Генетические маркеры патогенности условно-патогенных энтеробактерий и их связь с клиническими проявлениями острых кишечных инфекций у детей

А. П. Помогаева и др. Ассоциированная форма иксодового клещевого боррелиоза и клещевого энцефалита у детей

(р < 0,01). Через 7 дней количество эозинофилов увеличивалось, СОЭ оставалась повышенной у детей обеих групп, но больше — в группе больных ИКБ и КЭ, чем ИКБ. Только к концу 3 недели болезни количество эозинофилов у больных обеих групп не отличалось от показателя группы сравнения. СОЭ оставалась увеличенной у больных ИКБ с КЭ на фоне умеренного лейкоцитоза, а у больных ИКБ — нор-моцитоза (р < 0,05).

Титр антител к боррелиозному антигену у больных с микст-инфекцией колебался от отрицательного до 1/1280 (нРИФ), но чаще был умеренный (1/40). В динамике исчезали ранние антитела и увеличивалось количество поздних антител к вирусу КЭ.

Таким образом, сочетанное течение ИКБ и КЭ у детей наблюдается относительно редко (8,6%). Микст-инфекция сопровождается большей выраженностью синдрома интоксикации, менингеальным синдромом, меньшей частотой

развития эритемы, длительной эозинофилией, увеличенной СОЭ по сравнению с моноинфекцией. Ранняя госпитализация, специфическая и этиотропная терапия способствуют быстрой обратной динамике заболевания и клиническому выздоровлению.

Литература:

1. Микст-инфекция клещевого энцефалита и иксодовых клещевых боррелиозов /А.Л. Бондаренко и др. //Инфекционные болезни. — 2011. — №4. — С. 54—63.

2. Полиморфизм клинических проявлений смешанных инфекций при сочетании иксодовых клещевых боррелиозов с клещевым энцефалитом /А.Н. Усков //Мат. 6-го Росс. съезда врачей-инфекционистов. — СПб., 2003. — С. 394—395.

3. Клинико-лабораторные особенности безэритемных форм острого клещевого боррелиоза в Новосибирске / Е.В.Романова и др. // Мат. 6-го Росс. съезда врачей-инфекционистов. — СПб., 2003. — С. 322.

Генетические маркеры патогенности условно-патогенных энтеробактерий и их связь с клиническими проявлениями острых кишечных инфекций у детей

Е. Д. Савилов12, Е. В. Анганова12, A. В. Духанина2, Н. Н. Чемезова2, А. Ю. Зейналова3

ГБОУ ДПО Иркутская государственная медицинская академия последипломного образования1, ГФБУ Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека СО РАМН2, Иркутск ОГБУЗ Иркутская областная инфекционная клиническая больница3

Проведен анализ 175 случаев острых кишечных инфекций, вызванных условно-патогенными представителями Enterobacteriaceae, у детей Иркутской области. Выявлена генотипическая гетерогенность энтеробактерий. В 23,4% случаев клинические штаммы обладали генетическими детерминантами патогенности, ассоциированными с адгезивной активностью, продукцией гемолизинов и синтезом железорегулируемого белка. Установлена связь между наличием генетических детерминант патогенности у выделенных штаммов энтеробактерий и клиническими проявлениями острых кишечных инфекций.

Ключевые слова: острые кишечные инфекции, условно-патогенные Enterobacteriaceae, генетические детерминанты патогенности, клинические аспекты

Genetic Markers of Pathogenicity of Opportunistic Enterobacteria and their Correlation with Clinical Manifestations of Acute Intestine Infections in Children

E. D. Savilov12, E. V. Anganova1,2, A. V. Duhkanina2, N. N. Chemezova2, A. Yu. Zeinalova3

Irkutsk state medical academy of postgraduate education1, Scientific Centre of Family Health Problems and Human Reproduction, Siberian Branch of Russian Academy of Medical Sciences, Irkutsk2, Irkutsk Regional Infectious Diseases Hospital3

175 cases of acute intestinal infections caused by opportunistic Enterobacteria in children of Irkutsk region were analyzed. The genotypic heterogeneity of entero-bacteria was identified. The clinical strains possessed genetic determinants of pathogenicity conditioned by adhesive activity, production of hemolysins and the synthesis of iron regulated protein in 23,4% cases. The connection between the presence of genetic determinants of pathogenicity among isolates of Enterobacteria and clinical manifestations of acute intestinal infections was determined.

