Активность протеиназ и их эндогенных ингибиторов в экстракте ткани головного мозга и сыворотке крови крыс при острой алкогольной интоксикации

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2011

АКТИВНОСТЬ ПРОТЕИНАЗ И ИХ ЭНДОГЕННЫХ ИНГИБИТОРОВ В ЭКСТРАКТЕ ТКАНИ ГОЛОВНОГО МОЗГА И СЫВОРОТКЕ КРОВИ КРЫС ПРИ ОСТРОЙ АЛКОГОЛЬНОЙ ИНТОКСИКАЦИИ

ХОДОС О.А.*, ГИДРАНОВИЧ Л.Г.*, САЧЕК М.М.**

УО «Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет»,

кафедра органической химии*,

ГУ «Республиканский научно-практический центр медицинских технологий, информатизации,

управления и экономики здравоохранения»**

Резюме. Была исследована активность трипсиноподобных и цистеиновых протеиназ и их эндогенных ингибиторов в экстракте ткани головного мозга, а также сыворотке крови крыс при однократной острой алкогольной интоксикации. Установлено, что активность трипсиноподобных и цистеиновых протеиназ, а также их эндогенных ингибиторов в ткани головного мозга крыс не изменяется при однократном внутрибрюшинном введении 25% раствора этанола. В сыворотке крови общая протеолитическая активность, активность а1-протеиназного ингибитора и а2-макроглобулина не претерпевает изменений. Активность эндогенных ингибиторов цистеиновых протеиназ сыворотки крови возрастает на 87% через 90 минут после введения этилового спирта.

Ключевые слова: протеиназы, ингибиторы, острая алкогольная интоксикация, головной мозг.

Abstract. This study was undertaken to determine the activity of trypsinlike and cysteine proteinases and their endogenous inhibitors in brain tissue extract and in blood serum of rats in acute alcohol intoxication. It was determined that the activity of trypsinlike and cysteine proteinases and their endogenous inhibitors in brain tissue of rats in acute alcohol intoxication was not changed. The results of our study indicated no changes of proteinase activity and activity of a^proteinase inhibitor and a2-macroglobulin in blood serum. The activity of endogenous inhibitors of cysteine proteinases in blood serum was increased by 87% in 90 minutes after ethanol injection.

Острые отравления алкоголем представ-'ляют собой «острую химическую травму», развивающуюся вследствие попадания в организм токсической дозы этилового спирта. Этанол и его метаболит ацетальдегид обладают прямым мембранотоксическим действием, интенсифицируют процессы перекис-

Адрес для корреспонденции: г.Витебск, ул.Нижне-набережная, д. 19, кв. 28. Тел.: 8 (033) 329-27-20 -Ходос О.А.

ного окисления липидов [1, 2], нарушают механизмы переноса кальция в плазматической мембране и саркоплазматическом ретикулуме, негативно влияют на процесс транспорта кислорода, активируют выброс катехоламинов [1], формируют синдром эндогенной интоксикации [3] и содействуют развитию токсического поражения головного мозга и нарушению регуляции систем жизнеобеспечения. При алкогольной интоксикации изменяется также и уровень биологически активных пептидов [4]. Острая и хро-

ническая алкогольная интоксикация сопровождается нарушением функционирования ряда нейротрансмиттерных систем: серотонинерги-ческой, дофаминергической, а также систем возбуждающих и тормозных аминокислот-трансмиттеров [5]. Этанол способен к инициированию апоптотической нейродегенерации [2, 6, 7]. При острой интоксикации этанолом происходит увеличение активности каспазы-3, активацию которой связывают со способностью этанола вызывать смерть нервных клеток головного мозга [6, 8]. Этанол способствует увеличению активности кальпаинов, кальций-зависимых протеиназ [9], вовлеченных в расщепление белков цитоскелета [2, 10] и играющих важную роль в алкогольном поражении клеток [11]. Доказано, что активация кальпаина является характерным признаком патологии естественных и экспериментально происходящих нейродегенера-тивных состояний [12]. Воздействие этанола вызывает в мозжечке и коре головного мозга повышение активности циклин-зависимой киназы-5 (Cdk5), которая участвует в расщеплении ММОЛ-рецепторов и снижает проводимость синапсов [13]. Однако состояние протеолиза в ткани головного мозга при острой алкогольной интоксикации изучено далеко не полностью. Поэтому изучение активности протеолитичес-ких ферментов и их эндогенных ингибиторов в экстракте ткани головного мозга при острых отравлениях этанолом является актуальным.

