Хлорид 4-[(1Е)-1-(6-хлор-4-оксо-4Н-хромен-3-ил)-4-метилпент-1-ен-3-ил]морфолин-4-ия, способ его получения и противотуберкулезная активность
CHLORIDE 4-[(1E)-1-(6-CHLORO-4-OXO-4N-CHROMEN-3-YL)-4-METHYLPENT-1-EN-3-YL]MORPHOLINE-4-YL, METHOD OF PRODUCING THEREOF AND ITS ANTITUBERCULOSIS EFFECT

Группа изобретений относится к области органической и медицинской химии, а именно к новому индивидуальному полифункциональному гетероциклическому соединению - хлориду 4-[(1E)-1-(6-хлор-4-оксо-4H-хромен-3-ил)-4-метилпент-1-ен-3-ил]морфолин-4-ия формулы I, способу его получения и биологической активности, которые могут быть использованы в органическом синтезе и в медицине в качестве потенциального противотуберкулезного средства
В научно-технической литературе описано несколько способов получения 4-аллилморфолинов, содержащих ароматические заместители. Так, аллилморфолины (IV) были получены взаимодействием фенилалленов (II) с морфолином (III) [Nishina, N. Gold-catalyzed hydrofunctionalization of allenes with nitrogen and oxygen nucleophiles and its mechanistic insight / N. Nishina, Y. Yamamoto // Tetrahedron. - 2009. - V. 65. - P. 1799-1808]. Реакция проводилась при нагревании в толуоле при катализе комплексом золота и трифлатом серебра:
Похожая реакция получения аллилморфолина (VI) заключалась в присоединении по терминальной двойной связи диена (V) морфолина (III) [Goldfogel, M.J. Intermolecular hydroamination of 1,3-dienes catalyzed by bis(phosphine)carbodicarbene-rhodium complexes / M.J. Goldfogel, C.C. Roberts, S.J. Meek // Journal of American Chemical Society. - 2014. - V. 136. - P. 6227-6230]. Катализ по данному методу осуществлялся комплексом родия и тетрафторбората серебра при нагревании реагентов в среде хлорбензола:
Из литературы известен также способ получения фенилзамещенных аллилморфолинов (VIII) с катализом комплексом палладия и трифенилфосфина [Singh, К. Facile synthesis of Z-alkenes via uphill catalysis / K. Singh, S.J. Staig, J.D. Weaver // Journal of American Chemical Society. - 2014. - V. 136. - P. 5275-5278]. При этом реакция между эфиром (VII) с морфолином (III) проводилась в среде дихлорметана:
Как обнаружено авторами работы [Evans, R.W. A simple catalytic mechanism for the direct coupling of α-carbonyls with functionalized amines: a one-step synthesis of plavix / R.W. Evans, J.R. Zbieg, S. Zhu, W. Li, D.W.C. MacMillan // Journal of American Chemical Society. - 2013. - V. 135. - P. 16074-16077], нагревание смеси соединения (IX) с алифатическим альдегидом (X) и морфолином (III) в присутствии бромида двухвалентной меди также приводит к получению фенилаллилморфолинов (XI)
При достаточно высоких выходах (46-95%) продуктов приведенные выше методы получения аллилморфолинов обладают и недостатками, которые осложнят дальнейшее промышленное применение данных синтезов. К ним стоит отнести:
- Использование в качестве катализаторов сложных и малодоступных комплексов золота и родия, а также солей серебра и меди. Присутствие тяжелых металлов затруднит дальнейшую очистку продуктов реакции для использования их в качестве лекарственных средств.
- Все перечисленные процессы проводятся при повышенной температуре. Учитывая, что используемый в синтезах морфолин (III) легко окисляется при нагревании кислородом воздуха, для проведения реакции необходимо создание инертной атмосферы (например, азота).
- Указанные способы синтеза разработаны для получения групп веществ, имеющих ароматический заместитель.
Из патентной и научно-технической литературы не выявлены ни способ получения нового заявляемого авторами соединения - аллилморфолина с хроменовым заместителем (I), ни сама его структура.
Задачей предлагаемой группы изобретений является создание нового неописанного в литературе соединения - хлорида 4-[(1E)-1-(6-хлор-4-оксо-4Н-хромен-3-ил)-4-метилпент-1-ен-3-ил]морфолин-4-ия (I), что позволит расширить ассортимент потенциальных противотуберкулезных средств.
