СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ПАПИЛЛОМАВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ, РЕАЛИЗУЕМЫЙ ЧЕРЕЗ ИНДУКЦИЮ ИНТЕРЛЕЙКИНА-18
METHOD OF TREATING PAPILLOMA VIRAL INFECTIONS IMPLEMENTED THROUGH INTERLEUKIN-18 INDUCTION

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в дерматологии, венерологии, онкологии и других областях, связанных со стимуляцией иммунитета путем индукции интерлейкина-18. Изобретение относится к способам иммунокоррегирующей терапии.
Известна (Черныш С.И., Ким Су Ин, Беккер Г.П., Махалдиани Н., Хоффманн Ж., Бюле Ф. Патент РФ №2172322) группа противовирусных пептидов, выделенных из насекомых с общим названием аллофероны. На основе одного из пептидов этой группы аллоферона-1 был разработан лекарственный препарат «Аллокин-альфа» лиофилизат для приготовления раствора для подкожного введения, который выпускается с 2003 г. в качестве лекарственного средства против хронического рецидивирующего герпеса 1 и 2 типа и острого гепатита В.
Аллоферон является селективным специфическим стимулятором функциональной активности натуральных киллеров (НК), что связано с непосредственным усилением цитотоксической активности этих клеток, а не с увеличением их количества (Ершов Ф.И., Кубанова А.А., Пинегин Б.В и др. Влияние аллокина-альфа на течение рецидивов хронического генитального герпеса // Materia Medica. - 2003. - №4 (40). - С.103-111). Аллоферон по своему фармакологическому действию близок к интерферону-альфа. Отличием аллоферона является то, что он не только индуцирует синтез эндогенных интерферонов, но и активирует систему натуральных киллеров (НК) (Chernysh S.I., Kim S.I., Bekker G. et al. Antiviral and antitumor peptides from insects // Proceedings of National academy of science of USA. - 2002. - Vol.9. - №.20. - P.12628-12632, Черныш С.И. Аллокины (цитокиноподобные пептиды насекомых) как модуляторы иммунного ответа человека и других млекопитающих // Russian Journal of Immunology. - 2004. - Vol.9. - S.1. - P.36).
НК узнают определенные структуры высокомолекулярных гликопротеинов, которые экспрессируются на мембране инфицированных вирусом клеток. HK не являются антигенспецифическими клетками, вызывают независимый от антител и комплемента лизис клеток-мишеней, распознают свои клетки-мишени без участия антигенов гистосовместимости и относятся к факторам естественной резистентности. Клетка реагирует на стимулы, к которым есть рецепторы на мембране. У них есть рецепторы для цитокинов (по крайней мере для IL-2, 4, 10, 12, IFN-gamma), для антигенов МНС-1, CD16 (Fc-gammaRIIIA). Последний рецептор ответственен за активацию цитотоксического аппарата HK и реализацию реакции антителозависимой клеточной цитотоксичности (АЗКЦТ). В результате содержимое внутриклеточных гранул HK выбрасывается во внеклеточное пространство. Основная роль здесь принадлежит перфорину (цитолизину). Перфорин встраивается в мембрану клетки-мишени и образовывает трансмембранные поры, что приводит к гибели клетки, поскольку содержимое клетки вытекает через эти поры (Cerwenka N. 2001. NATURAL KILLER CELLS, VIRUSES AND CANCER).
Пролиферация и активация HK контролируется цитокинами EL-2, IL-15, IL-18. Отмечается значительная синергия между действием IL-12 и IL-18 (Papamichail M, Perez SA, Gritzapis AD, Baxevanis CN. Natural killer lymphocytes: biology, development, and function. Cancer Immunol Immunother. 2004; 53(3):176-86, Baxevanis CN, Gritzapis AD, Papamichail M. In vivo antitumor activity of NKT cells activated by the combination of IL-12 and IL-18. J Immunol. 2003; 171:2953-2959).
