СПОСОБЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК

1. Способ получения рекомбинантного белка, включающий:
а. культивирование клеток-хозяев, способных продуцировать рекомбинантный белок в среду;
b. проведение культуры через фазу продуцирования, на которой клетки продуцируют рекомбинантный белок, причем во время указанной фазы продуцирования культуру подпитывают:
цистеином или цистином до общего количества от 10 мас.% до 30 мас.% от ожидаемого общего количества продуцируемого рекомбинантного белка; и
триптофаном до общего количества от 8 мас.% до 35 мас.% от ожидаемого общего количества продуцируемого рекомбинантного белка,
с. и, необязательно, выделение рекомбинантного белка из среды для культивирования клеток.
2. Способ по п. 1, в котором культуру подпитывают цистеином или цистином до общего количества от 12 мас.% до 28 мас.% от ожидаемого общего количества продуцируемого рекомбинантного белка, например общего количества от 12 мас.% до 25 мас.%, например от 12 мас.% до 20 мас.% от ожидаемого общего количества продуцируемого рекомбинантного белка.
3. Способ по п. 1 или 2, в котором культуру подпитывают триптофаном до общего количества от 8 мас.% до 30 мас.% от ожидаемого общего количества продуцируемого рекомбинантного белка, например общего количества от 8 мас.% до 25 мас.%, например от 8 мас.% до 20 мас.% от ожидаемого общего количества продуцируемого рекомбинантного белка.
12
12
12
4. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором общее количество цистеина или цистина, обеспечиваемое в способе, составляет от 2,9 до 12 г/(10 клеток), например от 2,9 до 7 г/(10 клеток), например от 5,6 до 7 г/(10 клеток), причем клетки относятся к ожидаемому суммарному количеству жизнеспособных клеток в конце фазы продуцирования.
12
12
5. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором общее количество триптофана, обеспечиваемое в способе, составляет от 2,5 до 7 г/(10 клеток), например от 2,5 до 3,5 г/(10 клеток/л), причем клетки относятся к ожидаемому суммарному количеству жизнеспособных клеток в конце фазы продуцирования.
6. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором общее количество цистеина или цистина и триптофана в культуре достигается путем добавления цистеина или цистина и триптофана в среду для культивирования клеток:
а. в начале фазы продуцирования,
b. один или несколько раз в любой момент времени во время фазы продуцирования,
с. путем непрерывного добавления во время фазы продуцирования или
d. в любой комбинации а., b. и с.
7. Способ по любому из предшествующих пунктов, представляющий собой периодический процесс, такой как процесс с периодической подпиткой.
8. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором цистеин или цистин и триптофан обеспечивают путем ежедневного добавления во время фазы продуцирования.
12
9. Способ по п. 8, в котором перед добавлением цистеина или цистина на следующий день культуру истощают по цистеину или цистину, например, путем уменьшения добавления цистеина или цистина до уровня от 5,6 до 7 г/(10 клеток), причем клетки относятся к ожидаемому суммарному количеству жизнеспособных клеток в конце фазы продуцирования.
10. Способ по п. 8 или 9, в котором на поздней стадии продуцирования, т.е. когда клетки уже достигли максимальной жизнеспособной плотности клеток, культуру истощают по триптофану перед добавлением триптофана на следующий день.
11. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором концентрация цистеина или цистина в среде для культивирования клеток не превышает 0,9 г/л в любой момент времени во время фазы продуцирования, предпочтительно, в котором концентрация цистеина или цистина в среде для культивирования клеток не превышает 0,3 г/л в любой момент времени во время фазы продуцирования.
12. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором концентрация триптофана в среде для культивирования клеток не превышает 0,6 г/л в любой момент времени во время фазы продуцирования, предпочтительно, в котором концентрация триптофана в среде для культивирования клеток не превышает 0,3 г/л в любой момент времени во время фазы продуцирования.
13. Способ, в котором фазу продуцирования осуществляют в течение по меньшей мере 7 дней, предпочтительно по меньшей мере 14 дней.
14. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором в любой момент времени во время второй половины фазы продуцирования:
количество цистеина или цистина в культуре составляет от 10 мас.% до 30% от ожидаемого количества продуцируемого рекомбинантного белка; и
количество триптофана в культуре составляет от 8 мас.% до 35% от ожидаемого количества продуцируемого рекомбинантного белка.
15. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором в любой момент времени во время фазы продуцирования:
количество цистеина или цистина в культуре составляет от 10 мас.% до 30% от ожидаемого количества продуцируемого рекомбинантного белка; и
количество триптофана в культуре составляет от 8 мас.% до 35% от ожидаемого количества продуцируемого рекомбинантного белка.
16. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором клетки-хозяева представляют собой клетки млекопитающих, предпочтительно клетки СНО.
17. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором рекомбинантный белок представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.
