Способ получения высокоочищенного тетрадекапептида
METHOD FOR PRODUCING A HIGHLY PURIFIED TETRADECAPEPTIDE

Настоящее изобретение относится к области пептидной и фармацевтической химии, а именно к способу получения синтетического тетрадекапептида, представленного формулой (А)
и к его промежуточным продуктам.
Тетрадекапептид формулы «Н-Thr-Glu-Lys-Lys- Arg-Arg-Glu-Thr-Val-Glu-Arg-Glu-Lys-Glu-ОН» (тетрадекапептид формула (A), HEP-I, пептид эзрина), состоящий их 14 аминокислотных остатков, обладает иммуномодулирующим и противовирусным действием.
Лиофилизированный фармацевтический препарат Гепон, содержащий пептид HEP-I, вызывает продукцию альфа- и бета-интерферонов, мобилизует и активирует макрофаги, ограничивает выработку противовоспалительных цитокинов (интерлейкины 1, 6, 8 и фактор некроза опухоли (ФНО)), стимулирует продукцию антител к различным антигенам инфекционной природы, подавляет репликацию вирусов, применяется в качестве лекарственного средства иммуномодулирующего и противовирусного средства применяемого для лечения ВИЧ-инфекции, лечения и профилактики оппортунистических инфекций, вызванных бактериями, вирусами или грибами, повышения иммунной защиты от инфекций, лечении инфекций слизистых оболочек и кожи, вызванных грибами Candida, профилактики кандидоза слизистых оболочек и кожи, в результате терапии антибиотиками, уменьшения воспаления (покраснение, отек, зуд, жжение, боль) слизистых оболочек и кожи, а также сухости слизистых оболочек. У пациентов, инфицированных ВИЧ, снижает концентрацию ВИЧ в клетках крови и в плазме, одновременно активирует иммунные реакции, специфичные в отношении ВИЧ: увеличивает содержание CD4+T клеток и NK-клеток, повышает функциональную активность нейтрофилов и CDS+Тклеток, являющихся ключевыми звеньями защиты организма от бактерий, вирусов и грибов, усиливает выработку антител, специфичных к антигенам ВИЧ, а также к антигенам возбудителей оппортунистических инфекций, предупреждает рецидивы оппортунистических инфекций. («Гепон, лиофилизат для приготовления раствора для приема внутрь», «Гепон, раствор для приема внутрь, раствор для местного и наружного применения», Р N000015/01, ЛСР-001794/07-300614).
1
2
3
Из патента РФ 2694906 (Ниармедик Интернэшнл Лимитед (CY). Дата подачи 01.06.2016) известны пептиды, полученные из эзрина, в частности пептид, содержащий аминокислотную последовательность согласно общей формуле (I) XEKKRRETVERE ХХ, где каждый X представляет собой остаток неполярной аминокислоты. Применение пептидов в качестве иммуностимулирующих агентов, а более конкретно, для применения в лечении и предотвращении противовирусных, антибактериальных и противогрибковых инфекций, и лечении заболеваний желудочно-кишечного тракта. Синтез пептидов в данном изобретении, в том числе и НЕР1, авторы предлагают осуществлять или твердофазным, или жидкофазным способом
Известен способ получения тетрадекапептида формулы (A) (HEP-I) (патент RU 2127599, Ниармедик, Лтд. (CY), 02.06.1995), который заключается в том, что его синтез осуществляется методом твердофазного синтеза путем ступенчатого наращивания пептидной цепи, начиная с С-концевой глутаминовой кислоты, связанной с полимерной матрицей, с использованием соответствующих N-трет-бутилоксикарбониламинокислот в присутствии конденсирующего агента с последующей обработкой полученного защищенного пептида деблокирующими агентами.
Однако, несмотря на то, что при твердофазном синтезе синтезируется тетрадекапептид с защитными группами, и затем осуществляется удаление из смолы и удаление всех защитных групп, с последующей очисткой препаративной ВЭЖХ, очистка требует крупномасштабного оборудования для препаративной системы ВЭЖХ и занимает много времени, места и финансовых затрат. Также ограничивающим фактором для промышленного производства является низкий выход продукта, отсутствие возможности аналитического контроля на всех стадиях синтеза и низкая производительность процесса.
Наиболее близким к заявляемому способу является жидкофазный метод синтеза (патент RU 2175973 С1, Гепвитания Лимитед (GB), 10.08.2000). Согласно этому методу тетрадекапептид может быть синтезирован следующим образом: пентапептид формулы Z-Thr(X)-Glu(X)-Lys(Y)-Lys(Y)-Arg-OH подвергают конденсации с нонапептидом формулы Arg-Glu(X)-Thr(X)-Val-Glu(X)-Arg-Glu(X)-Lys(Y)-Glu(X)-OX с получением защищенного тетрадекапептида формулы Z-Thr(X)-Glu(X)-Lys(Y)-Lys(Y)-Arg-Arg-Glu(X)-Thr(X)-Val-Glu(X)-Arg-Glu(X)-Lys(Y)-Glu(X)-OH, где X, Y, Z -водород или защитные группы, подвергаются взаимодействию с трифторуксусной кислотой, гидрируют в присутствии катализатора и выделяют конечный продукт, отличающийся тем, что X представляет собой третбутильную группу (But), Y- третбутилоксикарбонильную группу (Boc), a Z - бензил карбонил.
У указанного способа есть ряд недостатков. Например, получаемый таким образом конечный продукт содержит большое количество примесей из-за использования труднолетучего растворителя. Кроме этого, при использовании в качестве исходных веществ защищенных аминокислот конечный продукт сильно загрязнен продуктами рацемизации. Эти недостатки в результате приводят к низкому выходу самого тетрадекапептида формулы (А), кроме того, загрязненного побочными продуктами и остатками растворителей.
В качестве технической проблемы рассматривается необходимость усовершенствования способа синтеза НЕР1 для получения высокоочищенного тетрадекапептида формулы (А) с максимально возможным выходом продукта.
