Способ оптической оценки концентрации микробных клеток в суспензии
METHOD OF OPTICAL EVALUATION OF MICROBIAL CELL CONCENTRATION IN SUSPENSION

Техническое решение относится к области анализа материалов путем определения их физических свойств, а именно к способу определения концентрации микробных клеток в суспензии, и может быть использовано в микробиологии, а также в биотехнологическом производстве.
Известен способ определения общего числа микробных клеток в 1 мл суспензии путем их подсчета под микроскопом с использованием счетной камеры Горяева [1]. Счетная камера Горяева представляет собой специальное предметное стекло, в центральной части которого имеется углубление, глубина которого во всех своих частях одинакова. На дне этого углубления выгравирована сетка, разделенная на квадраты определенной площади. По обе стороны от центрального углубления расположены две другие площадки с уровнем на 0,1 мм выше. Их плоскости служат для притирания покровного стекла до появления так называемых Ньютоновских колец. После притирания покровного стекла создается камера, закрытая с двух боковых сторон, а с двух других имеющая капиллярные пространства, через которые камеру заполняют разведением взвеси микроорганизмов с помощью пастеровской пипетки.
Подсчет клеток проводят под микроскопом, который настраивают таким образом, чтобы была видна нанесенная на камеру сетка и клетки микроорганизма, равномерно распределенные на ней. Считают число клеток в 5 горизонтальных и 15 диагональных ячейках, после чего по формуле определяют число клеток в 1 мл исследуемой взвеси.
, где:
x - число клеток в 1 мл исследуемой взвеси;
а - число клеток в 20 квадратах;
b - разведение исходной взвеси микроорганизма.
Недостатком данного способа подсчета является его не высокая точность и большая трудоемкость.
Известен способ турбидиметрии для определения общего числа клеток в 1 мл суспензии путем измерения оптической плотности взвесей микроорганизмов при определенной длине волны [2]. Действие турбидиметра основано на сопоставлении интенсивности света, рассеянного средой, с интенсивностью рассеяния эталона. При испытании пробу освещают, а затем измеряют интенсивность прошедшего излучения или излучения, рассеянного под определенным углом. Для определения количества клеток в среде используют калибровочную кривую, отображающую зависимость между величиной светорассеяния и числом клеток в единице объема взвеси. Для построения калибровочной кривой измеряют величину светорассеяния в ряде проб с известным содержанием клеток. Калибровочные кривые индивидуальны для каждого микроорганизма.
Недостатком данного способа подсчета является длительная подготовка к его использованию. Необходимо выполнить калибровку для каждого микроорганизма, что достаточно трудоемко и долго. Кроме этого, для калибровки необходимы образцы с известным количеством клеток в единице объема, что может быть определено достаточно неточными методами, допустим, с использованием метода последовательных разведений или камеры Горяева. Еще одним недостатком данного метода является его зависимость от условий, в которых проведена калибровка, действительно, если калибровка проведена при одних условиях, а измерения проводятся при других (температура, свойства растворителя и пр.), то точность измерений будет очень невысокой.
Задачей технического решения является совершенствование способа оценки концентрации микробных клеток в суспензии, направленного на увеличение скорости анализа, снижение его трудоемкости и себестоимости, а также уровня погрешности.
b
s
Поставленная задача решается благодаря тому, что способ оптической оценки концентрации микробных клеток в суспензии включает в себя определение значения волнового экспонента (n) для суспензии микроорганизмов в двух дисперсионных средах с различными показателями преломления, индивидуальный расчет показателя преломления бактерий (μ) данной конкретной суспензии и вычисление среднего радиуса находящихся в ней микробных тел (Rcp), затем, применяя асимптотическое приближение, находится коэффициент светорассеяния (К), с использованием которого по измеренной оптической плотности суспензии определяется концентрация микроорганизмов (N).
b
s
В предлагаемом способе оценки концентрации микробных клеток в суспензии предусмотрены следующие отличия от существующих, а именно проводится определение значения волнового экспонента (n) для суспензии микроорганизмов в двух дисперсионных средах с различными показателями преломления, на основе полученных его значений вычисляется для данного штамма микроорганизмов в данных конкретных условиях показатель преломления бактерий (μ) и средний радиус (Rcp) микробных тел, затем, применяя асимптотическое приближение, находится коэффициент светорассеяния (К), с использованием которого по измеренной оптической плотности суспензии определяется концентрация микроорганизмов (N).
Между совокупностью существенных признаков заявляемого объекта и достигаемым техническим результатом существует причинно-следственная связь, которую можно продемонстрировать на примере 1.
