СОСТАВЫ И СПОСОБЫ ДЛЯ УВЕЛИЧЕНИЯ БИОМАССЫ, КОНЦЕНТРАЦИИ ЖЕЛЕЗА И УСТОЙЧИВОСТИ РАСТЕНИЙ К ПАТОГЕНАМ
COMPOSITIONS AND METHODS FOR INCREASING BIOMASS, CONCENTRATION OF IRON AND PLANT RESISTANCE TO PATHOGENS

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
Данная заявка заявляет приоритет заявки с номером 61/309134, поданной 1 марта 2010 года, заявки с номером 61/414108, поданной 16 ноября 2010 года, и заявки с номером 61/416039, поданной 22 ноября 2010 года, которые включены в данный документ посредством ссылки во всей полноте и во всех отношениях.
ПОСТАНОВЛЕНИЕ О ГОСУДАРСТВЕННОЙ ПОДДЕРЖКЕ
Исследование, которое привело к раскрываемому изобретению, финансировалось, в частности, грантом Национального научного фонда (NSF) №0923806 и грантом NSF № IOS-0814477 при технической поддержке опытной полевой станции Министерства сельского хозяйства США в Джоржтауне, DE в Дэлаверском университете. Таким образом, правительство США может иметь определенные права на настоящее изобретение.
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится в общем к применению стимулирующих рост растений ризобактерий, чтобы усилить различные характеристики роста растений, включая увеличение биомассы, повышение засухоустойчивости, уменьшение содержания лигнина, увеличение прорастания семян, увеличение концентрации железа и увеличение устойчивости к патогенам. В частности, варианты осуществления настоящего изобретения относятся к применению Bacillus subtilis FB17 к растению. Полученные растения могут быть использованы в получении биотоплива, продуктов питания или для других целей.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Продовольственная безопасность всегда была высшим приоритетом во всем мире, и возрастающее беспокойство о воздействии растениеводства на окружающую среду делает необходимыми разработку и применение новых способов, чтобы повысить производительность, одновременно защищая окружающую среду. Ботаники разрабатывают и внедряют стратегии для высокой производительности культурных растений с целью обеспечения доступности необходимого сырья увеличивающемуся населению мира. Однако развитие биотоплива и возобновляемых технологий причисляют к этой задаче, так как они также стали все более важным приоритетом. Поэтому существует возрастающая потребность в усовершенствованных подходах, чтобы повысить урожайность культуры в разных полевых условиях.
Многообразие различных географических сред и климатов во всем мире представляет различные типы проблем в производстве увеличенной биомассы и потенциально возможного урожая культурных растений. Засуха является ведущим фактором, который глобально ограничивает производство культур. Долговременная засуха или кратковременная засуха в период вегетации могут существенно ограничить или даже уничтожить производство культур. Изменения глобальных погодных условий повлияли на частоту и интенсивность засухи даже в основных регионах выращивания культур в мире.
Доступность питательных веществ также ограничивает производство культур. Пополнение почвы питательными веществами является дорогостоящим и энергоемким, и даже если питательные вещества доступны в достаточных количествах, культурные растения иногда неспособны к поглощению питательных веществ. Недостаточное поглощение важных питательных веществ приводит к более низким урожаям и продовольственным культурам с более низкой питательной ценностью. К примеру, рис (семя однодольных растений Oryza sativa или Oryza glaberrima) является важнейшим основным продуктом питания для более чем двух третьих населения мира, обеспечивая значительную часть потребляемых калорий. Так как рис является важным основным продуктом питания для значительной части населения мира, производство риса с большими уровнями железа может иметь значительное влияние на сокращение дефицита питательных микроэлементов во всем мире, так как недостаток железа представляет собой один из самых широко распространенных недостатков микроэлементов среди людей в мире.
Патогенная нагрузка также ограничивает продуктивность. Растения должны затрачивать энергию, чтобы пережить атаку патогена, и этот расход энергии приводит к более низким урожаям. Растения также изменяют свой состав, чтобы задержать развитие болезни, и такие изменения часто делают переработку культур более сложной. Дополнительно некоторые патогены культур не могут быть эффективно ограничены ни генетическим разнообразием, ни химическим контролем, и оказывают значительное влияние на глобальное производство культур.
Пирикуляриоз риса {Magnaporthe grisea или Magnaporthe oryzae) является патогенным грибком растений, который вызывает серьезное заболевание, воздействующее на рис. Он является причиной экономически значительной потери культур ежегодно, приводя к предполагаемой 40% урожайности культур. Пирикуляриоз риса уничтожает достаточное количество риса для питания миллионов людей во всем мире каждый период вегетации. Так как рис является важным основным продуктом питания для значительной части человечества, эффекты пирикуляриоза риса оказывают широкое влияние на здоровье человека и окружающую среду. Нехватки риса приводят непосредственно к голоданию людей. Пирикуляриоз риса также приводит к потере культур и требуется применение дополнительных ресурсов для компенсации уменьшенного урожая. Остается большая потребность в стратегиях, которые усиливают различные характеристики роста растений в разнообразных условиях роста, такие как устойчивость к стрессу, вызванному засухой, устойчивость к давлению патогенов, доступность питательных веществ и в конечном счете урожай культур, так чтобы большие количества продуктов питания с увеличенной питательностью могли быть доступны для населения мира и для других важных преимуществ, таких как получение биотоплива.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Вариант осуществления настоящего изобретения обеспечивает способ для получения большей биомассы растения, который включает применение Bacillus subtilis FB17 к растению, семени растения или почве, окружающей растение или семя растения, в количестве, эффективном для получения большей биомассы растения по сравнению с необработанным растением.
Другой вариант осуществления обеспечивает способ для повышения засухоустойчивости растения, который включает применение Bacillus subtilis FB17 к растению, семени растения или почве, окружающей растение или семя растения, в количестве, эффективном для повышения засухоустойчивости растения по сравнению с необработанным растением.
Другой вариант осуществления обеспечивает способ для получения пониженной концентрации лигнина в растении, который включает применение Bacillus subtilis FB17 к растению, семени растения или почве, окружающей растение или семя растения, в количестве, эффективном для получения пониженной концентрации лигнина в растении по сравнению с необработанным растением.
Другой вариант осуществления обеспечивает способ для увеличения прорастания семян растений, который включает применение Bacillus subtilis FB17 к растению, семени растения или почве, окружающей растения или семена растений, в количестве, эффективном для повышения прорастания семян растений по сравнению с необработанными растениями.