Техническая проблема решается способом получения тетрадекапептида треонил-глутамил-лизил-лизил-аргинил-аргинил-глутамил-треонил-валил-глутамил-аргинил-глутамил-лизил-глутамат формулы H-Thr-Glu-Lys-Lys-Arg-Arg-Glu-Thr-Val-Glu-Arg-Glu-Lys-Glu-OH, отличающегося тем, что его получают реакцией конденсации пентапептида формулы Boc-Thr-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg-OH с нонапептидом со свободной аминогруппой формулы H-Arg-Glu(OtBut)-Thr-Val-Glu(OtBut)-Arg-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Glu(OtBut)-OtBut, при этом пентапептид Boc-Thr-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg-OH получают из аргинина путем последовательного присоединения к нему N-сукцинимидилового эфира Nα-карбобензокси-Nε-трет-бутилоксикарбонил-L-лизина, N-сукцинимидилового эфира Nα-карбобензокси-Nε-трет-бутилоксикарбонил-L-лизина, N-сукцинимидилового эфира Nα-карбобензокси-γ-третбутилглутаминовой кислоты и пентафторфенилового эфира N-третбутилоксикарбонил-L-треонина, а нонапептид получают конденсацией пентапептида Z-Glu(OtBut)-Thr-Val-Glu(OtBut)-ArgOH с трипептидом со свободной аминогруппой формулы Н-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Glu(OtBut)-OtBut с последующей конденсацией с защищенным аргинином.
В результате усовершенствованного способа получения авторы настоящего изобретения получили высокоочищенный (не менее 98,5%) продукт с выходом не менее 54%.
Краткое описание чертежей:
Фигура 1 - масс-спектр MALDI-TOF для определения молекулярной массы основного иона.
Фигура 2 - масс-спектр MALDI-TOF- TOF для определения фрагментов b-ионов.
Фигура 3 - хроматограмма определения посторонних примесей методом ВЭЖХ.
Осуществление изобретения.
Сущность способа заключается в следующем: пентапептид Boc-Thr-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg-OH конденсируют с нонапептидом со свободной аминогруппой формулы H-Arg-Glu(OtBut)-Thr-Val-Glu(OtBut)-Arg-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Glu(OtBut)-OtBut, удаляют защитные группы, проводят хроматографическую очистку и лиофилизируют.
Способ получения тетрадекапептида формулы (А) включает в себя несколько стадий. Стадии 1 и 2 проводят независимо друг от друга в произвольном порядке.
Стадия 1: получение пентапептида Boc-Thr-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg-OH.
Пентапептид Boc-Thr-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg-OH получают из аргинина (может представлять собой L-аргинин) путем последовательного присоединения к нему N- сукцинимидилового эфира Nα-карбобензокси-Nε-трет-бутилоксикарбонил-L-лизина, N-сукцинимидилового эфира Nα-карбобензокси-Nε-трет-бутилоксикарбонил-L-лизина, N-сукцинимидилового эфира Nα-карбобензокси-γ-третбутилглутаминовой кислоты и пентафторфенилового эфира N-третбутилоксикарбонил-L-треонина. Конденсации проводят с помощью активированных эфиров. Защитные группы из защищенных промежуточных пептидов удаляют каталитическим.
Стадия 2: получение нонапептида Z-Arg-Glu(OtBut)-Thr-Val-Glu(OtBut)-Arg-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Glu(OtBut)-OtBut с защищенной аминогруппой.
Его получают в несколько этапов:
1) конденсация дитретбутилового эфира глутаминовой кислоты в виде гидрохлорида и N-сукцинимидилового эфира Nα-карбобензокси-Nε-трет-бутилоксикарбонил-L-лизина с получением дипептида Z -Lys(Boc) -Glu(OtBut) - OtBut.
2) дипептид Z - Lys(Boc) - Glu(OtBut) - OtBut подвергают каталитическому гидрогенолизу, проводят конденсацию с N-сукцинимидиловым эфиром Nα-карбобензокси-γ-третбутилглутаминовой кислоты и получают трипетид Z-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Glu(OtBut)-OtBut.
3) трипептид Z-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Glu(OtBut)-OtBut подвергают каталитическому гидрогенолизу и получают трипептид со свободной аминогруппой формулы H-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Glu(OtBut)-OtBut.
4) пентапептид Z-Glu(OtBut)-Thr-Val-Glu(OtBut)-ArgOH получают из аргинина (может представлять собой L-аргинин) в виде свободного основания последовательным присоединением к нему N-сукцинимидилового эфира Nα-карбобензокси-γ-третбутилглутаминовой кислоты, N-сукцинимидилового эфира N-карбобензокси-валина, Nα-карбобензокси -L-треонингидразида и Nα-карбобензокси-γ-третбутилглутаминовой кислоты.
5) проводят конденсацию пентапептида Z-Glu(OtBut)-Thr-Val-Glu(OtBut)-ArgOH с трипептидом со свободной аминогруппой формулы Н-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Glu(OtBut)-OtBut с помощью дициклокарбодиимида (КДИ) и гидроксибензотриазола (НОВТ) с получением защищенного октапептида Z- Glu(OtBut)-Thr-Val-Glu(OtBut)-Arg-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Glu(OtBut)-OtBut.
6) октапептид Z- Glu(OtBut)-Thr-Val-Glu(OtBut)-Arg-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Glu(OtBut)-OtBut подвергают каталитическому гидрогенолизу в присутствии формиата аммония и получают октапептид со свободной аминогруппой формулы Н-Glu(OtBut)-Thr-Val-Glu(OtBut)-Arg-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Glu(OtBut)-OtBut.
7) октапептид со свободной аминогруппой формулы Н- Glu(OtBut)-Thr-Val-Glu(OtBut)-Arg-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Glu(OtBut)-OtBut конденсируют с Na-карбобензокси-аргинином с помощью дициклокарбодиимида в присутствии гидроксибензотриазола и N-метилморфолина и получают защищенный нонапептид Z-Arg-Glu(OtBut)-Thr-Val-Glu(OtBut)-Arg-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Glu(OtBut)-OtBut.
Стадия 3: получение тетрадекапептида формулы (А).
1. Нонапептид со свободной аминогруппой формулы H-Arg-Glu(OtBut)-Thr-Val-Glu(OtBut)-Arg-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Glu(OtBut)-OtBut получают путем каталитического гидрогенолиза нонапептида Z-Arg-Glu(OtBut)-Thr-Val-Glu(OtBut)-Arg-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Glu(OtBut)-OtBut
2. Пентапептид Boc-Thr-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg-OH конденсируют с нонапептидом со свободной аминогруппой формулы H-Arg-Glu(OtBut)-Thr-Val-Glu(OtBut)-Arg-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Glu(OtBut)-OtBut с помощью дициклокарбодиимида в присутствии гидроксибензотриазола и N-метилморфолина и получают защищенный тетрадекапептид формулы Z-Thr-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg-Arg-Glu(OtBut)-Thr-Val-Glu(OtBut)-Arg-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Glu(OtBut)-OtBut.
