СПОСОБ ИММУНОХИМИЧЕСКОЙ ОЦЕНКИ ПРОЛИФЕРАЦИИ ЛИМФОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА С ПОМОЩЬЮ НОВОГО МАРКЕРА - ЯДРЫШКОВОГО БЕЛКА А3
METHOD OF IMMUNOCHEMICAL EVALUATION OF HUMAN LYMPHOCYTE PROLIFERATION BY MEANS OF NEW MARKER - NUCLEOLAR PROTEIN A3

Изобретение относится к биологии, медицине и биотехнологии и касается способа оценки пролиферации лимфоцитов человека с помощью нового маркера - ядрышкового белка A3, выявляемого с помощью полученного авторами заявки методом гибридомной биотехнологии отечественных моноклональных антител A3 (Булычева Т.И. и др. Патент на изобретение №2296159 от 27.03.2007). Иммуноцитохимическая визуализация A3 антигена в клетках позволяет по количеству A3 позитивных фокусов в ядрышках определить состояние пролиферативной активности каждой клетки: от состояния покоя в фазе G0 (1 фокус) до максимума пролиферативной активности в S периоде клеточного цикла (до 8-10 фокусов в виде ожерелоподобных структур).
Пролиферация (деление, размножение) является основной функцией клеток, с помощью которой не только осуществляется регенерация и восстановление отмирающих тканей, но и по степени пролиферативной активности которой можно судить о нормальном или злокачественном росте клеток. Количественный показатель пролиферативной активности клеток является важнейшей характеристикой клеточной популяции и используется для ранней диагностики опухолевого процесса и прогнозирования скорости опухолевого роста при различных заболеваниях (Булычева и др. Патент на изобретение № 2310201 от 10.11.2007; Булычева и др. Terra Med, Лаб. диагностика, 2006, № 2, стр. 16-21; Bassoe CF et al. Leuk. Res., 1998; 22:329-339; Uechi et al. Genomics, 2001; 72:223- 230; Alon et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999; 96:6745-6750; Leek et al. J. Pathol, 1991, 165: 43-51; Leonard et al. Cancer Invest., 2005; 23 (7): 599-608).
Основной органеллой, отражающей функциональное состояние клетки, является ядрышко. В клетках с повышенной пролиферативной активностью изменяются морфология и размеры ядрышка, увеличивается их количество (Derenzini et al. Lab. Invest., 1990; 63:137-140; Ruggero et al. Nat. Rev., Cancer. 2003; 3(3): 179-92).
Однако наиболее адекватной оценкой функционального состояния ядрышка является иммуноцитохимическая визуализация определенных ядрышковых белков, изменяющихся или появляющихся в процессе пролиферативной активности клеток. К таким белкам-маркерам клеточной пролиферации относятся наиболее известные белки Ki-67, PCNA, В23, которые получили широкое применение в клинико-лабораторной практике. Данные белки были идентифицированы и получили название от созданных с помощью гибридомных биотехнологий соответствующих моноклональных антител (МКА).
Антитела к маркерам клеточной пролиферации на сегодняшний день не только являются мощным молекулярным инструментом для изучения регуляции клеточного цикла, но также остро необходимы в клинико-лабораторной практике для выявления пула пролиферирующих клеток, определяющих степень злокачественности процесса. Особое значение придается изучению и внедрению антител, обладающих ярко выраженной видоспецифичностью и высокой иммунореактивностью при различных способах фиксации, чему удовлетворяют полученные авторами патента МКА A3 (Булычева и др. Патент на изобретение №2296159 от 27.03.2007).
В настоящей заявке представлен способ оценки пролиферативного состояния лимфоцитов человека, осуществляемый в иммуноцитохимических реакциях по оценке экспрессии нового ядрышкового антигена A3, выявляемого с помощью полученных нами МКА A3, который локализуется в виде 1 фокуса в ядрышке лимфоцитов здоровых лиц и изменяется в соответствии с фазой пролиферативного процесса.
Классической моделью для изучения изменений в содержании и локализации основных белков ядра и ядрышка при активации клеток к пролиферации и синтезу рибосом является стимуляция интактных лимфоцитов периферической крови к пролиферации с помощью фитогемагглютинина (ФГА). При оценке пролиферативного состояния ФГА-стимулированных лимфоцитов по включению 3Н-тимидина показано, что клетки вступают в S фазу первого клеточного цикла через 24 часа после их активации. Максимум включения изотопа наблюдается через 48-72 ч после активации; при этом процент меченых клеток возрастет в несколько раз по сравнению с нестимулированными лимфоцитами (Булычева и др. Цитология, 2000, 3, 42 (10), 944-954; Дергунова и др., Иммунология, 2003, 24, №4, 205-208; Galand et al. Leukemia, 1995, 9 (6), 1075-1084; Lopez et al. Cytometry, 1991, 12 (1): 42-49; Dergunova et al., Immunology letters, 2002, 83, 67-72).
