Способ определения содержания ингибитора трипсина в соевом жмыхе или шроте и устройство для его осуществления
METHOD FOR DETERMINATION OF TRYPSIN INHIBITOR CONTENT IN SOYBEAN CAKE OR MEAL AND DEVICE FOR ITS IMPLEMENTATION

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к контролю качества кормов с содержанием сои для крупного рогатого скота, свиней и птицы.
Уровень техники
Известно, что соя, как пищевой продукт, с давних времен привлекает к себе внимание. По содержанию белка, жира и некоторых других питательных веществ она значительно превосходит многие масленичные и злаковые культуры (, Tran G., Kaushik S., 2012. Soybean meal. Feedipedia.org. A programme by INRA, CIRAD, AFZ and FAO. http://www.feedipedia.org/node/674 Last updated on September 3, 2012, 16:02).
Однако применению сои для кормления животных и птиц препятствует наличие ингибитора трипсина в составе сырья (Van Eys, J.Ε., Offner, Α., Bach, Α. (2004). Manual of Quality Analyses for Soybean Pro-ducts in the Feed Industry, American Soy-bean Association United Soybean Board, USA). Ингибитор трипсина - это антипищеварительный фермент, снижающий усвояемость продукта. В результате уменьшается соотношение величины привеса к массе использованных продуктов. Кроме этого ингибитор трипсина может вызывать заболевания животных, такие как гиперплазия поджелудочной железы, или даже смерть. В связи с этим при технологической переработке семян сои должны быть предусмотрены операции, обеспечивающие разрушение ингибиторов. С этой целью применяют влаготепловую обработку семян сои и соевых продуктов - жмыха и шрота. Обычно это делают с помощью экструдеров, прожаркой или обработкой СВЧ излучением.
При повышении температуры или увеличении времени воздействия на сою или соевые бобы или продукты ингибитор трипсина разрушается. Однако при избытке температуры или времени обработки начинается разрушение белков, что также приводит к снижению пищевой ценности корма и, соответственно, к уменьшению привеса.
В связи с вышеуказанным, для нахождения оптимального режима обработки соевого сырья необходимо контролировать содержание ингибитора трипсина. Известен химический метод определения TIA (индекс активности ингибитора трипсина) (van Oort, Μ.G., R.J. Hamer, and E.A. Slager. 1989. The trypsin inhibitor assay: Improvement of an existing method. In: J. Huisman, A.F.B. van der Poel, and I. E. Liener (Ed.) Recent Advances of Research in Antinutritional Factors in Legume Seeds, p 110. Pudoc, Wageningen, The Netherland (аналог).
Этот метод основан на способности ингибиторов формировать комплекс с ферментом, что приводит к снижению активности фермента. Неингибированный трипсин катализирует гидролиз синтетического субстрата ΒΑΡΝΑ, образуя продукт желтого цвета, приводящий к изменению оптического поглощения. Указанный метод, основанный на работе (Kakade, M.L., J.J. Rackis, J.E. McGhee and G. Puski, 1974. Determination of trypsin inhibitor activity of soy products: a collaborative analysis of an improved procedure. Cereal Chem. 51, 376-382) также используется в стандартах (AOCS. 2011b. Trypsin Inhibitor Activity. Offcial Method Ba 12-75. Official Methods and recommended Practices of the AOCS, AOCS, 6th ed., Second Printing, Urbana, IL), (AFNOR XP V18-202, 1997. Aliments des animaux: dosage des inhibiteurs trypsiques. Agence francaisede normalisation, Paris, France, Animal feeding stuffs: determination of trypsin activity of soya products), (ISO International Standard (ISO), no. 14902/International Organization for Standardization, Geneva (Switzerland), 2001 1. ed., 11 p).
Данный метод измеряет количество двух типов ингибиторов трипсина, включая KTI (Kunits trypsin iunhibitor) и BBI (Bowman-Birk inhibitor).
Для проведения анализа необходимы следующие реагенты:
Гексан или петролейный эфир.
1) Раствор гидрохлорида натрия (0.01N).
2) Трис-буфер: растворить 6.05 г трис (гидроксил-метил)-амино-метан и 2.94 г гидрохлорида кальция в 900 мл воды, довести рН до 8.2, затем развести в 1 литре. Нагреть до 37°С перед использованием.
