Возбудители остеомиелита длинных костей и их Резистентность

Возбудители остеомиелита длинных костей и их резистентность

Р.П. Терехова1, В.А. Митиш1' 2, Ю.С. Пасхалова1'2, Г.Е. Складан1, С.А. Прудникова1, JI.A. Блатун1

]ФТБУ«Институт хирургии им. A.B. Вишневского» Минздрава России; Россия, 117997, Москва, ул. Большая Серпуховская, 27; 2ФГАОУВО «Российский университет дружбы народов» Минобрнауки России; Россия, 117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 6

Контакты: Раиса Петровна Терехова Terekhova@ixv.ru

Цель исследования — изучить динамику изменений в структуре возбудителей остеомиелита длинных костей и их чувствительности к антимикробным препаратам в зависимости от стратегии хирургического лечения.

Материалы и методы. Изучены 1083 образца клинического материала от 384 больных, находившихся на лечении в отделе ран и раневых инфекций Института хирургии им. A.B. Вишневского в 2013—2015 гг. с различными формами остеомиелита длинных костей. Группу сравнения составили результаты микробиологических исследований 115 аналогичных больных, находившихся на лечении по поводу остеомиелита в том же отделе в 2010 г.

Результаты. Основными возбудителями остеомиелита длинных костей как в основной группе, так и в группе сравнения являются представители грамположительной кокковой флоры — S. aureus, S. epidermidis и в меньшей степени Е. faecalis. Среди грамотри-цательных бактерий лидирующее положение сохраняется у P. aeruginosa. Однако в основной группе больных отмечается значимое снижение резистентности ведущих патогенов, резкое уменьшение обнаружения госпитальной флоры как ре- и суперинфекции. Клинически это выражается тем, что разработанная в отделе ран и раневых инфекций стратегия хирургического лечения остеомиелита длинных костей различных этиологии и локализации позволяет улучшить результаты лечения больных за счет уменьшения сроков пребывания их в стационаре и возможности избежать инфицирования ран госпитальными штаммами микроорганизмов.

Ключевые слова: остеомиелит, хирургическое лечение, инфекция, микрофлора, микробиологические исследования, монокультуры, ассоциации, полирезистентные штаммы, структура возбудителей

Для цитирования: Терехова Р.П., Митиш В. А., Пасхалова Ю.С. и др. Возбудители остеомиелита длинных костей и их резистентность. Раны и раневые инфекции. Журнал им. проф. Б.М. Костючёнка 2016;3(2):24—30.

DOI: 10.17650/2408-9613-2016-3-2-24-30

Osteomyelitis agents of the long bones and their resistance

R.P. Terekhova1, V.A. Mitish1'2, Yu.S. Paskhalova1'2, G.E. Skladan1, S.A. Prudnikova1, L.A. Blatun1

}A. V. Vishnevsky Institute ofSurgeiy, Ministiy of Health of Russia; 27 Bol'shaya Serpukhovskaya St., Moscow, 117997, Russia; 2Russian Peoples Friendship University, Ministiy of Education and Science of Russia; 6Miklukho-Maklaya St., Moscow, 117198, Russia

Objective: to study the dynamics of changes in the structure of osteomyelitis agents of the long bones and their sensitivity to germicide depending on the surgical treatment strategy.

= Materials and methods. There were studied 1083patterns of clinical materialfrom 384patients with different forms of the osteomyelitis of the long bones that were treated in a period from 2013 to 2015 in the Department of Wound and Wound Infections of A. V. Vishnevsky Institute £ of Surgeiy. The comparison group consisted of microbiological studies results of 115 similar patients who were on treatment for osteomyelitis w in the same Department in 2010.

£ Results. The main osteomyelitis agents of the long bones both in the main and in the comparison group are representatives of the gram-positive " coccal flora — S. aureus, S. epidermidis and in a less degree E. faecalis. Among gram-negative bacterium P. aeruginosa keeps the leading position. However, in the main group of patients it is noticed a significant reduction of leading pathogens resistance, and a detection of hospital — re- and superinfection flora breakdown. Clinically, it is expressed by the fact that there were developed a surgical strategy of osteomyelitis = of the long bones treatment of different etiology and localization in the Department of Wound and Wound Infections, which allow improv-j ing the results of treatment for such patients by reducing their length of stay in hospital and the possibility to avoid the infection of wounds ^ by hospital strains of microorganisms.

co

= Key words: osteomyelitis, surgeiy treatment, infection, microflora, microbiology studies, pure culture, associations, multiresistant strains,

3 pathogen agent structure

^ For citation: Terekhova R.P., Mitish V.A., Paskhalova Yu.S. et al. Osteomyelitis agents of the long bones and their resistance. Wounds and

a Wound Infections. The Prof. B.M. Kostyuchenok Journal 2016;3(2):24—30.

