СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ГРИППА С
DIAGNOSTIC TECHNIQUE FOR INFLUENZA C

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к области медицины, в частности к диагностике гриппа С, и может быть использовано для выявления РНК вируса гриппа С в биологических образцах.
Уровень техники
В настоящее время проводятся интенсивные исследования вирусов гриппа, в том числе вируса гриппа С, вызывающего разнообразные заболевания верхних и нижних дыхательных путей как человека, так и животных. Несмотря на полученные данные о генетике, эволюции, распространении в популяциях человека и животных, сведения об эпидемиологии вируса гриппа С остаются недостаточными. В частности, информации о случаях заболевания, вызванных этим вирусом в России у человека, практически не имеется, также она полностью отсутствует для животных. Отчасти это связано с тем, что для проведения подобных работ используются методики, сложные для исполнения или недостаточно хорошо и быстро выявляющие возбудителя. В связи с этим является актуальной разработка эффективных методов тестирования биологических образцов и мониторинг состояния популяций как людей, так и животных на предмет выявления в них вируса гриппа С.
Высокая скорость эволюции вирусов гриппа наряду с их быстрым распространением по всему миру и способностью образовывать реассортанты создают предпосылки для возникновения новых антигенных вариантов и связанных с этим новых вспышек заболевания. Поэтому крайне важным и существенным этапом является раннее распознавание случаев инфицирования, в частности, вируса гриппа С. В связи с этим весьма востребованными являются средства быстрой и надежной диагностики данного возбудителя. Представляется также важным получить возможность осуществлять типирование и идентификацию конкретной разновидности вируса, поскольку это является основой для поиска генетических изменений, являющихся маркерами высокой вирулентности, что может быть связано с тяжестью течения заболевания. Необходимо разработать тест-системы, с помощью которых можно будет проводить постоянный мониторинг в популяциях как человека, так и животных (в хозяйствах, занимающихся разведением свиней, а также в  ветеринарных клиниках у собак), с целью детекции возбудителя и выявления новых генетических изменений в геноме этого быстро видоизменяющегося вируса.
До настоящего времени не были разработаны экспресс тест-системы, основанные на использовании метода ПЦР в режиме реального времени, пригодные для идентификации вируса гриппа С. Подобные разработки имеются только для гриппов А и В. Проведение такого рода исследований и разработка основанных на них методик соответствует современному уровню мировых стандартов.
Предварительные исследования, проведенные в столице Российской Федерации, показали, что в отдельные периоды года вирус гриппа С с достаточно высокой частотой (до 18%) выявлялся у больных с симптомами ОРЗ. Таким образом, создание способа быстрой идентификации данного возбудителя может представлять собой существенную помощь для медиков, поскольку разрабатываемый набор реагентов на основе ПЦР в режиме реального времени может применяться в медицинских учреждениях и ветеринарных клиниках для идентификации вируса гриппа С у пациентов с симптомами ОРВИ, бронхитов и пневмоний и для мониторинга распространения данного гриппа в хозяйствах, занимающихся разведением свиней, а также в ветеринарных клиниках у собак.
Известно, что РНК вирусы быстро эволюционируют, что связано с высокой скоростью мутаций, воспроизводства, коротким репликативным периодом и значительным размером популяций [Domingo E, Holland JJ. 1997. RNA virus mutations and fitness for survival. Annu Rev Microbiol. 51, 151-178]. Источником генетического разнообразия в РНК вирусах, помимо мутаций, являются также процессы реассортации и рекомбинации. Первый, реассортация, встречается только в вирусах, чей геном разделен на несколько частей и представляет собой обмен одной или несколькими дискретными частями молекул РНК, на которые сегментирован вирусный геном. Второй, рекомбинация, встречается как среди вирусов с сегментированным, так и несегментированным геномом [Worobey M, Holmes EC. 1999. Evolutionary aspects of recombination in RNA viruses. J Gen Virol. 80 (Pt 10), 2535-2543]. Четких доказательств существования рекомбинационных процессов в геноме вируса гриппа С получено не было. Анализ типов вариабельности среди последовательностей генов свидетельствует о том, что, скорее всего, эти процессы имеют место быть, однако есть исследования, в которых не было найдено сигналов, свидетельствующих о существовании процессов рекомбинации среди вируса гриппа С [Han GZ, Boni MF, Li SS. 2010. No observed effect of homologous recombination on influenza С virus evolution. Virol J. 7, 227]. Причины, вызывающие снижение уровня рекомбинации в минус-нитевых вирусах остаются невыясненными [Chare ER, Gould EA, Holmes EC. 2003. Phylogenetic analysis reveals a low rate of homologous recombination in negative-sense RNA viruses. J Gen Virol. 84, 2691-2703; Han GZ, Boni MF, Li SS. 2010. No observed effect of homologous recombination on influenza С virus evolution. Virol J. 7, 227]. В любом случае, с учетом данных, полученных при исследовании вирусов грипп А и В, можно утверждать, что гомологичная рекомбинация оказывает минимальный эффект на эволюцию вирусов гриппа.
