Системы, контролирующие специфический ответ бацилл на фосфатное голодание

Том 150, кн. 2

Естественные науки

2008

УДК 579.852.11:577.218

СИСТЕМЫ, КОНТРОЛИРУЮЩИЕ СПЕЦИФИЧЕСКИЙ ОТВЕТ БАЦИЛЛ НА ФОСФАТНОЕ ГОЛОДАНИЕ

В.В. Ульянова, В.И. Вершинина Аннотация

Проведен анализ распространенности систем, контролирующих специфический ответ клеток на фосфатное голодание, среди 10 видов бактерий рода Bacillus, геномы которых полностью секвенированы. Установлено, что гены, кодирующие основные регуляторы PHO-ответа - PhoP, ResD, SpoOA и AbrB, присутствуют во всех геномах бацилл, причем их генетические контексты весьма сходны. Кроме того, эти белки имеют высокую степень гомологии с одноименными регуляторами B. subtilis. С использованием мутантных штаммов B. subtilis, показано, что ResD-, SpoOA- и AbrB-белки при фосфатном голодании регулируют экспрессию генов гуанилспецифичных рибонуклеаз B. pumilus, B. intermedius и B. thuringiensis подобно генам PHO-регулона B. subtilis. Биосинтез РНКазы B. circulans не подвержен влиянию ResD-, SpoOA- и AbrB-регуляторов, как и PhoP-PhoR-системы, и, вероятно осуществляется по ов-зависимому механизму. Тем не менее полученные данные позволяют утверждать, что регуляторные системы, подобные PHO-регулону B. subtilis, функционируют у представителей различных видов бацилл, то есть PHO-регулон можно рассматривать как универсальную систему, обеспечивающую ответ бактериальной клетки на дефицит экзогенного фосфата.

Ключевые слова: PHO-регулон, бациллы, гуанилспецифичные рибонуклеазы.

Введение

Бактерии обладают поразительной способностью отслеживать и реагировать на любые изменения в их окружении, приспосабливая свой метаболический и физиологический потенциал для непосредственных нужд. Так, при снижении концентрации неорганического фосфата (Фн) в среде у Bacillus subtilis индуцируется фосфатный стимулон, состоящий из специфического PHO-регулона, неспецифического общестрессового о -регулона и группы генов, независимых от первых двух систем [1, 2]. Однако регуляторные связи между ними до конца не ясны.

Главным событием в условиях фосфатного голодания является восприятие сигнала о лимитировании фосфата и его трансдукция. У B. subtilis эту функцию выполняет двухкомпонентная система PhoP-PhoR, состоящая из сенсорной гистидин-киназы и регулятора ответа [3]. Белок PhoP, фосфорилированный с помощью киназы PhoR в условиях дефицита Фн, непосредственно связывается со специфическими последовательностями в промоторах pho-генов, продукты которых участвуют в усилении поглощения фосфата и/или повышении его доступности путем извлечения из дополнительных источников, и тем самым активирует или репрессирует их транскрипцию. В настоящее время PHO-регулон B. subtilis насчитывает 37 генов (табл. 1).

Табл. 1

Гены PHO-регулона

Гены Описание Ссылка

phoA Щелочная фосфатаза А [3]

phoB Щелочная фосфатаза III [3]

ydhF Липопротеин с неизвестной функцией, котранскрибиру-ется с геном phoB [2]

phoD Фосфодиэстераза-щелочная фосфатаза [4]

tatAD Компоненты транспортного пути Tat для секреции PhoD [5]

glnQ ABC транспортер глутамина [6]

pstSACB1B2 Высокоаффинная система транспорта фосфата [7]

tuaABCDEFGH Биосинтез тейхуроновой кислоты [8]

tagAB и tagDEF Биосинтез тейхоевых кислот, репрессируется при фосфатном голодании [8]

phoPR Регуляторные белки двухкомпонентной системы PhoP-PhoR [9]

glpQ Глицерофосфорилдиэфирфосфодиэстераза [2]

ykoL Пептид из 60 остатков с неизвестной функцией, также активируется глутаматом [10]

yhaX Функция неизвестна, возможно, регуляция косвенная [11]

yycP Неизвестный белок [6]

yttP Функция не известна [11]

yjdB Функция не известна [6]

yhbH Функция не известна [11]

ydbH Сходство с белками транспорта С4-дикарбоновых кислот [6]

resDE Регуляторные белки двухкомпонентной системы ResD-ResE, регулирующей процессы дыхания [12]

yfkN 2',3'-циклическая нуклеотид 2'-фосфодиэстераза [13]

yurI Внеклеточная рибонуклеаза [13]

vpr Внеклеточная сериновая протеаза [13]

В регуляции специфического РНО-ответа B. subtilis, кроме системы РЬоР-РЬоИ, задействованы, по крайней мере, еще два пути, объединенных в регуля-торную сеть, - это петля положительной обратной связи между двухкомпо-нентными системами РЬоР-РЬоЯ и Яе8Б-Яе8Е [12] и система 8ро0Л-фосфопе-редачи, осуществляющая негативный контроль pho-генов [1]. Основной функцией двухкомпонентной системы Яе8Б-Яе8Е в клетке является регуляция процессов аэробного и анаэробного дыхания [14]. Вместе с тем эта система стимулирует полную РНО индукцию, усиливая косвенным образом аутофосфорили-рование РЬоЯ киназы при фосфатном голодании в аэробных условиях [15].

