805, DX8951f, лемонала, DP2202, FK 317, пицибанила/ОК-432, AD 32/вальрубицина, метастрона/производного стронция, темодала/темозоломида, эвацета/липосомального доксорубицина, ютаксана/плаклитаксела, таксола/паклитаксела, кселоада/капецитабина, фуртулона/доксифлуридина, циклопакса/перорального паклитаксела, перорального таксоида, SPU-077/цисплатины, HMR 1275/флавопиридола, СР-358 (774)/EGFR, CP-609 (754)/ингибитора RAS онкогена, BMS-182751/пероральной платины, UFT (тегафура/урацила), эргамизола/левамизола, энилурацила/энхансера 776С85/5FU, кампто/левамизола, камптозара/иринотекана, тумодекса/ралитрекседа, леустатина/кладрибина, паксекса/паклитаксела, доксила/липосомального доксорубицина, каеликса/липосомального доксорубицина, флудара/флударабина, фармарубицина/эпирубицина, DepoCyt, ZD1839, LU 79553/бис-нафталимида, LU 103793/доластаина, каетикса/липосомального доксорубицина, гемзара/гемцитабина, ZD 0473/анормеда, YM 116, иодистых затравок, ингибиторов CDK4 и СDK2, ингибиторов PARP, D4809/дексифозамида, ифеса/меснекса/ифозамида, вумона/тенипозида, параплатины/карбопалтины, плантинола/цисплатины, вепезида/этопозида, ZD 9331, таксотера/доцетаксела, пролекарства на основе гуанин-арабинозида, аналога таксана, нитрозомочевин, алкилирующих агентов, таких как мелфелан и циклофосфамид, аминоглютетимида, аспарагиназы, бусульфана, карбоплатины, хлоромбуцила, цитарабина-HCl, дактиномицина, даунорубицина-HCl, эстрамустин-натрия фосфата, этопозида (VP16-213), флоксуридина, фторурацила (5-FU), флутамида, гидроксимочевины (гидроксикарбамида), ифосфамида, интерферона альфа-2а, альфа-2b, леупролида ацетата (аналога рилизинг-фактора ЛГРГ), ломустина (CCNU), меклоретамина-HCl (азотистой мази), меркаптопурина, месны, митотана (o.р'-DDD), митоксантрона-HCl, октреотида, пликамицина, прокарбазина-HCl, стрептозоцина, тамоксифена цитрата, тиогуанина, тиотепа, винбластина сульфата, амсакрина (m-AMSA), азацитидина, эртропоэтина, гексаметилмеламина (HMM), интерлейкина 2, митогуазона (метил-GAG; метилглиоксаль-бис-гуанилгидразона; MGBG), пентостатина (2'-дезоксикоформицина), семустина (метил-CCNU), тенипозида (VM-26) и виндезина сульфата. В существенном варианте осуществления настоящего изобретения противораковое лекарственное средство представляет таксол. В другом варианте противораковое лекарственное средство представляет сочетание карбоплатины и паклитаксела.
В другом варианте осуществления противораковое лекарственное средство представляет собой иммунотерапевтическое средство, выбранный из группы, состоящей из рибутаксина, герцептина, квадрамета, панорекса, IDEC-Y2B8, BEC2, C225, онколима, SMART M195, ATRAGEN, оварекса, бексара, LDP-03, ior t6, MDX-210, MDX-11, MDX-22, OV103, 3622W94, анти-VEGF, зенапакса, MDX-220, MDX-447, MELIMMUNE-2, MELIMMUNE-1, CEACIDE, претаргета, NovoMAb-G2, TNT, Gliomab-H, GNI-250, EMD-72000, LymphoCide, CMA 676, монофарма-С, 4B5, ior egf.r3, ior c5, BABS, анти-FLK-2, MDX-260, ANA антитела, SMART 1D10 антитела, SMART ABL 364 антитела и ImmuRAIT-CEA.
Дополнительно способы по настоящему изобретению охватывают варианты использования более чем одного противоракового лекарственного средства вместе с CpG иммуностимулирующими олигонуклеотидами. В качестве примеров можно отметить, что в приемлемых случаях CpG иммуностимулирующие олигонуклеотиды могут вводиться вместе и с химиотерапетическим средством и с иммунотрапевтическим агентом. Альтернативно противораковое лекарственное средство может включать иммунотерапевтическое средство и противораковую вакцину, или химиотерапевтическое средство и противораковую вакцину, или химиотерапевтическое средство, иммунотерапевтическое средство и противораковую вакцину, вводимые все одному индивидууму с целью лечения индивидуума с раком или с целью снижения риска развития рака.
Использование CpG иммуностимулирующих олигонуклеотидов в сочетании с иммунотерапевтическими средствами, такими как моноклональные антитела, способно повысить срок выживания за счет реализации множества механизмов, включающих существенное повышение ADCC (как описано выше), активацию естественных клеток-киллеров (NK) и повышение уровня IFNα. Олигонуклеотиды в случае их использования в сочетании с моноклональными антителами служат для снижения дозы антитела, необходимой для достижения биологического результата.
В контексте настоящего описания термины «раковый антиген» и «опухолевый антиген» используются взаимозаменяемо и обозначают антигены, которые дифференциально экспрессируются раковыми клетками и могут в этой связи использоваться для воздействия на раковые клетки. Раковые антигены представляют антигены, которые потенциально способны стимулировать явные опухолеспецифические иммунные ответы. Некоторые из таких антигенов кодируются, хотя и не всегда экспрессируются нормальными клетками. Указанные антигены могут быть охарактеризованы как антигены, которые в нормальном состоянии являются молчащими (то есть не экспрессируются) в нормальных клетках, но которые экспрессируются только на определенных стадиях дифференциации, а также антигены, которые временно экспрессируются, такие как эмбриональные и фетальные антигены. Другие раковые антигены кодируются мутантными клеточными генами, такими как онкогены (например, активированный ras онкоген), супрессорные гены (например, мутант p53), белки слияния, возникающие в результате внутренних делеций или хромосомных транслокаций. Другие раковые антигены могут кодироваться вирусными генами, такими как, например, гены, переносимые на РНК и ДНК опухолевых вирусов.
CpG иммуностимулирующие олигонуклеотиды также полезны для лечения и профилактики аутоиммунных заболеваний. Аутоиммунное заболевание относится к группе таких заболеваний, при которых собственные антитела индивидуума взаимодействуют с тканью индивидуума или при которых иммунные эффекторные Т-клетки становятся аутореактивными в отношении эндогенных собственных белков и вызывают деструкцию ткани. Таким образом, иммунный ответ направляется против собственных антигенов индивидуума, называемых аутоантигенами. Аутоиммунные заболевания включают, без ограничения, ревматоидный артрит, болезнь Крона, рассеянный склероз, системную красную волчанку (SLE), аутоиммунный энцефаломиелит, тяжелую псевдопаралитическую миастению (MG), тиреоидит Хашимото, синдром Гудпасчера, пузырчатку (например, обыкновенную пузырчатку), болезнь Грейвса, аутоиммунную гемолитическую анемию, аутоиммунную тромобцитарную пурпуру, склеродерму с антиколлагеновыми антителами, смешанную болезнь соединительной ткани, полимиозит, злокачественную анемию, идиопатическую болезнь Аддисона, бесплодие, ассоциированное с аутоиммунным состоянием, гломерулонефрит (например, серповидный гломерулонефрит, пролиферативный гломерулонефрит), буллезную пузырчатку, синдром Шегрена, инсулинорезистентность и аутоиммунный сахарный диабет.
Термин «аутоантиген» в контексте настоящего описания относится к антигену в нормальной хозяйской ткани. Нормальная хозяйская ткань не включает раковые клетки. Так, иммунный ответ, возникающий против аутоантигена в случае аутоиммунного заболевания, представляет собой нежелательный иммунный ответ и вносит вклад в деструкцию и повреждение нормальной ткани, тогда как иммунный ответ, проявляемый против ракового антигена, является желательным иммунным ответом и вносит вклад в деструкцию опухоли или рака. Таким образом, в некоторых аспектах изобретения, направленных на лечение аутоиммунных заболеваний, не рекомендуется, чтобы CpG иммуностимулирующие олигонуклеотиды вводились с аутоантигенами, в особенности с теми, которые являются мишенями при аутоиммунном расстройстве.
В некоторых случаях CpG иммуностимулирующие олигонуклеотиды могут доставляться вместе с низкими дозами аутоантигенов. На большом числе исследований, проведенных на животных, было показано, что введение через слизистую низких доз антигена может приводить к состоянию иммунной гипоотзывчивости или «толерантности». Механизм такой активности, по всей видимости, связан с цитокин-опосредованным отклонением иммунитета от Th1 механизма в направлении преобладания Th2 и Th3 ответа (например, TGF-β доминирующего). Активная супрессия низкой дозой при антигенной доставке может также подавлять неродственный иммунный ответ (побочная супрессия), который представляет особый интерес при лечении аутоиммунных заболеваний, например ревматоидного артрита и системной красной волчанки. Побочная супрессия вовлекает секрецию Th1 регуляторных супрессорных цитокинов, направленных против Th1 в локальном окружении, где провоспалительные и Th1 цитокины высвобождаются антиген-специфичным или антиген-неспецифичным образом. Термин «толерантность» в контексте настоящего описания используется применительно к данному явлению. В действительности, пероральная толерантность эффективна при лечении множества аутоиммунных заболеваний у животных, включающих экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (EAE), экспериментальную аутоиммунную тяжелую псевдопаралитическую миастению, артрит, индуцированный коллагеном (CIA), и инсулинозависимый сахарный диабет. В рамках данных моделей профилактика и супрессия аутоиммунного заболевания ассоциирована со сдвигом антиген-специфичных гуморальных и клеточных ответов от Th1 ответа в сторону Th2/Th3 ответа.
Настоящее изобретение также включает способ индукции активации антиген-неспецифического врожденного иммунитета и резистентности широкого спектра в отношении инфекционной провокации с использованием CpG иммуностимулирующих олигонуклеотидов. Термин «активация антиген-неспецифического врожденного иммунитета» в контексте настоящего описания относится к активации иммунных клеток, отличных от В-клеток, и может включать, например, активацию NK-клеток, Т-клеток и других клеток, которые могут отвечать антиген-независимым образом, или определенное сочетание таких клеток. Широкий спектр резистентности к инфекционной провокации индуцируется в связи с тем, что иммунные клетки находятся в активной форме и примируются для ответа на любое инвазивное соединение или микроорганизм. Клетки не должны специально примироваться против конкретного антигена. Такая процедура особенно полезна на случай применения биологического оружия и других описанных выше случаев, например, применительно к путешественникам.
CpG иммуностимулирующие олигонуклеотиды могут непосредственно вводиться индивидууму или могут вводиться в сочетании с комплексом доставки нуклеиновой кислоты. Комплекс доставки нуклеиновой кислоты обозначает молекулу нуклеиновой кислоты, которая ассоциирована (например, которая ионными силами или ковалентно присоединена или которая инкапсулирована) со средством целевой доставки (например, с молекулой, которая приводит к повышению афинности связывания с клеткой-мишенью). Примеры комплексов доставки нуклеиновой кислоты включают нуклеиновые кислоты, ассоциированные со стеролом (например, с холестерином), с липидом (например, с катионным липидом, виросомой или липосомой) или агентом, обладающим специфичностью по связыванию клетки-мишени (например, с лигандом, распознаваемым рецептором поверхности клетки-мишени). Предпочтительные комплексы могут быть достаточно стабильными in vivo для того, чтобы предотвратить выраженную диссоциацию до интернализации клеткой-мишенью. Однако комплекс может расщепляться в соответствующих условиях внутри клетки, так что олигонуклеотид будет высвобождаться в функциональной форме.
