Циркулирующие мкРНК как ранний индикатор инфекционно-воспалительных заболеваний у новорожденных

ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Циркулирующие мкРНК как ранний индикатор инфекиионно-воспалительных заболеваний у новорожденных

Тимофеева А.В.1, Никитина И.В.1, Гусар В.А.1, Чаговец В.В.1, Киртбая А. Р.1, 2, Ионов О.В.1, 2, Дегтярев Д.НЛ 2, Кан Н.Е.1, Франкевич В.Е.1

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И. Кулакова» Минздрава России, Москва

: ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Минздрава России

Инфекционно-воспалительные заболевания у новорожденных, возникающие на фоне морфофункцио-нальной незрелости иммунной системы, зачастую имеют стертую клиническую картину и остаются главной причиной смертельных исходов, в особенности глубоконедоношенных детей. Актуальным является поиск специфичных биомаркеров для своевременной неинвазивной диагностики и лечения данных заболеваний. Одними из ключевых регуляторов работы всех систем организма являются малые некодирующие РНК, в частности мкРНК, используемые для неинвазивной диагностики широкого спектра заболеваний, в том числе неонатального периода.

Цель - анализ уровня экспрессии мкРНК, потенциально регулирующих трансляцию IL-1ß, IL-6, IL-8, IL-10, IL-13, TNF-a, IFNy, CCL2, GM-CSF, в плазме периферической крови у детей различного гестационного возраста с дыхательными нарушениями инфекционного и неинфекционного генеза в первые сутки жизни.

Материал и методы. Методом ОТ-ПЦР в реальном времени проведена количественная оценка hsa-miR-16-5p, -92a-3p, -130a-3p, -223-3p в 81 образце плазмы крови 3 групп новорожденных различного гестационного возраста: 25-28, 29-31 и 32-40 нед, с применением коммерческих наборов Serum Plasma kit, miScript II RT Kit, SYBR Green PCR Kit (Qiagen, Германия).

Результаты. В плазме периферической крови новорожденных, родившихся на 32-40-й неделе гестации (н.г.), методом ОТ-ПЦР выявлено достоверное повышение уровня экспрессии hsa-miR-92a-3p и hsa-miR-130a-3p в случае диагностированной врожденной пневмонии (ВП), раннего неонатального сепсиса (РНС) и hsa-miR-16-5p в случае РНС относительно новорожденных с транзиторным тахипноэ (ТТН) и респираторным дистресс-синдромом (РДС). Непараметрическим методом ранговой корреляции по Спир-мену обнаружена достоверная корреляция между уровнем экспрессии hsa-miR-16-5p, -92a-3p, -130a-3p, -223-3p и ВП; hsa-miR-16-5p, -92a-3p и РНС; hsa-miR-92a-3p и балльной оценкой по шкале NEOMOD, характеризующей степень выраженности полиорганной недостаточности. В группе новорожденных в возрасте 25-31 н.г. продемонстрирована возможность дифференциальной диагностики ВП и РНС по уровню экспрессии hsa-miR-16-5p и hsa-miR-130a-3p в плазме крови. Найдена достоверная корреляция по Спирмену между уровнем экспрессии hsa-miR-16-5p и наличием внутрижелудочкового кровоизлияния (ВЖК) у детей с ВП или РНС, а также с балльной оценкой по шкале Сильвермана, характеризующей степень выраженности дыхательных расстройств у новорожденных.

Заключение. Впервые продемонстрирована значимость изменения уровня экспрессии hsa-miR-16-5p, -92a-3p, -130a-3p, -223-3p в плазме крови новорожденных различного гестационного возраста в диагностике ВП, РНС и ВЖК. Использование в клинической практике оценки уровня экспрессии мкРНК в плазме периферической крови новорожденных в сочетании с традиционным клинико-лабораторным обследованием позволит обеспечить более точную и раннюю диагностику инфекционно-воспалительных заболеваний, таких как ВП и РНС, в особенности у глубоконедоношенных детей.

Ключевые слова:

мкРНК, плазма периферической крови, ОТ-ПЦР в реальном времени, врожденная пневмония, ранний неонатальный сепсис, внутрижелудочковое кровоизлияние, новорожденный

Неонатология: новости, мнения, обучение. 2018. Т. 6. № 4. С. 34-48.

сЫ: 10.24411/2308-2402-2018-14004. Статья поступила в редакцию: 01.10.2018. Принята в печать: 10.10.2018.

Circulating miRNA as an early indicator of infectious inflammatory diseases in the newborns

TimofeevаA.V.1, NikitinaI.V.1, 1 V.I. Kulakov Obstetrics, Gynecology and Perinatology

Gusar V.A.1, Chagovets V.V.1, National Medical Research Center of Ministry of

Kirtbaya A.R.12, Ionov O.V.12, Healthcare of the Russian Federation, Moscow

Degtyarev D.N.12, Kan N.E.1, 2 I.M. Sechenov First Moscow State Medical University

Frankevich V.E.1

Infectious inflammatory diseases in newborns remain the main cause of the death in neonatal period. They occurred in the setting of the morphofunctional dismaturity of immune system and often paucisymptomatic. The assessment of the specific biomarkers for non-invasive diagnostics and treatment of these diseases is currently important. One of the key regulators of the body system is small non-coding RNAs. miRNAs used for non-invasive diagnostics of a wide range of diseases.

Aim: analysis of the expression level of miRNAs that potentially regulates translation of IL-1p, IL-6, IL-8, IL10, IL13, TNF-a, IFNy, CCL2 and GM-CSF in the peripheral blood plasma of newborns. Newborns of the first day of life with the different gestational ages with respiratory disorders by infectious and non-infectious nature were evaluated.

Material and methods. Real-time RT-PCR was used to quantify hsa-miR-16-5p, -92a-3p, -130a-3p, -223-3p in 81 blood plasma samples of 3 groups of newborns divided by gestational age: 25-28, 29-31 and 32-40 weeks. Serum Plasma kit, miScript II RT kit, SYBR Green PCR Kit (Qiagen, Germany) were used in the study.

Results. RT-PCR evaluated a significant increase in the expression level of hsa-miR-92a-3p and hsa-miR-130a-3p in the case of diagnosed congenital pneumonia (CP) and early neonatal sepsis (ENS). Statistical analysis revealed a significant correlation between the level of an expression of hsa-miR-16-5p, -92a-3p, -130a-3p, -223-3p and CP; hsa-miR-16-5p, -92a-3p and ENS; hsa-miR-92a-3p and NEOMOD score's scale. The possibility of differential diagnosis of CP and ENS by the expression level of hsa-miR-16-5p and hsa-miR-130a-3p in blood plasma was demonstrated for the group of newborns of 25-31 GA. Statistic significant Spearman correlation were found for CP or ENS. These findings related between the level of hsa-miR-16-5p expression in intraventricular hemorrhage (IVH) and Silverman Score for study groups.

Conclusions. For the first time, the significant changes in the expression level of hsa-miR-16-5p, -92a-3p, -130a-3p, -223-3p in the blood plasma of newborns of various gestational age were demonstrated. We suspected that these findings will use as important tool for the differential diagnosis of CP, ENS and IVH. The miRNA expression level detection in the blood plasma of newborns can allow for more accurate and early diagnosis of infectious inflammatory diseases: CP and ENS, especially among extremely preterm newborns.

Keywords: miRNA, peripheral blood plasma, real-time RT-PCR, congenital pneumonia, early neonatal sepsis, intraventricular hemorrhage, newborn

Keywords:

miRNA, peripheral blood plasma, real-time RT-PCR, congenital pneumonia, early neonatal sepsis, intraventricular hemorrhage, newborn

Neonatology: News, Opinions, Training. 2018; 6 (4): 34-48.

doi: 10.24411/2308-2402-2018-14004. Received: 01.10.2018. Accepted: 10.10.2018.

Список сокращений

ВЖК - внутрижелудочковое кровоизлияние

ВП - врожденная пневмония

ВЧОВЛ - высокочастотная осцилляторная вентиляция

легких

ИВЛ - искусственная вентиляция легких

МРТ - магнитно-резонансная томография

НСГ - нейросонография

ОНМТ - очень низкая масса тела

РДС - респираторный дистресс-синдром

РНС - ранний неонатальный сепсис

ССВО - синдром системного воспалительного ответа

ТТН - транзиторное тахипноэ новорожденных

ЭНМТ - экстремально низкая масса тела

ЭхоКГ - эхокардиография

ч.н. - число новорожденных

н.г. - неделя гестации

IL-1ß - интерлейкин 1ß

IL-6 - интерлейкин 6

IL-8 - интерлейкин 8

IL-10 - интерлейкин 10

IL-13 - интерлейкин 13

TNF-a - фактор некроза опухолей альфа

IFNy - интерферон гамма

Biphasic - режим ИВЛ с переменным положительным

давлением на вдохе и выдохе пациента

СРАР - режим ИВЛ постоянным положительным давлением

CCL2 - моноцитарный хемотаксический белок 1

CRP, СРБ - С-реактивный белок

GM-CSF - гранулоцитарно-макрофагальный колониестиму-лирующий фактор

Несмотря на значительные успехи перинатальной медицины, неонатальные инфекции и РДС остаются главной причиной смертности новорожденных и недоношенных детей [1, 2]. Для новорожденных и особенно глубоконедоношенных детей, родившихся с очень низкой (ОНМТ) и экстремально низкой массой тела (ЭНМТ), характерны быстрая генерализация инфекции и тяжелое течение заболевания, что отражает функциональную незрелость их иммунной системы [3-5]. Проявления клинических признаков инфекционных заболеваний, в частности сепсиса, у детей ОНМТ и ЭНМТ зачастую неспецифичны и отличаются от таковых у детей более старшего возраста и у взрослых [6]. Изучением созревания иммунной системы плода на протяжении беременности занимались различные научные коллективы [7-10].

