Способ генотипирования крупного рогатого скота по аллелям 1401G/T гена lhcgr (ss52050737) методом ПЦР в режиме реального времени
METHOD FOR CATTLE GENOTYPING BY 1401G/T ALLELES lhcgr (ss52050737) GENE BY PCR IN REAL TIME

Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярно-генетической диагностики, генетики и селекции сельскохозяйственных животных, в частности к оценке аллельного полиморфизма 1401G/T (ss52050737) гена lhcgr, кодирующего рецептор лютеинизирующего гормона/хориогонадотропина (luteinizing hormone/choriogonadotropin receptor, LHCGR) крупного рогатого скота молекулярно-генетическим методом исследования.
Изучение процесса трансплантации эмбрионов началось примерно сто лет назад и уже в 1970-х годах перешло в коммерческую сферу деятельности на международном уровне. Так, в 2016 году было получено 632 638 эмбрионов от 93 815 коров-доноров, из которых 196 тысяч были пересажены сразу, а оставшаяся часть была криоконсервирована. Лидером в области трансплантации эмбрионов на протяжении многих лет остается Северная Америка - в США и Канаде получено 52,5% от всего числа эмбрионов полученных in vivo, в то время как в Европе только 20,4% [G.A. Во, R.J. Mapletoft, "Embryo Transfer Technology in Cattle", Animal Biotechnology 1. - Springer, Cham, pp. 107-133. 2018; G. Perry. "Statistics of embryo collection and transfer in domestic farm animals", Embryo Transfer Newsletter, vol. 32, pp. 14-26. 2014]. В связи с таким широким распространением технологии трансплантации эмбрионов, появилась необходимость отбора коров-доноров по генетическим показателям чувствительности к процедуре стимуляции овуляции гонадотропными гормонами для дальнейшей оценки по количеству полученных зрелых ооцитов [G.A. Во, R.J. Mapletoft, "Historical perspectives and recent research on superovulation in cattle", Theriogenology, vol. 81, №1, pp 38-48. 2014]. В основе процесса суперовуляции лежит введение животным гонадотропных препаратов, одним из которых является лютеинизирующий гормон [W.K. Kroeze, D.J. Sheffler, B.L. Roth, "G-protein-coupled receptors at a glance", Journal of cell science, vol. 116, №24, pp. 4867-4869, 2003].
Рецептор лютеинизирующего гормона/хориогонадотропина (LHCGR) принадлежит к классу мембранных рецепторов, связанных с G-белкам [M.L. Dufau, С.Н. Tsai-Morris, Z.Z. Hu, Е. Buczko, "Structure and regulation of the luteinizing hormone receptor gene", The Journal of steroid biochemistry and molecular biology, vol. 53, №1-6, pp. 283-291, 1995]. У крупного рогатого скота (КРС) ген LHCGR локализован в 11 хромосоме и состоит из 11 экзонов [O.J. Ginther, D.R. Bergfelt, М.А. Beg, K. Kot, "Follicle selection in cattle: role of luteinizing hormone", Biology of reproduction, vol. 64, №1, pp. 197-205, 2001]. Полиморфизм данного гена может быть тесно связан с процессом суперовуляции [W.C. Yang, K.Q. Tang, S.J. Li, L.M. Chao, L.G. Yang, "Polymorphisms of the bovine luteinizing hormone/choriogonadotropin receptor (LHCGR) gene and its association with superovulation traits", Molecular biology reports, vol. 39, №3, pp. 2481-2487, 2012; Y. Yu, Y. Pang, H. Zhao, X. Xu, Z. Wu, L. An, J. Tian, "Association of a missense mutation in the luteinizing hormone/choriogonadotropin receptor gene (LHCGR) with superovulation traits in Chinese Holstein heifers", Journal of animal science and biotechnology, 3:35. 2012]. Ген lhcgr рассматривается как ген-кандидат для прогнозирования ответа на индукцию суперовуляции. А выявленные в гене полиморфные варианты рассматриваются в связи с фертильностью крупного рогатого скота [N. Hastings, S. Donn, K. Derecka, А.