ПОЛИПЕПТИДЫ, КОНКУРЕНТНО ИНГИБИРУЮЩИЕ Gq- БЕЛОК, СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЕ
POLYPEPTIDES COMPETITIVELY INHIBITING Gq-PROTEIN, METHODS OF THEIR PRODUCTION AND APPLICATION

Область техники
Настоящее изобретение относится к полипептиду. Более конкретно, настоящее изобретение относится к пептиду - конкурентному ингибитору Gq-белка α. Настоящее изобретение также относится к способу получения указанного полипептида, составу, содержащему указанный полипептид, и применению указанного полипептида для получения лекарственного средства для реверсии перестройки миокарда.
Уровень техники
[1]
Перестройка миокарда (известная как гипертрофия миокарда) представляет собой симптом, при котором количество кардиоцитов постоянно, но объем кардиоцитов увеличен. Данное явление представляет собой совместный ответ кардиоцитов на различные патологические раздражители и может быть результатом воздействия гемореологических стимулов, таких как гипертензия, порок сердца, острый инфаркт миокарда, врожденные заболевания сердца и вызванное физической нагрузкой повышение кровяного давления, а также гуморальных регуляторов, таких как эндотелин, ангиотензин II, катехинамины, трансформирующий фактор роста β и интерлейкин-1, и поэтому характеризуется чрезвычайно высокой распространенностью. Для одной лишь гипертензии уровень заболеваемости на Западе составляет 15-20%. Несмотря на то, что в Китае уровень заболеваемости немного ниже, число пациентов превышает 150 миллионов. Гипертрофия миокарда может сопровождаться некоторой компенсацией на начальной стадии развития данного симптома. С развитием данного состояния гипертрофия миокарда может приводить к нарушению функции сердца за счет развития отклонений, таких как рассеянная перестройка волокон миокарда и нарушения сократительной деятельности сердца, и подобным заболеваниям, и в дальнейшем может привести к сердечной недостаточности. Гипертрофия миокарда является основным фактором смертности, так как приводит к сердечной недостаточности, которая, в свою очередь, приводит к смерти. Таким образом, поиск конкретных лекарственных средств, эффективных для лечения и контроля гипертрофии миокарда, является не только предметом изучения и актуальной научно-исследовательской задачей, но также одной из основных задач в сфере здравоохранения, которая требует немедленного решения по всему миру.
[2]
[3-6]
В настоящее время не существует клинических терапевтических лекарственных средств, предназначенных специально для лечения гипертрофии миокарда, в основном по причине множественной этиологии и сложности механизма, лежащего в основе данного состояния. Исследования показали, что стимуляция растяжения, вызванного изменениями гемореологических параметров или действием гуморальных эндокринных регуляторов (что представляет собой обратную причинно-следственную связь при развитии данного заболевания), может вызывать патологические ответные реакции, такие как гипертрофия миокарда, интерстициальный фиброз и др., практически все из которых опосредуются через соответствующие рецепторы и пострецепторную передачу сигнала. На основании полученных данных были предприняты попытки различных видов терапии, направленных на устранение этиологических причин гипертрофии миокарда, с использованием антагониста эндотелина, гипотензивного лекарственного средства, ингибитора ангиотензин-превращающего фермента и других препаратов, для которых была показана хоть какая-то эффективность. Однако, поскольку многие факторы и рецепторы вовлечены в развитие патологической ответной реакции и, кроме того, вышеуказанные антагонисты/ингибиторы могут вызывать повышающую регуляцию соответствующих рецепторов и повышение компенсаторной секреции лигандов к другим родственным рецепторам при подавлении функции сигнальной молекулы, эффект от лечения становится очень ограниченным. Таким образом, существует выраженная потребность в разработке конкретного лекарственного средства для профилактики и лечения с задействованием более фундаментальных механизмов.
1
1
2
3
3
1
2+
[7-9]
G-белки представляют собой гетеротримерные ГТФ-связывающие белки, состоящие из субъединиц α, β и γ и играющие ключевую роль в передаче стимулирующих сигналов из внеклеточного пространства внутрь клетки. Норэпинефрин (NE), эндотелин (ЕТ), ангиотензин II (Ang II) и подобные им вещества являются агонистами α-AR, AT рецепторов и рецептора эндотелина соответственно, затем активируют эффекторный фермент, фосфолипазу С (PLC-β), с участием G-белков семейства Gq, при этом указанный фермент, в свою очередь, воздействует на PIP с получением DAG и PIP; и индуцируют экспрессию эмбриональных генов в клетке, обычно через сигнальный путь DAG-PKC-Ras-MAPK и IP-Ca-CaN/CaMPK II-NFAT3/GATA-4, что приводит к перестройке миокарда. Кроме активации Raf1, опосредуемой интегринами, факторы, усиливающие растяжение, могут стимулировать секрецию Ang II, NE и ET и, таким образом, также тесно связаны с Gq. Кроме того, эксперименты показали, что: (1) при патологическом процессе перестройки миокарда сигнал Gq является в значительной мере избыточным и значительно выше, чем физиологический сигнал Gq в нормальных тканях, при этом как функция, так и морфология кардиоцита не подвергается значительному изменению при повышении экспрессии Gqα в два раза (или ниже); гипертрофия миокарда и нарушение сократительной функции сердца происходят при повышении экспрессии Gqα в четыре раза, сердечная недостаточность происходит при повышении экспрессии Gqα приблизительно в восемь раз; (2) избыточная экспрессия гена Gqα, присущая трансгенным организмам, в сердце мыши может индуцировать заметную гипертрофию миокарда и фатальную сердечную недостаточность у животного; (3) блокирование экспрессии Gqα в сердце может значительно ослаблять гипертрофическую ответную реакцию в сердце на повышение давления. Таким образом, можно видеть, что Gqα играет центральную роль в возникновении и развитии перестройки миокарда и рассматривается в качестве общей мишени для множества сигнальных путей и ключевого сигнального элемента для перестройки /гипертрофии миокарда, вызываемой действием различных факторов. Таким образом, ожидается, что регуляция Gqα может стать новой стратегией и может быть успешной для реверсии перестройки /гипертрофии миокарда.
Тем не менее трансгенные животные представляют собой класс животных, которым искусственно введен экзогенный ген, стабильно интегрированный в хромосомный геном и способный передаваться по наследству. Принцип получения трансгенных животных заключается в следующем: интересующий ген/фрагмент гена, изолированный методами молекулярной биологии, вводят в зиготы/преимплантационные эмбриональные клетки экспериментальных животных с применением различных генетических процедур, введенные зиготы/преимплантационные эмбриональные клетки затем трансплантируют внутрь маточной трубы или матки животного-реципиента и ожидают развития трансгенного животного, несущего экзогенный ген. Функционирование данного экзогенного гена оценивают путем анализа степени интеграции экзогенного гена у трансгенного животного и фенотипа трансгенного животного, и тех животных, которые получены методом генной инженерии и обладают лучшими качествами, разводят с применением обычных методов генетической селекции. Таким образом, на основании существующей в настоящее время технологии лечение взрослых пациентов с приобретенной перестройкой миокарда/гипертрофией с использованием трансгенных методов непрактично и нерационально. Кроме того, блокирование экспрессии Gqα в сердце приведет к развитию тяжелых токсических побочных эффектов, поскольку Gqα также обладает важными физиологическими функциями. Таким образом, две данные стратегии и методы, описанные выше, не имеют практической ценности в клиническом контроле перестройки /гипертрофии миокарда.
В связи с этим авторы изобретения получили серию полипептидов, обладающих значительной активностью в отношении реверсии перестройки миокарда/гипертрофии с использованием систематических методов, таких как молекулярное конструирование, оптимизация, генная инженерия, получение полипептидов, скрининг in vitro и in vivo активности и других методов.
Описание изобретения
С учетом вышеописанных недостатков, присущих известным решениям, задачей настоящего изобретения является получение серии полипептидов, которые не только обладают терапевтической активностью в отношении реверсии гипертрофии миокарда, но и также могут быть легко получены с низкими затратами и готовы для внедрения в производство и для коммерциализации.
Другой задачей настоящего изобретения является обеспечение способа получения серии полипептидов, при этом такой способ должен быть простым в исполнении, экономически выгодным и должен приводить к получению серии полипептидных продуктов высокой чистоты, обладающих превосходными характеристиками активности в отношении реверсии гипертрофии миокарда.
Еще одной задачей настоящего изобретения является обеспечение состава, содержащего данный полипептид и применение указанного полипептида для получения лекарственного средства для лечения перестройки миокарда.
Для достижения цели настоящего изобретения сначала был получен полипептид в соответствии с последовательностью полипептида Gqα, аминокислотная последовательность которого представлена в SEQ ID NO:1 (последовательность пентапентаконтапептида) и обладает активностью в отношении реверсии гипертрофия миокарда.
В предпочтительном варианте реализации изобретения, полипептид, предложенный согласно настоящему изобретению, представляет собой полипептид, полученный путем делеции по меньшей мере одного аминокислотного остатка в любом положении, начиная с первой аминокислоты с N-конца последовательности SEQ ID NO 1, при сохранении по меньшей мере 12 аминокислотных остатков с С-конца указанного полипептида.