Другой вариант осуществления обеспечивает способ для получения большей концентрации железа в растении, особенно растении риса, который включает применение Bacillus subtilis FB17 к растению, семени растения или почве, окружающей растение или семя, в количестве, эффективном для получения более высокой концентрации железа в растении по сравнению с необработанным растением.
Другой вариант осуществления обеспечивает способ для ингибирования роста патогенного грибка растения и инфекции растения, особенно растения риса, грибковым патогеном, особенно пирикуляриозом риса, который включает применение Bacillus subtilis FB17 к растению, семени растения или почве, окружающей растение или семя, в количестве, эффективном для ингибирования инфекции растения грибковым патогеном.
Дополнительные варианты осуществления обеспечивают сельскохозяйственные носители и покрытия семян, содержащие Bacillus subtilis FB17. Биомасса растения, к которому применяли Bacillus subtilis FB17, может быть превращена в биотопливо, и полученная культура может быть использована безопасно для человека или животного в качестве еды или в других целях.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
Фигура 1: Морфометрический анализ (количество ветвей, количество листьев, высота побега, масса побега, длина корня, масса корня) растений Brachypodium distachyon (Bd2-1), обработанных В. subtilis FB17, по сравнению с контролями. Показано, что инокуляция В. subtilis FB17 увеличивает морфологию растения.
Фигура 2: Биохимический анализ растений Brachypodium distachyon, обработанных В.subtilis FB17, по сравнению с контролями, как измерено посредством общего содержания хлорофилла и каротиноидов. Показано, что инокуляция В.subtilis FB17 положительно влияет на способность растений накапливать энергию света.
Фигура 3: Количества B.subtilis FB17 и контролей, выделенных из почвы и корней Brachypodium distachyon. Это доказывает постоянство ассоциации с корнем В.subtilis FB17 инокулированных растений.
Фигура 4: Общий прирост биомассы у разных видов растений, обработанных В.subtilis FB17. Значительное увеличение (~28%) как надземной, так и корневой биомассы наблюдается у Z.mays (MO17).
Фигура 5: Количественные данные, отображающие увеличенную корневую биомассу и биомассу побегов у прошедших семенную обработку В.subtilis FB17 растений Z.mays MО-17.
Фигура 6: Количественные данные, отображающие увеличенные количества листьев у прошедших семенную обработку В.subtilis FB17 растений биоэнергетической культуры Brachypodium distachyon (генотип Bd2-1).
Фигура 7: Количественные данные, отображающие увеличенную корневую биомассу и биомассу побегов у прошедших семенную обработку В.subtilis FB17 растений биоэнергетической культуры Brachypodium distachyon (генотип Bd2-1).
Фигура 8: Количественные данные, отображающие увеличенную корневую биомассу и биомассу побегов у прошедших семенную обработку В.subtilis FB17 Zinnia sp.’Red Spider’.
Фигура 9: Количественные данные, отображающие увеличенную корневую биомассу и биомассу побегов у прошедших семенную обработку В.subtilis FB17 Zinnia sp.’Red Spider’.
Фигура 10: Общее содержание хлорофилла в растениях, обработанных В.subtilis FB17. Значительное увеличение общего содержание хлорофилла наблюдается у томата (14%), Z.mays CML10 (72%) и CML258 (87%) после обработки FB17.
Фигура 11: Общее содержание каротиноидов в растениях, обработанных В.subtilis FB17. Значительное увеличение общего содержания каротиноидов наблюдается у сои (31%) и Z.mays MO17 (82%) после обработки FB17.
Фигура 12: Количественные данные, отображающие увеличенную фотосинтетическую эффективность у прошедших семенную обработку В.subtilis FB17 растений МО17.
Фигура 13: Количественные данные, отображающие увеличенную фотосинтетическую эффективность у прошедших семенную обработку В.subtilis FB17 растений биоэнергетической культуры Brachypodium distachyon (генотип Bd2-1).
Фигура 14: Количественные данные, отображающие увеличенную фотосинтетическую эффективность у прошедших семенную обработку В.subtilis FB17 Zinnia sp.’Red Spider’.
Фигура 15: Количественные данные, отображающие увеличенную фотосинтетическую эффективность у прошедшей семенную обработку В.subtilis FB17 экзотической кукурузы CML 10 и CML 258.
Фигура 16: Повышение процента прорастания семян, обработанных В.subtilis FB17. Значительное увеличение общей доли процента прорастания наблюдается у томата (6%), Z.mays MO17 (2,1%) и CML258 (14%) после обработки FB17. В частности, сильно увеличилось прорастание экзотической кукурузы линии CML258.
Фигура 17: Скорость роста у Zea mays, обработанной В.subtilis FB17.
Фигура 18: Водоудерживающая способность у растений, обработанных В.subtilis FB17. Значительное увеличение общей водоудерживающей способности и задержания наблюдается у томата (2,1%) и Z.mays MO17 (3,5%) после обработки FB17.
Фигура 19: Засухоустойчивость у растений, обработанных В.subtilis FB17. Значительное увеличение скорости роста при воздействии засухой (отсутствием воды) наблюдается у MO17, то есть 37,5% увеличение по сравнению с подверженным стрессу, вызванному засухой (отсутствием воды), неинокулированным обработкой с контролем после обработки FB17.
Фигура 20: Семенная обработка В.subtilis FB17 снижает содержание лигнина в кукурузе. Значительное снижение общего содержания лигнина наблюдается у Z.mays (MО17=46%; CML10=64% и CML58=49%) после обработки FB17 при бесстрессовых условиях.
Фигура 21: Увеличение надземной и корневой биомассы у Oryza sativa (Nipponbare), обработанного В.subtilis FB17. Значительное увеличение общей биомассы наблюдается у О.sativa (рис; сорт Nipponbare) (более 200%) после обработки FB17.
Фигура 22: Концентрация железа, наблюдаемая у обработанных Bacillus subtilis FB17 растений риса по сравнению с необработанными растениями риса. Эти данные показывают, что инокуляция FB17 приводит к большему урожаю культур и более высоким концентрациям железа в рисовом зерне.
Фигура 23: Обобщение влияний В.subtilis FB17 на различные признаки у многочисленных видов растений.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Заявителями было обнаружено, что штамм стимулирующих рост растений ризобактерий (СРРР), Bacillus subtilis FB17, показывает удивительные эффекты, когда его применяют к растениям. В.subtilis штамм FB17 был первоначально выделен из корней свеклы столовой в Северной Америке (см. Fall et al. 2004 System Appli. Hicrobiol. 27: 372-379, включенный в данный документ посредством ссылки). Этот штамм был выделен из корня свеклы на основе его способности образовывать поверхностную биопленку и дендритный рост.
