ПОЛУЧЕНИЕ ГЕТЕРОМУЛЬТИМЕРНЫХ БЕЛКОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КЛЕТОК МЛЕКОПИТАЮЩИХ

1. Способ получения гетеромультимерного белка, включающего i) первый полипептид, содержащий шарнирный участок, имеющий первый домен гетеродимеризации, где первый полипептид, содержащий шарнирный участок, связан с первой легкой цепью, и ii) второй полипептид, содержащий шарнирный участок, имеющий второй домен гетеродимеризации, где второй полипептид, содержащий шарнирный участок, связан со второй легкой цепью, где второй домен гетеродимеризации взаимодействует с первым доменом гетеродимеризации на поверхности взаимодействия, и где первый и второй полипептиды, содержащие шарнирный участок, соединены, по меньшей мере, одной межцепьевой дисульфидной связью, где способ включает следующие стадии:
(a) культивирование первой клетки-хозяина, способной экспрессировать первый полипептид, содержащий шарнирный участок, и первую легкую цепь;
(b) культивирование второй клетки-хозяина, способной экспрессировать второй полипептид, содержащий шарнирный участок, и вторую легкую цепь; и,
(c) получение комбинированной культуральной среды для первой клетки-хозяина и второй клетки хозяина без разрушения клеточной мембраны первой и второй клеток-хозяев, где комбинированная культуральная среда включает гетеромультимерный белок, и где первая клетка-хозяин и вторая клетка-хозяин представляют собой клетку млекопитающего.
2. Способ получения гетеромультимерного белка, включающего i) первый полипептид, содержащий шарнирный участок, имеющий первый домен гетеродимеризации, где первый полипептид, содержащий шарнирный участок, связан с первой легкой цепью, и ii) второй полипептид, содержащий шарнирный участок, имеющий второй домен гетеродимеризации, где второй полипептид, содержащий шарнирный участок, связан со второй легкой цепью, где второй домен гетеродимеризации взаимодействует с первым доменом гетеродимеризации на поверхности взаимодействия, и где первый и второй полипептиды, содержащие шарнирный участок, соединены, по меньшей мере, одной межцепьевой дисульфидной связью, где способ включает следующие стадии:
(a) культивирование первой клетки-хозяина, способной экспрессировать первый полипептид, содержащий шарнирный участок, и первую легкую цепь, где первый гомодимер, включающий два первых полипептида, содержащих шарнирный участок, и две первые легкие цепи, является секретируемым;
(b) культивирование второй клетки-хозяина, способной экспрессировать второй полипептид, содержащий шарнирный участок, и вторую легкую цепь, где второй гомодимер, включающий два вторых полипептида, содержащих шарнирный участок, и две вторые легкие цепи, является секретируемым;
(c) получение комбинированной культуральной среды для первой клетки-хозяина и второй клетки хозяина без разрушения клеточной мембраны первой и второй клеток-хозяев, где комбинированная культуральная среда включает первый гомодимер и второй гомодимер;
(d) инкубирование комбинированной культуральной среды в восстанавливающих условиях, достаточных для образования гетеромультимерного белка, и;
(e) получение гетеромультимерного белка, где первая клетка-хозяин и вторая клетка-хозяин представляют собой клетку млекопитающего.
3. Способ по п. 1 или 2, где получение комбинированной культуральной среды включает:
(1) сбор первой культуральной среды от первой клетки-хозяина;
(2) сбор второй культуральной среды от второй клетки-хозяина; и
(3) объединение первой культуральной среды и второй культуральной среды для получения комбинированной культуральной среды.
4. Способ по п. 1 или 2, где получение комбинированной культуральной среды включает сбор культуральной среды от комбинированной культуры клеток, включающей первую клетку-хозяин и вторую клетку-хозяин.
5. Способ по п. 4, где первую клетку-хозяин и вторую клетку-хозяин культивируют по отдельности перед объединением в комбинированную культуру клеток.