Существует устойчивое мнение, что в природе одновременно имеется несколько коциркулирующих штаммов вируса гриппа С, что является основой для появления реассортантов [Ohyama S, Adachi К, Sugawara К, Hongo S, Nishimura H, Kitame F, Nakamura K. 1992. Antigenic and genetic analyses of eight influenza С strains isolated in various areas of Japan during 1985-9. Epidemiol Infect. 108, 353-365; Alamgir AS, Matsuzaki Y, Hongo S, Tsuchiya E, Sugawara K, Muraki Y, Nakamura K. 2000. Phylogenetic analysis of influenza С virus nonstructural (NS) protein genes and identification of the NS2 protein. J Gen Virol. 81, 1933-1940]. Примеры коциркуляции штаммов этого вируса приведены в работах [Kawamura H, Tashiro M, Kitame F, Homma M, Nakamura К. 1986. Genetic variation among human strains of influenza С virus isolated in Japan. Virus Res. 4, 275-288; Matsuzaki Y, Muraki Y, Sugawara K, Hongo S, Nishimura H, Kitame F, Katsushima N, Numazaki Y, Nakamura K. 1994. Cocirculation of two distinct groups of influenza С virus in Yamagata City, Japan. Virology. 202, 796-802; Matsuzaki Y, Mizuta K, Sugawara K, Tsuchiya E, Muraki Y, Hongo S, Suzuki H, Nishimura H. 2003. Frequent reassortment among influenza С viruses. Virol. 871-881]. Показано, что реассортаты между различными штаммами вируса гриппа С с высокой частотой образуются в условиях in vitro [Peng G, Hongo S, Muraki Y, Sugawara K, Nishimura H, Kitame F, Nakamura K. 1994. Genetic reassortment of influenza С viruses in man. J Gen Virol. 75 (Pt 12), 3619-3622], ряд наблюдений позволяет утверждать, что реассортанты между различными типами вируса гриппа С часто встречаются в природе [Peng G, Hongo S, Kimura H, Muraki Y, Sugawara K, Kitame F, Numazaki Y, Suzuki H, Nakamura K. 1996. Frequent occurrence of genetic reassortment between influenza С virus strains in nature. J. Gen. Virol. 77, 1489-1492; Matsuzaki Y, Mizuta K, Sugawara K, Tsuchiya E, Muraki Y, Hongo S, Suzuki H, Nishimura H. 2003. Frequent reassortment among influenza С viruses. Virol. 871-881; Han GZ, Boni MF, Li SS. 2010. No observed effect of homologous recombination on influenza С virus evolution. Virol J. 7, 227]. Были получены доказательства того, что ряд штаммов являются натуральными природными реассортантами [Peng G, Hongo S, Muraki Y, Sugawara К, Nishimura H, Kitame F, Nakamura K. 1994. Genetic reassortment of influenza С viruses in man. J Gen Virol. 75 (Pt 12), 3619-3622; Peng G, Hongo S, Kimura H, Muraki Y, Sugawara K, Kitame F, Numazaki Y, Suzuki H, Nakamura K. 1996. Frequent occurrence of genetic reassortment between influenza С virus strains in nature. J. Gen. Virol. 77, 1489-1492; Tada Y, Hongo S, Muraki Y, Sugawara K, Kitame F, Nakamura K. 1997. Evolutionary analysis of influenza С virus M genes. Virus Genes. 15, 53-59; Alamgir AS, Matsuzaki Y, Hongo S, Tsuchiya E, Sugawara K, Muraki Y, Nakamura K. 2000. Phylogenetic analysis of influenza С virus nonstructural (NS) protein genes and identification of the NS2 protein. J Gen Virol. 81, 1933-1940; Matsuzaki Y, Sugawara K, Mizuta K, Tsuchiya E, Muraki Y, Hongo S, Suzuki H, Nakamura K. 2002. Antigenic and genetic characterization of influenza С viruses which caused two outbreaks in Yamagata City, Japan, in 1996 and 1998. J Clin Microbiol. 40, 422-429; Matsuzaki Y, Mizuta K, Sugawara K, Tsuchiya E, Muraki Y, Hongo S, Suzuki H, Nishimwa H. 2003. Frequent reassortment among influenza С viruses. Virol. 871-881]. Хотя вирусы гриппов А, В и С имеют общих предков, реассортанты между этими вирусами не наблюдаются. Однако искусственным путем были получены вирусы гриппа А, в которых экспрессируется гликопротеин вируса гриппа С HEF взамен собственных НА и NA [Gao Q, Brydon EW, Palese P. 2008. A seven-segmented influenza A virus expressing the influenza С virus glycoprotein HEF. J Virol. 82, 6419-6426].
Проводились работы по филогении генов вируса гриппа С. В настоящее время на основании сравнения последовательностей генов HEF выделяют 6 генетических или антигенных групп (линий) вируса гриппа С [Muraki Y, Hongo S, Sugawara К, Kitame F, Nakamura К. 1996. Evolution of the haemagglutinin-esterase gene of influenza С virus. J Gen Virol. 77 (Pt 4), 673-679; Matsuzaki Y, Sugawara K, Mizuta K, Tsuchiya E, Muraki Y, Hongo S, Suzuki H, Nakamura K. 2002. Antigenic and genetic characterization of influenza С viruses which caused two outbreaks in Yamagata City, Japan, in 1996 and 1998. J Clin Microbiol. 40, 422-429; Matsuzaki Y, Mizuta K, Sugawara K, Tsuchiya E, Muraki Y, Hongo S, Suzuki H, Nishimura H. 2003. Frequent reassortment among influenza С viruses. Virol. 871-881].