В предпочтительном варианте реализации изобретения, полипептид, предложенный согласно настоящему изобретению, представляет собой полипептид, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:2 (последовательность пентатетраконтапептида), который получен путем делеции аминокислотных остатков в положениях 1-10 с N-конца последовательности SEQ ID NO:1.
В предпочтительном варианте реализации изобретения, полипептид, согласно настоящему изобретению, представляет собой полипептид, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:3 (последовательность пентатриаконтапептида), который получен путем делеции аминокислотных остатков в положениях 1-20 с N-конца последовательности SEQ ID NO:1.
В предпочтительном варианте реализации изобретения, полипептид, согласно настоящему изобретению, представляет собой полипептид, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:4 (последовательность триаконтапептида), который получен путем делеции аминокислотных остатков в положениях с 1 по 25 с N-конца последовательности SEQ ID NO:1.
В предпочтительном варианте реализации изобретения, полипептид, согласно настоящему изобретению, представляет собой полипептид, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:5 (последовательность гептакозапептида), который получен путем делеции аминокислотных остатков в положениях с 1 по 28 с N-конца последовательности SEQ ID NO:1.
В предпочтительном варианте реализации изобретения, полипептид, согласно настоящему изобретению, представляет собой полипептид, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:6 (последовательность пентакозапептида), который получен путем делеции аминокислотных остатков в положениях с 1 по 30 с N-конца последовательности SEQ ID NO:1.
В предпочтительном варианте реализации изобретения, полипептид, согласно настоящему изобретению, представляет собой полипептид, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:7 (последовательность икозапептида), который получен путем делеции аминокислотных остатков в положениях с 1 по 35 с N-конца последовательности SEQ ID NO:1.
В предпочтительном варианте реализации изобретения, полипептид, согласно настоящему изобретению, представляет собой полипептид, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:8 (последовательность гептадекапептида), который получен путем делеции аминокислотных остатков в положениях с 1 по 38 с N-конца последовательности SEQ ID NO:1.
В предпочтительном варианте реализации изобретения, полипептид, согласно настоящему изобретению, представляет собой полипептид, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:9 (последовательность пентадекапептида), который получен путем делеции аминокислотных остатков в положениях с 1 по 40 с N-конца последовательности SEQ ID NO:1.
В предпочтительном варианте реализации изобретения, полипептид, согласно настоящему изобретению, представляет собой полипептид, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:10 (последовательность додекапептида), который получен путем делеции аминокислотных остатков в положениях с 1 по 43 с N-конца последовательности SEQ ID NO:1.
Полипептид, предложенный в настоящем изобретении, может также представлять собой полипептид, который получен путем замены, делеции или добавления одной или более аминокислот в любую из вышеописанных полипептидных последовательностей, и обладает свойствами для реверсии перестройки миокарда, идентичной или сходной с действием данного полипептида с вышеописанной последовательности.
Полипептид, предложенный в настоящем изобретении, может также быть полипептидом, который включает вышеописанную полипептидную последовательность и обладает свойствами для реверсии перестройки миокарда.
Данное изобретение также включает нуклеотидные последовательности, кодирующие вышеописанные полипептиды:
последовательность нуклеотидов, представленная в SEQ ID NO:11, кодирующая полипептид, представленный в SEQ ID NO:1;
последовательность нуклеотидов, представленная в SEQ ID NO:12, кодирующая полипептид, представленный в SEQ ID NO:2;
последовательность нуклеотидов, представленная в SEQ ID NO:13, кодирующая полипептид, представленный в SEQ ID NO:3;
последовательность нуклеотидов, представленная в SEQ ID NO:14, кодирующая полипептид, представленный в SEQ ID NO:4;
последовательность нуклеотидов, представленная в SEQ ID NO:15, кодирующая полипептид, представленный в SEQ ID NO:5;
последовательность нуклеотидов, представленная в SEQ ID NO:16, кодирующая полипептид, представленный в SEQ ID NO:6;
последовательность нуклеотидов, представленная в SEQ ID NO:17, кодирующая полипептид, представленный в SEQ ID NO:7;
последовательность нуклеотидов, представленная в SEQ ID NO:18, кодирующая полипептид, представленный в SEQ ID NO:8;
последовательность нуклеотидов, представленная в SEQ ID NO:19, кодирующая полипептид, представленный в SEQ ID NO:9;
последовательность нуклеотидов, представленная в SEQ ID NO:20, кодирующая полипептид, представленный в SEQ ID NO:10,
Согласно настоящему изобретению также предложен рекомбинантный вектор, который содержит любую из вышеописанных нуклеотидных последовательностей.
В другом предпочтительном варианте реализации изобретения, рекомбинантный вектор содержит промотор Т7.
В предпочтительном варианте реализации изобретения рекомбинантный вектор содержит нуклеотидные последовательности и плазмиду pIVEX2.3MCS.
Согласно настоящему изобретению также предложен состав, содержащий вышеописанные полипептиды, и фармацевтически приемлемые добавки.
В предпочтительном варианте реализации изобретения данный состав представляет собой состав для парентеральной инъекции.
В другом аспекте, согласно настоящему изобретению предложено применение вышеописанного полипептида для получения лекарственного средства для лечения гипертрофии миокарда.
В предпочтительном варианте реализации изобретения, предложенный полипептид выполняет функцию активного ингредиента в составе лекарственного средства, которое также включает фармацевтически приемлемые добавки.
В другом аспекте, согласно настоящему изобретению предложен способ получения полипептидов, включающий этап проведения синтеза полипептида в соответствии с вышеописанными аминокислотными последовательностями в синтезаторе полипептидов.
Согласно настоящему изобретению также предложен способ получения полипептидов, включающий следующий этап: лигирование соответствующей нуклеотидной последовательности с вектором с образованием рекомбинантного вектора; трансформацию указанного рекомбинантного вектора в клетку-хозяина; индукцию экспрессии указанного полипептида в указанной клетке-хозяине; и выделение указанного полипептида.
В предпочтительном варианте реализации способа получения полипептида рекомбинантный вектор содержит промотор Т7.
В предпочтительном варианте реализации способа получения полипептида вектор представляет собой плазмиду, а клетка-хозяин представляет собой E.coli.
В предпочтительном варианте реализации изобретения для получения полипептида используют плазмиду pIVEX2.3MCS, a E.coli. представляет собой Е.coli. штамм BL21.
Для вышеупомянутых вариантов реализации изобретения предусмотрено, что серию полипептидов получают путем делеции некоторого числа, но по меньшей мере одного аминокислотного остатка в любом положении, начиная с первого аминокислотного остатка с N-конца аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1 в направлении к С-концу данной последовательности, что является постепенным уменьшением N-концевой последовательности до делеции 43 аминокислот при сохранении только 12 аминокислотных остатков с С-конца указанной последовательности. На основании данного изобретательского замысла были оптимизированы ген и молекулярная структура пантапентаконтапептида, длина пантапентаконтапептида была успешно сокращена на 78,2% с сохранением и усилением его активности, и исследуемые полипептиды были успешно синтезированы с 99,2% чистотой путем использования передовых методов синтеза пептидов и при наличии всех ключевых параметров для внедрения в производство.
Настоящее изобретение также позволяет успешно получать необходимый полипептид методами генной инженерии. Поскольку полная длина гена пантапентаконтапептида составляет только 165 п.н. и приблизительно 180 п.н. после добавления сайтов рестрикции, мы выбрали метод, при котором две части данного гена (состоящего из 4 фрагментов) были раздельно синтезированы и затем последовательно клонированы в экспрессионный вектор. Была сконструирована экспрессионная плазмида pIVEX2.3MCS2-пантапентаконтапептид, содержащая полноразмерный ген пантапентаконтапептида под контролем Т7-промотора. Это позволило осуществлять успешную экспрессию пантапентаконтапептида с использованием данной экспрессионной плазмиды в прокариотической клетке под контролем Т7-промотора.
В рамках настоящего изобретения было проведено более системное исследование фармакодинамики данного исследуемого полипептида с использованием таких методов, как световая микроскопия, электронная микроскопия, прямое взвешивание, цветное ультразвуковое исследование В-типа, и других методов и было показано, что фармакодинамические параметры характеризуются значительной эффективностью. При проведении данного исследования было показано, что исследуемый полипептид характеризуется хорошей эффективностью для проведения профилактики в in vitro модели гипертрофии кардиоцитов, индуцированной различными факторами, такими как ангиотензин II, норэпинефрин, и другими факторами; оказывает очень хорошее подавляющее действие на изменение активности МАРК, стимулируемое действием ангиотензина II, и другими факторами; оказывает хорошее терапевтическое действие как на гипертрофию миокарда у мыши в нормальной модели инвертированная коарктации грудной аорты, полученной путем проведения хирургического вмешательства in vivo. B рамках настоящего изобретения было проведено более системное исследование фармакодинамики данного исследуемого полипептида с использованием таких методов, как световая микроскопия, электронная микроскопия, прямое взвешивание, цветное ультразвуковое исследование В-типа и других методов и было показано, что фармакодинамические параметры характеризуются значительной эффективностью. При проведении данного исследования было показано, что исследуемый полипептид характеризуется хорошей эффективностью для проведения профилактики в in vitro модели гипертрофии кардиоцитов, индуцированной различными факторами, такими как ангиотензин II, норэпинефрин, и другими факторами; оказывает очень хорошее подавляющее действие на изменение активности МАРК, стимулируемое действием ангиотензина II, и другими факторами; оказывает положительное терапевтическое действие как на гипертрофию миокарда у мыши в нормальной модели инвертированная коарктации грудной аорты, полученной путем проведения хирургического вмешательства in vivo, и на гипертрофию миокарда, вызванной острой объемной перегрузкой у нормальных крыс; также было показано явное влияние на реверсию перестройки миокарда, реверсию патологического утолщения стенок сосудов и понижение кровяного давления у крыс со спонтанной гипертензией.
