Антимикробные пептиды из сцифоидной медузы Aurelia autita

УДК 612.398.1:547.964.4 Вестник СПбГУ. Сер. 3,2004, вып. 4

Е. С. Клушевская, А. В. Меныиенин, Г. М. Алешина, Е. Г. Краснодембский, В. А. Попова, В. Н. Кокряков

АНТИМИКРОБНЫЕ ПЕПТИДЫ ИЗ СЦИФОИДНОЙ МЕДУЗЫ AURELIA AUTITA*

Система механизмов врожденного иммунитета является древним эволюционным приобретением, обнаруженным у всех эукариотических организмов, начиная с простейших и заканчивая млекопитающими и человеком. Она обеспечивает быструю и надежную защиту организмов животных от патогенов. Важнейшими факторами системы врожденного иммунитета являются антибиотические пептиды (АП) [2]. К настоящему времени описано свыше 800 АП, выделенных из животных различных таксономических групп, родственно не связанных между собой, а также и растений, что является свидетельством универсальности и важности выполняемой ими функции [3]. Структурные принципы, лежащие в основе разделения пептидов по гомологическим семействам, определяют также и механизм действия АП. Следует подчеркнуть, что большинство животных и растительных организмов продуцируют не один, а целый набор разнообразных пептидов, действие которых чаще всего дополняет друг друга. Кроме этого, такое разнообразие АП позволяет системе врожденного иммунитета осуществлять более эффективную защиту организма против широкого круга разнообразных патогенов [10]. К тому же накапливается все_больше доказательств того, что АП обладают разнообразными дополнительными функциями, которые, как можно предположить, влияют на многие стороны иммунного ответа. АП являются эволюционно древними химическими факторами защиты, а их широкое распространение говорит о том, что, несмотря на появление системы приобретенного иммунитета у позвоночных, они до сих пор не потеряли свою биологическую значимость [1].

Несмотря на все разнообразие исследованных видов животных и выделенных из них пептидов, Aurelia aurita (тип Cnidaria - кишечнополостные, класс Scyphozoa - сцифоидные медузы) является объектом достаточно древним в эволюционном плане, но, к сожалению, мало исследованным в отношении АП. Выделение и изучение АП медуз может представлять интерес с точки зрения понимания закономерностей возникновения и развития системы врожденного иммунитета. Работы по выделению и очистке АП медузы были предприняты нами ранее. Предварительная оценка антибиотической активности экстрактов из разных частей тела медузы свидетельствует о том, что содержание антимикробных факторов в ней достаточно высоко. Настоящая работа является продолжением исследования антибиотических пептидов сцифоидной медузы Aurelia aurita.

Материалы и методы исследования. Объект исследования - сцифоидные медузы Aurelia aurita (кишечнополостные т. Cnidaria, кл. сцифоидные медузы Scyphozoa) был собран на Белом море в августе 2002 г. Экстракцию катионных белков и пептидов проводили из тканей и органов медуз: ротовых хоботков, щупалец, желудочных карманов, канальцев гастроваскулярной системы, гонад и мезоглеи. Вышеперечисленные части тела медузы помешали в 10%-ный раствор уксусной кислоты и хранили на холоде (4-5°С) до экстракции. Препарированные части тела разрушали гомогенизацией в 10%-ном растворе уксусной кислоты в стеклянном гомогенизаторе со стеклянным пестиком. Гомогенат центрифугировали при 25 000 g в течение I ч, после чего супернатант отбирали, а к осадку добавляли двойной объем 10%-ной уксусной кислоты и ресуспендировали. Суспензию повторно осаждали центрифугированием при 25 000 g в течение lV Полученный супернатант объединяли с предыдущим. Объединенные супернатанты подвергали ультрафильтрации через фильтр «Amicon» YM-10 с номинально отсекаемой

Работа выполнена при поддержке РФФИ (грант № 03-04-49349), МОУН (грант № 07.01.030. (2004 -2005) и ЦКП «Аналитическая спектрометрия».

