НОВЫЕ ПРОИЗВОДНЫЕ 1,2,4-ТРИАЗОЛО-[3,4-B]-1,3,4-ТИАДИАЗОЛА
NEW 1,2,4-TRIAZOLO-[3,4-B]-1,3,4-THIADIAZOLE DERIVATIVES

Техническая область изобретения
Настоящее изобретение относится к новым производным 1,2,4-триазоло-[3,4-b]-1,3,4-тиадиазола, способам их получения и применению в лечении рака.
Уровень техники
Рак все еще остается фатальной проблемой здравоохранения, даже несмотря на отмеченный прогресс в области терапевтических средств. В наше время наблюдается постоянное увеличение летальных исходов от различных типов рака, и считается, что в 2030 году число летальных исходов достигнет 12 миллионов. Обычно противораковую терапию рассматривают как проблематичную из-за сопровождающей ее высокой токсичности. Главными побочными эффектами лекарственных средств против рака являются тошнота, рвота, диарея, алопеция и инфекции (которые обычно вызываются лейкопенией). Следовательно, разработка новых нетоксичных или менее токсичных активных лекарственных средств против рака имеет наибольшее значение и необходимость.
Гетероциклические соединения, включающие тиазольные или тиадиазольные химические структуры, показали очень важную биологическую активность, такую как антибактериальная [a) Holla, B.S., Shivananda, M.K., Akberali, P.M., Baliga, S., Safeer, S., Farmaco, 1996, 51, 785. b) Zhang, Z.Y., Sum, X.W., Chu, C.H., Zhao, L., J. Chim. Chem. Soc., 1997, 44, 535. c) Demirbas, N., Demirbas, A., Karaoglu, S.A., Celik, E., Arkivoc., 2005, 1, 75.], противораковая [a) Ibrahim, D.A., Eur. J. Med. Chem., 2009, 44, 2776 b) Al-Masoudi, N.A., Al-Soud, Y.A., Nucleos:Nucleot. Nucleic Acids, 2008, 27, 1034. c) Chowrasia, D., Karthikeyan, C., Choure, L., Sahabjada, Gupta, M., Arshad, Md., Trivedi, P., Arab. J. of Chem., 2013, doi:10.1016/j.arabjc,2013,08,026. d) Ilango, K., Valentina, P., Eur. J. Chem., 2010, 1, 50.], противовирусная [a) Kritsanida, M., Mouroutsou, A., Marakos, P., Pouli, N., Papakonstantinou-Garoufalias, S., Pannecouque, C., Witvrouw, M., Declercq, E., Farmaco, 2002, 57, 253. b) Invidiata, F.P., Simoni, D., Skintu, F., Pinna, N., Farmaco., 1996, 51, 659. c) Srivastava, V., Sen, S., Shekar, R., Indian J. Chem., 1994, 33B, 344.], противовоспалительная [a) Chawla, G., Kumar, U., Bawa, S., Kumar, J., J. Enzyme Inhib. Med. Chem., 2012, 27, 658. b) Amir, M., Harish, K., Javed, S.A., Eur. J. Med. Chem., 2008, 43, 2056. c) Prasad, A.R., Ramlingam, T., Bhaskar Rao A., Diwan, P.B., Sattur., Indian J. Chem., 1986, 25B, 566.], аналгезирующая [a) Srivastava, V., Sen, S., Shekar, R., Indian J. Chem., 1994, 33B, 344. b) Chawla, G., Kumar, U., Bawa, S., Kumar, J., J. Enzyme Inhib. Med. Chem., 2012, 27, 658.], противогрибковая [a) Karabasanagouda, T., Adhikari, A.V., Suchethasettey, N., Eur. J. Med. Chem., 2007, 42, 521. b) Tiwari, N., Chaturvedi, B., Nizamuddin., Agric. Biol. Chem., 1988, 52, 1229.] и противогельминтозная [α) El-Khawass, S.M., Khalil, M.A., Hazzaa, A.A., Bassiouny, H.A., Loutfy, N.F., Farmaco. 1989, 44, 703. 2. Imitiaz, M., Kumar, V., Indian J. Chem., 1992, 31B, 673.]. В более старых исследованиях некоторые производные амино- и дииминотиадиазола показали противораковую активность [a) Hill, D.L. Cancer Chemother. Pharmacol. 1980, 4, 215. b) Nelson, J.A., Rose, L.M., Benette, L. Cancer Res. 1977, 37, 182. c) Tsukamoto, K., Suno, M., Igarashi, K., Kozai, Y., Sugino, Y., Cancer Res. 1975, 35, 2631].
Сущность изобретения
Настоящее изобретение предоставляет новые производные 1,2,4-триазоло-[3,4-b]-1,3,4-тиадиазола и их фармацевтически приемлемые соли, способы их получения и биологическую активность. Соединения согласно настоящему изобретению могут быть использованы в противораковых терапиях вследствие их противораковой активности, сопровождающейся низкой острой токсичностью.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение предоставляет 1,2,4-триазоло-[3,4-b]-1,3,4-тиадиазолы формулы (I) или их фармацевтически приемлемые соли
в которой,
1
2
1
5
R и R являются одинаковыми или разными и выбраны из группы, состоящей из C-C алкила, фенила, метилфенила,
3
2
8
2
2
8
8
2
2
2
8
2
8
2
8
8
2
8
2
2
8
8
2
8
2
2
8
8
2
8
2
2
8
R выбран из группы, состоящей из CHR, CHCHR, CH=CHR,CHCHCHR, CHCH=CHR, CH=CHCHR, CH=CH-OR, CH-OR, CHCH-OR, CH=CH-NHR, CH-NHR, CHCH-NHR, CH=CH-SR, CH-SR, CHCH-SR,
, , ,
2
2
2
2
3
2
2
замещенного или незамещенного фенила, бензила, пиридила, пиримидинила, триазинила, триазинанила, оксазинила, оксазинанила, циклогексанила, циклогексенила, циклогексадиенила, пиранила, оксатианила, пиперидинила, циклопентанила, циклопентенила, циклопентадиенила, пирролидинила, пирролила, фуранила, оксазолидинила, пиразолидинила, тиофенила, оксатиинил, оксатиолила, оксатиоланила, причем заместитель или заместители выбраны из группы, состоящей из метила, F, Cl, Br, I, NO, CN, NH, OCHX, CHX, CX, CHCHX, OH, причем X выбран из группы, состоящей из H, F, Cl, Br, I,
4
5
6
7
2
2
3
2
3
3
2
R, R, R, R являются одинаковыми или разными и выбраны из группы, состоящей из H, F, Cl, Br, I, NO, CN, NH, OCH, OH, NHCHCH, N(CH),
8
R выбран из группы, состоящей из
, , ,
2
2
2
2
3
2
2
замещенного или незамещенного фенила, бензила, пиридила, пиримидинила, триазинила, триазинанила, оксазинила, оксазинанила, циклогексанила, циклогексенила, циклогексадиенила, пиранила, оксатианила, пиперидинила, циклопентанила, циклопентенила, циклопентадиенила, пирролидинила, пирролила, фуранила, оксазолидинила, пиразолидинила, тиофенила, оксатиинила, оксатиолила, оксатиоланила, причем заместитель или заместители выбраны из группы, состоящей из метила F, Cl, Br, I, NO, CN, NH, OCHX, CHX, CX, CHCHX, OH, причем X выбран из группы, состоящей из H, F, Cl, Br, I,
9
10
11
12
R выбран из группы, состоящей из NHR, NRR,
10
1
5
R выбран из группы, состоящей из C-C алкила, фенила,
11
12
1
5
R и R являются одинаковыми или разными, и они обозначают C-C алкил.
