ПРИМЕНЕНИЕ АЛЬФАВИРУСА В ПОЛУЧЕНИИ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ
USE OF ALPHAVIRUS IN PREPARATION OF ANTITUMOR DRUGS

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение принадлежит к области биомедицины и оно также относится к применению альфавируса в получении противоопухолевых лекарственных средств.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Опухоли проистекают из кумулятивного изменения генов и эпигенетических факторов в нормальных клетках, и такое изменение способствует превращению нормальных клеток в злокачественные опухоли. Этот сложный процесс патологических изменений определяет разнообразие механизмов генеза, поддержания и метастазирования различных опухолей. В настоящее время удаление хирургическим путем, химиотерапия и лучевая терапия являются распространенными способами клинической терапии опухолей, хотя после удаления хирургическим путем опухоли склонны к рецидиву, а токсические и побочные эффекты химиотерапии и лучевой терапии являются очевидными.
15-20% видов рака человека ассоциированы с вирусной инфекцией, например, вирус гепатита B (HBV) и вирус гепатита C (HCV) ассоциированы с видами рака печени, а папилломавирус человека (HPV) ассоциирован с видами рака шейки матки и т.п.
th
Альфавирус принадлежит к семейству Togaviridae и он представляет собой тип вируса, содержащего одноцепочечную РНК, с оболочечной структурой, передающийся главным образом членистоногими в качестве средства передачи. 13 из 29 типов альфавирусов могут вызывать заболевания у людей и животных (David M. Knipe, Peter M. Howley, Chapter 23, Alphaviruses, Fields Virology 6 edition: 651-685, 2013).
Вирус венесуэльского лошадиного энцефалита, относящийся к альфавирусам, может выступать в качестве вектора для трансдукции дендритных клеток с целью лечения опухолей (Moran TP, Burgents JE, Long B, et al: Alphaviral vector-transduced dendritic cells are successful therapeutic vaccines against neu-overexpressing tumors in wild-type mice. Vaccine 25: 6604-6612, 2007). Однако такой вирус вызывал у людей лихорадку, судороги, прерывание беременности и даже смерть, так что проблемы избирательности и безопасности существенно влияют на применение вируса в противоопухолевой терапии.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Целью настоящего изобретения является обеспечение безопасного и эффективного вирусного противоопухолевого лекарственного средства.
Дополнительной целью настоящего изобретения является обеспечение безопасного и эффективного вирусного противоопухолевого лекарственного средства, действующего в отношении конкретного типа опухоли.
Дополнительной целью настоящего изобретения является обеспечение безопасного и эффективного вирусного противоопухолевого лекарственного средства, действующего в отношении конкретных индивидуума/опухоли.
Дополнительной целью настоящего изобретения является обеспечение эффективных системы введения и способа введения противоопухолевых средств.
Дополнительной целью настоящего изобретения является обеспечение более эффективного противоопухолевого лекарственного средства и способа лечения опухоли.
Вышеупомянутые цели достигаются в настоящем изобретении посредством следующего технического решения.
Настоящее изобретение обеспечивает применение альфавируса в получении противоопухолевых лекарственных средств, где альфавирус представляет собой вирус M1 или вирус Гета.
Вирус M1 (альфавирус M1) принадлежит к роду Alphavirus и он был выделен у комаров Culex на острове Хайнань в Китае в 1964 г. (Li XD, et al: Isolation of Getah virus from mosquitos collected on Hainan Island, China, and results of a serosurvey. Southeast Asian J Trop Med Public Health 23: 730-734, 1992). Полную последовательность генома вируса M1 определили в 2008 г. (Zhai YG, et al: Complete sequence characterization of isolates of Getah virus (genus Alphavirus, family Togaviridae) from China. J Gen Virol 89: 1446-1456, 2008). Способ сбора данных о нем является необязательным, но не ограничен сбором данных с помощью способа, описанного в вышеприведенных литературных источниках, или следующей информацией о депонировании (номер депонирования: CCTCC V201423; дата депонирования: 17 июля 2014 г.; классификация и номенклатура: альфавирус M1; депозитарий: Китайский центр коллекции типовых культур; адрес депонирования: Уханьский университет у Лоцзяшань, округ Учан, Ухань, провинция Хубэй).
Результаты предыдущих исследований вируса M1, проведенных исследователями, являющимися авторами настоящего изобретения, свидетельствовали о том, что вирус M1 обладал уничтожающим эффектом в отношении некоторых опухолевых клеток, таких как злокачественные клетки глиомы крыс C6, злокачественные клетки глиомы человека U251 и U-87; однако он не был эффективным в уничтожении некоторых других опухолевых клеток, таких как злокачественные клетки глиомы человека T98G. Эти исследования неспособны подтвердить, что вирус M1 обладает эффективным противоопухолевым эффектом.
Настоящее изобретение дополнительно обеспечивает типы опухолей, к которым вирус применим в большей степени, в целях улучшения эффективности терапии при применении вируса M1 в качестве противоопухолевого лекарственного средства.
Более предпочтительно, применение вируса M1 в настоящем изобретении в качестве противоопухолевого лекарственного средства является эффективным в лечении одного или более из рака печени, рака ободочной и прямой кишки, рака мочевого пузыря, рака молочной железы, рака шейки матки, рака предстательной железы, глиомы, меланомы, рака поджелудочной железы, назофарингеальной карциномы, рака легкого и рака желудка.
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что вирус M1 вызывает клеточную гибель в различной степени у различных опухолевых клеток. Через 48 часов после обработки опухолевых клеток вирусом M1 (MOI = 10) показатели клеточной гибели для рака поджелудочной железы, назофарингеальной карциномы, рака предстательной железы и меланомы составляют более 50%; показатели клеточной гибели для рака ободочной и прямой кишки (LoVo, HCT-8, SW620 и SW480), рака печени (Hep3B, Huh-7 и Huh-6), рака мочевого пузыря и рака молочной железы составляют более 40%; показатели клеточной гибели для глиомы, рака шейки матки, рака легкого составляют более 30%; показатель клеточной гибели для рака желудка составляет более 20%. Вышеприведенные результаты позволяют предположить, что вирус M1 в качестве противоопухолевого лекарственного средства оказывает наиболее значительные эффекты на такие типы опухолей: рак поджелудочной железы, назофарингеальную карциному, рак предстательной железы и меланому; при этом за ними следуют опухоли типа рака ободочной и прямой кишки, рака печени, рака мочевого пузыря и рака молочной железы; при этом далее за ними следуют опухоли типа глиомы, рака шейки матки, рака легкого; при этом наименее значительные эффекты имеют место при опухоли типа рака желудка.
Поскольку вирус M1 принадлежит к Гета-подобным вирусам и его гомология с вирусом Гета составляет до 97,8%, специалист в данной области имеет основание признать, исходя из противоопухолевого эффекта вируса M1, что вирус Гета также обладает сходным вирусу M1 действием и эффектом.
Дополнительно, настоящее изобретение обеспечивает способ более точного и эффективного обеспечения терапевтической схемы и терапевтического лекарственного средства, действующего в отношении конкретных индивидуума/опухоли, а также сопутствующего лекарственного средства, действующего в отношении конкретных индивидуума/опухоли.
Авторы настоящего изобретения впервые обнаружили, что вирус подходил для обработки опухолей с низкой экспрессией ZAP или ZAP-отрицательных опухолей, предпочтительно для обработки солидных опухолей с низкой экспрессией ZAP или ZAP-отрицательных солидных опухолей.
Было обнаружено, что эффективность терапии вирусом M1 в отношении опухоли тесно связана с регуляцией экспрессии ZAP в опухоли. Репликация вируса M1 ингибируется с помощью ZAP, экспрессия которого в различных типах опухолей имеет низкий уровень или является отрицательной. Вирусом M1 можно осуществлять избирательную обработку характеризующихся низкой экспрессией ZAP или ZAP-отрицательных опухолей/индивидуумов.
ZAP является сокращением от противовирусного белка 1 с "цинковыми пальцами" CCCH-типа, его английским названием является "zinc finger CCCH-type antiviral protein 1", и он кодируется геном zc3hav1. Сообщается, что в клетках ZAP ингибирует репликацию определенных вирусов, таких как вирус Эбола и вирус Марбург, посредством механизма индукции разрушения РНК и ингибирования трансляции. Однако ZAP не оказывает ингибирующего эффекта на репликацию других вирусов, таких как вирус везикулярного стоматита, полиовирус и вирус желтой лихорадки и т.п.
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что вирус M1 может вызывать значительную клеточную гибель в характеризующихся низкой экспрессией ZAP/ZAP-отрицательных линиях клеток, и характеризующиеся низкой экспрессией ZAP/ZAP-отрицательные опухолевые ткани организма животного, несущего опухоль, были обогащены вирусом M1, ингибирующим рост опухоли. В то же время вирус M1 ингибирует выживаемость характеризующихся низкой экспрессией ZAP/ZAP-отрицательных живых опухолевых тканей человека ex vivo.
Авторы настоящего изобретения впервые обнаружили, что во многих различных типах опухолей уровень экспрессии ZAP в опухолевых тканях ниже, чем в параканкрозных неопухолевых тканях. Иммуногистохимический анализ различных типов клинических патологических образцов опухоли указывал на то, что в 69% раковых тканей печени, 52% раковых тканей ободочной и прямой кишки и 61% раковых тканей мочевого пузыря уровни экспрессии ZAP являются значительно более низкими, чем в соответствующих параканкрозных неопухолевых тканях. Вирус M1 можно применять для избирательной обработки характеризующихся низкой экспрессией ZAP/ZAP-отрицательных опухолей.
