СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СУБСТАНЦИЙ ИЗ ЗМЕЕГОЛОВНИКА МОЛДАВСКОГО (Dracocephalum moldavica L.)
METHOD FOR PREPARING MEDICINAL SUBSTANCES FROM DRACOCEPHALUM MOLDAVICA L.

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, в частности, к способу получения лекарственных субстанций змееголовника молдавского (Dracocephalum moldavica L.) для создания средства, обладающего нейротропной активностью и влияющего на показатели сердечно-сосудистой системы.
Змееголовник молдавский (Dracocephalum moldavica L.) семейства яснотковых (Lamiaceae), интродуцированного на территории филиалов ФГБНУ ВИЛАР Российской федерации. Его культивируют как эфирномасличное растение на Украине, в Болгарии и Румынии. Кроме того в последнее время культивируют на юге России. Компоненты, входящие в состав змееголовника молдавского, являются биологически активными веществами и обуславливают лечебный эффект. Установлена антибактериальная активность эфирного масла и спиртовых извлечений из травы змееголовника молдавского, а также наличие у спиртовых извлечений отхаркивающего, диуретического и седативного действий. Его используют в парфюмерии, косметологии и кулинарии [1]. В традиционной медицине применяют растение в виде чаев, настоев, а также диэтических добавок в сочетании с другими компонентами [2].
Растения рода змееголовника с древних времен использовали в Китайской народной Уйгурской медицине для лечения болезней сердца (учащенное сердцебиение, ишемическая болезнь сердца), артериальной гипертензии, трахеитов, атеросклероза, невралгии, мигрени, головной и зубной боли.
В мировой литературе широко освещены исследования химического состава экстрактов из надземной части змееголовника молдавского [3-6]. В траве растения содержатся флавоноиды, эфирное масло, фенолокислоты, таннины и другие вещества. Особое значение в литературных данных уделено розмариновой кислоте (эфир кофейной кислоты и 3,4-дигидроксифенилмолочной кислоты), обладающая широким спектром лечебно-профилактических эффектов: антиоксидантной, гепатопротекторной, кардиопротекторной, нефропротекторной, иммуномодулирующей, антиаллергической и противоопухолевой активностями. Кислота ингибирует активность ацетилхолинэстеразы, глутатионредуктазы, снижает генотоксическое и цитотоксическое действие ионизирующей радиации [7].
В качестве прототипа выбран способ получения суммарного экстракта флавоноидов флавоного типа из змееголовника молдавского с выходом 50% от содержания в сырье, который заключается в обработке измельченного сырья этиловым спиртом, разбавления экстракта водой, пропускании через колонку с микропористой смолой или полиамидом, промывании водой и водным спиртом, отбора фракции целевых соединений, фильтровании, упаривании и далее для производства средств лечения атеросклероза, сердечных заболеваний, ангины, а также их содержащих комплексных фармацевтических формах (таблетках, гранулах, порошках, настойках, капсулах и др.), который принят нами за прототип [CN 101537039 A]. Недостатки прототипа длительность процесса и трудоемкость выделения.
Задачей предлагаемого изобретения является разработка из травы змееголовника молдавского, заготовленной в фазу цветения и бутонизации способа получения сухого очищенного экстракта с содержанием фенольных соединений (флавоноидов флавоного типа и фенилпропаноидов) в пересчете на розмариновую кислоту обеспечивающего нейротропную активность, а также средства из змееголовника молдавского с содержанием полифенольных соединений в пересчете на (+)-катехин, обладающего достоверным противовоспалительным эффектом, угнетая экссудативный и альтернативный компоненты патогенеза острого воспаления.
Технический результат изобретения предлагаемого изобретения является получения из травы змееголовника молдавского, заготовленной в фазу цветения или бутонизации средства под рабочим названием Розматин (далее Розматин), обеспечивающего нейротропную активность с содержанием фенольных соединений в пересчете на розмариновую кислоту, - Предложенный способ позволяет получить высокий выход целевого продукта.