1
2
1
3
1
2
Предпочтительно, R и R являются одинаковыми или разными и выбраны из группы, состоящей из C-C алкила, фенила, метилфенила. Более предпочтительно R и R являются метилом.
3
2
8
2
2
8
2
2
2
8
2
8
Предпочтительно, R выбран из группы, состоящей из CHR, CHCHR, CHCHCHR, CHCH=CHR,
, , ,
2
2
2
2
3
2
2
3
8
2
2
2
8
замещенного или незамещенного фенила, бензила, пиридила, причем заместитель или заместители выбраны из группы, состоящей из метила, F, Cl, Br, I, NO, CN, NH, OCHX, CHX, CX, CHCHX, OH, причем X выбран из группы, состоящей из H, F, Cl, Br, I. Более предпочтительно, R выбран из группы, состоящей из CH=CHR, CHCHCHR,
, , ,
2
замещенного или незамещенного фенила, пиридила, причем заместитель или заместители выбраны из группы, состоящей из F, Cl, NO.
4
5
6
7
2
3
4
7
5
6
3
Предпочтительно, R, R, R, R являются одинаковыми или разными, и они выбраны из группы, состоящей из H, Cl, Br, I, NH, OCH. Более предпочтительно, R и R обозначают H, R и R обозначает OCH.
8
Предпочтительно, R выбран из группы, состоящей из
, , ,
2
2
2
2
3
2
2
8
замещенного или незамещенного фенила, бензила, пиридила, причем заместитель или заместители выбраны из группы, состоящей из метила, F, Cl, Br, I, NO, CN, NH, OCHX, CHX, CX, CHCHX, OH, причем X выбран из группы, состоящей из H, F, Cl, Br, I. Более предпочтительно, R выбран из группы, состоящей из
, , ,
2
замещенного или незамещенного фенила, пиридила, причем заместитель или заместители выбраны из группы, состоящей из F, Cl, NO.
10
1
3
10
Предпочтительно, R выбран из группы, состоящей из C-C алкила, фенила. Более предпочтительно, R является метилом.
11
12
1
3
11
12
Предпочтительно, R и R являются одинаковыми или разными, и они обозначают C-C алкил. Более предпочтительно R и R являются метилом.
Соединения формулы (I) содержат по меньшей мере одну основную группу, и, следовательно, они могут образовывать фармацевтически приемлемые соли в результате обработки подходящей кислотой. Подходящие кислоты включают фармацевтически приемлемые органические кислоты, а также фармацевтически приемлемые неорганические кислоты. Примеры фармацевтически приемлемых солей включают хлорид, бромид, сульфат, фосфат, нитрат, ацетат, пропионат, бутират, малеат, тартрат, цитрат, лактат, оксалат, сукцинат и бензоат.
Соединения формулы (I) или их фармацевтически приемлемые соли могут использоваться в лечении различных типов злокачественных опухолей (солидные опухоли, лимфомы и лейкоз). Предпочтительно, они используются в лечении рака яичника, рака молочной железы, рака предстательной железы, рака легких и лимфом. Более предпочтительно они используются в лечении овариальной аденокарциномы и мелкоклеточного и немелкоклеточного рака легких.
Соединения формулы (I) или их фармацевтически приемлемые соли показывают сильное цитостатическое и цитотоксическое действие и низкую острую и системную токсичность.
Настоящее изобретение также предоставляет фармацевтические композиции, содержащие соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемую соль. Такая фармацевтическая композиция может быть составлена так, чтобы ее можно было вводить подходящим путем, таким как пероральное, внутриносовое, топическое или парентеральное введение. Например, такая фармацевтическая композиция может быть составлена в таблетку, капсулу, порошок, раствор, суспензию, мазь или гель. Такая композиция обычно содержит, кроме соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли, фармацевтически приемлемый носитель. Такой носитель может включать эксципиенты, хорошо известные в данной области техники, такие как разбавители, связующие, наполнители, разрыхлители, лубриканты, растворители, загустители, суспендирующие агенты, желирующие агенты, буферы или консерванты. Эти композиции могут быть получены согласно способам, которые известны в данной области техники.
Настоящее изобретение также предоставляет способ получения соединений формулы (I) или их фармацевтически приемлемых солей.
Общий путь синтеза 1,2,4-триазоло-[3,4-b]-1,3,4-тиадиазола представлен ниже на Схеме 1.
Схема 1
V
VI
IV
V
III
IV
III
II
II
I
Сульфонилхлориды () могут быть синтезированы реакцией ароматических сложных эфиров () с хлорсульфоновой кислотой. Сульфонамиды () могут быть получены реакцией сульфонилхлоридов () с аминами. Гидразиды () могут быть получены из сульфонамидов () обработкой водным раствором гидразина согласно методологии Camoutsis и его коллег (Ezabadi IR, Camoutsis C, Zoumpoulakis P, Geronikaki A, Soković M, Glamocilija J, Cirić A. Bioorg Med Chem. 2008, 16(3):1150-61). Стадии 4 и 5 могут быть выполнены согласно способу Mathew и его коллег (Mathew, V.; Keshavayya, J; Vaidya, V. P.; Giles, D. Eur. J. Med. Chem., 2007, 42, 521). Таким образом гидразиды () могут реагировать с дисульфидом углерода и гидразином, приводя к аминотриазолам () через промежуточные калиевые соли дитиокарбаматов. Наконец, аминотриазолы () могут быть превращены в 3,6-дизамещенные 1,2,4-триазоло[3,4-b]-1,2,4-тиазолы () реакцией с кислотами в присутствии оксихлорида фосфора.
Пример 1
Синтез 2-(2-(хлорсульфонил)-4
5-диметоксифенил)метилацетата
,
3
2
4
В колбу, содержащую 2-(3,4-диметоксифенил)метилацетат (3,7 г, 17,65 ммоль),добавляли CHCl (35 мл) и затем хлоросульфоновую кислоту (5,28 мл, 79,4 ммоль) по каплям при 0°C в атмосфере Ar. Раствор приобретал темно-фиолетовый цвет, и его перемешивали при комнатной температуре в течение 4 ч. Реакцию останавливали постепенным добавлением воды (35 мл) при 0°C с последующей экстракцией DCM (3×35 мл), высушиванием органического слоя над NaSО, конденсацией и колоночной хроматографией с элюентом 2:1 PS/ЕА. Каждый продукт собирали в форме твердого вещества белого цвета с 88%-ым выходом.
Синтез 2-(N,N-диметилсульфамоил)-4,5-диметокси-фенилацетилгидразида.
В систему автоклава, содержащую 2-(2-(хлорсульфонил)-4,5-диметоксифенил)метилацетат (450 мг, 1,46 ммоль), растворенный в THF (1,8 мл), добавляли раствор диметиламина в THF 2M (1,47 мл, 2,92 ммоль) при 0°C. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч и наблюдали твердое вещество бледно-желтого цвета. После того, как реакция была закончена, раствор фильтровали в колбу с необходимым количеством DCM, концентрировали на ротационном испарителе, и продукт собирали как твердое вещество бледно-желтого цвета с 100%-ым выходом.
Синтез 5-[2-(N,N-диметилсульфамоил)-4,5-диметокси-бензил]-4-амино-3-меркапто-1,2,4-триазола.
В холодный раствор 2-(N,N-диметилoсульфамоил)-4,5-диметокси-фенилацетилгидразида (0,01 моль) в абсолютном этаноле (150 мл) добавляли гидроксид калия (0,015 моль) и дисульфид углерода (0,015 моль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 20 ч. Во время реакции осаждалась промежуточная калиевая соль дитиокарбамата. Затем сухой эфир (150 мл) добавляли для завершения кристаллизации сформированной соли, полученной фильтрацией, и затем высушивали сухим эфиром.