Секвенирование с последующим филогенетическим анализом последовательностей М также показало эволюцию вирусов в три независимых линии [Tada Y, Hongo S, Muraki Y, Sugawara K, Kitame F, Nakamura K. 1997. Evolutionary analysis of influenza С virus M genes. Virus Genes. 15, 53-59]. Для генов РВ2, PB1, Р3 и NP было выделено от трех-четырех до пяти-шести независимых линий [Alamgir AS, Matsuzaki Y, Hongo S, Tsuchiya E, Sugawara K, Muraki Y, Nakamura K. 2000. Phylogenetic analysis of influenza С virus nonstructural (NS) protein genes and identification of the NS2 protein. J Gen Virol. 81, 1933-1940; Matsuzaki Y, Sugawara K, Mizuta K, Tsuchiya E, Muraki Y, Hongo S, Suzuki H, Nakamura K. 2002. Antigenic and genetic characterization of influenza С viruses which caused two outbreaks in Yamagata City, Japan, in 1996 and 1998. J Clin Microbiol. 40, 422-429; Matsuzaki Y, Mizuta K, Sugawara K, Tsuchiya E, Muraki Y, Hongo S, Suzuki H, Nishimura H. 2003. Frequent reassortment among influenza С viruses. Virol. 871-881]. Филогенетический анализ генов NS показал, что эти гены подразделяются на две достаточно близкие группы А и В [Alamgir AS, Matsuzaki Y, Hongo S, Tsuchiya E, Sugawara K, Muraki Y, Nakamura K. 2000. Phylogenetic analysis of influenza С virus nonstructural (NS) protein genes and identification of the NS2 protein. J Gen Virol. 81, 1933-1940].
Существуют статьи, в которых оценивалась скорость эволюции различных генов вируса гриппа С. Так, скорость эволюции гена гемагглютининэстеразы вируса гриппа С меньше, чем скорость эволюции гена гемагглютинина вируса гриппа А, примерно в 1/9 [Muraki Y, Hongo S, Sugawara K, Kitame F, Nakamura K. 1996. Evolution of the haemagglutinin-esterase gene of influenza С virus. J Gen Virol. 77 (Pt 4), 673-679]. Скорость накопления замен в вирусе гриппа В имеет такой же порядок величины, как и для гриппа С [Gatherer D. 2010. Tempo and mode in the molecular evolution of influenza C. PLoS Curr. 2, RRN1199].
Наиболее быстро эволюционирующий сегмент генома вируса гриппа С - второй, наиболее медленно - седьмой. Скорость накопления нуклеотидных замен различается примерно в два раза между различными сегментами генома вируса. Во всех семи сегментах генома вируса скорость несинонимичных замен ниже скорости синонимичных, что свидетельствует о действии стабилизирующего отбора, хотя были найдены некоторые доказательства действия положительного отбора в рецептор-связывающем домене гена HEF [Gatherer D. 2010. Tempo and mode in the molecular evolution of influenza C. PLoS Curr. 2, RRN1199].
Оценивалась вариабельность генов вируса гриппа С и кодируемых ими белков. Было показано, что четвертый сегмент генома, кодирующий белок HEF, является наиболее вариабельным среди всех. Число нуклеотидных замен на сайт в нем в два раза выше по сравнению наименее вариабельным первым сегментом, кодирующим полимеразу РВ2 [Gatherer D. 2010. Tempo and mode in the molecular evolution of influenza C. PLoS Curr. 2, RRN1199].
Уставлено время появления в процессе эволюции вируса гриппа С наиболее недавних общих предков современных форм генов гриппа, которое приходится на 1890 год для гена HEF и около 1930-1944 года для большинства других генов (за исключением гена, кодирующего белки NS, время появления наиболее недавнего общего предка которого приходится примерно на 1916 год) [Gatherer D. 2010. Tempo and mode in the molecular evolution of influenza C. PLoS Curr. 2, RRN1199].
Все вместе приведенные данные показывают, что все семь сегментов генома вируса гриппа С эволюционируют независимо.