В частности, Bacillus subtilis FB17 обеспечил удивительное увеличение биомассы у филогенетически разнообразных растений, а также увеличенную фотосинтетическую эффективность и увеличенные скорости роста в условиях засухи. Применение Bacillus subtilis FB17 к растениям также привело к пониженной концентрации лигнина в растениях, что может обеспечить важные преимущества в области биоэнергетики, так как лигнин является одним из основных препятствий в превращении биомассы растений в биотопливо. Относительно растений риса Bacillus subtilis FB17 обеспечил удивительное увеличение концентрации железа в рисе, а также показал способность ослаблять рост пирикуляриоза риса, грибкового патогена, который уничтожает культуры риса во всем мире. Настоящее изобретение обеспечивает способы для увеличения биомассы, повышения засухоустойчивости, понижения содержания лигнина, повышения прорастания семян, повышения концентрации железа и увеличения устойчивости к патогенам у различных растений, особенно культур растений, таких как кукуруза, соя и рис. Настоящее изобретение также обеспечивает сельскохозяйственные носители и покрытия семян, содержащие Bacillus subtilis FB17.
Вариант осуществления настоящего изобретения обеспечивает способ для получения большей биомассы у растения, который включает применение Bacillus subtilis FB17 к растению, семени растения или почве, окружающей растение или семя, в количестве, эффективном для получения большей биомассы растения по сравнению с необработанным растением. Как используется в данном документе, биомасса растения относится к общей массе растительного материала. Если не установлено иное, биомасса включает как поверхностную биомассу (то есть надземную биомассу, включая без ограничения стебель, листья и/или зерно), так и подземную биомассу (то есть корни). Биомасса растения, к которому применяли Bacillus subtilis FB17, может быть измерена согласно известным способам. В одном варианте осуществления биомассу растения измеряют согласно сухой массе (СМ) растения в граммах.
Биомасса растения, к которому применяли Bacillus subtilis FB17, может быть измерена в момент времени, который находится в промежутке от примерно 7 дней до примерно 100 дней, от примерно 10 дней до примерно 75 дней или от примерно 15 дней до примерно 35 дней после применения Bacillus subtilis FB17 к растению. Альтернативно, биомасса культурного растения, к которому применяли Bacillus subtilis FB17, может быть измерена в то время, когда растение пожинают для сбора его зерна или продукции, то есть в то время, когда зрелое культурное растение, такое как кукуруза, соя или растение томата, убирают с поля. Например, культурное растение, к которому применяли Bacillus subtilis FB17, согласно способу настоящего изобретения дает большее количество общей поверхностной и подземной биомассы, как измерено в граммах сухой массы, в количестве по меньшей мере примерно на 1%, от примерно 5% до примерно 200%, от примерно 5% до примерно 100%, от примерно 7,5% до примерно 75%, от примерно 15% до примерно 60% или от примерно 30% до примерно 55% больше, чем необработанное растение. В одном варианте осуществления способ включает применение Bacillus subtilis FB17 к семени растения перед посевом семени в почву в количестве, эффективном для получения большей биомассы у растения, в количестве примерно на 5%-100% больше, чем у необработанного растения после применения Bacillus subtilis FB17. Например, как проиллюстрировано на фигуре 4, увеличение примерно на 28% надземной и корневой биомассы наблюдали у обработанной Bacillus subtilis FB17 кукурузе по сравнению с необработанной кукурузой спустя 15 дней после обработки.
Другой вариант осуществления настоящего изобретения обеспечивает способ для получения большей засухоустойчивости у растения, который включает применение Bacillus subtilis FB17 к растению, семени растения или почве, окружающей растение или семя, в количестве, эффективном для получения большей засухоустойчивости у растения по сравнению с необработанным растением. Засухой является отсутствие дождя или полива в течение периода времени, достаточного, чтобы исчерпать почвенную влагу и повредить растения. Стресс, вызванный засухой, возникает, когда потеря воды растением превышает способность корней растения впитывать воду и когда содержание воды в растении снижено достаточно, чтобы помешать нормальным процессам в растении. Растение отвечает на нехватку воды остановкой роста, уменьшением фотосинтеза и другими процессами растения, чтобы сократить потребление воды. Как используется в данном документе, засухоустойчивость относится к скорости роста растения за сутки при отсутствии воды, например, грамм за сутки увеличения биомассы растения, инокулированного Bacillus subtilis FB17, по сравнению с необработанным растением. Например, как проиллюстрировано на фигуре 19, семя растений кукурузы, обработанное Bacillus subtilis FB17, при отсутствии воды давало примерно на 37,5% большую скорость роста за сутки по сравнению с необработанными растениями 15 дней после обработки. В одном варианте осуществления способ включает применение Bacillus subtilis FB17 к растению, почве, окружающей растение, или семени растения перед посевом семени в почву в количестве, эффективном для получения большей засухоустойчивости у растения в количестве по меньшей мере примерно на 10% больше, чем у необработанного растения, после применения указанного Bacillus subtilis FB17.
Другой вариант осуществления настоящего изобретения обеспечивает способ получения пониженной концентрации лигнина в растении, который включает применение Bacillus subtilis FB17 к растению, семени растения или почве, окружающей растение или семя, в количестве, эффективном для получения пониженной концентрации лигнина в растении по сравнению с необработанным растением. Концентрация лигнина может быть измерена согласно известным способам. Например, как проиллюстрировано на фигуре 20, растения, обработанные Bacillus subtilis FB17, показывают от примерно 46% до примерно 64% уменьшения количества лигнифицированных клеток, наблюдаемых у необработанных растений. Лигнин является неотъемлемым компонентом растений и находится в стенках растительных клеток, а также между растительными клетками. Лигнин является одним из основных препятствий для превращения биомассы растений в биотопливо. Целлюлоза, другой компонент растения, в настоящее время является главным источником для биотоплива. В то время как целлюлоза легко ферментируется до спирта, лигнин не превращается при использовании существующих процессов ферментации и делает экстракцию ферментируемых сахаров сложной. Поэтому выгодно получить растения, которые имеют пониженную концентрацию лигнина. Настоящее изобретение обеспечивает биотопливо, которое получают путем превращения любой из биомасс растения (например, всей биомассы растения или любой части биомассы растения), к которому применяли Bacillus subtilis FB17 согласно любому из способов настоящего изобретения, в биотопливо. Биомасса растения, к которому применяли Bacillus subtilis FB17, может быть превращена в биотопливо любым известным способом, таким как ферментация сахарных компонентов растения.