Техническими результатами, на решение которых направлена группа изобретений, являются получение нового полифункционального соединения (I), которое потенциально может быть использовано в медицине в качестве лекарственного средства; разработка простого способа его синтеза; выявленная противотуберкулезная активность данного соединения.
Задача решается тем, что синтезировано новое соединение - хлорид 4-[(1E)-1-(6-хлор-4-оксо-4H-хромен-3-ил)-4-метилпент-1-ен-3-ил]морфолин-4-ия формулы I
Задача решается также тем, что соединение обладает противотуберкулезной активностью.
Задача решается также тем, что способ получения хлорида 4-[(1E)-1-(6-хлор-4-оксо-4H-хромен-3-ил)-4-метилпент-1-ен-3-ил]морфолин-4-ия формулы I осуществляется путем взаимодействия 3-(4-оксо-6-хлор-4H-хромен-3-ил)акриловой кислоты с 4-(2-метилпроп-1-ен-1-ил)морфолином в соотношении 1:1,5 в среде дихлорэтана при температуре 18-20°С с последующим выделением целевого продукта в виде осадка при действии на реакционную массу 1 М соляной кислоты.
В ходе осуществления поставленной задачи был найден необычный способ получения хлорида 4-[(1E)-1-(6-хлор-4-оксо-4H-хромен-3-ил)-4-метилпент-1-ен-3-ил]морфолин-4-ия (I). Способ представляет собой двухстадийный процесс. Первая стадия заключается во взаимодействии 3-(4-оксо-6-хлор-4H-хромен-3-ил)акриловой кислоты (XII) с 4-(2-метилпроп-1-ен-1-ил)морфолина (XIII) в соотношении 1:1,5 в среде дихлорэтана при температуре 18-20°С. На второй стадии к реакционной массе добавляется 1 М соляная кислота, что приводит к выпадению осадка целевого продукта.
Предположительно на первой стадии протекает реакция Дильса-Альдера с образованием тетрагидроксантона (XIV). Согласно имеющимся литературным данным, тетрагидроксантоны, аналогичные соединениям (XIV), неустойчивы и отщепляют амин с образованием 3,4-дигидроксантонов [Bodwell, G.J. Electron deficient dienes 3: rapid access to 2-hydroxybenzophenones via inverse electron demand Diels-Alder-driven domino reactions of a chromone-fused electron deficient diene with enamines / G.J. Bodwell, K.M. Hawco, R.P. da Silva // Synlett. - 2003. - №2. - P. 179-182]. Однако вместо ожидаемого отщепления морфолина происходит раскрытие цикла, что является характерным поведением для аддуктов Дильса-Альдера, имеющих объемные заместители [Itoh, K. The reaction of b-nitrostyrenes with 2-methoxyfuran: a novel formation of isoxazoline N-oxide together with Michael adducts / K. Itoh, S. Kishimoto // New Journal of Chemistry. - 2000. - V. 24. - P. 347-349]. Раскрытие сопровождается декарбоксилированием и приводит к аллиламину (XV). Данный амин при реакции с соляной кислотой образует соответствующий гидрохлорид - целевой продукт (I).
Способ получения хлорида 4-[(1E)-1-(6-хлор-4-оксо-4H-хромен-3-ил)-4-метилпент-1-ен-3-ил]морфолин-4-ия (I) изучен и проведен в лабораторных условиях.
Данные элементного анализа и масс-спектрометрии, температура плавления и выход продукта реакции приведены в таблице 1, спектральные характеристики полученного соединения приведены в таблице 2.
Результаты исследования противотуберкулезной активности представлены на фиг. 1-5.
Фиг. 1 - МИК соединения (I) в отношении штамма H37Rv, где
по оси абсцисс - концентрации соединения (I), мкг/мл; по оси ординат - интенсивность свечения резоруфина (соединения, образующегося в результате воздействия ферментов живых микобактерий на резазурин) в усл. ед.; линия 1 - свечение в лунках с различными концентрациями соединения (I), 2 - контроль роста (свечение в лунках без препарата), 3 - контроль роста 10% популяции микобактерий; соответствующие штрих-линии - верхняя и нижняя границы доверительного интервала. МИК=50 мкг/мл.
