Состояние активности над-инадф-зависимых дегидрогеназ в клетках здоровой и опухолевой ткани у больных раком легкого в зависимости от полиморфизма гена GSTM1

УДК 577.15:616.24-006.04-008.9:575.113

A.A. Savchenko1, P. V. Lapeshin2, Е. V. Markova3, Yu.A. Dychno2, M.N. Moskovskih2,1.N. Denisov2, N. V. Ushakova3

NAD- AND NADP-DEPENDENT DEHYDROGENISES ACTIVITY IN TUMOR CELLS AND HEALTHY LUNG TISSUE ACCORDING TO GSTM1 GENE POLYMORPHISM

'State Enterprise Research Institute of North Medical Problems of Siberian Department of RAMS Krasnoyarsk State Medical Academy 3Krasnoyarsk State University

ABSTRACT

30 male patients with lung cancer were examined to study the NAD- and NADP-dependent dehydrogenises activity in tumor and healthy lung tissue according to GSTM1 gene polymorphism. Dehydrogenises activity was tested by bioluminescent method. Genetic polymorphism analysis of GSTM1 gene was determined by polymerase chain reaction. It was revealed that in patients with GSTM1 0/0 genotype metabolism in healthy lung tissue is characterized by elevated level of plastic processes with NADP synthesis and high Glutathione reductase activity. Activity of anaerobic reactions was decreased, tricarboxylic acids cycle was activated. In tumor lung tissue genotype GSTM1 0/0 is characterized by depressed Glutathione reductaze activity and activated anaerobic processes.

Key words: lung cancer, gene polymorphism, tumor lung tissue, metabolism, enzyme activity, glutathione reductase

А.А. Савченко1, П.В. Лапешин2, E.B. Маркова\ Ю.А. Дыхно2, M.H. Московских2, И.Н. Денисов2, Н.В. Ушакова3

СОСТОЯНИЕ АКТИВНОСТИ НАД- И НАДФ-ЗАВИСИМЫХ ДЕГИДРОГЕНАЗ В КЛЕТКАХ ЗДОРОВОЙ И ОПУХОЛЕВОЙ ТКАНИ У БОЛЬНЫХ РАКОМ ЛЕГКОГО В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНА GSTM1

'ГУ НИИ медицинских проблем Севера СО РАМН 2Красноярская государственная медицинская академия 3Красноярский государственный университет

РЕЗЮМЕ

С целью изучения особенностей активности НАД- и НАДФ-зависимых дегидрогеназ в клетках здоровой и опухолевой ткани у больных раком легкого в зависимости от полиморфизма гена GSTM1 обследовано 30 больных мужского пола, страдающих раком легкого, Активность дегидрогеназ определяли биолюминесцент-ным методом. Анализ генетического полиморфизма GSTM1 гена проводили методом ПЦР. Установлено, что метаболизм здоровой ткани легкого при генотипе GSTM1 0/0 характеризуется повышенным уровнем ряда пластических процессов с синтезом НАДФН и высокой активность глутатионредуктазы (ГР), а также снижением активности анаэробных реакций при повышении интенсивности субстратного потока по циклу трикарбоно-вых кислот. В опухолевой ткани при генотипе GSTM10/0 и сниженной активности ГР выявляется повышение интенсивности анаэробных процессов.

Ключевые слова: рак легкого, полиморфизм гена, опухолевая ткань легкого, метаболизм, активность ферментов, глутатионредуктаза

ВВЕДЕНИЕ

Рак легкого в последние годы стал одним из самых грозных заболеваний человека. В 35 индустриальных странах мира рак легкого является главной причиной смерти онкологических больных. Удельный вес рака легкого среди онкологических заболеваний в России составляет около 15 %. При этом у мужчин это самая распространенная локализация рака [4]. Рост заболеваемости раком легкого связывают не только с улучшением диагностики и общим старением населения, но и с повышением степени загрязнения окружающей среды и генетическими факторами [5; 9]. Среди этих факторов наибольшее значение имеют протоонкогены, а также гены «предрасположенности» [8]. Многими исследованиями показано, что полиморфизм гена 08ТМ1 (глугатион-З-трансферазы М1) - фермента биотрансформации ксенобиотиков - служит фактором риска развития рака легкого [2; 11; 15; 16]. Такие данные получены в том числе и для жителей г. Красноярска [6]. При так называемом “нулевом генотипе” (ЗЭТМ! (ОБТМ! 0/0) снижается эффективность глу-татион-зависимой системы биотрансформации, что повышает патогенность влияния вредных факторов окружающей среды (в том числе и курения) на легочную ткань и соответственно повышает вероятность развития рака легкого [1].

