Выделение и характеристика бактериальной культуры для биологического контроля заболевания растений

УДК 579.6

А. Р. Хабибуллина, Ш. З.Валидов, М. В. Шулаев

ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА БАКТЕРИАЛЬНОЙ КУЛЬТУРЫ ДЛЯ БИОЛОГИЧЕСКОГО КОНТРОЛЯ ЗАБОЛЕВАНИЯ РАСТЕНИЙ

Ключевые слова: гнотобиотическая система, колонизация, выделение микроорганизмов, борьба с фитопатогенами.

В результате работы с накопительной культурой получена бактериальная культура, которая в дальнейшем была идентифицирована как Pseudomonas putida на основе определения характерной последовательности гена 16S рРНК. Результаты биохимической характеристики штамма с помощью системы Biolog хорошо согласовались с данными сравнения последовательности гена 16S рРНК. Эффективность выделенного штамма Pseudomonas putida KFUBB5 в качестве агента биологической защиты томатов показана в биотесте на подавление корневой гнили томатов, вызванной фитопатогенным микромицетом Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici ZUM2407.

Key words: gnotobiotic system, colonization, microorganism isolation, control of phytopathogens.

As a result of work with the accumulative culture, obtained a bacterial culture which, subsequently, was identified as Pseudomonas putida on the basis of a comparison of the sequence of the 16S rRNA gene. The results of the biochemical characterization of the strain with the Biolog system were in good agreement with the comparison of the 16S rRNA gene sequence. The efficacy of obtained the Pseudomonas putida KFUBB5 strain as a biological protection agent for tomatoes is shown in the biotest to suppress root rot of tomatoes caused by phytopathogenic micromycete Fusarium ox-ysporum f.sp. Radicis-lycopersici ZUM2407.

Введение

Болезни растений представляют серьезную опасность для продовольственной безопасности. Кроме прямого снижения урожайности сельскохозяйственных культур, поражение растений приводит к накоплению токсинов.

Разработка мер борьбы с фитопатогенами человечество проводит с тех пор, как собирательство сменилось целенаправленным культивированием растений. Вспашка, выделение полей под «пар», севооборот и соляризация можно привести в качестве простых методов, которые земледельцы применяли для борьбы с болезнями растений. Эти методы и сегодня используются, снижая уровень заболевания растений.

В 20-м веке химические пестициды произвели «зеленую революцию» увеличив производительность сельского хозяйства. Хотя накопление химикатов в продуктах питания и окружающей среде, а также прямой вред здоровью персонала при применении этих соединений очевиден, полный отказ от химических средств защиты растений обернется острой нехваткой продуктов питания и снижением качества кормов.

Безопасной альтернативой химическим средствам защиты могут являться биологические препараты на основе непатогенных микроорганизмов. Конкурируя с патогенами, они могут подавлять развитие заболеваний растений. Биологические средства защиты безопасны для окружающей среды, метаболиты микроорганизмов не накапливаются в получаемых продуктах и чаще всего безопасны при применении [1].

Наибольшим преимуществом перед пестицидами обладают ризосферные бактерии, которые колонизируют подземную часть растений и могут обеспечивать его защиту. В настоящее время разработаны методики выделения штаммов с биозащитными свойствами, которые включают несколько трудоемких этапов [2], после которых следует сертификация и

испытание штаммов. Только после этого появляется возможность непрерывного производства биопрепаратов в лабораториях при тепличных хозяйствах и станциях защиты растений с помощью специального оборудования позволяет окупить затраты по выделению и сертификации штамма, а после снизить его конечную стоимость [3].

Целью данной работы является: совершенствование системы выделения безопасных штаммов почвенных бактерий -эффективных колонизаторов ризосферы способных подавлять болезни растений.

Материалы и методы

В качестве объектов исследования выступали бактериальные культуры Pseudomonas putida PCL1760; Pseudomonas putida KFUBB5; Pseudomonas fluorescens KFUBB4, а также микромицеты Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici (Fori) ZUM2407; Alternaria alternata ZUM 2372; T. asperellum T302.