Целью работы являлось определение активности трипсиноподобных и цистеиновых протеиназ и их эндогенных ингибиторов в экстрактах ткани головного мозга и сыворотке крови крыс при острой алкогольной интоксикации.

Методы

Для опытов использовали крыс-самцов линии Wistar массой тела 250 - 300 грамм. Животные содержались в пластиковых клетках с подстилкой из опилок лиственных пород деревьев на нормированном полноценном рационе в стандартных условиях вивария в соответствии с действующими нормами содержания экспериментальных животных, что обуславливало нормальный биологический фон. Световой режим был естественным. Для экспериментов отбира-

ли здоровых самцов с чистым и гладким шерстным покровом, а также нормальной поведенческой активностью.

Острую алкогольную интоксикацию воспроизводили путем однократного внутрибрю-шинного введения экспериментальным животным 25% раствора этанола в дозе 2,5 г/кг массы тела животного [14]. Животным контрольной группы внутрибрюшинно вводили равный объем физиологического раствора. Животных выводили из эксперимента путем декапитации через 30 и через 90 минут после инъекции. Уровень этанола в крови экспериментальных животных контролировали методом газовой хроматографии путем анализа равновесной парогазовой фазы на газовом хроматографе «Цвет 500М» с пламенно-ионизационным детектором [15]. После декапитации крыс путём анатомического препарирования быстро выделяли головной мозг, который помещали на стоящую во льду чашку Петри. При заборе материала использовали острые инструменты и старались не допускать сдавливание материала. Большие полушария головного мозга отмывали физиологическим раствором от крови, убирали остатки раствора с помощью фильтровальной бумаги и гомогенизировали с помощью стеклянного гомогенизатора. Условия получения гомогената и экстракта ткани головного мозга (разбавление, время, условия экстракции) отрабатывали экспериментально. Гомогенизацию ткани проводили в дистиллированной воде в соотношении 1:9, что способствовало более полному лизису цитоплазматических и лизосомальных мембран. Гомогенаты центрифугировали 30 минут при 3000 оборотах в минуту, осадок отбрасывали. Содержание белка в экстрактах определяли по методу Лоури [16]. Активность протеиназ и их эндогенных ингибиторов в экстракте ткани головного мозга крыс определяли спектрофотометрически по интенсивности гидролиза высокостабильного в растворе низкомолекулярного специфического хромогенного субстрата М-а-бен-зоил-О^-аргинин-пара-нитроанилида (БАП-НА), продуктом расщепления которого является пара-нитроанилин (рМЛ), имеющий максимум поглощения светового потока при спектрофото-метрии при 383 - 410 нм. Определение активности трипсиноподобных протеиназ проводи-

ли по методу Erlanger B. и др. [17]. При исследовании активности ингибиторов трипсиноподобных протеиназ использовали метод, который был предложен Хватовым Т.А. и Беловой В.Б. [18], при изучении цистеиновых протеиназ и их эндогенных ингибиторов - метод Lenney J.F. [19]. Указанные методы были модифицированы нами для исследования интенсивности протеолиза в экстрактах ткани головного мозга [20]. Активность протеиназ была пропорциональна количеству пара-нитроанилина (pNA), образующегося в результате расщепления субстрата. Оценку активности эндогенных ингибиторов трипсиноподобных протеиназ экстрактов головного мозга и aj-протеиназного ингибитора сыворотки крови осуществляли по сопоставлению степени гидролиза хромогенного субстрата БАП-НА равными количествами трипсина, а активность ингибиторов цистеиновых протеиназ -равными количествами папаина в пробах с добавлением и при отсутствии исследуемого биологического материала. Для проведения всех реакций, приготовления и хранения реактивов использовали стеклянную посуцу. Измерения оптической плотности контрольных и опытных проб осуществляли против дистиллированной воды на спектрофотометре СФ-46. Для расчета активности протеолитических ферментов и их эндогенных ингибиторов была построена калибровочная кривая в пределах от 0,01 до 0,1 мкм/мл пара-нитроанилина (рис. 1).

