Анализ имована в биологических субстратах

пература 100°С в течение 1 мин, затем нагревание со скоростью 10°С/мин до 210оС и выдержкой при конечной температуре 8 мин. Температура испарителя 210°С. Температура детектора 240°С. Скорость потока газа-носителя азота- 60, водорода-120, воздуха- 600 мл/мин. Регистрацию хроматограммы проводят на ПЭВМ.

Предварительное исследование проводится на набивной металлической колонке с неподвижной жидкой фазой "Carbowax 1500". При этом для ацетона в скрининговом исследовании имеется абсолютная калибровка для предварительной количественной оценки его содержания в крови, моче, либо содержимом желудка. Абсолютные калибровки так же построены для метанола, этанола, н-пропанола, н-бутанола, изо-бутанола и толуола. Идентификация проводится по временам удерживания и индексам удерживания относительно нормальных спиртов С1-С5. При идентификации летучих веществ, входящих в таблицу компонентов, и/или при обнаружении ацетона в количествах превышающих 40 мг/ л проводится подтверждающее исследование на набивной колонке заполненной полимерным сорбентом "Рогарак Q" отдельно приготовленной пробы. В случае подтверждения наличия ацетона, н-бутилового, изо-бу-тилового спиртов проводится количественное опреде-

ление для двух проб крови на колонке "Carbowax 1500" с использованием метода внутреннего стандарта, где в качестве внутреннего стандарта выступает н-пропанол. Времена удерживания и индексы удерживания приведены в таблицах 1 и 2. При анализе параметров удерживания для колонки "Porapak Q" более удобно использовать индексы удерживания относительно н-алкилаце-татов, которые перекрывают весь диапазон определяемых летучих веществ и разбивают этот диапазон на равномерные участки.

Данная схема исследования позволяет определить либо исключить основные растворители, наиболее часто являющиеся причиной отравлений. Предельные эксплуатационные температуры колонок позволяют использовать для анализа один хроматограф, имеющий два пламенно-ионизационных детектора. В результате такой подход позволяет сочетать два метода газожидкостную игазо-адсорбционнуюхроматографии,что соответствует современным требованиям судебно-химического исследования в части применения для предварительного и подтверждающего исследования двухметодов основанныхна различных физико-химических принципах. Еще одним плюсом, использования колонки с сорбентом "Porapak Q", является возможность проводить разделение, а так же определение глико-лей и алканов, включаяметан, пропан и гексан.

© Ю.А. Хомов, Н.В. Кокшарова, М. Дайех, В.П. Гаранин, 2004 УДК 340.67.615.212.7.074

Ю.А. Хомов, Н.В. Кокшарова, М. Дайех, В.П. Гаранин АНАЛИЗ ИМОВАНА В БИОЛОГИЧЕСКИХ СУБСТРАТАХ

Пермская государственная фармацевтическая академия

В продолжение исследований по разработке химикотоксикологического анализа имована [5] в данном сообщении приводятся результаты прогнозирования и экспериментального изучения экстрагируемости имована различными органическими растворителями в зависимости от рН среды, а также методики изолирования и определения его в биологических объектах.

Для решения вопроса максимального выделения соединения из объектов анализа очень важен процесс прогнозирования оптимальных условий его экстракции, среди которых важнейшее значение имеет показатель ионизации и природа используемого неполярного растворителя.

Результаты расчетов рКа и log P имована были получены с использованием "ACD/I-Lab Service" (Advanced Chemistry Development Inc., Toronto, Canada) по программам ACD/LogP v4.5, ACD/pKa v4.56, ACD/LogD v4.56, ACD/ Aqueous Solubility v4.0ACD/ Adsorption Coefficientv4.0. рКа имована составляет 7,11±0,50; log P -1,64±0,69.

При теоретическом расчете степени ионизации имована в процентах при различных значения рН 1-14 (с помощью программы на ПК [6]) установлено, что при рН 1 -4 исследуемое соединение полностью ионизировано. Начиная с рН 5 появляется его молекулярная форма, которая достигает 100% при рН 9-10. Поэтому сделано предположение, что при химико-токсикологических анализах максимальная экстракция имована органическими растворителями из водных извлечений должна достигаться при рН 9. Степень ионизации имована при этом минимальна. Процент ионизации составляет 1,17.