В качестве аналогов способов оценки пролиферации в иммуноцитохимических реакциях по экспрессии ядрышковых белков, изменяющихся в процессе пролиферации клеток и выявляемых с помощью соответствующих МКА, могут рассматриваться способы, где маркерами пролиферации являются следующие белки ядра и ядрышек:
1. белок Ki-67 (Gerdes et al. Int. J. Cancer, 1983, 15, 31 (1): 13-20), появляющийся в ядре и ядрышках клеток в позднем G1, а в основном, в S периоде клеточного цикла, присутствуя в G2 и М-периодах (производится только коммерческими фирмами Пако, Дания; Sigma, Santa-Cruz, США и др.) О пролиферативном показателе судят по количеству клеток, экпрессирующих этот антиген как в ядрышках, так и в ядре клеток. В настоящее время МКА к Ki-67 наиболее широко применяются в клинических исследованиях для оценки количества пролиферирующих клеток и выявления опухолевого процесса (Самойлова и др. Клин. лаб. диагн., 2003, 11, 35-39; Endl et al. Exp. Cell Res. 2000; 257(2): 231-237; Endl et al. Cell Physiol. 2000; 182(3): 371-380; MacCallum et al. Exp. Cell Res. 1999; 252 (1): 186-198; Hadar et al. Pathol. Oncol. Res., 2005; 11(1): 45-49; Beresford et al. Breast Cancer Res. 2006; 8(6):216; Urruticoechea et al. J. Clin. Oncol. 2005, 1; 23(28): 7212-20; Stuart-Harris et al. Breast., 2008, 17(4): 323-34).
1
2
2
2. белок PCNA (proliferating cell nuclear antigen) является кофактором ДНК-полимераз дельта и эпсилон и служит необходимым компонентом для репликации и репарации ДНК (Bravo et al. J. Cell Biol.; 1987, 105: 1549-1555; Tsurimoto. Front. Biosci., 1999; 4: 849-858). При фиксации клеток в органических растворителях PCNA выявляется в местах репликации ДНК (Вгауо et al. J. Cell Biol., 1987; 105: 1549-1555), в то время как при альдегидной фиксации выявляется диффузное окрашивание ядра в течение всего клеточного цикла. Опыты с ФГА-стимулированными лимфоцитами показали, что PCNA начинает выявляться в поздней G-фазе клеточного цикла и продолжает экспрессироваться в S и G-М-фазах (Bolton et al. Cytometry, 1994; 17(1): 66-74; Liu et al. J. Cell Biochem., 1995; 57(4): 641-646), причем в G-М-фазах уровень его содержания снижается. МКА к PCNA достаточно широко применяются как в фундаментальных, так и в клинических исследованиях (Kurki et al. Exp. Cell Res. 1986; 2166: 209-219; Girod et al. Pigment. Cell Res. 1994; 7(5): 354-357; Sarraf et al. Digestion. 1991; 50(2): 85-91; Woods et al. Histopathology. 1991; 19(1): 21-27).
2
3. Белок В23/нуклеофозмин является структурным элементом ядрышка, поэтому выявляется в иммуноцитохимических реакциях (в частности, в реакции непрямой иммунофлюоресценции) на всех этапах клеточного цикла (от G0 до S-G-M), достаточно интенсивно экспрессируется в ядрышках интактных клеток, в связи с чем цитохимически трудно оценить различия в его экспрессии при различных стадиях пролиферации (Булычева и др. Цитология, 2000, №3, 42 (10), 944-954; Chan et al. J Biol. Chem.,1986, 5; 261(4): 1868-72; Grisendi et al. Nature Rev., 2006, 493-505).
В то же время нами с помощью иммуноблоттинга (Булычева и др. Патент на изобретение №2310201 от 10.11.2007.) было показано, что количественное нарастание белка В23 в ядрышках клеток происходит уже на ранних стадиях пролиферативного процесса (ранний G1), достигая максимума через 48-72 от начала стимуляции лимфоцитов к пролиферации с помощью ФГА (Булычева и др. Terra Med, Лаб. диагностика, 2006, 2, 16-21). Однако при иммуноцитохическом исследовании эти изменения выявить невозможно. Появившиеся после 2004г. коммерческие антитела к B23 (Sigma, Santa-Cruz, США) дают аналогичную иммуноцитохимическую картину с еще более выраженной экспрессией антигена в покоящихся клетках, затрудняющую ее оценку в процессе пролиферации.