Кроме того, существует параллельный путь активации РЬоР-РЬоЯ-системы, опосредованный белком переходного состояния ЛЬгВ [1]. Белок ЛЬгВ обладает плейотропным действием: он является как позитивным, так и негативным регулятором компетентности, требуется для синтеза антибиотиков и гидролитических ферментов, образования биопленок, а также репрессирует гены, необходимые для спорообразования [16-18].

Стресс, связанный с истощением Фн в среде, активирует также систему 8ро0А-фосфопередачи, состоящую из нескольких гистидин-киназ, промежу-

точных белков SpoOF и SpoOB и регулятора транскрипции SpoOA [19]. При возрастающей концентрации фосфорилированный SpoOA-белок играет роль негативного регулятора, репрессируя гены, активные в период вегетативного роста [20]. Так, активированный SpoOA оказывает негативное влияние на PHO-регу-лон, репрессируя phoPR-оперон непосредственно, связываясь с предполагаемыми OA-боксами в его промоторе [21], либо косвенно - через репрессию ResD-ResE и AbrB [22]. Накопление достаточного количества фосфорилированного SpoOA-белка приводит к запуску программы спорообразования [2O].

B. licheniformis является вторым представителем рода Bacillus, для которого был описан PHO регулон [23]. Показано, что B. licheniformis обладает собственными стратегиями для борьбы с дефицитом фосфата. Так, в отличие от B. subtilis, фосфатное голодание у B. licheniformis не индуцирует ов-зависимый общестрессовый ответ. В условиях недостатка фосфата у B. licheniformis, кроме типичных pho-генов, происходит сильная индукция генов внутриклеточных и внеклеточных нуклеаз, фитаз, цитохром P450-подобного фермента, а также некоторых других оксидаз и оксидоредуктаз [23]. Гены же, кодирующие белки основного метаболизма (биосинтеза аминокислот, метаболизма нуклеотидов и коферментов) и рибосомальные белки, репрессируются в самом начале стационарной фазы роста в условиях дефицита фосфата. В тот же период индуцируется ряд генов, вовлеченных в процесс спорообразования.

У B. pumilus, B. intermedius и B. thuringiensis предполагают функционирование PHO-регулонов на основании того, что индуцируемая фосфатным голоданием экспрессия генов гуанилспецифичных рибонуклеаз этих видов бацилл позитивно регулируется PhoP-PhoR-системой B. subtilis [24, 25]. Подобные результаты получены также для гена фитазы B. amyloliquefaciens - фермента, расщепляющего фосфорсодержащее соединение фитат [26]. В связи с вышесказанным, нам представлялось интересным оценить, насколько широко распространены регуляторные системы, подобные PHO-регулону B. subtilis, среди других видов бацилл.

Результаты исследований

Гены phoP, resD, spoOA и abrB в секвенированных геномах бацилл.

На первом этапе наших исследований мы провели поиск генов phoP, resD, spoOA и abrB, кодирующих соответствующие белки-регуляторы PHO-ответа B. subtilis, в секвенированных геномах бацилл. Род Bacillus представлен обширной гетерогенной группой, насчитывающей к настоящему времени 214 адекватно описанных видов (http://www.bacterio.cict.fr/b/bacillus.html). К настоящему времени полностью секвенированы 17 геномов бактерий рода Bacillus, ограниченных 1O видами. Данные о геномах представлены на сайте Национального центра биотехнологической информации (NCBI, Bethesda, USA, http://www.ncbi.nlm .nih.gov/genomes/lproks.cgi).

На рис. 1 и 2 изображены участки геномов бацилл, содержащие анализируемые гены. Генетический контекст генов оказался весьма сходным. Так, тандем перекрывающихся генов phoP-phoR, по-видимому, образующих оперон, как у B. subtilis, у большинства видов находится, с одной стороны, в окружении генов малат дегидрогеназы (mdh) и изоцитрат дегидрогеназы (icd), а с другой -

mutM^

Г¡948425>

ти)М *

[ гтз»о1

тиШ

ти(М •

[2039920»-

ти!М 1

ро1А

ро1А

ро1А

ро1А

роМ

а) [шамкЬ Цгкгпу

рИоГ?

• рЬоР•

тсй

(С(/

Ь)

р1юГ?

рИоР

тбЬ

Ы

с)

———- РЬоР « ^ Ы

рИо!? 4- тф 4

•О

р/70Й

рЬоР

/гай

Ы

-р/юРч— -

рЬоЯ 4- А6С2712 тбЬ

а}

[5421361!

га;Х

5/дХ <

геяО

£2919622» [1331776 к-

- гввВ ч—; г!иВ

Ь)

[2399937

уси

ге$Е

гекО

--- гезВ 4--

геэС < ге&А

[ 2743684» [ 2210170

С)

; 2226243»

Г5/Х

^¿дХч

Е2Н1741|1> [20412237

ге$0-— ге$В «—; г!иВ

1 твС 4-геаДч-

«Ц

[2094429

геяЕ * гезС *• —

8Р11М_2МЗ « ге50 4- геяВ

[1848,52» [ 1943541 »

г1иВ

е1 [15565«»

> ге$В -

ге«А > гвяС

гезО

- АВС1837 '»

ГезЕ I ЛВС 5 838

[ )2Ёезм

ти1М 4

[4390090 »

тиШ

ро/Л

[3276026»

<- Ы1К 4-

ЬПС 4- рЬоЯ

- р/)ОР<-

— сПН

9)

ро1А

———- р/юР ВСЕ_4?21 рпон « «— ВСЕ_-1722

И)

