Вклад вариабельности генов эксцизионной репарации оснований в развитие невынашивания беременности в первом триместре

Раздел - Молекулярная медицина

Вклад вариабельности генов эксцизионной репарации оснований в развитие

невынашивания беременности в первом триместре

1 2

Хаджиева М.Б. ,

1Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, Москва, ул. Губкина, д. 3, 119991 Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Д. Рогачева, Москва, ул. Саморы Машела, д. 1, 117997 ФИО: Хаджиева Марьям Борисовна, младший научный сотрудник Адрес: 119991, Москва, ул. Губкина, д. 3

Резюме: С целью изучения роли вариабельности генов эксцизионной репарации оснований в развитии невынашивания беременности (НБ) в первом триместре, включая привычное невынашивание беременности (ПНБ), нами были исследованы полиморфные варианты rs1052536 гена LIG3, rs4462560 гена NEILI, rs174538 гена FENI, rs1052133 гена OGGI и rs2516739 гена NTHLI. В исследовании приняли участие 528 женщин, из которых 331 с НБ в анамнезе и 197 женщин с реализованной репродуктивной функцией и отсутствием НБ. В ходе исследования были выявлены рисковые аллели rs1052133-G (OGGI) и rs4462560-G (NEILI) в группе женщин с ПНБ, а также rs1052133-G (OGGI) и ге2516739-Т (NTHLI) в группе со сроком гестации на момент прерывания беременности > 8.5 недель. OGGI, NTHLI и NEILI относятся к семейству ДНК-гликозилаз, катализирующих гидролиз связи между повреждённым основанием и дезоксирибозным фрагментом.

Ключевые слова: невынашивание беременности, привычное невынашивание беременности, эксцизионная репарация оснований, однонуклеотидный полиморфный вариант, генетическая ассоциация

The contribution of base excision repair genes variability in the development of miscarriage in the first trimester

Khadzhieva M.B.1,2

1N.I. Vavilov Institute of General Genetics, Russian Academy of Sciences, Gubkin str. 3, 119991, Moscow

Federal Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology named after Dmitry Rogachev, Samora Machel str. 1, 117997, Moscow Abstract

Base excision repair may play a role in the miscarriage with no known etiology in the first trimester, including recurrent miscarriage (RM). This study was conducted to investigate the association of polymorphisms of base excision repair genes (BER) with pregnancy loss. A total of 331 idiopathic miscarriage patients and 197 controls were genotyped for LIG3 rs1052536, NEIL1 rs4462560, FEN1 rs174538, NTHL1 rs2516739 and OGG1 rs1052133. We revealed significant associations of alleles in the genes OGG1 (rs1052133-G), NEIL1 (rs4462560-G) with RM, and OGG1 (rs1052133-G), NTHL1 (rs2516739^) with miscarriage in the group with gestational age of more than 8.5 weeks. These genes belong to the family of DNA-glycosylases, which catalyze the first step of BER.

Keywords: miscarriage, recurrent miscarriage, base excision repair, single nucleotide polymorphism, genetic association

Оглавление:

1. Введение

2. Материалы и методы

3. Результаты и обсуждение

4. Список литературы Введение

Невынашивание беременности (НБ) - самопроизвольное прерывание беременности в сроки от зачатия до 22 недель, считая с первого дня последней менструации (Близнюк, Зражевская, 2007). НБ составляет 15-20% от общего числа диагностированных беременностей и не имеет тенденции к снижению, оставаясь на протяжении многих лет одним из наиболее распространенных осложнений беременности (Близнюк, Зражевская, 2007; Chan et al., 2016). Несмотря на уже известные факторы риска развития данной патологии (анатомические, эндокринные, инфекционные, иммунные, хромосомные аномалии, особенности образа жизни и др.), в 23-40% случаев этиология НБ остается невыясненной (Demirturk et al., 2014). Отдельную группу составляет привычное невынашивание беременности (ПНБ), характеризующееся наличием в анамнезе у женщины подряд трех и более самопроизвольных прерываний беременности в сроках до 22 недель (или при весе плода до 500 г), встречается у 1-2% супружеских пар репродуктивного возраста (Никитина, Лебедев, 2014). Примерно 80% выкидышей происходит в первом триместре, в течение которого наблюдается активное деление как фетальных, так и материнских клеток, при этом неизбежно возникновение повреждений молекул ДНК, которые в норме исправляются системой репарации (Куцын и др., 2013; Zhou et al., 2016). Целый ряд нарушений (одно- и двунитевые разрывы, делеции, хромосомные транслокации), способствующих геномной нестабильности и апоптозу клетки, инициируются активными формами кислорода (АФК) и азота. В малых концентрациях АФК являются необходимыми участниками множества биологических процессов, в том числе, и в течение беременности, однако чрезмерная продукция АФК может спровоцировать такие осложнения, как спонтанный аборт, невынашивание беременности, преэклампсию, задержку внутриутробного роста (Agarwal et al., 2012). Существенный вклад в стабильность генома

вносит эксцизионная репарация оснований (ЭРО, base excision repair BER), которая удаляет повреждения, вызываемые окислением, дезаминированием, алкилированием азотистых оснований. Известно, что полиморфные варианты генов репарации обуславливают значительные различия в эффективности репарации повреждений ДНК и тем самым потенциально способны приводить к накоплению мутаций

(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar), однако в генезе НБ они практически не изучены. В связи с вышеизложенным, целью работы явилось изучение роли полиморфных вариантов генов эксцизионной репарации оснований в развитии невынашивания беременности в первом триместре, включая ПНБ: rs1052536 гена LIG3 (ДНК-лигаза III), rs4462560 гена NEIL1 (ДНК-гликозилаза 1, гомологичная эндонуклеазе VIII), rs174538 гена FEN1 (флэп-эндонуклеаза 1) и rs2516739 гена NTHL1 (ДНК-гликозилаза 1, гомологичная эндонуклеазе III) (таблица 1).

Таблица 1. Исследованные полиморфные варианты

Ген SNP Функция Аллели MAF Функция кодируемого белка

FEN1 rs174538 nearGene-5 G:A 0.32 Эндонуклеаза

LIG3 rs1052536 UTR-3 С:Т 0.50 Лигаза

NEIL1 rs4462560 nearGene-3 C:G 0.20 Гликозилаза

NTHL1 rs2516739 nearGene-5 С:Т 0.19 Эндонуклеаза и гликозилаза

SNP - single nucleotide polymorphism (однонуклеотидный полиморфизм) MAF - minor allele frequency (частота минорного аллеля) Материалы и методы

В исследовании приняли участие 528 женщин, проходившие лечение на клинических базах кафедры акушерства и гинекологии лечебного факультета Российского национального исследовательского медицинского университета им. Н.И.Пирогова. Основная группа состояла из 331 пациентки, в контрольную группу было включено 197 женщин с реализованной репродуктивной функцией и отсутствием НБ в анамнезе. Клиническая и демографическая

характеристика групп представлена в таблице 2. Исследование одобрено Этическим Комитетом РНИМУ им. Н.И.Пирогова. Материалом послужили образцы ДНК, выделенной из лимфоцитов периферической крови набором реактивов Diatom DNA Prep 200 (Isogene Lab.Ltd, Россия). Женщины были прогенотипированы методом тетра-праймерной аллель-специфической ПЦР с помощью лиофилизированных наборов Master Mix (Isogene Lab.Ltd, Россия). Подбор праймеров выполнялся в программе Primer3web version 4.0.0 (http://primer3.ut.ee/) с последующей оптимизацией условий ПЦР. Визуализация результатов осуществлялась методом горизонтального электрофореза в 2% агарозном геле с добавлением бромистого этидия.

