СПОСОБ ПОСТАНОВКИ ПРОГНОЗА И НАБОРЫ, ПРИМЕНИМЫЕ В УКАЗАННОМ СПОСОБЕ
FORECASTING METHOD AND SETS APPLICABLE IN SAID METHOD

Область изобретения
Настоящее изобретение в целом относится к способам и анализам для постановки диагноза, прогноза и контроля рака молочной железы, а также наборам, которые можно применять в таких способах.
2
Более конкретно, настоящая заявка относится к применению экспрессии гетеромера HER2/CB для предсказания вероятной длительности выживаемости без признаков локального заболевания. Также возможна оценка вероятности метастазирования, длительности общей выживаемости у пациентов с раком молочной железы и исхода вариантов терапии рака молочной железы. Она также относится к улучшенным мишеням лекарственных средств.
Уровень техники
Рак молочной железы представляет собой одну из наиболее часто встречающихся злокачественных новообразований во всем мире и является важной проблемой здравоохранения. Несмотря на постоянное улучшение понимания заболевания, рак молочной железы по большей части остается устойчивым к медицинскому вмешательству. Большинство клинических мероприятий направлены на раннюю постановку диагноза, за которыми следуют традиционные формы вмешательства, в частности хирургическое вмешательство, лучевая терапия, гормональная супрессия и химиотерапия. Такие вмешательства имеют ограниченный успех, в частности у пациентов, у которых опухоль начала метастазировать. Таким образом, существует острая необходимость в улучшении арсенала средств для постановки диагноза и способов получения более точной и более обширной информации, которая будет способствовать успешному лечению наименее инвазивным из возможных путем. Также сохраняется необходимость в идентификации дополнительных и лучших мишеней для лечения лекарственными средствами.
2
2
2
В последние годы рак молочной железы классифицировали на разные подтипы в соответствии с молекулярными параметрами. Один подтип характеризуется сверхэкспрессией рецептора эпидермального фактора роста человека 2 типа (HER2) и составляет 20% – 25% всех случаев карциномы молочной железы. Отдельно было показано, что CB сверхэкспрессируется при HER2+ раке молочной железы и что CB стимулирует образование и прогрессирование опухолей в результате активации проонкогенной передачи сигнала посредством HER2 с участием c-SRC-киназы. Также было показано, что CB образует гетеромеры с HER2 в образцах рака молочной железы человека.
Сохраняется необходимость в разработке лучших средств для постановки диагноза, прогноза и контроля рака молочной железы и в особенности HER2+ рака молочной железы. Также важно идентифицировать новые терапевтические мишени.
Краткое описание изобретения
2
2
2
2
9
Авторами настоящего изобретения было обнаружено, что экспрессия HER2/CB коррелирует с выживаемостью без признаков локального заболевания у пациентов с раком молочной железы. Также недавно было описано, что HER2/CB присутствует в виде гетеромера в клетках рака молочной железы. Авторы настоящего изобретения также показали, что экспрессия гетеромеров HER2/CB коррелирует с неблагоприятным для пациентов прогнозом. Также гетеромеры HER2/CB диссоциируют при обработке раковых клеток Δ-тетрагидроканнабинолом (THC).
2
Соответственно, в первом аспекте настоящего изобретения предусмотрен способ постановки прогноза у пациента, страдающего раком молочной железы, включающий определение уровня экспрессии гетеромера HER2/CB в биологическом образце, полученном от указанного пациента.
2
2
Во втором аспекте настоящего изобретения предусмотрен способ предсказания длительности общей выживаемости у пациента с раком молочной железы, включающий определение уровня экспрессии гетеромера HER2/CB в биологическом образце, полученном от указанного пациента; сравнение указанного уровня со стандартами, характеризующими здоровых индивидуумов или характеризующими более высокую или более низкую общую выживаемость; с предсказанием за счет этого длительности общей выживаемости, ассоциированной с указанным уровнем экспрессии гетеромера HER2/CB.
2
В третьем аспекте настоящего изобретения предусмотрен способ предсказания длительности выживаемости без признаков заболевания у пациента с раком молочной железы, включающий определение уровня экспрессии гетеромера HER2/CB в биологическом образце, полученном от указанного пациента; сравнение указанного уровня со стандартами, характеризующими здоровых индивидуумов или характеризующими более высокую или более низкую общую выживаемость; с предсказанием за счет этого длительности выживаемости без признаков заболевания, ассоциированной с указанным уровнем экспрессии гетеромера HER2/CB2.
2
В четвертом аспекте настоящего изобретения предусмотрен способ постановки диагноза или прогноза рака молочной железы у субъекта, при этом способ включает получение ткани субъекта; определение уровня экспрессии гетеромера HER2/CB в ткани и постановку диагноза или прогноза рака молочной железы в случае, если уровень экспрессии превышает стандарт.
2
2
Стадию определения уровня экспрессии гетеромера HER2/CB в аспектах 1-4 можно осуществлять с помощью любого способа, известного из уровня техники. Однако в некоторых вариантах осуществления способ определения уровня экспрессии гетеромера HER2/CB представляет собой протоколы совместной локализации, анализы совместной иммунопреципитации, методики резонансного переноса энергии, анализы близкого лигирования или применение специфических зондов, разработанных для выявления гетеромеров.
2
В пятом аспекте настоящего изобретения предусмотрен способ лечения HER+ рака молочной железы, включающий стадию введения фармацевтического средства, способного разрушать гетеромер HER2/CB, за счет чего осуществляется лечение указанного HER+ рака молочной железы.
2
В шестом аспекте настоящего изобретения предусмотрен набор, содержащий средство, способное выявлять гетеромер HER2/CB, и инструкции по применению.