Другой вариант осуществления настоящего изобретения обеспечивает способ для увеличения скорости прорастания семян у растений, который включает применение Bacillus subtilis FB17 к растениям, семенам растений или почве, окружающей растения или семена растений, в количестве, эффективном для повышения прорастания семян растений по сравнению с необработанными растениями. Например, как проиллюстрировано на рисунке 16, повышение общих процентов прорастания наблюдали у томата и растений кукурузы после применения Bacillus subtilis FB17.
Другой вариант осуществления настоящего изобретения обеспечивает способ получения большей концентрации железа в растении, особенно растении риса, который включает применение Bacillus subtilis FB17 к растению, семени растения или почве, окружающей растение или семя, в количестве, эффективном для получения большей концентрации железа в растении по сравнению с необработанным растением. Поскольку недостаток железа является одним из наиболее широко распространенных недостатков микроэлементов у людей, и рис является наиболее важным основным продуктом питания для большой части населения мира, растения риса, полученные согласно способам настоящего изобретения, могут обеспечить важные питатательные преимущества во всем мире. Концентрация железа в растении, к которому применяли Bacillus subtilis FB17, может быть измерена согласно известным способам, включая атомно-эмиссионную спектрометрию с индуктивно связанной плазмой (ICP-AES), масс-спектрометрию с индуктивно связанной плазмой (ICP-MS) или другие стандартные способы. В одном варианте осуществления концентрация железа растения измеряется согласно миллиграммам железа на килограмм сухой массы растения. Как проиллюстрировано на фигуре 22, увеличение содержания железа приблизительно на 81% наблюдали у обработанных FB17 растений риса по сравнению с необработанными растениями, как измерено в мг железа на кг сухой массы растения.
Подходящие растения риса для применения в настоящем изобретении включают Oryza sativa, Oryza glaberrima, и все подвиды и сорта такого. Концентрация железа растения риса, к которому применяли Bacillus subtilis FB17, может быть измерена в то время, когда рис пожинают для сбора его зерна или продукции, то есть в то время, когда зрелые рисовые зерна убирают с поля. Альтернативно, концентрация железа растения риса, к которому применяли Bacillus subtilis FB17 17, может быть измерена в момент времени, например, от примерно одной недели до примерно пяти месяцев, предпочтительно примерно в три месяца после применения Bacillus subtilis FB17 к растению риса. Растение риса, к котрому применяли Bacillus subtilis FB17, согласно способу настоящего изобретения дает большее количество железа, как измерено, например, в граммах железа на грамм сухой массы поверхностной и подземной биомассы растения риса.
Например, растение риса, к которому применяли Bacillus subtilis FB17, согласно способу настоящего изобретения дает большее количество железа в сухой массе поверхностной и подземной биомассы растения риса в количестве, которое составляет по меньшей мере примерно на 5%, от примерно 10% до примерно 200%, от примерно 25% до примерно 150%, от примерно 50% до примерно 100%, от примерно 70% до примерно 90%, от примерно 75% до примерно 85%, или примерно на 80% больше, чем необработанное растение. Например, в одном варианте осуществления способ включает применение Bacillus subtilis FB17 к рисовому семени до посева рисового семени в почву в количестве, эффективном для получения большей концентрации железа в растении риса, в количестве по меньшей мере примерно на 25% больше, чем в необработанном растении, после введения указанного Bacillus subtilis FB17.
Другой вариант осуществления настоящего изобретения обеспечивает способ для ингибирования инфекции растения грибковым патогеном, который включает применение Bacillus subtilis FB17 к растению, семени растения или почве, окружающей растение или семя, в количестве, эффективном для ингибирования инфекции растения грибковым патогеном по сравнению с необработанным растением. Примеры растений включают растения риса и ячменя, такие как сорт риса Nipponbare. В особом варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает способы для ингибирования инфекции растения риса грибковым патогеном, особенно пирикуляриозом риса, который включает применение Bacillus subtilis FB17 к растению риса, семени растения риса или почве, окружающей растение риса или семя, в количестве, эффективном для ингибирования инфекции растения риса грибковым патогеном по сравнению с необработанным растением риса. Как используется в данном документе, "пирикуляриоз риса" относится к фитопатологическим грибам Hagnaporthe grisea или Magnaporthe oryzae.
7
9
8
Признаки пирикуляриоза риса включают повреждения или пятна (которые могут быть, например, белыми или серыми), образующиеся на любой части растения, особенно на надземных или поверхностных частях растения, таких как листья. Как используется в данном документе, "ингибирование инфекции" относится к возникновению ослабленной грибковой инфекции в растении риса, как измерено путем уменьшения симптомов грибковой инфекции, например, уменьшаемым количеством повреждений на надземных частях растения риса по сравнению с необработанным растением или уменьшаемым размером некоторых или всех повреждений. Например, в особых вариантах осуществления Bacillus subtilis FB17 применяют к растению риса, семени растения риса или почве, окружающей растение риса или семя, в количестве, эффективном для уменьшения количества повреждений на растении риса, вызванных пирикуляриозом риса, от примерно 5% до примерно 100%, от примерно 10% до примерно 80%, от примерно 20% до примерно 60% или от примерно 25% до примерно 45% по сравнению с необработанным растением риса. Не будучи связанным с любой теорией, считается, что В.subtilis FB17 образует противогрибковое летучее соединение, которое ослабляет или ингибирует рост М.oryzae. В особых вариантах осуществления, чтобы ингибировать рост пирикуляриоза риса и инфекцию растения риса, к семени риса применяют Bacillus subtilis FB17 в количестве от примерно 1×10 КОЕ/семя до примерно 1×10 КОЕ/семя, более предпочтительно примерно 1×10 КОЕ/семя, а затем семя высевают в почву.
Как используется в данном документе, "необработанное растение" относится к растению того самого вида и выращенному по сути при тех самых условиях (например, в течение того самого количества времени, в том самом климате, и культивируемому согласно тем самым способам, применяя те же самые материалы, с биомассой, засухоустойчивостью, концентрацией лигнина, концентрацией железа, грибковой инфекцией и другими параметрами, измеряемыми согласно тем самым способам), что и растение, к которому применяли Bacillus subtilis FB17, согласно способу настоящего изобретения, за исключением того, что к необработанному растению не применяли Bacillus subtilis FB17. Как используется в данном документе, характеристика растения, к которому применяли Bacillus subtilis FB17, такая как большая биомасса, большая засухоустойчивость, пониженная концентрация лигнина, большая концентрация железа или пониженная грибковая инфекция по сравнению с необработанным растением относится к большей биомассе, большей засухоустойчивости, пониженной концентрации лигнина, большей концентрации железа или пониженной грибковой инфекции, как измерено в тот самый момент времени, соответственно.