Соль в форме суспензии в 80%-м водном растворе гидразина (0,02 моль) перемешивали при нагревании с обратным холодильником в течение 2 ч. Реакционную смесь охлаждали, растворяли в холодной воде и нейтрализовали 10%-й соляной кислотой. Осадок собирали фильтрацией, промывали холодной водой, высушивали и перекристаллизовывали в метаноле.
3
13
19
5
4
2
1
13
Выход: 56%, Т.пл. 222-223°C (CHOH), H ЯМР (500 МГц, DMSO-d6) δ 13,30 (с, 1 H), 7,15 (с, 1 H), 6,92 (с, 1 H), 5,46 (с, 2H), 4,20 (с, 2H), 3,71 (с, 3H), 3,68 (с, 3H), 3,22 (с, 6H), C ЯМР (126 МГц, DMSO-d6) δ 165,8, 151,8, 151,5, 147,1, 127,7, 126,3, 115,6, 112,7, 55,9, 36,8, 28,1. Анализ: CHNOS (373). Рассчит. %: C:41,82, H:5,09, найдено N:18,76: C:41,77, H:5,12, N:18,79
Синтез 3-[2-(N,N-диметилсульфамоил)-4,5-диметокси-бензил]-6-фенил-1,2,4-триазоло[3,4-b]-1,3,4-тиазола.
.
Смесь 5-[2-(N,N-диметилсульфамоил)-4,5-диметокси-бензил]-4-амино-3-меркапто-1,2,4-триазола (0,01 моль) и бензойной кислоты (0,01 моль) в сухом оксихлориде фосфора (3,7 мл) перемешивали при нагревании с обратным холодильником в течение 2 ч.Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и затем выливали на лед.Избыток оксихлорида фосфора нейтрализовали сухим карбонатом калия, и соответствующим количеством гидроксида калия, пока pH реакции не становился равен 8Твердое вещество отфильтровывали, промывали обильно водой и высушивали.
3
3
20
21
5
4
2
1
- 1
Выход: 74%, Т.пл. 212-214°C (CHOH), H-ЯМР (CDCl) δ 7,95 (д, J=6,9 Гц, 2H), 7,68 (м, 1H), 7,63 (м, 2H), 7,30 (с, 1H), 7,21 (с, 1H), 4,78 (с, 2H), 3,84 (с, 3H), 3,80 (с, 3H), 2,63 (с, 6H), ИК v см 1601 (C=N), 1573, 1513, 1470, 1446 (C=C), 1265 (N-N=C), 1328 (S-O антисим.), 1141 (S-O сим.), Анализ: CHNOS (459). Рассчит. %: C:52,28, H:4,57, N:15,25 Найдено: C:52,25, H:4,53, N:15,27
Пример 2
В соответствии с методологией примера 1, осуществляли синтез следующих тиазолов.
3-[2-(N,N-диметилсульфамоил)-4,5-диметоксибензил]-6-(4-хлорфенил)-1,2,4-триазоло[3,4-b]-1,3,4-тиазол.
3
2
2
3
20
20
5
4
2
1
-1
Выход: 52%. Т.пл. 228-229°C (CHOH-CHCl), H-ЯМР (CDCl) δ 7,97 (д, J=8,5 Гц, 2H), 7,71 (д, J=8,6 Гц, 2H), 7,30 (с, 1H), 7,20 (с, 1H), 4,78 (с, 2H), 3,84 (с, 3H), 3,79 (с, 3H), 2,62 (с, 6H), ИК v см 1600 (C=N), 1573, 1519, 1470 (C=C), 1272 (N-N=C), 1339 (S-O антисим.), 1138 (S-O сим), Анализ: CHNOSCl (493,5). Рассчит. %: C:48,63, H:4,05, N:14,18 Найдено: C:48,65, H:4,01, N:14,21.
3-[2-(N,N-диметилсульфамоил)-4,5-диметоксибензил]-6-(2-хлор-4-нитрофенил)-1,2,4-триазоло[3,4-b]-1,3,4-тиазол
3
3
20
19
6
6
2
1
-1
J
J
J
Выход: 65%. Т.пл. 216-217°C (CHOH), H-ЯМР (CDCl) δ 8,57 (д, =2,3 Гц, 1H), 8,40 (дд, =8,7, 2,3 Гц, 1H), 8,27 (д, =8,7 Гц, 1H), 7,30 (с, 1H), 7,20 (с, 1H), 4,80 (с, 2H), 3,84 (с, 3H), 3,80 (с, 3H), 2,61 (с, 6H), ИК v см 1603 (C=N), 1573, 1518, 1476 (C=C), 1269 (N-N=C), 1331 (S-O антисим.), 1138 (S-O сим.), Анализ: CHNOSCl (538,5). Рассчит. %: C:44,56, H:3,52, N:15,60. Найдено: C:44,53, H:3,55, N:15,63.
3-[2-(N,N-диметилсульфамоил)-4,5-диметоксибензил]-6-(3-метил-4-нитрофенил)-1,2,4-триазоло[3,4-b]-1,3,4-тиазол.
3
3
21
22
6
6
2
1
-1
δ
J
J
Выход: 46%. Т.пл. 142-144°C (CHOH), H-ЯМР (CDCl)  8,18 (д, =8,5 Гц, 1H), 8,08 (с, 1H), 8,02 (д, =8,5 Гц, 1H), 7,30 (с, 1H), 7,22 (с, 1H), 4,80 (с, 2H), 3,84 (с, 3H), 3,80 (с, 3H), 2,62 (с, 6H), ИК v см 1600 (C=N), 1573, 1510, 1476 (C=C), 1271 (N-N=C), 1344 (S-O антисим.), 1133 (S-O сим.), Анализ: CHNOS (518). Рассчит. %: C:48,64, H:4,24, N:16,21. Найдено: C:48,68, H:4,21, N:16,25.
3-[2-(N,N-диметилсульфамоил)-4,5-диметоксибензил]-6-(3,4,5-триметоксифенил)-1,2,4-триазоло[3,4-b]-1,3,4-тиазол.
3
3
23
27
5
7
2
1
-1
δ
Выход: 38%. Т.пл. 169-170°C (CHOH),H-ЯМР (CDCl)  7,30 (с, 1H), 7,22 (с, 1H), 7,14 (с, 2H), 4,78 (с, 2H), 3,89 (с, 6H), 3,84 (с, 3H), 3,80 (с, 3H), 3,76 (с, 3H), 2,62 (с, 6H), ИК v см1630 (C=N), 1586, 1459, 1414 (C=C), 1267 (N-N=C), 1333 (S-O антисим.), 1127 (S-O сим.), Анализ: CHNOS (549). Рассчит. %: C:50,27, H:4,92, N:12,75. Найдено: C:50,25, H:4,96, N:12,78.
3-[2-(N,N-диметилoсульфамоил)-4,5-диметоксибензил]-6-(2-аминофенил)-1,2,4-триазоло[3,4-b]-1,3,4-тиазол.
2
5
3
20
22
6
4
2
1
-1
,
δ
J
Выход: 36%. Т.пл. 219-220°C (CHOH), H-ЯМР (CDCl)  7,30 (с, 1H), 7,23 (т, =7,8 Гц, 1H), 7,20 (с, 1H), 7,13 (м, 1H), 7,03 (д, J=8,35 Гц, 1H), 6,82 (д, J=8,2 Гц, 1H), 4,75 (с, 2H), 3,84 (с, 3H), 3,79 (с, 3H), 2,61 (с, 6H), ИК v см24363382, 3267 (N-H), 1608 (C=N), 1555, 1514, 1474 (C=C), 1265 (N-N=C), 1328 (S-O антисим.), 1141 (S-O сим.), Анализ: CHNOS (474). Рассчит. %: C:50,63, H:4,64, N:17,72. Найдено: C:50,60, H:4,61, N:17,75.