Стадия 4: удаление защитных групп.
Защитные группы с защищенного тетрадекапептида удаляют трифторуксусной кислотой с последующей обработкой ионообменной смолой и получают тетрадекапептид формулы H-Thr-Glu-Lys-Lys-Arg-Arg-Glu-Thr-Val-Glu-Arg-Glu-Lys-Glu-OH.
Стадия 5: хроматографическая очистка и лиофилизация.
Полученный тетрадекапептид H-Thr-Glu-Lys-Lys-Arg-Arg-Glu-Thr-Val-Glu-Arg-Glu-Lys-Glu-OH очищают методом препаративной обращенно-фазовой хроматографии и лиофильно высушивают.
Преимущества заявленного способа синтеза перед выбранным прототипом:
1. Заявленный тетрадекапептид получают реакцией конденсации пентапептида формулы Boc-Thr-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg-OH (по прототипу Z-Thr(X)-Glu(X)-Lys(Y)-Lys(Y)-Arg-OH) с нонапептидом со свободной аминогруппой формулы H-Arg-Glu(OtBut)-Thr-Val-Glu(OtBut)-Arg-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Glu(OtBut)-OtBut (по прототипу Arg-Glu(X)-Thr(X)-Val-Glu(X)-Arg-Glu(X)-Lys(Y)-Glu(X)-OX) это позволяет снизить возможность рацемизации и образования побочных продуктов, в том числе стереоизомеров, оптимизировать стадию снятия защитных групп конечного тетрадекапептида.
2. При получении пентапептида Boc-Thr-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg-OH вместо N-карбобензокси-О-трет-бутил-треонина используют пентафторфениловый эфир N-третбутилоксикарбонил-L-треонина, который самостоятельно получают из свободного треонина и ди-трет-бутилдикарбоната. Замена защищенной аминокислоты снижает возможность рацемизации и образования побочных продуктов, в том числе, стереоизомеров на стадии. Полученный пентапептид содержит меньше третбутильных групп, что позволяет оптимизировать стадию снятия защитных групп конечного тетрадекапептида.
3. При получении дипептида Z -Lys(Boc) - Glu(OtBut) - OtBut в качестве основного растворителя используется этилацетат, а не ДМФА. Этилацетат является более летучим, лучше отгоняется, соответственно его в значительно меньшем количестве остается в продукте.
4. При получении дипептида Z-Glu(OtBut)-Arg-OH в отличие от прототипа используют только 1 растворитель - ДМФА, выделение проводится с использованием воды, промежуточный продукт получается менее загрязненным органическими растворителями.
5. Нонапептид получают конденсацией пентапептида Z-Glu(OtBut)-Thr-Val-Glu(OtBut)-ArgOH с трипептидом со свободной аминогруппой формулы H-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Glu(OtBut)-OtBut с последующей конденсацией с защищенным аргинином. В используемом пентапептиде треонил не содержит дополнительной третбутильной группы, что позволяет оптимизировать стадию снятия защитных групп конечного тетрадекапептида.
6. При получении октапептида Z-Glu(OtBut)-Thr-Val-Glu(OtBut)-ArgOH исключена стадия получения трипептида гидрохлорида HCl•Н-Glu(But)-Lys(Boc)-Glu(But)-OBut, это позволяет оптимизировать процесс синтеза: снизить потери на стадии, снизить возможность загрязнения органическими растворителями и побочными продуктами синтеза на стадии.
7. Для получения тетрапептида Z-Thr-Val-Glu(OtBut)-Arg-OH используют Z-L-треонингидразид, что способствует снижению рацемизации и минимизирует риск образования оптических изомеров.
8. При снятии защитных групп тетрадекапептида не проводят каталитический гидрогенолиз, а используют ионообменную смолу, это существенно сокращает время проведения стадии, снижает потери при выделении продукта и количество использованных органических растворителей.
9. В отличие от прототипа, где используется только 3 системы для ТСХ, разработано 12 систем элюентов для ТСХ. Такой подход обеспечивает большую селективность и позволяет проводить тщательный постадийный контроль и оценивать полноту протекания реакций/качество отмывки для различных промежуточных продуктов.
Далее приведен пример конкретного воплощения изобретения. Данный пример служит для иллюстрации возможности осуществления заявленного способа и не являются исчерпывающим перечнем возможных вариантов синтеза.
1. Получение нонапептида Z- Arg-Glu(OtBut) - Thr -Val-Glu(OtBut)- Arg- Glu(OtBut)- Lys(Boc)-Glu(OtBut)-OtBut
Получение дипептида Z-Lys(Boc) - Glu(OtBut) - OtBut
170,0 г H-Glu(OtBut)-OtBut*HCl и 274,5 г Z -Lys(Boc)-OSu растворяют в 700,0 мл этилацетата, добавляют 81,0 мл триэтиламина и оставляют на 24 часа при постоянном перемешивании для протекания реакции при комнатной температуре. Контроль за ходом реакции ведут методом ТСХ в Элюенте 1. Добавляют 5,0 мл 3-диметиламинопропиламина, перемешивают, добавляют 0,5 л воды дистиллированной и 10,0 мл концентрированной соляной кислоты, перемешивают. Раствор фильтруют и промывают водой дистиллированной, контролируют уровень рН, упаривают до полной отгонки летучих компонентов при температуре 70°С.
Получают 360,3 г дипептида Z -Lys(Boc) - Glu(OtBut) - OtBut в виде масла.
Получение трипептида Z-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Glu(OtBut)-OtBut.
360,3 г дипептида Z-Lys(Boc) - Glu(OtBut) растворяют в метаноле, гидрируют в присутствии угольно-палладиевого катализатора в течение 24 часов. Контроль полноты прохождения реакции гидрирования проводят методом ТСХ в Элюенте 1.
Полученную суспензию фильтруют, упаривают до прекращения отгонки летучих компонентов при температуре 64°С, добавляют 300 мл ДМФА. Получают дипептид со свободной аминогруппой H-Lys(Boc) -Glu(OtBut) - OtBut - раствор в ДМФА.
251,7 г Z - Glu(OtBut)-OSu растворяют в 400,0 мл этилацетата, добавляют к раствору дипептида со свободной аминогруппой H-Lys(Boc) -Glu(OtBut) - OtBut. Спустя 2 часа проводят контроль прохождения реакции методом ТСХ в Элюенте 2.