6. Способ по любому из пп. 4, 5, дополнительно включающий стадию культивирования комбинированной культуры клеток при температуре от примерно 25°C до примерно 40°C.
7. Способ по любому из пп. 1-6, дополнительно включающий перемешивание комбинированной культуральной среды.
8. Способ по любому из пп. 1-7, дополнительно включающий выделение гетеромультимерного белка из комбинированной культуральной среды.
9. Способ по п. 8, где гетеромультимерный белок выделяют с использованием колонки с белком A.
10. Способ по п. 3, включающий добавление восстанавливающего агента к первой культуральной среде и/или ко второй культуральной среде до или после сбора первой и второй культуральной среды.
11. Способ по любому из пп. 4-10, включающий добавление восстанавливающего агента к культуральной среде от комбинированной культуры клеток до сбора культуральной среды от комбинированной культуры клеток.
12. Способ по п. 10 или 11, где восстанавливающий агент добавляют примерно за 4-24 часа до стадии сбора.
13. Способ по п. 12, где восстанавливающий агент добавляют примерно за 15 часов до стадии сбора.
14. Способ по любому из пп. 1-13, дополнительно включающий добавление восстанавливающего агента к комбинированной среде для культивирования клеток.
15. Способ по п. 14, где комбинированную культуральную среду, содержащую восстанавливающий агент, дополнительно инкубируют на протяжении от примерно 4 часов до примерно 7 дней.
16. Способ по п. 15, где комбинированную культуральную среду, содержащую восстанавливающий агент, дополнительно инкубируют на протяжении примерно 15 часов.
17. Способ по п. 16, где восстанавливающий агент добавляют к комбинированной культуральной среде до выделения гетеромультимерного белка из комбинированной культуральной среды.
18. Способ по п. 17, где комбинированную культуральную среду, содержащую восстанавливающий агент, инкубируют на протяжении, по меньшей мере, примерно 24 часов перед выделением гетеромультимерного белка.
19. Способ по п. 18, где гетеромультимерный белок выделяют с использованием колонки с белком A.
20. Способ получения гетеромультимерного белка, включающего i) первый полипептид, содержащий шарнирный участок, имеющий первый домен гетеродимеризации, где первый полипептид, содержащий шарнирный участок, связан с первой легкой цепью, и ii) второй полипептид, содержащий шарнирный участок, имеющий второй домен гетеродимеризации, где второй полипептид, содержащий шарнирный участок, связан со второй легкой цепью, где второй домен гетеродимеризации взаимодействует с первым доменом гетеродимеризации на поверхности взаимодействия, и где первый и второй полипептиды, содержащие шарнирный участок, соединены, по меньшей мере, одной межцепьевой дисульфидной связью, где способ включает следующие стадии:
(a) культивирование первой клетки-хозяина, способной экспрессировать первый гомодимер, где первый гомодимер включает два первых полипептида, содержащих шарнирные участки, и связанные с ними легкие цепи;
(b) культивирование второй клетки-хозяина, способной экспрессировать второй гомодимер, где второй гомодимер включает два вторых полипептида, содержащих шарнирные участки, и связанные с ними легкие цепи;
(c) получение комбинированной культуральной среды от первой клетки-хозяина и второй клетки-хозяина;
(c) инкубирование комбинированной культуральной среды в восстанавливающих условиях, достаточных для образования гетеромультимерного белка, и;
(d) получение гетеромультимерного белка.
21. Способ по любому из пп. 14-20, где восстанавливающий агент выбран из группы, состоящей из глутатиона, 2-меркаптоэтанола, 2-меркаптоэтиламина, трис(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР), цистеина, цистеина, дитиотрейтола, цистеина дитиотрейтола, дитиобутиламина или их комбинации.
22. Способ по п. 21, где восстанавливающий агент представляет собой глутатион, и где глутатион добавляют в концентрации от примерно 5 мМ до не более чем примерно 20 мМ.