3-[2-(N,N-диметилсульфамоил)-4,5-диметоксибензил]-6-(3-аминофенил)-1,2,4-триазоло[3,4-b]-1,3,4-тиазол.
2
5
3
2
20
26
6
4
2
1
-1
δ
J
J
J
Выход: 20%. Т.пл. 164-165°C (CHOH), H-ЯМР (CDCl)  7,44 (дд, =8,0, 1,4 Гц, 1H), 7,29 (м, 1H), 7,28 (с, 1H), 7,16 (с, 1H), 6,93 (д, =8,4 Гц, 1H), 6,71 (с ушир., 2H, NH), 6,68 (т, =7,5 Гц, 1H), 4,81 (с, 2H), 3,84 (с, 3H), 3,78 (с, 3H), 2,63 (с, 6H), ИК v см, 3450, 3347 (N-H), 1626 (C=N), 1579, 1512, 1473 (C=C), 1272 (N-N=C), 1322 (S-O антисим.), 1129 (S-O сим.), Анализ: CHNOS (474). Рассчит. %: C:50,63, H:4,64, N:17,72. Найдено: C:50,65, H:4,67, N:17,69.
3-[2-(N,N-диметилсульфамоил)-4,5-диметоксибензил]-6-(4-аминофенил)-1,2,4-триазоло[3,4-b]-1,3,4-тиазол.
2
5
3
20
26
6
4
2
1
-1
δ
J
J
J
J
Выход: 18%. Т.пл. 179-181°C (CHOH), H-ЯМР (CDCl)  7,58 (дд, =8,6, 2,9 Гц, 2H), 7,29 (д, =3,0 Гц, 1H), 7,19 (д, =2,8 Гц, 1H), 6,68 (дд, =8,6, 2,9 Гц, 2H), 6,17 (с, 2H), 4,72 (с, 2H), 3,84 (с, 3H), 3,78 (с, 3H), 2,61 (с, 6H), ИК v см 3457,3348, 3237 (N-H), 1603 (C=N), 1577, 1518, 1461 (C=C), 1265 (N-N=C), 1331 (S-O антисим.), 1138 (S-O сим.), Анализ: CHNOS (474). Рассчит. %: C:50,63, H:4,64, N:17,72. Найдено: C:50,60, H:4,59, N:17,70.
3-[2-(N,N-диметилсульфамоил)-4,5-диметоксибензил]-6-бензил-1,2,4-триазоло[3,4-b]-1,3,4-тиазол.
3
3
21
23
5
4
2
1
-1
δ
Выход: 18%. Т.пл. 178-179°C (CHOH); H-ЯМР (CDCl) 7,42-7,36 (м, 4H), 7,36-7,30 (м, 1H), 7,28 (с, 1H), 7,13 (с, 1H), 4,69 (с, 2H), 4,44, (с, 2H), 3,84 (с, 3H), 3,76 (с, 3H), 2,57 (с, 6H), ИК v см 1601 (C=N), 1565, 1517, 1475 (C=C), 1267 (N-N=C), 1339 (S-O антисим.), 1140 (S-O сим.), Анализ: CHNOS (473). Рассчит. %: C:53,27, H:4,86, N:14,80. Найдено: C:53,23, H:4,89, N:14,83.
3-[2-(N,N-диметилсульфамоил)-4,5-диметоксибензил]-6-(3-метоксибензил)-1,2,4-триазоло[3,4-b]-1,3,4-тиазол.
3
3
22
25
5
5
2
1
-1
δ
J
J
J
Выход: 58%. Т.пл. 165-166°C (CHOH), H-ЯМР (CDCl) 7,30 (д, =8,0 Гц, 1H), 7,29 (с, 1H), 7,13 (с, 1H), 6,97 (с, 1H), 6,94 (д, =7,7 Гц, 1H), 6,90 (дд, =8,3, 2,5 Гц, 1H), 4,70 (с, 2H), 4,41 (с, 2H), 3,84 (с, 3H), 3,77 (с, 3H), 3,75 (с, 3H), 2,57 (с, 6H), ИК v см 1607 (C=N), 1581, 1515, 1491 (C=C), 1266 (N-N=C), 1334 (S-O антисим.), 1139 (S-O сим.), Анализ: CHNOS (503). Рассчит. %: C:52,48, H:4,97, N:13,91. Найдено: C:52,44, H:4,95, N:12,88.
3-[2-(N,N-диметилсульфамоил)-4,5-диметоксибензил]-6-(4-метоксибензил)-1,2,4-триазоло[3,4-b]-1,3,4-тиазол.
3
3
22
25
5
5
2
1
-1
δ
J
J
Выход: 52%. Т.пл. 184-185°C (CHOH), H-ЯМР (CDCl) 7,30 (д, =8,6 Гц, 2H), 7,29 (с, 1H), 7,13 (с, 1H), 6,94 (д, =8,6 Гц, 2H), 4,69 (с, 2H), 4,36 (с, 2H), 3,84 (с, 3H), 3,77 (с, 3H), 3,75 (с, 3H), 2,57 (с, 6H), ИК v см 1610 (C=N), 1571, 1514, 1476 (C=C), 1267 (N-N=C), 1340 (S-O антисим.), 1140 (S-O сим.), Анализ: CHNOS (503). Рассчит. %: C:52,48, H:4,97, N:13,91. Найдено: C:52,45, H:4,99, N:13,94.
3-[2-(N,N-диметилсульфамоил)-4,5-диметоксибензил]-6-(3,4-диметоксибензил)-1,2,4-триазоло[3,4-b]-1,3,4-тиазол.
3
3
23
27
5
6
2
1
-1
δ
J
J
Выход: 50%. Т.пл. 139-140°C (CHOH), H-ЯМР (CDCl) 7,29 (с, 1H), 7,13 (с, 1H), 6,99 (с, 1H), 6,95 (д, =8,2 Гц, 1H), 6,90 (дд, =8,3, 2,0 Гц, 1H), 4,70 (с, 2H), 4,35 (с, 2H), 3,84 (с, 3H), 3,77 (с, 3H), 3,75 (с, 3H), 3,73 (с, 3H), 2,58 (с, 6H), ИК v см 1602 (C=N), 1555, 1516, 1462 (C=C), 1266 (N-N=C), 1336 (S-O антисим.), 1139 (S-O сим.), Анализ: CHNOS (533). Рассчит. %: C:51,78, H:5,06, N:13,13. Найдено %: C:51,81, H:5,10, N:13,15.
3-[2-(N,N-диметилсульфамоил)-4,5-диметоксибензил]-6-(3-фенилпропил)-1,2,4-триазоло[3,4-b]-1,3,4-тиазол.
3
3
23
27
5
4
2
1
-1
δ
J
J
J
Выход: 14%. Т.пл. 128-129°C (CHOH), H-ЯМР (CDCl) 7,30-7,26 (м, 3H), 7,23-7,17 (м, 3H), 7,12 (с, 1H), 4,69 (с, 2H), 3,82 (с, 3H), 3,77 (с, 3H), 3,04 (т, =7,4 Гц, 2H), 2,68 (т, =7,7 Гц, 2H), 2,59 (с, 6H), 2,03 (p, =7,6 Гц, 2H), ИК v см 1600 (C=N), 1574, 1516, 1478 (C=C), 1267 (N-N=C), 1334 (S-O антисим.), 1139 (S-O сим.), Анализ: CHNOS (501). Рассчит. %: C:55,09, H:5,38, N:13,97. Найдено %: C:55,11, H:5,41, N:14,01.