Были также описаны носители для доставки или средства доставки, используемые для доставки антигена и олигонуклеотидов на поверхности. CpG иммуностимулирующий олигонуклеотид и/или антиген или другие терапевтические средства могут вводиться поодиночке (например, в солевом растворе или в буфере) или с использованием носителей для доставки, известных в данной области.
Термин «эффективное количество CpG иммуностимулирующего олигонуклеотида» относится к количеству, необходимому или достаточному для реализации желательного биологического эффекта. Например, эффективное количество CpG иммуностимулирующего олигонуклеотида, вводимого вместе с антигеном для индукции иммунитета слизистой, представляет собой такое количество, которое необходимо для того, чтобы вызвать развитие IgA в ответ на антиген, при воздействии антигена, тогда как указанное количество, необходимое для индукции системного иммунитета, представляет собой количество, необходимое для того, чтобы вызвать развитие IgG в ответ на антиген, при воздействии антигена. В сочетании с приведенным описанием и при выборе соответствующих активных соединений из различных возможных вариантов с учетом таких факторов, как эффективность, относительная биологическая доступность, вес тела пациента, тяжесть неблагоприятных побочных эффектов и предпочтительный способ введения, может быть разработан эффективный профилактический или терапевтический режим лечения, который не будет вызывать существенной токсичности и все еще будет полностью эффективным для лечения конкретного индивидуума. Эффективное количество для каждого конкретного применения может варьировать в зависимости от таких факторов, как конкретное заболевание или состояние, подлежащее лечению, конкретный вводимый CpG иммуностимулирующий олигонуклеотид, размер индивидуума или тяжесть его заболевания или состояния. Каждый специалист со средним уровнем знаний в данной области может эмпирически определить эффективное количество CpG иммуностимулирующего олигонуклеотида и/или антигена и/или другого терапевтического средства без проведения длительных экспериментов.
Определенные дозы соединений, приведенных в настоящем описании, для доставки на слизистую или для локальной доставки, как правило, варьируют от примерно от 0,1 мкг до 10 мг на введение, что зависит от режима введения - ежедневного, еженедельного или ежемесячного и любого другого временного режима с другими интервалами времени между введениями. Более типично доза, применяемая при слизистой или местной доставке, варьирует примерно от 10 мкг до 5 мг на введение и в наиболее типичном случае варьирует примерно от 100 мкг до 1 мг, при этом 2-4 введения разделяются интервалом в несколько дней или недель. Более типично иммуностимулирующие дозы варьируют от 1 мкг до 10 мг на введение и чаще всего от 10 мкг до 1 мг при ежедневном или еженедельном введении. Эффективные дозы соединения по настоящему описанию, используемые для парентеральной доставки с целью индукции антиген-специфического иммунного ответа, где соединения доставляются вместе с антигеном, но не с другим терапевтическим средством, как правило, в 5-10000 раз выше, чем эффективная доза при слизистой доставке в случае применения в качестве вакцинного адъюванта или иммуностимулятора и чаще всего превышает в 10-10000 и еще чаще в 20-100 раз. Дозы соединений, приведенных в настоящем описании, используемые для парентеральной доставки с целью индукции врожденного иммунного ответа или для повышения ADCC или для индукции антиген-специфического иммунного ответа, когда CpG иммуностимулирующие олигонуклеотиды вводят в сочетании с другими терапевтическими средствами или в составе специализированных носителей доставки, как правило, варьируют от примерно 0,1 мкг до 10 мг на введение, что зависит от режима введения - ежедневного, еженедельного или ежемесячного, или любого другого временного режима с другими интервалами. Более типично парентеральные дозы для указанных целей варьируют примерно от 10 мкг до 5 мг на введение и в самом типичном случае - от примерно 100 мкг до 1 мг, при этом 2-4 введения разделяются интервалом в несколько дней или недель. Однако в некоторых вариантах парентеральные дозы, используемые для достижения указанных целей, могут описываться диапазоном, который в 5-10000 раз превосходит типичные дозы, описанные выше.
Для любого приведенного в настоящем описании соединения терапевтически эффективное количество может быть вначале определено с использованием моделей животных. Терапевтически эффективная доза может быть также определена с учетом полученных на человеке данных для тех CpG иммуностимулирующих олигонуклеотидов, которые проверялись на людях (клинические испытания на людях только что начались), и для тех соединений, в отношении которых известно, что они демонстрируют аналогичную фармакологическую активность, такие как другие адъюванты, например LT, и другие антигены, применяемые для целей вакцинации. Для парентерального введения могут потребоваться более высокие дозы. Вводимая доза может быть скорректирована с учетом относительной биологической доступности и эффективности вводимого соединения. Корректировка дозы, проводимая для достижения максимальной эффективности, основана на приведенных выше методах и других методах, которые известны и доступны специалистам со средним уровнем знаний в данной области.
Препараты по настоящему изобретению вводятся в виде фармацевтически приемлемых растворов, которые традиционно содержат фармацевтически приемлемые концентрации соли, забуферивающих агентов, консервантов, совместимых носителей, адъювантов и необязательно других терапевтических ингредиентов.
Для использования с терапевтической целью эффективное количество CpG иммуностимулирующего олигонуклеотида может вводиться индивидууму любым способом, который позволяет доставить олгинокулеотид на желательную поверхность, например на слизистую, или для оказания системного эффекта. Введение фармацевтической композиции по настоящему изобретению может быть осуществлено с помощью любых способов, известных специалистам в данной области. Предпочтительные способы введения включают, без ограничения, пероральный, парентеральный, внутримышечный, интраназальный, сублингвальный, интратеккальный, способ введения ингаляцией, внутриглазной, вагинальный и ректальный способы.
Для перорального введения соединения (например, CpG иммуностимулирующие олигонуклеотиды, антигены и другие терапевтические средства) могут быть введены в состав композиции просто путем объединения одного или нескольких активных соединений с фармацевтически приемлемыми носителями, известными в данной области. Такие носители облегчают изготовление композиций из соединений по настоящему изобретению с получением таблеток, пилюль, капсул, драже, жидких форм, гелей, сиропов, взвесей, суспензий и т.п., предназначенных для перорального употребления индивидуумом, подлежащим лечению. Фармацевтические препараты для перорального использования могут быть получены в виде твердых форм с добавкой соответствующих эксципиентов с проведением необязательно измельчения полученной смеси и обработки смеси гранул после добавления соответствующих вспомогательных веществ, при желании с получением таблеток или ядер драже. Подходящие эксципиенты включают, в частности, наполнители, такие как сахара, включая лактозу, сахарозу, манит или сорбит; препараты целлюлозы, такие как, например, кукурузный крахмал, пшеничный крахмал, рисовый крахмал, картофельный крахмал, желатин, трагакант, метилцеллюлоза, гидрокипропилметилцеллюлоза, натрий-карбоксиметилцеллюлоза и/или поливинилпирролидон (ПВП). При желании могут быть добавлены средства, способствующие разложению, такие как сшитый поливинилпирролидон, агар или альгиновая кислота или ее соль, такая как альгинат натрия. Необязательно перорально вводимые композиции могут быть изготовлены в солевом растворе или в буферах, например, с использованием ЭДТА для нейтрализации внутренних кислых условий, или могут быть введены без какого-либо носителя.
Кроме того, специально рассматриваются пероральные дозированные формы указанных выше одного или нескольких компонентов. Один или несколько указанных компонентов могут быть химически модифицированы таким образом, чтобы пероральная доставка такого производного стала эффективной. В основном изобретение относится к химической модификации, которая применима по меньшей мере к одному фрагменту молекулы компонента, где указанный фрагмент позволяет осуществлять (а) ингибирование протеолиза и (b) всасывание в кровоток из желудка или кишечника. Кроме того, желательно достичь повышения общей стабильности одного или нескольких компонентов и увеличения времени циркуляции в организме. Примеры таких фрагментов включают полиэтиленгликоль, сополимеры этиленгликоля и пропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлозу, декстран, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон и полипролин (Abuchowski and Davis, 1981, «Soluble Polymer-Enzyme Adducts» In: Enzymes as Drugs, Hocenberg and Roberts, eds., Wiley-Interscience, New York, NY, pp. 367-383; Newmark, et al., 1982, J. Appl. Biochem. 4: 185-189). Другие полимеры, которые могут использоваться, включают поли-1,3-диоксолан и поли-1,3,6-тиоксокан. Предпочтительными для фармацевтического использования, как было указано выше, являются полиэтиленгликолевые фрагменты.
Что касается компонента, то местом его высвобождения может быть желудок, тонкий кишечник (12-перстная кишка, тощая кишка или подвздошная кишка) или толстый кишечник. Специалист в данной области может иметь доступные композиции, которые не растворяются в желудке, но будут высвобождать нужный материал в 12-перстной кишке или в любом другом месте кишечника. Предпочтительно высвобождение будет происходить вдали от среды желудка, способной произвести вредный эффект, что достигается либо путем защиты олигонуклеотида, либо путем высвобождения биологически активного материала за пределами желудка, например в кишечнике.
Для гарантированного достижения полной резистентности к среде желудка необходимо нанесение покрытия, не проницаемого для среды с pH по меньшей мере 5,0. Примеры наиболее часто применяемых инертных ингредиентов, которые используются в качестве энтеросолюбильных покрытый, включают ацетаттримеллитатцеллюлозы (САТ), фталат гидроксипропилметилцеллюлозы (ГПМЦФ), ГПМЦФ 50, ГПМЦФ 55, поливинилацетатфталат (ПВАФ), Эудрагит L30D, Акватерик, ацетатфталат целлюлозы (САР), Эудрагит L, Эудрагит S и Шеллак. Указанные покрывающие оболочки могут использоваться в качестве смешанных пленок.
Для нанесения на таблетки может использоваться покрытие или смесь для создания покрывающей оболочки, которые не предназначены для защиты от действия среды желудка. Они могут включать сахарные покрытия или покрытия, которые облегчают проглатывание таблеток. Капсулы могут состоять из твердой оболочки (такой как желатиновая) для доставки сухого терапевтического средства, например порошка; для доставки жидких форм может использоваться мягкая желатиновая оболочка. Материал оболочки для пакетиков может представлять собой густой крахмал или другую применимую для пищи бумагу. В случае пилюль, леденцов, штампованных таблеток или растертых в порошок таблеток могут использоваться методики смачивания массы.
Терапевтическое средство может быть включен в композицию в виде тонкоизмельченных частиц, имеющих форму гранул или шариков с размером частиц примерно 1 мм. Материал вводимых капсул может быть изготовлен в виде порошка, слегка спрессованной массы или даже в виде таблеток. Терапевтический препарат может быть получен путем прессования.
Могут быть также включены красители и вкусовые агенты. Например, олигонуклеотид может быть изготовлен (например, путем инкапсулирования в липосому или микросферу) и далее введен в составе пищевого продукта, такого как охлажденный напиток, содержащий красители и вкусовые агенты.
Объем терапевтического препарата может быть разбавлен или увеличен инертным материалом. Указанные разбавители могут включать углеводы, в особенности маннит, а-лактозу, безводную лактозу, целлюлозу, сахарозу, модифицированные декстраны и крахмал. Могут быть также использованы некоторые неорганические соли в качестве наполнителей, включающие трифосфат кальция, карбонат магния и хлорид натрия. Некоторые коммерчески доступные разбавители представляют Fast-Flo, Emdex, STA-Rx 1500, Emcompress и Avicell.