6
9
7
8
В определенных вариантах осуществления способов, описанных в данном документе, Bacillus subtilis FB17 применяют к семени в количестве от примерно 1 мл/кг инокулята Bacillus subtilis FB17 (то есть 1 мл/кг 0,5 оптической плотности (ОП) Bacillus subtilis FB17, выращенного за ночь в среде LB, как измерено с применением спектрофотометра SmartSpec Bio Rad при длине волны 600 нм) до примерно 50 мл/кг, предпочтительно от примерно 5 мл/кг до примерно 25 мл/кг, более предпочтительно от примерно 10 мл/кг до примерно 15 мл/кг, наиболее предпочтительно примерно 12,5 мл/кг. В альтернативных вариантах осуществления Bacillus subtilis FB17 применяют к семени в количестве от примерно 1×10 КОЕ/семя до примерно 1×10 КОЕ/семя, более предпочтительно от примерно 1×10 КОЕ/семя до примерно 1×10 КОЕ/семя.
Способы настоящего изобретения можно применять для обработки многих типов растений (а также их семян или окружающей почвы), чтобы увеличить биомассу, повысить засухоустойчивость, понизить содержание лигнина, повысить прорастание семян, увеличить концентрацию железа и повысить устойчивость к патогенам. Растения могут включать однодольные или двудольные. В частности, растения могут включать культуры, такие как кукуруза, соя, томат, рис или ячмень. Дополнительные примеры растений, которые можно обрабатывать согласно способам настоящего изобретения, включают Arabidopsis thaliana и Zinnia, а также биоэнергетические культурные растения, то есть растения, которые в настоящее время используют или имеют потенциал быть используемыми в качестве источников биоэнергии (например, растения, которые полезны в производстве биотоплива), такие как Brachypodium distachyon.
Согласно настоящему изобретению Bacillus subtilis FB17 можно применять к растению любым известным способом, где обрабатывают все растение или часть растения, например, корневой, семенной или лиственной инокуляцией. Например, Bacillus subtilis FB17 можно применять к надземным частям растения, таким как листья и стебель, к корням растения, к семени растения до посева семени в почву, или к почве, окружающей растение или семя растения. Способы применения включают орошение, распыление, покрытие, инъекцию или другие способы, известные специалистам в данной области. Как используется в данном документе, применение Bacillus subtilis FB17 относится к любому из однократного применения, многократного применения (то есть применение Bacillus subtilis FB17 больше чем один раз), или непрерывного применения. Bacillus subtilis FB17 можно применять в любой момент жизненного цикла растения (например, до или после прорастания). Например, Bacillus subtilis FB17 можно применять к семени растения до посева семени в почву и до прорастания. Альтернативно Bacillus subtilis FB17 можно применять к растению, семени растения или почве, окружающей растение, после того как произошло прорастание. После применения Bacillus subtilis FB17 семена могут быть высеяны в почву и культивированы с применением обычных способов для генерирования роста растения.
6
9
7
8
Согласно вариантам осуществления настоящего изобретения Bacillus subtilis FB17 можно применять к растению, семени растения или почве как отдельно, так и в смеси с другими материалами. Например, Bacillus subtilis FB17 можно применять в составе, который состоит по сути из Bacillus subtilis FB17 в питательной среде без каких-либо дополнительных добавок или материалов. Альтернативно Bacillus subtilis FB17 можно применять в составе, который включает Bacillus subtilis FB17 в питательной среде, носитель, такой как вода, водный раствор или порошок. Питательная среда, носитель, водный раствор или порошок могут содержать дополнительные добавки, такие как инсектицид или фунгицид. Альтернативно Bacillus subtilis FB17 можно применять раздельно с другими добавками или материалами, применяемыми в разное время. В определенных вариантах осуществления Bacillus subtilis FB17 применяют в составе, который включает Bacillus subtilis FB17 в количестве от примерно 1 мл/кг (то есть 1 мл/кг 0,5 оптической плотности (ОП) Bacillus subtilis FB17, выращенного за ночь в среде LB, как измерено с применением спектрофотометра SmartSpec Bio Rad при длине волны 600 нм) до примерно 50 мл/кг, предпочтительно от примерно 5 мл/кг до примерно 25 мл/кг, более предпочтительно от примерно 10 мл/кг до примерно 15 мл/кг, наиболее предпочтительно примерно 12,5 мл/кг. В альтернативных вариантах осуществления Bacillus subtilis FB17 применяют в составе, который включает Bacillus subtilis FB17 в количестве от примерно 1×10 КОЕ/семя до примерно 1×10 КОЕ/семя, более предпочтительно от примерно 1×10 КОЕ/семя до примерно 1×10 КОЕ/семя.
6
8
7
Настоящее изобретение дополнительно обеспечивает сельскохозяйственные носители, включающие Bacillus subtilis FB17, которые можно применять к растениям (например, корням), к почве, окружающей растения, или к семенам до посева, а также покрытия семян, включающие Bacillus subtilis FB17, которые можно применить к семенам растений. Настоящее изобретение также обеспечивает семя растения, предпочтительно семя культурного растения (например, семя растения кукурузы, растения сои, растения риса, растения томата или биоэнергетической культуры, такой как Brachypodium distachyon), которое покрыто Bacillus subtilis FB17 так, что все семя или часть семени имеет покрытие или пленку, включающую Bacillus subtilis FB17. Сельскохозяйственный носитель может включать Bacillus subtilis FB17 в количестве от примерно 1 мл/кг инокулята Bacillus subtilis FB17 (то есть 1 мл/кг 0,5 оптической плотности (ОП) Bacillus subtilis FB17, выращенного за ночь в среде LB, как измерено с применением спектрофотометра SmartSpec Bio Rad при длине волны 600 нм) до примерно 50 мл/кг, от примерно 5 мл/кг до примерно 25 мл/кг, от примерно 10 мл/кг до примерно 15 мл/кг или примерно 12,5 мл/кг. Покрытие семени может включать Bacillus subtilis FB17 в количестве от примерно 1×10 КОЕ/семя до примерно 1×10 КОЕ/семя, более предпочтительно примерно 1×10 КОЕ/семя. Сельскохозяйственный носитель и покрытие семени могут каждый состоять по сути из Bacillus subtilis FB17 в питательной среде без каких-либо дополнительных добавок или материалов. Альтернативно, сельскохозяйственный носитель и покрытие семени могут каждый включать Bacillus subtilis FB17 в питательной среде, такой как вода, водный раствор или порошок. Питательная среда, водный раствор или порошок могут содержать дополнительные добавки, такие как инсектицид или фунгицид.