Р. Flint, J.A. Woolliams, "Polymorphisms within the coding region of the bovine luteinizing hormone receptor gene and their association with fertility traits", Animal genetics, vol. 37, №6, pp. 583-585, 2006; S.D. Cochran, J.B. Cole, D.J. Null, P.J. Hansen, "Discovery of single nucleotide polymorphisms in candidate genes associated with fertility and production traits in Holstein cattle", BMC genetics, 14: 49,2013; W.K. Santos-Biase, F.H. Biase, J.Jr. Buratini, J. Balieiro, Y.F. Watanabe, M.F. Accorsi, C.R. Ferreira, P. Stranieri, A.R. Caetano, F.V. Meirelles, "Single nucleotide polymorphisms in the bovine genome are associated with the number of oocytes collected during ovum pick up", Animal reproduction science, vol. 134, №3-4, pp. 141-149, 2012; H. Berg, "Restriction Fragment Length Polymorphism Analysis of PCR-Amplified Fragments (PCR-RFLP) and Gel Electrophoresis - Valuable Tool for Genotyping and Genetic Fingerprinting", in: Gel Electrophoresis - Principles and Basics: IntechOpen, 315-334, 2012]. Наиболее значимыми однонуклеотидными заменами (SNP) являются несинонимичные мутации, расположенные в экзонах гена, так как они ведут к замене аминокислотных остатков, что в свою очередь изменяет первичную структуру белка и может повлиять на его функции. Из всех найденных к настоящему времени SNP наибольший интерес представляет замена 1401G>T (ss52050737), так как было выявлено, что животные с генотипами GG или GT характеризуются более высокими показателями по общему количеству яйцеклеток, а по количеству выживших при трансплантации эмбрионов наилучшие показатели - у животных с генотипом GG. Так же животные с генотипом GG имеют наименьшее количество неоплодотворенных яйцеклеток по сравнению с носителями двух других генотипов [N. Hastings, S. Donn, K. Derecka, А.Р. Flint, J.A. Woolliams, "Polymorphisms within the coding region of the bovine luteinizing hormone receptor gene and their association with fertility traits", Animal genetics, vol. 37, №6, pp. 583-585, 2006]. Таким образом, ген lhcgr, кодирующий LHCGR, является одним из перспективных генетических маркеров репродуктивного статуса крупного рогатого скота.
Из уровня техники известен способ генотипирования крупного рогатого скота по аллелям 1401G/T (ss52050737) гена lhcgr, обеспечивающий их идентификацию на основе комбинации трех методов - полимеразной цепной реакции (ПЦР), анализа конформационного полиморфизма одноцепочечной ДНК на основе электрофоретического разделения полученных полиморфных фрагментов гена lhcgr (single-stranded conformation polymorphism - SSCP) и прямого секвенирования ДНК (прототип - Y. Yu, Y. Pang, Н. Zhao, X. Xu, Z. Wu, L. An, J.Tian, "Association of a missense mutation in the luteinizing hormone/choriogonadotropin receptor gene (LHCGR) with superovulation traits in Chinese Holstein heifers", Journal of animal science and biotechnology, 3:35. 2012]. Способ состоит в том, что для выявления аллелей 1401G/T гена lhcgr (ss52050737) на первом этапе анализа амплифицируют содержащий их участок гена lhcgr методом ПЦР с использованием праймеров sense: 5'-GCTCTACCTGCTGCTCAT-3' и anti-sense: 5'-TAATTGCTGACACCCACA-3'. Затем полученные ампликоны анализируют методом SSCP, а именно смешивают с 8 мкл денатурирующего раствора (95% формамида, 25 ммоль/л ЭДТА, 0,025% ксилол-цианола, 0,025% бромфенолового синего), нагревают в течение 10 мин при 98°С и охлаждают на льду. Денатурированную ДНК подвергают электрофорезу в 13% полиакриламидном геле (39: 1 акриламид/бисакриламид) в 1 × буфере ТВЕ при постоянном напряжении (120 В) в течение 8-10 ч. Гель окрашивают 0,1% раствором нитратом серебра. На последнем этапе продукты ПЦР с различной электрофоретической подвижностью секвенируют в обоих направлениях.