+
Техническая сущность предлагаемого решения заключается в использовании способа получения экстракта из травы змееголовника молдавского (Dracocephalum moldavica L.), содержащего флавоноиды, обладающего нейротропной активностью, заключающийся в экстракции измельченного сырья этиловым спиртом, фильтрации, упаривании. При этом измельченную траву змееголовника молдавского, в фазе бутонизации и цветения, трижды экстрагируют - 50-ти % этиловым спиртом, при соотношении сырье : экстрагент равном 1:10, при комнатной температуре, при подаче на каждую последующую экстракцию свежий экстрагент, равный слитому извлечению, полученные экстракты упаривают последовательно по мере поступления до объема до 1/20, водные кубовые концентраты объединяют и обрабатывают три раза хлороформом в соотношении хлороформ : водная фаза равном 1:2, органическую фазу отделяют, а водный кубовый остаток переосаждают спиртом этиловым 96% в соотношении 1:10, выпавший осадок отстаивают, упаренный надосадочный раствор из предыдущей стадии растворяют при 65°C в дистиллированной воде с добавлением катионита Ку-2-8-чс(Н) до pH равного 3, фильтруют, полученный раствор экстрагируют н-бутанолом трижды в соотношении 1:2, водный слой отделяют, бутанольный экстракт промывают водой дистиллированной дважды, а затем промытый водой бутанольный экстракт отгоняют в виде азеотропы с водой, с получением экстракта.
Предложенное техническое решение иллюстрируется следующими примерами 1 и 2 получения субстанции и доклиническими опытами 1 и 2.
ПРИМЕР 1. Способ получения Розматина
Исходное сырье: трава змееголовника молдавского, заготовленная в фазу цветения или фазу бутонизации. Измельченное сырье до размера частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 0,5-5 мм, с влажностью 8,57%, в количестве 200 г загружают в плоскодонную колбу вместимостью 10 л, трижды экстрагируют 50±5% водным этиловым спиртом в соотношении (сырье - экстрагент, 1:10) при комнатной температуре и при постоянном перемешивании в течение 3 часов. На каждую последующую экстракцию подают свежий экстрагент, равный слитому извлечению. Водно-спиртовые извлечения фильтруют на воронке Бюхнера. Получают от первой экстракции 1,530 л водно-спиртового извлечения, от второй экстракции 1,480 л и от третьей экстракции получают 1,490 л водно-спиртовых извлечений. Полученные экстракты упаривают до 1/20 первоначального объема. Упаривание водно-спиртовых извлечений проводят последовательно по мере поступления. Водные кубовые концентраты объединяют, получают водный кубовый остаток в количестве 240 мл с плотностью 1,113 г/см и обрабатывают 3 раза хлороформом в соотношении хлороформ : водная фаза (1:2). Органическую фазу отделяют, а остатки органического растворителя из водной фазы удаляют в вакууме. Водный кубовый остаток переосаждают из спирта этилового 96% в соотношении 1:10 для дальнейшей очистки.
Для этого в колбу плоскодонную вместимостью 5,0 л вливают 2,4 л спирта этилового 96%, туда же при интенсивном перемешивании порциями добавляют водный кубовый остаток из предыдущей стадии в количестве 240 мл (соотношение водный кубовый остаток : спирт этиловый 96% (1:10). Выпавший песочно-бежевый осадок отстаивают в течение 30 минут, затем надосадочный водно-спиртовый раствор фильтруют декантацией через фильтр Шотта №3. Осадок уплотняется и остается на дне колбы. При размешивании добавляют 250 мл спирта этилового 96% и дважды промывают и фильтруют через фильтр Шотта №3. Спирт от промывки осадка присоединяют в основному фильтрату. Надосадочный водно-спиртовый раствор имеет прозрачный коричневый цвет, вес упаренного надосадочного раствора 29,31 г.
Промытый осадок весом 63,64 г. высушивают на воздухе в течение двух дней или вакуум-сушильном шкафу при температуре 40°C в течение четырех часов.
+
Упаренный надосадочный водно-спиртовый раствор из предыдущей стадии в количестве 29,31 г растворяют в 160 мл дистиллированной воды (на водяной бане при температуре 65°C. В водный раствор добавляют катионита Ку-2-8-чс (Н) до кислой реакции раствора pH равного 3, фильтруют через фильтр ПОР 40 или ПОР 100.
Полученный кислый маточный раствор экстрагируют н-бутанолом, насыщенным водой, 3 раза в соотношении 1:2. Водно-органическая фаза легко расслаивается. Бутанольную фазу промывают дважды дистиллированной водой в соотношении 1:1. Далее бутанол отгоняют в виде азеотропы с водой в вакууме при 60-70°C, причем на 100 мл экстракта расходуется 50 мл воды. Получают 4.6 г субстанции «Розматин», выход готового продукта 2,51%, что составляет выход субстанции 33,15% от начала процесса с содержанием полифенолов в пересчете на розмариновую кислоту 60,9%.
Применение катионита КУ-2 с последующей обработкой кислого маточного раствора бутиловым спиртом позволяют вывести углеводы, которые сокращают сроки хранения субстанции Розматина.