3-[2-(N,N-диметилсульфамоил)-4,5-диметоксибензил]-6-(2-пиридинил)-1,2,4-триазоло[3,4-b]-1,3,4-тиазол.
3
3
19
20
6
4
2
1
-1
δ
Выход: 32%. Т.пл. 198-199°C (CHOH), H-ЯМР (CDCl) 8,76, (с, 1H), 8,23-8,00 (м, 2H), 7,69 (с, 1H), 7,37-7,15 (м, 2H), 4,79 (с, 2H), 3,83 (с, 3H), 3,78 (с, 3H), 2,62 (с, 6H), ИК v см 1599 (C=N), 1576, 1517, 1456 (C=C), 1270 (N-N=C), 1335 (S-O антисим.), 1137 (S-O сим.), Анализ: CHNOS (460). Рассчит. %: C:49,56, H:4,34, N:18,26. Найдено %: C:49,60, H:4,31, N:18,30.
3-[2-(N,N-диметилсульфамоил)-4,5-диметоксибензил]-6-(4-пиридинил)-1,2,4-триазоло[3,4-b]-1,3,4-тиазол.
2
5
3
19
20
6
4
2
1
-1
δ
J
J
Выход: 37%. Т.пл. 231-232°C (CHOH), H-ЯМР (CDCl) 8,85 (д, =5,0 Гц, 2H), 7,91 (д, =5,0 Гц, 2H), 7,30 (с, 1H), 7,21 (с, 1H), 4,80 (с, 2H), 3,84 (с, 3H), 3,80 (с, 3H), 2,63 (с, 6H), ИК v см 1600 (C=N), 1561, 1507, 1473, 1411 (C=C), 1274 (N-N=C), 1337 (S-O антисим.), 1138 (S-O сим.), Анализ: CHNOS (460). Рассчит. %: C:49,56, H:4,34, N:18,26. Найдено %: C:49,58, H:4,37, N:18,23.
3-[2-(N,N-диметилсульфамоил)-4,5-диметоксибензил]-6-(3-bromo-5-пиридинил)-1,2,4-триазоло[3,4-b]-1,3,4-тиазол.
2
5
3
19
19
6
4
2
1
-1
δ
J
J
Выход: 41%. Т.пл. 227-228°C (CHOH), H-ЯМР (CDCl) 9,10 (д,=2,0 Гц, 1H), 8,98 (д, =2,2 Гц, 1H), 8,58 (с, 1H), 7,30 (с, 1H), 7,22 (с, 1H), 4,79 (с, 2H), 3,84 (с, 3H), 3,80 (с, 3H), 2,63 (с, 6H), ИК v см 1600 (C=N), 1573, 1516, 1481, 1440, 1412 (C=C), 1270 (N-N=C), 1338 (S-O антисим.), 1140 (S-O сим.), Анализ: CHBrNOS (539). Рассчит. %: C:42,30, H:3,52, N:15,58. Найдено %: C:42,32, H:3,49, N:15,56.
3-[2-(N,N-диметилсульфамоил)-4,5-диметоксибензил]-6-циннамил-1,2,4-триазоло[3,4-b]-1,3,4-тиазол.
3
2
2
3
22
23
5
4
2
1
-1
δ
J
J
J
Выход: 44%. Т.пл. 191-193°C (CHOH-CHCl); H-ЯМР (CDCl) 7,81 (д, =7,1 Гц, 2H), 7,64 (д, =16,4 Гц, 1H), 7,60 (д, =16,3 Гц, 1H), 7,52-7,40 (м, 3H), 7,30 (с, 1H), 7,16 (с, 1H), 4,73 (с, 2H), 3,84 (с, 3H), 3,80 (с, 3H), 2,62 (с, 6H), ИК v см 1630 (CH=CH), 1600 (C=N), 1575, 1576, 1475 (C=C), 1267 (N-N=C), 1332 (S-O антисим.), 1138 (S-O сим.), Анализ: CHNOS (485). Рассчит. %: C:54,43, H:4,74, N:14,43. Найдено %: C:54,45, H:4,71, N:14,39.
3-[2-(N,N-диметилсульфамоил)-4,5-диметоксибензил]-6-(E)-4-фторстирил-1,2,4-триазоло[3,4-b]-1,3,4-тиазол.
1
-1
J=
J=
J=
Выход: 73%. Т.пл. 210-212 °C. H ЯМР (500 МГц, DMSO-d6) δ 7,89 (дд, 8,6, 5,6 Гц, 2H), 7,65 (д, 16,4 Гц, 1H), 7,58 (д, 16,4 Гц, 1H), 7,36-7,25 (м, 2H), 7,16 (с, 1H), 4,72 (с, 2H), 3,84 (с, 3H), 3,79 (с, 3H), 2,60 (с, 6H). ИК v см 2926, 2853, 1736, 1631, 1601, 1513, 1494, 1474, 1387, 1337, 1268, 1231, 1139, 1156, 1048.
3-[2-(N,N-диметилсульфамоил)-4,5-диметоксибензил]-6-(E)-4-хлорстирил-1,2,4-триазоло[3,4-b]-1,3,4-тиазол
1
13
-1
J=
J
Выход: 72%. Т.пл. 229-231 °C. H ЯМР (500 МГц, DMSO-d6) δ 7,84 (д, 8,6 Гц, 2H), 7,64 (с, 2H), 7,53 (д,=8,6 Гц, 2H), 7,30 (с, 1H), 7,15 (с, 1H), 4,72 (с, 2H), 3,84 (с, 3H), 3,79 (с, 3H), 2,61 (с, 6H). C ЯМР (126 МГц, DMSO-d6) δ 165,7, 151,9, 147,2, 146,3, 139,4, 134,8, 133,3, 129,8, 129,0, 127,9, 126,1, 119,0, 115,5, 112,7, 55,9, 36,8, 27,6. ИК v см 2934, 2844, 1726, 1633, 1516, 1488, 1473, 1410, 1381, 1339, 1268, 1224, 1139, 1175, 1087.
3-[2-(N,N-диметилсульфамоил)-4,5-диметоксибензил]-6-(E)-3-фторстирил-1,2,4-триазоло[3,4-b]-1,3,4-тиазол.
1
-1
Выход: 52%. Т.пл. 212-215 °C. H ЯМР (500 МГц, DMSO-d6) δ 7,92-7,73 (м, 2H), 7,68 (td, J=8,1, 5,8 Гц, 1H), 7,55 (td, J=8,6, 2,4 Гц, 1H), 7,30 (с, 1H), 7,21 (с, 1H), 4,78 (с, 2H), 3,84 (с, 3H), 3,80 (с, 3H), 2,63 (с, 6H). ИК v см 2929, 2844, 1589, 1516, 1474, 1387, 1338, 1270, 1228, 1174, 1155, 1140, 1042
3-[2-(N,N-диметилсульфамоил)-4,5-диметоксибензил]-6-феноксиметил-1,2,4-триазоло[3,4-b]-1,3,4-тиазол.
3
2
2
3
21
23
5
5
2
1
-1
δ
J
Выход: 41%. Т.пл. 178-179°C (CHOH-CHCl), H-ЯМР (CDCl) 7,37-7,31 (м, 2H), 7,29 (с, 1H), 7,13 (с, 1H), 7,09 (д, =7,7, 1,0 Гц, 2H), 7,06-7,01 (м, 1H), 5,55 (с, 2H), 4,72 (с, 2H), 3,84 (с, 3H), 3,78 (с, 3H), 2,58 (с, 6H), ИК v см 1598 (C=N), 1572, 1516, 1479 (C=C), 1267 (N-N=C), 1337 (S-O антисим.), 1139 (S-O сим.), Анализ: CHNOS (489). Рассчит. %: C:51,53, H:4,70, N:14,31. Найдено %: C:51,51, H:4,67, N:14,33.
