СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РИСКА РАЗВИТИЯ ЭССЕНЦИАЛЬНОЙ ГИПЕРТЕНЗИИ У ЖЕНЩИН
METHOD FOR PREDICTION OF RISK OF DEVELOPING ESSENTIAL HYPERTENSION IN WOMEN

Изобретение относится к области медицинской диагностики, а именно к медицинской генетике и кардиологии.
Как известно, эссенциальная гипертензия (ЭГ) является типичным мультифакториальным (многофакторным) заболеванием, в возникновении которого ключевую роль играют взаимодействия между генетическими и средовыми факторами [Williams RR, Hunt SC, Hasstedt SJ, Hopkins PN, Wu LL, Berry TD, Stults BM, Barlow GK, Schumacher MC, Lifton RP et al. Are there interactions and relations between genetic and environmental factors predisposing to high blood pressure? Hypertension. 1991 Sep;18(3 Suppl):I29-37. Knight BS, Sunn N, Pennell CE, Adamson SL, Lye SJ. Developmental regulation of cardiovascular function is dependent on both genotype and environment. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2009 Dec; 297(6):H2234-41. Kunes J, Zicha J. The interaction of genetic and environmental factors in the etiology of hypertension. Physiol Res. 2009; 58 Suppl 2:S33-41]. Таким образом, с практических позиций совместная комплексная оценка генетических средовых факторов риска развития эссенциальной гипертензии является наиболее адекватной в отношении прогнозирования вероятности возникновения болезни, потому как учитывает сочетание всех возможных предикторов, имеющих этиологическое значение для формирования предрасположенности к заболеванию [Cooper R.S. Gene-environment interactions and the etiology of common complex disease //Ann Intern Med. - 2003. - Vol.139. - P.437-440]. В этой связи представляется крайне необходимым поиск и выделение критериев индивидуального прогнозирования риска развития ЭГ, основанных на индивидуальной оценке ДНК-полиморфизмов генов предрасположенности к ЭГ и наличии средовых факторов риска. Внедрение такого комплексного подхода к прогнозированию ЭГ в практическое здравоохранение является наиболее востребованным сегодня среди врачей генетиков и кардиологов в свете интенсивного развития в последние годы геномной и персонализированной медицины [Ginsburg GS, Willard HF. Genomic and personalized medicine: foundations and applications. Transl Res. 2009; 154(6): 277-87. Генетический паспорт - основа индивидуальной предиктивной медицины. / Под ред. B.C.Баранова. - СПб.: Изд-во Н-Л, 2009. - 528 с.].
Из публикаций последних лет известно достаточно большое количество исследований, посвященных оценке взаимосвязи полиморфных вариантов различных генов с предрасположенностью к ЭГ [Benjafield AV, Jeyasingam CL, Nyholt DR, Griffiths LR, Morris BJ. G-protein beta3 subunit gene (GNB3) variant in causation of essential hypertension. Hypertension. 1998 Dec; 32(6):1094-7. Clark CJ, Davies E, Anderson NH, Farmer R, Friel EC, Fraser R, Connell JM. Alpha-adducin and angiotensin I-converting enzyme polymorphisms in essential hypertension. Hypertension. 2000 Dec; 36(6): 990-4. Hyndman M.E., Parsons H.G., Verma S. et al. The T-786C Mutation in Endothelial Nitric Oxide Synthase Is Associated With Hypertension. Hypertension. 2002; 39:919. Watkins WS, Hunt SC, Williams GH, Tolpinrud W, Jeunemaitre X, Lalouel JM, Jorde LB. Genotype-phenotype analysis of angiotensinogen polymorphisms and essential hypertension: the importance of haplotypes. J Hypertens. 2010; 28(1): 65-75]. Однако все исследования констатировали факт наличия или отсутствия ассоциаций аллелей и генотипов с развитием ЭГ и не ставили перед собой цель разработки статистических моделей для прогнозирования риска болезни, основанных на комплексной оценке генетических и средовых факторов риска.