23. Способ по п. 22, где восстанавливающий агент представляет собой глутатион, и где глутатион добавляют в концентрации от примерно 2 мМ до примерно 10 мМ.
24. Способ по п. 22, где восстанавливающий агент представляет собой глутатион, и где глутатион добавляют в концентрации от примерно 5 мМ до не более чем примерно 20 мМ.
25. Способ по п. 24, где восстанавливающий агент представляет собой глутатион, и где глутатион добавляют в концентрации примерно 15 мМ.
26. Способ по любому из пп. 1-25, где первая клетка-хозяин представляет собой стабильную клеточную линию.
27. Способ по любому из пп. 1-26, где вторая клетка-хозяин представляет собой стабильную клеточную линию.
28. Способ по любому из пп. 1-27, где первая клетка-хозяин представляет собой клетку CHO.
29. Способ по любому из пп. 1-28, где вторая клетка-хозяин представляет собой клетку CHO.
30. Способ по любому из пп. 1-29, где соотношение первой клетки-хозяина и второй клетки-хозяина оптимизируют таким образом, что молярное соотношение первого полипептида, содержащего шарнирный участок, и второго полипептида, содержащего шарнирный участок, составляет от примерно 1:10 до примерно 10:1 после объединения культуры первых клеток-хозяев и культуры вторых клеток-хозяев и получения комбинированной культуры клеток.
31. Способ по п. 30, где молярное соотношение первого полипептида, содержащего шарнирный участок, экспрессируемого первой клеткой-хозяином, и второго полипептида, содержащего шарнирный участок, экспрессируемого второй клеткой-хозяином, составляет примерно 1:1 после объединения культуры первых клеток-хозяев и культуры вторых клеток-хозяев и получения комбинированной культуры клеток.
32. Способ по любому из пп. 1-31, где полипептиды, содержащие шарнирный участок, включают участок Fc или его вариант.
33. Способ по любому из пп. 1-32, где первый и/или второй полипептид, содержащий шарнирный участок, включает тяжелую цепь антитела.
34. Способ по любому из пп. 1-33, где первый домен гетеродимеризации включает модификацию выступ на поверхности взаимодействия и второй домен гетеродимеризации включает модификацию впадину на поверхности взаимодействия.
35. Способ по п. 34, где модификация выступ включает замену исходного аминокислотного остатка из первого домена гетеродимеризации на аминокислотный остаток с боковой цепью большего размера, чем у исходного аминокислотного остатка.
36. Способ по п. 35, где замещающий аминокислотный остаток выбран из группы, состоящей из триптофана, фенилаланина, тирозина и аргинина.
37. Способ по п. 36, где модификация впадина включает замену исходного аминокислотного остатка из второго домена гетеродимеризации на аминокислотный остаток с боковой цепью меньшего размера, чем у исходного аминокислотного остатка.
38. Способ по п. 37, где замещающий аминокислотный остаток выбран из группы, состоящей из серина, треонина, валина и аланина.
39. Способ по любому из пп. 34-38, где модификация выступ включает замену T366W (нумерация EU).
40. Способ по любому из пп. 34-39, где модификация впадина включает две или больше аминокислотных замен, выбранных из группы, состоящей из T366S, L368A и Y407V (нумерация EU).
41. Способ по любому из пп. 1-40, где указанная межцепьевая дисульфидная связь находится между шарнирными участками.
42. Способ по любому из пп. 1-41, где гетеромультимерный белок представляет собой антитело.
43. Способ по любому из пп. 1-42 где гетеромультимерный белок представляет собой биспецифическое антитело.
44. Способ по п. 43, где антитело представляет собой гуманизированное или человеческое антитело.
45. Способ по п. 44, где антитело представляет собой полноразмерное антитело.
H
H
46. Способ по п. 45, где антитело представляет собой фрагмент антитела, включающий, по меньшей мере, часть человеческого домена C2 и/или домена C3.