Введение

Сведения о гнойно-деструктивном заболевании костной системы имеются еще в работах медиков глубокой древности и средневековья (Гиппократа, Ибн-Сины, А. Цельса, Ж. Пти, К. Галена), которые связывали происхождение этого патологического процесса с повреждением кости. В XIX веке появились указания на инфекционную природу данного заболевания, удалось выяснить решающую роль микробов в этиологии остеомиелита и пролить свет на патогенез гематогенного остеомиелита. Основательно остеомиелит был изучен в XX веке, совершенствование рентгенологических методов исследования позволило получить точные данные об объеме и характере патологических изменений в костях.

В настоящее время остеомиелит по частоте и тяжести, количеству осложнений и рецидивов остается наиболее распространенным и тяжелым заболеванием опорно-двигательного аппарата. Частота развития остеомиелита длинных костей варьирует в широких пределах и достигает при открытых переломах 2—50 %, при огнестрельных — 9—12 %, после хирургического лечения закрытых переломов — 0,2—12,0 %, при эндо-протезировании крупных суставов — 0,5—1,4 % [1—3]. В России острый гематогенный остеомиелит остается распространенным заболеванием (3—11 % среди хирургических болезней детского возраста) с высоким уровнем исходов в хроническую форму — 4—20 % [4, 5].

Остеомиелит — заболевание всегда инфекционной этиологии. В зависимости от источника микробного загрязнения выделяют понятия экзогенной и эндогенной инфекции. Эндогенная инфекция всегда возникает при снижении антиинфекционной резистентности организма и осуществляется путем транслокации возбудителя из очагов носительства самого больного. Механизм диссеминации реализуется в 3 этапа:

1) выведение микроорганизмов за пределы их экологической ниши с последующим заносом в регионарные лимфатические узлы, кровеносные и лимфатические сосуды;

2) пребывание патогенов в кровеносной и лимфатической системах на фоне сниженной неспецифической резистентности клеточного и гуморального иммунитета;

3) фиксация возбудителя в костной ткани [6].

Таким образом, благодаря механизму гематогенной и лимфогенной диссеминации микроорганизмы из естественных биотопов потенциальных возбудителей инфекции могут в ранние сроки (1—3 сут) колонизировать ткани потенциального очага и при наличии благоприятных условий вызвать инфекционный процесс [7]. Это так называемый классический путь развития гематогенного остеомиелита.

Экзогенная инфекция возникает при заносе возбудителей извне, в том числе и от медицинского

персонала. Основные механизмы передачи таких инфекций — контактный и аэрогенный. Так возникают раневые (травматический, огнестрельный, послеоперационный) остеомиелиты. Хронические процессы поддерживаются наличием адаптированной микрофлоры, располагающейся внутри остеоцитов.

Помимо путей проникновения инфекции, важную роль играет ее возбудитель, поэтому определение этиологического фактора воспалительного процесса — основная задача экспресс-диагностики и полного микробиологического исследования.

Возбудителями неспецифического остеомиелита могут быть любые условно-патогенные микроорганизмы, но наиболее часто это стафилококки, реже стрептококки. При свищевой форме часто выделяются грамотрицательные бактерии, в редких случаях остеомиелит имеет грибковую этиологию. Со временем микрофлора одного и того же больного может меняться, к первоначальной инфекции может присоединиться вторичная и госпитальная флора, поэтому микробиологические исследования следует проводить в динамике каждые 7—10 дней.

Лаборатория профилактики и лечения бактериальных инфекций отдела ран и раневых инфекций Института хирургии им. А.В. Вишневского на протяжении более 40 лет занимается мониторингом и анализом микробного спектра при остеомиелите длинных костей. Поэтому нам представляется актуальным представить основные изменения, происходящие в данной области в последние годы, с обсуждением возможных причин, способствовавших этому.