В изученной научно-медицинской и доступной патентной литературе нами были обнаружены 4 патента на изобретения, предлагающие различные способы прогнозирования вероятности возникновения ЭГ. Первый [Патент №2181260 (2002.04.20) Способ прогнозирования возможности развития гипертонической болезни.] и второй [патент №2307577 (2007.10.10) Способ прогнозирования возможности развития гипертонической болезни для коренных сельских жителей-телеутов юга кузбасса] способы основаны на антропометрических измерениях - оценке индекса массы тела и соматического индекса. Третий способ [Патент №2257139 (2005.07.27) Способ прогнозирования возникновения гипертонической болезни.] основан на гемодинамических показателях - оценке полноты наполнения пульса до нагрузки и на высоте задержки дыхания. Все вышеперечисленные способы прогнозирования основывались лишь на оценках отдельных фенотипических параметров и не учитывали индивидуальные наследственно детерминированные особенности пациентов, определяющие генетическую предрасположенность к развитию заболевания.
Однако наиболее близким к заявляемому способу (прототип) является способ прогнозирования ЭГ на основе данных генотипирования полиморфизмов генов PON1 и СЕТР [Патент №2287158 (2006.11.10) Способ прогнозирования развития гипертонической болезни по генетическим факторам риска]. Данный способ предполагает генотипирование двух полиморфных локусов PON1 и СЕТР и в зависимости от выявляемых генотипов пациентов относят в группу с высоким или низким риском развития гипертонической болезни.
Одним из недостатков данного способа является отсутствие как объективного способа расчета вероятности, выраженного в % относительного риска отнесения индивида к той или иной группе риска развития ЭГ, так и качества классификации пациентов на группы высокого и низкого риска развития болезни (критерия точности прогнозирования). Вторым недостатком является то, что способ не учитывает пол пациента, потому как данная особенность имеет немаловажное значение для прогнозирования риска гипертонической болезни, учитывая половой диморфизм подверженности болезни в популяции, который детерминирован генетическими и средовыми факторами [Patsopoulos NA, Tatsioni A, Ioannidis JP. Claims of sex differences: an empirical assessment in genetic associations. JAMA. 2007 Aug 22; 298(8):880-93. Sartori-Valinotti JC, Iliescu R, Fortepiani LA, Yanes LL, Reckelhoff JF. Sex differences in oxidative stress and the impact on blood pressure control and cardiovascular disease. Clin Exp Pharmacol Physiol. 2007 Sep; 34(9):938-45. Ober C, Loisel DA, Gilad Y. Sex-specific genetic architecture of human disease. Nat Rev Genet. 2008 Dec; 9(12):911-22]. И, наконец, наиболее существенным недостатком данного способа является то, что он не учитывает наличие у пациента средовых факторов риска, которые для данного заболевания имеют первостепенное значение, зачастую значительно большее, чем данные о генетических факторах риска.
Задачей изобретения стала разработка объективного, высокоинформативного способа прогнозирования риска развития эссенциальной гипертензии путем оценки комплекса генетических и средовых факторов риска с использованием логистической регрессионной модели.
С учетом полового диморфизма, проявляющегося в принципиальных различиях генетической компоненты предрасположенности к заболеванию у представителей различного пола, в рамках данного способа разработана статистическая модель для женщин.
Технический результат при использовании изобретения - существенное повышение точности прогнозирования риска развития ЭГ у женщин посредством совместной оценки комплекса генетических и средовых факторов риска заболевания и использования метода логистического регрессионного анализа.
Способ осуществляется следующим образом.