Интерлейкин-18 (ИЛ-18, IL-18), также известный как IFNγ-индуцирующий фактор (IGIF), первично был охарактеризован как потенциальный индуктор синтеза IFNγ Т и НК клеток. ИЛ-18 представляет собой негликозилированный полипептид, у которого нет классической сигнальной последовательности. ИЛ-18 синтезируется в виде неактивного пропептида с массой 24 кДа. После протеолитического расщепления под воздействием каспаз образуется зрелый активный пептид с молекулярой массой 18 кДа. Независимо от ИЛ-12, ИЛ-18 влияет на секрецию IFNγ и быстро активирует клетки моноцитарно/макрофагальной системы, что ведет к активации множества антибактериальных, антиопухолевых и антивирусных ответных реакций. Сам ИЛ-18 индуцируется стрессовыми сигналами (нейрогенными или бактериального происхождения). Считается, что индуцированное стрессом высвобождение ИЛ-18 может вести к усилению цикла IFNγ / ИЛ-18: вслед за первой волной образования IFNγ лимфоцитами, индуцированного IL-18, вновь синтезированный IFNγ, в свою очередь, стимулирует моноциты/макрофаги, что ведет к увеличению их ICE-активности. Увеличение ICE-активности, в частности, приводит к образованию IL-18. IL-18 не только стимулирует синтез IFNγ, но и модулирует его функциональную активность. Показано, что экспрессия Fas-лиганда CD4 + - Th 1 и NK-клетками также происходит под влиянием IL-18. С другой стороны, показано, что IFNγ участвует в активации экспрессии самого Fas. Таким образом, можно сделать вывод, что IL-18 самостоятельно (FasL) или посредством IFNγ (Fas) стимулирует инициализацию процессов апоптоза (Hirata J, Kotani J, Aoyama M, Kashiwamura S, Ueda H, Kuroda Y, Usami M, Okamura H, Marukawa S A role for IL-18 in human neutrophil apoptosis. Shock. 2008 Dec; 30(6):628-33).
Папилломавирусная инфекция - одна из наиболее распространенных вирусных инфекций. Более 50% сексуально активного населения мира в течение жизни инфицируется вирусом папилломы человека (ВПЧ). Несмотря на то, что за последние годы была разработана эффективная противовирусная терапия для многих вирусных инфекций, количество вирус-ассоциированных заболеваний остается высоким. Рак шейки матки, связанный с персистирующей инфекцией вирусом папилломы человека (ВПЧ), - один из самых распространенных и опасных видов злокачественных новообразований у женщин во всем мире. По данным ВОЗ, каждый год в мире диагностируется около 500000 новых случаев рака шейки матки, который занимает второе место в мире как причина смерти от рака среди женщин. На сегодняшний день, по крайней мере, 700 миллионов человек являются носителями ВПЧ-инфекции, а количество летальных исходов, связанных с ВПЧ-инфекцией, достигает 280 тысяч в год (Киселев В.И., Киселев О.И. Вирусы папилломы человека в развитии рака шейки матки. СПб.-М.: Роза мира, 2003).
Результатом инфекции являются заболевания аногенитальной области: рак шейки матки, вульвы, влагалища, перианальной области и генитальные кондиломы. Установлено, что малигнизация инфицированных ВПЧ эпителиальных клеток обусловлена синтезом двух онкобелков - Е6 и Е7, кодируемых геномом ВПЧ. При этом основная роль в индукции опухолевой трансформации принадлежит онкобелку Е7 (Baxevanis CN, Gritzapis AD, Papamichail M. In vivo antitumor activity of NKT cells activated by the combination of IL-12 and IL-18. J Immunol. 2003; 171:2953-2959).
Белок Е6 ВПЧ 16 и 18 типов способен вызвать малигнизацию эпителиальных клеток молочной железы. Белки Е6 и Е7 работают кооперативно, вызывают неконтролируемую пролиферацию первичных фибробластов человека и кератиноцитов (Young-Sik Cho, Jeong-Woo Kang, MinChul Cho et al. Down modulation of EL-18 expession by human papillomavirus type 16 Е6 oncogene via binding to IL-18. FEBS Letters 2001; 501:139-45).