Материалы и методы

Изучены 1083 образца клинического материала (раневое отделяемое, биоптаты костной и мягких тканей, отделяемое свищей, дренажей, катетеры, кровь и т. д.) от 384 больных, находившихся на лечении в отделе ран и раневых инфекций Института хирургии им. А.В. Вишневского в 2013—2015 гг. с различными формами остеомиелита длинных костей. Группу сравнения составили результаты микробиологических исследований аналогичных больных, находившихся на лечении по поводу остеомиелита в том же отделе в 2010 г. Группы больных сопоставимы по полу, возрасту, локализации и форме основного заболевания (табл. 1).

Исследование различных образцов клинического материала проводили стандартными методами микробиологической диагностики [7]. Идентификацию выделенных микроорганизмов осуществляли как рутинным способом, так и с помощью полуавтоматического и автоматического анализаторов. Чувствительность микрофлоры определяли также несколькими методами: диско-диффузионным, тест-полосками (Е-тест) и на автоматическом бактериологическом анализаторе Vitek 2 compact (Biomerieux, Франция).

Е

та

Е

и

Таблица 1. Общая характеристика больных Table 1. General characteristic of patients

Показатель Основная группа Группа сравнения

Primary group Reference group

Средний возраст, лет Average age, years 35,7 + 4,3 34,5 + 5,5

Пол, п

Голень Low leg 210

Бедро Thigh 114

Предплечье Forearm 39

Плечо Shoulder 21

Свищевая форма Fistulous form 306

Послеоперационная гнойная рана Postoperative purulent wound 78

Протокол обследования больных обеих групп включал общеклинические методы (общий и биохимический анализы крови, коагулограмма, общий анализ мочи), специальные методы (качественное и количественное микробиологическое исследование при поступлении в стационар, во время хирургической обработки гнойного очага и в динамике с интервалом 7—10 сут), лучевые методы (рентгенография в прямой и боковой проекциях, фистулогра-_а фия, компьютерная томография с контрастирова-Е нием и 3Б-реконструкцией пораженного сегмента), я ультразвуковые методы (ультразвуковое дуплексное Е сканирование артерий и вен пораженного сегмента, " ультразвуковое исследование мягких тканей пора-щ женной области). Хирургическое лечение больных 3 строили на принципах метода активного хирургиче-= ского лечения гнойных ран, разработанного в отделе ран и раневых инфекций Института хирургии им. я А. В. Вишневского: радикальная хирургическая обра-к ботка гнойного очага с резекцией пораженного участ-= ка скелета на необходимую длину и ширину (краевая, концевая, сегментарная резекция кости/костей/сус-в. тава), иммобилизация сегмента в аппарате внешней в фиксации при необходимости, местное лечение ран,

ранние реконструктивные кожно- и костно-пластические операции. Особенностями лечения больных основной группы являлись: обязательное наличие амбулаторного этапа лечения между хирургической обработкой и реконструктивными операциями; отказ от эмпирической антибактериальной терапии и назначение системных препаратов только при получении ответа о количестве и чувствительности возбудителя; включение в протокол местного лечения современных антисептиков (Мирамистин, Лавасепт, Йодопирон) и новых мазей на полиэтиленгликолевой основе (Офломелид, Стелланин-ПЭГ); исключение из местного лечения перекиси водорода, раствора хлоргексидина биглюконата, спиртосодержащих антисептиков и анилиновых красителей.

Результаты

Основными возбудителями остеомиелита являются стафилококки — S. aureus, S. epidermidis, реже Е. faecalis. Поддерживает группу лидеров P. aeruginosa, хотя выделение ее в процентном отношении значительно ниже, чем стафилококков (табл. 2). Изменения, происходящие в структуре возбудителей остеомиелита, касаются в основном грамотрицатель-ной флоры и анаэробных микроорганизмов. Если в 2010 г. среди ведущих возбудителей присутствовали неклостридиальные анаэробные микробы, то в последующие годы их выделение значительно сократилось, и в основной группе их нет. С энтеробактериями все происходит наоборот: в 2010 г. мы наблюдали их выделение на уровне 2,9 % — К. pneumoniae, 2,8 % — Е. coli, а в 2013 г. — уже 5,0 % и более. Выделение микрофлоры при остеомиелите происходит чаще в монокультуре (от 70 до 75 %), выделенные микробные ассоциации в разные годы отличаются по составу и количеству ассоциантов, в основном это 2- и 3-компонентные ассоциации, немногочисленные 4-компонентные, которых в 2015 г. выделено не было. В 2 раза снизилось выделение грибов, но если коснуться их видового состава, то надо отметить, что он стал более разнообразным: мы наблюдаем выделение не только С. albicans, но также С. krusei и С. parapsilosis.