3) Раствор трипсина: развести 4 мг дважды кристаллизованного бессолевого трипсина в 200 мл соляной кислоты (0.001N).
4) Раствор ΒΑΡΝΑ: в водяной бане развести 40 мг (-бензоил D L-аргинин р-нитроанилид (ΒΑΡΝΑ) в 1 мл диметилсульфоксида. Развести с 100 мл с трисбуфером(при 37°С) для использования. Каждый день необходимо приготовлять свежий раствор.
5) Раствор уксусной кислоты (30%): осторожно смешать 30 мл ледяной уксусной кислоты и 70 мл воды.
Требуемое оборудование: мельница, сито с ячейкой 0.15 мм или менее, спектрофотометр с длиной волны 410 нм.
Процедура анализа заключается в следующем.
Образцы должны быть тонко измельчены без избыточного нагрева. Образцы с содержанием жира выше 5% должны быть обезжирены гексаном или петролейным эфиром и высушены перед перемолкой.
Один грамм молотого образца помещается в мерный стакан с магнитной палочкой для магнитной мешалки. Раствор гидроксида натрия наливается в стакан и включается магнитная мешалка на малой скорости. Через 3 часа измеряется величина рН. Она должна быть в интервале от 8.4 до 10.0.
Порция суспензии забирается с помощью серологической пипетки и растворяется в дистиллированной воде, так чтобы концентрация ингибитора трипсина была достаточна для 40-80% ингибирования трипсина.
Серологическими пипетками 0, 0.6, 1.0, 1.4 и 1.8 мл разведенная суспензия помещается в тестовые кюветы. Добавляется вода для доведения объема до 2 мл в каждой кювете.
Через равные интервалы времени 2 мл раствора трипсина добавляется в каждую кювету и быстро смешивается Vortex-мешалкой. Затем помещается в водяную баню с температурой 37°С. 5 мл ΒΑΡΝΑ добавляют в каждую кювету и смешивают Vortex-мешалкой. Образцы инкубируются 10 минут при 37°С. Точно через 10 минут реакцию останавливают добавлением 1 мл уксусной кислоты, с последующим смешиванием Vortex-мешалкой.
Приготовляют пустой образец так же как описано выше, за исключением того, что трипсин добавляется после уксусной кислоты.
Содержание каждой кюветы фильтруется и измеряется поглощение на длине волны 410 нм.
Вычисляют активность ингибитора трипсина в единицах TIU/г. 1 единица TIU определяется как количество фермента, которое увеличивает поглощение на длине волны 410 нм на 0.01 единицы после 10 минут реакции для каждых 10 мл реакционного объема.
Активность ингибитора трипсина определяется как число ингибированных единиц TIU.
обр
TIU (/ml)=(поглощение пустого образца - поглощение образца)/(0.01*V, ml)
Рисуется график TIU в зависимости от объема разведенного раствора образца. Экстраполированное значение объема ингибитора при 0 мл дает окончательную величину TIU/мл. Эта величина используется для вычисления TIU на 1 г образца.
TIU(/г)=TIU (/мл)*d*50,
где d - фактор разведения (конечный объем, деленный на количество в граммах исследуемого твердого образца).
Недостатком данного метода является его сложность, дороговизна и больше время анализа.
Наиболее близким аналогом способа определения содержания ингибитора трипсина в соевых продуктах является химический метод, описанный в ГОСТ Ρ 53799-2010. Аналогичный стандарт используется в США и Европе.
Для реализации способа необходим рН-метр, мерный сосуд (250 мл), водяная баня для поддержания температуры 30°С в течение 30 минут, тестовые кюветы и пипетки.
Способ определяет остаточную активность уреазы соевых продуктов, в качестве непрямого индикатора того, насколько разрушен соевый ингибитор трипсина в результате тепловой или экструзионной обработки сырья. Оба фермента, как уреаза, так и ингибитор трипсина, присутствующие в сое, разрушаются при тепловой обработке.
Используемые реактивы.
1) Мочевина.
2) Известь натронная.
3) Раствор фосфатный буферный образцовый с рН=7.