Белок Е6 высокоонкогенных типов ВПЧ классифицируется как белок высокого риска, взаимодействует с белком Р53 и образует с ним устойчивый комплекс. Это приводит к быстрой протеолитической деградации Р53 в убиквитин-зависимом пути. В настоящее время установлена отчетливая корреляция между носительством генитальных ВПЧ, малигнизации кератиноцитов человека, протеолитической дестабилизацией Р53 и ассоциацией определенных типов (типы 16 и 18) ВПЧ с опухолями человека (Phelps WC, Barnes JA and Loba DC. Human papillomavirus: molecular targets and prospects for antiviral therapy. Internal Antiviral News 1999; 7:4-80).
Более того, именно белок Е6 связывается с интерлейкином-18, являющимся основным индуктором гамма-интерферона, что приводит к блокаде реакций клеточного цитотоксического иммунитета. Установлено негативное действие белков Е6/Е7 на экспрессию гена, кодирующего ИЛ-18, что свидетельствует о наличии у ВПЧ специфического механизма иммуносупрессии, подавляющего продукцию ИЛ-18 (Cho Y-S, Kang JW, Cho МС et al. Down modulation of EL-18 expession by human papillomavirus type 16 Е6 oncogene via binding to IL-18. FEBS Letters 2001; 501:139-45).
Было также показано, что белки Е6 и Е7 связываются с интерлейкином-18 в участке Е42А и нейтрализуют его действие (Lee КА, Cho KJ, Kim SH, Shim JH, Lim JS, Cho DH, Song MS, Dinarello CA, Yoon DY. IL-18 Е42А mutant is resistant to the inhibitory effects of HPV-16 Е6 and Е7 oncogenes on the IL-18-mediated immune response. Cancer Lett. 2005; 229(2):261-70).
Из приведенных данных следует, что увеличение количества IL-18 в организме должно способствовать его борьбе с ВПЧ. При этом препараты, вызывающие индукцию IL-18, могут являться лекарственными средствами против ВПЧ.
В настоящее время препаратов, избирательно воздействующих на ВПЧ, не существует. Наиболее часто для лечения ВПЧ-инфекции используются интерфероны (ИФН). Они представляют собой семейство белков, которые вырабатываются клетками иммунной системы в ответ на стимуляцию вирусными антигенами, митогенами. Чаще используется рекомбинантный препарат а-ИФН, имеющий разные торговые названия: «Этферон» (Egis), «Велферон» (Wellcome), «Реаферон», «Интераль» (Россия), «Реальдирон» (Литва) и др. (Серебряная, 2005). Но в 60% случаев даже длительная ИФН-терапия не приводит к клиническому улучшению. Показано, что эффективность лечения напрямую зависит от уровня синтеза онкобелка Е7. Было установлено, что белок Е7 нейтрализует противовирусную активность а-ИФН за счет того, что избирательно блокирует большинство генов, индуцируемых ИФН. Кроме того, Е7 внутриклеточно инактивирует IRF (фактор регуляции ИФН), который включает транскрипцию генов, кодирующих синтез противовирусных белков. Это говорит о том, что белок Е7 не только выполняет функции основного фактора малигнизации, но и определяет устойчивость клеток к ИФН-терапии. Поэтому перед ИФН-терапией целесообразно определять уровень онкобелка Е7. Его высокие значения могут свидетельствовать о нецелесообразности применения ИФН на первом этапе лечения ВПЧ-зависимой патологии шейки матки. В этой ситуации применение препаратов на основе олигопептида аллоферона является перспективным средством для блокирования развития папилломавирусной инфекции путем индукции IL-18.
Таким образом, предшествующий изобретению уровень техники позволяет считать эффективным применение препаратов на основе аллоферона как индуктора IL-18.
Предлагаемое изобретение является способом стимуляции врожденного иммунитета через индукцию интерлейкина-18 с помощью препаратов на основе пептида аллоферон, в том числе лекарственного средства «Аллокин-альфа» лиофилизат для приготовления раствора для подкожного введения.
Возможность достижения цели изобретения подтверждается следующими примерами.