При предварительной оценке безопасности было показано, что данный исследуемый полипептид является чрезвычайно безопасным для введения. (1) Тест на цитотоксичность: цитотоксичность отсутствует (отрицательно). (2) Тест на генотоксичность: генотоксичность отсутствует (отрицательно). (3) Тест на мутагенность (тест Эймса): мутагенное действие отсутствует (отрицательно). Предельно допустимая доза данного исследуемого полипептида у мышей превышает минимальное значение 50 мг/кг, отношение предельно допустимой дозы к эффективной дозе превышает минимальное значение 500; где отношение LD50 для мыши к обычной дозе (клиническую дозу преобразовали в дозу для мыши) каптоприла, Лозартана и нифедипина, типичных гипотензивных лекарственных средств, обладающих действием реверсии гипертрофии миокарда, составляет 388, 349 и 157 соответственно, что указывает на то, что безопасность данного исследуемого полипептида значительно превышает безопасность вышеуказанных лекарственных средств. Более того, не наблюдали развития каких-либо токсических нежелательных явлений при проведении данного теста.
ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
Фиг.1. Изменения морфологии тканей сердечной мышцы в модельной группе у крыс со спонтанной гипертензией (SHR).
Фиг.2. Изменения морфологии тканей сердечной мышцы в модельной группе, получавших лозартан.
Фиг.3. Изменения морфологии тканей сердечной мышцы в группе, получавших гептакозапептид.
Фиг.4. Изменения ультрамикроструктуры тканей сердечной мышцы в модельной группе у крыс со спонтанной гипертензией.
Фиг.5. Изменения ультрамикроструктуры тканей сердечной мышцы в группе, получавших лозартан.
Фиг.6. Изменения ультрамикроструктуры тканей сердечной мышцы в группе, получавших гептакозапептид.
ПРИМЕРЫ
Данное изобретение более подробно проиллюстрировано согласно отдельному варианту реализации в комбинации с фигурами.
Пример 1: Твердофазный синтез полипептида
1. Процесс синтеза и очистки гептакозапептида
25 г смолы (постоянный заместитель 0,6 ммоль/г) использовали для получения в лабораторном масштабе на следующих этапах. В производственном масштабе использовали 1 кг смолы, пропорционально увеличивали загрузку веществ на входе и увеличивали время реакции.
1.1 Процесс синтеза гептакозапептида
1. Готовили точную навеску 25 г Fmoc-Val-Wang смолы и помещали внутрь реактора вместимостью 1000 мл, затем добавляли дихлорметан, встряхивали и перемешивали в течение 30 минут, промывали соответственно 500 мл дихлорметана, метилового спирта и диметилформамида дважды и фильтровали с использованием насоса для удаления растворителя.
2. Добавляли 500 мл 20% пиперидина/диметилформамида, встряхивали при комнатной температуре и проводили реакцию в течение 30 минут для удаления N-концевой защитной Fmoc-группы. После удаления растворителя путем фильтрования с использованием насоса смолу промывали 500 мл дихлорметана, метилового спирта и диметилформамида дважды и удаляли растворитель путем вакуум-фильтрования.
3. Готовили навески 21,2 г Fmoc-Leu-OH и 22,8 г гексафторфосфата 2-(1Н-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония (HBTU) и растворяли в 500 мл диметилформамида, затем добавляли 40 мл диизопропилэтиламина и проводили реакцию при комнатной температуре в течение 30 минут при перемешивании. Полученную смесь затем помещали в реактор и проводили реакцию при комнатной температуре в течение 2 часов при встряхивании. После удаления реакционной жидкости путем фильтрования с использованием насоса смолу промывали 500 мл дихлорметана, метилового спирта и диметилформамида дважды и удаляли растворитель путем вакуум-фильтрования.
4. Повторяли этапы 2 и 3, все условия были оставлены без изменений и действия были идентичными за исключением того, что на Этапе 3 добавляли аминокислоту Fmoc-Asn(Trt)-OH в количестве 35,8 г, и время реакции составило 3 часа.
5. Повторяли этапы 2 и 3, и все условия были оставлены без изменений и действия были идентичными, за исключением того, что на Этапе 3 добавляли аминокислоту Fmoc-Tyr(tBu)-OH в количестве 27,6 г.
6. Повторяли этапы 2 и 3, и все другие условия были оставлены без изменений и действия были идентичными, за исключением того, что на Этапе 3 добавляли аминокислоту Fmoc-Glu(OtBu)-OH в количестве 25,5.
7. Повторяли этапы 2 и 3, и все другие условия были оставлены без изменений и действия были идентичными, за исключением того, на Этапе 3 добавляли аминокислоту Fmoc-Lys(Boc)-OH в количестве 28,1 г.
8. Повторяли этапы 2 и 3, и все другие условия были оставлены без изменений и действия были идентичными, за исключением того, что на Этапе 3 добавляли аминокислоту Fmoc-Leu-OH в количестве 21,2 г.
9. Повторяли этапы 2 и 3, и все другие условия были оставлены без изменений и действия были идентичными, за исключением того, что на Этапе 3 добавляли аминокислоту Fmoc-Asn(Trt)-OH в количестве 35,8 г.
10. Повторяли этапы 2 и 3, и все другие условия были оставлены без изменений и действия были идентичными, за исключением того, что на Этапе 3 добавляли аминокислоту Fmoc-Leu-OH в количестве 21,2 г.
11. Повторяли этапы 2 и 3, и все другие условия были оставлены без изменений и действия были идентичными, за исключением того, что на Этапе 3 добавляли аминокислоту Fmoc-Gln(Trt)-OH в количестве 36,7 г.
12. Повторяли этапы 2 и 3, и все другие условия были оставлены без изменений и действия были идентичными, за исключением того, что на Этапе 3 добавляли аминокислоту Fmoc-Leu-OH в количестве 21,2 г.
13. Повторяли этапы 2 и 3, и все другие условия были оставлены без изменений и действия были идентичными, за исключением того, что на Этапе 3 добавляли аминокислоту Fmoc-IIe-OH в количестве 21,2 г.
14. Повторяли этапы 2 и 3, и все другие условия были оставлены без изменений и действия были идентичными, за исключением того, что на Этапе 3 добавляли аминокислоту Fmoc-Thr(tBu)-OH в количестве 23,9 г.
15. Повторяли этапы 2 и 3, и все другие условия были оставлены без изменений и действия были идентичными, за исключением того, что на Этапе 3 добавляли аминокислоту Fmoc-Asp(OtBu)-OH в количестве 24,7 г.
16. Повторяли этапы 2 и 3, и все другие условия были оставлены без изменений и действия были идентичными, за исключением того, что на Этапе 3 добавляли аминокислоту Fmoc-Lys(Boc)-OH в количестве 28,1 г.
17. Повторяли этапы 2 и 3, и все другие условия были оставлены без изменений и действия были идентичными, за исключением того, что на Этапе 3 добавляли аминокислоту Fmoc-Val-OH в количестве 20,4 г.
18. Повторяли этапы 2 и 3, и все другие условия были оставлены без изменений и действия были идентичными, за исключением того, что на Этапе 3 добавляли аминокислоту Fmoc-Ala-OH в количестве 19,8 г.
19. Повторяли этапы 2 и 3, и все другие условия были оставлены без изменений и действия были идентичными, за исключением того, что на Этапе 3 добавляли аминокислоту Fmoc-Ala-OH в количестве 19,8 г.
20. Повторяли этапы 2 и 3, и все другие условия были оставлены без изменений и действия были идентичными, за исключением того, что на Этапе 3 добавляли аминокислоту Fmoc-Phe-OH в количестве 23,2 г.
21. Повторяли этапы 2 и 3, и все другие условия были оставлены без изменений и действия были идентичными, за исключением того, что на Этапе 3 добавляли аминокислоту Fmoc-Val-OH в количестве 20,4 г.
22. Повторяли этапы 2 и 3, и все другие условия были оставлены без изменений и действия были идентичными, за исключением того, что на Этапе 3 добавляли аминокислоту Fmoc-Phe-OH в количестве 23,2 г.
23. Повторяли этапы 2 и 3, и все другие условия были оставлены без изменений и действия были идентичными, за исключением того, что на Этапе 3 добавляли аминокислоту Fmoc-Arg(pbf)-OH в количестве 39,0 г.
24. Повторяли этапы 2 и 3, и все другие условия были оставлены без изменений и действия были идентичными, за исключением того, что на Этапе 3 добавляли аминокислоту Fmoc-IIe-OH в количестве 21,2 г.
25. Повторяли этапы 2 и 3, и все другие условия были оставлены без изменений и действия были идентичными, за исключением того, что на Этапе 3 добавляли аминокислоту Fmoc-Asn(Trt)-OH в количестве 35,8 г.