Таблица 2

Клиническая и демографическая характеристика исследуемых групп

Характеристика Контроль n=197 ПНБ n=331 P-value

Возраст, лет 33.71±6.14 32.63±5.69 0.11

ИМТ, кг/м2 23.97±4.36 23.98±4.64 0.88

Средний гестационный возраст на момент выкидыша (неделя) - 9.76±3.34 -

Количество выкидышей*:

1 0 62 -

2 0 190 -

3 и более 0 40 -

*Для 39 женщин данные отсутствуют

Для оценки различий между двумя независимыми выборками был использован и-критерий Манна-Уитни (пакет программ WinSTAT 2003.1) и точный двусторонний критерий Фишера (пакет программ WinPePi) (http://www.brixtonhealth.com/pepi4windows.html), статистически достоверными считались результаты при вероятности ошибки р<0.05. Соответствие распределения генотипов равновесию Харди-Вайнберга оценивали методом х2 (р>0.05). Оценки частот генотипов и их эффектов были получены методом логистического регрессионного анализа с помощью компьютерной программы SNPStats (http://bioinfo.iconcologia.net/snpstats/start.htm), выбор лучших генетических моделей

(доминантная, рецессивная, аддитивная) производился в соответствии с наименьшим значением информационного критерия Акаике (AIC). Результат считался статистически значимым при Р<0.05. Вклады различных генотипов в заболеваемость определяли с помощью показателя «odd ratio» (OR - мера коррелятивной связи). При отсутствии корреляций между генотипом и заболеванием OR=1; при OR>1 говорят о повышенном риске заболевания при данном генотипе; эффект рассматривался как клинически значимый при OR > 2. Мощность теста для достоверных результатов была вычислена с помощью программы WinPePi с учетом объема выборки, частоты генотипов (в соответствии с генетической моделью) и размера эффекта. Мощность теста для rs4462560 гена NEIL1 с 0R=2.04 составила 56.07% (двусторонний тест Фишера). Для исключения ошибки I рода учитывалась поправка Бонферрони на множественность сравнений, с учетом которой величина уровня значимости ассоциации для четырех независимых сравнений должна составлять менее 0.0125 (0.05/4). Однако ни один из полученных нами результатов не удовлетворяет данному условию, что, вероятно, связано с недостаточно высокой мощностью теста и скромным объемом выборки, в связи с чем в будущем рекомендуется подтвердить выявленные ассоциации на независимой выборке.

С помощью программы STRING 10.0 (Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins) был выполнен in silico анализ взаимодействия белков, кодируемых генами FEN1, LIG3, NEIL1, NTHL1, OGG1. Уровень взаимодействия оценивается, основываясь на общедоступные функциональные онтологии и базы данных KEGG, GO, PFAM, INTERPRO, BioGRID, PubMed и др (Szklarczyk et al., 2015).

Результаты и обсуждение

В ходе ассоциативного исследования нами были изучены полиморфные варианты rs1052536 гена LIG3, rs4462560 гена NEIL1, rs174538 гена FEN1 и rs2516739 гена NTHL1 в группе женщин с НБ (n=331) и у здоровых женщин (n=197). В контрольной группе все выше перечисленные генетические варианты находились в состоянии равновесия по Харди-Вайнбергу. Результаты генотипирования сайтов, в том числе rs1052133 гена OGG1 (8-

оксогуанин-ДНК-гликозилаза), который был нами изучен ранее, представлены в таблице 3 (Khadzhieva й а1., 2014). Таблица 3.