Значительный интерес представляет фенотипическое проявление полиморфизма гена С8ТМ1 на уровне клеточного метаболизма в здоровой и опухолевой тканях. Связано это с тем, что система катаболизма ксенобиотиков, с одной стороны, использует субстратные и энергетические ресурсы клетки, с другой, осуществляя биотрансформацию ксенобиотиков, защищает метаболическую систему от воздействия патогенных факторов [10; 11; 12]. В связи с этим целью исследования явилось изучение активности НАД- и НАДФ-зависимых дегидрогеназ в клетках здоровой и опухолевой тканей у больных раком легкого в зависимости от полиморфизма гена 08ТМ1.

В качестве показателей внутриклеточного метаболизма выбраны НАД(Ф)-зависимые дегидрогеназы в связи с тем, что, во-первых, основными переносчиками электронов в клетках являются пиридиновые нуклеотиды - активное участие оксидоредуктаз в биоэнергетических процессах; во-вторых, НАД(Ф)-зави-симые дегидрогеназы, участвуя в направленной координации сопряженных метаболических потоков, в значительной степени обеспечивают адаптивные изменения клеточного обмена веществ [3; 13; 14].

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

На базе торакального отделения Красноярского краевого онкологического центра обследовано 30 больных мужского пола, страдающих раком лепсого. Ткань легкого забиралась во время операции. Определение активности НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ в опухолевой и здоровой тканях легкого проводили биолюми-несцентнымметодом [7]. Данным методом определялась активность следующих ферментов: глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы (номер шифр 1.1.1,49) (Г-6-ФДГ), Н АД-и НАДН-зависимой реакции лактатдегидрогеназы (номер шифр 1.1.1.27) (ЛДГ и Обр. ЛДГ), НАД- и НАДН-

зависимой реакции малатдегидрогеназы (номер шифр 1.1.1.37) (МДГ и Обр.МДГ), НАДФ-иНАДФН-зави-симой глутаматдегидрогеназы (номер шифр 1.4.1.2) (НАДФГДГ иОбр.НАДФГДГ), НАД- и НАДН-зависимой глутаматдегидрогеназы (номер шифр 1.4.1.2) (НАДГДГ и Обр.НАДГДГ), НАД- и НАДФ-зависи-мых изоцшратдегидрогеназ (номер шифр 1.1.1.41) (НАДИЦДГ и НАДФИЦДГ) и глутатионредуктазы (номер шифр 1.6.4.2) (ГР). Активность дегидрогеназ выражали в ферментативных единицах (1 Е=1 мкмоль/мин [3]) на мг белка ткани.

Анализ генетического полиморфизма вЗТМ1 -гена проводили методом мультиплексной ПЦР. Для этого ДНК выделяли из цельной крови. В качестве контроля реакции использовали амплификацию СУР1 А1-гена [6]. Результат выявляли электрофорешчески в 3 %-ном агарозном геле с добавлением бромистого этидия и визуализировали на трансиллюминаторе. Гетерозиготное и гомозиготное по нормальному аллелю состояние гена (ОБТМ 1 +) определялось присутствием на элект-рофореграммах фрагмента амплификации размером 271 н.п. (рис. 1). Его отсутствие указывало на гомозиготное состояние по делеции данного участка гена (СБТШ 0/0).

Для всех полученных данных определяли среднее арифметическое значение (М) и ошибку средней арифметической (от). Сравнение величин уровней активности дегидрогеназ здоровой ткани и опухолевой ткани легкого осуществляли по критерию Вилкоксона. Гипотезу о статистической достоверности величин исследуемых показателей несвязанных выборок проверяли с помощью критерия Манна-Уитни. Силу взаимосвязей между исследуемыми параметрами исследовали с помощью корреляционного анализа. Статистическую обработку результатов осуществляли с помощью пакета прикладных программ ЭРБЗ 8.0.

1 2 3 4 5 6 7

Рис. 1. Идентификация генотипов гена в8ТМ1 методом ПЦР-анализа в 3%-ном агарозном геле:

1 - отрицательный контроль;

2, 5, б - генотип ОБТШ (+/+, +/0);

3, 4, 7 - генотип 08ТМ1 (0/0);

А - 271 н.п. (фрагмент СБТШ);

Б - 187 н.п.

РЕЗУЛЬТАТЫ

При исследовании особенностей уровней активности НАД- и НАДФ-зависимых дегидрогеназ в здоровой и опухолевой ткани легкого у больных раком легкого с различным генотипом в отношении гена ОБТЗУП обнаружено, что в клетках здоровой ткани при “нулевом генотипе” статистически достоверно повышены уровни Г-6-ФДГ, НАДФМДГ и ГР (рис. 2). Кроме того, в клетках здоровой ткани при ОБТМ! 0/0 значительно снижены уровни активности Обр. ЛДГ (при ОЯТМ1+-11,34+2,19 мкЕ/мг белка; при 08ТМ1 0/0 - 0,01±0,001 мкЕ/мг белка; Р<0,01) и Обр.МДГ (при С}8ТМ1+ - 106,18121,71 мкЕ/мг белка; при С8ТМ1 0/0 - 19,64±4,41 мкЕ/мг белка; Р<0,05), но при повышении активности МДГ (при С8ТМ1 + -49,61±12,36 мкЕ/мг белка; при 08ТМ1 0/0 -1363,99±205,54 мкЕ/мг белка; Р<0,01) и НАДИЦДГ (при ОБТМ1+- 6,18±2,11 мкЕ/мг белка; при С8ТМ1 0/0 - 36,93±12,07 мкЕ/мг белка; Р<0,05).