Полученная субстанция Розматина представляет собой сухой очищенный экстракт, содержащий в качестве доминирующего компонента розмариновую, а также кофейную кислоты флавоноидов флавоного типа: гликозид тилианин, цинарозид, лютеолин, апигенин. Розматин используют для приготовления лекарственной формы (таблеток, спреев, настоек, капсул).
Полученная субстанция Розматина представляет собой сухой очищенный экстракт, содержащий доминирующего компонента розмариновую, а также кофейную кислоты флавоноидов флавоного типа, гликозид тилианин, цинарозид, лютеолин, апигенин.
ОПЫТ 1. Изучение нейротропной активности и влияния на показатели сердечно-сосудистой системы Розматина
На исследование был представлен сухой очищенный экстракт Розматина из змееголовника молдавского.
Изучено влияния курсового введения Розматина в дозах 10 и 100 мг/кг на показатели деятельности сердечно-сосудистой системы (частоту сердечных сокращений, систолическое и диастолическое артериальное давление) и нервной системы (в тестах по изучению спонтанной двигательной активности и влиянию на параметры хлоралгидратного сна) мышей.
Методы исследования
Опыты проводили на белых нелинейных мышах массой 18-22 г в количестве 32 особей. Мышей содержали в условиях вивария ФГБНУ ВИЛАР на стандартном рационе. Лабораторные животные были разделены на четыре группы по 8 особей: первая - контрольные животные, вторая, третья и четвертая группы - опытные. Вторая и третья опытные группы мышей получали исследуемое вещество Розматин, четвертая группа получала препарат сравнения валерианы экстракт (таблетки, содержащие 20 мг густого экстракта валерианы) в дозе 100 мг/кг. Все вещества растворяли в 1% крахмальной взвеси и вводили внутрижелудочно в течение 4-5 дней, контрольные животные получали эквивалентный объем 1% крахмального клейстера.
На 4-й день эксперимента через 30 минут после внутрижелудочного введения веществ и 1% крахмальной взвеси проводили изучение в динамике спонтанной двигательной активности мышей по стандартной методике, используя актометр фирмы Ugo Basile (Италия) с автоматической регистрацией. В ходе опыта мышей помещали по четыре особи в каждую из двух камер прибора на пять минут для изучения спонтанной двигательной активности в динамике в течение двух часов: через 30, 60, 90 и 120 минут.
В этот же день у животных измеряли частоту сердечных сокращений, систолическое и диастолическое артериальное давление с использованием аппаратно-программных комплексов «Систола» и «Флогистон» (производитель ООО «Нейроботикс», г. Москва). Перед измерением артериального давления мышей помещали в контейнеры-ограничители на 30 минут, подогревая до 37°C на нагревательной платформе «Флогистон». Система неинвазивного измерения кровяного давления у лабораторных животных «Систола» с помощью встроенной электрической воздушной помпы автоматически нагнетает под давлением воздух в хвостовую манжету до прекращения пульсаций кровотока, а затем, медленно снижая в манжете давление, автоматически измеряет систолическое и рассчитывает диастолическое давление на основе показаний инфракрасного датчика пульса, одеваемого на хвост животного после манжеты. Система «Флогистон» предназначена для поддержания заданной температуры при подогреве мелких лабораторных животных. Подогрев мышей необходим для корректного проведения измерения давления, так как нагревание обеспечивает стабильную, с достаточным объемом, циркуляцию крови в хвосте.
На 5-й день эксперимента проводили изучение влияния Розматина на параметры сна, вызванного «корковым снотворным анализатором» хлоралгидратом. Раствор хлоралгидрата готовили непосредственно перед употреблением на физиологическом растворе хлорида натрия 0,9%. Вводили хлоралгидрат внутрибрюшинно в дозе 350 мг/кг контрольным и опытным группам мышей через 30 минут после внутрижелуд очного введения 1% крахмальной взвеси и изучаемого образца Розматина и препарата сравнения экстракта валерианы в дозе 100 мг/кг, соответственно. Время засыпания отмечали по боковому положению животных, время пробуждения фиксировали по принятию животными обычной позы при открытых глазах и груминге. Период наблюдения продолжительности сна составлял 4 часа.
Результаты изучения влияния курсового введения Розматина на спонтанную двигательную активность мышей в динамике представлены в таблице 1.
1. Как видно из таблицы 1, исследуемый образец Розматина в дозе 10 мг/кг достоверно усиливает спонтанную двигательную активность мышей - в 1,72 раза по сравнению с группой контроля - через 2 часа после начала тестирования.
Действие препарата сравнения - таблеток экстракта валерианы в дозе 100 мг/кг характеризовалось достоверным (на 60-й минуте) снижением спонтанной двигательной активности мышей на 44% по сравнению с контрольными животными.