Краткое описание графических материалов
2
2
2
Фигура 1. Иллюстративные изображения, показывающие экспрессию HER2, CB и гетеромера HER2-CB в HER2+ опухоли молочной железы (положительный контроль, верхние панели) и HER2- опухоли молочной железы (отрицательный контроль, нижние панели). Окрашивание HER2 и CB показано коричневым цветом, а окрашивание гетеромера – розовым. Ядра клеток окрашивали DAPI (синий цвет).
2
Фигура 2. Кривые Каплана-Мейера выживаемости без локальных рецидивов. Образцы классифицировали в зависимости от экспрессии гетеромера HER2-CB и распределяли на две группы (низкая и высокая экспрессия) путем отбора предельного значения вручную.
2
2
Фигура 3. Анализ с помощью вестерн-блоттинга HER2 и CB в указанных линиях клеток. Клетки трансфицировали плазмидой, кодирующей CB-HA, и обрабатывали THC в течение 4 ч. Затем обеспечивали иммунопреципитацию HER2 с помощью антитела к HER2 и блоты проявляли с помощью антител к HA.
2
Фигура 4. Экспрессия гетеромера HER2-CB в клетках HCC1954. Иллюстративные изображения экспериментов PLA в ответ на указанные обработки.
Фигура 5. Экспрессия белка в клетках HCC1954. Анализ экспрессии белка с помощью вестерн-блоттинга общего и фосфорилированного (т. е. активированного) HER2 в ответ на THC.Фигура 6. Экспрессия гетеромера HER2-HER2 в клетках HCC1954. Иллюстративные изображения экспериментов PLA в ответ на указанные обработки.
Подробное описание предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения
Перед описанием способов и наборов по настоящему изобретению необходимо понимать, что настоящее изобретение не ограничивается конкретными описанными способами, протоколами и реагентами, поскольку таковые могут меняться. Также необходимо понимать, что терминология, применяемая в данном документе, предназначена лишь в целях описания конкретных вариантов осуществления, и не предполагает ограничивать объем настоящего изобретения, который будет описан прилагаемой формулой изобретения.
Необходимо отметить, что, как применяется в данном документе и в прилагаемой формуле изобретения, формы существительного единственного числа включают формы множественного числа, если контекст четко не определяет иное. Таким образом, например, ссылка на «клетку» включает несколько таких клеток; ссылка на «антитело» включает одно или более антител и их эквиваленты, известные специалистам в данной области техники, и т. д.
Если не определено иное, все технические и научные термины, применяемые в данном документе, имеют такие же значения, которые обычно понимает средний специалист в области техники, к которой принадлежит настоящее изобретение. Хотя любые способы и материалы, аналогичные или эквивалентные тем, которые описаны в данном документе, можно применять при практическом осуществлении или тестировании настоящего изобретения, ниже описаны способы, изделия и материалы. Все публикации, упоминаемые в данном документе, включены в данный документ посредством ссылки с целью описания и раскрытия антител, белков, нуклеиновых кислот и способов, которые описаны в публикациях, которые можно применять в связи с настоящим изобретением. В данном документе ничего не следует истолковывать в качестве признания того, что настоящему изобретению не дается права на противопоставление такого раскрытия с более ранним приоритетом ввиду предшествующего изобретения.
Необходимо понимать, что, если в данном документе делается ссылка на какую-либо публикацию из уровня техники, то такая ссылка не означает признания того, что эта публикация образует часть общедоступных известных знаний в данной области техники в Австралии или любой другой стране.
В следующей формуле изобретения и предшествующем описании настоящего изобретения, за исключением случаев, когда контекст требует иного в силу явно выраженных формулировок или необходимого логического вывода, слово «содержать» или его варианты, такие как «содержит» или «содержащий», употребляются во включающем смысле, т. е. для указания наличия заявленных признаков, но не для исключения наличия или добавления дополнительных признаков в различных вариантах осуществления настоящего изобретения.
2
В соответствии с настоящим изобретением предусмотрены способы постановки прогноза у пациента, страдающего раком молочной железы, в особенности HER2+ раком молочной железы, включающие определение уровней экспрессии гетеромера HER2/CB в биологическом образце, полученном от указанного пациента.
2
В одном варианте осуществления способ может включать приведение в контакт указанного биологического образца с композицией, связывающей гетеромер HER2/CB.
2
2
В другом варианте осуществления способ может дополнительно включать сравнение уровней экспрессии гетеромера HER2/CB в указанном биологическом образце со стандартом, с постановкой за счет этого прогноза, ассоциированного с указанными определенными уровнями экспрессии гетеромера HER2/CB.
2
В другом варианте осуществления было обнаружено, что повышенные уровни экспрессии гетеромера HER2/CB ассоциированы с пациентами, имеющими сокращенную длительность выживаемости без признаков локального заболевания.
2
В одном варианте осуществления настоящего изобретения было обнаружено, что повышенные уровни экспрессии гетеромера HER2/CB ассоциированы с пациентами, имеющими сокращенную длительность выживаемости без прогрессирования.
2
В другом варианте осуществления было обнаружено, что повышенные уровни экспрессии гетеромера HER2/CB ассоциированы с пациентами, имеющими сокращенную длительность бессобытийной выживаемости.
2
Уровни экспрессии гетеромера HER2/CB можно применять в качестве единственного фактора при оценке статуса заболевания или вместе с дополнительными факторами, в том числе статусом лимфатических узлов, статусом эстрогеновых рецепторов и т. п.
Термин «диагноз» применяется в данном документе для обозначения идентификации пациента, который страдает раком молочной железы, в особенности HER2+ раком молочной железы.
