Способ диагностики субклинической стадии диабетической нейропатии
METHOD OF DIAGNOSTICS OF SUBCLINICAL STAGE OF DIABETIC NEUROPATHY

Изобретение относится к области медицины, в частности к неврологии, а именно к лабораторной диагностике диабетической полинейропатии, что может быть использовано для скрининга поражения нервной системы при различных формах нарушения углеводного обмена.
Диабетическая полинейропатия (ДПН) является одним из наиболее частых осложнений сахарного диабета. На ранних этапах ДПН может протекать субклинически, что делает невозможным применение наиболее информативных методов диагностики (электронейромиография, количественное сенсорное тестирование, биопсия кожного нерва) и ведет к несвоевременному выявлению полинейропатии. Поздняя верификация диагноза приводит к неизбежному прогрессированию заболевания, повышению риска развития синдрома диабетической стопы и, как следствие, ампутации конечностей с формированием стойкой потери трудоспособности и инвалидизации. Наиболее распространенный и привычный метод диагностики - электронейромиографическое исследование (ЭНМГ) нервных структур применяется лишь при появлении соответствующих жалоб, а зачастую и при далекозашедших непоправимых клинических проявлениях, соответственно, не может использоваться в качестве скрининга [LaMontagne A, Buchthal F. Electrophysiological studies in diabetic neuropathy. Journal of Neurology, Neurosurgery & Psychiatry. 1970; 33:442-452]. Несмотря на целый ряд положительных характеристик, количественные сенсорные тесты имеют ряд ограничений, так как достаточно субъективны и зависят от внимания пациента, его мотивации и готовности к сотрудничеству, от антропометрических переменных (возраста, пола, массы тела, наличия в анамнезе курения и употребления алкоголя) [Freeman R, Chase KP, Risk MR. Quantitative sensory testing cannot differentiate simulated sensory loss from sensory neuropathy. Neurology. 2003 Feb 11; 60(3):465-70]. Инвазивные методы диагностики, хоть и являются высокочувствительными, но сопряжены с целым рядом возможных осложнений. Особый интерес вызывают данные о применении конфокальной микроскопии роговицы с целью выявления повреждения нервных волокон на ранних стадиях, которые появились в последние годы [Azmi S, Ferdousi М, Petropoulos IN, et al. Corneal Confocal Microscopy Identifies Small-Fiber Neuropathy in Subjects With Impaired Glucose Tolerance Who Develop Type 2 Diabetes. Diabetes Care. 2015; 38(8):1502-1508]. Однако дороговизна и технические сложности проведения не позволяют использовать инструментальные неинвазивные и инвазивные методы выявления ДПН в качестве скрининговых. Все это обусловливает необходимость разработки общедоступных методов своевременной диагностики ДПН.
Прототипом заявляемого способа диагностики выбран способ прогнозирования диабетической периферической нейропатии у детей и подростков [патент РФ №2273028, Морозова Н.В., Галкина Г.А., Афонин А.А, Ермоленко Е.Н.], согласно которому в периферической крови серологическим методом исследуют мозговой нейротрофический фактор (brain derived neurotrophic factor - BDNF) и при его величине больше 9000 пг/мл диагностируют субклиническую стадию ДПН у детей. Недостатки способа - низкая чувствительность и специфичность. Анализ современных исследований показывает, что избыток нейротрофинов не объясняет прогрессирования нейропатии, так же как сниженный уровень факторов роста не исключает наличия ДПН [Leinninger GM, Vincent AM, Feldman EL. The role of growth factors in diabetic peripheral neuropathy. J Peripher Nerv Syst. 2004 Mar; 9(1):26-53]. Представленный метод не учитывает современные взгляды на патогенез данного заболевания, согласно которым важная роль отводится состоянию рецепторного аппарата нейротрофических факторов, без которых невозможно обеспечение процессов нейропластичности, а также эндотелиальной дисфункции, вторично усугубляющей повреждение нервных структур на ранней стадии [Manju Sasi, Beatrice Vignoli, Marco Canossa, Robert Blum. Neurobiology of local and intercellular BDNF signaling. Pflugers Arch - Eur J Physiol (2017) 469:593-610]. В экспериментальных исследованиях основной фактор ангиогенеза, васкулоэндотелиальный фактор роста (vascular endothelial growth factor - VEGF), показал возможность одновременного воздействия на сосудистый и метаболический компоненты патогенеза ДПН, что указывает на его стимулирующее влияние на рост и выживание нервных клеток [Schratzberger Р, Walter DH, Rittig K, et al. Reversal of experimental diabetic neuropathy by VEGF gene transfer. Journal of Clinical Investigation. 2001; 107(9): 1083-1092]. Игнорирование этих важных компонентов обеспечения компенсации нервной системы, задействованных на ранней стадии развития ДПН, обеспечивает высокий процент ложноположительных и ложноотрицательных результатов в диагностике данного осложнения.