Результаты эксперимента впервые предоставили доказательство того, что ZAP ингибировал репликацию вируса M1, и уровень экспрессии ZAP был решающим фактором, влияющим на эффект вируса M1, заключающийся в избирательной индукции гибели опухолевых клеток и ингибировании роста опухоли. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что противоопухолевый эффект вируса M1 был непосредственно связан с уровнем экспрессии ZAP. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что в случае инфицирования опухолевых клеток с нокдауном ZAP вирусом M1 показатель выживаемости опухолевых клеток значительно снижался по сравнению с опухолевыми клетками без нокдауна ZAP. Таким образом, в качестве необязательной предпочтительной терапевтической схемы, если пациента с раком обрабатывают вирусом M1, то вместе с этим или перед этим можно вводить ингибитор ZAP с целью улучшения чувствительности опухоли к вирусу M1.
Таким образом, в целях дополнительного улучшения эффективности терапии вирусом M1 в качестве противоопухолевого лекарственного средства при применении терапевтической схемы вначале можно определить уровень экспрессии ZAP у пациента, а затем можно специфическим образом применять терапевтическую схему с использованием вируса M1, тем самым улучшая эффективность терапевтической схемы и избегая задержки по времени в связи с неэффективным введением, а также избегая неправильного употребления лекарственного средства. Например, вначале выявляют уровень экспрессии ZAP в опухоли у пациента до введения, и если опухоль характеризуется низкой экспрессией ZAP или отрицательной экспрессией ZAP, то можно непосредственно проводить терапию вирусом M1; если опухоль характеризуется нормальным уровнем экспрессии ZAP/высоким уровнем экспрессии ZAP, то можно давать ингибитор ZAP до или во время введения вируса M1, тем самым улучшая чувствительность опухоли к вирусу M1 и улучшая эффективность терапии. Указанный ингибитор ZAP представляет собой, например, ингибитор экспрессии или функции ZAP, интерферирующий фрагмент для ZAP или антитело к ZAP и т.п. Величина экспрессии ZAP у опухоли непосредственно влияет на эффективность терапии с помощью M1. Чем более низкой является величина экспрессии ZAP у опухоли, тем более эффективной является ее обработка с помощью M1. Для определения того, подходят ли определенные индивидуум/опухоль для обработки с помощью M1 или нет, можно вначале выявить уровень экспрессии ZAP в опухоли. Уровень экспрессии ZAP предпочтительно можно определить посредством без ограничения следующих способов.
Низкая или высокая экспрессия ZAP относится к заключению, полученному в результате сравнения количества мРНК или белка ZAP между двумя группами образцов или двумя образцами. Если количество мРНК или белка ZAP в одной группе образцов или в одном образце является меньшим или большим такового в другой группе образцов или в другом образце, то данный образец называют соответственно образцом с низкой или высокой экспрессией ZAP; ZAP-отрицательные относятся к тем, у которых вообще отсутствует экспрессия мРНК или белка ZAP. Наборы образцов, применяемые для сравнения количества мРНК и белка ZAP, могут представлять собой: опухолевые клетки в сравнении с нормальными клетками, опухолевые ткани в сравнении с параканкрозными неопухолевыми тканями или опухоли, обработка которых с помощью M1 является эффективной, в сравнении с опухолями, обработка которых с помощью M1 не является эффективной.
В качестве необязательного способа, высокая, низкая или отрицательная экспрессия ZAP в опухолях означает, что мРНК и белок ZAP в опухолевых тканях соответственно находятся в большем, меньшем количестве или не экспрессируются по сравнению с соответствующими параканкрозными неопухолевыми тканями. Если нормализованная величина экспрессии мРНК или белка ZAP в первом случае (опухолевые ткани) меньше, чем в последнем случае (параканкрозные неопухолевые ткани), другими словами, если соотношение нормализованной величины экспрессии ZAP у опухолевых тканей и таковой у параканкрозных неопухолевых тканей составляет < 1, то данный случай относится к низкой экспрессии ZAP и, таким образом, является подходящим для обработки с помощью M1. Более эффективно, объектом терапии является опухоль, в которой соотношение нормализованной величины экспрессии ZAP у опухолевых тканей и таковой у параканкрозных неопухолевых тканей составляет < 0,8, более предпочтительно < 0,6, более предпочтительно < 0,4, более предпочтительно < 0,3, более предпочтительно < 0,2, более предпочтительно < 0,1, и наиболее предпочтительно, опухолевая ткань является ZAP-отрицательной. Эти опухолевые ткани и соответствующие параканкрозные неопухолевые ткани включают без ограничения образцы тканей, полученные в результате пункции патологического очага или хирургического удаления. В клиническом исследовании обнаружили, что в определенных опухолевых тканях величина экспрессии ZAP даже превышает таковую в параканкрозных неопухолевых тканях, и эти опухоли или пациенты с опухолями не подходят для непосредственного введения M1 в целях терапии.
Способ выявления мРНК или белка ZAP включает без ограничения QRT-PCR, нозерн-блоттинг, вестерн-блоттинг, иммуногистохимический анализ, ELISA и т.п. Для точного определения различия в количестве мРНК или белка ZAP между различными образцами вначале рассчитывают нормализованную величину экспрессии мРНК или белка ZAP у каждого образца. Нормализованная величина экспрессии относится к значению экспрессии мРНК или белка ZAP у каждого образца, деленному на значение экспрессии мРНК или белка у внутреннего стандартного образца, и анализ с нормализацией проводят для получения нормализованной величины экспрессии ZAP у образца. В различных способах выявления внутренние стандарты могут быть разными, и их общей характеристикой является то, что величины экспрессии внутренних стандартов в различных образцах клеток или тканей являются идентичными, и поэтому посредством такого анализа с нормализацией можно сравнить величины экспрессии ZAP в различных образцах, чтобы определить различие в количестве мРНК или белка ZAP между образцами.
-Ct
-Ct-ZAP
-Ct-внутренний стандарт
В одном иллюстративном примере настоящего изобретения (фигура 4) для эффектов ингибирования роста со стороны M1 в отношении культивируемых ex vivo живых раковых тканей печени и раковых тканей ободочной и прямой кишки человека среди двух видов тканей получают различные результаты ингибирования (таблица 2 и таблица 3), где в целом до 32 образцов демонстрируют показатель ингибирования роста опухоли, составляющий более 10%, тогда как 19 образцов демонстрируют показатель ингибирования роста опухоли, составляющей менее 10% или равный этому значению. Уровни экспрессии ZAP и мРНК внутреннего стандарта в каждой опухолевой ткани в этих двух группах дополнительно анализируют с помощью способа QRT-PCR (получая, соответственно, значение 2), и значение 2для каждого образца делят на значение 2с получением соответствующей нормализованной величины экспрессии ZAP. На основании статистического анализа нормализованной величины экспрессии ZAP у образцов в двух вышеприведенных группах обнаружено, что нормализованная величина экспрессии ZAP в группе образцов с показателем ингибирования более 10% составляет 0,117 ± 0,890, и она является более низкой, чем в группе с показателем ингибирования, меньшим или равным 10% (0,791 ± 0,108), и соотношение этих двух средних значений составляет 0,148.
В качестве другого необязательного способа, высокая, низкая или отрицательная экспрессия ZAP в опухоли означает, что мРНК и белок ZAP в опухолевых клетках (например, в полученных из опухоли пациента культивируемых опухолевых клетках) находятся в большем, меньшем количестве или не экспрессируются по сравнению с нормальными клетками. Если нормализованная величина экспрессии мРНК или белка ZAP в первом случае меньше, чем в последнем случае (т.е. соотношение нормализованной величины экспрессии ZAP у опухолевых клеток и таковой у нормальных клеток составляет < 1), то данный случай относится к низкой экспрессии ZAP и он является подходящим для терапии с помощью M1. Более эффективным объектом терапии является опухоль, в которой соотношение нормализованной величины экспрессии ZAP у опухолевых клеток и таковой в нормальных клеток составляет < 0,8, более предпочтительно < 0,6, более предпочтительно < 0,4, более предпочтительно < 0,3, более предпочтительно < 0,2, более предпочтительно < 0,1, и наиболее предпочтительно опухолевая клетка является ZAP-отрицательной.
В иллюстративном примере настоящего изобретения (фигура 3c) различие в уровне экспрессии белка ZAP между линией раковых клеток печени HepG2 и линией нормальных клеток печени L-02 выявляют с помощью способа вестерн-блоттинга, и в то же время выявляют эталонный стандарт β-актин, величина экспрессии которого идентична среди различных образцов, при этом на шкале серых тонов полосы выявления вестерн-блоттинга представлено количество выявленных молекул. Нормализованная величина экспрессии белка ZAP = (среднее значение по шкале серых тонов полосы ZAP)/(среднее значение по шкале серых тонов полосы β-актина). Соотношение нормализованной величины экспрессии белка ZAP у HepG2 и таковой у L-02 составляет 0,8, экспрессия ZAP в HepG2 является низкой. После инфицирования вирусом M1 показатель выживаемости клеток HepG2 составляет лишь 70,4% ± 3,5%, тогда как показатель выживаемости L-02 при такой же обработке составляет 100,3 ± 10,0%, при этом различие между их показателями выживаемости является статистически значимым.