Термин «прогноз», применяемый в настоящей заявке, означает вероятность выздоровления от рака молочной железы или предсказание возможного развития или исхода рака молочной железы, в том числе без ограничения предсказания длительности общей выживаемости, длительности выживаемости без рецидивов рака молочной железы, выживаемости без прогрессирования, бессобытийной выживаемости, вероятности повторного возникновения рака молочной железы у пациента и вероятности метастазирования рака молочной железы.
2
Фраза «общая выживаемость» хорошо известна специалисту в данной области техники и обозначает судьбу пациента после постановки диагноза, несмотря на возможность того, что причина смерти пациента прямо не связана с эффектами рака. Фраза «выживаемость без признаков заболевания» хорошо известна специалисту в данной области техники и означает проживание жизни без заболевания, в отношении которого осуществляют контроль. Например, если экспрессию гетеромера HER2/CB применяют для постановки диагноза или контроля рака молочной железы, то выживаемость без признаков заболевания будет означать отсутствие выявляемого рака молочной железы. Фраза «вероятность выздоровления» хорошо известна специалисту в данной области техники и обозначает вероятность исчезновения опухоли или отсутствия повторного возникновения опухоли, приводящую к выздоровлению пациента, после постановки диагноза рака, при этом данную вероятность определяют в соответствии со способом по настоящему изобретению. Фраза «вероятность повторного возникновения» хорошо известна специалисту в данной области техники и обозначает вероятность повторного возникновения опухоли или метастазирования у пациента после постановки диагноза рака, при этом данную вероятность определяют в соответствии со способом по настоящему изобретению. Фраза «бессобытийная выживаемость» хорошо известна специалисту в данной области техники и означает проживание жизни без возникновения определенных конкретной группой событий (например, прогрессирования рака) после конкретного действия (например, лечения). Фраза «выживаемость без прогрессирования» хорошо известна специалисту в данной области техники и обозначает продолжительность времени в ходе лечения или после него, в течение которого пациент проживает жизнь с заболеванием, которое не усугубляется, и может участвовать в клиническом исследовании или испытании в целях содействия обнаружению того, насколько эффективным является лекарственный препарат. Термин «метастазирование» хорошо известен специалисту в данной области техники и обозначает рост раковой опухоли в органе или части организма, которая непосредственно не привязана к органу исходной раковой опухоли. Необходимо понимать, что метастазирование включает микрометастазирование, которое представляет собой присутствие не подлежащего выявлению количества раковых клеток в органе или части организма, которые непосредственно не привязаны к органу исходной раковой опухоли. Таким образом, в настоящем изобретении предусмотрен способ определения риска дополнительного роста одной или более раковых опухолей в органе или части организма, которые непосредственно не привязаны к молочной железе.
2
Применяемая в данном документе фраза «биологический образец» охватывает ряд типов образцов, полученных от субъекта и применимых в процедуре по настоящему изобретению. Биологические образцы могут включать без ограничения твердые образцы тканей, жидкие образцы тканей, биологические жидкости, аспираты, клетки и клеточные фрагменты. Конкретные примеры биологических образцов включают без ограничения твердые образцы тканей, полученные посредством хирургического удаления, патологический образец, архивный образец или биоптат, культуры тканей или клетки, полученные из них, и их потомство, а также срезы и мазки, полученные из любого из этих источников. Неограничивающими примерами являются образцы, полученные из ткани молочной железы, лимфатических узлов и опухолей молочной железы. Весь биологический образец или его часть могут характеризоваться уровнем экспрессии гетеромера HER2/CB, характерным для одного или более болезненного(-ых) состояния(-й).
2
2
Как применяется в данном документе, «стандарт» представляет собой эталон, который выступает в качестве основы для сравнения других данных. Стандарт может включать биологический образец, фотографии или микрофотографии биологических образцов или нормальные диапазоны (например, в пределах диапазона здоровых индивидуумов), получаемые в результате анализа биологических образцов. Например, стандарты могут включать нормальную и/или раковую ткань, не содержащую рак ткань или архивный патологический образец, характеризующийся экспрессией гетеромерного белка HER2/CB на различных уровнях, для применения в качестве положительного контроля, и опухолевую ткань или другую ткань, характеризующуюся отсутствием уровней экспрессии гетеромера HER2/CB, в качестве образцов отрицательного контроля, фотографию или микрофотографии или нормальные диапазоны, полученные из указанных образцов. Такие стандарты можно применять в способах, в том числе без ограничения предсказания длительности выживаемости без признаков заболевания и общей выживаемости, предсказания выживаемости без прогрессирования заболевания, предсказания риска сокращенной выживаемости без признаков заболевания или общей выживаемости, предсказания вероятности выздоровления пациента, страдающего раком, предсказания вероятности повторного возникновения рака и/или метастазирования у индивидуума, имеющего раковую опухоль, предсказания риска повторного возникновения рака, способах скрининга пациента, страдающего раком, для определения риска метастазирования опухоли, способах определения соответствующего курса лечения для пациента, страдающего раком, и способах контроля эффективности курса лечения для пациента, страдающего раком.
2
2
2
2
2
2
«Композиция, связывающая гетеромер HER2/CB» может включать любое средство, в том числе без ограничения лиганды, антитела к гетеромеру HER2/CB или его антигенсвязывающие фрагменты, которые способны специфически связываться с гетеромером HER2/CB. Применяемый в данном документе термин «средство, которое связывается с (или способно связываться с) гетеромером HER2/CB» обозначает любую молекулу, которая специфически связывается с гетеромером HER2/CB или его полипептидным фрагментом, в том числе без ограничения антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, и, тем самым, выявляет уровни экспрессии гетеромера HER2/CB. Такие средства предпочтительно метят для обеспечения выявления с применением способов, хорошо известных специалистам в данной области техники. Примеры меток включают без ограничения радиоактивные метки, хромофоры, флуорофоры, ферменты, связывающие фрагменты (например, биотин) и т. п.