Технический результат: повышение чувствительности и специфичности способа.
Сущность метода заключается в определении глюкозы крови (Glu), сывороточных уровней мозгового нейротрофического фактора (BDNF), его высокоафинного тропомиозинового рецептора киназы (Trk-B), васкулоэндотелиального фактора роста (VEGF) у пациентов с нарушением углеводного обмена. Полученные значения используются в регрессионной модели, представленной формулой K=0,2*Glu+0,55*TrkB+0,3*(BDNF/VEGF), где К - коэффициент, 0,2 - константа регрессии, Glu - уровень глюкозы крови, 0,55 - константа регрессии, Trk-B - сывороточный уровень тропомиозинового рецептора киназы типа В, 0,3 - константа регрессии, BDNF - сывороточный уровень мозгового нейротрофического фактора, VEGF - сывороточный уровень васкулоэндотелиального фактора роста. При коэффициенте K>4,5 диагностируют субклиническую стадию диабетической нейропатии.
Данный способ отображает как качественную, так и количественную характеристики процесса компенсации нервной системы и эндотелия vasa nervorum в ответ на повреждение в условиях гипергликемии, за счет чего метод обладает высокой чувствительностью и специфичностью. Сбалансированность системы нейротрофин/рецептор/сосудистый фактор роста имеет высокую прогностическую значимость в отношении определения тяжести нейропатии. Метод позволяет принять заблаговременные терапевтические меры по лечению ДПН, снизить инвалидизацию и смертность от данного осложнения сахарного диабета. Метод высокоточен, не требует дорогостоящего медицинского оборудования, доступен для проведения в любой лаборатории.
Способ осуществляют следующим образом. У больного сахарным диабетом в крови определяют уровень глюкозы (Glu), сывороточные уровни BDNF, Trk-B, VEGF. Для этого натощак осуществляют забор венозной крови в стандартную вакуумную пробирку без коагулянта, отстаивают образец в течение 20 минут при комнатной температуре, центрифугируют в течение 15 мин на скорости 2000 об/мин, распределяют полученную сыворотку по пробиркам Эппендорфа. При необходимости образцы хранят в течение длительного периода при температуре -20 С. Проводят иммуноферментный анализ (ИФА) «сэндвичевого» типа с использованием тест-систем для количественного подсчета мозгового нейротрофического фактора (SEA011Hu ELISA Kit for Brain Derived Neurotrophic Factor), его тропомиозинового рецептора киназы (SEC183Hu ELISA Kit for Neurotrophic Tyrosine Kinase Receptor Type 2), васкулоэндотелиального фактора роста (SEA143Hu ELISA Kit for Vascular Endothelial Growth Factor А) в сыворотке периферической крови [Instruction manual, 11th Edition, July, 2013. Cloud-CloneCorp.USA]. Микропланшет в стандартном наборе сорбирован антителами, конъюгированными с биотином и специфичными к BDNF, Trk-B, VEGF. Образцы добавляют в определенные лунки планшета. Затем авидин, конъюгированный с пероксидазой хрена добавляют в каждую лунку планшета, проводится инкубация. После добавления ферментативного субстрата цвет изменяется только в лунках, содержащих BDNF (Trk-B, VEGF), антитела с биотином и авидин с пероксидазой хрена. Ферментативная реакция прекращается добавлением раствора серной кислоты. Оптическую плотность измеряют фотометрическим методом на длине волны 450±10 нм. Концентрацию BDNF, Trk-B, VEGF в образцах рассчитывают в соответствии со стандартной (калибровочной) кривой, построенной по результатам анализа с серией Стандартов, полученное количественное содержание BDNF, Trk-B, VEGF выражается в нг/мл. Затем вычисляют коэффициент регрессионной модели, отражающей количественную и качественную характеристику нейропластичности, по формуле K=0,2*Glu+0,55*TrkB+0,3*(BDNF/VEGF), где К - коэффициент, 0,2 - константа регрессии, Glu - уровень глюкозы крови, 0,55 - константа регрессии, Trk-B - сывороточный уровень тропомиозинового рецептора киназы типа В, 0,3 - константа регрессии, BDNF - сывороточный уровень мозгового нейротрофического фактора, VEGF - сывороточный уровень васкулоэндотелиального фактора роста. При коэффициенте K>4,5 диагностируют субклиническую стадию диабетической нейропатии.