Key words: acute intestinal infections, opportunistic Enterobacteriaceae, genetic determinants of pathogenicity, clinical aspects

Контактная информация: Савилов Евгений Дмитриевич — д.м.н., проф., засл. деятель науки РФ, проректор по научной и лечебной работе, зав. кафедрой эпидемиологии и микробиологии ИГМАПО; 664079, Иркутск, м/р Юбилейный, 100; (3952) 33-34-25; savilov47@gmail.com

УДК 616.34-03

Острые кишечные инфекции (ОКИ) занимают одно из ведущих мест в инфекционной патологии детского возраста [1—3]. В настоящее время имеет место рост ОКИ, вызываемых вирусами, а роль бактериальных ин-

фекционных агентов снижается. В то же время группа инфекций бактериальной этиологии продолжает сохранять свое важное значение в формировании клинических проявлений ОКИ [4]. При этом доля острых кишечных инфек-

Таблица 1. Оценка связей между наличием генетических маркеров патогенности условно-патогенных энтеробактерий и клиническими проявлениями ОКИ

Наличие hlyB, hlyA, sfaA, sfaG, fimA, \rp-2 Клинические проявления ОКИ 1 группа 2 группа Критерий Фишера (F) р

о1 о2

Продолжительность лихорадки (дн.) 0,95 1,85 3,80 p < 0,01

Средняя максимальная температура (°С) 0,32 0,65 4,4 p < 0,01

Продолжительность рвоты (дн.) 0,57 0,46 1,50 p > 0,05

Продолжительность диареи (дн.) 1,44 1,85 1,65 p < 0,01

1 группа — больные, у которых выделенные УПЭ не несли генетические детерминанты патогенности; 2 группа — больные, у которых этиологические агенты обладали генетическими маркерами патогенности

ций, вызванных условно-патогенными энтеробактериями (УПЭ), в общей структуре ОКИ установленной этиологии, по данным разных авторов, варьирует от 12,8—21,2% до 34,1% [5, 6].

Вопрос об этиологической значимости условно-патогенных энтеробактерий при ОКИ остается спорным [7]. Диагностика острых кишечных инфекций, вызванных УПЭ, основывается на клинико-лабораторных данных, включающих идентификацию микроорганизма и массивность его выделения. В то же время современный уровень изучения биологических свойств микроорганизмов показывает, что факт выделения УПЭ, как и их количественная оценка не всегда определяют способность изолята вызывать заболевание, которое в большей степени связано с реализацией патогенного потенциала возбудителя [8]. Исследования последних лет показывают эффективность определения пато-генности у бактерий данной группы на молекулярно-генети-ческом уровне. Важным является и выявление связей между генотипическими характеристиками культур и клиническими проявлениями ОКИ [6].

Вышеизложенное определило цель настоящего исследования — выявить нуклеотидные последовательности генов, контролирующих синтезфакторов патогенности, у штаммов условно-патогенных энтеробактерий, выделенных от детей с ОКИ, и их связь с течением инфекционного процесса.

Материалы и методы исследования

Анализ клиники острых кишечных инфекций, сопровождающихся выделением условно-патогенных энтеробактерий, проводили с использованием ст.уч.ф. № 0003/у (медицинская карта стационарного больного) у детей, поступавших на лечение в Иркутскую областную клиническую инфекционную больницу, за период 2006—2010 гг. Идентификацию выделенных микроорганизмов проводили согласно общепринятым методикам [9, 10]. Постановка диагноза (острый энтерит, гастроэнтерит, энтероколит, гастро-энтероколит) врачом-инфекционистом проводилась на основе клинико-лабораторных данных (таксономическая характеристика, массивность выделения микроорганизма, его выделение в первые дни заболевания до начала этиот-ропного лечения, клиническое течение инфекции).

Выборочно у 175 больных проведено изучение изолированных условно-патогенных энтеробактерий на наличие генетических маркеров патогенности. В работе использо-

вали праймеры к ряду генов, обнаруженных в составе «островков» патогенности E. coli, контролирующих адгезию S типа (sfaA, sfaG) и 1 типа (fim A); продукцию гемолизинов (hly A, hly В) и синтез железорегулируемого белка (irp-2) [8]. Выделение ДНК из бактериальных суспензий (107 КОЕ/мл) суточной агаровой культуры проводили методом прогревания на водяной бане в течение 30 мин. при температуре 100°С. Для амплификации использовали стандартный набор «АмплиСент-1» (пр-во ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора). Подбор температуры отжига осуществляли экспериментальным путем, а также используя данные литературы [11, 12]. Праймеры синтезированы в НПФ «Литех» (г. Москва).