© Е. С. Клушевская, А. В. Меньшенин, Г. М. Алешина, Е. Г. Краснодембский, В. А. Попова, В. Н Кокряков, 2004

молекулярной массой (НОММ) ЮкДа. Ультрафильтрат далее подвергали концентрированию на фильтре «Amicon» YM-1 (НОММ 1 кДа). ХроматографичеСкую очистку фракции белков и пептидов проводили на колонке карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ). Колонку уравновешивали 0,2 М натрий-ацетатным буфером, рН = 4,5. Элюцию осуществляли 1М NaCl. Элюент обессоливали нанесением на картридж С-18. Снятие с картриджа осуществляли 60%-ным ацетонитрилом. Смесь белков и пептидов полученного обессоленного концентрата разделяли на фракции препаративным электрофорезом в 12,5%-ном полиакриламидном геле в кислой буферной системе в присутствии мочевины в аппарате для препаративного электрофореза (Bio-Rad, модель AG501-X8) [4]. Спектр катионных пептидов во фракциях, полученных после проведения препаративного электрофореза, оценивали методом электрофореза в кислой буферной системе в присутствии мочевины в пластинах полиакриламидного геля на приборе фирмы «Hoefer» (США) [8]. Дополнительную очистку фракций осуществляли с помощью обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ) на установке фирмы «Весктап». Разделение проводили на колонке Alltech С18 (4,6x250 мм; сорбент Macrosphere 300 С18, диаметр частиц 5 мкм) в градиенте концентрации ацетонитрила (0-60%, 1%в мин) в 0,1%-ной трифторуксусной кислоте [5]. Чистоту полученных препаратов и приблизительную молекулярную массу пептидов оценивали при помощи диск-электрофореза в присутствии доде-цилсульфата натрия [9]. Электрофорез проводили в пластинах полиакриламидного геля на приборе фирмы «Hoefer» (США). В качестве стандарта использовали молекулярный весовой маркер для белков (Sigma, США), в состав которого входили белки с молекулярными массами: 2 800 Да (инсулин (а- и (3-цепи)), 6 200 Да (ингибитор трипсина быка), 14 300 Да (лизоцим), 18 400 Да ф-лактоглобулин), 29 000 Да (карбоангидраза), 43 000 Да (оваль-бумин). Для определения точной массы пептида брали MALDI-TOF (Matrix assisted laser desorbtion/ionization Time-of-F!ight) масс-спектрометрию на приборе «Voyadger» DE (Perseptive Biosystem Inc., USA) с использованием а-циано-4-гидроксикоричной кислоты в качестве матрицы. Каждый этап очистки белков предварялся анализом антимикробной активности фракций. Антибиотическое действие катионных пептидов определяли методом радиальной диффузии в агарозном геле [6]. В качестве объектов для определения антимикробного действия пептидов использовали культуры следующих микроорганизмов: Escherichia coli, штамм ML-35p (грамм-отрицательная бактерия), Listeria monocytogenes, штамм EGD (грамм-положительная бактерия), Candida albicans, штамм 820 (гриб кл. Аскомицеты). Определяли антибиотическое действие пептидов, находящихся 0,01%-ном водном растворе уксусной кислоты. С целью полуколичественной оценки антибиотического действия пептидов измеряли диаметр зоны лизиса вокруг лунок, принимая за 1 единицу 0,1 мм и вычитая из измеренного значения 10 единиц, соответствующих диаметру лунки. В качестве стандарта сравнения использовали дефенсин кролика NP-4. Наличие дисульфидных связей в катионных белках определяли, окисляя их надмуравьиной кислотой. О возможном наличии дисульфидных связей свидетельствовало изменение электрофоретической подвижности пептидов к катоду, обработанных надмуравьиной кислотой, по сравнению с контрольными пробами при проведении аналитического электрофореза в кислой буферной системе [7], как было описано выше.