В состав терапевтических препаратов в твердой дозированной форме могут быть включены средства, способствующие разложению. Материалы, используемые в качестве средств, способствующих разложению, включают, без ограничения, крахмал, включая коммерческие препараты, способствующие разложению, на основе крахмала (Explotab), гликолят натрий-крахмала, Амберлит, натрий-карбоксиметилцеллюлозу, ультрамилопектин, альгинат натрия, желатин, апельсиновую корку, кислую карбоксиметилцеллюлозу, природную губку и бентонит. Другая форма средств, способствующих разложению, включает нерастворимые катионообменные смолы. Порошковые камеди могут использоваться в качестве средств, способствующих разложению, и связующих веществ и включают порошкообразные камеди, такие как агар, камедь карайи или трагакант. Альгиновая кислота и ее натриевая соль могут использоваться в качестве средств, способствующих разложению.
Связующие вещества могут использоваться для удержания терапевтического средства в определенной ассоциации с образованием твердой таблетки и включают материалы из природных продуктов, таких как аравийская камедь, трагакант, крахмал и желатин. Другие соответствующие средства включают метилцеллюлозу (МЦ), этилцеллюлозу (ЭЦ) и карбоксиметилцеллюлозу (КМЦ). В водных растворах для грануляции терапевтического средства могут использоваться поливинилпирролидон (ПВП) и гидроксипропилметилцеллюлоза (ГПМЦ).
В состав композиции терапевтического препарата может быть включен агент, снижающий трение, с тем чтобы избежать возможного склеивания в процессе изготовления препарата. Замасливатели могут использоваться в виде слоя между терапевтическим средством и контактирующей поверхностью и включают, без ограничения, стеариновую кислоту, в том числе ее магниевую и кальциевую соли, политетрафторэтилен (ПТФЭ), жидкий парафин, растительные масла и воски. Могут также использоваться растворимые замасливатели, такие как лаурилсульфат натрия, лаурилсульфат магния, полиэтиленгликоль разного молекулярного веса, Карбовакс 4000 и 6000.
Могут также использоваться средства, способствующие скольжению, которые могут повысить текучесть лекарственного препарата в ходе его изготовления и способствовать перегруппировке при прессовании. Средства, способствующие скольжению, могут включать крахмал, тальк, пирогенный силикагель и гидратированный силикоалюминат.
Для повышения растворения терапевтического средства в водной среде может быть добавлено поверхностно-активное вещество в качестве увлажнителя. Поверхностно-активные вещества могут включать анионные детергенты, такие как лаурилсульфат натрия, диоктилсульфосукцинат натрия и диоктилсульфонат натрия. Катионные детергенты также могут использоваться и включают хлорид бензалкония или хлорид бензетония. Список потенциальных неионных детергентов, которые могут быть включены в композицию в качестве поверхностно-активных веществ, включает лауромакрогол 400, полиоксил-40-стеарат, полиоксиэтилен-гидрогенизированное касторовое масло 10, 50 и 60, глицеролмоностеарат, полисорбат 40, 60, 65 и 80, сложный эфир сахарозы и жирной кислоты, метилцеллюлозу и карбоксиметилцеллюлозу. Указанные поверхностно-активные вещества могут присутствовать в композиции олигонуклеотида или его производного либо сами по себе, либо в виде смеси в разных соотношениях.
Фармацевтические препараты, которые могут использоваться перорально, включают капсулы с насечкой, выполненные из желатина, а также мягкие герметичные капсулы, выполненные из желатина и пластификатора, такого как глицерин или сорбит. Капсулы с насечкой могут содержать активные ингредиенты в смеси с наполнителем, таким как лактоза, связующими веществами, такими как крахмалы, и/или замасливателями, такими как тальк или стеарат магния, и необязательно со стабилизаторами. Входящие в состав мягких капсул активные соединения могут быть растворены или суспендированы в подходящих жидкостях, таких как жирные масла, жидкий парафин или жидкие полиэтиленгликоли. Кроме того, могут быть добавлены стабилизаторы. Могут также использоваться микросферы, изготовленные для перорального введения. Такие микросферы известны и хорошо описаны в данной области. Все композиции для перорального введения должны быть представлены в дозировках, подходящих для такого введения.
Для целей трансбуккального введения композиции могут иметь вид таблеток или леденцов, изготовленных традиционным способом.
Для введения методом ингаляции соединения по настоящему изобретению, могут доставляться в форме аэрозольного спрея из упаковок под давлением или из небулайзера с использованием для этого подходящего пропеллента, например дихлордифторметана, трихлорфторметана, дихлортетрафторэтана, диоксида углерода или другого подходящего газа. В случае находящихся под давлением аэрозольных форм дозированная единица может быть отмерена с помощью клапана, доставляющего определенное таким образом количество. Капсулы и картриджи, например, из желатина для использования в ингаляторе или инсуффляторе могут быть изготовлены с включением порошковой смеси соединений и подходящей порошковой основы, такой как лактоза или крахмал.
В настоящем описании также рассматривается внутрилегочная доставка олигонуклеотидов (или их производных). Олигонуклеотид доставляется в легкие млекопитающего при вдыхании и перехода через слой выстилающего эпителия легкого в кровоток. Другие сообщения, описывающие молекулы для ингаляции, включают Adjei et al., 1990, Pharmaceutical Research, 7: 565-569; Adjei et al., 1990, International Journal of Pharmaceuticals, 63: 135-144 (леупролида ацетат); Braquet et al., 1989, Journal of cardiovascular Pharmacology, 13 (suрpl. 5): 143-146 (эндотелин-1); Hubbard et al., 1989, Annals of Internal Medicine, Vol. III, pp. 206-212 (а1-антитрипсин); Smith et al., 1989, J. Clin. Unvest. 84: 1145-1146 (а-1-протеиназа); Oswein et аl., 1990, «Aerosolization of Proteins», Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II, Keystone, Colorado, March, (рекомбинантный гормон роста человека); Debs et al., 1988, J. Immunol. 140: 3482-3488 (интерферон-g и фактор некроза опухолевой ткани альфа) и Platz et al., патент США No. 5 284 656 (гранулоцитарный колониестимулирующий фактор). Способ и композиция, подходящие для внутрилегочной доставки лекарственных средств с целью оказания системного эффекта, описаны в патенте США Nо. 5451569, выданном 19 сентября 1995 года (Wong et al).
Для практики осуществления настоящего изобретения рассматривается широкий перечень механических устройств, предназначенных для внутрилегочной доставки терапевтических продуктов, которые включают, без ограничения, небулайзеры, ингаляторы с отмеряемой дозой и порошковые ингаляторы, хорошо известные специалистам в данной области.
Некоторые конкретные примеры коммерчески доступных устройств, подходящих для осуществления настоящего изобретения, включают небулайзер Ultravent, производимый компанией Mallinckrodt, Inc., St. Louis, Missouri; небулайзер Acоrn II, производимый компанией Marquest Medical Products, Englewood, Colorado; ингалятор с отмеряемой дозой Ventolin, производимый компанией Glaxo Inc., Research Triangle Park, North Carolina; и порошковый ингалятор Spinhaler, производимый компанией Fisons Corp., Bedford, Massachusetts.
Все такие устройства требуют использования композиций, пригодных для доставки олигонуклеотида (или его производного). Как правило, каждая композиция является специфичной для определенного типа используемого устройства и может включать использование соответствующего материала пропеллента в дополнение к обычным разбавителям, адъювантам и/или носителям, используемым в терапии. Кроме того, в настоящем описании рассматривается также использование липосом, микрокапсул или микросфер, комплексов включения или других типов носителей. Химически модифицированный олигонуклеотид может быть также получен в виде различных композиций в зависимости от типа химической модификации или типа используемого устройства.
Композиции, приемлемые для использования с небулайзером, струйным или ультразвуковым, включают, как правило, олигонуклеотид, растворенный в воде в концентрации примерно 0,1-25 мг биологически активного олигонуклеотида на мл раствора. Композиция может также включать буфер и простой сахар (например, для стабилизации олигонуклеотида и регуляции осмотического давления). Композиция для небулайзера может содержать поверхностно-активное вещество для снижения или предупреждения агрегации олигонуклеотида, вызванной атомизацией раствора при образовании аэрозоля.
Композиции для использовании в ингалирующем устройстве с отмеряемой дозой в основном включают тонкоизмельченный порошок, содержащий олигонуклеотид, суспендированный в пропелленте с помощью поверхностно-активного вещества. Пропеллент может включать любой традиционный материал, используемый для этой цели, такой как хлорфторуглерод, гидрохлорфторуглерод, гидрофторуглерод или углеводород, включающий трихлорфторметан, дихлордифторметан, дихлортетрафторэтанол и 1,1,1,2-тетрафторэтан или их сочетания. Подходящие поверхностно-активные вещества включают сорбитана триолеат и соевый лецитин. В качестве поверхностно-активного вещества может также использоваться олеиновая кислота.
Композиции для доставки из порошкового ингалятора включают тонкоизмельченный сухой порошок, содержащий олигонуклеотид, и могут также включать объемный агент, такой как лактоза, сорбит, сахароза или маннит в количествах, которые способствуют выдаче порошка из устройства, например, в количестве от 50 до 90% от веса композиции. Форма олигонуклеотида, которая максимально эффективно доставляется в отдаленные части легкого, включает препарат, получаемый на основе частиц со средним размером менее чем 10 мм (или микрон) и наиболее предпочтительно от 0,5 до 5 мм.
Назальная доставка фармацевтической композиции по настоящему изобретению также рассматривается. Назальная доставка позволяет фармацевтической композиции по настоящему изобретению пройти в кровоток непосредственно после введения терапевтического продукта в нос без стадии осаждения продукта в легком. Композиции для назальной доставки включают композиции, выполненные с добавлением декстрана или циклодекстрана.
Для назальной доставки используют устройство, представляющее собой маленькую жесткую бутыль, к которой присоединен распылитель с отмеряемой дозой. В одном из вариантов осуществления отмеряемая доза доставляется путем проталкивания фармацевтической композиции по настоящему изобретению в камеру определенного объема, где указанная камера имеет отверстие с размерами, позволяющими получить распыленную аэрозольную композицию путем образования распыла при прессовании жидкости в камере. Камеру сжимают для введения фармацевтической композиции по настоящему изобретению. В конкретном варианте камера представляют собой поршневое устройство. Такие устройства коммерчески доступны.
Альтернативно пластиковая сжимаемая бутыль с отверстием или апертурой, имеющими размеры, подходящие для распыления арозольной композиции путем формирования распыла при сжатии. Отверстие обычно расположено в верхней части бутыли, и ее верхняя часть обычно сужается на конус для частичного введения в носовые проходы с целью эффективного введения аэрозольной композиции. Предпочтительно назальный ингалятор обеспечивает выход отмеренного количества аэрозольной композиции для доставки указанной дозы лекарственного средства.
В случае желательности доставки соединений системно они могут вводиться в состав композиции для парентерального введения путем инъекции, например инъекции болюсом, или путем непрерывной инфузии. Композиции для инъекций могут быть представлены в стандартной дозированной форме, например в виде ампул или контейнеров с многоразовой дозой, и содержать введенный в них консервант. Композиции могут иметь такие формы, как суспензии, растворы или эмульсии в масляных или водных носителях, и могут содержать агенты, используемые для создания композиций, такие как средства, способствующие суспендированию, стабилизации и/или диспергированию.
Фармацевтические композиции для парентерального введения включают водные растворы активных соединений в водорастворимой форме. Дополнительно суспензии активных соединений могут быть приготовлены в виде соответствующих масляных суспензий для инъекций. Подходящие липофильные растворители или носители включают жирные масла, такие как кунжутное масло, или синтетические сложные эфиры жирных кислот, такие как этилолеат или триглицериды, или липосомы. Водные суспензии для инъекций могут содержать вещества, которые повышают вязкость суспензии, такие как натрий-карбоксиметилцеллюлоза, сорбит или декстран. Необязательно суспензия может содержать подходящие стабилизаторы или агенты, которые повышают стабильность соединений и позволяют получать высококонцентрированные растворы.