26. Повторяли этапы 2 и 3, и все другие условия были оставлены без изменений и действия были идентичными, за исключением того, что на Этапе 3 добавляли аминокислоту Fmoc-Glu(OtBu)-OH в количестве 25,5 г.
27. Повторяли этапы 2 и 3, и все другие условия были оставлены без изменений и действия были идентичными, за исключением того, что на Этапе 3 добавляли аминокислоту Fmoc-Thr(tBu)-OH в количестве 23,9 г.
28. Повторяли этапы 2 и 3, и все другие условия были оставлены без изменений и действия были идентичными, за исключением того, что на Этапе 3 добавляли аминокислоту Fmoc-Asp(OtBu)-OH в количестве 24,7 г.
29. Добавляли 500 мл 20% пиперидина/диметилформамида, встряхивали при комнатной температуре и проводили реакцию в течение 30 минут для удаления N-концевой Fmoc защитной группы. После удаления растворителя путем вакуум-фильтрования смолу промывали 500 мл дихлорметана, метилового спирта и диметилформамида дважды и фильтровали с использованием насоса для удаления растворителя. Смолу высушивали в вакууме в течение ночи.
2
30. Высушенную смолу взвешивали, общая масса составила 68 г, увеличение массы составило 43 г. Смолу помещали в круглодонную колбу вместимостью 250 мл, добавляли 150 мл смеси трифторуксусная кислота/ТА/1,2-этан дитиол/ TIS/HO/фенол в соотношении 7:1:1:0,1:0,35/0,5 и перемешивали при комнатной температуре в течение 4 часов. Смолу отделяли от фильтрата путем фильтрования с использованием насоса, к фильтрату добавляли 2000 мл этилового эфира при 0°С и полученный преципитат отделяли от этилового эфира путем центрифугирования и затем высушивали до получения массы 40 г неочищенного продукта, содержащего гептакозапептид.
1.2 Способ очистки гептакозапептида
1.2.1 Лиофилизованный образец неочищенного продукта, содержащего гептакозапептид растворяли в диметилсульфоксиде, разделяли с использованием системы для обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии и элюировали по градиенту. Фракции основного пика гептакозапептида собирали, объединяли и подвергали повторной лиофилизации для получения первичного очищенного сырьевого материала гептакозапептида. Лиофилизованный продукт после первоначальной очистки растворяли в 15% ацетонитриле и подвергли вторичной очистке с использованием системы для обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии. Собирали фракции основного пика, при этом удаляли загрязняющие вещества вблизи основного пика, объединяли и подвергали повторной лиофилизации для получения очищенного гептакозапептида.
1.2.2 Условия проведения хроматографии:
оборудование для проведения хроматографии: оборудование для проведения жидкостной хроматографии Varian prepstar и программное обеспечение для управления и проведения анализа;
18
хроматографическая колонка; хроматографическая колонка C (250×50 мм), заполненная Load & Lock;
подвижная фаза А: 0,05% TFA/2% ацетонитрил/вода; В: 90% ацетонитрил/вода; градиент элюции: первоначальная очистка: 8-8-32-57% подвижная фаза B в течение 70 минут, уровень градиента в течение 5 минут; вторичная очистка: 0-0-34-55% подвижная фаза B в течение 70 минут, уровень градиента в течение 5 минут;
длина волны УФ-детектора: 275 нм.
2. Способы синтеза и очистки пантапентаконтапептида
25 г смолы (постоянный заместитель 0,6 ммоль/г) использовали для получения в лабораторном масштабе в следующих этапах. В производственном масштабе использовали 1 кг смолы, пропорционально увеличивали загрузку веществ на входе и увеличивали время реакции.
1. Готовили точную навеску 25 г смолы Fmoc-Val-Wang и помещали внутрь реактора вместимостью 67,63 жидких унций (2 л), затем добавляли дихлорметан, встряхивали и выдерживали в течение 30 минут, промывали соответственно по 500 мл дихлорметана, метилового спирта и диметилформамида дважды и подвергали вакуум-фильтрованию для удаления растворителя.
2. Добавляли 500 мл 20% пиперидин/диметилформамида, перемешивали при комнатной температуре и проводили реакцию в течение 30 минут для удаления N-концевой защитной группы Fmoc. После удаления растворителя путем фильтрования с использованием насоса смолу затем промывали 500 мл дихлорметана, метилового спирта и диметилформамида дважды и удаляли растворитель путем вакуум-фильтрования.
3. Готовили навески 21,2 г Fmoc-Leu-OH и 22,8 г гексафторфосфат 2-(1Н-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония и растворяли в 500 мл диметилформамида, затем добавляли 40 мл диизопропилэтиламина и проводили реакцию при комнатной температуре в течение 30 минут при перемешивании. Затем полученную смесь помещали в реактор и проводили реакцию при комнатной температуре в течение 2 часов при встряхивании. После удаления реакционной жидкости путем фильтрования с использованием насоса смолу промывали 500 мл дихлорметана, метилового спирта и диметилформамида дважды и удаляли растворитель путем вакуум-фильтрования.
4. Повторяли промывание и удаление защитной группы в Этапах 2 и 3 и данные аминокислоты последовательно вводили до реакции с последней аминокислотой.
5. Добавляли 750 мл смеси 20% пиперидин/ диметилформамида, перемешивали при комнатной температуре и проводили реакцию в течение 30 минут для удаления N-концевой защитной группы Fmoc. Затем удаляли растворитель путем фильтрования с использованием насоса, смолу затем промывали 500 мл дихлорметана, метилового спирта и диметилформамида дважды, и удаляли растворитель путем фильтрования с использованием насоса. Смолу просушивали в вакууме в течение ночи.
2
6. Высушенную смолу взвешивали: общий вес составил 113 г, прибавка в весе составила 88 г. Смолу затем помещали в круглодонную колбу вместимостью 250 мл, затем добавляли 8,45 жидких унций (250 мл) смеси трифторуксусная кислота/ТА/1,2-этан дитиол/TIS/НО/фенол 7:1:1:0,1:0,35/0,5 и перемешивали при комнатной температуре в течение 4 часов. Смолу отделяли от фильтрата путем фильтрования с использованием насоса, к фильтрату добавляли 3000 мл этилового эфира при 0°С, полученный осадок отделяли от этилового эфира путем центрифугирования и затем высушивали до веса 85 г неочищенного пантапентаконтапептида.
7. Способ очистки и условия проведения хроматографии были определены со ссылкой на те же этапы, относящиеся к получению гептакозапептида.
3. Способ синтеза и очистки додекапептида.
1-4. Те же этапы, что и при получении пантапентаконтапептида.
5. Добавляли 500 мл смеси 20% пиперидин/диметилформамида, встряхивали при комнатной температуре и проводили реакцию в течение 30 минут для удаления N-концевой защитной группы Fmoc. Затем удаляли растворитель путем фильтрования с использованием насоса, смолу затем промывали по 500 мл дихлорметана, метилового спирта и диметилформамида дважды и удаляли растворитель путем вакуум-фильтрования. Смолу просушивали в вакууме в течение ночи.
2
6. Высушенную смолу взвешивали: общий вес составил 46 г, прибавка в весе составила 21 г. Смолу помещали в круглодонную колбу вместимостью 250 мл, затем добавляли 100 мл смеси трифторуксусная кислота/ТА/1,2-этан дитиол/TIS/HO 7:1:1:0,1:0,35 и перемешивали при комнатной температуре в течение 3 часов. Смолу отделяли от фильтрата путем фильтрования с использованием насоса, к фильтрату добавляли  1500 мл этилового эфира при 0°С и полученный преципитат отделяли от этилового эфира путем центрифугирования и затем высушивали с получением 0,67 унций (17,0 г) неочищенного продукта, содержащего додекапептид.
7. Способ очистки и условия проведения хроматографии были определены со ссылкой на те же этапы, относящиеся к получению гептакозапептида.
Пример 2. Получение пантапентаконтапептида и гептакозапептида методом генетической инженерии и их очистка
На основании нуклеотидных последовательностей, кодирующих пантапентаконтапептид и гептакозапептид, соответствующие олигонуклеотидные последовательности использовали для конструирования экспрессионных векторов.
Для получения пантапентаконтапептида синтезировали четыре одноцепочечных олигонуклеотида следующим образом:
55-1: 60 п.н.
5' tcgagctccatgggtcgagaattcattctgaagatgttcgtcgactaaacgttctctgca 3'
55-2: 52 п.н.
5' gagaacgtttagtcgacgaacatcttcagaatgaattctcgacccatggagc 3'
55-3: 85 п.н.
5' gaggtcgacctgaacccagacagtgacaaaattatctactcccacttcacgtgtgccacagacaccgagaatatccgctttgtct 3'
55-4: 85 п.н.