Основными недостатками прототипа являются многостадийность способа гентипирования крупного рогатого скота по аллельным вариантам 1401G/T (ss52050737) гена lhcg, основанного на комбинации трех методов (амплификация полиморфного участка гена методом ПЦР, электрофоретическое разделение полученных полиморфных фрагментов гена lhcgr, секвенирование ДНК), его продолжительность и трудозатратность.
Технический результат, обеспечиваемый изобретением, заключается в упрощении способа генотипирования крупного рогатого скота по аллельным вариантам 1401G/T (ss52050737) гена lhcgr, в сокращении времени проведения анализа.
Технический результат достигается тем, что способ генотипирования крупного рогатого скота по аллелям 1401G/T гена lhcgr (ss52050737) методом ПЦР в режиме реального времени состоит в том, что используются:
прямой праймер 5'-TGAACTCTCTGTCTACACCCTCACA-3'
обратный праймер 5'-GCATGACTGGAATGGCATGTT-3'
lhcgr-T-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд
5'-(FAM)-CACTAGAAAGATGTCACACC-(BHQ1)-3'
lhcgr-G - аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд
5'-(VIC)-CTAGAAAGATGGCACACC-(BHQ1)-3'
Перечень графических материалов.
На фиг. 1 представлены нуклеотидные последовательности фрагмента гена lhcgr длиной 113 п.н., кодирующие аллели 1401G/T (ss52050737). Жирным шрифтом отмечены последовательности праймеров; жирным шрифтом и курсивом - последовательности зондов.
На фиг. 2 представлены: А - кривые флуоресценции для гомозиготных образцов по аллелю Т (генотип ТТ). В - кривые флуоресценции для гомозиготных образцов по аллелю G (генотип GG). С - кривые флуоресценции для гетерозигот (генотип TG). D - график распределения генотипов (ss52050737) гена lhcgr.
Патентуемый способ заключается в проведения ПЦР в режиме реального времени для генотипирования крупного рогатого скота по аллельным вариантам 1401G/T (ss52050737) гена lhcgr. Заявленный способ отличается тем, что используются два общих для аллельных вариантов праймера: прямой праймер lhcgr-F: 5'-TGAACTCTCTGTCTACACCCTCACA-3' и обратный праймер lhcgr-R: 5'-GCATGACTGGAATGGCATGTT-3', фланкирующие участок гена lhcgr длиной 113 п.н., и два аллель-специфичных флуоресцентно-меченых зонда lhcgr-T: 5'-(FAM)-CACTAGAAAGATGTCACACC-(BHQ1)-3' и lhcgr-G: 5'-(VIC)-CTAGAAAGATGGCACACC-(BHQ1)-3' (фиг. 1).
Точки мутаций те же, что и в прототипе, однако подход детекции иной: в заявленном изобретении осуществляется идентификация полиморфизма методом ПЦР в режиме реального времени с помощью флуоресцентно-меченых аллель-специфичных зондов.