«HER2», «ErbB2» «c-Erb-B2» применяют взаимозаменяемо. Если не указано иное, термины «ErbB2», «c-Erb-B2» и «HER2» при применении в данном документе обозначают белок человека. Ген ErbB2 и белок ErbB2 человека описаны, например, в Semba et al., PNAS (USA) 82:6497-650 (1985) и Yamamoto et al. Nature 319:230-234 (1986) (номер доступа в Genbank X03363). Примеры антител, которые специфически связываются с HER2, раскрыты в патентах США №№ 5677171; 5772997; Fendly et al., Cancer Res., 50: 1550-1558 (1990); моноклональное антитело 4D5 к HER2, продуцируемое линией клеток гибридомы (ATCC CRL 10463), моноклональное антитело 6B3 к HER2, продуцируемое линией клеток гибридомы (номер в ATCC PTA-5262), моноклональное антитело к ErbB2, продуцируемое линиями клеток гибридомы HB-11601 и HB-11602; и т. п.
2
2
2
2
Антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, как моноклональные, так и поликлональные, можно применять в качестве композиции, связывающей гетеромер HER2/CB, которая связывает гетеромерный белок HER2/CB или его полипептидный фрагмент. В данном документе также предусмотрены в качестве композиции, связывающей гетеромер HER2/CB, любые мутантные формы белков, которые специфически связывают гетеромер HER2/CB, полученные в результате либо добавления (например, добавления домена GST или домена GFP), либо модификации последовательности (например, сайт-специфического мутагенеза) и т. п.
Термин антитело в данном документе включает без ограничения человеческие и отличные от человеческих поликлональные антитела, человеческие и отличные от человеческих моноклональные антитела (mAb), химерные антитела, антиидиотипические антитела (антитела к IdAb) и гуманизированные антитела.
Подразумевается, что термин антитело также включает интактные молекулы, а также их фрагменты, такие как, например, Fab, F(ab).sub.2, Fab', F(ab').sub.2, Fd, Fd', Fv и scFv, одноцепочечные антитела (природные или рекомбинантные), которые способны связываться с антигеном. Антитело или антигенсвязывающий компонент могут находиться в растворе или быть прикреплены к подложке (планшету, гранулам, магнитным гранулам и т. д.).
2
Антитела или фрагменты антител могут представлять собой применимые иммунофлуоресцентные методики, в которых используют флуоресцентно-меченое антитело с флуоресцентно-микроскопическим, проточно-цитометрическим или флуорометрическим выявлением. Реакцию антител и полипептидов по настоящему изобретению можно выявлять с помощью способов иммуноанализа, хорошо известных из уровня техники. Антитела по настоящему изобретению можно использовать гистологически в световой микроскопии, визуализации, иммунофлуоресцентной или иммуноэлектронной микроскопии, например, для выявления in situ гетеромерного белка HER2/CB в образцах тканей или биоптатах. Выявление in situ можно осуществлять путем удаления гистологического образца из организма пациента и нанесения соответствующим образом меченого антитела по настоящему изобретению.
2
Биологический образец можно обрабатывать на твердофазной подложке или носителе, таком как нитроцеллюлоза или другая твердая подложка, способная обеспечивать иммобилизацию клеток или клеточных частиц или растворимых белков. Подложку можно затем промывать с последующей обработкой выявляемым меченым антителом к гетеромеру HER2/CB. За этим следует промывание подложки в целях удаления несвязанного антитела. Количество связанной метки на указанной подложке затем можно выявлять с помощью традиционных способов. Под твердофазной подложкой подразумевается любая подложка, способная связывать антиген или антитела, такая как без ограничения стекло, полистирол, полипропилен, нейлон, модифицированная целлюлоза или полиакриламид. Альтернативно антиген может находиться в растворе, а антитело быть прикрепленным к подложке (планшету, гранулам, магнитным гранулам и т. д.).
2
Активность связывания определенной части антитела с гетеромерным белком HER2/CB можно определять в соответствии с хорошо известными способами. Специалисты в данной области техники смогут определить рабочие и оптимальные условия анализа для каждого определения путем проведения стандартных экспериментов.
2
В одном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрены способы прогнозирования HER2+ рака молочной железы путем выявления уровня экспрессии гетеромера HER2/CB.
2
2
2
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрены способы предсказания длительности выживаемости без признаков HER2+ рака молочной железы у пациента, страдающего HER2+ раком молочной железы, путем определения уровня экспрессии гетеромера HER2/CB в биологическом образце, полученном от указанного пациента, сравнения указанного уровня со стандартами, характеризующими здоровых индивидуумов или характеризующими более высокую или более низкую длительность выживаемости без признаков HER2+ рака молочной железы, с предсказанием за счет этого длительности выживаемости без признаков HER2+ рака молочной железы, ассоциированной с указанным уровнем экспрессии гетеромера HER2/CB, где повышенные уровни экспрессии гетеромера HER2/CB ассоциированы с сокращенной длительностью выживаемости без признаков рака молочной железы.
2
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрены способы определения уровней экспрессии гетеромера HER2/CB на ранней стадии развития опухоли. Различные стадии развития опухоли хорошо известны специалистам в данной области техники, как проиллюстрировано, например, в Markman, (1997), Basic Cancer Medicine.
2
Определение уровней экспрессии гетеромера HER2/CB
2
2
Определение экспрессии гетеромера HER2/CB можно выполнять с помощью одного или более из способов, известных среднему специалисту в данной области техники. Например, уровни экспрессии гетеромера HER2/CB можно определять с применением протоколов совместной локализации, анализов совместной иммунопреципитации, методик резонансного переноса энергии, анализов близкого лигирования или применения специфических зондов, разработанных для выявления гетеромеров.