5' tagcccggggaccagattgtactccttcaggttcagctggaggatggtgtccttgacggctgcaaagacaaagcggatattctcg 3'
Для получения гептакозапептида два одноцепочечного олигонуклеотида были синтезированы следующим образом:
27-1:
5' catggacaccgagaatatccgctttgtctttgcagccgtcaaggacaccatcctccagctgaacctgaaggagtacaatctggtctaaccc 3'
27-2:
5' gggttagaccagattgtactccttcaggttcagctggaggatggtgtccttgacggctgcaaagacaaagcggatattctcggtgtc 3'
Первый и второй одноцепочечные олигонуклеотиды, синтезированные для получения пантапентаконтапептида, отжигали для получения двуцепочечного фрагмента ДНК с липкими концами, полученный фрагмент ДНК клонировали в прямом направлении между сайтами рестрикции Xho I и Pst I в плазмиде pEGFP-N1 (плазмида предоставлена Факультетом генетики Третьего военного медицинского университета, Цунцин, Китай) и полученную плазмиду назвали pEGFP-A. Поскольку было 20 комплементарных оснований на 3'-концах третьего и четвертого синтезированных олигонуклеотидов, третий и четвертый олигонуклеотиды отжигали и удлиняли с использованием Taq-полимеразы для получения двуцепочечного фрагмента ДНК В. Амплифицированный фрагмент наблюдали в положении 150 п.н. маркера молекулярной массы ДНК при проведении электрофореза в 2,5% агарозном геле. Фрагмент В подвергали двойному расщеплению с использованием Sal I и Sma I и затем в прямом направлении клонировали между сайтами рестрикции Sal I и Sma I в плазмиде pEGFP-A и полученную плазмиду назвали pEGFP-55, которая содержит ген пантапентаконтапептид полностью. Ген пантапентаконтапептид получали путем двойной рестрикции с использованием Xho I и Sma I и вставляли между сайтами рестрикции Xho I и Sma I в плазмиде pIVEX2.3-MCS и полученную плазмиду назвали pIVEX2.3MCS-55. Скрининг нужной плазмиды может быть осуществлен следующим образом: исследуемую плазмиду подвергают двойному расщеплению с использованием Xho I и Sma I, анализируют путем проведения электрофореза в 2,5% агарозном геле и определяют как положительный клон, если в геле имеется полоса, соответствующая приблизительно 180 п.н. маркера молекулярной массы ДНК.
Первый и второй одноцепочечные олигонуклеотиды, синтезированные для получения гептагозапептида, отжигали для получения двуцепочечного фрагмента ДНК с липкими концами для Nco I и Sma I, плазмиду pIVEX2.3 подвергали двойному расщеплению с использованием Nco I и Sma I и подвергали электрофорезу, затем фрагмент плазмиды с липкими концами выделяли с использованием набора для выделения фрагментов ДНК из геля. Ген гептакозапептида в прямом направлении клонировали в плазмиду pIVEX2.3 (приобретена в компании Roche, Швейцария) с использованием Т4 ДНК-лигазы. Положительный клон содержит ген гептакозапептида, и такую плазмиду назвали pIVEX2.3-27. С чашки, содержащей ампициллин, были отобраны шесть колоний с лигированной рекомбинантной плазмидой, помещены в 5 мл среды LB и культивированы в течение ночи; плазмиду выделяли, проводили двойное расщепление с использованием эндокуклеаз рестрикции Nco I и Sma I и исследовали методом электрофореза для идентификации; клон, идентифицированный как положительный, далее подтверждали путем секвенирования. Было установлено, что плазмиды pIVEX2.3MCS-55 и pIVEX2.3-27 были успешно сконструированы. Плазмиды pIVEX2.3MCS-55 и pIVEX2.3-27 были отдельно трансформированы в компетентные клетки BL21 (DE3) pLysE (приобретены в компании Sangon Biotech Co., Ltd., Шанхай), плазмиду выделяли из колонии трансформированных клеток с использованием набора для выделения плазмид и идентифицировали путем рестрикции, и единичные колонии отбирали и культивировали в течение 10 часов в 2 мл среды LB с ампициллином (100 мкг/мл) при 37°С при встряхивании 180 об/мин. К полученной бактериальной суспензии (200 мкл) добавляли 250 мл среды LB с ампициллином, культивировали в течение 10 часов при 37°С при встряхивании 180 об/мин, затем добавляли ИПТГ до конечной концентрации 1 мМ, культивировали в течение 4-6 часов при 37°С и затем при 30°С в течение 10 часов. Бактериальные клетки осаждали путем центрифугирования и хранили при -70°С до использования. 1 г влажного бактериального осадка ресуспендировали в 5 мл связывающего буферного раствора, разрушали путем обработки ультразвуком во льду (параметры: продолжительность пульса 6 с, амплитуда 15-20, продолжительность перерыва 8-10 минут) и центрифугировали при 12000 об/мин в течение 10 минут. Полученный супернатант отбирали пипеткой для очистки. Очистку проводили с использованием аффинной хроматографии с использованием никель-хелатирующей смолы в денатурирующих условиях. Колонку с никель-хелатирующей смолой сначала уравновешивали 5 мл денатурирующего связывающего буфера. Супернатант, полученный после обработки ресуспендированного бактериального осадка ультразвуком, пропускали через колонку с контролируемой скоростью потока, не превышающей 10 м/ч и собирали элюат. На колонку помещали 5 мл денатурирующего отмывочного буфера А и собирали элюат. Смешивали 1 мл полученной жидкости с неденатурирующим отмывочным буфером В и денатурирующим отмывочным буфером В в отношении 0:1, 1:9, 2:8, 3:7, 4:6, 5:5, 6:4, 7:3, 8:2, 9:1 и 1:0. Затем элюировали содержимое колонки с использованием вышеописанных буферных растворов и затем 2 мл неденатурирующего буфера В для промывки (общая продолжительность процедуры должна быть не меньше 2-3 часов) и собирали элюат. Элюирующий буфер А (3 мл) пропускали через колонку для элюирования белка и собирали элюат. Элюирующий буфер А (2×3 мл) пропускали через колонку для элюирования белка и собирали элюат. Чистоту полученного белка определяли методом электрофореза в SDS-полиакриламидном геле. Было показано, что бактериальные клетки BL21 (DE3) экспрессируют нужный полипептид, количество экспрессируемого полипептида составляет приблизительно 10% общего белка в бактериальных клетках, и выход данного полипептида из 250 мл бактериальной суспензии после очистки на колонке с никель-хелатирующей смолой и ренатурации составляет приблизительно 1,5 мг. Большую часть данного полипептида элюировали раствором 500 мМ имидазола, и данный полипептид формирует одну полосу при проведении электрофореза в SDS-полиакриламидном геле, чистота продукта, определенная методом денситометрии, составила 98%.
Пример 3. Серия полипептидов, описываемых в настоящем изобретении, может снижать содержание белка у крыс в модели гипертрофии кардиоцитов, индуцированной норэпинефрином.
3
2
1. Исследование проводили на крысах линии Wistar в возрасте 1-3 дня после рождения (приобретены в Центре экспериментальных животных Третьего военного медицинского университета). Крыс умерщвляли путем цервикальной дислокации и фиксировали на секционный стол. Кожу в вентральной части тела дезинфицировали 2% настойкой йода и затем 75% этиловым спиртом. Сердце удаляли, резали на куски размером приблизительно 1-3 мм, подвергали повторному расщеплению с использованием дигестирующего раствора, содержащего 0,08% трипсина, 0,02% ЭДТА и 0,05% коллагена. Клетки собирали в модифицированную по способу Дульбекко культуральную среду Игла, содержащую 10% эмбриональной бычьей сыворотки, и культивировали в инкубаторе при 37°С и содержании CO 5%.
2. Кардиоциты культивировали в течение 48 часов и помещали в не содержащую сыворотки модифицированную по способу Дульбекко культуральную среду Игла и затем культивировали в течение 24 часов до добавления лекарственного средства в соответствии со следующим разделением на группы:
нормальная контрольная группа: добавляли 10 мкл фосфатно-солевого буфера;
группа норэпинефрина; норэпинефрин (НОРЭПИНЕФРИН, Serva Corporation, США) добавляли в концентрации 1 мкМ;
группа полипептида: добавляли Н норэпинефрин, в то время как соответствующий полипептид добавляли в концентрации 10 нМ.
3. После добавления лекарственного средства клетки культивировали в течение 24 часов и затем удаляли культуральную среду. Культуру затем промывали с использованием фосфатно-солевого буфера, затем добавляли 0,5 мл 5% трихлоруксусной кислоты на ячейку и выдерживали при 4°С в течение 1 часа. Полученный преципитат растворяли в 1 мл 0,1 М NaOH. Содержание белка определяли методом Лоури.
4. Результат: пантапентаконтапептид, пентатетраконтапептид, пентатриаконтапептид, триаконтапептид, гептакозапептид, пентадикозапептид, дикозапептид, гептадекапептид и пентадекапептид в количестве 10 нмоль/л может существенно снижать содержание белка в гипертрофии кардиоцитов, индуцированной норэпинефрином; додекапептид не обладает явным эффектом (как показано в Таблице 1).
Таблица 1
Влияние серийных полипептидов, описываемых настоящим изобретением, на содержание белка в культуральных кардиоцитах у крыс (n=6, <maths num="1"><math display="block"><mrow><mover accent="true"><mi>x</mi><mo stretchy="true">¯</mo></mover><mo>±</mo><mi>s</mi></mrow></math><img file="00000001.tif" he="5" wi="12" img-content="undefined" img-format="tif" /></maths>
)
Группа
Доза (нмоль/л)
Содержание белка (мкг/10<sup>5</sup> клеток)
Контроль
-
80,5±13,9
Норэпинефрин
1000
121,0±13,2<sup>**</sup>
Пантапентаконтапептид
10
90,3±10,8<sup>##</sup>
Пентатетраконтапептид
10
92,7±12,3<sup>##</sup>
Пентатриаконтапептид
10
93,4±12,0<sup>##</sup>
Триаконтапептид
10
99,8±9,9<sup>##</sup>
Гептакозапептида
10
89,4±10,7<sup>##</sup>
Пентадикозапептид
10
100,2±11,6<sup>##</sup>
Дикозапептид
10
103,4±11,4<sup>#</sup>
Гептадекапептид
10
96,4±10,5<sup>##</sup>
Пентадекапептид
10
104,3±12,6<sup>##</sup>
Додекапептид
10
113,3±11,6
<sup>**</sup>Р<0,01 по сравнению с контрольной группой; <sup>#</sup>Р<0,05; <sup>##</sup>Р<0,01 по сравнению с группой норэпинефрина.