Альтернативно активные соединения могут иметь порошкообразную форму, которая потом восстанавливается соответствующим носителем перед употреблением, например стерильной водой, не содержащей пирогенов.
Соединения могут быть также изготовлены с получением ректальных или вагинальных композиций, таких как суппозитории или удерживающие клизмы, например, содержащие традиционные основы для суппозиториев, такие как какао-масло или другие глицериды.
Кроме ранее описанных композиций соединения могут быть также изготовлены в виде депо-препарата. Такие пролонгированные композиции могут быть изготовлены с использованием подходящих полимерных или гидрофобных материалов (например, в виде эмульсии в подходящем масле) или ионообменных смол или слаборастворимых производных, например в виде слаборастворимой соли.
Фармацевтические композиции могут также включать соответствующие носители или эксципиенты в твердой или гелеобразной фазе. Примеры таких носителей или эксципиентов включают, без ограничения, карбонат кальция, фосфат кальция, различные сахара, крахмалы, производные целлюлозы, желатин и полимеры, такие как полиэтиленгликоли.
Подходящие жидкие или твердые фармацевтические формы препарата включают, например, водные или солевые растворы для ингаляции, микроинкапсулированные, дозированные формы, состоящие из доз, соответствующих ложке препарата, формы в виде нанесения покрытия на микроскопические частицы золота, формы, содержащиеся в липосомах, распыляемые из небулайзера, в виде аэрозолей, формы, имеющие вид шариков для имплантации в кожу, или формы, нанесенные на острый предмет и высушенные для втирания в кожу. Фармацевтические композиции также включают гранулы, порошки, таблетки, таблетки, покрытые оболочкой, микро(капсулы), суппозитории, сиропы, эмульсии, суспензии, кремы, капли или препараты с пролонгированным высвобождением активных веществ, в которых эксципиенты и добавки и/или вспомогательные вещества, такие как средства, способствующие разложению, связующие вещества, агенты, составляющие покрытие, набухающие агенты, замасливатели, вкусовые вещества, подсластители или солюбилизаторы, используются, как было описано выше. Фармацевтические композиции приемлемы для использования в широком диапазоне систем доставки лекарственных средств. Краткий обзор способов доставки лекарственных средств приведен в статье Лангера (Langer, Science 249: 1527-1533, 1990), которая включена в настоящее описание в качестве ссылки.
CpG иммуностимулирующие олигонуклеотиды и необязательно другие терапевтические средства и/или антигены могут вводиться per se (в чистом виде) или в форме фармацевтически приемлемой соли. При использовании в лекарственном препарате соли должны быть фармацевтически приемлемыми, однако соли, отличные от фармацевтически приемлемых, могут обычно использоваться для получения фармацевтически приемлемых солей. Такие соли включают, без ограничения, соли, полученные на основе следующих кислот: хлористоводородная, бромистоводородная, серная, азотная, фосфорная, малеиновая, уксусная, салициловая, п-толуолсульфоновая, винная, лимонная, метансульфоновая, муравьиная, малоновая, янтарная, нафталин-2-сульфоновая и бензолсульфоновая. Кроме того, такие соли могут быть получены в виде солей щелочного металла или щелочноземельных металлов, таких как натриевая, калиевая или кальциевая соли группы карбоновой кислоты.
Подходящие забуферивающие агенты включают: уксусную кислоту и соль (1-2% вес/объем); лимонную кислоту и соль (1-3% вес/объем); борную кислоту и соль (0,5-2,5% вес/объем); и фосфорную кислоту и соль (0,8-2% вес/объем). Подходящие консерванты включают: хлорид бензалкония (0,003-0,03% вес/объем); хлорбутанол (0,3-0,9% вес/объем); парабены (0,01-0,25% вес/объем) и тримерозал (0,004-0,02% вес/объем).
Фармацевтические композиции по настоящему изобретению содержат эффективное количество CpG иммуностимулирующего олигонуклеотида и необязательно антигенов и/или других терапевтических средств, которые могут включаться в фармацевтически приемлемый носитель. Термин «фармацевтически приемлемый носитель» обозначает один или несколько совместимых твердых или жидких наполнителей, разбавителей или инкапсулированных веществ, которые пригодны для введения человеку или другому позвоночному животному. Термин «носитель» обозначает органический или неорганический ингредиент, природный или синтетический, с которым объединяют активный ингредиент для облегчения его применения. Компоненты фармацевтических композиций также способны смешиваться с соединениями по настоящему изобретению и друг с другом таким образом, что отсутствует взаимодействие, которое бы существенно ухудшало желательную фармацевтическую эффективность.
Ниже настоящее изобретение иллюстрируется приведенными примерами, которые никоим образом не стоит трактовать как ограничивающие. Полное содержание всех ссылок (включая литературные ссылки, выданные патенты, опубликованные патентные заявки и совместно рассматриваемые патентные заявки), процитированных в заявке, включены в качестве ссылочного материала.
ПРИМЕРЫ
Олигодезоксинуклеотиды (ODN)
Приведенные ниже ODN используются в примерах.
Материалы и методы
Олигодезоксинуклеотиды (ODN)
ODN получают от компании Biospring (Frankfurt, Germany) или Sigma-Ark (Darmstadt, Germany), которые были проверены на идентичность и чистоту в компании Coley Pharmaceutical GmbH (Langenfeld, Germany). ODN разбавляют раствором фосфатного буфера (Sigma, Germany) и хранят при температуре -20°С. Все разбавления выполняют с использованием реактивов, не содержащих пирогена. ODN, соответствующие SEQ ID NO: 15-23 были синтезированы в Trilink Biotechnologies.
Очищение клеток
Препараты из периферической крови здоровых доноров мужчин и женщин были получены из Банка крови Университета Дюссельдорфа (Германия) и из них были выделены и очищены РВМС путем центрифугирования с использованием Ficoll-Hypaque (Sigma). Очищенные РВМС используют либо в свежеприготовленном виде (в большинстве тестов), либо суспендируют в замороженной среде и хранят при температуре -70°С. При необходимости аликвоты клеток оттаивают, промывают и ресуспендируют в культуральной среде RPMI 1640 (Bio Whittaker, Belgium) с добавкой 5% (об./об.) инактивированной тепловой обработкой человеческой сыворотки AB (Bio Whittaker, Belgium) или 10% (об./об.) инактивированной тепловой обработкой ФСТ, 2 мМ L-глютамина (Bio Whittaker), 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (Invitrogen (Karlsruhe, Germany)).
Выявление цитокинов
Оттаявшие или свежие РВМС высевают на 48-луночных планшетах с плоским дном или 96-луночных планшетах с круглым дном и инкубируют с ODN в указанных концентрациях в увлажненном инкубаторе при температуре 37°С. Культуральные супернатанты собирают и, если сразу не используют, замораживают при температуре -20°С до использования. Количество цитокинов в супернатантах оценивают с использованием коммерчески доступных наборов для ИФТФА (Diaclon, USA) или с помощью наборов для ИФТФА местного производства, разработанных с использованием коммерчески доступных антител (от Becton Dickinson/Pharmingen или PBL).
Исследования по процедуре примера 13 проводят следующим образом.
7
2
Из 6 мышей отбирают селезенки (самцы, BALB/c). Спленоциты из каждой селезенки отделяют путем осторожного пропускания через клеточное сито (размер пор 70 мкм) и затем объединяют. Спленоциты добавляют к ячейкам в культуральных планшетах. К каждой ячейке добавляют 1×10 клеток в объеме 900 мкл среды. В качестве среды используют RPMI 1640, содержащую 10% фетальной сыворотки теленка. Аликвот растворов CpG ODN по 100 мкл в среде добавляют к каждой ячейке до конечных концентраций в ячейках 0,01-10 мкг/мл. После инкубации в течение 36 часов (37°С, инкубатор с содержанием 5% CO) культуральные супернатанты собирают и определяют в них концентрации цитокина с использованием теста Luminex multiplex (IFNγ, IP-10, IL-10, IL-6, TNFα) или метода ИФТФА (IFNα).
Индукция антиген-индуцированного повышения назальной резистентности у морских свинок
Морских свинок (самцы, Hartley) сенсибилизируют антигеном (овальбумин, 5 мг, вводимый внутрибрюшинно и подкожно) в день исследования 0. На 4 день исследования проводят буст-сенсибилизацию (5 мг, внутрибрюшинно). Проводят антигенную провокацию морских свинок путем интраназального введения антигена два раза в неделю в течение двух последовательных недель. Первую провокацию проводят на 14 день исследования. SEQ ID NO: 7 (номер лота AQE-03J-001-M, 0,03-1 мг/кг в 150 мкл/кг солевого раствора) вводят интраназально один раз в неделю, за два дня до первой провокации антигеном в неделю. За исключением последней провокации в 24 день исследования, антигенную провокацию проводят овальбумином (1,5 мг/кг в 150 мкл/кг солевого раствора). Проводят предварительную обработку животных мепирамином (10 мг/кг, внутрибрюшинно) за 30 минут до провокации с целью защиты от гистамин-индуцированной анафилаксии. На 24 день исследования проводят анестезию морских свинок для последующего измерения назальной резистентности с использованием респираторной механической системы Buxсo и соответствующего программного обеспечения. Последнюю антигенную провокацию проводят овальбумином (2,5 мг/кг в 250 мкл солевого раствора), вводимого в носоглотку. Животных подвергают предварительной обработке мепирамином (3 мг/кг, внутрибрюшинно) за 30 минут до провокации. Назальную резистентность определяют через 40 после провокации.
Индукция антиген-индуцированного повышения назальной резистентности у мышей
Мышей (самцы, BALB/c) сенсибилизируют в дни исследования 0 и 7 антигеном (овальбумин, 100 мкг, в/б) с адъювантом гидроксидом алюминия (Pierce Alum в/б). Мышей подвергают антигенной провокации путем интраназального введения антигена (1 мг в 10 мкл солевого раствора). Первую провокацию проводят на 14 день исследования. SEQ ID NO: 7 вводят интраназально дважды. Первую дозу вводят за 2 дня до первой антигенной провокации. Вторую дозу вводят через 7 дней. Альтернативно интраназально ежедневно вводят будезонид (противовоспалительный синтетический кортикостероид). Первую дозу вводят за 2 дня до первой антигенной провокации. Каждый день дозу будезонида вводят интраназально за 4 часа до интраназальной антигенной провокации. Конечной точкой измерений является 26 день исследования (то есть через 7 дней после введения второй дозы SEQ ID NO: 7). Отбирают назальные ткани для гистопатологической оценки воспаления. Отдельным мышам проводят последнюю антигенную провокацию и определяют частоту насморка и заложенности носа в течение 10-минутного периода после провокации.
Статистический анализ
Используют тест Манн-Уитни для сравнения групп данных, где сравниваемые популяции отличались от нормы. Тест на множественные сравнения Даннита (Dunnit) был использован для сравнения групп данных с единственным контролем.
Индукция цитокина у мышей in vivo
Мышам (самцы, BALB/c) вводят дозу CpG ODN (0,1 и 1 мг/кг) или контрольного носителя (солевой раствор, 25 мкл) путем интраназальной инстилляции. Собирают через 8 часов и 15 часов после введения дозы бронхоальвеолярный лаваж и сыворотку (полученную из крови после сердечного прокола). Подсчитывают число клеток в бронхоальвеолярном лаваже с использованием автоматизированного счетчика клеток Advia. Концентрации цитокинов и хемокинов в бронхоальвеолярном лаваже и сыворотке определяют с использованием метода ИФТФА (IFNα, IL-12p40) или мультиплексной системы для оценки цитокинов Luminex (IFNγ, IP-10, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-13, IL-15, IL-17, ГM-КСФ, RANTES, TNFα). Минимальные выявляемые концентрации различались для каждого аналитического образца, но в целом были в диапазоне 0,3-12 пг/мл.