2
2
2
2
Анализы близкого лигирования становятся все больше применимыми для понимания биологической роли молекулярных комплексов, а также при исследовании биомаркеров. Например, композиции, связывающие гетеромер HER2/CB, т. е. композиции, которые специфически связывают гетеромер HER2/CB, можно сочетать со многими разными системами выявления для измерения присутствия и/или количества гетеромера HER2/CB. Любой способ, который, как известно специалисту в данной области техники, является применимым для определения количества гетеромера HER2/CB, можно применять в соответствии с настоящим изобретением. Такие способы включают без ограничения ферстеровский резонансный перенос энергии (FRET), биолюминесцентный резонансный перенос энергии (BRET), биомолекулярную флуоресцентную комплементацию, анализ близкого лигирования (PLA) и сцинтиляционный анализ сближения (SPA).
2
2
2
2
2
2
2
2
Уровни экспрессии гетеромера HER2/CB также можно выявлять путем измерения уровней гетеромерного белка HER2/CB с применением композиций, связывающих гетеромер HER2/CB. Выявление уровней гетеромерного белка HER2/CB можно выполнять с применением любого из способов, известных среднему специалисту в данной области техники, в том числе без ограничения хемилюминесцентных способов, гистохимического окрашивания или биохимического выявления (т. е. иммуногистохимических анализов), анализа с помощью вестерн-блоттинга, проточной цитометрии, иммунопреципитации (или их эквивалента в случае средств, не являющихся антителами), измерения поглощения с помощью плазмонного резонанса и т. п. В одном варианте осуществления настоящего изобретения способ выявления уровней гетеромерного белка HER2/CB представляет собой иммуноанализ (такой как ELISA), который предусматривает применение по меньше мере одного антитела. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения окрашивание гетеромера HER2/CB в образце ткани, например, фиксированных в формалине и залитых парафином срезах ткани, можно выполнять с помощью иммуногистохимического анализа с применением антитела к гетеромеру HER2/CB, и при этом определять экспрессию гетеромера HER2/CB.
Классифицирование пациентов
Термин «рак молочной железы», применяемый в данном документе, включает проточную карциному in situ (внутрипротоковую карциному), лобулярную карциному in situ, инвазивную (или инфильтрующую) протоковую карциному, инвазивную (или инфильтрующую) лобулярную карциному, воспалительный рак молочной железы, трижды негативный рак молочной железы, болезнь Педжета соска молочной железы, филлоидную цистосаркому, ангиосаркому или инвазивную карциному молочной железы. В некоторых вариантах осуществления инвазивную карциному молочной железы дополнительно классифицируют на подтипы. В некоторых вариантах осуществления подтипы включают аденоидную кистозную (или аденокистозную) карциному, аденосквамозную карциному с низкой степенью злокачественности, медуллярную карциному, муцинозную (или коллоидную) карциному, папиллярную карциному, тубулярную карциному, метапластическую карциному, микропапиллярную карциному или смешанную карциному. Предпочтительно данный термин при применении в данном документе означает HER2+ рак молочной железы.
Термин «пациент, страдающий раком молочной железы» означает, что субъекту-человеку поставили диагноз рака молочной железы, как определено в данном документе.
2
2
2
2
2
2
2
2
Пациентов можно классифицировать путем сравнения уровней экспрессии гетеромера HER2/CB в биологическом образце, полученном от пациента, со стандартом. Например, после измерения уровня экспрессии гетеромера HER2/CB в образце измеренный уровень сравнивают со стандартом. Этот стандарт представляет собой уровень экспрессии гетеромера HER2/CB, применяемый для оценки уровня экспрессии гетеромера HER2/CB в биологическом образце пациента. Например, в одном варианте осуществления, если уровни экспрессии гетеромера HER2/CB в образце пациента выше, чем стандарта, то будет считаться, что образец пациента имеет повышенные уровни экспрессии гетеромера HER2/CB. В противоположном случае, в другом варианте осуществления, если уровни экспрессии гетеромера HER2/CB в образце ниже, чем стандарта, то будет считаться, что образец имеет низкие уровни экспрессии гетеромера HER2/CB.
2
2
2
2
В другом варианте осуществления пациентам может присваиваться «оценочный балл», ассоциированный с экспрессией гетеромера HER2/CB в определенном биологическом образце. Образец может быть «оценен в баллах» во время постановки диагноза или контроля рака молочной железы. Оценку в баллах можно определять по уровням экспрессии гетеромера HER2/CB в биологическом образце. В одном варианте осуществления повышенным уровням экспрессии гетеромера HER2/CB в биологическом образце присваивают более высокий оценочный балл по сравнению с более низкими уровнями экспрессии гетеромера HER2/CB, которым присваивают сравнительно более низкий оценочный балл. Оценку в баллах также можно определять путем визуального исследования образцов с помощью иммуногистохимического анализа. В другом варианте осуществления более точная количественная оценка в баллах предусматривает определение двух или более параметров, например, (i) интенсивности окрашивания и (ii) доли окрашенных («положительных») клеток, которые отбирают. На основе этих нескольких параметров можно присваивать оценочные баллы, которые отражают повышенные уровни положительного окрашивания.
