СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ИЛИ ПРОФИЛАКТИКИ ЗАБОЛЕВАНИЙ И/ИЛИ ПАТОФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ СОСТОЯНИЙ, ВЫЗВАННЫХ МИКРООРГАНИЗМАМИ, ПОСРЕДСТВОМ ПРОИЗВОДНЫХ АЛКИЛФОСФОЛИПИДОВ
METHOD OF TREATING OR PREVENTING DISEASES AND/OR PATHOPHYSIOLOGICAL CONDITIONS CAUSED BY MICROORGANISMS THROUGH ALKYLPHOSPHOLIPID DERIVATIVES

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к новым производным алкилфосфолипидов с пониженной цитотоксичностью, пригодным для лечения разнообразных заболеваний и/или патофизиологических состояний у млекопитающих, вызванных микроорганизмами, в частности бактериями, грибками, протозоа и/или вирусами. Такие производные алкилфосфолипидов могут использоваться как самостоятельные лекарственные средства или в ходе комбинированной терапии, и могут также проявлять антинеопластические свойства.
Уровень техники
Алкилфосфолипиды (APL) представляют собой класс веществ, о которых уже несколько десятилетий известно, что они характеризуются такими свойствами и проявляют такую биологическую активность, которые можно использовать для лечения при различных медицинских показаниях.
Исчерпывающий обзор разнообразных эффектов и областей применения, например, алкилфосфохолинов, приводится в журнале Drugs of Today, том 34, Suppl. F, 1998.
Дополнительная информация по алкилфосфолипидам, их разнообразным способам применения и соответствующим показаниям (включая соответствующие стандартные методы лечения) содержится в следующих источниках:
В патенте ЕР 0108565 описаны алкилфосфохолины, о которых говорится, что они обладают антинеопластическими свойствами. WO 87/03478 описывает применение алкилфосфолипидов в качестве противоопухолевого лекарственного средства. В патенте US 5,219,866 рассматриваются октадецил-[2-(N-метилпиперидино)-этил]-фосфаты, полезные при лечении раков, а также процесс их приготовления. В патентах US 6,172,050, US 6,479,472 и ЕР 0579939 описаны специфические производные фосфолипидов и способы их использования в качестве лекарственных средств, в частности, при лечении опухолей. US 5,449,798 и US 5,958,906 относятся к фосфолипидным производным, содержащим более тяжелые элементы пятой группы, о которых известно, что они являются антинеопластиками. Патент US 6,093,704 описывает применение антагонистов дофаминовых рецепторов при паллиативной терапии опухолей, уменьшающее потенциальные побочные эффекты алкилфосфохолинов, таких как милтефозин. WO 2004/012744 относится к применению алкилфосфохолинов совместно с противоопухолевыми лекарственными средствами.
Патент ЕР 0108565 описывает алкилфосфохолины, которые, помимо прочего, проявляют противогрибковые свойства. Lu с соавторами рассматривают применение природного бисфосфохолина ирлбахолина и его синтетических аналогов в качестве противогрибковых агентов (Lu Q et al., J. Nat. Prod. 1999, 62 (6): 824-828). Ganendren с соавторами исследовали соединения, структурно похожие на фосфолипидные субстраты, и их использование в качестве ингибиторов фосфолипаз из дрожжевого патогена Cryptococcus neoformans (Ganendren R et al., Antimicrob. Agents Chemother. 2004, 48 (5): 1561-1569).
Koufaki M с соавторами описывают алкил- и алкоксиэтилфосфолипиды и их использование в качестве антинеопластиков для лечения опухолей (Koufaki et al., J. Med. Chem. 1996, 39:2609-2614). Konstatinov с соавторами изучают апоптические эффекты некоторых алкилфосфолипидов (Konstatinov et al., Cancer Chemother. Pharmacol. 1998, 41:210-216). Engel et al. обсуждают фармакологическую активность перифозина как противоопухолевого лекарственного средства (Engel et al., Drugs of the Future 2000, 25 (12): 1257-1260). WO 00/33917 содержит описание агентов, основанных на липосомах, которые могут содержать милтефозин или перифозин и могут использоваться для лечения опухолей. Патент ЕР 0284395 содержит описание новых производных глицерина и антигипертензивных агентов для снижения давления крови. Andresen с соавторами исследовали биологическое действие синтетизированных противораковых липидов эфиров, которые специфически высвобождаются фосфолипазой А2 в опухолевой ткани (Andresen TL et al., J. Med. Chem. 2005, 48:7305- 7314).
Протозойные заболевания остаются общемировой проблемой. Для большинства таких заболеваний лечение отсутствует. Двумя распространенными примерами заболеваний этого класса являются лейшманиоз и болезнь Шагаса.
Лейшманиоз находится на третьем месте в списке ВОЗ болезней, которым уделяется недостаточное внимание (список ранжирован по количеству смертей в год). Это заболевание вызывает 60000 смертей в год, и только малярия и туберкулез более смертоносны. Предполагается, что по всему миру в группе риска находятся 350 миллионов человек, в настоящее время инфицировано 12 миллионов человек. Это заболевание обнаружено в 88 странах нового и старого света, причем больше всего инфицированных живет в Индии, Бангладеше, Бразилии и Судане. Каждый год заболевает 1-1,5 миллиона человек. По данным ВОЗ и организации TDR (WHO/TDR) нагрузка DALY составляет 860000 для мужчин и 1200000 для женщин.
Лейшманиоз вызывается простейшими семейства Leishmania, передающимися песчаными блохами (Phlebotomus sp. и Lutzomyia sp.). Существует две формы заболевания. Наиболее опасной из них является внутренний или висцеральный лейшманиоз, в отсутствие лечения он приводит к смерти через 6-12 месяцев. Другая форма, так называемый кожный лейшманиоз, приводит к повреждениям кожи и в отсутствие лечения к образованию язв. Если не наблюдается спонтанного выздоровления, то в конце образуются шрамы на теле и лице. Возможные осложнения нелеченного лейшманиоза включают вторичное инфицирование язв и развитие слизисто-кожной формы, которая может приводить к разрушению кожи и слизистых оболочек на лице.
Висцеральная форма наблюдается в странах старого (виды Leishmania: L. donovani, L. infantum) и нового (L. chagasi) света. Она затрагивает также и субиндийский континент (Индию, Бангладеш и Непал), части Восточной Африки (Судан и Эфиопию) и Южной Америки (Бразилию и Колумбию). В год заболевает около 500000 человек, наблюдается высокая смертность. Течение висцерального лейшманиоза сопровождается лихорадкой, потерей веса, увеличением размеров селезенки и печени. Если болезнь не лечить, она приводит к смерти.
Кожная форма заболевания широко распространена по всему миру. В странах старого света основными патогенами являются Leishmania major и Leishmania tropica. L. major присутствует в сельскохозяйственных регионах, а L. tropica в промышленных областях. Более всего болезнь распространена в Афганистане, Пакистане и на всем Среднем Востоке, особенно в Иране, Ираке, Сирии и Саудовской Аравии.
В настоящее время существует тенденция не лечить таких пациентов, так как шрамы и болезненные язвы не считаются угрожающими для жизни. Более вероятно, однако, что такая выжидательная позиция обусловлена побочными эффектами от лечения. В новом свете складывается более угрожающая ситуация. У больных кожным лейшманиозом может развиваться кожно-слизистая форма, которая приводит к болезненным и уродливым разрушениям отдельных участков лица. Болезнь наблюдается по всей Средней и Южной Америке с фокальными точками в Венесуэле, Перу, Боливии и Гватемале.
Существующие стандартные методы терапии проводят в госпиталях, и они высокотоксичны. Риск увеличивает СПИД и другие состояния подавленного иммунитета, такие как недостаточное питание. Фактически, страны, в которых превалирует висцеральный лейшманиоз, характеризуются также значительным распространением СПИДа и недостаточным питанием населения. Возможности лечения в настоящее время ограничены. Уже 50 лет стандартным средством терапии лейшманиоза являются парентерально вводимые препараты на основе сурьмы (стибоглюканат натрия, SSG, пентостам и меглигумин стимоглюконат глюкантайм). Их использование связано с чрезвычайно серьезными побочными эффектами, включая тошному, рвоту, диаррею и анорексию. В ходе лечения необходимо следить за содержанием креатина, а также отслеживать ECG.
Альтернативным способом лечения (второй линией лечения) является амфотерицин Б. К этому препарату не вырабатывается резистентности, однако к высокой стоимости госпитализации необходимо добавить также и еще более высокую стоимость лекарственного средства. Побочные эффекты столь же серьезны, к вышеперечисленным проблемам добавляется вызванная лекарственным средством лихорадка, поэтому его использование одобрено только для висцерального лейшманиоза. Еще одной альтернативой, позволяющей преодолеть побочные эффекты, является липосомальный амфотерицин Б. Лекарственное средство паромомицин в настоящее время проходит третью фазу клинических испытаний; по данным отчетов оно эффективно в 95% случаев и, в целом, хорошо переносится. Все методы лечения являются парентеральными и требуют длительного периода госпитализации.
По сравнению с лейшманиозом ситуация с болезнью Шагаса значительно более проблематична. Эту болезнь называют также американским трипаносомозом, и вызывает ее простейший паразит Trypanosoma cruzi. Болезнь эндемична для 21 страны Южной и Латинской Америки. В настоящее время инфицировано 16-18 миллионов человек, а 100 миллионов находится в группе риска. Болезнь переносится кровососущими насекомыми, из желудочно-кишечного тракта которых паразиты попадают в кровь жертвы.
У людей болезнь начинается с острой фазы, за которой следует хроническая фаза, продолжающаяся всю жизнь. У людей острая фаза иногда характеризуется лихорадкой, опуханием лимфоузлов, увеличением печени и селезенки, а также местными воспалительными процессами. В связи с тем, что часто острую фазу диагностируют неправильно (или, вообще, не диагностируют), болезнь остается невылеченной. Как следствие, начинается хроническая фаза болезни Шагаса, при которой паразит проникает в сердечную мышцу, начинаются сильные локальные воспалительные процессы и развивается хроническое заболевание сердца. Обычно из-за этого пациенты вскоре умирают.
[Общая литература по болезни Шагаса: Guzman-Bracho С, Trends Parasitol. 2001, 17 (8): 372-376; Roberts A et al., J. Am. Acad. Nurse Pract. 2001, 13 (4): 152-153; Tarleton RL et al., Parasitol. Today. 1999, 15 (3): 94-99; Anez N et al., Mem. Inst. Oswaldo Cruz 2004, Rio de Janeiro, 99 (8): 781-787; Second Report of the WHO Expert Committee, WHO technical report series 905, WHO 2002; Behbehani K, Bull World Health Organ. 1998, 76 (Suppl. 2): 64-67; Umezawa ES et al., Lancet. 2001, 357 (9258) 797-799].
В настоящее время возможности лечения заболевания ограничены. Для лечения болезни одобрено только два лекарственных средства: бензнидазол (раданил™) и нифуртимокс (лампит™). Они чрезвычайно токсичны, и их применение ограничено только острой фазой заболевания. Доказательства эффективности хотя бы одного из них при хронической фазе очень незначительны. В настоящее время предпочитают бензнидазол, его назначают в дозе 5-7 мг на кг веса тела в течение 60 дней. Побочные эффекты могут быть очень сильными, и об их возникновении необходимо немедленно извещать лечащего врача. Распространенными побочными эффектами являются конвульсии (судороги), потеря чувствительности, колющая боль, слабость рук и ног, покраснение кожи, боли в брюшной полости или в желудке, диаррея, рвота и тошнота. Более редкими побочными эффектами являются лихорадка или озноб, появление красных пятен на коже, кожная сыпь, ангина, необычные кровотечения или кровоподтеки, спутанность мыслей, головокружение, головная боль, беспокойство, временная потеря памяти, проблемы со сном, трудности с концентрацией, необычная напряженность или слабость.
Более старый препарат нифуртимокс используется значительно реже, чем бензидазол. Его необходимо назначать в течение 50 дней в дозе от 8 до 10 мг на кг веса тела. Известные побочные эффекты включают боли в желудке или в брюшной полости, головокружение, головную боль, потерю аппетита, тошноту, рвоту, потерю веса, сыпь на коже, лихорадку или ангину, неповоротливость или неустойчивость, спутанность мыслей, конвульсии (судороги), снижение сексуальных желаний и способности их осуществить, лихорадку, забывчивость, раздражительность, изменения настроения и ментальных способностей, мышечную слабость, онемение, потерю чувствительности, боль, слабость рук и ног, тремор, проблемы со сном, неконтролируемые движения зрачков вперед-назад и вращательные движения, необычное возбуждение, нервозность и беспокойство.
[Литература по (стандартному) лечению болезни Шагаса: Coura JR et al., Mem. Inst. Oswaldo. Cruz 2002, Rio de Janeiro, 97 (1): 3-24; Docampo R, Curr. Pharm. Des.2001, 7 (12): 1157-1164; Kayser O et al., Pharm. Unserer Zeit. 1999, 28 (4): 177-185; Cerecetto H et al., Curr. Top. Med. Chem. 2002, 2 (11): 1187-1213; Urbina JA, Curr. Opin. Infect. Dis. 2001, 14(6):733-741; Paulino M et al., Mini-Reviews in Medicinal Chemistry 2005, 5: 499-519; Campos RF et al., Rev. Soc. Bras. Med. Trop. 2005, 38 (2): 142-146; Garcia S et al., Antimicrob. Agents Chemother. 2005, 49 (4): 1521-1528; Schenone H et al., Rev. Med. Chile 2003; 131: 1089-1090; Marcondes MC et al., Microbes Infect. 2000, 2 (4): 347-352; Corrales M et al., Antimicrob. Agents Chemother. 2005, 49 (4): 1556-1560; Urbina JA et al., Int. J. Antimicrob. Agents 2003, 21 (1): 39-48; Maya JD et al., Biochem. Pharmacol. 2003, 65 (6): 999-1006; Lockman JW et al., Curr. Med. Chem. 2005, 12 (8): 945-959].
Отмечено использование алкилфосфолипидов для лечения протозойных болезней, в особенности лейшманиоза и болезни Шагаса. Показано, что милтефозин так же эффективен при лечении лейшманиоза, как и используемый в настоящее время амфотерицин Б. Он был зарегистрирован в нескольких странах как первое оральное лекарство для лечения кожной и висцеральной форм лейшманиоза. Однако, по-прежнему, существует потребность улучшить схемы лечения и эффективность курса терапии лейшманиоза. Существует возрастающая опасность возникновения резистентности в связи с длительным метаболическим периодом полужизни препарата и длительным курсом терапии - 28 дней, который может не полностью выполняться пациентом. В предклинических исследованиях in vivo и in vitro показано, что алкилфосфолипиды активны в острой фазе при борьбе с Trypanosoma cruzi.
[Литература по использованию APL для лечения лейшманиоза и болезни Шагаса: Croft SL et al., Mol. Biochem. Parasitol. 2003, 126 (2): 165-172; Saraiva VB et al., Antimicrob. Agents Chemother. 2002, 46 (11): 3472-3477; de Castro SL et al., Mini-Reviews in Medicinal Chemistry 2004, 4:141-151; Berman J, Expert Opin. Pharmacother. 2005, 6 (8): 1381-1388; Bhattacharya SK et al., Clin. Infect. Dis. 2004, 38 (2): 217-221; Jha TK et al., N. Engl. J. Med. 1999, 341 (24): 1795-1800; Jacobs S, N. Engl. J. Med. 2002, 347 (22): 1737-1738; Sundar S et al., N. Engl. J. Med. 2002, 347 (22): 1739-1746; Sindermann H et al., Clin. Infect. Dis. 2004, 39 (10): 1520-1523; Soto J et al., Clin. Infect. Dis. 2004, 38 (9): 1266-1272; Soto J et al., Clin. Infect. Dis. 2001, 33 (7): E57-61; Sundar S et al., Pediatr. Infect. Dis. J. 2003, 22 (5): 434-438; Croft SL et al., J. Antimicrob. Chemother. 1996, 38 (6): 1041-1047; Santa-Rita RM et al., Acta Trop. 2000, 75 (2): 219-228; Sundar S et al., Lancet. 1998, 352 (9143): 1821-1823; Sundar S et al., Ann. Trop. Med. Parasitol. 1999, 93 (6): 589-597; Sundar S et al., Clin. Infect. Dis. 2000, 31 (4): 1110-1113; Lux H et al., Mol. Biochem. Parasitol. 2000, 111 (1): 1-14; US 5,980,915, US 6,521,879, US 6,506,393; US 2003/0216355; US 2004/0242543; Verma NK et al., Antimicrob. Agents Chemother. 2004, 48 (8): 3010-3015; Walochnik J et al., Antimicrob. Agents Chemother. 2002, 46 (3): 695-701; Seifert К et al., Antimicrob. Agents Chemother. 2006, 50 (1): 73-79].
О применении комбинированной терапии при лечении протозойных болезней, в особенности лейшманиоза и болезни Шагаса, сообщалось только изредка. Gupta с соавторами упоминали об эффективности пикролива совместно с милтефозином (Gupta S et al., Acta Trop. 2005, 94 (1): 41-47). Потенциальная антипролиферативная синергия аналогов лизофосфолипида, а также кетоконазола, против Trypanosoma cruzi рассматривается в работах Santa-Rita и соавторов (Santa-Rita RM et al., J. Antimicrob. Chemother. 2005, 55 (5): 780-784). Механизм действия антипролиферативных аналогов лизофосфолипидов против Trypanosoma cruzi обсуждается в работе Lira и соавторов, которые постулировали усиление активности in vitro ингибитора биосинтеза стерола кетоконазола (Lira R et al., J. Antimicrob. Chemother. 2001, 47 (5): 537-546). Araujo с соавторами показали, что комбинация бензнидазола и кетоконазола усиливает эффективность химиотерапии при лечении экспериментальной болезни Шагаса (Araujo MS et al., J. Antimicrob. Chemother. 2000, 45 (6): 819-824).