Пример 1. Индукция IL-18 путем однократного введения препарата «Аллокин-альфа»
Индукция осуществлялась путем введения подкожно препарата «Аллокин-альфа» однократно в дозе 2 мг на кг веса лабораторных животных. Для эксперимента использовались мыши линии BALB/C, самки, массой 16-22 грамма, возраста 14 недель. Определялся уровень интерлейкина-18 (IL-18) в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа с использованием специфических антител. Количество IL-18 в сыворотке определяли на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 12, 16, 24, 32, 40, 48, 54 час после введения препарата. Параллельно изучалось «фоновое» количество IL-18, присутствующее в сыворотке крови исследуемых животных. Для этой цели использовалось 14 мышей в качестве контрольной группы, которые получали подкожную инъекцию физиологического раствора. В опытной группе использовалось 42 животных. В случае контрольной группы доверительный интервал рассчитывался по измерениям разведения одного и того же образца. В опытной группе доверительный интервал вычислялся относительно трех образцов от трех животных на каждую измеряемую точку.
Результаты испытания препарата представлены на Рисунке 1. Через 3-4 часа после введения наблюдается небольшой достоверный пик увеличения концентрации IL-18. Через 32 часа наблюдается второй пик значительного увеличения содержания IL-18 в сыворотке крови опытной группы животных, который длится около 20 часов. Наличие первого пика на 3-4 часу возможно обусловлено неспецифической индукцией. Значительное повышение IL-18 на 2-3-й день эксперимента свидетельствует о специфической способности препарата индуцировать изучаемый цитокин.
При подкожном введении препарата «Аллокин-альфа» через 3 часа показана индукция ИЛ-18, которая длилась до 3 суток. Максимальная концентрация ИЛ-18 достигается спустя 35 часов после однократного введения препарата.
Пример 2. Индукция IL-18 путем многократного введения препарата «Аллокин-альфа»
Для этой цели изучалось 2-, 3-, 6-, 8- и 10-кратное введение препарата с интервалами 24, 48 и 72 часа.
Для эксперимента использовались мыши линии BALB/C, самки массой 16-22 грамма, возраста 14 недель. Определялся уровень интерлейкина-18 (IL-18) в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа с использованием специфических антител. Количество IL-18 в сыворотке определялось на 24, 32, 40, 48, 54 час после каждого введения препарата. Параллельно изучалось «фоновое» количество IL-18, присутствующее в сыворотке крови исследуемых животных. Для этой цели использовалось 11 мышей в качестве контрольной группы, которые получали подкожную инъекцию физиологического раствора. В опытных группах суммарно использовалось 150 животных. В случае контрольной группы доверительный интервал рассчитывался по измерениям разведения одного и того же образца. В опытной группе доверительный интервал вычислялся относительно одного образца от трех животных на каждую измеряемую точку. Результаты испытания препарата представлены в Таблице 1.
Таблица 1
Концентрация ИЛ-18 (пг/мл) в крови мышей после различной кратности введения препарата «Аллокин-альфа»
Интервал между инъекциями, часы
Кратность введения
2
3
6
8
10
24
380±15
560±24
1050±41
459±19
498±14
48
402±22
592±21
800±27
600±23
744±27
72
520±14
740±32
1444±49
1200±35
924±31
Контроль
200±12
В таблице 1 представлены максимальные значения концентраций ИЛ-18 после последней инъекции препарата.
Максимальный уровень интерлейкина-18 (1444 пг/мл) был достигнут в группе, где использовалось 6-кратное введение препарата с интервалом в 72 часа. Фоновый уровень в среднем в группе контрольных животных составил 200 пг на мл. Уровень индуцируемого ИЛ-18 от однократного введения составил около 400 пг/мл. При введении через 48 часов максимальный уровень составил 800 пг/мл. При введении через 24 часа - 1050 пг/мл (шестикратная схема введения). Превышение кратности введения более чем в шесть раз вызывало спад индукции ИЛ-18.
Пример 3.
Пациенты, 24 человека, с диагностированной ВПЧ-инфекцией были разделены на 2 группы: в 1-ю группу вошли 15 человек, во 2-ю - 9 человек. В обеих группах также проводилась электроэксцизия очага папилломатоза. Пациенты 1-й группы принимали Аллокин-альфа с целью иммунокоррекции дважды (первая и вторая серия инъекций), с интервалом 1 месяц, по схеме: 1 мг подкожно (3 инъекции) через день. Пациентам 2-й группы проводилась только электроэксцизия.