Статистическая обработка полученных данных проводилась с использованием пакета прикладных компьютерных программ. В соответствии с рекомендациями специальной литературы [21] перед проведением расчетов была проведена подготовка первичных данных к анализу и определен их тип - интервальные непрерывные количественные (числовые) данные, так как они не являются безразмерными, измеряются в абсолютных величинах, имеющих физический смысл, и теоретически могут иметь дробную часть [21]. Так как в малых выборках вероятность нормального распределения крайне низка, для анализа применяли наиболее мощные из непараметрических статистических методов: метод сравнения независимых групп Краскела-Уолли-са (ЛМОУЛ по Краскелу-Уоллису) и тест Манна-Уитни, применяя поправку Бонферрони при оценке значения р [21].

Результаты и обсуждение

Концентрация этанола в крови экспериментальных животных через 30 минут после введения раствора этилового спирта соответствовала 1,940/00 (ДИ от 0,942 до 2,5780/00), через 90 минут - 1,00°/00 (ДИ от 0,608 до 1,770/00).

Активность трипсиноподобных протеи-наз в экстракте ткани головного мозга крыс, подвергшихся декапитации через 30 минут после инъекции раствора этанола, составила 47,033

Е 410нм

Концентрация pNa, мкм/мл

Рис. 1. Зависимость оптической плотности от концентрации пара-нитроанилана.

Таблица 1

Активность протеолитических ферментов и их эндогенных ингибиторов

в ткани головного мозга крыс

Показатель/Единицы измерения Контрольная группа Через 30 минут после введения раствора этанола Через 90 минут после введения раствора этанола

Активность трипсиноподобных протеиназ, нмоль/ч-мг белка. 46,960

Активность эндогенных ингибиторов трипсиноподобных протеиназ, нмоль/с-мг белка. 0,295

Активность цистеиновых протеиназ, нмоль/ч-мг белка. 23,300

Активность эндогенных ингибиторов кислых лизосомальных цистеиновых протеиназ, нмоль/ч-мг белка. 5,500

Примечание: данные представлены в виде медианы, (-95% - +95%) - доверительный интервал.

нмоль/ч-мг белка, а через 90 минут - 46,564 нмоль/ч-мг белка. Полученные данные не имеют статистически значимых различий с контрольной группой.

Активность эндогенных ингибиторов трипсиноподобных протеиназ через 30 минут после введения раствора этанола составила

0,289 нмоль/с-мг белка, а через 90 минут - 0,306 нмоль/с-мг белка, что значимо не отличалось от контроля. Активность кислых лизосомальных цистеиновых протеиназ через 30 минут после внутрибрюшинного введения раствора этилового спирта соответствовала 21,345 нмоль/ч-мг белка, тогда как через 90 минут - 15,561 нмоль/ ч-мг белка. Различия активности цистеиновых протеиназ по сравнению с контролем не были статистически значимыми. Активность эндогенных ингибиторов кислых лизосомальных цис-теиновых протеиназ составила 3,50 нмоль/ч-мг белка и 2,81 нмоль/ч-мг белка через 30 и 90 минут после инъекции соответственно. Полученные данные также не отличались от контрольных значений.

Общая протеолитическая активность сыворотки крови через 30 и 90 минут после инъекции раствора этанола составила 37,130 нмоль/ с-л и 25,580 нмоль/с-л, что значимо не отличалась от контрольной группы. Активность а1-

протеиназного ингибитора сыворотки крови через 30 минут после введения этанола составила 5,491 мкмоль/с-л, а спустя 90 минут - 5,466 мкмоль/с-л. Изменения активности а1-протеи-назного ингибитора также не являлись статистически значимыми по сравнению с контролем. Активность а2-макроглобулина сыворотки крови в группах животных, которым вводили раствор этанола, составила через 30 минут 0,529 мкмоль/с-л и через 90 минут - 0,562 мкмоль/с-л. Полученные данные не имели статистически значимых различий с контролем.

