СВЯЗЫВАЮЩИЕ БЕЛКИ, СПЕЦИФИЧНЫЕ В ОТНОШЕНИИ LOX1, И ПУТИ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
LOX1-SPECIFIC BINDING PROTEINS AND THEIR APPLICATION METHODS

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
[1]
Настоящая заявка на патент заявляет приоритет по предварительной заявке на патент США № 62/058 254, поданной 1 октября 2014 г., которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.
ССЫЛКА НА ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ, ПОДАННЫЙ В ЭЛЕКТРОННОМ ВИДЕ
[2]
Содержание перечня последовательностей, поданного в электронном виде в текстовом файле ASCII (наименование: LOX1-100WO1_SequenceListing_ascii.txt; размер: 50 926 байт; а также дата создания: 30 сентября 2015 г.), поданного вместе с заявкой, включено в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[3]
В настоящем раскрытии предусматривают белки, связывающие лектиноподобный рецептор 1 окисленных липопротеинов низкой плотности (LOX1), и способы применения таких связывающих белков, например, для лечения, предупреждения и/или облегчения заболевания или состояния, связанного с LOX1, включая, например, сосудистую дисфункцию, атеросклероз (развитие, разрыв бляшек и/или тромбоз) коронарную недостаточность (CAD), ишемию (например, ишемию миокарда), инфаркт (например, инфаркт миокарда), инсульт и острый коронарный синдром (ACS).
[4]
Атеросклероз представляет собой комплексное заболевание, обусловленное скоплением липидов, макрофагов и фиброзных элементов в виде участков поражения на стенке артерий. Участки поражения развиваются в сложные бляшки, которые сужают просвет артерии и являются очагом хронического воспаления. Бляшки легко поддаются разрыву, вызывая тромбоз, который приводит к нежелательным сердечно-сосудистым явлениям, в том числе инсульту и инфаркту миокарда. Атеросклероз является основной причиной коронарной недостаточности, инсульта и заболевания периферических сосудов и, таким образом, является наиболее распространенной причиной смертности в мире (Всемирная организация здравоохранения, 2011 г.).
[5]
et al.,
et al., Structure
Chlamydia pneumoniae
et. al., Eur J Clin Invest.
th
Лектиноподобный рецептор 1 окисленных липопротеинов низкой плотности (LOX1) представляет собой связанный дисульфидными мостиками трансмембранный белок II типа. Изначально он был идентифицирован в качестве основного рецептора окисленных липопротеинов низкой плотности (oxLDL) (Kume 70 Scientific Sessions of the American Heart Association Ser. 96, 1997); Рецептор состоит из короткого N-концевого цитоплазматического домена, трансмембранного домена, шеечного домена и лектинового домена типа С (CTLD), при этом вопрос о структуре CTLD был решен (Ohki 13:905-917 (2005)). Кроме того, LOX1 может быть расщеплен протеолитическим путем в шеечном домене с высвобождением растворимого LOX1 (sLOX1). LOX1 представляет собой скавенджер-рецептор класса E и связывает множество лигандов, в том числе oxLDL, C-реактивный белок (CRP), фосфатидилсерин, конечные продукты усиленного гликозилирования (AGE), мелкие плотные частицы липопротеинов (sdLDL), окисленные HDL, N4-оксононаноиллизин (ONL), белки теплового шока (hsp), , тромбоциты, лейкоциты и апоптические клетки. Многие из этих лигандов, в частности oxLDL, связаны с атеросклерозом. Множество путей трансдукции сигнала связаны с активацией LOX1, в том числе сигнальные пути RhoA/Rac1, монооксида азота, p38MAPK, протеинкиназы B и C, ERK1/2 и NFκB. См., например, Taye 43(7):740-5 (2013).
[6]
et al., Expert Opin Ther Targets.
et al., Circ. Res.
et al
Circ. Res.
et al., Cardiovascular pathology
et al
Cir. Cardio. Imaging
et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol.
et al
Cardiovasc. Res.
et al
J. Pharm. Biomed. Anal.
et al.,
et al
Clin. Cardiol.
th
Доклинические данные указывают на то, что LOX1 вовлечен в стимуляцию развития сосудистой дисфункции, развития, разрыва бляшек и тромбоза, атеросклероза и воспалительных состояний. См., например, Ulrich-Merzenich 17(8):905-19 (2013). Например, в то время как у нокаутных по LOX1 мышей наблюдался облегченный аортальный атеросклероз и сниженная степень отложения коллагена на стенке сосуда, (Mehta 100:1634-1642 (2007)), сверхэкспрессия LOX1 обуславливала усиленное образование бляшек (Inoue ., 97:176-84 (2005); и White 20:369-73 (2011)), при этом экспрессия LOX1 наблюдалась в промежуточных участках нестабильной бляшки, и она связана со скоплением макрофагов, апоптозом и экспрессией MMP-9 (Li ., 3:464-72 (2010)). Нейтрализующие LOX1 антитела обеспечивают восстановление индуцируемой ацетилхолином дилатации коронарных артерий (Xu 27(4) 871-877 (2007)) и уменьшают утолщение интимы после баллонного повреждения у крыс (Hinagata ., 69:263-71 (2006)). Экспрессия LOX1 у людей не является конститутивной, а является динамически индуцируемой провоспалительными стимулами. В атеросклеротической бляшке LOX1 экспрессируется на эндотелиальных клетках, гладкомышечных клетках и макрофагах. Примечательно, что sLOX1 сыворотки был предложен в качестве диагностического критерия нестабильности и разрыва бляшек у пациентов с острым коронарным синдромом (ACS) (Nakamura ., 51:158-163 (2010)); для прогнозирования рецидива ACS или летального исхода (Kume 70 Scientific Sessions of the American Heart Association Ser. 96, 1997); и он связан с увеличенным числом комплексных поражений (Zhao ., 34:172-177 (2011)).
[7]
Связанная с атеросклерозом смертность продолжает расти, что обусловлено возрастающей распространенностью гипертензии, диабета, дислипидемии и особенностями образа жизни (например, курением и ожирением), которые являются факторами риска возникновения атеросклероза. Меры с применением стандартных видов лечения, в том числе ингибиторы тромбоцитов, антигипертензивные препараты, ингибиторы HMG-CoA редуктаз (статины), тромболитические средства, чрескожная дилатация артерий, стентирование или шунтирование коронарной артерии, имели значительный клинический результат. Тем не менее, несмотря на применение профилактических стратегий и лечения, все еще остается множество пациентов, которые страдают от вторичных тяжелых неблагоприятных сердечно-сосудистых явлений (MACE). Следовательно, существует потребность в новых терапевтических средствах, которые можно применять по отдельности или в комбинации со стандартным лечением.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ
[8]
В настоящем раскрытии предусматривают LOX1-связывающие белки и способы их применения. В конкретных аспектах LOX1-связывающие белки, раскрытые в данном документе, обеспечивают снижение, ингибирование или блокирование связывания LOX1 с одним или несколькими его лигандами. В некоторых аспектах LOX1-связывающие белки обеспечивают снижение, ингибирование или блокирование связывания LOX1 с окисленным липопротеином низкой плотности (oxLDL), С-реактивным белком (CRP) и/или конечными продуктами усиленного гликозилирования (AGE). В некоторых аспектах в настоящем раскрытии предусматривают способы применения LOX1-связывающих белков для лечения, предупреждения и/или облегчения заболевания или состояния, связанного с экспрессией LOX1 и/или подавлением опосредованной HDL передачи сигнала. В настоящем раскрытии также предусматривают способы применения LOX1-связывающих белков для лечения, предупреждения и/или облегчения острого коронарного синдрома (ACS), инфаркта миокарда (MI) или коронарной недостаточности (CAD) или состояния, связанного с ACS, MI или CAD. В некоторых аспектах в настоящем раскрытии предусматривают способы применения LOX1-связывающих белков для лечения, предупреждения и/или облегчения заболевания или состояния, выбранного из группы, включающей без ограничения: атеросклероз, тромбоз, коронарную недостаточность (CAD), ишемию (например, ишемию миокарда), инфаркт (например, инфаркт миокарда), острый коронарный синдром (ACS), инсульт, реперфузионное повреждение, рестеноз, заболевание периферических сосудов, гипертензию, сердечную недостаточность, воспаление, ангиогенез, преэклампсию и рак.
[9]
В некоторых аспектах LOX1-связывающий белок содержит набор определяющих комплементарность участков (CDR): вариабельного участка тяжелой цепи (VH)-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3 и вариабельного участка легкой цепи (VL)-CDR1, VL-CDR2 и VL-CDR3, где набор CDR предусматривает в общей сложности 18 или меньше (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 или 18) аминокислотных замен, делеций и/или вставок по сравнению с эталонным набором CDR, или идентичен ему, в котором: (a) VH-CDR1 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:1; (b) VH-CDR2 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:5; (c) VH-CDR3 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:14; (d) VL-CDR1 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:30; (e) VL-CDR2 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:31; и (f) VL-CDR3 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:32.
[10]
В некоторых аспектах LOX1-связывающий белок содержит набор из шести определяющих комплементарность участков (CDR): вариабельного участка тяжелой цепи (VH)-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3 и вариабельного участка легкой цепи (VL)-CDR1, VL-CDR2 и VL-CDR3, где набор CDR предусматривает в общей сложности одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь или меньше аминокислотных замен, делеций и/или вставок по сравнению с эталонным набором CDR, или идентичен ему, в котором: (a) VH-CDR1 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:1; (b) VH-CDR2 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:2; (c) VH-CDR3 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:3; (d) VL-CDR1 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:30; (e) VL-CDR2 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:31; и (f) VL-CDR3 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:32.
[11]
В некоторых аспектах LOX1-связывающий белок содержит набор из определяющих комплементарность участков (CDR): вариабельного участка тяжелой цепи (VH)-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, вариабельного участка легкой цепи (VL)-CDR1, VL-CDR2 и VL-CDR3, где набор CDR предусматривает в общей сложности одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь или меньше аминокислотных замен, делеций и/или вставок по сравнению с эталонным набором CDR, или идентичен ему, в котором: (a) VH-CDR1 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:38; (b) VH-CDR2 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:39; (c) VH-CDR3 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:40; (d) VL-CDR1 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:55; (e) VL-CDR2 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:56; и (f) VL-CDR3 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:57.
[12]
В дополнительных аспектах LOX1-связывающий белок содержит набор из шести CDR: VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, VL-CDR1, VL-CDR2 и VL-CDR3, где: (a) VH-CDR1 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:1; (b) VH-CDR2 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:2; (c) VH-CDR3 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:3; (d) VL-CDR1 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:30; (e) VL-CDR2 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:31; и (f) VL-CDR3 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:32.
[13]
В дополнительных аспектах LOX1-связывающий белок содержит набор из шести CDR: VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, VL-CDR1, VL-CDR2 и VL-CDR3, где: (a) VH-CDR1 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:38; (b) VH-CDR2 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:39; (c) VH-CDR3 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:44; (d) VL-CDR1 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:55; (e) VL-CDR2 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:60; и (f) VL-CDR3 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:61.
[14]
В дополнительных аспектах LOX1-связывающий белок содержит набор из шести CDR: VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, VL-CDR1, VL-CDR2 и VL-CDR3, где: (a) VH-CDR1 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:38; (b) VH-CDR2 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:39; (c) VH-CDR3 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:40; (d) VL-CDR1 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:55; (e) VL-CDR2 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:56; и (f) VL-CDR3 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:57.
[15]
В некоторых аспектах LOX1-связывающий белок содержит вариабельный участок тяжелой цепи (VH), характеризующийся по меньшей мере 90, 95, 97, 98 или 99% идентичностью последовательности с SEQ ID NO:4, и/или вариабельный участок легкой цепи (VL), характеризующийся по меньшей мере 90, 95, 97, 98 или 99% идентичностью последовательности с SEQ ID NO:33.
[16]
В некоторых аспектах LOX1-связывающий белок содержит VH, характеризующийся по меньшей мере 90, 95, 97, 98 или 99% идентичностью последовательности с SEQ ID NO:41, и/или VL, характеризующийся по меньшей мере 90, 95, 97, 98 или 99% идентичностью последовательности с SEQ ID NO:58.
[17]
В некоторых аспектах LOX1-связывающий белок содержит вариабельный участок тяжелой цепи (VH), характеризующийся по меньшей мере 90, 95, 97, 98 или 99% идентичностью последовательности с SEQ ID NO:4, 19-29, 41 или 48-54; и вариабельный участок легкой цепи (VL), характеризующийся по меньшей мере 90, 95, 97, 98 или 99% идентичностью последовательности с SEQ ID NO:33, 36, 37, 58 или 65-70.
[18]
В некоторых аспектах LOX1-связывающий белок содержит вариабельный участок тяжелой цепи (VH), характеризующийся по меньшей мере 90, 95, 97, 98 или 99% идентичностью последовательности, и вариабельный участок легкой цепи (VL), характеризующийся по меньшей мере 90, 95, 97, 98 или 99% идентичностью последовательности с VH и VL, выбранными из: (a) VH с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:4 и VL с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:33; (b) VH с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:29 и VL с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:33; (c) VH с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:41 и VL с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:58; и (d) VH с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:54 и VL с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:70.
[19]
В некоторых аспектах LOX1-связывающий белок содержит вариабельный участок тяжелой цепи (VH) и вариабельный участок легкой цепи (VL), где последовательность VH предусматривает в общей сложности 15 или меньше (например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15) аминокислотных замен, делеций и/или вставок по сравнению с эталонной последовательностью VH под SEQ ID NO:4, 19-28 или 29, или идентична ей, и где последовательность VL предусматривает в общей сложности 6 или меньше (например 1, 2, 3, 4, 5, или 6) аминокислотных замен, добавлений и/или делеций по сравнению с эталонной последовательностью VL под SEQ ID NO:33, 36 или 37, или идентична ей.
[20]
В некоторых аспектах LOX1-связывающий белок содержит вариабельный участок тяжелой цепи (VH), выбранный из группы, состоящей из VH, содержащего SEQ ID NO:4, 19-29, 41 или 48-54; и вариабельный участок легкой цепи (VL), выбранный из группы, состоящей из VL, содержащего SEQ ID NO:33, 36, 37, 58 или 65-70.
[21]
В некоторых аспектах LOX1-связывающий белок содержит вариабельный участок тяжелой цепи (VH) и вариабельный участок легкой цепи (VL), выбранные из группы, состоящей из: (a) VH с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:4 и VL с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:33; (b) VH с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:29 и VL с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:33; (c) VH с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:41 и VL с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:58; и (d) VH с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:54 и VL с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:70.
[22]
В некоторых аспектах LOX1-связывающий белок содержит вариабельный участок тяжелой цепи (VH), содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:4, и вариабельный участок легкой цепи (VL), содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:33.
[23]
В некоторых аспектах LOX1-связывающий белок содержит вариабельный участок тяжелой цепи (VH), выбранный из VH, содержащего VH-CDR1 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:1, VH-CDR2 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:2, 5-12 или 13 и VH-CDR3 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:3, 14-17 или 18; и вариабельный участок легкой цепи (VL), выбранный из VL, содержащего VL-CDR1 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:30, VL-CDR2 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:31 и VL-CDR3 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:32, 34 или 35.
[24]
В некоторых аспектах LOX1-связывающий белок содержит вариабельный участок тяжелой цепи (VH) и вариабельный участок легкой цепи (VL), где последовательность VH предусматривает в общей сложности одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь или меньше аминокислотных замен, делеций и/или вставок по сравнению с эталонной последовательностью VH под SEQ ID NO:41, 48-53 или 54, или идентична ей, и где последовательность VL предусматривает в общей сложности одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь или меньше аминокислотных замен, добавлений и/или делеций по сравнению с эталонной последовательностью VL под SEQ ID NO:58, 65-69 или 70, или идентична ей.
[25]
В некоторых аспектах LOX1-связывающий белок содержит вариабельный участок тяжелой цепи (VH), выбранный из VH, содержащего VH-CDR1 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:38, VH-CDR2 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:39, 42 или 43, и VH-CDR3 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:40, 44-46 или 47; и вариабельный участок легкой цепи (VL), выбранный из VL, содержащего VL-CDR1 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:55 или 59, VL-CDR2 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:56 или 60 и VL-CDR3 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:57, 61-63 или 64.
[26]
В некоторых аспектах LOX1-связывающий белок содержит набор CDR: VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, VL-CDR1, VL-CDR3 и VL-CDR3, описанных в таблице 1, на фигуре 4 или на фигуре 5 (например, набор CDR из Lox514, LX5140011, LX5140014, LX5140016, LX5140038, LX5140094, LX5140108, LX5140110, LX5140092, LX5140092_D, LX5140093, LX5140093_D, Lox696, LX6960067_ngl1, LX6960071_ngl1, LX6960073_ngl1, LX6960086_ngl1, LX6960094_ngl1, LX6960101_ngl1, LX6960102_ngl1, LX6960116_ngl1, LX6960073_gl или LX6960073_G82bs_gl).
[27]
В некоторых дополнительных аспектах LOX1-связывающий белок содержит вариабельный участок тяжелой цепи (VH) и вариабельный участок легкой цепи (VL), описанные в таблице 1, на фигуре 4 или на фигуре 5 (например, VH и VL из Lox514, LX5140011, LX5140014, LX5140016, LX5140038, LX5140094, LX5140108, LX5140110, LX5140092, LX5140092_D, LX5140093, LX5140093_D, Lox696, LX6960067_ngl1, LX6960071_ngl1, LX6960073_ngl1, LX6960086_ngl1, LX6960094_ngl1, LX6960101_ngl1, LX6960102_ngl1, LX6960116_ngl1, LX6960073_gl или LX6960073_G82bs_gl).
[28]
В некоторых аспектах выделенный LOX1-связывающий белок содержит набор определяющих комплементарность участков (CDR): вариабельный участок тяжелой цепи (VH)-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3 и вариабельный участок легкой цепи (VL)-CDR1, VL-CDR2 и VL-CDR3, где: (a) VH-CDR1 содержит аминокислотную последовательность: E L S M H (SEQ ID NO: 1); (b) VH-CDR2 содержит аминокислотную последовательность: G F D P E D HX1 HX2 HX3 HX4 HX5 HX6 Q K F Q G, где HX1 выбрана из группы, состоящей из G, W, Y и F, HX2 выбрана из группы, состоящей из E, T, Q, K, A и S, HX3 выбрана из группы, состоящей из T, Y, I и N, HX4 выбрана из группы, состоящей из I, A, R и H, HX5 выбрана из группы, состоящей из Y, V, T, L и Q, и HX6 выбрана из группы, состоящей из A, D, G, S и H (SEQ ID NO: 71); (c) VH-CDR3 содержит аминокислотную последовательность: HX7 HX8 G HX9 HX10 HX11 HX12 G V R G W D Y Y Y G M D V, где HX7 выбрана из группы, состоящей из P, S и V, HX8 выбрана из группы, состоящей из N, W, D, и T, HX9 выбрана из группы, состоящей из Q, R и T, HX10 выбрана из группы, состоящей из Q и H, HX11 выбрана из группы, состоящей из G и Q, и HX12 выбрана из группы, состоящей из K и G (SEQ ID NO: 72); (d) VL-CDR1 содержит аминокислотную последовательность: T G S S S N I G A G Y D V H (SEQ ID NO: 30); (e) VL-CDR2 содержит аминокислотную последовательность: G N S N R P S (SEQ ID NO: 31); и (f) VL-CDR3 содержит аминокислотную последовательность: Q S Y D S LX1 LX2 LX3 LX4 LX5 LX6, где LX1 выбрана из группы, состоящей из M и S, LX2 выбрана из группы, состоящей из L, Y и H, LX3 выбрана из группы, состоящей из S и R, LX4 выбрана из группы, состоящей из A и G, или она пропущена (аминокислота отсутствует), LX5 выбрана из группы, состоящей из W и F, и LX6 выбрана из группы, состоящей из V, G и A (SEQ ID NO: 73).
[29]
В некоторых аспектах LOX1-связывающий белок связывает тот же эпитоп, что и LOX-1-связывающий белок (например, антитело к LOX-1 или его фрагмент), содержащий вариабельный участок тяжелой цепи (VH) и вариабельный участок легкой цепи (VL), описанные в таблице 1, на фигуре 4 или на фигуре 5, в том числе LOX-1-связывающий белок (например, антитело к LOX-1 или его фрагмент), содержащий последовательность VH под SEQ ID NO:4 и последовательность VL под SEQ ID NO:33.
[30]
В других аспектах в настоящем раскрытии предусматривают LOX1-связывающие белки (например, антитела, такие как полноразмерные антитела к LOX1, фрагменты антител, связывающие LOX1, и их варианты и производные), которые конкурируют или перекрестно конкурируют за связывание с LOX1 с LOX-1-связывающим белком (например, антителом к LOX-1 или его фрагментом), содержащим вариабельный участок тяжелой цепи (VH) и вариабельный участок легкой цепи (VL), описанные в таблице 1, на фигуре 4 или на фигуре 5, в том числе LOX-1-связывающим белком (например, антителом к LOX-1 или его фрагментом), содержащим последовательность VH под SEQ ID NO:4 и последовательность VL под SEQ ID NO:33.
[31]
В некоторых аспектах LOX1-связывающий белок связывает тот же эпитоп, что и антитело, содержащее последовательность VH под SEQ ID NO:4 и последовательность VL под SEQ ID NO:33.
[32]
В других аспектах в настоящем раскрытии предусматривают LOX1-связывающие белки (например, антитела, такие как полноразмерные антитела к LOX1, фрагменты антител, связывающие LOX1, и их варианты и производные), которые конкурируют или перекрестно конкурируют за связывание с LOX1 с антителом, содержащим последовательность VH под SEQ ID NO:4 и последовательность VL под SEQ ID NO:33.
[33]
5
-1
-1
6
-1
-1
5
-1
-1
-4
-1
-4
-1
-4
-1
В некоторых аспектах LOX1-связывающие белки, раскрытые в данном документе, снижают, ингибируют активность LOX1 или являются ее антагонистами. В некоторых аспектах LOX1-связывающий белок характеризуется по меньшей мере одним свойством, выбранным из группы, состоящей из следующего: (a) снижает или ингибирует связывание oxLDL, С-реактивного белка (CRP) и/или конечных продуктов усиленного гликозилирования (AGE) с LOX1, что определяют с помощью любого подходящего анализа, в том числе анализа, раскрытого в данном документе (см., например, пример 10, анализы 1, 2 и/или 3 или пример 11); (b) подавляет или ингибирует передачу сигнала с участием RhoA/Rac1, монооксида азота (NO), p38MAPK, протеинкиназы B и C, ERK1/2 и/или NFκB в эндотелиальной клетке, экспрессирующей LOX1 клеточной поверхности, что определяют с помощью любого подходящего анализа, в том числе анализа, раскрытого в данном документе (см., например, пример 11); (c) снижает или ингибирует активность каспазы-8, каспазы-9 и/или BAX в эндотелиальной клетке, экспрессирующей LOX1 клеточной поверхности, что определяют с помощью любого подходящего анализа, в том числе анализа, раскрытого в данном документе; (d) связывает LOX1 с однонуклеотидным полиморфизмом K167N, что определяют с помощью любого подходящего анализа, в том числе анализа, раскрытого в данном документе (см., например, пример 10, анализы 1, 2 и/или 3 или пример 11); (e) снижает или ингибирует интернализацию oxLDL, что определяют с помощью любого подходящего анализа, в том числе анализа, раскрытого в данном документе (см., например, пример 10, анализ 4 или пример 11); (f) подавляет или ингибирует индуцируемую oxLDL передачу сигнала LOX1, что определяют с помощью любого подходящего анализа, в том числе анализа, раскрытого в данном документе (см., например, пример 10, анализ 5 или пример 11); (g) связывает LOX1 с константой диссоциации (KD) от приблизительно 150 пМ до приблизительно 600 пМ (например, приблизительно 400 пМ), что определяют с помощью BIACORE или KinExA; (h) связывает LOX1 со скоростью ассоциации от приблизительно 1×10 M сдо приблизительно 6×10 M с (например, приблизительно 5×10 M с), что определяют с помощью BIACORE; и (i) связывает LOX1 со скоростью диссоциации от приблизительно 1×10 с до приблизительно 3×10 с (например, приблизительно 2,3×10 с), что определяют с помощью BIACORE.
[34]
2
В дополнительных аспектах LOX1-связывающий белок представляет собой антитело. В некоторых аспектах антитело представляет собой моноклональное антитело, рекомбинантное антитело, антитело человека, гуманизированное антитело, химерное антитело, биспецифическое антитело, мультиспецифическое антитело или фрагмент антитела, связывающий LOX-1. В некоторых аспектах антитело представляет собой фрагмент антитела, связывающий LOX1, выбранный из группы, состоящей из Fab-фрагмента, Fab'-фрагмента, F(ab')-фрагмента, Fv-фрагмента, диатела и молекулы одноцепочечного антитела.
[35]
В некоторых аспектах LOX1-связывающий белок представляет собой антитело, которое содержит константный участок тяжелой цепи иммуноглобулина IgG1. В некоторых аспектах константный участок IgG1 предусматривает мутацию, которая обеспечивает подавление эффекторной функции. В дополнительных аспектах константный участок IgG1 предусматривает тройную мутацию L234F/L235E/P331S, которая приводит к образованию не обладающих эффекторной функцией IgG1.
[36]
нуклеиновая кислота или набор нуклеиновых кислот, кодирующих LOX1-связывающий белок (например, антитело к LOX-1 или его фрагмент)
(например, антитело к LOX-1 или его фрагмент)
В настоящем раскрытии предусматривается выделенная . Также предусматривают вектор или набор векторов, содержащих нуклеиновые кислоты или набор нуклеиновых кислот, а также клетки-хозяева, трансформированные выделенными нуклеиновыми кислотами или векторами. В некоторых аспектах клетка-хозяин представляет собой клетку-хозяина млекопитающего, такую как клетка миеломы мыши NS0, клетка человека PER.C6 или клетка яичника китайского хомячка (CHO). Также предусматривают клетки-хозяева и гибридомы, продуцирующие LOX1-связывающие белки .
[37]
(например, антитело к LOX-1 или его фрагмент)
(например, антитело к LOX-1 или его фрагмент)
В настоящем раскрытии также предусматривают способ получения LOX1-связывающего белка, раскрытого в данном документе. В некоторых аспектах способ включает культивирование клетки-хозяина или гибридомы, способных экспрессировать LOX1-связывающий белок , в подходящих условиях и, необязательно, предусматривают способ выделения LOX1-связывающего белка, секретируемого клеткой-хозяином или гибридомой. Также в настоящем раскрытии дополнительно предусматривают LOX1-связывающий белок , выделенный с применением данных способов.
[38]
фармацевтические композиции, содержащие LOX1-связывающий белок (например, антитело к LOX-1 или его фрагмент),
и фармацевтически приемлемый носитель.
способы
.
Также предусматривают Также в данном документе предусматривают  лечения, предупреждения и/или облегчения у субъекта состояния, связанного с LOX1, повышенной активностью LOX1 и/или повышенными уровнями экспрессии LOX1, в том числе, например, атеросклероза, тромбоза, коронарной недостаточности (CAD), ишемии (например, ишемии миокарда), инфаркта (например, инфаркта миокарда), острого коронарного синдрома (ACS), инсульта, реперфузионного повреждения, рестеноза, заболевания периферических сосудов, гипертензии, сердечной недостаточности, воспаления (например, хронического воспаления), ангиогенеза, преэклампсии и/или рака. В некоторых аспектах способы включают введение нуждающемуся в этом субъекту фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество LOX1-связывающего белка
[39]
В некоторых аспектах LOX1-связывающий белок вводят отдельно. В других аспектах LOX1-связывающий белок вводят в комбинированной терапии. В некоторых аспектах LOX1-связывающий белок вводят в комбинированной терапии в дополнение к стандартному лечению/терапии.
[40]
Также предусматривают способ
снижения активности LOX1 у субъекта, включающий введение эффективного количества LOX1-связывающего белка нуждающемуся в этом субъекту.
[41]
Дополнительно предусматривают способы лечения, предупреждения и/или облегчения атеросклероза. В некоторых случаях способ включает введение LOX1-связывающего белка (например, антитела к LOX1 или его фрагмента в фармацевтической композиции, описанной в данном документе) субъекту с атеросклерозом. В других аспектах субъект, которому вводят LOX1-связывающий белок, подвержен риску развития атеросклероза. В некоторых аспектах у субъекта наблюдается проатерогенное состояние. В дополнительных аспектах проатерогенное состояние представляет собой системную красную волчанку (SLE), диабет, гипертензию, гипергликемию, сердечную недостаточность, повреждение сосудов, состояние при трансплантации органов, дислипидемию (например, гиперлипидемию), воспаление (например, хроническое воспаление и воспаление, индуцированное эндотоксинами) и/или бактериальную инфекцию. Также предусматривают способы ослабления атеросклероза. В некоторых случаях в настоящем раскрытии предусматривают способ ослабления атеросклероза у субъекта, который включает введение LOX1-связывающего белка субъекту с атеросклерозом.
[42]
Также предусматривают способы лечения, предупреждения и/или облегчения тромбоза. В некоторых случаях способ включает введение LOX1-связывающего белка (например, антитела к LOX1 или его фрагмента) субъекту с тромбозом. В других аспектах субъект, которому вводят LOX1-связывающий белок, подвержен риску развития тромбоза. В некоторых аспектах тромбоз представляет собой тромбоз артерии. В дополнительных аспектах тромбоз представляет собой тромбоз артерии.
[43]
В настоящем раскрытии также предусматривают способы лечения, предупреждения и/или облегчения коронарной недостаточности (CAD) или состояния, связанного с CAD. В некоторых случаях способ включает введение LOX1-связывающего белка (например, антитела к LOX1 или его фрагмента в фармацевтической композиции, описанной в данном документе) субъекту с CAD. В других аспектах субъект, которому вводят LOX1-связывающий белок (например, антитело к LOX1 или его фрагмент), подвержен риску развития CAD. В некоторых аспектах у субъекта наблюдается проатерогенное состояние. В дополнительных аспектах проатерогенное состояние представляет собой системную красную волчанку (SLE), диабет, гипертензию, гипергликемию, сердечную недостаточность, повреждение сосудов, состояние при трансплантации органов, дислипидемию (например, гиперлипидемию), воспаление (например, хроническое воспаление и воспаление, индуцированное эндотоксинами) и/или бактериальную инфекцию.
[44]
В настоящем раскрытии также предусматривают способы лечения, предупреждения и/или облегчения ишемии или состояния, связанного с ишемией. В некоторых случаях способ включает введение LOX1-связывающего белка (например, антитела к LOX1 или его фрагмента в фармацевтической композиции, описанной в данном документе) субъекту с ишемией. В других аспектах субъект, которому вводят LOX1-связывающий белок (например, антитело к LOX1 или его фрагмент), подвержен риску развития ишемии. В некоторых аспектах у субъекта наблюдается ишемия миокарда. В других аспектах субъект подвержен риску развития ишемии миокарда. В дополнительных аспектах у субъекта наблюдается системная красная волчанка (SLE), диабет, гипертензия, гипергликемия, сердечная недостаточность, повреждение сосудов, состояние при трансплантации органов, дислипидемия (например, гиперлипидемия), воспаление (например, хроническое воспаление и воспаление, индуцированное эндотоксинами) и/или бактериальная инфекция.
[45]
Также предусматривают способы лечения, предупреждения и/или облегчения инфаркта или состояния, связанного с инфарктом. В некоторых случаях способ включает введение LOX1-связывающего белка (например антитела к LOX1 или его фрагмента в фармацевтической композиции, описанной в данном документе) субъекту с инфарктом. В других аспектах субъект, которому вводят LOX1-связывающий белок (например, антитело к LOX1 или его фрагмент), подвержен риску развития инфаркта. В некоторых аспектах у субъекта наблюдается инфаркт миокарда. В других аспектах субъект подвержен риску развития инфаркта миокарда. В дополнительных аспектах у субъекта наблюдается ишемия, системная красная волчанка (SLE), диабет, гипертензия, гипергликемия, сердечная недостаточность, повреждение сосудов, состояние при трансплантации органов, дислипидемия (например, гиперлипидемия), воспаление (например, хроническое воспаление и воспаление, индуцированное эндотоксинами) и/или бактериальная инфекция.
[46]
В настоящем раскрытии также предусматривают способы лечения, предупреждения и/или облегчения острого коронарного синдрома (ACS) или состояния, связанного с ACS. В некоторых случаях способ включает введение LOX1-связывающего белка (например, антитела к LOX1 или его фрагмента в фармацевтической композиции, описанной в данном документе) субъекту с ACS. В других аспектах субъект, которому вводят LOX1-связывающий белок (например, антитело к LOX1 или его фрагмент), подвержен риску развития ACS. В некоторых аспектах у субъекта наблюдаются повышенные уровни растворимого LOX1 (sLOX1) в сыворотке или повышенная активность LOX1. В дополнительных аспектах у субъекта наблюдается атеросклероз.
[47]
В настоящем раскрытии также предусматривают способы лечения, предупреждения и/или облегчения инсульта или состояния, связанного с инсультом. В некоторых случаях способ включает введение LOX1-связывающего белка (например, антитела к LOX1 или его фрагмента в фармацевтической композиции, описанной в данном документе) субъекту, который перенес инсульт. В других аспектах субъект, которому вводят LOX1-связывающий белок, подвержен риску возникновения инсульта. В некоторых аспектах у субъекта наблюдаются повышенные уровни sLOX в сыворотке и/или повышенная активность LOX1. В дополнительных аспектах у субъекта наблюдается атеросклероз.
[48]
Также предусматривают способы лечения, предупреждения и/или облегчения реперфузионного повреждения или состояния, связанного с реперфузионным повреждением. В некоторых случаях способ включает введение LOX1-связывающего белка (например, антитела к LOX1 или его фрагмента в фармацевтической композиции, описанной в данном документе) субъекту с реперфузионным повреждением. В других аспектах субъект, которому вводят LOX1-связывающий белок (например, антитело к LOX1 или его фрагмент), подвержен риску развития реперфузионного повреждения. В некоторых аспектах субъекту будут делать операцию. В других аспектах субъект перенес операцию. В некоторых аспектах операция представляет собой трансплантацию или операцию коронарного шунтирования. В дополнительных аспектах у пациента наблюдается ишемически-реперфузионное повреждение миокарда или он подвержен риску его развития. В дополнительных аспектах способ обеспечивает уменьшение повреждения миокарда, снижение уровней изофермента креатинкиназы-MB (CK-MB) в сыворотке и малонового диальдегида (MDA) в сыворотке, уменьшение размера кардиомиоцитов, снижение степени инфильтрации лейкоцитов в месте повреждения и/или снижение кардиальной дисфункции (например, снижение давления в левом желудочке (LVP) и повышение давления в левом желудочке в конце диастолы (LVEDP). В дополнительных аспектах способ обеспечивает повышение ударного объема сердца, фракции укорочения и/или фракции выброса.
[49]
В настоящем раскрытии также предусматривают способы лечения, предупреждения и/или облегчения рестеноза или состояния, связанного с рестенозом. В некоторых случаях способ включает введение LOX1-связывающего белка (например, антитела к LOX1 или его фрагмента в фармацевтической композиции, описанной в данном документе) субъекту с рестенозом. В других аспектах субъект, которому вводят LOX1-связывающий белок, подвержен риску развития рестеноза. В некоторых аспектах субъекту будут делать операцию. В других аспектах субъект перенес операцию. В некоторых аспектах операция представляет собой эндоваскулярную процедуру, операцию на сосудах, операцию на сердце или ангиопластику. В дополнительных аспектах рестеноз связан с процедурой трансплантации или операцией коронарного шунтирования. В дополнительных аспектах подлежащий лечению, предупреждению и/или облегчению рестеноз представляет собой внутристентовый рестеноз или рестеноз после ангиопластики.
[50]
В дополнительных аспектах в настоящем раскрытии предусматривают способы лечения, предупреждения и/или облегчения заболевания периферических сосудов (PVD) или состояния, связанного с PVD. В некоторых случаях способ включает введение LOX1-связывающего белка (например, антитела к LOX1 или его фрагмента в фармацевтической композиции, описанной в данном документе) субъекту с PVD. В других аспектах субъект, которому вводят LOX1-связывающий белок, подвержен риску развития PVD. В некоторых аспектах у субъекта наблюдаются повышенные уровни sLOX в сыворотке и/или повышенная активность LOX1. В дополнительных аспектах у субъекта наблюдается атеросклероз.
[51]
В настоящем раскрытии также предусматривают способы лечения, предупреждения и/или облегчения воспаления или состояния, связанного с воспалением. В некоторых случаях способ включает введение LOX1-связывающего белка (например, антитела к LOX1 или его фрагмента в фармацевтической композиции, описанной в данном документе) субъекту с воспалением. В дополнительных аспектах у субъекта наблюдается хроническое воспаление. В некоторых аспектах у субъекта наблюдаются повышенные уровни oxLDL и/или sLOX в сыворотке и/или повышенная активность LOX1. В дополнительных аспектах у субъекта наблюдается атеросклероз.
[52]
В настоящем раскрытии также предусматривают способы лечения, предупреждения и/или облегчения преэклампсии или состояния, связанного с преэклампсией. В некоторых случаях способ включает введение LOX1-связывающего белка (например, антитела к LOX1 или его фрагмента в фармацевтической композиции, описанной в данном документе) субъекту с преэклампсией или эклампсией. В дополнительных аспектах у субъекта наблюдаются высокое кровяное давление и большие количества белка в моче. В некоторых аспектах у субъекта наблюдаются повышенные уровни oxLDL и/или sLOX в сыворотке и/или повышенная активность LOX1. В дополнительных аспектах у субъекта наблюдается отечность стоп, ног и/или рук.
[53]
В дополнительных аспектах в настоящем раскрытии предусматривают способы стабилизации атеросклеротической бляшки у субъекта. В некоторых случаях способ включает введение LOX1-связывающего белка (например, антитела к LOX1, такого как полноразмерное антитело к LOX1, фрагмент антитела, связывающий LOX-1, и их варианты и производные) нуждающемуся в этом субъекту. В некоторых аспектах способ обеспечивает подавление передачи сигнала с участием RhoA/Rac1, монооксида азота, p38MAPK, протеинкиназы B и C, ERK1/2 и/или пути сигнальной трансдукции NFκB в бляшке. В других аспектах способ обеспечивает снижение уровня апоптоза в бляшке. В дополнительных аспектах способ обеспечивает снижение активности каспазы-8, каспазы-9 и/или BAX и/или повышение активности BCL-2 в бляшке. В других аспектах способ обеспечивает снижение уровней молекул адгезии или цитокинов, продуцируемых бляшкой. В дополнительных аспектах способ обеспечивает снижение уровня экспрессии в бляшке E-селектина, P-селектина, ICAM-1, VCAM-1, MCP1 и/или CD40/CD40L. В дополнительных аспектах способ обеспечивает уменьшение размера атеросклеротической бляшки или сокращение ее образования, скопления макрофагов и/или уровня экспрессии MMP (например, MMP9) в атеросклеротической бляшке. В дополнительных аспектах результатом способа является подавление развития или регрессия бляшки.
[54]
Также предусматривают способы снижения потери тонуса сосудов у субъекта. В некоторых случаях способ включает введение LOX1-связывающего белка (например, антитела к LOX1, такого как полноразмерное антитело к LOX1 и фрагмент антитела, связывающий LOX-1, и их варианты и производные) нуждающемуся в этом субъекту. В некоторых аспектах способ обеспечивает снижение потери тонуса сосудов. В дополнительных аспектах способ обеспечивает снижение потери тонуса сосудов у субъекта посредством регуляции HDL-контролируемого продуцирования NO (за счет способности антитела стимулировать продуцирование эндотелиального NO). Дополнительно предусматривают способы улучшения тонуса сосудов у субъекта. В некоторых случаях способ включает введение LOX1-связывающего белка нуждающемуся в этом субъекту.
[55]
Дополнительно предусматривают способы лечения, предупреждения и/или облегчения рака. В некоторых случаях в настоящем раскрытии предусматривается способ лечения, предупреждения и/или облегчения рака у субъекта, который включает введение LOX1-связывающего белка (например, антитела к LOX1 или его фрагмента) субъекту с раком. В некоторых аспектах у субъекта наблюдается рак, выбранный из группы, состоящей из рака молочной железы, рака толстой кишки, рака яичников, меланомы, рака шейки матки, рака легкого, рака матки, рака почки и рака поджелудочной железы.
[56]
Также предусматривают способы ингибирования пролиферации, миграции или инвазии опухолевых клеток. В некоторых случаях в настоящем раскрытии предусматривается способ подавления активности LOX1, который включает приведение LOX1-связывающего белка (например, антитела к LOX1 или его фрагмента) с экспрессирующей LOX1 опухолевой клеткой. В некоторых аспектах опухолевая клетка происходит из рака, выбранного из группы, состоящей из рака молочной железы, рака толстой кишки, рака яичников, меланомы, рака шейки матки, рака легкого, рака матки, рака почки и рака поджелудочной железы. В некоторых аспектах опухолевая клетка происходит из раковой линии.
[57]
in vitro
in vivo
В настоящем раскрытии дополнительно предусматривают способы уменьшения интенсивности или ингибирования ангиогенеза. В некоторых аспектах способ уменьшения интенсивности или ингибирования ангиогенеза включает введение LOX1-связывающего белка (например, антитела к LOX1 или его фрагмента) нуждающемуся в этом субъекту. В некоторых аспектах у субъекта наблюдается состояние, связанное с патологическим ангиогенезом. В дополнительных аспектах в настоящем раскрытии предусматривают способ ингибирования ангиогенеза, который включает приведение LOX1-связывающего белка (например, антитела к LOX1 или его фрагмента) в контакт с экспрессирующей LOX1 клеткой. В некоторых аспектах клетка представляет собой эндотелиальную клетку. В дополнительных аспектах эндотелиальная клетка представляет собой эндотелиальную клетку коронарной артерии. В некоторых аспектах способ осуществляют . В других аспектах способ осуществляют .
[58]
in vivo
in vitro.
Дополнительно предусматривают способы блокирования или снижения активности LOX1. В некоторых аспектах в настоящем раскрытии предусматривают способы блокирования активности LOX1, включающие введение LOX1-связывающего белка (например, антитела к LOX1 или его фрагмента), который снижает или ингибирует взаимодействие LOX1 и LOX1-связывающего белка, такого как oxLDL, AGE и/или CRP. В некоторых аспектах LOX1 экспрессируется на поверхности эндотелиальной клетки, макрофага, гладкомышечной клетки сосудов и/или тромбоцита. В некоторых аспектах клетка представляет собой клетку, как например, эндотелиальную клетку коронарной артерии. В дополнительных аспектах клетка представляет собой гладкомышечную клетку сосудов, макрофаг или тромбоцит. В других аспектах клетка является частью атеросклеротической ткани. В некоторых аспектах способ осуществляют . В других аспектах способ осуществляют В некоторых аспектах блокированная или сниженная активность LOX1 касается связывания и/или поглощения (например, интернализации) oxLDL. В дополнительных аспектах блокированная или сниженная активность LOX1 касается индукции сигнального пути p38 (MAPK), p44/42 MAPK, протеинкиназы C (PKC), протеинкиназы B (PKB), тирозиновой протеинкиназы (PTK), фактора транскрипции NF-KB и/или AP1. В дополнительных аспектах блокированная или сниженная активность LOX1 касается индукции апоптоза. В дополнительных вариантах осуществления индукция апоптоза опосредуется каспазой-9, каспазой-3 и/или Bcl-2. В дополнительных аспектах блокированная или сниженная активность LOX1 касается экспрессии цепей A и B PDFG и/или гепарин-связывающего EGF-подобного белка (HB-EGF) в экспрессирующих LOX1 эндотелиальных клетках. В некоторых аспектах блокированная или сниженная активность LOX1 касается активности LOX1, индуцированной связыванием oxLDL с LOX1.
[59]
Дополнительно предусматривают способы блокирования или снижения активности LOX1 при патологическом состоянии, связанном с повышенными уровнями активности LOX1 или уровнями экспрессии LOX1 (например, уровнями белка sLOX1 в сыворотке). В некоторых случаях способ включает введение LOX1-связывающего белка (например, антитела к LOX1 или его фрагмента) субъекту с повышенной активностью LOX1 или уровнями экспрессии LOX1 (например, уровнями белка sLOX1 в сыворотке). В некоторых аспектах патологическое состояние представляет собой системную красную волчанку (SLE), диабет, гипертензию, гипергликемию, сердечную недостаточность, повреждение сосудов, трансплантацию, дислипидемию (гиперлипидемию), воспаление, (например, хроническое воспаление и воспаление, индуцированное эндотоксинами) или бактериальную инфекцию. В некоторых аспектах у субъекта наблюдаются повышенные уровни OxLDL. В некоторых аспектах у субъекта наблюдаются повышенные уровни OxLDL, модифицированного под действием липоксигеназы 15 LDL, модифицированного под действием липоксигеназы 15 HDL, LDL, подверженного гликированию-окислению, лизофосфатидилхолинэстеразы (LPC) и/или пальмитиновой кислоты. В дополнительных аспектах у субъекта наблюдаются повышенные уровни TNF-альфа, IL1, гамма-интерферона, LPS (липополисахарида), CRP, ангиотензина II, эндотелина I и/или AGE. В дополнительных аспектах у субъекта наблюдаются повышенные уровни растворимого LOX1 (sLOX1). В некоторых аспектах у субъекта в гене LOX1 имеется однонуклеотидный полиморфизм (SNP). В некоторых аспектах SNP в гене LOX1 представляет собой вариант LOX1 K167N.
[60]
Также предусматривают способы обеспечения агонизма или повышения активности липопротеина высокой плотности (HDL). В некоторых аспектах в настоящем раскрытии предусматривают способ повышения или стимуляции активности HDL посредством введения LOX1-связывающего белка (например, антитела к LOX1 или его фрагмента) нуждающемуся в этом субъекту. В некоторых аспектах повышенная активность HDL подразумевает стимуляцию HDL-опосредованного продуцирования эндотелиального NO. В некоторых аспектах повышенная активность HDL подразумевает ингибирование активности эндотелиальной клетки в отношении передачи сигнала NFKB. В некоторых аспектах повышение активности HDL подразумевает стимуляцию восстановления эндотелиальных клеток. В некоторых аспектах повышение активности HDL подразумевает уменьшение воспаления.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ/ФИГУР
[61]
фигуре 1
(Фиг. 1A)
(Фиг. 1B)
(Фиг. 1C)
(Фиг. 1D),
На показаны результаты ингибирования связывания oxLDL, AGE-BSA и CRP с LOX1 человека (hLOX1) с помощью антител LOX514 и LOX696. Связывание меченых DyLight 649 ox-LDL или меченых DyLight 649 AGE-BSA с hLOX1 трансфицированных клеток или связывание меченого биотином С-реактивного белка (CRP) с рекомбинантным hLOX1измеряли в присутствии LOX514 ("LOX10514-IgG1-TM") (ромбы), LOX696 ("LOX10696-IgG1-TM") (кружки) или 23C11 (квадраты), коммерчески доступного антитела мыши к LOX-1. Характерные графики показаны на фигурах 1A, 1B и 1C, демонстрирующие зависимое от дозы ингибирование связывания oxLDL, AGE-BSA и CRP с помощью LOX514 и LOX696 соответственно. Кроме того, LOX514 и LOX696 также блокируют связывание меченых DyLight 649 ox-LDL с hLOX1 K167N трансфицированных клеток что подтверждает, что связывание данных антител блокирует связывание oxLDL с вариантом LOX1 с SNP K167N. Данные результаты демонстрируют специфическое, мультилигандное ингибирование связывания LOX1 с oxLDL, AGE-BSA и CRP с помощью антител LOX514 и LOX696; и что LOX514 и LOX696 функциональным образом перекрестно реагируют с типичным вариантом LOX1 с SNP K167N. M=молярная концентрация антитела; планки погрешностей обозначают стандартную ошибку.
[62]
фигуре 2
(Фиг. 2A)
(Фиг. 2B)
(Фиг. 2B).
На показаны результаты ингибирования с помощью антител LOX514 и LOX696 интернализации oxLDL и oxLDL-опосредованного образования активных форм кислорода (ROS). Интернализацию меченых Cypher 5E ox-LDL или oxLDL-зависимое образование ROS в трансфицированных LOX1 клетках человека измеряли в присутствии LOX514 ("LOX10514-IgG1-TM") (ромбы), LOX696 ("LOX10696-IgG1-TM") (кружки) или 23C11 (квадраты), коммерчески доступного антитела мыши к LOX-1. Характерные графики показаны на фигурах 2A и 2B, демонстрирующие зависимое от дозы ингибирование интернализации oxLDL и oxLDL-зависимой передачи сигнала соответственно с помощью LOX514 и LOX696. Для oxLDL-зависимого образования ROS в трансфицированных hLOX1 клетках показаны относительные единицы флуоресценции (RFU) количества карбоксидихлорфлуоресцеина (DCF), образованного в анализе с LOX514, LOX696 и 23C11, в виде усредненного значения трех повторов Данные результаты демонстрируют, что антитела LOX514 и LOX696 ингибируют интернализацию oxLDL и oxLDL-зависимую передачу сигнала LOX-1. M=молярная концентрация антитела; планки погрешностей обозначают стандартную ошибку.