Добавляют 10,0 мл 3-диметиламинопропиламина для удаления избытка активированного эфира. Спустя 1 час добавляют 400 мл воды дистиллированной, 400 мл смеси этилацетат/вода (50:50), разделяют фазы, к органической фазе добавляют 300,0 мл этилацетата, 300,0 мл воды дистиллированной и 10,0 мл кислоты соляной концентрированной, контролируют уровень рН реакционной смеси. Органическую фазу промывают водой дистиллированной, контролируют уровень рН реакционной смеси. Органическую фазу упаривают до прекращения отгонки летучих компонентов при температуре 73°С. Добавляют 200,0 мл толуола и отгоняют при температуре в бане 83°С до прекращения конденсации растворителя. Добавляют 700,0 мл толуола, перемешивают без отгонки при температуре 81°С до полного растворения, охлаждают на ледяной бане. Спустя 24 часа смесь гомогенизируют, охлаждают жидким азотом, фильтруют, промывают 700,0 мл петролейного эфира и сушат при комнатной температуре. Получают 250,1 г трипептида Z-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Glu(OtBut)-OtBut. Получение дипептида Z-Glu(OtBut)-Arg-OH.
К 217,0 г Z-Glu(OtBut)-OSu и 87,0 г L-аргинина добавляют 500,0 мл ДМФА, перемешивают при температуре 75°С до растворения. Оставляют на ночь для прохождения реакция, добавляют 700 мл воды дистиллированной, охлаждают при температуре -15°С в течение 3 часов, фильтруют. Контроль за выделением продукта ведут методом ТСХ в Элюенте 2. Получают 232,4 г дипептида Z-Glu(OtBut)-Arg-OH.
Получение трипептида Z-Val-Glu(OtBut)-Arg-OH.
223,1 г Z-Glu(OtBut)-ArgOH растворяют в метаноле, гидрируют в присутствии угольно-палладиевого катализатора. Контроль полноты прохождения проводят методом ТСХ в Элюенте 2. Суспензию фильтруют, упаривают до прекращения отгонки летучих при температуре 70°С, добавляют 300 мл ДМФА. Получают раствор дипептида со свободной аминогруппой Н-Glu(OtBut)-ArgOH в ДМФА.
157,5 г Z-Val-OSu растворяют в 500,0 мл ДМФА, добавляют к дипептиду со свободной аминогруппой H-Glu(OtBut)-ArgOH при перемешивании. Спустя 18 часов упаривают до отгона летучих компонентов при температуре бани 71°С.Добавляют 300,0 мл метилтретбутилового эфира, 1,0 кг льда, гомогенизируют, фильтруют, осадок промывают смесью метилтретбутилового эфира и воды сушат при комнатной температуре. Контроль выделения продукта осуществляют методом ТСХ в Элюенте 2 и Элюенте 4. Получают 225,6 г трипептида Z-Val-Glu(OtBut)-Arg-OH.
Получение тетрапептида Z-Thr-Val-Glu(OtBut)-Arg-OH.
225,6 г трипептида Z-Val-Glu(OtBut)-Arg-OH растворяют в метаноле при температуре 80°С, гидрируют при комнатной температуре в присутствии угольно-палладиевого катализатора. Контроль полноты прохождения реакции проводят методом ТСХ в Элюенте 2. Суспензию фильтруют, упаривают до прекращения отгонки летучих компонентов при температуре 70°С, добавляют 300 мл ДМФА. Получают раствор трипептида со свободной аминогруппой Н-Val-Glu(OtBu)-Arg-OH в ДМФА.
2
3
3
178,9 г Z-Thr-NH растворяют в 500,0 мл ДМФА, добавляют 70,0 мл воды и 83,0 мл трифторуксусной кислоты, перемешивают до полного растворения. Колбу охлаждают жидким азотом до температуры 0°С, добавляют по порциям 259,0 мл раствора хлористого водорода в диоксане, 78,2 мл BuONO. Перемешивание со скоростью 620 rpm ведут до установления постоянной температуры. При охлаждении добавляют по порциям 318,0 мл триэтиламина (для нейтрализации). Гомогенизируют полученную реакционную смесь при комнатной температуре. Получают Z-Thr-N.
3
В предварительно охлажденную колбу с раствором трипептида со свободной аминогруппой H-Val-Glu(OtBu)-Arg-OH) в ДМФА добавляют 77% полученного Z-Thr-N, определяют уровень рН. Колбу оставляют для прохождения реакции на 1 час при комнатной температуре. Добавляют 38,0 мл N-метилморфолина, перемешивают. Спустя 20 часов отбирают пробу для контроля полноты протекания реакции методом ТСХ в Элюенте 2 и 4.
Содержимое колбы упаривают до окончания отгонки летучих растворителей при температуре 70°С, добавляют 500,0 мл метилтретбутилового эфира, 1 кг льда, 0,5 л воды, перемешивают. Спустя 20 часов полученную смесь фильтруют, осадок сушат при комнатной температуре. Контроль за выделением продукта ведут методом ТСХ в Элюенте 2 и 4. Получают 271,2 г тетрапептида Z-Thr-Val-Glu(OtBut)-Arg-OH.
Получение пентапептида Z-Glu(OtBut)-Thr-Val-Glu(OtBut)-Arg-OH.
271,2 г Z-Thr-Val-Glu(OtBut)-Arg-OH растворяют в метаноле при температуре 80°С, гидрируют в присутствии угольно-палладиевого катализатора при комнатной температуре в течение 6 часов. Контроль за ходом реакции осуществляют методом ТСХ в Элюенте 2 и Элюенте 4.
Полученную суспензию фильтруют, фильтрат упаривают до прекращения отгонки летучих компонентов при температуре 70°С, добавляют 300 мл ДМФА, упаривают до прекращения отгонки летучих компонентов. Получают раствор тетрапептида со свободной аминогруппой H-Thr-Val-Glu(OtBut)-Arg-OH в ДМФА.
165,0 г Z-Glu(OtBut)-OSu растворяют в 500,0 мл ДМФА, переносят в колбу с раствором тетрапептида со свободной аминогруппой H-Thr-Val-Glu(OtBut)-Arg-OH. Спустя 22 часа отбирают пробу для контроля полноты прохождения реакции методом ТСХ в Элюенте 2. Добавляют 1,5 л метилтретбутилового эфира и 1,5 кг льда, гомогенизируют, нагревают на водяной бане при температуре бани 60°С, охлаждают на ледяной бане. Контроль прохождения реакции осуществляют методом ТСХ в Элюенте 2. Осадок фильтруют, промывают водой дистиллированной, сушат при комнатной температуре.