ро1А

р/юЯ

рЬоР * ВА4834 I—- + ВА4В35

¡)

ро!А

р/ю!*

рЛОР 4-БАиН_Ш47

[16КН8к

[1659941»

геаД > гезС

гея О

> «-ВН1583

Ге$Е «— ВН15Э2

[1413013»

Э)

[1420760 »

гезС

гея О

ге^Е

[4398320*. [,568129»

Ч

[1575082

> гезб ^

гезО

геэЕ

[4396283  [1472759

[1479818^

г!иБ - ваш_1Э31 геяС -— геяЕ

. ...и...... —и <, ге^О

Рис. 1. Гены р1юР/р1юР1 (слева) и ге.\!)/ге.\1( (справа) в секвенированных геномах бацилл: а) В. .\ubtilis .\ubsp. .\ubtilis мг. 168; Ь) В. \icheniformis АТСС 14580; с) В. ату1оИдие/аает' Р2В42; сГ) В. ритИиз 8АРК-032; е) В. с1аивп К8М-К16; _/) В. Иа1ос1игат С-125; g) В. апЛгаая й1г Атей', И) В. сегеия АТСС 10987; У) В. 1кип1щ\еп8\8 А1 Накат. На рисунке не представлен вид В. \veihenstephanensis, так как его гены до конца не идентифицированы и носят условные названия локусов

[3914799

я) [í921510^

yqiH yqlG spoOA

spolVB

recN

[2509395

ь) [251017s^

yqiH

í ЙЭЭС1159 y

Bl ¡02592

spoOA

spolVB

recN

rbaM_Û2253O

[219173S^

gipO '

yncD

spoOA

spolVB

recN

4- BPÜM_Z153 SpOOA -

BPUM_2152 t *- SpolVB

recN

[2593201

— АБС2456 *-

ABC2455 « SpoOA

[2996541

spolVB

recN

BH277Û л- БН2772 SpoOA *-

BH2771 < <- BH2774

UOOOSlJ*

spolVB

recN

BA4392 [Э95Ь627к

spoOA

spolVB

recN

ВСЁ 4244

ВСЕ 4242

[3WZ433^

spoOA

spolVB

recN

[ 3993Ç51 *

*- 8ALH_3779 «- SpolVB

glpQ I SpoOA <

recN

[42315^

ya öS -

(47135*

yabB =

a)

[49471

yazA—* yabC abrB met G

yabD

Ь' [ятя*

yazA —* yabC abrB metG

C) Г 2 306133 y

yabD

o)

[49219

УаЬВ yàzA yabC ,abrB

mets

yabD

d)

e) [25W557» [7166S»

yabB ~r* УаЬС BPUM 0021 metG

yazA-h

yabD

e)

ABC005S -«. ЛВССЮ57 abrB

ABC0056 — .>

ABCC060

4 [2904Ï91  [93977 ^

[ 09175

BH0048 1- BH0051 -

m 0O47 — BH0049 abrB — —» внооэг

S) [«1J1»>

g)

BA0031 BA0D33 abrB BA0032-

metG

BA0Q37

h) [j«D!H> i™'"

h) [4

8CE 0032 — ЙСЕ 0034 ,brB все jx)33->

metG

ВСЕ 0037

[39950

[44522 >

balh_0030 — cobA abrB mets

ВАШ 0031 — »

BAL H 0035

Рис. 2. Гены spoOA (слева) и abrB (справа) в секвенированных геномах бацилл: а) В. subtilis subsp. subtilis str. 168; b) В. licheniformis ATCC 14580; с) B. amyloliquefaciens FZB42; d) B. pumilus SAFR-032; e) B. clausii KSM-K16; f) B. halodurans C-125; g) B. anthracis str Ames; h) Bacillus cereus ATCC 10987; i) B. thuringiensis str. Al Hakam. На рисунке не представлен вид В. weihenstephanensis, так как его гены до конца не идентифицированы и носят условные названия локусов

Табл. 2

Гомология аминокислотных последовательностей регуляторных белков различных видов бацилл

Штаммы Bacillus Гомология (идентичность), %

PhoP ResD Spo0A AbrB

B. subtilis subsp. subtilis str. 168 100

B. licheniformis ATCC 14580 90

B. amyloliquefaciens FZB42 94

B. pumilus SAFR-032 90

B. clausii KSM-K16 81

B. halodurans C-125 84

B. anthracis str. Ames 87

B. anthracis str. 'Ames Ancestor' 87

B. anthracis str. Sterne 87

B. cereus ATCC 10987 87

B. cereus E33L 87

B. cereus ATCC 14579 87

B. cereus subsp. cytotoxis NVH 391-98 88

B. thuringiensis str. Al Hakam 87

B. thuringiensis serovar konkukian str. 97-27 87

B. weihenstephanensis KBAB4 87

генов ДНК полимеразы I (polA) и формамидопиримидин-ДНК гликозилазы (mutM). Гены resD и resE y B. subtilis входят в состав оперона resABCDE, у других бацилл отмечена аналогичная организация res-генов. Гены spo0A расположены в более вариабельных локусах: после этого гена в большинстве случаев встречаются гены spoIVB (сериновой пептидазы) и recN (АТФазы, участвующей в рекомбинации и репарации), а перед ним - неидентифицированные открытые рамки считывания. За abrB-генами, транскрибируемыми в обратном от основного контекста направлении, чаще следует ген метионил-тРНК синтетезы (metG или metS), а перед ними, за исключением B. halodurans и B. clausii, а также группы B. cereus, расположены гены эндонуклеазы (yazA) и метилтранс-феразы (yabC).

