Способ трансплантации аутологичных гемопоэтических стволовых клеток периферической крови
METHOD FOR TRANSPLANTATION OF PERIPHERAL BLOOD AUTOLOGOUS HAEMOPOIETIC STEM CELLS

Заявляемое изобретение относится к медицине, а именно, к методам лечения злокачественных новообразований кроветворной, лимфоидной и родственных им тканей и, в частности, к проведению высокодозной химиотерапии (ВДХТ) с последующей аутологичной трансплантацией гемопоэтических стволовых клеток (ауто-ТГСК) периферической крови (ПК).
Программное лечение большинства лимфопролиферативных новообразований, в том числе множественной миеломы (ММ), непременно включает высокодозную химиотерапию с последующей ауто-ТГСК [Ljungman P.J. et al. Bone Marrow Transplantation, 2010, 45, 219-234].
Данный вид лечения включает проведение отдельных стандартных этапов: заготовка (сбор/коллекция/эксфузия) гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) ПК и/или костного мозга (КМ), криоконсервирование и хранение ГСК, их размораживание и реинфузия (возврат) пациенту после завершения подготовительного режима ВДХТ. От качества проведения каждого из этих этапов зависит скорость восстановления кроветворения, что в свою очередь определяет успех трансплантации, снижает риски развития осложнений и увеличивает общую выживаемость пациентов [Davies S.M. et al. Blood, 2000, 96:4096-102].
Ауто-ТГСК периферической крови могут быть заготовлены только до начала подготовительного химиотерапевтического режима (кондиционирования), не позднее, чем за 1 сутки до начала подготовительного периода; после начала кондиционирования заготовка ауто-ТГСК невозможна в связи с миелосупрессивным действием химиопрепаратов. Трансфузия ауто-ТГСК проводится в срок не менее 24 часов после последнего введения химиотерапевтического агента.
Известен стандартный способ поддержания жизнеспособности ауто-ТГСК путем управляемого криоконсервирования взвеси ГСК с использованием внутриклеточного криопротектора диметилсульфоксида (ДМСО); криоконсервированные ГСК до проведения трансплантации (реинфузии) хранят в парах жидкого азота при сверхнизких температурах (ниже -180°С) в условиях биологического хранилища (криобанка) [Bakken A.M. Cryopreserving human peripheral blood progenitor cells. Curr Stem Cell Res Ther. 2006; 1:47-54; см. также RU 2623081, A01N 1/02, 2017; RU 2623083, A01N 1/02, 2017; RU 2623864, A01N 1/02, 2017].
Однако при криоконсервировании и последующем размораживании значительная часть собранных ГСК (20-30%) разрушается и утрачивает жизнеспособность из-за необратимой активации раннего апоптоза [F. de Boer, A.M. Drager, H.M. Pinedo et al., "Extensive early apoptosis in frozen-thawed CD34-positive stem cells decreases threshold doses for haematological recovery after autologous peripheral blood progenitor cell transplantation", Bone Marrow Transplantation, vol. 29, no. 3, pp. 249-255, 2002]. Кроме того, реинфузии ГСК, подвергнувшихся криоконсервированию, вызывают у больных ряд тяжелых побочных и токсических эффектов ДМСО: тошноту, рвоту, боли в животе, а также сердечнососудистые, неврологические, респираторные, почечные, печеночные и гемолитические осложнения.
Результат, на достижение которого направлено заявляемое изобретение, заключается в том, чтобы исключить токсические эффекты, связанные с введением ДМСО при реинфузии.
Указанный результат достигается тем, что в способе трансплантации аутологичных гемопоэтических стволовых клеток периферической крови, включающем заготовку, хранение и реинфузию аутологичных гемопоэтических стволовых клеток периферической крови, заготовленные стволовые клетки в виде лейкослоя, взвешенные в многокомпонентном растворе антикоагулянта, переводят в контейнер, исключающий проникновение кислорода из воздуха, и хранят в указанном контейнере без доступа воздуха в антикоагулянтном растворе при температуре (+3) - (+5)°С в течение 3-6 суток.