[63]
фигуре 3
фигуре 3A
фигуре 3B
На показана видовая перекрестная реактивность антител к LOX1, LOX514 и LOX696. Перекрестную реактивность антител к LOX1 человека с ортологами LOX1 различных видов оценивали с применением ELISA на основе связывания scFv. Как показано на , LOX514 ("LOX10514") и LOX696 ("LOX10696") связываются с LOX1 человека и яванского макака, но не с ортологами LOX1 мыши, крысы или кролика или сывороточным альбумином быка (отрицательный контроль). Также оценивали специфичность LOX514 и LOX696 к другим рецепторам лектина C-типа и скавенджер-рецепторам человека, родственным LOX-1, с применением ELISA на основе связывания IgG. Как показано на , LOX514 ("LOX10514 IgG1-TM") и LOX696 ("LOX10696 IgG1-TM") связывают только LOX1 человека и не связываются с CLEC-7A, CLEC-1A, CLEC-4L, CLEC-1B, SR-A1 или SR-B3 человека. Как и ожидалось, IgG1-TM CAT252, антитело изотипического контроля, не связывалось ни с одним из исследуемых рецепторов лектина C-типа и скавенджер-рецепторами человека. CLEC-7A=представитель А семейства 7 с доменом, подобным домену лектина С-типа (также известный как Dectin-1); CLEC-1A=представитель А семейства 1 с доменом, подобным домену лектина С-типа; CLEC-4L=представитель L семейства 4 с доменом, подобным домену лектина С-типа (также известный как DC-SIGN); CLEC-1B=представитель B семейства 1 с доменом, подобным домену лектина С-типа (также известный как CLEC-2); SR-A1=скавенджер-рецептор типов I и II макрофагов (также известный как MSR); SR-B3= гликопротеин 4 тромбоцитов (также известный как CD36). Планки погрешностей обозначают стандартную ошибку.
[64]
фигуре 4
(Фиг. 4A)
(Фиг. 4B)
На показаны результаты сравнения LOX514 и нескольких оптимизированных антител LOX514. Показаны результаты выравнивания аминокислотной последовательности вариабельного участка тяжелой цепи (VH) или вариабельного участка легкой цепи (VL) с LOX514 и оптимизированными антителами LOX514. Различия относительно VH или VL LOX514 выделены. FW=каркасный участок; CDR=определяющие комплементарность участки.
[65]
фигуре 5
(Фиг. 5A)
(Фиг. 5B)
На показаны результаты сравнения LOX696 и нескольких оптимизированных антител LOX696. Показаны результаты выравнивания аминокислотной последовательности вариабельного участка тяжелой цепи (VH) или вариабельного участка легкой цепи (VL) с LOX696 и оптимизированными антителами LOX696. Различия относительно VH или VL LOX696 выделены. FW=каркасный участок; CDR=определяющие комплементарность участки.
[66]
фигуре 6
На показана специфичность антител к LOX1 в отношении LOX1 человека по сравнению с несколькими рецепторами лектина C-типа и скавенджер-рецепторами человека, родственными LOX-1. Специфичность антител к LOX1 LX5140108, LX5140110, LX5140092_N>D, LX5140093_N>D, LX6960073_gl ("LX6960073") и LX6960073_G82bS_gl ("LX6960073G82bS") в формате IgG1-TM к LOX-1 человека и другим рецепторам лектина C-типа и скавенджер-рецепторам человека, родственным LOX-1, оценивали с применением ELISA на основе связывания IgG. LX5140108, LX5140110, LX5140092_N>D, LX5140093_N>D, LX6960073_gl и LX6960073_G82bS_gl связывают только LOX1 человека и не связываются с CLEC-7A, CLEC-1A, CLEC-4L, CLEC-1B, SR-A1 или SR-B3 человека. NIP228, антитело изотипического контроля IgG1-TM не связывалось с LOX-1 человека или какими-либо исследуемыми рецепторами лектина C-типа и скавенджер-рецепторами человека. CLEC-7A=представитель А семейства 7 с доменом, подобным домену лектина С-типа (также известный как Dectin-1); CLEC-1A=представитель А семейства 1 с доменом, подобным домену лектина С-типа; CLEC-4L=представитель L семейства 4 с доменом, подобным домену лектина С-типа (также известный как DC-SIGN); CLEC-1B=представитель B семейства 1 с доменом, подобным домену лектина С-типа (также известный как CLEC-2); SR-A1=скавенджер-рецептор типов I и II макрофагов (также известный как MSR); SR-B3= гликопротеин 4 тромбоцитов (также известный как CD36). Планки погрешностей обозначают стандартную ошибку.
[67]
фигуре 7
фигуре 7A
фигуре 7B
На показана перекрестная реактивность антител к LOX1 с ортологами LOX1 различных видов. Перекрестная реактивность антител к LOX1 LX5140108, LX5140110, LX5140092_N>D, LX5140093_N>D, LX6960073_gl и LX6960073_G82bS_gl в формате IgG1-TM с ортологами LOX1 различных видов оценивали с применением ELISA на основе связывания IgG. Как показано на , антитела к LOX1 LX5140108, LX5140110, LX5140092_N>D, LX5140093_N>D, LX6960073_gl и LX6960073_G82bS_gl связываются с LOX1 человека и яванского макака, но не с ортологами LOX1 мыши или крысы или CD86 (отрицательный контроль). Только LX5140108, LX5140110 и LX5140092_N>D связывают также LOX-1 кролика. NIP228, антитело изотипического контроля IgG1-TM, не связывалось с CD86 или каким-либо исследуемым ортологом LOX-1. Кроме того, проводили исследование перекрестной реактивности между LOX1 человека (huLOX) и яванского макака (cyLOX) для антител к LOX1 IgG1-TM LX5140108, LX5140110 и LX6960073_G82bS_gl ("LX6960073_G82bS") с применением конкурентного ELISA. Как показано на , LX5140108 (кружки), LX5140110 (квадраты) и LX6960073_G82bS_gl (треугольники) конкурируют как с LOX1 яванского макака, так и с LOX1 человека, что дополнительно подтверждает наличие у яванского макака перекрестной реактивности антител к LOX1 LX5140108, LX5140110 и LX6960073_G82bS_gl. Планки погрешностей обозначают стандартную ошибку.
[68]
фигуре 8
(Фиг. 8A)
(Фиг. 8B)
(Фиг. 8C)
(Фиг. 8D),
(Фиг. 8E)
(Фиг. 8F)
На показаны результаты ингибирования связывания oxLDL, AGE-BSA и CRP с LOX1 человека (hLOX1), ингибирования интернализации oxLDL и ингибирование oxLDL-зависимой передачи сигнала LOX-1 с помощью антител LX5140110 и LX6960073_G82bS_gl. Связывание меченных DyLight 649 ox-LDL или меченных DyLight 649 AGE-BSA с hLOX1 трансфицированных клеток или связывание меченного биотином С-реактивного белка (CRP) с рекомбинантным hLOX1 измеряли в присутствии LX5140110-IgG1-TM ("LOX514_110"; кружки на фигурах 8A и 8C, квадраты на фиг. 8B) или LX6960073_G82bS_gl-IgG1-TM ("LX6960073_G82bS"; квадраты на фигурах 8A и 8C, кружки на фиг. 8B). Характерные графики показаны на фигурах 8A, 8B и 8C, демонстрирующие зависимое от дозы ингибирование связывания oxLDL, AGE-BSA и CRP с hLOX1 с помощью LX5140110 и LX6960073_G82bS_gl соответственно. Кроме того, LX5140110 и LX6960073_G82bS_gl также блокируют связывание меченых DyLight 649 ox-LDL с hLOX1 K167N трансфицированных клеток что подтверждает, что связывание данных антител блокирует связывание oxLDL с вариантом LOX1 с SNP K167N. Для изучения способности LX5140110 и LX6960073_G82bS_gl блокировать интернализацию oxLDL и oxLDL-зависимую передачу сигнала LOX-1, интернализацию меченых cypher 5E ox-LDL или oxLDL-зависимое образование ROS в трансфицированных LOX1 человека клетках измеряли в присутствии LX5140110-IgG1-TM ("514_110", кружки на фиг. 8E; и "LOX10514_110", ромбы на фиг. 8F) или LX6960073_G82bS_gl-IgG1-TM ("LX6960073_G82bS", квадраты на фиг. 8E; и "LOX10696_73", квадраты Фиг. 8F). Характерные графики показаны на фигурах 8E и 8F, демонстрирующие зависимое от дозы ингибирование соответственно интернализации oxLDL и oxLDL-зависимого образования ROS с помощью LX5140110 и LX6960073_G82bS_gl. Данные результаты демонстрируют: (1) специфическое, мультилигандное ингибирование связывания LOX1 с oxLDL, AGE-BSA и CRP с помощью антител LX5140110 и LX6960073_G82bS_gl; (2) LX5140110 и LX6960073_G82bS_gl функциональным образом перекрестно реагируют с типичным вариантом LOX1 с SNP K167N; и (3) LX5140110 и LX6960073_G82bS_gl ингибируют интернализацию oxLDL и oxLDL-зависимую передачу сигнала LOX-1. M=молярная концентрация антитела; планки погрешностей обозначают стандартную ошибку.
[69]
фигуре 9A
На показаны результаты ингибирования поглощения OxLDL эндотелиальными клетками аорты человека (HAEC) с помощью LX5140110. Поглощение AlexaFluor568-OxLDL HAEC, инкубированных с 0, 0,5, 1, 5 или 10 нМ антитела к LOX1 LX5140110 ("514") или 10 нМ контрольного антитела (NIP), измеряли с применением флуоресцентной микроскопии для исследования способности LX5140110 блокировать связывание и интернализацию окисленных липопротеинов низкой плотности (OxLDL) HAEC. Анализировали примерно 12 изображений для каждого набора и спустя 1 час инкубации определяли среднее число конъюгированных с Alexafluor-568 красных флуоресцентных пузырьков OxLDL в каждой клетке. Отмечали число пузырьков на клетку с 1 стандартным отклонением. Данные результаты демонстрируют, что 5 нМ или 10 нМ LX5140110 существенно ингибируют поглощение OxLDL HAEC (p=0,0003 или p=0,0002 соответственно для 5 нМ и 10 нМ). * обозначает P<0,05 по сравнению с необработанными контролями (клетки, инкубированные только с меченным Alexa-Fluor OxLD и без антитела); планки погрешностей обозначают стандартное отклонение.
[70]
фигуре 9B
На показаны результаты подавления OxLDL-зависимой передачи сигнала NFkB в эндотелиальных клетках аорты человека (HAEC) с помощью LX5140110. HAEC, коэкспрессирующие NFκB-люциферазу и GFP, подвергали сывороточному голоданию в течение 24 часов и инкубировали в течение 8 часов с носителем (контроль); только OxLDL (50 мкг/мл); OxLDL (50 мкг/мл)+LX5140110 ("514") (10 нМ); или OxLDL (50 мкг/мл)+NIP (10 нМ). Измеряли активность люциферазы и люминесценцию, тогда как флуоресценцию GFP применяли в качестве контроля для нормализации. Данные результаты демонстрируют, что добавление 10 мМ LX5140110, но не NIP (контрольное антитело), существенно подавляет OxLDL-зависимую передачу сигнала NFkB в HAEC. N=5 для каждой группы; * обозначает P<0,05 (по сравнению с контролем, представляющим собой только носитель); # обозначает P<0,05 (по сравнению только с OxLDL); планки погрешностей обозначают стандартную ошибку.
[71]
фигуре 9C
На показаны результаты ингибирования увеличения OxLDL-зависимой активности аргиназы в эндотелиальных клетках аорты человека (HAEC) с помощью LX5140110. HAEC подвергали сывороточному голоданию в течение 24 часов и инкубировали в течение 3 часов только с носителем (контроль); OxLDL (50 мкг/мл); OxLDL (50 мкг/мл)+LX5140110 ("514") (1 нМ); OxLDL (50 мкг/мл)+LX5140110 ("514") (3 нМ); OxLDL (50 мкг/мл)+LX5140110 ("514") (10 нМ); или OxLDL (50 мкг/мл)+NIP (10 нМ). Клетки лизировали и определяли активность аргиназы с применением анализа на основе образования мочевины. Данные результаты демонстрируют, что добавление 3 нМ или 10 нМ LX5140110, но не 10 нМ NIP (контрольное антитело), обеспечивает существенное снижение OxLDL-зависимой активности аргиназы в HAEC зависимым от дозы образом. N=3 для каждой группы; * обозначает P<0,05 по сравнению с контролями, представляющими собой только носитель; # обозначает P<0,05 по сравнению с контролем OxLDL (50 мкг/мл) (без антитела); планки погрешностей обозначают стандартную ошибку.
[72]
фигуре 9D
На показано, что LX5140110 блокирует OxLDL-зависимое уменьшение продуцирования оксида азота HAEC. HAEC подвергали сывороточному голоданию (1% сыворотка) в течение ночи и инкубировали в течение 24 часов с носителем (контроль); OxLDL (50 мкг/мл); OxLDL (50 мкг/мл)+LX5140110 ("514") (0,5 нМ); OxLDL (50 мкг/мл)+LX5140110 ("514") (1 нМ); OxLDL (50 мкг/мл)+LX5140110 ("514") (5 нМ); OxLDL (50 мкг/мл)+LX5140110 ("514") (10 нМ); или OxLDL (50 мкг/мл)+NIP (10 нМ) перед добавлением DAF-FM DA (5 мкМ) в свежей среде и измерением общей флуоресценции DAF-FM DA. Данные результаты демонстрируют, что добавление 5 нМ или 10 нМ LX5140110, но не 10 нМ NIP (контрольное антитело), обеспечивает существенное ингибирование OxLDL-зависимого уменьшения продуцирования оксида азота HAEC зависимым от дозы образом. Для подтверждения того, что оксид азота (NO) продуцировался eNOS, в качестве контроля применяли ингибитор NOS L-NAME (данные не показаны). N=5 для каждой группы; * обозначает P<0,05 (по сравнению с контролем, представляющим собой только носитель); планки погрешностей обозначают стандартную ошибку.
[73]
фигуре 9E
На показано, что LX5140110 блокирует OxLDL-зависимое усиление образования активных форм кислорода (ROS) HAEC. HAEC подвергали сывороточному голоданию (1% сыворотка) в течение ночи и инкубировали в течение 24 с носителем (контроль); OxLDL (50 мкг/мл); OxLDL (50 мкг/мл)+LX5140110 ("514") (0,5 нМ); OxLDL (50 мкг/мл)+LX5140110 ("514") (1 нМ); OxLDL (50 мкг/мл)+LX5140110 ("514") (5 нМ); OxLDL (50 мкг/мл)+LX5140110 ("514") (10 нМ); или OxLDL (50 мкг/мл)+NIP (10 нМ), перед инкубированием клеток со свежей средой без фенола, содержащей 400 мкМ аналога люминола L-012. Количественно выраженные, исходя из люминесценции аналога люминола L-012, относительные световые единицы (RLU) указывают на изменения образования ROS. Данные результаты демонстрируют, что добавление 0,5 нМ, 1 нМ, 5 нМ или 10 нМ LX5140110, но не 10 нМ NIP (контрольное антитело), обеспечивает ингибирование OxLDL-зависимого образования ROS в HAEC. Для подтверждения того, что супероксид продуцировался eNOS, в качестве контроля применяли ингибитор NOS L-NAME (данные не показаны). N=5 для каждой группы; * обозначает P<0,05 по сравнению с контролями, представляющими собой только носитель; # обозначает P<0,05 по сравнению с контролем OxLDL (50 мкг/мл) (без антитела); планки погрешностей обозначают стандартную ошибку.
[74]
фигуре 9F
На показано, что аналог люминола L-012 является специфичным в отношении активных форм кислорода (ROS). HAEC подвергали сывороточному голоданию (1% сыворотка) в течение ночи и инкубировали в течение 24 часов с носителем (Veh) или утилизатором супероксида SOD (5 мМ). Как показано на фигуре 9E, добавление утилизатора супероксида SOD давало практически невыявляемые уровни люминесценции, подтверждая тем самым специфичность L-012 для измерения супероксида (ROS). * обозначает P<0,05 (по сравнению с носителем); планки погрешностей обозначают стандартную ошибку.
[75]
фигурах 9G и 9H
фигуре 9G
фигуре 9H
На показано, что LX5140110 блокирует OxLDL-опосредованное фосфорилирование киназы фокальной адгезии (FAK) по тирозину (Y) 397. HAEC подвергали сывороточному голоданию в течение 18 часов и инкубировали в течение 1 часа с 0, 0,1, 0,5, 1, 5 или 10 нМ антитела к LOX1 LX5140110 (514) или 10 нМ контрольного антитела (NIP), перед инкубированием клеток в течение часа в свежей среде с 50 мкг/мл OxLDL и разделением 10 мкг белковых лизатов на 4-15% градиентных полиакриламидных гелях. Образцы белков, которые подвергали SDS-PAGE, переносили на нитроцеллюлозные мембраны для вестерн-блоттинга. Характерные результаты блоттинга, демонстрирующие изменения фосфорилирования FAK по Tyr397 и экспрессии GAPDH, показаны на , а результаты количественного определения процентного повышения уровня фосфорилирования FAK по Tyr397 (pY397-FAK), нормализованного относительно экспрессии GAPDH, показаны на . Данные результаты демонстрируют, что добавление 5 нМ или 10 нМ LX5140110, но не 10 нМ NIP (контрольное антитело), обеспечивает ингибирование OxLDL-опосредованного фосфорилирования FAK по Tyr397 в HAEC. * обозначает P<0,05 (по сравнению с необработанным контролем); # обозначает P<0,05 по сравнению с 0 нМ LX5140110 (514); планки погрешностей обозначают стандартную ошибку.
[76]
фигуре 9I
На показано, что LOX1 является необходимым для передачи сигнала OxLDL в HAEC. Эндотелиальные клетки аорты человека (HAEC) совместно трансдуцировали аденовирусами, кодирующими NFKB-LUC, и либо не осуществляющей целенаправленное воздействие shRNA (Ad-NTsh), либо shRNA для Lox-1(Ad-Lox-1sh) для специфичного ингибирования экспрессии LOX1. Через 24 часа после трансдукции клетки обрабатывали с или без OxLDL (50 мкг/мл) и инкубировали при 37°C в течение 24 часов. Активность люциферазы светлячка измеряли в клеточных лизатах с помощью хемилюминесценции. Ad-LOX-1sh существенно ингибировала OxLDL-опосредованную передачу сигнала NFkB в HAEC по сравнению с клетками, которые инкубировали с контролем, не осуществляющей целенаправленное воздействие shRNA (Ad-NTsh) вируса. * обозначает P<0,05 (по сравнению с необработанным контролем); # обозначает P<0,05 по сравнению с OxLDL+Ad-NTsh.
[77]
фигуре 9J
На показано, что вирусный вектор, экспрессирующий короткие интерферирующие РНК, образующие шпильки (shRNA), направленные на 5'UTR-область гена LOX1 человека (LOX1-shRNA), обеспечивает снижение уровня экспрессии белка LOX1. Экспрессию белка LOX1 отслеживали с помощью иммуноблоттинга с применением антител к Lox1 (IB:LOX-1) и к GAPDH (IB:GAPDH, применяли в данном случае в качестве контроля нагрузки белка) антитела из следующих образцов: лизаты HAEC, трансдуцированные не осуществляющей целенаправленное воздействие shRNA (NT shRNA) (дорожки 1 и 2) или лизаты HAEC, трансдуцированные shRNA для Lox-1 (дорожка 3). Лизаты, соответствующие дорожкам 2 и 3, обрабатывали OxLDL (50 мкг/мл), тогда как лизаты, соответствующие дорожке 1, не подвергали действию OxLDL. Добавление LOX1-shRNA обеспечивало существенное снижение уровня экспрессии белка LOX1 (дорожка 3) по сравнению с уровнями, измеряемыми в лизатах клеток, обработанных не осуществляющей целенаправленное воздействие shRNA (дорожки 1 и 2). Эти данные подтверждают, что LOX1-shRNA эффективно ингибирует экспрессию LOX1 в HAEC.
[78]
фигуре 9K
На показано, что вирусный вектор, экспрессирующий короткие интерферирующие РНК, образующие шпильки (shRNA), направленные на 5'UTR-область гена LOX1 человека (Ad-LOX-1shRNA), обеспечивает снижение уровня экспрессии белка LOX1 зависимым от дозы образом. HAEC, трансдуцированные Lox-1 shRNA в возрастающих концентрациях (Ad-LOX-1shRNA) (0, 10, 20, 30 и 100 MOI соответственно для дорожек 1-5), стимулировали OxLDL (50 мкг/мл) (за исключением контроля, нестимулированного образца на дорожке 1). Получали клеточные лизаты и подвергали их иммуноблоттингу с антителом к LOX-1. Результаты являются репрезентативными по меньшей мере для 3 независимых экспериментов. Ad-LOX-1shRNA существенно снижала уровень экспрессии белка LOX1 зависимым от дозы образом.
[79]
фигуре 10
На показаны некоторые сигнальные пути, вовлеченные в передачу сигнала рецептора LOX1, блокируемые антителами к LOX1, раскрытыми в данном документе, в том числе LX5140110 ("514Ab").
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[80]
В настоящем раскрытии предусматривают LOX1-связывающие белки. В некоторых аспектах в настоящем раскрытии предусматривают антагонисты активности LOX1, которые представляют собой антитела к LOX1, такие как полноразмерные антитела к LOX1, фрагменты антител, связывающие LOX1, и их варианты и производные. Также предусматривают связанные с ними нуклеиновые кислоты, композиции, содержащие LOX1-связывающие белки, и способы получения LOX1-связывающих белков. Дополнительно предусматривают способы применения LOX1-связывающих белков, например, для смягчения у субъекта заболеваний или состояний, связанных с LOX1-связывающим белком, таких как атеросклероз, тромбоз, коронарная недостаточность (CAD), ишемия (например, ишемия миокарда), инфаркт (например, инфаркт миокарда), острый коронарный синдром (ACS), инсульт, реперфузионное повреждение, рестеноз, заболевание периферических сосудов, гипертензия, сердечная недостаточность, воспаление (например, хроническое воспаление), ангиогенез, преэклампсия или рак, а также варианты применения в диагностике.
[81]
Для возможности более легкого понимания настоящего раскрытия сперва приведены определения некоторых терминов. В ходе подробного описания изложены дополнительные определения.
I. Определения
[82]
Используемые в настоящем описании и прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа включают определяемые объекты и во множественном числе, если из контекста явно не следует иное. Выражения "один или несколько" и "по меньшей мере один" можно использовать в данном документе взаимозаменяемо.
[83]
Используемое в данном документе выражение "приблизительно" означает примерно, порядка, ориентировочно или около. Если выражение "приблизительно" используется совместно с числовым значением или диапазоном, то оно изменяет данные значение или диапазон, расширяя границы выше и ниже изложенных числовых значений или диапазонов. В целом, выражение "приблизительно" используется в данном документе для изменения числового значения или диапазона выше и ниже приведенного значения или диапазона с отклонением на 10%.
[84]
Кроме того, выражение "и/или" следует рассматривать как конкретное раскрытие каждого из двух указанных признаков или компонентов с другим или без другого. Таким образом, подразумевается, что выражение "и/или", используемое в такой фразе, как "А и/или В", включает "А и В", "А или В", "А" (отдельно) и "В" (отдельно). Аналогично, выражение "и/или", используемое в такой фразе, как "А, В и/или С", должно охватывать каждый из следующих аспектов: А, В и С; А, В или С; А или С; А или В; В или С; А и С; А и В; В и С; А (отдельно); В (отдельно); а также С (отдельно).
[85]
Если не определено иное, все используемые в настоящем документе технические и научные термины имеют то же значение, которое обычно понимает специалист обычной квалификации в данной области, к которой относится данное раскрытие. Например, Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press; а также Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press предоставляют специалисту общий словарь многих терминов, используемых в настоящем раскрытии.
[86]
Единицы измерения, префиксы и символы обозначены в их форме, принятой согласно Международной системе единиц (SI). Числовые диапазоны включают числа, определяющие диапазон. Если не указано иное, то аминокислотные последовательности записаны слева направо в направлении от амино- к карбокси-концу. Приведенные в данном документе заголовки не ограничивают различные аспекты настоящего раскрытия, которые могут обеспечиваться ссылкой на описание в целом. Соответственно термины, приведенные непосредственно ниже, более полно определены посредством ссылки на описание во всей своей полноте.
[87]
Какие бы аспекты ни описывались в настоящем документе формулировкой "содержащий", другие аналогичные аспекты, описываемые выражениями "состоящий из" и/или "состоящий главным образом из", также предусмотрены.
[88]
В данном документе аминокислоты обозначены с помощью их общеизвестных трехбуквенных символов или с помощью однобуквенных символов, рекомендованных Комиссией по биохимической номенклатуре IUPAC-IUB. Аналогично, нуклеотиды обозначены с помощью их общепринятых однобуквенных кодов.
[89]
Выражения "LOX1" и "лектиноподобный рецептор-1 окисленных липопротеинов низкой плотности" используются в данном документе взаимозаменяемо и относятся к LOX1 и/или биологически активным фрагментам LOX1. кДНК и аминокислотные последовательности трех изоформ hLOX1 представлены в GenBank с номерами доступа: NP_002534.1, NP_001166103.1 и NP_001166104.1, каждая из которых включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.
[90]
Выражения "ингибировать," "блокировать," "уменьшать" и "подавлять" используются в данном документе взаимозаменяемо и относятся к любому статистически значимому снижению биологической активности, в том числе полному блокированию активности. Например, "ингибирование" может относиться к снижению биологической активности LOX1 на приблизительно 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100%. Следовательно, если выражения "ингибирование" или "подавление" применяют для описания, например, эффекта в отношении LOX1-опосредованного пути сигнальной трансдукции в клетке, экспрессирующей LOX1 клеточной поверхности (например, эндотелиальной клетке, гладкомышечной клетке, макрофаге и тромбоците) и в присутствии лиганда LOX1 (например, oxLDL, CRP и AGE), то выражения относятся к способности LOX1-связывающего белка, например, антитела к LOX1, подавлять индуцированную LOX1-опосредованным действием сигнальную трансдукцию в клетке на статистически значимом уровне (например, с p-значением равным 0,05, или меньше). В некоторых аспектах в LOX1-опосредованный путь сигнальной трансдукции вовлечен представитель, выбранный из RhoA/Rac1, монооксида азота, p38MAPK, протеинкиназы B и C, ERK1/2 и/или NFκB. В дополнительных аспектах ингибированная или блокированная LOX1-опосредованная биологическая активность подразумевает программируемую клеточную гибель (т.е. апоптоз). В дополнительных вариантах осуществления сниженная, ингибированная или блокированная LOX1-опосредованная биологическая активность подразумевает LOX1-опосредованное повышение активности каспазы-8, каспазы-9 и/или снижение активности BAX. Клетка, которая экспрессирует LOX1 клеточной поверхности, может представлять собой встречающуюся в природе клетку (например, эндотелиальные клетки человека, гладкомышечные клетки и макрофаг), клетку из клеточной линии или рекомбинантную клетку, полученную в результате введения нуклеиновой кислоты, кодирующей LOX1 в клетке-хозяине.
[91]
Примеры антител по настоящему раскрытию включают типичные антитела, scFv и их комбинации, где, например, scFv ковалентно соединен (например, посредством пептидных связей или посредством химического линкера) с N-концом тяжелой цепи и/или легкой цепи типичного антитела, или встроен в тяжелую цепь и/или легкую цепь типичного антитела.
Выражения "антитело" или "иммуноглобулин", используемые в данном документе взаимозаменяемо, включают целые антитела и любой их антигенсвязывающий фрагмент или отдельные цепи. Типичное антитело содержит по меньшей мере две тяжелых (H) цепи и две легких (L) цепи, связанные между собой дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельного участка тяжелой цепи (в настоящем документе сокращенно VH) и константного участка тяжелой цепи. Константный участок тяжелой цепи состоит из трех доменов: CH1, CH2 и CH3. Каждая легкая цепь состоит из вариабельного участка легкой цепи (в настоящем документе сокращенно VL) и константного участка легкой цепи. Константный участок легкой цепи состоит из одного домена CL. Области VH и VL можно дополнительно подразделить на области гипервариабельности, называемые областями, определяющими комплементарность (CDR), чередующиеся с более консервативными участками, называемыми каркасными участками (FW). Каждая VH и VL состоит из трех CDR и четырех FW, расположенных от амино-конца к карбокси-концу в следующем порядке: FW1, CDR1, FW2, CDR2, FW3, CDR3, FW4. Вариабельные участки тяжелой и легкой цепей содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном. Константные области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина, в том числе различными клетками иммунной системы (например, эффекторными клетками) и первым компонентом (C1q) в рамках классического пути активации комплемента.
[92]
Выражение "антитело" может относиться к молекуле иммуноглобулина, которая распознает и специфически связывается с мишенью, такой как белок, полипептид, пептид, углевод, полинуклеотид, липид или комбинацией вышеуказанного, посредством по меньшей мере одного антиген-распознающего сайта вариабельного участка молекулы иммуноглобулина. Выражение "антитело" включает моноклональные антитела, рекомбинантные антитела, антитела человека, гуманизированные антитела, химерные антитела, биспецифические антитела, мультиспецифические антитела или фрагменты этих антител.
[93]
например
Выражение "антитело" охватывает интактные поликлональные антитела, интактные моноклональные антитела, области антител (такие как Fab, Fab', F(ab')2 и Fv-области), одноцепочечные Fv (scFv) мутанты, мультиспецифические антитела, такие как биспецифические антитела, полученные по меньшей мере из двух интактных антител, химерные антитела, гуманизированные антитела, антитела человека, гибридные белки, содержащие антиген-определяющую часть антитела, и любую другую модифицированную молекулу иммуноглобулина, содержащую сайт распознавания антигена, при условии, что антитела проявляют необходимую биологическую активность. Антитело может быть любым из пяти основных классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM или их подклассов (изотипов) (, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2), исходя из идентичности их константных доменов тяжелой цепи, обозначаемых как альфа, дельта, эпсилон, гамма и мю соответственно. Разные классы иммуноглобулинов характеризуются разными и хорошо известными структурами субъединиц и пространственными конфигурациями. Антитела могут быть "голыми" или конъюгированными с другими молекулами, такими как токсины, радиоактивные изотопы и т.д.
[94]
Выражение "получение последовательности зародышевого типа" означает, что аминокислоты в конкретных положениях в антителе подвергнуты обратной мутации в отношении тех аминокислот, которые находятся в том же положении, что и встречающиеся в зародышевой линии.
[95]
2
Выражение "антигенсвязывающий фрагмент антитела" или "фрагмент антитела, связывающий LOX-1" относится к части интактного антитела и также относится к определяющим комплементарность вариабельным участкам интактного антитела. Примеры фрагментов антитела включают без ограничения Fab, Fab', F(ab')2 и Fv-фрагменты, линейные антитела, одноцепочечные антитела (например, ScFv) и полиспецифические антитела, образованные из фрагментов антитела. В настоящем раскрытии также предусматривают фрагменты антител, связывающие LOX1, где фрагмент антитела представляет собой Fab-фрагмент, Fab'-фрагмент, F(ab')-фрагмент, Fv-фрагмент, диатело или молекулу одноцепочечного антитела.
[96]
"Моноклональное антитело" относится к гомогенной популяции антител, вовлеченных в высокоспецифичное распознавание и связывание одной антигенной детерминанты или эпитопа. Этим они отличаются от поликлональных антител, которые, как правило, включают разные антитела, направленные против разных антигенных детерминант. Выражение "моноклональное антитело" охватывает как интактные, так и полноразмерные моноклональные антитела, а также фрагменты антитела (такие как Fab, Fab', F(ab')2, Fv), одноцепочечные (scFv) мутанты, белки слияния, содержащие часть антитела, и любую другую модифицированную молекулу иммуноглобулина, содержащую сайт распознавания антигена. Кроме того, "моноклональное антитело" относится к таким антителам, которые получены любым из ряда способов, в том числе без ограничения посредством гибридомы, отбора с помощью фагового дисплея, рекомбинантной экспрессии и с использованием трансгенных животных.
[97]
et al., Nature
et al., Nature
et al., Science
Выражение "гуманизированное антитело" относится к антителу, полученному из иммуноглобулина, отличного от иммуноглобулина человека (например, мыши), которое было сконструировано так, чтобы содержание последовательностей не человеческого (например, мышиного) происхождения было минимальным. Как правило, гуманизированные антитела представляют собой иммуноглобулины человека, в которых остатки определяющего комплементарность участка (CDR) заменены остатками CDR видов, отличных от человека (например, мыши, крысы, кролика или хомяка), которые характеризуются требуемой специфичностью, аффинностью и функциональной способностью (Jones , 321:522-525 (1986); Riechmann , 332:323-327 (1988); Verhoeyen , 239:1534-1536 (1988)). В ряде случаев остатки каркасного участка (FW) Fv иммуноглобулина человека заменены соответствующими остатками антитела из видов, отличных от человека, которые характеризуются требуемой специфичностью, аффинностью и функциональной способностью.
[98]
Гуманизированные антитела можно дополнительно модифицировать посредством замены дополнительных остатков в каркасном участке Fv и/или в замененных, не относящихся к человеческим остатках для усовершенствования и оптимизации специфичности, аффинности и/или функциональной способности антитела. Как правило, гуманизированные антитела будут включать практически все из по меньшей мере одного, и, как правило, двух или трех вариабельных доменов, содержащих все или практически все из CDR-участков, которые соответствуют таковым у иммуноглобулина, отличного от иммуноглобулина человека, тогда как все или практически все из FW-участков являются таковыми из консенсусной последовательности иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело может также содержать по меньшей мере часть константного участка или домена (Fc) иммуноглобулина, как правило, иммуноглобулина человека. Примеры способов, используемых для получения гуманизированных антител, описаны в патентах США №№ 5225539 или 5639641.
[99]
et al.
et al., J
Molec. Biol.
th
"Вариабельный участок" антитела относится к вариабельному участку легкой цепи антитела или вариабельному участку тяжелой цепи антитела либо отдельно, либо в комбинации. Каждые из вариабельных участков тяжелой и легкой цепей состоят из четырех каркасных участков (FW), соединенных с тремя определяющими комплементарность участками (CDR), также известными как гипервариабельные участки. В каждой цепи CDR удерживаются в непосредственной близости с помощью FW-участков и вместе с CDR из другой цепи участвуют в образовании антигенсвязывающего участка антител. Существует по меньшей мере две методики определения CDR: (1) подход, основанный на межвидовой вариабельности последовательностей (т.е. Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5 ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda Md.)); и (2) подход, основанный на кристаллографических исследованиях комплексов антиген-антитело (Al-lazikani . 273:927-948 (1997)). Кроме того, для определения CDR иногда в данной области применяют комбинации этих двух подходов.
[100]
et al.,
et al.,
th
Систему нумерации согласно Kabat обычно применяют при обозначении остатка в вариабельном домене (примерно остатки 1-107 легкой цепи и остатки 1-113 тяжелой цепи) (например, Kabat Sequences of Immunological Interest, 5 Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991), включенная в данный документ посредством ссылки). Нумерация аминокислотных положений согласно Kabat относится к системе нумерации, применяемой к вариабельным доменам тяжелой цепи или вариабельным доменам легкой цепи антител в соответствии с собранными сведениями в Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991). При применении этой системы нумерации фактическая линейная аминокислотная последовательность может содержать меньшее количество аминокислот или дополнительные аминокислоты, соответствующие укорочению FW или CDR вариабельного домена или вставке в них. Например, вариабельный домен тяжелой цепи может содержать вставку одной аминокислоты (остаток 52a согласно Kabat) после остатка 52 в H2 и вставленные остатки (например, остатки 82a, 82b и 82c и т.д. согласно Kabat) после остатка 82 FW тяжелой цепи.
[101]
J. Mol. Biol.
Нумерацию остатков согласно Kabat можно определить для данного антитела путем выравнивания участков антитела с гомологией последовательности антитела со "стандартной" последовательностью с нумерацией согласно Kabat. В отличие от этого, Chothia обращается к расположению структурных петель (Chothia and Lesk, 196:901-917 (1987)). Конец петли CDR-H1 согласно Chothia при нумерации с использованием правила нумерации согласно Kabat варьирует от H32 до H34 в зависимости от длины петли (это обусловлено тем, что согласно схеме нумерации Kabat размещаются вставки в H35A и H35B; при этом если как 35A, так и 35B отсутствуют, то петля заканчивается на 32; если присутствует только 35A, то петля заканчивается на 33; если присутствуют как 35A, так и 35B, то петля заканчивается на 34). Определение гипервариабельных участков согласно AbM представляет собой компромисс между определением CDR согласно Kabat и структурных петель согласно Chothia, и применяется в программном обеспечении для моделирования антител Oxford Molecular AbM.
[102]
et al., Dev. Comp. Immunol
IMGT (ImMunoGeneTics) также предусматривает систему нумерации для вариабельных участков иммуноглобулинов, в том числе CDR. См., например, Lefranc, M.P. . 27: 55-77(2003), которая включена в данный документ посредством ссылки. Система нумерации IMGT была основана на выравнивании более 5000 последовательностей, данных о структуре и определении характеристик гипервариабельных петель, и она обеспечивает возможность легкого сравнения вариабельных и CDR-участков для всех видов. В соответствии со схемой нумерации IMGT VH-CDR1 находится в положениях 26-35, VH-CDR2 находится в положениях 51-57, VH-CDR3 находится в положениях 93-102, VL-CDR1 находится в положениях 27-32, VL-CDR2 находится в положениях 50-52 и VL-CDR3 находится в положениях 89-97.
[103]
Используемые в настоящем описании описанные последовательности VH CDR соответствуют местоположениям согласно классической нумерации по Kabat, а именно VH-CDR1 согласно Kabat находится в положениях 31-35, VH-CDR2 находится в положениях 50-65 и VH-CDR3 находится в положениях 95-102. VL-CDR1, VL-CDR2 и VL-CDR3 также соответствуют местоположениям согласно классической нумерации по Kabat, а именно положениям 24-34, 50-56 и 89-97 соответственно.
[104]
Выражение "антитело человека" означает антитело, вырабатываемое в организме человека, или антитело с аминокислотной последовательностью, соответствующей антителу, вырабатываемому в организме человека, полученное с применением любых методик, известных из уровня техники. Это определение антитела человека включает в себя интактные или полноразмерные антитела, их фрагменты и/или антитела, содержащие по меньшей мере один полипептид тяжелой и/или легкой цепи человеческого происхождения, такие как, например, антитела, содержащие полипептиды легкой цепи мышиного происхождения и тяжелой цепи человеческого происхождения.
[105]
Выражение "химерные антитела" относится к антителам, в которых аминокислотная последовательность молекулы иммуноглобулина получена от двух или более видов. Как правило, вариабельный участок как легкой, так и тяжелой цепей соответствует вариабельному участку антител, полученных от одного вида млекопитающих (например, мыши, крысы и т. д.) с требуемой специфичностью, аффинностью и функциональной способностью, в то время как константные участки гомологичны последовательностям антител, полученных от другого (обычно человека), во избежание вызывания иммунного ответа у тех видов.
[106]
et al.
Выражения "TM" или "TM-мутант" относятся к мутации в константном участке IgG1, которая приводит к подавлению эффекторной функции (например, ADCC) антитела с указанной мутацией. TM-мутант предусматривает комбинацию трех мутаций L234F/L235E/P331S, приводящих к образованию не обладающих эффекторной функцией IgG1 человека (нумерация согласно EU-индексу по Kabat (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Public Health Service, National Institutes of Health, Washington, D.C.), введенных в тяжелую цепь IgG1.
[107]
et al.
et al., J. Biol. Chem.
Выражения "YTE" или "YTE-мутант" относятся к мутации в Fc IgG1, которая приводит к усилению связывания с FcRn человека и улучшению в отношении времени полужизни в сыворотке антитела с указанной мутацией. TM-мутант предусматривает комбинацию трех мутаций M252Y/S254T/T256E, (нумерация согласно EU-индексу по Kabat (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Public Health Service, National Institutes of Health, Washington, D.C.), введенных в тяжелую цепь IgG1. См. патент США № 7658921, включенный в данный документ посредством ссылки. Было показано, что мутация YTE увеличивает время полужизни антител в сыворотке примерно в четыре раза по сравнению с таковым для того же антитела дикого типа (Dall'Acqua 281:23514-24 (2006)). См. также патент США № 7083784, включенный в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.
[108]
Выражения "LOX1-связывающий белок", "антитело к LOX1," или "антитело, которое специфично связывает LOX1" относятся к LOX1-связывающему белку, такому как антитело к LOX1, способному связывать LOX1 с достаточной аффинностью, благодаря чему антитело является применимым в качестве терапевтического средства или диагностического реагента при целенаправленном воздействии на LOX1. Степень связывания антитела к LOX1 с неродственным белком помимо LOX1 составляет менее приблизительно 10% от связывания антитела с LOX1, как измерено, например, с помощью радиоиммунологического анализа (RIA), BIACORE (с применением рекомбинантного LOX1 в качестве анализируемого компонента и антитела в качестве лиганда, или наоборот), кинетического эксклюзионного анализа (KINEXA) или других анализов связывания, известных из уровня техники. В определенных аспектах LOX1-связывающий белок представляет собой полноразмерное антитело или фрагмент антитела, связывающий LOX-1, (которое)который характеризуется константой диссоциации (KD) ≤ 1 нМ, ≤0,5 нМ, ≤0,1 нМ, ≤10 пМ или ≤1 пМ, или в некоторых случаях KD составляет от приблизительно 150 пМ до приблизительно 600 пМ или от приблизительно 400 пМ до приблизительно 600 пМ. В определенных аспектах LOX1-связывающий белок представляет собой полноразмерное антитело или фрагмент антитела, связывающий LOX-1, (которое)который характеризуется константой диссоциации (KD) ≤1 мкМ, ≤100 нМ, ≤10 нМ, ≤1 нМ, ≤0,1 нМ, ≤10 пМ, ≤1 пМ или ≤0,1 пМ, или в некоторых случаях KD составляет от приблизительно 150 пМ до приблизительно 600 пМ.
[109]
"Антагонистический" или "блокирующий" LOX1-связывающий белок представляет собой таковой, который ингибирует или снижает биологическую активность LOX1. В некоторых аспектах антагонистический LOX1-связывающий белок ингибирует способность LOX1 связывать oxLDL, AGE и/или CRP. В некоторых аспектах LOX1-связывающий белок ингибирует способность LOX1 связывать oxHDL, HSP60 лейкоциты и/или активированные тромбоциты. В некоторых аспектах LOX1-связывающий белок в значительной степени или полностью ингибирует биологическую активность LOX1. Желательно, чтобы биологическая активность LOX1 снижалась на 10%, 20%, 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% или даже 100%. В конкретных аспектах LOX1-связывающий белок представляет собой антитело к LOX1, такое как полноразмерное антитело или фрагмент антитела, связывающий LOX1. В дополнительных аспектах антитело к LOX1 ингибирует или снижает биологическую активность LOX1 на 10%, 20%, 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% или даже 100%.
[110]
D
ʺАффинность связыванияʺ, в целом, относится к силе суммы всех нековалентных взаимодействий между одним участком связывания молекулы (например, антитела) и его партнером по связыванию (например, антигеном). Если не указано иное, как используется в данном документе, "аффинность связывания" относится к присущей аффинности связывания, которая отражает взаимодействие 1:1 между членами связывающейся пары (например, антителом и антигеном). Аффинность молекулы X к ее партнеру Y в целом можно представить константой диссоциации (K). Аффинность можно измерить с помощью общеизвестных способов из уровня техники, в том числе описанных в данном документе. Антитела с низкой аффинностью, как правило, связывают антиген медленно и склонны легко диссоциировать, тогда как антитела с высокой аффинностью, как правило, связывают антиген быстрее и склонны оставаться дольше в связанном состоянии. Из уровня техники известен ряд способов измерения аффинности связывания, любой из которых можно применять для целей настоящего раскрытия.
[111]
50
50
50
50
50
"Эффективность", как правило, выражают в виде значения IC в нМ или пМ, если не указано иное. IC представляет собой медианную ингибирующую концентрацию молекулы антитела. В функциональных анализах IC представляет собой концентрацию, которая снижает биологический ответ на 50% от его максимума. В исследованиях по связыванию лиганда IC представляет собой концентрацию, которая уменьшает уровень связывания рецептора на 50% от максимального уровня специфического связывания. IC можно рассчитать любым способом, известным в данной области.
[112]
Кратность повышения эффективности LOX1-связывающего белка, раскрытого в данном документе (например, антитела, такого как полноразмерное антитело к LOX1 и фрагмент антитела, связывающий LOX-1, и их варианты и производные) по сравнению с эталонным антителом, может быть по меньшей мере приблизительно 2-кратной, по меньшей мере приблизительно 4-кратной, по меньшей мере приблизительно 6-кратной, по меньшей мере приблизительно 8-кратной, по меньшей мере приблизительно 10-кратной, по меньшей мере приблизительно 20-кратной, по меньшей мере приблизительно 30-кратной, по меньшей мере приблизительно 40-кратной, по меньшей мере приблизительно 50-кратной, по меньшей мере приблизительно 60-кратной, по меньшей мере приблизительно 70-кратной, по меньшей мере приблизительно 80-кратной, по меньшей мере приблизительно 90-кратной, по меньшей мере приблизительно 100-кратной, по меньшей мере приблизительно 110-кратной, по меньшей мере приблизительно 120-кратной, по меньшей мере приблизительно 130-кратной, по меньшей мере приблизительно 140-кратной, по меньшей мере приблизительно 150-кратной, по меньшей мере приблизительно 160-кратной, по меньшей мере приблизительно 170-кратной или по меньшей мере приблизительно 180-кратной или больше.
[113]
"Антителозависимая клеточноопосредованная цитотоксичность" или "ADCC" относится к форме цитотоксичности, при которой секретируемый Ig, связанный с Fc-рецепторами (FcR), представленными на определенных цитотоксических клетках (например, естественных клетках-киллерах (NK), нейтрофилах и макрофагах), дает возможность данным цитотоксическим эффекторным клеткам специфично связываться с несущей антиген клеткой-мишенью, а затем уничтожать клетку-мишень с помощью цитотоксинов. Специфические антитела IgG с высокой аффинностью, направленные на поверхность клеток-мишеней, "вооружают" цитотоксические клетки и исключительно необходимы для такого уничтожения. Лизис клетки-мишени является внеклеточным, требует непосредственного межклеточного контакта и не вовлекает систему комплемента. Предполагается, что помимо антител другие белки, содержащие Fc-участки, в частности Fc-гибридные белки, со способностью специфично связываться с несущей антиген клеткой-мишенью будут способными влиять на клеточноопосредованную цитотоксичность. С целью упрощения, клеточноопосредованная цитотоксичность, возникающая в результате активности Fc-гибридного белка, также упоминается в данном документе как ADCC-активность.
[114]
LOX1-связывающий белок (например, антитело к LOX1, в том числе его антигенсвязывающий фрагмент, вариант и производное), полинуклеотид, вектор, клетка или композиция, которые являются "выделенными", представляют собой полипептид, антитело, полинуклеотид, вектор, клетку или композицию, которые находятся в форме, не встречающейся в природе. Выделенные полипептиды (например, антитела к LOX1, в том числе полноразмерные антитела и фрагменты антител, связывающие LOX1), полинуклеотид, вектор, полинуклеотиды, векторы, клетки или композиции включают таковые, которые были очищены до такой степени, что они больше не находятся в такой форме, в которой они встречаются в природе. В некоторых аспектах выделенные антитело, полинуклеотид, вектор, клетка или композиция являются практически чистыми.
[115]
Под "субъектом", или "индивидом", или "животным", или "пациентом", или "млекопитающим" подразумевается любой субъект, в частности, субъект-млекопитающее, которому необходимо провести диагностику, прогнозирование или терапию. Субъекты-млекопитающие включают людей, домашних животных, сельскохозяйственных животных, используемых в спорте животных и зоопарковых животных, в том числе, например, людей, отличных от человека приматов, собак, кошек, морских свинок, кроликов, крыс, мышей, лошадей, крупный рогатый скот, медведей и т.д.
[116]
(например, LOX1-связывающего белка, раскрытого в данном документе)
Выражение "фармацевтическая композиция" относится к препарату, который пребывает в такой форме, которая обеспечивает эффективность биологической активности активного ингредиента , и который не содержит дополнительных компонентов, которые неприемлемо токсичны для субъекта, которому будут вводить композицию. Такая композиция может быть стерильной.
[117]
"Эффективное количество" или "фармацевтически эффективное количество" LOX1-связывающего белка, такого как антитело к LOX1, или другого терапевтического средства, представляет собой количество, достаточное для осуществления конкретно поставленной цели. "Эффективное количество" в отношении поставленной цели можно определить опытным путем и стандартным способом. В настоящем раскрытии предусматривают терапевтические средства для лечения, предупреждения или облегчения заболеваний и состояний, связанных с LOX1 и/или подавленной HDL-опосредованной передачей сигнала. Данные заболевания и состояния включают, например, атеросклероз, тромбоз, CAD, ишемию (например, ишемию миокарда), инфаркт (например, инфаркт миокарда), острый коронарный синдром (ACS), инсульт, реперфузионное повреждение, рестеноз, заболевание периферических сосудов, гипертензию, сердечную недостаточность, воспаление (например, хроническое воспаление), ангиогенез, преэклампсию и рак.
[118]
Слово "метка" при использовании в данном документе относится к детектируемому соединению или композиции, которая конъюгирована прямо или опосредованно с антителом с получением "меченого" антитела. Метка может быть выявляемой сама по себе (например, радиоизотопные метки или флуоресцентные метки) или, в случае ферментной метки, может катализировать химическое превращение субстратного соединения или композиции, которое является выявляемым.
[119]
Выражения, такие как "осуществление лечения", или "лечение", или "лечить", или "облегчение", или "облегчать" относятся как к (1) терапевтическим мерам, с помощью которых излечивают, замедляют развитие, ослабляют состояния и/или останавливают прогрессирование диагностированного заболевания или состояния, так и к (2) профилактическим или предупреждающим мерам, с помощью которых предупреждают и/или замедляют развитие целевого заболевания или состояния. Таким образом, к нуждающимся в лечении относят тех, у кого уже имеется заболевание или состояние; тех, кто подвержен риску развития заболевания или состояния; и тех, у кого нужно предупредить заболевание или состояние. В определенных аспектах в соответствии со способами, предусмотренными в данном документе, субъект успешно "проходит лечение", если у субъекта обнаруживается, например, полное, частичное или временное облегчение или устранение симптома, связанного с заболеванием или состоянием. Такие заболевания или состояния включают, например, атеросклероз, тромбоз, CAD, ишемию (например, ишемию миокарда), инфаркт (например, инфаркт миокарда), острый коронарный синдром (ACS), инсульт, реперфузионное повреждение, рестеноз, заболевание периферических сосудов, гипертензию, сердечную недостаточность, воспаление (например, хроническое воспаление), ангиогенез, преэклампсию и рак.