2
4
2
4
2
4) KНРO или NaHPO*2HO.
2
4
2
5) KНРO*3НO.
2
4
2
4
2
6) NaHPO безводный или NaHPO*12НO.
7) Вода дистиллированная, не содержащая углекислого газа.
Подготовка к измерениям
Дистиллированную воду кипятят на электроплитке в течение 15 минут для удаления углекислого газа и охлаждают в колбе, закрывающейся пробкой, снабженной натронной известью.
3
Буферные растворы готовят следующим образом. Взвешивают на весах с точностью до третьего знака две пробы однозамещенной и двузамещенной солей калия или натрия, растворяют в дистиллированной воде в мерной колбе вместимостью 1000 мл и доводят объем раствора до 1000 см. Полученный буферный раствор А хранят в темном месте не более 1 месяца.
3
3
Для приготовления буферного раствора Б с мочевиной растворяют мочевину в растворе А в колбе вместимостью 500 или 1000 см из расчет 1.5 г мочевины на 50 смраствора А. Раствор Б хранят в темном месте не более 10 дней.
Подготовка образца
Из средней пробы методом диагонального деления отбирают пробу для анализа массой около 10 г. Пробу измельчают до прохода не менее 60% ее через сито с отверстиями диаметром 0.5 мм. Просеянный материал вновь смешивают с остатком на сите и используют для взятия пробы. При масличности продукта более 2%, после измельчения его обезжиривают.
Проведение измерений
3
3
Берут три пробы измельченного материала массой 1±0.01 г и помещают в стеклянные стаканы вместимостью 100 и 150 см. В один стакан приливают 50 смраствора А и помещают его в водяную баню с температурой 30±2°С. Во второй и третий стаканы с интервалом в 5 минут приливают по 50 см3 раствора Б и помещают их немедленно после приливания раствора в ту же водяную баню. Время термостатирования 30 минут, при этом следует каждые 5 минут перемешивать содержимое стаканов стеклянной палочкой, заканчивая перемешивания за 5 минут до конца нагрева. По истечении 30 минут выдержки жидкость над осадком из каждого стакана декантируют в стаканчики прибора и определяют рН каждого раствора в соответствии с инструкцией рН - метра.
1
2
1
Активность уреазы в единицах рН вычисляют по формуле А=pΗ-рН, где pΗ - значение рН в основном измерении (с раствором Б);
2
рН - значение рН в контрольном измерении (с раствором А).
За окончательный результат измерения принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных измерений, расхождения между которыми не должны превышать 30% от среднего арифметического значения рН при доверительной вероятности 0.95. Недостатком прототипа является необходимость отбора проб, сложная пробоподготовка, большое время получения результатов, достигающее 24 часов, необходимость наличия набора реактивов и высококвалифицированного химика для проведения работ. Существенным является также непрямой характер измерений содержания ингибитора трипсина, что не всегда дает возможность сделать однозначные выводы относительно достаточности тепловой обработки для достижения уничтожения ингибитора трипсина в соевом сырье.
Указанные недостатки делают невозможным оперативную регулировку режимов работы экструдера или другого устройства, используемого для тепловой обработки сои.
Раскрытие изобретения
Задачей изобретения является упрощениt процесса и сокращение времени определения концентрации ингибитора трипсина, чтобы обеспечить возможность оперативною управления параметрами тепловой обработки.
В предлагаемом изобретении используется физический метод прямого определения содержания ингибитора трипсина в термически обработанном соевом сырье без пробоподготовки. Соевая мука, шрот или жмых просто насыпается в виалу, затем виала вставляется в спектрофлюориметр. Для определения содержания ингибитора трипсина используется спектрально-люминесцентный метод, заключающийся в облучении соевого жмыха или шрота УФ излучением с длиной волны 365 нм, измерении спектра люминесценции, нормирование спектра на интервал 0-1, измерение интенсивности люминесценции в области 500-700 нм. Нами впервые установлено, что величина нормированной интенсивности в указанной области зависит от содержания ингибитора трипсина в соевом жмыхе или шроте.
Описание чертежей
На фиг. 1 приведен график зависимости нормированных спектров люминесценции образцов с величиной активности уреазы ΔpΗ=1.91 и 0.04.