2
ДНК выделяют из образцов периферической венозной крови больных гипертонической болезнью стандартным методом фенол-хлороформной экстракции и прецитпитации этанолом [Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. Методы генной инженерии. Молекулярное клонирование. Пер. с анг. М.: Мир, - 1984. - 480 с]. Для генотипирования полиморфизмов генов используют стандартные олигонуклеотидные праймеры. Выделенную геномную ДНК подвергают полимеразной цепной реакции (ПЦР). При приготовлении растворов для проведения ПЦР используют импортные реагенты высокой степени очистки (Ultra pure и Biotechnology Grade). ПЦР проводится в 12 мкл реакционной смеси, содержащей 0,5 мкл образца геномной ДНК. Смесь для амплификации включает: 67 мМ Трис-HCl, рН 8,8, 16,6 мМ сульфата аммония, 6,7 мкМ ЭДТА, 2,5-3,5 мM MgCl, 1 мМ β-меркаптоэтанола, 1 мМ каждого dNTPs (dATP, dCTP, dTTP и dGTP), 15 нМ каждого из праймеров и 1U (1 единица активности) термостабильной Taq-ДНК-полимеразы. Для предотвращения испарения амплификационной смеси и образования конденсата на реакционную смесь наслаивают по 30 мкл минерального масла. Обнаружение полиморфизмов исследуемых генов проводится путем обработки ампликонов 5U соответствующими эндонуклеазами рестрикции (ООО "Сибэнзим", г.Новосибирск) согласно протоколам, описанным производителем ферментов. Рестрикционную смесь термостатируют 16 часов при температурах, рекомендуемых ООО "Сибэнзим" для каждой эндонуклеазы. После инкубации фрагменты ДНК фракционируют с помощью электрофореза в 2-3% агарозных гелях, приготовленных на основе ТВЕ буфера (0,089 М Трис-HCl, 2 мМ ЭДТА, 0,089М борная кислота) с 0,01% бромистым этидием. Разделенные фрагменты ДНК визуализируют на трансиллюминаторе с помощью прибора компьютерной видеосъемки GDS-8000 ("UVP", США). Документирование и обработка изображений электрофоретических гелей проводится с помощью аналитического пакета Labworks.
Ниже представлена интерпретация результатов электрофоретического разделения фрагментов ДНК по всем изучаемым локусам:
Полиморфизм rs1056836 (нуклеотидная замена C/G) гена цитохрома Р-450 1В1. Гидролиз продукта ПЦР размером 187 п.н. гена цитохрома Р-450 1В1 эндонуклеазой PstI при электрофоретическом разделении приводит к образованию следующих фрагментов ДНК: фрагмент длиной 187 п.н. соответствуют аллелю С (генотип СС); фрагменты длиной 158 и 29 п.н. соответствуют аллелю G (генотип GG); фрагменты длиной 187, 158 и 29 п.н. наблюдаются у гетерозигот CG. Обозначение генотипов в базе данных проводится следующим образом: 0 - гомозиготы по аллелю дикого типа, 1 - гетерозиготы, 2 - гомозиготы по мутантному аллелю.
Полиморфизм rs2070744 (нуклеотидная замена Т/С) гена эндотелиальной синтазы окиси азота. Гидролиз продукта ПЦР размером 237 п.н. гена эндотелиальной синтазы окиси азота эндонуклеазой MroNI при электрофоретическом разделении приводит к образованию следующих фрагментов ДНК: фрагмент длиной 237 п.н. соответствуют аллелю Т (генотип ТТ); фрагменты длиной 204 и 33 п.н. соответствуют аллелю С (генотип СС); фрагменты длиной 237, 204 и 33 п.н. наблюдаются у гетерозигот ТС. Обозначение генотипов в базе данных проводится следующим образом: 0 - гомозиготы по аллелю дикого типа, 1 - гетерозиготы, 2 - гомозиготы по мутантному аллелю.
Кодирование информации о генетических факторах риска пациенток осуществляется следующим образом: гомозиготам по аллелю дикого типа, гетерозиготам и гомозиготам по вариантному аллелю полиморфизмов rs1056836 гена цитохрома Р-450 1В1 и rs2070744 гена эндотелиальной синтазы окиси азота присваивают значения 0, 1 и 2 соответственно.