В клетках опухолевой ткани у больных раком легкого с генотипом ОЭТМ10/0 по сравнению с показателями больных с генотипом ОБТМ1+значительно снижена активность ГР (см. рис. 2), но повышены уровни Обр.ЛДГ (при ОЗТМ1+ - 0,01+0,001 мкЕ/мг белка; при С8ТМ1 0/0 - 42,51+10,48 мкЕ/мг белка; Р<0,001) и Обр.МДГ (при 08ТМ1+ - 2,36±0,41 мкЕ/мг белка; при С8ТМ1 0/0 -130,63±25,69 мкЕ/мг белка; Р<0,05).

При сравнительном исследовании уровней активности оксидоредуктаз в здоровой и опухолевой ткани легкого в зависимости от 08ТМ1-генотипа установлено, что у больных с генотипом 08ТМ1+в клетках опухолевой ткани по сравнению с клетками здоровой ткани увеличена активность НАДФМДГ и ГР (см. рис. 2), но снижены уровни Обр.ЛДГ (Р<0,01) и Обр.МДГ (Р<0,01). В то же время у больных с генотипом 08ТМ1 0/0 в клетках опухолевой ткани по сравнению с клетками здоровой ткани снижена активность Г-6-ФДГ, НДДФМДГ, ГР (см. рис. 2) и МДГ (Р<0,01), но при повышении уровней Обр. ЛДГ (Р<0,01) и Обр.МДГ (Р<0,05).

ОБСУЖДЕНИЕ

Исследуемые ферменты находятся на разных метаболических путях и преимущественно характеризуют пластические и энергетические реакции. Так, повышение активности Г6ФДГ в здоровой ткани легкого у больных с генотипом 08ТМ1 0/0, которая является ключевым и инициализирующим ферментом пентозофосфатного цикла, определяющего реакции макромолекулярного синтеза нуклеозвдов и нуклеотидов [3; 13] соответственно, может привести к активации ряда пластических процессов. Кроме того, известно, что НАДФН, образованный в окислительно-восстановительных реакциях пентозофосфатного цикла, может быть использован ГР в реакциях восстановления глутатиона [3]. При этом установлено, что в здоровой ткани легкого у больных данной группы активность ГР также повышена. НАДФМДГ, уровень активности которого повышен в здоровой ткани легкого больных раком с генотипом 08ТМ1 0/0, является ключевым ферментом липидного анаболизма, причем синтезированный НАДФН также исполь-

120

к

I 100

Рі<0,01

Р2<0,01

30

я

X

5

ш 25

1 20 С

^ 15

I»

і

§ * ^ о

Рі<0,01

Рі<0,05 Рг<0,05

8

150

Рі<0,001

Рі<0,001

—Ї— Рг<0,001

Рз<0,01

Г—. »—  1 —І

12 3 4

Рис. 2. Активность Г6ФДГ, НАДФМДГ и ГР в клетках здоровой и опухолевой ткани легкого у больных раком легкого с генотипами С8ТМ1+ и СвТМІ 0/0:

1 - активность ферментов в клетках здоровой ткани при генотипе ОЗТМ1+;

2 - активность ферментов в клетках здоровой ткани при генотипе ввТМ! 0/0;

3 - активность ферментов в клетках опухолевой ткани при генотипе ОЗТМ1+;

4 - активность ферментов в клетках опухолевой ткани при генотипе вйТМ! 0/0.

зуется в реакциях катаболизма ксенобиотиков. По-видимому, подобное состояние ферментов пластического обмена, синтезирующих НАДФН, является компенсаторной реакцией, связанной с недостаточностью глутатион-8-трансферазы М1.

Характеризуя энергетические процессы здоровой ткани легкого у больных с генотипом в8ТМ 1 0/0, необходимо отметить снижение активности НАДН -зависимых реакций ЛДГ и МДГ. Основной синтез НАДН в цитоплазматическом компартменте осуществляется в реакциях гликолиза. Ингибирование анаэробной реакции ЛДГ и НАДН-зависимой реакции МДГ отражает сниженную интенсивность анаэробного гликолиза. В то же время в здоровой ткани легкого у больных

с генотипом 08ТМ1 0/0 повышены уровни активности МДГ и НАДИЦДГ, что позволяет предположить усиленный субстратный поток по циклу трикарбоно-вых кислот, который является основным метаболическим циклом в митохондриальном компартменте для реакций аэробного дыхания.