Гомология PhoP-, ResD-, SpoOA- и AbrB-белков бацилл. Далее с помощью компьютерной программы «Blastp» (стандартные параметры) была установлена степень гомологии PhoP-, ResD-, SpoOA- и AbrB-белков бацилл с одноименными регуляторными белками B. subtilis (табл. 2). Показано, что аминокислотные последовательности исследуемых белков разных видов бацилл близки между собой: гомология белков PhoP с белком B. subtilis составила более 81%, белков ResD и SpoOA - более 85%, белков AbrB - более 77%.

Необходимо заметить, что у B. pumilus, а также штаммов B. cereus и B. thuringiensis было обнаружено несколько abrB-подобных генов. Так, например, у B. pumilus присутствуют два гена, которые могут быть названы гомологами abrB B. subtilis. Первый ген обозначен в аннотации к последовательности нуклеотидов как возможный регулятор транскрипции и назван BPUM_0021. Его генетический контекст сходен с таковым B. subtilis (рис. 2, d). Второй ген

расположен в другом генетическом окружении, но обозначен как регулятор транскрипции abrB. Белок, кодируемый BPUM_0021, идентичен AbrB B. subtilis на 94% (гомология - 97%), в то время как белок, кодируемый abrB-геном, -только на 44% (гомология - 70%). В результате, на основании подобия генетического контекста с таковым B. subtilis и наибольшей гомологии белков мы считаем, что именно регулятор транскрипции BPUM_0021 является AbrB-бел-ком B. pumilus, а второй белок может быть его паралогом. У бактерий парало-гичные факторы транскрипции обычно выполняют иные функции в клетке [27].

Таким образом, наибольшее сходство в организации генетических локусов с B. subtilis отмечено у B. amyloliquefaciens, B. licheniformis и B. pumilus. Для этих же видов характерен более высокий процент гомологии белков-регуляторов (более 90-94% для PhoP-белков, 94-96% для ResD, 96-99% для Spo0A и AbrB).

Роль ResD-, SpoOA- и AbrB-белков B. subtilis в регуляции биосинтеза гуанилспецифичных рибонуклеаз. Ранее было установлено, что синтез гуанил-специфичных рибонуклеаз B. pumilus (РНКаза Bpu), B. intermedius (РНКаза Bi), B. thuringiensis (РНКаза Bth) осуществляется в условиях фосфатного голодания, а экспрессия их генов в рекомбинантных штаммах B. subtilis позитивно регулируется PhoP-PhoR-системой (рис. 3, а) [24, 25]. Мы попытались расширить представление о фосфатной регуляции у этих видов бацилл и показать для них справедливость схемы регуляции специфического PHO-ответа B. subtilis, в частности доказать участие ResD-, AbrB- и Spo0A-белков. В исследование мы также включили вид B. circulans, синтез гуанилспецифичной рибонуклеазы (РНКаза Bci) которого хотя и происходит при недостатке фосфата в среде, однако не зависит от PhoP-PhoR-системы (рис. 3, а).

Чтобы установить роль ResD-, Spo0A- и AbrB-белков B. subtilis в регуляции биосинтеза гуанилспецифичных рибонуклеаз, плазмидами, несущими гены РНКаз Bi, Bpu, Bth и Bci, состыкованные с геном внутриклеточного ингибитора барстара [25, 29], были трансформированы полноценные (контроль) и му-тантные по генам регуляторных белков штаммы: B. subtilis JH642 (pheAl trpC2), B. subtilis LAB2506 (trpC2 pheAl resD: :cat), B. subtilis JH646 (pheAl trpC2 spo0A12), B. subtilis R15-13 (pheAl trpC2 abrB23 spo0A12). Штаммы для работы были любезно предоставлены доктором Д. Зейглером (D. Zeigler, BGSC, The Ohio State University, USA) и профессором М. Накано (M.M. Nakano, Oregon Health and Science University, Beaverton, USA). Рекомбинанты отбирали по двум признакам: устойчивости к канамицину (маркеру плазмиды) и наличию РНКазной активности. Рибонуклеазную активность в культуральной жидкости рекомби-нантов определяли по кислоторастворимым продуктам гидролиза модельного субстрата - РНК [30]. Специфическую активность рибонуклеазы, которая является показателем продуктивности культуры в отношении синтеза фермента, рассчитывали как отношение общей активности фермента к величине биомассы. Статистический анализ результатов проводили с использованием программы электронных таблиц. Определяли стандартное отклонение (<S) и доверительный интервал для среднего, принимая р = 0.05 за достоверный уровень значимости.

Показано, что все исследуемые рибонуклеазы синтезируются на бесфосфорной среде как рекомбинантными штаммами с полноценными белками, так и мутантными штаммами, однако уровни их активностей различаются значимо

PhoP

¡0

Re SO

b)

# 3

fo ra i: I Q_

A 100 --

140 т

120 -

-&

s

3-

80

60 -

40 --

20 -

РНКаза Ври РНКаза Bi РНКаэа 8th РНКаза Bci

РНКаза Бри РНКаза Si РНКаза Bth РНКаза Е

SpoOA

II

С)

РНКаза 8ри РНКаза 8i РНКаза Bth РНКаза ВЫ

SpoOA/AbrS

РНКаза Ври РНКаза Bi РНКаза Bth РНКаза Bci

Рис. 3. Экспрессия генов рибонуклеаз В. pumihts. В. intermedins, В. thuringiensis и B.circulans в рекомбинантных штаммах B.subtilis с полноценными (белые столбики) и мутантными (черные столбики) генамиphoP, rest). spoOA, abrB

