СПОСОБ УВЕЛИЧЕНИЯ ПУЛА СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК В ОРГАНИЗМЕ
METHOD OF INCREASING STEM CELL POOL IN BODY

Изобретение относится к области клеточной биологии и медицины, конкретно к клеточным технологиям, и касается способа увеличения пула стволовых клеток в организме.
Уровень техники
Известны способы увеличения содержания в организме коммитированных клеток-предшественников гемопоэза с помощью раннедействующих факторов роста: ГМ-КСФ (Metcalf D. Hemopoietic growth factors. 1 // The Lancet. - 1989. - Vol. 15. - P. 825-827) и ИЛ-3 (Platzer E. Human hemopoietic growth factors // Eur. J. Haematol. - 1989. - V. 42. - №1. - P. 1-15, Натан Д.Г., Зифф K.A. Регуляция кроветворения // Гематол. и трансфузиол. - 1994. - Т. 39. - №2. - С. 3-10). Недостатком данных способов является их стимулирующее влияние только на гемопоэтические предшественники и не затрагивающее популяцию мезенхимальных стволовых клеток.
Известен способ увеличения резерва мезенхимальных стволовых клеток в организме, заключающийся во внутрибрюшинном введении лабораторным животным (мыши) препарата гиалуронидазы в дозе 1000 УЕ/кг 1 раз в сутки в течение 2 дней (Патент 2347583 RU, принятый в качестве прототипа).
Недостатком предложенного способа является не полностью раскрытый потенциал увеличения пула мезенхимальных стволовых клеток.
Известно, что гидролизат рибонуклеиновой кислоты, представляющий собой комплекс рибонуклеотидов, обладает свойством активатора регенерации и применяется при наследственных тапеторетинальных абиотрофиях, болезни Шегрена, дегенеративных заболеваниях нервно-мышечной системы, наследственных формах миопатий, врожденном и приобретенном миопатическом синдроме, различных формах невральных амиотрофий, последствиях нейроинфекций, спинальных амиотрофиях и боковом амиотрофическом склерозе (Фукс Б.Б., Шершевская С.Ф., Попова Л.М., Шнапер А.Л. Заместительный лечебный эффект рибонуклеотидов при некоторых болезнях // Бюл. эксперим. биол. и медицины. - 1969. - №9. - С. 23-26; Фукс Б.Б., Шершевская С.Ф., Левина Ф.Г., Шабанова М.Е. О специфическом лечебном эффекте рибонуклеотидов при тапеторетинальных дистрофиях // Вестн. АМН СССР. - 1971. - №7. - С. 63-68; Бунина Т.Л., Хондкариан О.А., Коршунова Т.С. и др. Лечение бокового амиотрофического склероза рибонуклеотидами // Журн. невропатол. и психиатр. - 1976. - №2. - С. 166-174.2).
Новым в предлагаемом изобретении является использование препарата гиалуронидазы, вводимого внутрибрюшинно в дозе 1000 УЕ/кг 1 раз в сутки в течение 2 дней в сочетании с гидролизатом рибонуклеиновой кислоты, состоящим из моно-, ди-, три-, тетра-, пента- и гексануклеотидов с pH 7,2, в дозе 1 мкг/кг веса.
Таким образом, предложен способ увеличения пула стволовых клеток в организме, включающий внутрибрюшинное введение гиалуронидазы в дозе 1000 УЕ/кг веса и отличающийся тем, что одновременно вводят внутрибрюшинно гидролизат рибонуклеиновой кислоты, состоящий из моно-, ди-, три-, тетра-, пента- и гексануклеотидов с pH 7,2 в дозе 1 мкг/кг веса раз в сутки в течение 2 дней.
Факт сочетания применения гиалуронидазы с низкомолекулярным гидролизатом РНК и достижением нового технического результата: создание эффективного способа увеличения резерва стволовых клеток в организме для специалиста является неочевидным.