Авторы Kanetani/Kanaya F с соавторами описывают синтез, физико-химические и противомикробные свойства алкилфосфорилхолинов с длинной цепью. Авторы показывают, что изученные соединения практически не демонстрируют протимомикробных свойств против Escherichia coli и Staphylococcus aureus. Однако два таких соединения показывают противогрибковый эффект против Aspergillus oryzae (Kanetani/Kanaya F et al., Nippon Kagaku Zasshi 1984, 9:1452-1458). Berger с соавторами исследовали влияние дексадецилфосфохолина на регрессию опухолей и на инфицирование вирусом клетки (Berger MR et al., J. Cancer Res. Clin. Oncol. 1993, 119:541-548). Ng с соавторами изучили корреляцию противогрибковой активности с ингибированием грибковой фосфолипазы при использовании серии бис-четвертичных аммонийных солей (Ng et al., J. Med. Chem 2006, 49:811-816). Widmer с соавторами исследовали фунгицидальную активность дексадецилфосфохолина на модели криптококкоза у мышей (Widmer Fet al., Antimicrob. Agents Chemother. 2006, 50 (2): 414-421).
Однако известные в уровне техники производные фосфолипидов и их применение характеризуются свойственными им недостатками. Так, стандартное медикаментозное лечение (APL и другие препараты) бактериальных, грибковых, протозойных и/или вирусных заболеваний приводит к нескольким побочным эффектам, таким как резистентность целевых микроорганизмов, а также серьезные последствия высокой токсичности применяемых соединений и длительного характера лечения.
Раскрытие изобретения
Целью настоящего изобретения является получение новых производных алкилфосфолипидов, которые могут применяться для лечения заболеваний или патофизиологических состояний у млекопитающих, вызванных микроорганизмами, в особенности бактериями, грибками, простейшими и/или вирусами. Другой целью изобретения является получение новых производных алкилфосфолипидов, которые проявляют антинеопластические свойства и могут использоваться для лечения опухолей у животных. Еще одной целью изобретения является разработка новых способов комбинированной терапии алкилфосфолипидными производными и известных лекарственных средств, подходящих для лечения заболеваний или патофизиологических состояний у млекопитающих, вызванных микроорганизмами, в особенности простейшими.
Цель настоящего изобретения была неожиданно достигнута, в соответствии с одним своим вариантом осуществления, с получением производных алкилфосфолипидов, соответствующих общей формуле (I):
где:
W, X, Y независимо означают атом кислорода или атом серы;
m
n
R1 представляет собой -[(CR3R4)-Z]-R5;
p
R2 представляет собой -(CR6R7)-R8;
q
r
R3 и R4 независимо друг от друга выбраны из группы, включающей атом водорода, замещенный или незамещенный С1-С12алкил, замещенный или незамещенный (С1-С12алкил)-А-(С1-С18алкил), -ОН, замещенный или незамещенный -С(O)-(С8-С30алкил), замещенный или незамещенный -ОС(O)-(С8-С30алкил), замещенный или незамещенный -NHCO-(С1-С12алкил), замещенный или незамещенный -N(С1-С12алкил)СО-(С1-С12алкил);
или, необязательно, R3 и R4 вместе формируют замещенную или незамещенную, насыщенную, частично ненасыщенную или ароматическую гетероциклическую систему, содержащую 3, 4, 5, 6, 7 и 8 атомов углерода, по меньшей мере один из которых является гетероатомом, выбранным из группы, включающей атом кислорода и атом серы;
R5 независимо выбран из группы, включающей замещенный или незамещенный С8-С30алкил, замещенный или незамещенный -С(O)-(С8-С30алкил), замещенную или незамещенную стероидную группу;
3
3
2
2
3
R6 и R7 независимо друг от друга выбраны из группы, включающей атом водорода, -ОН, атом галогена, -F, -Cl, -Br, -I, -CN, С1-С6алкил, -CF, -N, -NH, -NO, -OCF, -SH;
или, необязательно, R6 и R7 вместе формируют замещенную или незамещенную, насыщенную, частично ненасыщенную или ароматическую циклическую систему, содержащую 3, 4, 5, 6 или 7 атомов углерода;
p
или, необязательно, если р=1, то -(CR6R7)- также может представлять собой замещенную или незамещенную насыщенную, частично ненасыщенную или ароматическую циклическую систему, содержащую 3, 4, 5, 6 или 7 атомов углерода, формируемую совместно группами R6 и R7;
R8 выбран из группы, включающей -VR9R10R11, замещенный или незамещенный гетероцикл, где гетероцикл представляет собой
(i) 5-, 6- или 7-членную насыщенную, частично ненасыщенную или ароматическую моноциклическую углеродную систему, содержащую по меньшей мере один гетероатом, выбранный из группы, включающей атом азота, атом кислорода, атом серы, атом мышьяка, причем по меньшей мере один гетероатом представляет собой четвертичный атом азота или четвертичный атом мышьяка; или
(ii) 7-, 8-, 9-, 10-, 11- или 12-членную насыщенную, частично ненасыщенную или ароматическую бициклическую углеродную систему, содержащую по меньшей мере один гетероатом, выбранный из группы, включающей атом азота, атом кислорода, атом серы, атом мышьяка, причем по меньшей мере один гетероатом представляет собой четвертичный атом азота или четвертичный атом мышьяка; или
(iii) группу тропина,
по меньшей мере два атома гетероцикла можно дополнительно соединить через алкиленовые мостики, и где если гетероцикл является замещенным, то он замещен по меньшей мере одним радикалом R12, которые, в случае по меньшей мере двух радикалов R12, независимо друг от друга идентичны, частично идентичны или различны.
s
t
u
R9, R10, R11, R12 независимо друг от друга выбраны из группы, включающей атом водорода, замещенный или незамещенный С1-С18алкил, замещенный или незамещенный С3-С8циклоалкил, замещенный или незамещенный (С1-С12алкил)-В-(С1-С12алкил)-С-(С1-С12алкил), замещенный или незамещенный арил, замещенный или незамещенный гетероарил, замещенный или незамещенный алкокси, -ОН, галоген, -F, -Cl, -Br, -I, =O, -C(O)O-(C1-С12алкил), -С(O)O-(С3-С8циклоалкил), -С(O)O-арил, -С(O)O-гетероарил, -С(O)O-гетероциклил, -С(O)-(С1-С12алкил), С(O)-(С3-С8циклоалкил), -С(O)-арил, -С(O)-гетероарил, -С(O)-гетероциклил, и, необязательно,
два заместителя R12 могут совместно формировать замещенную или незамещенную насыщенную, частично ненасыщенную или ароматическую циклическую систему из 3, 4, 5, 6 или 7 атомов углерода;
Z независимо выбран из группы, включающей атом кислорода и атом серы;
V независимо выбран из группы, включающей атом азота и атом мышьяка;
2
А, В, С независимо друг от друга выбраны из группы, включающей атом кислорода, атом серы и S(O);
m независимо представляет собой 1, 2 или 3;
n независимо представляет собой 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10, и предпочтительно 0, 1, 2 или 3;
р независимо представляет собой 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6, и предпочтительно 0, 1, 2 или 3;
q, r, s, t, u независимо друг от друга соответствуют 0 или 1;
которые могут применяться для получения лекарственного средства для лечения или профилактики заболеваний и/или патофизиологических состояний у млекопитающих, вызванных микроорганизмами.
m
n
m
2
3
2
Если R1 соответствует -[(CR3R4)-Z]-R5 и n не менее 2, то для каждого остатка -[(CR3R4)-Z] группы Z, R3 и R4 могут быть идентичны, частично идентичны или различны, например, -CH-O-СНСН-S-СН-О-.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления изобретение относится к производным алкилфосфолипидов, соответствующим приведенной выше формуле (I), где р=0,
R2 соответствует R8,
R8 представляет собой замещенный или незамещенный гетероцикл,
которые могут применяться для получения лекарственного средства для лечения или профилактики заболеваний и/или патофизиологических состояний у млекопитающих, вызванных микроорганизмами.
В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления изобретение относится к производным алкилфосфолипидов, соответствующим приведенной выше формуле (I), где р независимо может быть 1, 2, 3, 4, 5 или 6, и, предпочтительно, соответствует 2 или 3;
R8 представляет собой замещенный или незамещенный гетероцикл;
которые могут применяться для получения лекарственного средства для лечения или профилактики заболеваний и/или патофизиологических состояний у млекопитающих, вызванных микроорганизмами.
В соответствии с еще одним предпочтительным вариантом осуществления изобретение относится к производным алкилфосфолипидов, соответствующим приведенной выше формуле (I), где р независимо может быть 1, 2, 3, 4, 5 или 6, и, предпочтительно, соответствует 2 или 3;
R8 представляет собой -VR9R10R11,
которые могут применяться для получения лекарственного средства для лечения или профилактики заболеваний и/или патофизиологических состояний у млекопитающих, вызванных микроорганизмами.
В соответствии с еще одним предпочтительным вариантом осуществления изобретение относится к производным алкилфосфолипидов, соответствующим приведенной выше формуле (I), где
R1 соответствует R5,
n=0,
которые могут применяться для получения лекарственного средства для лечения или профилактики заболеваний и/или патофизиологических состояний у млекопитающих, вызванных микроорганизмами.
В соответствии с еще одним предпочтительным вариантом осуществления изобретение относится к производным алкилфосфолипидов, соответствующим приведенной выше формуле (I), где
m может быть 2 или 3,
n может быть 1 или 2,
которые можно использовать для получения лекарственного средства для лечения или профилактики заболеваний и/или патофизиологических состояний у млекопитающих, вызванных микроорганизмами.
В соответствии с другим вариантом осуществления цель изобретения была неожиданно достигнута с помощью новых производных алкилфосфолипидов, выбранных из группы, включающей:
Эти производные алкилфосфолипидов (Соединения 1-317) можно применять для получения лекарственного средства для лечения или профилактики заболеваний и/или патофизиологических состояний у млекопитающих, вызванных микроорганизмами.
Во избежание сомнений, если химическое название и химическая структура проиллюстрированных выше соединений по ошибке не соответствуют друг другу, следует считать, что соединение однозначно описано его структурой.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления все указанные выше общие или явно определенные производные алкилфосфолипидов, включая предпочтительные соединения формулы (I) и Соединения 1-317, далее называемые соединениями (настоящего) изобретения, могут применяться для получения лекарственных средств для лечения или профилактики заболеваний и/или патофизиологических состояний у млекопитающих, вызванных микроорганизмами, где микроорганизм выбран из группы, включающей бактерии, грибки, простейшие и/или вирусы.
Термины, используемые для разъяснения приведенных выше соединений изобретения, всегда, если в описании или формуле изобретения не указано иначе, имеют следующие значения:
Термин "незамещенный" означает, что соответствующий радикал или группа не содержат заместителей.
Термин "замещенный" означает, что соответствующий радикал или группа содержат по меньшей мере один заместитель. Если радикал может содержать несколько заместителей, и заданы все заместители, которые могут присутствовать, то заместители выбираются независимо друг от друга, и они необязательно идентичны.
Термин "алкил" в контексте настоящего изобретения означает ациклические и циклические насыщенные, ненасыщенные или частично ненасыщенные углеводороды, которые могут содержать прямую, разветвленную цепь или также включать циклические углеводороды в составе прямой или разветвленной углеводородной системы, и которые могут содержать по меньшей мере одну двойную и/или тройную связь. В этой связи углеводороды С1-С6алкил, С1-С12алкил, С1-С18алкил, С8-С30алкил и подобные им соответствуют приведенному определению, они содержат от 1 до 6, от 1 до 12, от 1 до 18 и от 8 до 30 атомов углерода, соответственно.
2
2
3
2
3
2
3
Примеры подходящих алкильных радикалов включают метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, втор-бутил, трет-бутил, н-пентил, изопентил, неопентил, трет-пентил, 2- или 3-метил-пентил, н-гексил, 2-гексил, изогексил, н-гептил, н-октил, н-нонил, н-децил, н-ундецил, н-додецил, н-тетрадецил, н-гексадецил, н-октадецил, н-икосанил, н-докосанил, этиленил (винил), пропенил (-CHCH=CH; -СН=СН-СН, -C(=CH)-CH), бутенил, пентенил, гексенил, гептенил, октенил, октадиенил, октадеценил, октадец-9-енил, икосенил, икос-11-енил, (Z)-икос-11-енил, докоснил, докос-13-енил, (Z)-докос-13-енил, этинил, пропинил, (-СН-С≡СН, -С≡С-СН), бутинил, пентинил, гексинил, гептинил, октинил, циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил, циклогептил, циклооктил, циклодецил, циклогексенил, циклопентенил, циклооктадиенил.
Термин "С3-С8циклоалкил" означает насыщенный или частично ненасыщенный неароматический циклический углеводородный радикал/группу, содержащий от 3 до 8 атомов углерода, который может присоединяться через алкильную группу, где термин "алкил" соответствует приведенному здесь определению, предпочтительно это (С3-С8)-циклоалкил-(С1-С4)-алкильныи радикал. Такие "С3-С8циклоалкильные" радикалы могут прикрепляться через любого участника цикла.
Примеры подходящих циклоалкильных радикалов представляют собой циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил, циклогексил, циклогептил, циклооктил, циклогексенил, циклопентенил, циклооктадиенил, циклопропилметил, циклогексилметил, циклопентилэтил или циклогексенилэтил.
Термин "стероидная группа" в контексте настоящего изобретения означает базовую стероидную структуру, например, представленную на странице 131 руководства "Organische Chemie" автора К. Peter С. Vollhardt (VCH Weinheim, 1. korrigierter Nachdruck, 1990, der 1. Auflage 1988, ISBN 3-527-26912-6). Такая стероидная группа может прикрепляться через любой свой атом.
Термин "арил" означает ароматическую углеводородную систему, содержащую от 3 до 14, предпочтительно от 5 до 14, атомов углерода. Термин также включает системы, в которых ароматический цикл входит в состав би- или полициклической насыщенной, частично ненасыщенной и/или ароматической системы, например, в которой ароматический цикл сопряжен с арилом, "С3-С8циклоалкилом", "гетероарилом" или "гетероциклилом" в соответствии с приведенными здесь определениями через любой желательный и возможный атом цикла радикала арила. Такие "арилы" могут присоединяться к основной молекуле через любого участника цикла. Примеры арилов, помимо прочего, включают фенил, бифенил, нафтил и антраценил, а также инданил, инденил или 1,2,3,4-тетрагидронафтил. Термин "арил" означает также радикалы, в которых арильный радикал связан посредством группы, включающей С 1-С18алкил, предпочтительно С1-С12алкил. Наиболее предпочтительны радикалы арил-С1-С4алкил, а из них - бензил или фенилэтил.
Термин "гетероарил" означает 5-, 6- или 7-членный циклический ароматический радикал, содержащий по меньшей мере один, а возможно 2, 3, 4 или 5 гетероатомов, предпочтительно азот, кислород и/или серу, где гетероатомы идентичны или различны. Число атомов азота, предпочтительно, составляет 0, 1, 2 или 3, а число атомов кислорода и серы - независимо друг от друга равно 0 или 1. Термин "гетероарил" включает также системы, в которых ароматический цикл входит в состав би- или полициклической насыщенной, частично ненасыщенной и/или ароматической системы, например, в которой ароматический цикл сопряжен с арилом, С3-С8циклоалкилом, гетероарилом или гетероциклилом в соответствии с приведенными здесь определениями через любой желательный и возможный атом цикла радикала гетероарила. Такие гетероарилы могут присоединяться к основной молекуле через любого участника цикла. Примеры гетероарилов включают пирролил, тиенил, фурил, имидазолил, тиазолил, изотиазолил, оксазолил, оксадиазолил, изоксазолил, пиразолил, пиридинил, пиримидинил, пиразинил, индолил, хинолинил, изохинолинил, имидазолил, тиазолил, тетразолил, пиридазинил, фталазинил, индазолил, индолизинил, хиноксалинил, хиназолинил, птеридинил, карбазолил, феназинил, феноксазинил, фенотиазинил, акридинил. Термин "гетероарил" означает также радикалы, в которых гетероарильный радикал связан посредством группы, включающей С1-С18алкил, предпочтительно С1-С12алкил. Наиболее предпочтительны радикалы гетероарил-С1-С4алкил, а из них - 1Н-индол-3-ил-метил или 2-(1Н-индол-3-ил)-этил.
Термин "гетероциклил" означает моно- или полициклическую систему из 3-20, предпочтительно 5- или 6-14 атомов в цикле, включающих атомы углерода и 1, 2, 3, 4 или 5 гетероатомов, в частности, азота, кислорода и/или серы, которые могут быть идентичны или различны. Циклическая система может быть насыщенной, моно- или полиненасыщенной, но не может быть ароматической. Если циклическая система содержит по меньшей мере два цикла, то они могут быть сопряжены или соединены через спиро-связь или любым другим способом. Такие гетероциклильные радикалы можно связать через любого участника цикла. Термин "гетероциклил" включает также системы, в которых гетероцикл входит в состав би- или полициклической насыщенной, частично ненасыщенной и/или ароматической системы, например, в которой ароматический цикл сопряжен с арилом, С3-С8циклоалкилом, гетероарилом или гетероциклилом в соответствии с приведенными здесь определениями через любой желательный и возможный атом цикла радикала гетероциклила. Примеры гетероциклилов включают пирролидинил, тиапирролидинил, пиперидинил, пиперазинил, оксапиперазинил, оксапиперидинил, оксадиазолил, тетрагидрофурил, имидазолидинил, тиазолидинил, тетрагидропиранил, морфолинил, тетрагидротиофенил, дигидропиранил. Термин "гетероциклил" означает также радикалы, в которых гетероциклильный радикал связан посредством группы, включающей С1-С18алкил, предпочтительно С1-С12алкил. Наиболее предпочтительны радикалы гетероциклил-С1-С4алкил.