Данный способ был апробирован при исследовании 25 человек с различными формами нарушения углеводного обмена. Среди них 15 пациентов с сахарным диабетом 2 типа длительностью менее 2 и 10 человек с нарушением толерантности к глюкозе, выявленным впервые. Группу контроля составили 15 практически здоровых лиц, сходных по полу и возрасту основной группе. Комплексное обследование включало оценку жалоб, анамнеза, клиническое обследование с помощью специализированных шкал-опросников на выявление нейропатической боли (PainDetect), объективного обследования с помощью шкалы нейропатического дисфункционального счета (NDS). Всем исследованным проводилось электронейромиографиеческое исследование нижних конечностей (прибор Nicolet VikingQuest, USA) с оценкой амплитуды сенсорного ответа и показателя латентности для икроножного нерва, амплитуды моторного ответа и латентности для малоберцового нерва. Лабораторное исследование включало измерение гликемии натощак (ммоль/л) (у пациентов с НТГ - проведение теста толерантности к глюкозе), иммуноферментный анализ мозгового нейротрофического фактора, его высокоаффинного тропомиозинового рецептора киназы, васкулоэндотелиального фактора роста в сыворотке пациентов по указанной методике. Впоследствии вычислялся коэффициент регрессионной зависимости по формуле K=0,2*Glu+0,55*TrkB+0,3*(BDNF/VEGF). Среди 19 пациентов был выявлен коэффициент свыше 4,5, что соответствовало признакам легкой и умеренной нейропатии по данным электронейромиографического исследования. У 21 обследованного, в том числе у всех пациентов группы контроля, выявлено соотношение BDNF/Trk-B в диапазоне менее 4,5, среди них не обнаружено признаков нейропатии электрофизиологически. Количество ложноотрицательных результатов - 1, ложноположительных - 0. Чувствительность метода составила 95%, специфичность 100%, точность метода - 97,56%.
Примеры конкретного выполнения.
Пример 1. Пациентка Т., 62 года. Сахарный диабет 2 типа установлен 2 года назад. Уровень гликемии на момент исследования составил 6,8 ммоль/л, пикированный гемоглобин (HbA1C) 7,1%. Пациентка предъявляет жалобы на жгучие боли в конечностях, онемение, покалывание в кончиках пальцев, шаткость при ходьбе. Уровень болевого синдрома по визуальной аналоговой шкале (ВАШ) составил 8 баллов, нейропатический характер болевого синдрома установлен по шкале PainDetect (17 баллов). Данные объективного обследования определили умеренную степень нейропатии по шкале нейропатического дисфункционального счета (NDS) - 12 баллов, были обусловлены снижением коленных, выпадением ахилловых рефлексов с обеих сторон, снижением болевой, температурной чувствительности до середины голеней, легкую паллестезию у основания I пальца, выявленную с помощью градуированного камертона.
С помощью иммуноферментного анализа по вышеописанной методике определены сывороточные уровни BDNF - 2,0304 нг/мл, его рецептора Trk-B - 2,3684 нг/мл, VEGF - 0,26522 нг/мл. Коэффициент регрессии составил K=0,2*6,8+0,55*2,3684+0,3*(2,0304/0,26522)=4,9593, что свидетельствует о наличии диабетической нейропатии согласно заявленному способу.
По данным электронейромиографического исследования подтверждена аксонально-демиелинизирующая нейропатия икроножных, малоберцовых нервов умеренной степени выраженности: амплитуда S-ответа икроножного нерва - 6 мВ, латентность 3,8 мс, М-амплитуда малоберцового нерва (n.peroneus) на уровне лодыжки - 2,3 мВ, головки малоберцовой кости - 2,1 мВ, подколенной ямки - 2,3 мВ. Латентность n.peroneus на уровне лодыжки - 3,4 мс, головки малоберцовой кости - 10,4 мс, в поколенной ямке 11,8 мс, скорость проведения импульса по нерву - 43 м/с.