У пациентов проводят анкетирование по средовым факторам риска при непосредственном общении с пациентами. Опросник, кроме традиционно использующихся основных социально-демографических параметров, включает сведения о наличии у обследуемых средовых факторов риска ЭГ, таких как: вредные привычки (курение, употребление алкоголя), характер питания, психоэмоциональная обстановка в семье и рабочем коллективе, профессиональные вредности. Градация "характер употребление алкоголя" (крепких алкогольных напитков) по частоте его употребления ранжируется на следующие категории: 1) реже, чем 1 раз в месяц или не употребляю, 2) 1-2 раза в месяц, 3) 1-2 раза в неделю, 4) 3-4 раза в неделю, 5) ежедневное употребление алкоголя. Респондентов, выбравших 4-ю или 5-ю категории ответов, относят к лицам с высоким уровнем употребления алкоголя (в базе данных присваивается значение 4), респондентов, выбравших с 2-й (в базе данных присваивается значение 2) по 3-ю (в базе данных присваивается значение 3) категории ответов, относили к лицам с умеренным/низким уровнем употребления алкоголя, респондентов, выбравших 1-ю категорию ответов (в базе данных присваивается значение 1), относили к лицам, не употребляющим алкоголь. Психоэмоциональная обстановка в рабочем коллективе оценивается и градируется следующим образом: хорошая (в базе данных присваивается значение 1), удовлетворительная (в базе данных присваивается значение 2), неудовлетворительная (в базе данных присваивается значение 3).
Возможность использования предложенного способа прогнозирования риска развития ЭГ подтверждает анализ результатов наблюдений 271 пациенток, из которых 136 - больные ЭГ и 135 - здоровые женщины. Все пациентки были русской национальности, проживающие на территории Курской области, которые находились на стационарном лечении в кардиологических отделениях Курской областной клинической больницы и городской больницы скорой медицинской помощи г.Курска. Контрольная группа формировалась при профилактических осмотрах на предприятиях и учреждениях города Курска. Подавляющая часть больных имела длительный стаж ЭГ и антигипертензивной терапии. У первичных больных диагноз ЭГ устанавливался согласно рекомендациям ВОЗ после исключения симптоматических артериальных гипертензий с помощью клинических, лабораторных и клинико-инструментальных методов. Критерием включения здоровых индивидов в контрольную группу были: систолическое АД ≤130 мм рт.ст., диастолическое АД ≤85 мм рт.ст. при двух повторных измерениях, отсутствие стойких хронических заболеваний по данным субъективного обследования.
2
0
1
2
i
Формирование базы данных и статистические расчеты осуществлялись с использованием программы STATISTIC А 8.0. Для оценки соответствия наблюдаемого распределения генотипов ожидаемому, исходя из равновесия Харди-Вайнберга, используется критерий χ, наблюдаемая и ожидаемая гетерозиготности. Оценка влияния генетических и средовых факторов на риск развития ЭГ осуществлялась методом бинарной логистической регрессии, которая позволяла построить статистическую модель для прогнозирования вероятности заболевания [Hosmer D.W., Lemeshow S. Applied Logistic Regression. New York; John Wiley and Sons Inc., 2000. - P.1-175.]. Результатом логистического регрессионного анализа является расчет оценок регрессионных коэффициентов b, b, b,…bуравнения [Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA / М.: Медиасфера, 2003. - 312 с.]:
0
1
1
2
2
i
i
Y=b+bX+bX+…bX,
l
i
i
i
где X…X - прогностически ценные независимые (объясняющие) признаки (в нашем случае это исследуемые ДНК-маркеры и средовые факторы риска). Значения коэффициентов b представляют собой натуральные логарифмы отношения шансов (OR) для каждого из соответствующих предикторов X. Значение Y в уравнении регрессии - это натуральный логарифм OR для изучаемого события (для риска возникновения ЭГ), т.е. Y=In (P/(l-P)). Вероятность свершения события (для риска возникновения ГБ) для каждого конкретного индивида вычисляется по формуле [Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA /М.: Медиасфера, 2003. - 312 с.]:
у
у
P=е/(1+е),
где P - вероятность свершения события, е - математическая константа, приблизительно равная 2,72.
2
При оценке уравнений регрессии использовался метод пошагового включения предикторов, который ранжировал признаки в соответствии с их вкладом в модель. Относительный вклад отдельных предикторов оценивается величинами статистик χ Вальда, величин стандартизированных коэффициентов регрессии и соответствующих уровней значимости. В качестве критерия согласия реального распределения наблюдений по отдельным градациям факторов риска на основе уравнения логистической регрессии использовался процент правильной классификации. Наилучшая предиктивная статистическая модель отбиралась по следующим критериям: наивысший уровень статистической значимости модели в целом, наличие статистически значимых эффектов каждого из предикторов, включенных в модель, наиболее высокие значения процента правильной классификации больных ЭГ и здоровых.