Итак, полного аналога заявляемого нами способа оценки пролиферации по экспрессии ядрышкового белка A3 не обнаружено ни по результатам иммуноцитохимического окрашивания, ни по молекулярной массе, т.к. белок A3 не связывает антитела на иммуноблотах, а МКА A3 не имеют аналогов.
Для доказательства причастности A3 антигена к изменениям, происходящим в ядрышке клеток в процессе клеточного цикла (пролиферации), были проведены эксперименты по иммуноцитохимическому исследованию лимфоцитов, выделенных из крови здоровых лиц, при искусственной стимуляции их к пролиферации с помощью ФГА. Предлагаемый способ включает 3 этапа.
I этап. Выделение лимфоцитов из периферической крови здоровых лиц
3
Лимфоциты выделяли из венозной крови доноров с помощью градиентного центрифугирования на фиколле (d=l,077 г/см, Pharmacia, Швеция), дважды промывали средой RPMI 1640 и помещали в среду RPMI 1640, содержащую 10% пуловой сыворотки человека АВ (IY) группы, 0.01 М буфера HEPES, глутамин и гентамицин. В полученной взвеси подсчитывали общее количество клеток в камере Горяева и делили на две равные порции: 1-ая порция исследовалась в качестве контроля (без добавления стимулятора пролиферации), 2-ая порция была опытной (с добавлением стимулятора пролиферации). Вся работа проводилась в стерильных условиях.
II этап. Стимуляция лимфоцитов к пролиферации
2
9
Для стимуляции лимфоцитов к пролиферации в опытные порции добавляли 50 мкг/мл ФГА (Difco, США) и разливали для культивирования при 37°С в СО инкубаторе в 3 пластиковых матраса объемом 5.0 мл из расчета 1×10 лимфоцитов в 1 мл среды для исследования на разных сроках инкубации: через 24, 48 и 72 часа. В качестве контроля исследовали лимфоциты, которые культивировали в тех же условиях без ФГА, в том числе и выделенные до начала инкубации (G0 период).
III этап. Иммуноцитохимическое исследование лимфоцитов
Отмытую от культуральной среды суспензию лимфоцитов каждого срока культивирования раскапывали на стекла с лунками, предварительно обработанные 0,1% поли-L-лизином (Serva, Германия) в течение 30 мин, инкубируя 30 мин во влажной камере. За счет этого достигалось прочное прикрепление клеток к поверхности стекла. Затем клетки фиксировали абсолютным ацетоном в течение 10 мин при -20°С.
Стекла с зафиксированными клетками промывали PBS и инкубировали с МКА A3 в разведении 1:1000 (или с PBS для контроля) во влажной камере в течение 30 мин при комнатной температуре. Затем препараты промывали PBS в трех сменах PBS по 10 мин и инкубировали со вторичными антителами (козьей сывороткой против иммуноглобулинов мыши, меченной ФИТЦ (Сорбент, Россия) в разведении 1:80 в течение 30 мин при тех же условиях. В качестве контроля для исключения прямого иммуномечения клеток со вторыми антителами вместо МКА A3 использовали PBS. После инкубации с вторичными антителами клетки отмывали в трех сменах PBS по 10 мин, после чего заключали в мовиол. Полученные препараты изучали с помощью люминесцентного микроскопа "Axiophot" (Carl Zeiss, Германия), используя объективы ×100/1,3 и окуляры ×10. Захват изображения производился с помощью цифровой камеры Delta Pix.
Результаты иммуноцитохимического исследования локализации и характера распределения A3 антигена в ядрышках лимфоидных клеток на разных сроках инкубации с ФГА: от начального исследования интактных лимфоцитов (до внесения ФГА) до инкубации их с ФГА в течение 24, 48 и 72 часов (фото а-г) в сравнении с контрольными (без ФГА) лимфоцитами (фото а'-г') на тех же сроках инкубации - представлены на иллюстрации.
Из фото а, а' видно, что в нативных (интактных) лимфоцитах A3 антиген выявляется в виде 1 фокуса в ядрышке клеток. При культивировании лимфоцитов с ФГА в течение 24, 48 и 72 часов (фото б-г) происходит постепенное нарастание количества фокусов от 2-4 до 8-10 на пике пролиферации (через 48-72 часа). При этом фокусы локализации A3 антигена, не сливаясь, образовывали ожерелоподобные структуры (в виде бус), находящиеся в пределах ядрышка.
В то же время в культуре лимфоцитов без добавления ФГА, т.е в постепенно отмирающей, а не пролиферирующей культуре, подобного увеличения фокусов иммуноокрашивания не наблюдается (фото б'-г'). Исследования лимфоцитов, выделенных из периферической крови 5 различных здоровых лиц, дало однотипные данные.