В качестве контейнера, исключающего проникновение (подсос) кислорода воздуха в содержимое, может быть использован, например, стандартный контейнер для криоконсервирования крови и ее компонентов или любой другой контейнер с двухслойными стенками.

В качестве раствора антикоагулянта может быть использован многокомпонентный раствор на основе цитрата натрия (типа ACD Solution, formula A (ACD-А) или другие стандартные растворы, применяемые при заготовке крови и ее компонентов.

Лейкослой, используемый для ауто-ТГСК, получают путем стандартного афереза на сепараторе клеток крови (типа Terumo ВСТ Spectra Optia Apheresis System или Haemonetic MCS+). В соответствии с указанной технологией, отделенный лейкослой обогащен гемопоэтическими стволовыми клетками CD34+ и содержит некоторое количество тромбоцитов и эритроцитов.
Продукт аппаратного афереза ГСК ПК от момента заготовки и до его реинфузии при ауто-ТГСК может храниться при температуре +3 - +5°С в медицинском оборудовании для хранения крови, компонентов лекарственных средств и вакцин типа

Sanyo MPR или Pozis ХФ-400-2, в том же мешке для криоконсервирования клеток крови (типа CrioMax750), в котором он был заготовлен.
Нами было обнаружено, что хранение нативной взвеси ГСК с антикоагулянтом раствором ACD-A без доступа воздуха в мешке, исключающем подсос воздуха, в медицинском холодильнике при колебаниях температуры от +3°С до +5°С в течении 5 (пяти) суток значимо не влияет ни на содержание CD34+ клеток в продукте, ни на количество 7AAD- клеток и колониеобразующую способность (КОС) ГСК, а главное - на сроки восстановления кроветворения у больных ММ после ауто-ТГСК. При этом удавалось избежать типичных для инфузий криоконсервированных с ДМСО ГСК осложнений.
Далее изобретение пояснено примерами конкретного воплощения.
Пример 1
Для оценки эффективности способа была выбрана группа из десяти пациентов, 5 женщин и 5 мужчин, страдающих множественной миеломой (ММ). Все пациенты получали стандартные программы иммунохимиотерапии и на момент проведения ауто-ТГСК находились в состоянии ремиссии заболевания.
Аферез ГСК производился с помощью систем аппаратного цитафереза. Полученный лейкослой, обогащенный CD34+ стволовыми клетками, засасывали в пакет для криоконсервирования, из которого предварительно удаляли воздух. Хранение осуществлялось в тех же пакетах для криоконсервирования при колебаниях температуры от +3°С до +5°С в течении 5 суток в медицинском холодильнике. Медиана срока хранения составила 4 (2-6) суток.
5
Количество CD34+ клеток определялось методом проточной цитофотометрии. Жизнеспособность клеток аферезного продукта оценивалась по показателю 7-AAD-. 7-AAD (7-аминоактиномицин-Д) - флуоресцентный маркер, проникающий через поврежденные клеточные мембраны и связывающийся с двуспиральной ДНК. Через интактные мембраны этот маркер не проникает, таким образом, живые клетки не окрашиваются 7-аминоактиномицином-Д при флуоресцентной микроскопии или проточной цитометрии. Показатель 7-AAD- ГСК на момент трансплантации составил в среднем 89,5±7,25%. Перед реинфузией ГСК КОС (гранулоцитарные и гранулоцитарномакрофагальные колонии) клеток аферезного продукта составляла 65,5±61,24×10/л колоний.
2
5
Предпочтительным режимом кондиционирования для проведения ауто-ТГСК была выбрана стандартная высокодозная химиотерапия мелфаланом (MEL200) с дозировкой лекарственного препарата 200 мг/м, вводимой внутривенно в равных дозах в 1-й и 2-й дни [Kerry Atkinston. The ВМТ data book: a manual for bone marrow and blood stem cell transplantation, pp. 76-77, 1997]. Основанием для выбора данного режима явилась его короткая продолжительность (3 дня). Аутологичная трансплантация ГСК производилась через 24 часа в условиях боксированных палат блока интенсивной терапии. Среднее содержание CD34+ клеток в аферезном продукте на момент реинфузии ГСК составило 2,49±0,6×10/кг веса пациента.