3-[2-(N,N-диметилсульфамоил)-4,5-диметоксибензил]-6-[2-(2-метоксифенил)этил]-1,2,4-триазоло [3,4-b]-1,3,4-тиазол.
3
2
2
3
23
27
5
5
2
1
-1
δ
J
J
J
Выход: 37%. Т.пл. 154-155°C (CHOH-CHCl), H-ЯМР (CDCl) 7,29 (с, 1H), 7,21 (м, 1H), 7,17 (д, =7,5 Гц, 1H), 7,10 (с, 1H), 6,95 (д, =8,2 Гц, 1H), 6,84 (т, J=7,26 Гц, 1H), 4,67 (с, 2H), 3,84 (с, 3H), 3,77 (с, 3H), 3,75 (с, 3H), 3,29 (м, 2H), 3,01 (т, =7,5 Гц, 4H), 2,56 (с, 6H), ИК v см 1601 (C=N), 1569, 1519, 1477 (C=C), 1267 (N-N=C), 1336 (S-O антисим.), 1139 (S-O сим.), Анализ: CHNOS (517). Рассчит. %: C:53,38, H:5,22, N:13,53. Найдено %: C:53,41, H:5,19, N:13,56.
3-[2-(N,N-диметилсульфамоил)-4,5-диметоксибензил]-6-[2-(4-метоксифенил)этил]-1,2,4-триазоло[3,4-b]-1,3,4-тиазол.
3
2
2
3
23
27
5
5
2
1
-1
δ
J
J
J
Выход: 41%. Т.пл. 151-152°C (CHOH-CHCl), H-ЯМР (CDCl) 7,29 (с, 1H), 7,18 (д, =8,3 Гц, 2H), 7,11 (с, 1H), 6,83 (д, =8,1 Гц, 2H), 4,67 (с, 2H), 3,83 (с, 3H), 3,77 (с, 3H), 3,71 (с, 3H), 2,99 (т, =7,6 Гц, 2H), 2,55 (с, 6H), ИК v см1601 (C=N), 1569, 1519, 1477 (C=C), 1267 (N-N=C), 1336 (S-O антисим.), 1139 (S-O сим.), Анализ: CHNOS (517). Рассчит. %: C:53,38, H:5,22, N:13,53. Найдено %: C: 53,35, H:5,24, N:13,50.
3-[2-(N,N-диметилсульфамоил)-4,5-диметоксибензил]-6-(3-хлорфенил)-1,2,4-триазоло[3,4-b]-1,3,4-тиазол.
1
13
-1
3
3
Выход: 45%. Т.пл. 237-239 °C, H ЯМР (500 МГц, CDCl) δ 7,86 (с, 1H), 7,74 (д, J=7,7 Гц, 1H), 7,56 (д, J=8,0 Гц, 1H), 7,53-7,39 (м, 2H), 6,99 (с, 1H), 4,90 (с, 2H), 3,93 (с, 3H), 3,87 (с, 3H), 2,72 (с, 6H). C ЯМР (126 МГц, CDCl) δ 164,9, 153,1, 152,5, 147,7, 146,8, 135,7, 132,7, 130,9, 130,8, 127,9, 127,03, 127,0 125,3, 114,4, 113,4, 56,4, 56,2, 36,9, 27,9. ИК v см 3088, 3056, 2955, 2927, 2852, 2616, 1598, 1573, 1518, 1482, 1470, 1439, 1405, 187, 1339, 1270, 1228, 1175, 1139, 1101, 1078, 1043.
3-[2-(N,N-диметилсульфамоил)-4,5-диметоксибензил]-6-(4-нитрофенил)-1,2,4-триазоло[3,4-b]-1,3,4-тиазол.
1
13
-1
3
3
J
J
Выход: 53%. Т.пл. 223-225 °C, H ЯМР (500 МГц, CDCl) δ 8,39 (д, =8,7 Гц, 2H), 8,08 (д, =8,7 Гц, 2H), 7,45 (с, 1H), 7,00 (с, 1H), 4,94 (с, 2H), 3,93 (с, 3H), 3,88 (с, 3H), 2,73 (с, 6H), C ЯМР (126 МГц, CDCl) δ 163,9, 153,1, 152,5, 150,1, 147,9, 147,1, 134,8, 128,2, 127,5, 126,9, 124,7, 114,5, 113,1, 113,1, 56,4, 37,1, 28,0, ИК v см 3108, 3004, 2931, 2837, 1600, 1534, 1571, 1518, 1471, 1351, 1337, 1270, 1227, 1138, 1049
3-[2-(N,N-диметилсульфамоил)-4,5-диметоксибензил]-6-(4-фторфенил)-1,2,4-триазоло[3,4-b]-1,3,4-тиазол.
1
-1
J
J
Выход: 66%. Т.пл. 220-223 °C, H ЯМР (500 МГц, DMSO-d6) δ 8,02 (дд, =8,8, 5,2 Гц, 2H), 7,48 (т, =8,8 Гц, 2H), 7,30 (с, 1H), 7,20 (с, 1H), 4,78 (с, 2H), 3,84 (с, 3H), 3,79 (с, 3H), 2,62 (с, 6H), ИК v см 2933, 2842,1602, 1517, 1475, 187, 1337, 1268, 1241, 1225, 1139, 1042
3-[2-(N,N-диметилсульфамоил)-4,5-диметоксибензил]-6-(2,4-динитрофенил)-1,2,4-триазоло[3,4-b]-1,3,4-тиазол.
1
13
-1
J
J
Выход: 29%. Т.пл. 162-164 °C,H ЯМР (500 МГц, DMSO-d6) δ 8,74 (с, 1H), 8,69 (д, =8,4 Гц, 1H), 8,50 (д, =8,6 Гц, 1H), 7,29 (с, 1H), 7,13 (с, 1H), 4,74 (с, 2H), 3,83 (с, 3H), 3,79 (с, 3H), 2,58 (с, 6H),C ЯМР (126 МГц, DMSO-d6) δ 161,2, 153,8, 151,9, 150,5, 149,3, 147,3, 146,3, 128,2, 127,7, 127,6, 126,9, 126,1, 124,3, 115,4, 112,8, 55,9, 55,8, 36,7, 27,6, ИК v см 2917, 2850, 1729, 1555, 1514, 1457, 1346, 1308, 1270, 1223, 1137, 1042
Пример 3
In vitro исследование цитостатическо-цитотоксической активности в отношении человеческих линий клеток рака и лейкоза
Настоящий пример иллюстрирует цитостатическо-цитотоксические эффекты следующих соединений согласно настоящему изобретению в отношении человеческих клеточных линий рака яичника UWB1,289 (с мутантом BRCA1), UWB1,289+BRCA1, OVCAR-3, SCOV-3, человеческих клеточных линий рака молочной железы MCF-7 [экспрессирующих рецепторы эстрогена, белков, связывающих инсулиноподобный фактор роста (IGFBP) BP-2, BP-4; BP-5), онкоген WNT7B], T-47D (положительной в отношении экспрессии всех стероидных рецепторов и онкогена WNT7B), человеческой линии раковых клеток гормон-резистентного рака предстательной железы PC-3, человеческой линии острого T-клеточного лейкоза MOLT-4 (не демонстрирующей экспрессию мутанта онкогена P53) и человеческой клеточной линии рака легкого A549, имеющий мутацию в онкогене KRAS (p. G12S c, 34G>A).