Термин "алкокси" означает радикалы, в которых алкил, С3-С8циклоалкил, арил, гетероарил, и/или гетероциклил присоединены посредством атома кислорода (группа -O-), где алкил, С3-С8циклоалкил, арил, гетероарил, и/или гетероциклил определены в настоящей заявке.
Термин "галоген", "атом галогена" или "галогензамещенный" (Hal-) означает по меньшей мере один атом фтора (F), брома (Br), хлора (Cl) или иода (I). Термины "дигалоген", "тригалоген" и "пергалоген" означают, соответственно, два, три или четыре заместителя, где каждый заместитель может быть независимо выбран из группы, включающей фтор, хлор, бром и иод. Предпочтительно, термин "галоген" означает атомы фтора, хлора или брома.
2
2
2
3
3
2
2
2
3
3
3
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
3
3
3
3
Термин "замещенный", применительно к стероидной группе, алкилу, в особенности С1-С6алкилу, С1-С12алкилу, С1-С18алкилу, С8-С30алкилу, арилу, гетероарилу, гетероциклилу, гетероциклу и алкокси, если в описании конкретных пунктов формулы изобретения не указано иначе, означает независимую замену одного или более атомов водорода заместителем, независимо выбранным из группы, включающей -NO, -NO, -CN, -ОН, галоген, F, Cl, Br, I, -NH, -NHNH, -N, -SH, -SOH, -СООН, -CONH, -СНО, -CHNOH, -NH-C(NH)=NH, -С(NH)=NH, -CF, -OCF, -OSOH, -ОР(O)(ОН), -Р(O)(ОН), -NH-(С1-С12алкил), -N(С1-С12алкил), NH-арил, -N(арил), -N-A5A6, -NH-С(NH)=N-(С1-С12алкил), -C(NH)=N-(C1-С12алкил), -NH-C(NH)=N-арил, -C(NH)=N-арил, -ОР(O)(O-(С1-С12алкил)), -ОР(O)(O-арил), -ОР(O)(O-гетероарил), -ОР(O)(O-А7)(O-А8), -O-арил, -О-гетероарил, -O-(С3-С8циклоалкил), -O-гетероциклил, -S-(С1-С12алкил), -S-арил, -S-гетероарил, -S-(С3-С8циклоалкил), -S-гетероциклил, -SO-(C1-С12алкил), -SO-арил, - SO-гетероарил, -SO-(С3-С8циклоалкил), -SO-гетероциклил, -SO-(C1-С12алкил), -SO-арил, -SO-гетероарил, -SO-(С3-С8циклоалкил), -SO-гетероциклил, -SO-(С1-С12алкил), -SO-арил, -SO-гетероарил, -SO-(С3-С8циклоалкил), -SO-гетероциклил, -ОС(O)-(С1-С12алкил), -ОС(O)-(С3-С8циклоалкил), -ОС(O)-арил, -ОС(O)-гетероциклил, -ОС(O)-гетероарил, -С(O)-(С1-С12алкил), -С(O)-(С3-С8циклоалкил), -С(O)-арил, -С(O)-гетероциклил, -С(O)-гетероарил, -С(O)O-(С1-С12алкил), -С(O)O-(С3- С8циклоалкил), -С(O)O-арил, -С(O)O-гетероциклил, -С(O)O-гетероарил, -ОС(O)NH-(С1-С12алкил), -ОС(O)NH-(С3-С8циклоалкил), -ОС(O)NH-арил, -ОС(O)NH-гетероарил, -ОС(O)NH-гетероциклил, -ОС(O)N-А1А2, -ОС(O)N-гетероциклил, -С(O)NH-(С1-С12алкил), -C(O)NH-(С3-С8циклоалкил), -С(O)NH-арил, -С(O)NH-гетероарил, -С(O)NH-гетероциклил, -C(O)N-A3A4, -С(O)N-гетероциклил, С1-С12алкил, С3-С8циклоалкил, арил, гетероарил, гетероциклил, где А1, А2, A3, А4, А5, А6, А7, А8, А9, А10 независимо выбраны из группы, включающей С1-С12алкил, С3-С8циклоалкил, арил, гетероарил, гетероциклил.
В контексте настоящего изобретения термины, используемые для описания приведенной выше группы, включающей микроорганизмы, всегда, если не указано иначе в описании или формуле изобретения, имеют нижеприведенные значения:
Термин "бактерия" включает в себя все известные аэробные бактерии, облигаторные/прихотливые анаэробные бактерии и факультативные анаэробные бактерии. Бактерии могут быть грамположительными, грамотрицательными или не окрашиваться по Граму (атипичными), могут быть спорообразующими или представлять собой бактериальные споры, и, например, относиться к семействам Actinobacteria, Aquificae, Bacteroidetes/Chlorobi, Chlamydiae/Verrucomicrobia, Chloroflexi, Chrysiogenetes, Cyanobacteria, Deferribacteres, Deinococcus-Thermus, Dictyoglomi, Fibrobacteres/Acidobacteria, Firmicutes, Fusobacteria, Gemmatimonadetes, Nitrospirae, Omnibacteria, Planctomycetes, Proteobacteria, Spirochaetes, Thermodesulfobacteria, Thermomicrobia и/или Thermotogae.
Деление бактерий на "грамположительные", "грамотрицательные" бактерии и "бактерии, не поддающиеся процедуре окрашивания по Граму (атипичные)", а также определение их аэробного или анаэробного состояния может легко выполнить квалифицированный специалист на основании своих специальных знаний, например, проведя соответствующее окрашивание или анализы метаболизма, которые представляют собой не более чем рутинные эксперименты.
В этой связи "грамотрицательными" в контексте настоящего изобретения являются бактерии, которые не окрашиваются по Граму, а также такие, которые не поддаются процедуре такого окрашивания (атипичные). Напротив, "грамположительными" в контексте настоящего изобретения являются все бактерии, которые окрашиваются по Граму.
Термин "грибок" или "грибки" включает все известные одноклеточные или многоклеточные представители царства грибов, такие как Chytridiomycota, Zygomycota, Glomeromycota, Ascomycota и/или Basidiomycota, а также, помимо этого, Myxomycota, Oomycota и/или Hypochytriomycota.
Термин "вирус" или "вирусы" включает все известные ДНК-вирусы, например, двуцепочечные ДНК (dsDNA)-вирусы и одноцепочечные ДНК (ssDNA)-вирусы; РНК-вирусы, например, двуцепочечные PHK(dsRNA)-вирусы, положительные одноцепочечные PHK((+)ssRNA)-вирусы (или мРНК-подобные вирусы) и отрицательные одноцепочечные РНК-вирусы ((-)ssRNA); а также ДНК и РНК-обратно транскрибирующие вирусы (ретровирусы), такие как вирусы ssRNA-RT (одноцепочечной РНК) и dsDNA-RT (двуцепочечной ДНК). Вирусы могут находиться в оболочке или не содержать оболочки.
Другими примерами вирусов являются аденовирус типов 1, 2, 3, 5, 11, 21, аденовирус, альфавирус, арбовирус, аренавирус, вирус болезни Борна, вирусы группы, включающей буньямвера, калицивирус, вирус калифорнийского энцефалита, вирус колорадской клещевой лихорадки, коронавирус коровьей оспы, вирус коксаки типов А, В, А-16, А-24, В1, В2, В3, В4, В5, цитомегаловирус (CMV), дельтавирус, вирус тропической лихорадки, вирус Эбола, эховирус, вирус ЕЕЕ, энтеровирус типов 7, 70, вирус Эпштейна-Барра (EBV), филовирус, флавивирус, вирус Ящура, вирус FSME, хантавирусы типов Hantaan, Seoul, Dobrava (Belgrade), Puumala, Sin Nombre, Black Creek Canal, Bayou, New York-1, хантавирус, гепаднавирус, вирус гепатита А, В, С, D, Е, F, G, вирус простого герпеса (HSV), вирус простого герпеса типов 1 и 2 (HSV-1, HSV-2), вирус герпеса, ВИЧ, ВИЧ-1, ВИЧ-2, папилломавирус человека (HPV), вирус лейкемии Т-клеток человека, лимфотропный вирус Т-клеток человека типов I и II (HTLV-I, -II), вирус гриппа, вирус гриппа типа A (H5N1) и (H3N2), вирус гриппа типов А, В, С, вирус японского энцефалита, вирус JC, юнивирус, вирус, ассоциированный с Саркомой Капоши, вирус Ла Кросса, лассавирус, лентивирус, вирус лимфоцитарного хориоменингита, мачуповирус, вирус Марбурга, вирус кори, вирус Моллускума, вирус свинки, вирус Норвалка, орфвирус, ортомиксовирус, паповавирус, вирус парагриппа типов 1, 2, 3, вирус парагриппа, парамиксовирус типов 1, 2, 3, 4, парамиксовирус, парвовирус В19, парвовирус, пикорнавирус, полиовирус, поксивирус, вирус бешенства, реовирус, респираторный синцитиальный вирус, рабдовирус, риновирусы, ротавирус, вирус Рубелла, вирус кори, рубивирус, вирус SARS, вирус Симиана 40, вирус SLE, тогавирус, вирус TTV, вирус коровьей оспы, вирус ветряной оспы, вирус оспы, эндорнавирус садовых бобов, вирус WEE, вирус Западного Нила и/или вирус желтой лихорадки.
Термин "spp." в отношении любого микроорганизма означает в контексте настоящего изобретения все члены данного семейства, включая виды, подвиды и др. Например, термин "Trypanosoma spp." означает всех представителей семейства Trypanosoma, таких как Trypanosoma cruzi, Trypanosoma brucei, Trypanosoma brucei brucei и Trypanosoma brucei gambiense.
В контексте настоящего изобретения термин "лечение" включает также профилактическое лечение или облегчение.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления соединения по изобретению можно использовать для получения лекарственного средства для лечения или профилактики заболеваний и/или патофизиологических состояний у млекопитающих, вызванных микроорганизмами, где микроорганизм представляет собой бактерию.
В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления соединения по изобретению можно использовать для получения лекарственного средства для лечения или профилактики заболеваний и/или патофизиологических состояний у млекопитающих, вызванных микроорганизмами, где микроорганизм представляет собой грамположительную бактерию.
В соответствии с еще одним предпочтительным вариантом осуществления соединения по изобретению можно использовать для получения лекарственного средства для лечения или профилактики заболеваний и/или патофизиологических состояний у млекопитающих, вызванных микроорганизмами, где микроорганизм представляет собой грамотрицательную бактерию.
Более предпочтительно, соединения по изобретению можно использовать для получения лекарственного средства для лечения или профилактики заболеваний и/или патофизиологических состояний у млекопитающих, вызванных микроорганизмами, где микроорганизм представляет собой бактерию, предпочтительно грамположительную бактерию или грамотрицательную бактерию, и выбранную из группы,
В соответствии с еще более предпочтительным вариантом осуществления соединения по изобретению являются бактерицидными (приводящими к гибели бактерий) и/или бактериостатическими (ингибирующими рост/воспроизводство бактерий). В этом контексте соединения по изобретению могут даже быть бактерицидными по отношению к одному или нескольким родам, видам, подвидам, штаммам и т.д. бактерий, но бактериостатичны по отношению к другому или другим родам, видам, подвидам, штаммам и т.д. бактерий и наоборот.
В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления соединения по изобретению можно использовать для получения лекарственного средства для лечения или профилактики заболеваний и/или патофизиологических состояний у млекопитающих, вызванных микроорганизмами, где микроорганизм представляет собой бактерию, предпочтительно грамположительную или грамотрицательную бактерию, более предпочтительно различные предпочтительные проиллюстрированные здесь бактерии, где соединения изобретения, предпочтительно, являются бактерицидными (приводящими к гибели бактерий) и/или бактериостатическими (ингибирующими рост/воспроизводство бактерий), где производное алкилфосфолипидов выбрано из числа описанных в общем или явным образом указанных производных алкилфосфолипидов, соответствующих общей формуле (I), включая предпочтительные группы соединений формулы (I) и соединения 1-317,
причем если R8 представляет собой -VR9R10R11, то V означает атом азота,
а также если R8 представляет собой замещенный или незамещенный гетероцикл, то замещенный или незамещенный гетероцикл не содержит по меньшей мере одного атома мышьяка, а также четвертичных атомов мышьяка,
причем следующие соединения исключены из формулы (I), в том числе и из предпочтительных групп соединений формулы (I) и соединений 1-317:
Еще более предпочтительно, если производное алкилфосфолипидов для вышеуказанного применения против бактерий выбрано из группы, включающей соединение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 34, 37, 38, 62, 66, 67, 89, 90, 107, 117, 144, 260, 266, 301, 307 и/или соединение 314.
В соответствии с дополнительным предпочтительным вариантом осуществления соединения по изобретению можно использовать для получения лекарственного средства для лечения или профилактики заболеваний и/или патофизиологических состояний у млекопитающих, вызванных микроорганизмами, где микроорганизм представляет собой грибковый микроорганизм и выбран из группы, включающей
В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления соединения изобретения можно использовать для получения лекарственного средства для лечения или профилактики заболеваний и/или патофизиологических состояний у млекопитающих, вызванных микроорганизмами, где микроорганизм представляет собой вирус и выбран из группы, включающей ДНК вирус; dsDNA вирус, ssDNA вирус, RNA вирус; dsRNA вирус; (+)ssRNA вирус; (-)ssRNA вирус; DNA/RNA обратно транскрибирующий вирус; ssRNA-RT вирус и/или dsDNA-RT вирус. Более предпочтительно, соединения по изобретению можно использовать для получения лекарственного средства для лечения или профилактики заболеваний и/или патофизиологических состояний у млекопитающих, вызванных микроорганизмами, где микроорганизм представляет собой вирус из группы, включающей аденовирус типов 1, 2, 3, 5, 11, 21, аденовирус, альфавирус, арбовирус, аренавирус, вирус болезни Борна, вирусы группы буньямвера, калицивирус, вирус калифорнийского энцефалита, вирус колорадской клещевой лихорадки, коронавирус коровьей оспы, вирус коксаки типов А, В, А-16, А-24, В1, В2, В3, В4, В5, цитомегаловирус (CMV), дельтавирус, вирус тропической лихорадки, вирус Эбола, эховирус, вирус ЕЕЕ, энтеровирус типов 7, 70, вирус Эпштейна-Барра (EBV), филовирус, флавивирус, вирус Ящура, вирус FSME, хантавирусы типов Hantaan, Seoul, Dobrava (Belgrade), Puumala, Sin Nombre, Black Creek Canal, Bayou, New York-1, хантавирус, гепаднавирус, вирус гепатита А, В, С, D, Е, F, G, вирус простого герпеса (HSV), вирус простого герпеса типов 1 и 2 (HSV-1, HSV-2), вирус герпеса, HIV, HIV-1, HIV-2, папилломавирус человека (HPV), вирус лейкемии Т-клеток человека, лимфотропный вирус Т-клеток человека типов I и II (HTLV-I, -II), вирус гриппа, вирус гриппа типа A (H5N1) и (H3N2), вирус гриппа типов А, В, С, вирус японского энцефалита, вирус JC, юнивирус, вирус, ассоциированный с Саркомой Капоши, вирус Ла Кросса, лассавирус, лентивирус, вирус лимфоцитарного хориоменингита, мачуповирус, вирус Марбурга, вирус кори, вирус Моллускума, вирус свинки, вирус Норвалка, орфвирус, ортомиксовирус, паповавирус, вирус парагриппа типов 1, 2, 3, вирус парагриппа, парамиксовирус типов 1, 2, 3, 4, парамиксовирус, парвовирус В19, парвовирус, пикорнавирус, полиовирус, поксивирус, вирус бешенства, реовирус, респираторный синцитиальный вирус, рабдовирус, риновирусы, ротавирус, вирус Рубелла, вирус кори, рубивирус, вирус SARS, вирус Симиана 40, вирус SLE, тогавирус, вирус TTV, вирус коровьей оспы, вирус ветряной оспы (varicella zoster virus), вирус оспы, эндорнавирус садовых бобов, вирус WEE, вирус Западного Нила и/или вирус желтой лихорадки. Еще более предпочтительно, если алкилфосфолипидное производное выбрано из группы, включающей соединение 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 18, 19 и/или соединение 20.
В область действия изобретения входят все стереоизомеры его соединений, либо в виде смеси, либо в виде чистых или в значительной степени чистых форм. Соединения по изобретению могут содержать асимметричные центры по любому атому углерода. Соответственно, они могут существовать в форме своих рацематов, в форме чистых энантиомеров и/или диастереомеров или в форме смеси этих энантиомеров и/или диастереомеров. Смеси могут содержать любое желательное соотношение стереоизомеров.
Так, например, соединения по изобретению, которые содержат по меньшей мере один центр хиральности и представляют собой смеси рацематов или диастереомеров, можно фракционировать известными методами на оптически чистые изомеры, то есть энантиомеры или диастереомеры. Разделение соединений по изобретению можно провести на колонке с хиральной или нехиральной фазами или проведя перекристаллизацию из оптически активного растворителя, либо с использованием оптически активной кислоты или основания, либо путем получения производных с оптически активным реагентом, таким как, например, оптически активный спирт, с последующим элиминированием радикала.
По отношению к двойной связи соединения по изобретению могут представлять собой как чистые Е- или Z-изомеры, так и смеси этих изомеров.
В случаях, когда это возможно, соединения по изобретению могут находиться в форме таутомеров.
Соединения по изобретению могут также находиться в форме любой желательной пролекарственной формы, такой как, например, сложные эфиры, карбонаты, карбаматы, мочевины, амиды или фосфаты; в этом случае биологически активная форма высвобождается в результате метаболизма. Любое соединение, которое может in vivo подвергаться превращению с образованием биоактивного агента (то есть соединения по изобретению), называется пролекарственной формой, относится к области изобретения и соответствует его идее.