Результаты исследований и их обсуждение. Предварительный анализ кислотных экстрактов из отдельных частей тела медузы (ротовых хоботков, щупалец, желудочных карманов, каналов гастроваскулярной системы, гонад и мезоглеи) показал, что все они в большей или меньшей степени обладают антимикробной активностью как против грамм-отрицательной бактерии Escherichia coli, так и против грамм-положительной бактерии Listeria monocytogenes. Однако наибольшей активностью отличались экстракты из желу1 дочных карманов и каналов гастроваскулярной системы, а также гонад. Экстракты из желудочных карманов и каналов гастроваскулярной системы были объединены и подвергнуты ультрафильтрации на фильтре «Amicon» YM-10, а затем сконцентрированы на фильтре «Amicon» YM-1, таким образом мы получили фракцию белков и пептидов, молекулярная масса которых не превышала 10 кДа. На следующем этапе смесь белков' и пептидов была подвергнута йонно-обменной хромотографии на КМЦ колонке. Колонка промывалась 0,2 М натрий ацетатным буфером. Элюцию проводили 1М NaCl. После чего элюент был обессолен нанесением на картридж и снятием 60%-ным ацтонитрилом. Затем обессоленный концентрат был разделен на фракции препаративным электрофорезом в полиакриламидном геле в присутствии мочевины. О наличии белка во фракциях судили по величине поглощения в каждой фракции измеренной при длине волны Х=225 нм в области поглощения пептидными связями. Все фракции, где наблюдалось поглощение, были подвергнуты анализу на наличие антибиотической активности по методу радиальной диффузии в агарозном геле. Фракции №9-14, 16-18 обладали антибиотической активностью как против грамм-отрицательного микроорганизма Escherichia coli, так и против грамм-положительного микроорганизма Listeria monocytogenes. Фракции № 19-21 обладали активностью только про-

тив грамм-отрицательного микроорганизма Escherichia coli. Электрофоретическую подвижность полученных фракций оценивали методом аналитического электрофореза в поли-акриламидном геле в кислой буферной системе в присутствии мочевины. В качестве стандарта был использован дефенсин кролика NP-4. Гетерогенность полученных фракций и приблизительную молекулярную массу белков и пептидов фракций оценивали с помощью диск-электрофореза в денатурирующих условиях в присутствии додецил-сульфата натрия. В дальнейшей работе мы использовали фракции, где наблюдалась антибиотическая активность, а электрофоретическая подвижность пептидов фракций была сопоставима с электро-форетической подвижностью дефенсина кролика NP-4, использованного в качестве контроля. По предварительной оценке молекулярная масса пептидов фракций составляла 2-6 кДа. Фракции № 9-14 были подвергнуты очистке с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии в градиенте ацетонитрила 0-60%, 1% в минуту в 0,1%-ной трифторуксусной кислоте. О наличии белка во фракциях судили по величине оптической плотности при длине волны X = 225 нм. Все фракции, содержащие белок, были подвергнуты анализу на наличие антибиотической активности в отношении грамм-отрицательной бактерии Escherichia coli и в отношении грамм-положительной бактерии Listeria monocytogenes методом радиальной диффузии в агарозном геле. В результате проделанной работы из фракции № i 3 мы получили пептид, который сходил с колонки на 32-33-й минутах, что приблизительно соответствует концентрации ацетонитрила 31-32%. Приблизительная молекулярная масса данного пептида, определенная с помощью электрофореза, в денатурирующих условиях составляет 3 кДа. Точная молекулярная масса данного пептида была определена методом MALDI-TOF масс-спектрометрии и составляет 3839,4 Да. Данный пептид проявляет антибиотическую активность как. в отношении грамм-отрицательной Escherichia coli, так и в отношении грамм-положительной бактерии Listeria monocytogenes, сопоставимую с активностью дефенсина кролика NP-4:

Пептид Listeria monocytogenes Escherichia coli

17 24

/

NP-4 25 19

Следует отметить, что проявляемая по отношению к Escherichia coli активность превосходит таковую в отношении Listeria monocytogenes и является неактивной в отношении низшего гриба Candida albicans. По своей электрофоретической последовательности полученный нами пептид близок к электрофоретической подвижности дефенсина кролика NP-4. Однако в геле он находится несколько выше дефенсина кролика, что, вероятно, является следствием меньшего положительного заряда пептида и ведет к понижению скорости движения в геле. По результатам теста на, наличие дисульфидных связей в полученном пептиде можно предположить, что он содержит дисульфидные связи (так как пептид, обработанный надмуравьиной кислотой, движется в геле медленнее, чем пептид, не обработанный кислотой, использованный в качестве контроля).