Группы наблюдения были репрезентативны по полу и возрасту больных. Результаты лечения основного заболевания оценивали через 3, 4 и 6 недель после окончания курса терапии. Определялся уровень интерлейкина-18 (IL-18) в сыворотке крови пациентов методом иммуноферментного анализа с использованием специфических антител. Количество IL-18 в сыворотке определяли на 40 час после последнего введения препарата. Параллельно изучалось «фоновое» количество IL-18, присутствующее в сыворотке крови пациентов 2-й группы. Результаты измерений представлены в Таблице 2.
Таблица 2
Концентрация ИЛ-18 (пг/мл) в крови пациентов после введения препарата «Аллокин-альфа» и пациентов, не получавших иммунотерапию.
Группа пациентов
Концентрация ИЛ-18 в сыворотке после первой серии инъекций
Концентрация ИЛ-18 в сыворотке после второй серии инъекций
1-я группа, терапия препаратом Аллокин-альфа
88±13
134±25
2-я группа, контрольная, проводилась только электроэкцизия
34±11
37±14
При проведении диагностики методом ПЦР ВПЧ был выявлен в 1-й группе у трех пациентов (16,7%), во 2-й - у шести (66,6%) пациентов.
Результаты исследования показывают связь увеличения концентрации ИЛ-18 в сыворотке пациентов с применением препарата Аллокина-альфа и сопутствующим лечением ВПЧ-инфекции.
Пример 4. Индукция IL-18 с помощью препарата аллоферона, вводимого в составе суппозиториев и мазей.
Использовались суппозитории на основе масла какао или витебсола массой 1,0 г и содержащие в своем составе 1,0 мг пептида аллоферон. Мазь, примененная в эксперименте, имела следующий состав: Аллоферон 0,1 г; вазелиновое масло 13,0 г; вазелин 4,0 г; глицерин 3,0; ПЭГ сорбитан (моностеарат) 4,0; сорбитан моностеарат 3,0; стеариловый спирт 3,0; цетиловый спирт 2,0; диэтиленгликоля моноэтиловый эфир 2,0; метилпарагидроксибензоат (нипагин) 0,5; пропилпарагидроксибензоат 0,2; вода до 100,0 г.
Для эксперимента использовались мыши линии BALB/C, самки, массой 16-22 грамма, возраста 14 недель. Определялся уровень интерлейкина-18 (IL-18) в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа с использованием специфических антител. Количество IL-18 в сыворотке определяли на 24, 32, 40 час после каждого введения препарата. Параллельно изучалось «фоновое» количество IL-18, присутствующее в сыворотке крови исследуемых животных. Для этой цели использовалось 5 мышей в качестве контрольной группы, которые получали подкожную инъекцию физиологического раствора. В каждой опытной группе (1-я группа - свечи, 2-я группа - мазь) использовалось 15 животных. Для вагинального введения лабораторным животным использовалась 1/50 часть суппозитория. Мазь вводилась с помощью пропитанного ватного тампона (50 мг мази). Производилось однократное введение.
В случае контрольной группы доверительный интервал рассчитывался по измерениям разведения одного и того же образца. В опытной группе доверительный интервал вычислялся относительно одного образца от трех животных на каждую измеряемую точку. Результаты испытания препарата представлены в Таблице 3.
Таблица 3
Концентрация ИЛ-18 (пг/мл) в крови мышей после введения препарата аллоферон в виде суппозиториев.
Лабораторныеживотные
Измерение концентрации IL-18 после введенияпрепарата, часы
24
32
40
Вагинальное введение суппозиториев
153±15
171±13
263±19
Вагинальное введение мазей
161±14
201±17
280±16
Контрольная группа
164±12
Термины, используемые в настоящем описании:
Цитокины - это гормоноподобные молекулы белково-пептидной природы, которые продуцируются клетками организма. Цитокины осуществляют короткодистантную регуляцию межклеточных и межсистемных взаимодействий, определяют выживаемость клеток, стимуляцию или ингибирование их роста, а также дифференцировку, функциональную активацию и апоптоз клеток. Цитокины можно условно подразделить на 4 следующие группы:
1. Гемопоэтические факторы (CSF-G, -M, -GM, ИЛ-3 и ИЛ-7, эритропоэтин) - стимуляторы роста и созревания незрелых кроветворных клеток.