Однако особенности регулирования межклеточного взаимодействия в рамках первичного иммунного ответа до конца не изучены. Одними из ключевых регуляторов работы всех систем организма являются малые некодирующие РНК, в частности мкРНК, оказывающие посттранскрипционное воздействие на уровень экспрессии белок-кодирующих генов. В связи с выраженной зависимостью уровня экспрессии тканевых мкРНК от гестационного возраста плода [11] преждевременное родоразрешение может быть причиной несбалансированной работы мкРНК, контролирующих развитие, дифференцировку и функцию клеток иммунной системы у плода, а значит нарушений во врожденном и адаптивном иммунных ответах при попадании патогена внутрь организма. В статье А.С. Жуковой и соавт. [12] проанализирован спектр хемокинов, про- и противовоспалительных цитокинов в плазме пуповинной и периферической крови у новорожденных и выявлены достоверные отличия по их содержанию у детей с ВП при сравнении с таковым у детей с респираторными нарушениями неинфекционного генеза.

Цель настоящей работы - проведение ретроспективного анализа клинической значимости уровня экспрессии мкРНК, потенциально регулирующих IL-1ß, IL-6, IL-8, IL-10, IL-13, TNF-a, IFNy, CCL2, GM-CSF, согласно базам данных miRWalk, miRanda, RNA22, Targetscan, в плазме периферической крови

у детей различного гестационного возраста с дыхательными нарушениями инфекционного и неинфекционного генеза в первые сутки жизни.

Материал и методы

Пациенты

В исследование включен 81 новорожденный, поступивший в возрасте первых суток жизни в отделение реанимации и интенсивной терапии новорожденных (ОРИТН) ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И. Кулакова» Минздрава России для обследования и лечения (табл. 1). Глубоконедоношенные дети, родившиеся на сроке беременности от 25-й до 31-й недели гестации (н.г.), вошли в 1-ю (25-28 н.г.) и 2-ю (29-31 н.г.) группы; недоношенные и доношенные дети, родившиеся на сроке беременности от 32-й до 40-й н.г., вошли в 3-ю группу. Дети, у которых было диагностировано транзиторное тахипноэ новорожденных (ТТН), составили контрольную группу для детей с респираторным дистресс-синдромом (РДС), врожденной пневмонией (ВП) и ранним неонатальным сепсисом (РНС) 3-й группы. Дети с РДС служили контролем для детей с ВП и РНС 1-й и 2-й групп.

Все дети, включенные в исследование, из родильного зала были госпитализированы в ОРИТН. При поступлении новорожденным налаживали респираторную терапию, мониторинг жизненно важных функций организма, проводили первичное клинико-лабораторное обследование: посев крови на стерильность, клинический анализ крови и определение уровня СРБ в возрасте 6 ч жизни, рентгенографию органов грудной полости, ПЦР-диагностику (бактериальный и грибковый скрининг), НСГ, ЭхоКГ и УЗИ внутренних органов. На 3-и сутки жизни с целью верификации клинического диагноза выполняли расширенное клинико-лабораторное и инструментальное обследование, включавшее клинический и биохимический анализы крови, контроль показателей СРБ, общий анализ мочи, нейросонографию (НСГ), эхокарди-ографию (ЭхоКГ), ультразвуковое исследование (УЗИ) вну-

Таблица 1. Клинические характеристики анализируемых групп новорожденных

Показатель Группа, диапазон гестационного возраста, нед

1-я, 25- 28-я н.г. 2-я, 29-31-я н.г. 3-я, 32- 40-я н.г.

1-я подгруппа 2-я подгруппа 1-я подгруппа 2-я подгруппа 3-я подгруппа 1-я подгруппа 2-я подгруппа 3-я подгруппа 4-я подгруппа

Подгруппа, численность ВП, п=5 РНС, п=7 РДС, п=8 ВП, /1=7 РНС, п=9 ТТН, п=12 РДС, м-16 ВП, п=12 РНС, п=5

Гестационный возраст, нед 27±1 26±1 30±1 29±1 30±1 36±3 34±2 35±3 37±3

Пол (мужской/женский), ч.н. 2/3 4/3 3/5 3/4 5/4 5/7 8/8 8/4 4/1

Масса тела при рождении, г 910±98 803±220 1537±285 1094±267 1046±360 2448±375 1826±311 2219±705 2586±681

Способ родоразрешения (самопроизвольные/кесарево сечение), ч.н. 0/5 0/7 0/8 0/7 0/9 5/7 2/14 4/8 2/3

Оценка по шкале Апгар

Оценка по шкале Апгар

Оценка по шкале NEOMOD (>5 баллов), ч.н. 2 3 0 4 5 0 0 3 1

Оценка по шкале NEOMOD, средний балл

Оценка по шкале Сильвермана (>4 баллов), ч.н. 0 3 0 5 4 0 1 2 0

Оценка по шкале Сильвермана, средний балл

Асфиксия (нет/средняя степень/ тяжелая степень), ч.н. 2/2/1 1/3/3 8/0/0 4/1/2 2/6/1 9/3/0 16/0/0 9/0/3 5/0/0

ИВЛ, ч.н. 3 4 0 6 6 2 2 6 4

ВЧОВЛ, ч.н. 0 3 0 4 4 0 0 3 3

CPAP, ч.н. 0 1 5 0 0 6 11 7 4

BiPAP, ч.н. 2 6 4 6 7 з 12 5 0

ВЖК (I/II/III степень), ч.н. 0/5/0 0/3/1 1/0/0 0/4/3 2/1/3 0/0/0 0/0/0 1/1/0 0/0/0

Лейкоцитоз (>30 тыс.), ч.н. 0 0 0 0 0 0 1 1 0

Абсолютное число нейтрофилов [норма/нейтрофилез (>20 тыс.)/ нейтропения (<2 тыс.)], ч.н. 5/0/0 5/1/1 8/0/0 6/0/1 6/0/3 12/0/0 13/1/2 12/0/0 4/0/1

Тромбоцитопения (<150 тыс.), ч.н. 1 1 0 2 3 0 0 2 0

CRP (>5 мг/л), ч.н. 1 1 0 0 1 0 0 1 1

Положительная гемокультура, ч.н. 0 1 1 1 1 0 0 0 1

Антибиотикотерапия, ч.н. 5 7 5 7 9 2 9 12 5

I в тексте.

тренних органов и рентгенологическое исследование легких в динамике. Магнитно-резонансную томографию (МРТ) головного мозга выполняли по показаниям детям с внутри-желудочковым кровоизлиянием (ВЖ^ II и III степени после стабилизации их клинического состояния.

О наличии ВП у детей с дыхательными расстройствами свидетельствовало присутствие как минимум 2 клинических и 1 лабораторного признака синдрома системного воспалительного ответа (ССВО), а также наличие инфильтративных изменений в легких по данным рентгенографии органов грудной полости. О течении РНС свидетельствовало наличие очага инфекции, явлений полиорганной недостаточности и признаков ССВО [13]. Оценку общей тяжести состояния и степени выраженности полиорганной недостаточности в первые 3 сут проводили с использованием шкалы NEOMOD [14, 15], балльную оценку дыхательных нарушений -по шкале Сильвермана [16].

Выделение РНК из плазмы периферической крови

Материалом исследования служили образцы периферической крови новорожденных первых суток жизни. Взятие образцов периферической крови объемом 500 мкл осуществляли в пробирки VACUETTE, содержащие 0,1М раствор ЭДТА. Образцы центрифугировали в течение 20 мин при 300 g (4 °C), отбирали плазму, которую повторно центрифугировали в течение 10 мин при 14 500 g (4 °C). PНK выделяли из 100 мкл плазмы крови набором Serum Plasma kit (Qiagen, Германия) с предварительным добавлением в каждый образец 5,6xl08 копий экзогенной нормировочной мкPНK cel-miR-39 (Qiagen, Германия) после обработки фенол-содержа-щей смесью Qiazol (Qiagen, Германия).

Обратная транскрипция РНК

7 из 14 микролитров РН^содержащего элюата колонки набора Serum Plasma kit конвертировали в кДНK в реакционной смеси (20 мкл), содержащей однократный буфер (Hispec buffer), однократную смесь дезоксинуклеотид-трифосфатов (Nucleics mix) и обратную транскриптазу (miScript RT) в соответствии с протоколом miScript II RT Kit (Qiagen, Германия); по окончании реакции объем образца доводили деионизованной водой до 200 мкл.