9
9
Все пациенты перенесли реинфузию аутологичных ГСК без значимых реакций и осложнений. Медиана сроков восстановления уровня нейтрофилов выше 1,0×10/л - 10 (10-12) суток, уровня тромбоцитов более 25×10/л - 11 (10-17) суток. Среди осложнений посттрансплантационного периода были отмечены: фебрильная нейтропения у 6 (60%), энтеропатия у 3 (30%), мукозит с присоединением кандидоза верхних отделов желудочно-кишечного тракта у 2 (20%) пациентов. Медиана продолжительности нахождения в стационаре после ауто-ТГСК составила 16 (13-19) суток.
Пример 2 (контрольный)
5
5
Для сравнения была взята контрольная группа из 16 больных ММ (10 мужчин и 6 женщин), которым были проведены аналогичные процедуры сбора и реинфузии ГСК ПК. Аферезный продукт криоконсервировали в присутствии ДМСО и хранили при сверхнизких температурах в условиях криобанка. Все больные после индукционной иммунохимиотерапии находились в состоянии ремиссии заболевания. Количество CD34+ клеток в продукте перед реинфузией в среднем составило 2,5±0,5×10/кг веса пациента. Показатель 7-AAD- размороженных ГСК составил в среднем 91,1±6,32%. Колониеобразующая способность ГСК в среднем составила 109,5±45,7×10/л колоний.
У 14 пациентов (87,5%) при проведении реинфузии ГСК были отмечены реакции на ДМСО в виде: тошноты и рвоты у 5 пациентов (31%), тахикардии более 90 ударов в минуту у 7 (44%), эпизоды стенокардии у 2 пациентов (12,5%), повышение общего билирубина и индикаторных печеночных ферментов (АлАТ, АсАТ) выше верхней границы нормы у 2 пациентов (12,5%). Подобные осложнения отсутствовали в 1 группе пациентов. Среди осложнений посттрансплантационного периода были отмечены: фебрильная нейтропения - у 12 (75%), энтеропатия - у 8 (50%), мукозит и кандидоз слизистой полости рта - у 2 (12,5%) пациентов.
Статистически значимые различия в количестве CD34+ клеток при реинфузии, значении показателя 7AAD-, КОС, сроках восстановления кроветворения и продолжительности нахождения в стационаре после ауто-ТГСК не выявлены (табл. 1 и 2).
Из данных, представленных в таблице 3, видно, что статистически значимых различий в количестве осложнений посттрансплантационного периода между пациентами 1 и 2 примеров также не выявлено, однако, прослеживается тенденция к более высокой частоте осложнений при использовании криоконсервированных ГСК.
Таким образом, предложенный способ трансплантации гемопоэтических стволовых клеток не уступает традиционному способу с криоконсервированием по таким параметрам как количество CD34+ клеток и 7AAD- клеток, колониеобразующая способность, количество необходимых трансфузий тромбоцитного концентрата, сроки приживления гранулоцитарного и мегакариоцитарного ростков кроветворения, продолжительность нахождения в стационаре после ТГСК, количество осложнений в посттрансплантационном периоде. В то же время предложенный способ исключает этапы криоконсервирования, хранения в условиях криобанка и разморозки ГСК, а главное - снижает частоту осложнений и исключает токсические эффекты, связанные с введением ДМСО при реинфузии.
Заявляемый способ увеличивает доступность ауто-ТГСК за счет вовлечения в процесс оказания медицинской помощи методом трансплантации ГСК медицинских учреждений, имеющих инфраструктуру для лечения больных злокачественными новообразованиями кроветворной, лимфоидной и родственных им тканей, но не имеющих структурных подразделений для обеспечения процесса криоконсервирования биологических сред. Он также позволяет экономить ресурсы благодаря исключению этапов «замораживания, хранения и размораживания» ГСК из технологии проведения ауто-ТГСК.