2. Регуляторы естественного иммунитета - провоспалительные цитокины (IFNα, β, ИЛ-1 и ИЛ-6, TNFα, хемокины - ИЛ-8, МСР-1, RANTES и др.). Они участвуют в неспецифической защите организма от бактериальных и вирусных инфекций. Их основными мишенями являются клетки-фагоциты - макрофаги и гранулоциты.
3. Цитокины, регулирующие специфические иммунные реакции (ИЛ-2 и ИЛ-4, трансформирующий фактор роста (TGFβ) и др.). Эти белки участвуют в активации, росте и дифференцировке зрелых лимфоцитов.
4. Цитокины, регулирующие воспалительные реакции, развивающиеся в процессе специфического иммунного ответа (INFγ, лимфотоксин, ИЛ-5, ИЛ-10, ИЛ-18 и др.). Их основная функция - активация неспецифических эффекторных клеток: цитотоксических макрофагов и естественных киллеров.
Интерфероны - гликопротеины, представители группы цитокинов. В зависимости от происхождения и, соответственно, строения молекулы интерфероны человека делятся на 3 основных типа: IFNα, продуцентами которого преимущественно являются макрофаги и В-клетки; IFNβ, продуцируемый фибробластами, и IFNγ, который синтезируют главным образом активированные Т-лимфоциты и натуральные киллеры. Молекулярная масса интерферонов варьирует в пределах от 17-45 кДа у IFNα и IFNβ и от 20 до 80 кДа у IFNγ. Считается, что IFNα и IFNβ обладают преимущественно антивирусной, а IFNγ - иммуномодулирующей активностью.
Интерлейкины - это большая группа цитокинов, синтезируемых в основном Т-лимфоцитами, но в некоторых случаях также натуральными киллерами или другими тканевыми клетками. Интерлейкины обладают разнообразными функциями, но большинство их стимулирует другие клетки для деления или дифференцировки, при этом каждый из них действует на отдельную, ограниченную группу клеток, экспрессирующих специфичные для данного интерлейкина рецепторы. Это растворимые пептиды, сильные иммунорегуляторы локального действия; активируют Т-клетки.
Натуральные (естественные) киллеры (НК) - это лимфоциты, участвующие в системе врожденного иммунитета. НК были открыты по своей способности убивать клетки опухолей, откуда и получили свое название. Основной функцией активированных НК является распознавание и уничтожение собственных клеток организма, в которых имеются нарушения - опухолевые клетки и клетки, инфицированные патогеном. НК обладают характерной морфологией: основная часть обильной цитоплазмы содержит несколько митохондрий, свободные рибосомы с отдельными элементами шероховатого эндоплазматического ретикулума, аппарат Гольджи и характерные электроноплотные гранулы, связанные с мембраной. На поверхности НК находится множество рецепторов для активации самих клеток с помощью цитокинов, а также для распознавания лигандов на поверхности опухолевых и инфицированных клеток.
Вирус папилломы человека (ВПЧ) - инфекция, вызывающая рак шейки матки за счет развития цервикальных интраэпителиальных неоплазий, причиной которых является нарушение контроля пролиферации клетки. Усиление пролиферации инфицированных ВПЧ супрабазальных клеток цервикального эпителия сопровождается экспрессией вирусных онкогенов - белков Е6 и Е7. Способность к неограниченно долгому персистированию в организме больного обусловлена особенностями жизненной стратегии этих вирусов, основанной на блокировании механизмов врожденного и адаптивного антивирусного иммунитета. Риск злокачественного перерождения связан с несколькими типами папилломавирусной инфекции. Их обозначают как вирусы высокого риска онкогенного риска. Это типы 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 и 68. К вирусам низкого риска относят 5 типов - 6, 11, 42, 43, 44.