В патентуемом способе идентификации аллельных вариантов 1401G/T (ss52050737) гена lhcgr на основе ПЦР в режиме реального времени используются два праймера, общие для обоих аллелей гена, и два аллель-специфичных флуоресцентно-меченых зонда типа TaqMan (Фиг. 1). Праймеры lhcgr-F и lhcgr-R инициируют амплификацию участка гена lhcgr крупного рогатого скота длиной 113 п.н. Реакцию амплификации проводили в 10 мкл смеси ПЦР, содержащей 5 мкл реактива LightCycler 480 Probes Master («Roche», Швейцария), по 0.4 мкМ прямого праймера lhcgr-F: 5'-TGAACTCTCTGTCTACACCCTCACA-3' и обратного праймера lhcgr-R: 5'-GCATGACTGGAATGGCATGTT-3', по 0.2 мкМ аллель-специфичных зондов lhcgr-T: 5'-(FAM)-CACTAGAAAGATGTCACACC-(BHQ1)-3' (0.2 μМ) и lhcgr-G: 5'-(VIC)-CTAGAAAGATGGCACACC-(BHQ1)-3', 10 нг ДНК. ПЦР проводили с помощью прибора LightCycler 96 («Roche», Швейцария) в оптимизированных условиях (95°С - 10 мин.; 95°С 15 сек., 58°С r 30 сек., 72°С 20 сек., 40 циклов). Детекция флуоресценции проводилась на стадии элонгации по каналам FAM и VIC. Для анализа результатов генотипирования по конечной точке использовали программное обеспечение к амплификатору LightCycler 96 версии SW1.1. Идентификация аллелей 1401G/T (полиморфизм ss52050737) основана на сравнении интенсивности флуоресценции красителей VIC и FAM, соответственно. Для определения генотипа животного используются конечные значения флуоресценции красителей FAM и VIC. Программное обеспечение для амплификатора LightCycler 96 версии SW1.1. представляет результаты генотипирования в виде распределения генотипов (Фиг. 2D). Для гомозиготных образцов по аллелю Т (генотип 1401Т/Т) детектируется нарастание флуоресценции по каналу FAM (Фиг. 2А). Для гомозиготных образцов по аллелю G (генотип 1401G/G) детектируется сигнал по каналу VIC (Фиг. 2В). Для гетерозиготного образца (генотип 1401T/G) наблюдается нарастание флуоресценции по обоим каналам детекции (Фиг. 2С). Наличие двух красителей, FAM и VIC, позволяют однозначно определить присутствие каждого из исследуемых аллелей гена lhcgr в анализируемом образце ДНК и, соответственно, генотип животного.
Разработанный метод на основе ПЦР в реальном времени был валидирован на 195 образцах ДНК коров черно-пестрого голштинизированного скота. Результаты генотипирования показали, что 43,2% животных являлись носителями обоих аллелей (генотип GT), 15,2% коров были гомозиготами по аллелю Т (генотип ТТ) и 41,6% % животных - гомозитотами по аллелю G (генотип GG). Таким образом, в изученной популяции крупного рогатого скота частота аллеля G, связанная с более высокими показателями общего числа ооцитов и числа выживших эмбрионов после трансплантации, а также с наименьшим числом неоплодотворенных ооцитов, составила 63,2%.
Валидацию способа проводили с помощью анализа по прототипу (Y. Yu, Y. Pang, Н. Zhao, X. Xu, Z. Wu, L. An, J.Tian, "Association of a missense mutation in the luteinizing hormone/choriogonadotropin receptor gene (LHCGR) with superovulation traits in Chinese Holstein heifers", Journal of animal science and biotechnology, 3:35. 2012). Результаты обоих методов генотипирования полностью совпали. Однако, патентуемый способ позволяет упростить и значительно (до 1 часа) сократить время проведения анализа за счет проведения одновременно амплификации полиморфного участка гена lhcgr и детекции его алелльных вариантов 1401G/T (ss52050737) методом ПЦР в режиме реального времени, что выгодно отличает его от анализа, используемого в прототипе.
Таким образом, разработан эффективный и надежный способ для экспресс-идентификации аллельных вариантов 1401G/T (ss52050737) гена lhcgr крупного рогатого скота методом ПЦР в режиме реального времени с использованием аллель-специфичных флуоресцентно-меченых зондов. Разработанный метод позволяет проводить генотипирование до 480 животных по аллельным вариантам 1401G/T (ss52050737) гена lhcgr (в зависимости от модели амплификатора) в течение 1 часа и может быть использован для отбора перспективных коров-доноров эмбрионов.