[120]
Выражения "нуклеиновая кислота" или "полинуклеотид," используемые в данном документе, могут включать один или несколько "полинуклеотидов," "молекул полинуклеотида" или "полинуклеотидные последовательности" и относятся к полимеру из нуклеотидов любой длины и включают ДНК (геномную или кДНК) и РНК. Нуклеиновые кислоты могут включать дезоксирибонуклеотиды, рибонуклеотиды, модифицированные нуклеотиды или основания, и/или их аналоги, или любой субстрат, который можно встроить в полимер с помощью ДНК- или РНК-полимеразы. "Нуклеиновая кислота" или "полинуклеотид" может содержать модифицированные нуклеотиды, такие как метилированные нуклеотиды и их аналоги. Предыдущее описание применимо ко всем указанным в данном документе полинуклеотидам, в том числе РНК и ДНК (геномной или кДНК).
[121]
Выражение "вектор" означает конструкцию, способную доставлять в клетку-хозяин, а в некоторых аспектах экспрессировать в клетке-хозяине один или несколько представляющих интерес ген(генов) или последовательность(последовательностей). Примеры векторов включают без ограничения вирусные векторы, векторы экспрессии "голой" ДНК или РНК, плазмиды, космиды или фаговые векторы, векторы экспрессии ДНК или РНК, ассоциированные с катионными конденсирующими средствами, векторы экспрессии ДНК или РНК, инкапсулированные в липосомы, и некоторые эукариотические клетки, такие как клетки-продуценты.
[122]
Выражения "полипептид", "пептид" и "белок" используются в данном документе взаимозаменяемо для обозначения полимеров из аминокислот любой длины. Полимер может быть линейным или разветвленным, может содержать модифицированные аминокислоты и его могут разделять не аминокислоты. Выражения также охватывают полимер из аминокислот, который был модифицирован в естественных условиях или посредством вмешательства; например, образованием дисульфидной связи, гликозилированием, липидизацией, ацетилированием, фосфорилированием или любой другой манипуляцией или модификацией, такой как конъюгация с метящим компонентом. В данное определение также включены, например, полипептиды, содержащие один или несколько аналогов аминокислоты (в том числе, например, не встречающиеся в природе аминокислоты и т.п.), а также другие модификации, известные из уровня техники. Следует понимать, что поскольку полипептиды согласно настоящему раскрытию исходят из антител, в некоторых аспектах данные полипептиды могут встречаться в виде одиночных цепей или связанных цепей.
[123]
Выражения "идентичный" или процентная "идентичность" последовательностей в контексте двух или более нуклеиновых кислот или белков относятся к двум или более последовательностям или подпоследовательностям, которые являются одинаковыми, или которые характеризуются определенным процентным содержанием нуклеотидов или аминокислотных остатков, которые являются одинаковыми, при сравнении и выравнивании (с введением при необходимости гэпов) для максимального соответствия, без учета каких-либо консервативных аминокислотных замен как части идентичности последовательностей. Процентную идентичность можно измерять с применением программного обеспечения или алгоритмов для сравнения последовательностей или посредством визуальной проверки. Различные алгоритмы и программное обеспечение, которые можно применять для получения выравниваний аминокислотных или нуклеотидных последовательностей, известны из уровня техники.
[124]
et al., Proc. Natl. Acad. Sci.,
et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
et al., Nucleic Acids Res.,
et al., Nucleic Acids Res.
et al., Methods in Enzymology
J. Mol. Biol.
CABIOS
Один из таких неограничивающих примеров алгоритма выравнивания последовательностей представляет собой алгоритм, описанный в Karlin 87:2264-2268 (1990), в качестве модификации в Karlin 90:5873-5877 (1993) и включенный в программы NBLAST и XBLAST (Altschul 25:3389-3402 (1991)). В определенных аспектах можно применять Gapped BLAST, описанную в Altschul 25:3389-3402 (1997), BLAST-2, WU-BLAST-2 (Altschul 266:460-480 (1996)), ALIGN, ALIGN-2 (Genentech, Южный Сан Франциско, Калифорния) или Megalign (DNASTAR) представляют собой дополнительные общедоступные программы системы программного обеспечения, которые можно применять для выравнивания последовательностей. В определенных аспектах процентную идентичность двух нуклеотидных последовательностей определяют с применением программы GAP в пакете программного обеспечения GCG (например, с применением матрицы NWSgapdna.CMP и штрафа за открытие гэпа 40, 50, 60, 70 или 90 и штрафа за продолжения гэпа 1, 2, 3, 4, 5 или 6). В некоторых альтернативных аспектах программу GAP в пакете программного обеспечения GCG, в которую включен алгоритм Нидлмана-Вунша ((48):444-453 (1970)), можно применять для определения процентной идентичности двух аминокислотных последовательностей (например, с применением либо матрицы BLOSUM 62, либо матрицы PAM250, и штрафа за открытие гэпа 16, 14, 12, 10, 8, 6 или 4 и штрафа за продолжения гэпа 1, 2, 3, 4, 5). Альтернативно, в определенных аспектах процентную идентичность нуклеотидных или аминокислотных последовательностей определяют с применением алгоритма Миллера-Майерса (, 4:11-17 (1989)). Например, процентную идентичность можно определять с применением программы ALIGN (версия 2.0) и с применением PAM120 с таблицей замен остатков, штрафа за продления гэпа 12 и штрафа за внесение гэпа 4. Специалист в данной области может определить соответствующие параметры с целью максимального выравнивания с помощью конкретного программного обеспечения для выравнивания. В определенных аспектах применяют параметры по умолчанию программного обеспечения для выравнивания.
[125]
В определенных аспектах процентная идентичность "X" первой аминокислотной последовательности со второй аминокислотной последовательностью рассчитывают как 100 x (Y/Z), где Y представляет собой количество аминокислотных остатков, посчитанных как идентичные совпадения при выравнивании первой и второй последовательностей (выравненные путем визуальной проверки или с помощью конкретной программы для выравнивания последовательностей), и Z представляет собой общее число остатков во второй последовательности. Если длина первой последовательности больше, чем второй последовательности, процентная идентичности первой последовательности со второй последовательностью будет выше, чем процентная идентичность второй последовательности с первой последовательностью.
[126]
et al., Biochem.
et al., Protein Eng.
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
"Консервативная аминокислотная замена" представляет собой замену, при которой один аминокислотный остаток замещается другим аминокислотным остатком со схожей боковой цепью. Семейства аминокислотных остатков со сходными боковыми цепями определены в данной области техники и включают основные боковые цепи (например, лизин, аргинин, гистидин), кислые боковые цепи (например, аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту), незаряженные полярные боковые цепи (например, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), неполярные боковые цепи (например, глицин, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветвленные боковые цепи (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматические боковые цепи (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Например, замена тирозина фенилаланином является консервативной заменой. В определенных аспектах консервативные замены в последовательностях LOX1-связывающих белков согласно настоящему раскрытию не отменяют связывание содержащего аминокислотную последовательность с замещением белка с LOX1. Способы идентификации нуклеотидных и аминокислотных консервативных замен, которые не устраняют связывание антигена, хорошо известны из уровня техники (см., например, Brummell 32: 1180-1 187 (1993); Kobayashi 12(10):879-884 (1999); и Burks 94:412-417 (1997)).
[127]
Выражение "эпитоп", применяемое в данном документе, относится к белковой детерминанте LOX1, например, LOX1 человека (hLOX1) или LOX1 обезьяны (например, яванского макака), способной связываться с LOX1-связывающим белком (например, антителом) согласно настоящему раскрытию. Эпитопы обычно состоят из химически активных поверхностных групп молекул, таких как аминокислоты или боковые цепи сахаров, и обычно обладают специфическими характеристиками трехмерной структуры, а также специфическими характеристиками заряда. Конформационные и неконформационные эпитопы отличаются тем, что связывание с первыми, но не с последними, утрачивается в присутствии денатурирующих растворителей. Такие LOX1-связывающие белки можно идентифицировать на основании их способности перекрестно конкурировать (например, конкурентно ингибировать связывание, со статистической значимостью) с антителами, содержащими, например, последовательность VH под SEQ ID NO:4 и последовательность VL под SEQ ID NO:33 или последовательность VH под SEQ ID NO:41 и последовательность VL под SEQ ID NO:58 в стандартных анализах на основе связывания антигена или анализах активности.
[128]
Говорят, что LOX1-связывающий белок (например, антитело) "конкурирует" с эталонной молекулой за связывание с LOX1, если он связывается с LOX1 в той мере, что он блокирует, до некоторой степени, связывание эталонной молекулы с LOX1. Способность белков конкурировать за связывание с LOX1 можно определять с помощью любого способа, известного из уровня техники, в том числе, например, конкурентного анализа ELISA. В контексте данного документа можно сказать, что LOX1-связывающий белок конкурентно ингибирует связывание эталонной молекулы с LOX1, например, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 60% или по меньшей мере на 50%.
II. LOX1-связывающие белки
[129]
В настоящем раскрытии предусматривают LOX1-связывающие белки, которые специфично связывают LOX1. В некоторых аспектах LOX1-связывающий белок представляет собой антитело (например, полноразмерное антитело к LOX1, антигенсвязывающий фрагмент антитела и их варианты и производные). В дополнительных аспектах антитело представляет собой моноклональное антитело, рекомбинантное антитело, антитело человека, гуманизированное антитело, химерное антитело, биспецифическое антитело, мультиспецифическое антитело или фрагмент этих антител. В определенных аспектах антитело к LOX1 представляет собой полноразмерное антитело.
[130]
2
3
2
2
В некоторых аспектах антитело к LOX1 представляет собой фрагмент антитела, связывающий LOX-1. В некоторых аспектах фрагмент антитела, связывающий LOX-1, представляет собой: Fab, Fab', F(ab'), Fv-фрагмент, диатело или молекулу одноцепочечного антитела. В дополнительных аспектах антитело к LOX1 представляет собой Fd, одноцепочечный Fv(scFv), Fv, соединенный дисульфидными мостиками, домен V-NAR, IgNar, интраантитело, IgGΔCH2, миниантитело, F(ab'), тетратело, триатело, диатело, однодоменное антитело, DVD-Ig, Fcab, mAb, (scFv) или scFv-Fc.
[131]
,
В дополнительных аспектах LOX1-связывающий белок представляет собой антитело, которое содержит VH и VL. В некоторых аспектах LOX1-связывающий белок (напримерантитело к LOX1 или его фрагмент) дополнительно содержит константный участок тяжелой цепи или ее фрагмент. В некоторых аспектах антитело содержит константный участок тяжелой цепи иммуноглобулина, выбранный из группы, состоящей из: (a) константного участка IgA человека или его фрагмента; (b) константного участка IgD человека или его фрагмента; (c) константного домена IgE человека или его фрагмента; (d) константного участка IgG1 человека или его фрагмента; (e) константного участка IgG2 человека или его фрагмента; (f) константного участка IgG3 человека или его фрагмента; (g) константного участка IgG4 человека или его фрагмента; и (h) константного участка IgM человека или его фрагмента. В дополнительных аспектах LOX1-связывающий белок (например, антитело к LOX1 или его фрагмент) содержит константный домен тяжелой цепи иммуноглобулина, который обладает сниженной ADCC-активностью или который был подвергнут обуславливающей ее мутации. В конкретных аспектах LOX1-связывающий белок (например, антитело к LOX1 или его фрагмент) содержит константный участок тяжелой цепи IgG1, предусматривающий мутацию, которая обеспечивает подавление эффекторной функции. В некоторых аспектах константный участок IgG1 предусматривает мутацию в положениях 234, 235 и 331, где нумерация положений приведена согласно EU-индексу по Kabat. В дополнительных аспектах константный участок IgG1 предусматривает тройные мутации L234F/L235E/P331S (TM), где нумерация положений приведена согласно EU-индексу по Kabat, приводящие к образованию не обладающих эффекторной функцией IgG1 человека. В некоторых аспектах константный участок IgG1 предусматривает тройную мутацию YTE, раскрытую в разделе "Определения" выше. В дополнительных аспектах LOX1-связывающий белок представляет собой антитело, содержащее константный участок IgG1, который предусматривает как тройную мутацию TM, так и тройную мутацию YTE.
[132]
В некоторых аспектах константный участок тяжелой цепи или ее фрагмент, например, константный участок IgG человека или ее фрагмент, могут включать один или несколько аминокислотных замен по сравнению с константным доменом IgG дикого типа, где модифицированный IgG характеризуется увеличенным временем полужизни в сравнении с временем полужизни IgG с константным доменом IgG дикого типа. Например, константный домен IgG может содержать одну или несколько аминокислотных замен аминокислотных остатков по положениям 251-257, 285-290, 308-314, 385-389 и 428-436, где нумерация аминокислотных положений приведена согласно EU-индексу, как изложено у Kabat. В некоторых аспектах константный домен IgG может содержать одну или несколько замен аминокислоты по положению 252 согласно Kabat на тирозин (Y), фенилаланин (F), триптофан (W) или треонин (T), замену аминокислоты по положению 254 согласно Kabat на треонин (T), замену аминокислоты по положению 256 согласно Kabat на серин (S), аргинин (R), глутамин (Q), глутаминовую кислоту (E), аспарагиновую кислоту (D) или треонин (T), замену аминокислоты по положению 257 согласно Kabat на лейцин (L), замену аминокислоты по положению 309 согласно Kabat на пролин (P), замену аминокислоты по положению 311 согласно Kabat на серин (S), замену аминокислоты по положению 428 согласно Kabat на треонин (T), лейцин (L), фенилаланин (F) или серин (S), замену аминокислоты по положению 433 согласно Kabat на аргинин (R), серин (S), изолейцин (I), пролин (P) или глутамин (Q) или замену аминокислоты по положению 434 согласно Kabat на триптофан (W), метионин (M), серин (S), гистидин (H), фенилаланин (F) или тирозин. Более конкретно, константный домен IgG может содержать аминокислотные замены по сравнению с константным доменом дикого типа IgG человека, в том числе в виде замены аминокислоты по положению 252 согласно Kabat на тирозин (Y), замены аминокислоты по положению 254 согласно Kabat на треонин (T) и замены аминокислоты по положению 256 согласно Kabat на глутаминовую кислоту (E).
[133]
В дополнительных аспектах LOX1-связывающий белок (например, антитело к LOX1 или его фрагмент) содержит константный домен легкой цепи иммуноглобулина выбранный из группы, состоящей из: (a) константного доменa каппа-цепи Ig человека; и (b) константного доменa лямбда-цепи Ig человека. В дополнительных аспектах LOX1-связывающий белок (например, антитело к LOX1 или его фрагмент) содержит константный домен тяжелой цепи IgG1 человека, предусматривающий тройную мутацию L234F/L235E/P331S ("IgG-TM"), приводящую к образованию не обладающих эффекторной функцией IgG1 человека и константного доменa легкой лямбда-цепи человека.
[134]
В настоящем раскрытии предусматривают выделенный LOX1-связывающий белок, содержащий VH и/или VL, которые предусматривают в общей сложности одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь или меньше аминокислотных замен, делеций и/или вставок по сравнению с эталонными VH или VL, раскрытыми в данном документе. В некоторых аспектах LOX1-связывающий белок имеет VH и/или VL, приведенные в таблице 1.
[135]
Иллюстративные LOX-1 связывающие белки представлены в таблице 1.
Таблица 1. Иллюстративные LOX-1 связывающие белки
<b>Lox514</b>
VH CDR1
ELSMH (SEQ ID NO:1)
VH CDR2
GFDPEDGETIYAQKFQG (SEQ ID NO:5)
VH CDR3
PNGQQGKGVRGWDYYYGMDV (SEQ ID NO:14)
VH
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTLTELSMHWVRQAPGKGLEWMGGFDPEDGETIYAQKFQGRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATPNGQQGKGVRGWDYYYGMDVWGRGTTVTVSS (SEQ ID NO:29)
VL CDR1
TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO:30)
VL CDR2
GNSNRPS (SEQ ID NO:31)
VL CDR3
QSYDSSLSGWV (SEQ ID NO:32)
VL
QSVVTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGWVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO:33)
<b>LX5140011</b>
VH CDR1
ELSMH (SEQ ID NO:1)
VH CDR2
GFDPEDWEYAYDQKFQG (SEQ ID NO:6)
VH CDR3
PNGQQGKGVRGWDYYYGMDV (SEQ ID NO:14)
VH
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTLTELSMHWVRQAPGKGLEWMGGFDPEDWEYAYDQKFQGRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATPNGQQGKGVRGWDYYYGMDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:19)
VL CDR1
TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO:30)
VL CDR2
GNSNRPS (SEQ ID NO:31)
VL CDR3
QSYDSSLSGWV (SEQ ID NO:32)
VL
QSVVTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGWVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO:33)
<b>LX5140014</b>
VH CDR1
ELSMH (SEQ ID NO:1)
VH CDR2
GFDPEDYTIRVGQKFQG (SEQ ID NO:7)
VH CDR3
PNGQQGKGVRGWDYYYGMDV (SEQ ID NO:14)
VH
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTLTELSMHWVRQAPGKGLEWMGGFDPEDYTIRVGQKFQGRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATPNGQQGKGVRGWDYYYGMDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:20)
VL CDR1
TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO:30)
VL CDR2
GNSNRPS (SEQ ID NO:31)
VL CDR3
QSYDSSLSGWV (SEQ ID NO:32)
VL
QSVVTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGWVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO:33)
<b>LX5140016</b>
VH CDR1
ELSMH (SEQ ID NO:1)
VH CDR2
GFDPEDWQTHTAQKFQG (SEQ ID NO:8)
VH CDR3
PNGQQGKGVRGWDYYYGMDV (SEQ ID NO:14)
VH
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTLTELSMHWVRQAPGKGLEWMGGFDPEDWQTHTAQKFQGRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATPNGQQGKGVRGWDYYYGMDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:21)
VL CDR1
TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO:30)
VL CDR2
GNSNRPS (SEQ ID NO:31)
VL CDR3
QSYDSSLSGWV (SEQ ID NO:32)
VL
QSVVTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGWVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO:33)
<b>LX5140038</b>
VH CDR1
ELSMH (SEQ ID NO:1)
VH CDR2
GFDPEDWTIHVDQKFQG (SEQ ID NO:9)
VH CDR3
PNGQQGKGVRGWDYYYGMDV (SEQ ID NO:14)
VH
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTLTELSMHWVRQAPGKGLEWMGGFDPEDWTIHVDQKFQGRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATPNGQQGKGVRGWDYYYGMDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:22)
VL CDR1
TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO:30)
VL CDR2
GNSNRPS (SEQ ID NO:31)
VL CDR3
QSYDSSLSGWV (SEQ ID NO:32)
VL
QSVVTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGWVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO:33)
<b>LX5140094</b>
VH CDR1
ELSMH (SEQ ID NO:1)
VH CDR2
GFDPEDWQYHVSQKFQG (SEQ ID NO:10)
VH CDR3
PNGQQGKGVRGWDYYYGMDV (SEQ ID NO:14)
VH
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTLTELSMHWVRQAPGKGLEWMGGFDPEDWQYHVSQKFQGRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATPNGQQGKGVRGWDYYYGMDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:23)
VL CDR1
TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO:30)
VL CDR2
GNSNRPS (SEQ ID NO:31)
VL CDR3
QSYDSMYRFG (SEQ ID NO:34)
VL
QSVVTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSMYRFG FGGGTKLTVL (SEQ ID NO:36)
<b>LX5140108</b>
VH CDR1
ELSMH (SEQ ID NO:1)
VH CDR2
GFDPEDWSNHVSQKFQG (SEQ ID NO:11)
VH CDR3
STGRQGKGVRGWDYYYGMDV (SEQ ID NO:15)
VH
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTLTELSMHWVRQAPGKGLEWMGGFDPEDWSNHVSQKFQGRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCLTSTGRQGKGVRGWDYYYGMDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:24)
VL CDR1
TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO:30)
VL CDR2
GNSNRPS (SEQ ID NO:31)
VL CDR3
QSYDSSLSGWV (SEQ ID NO:32)
VL
QSVVTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGWVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO:33)
<b>LX5140110</b>
VH CDR1
ELSMH (SEQ ID NO:1)
VH CDR2
GFDPEDFKYHTHQKFQG (SEQ ID NO:2)
VH CDR3
VWGTQGKGVRGWDYYYGMDV (SEQ ID NO:3)
VH
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTLTELSMHWVRQAPGKGLEWMGGFDPEDFKYHTHQKFQGRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCALVWGTQGKGVRGWDYYYGMDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:4)
VL CDR1
TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO:30)
VL CDR2
GNSNRPS (SEQ ID NO:31)
VL CDR3
QSYDSSLSGWV (SEQ ID NO:32)
VL
QSVVTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGWVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO:33)
<b>LX5140092</b>
VH CDR1
ELSMH (SEQ ID NO:1)
VH CDR2
GFDPEDWKYHLSQKFQG (SEQ ID NO:12)
VH CDR3
PNGTHQGGVRGWDYYYGMDV (SEQ ID NO:17)
VH
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTLTELSMHWVRQAPGKGLEWMGGFDPEDWKYHLSQKFQGRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATPNGTHQGGVRGWDYYYGMDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:26)
VL CDR1
TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO:30)
VL CDR2
GNSNRPS (SEQ ID NO:31)
VL CDR3
QSYDSSLSGWV (SEQ ID NO:32)
VL
QSVVTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGWVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO:33)
<b>LX5140092_D</b>
VH CDR1
ELSMH (SEQ ID NO:1)
VH CDR2
GFDPEDWKYHLSQKFQG (SEQ ID NO:12)
VH CDR3
PDGTHQGGVRGWDYYYGMDV (SEQ ID NO:16)
VH
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTLTELSMHWVRQAPGKGLEWMGGFDPEDWKYHLSQKFQGRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATPDGTHQGGVRGWDYYYGMDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:25)
VL CDR1
TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO:30)
VL CDR2
GNSNRPS (SEQ ID NO:31)
VL CDR3
QSYDSSLSGWV (SEQ ID NO:32)
VL
QSVVTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGWVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO:33
<b>LX5140093</b>
VH CDR1
ELSMH (SEQ ID NO:1)
VH CDR2
GFDPEDWAYHQAQKFQG (SEQ ID NO:13)
VH CDR3
PNGQQGKGVRGWDYYYGMDV (SEQ ID NO:14)
VH
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTLTELSMHWVRQAPGKGLEWMGGFDPEDWAYHQAQKFQGRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATPNGQQGKGVRGWDYYYGMDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:27)
VL CDR1
TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO:30)
VL CDR2
GNSNRPS (SEQ ID NO:31)
VL CDR3
QSYDSSHRAWA (SEQ ID NO:35)
VL
QSVVTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSHRAWAFGGGTKLTVL (SEQ ID NO:37
<b>LX5140093_D</b>
VH CDR1
ELSMH (SEQ ID NO:1)
VH CDR2
GFDPEDWAYHQAQKFQG (SEQ ID NO:13)
VH CDR3
PDGQQGKGVRGWDYYYGMDV (SEQ ID NO:18)
VH
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTLTELSMHWVRQAPGKGLEWMGGFDPEDWAYHQAQKFQGRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATPDGQQGKGVRGWDYYYGMDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:28)
VL CDR1
TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO:30)
VL CDR2
GNSNRPS (SEQ ID NO:31)
VL CDR3
QSYDSSHRAWA (SEQ ID NO:35)
VL
QSVVTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSHRAWAFGGGTKLTVL (SEQ ID NO:37
<b>Lox696</b>
VH CDR1
DYAMH (SEQ ID NO:38)
VH CDR2
GISWNSGSIGYADSVKG (SEQ ID NO:39)
VH CDR3
EGNWNYDAFDI (SEQ ID NO:44)
VH
QVQLVQSGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGNWNYDAFDIWGRGTTVTVSS (SEQ ID NO:54)
VL CDR1
TGTSSDVGGYNYVS (SEQ ID NO:55)
VL CDR2
DVSNRPS (SEQ ID NO:60)
VL CDR3
SSYTSSSTNWV (SEQ ID NO:61)
VL
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTNWVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO:70)
<b>LX6960067_ngl1</b>
VH CDR1
DYAMH (SEQ ID NO:38)
VH CDR2
GVSLQELYTGYADSVKG (SEQ ID NO:42)
VH CDR3
EGSWNYDAFDI (SEQ ID NO:45)
VH
QVQLVQSGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGVSLQELYTGYADSVKGRFTVSGDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGSWNYDAFDIWGRGTTVTVSS (SEQ ID NO:48)
VL CDR1
TGTSSDVGGYNYVS (SEQ ID NO:55)
VL CDR2
DVSNRPS (SEQ ID NO:60)
VL CDR3
LGRTWSSTNWV (SEQ ID NO:62)
VL
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCLGRTWSSTNWVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO:65)
<b>LX6960071_ngl1</b>
VH CDR1
DYAMH (SEQ ID NO:38)
VH CDR2
GISWNSGSIGYADSVKG (SEQ ID NO:39)
VH CDR3
EGNWNYDAFDI (SEQ ID NO:44)
VH
QVQLVQSGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMDSLRAEDTAVYYCAREGNWNYDAFDIWGRGTTVTVSS (SEQ ID NO:49)
VL CDR1
TGTSSDVGGYNYVS (SEQ ID NO:55)
VL CDR2
DVSNRPS (SEQ ID NO:60)
VL CDR3
MGGMGRSTNWV (SEQ ID NO:57)
VL
QSALTQPASVSGSPGQPITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCMGSMGRSTNWVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO:66)
<b>LX6960073_ngl1</b>
VH CDR1
DYAMH (SEQ ID NO:38)
VH CDR2
GISWNSGSIGYADSVKG (SEQ ID NO:39)
VH CDR3
EGSWNYDALDI (SEQ ID NO:46)
VH
QVQLVQSGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTSDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNGLRAEDTAVYYCAREGSWNYDALDIWGRGTTVTVSS (SEQ ID NO:50)
VL CDR1
TGTSSDVGGYNYVS (SEQ ID NO:55)
VL CDR2
DVSKRPS (SEQ ID NO:56)
VL CDR3
MGGMGRSTNWV (SEQ ID NO:57)
VL
QSALTQPASVSGSPGQPITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSKRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCMGGMGRSTNWVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO:67)
<b>LX6960086_ngl1</b>
VH CDR1
DYAMH (SEQ ID NO:38)
VH CDR2
GISWNSPDRYMDDSVKG (SEQ ID NO:43)
VH CDR3
EGNWNYDAFDI (SEQ ID NO:44)
VH
QVQLVQSGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSPDRYMDDSVKGRFTISRDNAQNSLYLQMDSLRAEDTAVYYCAREGNWNYDAFDIWGRGTTVTVSS (SEQ ID NO:51)
VL CDR1
TGTSSDVGGYNYVS (SEQ ID NO:55)
VL CDR2
DVSNRPS (SEQ ID NO:60)
VL CDR3
LGRTWSSTNWV (SEQ ID NO:62)
VL
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCLGRTWSSTNWVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO:65)
<b>LX6960094_ngl1</b>
VH CDR1
DYAMH (SEQ ID NO:38)
VH CDR2
GISWNSGSIGYADSVKG (SEQ ID NO:39)
VH CDR3
EGNWNYDAFDI (SEQ ID NO:44)
VL
QVQLVQSGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGNWNYDAFDIWGRGTTVTVSS (SEQ ID NO:54)
VL CDR1
TGTSSDVGGYNYVS (SEQ ID NO:55)
VL CDR2
DVSNRPS (SEQ ID NO:60)
VL CDR3
AQRTVSSTNWV (SEQ ID NO:64)
VL
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCAQRTVSSTNWVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO:68)
<b>LX6960101_ngl1</b>
VH CDR1
DYAMH (SEQ ID NO:38)
VH CDR2
GISWNSGSIGYADSVKG (SEQ ID NO:39)
VH CDR3
EGNWNYDAFDV (SEQ ID NO:47)
VH
QVQLVQSGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNGLRAEDTAVYYCAREGNWNYDAFDVWGRGTTVTVSS (SEQ ID NO:52)
VL CDR1
TGTSSDVGGYNYVS (SEQ ID NO:55)
VL CDR2
DVSNRPS (SEQ ID NO:60)
VL CDR3
MGGMGRSTNWV (SEQ ID NO:57)
VL
QSALTQPASVSGSPGQPITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSKRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCMGGMGRSTNWVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO:67)
<b>LX6960102_ngl1</b>
VH CDR1
DYAMH (SEQ ID NO:38)
VH CDR2
GISWNSGSIGYADSVKG (SEQ ID NO:39)
VH CDR3
EGNWNYDAFDI (SEQ ID NO:44)
VH
QVQLVQSGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGNWNYDAFDIWGRGTTVTVSS (SEQ ID NO:54)
VL CDR1
TGTSSDVGGYNYVS (SEQ ID NO:55)
VL CDR2
DVSNRPS (SEQ ID NO:60)
VL CDR3
MGGMGRSTNWV (SEQ ID NO:57)
VL
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTNWVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO:70)
<b>LX6960116_ngl1</b>
VH CDR1
DYAMH (SEQ ID NO:38)
VH CDR2
GISWNSGSIGYADSVKG (SEQ ID NO:39)
VH CDR3
EGNWNYDAFDI (SEQ ID NO:44)
VH
QVQLVQSGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGNWNYDAFDIWGRGTTVTVSS (SEQ ID NO:54)
VL CDR1
TGTSNDVGGYNYVS (SEQ ID NO:59)
VL CDR2
DVSNRPS (SEQ ID NO:60)
VL CDR3
SSYTSSSTNWV (SEQ ID NO:61)
VL
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSNDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCMGSMGRSTNWVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO:69)
<b>LX6960073_gl</b>
VH CDR1
DYAMH (SEQ ID NO:38)
VH CDR2
GISWNSGSIGYADSVKG (SEQ ID NO:39)
VH CDR3
EGSWNYDALDI (SEQ ID NO:40)
VH
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTSDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNGLRAEDTAVYYCAREGSWNYDALDIWGQGTMVTVSS (SEQ ID NO:53)
VL CDR1
TGTSSDVGGYNYVS (SEQ ID NO:55)
VL CDR2
DVSKRPS (SEQ ID NO:56)
VL CDR3
MGGMGRSTNWV (SEQ ID NO:57)
VL
QSALTQPASVSGSPGQPITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSKRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCMGGMGRSTNWVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO:58)
<b>LX6960073_G82bS_gl</b>
VH CDR1
DYAMH (SEQ ID NO:38)
VH CDR2
GISWNSGSIGYADSVKG (SEQ ID NO:39)
VH CDR3
EGSWNYDALDI (SEQ ID NO:40)
VH
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTSDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGSWNYDALDIWGQGTMVTVSS (SEQ ID NO:41)
VL CDR1
TGTSSDVGGYNYVS (SEQ ID NO:55)
VL CDR2
DVSKRPS (SEQ ID NO:56)
VL CDR3
MGGMGRSTNWV (SEQ ID NO:57)
VL
QSALTQPASVSGSPGQPITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSKRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCMGGMGRSTNWVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO:58)
[136]
В некоторых аспектах выделенный LOX1-связывающий белок содержит последовательность VH, которая предусматривает в общей сложности одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь или меньше аминокислотных замен, делеций и/или вставок по сравнению с эталонной последовательностью VH под SEQ ID NO:4. В настоящем раскрытии также предусматривают нуклеиновые кислоты, кодирующие LOX1-связывающий белок, векторы, содержащие данные нуклеиновые кислоты, и клетки-хозяева, трансформированные данными нуклеиновыми кислотами и векторами, а также способы получения и применения LOX1-связывающего белка.
[137]
В дополнительных аспектах в настоящем раскрытии предусматривают выделенный LOX1-связывающий белок, содержащий VH под SEQ ID NO:4. В настоящем раскрытии также предусматривают нуклеиновые кислоты, кодирующие LOX1-связывающий белок, векторы, содержащие данные нуклеиновые кислоты, и клетки-хозяева, трансформированные данными нуклеиновыми кислотами и векторами, а также способы получения и применения LOX1-связывающего белка.
[138]
В некоторых аспектах выделенный LOX1-связывающий белок содержит последовательность VL, которая предусматривает в общей сложности одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь или меньше аминокислотных замен, делеций и/или вставок по сравнению с эталонной последовательностью VL под SEQ ID NO:33. В настоящем раскрытии также предусматривают нуклеиновые кислоты, кодирующие LOX1-связывающий белок, векторы, содержащие данные нуклеиновые кислоты, и клетки-хозяева, трансформированные данными нуклеиновыми кислотами и векторами, а также способы получения и применения LOX1-связывающего белка.
[139]
В дополнительных аспектах в настоящем раскрытии предусматривают выделенный LOX1-связывающий белок, содержащий VL под SEQ ID NO:33. В настоящем раскрытии также предусматривают нуклеиновые кислоты, кодирующие LOX1-связывающий белок, векторы, содержащие данные нуклеиновые кислоты, и клетки-хозяева, трансформированные данными нуклеиновыми кислотами и векторами, а также способы получения и применения LOX1-связывающего белка.
[140]
В некоторых аспектах LOX1-связывающий белок содержит VH, выбранную из VH, содержащей VH-CDR1 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:1, VH-CDR2 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:2, 5-12 или 13 и VH-CDR3 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:3, 14-17 или 18; и легкой цепи VL, выбранной из VL, содержащей VL-CDR1 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:30, VL-CDR2 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:31 и VL-CDR3 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:32, 34 или 35. В настоящем раскрытии также предусматривают нуклеиновые кислоты, кодирующие LOX1-связывающий белок, векторы, содержащие данные нуклеиновые кислоты, и клетки-хозяева, трансформированные данными нуклеиновыми кислотами и векторами, а также способы получения и применения LOX1-связывающего белка.
[141]
В настоящем раскрытии также предусматривают выделенный LOX1-связывающий белок, содержащий последовательности VH и VL, каждая из которых предусматривает в общей сложности одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь или меньше аминокислотных замен, делеций и/или вставок по сравнению с эталонными VH и VL LOX1-связывающих белков, раскрытых в данном документе. В настоящем раскрытии также предусматривают нуклеиновые кислоты, кодирующие LOX1-связывающий белок, векторы, содержащие данные нуклеиновые кислоты, и клетки-хозяева, трансформированные данными нуклеиновыми кислотами и векторами, а также способы получения и применения LOX1-связывающего белка.
[142]
В некоторых аспектах выделенный LOX1-связывающий белок имеет VH, содержащий SEQ ID NO:4, 19-28 или 29, и VL, содержащий SEQ ID NO:33, 36 или 37. В настоящем раскрытии также предусматривают нуклеиновые кислоты, кодирующие LOX1-связывающий белок, векторы, содержащие данные нуклеиновые кислоты, и клетки-хозяева, трансформированные данными нуклеиновыми кислотами и векторами, а также способы получения и применения LOX1-связывающего белка.
[143]
В некоторых аспектах выделенный LOX1-связывающий белок содержит набор определяющих комплементарность участков (CDR): вариабельного участка тяжелой цепи (VH)-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3 и вариабельного участка легкой цепи (VL)-CDR1, VL-CDR2 и VL-CDR3, где набор CDR предусматривает в общей сложности 18 или меньше (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 или 18) аминокислотных замен, делеций и/или вставок по сравнению с эталонным набором CDR, или идентичен ему, в котором: (a) VH-CDR1 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:1; (b) VH-CDR2 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:5; (c) VH-CDR3 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:14; (d) VL-CDR1 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:30; (e) VL-CDR2 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:31; и (f) VL-CDR3 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:32. В настоящем раскрытии также предусматривают нуклеиновые кислоты, кодирующие LOX1-связывающий белок, векторы, содержащие данные нуклеиновые кислоты, и клетки-хозяева, трансформированные данными нуклеиновыми кислотами и векторами, а также способы получения и применения LOX1-связывающего белка.
[144]
В дополнительных аспектах LOX1-связывающий белок содержит набор CDR: VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, VL-CDR1, VL-CDR2 и VL-CDR3, где: (a) VH-CDR1 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:1; (b) VH-CDR2 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:2; (c) VH-CDR3 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:3; (d) VL-CDR1 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:30; (e) VL-CDR2 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:31; и (f) VL-CDR3 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:32. В настоящем раскрытии также предусматривают нуклеиновые кислоты, кодирующие LOX1-связывающий белок, векторы, содержащие данные нуклеиновые кислоты, и клетки-хозяева, трансформированные данными нуклеиновыми кислотами и векторами, а также способы получения и применения LOX1-связывающего белка.
[145]
В настоящем раскрытии также предусматривается выделенный LOX1-связывающий белок, содержащий вариабельный участок тяжелой цепи (VH), характеризующийся по меньшей мере 90, 95, 97, 98 или 99% идентичностью последовательности с эталонной последовательностью VH, раскрытой в данном документе, и/или вариабельный участок легкой цепи (VL), характеризующийся по меньшей мере 90, 95, 97, 98 или 99% идентичностью последовательности с эталонной последовательностью VL, раскрытой в данном документе (например, последовательности VH и VL, раскрытые в таблице 1, на фигуре 4 или на фигуре 5). В дополнительных аспектах в настоящем раскрытии предусматривается выделенный LOX1-связывающий белок, содержащий VH, характеризующийся по меньшей мере 90, 95, 97, 98 или 99% идентичностью последовательности с SEQ ID NO:4 и/или VL, характеризующийся по меньшей мере 90, 95, 97, 98 или 99% идентичностью последовательности с SEQ ID NO:33. В настоящем раскрытии также предусматривают нуклеиновые кислоты, кодирующие LOX1-связывающий белок, векторы, содержащие данные нуклеиновые кислоты, и клетки-хозяева, трансформированные данными нуклеиновыми кислотами и векторами, а также способы получения и применения LOX1-связывающего белка.
[146]
В некоторых аспектах LOX1-связывающий белок содержит вариабельный участок тяжелой цепи (VH), характеризующийся по меньшей мере 90, 95, 97, 98 или 99% идентичностью последовательности, и вариабельный участок легкой цепи (VL), характеризующийся по меньшей мере 90, 95, 97, 98 или 99% идентичностью последовательности с VH и VL, выбранными из группы, состоящей из: (a) VH с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:4 и VL с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:33; (b) VH с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:29 и VL с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:33; (c) VH с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:41 и VL с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:58; и (d) VH с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:54 и VL с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:70. В настоящем раскрытии также предусматривают нуклеиновые кислоты, кодирующие LOX1-связывающий белок, векторы, содержащие данные нуклеиновые кислоты, и клетки-хозяева, трансформированные данными нуклеиновыми кислотами и векторами, а также способы получения и применения LOX1-связывающего белка.
[147]
В некоторых аспектах LOX1-связывающий белок содержит VH, характеризующийся по меньшей мере 90, 95, 97, 98 или 99% идентичностью последовательности и VL, характеризующийся по меньшей мере 90, 95, 97, 98 или 99% идентичностью последовательности с VH и VL, выбранными из группы, состоящей из: (a) VH с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:19 и VL с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:33; (b) VH с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:20 и VL с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:33; (c) VH с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:21 и VL с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:33; (d) VH с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:22 и VL с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:33; (e) VH с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:23 и VL с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:33; (f) VH с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:24 и VL с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:33; (g) VH с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:25 и VL с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:33; (h) VH с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:26 и VL с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:33; (i) VH с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:27 и VL с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:37; (j) VH с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:28 и VL с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:37; (k) VH с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:48 и VL с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:65; (l) VH с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:49 и VL с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:66; (m) VH с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:50 и VL с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:67; (n) VH с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:51 и VL с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:65; (o) VH с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:54 и VL с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:68; (p) VH с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:52 и VL с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:67; (q) VH с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:54 и VL с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:69; (r) VH с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:53 и VL с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:58; и (s) VH с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:41 и VL с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:58. В настоящем раскрытии также предусматривают нуклеиновые кислоты, кодирующие LOX1-связывающий белок, векторы, содержащие данные нуклеиновые кислоты, и клетки-хозяева, трансформированные данными нуклеиновыми кислотами и векторами, а также способы получения и применения LOX1-связывающего белка.
[148]
В дополнительных аспектах в настоящем раскрытии предусматривают выделенный LOX1-связывающий белок, содержащий VH-CDR3 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:3. В дополнительных аспектах LOX1-связывающий белок содержит VH-CDR3 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:3 и VH-CDR2 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:2. В других аспектах LOX1-связывающий белок содержит VH-CDR3 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:3 и VH-CDR2 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:5-12 или 13. В дополнительных аспектах LOX1-связывающий белок содержит VH-CDR3 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:3, 14-17 или 18 и VH-CDR2 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:2. В дополнительных аспектах LOX1-связывающий белок содержит VH-CDR3 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 3, 14-17 или 18 и VH-CDR2 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:2, 5-12 или 13. В дополнительных аспектах LOX1-связывающий белок содержит VH-CDR3 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 3, 14-17 или 18 и VH-CDR2 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:2, 5-12 или 13 и VH-CDR1 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:1. В настоящем раскрытии также предусматривают нуклеиновые кислоты, кодирующие LOX1-связывающий белок, векторы, содержащие данные нуклеиновые кислоты, и клетки-хозяева, трансформированные данными нуклеиновыми кислотами и векторами, а также способы получения и применения LOX1-связывающего белка.
[149]
В дополнительных аспектах в настоящем раскрытии предусматривают выделенный LOX1-связывающий белок, содержащий VLH-CDR3 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:32. В дополнительных аспектах LOX1-связывающий белок содержит VL-CDR3 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:32 и VL-CDR2 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:31. В других аспектах LOX1-связывающий белок содержит VL-CDR3 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:32, VL-CDR2 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:31 и VL-CDR1 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:30. В других аспектах LOX1-связывающий белок содержит VL-CDR3 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:32, 34 или 35, VL-CDR2 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:31. В дополнительных аспектах LOX1-связывающий белок содержит VL-CDR3 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:32, 34 или 35, VL-CDR2 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:31 и VL-CDR1 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:30. В настоящем раскрытии также предусматривают нуклеиновые кислоты, кодирующие LOX1-связывающий белок, векторы, содержащие данные нуклеиновые кислоты, и клетки-хозяева, трансформированные данными нуклеиновыми кислотами и векторами, а также способы получения и применения LOX1-связывающего белка.
[150]
В дополнительных аспектах LOX1-связывающий белок содержит один, два или три VH-CDR, как например, VH-CDR1, который предусматривает в общей сложности одну, две или меньше аминокислотных замен, делеций или вставок по сравнению с SEQ ID NO:1 или идентичен ей, VH-CDR2, который предусматривает в общей сложности одну, две или меньше аминокислотных замен, делеций или вставок по сравнению с SEQ ID NO:2, 5-12 или 13 или идентичен ей, VH-CDR3, который предусматривает в общей сложности одну, две или меньше аминокислотных замен, делеций или вставок по сравнению с SEQ ID NO:3, 14-17 или 18 или идентичен ей.
[151]
В дополнительных аспектах LOX1-связывающий белок содержит один, два или три VL-CDR, как например, VL-CDR1, который предусматривает в общей сложности одну, две или меньше аминокислотных замен, делеций или вставок по сравнению с SEQ ID NO:30 или идентичен ей, VL-CDR2, который предусматривает в общей сложности одну, две или меньше аминокислотных замен, делеций или вставок по сравнению с SEQ ID NO:31 или идентичен ей, VH-CDR3, который предусматривает в общей сложности одну, две или меньше аминокислотных замен, делеций или вставок по сравнению с SEQ ID NO:32, 34 или 35 или идентичен ей.
[152]
В некоторых аспектах выделенный LOX1-связывающий белок содержит последовательность VH, которая предусматривает в общей сложности одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь или меньше аминокислотных замен, делеций и/или вставок по сравнению с эталонной последовательностью VH под SEQ ID NO:41. В настоящем раскрытии также предусматривают нуклеиновые кислоты, кодирующие LOX1-связывающий белок, векторы, содержащие данные нуклеиновые кислоты, и клетки-хозяева, трансформированные данными нуклеиновыми кислотами и векторами, а также способы получения и применения LOX1-связывающего белка.
[153]
В дополнительных аспектах в настоящем раскрытии предусматривают выделенный LOX1-связывающий белок, содержащий VH под SEQ ID NO:41. В настоящем раскрытии также предусматривают нуклеиновые кислоты, кодирующие LOX1-связывающие белки, векторы, содержащие данные нуклеиновые кислоты, и клетки-хозяева, трансформированные данными нуклеиновыми кислотами и векторами, а также способы получения и применения LOX1-связывающих белков.
[154]
В некоторых аспектах выделенный LOX1-связывающий белок содержит последовательность VL, которая предусматривает в общей сложности одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь или меньше аминокислотных замен, делеций и/или вставок по сравнению с эталонной последовательностью VL под SEQ ID NO:58. В настоящем раскрытии также предусматривают нуклеиновые кислоты, кодирующие LOX1-связывающий белок, векторы, содержащие данные нуклеиновые кислоты, и клетки-хозяева, трансформированные данными нуклеиновыми кислотами и векторами, а также способы получения и применения LOX1-связывающего белка.
[155]
В дополнительных аспектах в настоящем раскрытии предусматривают выделенный LOX1-связывающий белок, содержащий VL под SEQ ID NO:58. В настоящем раскрытии также предусматривают нуклеиновые кислоты, кодирующие LOX1-связывающий белок, векторы, содержащие данные нуклеиновые кислоты, и клетки-хозяева, трансформированные данными нуклеиновыми кислотами и векторами, а также способы получения и применения LOX1-связывающего белка.
[156]
В некоторых аспектах LOX1-связывающий белок содержит VH, выбранную из VH, содержащей VH-CDR1 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:38, VH-CDR2 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:39, 42 или 43 и VH-CDR3 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:40, 44-46 или 47; и легкой цепи VL, выбранной из VL, содержащей VL-CDR1 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:55 или 59, VL-CDR2 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:56 или 60 и VL-CDR3 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:57, 61-63 или 64.
[157]
В некоторых аспектах выделенный LOX1-связывающий белок имеет VH, содержащий последовательность под SEQ ID NO:41, 48-53 или 54, и VL, содержащий последовательность под SEQ ID NO:58, 65-69 или 70. В настоящем раскрытии также предусматривают нуклеиновые кислоты, кодирующие LOX1-связывающий белок, векторы, содержащие данные нуклеиновые кислоты, и клетки-хозяева, трансформированные данными нуклеиновыми кислотами и векторами, а также способы получения и применения LOX1-связывающего белка.
[158]
В некоторых аспектах выделенный LOX1-связывающий белок содержит набор из определяющих комплементарность участков (CDR): вариабельного участка тяжелой цепи (VH)-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, вариабельного участка легкой цепи (VL)-CDR1, VL-CDR2 и VL-CDR3, где набор CDR предусматривает в общей сложности одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь или меньше аминокислотных замен, делеций и/или вставок по сравнению с эталонным набором CDR, или идентичен ему, в котором: (a) VH-CDR1 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:38; (b) VH-CDR2 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:39; (c) VH-CDR3 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:44; (d) VL-CDR1 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:55; (e) VL-CDR2 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:60; и (f) VL-CDR3 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:61. В настоящем раскрытии также предусматривают нуклеиновые кислоты, кодирующие LOX1-связывающий белок, векторы, содержащие данные нуклеиновые кислоты, и клетки-хозяева, трансформированные данными нуклеиновыми кислотами и векторами, а также способы получения и применения LOX1-связывающего белка.
[159]
В некоторых аспектах выделенный LOX1-связывающий белок содержит набор из определяющих комплементарность участков (CDR): вариабельного участка тяжелой цепи (VH)-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, вариабельного участка легкой цепи (VL)-CDR1, VL-CDR2 и VL-CDR3, где набор CDR предусматривает в общей сложности одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь или меньше аминокислотных замен, делеций и/или вставок по сравнению с эталонным набором CDR, или идентичен ему, в котором: (a) VH-CDR1 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:38, (b) VH-CDR2 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:39; (c) VH-CDR3 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:40; (d) VL-CDR1 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:55; (e) VL-CDR2 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:56; и (f) VL-CDR3 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:57. В настоящем раскрытии также предусматривают нуклеиновые кислоты, кодирующие LOX1-связывающий белок, векторы, содержащие данные нуклеиновые кислоты, и клетки-хозяева, трансформированные данными нуклеиновыми кислотами и векторами, а также способы получения и применения LOX1-связывающего белка.
[160]
В дополнительных аспектах LOX1-связывающий белок содержит набор CDR: VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, VL-CDR1, VL-CDR2 и VL-CDR3, где: (a) VH-CDR1 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:38; (b) VH-CDR2 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:39; (c) VH-CDR3 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:40; (d) VL-CDR1 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:55; (e) VL-CDR2 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:56; и (f) VL-CDR3 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:57. В настоящем раскрытии также предусматривают нуклеиновые кислоты, кодирующие LOX1-связывающий белок, векторы, содержащие данные нуклеиновые кислоты, и клетки-хозяева, трансформированные данными нуклеиновыми кислотами и векторами, а также способы получения и применения LOX1-связывающего белка.
[161]
В дополнительных аспектах в настоящем раскрытии предусматривают выделенный LOX1-связывающий белок, содержащий VH-CDR3 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:40. В дополнительных аспектах LOX1-связывающий белок содержит VH-CDR3 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:40 и VH-CDR2 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:39. В других аспектах LOX1-связывающий белок содержит VH-CDR3 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:40 и VH-CDR2 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:42 или 43. В дополнительных аспектах LOX1-связывающий белок содержит VH-CDR3 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:40, 44-46 или 47 и VH-CDR2 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:39. В дополнительных аспектах LOX1-связывающий белок содержит VH-CDR3 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 40, 44-46 или 47 и VH-CDR2 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:39, 42 или 43. В дополнительных аспектах LOX1-связывающий белок содержит VH-CDR3 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 40, 44-46 или 47 и VH-CDR2 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 39, 42 или 43 и VH-CDR1 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:38. В настоящем раскрытии также предусматривают нуклеиновые кислоты, кодирующие LOX1-связывающий белок, векторы, содержащие данные нуклеиновые кислоты, и клетки-хозяева, трансформированные данными нуклеиновыми кислотами и векторами, а также способы получения и применения LOX1-связывающего белка.