Далее было проведено экспериментальное подтверждение теоретических предположений. Для чего использовали универсальные буферные растворы Бриттона и Робинсона и свежеперегнанные растворители: хлороформ, хлористый метилен, бензол, гексан. Растворители, имеющие величину диэлектрической проницаемости большую, чем у хлороформа не исследовались в связи с их значительной смешиваемостью с водой. Значение рН определяли универсальным иономером ЭВ-74, количественное определение проводили УФ спектрофотометрически. Как показали экспериментальные данные имован экстрагируется органическими растворителями, достигая максимума при рН 8-9 хлористым метиленом - 99,82%, хлороформом - 99,60%, бензолом - 99,52%. В этих же условиях процент экстракции имована гексаном составляет - 12,60% .

Полученные результаты послужили основой для разработки методик изолирования имована из биосубстратов. При отсутствии в доступной литературе данных по изолированию имована, нами использованы приемы, которые находят применение в практике химико-токсикологического анализа. Выделение имована из ткани печени проводили водой подкисленной щавелевой кислотой; из крови и мочи - жидкостно-жидкостной экстракцией хлористым метиленом.

Однако выделение из биологических объектов не может быть строго охарактеризовано только рКа, рН и растворимостью в тех или иных растворителях. Необходимо учитывать также потенциальное влияние фоновых соединений, которое может определяться видом образца,

особенностями распределения, характером биотрансформации эндо- и экзогенных соединений происходящих в организме и т.д. Вопросы очистки имована от сопутствующих балластных веществ решали использованием приемов центрифугирования, высаливания электролитом (в схему изолирования по методике Васильевой A.A. был введен этап очистки - коагуляция белков при насыщении водного извлечения кристаллическим аммония сульфатом) и хроматографического исследования в тонких фиксированных слоях сорбента.

Хроматография в тонком слое сорбента (ХТС) служила и тестом для предварительного обнаружения. Хроматографическое исследование имована осуществляли восходящим способом на пластинках ВЭТСХ Кизельгеля 60 F254

(Merck) или других стандартных. В качестве подвижной фазы избрана универсальная система толуол - ацетон

- этанол - 25% раствор аммиака 45:45:7,5:2,5 при анализе биологических жидкостей (Rf 0,48-0,51); система диоксан

- хлороформ - ацетон - 25% раствор аммиака 47,5:45:5:2,5 при анализе ткани печени (Rf0,46-0,48) [2].

Идентификацию выделенного из биосубстратов имована проводили по сопоставлению его УФ-спектраи параметров ВЭЖХ и ГХ/МС с этими же параметрами стандартного раствора имована в соответствующем растворителе. УФ-спектры поглощения 0,0016% растворов имована в воде, 0,1М растворе кислоты хлористоводородной, 95% этаноле, хлороформе, снятые на Specord-40M в интервале длин волн 220-400 нм характеризуются одной полосой поглощения с одним максимумом и одним минимумом [3].

ВЭЖХ анализ проводили на хроматографе "Милихром A-02" с УФ-детекцией на стандартной колонке 3х75 мм с обращенно-фазным сорбентом Силасорб 100-5С18 (5 мкм). Подвижная фаза - смесь ацетонитрил - вода 65:35 рН 3-4 (добавлением концентрированной кислоты фосфорной по универсальному индикатору). Скорость потока элюента 50 мкл/мин, вводимая доза на анализ 5 мкл. Длина волны детектирования 304 нм. Время удерживания имо-вана в данных условиях 4,17±0,062 мин. Для количественной обработки хроматограмм использовали метод абсолютной калибровки. При построении калибровочной кривой готовили серию стандартных растворов имована в элюенте и хроматографировали в ранее определенных растворах. Расчет концентраций осуществляли через программу сбора и обработки данных "Мультихром" по площади пика. Линейная зависимость наблюдается в интервале концентраций 0,05 - 0,21 мкг/мл [4].

ГХ/МС исследование проведено на хромато-масс-спектрометре фирмы "Хьюлетт-Паккард": газовый хроматограф НР 5890 сер. 11, с масс-селективным детектором НР 5972, колонка капиллярная кварцевая НР-5МS, размером 20м х 0,25мм, со скоростью газа-носителя гелия через колонку 1,0 мл/мин. Температура инжектора и интерфейса 250° и 280°С. Программирование колонки 2 мин. при 70°С, нагрев 20 градусов в минуту до 270°С и выдержка при конечной температуре 8 минут. Ввод пробы ручной, без деления потока газа-носителя. Включение детектора с задержкой на 3 минуты. Объем введенной пробы 1 мкл в хлористом метилене при концентрации в растворе 100 мкг/ мл. МСД работает в режиме электронного удара при 70 эВ. Регистрация масс-спектра в режиме полного сканирования ионов с m/z от 40 до 450 аем. Получена хроматограмма (время удерживания имована 17,43 мин.) и проведена регистрация масс-спектра в режиме полного скани-

рования от 40 до 500 аем. Характеристические ионы имована при выделении фрагментограммы с временем удерживания 17,43 минуты - 143,245, 99, 112,217 т/г (данные приведены в порядке уменьшения интенсивности) [1].