(рис. 3). О позитивной роли белка ResD в регуляции экспрессии генов РНКаз Bpu, Bi и Bth свидетельствуют данные, представленные на рис. 3, b. В resD-мутантных штаммах специфическая активность рибонуклеаз была снижена на 89-93% (РНКаза Bpu), 87-90% (РНКаза Bi) и 90-95% (РНКаза Bth) по сравнению с контролем. В штаммах, дефектных по SpoOA-белку (рис. 3, с), уровни активностей этих РНКаз превышали контрольные значения в 5.4-5.8 раз (РНКаза Bpu), 5.5-6.0 раз (РНКаза Bi) и 4.9-5.3 раза (РНКаза Bth), а в двойных spo0A/abrB мутантах (рис. 3, d) - в 3.0-3.3 раза (РНКаза Bpu), 3.0-3.4 раза (РНКаза Bi) и 2.7-3.1 раза (РНКаза Bth). Подобные результаты говорят о том, что белок Spo0A регулирует продукцию рибонуклеаз, выполняя роль репрессора, а белок AbrB является активатором экспрессии генов рибонуклеаз Bpu, Bi и Bth. Так как в нашем случае использовались штаммы, мутантные по двум генам: и репрессора, и активатора, экспрессия генов рибонуклеаз в двойных мутантах была возможна, несмотря на недостаток активатора, однако ее уровень был снижен по сравнению с таковым в штаммах с мутацией только по spo0A-гену.

Активность РНКазы B. circulans во всех исследуемых мутантных штаммах была сопоставима с контролем (рис. 3, b-d), что указывает на отсутствие регуляции ее биосинтеза со стороны ResD-, Spo0A- и AbrB-белков.

Обсуждение результатов

Неорганический фосфат (Фн) - предпочтительный источник фосфора для бактерий - является одним из самых малодоступных веществ в окружающей среде, следовательно, адаптация к изменению его внеклеточной концентрации является важной биологической особенностью. У бактерий для извлечения, хранения и метаболизма Фн сформировались сложные регуляторные механизмы. Известно, что специфическим ответом B. subtilis на снижение концентрации фосфата в окружающей среде является экспрессия генов PHO-регулона, которая контролируется, по крайней мере, тремя системами трансдукции сигнала: PhoP-PhoR, ResD-ResE и системой Spo0A-фосфопередачи [1, 12]. Кроме B. subtilis, PHO-регулон охарактеризован также для B. licheniformis [23]. Однако ответ B. licheniformis на фосфатное голодание лишь частично сходен с таковым B. subtilis. Кроме того, наличие PHO-регулона предполагается у таких видов, как B. amyloliquefaciens, B. thuringiensis, B. pumilus, B. intermedius. У B. anthracis, B. thuringiensis и B. cereus описаны отдельные белки, которые могли бы участвовать в регуляции специфического PHO-ответа, а именно ResD, AbrB и Spo0A. Однако в основном их функции изучались применительно к процессу образования токсинов. Показано, что у B. anthracis белок AbrB, а у B. thuringiensis белок Spo0A являются репрессорами транскрипции генов токсинов [32, 33]. У B. cereus и B. anthracis совместную регуляцию метаболизма и токсинообра-зования осуществляют также гомологи двухкомпонентной системы ResD-ResE В. subtilis [34, 35]. Белок AbrB B. thuringiensis репрессирует экспрессию гена металлопротеазы [36]. В связи с этим в настоящей работе мы попытались проанализировать встречаемость среди бацилл систем, участвующих в PHO-регу-ляции у B. subtilis.

В секвенированных геномах таких видов бацилл, как B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. pumilus, B. clausii, B. halodurans, B. anthracis, B. cereus,

B. thuringiensis и B. weihenstephanensis, нами были найдены гены, кодирующие белки PhoP, ResD, Spo0A и AbrB. В широком смысле белки, имеющие общее происхождение и выполняющие сходные функции в разных организмах, называются ортологами. Один из методов предсказания ортологичных генов в геномах бактерий основан на определении совместной встречаемости гомологичных генов [37]. Авторы исходят из наблюдения, что гомологичные гены с высокой долей вероятности будут ортологичными, если соседние с ними гены также гомологичны. Генетические контексты исследуемых нами генов оказались сходными. Кроме того, белки, кодируемые этими генами, по первичной структуре высокогомологичны регуляторам B. subtilis. Отмечена также следующая закономерность: наибольшее сходство аминокислотных последовательностей с таковыми B. subtilis наблюдается у B. licheniformis, B. amyloliquefaciens и B. pumilus (90-99%); отдельную группу с более низким уровнем гомологии формируют B. anthracis, B. cereus, B. thuringiensis и B. weihenstephanensis (8793%); третью группу образуют B. clausii и B. halodurans, у которых в большинстве случаев сходство белков с регуляторами B. subtilis еще на несколько процентов ниже, чем у группы B. cereus (81-93%). Такое распределение, по-видимому, является отражением их филогенетического родства. Так, по данным Донг и Сотэ, полученным при секвенировании и выравнивании нуклеотидных последовательностей 3'-конца 16S рДНК и 16S-23S внутреннего транскрибируемого спейсера 46 видов бацилл, B. subtilis, B. licheniformis и B. amyloliquefaciens отнесены к VI группе, а B. anthracis, B. cereus и B. thuringiensis - к группе X [31]. Однако вид B. halodurans, состоящий в группе V, более близок к группе B. subtilis, чем группа B. cereus.