В уровне техники хорошо известны различные пролекарственные формы, они описаны, например, в работах:
(i) Wermuth CG et al., Chapter 31: 671-696, The Practice of Medicinal Chemistry, Academic Press 1996;
(ii) Bundgaard H, Design of Prodrugs, Elsevier 1985; и
(iii) Bundgaard H, Chapter 5: 131-191, A Textbook of Drug Design и Development, Harwood Academic Publishers 1991.
Эти работы включены сюда в качестве ссылки во всей своей полноте.
Известно также, что химические вещества могут в организме превращаться в свои метаболиты, которые могут также проявлять желаемую биологическую активность - в некоторых случаях в более выраженной форме.
Любое биологически активное соединение, которое образовалось in vivo путем метаболизма из любого соединения по изобретению, представляет собой метаболит, соответствующий области изобретения и его идее.
Если соединения по изобретению содержат достаточно основные группы, например, если это вторичный или третичный амин, то они могут быть преобразованы в соли действием неорганических и органических кислот. Фармацевтически приемлемые соли соединений настоящего изобретения, предпочтительно, образуются из соляной, бромоводородной, йодной, серной, фосфорной, метансульфоновой, пара-толуолсульфоновой, угольной, муравьиной, уксусной, сульфоуксусной, трифторуксусной, щавелевой, малоновой, малеиновой, янтарной, винной, рацемовой, яблочной, эмбоновой, манделовой, фумаровой, молочной, лимонной, таурохолиновой, глутаровой, стеариновой, глутамовой или аспарагиновой кислот. При этом образутся соли, которые называют, помимо прочего, гидрохлориды, хлориды, гидробромиды, бромиды, иодиды, сульфаты, фосфаты, метансульфонаты, тосилаты, карбонаты, бикарбонаты, форматы, ацетаты, сульфоацетаты, трифлаты, оксалаты, малонаты, малеаты, сукцинаты, тартраты, малаты, эмбонаты, манделаты, фумараты, лактаты, цитраты, глутараты, стеараты, аспартаты и глутаматы. Кроме того, стехиометрически соли соединений по настоящему изобретению могут содержать целое или нецелое число компонентов.
Если соединения по изобретению содержат достаточно кислые группы, такие как, например, карбокси, сульфокислую, фосфорокислую или фенольную группы, то они могут быть преобразованы в физиологически переносимые соли действием неорганических и органических оснований. Примеры подходящих неорганических оснований - это аммиак, гидроксид натрия, калия и кальция, а примеры органических оснований включают этаноламин, диэтаноламин, триэтаноламин, этилендиамин, трет-бутиламин, трет-октиламин, дегидроабиетиламин, циклогексиламин, дибензилэтилен-диамин и лизин. Кроме того, стехиометрически соли соединений по настоящему изобретению могут содержать целое или нецелое число компонентов.
Соединения по настоящему изобретению могут также находиться в форме своих сольватов и, в особенности, гидратов, которые получают, например, кристаллизацией из растворителя или из водного раствора. Более того, в состав сольватов или гидратов могут входить одна, две, три или любое количество молекул сольвата или воды.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления соединения по изобретению доступны в форме своих гидратов, с любым количеством молекул воды, включая целые и нецелые соотношения, такие как 1:0,5; 1:1; 1:1,5; 1:2; 1:2,5; 1:3; 1:3,5; 1:4 и т.д.
Известно, что химические вещества образуют твердые формы, существующие в виде состояний различной упорядоченности, их называют полиморфными формами или модификациями. Различные модификации полиморфного соединения могут сильно различаться по своим физическим свойствам. Соединения по изобретению могут существовать в виде различных полиморфных форм, и, более того, некоторые модификации могут быть метастабильны. Считается, что все эти полиморфные формы соединений принадлежат к настоящему изобретению.
Соединения по изобретению пригодны для лечения или профилактики заболеваний и/или патофизиологических состояний у млекопитающих, вызванных микроорганизмами, в особенности, если микроорганизм выбран из группы, включающей бактерию, грибок, простейшее и/или вирус.
В контексте настоящего изобретения предполагается, что к числу известных заболеваний и/или патофизиологических состояний у млекопитающих относятся те, которые вызваны бактериями.
Примерами таких бактериальных заболеваний и/или патофизиологических состояний являются актиномикоз, острый эпиглоттит, острый отит среднего уха, острый гнойный (септический) артрит, острый гнойный менингит, сибирская язва, аппендицит, бациллярная дизентерия, бактериемия, чума, граничная проказа, бореллиоз, ботулизм, легочный абсцесс, бронхит, бруцеллез, бубонная чума, карбункулы, целлюлит, головной столбняк, церебрит, цервисит, хорела, конъюктивит, кожная форма сибирской язвы, цистит, дерматит, диаррея, эмпиема, энцефалит, эндокардит, энтерическая лихорадка, энтерит, энтероколит, эпидидимит, рожистое воспаление, эризипелотрикоз, шелушение, внелегочный туберкулез, пищевое отравление, фурункулы, газовая гангрена, гастрит, гастроэнтерит, инфекции желудочно-кишечного тракта, желудочно-кишечный туберкулез, туберкулез мочеполовой системы, гломерулонефрит, гематогенный или лимфогематогенный туберкулез, импетиго, внутрибрюшинные инфекции, ларингит, лепроматозная проказа, проказа, лептоспироз, листериоз, локализованный столбняк, болезнь Лайма, мастит, мелиоидоз, менингит, менингоэнцефалит, просовидный туберкулез, мионекроз, тошнота, некротизирующий энтерит, неонатальный листериоз, неонатальный сепсис, нокардиоз, офтальмит, остеомиелит, отит, панкреатит, паротит, перикардит, перитонит, коклюш, чума, фарингит, пневмония, послеродовой сепсис, первичная листеремия, проктит, простатит, родильный сепсис, легочная сибирская язва, туберкулез легких, гнойничковый или буллезный кожные абсцессы, пиелонефрит, пиодермия, лихорадка, вызванная укусами лосиной/кроличьей моли, лихорадка, вызванная укусами крыс, рецидивирующая лихорадка, ревматическая лихорадка, ринит, тромбоэнцефалит, сальмонеллез, салфингит, синдром обожженной кожи, скарлатина, сепсис, септический антрит, септический тромбофлебит, септицемия, шигеллиоз, синусит, кожные инфекции, шовный абсцесс, сифилис, столбняк, клещевой/возвратный/сыпной тиф, тонзиллит, синдром токсического шока, трахеобронхит, трепонематоз, туберкулез, туберкулоидная проказа, туберкулезный лимфаденит, туберкулезный менингит, туберкулезный перикардит, туберкулезный перитонит, туляремия, брюшной тиф, шанкр, мальтийская/средиземноморская/гибралтарская лихорадка, уретрит, инфекции мочеиспускательного канала, рвотные и/или раневые инфекции, а также их различные формы и подформы. Предпочтительно, если заболевания и/или патофизиологические состояния у млекопитающих, вызванные бактериями, выбраны из группы, включающей острый отит среднего уха, бронхит, дерматит, энцефалит, эндокардит, гастрит, гастроэнтерит, инфекции желудочно-кишечного тракта, ларингит, менингит, отит среднего уха, перикардит, фарингит, пневмонию, сепсис, синусит, кожные инфекции, туберкулез и/или инфекции мочеиспускательного канала, а также их различные формы и подформы.
В контексте настоящего изобретения предполагается, что к числу известных заболеваний и/или патофизиологических состояний у млекопитающих относятся те, которые вызваны грибками.
Примерами таких грибковых заболеваний и/или патофизиологических состояний являются аспергиллез, бластомикоз, кандидоз, хромобластомикоз, кокцидиоидоз, криптококкоз, дерматомикоз, дерматофитоз, гистоплазмоз, лобомикоз, мукормикоз, мицетома, микотический кератит, окуломикоз, онихомикоз, отомикоз, паракокцидиоидоз, фаеогипомикоз, пьедра, лишай разноцветный, риноспоридиоз, споротрихоз, дерматофития, стригущий лишай, трихофития гладкой кожи, трихофития промежности, черный лишай, микозы стоп, дерматофития ногтей и/или зигомикоз, а также их различные формы и подформы.
В целях настоящего изобретения предполагается, что к числу известных заболеваний и/или патофизиологических состояний у млекопитающих относятся те, которые вызваны простейшими.
Примерами таких протозойных заболеваний и/или патофизиологических состояний являются африканский трипаносомоз, американский трипаносомоз, амебиаз, амебная дизентерия, амебный кератит, амебный менингоэнцефалит, амебный вагинит, бабезиоз, болезнь Шагаса, кокцидоз, криптоспоридиоз, кожный лейшманиоз, циклоспориоз, диентамебиоз, энтамебиоз, жиардиаз, изопсориаз, ламблиоз, лейшманиоз, малярия, четырехдневная и трехдневная малярия, тропическая малярия, микроспоридоз, мукокожный лейшманиоз, пневмоцитоз, сакроспоридоз, сонная болезнь, токсоплазмоз, трихомониоз, трипаносомоз и/или висцеральный лейшманиоз, а также их различные формы и подформы. Предпочтительно, если заболевания и/или патофизиологические состояния у млекопитающих, вызванные простейшими, выбраны из группы, включающей трипаносомоз, американский трипаносомоз, болезнь Шагаса, лейшманиоз, кожный лейшманиоз, висцеральный лейшманиоз, мукокожный лейшманиоз, малярию, тропическую малярию и/или токсоплазмоз, а также их различные формы и подформы.
В контексте настоящего изобретения предполагается, что к числу известных заболеваний и/или патофизиологических состояний у млекопитающих относятся те, которые вызваны вирусами.
Примерами таких вирусных заболеваний и/или патофизиологических состояний являются острая фибриллярная респираторная болезнь, острый геморрагический конъюктивит, острый геморрагический цистит, острая фарингоконъюктивальная лихорадка, острый поздний ганглиотит, острое респираторное заболевание, СПИД, арбовирусный энцефалит, асептический менингит, болезнь Борна, болезнь Борнхолма (плевродиния), лихорадка Денге, бронхиолит, бронхит, лимфома Буркитта, калифорнийский энцефалит, болезнь Кастлмана, рак шейки матки, ветряная оспа, чукунгунская лихорадка, колорадская клещевая лихорадка, простуда, конъюктивит, оспа, болезнь Крейцфельда-Якоба, круп, болезнь цитомегалических включений, денге, геморрагическая лихорадка денге, плевродиния, восточный конский энцефалит, геморрагическая лихорадка Эбола, вирусная инфекция Эбола, энцефаломиелит, эпидемический кератоконъюктивит, эпидемический нефрозонефрит, инфекционная эритрема, смертельная семейная бессонница, пятая болезнь, грипп, ящур, гастроэнтерит, опоясывающий лишай, генитальный герпес, генитальные вши, краснуха, болезнь Герстмана-Штраусслера-Шейнкера, гингивостоматит, Хантаан-корейская геморрагическая лихорадка, хантавирусная геморрагическая лихорадка, хантавирусный легочный синдром, геморрагическая лихорадка с ренальным синдромом, гепатиты А, В, С, D, Е, герпангина, герпес на губах, опоясывающий лишай, герпетический стоматит, инфекция ВИЧ, болезнь Ходжкина, миелопатия, ассоциированная с HTLV-1, гидрофобия, инфекционный миокардит, инфекционный перикардит, инфлюэнца, японский энцефалит, желтая лихорадка джунглей, аргентинская геморрагическая лихорадка Юнина, саркома Капоши, кератит, кератоконъюктивит, корейская геморрагическая лихорадка, куру, энцефалит ЛаКросса, ларингит, ларинготрахеобронхит (типы 1 и 2), геморрагическая лихорадка Ласса, лейкемия, лимфоцитарный хориоменингит, лимфома, боливийская геморрагическая лихорадка Мачупо, геморрагическая лихорадка Марбурга, болезнь Майяро, корь, менингоэнцефалит, контагиозный моллюск, мононуклеоз, мононуклеоз-похожий синдром, многофокальная лейкоэнцефалопатия, свинка, назофарингеальная карцинома, рвота, неонатальный герпес, эпидемическая нефропатия, офтальмический опоясывающий лишай, орхитит, контагиозный пустулезный дерматит, парагрипп, паротит, фарингит, фарингоконъюктивиальная лихорадка, плевродиния, пневмония, полио, полиомиелит, прогрессирующая мультифокальная лейкоэнцефалопатия, бешенство, инфантильная краснуха, краснуха, краснушный панэнцефалит, склеротирующий панэнцефалит, тяжелый острый респираторный синдром (SARS), опоясывающий лишай, инфекционная эритрема, оспа, соеола, энцефалит Св. Луиса, энцефалит височных долей головного мозга, трахеобронхит, заразные губчатые энцефалопатии, тропический спастический парапорез, городская желтая лихорадка, уретрит, ветряная оспа, бородавки, морская болезнь, бородавки, западный конский энцефалит, желтая лихорадка и/или опоясывающий лишай.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления соединения по изобретению можно использовать для получения лекарственного средства для лечения или профилактики заболеваний и/или патофизиологических состояний у млекопитающих, вызванных микроорганизмами, где заболевание и/или патофизиологическое состояние выбрано из группы, включающей аспергиллез, бластомикоз, кандидоз, хромобластомикоз, кокцидиоидоз, криптококкоз, дерматомикоз, дерматофитоз, гистоплазмоз, лобомикоз, мукормикоз, мицетому, микотический кератит, окуломикоз, онихомикоз, отомикоз, паракокцидиоидоз, фаеогипомикоз, пьедру, лишай разноцветный, риноспоридиоз, споротрихоз, дерматофитию, стригущий лишай, трихофитию гладкой кожи, трихофитию промежности, черный лишай, микозы стоп, дерматофитию ногтей, зигомикоз; африканский трипаносомоз, американский трипаносомоз, амебиаз, амебную дизентерию, амебный кератит, амебный менингоэнцефалит, амебный вагинит, бабезиоз, болезнь Шагаса, кокцидоз, криптоспоридиоз, кожный лейшманиоз, циклоспориоз, диентамебиоз, энтамебиоз, жиардиаз, изопсориаз, ламблиоз, лейшманиоз, малярию, четырехдневную и трехдневную малярию, тропическую малярию, микроспоридоз, мукокожный лейшманиоз, пневмоцитоз, сакроспоридоз, сонную болезнь, токсоплазмоз, трихомониоз, трипаносомоз, висцеральный лейшманиоз, актиномикоз, острый эпиглоттит, острый отит среднего уха, острый гнойный (септический) артрит, острый гнойный менингит, сибирскую язву, аппендицит, бациллярную дизентерию, бактериемию, чуму, граничную проказу, бореллиоз, ботулизм, легочный абсцесс, бронхит, бруцеллез, бубонную чуму, карбункулы, целлюлит, головной столбняк, церебрит, цервисит, хорелу, конъюктивит, кожную форму сибирской язвы, цистит, дерматит, диаррею, эмпиему, энцефалит, эндокардит, энтерическую лихорадку, энтерит, энтероколит, эпидидимит, рожистое воспаление, эризипелотрикоз, шелушение, внелегочный туберкулез, пищевое отравление, фурункулы, газовую гангрену, гастрит, гастроэнтерит, инфекции желудочно-кишечного тракта, желудочно-кишечный туберкулез, туберкулез мочеполовой системы, гломерулонефрит, гематогенный или лимфогематогенный туберкулез, импетиго, внутрибрюшинные инфекции, ларингит, лепроматозную проказу, проказу, лептоспироз, листериоз, локализованный столбняк, болезнь Лайма, мастит, мелиоидоз, менингит, менингоэнцефалит, просовидный туберкулез, мионекроз, тошноту, некротизирующий энтерит, неонатальный листериоз, неонатальный сепсис, нокардиоз, офтальмит, остеомиелит, отит, панкреатит, паротит, перикардит, перитонит, коклюш, чуму, фарингит, пневмонию, послеродовой сепсис, первичную листеремию, проктит, простатит, родильный сепсис, легочную сибирскую язву, туберкулез легких, гнойничковый или буллезный кожные абсцессы, пиелонефрит, пиодермию, лихорадку, вызванную укусами лосиной/кроличьей моли, лихорадку, вызванную укусами крыс, рецидивирующую лихорадку, ревматическую лихорадку, ринит, тромбоэнцефалит, сальмонеллез, салфингит, синдром обожженной кожи, скарлатину, сепсис, септический антрит, септический тромбофлебит, септицемию, шигеллиоз, синусит, кожные инфекции, шовный абсцесс, сифилис, столбняк, клещевой/возвратный/сыпной тиф, тонзиллит, синдром токсического шока, трахеобронхит, трепонематоз, туберкулез, туберкулоидную проказу, туберкулезный лимфаденит, туберкулезный менингит, туберкулезный перикардит, туберкулезный перитонит, туляремию, брюшной тиф, шанкр, мальтийскую/средиземноморскую/гибралтарскую лихорадку, уретрит, инфекции мочеиспускательного канала, рвотные и/или раневые инфекции, острую фибриллярную респираторную болезнь, острый геморрагический конъюктивит, острый геморрагический цистит, острую фарингоконъюктивальную лихорадку, острый поздний ганглиотит, острое респираторное заболевание, СПИД, арбовирусный энцефалит, асептический менингит, болезнь Борна, болезнь Борнхолма (плевродиния), лихорадку Денге, бронхиолит, бронхит, лимфому Буркитта, калифорнийский энцефалит, болезнь Кастлмана, рак шейки матки, ветряную оспу, чукунгунскую лихорадку, колорадскую клещевую лихорадку, простуду, конъюктивит, оспу, болезнь Крейцфельда-Якоба, круп, болезнь цитомегалических включений, денге, геморрагическую лихорадку денге, плевродинию, восточный конский энцефалит, геморрагическую лихорадку Эбола, вирусную инфекцию Эбола, энцефаломиелит, эпидемический кератоконъюктивит, эпидемический нефрозонефрит, инфекционную эритрему, смертельную семейную бессонницу, пятую болезнь, грипп, ящур, гастроэнтерит, опоясывающий лишай, генитальный герпес, генитальные вши, краснуху, болезнь Герстмана-Штраусслера-Шейнкера, гингивостоматит, Хантаан-корейскую геморрагическую лихорадку, хантавирусную геморрагическую лихорадку, хантавирусный легочный синдром, геморрагическую лихорадку с ренальным синдромом, гепатиты А, В, С, D, Е, герпангину, герпес на губах, опоясывающий лишай, герпетический стоматит, инфекцию ВИЧ, болезнь Ходжкина, миелопатию, ассоциированную с HTLV-1, гидрофобию, инфекционный миокардит, инфекционный перикардит, инфлюэнцу, японский энцефалит, желтую лихорадку джунглей, аргентинскую геморрагическую лихорадку Юнина, саркому Капоши, кератит, кератоконъюктивит, корейскую геморрагическую лихорадку, куру, энцефалит ЛаКросса, ларингит, ларинготрахеобронхит (типы 1 и 2), геморрагическую лихорадку Ласса, лейкемию, лимфоцитарный хориоменингит, лимфому, боливийскую геморрагическую лихорадку Мачупо, геморрагическую лихорадку Марбурга, болезнь Майяро, корь, менингоэнцефалит, контагиозный моллюск, мононуклеоз, мононуклеоз-похожий синдром, многофокальную лейкоэнцефалопатию, свинку, назофарингеальную карциному, рвоту, неонатальный герпес, эпидемическую нефропатию, офтальмический опоясывающий лишай, орхитит, контагиозный пустулезный дерматит, парагрипп, паротит, фарингит, фарингоконъюктивиальную лихорадку, плевродинию, пневмонию, полио, полиомиелит, прогрессирующую мультифокальную лейкоэнцефалопатию, бешенство, инфантильную краснуху, краснуху, краснушный панэнцефалит, склеротирующий панэнцефалит, тяжелый острый респираторный синдром (SARS), опоясывающий лишай, инфекционную эритрему, оспу, соеолу, энцефалит Св. Луиса, энцефалит височных долей головного мозга, трахеобронхит, заразные губчатые энцефалопатии, тропический спастический парапорез, городскую желтую лихорадку, уретрит, ветряную оспу, бородавки, морскую болезнь, бородавки, западный конский энцефалит, желтую лихорадку и/или опоясывающий лишай, а также их различные формы и подформы, и, предпочтительно, выбрано из группы, включающей трипаносомоз, американский трипаносомоз, болезнь Шагаса, лейшманиоз, кожный лейшманиоз, мукокожный лейшманиоз, висцеральный лейшманиоз, малярию, тропическую малярию, токсоплазмоз, острый отит среднего уха, бронхит, дерматит, энцефалит, эндокардит, гастрит, гастроэнтерит, инфекции желудочно-кишечного тракта, ларингит, менингит, отит среднего уха, перикардит, фарингит, пневмонию, сепсис, синусит, кожную инфекцию, туберкулез и/или инфекции мочеиспускательного тракта, а также их различные формы и подформы.