Количественная ПЦР в реальном времени

Синтезированную кДНK (2 мкл) использовали в качестве матрицы для ПЦР в реальном времени c применением смысловых праймеров, специфичных для hsa-miR-l6-5p (5'-TAGCAGCACGTAAATATTGGCG, Tm = 62 °C), hsa-miR-92a-3p (5'-TATTGCACTTGTCCCGGCCTGT, Tm = 60 °C), hsa-miR-l30a-3p (5'-CAGTGCAATGTTAAAAGGGCAT, Tm = 49 °C), hsa-miR-223-3p (5'-TGTCAGTTTGTCAAATACCCCA, Tm = 56 °C), cel-miR-39 (miScript Primer Assay, Ce_miR-39_l, Qiagen, Германия, Tm = 55 °C) и однократной реакционной смеси (SYBR PCR Master Mix) с добавленным однократным универсальным антисмысловым праймером (miScript Universal Primer) из набора miScript SYBR Green PCR Kit (Qiagen, Германия). Протокол амплификации: (1) денатурация ДНK в течение 15 мин при 95 °C, (2) 40 циклов амплификации: денатурация ДНK при 94 °C в течение 15 с, отжиг смыслового и антисмыс-

лового праймеров при оптимизированной температуре (49-62 °C) в течение 30 с, удлинение праймеров при 70 °C в течение 30 с с детекцией флюоресцентного сигнала после каждого цикла реакции, (3) построение кривых плавления продукта ПЦР (нагревание реакционной смеси с 65 до 95 °С с шагом 0,1 °С, сопровождающееся детекцией флюоресцентного сигнала на каждом шаге) в амплификаторе StepOne-PLusTM thermocycLer (Applied Biosystems, USA). Специфичность амплификации оценивали по кривым плавления продукта ПЦР. Относительный уровень экспрессии кДНК вычисляли по разнице пороговых циклов амплификации кДНК анализируемой мкРНК (hsa-miR-16-5p, -92a-3p, -130a-3p, -223-3p) и нормировочной экзогенной мкРНК (cel-miR-39) в одном и том же образце. Анализ значимости различий медианы ACt мкРНК в сравниваемых группах новорожденных выполняли с использованием двустороннего теста Вилкоксона-Манна-Уитни.

Результаты

Биоинформатический поиск мкРНК-потенциальных регуляторов иммунного ответа

С помощью базы данных miRWalk, miRanda, RNA22 и Targetscan были выбраны четыре мкРНК - hsa-miR-16-5p, -92a-3p, -130a-3p, -223-3p, потенциально регулирующие основные звенья иммунного ответа (табл. 2), а именно: пополнение пула гранулоцитарно-макрофагальной популяции клеток (GM-CSF), активация которых при контакте с патогеном ведет к выбросу провоспалительных цитоки-нов (в том числе IL-1ß, IL-6, TNF-a, IFNy), противовоспалительных цитокинов (например, IL-10, IL-13) и хемокинов (среди прочих IL-8, CCL2). От соотношения медиаторов воспалительной реакции зависит ее исход - разрешение или усугубление с развитием осложнений, в том числе септических. Известно, что иммунный ответ неонатального периода сдвинут в сторону регуляторного Т1п2-типа относительно провоспалительного Т1п1-типа, обеспечивая тем самым пролонгирование и физиологическое течение беременности, но обусловливая высокую уязвимость к патогенным микроорганизмам [17, 18]. Представлялось интересным проанализировать возможность дифференцировать респираторные нарушения инфекционного и неинфекционного генеза по уровню экспрессии hsa-miR-16-5p, -92a-3p, -130a-3p, -223-3p в плазме периферической крови новорожденных разного гестационного возраста.

Анализ экспрессии мкРНК в плазме периферической крови новорожденных, родившихся на сроке беременности более 32 нед гестации

В группе детей, рожденных после 32-й недели гестации (3-я группа, см. табл. 1), проведен сравнительный анализ уровня экспрессии hsa-miR-16-5p, -92a-3p, -130a-3p, -223-3p в подгруппах 2, 3 и 4 относительно контрольной подгруппы 1 (см. табл. 1, рис. 1). Не выявлено статистически значимых различий в уровне экспрессии перечисленных мкРНК между подгруппами с респираторными нарушениями неинфекционного генеза (РДС и ТТН), т.е. между 2-й и 1-й подгруппой соответственно. Содержа-

Таблица 2. мкРНК и их потенциальные гены-мишени

мкРНК MIMATid Ген -мишень EntrezID RefseqID miRWalk* miRanda* RNA22* Targetscan* 1 Общий балл

hsa-miR-16-5p MIMAT0000069 IL13 3596 NM_002188 1 0 1 1 3

GM-CSF 1437 NM_000758 0 0 1 0 1

hsa-miR-92a-3p MIMAT0000092 ILIO 3586 NM_000572 0 0 1 0 1

IFNG 3458 NM_000619 1 0 0 1 2

IL6 3569 XM_005249745 1 0 0 0 II 1

IL1B 3553 NM_000576 0 0 1 0

IL13 3596 NM_002188 0 0 1 0

IL8 3576 NM_000584 1 0 1 1 3

TNF-a 7124 NM_000594 1 0 0 0 1

hsa-miR-130a-3p MIMAT0000425 TNF-a 7124 NM_000594 1 1 0 1 3

IL13 3596 NM_002188 0 0 1 0 1

CCL2 6347 NM_002982 0 0 1 0 1

hsa-miR-223-3p MIMAT0000280 IL10 3586 NM_000572 0 0 1 0

IL6 3569 XM_005249745 0 0 1 0

GM-CSF 1437 NM_000758 1 0 1 1 3

IL13 3596 NM_002188 1 0 0 0 1

TNF-a 7124 NM_000594 1 0 0 0 1

Примечание. * - 1 означает наличие; 0 - отсутствие участка связывания мкРНК с 3'-НТО мРНК гена-мишени в соответствии с алгоритмом расчета межмолекулярных взаимодействий баз данных т1Я'^а!к, т1Яапда, ЯЫЛ22, Та^еТэсап.

5-

II

0-

I

-5-

mir-130a-3p

mir-16-5p

mir-223-3p

mir-92a-3p

ТТН

РДС

ВП

РНС

Рис. 1. Сравнительный анализ уровня экспрессии Ива-тнМб^р, -92а-3р, -130а-3р, -223-3р в подгруппах детей с транзитор-ным тахипноэ новорожденных (ТТН), респираторным дистресс-синдромом (РДС), врожденной пневмонией (ВП) и ранним нео-натальным сепсисом (РНС), рожденных на 32-40-й неделе гестации

ние 1^-1^-16^ в плазме крови новорожденных с РНС (4-я подгруппа) было значимо выше такового у детей с ТТН (1-я подгруппа, р=0,019) и детей с РДС (2-я подгруппа, р=0,05). Уровень экспрессии hsa-miR-92a-3p был повышен у новорожденных с ВП (р=0,002) и РНС (р=0,004) по срав-

нению c показателями детей с ТТН. У детей с ВП и РНС было достоверно повышено содержание hsa-miR-130a-3p как при сравнении с детьми с ТТН (р=0,002 и р=0,019 соответственно), так и с детьми с РДС (р=0,001 и р=0,025 соответственно).

со сч и с^

о

г- со ю о 00

о о"

с^ о

со о

=} «

со о

О «9

Н М о О

(О СП

О 00

О СП

^н о

о о"

г^ О)

с^ см о о

(О л

СП Л

°> й

N М

о" О

г-

Ь- < С^ 2

о"

со

ю < 00 2

со <

О 2

о

И гТ и %

ю ^ сэ

£

си §

о.

¿3

X X

а" <к

5

. .

о

>х

0

Щ

1 га

.

I си X а X

О

о

8 ^ & 1

С *

С целью статистического анализа взаимосвязи уровня экспрессии мкРНК (значения ДО) в плазме периферической крови новорожденных с клинико-анамнестическими параметрами был применен непараметрический метод ранговой корреляции по Спирмену (табл. 3). Была выявлена отрицательная достоверная корреляция между уровнем экспрессии 1пБа-Ш11М6-5р, -92а-3р, -130а-3р, -223-3р и наличием у новорожденного ВП. Важно отметить, что чем больше значение ДС: тем ниже уровень экспрессии, т.е. отрицательная корреляция между ДО и клинико-лабораторным параметром свидетельствует о наличии корреляции между повышением уровня экспрессии ИБа-шИМ6-5р, -92а-3р, -130а-3р, -223-3р и диагностированной ВП. Повышение уровня экспрессии 1пБа-ш11М6-5р и 1пБа-ш1К-92а-3р достоверно коррелировало с наличием как РНС, так и лейкоцитоза у новорожденных, а ИБа-шИ}-92а-3р - с повышением балльной оценки по шкале МЕОМОй, характеризующей степень выраженности полиорганной недостаточности.