Диагноз: Сахарный диабет 2 типа, декомпенсированный. Осл.: Диабетическая сенсомоторная полинейропатия нижних конечностей, аксонально-демиелинизирующий вариант умеренной степени выраженности по данным ЭНМГ, хроническая форма, нейропатический болевой синдром.
Пример 2. Пациент Р. 54 года. Во время прохождения диспансеризации в 2017 году впервые выявлена гипергликемия натощак 6,2 ммоль/л. Обследован, наблюдается у эндокринолога с диагнозом нарушение толерантности к глюкозе. Наследственность отягощена по сахарному диабету 2 типа (у матери). Тест толерантности к глюкозе на момент исследования: гликемия натощак 6,2 ммоль/л, постпрандиальная - 8,6 ммоль/л. Гликированный гемоглобин 6,1%. Пациент не предъявлял никаких жалоб. Оценка субъективных данных по шкале PainDetect составила 2 балла. Объективно выявлено снижение болевой и температурной чувствительности на кончиках I пальцев обеих стоп, что соответствовало 4 баллам по шкале NDS.
По результатам ИФА: сывороточный уровень BDNF составил 2,43861 нг/мл, уровень Trk-B=1,293984 нг/мл, VEGF=0,27444 нг/мл. Был рассчитан коэффициент регрессионной зависимости К=0,2*6,2+0,55*1,293984+0,3*(2,43861/0,27444)=4,618, что также свидетельствует о наличии нейропатии по предложенному способу диагностики.
Электрофизиологически было выявлено грубое поражение икроножных нервов с обеих сторон по типу аксонопатии: S-ответ справа 0 мВ, слева 0 мВ, латентность слева 0 мс, справа 0 мс. Также выявлено легкое снижение показателей малоберцового нерва с обеих сторон: М-амплитуда n.peroneus на уровне лодыжки - 2,5 мВ, головки малоберцовой кости - 2,3 мВ, подколенной ямки - 2,3 мВ. Латентность n.peroneus на уровне лодыжки - 3,8 мс, головки малоберцовой кости - 12,0 мс, в поколенной ямке 13,9 мс, скорость проведения импульса по нерву - 42 м/с.
Диагноз: Нарушение толерантности к глюкозе.
Осл.: Сенсомоторная полинейропатия нижних конечностей, ассоциированная с НТГ, с преимущественным вовлечением аксонов сенсорных нервов по ЭНМГ, субклиническая стадия.
Пример 3. Пациентка З, 59 лет. Наблюдается у эндокринолога с диагнозом нарушение толерантности к глюкозе в течение двух лет. Страдает ожирением 1 ст. (ИМТ 32 кг/м2), артериальной гипертензией IIcт, 3cт, р3. На момент исследования уровень гликемии натощак составил 5,5 ммоль/л на момент исследования, постпрандиальная гликемия 8,9 ммоль/л. Уровень гликозилированного гемоглобина 5,5%. Беспокоят периодические судороги в ногах. Объективно выявлено снижение температурной, тактильной чувствительности на уровне I пальцев обеих стоп, что оценено на 4 балла по NDS.
При проведении иммуноферментного анализа был получен сывороточный уровень BDNF=1,578664 нг/мл, уровень Trk-B=1,323269 нг/мл, VEGF=0,23458 нг/мл. Коэффициент, рассчитанный по формуле, равнялся К=0,2*5,5+0,55*1,323+0,3(1,579/0,23458)=3,847, что исключает повреждение периферической нервной системы согласно предложенному методу скрининга.
Электронейромиографически данных за полинейропатию не получено: амплитуда S-ответа икроножного нерва - 11 мВ, латентность 2,4 мс, М-амплитуда n.peroneus на уровне лодыжки - 5,8 мВ, головки малоберцовой кости - 5,2 мВ, подколенной ямки - 5,4 мВ. Латентность n.peroneus на уровне лодыжки - 3,2 мс, головки малоберцовой кости - 9,3 мс, в поколенной ямке 10,4 мс, скорость проведения импульса по нерву - 50 м/с.
Диагноз: Ожирение 1 ст. Нарушение толерантности к глюкозе. Артериальная гипертензия IIcт, 3cт, р3.
Данных за поражение нервной системы по результатам электронейромиографии не получено, что соответствует коэффициенту менее 4,5, рассчитанному по предложенной формуле.