В другом иллюстративном примере (фигура 3a и фигура 3b) в линиях опухолевых клеток T24, SCaBER, LoVo и Hep3B мРНК (фигура 3a) и белок (фигура 3b) ZAP выявляют с помощью QRT-PCR и вестерн-блоттинга и затем сравнивают с соответствующими внутренними стандартами с получением нормализованных величин экспрессии, невыявляемых или близких к 0 (< 0,1), иными словами, экспрессия ZAP является отрицательной или близкой к отрицательной (< 0,1); после инфицирования этих опухолевых клеток с помощью M1 индуцируется клеточная гибель, и показатель выживаемости клеток значительно снижается до: T24 - 21,1%, SCaBER - 11,5%, LoVo - 6,9% и Hep3B - 3,8% (таблица 1). Для нормальных клеток L-02 и HEB, как показано на фигуре 3a и фигуре 3b, соотношение нормализованной величины экспрессии мРНК (фигура 3a) или белка ZAP и таковой у вышеупомянутых опухолевых клеток составляет более 1, что относится к высокой экспрессии ZAP, и после инфицирования с помощью M1 не индуцируется явное снижение показателя выживаемости этих нормальных клеток. Показатель выживаемости у L-02 составляет 100,3%, а у HEB составляет 98,8% (таблица 1).
Таким образом, настоящее изобретение также обеспечивает систему введения противоопухолевых средств, где она содержит реагент для выявления уровня экспрессии ZAP и альфавирус; при этом альфавирус представляет собой вирус M1 или вирус Гета. Сперва выявляют уровень экспрессии ZAP в опухоли пациента, а затем специфическим образом применяют подходящую схему введения.
Настоящее изобретение также обеспечивает противоопухолевое лекарственное средство, содержащее альфавирус и ингибитор ZAP; при этом альфавирус представляет собой вирус M1 или вирус Гета. Ингибитор ZAP представляет собой ингибитор экспрессии или функции ZAP, интерферирующий фрагмент для ZAP или антитело к ZAP и т.п.
Чтобы избежать эффекта уничтожения нормальных клеток вирусом M1, ингибитор ZAP предпочтительно специфическим образом доставляется в опухолевые ткани или нацеливается на них, будучи нацеленным на опухоль ингибитором ZAP.
В качестве необязательного варианта осуществления противоопухолевое лекарственное средство, обеспечиваемое настоящим изобретением, может представлять собой инъекционную форму, таблетку, капсулу или пластырь и т.п. В качестве предпочтительного варианта осуществления противоопухолевое лекарственное средство по настоящему изобретению представляет собой инъекционную форму; предпочтительно осуществляют внутривенную инъекцию.
5
9
6
10
В качестве необязательного способа введения вирус M1 по настоящему изобретению можно вводить путем внутривенной или внутриопухолевой инъекции. При внутриопухолевой инъекции ежедневно вводят 2 × 10БОЕ/кг - 2 × 10БОЕ/кг; при внутривенной инъекции ежедневно вводят 2 × 10БОЕ/кг - 2 × 10БОЕ/кг. По сравнению с контрольной группой с растворителем в группе с вирусом M1 происходило значительное ингибирование роста опухолей.
По сравнению с предшествующим уровнем техники настоящее изобретение имеет следующие благоприятные эффекты.
Противоопухолевые лекарственные средства, обеспечиваемые настоящим изобретением, можно применять для лечения различных типов опухолей, в том числе рака печени, рака ободочной и прямой кишки, рака мочевого пузыря, рака молочной железы, рака шейки матки, рака предстательной железы, глиомы, меланомы, рака поджелудочной железы, назофарингеальной карциномы, рака легкого и рака желудка. Цитологические эксперименты предоставляют доказательство того, что вирус M1 вызывает гибель определенных типов опухолевых клеток; эксперименты на животных предоставляют доказательство того, что вирус M1 in vivo в значительной степени ингибирует рост раковых опухолей печени и раковых опухолей ободочной и прямой кишки; эксперименты по культивированию живых опухолевых тканей человека ex vivo предоставляют доказательство того, что вирус M1 в значительной степени ингибирует выживаемость раковых тканей печени и раковых тканей ободочной и прямой кишки.
С помощью противоопухолевых лекарственных средств, обеспечиваемых настоящим изобретением, можно преимущественно лечить характеризующиеся низкой экспрессией ZAP/ZAP-отрицательные опухоли, в том числе без ограничения рак печени, рак ободочной и прямой кишки, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, рак предстательной железы, глиому, меланому, рак поджелудочной железы, назофарингеальную карциному, рак легкого и рак желудка.
2
6
Противоопухолевое лекарственное средство, обеспечиваемое настоящим изобретением, обладает избирательной противоопухолевой активностью при надлежащей безопасности. Вирус M1 может вызывать избирательную гибель опухолевых клеток, но он не оказывает эффекта на выживаемость нормальных клеток, что означает, что вирус M1 обладает избирательностью в отношении опухолевых клеток. В организме "голых" мышей, несущих опухоль, опухолевые ткани в высокой степени обогащены внутривенно инъецируемым вирусом M1, тогда как существующее в нормальных тканях количество вируса является более низким, и вышеуказанные два вида тканей различаются по количеству вируса приблизительно в 10 - 10 раз. Это предоставляет дополнительное доказательство того, что вирус M1 избирательно влияет на опухоль. В дополнение, введение вируса M1 не влияет на массу тела и психическое состояние "голой" мыши, что указывает на то, что вирус M1 обладает надлежащей безопасностью.
Настоящее изобретение впервые обеспечивает безопасное и эффективное вирусное противоопухолевое лекарственное средство, действующее в отношении конкретных индивидуума/опухоли. С помощью лекарственного средства по настоящему изобретению осуществляют избирательное лечение характеризующихся низкой экспрессией ZAP/ZAP-отрицательных опухолей, тем самым повышая показатель эффективности дозы, избегая неэффективного введения и неправильного употребления лекарственного средства.
Настоящее изобретение обеспечивает более эффективные способ введения и систему введения. Вначале выявляют уровень экспрессии ZAP в опухоли пациента, затем проводят терапию лекарственным средством специфическим образом или при содействии других средств для проведения терапии, тем самым повышая специфичность и эффективность терапии вирусом M1.
Настоящее изобретение обеспечивает более эффективные противоопухолевое лекарственное средство и способ терапии опухолей; ингибитор ZAP добавляют до введения или во время введения, тем самым повышая чувствительность опухолей к лекарственному средству.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
На фигуре 1 показано, что вирус M1 вызывает значительный цитопатический эффект в опухолях;
a) показано, что инфицирование вирусом M1 вызывает цитоморфологическое изменение опухолей;
b) показано, что инфицирование вирусом M1 не оказывает эффекта на морфологические характеристики линий нормальных клеток. Контроль представляет контрольную группу со средой OptiPRO™SFM, M1 представляет экспериментальную группу, инфицированную вирусом M1.
На фигуре 2 показано, что вирус M1 эффективно ингибирует рост опухоли у мышей, несущих опухоль;
a) показано влияние вируса M1 на объем опухоли и массу тела животных у мышей, несущих опухоль из Hep3B, после обработки с помощью внутриопухолевой инъекции M1, где M1 представляет группу, обработанную вирусом M1, растворитель представляет контрольную группу с растворителем средой OptiPRO™SFM (n=9);
b) показано влияние вируса M1 на объем опухоли и массу тела животных у мышей, несущих опухоль из LoVo, после обработки с помощью внутриопухолевой инъекции M1 (n=11);
c) показано влияние вируса M1 на объем опухоли и массу тела животных у мышей, несущих опухоль из Hep3B, после обработки с помощью внутривенной инъекции M1 (n=9);
d) показано распределение M1 в тканях мышей, несущих опухоль из Hep3B, после обработки с помощью внутривенной инъекции вируса M1. Проводят выявление с помощью QRT-PCR (n=6).
Данные об объеме опухоли и массе тела представлены как среднее значение ± стандартное отклонение, и статистическим способом является способ ANOVA; стрелки представляют группу, обработанную вирусом M1, кружки представляют контрольную группу со средой OptiPRO™SFM, ns представляет отсутствие статистической значимости; i.t представляет внутриопухолевую инъекцию, i.v представляет внутривенную инъекцию; и * представляет отсутствие выявленной экспрессии мРНК вируса M1.