[162]
В дополнительных аспектах в настоящем раскрытии предусматривают выделенный LOX1-связывающий белок, содержащий VLH-CDR3 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:57. В дополнительных аспектах LOX1-связывающий белок содержит VL-CDR3 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:57 и VL-CDR2 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:56. В других аспектах LOX1-связывающий белок содержит VL-CDR3 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:57, VL-CDR2 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:56 и VL-CDR3 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:55. В других аспектах LOX1-связывающий белок содержит VL-CDR3 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:57, VL-CDR2 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:56 или 60 и VL-CDR1 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:55 или 59. В настоящем раскрытии также предусматривают нуклеиновые кислоты, кодирующие LOX1-связывающий белок, векторы, содержащие данные нуклеиновые кислоты, и клетки-хозяева, трансформированные данными нуклеиновыми кислотами и векторами, а также способы получения и применения LOX1-связывающего белка.
[163]
В дополнительных аспектах LOX1-связывающий белок содержит один, два или три VH-CDR, как например, VH-CDR1, который предусматривает в общей сложности одну, две или меньше аминокислотных замен, делеций или вставок по сравнению с SEQ ID NO:38 или идентичен ей, VH-CDR2, который предусматривает в общей сложности одну, две или меньше аминокислотных замен, делеций или вставок по сравнению с SEQ ID NO:39,42 или 43 или идентичен ей, VH-CDR3, который предусматривает в общей сложности одну, две или меньше аминокислотных замен, делеций или вставок по сравнению с SEQ ID NO:40, 44-46 или 47 или идентичен ей. В настоящем раскрытии также предусматривают нуклеиновые кислоты, кодирующие LOX1-связывающий белок, векторы, содержащие данные нуклеиновые кислоты, и клетки-хозяева, трансформированные данными нуклеиновыми кислотами и векторами, а также способы получения и применения LOX1-связывающего белка.
[164]
В дополнительных аспектах LOX1-связывающий белок содержит один, два или три VL-CDR, как например, VL-CDR1, который предусматривает в общей сложности одну, две или меньше аминокислотных замен, делеций или вставок по сравнению с SEQ ID NO: 55 или 59 или идентичен ей, VL-CDR2 который предусматривает в общей сложности одну, две или меньше аминокислотных замен, делеций или вставок по сравнению с SEQ ID NO:56 или 60 или идентичен ей, или VH-CDR3, который предусматривает в общей сложности одну, две или меньше аминокислотных замен, делеций или вставок по сравнению с SEQ ID NO: 57, 61-63 или 64 или идентичен ей. В настоящем раскрытии также предусматривают нуклеиновые кислоты, кодирующие LOX1-связывающий белок, векторы, содержащие данные нуклеиновые кислоты, и клетки-хозяева, трансформированные данными нуклеиновыми кислотами и векторами, а также способы получения и применения LOX1-связывающего белка.
[165]
В некоторых аспектах LOX1-связывающий белок содержит набор CDR: VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, VL-CDR1, VL-CDR3 и VL-CDR3, описанные в таблице 1, на фигуре 4 или на фигуре 5. В настоящем раскрытии также предусматривают нуклеиновые кислоты, кодирующие LOX1-связывающий белок, векторы, содержащие данные нуклеиновые кислоты, и клетки-хозяева, трансформированные данными нуклеиновыми кислотами и векторами, а также способы получения и применения LOX1-связывающего белка.
[166]
В некоторых дополнительных аспектах LOX1-связывающий белок содержит вариабельный участок тяжелой цепи (VH) и вариабельный участок легкой цепи (VL), описанные в таблице 1, на фигуре 4 или на фигуре 5. В настоящем раскрытии также предусматривают нуклеиновые кислоты, кодирующие LOX1-связывающий белок, векторы, содержащие данные нуклеиновые кислоты, и клетки-хозяева, трансформированные данными нуклеиновыми кислотами и векторами, а также способы получения и применения LOX1-связывающего белка.
[167]
1
2
3
4
5
6
1
2
3
4
5
6
1
2
3
4
5
6
В некоторых аспектах выделенный LOX1-связывающий белок содержит VH-CDR2 с аминокислотной последовательностью G F D P E D HX HX HX HX HX HX Q K F Q G (Gly Phe Asp Pro Glu Asp HX HX HX HX HX HX Gln Lys Phe Gln Gly), где HX представляет собой Gly, Trp, Tyr или Phe; HX представляет собой Glu, Thr, Gln, Ser, Lys или Ala; HX представляет собой Thr, Tyr, Ile или Asn; HX представляет собой Ile, Ala, Arg или His; HX представляет собой Tyr, Val, Thr, Leu или Gln и HX представляет собой Ala, Asp, Gly, Ser или His (SEQ ID NO:71).
[168]
7
8
9
10
11
12
7
8
9
10
11
12
7
8
9
10
11
12
В дополнительных аспектах выделенный LOX1-связывающий белок содержит VH-CDR3 с аминокислотной последовательностью HX HX G HX HX HX HX G V R G W D Y Y Y G M D V (HX HX Gly HX HX HX HX Gly Val Arg Gly Trp Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp), где HX представляет собой Pro, Ser или Val; HX представляет собой Asn, Thr, Trp или Asp; HX представляет собой Gln, Arg или Thr; HX представляет собой Gln или His; HX представляет собой Gly или Gln; HX представляет собой Lys или Gly (SEQ ID NO:72).
[169]
1
2
3
4
5
6
1
2
3
4
5
6
1
2
3
4
5
6
В других аспектах выделенный LOX1-связывающий белок содержит VL-CDR3 с аминокислотной последовательностью Q S Y D S LX LX LX LX LX LX (Gln Ser Tyr Asp Ser LX LX LX LX LX LX), где LX представляет собой Ser или Met; LX представляет собой Leu, Tyr или His; LX представляет собой Ser или Arg; LX представляет собой Gly, Ala или аминокислота отсутствует; LX представляет собой Trp или Phe; и LX представляет собой Val, Gly или Ala (SEQ ID NO:73).
[170]
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
1
2
3
4
5
6
В некоторых аспектах выделенный LOX1-связывающий белок содержит набор определяющих комплементарность участков (CDR): вариабельный участок тяжелой цепи (VH)-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3 и вариабельный участок легкой цепи (VL)-CDR1, VL-CDR2 и VL-CDR3, где: (a) VH-CDR1 содержит аминокислотную последовательность: E L S M H (SEQ ID NO: 1); (b) VH-CDR2 содержит аминокислотную последовательность: G F D P E D HX HX HX HX HX HX Q K F Q G, где HX1 выбрана из группы, состоящей из G, W, Y и F, HX2 выбрана из группы, состоящей из E, T, Q, K, A и S, HX3 выбрана из группы, состоящей из T, Y, I и N, HX4 выбрана из группы, состоящей из I, A, R и H, HX5 выбрана из группы, состоящей из Y, V, T, L и Q, и HX6 выбрана из группы, состоящей из A, D, G, S и H (SEQ ID NO: 71); (c) VH-CDR3 содержит аминокислотную последовательность: HX HX G HX HX HX HX G V R G W D Y Y Y G M D V, где HX7 выбрана из группы, состоящей из P, S и V, HX8 выбрана из группы, состоящей из N, W, D и T, HX9 выбрана из группы, состоящей из Q, R и T, HX10 выбрана из группы, состоящей из Q и H, HX11 выбрана из группы, состоящей из G и Q, и HX12 выбрана из группы, состоящей из K и G (SEQ ID NO: 72); (d) VL-CDR1 содержит аминокислотную последовательность: T G S S S N I G A G Y D V H (SEQ ID NO: 30); (e) VL-CDR2 содержит аминокислотную последовательность: G N S N R P S (SEQ ID NO: 31); и (f) VL-CDR3 содержит аминокислотную последовательность: Q S Y D S LX LX LX LX LX LX, где LX1 выбрана из группы, состоящей из M и S, LX2 выбрана из группы, состоящей из L, Y и H, LX3 выбрана из группы, состоящей из S и R, LX4 выбрана из группы, состоящей из A и G, или она пропущена (аминокислота отсутствует), LX5 выбрана из группы, состоящей из W и F, и LX6 выбрана из группы, состоящей из V, G и A (SEQ ID NO: 73).
[171]
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
В дополнительных аспектах выделенный LOX1-связывающий белок содержит VH-CDR2 с аминокислотной последовательностью G HX S HX HX HX HX HX HX HX HX HX D S V K G (Gly HX Ser HX HX HX HX HX HX HX HX HXAsp Ser Val Lys Gly), где HX представляет собой Ile или Val; HX представляет собой Trp или Leu; HX представляет собой Asn или Gln; HX представляет собой Ser или Glu; HX представляет собой Gly, Leu или Pro; HX представляет собой Ser, Tyr или Asp; HX представляет собой Ile, Thr или Arg; HXпредставляет собой Gly или Tyr; HX представляет собой Tyr или Met; и HX представляет собой Ala или Asp (SEQ ID NO:74).
[172]
11
12
13
11
12
13
11
12
13
В дополнительных аспектах выделенный LOX1-связывающий белок содержит VH-CDR3 с аминокислотной последовательностью E G HX W N Y D A HX D HX (Glu Gly HX Trp Asn Tyr Asp Ala HX Asp HX), где HX представляет собой Asn или Ser; HX представляет собой Phe или Leu; и HX представляет собой Ile или Val (SEQ ID NO:75).
[173]
1
1
1
В дополнительных аспектах выделенный LOX1-связывающий белок содержит VL-CDR1 с аминокислотной последовательностью T G T S LX D V G G Y N Y V S (Thr Gly Thr Ser LX Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser), где LX представляет собой Ser или Asn (SEQ ID NO:76).
[174]
2
2
В дополнительных аспектах выделенный LOX1-связывающий белок содержит VL-CDR2 с аминокислотной последовательностью D V S LX R P S (Asp Val Ser X4 Arg Pro Ser), где LX представляет собой Asn или Lys (SEQ ID NO:77).
[175]
3
4
5
6
7
8
3
4
5
6
7
8
3
4
5
6
7
8
В дополнительных аспектах выделенный LOX1-связывающий белок содержит VL-CDR3 с аминокислотной последовательностью LX LX LX LX LX LX S T N W V (LX LX LX LX LX LX Ser Thr Asn Trp Val), где LX представляет собой Ser, Leu, Met или Ala; LX представляет собой Ser, Gly, или Gln; LX представляет собой Tyr, Arg, Ser или Gly; LX представляет собой Thr или Met; LX представляет собой Ser, Trp, Gly или Val; и LX представляет собой Ser или Arg (SEQ ID NO:78).
[176]
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
В некоторых аспектах выделенный LOX1-связывающий белок содержит набор определяющих комплементарность участков (CDR): вариабельный участок тяжелой цепи (VH)-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3 и вариабельный участок легкой цепи (VL)-CDR1, VL-CDR2 и VL-CDR3, где: (a) VH-CDR1 содержит аминокислотную последовательность: D Y A M H (SEQ ID NO: 38); (b) VH-CDR2 содержит аминокислотную последовательность: G HX S HX HX HX HX HX HX HX HX HX D S V K G, где HX1 выбрана из группы, состоящей из I и V, HX2 выбрана из группы, состоящей из W и L, HX3 выбрана из группы, состоящей из N и Q, HX4 выбрана из группы, состоящей из S и E, HX5 выбрана из группы, состоящей из G, L и P, HX6 выбрана из группы, состоящей из S, Y и D, HX7 выбрана из группы, состоящей из I, T и R, HX8 выбрана из группы, состоящей из G и Y, HX9 выбрана из группы, состоящей из M и Y, и
11
12
13
1
2
3
4
5
6
7
8
HX10 выбрана из группы, состоящей из A и D (SEQ ID NO:74); (c) VH-CDR3 содержит аминокислотную последовательность: E G HX W N Y D A HX D HX, где HX11 выбрана из группы, состоящей из N и S, HX12 выбрана из группы, состоящей из F и L, и HX13 выбрана из группы, состоящей из I и V (SEQ ID NO:75); (d) VL-CDR1 содержит аминокислотную последовательность: T G T S LX D V G G Y N Y V S, где LX1 выбрана из группы, состоящей из N и S (SEQ ID NO:76); (e) VL-CDR2 содержит аминокислотную последовательность: D V S LX R P S, где LX2 выбрана из группы, состоящей из N и K (SEQ ID NO:77); и (f) VL-CDR3 содержит аминокислотную последовательность: LX LX LX LX LX LX S T N W V, где LX3 выбрана из группы, состоящей из L, M, A и S, LX4 выбрана из группы, состоящей из S, Q и G, LX5 выбрана из группы, состоящей из Y, S, G и R, LX6 выбрана из группы, состоящей из T и M, LX7 выбрана из группы, состоящей из S, W, G и V, и LX8 выбрана из группы, состоящей из S и R (SEQ ID NO:78).
[177]
В некоторых аспектах набор CDR LOX1-связывающего белка, раскрытый в данном документе, представлен в пределах каркасных участков антитела или других белковых каркасах, известных из уровня техники. Иллюстративные каркасные участки антитела включают каркасные участки зародышевого типа, такие как VH1-24 (DP-5), JH6, VH3-09 (DP-31) и JH3 в случае каркасного участка тяжелой цепи антитела, и Vλ1e (DPL-8), Vλ2a2 (DPL-11) и JL3 в случае каркасного участка легкой цепи антитела и/или любые подходящие каркасные участки, хорошо известные специалисту в данной области.
[178]
В некоторых аспектах LOX1-связывающий белок содержит один или несколько каркасных участков из вариабельного участка тяжелой цепи (VH) и/или вариабельного участка легкой цепи (VL), которые являются каркасными участками зародышевого типа. Каркасные участки домена тяжелой цепи могут быть выбраны из каркасов VH1-24 (DP-5), JH6, VH3-09 (DP-31), JH3 и/или любых подходящих каркасных участков или белковых каркасов, хорошо известных из уровня техники. Каркасные участки легкой цепи могут быть выбраны из каркасных участков Vλ1e (DPL-8), Vλ2a2 (DPL-11) и JL3 и/или любых подходящих каркасных участков или белковых каркасов, хорошо известных из уровня техники. Один или несколько CDR могут быть взяты из LOX1-связывающих белков, раскрытых в данном документе (например, LOX1-связывающего белка, описанного в таблице 1, на фигуре 4 или на фигуре 5), и встроены в подходящий каркасный участок и/или белковый каркас.
[179]
В дополнительных аспектах в настоящем раскрытии предусматривают выделенный LOX1-связывающий белок, который связывается с тем же эпитопом LOX1, что и антитело, содержащее VH и VL под SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:33 соответственно.
[180]
В других аспектах в настоящем раскрытии предусматривают LOX1-связывающие белки (например, антитела, такие как полноразмерные антитела к LOX1, фрагменты антител, связывающие LOX1, и их варианты и производные), которые конкурируют или перекрестно конкурируют за связывание с LOX1 с антителом, содержащим последовательность VH под SEQ ID NO:4 и последовательность VL под SEQ ID NO:33. В конкретном аспекте LOX1-связывающий белок способен конкурентно ингибировать связывание с LOX1 антитела, содержащего VH под SEQ ID NO:4 и VL под SEQ ID NO:33.
[181]
Также предусмотрен LOX1-связывающий белок, такой как антитело к LOX1 (например, полноразмерное антитело к LOX1, фрагмент антитела, связывающий LOX-1, и их варианты и производные), которое может связываться с LOX1 с большей аффинностью, чем LOX1-связывающий белок (например, антитело к LOX1 или его фрагмент), содержащий VH под SEQ ID NO:29 и VL под SEQ ID NO:33. В настоящем раскрытии также предусматривают нуклеиновые кислоты, кодирующие LOX1-связывающий белок, векторы, содержащие данные нуклеиновые кислоты, и клетки-хозяева, трансформированные данными нуклеиновыми кислотами и векторами, а также способы получения и применения LOX1-связывающего белка.
[182]
В дополнительных аспектах в настоящем раскрытии предусматривают выделенный LOX1-связывающий белок, который связывается с тем же эпитопом LOX1, что и антитело, содержащее VH и VL под SEQ ID NO:41 и SEQ ID NO:58 соответственно.
[183]
В других аспектах в настоящем раскрытии предусматривают LOX1-связывающие белки (например, антитела, такие как полноразмерные антитела к LOX1 и фрагменты антител, связывающие LOX1, и их варианты и производные), которые конкурируют или перекрестно конкурируют за связывание с LOX1 с антителом, содержащим последовательность VH под SEQ ID NO:41 и последовательность VL под SEQ ID NO:58. В конкретном аспекте LOX1-связывающий белок способен конкурентно ингибировать связывание с LOX1 антитела, содержащего VH под SEQ ID NO:41 и VL под SEQ ID NO:58.
[184]
Также предусмотрен LOX1-связывающий белок, такой как антитело к LOX1 (например, полноразмерное антитело к LOX1 и фрагмент антитела, связывающий LOX-1, и его варианты и производные), которое может связываться с LOX1 с большей аффинностью, чем полноразмерное антитело, содержащее VH под SEQ ID NO:54 и VL под SEQ ID NO:70. В настоящем раскрытии также предусматривают нуклеиновые кислоты, кодирующие LOX1-связывающий белок, векторы, содержащие данные нуклеиновые кислоты, и клетки-хозяева, трансформированные данными нуклеиновыми кислотами и векторами, а также способы получения и применения LOX1-связывающего белка.
[185]
В некоторых аспектах предусмотренное в данном документе антитело к LOX1 представляет собой антитело мыши, антитело человека, гуманизированное антитело, химерное антитело, моноклональное антитело, поликлональное антитело, рекомбинантное антитело, биспецифическое антитело, полиспецифическое антитело или любую их комбинацию. В некоторых аспектах антитело к LOX1 представляет собой Fv-фрагмент, Fab-фрагмент, F(ab')2-фрагмент, Fab'-фрагмент, dsFv-фрагмент, scFv-фрагмент или sc(Fv)2-фрагмент.
[186]
В настоящем раскрытии предусматривают LOX1-связывающий белок (например, выделенное антитело к LOX1, такое как полноразмерное антитело к LOX1, фрагмент антитела, связывающий LOX-1, и их варианты и производные), который может связываться с молекулами LOX1 у разных видов. В некоторых аспектах LOX1-связывающий белок связывается с LOX1 человека (hLOX1) и LOX1 яванского макака (cynoLOX1). В дополнительных аспектах LOX1-связывающий белок связывается с LOX1 человека (hLOX1) и LOX1 кролика. В дополнительных аспектах LOX1-связывающий белок связывается с hLOX1, cynoLOX1 и LOX1 кролика. В некоторых аспектах предусмотренный в данном документе LOX1-связывающий белок (например, антитело к LOX1) специфично связывается с LOX1 (например, hLOX1, cynoLOX1 и/или LOX1 кролика) и не связывается с одним или несколькими из: CLEC-7A, CLEC-1A, CLEC-4L, CLEC-1B, SR-A1 и/или SR-B3. См., например, фигуры 3, 6 и 7.
[187]
В некоторых аспектах LOX1-связывающий белок (например, выделенное антитело к LOX1 или его варианты и производные) дополнительно содержит TM-мутантную тяжелую цепь IgG1 человека, где вариабельный участок тяжелой цепи (VH) содержит аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 99% или 100% идентичностью последовательности с эталонной аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:4, 19-28 или 29.
[188]
В некоторых аспектах LOX1-связывающий белок (например, выделенное антитело к LOX1 или его варианты и производные) дополнительно содержит TM-мутантную тяжелую цепь IgG1 человека, где вариабельный участок тяжелой цепи (VH) содержит аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 99% или 100% идентичностью последовательности с эталонной аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:41, 48-53 или 54.
[189]
В некоторых аспектах LOX1-связывающий белок (например, полноразмерное антитело к LOX1, фрагмент антитела, связывающий LOX-1, и его вариант и производное) включает в дополнение к вариабельному участку тяжелой цепи (VH) и вариабельному участку легкой цепи (VL), и необязательно константному участку тяжелой цепи, или их фрагментам, константный участок или его фрагмент. В некоторых аспектах константный участок легкой цепи представляет собой константный участок легкой каппа/лямбда-цепи, например, константный участок каппа-цепи человека или константный участок лямбда-цепи человека. В конкретном аспекте, константный участок легкой цепи представляет собой константный участок каппа-цепи человека.
[190]
В дополнительных аспектах LOX1-связывающий белок (например, полноразмерное антитело к LOX1, фрагмент антитела, связывающий LOX-1, и его вариант и производное) содержит вариабельный участок легкой цепи (VL), который содержит константный участок каппа-цепи человека, например, VL содержит аминокислотную последовательность VL, характеризующуюся по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, или 100% идентичностью последовательности с эталонной аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:33, 36 или 37. В определенных аспектах в настоящем раскрытии предусматривают LOX1-связывающий белок (например, антитело к LOX1 или его фрагмент), дополнительно содержащий TM-мутантную тяжелую цепь IgG1 человека и легкую каппа-цепь человека, где вариабельный участок тяжелой цепи (VH) и вариабельный участок легкой цепи (VL) содержит: SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:33; SEQ ID NO:29 и SEQ ID NO:33; SEQ ID NO:41 и SEQ ID NO:58; или SEQ ID NO:54 и SEQ ID NO:70 соответственно.
[191]
В дополнительных аспектах LOX1-связывающий белок (например, полноразмерное антитело к LOX1, фрагмент антитела, связывающий LOX-1, и его вариант и производное) содержит вариабельный участок легкой цепи (VL), который дополнительно содержит константный участок каппа-цепи человека, например, легкая цепь может содержать аминокислотную последовательность легкой цепи, характеризующуюся по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% идентичностью последовательности с эталонной аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:58, 65-69 или 70. В определенных аспектах в настоящем раскрытии предусматривают LOX1-связывающий белок (например, антитело к LOX1 или его фрагмент), дополнительно содержащий TM-мутантную тяжелую цепь IgG1 человека и легкую каппа-цепь человека, где вариабельный участок тяжелой цепи (VH) и вариабельный участок легкой цепи (VL) содержит: SEQ ID NO:41 и SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:48 и SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:49 и SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:50 и SEQ ID NO:67, или SEQ ID NO:53 и SEQ ID NO:58 соответственно.
[192]
5
-1
-1
6
-1
-1
5
-1
-1
-4
-1
-4
-1
-4
-1
В некоторых аспектах в настоящем раскрытии предусматривают выделенный LOX1-связывающий белок, такой как антитело к LOX1 (например, полноразмерное антитело к LOX1, фрагмент антитела, связывающий LOX-1, и его вариант и производное), где LOX1-связывающий белок обладает по меньшей мере одним свойством, выбранным из группы, состоящей из следующего: (a) он снижает или ингибирует связывание oxLDL, С-реактивного белка (CRP) и/или конечных продуктов усиленного гликозилирования (AGE) с LOX1, что определяют с помощью любого подходящего анализа, в том числе анализа, раскрытого в данном документе (см., например, пример 10, анализы 1, 2 и/или 3 или пример 11); (b) он подавляет или ингибирует передачу сигнала с участием RhoA/Rac1, монооксида азота (NO), p38MAPK, протеинкиназы B и C, ERK1/2 и/или NFκB в эндотелиальной клетке, экспрессирующей LOX1 клеточной поверхности, что определяют с помощью любого подходящего анализа, в том числе анализа, раскрытого в данном документе (см., например, пример 11); (c) он снижает или ингибирует активность каспазы-8, каспазы-9 и/или BAX в эндотелиальной клетке, экспрессирующей LOX1 клеточной поверхности, что определяют с помощью любого подходящего анализа, в том числе анализа, раскрытого в данном документе; (d) он связывает LOX1 с однонуклеотидным полиморфизмом K167N, что определяют с помощью любого подходящего анализа, в том числе анализа, раскрытого в данном документе (см., например, пример 10, анализы 1, 2 и/или 3 или пример 11); (e) он снижает или ингибирует интернализацию oxLDL, что определяют с помощью любого подходящего анализа, в том числе анализа, раскрытого в данном документе (см., например, пример 10, анализ 4 или пример 11); (f) он подавляет или ингибирует индуцируемую oxLDL передачу сигнала LOX1, что определяют с помощью любого подходящего анализа, в том числе анализа, раскрытого в данном документе (см., например, пример 10, анализ 5 или пример 11); (g) он связывает LOX1 с константой диссоциации (KD) от приблизительно 150 пМ до приблизительно 600 пМ (например, приблизительно 400 пМ), что определяют с помощью BIACORE или KinExA; (h) он связывает LOX1 со скоростью ассоциации от приблизительно 1×10 M с до приблизительно 6×10 M с (например, приблизительно 5×10 M с), что определяют с помощью BIACORE; и (i) он связывает LOX1 со скоростью диссоциации от приблизительно 1×10 с до приблизительно 3×10 с (например, приблизительно 2,3×10 с), что определяют с помощью BIACORE.
[193]
В определенных аспектах блокирование биологической активности LOX1 с помощью LOX1-связывающего белка (например, антитела к LOX1 или его фрагмента), описанного в данном документе, ослабляет атеросклероз и/или уменьшает проявление одного или нескольких состояний, связанных с атеросклерозом. В конкретных аспектах антагонист LOX1 (например, антитело к LOX1 или его фрагмент) ингибирует или подавляет LOX1-опосредованное развитие атеросклеротических поражений, коронарной недостаточности, инсульта, ишемии, инфаркта, заболевания периферических сосудов, реперфузионного повреждения или других клинических симптомов, связанных с развитием атеросклероза.
[194]
D
D
-6
-7
-8
-9
-10
-11
-12
-13
-14
-15
-8
-10
В определенных аспектах LOX1-связывающий белок, такой как антитело к LOX1 (например, полноразмерное антитело к LOX1, фрагмент антитела, связывающий LOX-1, и его вариант и производное) может специфично связываться с LOX1, например, LOX1 человека (hLOX1) и/или LOX1 яванского макака (cynoLOX1) и их антигенными фрагментами, с константой диссоциации или K менее 10 M, или менее 10 M, или менее 10 M, или менее 10 M, или менее 10 M, или менее 10 M, менее 10 M, менее 10 M, менее 10 M или менее 10 M, что измеряют, например, с помощью KINEXA или BIACORE. В одном аспекте антитело к LOX1 может связываться с hLOX1 и cynoLOX1 с K от менее приблизительно 1×10 M до приблизительно 1×10M, что измеряют с помощью BIACORE.
[195]
off
off
off
-3
-1
-3
-1
-3
-1
-3
-1
-4
-1
-4
-1
-5
-1
-5
-1
-6
-1
-6
-1
-7
-1
-8
-1
-8
-1
-9
-1
-9
-1
-10
-1
-4
-1
В другом аспекте LOX1-связывающий белок, такой как антитело к LOX1 (например, полноразмерное антитело к LOX1, фрагмент антитела, связывающий LOX-1, и его вариант и производное) может связываться с LOX1 с Kменее 1×10 с или менее 2×10 с. В других аспектах LOX1-связывающий белок связывается с LOX1 с K менее 10 с, менее 5×10 с, менее 10 с, менее 5×10 с, менее 10 с, менее 5×10 с, менее 10 с, менее 5×10 с, менее менее 5×10 с, менее 10 с, менее 5×10 с, менее 10 с, менее 5×10 с или менее 10 с, что измеряют, например, с помощью KINEXA или BIACORE. В одном аспекте антитело к LOX1 может связываться с hLOX1 и cynLOX1 с Kот 1 до 10×10 с, что измеряют с помощью BIACORE.
[196]
on
on
5
-1
-1
5
-1
-1
6
-1
-1
6
-1
-1
7
-1
-1
7
-1
-1
8
-1
-1
9
-1
-1
5
-1
-1
5
-1
-1
В другом аспекте LOX1-связывающий белок, такой как антитело к LOX1 (например, полноразмерное антитело к LOX1, фрагмент антитела, связывающий LOX-1, и его вариант и производное) может связываться с LOX1, например, LOX1 человека (hLOX1) и/или LOX1 яванского макака с константой скорости ассоциации, или коэффициентом k, по меньшей мере 10 M с, по меньшей мере 5×10 M с, по меньшей мере 10 M с, по меньшей мере 5×10 M с, по меньшей мере 10 M с, по меньшей мере 5×10 M с, или по меньшей мере 10 M с, или по меньшей мере 10 M с, что измеряют, например, с помощью KINEXA или BIACORE. В одном аспекте антитело к LOX1 может связываться с hLOX1 и cynLOX1 с коэффициентом k от приблизительно 1×10 M сдо приблизительно 20×10 M с, что измеряют с помощью BIACORE.
[197]
Как упоминалось выше, LOX1-связывающий белок (например, полноразмерное антитело к LOX1, фрагмент антитела, связывающий LOX-1, и его вариант и производное), содержащий аминокислотную последовательность VH и/или VL, который связывает LOX1, может характеризоваться по меньшей мере 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью последовательности с последовательностью, изложенной в данном документе (см., например, таблицу 1, фигуру 4 или фигуру 5). В некоторых аспектах аминокислотная последовательность(аминокислотные последовательности) VH и/или VL, которая(которые) связывает(связывают) LOX1, предусматривает(предусматривают) 15 или меньше (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15) аминокислотных добавлений, замен (например, консервативных замен) или делеций по сравнению с последовательностью, изложенной в данном документе. В некоторых аспектах аминокислотная последовательность(аминокислотные последовательности) VH и/или VL, которая(которые) связывает(связывают) LOX1, предусматривает(предусматривают) 8 или меньше (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8) аминокислотных добавлений, замен (например, консервативных замен) или делеций по сравнению с последовательностью, изложенной в данном документе. В дополнительных аспектах аминокислотная последовательность VH и/или VL, которая связывает LOX1, предусматривает 5 или меньше (например, 1, 2, 3, 4 или 5) аминокислотных добавлений, замен (например, консервативных замен) или делеций по сравнению с последовательностью, изложенной в данном документе. LOX1-связывающий белок (например, антитело к LOX1 или его фрагмент), содержащий участки VH и VL с определенным процентом сходства с участком VH или участком VL или предусматривающий одну или несколько замен, делеций и/или вставок (например, консервативных замен), можно получить с помощью мутагенеза (например, сайт-направленного или ПЦР-опосредованного мутагенеза) молекул нуклеиновых кислот, кодирующих участки VH и/или VL, описанные в данном документе, с последующей проверкой кодируемого измененного антитела в отношении связывания с LOX1 и, необязательно, проверкой в отношении сохранения функции с применением функциональных анализов, описанных в данном документе, или известного из уровня техники анализа, который можно легко модифицировать с целью проверки в отношении сохранения функции.
[198]
et al.,
D
on
off
Аффинность или авидность LOX1-связывающего белка, такого как антитело к LOX1 (например, полноразмерное антитело к LOX1, фрагмент антитела, связывающий LOX-1, и его вариант и производное), для LOX1 можно определять экспериментально с применением любого подходящего способа, известного из уровня техники, например, проточной цитометрии, твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) или радиоиммунологического анализа (RIA), или кинетических анализов (например, анализа KINEXA или BIACORE). С легкостью можно применять анализы в формате прямого связывания, а также анализы в формате конкурентного связывания. (См., например, Berzofsky "Antibody-Antigen Interactions," в Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press: New York, N.Y. (1984); Kuby, Immunology, W. H. Freeman и Company: New York, N.Y. (1992); и способы, описанные в данном документе). Измеряемая аффинность конкретного взаимодействия антитело-антиген может варьироваться в различных условиях (например, концентрация солей, pH, температура). Таким образом, измерения аффинности и других параметров связывания LOX1 (например, K или Kd, K, K) проводят со стандартизированными растворами LOX1-связывающих белков и LOX1 и стандартизированным буфером, известным из уровня техники, таким как буфер, описанный в данном документе.
[199]
В настоящем раскрытии также предусматривают LOX1-связывающий белок, такой как антитело к LOX1 (например, полноразмерное антитело к LOX1, фрагмент антитела, связывающий LOX-1, и его вариант и производное), описанный в данном документе (см., например, таблицу 1, фигуру 4 или фигуру 5), где антитело конъюгировано с гетерологичным средством. В некоторых аспектах указанное средство представляет собой противомикробное средство, терапевтическое средство, пролекарство, пептид, белок, фермент, липид, модификатор биологического ответа, фармацевтическое средство, лимфокин, гетерологичное антитело или фрагмент антитела, детектируемую метку или полиэтиленгликоль (PEG). Гетероконъюгат LOX1-связывающих белков рассматривается более подробно в другом месте данного документа.
[200]
Curr. Opin. Biotech
et al., Protein Science
et al., Curr. Opin. Biotechnol
FEBS J
FEBS J
В определенных аспектах LOX1-связывающий белок не является антителом к LOX1. Ряд способов идентификации и получения не являющихся антителами полипептидов, которые связываются с высокой аффинностью с белковой мишенью, известны из уровня техники. См., например, Skerra, . 18:295-304 (2007), Hosse 15:14-27 (2006), Gill . 17:653-658 (2006), Nygren, . 275:2668-76 (2008) и Skerra, . 275:2677-83 (2008), каждая из которых включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. В определенных аспектах для идентификации/получения LOX1-связывающего белка можно применять технологию фагового дисплея. В определенных аспектах полипептид содержит белковый каркас типа, выбранного из группы, состоящей из анкирина, белка A, липокалина, домена фибронектина, домена анкирина с консенсусными повторами и тиоредоксина.
Белки, которые связывают тот же эпитоп, что и LOX1-связывающий белок
[201]
В некоторых аспектах в настоящем раскрытии предусматривают LOX1-связывающие белки (например, антитела к LOX1, такие как полноразмерные антитела к LOX1, фрагменты антител, связывающие LOX1, и их варианты и производные), которые связываются с тем же эпитопом, что и один или несколько LOX1-связывающих белков, раскрытых в данном документе (см., например, таблицу 1, фигуру 4 или фигуру 5). Выражение "эпитоп", применяемое в данном документе, относится к детерминанте целевого белка, способной связываться с антителом согласно настоящему раскрытию. Эпитопы обычно состоят из химически активных поверхностных групп молекул, таких как аминокислоты или боковые цепи сахаров, и обычно обладают специфическими характеристиками трехмерной структуры, а также специфическими характеристиками заряда. Конформационные и неконформационные эпитопы отличаются тем, что связывание с первыми, но не с последними, утрачивается в присутствии денатурирующих растворителей. Такие антитела можно идентифицировать на основании их способности перекрестно конкурировать (например, конкурентно ингибировать связывание со статистической значимостью) с антителами, содержащими последовательность VH под SEQ ID NO:4 и последовательность VL под SEQ ID NO:33, и/или антителами, содержащими последовательность VH под SEQ ID NO:41 и последовательность VL под SEQ ID NO:58, в стандартных анализах на основе связывания антигена или анализах активности.
[202]
В настоящем раскрытии также предусматривают LOX1-связывающие белки, такие как антитела к LOX1 (например, полноразмерные антитела к LOX1, фрагменты антител, связывающие LOX1, и их варианты и производные), которые связывают тот же эпитоп, что и выделенный LOX1-связывающий белок, раскрытый в данном документе (см., например таблицу 1, фигуру 4 или фигуру 5).
[203]
Способность исследуемого LOX1-связывающего белка ингибировать связывание, например, антитела, содержащего последовательность VH под SEQ ID NO:4 и последовательность VL под SEQ ID NO:33, и/или антитела, содержащего последовательность VH под SEQ ID NO:41 и последовательность VL под SEQ ID NO:58, демонстрирует, что исследуемый LOX1-связывающий белок может конкурировать с этим антителом за связывание с LOX1; такой LOX1-связывающий белок может, в соответствии с теорией, не имеющей ограничительного характера, связываться с этим же или родственным (например, структурно подобным или пространственно близким) эпитопом LOX1, что и LOX1-связывающие белки (например, антитела к LOX1, такие как полноразмерные антитела к LOX1, фрагменты антител, связывающие LOX1, и их варианты и производные), с которыми он конкурирует. В одном аспекте LOX1-связывающий белок связывает тот же эпитоп, что и антитело, содержащее последовательность VH под SEQ ID NO:4 и последовательность VL под SEQ ID NO:33. В другом аспекте LOX1-связывающий белок связывает тот же эпитоп, что и антитело, содержащее последовательность VH под SEQ ID NO:41 и последовательность VL под SEQ ID NO:58.
[204]
В одном аспекте в настоящем раскрытии предусматривают LOX1-связывающие белки (например, антитела, такие как полноразмерные антитела к LOX1, фрагменты антител, связывающие LOX1, и их варианты и производные), которые конкурируют за связывание с LOX1 с антителом, содержащим последовательность VH под SEQ ID NO:4 и последовательность VL под SEQ ID NO:33. В другом аспекте в настоящем раскрытии предусматривают LOX1-связывающие белки (например, антитела, такие как полноразмерные антитела к LOX1, фрагменты антител, связывающие LOX1, и их варианты и производные), которые конкурируют за связывание с LOX1 с антителом, содержащим последовательность VH под SEQ ID NO:41 и последовательность VL под SEQ ID NO:58.
IV. Активность LOX1-связывающих белков
[205]
5
-1
-1
6
-1
-1
5
-1
-1
-4
-1
-4
-1
-4
-1
В некоторых аспектах LOX1-связывающий белок (например, антитело к LOX1, такое как полноразмерное антитело к LOX1, фрагмент антитела, связывающий LOX-1, и их варианты и производные) обладает по меньшей мере одним свойством, выбранным из группы, состоящей из следующего: (a) он снижает или ингибирует связывание oxLDL, С-реактивного белка (CRP) и/или конечных продуктов усиленного гликозилирования (AGE) с LOX1, что определяют с помощью любого подходящего анализа, в том числе анализа, раскрытого в данном документе (см., например, пример 10, анализы 1, 2 и/или 3 или пример 11); (b) он подавляет или ингибирует передачу сигнала с участием RhoA/Rac1, монооксида азота (NO), p38MAPK, протеинкиназы B и C, ERK1/2 и/или NFκB в эндотелиальной клетке, экспрессирующей LOX1 клеточной поверхности, что определяют с помощью любого подходящего анализа, в том числе анализа, раскрытого в данном документе (см., например, пример 11); (c) он снижает или ингибирует активность каспазы-8, каспазы-9 и/или BAX в эндотелиальной клетке, экспрессирующей LOX1 клеточной поверхности, что определяют с помощью любого подходящего анализа, в том числе анализа, раскрытого в данном документе; (d) он связывает LOX1 с однонуклеотидным полиморфизмом K167N, что определяют с помощью любого подходящего анализа, в том числе анализа, раскрытого в данном документе (см., например, пример 10, анализы 1, 2 и/или 3 или пример 11); (e) он снижает или ингибирует интернализацию oxLDL, что определяют с помощью любого подходящего анализа, в том числе анализа, раскрытого в данном документе (см., например, пример 10, анализ 4 или пример 11); (f) он подавляет или ингибирует индуцируемую oxLDL передачу сигнала LOX1, что определяют с помощью любого подходящего анализа, в том числе анализа, раскрытого в данном документе (см., например, пример 10, анализ 5 или пример 11); (g) он связывает LOX1 с константой диссоциации (KD) от приблизительно 150 пМ до приблизительно 600 пМ (например, приблизительно 400 пМ), что определяют с помощью BIACORE или KinExA; (h) связывает LOX1 со скоростью ассоциации от приблизительно 1×10 M сдо приблизительно 6×10 M с (например, приблизительно 5×10 M с), что определяют с помощью BIACORE; и (i) он связывает LOX1 со скоростью диссоциации от приблизительно 1×10 с до приблизительно 3×10 с (например, приблизительно 2,3×10 с), что определяют с помощью BIACORE.
[206]
50
В некоторых аспектах LOX1-связывающий белок (например, антитело к LOX1, такое как полноразмерное антитело к LOX1, фрагмент антитела, связывающий LOX-1, и их варианты и производные) может подавлять, ингибировать или снижать LOX1-опосредованную сигнальную трансдукцию в экспрессирующих LOX1 клетках. В некоторых аспектах LOX1-связывающий белок может подавлять, ингибировать или снижать LOX1-опосредованную активацию пути сигнальной трансдукции RhoA/Rac1, монооксида азота, p38MAPK, протеинкиназы B и C, ERK1/2 и/или NFκB, что измеряют с применением клеточного анализа, например, описанного в данном документе, с IC ниже приблизительно 500 пМ, ниже приблизительно 450 пМ, ниже приблизительно 450 пМ, ниже приблизительно 350 пМ, ниже приблизительно 300 пМ, ниже приблизительно 250 пМ, ниже приблизительно 150 пМ, ниже приблизительно 100 пМ, ниже приблизительно 75 пМ, ниже приблизительно 100 нМ, ниже приблизительно 75 нМ, ниже приблизительно 50 нМ, ниже приблизительно 30 нМ, ниже приблизительно 20 пМ, ниже приблизительно 10 нМ или ниже приблизительно 5 нМ.
[207]
50
50
В определенных аспектах LOX1-связывающий белок (например, антитело к LOX1, такое как полноразмерное антитело к LOX1, фрагмент антитела, связывающий LOX-1, и их варианты и производные) может подавлять, ингибировать или снижать опосредованную LOX1 яванского макака активацию сигнального пути RhoA/Rac1, монооксида азота, p38MAPK, протеинкиназы B и C, ERK1/2 и/или NFκB в экспрессирующих LOX1 эндотелиальных клетках, гладкомышечных клетках и/или макрофагах яванского макака с IC приблизительно 700 пМ, приблизительно 550 пМ, приблизительно 500 пМ, приблизительно 300 пМ, приблизительно 250 пМ, приблизительно 220 пМ, приблизительно, 100 пМ, приблизительно 1 пМ, приблизительно 0,1, приблизительно 1 нМ, приблизительно 10 нМ, приблизительно 20 нМ, приблизительно 30 нМ, приблизительно 50 нМ или приблизительно 100 нМ. В определенных аспектах LOX1-связывающий белок может подавлять, ингибировать или снижать опосредованную LOX1 яванского макака активацию в экспрессирующих LOX1 эндотелиальных клетках, гладкомышечных клетках и/или макрофагах яванского макака с IC от приблизительно 1 нМ до приблизительно 500 пМ.
[208]
50
В дополнительных аспектах антагонистический LOX1-связывающего белка (например, антитело к LOX1, такое как полноразмерное антитело к LOX1, фрагмент антитела, связывающий LOX-1, и их варианты и производные) может подавлять, ингибировать или снижать опосредованную LOX1 человека активацию пути сигнальной трансдукции RhoA/Rac1, монооксида азота, p38MAPK, протеинкиназы B и C, ERK1/2 и/или NFκB, что измеряют с применением клеточного анализа, например, описанного в данном документе, в экспрессирующих LOX1 эндотелиальных клетках, гладкомышечных клетках и/или макрофагах с IC приблизительно 300 пМ, приблизительно 250 пМ, приблизительно 100 пМ, приблизительно 55 пМ, приблизительно 44 пМ, приблизительно 1 пМ, приблизительно 0,1 пМ, приблизительно 100 нМ, приблизительно 50 нМ приблизительно 44 нМ, приблизительно 10 нМ или приблизительно 3 нМ.
[209]
Chlamydia pneumoniae
В некоторых аспектах LOX1-связывающий белок (например, антитело к LOX1, такое как полноразмерное антитело к LOX1, фрагмент антитела, связывающий LOX-1, и их варианты и производные) ингибирует или снижает степень связывания LOX1 с oxLDL. В некоторых аспектах LOX1-связывающий белок ингибирует или снижает степень связывания LOX1 со множеством лигандов LOX1. В некоторых аспектах LOX1-связывающий белок ингибирует или снижает степень связывания LOX1 с oxLDL и AGE. В некоторых аспектах LOX1-связывающий белок ингибирует или снижает степень связывания LOX1 с oxLDL и CRP. В некоторых аспектах LOX1-связывающий белок ингибирует или снижает степень связывания LOX1 с oxLDL, AGE и CRP. В дополнительных аспектах LOX1-связывающий белок ингибирует или снижает степень связывания LOX1 с oxLDL, CRP, фосфатидилсерином, AGE, мелкими плотными частицами липопротеинов (sdLDL), окисленными HDL, N4-оксононаноиллизином (ONL), белками теплового шока (hsp, например, HSP60), , тромбоцитами, лейкоцитами и/или апоптическими клетками. Способы измерения ингибирования или снижения степени связывания LOX-1 с одним или несколькими лигандами включают таковые, описанные в данном документе в примерах, а также любой другой подходящий способ, известный из уровня техники.
V. Получение антител к LOX1
[210]
В определенных аспектах LOX1-связывающие белки представляют собой антитела к LOX1, например, полноразмерное антитело к LOX1, фрагменты антител, связывающие LOX1, и их варианты и производные.
[211]
Nature
in vitro
in vitro
in vitro
in vivo
Моноклональные антитела к LOX1 можно получать с применением способов с использованием гибридомы, например, таковых, описанных Kohler and Milstein, 256:495 (1975). В способе с использованием гибридомы мышь, хомяка или другое подходящее животное-хозяина иммунизируют, как описано выше, чтобы вызвать выработку лимфоцитами антител, которые будут специфически связываться с иммунизирующим антигеном. Лимфоциты также можно иммунизировать . После иммунизации лимфоциты выделяют и сливают с подходящей линией клеток миеломы с использованием, например, полиэтиленгликоля, с образованием клеток гибридомы, которые затем могут быть отобраны из не слитых лимфоцитов и клеток миеломы. Гибридомы, которые вырабатывают моноклональные антитела, специфически направленные против LOX1, такого как hLOX1, как определяется с помощью иммунопреципитации, иммуноблоттинга или с использованием анализа связывания (например, радиоиммунологического анализа (RIA); твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA)), затем можно размножить либо в культуре с использованием стандартных способов (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 1986) или в виде асцитных опухолей у животных. Моноклональные антитела затем можно выделить из культуральной среды или асцитной жидкости, как описано для поликлональных антител выше.
[212]
E. coli
et al., Nature
et al., Nature
et al., J. Mol. Biol.
Альтернативно, моноклональные антитела к LOX1 можно получать с применением способов рекомбинантных ДНК, как описано в патенте США № 4816567. Полинуклеотиды, кодирующие моноклональное антитело, выделяют из зрелых В-клеток или клетки гибридомы, например, с помощью RT-PCR с использованием олигонуклеотидных праймеров, которые специфически амплифицируют гены, кодирующие тяжелую и легкую цепи антитела, и их последовательность определяют с помощью обычных процедур. Выделенные полинуклеотиды, кодирующие тяжелую и легкую цепи, затем клонируют в подходящие векторы экспрессии, которые при трансфекции в клетки-хозяева, такие как клетки , клетки COS обезьяны, клетки яичника китайского хомячка (CHO), клетки Per.C6 или клетки миеломы (например, клетки NS0), которые в других случаях не производят белок иммуноглобулин, вырабатывают моноклональные антитела с помощью клеток-хозяев. Также рекомбинантные моноклональные антитела к LOX1 можно выделить с использованием библиотек фагового дисплея, экспрессирующих CDR требуемых видов, как описано (McCafferty 348:552-554 (1990); Clackson 352:624-628 (1991); и Marks 222:581-597 (1991)).
[213]
Нуклеиновая кислота(нуклеиновые кислоты), кодирующая(кодирующие) антитело к LOX1, такое как полноразмерное антитело к LOX1 и фрагмент антитела, связывающий LOX-1, и их варианты и производные, можно дополнительно модифицировать с помощью ряда различных способов с применением технологии рекомбинантных ДНК для получения альтернативных антител. В некоторых аспектах константные домены легкой и тяжелой цепей, например, моноклонального антитела мыши, можно заменить (1) на таковые участки, например, антитела человека, с получением химерного антитела или (2) на отличный от иммуноглобулина полипептид с получением гибридного антитела. В некоторых аспектах константные участки усекают или удаляют с получением необходимого фрагмента антитела моноклонального антитела. Сайт-направленный или высокопроизводительный мутагенез вариабельного участка можно применять для оптимизации специфичности, аффинности и т.д. моноклонального антитела.
[214]
in vitro
et al
et al
J. Immunol
В определенных аспектах LOX1-связывающий белок связывает LOX1 человека, как например, полноразмерное антитело к hLOX1 и фрагмент антитела человека, связывающий hLOX1, и их варианты и производные. Антитела человека можно непосредственно получать при помощи различных методик, известных из уровня техники. Можно получать иммортализованные B-лимфоциты человека, иммунизированные , или выделенные из иммунизированного индивида, у которого вырабатываются антитела к целевому антигену (см., например, Cole ., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boemer ., . 147 (1):86-95(1991); и патент США № 5750373).
[215]
et al., Nat. Biotech
et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci.
, J. Mol. Biol.
et al., J. Mol. Biol
et al., J. Mol. Biol
Также антитело человека к LOX1 (например, фрагмент антитела человека, связывающий LOX1) может быть отобрано из фаговой библиотеки, при этом в такой фаговой библиотеке экспрессируются антитела человека, как описано, например, в Vaughan ., 14:309-314 (1996), Sheets 95:6157-6162 (1998), Hoogenboom and Winter227:381 (1991) и Marks . 222:581 (1991)). Методики получения и применения фаговых библиотек антител также описаны в патентах США №№ 5969108, 6172197, 5885793, 6521404; 6544731; 6555313; 6582915; 6593081; 6300064; 6653068; 6706484; и 7264963; и Rothe . 376(4): 1182-200 (2008) (каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте).
[216]
et al., Bio/Technology
Стратегии созревания аффинности и стратегии перестановки цепей (Marks 10:779-783 (1992), включенная в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте), известны из уровня техники и могут использоваться для получения высокоаффинных антител человека к LOX1.