Активность эндогенных ингибиторов цистеиновых протеиназ сыворотки крови через 30 минут после введения этанола достигала 3536,585 отн. ед., а спустя 90 минут увеличивалась до 3658,536 отн. ед. При этом не было выявлено статистически значимых различий данного показателя с контрольной группой через 30 минут после инъекции раствора этанола, тогда как через 90 минут происходило его увеличение на 87% (рис. 2).

Таким образом, при однократной острой алкогольной интоксикации в сыворотке крови установлено увеличение активности эндогенных ингибиторов цистеиновых протеиназ на 87% только через 90 минут, в то время как другие показатели в сыворотке крови и ткани го-

Таблица 2

Активность протеолитических ферментов и их ингибиторов в сыворотке крови

Показатель/Единицы измерения Контрольная группа Через 30 минут после введения раствора этанола Через 90 минут после введения раствора этанола

Общая протеолитическая активность сыворотки крови, нмоль/с-л. 25,450

Активность б1-протеиназного ингибитора сыворотки крови, мкмоль/с-л. 5,428

Активность б2- макроглобулина, мкмоль/с-л. 0,511

Активность эндогенных ингибиторов цистеиновых протеиназ, отн. ед. 1951,219

Примечания: Данные представлены в виде медианы, (-95% - +95%) - доверительный интервал, * - статистически значимые различия показателей по отношению к контролю.

6000

5000

4000

3000

2000

1000

Контроль 90 мин.

30 мин.

Средний

25%-75%

Min-Max

0

Рис. 2. Активность эндогенных ингибиторов цистеиновых протеиназ сыворотки крови при однократной острой алкогольной интоксикации, отн. ед.

ловного мозга не имели статистически значимых по сравнению с контролем различий. Вероятно, это может свидетельствовать о том, что в головном мозге в срок до 90 минут после однократного введения этанола не наступает ис-

тощение системы протеиназы/ингибиторы. Увеличение активности эндогенных ингибиторов цистеиновых протеиназ в сыворотке крови указывает на нарушение баланса в системе протеиназы/ингибиторы. Выявленное повышение

активности эндогенных ингибиторов цистеино-вых протеиназ в сыворотке крови, возможно, является компенсаторным изменением в ответ на воздействие этанола.

Заключение

1. При однократном внутрибрюшинном введении 25 % раствора этанола в дозе 2,5 грамм на килограмм массы тела животного в головном мозге не установлено статистических значимых различий активности трипсиноподобных и цистеиновых протеиназ, а также их эндогенных ингибиторов.

2. В сыворотке крови при острой алкогольной интоксикации через 90 минут после введения этанола отмечено повышение активности эндогенных ингибиторов цистеиновых проте-иназ на 87%, тогда как общая протеолитическая активность, активность а^-протеиназного ингибитора и а2-макроглобулина как через 30 минут, так и через 90 минут не имели статистически значимых по сравнению с контролем различий.

Литература

1. Кардиопротекторные свойства производных ГАМК в условиях острой алкогольной интоксикации / В.Н. Перфилова [и др.] // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2006. - N° 4. - С. 23 - 27.

2. Intracellular Proteolytic Systems in Alcohol-Induced Tissue Injury / M. Terrence [et al.] // Alcohol Research and Health. - 2003. - Vol. 27, № 4. - P 317-324.

3. Афанасьев, В.В. Клиническая фармакология реамбе-рина: пособие для врачей / В.В. Афанасьев. - СПб., 2005. - С. 4 - 5.

4. Влияние хронического потребления этанола на активность основных карбоксипептидаз в отделах мозга пренатально алкоголизированных крыс / А.Н. Верни-гора [и др.] // Нейрохимия. - 2003. - № 1. - С. 56 - 59.