Анализ продуктов ПЦР проводили гель-электрофорезом в агарозе. Результаты фиксировали с применением видеосистемы гель-документирования. Амплифицированный фрагмент идентифицировали по размеру, используя для сравнения маркер молекулярного веса ДНК Gene Ruler 100 Ьр DNA Ladder Plus. Результаты документировали с использованием видеосистемы гель-документирования и программы «Gel Imager».

Сравнение выборок, различающихся по степени варьирования (о), проводили с использованием факторного дисперсионного анализа [13].

Результаты и их обсуждение

Проведенный анализ показал, что основная часть заболевших ОКИ установленной этиологии, вызванная условно-патогенными энтеробактериями, приходится на детей в возрастной группе до 3-х лет (около 80%) с доминированием среднетяжелых форм заболевания (88,8 ± ± 0,3%). Значимо чаще (p < 0,01) указанная группа ОКИ протекала по типу острого гастроэнтерита и энтероколита (более 70% от всех острых кишечных инфекций).

Условно-патогенные энтеробактерии, выделенные от больных ОКИ и подлежащие исследованию на наличие маркеров патогенности (п = 175), были представлены следующими штаммами: Proteus spp. — 64, Klebsiella spp. — 50, Citrobacter spp. — 22, Enterobacter spp. — 11, Morganella morganii — 10, Kluyvera ascarbata — 6, Serratia odorífera — 5, Providencia rettgeri — 4, Pantoea agglomerans — 3. Проведенные исследования показали, что у 41 изолята (23,4 ± 3,2%) выявлены нуклеотидные последовательности генов, кодирующих фимбриальные факторы адгезии, продукцию гемолизинов и синтез железорегулируемого белка.

При этом среди условно-патогенных энтеробактерий, обладающих генетическими детерминантами патогенности, наибольшую долю составили Klebsiella spp. и Citrobacter spp.: 39,0 и 24,4% соответственно (рис. 1).

Установлено, что из изученных маркеров патогенности чаще встречались гемолитические детерминанты (hlyA и (или) hlyB — 13,4 ± 2,6%), вызывающие цитопатические изменения и являющиеся одним из важнейших факторов вирулентности энтеробактерий, и генетические детерминанты адгезивной активности энтеробактерий S типа и (или) 1 типа — 11,7 ± 2,4%. Частота выявления нуклеотидных по следовательностей этих генов оказалась значимо более высокой (p < 0,01) по сравнению со встречаемостью других исследуемых генов. Так, в пуле исследуемых культур искомые ампликоны при использовании праймеров к hlyA и hlyB определены у 17 штаммов (9,7 ± 2,2%), sfaА —13 (7,4 ± ± 1,9%); sfaG — 8 (4,6 ± 1,5%), fim A — 4 (2,3 ± 1,1%), irp — 2 (1,2 ± 0,3%).

После детекции у микроорганизмов генетических маркеров патогенности, все больные острыми кишечными инфекциями были условно разделены на две группы. В первую группу вошли больные, у которых выделенные условно-патогенные энтеробактерии не несли генетических детерминант патогенности (п = 1 34). Во вторую группу вошли больные, у которых этиологические агенты обладали генетическими маркерами патогенности (п = 41).

У больных обеих групп проведено сравнение некоторых аспектов клинического течения ОКИ. Так, у детей первой группы средняя продолжительность лихорадки составила 3,1 ± 0,08 дня, а больных второй группы — увеличилась до 4,7 ± 0,2 дней (p < 0,01). Средняя максимальная температура у больных первой группы оказалась на уровне 37,6 ± ±0,03°С, второй группы — 38,2 ± 0,1°С (p < 0,01). Выявлены различия и в продолжительности диареи у больных двух групп: 3,4 ± 0,2 и 4,5 ± 0,2 дней соответственно (p < <0,01). Продолжительность рвоты у больных первой группы составила 2,0 ± 0,07; второй группы — 1,9 ± 0,05 (p > 0,05). Сравнение указанных показателей, различающихся степенью варьирования, с использованием факторного дисперсионного анализа показало наличие значимых связей между наличием генетических маркеров патоген-ности у возбудителей ОКИ и клиническими проявлениями острых кишечных инфекций. И только по такому показателю, как продолжительность рвоты, не было выявлено значимых различий между сравниваемыми группами (табл. 1).