2
2
2
2
2
Таким образом, в одном варианте осуществления оценочный балл, ассоциированный с уровнями экспрессии гетеромера HER2/CB в биологическом образце, полученном от пациента, можно сравнивать с оценочным баллом, ассоциированным с уровнями экспрессии гетеромера HER2/CB в стандарте или с клетками, характеризующимися отсутствием, низкими или повышенными уровнями экспрессии гетеромера HER2/CB, применяемыми в качестве контролей. Такое сравнение может служить основой для лучшей постановки прогноза у пациента. Например, в одном варианте осуществления в способах по настоящему изобретению уровни экспрессии гетеромера HER2/CB можно оценивать в баллах с применением шкалы от 0 до 3+, где 0 представляет собой отрицательную (не подлежащую выявлению экспрессию гетеромера HER2/CB), 1+ и 2+ ассоциированы со слабым или от слабого до умеренного окрашиванием соответственно, и 3+ ассоциирован с высокой интенсивностью окрашивания в более чем 10% опухолевых клеток; и при этом более низкий оценочный балл указывает на лучший прогноз у пациентов.
2
2
2
2
2
Постановку прогноза у пациентов, у которых экспрессируются различные уровни гетеромера HER2/CB, можно выполнять с применением анализа с одной или несколькими переменными. В этих способах определяют вероятность корреляции между одной или более переменными и определенным исходом. В одном варианте осуществления в способах будет определяться вероятность корреляции между уровнями экспрессии гетеромера HER2/CB (или уровнями экспрессии гетеромера HER2/CB в сочетании с другой переменной) и выживаемостью без признаков заболевания или общей выживаемостью пациентов с раком молочной железы. Для выполнения таких анализов можно применять любой из множества способов, хорошо известных средним специалистам в данной области техники. Примером анализа с одной переменной является способ Каплана-Мейера или лог-ранговый критерий. Примером анализа с несколькими переменными является регрессионная модель пропорциональных рисков Кокса. Способы по настоящему изобретению могут дополнительно включать осуществление анализа уровней экспрессии гетеромера HER2/CB в сочетании с дополнительными маркерами рака молочной железы. Пропорциональное отношение Кокса дает отношение рисков или риск выживаемости без признаков заболевания и общей выживаемости для пациента с различным уровнем экспрессии гетеромера HER2/CB.
Анализ выживаемости с применением способов Каплана-Мейера является рекомендуемой статистической методикой для применения в испытаниях рака. Ее применяют путем осуществления анализа распределения времени выживаемости пациентов после их включения в исследование. В анализе его выражают с точки зрения доли пациентов, которые остаются в живых к определенному времени после включения в исследование. С графической точки зрения график зависимости доли выживших пациентов от времени имеет характерный наклон (часто экспоненциальный), при этом крутизна кривой указывает на эффективность лечения, в отношении которого проводят исследование. Чем более пологой является кривая выживаемости, тем более эффективным является лечение. Анализ Каплана-Мейера можно применять для проверки статистической значимости различий между кривыми выживаемости, ассоциированными с двумя разными видами лечения.
2
2
2
2
В одном варианте осуществления после определения уровней экспрессии гетеромера HER2/CB в образце, полученном от пациента, и их сравнения со стандартом затем пациента относят к группе, характеризующейся определенной вероятностью выживаемости без признаков заболевания или общей выживаемости. Затем вероятность выживаемости без признаков заболевания или общей выживаемости оценивают на основании вероятности выживаемости без признаков заболевания или общей выживаемости для пациентов в данной группе. Например, можно определить, что биологический образец, полученный от пациента, характеризуется повышенными уровнями экспрессии гетеромера HER2/CB по сравнению со стандартом. В данном случае такого пациента можно отнести к группе пациентов с повышенными уровнями экспрессии гетеромера HER2/CB. Поскольку в соответствии с настоящим изобретением было обнаружено, что существует сокращенная длительность выживаемости без признаков заболевания или общей выживаемости для группы пациентов, у которых экспрессируются повышенные уровни гетеромера HER2/CB, то будет считаться, что конкретный пациент, страдающий раком, имеет сокращенную длительность выживаемости без признаков заболевания или общей выживаемости.
Наборы
Способ выявления по настоящему изобретению предпочтительно проводить в любом традиционном формате набора для тестирования. Например, иммуноанализ может представлять собой твердофазный иммуноанализ с захватом, конкурентный иммуноанализ или сэндвичный иммуноанализ.
2
Набор для тестирования в случае твердофазного иммуноанализа с захватом включает антитело, способное связываться с гетеромером HER2/CB и имеющее метку для обеспечения выявления, и твердую подложку. Твердая подложка может продаваться либо как часть набора для тестирования, либо отдельно от него. При использовании в способе выявления по настоящему изобретению антитело приводят в контакт с тестируемым образцом. Полученную в результате смесь приводят в контакт с твердой подложкой таким образом, что комплекс связывается с подложкой. Затем после удаления несвязанного материала антитело можно выявлять.
2
2
В особенно предпочтительной форме настоящего изобретения смесь антитела к гетеромеру HER2/CB и тестируемый образец можно приводить в контакт с аффинной матрицей таким образом, что комплекс связывается с аффинной матрицей. После удаления несвязанного материала комплекс элюируют из аффинной матрицы и позволяют прийти в контакт и адсорбироваться к твердой подложке. Аффинную матрицу также можно применять для связывания комплекса и, тем самым, отделения комплекса от остатка смеси тестируемого образца и гетеромера HER2/CB в сэндвичном и конкурентном форматах. В каждом случае комплекс можно впоследствии элюировать из аффинной матрицы и привести в абсорбционный контакт с твердой подложкой.
Твердая подложка, применяемая в наборе для тестирования в любом из форматов иммуноанализа, может представлять собой водонерастворимый суспендируемый в воде твердый материал, традиционно используемый в таких наборах. Подходящими примерами являются полимерные мембраны, пластмассовые или стеклянные гранулы, пробирки или микротитрационные планшеты. Связывающее вещество в комплексе может связываться с твердым носителем за счет ковалентного связывания или адсорбции. При использовании пробирок или микротитрационных планшетов такое связывание происходит на внутренних стенках данных носителей.