Выделение активных колонизаторов

Смесь бактерий из ризосферы томатов, которые культивировали 12 недель в теплице в грунте без обработки пестицидами, была использована для инокуляции проростков томатов (рис. 1).

Рис. 1 - Выделение бактерий с повышенной колонизационной активностью

После первого цикла бактерии, смытые с 1 см апикальной части корня были использованы для инокулирования стерильных семян без дополнительного подращивания на лабораторных средах. После второго цикла бактерии, изолированные с кончика корня были высеяны на агаризованную среду М9 с сукцинатом. Выросшие колонии использовали для инокуляции стерильных семян томатов и на седьмой день измеряли плотность колонизации.

Гчотобиотическая система

Для исследования колонизационных способностей бактерий использовали гнотобиотическую систему томатов. Стерилизация производилась следующим образом: семена томата (сорт Carmello, Син-гента, Энкхэузен, Нидерланды) замачивали в 50 мл 70% этанола на 5 минут (0,12 г ~ 300 семян томатов или 50 семян огурца). Затем раствор сливали и помещали семена в 50 мл 1% раствор гипохлорида натрия с добавлением додецил сульфата натрия (ДСН) до 0,1%, для увеличения смачиваемости семян. Семена активно перемешивали в данном растворе при комнатной температуре в течение 15 минут, после чего раствор аккуратно сливали. Семена промывали стерильной дистиллированной водой в течение 1 часа (6-8 смен воды) до полного удаления гипохлорида натрия. Семена стерильно выкладывали на поверхность агаризованной PNS и выдерживали при 8°С 24 часа для синхронизации прорастания семян.

Выделечие ДНК

Для выделения использовали биомассу одной колонии эквивалентную по количеству ~109 клеток. Выделение ДНК производили с помощью набора QIAGamp DNA. Для этого культуру клеток KFUBB5, рост которых производился в чашках Петри на среде LB [4], в течении двух суток при 28°C. Ресуспенди-ровали осадки в 180 мкл раствора для лизиса. Вносили 20 мкл протеиназы К, размешивали, и полученную суспензию инкубировали в течении 30 минут при температуре 56 °C. По истечении времени добавили 20 мкл РНКазы, перемешали, и оставили инкубироваться при комнатной температуре 10 минут. Далее добавили 200 мкл лизисного буфера, перемешивали до получения гомогенной смеси. К полученной смеси влили 400 мкл 50% этанола, и размешали. Полученный раствор перенеси в колонки и центрифугировали 1 минуту при 6000 оборотах в минуту. После осаждения ДНК, вылили ненужный раствор. В колонку влили 500 мкл промывочного буфера AW1 и центрифугировали 1 минуту при 8000 оборотах в минуту, по завершении промывки раствор вылили. Что бы избавиться от солей процедуру промывки повторили с раствором AW2. Для завершения процедуры выделения ДНК добавили 200 мкл буфера для элюции. Инкубировали 2 минуты при комнатной температуре. После центрифугировали 1 минуту при 8000 оборотах. Качество выделенной ДНК проверяли с помощью электрофореза.

Выделечие биосурфактачта

Для выделения биосурфактанта использовали культуры клеток KFUBB5 и 1760 (последний использовали в качестве контроля). Штаммы инокули-

ровали в 25 мл свежей среды КБ [5] используя отдельные колонии. После инкубации в течении 48 часов при 28°C с интенсивной аэрацией (150 об/мин), клетки осаждали центрифугированием. В две колбы отбирали супернатант (15 мл) и добавляли этилацетат (15 мл). Хорошо перемешивали и оставили для разделения фаз.

Тест на наличие биосурфактанта

Культуры штаммов KFUBB5 и PCL 1760, выращенные как описано в разделе «Выделение биосурфактанта». На ленту Parafilm (Denis, США) наносили выращенные культуры KFUBB5 и PCL 1760. Реакцию наблюдали на изменение поверхностного натяжения капли (изменение диаметра капли).