Заключение

Проведенные исследования показывают, что клинические штаммы условно-патогенных энтеробактерий, изолированные от больных острыми кишечными инфекциями, обладают генотипической гетерогенностью и в 23,4 ± ± 3,2% случаях несут генетические маркеры патогенности, ассоциированные с продукцией гемолизинов, адгезивной активностью и синтезом железорегулируемого белка. Выявлена значимая связь между наличием генетических детерминант патогенности у выделенных от больных детей штаммов энтеробактерий и клиническими проявлениями вызываемых ими инфекций (продолжительность и уровень лихорадки, длительность диареи). Полученные данные свидетельствуют о целесообразности определения генетиче-

Klebsiella spp.

Citrobacter spp.

Enterobacter spp.

Proteus spp.

24,4

Morganella spp.

Kluyvera spp.

Pantea spp.

Serratia spp.

Рисунок 1. Спектр штаммов условно-патогенных энтеробактерий, у которых выявлены генетические маркеры патогенности

ских маркеров патогенности УПЭ для выявления их этиологической значимости и прогноза клинического течения заболевания.

Литература:

1. Воротынцева Н.В. Острые кишечные инфекции у детей / Н.В. Во-ротынцева, Л.Н. Мазанкова. — М.: Медицина, 2001. — 480 с.

2. Генетические маркеры патогенности условно-патогенных энтеробактерий, выделенных у детей и подростков при острых кишечных инфекциях / Н.Ю. Жеребцова, А.Х. Маймиев, Д.А. Ва-лишин, А.Р. Мавзютов // ЖМЭИ. — 2007. — № 2. — С. 3—8.

3. Денисюк Н.Б. Инфекционные болезни у детей: актуальные проблемы // Актуальные вопросы эпидемиологии на современном этапе: Мат. Всеросс. НПК, посв. 80-летию кафедры эпидемиологии и доказательной медицины, 13 — 14 октября 2011 г. — Москва. — С. 141—143.

4. Краснов В.В. Острые кишечные инфекции у детей. Современные представления / Ремедиум Приволжье. — 2011. — № 5/ http://www.remedium.ru

5. Зуева Л.П. Эпидемиология : учебник / Л.П. Зуева, Р.Х. Яфаев. — СПб.: ООО «Издательство ФОЛИАНТ», 2005. — 752 с.

6. Жеребцова Н.Ю. Клинико-лабораторные особенности острых кишечных инфекций, вызванных условно-патогенными энтеро-бактериями у детей и подростков: Автореф. дисс. ... к.м.н. — Академия им. И. М. Сеченова, Москва, 2006. — 24 с.

7. Егорова С.А. Патогенный потенциал микроорганизмов рода Klebsiella, как возбудителей острых кишечных инфекций / С. А. Егорова, Л. А. Кафтырева, М.А. Макарова // Вестник Военно-мед. академии. — Приложение 2 (22). — 2008. — С. 535—536.

8. Бондаренко В.М. Генетические маркеры вирулентности условно патогенных бактерий / Ж. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. — 2011. — № 3. — С. 94—99.

9. Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений. Приказ МЗ СССР от 22.04.85 № 535.

10. Марри П.Р. Клиническая микробиология. Краткое руководство / П.Р. Марри, И.Р. Шей. — Пер. с анг. — М.: Мир, 2006. — 425 с.

1 1. Мавзютов А.Р. «Острова» патогенности условно-патогенных энтеробактерий / А.Р. Мавзютов, С.В. Фиалкина, В.М. Бондаренко // Ж. микробиол. — 2002. — № 6. — С. 5—9.

12. Генетические детерминанты патогенности E.coli, изолированные из мочи и фекалий детей с различными клиническими вариантами инфекции мочевой системы / В.М. Бондаренко и др. // Ж. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. — 2004. — № 4. — С. 3—7.

13. Применение статистических методов в эпидемиологическом анализе / Е.Д. Савилов, Л.М. Мамонтова, В.А. Астафьев, С.Н. Жданова. — М.: МЕДпресс-информ. — 2004. — 112 с.