Среди изолятов вируса гриппа С присутствуют различные антигенные варианты, что было показано с помощью антигенного анализа с помощью HEF-моноклональных антител [Sugawara K, Kitame F, Nishimura H, Nakamura K. 1988. Operational and topological analyses of antigenic sites on influenza С virus glycoprotein and their dependence on glycosylation. J Gen Virol. 69 (Pt 3), 537-547; Sugawara К, Nishimura H, Hongo S, Muraki Y, Kitame F, Nakamura K. 1993. Construction of an antigenic map of the haemagglutinin-esterase protein of influenza С virus. J Gen Virol. 74 (Pt 8), 1661-1666]. Всего на поверхности белка HEF присутствует девять неперекрывающихся или частично перекрывающихся антигенных сайтов (А1-А5 и В1-В4) [Sugawara К, Kitame F, Nishimura H, Nakamura К. 1988. Operational and topological analyses of antigenic sites on influenza С virus glycoprotein and their dependence on glycosylation. J Gen Virol. 69 (Pt 3), 537-547; Sugawara К, Nishimura H, Hongo S, Muraki Y, Kitame F, Nakamura K. 1993. Construction of an antigenic map of the haemagglutinin-esterase protein of influenza С virus. J Gen Virol. 74 (Pt 8), 1661-1666]. Вирусы гриппа С могут существовать продолжительное время (семь-девять лет и более) без изменения специфичности антигена HEF и антигенно значительно более стабильны, нежели вирусы гриппов А и В [Sugawara K, Kitame F, Nishimura H, Nakamura K. 1988. Operational and topological analyses of antigenic sites on influenza С virus glycoprotein and their dependence on glycosylation. J Gen Virol. 69 (Pt 3), 537-547; Ohyama S, Adachi K, Sugawara K, Hongo S, Nishimura H, Kitame F, Nakamura K. 1992. Antigenic and genetic analyses of eight influenza С strains isolated in various areas of Japan during 1985-9. Epidemiol Infect. 108, 353-365; Matsuzaki Y, Mizuta K, Sugawara K, Tsuchiya E, Muraki Y, Hongo S, Suzuki H, Nishimura H. 2003. Frequent reassortment among influenza С viruses. Virol. 871-881].
Также с помощью моноклональных антител было показано, что в белках М и NP имеется, как минимум, по два неперекрывающихся или частично перекрывающихся антигенных сайта, (M-I и M-I) и (NP-I и NP-I), соответственно. По всей вероятности белки NP и М в природе иммунологически более консервативны, чем HEF [Sugawara К, Nishimura H, Hongo S, Kitame F, Nakamura K. 1991. Antigenic characterization of the nucleoprotein and matrix protein of influenza С virus with monoclonal antibodies. J Gen Virol. 72 (Pt 1), 103-109].
Вероятно, геномный состав вируса гриппа С влияет на его способность к распространению в популяции, и некоторые реассортанты имеют эпидемиологические преимущества перед своими родительскими вирусами и начинают циркулировать как превалирующий штамм [Muraki Y, Hongo S. 2010. The molecular virology and reverse genetics of influenza С virus. Jpn J Infect Dis. 63, 157-165].
Вирусы гриппа С способны распространяться по всему миру [Muraki Y, Hongo S, Sugawara К, Kitame F, Nakamura K. 1996. Evolution of the haemagglutinin-esterase gene of influenza С virus. J Gen Virol. 77 (Pt 4), 673-679; Matsuzaki Y, Sugawara K, Mizuta K, Tsuchiya E, Muraki Y, Hongo S, Suzuki H, Nakamura K. 2002. Antigenic and genetic characterization of influenza С viruses which caused two outbreaks in Yamagata City, Japan, in 1996 and 1998. J Clin Microbiol. 40, 422-429].
Помимо человека, вирус гриппа С может инфицировать свиней и собак [Muraki Y, Hongo S. 2010. The molecular virology and reverse genetics of influenza С virus. Jpn J Infect Dis. 63, 157-165]. В 1981-1982 годах кодируемые вирусом белки и геномы вируса гриппа С были изолированы из китайских свиней. Путем картирования геномных последовательностей было показано, что они были весьма похожи, хотя и не идентичны последовательностям шаммов вируса гриппа С, выделенных из человека [Elliott RM, Yuanji G, Desselberger U. 1985. Protein and nucleic acid analyses of influenza С viruses isolated from pigs and man. Vaccine. 3, 182-188]. В исследовании, оценивающем наличие антител против вируса гриппа С в сыворотках из крови 2000 свиней, собранных в Англии, было продемонстрировано, что 9,9% образцов были серопозитивны [Brown IH, Harris PA, Alexander DJ. 1995. Serological studies of influenza viruses in pigs in Great Britain 1991-2. Epidemiol Infect. 114, 511-520]. Для сравнения, серопозитивность сывороток свиней, собранных в Китае и Японии составляла 1-8% (образцы собирались каждый месяц в течение года) и 19% соответственно [Guo YJ, Jin FG, Wang P, Wang M, Zhu JM. 1983. Isolation of influenza С virus from pigs and experimental infection of pigs with influenza С virus. J Gen Virol. 64 (Pt 1), 177-182; Yamaoka M, Hotta H, Itoh M, Homma M. 1991. Prevalence of antibody to influenza С virus among pigs in Hyogo Prefecture, Japan. Gen. Virol. 72, 711-714]. Эти результаты показывают, что вирус гриппа С широко распространен в популяциях свиней.
Эксперименты на свиньях продемонстрировали, что эти животные могут быть искусственным образом инфицированы вирусом гриппа С и что вирус может естественным путем передаваться от свиньи к свинье. Также были получены результаты, свидетельствующие о том, что в организме свиней вирус может находиться в персистентном состоянии. Об этом свидетельствовал тот факт, что животные, искусственно зараженные вирусом гриппа С, через 25 дней после прививки представляли собой инфекционную опасность для других свиней, вызывая у последних повышение уровня соответствующих антител [Guo YJ, Jin FG, Wang P, Wang M, Zhu JM. 1983. Isolation of influenza C virus from pigs and experimental infection of pigs with influenza С virus. J Gen Virol. 64 (Pt 1), 177-182].