Пример 4. Серия полипептидов, описываемых в настоящем изобретении, может снижать содержание белка у крыс в модели гипертрофии кардиоцитов, вызванной ангиотензином II (Ангиотензин II).
1. Кардиоциты культивировали в течение 48 часов так же, как описано выше, затем помещали в не содержащую сыворотки модифицированную по способу Дульбекко культуральную среду Игла и культивировали в течение 24 часов до добавления лекарственного средства в соответствии с разделением на следующие группы: нормальная контрольная группа: добавляли 10 мкл фосфатно-солевого буфера; группа ангиотензина II: ангиотензин II добавляли в концентрации 1 мкМ; группа серии полипептидов: добавляли ангиотензин II, в то время как додекапептид, пентадекапептид, гептакозапептид, пантапентаконтапептид добавляли в концентрации 10 нМ.
2. После добавления лекарственного средства клетки культивировали в течение 24 часов и затем удаляли культуральную среду. Культуру затем промывали с использованием фосфатно-солевого буфера, затем добавляли 0,5 мл 5% трихлоруксусной кислоты на ячейку и выдерживали при 4°С в течение 1 часа. Полученный преципитат растворяли в 1 мл 0,1 М NaOH. Содержание белка определяли методом Лоури.
3. Результат: добавление ангиотензина II в культуральную среду существенно повышает содержание белка в кардиоците (мкг: 143,2±5,49 по сравнению 113,9±7,48, p<0,01) по сравнению с нормальной контрольной группой. По сравнению с ангиотензином II пентадекапептид, гептакозапептид и пантапентаконтапептид могут снижать содержание белка в кардиоците в разной степени, в то время как додекапептид не обладает явным эффектом (см. Таблица 2).
Таблица 2
Влияние серийных полипептидов на содержание белка в гипертрофических кардиоцитах, сформировавшихся под действием ангиотензина II (n=6, <maths num="2"><math display="block"><mrow><mover accent="true"><mi>x</mi><mo stretchy="true">¯</mo></mover><mo>±</mo><mi>s</mi></mrow></math><img file="00000001.tif" he="5" wi="12" img-content="undefined" img-format="tif" /></maths>
)
Группа
Доза (нмоль/л)
Содержание белка (мкг/10<sup>5</sup> клеток)
Контроль
-
113,9±7,48
Ангиотензин II
1000
143,2±5,49<sup>**</sup>
Додекапептид
10
144,0±11,7
Пентадекапептид
10
130,6±10,79<sup>#</sup>
Гептакозапептид
10
125,3±9,41<sup>##</sup>
Пантапентаконтапептид
10
127,2±6,33<sup>##</sup>
Примечание: <sup>**</sup>Р<0,01 по сравнению с контрольной группой; <sup>#</sup>Р<0,05; <sup>##</sup>Р<0,01 по сравнению с группой ангиотензина II.
Пример 5. Полипептиды могут значительно подавлять гипертрофию миокарда у мышей, индуцированную норэпинефрином.
Пятьдесят мышей из использованных при проведении данного эксперимента (приобретены в Центре экспериментальных животных Третьего военного медицинского университета) были разделены на пять групп, содержащих по 10 мышей в группе. Мышам в контрольной группе вводили смесь 0,1% аскорбиновой кислоты, 3 мг % смешанного виннокислого калия-натрия и физиологического раствора натрия хлорида. Мышам в модельной группе вводили смесь 0,1% аскорбиновой кислоты, 6 мг % норэпинефрина битартрата, физиологического раствора натрия хлорида (эквивалент 1,5 мг/кг норэпинефрина). Мышам в трех дозовых группах вводили пентадекапептид, гептакозапептид и пантапентаконтапептид в количестве 30 мкг/кг соответственно, во время введения смеси 0,1% аскорбиновой кислоты, 6 мг % норэпинефрина битартрата и физиологического раствора натрия хлорида. Введение осуществляли последовательно интраперитонеально дважды в день в течение 15 дней. Объемы дозирования для каждой группы составили 50 мл/кг. Затем животных забивали путем цервикальной дислокации, вскрывали грудную клетку, вынимали сердце, промывали от крови охлажденным физиологическим раствором натрия хлорида, промакали фильтровальной бумагой и взвешивали на весах. Осторожно отделяли предсердия и правый желудочек (оставляя межжелудочковую перегородку) и взвешивали левый желудочек.
Полученные результаты показывают, что серия полипептидов может значительным образом предотвращать развитие гипертрофии миокарда у мышей, и различные индикаторы гипертрофии миокарда во всех остальных группах были значительно улучшены, кроме массы сердца в группе пентадекапептида (снижение на 9,9% при Р>0,05) (см. Таблицу 3).
Таблица 3
Влияние серий полипептидов на гипертрофию миокарда у мышей (<maths num="3"><math display="block"><mrow><mover accent="true"><mi>x</mi><mo stretchy="true">¯</mo></mover><mo>±</mo><mi>s</mi></mrow></math><img file="00000001.tif" he="5" wi="12" img-content="undefined" img-format="tif" /></maths>
)
Группа
N
МТ (г)
МС (мг)
МЛЖ (мг)
СИ (мг/г)
ИЛЖ (мг/г)
Контроль
10
25,1±2,19
98,8±9,68
70,8±8,21
3,95±0,31
2,82±0,27
Норэпинефрин
8
23,2±1,69
112,1±12,1<sup>*</sup>
85,6±9,16<sup>**</sup>
4,82±0,44<sup>**</sup>
3,69±0,36<sup>**</sup>
Пентадекапептид
9
23,6±2,51
100,9±12,8
74,7±9,25<sup>##</sup>
4,27±0,42<sup>##</sup>
3,16±0,39<sup>##</sup>
Гептакозапептида
8
23,1±2,26
95,2±5,79<sup>#</sup>
67,9±6,30<sup>##</sup>
4,17±0,52<sup>##</sup>
2,98±0,48<sup>##</sup>
Пантапентаконтапептид
8
23,3±2,05
99,0±16,3<sup>#</sup>
72,9±12,8<sup>##</sup>
4,24±0,59<sup>##</sup>
3,13±0,50<sup>##</sup>
Примечание: МТ - масса тела; МС - масса сердца; МЛЖ - масса левого желудочка; СИ - сердечный индекс; ИЛЖ - индекс левого желудочка или индекс гипертрофии 5 миокарда.
<sup>*</sup>Р<0,05; <sup>**</sup>Р<0,01 по сравнению с контрольной группой; <sup>#</sup>Р<0,05; <sup>##</sup>Р<0,01 по сравнению с группой норэпинефрина
Пример 6. Серия полипептидов, описываемых в настоящем изобретении, значительно подавляет гипертрофию миокарда у крыс, индуцированную норэпинефрином.
Отбирали тридцать из крыс линии Wistar и разделяли на пять групп по 6 животных. Крысам контрольной группы вводили смесь 0,1% аскорбиновой кислоты, 3 мг % смешанного виннокислого калия-натрия и физиологического раствора натрия хлорида; крысам в модельной группе вводили смесь 0,1% аскорбиновой кислоты, 6% мг норэпинефрина битартрата и физиологического раствора натрия хлорида; крысам в трех группах дозирования вводили пентадекапептид, гептакозапептид и пантапентаконтапептид в количестве 15 мкг/кг соответственно, во время введения норэпинефрина. Объем дозирования для каждой группы составил 33 мл/кг, и введение осуществляли последовательно интраперитонеально дважды в день в течение 20 дней. По истечении указанного периода времени сердце и левый желудочек взвешивали.
Полученные результаты показали, что пентадекапептид может существенно снижать индекс левого желудочка, гептакозапептид и пантапентаконтапептид могут существенно снижать массу левого желудочка, сердечный индекс и индекс левого желудочка (см. Таблицу 4).
Таблица 4.
