Содержание провоспалительных цитокинов, экспрессия тканевого фактора лейкоцитами и гемостаз у больных рожистым воспалением

А.Н. Емельянова, B.C. Едемская, Ю.А. Витковский

СОДЕРЖАНИЕ ПРОВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЦИТОКИНОВ, ЭКСПРЕССИЯ ТКАНЕВОГО ФАКТОРА ЛЕЙКОЦИТАМИ И ГЕМОСТАЗ У БОЛЬНЫХ РОЖИСТЫМ ВОСПАЛЕНИЕМ

Читинская государственная медицинская академия, г. Чита

несмотря на значительные достижения медицинской науки и практики, проблема рожистого воспаления не сходит с повестки дня, так как заболеваемость до настоящего времени остается высокой без тенденции к снижению, занимая существенное место в структуре временной утраты трудоспособности, вплоть до инвалидиза-ции, снижая качество жизни; учащается переход острых форм в хронические; изменяется клиническое течение в сторону утяжеления инфекции и развития осложнений [10, 11]. к настоящему времени до конца не изучен патогенез рожистого воспаления, в котором иммунологические и гемостазиологические звенья являются ведущими и определяют характер течения заболевания. известно, что между иммунитетом и гемостазом существуют тесные взаимосвязи, включающие клеточные и гуморальные реакции [3-9, 12]. их более глубокое изучение может пролить свет на механизмы развития рожистого воспаления.

Целью настоящей работы явилось исследование продукции провоспалительных цитокинов, экспрессии тканевого фактора и состояния системы гемостаза у больных с рожистым воспалением.

Материалы и методы

В работе соблюдались этические принципы, предъявляемые Хельсинкской декларацией Всемирной медицинской ассоциации (World Medical Association Declaration of Helsinki, 1964).

Под наблюдением находилось 56 больных с рожистым воспалением (41 женщина и 15 мужчин) в возрасте 45-55 лет. У всех больных диагностировано первичное заболевание средней степени тяжести, эритематозно-бул-лезной формы, с локализацией воспалительного процесса на нижних конечностях. Больные госпитализированы в течение 1-3 сут с начала клинических проявлений болезни. лабораторные исследования проведены на 3 сут с момента проявления симптомов рожистого воспаления. контрольная группа представлена 45 здоровыми лицами обоего пола в возрасте 45-55 лет.

концентрацию цитокинов определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа реактивами ооо «Вектор-Бест» (новосибирск).

исследование экспрессии тканевого фактора моноцитами осуществляли по методу, предложенному R.A. Santucci et al. (2000) [13], в нашей модификации. Забор крови у каждого больного производился в две вакуумные силиконированные пробирки, содержащие 0,5 мл 3,8% раствора цитрата натрия, в количестве 4,5 мл. В одну из пробирок вносили продигиозан в дозе 10 мкг/мл крови, во вторую — физиологический раствор в количестве 10 мкл. Пробирки инкубировали в термостате при температуре 37°С в течение 4 ч. После инкубации кровь пере-

Резюме

Содержание ИЛ-1а, ИЛ-1Р, ФНОа, ИЛ-8, экспрессия тканевого фактора лейкоцитами периферической крови и состояние системы гемостаза изучено у 56 больных с рожистым воспалением (41 женщина и 15 мужчин) в возрасте 45-55 лет. У всех больных диагностировано первичное заболевание эритематозно-буллезной формы с локализацией воспалительного процесса на нижних конечностях. Установлено, что у этих больных на 3 сут от начала заболевания повышается продукция провоспалительных цитокинов ИЛ-1а, ИЛ-1Р, ФНОа и хемокина ИЛ-8. При этом повышается экспрессия тканевого фактора моноцитами периферической крови и развивается выраженная гиперкоагуляция.

Ключевые слова: цитокины, воспаление, лейкоциты.

A.N. Yemelyanova, V.S. Edemskaya, Yu.A. Vitkovsky

CONTENTS OF PRO-INFLAMMATORY CYTOKINES, LEUKOCYTES’ TISSUE FACTOR EXPRESSING AND

HOMEOSTASIS IN PATIENTS WITH ERYSIPELAS

Chita state medical academy, Chita Summary

Contents of IL1a, IL1P, TNFa, IL-8, leukocytes’ tissue factor of peripheral blood and homeostasis were investigated in 56 patients (41 females, 15 males) with erysipelas (age 45-55 years). Erythemic and bull forms of primary disease on the low extremities were diagnosed in all patients. It was revealed that on the 3rd after onset of the disease the production of the pro-inflammatory cytokines IL1a, IL1P, TNFa and chemokine IL-8 elevated. At the same time the expressing of tissue factor by monocyte of peripheral blood increased and hypercoagulability developed.

Key words: cytokines, inflammation, leukocytes.

мешивали и использовали для исследования экспрессии тканевого фактора. для этого цельную цитратную кровь в количестве 0,1 мл вносили в полистироловую кювету, добавляли 0,1 мл забуференного физиологического раствора (рн 7,4) и запускали реакцию с добавлением 0,2 мл 1/40 М раствора хлорида кальция. Время свертывания крови регистрировали импедансным методом с помощью коагулографа.