В соответствии с другим вариантом осуществления цель изобретения была неожиданно решена получением соединений по изобретению для использования получения лекарственного средства для лечения опухолей у млекопитающих.
Термин "опухоль" или "рак" в настоящем изобретении включает все известные доброкачественные и/или злокачественные опухоли, то есть различные известные раки, опухоли, неоплазмы и/или язвы любой ткани и/или органа у млекопитающих, такие как проиллюстрированы для примера в работе "Encyclopedic Reference of Cancer, Ed: Manfred Schwab, Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2001 (ISBN 3-540-66527-7)".
Как показано в этой заявке, соединения по изобретению пригодны для лечения или профилактики заболеваний и/или патофизиологических состояний у млекопитающих, таких как описано в настоящей заявке. Их можно вводить различным видам млекопитающих, включая людей.
В настоящей заявке виды млекопитающих понимаются обобщенно. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления такие млекопитающие выбраны из группы, включающей человека, домашних животных, корову, крупный рогатый скот, мелких домашних животных, овцу, свинью, козу, лошадь, пони, осла, лошака, мула, зайца, кролика, кошку, собаку, морскую свинку, омара, крысу, мышь. Более предпочтительно, если млекопитающее предтставляет собой человека.
В соответствии с другим вариантом осуществления настоящего изобретения соединения по изобретению применяются совместно по меньшей мере с одним дополнительным фармакологически активным веществом. В зависимости от цели комбинированного использования такое дополнительное фармакологически активное вещество может представлять собой другое производное алкилфосфолипидов (соединения изобретения и/или известные производные алкилфосфолипидов, такие как милтефозин, перифозин и/или эрицилфосфохолин) и/или другой подходящий терапевтический агент, пригодный при лечении и/или профилактике упомянутых выше заболеваний и/или патофизиологических состояний. Выбор и комбинация дополнительного фармакологически активного вещества (веществ) квалифицированный специалист может легко выполнить на основании своих экспертных знаний и в зависимости от цели комбинированного использования и подлежащих лечению заболеваний и/или патофизиологических состояний.
Упомянутые выше пригодные терапевтические агенты включают бензнидазол (N-бензил-2-нитроимидазол-1-ил-ацетамид; CAS номер: 22994-85-0); нифуртимокс [3-метил-4-(5-нитрофурфурил-иденамино) тетрагидро-1,4-тиазин-1,1-диоксид; CAS номер: 23256-30-6]; амфотерицин В[(1 R, 3S, 5R, 6R, 9R, 11R, 15S, 16R, 17R, 18S, 19E, 21E, 23E, 25E, 27E, 29E, 31E, 33R, 35S, 36R, 37S)-33-[(3-Амино-3,6-дидеокси-бета-D-маннопиразонил)окси]-1,3,5,6,9,11,17,37-октагидрокси-15,16,18-триметил-13-оксо-14,39-диоксабицикло[33.3.1]нонатриаконта-19,21,23,25,27,29,31-гептаен-36-карбоновая кислота; CAS номер: 1397-89-3]; липосомальный амфотерицин В (AmBisome(tm); Gilead Sciences, Inc., Astellas Pharma US, Inc.), ситамаквин (N,N-диэтил-N'-(6-метокси-4-метил-8-хинолинил)-1,6-гександиамин; CAS номер: 57695-04-2) и/или паромомицин [O-2-амино-2-деокси-альфа-D-глюкопиранозил-(1-4)-O-[O-2,6-диамино-2,6-дидеокси-бета-L-идопиранозил-(1-3)-бета-D-рибофуранозил-(1-5)]-2-деокси-D-стрептамин; CAS номер: 7542-37-2] и, предпочтительно, подходящие терапевтические агенты выбраны из группы, состоящей из этих агентов.
Упомянутые выше другие терапевтические агенты, при использовании совместно с соединениями по настоящему изобретению, могут применяться, например, в количествах, указанных в справочнике Physicians' Desk Reference (PDR) или иначе определенных специалистов в соответствующей области.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления соединения по изобретению используются для лечения и/или профилактики упомянутых выше заболеваний и/или патофизиологических состояний в форме лекарственного средства, причем такое лекарственное средство содержит по меньшей мере одно дополнительное фармакологически активное вещество.
В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления соединения по настоящему изобретению используются для лечения и/или профилактики упомянутых выше заболеваний и/или патофизиологических состояний в форме лекарственного средства, где такое лекарственное средство применяется перед, и/или одновременно, и/или после лечения по меньшей мере одним дополнительным фармакологически активным веществом.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления соединения по настоящему изобретению используются для лечения и/или профилактики упомянутых выше заболеваний и/или патофизиологических состояний в форме лекарственного средства, где такое лекарственное средство содержит по меньшей мере одно соединение по изобретению и по меньшей мере одно дополнительное фармакологически активное вещество, выбранное из группы, включающей бензнидазол(N-бензил-2-нитроимидазол-1-ил-ацетамид); нифуртимокс[3-метил-4-(5-нитрофурфурил-иденамино)тетрагидро-1,4-тиазин-1,1-диоксид]; амфотерицин В [(1R, 3S, 5R, 6R, 9R, 11R, 15S, 16R, 17R, 18S, 19Е, 21E, 23E, 25E, 27E, 29E, 31E, 33R, 35S, 36R, 37S)-33-[(3-Амино-3,6-дидеокси-бета-D-маннопиразонил)окси]-1,3,5,6,9,11,17,37-октагидрокси-15,16,18-триметил-13-оксо-14,39-диоксабицикло[33.3.1]нонатриаконта-19,21,23,25,27,29,31-гептаен-36-карбоновая кислота]; липосомальный амфотерицин В, ситамаквин (N,N-диэтил-N'-(6-метокси-4-метил-8-хинолинил)-1,6-гександиамин; CAS номер: 57695-04-2) и/или паромомицин [O-2-амино-2-деокси-альфа-D-глюкопиранозил-(1-4)-O-[O-2,6-диамино-2,6-дидеокси-бета-L-идопиранозил-(1-3)-бета-D-рибофуранозил-(1-5)]-2-деокси-D-стрептамин].
Более предпочтительно, если такие заболевания и/или патофизиологические состояния выбраны из группы, включающей трипаносомоз, американский трипаносомоз, болезнь Шагаса, лейшманиоз, кожный лейшманиоз, мукокожный лейшманиоз, висцеральный лейшманиоз, малярию и/или тропическую малярию, а также их различных формы и подформы.
В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления соединения по настоящему изобретению используются для лечения и/или профилактики упомянутых выше заболеваний и/или патофизиологических состояний в форме лекарственного средства, где такое лекарственное средство, содержащее по меньшей мере одно соединение по изобретению, применяется до, и/или одновременно с, и/или после лечения по меньшей мере одним дополнительным фармакологически активным веществом, выбранным из группы, включающей бензнидазол (N- бензил-2-нитроимидазол-1-ил-ацетамид); нифуртимокс[3-метил-4-(5-нитрофурфурил-иденамино)тетрагидро-1,4-тиазин-1,1-диоксид]; амфотерицин В [(1R, 3S, 5R, 6R, 9R, 11R, 15S, 16R, 17R, 18S, 19Е, 21E, 23E, 25E, 27E, 29E, 31 E, 33R, 35S, 36R, 37S)-33-[(3-Амино-3,6-дидеокси-бета-D-маннопиразонил)окси]-1,3,5,6,9,11,17,37-октагидрокси-15,16,18-триметил-13-оксо-14,39-диоксабицикло[33.3.1]нонатриаконта-19,21,23,25,27,29,31-гептаен-36-карбоновая кислота]; липосомальный амфотерицин В, ситамаквин (N,N-диэтил-N'-(6-метокси-4-метил-8-хинолинил)-1,6-гександиамин;CAS номер: 57695-04-2) и/или паромомицин[O-2-амино-2-деокси-альфа-D-глюкопиранозил-(1-4)-O-[O-2,6-диамино-2,6-дидеокси-бета-L-идопиранозил-(1-3)-бета-D-рибофуранозил-(1-5)]-2-деокси-D-стрептамин].
Более предпочтительно, если такие заболевания и/или патофизиологические состояния выбраны из группы, включающей трипаносомоз, американский трипаносомоз, болезнь Шагаса, лейшманиоз, кожный лейшманиоз, мукокожный лейшманиоз, висцеральный лейшманиоз, малярию и/или тропическую малярию, а также их различные формы и подформы.
В соответствии с еще одним вариантом осуществления задача изобретения была неожиданным образом решена с использованием производных алкилфосфолипидов, выбранных из группы, включающей милтефозин (гексадецилфосфохолин), перифозин (октадецил-1,1-диметил-пиперидино-4-ил-фосфат) и/или еруцилфосфохолин[(13Z)-докосенилфосфохолин] в форме лекарственного средства для лечения или профилактики упомянутых выше заболеваний и/или патофизиологических состояний у млекопитающих, которые вызваны разнообразными проиллюстрированными здесь микроорганизмами, где такое лекарственное средство содержит по меньшей мере одно дополнительное фармакологически активное вещество, выбранное из группы, включающей бензнидазол (N-бензил-2-нитроимидазол-1-ил-ацетамид); нифуртимокс [3-метил-4-(5-нитрофурфурил-иденамино)тетрагидро-1,4-тиазин-1,1-диоксид]; амфотерицин В [(1R, 3S, 5R, 6R, 9R, 11R, 158, 16R, 17R, 18S, 19E, 21E, 23E, 25E, 27E, 29E, 31E, 33R, 35S, 36R, 37S)-33-[(3-Амино-3,6-дидеокси-бета-D-маннопиразонил)окси]-1,3,5,6,9,11,17,37-октагидрокси-15,16,18-триметил-13-оксо-14,39-диоксабицикло[33.3.1]нонатриаконта-19,21,23,25, 27,29,31-гептаен-36-карбоновая кислота]; липосомальный амфотерицин В, ситамаквин (N,N-диэтил-N'-(6-метокси-4-метил-8-хинолинил)-1,6-гександиамин; CAS номер: 57695-04-2) и/или паромомицин [O-2-амино-2-деокси-альфа-D-глюкопиранозил-(1-4)-O-[O-2,6-диамино-2,6-дидеокси-бета-L-идопиранозил-(1-3)-бета-D-рибофуранозил-(1-5)]-2-деокси-D-стрептамин] и алкилфосфолипидное производное, выбранное из группы, включающей милтефозин (гексадецилфосфохолин), перифозин(октадецил-1,1-диметил-пиперидино-4-ил-фосфат) и/или еруцилфосфохолин [(13Z)-докосенилфосфохолин].
В соответствии с еще одним вариантом осуществления задача изобретения была неожиданным образом решена с использованием производных алкилфосфолипидов, выбранных из группы, включающей милтефозин (гексадецилфосфохолин), перифозин (октадецил-1,1-диметил-пиперидино-4-ил-фосфат) и/или еруцилфосфохолин[(13Z)-докосенилфосфохолин] в форме лекарственного средства для лечения или профилактики упомянутых выше заболеваний и/или патофизиологических состояний у млекопитающих, которые вызваны разнообразными проиллюстрированными здесь микроорганизмами, где такое лекарственное средство применяется до, и/или во время, и/или после лечения по меньшей мере одним дополнительным фармакологически активным веществом, выбранным из группы, включающей бензнидазол (N-бензил-2-нитроимидазол-1-ил-ацетамид); нифуртимокс[3-метил-4-(5-нитрофурфурил-иденамино)тетрагидро-1,4-тиазин-1,1-диоксид]; амфотерицин В [(1R, 3S, 5R, 6R, 9R, 11R, 15S, 16R, 17R, 18S, 19E, 21E, 23E, 25E, 27E, 29E, 31E, 33R, 35S, 36R, 37S)-33-[(3-Амино-3,6-дидеокси-бета-D-маннопиразонил)окси]-1,3,5,6,9,11,17,37-октагидрокси-15,16,18-триметил-13-оксо-14,39-диоксабицикло[33.3.1]нонатриаконта-19,21,23,25,27,29,31-гептаен-36-карбоновая кислота]; липосомальный амфотерицин В, ситамаквин (N,N- диэтил-N'-(6-метокси-4-метил-8-хинолинил)-1,6-гександиамин; CAS номер: 57695-04-2) и/или паромомицин[O-2-амино-2-деокси-альфа-D-глюкопиранозил-(1-4)-O-[O-2,6-диамино-2,6-дидеокси-бета-L-идопиранозил-(1-3)-бета-D-рибофуранозил-(1-5)]-2-деокси-D-стрептамин].
Более предпочтительно, если такие заболевания и/или патофизиологические состояния выбраны из группы, включающей трипаносомоз, американский трипаносомоз, болезнь Шагаса, лейшманиоз, кожный лейшманиоз, мукокожный лейшманиоз, висцеральный лейшманиоз, малярию и/или тропическую малярию, а также их различные формы и подформы.
Еще более предпочтительно, если такое лекарственное средство содержит милтефозин и амфотерицин В, липосомальный амфотерицин В, ситамаквин и/или паромомицин и используется для лечения лейшманиоза, кожного лейшманиоза, мукокожного лейшманиоза и/или висцерального лейшманиоза, а также их различных форм и подформ.
Еще более предпочтительно, если такое лекарственное средство содержит милтефозин и бензнидазол и/или нифуртимокс и используется для лечения трипаносомоза, американского трипаносомоза и/или болезни Шагаса, а также их различных форм и подформ.
Наиболее предпочтительно, если такое лекарственное средство содержит милтефозин и бензнидазол и используется для лечения трипаносомоза, американского трипаносомоза и/или болезни Шагаса, в особенности хронических форм трипаносомоза, американского трипаносомоза и/или болезни Шагаса, вызванных Trypanosoma cruzi в эпимастиготной форме и/или, в особенности, Trypanosoma cruzi в амастиготной форме. Амастиготы Trypanosoma cruzi представляют собой внутриклеточную форму паразита Trypanosoma cruzi, главным образом, ответственного за хроническую форму болезни. Амастиготы Trypanosoma cruzi живут в мышцах миокарда, что ведет к сердечной недостаточности и в результате к кардиомиопатии. Таким образом, предпочтительны лечение или профилактика эпимастигот Тryраnosomа cruzi и/или, в особенности, амастигот Trypanosoma cruzi, в частности, сердечной недостаточности и/или кардиомиопатии, вызванной этими формами паразита.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления соединения по настоящему изобретению или производные алкилфосфолипидов, выбранные из группы, включающей милтефозин (гексадецилфосфохолин), перифозин (октадецил-1,1-диметил-пиперидино-4-ил-фосфат) и/или еруцилфосфохолин[(13Z)-докосенилфосфохолин], применяются для лечения и/или профилактики упомянутых выше заболеваний и/или патофизиологических состояний в форме фармацевтического набора, где такой фармацевтический набор содержит по меньшей мере одно дополнительное фармакологически активное вещество, как описано в настоящей заявке.