Пример 1
11
Нами был проведен сравнительный эксперимент по определению концентрации микроорганизмов в суспензии способом с использованием камеры Горяева и "Способом оптической оценки концентрации микробных клеток в суспензии". Для эксперимента выбран из коллекции ТюмНЦ СО РАН штамм 10-50-TS2, определенный до вида Achromobacter spanius с помощью анализа генов, кодирующих 16S РНК. Род Achromobacter являются аэробными гетеротрофами, представляют собой грамотрицательные, не спорообразующие удлиненные палочки. Бактерии высевали на в пробирки на скошенный мясопептонный агар (ТУ 9385-001-64786015-2012, г. Углич) и культивировали 24 часа в термостате при температуре 26°C, после чего микроорганизмы смывали с поверхности питательной среды дистиллированной водой в объеме 5 мл. В камеру Горяева помещалась суспензия, полученная методом последовательных разведений, концентрацией 1/10000 от концентрации смыва. Далее проводилась фотофиксация сеток камеры, подсчет количества микроорганизмов на полученных снимках и обработка данных по методике [1]. Размеры бактериальных клеток не оценивались, так как на снимках они были очень малы. По полученным данным можно было лишь констатировать, что их средний размер значительно меньше 1 мкм. Точность этого метода определяется точностью серийных разведений (она невысока при использовании пипетки Пастера), аккуратностью подготовки камеры Горяева к работе, жизнедеятельностью микроорганизмов в процессе длительного эксперимента, а также точностью подсчета микроорганизмов в камере. Для штамма 10-50-TS2 концентрация микроорганизмов в неразбавленной суспензии составила x=(5,3±0,1)⋅10. Трудоемкость составила четыре чел./дня.
b
11
При использовании "Способа оптической оценки концентрации микробных клеток в суспензии" аналогичный объем материала был обработан нами, с использованием рефрактометра RL3 и спектрофотометра ПЭ - 5400УФ, в течение часа. Значение показателя преломления бактерий определено μ=1,46, средний размер оценен Rcp=0,37 мкм, концентрация составила x=2×10.
Предлагаемый нами способ «Способ определения концентрации микробных клеток в суспензии» увеличивает скорость определения концентрации микробных клеток в суспензии почти в 32 раз по сравнению с применяемым сегодня способами и не требует наличия для его выполнения специализированного дорогостоящего оборудования.
Нами предлагается следующий "Способ оптической оценки концентрации микробных клеток в суспензии".
s1
s2
Подготавливаются две дисперсионные среды с различными показателями преломления, а именно 10% и 40% раствор глюкозы (применяются в медицине и фармацевтике). Подготавливается суспензии микроорганизмов. Для этого в 9 частей дисперсионной среды помещают одну часть микробной суспензии. Суспензию хорошо перемешивают. Далее, измеряем показатели преломления полученных суспензий с использованием рефрактометра Аббе по методике, изложенной в инструкции по эксплуатации. Получаем значения μ и μ.
Помещаем полученные суспензии в кюветы спектрофотометра и устанавливаем их в измерительную камеру спектрофотометра. В качестве базы в третью кювету помещаем дистиллированную воду.
1
2
λ1
λ2
λ1
λ2
1
2
1
2
Проводим измерения оптической плотности суспензий (относительно базовой кюветы) на двух длинах волн λ=450 нм и λ=600 нм, получаем значения D и D. Используя определение волнового экспонента [5], можем записать: n=-(lgD-lgD)/(lgλ-lgλ), и по этой формуле рассчитываем волновые экспоненты для исследуемых суспензий n и n.
Далее, применяя асимптотическое приближение, определяем безразмерный параметр ρ [5] для каждой из двух дисперсионных сред, используя формулы [4]:
ρ(n)=a/(b+n-2)+c, для 2≤n≤3,5
1/2
ρ(n)=3⋅(y+n⋅q/(h+у)), для -1≤n≤2
1
b
s
в этих формулах y, a, b, c, d, e, q, h определяются следующим образом (m=m-1; m=μ/μ) [3]:
2
y=2-n-(2-n)/20
a=b⋅d
b=1,5⋅(d/e-1)
1
1
q=m⋅(1-0,8⋅exp(-11⋅m))/3
1/3
h=(2⋅q)
c=3⋅h-d
1
1
1
1
d=e⋅(3⋅h-ρ)⋅(1,5-ρ)/(1,5⋅(3⋅h-ρ)-e⋅ρ)
1
e=3⋅h-2⋅m⋅(0,22+0,58⋅m)
1
1
1
1
2
ρ=0,1+m⋅(3,9-5⋅m+0,5/(1+1000⋅(m-0,05)))
1
2
1
2
To есть по известным n и n рассчитываем значения ρ(n) и ρ(n).