Таким образом, учитывая высокой уровень гомологии исследуемых белков, можно предположить их функциональное сходство. Однако было показано, что предсказать точную функцию факторов транскрипции бактерий только по гомологии невозможно из-за быстрой дивергенции функций [28]. Связь между сохранением функций и уровнем сходства последовательностей исследовалась в работах [40, 41]. Показано, чтобы предсказать функцию ферментов с точностью 90%, идентичность аминокислотных последовательностей должна составлять от 40 до 70%. В центре нашего внимания находилась близкородственная группа - род Bacillus, и полное совпадение аминокислотных последовательностей белков составило не менее 54%, поэтому мы полагаем, что основные функции регуляторов сохранились у этих филогенетически близких видов. Действительно, установлено, что структурно близкие AbrB- и ResD-белки B. anthracis и B. subtilis выполняют сходные функции [32, 34, 40]. С использованием очищенных AbrB-белков из B. subtilis и B. anthracis и их ДНК-мишеней, а также синтетических последовательностей нуклеотидов была экспериментально подтверждена одинаковая ДНК-связывающая специфичность этих ор-тологов [41].

Учитывая тот факт, что ResD-, Spo0A- и AbrB-белки у В. subtilis принимают участие в регуляции экспрессии генов pho, мы изучили их влияние на экспрессию генов гуанилспецифичных рибонуклеаз B. pumilus, B. intermedius B. thuringiensis и B. circulans, синтез которых также осуществляется при фосфатном голодании. Полученные нами данные показывают, что дефекты в ResD-, Spo0A- и AbrB-

белках приводят к изменению биосинтеза РНКаз Bpu, Bi и Bth рекомбинант-ными штаммами B. subtilis, что позволяет сделать вывод об их позитивной (ResD и AbrB) или негативной (SpoOA) роли. Эти результаты согласуются с данными литературы, свидетельствующими о том, что в условиях фосфатного голодания мутация в гене resD приводит к снижению специфической активности щелочной фосфатазы - типичного фермента PHO-регулона B. subtilis - на 8090% от уровня активности в штамме дикого типа [14]. В spoOA-мутантных штаммах наблюдается сверхпродукция щелочной фосфатазы, а мутации в abrB- или resD-генах снижают экспрессию генов PHO-регулона в spoOA-мутантном штамме [14]. Как и у В. subtilis, белки SpoOA B. anthracis и B. thuringiensis репрессируют ген abrB [32, 33]. Следовательно, экспрессия генов гуанилспеци-фичных рибонуклеаз B. pumilus, B. intermedius и B. thuringiensis регулируется подобно генам PHO-регулона B. subtilis.

Биосинтез РНКазы B. circulans при фосфатном голодании не подвержен влиянию ResD-, SpoOA- и AbrB-регуляторов, как и PhoP-PhoR-системы. Возможно, синтез фермента осуществляется по g -зависимому механизму. Вместе с тем отсутствие регуляции со стороны этих белков еще не свидетельствует о том, что PHO-регулон у B. circulans не функционирует. Так например, у B. subtilis фи-таза не является членом PHO-регулона, а у B. licheniformis и B. amyloliquefaciens она относится к ферментам, наиболее сильно индуцируемым при PHO-ответе [23, 26].

Таким образом, регуляторные системы, подобные PHO-регулону B. subtilis, обнаружены у представителей различных видов бацилл, что позволяет рассматривать PHO-регулон как универсальную систему, обеспечивающую ответ клетки на дефицит экзогенного фосфата.

Summary

V.V. Ulyanova, V.I. Vershinina. Systems That Control Bacillus Phosphate Starvation Specific Response.

Distribution analysis of systems that control phosphate starvation response was carried out among 10 Bacillus species with completely sequenced genomes. It was determined that genes coding for main regulators of PHO response, PhoP, ResD, SpoOA and AbrB, are present in all Bacillus genomes, locating in very similar genetic contexts. Moreover, these proteins share a high level of homology with the same regulators of B. subtilis. Using mutant B. subtilis strains ResD, SpoOA and AbrB proteins was shown to regulate expression of the genes for guanyl-specific ribonucleases from B. pumilus, B. intermedius and B. thuringiensis in a similar to B. subtilis PHO genes manner under phosphate starvation conditions. Biosynthesis of B. circulans RNAse is not subject to influence of ResD, SpoOA and AbrB regulators as well as PhoP-PhoR system and it is likely to be GB-dependent. Nevertheless, the data obtained makes it possible to conclude that regulatory systems similar to B. subtilis PHO regu-lon function in the representatives of different Bacillus species, and consider PHO regulon as universal system mediating cell response to deficiency of exogenous phosphate.

Key words: PHO regulon, Bacillus, guanyl-specific ribonucleases.

Литература

1. Hulett F.M. The signal - transduction network for PHO regulation in Bacillus subtilis // Mol. Microbiol. - 1996. - V. 19, No 5. - P. 933-939.

2. Antelmann H., Scharf C., Hecker M. Phosphate starvation-inducible proteins of Bacillus subtilis: proteomics and transcriptional analysis // J. Bacteriol. - 2000. - V. 182, No 16. -P. 4478-4490.

3. Hulett F.M., Lee J.K., Shi L., Sun G., Chesnut R., Sharkova E., Duggan M.F., Kapp N. Sequential action of two-component genetic switches regulates the pho regulon in Bacillus subtilis // J. Bacteriol. - 1994. - V. 176, No 5. - P. 1348-1358.