Анализ уровня экспрессии мкРНК в плазме периферической крови у новорожденных, родившихся на сроке беременности менее 32 нед гестации

При анализе уровня экспрессии мкРНК в плазме периферической крови новорожденных 1-й и 2-й групп (см. табл. 1) обращало на себя внимание наличие ВЖК II и III степени у всех детей с диагнозом ВП, у 4 из 7 детей с диагнозом РНС 1-й группы, у 4 из 9 детей с диагнозом РНС 2-й группы, в отличие от детей с диагнозом РДС 2-й группы, у которых ВЖК не было. В связи с тем что ВЖК имеет многофакторный генез и основными факторами возникновения являются внутриутробная гипоксия, недоношенность и внутриутробная инфекция [19], важно было учитывать наличие данного патологического состояния при сравнении подгрупп внутри 1-й и 2-й групп детей. Кроме того, при использовании непараметрического метода ранговой корреляции по Спирмену была выявлена отрицательная корреляция между значением ДО: ИБа-шИМ6-5р и наличием ВЖК у новорожденных (/"=-0,4717, р=0,0037).

В 1-й группе выявлено достоверное повышение уровня экспрессии 11Ба-тИМ6-5р у детей с РНС, имеющих ВЖК, по сравнению с детьми с РНС без ВЖК (р=0,00761, рис. 2). Однако зависимости уровня экспрессии 1пБа-ш11М6-5р от наличия ВЖК у детей II группы с РНС не обнаружено. При отсутствии ВЖК у детей с РНС наблюдали зависимость уровня экспрессии 11Ба-тИМ6-5р от гестационного возраста (2-я подгруппа 1-й группы в сравнении с 3-й подгруппой 2-й группы, р=0,03475) в виде повышения содержания 1пБа-ш11М6-5р в плазме периферической крови с увеличением срока беременности. Напротив, при сопоставлении 2-й подгруппы 1-й группы и 3-й подгруппы 2-й группы детей с РНС и ВЖК наблюдали достоверное снижение уровня экспрессии 11Ба-тИМ6-5р с увеличением гестационного возраста (р=0,03812).

При сопоставлении 1-й и 2-й подгрупп внутри I группы обнаружено повышение уровня экспрессии 1пБа-ш11М6-5р, |1Ба-шИМ30а-3р, 1пБа-ш1К-223-3р у детей с РНС и ВЖК

6"

3-

о

<

0-

о

<

0-

5

-5-

25-28-я н.г.

29-31-я н.г.

mir-130a-3p mir-16-5p mir-223-3p mir-92a-3p

н РНС без ВЖК Е±1| РНС с ВЖК

Рис. 2. Относительный уровень экспрессии Ива-тпМб-Бр в подгруппах детей с ранним неонатальным сепсисом (РНС) в сочетании с ВЖК и без внутрижелудочковым кровоизлиянием (ВЖК), рожденных в период с 25-й по 28-ю и с 29-й по 31-ю неделю гестации

н ВП, ВЖК РНС, вжк

Рис. 3. Сравнительный анализ уровня экспрессии Ива-тпР-16-5р, -92а-3р, -130а-3р, -223-3р в подгруппах детей с врожденной пневмонией (ВП) и ранним неонатальным сепсисом (РНС) в сочетании с внутрижелудочковым кровоизлиянием (ВЖК), рожденных на 25-28-й неделе гестации

в сравнении с детьми с ВП и ВЖК (рис. 3), при этом достоверные изменения были выявлены лишь для hsa-miR-16-5p (p=0,032). Напротив, во 2-й группе при сопоставлении 2-й и 3-й подгрупп обнаружено достоверное снижение уровня экспрессии hsa-miR-16-5p (p=0,050) у детей с РНС и ВЖК в сравнении с детьми с ВП и ВЖК (рис. 4). Важно отметить, что в настоящей работе в 1-й и 2-й группах обнаружена отрицательная корреляция между значением ACt hsa-miR-16-5p и балльной оценкой по шкале Сильвермана (/-=-0,4548, p=0,0053), характеризующей степень выраженности дыхательных расстройств у новорожденного, и использованием в связи с дыхательной недостаточностью ИВЛ (/-=-0,4312, p=0,0087) или ВЧОВЛ (/=-0,4267, p=0,0095) (см. табл. 3).

Сопоставление 1-й и 3-й подгрупп внутри 2-й группы не выявило никаких достоверных отличий в уровне экспрессии четырех анализируемых мкРНК у новорожденных с РНС без ВЖК относительно детей с РДС без ВЖК.

Необходимо отметить, что у всех детей с ВП из 1-й подгруппы 1-й группы и 2-й подгруппы 2-й группы было ВЖК II-III степени, и данные подгруппы достоверно отличались по уровню экспрессии hsa-miR-16-5p (p=0,048), hsa-miR-92a-3p (p=0,030), hsa-miR-130a-3p (p=0,003), hsa-miR-223-3p (p=0,048) с более высоким уровнем экспрессии в 2-й подгруппы 2-й группы (рис. 5). Эти данные демонстри-

руют зависимость уровня экспрессии перечисленных выше мкРНК от срока гестации, что может и обусловливать различия в иммунных реакциях при возникновении внутриутробной инфекции и, соответственно, различия в клинической картине ВП (см. табл. 1).

Найдены достоверные различия между РНС и ВП на разных сроках гестации по уровню экспрессии мкРНК в плазме периферической крови детей первых суток жизни: повышенная экспрессия hsa-miR-130a-3p у детей с РНС относительно детей с ВП, рожденных на сроке беременности 25-28 нед (p=0,003, рис. 6); сниженная экспрессия hsa-miR-16-5p у детей с РНС относительно детей с ВП, рожденных на сроке беременности 29-31 нед (p=0,023, рис. 7).

Гены-мишени дифференциально экспрессированных мкРНК

В рамках базы данных miRPathDB v1.1 (https://mpd. bioinf.uni-sb.de) с использованием внешней базы данных MiRTargetLink Human были найдены гены-мишени hsa-miR-16-5p (132 гена), -92a-3p (30 генов), -130a-3p (13 генов), -223-3p (40 генов). При этом регуляторная взаимосвязь пары «мкРНК/ген-мишень» была доказана экспериментально как минимум двумя независимыми исследованиями и расценивалась как strong (сильная). Система классификации генов KEGG (https://www.kegg.jp) позволила проана-

лизировать функцию выявленных генов-мишеней, и информация об их участии в сигнальных путях, задействованных в иммунном ответе, оформлена в виде табл. 4.

Обсуждение

В настоящем исследовании в плазме периферической крови новорожденных первых суток жизни проанализирован уровень экспрессии четырех мкРНК - 1п$а-т11М6-5р, -92а-3р, -130а-3р, -223-3р, потенциально регулирующих пополнение пула гранулоцитарно-макрофагальной популяции клеток, синтез про- и противовоспалительных цитоки-нов и хемотаксис лейкоцитов, согласно базам данных шИ}-WaLk, шИ^апСа, РЫД22 и Тагде1Бсап, в группах детей в возрасте 25-28, 29-31 и 32-40 н.г. с респираторными нарушениями неинфекционного и инфекционного генеза, осложненными ВЖК и без ВЖК. Выявлена зависимость уровня экспрессии данных мкРНК от гестационного возраста новорожденных, в связи с чем проанализирована связь респираторных нарушений с уровнем экспрессии мкРНК в каждой из трех анализируемых групп детей различного гестационного возраста в первые сутки жизни, а именно: повышенная экспрессия ИБа-шИМЗОа-Зр характерна для детей с РНС, рожденных на 25-28-й н.г.; сниженная экспрессия 1п$а-т11М6-5р является

маркером РНС у детей в возрасте 29-31 н.г.; повышенная экспрессия 11$а-ш11М6-5р является признаком наличия ВЖК П-Ш степени в группе детей с РНС в возрасте 25-28 н.г.; повышенная экспрессия И$а-ш1К-92а-3р и ИБа-тИМЗОа-Зр ассоциирована с наличием ВП в группе детей возрастом 32-40 н.г.; в случае развития РНС повышена экспрессия ИБа-тИМ6-5р, 11Ба-т1К-92а-3р и 1п$а-т11М30а-3р в группе детей в возрасте 32-40 н.г.

Обращает на себя внимание участие анализируемых мкРНК в регуляции дифференцировки ТИ1- и ТИ2-лимфоцитов, воздействуя на гены-мишени СНиК, НИв, Ы0ГСН2, ЯиЫХЗ, ЯГАГБА (РДТН:ко04658, см. табл. 4). Согласно базе данных KEGG, пул ТИ1-клеток образуется под действием провоспалительных цитокинов, характеризуется синтезом транскрипционного фактора Т-Ье1, БТДТ4 и формирует клеточный иммунитет; напротив, противовоспалительные цитокины, уровень которых регулируется М0ТСН1/2 и транскрипционными факторами GATA3, БТДТ5, БТДТ6 и др., направляют дифференцировку Т-клеток по ТИ2-пути, участвующему в гуморальном иммунном ответе. Сбалансированность формирования ТИ1- и ТИ2-подтипов Т-хелперов, в которой ключевую роль играют ингибитор альфа-субъединицы киназы ядерного фактора каппа-В (СНиК) и транскрипционный фактор 1^иМХ3 [20], определяет подверженность организма

9-

- II

1

1 1 II II

II и

1 и 1

•

о

<

1

•  1

• • 1

-

г ^

т1г-130а-3р т1г-16-5р т1г-223-3р т1г-92а-3р

т1г-130а-3р т1г-16-5р т1г-223-3р т1г-92а-3р

ВП, ВЖК

РНС, ВЖК

25-28 н.г.