Показано, что искусственным образом привнесенный вирус гриппа С вызывает симптомы заболевания (выделения из носа, отек век, выделение слез и слизи из глаз) у собак. [Ohwada К, Kitame F, Homma M. 1986. Experimental infections of dogs with type С influenza virus. Microbiol Immunol. 30, 451-460]. Надо отметить, что в генетическом банке на настоящий момент не существует ни одной нуклеотидной последовательности, относящейся к изоляту гриппа С, полученному от собак.
Вирус гриппа С обладает способностью к преодолению межвидовых барьеров. Во-первых, известен тот факт, что штаммы вируса, выделенные из человека, способны размножаться в организме свиньи, инфицированной искусственным путем [Guo YJ, Jin FG, Wang P, Wang M, Zhu JM. 1983. Isolation of influenza С virus from pigs and experimental infection of pigs with influenza С virus. J Gen Virol. 64 (Pt 1), 177-182]. Во-вторых, имеются другие данные свидетельствующие о межвидовой передаче этого вируса между людьми и свиньями естественным путем, а именно: сравнение полных или частичных нуклеотидных последовательностей всех семи сегментов генома штаммов, изолированных в Японии в 1991-1993 годах, с полученными из человека и свиньи в 1980-1989 годах, показало, что по крайней мере один штамм имел большее сходство с вирусами изолированными из свиней в Китае, чем с изолятами, полученными из человека.
Эксперименты на животных демонстрируют связь между различной активностью вируса и сезоном. Так, успешность выявления вируса гриппа С на протяжении года в группах свиней со скотобойни различалась в зависимости от месяца, в который производили забор образцов [Guo YJ, Jin FG, Wang P, Wang M, Zhu JM. 1983. Isolation of influenza C virus from pigs and experimental infection of pigs with influenza С virus. J Gen Virol. 64 (Pt 1), 177-182].
Информация о распространении вируса гриппа С в популяциях как человека, так и животных достаточно ограничена и часто представлена работами, выполненными на национальных языках, что сильно затрудняет их осмысление.
В работе Takao с соавторами было показано, что частота встречаемости вируса гриппа С в период с ноября 1999 по март 2000 года в японской префектуре Хирошима составила 0,2%, поскольку была выявлена только в 8 случаях из 667 образцов, полученных от пациентов с острым респираторным заболеванием [Takao S, Matsuzaki Y, Shimazu Y, Fukuda S, Noda M, Tokumoto S. 2000. Isolation of influenza С virus during the 1999/2000-influenza season in Hiroshima Prefecture, Japan. Jpn J Infect Dis. 53, 173-174].
Изучение вируса гриппа С у детей младше пятнадцати лет с симптомами острого респираторного заболевания проводилась в японском городе Ямагато в течение трехлетнего периода с января 1996 по декабрь 1998 года. Было изучено свыше 10000 образцов, вирусы изолировались в культуре, тестировались методом ингибирования гемагглютинации с моноклональными антителами, после чего геномы некоторых штаммов были секвенированы. Было выявлено 33 различных штамма вируса гриппа С, причем 20 штаммов выявились в течение короткого периода с мая по август 1996 (из них 16 в период 24 дней с 3 по 27 июня), еще 13 штаммов были выделены в марте-июне 1998. При этом в 1997 году не было выявлено ни одного случая заболевания, вызванного вирусом гриппа С, несмотря на то, что в этом году было изучено 3550 образцов. Частота выявления вируса в июне 1996 и апреле 1998 годов достигала 4,9 и 2,8% соответственно, хотя среднегодовая встречаемость за три года была низка (0,3%) [Matsuzaki Y, Sugawara К, Mizuta К, Tsuchiya E, Muraki Y, Hongo S, Suzuki H, Nakamura K. 2002. Antigenic and genetic characterization of influenza С viruses which caused two outbreaks in Yamagata City, Japan, in 1996 and 1998. J Clin Microbiol. 40, 422-429].
Исследования гриппа С проводились также в Японии с января по июль 2004 года на материале из 11 различных префектур. Вирусы изолировались в культуре, с последующим тестированием с помощью ингибирования гемагглютинации либо с применением РТ-ПЦР. Частота встречаемости вируса составила 1,4-2,5%, при этом сравнение с предыдущими исследованиями показали, что это была самая высокая частота встречаемости за период в 14 лет. Максимальные временные пики заболевания различались в зависимости от префектуры и в зависимости от использованного метода исследования - они наблюдались в одной префектуре в марте, в нескольких других в январе-феврале, еще в одном случае в феврале и мае. В целом авторы делают вывод о том, что вирус гриппа С циркулирует в Японии на протяжении всего изученного полугодового периода [Matsuzaki Y, Abiko С, Mizuta К, Sugawara К, Takashita E, Muraki Y, Suzuki H, Mikawa M, Shimada S, Sato K, Kuzuya M, Takao S, Wakatsuki K, Itagaki T, Hongo S, Nishimura H. 2007. A nationwide epidemic of influenza С virus infection in Japan in 2004. J Clin Microbiol. 45, 783-788].