У настоящего изобретения есть как основное, так и приложенное применения. В широком смысле можно применять способы, описанные в данном документе, для увеличения биомассы (например, в альтернативных видах растений, используемых для биотоплива, или для воздействия на потенциально возможный урожай культурных растений) и придания повышенной засухоустойчивости. По сравнению с трансгенными подходами такие способы непосредственно применимы к любому растению, без времени, необходимого для генной идентификации, генерации и характеристики трансгенных линий, и являются независимыми от нормативных и социальных вопросов, связанных с применением трансгенов. По сравнению с использованием традиционных агрономических приемов (применениями химических удобрений и воды) способы, описанные в данном изобретении, являются менее ресурсоемкими и трудоемкими для фермера и более безвредными для окружающей среды. Кроме того, применение химических удобрений, как известно, усиливает восприимчивость культуры к болезни индукцией быстро ослабленного роста, тогда как растения, выращенные по данному способу, не демонстрируют увеличенной восприимчивости к болезням. По сравнению с другими ризобактериями, которые применяют для обработки семян, FB17 предусматривает малые инокуляты для предоставления выгодных результатов. Наконец, такие способы совместимы с практиками органического земледелия, тогда как другие способы, описанные выше (например, применение химических удобрений), - нет.
Депонирование В. subtilis штамма FB17 было доступно с 1 марта 2010 в Delaware Biotechnology Institute, 15 Innovation way, Room # 145, Newark, DE 19711. Депонирование В.subtilis штамма FB17 будет осуществляться из Американской коллекции типовых культур (АТСС), 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209 США. Доступ к этому депонированному штамму АТСС будет возможен во время нахождения заявки на рассмотрении специальным уполномоченным по патентам и торговым маркам и лицами, выбранными специальным уполномоченным быть правомочными кроме него по требованию. Депонированный штамм будет поддерживаться в депозитарии АТСС, который является общественным депозитарием, в течение 30 лет или 5 лет после самого последнего запроса, или в течение имеющего законную силу срока действия патента, в зависимости от того, какой дольше, и будет восстановлен, если станет нежизнеспособным во время этого периода. Депонированный штамм будет доступен, как требуется иностранными патентными правами в странах, в которых поданы аналоги заявок по такому же объекту, или его обновленные версии.
Далее, объект депонирования будет храниться и будет доступен общественности в соответствии с положениями Будапештского соглашения закладки микроорганизмов, то есть он будет храниться со всей необходимой осторожностью, чтобы поддерживать его жизнеспособным и неконтаминированным в течение по меньшей мере пяти лет после самого последнего запроса касательно предоставления образца депонирования, но в любом случае, в течение по меньшей мере тридцати (30) лет после даты депонирования или касательно имеющего законную силу срока действия любого патента, в котором могут опубликовать раскрытие культуры.
Следующие примеры обеспечены для описания настоящего изобретения более подробно и предназначены для иллюстрирования, без ограничения, настоящего изобретения. "UD10-22", как указано на некоторых фигурах, описанных ниже, относиться к Bacillus subtilis FB17.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
Brachypodium distachyon и растения кукурузы проращивали и выращивали в течение 21 дня. Один раз в 5 дней (3 раза) добавляли по 5 мл 0,5 ОП В.subtilis FB17 на вегетационный сосуд. Для контроля добавляли 5 мл 0,5 ОП Е.coli ОР50 на вегетационный сосуд. FB17 и ОР50 выращивали в течение ночи в питательной среде LB и оптическую плотность (ОП) получали с использованием спектрофотометра SmartSpec (Bio Rad) при длине волны (600 нм). Спустя десять дней после последней обработки растения подвергали анализу. Контроли, описанные во всех экспериментах в данном документе, относятся к растениям, которые не обрабатывали бактериями или которые обрабатывали Е.coli ОР50.
Brachypodium distachyon (Bd2-1) и растения кукурузы, обработанные В.subtilis FB17, бактериальный контроль по Е.coli, или ложная обработка, выращивали в 4×4 дюймових вегетационных сосудах при стандартных условиях (22-25°С, 60% влажность, 16 ч световой - 8 ч темновой фотопериод) в течение 30 дней после обработки. Надземная и корневая биомассы энергетической культуры В.distachyon увеличилась в случае обработки FB17. На фигуре 1 показано, что биомасса В. distachyon, обработанного FB17, была увеличена на статистическом уровне. На фигуре 2 отображено увеличение фотосинтетической эффективности, наблюдаемой у В.distachyon, прошедшего обработку FB17. В.distachyon, обработанный FB17, содержал больше хлорофилла и общее содержание каротиноидов, чем контроли, показывая сильную жизнеспособность растения. На фигуре 3 показаны количества FB17, выделенные из почвы, окружающей корни В.distachyon. Фигура показывает, что FB17 связана гораздо более сильно с корнями В. distachyon по сравнению с Е.coli, говоря об истинной ризобактериальной природе FB17.
Растения кукурузы также показали увеличение надземной и корневой биомассы после 30-дневного роста после обработки В. subtilis FB17, бактериальный контроль по Е.coli ОР50 или имитирующий обработку.
Пример 2
Семена Arabidopsis thaliana проращивали и выращивали в течение 21 дня. Один раз в 5 дней (3 раза) добавляли 5 мл 0,5 ОП В.subtilis FB17 на вегетационный сосуд. Для контроля добавляли 5 мл 0,5 ОП Е.coli ОР50 на вегетационный сосуд. FB17 и ОР50 выращивали в течение ночи в питательной среде LB и оптическую плотность (ОП) получали с использованием спектрофотометра SmartSpec (Bio Rad) при длине волны (600 нм). Спустя десять дней после последней обработки растения подвергали засухе (то есть не добавляли воду) при 25°С с 40% влажностью в течение 4 недель. Спустя тридцать дней после обработки засуху оценивали по потере стоячего зеленого фенотипа у необработанных растений по сравнению с обработанными FB17 растениями, указывая на то, что FB17 придает повышенную засухоустойчивость Arabidopsis.
Пример 3
Обработка семени В.subtilis FB17 способствует увеличению биомассы у кукурузы МО17, CML258, CML10, Zinnia и Brachypodium distachyon.