Количество полирезистентных штаммов к 2014 г. нарастает, также как и их видовой состав (табл. 3). В 2015 г. количество мультирезистентной флоры резко сокращается и выявляются только стафилококки и ацинетобак-тер. Среди стафилококков также происходит уменьшение количества резистентных штаммов (табл. 4).

Поскольку антибактериальная терапия является одним из основных методов лечения остеомиелита, выбор антибактериального препарата становится очень важным моментом, и назначаться он должен на основе данных о чувствительности микроорганизма [1]. В нашем наблюдении не было ванкомицин-резис-тентных стафилококков и штаммов с промежуточной

Таблица 2. Изменения в структуре ведущих возбудителей инфекции

2010 г. 2013 г. 2014 г. 2015 г.

S. epidermidis — 21 S. aureus — 21 S. aureus — 32 S. epidermidis — 29

S. aureus — 19 S. epidermidis — 20 S. epidermidis — 18 S. aureus — 21

P. aeruginosa — 11 P. aeruginosa — 10 P. aeruginosa — 9 P. aeruginosa — 8

В. fragilis — 9 E. faecalis — 1 K. pneumoniae — 1 E. faecalis — 6

P. melaninogenica — 6 A. baumannii — 5 E. faecalis — 6 K. pneumoniae — 6

E. faecalis — 5 K. pneumoniae — 5 A. baumannii — 4 A. baumannii — 4

Candida spp. — 4 Candida spp. — 1,2 Candida spp. — 2 Candida spp. — 2

Таблица 3. Полирезистентные штаммы

2010r.

19

Таблица 4. Метициллин-резистентные штаммы

Микроорганизм 2010 r. 2013 r. 2014r. 2015r.

Метициллин-резистентный S. aureus Methicillin-resistant S. aureus 51 {n = 211) 47

Метициллин-резистентный S. epidermidis Methicillin-resistant S. aureus 64

Таблица 5. Резистентность грамположительной флоры

Microorganism

E.faecalis

2010 r. 2013 r. 2014 r. 2015 r.

Va Amc Cip Va Amc Cip Va Amc Cip Va Amc Cip

22

33

72

92

Примечание. Va — ванкомицин; Amc — амоксициллин/клаву.лановая кислота; Cip — ципрофлоксацин. Note. Va — vancomycin; Amc — amoxicillin/clavulanic acid; Cip — ciprofloxacin.

S. aureus 0 63 33 0 50 48 0 46 63 0 38 50

S. epidermidis 0 68 36 0 67 59 0 58 46 0 46 50

100

чувствительностью, мы даже констатируем уменьшение резистентности к амоксиклаву, но отмечаем ее рост к ципрофлоксацину, особенно у Е./аесаШ (табл. 5).

Присутствие в ране таких микроорганизмов, как не-ферментирующие грамотрицательные бактерии, всегда

создает дополнительные проблемы, связанные с их высокой устойчивостью к антибактериальным препаратам.

Синегнойная палочка является типичным условно-патогенным микроорганизмом, она встречается на коже у 3—5 % здоровых людей, и в то же время

Таблица 6. Резистентность P. aeruginosa

Название препарата 2010 г. 2013 г. 2014 г. 2015 г.

Имипенем Imipenem 42 44 55 22

Меропенем Meropenem 41 48 57 20

Амикацин Amikacin 37 28 37 0

Нетилмицин Netilmicin 16 24 37 0

Цефепим Cefepini 27 37 35 И

Цефтазидим Ceftazidime 35 41 37 0

Цефоперазон/ сульбактам Cefoperazon/sulbactam 30 35 45 22

Ципрофлоксацин Ciprofloxacin 43 76 76 56

Полимиксин Е (колистин) Polymyxin Е (Colistin) 0 0 0 0

Пиперациллин/тазобактам Piperacillin/tazobactam - 16 25 0

Таблица 7. Резистентность A. baumannii

Название препарата 2010 г.