В таблице 2 приведены результаты влияния курсового введения образца Розматина в дозах 10 и 100 мг/кг на показатели сердечно-сосудистой системы мышей: на систолическое, диастолическое и пульсовое артериальное давление (АД) и частоту сердечных сокращений (ЧСС).
Как видно из таблицы 2, после курсового введения Розматина в дозах 10 и 100 мг/кг наблюдалось достоверное повышение систолического (на 13% и 11%, соответственно) и пульсового (на 36% и 31%, соответственно) артериального давления у опытных мышей по сравнению с группой контроля, а также регистрировался достоверный положительный хронотропный эффект - учащение сердечных сокращений на 24% и 20%, соответственно, по сравнению с контрольными животными. Препарат сравнения не вызывал каких-либо значимых изменений артериального давления и частоты сокращений сердца у мышей по сравнению с контрольными животными.
В таблице 3 приведены данные о влиянии 5-ти дневного курсового введения Розматина в дозах 10 и 100 мг/кг на параметры сна, вызванного «снотворным анализатором» хлоралгидратом.
Как видно из таблицы 3, курсовое 5-ти дневное введение исследуемого образца Розматина приводило к увеличению продолжительности сна, вызванного «корковым снотворным анализатором» хлоралгидратом, то есть потенцировало корковое торможение и снотворный эффект хлоралгидрата, причем в дозе 100 мг/кг усиление снотворного действия носило достоверный характер (длительность сна увеличилась на 36% по сравнению с контрольными животными). Курсовое введение препарата сравнения -экстракта валерианы в дозе 100 мг/кг в нашем эксперименте сопровождалось менее значительным (на 13% по сравнению с группой контроля) увеличением продолжительности хлоралгидратного сна.
Исследуемый образец Розматина в дозе 100 мг/кг оказывает достоверное фазовое действие на параметры сна, вызванного «корковым снотворным анализатором» хлоралгидратом: после фазы активирующего влияния на центральную нервную систему, характеризующегося увеличением времени засыпания (латентного периода сна) в 1,4 раза по сравнению с группой контроля, затем наблюдалось потенцирование коркового торможения, вызываемого хлоралгидратом, и увеличение общей продолжительности сна в 1,36 раза по сравнению с контрольными животными.
Таким образом, в данном эксперименте был выявлен фазовый характер нейропсихотропной активности исследуемого образца Розматин в дозе 100 мг/кг - после фазы активирующего влияния на центральную нервную систему наблюдалось потенцирование коркового торможения, вызванного хлоралгидратом.
Таким образом, исследуемый образец Розматина обладает активирующим, тонизирующим действием на сердечно-сосудистую и нервную системы.
Список литературы
1 Никитина А.С. «Фармакогностическое изучение змееголовника молдавского (Dracocephalum moldavica L.) и иссопа лекарственного (Hissopus officinalis L.) с целью обоснования применения в медицине» // Автореферат диссертации, к.ф.н., 2005.
2 (Попова О.И., Никитина А.С. «Змееголовник Молдавский и иссоп лекарственный, Взгляд на растения // змееголовника молдавского (Dracocephalum moldavica L.)», Монография. Волгоград. ВолгГМУ, 2014, 117 стр.).
3 K Dastmalchi, H.J.D Dorman,  R Hiltunena. Chemical composition and in vitro antioxidant evaluation of a water-soluble Moldavian balm (Dracocephalum moldavica L.) extract/LWT - Food Science and TechnologyVolume 40, Issue 2, March 2007, Pages 239-248
4 K Dastmalchi, H.J.D Dorman, I Laakso, R Hiltunen. Chemical composition and antioxidative activity of Moldavian balm (Dracocephalum moldavica L.) extracts/LWT - Food Science and Technology, Volume 40, Issue 9, November 2007, Pages 1655-1663
5 A. Sultan, Bahang, H.A. Aisa, K.A. Eshbakova. Flavonoids from Dracocephalum moldavica / Chemistry of Natural Compounds, May 2008, Volume 44, Issue 3, pp 366-367
6 Gu HF, Chen RY, Sun YH, Liu F. Studies on chemical constituents from herb of Dracocephalum moldavica / Zhongguo zhongyao zazhi, 2014
7  R. Estrada-Reyes,  G. Heinze. Neuropharmacological study of Dracocephalum moldavica L. (Lamiaceae) in mice: Sedative effect and chemical analysis of an aqueous extract / Journal of Ethnopharmacology, Volume 141, Issue 3, 14 June 2012, Pages 908-917