На фигуре 3 показано, что вирус M1 вызывает избирательную клеточную гибель в характеризующихся низкой экспрессией ZAP/ZAP-отрицательных опухолях;
a) показана дифференциальная экспрессия и величина экспрессии мРНК ZAP в различных клетках; и ND представляет отсутствие выявленной экспрессии мРНК ZAP;
b) показана дифференциальная экспрессия и величина экспрессии белка ZAP у различных клеток; и β-актин представляет собой внутренний стандарт;
c) показаны уровень белка ZAP в клетках и изменение показателя выживаемости клеток, вызванное инфицированием вирусом M1. β-актин представляет собой внутренний стандарт. Проводят статистический анализ с применением критерия Стьюдента. ** P < 0,01;
d) показано, что для нормальных клеток L-02, опухолевых клеток PLC и HCT116 после нокдауна ZAP вирус M1 индуцировал значительную клеточную гибель. Незакрашенные кружки/незакрашенные треугольники/незакрашенные перевернутые треугольники представляют группы с интерференционным нокдауном ZAP, закрашенные кружки/закрашенные треугольники/закрашенные перевернутые треугольники представляют группы отрицательного контроля, обработанные интерферирующим фрагментом с неупорядоченным кодом. Для статистического анализа применяли критерий Стьюдента, */#/& представляет P < 0,05, && представляет P < 0,01, а ns представляет отсутствие статистической значимости;
e) показано, что для нормальных клеток L-02, опухолевых клеток PLC и HCT116 после нокдауна ZAP относительный титр вируса M1 повышается. Для статистического анализа применяли критерий Стьюдента, и * представляет P < 0,05;
f) показано, что для нормальных клеток L-02, опухолевых клеток PLC и HCT116 после нокдауна ZAP экспрессия РНК вируса M1 повышается. Для статистического анализа применяли критерий Стьюдента, * представляет P < 0,05, и ** представляет P < 0,01;
g) показано, что для нормальных клеток L-02, опухолевых клеток PLC и HCT116 после нокдауна ZAP экспрессия белков NS3 и E1 вируса M1 повышается. GAPDH применяют в качестве внутреннего стандарта;
h) показано, что сверхэкспрессия ZAP частично блокирует гибель опухолевых клеток, вызываемую вирусом M1. Для статистического анализа применяли критерий Стьюдента. # представляет P < 0,05, а ns представляет отсутствие статистической значимости;
i) показано, что для опухолевых клеток со сверхэкспрессией ZAP относительный титр вируса M1 снижается. Для статистического анализа применяли критерий Стьюдента. ** представляет P < 0,01;
j) показано, что для опухолевых клеток со сверхэкспрессией ZAP уровень РНК вируса M1 снижается. Для статистического анализа применяли критерий Стьюдента. ** представляет P < 0,01;
k) показано, что для опухолевых клеток со сверхэкспрессией ZAP экспрессия белков NS3 и E1 вируса M1 повышается. β-актин применяют в качестве внутреннего стандарта.
На фигуре 4 показано, что показатель ингибирования для вируса M1 в отношении живой опухолевой ткани человека ex vivo отрицательно коррелирует с уровнем экспрессии мРНК ZAP.
Экспрессию мРНК ZAP определяют с помощью QRT-PCR. Относительную величину экспрессии ZAP в группе неэффективной обработки вирусом M1 (показатель ингибирования ≤ 10%) сравнивают с таковой в группе эффективной обработки вирусом M1 (показатель ингибирования > 10%). Для тех опухолевых тканей, в которых показатель ингибирования при обработке вирусом M1 составляет менее 10% или равен этому значению, среднее значение нормализованной величины экспрессии ZAP составляет 0,414. Для тех опухолевых тканей, в которых показатель ингибирования при обработке вирусом M1 составляет более 10%, среднее значение величины экспрессии ZAP составляет 0,075. Для статистического анализа применяли критерий суммы рангов, P < 0,05.
На фигуре 5 показана низкая экспрессия ZAP в различных типах клинических патологических опухолевых тканей;
a) показана экспрессия ZAP в клинических патологических опухолевых тканях посредством выявления путем иммуногистохимического окрашивания; N: параканкрозная неопухолевая группа, T: опухолевая группа;
b) показано, что в различных типах клинических патологических опухолевых тканей экспрессия ZAP в опухолевой группе является значительно более низкой, чем в параканкрозной неопухолевой группе; N: параканкрозная неопухолевая группа, T: опухолевая группа; для N и T используется применяемый для статистического анализа критерий суммы рангов, *** P < 0,001;
c) показано, что в различных типах клинических патологических опухолевых тканей экспрессия ZAP в опухолевых тканях является более низкой, чем в параканкрозных неопухолевых тканях.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано следующими вариантами осуществления. Однако варианты осуществления настоящего изобретения не ограничены следующим описанием примеров. Эквивалентные изменения или адаптации, производимые в соответствии с принципом или идеей настоящего изобретения, следует считать находящимися в пределах объема защиты настоящего изобретения.
Материалы и экспериментальные способы, применяемые в настоящем изобретении, являются традиционными материалами и способами, если не указано иное.
Пример 1. Вирус M1 вызывал избирательную гибель опухолевых клеток
1) Вирус M1 вызывает значительные морфологические изменения опухолевой клетки
Материалы
Линия клеток гепатоцеллюлярной карциномы Hep3B, линия клеток переходноклеточной карциномы мочевого пузыря человека T24, линия раковых клеток ободочной и прямой кишки человека LoVo, иммортализированная линия нормальных клеток печени человека L-02, вирус M1, среда DMEM с высоким содержанием глюкозы, среда F-12, инвертированный фазово-контрастный микроскоп.
Способы
2
a) Культивирование клеток: линию клеток гепатоцеллюлярной карциномы человека Hep3B, линию клеток переходноклеточной карциномы мочевого пузыря человека T24 и иммортализированную линию нормальных клеток печени человека L-02 выращивали в полной среде DMEM, содержащей 10% FBS, 100 ед./мл пенициллина и 0,1 мг/мл стрептомицина; линию раковых клеток ободочной и прямой кишки человека LoVo выращивали в полной среде F-12, содержащей 10% FBS, 100 ед./мл пенициллина и 0,1 мг/мл стрептомицина. Все линии клеток помещали в закрытый инкубатор с 5% CO и постоянной температурой 37°C (относительная влажность 95%) для субкультивирования. Рост линий клеток наблюдали при помощи инвертированного микроскопа. Клетки пассировали приблизительно каждые 2-3 дня, и клетки в экспоненциальной фазе роста извлекали для проведения формального эксперимента.
4
b) Наблюдение под микроскопом для изучения клеток: клетки в экспоненциальной фазе роста отбирали и добавляли в полную среду DMEM или F-12 (содержащую 10% фетальную бычью сыворотку, 1% двойное антитело) с получением суспензии клеток. Клетки инокулировали в 24-луночный культуральный планшет при плотности 2,5 × 10/лунка. Через 48 часов после обработки путем инфицирования вирусом M1 (MOI = 1) под инвертированным фазово-контрастным микроскопом наблюдали цитоморфологические изменения.
Результаты
Цитоморфологические характеристики наблюдали под фазово-контрастным микроскопом. Все из клеток Hep3B, клеток T24 и клеток LoVo росли в виде адгезивной монокультуры, и клетки были расположены близко друг к другу, и фенотипы были однородными. Однако через 48 часов после обработки вирусом M1 (MOI = 1) морфологические характеристики клеток явно изменялись. По сравнению с клетками в контрольной группе количество клеток в группе, инфицированной вирусом, явно снижалось. Клеточное тело сжималось в сферическую форму, и его показатель преломления явно повышался, что представляло смертельное патологическое изменение, показанное на фигуре 1a. На фигуре 1b показан эффект инфицирования вирусом M1 в отношении нормальных клеток. Клетки L-02 инфицировали равным титром вируса M1, и явных изменений количества и морфологических характеристик клеток обнаружено не было. Результаты указывают на то, что вирус M1 вызывал избирательную клеточную гибель опухолевых клеток, но не оказывал эффекта на выживаемость нормальных клеток.
2) Вирус M1 избирательно снижал выживаемость линий опухолевых клеток
Материалы
Тридцать четыре линии опухолевых клеток (см. таблицу 1), три иммортализированных линии нормальных клеток человека (см. таблицу 1), вирус M1, среда DMEM с высоким содержанием глюкозы, среда F-12, MTT (тетраметилтиазолилтетразолий).
Способы
3
a) Инокуляция клеток и обработка путем введения: клетки в экспоненциальной фазе роста отбирали и добавляли в полную среду DMEM (или F-12) (содержащую 10% фетальную бычью сыворотку и 1% двойное антитело) с получением суспензии клеток и инокулировали в 96-луночный культуральный планшет при плотности 4 × 10/лунка. Через 12 часов было обнаружено, что клетки полностью прилипли к стенке. Эксперимент разделяли на экспериментальную группу и контрольную группу, экспериментальная группа представляла собой клетки, инфицированные вирусом M1 (MOI = 10); контрольная группа представляла собой контрольную группу с растворителем DMEM с высоким содержанием глюкозы. В двух группах размещали пять составных перегородок с отверстиями.
b) Реакция MTT с сукцинатдегидрогеназой в клетках: при культивировании до 48 часов в каждую лунку добавляли 15 мкл MTT (5 мг/мл), и инкубирование продолжали в течение 4 часов. При микроскопическом исследовании наблюдали образование зернистых синих и пурпурных кристаллов формазана в живых клетках.
c) Растворение частиц формазана: надосадочную жидкость осторожно отсасывали и добавляли 100 мкл/лунка DMSO для растворения полученного в результате кристалла, затем полученный в результате растворитель встряхивали на микроосцилляторе в течение 5 минут и для каждой лунки выявляли оптическую плотность (значение OD) на иммуноферментном детекторе при длине волны 570 нм. Эксперименты повторяли 3 раза в каждой группе. Показатель выживаемости клеток = значение OD в группе обработки лекарственным средством/значение OD в контрольной группе × 100%.
Результаты
Как показано в таблице 1, через 48 часов после обработки опухолевых клеток вирусом M1 (MOI = 10) показатели клеточной гибели для рака поджелудочной железы, назофарингеальной карциномы, рака предстательной железы и меланомы составляли более 50%; показатели клеточной гибели для рака ободочной и прямой кишки (LoVo, HCT-8, SW620 и SW480), рака печени (Hep3B, Huh-7 и Huh-6), рака мочевого пузыря и рака молочной железы составляли более 40%; показатели клеточной гибели для глиомы, рака шейки матки, рака легкого составляли более 30%; показатель клеточной гибели для рака желудка составлял более 20%. Статистически значимые изменения показателя выживаемости клеток в трех линиях нормальных клеток (L-02, HEB и SV-HUC-1), а также PLC и HCT116 не наблюдались. Результаты указывали на то, что инфицирование вирусом M1 вызывало избирательную клеточную гибель в большинстве опухолей.