В наборах для тестирования в случае конкурентного и сэндвичного иммуноанализа набор может реализовываться уже со связанным с твердой подложкой связывающим веществом. Такое нанесение на поверхность твердой подложки достигается в результате приведения в контакт связывающего вещества с твердой подложкой и поддержания такого контакта в течение достаточного времени для обеспечения связывания первого участка связывающегося вещества с твердой подложкой. Обычно обеспечение такого контакта занимает от одного до восемнадцати часов, предпочтительно четыре часа. Не прикрепившееся связывающее вещество затем отделяют от нерастворимого связывающего вещества (т. е. такового, которое связано с твердой подложкой) и затем твердую подложку промывают.
2
2
2
В наборах для тестирования во всех трех форматах иммуноанализа тестируемый образец и антитело к гетеромеру HER2/CB приводят в контакт друг с другом и инкубируют в течение достаточного времени для обеспечения связывания. Обычно обеспчеение такого связывания занимает два часа. После обеспечения такого контакта предпочтительно следует приведение в контакт смеси тестируемого образца и антитела к гетеромеру HER2/CB с твердой подложкой. В случае твердофазного анализа с захватом комплекс связывается непосредственно с твердой подложкой, тогда как в случае конкурентного анализа или сэндвичных иммуноанализов комплекс связывается опосредованно (т. е. посредством связывающего вещества) с твердой подложкой. В наборах для тестирования во всех трех форматах иммуноанализа по настоящему изобретению после обеспечения достаточного времени для инкубации остаточную смесь тестируемого образца и антитела к гетеромеру HER2/CB отделяют от нерастворимого материала, связанного с твердой подложкой. Затем нерастворимый материал промывают.
Необходимо понимать, что применение идей настоящего изобретения по отношению к конкретной проблеме или среде будет находиться в пределах квалификации специалиста в данной области техники в свете идей, содержащихся в данном документе. Настоящее изобретение более полно проиллюстрировано следующими неограничивающими примерами.
Пример 1. Экспрессия гетеромера HER2/CB
в качестве средства прогнозирования при HER2+ раке молочной железы
2
2
2
Экспрессию гетеромеров HER2-CB анализировали в методе тканевых матриц (TMA), предусматривающем 57 образцов HER2+ рака молочной железы, соответствующих случаям оперативного вмешательства в 12 de Octubre Hospital (Мадрид, Испания) между 1999 г. и 2013 г. Анализ экспрессии выполняли с помощью анализа близкого лигирования с применением набора выявления PLA in situ Duolink II (Olink, Bioscience, Уппсала, Швеция). Образцы исследовали под конфокальным микроскопом и сигналы красной флуоресценции (соответствующие гетеромерам) обрабатывали с помощью программного обеспечения ImageJ. Образцы ранжировали по экспрессии гетеромера HER2-CB, а предельное значение выбирали вручную.
2
2
Сначала авторы настоящего изобретения проводили окрашивание контролей на наличие HER2, CB и гетеромеров HER2-CB (см. фигуру 1). Затем авторы настоящего изобретения ранжировали образцы по сигналу PLA (число розовых точек/PLA-положительных клеток) и анализировали потенциальные ассоциации с клиническими параметрами, связанными с прогнозом у пациента. Как показано на фигуре 2, авторы настоящего изобретения обнаружили значимую корреляцию между высокой экспрессией гетеромера и более низкой выживаемостью без локальных рецидивов.
Пример 2
Механизм действия THC
.
2
2
Авторы настоящего изобретения ранее сообщали, что THC при применении в концентрациях, которые приводят к противоопухолевым ответам, разрушает гетеромеры HER2-CB в клетках BT474. Как обсуждалось в примере 1, авторы настоящего изобретения наблюдали данные эффекты с помощью анализов близкого лигирования (PLA) и анализов резонансного переноса энергии биолюминесценции (BRET). Авторы настоящего изобретения также наблюдали сопутствующее расщепление HER2 в этой же линии клеток, что указывало на то, что THC индуцировал антипролиферативные эффекты путем разрушения гетеромеров HER2-CB и дестабилизации HER2.
2
Авторы настоящего изобретения подтвердили с помощью другой методики (совместной иммунопреципитации, совместной IP), что THC разрушает гетеромеры HER2-CB в двух разных линиях клеток HER2+ рака молочной железы (BT474 и HCC1954). Результаты показаны на фигуре 3.
2
2
Авторы настоящего изобретения выполняли PLA в клетках HCC1954, которые показали что SR2 (селективный антагонист CB) блокирует индуцируемое THC разрушение гетеромера. Данные наблюдения подтверждают, что THC разрушает гетеромеры за счет действия на CB (фигура 4).
Авторы настоящего изобретения ранее наблюдали расщепление HER2 при обработке THC в клетках BT474. В настоящем изобретении авторы настоящего изобретения подтвердили данное наблюдение с помощью вестерн-блоттинга в клетках HCC1954 (фигура 5).
2
Авторы настоящего изобретения проводили PLA, которые показали, что THC разрушает не только HER2-CB, но также и димеры HER2-HER2 (которые представляют собой общеизвестные комплексы передачи сигналов, которые регулируют прогрессирование опухоли при HER2+ раке молочной железы). Эти данные показаны на фигуре 6.
Способы и материалы
Клетки, культуры клеток и способы трансфекции
Клетки аденокарциномы молочной железы человека BT474 и HCC1954 поддерживали в среде RPMI, дополненной 10% FBS и пенициллином/стрептомицином.