Соединения по настоящему изобретению характеризуются удивительно хорошим действием и/или улучшенной эффективностью против разнообразных бактерий, грибков, простейших и/или вирусов, а также при лечении соответствующих заболеваний и/или патофизиологических состояний. Благодаря своему удивительно сильному действию и/или эффективности, соединения по настоящему изобретению можно вводить в более низких дозах по сравнению с другими известными, но менее сильными APL или другими пригодными терапевтическими агентами, достигая при этом такого же или даже превосходящего биологического эффекта. Кроме того, такое уменьшение дозы может приводить к меньшим медицинским побочным эффектам или даже к их исчезновению.
Более того, соединения по настоящему изобретению оказались на удивление менее цитотоксичными, по сравнению с известными APL или другими пригодными терапевтическими агентами, обеспечивая по меньшей мере такую же или даже превосходящую эффективность. Таким образом, использование соединений по настоящему изобретению в лечении упомянутых здесь заболеваний и/или патофизиологических состояний даже в несниженной дозе ведет к уменьшению или исчезновению медицинских побочных эффектов.
Кроме того, соединения по настоящему изобретению оказались на удивление менее эмбриотоксичными или даже не эмбриотоксичными по сравнению с известными APL или другими пригодными терапевтическими агентами, будучи столь же или даже более сильнодействующими. Эмбриотоксичностью называют способность вещества вызывать повреждения/быть токсичным для эмбриона, что приводит к нарушениям в его развитии или к его смерти.
Более того, использование соединений по изобретению, а также мелтифозина, перифозина и/или эрацилфосфохолина в комбинации с известными стандартными терапевтическими агентами (например, бензимидазолом, нифуртимоксом, амфотерицином В, липосомальным амфотерицином В и/или паромомицином) для лечения перечисленных здесь заболеваний и/или патофизиологических состояний характеризуется гораздо более высокой эффективностью по сравнению со стандартным подходом, использующим терапевтические агенты по отдельности.
Кроме того, такое комбинированное лечение неожиданно позволило уменьшить дозу дополнительных терапевтических агентов (например, бензимидазола, нифуртимокса, амфотерицина В, липосомального амфотерицина В и/или паромомицина) по сравнению с их отдельным использованием. При этом они проявляли, по крайней мере, такую же, если не более высокую эффективность. В дополнение к этому, отмеченное снижение дозы может уменьшить или даже свести на нет нежелательные побочные эффекты.
Более того, такое комбинированное лечение неожиданно позволило уменьшить время лечения, т.е. использовать более короткий курс лечения, что благоприятно как с точки зрения пациентов, так и с экономической точки зрения.
Описанные здесь производные алкилфосфолипидов и/или используемые при необходимости дополнительные фармакологически активные препараты могут вводиться известным способом. Путь введения может быть любым из тех, которые обеспечивают эффективный транспорт активного соединения к свойственному для него или желательному участку действия, например пероральный или непероральный, в частности локальный трансдермальный, легочный, ректальный, интравагинальный, назальный или парентеральный путь введения, а также имплантация. Пероральное введение предпочтительнее.
Открытые здесь производные алкилфосфолипидов и/или используемые при необходимости дополнительные фармакологически активные препараты преобразуются в пригодную для введения форму и смешиваются, если необходимо, с фармакологически приемлемыми носителями или растворителями. Соответствующие наполнители или носители описаны, например, в Zanowiak P, Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry 2005, Pharmaceutical Dosage Forms, 1-33; Spiegel AJ et al., Journal of Pharmaceutical Sciences 1963, 52: 917-927; Czetsch-Lindenwald H, Pharm. Ind. 1961, 2: 72-74; Fiedler HP, Lexikon der Hilfsstoffe fur Pharmazie, Kosmetik и angrenzende Gebiete 2002, Editio Cantor Verlag, p65-68.
Для перорального введения в твердой форме могут быть использованы таблетки, капсулы, гелевые капсулы, таблетки в оболочке, гранулы или порошок, а также может быть использован раствор для приема внутрь. Открытые здесь производные алкилфосфолипидов при пероральном введении могут комбинироваться с известными и обычно используемыми физиологически толерантными наполнителями и носителями, такими как, например, гуммиарабик, тальк, крахмал, а также сахара, такие как, например, маннит, метилцеллюлоза, лактоза, желатин, поверхностно-активными агентами, стеаратом магния, циклодекстринами, водными и неводными носителями, разжижителями, диспергирующими агентами, эмульгаторами, масляными веществами, консервантами и специями (например, эфирными маслами). Алкильные производные фосфолипидов, открытые здесь, могут также быть диспергированы в микрочастицах, например в наночастицах.
Препараты могут также вводиться непероральным путем, например, с помощью внутривенной, подкожной, внутримышечной инъекции стерильного водного или масляного раствора, суспензии или эмульсии, посредством имплантов, с помощью мазей, кремов или суппозиториев. При необходимости возможно введение препарата в виде лекарственной формы с длительным высвобождением. Импланты могут содержать инертные материалы, например биоразлагаемые полимеры или синтетические силиконы, такие как, например, силиконовая резина. Внутривагинальное введение возможно, например, путем использования вагинального кольца. Внутриматочное введение возможно, например, с помощью диафрагмы или других подходящих внутриматочных средств. Дополнительно предусмотрено чрезкожное введение, особенно с помощью подходящего для этой цели способа или известным способом, например с помощью пластырей.
Дозировка может варьироваться в широком диапазоне в зависимости от типа и/или тяжести заболевания, а также патофизиологических условий, формы введения, возвраста, пола, веса и чувствительности субъекта к препарату. Квалифицированные специалисты могут определять фармакологически эффективное количество производных алкилфосфолипидов, как показано здесь, и/или определить дополнительные фармакологически активные вещества. Введение можно производить одной дозой или несколькими дозами.
Дозировка может колебаться в пределах от 0,001 мг до 100 мг активного ингредиента на килограмм веса тела. Препарат может содержать, по крайней мере, одно активное производное алкилфосфолипидов и, если необходимо, еще одно фармакологически активное вещество.
Осуществление изобретения
Химический синтез
Описанный здесь синтез производных алкилфосфолипидов является хорошо описанной в уровне технике процедурой, известной квалифицированному специалисту в области синтеза благодаря его знаниям. В этом контексте явным образом сделана ссылка на приведенную ниже патентную, а также процитированную здесь литературу: ЕР 0 108 565 А2; WO 87/03478; US 5,980,915; US 6,254,879; US 6,506,393; US 6,172,050; US 6,479,472; US 5,449,798; US 5,958,906.
Далее описаны дополнительные детали синтеза некоторых специфических головных или хвостовых групп. Во избежание сомнений следует отметить, что различные радикалы R, упомянутые в разделе химического синтеза, не соответствуют тем, которые определены для формулы (I) и специфических подгрупп. Таким образом, они могут отличаться или иметь то же значение.
А)
Некоторые азотсодержащие головные группы синтезированы путем алкилирования амина (см. таблицу 1 и Общую процедуру 1).
Таблица 1
Соединение
Азотсодержащая головная группа
3
<img file="00000065.tif" he="16" wi="39" img-content="undefined" img-format="tif" />
19
<img file="00000066.tif" he="16" wi="39" img-content="undefined" img-format="tif" />
Общая процедура 1:
где R1 представляет собой производное холина, и R2 представляет описанные здесь замещенные и/или незамещенные алкильные радикалы.
3
0,3 моль амина, 150 мл CHCN и каталитические количества KI помещают в реакционный сосуд. К полученной смеси добавляют по каплям алкокси-бромид при комнатной температуре, перемешивают в течение 15 минут и затем нагревают до кипения в течение 2 часов. После концентрирования в вакууме остаток кристаллизуют из ацетона. Выходы варьируются от 10 до 50%.
Когда необходимо, могут быть также использованы другие алкилирующие амин агенты (например, бензилбромид или фенетилбромид).
В)
Другие азотсодержащие головные группы синтезированы путем метилирования (см. таблицу 2 и Общую процедуру 2).
Таблица 2
Соединение
Метилированная азотсодержащая головная группа
2, 20
<img file="00000067.tif" he="16" wi="39" img-content="undefined" img-format="tif" />
1
<img file="00000068.tif" he="20" wi="51" img-content="undefined" img-format="tif" />
4
<img file="00000069.tif" he="24" wi="57" img-content="undefined" img-format="tif" />
6, 7, 10, 12, 13, 15, 17
<img file="00000070.tif" he="16" wi="33" img-content="undefined" img-format="tif" />
8, 11, 14, 16
<img file="00000071.tif" he="18" wi="32" img-content="undefined" img-format="tif" />
9
<img file="00000072.tif" he="22" wi="39" img-content="undefined" img-format="tif" />
Общая процедура 2:
где R3 представляет собой производное холина и R4 представлена указанными здесь замещенными и/или незамещенными алкильными радикалами.
3
3
2
5
0,5 моль производного холина и 125 мл CHCN помещают в реакционный сосуд. 0,5 моль метилового эфира пара-толуолсульфоновой кислоты в 125 мл CHCN добавляют по каплям, поддерживая температуру реакционной смеси ниже 10°С. После перемешивания в течение 30 минут при комнатной температуре смесь нагревают до кипения в течение 30 минут и охлаждают до комнатной температуры. Полученный твердый осадок ("тозилат") отделяют (если нужно, в инертной атмосфере), кристаллизуют из 125 мл изопропанола и сушат над РО в вакууме. Выходы варьируются от 40 до 60%.
В качестве альтернативы, для метилирования могут быть также использованы метилгалогениды.
С)
Другие азотсодержащие головные группы синтезированы путем этилирования (см. таблицу 3 и Общую процедуру 3).
Таблица 3
Соединение
Азотсодержащая головная группа
5
<img file="00000073.tif" he="16" wi="39" img-content="undefined" img-format="tif" />
18
<img file="00000074.tif" he="28" wi="35" img-content="undefined" img-format="tif" />
Общая процедура 3:
где R5 представляет собой производное холина, и R6 представлен указанными здесь замещенными и/или незамещенными алкильными радикалами.
3
3
2
5
0,5 моль производного холина и 125 мл CHCN помещают в реакционный сосуд. 0,5 моль этилбромида в 125 мл CHCN добавляют по каплям, поддерживая температуру реакционной смеси ниже 10°С. После перемешивания в течение 30 минут при комнатной температуре смесь нагревают до кипения в течение 30 минут и охлаждают до комнатной температуры. Полученный твердый осадок ("бромид") отделяют (если нужно, в инертной атмосфере), перекристаллизовывают из 125 мл изопропанола и сушат над PO в вакууме. Выходы варьруются от 40 до 60%.
В качестве альтернативы также может быть использован этил иодид.
D)
Различные липофильные хвостовые группы, присоединенные к фосфатной группе, могут использоваться, как показано ниже (см. таблицу 4).
Таблица 4
Соединение
Азотсодержащая головная группа
1, 2, 3, 4, 5, 9, 16, 17, 18, 19
Насыщенные алкильные цепи: С16, С18. Ненасыщенные алкильные цепи: С16, С18.
6, 12, 13, 15
<img file="00000075.tif" he="26" wi="39" img-content="undefined" img-format="tif" />где R1 - это алкокси- или алкилалкоксигруппа и R2 - это С16, С18.
14
<img file="00000076.tif" he="30" wi="26" img-content="undefined" img-format="tif" /> где R4 - это алкилсульфонилалкиловый эфир и R5 - это С16.
7, 10, 11
<img file="00000077.tif" he="16" wi="34" img-content="undefined" img-format="tif" /> где R1 - это С16, С18.
8, 20
Алкокси-алкокси цепи
Е)
Производные алкилфосфолипидов 1-20 синтезированы в соответствии с приведенной ниже общей процедурой 4, где "тозилат" означает азотсодержащую головную группу и "спирт" означает липофильную хвостовую группу.
Общая процедура 4:
3
2
2
3
2
2
2
2
3
В реакционный сосуд помещают 0,1 моль РОСl в 50 мл хлороформа и охлаждают на ледяной бане. Раствор 0,9 моль спирта и 32 мл пиридина в 100 мл CHCl добавляют по каплям к раствору POCl, поддерживая температуру реакционной смеси между 5-12°С. После перемешивания в течение 30 минут при комнатной температуре добавляют 0,12 моль тозилата, охлаждают до 10°С и добавляют по каплям к этому раствору 40 мл пиридина. Смесь перемешивают в течение 2,5 часов при комнатной температуре. Добавляют 15 мл воды (Т<20°С) и продолжают перемешивать еще 30 мин. Смесь промывают 200 мл HO:МеОН (1:1 объем/объем), 200 мл 3% HCl: МеОН (1:1 объем/объем) и 200 мл HO:МеОН (1:1 объем/объем). Органический слой концентрируют в вакууме (добавляют изопропанол, чтобы уменьшить вспенивание). Сырой продукт перекристаллизовывают из 200 мл метил этил кетона. Полученный твердый осадок нагревают в 150 мл EtOH, фильтруют, охлаждают в течение 4 часов до 5-7°С и снова фильтруют. К фильтрату добавляют 85 г амберлита МВ3 и перемешивают в течение 3 часов при комнатной температуре. После фильтрации прозрачный раствор концентрируют в вакууме и кристаллизуют из 150 мл метил этил кетона. Если необходимо, продукт очищают колоночной хроматографией (CHCl/МеОН/NH (25%) 80:25:5). Выходы варьруются от 25 до 50%.
Содержание всех процитированных ссылок и патентов включено сюда во всей их полноте.
Более подробно изобретение разъясняется на приведенных ниже примерах, которые, однако, их не ограничивают.
Примеры
I) Синтез/физико-химическая характеризация некоторых производных алкилфосфолипидов
Пример 1: Соединение 1
1-Бензил-1-метил-пиперидин-4-иловый эфир гексадециловый эфир фосфорной кислоты
3,1 г (6%) соединения 1 получили, исходя из гексадекан-1-ола и 1-бензил-пиперидин-4-ола, следуя общей процедуре 4 после метилирования 1-бензил-пиперидин-4-ола в соответствии с общей процедурой 2.
1
3
H-NMR (600 MHz, CDCl-d1, 300 К): δ=7.59 (2Н, d), 7.47-7.40 (3H, m), 4.78 (2Н, broad-s), 4.55 (1 H, broad-s), 3.86-3.77 (4H, m), 3.56 (2Н, d), 3.13 (3H, s), 2.27 (2Н, d), 2.13 (2Н, t), 1.57 (2Н, квинтет), 1.31-1.18 (26Н, m), 0.88 (3H, t) ppm
ESI-MS: получено: m/z 510.4 [М+Н], рассчитано: 510.7 г/моль
Пример 2: Соединение 2
2-(1-метил-пиперидин-1-ил)-этиловый эфир гексадециловый эфир фосфорной кислоты
5.8 г (13%) соединения 2 получили, исходя из гексадекан-1-ола и 2-пиперидин-1-ил-этанола, следуя общей процедуре 4 после метилирования 2-пиперидин-1-ил-этанола в соответствии с общей процедурой 2.
1
3
H-NMR (600 MHz, CDCl-d1, 300 К): δ=4.33 (2Н, широкий-s), 3.89-3.81 (4Н, m), 3.70 (2Н, m), 3.57-3.53 (2Н, m), 3.37 (3H, s), 1.93-1.86 (4H, m), 1.74-1.68 (2Н, m), 1.59 (2Н, квинтет), 1.35-1.19 (26Н, m), 0.88 (3H, s) ppm
ESI-MS: получено: m/z 448.3 [М+Н], рассчитано: 448.6 г/моль
Пример 3: Соединение 3
2-(1-аза-бицикло[2.2.2]окт-1-ил)-этиловый эфир гексадециловый эфир фосфорной кислоты
2,0 г (5%) соединения 3 получили, исходя из гексадекан-1-ола и 1-(2-гидрокси-этил)-хинуклидина, следуя общей процедуре 4 после алкилирования хинуклидина в соответствии с общей процедурой 1.
1
3
H-NMR (600 MHz, CDCl-d1, 300 К): δ=4.29 (2Н, широкий-s), 3.84 (2Н, q), 3.73 (8H, m), 2.17 (1H, m), 1.60 (2Н, квинтет), 1.34-1.22 (26Н, m), 0.88 (3H, t) ppm
ESI-MS: получено: m/z 460.5 [М+Н], рассчитано: 460.7 г/моль
Пример 4: Соединение 4
1-метил-1-фенэтил-пиперидин-4-иловый эфир гексадециловый эфир фосфорной кислоты
6,3 г (12%) соединения 4 получили исходя из гексадекан-1-ола и 1-фенэтил-пиперидин-4-ола, следуя общей процедуре 4 после метилирования 1-фенэтил-пиперидин-4-ола в соответствии с общей процедурой 2.
1
3
H-NMR (600 MHz, CDCl-d1, 300 К): δ=7.34-7.22 (5Н, m), 4.49 (1H, широкий-s), 3.80 (2H, q), 3.77-3.58 (6H, m), 3.29 (3H, s), 3.10 (2H, dd), 2.24 (2H, m), 2.10 (2H, m), 1.59 (2H, квинтет), 1.31-1.19 (26Н, m), 0.88 (3H, t) ppm
ESI-MS: получено: m/z 524.4 [М+Н], рассчитано: 524.8 г/моль
Пример 5: Соединение 5
1,1-диэтил-пиперидин-4-иловый эфир октадециловый эфир фосфорной кислоты
6,9 г (14%) соединения 5 получили исходя из октадекан-1-ола и 1-этил-пиперидин-4-ола, следуя общей процедуре 4 после алкилирования 1-этил-пиперидин-4-ола в соответствии с общей процедурой 3.