Таблица 1. Вирус M1 значительно снижал показатель выживаемости опухолевых клеток
Линии клеток
Источник
Показатель выживаемости (%)
Статистическая значимость
Hep3B
Рак печени
3,8
-
Huh-7
Рак печени
52,2 ± 10,0
**
Huh-6
Рак печени
59,0 ± 8,9
**
HepG2
Рак печени
70,4 ± 3,5
*
PLC
Рак печени
80,5
-
HCT116
Рак печени
81,3 ± 4,3
ns
LoVo
Рак ободочной и прямой кишки
6,9
-
HCT-8
Рак ободочной и прямой кишки
35,4 ± 5,2
**
SW620
Аденокарцинома ободочной и прямой кишки
43,7 ± 6,7
**
SW480
Рак ободочной и прямой кишки
53,8 ± 8,4
**
SCaBER
Рак мочевого пузыря
11,5 ± 4,4
**
T24
Рак мочевого пузыря
21,1 ± 3,8
**
UM-UC-3
Рак мочевого пузыря
39,8 ± 19,6
**
5637
Рак мочевого пузыря
50,2 ± 19,0
**
Capan-1
Рак поджелудочной железы
40,4 ± 10,1
**
PANC-1
Рак поджелудочной железы
49,3 ± 16,3
**
SW1990
Рак поджелудочной железы
45,6 ± 16,9
**
MIA PaCa-2
Рак поджелудочной железы
49,1 ± 13,2
**
U-87 MG
Злокачественная глиома
32,4
-
U-251
Злокачественная глиома
34,7 ± 4,9
**
T98G
Мультиформная глиобластома
38,2
-
U-138 MG
Злокачественная глиома
40,1
-
MGR2
Глиома
63,2
-
MDA-MB-468
Рак молочной железы
43,7 ± 10,1
**
MDA-MB-231
Рак молочной железы
58,9 ± 2,7
**
C-33 A
Рак шейки матки
14,8 ± 1,8
**
HeLa
Рак шейки матки
66
-
22Rv1
Рак предстательной железы
39,1
-
CNE-2
Назофарингеальная карцинома
24,5
-
CNE-1
Назофарингеальная карцинома
48,2
-
A-375
Меланома
47,3 ± 19,2
*
A549
Рак легкого
68,2
-
NCI-N87
Рак желудка
76,4 ± 9,3
*
HGC-27
Рак желудка
79,2
-
L-02
Нормальные клетки печени
100,3 ± 10,0
ns
HEB
Глиальные клетки
98,8
-
SV-HUC-1
Иммортализированные эпителиальные клетки яйцевода
97,2
-
(Примечание: ** p < 0,01, * p < 0,05, ns: различие статистически незначимо. Статистические способы: критерий Стьюдента, - : статистические данные отсутствуют).
Пример 2. Вирус M1 избирательно и эффективно ингибировал рост опухоли
1) В организме мышей, несущих опухоль, вирус M1 эффективно ингибирует рост опухоли
Материалы
вирус M1, линия раковых клеток печени человека Hep3B, линия раковых клеток ободочной и прямой кишки человека LoVo, пятьдесят восемь самок "голых" мышей BALB/c в возрасте 4 недель.
Способы
6
a) Моделирование мышей, несущих опухоль: 5 × 10клеток Hep3B или LoVo инъецировали подкожно в дорсальную часть тела "голых" мышей BALB/c в возрасте 4 недель.
3
3
6
2
b) Внутриопухолевое введение: когда объем опухоли из Hep3B достигал приблизительно 50 ммили объем опухоли из LoVo достигал приблизительно 70 мм, начинали введение путем внутриопухолевой инъекции. В опухоль инъецировали вирусы M1 в общей сложности шесть раз в течение 12 дней (по 2 × 10 БОЕ каждый раз), и обработку путем инъекции среды OptiPRO™SFM назначали для контрольной группы с растворителем. Длину и ширину опухоли и массу тела измеряли каждые два дня, и объем опухоли рассчитывали согласно формуле: длина × ширина /2.
3
7
2
c) Внутривенное введение: когда объем опухоли из клеток Hep3B достигал приблизительно 50 мм, производили внутривенную инъекцию вируса M1 (по 3 × 10 БОЕ каждый раз), и через три дня производили вторую внутривенную инъекцию. Обработку путем инъекции среды OptiPRO™SFM назначали для контрольной группы с растворителем. Массу тела и длину и ширину опухоли измеряли каждые три дня и объем опухоли рассчитывали согласно формуле: длина × ширина /2.
Результаты
3
3
3
3
3
3
После создания моделей "голых" мышей, несущих подкожные опухоли из Hep3B (фигуры 2a и 2c) и LoVo (фигура 2b), на "голых" мышах BALB/c вирусы M1 вводили несколько раз в течение длительного времени путем внутриопухолевой (фигура 2a и фигура 2b) или внутривенной инъекции (фигура 2c) и наблюдали изменения объема опухоли и массы тела животных у "голых" мышей. В модели "голых" мышей с Hep3B применяли введение путем внутриопухолевой инъекции, как показано на фигуре 2a. На 20-й день эксперимент завершали, среднее значение объема опухоли в контрольной группе с растворителем составляло 0,368 ± 0,051 см, а среднее значение объема опухоли в группе с вирусом M1 составляло 0,172 ± 0,058 см. Статистические результаты указывали на то, что вирус M1 в значительной степени ингибировал рост опухоли у мышей, несущих опухоль из Hep3B. В дополнение, значимое различие в средней массе тела между "голыми" мышами в группе с вирусом M1 (16,4 ± 1,54 г) и "голыми" мышами в контрольной группе (17,0 ± 1,16 г) не наблюдалось, и психическое состояние "голых" мышей в группе с вирусом M1 было удовлетворительным, что указывало на надлежащую безопасность вируса M1. В модели "голых" мышей с LoVo проводили внутриопухолевое введение, как показано на фигуре 2b. Эксперимент завершали на 24-й день, среднее значение объема опухоли в контрольной группе составляло 0,546 ± 0,087 см, а среднее значение объема опухоли в группе с вирусом M1 составляло 0,389 ± 0,049 см. Статистические результаты указывали на то, что вирус M1 в значительной степени ингибировал рост опухоли у мышей, несущих опухоль из LoVo. В дополнение, значимое различие в средней массе тела между "голыми" мышами в группе с вирусом M1 (18,9 ± 1,40 г) и "голыми" мышами в контрольной группе (19,4 ± 1,86 г) не наблюдалось, и психическое состояние было удовлетворительным, что указывало на надлежащую безопасность вируса M1; в модели "голых" мышей с Hep3B проводили введение путем внутривенной инъекции, как показано на фигуре 2c. Эксперимент завершали на 21-й день, средний объем опухоли в контрольной группе составлял 0,247 ± 0,067 см, а средний объем опухоли в группе с вирусом M1 составлял 0,134 ± 0,057 см. Статистические результаты указывали на то, что вирус M1 в значительной степени ингибировал рост опухоли у мышей, несущих опухоль из Hep3B. В дополнение, значимое различие в средней массе тела между "голыми" мышами в группе с вирусом M1 (17,2 ± 2,50 г) и в контрольной группе (17,5 ± 2,16 г) не наблюдалось, и психическое состояние было удовлетворительным, что указывало на надлежащую безопасность вируса M1.
2) Опухолевая ткань была избирательно обогащена вирусом M1
Материалы
Двадцать четыре самки "голых" мышей BALB/c в возрасте 4 недель, линия раковых клеток печени Hep3B, тризол, гомогенизатор тканей, прибор для количественной флуоресцентной ПЦР в режиме реального времени.
Праймер для β-актина:
смысловая нить (SEQ ID NO:1: GATCATTGCTCCTCCTGAGC)
антисмысловая нить (SEQ ID NO:2: ACTCCTGCTTGCTGATCCAC)
Праймер для неструктурного белка NS1 вируса M1:
смысловая нить (SEQ ID NO:3: GTTCCAACAGGCGTCACCATC)
антисмысловая нить (SEQ ID NO:4: ACACATTCTTGTCTAGCACAGTCC)
Способы
6
7
-(C
-C
)
C
C
t-NS1
t-внутренний стандарт
t-NS1
t-внутренний стандарт
5 × 10клеток Hep3B инъецировали подкожно в дорсальную часть тела "голых" мышей в возрасте 4 недель. Через четыре дня каждой мыши инъецировали вирус M1 в хвостовую вену (3 × 10БОЕ). "Голых" мышей умерщвляли соответственно через 1, 2, 3 и 4 дня после введения, и собирали образцы тканей (включая опухоль, сердце, печень, селезенку, легкое, почку, головной мозг и мышцы), и экстрагировали РНК из тканей. Затем с помощью способа QRT-PCR определяли количество вируса M1 с целью определения неструктурного белка NS1 вируса M1, дающего представление о количестве вируса M1. В то же время определяли внутренний стандарт β-актин и относительное количество РНК вируса M1 рассчитывали согласно формуле: 2.  иполучали на основе показаний приборов в Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System.
Результаты
2
6
Как показано на фигуре 2d, в модели подкожной опухоли из Hep3B у "голых" мышей в четыре различных момента времени количество вируса M1 в опухолевых тканях в 10 - 10разпревышает таковое в других тканях органов, что указывает на избирательное обогащение опухолевых тканей вирусом M1.