29-31 н.г.

Рис. 4. Сравнительный анализ уровня экспрессии Ива-тпР-16-5р, -92а-3р, -130а-3р, -223-3р в подгруппах детей с врожденной пневмонией (ВП) и ранним неонатальным сепсисом (РНС) в сочетании с внутрижелудочковым кровоизлиянием (ВЖК), рожденных на 29-31-й неделе гестации

Рис. 5. Относительный уровень экспрессии Ива-т1Р-16-5р, -92а-3р, -130а-3р, -223-3р в подгруппах детей с врожденной пневмонией (ВП) в сочетании с внутрижелудочковым кровоизлиянием (ВЖК), рожденных на 25-28-й и 29-31-й неделе гестации

5-

о

<

0-

0-

-5-

II

mir-130a-3p mir-16-5p mir-223-3p mir-92a-3p

mir-130a-3p mir-16-5p mir-223-3p mir-92a-3p

ВП

РНС

ВП

РНС

Рис. 6. Относительный уровень экспрессии экспрессии Ива-1ГнР-16-5р, -92а-3р, -130а-3р, -223-3р в подгруппах детей врожденной пневмонией (ВП) и ранним неонатальным сепсисом (РНС), рожденных на 25-28-й неделе гестации

Рис. 7. Относительный уровень экспрессии экспрессии Ива-1ГнР-16-5р, -92а-3р, -130а-3р, -223-3р в подгруппах детей врожденной пневмонией (ВП) и ранним неонатальным сепсисом (РНС), рожденных на 29-31-й неделе гестации

к действию инфекционного агента и способность ему противостоять. В свою очередь, цитокины IL-4, IL-27 Т1п2-клеток и цитокин IFNG Thl-клеток путем активации STAT5, STAT6 и STAT1 соответственно ингибируют дифференцировку CD4+ Т-клеток в клетки Th17 (PATH:ko04659), продуцирующих IL-17, IL-21 и IL-22 под действием транскрипционных факторов STAT3, ROR(gamma)t, SMAD, mTOR в ответ на активацию антигенпрезентирующих клеток и синтеза ими TGFB, IL-6, IL-1, IL-23 и IL-21. Ингибирование дифференцировки Т-хелперов в ^^-клетки необходимо для предупреждения чрезмерной воспалительной реакции и защиты тканей от повреждения. При этом индукция синтеза цитокинов воспаления и хемокинов в дендритных клетках, макрофагах и нейтрофилах происходит через рецепторы лектина C-типа (CLRs), которые узнают бактериальные, дрожжевые и грибковые паттерны (в частности, бета-глюканы и углеводы маннозного типа), уровень синтеза которых и определяет дифференцировку CD4+-клеток в Th1-, Th2- или ^^-клетки. Согласно табл. 4 (PATH:ko04625), сигнальный путь через активацию рецепторов лектина C-типа регулируется мкРНК hsa-miR-16-5p, hsa-miR-130a-3p, hsa-miR-223-3p путем посттранскрипционного воздействия на гены-мишени CHUK, KRAS, PTGS2, RAF1, TNF, IL-6. Недавние исследования выявили сниженную продукцию ^-цита^нов и повышенную продукцию Th17-цитокинов у новорожденных в сравнении

со взрослыми людьми [21]. H.-C. Huang и соавт. обнаружили повышенный уровень IL-8 и TNF-a в крови новорожденных в сравнении со взрослыми людьми [22, 23]. Важно отметить, что при неонатальных инфекциях повышенный уровень про-воспалительных цитокинов коррелирует с частотой смертельных исходов [24, 25].

Нельзя не отметить возможную роль анализируемых мкРНК в сигнальном пути, опосредованном Toll-подобными рецепторами (PATH:ko04620, см. табл. 4), экспрессирующи-мися на клетках врожденного иммунитета (макрофаги, дендритные клетки) и связывающими мембранные компоненты грамотрицательных и грамположительных бактерий. Активация данных рецепторов приводит к синтезу провоспалитель-ных цитокинов (например, TNF и IL-6) и хемокинов (в том числе CCL3) посредством действия митоген-активируемых киназ (MAP2K4) и регуляторов NFKB (CHUK). Распознавание патогенной инфекции осуществляется и цитозольными NOD-подобными рецепторами (PATH:ko04621, см. табл. 4), обусловливая синтез цитокинов IL-6, IL-18, TNF путем активации NFKB и MAPK с участием белков XIAP и CHUK, в то время как продукция цитокинов воспаления IL-1ß и IL-18 в сигнальном пути, опосредованном NOD-подобными рецепторами, происходит под действием каспазы-1 через формирование мультибелкового комплекса - инфламмосомы, регулируемого белком BCL2. Ключевая роль hsa-miR-16-5p в про-

5

Таблица 4. Сигнальные пути, участвующие в иммунном ответе и регулируемые Ива-т1Р-16-5р, -92а-3р, -130а-3р, -223-3р, согласно базам данных тнРРаШРВ 71.1 и КБвв

Сигнальные пути (KEGG) hsa-miR-16-5p hsa-miR -92a-3p hsa-miR-130a-3p hsa-miR-223-3p

Th1 and Th2 cell differentiation [PATH:ko04658] CHUK, IFNG, NOTCH2 RUNX3 CHUK, STAT5A

Toll-like receptor signaling pathway CHUK MAP2K4 TNF CCL3, CHUK, IL6

[PATH:ko04620]

Complement and coagulation cascades F2

[PATH:ko04610]

Platelet activation [PATH:ko04611] ITGA2

NOD-like receptor signaling pathway BCL2, CHUK, MCU, IL18, CHUK, IL6

[PATH:ko04621] PANX1 TNF, XIAP

C-type lectin receptor signaling pathway CHUK, KRAS, CHUK, IL6

[PATH:ko04625] PTGS2, RAF1

Natural killer cell mediated cytotoxicity IFNG, KRAS, RAF1 TNF

[PATH:ko04650]

Antigen processing and presentation IFNG TNF

[PATH:ko04612]

T-cell receptor signaling pathway CHUK, IFNG, KRAS, TNF CHUK

[PATH:ko04660] RAF1

Th17 cell differentiation [PATH:ko04659] CHUK, IFNG, MTOR STAT3, TGFBR2 SMAD4, TGFB1 CHUK, IL6, STAT5A

IL-17 signaling pathway [PATH:ko04657] CHUK, IFNG, PTGS2 TNF CHUK, IL6

B-cell receptor signaling pathway [PATH:ko04662] CHUK, KRAS, RAF1 IFITM1 CHUK

Fc epsilon RI signaling pathway [PATH:ko04664] KRAS, RAF1 MAP2K4 TNF

Fc gamma R-mediated phagocytosis RAF1

[PATH:ko04666]

Chemokine signaling pathway [PATH:ko04062] CHUK, KRAS, RAF1 CCL8, STAT3 CCL3, CHUK, FOXO3

дукции провоспалительных цитокинов и инициации хемотаксиса макрофагами и дендритными клетками путем регуляции сигнального пути, опосредованного Toll-подобными рецепторами, была доказана Xiaoliang Wang и соавт. [26]. Авторы данной работы обнаружили снижение уровня экспрессии генов TLR4 (Toll-подобный рецептор 4) и IRAKI (ассоциированная с рецептором к интерлейкину 1 киназа 1) в обработанных LPS клетках RAW264.7, трансфецированных миметиками miRNA-15a и miRNA-16 в экспериментах in vitro, равно как и достоверное троекратное повышение уровня экспрессии hsa-miR-16-5p в сыворотке периферической крови доношенных детей с РНС в возрасте 7-21 сут жизни. При этом ключевая роль IL-18 в патофизиологии сепсиса, в том числе связь повышенного уровня сывороточного IL-18 с неблагоприятным клиническим исходом была доказана во многих исследованиях [27-30]. Регулятором экспрессии IL-18 является miR-130a, уровень которой резко снижается в плазме крови у пациентов с тяжелым сепсисом, осложненным тромбоцитопенией [31].

В настоящем исследовании в 1-й группе новорожденных в первые сутки жизни выявлено достоверное повышение уровня экспрессии hsa-miR-16-5p у детей с РНС и ВЖК по сравнению с детьми с РНС без ВЖК. Причем при использовании непараметрического метода ранговой корреляции по Спирмену была выявлена достоверная отрицательная корреляция между значением ACt hsa-miR-16-5p и наличием ВЖК у новорожденных (r=-0,4717, p=0.0037), т.е. повышение уровня экспрессии hsa-miR-16-5p коррелировало с наличием ВЖК у детей с РНС, рожденных на сроке 25-28 нед беременности. Связь изменения содержания hsa-miR-16-5p в плазме крови у детей и наличием ВЖК в неонатальный

период выявлена нами впервые. Важно отметить, что у недоношенных детей поражения центральной нервной системы доминируют среди причин инвалидизации и смертности, среди которых ВЖК встречаются в 60-90% случаев. Среди детей с ОНМТ при рождении при отсутствии ВЖК летальность составляет 6,5%, в то время как при ВЖК II-III степени летальность достигает 70% вследствие развития постгеморрагической гидроцефалии. В связи с этим найденный нами мкРНК-маркер ВЖК у детей с РНС при ОНМТ может быть использован для ранней неинвазивной диагностики ВЖК, что подчеркивает значимость настоящего исследования в клинической практике.