Заместитель R3 изученных соединений определен в Таблице 1:
Ένωση
R<sub>3</sub>
Ένωση
R<sub>3</sub>
TS167
C<sub>6</sub>H<sub>5</sub>-
TS50
4-CH<sub>3</sub>O-C<sub>6</sub>H<sub>4</sub>CH<sub>2</sub>-
TS63
4-Cl-C<sub>6</sub>H<sub>4</sub>-
TS51
3,4-CH<sub>3</sub>O-C<sub>6</sub>H<sub>3</sub>CH<sub>2</sub>-
TS57
2-NH<sub>2</sub>-C<sub>6</sub>H<sub>4</sub>-
TS56
C<sub>6</sub>H<sub>5</sub>-OCH<sub>2</sub>-
TS70
3-NH<sub>2</sub>-C<sub>6</sub>H<sub>4</sub>-
TS53
C<sub>6</sub>H<sub>5</sub>-CH=CH-
TS71
4-NH<sub>2</sub>-C<sub>6</sub>H<sub>4</sub>-
TS54
2-CH<sub>3</sub>O-C<sub>6</sub>H<sub>4</sub>CH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>-
TS61
2-Cl-4-NO<sub>2</sub>-C<sub>6</sub>H<sub>3</sub>-
TS55
4-CH<sub>3</sub>O-C<sub>6</sub>H<sub>4</sub>CH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>-
TS60
2-CH<sub>3</sub>-4-NO<sub>2</sub>-C<sub>6</sub>H<sub>3</sub>-
TS52
C<sub>6</sub>H<sub>5</sub>CH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>-
TS59
3,4,5-CH<sub>3</sub>O-C<sub>6</sub>H<sub>2</sub>-
TS66
<img file="00000038.jpg" he="10" wi="15" img-content="undefined" img-format="jpg" />
TS62
C<sub>6</sub>H<sub>5</sub>CH<sub>2</sub>-
TS65
<img file="00000039.jpg" he="9" wi="16" img-content="undefined" img-format="jpg" />
TS58
3-CH<sub>3</sub>O-C<sub>6</sub>H<sub>4</sub>CH<sub>2</sub>-
TS67
<img file="00000040.jpg" he="15" wi="17" img-content="undefined" img-format="jpg" />
TS22
3-Cl-C<sub>6</sub>H<sub>4</sub>-
TS25
4-F-C<sub>6</sub>H<sub>4</sub>-CH=CH-
TS29
3-F-C<sub>6</sub>H<sub>4</sub>-
TS26
4-Cl-C<sub>6</sub>H<sub>4</sub>-CH=CH-
Таблица 1
Специфические характеристики линий клеток рака яичника
SKOV-3 (SKOV-3) (ATCC HTB 77)
(ATCC HTB-161™)
и OVCAR-3
Человеческие клетки аденокарциномы яичника, выращенные легко в однослойной культуре с эпителиоподобной морфологией. SKOV-3 резистентны к фактору некроза опухоли (TNF) и к другим цитотоксическим лекарственным средствам, таким как цисплатин и адриамицин, в то время как OVCAR-3 резистентны к адриамицину, цисплатину и мелфалану. Эти клеточные линии экспрессируют рецепторы андрогенов, эстрогенов и прогестерона. Когда клетки SKOV-3 или OVCAR-3 внедряют подкожно голым мышам, мышам SCID, развивается умеренно дифференцированная опухоль, и полученная модель напоминает первичную овариальную аденокарциному у человека.
UWB1.289 (ATCC CRL-2945)
Человеческие овариальные клетки аденокарциномы, выращенные легко в однослойной культуре, имеют морфологию эпителиальных раковых клеток и не экспрессируют эстрогеновые и прогестероновые рецепторы. Кроме того, клетки UWB1.289 имеют мутированный ген-супрессор опухоли p53 и положительную экспрессию белка опухоли Вилмса (WT), не имеют функционального гена BRCA1 и являются положительными в отношении экспрессии цитокератина 7 (CK-7), калретинина и белка опухоли Вилмса (WT). Наконец, они чувствительны к ионизирующему излучению.
UBWB1.289+BRCA1 (ATCC CRL-2946)
Человеческие овариальные клетки аденокарциномы, полученные из UBWB1.289, в которых было восстановлено присутствие гена BRCA1. Они легко растут в культуре, создавая монослои, имеют морфологию эпителиальных раковых клеток и не экспрессируют эстрогеновые и прогестероновые рецепторы. Они не чувствительны к ионизирующему излучению и радиоиммунным химическим веществам (например, алкилирующим агентам). Кроме того, клетки UWB1.289 имеют мутированный ген-супрессор опухоли p53 и являются положительными в отношении экспрессии цитокератина 7 (CK-7), калретинина и белка опухоли Вилмса (WT).
Клеточная культура
o
2
2
4
2
4
Все линии раковых клеток хранят в резервуаре с жидким азотом в криоампулах на 2,5 мл (Corning-Costar, Кембридж, Массачусетс). DMSO (диметилсульфоксид) действует как криопротектор и добавляется для предотвращения формирования ледяных кристаллов, которые могут привести к лизису клеток. Клетки выращивали как однослойные культуры в колбах T-75 (Corning-Costar, Кембридж, Массачусетс) и сохраняли при 37C в инкубаторе с 5% CO и при относительной влажности 100%. Используемой культуральной средой является McCoy's 5a Medium, дополненная 10%-й эмбриональной бычьей сывороткой (FBS, Gibco) и 1% антибиотиков (100 МЕ/мл пенициллина/100 мкг/мл стрептомицина), стерилизованная фильтрацией (Фильтр Corning-Costar, диаметр 0,2 мкм, RPMI-1640 и 50% RPMI-1640 (Каталог No 30-2001) плюс 50%-я среда для выращивания эпителия млекопитающих (MEGM), дополненная 10%-й эмбриональной бычьей сывороткой (FBS, Gibco) и 1% антибиотиков (100 МЕ/мл пенициллина/100 мкг/мл стрептомицина). Пассаж осуществляли каждые 3-4 дня следующим образом: Клетки промывали стерильным PBS (Фосфатный буферный солевой раствор): 8 г/л NaCl, 0,2 г/л KCl, 1,15 г/л NaHPO, 0,2 г/л KHPO. pH:7,4), добавляли 2-3 мл 0,05% трипсина (Gibco 1:250) и 0,02% EDTA, чтобы покрыть монослой, и инкубировали колбу при 37°C в течение 5-10 минут. Трипсин-EDTA используется в основном, чтобы отделить клетки от колбы и получить суспензию отдельных клеток. Наконец, число клеток может быть определено прямым подсчетом с помощью камеры Neubauer, и жизнеспособность клеток определяют путем окрашивания клеток трипановым синим.
In vitro исследование
4
2
В экспериментальном исследовании in vitro эффект соединения типа (I) был оценен в отношении клеточных линий рака яичника UWB1.289, UWB1.289+BRCA1 и SKOV-3. Клетки высевали на планшет с 96 лунками (MTP) при плотности 1×10 клеток/мл на лунку и сохраняли в течение 72 ч при 37°C в инкубаторе с 5% CO, и выращивали как монослои. Выбор начального числа клеток был сделан согласно скорости пролиферации клеточной линии с тем, чтобы клетки в течение эксперимента находились в фазе экспоненциального (log) роста. Через 24 часа клетки обрабатывали 1-100 мкмоль/л тестируемых соединений в течение 48 ч. Эксперименты проводили с использованием тройных лунок. Жизнеспособность культивируемых клеток оценивали с помощью метаболического теста с (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий бромидом (MTT), как описано ранее (Finlay GJ, Wilson WR and Baguley BC: Comparison of in vitro activity of cytotoxic drugs towards human carcinoma and leukaemia cell lines. Eur J Cancer Clin Oncol 22: 655-662, 1986; Alley MC, Scudiero DA, Monks A, Hursey ML, Czerwinski MJ, Fine DL, et al. Feasibility of drug screening with panels of human tumor cell lines using a microculture tetrazolium assay. Cancer Res 1988; 48:589-601). MTT (Sigma, Сент-Луис, Миссури, США) растворяли в PBS в концентрации 5 мг/мл, стерилизовали фильтрацией и сохраняли при 4°C. MTT (50 мкл стокового раствора) добавляли к каждой культуре и инкубировали в течение 3 ч при 37°C для обеспечения метаболизации. Кристаллы формазана растворяли с помощью DMSO (100 мкл). Поглощение конвертированного красителя измеряли при длине волны 540 нм на ридере ELISA (BioTek, Винооски, Вермонт, США).