s
b
s
1
2
Так как, по определению, ρ=4⋅π⋅Rcp⋅μ⋅(μ/μ-1)/λ [4], при одинаковой длине волны этот параметр зависит только от соотношений показателей преломлений бактерий и среды, то по известным значениям ρ(n) и ρ(n) можно однозначно определить значение показателя преломления бактерий:
1
2
b
s1
b
s2
ρ(n)/ρ(n)=(μ-μ)/(μ-μ), откуда находим
b
s2
1
2
s1
s2
1
2
μ=μ⋅(ρ(n)/ρ(n)-μ/μ)/(ρ(n)/ρ(n)-1),
s1
s2
1
1
2
2
b
где μ - показатель преломления первой дисперсионной среды; μ - показатель преломления второй дисперсионной среды; ρ(n) - безразмерный параметр ρ для первой дисперсионной среды, определенный по волновому экспоненту n; ρ(n) - безразмерный параметр ρ для второй дисперсионной среды, определенный по волновому экспоненту n; μ - показатель преломления бактерий.
b
s
Используя значение параметра ρ и найденный показатель преломления бактерий, для любой из дисперсионных сред можно оценить средний размер бактерий исходя из определения ρ [5]: Rcp=ρ-λ/(4⋅π⋅(μ-μ)),
Далее, используя асимптотическое приближение [4], находим коэффициент светорассеяния:
s
2
3
К=K⋅{1+(0,3724-0,2974⋅m)/[α+4⋅(α-0,8)-0,744]}, для 2≤n≤3,3
s
1
2
3
K=Q(ρ)⋅(m-m)/[1+(0,3⋅m-0,28)⋅(3h/ρ)], для -1≤n≤2,
2
2
2
2
где К=А⋅α⋅[(3,25m+1,55)⋅α-3,4], и А=[(m-1)/(m+2)],
s
α=2⋅π⋅Rcp⋅μ/λ
Затем определяем концентрацию микроорганизмов в исследуемой суспензии, для чего, используя формулу τ=π⋅r2⋅Ks(r,λ,m)⋅N [3], запишем: N=τπ⋅Rcp2⋅Ks, где мутность суспензии τ либо измеряется на спектрофотометре, либо вычисляется по ранее измеренной оптической плотности среды (для используемого спектрофотометра равняется τ=2,3⋅D (1/см)). Проведя вычисления, оцениваем концентрацию микроорганизмов в исследуемой суспензии - N.
Концентрацию микроорганизмов в неразведенной суспензии рассчитываем по формуле: x=10⋅N.
Следует отметить, что предлагаемый нами способ не требует точного совпадения концентраций микроорганизмов в двух исследуемых суспензиях с различными показателями преломления и позволяет, используя определенные значения показателя преломления бактерий, применять турбодиметрические методы определения концентраций с большей точностью.
Технико-экономическая эффективность предлагаемого способа определения концентрации микробных клеток в суспензии обусловлена увеличением почти в 32 раза скорости анализа по сравнению с применяемыми сегодня способами, отсутствием необходимости наличия для его выполнения специального дорогостоящего оборудования, что безусловно существенно снизит себестоимость получаемого биотехнологического продукта и увеличит его количество.
Используемые обозначения:
- x - число клеток в 1 мл исследуемой суспензии;
- Rcp - средний размер микроорганизмов в суспензии;
b
- μ - показатель преломления микроорганизмов;
s1
s2
- μ, μ - показатели преломления первой и второй дисперсионных сред;
- D - оптическая плотность суспензии;
- λ - длина волны светового излучения;
s
- К - коэффициент светорассеяния;
- N - концентрация микроорганизмов в исследуемой на спектрофотометре суспензии;
- τ - мутность исследуемой на спектрофотометре суспензии.
Источники информации
1. Государственная Фармакопея Российской Федерации, XIII издание, М., 2015. - Т. 2. - С. 624-627. Определение концентрации микробных клеток ОФС.1.7.2.0008.15 [электронный ресурс]: - Режим доступа: http://femb.ru/feml?1850324. Федеральная электронная медицинская библиотека Министерства здравоохранения Российской Федерации. - (Дата обращения 12.08.2016).
2. Государственная Фармакопея Российской Федерации, XIII издание, М., 2015. - Т. 2. - С. 628-629. Определение концентрации микробных клеток ОФС.1.7.2.0008.15 [электронный ресурс]: - Режим доступа: http://femb.ru/feml?1850324. Федеральная электронная медицинская библиотека Министерства здравоохранения Российской Федерации. - (Дата обращения 12.08.2016).
3. Нестеров А.Н. Кинетика и механизм гидратообразования газов в присутствии поверхностно-активных веществ: дис. … д-ра хим. наук: 02.00.04 / Нестеров Анатолий Николаевич. - Тюмень, 2006. - 279 с.
4. Характеристические функции светорассеяния полидисперсных систем [Текст] / К.Р. Рамазанов [и др.] // Коллоидный журнал. - 1983. - Т. XLV, №3. - С. 473-479.
5. Щеголев С.Ю. Определение параметров сложных дисперсных полимерных систем из спектра мутности [Текст] / С.Ю. Щёголев, В.И. Кленин // Высокомолекулярные соединения. - 1971. - Т. А13, №12. - С. 2809-2015.