Пример 3. Вирус M1 вызывал избирательную клеточную гибель в характеризующихся низкой экспрессией ZAP/ZAP-отрицательных опухолях
Вирус M1 вызывал избирательную клеточную гибель в опухолях с низкой экспрессией ZAP, но не оказывал эффекта на нормальные клетки. Было указано, что уровень экспрессии ZAP являлся решающим фактором избирательности вируса M1. В нормальных клетках и опухолевых клетках с нормальной экспрессией/высокой экспрессией ZAP с помощью интерферирующей РНК и нокдауна уровня экспрессии ZAP вирус M1 может вызывать значительную клеточную гибель. В то же время в опухолевых клетках с низкой экспрессией ZAP вызываемая вирусом M1 гибель опухолевых клеток частично блокировалась посредством сверхэкспрессии ZAP.
1) Вирус M1 не вызывал клеточной гибели в нормальных клетках и опухолях с высокой экспрессией ZAP
Материалы
Вирус M1, клетки печени человека L-02, глиальные клетки человека HEB, раковые клетки мочевого пузыря человека SCaBER и T24, линии раковых клеток печени человека Hep3B и PLC, линия раковых клеток печени человека HepG2, линии раковых клеток ободочной и прямой кишки человека LoVo и HCT116.

Вестерн-блоттинг: экстракт общего клеточного белка (реагент для экстракции белков млекопитающих M-PER, Thermo), антитело к ZAP (Thermo, США), антитело к β-актину (Neomarker, США);
Экстракция РНК. ПЦР: реагент тризол для экстракции РНК, прибор для количественной ПЦР в режиме реального времени, Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System (Life, США).
Праймер для ZAP:
смысловая нить для ZAP (SEQ ID NO:5: TCACGAACTCTCTGGACTGAA)
антисмысловая нить для ZAP (SEQ ID NO:6: ACTTTTGCATATCTCGGGCATAA)
Праймер для β-актина является таким же, как в примере 2.
Способы
5
-(C
–C
)
C
C
t-ZAP
t-внутренний стандарт
t-ZAP
t-внутренний стандарт
Клетки в экспоненциальной фазе роста отбирали и добавляли в полную среду DMEM или F-12 (содержащую 10% фетальную бычью сыворотку и 1% двойное антитело) с получением суспензии клеток, клетки инокулировали в лунки на 35 мм при плотности 2 × 10/лунка. РНК экстрагировали, и величину экспрессии мРНК ZAP у клеток определяли с помощью ПЦР. Внутренний стандарт в данном эксперименте являлся β-актином. Нормализованную величину экспрессии мРНК ZAP рассчитывали согласно формуле: нормализованная величина экспрессии РНК ZAP = 2.  и получали на основе показаний приборов в Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System, и они представляли число циклов, соответствующее пороговому уровню, при котором флуоресцентный сигнал в ходе ПЦР-амплификации начинает входить в стадию экспоненциального роста относительно фонового уровня.
Общий клеточный белок экстрагировали, оценивали количественно, и проводили эксперимент по методу вестерн-блоттинга (электрофорез, перенос на мембрану, блокирование, инкубирование первичного антитела и вторичного антитела и проявление). Шкалу серых тонов полосы ZAP и внутреннего стандарта β-актина сканировали с помощью программного обеспечения для визуализации Image Lab, выявляли значение по шкале серых тонов полосы, и рассчитывали нормализованную величину экспрессии белка ZAP согласно следующей формуле: нормализованная величина экспрессии белка ZAP = значение по шкале серых тонов полосы ZAP/значение по шкале серых тонов полосы внутреннего стандарта. Эксперименты повторяли 3 раза и для расчета нормализованной величины экспрессии белка ZAP брали среднее значение.
Результаты
Как показано на фигурах 3a и 3b, у опухолевых клеток SCaBER, T24, Hep3B и LoVo нормализованная величина экспрессии мРНК (фигура 3a) и белка (фигура 3b) ZAP была практически невыявляемой, являясь значительно более низкой, чем у нормальных клеток (L-02 и HEB) и в опухолевых клеток (PLC, HCT116).
Вирус M1 вызывал клеточную гибель в опухолях с низкой/отрицательной экспрессией ZAP, но не вызывал клеточной гибели в опухолях с высокой экспрессией ZAP. После инфицирования нормальных клеток (L-02 и HEB) и части опухолевых клеток (PLC, HCT116) вирусом M1 не наблюдали статистически значимое изменение показателя выживаемости. Показатель выживаемости у L-02 составлял 100,3%, а у HEB составлял 98,8% (таблица 1). После инфицирования вирусом M1 показатель выживаемости клеток для опухолевых клеток SCaBER, T24, Hep3B и LoVo значительно снижался до: T24 - 21,1%, SCaBER - 11,5%, LoVo - 6,9% и Hep3B - 3,8% (таблица 1).
Как показано на фигуре 3c и в таблице 1, нормализованная величина экспрессии белка ZAP у раковых клеток печени HepG2 являлась более низкой, чем у нормальных клеток L-02, и соотношение этих двух величин составляло 0,8. После инфицирования клеток L-02 вирусом M1 показатель выживаемости явно не изменялся, тогда как для клеток HepG2 после их инфицирования вирусом M1 показатель выживаемости снижался до 70,4%. Наблюдалось статистическое различие между этими двумя типами клеток. Это дополнительно указывало на то, что вирус M1 вызывает избирательную клеточную гибель в опухолях с низкой экспрессией ZAP.
2) Вирус M1 вызывал значительную клеточную гибель в нормальных клетках и опухолях после нокдауна уровня ZAP
Материалы

Вирус M1, клетки печени человека L-02, раковые клетки печени человека PLC, раковые клетки ободочной и прямой кишки человека HCT116, интерферирующий фрагмент РНК для ZAP, MTT (метилтиазолилтетразолий), Lipofectamine™ RNAiMAX (Invitrogen, США); вестерн-блоттинг: экстракт общего клеточного белка (реагент для экстракции белков млекопитающих M-PER, Thermo), антитело к ZAP (Thermo, USA), антитело к NS3 вируса M1 (Beijing Protein Innovation), антитело к E1 вируса M1 (Beijing Protein Innovation), антитело к GAPDH (CST, США);
экстракция РНК, ПЦР: тризол, прибор для количественной ПЦР в режиме реального времени (Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System), при этом праймеры для β-актина и неструктурного белка NS1 вируса M1 являются такими же, как в примере 2.
Интерферирующий фрагмент для ZAP (siRNA), предназначенный для целевой последовательности SEQ ID NO:7: 5'-CCAAGAGTAGCACTTGTTA-3':
смысловая нить siRNA (SEQ ID NO:8: 5'-CCAAGAGUAGCACUUGUUA-dTdT-3')
антисмысловая нить siRNA (SEQ ID NO:9: 3'-dTdT-GGUUCUCAUCGUGAACAAU-5')
Контрольный интерферирующий фрагмент для ZAP с неупорядоченным кодом (siNC): соотношение нуклеотидов смысловой нити и антисмысловой нити является таким же, как и во фрагменте siRNA, но порядок их расположения является совершенно случайным.
Способы
5
Клетки в экспоненциальной фазе роста отбирали и добавляли в полную среду DMEM (10% фетальная бычья сыворотка, 1% двойное антитело) с получением суспензии клеток, и клетки инокулировали в 6-луночный планшет при плотности 1 × 10/лунка. Через 24 часа добавляли фрагмент siRNA, упакованный в RNAiMAX. Через 48 часов клетки инфицировали вирусом M1. Через 48 часов после инфицирования образцы обрабатывали.
В каждую лунку добавляли 20 мкл MTT (5 мг/мл), и через четыре часа определяли значение поглощения и рассчитывали показатель выживаемости клеток. Экспериментальную группу siZAP обрабатывали интерферирующим фрагментом РНК для ZAP, а контрольную группу siNC обрабатывали интерферирующим фрагментом для ZAP с неупорядоченным кодом.
a) Собирали надосадочную жидкость культуры клеток, и титр вируса выявляли с помощью способа с определением TCID50.
b) Образцы РНК экстрагировали, с ними проводили ПЦР и количество вируса M1 определяли путем выявления количества неструктурного белка NS1 вируса M1. β-актин являлся внутренним стандартом.
c) Образец белка экстрагировали, экспрессию белка ZAP и белки NS3 и E1 вируса M1 выявляли с помощью вестерн-блоттинга, и внутренний стандарт представлял собой GAPDH. Расчет нормализованной величины экспрессии ZAP был таким же, как в 1) примера 3, за исключением того, что в качестве внутреннего стандарта β-актин заменяли на GAPDH.
d) Эксперимент повторяли 3 раза, данные представляли как среднее значение ± стандартное отклонение; статистический анализ с использованием критерия Стьюдента проводили путем сравнения с соответствующими контрольными группами, */#/& представляет P < 0,05, **/&& представляет P < 0,01, ns представляет отсутствие статистической значимости.