Получают 206,2 г пентапептида (VI) Z-Glu(OtBut)-Thr-Val-Glu(OtBut)-Arg-OH.
Получение октапептида Z-Glu(OtBut)-Thr-Val-Glu(OtBut)-Arg-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Glu(OtBut)-OtBut
185,4 г трипептида Z-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Glu(OtBut)-OtBut. растворяют при нагревании в 500,0 мл метанола при температуре 72°С, гидрируют в присутствии угольно-палладиевого катализатора при комнатной температуре в течение 24 часов. Контроль полноты прохождения реакции осуществляют методом ТСХ в Элюенте 1. Полученную суспензию фильтруют, упаривают до прекращения отгонки летучих компонентов при температуре в бане испарителя 74°С, добавляют 200 мл ДМФА, упаривают до прекращения отгонки летучих компонентов. Получают раствор трипептида со свободной аминогруппой H-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Glu(OtBut)-OtBut в ДМФА.
206,2 г Z-Glu(OtBut)-Thr-Val-Glu(OtBut)-Arg-OH растворяют в 500,0 мл ДМФА, добавляют 300,0 мл ДМСО.
62,0 г НОВТ добавляют в колбу с раствором пентапептида Z-Glu(OtBut)-Thr-Val-Glu(OtBut)-Arg-OH, перемешивают, добавляют раствор трипептида со свободной аминогруппой H-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Glu(OtBut)-OtBut в ДМФА, перемешивают, отгоняют при температуре 74°С, охлаждают на ледяной бане.
2
3
65,0 г КДИ растворяют в 50,0 мл ДМФА, добавляют к реакционной массе, охлаждают на ледяной бане. Спустя 20 часов отбирают пробу для контроля полноты прохождения реакции методом ТСХ в Элюенте 1 и Элюенте 4. Содержимое колбы фильтруют, фильтрат упаривают на 2/3 объема при температуре в бане испарителя 71°С, добавляют 200,0 мл ДМФА, упаривают до прекращения отгонки летучих компонентов. Добавляют 500,0 мл метилтретбутилового эфира и 500,0 мл петролейного эфира, 600,0 мл 8,3% раствора NaCO в воде дистиллированной, около 1,0 кг льда, гомогенизируют, фильтруют. Получают октапептид Z- Arg-Glu(OtBut)-Thr-Val-Glu(OtBut)-Arg-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Glu(OtBut)-OtBut в виде осадка.
Получение нонапептида Z-Arg-Glu(OtBut)-Thr-Val-Glu(OtBut)-Arg-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Glu(OtBut)-OtBut.
Октапептид Z-Arg-Glu(OtBut)-Thr-Val-Glu(OtBut)-Arg-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Glu(OtBut)-OtBut растворяют в 2,0 л изопропанола при температуре 77°С. Концентрированной соляной кислотой при непрерывном перемешивании доводят содержимое колбы до рН=4,5-5,0. Гидрируют в присутствии угольно-палладиевого катализатора при комнатной температуре в течение 20 часов. Содержимое колбы нагревают, температура мешалки около 120°С, добавляют по порциям 50,0 мл формиата аммония, перемешивают в течение 20 минут. Контроль полноты прохождения реакции осуществляют методом ТСХ в Элюенте 1 и Элюенте 4. Фильтруют, фильтрат упаривают до прекращения отгонки летучих компонентов при температуре 77°С.
100,0 мл концентрированной соляной кислоты растворяют в 600,0 мл воды дистиллированной, контролируют рН с помощью рН-метра, при непрерывном перемешивании по порциям добавляют 200,0 мл пиридина.
Добавляют полученный раствор гидрохлорида пиридина в воде к реакционной смеси. Добавляют 1,0 л метилтретбутилового эфира, 1,2 л петролейного эфира и около 1,0 кг льда, гомогенизируют, фильтруют. Осадок на фильтре промывают 500,0 мл петролейного эфира, 600,0 мл воды дистиллированной.
Получают октапептид со свободной аминогруппой H-Arg-Glu(OtBut)-Thr-Val-Glu(OtBut)-Arg-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Glu(OtBut)-OtBut.
86,0 г Z-Arg-OH растворяют в 400,0 мл ДМФА, добавляют 60,0 мл раствора хлористого водорода в диоксане, перемешивают.
Октапептид со свободной аминогруппой Н- Arg-Glu(OtBut) - Thr -Val-Glu(OtBut)- Arg- Glu(OtBut)- Lys(Boc)- Glu(OtBut)-OtBut растворяют в 600,0 мл ДМФА, добавляют 62,0 г НОВТ, раствор Z-Arg-OH в ДМФА, упаривают до прекращения отгонки летучих компонентов при температуре 74°С, охлаждают на ледяной бане, добавляют 30,0 мл N-метилморфолина.
65,0 г КДИ растворяют в 50,0 мл ДМФА и добавляют к реакционной массе, охлаждают на ледяной бане. Спустя 48 часов отбирают пробу для контроля полноты прохождения реакции методом ТСХ в Элюенте 1 и Элюенте 10. Проводят дополнительную пробоподготовку образцов: Образец переносят в стеклянный флакон, добавляют около 2,0 мл метанола, 2 капли ледяной уксусной кислоты, угольно-палладиевый катализатор на кончике шпателя и 2 капли формиата аммония, перемешивают вручную и нагревают в течение 20 минут. Заключение о полноте протекания реакции делают по исчезновению исходных веществ.
2
3
Содержимое колбы нагревают при температуре 60°С, фильтруют, добавляют 45,0 мл концентрированной соляной кислоты, 400,0 мл ДМСО, фильтруют, фильтрат упаривают при температуре 71°С.Добавляют 600,0 мл метилтретбутилового эфира, 600,0 мл петролейного эфира, 600 мл 8,3% раствора NaCO в воде, 1,0 кг льда, гомогенизируют реакционную смесь, фильтруют. Контроль выделения продукта осуществляют методом ТСХ в Элюенте 7 и Элюенте 10. Осадок на фильтре отжимают, добавляют 600,0 мл изопропилового спирта, нагревают при температуре 70°С. Маточный раствор перемещают в делительную воронку. После разделения фаз водную фазу утилизируют, органическую переносят в круглодонную колбу объемом 2,0 л и упаривают при температуре 70°С.