5. Разводовский, Ю.Е. Влияние L-триптофана на фонд центральных нейроактивных соединений при синдроме отмены этанола / Ю.Е. Разводовский, Е.М. Дорошенко // Нейрохимия. - 2004. - № 1. - С. 44 - 51.

6. Ethanol Induces Cell Death by Activating Caspase-3 in the Rat Cerebral Cortex / J. Y Han [et al.] // Molecules and Cells. - 2005. - Vol. 20, №2. - P. 189 - 195.

7. A Systems-Based Computational Model for Dose-Response

Comparisons of Two Mode of Action Hypotheses for Ethanol-Induced Neurodevelopmental Toxicity / J.M. Gohlke [et al.] // Toxicological Sciences. - 2005. - №2. - P 470 - 484.

8. Apoptotic effect of caspase-3 cleaved tau in hippocampal

neurons and its potentiation by tau FTDP-mutation N279K / L. Fasulo [et al.] // J Alzheimers Dis. - 2005. - Vol.

7, № 1. - P 3 - 13.

9. Johnson, GV Calpains: intact and active? / GV Johnson, RP. Guttmann // Bioessays. - 1997. - № 11. - P 1011 -1018.

10. Inhibitory effect of a brain derived peptide preparation on the Ca++ -dependent protease, calpain / R. Wronski [et al.] // J. Neural. Transm. - 2000. - Vol. 107, № 2. - P 145 -157.

11. Calpain activation and alpha-spectrin cleavage in rat brain

by ethanol / Y. Rajgopal [et al.] // Neurosci Lett. - 2002. -Vol. 321, № 3. - P 187 - 191.

12. Spectrin and calpain: a «target» and a «sniper» in the pathology of neuronal cells / A. Czogalla [et al.] // Cell Mol Life Sci. - 2005. - Vol. 62, № 17. - P. 1913 - 1924.

13. Rajgopal, Y. Ethanol induced changes in cyclin-dependent

kinase-5 activity and its activators, P35, P67 (Munc-18) in rat brain / Y. Rajgopal, MC. Vemuri // Neurosci Lett. -2001. - № 10. - P 173 - 176.

14. Давыдов, Б.И. Радиационное поражение головного мозга. / Б.И. Давыдов, И.Б. Ушаков, В.П. Федоров; под ред. В.А. Пономаренко. - М.: Энергоатом.-издат, 1991.

- 240 с.

15. Шишкин, С.Н. Оптимизация техники определения уров-

ня эндогенного этанола в крови и тканях человека и экспериментальных животных / С.Н. Шишкин, Ю.М. Островский, П.С. Пронько // Вопросы медицинской химии. - 1988. - №5. - С. 129 - 133.

16. Protein measurement with the Folin phenol reagent / O.H. Lowry [et al.] // J. Biol. Chem. - 1951. - Vol. 193, № 1. - P 265-275.

17. Erlanger, B.F. The preparation and properties of two new chromogenic substrates of trypsin / B.F Erlanger, N. Kokowsky, M. Cohen // Arch Biochem. Biophys. - 1961.

- Vol. 95, № 2. - Р 271-278.

18. Ускоренный метод определения основных ингибиторов протеиназ в плазме крови человека: Метод. рекомендации. / Хватов В.Б., Белова Т.А. - М., 1981. - 27 с.

19. Thermostable endogenous inhibitors of cathepsins B and

H / JF. Lenney [et al.] // Eur J Biochem. - 1979. - Vol. 101, № 1. - Р 153 - 161.

20. Ходос, О. А. Исследование активности протеолитичес-ких ферментов и их эндогенных ингибиторов в экстракте ткани головного мозга крыс. / О.А. Ходос // Актуальные вопросы теоретической и практической медицины: Сборник научных статей науч.-практ. конф., Гомель, 1 - 2 дек. 2005 г. / Гомельский гос. мед. Ун-т; редкол.: С.В. Жаворонок [и др.]. - Гомель, 2006. - Т 2.

- С. 128 - 130.

21. Реброва, О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA / О.Ю. Реброва. - Минск: МедиаСфера, 2003. - 312 с.

Поступила 30.05.2011 г. Принята в печать 03.06.2011 г.