1
3
H-NMR (600 MHz, CDCl-d1, 300 К): δ=4.50 (1H, широкий-s), 3.81 (2H, q), 3.71 (2H, m), 3.62 (2H, m), 3.51 (2H, q), 3.46 (2H, q), 2.25-2.09 (4Н, m), 1.58 (2H, квинтет), 1.38- 1.21 (36Н, m), 0.88 (3H, t) ppm
+
ESI-MS: получено: m/z 490.6 [М+Н]/раcсчитано: 490.8 г/моль
Пример 6: Соединение 8
3-гексадецилокси-пропиловый эфир 2-триметил-аммоний-этиловый эфир фосфорной кислоты
9,3 г (20%) соединения 8 получили, исходя из 3-гексадецилокси-пропан-1-ола и 2-диметиламино-этанола, следуя общей процедуре 4 после метилирования 2-диметиламино-этанола в соответствии с общей процедурой 2.
1
3
H-NMR (600 MHz, CDCl-d1, 300 К): δ=4.32 (2Н, широкий-s), 3.93 (2Н, q), 3.83 (2Н, bs), 3.50 (2Н, t), 3.42 (9H, s), 3.39 (2Н, t), 1.89 (2Н, квинтет), 1.54 (2Н, квинтет), 1.34- 1.22 (26Н, m), 0.88 (3H, t) ppm
ESI-MS: получено: m/z 466.5 [М+Н], рассчитано: 466.7 г/моль
Пример 7: Соединение 22
Октадециловый эфир 2-(N,N,N-триметил-арсен)-этиловый эфир фосфорной кислоты
1
3
H-NMR (600 MHz, CDCl-d1, 300 К): δ=4.28 (2Н, q), 3.85 (2Н, q), 2.94 (2Н, t), 2.14 (9H, s), 1.62 (2Н, квинтет), 1.37-1.21 (3OH, m), 0.90 (3H, s) ppm
ESI-MS: получено: m/z 497.3 [М+Н], рассчитано: 496.5 г/моль
Пример 8: Соединение 89
Гексадециловый эфир 2-(1-метил-азепан-1-ил)-этиловый эфир фосфорной кислоты
1
3
H-NMR (600 MHz, CDCl-d1, 300 К): δ=4.66 (2Н, m), 4.06 (2Н, q), 4.02 (2Н, широкий-s), 3.80 (2Н, dd), 3.59 (2Н, dd), 3.36 (3H, s), 2.02-1.90 (4H, m), 1.74 (4H, m), 1.67 (2Н, квинтет), 1.37-1.22 (26Н, m), 0.88 (3H, s) ppm
ESI-MS: получено: m/z 462.5 [М+Н], рассчитано: 461.6 г/моль
Пример 9: Соединение 107
Гексадециловый эфир 2-(N-фенил-N,N-диметиламино)-этиловый эфир фосфорной кислоты
1
3
H-NMR (600 MHz, CDCl-d1, 300 К): δ=7.99 (2Н, d), 7.65 (2H, t), 7.55 (1H, t), 4.90 (2H, широкий-s), 4.24 (2H, широкий-s), 4.02-4.00 (6H, m), 3.93 (2H, q), 1.57 (2H, квинтет), 1.32-1.22 (26Н, m), 0.88 (3Н, s) ppm
ESI-MS: получено: m/z 470.5 [М+Н], рассчитано: 469.64 г/моль
Физико-химические данные для приведенных в примерах производных алкилфосфолипидов представлены в таблице 5:
Таблица 5
Производные алкилфосфолипидов, схемы их синтеза и масс-спектрометрические данные
No.
Синтетические схемы
[М+Н] (рассчитанный)
ESI-MS измеренный {M+H}<sup>+</sup>
6
2,4
552,8
542,4
7
2,4
548,8
546,5
9
2,4
476,7
476,5
10
2,4
576,8
576,4
11
2,4
522,7
522,5
12
2,4
522,7
522,7
13
2,4
536,7
536,5
14
2,4
558,8
558,4
15
2,4
550,8
550,5
16
2,4
462,7
462,4
17
2,4
516,8
516,5
18
3,4
422,6
422,3
19
4
460,7
460,5
20
2,4
452,6
452,4
22
496,4
497,4
27
538,6
538,8
30
408,6
408,4
33
436,6
436,4
35
448,6
446,6
40
464,7
464,3
41
554,9
554,6
42
406,6
406,2
43
434,6
434,4
47
492,8
492,5
49
462,9
462,3
51
450,7
450,4
55
432,6
432,3
56
450,7
450,4
57
394,5
394,5
60
436,6
436,3
66
450,6
450,4
67
445,6
445,3
68
594,4
594,2
70
436,6
436,4
75
434,6
434,5
76
446,6
446,3
80
490,7
490,5
81
466,7
466,5
93
490,7
95
459,6
459,5
98
462,7
462,3
99
492,7
492,3
103
474,7
474,5
106
490,7
490,6
107
470,6
470,4
108
464,7
464,3
109
488,7
488,4
112
448,6
448,3
113
476,5
476,5
115
604,7
504,4
116
462,7
462,4
117
460,7
460,4
124
476,7
476,4
133
546,8
546,4
134
532,8
532,5
136
450,7
450,4
138
448,7
448,3
139
504,8
504,5
146
476,7
476,5
154
491,7
491,5
155
478,3
478,3
169
460,7
460,5
171
494,7
494,3
176
488,7
488,5
179
564,8
564,3
192
536,7
536,5
195
538,8
538,5
197
538,8
538,5
204
550,1
550,5
211
564,8
564,6
213
550,8
550,4
215
504,7
504,5
233
614,9
614,4
236
849,1
849,4
243
594,9
594,4
257
875,1
875,5
275
532,8
532,5
296
488,7
488,4
298
576,8
576,3
305
496,7
496,4
309
578,8
578,5
314
436,8
436,5
II) Определение цитотоксичности на линиях клеток млекопитающих
Цитотоксичность выбранных соединений по изобретению против различных линий клеток млекопитающих была определена следующим образом.
В автоматизированном ХТТ скрининге для определения цитотоксичности были использованы человеческие опухолевые линии клеток KB/HeLa (ATCC CCL17, карцинома шейки матки человека), РС3 (ATCC CRL1435, карцинома простаты человека) и RKOp21 (аденокарцинома толстой кишки человека; Schmidt et al., Oncogene 2000, 19: 2423-2429).
В автоматизированном ХТТ скрининге для определения цитотоксичности могут быть протестированы также и другие клеточные линии FDCP-1 (DSMZ АСС 368, костный мозг мыши), Н9с2 (2-1) (ЕСАСС 88092904, сердце крысы), L8 (ЕСАСС 95102434, скелетная мышца крысы), С2С12 (ЕСАСС 91031 101, скелетная мышца мыши), СНО (ЕСАСС 85050302, яичники китайского хомячка), NRK-52E (ЕСАСС 87012902, почка крысы), NRK-49F (ЕСАСС 86101301, почка крысы), MDCK (ЕСАСС 84121903/АТСС CCL-34, почка собаки породы кокер спаниэль), HepG2 (ATCC НВ-8065, человеческая гепатоцеллюлярная карцинома), NIH3T3 (ATCC CRL-1658, фибробласты мыши), НаСаТ (Deutsches Krebsforschungszentrum (DKFZ), человеческие кератиноциты), а также первичные культуры клеток, например первичная культура гепатоцитов крысы.
ХТТ анализ позволяет количественно определить метаболическую активность, которая коррелирует с жизнеспособностью клеток и их числом. Исследуемые соединения (выбранные соединения настоящего изобретения и известные вещества в качестве контроля) растворили в культуральной среде до концентрации 600 мкМ и затем добавили к опухолевым клеткам в 10 различных концентрациях полулогарифмической шкалы, исходя из 100 мкМ в качестве самой высокой концентрации.
2
Во второй серии экспериментов на клетках РС3, RKOp21 и SKOV-3 (ATCC НТВ-77, человеческая аденокарцинома яичника) исследуемые и контрольные соединения сначала растворили в смеси 70% этанол/30% НО, с концентрацией маточного раствора 10 мМ, и затем разбавили культуральной средой, чтобы получить конечную концентрацию 31,6 мкМ (РС3 и RKOp21) или 100 мкМ (SKOV-3).
Через 48 часов измеряли метаболическую активность клеток, обработанных исследуемыми соединениями. Ее определяли по поглощению при 490 нм (рабочая длина волны для красителя ХТТ). В качестве контроля использовались необработанные клетки (100% жизнеспособность).
2
Клетки КВ/HeLa и РС3 культивировали в среде RPMI 1640 (Gibco, Cat. No. 42401-018) с добавлением 10% инактивированной фетальной сыворотки теленка (FCS, Biochrom AG, Cat. No. S0115), 2 мМ L-глутамина (Gibco, Cat. No. 25030-24) и 2% пенициллина-стрептомицина (PenStrep, Gibco, Cat. No. 15140-122). Клетки RKOp21 выращивали в среде DMEM + GlutaMAXTM-I (Gibco, Cat. No. 61965-026) с добавлением 10% инактивированной фетальной сыворотки теленка (FCS, Biochrom AG, Cat. No. S0115), 2 мМ L-глутамина (Gibco, Cat. No. 25030-24), 2% пенициллина-стрептомицина (PenStrep, Gibco, Cat. No. 15140-122) и 1% 1 M HEPES (Gibco, Cat. No. 15630-056). Все клетки культивировали при 37°С в атмосфере 5% СО и в увлажненном воздухе.
В первый день эксперимента клетки были пересажены путем трипсинизации в 96-луночные плоскодонные планшеты для микротитрования. Количество пересаженных клеток на 1 лунку зависело от типа клеточной линии и приведено в таблице:
Клеточная линия
Количество/Лунка
Объем/Лунка
KB/HeLa
2500
125 мкл
РС3
6000
125 мкл
RKOp21
6000
125 мкл
SKOV3
3750
125 мкл
2
Через 24 часа, которые были необходимы, чтобы клетки восстановились (после обработки трипсином) и вошли в фазу роста, исследуемые соединения, растворенные непосредственно перед использованием, добавляли в каждую лунку в объеме 25 мкл. Клетки инкубировали с препаратом в течение 2 дней. Затем добавили в каждую лунку 50 мкл свежеприготовленного раствора XTT-PMS {2% 0.386 мг/мл PMS (N-Метил дибензопиразинметилсульфат; Sigma, Cat. No. P9625) в PBS+98% 1 мг/мл ХТТ (натриевая соль2,3-бис(2-метокси-4-нитро-5-сульфофенил)-5-[(фениламино)кабонил]-2Н-тетразолия; Serva, Cat. No. 38450) в среде RPMI 1640 без фенолового красного. Чтобы измерить относительное количество живых клеток, клетки инкубировали в течение 3 часов с реагентом XTT-PMS при 37°С, 5% CO и во влажной атмосфере, чтобы образовалась соль формазана. Растворимая соль формазана образуется за счет восстановления клетками ХТТ. Количество этой соли определяется по поглощению при 490 нм на сканирующем спектрофотометре Biomek(r) 2000 ELISA (планшетный ридер).
50
% ингибирования (цитотоксичность) каждого исследуемого соединения было рассчитано по отношению к необработанным контрольным клеткам. Затем были построены кривые ингибирования и с использованием GraphPad Prism рассчитан IC.
50
В таблице 6 приведены результаты определения цитотоксичности (значения IC), полученные для выбранных соединений по изобретению. Они представлены в сравнении с примерами из уровня техники (перифозин, милтефозин).
Таблица 6
Результаты определения цитотоксичности для линий клеток млекопитающих RKOp21, KB/HELA и РС3 (величины IC<sub>50</sub> выбранных типичных соединений)
Соединение
RKOp21 [IC<sub>50</sub> (мкМ)]
РС3 [IC<sub>50</sub> (мкМ)]
KB/HELA [IC<sub>50</sub> (мкМ)]
17
32,47
18,28
16,59
19
>100
>100
>100
50
>100
>100
>100
25
>100
12,78
23,91
41
>100
>100
>100
46
>100
>100
>100
48
>100
>100
>100
50
>100
>100
>100
55
>100
>100
>100
59
>100
>100
>100
60
>100
>100
>100
63
>100
>100
>100
67
>100
>100
>100
72
>100
>100
>100
76
68,80
24,99
11,27
82
20,53
45,61
37,73
85
>100
32,90
43,66
86
>100
>100
75,64
91
>100
86,79
>100
97
89,37
49,44
>100
114
>100
>100
>100
116
39,97
50,25
37,72
123
76,62
21,83
39,08
128
>100
26,13
13,78
133
>100
81,58
>100
144
51,14
>100
>100
145
>100
>100
>100
147
>100
>100
>100
152
>100
23,90
32,32
153
>100
39,82
38,25
154
77,43
18,25
12,62
159
21,01
37,70
>100
172
65,52
29,82
>100
173
>100
64,47
>100
176
67,04
13,41
16,87
180
>100
>100
>100
185
>100
30,36
>100
190
>100
73,27
100,00
200
>100
34,52
66,38
203
>100
63,12
>100
235
>100
>100
>100
237
46,84
>100
>100
240
>100
>100
>100
256
>100
82,00
>100
257
25,06
29,68
19,22
258
>100
>100
>100
262
>100
31,25
10,10
263
>100
>100
>100
275
44,44
69,15
>100
281
95,20
16,57
20,64
282
>100
>100
>100
301
34,43
24,38
20,41
302
>100
>100
>100
306
53,45
18,65
34,31
311
>100
>100
>100
милтефозин
18,04
9,39
8,66
перифозин
3,31
3,22
2,37
Результаты, представленные в таблице 6, четко демонстрируют заметно более низкий уровень цитотоксичности выбранных соединений по изобретению по сравнению с соединениями из уровня техники перифозином и милтефозином.
В таблице 7 приведены результаты определения цитотоксичности (% ингибирования роста клеток), полученные во второй серии экспериментов для выбранных соединений по изобретению. Они представлены в сравнении с уровнем техники (перифозин, милтефозин). Представлены значения, полученные для индивидуальных клеточных линий, а также среднее значение, рассчитанное для трех протестированных клеточных линий.
Таблица 7
Результаты определения цитотоксичности для линий клеток млекопитающих РС3, RKOp21 и SKOV-3 (% ингибирования роста клеток, %INH)
Соединение
РС3 %INH [31,6 мкМ]
RKOp21 %INH [31,6 мкМ]
SKOV-3 %INH [100 мкМ]
Mean %INH
2
50,1
38,8
19,5
36,1
19
16,2
53,4
26,9
32,2
20
13,4
-12,4
-6,1
-1,7
89
50,6
11,3
26,1
29,3
90
55,5
51,9
54,6
54,0
144
14,0
48,0
-3,0
19,7
260
45,2
40,5
56,1
47,3
266
25,8
6,6
8,5
13,6
307
48,4
18,3
53,3
40,0
314
51,6
10,6
33,2
31,8
милтефозин
67,4
64,0
74,7
68,7
перифозин
80,2
63,0
90,7
78,0
Результаты, представленные в таблице 7, четко демонстрируют заметно более низкий уровень цитотоксичности выбранных соединений по изобретения для всех трех протестированных клеточных линий по сравнению с соединениями-прототипами перифозином и милтефозином.
III) Определение эмбриотоксичности для линий клеток млекопитающих
Эмбриотоксичность может быть вызвана нарушениями процесса дифференциации при развитии эмбриона за счет действия химических соединений. In vitro тест на эмбриональных стволовых клетках (EST) дает потенциальную возможность оценить in vitro способность химических соединений нарушать и влиять на процесс дифференциации.
Так как первым органом, формирующимся в процессе эмбрионального развития, является сердце, для исследования на эмбриотоксичность были взяты политентные эмбриональные стволовые клетки мыши (D3), которые дифференцировались в кардиомиоциты. Процесс in vitro дифференциации в сократительные клетки сердца хорошо охарактеризован и стандартизирован. В присутствии mLIF (фактор ингибирований лейкемии мыши) D3 клетки могут быть зафиксированы в недифференцированном состоянии как непрерываемая клеточная линия. В отсутствие mLIF клетки будут образовывать эмбриональные тела, которые затем спонтанно дифференцируются в функциональные кардиомиоциты, после чего под обычным микроскопом можно заметить биение.
Определение эмбриотоксичности выбранных соединений по изобретению проводилось с помощью упомянутого выше исследования на эмбриональных стволовых клетках (EST). Для оценки эмбриотоксичности исследуемых соединений были взяты две непрерывающихся линии клеток мыши: 3Т3 фибробласты (АТСС CCL-92; ATCC CRL-1658, ATCC CCL-163) и линия эмбриональных стволовых клеток D3 (ATCC CRL-1934).
50
50
50
Ингибирование дифференциации и роста определялось на эмбриональных стволовых клетках и сравнивалось с ингибированием роста 3Т3 фибробластов, которые использовались как образец здоровых клеток. Для определения эмбриотоксичности в тесте EST использовались три критерия: ингибирование роста эмбриональных стволовых клеток и 3Т3 фибробластов на 50% от контроля (IC D3, IC 3Т3) с помощью анализа МТТ (набор для определения жизнеспособности клеток МТТ (МТТ cell viability assay kit, Cat. No. 30006, Biotium Inc., www.biotium.com)) и ингибирование дифференциации эмбриональных стволовых клеток в самопроизвольно сокращающиеся кардиомиоциты на 50% (ID).
Эмбриотоксичность выбранных соединений по изобретению определялась методом ранжирования относительно прототипа APL.
IV) Определение антибактериальной активности
Для определения восприимчивости бактериальных штаммов к ингибированию роста клетки выбранные соединения по изобретению были протестированы методом микроразведений питательной среды согласно рекомендациям DIN 58940 (www.din.de). Метод определяет количество растущих бактериальных клеток, которое соответствует мутности жидкой культуральной среды при фотометрическом измерении, проводимом при 595 нм.
Определение MIC выполняли согласно DIN 58940-5. Объемы были адаптированы в соответствии с методом микроразведений, как описано в руководстве DIN 58940-7.
