Способ получения липосом
METHOD FOR LIPOSOMES OBTAINING

Изобретение относится к области биотехнологии, позволяет получать наноконтейнеры для различного рода веществ в косметологии, фармакологии, медицине.
Возможность применения липосомальных лекарственных средств активно начали исследовать еще в 80-х годах. Так, были разработаны липосомальные носители для ферментных, гормональных, противомикробных и противоопухолевых препаратов.
Одной из важнейших характеристик липосом является их размер. При производстве липосомальных частиц разброс в размерах может составлять десятки и сотни нм. Оптимальный размер носителей, обеспечивающий пассивный транспорт лекарств, как свидетельствуют литературные данные, попадает в интервал 50-200 нм. Такие липосомы медленно удаляются ретикулоэндотелиальной системой (РЭС). С уменьшением размера увеличивается время циркуляции липосом в крови, объем распределения и прохождение сквозь стенки сосудов. В связи с этим большое практическое значение имеет разработка методов производства липосомальных частиц стандартизированных размеров.
Известны способы получения липосомальных частиц из соевого лецитина [Забодалова Л.А. Получение липосом из соевого лецитина / Л.А. Забодалова, В.А. Чернявский, Т.Н. Ищенко, Н.Н. Скворцова // Научный журнал НИУ ИТМО. Серия "Процессы и аппараты пищевых производств". - №2. - 2011]. По одному из способов лецитин ЛециПРО 90С и β-каротин смешивали в весовом соотношении 1:0,005, растворяли в гексане и добавляли витамин Е в количестве 0,01% от массы лецитина. Растворитель упаривали на ротационном испарителе при температуре водяной бани 45-50°С. К остатку после упаривания добавляли смесь вода-этанол (1:1, об.) в количестве, превышающем в 1,5 раза массу взятого лецитина. Содержимое колбы встряхивали до полного переноса остатка после упаривания в водно-спиртовую смесь. Образовавшуюся эмульсию оставляли в прохладном темном месте. Через сутки отбирали навеску смеси и приливали дистиллированную воду с таким расчетом, чтобы содержание липида в среде составляло 1%. Смесь гомогенизировали на механической мешалке при 15000 об/мин в течение 2 мин.
Недостатком этого метода является неоднородность линейных размеров и количества липидных слоев получаемых липосомальных частиц.
В ряде методов также используется в качестве растворителя этиловый спирт [Патент РФ №2130771, кл. А61K 9/127, Автушенко С.С., 1999 г.]. В емкость при перемешивании поместили 800 мг БАВ - глюкозы, 200 мг яичного лецитина и 700 мг этанола и при перемешивании со скоростью 50 об/мин при 37°С подвергли смесь в течение часа воздействию вакуума. Было получено 1.0 г сухого порошка с влажностью 0.8%. Порошок диспергировали в 10 мл дистиллированной воды.
Недостатком этого метода является длительность процесса.
Задачей данного изобретения является разработка более усовершенствованного простого в техническом плане способа получения липосом, строготандартизированных по размеру.
Технический результат - получение монодисперсной гомогенной системы с размером частиц от 59,9 до 106,2 нм достигается тем, что раствор лецитина в этиловом спирте (1%) испаряют в роторном испарителе при температуре водной бани 60 С, в результате на стенке испарительной колбы получили пленку липидов,  после чего добавляли сантимолярный (0,01 М) натрий-фосфатный буфер (рН 7,4) в объеме, равном объему раствора лецитина в этиловом спирте, а затем перемешивали в течение 1 минуты
Изобретение проиллюстрировано таблицей 1, где показаны характеристики липосом, подверженных облучению ультразвуком, и таблицей 2, где показаны характеристики липосом, подверженных облучению ультразвуком и экструзии через мембранные фильтры. В таблицах 1 и 2 показаны размеры частиц липосом.