На фиг. 2 приведен график зависимости нормированных спектров люминесценции образцов с величиной активности уреазы ΔpΗ=0.62 и 0.33.
На фиг. 3 изображена зависимость взвешенной разности нормированных спектров люминесценции образцов с величиной активности уреазы ΔpΗ=0.62 и 0.33.
На фиг. 4 представлена схема устройства для оптического измерения величины содержания ингибитора трипсина в соевом сырье.
Осуществление изобретения
1
2
N
i
i
Были приготовлены образцы соевого жмыха с разной степенью прожарки (температура и продолжительность теплового воздействия). Для каждого из исследуемых образцов проводилось измерение активности уреазы по ГОСТ Ρ 53799-2010. Затем проводилась регистрация спектра люминесценции каждого образца с последующим нормированием спектра на интервал 0-1. Таким образом был получен набор эталонных спектральных кривых S, S, ….S в интервале изменения ΔpΗ от 2.2 до 0.04. Каждому из эталонных спектров S соответствует определенное значение ΔρΗ, где i - номер спектра.
В результате этой операции строится таблица взаимно-однозначного соответствия между измеренным спектром и величиной, определенной по ГОСТ Ρ 53799-2010, активности уреазы в единицах ΔpΗ.
На фиг. 1 представлен график зависимости нормированной интенсивности люминесценции для образца (1) с ΔρΗ=1.91 и образца (2) с ΔpΗ=0.04. Видно, что с уменьшением величины активности уреазы ΔpΗ растет нормированная интенсивность люминесценции в области длин волн 500-700 нм. На фиг. 2 представлены графики зависимостей интенсивности люминесценции для образца (3) ΔpΗ=0.62 и образца (4) с ΔpΗ=0.33. Хотя кривые на фиг. 2 близки друг к другу, различия в нормированной интенсивности в области 500-700 нм могут быть определены достаточно уверено, как это видно из фиг. 3, где изображена взвешенная разница (5) между кривыми (3) и (4). Под взвешенной разницей понимается величина
3
4
3
4
Diff=200*(S-S)/(S+S)
изм
изм
1
2
N
i
i+1
изм
i
изм
i+1
изм
Для определения параметра ΔpΗ текущего образца производится последовательное сравнение нормированного спектра S люминесценции с эталонными спектрами S, S, ….S, и находятся два эталонных спектра S и S, наиболее близкие к S, такие, что в области 500-700 нм S<S, a S>S. Соответствующее данному образцу значение активности уреазы определяется по формуле
изм
i
изм
i
i+1
i
i+1
i
ΔpΗ=ΔpΗ+(S-S)*(ΔpΗ - ΔpΗ)/(S-S),
i
т.е. производится линейная интерполяция между табличными значениями ΔpΗ.
Для проведения регистрации спектров люминесценции используются люминесцентные спектрографы. Известен классический люминесцентный спектрограф «Флюорат-02-ПАНОРАМА» (http://www.lumex.ru/application/14LR01.09-1.pdf), включающий в себя: источник возбуждающего света, фокусирующую линзу, первичный монохроматор, входные и выходные щели, кюветное отделение, вторичный монохроматор, приемник люминесцентного изучения, регистрирующее устройство. В качестве источников возбуждения чаще всего используют мощные УФ-лампы (ртутные, ксеноновые и др.), а также лазеры. Недостатком данного типа приборов является сложность, дороговизна, большой вес и невысокая точность регистрации спектра, так как для возбуждения люминесценции используется очень малая часть интенсивности возбуждающего излучения из-за больших потерь в первичном монохроматоре, что приводит к малому соотношению сигнал/шум для слабо люминесцирующего образца - соевого шрота или жмыха. Известны малогабаритные люминесцентные спектрографы на основе ПЗС - линеек фирмы an Optics http://oceanoptics.com/product/flame-bundle-fluorescence/, где в качестве источника возбуждения используется УФ светодиод с длиной волны 365 нм (прототип). В этом случае не нужен первичный монохроматор. Недостатком прототипа является широкий спектр излучения диода - красное крыло которого попадает в диапазон 400-425 нм, как показано в характеристиках светодиодого источника AvaLight-LED 355/380 (http://www.avantes.com/products/light-sources/item/243-avalight-led-light-sources-for-fluorescence-applications). Другим недостатком является применение использование вертикального держателя твердого образца. Для порошка такой держатель неудобен. Требуется нанесение порошка на подложку, закрывание подложки прозрачной крышкой и закрепление всей конструкции в держателе образцов спектрометра. Этот недостаток определяется тем, что в известных стандартных спектрометрах свет собирается вдоль горизонтальной оси.