4. Eder S., Shi L., Jensen K., Yamane K., Hulett F.M. A Bacillus subtilis secreted phospho-diesterase/alkaline phosphatase is the product of a Pho regulon gene, phoD // Microbiol. -1996. - V. 142, No 8. - P. 2041-2047.

5. Jongbloed J.D., Martin U., Antelmann H., Hecker M., Tjalsma H., Venema G., Bron S., van Dij J.M., Müller J. TatC is a specificity determinant for protein secretion via the twin-arginine translocation pathway // J. Biol. Chem. - 2000. - V. 275, No 52. -Р. 41350-41357.

6. Ogura M., Yamaguchi H., Yoshida K., Fujita Y., Tanaka T. DNA microarray analysis of Bacillus subtilis DegU, ComA and PhoP regulons: an approach to comprehensive analysis of B. subtilis two-component regulatory systems // Nucleic Acids Res. - 2001. -V. 29, No 18. - Р. 3804-3813.

7. Qi Y., Kobayashi Y., Hulett F.M. The pst operon of Bacillus subtilis has a phosphate regulated promoter and is involved in phosphate transport but not in regulation of the pho regulon // J. Bacteriol. - 1997. - V. 179, No 8. - P. 2534-2539.

8. Liu W., Eder S., Hulett F.M. Analysis of Bacillus subtilis tagAB and tagDEF expression during phosphate starvation identifies a repressor role for PhoP-P // J. Bacteriol. - 1998. -V. 180, No 3. - P. 753-758.

9. Paul S., Birkey S., Liu W., Hulett F.M. Autoinduction of Bacillus subtilis phoPR operon: transcription results from enhanced transcription from Ega- and EcE-responsive promoters by phosphorylated PhoP // J. Bacteriol. - 2004. - V. 186, No 13. - Р. 4262-4275.

10. Robichon D., ArnaudM., Gardan R., Pragai Z., O'Reilly M., Rapoport G., Debarbouille M. Expression of a new operon from Bacillus subtilis, ykzB-ykoL, under the control of the TnrA and PhoP-PhoR global regulators // J. Bacteriol. - 2000. - V. 182, No 5. - Р. 12261231.

11. Pragai Z., Harwood C.R. Regulatory interactions between the Pho and sigma B-dependent general stress regulons of Bacillus subtilis // Microbiol. - 2002. - V. 148, No 5. -Р. 1593-1602.

12. Birkey S.M., Liu W., ZhangX., Duggan M.F., Hulett F.M. PHO signal transduction network reveals direct transcriptional regulation of one two-component system by another two-component regulator: B. subtilis PhoP directly regulates production of ResD // Mol. Microbiol. - 1998. - V. 30, No 5. - P. 943-953.

13. Allenby N., O'Connor Z., Pragai N.E., Ward A.C., Wipat A., Harwood C.R. Genome-wide transcriptional analysis of the phosphate starvation stimulon of Bacillus subtilis // J. Bacteriol. - 2005. - V. 187, No 23. - Р. 8063-8080.

14. Sun G., Sharkova E., Chesnut R., Birkey S., Duggan M.F., Sorokin A., Pujic P., Ehrlich S.D., Hulett F.M. Regulators of aerobic and anaerobic respiration in Bacillus subtilis // J. Bacteriol. - 1996. - V. 178, No 5. - Р. 1374-1385.

15. Schau M., Eldakak A., Hulett F.M. Terminal oxidases are essential to bypass the requirement for ResD for full Pho induction in Bacillus subtilis // J. Bacteriol. - 2004. -V. 186, No 24. - P. 8424-8432.

16. Phillips Z.E., Strauch M.A. Bacillus subtilis sporulation and stationary phase gene expression // Cell. Mol. Life Sci. - 2002. - V. 59, No 3. - Р. 392-402.

17. Hamon M.A., Stanley N.R., Britton R.A., Grossman A.D., Lazazzera B.A. Identification of AbrB-regulated genes involved in biofilm formation by Bacillus subtilis // Mol. Microbiol. - 2004. - V. 52, No 3. - Р. 847-860.

18. Hahn J., Roggiani M., Dubnau D. The major role of Spo0A in genetic competence is to downregulate abrB, an essential competence gene // J. Bacteriol. - 1995. - V. 177, No 12. -Р. 3601-3605.

19. Burbulys D., Trach K.A., Hoch J.A. Initiation of sporulation in Bacillus subtilis is controlled by a multicomponent phosphorelay // Cell. - 1991. - V. 64, No 3. - P. 545-552.

20. Fujita M., González-Pastor J.E., LosickR. High- and low-threshold genes in the Spo0A regulon of Bacillus subtilis // J. Bacteriol. - 2005. - V. 187, No 4. - Р. 1357-1368.

21. Prágai Z., Allenby N.E., O'Connor N., Dubrac S., Rapoport G., Msadek T., Harwood C.R. Transcriptional regulation of the phoPR operon in Bacillus subtilis // J. Bacteriol. - 2004. -V. 186. No 4. - Р. 1182-1190.

22. Sun G., Birkey S.M., Hulett F.M. Three two-component signal-transduction systems interact for Pho regulation in Bacillus subtilis // Mol. Microbiol. - 1996. - V. 19, No 5. -P. 942-948.

23. Hoi L.T., Voigt B., Jеrgen B., Ehrenreich A., Gottschalk G., Evers S., Feesche J., Maurer K., Hecker M., Schweder T. The phosphate-starvation response of Bacillus licheniformis // Proteomics. - 2006. - V. 6, No 12. - Р. 3582-3601.