Индукция вирусом гриппа воспаления в дыхательных путях мышей
50
Вирус гриппа (грипп типа A, подтип H1N1, адаптированный для мышей штамм PR8) был любезно предоставлен Дэвидом Вудхаусом (David Woodhouse, Trudeau Institute, Saranac Lake, NY). В рамках предварительного исследования, проведения с целью титрования дозы гриппа и определения временных параметров инфекции мышей BALB/c (самки) инфицируют вирусом гриппа путем интраназальной инстилляции на день исследования 0. Мышам вводят 50, 200 или 500 средних инифицирующих доз для куриного эмбриона (EID) в 40 мкл солевого раствора. Воспаление дыхательных путей оценивают через 1, 3, 6, 9 и 14 дней после инфицирования.
Интраназальное введение CpG ODN и оценка воспаления дыхательных путей
50
Мышам вводят CpG ODN (0,03, 0,3 или 3 мг/кг) путем интраназальной инстилляция в 25 мкл солевого раствора. Каждой мыши вводят дозу дважды, за 6 дней и 2 дня до инфекции вирусом гриппа (200 EID, интраназально). Указанная доза вируса была выбрана на основании результатов предварительного исследования. Воспаление дыхательных путей и вирусную нагрузку в легких оценивают через 6 дней после вирусной инфекции. Данная временная точка была выбрана на основании результатов предварительного исследования. Клетки из дыхательных путей отбирают путем бронхоальвеолярного лаважа. Общее число лейкоцитов определяют на автоматизированном счетчике клеток Advia (Advia, Bayer Diagnostics, Zurich, Switzerland). Дифференциальный подсчет клеток проводят под световым микроскопом при использовании препаратов после центрифугирования и окрашивания краской Райт-Гимза (Wright-Giemza). Легкие отбирают и гомогенизируют в 300 мкл стерильного ФБР. Супернатанты собирают и оценивают вирусную нагрузку с использованием набора для иммуноферментного анализа (Takara Biomedical, Shiga, Japan), в соответствии с инструкциями от производителя. В данном тесте используется моноклональное антитело против ядерного белка вируса гриппа А в составе твердой фазы и поликлонального антитела для выявления вируса гриппа.
Пример 1
Влияние обработки CpG ODN человеческих РВМС на секрецию IFNα
Методы: Периферические мононуклеарные клетки крови человека от трех доноров (SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6) или от семи доноров (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3) инкубируют с CpG ODN в течение 48 часов в указанных концентрациях. Определяют секрецию интерферона-альфа человеческими РВМС.
Результаты: На фиг.1 показано повышение продукции IFNα при инкубации с CpG ODN. Приведенные данные представляют среднее значение ± СКО. Следует отметить, что абсолютные уровни в пг/мл нельзя сравнивать непосредственно, поскольку РВМС были взяты от разных доноров и результаты для каждого донора варьируют.
Пример 2
Стимуляция TLR9-трансфицированных клеток in vitro
Методы: Клетки HEK 293, трансфицированные человеческим TLR9, инкубируют с SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 6 в течение 16 часов. Сигнал определяют с использованием теста c люциферазой.
50
Результаты: Результаты показаны в таблице 1. Значения ЭК вычисляют с использованием программы Sigma Plot (Sigma Plot 2002, Windows версия 8.0). Максимальный индекс стимуляции (max SI) вычисляют как коэффициент между наивысшим показателем для всех исследованных концентраций любого ODN и значением контроля.
<u>Таблица 1</u>
ODN
ЭК<sub>50</sub>
max SI
SEQ ID NO: 1
2320
22
SEQ ID NO: 2
4730
20
SEQ ID NO: 3
2400
16
SEQ ID NO: 4
3200
14
SEQ ID NO: 5
4290
13
SEQ ID NO: 6
4580
11
Пример 3
Эффекты CpG олигодезоксинуклеотида SEQ ID NO: 7 против антиген-индуцированного повышения назальной резистентности у морских свинок
Методы: Для исследования эффектов CpG олигодезоксинуклеотида SEQ ID NO: 7 против антиген-индуцированного повышения назальной резистентности у морских свинок проводят сенсибилизацию морских свинок антигеном с последующей назальной провокацией антигеном. Назальную резистентность измеряют через 40 минут после провокации.
Таблица 2
Краткое описание протокола исследования
Результаты: На фиг.2 приведены результаты, демонстрирующие, что провокация антигеном вызывает прогрессивное повышение назальной резистентности в течение 40 минут, которое существенно подавляется у морских свинок после введения SEQ ID NO: 7 (0,03-1 мг/кг).
Пример 4
Эффекты CpG олигодезоксинуклеотида SEQ ID NO: 7 на модели мышей с аллергическим ринитом
Методы: Используют мышей BALB/c для изучения эффекта SEQ ID NO: 7 на симптомы аллергического ринита. После сенсибилизации и антигенной провокации отбирают назальные ткани для гистопатологической оценки воспаления. Отдельным мышам проводят последнюю провокацию антигеном и через 10 минут после провокации определяют частоту развития насморка и заложенности носа.
Таблица 3
Краткое описание протокола исследования: мыши, обработанные олигонуклеотидом
Таблица 4
Краткое описание протокола исследования: мыши, обработанные будезонидом
Результаты: Антигенная провокация вызывает насморк и заложенность носа. Как показано на фиг.3, частота обоих явлений подавляется у мышей, которым вводят SEQ ID NO: 7.
Пример 5
Воспаление дыхательных путей, индуцированное вирусом гриппа в легких мышей: эффекты CpG олигодезоксинуклеотида класса С
Введение: CpG олигодезоксинуклеотиды (ODN) индуцируют иммуномодифицирующие цитокины, которые должны проявлять антиастматические эффекты. CpG ODN класса С индуцируют более высокие титры IFNα, чем исследованные ранее ODN класса В. CpG ODN класса С могут оказывать дополнительной полезный эффект в направлении супрессии вирус-индуцированного ухудшения астматического состояния. Данное исследование было проведено для оценки способности трех CpG ODN класса С подавлять вирусную нагрузку (вирус гриппа) в легких мышей и вирус-индуцированное воспаление в дыхательных путях.
Методы: Используют вирус гриппа для индукции воспаления дыхательных путей у мышей BALB/c. CpG ODN вводят интраназально и определяют защитный эффект.
50
Результаты: На фиг.4 показано, что в предварительном исследовании, проведенном с целью титрования дозы вируса гриппа и определения временных параметров инфекции, вирус гриппа вызывал накопление лейкоцитов в дыхательных путях. Пик воспаления достигался через 6-9 дней. Мыши, инфицированные 500 EID вируса, у которых наблюдалось выраженное снижение веса через 6 дней, были умерщвлены.
50
На фиг.5 показаны защитные эффекты CpG ODN на вирусную нагрузку и вирус-индуцированное воспаление в дыхательных путях. Предварительная обработка CpG ODN перед инфекцией вирусом гриппа (200 EID) снижает вирусную нагрузку в легких, по данным оценки через 6 дней после инфекции. На фиг.6 показано, что инфекция вирусом гриппа вызывает накопление лейкоцитов в дыхательных путях через 6 дней. Среди них доминировали нейтрофилы и мононуклеарные клетки (моноциты, макрофаги и лимфоциты). Среди них было совсем немного эозинофилов. Накопление клеток существенно подавляется у мышей, которым предварительно вводили любой из CpG ODN.
Пример 6
Эффекты CpG олигодезоксинуклеотидов класса С против антиген-индуцированного воспаления дыхательных путей у мышей
Сравнивают активность трех CpG олигодезоксинуклеотидов (ODN) класса С. CpG ODN SEQ ID NO: 7 класса В был включен в исследование для целей сравнения.
Методы: Мышей (самцы BALB/c) сенсибилизируют в дни исследования 0 и 7 антигеном (антиген таракана, 10 мкг, внутрибрюшинно) с использованием адъюванта гидроксида алюминия (Pierce Alum, внутрибрюшинно). Мышей подвергают антигенной провокации путем интраназального введения антигена (10 мкг в 40 мкл солевого раствора) два раза в неделю в течение двух последовательных недель. Первую провокацию проводят в 21 день исследования. СpG ODN (1, 10 и 100 мкг/кг) вводят интраназально раз неделю за два дня до первой антигенной провокации в неделю.
Воспаление дыхательных путей оценивают через 48 часов после последней антигенной провокации. Клетки дыхательных путей получают бронхоальвеолярным лаважем. Проводят дифференциальный подсчет клеток с использованием автоматизированного счетчика Advia. Количество Т-клеток (общее число CD3+ клеток и CD3+CD4+клеток) определяют при подсчете методом проточной цитометрии.
Таблица 5
Краткое описание протокола исследования
<u>Таблица 6</u>
Исследованные CpG ODN
SEQ ID NO: 7
Полумягкие, класса В
Лот А25-0313-L1
SEQ ID NO: 1
Полумягкие, класса С
Лот C44-1209-M1B
SEQ ID NO: 2
Полумягкие, класса С
Лот C44-1209-M2D
SEQ ID NO: 3
Полумягкие, класса С
Лот C44-1209-M4B
Результаты: Антигенная провокация вызывают накопление эозинофилов и Т-клеток в дыхательных путях (фиг. 7 и 8). Не происходит накопления нейтрофилов. Каждый из исследованных СpG ODN вызывает значительную супрессию накопления эозинофилов в наивысшей исследованной дозе (100 мг/кг) (фиг.7). Количество Т-клеток также ниже, хотя снижение в основном не было статистически значимым (фиг.8).
Пример 7
Индукция CpG олигодезоксинуклеотидами класса С цитокинов у мышей in vivo
Сравнивают активности трех CpG олигодезоксинуклеотидов класса С (ODN). СpG ODN класса В SEQ ID NO: 7 был включен в настоящее исследование для целей сравнения.
Методы: Концентрации цитокинов и хемокинов в бронхоальвеолярном лаваже определяют по процедуре, приведенной в разделе «Материала и методы».
<u>Таблица 7</u>
Группы лечения
CpG олигодезоксинуклеотид
Интраназальная доза
Временные точки отбора образца
Носитель
8, 15 часов
SEQ ID NO: 7
полумягкий, класса В;
Лот А25-0313-L1
0,1, 1 мг/кг
8, 15 часов
SEQ ID NO: 1,
полумягкий ODN класса С;
Лот C44-1209-M1B
0,1, 1 мг/кг
8, 15 часов
SEQ ID NO: 2,
полумягкий ODN класса С;
Лот C44-1209-M2D
0,1, 1 мг/кг
8, 15 часов
SEQ ID NO: 3,
полумягкий ODN, класса С
Лот C44-1209-M4B
0,1, 1 мг/кг
8, 15 часов
Результаты: На фиг.9 продемонстрировано число клеток в бронхоальвеолярном лаваже. Интраназальная инстилляция каждого из ODN класса С, особенно в дозе 1 мг/кг, демонстрирует тенденцию к очень слабому накоплению лейкоцитов в бронхоальвеолярном лаваже.
На фиг. 10-15 показаны концентрации цитокинов в бронхоальвеолярном лаваже. Интраназальная инстилляция каждого из CpG ODN индуцирует выявляемые для измерения титры IFNα, IFNγ, IP-10, IL-12p40, IL-6 и TNFα в бронхоальвеолярном лаваже. Титры других анализируемых ингредиентов не выявлялись или концентрации были несколько выше фоновой (как правило, <20 пг/мл, данные не показаны). ODN класса С были более эффективными средствами, чем ODN класса В SEQ ID NO: 7 в качестве индукторов IFNα, IFNγ, IP-10, IL-12p40, IL-6 и TNFα. Повышенная эффективность ODN класса С была особенно очевидной в дозе 0,1 мг/кг. Особый интерес представляет тот факт, что только ODN класса С был способен индуцировать выявляемые титры IFNα и IFNγ после введения дозы 0,1 мг/кг (фиг.10).