Проведенный нами регрессионный анализ показал, что среди всех оцененных статистических моделей наиболее прогностически ценной в отношении риска развития ЭГ у женщин была модель, включающая следующие предикторы: полиморфизм rs1056836 гена цитохрома Р-450 1В1, полиморфизм rs2070744 гена эндотелиальной синтазы окиси азота, употребление алкоголя и психоэмоциональная обстановка в рабочем коллективе (значение p для модели в целом составило р<0,000001). Параметры логистической регрессионной модели представлены в таблице.
Таблица
Логистическая регрессионная модель прогнозирования риска возникновения гипертонической болезни у женщин на основе анализа данных генотипирования и средовых факторов риска
Независимые (объясняемые) признаки (предикторы) и их градации (цифровые выражения X<sub>i</sub>)
Регрессионные коэффициенты, b<sub>i</sub>.
Уровень значимости (p) для b<sub>i</sub>
0. Интерцепт (константа)
-23,627
0,0001
1. Полиморфизм rs1056836 гена цитохрома Р-450 1В1 (X<sub>1</sub>-0, 1, 2)
2,169
0,01
2. Полиморфизм rs2070744 гена эндотелиальной синтазы окиси азота (Х<sub>2</sub> - 0, 1, 2)
1,544
0,02
3. Характер употребления алкоголя (Х<sub>3</sub>- 1, 2, 3, 4)
7,022
0,00001
4. Психо-эмоциональная обстановка в рабочем коллективе (Х<sub>4</sub>- 1, 2, 3)
2,481
0,02
Параметры логистической регрессионной модели:
Уровень значимости модели в целом ρ<0,000001(χ<sup>2</sup>=107,6; df=4, OR=532);
Процент правильной классификации: больных ГБ - 99,0%, здоровых лиц - 84,9%.
Как видно из таблицы, уровни значимости коэффициентов регрессии для всех предикторов были менее 0,05, т.е. каждый из них оказывал статистически значимое влияние на риск возникновения ЭГ у женщин. Величина отношения шансов для представленной регрессионной модели составляла 107,6, демонстрируя, что при увеличении на единицу значения i-го признака шанс возникновения ЭГ у женщин увеличивается более чем в 100 раз. Учитывая значения правильности классификации пациентов можно утверждать об очень высокой точности данной прогностической модели: модель корректно предсказывает в 99% случаев вероятность возникновения ЭГ и в 84% случаев правильно классифицирует здоровых женщин.
Особенностью разработанного нами способа прогнозирования риска развития ЭГ у женщин является использование комбинации генетических (данные генотипирования полиморфизма rs1056836 гена цитохрома Р-450 1В1, полиморфизма rs2070744 гена эндотелиальной синтазы окиси азота) и средовых (характер употребления алкоголя и психоэмоциональная обстановка в рабочем коллективе) факторов, значения которых вносятся в логистическую регрессионную модель следующего вида:
0
у
у
Y=-23,627+(2,169× цифровое выражение генотипа полиморфизма rs1056836 гена цитохрома Р-450 1В1)+(1,544× цифровое выражение генотипа полиморфизма rs2070744 гена эндотелиальной синтазы окиси азота)+(7,022× цифровое выражение характера употребления алкоголя)+(2,481× цифровое выражение психоэмоционалъной обстановки в рабочем коллективе), где Y - натуральный логарифм отношения шансов развития эссенциальной гипертензии у пациентки; -23,627 - рассчитанная с помощью регрессионного анализа константа b для данной логистической модели; 2,169 - коэффициент регрессии, рассчитанный для генотипа полиморфизма rs1056836 гена цитохрома Р-450 1В1; 1,544 - коэффициент регрессии, рассчитанный для генотипа полиморфизма rs2070744 гена эндотелиальной синтазы окиси азота; 7,022 - коэффициент регрессии, рассчитанный для характера употребления алкоголя; 2,481 - коэффициент регрессии, рассчитанный для психоэмоциональной обстановки в рабочем коллективе. Затем, подставляя полученное значение Y в формулу P=е/(1+е), где Р - прогнозируемая вероятность риска развития ЭГ у пациентки, а е - математическая константа, приблизительно равная 2,72, рассчитываем точное значение вероятности отнесения пациентки к группе с низким - от 1 до 10%, средним - от 11-19% или высоким - более 20% риском развития эссенциальной гипертензии.