7
Для проверки влияниия В.subtilis FB17 на увеличение биомассы у кукурузы (МО17, CML258, CML10), сои (Will-82), томата (Solanum lycopersicum), Zinnia и Brachypodium distachyon (модель энергетической культуры) осуществляли семенную обработку 50 семян (n=50) каждого вида растений В.subtilis FB17 (примерно 1×10 КОЕ/семя или 12,5 мл/кг 0,5 оптической плотности (ОП) Bacillus subtilis FB17, выращенного за ночь в среде LB, как измерено с применением спектрофотометра SmartSpec Bio Rad при длине волны 600 нм). После семенной обработки семена по отдельности высевали в вегетационные сосуды (4×4 дюйма) с почвенной смесью для изучения прорастания и биомассы. Интересно, что обработка семени В.subtilis FB17 способствовала росту корня и побега у всех исследуемых видов культур. Измерения проводили 15 дней после обработки.
Семенная обработка растений способствовала увеличенной корневой биомассе, что привело к более густым корневым системам, а не к увеличенной длине корня. Более густая корневая система возникает из прибавленных боковых корней и корневых волосков, обеспечивающих более доступное поглощение воды и питательных веществ.
Zea mays var. CML258 имела своим результатом примерно 16% увеличение надземной биомассы (г СМ) по сравнению с контролем. Zea mays var. CML10 имела своим результатом примерно 9% увеличение надземной биомассы (г СМ) по сравнению с контролем. Zea mays var. MО17 имела своим результатом примерно 38% увеличение надземной биомассы (г СМ) по сравнению с контролем. Brachypodium имел своим результатом примерно 40% надземной биомассы (г СМ) по сравнению с контролем. Значительное увеличение примерно на 28% общей надземной и корневой биомассы наблюдали у Z.mays (МО17) по сравнению с контролем. На фигуре 4 проиллюстрирован общий прирост биомассы у растений, обработанных В.subtilis FB17.
На фигуре 5 показаны количественные данные, отображающие увеличенную корневую биомассу и биомассу побегов у прошедших семенную обработку В.subtilis FB17 растений MО17. На фигуре 6 показаны количественные данные, отображающие увеличенные количества листьев у прошедших семенную обработку В.subtilis FB17 растений биоэнергетической культуры Brachypodium distachyon (генотип Bd2-1). На фигуре 7 показаны количественные данные, отображающие увеличенную корневую биомассу и биомассу побегов у прошедших семенную обработку В.subtilis FB17 растений биоэнергетической культуры Brachypodium distachyon (генотип Bd2-1). На фигурах 8 и 9 показаны количественные данные, отображающие увеличенную корневую биомассу и биомассу побегов у прошедшей семенную обработку В.subtilis FB17 Zinnia sp.’Red Spider’.
Пример 4
Семенная обработка В.subtilis FB17 способствует фотосинтетической эффективности у кукурузы и томата.
Для проверки влияниия В.subtilis FB17 на фотосинтетическую эффективность у кукурузы (МО17, CML258, CML10), сои (Will-82), томата (Solarium lycopersicum}, Zinnia и Brachypodium (модель энергетической культуры) осуществляли семенную обработку 50 семян (n=50) каждого вида растений В. subtilis FB17 (12,5 мл/кг или 1е7 КОЕ/семя). Листья спустя 15-32 дней после обработки собирали и подвергали анализу на общее содержание хлорофилла. Результаты показали, что инокулированные В.subtilis FB17 растения кукурузы и томатов (линии томатов и экзотические линии кукурузы CML258 и CML10) показали увеличенное содержание хлорофилла и каротиноидов по сравнению с необработанными образцами, как отображено на фигурах 10 и 11.
Увеличенные значения общего хлорофилла имеют потенциал способствовать повышенной мощности и биомассе, как наблюдается с CML258 и CML10. Общее содержание хлорофилла у инокулированных семян томатов В.subtilis FB17 имело своим результатом увеличение примерно на 14%. Еще более значительными являются экзотические линии кукурузы CML258 и CML10 с увеличением примерно на 87% и увеличением примерно на 72%, соответственно.
Хотя имеет место увеличение общего содержания хлорофилла, это не означает, что общее содержание каротиноидов будет также соответствовать увеличенному значению. У инокулируемых B.subtilis FB17 томатов и Zinnia был значительно снижен общий процент каротиноидов по сравнению с необработанными семенами. У кукурузы CML258 и CML10 были значительно увеличены общие проценты каротиноидов, в то время как соя, кукуруза МО17 и Brachypodium не показали статистически достоверную разницу между обработанными и необработанными семенами.
На фигуре 12 показаны количественные данные, отображающие увеличенную фотосинтетическую эффективность у прошедших семенную обработку В.subtilis FB17 растений МО17. На фигуре 13 показаны количественные данные, отображающие увеличенную фотосинтетическую эффективность у прошедших семенную обработку В.subtilis FB17 растений биоэнергетической культуры Brachypodium distachyon (генотип Bd2-1). На фигуре 14 показаны количественные данные, отображающие увеличенную фотосинтетическую эффективность у прошедшей семенную обработку В.subtilis FB17 Zinnia sp.’Red Spider’. На фигуре 15 показаны количественные данные, отображающие увеличенную фотосинтетическую эффективность у прошедших семенную обработку В. subtilis FB17 экзотической кукурузы CML 10 и CML 258.
Пример 5
Семенная обработка В.subtilis FB17 способствует прорастанию растений кукурузы и томатов.
Для проверки влияниия В.subtilis FB17 на увеличение процента прорастания у кукурузы (МО17, CML258, CML10), сои (Will-82), томатов (Solarium lycopersicum), Zinnia и Brachypodium (модель энергетической культуры) осуществляли семенную обработку 50 семян (n=50) каждого вида растений В.subtilis FB17 (12,5 мл/кг или 1е7 КОЕ/семя). Последние проценты прорастания оценивали 8 дней после даты посева. Результаты показали, что обработка В.subtilis FB17 способствует статистически достоверному ответу прорастания у томатов и кукурузы, как показано на фигуре 16.
Обработанные B.subtilis FB17 семена томатов и экзотической кукурузы линии CML 258 имели 5,9% и 14% увеличение процента прорастания, соответственно.
Семенная обработка В.subtilis FB17 имела нейтральный и положительный эффекты относительно всех протестированных видов культур. Если применяли семенную обработку, статистически отрицательного ответа в отношении процента прорастания не было.