Влияние серийных полипептидов на гипертрофию миокарда у крыс, индуцированную действием норэпинефрина (n=6, <maths num="4"><math display="block"><mrow><mover accent="true"><mi>x</mi><mo stretchy="true">¯</mo></mover><mo>±</mo><mi>s</mi></mrow></math><img file="00000001.tif" he="5" wi="12" img-content="undefined" img-format="tif" /></maths>
)
Группа
МТ (г)
MC (г)
МЛЖ (г)
СИ (г/кг)
ИЛЖ (г/кг)
Контроль
189±15
0,573±0,035
0,408±0,027
3.043±0,178
2.166±0,114
Норэпинефрин
187±5,0
0,690±0,078<sup>*</sup>
0,555±0,055<sup>**</sup>
3.674±0,348<sup>**</sup>
2.954±0,225<sup>**</sup>
Пентадекапептид
188±12
0,673±0,055
0,490±0,038
3.580±0,226
2.606±0,154<sup>#</sup>
Гептакозапептид
200±13
0,622±0,032
0,442±0,017<sup>##</sup>
3.111±0,041<sup>##</sup>
2.213±0,056<sup>##</sup>
Пантапентаконтапептид
190±21
0,630±0,052
0,450±0,036<sup>##</sup>
3.310±0,137<sup>#</sup>
2.368±0,166<sup>##</sup>
Примечание: МТ - масса тела; МС - масса сердца; МЛЖ - масса левого желудочка; СИ - сердечный индекс; ИЛЖ - индекс левого желудочка, или индекс гипертрофии 10 миокарда.
<sup>*</sup>Р<0,05; <sup>**</sup>Р<0,01 по сравнению с контрольной группой; <sup>#</sup>Р<0,05; <sup>##</sup>Р<0,01 по сравнению с группой норэпинефрина
Пример 7. Полипептиды, которые могут значительным образом развитие гипертрофии миокарда у крыс, индуцированной коарктацией аорты.
Взрослые самцы крыс линии Wistar (приобретены в Центре экспериментальных животных Третьего военного медицинского университета) были случайным образом распределены в следующие группы: группа, которой была проведена имитация операции; группа, которой была проведена модельная операция; и группа, получавшая полипептиды. До проведения операции животных не кормили в течение ночи и предоставляли неограниченный доступ к воде, затем животным была введена анестезия (фенобарбитал натрия) и проведена перитонеотомия. Абдоминальную аорту отделили и вдоль абдоминальной аорты ввели 8 G иглу (внешний диаметр 0,80 мм) поверх правой почечной артерии с использованием шелковой хирургической нити до того, как иглу быстро удалили. Затем живот зашили с использованием шелковой хирургической нити. Крыс из группы имитации операции подвергли той же процедуре, как указано выше, кроме того, что лигатуру из шелковой нити не накладывали. С первого дня после операции крысам в группе имитации операции и в группе модельной операции интраперитонеально вводили физиологический раствор натрия хлорида в количестве 7,5 мл/кг один раз в день; крысам в группе полипептида интраперитонеально вводили пентадекапептид, гептакозапептид и пантапентаконтапептид соответственно, в количестве 15 мкг/кг один раз в день. Крыс разводили в течение 3 недель и затем забивали, вскрывали грудную клетку, вынимали сердце, промывали от крови охлажденным физиологическим раствором натрия хлорида, промакивали фильтровальной бумагой и взвешивали на весах. Взвешивали сердце и левый желудочек.
Результаты показали, что серия полипептидов может значительным образом предотвращать развитие гипертрофии миокарда у крыс; наблюдали существенное снижение показателей МС, МЛЖ, СИ и ИЛЖ (см. Таблицу 5).
Таблица 5
Влияние серийных полипептидов на гипертрофию миокарда у крыс, индуцированную коарктацией аорты (<maths num="5"><math display="block"><mrow><mover accent="true"><mi>x</mi><mo stretchy="true">¯</mo></mover><mo>±</mo><mi>S</mi><mi>E</mi><mi>M</mi></mrow></math><img file="00000002.tif" he="5" wi="17" img-content="undefined" img-format="tif" /></maths>
)
n
МТ (г)
МС (мг)
МЛЖ (мг)
СИ (мг/г)
ИЛЖ (мг/г)
Группа, которой была проведена имитация операции
6
222±8,2
713±23,3
399±24,9
3,22±0,08
1,80±0,07
Группа, которой была проведена модельная операция
5
204±5,8
813±31,3<sup>*</sup>
508±26,4<sup>*</sup>
3,98±0,09<sup>**</sup>
2,48±0,10<sup>**</sup>
Пентадекапептид
5
208±5,6
706±30,8<sup>#</sup>
418±12,3<sup>#</sup>
3,39±0,10<sup>##</sup>
2,01±0,06<sup>##</sup>
Гептакозапептида
5
211±6,4
696±30,7<sup>##</sup>
413±22,1<sup>#</sup>
3,30±0,08<sup>##</sup>
1,96±0,08<sup>##</sup>
Пантапентаконтапептид
5
215±8,0
702±31,3<sup>##</sup>
409±24,6<sup>#</sup>
3,27±0,08<sup>##</sup>
1,90±0,07<sup>##</sup>
<sup>*</sup>Р<0,05; <sup>**</sup>Р<0,01 по сравнению с группой, которой была проведена имитация операции; <sup>#</sup>Р<0,05; <sup>##</sup>Р<0,01 по сравнению с группой, которой была проведена модельная операция.
Пример 8. Серия полипептидов, описываемых в настоящем изобретении, могут предотвращать перестройку миокарда у крыс со спонтанной гипертензией.
1. Тридцать крыс в возрасте 13 недель со спонтанной гипертензией (SHR, приобретены в Пекинской лаборатории животных технологий Vital River Co. Ltd., Пекин) были отобраны и случайным образом распределены в пять групп по 6 крыс на группу.
Крысам со спонтанной гипертензией в модельной группе (плацебо) интраперитонеально вводили 0,9% физиологического раствора в количестве 5 мл/кг дважды в день.
В группе положительного контроля (лозартан) крысам ежедневно внутрижелудочно вводили калий лозартан в количестве 6 мг/кг.
В группе пентадекапептида: крысам вводили пентадекапептид в количестве 30 мкг/кг интраперитонеально дважды в день.
В группе гептакозапептида: крысам вводили гептакозапептид в количестве 30 мкг/кг интраперитонеально дважды в день.
В группе пантапентаконтапептида: крысам вводили пантапентаконтапептид в количестве 30 мкг/кг интраперитонеально дважды в день.
Шесть крыс лини WKY (Wistar-Kyoto) (приобретены в Центре экспериментальных животных Третьего военного медицинского университета) были дополнительно отобраны в качестве нормального контроля.
2. Введение лекарственного средства осуществляли последовательно в течение восьми недель (с 14-й недели по 21-ю неделю). Значения массы тела всех тестированных крыс получали один раз в две недели и вводимую дозу корректировали на основании полученных значений массы тела.
3. Полученные результаты позволяют предположить, что:
(1) серия полипептидов обладает некоторым гипотензивным действием и может существенно снижать систолическое кровяное артериальное давление у крыс со спонтанной гипертензией (см. Таблицу 6).
Таблица 6
Влияние серийных полипептидов, описываемых в настоящем изобретении, на систолическое кровяное давление у крыс со спонтанной гипертензией (<maths num="6"><math display="block"><mrow><mover accent="true"><mi>x</mi><mo stretchy="true">¯</mo></mover><mo>±</mo><mi>s</mi></mrow></math><img file="00000001.tif" he="5" wi="12" img-content="undefined" img-format="tif" /></maths>
, n=6).
Группа
Доза
Систолическое кровяное артериальное давление (мм рт.ст.)
0 недель
2 недель
4 недель
6 недель
8 недель
WKY
143,8±10,79
144,8±9,03
143,8±8,16
144,4±9,67
142,6±4,82
Плацебо
-
176,9±1,82
207,4±8,80<sup>##</sup>
225,3±16,24<sup>##</sup>
238,6±8,09<sup>*</sup>
248,1±7,27<sup>*</sup>
Лозартан
6 мг/кг
178,3±2,24
165,1±4,80<sup>**</sup>
177,1±8,27<sup>**</sup>
178,3±6,23<sup>**</sup>
172,6±4,82<sup>**</sup>
Пентадекапептид
30 мкг/кг
177,3±6,42
190,4±7,75<sup>**</sup>
200,2±4,13<sup>**</sup>
217,1±8,82<sup>**</sup>
224,1±6,37<sup>**</sup>
Гептакозапептида
30 мкг/кг
180,0±3,60
185,2±6,92<sup>**</sup>
189,4±6,34<sup>**</sup>
211,6±3,97<sup>**</sup>
202,3±3,87<sup>**</sup>
Пантапентаконтапептид
30 мкг/кг
178,2±4,15
189,8±7,80<sup>**</sup>
193,4±5,31<sup>**</sup>
216,0±5,55<sup>**</sup>
218,3±8,54<sup>**</sup>
## Р<0,01 по сравнению с WKY; <sup>**</sup>Р<0,01 по сравнению с плацебо.
(2) Применение серии полипептидов, предложенных согласно настоящему изобретению, может значительно улучшить состояние при перестройке миокарда у крыс со спонтанной гипертензией, и может привести к значительному снижению МТ, МЛЖ, СИ и ИЛЖ у крыс (Таблица 7), а также толщины задней стенки левого желудочка (ТЗСЛЖ) и толщины межжелудочковой перегородки (ТМЖП) у крыс со спонтанной гипертензией (Таблица 8).
Таблица 7
Влияние серийных полипептидов на гипертрофию миокарда у крыс (<maths num="7"><math display="block"><mrow><mover accent="true"><mi>x</mi><mo stretchy="true">¯</mo></mover><mo>±</mo><mi>s</mi></mrow></math><img file="00000001.tif" he="5" wi="12" img-content="undefined" img-format="tif" /></maths>
, n=6).