В зависимости от растворимости в воде соединения по изобретению растворяли в воде или в этаноле в концентрации 10 мг/мл. После этого маточный раствор разбавили в воде в концентрации 512 мкг/мл. Были выполнены последовательные разведения (фактор 2) в воде с получением 10 концентраций для тестирования: 256 мкг/мл, 128 мкг/мл, 64 мкг/мл, 32 мкг/мл, 16 мкг/мл, 8 мкг/мл, 4 мкг/мл, 2 мкг/мл, 1 мкг/мл, 0.5 мкг/мл, 0.25 мкг/мл и 0.125 мкг/мл. Соединения по изобретению после разбавления переносили в объеме 100 мкл в лунки планшета для микротитрования.
Бактериальные штаммы выращивали в различных средах в зависимости от типа штамма и требующихся условий (см. таблицу 8).
6
5
8
Пре-культуру бактерий выращивали в соответствующей жидкой среде (см. интернет-сайт ATCC, www.atcc.org), после чего пересевали в соответствующую жидкую среду. 100 мкл инокулятов, в которых количество микроорганизмов равнялось примерно 1×10 на мл (в пределах 10-10микроорганизмов на мл)], добавляли к каждой из исследуемых концентраций выбранного соединения и культивировали в соответствующих условиях.
Перед и после инкубации бактериальный рост определяли фотометрическим методом, используя в качестве положительного контроля растущие бактерии без добавленного соединения, и в качестве стерильного/отрицательного контроля - среду без бактерий. Минимальная ингибирующая концентрация препарата (MIC) определялась как самая низкая концентрация препарата в серии разведений, при которой не наблюдалось увеличения оптической плотности.
Таблица 9 [от (а) до (е)] показывает результаты измерения антибактериальной активности (значения MIC в мкг/мл), полученные на различных бактериальных штаммах для выбранных соединений по изобретению (соединения 2, 3, 67, 89, 90, 107, 260, 266, 301) по сравнению с взятыми из уровня техники данными для милтефозина (гексадецил-фосфохолина).
Результаты, представленные в таблице 9, показывают значительную антибактериальную активность выбранных соединений по изобретению против различных грамположительных и грамотрицательных бактерий по сравнению с соединением-прототипом милтефозином (гексадецил-фосфохолином).
V) Определение противогрибковой активности
Противогрибковая активность выбранных соединений по изобретению определялась с помощью теста на противогрибковую восприимчивость следующим образом.
Противогрибковая активность выбранных соединений по изобретению против различных грибов измерялась стандартным методом микроразведений питательной среды в соответствии со требованиями Национального комитета США по клиническим лабораторным стандартам (US National Committee for Clinical Laboratory standards (NCCLS)) для дрожжей (NCCLS document M27-A, 1997) и мицелиальных грибов (NCCLS document M38-A, 2002).
Соединения по изобретению исследовались in vitro на противогрибковую активность против различных грибковых штаммов, перечисленных в таблице 10.
Таблица 10
Тестируемый штамм
Морфология
Происхождение
Среда ATCC
ATCC Teмп.
А
AAspergillus fumigatus ATCC 204305
мицелиальный
ATCC
Агар на солодовом экстракте, Солодовый экстракт 20 г, Глюкоза 20 г, Пептон 1 г, Довести водой до 1 л
25°С
В
Aspergillus fumigatus 322-384
мицелиальный
выделен
С
Aspergillus fumigatus 040-200167
мицелиальный
выделен
D
Candida albicans ATCC 10231
дрожжи
ATCC
Питательная среда для дрожжей
25°С
Е
Candida albicans ATCC 90028
дрожжи
ATCC
Питательная среда для дрожжей
35°С
F
Candida albicans TS3 (Shrikantha et al., Journal of Bacteriology 2000, 182 (6): 1580-1591)
дрожжи
Ауксотрофный штамм urа 3.
Клетки выращивали в агаре, содержащем модифицированную среду Ли (modified Lee's medium), содержащую 0,01 М уридин
G
Candida parapsilosis ATCC 22019
дрожжи
ATCC
Питательная среда для дрожжей
35°С
Н
Cryptococcus neoformans ATCC 90112
дрожжи
ATCC
Питательная среда для дрожжей
24°С
I
Cryptococcus neoformans H99 (Ganendren et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2004, 48 (5): 1561-1569)
дрожжи
Выделен из человеческой спинномозговой жидкости
Среда RPMI
J
Cryptococcus gattü ATCC 32608
дрожжи
ATCC
Среда на солодовом экстракте Солодовый экстракт 30 г Бактоагар (Agar Bacto 15 г довести водой до 1 л; рН 5.5)
26°С
Условия культивирования штаммов ATCC взяты с интернет-сайта www.atcc.org.
Маточные растворы соединений по изобретению были приготовлены в день измерения. Концентрация - 1,28 мг/10 мл среды. Затем были выполнены серийные разведения, чтобы получить для тестирования следующие концентрации: 64 мкг/мл, 32 мкг/мл, 16 мкг/мл, 8 мкг/мл, 4 мкг/мл, 2 мкг/мл, 1 мкг/мл, 0,5 мкг/мл, 0,25 мкг/мл и 0,125 мкг/мл.
Инокулят с содержанием грибкового штамма 106 CFU/мл был получен в соответствующей среде и перенесен в тестовые пробирки для инкубации.
Метод был использован для определения минимальной ингибирующей концентрации препарата (MIC) для грибковых штаммов. MIC определялась фотометрическим методом при длине волны 595 нм после 48 часов культивирования при 35°С при той концентрации, которая показывала более чем 80% видимое ингибирование роста дрожжей. Для мицелиальных грибов MIC определяли после 48-72 часов культивирования при 35°С при той концентрации, которая показывала более чем 50% видимое ингибирование роста.
Таблица 11 показывает результаты определения противогрибковой активности (значения MIC в мкг/мл) выбранных соединений по изобретению (соединения 1, 2, 3, 5, 8, 22) по сравнению с взятым в качестве примера прототипом эрацилфосфохолином (ErPC).
Таблица 11
Чувствительность различных грибковых штаммов (MIC в мкг/мл) к выбранным производным алкилфосфолипидов
Гриб
1
2
3
5
8
22
ErPC
А
2
2
3
6
2
3
>64
В
2
2
2
8
2
2
>64
С
4
6
4
24
2
3
>64
D
2
1
1
2
0,75
0,5
>64
Е
1
1
1
2
0,75
1
>64
F
1,5
1,5
2
2
1
1
64
G
3
2
2
3
0,75
1
64
Н
1,5
1,5
1,5
1,5
2
1,5
4
I
2
1
1
2
1,5
6,6
5
J
<sup>1</sup>
0,75
0,75
0,75
0,75
0,5
1,5
Результат, представленный в таблице 11, показывает высокую противогрибковую активность выбранных соединений изобретения по сравнению с прототипом эрацилфосфохолином (ErPC).
VI) Измерение in vitro активности препаратов против различных простейших
In vitro активность выбранных соединений изобретения против различных простейших была определена следующим образом.
5
50
Макрофаги из брюшной полости мыши (CD1) собирали через 24 часа после индукции крахмалом и пересаживали в 96-луночные планшеты, создавая концентрацию 4×10 мл. Через 24 клетки инфицировали лейшманиозом Trypanosoma cruzi Tulahuan LAC-Z (рост и культивирование по Buckner et al., Infection и Immunity 1999, 67(1): 403-409). Еще через 24 часа инфицированные клетки инкубировали с тестируемыми соединениями (соединения изобретения и хорошо известные прототипы). Инкубацию проводили в течение 3 дней. В каждую лунку добавляли по 50 мкл 500 мкМ CPRG-1% Nonidet P-40. Через 2-5 часов платы сканировали при 570 нм (Buckner et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy 1996, 40 (11): 2592-2597). Значение ED рассчитано с помощью Msxifit (IDBS).
2
2
50
5
Трипомастиготы trypanosoma brucei rhodesiense STIB900 из кровотока культивировали в среде HMI-18 (Hirumi H, Hirumi К, J Parasitol. 1989, 75 (6): 985-989), содержащей 15% термоинактивированную фетальную сыворотку теленка при 37°С, 5% CO, во влажной атмосфере. Трипомастиготы отмывали и суспендировали в свежеприготовленной среде, создавая концентрацию 2×10 на мл. Затем к ним добавляли тестируемые соединения и инкубировали платы в течение 72 часов при 37°С, 5% CO, во влажной атмосфере. Через 72 часа планшеты исследовали на микроскопе, после чего добавили Alamar Blue (Raz et al., Acta Trop. 1997, 68: 139-147). Через 5-6 часов платы проскринировали при длинах волн ЕХ/ЕМ 530/585 нм с отсекающим фильтром 550 нм. Величину ED рассчитывали с помощью Msxlfit (IDBS).
3
50
Линию малярийных плазмодий К1 и линию паразитов 3D7 культивировали согласно Trager W и Jensen JB (Science 1976, 193: 673-675). Измерение чувствительности препаратов in vitro для тестируемых соединений проводили согласно методике Korsinczky M et al. (Antimicrobial agents и chemotherapy 2000, 44 (8): 2100-2108) и Fivelman QL et al. (Antimicrobial agents и chemotherapy 2004, 48 (11): 4097-4102) радиоизотопного метода с использованием меченого [Н]-гипоксантина. Величину ED расчитывали с помощью Msxlfit (IDBS).
Исследования проводили на простейших, перечисленных ниже:
A) Trypanosoma cruzi (Tulahuan-LACZ amstigotes in РЕМ, Lorente SO et al., Antimicrobial agents и chemotherapy 2004, 48 (8): 2937-2950; Buckner et al., Infection и Immunity 1999, 67 (1): 403-409; Buckner et al., Antimicrobial Agents и Chemotherapy 1996, 40 (11): 2592-2597);
B) Trypanosoma brucei rhodesiense (линия STIB900, Lorente SO et al., Antimicrobial agents и chemotherapy 2004, 48 (8): 2937-2950; Habtemariam S, BMC Pharmacology 2003, 3:6);
C) Plasmodium falciparum (линия К1, Korsinczky M et al., Antimicrobial agents и chemotherapy 2000, 44 (8): 2100-2108; Thaitong S и Beale GH, Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 1981, 75: 271-273; TragerW и Jensen JB, Science 1976, 193: 673-675);
D) Plasmodium falciparum (strain 3D7, Mu et al., PLoS Biology 2005, 3 (10): e335).
50
Таблица 12 содержит результаты определения in vitro активности препаратов против различных простейших (ED в мкг/мл) для выбранных соединений изобретения (соединения 1, 2, 3, 4, 5).
Таблица 12
Активность препаратов против различных простейших (значения ED<sub>50</sub> для ряда выбранных типичных соединений)
Соединение
Простейшее
ED<sub>50</sub> (мг/мл)
1
А
1,71
1
В
18,80
1
С
6,93
1
D
9,97
2
А
0,50
2
В
17,50
2
С
19,36
2
D
2,21
3
A
0,33
3
В
25,03
3
С
8,03
3
С
2,25
4
А
1,93
4
В
12,29
4
С
5,44
4
D
15,32
5
А
1,43
5
В
14,20
5
С
21,26
5
D
16,31
бензиндазол
А
0,22
милтефозин
А
0,63
VII) Активность in vitro милтефозина и бензимидазола против Trypanosoma cruzi
Активность in vitro комбинации милтефозина и бензимидазола против Trypanosoma cruzi линии Y сравнивали с активностью этих же препаратов, применяемых по отдельности.
Комбинацию милтефозина и бензимидазола исследовали in vitro против эпимастиготной формы Trypanosoma cruzi линии Y, которая была выделена у пациентов, больных трипаносомозом в Сан-Пауло, Бразилия (Sao Paulo, Brazil), и была получена от доктора Виктора Нассенцвейга (Dr. Victor Nussenzweig (Silva, LH. и Nussenzweig, V.; Folia clin. biol., 20: 191-207, 1953)). Эта линия Т. cruzi Y может быть также заказана в АТСС 50832, при этом линия АТСС должна быть реадаптирована несколькими пассажами на мышах, чтобы восстановить изначальные характеристики линии, такие как дифференцируемость и вирулентность.
Эпимастиготы культивировали в стерильных условиях в среде для инфузии сердца и мозга (BHI, Becton, Dickinson, Cat. No. 221812), содержащей 10 мг/л гемина и 5% термоинактивированную фетальную сыворотку теленка (FCS) при 28°С со встряхиванием (приблизительно, 80 rpm). Использовали эпимастиготы до 10-12 пассажа.
Культуру добавляли для получения метациклической формы, которую очищали на колонке DE-52 (Whatman DEAE целлюлоза, ионообменная колонка, Waco, Cat. No. 17050-03 или 17050-04) и делали инъекцию мышам. Через 2-4 недели паразитов выделяли из крови и снова помещали в стерильные условия культивирования.
Маточные растворы милтефозина и бензимидазола растворяли в метаноле в концентрациях 10 мг/мл и 20 мг/мл. Затем эти растворы последовательно разводили с фактором 2 в среде BHI-FCS до тестовых концентраций. Для бензимидазола использовались следующие исследуемые концентрации: 80 мкг/мл, 40 мкг/мл, 20 мкг/мл, 10 мкг/мл, 5 мкг/мл и 2,5 мкг/мл. Для милтефозина использовались следующие исследуемые концентрации: 20 мкг/мл, 10 мкг/мл, 5 мкг/мл, 2,5 мкг/мл, 1,25 мкг/мл и 0,625 мкг/мл.
6
Эпимастиготы в количестве 2×10 инкубировали в среде BHI-FCS с милтефозином и бензимидазолом в объеме 200 мкл. Через 72 часа инкубации при 28°С определяли рост паразитов, считая их в камере Небауэра. 50% ингибирующую концентрацию определяли методом линейной регрессии.
2
2
Для определения действия in vitro комбинации милтефозина и бензимидазола на колонии амастиготов/трипомастиготов эпимастиготы дифференцировали in vitro в метациклические трипомастиготы с использованием триатомина в искусственной среде с мочевиной. Культуру трипаносом Trypanosoma cruzi выращивали в среде для инфузии печени с триптозой (LIT, Castellani et al., J. Protozool. 1967, 14 (3): 447-451) при 27°С и при содержании эпимастигот в количестве, близком к 100% в конце экспоненциальной фазы, центрифугировали при 10000×g в течение 15 минут при 10°С и ресуспендировали в искусственной среде с триатомином и мочевиной (TAU) (190 мМ NaCl, 8 мМ фосфатный рН 6.0, 17 мМ KCl, 2 мМ CaCl, 2 мМ MgCl).
6
Клетки паразитов разбавили до конечной концентрации 3-5×10паразитов на мл средой TAU, содержащей 2,5% (объем/объем) бикарбоната натрия 1.4%, 500 U пенициллина на мл, 10 мМ L-пролина, и инкубировали при 27°С в плотно закрытом культуральном флаконе в течение 2 часов при комнатной температуре. Глубина жидкости во флаконах была не более 10 мм, флаконы инкубировали без встряхивания.
Клетки эксцудата, выделенные из брюшной полости мышей линии BALB/c, культивировали в полной среде RPMI 1640 (Difco), содержащей 2 мМ L-глутамина, 1 мМ пирувата натрия, 10 мкг/мл гентамицина, минимальную среду, содержащую заменимые аминокислоты, 10 мМ HEPES, 50 мкМ 2-меркаптоэтанола и 5% FCS.
5
6
Клетки в концентрации 3×10 клеток/мл были пересеяны в 24-луночные планшеты. Перитонеалтьные макрофаги хомяка инфицировали метациклическими трипомастиготами в количестве 1,5×10 из расчета 5 паразитов на макрофаг на 1 лунку. Через 24 часа неинтернализированных паразитов удалили, а инфицированные макрофаги культивировали в объеме 1 мл в полной среде RPMI, а также в среде, содержащей 10 нг/мл LPS и 40 U/мл IFN-гамма или в среде, содержащей исследуемые соединения.
Милтефозин и бензимидазол растворяли в полной среде RPMI. Использовались следующие концентрации бензимидазола: 40 мкг/мл, 20 мкг/мл, 10 мкг/мл, 5 мкг/мл, 2,5 мкг/мл и 1,25 мкг/мл. Милтефозин использовался в следующих концентрациях: 40 мкг/мл, 20 мкг/мл, 10 мкг/мл, 5 мкг/мл, 2,5 мкг/мл, 1,25 мкг/мл и 0,625 мкг/мл.
2
2
6
После инкубации при 37°С в 5% СО подсчитывали подвижные трипомастиготы в супернатанте через 5, 7 и 10 дней после инфицирования. Чтобы определить число внутриклеточных амастигот, макрофаги помещали на 13 мм покровное стекло в 24-луночной планшете и инфицировали метациклическими трипомастиготами в количестве 1,5×10. Через 3 дня культивации монослой инфицированных макрофагов отмывали фосфатным буфером (PBS) при 37°С, фиксировали в метаноле и окрашивали с помощью Giemsa. Количество амастигот определяли подсчетом, по крайней мере, 400 макрофагов в 2-х параллельных культурах. При этом определяли среднее число амастигот на инфицированный макрофаг.
Таблица 13 отражает результаты измерения активности in vitro бензимидазола, милтефозина и комбинации бензимидазол + милтефозин в различных концентрациях против эпимастигот Trypanosoma cruzi линии Y.
Таблица 13
Концентрация препарата [мкг/мл]
Эпимастиготы [кол-во/мл]
бензимидазол
5
455,833
милтефозин
1,25
820,000
бензимидазол + милтефозин
5+1,25
233,333
бензимидазол
10
358,333
милтефозин
2,5
290,000
бензимидазол + милтефозин
10+2,5
40,833
бензимидазол
40
190,000
милтефозин
1,25
820,000
бензимидазол + милтефозин
40+1,25
81,000
Результаты, представленные в таблице 13, четко демонстрируют значительный синергический эффект, получаемый при использовании комбинации бензимидазол + милтефозин в различных концентрациях препарата по сравнению с введением этих же препаратов по отдельности.