o
Способ определения оптимального моноэндоцеллюлярного криоконсерванта для хранения клеток при -80 С
METHOD FOR DETERMINATION OF OPTIMUM MONO-ENDOCELLULAR CRYOPRESERVING AGENT FOR CELLS STORAGE AT -80C

Изобретение относится к медицине, в частности к лабораторному исследованию биологической жидкости (супернатант, плазма или сыворотка крови), и позволяет прогнозировать реакцию организма на лечебное воздействие по коррекции гемопоэза. Проводят сравнительное исследование зональных структур высушенных капель супернатантов с различными криоконсервантами, замороженных до температуры минус 80°С, а также до и спустя определенные интервалы времени после испытания на модели трансфузии in vitro и при аналогичности структуропостроения центральных, срединных и краевых зон контрольного и опытного микробиопрепаратов примененный криоконсервант оценивают как оптимальный для конкретного больного.
Для осуществления способа изъятую у больного порцию венозной крови при комнатной температуре делят на равные части в пробирки, одна из которых контрольная, в опытных смешивают с разными криоконсервантами в соотношении 25:1, соответственно, предварительно охлажденными до температуры минус 80°С, перемешивают при температуре 37°С в течение определенного отрезка времени (модель трансфузии in vitro), центрифугируют, супернатант раскапывают на предметном стекле, высушивают при температуре 37°С и исследуют под малый увеличением микроскопа в проходящем свете. Производят качественный и количественный анализ визуаметрических параметров структуропостроения центральных, срединных и краевых зон высушенных капель микропрепаратов биожидкости контрольного и опытных образцов* (*Мартусевич А.К., Гришина А.А. Биокристалломика: общие представления, методология и методы исследования. Учебное пособие. Кирон: Типография ВГСХА, 2009. - 26 с.) и при аналогичности структуропостроения центральных, срединных и краевых зон контрольного и опытного микробиопренаратов примененный криоконсервант для замораживания клеток крови при температуре минус 80°С оценивают как оптимальный для конкретного больного.
Клетки крови, консервированные при температуре минус 80°С, являются одними из эффективных средств в терапии депрессивных состоянии гемопоэза различного генеза (Белоус A.M., Грищенко В И. Криобиология. Киев: «Наукова думка», 1994. - 432 с.; Руководство по трансфузионной медицине (Под редакцией Е.П. Сведенцова. - Киров, 1999.)).
Ключевым вопросом в применении криомедицинских технологий является использование нетоксичных или малотоксичных криопротекторов и криоконсервантов на их основе для замораживания клеток крови с лечебной целью (Смит О. Биологическое действие замораживания и переохлаждения. - М.: Издательство иностранной литературы, 1963. - 505 с.; Хлябич Г.Н. Кровезаменители, консерванты крови и костного мозга. Москва: Медицина, 1997. -192 с.; Багаутдинов Ш.М. Совершенствование методов долгосрочного хранения крови и костного мозга в замороженном состоянии в службе крови вооруженных сил: Автореф: дис. докт. биол. наук. - СПб., 1998. - 29 с.; Сведенцов Е.П. Криоконсерванты для живых клеток. Сыктывкар, 2010. - 80 с.).
При этом особую ценность приобретают методы тестирования биологической активности криоконсервантов и возможной реакции организма в посттрансфузионном периоде по определению уровня белка, гемоглобина, холестерина, билирубина и других показателей гомеостаза (см. Руководство по клинической лабораторной диагностике. Под ред. А.С. Петровой. М.: Медицина, 1985).
Известны способы оценки эффективности криоконсервантов, основанные на исследовании морфологических, функциональных и иммунологических показателей консервируемых клеток крови на этапах их консервирования (Регламенты по изготовлению гемоконсервантов. Государственная Фармакопея РФ ХП ч. 1; Инструкция по применению компонентов крови, утвержденная Приказом Минздрава Росси 25 ноября 2002 г. №363).
Однако перечисленные показатели изменяются при развитой картине посттрансфузионной реакции или осложнения и не позволяют прогнозировать реакцию организма на лечебное воздействие по коррекции гемопоэза на более раннем, доклиническом этапе применения криоконсервированных клеток крови.
Наиболее близким к заявляемому способу является микроскопический способ оценки состояния гомеостаза, основанный на кристаллографическом исследовании высушенных капель плазмы (сыворотки) крови (патент РФ N 2114432). При этом пробы биологической жидкости обрабатывают лазером или электромагнитным полем, раскапывают на чистое стекло, высушивают и исследуют под микроскопом в поляризованном свете, после чего сравнивают зональные структуры фаций опытного образца с исходным, т.е. полученным до воздействия на биожидкость внешнего фактора. При этом, чем раньше происходит возвращение параметров зональных структур капель высушенной биожидкости к исходным показателям, тем более устойчивое ожидаемое у субъекта состояние гомеостаза. Если восстановление параметров морфотипов зональных структур биожидкости после воздействия на нее изучаемого физического фактора замедлено по сравнению с контрольной группой, то это указывает на неустойчивое состояние гомеостаза.