Распределение генотипов генов БЕЯ в группе с НБ и в контроле

Контроль НБ Р (модель), ОЯ, 95% ДИ Рай] (модель), ОЯ, 95% ДИа

БКР и генотипы (с учетом

Число

п=189 п=322

ЕЕЫ1 О/О 91

ге174538 О/А 74 (39.15) 0.18 122 (37.9) 0.27 0.84 0.78

А/А 24 (12.70) 30 (9.3) 0.64-1.09 0.42-1.46

п=188 п=323

ЫО3 Т/Т 57

ге1052536 Т/С 87 (46.3) 0.38 147 (45.5) 0.12 1.15 1.44

С/С 44 (23.4) 89 (27.6) 0.90-1.47 0.92-2.24

п=185 п=322

Ж1Ь1 С/С 104

ге4462560 С/О 68 (36.8) 0.7 113 (35.1) 0.036 1.46 2.04

О/О 13 (7.0) 32 (9.9) 0.75-2.86 0.94-4.43

п=187 п=314

ЫГИЫ С/С 124

ге2516739 С/Т 59 (31.6) 0.46 89 (28.3) 0.26 2.13 2.40

Т/Т 4 (2.1) 14 (4.5) 0.69-6.58 0.66-8.68

п=192 п=323

0001 С/С 135

ге1052133 С/О 51 (26.6) 0.6 102 (31.6) 0.4 1.34 1.38

О/О 6 (3.1) 17 (5.3) 0.97-1.86 0.97-1.96

ОЯ - отношение шансов; ДИ - доверительный интервал;

рец.- рецессивная модель; дом.- доминантная модель; адд.- аддитивная модель

Ра% - значение Р с поправкой на возраст и индекс массы тела женщин

ИШР - соответствие распределения генотипов равновесию Харди-Вайнберга

В общей выборке с поправкой на возраст и индекс массы тела пограничная значимость в ассоциации с НБ была выявлена для генотипа ге4462560^^ гена (рец. модель, Р=0.058,

OR=2.04, 95%ДИ: 0.94-4.43). В подгруппе с привычным невынашиванием беременности (от трех и более прерываний беременности) зарегистрированы рисковые аллели ге1052133^ гена OGG1 (рец. модель, P=0.029, OR=4.50, 95%ДИ: 1.21-16.69) и ге4462560^ гена ШК1 (рец. модель, P=0.039, OR=3.46, 95%ДИ: 1.12-10.68).

При стратификации выборки по сроку гестации на момент прерывания беременности (до 8.5 недель включительно и более 8.5 недель) была выявлена достоверно значимая корреляция аллеля ге1052133^ гена OGG1 (дом. модель, P=0.028, OR=1.68, 95%ДИ: 1.05-2.69) и ^2516739-Т гена (рец модель, Р=0.031, OR=3.81, 95%ДИ: 1.01-14.33), а также пограничная

значимость для ге4462560^ гена (рец. модель, Р=0.059, OR=2.18, 95%ДИ: 0.95-5.03) с

повышенным риском НБ в группе с более поздним сроком (более 8.5 недель), в то время как в группе со сроком до 8.5 недель статистически значимых результатов не получено (таблица 4).

Таблица 4. Распределение генотипов генов 0001, МТНЬ1 и МЕ1Ь1 в контрольной и основной группах при стратификации выборки по сроку гестации на момент прерывания беременности

SNP и Контроль НБ

генотипы < 8.5 недель > 8.5 недель

Число (%) Число(%) Padj(MOдель), OR, 95%ДИ Число(%) pad(модель), OR, 95%ДИ

ге1052133 п=159 п=95 п=155

OGG1 те 111

те 43 (27.05) 23 (24.2) 1.22 57 (36.8) 1.68

G/G 5 (3.15) 7 (7.4) 0.78-1.90 8 (5.15) 1.05-2.69

^2516739 п=157 п=96 п=153

ШЖ1 те 103

C/T 51 (32.5) 26 (27.1) 0.81 45 (29.41) 3.81

T/T 3 (1.9) 2 (2.1) 0.46-1.41 10 (6.54) 1.01-14.33

rs4462560 n=159 n=96 n=157

NEIL1 C/C 98

C/G 52 (32.7) 30 (31.2) 1.53 52 (33.1) 2.18

G/G 9 (5.7) 8 (8.3) 0.57-4.14 19 (12.1) 0.95-5.03

Padj- значение Р с поправкой на возраст и индекс массы тела женщины; Полужирным шрифтом отмечены достоверные результаты

Анализ в программе STRING 10.0 выявил по базе данных KEGG наибольшую силу белок-белковых взаимодействий для OGG1-NTHL1, OGG1-FEN1 и NTHL1-NEIL1 (Рисунок 1).