Фиг. 2 - МИК соединения (I) в отношении клинического штамма №2067 с множественной лекарственной устойчивостью, где
по оси абсцисс - концентрации соединения (I), мкг/мл; по оси ординат - интенсивность свечения резоруфина (соединения, образующегося в результате воздействия ферментов живых микобактерий на резазурин) в усл. ед.; линия 1 - свечение в лунках с различными концентрациями соединения (I), 2 - контроль роста (свечение в лунках без препарата), 3 - контроль роста 10% популяции микобактерий, 4 - контроль роста 1% популяции микобактерий; соответствующие штрих-линии - верхняя и нижняя границы доверительного интервала. МИК=12,5 мкг/мл.
Фиг. 3 - МИК соединения (I) в отношении клинического штамма №5227 с полирезистентностью, где
(см. к фиг. 2). МИК=50,0 мкг/мл.
Фиг. 4 - МИК соединения (I) в отношении клинического штамма №5307 с полирезистентностью, где:
(см. к фиг .2). МИК=50,0 мкг/мл.
Фиг. 5 - МИК соединения (I) в отношении клинического штамма №7106 с множественной лекарственной устойчивостью, где (см. к фиг. 2). МИК=50,0 мкг/мл.
Предлагаемая группа изобретений проиллюстрирована примерами практического осуществления.
Пример 1. Получение хлорида 4-[(1E)-1-(4-оксо-6-хлор-4H-хромен-3-ил)-4-метилпент-1-ен-3-ил]морфолин-4-ия (I)
В коническую колбу помещают 50 мл дихлорэтана (х.ч., ТУ 2631-085-44493179-02) и 5 г (20 ммоль) 3-(4-оксо-6-хлор-4Н-хромен-3-ил)акриловой кислоты, затем при перемешивании порциями прибавляют 4,2 г (30 ммоль) 4-(2-метилпроп-1-ен-1-ил)морфолина. Реакционную смесь перемешивают при температуре 18-20°С в течение 3 суток. Далее к реакционной массе приливают 50 мл 1 М соляной кислоты, образовавшуюся эмульсию интенсивно перемешивают в течение 4 часов. Выделившийся осадок продукта отфильтровывают, промывают дихлорэтаном и водой. Осадок перекристаллизовывают из воды и затем сушат 2 часа при 40-45°С.
Целевой продукт представляет собой порошок белого или бежевого цвета. Масса продукта составляет 5,2 г (68%, считая на 3-(4-оксо-6-хлор-4H-хромен-3-ил)акриловую кислоту).
19
23
2
3
-
+
Состав синтезированного соединения подтвержден элементным анализом и данными масс-спектрометрии (табл. 1). Брутто-формула: СHClNO. Найдено, %: С - 59,14, Н - 5,48, N - 3,53. Вычислено %: С - 59,38, Н - 6,03, N - 3,63. В масс-спектре (ионизация электроспреем (ESI), регистрация положительных ионов) наблюдаются пики катионов [М-Сl]с m/z 348,1343 и 350,1318 с соотношением интенсивностей 3:1, что связано с изотопным составом хлора.
1
13
Строение синтезированного вещества было доказано методами Н- и С-ЯМР-спектроскопии (табл. 2).
1
6
2
5
7
8
В спектре ЯМР Н раствора исследуемого соединения в ДМСО-d в слабом поле присутствует уширенный синглет кислого протона в области 11,27 м.д. (1Н). Сигналы протонов ароматической системы зарегистрированы в виде синглета 8,72 м.д. (СН, 1Н) и группы пиков 7,98 м.д. (д, 1Н, J 2,3 Гц, СН), 7,83 м.д. (дд, 1Н, J 2,3 и 9,0 Гц, СН), 7,73 м.д. (д, 1Н, J 9,0 Гц, СН). Сигналы 6,81 м.д. (дд, 1Н, J 10,3 и 15,8 Гц) и 6,57 м.д. (д, 1Н, J 15,8 Гц) соответствуют олефиновым протонам. Константа спин-спинового взаимодействия 15,8 Гц указывает на трансконфигурацию двойной связи. В сильном поле находится ряд мультиплетных сигналов протонов морфолинового цикла 4,07 м.д. (2Н), 3,92 м.д. (2Н), 3,44 м.д. (2Н) и 3,07 м.д. (2Н) и группы CH-N 3,75 м.д. (1Н). Изопропильный фрагмент обнаруживается в виде мультиплета 2,42 м.д. (1Н) и двух дублетов метальных групп 1,06 м.д. (3Н, J 6,8 Гц) и 0,93 м.д. (3Н, J 6,8 Гц).