Отогнанный растворитель переносят в колбу с суспензией продукта, добавляют 1 кг льда, гомогенизируют, фильтруют. Контроль выделения продукта осуществляют методом ТСХ в Элюенте 7 и Элюенте 10.
Получают нонапептид Z-Arg-Glu(OtBut)-Thr-Val-Glu(OtBut)-Arg-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Glu(OtBut)-OtBut.
2. Получение пентапептида Boc-Thr- Glu(OtBut) - Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg-OH.
Получение дипептида Z- Lys(Boc)- Arg-OH.
213,0 г Z-Lys(Boc)-OSu и 78,3 г L-аргинина растворяют в 700,0 мл ДМФА при перемешивании на водяной бане, температура бани около 35-40°С. Реакцию проводят при комнатной температуре в течение 18 часов. Контроль осуществляют методом ТСХ в Элюенте 2. Упаривают при температуре 72°С, добавляют 500,0 мл смеси бутанол-вода (3:2), переносят в делительную воронку, добавляют около 2,0 л смеси бутанол-вода (3:2). Органическую фазу промывают 0,5 л воды дистиллированной, переносят в колбу. Водную фазу переносят в делительную воронку и промывают 0,5 л бутанола. Контроль выделения осуществляют методом ТСХ в Элюенте 2. Органическую фазу упаривают при температуре бани 70°С до окончания отгонки летучих растворителей.
Получают дипептид Z-Lys(Boc)-Arg-OH в виде масла.
Получение трипептида Z-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg-OH.
Дипептид Z-Lys(Boc)-Arg-OH растворяют в 1,0 л метанола при перемешивании при температуре 70°С, гидрируют в присутствии угольно-палладиевого катализатора в течение 24 часов при комнатной температуре. Контроль за ходом реакции осуществляют методом ТСХ в Элюенте 1. Полученную суспензию фильтруют, фильтрат упаривают при температуре 70°С, добавляют 200 мл ДМФА, упаривают до прекращения отгонки летучих компонентов при температуре 74°С. Получают раствор дипептида со свободной аминогруппой H-Lys(Boc)-Arg-OH в ДМФА.
213,0 г Z-Lys(Boc)-OSu растворяют в 500,0 мл ДМФА, фильтруют. Фильтрат переносят в колбу с раствором дипептида со свободной аминогруппой H-Lys(Boc)-Arg-OH в ДМФА, оставляют при комнатной температуре для прохождения реакции на 22 часа. Контроль полноты прохождения реакции осуществляют методом ТСХ в Элюенте 1 и Элюенте 4. Упаривают до прекращения отгонки летучих компонентов при температуре 71°С, растворяют в 0,5 л бутанола при температуре 61°С (без отгонки), переносят в делительную воронку, добавляют 1,0 л бутанола и 0,5 л воды. Органическую фазу промывают 700,0 мл воды. Контроль обработки осуществляют методом ТСХ в Элюенте 7. Органическую фазу упаривают до прекращения отгонки летучих компонентов при температуре 68°С.
Полученный продукт растирают с 1,0 л петролейного эфира, декантируют жидкость, процедуру повторяют дважды. Получают трипептид Z-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg-OH в виде вязкого вещества.
Получение тетрапептида Z-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg-OH.
Трипептид Z-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg-OH растворяют в 1,0 л метанола при температуре 61°С, гидрируют в присутствии угольно-палладиевого катализатора в течение 24 часов при комнатной температуре. Контроль за ходом реакции осуществляют методом ТСХ в Элюенте 4. Суспензию фильтруют, фильтрат упаривают до прекращения отгонки летучих компонентов при температуре 65°С. Добавляют 300 мл ДМФА, упаривают до прекращения отгонки летучих компонентов.
Получают раствор трипептида со свободной аминогруппой Н- Lys(Boc)-Lys(Boc)-ArgOH в ДМФА.
193,5 г Z-Glu(OtBut)-OSu растворяют в 400,0 мл ДМФА, переносят в колбу с раствором трипептида со свободной аминогруппой H-Lys(Boc)-Lys(Boc)-ArgOH в ДМФА, перемешивают при температуре 73°С, оставляют при комнатной температуре для прохождения реакции на 19 часов. Контроль за прохождением реакции осуществляют методом ТСХ в Элюенте 2 и Элюенте 4. Добавляют 0,5 л метилтретбутилового эфира, 1 кг льда, гомогенизируют, фильтруют. Контроль выделения продукта осуществляют методом ТСХ в Элюенте 2 и Элюенте 7. Осадок промывают смесью: 300,0 мл воды дистиллированной/300,0 мл метилтретбутилового эфира; 1,5 л метилтретбутилового эфира, сушат при комнатной температуре в течение 24 часов.
Получают 316,0 г тетрапептида (XI) Z-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg-OH.
Выход со стадии 73%.
Получение пентапептида Boc-Thr-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg-OH.
Получение пентафторфенилового эфира N-третбутилоксикарбонил L-треонина (Boc-Thr-OPFP).
238,0 г треонина растворяют в 300,0 мл изопропилового спирта, 600,0 мл воды, добавляют 40% раствор едкого натра до рН=9,5-10,5.
2
К полученному раствору по порциям добавляют 444,0 г ВосО, поддерживая рН на уровне 9,5-10,5 добавлением 40% раствора едкого натра. После стабилизации содержимое колбы фильтруют. Фильтрат упаривают до окончания отгонки летучих растворителей, температура в бане 70°С.
Получают Boc-Thr-ONa в виде масла, доводят рН до уровня 3,0-3,5, добавляют 1 л смеси этилацетат : вода 50:50. Органическую фазу упаривают полностью, температура в бане 70°С. Добавляют 400,0 мл диоксана и упаривают до окончания отгонки летучих растворителей при температуре в бане 70°С.
К реакционной массе добавляют 340,0 г HOPFP, 1,5 л этилацетата, помещают в морозильную камеру при -15°С.
Спустя 18 часов к реакционной массе добавляют раствор 363,0 г КДИ в 300,0 мл этилацетата. Фильтруют, фильтрат упаривают до окончания отгонки летучих растворителей, температура в бане 80°С.Добавляют 1600,0 мл петролейного эфира, охлаждают в морозильной камере при температуре -15°С в течение 2 часов, фильтруют.Контроль выделения продукта осуществляют методом ТСХ в Элюенте 8.
Получают Boc-Thr-OPFP.