В России была проведена работа с использованием данных, собранных в периоды с сентября по июнь в 2005-2009 годах и весной 2010 в г.Москве. Детектирование вируса в образцах проводилась с помощью ПЦР в режиме реального времени. Выборку составили 1868 детей (в возрасте преимущественно от 1 месяца до 5 лет) и 31 взрослый (25-60 лет) с симптомами ОРЗ. Контрольная группа был сформирована из 106 образцов от детей без признаков ОРЗ. Показано, что с наибольшей частотой (8,3-18,2%) вирус гриппа С выявлялся у больных в сентябре 2005, январе-феврале 2006 и в апреле и октябре 2008 года. Среднегодовая частота выявления вируса составила 1-5%. В контрольной группе РНК вируса гриппа С была обнаружена только в одном образце (0,9%) в октябре месяце, что совпадает с периодом повышения частоты обнаружения данного вируса у больных детей [Кудрявцева АВ. 2010. Изучение циркуляции вируса гриппа С у больных ОРЗ в г.Москве. Молекулярная диагностика. 4, 184-186].
Интенсивные миграционные потоки в мировом пространстве в сочетании с активным эволюционным процессом в популяции вирусов гриппа создают предпосылки для возникновения новых антигенных вариантов и их быстрого глобального распространения. Поэтому крайне важным и существенным этапом является раннее распознавание случаев инфицирования. В связи с этим крайне востребованы средства быстрой диагностики гриппа с возможностью типирования и идентификации данной разновидности вируса. Особое значение имеет выявление различных генетических групп вирусов гриппа, в частности вируса гриппа С, поиск генетических изменений, являющихся маркерами высокой вирулентности, а также постоянный мониторинг с целью выявления новых генетических изменений в геноме этого быстро видоизменяющегося вируса. Усиление эпиднадзора за гриппом С как потенциально опасным заболеванием, способным вызывать пневмонии у человека и периодические подъемы заболеваемости, особенно в закрытых учреждениях, а также заболевания свиней, особенно в пределах одного хозяйства, становится все более актуальным.
Изучение изменчивости геномов вирусов является важной фундаментальной проблемой. Прежде всего, это связано с тем, что иммунная система организма часто не распознает новые формы вируса гриппа С, благодаря постоянному формированию новых антигенных вариантов. Известно, что почти у половины привитых добровольцев развиваются симптомы заболевания, несмотря на высокий уровень серопозитивности популяции [Joosting AC, Head В, Bynoe ML, Tyrrell DA. 1968. Production of common colds in human volunteers by influenza С virus. Br Med J. 4, 153-154; Gatherer D. 2010. Tempo and mode in the molecular evolution of influenza C. PLoS Curr. 2, RRN1199]. Кроме того, важной проблемой является изучение конкретных генетических изменений, которые могут быть маркерами высокой вирулентности и связаны с тяжестью течения заболевания [Кудрявцева АВ. 2010. Изучение циркуляции вируса гриппа С у больных ОРЗ в г.Москве. Молекулярная диагностика. 4, 184-186].
Раскрытие изобретения
Нами проанализированы нуклеотидные последовательности, представленные в базах данных, в частности NCBI Influenza Virus Resource [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/] [Bao Y, Bolotov P, Demovoy D, Kiryutin B, Zaslavsky L, Tatusova T, Ostell J, Lipman D. 2008. The influenza virus resource at the National Center for Biotechnology Information. J Virol. 82, 596-601], с целью выбора участков сегментов генома, являющихся наиболее консервативными в различных генетических группах вируса гриппа С.
В результате было установлено, что такими участками являются ген М (кодирующий белок матрикса) и ген NP (кодирующий нуклеопротеин).
Ген М является консервативным для вируса гриппа С, и в то же время существенно отличаются от гомологичных генов вирусов гриппа А и В. К последовательностям гена М были разработаны диагностические олигонуклеотидные праймеры (прямой праймер: 5'-GAAATATTGATTGCTGAGACAGA-3'; обратный праймер: 5'-CCCTCCTGTTATTGCTGAAATTA-3') и зонд (5'-TGCTCCTGAAACCAGGACAG-3') и проведено их тестирование.
На концах зонда InfC находятся флуорофор и гаситель флуоресценции, в растворе зонд образует шпильку, флуорофор и гаситель сближены и уровень флуоресценции очень низок. При гибридизации зонда со специфичным продуктом реакции зонд разворачивается, что приводит к разобщению флуорофора и гасителя и существенному повышению уровня флуоресценции, которое фиксируется детектирующим амплификатором.
Разработана методика, включающая проведение этапов обратной транскрипции и амплификации в одной пробирке, позволяющая выявлять РНК вируса гриппа С в биологических образцах, представляющих собой мазки из носоглотки человека и животных. Мазки получали, собирая клетки эпителия с помощью специальных зондов, стремясь свести к минимуму количество слизистых выделений. Зонды помещали в пробирки, содержащие транспортную среду для стабилизации РНК производства компании Амплисенс. Показано, что хранение мазка возможно в течение суток при температуре +4°С, более длительное хранение возможно при -20°С, архивы рекомендуется хранить при -70°С.
Выделение РНК из собранных образцов проводили с использованием набора РИБО-ПРЕП производства компании Амплисенс. Приготовление реакционной смеси для ОТ/ПЦР проводили, используя реактивы компании Амплисенс и разработанные праймеры и зонд (табл.1).