Группа
Доза
МТ (г)
МС (мг)
МЛЖ (мг)
СИ (мг/г)
ИЛЖ (мг/г)
WKY
300±8
876±29
582±20
2,92±0,05
1,94±0,10
Плацебо
-
309±6
1176±39<sup>##</sup>
950±31<sup>##</sup>
3,80±0,08<sup>##</sup>
3,07±0,13<sup>##</sup>
Лозартан
6 мг/кг
288±9
1003±16<sup>**</sup>
789±88
3,48±0,05<sup>**</sup>
2,74±0,28
Пентадекапептид
30 мкг/кг
307±8
1055±30<sup>**</sup>
775±28<sup>**</sup>
3,44±0,05<sup>**</sup>
2,46±0,04<sup>**</sup>
Гептакозапептида
30 мкг/кг
304±10
849±23<sup>**</sup>
609±99<sup>**</sup>
2,80±0,03<sup>**</sup>
2,01±0,07<sup>**</sup>
Пантапентаконтапептид
30 мкг/кг
291±7
949±28<sup>**</sup>
705±49<sup>**</sup>
3,26±0,05<sup>**</sup>
2,30±0,08<sup>**</sup>
Примечание: <sup>**</sup>Р<0,01 по сравнению с плацебо; <sup>##</sup>Р<0,01 по сравнению с WKY
(3) Действие серии полипептидов, описываемых в настоящем изобретении, на морфологию сердечной мышечной ткани у крыс со спонтанной гипертензией.
Результаты морфологического анализа позволяют предположить, что в то время как поперечный диаметр (ПД) и площадь поперечного сечения (ППС) кардиоцита крыс из модельной группы существенно снижаются по сравнению с данными параметрами в группе WKY (Р<0,01), площадь поперечного сечения кардиоцита у крыс в группе, получавших серию полипептидов и в группе, получавших Лозартан, существенно снижены по сравнению с данными параметрами в модельной группе (Р<0,01) (см. Таблицу 9).
Таблица 9
Морфологический анализ кардиоцитов крыс (<maths num="8"><math display="block"><mrow><mover accent="true"><mi>x</mi><mo stretchy="true">¯</mo></mover><mo>±</mo><mi>s</mi></mrow></math><img file="00000001.tif" he="5" wi="12" img-content="undefined" img-format="tif" /></maths>
, n=6)
Группа
Доза
ПД (мкм)
ППС (мкм<sup>2</sup>)
WKY
-
11,30±2,35
248±26
Плацебо
-
15,5612,94<sup>##</sup>
375±11<sup>##</sup>
Лозартан
6 мг/кг
13,83±2,54
335±20<sup>**</sup>
Пентадекапептид
30 мкг/кг
14,88±2,56
329±24<sup>**</sup>
Гептакозапептида
30 мкг/кг
12,33±1,84<sup>**</sup>
286±22<sup>**</sup>
Пантапентаконтапептид
30 мкг/кг
14,62±2,36
313±29<sup>**</sup>
## p<0,01 по сравнению с WKY; <sup>**</sup>p<0,01; <sup>**</sup>p<0,01 по сравнению с плацебо.
Под световым микроскопом было видно, что ядро кардиоцита было окрашено в синий цвет, плазма клетки была окрашена в розовый цвет, а коллаген не был окрашен.
В модельной группе у крыс со спонтанной гипертензией (Фиг.1): волокна миокарда утолщались, набухали, имели непрозрачные промежуточные пространства, были изломаны, сливались или беспорядочно располагались, и часть волокон миокарда характеризовалась более выраженной дегенерацией миокарда на обширной площади; кардиоциты были подвергнуты значительной гипертрофии, мутному набуханию, дегенерации по вакуолярному типу; ядра клеток увеличивались или подвергались пикнозу; содержимое клетки становилось гранулярным, изломанным и сливалось, даже присутствовали участки некроза; пятнистые некротические участки и очаговые некротические участки были видны в нескольких полях зрения; стенки сосудов утолщались; клетки гладкой мускулатуры пролиферировали и гипертрофировались; наблюдали интерстициальный фиброз миокарда в нескольких отдельных полях зрения. Но в целом, степень фиброза относительно умеренная и воспалительная ответная реакция относительно острая в модельной группе; очаги некроза наблюдали в нескольких полях зрения.
В группе, получавшей Лозартан (Фиг.2): патологические изменения некоторым образом улучшены и представлены в основном как инфильтрация воспалительных клеток. Можно видеть, что кардиоциты подвергнуты воспалительным изменениям, таким как видимое мутное набухание, гипертрофия и другие изменения, и участки некроза также наблюдают в нескольких полях зрения.
В группе, получавшей гептакозапептид (Фиг.3): по сравнению с модельной группой крыс со спонтанной гипертензией вышеописанные патологические изменения в кардиоцитах значительно облегчены. Улучшения патологических изменений в группе гептакозапептида значительно приближают статус этой группы к нормальной контрольной группе, и воспалительные изменения были видны случайным образом в отдельных полях зрения, такие как незначительное набухание кардиоцитов и другие изменения. Участки некроза не сформированы, и морфология волокон миокарда и стенки сосудов соответствуют норме.
(4) Действие гептакозапептида на ультраструктуру кардиоцита у крыс со спонтанной гипертензией (трансмиссионный электронный микроскоп PHILIPS-TECNI10, Нидерланды).
В модельной группе крыс со спонтанной гипертензией (Фиг.4): объем кардиоцитов увеличен, целостность ядерной мембраны кардиоцитов нарушена, ядро подвергнуто нерегулярным изменениям, таким как гипертрофия, деформация, лизис и другим изменениям; саркоплазматический ретикулум расширен; митохондрии пролиферируют, беспорядочно располагаются и набухшие в разной степени (незначительно, умеренно или остро), внутри которых формируются вакуоли; миофиламенты в основном нормально организованы и подвергаются очаговому лизису в части кардиоцитов; поперечная полосатость с расплывчатыми контурами могут быть видны в отдельных участках и Z-линии в основном соответствуют норме, некоторые из которых беспорядочно располагаются; интерстициальные коллагеновые волокна не характеризуются значительной пролиферацией.
В группе, получавшей Лозартан (Фиг.5): морфология клеточного ядра в основном соответствует норме и некоторым образом нерегулярна; миофиламенты под плазматической мембраной подвергаются очаговому лизису; митохондрии слегка набухшие; саркоплазматический ретикулум расширен и слегка набухший; структура Z-линий и поперечная полосатость в основном соответствуют норме.
В группе, получавшей гептакозапептид (Фиг.6): по сравнению с модельной группой крыс со спонтанной гипертензией, ультраструктура миокарда значительно улучшена. Структура кардиоцитов в-основном соответствует норме: саркомеры кардиоцита и миофиламенты в основном соответствуют норме; поперечные полосы четко видны; интерстициальные коллагеновые волокна не характеризуются значительной пролиферацией; Z-линии располагаются организованно; митохондрии не характеризуются значительной пролиферацией, некоторые митохондрии слегка набухшие; миофиламенты слегка подвергнуты лизису; и эндотелиальные клетки капиллярных сосудов соответствуют норме.
Несмотря на приведенные выше примеры, варианты реализации настоящего изобретения не ограничены вышеупомянутыми примерами; различные вариации вариантов реализации настоящего изобретения могут быть предложены, не выходя за рамки данного изобретения, и в любом случае будут попадать в объем, определяемый формулой настоящего изобретения.
Список литературы
1. Cooper G 4th. Basic determinants of myocardial hypertrophy: a review of molecular mechanisms. Annu Rev Med, 1997, 48:13-23.
2. Aoki H, Sadoshima J, Izumo S. Myosin light chain kinase mediates sarcomere organization during cardiac hypertrophy in vitro. Nat Med 2000, 6(2):183-188.
3. McKinsey ТА, Kass DA. Small-molecule therapies for cardiac hypertrophy: moving bеneаth the cell surface. Nat Rev Drug Discov. 2007; 6(8):617-635.
4. Mitchell JA, Ventura HO, Mehra MR. Early recognition and treatment of hypertensive heart disease. Curr Opin Cardiol. 2005; 20(4):282-289.
5. Jalili T, Carlstrom J, Kim S, Freeman D, Jin H, Wu TC, Litwin SE, David Symons J. Quercetin-supplemented diets lower blood pressure and attenuate cardiac hypertrophy in rats with aortic constriction. J Cardiovasc Pharmacol. 2006; 47(4):531-541.
6. Carlstrom J, Symons JD, Wu TC, Bruno RS, Litwin SE, Jalili T. A quercetin supplemented diet does not prevent cardiovascular complications in spontaneously hypertensive rats. J Nutr. 2007; 137(3):628-633.
7. Niizeki T, Takeishi Y, Kitahara T, et al. Diacylglycerol Kinase zeta Rescues Galphaq-Induced Heart Failure in Transgenic Mice. Circ J. 2008; 72(2):309-317.
2
8. Dorn GW 2nd, Tepe NM, Lorenz JN, Koch WJ, Liggett SB. Low- and high-level transgenic expression of β-adrenergic receptors differentially affect cardiac hypertrophy and function in Gαq-overexpressing mice. Proc Natl Acad Sci USA. 1999; 96(11):6400-6405.
9. Berenji K, Drazner MH, Rothermel BA, Hill JA. Does load-induced ventricular hypertrophy progress to systolic heart failure? Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2005; 289(1):H8-H16.