Пример конкретного выполнения способа
С целью проверки работоспособности модели в прогнозировании риска развития эссенциальной гипертензии нами были обследованы три относительно здоровые женщины молодого возраста русской национальности жительницы Курской области.
1
2
3
4
-3,389
-3,389
3,389
3,389
1. Пациентка А: генотип CG полиморфизма rs1056836 цитохрома Р-450 1В1 (значение X=1), генотип ТС полиморфизма rs2070744 гена эндотелиальной синтазы окиси азота (значение Х=1), алкоголь употребляет 1-2 раза в месяц (значение Х=2), психоэмоциональная обстановка в рабочем коллективе хорошая (значение Х=1). Подставив эти значения в уравнение регрессии, получим для пациентки A.: Y=-23,627+(2,169×1)+(1,544×1)+(7,022×2)+(2,481×1)=-3,389, соответственно Р=2,72) / (1+2,72) или (1/2,72) / 1+(1/2,72)=0,0326. Это означает, что вероятность риска возникновения ЭГ у женщины А. минимальная (вероятность риска развития ЭГ ниже общепопуляционного значения) и составляет всего 3%. Данную женщину следует отнести к группе с пониженным риском развития ЭГ.
1
2
3
4
1,845
-1,845
1,845
1,845
2. Пациентка Б: генотип CG полиморфизма rsl056836 цитохрома Р-450 1В1 (значение Х=1), генотип СС полиморфизма rs2070744 гена эндотелиальной синтазы окиси азота (значение Х=2), алкоголь употребляет 1-2 раза в месяц (значение Х=2), психоэмоциональная обстановка в рабочем коллективе хорошая (значение Х=2). Подставив эти значения в уравнение регрессии, получим для пациентки Б.: Y=-23,627+(2,169×1)+(1,544×2)+(7,022×2)+(2,481×1)=-1,845, соответственно Р=2,72- (1+2,72) или (1/2,72)/1+(1/2,72)=0,136. Это означает, что вероятность риска возникновения ЭГ у женщины Б. умеренная и составляет почти 14%. Данную женщину следует отнести к группе со средним риском развития ЭГ.
1
2
3
1
0,636
0,636
3. Пациентка В: генотип CG полиморфизма rs1056836 цитохрома Р-450 1В1 (значение Х=2), генотип СС полиморфизма rs2070744 гена эндотелиальной синтазы окиси азота (значение Х=2), алкоголь употребляет 1-2 раза в месяц (значение Х=2), психоэмоциональная обстановка в рабочем коллективе удовлетворительная (значение Х=2). Подставив эти значения в уравнение регрессии, получим для пациентки В.:Y=-23,627+(2,169×1)+(1,544×2)+(7,022×2)+(2,481×2)=0,636, соответственно Р=2,72/(1+2,72)=0,653. Это означает, что вероятность риска возникновения ЭГ у пациентки В. высокая (вероятность риска более 20% относится к категории высокого риска) и составляет 65%. Данную женщину следует отнести к группе с повышенным риском развития ЭГ.
Таким образом, использование способа позволяет повысить точность (точность предсказания на основе предложенного способа составляет 85-99%) и объективность прогноза развития заболевания и расширяет арсенал диагностических средств прогнозирования риска возникновения эссенциальной гипертензии у женщин. Учитывая указанные выше преимущества заявляемого способа, разработанная статистическая модель может быть пригодна для использования в практике медико-генетического консультирования для формирования среди пациенток группы риска развития ЭГ и последующей разработки лечебно-профилактических мероприятий по предупреждению развития болезни. Разработанная модель может быть также востребована в кардиологической практике при установлении диагноза ЭГ и дифференциальной диагностики с вторичными формами артериальных гипертензии.