для оценки экспрессии тканевого фактора моноцитами сравнивали время свертывания образцов крови с добавлением продигиозана и без него. об экспрессии тканевого фактора судили по степени сокращения времени коагуляции, выражаемой в процентах по формуле:

(ТІ-Т2) хЮ0%

Таблица 2

Ti

где Т — время свертывания нестимулированной крови; Т2 — время свертывания стимулированной крови.

Коагуляционный гемостаз мы оценивали по следующим тестам: время свертывания крови (R.J. Lee, P. White, 1913), время рекальцификации плазмы (H.D. Bergerhof, L. Roka, 1954), АЧТВ (M.J. Larrien, С. Weillard, 1957), протромбиновое (A.J. Quick, 1943), тромбиновое время (E. Syrmai, 1957). Концентрацию фибриногена и AT-III определяли коагулометрическим способом. Фибринолиз оценивали по времени лизиса эуглобулинового сгустка и Хагеман-зависимого лизиса. Все методы, применяемые в наших исследованиях, опубликованы в руководствах по исследованию системы гемостаза [1, 2] и поэтому не нуждаются в дополнительном разъяснении.

Полученные данные обработаны методом вариационной статистики с использованием критерия t-Стьюдента, и вычислен показатель достоверности различий. Обработка параметров выполнена с помощью программы Microsoft Excel.

Результаты и обсуждение

Как показали наши исследования, у больных рожистым воспалением резко увеличивается концентрация провоспалительных ИЛ-1а до 172,5±11,3 пкг/мл, ИЛ-1Р до 186,9±15,3 пкг/мл, в то время как у здоровых она составляет 19,3±4,1 пкг/мл и 32,6±9,4 пкг/мл соответственно (р<0,001) (табл. 1). При этом одновременно выявлялся подъем концентрации ФНОа до 296,3±20,7 пкг/мл против 12,3±2,1 пкг/мл в контроле (р<0,001). Одновременно с этим нарастала продукция хемокина Ил-8 с 25,9±4,2 до 423,6±21,6 пкг/мл (р<0,001).

Известно, что между иммунитетом и гемостазом существуют тесные взаимосвязи и цитокины являются сигнальными молекулами, определяющими течение не только иммунных, но и гемостазиологических реакций [3-9, 12]. В связи с этим мы исследовали экспрессию тканевого фактора моноцитами периферической крови, поскольку он является основным триггером гиперкоагуляции и основными его индукторами являются провос-палительные цитокины. С этой целью нами проводилась оценка времени коагуляции рекальцифицированной цельной крови после 4-часовой инкубации в присутствии продигиозана. В качестве контроля служила нестиму-лированная культура крови. По разности времени коагуляции стимулированной и нестимулированной крови мы судили о степени экспрессии тканевого фактора. Как показали наши исследования, у здоровых людей отме-

Время коагуляции неактивированной и активированной продигиозаном крови здоровых и больных рожистым воспалением

Наблюдаемые группы n Время коагуляции крови Сокращение времени коагуляции, %

реактивированной, с активированной ЛПС, с

Здоровые 45 171,б±17,9 94,8±22,3 45,0±2,5

Больные рожистым воспалением 5б 103,б±18,2 р<0,001 92,5±3б,2 р>0,05 10,3±3,1 р<0,001

Примечание. р — достоверность различий времени коагуляции по сравнению со здоровыми.

Таблица 3

Коагулограмма у больных рожистым воспалением

Показатель Здоровые, n=45 Больные, п=5б

Время свертывания крови,с 432±15 33б±18, р<0,05

Время рекальцификации, с 1б5±3,2 105,7±8,1, р<0,001

АЧТВ, с 48,б±1,8 32,б±37, р<0,001

Протромбиновое время, с 12,0±0,5 10,4±0,2, р<0,001

Тромбиновое время, с 20,0±0,4 17,2±0,2, р<0,01

Антитромбин-111, % 100,0±1,2 7б,8±3,9, р<0,001

Фибриноген, г/л 3,1±0,1 б,б±0,3, р<0,001

Фибринолиз эуглобулиновый, мин 143±9,1 198±11, р>0,05

Фибринолиз Хагеман-зависи-мый, мин 1б,5±1,9 42,4±3,1, р<0,001

Примечание. р — достоверность различий по сравнению со здоровыми людьми.

чается выраженная разница между стимулированным продигиозаном и нестимулированными образцами крови — 45,0±2,5% (табл. 2). Однако у пациентов с рожистым воспалением эта разница существенно уменьшилась до 10,3±3,1% (р<0,001), что указывает на высокую экспрессию тканевого фактора.

Повышенная экспрессия тканевого фактора подтвердилась данными коагуологического исследования (табл. 3). В коагулограмме больных рожистым воспалением выявлялось сокращенное время свертывания, время рекальцификации, протромбиновое время, АЧТВ, тромбиновое время. У таких больных снижался уровень антитромби-на-Ш, укорачивался тотальный эуглобулиновый и Ха-геман-зависимый фибринолиз. Полученные результаты свидетельствуют о выраженной гиперкоагуляции у пациентов с рожистым воспалением.