Для количественной оценки содержания имована, выделенного из биологических объектов в качестве базового использован метод УФ-спектрофотометрии. Наличие ярко выраженного максимума абсорбции имована в 0,1М растворе кислоты хлористоводородной в доступной области измерений позволило нам использовать собственное поглощение вещества в разработке спектрофотометрической методики его количественного определения. Абсорбцию стандартных растворов при построении калибровочного графика измеряли при 305 нм на спектрофотометре СФ-26 в 1 см кюветах относительно чистого растворителя. Зависимость оптической плотности от концентрации имована аппроксимирована линейным уравнением с помощью метода наименьших квадратов на ПК. Коэффициент корреляции составил 1,0070. Подчинение основному закону светопоглощения в интервале концентраций 4-32 мкг/мл. Чувствительность определения 0,32 мкг/мл. Удельный показатель поглощения 311 [1].

Изолирование имована из трупного материала (ткань печени) проводили водой, подкисленной щавелевой кислотой (по методике А.А.Васильевой). Водное извлечение вместе с объектом помещали в центрифужный стакан и центрифугировали (2,5 тыс. об/мин - 25 мин). Надосадоч-ную жидкость сливали и добавляли кристаллический аммония сульфат до насыщения. Через 20 мин. выпавший осадок отделяли центрифугированием. Экстракцию из водного извлечения осуществляли хлороформом при рН 8-9 (добавлением 25% раствора аммиака по универсальному индикатору) трижды по 20,15,15 мл на электровстряхи-вателе по 10 мин. Хлороформные извлечения объединяли, фильтруя через мелкопористый стеклянный фильтр с безводным натрия сульфатом. Объем доводили в мерной колбе хлороформом до 50 мл (У1). 1/10 - 1/5 часть извлечения (У2) концентрировали и количественно наносили на стартовую линию хроматографической пластинки в виде полосы длиной 1,5-2 см. Одновременно наносят внешний метчик - стандартный раствор имована 1 мг/мл в хлороформе и внутренний метчик 1/25 часть полученного извлечения в виде точек. Хроматографируют в указанных выше условиях. Имован детектируется в виде фиолетовых пятен при экспонировании в УФ - 254 нм.

Зоны метчиков для подтверждающего исследования обрабатывают реактивом Драгендорфа (пятна приобретают желто-оранжевую окраску). Зону имована, выделенного из биообъекта для количественного определения снимают и элюируют 0,1 М раствором кислоты хлористоводородной 2 раза по 3 мл (У3). Измеряют оптическую плотность элюата при длине волны 305 нм в 1 см кювете. Раствор сравнения - элюат в 0,1М растворе кислоты хлористоводородной с контрольного участка хроматограммы.

Количество вещества в пробе рассчитывали по формуле:

_ БхУ1 хУ2 х1000х1000 х 1 х100 х V

X - количество вещества в пробе, мкг;

Б - значение оптической плотности;

Е— - удельный показатель поглощения;

1 - толщина поглощающего слоя, см;

V - объем 0,1 М раствора кислоты хлористоводородной, взятый для количественного определения, мл;

V - общий объем хлороформного извлечения, мл;

Уъ - объем хлороформного извлечения, взятого для количественного определения, мл.

Изолирование имована из мочи. К 20 мл мочи добавляли кристаллический аммония сульфат до насыщения. Через 10 минут осадок отделяли центрифугированием (2500 об/мин, 15 минут). Центрифугат экстрагировали хлористым метиленом из щелочного аммиачного раствора прирН 8-9 дважды по 15и 10млнаэлектровстряхивателепо 10 минут. Слой органического растворителя отделяли, фильтровали через мелкопористый стеклянный фильтр с безводным натрия сульфатом. Объем доводили в мерной колбе вместимостью на 25 мл хлористым метиленом (У1). 1/10часть извлечения использовали для идентификации вещества по величине Ш", 1/2 часть для спектрофотометрического исследования (У2) по методике описанной выше.

Изолирование имована из крови. 5 мл плазмы разбавляли трехкратным количеством воды, оставляли на 30 минут, насыщали кристаллическим аммония сульфатом, центрифугировали при 2500 об/мин, 15 минут. Центрифугат экстрагировали хлористым метиленом из щелочного аммиачного раствора при рН 8-9 дважды по 15 и 10 мл на элек-тровстряхивателе по 10 минут и далее исследовали по методике анализа мочи на имован.