Заявляемые существенные признаки проявили в совокупности новые свойства, не вытекающие явным образом из уровня техники в данной области. Новые признаки позволяют создать эффективный способ увеличения резерва стволовых клеток в организме. Предлагаемое изобретение может быть использовано в экспериментальной биологии и медицине с выходом в практическое здравоохранение. Идентичной совокупности признаков при исследовании уровня техники по патентной и научно-медицинской литературе не обнаружено.
Исходя из вышеизложенного, следует считать заявляемое техническое решение соответствующим критериям: «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».
Способ осуществляют следующим образом.
Лабораторному интактному животному (мыши) 1 раз в сутки в течение 2 дней внутрибрюшинно вводят гиалуронидазу в дозе 1000 УЕ/кг в смеси с гидролизатом рибонуклеиновой кислоты, состоящим из моно-, ди-, три-, тетра-, пента- и гексануклеотидов с pH 7,2 в дозе 1 мкг/кг веса.
Заявляемая доза и режим введения препаратов подобраны опытным путем и являются оптимальными для получения заявленного технического результата. Повышение дозы и кратности введения отменяют получение заявленного технического результата. Снижение дозы и/или однократное введение препарата значительно снижают эффективность способа.
Предлагаемый способ был изучен в экспериментах на мышах линии Balb\c.
На 5-е сутки с помощью метода лимитирующих разведений определяли количество мезенхимальных (истинных) стволовых клеток (MCK) (Anker P.S., Noort W.A., Scherjon S.A. e.a. Mesenchymal stem cells in human second-trimester bone marrow, liver, lung, and spleen exhibit a similar immunophenotype but a heterogenous multilineage differentiation potential // Haematologica. - 2003. - Vol. 88. - P. 845-852) в костном мозге (Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Шахов В.П. Методы культуры ткани в гематологии. - Томск: Изд-во ТГУ, 1992. - 272 с.), представляющим собой депо стволовых клеток (Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Жданов В.В. Современные взгляды на проблему стволовых клеток и возможности их использования в медицине // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2005. - №4. - С. 184-199).
Обработку результатов проводили методом вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента и непараметрического U-критерия Вилкоксона-Манна-Уитни. Частоту встречаемости МСК в костном мозге определяли с помощью обобщенной линейной модели для распределения Пуассона. Соответствие данных лимитирующих разведений одномерной модели Пуассона оценивалось посредством линейной log-log регрессии. При этом теоретическая фракция отрицательных лунок i распределялась как i=exp(-fxi), где f - частота встречаемости MCK, xi - количество клеток, высаженных в лунку (Bonnefoix T., Bonnefoix P., Callanan M. е.а. Graphical representation of a generalized linear model-based statistical test estimating the fit of the single-hit poisson model to limiting dilution assays // J. Immunol. - 2001. - Vol. 167. - P. 5725-5730). Использовалась программа Statistica 6.0.
Пример 1
Гиалуронидазу, растворенную в 0,2 мл физиологического раствора, смешивали с 0,1 мл раствора гидролизата рибонуклеиновой кислоты, состоящего из моно-, ди-, три-, тетра-, пента- и гексануклеотидов с pH 7,2, вводили интактным животным внутрибрюшинно 1 раз в сутки в течение 2 дней в дозе 1000 УЕ/кг гиалуронидазы (УЕ - условные единицы) и 1 мкг/кг веса гидролизата рибонуклеиновой кислоты. Контрольным мышам в эквивалентном объеме внутрибрюшинно вводили физиологический раствор. На пятые сутки количество МСК было значительно повышено, причем более заметный эффект был продемонстрирован в варианте сочетанного введения гиалуронидазы и низкомолекулярной фракции рибонуклеиновой кислоты (Таблица 1).
Предлагаемый способ позволяет значительно увеличить резерв стволовых клеток в организме путем сочетанного введения гиалуронидазы и низкомолекулярного гидролизата рибонуклеиновой кислоты.