Получение пентапептида Boc-Thr-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg-ОН.
Тетрапептид Z-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg-OH растворяют в 1,5 л метанола при температуре бани 60°С, гидрируют в присутствии угольно-палладиевого катализатора в течение 20 часов при комнатной температуре. Контроль за ходом реакции осуществляют методом ТСХ в Элюенте 2 и Элюенте 4. Суспензию фильтруют, фильтрат упаривают до прекращения отгонки летучих компонентов при температуре 70°С.
Получают тетрапептид со свободной аминогруппой H-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg-OH.
134,9 г Boc-Thr-OPFP добавляют к тетрапептиду со свободной аминогруппой H-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg-OH и оставляют при комнатной температуре на 2 часа. Добавляют 600, 0 мл метилтретбутилового эфира, 600,0 мл петролейного эфира и 1,0 кг льда, гомогенизируют, добавляют около 27,0 мл концентрированной соляной кислоты, оставляют на ночь при комнатной температуре. Содержимое колбы переносят в делительную воронку и оставляют до разделения фаз. Контроль за выделением осуществляют методом ТСХ в Элюенте 1 и Элюенте 3. К водной фазе добавляют 500,0 мл петролейного эфира и суспензию гидрокарбоната натрия (42,0 г в 200,0 мл воды), 700,0 мл охлажденной воды. Спустя 18 часов к реакционной массе добавляют 500,0 г льда, гомогенизируют, фильтруют, контроль отмывки осуществляют методом ТСХ в Элюенте 3. Осадок промывают водой дистиллированной.
Получают пентапептид Boc-Thr-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg-OH.
3. Получение защищенного тетрадекапептида Z-Thr-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg-Arg-Glu(OtBut)-Thr-Val-Glu(OtBut)-Arg-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Glu(OtBut)-OtBut.
Нонапептид Z-Arg-Glu(OtBut)-Thr-Val-Glu(OtBut)-Arg-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Glu(OtBut)-OtBut растворяют в 3,0 л метанола при температуре 70°С, гидрируют в присутствии угольно-палладиевого катализатора в течение 20 часов при комнатной температуре. Контроль за ходом реакции осуществляют методом ТСХ в Элюенте 7 и Элюенте 10. Фильтруют, фильтрат доводят до рН=5,0 концентрированной соляной кислотой, упаривают до прекращения отгонки летучих компонентов при температуре 66°С.После отгонки добавляют 500,0 мл петролейного эфира, 500,0 мл метилтретбутилового эфира, 1,5 кг льда, гомогенизируют, фильтруют. Контроль за выделением продукта осуществляют методом ТСХ в Элюенте 4 и Элюенте 7.
Получают 256,4 г нонапептида со свободной аминогруппой H-Arg-Glu(OtBut)-Thr-Val-Glu(OtBut)-Arg-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Glu(OtBut)-OtBut.
К 256,4 г нонапептида со свободной аминогруппой H-Arg-Glu(OtBut)-Thr-Val-Glu(OtBut)-Arg-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Glu(OtBut)-OtBut добавляют 162,5 г пентапептида Boc-Thr-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg-OH, 43,2 г НОВТ, 800,0 мл ДМФА и 400,0 мл ДМСО, перемешивают, отгоняют летучие компоненты при температуре 71°С.
К реакционной массе добавляют 48,3 г КДИ и 25,0 мл метилморфолина, оставляют при комнатной температуре на 18 часов. Контроль реакции ведут методом ТСХ в Элюенте 7 и Элюенте 11.
2
3
Полученный защищенный тетрадекапептид Z-Thr-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg-Arg-Glu(OtBut)-Thr-Val-Glu(OtBut)-Arg-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Glu(OtBut)-OtBut фильтруют, фильтрат упаривают до отгона ДМФА при температуре 53°С.После отгонки добавляют 600,0 мл метилтретбутилового эфира, 600,0 мл петролейного эфира, 1 кг льда и 600 мл 6,67% раствора NaCO в воде, фильтруют, к осадку добавляют 500,0 мл метилтретбутилового эфира, 500,0 мл петролейного эфира и 1,5 л воды дистиллированной. Контроль за выделением продукта осуществляют методом ТСХ в Элюенте 7 и Элюенте 11.
Получают 464,5 г защищенного тетрадекапептида Z-Thr-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg-Arg-Glu(OtBut)-Thr-Val-Glu(OtBut)-Arg-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Glu(OtBut)-OtBut.
4. Получение тетрадекапептида (XIV) H-Thr-Glu-Lys-Lys- Arg-Arg-Glu-Thr-Val-Glu-Arg-Glu-Lys-Glu-OH.
К 464,5 г защищенного тетрадекапептида Z-Thr-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg-Arg-Glu(OtBut)-Thr-Val-Glu(OtBut)-Arg-Glu(OtBut)-Lys(Boc)-Glu(OtBut)-OtBut добавляют 1200,0 мл трифторуксусной кислоты. Реакцию проводят в течение 60 минут. Контроль за ходом реакции осуществляют методом ВЭЖХ. После прохождения реакции реакционную смесь упаривают при температуре 45°С до прекращения отгонки летучих растворителей, растирают с 2000,0 мл диоксана, декантируют диоксан. Контроль за выделением осуществляют методом ВЭЖХ. Полученный осадок растирают с 2000,0 мл метилтретбутилового эфира, фильтруют осадок промывают метилтретбутиловым эфиром. Контроль за выделением осуществляют методом ВЭЖХ.
Добавляют 2,0 л воды дистиллированной и перемешивают до полного растворения со скоростью 427 rpm около 1 часа. Предварительно подготовленную ионообменную смолу PureLite А500Р фильтруют от лишней жидкости и по порциям титруют раствор тетрадекапептида в воде до рН=3-4, фильтруют промывают водой, доводят объем фильтрата до 10,0 л.
5. Хроматографическая очистка и лиофильное высушивание.
5,0 л раствора тетрадекапептида наносят на хроматографическую колонку, содержащую 2,163 л предварительно регенерированного СПС-БИО-SP, вещество смывают с колонки линейным градиентом пиридин-ацетатного буфера от 0.2 М до 1.5 М со скоростью 700 мл/час (суммарный объем подвижной фазы равен 10,0 литрам). Отбор фракций осуществляют с интервалом 31 минута для каждой фракции. Полученные фракции анализируют методом ТСХ в Элюенте 2 и Элюенте 12 и методом ВЭЖХ. Процедуры повторяют для второй порции раствора.