На фиг. 15-18 показана концентрация цитокинов в сыворотке крови. Интраназальная инстилляции каждого из ODN индуцирует выявляемые титры IFNγ, IL-6 и TNFα в сыворотке. Титры других анализируемых компонентов при их измерении не давали выявляемых концентраций (как правило <20 пг/мл, данные не показаны). При сравнении с CpG класса В SEQ ID NO: 7, каждый из трех ODN класса С действовал как мощный индуктор иммуномодифицирующих цитокинов IFNα, IFNγ, IP-10, IL-12p40, IL-6 и TNFα.
Пример 8
Эффекты CpG олигодезоксинуклеотида SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 7 на антиген-индуцированную продукцию IgE у мышей
Методы: Мышей (самцы BALB/c) сенсибилизируют в дни исследования 0 и 7 антигеном (овальбумин, 10 мкг, в/б) с использованием адъюванта гидроксида алюминия (Pierce Alum, в/б). Мышам вводят SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 7 в дни исследований -2, 0, 5 и 7 (то есть за два дня до каждой сенсибилизации и в день сенсибилизации). У мышей отбирают кровь путем сердечной пункции на 18 день исследования. Сыворотку собирают центрифугированием и анализируют методом ИФТФА на наличие овальбумин-специфичных IgE и IgG2a.
<u>Таблица 8</u>
Группы лечения
Сенсибилизация
Лечение
n
1 Нет2 Антиген
НетНоситель, в/б
510
3 Антиген4 Антиген5 Антиген6 Антиген
SEQ ID NO: 2, 1 мкг/кг, в/бSEQ ID NO: 2, 10 мкг/кг, в/бSEQ ID NO: 2, 100 мкг/кг, в/бSEQ ID NO: 2, 1000 мкг/кг, в/б
10101010
7 Антиген8 Антиген9 Антиген10 Антиген
SEQ ID NO: 7, 1 мкг/кг, в/бSEQ ID NO: 7, 10 мкг/кг, в/бSEQ ID NO: 7, 100 мкг/кг, в/бSEQ ID NO: 7, 1000 мкг/кг, в/б
10101010
<u>Таблица 9</u>
Краткое описание протокола исследования
Иммунизация
Иммунизация
↓
↓
ODN
ODN
ODN
ODN
↓
↓
↓
↓
День
-2
0
5
7
18
↓
Конечная точка
Результаты: Антигенная сенсибилизации приводит к появления сывороточных титров антиген(овальбумин)-специфичных IgE и IgG2a. Продукция IgE подавляется у мышей при введении SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 7, тогда как продукция IgG2a потенцируется (фиг.19).
Выводы: Данные примера 8 показывают, что SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 7 подавляют Th2-ассоциированную продукцию IgE в ответ на сенсибилизацию антигеном и потенцируют Th1-ассоциированную продукцию IgG2a. Результаты данного исследования дают дополнительные доказательства того, что указанные CpG олигонуклеотиды могут подавлять Th2-тип ответа на воздействие антигена у мышей.
Пример 9
Эффекты SEQ ID NO: 2 против обострения воспаления дыхательных путей, индуцированного инфекцией гриппом, объединенной с антигенной провокацией
Введение: CpG олигодезоксинуклеотид SEQ ID NO: 2 класса С может подавлять нагрузку вирусом гриппа и вирус-индуцированное воспаление дыхательных путей у мышей. Настоящее исследование проведено с целью оценки защитных эффектов SEQ ID NO: 2 против обострения воспаления дыхательных путей, индуцированного объединением инфекции вирусом гриппа и антигенной провокации.
50
Методы: Введение антигена и вируса: мышей (самцы BALB/c) сенсибилизируют в дни исследования 0 и 7 антигеном (антиген таракана, 10 мкг, внутрибрюшинно) с использованием адъюванта гидроксида алюминия (Pierce Alum). Мышей подвергают антигенной провокации путем интраназального введения антигена (10 мкг в 40 мкл солевого раствора) два раза в неделю в течение трех последовательных недель. Первую провокацию проводят в 21 день исследования. Мышей инфицируют вирусом гриппа (вирус гриппа типа А, подтип H1N1, адаптированный для мышей штамм PR8, 200 EID в 40 мкл солевого раствора) путем интраназальной инстилляции в 34 день исследования (то есть перед первой парой антигенных провокаций). Альтернативно отдельным группам мышей проводят только провокацию антигеном или только инфекцию вирусом.
SEQ ID NO: 2 (100 мкг/кг) вводят интраназально раз в неделю за два дня до первой антигенной провокации в неделю. Воспаление дыхательных путей оценивают через 48 часов после последней антигенной провокации. Клетки из дыхательных путей получают путем бронхоальвеолярного лаважа. Дифференциальный подсчет клеток проводят под световым микроскопом с использованием препаратов, полученных после цитоцентрифугирования и окрашивания краской Райт-Гимза (Wright-Giemza).
Таблица 10
Краткое описание протокола исследования
Результаты: Приведенные на фиг.20 данные показывают, что только инфекция вирусом гриппа и только провокация антигеном вызывает повышение общего числа лейкоцитов в бронхоальвеолярном лаваже. У мышей, инфицированных вирусом, указанное накопление клеток включает выраженную нейтрофилию, тогда как у антиген-провоцированных мышей накопление включает выраженную эозинофилию. При сравнении мышей, которым проводили только антигенную провокацию, с мышами, которым проводили и антигенную провокацию, и инфекцию вирусом, видно, что у последних наблюдается повышение накопления лейкоцитов в бронхоальвеолярном лаваже. Указанное повышенное накопление распространяется как на нейтрофилы, так и на мононуклеарные клетки. Однако у данных мышей отмечается снижение эозинофилии. Другие исследователи получили аналогичные результаты, согласно которым гриппозная инфекция может подавлять эозинофилию в дыхательных путях у антиген-провоцированных мышей, и было высказано предположение, что в этом случае имеет место Th1-опосредованный эффект (например, Wohlleben et al., 2003).
Введение SEQ ID NO: 2 (100 мкг/кг) не подавляет вирус-индуцированную нейтрофилию (фиг.20). Такой отрицательный результат был ожидаем, поскольку в более раннем исследовании повышенная доза в 300 мкг/кг оказалась самой подходящей для достижения антивирусного эффекта. Кроме того, SEQ ID NO: 2 (100 мкг/кг) незначительно подавляет антиген-индуцированную эозинофилию. Данный положительный результат согласуется с результатами более ранних исследований.
SEQ ID NO: 2 (100 мкг/кг) существенно подавляет обострение воспаления дыхательных путей, индуцированное у мышей, которые подвергались и инфекции вирусом, и антигенной провокации. При этом подавляется повышенное накопление и нейтрофилов, и мононуклеарных клеток. Кроме обострения воспаления дыхательных путей у мышей, которые подвергались и инфекции вирусом, и антигенной провокации, отмечалось выраженное снижение веса тела. Указанное снижение веса также существенно подавлялось у мышей, которым вводили SEQ ID NO: 2.
Выводы: У детей и у взрослых, имеющих астму, инфекции вирусами дыхательного тракта являются важными преципитирующими факторами, вызывающими обструкцию и развитие стерторозного дыхания. Механизмы воспаления, вовлекаемые в эти процессы, весьма сложны. Однако известно, что вирус-индуцированный рекрутмент и активация нейтрофилов и мононуклеарных клеток вовлекаются в усиление обструкции дыхательных путей, что, в свою очередь, сказывается на обострении астмы (см. обзор Gern and Busse, Nature Immunology, 2002). Данные, приведенные в примере 9, показывают, что SEQ ID NO: 2 существенно подавляет повышение накопления нейтрофилов и мононуклеарных клеток, индуцированное у мышей объединенной инфекцией вирусом и антигенной провокацией.
Пример 10
Исследование на морских свинках
Пример 10а
Краткое описание протокола исследования на морских свинках AHR
Самцов морских свинок сенсибилизируют в дни исследования 0 и 4 антигеном (овальбумин, 0,5 мл, 1% OVA в/б-п/к) с использованием в качестве адъюванта гидроксида алюминия. Антигенную провокацию морских свинок проводят путем ингаляции аэрозольной формы овальбумина два раза в неделю в течение двух последовательных недель. Первую провокацию проводят в 13 день исследования. Один раз в неделю интраназально вводят CpG ODN или носитель (солевой раствор, 20 мкл) за два дня до первой антигенной провокации в неделю. Гиперреактивность дыхательных путей оценивают через 24 часа после последней антигенной провокации путем измерения бронхоконстрикции (повышение резистентности дыхательных путей) при внутривенном введении метахолина. Для каждого животного строят график зависимости доза-ответ на введение метахолина и определяют количественные характеристики реактивности дыхательных путей на основании показателя «площадь под кривой». На фиг.21 схематически проиллюстрирована данная процедура.
Пример 10b
Эффект SEQ ID NO: 7 на резистентность дыхательных путей и эластичность легкого у морских свинок
Метод: Морских свинок сенсибилизируют, как описано в примере 10. Первую провокацию проводят в 13 день. Морским свинкам вводят интраназально либо носитель (солевой раствор), либо один ОVA, либо SEQ ID NO:7 в концентрациях 10 мкл/кг, 30 мкл/кг, 100 мкл/кг или 300 мкл/кг, в/т.
Результаты: на фиг.22 показано, что SEQ ID NO:7 вызывает зависимое от дозы снижение AUC-резистентности.
Пример 10с
Статистический анализ эффекта SEQ ID NO: 7 на резистентность дыхательных путей и эластичность легкого у морских свинок
Метод: Используют тест на множественные сравнения Даннетта (Dunnett) для анализа результатов экспериментов, описанных в примере 10b. Тест на множественные сравнения Даннетта позволяет проводить сравнение всех образцов с одной контрольной группой.
Результаты: На фиг.23 показано, что SEQ ID NO: 7 вызывает зависимое от дозы снижение AUC-резистентности.
Пример 10d
Эффект SEQ ID NO: 2 на резистентность дыхательных путей и эластичность легкого у морских свинок
Метод: Морских свинок сенсибилизируют, как описано в примере 10. Первую провокацию проводят в 13 день исследования. Морским свинкам вводят интраназально либо носитель (солевой раствор), либо один OVA, либо SEQ ID NO: 2 в концентрациях 10 мкл/кг, 30 мкл/кг, 100 мкл/кг или 300 мкл/кг, в/т.
Результаты: На фиг.24 показано, что SEQ ID NO: 2 вызывает зависимое от дозы снижение AUC-резистентности.
Пример 10е
Статистический анализ эффекта SEQ ID NO: 2 на резистентность дыхательных путей и эластичность легкого у морских свинок
Метод: Используют тест на множественные сравнения Даннетта (Dunnett) для анализа результатов экспериментов, описанных в примере 10d. Тест на множественные сравнения Даннетта позволяет проводить сравнение всех образцов с одной контрольной группой.
Результаты: На фиг.25 показано, что SEQ ID NO: 2 вызывает зависимое от дозы снижение AUC-резистентности.
Пример 11
На фиг. 27-31 показаны уровни IL-10, TNF-альфа, интерферон-гамма и IL-6 (пг/мл), продуцируемые человеческими РВМС после воздействия на клетки CpG олигонуклеотидов по настоящему изобретению. Исследованные нуклеотиды, показанные на фиг.27, включают SEQ ID NО: 10, 9, 13, 14, 1 и 2. Концентрация олигонуклеотида, используемого для получения конкретного данного, показана на оси Х (мкМ).