Наряду с этим в опухолевой ткани уровни активности исследуемых ферментов также значительно различаются в зависимости от полиморфизма гена ОБТМ!. Так, в опухолевой ткани больных с генотипом 08ТМ1 0/0 выявляется снижение ГР по сравнению с выявленным уровнем у больных с генотипом 08ТМ1+, что отражает ингибирование глутатион-за-висимойатгиоксидантной системы. Можно предположить, что при недостаточности гяутатион-8-трансфе-разы М1 в случае развития опухолевого процесса происходит полный сбой системы обмена глутатиона. Кроме того, повышение активности анаэробной реакции ЛДГ и НАДН-зависимой реакции МДГ характеризует повышенный уровень анаэробных процессов в опухолевой ткани у больных с генотипом С8ТМ10/0.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, метаболические процессы в здоровой и опухолевой тканях легкого у больных раком легкого значительно различаются в зависимости от генотипа С8ТМ1, причем для ряда метаболических процессов в здоровой и опухолевой ткани выявляются противоположные изменения. Так, метаболизм здоровой ткани легкого при генотипе СБТМ1 0/0 характеризуется повышенным уровнем ряда пластических процессов с синтезом НАДФН и высокой активностью ГР. Со стороны энергетических процессов обнаружено выраженное снижение активности анаэробных реакций при повышении интенсивности субстратного потока по циклу трикарбоновых кислот. В опухолевой ткани пациентов с генотипом ОЭТМ10/0 при сниженной активности ГР выявляется повышение интенсивности анаэробных процессов. Эти особенности ткани легкого - как опухолевой, так и еще не претерпевшей морфологических изменений, позволили выделить

те метаболические процессы, которые качественно изменяют интенсивность при перерождении ткани, что, с одной стороны, характеризует патогенез опухолевого процесса, с другой, - делает данные ферментативные реакции перспективными в качестве цели воздействия при разработке новых медикаментозных методов терапии.

ЛИТЕРАТУРА

1. Баранов B.C., БарановаЕ.В., Иващенко Т.Э., Асеев М.В. Геном человека и гены «предрасположенности». Введение в предиктивную медицину - СПб.: «Интермедика», 2000.-271 с.

2. Белогубова Е.В., ТогоА.В., Кондратьева Т.В и др. //Вопр. онкологии. - 2000. - Т. 46, № 5. - С. 549-554.

3. Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия. -М.: Медицина, 1998. - 704 с.

4. Давыдов М.И., Аксель Е.М. Злокачественные новообразования в России и странах СНГ в 2001г. - М.: издательская группа РОНЦ, 2003. - 263 с.

5. Перельман М. //Врач.-2001.-№9.-С. 11-16.

6. Румянцева О.А., Маркова Е.В., Титова Н.М., Лапешин П. В. Полиморфизм генов глутатион-Б-трансферазы класса Ml и цитохрома Р-450А1 здоровых жителей города Красноярска и больных раком легкого // Депо-нир. в ВИНИТИ, 03.10,2003, № 1761-В2003. -44 с.

7. Савченко А.А., СущоваЛ.Н. II Лаб. дело. -1989. -№ 11.

- С. 23-25.

8. Bilello K.S., Murin S., Mattay R.A. II Clin. Chest. Med. -

2002. - Vol. 23, № 1. - P. 1-25.

9. Hemminki K., Zhang H., Csene К. IIInt. J. Cancer. -2003.

- Vol. 205, № 5. - P. 692-700.

10. Jefferies H., Coster J., Khalil A. et al. H ANZ J. Surg. -

2003. - Vol. 73, № 7. - P. 517-522.

11. Kiyohara C., Wakai K., Mikami H. et al. IIInt. J. Cancer. -2003. - Vol. 107, № 1. - P. 139-144.

12. Ma J. Y., Rengasamy A., Frazer D. et al. // Environ. Health Perspect.-2003.-Vol. 111,№9.-P. 1215-1221.

13. Matsubara S., Matsubara D., Ishibashi Т., Takizawa Т. II Eur. J. Histochem. - 2003. - Vol. 47, № 2. - P. 173-176.

14. McCammon М. Т., Epstein C.B., Przybyla-Zawislak B. et al II Mol. Biol. Cell. - 2003. - Vol. 14, № 3. - P.958-972.

15. Seidegard J., Pero R.W., Markowitz M.M. et al. II Carcinogenesis. -1990. - Vol. 11. - P. 33-36.

16. Strange R.S., Mathereo B., Faulder J.C. et al. I/ Carcenogenesis. -1991. - Voi. 12. - P.25-28.