Как можно объяснить полученные результаты? Мы считаем, что инициация этих сдвигов начинается с продукции провоспалительных цитокинов и, в частности, ИЛ-1р. Он образуется многими клетками, такими как моноциты/макрофаги, клетки Лангерганса кожи, фагоцитирующие клетки печени и селезенки, мозговые астроциты и микроглия, эндотелиальные клетки и др. Действие ИЛ-1Р носит системный характер и направлено на иммуно-компетентные клетки, ЦНС, печень, эндотелий и др. [9].

Параллельно с ИЛ-1Р у больных с рожистым воспалением возрастала продукция ФНОа. Одновременно наблюдался подъем концентрации хемокина ИЛ-8, вероятно связанного с тем, что ИЛ-1Р является внутриклеточным индуктором биосинтеза мРНК для ИЛ-8. Все изучаемые противовоспалительные цитокины оказали индуцирующее

Таблица 1

Содержание цитокинов у больных рожистым воспалением, пкг/мл

Цитокины Здоровые, р=45 Больные, р=5б

ИЛ-1а 19,3±4,1 172,5±11,3, р<0,001

ИЛ-1р 32,б±9,4 18б,9±15,3, р<0,001

ИЛ-8 25,9±4,2 423,б±21,б, р<0,001

ФНОа 12,3±2,1 29б,3±20,7, р<0,001

Примечание. р — достоверность различий по сравнению с контролем.

влияние на экспрессию тканевого фактора моноцитами периферической крови, а в сосудистом русле — и эндотелиальными клетками. Тканевой фактор является главным физиологическим инициатором гемокоагуляции. Он представляет собой трансмембранный гликопротеин, который одновременно является поверхностным клеточным рецептором и кофактором плазменного фактора свертывания VII. Активация проферментно-ферментного каскада свертывания крови с участием тканевого фактора приводит к образованию тромбина, активации тромбоцитов, отложению фибрина [14]. Чрезмерная экспрессия тканевого фактора в циркулирующей крови, в основном на поверхности моноцитов, связана с большим риском развития тромбоза при различных заболеваниях, в том числе и роже [14]. Выраженная активация иммунных и гемостазиологических реакций может предрасполагать больных с рожистым воспалением к различным осложнениям.

Выводы

1. У больных с рожистым воспалением повышается продукция провоспалительных цитокинов ИЛ-1а, ИЛ-1Р, ФНОа и хемокина ИЛ-8.

2. При рожистом воспалении увеличивается экспрессия тканевого фактора моноцитами периферической крови и развивается выраженная гиперкоагуляция.

Литература

1. Балуда В.П., Баркаган З.С., Гольдберг Е.Д. и др. Лабораторные методы исследования системы гемостаза. Томск, 1980. 314 с.

2. Баркаган З.С., Момот А.П. Основы диагностики нарушений гемостаза. М.: Негодиамед-АО, 1999. 224 с.

3. Витковский Ю.А. Роль цитокинов в регуляции системы гемостаза: Автореф. дис. ... д-ра мед. наук. Чита, 1997. 40 с.

4. Витковский Ю.А., Кузник Б.И., Солпов А.В. и др. // Иммунология. 1999. №5. С. 20-23.

5. Витковский Ю.А., Кузник Б.И., Еделев Д.А. и др. // Иммунология. 2001. №1. С. 43-45.

6. Витковский Ю.А., Кузник Б.И. // Рос. физиологический журнал им. И.М. Сеченова. 2002. Т. 88, №4. С. 468-475.

7. Витковский Ю.А. // Забайкальский медицинский вестник. 2003. №3. С. 24-26.

8. Витковский Ю.А., Кузник Б.И., Солпов А.В. // Тромбоз, гемостаз и реология. 2006. №1. С. 15-28.

9. Кузник Б.И., Васильев Н.В., Цыбиков Н.Н. Иммуногенез, гемостаз и неспецифическая резистентность организма. М.: Медицина, 1989. 320 с.

10. Ратников Л.И., Жамбурчинова А.Н., Лаврентьева Н.Н. // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2007. №2. С. 16-21.

11. Шляпников С.А., Насер Н.Р., Еремин С.Р. // Вестник хирургии. 2004. Т. 163, №4. С. 71-73.

12. Vitkovsky Yu. // Thrombosis and Haemostasis. №3, Suppl. 2. 1997. P. 111.

13. Santucci R.A., Erlich J., Labriola J. et al. // Thrombosis and Haemostasis. 2000. Vol. 83, №3. P. 445-454.

14. Seghatchian M.J., Samama M.M. Hypercoagulable states: an overview / In: Hypercoagulamle States. Fundamental Aspects, Acquired Disorders, and Congenital Thrombophilia. CRC Press, Inc. Boca Raton-New York-London-Tokyo. 1996. P. 2-17.