Как видно из фиг.27, все олигонуклеотиды, исследованные в указанных тестах, способны продуцировать разные уровни и картины секреции IL-10. Из исследованных ODN SEQ ID NО: 1 и 2 привели к резкому повышению индукции IL-10.
На фиг.28 приведены данные, относящиеся к TNF-альфа, интерферону-гамма и IL-6 в трех репрезентативных дозах. Более детальные графики, описывающие данные цитокины, приведены на фиг. 29-31, где использованы дополнительные дозировки олигонуклеотидов.
Пример 12
На фиг. 32-42 показаны уровни активации В-клеток, плазмацитоидных дендритных клеток и моноцитов после воздействия на эти клетки CpG олигонуклеотидов по настоящему изобретению. Исследованные и показанные на данных фигурах олигонуклеотиды включают SEQ ID NО: 9, 13, 10, 14, 2, 1, 11, 12 и 3. Концентрация олигонуклеотида, используемого для получения значения в конкретной точке, показана на оси Х (мкМ).
Как видно из фиг. 32, 34, 35, 40 и 42, CpG олигонуклеотиды, исследованные в данных тестах, способны активировать В-клетки, на что указывают использованные в исследовании маркеры. Из фиг. 32 и 33 видно, что CpG олигонуклеотиды, исследованные в данных тестах, способны активировать NK-клетки, на что указывают использованные маркеры. На фиг. 36, 37, 40 и 41 показано, что CpG олигонуклеотиды, исследованные в данных тестах, способны активировать моноциты, на что указывают использованные маркеры. Как видно из фиг. 36 и 39, CpG олигонуклеотиды, исследованные в данных тестах, способны активировать плазмацитоидные дендритные клетки, на что указывают использованные маркеры.
Все пять ODN, содержащие полумягкий скелет, которые были исследованы в данных тестах, демонстрируют повышенную эффективность в рамках данных тестов (IFN-альфа, IР-10, IL-10), в сравнении с SEQ ID NO: 9 (полностью фосфоротиоатный скелет). Эффективность указанных полумягких ODN также повышается при активации моноцитов (экспрессия CD80, CD86), активации pDC (экспрессия CD86), активации внутриклеточных IP-10 (моноциты и B-клетки), активации секреции IL-6 и активации B-клеток (экспрессия CD80 и CD86). Например, при использовании примерно равных или сниженных концентраций большая часть исследованной ODN приводила к лучшей индукции маркеров-клеточной поверхности, чем полностью фосфортиоатная последовательность SEQ ID NO:9.
Пример 13
Целью настоящего исследования является оценка биологической активности выбранных фрагментов (предположительных метаболитов) SEQ ID NO:2. Активность определяют при оценке способности каждого фрагмента индуцировать секрецию TLR9-ассоциированных цитокинов из спленоцитов мышей in vivo.
Стимуляция секреции цитокинов фрагментами SEQ ID NO:2 показана на фиг.43-45. Исследованные олигонуклеотиды указаны на чертежах в виде SEQ ID NO: и включают SEQ ID NO:15-23. Концентрация олигонуклеотида, соответствующая значению в каждой конкретной точке, показана на оси Х (мкМ).
Как видно из данных фиг.43-45, SEQ ID NO:2 и исследованные фрагменты (предположительные метаболиты, SEQ ID NO:15-23), все индуцируют секрецию TLR9-ассоциированных цитокинов IFNα, IFNγ, IP-10, IL-6, IL-10 и TNFα из спленоцитов мышей in vitro (фиг.43, 44 и 45). Приведенные данные показывают, что каждый из этих фрагментов сохраняет биологическую активность.
Пример 14
1. CpG ODN С-класса (SEQ ID NO:2) индицируют IFNα и IFN-связанные гены
Способы: Мышам (самцы, BALB/c) интраназальной инфузией вводили SEQ ID NO:2 (100 мкг/кг на фигурах 46а-46с; или 10, 100, или 1000 мкг/кг на фигурах 46d-46f) или физиологический раствор.
Через 15 часов в брохиоальвиолярном лаваже анализировали секретируемые белки (IFNα, IFNγ и IP-10), или через 30 часов с помощью ПЦР в реальном времени анализировали экспрессию генов в ткани легких.
Результаты: Полумягкие CpG ODN С-класса (SEQ ID NO:2) индуцировали секрецию IFNα, IFNγ и интерферон-зависимого белка-10 (IP-10). Результаты представлены на фигуре 46.
Авторы также исследовали экспрессируется ли интерферон-индуцибельный ген индоламин-2,3-диоксигеназы в легких. При введении в дыхательные пути CpG ODN увеличивал экспрессию мРНК этого иммунно-модулируемого фермента (фиг.46f). В легких мыши также была отмечена индукция экспрессии Мх1 и индоламин 2,3-дикосигеназы (фигуры 46d и 46е).
2. Противовирусный эффект CpG ODN С-класса
Так как вирусная инфекция респираторного тракта является главной причиной обострений астмы, то была создана мышиная модель, на которой воспаление дыхательных путей обостряли введением антигена на фоне вирусной инфекции.
Способы: Мышам дважды вводили SEQ ID NO:2 в количестве 30, 100 или 300 мкг/кг с интервалом в 4 дня путем интраназального впрыскивания в количестве 40 мкл физиологического раствора. Через два дня после введения последней дозы мышей инфицировали вирусом гриппа (вирус гриппа типа А, подтип H1N1, штамм PR8, адаптированный для мышей, 200 EID50, в количестве 40 мкл физиологического раствора) интраназальное впрыскивание.
Вирус проникал в легкие (иммунноферментный анализ на нуклеарный белок Takara Biomedical), а воспаление дыхательных путей (количество клеток подсчитывали в бронхоальвеолярном лаваже) анализировали через 6 дней после инъекции вируса.
Результаты: Предварительное введение SEQ ID NO:2 снижало вирусную нагрузку в легких (фигура 47а) и вирус-индуцированное накопление лейкоцитов (включая нейтрофилы и мононуклеарные клетки) в дыхательных путях (фигуры 47b и 47с, соответственно). Результаты показаны на фигуре 47.
3. Защитные эффекты CpG ODN С-класса против антиген- и вирус-индуцированного воспаления дыхательных путей и гиперреактивности
Способы: Мышей сенсибилизировали антигеном (таракана, 10 мкг, внутрибрюшинно вместе с гидроксидом алюминия в качестве адъюванта) и затем два раза в неделю последующие три недели интраназальным антигеном (10 мкг в 40 мкл физиологического раствора). Мышей инфицировали вирусом гриппа путем интраназального впрыскивания перед последним введением пары антигенов. Альтернативно, мышам вводили только антиген или только вирус.
Последовательность SEQ ID NO:2 (100 мкг/кг) вводили интраназально один раза в неделю за два дня до первого еженедельного введения антигена. Воспаление дыхательных путей (количество клеток получали из бронхиоальвиолярного лаважа) и гиперреактивность дыхательных путей, вызванную вдыханием метахолина (Sirma, St. Louis, МО, США), оценивали через 48 часов после последнего введения антигена. Мышей анастезировали пентобабитоном натрия (60 мг/кг, внутрибрюшинно) и механически вентилировали через трахиальную канюлю. Клетки получали из бронхиоальвеолярного лаважа дыхательных путей, смытого 1 мл среды RPMI 1640, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (оба раствора Invitroren, Carlsbad, CA, США) путем впрыскивания через трахиальную канюлю. Устойчивость дыхательных путей рассчитывали на основании измерений пульмонарного воздушного потока и интратрахеального давления, используя программное обеспечение для респираторной механики (Buxco Research Systems, Wilmington, NC, USA). После записи основной линии устойчивости дыхательных путей, через трахеальную канюлю подавали увеличивающиеся концентрации метахолина в аэрозоле (5-100 мг/мл в течение 5 секунд с 5 минутными интервалами). Полученный бронхоспазм измеряли как повышение устойчивости дыхательных путей. Для каждого животного рассчитывали площадь под кривой доза метохолина - ответ.
Данные анализа: Статистическую значимость разницы между средними значениями обрабатываемой группой и необрабатываемой контрольной группы определяли, используя тест множественного сравнения Манна-Витнея (Mann-Ehitney) или Крускал-Валлиса (Kruskal-Wallis) (*p<0,05).
Результаты: Мыши, получавшие антиген и инфицированные вирусом, показали более сильное накопление лейкоцитов (включая нейтрофилы и мононуклеарные клетки) в дыхательных путях, чем мыши получавшие только антиген или мыши, которых только инфицировали вирусом (фигуры 48а-48с).
У этих мышей также возникала гиперреактивность дыхательных путей. Если дозу вводили в дыхательные пути один раз каждую неделю в течение трех недель, то введение CpG ODN защищало мышей от обострений воспаления дыхательных путей и снижения массы тела и практически полностью предотвращало повышение основной линии устойчивости дыхательных путей и развитие гиперреактивности дыхательных путей (фигуры 49а-49с).
Пример 15
Данные, показанные выше, продемонстрировали, что SEQ ID NO:2 может супрессировать нагрузку вирусом гриппа и вирус-индуцированное воспалении дыхательных путей. Защитные эффекты SEQ ID NO:2 против осложнения воспаления дыхательных путей, вызванные сочетанием инфекции вирусом гриппа и антигенной нагрузкой, проанализированы далее.
Способы 1.
Введение антигена и вируса:
Мышей (самцы BALB/c) сенсибилизировали на 0 и 7 день исследований антигеном (таракан, 10 мкг, внутрибрюшинно) вместе с адъювантом гидроксидом алюминия (Pierce Alum).
Мышам вводили антиген путем интраназального введения (10 мкг в 40 мкл физиологического раствора) дважды каждую неделю в течение трех последующих недель. Первое введение антигена осуществляли на 21 день исследования.
50
Мышей инфицировали вирусом гриппа (грипп типа А, подтип H1N1, штамм PR8, адаптированный для мыши, 200 EID в 40 мкл физиологического раствора) путем интраназального впрыскивания на 34 день исследования (т.е. перед последним введением пары антигенов).
Альтернативно отдельным группам мышей вводили только антиген или мышей только инфицировали вирусом.
2. Обработка SEQ ID NO:2:
Введение SEQ ID NO:2 (100 мкг/кг) осуществляли интраназально один раз каждую неделя, за два до еженедельного введения первого антигена.
3. Окончание исследования:
Воспаление дыхательных путей оценивали через 48 часов после последнего введения антигена. Клетки дыхательных путей получали из бронхоальвеолярного лаважа. Осуществляли подсчет различных клеток под световым микроскопом в цитоцентрифугированных препаратах, окрашенных по Райту-Гимзе.
Резюме протокола исследования:
Результаты
Характеристика вирус- и антиген-индуцированного воспаления дыхательных путей
Инфицирование только вирусом гриппа или введение только антигена вызывало повышение общего числа лейкоцитов в жидкости бронхоальвеолярного лаважа (фигура 50). У мышей, инфицированных вирусом, такое клеточное накопление включает значительную нейтрофилию, при этом у мышей, получавших антиген, накопление включает значительную эозинофилию.
При сравнении мышей, получавших только антиген, у мышей, получавших антиген и инфицированных вирусом, было обнаружено осложнение, проявляющееся накоплением лейкоцитов в жидкости лаважа (фигура 50). Такое повышенное накопление включает увеличение как нейтрофилов, так и мононуклеарных клеток. Однако у этих мышей было отмечено снижение эозинофилии.
Эффекты SEQ ID NO:2:
Введение SEQ ID NO:2 (100 мкг/кг) не подаваляло индуцированную вирусом нейтрофилию (фигура 50). Результаты были ожидаемы для этой дозы. Было показано, что более высокая доза в 300 мкг/кг, как правило, демонстрирует более сильные противовирусные эффекты.