Полученные результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1

Метрологические характеристики результатов количественного определения имована

п 1 X Б 1 & AX £а

в ткани печени

5 1 62,55 2,20 1 0,98 2,73 4,36

в плазме крови

5 1 90,05 1,58 1 0,71 1,96 2,18

в моче

5 1 94,34 3,49 1 1,56 4,34 4,59

После измерения оптической плотности элюата снимают УФ-спектр. Затем раствор из кюветы подщелачивают 25% раствором аммиака до рН 8-9 и извлекают 5 мл хлороформа. Снимают спектр полученного хлороформного экстракта, раствор сравнения - хлороформ. Далее раствор из кюветы переносят в выпарительную чашку, хлороформ испаряют досуха. Остаток при проведении подтверждающего исследования методом ВЭЖХ растворяют в 1 мл элюента и 5 мкл этого раствора анализируют; при использовании метода хромато-масс-спектроскопии остаток растворяют в 100 мкл хлористого метилена и 1 мкл берут для исследования.

Предложенная методика изолирования и анализа позволяет выделить из ткани печени до 62% имована из 50 г органа при содержании в нем 10 мг анализируемого вещества, из плазмы крови (5 мл) до 90% при содержании 0,5 мг имована, из мочи (20 мл) до 94% при содержании 0,3 мг имована.

Литература

1. Хомов Ю.А. Аналитическое изучение имована / Ю.А.Хомов, Н.В.Кокшарова, В.П.Гаранин, М.Дайех // Человек и лекарство: IX Рос. нац. конгр. Москва, 2002. - М.: 2002. - С. 716-717.

2. Хомов Ю.А. Варианты ВЭТСХ в анализе имована /Ю.А.Хомов, Н.В.Кокшарова, М.Дайех//Науки о человеке. Матер. III конгресса молодых ученых и специалистов. Томск, 2002. - С. 240.

3. Хомов Ю.А. Спектральные характеристики имована / Ю.А.Хомов, Н.В.Кокшарова, М.Дайех, В.П.Гаранин // Науки о человеке. Матер. IVмеждународного конгресса молодых ученых и специалистов. Томск, 2003. - С. 198.

4. Хомов Ю.А. Метод ВЭЖХ в анализе имована /Ю.А.Хомов, С.И.Стрельцов, Н.В.Кокшарова, М.Дайех // Актуальные проблемы фармацевтической науки и образования: итоги и перспективы. Материалы межвузовской научно-практической конференции. "ВУЗЫ И РЕГИОН". Пермь, 2003, С. 96-97.

5. Хомов Ю.А. Химико-токсикологический анализ имована /Ю.А.Хомов, Н.В.Кокшарова, М.Дайех, В.П.Гаранин // Проблемы экспертизы в медицине. 2004. - №1. - С. 25-27.

6. Хомов Ю.А. Исследования в области химико-токсикологического анализа азотсодержащих соединений основного характера: Автореф. дис. ... доктора фарм. наук/Ю.А.Хомов. - Пермь, 1996. - 50с.

© В.И. Жихорев, 2004 УДК 340.6

В.И. Жихорев

МОРФОЛОГИЯ ИНТРАМУРАЛЬНЫХ НЕРВНЫХ СТРУКТУР ПРИ ОТРАВЛЕНИИ ЭТАНОЛОМ

Государственное учреждение здравоохранения "Бюро судебно-медицинской экспертизы" МЗУР

Диагностика отравлений этанолом до настоящего времени не является однозначной и представляет определенные затруднения в связи с недостаточно полной разработкой ряда аспектов пато- и танатогенеза. Среди них, в первую очередь, следует указать на различную степень алкогольной резистентности, что делает в некоторых случаях несостоятельной ссылку на количественное содержание этанола в жидких средах организма. С этих позиций, большое значение для правильной оценки особенностей пато

- и танатогенеза в каждом конкретном случае отравления этиловым алкоголем приобретает разработка новых морфологических критериев данного вида смерти. Учитывая

нередкость сочетания отравлений этанолом с проявлениями различной степени выраженности ишемической болезни сердца (ИБС), следует обратить внимание на исследование интрамуральной нервной системы сердца (ИМНС) для получения более полных и объективных комплексов диагностических критериев.

С этой целью на протяжении ряда лет нами изучались различные отделы интрамуральной нервной системы. Специальному исследованию подвергли интрамуральные нервные образования: нервные волокна и узлы области синусового узла, межжелудочковой перегородки, передней и задней стенок левого и правого желудочков сердца.