ВАРИАНТЫ ИЗОПРЕНСИНТАЗЫ, ПРИМЕНЯЕМЫЕ ДЛЯ УЛУЧШЕНИЯ ПРОДУЦИРОВАНИЯ ИЗОПРЕНА МИКРООРГАНИЗМАМИ

1. Выделенный вариант изопренсинтазы тополя, где указанный вариант содержит усечение в N-концевой части изопренсинтазы.
2. Выделенный вариант изопренсинтазы тополя по п. 1, где указанный вариант изопренсинтазы обладает повышенной удельной активностью по сравнению с полноразмерной изопренсинтазой.
3. Выделенный вариант изопренсинтазы тополя по п. 1, где указанной изопренсинтазой является изопренсинтаза P. alba SEQ ID NO:120.
4. Выделенный вариант изопренсинтазы тополя по п. 3, где указанный вариант выбран из группы, состоящей из: варианта MEA (SEQ ID NO:122), варианта MSV (SEQ ID NO:124), варианта MVS (SEQ ID NO:126), варианта MTE (SEQ ID NO:128) и варианта MNV (SEQ ID NO:130).
5. Выделенный вариант изопренсинтазы тополя по п. 4, где указанным вариантом является вариант MEA (SEQ ID NO:122).
6. Выделенный вариант изопренсинтазы тополя по п. 3, где указанный вариант выбран из группы, состоящей из: варианта TRC (-3) (SEQ ID NO:136), варианта TRC (-4) (SEQ ID NO:138), варианта TRC (-5) (SEQ ID NO:140), варианта TRC (-6) (SEQ ID NO:142) и варианта TRC (-7) (SEQ ID NO:144).
7. Выделенный вариант изопренсинтазы тополя по п. 1, где указанным вариантом является вариант MET изопренсинтазы P. tremuloides (SEQ ID NO:146).
8. Выделенный вариант изопренсинтазы тополя по п. 1, где указанным вариантом является вариант MET изопренсинтазы P. trichocharpa (SEQ ID NO:148).
9. Выделенный вариант изопренсинтазы тополя, где указанный вариант содержит замену одного или нескольких аминокислотных остатков изопренсинтазы дикого типа, и где указанный вариант изопренсинтазы обладает повышенной изопренсинтазной активностью по сравнению с активностью изопренсинтазы дикого типа.
10. Выделенный вариант изопренсинтазы тополя по п. 9, где повышенная изопренсинтазная активность указывает на то, что клетка-хозяин, содержащая вариант изопренсинтазы, растет быстрее в присутствии диметилаллилпирофосфата (DMAPP), чем клетка-хозяин, содержащая родительскую изопренсинтазу.
11. Выделенный вариант изопренсинтазы тополя по п. 9, где указанной изопренсинтазой является изопренсинтаза P. alba SEQ ID NO:120.
12. Выделенный вариант изопренсинтазы тополя по п. 11, где указанный вариант содержит одну или несколько аминокислотных замен, выбранных из группы, состоящей из V10M, F12S, T15A, E18G, V58I, V58F, L70Q, L70V, L70T, T71P, V79L, E89D, G94A, S119F, F120L, G127R, E175V, T212I, S257A, R262G, A266G, F280L, N297K, F305L, L319M, E323K, A328T, D342E, A359T, K366N, E368D, L374M, S396T, V418S, K438N, H440R, T442I, T442A, I449V, A469S, K500R, K505Q, G507S, S509N, F511Y и N532K.
13. Выделенный вариант изопренсинтазы тополя по п. 11, где по меньшей мере одной аминокислотной заменой является замена L70R.
14. Выделенный вариант изопренсинтазы тополя по п. 11, где указанный вариант содержит одну или несколько аминокислотных замен, выбранных из группы, состоящей из G127R/F511Y,
L70Q/G94A/R262G/F305L, F12S/T15A/E18G/N297K, S396T/T442I, V10M/E323K, F120L/A266G, K438N/K500R, V79L/S509N, E175V/S257A/E368D/A469S, T71P/L374M, F280L/H440R, E89D/H440R, V58F/A328T/N532K, S119F/D342E/I449V и K366N/G507S.