Для производства липосомальных частиц нами был выбран фосфотидилхолин в силу ряда причин. В организме лецитин является основным составляющим клеточных мембран, участвует в доставке активных компонентов, обладает выраженным антиоксидантным действием. Лецитин участвует в восстановлении поврежденных клеток. Он более стабилен по сравнению с другими липидами. Также преимуществом лецитина является его свойство природного эмульгатора: у него есть как водо-, так и жирорастворимые участки.
Способ получения липосом осуществляют следующим образом. В способе использовали соевый лецитин (Sigma). В состав соевого лецитина входят: фосфатидилхолин (мин. 90%), эндотоксин (макс. 6 EU/гp), свободные жирные кислоты (макс. 0,5%).
Липосомальные везикулы получали методом дегидратации/регидратации по следующей схеме.
Раствор лецитина в этиловом спирте (1%) испаряли в роторном испарителе IKA RV10 control при температуре водяной бани 60°С. В результате на стенке испарительной колбы получали пленку липидов. Затем добавляли сантимолярный (0,01 М) натрий-фосфатный буфер (рН 7,4) в объеме, равном объему раствора лецитина в этиловом спирте, перемешивали в течение 1 минуты.
Следующим этапом стала диспергенция получаемых липосом, для чего растворы были подвержены воздействию ультразвуком. Облучение проводили на ультразвуковом дезинтеграторе Qsonica Sonicators в течение 15 минут (20кГц, 10-секундный импульс с перерывом 3 сек).
Для получения однослойных липосом суспензию подвергали продавливанию через мембранные фильтры с определенным размером пор. В работе использовали липосомальный экструдер LP-50, LipoFast, размер пор мембранного фильтра 100нм.
Размер полученных липосом измеряли с помощью спектрометра динамического светорассеяния Photocor-FC. Данные, полученные с использованием этого метода, показывают, что образована монодисперсная система. В случае использования только ультразвукового дезинтегратора гидродинамический радиус частиц составляет 106,2 нм +-4,8% (табл. 1); в случае использования дезинтегратора и экструдера - 59, 95 нм +-2,5% (табл. 2).
В результате получен новый усовершенствованный по сравнению с ранее используемыми способ производства липосом. Установленные условия получения суспензии липосом и режимы последующей ее обработки позволяют получать строгостандартизированные частицы, которые могут быть применены в различных отраслях промышленности и медицине. Предложенный способ обладает рядом преимуществ:
- полученная липосомальная дисперсия является гомогенной;
- размер получаемых частиц оптимален для практического применения;
- технология получения липосомальных частиц является более усовершенствованной по сравнению с используемыми.
Источники информации
1. Забодалова Л.А., Чернявский В.А., Ищенко Т.Н., Скворцова Н.Н. Получение липосом из соевого лецитина / Л.А .Забодалова // Научный журнал НИУ ИТМО. Серия «Процессы и аппараты пищевых производств» - вып.2, 2015.
2. Каплун А.П., Шон Л.Б., Краснопольский Ю.М., Швец В.И. Липосомы и другие наночастицы как средство доставки лекарственных веществ // Вопросы медицинской химии. - 1999.-№1.
3. Кобринский Г. Липосомы в медицине // Наука и жизнь. /Электронный ресурс/.
4. Кузякова Л.М. Конструирование трансдермальных липосомальных препаратов с заданными свойствами / Л.М. Кузякова // Вестник Московского университета. Сер. 2, Химия. 2005. Т. 46, N 1. С. 7479.
5. Т. М. Allen, "Liposomes. Opportunities in drug delivery," Drugs, vol. 54, no. 4, supplement, pp. 8-14, 1997.
6. Moghimi S.M., Hunter A.C, Murray J.C. Long-circulating and target-specific nanoparticles: theory to practice. Pharmacol. Rev. 2003; 53: 283-318.
7.3абодалова Л.А. Получение липосом из соевого лецитина / Л.А. Забодалова, В.А. Чернявский, Т.Н. Ищенко, Н.Н. Скворцова // Научный журнал НИУ ИТМО. Серия "Процессы и аппараты пищевых производств". - №2. – 2011.
8. Патент РФ №2130771.