50
50
Средние концентрации каждого соединения, генерирующие 50% или полное (100%) ингибирование роста (GI и TGI, соответственно), а также концентрации соединения, демонстрирующие цитотоксичность в отношении 50% культивируемых клеток [(половина максимальной ингибирующей концентрации (IC)] вычисляли с помощью способа линейной регрессии. Используя семь измерений поглощения [время 24 ч (Ct24), контрольный рост 72 ч (Ct72) и исследование роста в присутствии лекарственного средства при пяти уровнях концентрации (Tt72x)], процент роста вычисляли при каждом уровне концентраций лекарственного средства. Процент ингибирования роста вычисляли согласно Национальному институту онкологии (NCI) как:
[(Tt72x)-(Ct24)/(Ct72)-(Ct24)]×100 для концентраций, для которых Tt72x>Ct24 и
[(Tt72x)-(Ct24)/Ct24]×100 для концентраций, для которых Tt72x<Ct24
50
GI: средняя концентрация, вызывающая 50%-е ингибирование роста клеток (Ингибирование роста 50%). Вычисление значения основывается на формуле:
(Tt72x)-(Ct24)/(Ct72)-(Ct24)×100=50
TGI: средняя концентрация, вызывающая 100%-е ингибирование роста клеток (Полное ингибирование роста). Значение вычисляется согласно формуле:
(Tt72x)-(Ct24)/(Ct72)-(Ct24)×100=0
50
IC: средняя концентрация, убивающая 50% клеток (Ингибирующая концентрация 50%). Значение вычисляется согласно формуле:
(Tt72x)-(Ct24)/(Ct24)×100=50
Результаты
Результаты анализировали с использованием t-теста Стъюдента. P<0,05 считали статистически значимым.
Результаты in vitro исследования представлены в Таблице 2.
Соед.
GI50 (мкМ)
TGI (мкМ)
IC50 (мкМ)
GI50 (мкМ)
TGI (мкМ)
IC50 (мкМ)
GI50 (мкМ)
TGI (мкМ)
IC50 (мкМ)
UWB1.289+BRCA1
TS53
12
28
42
OVCAR-3
5
12
25
SKOV-3
8
16
32
TS63
8
64
>100
3
32
>100
8
38
>100
TS62
8
64
>100
8
68
>100
12
56
>100
TS50
16
>100
>100
5
86
>100
6
>100
>100
TS66
>100
>100
>100
24
>100
>100
20
>100
>100
TS167
76
>100
>100
65
>100
>100
80
>100
>100
TS71
90
>100
>100
97
>100
>100
>100
>100
>100
TS57
85
>100
>100
95
>100
>100
>100
>100
>100
TS22
16
>100
>100
90
>100
>100
60
100
>100
TS25
5
12
36
24
68
94
18
52
80
TS29
10
64
>100
74
>100
>100
45
84
>100
TS26
11
37
54
41
87
>100
38
72
>100
UWB1.289
TS53
12
56
>100
MCF-7
15
45
>100
T-47D
8
37
>100
TS63
30
50
>100
22
50
>100
27
55
>100
TS62
13
>100
>100
18
>100
>100
24
>100
>100
TS50
30
>100
>100
40
>100
>100
28
>100
>100
TS66
>100
>100
>100
>100
>100
>100
>100
>100
>100
TS167
56
>100
>100
65
>100
>100
52
>100
>100
TS71
>100
>100
>100
>100
>100
>100
>100
>100
>100
TS57
>100
>100
>100
>100
>100
>100
>100
>100
>100
TS22
88
>100
>100
24
90
>100
48
97
>100
TS22
16
>100
>100
90
>100
>100
60
100
>100
TS25
2
4
60
16
51
86
12
34
76
TS29
10
67
>100
66
>100
>100
48
86
>100
TS26
8
21
72
25
67
>100
78
>100
>100
PC-3
TS53
12
31
85
MOLT-4
4
21
36
A-549
9
24
58
TS63
20
45
>100
6
45
78
14
36
92
TS62
27
>100
>100
7
55
>100
15
71
>100
TS50
44
>100
>100
10
>100
>100
35
>100
>100
TS66
>100
>100
>100
85
>100
>100
>100
>100
>100
TS167
62
>100
>100
42
>100
>100
74
>100
>100
TS71
>100
>100
>100
55
>100
>100
>100
>100
>100
TS57
>100
>100
>100
94
>100
>100
>100
>100
>100
TS22
>100
>100
>100
72
>100
>100
45
95
>100
TS25
8
24
69
16
29
78
11
56
87
TS29
85
>100
>100
61
>100
>100
30
71
>100
TS26
19
47
86
32
81
>100
20
90
>100
Таблица 2
12 производных 1,2,4-триазоло-[3,4-b]-1,3,4-тиадиазола TS167, TS70, TS61, TS60, TS59, TS58, TS51, TS56, TS54, TS55, TS52, TS65 показывают более мощную цитостатическую (IG50 < 100 мкм), чем цитотоксическую противораковую активность при протестированной концентрации с IC50 > 100 мкМ во всех 9 человеческих линиях раковых клеток.
Пример 4
Исследование токсичности у мышей C57Bl/6 in vivo
Острая токсичность in vivo
Острую токсичность соединений оценивали по летальности путем тестирования различных концентраций, начиная с 100 мг/кг. Терапевтическая доза тестируемого соединения определяется как LD10 (летальная доза для 10% животных). Для внутрибрюшинного (i.p.) лечения стоковые растворы тестируемых соединений готовили непосредственно перед использованием. Их суспендировали в кукурузном масле при желаемой концентрации после начального растворения в 10%-м диметилсульфоксиде (DMSO). Самцов и самок C57Bl/6 использовали для исследований токсичности. Мышей держали в условиях постоянной температуры и влажности в стерильных клетках с водой и пищей.
Результаты исследования острой токсичности представлены в Таблице 3.
Соединение
LD50 (мг/кг)
LD10 (мг/кг)
TS53
375
>500
TS63
430
>500
TS62
480
>500
TS25
345
>500
TS26
365
>500
TS50
>500
>500
TS66
>500
>500
TS167
>500
>500
TS71
>500
>500
TS57
>500
>500
Таблица 3
Известно, что все соединения производили относительно очень низкую острую токсичность на мышах C57Bl/6. Все LD10 от i.p. введения тестируемых производных 1,2,4-триазоло-[3,4-b]-1,3,4-тиадиазола составляли более 350 мг/кг, тогда как LD50 не были достигнуты в любом случае. Для производных TS50, TS66, TS167, TS71, TS57, TS167, TS70, TS61, TS60, TS59, TS58, TS51, TS56, TS54, TS55, TS52 и TS65, острая токсичность не была продемонстрирована при i.p. введении в более высоких дозах, и LD10 и LD50 не были достигнуты (>500 мг/кг).