Рисунок 1. Сеть белок-белковых взаимодействий для FEN1, LIG3, NEIL1, NTHL1, OGG1 (STRING 10.0); толщина линии отражает силу взаимодействия

OGG1, NTHL1 и NEIL1 относятся к семейству ДНК-гликозилаз, катализирующих гидролиз связи между повреждённым основанием и дезоксирибозным фрагментом; специфичными субстратами для данных ферментов выступают окисленные пурины и пиримидины (Жарков, 2013). OGG1 вырезает 8-Оксо-7,8-дигидро-2'-дезоксигуанозин (8-oxo-dG), образующийся при взаимодействии 2'-дезоксигуанозина с гидроксил-радикалом. 8-oxo-dG - известный биомаркер окислительных повреждений ДНК, высокое содержание которого отмечается при преэклампсии, а также при рождении детей с низкой массой тела (Stein et al., 2008; Nishizawa et al., 2011). Rs1052133 гена OGG1 (c.977C>G) приводит к изменению в строении белка с заменой аминокислоты серина на цистеин (Ser326Cys), что обуславливает

снижение активности фермента 8-оксогуанин-ДНК-гликозилаза (Bravard et al., 2009; Kershaw, Hodges, 2012). Аллель rs1052133-G ассоциирован с риском развития онкологических заболеваний различной локализации (Costa et al., 2016; Ravegnini et al., 2016). Полиморфный вариант rs2516739 гена NTHL1 коррелирует с продолжительностью жизни (Yashin et al., 2010), а rs4462560 гена NEIL1 — с депрессией и с риском возникновения радиационно-индуцированной токсичности у больных раком пищевода (Chen et al., 2013; Czarny et al., 2015).

Известно, что окисление азотистых оснований вызывается различными АФК. В 2000 году Jauniaux с коллегами установили, что напряжение кислорода в плаценте резко повышается от <20 мм рт. ст. на 8 неделе беременности до >50 мм рт. ст. к 12 недели, что связано с формированием артериальной циркуляции в конце первого триместра беременности, необходимой для свободного потока материнской крови в плаценту (Jauniaux et al., 2000). Таким образом, «окислительный взрыв», сопровождающий васкуляризацию плаценты, при функциональной недостаточности генов антиоксидантной защиты и эксцизионной репарации оснований может явиться причиной преэклампсии и прерывания беременности в конце первого триместра. Примечательно, что в нашем исследовании корреляция rs1052133-G гена OGG1, rs2516739-T гена NTHL1 и rs4462560-G гена NEIL1 с НБ была выявлена именно в группе со сроком гестации на момент прерывания беременности > 8.5 недель. Вклад вариабельности генов OGG1 и NEIL1 в репродуктивное здоровье женщины подтверждается ассоциациями, полученными в группе с привычным невынашиванием беременности. В дальнейшем мы планируем изучить больший спектр генов репарации, увеличив исследуемую выборку.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (проект №16-34-01322 мол_а).

Список литературы

1. Близнюк Е.А., Зражевская С.Г. Невынашивание беременности. Учебное пособие. Благовещенск, 2007. 123 с.

2. Жарков Д.О. Днк-гликозилазы - основные элементы системы репарации ДНК. Вестник Российской академии наук. 2013. Т. 83. № 2. С. 112-119.

3. Куцын К.А., Коваленко К.А., Машкина Е.В., Шкурат Т.П. Экспрессия генов системы репарации (APEX1, XPD) и контроля клеточного цикла (CHEK2, P53) при патологии беременности. Современные проблемы науки и образования. 2013. № 1. С. 344.

4. Никитина Т.В., Лебедев И.Н. Цитогенетика привычного невынашивания беременности. Генетика. 2014. Т. 50. № 5. С. 501-514.