Пример 6
Для проверки влияниия В.subtilis FB17 на кукурузу (МО17, CML258, CML10), сою (Will-82), томаты(Solanum lycopersicum), Zinnia и Brachypodium (модель энергетической культуры) осуществляли семенную обработку 50 семян (n=50) каждого вида растений В.subtilis FB17 (1е7 КОЕ/семя или 12,5 мл/кг 0,5 оптической плотности (ОП) Bacillus subtilis FB17, выращенного за ночь в среде LB, как измерено с применением спектрофотометра SmartSpec Bio Rad при длине волны 600 нм). После семенной обработки семена по отдельности высевали в вегетационные сосуды (4×4 дюйма). Измерения проводили спустя 15 дней после обработки. На фигуре 17 показана скорость роста Zea mays после обработки В.subtilis FB17. На фигуре 18 показана водоудерживающая способность у растений, обработанных В.subtilis FB17. Значительное увеличение общей водоудерживающей способности и задержания наблюдали у томатов (2,1%) и Z.mays MO17 (3,5%) после обработки FB17. На фигуре 19 показана засухоустойчивость растений, обработанных В.subtilis FB17. Значительное увеличение скоростей роста при воздействии засухой наблюдали у MO17 (37,5% увеличение относительно не обработанного водой контроля) после обработки FB17. На фигуре 20 показано, что семенная обработка В.subtilis FB17 снижает содержание лигнина в кукурузе. Значительное снижение общего содержания лигнина наблюдали у Z.mays (примерно 46% снижение у MO17; примерно 64% снижение у CML10 и примерно 49% снижение у CML58) после обработки FB17.
Пример 7
8
На фигуре 21 показано увеличение надземной и корневой биомассы у растений риса, Oryza sativa (Nipponbare), обработанных В.subtilis FB17, спустя 60 дней после инокуляции. Ночные культуры FB17, выращенные в LB, использовали для создания инокулята 10 клеток на мл. Четырехнедельные растения риса (сорт Nipponbare), выращенные методом гидропоники, использованы для добавления FB17. Растения риса, к которым применяли В. subtilis FB17, показали примерно 200% увеличение биомассы по сравнению с необработанными растениями риса.
Пример 8
Чтобы оценить, колонизирует ли Bacillus subtilis FB17 корни риса, растения риса (сорт Nipponbare) инокулировали Bacillus subtilis FB17 и корни растений риса осматривали спустя 96 часов после инокуляции путем лазерной сканирующей конфокальной микроскопии. Наблюдения подтвердили, что полезные ризобактерии (Bacillus subtilis FB17) образуют биопленку у растений. В частности, данные показывают, что Bacillus subtilis FB17 успешно колонизирует корни риса после 96 часов от обработки, указывая на то, что корни риса содействуют колонизации полезными микробами.
Чтобы оценить, причиняет ли ризобактериальная обработка растений риса какие-либо изменения в устьичной апертуре, заявители подвергли анализу растения риса, обработанные ризобактериями. Результаты показали, что ризобактериальная обработка риса Bacillus subtilis FB17 сильно уменьшила устьичную апертуру у обработанных растений риса (сорт Nipponbare). В случае обработки Bacillus subtilis FB17 замыкающие клетки осматривали спустя 1 неделю после добавления Bacillus subtilis FB17. Такие результаты предполагают, что В.subtilis FB17 (Bacillus subtilis FB17) причиняет общий ответ закрытости устьиц как у однодольных, так и у двудольных растений, как доказано и с A.thaliana, и с рисом.
Чтобы оценить, ослабляет ли Bacillus subtilis FB17 рост пирикуляриоза риса, заявители подвергли Magnaporthe oryzae культурам Bacillus subtilis FB17. Чашки качественного отделения и количественные данные показали, что Bacillus subtilis FB17 снизили рост Н.oryzae, как показано сниженным радиальным ростом у грибковой культуры, подвергнутой действию Bacillus subtilis FB17. Сравнение с контролями (TY и LB) показывает степень, до которой патоген вырос бы без обработки. Как показано в таблице 1, Bacillus subtilis FB17 задерживает рост М.oryzae на примерно 25% in vitro. Такие результаты предполагают, что В.subtilis FB17 вырабатывает противогрибковое летучее соединение, которое может ослабить или ингибировать рост Н.oryzae.
Таблица 1
Обработка
Средний диаметр грибковой колонии (см)
Процент грибкового роста относительно контрольной обработки
TY контроль
3,175
100
LB контроль
3,098
100
Bacillus subtilis FB17
2,342
75,59
Bacillus subtilis FB17 индуцировал системную сопротивляемость у риса и ячменя к Magnaporthe oryzae. Как у растений риса, так и растений ячменя, подверженных M.Oryzae, уменьшилось образование повреждений на листьях риса и семядолях ячменя, соответственно, РВ17-обработанных растений по сравнению с контролями, как показано в таблице 2 ("инфицированный" определяли как лист, имеющий по меньшей мере одно типичное ромбовидное повреждение вредителя на нем).
Таблица 2
# инфицированные листья
Всего # повреждений
Ничего/Мо
3
23
FB17/Mo
5
13
Пример 9
Чтобы оценить, увеличивает ли Bacillus subtilis FB17 обогащение железом риса, заявители проанализировали общее содержание железа в листьях риса, корнях и зернах растений, которым добавляли Bacillus subtilis FB17, используя атомно-эмиссионную спектрометрию с индуктивно связанной плазмой (ICP-AES). Результаты показали, что добавка Bacillus subtilis FB17 к рису помогает мобилизировать железо в растении, то есть важный элемент-железо активно поглощается растением, где он используется для роста и развития растения. Как показано на фигуре, увеличение содержания железа на 22, 81% наблюдали у FB17-обработанных растений риса по сравнению с необработанными контролями, как измерено в мг железа на кг сухой массы растения ("UD1022," как установлено на фигуре 1, относится к Bacillus subtilis FB17). Таким образом, применение Bacillus subtilis FB17 к растению, особенно к растению риса, может существенно увеличить питательную ценность продукта питания путем увеличения концентрации железа в продукте питания.
Фигура 23 обобщает влияния В.subtilis FB17 на различные признаки в многочисленных видах растений, описанных выше,
Несмотря на то, что настоящее изобретение было описано в соединении с определенными вариантами осуществления, должно быть понятно, что изобретение, как заявлено, не должно быть чрезмерно ограничено такими определенными вариантами осуществления. Действительно, различные модификации и вариации описанных составов и способов настоящего изобретения будут очевидны для специалистов в данной области и предназначены находиться в объеме прилагаемой формулы изобретения.