[217]
В некоторых аспектах антитело к LOX1, такое как полноразмерное антитело к LOX1 и фрагмент антитела, связывающий LOX-1, и их варианты и производные), может представлять собой гуманизированное антитело. Можно также использовать способы конструирования, гуманизации или изменения поверхности антител, не являющихся антителами человека, или антител человека, и они известны из уровня техники. Гуманизированное, с измененной поверхностью или подобным образом сконструированное антитело может иметь один или несколько аминокислотных остатков из отличного от человека источника, например, без ограничения, мыши, крысы, кролика, отличного от человека примата или другого млекопитающего. Эти аминокислотные остатки, не являющиеся аминокислотными остатками человека, заменяют остатками, часто называемыми "импортированными" остатками, которые, как правило, взяты из "импортированного" вариабельного, константного или другого домена известной последовательности человека. Такие импортированные последовательности можно применять для снижения иммуногенности или снижения, повышения или модификации связывания, аффинности, скорости ассоциации, скорости диссоциации, авидности, специфичности, времени полужизни или любых других подходящих характеристик, известных из уровня техники. В целом, остатки CDR непосредственно и в наиболее значительной степени участвуют во влиянии на связывание LOX1. Соответственно, часть или все из не относящихся к человеческим или человеческих последовательностей CDR сохраняются, тогда как не относящиеся к человеческим последовательности вариабельных и константных областей могут заменяться человеческими или другими аминокислотными последовательностями.
[218]
Антитела к LOX1 также необязательно можно гуманизировать, изменять поверхность, конструировать, или антитела человека можно сконструировать с сохранением высокой аффинности к антигену LOX1 и других предпочтительных биологических свойств. Для достижения этой цели гуманизированное (или человеческое) или сконструированное антитело к LOX1, такое как полноразмерное антитело к LOX1 и фрагмент антитела, связывающий LOX-1, и их варианты и производные, как например, антитела с измененной поверхностью, можно необязательно получать в способе с анализом исходных последовательностей и различных концептуальных гуманизированных и сконструированных продуктов с применением трехмерных моделей исходных, сконструированных и гуманизированных последовательностей. Трехмерные модели иммуноглобулинов являются доступными и известны специалистам в данной области. Существуют компьютерные программы, которые иллюстрируют и показывают возможные трехмерные конформационные структуры выбранных последовательностей иммуноглобулина-кандидата. Рассмотрение этих изображений позволяет проанализировать вероятную роль остатков в функционировании последовательности иммуноглобулина-кандидата, т.е. анализ остатков, которые влияют на способность иммуноглобулина-кандидата связывать его антиген, такой как LOX1. Таким образом, остатки каркасных участков (FW) можно выбирать и комбинировать из консенсусной и вносимой последовательностей так, что обеспечиваются требуемые характеристики антитела, такие как повышенная аффинность к целевому антигену(антигенам).
[219]
et al., Nature
et al., Nature
et al., Science
et al
J. Immunol.
J. Mol. Biol.
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A
et al., J. Immunol.
Гуманизацию, изменение поверхности или конструирование антител к LOX1 согласно настоящему раскрытию можно осуществлять с применением любого известного способа, в том числе без ограничения таковых, описанных в Jones 321:522 (1986); Riechmann 332:323 (1988); Verhoeyen 239:1534 (1988)), Sims ., 151: 2296 (1993); Chothia and Lesk, 196:901 (1987), Carter . 89:4285 (1992); Presta 151:2623 (1993), патентах США №№ 5639641, 5723323; 5976862; 5824514; 5817483; 5814476; 5763192; 5723323; 5766886; 5714352; 6204023; 6180370; 5693762; 5530101; 5585089; 5225539; 4816567, 7557189; 7538195; и 7342110; международных заявках №№ PCT/US98/16280; PCT/ US96/18978; PCT/US91/09630; PCT/US91/05939; PCT/US94/01234; PCT/GB89/01334; PCT/GB91/01134; PCT/GB92/ 01755; публикациях международных заявок №№ WO90/14443; WO90/14424; WO90/14430; и публикации патента EP № EP 229246; каждый из которых в полном объеме включен в данный документ посредством ссылки, включая ссылки, цитируемые в них.
[220]
Антагонистические антитела человека к LOX1 также можно получать с использованием трансгенных мышей, содержащих локусы иммуноглобулинов человека, способных после иммунизации вырабатывать полный спектр антител человека в отсутствие эндогенной выработки иммуноглобулинов. Данный подход описан в патентах США №№ 5545807; 5545806; 5569825; 5625126; 5633425; и 5661016.
[221]
et al., J. Biochem. Biophys. Meth.
et al., Science
E. coli
В некоторых аспектах антитело к LOX1 представляет собой фрагмент антитела, связывающий LOX-1. Известны различные методики получения фрагментов антител. Традиционно эти фрагменты получают посредством протеолитического расщепления интактных антител (например, Morimoto 24:107-117 (1993); Brennan 229:81 (1985)). В определенных аспектах фрагменты антител, связывающие LOX1, получают рекомбинантным путем. Все Fab-, Fv- и scFv-фрагменты антител могут быть экспрессированы и секретированы или другими клетками-хозяевами что, таким образом, обеспечивает получение больших количеств этих фрагментов. Такие фрагменты антител, связывающие LOX1, можно выделять из обсуждаемых выше фаговых библиотек антител. Фрагменты антител, связывающие LOX1, также могут быть линейными антителами, как описано в патенте США № 5641870. Другие методики получения фрагментов антител известны из уровня техники.
[222]
et al., Science
В соответствии с настоящим раскрытием известные из уровня техники методики можно адаптировать для получения одноцепочечных антител, специфических в отношении LOX1 (см., например, патент США № 4946778). Кроме того, способы можно адаптировать для конструирования библиотек, экспрессирующих Fab (см., например, Huse 246:1275-1281 (1989)), для обеспечения возможности быстрой и эффективной идентификации моноклональных Fab-фрагментов с требуемой специфичностью в отношении LOX1. Связывающие фрагменты антител к LOX1 можно получать с помощью методик, известных из уровня техники, в том числе без ограничения: (a) F(ab')2-фрагмент, полученный путем расщепления пепсином молекулы антитела; (b) Fab-фрагмент, полученный путем восстановления дисульфидных мостиков F(ab')2-фрагмента, (c) Fab-фрагмент, полученный при обработке антитела к LOX1 папаином и восстанавливающим средством, и (d) Fv-фрагменты.
[223]
В определенных аспектах LOX1-связывающий белок (например, антитело к LOX1, такое как полноразмерное антитело к LOX1 и фрагмент антитела, связывающий LOX-1, и их варианты и производные) можно модифицировать с целью увеличения его времени полужизни в сыворотке. Это может быть достигнуто, например, путем включения эпитопа, связывающегося с рецептором реутилизации, в LOX1-связывающий белок с помощью мутации соответствующего участка в LOX1-связывающем белке или путем включения эпитопа в пептидную метку, которую затем сливают с LOX1-связывающим белком на любом конце или в середине (например, с помощью синтеза ДНК или пептида), либо с помощью мутации YTE. Другие способы увеличения времени полужизни в сыворотке LOX1-связывающего белка (например, антитела к LOX1, такого как полноразмерное антитело к LOX1 и фрагмент антитела, связывающий LOX-1, и их варианты и производные), например, конъюгирование с гетерологичной молекулой, такой как PEG, известны из уровня техники.
[224]
in vitro
Гетероконъюгат LOX1-связывающих белков (например, антител к LOX1, таких как полноразмерные антитела к LOX1 и фрагменты антител, связывающие LOX1, и их варианты и производные) также находятся в пределах объема настоящего раскрытия. Гетероконъюгат LOX1-связывающих белков состоит из двух ковалентно связанных белков. Такие белки были предложены, например, для направления иммунных клеток к нежелательным клеткам (см., например, патент США № 4676980). Предполагается, что гетероконъюгат LOX1-связывающих белков можно получать с применением известных способов химического синтеза белков, в том числе таковых, включающих средства для перекрестного связывания. Например, иммунотоксины можно сконструировать с помощью реакции дисульфидного обмена или путем образования тиоэфирной связи. Примеры подходящих для этой цели реагентов включают иминотиолат и метил-4-меркаптобутиримидат.
[225]
Модифицированные антитела к LOX1, такие как полноразмерные антитела к LOX1 и фрагменты антител, связывающие LOX1, и их варианты и производные, предусмотренные в данном документе, могут содержать вариабельный участок любого типа, обеспечивающий связывание антитела с LOX1. В связи с этим вариабельный участок может содержаться или может происходить от млекопитающего любого типа, у которого может быть вызван гуморальный ответ и выработка иммуноглобулинов против антигена LOX1. Таким образом, вариабельный участок антитела к LOX1 может происходить, например, от человека, мыши, примата, отличного от человека примата, (например, яванских макаков, макаков и т.д.) или представителя семейства волчьих. В некоторых аспектах как вариабельный, так и константный участки модифицированного антитела к LOX1 происходят от человека. В других аспектах вариабельные участки совместимых антител (обычно происходящие от источника, отличного от человека) можно сконструировать или специфично оптимизировать с целью улучшения свойств связывания или снижения иммуногенности молекулы. В связи с этим вариабельные участки, применимые в соответствии с настоящим раскрытием, могут быть гуманизированы или иным образом изменены посредством включения импортируемых аминокислотных последовательностей.
[226]
В определенных аспектах вариабельные домены как тяжелых, так и легких цепей антитела к LOX1 (например, полноразмерного антитела к LOX1 и фрагмента антитела, связывающего LOX-1, и их варианты и производные) изменены посредством по меньшей мере частичного замещения одного или нескольких CDR и/или частичного замещения каркасного участка и изменения последовательности. Хотя CDR могут быть получены из антитела того же класса или даже подкласса, что и антитело, из которого получены каркасные участки, предусматривается, что CDR будут получены из антитела другого класса и в некоторых аспектах из антитела от другого вида. Для передачи антиген-связывающей способности одного вариабельного домена другому замещение всех CDR полными CDR из донорного вариабельного участка не является необходимым. Наоборот, необходимым является только перенос тех остатков, которые являются необходимыми для сохранения активности антигенсвязывающего сайта. С учетом пояснений, изложенных в патентах США №№ 5585089, 5693761 и 5693762, получение функционального антитела со сниженной иммуногенностью путем проведения стандартных экспериментов либо путем исследования методом проб и ошибок будет полностью находиться в пределах компетенции специалиста в данной области.
[227]
Безотносительно к изменениям в вариабельном участке, специалистам в данной области будет понятно, что модифицированные антитела к LOX1 (например, полноразмерные антитела к LOX1 и фрагменты антител, связывающие LOX1, и их варианты и производные) согласно настоящему раскрытию будут включать антитела, в которых по меньшей мере часть одного или нескольких доменов константного участка были удалены или иным образом изменены с обеспечением требуемых биохимических характеристик, например, повышенной локализации в опухоли или сокращенного времени полужизни в сыворотке по сравнению с антителом примерно с такой же иммуногенностью, содержащим нативный или неизмененный константный участок. В некоторых аспектах константный участок модифицированных антител к LOX1 будет предусматривать константный участок человека. Модификации константного участка могут включать добавления, делеции или замены одной или нескольких аминокислот в одном или нескольких доменах. То есть модифицированные антитела к LOX1, раскрытые в данном документе, могут включать изменения или модификации одного или нескольких из трех константных доменов тяжелой цепи (CH1, CH2 или CH3) и/или константных доменов легкой цепи (CL). В некоторых аспектах предполагается, что модифицированные антитела к LOX1 будут содержать константные участки, в которых один или несколько доменов частично или полностью удалены. В некоторых аспектах модифицированные антитела к LOX1 будут включать конструкции с делециями в доменах или варианты, в которых был удален полный CH2-домен (ΔCH2-конструкции). В некоторых аспектах исключенный домен константного участка может быть замещен коротким аминокислотным спейсером (например, из 10 остатков), что обеспечивает некоторую гибкость молекулы, которую обычно придает отсутствующий константный участок.
[228]
Помимо его конфигурации, из уровня техники известно, что константный участок опосредует некоторые эффекторные функции. Например, связывание C1-компонента системы комплемента с антителами активирует систему комплемента. Активация системы комплемента важна для опсонизации и лизиса патогенов в клетке. Активация системы комплемента также стимулирует воспалительный ответ и может также быть вовлечена в аутоиммунные реакции гиперчувствительности. Дополнительно, антитела связываются с клетками посредством Fc-участка, при этом сайт связывания Fc-рецептора Fc-участка антитела связывается с Fc-рецептором (FcR) клетки. Существует ряд Fc-рецепторов, являющихся специфичными в отношении антител различных классов, включая IgG (гамма-рецепторы), IgE (эта-рецепторы), IgA (альфа-рецепторы) и IgM (мю-рецепторы). Связывание антитела с Fc-рецепторами на поверхностях клеток запускает ряд важных и разнообразных биологических ответов, включая поглощение и разрушение нагруженных антителами частиц, клиренс иммунных комплексов, лизис нагруженных антителами клеток-мишеней клетками-киллерами (называемый антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичностью или ADCC), высвобождение медиаторов воспаления, плацентарный перенос и регуляцию выработки иммуноглобулинов.
[229]
В определенных аспектах антитело к LOX1 (например, полноразмерное антитело к LOX1 и фрагмент антитела, связывающий LOX-1, и их варианты и производные) характеризуется измененной эффекторной функцией, что, в свою очередь, влияет на биологические параметры введенного антитела к LOX1. Например, делеция или инактивация (с помощью точечных мутаций или других средств) домена константного участка может уменьшать степень связывания циркулирующего модифицированного антитела с Fc-рецепторами. В других случаях модификации константного участка могут обеспечивать умеренность связывания комплемента и таким образом сокращать время полужизни в сыворотке и неспецифическое связывание конъюгированного цитотоксина. Еще несколько модификаций константного участка можно применять для устранения дисульфидных связей или олигосахаридных фрагментов, что дает возможность увеличения локализации в связи с повышенной специфичностью по отношению к антигену или гибкостью антитела. Аналогичным образом, модификации константного участка в соответствии с настоящим раскрытием можно без труда осуществлять с применением хорошо известных методик биохимической или молекулярной инженерии, которые полностью находятся в пределах компетенции специалиста в данной области.
[230]
В некоторых аспектах LOX1-связывающий белок, предусмотренный в данном документе, представляет собой антитело к LOX1 (например, полноразмерное антитело к LOX1 и фрагмент антитела, связывающий LOX-1, и их варианты и производные), не обладает одной или несколькими эффекторными функции. К примеру, в некоторых аспектах антитело к LOX1 не обладает активностью в виде антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) и/или активностью в виде комплементзависимой цитотоксичности (CDC). В определенных аспектах антитело к LOX1 не связывается с Fc-рецептором и/или факторами комплемента. В определенных аспектах антитело к LOX1 не обладает эффекторной функцией.
[231]
В некоторых аспектах антитело к LOX1 (например, полноразмерное антитело к LOX1 и фрагмент антитела, связывающий LOX-1, и их варианты и производные) конструируют для слияния CH3-домена непосредственно с шарнирным участком соответствующего модифицированного антитела. В других конструкциях вставляют пептидный спейсер между шарнирным участком и модифицированными CH2 и/или CH3-доменами. Например, можно экспрессировать совместимые конструкции, в которых CH2-домен был удален и оставшийся CH3-домен (модифицированный или немодифицированный) соединяется с шарнирным участком с помощью спейсера из 5-20 аминокислот. Такой спейсер можно добавить, например, для обеспечения того, чтобы регуляторные элементы константного домена оставались свободными и доступными, или чтобы шарнирная область оставалась гибкой. Аминокислотные спейсеры могут в некоторых случаях оказаться иммуногенными и вызывать нежелательный иммунный ответ в отношении конструкции. Соответственно, в определенных аспектах любой спейсер, добавленный к конструкции, может быть относительно неиммуногенным или вовсе не будет включен, с целью сохранения требуемых биохимических свойств модифицированного антитела к LOX1.
[232]
Наряду с делецией целых доменов константного участка, антитела к LOX1 (например, полноразмерные антитела к LOX1 и фрагменты антител, связывающие LOX1, и их варианты и производные) можно модифицировать посредством частичной делеции или замены нескольких или даже одной аминокислоты в константном участке. Например, мутации одной аминокислоты в выбранных областях CH2-домена может быть достаточно, чтобы существенно снизить степень Fc-связывания и, тем самым. Аналогичным образом, один или несколько доменов константных участков, которые регулируют эффекторную функцию (например, связывание C1Q комплемента), могут быть полностью или частично удалены. Такие частичные делеции константных участков могут обеспечивать улучшение выбранных характеристик антагонистического антитела к LOX1 (например, время полужизни в сыворотке), сохраняя при этом другие требуемые функции, связанные с соответствующим доменом константного участка, в неизменном виде. Кроме того константные участки антител к LOX1, предусмотренных в данном документе, можно модифицировать путем мутации или замены одной или нескольких аминокислот, что улучшает профиль полученной конструкции. В связи с этим можно блокировать активность, обеспечиваемую консервативным сайтом связывания (например, Fc-связывания), при этом, по сути, сохраняя конфигурацию и профиль иммуногенности модифицированного антитела к LOX1. В настоящем раскрытии также предусматривают антитело к LOX1, которое включает добавление одной или нескольких аминокислот к константному участку для улучшения требуемых характеристик, таких как подавление или усиление эффекторной функции или обеспечение сайтов присоединения большего количества цитотоксинов, меток или углеводных фрагментов. В таких аспектах может быть желательной вставка или копирование специфических последовательностей, полученных из выбранных доменов константных участков.
[233]
Настоящее раскрытие также относится к вариантам и эквивалентам, которые в значительной степени являются гомологичными по структуре и/или схожими по одной или нескольким функциям с антителами к LOX1, раскрытыми в данном документе (например, мышиными, химерными, гуманизированными и LOX1-связывающими белками человека). Эти варианты могут включать, например, мутации с заменой консервативных аминокислотных остатков. Как в целом понятно из уровня техники, замена консервативного аминокислотного остатка относится к замене аминокислотного остатка другим из того же общего класса, например, одной кислотной аминокислоты другой кислотной аминокислотой, одной основной аминокислоты другой основной аминокислотой или одной нейтральной аминокислоты другой нейтральной аминокислотой. Из уровня техники известно, что подразумевается под заменой консервативной аминокислоты.
[234]
th
LOX1-связывающие белки, такие как антитела к LOX1, предусмотренные в данном документе, могут быть дериватизированы с содержанием дополнительных химических фрагментов, которые обычно не являются частью белка. Такие фрагменты для дериватизации известны из уровня техники и могут выполнять функцию улучшения, например, растворимости, времени полужизни, биодоступности и в других случаях улучшать стабильность, составление и/или терапевтические свойства LOX1-связывающего белка. Не исчерпывающий обзор таких фрагментов можно найти, например, в Remington's Pharmaceutical Sciences, 20 ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (2000).
VI. Нуклеиновые кислоты, кодирующие LOX1-связывающие белки, и их экспрессия
[235]
В настоящем раскрытии предусматривают молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют LOX1-связывающие белки (см., например, таковые, описанные в таблице 1, на фигуре 4 или на фигуре 5), в том числе антитела к LOX1, такие как полноразмерные антитела к LOX1, фрагменты антител, связывающие LOX1, и их варианты и производные. Молекулы нуклеиновых кислот, раскрытые в данном документе, могут находиться в форме РНК или в форме ДНК. ДНК включает кДНК, геномную ДНК и синтетическую ДНК; и может быть двунитевой или однонитевой, и если она однонитевая, то может представлять собой кодирующую нить или некодирующую (антисмысловую) нить. В определенных аспектах молекула нуклеиновой кислоты является выделенной. В дополнительных аспектах молекула нуклеиновой кислоты является практически чистой. В некоторых аспектах нуклеиновая кислота представляет собой кДНК или получена из кДНК. В некоторых аспектах нуклеиновая кислота получена рекомбинантным путем.
[236]
in vitro
in vitro
В некоторых аспектах молекула нуклеиновой кислоты содержит кодирующую LOX1-связывающий белок последовательность, функционально связанную с регуляторной последовательностью, которая регулирует экспрессию кодирующей последовательности в клетке-хозяине или . В конкретных аспектах кодирующая последовательность представляет собой кДНК. Настоящее раскрытие также относится к векторам, содержащим молекулы нуклеиновых кислот, содержащие кодирующую LOX1-связывающий белок последовательность, функционально связанную с регуляторной последовательностью, которая регулирует экспрессию кодирующей последовательности в клетке-хозяине или .
[237]
В некоторых аспектах молекула нуклеиновой кислоты содержит кодирующую последовательность для зрелого LOX1-связывающего белка, которая слита в той же рамке считывания с гетерологичной полинуклеотидной последовательностью. В некоторых аспектах гетерологичная полинуклеотидная последовательность кодирует лидерную пептидную последовательность, которая способствует секреции экспрессируемого белка из клетки-хозяина, трансформированной молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей LOX1. Белок, содержащий лидерную последовательность, называется белком-предшественником и может иметь лидерную последовательность, расщепляемую клеткой-хозяином, с получением зрелой формы полипептида. Такие лидерные пептидные последовательности и их применение, способствующие секреции рекомбинантных белков из клеток-хозяев, в целом известны из уровня техники. В дополнительных аспектах гетерологичная полинуклеотидная последовательность кодирует дополнительные 5'- и/или 3'-аминокислотные остатки, которые могут выполнять функцию, например, облегчения очистки, придания или улучшения стабильности белка и/или терапевтических или диагностических свойств рекомбинантно экспрессируемого LOX1-связывающего белка.
[238]
В некоторых аспектах в настоящем раскрытии предусматривают выделенные нуклеиновые кислоты, такие как молекула кДНК, достаточные для применения в качестве гибридизационного зонда, ПЦР-праймера или праймера для секвенирования.
[239]
В некоторых аспектах в настоящем раскрытии предусматривают выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую вариабельный участок легкой цепи (VL), где VL содержит аминокислотные последовательности VL-CDR1, VL-CDR2 и VL-CDR3, которые содержат в общей сложности одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь или меньше аминокислотных замен в одном или нескольких из VL-CDR по сравнению соответственно с SEQ ID NO:30; SEQ ID NO:31 или SEQ ID NO:32, 34 или 35, или идентичные им. В других аспектах в настоящем раскрытии предусматривают выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую вариабельный участок легкой цепи (VL), где VL содержит аминокислотные последовательности VL-CDR1, VL-CDR2 и VL-CDR3, которые содержат в общей сложности одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь или меньше аминокислотных замен в одном или нескольких из VL-CDR по сравнению соответственно с SEQ ID NO:55 или 59; SEQ ID NO:56 или 60 или SEQ ID NO:57, 61-63 или 64, или идентичные им.
[240]
В настоящем раскрытии дополнительно предусматривают выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую вариабельный участок тяжелой цепи (VH), где VH содержит аминокислотные последовательности VH-CDR1, VH-CDR2 и VH-CDR3, которые содержат в общей сложности одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь или меньше аминокислотных замен в одном или нескольких из VH-CDR по сравнению соответственно с SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO:2, 5-12 или 13; и SEQ ID NO:3, 14-17 или 18, или идентичные им. В других аспектах в настоящем раскрытии предусматривают выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую вариабельный участок тяжелой цепи (VH), где VH содержит аминокислотные последовательности VH-CDR1, VH-CDR2 и VH-CDR3, которые содержат в общей сложности одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь или меньше аминокислотных замен в одном или нескольких из VH-CDR по сравнению соответственно с SEQ ID NO:38; SEQ ID NO:39, 42 или 43; и SEQ ID NO:40, 44-46 или 47, или идентичные им.
[241]
В настоящем раскрытии также предусматривают выделенную нуклеиновую кислоту, такую как кДНК, кодирующую вариабельный участок легкой цепи (VL), где VL содержит аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью последовательности с эталонной аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:36 и SEQ ID NO:37. В некоторых аспектах выделенная молекула нуклеиновой кислоты кодирует вариабельный участок легкой цепи (VL), где VL содержит аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 90%, 95%, 97%, 98%, 99% идентичностью последовательности с эталонной аминокислотной последовательностью.
[242]
Кроме того, в настоящем раскрытии предусматривают выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую вариабельный участок тяжелой цепи (VH), где VH содержит аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью последовательности с эталонной аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:4, 19-28 и 29. В некоторых аспектах выделенная молекула нуклеиновой кислоты кодирует вариабельный участок тяжелой цепи (VH), где VH содержит аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 90%, 95%, 97%, 98%, 99% идентичностью последовательности с эталонной аминокислотной последовательностью.
[243]
В некоторых аспектах в настоящем раскрытии предусматривают молекулу нуклеиновой кислоты или комбинацию молекул нуклеиновых кислот, которые кодируют LOX1-связывающий белок (например, LOX-1 связывающие белки, описанные в таблице 1, на фигуре 4 или на фигуре 5), который специфично связывается с LOX1. Дополнительно предусматривают вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, такую как кДНК, или комбинацию молекул нуклеиновых кислот, описанных в данном документе. Подходящие векторы описаны в другом месте данного документа и известны из уровня техники.
[244]
В определенных аспектах вариабельный участок тяжелой цепи (VH) и вариабельный участок легкой цепи (VL) кодируются последовательностями нуклеиновых кислот, характеризующимися по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью последовательностей с эталонными последовательностями нуклеиновых кислот, кодирующими SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:23 и SEQ ID NO:36 или SEQ ID NO:27 и SEQ ID NO:37 соответственно. В конкретном аспекте выделенный LOX1-связывающий белок (например, антитело к LOX1 или его фрагмент) кодируется последовательностями нуклеиновых кислот, кодирующими SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:33 соответственно.
[245]
В настоящем раскрытии также предусматривают выделенную нуклеиновую кислоту, такую как кДНК, кодирующую вариабельный участок легкой цепи (VL), где VL содержит аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью последовательности с эталонной аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:58, 65-69 и 70. В некоторых аспектах выделенная молекула нуклеиновой кислоты кодирует вариабельный участок легкой цепи (VL), где VL содержит аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 90%, 95%, 97%, 98%, 99% идентичностью последовательности с эталонной аминокислотной последовательностью.
[246]
В настоящем раскрытии также предусматривается выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая вариабельный участок тяжелой цепи (VH), где VH содержит аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью последовательности с эталонной аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:41, 48-53 и 54. В некоторых аспектах выделенная молекула нуклеиновой кислоты кодирует вариабельный участок тяжелой цепи (VH), где VH содержит аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 90%, 95%, 97%, 98%, 99% идентичностью последовательности с эталонной аминокислотной последовательностью.
[247]
В определенных аспектах вариабельный участок тяжелой цепи (VH) и вариабельный участок легкой цепи (VL) кодируются последовательностями нуклеиновых кислот, характеризующимися по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью последовательностей с эталонными последовательностями нуклеиновых кислот, кодирующими SEQ ID NO:54 и SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:41 и SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:48 и SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:49 и SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:50 и SEQ ID NO:67 или SEQ ID NO:53 и SEQ ID NO:58 соответственно. В конкретном аспекте выделенный LOX1-связывающий белок (например, антитело к LOX1 или его фрагмент) кодируется последовательностями нуклеиновых кислот, кодирующими SEQ ID NO:41 и SEQ ID NO:58 соответственно.
[248]
В некоторых аспектах выделенная нуклеиновая кислота кодирует LOX1-связывающий белок, содержащий набор CDR: VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, VL-CDR1, VL-CDR3 и VL-CDR3, описанные в таблице 1, на фигуре 4 или на фигуре 5. В некоторых дополнительных аспектах выделенная нуклеиновая кислота кодирует LOX1-связывающий белок, содержащий вариабельный участок тяжелой цепи (VH) и вариабельный участок легкой цепи (VL), описанные в таблице 1, на фигуре 4 или на фигуре 5.
[249]
В композиции на основе описанной выше молекулы нуклеиновой кислоты нуклеиновая кислота, кодирующая VH, и нуклеиновая кислота, кодирующая VL, могут находиться в одном векторе или могут находиться в отдельных векторах. Следовательно, в настоящем раскрытии предусматривают один или несколько векторов, содержащих композицию на основе молекулы нуклеиновой кислоты или комбинацию молекул нуклеиновых кислот, описанных выше.
[250]
В некоторых случаях композиция на основе полинуклеотида, кодирующего описанные выше VH и VL, может кодировать антитело (в том числе фрагмент антитела, связывающий LOX-1), которое специфично связывается с LOX1, например, LOX1 человека и яванского макака. В некоторых аспектах композиция на основе полинуклеотида кодирует антитело, которое специфично связывается с тем же эпитопом, что и антитело или антигенсвязывающий фрагмент, содержащие VH и VL под SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:33 соответственно. В других аспектах композиция на основе полинуклеотида кодирует антитело, которое специфично связывается с тем же эпитопом, что и антитело или антигенсвязывающий фрагмент, содержащие VH и VL под SEQ ID NO:41 и SEQ ID NO:58 соответственно. В некоторых дополнительных аспектах композиция на основе полинуклеотида кодирует антитело, которое специфично связывается с тем же эпитопом, что и LOX1-связывающий белок, содержащий вариабельный участок тяжелой цепи (VH) и вариабельный участок легкой цепи (VL), описанные в таблице 1, на фигуре 4 или на фигуре 5.
[251]
В дополнительных аспектах в настоящем раскрытии предусматривают клетку-хозяин, содержащую предусмотренные выше нуклеиновую кислоту, или нуклеиновые кислоты, или вектор, при этом клетка-хозяин может в некоторых случаях экспрессировать LOX1-связывающий белок (например, антитело к LOX1, такое как полноразмерное антитело к LOX1, фрагмент антитела, связывающий LOX-1, и их варианты и производные), который специфично связывается с LOX1. Такую клетку-хозяин можно использовать в способе получения LOX1-связывающего белка, предусмотренного в данном документе, при этом способ включает (a) культивирование клетки-хозяина и (b) выделение LOX1-связывающих белков, экспрессируемых в клетке-хозяине.
[252]
В настоящем раскрытии также предусматривают способ получения LOX1-связывающего белка, включающий культивирование клетки-хозяина или гибридомы, способных экспрессировать LOX1-связывающий белок в подходящих условиях, и необязательно предусматривают способ выделения LOX1-связывающего белка, секретируемого клеткой-хозяином или гибридомой. Кроме того, в настоящем раскрытии дополнительно предусматривают LOX1-связывающий белок (например, антитело к LOX1 или его фрагмент), выделенный после секретирования клеткой-хозяином или гибридомой, с применением раскрытых способов.
[253]
В некоторых аспектах полинуклеотиды содержат кодирующую(кодирующие) последовательность(последовательности) для зрелого(зрелых) LOX1-связывающего(связывающих) белка(белков) (например, антитела к LOX1, такое как полноразмерное антитело и фрагмента антитела, связывающего LOX-1), слитую(слитые) в одной и той же рамке считывания с маркерной последовательностью, которая обеспечивает возможность, например, очистки кодируемого полипептида. Например, маркерная последовательность может представлять собой гексагистидиновую метку, доставляемую вектором pQE-9, для обеспечения очистки зрелого полипептида, слитого с маркером, в случае хозяина-бактерии, или маркерная последовательность может представлять собой гемагглютининовую (HA) метку, полученную из белка гемагглютинина вируса гриппа, если применяют хозяина-млекопитающего (например, клетки COS-7).
[254]
E. coli
Варианты нуклеиновых кислот, кодирующих LOX1-связывающий белок, такой как антитело к LOX1 и фрагмент антитела, связывающий LOX-1, также предусматривают. Варианты нуклеиновых кислот могут содержать изменения в кодирующих участках, некодирующих участках или как в тех, так и в других. В некоторых аспектах варианты нуклеиновых кислот содержат изменения, которые приводят к "молчащим" заменам, добавлениям или делециям, но не изменяют свойства или виды активностей кодируемого полипептида. В некоторых аспектах варианты нуклеиновых кислот получены с помощью "молчащих" замен благодаря вырожденности генетического кода. Варианты нуклеиновых кислот можно получать в силу ряда причин, например, для оптимизации экспрессии кодонов для конкретного хозяина (замена кодонов в мРНК человека на кодоны, предпочтительные для бактериального хозяина, такого как ). Также предусмотрены векторы и клетки, содержащие описанные в данном документе нуклеиновые кислоты.
[255]
В некоторых аспектах последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей LOX1-связывающий белок (например, антитело к LOX1, такое как полноразмерное антитело и фрагмент антитела, связывающий LOX-1), конструируют с помощью химического синтеза с применением олигонуклеотидного синтезатора. Такие олигонуклеотиды могут быть сконструированы на основе аминокислотной последовательности требуемого полипептида и оптимизации кодонов, исходя из предпочтений в отношении клетки-хозяина. Для синтеза выделенных полинуклеотидных последовательностей, кодирующих LOX1-связывающие белки, можно запросто применять стандартные способы.
[256]
После сборки (с помощью синтеза, сайт-направленного мутагенеза или другого способа) последовательности нуклеиновых кислот, кодирующих LOX1-связывающие белки, могут быть обычным способом функционально связаны с регуляторной последовательностью, подходящей для экспрессии LOX1-связывающих белков в требуемом хозяине. В некоторых аспектах последовательности нуклеиновых кислот, кодирующих LOX1-связывающие белки, вставляют в вектор экспрессии и обеспечивают функциональное связывание с регуляторной последовательностью, подходящей для экспрессии белка в требуемом хозяине. С целью получения высоких уровней экспрессии трансфицированного гена в хозяине, ген может быть функционально связан или ассоциирован с осуществляющими контроль транскрипции и трансляции последовательностями, которые являются функциональными в выбранном хозяине для экспрессии.
[257]
В определенных аспектах рекомбинантные векторы экспрессии применяют для амплификации и экспрессии ДНК, кодирующей LOX1-связывающий белок, такой как антитело к LOX1 или фрагмент антитела, связывающий LOX-1. Рекомбинантные векторы экспрессии представляют собой реплицируемые ДНК-конструкции, которые содержат синтетические или полученные из кДНК ДНК-фрагменты, кодирующие полипептидную цепь LOX1-связывающих белков (например, антитела к LOX1, такого как полноразмерное антитело и фрагмент антитела, связывающий LOX-1), функционально связанные с подходящими регулирующими транскрипцию или трансляцию элементами, полученными из генов млекопитающих, микроорганизмов, вирусов или насекомых. Транскрипционная единица, как правило, содержит сборку из (1) генетического элемента или элементов, имеющих регуляторную роль в экспрессии генов, например, промоторы или энхансеры транскрипции, (2) структурной или кодирующей последовательности, которая транскрибируется в мРНК и транслируется в белок, и (3) соответствующих последовательностей инициации транскрипции и трансляции и последовательностей терминации, подробно описанных ниже. Такие регуляторные элементы могут включать последовательность оператора для контроля транскрипции. Способность к репликации в хозяине, как правило, обеспечивается точкой начала репликации, и можно дополнительно включить ген селекции для облегчения распознавания трансформантов. Области ДНК являются функционально связанными, когда они функционально зависят друг от друга. Например, ДНК для сигнального пептида (секреторная лидерная последовательность) функционально связана с ДНК для полипептида, если она экспрессируется в виде предшественника, который участвует в секреции полипептида; промотор функционально связан с кодирующей последовательностью, если он контролирует транскрипцию последовательности; или сайт связывания рибосомы функционально связан с кодирующей последовательностью, если он расположен так, чтобы обеспечивать трансляцию. Структурные элементы, предназначенные для применения в дрожжевых системах экспрессии, включают лидерную последовательность, обеспечивающую внеклеточную секрецию транслируемого белка клеткой-хозяином. В качестве альтернативы, если рекомбинантный белок экспрессируется без лидерной или транспортной последовательности, белок может включать в себя N-концевой остаток метионина. Этот остаток может впоследствии быть необязательно отщеплен от экспрессированного рекомбинантного белка с получением конечного белка. В определенных аспектах в настоящем раскрытии предусматривают композицию, например, фармацевтическую композицию, содержащую нуклеиновую кислоту или вектор, описанные выше или в другом месте данного документа, необязательно дополнительно содержащую один или несколько носителей, разбавителей, наполнителей или других добавок.
[258]
Также предусматривают клетку-хозяин, трансформированную молекулой нуклеиновой кислоты или молекулами кДНК и/или векторами, раскрытыми в данном документе. В настоящем раскрытии также предусматривают клетки-хозяева, трансформированные раскрытой молекулой нуклеиновой кислоты или молекулами, функционально связанными с регуляторной последовательностью, и необязательно вставленными в вектор. В некоторых аспектах клетка-хозяин представляет собой клетку-хозяина млекопитающего. В дополнительных аспектах клетка-хозяин млекопитающего представляет собой клетку миеломы мыши NS0, клетку человека PER.C6 или клетку яичника китайского хомячка (CHO). В других аспектах клетка-хозяин представляет собой клетку гибридомы.
[259]
Дополнительно клетки-хозяева, экспрессирующие нуклеиновые кислоты, кодирующие LOX1-связывающие белки, раскрытые в данном документе, представляют собой гибридомы, которые вырабатывают LOX1-связывающий белок.
[260]
В дополнительных аспектах в настоящем раскрытии предусматривают способ получения LOX1-связывающего белка (например, антитела к LOX1, такое как полноразмерное антитело к LOX1 и фрагмента антитела, связывающего LOX-1, и их варианты и производные), предусмотренного в данном документе, включающий культивирование трансформированной клетки-хозяина или гибридомы, раскрытых в данном документе, в подходящих условиях для выработки LOX1-связывающего белка. В настоящем раскрытии необязательно предусматривают выделение LOX1-связывающего белка, секретируемого клеткой-хозяином или гибридомой. В настоящем раскрытии также необязательно предусматривают LOX1-связывающий белок, полученный с применением данного способа, и фармацевтические композиции, содержащие LOX1-связывающий белок и фармацевтически приемлемый носитель.
[261]
E. coli
Выбор последовательности, осуществляющей контроль экспрессии, и вектора экспрессии будет зависеть от выбора хозяина. Можно использовать широкое разнообразие комбинаций хозяин/вектор для экспрессии. Пригодные векторы экспрессии для эукариотических хозяев включают, например, векторы, содержащие контролирующие экспрессию последовательности из SV40, вируса папилломы крупного рогатого скота, аденовируса и цитомегаловируса. Пригодные векторы экспрессии для бактериальных хозяев включают известные бактериальные плазмиды, такие как плазмиды из , в том числе pCR1, pBR322, pMB9 и их производные, а также плазмиды для более широкого круга хозяев, такие как M13 и нитевидные фаги, содержащие однонитевую ДНК.
[262]
E. coli
Подходящие клетки-хозяева для экспрессии LOX1-связывающего белка (например, антитела к LOX1, такого как полноразмерное антитело к LOX1, и фрагмента антитела, связывающего LOX-1, и их варианты и производные), под контролем соответствующих промоторов, включают в себя клетки прокариот, дрожжей, насекомых или высших эукариот. Прокариоты включают грамотрицательные или грамположительные организмы, например, или бациллы. Клетки высших эукариот включают устойчивые клеточные линии, происходящие от млекопитающих, описанные ниже. Можно также использовать бесклеточные системы трансляции. Дополнительную информацию касательно способов получения белков, в том числе получения антител, можно найти, например, в публикации заявки на патент США № 2008/0187954, патентах США № 6413746 и 6660501 и публикации международной заявки № WO 04009823, каждая из которых включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.
[263]
Cell
BioTechnology
Различные системы культивирования клеток млекопитающих или насекомых также можно с успехом применять для экспрессии рекомбинантного LOX1-связывающего белка (например, антитела к LOX1, такого как полноразмерное антитело к LOX1, и фрагмента антитела, связывающего LOX-1, и их варианты и производные). Экспрессию рекомбинантных LOX1-связывающих белков можно осуществлять в клетках млекопитающих, поскольку такие белки обычно правильно свернуты, модифицированы соответствующим образом и полностью функциональны. Примеры подходящих линий клеток-хозяев млекопитающих включают HEK-293 и HEK-293T, линии клеток почки обезьяны COS-7, описанные Gluzman (23:175 (1981)), и другие линии клеток, в том числе, например, L-клетки, линии клеток C127, 3T3, яичника китайского хомячка (CHO), HeLa и BHK. Векторы экспрессии для млекопитающих могут содержать нетранскрибируемые элементы, такие как точка начала репликации, подходящий промотор и энхансер, связанный с геном, подлежащим экспрессии, и другие 5' и 3'-фланкированные нетранскрибируемые последовательности, и 5' или 3'-нетранслируемые последовательности, такие как необходимые сайты связывания рибосом, сайт полиаденилирования, донорные и акцепторные сайты сплайсинга и последовательности терминации транскрипции. Бакуловирусные системы для получения гетерологичных белков в клетках насекомых рассматриваются в Luckow & Summers, 6:47 (1988).
[264]
LOX1-связывающие белки (например, антитела к LOX1, такие как полноразмерные антитела к LOX1 и фрагменты антител, связывающие LOX1, и их варианты и производные), вырабатываемые трансформированным хозяином или гибридомой, могут быть очищены в соответствии с любым подходящим способом. Такие стандартные способы включают хроматографию (например, ионообменную, аффинную и эксклюзионную колоночную хроматографию), центрифугирование, очистку на основе различной растворимости или любую другую стандартную методику очистки белков. Аффинные метки, такие как гексагистидин, домен связывания мальтозы, последовательность оболочки вируса гриппа и глутатион-S-трансфераза, можно присоединять к белку для обеспечения возможности легкой очистки путем пропускания через соответствующую аффинную колонку. Выделенные LOX1-связывающие белки можно также характеризовать физически при помощи таких методик, как протеолиз, ядерный магнитный резонанс и рентгеноструктурная кристаллография.
[265]
Например, надосадочные жидкости из систем, которые секретируют рекомбинантный LOX1-связывающий белок в культуральную среду, можно вначале сконцентрировать при помощи коммерчески доступного фильтра для концентрирования белков, например, установки для ультрафильтрации Amicon или Pellicon от Millipore. Следом за стадией концентрирования концентрат можно нанести на подходящую матрицу для очистки. В качестве альтернативы, можно использовать анионообменную смолу, например, матрицу или субстрат с боковыми диэтиламиноэтильными (DEAE) группами. Матрицы могут быть акриламидными, агарозными, декстрановыми, целлюлозными или других типов, обычно используемых для очистки белков. В качестве альтернативы можно использовать стадию катионного обмена. Подходящие катионообменники включают различные нерастворимые матрицы, содержащие сульфопропильные или карбоксиметильные группы. В конечном счете можно применять одну или несколько стадий обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (RP-HPLC), в которых используют гидрофобные среды для RP-HPLC, например, силикагель с боковыми метильными или другими алифатическими группами, для дополнительной очистки LOX1-связывающего белка. Некоторые или все из вышеизложенных стадий очистки в различных комбинациях можно также запросто использовать для получения гомогенных рекомбинантных LOX1-связывающих белков.
[266]
Рекомбинантный LOX1-связывающий белок (например, антитело к LOX1, такое как полноразмерное антитело к LOX1 и фрагмент антитела, связывающий LOX-1, и их варианты и производные), вырабатываемый в бактериальной культуре, можно выделить, например, с помощью изначального выделения из клеточных осадков с последующей одной или несколькими стадиями концентрирования, высаливания, ионообменной или эксклюзионной хроматографии в водной среде. На конечных этапах очистки можно использовать высокоэффективную жидкостную хроматографию (HPLC). Используемые для экспрессии рекомбинантного белка клетки микроорганизмов можно разрушать с помощью любого общепринятого способа, в том числе чередования циклов замораживания-оттаивания, разрушения ультразвуком, механического разрушения или применения средств, лизирующих клетки.
[267]
Известные из уровня техники способы очистки целевых связывающих белков, таких как полноразмерные антитела и антигенсвязывающие фрагменты антител, также включают, например, таковые, описанные в публикациях на патенты США №№ 2008/0312425, 2008/0177048 и 2009/0187005, каждая из которых включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.
VII. Способы лечения с применением терапевтических LOX1-связывающих белков
[268]
Предусмотрены способы применения LOX1-связывающего белка (например, антитела к LOX1, такого как полноразмерное антитело к LOX1, фрагмент антитела, связывающий LOX-1, и их варианты и производные) для лечения субъектов с заболеванием, связанным с LOX1, активностью LOX1 и/или экспрессией LOX1. Способы выявления экспрессии LOX1 известны из уровня техники и включают без ограничения методики ПЦР, иммуногистохимии, проточной цитометрии, вестерн-блоттинга, ELISA и т.п.
[269]
фармацевтически приемлемый носитель.
фармацевтически приемлемый носитель
В дополнительных аспектах в настоящем раскрытии предусматривают фармацевтическую композицию, содержащую LOX1-связывающий белок, предусмотренный в данном документе (например, антитело к LOX1 или его фрагмент) и  В некоторых аспектах в настоящем раскрытии предусматривают фармацевтическую композицию, содержащую LOX1-связывающий белок и , для применения в качестве лекарственного препарата. В настоящем раскрытии также предусматривают применение фармацевтических композиций для лечения, предупреждения и/или облегчения заболевания или состояния, связанного с LOX1, активностью LOX1, экспрессией LOX1 и/или подавлением опосредованной HDL передачи сигнала. В некоторых аспектах заболевание или состояние, подлежащие лечению с применением фармацевтических композиций, предусмотренных в данном документе, представляют собой атеросклероз, тромбоз, CAD, ишемию (например, ишемию миокарда), инфаркт (например, инфаркт миокарда), острый коронарный синдром (ACS), инсульт, реперфузионное повреждение, рестеноз, заболевание периферических сосудов, гипертензию, сердечную недостаточность, воспаление (например, хроническое воспаление), ангиогенез, преэклампсию и/или рак.
[270]
В некоторых аспектах фармацевтическая композиция содержит LOX1-связывающий белок (например, антитело к LOX1, такое как полноразмерное антитело к LOX1 и фрагмент антитела, связывающий LOX-1, и их варианты и производные), фармацевтически приемлемый носитель и дополнительно содержит группу для введения метки или эффекторную группу. Применяемое в данном документе выражение "метка" относится к одному или нескольким элементам, изотопам или химическим соединениям, присоединенным с возможностью выявления при скрининге. Метки в целом делятся на три класса: (a) изотопные метки, которые могут быть радиоактивными изотопами или тяжелыми изотопами, (b) низкомолекулярные метки, которые могут включать флуоресцентные или определяемые колориметрически красители или молекулы, такие как биотин, которые обеспечивают другие способы мечения, и (c) определяемые иммунологическими методами метки, которые могут представлять собой эпитоп, включенный в качестве партнера слияния, распознаваемый антителом. "Группа для введения метки" относится к любой выявляемой метке. В некоторых аспектах группа для введения метки связана с LOX1-связывающим белком с помощью спейсера (например, пептидного спейсера) для уменьшения стерического несоответствия. Метки могут быть включены в соединение в любом положении и могут быть включены in vitro или in vivo в ходе экспрессии белка. Различные способы мечения белков известны из уровня техники и могут быть применены при осуществлении предусмотренных способов. В дополнительных аспектах группа для введения метки выбрана из группы, состоящей из: изотопных меток, магнитных меток, редокс-активных фрагментов, оптических красителей, биотинилированных групп и эпитопов полипептидов, распознаваемых вторичным репортером. В некоторых аспектах группа для введения метки представляет собой флуоресцентный белок, такой как зеленый флуоресцентный белок или его производное (например, усиленный GFP, синий флуоресцентный белок (BFP) или его производное (например, EBFP (усиленный синий флуоресцентный белок), EBFP2, Azurite, mKalama1, голубой флуоресцентный белок (CFP) или его производное (например, ECFP (усиленный голубой флуоресцентный белок), Cerulean, CyPet), желтый флуоресцентный белок или его производное (например, YFP, Citrine, Venus, YPet). В некоторых аспектах эпитоп полипептида является представителем, выбранным из биотинилированного сигнального пептида, гистидинового пептида (his), гемагглютинина (HA), Flag, пептида, связывающегося с частицами золота. В дополнительных аспектах эффекторная группа выбрана из группы, состоящей из радиоактивного изотопа, радионуклида, токсина, терапевтического и химиотерапевтического средства.
[271]
В дополнительных аспектах эффекторная группа выбрана из группы, состоящей из радиоактивного изотопа, радионуклида, токсина, терапевтического и химиотерапевтического средства.
[272]
Следующее обсуждение относится к диагностическим способам и способам лечения, предупреждения и/или облегчения ряда заболеваний и состояний, связанных с LOX1-связывающим белком (например, антителом к LOX1, таким как полноразмерное антитело к LOX1, фрагментом антитела, связывающим LOX-1, и их вариантами и производными). В некоторых аспектах LOX1-связывающие белки представляют собой человеческие, мышиные или гуманизированные антитела.
[273]
В одном аспекте в настоящем раскрытии предусматривают лечение, предупреждение или облегчение заболевания или состояния, включающее введение LOX1-связывающего белка (например, антитела к LOX1, такого как полноразмерное антитело к LOX1, фрагмент антитела, связывающий LOX-1, и их варианты и производные) субъекту, у которого наблюдается заболевание или состояние, или который подвержен риску развития заболевания или состояния, связанного с LOX1. В другом аспекте лечение включает введение LOX1-связывающего белка в выделенную ткань или клетку от субъекта, при этом у субъекта наблюдается заболевание или состояния или он подвержен риску развития заболевания или состояния, связанного с LOX1.
[274]
В настоящем раскрытии также предусматривают способы лечения, предупреждения и/или облегчения заболевания или состояния, связанного с атеросклерозом, тромбозом, CAD, ишемией (например, ишемией миокарда), инфарктом (например, инфарктом миокарда), острым коронарным синдромом (ACS), инсультом, реперфузионным повреждением, рестенозом, заболеванием периферических сосудов, гипертензией, сердечной недостаточностью, воспалением (например, хроническим воспалением), ангиогенезом, преэклампсией и раком у субъекта. В некоторых аспектах способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей LOX1-связывающий белок (например, антитело к LOX1, такое как полноразмерное антитело к LOX1, фрагмент антитела, связывающий LOX-1, и их варианты и производные). В дополнительных аспектах LOX1-связывающий белок вводят отдельно или в комбинированной терапии.