Анализы близкого лигирования in situ (PLA)
2
2
Клетки выращивали на стеклянных покровных стеклах и фиксировали в 4% параформальдегиде, промывали с помощью PBS, содержащим 20 мМ глицина, пермеабилизовали тем же буфером, содержащим 0,05% Triton X-100, и промывали последовательно с помощью PBS. Гетеромеры HER2-CBR выявляли с применением набора с зондом-маркером для исследования in situ Duolink (Olink, Bioscience, Уппсала, Швеция). После инкубации в течение 1 ч. при 37°C с блокирующим раствором в предварительно нагретой влажной камере клетки инкубировали в течение ночи в разбавленной среде антитела со смесью равных количеств кроличьего антитела к CB (1:50, Cayman Chemical, Анн-Арбор, Мичиган), непосредственно связанного с плюс-зондом для PLA, и кроличьего антитела к HER2 (1:50, Santa Cruz Biotechnology, Санта-Круз, Калифорния, США), непосредственно связанного с минус-зондом для PLA. Клетки промывали промывочным буфером A при комнатной температуре и инкубировали в предварительно нагретой влажной камере в течение 30 минут при 37°C с лигирующим раствором (маточный лигирующий раствор Duolink II, 1:5, и лигаза Duolink II, 1:40) для индуцирования отжига и лигирования двух ДНК-зондов. Амплификацию выполняли с помощью набора реагентов для выявления по красной флуоресценции Duolink II, который содержал флуоресцентные нуклеотиды. После тщательного промывания при комнатной температуре промывочным буфером B клетки заключали с применением заливочной среды с DAPI. Образцы наблюдали под конфокальным микроскопом Leica SP2 (Leica Microsystems, Мангейм, Германия). Изображения с красной флуоресценцией обрабатывали с помощью программного обеспечения ImageJ. Для PLA требовалось, чтобы оба рецептора располагались достаточно близко для обеспечения возможности лигирования двух разных конъюгатов антитело-ДНК зонд (<17 нм) ((Söderberg et al., (2008), Methods., 45: 227–232; Trifilieff et al., (2011), BioTechniques, 51: 111–118). Если рецепторы находятся достаточно близко, то точечный флуоресцентный сигнал можно выявлять с помощью конфокальной микроскопии.
Вестерн-блоттинг
3
4
Клетки HCC1954 обрабатывали буфером RIPA (50 мМ Tris, 150 мМ NaCl, 1% NP-40, 0,5% дезоксихолата натрия и 0,1% натрия додецилсульфата), содержащим смесь ингибиторов протеаз (пепстатин, лейпептин, апротинин, химостатин, антипаин и фенилметилсульфонилфторид) и ингибиторов фасфатаз (NaVO и NaF; Sigma Chemical Co., Сент-Луис, Миссури). Белки, разделенные с помощью восстанавливающих гелей на основе натрия додецилсульфата – 10% полиакриламида, переносили на поливинилидендифторидные мембраны (Bio-Rad Laboratories, Геркулес, Калифорния). После блокирования 5% обезжиренным молоком и 1% альбумином бычьей сыворотки мембраны инкубировали с антисывороткой к ErbB2 (Santa Cruz Biotechnology, Санта-Круз, Калифорния), разведенной 1:500 в течение 3 ч. при комнатной температуре. Связанные антитела выявляли с помощью меченого пероксидазой козьего антитела к кроличьему иммуноглобулину G (IgG) (Zymed Laboratories, Саус-Сан-Франциско, Калифорния). Систему для хемилюминесцентного выявления (Amersham Pharmacia Biotech, Пискатавей, Нью-Джерси) применяли для выявления пероксидазы. Контрольные эксперименты выполняли с помощью моноклонального антитела к актину (MAb; Boehringer Mannheim, Индианаполис, Индиана), разведенного 1:5000 с последующим применением меченого пероксидазой антитела к мышиному IgG, разведенного 1:4000 (Zymed).
Анализы совместной иммунопреципитации
2
Клетки HCC1954 и BT474 транзиентно трансфицировали с помощью pcDNA3-HA-hCB или соответствующего пустого вектора (pcDNA3) с применением реагента для трансфекции Fugene HD (Promega, Мэдисон, Висконсин). Через 48 ч. после трансфекции клетки обрабатывали 3 мкМ THC или соответствующей средой-носителем (DMSO) в течение 4 ч. и лизировали с применением специфического буфера для совместной иммунопреципитации (40 мМ Hepes, pH 7,5, 120 мМ NaCl, 1 мМ EDTA, 10 мМ пирофосфата натрия, 10 мМ глиферофосфата натрия, 50 мМ фторида натрия, 0,5 мМ ортованадата натрия, 0,3% CHAPS и дополненного 1 мМ бензамидина и 0,1 мМ PMSF, свежеприготовленного). Клеточные лизаты (1 мг) подвергали иммунопреципитации с применением 5 мкг антитела к ErbB2 (Neu C-18, Santa Cruz Biotechnology, Санта-Круз, Калифорния, США), ковалентно связанного с 5 мкл белка G-сефарозы. После иммунопреципитации белки разделяли с помощью восстанавливающих гелей на основе SDS – 10% полиакриламида и переносили на мембраны PVDF. После блокирования с помощью 5% вес/об. обезжиренного сухого молока в TBST мембраны инкубировали с антителом к ErbB2 (1:1000) и антителом к HA (1:1000, Cell Signaling Technology, Данверс, Миннесота) в течение ночи при 4ºC. Связанные антитела выявляли с помощью меченого пероксидазой ослиного антитела к кроличьему иммуноглобулину G (IgG) (GE Healthcare, Великобритания). Систему для хемилюминесцентного выявления (Bio-Rad, Калифорния, EEUU) применяли для выявления активности пероксидазы.