Таблица 1
Схема приготовления реакционной смеси для ОТ/ПЦР
Реагент
Объем реагента на одну реакцию (мкл)
ОТ-ПЦР-смесь-2-FRT (Амплисенс)
5
RT-Gmix-2 (Амплисенс)
0,25
Полимераза Taq (Амплисенс)
0,5
ТМ-Ревертаза MMIv (Амплисенс)
0,25
Праймер InfC-F (концентрация 20 пмоль/мкл)
0,4
Праймер InfC-R (концентрация 20 пмоль/мкл)
0,4
Зонд InfC (концентрация 10 пмоль/мкл)
0,3
5% азид натрия
0,08
дНТФ (Т+У) (1,76 мМ)
2,5
Стерильная вода
6,32
Анализ результатов поводили с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР с детекцией в режиме «реального времени». Разработанная программа амплификации представлена в таблице 2.
Таблица 2
Программа амплификации
Цикл
Температура, °С
Время
Число повторов циклов
1
50
30 мин
1
2
95
15 мин
1
3
95
10 с
10
54
20 с
72
10 с
4
95
10 с
35
54
20
Детекция флуоресц. сигнала
72
10 с
Анализировали кривые накопления флуоресцентного сигнала по двум каналам: JOE/HEX/Су3 (регистрация сигнала, свидетельствующего о накоплении продукта амплификации фрагмента РНК Influenza virus С) и FAM (регистрация сигнала, свидетельствующего о накоплении продукта амплификации кДНК внутреннего контрольного образца STI-88-rec).
Краткое описание чертежей
Фиг.1. Процент больных гриппом С от общего числа больных.
Осуществление изобретения
Пример 1. Методика для выявления РНК вируса гриппа С в клиническом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией
1.1. В исследованиях используют мазки, полученные из носоглотки человека или животного. Необходимо тщательно провести по стенке слизистой, чтобы максимально увеличить количество клеток эпителия в образце при минимальном количестве слизистых выделений. Используются стандартные зонды для мазков, которые помещаются в пробирку объемом 1,5 мл, содержащую 500 мкл транспортной среды, например транспортной среды для стабилизации РНК производства компании Амплисенс. Хранение мазка возможно в течение суток при температуре +4°С, более длительное хранение возможно при -20°С, архивы рекомендуется хранить при -70°С.
1.2. Выделение РНК с использованием набора РИБО-ПРЕП производства компании Амплисенс.
1.2.1. Раствор для лизиса прогреть при температуре 65°С до полного растворения кристаллов.
1.2.2. Отобрать необходимое количество одноразовых пробирок на 1,5 мл с плотно закрывающимися крышками (включая отрицательный и положительный контроли выделения). Внести в каждую пробирку по 10 мкл внутренний контрольный образец (ВКО, STI-88-rec). Добавить в пробирки по 300 мкл раствора для лизиса. Промаркировать пробирки.
1.2.3. В пробирки с раствором для лизиса и ВКО внести по 100 мкл подготовленных проб, используя наконечники с аэрозольным барьером. В пробирку отрицательного контроля выделения внести 100 мкл отрицательный контрольный образец (ОКО). В пробирку положительного контроля выделения внести 90 мкл ОКО и 10 мкл положительный контрольный образец (ПКО).
1.2.4. Содержимое пробирок тщательно перемешать на вортексе и прогреть 5 мин при 65°С в термостате.
1.2.5. Добавить в пробирки по 400 мкл раствора для преципитации, перемешать на вортексе.
1.2.6. Процентрифугировать пробирки на микроцентрифуге в течение 5 мин при 13 тыс об/мин.
1.2.7. Аккуратно отобрать надосадочную жидкость, не задевая осадок, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник на 200 мкл для каждой пробы.
1.2.8. Добавить в пробирки по 500 мкл раствора для отмывки 3, плотно закрыть крышки, осторожно промыть осадок, переворачивая пробирки 3-5 раз. Можно провести процедуру одновременно для всех пробирок, для этого необходимо накрыть пробирки в штативе сверху крышкой или другим штативом, прижать их и переворачивать штатив.
1.2.9. Процентрифугировать при 13 тыс об/мин в течение 1-2 мин на микроцентрифуге.
1.2.10. Осторожно, не захватывая осадок, отобрать надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник на 10 мкл для каждой пробы.
1.2.11. Добавить в пробирки по 200 мкл раствора для отмывки 4, плотно закрыть крышки и осторожно промыть осадок, переворачивая пробирки 3-5 раз.
1.2.12. Процентрифугировать при 13 тыс об/мин в течение 1-2 мин на микроцентрифуге.
1.2.13. Осторожно, не захватывая осадок, отобрать надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник на 10 мкл для каждой пробы.
1.2.14. Поместить пробирки в термостат при температуре 65°С на 5 мин для подсушивания осадка (при этом крышки пробирок должны быть открыты).
1.2.15. Добавить в пробирки по 50 мкл РНК-буфера. Перемешать на вортексе. Поместить в термостат при температуре 65°С на 5 мин, периодически встряхивая на вортексе.
1.2.16. Процентрифугировать пробирки при 13 тыс об/мин в течение 1 мин на микроцентрифуге. Надосадочная жидкость содержит очищенную РНК.
1.3. Проведение этапа обратной транскрипции/ПЦР.
1.3.1. Смешать компоненты реакционной смеси в соотношении, указанном в табл.1, непосредственно перед проведением анализа. Смешивать реагенты из расчета на необходимое число реакций, включающее тестирование исследуемых и контрольных образцов.