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что ядрышковый антиген A3 принимает непосредственное участие в пролиферативном процессе, что выражается в увеличении количества фокусов его связывания с МКА A3 при активации лимфоцитов к пролиферации при ФГА-стимуляции, т.е при переходе клеток из фазы покоя G0 в последующие фазы клеточного цикла. В связи с этим антиген A3 может быть назван новым маркером пролиферации, оценка экспрессии которого позволяет определить состояние пролиферативной активности клеток.
Пример 1.
В лабораторию на исследование доставлена периферическая кровь больного К., 65 лет, с начальным диагнозом: хронический лимфолейкоз, начальная стадия. В крови: лейкоцитоз 15000, лимфоцитов 85%. При исследовании пролиферативной активности лимфоцитов в реакции непрямой иммунофлуоресценции с МКА Ki-67 выявлено 3% антиген-позитивных клеток; с МКА A3 - в 89% клеток выявлен 1 фокус свечения в ядрышке, в 7% - 2-3 фокуса и в 4% лимфоцитов - 4-6 фокусов свечения. Полученные данные свидетельствовали о том, что основная часть лимфоцитов находится в фазе G0 клеточного цикла, 4% - в S-фазе клеточного цикла, а 7% в начальной стадии пролиферативной активности, не детектируемой еще МКА Ki-67. Рекомендовано повторное исследование через 3-6 мес для мониторирования опухолевого процесса.
Пример 2.
Больной Д., 28 лет, с начальным диагнозом: острый лимфобластный лейкоз в периоде ремиссии. Однако в крови выявлено 70% бластных клеток, 18% - лимфоцитов, остальные - сегментоядерные лейкоциты. При исследовании клеток с МКА Ki-67 выявлено 72% Ki-67 - позитивных клеток, с МКА A3 -75% клеток имело в ядрышках многочисленные фокусы свечения (в виде бус), что свидетельствовало о максимальной пролиферативной активности, совпадающей с экспрессией Ki-67. Однако 12% клеток, похожих на лимфоциты при фазово-контрастной микроскопии, имели по 2-4 фокуса свечения в ядрышках, что могло свидетельствовать о наличии «маскированных» бластных клеток, не различаемых морфологически, но уже вступивших в фазу пролиферации. У больного выявлен рецидив заболевания. Изменен диагноз. Назначено адекватное лечение.
Приведенные примеры демонстрируют, что исследование A3 антигена параллельно с Ki-67 наряду с одинаковой детекцией S-фазы клеточного цикла позволяет дополнительно выявлять клетки на начальной стадии пролиферации, что важно как для диагностики, так и для назначения адекватного лечения.
Таким образом, в заявке представлен способ оценки пролиферативной активности клеток в иммуноцитохимической реакции (в методе непрямой иммунофлюоресценции) с помощью нового маркера - ядрышкового белка A3, определяемого с помощью отечественных МКА A3, который может иметь важное значение как для клинических, так и для лабораторных исследований, детектируя по количеству антиген-позитивных гранул стадию пролиферации каждой клетки в отдельности. Это особенно важно в онкологии и в онкогематологии при наличии гетерогенной популяции клеток в крови или в исследуемой ткани, когда необходимо оценить селективно степень пролиферации в опухолевых и здоровых клетках, а также провести дифференциальную диагностику между злокачественным опухолевым заболеванием и реактивным доброкачественным процессом.
Особенностью данного способа, основанного на исследовании A3 антигена, является то, что он позволяет определять степень пролиферативной активности клеток не по субъективной оценке интенсивности экспрессии антигена и общему количеству антиген-позитивных клеток, а по количеству фокусов связывания A3 антигена с МКА A3 в ядрышках каждой клетки, отражающему степень пролиферации, что невозможно оценить с другими МКА. Экономическая обоснованность использования выявленного феномена обусловлена наличием в неограниченных количествах отечественных МКА A3, секретируемых штаммом гибридомы A3, полученным авторами заявки (патент №2296159 от 27.03.2007).
Наличие отечественных моноклональных антител взамен дорогостоящих импортных реактивов позволит не только сэкономить средства, но и значительно расширить исследования по определению количества пролиферирующих клеток, столь необходимые для клиницистов при установлении диагноза, при определении степени злокачественности и прогноза течения заболевания, а также для назначения адекватной терапии.
Использование в предлагаемом способе нового ядрышкового белка A3, изменяющегося в процессе пролиферации и позволяющего визуализировать в иммуноцитохимических реакциях различные фазы клеточного цикла по количеству фокусов связывания с МКА A3, расширяет спектр имеющихся до сих пор маркеров пролиферации и дополняет фундаментальные данные о ядрышковых белках.