Тест на антогонизм

Тест на антагонизм проводили с использованием штаммов 1760,30-84, KFUBB4, KFUBB5 (исследуемый объект) и грибов F. oxysporum ZUM2407 и V03-2g, A. alternata ZUM2372, T. asperellum T302. Для определения антагонистических свойств, кусок агара 0.5 x0.5 см с мицелием каждого гриба были помещены в центр чашки Петри с LB [6] средой. Испытываемые штаммы бактерий были помещены на расстоянии три см от гриба по краю агара. Далее микроорганизмы культивировали в течении шести суток при 28°C. Бактериальные штаммы, создававшие зоны подавления более 2 мм, считались продуцентами антагонистических веществ.

Генетическая и биохимическая идентификация изолята KFUBB5

Биохимическое профилирование штамма с помощью системы Biolog (Biolog Inc., Хейворд, США), соответственно, содержащие 95 различных источников углерода. В таблице 9 указан перечень использованных субстратов.

Согласно степени потребления субстрата можно сделать следующий вывод, что штамм хорошо потребляет широкий спектр органических кислот: Fusidic acid, L-Aspartic Acid, L-Glutamic Acid, L-Pyroglutamic Acid, D-Galacturonic Acid, D-Gluconic Acid, D-Glucuronic Acid, Mucic Acid, Quinic Acid, D-Saccharic Acid, L-Lactic Acid, Citric Acid, a-Keto-Glutaric Acid, D-Malic Acid, L-Malic Acid, Nalidixic Acid, y-Amino-Butryric Acid, a-Hydroxy- Butyric Acid, a-Keto-Butyric Acid, Acetoacetic Acid, Propionic Acid, Acetic Acid, Formic Acid .

Исследуемый штамм потреблял органические кислоты, - основные компонентов корневых экссудатов, что является доказательством хороших колонизационных свойств.

Видовая принадлежность штамма KFUBB5 была определена на основе последовательности гена 16S рРНК. Полногеномный анализ проводили на основе ампликонов 16S рРНК методом пиросеквенирова-ния. Длина ридов: до 100 тыс. Длина прочтения 450-500bp. Общий объем получаемой информации с прибора ~ 50 Mb, точность 99.9% на всю длину прочтения. Для проведения анализа использовали се-квенатор «GS Junior» (Roshe, Switzerland).

Сравнение последовательности изолята KFUBB5 с последовательностями гена 16S рРНК уже известных бактерий в генетической базе данных GeneBank в системе показало его 99% сходство c последовательностью Pseudomonas putida штамма. На основе этого сравнения изолят KFUBB5 был идентифицирован как Pseudomonas putida.

Экспериментальная часть

Смесь бактерий из ризосферы томатов, которые культивировали 12 недель в теплице в грунте без обработки пестицидами, была использована для инокуляции проростков томатов. Бактерии, изолированные с кончика корня были высеяны на агари-зованную среду М9 с сукцинатом, при этом наблюдаемое разнообразие составило 5 разных морфологических типов высеваемых колоний (цвет, форма, прозрачность и т.д.). Эти колонии были использованы для инокуляции стерильных семян томатов и на седьмой день показали плотность колонизации от 103 до 105 клеток/см кончика корня. Наибольшую плотность колонизации - 0.8-1.1*105 клеток/см кончика корня показывал изолят, обозначенный штамм KFUBB5, который и был выбран для дальнейшей работы.

Видовая принадлежность штамма KFUBB5 была определена на основе последовательности гена 16S рРНК и биохимического профилирования штамма с помощью системы Biolog (Biolog Inc., Хейворд, США).

Сравнение последовательности изолята KFUBB5 с последовательностями гена 16S рРНК уже известных бактерий в генетической базе данных GeneBank в системе показало его 99% сходство c последовательностью Pseudomonas putida штамма. На основе этого сравнения изолят KFUBB5 был идентифицирован как Pseudomonas putida.