15. Кристаллическая форма полипептида, включающая аминокислотные остатки SEQ ID NO:120 (фиг.19).
16. Способ продуцирования изопрена, включающий: (a) получение клеток-хозяев, содержащих экспрессионный вектор, включающий полинуклеотидную последовательность, кодирующую вариант изопренсинтазы, и (b) культивирование клеток-хозяев в условиях, подходящих для продуцирования изопрена.
17. Способ по п. 16, дополнительно включающий (с) выделение изопрена.
18. Способ по п. 17, дополнительно включающий (d) полимеризацию изопрена.
19. Способ детектирования изопренсинтазной активности, включающий: (a) культивирование клеток-хозяев, содержащих экспрессионный вектор, в условиях, подходящих для продуцирования варианта изопренсинтазы; (b) лизис клеток-хозяев с использованием буфера для лизиса, содержащего лизоцим, с получением клеточного лизата; и (c) детектирование изопренсинтазной активности в клеточном лизате путем измерения уровня продуцирования изопрена из диметилаллилдифосфата (DMAPP).
20. Способ по п. 19, где указанная клетка-хозяин выбрана из группы, состоящей из грамположительных бактериальных клеток, грамотрицательных бактериальных клеток, клеток нитчатых грибов и дрожжевых клеток.
21. Способ по п. 19, где указанная клетка-хозяин выбрана из группы, состоящей из Escherichia sp. (E. coli), Panteoa sp. (P. citrea), Bacillus sp. (B. subtilis), Yarrowia sp. (Y. lipolytica) и Trichoderma (T. reesei).
22. Способ по п. 19, где указанную клетку-хозяина культивируют в среде, включающей источник углерода, выбранный из группы, состоящей из глюкозы, глицерола, глицерина, дигидроксиацетона, дрожжевого экстракта, биомассы, мелассы, сахарозы и масла.
23. Способ детектирования изопрена во множестве образцов с применением крупномасштабного скрининга, где указанный способ включает:
(a) получение: i) множества образцов, каждый из которых содержит изопренсинтазу; ii) стеклянного планшета, содержащего множество лунок; и iii) герметика для заклеивания стеклянных планшетов;
(b) внесение множества образцов во множество лунок указанного стеклянного планшета;
(c) заклеивание стеклянного планшета герметиком, с получением герметично закрытого стеклянного планшета, имеющего зону «хэдспейс» над образцом в каждой из множества лунок;
(d) инкубирование указанного стеклянного планшета в условиях, при которых изопренсинтаза является активной, и
(e) детектирование изопрена в зоне «хэдспейс» планшета.
24. Способ по п. 23, где изопрен детектируют с помощью газовой хроматографии-масс-спектрометрии (ГХ-МС).
25. Способ по п. 23, где множество образцов содержат клетки-
хозяева, включающие экспрессионный вектор, содержащий полинуклеотидную последовательность, кодирующую вариант изопренсинтазы, функционально присоединенную к промотору.
26. Способ по п. 23, где множество образцов включает лизат клеток-хозяев, лизоцим и диметилаллилдифосфат (DMAPP).
27. Способ по п. 23, где указанным стеклянным планшетом является стеклянный блок с глубокими лунками.
28. Способ по п. 23, где планшет с множеством лунок имеет по меньшей мере 24 лунки.
29. Способ по п. 23, где каждая из множества лунок имеет объем 2 мл или менее.
30. Способ продуцирования изопренсинтазы, включающий:
(a) получение: (i) клеток-хозяев и (ii) нуклеиновой кислоты, кодирующей вариант изопренсинтазы, функционально присоединенной к промотору, где указанный вариант изопренсинтазы содержит замену в положении, соответствующем положению одного или нескольких (одного, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти или десяти) остатков изопренсинтазы P. alba SEQ ID NO:120;
(b) контактирование клеток-хозяев с нуклеиновой кислотой с продуцированием трансформированной клетки-хозяина; и
(c) культивирование трансформированных клеток-хозяев в условиях, подходящих для продуцирования изопренсинтазы.