Имипенем Imipenem 60 100 89 75

Меропенем Meropenem 55 100 89 100

Амикацин Amikacin 70 100 77 100

Нетилмицин Netilmicin 50 100 66 100

Цефепим Cefepini 70 75 100 100

Цефтазидим Ceftazidime 89 100 100 100

Цефоперазон/ сульбактам Cefoperazon/sulbaktam 20 50 55 98

Ципрофлоксацин Ciprofloxacin 80 100 100 100

Полимиксин Е (колистин) Polymyxin Е (Colistin) 0 0 0 0

Тигециклин Tigecyclin - 0 0 0

25

CN

Таблица 8. Резистентность К. pneumoniae

Название препарата 2010 г.

Имипенем Imipenem 0 0 33 12

Меропенем Meropenem 0 0 33 12

Амикацин Amikacin 25 18 18 16

Нетилмицин Netilmicin 25 27 35 33

Цефепим Cefepini 66 54 94 80

Цефтазидим Ceftazidime 75 81 94 67

Цефоперазон/сульбактам Cefoperazon/sulbactam 20 36 50 50

Ципрофлоксацин Ciprofloxacin 75 66 93 67

Полимиксин Е (колистин) Polymyxin Е (Colistin) - - 0 0

Тигециклин Tigecyclin - - 0 0

госпитальные штаммы синегнойной палочки представляют большую опасность. Р. аегщтот — 4-й по частоте выделения возбудитель, который отвечает за возникновение 10 % госпитальных инфекций, при этом доля штаммов, устойчивых к фторхинолонам и карбапене-мам, постоянно увеличивается. В нашем исследовании наблюдается очень умеренное нарастание устойчивости к препаратам в 2013 и 2014 гг. и ее снижение в 2015 г. Отсутствие устойчивости к аминогликозидам, возможно, объясняется редким применением этих антибиотиков у больных с остеомиелитом, к фторхинолонам устойчивость выше, чем к другим группам, на уровне 20 % она сохраняется и к карбапенемам (табл. 6).

А. Ьаитаппп описан как возбудитель тяжелых инфекционных состояний, таких как сепсис, пневмония, раневая инфекция; летальность пациентов доходит до 52 %. Колонизация А. Ьаитаппп на коже у здоровых людей является первичным фактором риска возникновения раневых инфекций. Частота госпитальной раневой инфекции составляет не более 2 %. Наибольшее внимание А. Ьаитаппп привлекает из-за распространения резистентности к карбапенемам. Механизм резистентности связан, прежде всего, с наличием карбапенемаз класса В (металлобеталактамаз) [8,9]. Такую мультире-зистентность мы и наблюдаем в нашем исследовании, только к 2 препаратам нет устойчивых штаммов (табл. 7).

Становятся проблемными и некоторые представители семейства ЕМегоЬа^епасеае из-за увеличения

продукции бета-лактамаз расширенного спектра и карбапенемаз. Особенно выделяется своей устойчивостью К. pneumoniae (табл. 8). Резистентность клеб-сиелл нарастала до 2014 г. быстрее, чем у Е. coli и P. mirabilis., среди них росло количество устойчивых форм к имипенему и меропенему. Но к 2015 г. мы наблюдаем небольшое снижение уровня резистентности.

Клинически выявленные изменения выражались в снижении количества повторных хирургических обработок, а следовательно, уменьшении длины дефекта длинной кости, что в конечном счете проявлялось в уменьшении длительности лечения больных (в среднем на 2,5 мес) и улучшении функциональных и косметических результатов (табл. 9). j

Е

Заключение «

Все описанные изменения, происходящие в струк- Е туре возбудителей и их резистентности к антибак- " териальным препаратам, связаны с изменениями ш в стратегии хирургического лечения данной груп- з пы пациентов. Эта стратегия позволяет избежать = реинфицирования больных госпитальной флорой, что дает возможность выполнять реконструктивные я операции в более ранние сроки и снижает число s койко-дней, проведенных в стационаре, кроме то- = го, уменьшаются количество выделенной грамотри-цательной микрофлоры и уровень резистентности а микроорганизмов. в