Основными механизмами патогенеза ВЖК, по мнению Р. BaLLabh и соавт. [19], являются: 1) нарушения мозгового кровотока; 2) склонность сосудов герминативного матрикса к повреждениям вследствие нарушения проницаемости гематоэнцефалического барьера при гипоксии-ишемии и сепсисе и 3) нарушения функции тромбоцитарного и коа-гуляционного звена вследствие недостаточности гемостаза. Регуляция системы гемостаза осуществляется сложнейшими механизмами, в которых принимают участие факторы свертывающей, противосвертывающей и фибринолитической систем крови. В свертывающей системе ключевым ферментом является тромбин, обеспечивающий формирование фибринового сгустка, а в системе фибринолиза - плазмин, под действием которого происходит разрушение фибрина [32]. К наиболее значимым физиологическим антикоагулянтам относятся антитромбин III, система протеина С, ингибитор пути тканевого фактора и а2-макроглобулин [33]. Нарушение межсистемных взаимосвязей может привести к тяжелым патологическим состояниям организма, заключа-

ющимся или в повышенной кровоточивости, или во внутри-сосудистом тромбообразовании. По литературным данным, важным регулятором системы свертывания крови является miR-122, сывороточный уровень которой при сепсисе коррелировал с антитромбином III (r=-0,913, p<0,001), временем образования и активности тромбопластина (r=0,426, p=0,008) и фибриногеном (r=0,398, p=0,008) [34].

Согласно табл. 4, hsa-miR-16-5p регулирует каскады реакций коагуляции и активации комплемента (PATH:ko04610) и тромбоцитов (PATH:ko04611) путем взаимодействия с мРНК генов-мишеней протромбина (F2) и интегрина альфа-2 (ITGA2) соответственно. Последний отвечает за адгезию тромбоцитов к коллагену при нарушении целостности сосудистой стенки, их активации с последующим повышением внутриклеточного кальция и запуску Rap1-сигнального пути, что приводит к реализации фибрино-ген-связывающей функции интегрина альфа(ПЬ)бета(3) и ретракции фибринового сгустка. В свою очередь, тромбин, помимо выполнения основной задачи - превращения растворимого фибриногена в нерастворимый фибрин, влияет на проницаемость эндотелия, стимулирует хемотаксис лейкоцитов и продукцию провоспалительных цитокинов, что является важным компонентом воспаления и отека в ткани [35, 36]. Клеточные эффекты тромбина осуществляются через PAR-рецепторы. Активация PAR1, основного рецептора тромбина, может приводить либо к индукции, либо к ингибированию апоптоза эпителиальных и ней-рональных клеток в зависимости от концентрации тромбина [33, 37]. Ряд исследований показал, что тромбин в высокой (100 пМ), но не низкой (50 пМ), концентрации может разрушать эндотелиальный барьер путем активации PAR1 [38].

Согласно табл. 4 (PATH:ko04062), важную роль в регуляции хемокин-опосредованных реакций играет не только hsa-miR-16-5p, но и hsa-miR-92a-3p, hsa-miR-223-3p. Доставку лейкоцитов к участкам воспаления, их выживание, пролиферацию и дифференцировку осуществляют хемо-кины (например, CCL3 и CCL8), которые взаимодействуют с рецепторами, сопряженными с G-белками, и активируют: либо 1) ГТФазу KRAS с последующей активацией белков семейства Raf (RAF1), фосфорилированием ERK1/2 и индукцией генов раннего ответа, либо 2) фосфатидилинозитол-3-киназу с последующим вовлечением транскрипционных факторов FOXO3 и NFKB (в том числе регулятора его активности - CHUK), либо 3) тирозинкиназ JAK, фосфорилирую-

щих транскрипционные факторы STAT (в том числе STAT3). В работе Xiaohong Wang и соавт. было выявлено негативное влияние miR-223 на уровень экспрессии STAT-3 и IL-6, и на мышиной модели тяжелого сепсиса у мышей с деле-цией гена, кодирующего miR-223, было продемонстрировано индуцированное сепсисом увеличение сердечной недостаточности, воспаления и смертности [39]. Роль miR-92a в воспалительных реакциях и дисфункции эндотелия, наряду со значимым повышением уровня ее экспрессии в цельной крови при остром РДС у взрослых пациентов и в легочной ткани в мышиной модели LPS-индуцирован-ного острого воспаления легких, была выявлена в ряде исследований [40-42].

Таким образом, полученные в настоящей работе данные являются весомым дополнением к имеющимся результатам анализа роли мкРНК в патофизиологии неонатальных заболеваний, в частности неонатального сепсиса.

Заключение

Впервые продемонстрирована клиническая значимость изменения уровня hsa-miR-16-5p, -92a-3p, -130a-3p, -223-3p в плазме крови новорожденных различного геста-ционного возраста в диагностике ВП, РНС и ВЖК. Использование в неонатологической практике оценки уровня экспрессии мкРНК в плазме крови новорожденных в сочетании с традиционным клинико-лабораторным обследованием позволит обеспечить более точную и раннюю диагностику инфекционно-воспалительных заболеваний, таких как ВП и РНС, в особенности у глубоконедоношенных детей.

Благодарность. 81 образец плазмы периферической крови новорожденных, включенных в исследование, предоставлен Муллабаевой Светланой Мининхаевной, заведующей лабораторией по сбору и хранению биоматериалов ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И. Кулакова» Минздрава России.

Финансирование работы осуществлено за счет госзадания (регистрационный номер 116082210002) по теме «Изучение диагностической и прогностической роли моле-кулярно-генетических, иммунологических, эпигенетических факторов в развитии преэклампсии».

СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ

Тимофеева Анжелика Владимировна - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории прикладной транскриптомики отдела системной биологии в репродукции ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И. Кулакова» Минздрава России, Москва Е-таН: v_timofeeva@oparina4.ru

Никитина Ирина Владимировна - кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник отделения реанимации и интенсивной терапии новорожденных отдела неонатологии и педиатрии, заведующая учебной частью, доцент кафедры неонато-логии ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И. Кулакова» Минздрава России, Москва Е-таН: i_nikitina@oparina4.ru

Гусар Владислава Анатольевна - кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник лаборатории прикладной транс-криптомики отдела системной биологии в репродукции ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И. Кулакова» Минздрава России, Москва E-maiL: v_gusar@oparina4.ru

Чаговец Виталий Викторович - кандидат физико-математических наук, старший научный сотрудник лаборатории протео-мики и метаболомики в репродукции человека отдела системной биологии в репродукции ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И. Кулакова» Минздрава России, Москва E-maiL: v_chagovets@oparina4.ru

Киртбая Анна Ревазиевна - кандидат медицинских наук, заведующая по клинической работе отделения реанимации и интенсивной терапии новорожденных отдела неонатологии и педиатрии ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И. Кулакова» Минздрава России, Москва, доцент кафедры неонатологии ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Минздрава России (Сеченовский университет) E-maiL: a_kirtbaya@oparina4.ru

Ионов Олег Вадимович - кандидат медицинских наук, заведующий отделением реанимации и интенсивной терапии новорожденных отдела неонатологии и педиатрии ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И. Кулакова» Минздрава России, доцент кафедры неонатологии ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Минздрава России (Сеченовский университет) E-maiL: o_ionov@oparina4.ru

Дегтярев Дмитрий Николаевич - доктор медицинских наук, профессор, заместитель директора по научной работе ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И. Кулакова» Минздрава России, заведующий кафедрой неонатологии ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Минздрава России (Сеченовский университет) E-maiL: d_degtiarev@oparina4.ru

Кан Наталья Енкыновна - доктор медицинских наук, заведующая акушерским обсервационным отделением ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И. Кулакова» Минздрава России, Москва E-maiL: n_kan@oparina4.ru

Франкевич Владимир Евгеньевич - кандидат физико-математических наук, заведующий отделом системной биологии и репродукции ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И. Кулакова» Минздрава России, Москва E-maiL: v_frankevich@oparina4.ru

ЛИТЕРАТУРА

1. Camacho-Gonzalez A., Spearman P.W., StoLL B.J. Neonatal infectious diseases: evaluation of neonatal sepsis // Pediatr. CLin. North Am. 2013. VoL. 60, N 2. P. 367-389.

independent effects of gestational age, neonatal infection, maternalpre-eclampsia, maternal betamethasone therapy, and mode of delivery // Clin. Exp. Immunol. 1999. Vol. 115. P. 309-314.

2. VasiLcan G., AvasiLoaiei A., MoscaLu M., Dimitriu A.G. et aL. ProcaLci-tonine-earLy marker of neonataL infection // Rev. Med. Chir. Soc. Med. Nat. Iasi. 2011. VoL. 115, N 4. P. 1243-1250.

9. Juretic E., Uzarevic B., Petrovecki M., JureticA. Two-colour flow cytometric analysis of preterm and term newborn lymphocytes // Immunobi-ology. 2000. Vol. 202. P. 421-428.