По результатам ТСХ и ВЭЖХ отбирают фракции, содержащие целевой компонент.Для фракций с содержанием основного компонента менее 97% проводят очистку методом препаративной обращенно-фазовой хроматографии для этого фракции объединяют и упаривают полностью при температуре в бане 50°С.После отгонки к содержимому колбы добавляют 300,0 мл воды дистиллированной и полностью упаривают на роторном испарителе, чтобы избавиться от остатков пиридин-ацетатного буфера. Процедуру повторяют дважды. Полученный сухой остаток растворяют в воде дистиллированной из расчета: 4,0 г целевого вещества на 1 прогонку в 50-100 мл.
Условия для проведения хроматографической очистки:
колонка - Reprosil 100 С18, 10 мкм, 250*50 мм;
объем вводимой пробы: с помощью насосного блока хроматографа на колонку наносят 50,0-100,0 мл раствора тетрадекапептида в воде (объем вводимого раствора варьируют в зависимости от объема полученного раствора);
скорость потока - 50 мл/мин;
время элюирования - 40 минут;
поглощение измеряют при длине волны равной 226 нм, результат хроматографии выводится на бумагу при помощи самописца;
подвижная фаза - линейный градиент от компонента А к компоненту В.
Компонент А: 0,1% трифторуксусная кислота в воде,
Компонент В: 6% изопропанол в 0,1% растворе трифторуксусной кислоты в воде;
после очистки каждой третьей порции колонку промывают 300,0 мл 40% раствора изопропанола в воде и уравновешивают 700,0 мл компонента А подвижной фазы.
Полученные фракции выборочно анализируют методом ВЭЖХ.
Фракции с содержанием целевого компонента более 98,5% объединяют, титруют смолой PureLite А500Р, обработанной уксусной кислотой, до рН=3-4, фильтруют, упаривают фильтрат до объема около 350,0 мл при температуре бани 80°С, замораживают жидким азотом и подвергают лиофильному высушиванию при температуре -100°С, давлении 0,001 мБар в течение 24 часов.
Содержание аминокислот в полученном тетрадекапептиде определяли на аминокислотном анализаторе Clarity Amino Acid Analyzer SW и получили следующие результаты:
что подтверждает заявленный аминокислотный состав TEKKRRETVEREKE.
Получают 95,2 г порошка тетрадекапептида (треонил-глутамил-лизил-лизил-аргинил-аргинил-глутамил-треонил-валил-глутамил-аргинил-глутамил-лизил-глутамат) в виде лиофилизата чистотой не менее 98,5%. Выход продукта составляет 54,0%.
Проведение контроля методом тонкослойной хроматографии.
Тонкослойная хроматография проводится на пластинках Merck -Kieselgel. Пластину с нанесенным веществом сушат с помощью фена при нагревании, остужают, помещают в хроматографическую камеру с хлором (в эксикатор насыпают около 1 г сухого перманганата калия, добавляют около 10 мл концентрированной соляной кислоты, оставляют с закрытой крышкой на 20 мин), после чего их проявляют водным раствором следующего состава: 0,1% о-толидин, 0,5% калий йодистый, 2% кислота уксусная.
Элюент 1: 37 мл смеси: пиридин-уксусная кислота-вода очищенная (20:6:11) + 120 мл этилацетата
Элюент 2: хлороформ - метанол - уксусная кислота - вода (60:45:6,4:13,6).
Элюент 3: этилацетат, х.ч.
Элюент 4: 37 мл смеси: пиридин - уксусная кислота - вода очищенная (20:6:11) + 45 мл этилацетата
Элюент 5: бутанол - уксусная кислота - вода (3:1:1).
Элюент 6: 37 мл смеси пиридин-уксусная кислота-вода очищенная (20:6:11) + 300 мл этилацетата.
Элюент 7: 37 мл смеси пиридин-уксусная кислота-вода очищенная (20:6:11) + 90 мл этилацетата
Элюент 8: этилацетат/ петролейный эфир (50:50);
Элюент 9: хлороформ / метанол / уксусная кислота (10:2:1);
Элюент 10: хлороформ / метанол / уксусная кислота (10:3:1);
Элюент 11: хлороформ / метанол / буфер [пиридин-уксусная кислота-вода очищенная (20:6:11)] (4:2:2)
Элюент 12: бутанол/ трифторэтанол / аммиак (3:2:2)
Проведение контроля методом ВЭЖХ
Контроль осуществляют с использованием хроматографической системы Gilson.
Условия хроматографирования:
Колонка - Luna С18, 5 мкм, 250*4,6 мм
Скорость потока - 1 мл/мин
Объем вкола - 20 мкл
Длина волны - 220 нм
Подвижная фаза:
Компонент А: вода очищенная, содержащая 0,1% трифторуксусной кислоты
Компонент В: ацетонитрил (HPLC grade), содержащий 0,1% трифторуксусной кислоты
Градиент:
Полученный продукт характеризуется удельным вращением в пересчете на сухое вещество -68°.
Аминокислотная последовательность подтверждена методами: времяпролетной масс-спектрометрии MALDI-TOF; тандемной масс-спектрометрии MALDI-TOF-TOF.
Внутренний стандарт - продукты автолиза свиного трипсина.
Основной регистрируемый ион (+Н) имеет моноизотопную молекулярную массу 1817,95 а.е.м (фиг. 1).
В спектре фрагментации присутствуют последовательности фрагментов b-ионов (фиг. 2): 1-2,5-12; b+18-ионов: 5,7,13-14; у-ионов 1,3-6,9,11,13; i-ионов 1-5, 9-13. В сумме полностью перекрывают заявленную аминокислотную последовательность образца и соответствуют заявленной последовательности.
Наличие и количественное содержание примесей подтверждается методом ВЭЖХ:
Критерии приемлемости:
- единичная неидентифицированная примесь - не более 1%,
- сумма примесей - не более 1,5%.
Характерная хроматограмма определения посторонних примесей методом ВЭЖХ представлена на фиг. 3.
Предложенный способ синтеза позволяет получать 100±5 г тетрадекапептида формулы (А) за цикл с чистотой не менее 98,5%. Выход продукта по прототипу за цикл составляет 13 г с чистотой примерно 96%. Выход продукта, полученного заявленным способом, составляет не менее 54%, в то время как в прототипе он равен 44%. Единичная неидентифицированная примесь - не более 1%, сумма примесей - не более 1,5%.