Результаты
Как показано на фигурах 3d-3g, после обработки нормальных клеток печени человека L-02, раковых клеток печени человека PLC и раковых клеток ободочной и прямой кишки человека HCT116 интерферирующим фрагментом РНК для ZAP величина экспрессии белка ZAP значительно снижалась до невыявляемого уровня (фигура 3g), тогда как уровень белка NS3 и белка E1 вируса M1 явно повышался; после инфицирования вирусом M1 (MOI = 100) показатель выживаемости клеток L-02 (группа siZAP) с нокдауном уровня ZAP значительно снижался до 69,7% ± 3,45%, показатель выживаемости клеток PLC с нокдауном уровня ZAP снижался до 63,9% ± 11,5%, и показатель выживаемости клеток HCT116 с нокдауном уровня ZAP снижался до 49,6% ± 1,21% (фигура 3d); как показано на фигуре 3e, через 48 часов после инфицирования вирусом M1 относительный титр вируса M1 в клетках L-02 с нокдауном ZAP (группа siZAP) в 4,10 ± 1,38 раза превышал таковой в соответствующей группе siNC; при этом для клеток HCT116 (группа siZAP) он в 3,39 ± 1,27 раза превышал таковой в соответствующей группе siNC; при этом для клеток PLC (группа siZAP) он в 32,6 ± 2,34 раза превышал таковой в соответствующей группе siNC. В то же время, как показано на фигуре 3f, через 48 часов после инфицирования вирусом M1 величина экспрессии РНК вируса M1 у клеток L-02 с нокдауном ZAP (группа siZAP) в 16,3 ± 8,20 раза превышала таковую в соответствующей группе siNC; при этом для клеток HCT116 она в 8,82 ± 4,02 раза превышала таковую в соответствующей группе siNC; при этом для клеток PLC она в 30,5 ± 12,23 раза превышала таковую в соответствующей группе siNC. Вышеприведенные результаты указывают на то, что вирус M1 вызывал значительную гибель нормальных клеток и опухолевых клеток после нокдауна уровня ZAP.
3) Сверхэкспрессия ZAP противодействовала гибели опухолевых клеток, индуцированной вирусом M1
Материалы
Вирус M1, раковые клетки печени человека Hep3B, плазмида pReceiver-M02-GFP для экспрессии GFP (пустая контрольная плазмида, Guangzhou Funeng Gene Co., Ltd.), плазмида pReceiver-M02-ZAP для экспрессии ZAP (плазмида, сверхэкспрессирующая ZAP), реагент для трансфекции FuGENE HD, MTT (метилтиазолилтетразолий).
Экстракция РНК, ПЦР: тризол, прибор для количественной ПЦР в режиме реального времени (Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System), при этом праймеры для β-актина и неструктурного белка NS1 вируса M1 являются такими же, как в примере 2.

Вестерн-блоттинг: экстракт общего клеточного белка (реагент для экстракции белков млекопитающих M-PER, Thermo), антитело к ZAP (Thermo, США), антитело к NS3 вируса M1 (Beijing Protein Innovation), антитело к E1 вируса M1 (Beijing Protein Innovation), антитело к GAPDH (CST, США).
Способы
5
Клетки в экспоненциальной фазе роста отбирали и добавляли в полную среду DMEM (10% фетальная бычья сыворотка и 1% двойное антитело) с получением суспензии клеток и затем клетки инокулировали в 6-луночный планшет при плотности 1 × 10/лунка. Через 24 часа клетки трансфицировали, соответственно, контрольными плазмидами, сверхэкспрессирующими GFP, и плазмидами, сверхэкспрессирующими ZAP, с получением соответствующих клеток, экспрессирующих зеленый флуоресцентный белок, и клеток со сверхэкспрессией ZAP. Через 48 часов проводили обработку путем инфицирования вирусом M1. Через 48 часов после инфицирования образец обрабатывали и подвергали выявлению.
a) Показатель выживаемости клеток определяли с помощью способа с использованием MTT. В каждую лунку добавляли 20 мкл MTT (5 мг/мл) и через четыре часа выявляли значение поглощения при длине волны 570 нм. Другие проводимые виды обработки были такими же, как в примере 1.
b) Собирали надосадочную жидкость культуры клеток и титр вируса выявляли с помощью способа с определением TCID50.
c) Из пробы экстрагировали образец общей РНК и величину экспрессии РНК вируса M1 определяли с помощью способа QRT-PCR и рассчитывали согласно способу из примера 2.
d) Собирали образцы белков, величину экспрессии белка ZAP и величину экспрессии белка NS3 и белка E1 вируса M1 выявляли с помощью вестерн-блоттинга, и способ обработки был таким же, как и в 1 примера 3).
e) Каждый эксперимент повторяли три раза, и данные представляли как среднее значение ± стандартное отклонение. Для статистического анализа путем сравнения с соответствующими контрольными группами применяли критерий Стьюдента. # представляет P < 0,05, ** представляет P < 0,01, а ns представляет отсутствие статистической значимости для различия.
Результаты
Как показано на фигуре 3k, после трансфекции раковых клеток печени человека Hep3B плазмидой, сверхэкспрессирующей ZAP, шкалу серых тонов полосы ZAP и внутреннего стандарта β-актина в различных образцах сканировали с помощью программного обеспечения Image Lab и рассчитывали соответствующие нормализованные величины экспрессии белка ZAP. Нормализованная величина экспрессии белка ZAP в группе сверхэкспрессии ZAP составляла 1,61 ± 0,05, тогда как в контрольной группе сверхэкспрессии GFP она составляла 0,03 ± 0,01. Среднее значение в первом случае в 53,7 раза превышало таковое в последнем случае; уровни белка NS3 и белка E1 вируса M1 явно повышались.
Как показано на фигуре 3h, сверхэкспрессия ZAP частично блокировала гибель клеток Hep3B, вызываемую инфицированием вирусом M1. Через 48 часов после инфицирования с помощью различных титров вируса M1 при MOI = 0,1 среднее значение показателя выживаемости клеток в группе со сверхэкспрессией ZAP составляло 74,7% ± 8,94%, являясь значительно более высоким, чем показатель выживаемости клеток в контрольной группе со сверхэкспрессией GFP (59,0% ± 6,27%); при MOI = 1 среднее значение показателя выживаемости клеток в группе со сверхэкспрессией ZAP составляло 69,4% ± 6,95%, являясь значительно более высоким, чем показатель выживаемости клеток в контрольной группе со сверхэкспрессией GFP (51,4% ± 5,31%); при MOI = 10 среднее значение показателя выживаемости клеток в группе со сверхэкспрессией ZAP составляло 63,7% ± 6,04%, являясь значительно более высоким, чем показатель выживаемости клеток в контрольной группе со сверхэкспрессией GFP (40,5% ± 3,19%).
Как показано на фигуре 3i, после обработки путем инфицирования вирусом M1 относительный титр вируса в клетках Hep3B со сверхэкспрессией ZAP составлял 31,5 ± 11,6% от такового в соответствующей контрольной группе со сверхэкспрессией GFP. В то же время после обработки путем инфицирования вирусом M1 величина экспрессии РНК вируса M1 в клетках Hep3B со сверхэкспрессией ZAP составляла 9,5 ± 4,7% от таковой в соответствующей контрольной группе со сверхэкспрессией GFP.
Пример 4. Вирус M1 ингибировал рост живой опухолевой ткани человека с низкой экспрессией ZAP ex vivo (ex vivo).
Материалы
Среда DMEM с высоким содержанием глюкозы, TECIA (тест на чувствительность к химиотерапии в анализе с культивированием ткани, окрашиванием с помощью MTT и компьютерной визуализацией в конечной точке), праймеры для β-актина и ZAP являются такими же, как в 1) примера 3.
Способы
a) Культивирование живой раковой ткани печени и раковой ткани ободочной и прямой кишки человека ex vivo
Живую ткань ex vivo получали путем удаления хирургическим путем в Центре по предупреждению рака Университета Сунь Ятсена, хранили при 4°C, а затем в течение четырех часов отправляли в лабораторию для проведения теста на чувствительность к лекарственным средствам. Все случаи подтверждали путем гистопатологического исследования. В стерильных условиях опухолевую ткань забирали и разрезали на фрагменты ткани диаметром 0,5-1 мм, помещали в 24-луночный культуральный планшет (4-6 фрагментов на лунку) и в каждую лунку добавляли 1 мл среды DMEM. После одного часа культивирования получали проекционное освещенное изображение фрагмента опухолевой ткани с помощью анализатора изображений, приспособленного для теста на чувствительность к лекарственным средствам. Площадь фрагмента опухоли определяли и сравнивали (площадь, A) для анализа ингибирующего эффекта вируса M1 в отношении живой опухолевой ткани человека ex vivo.
b) Обработка лекарственными средствами и определение активности в ткани
2
7
Опухолевую ткань культивировали в CO-инкубаторе для клеток в течение 12 часов. После достижения стабильного состояния добавляли 10 БОЕ вируса M1 и лекарственное средство 5-фторурацил (5-Fu, 10 мг/л) в качестве положительного контроля. Через 96 часов после обработки путем инфицирования добавляли MTT (5 мг/мл) при 50 мкл/лунка и культивировали в течение 3 часов. Затем получали освещенное рассеянным светом изображение фрагмента опухолевой ткани с помощью анализатора изображений, приспособленного для теста на чувствительность к лекарственным средствам, для определения области, окрашенной синим с помощью формазана, во фрагменте опухоли в каждой лунке и степени окрашивания (синяя область, BA). Затем рассчитывали показатель выживаемости ткани (долю выживания, SF) согласно следующей формуле:
обработка лекарственным средством
обработка лекарственным средством
контроль
контроль
Показатель ингибирования для опухолевой ткани (клеточное ингибирование, CI): CI = (1 - SF) × 100%, BAпредставляет окрашенную синим область в группе, обработанной вирусом M1/5-Fu, Aпредставляет площадь фрагмента опухоли в группе, обработанной вирусом M1/5-Fu, BAпредставляет окрашенную синим область в контрольной группе, обработанной растворителем, и Aпредставляет площадь фрагмента опухоли в контрольной группе, обработанной растворителем.
c) Определение нормализованной величины экспрессии мРНК ZAP
По стандартному показателю ингибирования для опухоли 10% ткани во всех вышеупомянутых случаях разделяли на две группы. Из образцов соответственно экстрагировали РНК и уровни мРНК ZAP и β-актина (внутреннего стандарта) определяли с помощью способа QRT-PCR. Сравнивали различие нормализованных величин экспрессии ZAP между двумя группами. Для статистического анализа применяли критерий суммы рангов. Способ расчета нормализованной величины экспрессии ZAP является таким же, как в 1) примера 3.