1.3.2. Отобрать необходимое количество пробирок для амплификации исследуемых и контрольных образцов РНК. Внести в каждую пробирку по 15 мкл подготовленной реакционной смеси.
1.3.3. В пробирки с реакционной смесью добавить по 10 мкл РНК-проб, выделенных из клинических или контрольных образцов.
1.3.4. Поставить контрольные реакции:
- отрицательный контроль ПЦР (К-) - внести в пробирку 10 мкл РНК-буфера,
- положительный контроль ПЦР (К+) - внести в пробирку 10 мкл ПКО кДНК,
- Influenza virus С,
- положительный контроль ПЦР ВКО (ВК+) - внести в пробирку 10 мкл ПКО STI-88-rec,
- отрицательный контроль экстракции (выделения) (В-) - внести в пробирку 10 мкл пробы, выделенной из ОКО,
- положительный контроль экстракции (выделения) (В+) - внести в пробирку 10 мкл пробы, выделенной из ПКО Influenza virus С (вируса гриппа С).
1.3.5. Запрограммировать амплификатор с системой детекции в режиме «реального времени» для выполнения соответствующей программы амплификации и детекции флуоресцентного сигнала (табл.2) Детекция флуоресцентного сигнала назначается по каналам для флуорофоров FAM и JOE.
1.3.6. Установить пробирки в ячейки реакционного модуля прибора.
1.3.7. Запустить выполнение программы амплификации с детекцией флуоресцентного сигнала.
1.3.8. По окончании выполнения программы приступить к анализу и интерпретации результатов.
1.4. Анализ и интерпретация результатов ПЦР в режиме «реального времени».
1.4.1. Анализ результатов поводят с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР с детекцией в режиме «реального времени». Анализируют кривые накопления флуоресцентного сигнала по двум каналам:
- по каналу для флуорофора IOE/НЕХ/Су3 регистрируется сигнал, свидетельствующий о накоплении продукта амплификации фрагмента РНК Influenza virus С,
- по каналу для флуорофора FAM регистрируется сигнал, свидетельствующий о накоплении продукта амплификации кДНК ВКО STI-88-rec.
1.4.2. Результаты интерпретируются на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией, что определяет наличие (или отсутствие) для данной пробы ДНК значения порогового цикла «Ct» в соответствующей графе в таблице результатов. Принцип интерпретации результатов:
- РНК Influenza virus С обнаружена, если для данной пробы в таблице результатов по каналу для флуорофора JOE/Yellow/HEX/Су3 определено значение порогового цикла Ct, не превышающее значение 0,1. При этом кривая флуоресценции данной пробы должна пересекать пороговую линию на участке характерного экспоненциального подъема флуоресценции.
- РНК Influenza virus С не обнаружена, если для данной пробы в таблице результатов по каналу для флуорофора JOE/Yellow/HEX/Су3 не определено (отсутствует) значение порогового цикла Ct (кривая флуоресценции не пересекает пороговую линию), а в таблице результатов по каналу для флуорофора FAM/Green определено значение порогового цикла Ct, не превышающее значение 0,1.
- Результат анализа невалидный, если для данной пробы не определено (отсутствует) значение порогового цикла Ct по каналу для флуорофора JOE/Yellow/HEX/Су3, и по каналу для флуорофора FAM/Green значение Ct также не определено (отсутствует) или превышает значение 0,1. В этом случае требуется повторно провести исследование соответствующего клинического образца начиная с этапа выделения.
Представленное выше подробное описание методики предназначено исключительно для более полного уяснения сущности заявленного изобретения, но не для его ограничения. Специалисту будет ясно, что могут быть сделаны различные изменения, которые, тем не менее, будут соответствовать сущности и объему настоящего изобретения, которые определяются прилагаемой формулой изобретения.
Пример 2. С помощью разработанного диагностического набора проведен анализ накопленной коллекции образцов. Проанализировано 1805 образцов, полученных с сентября 2005-го года по ноябрь 2009-го включительно. Кроме гриппа С в исследуемых образцах диагностировали также гриппы А и В. Рассчитан процент больных гриппами А, В и С от общего числа больных в каждом месяце, результат представлен на фиг.1.
2
Как видно из фиг.1, наименьшая частота заболеваний вирусами гриппа А, В и С приходится на летне-осенний период, а наибольшая - на зимне-весенний. Частота заболеваний в зимне-весенний период достоверно выше, чем в летне-осенний (Р<0,05, здесь и далее в этом разделе для определения статистической достоверности данных использовались точный тест Фишера и критерий χ). Наиболее часто встречающимся из диагностируемых является грипп А (Р<0,05), а наиболее редко грипп В (Р<0,05). Частоты встречаемости для гриппов А, В и С относятся как 4:1:2 соответственно. Для гриппа С характерны более резкие пики заболеваемости, по сравнению с гриппами А и В, для которых периоды роста, пика и спада числа заболевших растянуты на несколько месяцев.
Как видно из полученных данных, число болевших гриппом С составляет значительную часть от общего числа и почти 30% от болевших гриппами А, В и С вместе взятыми. Для гриппа С пики заболеваемости приходятся на те же периоды, что и для гриппов А и В, однако сами пики значительно уже.