Таблица 9. Клинические результаты Table 9. Clinical results

Показатель Основная группа Группа сравнения

Reference group

inaex

Хирургическая обработка гнойного очага Surgical treatment of a suppurative focus 384

Повторная хирургическая обработка гнойного очага Repeated surgical treatment of a suppurative focus 1,2 + 0,8 3,5 + 0,5

Краевая резекция Regional resection 97

Концевая резекция 2—4 см Lrailer resection of 2—4 cm 83

Сегментарная резекция 4—10 см Segmentary resection of 4—10 cm 98

Сегментарная резекция 10—15 см Segmentary resection of 10—15 cm 85

Сегментарная резекция 15—20 см Segmentary resection of 15—20 cm 14

Сегментарная резекция более 20 см Segmentary resection more than 20 cm 7

Кожно- и костно-пластические операции Dermo- and bone-plastic surgeries 381

Срок лечения, мес Lerm of treatment, months 4,5 + 2,4 6,9 + 3,1

Ампутация на уровне 1/3 голени Below-knee amputation 2

Летальные исходы Lethal outcomes 1

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.

ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES

1. Зубков М.Н. Антибиотикопрофилактика и антибиотикотерапия гнойных осложнений в травматологии и ортопедии. Русский медицинский журнал 1999; 1 (7): 15—9. [Zubkov M.N. Antibiotic prophylaxis and antibiotic treatment of purulent complications

in traumatology and orthopedics. Russkiy meditsinskiy zhurnal = Russian Medical Journal 1999;l(7):15-9. (In Buss.)].

2. Шаповалов В.П., Овдеенко А.Г. Хирургическая инфекция при боевых повреждениях опорно-двигательного аппарата. Вестник хирургии им. И.И. Грекова 2004;1(2):60-8.

[Shapovalov V.P., Ovdeenko A.G. Surgical infection of the musculoskeletal system combat injuries. Vestnik khirurgii im. I.I. Grekova = I.I. Grekov Bulletin of Surgery 2004;l(2):60-8. (In Buss.)].

3. BowenT.R., Widmaier J.C. Host classification predicts infection after open fracture. Clin Orthop Relat Res 2005;(433):205-ll. PMID: 15805959.

4. Абаев Ю.К, Адарченко A.A., Зафранская M.M. Гнойная хирургия детского возраста: меняющиеся перспективы. Детская хирургия 2004;(6):4—7.

[Abaev Yu.K.,AdarchenkoAA., Zafranskaya M.M. Purulent surgety of children's age: the changing prospects. Detskaya khitwgiya = Pediatric Surgety 2004;(6):4- 7. (In Buss.)].

5. Барская M.A., Кузьмин А.И., Куксов В.Ф. Хирургическая тактика при хроническом гематогенном остеомиелите у детей. Детская хирургия 2000;(4):31—2. [Barskaya М.А., Kuz'min A.I., Kuksov V.F. Surgical tactics in childhood chronic hematogenous osteomyelitis. Detskaya khitwgiya = Pediatric Surgety 2000;(4):31—2. (In Buss.)].

6. Ерюхин И.А., Гельфанд Б.P., Шляпников C.A. Хирургические инфекции. Руководство. СПб.: Питер, 2003. С. 248-9. [Etyukhin I.A., Gel'fandВ.В., Shlyapnikov S.A. Surgical infections. Guide. Saint Petersburg: Piter, 2003. Pp. 248-9. (In Buss.)].

7. Бактериологическая диагностика раневой инфекции. Методические рекомендации. Под ред. М.И. Кузина. М., 1984.

[Bacteriological diagnostics of a woundfever. Methodical references. Ed. by M.I. Kuzin. Moscow, 1984. (In Buss)].

8. Moultrie D., Hawker J., Cole S. Factors associated with multidrag-resistant Acinetobacter transmission: an integrative review of the literature. AORN J

2011;94(1):27—36.

DOI: 10.1016/j.aorn.2010.12.026.

PMID: 21722769.

9. Sheng W.H., liao C-.H., Lauderdale T.L. et al. A multicenter study of risk factors and outcome of hospitalized patients with infections due to carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii. Int J Infect Dis 2010;14(9):e7649.

DOI: 10.1016/j.ijid.2010.02.2254. PMID: 20646946.