3. Wynn J.L., Levy O. RoLe of innate host defenses in susceptibiLity to earLy-onset neonataL sepsis // CLin. PerinatoL. 2010. VoL. 37. P. 307-337.

10. Perez A., Gurbindo M.D., Resino S., Aguaron A. et aL NK cell increase in neonates from the preterm to the full-term period of gestation // Neonatology. 2007. Vol. 92, N 3. P. 158-163.

4. Wynn J., Cornell T.T., Wong H.R., Shanley T.P. et aL The host response to sepsis and developmental impact // Pediatrics. 2010. Vol. 125, N 5. P. 1031-1041.

11. Timofeeva A.V., Gusar V.A., Kan N.E., Prozorovskaya K.N. et aL. Identification of potentiaL earLy biomarkers of preecLampsia // PLacenta. 2018. VoL. 61. P. 61-71.

5. Watson R.S., Carcillo J.A., Linde-Zwirble W.T., Clermont G. et al. The epidemiology of severe sepsis in children in the United States // Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2003. Vol. 167, N 5. P. 695-701.

12. Жукова А.С., Ванько Л.В., Никитина И.В., Балашова Е.Н. и др. Содержание цитокинов в плазме крови недоношенных новорожденных детей в раннем неонатальном периоде // Иммунология. 2017. Т. 38,

6. Futata E.A., Fusaro A.E., de Brito C.A., Sato M.N. The neonatal immune system immunomodulation of infections in early life // Expert Rev. Antiinfect. Ther. 2012. Vol. 10. P. 289-298.

№ 3. С. 143-147.

13. Никитина И.В., Ионов О.В., Милая О.В. Прокальцитонин в диагностике инфекционно-воспалительных заболеваний у новорожденных // Неонатология. 2014. № 4. С. 96-103.

7. WiLson C., Penix L., Weaver W., MeLvin A. et aL. Ontogeny of T Lymphocyte function in the neonate // Am. J. Reprod. ImmunoL. 1992. VoL. 28. P. 132-135.

14. Janota J., Stranak Z., Statecna B., Dohnalova A. et al. Characterization of multiple organ dysfunction syndrome in very low birthweight infants: a new sequential scoring system // Shock. 2001. Vol. 15, N 5. P. 348-352.

8. Kotiranta-Ainamo A., ApajasaLo M., Pohjavuori M., Rautonen N. et aL. MononucLear ceLL subpopuLations in preterm and fuLL-term neonates:

15. Серебрякова Е.Н., Волосников Д.К. Использование шкалы NEOMOD для оценки тяжести состояния новорожденных с полиорганной недостаточностью // Вопр. практ. педиатрии. 2010. Т. 5, № 5. С. 37-39.

16. Кусельман А.И., Самсыгина Г.А. Оценка состояния тяжести больных детей // Педиатрия. 2012. Т. 91, № 4. С. 115-121.

17. Levy O. Innate immunity of the newborn: basic mechanisms and clinical correlates // Nat. Rev. Immunol. 2007. Vol. 7. P. 379-390.

18. Kollmann T.R., Levy O., Montgomery R.R., Goriely S. Innate immune function by Toll-like receptors: distinct responses in newborns and the elderly // Immunity. 2012. Vol. 37. P. 771-783.

19. Ballabh Р. Intraventricular hemorrhage in premature infants: mechanism of disease // Pediatr. Res. 2010. Vol. 67, N 1. P. 1-8.

20. Mikami Y., Kanno Y. GoldiRunx and remembering cytotoxic memory // Immunity. 2018. Vol. 48, N 4. P. 614-615.

21. Kollmann T.R., Crabtree J., Rein-Weston A., Blimkie D. et al. Neonatal innate TLR-mediated responses are distinct from those of adults // J Immunol. 2009. Vol. 183, N 11. P. 7150-7160.

22. Huang H.C., Tai F.Y., Wang F.S., Liu C.A. et al. Correlation of augmented il-8 production to premature chronic lung disease: implication of post-transcriptional regulation // Pediatr. Res. 2005. Vol. 58, N 2. P. 216-221.

23. Huang H.C., Yu H.R., Huang L.T., Huang H.C. et al. miRNA-125b regulates TNF-a production in CD14+ neonatal monocytes via post-tran-scriptional regulation // J. Leukoc. Biol. 2012. Vol. 92, N 1. P. 171-182.

24. Krueger M., Nauck M.S., Sang S., Hentschel R. et al. Cord blood levels of interleukin-6 and interleukin-8 for the immediate diagnosis of early-onset infection in premature infants // Biol. Neonate. 2001. Vol. 80, N 2. P. 118-123.

25. Santana C., Guindeo M.C., Gonzalez G., Garcia-Munoz F. et al. Cord blood levels of cytokines as predictors of early neonatal sepsis // Acta Pae-diatr. 2001. Vol. 90, N 10. P. 1176-1181.

26. Wang X., Wang X., Liu X., Wang X. et al. miR-15a/16 are upreug-lated in the serum of neonatal sepsis patients and inhibit the LPS-induced inflammatory pathway // Int. J. Clin. Exp. Med. 2015. Vol. 8, N 4. P. 56835690.

27. Tschoeke S.K., Oberholzer A., Moldawer L.L. Interleukin-18: a novel prognostic cytokine in bacteria-induced sepsis // Crit. Care Med. 2006. Vol. 34. P. 1225-1233.

28. Lamkanfi M., Sarkar A., Vande Walle L. et al. Inflammasome-depen-dent release of the alarmin HMGB1 in endotoxemia // J. Immunol. 2010. Vol. 185. P. 4385-4392.

29. Hochholzer P., Lipford G.B., Wagner H., Pfeffer K. et al. Role of interleukin-18 (IL-18) during lethal shock: decreased lipopolysac-charide sensitivity but normal superantigen reaction in IL-18-deficient mice // Infect. Immun. 2000. Vol. 68. P. 3502-3508.

REFERENCES

1. Camacho-Gonzalez A., Spearman P.W., Stoll B.J. Neonatal infectious diseases:evaluation of neonatal sepsis. Pediatr Clin North Am. 2013; 60 (2): 367-89.

2. Vasilcan G., Avasiloaiei A., Moscalu M., Dimitriu A.G., et al. Procalci-tonine-early marker of neonatal infection. Rev Med Chir Soc Med Nat Iasi. 2011; 115 (4): 1243-50.

3. Wynn J.L., Levy 0. Role of innate host defenses in susceptibility to early-onset neonatal sepsis. Clin Perinatol. 2010; 37: 307-37.

4. Wynn J., Cornell T.T., Wong H.R., Shanley T.P., et al. The host response to sepsis and developmental impact. Pediatrics. 2010; 125 (5): 1031-41.

30. Opal S.M. Dual inhibition of interleukin-1ß and interleukin-18: a new treatment option for sepsis? // Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2014. Vol. 189. P. 242-244.

31. Zhao H., Li H., Du W. et al. Reduced MIR130A is involved in pri-mary immune thrombocytopenia via targeting TGFB1 and IL18 // Br. J. Haematol. 2014. Vol. 166, N 5. P. 767-773.

32. Hoffman M., Monroe D.M. Coagulation 2006: a modern view of he-mostasis // Hematol. Oncol. Clin. North Am. 2007. Vol. 21, N 1. P. 1-11. Review.

33. Versteeg H.H., Heemskerk J.W., Levi M., Reitsma P.H. New fundamentals in hemostasis // Physiol. Rev. 2013. Vol. 93, N 1. P. 327-358.

34. Wang H.J., Deng J., Wang J.Y., Zhang P.J. et al. Serum miR-122 levels are related to coagulation disorders in sepsis patients // Clin. Chem. Lab. Med. 2014. Vol. 52, N 6. P. 927-933.

35. Tsopanoglou N.E., Maragoudakis M.E. Thrombin's central role in angiogenesis and pathophysiological processes // Eur. Cytokine Netw. 2009. Vol. 20, N 4. P. 171-179. Review.

36. D'Audigier C., Cochain C., Rossi E., Guerin C.L. et al. Thrombin receptor PAR-1 activation on endothelial progenitor cells enhances chemotaxis-associated genes expression and leukocyte recruitment by a C0X-2-dependent mechanism // Angiogenesis. 2015. Vol. 18, N 3. P. 347359.

37. Zania P., Papaconstantinou M., Flordellis C.S., Maragoudakis M.E. et al. Thrombin mediates mitogenesis and survival of human endothelial cells through distinct mechanisms // Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 2008. Vol. 294, N 5. P. C1215-C1226.

38. Bae J.S., Yang L., Manithody C., Rezaie A.R. The ligand occupancy of endothelial protein C receptor switches the protease-activated receptor 1-dependent signaling specificity of thrombin from a permeability-enhancing to a barrier-protective response in endothelial cells // Blood. 2007. Vol. 110, N 12. P. 3909-3916.

39. Wang X., Huang W., Yang Y., Wang Y. et al. Loss of duplexmiR-223 (5p and 3p) aggravates myocardial depression and mortality in polymicrobial sepsis // Biochim. Biophys. Acta. 2014. Vol. 1842, N 5. P. 701-711.