5. Agarwal A., Aponte-Mellado A., Premkumar B.J., Shaman A., Gupta S. The effects of oxidative stress on female reproduction: a review. Reprod Biol Endocrinol. 2012. V. 10. Р. 49.

6. Bravard A., Vacher M., Moritz E., et al. Oxidation status of human OGG1-S326C polymorphic variant determines cellular DNA repair capacity. Cancer Res. 2009. V. 69. P. 3642 -3649.

7. Chan D.M., Cheung K.W., Yung S.S., et al. A randomized double-blind controlled trial of the use of dydrogesterone in women with threatened miscarriage in the first trimester: study protocol for a randomized controlled trial./ Trials. 2016. V. 17. No. 1. Р. 408.

8. Chen Y., Zhu M., Zhang Z., et al. A NEIL1 single nucleotide polymorphism (rs4462560) predicts the risk of radiation-induced toxicities in esophageal cancer patients treated with definitive radiotherapy. Cancer. 2013. V. 119. No.23. P. 4205-4211.

9. Costa E.F., Santos E.S., Liutti V.T., et al. Association between polymorphisms in genes related to DNA base-excision repair with risk and prognosis of oropharyngeal squamous cell carcinoma. J Cancer Res Clin Oncol. 2016. V. 142. No. 9. P. 1917-1926.

10. Czarny P, Kwiatkowski D, Galecki P, et al. Association between single nucleotide polymorphisms of MUTYH, hOGG1 and NEIL1 genes, and depression. J Affect Disord. 2015. V.184. P. 90-96.

11. Demirturk F., Ates O., Gunal O., et al. IL-6 gene promoter polymorphisms: genetic susceptibility to recurrent pregnancy loss. Bratisl Lek Listy. 2014. V. 115. No. 8. P. 479-482.

12. Jauniaux E., Watson A.L., Hempstock J., et al. Onset of maternal arterial blood flow and placental oxidative stress. A possible factor in human early pregnancy failure. Am J Pathol. 2000. V. 157. No. 6. P. 2111-2122.

13. Kershaw R.M., Hodges N.J. Repair of oxidative DNA damage is delayed in the Ser326Cys polymorphic variant of the base excision repair protein OGG1. Mutagenesis. 2012. V. 27. No. 4. P. 501-510.

14. Khadzhieva M.B., Lutcenko N.N., Volodin I.V., et al. Association of oxidative stress-related genes with idiopathic recurrent miscarriage. Free Radic Res. 2014. V. 48. No. 5. P. 534541.

15. Nishizawa H., Suzuki M., Pryor-Koishi K., et al. Impact of indoleamine 2,3-dioxygenase on the antioxidant system in the placentas of severely pre-eclamptic patients. Syst Biol Reprod Med. 2011. V. 57. P. 174 - 178.

16. Ravegnini G., Nannini M., Simeon V., et al. Polymorphisms in DNA repair genes in gastrointestinal stromal tumours: susceptibility and correlation with tumour characteristics and clinical outcome. Tumour Biol. 2016 Jul 27. [Epub ahead of print].

17. Stein T.P., Scholl T.O., Schluter M.D., et al. Oxidative stress early in pregnancy and pregnancy outcome. Free Radic Res. 2008. V. 42. P. 841 - 848.

18. Szklarczyk D., Franceschini A., Wyder S., et al. STRING v10: protein-protein interaction networks, integrated over the tree of life. Nucleic Acids Res. 2015. V. 43 (Database issue). D447-452.

19. Yashin A.I., Wu D., Arbeev K.G., Ukraintseva S.V. Joint influence of small-effect genetic variants on human longevity. Aging (Albany NY). 2010. V. 2. No. 9. P. 612-620.

20. Zhou H., Liu Y., Liu L., et al. Maternal pre-pregnancy risk factors for miscarriage from a prevention perspective: a cohort study in China. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 2016. V. 206. P. 57-63.