Результаты
a) Как показано в таблице 2 для раковой ткани печени, относительное число случаев с показателем ингибирования более 10% в группе с вирусом M1 составляло 59,5%, являясь более высоким, чем в группе 5-Fu (53,8%). Было доказано, что в клинической терапии рака печени показатель эффективности обработки вирусом M1 был более высоким, чем для существующей в настоящее время обработки лекарственным средством 5-Fu.
Таблица 2. Вирус M1 и 5-Fu ингибируют показатель выживаемости живых раковых тканей печени человека ex vivo
Показатель ингибирования (% от контроля)
Обработка вирусом M1(%)
Обработка с помощью 5-Fu(%)
> 10%
22 (59,5%)
14 (53,8%)
≤ 10%
15 (40,5%)
12 (46,2%)
Число случаев
37
26
b) Как показано в таблице 3 для раковых тканей ободочной и прямой кишки, относительное число случаев, в которых показатель ингибирования составляет более 10%, в группе с вирусом M1 составляло 71,4%, являясь более высоким, чем в группе 5-Fu (61,5%). Было доказано, что в клинической терапии рака ободочной и прямой кишки показатель эффективности обработки вирусом M1 был более высоким, чем для существующей в настоящее время обработки лекарственным средством 5-Fu.
Таблица 3. Вирус M1 и 5-Fu ингибируют рост живых раковых тканей ободочной и прямой кишки человека ex vivo
Показатель ингибирования (% от контроля)
Обработка вирусом M1(%)
Обработка с помощью 5-Fu(%)
> 10%
10 (71,4%)
8 (61,5%)
≤ 10%
4 (28,6%)
5 (38,5%)
Число случаев
14
13
c) Вышеупомянутые живые опухолевые ткани человека ex vivo, которые обрабатывали вирусом M1, разделяли на две группы по показателю ингибирования 10%. Дополнительно анализировали корреляцию уровня экспрессии мРНК ZAP и показателя ингибирования в этих тканях. Нормализованная величина экспрессии ZAP в группе с обработкой вирусом M1 с показателем ингибирования более 10% составляла 0,117 ± 0,890, являясь более низкой, чем в группе с показателем ингибирования, меньшим или равным 10% (0,791 ± 0,108). Соотношение средних значений в двух группах составляло 0,148. Как показано на фигуре 4, среднее значение нормализованной величины экспрессии ZAP у опухолевой ткани в группе с обработкой вирусом M1 с показателем ингибирования, меньшим или равным 10%, составляла 0,414, а среднее значение величины экспрессии ZAP у опухолевой ткани в группе с обработкой вирусом M1 с показателем ингибирования более 10% составляла 0,075. Для статистического анализа применяли способ с использованием критерия суммы рангов. Различие было статистически значимым (P < 0,05), что указывало на то, что вирус M1 мог вызывать избирательную гибель тканей в характеризующихся низкой экспрессией ZAP/ZAP-отрицательных опухолях.
Пример 5. Низкая экспрессия ZAP в различных типах клинических патологических опухолевых тканей
Материалы
Восемь кусочков тканей от 506 пациентов (в том числе раковая ткань печени, раковая ткань ободочной и прямой кишки, раковая ткань мочевого пузыря и парная параканкрозная ткань), антитело к ZAP (Thermo, США) и полностью автоматический сканер срезов APERIO для цифровой патологии.
Способы
Восемь кусочков тканей из нескольких очагов подвергали иммуногистохимическому окрашиванию (IHC), сканировали сканером APERIO, и с помощью программного обеспечения для сопоставления рассчитывали плотность окрашивания для определения нормализованной величины экспрессии ZAP. ZAP нормализованная величина экспрессии = интенсивность окрашивания ZAP в поле зрения/число клеток в поле зрения. Количество клеток в поле зрения использовали в качестве стандарта гомогенизации.
Результаты
Применяя иммуногистохимический способ, авторы настоящего изобретения определили экспрессию ZAP в различных типах патологических образцов опухолей человека. На фигуре 5a показаны иллюстративные изображения патологических образцов раковой ткани печени, раковой ткани ободочной и прямой кишки и раковой ткани мочевого пузыря человека, подвергнутых иммуногистохимическому окрашиванию на ZAP. Полученное в результате окрашивание на ZAP в опухолевых тканях было более светлым, чем в соответствующих параканкрозных тканях.
Как показано на фигуре 5b, проводили статистический анализ средних значений величины экспрессии белка ZAP у гомогенизированных раковых тканей печени, раковых тканей ободочной и прямой кишки, раковых тканей мочевого пузыря и соответствующих параканкрозных неопухолевых тканей. Результаты указывали на то, что усредненная нормализованная величина экспрессии белка ZAP у каждого из вышеупомянутых типов опухолевых тканей была значительно более низкой, чем у соответствующих параканкрозных неопухолевых тканей, что указывало на низкую экспрессию ZAP в опухолевых тканях. Усредненная нормализованная величина экспрессии ZAP у всех раковых опухолевых тканей печени составляла 5,83 ± 8,49, являясь значительно более низкой, чем у соответствующих параканкрозных неопухолевых тканей (11,8 ± 11,5). Соотношение этих двух усредненных значений составляло 0,494. Усредненная нормализованная величина экспрессии ZAP у всех раковых опухолевых тканей ободочной и прямой кишки составляла 2,41 ± 3,60, являясь значительно более низкой, чем у соответствующих параканкрозных неопухолевых тканей (8,30 ± 8,94). Соотношение этих двух усредненных значений составляло 0,290. Усредненная нормализованная величина экспрессии ZAP у всех раковых опухолевых тканей мочевого пузыря составляла 2,93 ± 4,63, являясь более низкой, чем у параканкрозных неопухолевых тканей (10,3 ± 8,36). Соотношение этих двух усредненных значений составляло 0,284.
Как указано на фигуре 5c, среди всех проанализированных случаев рака печени процентное число случаев с низкой экспрессией ZAP составляло 69%. Среди всех проанализированных случаев рака ободочной и прямой кишки процентное число случаев с низкой экспрессией ZAP составляло 52%. Среди всех проанализированных случаев рака мочевого пузыря процентное число случаев с низкой экспрессией ZAP составляло 61%. ZAP становится селективным молекулярным маркером для противоопухолевой терапии рака печени, рака ободочной и прямой кишки и рака мочевого пузыря с помощью вируса M1.
Пример 6. Способ получения вируса M1
Материалы
Клетки Vero почки африканской зеленой мартышки , среда DMEM с высоким содержанием глюкозы, среда OptiPRO™SFM (1×), вирус M1, чашка для культуры клеток на 100 мм, центрифуга.
Способы
Клетки в экспоненциальной фазе роста отбирали и добавляли в полную среду DMEM (содержащую 10% фетальную бычью сыворотку и 1% двойное антитело) с получением суспензии клеток. Затем клетки инокулировали в чашку для культуры клеток на 100 мм. Когда степень слияния клеток достигала 80%-90%, среду заменяли средой OptiPRO™SFM. Затем добавляли 50 мкл (MOI = 0,01) вируса M1 для обработки путем инфицирования. Когда патологические изменения, происходящие в клетках, охватывали большую область (приблизительно через 36 часов), собирали надосадочную жидкость культуры клеток. Надосадочную жидкость культуры клеток центрифугировали при 2000-3000 об./мин. в течение 5 минут, затем надосадочную жидкость осторожно отсасывали, перемешивали и помещали в субупаковку, и хранили в холодильнике при -80°C.
Вышеописанные примеры являются пояснением иллюстративного варианта осуществления и эффекта настоящего изобретения. Однако вариант осуществления настоящего изобретения не ограничен вышеописанными примерами. Любые другие изменения, модификации, замены, комбинации и упрощения без отступления от сущности и принципа настоящего изобретения включены в объем защиты настоящего изобретения.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<160>  9
<170>  PatentIn версии 3.5
<210>  1
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  синтетическая последовательность
<400>  1
gatcattgct cctcctgagc                                                   20
<210>  2
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  синтетическая последовательность
<400>  2
actcctgctt gctgatccac                                                   20
<210>  3
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  синтетическая последовательность
<400>  3
gttccaacag gcgtcaccat c                                                 21
<210>  4
<211>  24
<212>  ДНК
<213>  синтетическая последовательность
<400>  4
acacattctt gtctagcaca gtcc                                              24
<210>  5
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  синтетическая последовательность
<400>  5
tcacgaactc tctggactga a                                                 21
<210>  6
<211>  23
<212>  ДНК
<213>  синтетическая последовательность
<400>  6
acttttgcat atctcgggca taa                                               23
<210>  7
<211>  19
<212>  ДНК
<213>  синтетическая последовательность
<400>  7
ccaagagtag cacttgtta                                                    19
<210>  8
<211>  21
<212>  ДНК/РНК
<213>  синтетическая последовательность
<400>  8
ccaagaguag cacuuguuat t                                                 21
<210>  9
<211>  21
<212>  ДНК/РНК
<213>  синтетическая последовательность
<400>  9
uaacaagugc uacucuuggt t                                                 21