Напротив, введение SEQ ID NO:2 (100 мкг/кг) значительно подавляло антиген-индуицированную клеточную инфильтрацию (фигура 49).
На основании этого анализа было сделано важное открытие, что введение SEQ ID NO:2 (100 мкг/кг) значительно подавляло осложнение воспаления дыхательных путей у мышей, инфицированных вирусом и получавших антиген. Осложнение, проявлявшееся в накоплении нейтрофилов и мононуклеарных клеток, было подавлено для обоих типов указанных клеток (фигура 50).
Кроме осложнения воспаления дыхательных путей у мышей, которые были инфицированы вирусом и получали антиген, было отмечена значительная потеря веса. Потеря веса значительно снижалась у мышей, получавших SEQ ID NO:2.
Пример 16
Индукция TLR9-связанных цитокинов в спленоцитах мышей in vitro и в легких мышей in vivo
Анализировали способность SEQ ID NO:2 индуицировать секрецию TLR9-связанных цитокинов в спленоцитах мышей in vitro.
Способы
Стимуляция цитокинов спленоцитов in vitro
7
2
Спленоциты собирали и объединяли у 6 мышей и инкубировали вместе с ODN (0,1; 1 или 10 мкг/мл) в течение 36 часов. Клетки выделяли механически, аккуратно продавливая порезанную селезенку мыши через клеточное сито (размер пор 70 мкм). Клетки (1×10, объединены у 6 мышей) инкубировали (37°С, 5% СО) в 1 мл среды (RPMI 1640, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, оба от Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Добавляли SEQ ID NO:2 или контрольную ODN (с инвертированным повтором CpG) или любой из двух доменов последовательности SEQ ID NO:2 (5'-конец стимуляторной последовательности и палиндром) до концентрации 0,1; 1 или 10 мкг/мл. После инкубации в течение 24 часов среду для культивирования анализировали, как описано ниже, на наличие секретируемых цитокинов (IFNα, IFNγ, интерферон-индуцибельный белок [IP]-10, IL-6, IL-10 и TNFα).
Стимуляция цитокинов в дыхательных путях мыши
Мышам вводили SEQ ID NO:2 (10-1000 мкг/кг) или носитель (40 мкл физиологического раствора) путем интраназального впрыскивания, осуществляемого под анастезией изофлураном, для введения в дыхательные пути. Через двадцать четыре часа через трахеальную канюлю получали бронхоальвеолярный лаваж, используя 1 мл физиологического раствора. Анализировали концентрацию цитокинов (IFNα, IFNγ, IP-10, IL-6 и IL-12p40) в жидкости бронхиального лаважа.
Результаты
Как показано в таблице, введение SEQ ID NO:2 индуицировало секрецию TLR9-связанных цитокинов в выделенных клетках мыши. Напротив, введение контрольного ODN с инвертированных повтором CpG, только 5'-концевой стимуляторной последовательности SEQ ID NO:2 или только палиндрома не давало значимой активации. Наиболее высокие титры каждого цитокина индуцировались при введении ODN в количестве 10 мкг/мл (данные минимальной концентрации не показаны). Н.о. = не определено (<12 пг/мл). Таким образом, введение SEQ ID NO:2 индуцировало секрецию IFNα, IFNγ, IP-10, IL-6, IL-10 и TNFα зависимым от концентрации образом. Наиболее высокие титры каждого цитокина были вызваны введением SEQ ID NO:2 в количестве 10 мкг/мл.
Для оценки значимости корректно расположенных повторов CpG для стимуляции биологической активности SEQ ID NO:2, анализ повторяли с ODN с той же последовательностью, что и SEQ ID NO:2, но с интвертированными повторами CpG на 5'-конце стимуляторной последовательности (SEQ ID NO:55). Контрольный олигонуклеотид демонстрирует почти полное отсутствие способности индуцировать эти TLR9-связанные цитокины. В случае только 5'-концевой стимуляторной последовательности SEQ ID NO:2 или только палиндрома также не было отмечено значимой активности, что указывает на то, что интактная молекула с обоими этими доменами необходима для проявления активности (последовательности показаны в таблице 12).
Таблица 12
Титры цитокинов (пг/мл),
индуцированные ODN (10 мкг/мл)
ODN
IFNα
IFNγ
IP-10
IL-6
IL-10
TNFα
Только среда
34,4
н.о.
21,9
64,8
н.о.
н.о.
<u>SEQ ID NO:2</u>
<u>199,0</u>
<u>539, 9</u>
<u>111, 1</u>
<u>11531,5</u>
<u>113,1</u>
<u>71,1</u>
Контрольный ODN
22,1
н.о.
22,4
537,5
н.о.
н. о.
Только стимуляторная
19,5
н.о.
17,9
427,1
н.о.
21, 0
последовательность
Только палиндром
18, 8
н.о.
17,7
59,0
н.о.
н.о.
Затем анализировали может ли последовательность SEQ ID NO:2 индуцировать TLR9-связанные цитокины при введении дозы в дыхательные пути мыши in vivo. Введение SEQ ID N0:2 вызывало секрецию IFNα, IFNγ, IP-10, IL-6 и IL-12p40, на что указывает повышенная концентрация этих цитокинов в жидкости бронхоальвеолярного лаважа (фиг.51).
Пример 17
Введение SEQ ID NO:2 вызывает иммунные отклонения от Тh2 ответа на сенсибилизацию антигеном
Для определения, может ли последовательность SEQ ID NO:2 супрессировать Th2 ответ на антигенную сенсибилизацию при введении в подошву мыши сенсибилизирующего антигена (овальбумин), мышей повторно стимулировали антигеном в повторном анализе ех vivo.
Способы
2
6
Мышей сенсибилизировали антигеном (10 мкг овальбумина V-класса, Sigma, St. Louis, МО, USA), делая инъекцию в подошву правой задней лапы. Инъекцией вводили только антиген или антиген вместе с SEQ ID NO:2 (10-1000 мкг/кг). В каждом случае общий объем инъекции составлял 20 мкл. Через шесть дней извлекали подколенный дренирующий лимфоузел и выделяли клеточную суспензию, аккуратно продавливая узлы через клеточное сито (размер пор 70 мкм). Повторный анализ с антигеном проводили ex vivo, инкубируя (37°С, 5% СО) 1×10 нефракционированные клетки лимфоузла в 220 мкл среды (RPMI 1640, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, оба от Invitrogen, Carlsbad, СА, USA) в присутствии или в отсутствие антигена (овальбумин, 10 мкг/мл). После инкубации в течение 36 часов среду для культивирования анализировали, как описано ниже, на секретируемые цитокины (IL-5, IL-13 и IFNγ).
Результаты
Клетки подколенного лимфоузла сенсибилизированной мыши секретировали IL-5, IL-13 и IFNγ (фиг.52). Клетки, инкубированные без антигена или с контрольным антигеном (таракана), к которому мыши были ранее сенсибилизированы, не секретировали обнаруживаемых титров ни одного из указанных цитокинов (<19 пг/мл). Клетки, взятые у животных, получавших SEQ ID NO:2, демонстрируют ослабленную антиген-индуцированную секрецию Th2 цитокинов IL-5 и IL-13. Напротив, секреция Th1 цитокина IFNγ была значительно повышена (фиг.52с). Клетки, инкубированные без антигена или с контрольным антигеном (таракана), к которому мыши были ранее сенсибилизированы, не секретировали обнаруживаемых титров любого из указанных цитокинов (<10 пг/мл).
Пример 18
Последовательность SEQ ID NO:2 супрессировала антиген-индуицированную продукцию IgG и стимулировала продукцию IgG2a у мышей in vivo
Следующее исследование касалось возможности SEQ ID NO:2 изменять параметры продукции иммуноглобулинов при введении мышам одновременно с антигенной сенсибилизацией.
Способы
Мышей дважды сенсибилизировали антигеном с интервалом в 7 дней одновременно с внутрибрюшинным введением антигена (10 мкг овальбумина V-класса, Sigma, St. Louis, МО, USA), растворенным в адъюванте, гидроксиде алюминия (0,2 мл. Pierce Imject Alum, Rockford, IL, USA). Мышам вводили SEQ ID NO:2 (1-1000 мкг/кг) или контрольный носитель (физиологический раствор, 10 мл/кг) путем внутрибрюшинной инъекции за два дня до каждой сенсибилизации (два раза) и на день каждой сенсибилизации. У мышей собирали кровь путем пункции сердца через 12 дней после второй сенсибилизации. Сыворотку собирали центрифугированием и анализировали, как описано далее, на овальбумин-специфические IgE и IgG2a.
3
В планшетах для микротитрования проводили ELISA (Nunc, Rochester, NY, USA), промывая 0,05% полисорбатом 20 (Sigma, St. Louis, МО, USA) в фосфатно-солевом буфере (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) между каждыми последующими этапами. Планшеты покрывали овальбумином (150 мкл в 100 мкг/мл) в буфере для связывания (0,1М NaHCO, Sigma) в течение 15 часов при 4°С. Планшеты затем блокировали аналитическим разбавителем (200 мкл/лунка, Pharmingen, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) в течение 2 часов при 20°С. Добавляли образцы с сывороткой (разведенные 1 в 40 в аналитическом разбавителе, 100 мкл/лунка) и оставляли на 2 часа при 20°С. Добавляли конъюгированные с биотином IgG или IgG2a крысы против мыши (Pharmingen) (2 мкг/мл в аналитическом разбавителем, 100 мкл/лунка) и оставляли на 2 часа при 4°С. Добавляли конъюгированную со стрептавидином пероксидазу хрена (Pharmignen, разведенный 1:200 в аналитическом разбавителе, 100 мкл/лунка) и оставляли на 1 час при 20°С. Добавляли реагент тетраметилбензидиновый субстрат (Pharmingen, 100 мкл/лунка) в течение 30 минут при 20°С и затем реакцию останавливали с помощью 2Н серной кислоты (50 мкл/лунку). С помощью спектрофотометра (Spectramax, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) измеряли поглощение при 450 нм.
Результаты
Введение SEQ ID NO:2 подавляло продукцию антиген-специфического IgE (85% супрессия при дозе 1000 мкг/кг) и усиливало продукцию IgG2a, что служит дополнительным свидетельством иммунного отклонения от Th2 ответа на антиген (фиг.53).
Пример 19
Введение SEQ ID NO:2 подавляет антиген-индуцированное накопление эозинофилов и лимфоцитов в дыхательных путях мыши in vivo
Выше было показано, что SEQ ID NO:2 способна подавлять Th2 иммунный ответ. Таким образом, были проанализированы защитные эффекты последовательности SEQ ID NO:2 на модели мыши синдуцированным антигеном воспалением дыхательных путей.
Способы
Мышей сенсибилизировали внутрибрюшинным введением антигена (таракана), а затем дважды в неделю вводили антиген, впрыскивая антиген в дыхательные пути. В течение каждого двухразового введения антигена мышам вводили один раз последовательность SEQ ID NO:2 или впрыскивали в дыхательные пути носитель (Носит.). Альтернативно мышей не обрабатывали (необ.). Бронхоальвеолярный лаваж брали через 48 часов после последнего введения антигена и полученные клетки подсчитывали. Общее число лейкоцитов (а) и эозинофилов (b) подсчитывали на автоматическом счетчике для клеток.
Результаты
На этой экспериментальной модели с симптомами аллергической астмы были показаны защитные эффекты последовательности SEQ ID NO:2. Если дозу вводили в дыхательные пути один раз каждую неделю в течение двух недель, то введение SEQ ID NO:2 супрессировало накопление в дыхательных путях эозинофилов, Т-клеток и В-клеток, которые "индуцировались внутрилегочным введением антигена (фиг.54). При максимальной тестированной дозе (300 мкг/кг) SEQ ID NO:2 накопление этих клеток было супрессировано на 78%, 65% и 79% соответственно.