[275]
В настоящем раскрытии также предусматривают способы снижения или ингибирования активности LOX1 и/или стимулирования или усиления HDL-опосредованной передачи сигнала у субъекта. В некоторых аспектах способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту (например, субъекту, у которого был диагностирован атеросклероз, тромбоз, CAD, ишемия (например, ишемия миокарда), инфаркт (например, инфаркт миокарда), острый коронарный синдром (ACS), инсульт, реперфузионное повреждение, рестеноз, заболевание периферических сосудов, гипертензия, сердечная недостаточность, воспаление (например, хроническое воспаление), ангиогенез, преэклампсия и/или рак) эффективного количества LOX1-связывающего белка (например, антитела к LOX1, такого как полноразмерное антитело к LOX1, фрагмент антитела, связывающий LOX-1, и их варианты и производные).
[276]
Дополнительно предусматривают способы лечения, предупреждения и/или облегчения атеросклероза. В некоторых случаях способ включает введение LOX1-связывающего белка (например, антитела к LOX1 или его фрагмента в фармацевтической композиции, описанной в данном документе) субъекту с атеросклерозом. В других аспектах субъект, которому вводят LOX1-связывающий белок (например, антитело к LOX1 или его фрагмент), подвержен риску развития атеросклероза. В некоторых аспектах у субъекта наблюдается проатерогенное состояние. В дополнительных аспектах проатерогенное состояние представляет собой системную красную волчанку (SLE), диабет, гипертензию, гипергликемию, сердечную недостаточность, повреждение сосудов, состояние при трансплантации органов, дислипидемию (например, гиперлипидемию), воспаление (например, хроническое воспаление и воспаление, индуцированное эндотоксинами) и/или бактериальную инфекцию. Также предусматривают способы ослабления атеросклероза. В некоторых случаях в настоящем раскрытии предусматривают способ ослабления атеросклероза у субъекта, который включает введение LOX1-связывающего белка субъекту с атеросклерозом.
[277]
Также предусматривают способы лечения, предупреждения и/или облегчения тромбоза. В некоторых случаях способ включает введение LOX1-связывающего белка (например, антитела к LOX1 или его фрагмента) субъекту с тромбозом. В других аспектах субъект, которому вводят LOX1-связывающий белок, подвержен риску развития тромбоза. В некоторых аспектах тромбоз представляет собой тромбоз артерии. В дополнительных аспектах тромбоз представляет собой тромбоз глубоких вен.
[278]
В настоящем раскрытии также предусматривают способы лечения, предупреждения и/или облегчения коронарной недостаточности (CAD) или состояния, связанного с CAD. В некоторых случаях способ включает введение LOX1-связывающего белка (например, антитела к LOX1 или его фрагмента в фармацевтической композиции, описанной в данном документе) субъекту с CAD. В других аспектах субъект, которому вводят LOX1-связывающий белок, подвержен риску развития CAD. В некоторых аспектах у субъекта наблюдается проатерогенное состояние. В дополнительных аспектах проатерогенное состояние представляет собой системную красную волчанку (SLE), диабет, гипертензию, гипергликемию, сердечную недостаточность, повреждение сосудов, состояние при трансплантации органов, дислипидемию (например, гиперлипидемию), воспаление (например, хроническое воспаление и воспаление, индуцированное эндотоксинами) и/или бактериальную инфекцию.
[279]
В настоящем раскрытии также предусматривают способы лечения, предупреждения и/или облегчения ишемии или состояния, связанного с ишемией. В некоторых случаях способ включает введение LOX1-связывающего белка (например, антитела к LOX1 или его фрагмента в фармацевтической композиции, описанной в данном документе) субъекту с ишемией. В других аспектах субъект, которому вводят LOX1-связывающий белок, подвержен риску развития ишемии. В некоторых аспектах у субъекта наблюдается ишемия миокарда. В других аспектах субъект подвержен риску развития ишемии миокарда. В дополнительных аспектах у субъекта наблюдается системная красная волчанка (SLE), диабет, гипертензия, гипергликемия, сердечная недостаточность, повреждение сосудов, состояние при трансплантации органов, дислипидемия (например, гиперлипидемия), воспаление (например, хроническое воспаление и воспаление, индуцированное эндотоксинами) и/или бактериальная инфекция.
[280]
Также предусматривают способы лечения, предупреждения и/или облегчения инфаркта или состояния, связанного с инфарктом. В некоторых случаях способ включает введение LOX1-связывающего белка (например антитела к LOX1 или его фрагмента в фармацевтической композиции, описанной в данном документе) субъекту с инфарктом. В других аспектах субъект, которому вводят LOX1-связывающий белок, подвержен риску развития инфаркта. В некоторых аспектах у субъекта наблюдается инфаркт миокарда. В других аспектах субъект подвержен риску развития инфаркта миокарда. В дополнительных аспектах у субъекта наблюдается ишемия, системная красная волчанка (SLE), диабет, гипертензия, гипергликемия, сердечная недостаточность, повреждение сосудов, состояние при трансплантации органов, дислипидемия (например, гиперлипидемия), воспаление (например, хроническое воспаление и воспаление, индуцированное эндотоксинами) и/или бактериальная инфекция.
[281]
В настоящем раскрытии также предусматривают способы лечения, предупреждения и/или облегчения острого коронарного синдрома (ACS) или состояния, связанного с ACS. В некоторых случаях способ включает введение LOX1-связывающего белка (например, антитела к LOX1 или его фрагмента в фармацевтической композиции, описанной в данном документе) субъекту с ACS. В других аспектах субъект, которому вводят LOX1-связывающий белок, подвержен риску развития ACS. В некоторых аспектах у субъекта наблюдаются повышенные уровни sLOX в сыворотке или повышенная активность LOX1. В дополнительных аспектах у субъекта наблюдается атеросклероз.
[282]
В настоящем раскрытии также предусматривают способы лечения, предупреждения и/или облегчения инсульта или состояния, связанного с инсультом. В некоторых случаях способ включает введение LOX1-связывающего белка (например, антитела к LOX1 или его фрагмента в фармацевтической композиции, описанной в данном документе) субъекту, который перенес инсульт. В других аспектах субъект, которому вводят LOX1-связывающий белок, подвержен риску возникновения инсульта. В некоторых аспектах у субъекта наблюдаются повышенные уровни sLOX в сыворотке или повышенная активность LOX1. В дополнительных аспектах у субъекта наблюдается атеросклероз.
[283]
Также предусматривают способы лечения, предупреждения и/или облегчения реперфузионного повреждения или состояния, связанного с реперфузионным повреждением. В некоторых случаях способ включает введение LOX1-связывающего белка (например, антитела к LOX1 или его фрагмента в фармацевтической композиции, описанной в данном документе) субъекту с реперфузионным повреждением. В других аспектах субъект, которому вводят LOX1-связывающий белок, подвержен риску реперфузионного повреждения. В некоторых аспектах субъекту будут делать операцию. В других аспектах субъект перенес операцию. В некоторых аспектах операция представляет собой трансплантацию или операцию коронарного шунтирования. В дополнительных аспектах у пациента наблюдается ишемически-реперфузионное повреждение миокарда или он подвержен риску его развития. В дополнительных аспектах способ обеспечивает уменьшение повреждения миокарда, уменьшение отложения коллагена, снижение уровней CK-MB и MDA в сыворотке, уменьшение размера кардиомиоцитов, снижение степени инфильтрации лейкоцитов и/или снижение кардиальной дисфункции (например, снижение LVP и повышение LVEDP). В дополнительных аспектах способ обеспечивает повышение ударного объема сердца, фракции укорочения и/или фракции выброса.
[284]
В настоящем раскрытии также предусматривают способы лечения, предупреждения и/или облегчения рестеноза или состояния, связанного с рестенозом. В некоторых случаях способ включает введение LOX1-связывающего белка (например, антитела к LOX1 или его фрагмента в фармацевтической композиции, описанной в данном документе) субъекту с рестенозом. В других аспектах субъект, которому вводят LOX1-связывающий белок, подвержен риску развития рестеноза. В некоторых аспектах субъекту будут делать операцию. В других аспектах субъект перенес операцию. В некоторых аспектах операция представляет собой эндоваскулярную процедуру. В дополнительных вариантах осуществления операция представляет собой операцию на сосудах, операцию на сердце или ангиопластику. В дополнительных аспектах процедура представляет собой трансплантацию или операцию коронарного шунтирования. В дополнительных аспектах подлежащий лечению, предупреждению и/или облегчению рестеноз представляет собой внутристентовый рестеноз или рестеноз после ангиопластики.
[285]
В дополнительных аспектах в настоящем раскрытии предусматривают способы лечения, предупреждения и/или облегчения заболевания периферических сосудов (PVD) или состояния, связанного с PVD. В некоторых случаях способ включает введение LOX1-связывающего белка (например, в фармацевтической композиции, описанной в данном документе) субъекту с PVD. В других аспектах субъект, которому вводят LOX1-связывающий белок, подвержен риску развития PVD. В некоторых аспектах у субъекта наблюдаются повышенные уровни sLOX в сыворотке или повышенная активность LOX1. В дополнительных аспектах у субъекта наблюдается атеросклероз.
[286]
В настоящем раскрытии также предусматривают способы лечения, предупреждения и/или облегчения воспаления или состояния, связанного с воспалением. В некоторых случаях способ включает введение LOX1-связывающего белка (например, антитела к LOX1 или его фрагмента в фармацевтической композиции, описанной в данном документе) субъекту с воспалением. В дополнительных аспектах у субъекта наблюдается хроническое воспаление. В некоторых аспектах у субъекта наблюдаются повышенные уровни oxLDL и/или sLOX в сыворотке и/или повышенная активность LOX1. В дополнительных аспектах у субъекта наблюдается атеросклероз.
[287]
В настоящем раскрытии также предусматривают способы лечения, предупреждения и/или облегчения преэклампсии или состояния, связанного с преэклампсией. В некоторых случаях способ включает введение LOX1-связывающего белка (например, антитела к LOX1 или его фрагмента в фармацевтической композиции, описанной в данном документе) субъекту с преэклампсией или эклампсией. В дополнительных аспектах у субъекта наблюдаются высокое кровяное давление и большие количества белка в моче. В некоторых аспектах у субъекта наблюдаются повышенные уровни oxLDL и/или sLOX в сыворотке и/или повышенная активность LOX1. В дополнительных аспектах у субъекта наблюдается отечность стоп, ног и/или рук.
[288]
В дополнительных аспектах в настоящем раскрытии предусматривают способы стабилизации атеросклеротической бляшки у субъекта. В некоторых случаях способ включает введение LOX1-связывающего белка (например, антитела к LOX1, такого как полноразмерное антитело к LOX1, фрагмент антитела, связывающий LOX-1, и их варианты и производные) нуждающемуся в этом субъекту. В некоторых аспектах способ обеспечивает подавление передачи сигнала с участием RhoA/Rac1, монооксида азота, p38MAPK, протеинкиназы B и C, ERK1/2 и/или пути сигнальной трансдукции NFκB в бляшке. В других аспектах способ обеспечивает снижение уровня апоптоза в бляшке. В дополнительных аспектах способ обеспечивает снижение активности каспазы-8, каспазы-9 и/или BAX и/или повышение активности BCL-2 в бляшке. В других аспектах способ обеспечивает снижение уровней молекул адгезии или цитокинов, продуцируемых бляшкой. В дополнительных аспектах способ обеспечивает снижение уровня экспрессии в бляшке E-селектина, P-селектина, ICAM-1, VCAM-1, MCP1 и/или CD40/CD40L. В дополнительных аспектах способ обеспечивает уменьшение размера атеросклеротической бляшки или сокращение ее образования, скопления макрофагов и/или уровня экспрессии MMP (например, MMP9) в атеросклеротической бляшке. В дополнительных аспектах результатом способа является подавление развития или регрессия бляшки.
[289]
Также предусматривают способы снижения потери тонуса сосудов у субъекта. В некоторых случаях способ включает введение LOX1-связывающего белка (например, антитела к LOX1, такого как полноразмерное антитело к LOX1, фрагмент антитела, связывающий LOX-1, и их варианты и производные) нуждающемуся в этом субъекту. В некоторых аспектах способ обеспечивает снижение потери тонуса сосудов. В дополнительных аспектах способ обеспечивает снижение потери тонуса сосудов у субъекта посредством регуляции HDL-контролируемого продуцирования оксида азота (NO) (за счет способности антитела стимулировать продуцирование эндотелиального NO).
[290]
Дополнительно предусматривают способы улучшения тонуса сосудов у субъекта. В некоторых случаях способ включает введение LOX1-связывающего белка (например, антитела к LOX1 или его фрагмента) нуждающемуся в этом субъекту.
[291]
В некоторых аспектах в настоящем раскрытии предусматривают способы лечения, предупреждения и/или облегчения состояния, связанного с гипергликемией или гипертензией. В некоторых случаях способ включает введение LOX1-связывающего белка субъекту с гипергликемией или гипертензией.
[292]
Дополнительно предусматривают способы лечения, предупреждения и/или облегчения рака. В некоторых случаях в настоящем раскрытии предусматривают способ лечения, предупреждения и/или облегчения рака у субъекта, который включает введение LOX1-связывающего белка субъекту с раком. В некоторых аспектах у субъекта наблюдается рак, выбранный из группы, состоящей из рака молочной железы, рака толстой кишки, рака яичников, меланомы, рака шейки матки, рака легкого, рака матки, рака почки и рака поджелудочной железы.
[293]
Также предусматривают способы ингибирования пролиферации, миграции или инвазии опухолевых клеток. В некоторых случаях в настоящем раскрытии предусматривают способ подавления активности LOX1, который включает приведение LOX1-связывающего белка в контакт с экспрессирующей LOX1 опухолевой клеткой. В некоторых аспектах опухолевая клетка происходит из рака, выбранного из группы, состоящей из рака молочной железы, рака толстой кишки, рака яичников, меланомы, рака шейки матки, рака легкого, рака матки, рака почки и рака поджелудочной железы. В некоторых аспектах опухолевая клетка происходит из раковой линии.
[294]
in vitro
in vivo
В настоящем раскрытии дополнительно предусматривают способы уменьшения интенсивности или ингибирования ангиогенеза. В некоторых аспектах способ уменьшения интенсивности или ингибирования ангиогенеза включает введение LOX1-связывающего белка (например, антитела к LOX1 или его фрагмента) нуждающемуся в этом субъекту. В некоторых аспектах у субъекта наблюдается состояние, связанное с патологическим ангиогенезом. В дополнительных аспектах в настоящем раскрытии предусматривают способ ингибирования ангиогенеза, который включает приведение LOX1-связывающего белка в контакт с экспрессирующей LOX1 клеткой. В некоторых аспектах клетка представляет собой эндотелиальную клетку. В дополнительных аспектах эндотелиальная клетка представляет собой эндотелиальную клетку коронарной артерии. В некоторых аспектах способ осуществляют . В других аспектах способ осуществляют .
[295]
in vivo
in vitro.
Дополнительно предусматривают способы блокирования или снижения активности LOX1. В некоторых аспектах в настоящем раскрытии предусматривают способы блокирования активности LOX1, включающие введение LOX1-связывающего белка (например, антитела к LOX1 или его фрагмента), который снижает или ингибирует взаимодействие LOX1 и лиганда LOX1, такого как oxLDL, AGE и/или CRP. В некоторых аспектах LOX1 экспрессируется на поверхности эндотелиальной клетки, макрофага, гладкомышечной клетки сосудов и/или тромбоцита. В некоторых аспектах клетка представляет собой клетку, как например, эндотелиальную клетку коронарной артерии. В дополнительных аспектах клетка представляет собой гладкомышечную клетку сосудов, макрофаг или тромбоцит. В других аспектах клетка является частью атеросклеротической ткани. В некоторых аспектах способ осуществляют . В других аспектах способ осуществляют В некоторых аспектах блокированная или сниженная активность LOX1 касается связывания и/или поглощения (например, интернализации) oxLDL. В дополнительных аспектах блокированная или сниженная активность LOX1 касается индукции сигнального пути p38 (MAPK), p44/42 MAPK, протеинкиназы C (PKC), протеинкиназы B (PKB), тирозиновой протеинкиназы (PTK), фактора транскрипции NF-KB и/или AP1. В дополнительных аспектах блокированная или сниженная активность LOX1 касается индукции апоптоза. В дополнительных вариантах осуществления индукция апоптоза опосредуется каспазой-9, каспазой-3 и/или Bcl-2. В дополнительных аспектах блокированная или сниженная активность LOX1 касается экспрессии цепей A и B PDFG и/или гепарин-связывающего EGF-подобного белка (HB-EGF) в экспрессирующих LOX1 эндотелиальных клетках. В некоторых аспектах блокированная или сниженная активность LOX1 касается активности LOX1, индуцированной связыванием oxLDL с LOX1.
[296]
Дополнительно предусматривают способы блокирования или снижения активности LOX1 при патологическом состоянии, связанном с повышенными уровнями активности LOX1 или уровнями экспрессии LOX1 (например, уровнями белка sLOX1 в сыворотке). В некоторых случаях способ включает введение LOX1-связывающего белка (например, антитела к LOX1 или его фрагмента) субъекту с повышенной активностью LOX1 или уровнями экспрессии LOX1 (например, уровнями белка sLOX1 в сыворотке). В некоторых аспектах патологическое состояние представляет собой системную красную волчанку (SLE), диабет, гипертензию, гипергликемию, сердечную недостаточность, повреждение сосудов, трансплантацию, дислипидемию (гиперлипидемию), воспаление, (например, хроническое воспаление и воспаление, индуцированное эндотоксинами) или бактериальную инфекцию. В некоторых аспектах у субъекта наблюдаются повышенные уровни OxLDL. В некоторых аспектах у субъекта наблюдаются повышенные уровни OxLDL, модифицированного под действием липоксигеназы 15 LDL, модифицированного под действием липоксигеназы 15 HDL, LDL, подверженного гликированию-окислению, лизофосфатидилхолинэстеразы (LPC) и/или пальмитиновой кислоты. В дополнительных аспектах у субъекта наблюдаются повышенные уровни TNF-альфа, IL1, гамма-интерферона, LPS (липополисахарида), CRP, ангиотензина II, эндотелина I и/или AGE. В дополнительных аспектах у субъекта наблюдаются повышенные уровни растворимого LOX1 (sLOX1). В некоторых аспектах у субъекта в гене LOX1 имеется однонуклеотидный полиморфизм (SNP). В некоторых аспектах SNP в гене LOX1 представляет собой вариант LOX1 K167N.
[297]
Также предусматривают способы обеспечения агонизма или повышения активности липопротеина высокой плотности (HDL). В некоторых аспектах в настоящем раскрытии предусматривают способ повышения или стимуляции активности HDL посредством введения LOX1-связывающего белка (например, антитела к LOX1 или его фрагмента) нуждающемуся в этом субъекту. В некоторых аспектах повышенная активность HDL подразумевает стимуляцию HDL-опосредованного продуцирования эндотелиального NO. В некоторых аспектах повышенная активность HDL подразумевает ингибирование активности эндотелиальной клетки в отношении передачи сигнала NFKB. В некоторых аспектах повышение активности HDL подразумевает стимуляцию восстановления эндотелиальных клеток. В некоторых аспектах повышение активности HDL подразумевает уменьшение воспаления.
[298]
125
131
35
3
Также предусмотрено применение LOX1-связывающего белка, такого как LOX1-связывающий белок, предусмотренный в данном документе, для диагностического мониторинга уровней белка (например, уровней LOX1) в крови или тканях как части клинической процедуры тестирования, например, для определения эффективности данной схемы лечения. Например, выявление можно облегчить с помощью связывания LOX1-связывающего белка (например, антитела к LOX1) с детектируемым веществом. Примеры детектируемых веществ включают различные ферменты, простетические группы, флуоресцентные материалы, люминесцентные материалы, биолюминесцентные материалы и радиоактивные материалы. Примеры подходящих ферментов включают пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, бета-галактозидазу или ацетилхолинэстеразу; примеры подходящих комплексов простетических групп включают стрептавидин/биотин и авидин/биотин; примеры подходящих флуоресцентных материалов включают умбеллиферон, флуоресцеин, флуоресцеина изотиоцианат, родамин, флуоресцеина дихлортриазиниламин, дансилхлорид или фикоэритрин; пример люминесцентного материала включает люминол; примеры биолюминесцентных материалов включают люциферазу, люциферин и экворин; и примеры подходящих радиоактивных материалов включают I, I, S или H.
VIII. Фармацевтические композиции и способы введения
[299]
Способы получения и введения предусмотренного в данном документе LOX1-связывающего белка нуждающемуся в этом субъекту известны специалистам в данной области или могут быть без труда определены ими. Путь введения LOX1-связывающих белков, может быть, например, пероральным, парентеральным, ингаляционным или местным. Используемое в данном документе выражение "парентеральное" включает, например, внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное, внутримышечное, подкожное, ректальное или вагинальное введение. Хотя все эти формы введения явно рассматриваются как находящиеся в пределах объема настоящего раскрытия, другим примером формы для введения будет раствор для инъекций, в частности, для внутривенной или внутриартериальной инъекции или капельного вливания. Как правило, подходящая фармацевтическая композиция может содержать буфер (например, ацетатный, фосфатный или цитратный буфер), поверхностно-активное вещество (например, полисорбат), необязательно стабилизатор (например, человеческий альбумин) и т.д. В других способах, совместимых с идеями данного документа, LOX1-связывающие белки, предусмотренные в данном документе, можно доставлять непосредственно к органу и/или месту локализации атеросклероза или опухоли, увеличивая тем самым воздействие терапевтического средства на пораженную ткань. В одном аспекте введение осуществляют непосредственно в дыхательные пути, например, посредством ингаляции или интраназального введения.
[300]
in vivo
th
Как обсуждалось в данном документе, LOX1-связывающие белки можно вводить в фармацевтически эффективном количестве для лечения LOX1-опосредованных заболеваний и состояний, таких как атеросклероз, тромбоз, CAD, ишемия (например, ишемия миокарда), инфаркт (например, инфаркт миокарда), острый коронарный синдром (ACS), инсульт, реперфузионное повреждение, рестеноз, заболевание периферических сосудов, гипертензия, сердечная недостаточность, воспаление (например, хроническое воспаление), ангиогенез, преэклампсия и рак. В этом отношении следует иметь в виду, что раскрытые LOX1-связывающие белки будут составлять таким образом, чтобы облегчать введение и способствовать стабильности активного средства. Фармацевтические композиции в соответствии с настоящим раскрытием могут содержать фармацевтически приемлемый, нетоксичный, стерильный носитель, такой как физиологический солевой раствор, нетоксичные буферы, консерванты и т. д. Для целей настоящей заявки фармацевтически эффективное количество LOX1-связывающего белка, конъюгированного или неконъюгированного, означает количество, достаточное для достижения эффективного связывания с LOX1 и для достижения положительного эффекта, например, облегчения симптомов заболевания или состояния или для выявления вещества или клетки. Подходящие составы для применения в терапевтических способах, раскрытых в данном документе, описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co.) 16 ed. (1980).
[301]
Определенные фармацевтические композиции, предусмотренные в настоящем документе, можно вводить перорально в виде приемлемой лекарственной формы, включающей, например, капсулы, таблетки, водные суспензии или растворы. Определенные фармацевтические композиции также можно вводить с применением назального аэрозоля или путем ингаляции. Такие композиции можно получать в виде растворов в физиологическом растворе с использованием бензилового спирта или других подходящих консервантов, стимуляторов абсорбции для повышения биодоступности и/или других традиционных солюбилизирующих или диспергирующих средств.
[302]
Количество LOX1-связывающего белка (например, антитела к LOX1, такого как полноразмерное антитело к LOX1 и фрагмента антитела, связывающего LOX-1, и их вариантов и производных), который можно объединять с материалами-носителями для получения единичной лекарственной формы, будет варьировать в зависимости от субъекта, подвергаемого лечению, и конкретного способа введения. Композицию можно вводить в виде однократной дозы, многократных доз или в течение установленного периода времени в виде инфузии. Схемы дозирования также можно скорректировать таким образом, чтобы обеспечить оптимальный желаемый ответ (например, терапевтический или профилактический ответ).
[303]
В соответствии с объемом настоящего раскрытия LOX1-связывающий белок можно вводить человеку или другому субъекту в соответствии с вышеупомянутыми способами лечения в количестве, достаточном для получения терапевтического эффекта. LOX1-связывающие белки, предусмотренные в данном документе, можно вводить такому человеку или другому животному в традиционной лекарственной форме, полученной при объединении LOX1-связывающих белков с традиционным фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем в соответствии с известными методиками. Форма и свойство фармацевтически приемлемого носителя или разбавителя могут быть обусловлены количеством активного ингредиента, с которым они будут объединены, путями введения и другими хорошо известными переменными. Также можно применять смесь, содержащую один или несколько различных LOX1-связывающих белков.
[304]
Под "терапевтически эффективной дозой или количеством" или "эффективным количеством" подразумевается количество LOX1-связывающего белка (например, антитела к LOX1, такого как полноразмерное антитело к LOX1 и фрагмента антитела, связывающего LOX-1, и их вариантов и производных), которое при введении вызывает положительный терапевтический ответ в отношении лечения субъекта с заболеванием или состоянием, подлежащим лечению.
[305]
Терапевтически эффективные дозы композиций на основе LOX1-связывающего белка для лечения LOX1-опосредованных заболеваний или состояний, таких как атеросклероз, тромбоз, CAD, ишемия (например, ишемия миокарда), инфаркт (например, инфаркт миокарда), острый коронарный синдром (ACS), инсульт, реперфузионное повреждение, рестеноз, заболевание периферических сосудов, гипертензия, сердечная недостаточность, воспаление (например, хроническое воспаление), ангиогенез, преэклампсия и рак, варьируют в зависимости от множества различных факторов, в том числе от способа введения, целевого участка, физиологического состояния субъекта, того, является ли субъект человеком или животным, других вводимых лекарственных препаратов и того, является ли лечение профилактическим или терапевтическим. Как правило, субъект является человеком, но также можно лечить млекопитающих, отличных от человека, включая трансгенных млекопитающих. Дозировки для лечения можно подбирать с помощью обычных способов, известных специалистам в данной области, для оптимизации безопасности и эффективности.
[306]
В контексте данного документа облегчение симптомов конкретного заболевания или состояния посредством введения LOX1-связывающего белка относится к любому ослаблению, постоянному или временному, продолжительному или кратковременному, которое обусловлено или связано с введением LOX1-связывающего белка.
[307]
Количество по меньшей мере одного LOX1-связывающего белка, например, антитела или связывающего фрагмента для введения, может быть легко определено специалистом обычной квалификации в данной области без излишних экспериментов с учетом настоящего раскрытия. Факторы, влияющие на способ введения и соответствующее количество по меньшей мере одного LOX1-связывающего белка, включают без ограничения тяжесть заболевания, историю болезни и возраст, рост, вес, состояние здоровья и физическое состояние индивидуума, подвергаемого терапии. Аналогичным образом, количество LOX1-связывающего белка для введения будет зависеть от способа введения и оттого, будет ли субъект получать одну дозу или несколько доз этого средства.
[308]
В настоящем раскрытии также предусматривают применение LOX1-связывающего белка, такого как антитело к LOX1 (например, полноразмерное антитело к LOX1 и фрагмент антитела, связывающий LOX-1, и его вариант и производное) для изготовления лекарственного препарата, например, для улучшения активности HDL, а также способы лечения, предупреждения и/или облегчения атеросклероза, тромбоза, CAD, ишемии (например, ишемии миокарда), инфаркта (например, инфаркта миокарда), острого коронарного синдрома (ACS), инсульта, реперфузионного повреждения, рестеноза, заболевания периферических сосудов, воспаления (например, хронического воспаления), ангиогенеза, преэклампсии и рака.
Варианты комбинированной терапии
[309]
В некоторых аспектах LOX1-связывающий белок (например, антитело к LOX1, такое как полноразмерное антитело к LOX1 и фрагмент антитела, связывающий LOX-1, и их варианты и производные) применяют в комбинации с одним или несколькими другими вариантами терапии. Такие варианты терапии включают дополнительные терапевтические средства, а также другие виды медицинского вмешательства. Иллюстративные терапевтические средства, которые можно вводить в комбинации с LOX1-связывающими белками, предусмотренными в данном документе, включают без ограничения ингибиторы тромбоцитов, антикоагулянты, антигипертензивные препараты, ингибиторы рецепторов гликопротеина IIb/IIIa, бета-блокаторы, блокаторы кальциевых каналов, ингибиторы HMG-CoA редуктаз (статины), эзетимиб, фибраты (например, гемфиброзил и фенофибрат), зетия, препараты, способствующее выведению желчных кислот, нитраты и тромболитические средства.
[310]
В ряде аспектов LOX1-связывающий белок вводят субъекту до, во время и/или после хирургической процедуры. В некоторых аспектах операция представляет собой эндоваскулярную процедуру. В дополнительных вариантах осуществления операция представляет собой операцию на сосудах, операцию на сердце или ангиопластику. В дополнительных аспектах процедура представляет собой трансплантацию или операцию коронарного шунтирования.
IX. Диагностика
[311]
В настоящем раскрытии дополнительно предусматривают диагностический способ, применимый в ходе определения диагноза LOX1-опосредованных заболеваний и состояний, таких как атеросклероз, тромбоз, коронарная недостаточность (CAD), ишемия (например, ишемия миокарда), инфаркт (например, инфаркт миокарда), острый коронарный синдром (ACS), инсульт, реперфузионное повреждение, рестеноз, заболевание периферических сосудов, гипертензия, сердечная недостаточность, воспаление, ангиогенез, преэклампсия и рак, который включает измерение уровня экспрессии белка LOX1 (в том числе sLOX1) в ткани или жидкости организма, такой как сыворотка, от индивида, и сравнение измеряемого уровня экспрессии со стандартным уровнем экспрессии LOX1 в нормальной ткани или жидкости организма, при этом повышение уровня экспрессии по сравнению со стандартным свидетельствует о том, что нарушение подлежит лечению LOX1-связывающим белком, предусмотренным в данном документе, таким как полноразмерное антитело к LOX1 и антигенсвязывающий фрагмент антитела, предусмотренные в данном документе.
[312]
et al., J. Cell. Biol. 101
et al., J. Cell Biol
LOX1-связывающие белки, предусмотренные в данном документе, такие как антитела к LOX1 (например, полноразмерные антитела к LOX1 и фрагменты антител, связывающие LOX1, и их варианты и производные) можно применять для анализа уровней белка LOX1 в биологическом образце с применением классических иммуногистологических способов, известных специалистам в данной области (см., например, Jalkanen, :976-985 (1985); Jalkanen . 105:3087-3096 (1987)). Другие способы на основе применения антител, пригодные для обнаружения экспрессии белка LOX1, включают иммунологические анализы, такие как твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), иммунопреципитация или вестерн-блоттинг.
[313]
Под "анализом уровня экспрессии белка LOX1" подразумевается качественное или количественное измерение или оценивание уровня белка LOX1 в первом биологическом образце напрямую (например, путем определения или оценивания абсолютного уровня белка) либо относительно (например, путем сравнения с уровнем ассоциированного с заболеванием полипептида во втором биологическом образце). Уровень экспрессии белка LOX1 в первом биологическом образце можно измерить или оценить и сравнить со стандартным уровнем белка LOX1, при этом стандарт берут из второго биологического образца, полученного от индивидуума, не имеющего нарушения, или определяют путем усреднения уровней из популяции индивидуумов, не имеющих нарушения. Как будет понятно в данной области техники, если "стандартный" уровень белка LOX1 известен, его можно использовать повторно в качестве стандарта для сравнения.
[314]
Под "биологическим образцом" подразумевается любой биологический образец, полученный от индивидуума, линии клеток, культуры ткани или другого источника клеток, потенциально экспрессирующих LOX1. Способы получения биоптатов тканей и жидкостей организма от млекопитающих известны в данной области техники.
X. Наборы, содержащие LOX1-связывающие белки
[315]
В настоящем раскрытии дополнительно предусматривают наборы, которые содержат LOX1-связывающий белок (например, антитело к LOX1, такое как полноразмерное антитело к LOX1, фрагмент антитела, связывающий LOX-1, и их варианты и производные) в подходящей упаковке, и письменный материал, и которые можно применять для осуществления способов, описанных в данном документе.
[316]
Письменный материал может включать любую из следующей информации: инструкции по применению, описание клинических исследований, перечень побочных эффектов, ссылки на научную литературу, листки-вкладыши, результаты клинических испытаний и/или их краткие описания и т. д. Письменный материал может указывать или обосновывать виды активности и/или преимущества композиции и/или описывать дозировку, введение, побочные эффекты, взаимодействие лекарств или другую информацию, полезную для медицинского работника. Такая информация может основываться на результатах различных исследований, например, исследований с применением экспериментальных животных, включая in vivo модели, и/или исследований на основе клинических испытаний с участием людей. Набор может дополнительно содержать другой терапевтический препарат (например, другое средство) и/или письменный материал, такой как описанный выше, служащий для предоставления информации касательно другого терапевтического препарата (например, другого средства).
[317]
В определенных аспектах набор содержит по меньшей мере один очищенный LOX1-связывающий белок в одном или нескольких контейнерах. В некоторых аспектах наборы содержат все компоненты, необходимые и/или достаточные для проведения анализа на обнаружение, в том числе все контрольные образцы, указания для проведения анализов и любое необходимое программное обеспечение для анализа и представления результатов.
XI. Иммунологические анализы
[318]
et al
LOX1-связывающие белки (например, антитела к LOX1 и LOX1-связывающие фрагменты, варианты или их производные) можно анализировать на предмет иммуноспецифического связывания с помощью любого способа, известного из уровня техники. Иммунологические анализы, которые можно применять, включают без ограничения системы конкурентного и неконкурентного анализа с использованием таких методик, как вестерн-блоттинг, радиоиммунологические анализы, ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ), иммунологические "сэндвич"-анализы, анализы иммунопреципитации, реакции преципитации, реакции диффузионной преципитации в геле, анализы иммунодиффузии, анализы агглютинации, анализы фиксации комплемента, иммунорадиометрические анализы, флуоресцентные иммунологические анализы, иммунологические анализы с белком A и многие другие. Такие анализы являются обычными и известны в данной области техники (см., например, Ausubel ., eds, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, Vol. 1 (1994), который включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте).
[319]
in situ
in situ
LOX1-связывающие белки (например, антитела к LOX1 или LOX1-связывающие фрагменты, варианты или их производные), предусмотренные в данном документе, можно использовать в гистологических анализах, например, на основе иммунофлуоресценции, иммуноэлектронной микроскопии или неиммунологических анализах, например выявления LOX1 или его консервативных вариантов или пептидных фрагментов. Выявление можно выполнять путем взятия у субъекта гистологического образца и нанесения на него меченых LOX1-связывающих белков путем покрытия биологического образца мечеными LOX1-связывающими белками. Благодаря применению такой процедуры можно определить не только присутствие LOX1 или его консервативных вариантов или пептидных фрагментов, но также и его распределение в исследуемой ткани. Используя настоящее раскрытие, средние специалисты в данной области легко поймут, что любой из широкого спектра гистологических способов (таких как методы окрашивания) можно модифицировать для того, чтобы добиться такого обнаружения in situ.
[320]
Активность связывания данной партии LOX1-связывающего белка (например, антитела к LOX1, такого как полноразмерное антитело к LOX1, и фрагмента антитела, связывающего LOX-1, и их вариантов и производных) можно определять в соответствии со способами, известными из уровня техники. Специалисты в данной области смогут определить рабочие и оптимальные условия анализа для каждого определения с использованием стандартных экспериментов.
[321]
Способы и реагенты, подходящие для определения характеристик связывания выделенного LOX1-связывающего белка, известны из уровня техники и/или коммерчески доступны. Оборудование и программное обеспечение, предназначенное для таких кинетических анализов, является коммерчески доступным (например, BIACORE, программное обеспечение BIAevaluation, GE Healthcare; программное обеспечение KINEXA, Sapidyne Instruments).
[322]
et al.,
et al
et al
et al
et al
nd
Если не указано иное, для осуществления настоящего раскрытия на практике используют традиционные методики клеточной биологии, культивирования клеток, молекулярной биологии, биологии трансгенных организмов, микробиологии, рекомбинантных ДНК и иммунологии, которые находятся в пределах компетенции специалиста в данной области. Такие методики в полном объеме объясняются в литературе. См., например, Sambrook ed. (1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual (2 ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press); Sambrook ., ed. (1992) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Springs Harbor Laboratory, NY); D. N. Glover ed., (1985) DNA Cloning, Volumes I and II; Gait, ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis; Mullis ., патент США № 4683195; Hames and Higgins, eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization; Hames and Higgins, eds. (1984) Transcription And Translation; Freshney (1987) Culture Of Animal Cells (Alan R. Liss, Inc.); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press) (1986); Perbal (1984) A Practical Guide To Molecular Cloning; научный трактат, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., NY); Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, (Cold Spring Harbor Laboratory); Wu ., eds., Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155; Mayer and Walker, eds. (1987) Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Academic Press, London); Weir and Blackwell, eds., (1986) Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1986); и в Ausubel (1989) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Baltimore, Md.).
[323]
nd
nd
th
et al
et al
et al
Общие принципы инженерии антител изложены в Borrebaeck, ed. (1995) Antibody Engineering (2 ed.; Oxford Univ. Press). Общие принципы белковой инженерии изложены в Rickwood ., eds. (1995) Protein Engineering, A Practical Approach (IRL Press at Oxford Univ. Press, Oxford, Eng.). Общие принципы относительно антител и связывания антител с гаптенами изложены в: Nisonoff (1984) Molecular Immunology (2 ed.; Sinauer Associates, Sunderland, Mass.) и Steward (1984) Antibodies, Their Structure and Function (Chapman and Hall, New York, N.Y.). Кроме того, стандартные способы в иммунологии, известные в данной области техники и не описанные конкретно, как правило, соответствуют изложенному в Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York; Stites ., eds. (1994) Basic and Clinical Immunology (8 ed; Appleton & Lange, Norwalk, Conn.) и Mishell , (eds) (1980) Selected Methods in Cellular Immunology (W.H. Freeman & Co., NY).
[324]
et al
et al
et al
et al
et al
et al.,
th
th
th
Авторитетные справочные издания, в которых изложены общие принципы иммунологии, включают Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York; Klein (1982) J., Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination (John Wiley & Sons, NY); Kennett ., eds. (1980) Monoclonal Antibodies, Hybridoma: A New Dimension in Biological Analyses (Plenum Press, NY; Campbell (1984) "Monoclonal Antibody Technology" в Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, ed. Burden ., (Elsevere, Amsterdam); Goldsby ., eds. (2000) Kuby Immunology (4 ed.; H. Freemand & Co.); Roitt . (2001) Immunology (6 ed.; London: Mosby); Abbas . (2005) Cellular and Molecular Immunology (5 ed.; Elsevier Health Sciences Division); Kontermann and Dubel (2001) Antibody Engineering (Springer Verlan); Sambrook (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press); Lewin (2003) Genes VIII (Prentice Hall2003); Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press); Dieffenbach (2003) PCR Primer (Cold Spring Harbor Press).
[325]
Следующие примеры предлагаются в качестве иллюстрации, но не в качестве ограничения.
ПРИМЕРЫ
[326]
Аспекты настоящего раскрытия могут быть дополнительно определены путем ссылки на следующие неограничивающие примеры, которые подробно описывают получение определенных антител по настоящему раскрытию и способы применения антител по настоящему раскрытию. Специалистам в данной области будет очевидно, что многочисленные модификации как материалов, так и способов можно осуществлять на практике без отступления от объема настоящего раскрытия.
Пример 1. Выделение и идентификация scFv-антител к LOX1
[327]
et al., Nat. Biotechnol
Для отборов применяли полученную из костного мозга не получавших лечение доноров большую библиотеку одноцепочечных Fv (scFv) антител человека, клонированных в фагмидный вектор на основе нитевидного фага М13 (Hutchings, C., Generation of Naïve Human Antibody Libraries, in Antibody Engineering, R. Kontermann and S. Dubel, Editors. 2001, Springer Laboratory Manuals, Berlin. p. 93). LOX1-специфические scFv-антитела выделяли из библиотеки фагового дисплея в сериях повторяемых циклов отбора на рекомбинантном экспрессируемом LOX1 человека (R&D Systems), главным образом как описано ранее (Vaughan . 14:309 (1996)). В то время как некоторые антиген-специфические scFv получали исходя из вариантов этого протокола, исходные клоны LOX514 (SEQ ID NO:29 (VH) и SEQ ID NO:33 (VL), также называемые в данном документе "LOX10514") и LOX696 (SEQ ID NO:54 (VH) и SEQ ID NO:70 (VL), также называемые в данном документе "LOX10696") выделяли следующим образом: 10 мкг/мл LOX1 человека иммобилизовали на планшетах MAXISORP™ (Nunc) и инкубировали с бактериофагами библиотеки фагового дисплея. Несвязавшихся бактериофагов отмывали в серии циклов отмывки. Удерживаемые на антигене фаговые частицы элюировали, инфицировали ими бактерии и высвобождали для следующего раунда отбора. Таким образом осуществляли три раунда отбора. Репрезентативное число отдельных клонов из продуктов раунда 2 и раунда 3 отбора выращивали на 96-луночных планшетах. ScFv экспрессировали в периплазме бактерий и подвергали скринингу в отношении их ингибиторной активности в анализе связывания LOX1 человека:oxLDL, как описано в примере 10, анализе 1.
[328]
et al., Nat. Biotechnol
et al., Immunotechnology
50
Пики скрининга, то есть клоны scFv, которые продемонстрировали ингибиторный эффект в отношении взаимодействия LOX1:oxLDL, в виде неочищенных экстрактов из периплазмы, подвергали секвенированию ДНК (Vaughan . 14:309 (1996) и Osbourn 2:181 (1996)). Уникальные scFv экспрессировали в бактериях и очищали с помощью аффинной хроматографии (как описано в примере 3 публикации международной заявки на патент США № WO01/66754) и определяли значения IC путем тестирования серий разведений очищенных scFv в вышеупомянутом анализе.
[329]
et al., Gene
et al
Anal Biochem
Наиболее эффективные клоны scFv преобразовывали в формат антитела в виде иммуноглобулина G1 с тройной мутацией (IgG1-TM, Fc-последовательность IgG1 человека с введенными мутациями L234F, L235E и P331S), главным образом как описано в Persic 187:9 (1997) со следующими модификациями. Фрагмент OriP включали в векторы экспрессии для облегчения использования клеток CHO и для обеспечения возможности эписомной репликации. VH-домен клонировали в вектор, содержащий константные домены тяжелой цепи человека и регуляторные элементы, для экспрессии целой тяжелой цепи IgG1 в клетках млекопитающих. Аналогично, VL-домен клонировали в вектор для экспрессии константных доменов легкой цепи человека, который содержал регуляторные элементы для экспрессии целой легкой цепи IgG в клетках млекопитающих. Для получения IgG векторы, экспрессирующие тяжелую и легкую цепи IgG, трансфицировали в клетки млекопитающих CHO. IgG экспрессировались и секретировались в среду. Собранный материал объединяли и фильтровали, и IgG очищали с применением хроматографии с использованием белка А. Супернатанты культуры загружали на колонку соответствующего размера с Ceramic Protein A (BioSepra) и промывали с помощью 50 мМ Tris-HСl, pH 8,0, 250 мМ NaCl. Связанный IgG элюировали из колонки с помощью 0,1 M цитрата натрия (pH 3,0) и нейтрализовали добавлением Tris-HСl (pH 9,0). В элюированном материале осуществляли замену буфера на PBS с применением колонок Nap10 (Amersham, #17-0854-02) и концентрацию IgG определяли спектрофотометрически с применением коэффициента экстинкции на основании аминокислотной последовательности IgG (Mach ., , 200:74 (1992)). Очищенный IgG анализировали на предмет агрегации и деградации с применением SEC-HPLC и SDS-PAGE.
ПРИМЕР 2. Антитела к LOX1 ингибируют мультилигандное связывание, интернализацию oxLDL и индуцируемую oxLDL передачу сигнала
[330]
et al., Biochem Biophys Res Commun
Очищенные IgG исследовали в отношении их способности специфично ингибировать связывание окисленных липопротеинов низкой плотности ("oxLDL"), конечных продуктов усиленного гликозилирования сывороточного альбумина быка ("AGE-BSA") и С-реактивного белка ("CRP") с LOX1, как описано в примере 10, анализах 1, 2 и 3. Ряд выделенных клонов, в том числе LOX10514 и LOX10696 и коммерчески доступного антитела мыши к LOX1 (23C11), исследовали в отношении их способности блокировать связывание oxLDL, AGE-BSA и CRP с LOX1. Характерные графики показаны на фигурах 1A, 1B и 1C, демонстрирующие ингибирование связывания oxLDL, AGE-BSA и CRP с помощью LOX514 и LOX696 соответственно. Для подтверждения перекрестного реагирования антител и того, что они обладают функциональной активностью в отношении LOX1 с SNP K167N, антитела исследовали в отношении их способности блокировать связывание oxLDL с LOX1 с SNP K167N. LOX1 с SNP K167N (номер доступа в GenBank AB102861) представляет собой встречающийся в природе вариант LOX1 человека, изначально обнаруженный в семье пациентов с ишемической болезнью сердца, и, как полагают, связан с повышенным риском развития инфаркта миокарда. См., например, Tatsuguchi . 28;303(1):247-50 (2003). Характерные графики показаны на фигуре 1D, демонстрирующие, что как LOX514, так и LOX696, блокируют связывание oxLDL с вариантом LOX1 с SNP K167N. В дополнение к ингибированию связывания ряд выделенных клонов, в том числе LOX10514 и LOX10696, исследовали в отношении их способности блокировать интернализацию oxLDL в экспрессирующие LOX1 клетки (как описано в примере 10, анализе 4) и индуцируемую oxLDL передачу сигнала LOX1 (как описано в примере 10, анализе 5). Характерные графики касательно ингибирования интернализации oxLDL и передачи сигнала показаны соответственно на фигурах 2A и 2B. Результаты этих исследований обобщены в таблице 2.
Таблица 2. Ингибирование интернализации oxLDL.
<b>LOX10696</b>
<b>23C11</b>
<b>LOX10514</b>
<b>Среднее</b>
<b>1,31E-10</b>
<b>2,20E-09</b>
<b>6,42E-10</b>
SD
<i>1,14E-10</i>
<i>6,49E-10</i>
<i>8,54E-11</i>
n
8
5
4
<b>Среднее</b>
<b>2,46E-10</b>
<b>1,31E-09</b>
<b>7,03E-10</b>
SD
<i>1,11E-10</i>
<i>2,82E-10</i>
n
2
1
3
<b>Среднее</b>
<b>3,50E-10</b>
<b>2,85E-09</b>
<b>7,72E-10</b>
SD
<i>7,68E-11</i>
<i>8,38E-10</i>
<i>1,11E-10</i>
n
2
3
3
<b>Среднее</b>
<b>8,73E-11</b>
<b>1,15E-09</b>
<b>2,07E-10</b>
SD
<i>8,23E-11</i>
<i>1,07E-09</i>
<i>1,61E-10</i>
n
2
2
3
<b>Среднее</b>
<b>4,69E-09</b>
<b>1,11E-08</b>
<b>1,98E-09</b>
SD
<i>4,02E-09</i>
<i>9,62E-10</i>
<i>7,31E-10</i>
n
2
2
2
<b>Среднее</b>
<b>6,22E-09</b>
<b>1,01E-08</b>
<b>8,28E-09</b>
SD
<i>2,13E-09</i>
<i>2,84E-09</i>
n
6
1
8
[331]
Данные результаты демонстрируют: (1) специфическое ингибирование связывания LOX1 с oxLDL, AGE-BSA и CRP с помощью антител LOX514 и LOX696; (2) как LOX514, так и LOX696, функциональным образом перекрестно реагируют с типичным вариантом LOX1 с SNP K167N; (3) LOX514 и LOX696 ингибируют интернализацию oxLDL; и (4) LOX514 и LOX696 ингибируют индуцируемую oxLDL передачу сигнала LOX1.
Пример 3. Межвидовая перекрестная реактивность антител к LOX1 и специфичность в отношении LOX1 человека в панели родственных ему представителей семейства рецепторов человека
[332]
Перекрестную реактивность антител к LOX1 человека с ортологами LOX1 различных видов оценивали с применением ELISA на основе связывания scFv. Конструкции внеклеточных доменов LOX1 человека (Uniprot: P78380), мыши (Uniprot: Q9EQ09), крысы (Uniprot: O70156), кролика (Uniprot: Q9XTA8) и яванского макака были сконструированы с Flag- и гистидиновыми метками либо на N-, либо на C-конце, и клонированы в принимающие векторы системы Gateway (Invitrogen). Конструкции трансфицировали в клетки млекопитающих HEK293 EBNA для экспрессии белка. Затем белки подвергали стандартным методам очистки с помощью аффинной и эксклюзионной хроматографии. Вкратце, (HisFlag)-LOX1 человека, LOX1-(FlagHis) яванского макака, LOX1-(FlagHis) мыши, LOX1-(FlagHis) крысы и LOX1-(FlagHis) кролика покрывали планшеты MAXISORP™ соответственно в концентрациях 10, 10, 5, 5 и 5 мкг/мл в буфере PBS. Эффективность покрытия антигеном с использованием таких концентраций сперва проверяли с помощью ELISA с применением коммерческих антител к LOX1 человека (23C11 от Hycult) или антител к His (меченных европием от Perkin Elmer). После блокирования лунок PBS, содержащим 3% сухое молоко, очищенные антитела scFv к LOX1 в PBS с 3% сухим молоком инкубировали с различными покрытыми антигенами в течение часа. Связанные молекулы scFv выявляли с применением меченого европием вторичного антитела к Myc-метке (Perkin Elmer) в концентрации 100 нг/мл. Планшеты считывали в отношении флуоресценции с возбуждением при 340 нм и испусканием при 615 нм. Неспецифическое связывание определяли по сывороточного альбумину быка (New England Biolabs), покрытому в концентрации 10 мкг/мл.