13
4
2
sp2
В спектре ЯМР С в слабом поле присутствуют сигналы атомов углерода С=O (174,7 м.д.) и C-O (157,2 и 154,3 м.д.). Сигналы с химическими сдвигами 134,6, 130,6, 130,1, 125,0, 124,6, 122,9, 121,5 и 119,6 м.д. принадлежат sp-гибридным атомам углерода молекулы. Сигналы атомов углерода морфолинового цикла и CH-N имеют химический сдвиг 75,0, 63,4, 63,3, 50,7 и 49,9 м.д. Изопропильный фрагмент зарегистрирован в виде пиков 26,5, 21,0 и 17,2 м.д.
Пример 2. Туберкулостатическая активность хлорида 4-[(1E)-1-(4-оксо-6-хлор-4H-хромен-3-ил)-4-метилпент-1-ен-3-ил]морфолин-4-ия (I) (исследования in vitro)
Исследование туберкулостатической активности проводили методом двукратных серийных микроразведений в жидкой синтетической среде Миддлбрука (Middlebrook 7Н9 BrothBase, Sigma-Aldrich, кат. № МО 178) с 10% ростовой добавки OADC (BBL Middlebrook OADCEnrichment, Becton Dickinson, кат. №245116) в 96-луночном планшете с индикацией роста микобактерий с помощью 0,01% резазурина (Resazurinsodiumsalt, Sigma, кат. № R7017) (метод REMA - Resazurin Microdilution Assay; Palomino J.-C., Martin A., Camacho M., Guerra H., Swings J., Portaels F. ResazurinMicrotitre Assay Plate Simple and Inexpensive method for Detection of Dgug Resistance in Mycobacterium tuberculosis. // Antimicrob. Agents Chemotherap. - 2002. - Vol. 46. - №8. - P. 2720-2722) и регистрацией роста с помощью планшетного флуориметра FLUO Star Optima (длина волны возбуждения - 520 нм, излучения - 590 нм). В качестве тест-штаммов использовали:
37
1. Чувствительный к противотуберкулезным препаратам штамм Mycobacterium tuberculosis HRv (ТВС # 1/47, источник - Институт гигиены и эпидемиологии, Прага, 1976 г., получен из ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России);
2. 4 клинических штамма, выделенных от больных с впервые выявленным туберкулезом легких (коллекция ФГБУ «Санкт-Петербургский НИИ фтизиопульмонологии» Минздрава России):
- клинический штамм №2067 с множественной лекарственной устойчивостью, спектр устойчивости - изониазид, рифампицин, канамицин, мутации - в гене ahp С (Т10), в гене rpoB (His526→Arg);
- клинический штамм №5227 с полирезистентностью, спектр устойчивости: изониазид, стрептомицин; мутации - в гене kat G (Ser315→Thr), ahp C (А 10);
- клинический штамм №5307 с полирезистентностью, спектр устойчивости: изониазид, стрептомицин, этионамид; мутация - в гене inhA (Т15);
- клинический штамм №7106 с множественной лекарственной устойчивостью, спектр устойчивости: изониазид, стрептомицин, рифампицин, этамбутол, канамицин, этионамид, капреомицин, амикацин; мутации - в гене katG (Ser315→Thr), в гене rpoB (Ser531→Leu).
Минимальная ингибирующая концентрация (МИК) соединения (I) в отношении чувствительного к противотуберкулезным препаратам штамма H37Rv, а также лекарственно-устойчивых клинических изолятов №№5227, 5307, 7106 составила 50 мкг/мл, в отношении клинического штамма №2067 - 12,5 мкг/мл (фиг. 1-5).
Преимуществом соединения (I) является то, что оно обладает сходной степенью туберкулостатической активности как в отношении чувствительного, так и лекарственно-устойчивых штаммов независимо от характера и спектра их устойчивости к противотуберкулезным препаратам, от набора мутаций, ассоциированных с устойчивостью к изониазиду и рифампицину - основных противотуберкулезных препаратов.
Таким образом, хлорид 4-[(1E)-1-(4-оксо-6-хлор-4H-хромен-3-ил)-4-метилпент-1-ен-3-ил]морфолин-4-ия (I) обладает туберкулостатической активностью в отношении лекарственно-устойчивых клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis и является перспективным для применения в медицинской практике.