18. Способ по п. 17, в котором антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой:
1) антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который:
а. содержит CDR-H1, имеющую последовательность, определенную в SEQ ID NO: 1; CDR-H2, имеющую последовательность, определенную в SEQ ID NO: 2; CDR-H3, имеющую последовательность, определенную в SEQ ID NO: 3; CDR-L1, имеющую последовательность, определенную в SEQ ID NO: 4; CDR-L2, имеющую последовательность, определенную в SEQ ID NO: 5, и CDR-L3, имеющую последовательность, определенную в SEQ ID NO: 6; или
b. содержит вариабельную область легкой цепи, имеющую последовательность, определенную в SEQ ID NO: 7, и вариабельную область тяжелой цепи, имеющую последовательность, определенную в SEQ ID NO: 8; или
с. содержит вариабельную область легкой цепи, имеющую по меньшей мере 80% идентичности или сходства, предпочтительно, 90% идентичности или сходства с последовательностью, определенной в SEQ ID NO: 7, и вариабельную область тяжелой цепи, имеющую по меньшей мере 80% идентичности или сходства, предпочтительно, 90% идентичности или сходства с последовательностью, определенной в SEQ ID NO: 8;
d. содержит вариабельную область легкой цепи, имеющую последовательность, определенную в SEQ ID NO: 7, и тяжелую цепь, имеющую последовательность, определенную в SEQ ID NO: 11; или
е. содержит вариабельную область легкой цепи, имеющую по меньшей мере 80% идентичности или сходства, предпочтительно, 90% идентичности или сходства с последовательностью, определенной в SEQ ID NO: 7, и тяжелую цепь, имеющую по меньшей мере 80% идентичности или сходства, предпочтительно, 90% идентичности или сходства с последовательностью, определенной в SEQ ID NO: 11; или
2) антитело, которое содержит легкую цепь, имеющую последовательность, определенную в SEQ ID NO: 9, и тяжелую цепь, имеющую последовательность, определенную в SEQ ID NO: 10; или
3) антитело, которое содержит легкую цепь, имеющую по меньшей мере 80% идентичности или сходства, предпочтительно, 90% идентичности или сходства с последовательностью, определенной в SEQ ID NO: 9, и тяжелую цепь, имеющую по меньшей мере 80% идентичности или сходства, предпочтительно, 90% идентичности или сходства с последовательностью, определенной в SEQ ID NO: 10.
19. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором фазу продуцирования осуществляют в биореакторе, предпочтительно имеющем объем 50 л или более, 100 л или более, 500 л или более, 1000 л или более, 2000 л или более, 5000 л или более, 10000 л или более или 20000 л или более.
20. Способ по любому из предшествующих пунктов, включающий этап выделения рекомбинантного белка из среды для культивирования клеток и дополнительный этап очистки рекомбинантного белка.
21. Способ по п. 20, в котором очистка включает хроматографию с белком А.
22. Способ по п. 20 или 21, дополнительно включающий этап приготовления состава очищенного рекомбинантного белка.
23. Способ по п. 22, в котором состав рекомбинантного белка готовят в виде жидкого состава, содержащего одну или более аминокислот и поверхностно-активное вещество.
24. Способ по п. 23, в котором состав содержит гистидин и/или пролин.
25. Способ по п. 24, в котором состав содержит гистидин в концентрации от 5 мМ до 100 мМ, например, в концентрации от 10 мМ до 50 мМ, и/или пролин в концентрации от 100 мМ до 500 мМ при рН от 5 до 7,4, например от 5 до 6,5, например, от 5 до 6.
26. Способ по п. 25, в котором состав содержит гистидин в концентрации 30 мМ и пролин в концентрации 250 мМ при рН от 5.2 до 6,0.
27. Способ по любому из пп. 23-26, в котором поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат 80, предпочтительно в концентрации от 0,001% до 0,1% (мас./об.), например, от 0,005% до 0,1%, например от 0,01% до 0,1%, например от 0,01% до 0,05%, например 0,03%.
28. Способ по любому из пп. 23-27, в котором рекомбинантный белок представляет собой антитело, при этом антитело находится в составе в концентрации от 10 до 250 мг/мл, например от 20 до 250 мг/мл, например от 50 до 250 мг/мл, например от 120 до 160 мг/мл, например 140 мг/мл.
29. Способ по любому из предшествующих пунктов, обеспечивающий уменьшение гетерогенности полученных рекомбинантных белков, причем указанное уменьшение гетерогенности включает уменьшение:
а. гетерогенности заряда, предпочтительно группы кислых пиков (APG); и/или
b. окисления аминокислот, изомеризации, фрагментации, гликирования других ковалентных аддуктов, дезамидирования, цистеинилирования; и/или
с. цвета или интенсивности цвета, например между разными партиями рекомбинантного белка; и/или
d. высокомолекулярных видов (HMWS); и/или
е. нестабильности рекомбинантного белка.
30. Способ получения рекомбинантного белка, включающий:
а. культивирование клеток-хозяев, способных продуцировать рекомбинантный белок в среду;
b. проведение культуры через фазу продуцирования, в которой клетки продуцируют рекомбинантный белок и среду для культивирования клеток подпитывают цистеином или цистином и триптофаном, причем
12
12
общее количество цистеина или цистина, обеспечиваемое в способе, составляет от 2,9 до 7 г/(10 клеток), например, от 5,6 до 7 г/(10 клеток), причем клетки относятся к ожидаемому суммарному количеству жизнеспособных клеток в конце фазы продуцирования, и
12
общее количество триптофана, обеспечиваемое в способе, составляет от 2,5 до 3,5 г/(10 клеток), причем клетки относятся к ожидаемому суммарному количеству жизнеспособных клеток в конце фазы продуцирования,
с. и, необязательно, выделение рекомбинантного белка из среды для культивирования клеток.
31. Способ по п. 30, имеющий один или более дополнительных признаков, перечисленных в любом из пп. 2-29.
32. Способ уменьшения гетерогенности популяции рекомбинантных белков в партии, полученной на фазе продуцирования рекомбинантными клетками-хозяевами, включающий ограничение общего количества
а. цистеина или цистина и
b. триптофана,
присутствующих в среде для культивирования клеток во время фазы продуцирования рекомбинантного белка.
33. Способ по п. 32, имеющий один или более дополнительных признаков, перечисленных в любом из пп. 2-29.
34. Препарат рекомбинантного белка, который можно получить или получают способом по любому из предшествующих пунктов.
35. Фармацевтическая композиция, содержащая антитело, причем композиция имеет один или более дополнительных признаков, перечисленных в любом из пп. 23-28, при этом антитело предпочтительно представляет собой антитело, указанное в п. 18.