[333]
Как показано на фигуре 3A, LOX514 ("LOX10514") и LOX696 ("LOX10696") связываются с LOX1 человека и яванского макака, но не с ортологами LOX1 мыши, крысы или кролика. Отсутствие перекрестной реактивности антитела с LOX1 мыши не удивительно, принимая во внимание низкую степень гомологии лектинового домена C-типа среди данных видов (~62% идентичность для человека и мыши).
[334]
Специфичность молекул антител к LOX1 человека в отношении других молекул, родственных рецепторам лектина C-типа и скавенджер-рецепторам человека, оценивали с помощью ELISA на основе связывания IgG, как описано в примере 10, анализе 6. Как показано на фигуре 3B, LOX514 ("LOX10514") и LOX696 ("LOX10696") связывают только LOX1 человека и не связываются с CLEC-7A, CLEC-1A, CLEC-4L, CLEC-1B, SR-A1 и SR-B3 человека. Данный результат демонстрирует специфичность LOX514 и LOX696 к LOX1.
Пример 4. Выделение и идентификация оптимизированных в отношении эффективности scFv-антител к LOX1 посредством направленной рандомизации CDR и рекомбинации LOX514
[335]
et al
LOX514 оптимизировали с применением отборов с фаговым дисплеем на основе аффинности. Большие фаговые библиотеки scFv, полученных исходя из последовательности scFv LOX514, создавали с помощью олигонуклеотид-направленного мутагенеза определяющих комплементарность участков 2 или 3 (VH-CDR2 или VH-CDR3) вариабельного участка (VH) тяжелой цепи или определяющих комплементарность участков 3 (VL-CDR3) вариабельного участка (VL) легкой цепи с применением стандартных методов молекулярной биологии, как описано (Clackson, T. и Lowman, H.B. Phage Display - A Practical Approach, 2004. Oxford University Press). Библиотеки подвергали отборам с фаговым дисплеем на основе аффинности, чтобы выбрать варианты с более высокой аффинностью к LOX1 человека. Ожидалось, что они продемонстрируют улучшенную ингибиторную активность в отношении связывания LOX1 с oxLDL и другими лигандами LOX1. Процедуры отбора проводили, главным образом, как описано ранее (Thompson et al., J Mol Biol. 256(1):77-88, (1996)). Вкратце, scFv-фаговые частицы инкубировали с рекомбинантным биотинилированным LOX1 человека в растворе (биотинилированным по свободным аминогруппам с применением EZ LINK™ Sulfo-NHS-LC-Biotin (Thermo/Pierce, продукт: 21335)). ScFv, связанный с антигеном, затем иммобилизировали на покрытых стрептавидином парамагнитных гранулах (DYNABEADS M-280) согласно рекомендациям производителя. Отобранные scFv-фаговые частицы высвобождали, как описано ранее (Osbourn ., Immunotechnology, 2(3):181-96, (1996)), и процесс отбора повторяли в присутствии понижающихся концентраций биотинилированного LOX1 человека (типичным примером будет от 50 нМ дo 20 пМ за четыре раунда).
[336]
Неочищенные экстракты из периплазмы, содержащие scFv, готовили для получения репрезентативного числа отдельных scFv из направленных на CDR продуктов отбора и подвергали скринингу в формате анализа конкуренции за связывание с эпитопом HTRF (гомогенной флуоресценции с временным разрешением) по сравнению с антителом LOX514, описанным в примере 10, анализе 7. Пики скрининга, то есть варианты scFv, которые продемонстрировали значительное улучшение ингибиторного эффекта по сравнению с исходным LOX514, подвергали секвенированию ДНК, и получали уникальные варианты продуктов с CDR2 или CDR3 вариабельного участка тяжелой цепи и CDR3 вариабельного участка легкой цепи в виде очищенного scFv и подвергали их тестированию. Для дополнительного определения характеристик отбирали некоторое количество scFv и преобразовывали в IgG1-TM. Типичные примеры оптимизированных антител LOX514, полученных согласно данному подходу, включают: LX5140011, LX5140014, LX5140016 и LX5140038 (описанные в таблице 1 или на фигуре 4).
[337]
С целью получения дополнительного улучшения, CDR-рандомизированные продукты отбора, включающие большое число вариантов scFv, обладающих способностью ингибировать связывание исходных LOX514 с LOX1 человека, рекомбинировали с получением библиотек, в которых клоны содержали случайно спаренные отдельно рандомизированные CDR2 VH с последовательностями CDR3 VH или VL.
[338]
Неочищенные экстракты из периплазмы, содержащие scFv, готовили для получения репрезентативного числа отдельных scFv из библиотек рекомбинированных VH2/VH3 или VH2/VL3 в анализе конкуренции за связывание с эпитопом HTRF. Пики скрининга, то есть варианты scFv, которые продемонстрировали значительное улучшение ингибиторного эффекта по сравнению с исходным scFv, и приводили к получению предварительной рекомбинации, подвергали секвенированию ДНК, и получали уникальные рекомбинированные варианты в виде очищенного scFv и подвергали их тестированию. Для дополнительного определения характеристик отбирали наиболее активные scFv и преобразовывали в IgG1-TM. Типичные примеры оптимизированных антител LOX514, полученных из этих рекомбинированных библиотек, представляли собой: LX5140092, LX5140093, LX5140094, LX5140108 и LX5140110 (описанные в таблице 1 или на фигуре 4).
[339]
Выравнивания аминокислотной последовательности оптимизированных тяжелых цепей для отобранных антител из ряда LOX514 показаны на фигуре 4A. Выравнивания аминокислотной последовательности оптимизированных легких цепей для отобранных антител из ряда LOX514 показаны на фигуре 4B.
Пример 5. Выделение и идентификация оптимизированных в отношении эффективности вариантов scFv к LOX1, полученных из LOX696
[340]
et al., J. Mol. Biol.
LOX696 сперва оптимизировали путем отбора с помощью рибосомного дисплея на основе аффинности, как, главным образом, описано в EP494955, US5658754 и Hanes et al (Thompson 256(1):77-88 (1996)).
[341]
et al., J. Mol. Biol.
et al., J. Mol. Biol.
Большие библиотеки scFv в формате рибосомного дисплея, полученные исходя из последовательности scFv LOX696, создавали с помощью олигонуклеотид-направленного мутагенеза определяющих комплементарность участков 2 или 3 (VH-CDR2 или VH-CDR3) вариабельного участка (VH) тяжелой цепи или определяющих комплементарность участков 3 (VL-CDR3) вариабельного участка (VL) легкой цепи с применением стандартных методов молекулярной биологии, как описано (Thompson 256(1):77-88 (1996)). Для эффективной транскрипции в мРНК на уровне ДНК к 5'-концу добавляли промотор T7. На уровне мРНК конструкция содержала сайт связывания прокариотической рибосомы (последовательность Shine-Dalgarno). На 3'-конце отдельной цепи удаляли стоп-кодон и добавляли часть гена gIII (ген III) бактериофага M13, выполняющего роль спейсера между образующимся полипептидом scFv и рибосомой (Thompson 256(1):77-88 (1996)).
[342]
Библиотеки подвергали отборам с рибосомным дисплеем на основе аффинности, чтобы выбрать варианты с более высокой аффинностью к LOX1 человека. Ожидалось, что они продемонстрируют улучшенную ингибиторную активность в отношении связывания LOX1 с oxLDL и другими лигандами LOX1. scFv экспрессировали in vitro с применением системы (T7) для крупномасштабного получения РНК RIBOMAX™ (Promega) согласно протоколу производителя и бесклеточной системы трансляции. Полученные комплексы scFv-антитело-рибосома-мРНК (ARM) инкубировали в растворе с биотинилированным LOX1 человека (биотинилированным по свободным аминогруппам с применением EZ LINK™ Sulfo-NHS-LC-Biotin (Thermo/Pierce, продукт: 21335)). Специфично связанные тройные комплексы (LOX1:ARM) иммобилизовали на покрытых стрептавидином парамагнитных гранулах (DYNABEADS M-280) согласно рекомендациям производителя (Dynal), тогда как несвязанные ARM отмывали. мРНК, кодирующую связанные scFv, затем восстанавливали посредством ПЦР с обратной транскрипцией (RT-PCR). Процесс отбора для полученной популяции повторяли в течение дополнительных раундов процедур отбора с применением понижающихся концентраций биотинилированного LOX1 человека (от 1 мкМ до минимальной 2 нМ за 4 раунда) с целью обогащения клонами с более высокой аффинностью к LOX1. Продукты раундов отбора 2, 3 и 4 субклонировали в pCantab6 (1) для бактериальной экспрессии в виде scFv, и улучшенные клоны идентифицировали в виде экстрактов из периплазмы в анализе конкуренции за связывание с эпитопом LOX696 (см. пример 10, анализ 7), как описано в примере 4.
[343]
et al
Библиотеки фагового дисплея второго поколения конструировали на основе продуктов CDR-рандомизированного рибосомного дисплея LOX696 или его вариантов. Всего получали четыре библиотеки: (1) посредством рекомбинации последовательностей CDR2 VH с последовательностями CDR3 VL на основе продуктов раунда 2 в обоих случаях; (2) путем осуществления дополнительной ПЦР с внесением ошибок для библиотеки подверженных рекомбинации CDR2 VH X CDR3 VL (см. выше) для введения дополнительных различий в последовательности с применением набора для ПЦР со случайным мутагенезом DIVERSIFY™ (BD Biosciences) согласно рекомендациям производителя; (3) посредством случайного мутагенеза в отношении полной последовательности scFv с помощью ПЦР с внесением ошибок, описанной выше, с применением в качестве матрицы набора из 9 ДНК-совпадений scFv исходя из полученной ранее библиотеки рибосомного дисплея и исходной ДНК scFv LOX696 в эквимолярном соотношении; (4) посредством «мягкой» рандомизации всего CDR3 VH, как описано в Gallop MA ., J Med Chem, 37(9):1233-51 (1994) с применением в качестве матрицы набора из 6 ДНК-совпадений scFv, исходя из полученной ранее библиотеки рибосомного дисплея и исходной ДНК scFv LOX696 в эквимолярном соотношении.
[344]
Процедуры отбора с фаговым дисплеем осуществляли как описано в примере 4 с применением понижающихся концентраций биотинилированного LOX1 (обычно от 100 нМ до 2 пМ за четыре раунда). Неочищенные экстракты из периплазмы, содержащие scFv, готовили для получения репрезентативного числа отдельных scFv из разных библиотек второго поколения и тестировали в анализе конкуренции за связывание с эпитопом HTRF (описанном в примере 10, анализе 7). Варианты ScFv, демонстрирующие наибольшую конкуренцию за связывание, снова подвергали секвенированию, и очищенные scFv готовили для тестирования как в примере 1. Наиболее эффективные scFv из этих библиотек второго поколения преобразовывали в формат IgG1 TM для дополнительного определения характеристик, как описано в следующих примерах.
[345]
Типичные примеры оптимизированных антител LOX696, полученных из этих библиотек 2-го поколения, включают: LX6960067_ngl1, LX6960071_ngl1, LX6960073_ngl1, LX6960086_ngl1, LX6960094_ngl1, LX6960101_ngl1, LX6960102_ngl1 и LX6960116_ngl1 (описанные в таблице 1 или на фигуре 5).
[346]
Выравнивания аминокислотной последовательности оптимизированных VH для отобранных антител из ряда LOX696 показаны на фигуре 5A. Выравнивания аминокислотной последовательности оптимизированных VL для отобранных антител из ряда LOX696 показаны на фигуре 5B.
Пример 6. Получение последовательности зародышевого типа и конструирование с изменением стабильности антител к LOX-1 в виде IgG1-TM
[347]
Аминокислотную последовательность VH и VL LOX514 выравнивали с известными последовательностями зародышевого типа человека из базы данных VBASE (Tomlinson, I., VBASE. 1997, Центр белковой инженерии совета медицинских исследований, Кембридж, Великобритания) и наиболее близкий зародышевый тип идентифицировали по сходству последовательностей. В случае VH-домена это была VH1-24 (DP-5) и JH6, в случае VL-домена это была Vλ1-e (DPL-8) и JL3. Имело место всего одно отличие в двух выравниваниях, расположенное в каркасном участке 4 тяжелой цепи. Этот единственный остаток (R105 - нумерация согласно Kabat) обращали в свойственный зародышевому типу остаток (Q) в ходе процесса преобразования IgG с помощью стандартных методов молекулярной биологии, что означает, что все оптимизированные IgG из ряда LOX514 были фактически получены в формате зародышевого типа. Дополнительно осуществляли мутагенез тяжелой цепи по N96D (нумерация по Kabat) с целью удаления потенциального мотива N-дезамидирования в CDR3 как LX5140092, так и LX5140093. Варианты были названы LX5140092_N>D и LX5140093_N>D соответственно (см. таблицу 1 или фигуру 4). Выравнивание аминокислотных последовательностей тяжелой и легкой цепей для LX5140092_N>D и LX5140093_N>D представлено на фигурах 4A и 4B соответственно.
[348]
et al., J Mol. Biol.,
Аналогичным образом проводили анализ с получением последовательности зародышевого типа антитела LOX696. Наиболее близкий зародышевый тип идентифицировали как VH3-09 (DP-31) и JH3 для тяжелой цепи и Vλ2a2 (DPL-11) и JL3 для легкой цепи. За исключением остатков Вернье (Foote, 224:487 (1992)), выявляли всего пять различий, при этом все в VH: два в каркасном участке 1, один в каркасном участке 3 и два в каркасном участке 4. Различия в оптимизированных последовательностях LOX696 IgG1-TM, за исключением V89, обращали в соответствии с наиболее близкими в отношении зародышевого типа остатками с помощью стандартных методов молекулярной биологии: Q1E, Q6E, R105Q и T108M. Дополнительно осуществляли мутагенез тяжелой цепи по G82bS (нумерация по Kabat) с целью удаления потенциального мотива N-дезамидирования в каркасном участке 3 подверженных приведению в соответствие с зародышевым типом LX6960073_gl (см. таблицу 1 или фигуру 5). Вариант был назван LX6960073_G82bS_gl (см. таблицу 1 или фигуру 5). Выравнивание аминокислотных последовательностей тяжелой и легкой цепей для неподверженных приведению в соответствие с зародышевым типом LX6960073_ngl1>D, подверженных приведению в соответствие с зародышевым типом LX6960073_gl и LX6960073_G82bS_gl>D, представлено на фигурах 5A и 5B соответственно.
Пример 7. Специфичность и межвидовая перекрестная реактивность оптимизированных антител к LOX1
[349]
Специфичность оптимизированных антител к LOX1 человека в виде IgG1-TM в отношении других молекул, родственных рецепторам лектина C-типа и скавенджер-рецепторам человека, оценивали с помощью ELISA на основе связывания IgG, как описано в примере 10, анализе 7. Панель родственных молекул включала CLEC-7A (Dectin-1) человека, CLEC-1A человека, CLEC-4L (DC-SIGN) человека, CLEC-1B (CLEC-2) человека, SR-A1 человека и SR-B3 человека (CD36). LOX1 человека также применяли для покрытия в качестве положительного контроля связывания. Тестировали следующие оптимизированные антитела: LX5140108, LX5140110, LX5140092_N>D, LX5140093_N>D, LX6960073_gl и LX6960073_G82bS_gl. Антитело изотипического контроля IgG1-TM NIP228 было включено в панель антител для тестирования с целью определения фонового уровня неспецифического связывания.
[350]
Как показано на фигуре 6, все оптимизированные антитела к LOX1 связывают LOX1 человека, но не связывают CLEC-7A, CLEC-1A, CLEC-4L, CLEC-1B, SR-A1 или SR-B3 человека, демонстрируя тем самым специфичность LX5140108, LX5140110, LX5140092_N>D, LX5140093_N>D, LX6960073_gl и LX6960073_G82bS_gl в отношении LOX1 человека.
[351]
Перекрестную реактивность антител к LOX1 человека с ортологами LOX1 различных видов оценивали с применением ELISA на основе связывания IgG (как описано в примере 10, анализе 7). Вкратце, (HisFlag)-LOX1 человека, LOX1-(FlagHis) яванского макака, LOX1-(FlagHis) мыши, LOX1-(FlagHis) крысы и LOX1-(FlagHis) кролика покрывали планшеты MAXISORP™ в концентрации 5 мкг/мл в буфере PBS. После блокирования PBS, содержащим 3% сухое молоко, очищенные антитела IgG1-TM к LOX1 в концентрации 10 мкг/мл в блокирующем буфере инкубировали с различными покрытыми антигенами. Связанные молекулы IgG выявляли с применением меченого европием вторичного антитела к IgG человека (Perkin Elmer) в концентрации 100 нг/мл. Планшеты считывали в отношении флуоресценции с возбуждением при 340 нм и испусканием при 615 нм. Неспецифическое связывание определяли по антигену CD86 FlagHis, которым также покрывали в концентрации 5 мкг/мл. Тестировали следующие оптимизированные антитела к LOX1, а также IgG1-TM NIP228 человека в качестве отрицательного контроля: LX5140108, LX5140110, LX5140092_N>D, LX5140093_N>D, LX6960073_gl и LX6960073_ G82bS_gl. Как показано на фигуре 7A, все из тестируемых антител (LX5140108, LX5140110, LX5140092_N>D, LX5140093_N>D, LX6960073_gl и LX6960073_G82bS_gl) связываются с LOX1 человека и яванского макака, но не с белками LOX1 мыши или крысы. Некоторые из этих антител (LX5140108, LX5140110 и LX5140092_N>D) также связываются с LOX1 кролика, но в меньшей степени с LOX1 человека или яванского макака, что демонстрирует меньший импульс флуоресценции.
[352]
Кроме того, осуществляли характеристику перекрестной реактивности между LOX1 человека и яванского макака для оптимизированных антител к LOX1 IgG1-TM LX5140108, LX5140110 и LX6960073_G82bS_gl с применением конкурентного ELISA.
[353]
Вкратце, планшеты со стрептавидином (Abgene) покрывали биотинилированным LOX1 человека в концентрации 0,125 мкг/мл в PBS. После блокирования PBS, содержащим 3% сухое молоко, очищенные антитела IgG1-TM к LOX1 в концентрации 12,5 нг/мл в блокирующем буфере совместно инкубировали с конкурирующими белками LOX1 человека или яванского макака. Титр 1:3 конкурирующего белка в блокирующем буфере применяли начиная с 400 нМ для LX5140108 и LX5140110 и 2 мкМ для LX6960073_G82bS_gl. Связанные молекулы IgG к LOX1 выявляли с применением меченого европием вторичного антитела к IgG человека (Perkin Elmer) в концентрации 100 нг/мл. Планшеты считывали в отношении флуоресценции с возбуждением при 340 нм и испусканием при 615 нм.
[354]
50
50
Как показано на фигуре 7B и в таблице 3 ниже, все три оптимизированных IgG1-TM к LOX1 (LX5140108, LX5140110 и LX6960073_G82bS_gl) конкурируют с LOX1 яванского макака и характеризуются IC в пределах 5-кратного значения IC в случае конкурирования с LOX1 человека, демонстрируя сильную перекрестную реактивность антител к LOX1 LX5140108, LX5140110 и LX6960073_G82bS_gl у яванского макака.
Таблица 3. Связывание оптимизированного антитела с LOX1 яванского макака и LOX1 человека.
<b>Антитела к LOX1</b>
<b>IC50 для конкурирования с huLOX1 (M)</b>
<b>IC50 для конкурирования с cynoLOX1 (M)</b>
LX5140108
2,2 × 10<sup>-10</sup>
2,5 × 10<sup>-10</sup>
LX5140110
2,8 × 10<sup>-8</sup>
4,4 × 10<sup>-8</sup>
LX6960073_G82bS_gl
5,5 × 10<sup>-10</sup>
1,8 × 10<sup>-9</sup>
Пример 8. Аффинность оптимизированных антител к LOX1 к hLOX1, определенная с помощью BIACORE™ и KinExATM
[355]
Аффинность антитела к LOX1 к ортологам рекомбинантного внеклеточного домена LOX1 человека и яванского макака (ECD) определяли при 37°C с применением отслеживания взаимодействий в реальном времени с помощью Biacore (для LOX1 человека и яванского макака) и в равновесном состоянии с применением KinExA (для измерений аффинности LOX1 человека).
[356]
В анализе Biacore рекомбинантный белок G+антитело к LOX1, захваченное белком G, иммобилизовали посредством связи с аминогруппой на поверхности чипа CM5 и получали профили ассоциации и диссоциации LOX1 ортологов, пропускаемых над поверхностью. Анализы проводили при температуре IFC, установленной на 37˚C, при этом ячейки для образцов оставляли при температуре окружающей среды. Все эксперименты осуществляли с пропусканием буфера подвижной фазы HBSEP через IFC при постоянной скорости 30 мкл/мин. В конце каждого внесения LOX1 любое антитело и комплекс антитела снимали с белка G посредством импульсной обработки в течение 40 секунд 10 мМ глицина при pH 1,5. Количество антитела к LOX1, захваченного на поверхности белка G, рассчитывали, во-первых, во избежание ограничений массообмена, и во-вторых, чтобы убедится, что может быть зафиксирована достаточная степень диссоциация для точного моделирования. Диапазон концентраций взаимодействующего LOX1 был достаточным, чтобы убедиться, что фиксировали связывание в полном диапазоне, от насыщения антитела до невыявляемого связывания. Данные анализировали с применением программного обеспечения для оценки BiaEval с последующим двойным контрольным вычитанием профиля только антитела.
[357]
Анализ равновесия в растворе проводили при единственной концентрации антитела к LOX1, в котором титрование рекомбинантного ECD LOX1 человека осуществляли начиная от концентрации, превышающей в 100 раз до концентрации, в 100 раз меньшей чем концентрация антитела. Концентрации свободного антитела определяли посредством захвата незанятого антитела, которое затем выявляли с помощью специфического к Fc человека зонда, меченого флуоресцентной меткой. Таблица 4. Данные касательно наблюдаемых констант скоростей и суммарные значения аффинности.
Таблица 4. Аффинность LX5140110 и константы скоростей.
<b>Лиганд/LOX1</b>
<b>Анализ</b>
<b>Скорость ассоциации (1/Мс)</b>
<b>Скорость диссоциации (1/с)</b>
<b>KD (пМ)</b>
<b>Человек</b>
Biacore
5,75e5
2,30e-4
401
<b>Яванский макак</b>
Biacore
1,09e6
1,68e-4
154
<b>Человек</b>
KinExA
н/д
н/д
От 378 до 587 пМ
Пример 9. Оптимизированные антитела к LOX1 демонстрируют ингибирование мультилигандного связывания, интернализации oxLDL и индуцируемой oxLDL передачи сигнала
[358]
Очищенные IgG исследовали в отношении их способности специфично ингибировать связывание oxLDL, AGE-BSA и CRP с LOX1 (см. пример 10; анализы 1, 2 и 3). Ряд выделенных клонов, в том числе LX5140110 и LX6960073_G82bS_gl, исследовали в отношении их способности блокировать связывание oxLDL, AGE-BSA и CRP с LOX1. Характерные графики показаны на фигурах 8A, 8B и 8C, демонстрирующие ингибирование связывания oxLDL, AGE-BSA и CRP с помощью LX5140110 и LX6960073_G82bS_gl соответственно. Для подтверждения перекрестного реагирования антител и того, что они обладают функциональной активностью в отношении LOX1 с SNP K167N, антитела исследовали в отношении их способности блокировать связывание oxLDL с LOX1 с SNP K167N. Характерные графики показаны на фигуре 8D, демонстрирующие, что как LX5140110, так и LX6960073_G82bS_gl блокируют связывание oxLDL с вариантом LOX1 с SNP K167N. В дополнение к ингибированию связывания, ряд выделенных клонов, в том числе LX5140110 и LX6960073_G82bS_gl, исследовали в отношении их способности блокировать интернализацию oxLDL в экспрессирующие LOX1 клетки (см. пример 10, анализ 4) и индуцируемую oxLDL передачу сигнала LOX1 (см. пример 10, анализ 5). Характерные графики показаны на фигурах 8A и 8F, демонстрирующие ингибирование интернализации oxLDL и oxLDL индуцированной передачи сигнала LOX1 соответственно, с помощью LX5140110 и LX6960073_G82bS_gl. Результаты этих исследований обобщены в таблице 5.
Таблица 5. Ингибирование оптимизированным антителом к LOX1 интернализации oxLDL и передачи сигнала.
<b>LOX514_110</b>
<b>LX6960073_G82bS</b>
<b>OxLDL/hLOX1 CHO</b>
<b>Среднее</b>
<b>1,04663E-10</b>
<b>2,00052E-11</b>
<b>Конкуренция</b>
SD
<i>1,91372E-10</i>
<i>6,29934E-12</i>
n
3
3
<b>OxLDL/K167N hLOX1 CHO</b>
<b>Среднее</b>
<b>4,92E-10</b>
<b>1,04531E-10</b>
<b>Конкуренция</b>
SD
<i>5,40E-10</i>
<i>2,37936E-10</i>
n
7
5
<b>OxLDL/hLOX1 CHO</b>
<b>Среднее</b>
<b>3,1223E-10</b>
<b>3,80346E-10</b>
<b>Интернализация</b>
SD
<i>1,12532E-10</i>
<i>3,32497E-10</i>
n
3
3
<b>AGE BSA/hLOX1 CHO</b>
<b>Среднее</b>
<b>2,07257E-11</b>
<b>1,76549E-11</b>
<b>Конкуренция</b>
SD
<i>1,27853E-10</i>
<i>1,34571E-11</i>
n
3
3
<b>CRP/hLOX1</b>
<b>Среднее</b>
<b>5,01529E-09</b>
<b>2,99815E-09</b>
<b>Конкуренция</b>
SD
<i>6,37843E-09</i>
<i>1,64015E-09</i>
n
3
3
<b>Анализ ROS</b>
<b>Среднее</b>
<b>1,98E-09</b>
<b>2,21E-09</b>
SD
<i>4,47E-10</i>
<i>2,50E-10</i>
n
3
3
[359]
Данные результаты демонстрируют специфическое мультилигандное ингибирование связывания LOX1 с oxLDL, AGE-BSA и CRP с помощью антител LX5140110 и LX6960073_G82bS_gl, и что как LX5140110, так и LX6960073_G82bS_gl функциональным образом перекрестно реагируют с типичным вариантом LOX1 SNP K167N и ингибируют интернализацию oxLDL и индуцированную oxLDL передачу сигнала LOX1.
Пример 10. Анализы и способы
[360]
В экспериментах, описанных в примерах 1-9, применяли следующие материалы и способы.
Материалы
[361]
2
Доксициклина гидрохлорид (Sigma № D9891-1G); карбокси-HDCFDA (MolecularProbes № C400); краситель Hoechst (Molecular probes № 33342); AGE-BSA (Biovision № 2221-10); PBS (Gibco № 14190); рекомбинантный С-реактивный белок (R&D № 1707-CRCF); BSA 30% (SIGMA № A9576); набор для конъюгирования с биотином Lightning Link (Innova Biosciences № 704-0010); DyLight 649, активируемый сложным эфиром NHS (Thermo Scientific № 46416); Cypher 5E, активируемый Mono NHS; сложный эфир (GE healthcare № PA15401); HBSS (1X) (GIBCO № 14025); черный 384-луночный планшет для анализа Corning CellBind (Corning Costar № 3683); раствор усиления Delfia (Perkin Elmer № 4001-0010); меченный европием стрептавидин (Perkin Elmer № 1244-360); обессоливающие колонки Zeba на 0,5 мл (Pierce № 89883); CHO-TREx (Invitrogen № R718-07); oxLDL (Intracel № RP049); DiI-oXLDL (Intracel № RP-173); антитело к LOX1 (Biovision № 3659); краситель Hoechst (Molecular probes № 33342); PBS (Gibco № 14190); среда для культивирования: Hams:F12-GlutaMax-I (Gibco № 31765-027); дополненная 10% фетальной бычьей сывороткой (Invitrogen № 16000-044); бластицидин (Invitrogen № 46-1120); зеоцин (Invitrogen № R25001); липофектамин (Invitrogen № 11668-019); доксициклина гидрохлорид (Sigma № D9891-1G).
Модификации реагентов
Мечение oxLDL с помощью Cypher 5E
[362]
pH раствора ox-LDL (1 мг/мл) доводили до pH 8,5 с применением 1/10 объема 0,5 M натрий-боратного буфера и oxLDL метили в соответствии с инструкциями из набора от производителя при молярных соотношениях белок:краситель 40:1 (1 час при комнатной температуре в темноте). Непрореагировавший краситель удаляли с применением центрифужных колонок Zeba в соответствии с инструкциями производителя (Cypher 5E, активируемый сложным эфиром Mono NHS от GE healthcare) и осуществляли замену буфера на PBS. Меченый белок выдерживали при 4°C в темноте. С целью расчета предполагалось, что восстанавливалось 95% белка, и коэффициенты разбавления не учитывали.
Мечение oxLDL и AGE-BSA с помощью DyLight 649
[363]
pH раствора ox-LDL или AGE-BSA (1 мг/мл) доводили до pH 8,5 с применением 1/10 объема 0,5 M натрий-боратного буфера и осуществляли мечение в соответствии с инструкциями производителя (DyLight 649, активируемый сложным эфиром NHS от Thermo Scientific в течение часа при комнатной температуре в темноте). Непрореагировавший краситель удаляли с применением центрифужных колонок Zeba в соответствии с инструкциями производителя и осуществляли замену буфера на PBS. С целью расчета предполагалось, что восстанавливалось 95% белка, и коэффициенты разбавления не учитывали.
Мечение антител к LOX1 человека с помощью Dylight 649
[364]
pH раствора антитела к LOX1 человека (1 мг/мл) доводили до pH 8,5 с применением 1/10 объема 0,5 M натрий-боратного буфера и осуществляли мечение в соответствии с инструкциями производителя (DyLight 649, активируемый сложным эфиром NHS от Thermo Scientific в течение часа при комнатной температуре в темноте). Непрореагировавший краситель удаляли с применением центрифужных колонок Zeba в соответствии с инструкциями производителя и осуществляли замену буфера на PBS. С целью расчета предполагалось, что восстанавливалось 95% белка, и коэффициенты разбавления не учитывали.
Мечение CRP биотином
[365]
С-реактивный белок CRP (R&D systems; без носителя) разбавляли в дистиллированной воде до концентрации 4 мг/мл и осуществляли биотинилирование в соответствии с прилагаемыми инструкциями из набора с помощью набора для конъюгирования с биотином Lightning-Link™ (типа A).
Линия клеток CHO-TREX 3A9, экспрессирующая LOX1 человека
[366]
Ген LOX1 человека (NM 002543) применяли для получения рекомбинантной плазмиды pcDNA4/TO-LOX1 (pAM2037), который был синтезирован и предоставлен Geneart. Ген LOX1 синтезировали с добавлением сайта рестрикции Afl II и последовательности Kozak на 5'-конце и сайта рестрикции EcoRI на 3'-конце. pAM2037 затем трансфицировали в клетки яичника китайского хомячка, экспрессирующие тетрациклиновый репрессор, (клетки CHO-TREx) с применением липофектамина 2000. CHO-TREx представляет собой клеточную линию CHO-K, которая содержит pcDNA6/TR, содержащий ген тетрациклинового (Tet) репрессора, который будет блокировать экспрессию генов, клонированных в pcDNA4/TO. Если эти клетки обработать тетрациклином, репрессор освободится и ген LOX1 будет экспрессироваться.
[367]
Смешанную популяцию трансфицированных клеток отсортировывали с применением прибора FACS в 96-луночные планшеты с получением единичной клетки в каждой лунке. Отбор в отношении pcDNA6/TR осуществляли с помощью 10 мкг/мл бластицидина, а для отбора в отношении плазмиды pcDNA4TO-LOX1 применяли 300 мкг/мл зеоцина и 200 мкг/мл для поддержания. Отдельные клетки размножали и стабильные клоны отбирали по их способности связывать и поглощать DiI-меченный oxLDL с применением подхода с использованием одновременного многопараметрического анализа для количественного определения флуоресценции, поглощаемой клетками. Один клон отбирали по поглощению DiI-oxLDL и стабильности в течение нескольких пассажей в ходе роста. Экспрессию белка LOX1 на поверхности определяли с помощью иммунного окрашивания с применением специфического антитела к LOX1 от Biovision. Функциональная активность белка LOX1 была продемонстрирована по поглощению OxLDL и формированию oxLDL-опосредованного ответа ROS в клетках CHO-TREx-LOX1.
АНАЛИЗЫ 1 и 2. Анализы связывания LOX1:oxLDL и LOX1:AGE-BSA
Кривая насыщения связывания
[368]
Как меченый DyLight 649 oxLDL, так и AGE-BSA (1 мг/мл) разбавляли 1:50 в HBSS и раститровывали в 384-луночный планшет с применением серийного разведения 1+1 с 16 точками в трех повторах. Для определения общего связывания во все лунки добавляли 10 мкл HBSS с последующим добавлением 10 мкл клеток CHO TREX, трансфицированных LOX1 человека (4000 клеток на лунку). Для определения неспецифического связывания 10 мкл HBSS заменяли на 10 мкл немеченого oxLDL (1 мг/мл). Аналитический планшет инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. После инкубации планшеты считывали с помощью системы детекции клеток Applied Biosystems 8200 (планшет-ридер FMAT) с применением PMT1, установленного на 422 с минимальным числом единиц, равным 10; цвет <0,4 и FL1 <5600. Специфическое связывание определяли путем вычитания среднего общего сигнала связывания из среднего сигнала неспецифического связывания и построения полученной изотермы связывания с помощью программного обеспечения Prism Graphpad с применением алгоритма для односайтового специфического связывания. Рассчитанную концентрацию, при которой определяли KD, применяли для последующего высокопроизводительного скрининга и экспериментов по конкурентному связыванию антител.
Оценка моноклональных антител к hLOX1
[369]
Анализ конкуренции между антителами к LOX1 и меченым DyLight 649 лигандом (oxLDL; AGE-BSA) за связывание с рецептором LOX1, экспрессируемым на клетках CHO TREX, осуществляли следующим образом.
[370]
Конкурирующие антитела применяли без какого-либо предварительного разведения и раститровывали в 384-луночный планшет с применением серийного разведения 1+1 в буфере для анализа (HBSS) с 24 точками в двух повторах (10 мкл на лунку). Меченые Dylight 649 лиганды (в концентрациях при соответствующих KD) добавляли во все лунки, содержащие антитела (10 мкл на лунку), с последующим добавлением клеток CHO TREX, трансфицированных LOX1 человека (4000 клеток на лунку в 10 мкл) или клеток CHO TREX, трансфицированных K167N SNP.
[371]
50
50
Аналитические планшеты инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. После инкубации планшеты считывали с помощью системы детекции клеток Applied Biosystems 8200 (планшет-ридер FMAT) с применением PMT1, установленного на 422 с минимальным числом единиц, равным 10; цвет <0,4 и FL1 <5600. Данные анализировали с применением логистического уравнения с 4 параметрами с помощью GRAPHPAD™ Prism версии 5 (GraphPad Inc, Калифорния) для определения отдельных значений IC. Y=нижнее значение+(верхнее значение - нижнее значение)/(1+10 ^ ((Log IC-X)*наклон)), где X представляет собой логарифм концентрации, и Y представляет собой % специфического связывания. IC50 представляет собой концентрацию образца, которая обеспечивает 50% ингибирование специфического связывания.
Таблица 6 В анализах связывания oxLDL и AGE-BSA применяли исходные концентрации.
<b>Условия анализа для анализов HTS и IC</b><sub><b>50</b></sub>
<b>Конц. рабочего раствора</b>
<b>Конечная конц. для анализа</b>
<b>Меченый DyLight 649 oxLDL</b>
8,7 нМ
2,9 нМ
<b>Меченый DyLight 649 AGE BSA</b>
7,5 мкг/мл
2,5 мкг/мл
<b>Клетки CHO TREX, трансфицированные hLOX1</b>
4×10<sup>5</sup> клеток/мл
4000 клеток/лунку
<b>Материал Peri-prep для HTS (анализ связывания oxLDL)</b>
100%
30%
<b>Очищенные образцы scFv/IgG для анализа IC</b><sub><b>50</b></sub>
Серийное разведение 1+1 очищенных белков с 24 точками
30%
Анализ 3. Анализ связывания LOX1:CRP
Кривая насыщения связывания
[372]
D
LOX1 (R&D systems) иммобилизовали на поверхности 384-луночного планшета Nunc Maxisorp в концентрации 3 мкг/мл в PBS в течение ночи при 4°C (25 мкл на лунку). На следующий день аналитический планшет промывали с помощью 12x PBS (без кальция и магния). Рабочий раствор биотинилированного CRP готовили в концентрации 20 мкг/мл (769 нМ) в PBS/0,1%BSA/0,01% tween 20 и раститровывали в 384-луночный планшет с применением серийного разведения 1+1 с 16 точками в трех повторах (12,5 мкл на лунку). Дополнительно в каждую лунку добавляли 12,5 мкл буфера для анализа (в PBS/0,1%BSA/0,01% tween 20) и инкубировали аналитический планшет в течение 2 часов при комнатной температуре. Планшет промывали с помощью 16× PBS/0,01% Tween 20 с последующим добавлением 50 мкл меченого европием стрептавидина (разведение 1:1000). Аналитический планшет инкубировали в течение дополнительного 1 часа при комнатной температуре с последующим промыванием с помощью 16× PBS/0,01% Tween 20. Планшет проявляли путем добавления 100 мкл/лунку раствора усиления DELFIA и считывания на планшет-ридере Wallac Victor V с применением установленного изготовителем протокола DELFA с использованием европия. Построение полученной изотермы связывания осуществляли с помощью программного обеспечения Prism Graphpad с применением алгоритма для односайтового специфического связывания. Рассчитанную концентрацию, при которой определяли отдельные K, применяли для последующего высокопроизводительного скрининга и экспериментов по конкурентному связыванию антител.
Оценка моноклональных антител к LOX1 человека
[373]
D
50
50
50
Анализ конкуренции между антителом и меченым биотином CRP за связывание с рекомбинантным LOX1 человека осуществляли следующим образом: LOX1 (R&D systems) иммобилизовали на поверхности 384-луночного аналитического планшета Nunc Maxisorp в концентрации 3 мкг/мл в PBS в течение ночи при 4°C (25 мкл на лунку). На следующий день аналитический планшет промывали с помощью 12× PBS (без кальция и магния). Конкурирующие антитела применяли без какого-либо предварительного разведения и раститровывали в 384-луночный планшет для разведения с применением серийного разведения 1+1 в буфере для анализа (PBS/0,1%BSA/0,01% tween 20) с 24 точками в двух повторах (30 мкл на лунку). Затем во все лунки, содержащие антитела, добавляли меченый биотином CRP (30 мкл на лунку в концентрации K). Образцы (50 мкл) затем переносили с применением роботизированной станции дозирования жидкостей MiniTrak для 384-луночных планшетов из планшета для разведения в аналитический планшет, содержащий иммобилизованный рекомбинантный LOX1 человека. Планшеты инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре. Планшет промывали с помощью 16× PBS/0,01% Tween 20 с последующим добавлением 50 мкл меченого европием стрептавидина (разведение 1:1000). Аналитический планшет инкубировали в течение дополнительного 1 часа при комнатной температуре с последующим промыванием с помощью 16× PBS/0,01% Tween 20. Планшет проявляли путем добавления 100 мкл/лунку раствора усиления DELFIA и считывания на планшет-ридере Wallac Victor V с применением установленного изготовителем протокола DELFA с использованием европия. Данные анализировали с применением логистического уравнения с 4 параметрами с помощью GRAPHPAD™ Prism версии 5 (GraphPad Inc, Калифорния) для определения отдельных значений IC. Y=нижнее значение+(верхнее значение - нижнее значение)/(1+10 ^ ((Log IC-X)*наклон)), где X представляет собой логарифм концентрации, и Y представляет собой % специфического связывания. IC представляет собой концентрацию образца, которая обеспечивает 50% ингибирование специфического связывания.
Таблица 7 Исходные концентрации, применяемые в анализах связывания CRP
<b>Условия анализа для анализов HTS и IC</b><sub><b>50</b></sub>
<b>Конц. рабочего раствора</b>
<b>Конечная конц. для анализа</b>
<b>Меченый биотином CRP</b>
784 нМ
6,12 нМ
<b>Рекомбинантный LOX1</b>
39,2 мкм
0,11 мкм
<b>Меченый европием стрептавидин</b>
0,1мг/мл
0,1 мкг/мл
<b>Очищенные образцы scFv/IgG для анализа IC</b><sub><b>50</b></sub>
Серийное разведение 1+1 очищенных белков с 24 точками
50%
Анализ 4. Анализ интернализации LOX1:oxLDL
Кривая насыщения связывания
[374]
Меченый Cypher 5E oxLDL (молярное соотношение 40:1 при 1 мг/мл) разбавляли 1:50 в HBSS и раститровывали в 384-луночный планшет с применением серийного разведения 1+1 с 16 точками в трех повторах. Для определения общего связывания во все лунки добавляли 10 мкл HBSS с последующим добавлением 10 мкл клеток CHO TREX, трансфицированных LOX1 человека (4000 клеток на лунку). Для определения неспецифического связывания 10 мкл HBSS заменяли на 10 мкл немеченого oxLDL (1 мг/мл).
[375]
D
Аналитический планшет инкубировали в течение 1 часа при 37°C. Проводили параллельный эксперимент, в котором все реагенты хранили при 4°C, чтобы продемонстрировать, что интернализация представляла собой метаболически активный процесс. После инкубации планшеты считывали с помощью системы детекции клеток Applied Biosystems 8200 (планшет-ридер FMAT) с применением PMT1, установленного на 422 с минимальным числом единиц, равным 10; цвет <0,4 и FL1 <5600. Специфическое связывание определяли путем вычитания среднего общего сигнала связывания из среднего сигнала неспецифического связывания и построения полученной изотермы связывания с помощью программного обеспечения Prism Graphpad с применением алгоритма для односайтового специфического связывания. Рассчитанную концентрацию, при которой определяли K, применяли для последующего высокопроизводительного скрининга и экспериментов по конкурентному связыванию антител.
Оценка моноклональных антител к hLOX1
[376]
Анализ конкуренции между антителами к LOX1 и меченым Cypher5E ox-LDL за интернализацию в клетки CHO TREX, экспрессирующие рецептор LOX1, осуществляли следующим образом.
[377]
D
Конкурирующие антитела применяли без какого-либо предварительного разведения и раститровывали в 384-луночный планшет с применением серийного разведения 1+1 в буфере для анализа (HBSS) с 24 точками в двух повторах (10 мкл на лунку). Меченые Dylight 649 лиганды (в концентрациях при соответствующих K) добавляли во все лунки, содержащие антитела (10 мкл на лунку), с последующим добавлением клеток CHO TREX, трансфицированных LOX1 человека (4000 клеток на лунку в 10 мкл) или клеток CHO TREX, трансфицированных K167N SNP.
[378]
50
50
50
Аналитические планшеты инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. После инкубации планшеты считывали с помощью системы детекции клеток Applied Biosystems 8200 (планшет-ридер FMAT) с применением PMT1, установленного на 422 с минимальным числом единиц, равным 10. Цвет <0,4 и FL1 <5600. Данные анализировали с применением логистического уравнения с 4 параметрами с помощью GRAPHPAD™ Prism версии 5 (GraphPad Inc, Калифорния) для определения отдельных значений IC. Y=нижнее значение+(верхнее значение - нижнее значение)/(1+10 ^ ((Log IC-X)*наклон)), где X представляет собой логарифм концентрации, и Y представляет собой % специфического связывания. IC представляет собой концентрацию образца, которая обеспечивает 50% ингибирование специфического связывания.
Таблица 8 Исходные концентрации, применяемые в анализах интернализации oxLDL
<b>Условия анализа для анализов HTS и IC</b><sub><b>50</b></sub>
<b>Конц. рабочего раствора</b>
<b>Конечная конц. для анализа</b>
<b>Меченый Cypher5E oxLDL</b>
9,6 нМ
3,2 нМ
<b>Клетки CHO TREX, трансфицированные LOX1 человека</b>
4×10<sup>5</sup> клеток/мл
4000 клеток на лунку
<b>Очищенные образцы scFv/IgG для анализа IC</b><sub><b>50</b></sub>
Серийное разведение 1+1 очищенных белков с 24 точками
30%
Анализ 5. Индукция ROS в рекомбинантных клетках CHO-LOX1
Подготовка клеток
[379]
5
Перед проведением экспериментов клетки CHO TREX, трансфицированные LOX1 человека, индуцировали 24 часа с помощью 1 мкг/мл (конечная концентрация) доксициклина. В день эксперимента клетки соскабливали и центрифугировали в течение 5 минут при 1200 об/мин. Супернатант выбрасывали и клеточный осадок ресуспендировали в 50 мл PBS и центрифугировали при 1200 об/мин. в течение 5 минут. Эту процедуру повторяли дважды. Супернатант выбрасывали и клеточный осадок ресуспендировали в 5 мл HBSS. Клетки подсчитывали на гемоцитометре с применением способа с исключением окрашивания трипановым синим. Число клеток доводили до получения в общей сложности 4×10 клеток. До применения клетки хранили на льду.
Кривая насыщения связывания
[380]
Меченый Cypher 5E oxLDL (молярное соотношение 40:1 при 1 мг/мл) разбавляли 1:50 в HBSS и раститровывали в 384-луночный планшет с применением серийного разведения 1+1 с 16 точками в трех повторах. Для определения общего связывания во все лунки добавляли 10 мкл HBSS с последующим добавлением 10 мкл клеток CHO TREX, трансфицированных LOX1 человека (4000 клеток на лунку). Для определения неспецифического связывания 10 мкл HBSS заменяли на 10 мкл немеченого oxLDL (1 мг/мл).
[381]
Аналитический планшет инкубировали в течение 1 часа при 37°C. Проводили параллельный эксперимент, в котором все реагенты хранили при 4°C, чтобы продемонстрировать, что интернализация представляла собой метаболически активный процесс.
[382]
После инкубации планшеты считывали с помощью системы детекции клеток Applied Biosystems 8200 (планшет-ридер FMAT) с применением PMT1, установленного на 422 с минимальным числом единиц, равным 10; цвет <0,4 и FL1 <5600.
[383]
D
Специфическое связывание определяли путем вычитания среднего общего сигнала связывания из среднего сигнала неспецифического связывания и построения полученной изотермы связывания с помощью программного обеспечения Prism Graphpad с применением алгоритма для односайтового специфического связывания. Рассчитанную концентрацию, при которой определяли K, применяли для последующего высокопроизводительного скрининга и экспериментов по конкурентному связыванию антител.
[384]
2
2/
2
2
2
2/
2
Трансфицированные клетки CHO-TREx-LOX1 высевали в аналитические планшеты в концентрации 7000 клеток/лунку (100 мкл/лунку в среде+10% FCS (без тетрациклина)) и инкубировали в течение ночи при 37°C, 5% CO. На следующий день добавляли доксициклин в конечной концентрации 50 нг/мл на лунку для индукции экспрессии LOX и инкубировали планшеты в течение ночи при 37°C в атмосфере 95% O5%CO. Для каждого скринингового эксперимента готовили три отдельных планшета и антитела к LOX анализировали в трех повторностях с одним повтором на планшет. На следующий день готовили антитела к LOX1 посредством серийного разведения антител в теплой среде для культивирования клеток в виде 2× концентрированных растворов в отдельном планшете для разведения. Из аналитических планшетов удаляли всю среду и в каждую лунку аналитического планшета добавляли аликвоты на 25 мкл из серий разведений антител к LOX1 (2× концентрированный раствор) и инкубировали в течение 20 мин. при 37°C в атмосфере 95% O/5% CO. После этого добавляли 25 мкл на лунку oxLDL (в фиксированной конечной концентрации 25 мкг/мл) и планшеты инкубировали в течение 60 мин. при 37°C в атмосфере 95% O5% CO.
[385]
2
2
2
Затем лунки аккуратно промывали 100 мкл 1× теплой HBSS/Ca/Mg и после этого добавляли 50 мкл/лунку карбокси-HDCFDA (1,5 мкМ в теплой HBSS/Ca/Mg) и аналитические планшеты инкубировали в течение 30 минут. В течение следующих 5 мин. инкубирования с карбокси-HDCFDA клетки подвергали контр-окрашиванию красителем Hoechst (конечная концентрация 8,3 мкг/мл) в теплой HBSS/Ca/Mg путем добавления 10 мкл 50 мкг/мл Hoechst в теплой HBSS/Ca/Mg в лунки с уже присутствующим карбокси-HDCFDA.
[386]
50
Аналитические планшеты затем промывали 2x с помощью теплой HBSS+Ca/Mg и сразу же считывали на планшет-ридере Arrayscan системы для одновременного многопараметрического анализа (ThernoFischerScientific, Cellomics) с применением условий XF53-Hoechst (Ch1) и XF53-FITC (Ch2). Для анализа изображений применяли алгоритм BioApplication для блочного анализа и количественно определяли флуоресценцию, генерируемую пробой с ROS, с помощью параметра CircSpotAvgIntensity. Данные по конкурентному связыванию и полученные IC наносили на график и рассчитывали в ExcelFit v.5.1 с использованием исходной модели для одного участка связывания с сигмоидальной кривой зависимости доза-ответ с применением логистической модели с 4 параметрами (Model 903).