Недостатком прототипа является то, что в нем не предлагается количественный и качественный анализ визуаметрических параметров структуропостроения кристаллизации высушенных капель биологической жидкости. Кроме того, при оценке состояния гомеостаза по кристаллогенной активности плазмы (сыворотки) крови известным способом не представляется возможным оценить влияние различных криоконсервантов на гомеостаз до введения в сосудистое русло реципиента консервированного при температуре минус 80°С компонента крови. Вместе с тем, индивидуальный выбор криоконсерванта в трансфузиологии на доклиническом этапе очень важен, так как позволяет своевременно (до проявления первых клинических признаков посттрансфузионной реакции или осложнения) дать оценку пригодности или непригодности препарата для консервирования клеток крови конкретно данному больному.
Поэтому поставленной задачей было устранение недостатка и создание такого способа, который бы позволял индивидуально подобрать in vitro для конкретного больного наиболее эффективный и безопасный криоконсервант на этапе, предшествующем его инфузии с клетками крови, криоконсервированными при температуре минус 80°С.
Поставленная задача решается по следующей схеме.
Пример выполнения. Пациентка М. (мед. карта 386/13. У пациентки (после получения добровольного информированного согласия) аспирировали 20 мл венозной крови, которые фасовали в пробирки по 5,0 мл. Пробирка №1 - контрольная, без криоконсерванта. В пробирку №2 с помощью дозаторной пипетки вносили 0,2 мл криоконсерванта на основе 5% раствора ДМАЦ и 2,5% раствора глюкозы, в пробирку №3 - 0,2 мл криоконсерванта на основе 5% раствора ДМСО, в пробирку №4 - 0,2 мл криоконсерванта на основе 5% раствора Глицерина и 4% раствора глюкозы (ГЛ). Растворы криоконсервантов предварительно охлаждали до температуры минус 80°С. Готовые биологические системы «кровь + криоконсервант» перемешивали на шейкере при температуре 37°С в течение 4 ч и 24 ч, центрифугировали при 2100 об/мин 18 мин, получали супернатант, последний раскапывали (не меньше 6 капель объемом 4 мкл каждая) на горизонтальную поверхность предметного стекла, высушивали при 37°С, после чего исследовали характеристики и параметры кристаллизации зональных морфологических структур: центральных, срединных, краевых под увеличением ×40 и ×100 микроскопа в проходящем свете.
Необходимые математические расчеты выявленных количественных и качественных критериев морфологических структур высушенных капель супернатанта производили по известной методике* (*Мартусевич А.К., Гришина А.А. Биокристалломика: общие представления, методология и методы исследования. Учебное пособие. Кирон: Типография ВГСХА, 2009. - 26 с.). Далее сопоставляли результаты оценки фаций высушенных капель образцов биологической жидкости с данными контрольного образца. В случае аналогичности структуропостроения зональных структур контрольного и опытного образцов микробиопрепарата примененный криоконсервант оценивали как безопасный и оптимальный из числа сравниваемых для конкретного больного (табл. 1).
Представленный пример иллюстрирует применимость предлагаемого способа индивидуализации использования гемоконсервантов. Согласно анализу результатов кристаллизации контрольной и опытных проб супернатантов, оптимальным для конкретного больного является криоконсервант на основе 5% раствора ДМАЦ и 2,5% раствора глюкозы, опытный образец с которым обладает наиболее высокой аналогичностью структуропостроения к контрольной пробе по сравнению с биопробами, содержащими 5% раствор ДМСО или 5% раствор Глицерина. Из чего следует заключение: для пациентки М. оптимален криоконсервант на основе 5% раствора ДМАЦ и 2,5% раствора глюкозы. Криоконсерванты, содержащие 5% раствор ДМСО или 5% раствор Глицерина, пациентке М. не оптимальны и не показаны для замораживания компонентов крови.
Необходимое оборудование: персональный компьютер, микроскоп с проходящим светом, цифровая приставка, пипеточный микродозатор, предметные стекла, набор гемоконсервантов из ДМАЦ, ДМСО и Глицерина, разрешенных МЗ РФ к клиническому применению.
Способ дешев и может быть освоен на базе клинической лаборатории ЛПУ, использующего трансфузии компонентов крови, замороженных до температуры минус 80°С.
Таким образом, благодаря использованию указанного, более чувствительного способа определения индивидуальной безопасности криоконсервантов, удается на раннем доклиническом этапе выявить in vitro безопасный и оптимальный для конкретного больного криоконсервант и рекомендовать его для замораживания компонентов крови с лечебной целью.
Предлагаемое изобретение отвечает критериям «новизна» и «изобретательский уровень», так как проведенные патентно-информационные исследования не выявили источников патентной и научно-технической литературы, которые бы порочили новизну предлагаемого способа, равно как и известных способов с существенными признаками предлагаемого технического решения. Техническим результатом использования изобретения является возможность проведения индивидуального скрининга криоконсерванта на доклиническом этапе его применения.