Целью предлагаемого устройства является упрощение конструкции и процедуры измерения, повышение точности и воспроизводимости результатов измерений.
В предлагаемом спектрометре нашей конструкции, изображенном на фиг. 4, используется вертикальное расположение оптической оси, вдоль которой распространяется излучение люминесценции. При этом образец соевого продукта (6) насыпается в виалу (7), виала помещается в держатель спектрометра, под которым расположены светодиоды (8) и (9). Используются светодиоды NSHU591B производства Nichia Corporation, угол расходимости 10 градусов, рабочий ток 20 ма, световая мощность 5 мВт. Малая расходимость излучения обеспечивает высокую плотность мощности излучения на облучаемом образце. Процедура помещения виалы в спектрометр не требует дополнительных операций закрывания слоя порошка стеклом и закрепления винтом в держателе спектрометра. Каждый светодиод снабжен оптическим полосовым фильтром (10) и (11), пропускающим излучение в диапазоне 345-385 нм. Используется цветное стекло УФС-8, УФС-6 или интерференционный фильтр. Наличие фильтра является существенным отличием от прототипа, где излучение светодиода с длинами волн 400-425 нм, рассеянное на порошковом образце, частично попадает в приемный тракт спектрометра, изменяя измеряемый спектр люминесценции образца. В качестве виал используем изделия G075Y-27/037-H компании Ihfochroma (www.infochroma.ch) размером 27*37 mm. Эти виалы изготовлены из стекла, практически не люминесцирующего под действием излучения 365 нм. Это также является существенным отличием, так как большинство химической стеклянной посуды обладает сильной люминесценцией, что в случае слабо люминесцирующей сои может искажать результаты измерений, так как спектр люминесценции стекла перекрывается со спектром излучения сои. Люминесценция порошка (6) в виале (7) возбуждаемая УФ излучением светодиодов (8) и (9) с помощью линзы (12) фокусируется на входной щель микроспектрометра Хамаматсу С12880МА (13), размером 20.1*12.5*10.1 мм присоединенного к плате микропроцессора (14). Микроспетрометр С12880 состоит из входной щели, фокусирующей дифракционной решетки и КМОП фоточувствительной линейки с 288 пикселями размером 14×200 микрометров. Сигналы от микроспектрометра обрабатываются в микропроцессорном блоке (14) и через USB порт передаются на управляющий компьютер, проводящий нормирование спектров и вычисление интенсивности нормированной люминесценции в области 500-700 нм. Корпус спектрометра имеет широкое основание (15), обеспечивающее его устойчивость. В отличие от прототипа, не используются оптоволоконные световоды, существенно уменьшающие силу света, попадающего на входную щель микроспектрометра (13). В системе используется от двух до шести светодиодов, что обеспечивает яркую люминесценцию соевого сырья и получение спектров практически без шумов. За 10 секунд производится регистрация и усреднение порядка 300-400 спектров люминесценции, что обеспечивает хорошее соотношение сигнал/шум, и, соответственно, достоверность определения концентрации ингибитора трипсина. Таким образом, за 10 секунд возможно получить информацию, необходимую для корректировки режимов работы экструдера или другого прибора, обеспечивающего тепловую обработку соевого сырья в отличие от прототипа, где требуется 24 часа. Спектрометр получает электрическое питание от разъема USB управляющего компьютера, подключенного к контроллеру. От этого контроллера питаются УФ светодиоды, так что нет необходимости в отдельном источнике электропитания всего устройства. Величина тока через светодиоды определяется контроллером и может управляться через программное обеспечение компьютера. В приборе нет никаких оптических юстировочных приспособлений, что упрощает и удешевляет конструкцию.