Анализ 6. Анализы ELISА специфичности LOX1
[387]
2
4
Анализы ELISА специфичности IgG в отношении LOX1 и родственных LOX1 молекул, перечисленных в таблице 9 ниже, осуществляли в основном следующим образом. Планшеты MAXISORB™ (NUNC) покрывали антигеном в концентрации 5 мкг/мл в PBS и инкубировали в течение ночи при 4°C, а для SR-B3 человека применяли 10 мкг/мл. Планшеты промывали 3× с помощью PBS и блокировали 200 мкл/лунку блокирующего буфера (PBS+3% сухое молоко) в течение часа. После промывания планшетов 3x с помощью PBS IgG разбавляли до 0,2 мкг/мл в блокирующем буфере, добавляли в концентрации 50 мкл/лунку и 1 инкубировали в течение 1 часа. Затем планшеты промывали 3× с помощью PBS-Tween, добавляли реагент для обнаружения (конъюгат легкой лямбда цепи с пероксидазой (Sigma A5175, разбавленный до 0,23 мкг/мл) или тяжелой каппа-цепи (Sigma A7164, разбавленный до 0,8 мкг/мл к IgG человека)) (50 мкл/лунку в блокирующем буфере) и планшеты инкубировали в течение 1 часа. Планшеты промывали 3x с помощью PBS-Tween, добавляли 50 мкл/лунку TMB и планшеты оставляли для проявления в течение 5-15 минут. Реакцию гасили с помощью 50 мкл/лунку 0,1 M HSO и планшеты считывали на планшет-ридере ENVISION™, или подобном оборудовании, при 450 нМ.
Таблица 9 Реагенты, применяемые в анализах ELISА специфичности LOX1.
<b>Реагент</b>
<b>Поставщик</b>
<b>Название по каталогу</b>
Меченый HisFlag LOX1 человека
MedImmune
Н/Д
CLEC-7A (Dectin-1) человека
R&D Systems
1859-DC
Human CLEC-1A
R&D Systems
1704-CL
CLEC-4L (DC-SIGN) человека
R&D Systems
161-DC
CLEC-1B (CLEC-2) человека
R&D Systems
1718-CL
SR-A1 (MSR) человека
R&D Systems
2708-MS
Human SR-B3 (CD36)
R&D Systems
1955-CD
Анализ 7. Анализ конкуренции за связывание с эпитопом.
[388]
D
LOX514 и LOX696 метили DyLight 649, описанной выше в разделе, описывающем модификации белков, и применяли в качестве конкурирующих молекул как для высокопроизводительного скрининга, так и для сравнения анализов связывания лиганда. Меченые антитела применяли в нескольких концентрациях, превышающих их соответствующие концентрации K с целью усложнения конкуренции немеченых антител с более высокой аффинностью.
Определение K
меченых DyLight 649 LOX514 и LOX696
D
[389]
Меченые Dylight 649 антитела к LOX1 разбавляли 1:50 в HBSS и раститровывали в 384-луночный планшет с применением серийного разведения 1+1 с 16 точками в трех повторах. Для определения общего связывания во все лунки добавляли 10 мкл HBSS с последующим добавлением 10 мкл клеток CHO TREX, трансфицированных LOX1 человека (4000 клеток на лунку). Для определения неспецифического связывания 10 мкл HBSS заменяли 10 мкл немеченого антитела к LOX1 человека (1 мг/мл).
[390]
Аналитический планшет инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре.
[391]
После инкубации планшеты считывали с помощью системы детекции клеток Applied Biosystems 8200 (планшет-ридер FMAT) с применением PMT1, установленного на 422 с минимальным числом единиц, равным 10; цвет <0,4 и FL1 <5600.
[392]
D
Специфическое связывание определяли путем вычитания среднего общего сигнала связывания из среднего сигнала неспецифического связывания и построения полученной изотермы связывания с помощью программного обеспечения Prism Graphpad с применением алгоритма для односайтового специфического связывания. Антитела применяли в многократных повторах в концентрации сверх рассчитанной концентрации K.
Таблица 10 Исходные концентрации LOX514 и LOX696 для анализов конкуренции за связывание с эпитопом.
<b>Условия анализа для анализов HTS и IC</b><sub><b>50</b></sub>
<b>K</b><sub><b>D</b></sub>
<b>Конечная концентрация для анализа (xK</b><sub><b>D</b></sub><b>)</b>
<b>Меченый DyLight 649 LOX10514</b>
0,8нМ
6,5 нМ (x8)
<b>Меченый DyLight 649 LOX10696</b>
3,3 нМ
20,8 нМ (x6,3)
<b>Клетки CHO TREX, трансфицированные LOX1 человека</b>
4×10<sup>5</sup> клеток/мл
4000 клеток на лунку
<b>Материал Peri-prep для HTS (анализ связывания oxLDL)</b>
100%
30%
<b>Очищенные образцы scFv/IgG для анализа IC</b><sub><b>50</b></sub>
Серийное разведение 1+1 очищенных белков с 24 точками
30%
Пример 11.
Эффекты антител к LOX1 на поглощение липидов эндотелиальными клетками, передачу сигнала в клетке и гомеостаз оксида азота в культуре ткани и в кровеносных сосудах человека.
[393]
et al
Cardiol Res Pract
et al
Atherosclerosis
et al
Circ Res
et al
Circ Res.
et al
Thrombosis Res
Рецептор LOX1 является непосредственной причиной атерогенного процесса посредством специфического связывания и интернализации OxLDL с последующей активацией множества внутриклеточных каскадов сигнальной трансдукции. См., например, Twigg ., . 2012:632408 (2012). Активация рецептора LOX1 в эндотелиальных клетках способствует нарушению функции эндотелия, в том числе посредством повышения образования ROS и ухудшения передачи сигнала оксида азота (NO), индуцируемого, в частности, активацией аргиназы 2. (См., например, Ryoo ., 214(2):279-287 (2011), Ryoo ., . 102(8):923-932 (2008); и Ryoo ., 99(9):951-60 (2006). Кроме того, активация рецептора LOX1 приводит к инициации и сохранению воспалительного процесса в стенке сосуда за счет увеличенной продукции цитокинов и экспрессии молекул адгезии. Разработка биологического ингибитора рецептора LOX1, вероятно, будет эффективным способом ослабления развития атерогенного процесса. В данном документе авторы настоящего изобретения демонстрируют, что LX5140110 блокирует поглощение OxLDL эндотелиальными клетками аорты человека (HAEC) зависимым от дозы образом. Кроме того, LX5140110 предотвращает активацию аргиназы 2, процесс, который, как было продемонстрировано ранее, является LOX1-зависимым. Кроме того, LX5140110 предотвращает Ox-LDL-зависимое уменьшение продукции NO и увеличение продукции супероксида (ROS). Кроме того, с применением конструкции с репортерной системой NFkB-люцифераза, авторы настоящего изобретения демонстрируют, что LX5140110 существенно ослабляет активацию NFkB - основного регулятора воспаления при атерогенезе. См., например, Pamukcu ., . 128(2):117-23 (2011). Наконец, антитело LX5140110 предотвращает фосфорилирование и активацию киназы фокальной адгезии (FAK), процесс, крайне важный для барьерной функции эндотелиальных клеток. Таким образом, авторы настоящего изобретения демонстрируют, что LX5140110 блокирует ряд LOX1-зависимых процессов, которые приводят к активации эндотелия и инициации и стимуляции атерогенеза. Результаты данных экспериментов обсуждаются поочередно.
A. LX5140110 блокирует поглощение OxLDL в HAEC (фигура 9A)
Способы
Конъюгирование OxLDL с Alexa Fluor-568
[394]
500 микролитров окисленного LDL человека (1 мг/мл, Intracel, Фредерик, Мэриленд) метили Alexafluor-568 с применением набора для мечения белков Alexafluor-568 (Molecular probes, Юджин, Орегон) согласно протоколу производителя. Вкратце, OxLDL инкубировали с Alexafluor-568 в 0,1 M бикарбонате (pH 8,3) при комнатной температуре в течение одного часа. Конъюгированный с Alexafluor-568 OxLDL затем очищали с помощью очистки на колонке со смолой.
Поглощение конъюгированного с Alexa Fluor-568 OxLDL клетками HAEC
[395]
HAEC высевали на покрытые фибронектином (10 мкг/мл) покровные стекла на восемь часов в среде, содержащей сыворотку, перед сывороточным голоданием в течение 18 часов.
[396]
2
Затем клетки инкубировали с 0, 0,5, 1, 5 или 10 нМ LX5140110 (("514") или 10 нМ контрольного антитела NIP в течение одного часа в среде без сыворотки. Антитело полностью отмывали свежей средой без сыворотки перед добавлением в среду примерно 50 нг/мл AlexaFluor568-OxLDL для поглощения в течение одного часа. Затем клетки пермеабилизировали в течение 2 мин с помощью 0,5% Triton X-100 (Fisher Scientific) в 3% параформальдегиде (Sigma) с последующей фиксацией 3% параформальдегидом в течение 20 мин. Зафиксированные клетки метили конъюгатом флуоресцеин-фаллоидин (Life Technologies, Гранд Айленд, Нью-Йорк) и DAPI (Life Technologies) и отслеживали на эпифлюоресцентном микроскопе Nikon TE-200. Изображения фиксировали с помощью камеры Rolera EMCCD (QImaging, Ванкувер, Канада) с программным обеспечением Volocity (PerkinElmer, Лексингтон, Массачусетс). Изображения дополнительно анализировали с помощью программного обеспечения Volocity путем подсчета красных флуоресцентных частиц, конъюгированных с Alexafluor-568 OxLDL (за исключением частиц с размером менее 0,1 мкм) внутри клеток HAEC (изображения не показаны). Для каждого набора получали примерно 12 изображений и анализировали на предмет среднего числа красных флуоресцентных частиц, конъюгированных с Alexafluor-568 OxLDL в клетке. Данные доза-ответ показаны на фигуре 9A (число пузырьков на клетку со стандартным отклонением). Как показано на фигуре 9A, 5 нМ или 10 нМ LX5140110 обеспечивало существенное ингибирование поглощения OxLDL HAEC (p=0,0003 или p=0,0002 соответственно).
B.
LX5140110
подавляет передачу сигнала NFkB в HAEC (фигуре 9B)
[397]
Способы Конфлюэнтные 6-луночные планшеты с HAEC, которые совместно экспрессировали NFκB-люциферазу и GFP, подвергали сывороточному голоданию в течение 24 часов перед тем как подвергнуть следующим условиям (числа обозначают столбики на фигуре 9B, слева направо): 1. Контроль; 2. Только OxLDL (50 мкг/мл); 3. OxLDL+LX5140110 ("514") (10 нМ); 4. OxLDL+ NIP (контрольное антитело) (10 нМ).
[398]
3
4
et al.,
Антитела добавляли за 1 час до добавления OxLDL (50 мкг/мл). Инкубацию с OxLDL проводили в течение дополнительных 8 часов. Клетки лизировали и подвергали анализу на основе активности люциферазы (Promega) и люминесценцию определяли с помощью ридера для микропланшетов FlexStation 3 (Molecular Devices). Вкратце, HAEC лизировали с помощью 5× лизирующего буфера Promega и супернатанты переносили в белый планшет, содержащий в каждой лунке 50 мкл субстрата Promega. Через 48 часов после трансфекции клетки лизировали в ледяном модифицированном лизирующем буфере, состоящем из 20 мМ Tris-HCl с pH 7,5, 150 мМ NaCl, 1 мМ EDTA, 1 мМ EGTA, 1% NP40, 1% дезоксихолата натрия, 1 мМ NaVO, 2,5 мМ пирофосфата натрия, 1 мМ β-глицерофосфата, 1 мкг/мл леупептина и разбавленной 1:1000 смеси ингибиторов протеаз (Sigma). Буфер для внесения добавляли в конечной концентрации 2x, варили в течение 5 мин., осаждали в течение 3 минут и загружали на гель. Флуоресценцию GFP применяли в качестве контроля для нормализации. N=5 для каждой группы; * обозначает P<0,05 (по сравнению с необработанным контролем); # обозначает P<0,05 (по сравнению с OxLDL+0 нМ ab 514 (LX5140110). Как показано на фигуре 9B, добавление 10 мМ LX5140110, но не NIP (контрольное антитело), существенно подавляло OxLDL-зависимую передачу сигнала NFkB в HAEC. Это указывает на то, что LX5140110 способно ингибировать LOX1-зависимую активацию NFkB, сигнальный путь, который, как хорошо известно, является нисходящим относительно рецептора LOX-1. См., например, Zhao W, "Lipopolysaccharide induced LOX-1 expression via TLR4/MyD88/ROS activated p38MAPK-NF-κB pathway." Vascul Pharmacol. (2014).
C.
LX5140110
ингибирует активацию аргиназы в HAEC (фигура 9C)
[399]
et al.,
Способы Конфлюэнтные 6-луночные планшеты с HAEC подвергали сывороточному голоданию в течение 24 часов перед тем как подвергнуть следующим условиям (числа обозначают столбики на фигуре 9С, слева направо): 1. Контроль; 2. OxLDL (50 мкг/мл); 3. OxLDL+LX5140110 ("514") (1 нМ); 4. OxLDL+LX5140110 ("514") (3 нМ); 5. OxLDL+LX5140110 ("514") (10 нМ); 6. OxLDL+NIP (10 нМ). Антитела добавляли за 1 час до инкубации HAEC с OxLDL (50 мкг/мл) в течение еще 3 часов. Клетки лизировали и определяли активность аргиназы с применением анализа на основе образования мочевины с применением α-изонитрозопропиофенона. Вкратце, после инкубации с лизирующим буфером (50 мМ Tris-HCl, pH 7,5, 0,1 мМ EDTA и ингибиторы протеаз) в течение 30 мин. при 4°C и центрифугирования в течение 20 минут при 14000×g при 4°C получали супернатанты экстрагированных клеточных лизатов. Затем супернатанты инкубировали с 150 мМ L-аргинина в течение часа при 37°C. Через 1 час реакцию останавливали с помощью 400 мкл раствора из смеси кислот (H2SO:H3PO4:H2O 1:3:7), а затем добавляли 25 мкл 9% α-изонитрозопропиофенона (в 100% EtOH) и нагревали в течение 30 мин при 95°C и считывали через 10 мин при 540 нМ. N=3 для каждой группы; * обозначает P<0,05 по сравнению с необработанными контролями; # обозначает P<0,05 по сравнению с 0 нМ ab 514 (LX5140110). Как показано на фигуре 9C, добавление 3 нМ или 10 нМ LX5140110, но не 10 нМ NIP (контрольное антитело), обеспечивало существенное снижение OxLDL-зависимой активности аргиназы в HAEC зависимым от дозы образом. Это дополнительно указывает на то, что LX514110 ингибирует LOX1-зависимую активацию аргиназы 2, нисходящий сигнальный путь, который, как было недавно показано, связан с LOX-1 в эндотелии сосудов. См., например, Ryoo Atherosclerosis 214:279-87 (2011).
D.
LX5140110
блокирует OxLDL-зависимое уменьшение образования оксида азота (фигура 9D)
[400]
4
Способы Образование NO определяли с применением флуоресценции DAF. Вкратце, для измерения NO клетки HAEC высевали в белые 96-луночные планшеты (ThermoLabsystems) при плотности примерно 5×10 клеток на лунку и подвергали сывороточному голоданию (1% сыворотка) в течение ночи. Клетки изучали в рамках 7 экспериментальных групп (числа обозначают столбики на фигуре 9D, слева направо): 1. Контроль; 2. OxLDL (50 мкг/мл); 3. OxLDL+LX5140110 ("514") (0,5 нМ); 4. OxLDL+LX5140110 ("514") (1 нМ); 5. OxLDL+LX5140110 ("514") (5 нМ); 6. OxLDL+LX5140110 ("514") (10 нМ); 7. OxLDL+NIP (10 нМ). Антитела добавляли за 1 час до инкубации HAEC с OxLDL (50 мкг/мл) в течение 24 часов. Затем среду удаляли и клетки помещали при 37°C в среду EBM2, содержащую DAF-FM DA (5 мкМ) на 30 мин. при 37°C. Среду затем заменяли свежей средой и клетки инкубировали в течение еще 20 мин. перед измерением общей флуоресценции с применением ридера для микропланшетов FlexStation 3 (Molecular Devices) с возбуждением при 495 нм и испусканием при 515 нм. Для подтверждения того, что супероксид продуцировался eNOS, в качестве контроля применяли ингибитор NOS L-NAME (данные не показаны). N=5 для каждой группы; * обозначает P<0,05 (по сравнению с необработанным контролем). Как показано на фигуре 9D, добавление 5 нМ или 10 нМ LX5140110, но не 10 нМ NIP (контрольное антитело), обеспечивало существенное ингибирование OxLDL-зависимого уменьшения продукции оксида азота HAEC зависимым от дозы образом.
E.
LX5140110
блокирует OxLDL-зависимое увеличение продукции ROS (фигуры 9E и 9F)
[401]
4
et al.,
Способы Продукцию супероксида определяли с применением аналога люминола L-012. Для измерения супероксида (ROS) клетки HAEC высевали в обработанные TC белые 96-луночные планшеты (ThermoLabsystems) при плотности примерно 5×10 клеток на лунку и подвергали сывороточному голоданию (1% сыворотка) в течение ночи. 7 исследуемых популяций были следующими (числа обозначают столбики на фигуре 9E, слева направо): 1. Контроль; 2. OxLDL (50 мкг/мл); 3. OxLDL+LX5140110 ("514") (0,5 нМ); 4. OxLDL+LX5140110 ("514") (1 нМ); 5. OxLDL+LX5140110 ("514") (5 нМ); 6. OxLDL+LX5140110 ("514") (10 нМ); 7. OxLDL+NIP (10 нМ). Антитела добавляли за 1 час до инкубации HAEC с OxLDL (50 мкг/мл) в течение 24 часов. Затем среду удаляли и клетки дополнительно инкубировали при 37°C в DMEM без фенола (Sigma), содержащей 400 мкМ аналога люминола L-012 (Wako), в течение минимум 20 минут перед добавлением агонистов. Люминесценцию количественно определяли в динамике с применением ридера для микропланшетов FlexStation 3 (Molecular Devices). Специфичность L-012 в отношении активных форм кислорода подтверждали с помощью совместной инкубации с утилизатором супероксида SOD (5 мМ), и это давало практически невыявляемые уровни люминесценции в условиях с контролем или стимуляцией OxLDL (см. фигуру 9F). Количественно выраженные, исходя из люминесценции L-012, относительные световые единицы (RLU), указывают таким образом на изменения образования ROS. Для подтверждения того, что супероксид продуцировался eNOS, в качестве контроля применяли ингибитор NOS L-NAME. N=5 для каждой группы. Как показано на фигурах 9E и 9F, добавление 0,5 нМ, 1 нМ, 5 нМ или 10 нМ LX5140110, но не 10 нМ NIP (контрольное антитело), обеспечивало ингибирование OxLDL-зависимого образования ROS в HAEC. Таким образом, LX5140110 предотвращает OxLDL-опосредованное разъединение eNOS и последующее увеличение продукции ROS посредством предотвращения активации LOX-1 и последующей активации аргиназы 2. См., например, Ryoo Atherosclerosis 214:279-87 (2011).
F. LX5140110
блокирует OxDL-опосредованное фосфорилирование киназы фокальной адгезии (FAK), Y397 (фигуры 9G и 9H).
[402]
Способы HAEC культивировали в среде ECM (ScienCell, Карлсбад, Калифорния) с 5% сывороткой в течение одного дня перед сывороточным голоданием в течением 18 часов. Затем к клеткам добавляли LX5140110 или контрольное антитело NIP в концентрации, указанной на фигуре 9G, и инкубировали в течение одного часа. Клетки промывали свежей средой с целью удаления антител перед инкубацией их с 50 мкг/мл OxLDL в течение одного часа. Клетки промывали ледяным буфером PBS, а затем белок экстрагировали с применением модифицированного буфера RIPA (0,1% DOC, 0,1% Trition X-100, 2 мМ EDTA, 1 мМ PMSF, 2 мМ ванадата натрия, 20 мг/мл леупептина и 20 мг/мл апротинина в PBS). Клеточные лизаты осветляли с помощью центрифугирования при 15000×g при 4°C в течение 10 минут. Концентрацию белка затем количественно определяли с помощью анализа с использованием бицинхониновой кислоты (Pierce, Рокфорд, Иллинойс). 10 мкг лизатов с белком смешивали с 2X буфером Лэммли для внесения образцов, варили, а затем подвергали SDS-PAGE с применением 4-15% градиентных полиакриламидных гелей с последующим переносом на нитроцеллюлозные мембраны для вестерн-блоттинга.
[403]
Первичные антитела, применяемые в экспериментах, описанных на фигурах 9G и 9H, включают антитела к pY397-FAK (поликлональные антитела кролика, Life Technologies, Гранд Айленд, Нью-Йорк) и антитела к GAPDH (моноклональные антитела мыши, Novus Biologicals, Литлтон, Колорадо). Конъюгированные с пероксидазой хрена вторичные антитела к антителам мыши и кролика были получены от ICN Biochemicals, Inc. (Коста-Меса, Калифорния).
[404]
фигуре 9G
фигуре 9H
Для анализа различий в фосфорилировании FAK по Tyr397 в контрольных, обработанных OxLDL клетках и клетках, предварительно инкубированных с антителом, применяли t-критерий Стьюдента. P-значения представлены на фигуре 9H и наличие значимости (*) устанавливали при р-значениях менее 0,05 для всех данных. Фигуры включают планки погрешностей, обозначающие стандартную ошибку. Характерные результаты блоттинга, демонстрирующие изменения фосфорилирования FAK по Tyr397 и экспрессии GAPDH в HAEC, показаны на , а результаты количественного определения процентного повышения уровня фосфорилирования FAK по Tyr397 (pY397-FAK), нормализованного относительно экспрессии GAPDH, показаны на . Данные результаты демонстрируют, что добавление 5 нМ или 10 нМ LX5140110, но не 10 нМ NIP (контрольное антитело), обеспечивает существенное ингибирование OxLDL-зависимого и опосредованного им фосфорилирования FAK по Tyr397 в HAEC. * обозначает P<0,05 (по сравнению с необработанным контролем); # обозначает P<0,05 по сравнению с 0 нМ LX5140110 (514). Эти данные указывают на то, что LX5140110 ингибирует OxLDL-опосредованную индукцию LOX-1-зависимого фосфорилирования FAK, процесса, который обеспечивает регуляцию цитоскелетных функций эндотелия, в том числе межклеточной адгезии и адгезии клетка-матрикс с последующими эффектами в отношении барьерной функции эндотелия.
G. LOX1 является основным рецептором, отвечающим за передачу сигнала OxLDL в HAEC (фигуры 9I, 9J и 9K).
Способы Конструирование аденовирусов с shRNA для LOX1
[405]
Вирусы, кодирующие нецеленаправленно действующие Ad-sh и Ad shLOX1 получали с применением набора pAdBLOCK-iT (Life Sciences). Вкратце, олигонуклеотиды, действующие нецеленаправленно, и другой целевой 5'UTR-участок LOX1 человека конструировали с помощью соответствующего программного обеспечения от Life Sciences и клонировали в pU6-ENTR. Применяли следующие последовательности. Действующие нецеленаправленно: Вверху, 5'-CAC CGA TGG ATT GCA CGC AGG TTC TCG AAA GAA CCT GCG TGC AAT CCA TC-3' (SEQ ID NO:79); снизу, 5'-AAA AGA TGG ATT GCA CGC AGG TTC TTT CGA GAA CCT GCG TGC AAT CCA TC-3' (SEQ ID NO:80). LOX1sh: Вверху, 5'-CAC CGC TTC ACT CTC TCA TTC TTA GCG AAC TAA GAA TGA GAG AGT GAA GC-3' (SEQ ID NO:81); снизу, 5'-AAA AGC TTC ACT CTC TCA TTC TTA GTT CGC TAA GAA TGA GAG AGT GAA GC -3' (SEQ ID NO:82).
[406]
Полученные плазмиды pU6 с нецеленаправленно действующими sh и pU6-LOX1shRNA исследовали в отношении функции в экспериментах с транзиентной трансфекцией клеток HAEC. Конструкции, демонстрирующие наибольшую степень ингибирования, рекомбинировали с pAD/BLOCK-iTDEST (Invitrogen) с получением действующих нецеленаправленно pAd и Ad-shLOX1. Вирусы амплифицировали, очищали и концентрировали с применением набора от Millipore.
[407]
Для подтверждения того, что LOX1 является необходимым для передачи сигнала OxLDL в HAEC, экспрессию РНК LOX1 ингибировали с применением вирусного вектора, экспрессирующего интерферирующие РНК, образующие шпильки (shRNA), направленные на 5'UTR-область гена LOX1 человека (LOX1shRNA). Вкратце, HAEC с 60-процентной конфлюэнтностью трансдуцировали при 25 MOI (множественность заражения, мера вирулентности) аденовирусом, экспрессирующим LOX1shRNA ("LOX1-shRNA" или "Ad-LOX-1shRNA"). Через 24 часа среду заменяли средой с низкой концентрацией сыворотки (1%), содержащей вирусы, кодирующие NFKB-LUC. Через день после трансдукции вирусом клетки обрабатывали 50 мкг/мл OxLDL и инкубировали в течение дополнительных 8 часов с последующим измерением активности люциферазы с помощью хемилюминесценции. Клеточные лизаты затем подвергали иммуноблоттингу с антителами к Lox-1 или GAPDH. Как показано на фигурах 9J и 9K, добавление LOX1shRNA обеспечивает существенное снижение уровня экспрессии белка LOX1 (см., например, дорожку 3 на фигуре 9J по сравнению с дорожками 1 и 2), что подтверждает, что LOX1shRNA эффективно ингибирует экспрессию LOX1 в HAEC. Кроме того, как показано на фигуре 9I, AdshLOX1 существенно ингибирует OxLDL-опосредованную передачу сигнала NFkB в HAEC по сравнению с клетками, которые инкубировали с OxLDL и контролем, не осуществляющей целенаправленное воздействие конструкцией shRNA (Ad-NTsh). * обозначает P<0,05 (по сравнению с необработанным контролем); # обозначает P<0,05 по сравнению с OxLDL+Ad-NTsh.
[408]
Краткая схема сигнальных путей, вовлеченных в передачу сигнала рецептора LOX1 и блокируемых антителами к LOX1, раскрытыми в данном документе (в том числе, например, LX5140110; "514 Ab"), показана на фигуре 10.
****
[409]
Предшествующее описание конкретных аспектов настолько полно раскрывает общий характер настоящего раскрытия, что другие могут, используя знания в данной области, легко модифицировать и/или адаптировать для различных применений такие конкретные аспекты без излишнего экспериментирования, не отступая от общей концепции настоящего раскрытия. Следовательно, такие адаптации и модификации предназначены находиться в пределах значения и диапазона эквивалентов раскрытых аспектов, основанных на идее и принципе, представленных в данном документе. Следует понимать, что формулировки или терминология в настоящем документе предназначены для целей описания, а не ограничения, поэтому терминологию или формулировки в настоящем описании квалифицированному специалисту следует интерпретировать в свете идей и принципов.
[410]
Все публикации, патенты, патентные заявки или другие документы, цитируемые в данном документе, включены посредством ссылки во всей их полноте для всех целей в той же мере, как если бы каждая отдельная публикация, патент, патентная заявка или другой документ были включены посредством ссылки для всех целей.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  MEDIMMUNE LTD и THE JOHNS HOPKINS UNIVERSITY
<120>  LOX1-СВЯЗЫВАЮЩИЕ БЕЛКИ И СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ НА ИХ ОСНОВЕ
<130>  LOX1-100WO1
<140>  62/058,254
<141>  1 октябрь 2014
<160>  82
<170>  PatentIn версия 3.5
<210>  1
<211>  5
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Последовательность CDR-1 тяжелой цепи Lox514
<400>  1
Glu Leu Ser Met His
1.
5
<210>  2
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Последовательность CDR-2 тяжелой цепи LX5140110
<400>  2
Gly Phe Asp Pro Glu Asp Phe Lys Tyr His Thr His Gln Lys Phe Gln
1.
5                   10                  15
Gly
<210>  3
<211>  20
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Последовательность CDR-3 тяжелой цепи LX5140110
<400>  3
Val Trp Gly Thr Gln Gly Lys Gly Val Arg Gly Trp Asp Tyr Tyr Tyr
1.
5                   10                  15
Gly Met Asp Val
20
<210>  4
<211>  129
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Последовательность тяжелой цепи LX5140110
<400>  4
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1.
5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Leu
20                  25                  30
Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Phe Lys Tyr His Thr His Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Leu Val Trp Gly Thr Gln Gly Lys Gly Val Arg Gly Trp Asp Tyr
100                 105                 110
Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
115                 120                 125
Ser
<210>  5
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Последовательность CDR-2 тяжелой цепи Lox514
<400>  5
Gly Phe Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1.
5                   10                  15
Gly
<210>  6
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Последовательность CDR-2 тяжелой цепи LX5140011
<400>  6
Gly Phe Asp Pro Glu Asp Trp Glu Tyr Ala Tyr Asp Gln Lys Phe Gln
1.
5                   10                  15
Gly
<210>  7
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Последовательность CDR-2 тяжелой цепи LX5140014
<400>  7
Gly Phe Asp Pro Glu Asp Tyr Thr Ile Arg Val Gly Gln Lys Phe Gln
1.
5                   10                  15
Gly
<210>  8
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Последовательность CDR-2 тяжелой цепи LX5140016
<400>  8
Gly Phe Asp Pro Glu Asp Trp Gln Thr His Thr Ala Gln Lys Phe Gln
1.
5                   10                  15
Gly
<210>  9
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Последовательность CDR-2 тяжелой цепи LX5140038
<400>  9
Gly Phe Asp Pro Glu Asp Trp Thr Ile His Val Asp Gln Lys Phe Gln
1.
5                   10                  15
Gly
<210>  10
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Последовательность CDR-2 тяжелой цепи LX5140094
<400>  10
Gly Phe Asp Pro Glu Asp Trp Gln Tyr His Val Ser Gln Lys Phe Gln
1.
5                   10                  15
Gly
<210>  11
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Последовательность CDR-2 тяжелой цепи LX5140108
<400>  11
Gly Phe Asp Pro Glu Asp Trp Ser Asn His Val Ser Gln Lys Phe Gln
1.
5                   10                  15
Gly
<210>  12
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Последовательность CDR-2 тяжелой цепи LX5140092
<400>  12
Gly Phe Asp Pro Glu Asp Trp Lys Tyr His Leu Ser Gln Lys Phe Gln
1.
5                   10                  15
Gly
<210>  13
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Последовательность CDR-2 тяжелой цепи LX5140093
<400>  13
Gly Phe Asp Pro Glu Asp Trp Ala Tyr His Gln Ala Gln Lys Phe Gln
1.
5                   10                  15
Gly
<210>  14
<211>  20
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Последовательность CDR-3 тяжелой цепи LX5140011
<400>  14
Pro Asn Gly Gln Gln Gly Lys Gly Val Arg Gly Trp Asp Tyr Tyr Tyr
1.
5                   10                  15
Gly Met Asp Val
20
<210>  15
<211>  20
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Последовательность CDR-3 тяжелой цепи LX5140108
<400>  15
Ser Thr Gly Arg Gln Gly Lys Gly Val Arg Gly Trp Asp Tyr Tyr Tyr
1.
5                   10                  15
Gly Met Asp Val
20
<210>  16
<211>  20
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Последовательность CDR-3 тяжелой цепи LX5140092_D
<400>  16
Pro Asp Gly Thr His Gln Gly Gly Val Arg Gly Trp Asp Tyr Tyr Tyr
1.
5                   10                  15
Gly Met Asp Val
20
<210>  17
<211>  20
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Последовательность CDR-3 тяжелой цепи LX5140092_N
<400>  17
Pro Asn Gly Thr His Gln Gly Gly Val Arg Gly Trp Asp Tyr Tyr Tyr
1.
5                   10                  15
Gly Met Asp Val
20
<210>  18
<211>  20
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Последовательность CDR-3 тяжелой цепи LX5140093_D
<400>  18
Pro Asp Gly Gln Gln Gly Lys Gly Val Arg Gly Trp Asp Tyr Tyr Tyr
1.
5                   10                  15
Gly Met Asp Val
20
<210>  19
<211>  129
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Последовательность тяжелой цепи LX5140011
<400>  19
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1.
5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Leu
20                  25                  30
Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Trp Glu Tyr Ala Tyr Asp Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Thr Pro Asn Gly Gln Gln Gly Lys Gly Val Arg Gly Trp Asp Tyr
100                 105                 110
Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
115                 120                 125
Ser
<210>  20
<211>  129
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Последовательность тяжелой цепи LX5140014
<400>  20
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1.
5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Leu
20                  25                  30
Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Tyr Thr Ile Arg Val Gly Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Thr Pro Asn Gly Gln Gln Gly Lys Gly Val Arg Gly Trp Asp Tyr
100                 105                 110
Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
115                 120                 125
Ser
<210>  21
<211>  129
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Последовательность тяжелой цепи LX5140016
<400>  21
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1.
5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Leu
20                  25                  30
Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Trp Gln Thr His Thr Ala Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Thr Pro Asn Gly Gln Gln Gly Lys Gly Val Arg Gly Trp Asp Tyr
100                 105                 110
Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
115                 120                 125
Ser
<210>  22
<211>  129
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Последовательность тяжелой цепи LX5140038
<400>  22
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1.
5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Leu
20                  25                  30
Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Trp Thr Ile His Val Asp Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Thr Pro Asn Gly Gln Gln Gly Lys Gly Val Arg Gly Trp Asp Tyr
100                 105                 110
Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
115                 120                 125
Ser
<210>  23
<211>  129
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Последовательность тяжелой цепи LX5140094
<400>  23
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1.
5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Leu
20                  25                  30
Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Trp Gln Tyr His Val Ser Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Thr Pro Asn Gly Gln Gln Gly Lys Gly Val Arg Gly Trp Asp Tyr
100                 105                 110
Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
115                 120                 125
Ser
<210>  24
<211>  129
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Последовательность тяжелой цепи LX5140108
<400>  24
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1.
5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Leu
20                  25                  30
Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Trp Ser Asn His Val Ser Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Leu Thr Ser Thr Gly Arg Gln Gly Lys Gly Val Arg Gly Trp Asp Tyr
100                 105                 110
Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
115                 120                 125
Ser
<210>  25
<211>  129
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Последовательность тяжелой цепи LX5140092_D
<400>  25
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1.
5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Leu
20                  25                  30
Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Trp Lys Tyr His Leu Ser Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Thr Pro Asp Gly Thr His Gln Gly Gly Val Arg Gly Trp Asp Tyr
100                 105                 110
Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
115                 120                 125
Ser
<210>  26
<211>  129
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Последовательность тяжелой цепи LX5140092_N
<400>  26
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1.
5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Leu
20                  25                  30
Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Trp Lys Tyr His Leu Ser Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Thr Pro Asn Gly Thr His Gln Gly Gly Val Arg Gly Trp Asp Tyr
100                 105                 110
Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
115                 120                 125
Ser
<210>  27
<211>  129
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Последовательность тяжелой цепи LX5140093_D
<400>  27
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1.
5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Leu
20                  25                  30
Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Trp Ala Tyr His Gln Ala Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Thr Pro Asp Gly Gln Gln Gly Lys Gly Val Arg Gly Trp Asp Tyr
100                 105                 110
Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
115                 120                 125
Ser
<210>  28
<211>  129
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Последовательность тяжелой цепи LX5140093_N
<400>  28
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1.
5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Leu
20                  25                  30
Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Trp Ala Tyr His Gln Ala Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Thr Pro Asn Gly Gln Gln Gly Lys Gly Val Arg Gly Trp Asp Tyr
100                 105                 110
Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
115                 120                 125
Ser
<210>  29
<211>  129
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Последовательность тяжелой цепи Lox514
<400>  29
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1.
5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Leu
20                  25                  30
Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Thr Pro Asn Gly Gln Gln Gly Lys Gly Val Arg Gly Trp Asp Tyr
100                 105                 110
Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Arg Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
115                 120                 125
Ser
<210>  30
<211>  14
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Последовательность CDR-1 легкой цепи Lox514
<400>  30
Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His
1.
5                   10
<210>  31
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Последовательность CDR-2 легкой цепи Lox514
<400>  31
Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser
1.
5
<210>  32
<211>  11
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Последовательность CDR-3 легкой цепи Lox514
<400>  32
Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Trp Val
1.
5                   10
<210>  33
<211>  111
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Последовательность легкой цепи LX5140110
<400>  33
Gln Ser Val Val Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1.
5                   10                  15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20                  25                  30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35                  40                  45
Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50                  55                  60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65                  70                  75                  80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser
85                  90                  95
Leu Ser Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100                 105                 110
<210>  34
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Последовательность CDR-3 легкой цепи LX5140094
<400>  34
Gln Ser Tyr Asp Ser Met Tyr Arg Phe Gly
1.
5                   10
<210>  35
<211>  11
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Последовательность CDR-3 легкой цепи LX5140093
<400>  35
Gln Ser Tyr Asp Ser Ser His Arg Ala Trp Ala
1.
5                   10
<210>  36
<211>  110
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Последовательность легкой цепи LX5140094
<400>  36
Gln Ser Val Val Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1.
5                   10                  15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20                  25                  30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35                  40                  45
Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50                  55                  60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65                  70                  75                  80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Met
85                  90                  95
Tyr Arg Phe Gly Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100                 105                 110
<210>  37
<211>  111
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Последовательность легкой цепи LX5140093
<400>  37
Gln Ser Val Val Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1.
5                   10                  15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20                  25                  30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35                  40                  45
Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50                  55                  60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65                  70                  75                  80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser
85                  90                  95
His Arg Ala Trp Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100                 105                 110
<210>  38
<211>  5
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Последовательность CDR-1 тяжелой цепи Lox696
<400>  38
Asp Tyr Ala Met His
1.
5
<210>  39
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Последовательность CDR-2 тяжелой цепи Lox696
<400>  39
Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1.
5                   10                  15
Gly
<210>  40
<211>  11
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Последовательность CDR-3 тяжелой цепи LX6960073_G82bS_gl
<400>  40
Glu Gly Ser Trp Asn Tyr Asp Ala Leu Asp Ile
1.
5                   10
<210>  41
<211>  120
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Последовательность тяжелой цепи LX6960073_G82bS_gl
<400>  41
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1.
5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ser Asp Asp Tyr
20                  25                  30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Glu Gly Ser Trp Asn Tyr Asp Ala Leu Asp Ile Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  42
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Последовательность CDR-2 тяжелой цепи LX6960067_ngl1
<400>  42
Gly Val Ser Leu Gln Glu Leu Tyr Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1.
5                   10                  15
Gly
<210>  43
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Последовательность CDR-2 тяжелой цепи LX6960086_ngl1
<400>  43
Gly Ile Ser Trp Asn Ser Pro Asp Arg Tyr Met Asp Asp Ser Val Lys
1.
5                   10                  15
Gly
<210>  44
<211>  11
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Последовательность CDR-3 тяжелой цепи Lox696
<400>  44
Glu Gly Asn Trp Asn Tyr Asp Ala Phe Asp Ile
1.
5                   10
<210>  45
<211>  11
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Последовательность CDR-3 тяжелой цепи LX6960067_ngl1
<400>  45
Glu Gly Ser Trp Asn Tyr Asp Ala Phe Asp Ile
1.
5                   10
<210>  46
<211>  11
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Последовательность CDR-3 тяжелой цепи LX6960073_ngl1
<400>  46
Glu Gly Ser Trp Asn Tyr Asp Ala Leu Asp Ile
1.
5                   10
<210>  47
<211>  11
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Последовательность CDR-3 тяжелой цепи LX6960101_ngl1
<400>  47
Glu Gly Asn Trp Asn Tyr Asp Ala Phe Asp Val
1.
5                   10
<210>  48
<211>  120
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Последовательность тяжелой цепи LX6960067_ngl1
<400>  48
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1.
5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20                  25                  30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Gly Val Ser Leu Gln Glu Leu Tyr Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Gly Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Glu Gly Ser Trp Asn Tyr Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Arg
100                 105                 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  49
<211>  120
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Последовательность тяжелой цепи LX6960071_ngl1
<400>  49
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1.
5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20                  25                  30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Glu Gly Asn Trp Asn Tyr Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Arg
100                 105                 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  50
<211>  120
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Последовательность тяжелой цепи LX6960073_ngl1
<400>  50
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1.
5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ser Asp Asp Tyr
20                  25                  30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Gly Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Glu Gly Ser Trp Asn Tyr Asp Ala Leu Asp Ile Trp Gly Arg
100                 105                 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  51
<211>  120
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Последовательность тяжелой цепи LX6960086_ngl1
<400>  51
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1.
5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20                  25                  30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Pro Asp Arg Tyr Met Asp Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Gln Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Glu Gly Asn Trp Asn Tyr Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Arg
100                 105                 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  52
<211>  120
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Последовательность тяжелой цепи LX6960101_ngl1
<400>  52
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1.
5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20                  25                  30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Gly Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Glu Gly Asn Trp Asn Tyr Asp Ala Phe Asp Val Trp Gly Arg
100                 105                 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  53
<211>  120
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Последовательность тяжелой цепи LX6960073_gl
<400>  53
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1.
5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ser Asp Asp Tyr
20                  25                  30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Gly Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Glu Gly Ser Trp Asn Tyr Asp Ala Leu Asp Ile Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  54
<211>  120
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Последовательность тяжелой цепи Lox696
<400>  54
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1.
5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20                  25                  30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Glu Gly Asn Trp Asn Tyr Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Arg
100                 105                 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  55
<211>  14
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Последовательность CDR-1 легкой цепи LX6960073_G82bS_gl
<400>  55
Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser
1.
5                   10
<210>  56
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Последовательность CDR-2 легкой цепи LX6960073_G82bS_gl
<400>  56
Asp Val Ser Lys Arg Pro Ser
1.
5
<210>  57
<211>  11
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Последовательность CDR-3 легкой цепи LX6960073_G82bS_gl
<400>  57
Met Gly Gly Met Gly Arg Ser Thr Asn Trp Val
1.
5                   10
<210>  58
<211>  111
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Последовательность легкой цепи LX6960073_G82bS_gl
<400>  58
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1.
5                   10                  15
Pro Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20                  25                  30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35                  40                  45
Met Ile Tyr Asp Val Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50                  55                  60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65                  70                  75                  80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Met Gly Gly Met Gly Arg
85                  90                  95
Ser Thr Asn Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100                 105                 110
<210>  59
<211>  14
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Последовательность CDR-1 легкой цепи LX6960116_ngl1
<400>  59
Thr Gly Thr Ser Asn Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser
1.
5                   10
<210>  60
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Последовательность CDR-2 легкой цепи Lox696
<400>  60
Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser
1.
5
<210>  61
<211>  11
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Последовательность CDR-3 легкой цепи Lox696
<400>  61
Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Ser Thr Asn Trp Val
1.
5                   10
<210>  62
<211>  11
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Последовательность CDR-3 легкой цепи LX6960067_ngl1
<400>  62
Leu Gly Arg Thr Trp Ser Ser Thr Asn Trp Val
1.
5                   10
<210>  63
<211>  11
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Последовательность CDR-3 легкой цепи LX6960071_ngl1
<400>  63
Met Gly Ser Met Gly Arg Ser Thr Asn Trp Val
1.
5                   10
<210>  64
<211>  11
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Последовательность CDR-3 легкой цепи LX6960094_ngl1
<400>  64
Ala Gln Arg Thr Val Ser Ser Thr Asn Trp Val
1.
5                   10
<210>  65
<211>  111
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Последовательность легкой цепи LX6960067_ngl1
<400>  65
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1.
5                   10                  15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20                  25                  30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35                  40                  45
Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50                  55                  60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65                  70                  75                  80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gly Arg Thr Trp Ser
85                  90                  95
Ser Thr Asn Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100                 105                 110
<210>  66
<211>  111
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Последовательность легкой цепи LX6960071_ngl1
<400>  66
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1.
5                   10                  15
Pro Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20                  25                  30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35                  40                  45
Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50                  55                  60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65                  70                  75                  80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Met Gly Ser Met Gly Arg
85                  90                  95
Ser Thr Asn Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100                 105                 110
<210>  67
<211>  111
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Последовательность легкой цепи LX6960073_ngl1
<400>  67
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1.
5                   10                  15
Pro Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20                  25                  30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35                  40                  45
Met Ile Tyr Asp Val Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50                  55                  60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65                  70                  75                  80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Met Gly Gly Met Gly Arg
85                  90                  95
Ser Thr Asn Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100                 105                 110
<210>  68
<211>  111
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Последовательность легкой цепи LX6960094_ngl1
<400>  68
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1.
5                   10                  15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20                  25                  30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35                  40                  45
Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50                  55                  60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65                  70                  75                  80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Gln Arg Thr Val Ser
85                  90                  95
Ser Thr Asn Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100                 105                 110
<210>  69
<211>  111
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Последовательность легкой цепи LX6960116_ngl1
<400>  69
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1.
5                   10                  15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Asn Asp Val Gly Gly Tyr
20                  25                  30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35                  40                  45
Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50                  55                  60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65                  70                  75                  80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Met Gly Ser Met Gly Arg
85                  90                  95
Ser Thr Asn Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100                 105                 110
<210>  70
<211>  111
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Последовательность легкой цепи Lox696
<400>  70
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1.
5                   10                  15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20                  25                  30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35                  40                  45
Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50                  55                  60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65                  70                  75                  80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser
85                  90                  95
Ser Thr Asn Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100                 105                 110
<210>  71
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Lox514 VH CDR2
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (7)..(7)
<223>  Xaa представляет собой Gly, Trp, Tyr или Phe
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (8)..(8)
<223>  Xaa представляет собой Glu, Thr, Gln, Ser, Lys или Ala
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (9)..(9)
<223>  Xaa представляет собой Thr, Tyr, Ile или Asn
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (10)..(10)
<223>  Xaa представляет собой Ile, Ala, Arg или His
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (11)..(11)
<223>  Xaa представляет собой Tyr, Val, Thr, Leu или Gln
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (12)..(12)
<223>  Xaa представляет собой Ala, Asp, Gly, Ser или His
<400>  71
Gly Phe Asp Pro Glu Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gln Lys Phe Gln
1.
5                   10                  15
Gly
<210>  72
<211>  21
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Lox514 VH CDR3
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (1)..(1)
<223>  Xaa представляет собой Pro, Ser или Val
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (2)..(2)
<223>  Xaa представляет собой Asn, Thr, Trp или Asp
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (4)..(4)
<223>  Xaa представляет собой Gln, Arg или Thr
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (5)..(5)
<223>  Xaa представляет собой Gln или His
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (6)..(6)
<223>  Xaa представляет собой Gly или Gln
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (7)..(7)
<223>  Xaa представляет собой Lys или Gly
<400>  72
Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Val Arg Gly Trp Asp Tyr Tyr Tyr
1.
5                   10                  15
Gly Met Asp Val
20
<210>  73
<211>  11
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Lox514 VL CDR3
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (6)..(6)
<223>  Xaa представляет собой Ser или Met
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (7)..(7)
<223>  Xaa представляет собой Leu, Tyr или His
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (8)..(8)
<223>  Xaa представляет собой Ser или Arg
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (9)..(9)
<223>  Xaa представляет собой Gly, Ala или аминокислота отсутствует
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (10)..(10)
<223>  Xaa представляет собой Trp или Phe
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (11)..(11)
<223>  Xaa представляет собой Val, Gly или Ala
<400>  73
Gln Ser Tyr Asp Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1.
5                   10
<210>  74
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Lox696 VH CDR2
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (2)..(2)
<223>  Xaa представляет собой Ile или Val
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (4)..(4)
<223>  Xaa представляет собой Trp или Leu
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (5)..(5)
<223>  Xaa представляет собой Asn или Gln
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (6)..(6)
<223>  Xaa представляет собой Ser или Glu
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (7)..(7)
<223>  Xaa представляет собой Gly, Leu или Pro
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (8)..(8)
<223>  Xaa представляет собой Ser, Try или Asp
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (9)..(9)
<223>  Xaa представляет собой Ile, Thr или Arg
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (10)..(10)
<223>  Xaa представляет собой Gly или Tyr
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (11)..(11)
<223>  Xaa представляет собой Tyr или Met
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (12)..(12)
<223>  Xaa представляет собой Ala или Asp
<400>  74
Gly Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Ser Val Lys
1.
5                   10                  15
Gly
<210>  75
<211>  11
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Lox696 VH CDR3
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (3)..(3)
<223>  Xaa представляет собой Asn или Ser
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (9)..(9)
<223>  Xaa представляет собой Phe или Leu
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (11)..(11)
<223>  Xaa представляет собой Ile или Val
<400>  75
Glu Gly Xaa Trp Asn Tyr Asp Ala Xaa Asp Xaa
1.
5                   10
<210>  76
<211>  14
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Lox696 VL CDR1
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (5)..(5)
<223>  Xaa представляет собой Ser или Asn
<400>  76
Thr Gly Thr Ser Xaa Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser
1.
5                   10
<210>  77
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Lox696 VL CDR2
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (4)..(4)
<223>  Xaa представляет собой Asn или Lys
<400>  77
Asp Val Ser Xaa Arg Pro Ser
1.
5
<210>  78
<211>  11
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Lox696 VL CDR3
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (1)..(1)
<223>  Xaa представляет собой Ser, Leu, Met или Ala
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (2)..(2)
<223>  Xaa представляет собой Ser, Gly или Gln
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (3)..(3)
<223>  Xaa представляет собой Tyr, Arg, Ser или Gly
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (4)..(4)
<223>  Xaa представляет собой Thr или Met
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (5)..(5)
<223>  Xaa представляет собой Ser, Trp, Gly или Val
<220>
<221>  другой_признак
<222>  (6)..(6)
<223>  Xaa представляет собой Ser или Arg
<400>  78
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Thr Asn Trp Val
1.
5                   10
<210>  79
<211>  50
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вверху, синтетический праймер для нецеленаправленно действующей Ad-sh
<400>  79
caccgatgga ttgcacgcag gttctcgaaa gaacctgcgt gcaatccatc                  50
<210>  80
<211>  50
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Внизу, синтетический праймер для нецеленаправленно действующей Ad-sh
<400>  80
aaaagatgga ttgcacgcag gttctttcga gaacctgcgt gcaatccatc                  50
<210>  81
<211>  50
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вверху, синтетический праймер для LOX1sh
<400>  81
caccgcttca ctctctcatt cttagcgaac taagaatgag agagtgaagc                  50
<210>  82
<211>  50
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Внизу, синтетический праймер для LOX1sh
<400>  82
aaaagcttca ctctctcatt cttagttcgc taagaatgag agagtgaagc                  50
<---