Исходя из анализа электрофоретической подвижности полученного пептида, обработанного кислотой, в сопоставлении с электрофоретической подвижностью дефенсина кролика NP-4, также обработанного надмуравьиной кислотой (пептид движется быстрее), а также исходя из того, что дефенсин кролика содержит 3 дисульфидных связи, мы предположили, что, возможно, пептид содержит одну дисульфидную связь. В литературе описаны пептиды, содержащие одну дисульфидную связь. Данные пептиды были выделены из лейкоцитов крови крупного рогатого скота и кожи лягушек разных видов [1]. Однако наверняка судить о принадлежности выделенного пептида к какой-либо группе можно будет лишь после установления его точной аминокислотной последовательности/

В настоящее время проводится работа по дальнейшему выделению и очистке пептидов сцифоидной медузы, обладающих антимикробной активностью.

Авторы выражают благодарность за помощь в работе О. В. Шамовой, И. А. Тверья-новичу.

Summary

Klushevskaya Е. S. Menshenin А. К. Aleshina G. М„ Krasnodembskiy Е. G„ PopovaV A Kokryakov V. N. Antimicrobial peptides from jelly-fish Aurelia aurita.

The innate immunity system is presented in all eukaryotic organisms, from protista to mammals and plants The main factor of the innate immunity is antimicrobial peptides. Aurelia aurita (ph. Cnidaria, cl.ScyphozoaJ is an evolutionary ancient species, though insufficiently studied in this respect. We have obtained a peptide with Mr = 3 8 kDa from the extract of the gastrovascular canals and gastral cavity. The peptide is active against the gram-negative E. coli and to a lesser degree against the gram-positive L. monocytogenes.

Литература ;

1 КокряковВ. H. Биология антибиотиков животного происхождения. СПб., 1999. 2. КокряковВ Н Стефанов В. Е., Алешина Г. М. и др. Дефенсины и родственные им антибиотические пептиды в эволюции защитных систем животных // Журн. эволюц. биохимии и физиологии. 1997. Т. 33, №1. С. 109-123. 3. BomanH.G Antibacterial peptides: basic facts and emerging concepts // J. of Inter. Med. 2003. Vol. 254. P. 197-215. 4. HarwigS. S. Chen N P Park A. S. K., Lehrer R. /.- Purification of cysteine-rich bioactive peptides from leukocytes by continuous acid-urea-polyacrylamide gel electrophoresis // Anal. Biochem. 1993. Vol.208. P. 382-386. 5. Kokryakov V. N. Harwig I L PanyutichE. A. etal. Protegrins: leukocyte antimicrobial peptides that combine features of corticostatic defensins and tachyplesins // FEBS Lett.1993. Vol.327, N2 P.231-236. 6. LehrerR. I. RosenmanM., HarwigS S Jackson R Eisenhauer P. Ultrasensitive assays for endogenous antimicrobial polypeptides // J. Immunol. Metl.ods 1991*' Vol. 137. P. 167-173. 7. MarchiniD., Giordano P. C., AmonsR. etal. Purification and primary structure of ceratotoxin -a and ceratotoxin -b, 2 antibacterial peptides from the female reproductive accessory glands of the medfly Ceratilis cupitala (Insecta, Diptera) // Insect Biochem. Molec. Dial. 1993. Vol. 23 P. 591-598. 8. PanyimS., Chalkley R High resolution acrylamide gel electrophoresis of histones // Arch. Biochem. and Biophys. 1969 Vol 130 N2 P 337-346 9.SchaggerH., vonJagowG. Tricine - sodium dodecyl sulfate - polyacrylsmide gel electrophoresis for'separation of protein in the range from I to 100 kDa // Anal. Biochem. 1987. Vol. 166. P 368-379. 1 . ZasloffM Antimicrobial peptides of multicellular organisms //Nature. 2002. Vol. 415. P. 389-395.

Статья поступила в редакцию 17 июня 2004 г