Биохимическое профилирование штамма KFUBB5 с использованием планшет GENIII MicroPlate и сравнение с профилями других активных колонизаторов показало, что профиль потребления 95 субстратов был наиболее близок к таковым штаммов вида Pseudomonas putida: при сравнении биохимических профилей штамм P. putida KFUBB5 был помещен в один кластер с другим штаммом P. putida PCL1760, что хорошо согласуется с данными по идентификации штамма KFUBB5 на основе сравнения последовательности гена 16S рРНК.

Биозащитные свойства P. putida KFUBB5 были доказаны в системе с модельным патогеном F. ox-ysporum f.sp. radicis-lycopersici ZUM2407. Так же как и P. putida PCL1760, штамм KFUBB5 показывал значительное снижение количества больных растений.

По совокупности таких свойств штамма P. putida KFUBB5 как выдающиеся колонизационные качества, отсутствие антагонизма и литических ферментов можно заключить, что конкуренция за экологические ниши может быть механизмом биологической защиты от корневой гнили, вызванной Fori ZUM2407.

Выводы

1. Из ризосферы томатов выделен штамм KFUBB5 - эффективный колонизатор.

2. Проведен биохимический анализ штамма, выявлен синтез биосурфактанта.

3. Биохимическое профилирование подтвердило результаты идентификации на основе гена 16S рРНК, и показало широкий спектр утилизируемых органических кислот, что характерный для активных колонизаторов.

4. В модельном эксперименте показан эффект биологической защиты томатов от фузариозной корневой гнили. По совокупности признаков, штамм Pseudomonas putida KFUBB5 использует механизм конкуренции за экологические ниши.

Литература

1. Cross, J. V., An industry perspective on registration and commercialization of biocontrol agents in Canada [text] / J. V. Cross, D. R. Polonenko // Can. J. Plant Pathol. - 1996. -V.18. - P. 446-454.

2. Validov, S. Selection of bacteria able to control Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici in stonewool substrate [Text] / S. Validov, F. Kamilova, S. Qi, D. Stephan, J. J. Wang, N. Makarova, B. Lugtenberg // Journal of applied microbiology. - 2007. - V. 102. - №. 2. - P. 461-471.

3. Алимова, Ф. К. Некоторые вопросы применения препаратов на основе грибов рода Trichoderma в сельском хозяйстве [Текст] / Ф.К. Алимова // Агро XXI. - 2006. - №. 4-6. -

C. 18-21.

4. Sambrook, J. Molecular Cloning: [Text] and Russel,D. / A Laboratory Manual. Cold Spring Laboratory Press, Cold Spring Harbor / NY- USA: 2001. - P. 345-349.

5. King, E.O. Two simple media for the demonstration of pyocyanin and fluorescin. [Text] / Ward M.K. and Raney

D.E., J. Lab. // Clin. Med. - 44: - 1954. - P. 301-307.

6. Lugtenberg, B.J.J. Life in the rhizosphere [Text] / B.J.J. Lugtenberg, G. V. Bloemberg // Pseudomonas. - Springer US. - 2004. - P. 403-430.

© А. Р. Хабибуллина, магистрант кафедры химической кибернетики КНИТУ, a.r.habibullina@gmail.com; Ш. З. Валидов, ст. науч. сотр. НИЛ Структурная биология Института фундаментальной медицины и биологии КФУ, szvalidov@kpfu.ru; М. В. Шулаев, д-р техн. наук, проф. каф. химической кибернетики КНИТУ, mshulaev@mail.ru.

© A. R. Khabibullina, Master of the Department of Chemical Cybernetics, KNRTU, a.r.habibullina@gmail.com; Sh. Z. Validov, PhD, KFU/ Institute of Fundamental Medicine and Biology / Nile Structural Biology, szvalidov@kpfu.ru; M. V. Shulaev, Doctor of technical sciences (Full Professor), Professor of the Department of chemical Cybernetics, KNRTU, mshulaev@mail.ru.