40. Loyer X., Potteaux S., Vion A.C., Guerin C.L. et al. Inhibition of microRNA-92a prevents endothelial dysfunction and atherosclerosis in mice // Circ. Res. 2014. Vol. 114, N 3. P. 434-443.

41. Fu L., Zhu P., Qi S., Li C. et al. MicroRNA-92a antagonism attenuates lipopolysaccharide (LPS)-induced pulmonary inflammation and injury in mice through suppressing the PTEN/AKT/NF-kB signaling pathway // Biomed. Pharmacother. 2018. Vol. 107. P. 703-711.

42. Zhu Z., Liang L., Zhang R., Wei Y. et al. Whole blood microRNA markers are associated with acute respiratory distress syndrome // Intensive Care Med. Exp. 2017. Vol. 5, N 1. P. 38.

5. Watson R.S., Carcillo J.A., Linde-Zwirble W.T., Clermont G., et al. The epidemiology of severe sepsis in children in the United States. Am J Respir Crit Care Med. 2003; 167 (5): 695-701.

6. Futata E.A., Fusaro A.E., de Brito C.A., Sato M.N. The neonatal immune system immunomodulation of infections in early life. Expert Rev Anti Infect Ther. 2012; 10: 289-98.

7. Wilson C., Penix L., Weaver W., Melvin A., et al. Ontogeny of T lymphocyte function in the neonate. Am J Reprod Immunol. 1992; 28: 132-5.

8. Kotiranta-Ainamo A., Apajasalo M., Pohjavuori M., Rautonen N., et al. Mononuclear cell subpopulations in preterm and full-term neonates:

independent effects of gestational age, neonatal infection, maternalpre-eclampsia, maternal betamethasone therapy, and mode of delivery. Clin Exp Immunol. 1999; 115: 309-14.

9. Juretic E., Uzarevic B., Petrovecki M., JureticA. Two-colour flow cytometric analysis of preterm and term newborn lymphocytes. Immunobi-ology. 2000; 202: 421-8.

10. Perez A., Gurbindo M.D., Resino S., Aguaron A., et al. NK cell increase in neonates from the preterm to the full-term period of gestation. Neonatology. 2007; 92 (3): 158-63.

11. Timofeeva A.V., Gusar V.A., Kan N.E., Prozorovskaya K.N., et al. Identification of potential early biomarkers of preeclampsia // Placenta. 2018; 61: 61-71.

12. Zhukova A.S., Van'ko L.V., Nikitina I.V., Balashova E.N., et al. Plasma cytokine levels in preterm newborns in the early neonatal period. Immunologiya [Immunology]. 2017; 38

13. Nikitina I.V., Ionov O.V., Milaya O.V. Procalcitonin in the diagnosis of infectious and inflammatory diseases in newborns. Neonatologiya [Neo-natology]. 2014; 4: 96-103.

14. Janota J., Stranak Z., Statecna B., Dohnalova A., et al. Characterization of multiple organ dysfunction syndrome in very low birth-weight infants: a new sequential scoring system. Shock. 2001; 15 (5): 348-52.

15. Serebryakova E.N., Volosnikov D.K. Using NEOMOD scores to evaluate the severity of the condition of newborns with multiple organ dysfunction. Voprosy prakticheskoy pediatrii [Problems of Practical Pediatrics]. 2010; 5

16. Kuselman A.I., Samsygina G.A. Estimation of state criticality in ill children. Pediatriya [Pediatrics]. 2012; 91

17. Levy O. Innate immunity of the newborn: basic mechanisms and clinical correlates. Nat Rev Immunol. 2007; 7: 379-90.

18. Kollmann T.R., Levy O., Montgomery R.R., Goriely S. Innate immune function by Toll-like receptors: distinct responses in newborns and the elderly. Immunity. 2012; 37: 771-83.

19. Ballabh P. Intraventricular hemorrhage in premature infants: mechanism of disease. Pediatr Res. 2010; 67 (1): 1-8.

20. Mikami Y., Kanno Y. GoldiRunx and remembering cytotoxic memory. Immunity. 2018; 48 (4): 614-5.

21. Kollmann T.R., Crabtree J., Rein-Weston A., Blimkie D., et al. Neonatal innate TLR-mediated responses are distinct from those of adults. J Immunol. 2009; 183 (11): 7150-60.

22. Huang H.C., Tai F.Y., Wang F.S., Liu C.A., et al. Correlation of augmented IL-8 production to premature chronic lung disease: implication of posttranscriptional regulation. Pediatr Res. 2005; 58 (2): 216-21.

23. Huang H.C., Yu H.R., Huang L.T., Huang H.C., et al. miRNA-125b regulates TNF-a production in CD14+ neonatal monocytes via post-tran-scriptional regulation. J Leukoc Biol. 2012; 92 (1): 171-82.

24. Krueger M., Nauck M.S., Sang S., Hentschel R., et al. Cord blood levels of interleukin-6 and interleukin-8 for the immediate diagnosis of early-onset infection in premature infants. Biol Neonate. 2001; 80 (2): 118-23.

25. Santana C., Guindeo M.C., Gonzalez G., Garcia-Munoz F., et al. Cord blood levels of cytokines as predictors of early neonatal sepsis. Acta Pae-diatr. 2001; 90 (10): 1176-81.

26. Wang X., Wang X., Liu X., Wang X., et al. miR-15a/16 are upreug-lated in the serum of neonatal sepsis patients and inhibit the LPS-induced inflammatory pathway. Int J Clin Exp Med. 2015; 8 (4): 5683-90.

27. Tschoeke S.K., Oberholzer A., Moldawer L.L. Interleukin-18: a novel prognostic cytokine in bacteria-induced sepsis. Crit Care Med. 2006; 34: 1225-33.

28. Lamkanfi M., Sarkar A., Vande Walle L., et al. Inflammasome-de-pendent release of the alarmin HMGB1 in endotoxemia. J Immunol. 2010; 185: 4385-92.

29. Hochholzer P., Lipford G.B., Wagner H., Pfeffer K., et al. Role of interleukin-18 (IL-18) during lethal shock: decreased lipopolysac-charide sensitivity but normal superantigen reaction in IL-18-deficient mice. Infect Immun. 2000; 68: 3502-8.

30. Opal S.M. Dual inhibition of interleukin-1p and interleukin-18: a new treatment option for sepsis? Am J Respir Crit Care Med. 2014; 189: 242-4.

31. Zhao H., Li H., Du W., et al. Reduced MIR130A is involved in primary immune thrombocytopenia via targeting TGFB1 and IL18. Br J Haematol. 2014; 166 (5): 767-73.

32. Hoffman M., Monroe D.M. Coagulation 2006: a modern view of he-mostasis. Hematol Oncol Clin North Am. 2007; 21 (1): 1-11. Review.

33. Versteeg H.H., Heemskerk J.W., Levi M., Reitsma P.H. New fundamentals in hemostasis. Physiol Rev. 2013; 93 (1): 327-58.

34. Wang H.J., Deng J., Wang J.Y., Zhang P.J., et al. Serum miR-122 levels are related to coagulation disorders in sepsis patients. Clin Chem Lab Med. 2014; 52 (6): 927-33.

35. Tsopanoglou N.E., Maragoudakis M.E. Thrombin's central role in angiogenesis and pathophysiological processes. Eur Cytokine Netw. 2009; 20 (4): 171-9. Review.

36. d'Audigier C., Cochain C., Rossi E., Guerin C.L., et al. Thrombin receptor PAR-1 activation on endothelial progenitor cells enhances che-motaxis-associated genes expression and leukocyte recruitment by a COX-2-dependent mechanism. Angiogenesis. 2015; 18 (3): 347-59.

37. Zania P., Papaconstantinou M., Flordellis C.S., Maragoudakis M.E., et al. Thrombin mediates mitogenesis and survival of human endothelial cells through distinct mechanisms. Am J Physiol Cell Physiol. 2008; 294 (5): C1215-26.

38. Bae J.S., Yang L., Manithody C., Rezaie A.R. The ligand occupancy of endothelial protein C receptor switches the protease-activated receptor 1-dependent signaling specificity of thrombin from a permeability-enhancing to a barrier-protective response in endothelial cells. Blood. 2007; 110 (12): 3909-16.

39. Wang X., Huang W., Yang Y., Wang Y., et al. Loss of duplexmiR-223 (5p and 3p) aggravates myocardial depression and mortality in polymicrobial sepsis. Biochim Biophys Acta. 2014; 1842 (5): 701-11.

40. Loyer X., Potteaux S., Vion A.C., Guerin C.L., et al. Inhibition of microRNA-92a prevents endothelial dysfunction and atherosclerosis in mice. Circ Res. 2014; 114 (3): 434-43.

41. Fu L., Zhu P., Qi S., Li C., et al. MicroRNA-92a antagonism attenuates lipopolysaccharide (LPS)-induced pulmonary inflammation and injury in mice through suppressing the PTEN/AKT/NF-kB signaling pathway. Biomed Pharmacother. 2018; 107: 703-11.

42. Zhu Z., Liang L., Zhang R., Wei Y., et al. Whole blood microRNA markers are associated with acute respiratory distress syndrome. Intensive Care Med Exp. 2017; 5 (1): 38.