24. Znamenskaya L.V., Vershinina O.A., Vershinina V.I., Leshchinskaya I.B., Hartley R.W. Expression of the genes for guanilspecific ribonucleases from Bacillus intermedius and Bacillus pumilus is regulated by the two-component signal-trunsduction system PhoP-PhoR in Bacillus subtilis // FEMS Microbiol. Lett. - 1999. - V. 173, No 1. - P. 217-222.

25. Морозова О.В., Вершинина О.А., Вершинина В.И., Лещинская И.Б., Знаменская Л.В. Регуляция биосинтеза внеклеточных фосфогидролаз у бацилл // Мол. генетика, микробиол., вирусол. - 2001. - № 2. - С. 13-17.

26. Makarewicz O., Dubrac S., Msadek T., Borriss R. Dual role of the PhoP-P response regulator: Bacillus amyloliquefaciens FZB45 phytase gene transcription is directed by positive and negative interactions with the phyC promoter // J. Bacteriol. - 2006. -V. 188, No 19. - Р. 6953-6965.

27. GelfandM.S. Evolution of transcriptional regulatory networks in microbial genomes // Curr. Opin. Struct. Biol. - 2006. - V. 16, No 3. - Р. 420-429.

28. Price M.N., Dehal P.S., Arkin A.P. Orthologous transcription factors in bacteria have different functions and regulate different genes // PLoS Comput. Biol. - 2007. - V. 3, No 9. - Art. e175.

29. Znamenskaya L.V., Gabdrakhmanova L.A., Chernokalskaya E.B., Leshchinskaya I.B., HartleyR.W. Phosphate regulation of biosynthesis of extracellular RNases of endospore-forming bacteria // FEBS Lett. - 1995. - V. 375, No 1-2. - P. 16-18.

30. Anfmsen С.В., RedfieldR.R., Choate W.I, Page J., Carrol W.R. Studies of gross structure, cross-linkage and terminal sequences in ribonuclease // J. Biol. Chem. - 1957. -V. 207, No 1. - P. 201-210.

31. Dong X., Cote J.C. Phylogenetic relationships between Bacillus species and related genera inferred from comparison of 3' end 16S rDNA and 5' end 16S-23S ITS nucleotide sequences // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. - 2003. - V. 53, No 3. - Р. 695-704.

32. Chun J., Bae K.S. Phylogenetic analysis of Bacillus subtilis and related taxa based on partial gyrA gene sequences // Antonie van Leeuwenhoek. - 2000. - V. 78, No 2. -Р. 123-127.

33. Gatson J.W., Benz B.F., Chandrasekaran C., Satomi M., Venkateswaran K., Hart M.E. Bacillus tequilensis sp. nov., isolated from a 2000-year-old Mexican shaft-tomb, is closely related to Bacillus subtilis // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. - 2006. - V. 56, No 7. -Р. 1475-1484.

34. Saile E., Koehler T.M. Control of anthrax toxin gene expression by the transition state regulator abrB // J. Bacteriol. - 2002. - V. 184, No 2. - Р. 370-380.

35. Poncet S., Dervyn E., Klier A., Rapoport G. Spo0A represses transcription of the cry toxin genes in Bacillus thuringiensis // Microbiol. - 1997. - V. 143, No 8. - Р. 2743-2751.

36. Vetter S.M., Schlievert P.M. The two-component system Bacillus respiratory response A and B (BrrA-BrrB) is a virulence factor regulator in Bacillus anthracis // Biochem. -2007. - V. 46, No 25. - Р. 7343-7352.

37. Duport C., Zigha A., RosenfeldE., Schmitt P. Control of enterotoxin gene expression in Bacillus cereus F4430/73 involves the Redox-sensitive ResDE signal transduction system // J. Bacteriol. - 2006. - V. 188, No 18. - Р. 6640-6651.

38. Grandvalet C., GominetM., Lereclus D. Identification of genes involved in the activation of the Bacillus thuringiensis inhA metalloprotease gene at the onset of sporulation // Mi-crobiol. - 2001. - V. 147, No 7. - Р. 1805-1813.

39. Wu H., Mao F., Olman V., Xu Y. Accurate prediction of orthologous gene groups in microbes // Proc. IEEE Comput. Syst. Bioinform. Conf. - 2005. - Р. 73-79.

40. Rost B. Enzyme function less conserved than anticipated // J. Mol. Biol. - 2002. - V. 318, No 2. - Р. 595-608.

41. Tian W., Skolnick J. How well is enzyme function and conserved as a function of pair-wise sequence identity? // J. Mol. Biol. - 2003. - V. 333, No 4. - Р. 863-882.

42. Baillie L., Moir A., Manchee R. The expression of the protective antigen of Bacillus anthracis in Bacillus subtilis // J. Appl. Microbiol. - 1998. - V. 64, No 2. - Р. 741-746.

43. StrauchM.A., BallarP., RowshanA.J., ZollerK.L. The DNA-binding specificity of the Bacillus anthracis AbrB protein // Microbiol. - 2005. - V. 151, No 6. - Р. 1751-1759.

Поступила в редакцию 21.02.08

Ульянова Вера Владимировна - аспирант кафедры микробиологии Казанского государственного университета. E-mail: ulyanova_vera@mail.ru

Вершинина Валентина Ивановна - кандидат биологических наук, доцент кафедры микробиологии Казанского государственного университета. E-mail: Valentina.Vershinina@ksu.ru