47. Способ по любому из пп. 42-46, где антитело выбрано из группы, состоящей из IgG, IgA и IgD.
48. Способ по п. 47, где антитело представляет собой IgG.
49. Способ по 48, где антитело представляет собой IgG1, IgG2 или IgG4.
50. Способ по любому из пп. 1-49, где первая легкая цепь и вторая легкая цепь включают разные последовательности вариабельных доменов.
51. Способ получения гетеромультимерного белка, включающего i) первый полипептид, содержащий шарнирный участок, имеющий первый домен гетеродимеризации, где первый полипептид, содержащий шарнирный участок, связан с первой легкой цепью, и ii) второй полипептид, содержащий шарнирный участок, имеющий второй домен гетеродимеризации, где второй полипептид, содержащий шарнирный участок, связан со второй легкой цепью, где второй домен гетеродимеризации взаимодействует с первым доменом гетеродимеризации на поверхности взаимодействия, и где первый и второй полипептиды, содержащие шарнирный участок, соединены, по меньшей мере, одной межцепьевой дисульфидной связью, где способ включает следующие стадии:
(a)культивирование комбинированной культуры клеток из первой клетки-хозяина и второй клетки-хозяина, где первая клетка-хозяин способна экспрессировать первый полипептид, содержащий шарнирный участок, и первую легкую цепь, где вторая клетка-хозяин способна экспрессировать второй полипептид, содержащий шарнирный участок, и вторую легкую цепь, и где первая клетка-хозяин и вторая клетка-хозяин представляют собой клетку млекопитающего;
(b)добавление восстанавливающего агента к комбинированной культуральной среде; и
(c)сбор комбинированной культуральной среды от комбинированной культуры клеток без разрушения клеточной мембраны, где комбинированная культуральная среда включает гетеромультимерный белок.
52. Способ по п. 51, где первая клетка-хозяин секретирует первый гомодимер, включающий два первых полипептида, содержащих шарнирные участки, и две первых легких цепи, где вторая клетка-хозяин секретирует второй гомодимер, включающий два вторых полипептида, содержащих шарнирные участки и две вторые легкие цепи.
53. Способ по п. 51 или 52, где комбинированную культуральную среду собирают через 4-24 часа после добавления восстанавливающего агента.
54. Способ по любому из пп. 51-53, где стадия сбора комбинированной культуральной среды включает удаление первой клетки-хозяина и второй клетки-хозяина из комбинированной культуральной среды.
55. Способ по любому из пп. 51-54, где комбинированную культуральную среду инкубируют на протяжении от 4 часов до 7 дней.
56. Гетеромультимерный белок, полученный способом по любому из пп. 1-55.
57. Гетеромультимерный белок по п. 56, где гетеромультимерный белок представляет собой биспецифическое антитело.
58. Композиция, включающая гетеромультимерный белок по п. 56 или 57 и фармацевтически приемлемый носитель.
59. Клетка-хозяин, включающая полинуклеотид или рекомбинантный вектор, кодирующий первый полипептид гетеромультимерного белка по п. 56 или 57, содержащий шарнирный участок, где первая клетка-хозяин не экспрессирует второй полипептид гетеромультимерного белка, содержащий шарнирный участок.
60. Клетка-хозяин по п. 59, где полипептид, содержащий шарнирный участок, представляет собой тяжелую цепь антитела.
61. Клетка-хозяин по п. 59 или 60, где полипептид, содержащий шарнирный участок, образует пару с легкой цепью антитела.
62. Клетка-хозяин по любому из пп. 59-61, где клетка-хозяин представляет собой стабильную клеточную линию.
63. Клетка-хозяин по любому из пп. 59-62, где клетка-хозяин представляет собой клетку млекопитающего.
64. Клетка-хозяин по пп. 59-63, где клетка-хозяин представляет собой клетку CHO.