СИАЛОВАЯ КИСЛОТА ДЛЯ ПОДДЕРЖКИ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ В ПОЖИЛОМ ВОЗРАСТЕ
SIALIC ACID FOR BOLSTERING IMMUNE SYSTEM IN ELDERLY AGE

Настоящее изобретение в целом относится к области иммунной системы, в частности, к области укрепления иммунной системы в пожилом возрасте. Одно воплощение настоящего изобретения относится к применению обогащенного сиаловой кислотой пищевого продукта для приготовления композиции для укрепления иммунной системы в пожилом возрасте.
В течение процесса старения иммунные функции ослабевают - этот феномен затрагивает каждого человека, а также животных. Ослабление проявляется в увеличении восприимчивости к инфекциям с повышенной заболеваемостью и смертностью.
Например, возрастные изменения в иммунной системе включают изменения в подмножествах Т-клеток, снижение числа необученных Т-клеток и накопление Т-клеток памяти, что в результате приводит к ослаблению функции Т-клеток. Подобным образом, первичные гуморальные ответы у пожилых людей часто являются слабыми и непродолжительными с более низким сродством. Таким образом, иммунная система в пожилом возрасте, как правило, менее способна защищать тело от внешних угроз.
В результате ослабленная иммунная система у пожилых пациентов приводит к большему риску развития инфекций и к обострению инфекций по сравнению с более молодыми взрослыми.
В настоящее время, путем вакцинации сделаны успешные попытки снижения повышенного риска развития инфекций, хотя, как правило, в иммунной системе людей старшего возраста вакцины не столь успешны. Типичные вакцинации, используемые в настоящее время, включают вакцинации против таких заболеваний как грипп, пневмония, гепатит В, туберкулез, дифтерия и столбняк.
Однако в данной области существует потребность в альтернативном инструменте для укрепления иммунной защиты тела.
Авторы изобретения решили удовлетворить данную потребность;
Следовательно, задача настоящего изобретения заключалась в обеспечении композиции, которая доступна каждому, кому она может быть введена без риска нежелательных побочных эффектов, и которая является недорогой и может быть использована для укрепления иммунной системы пожилых людей.
Авторы изобретения с удивлением обнаружили, что они могут, достичь этой цели путем применения в соответствии с пунктом 1.
Сиаловые кислоты (SiAc) являются семейством заряженных моносахаридов с цепью из девяти атомов углерода, производных нейраминовой кислоты (NeuAc) и включающих NeuAc. NeuAc является единственной сиаловой кислотой, образуемой в организме человека в естественных условиях. А в других позвоночных, например, также присутствуют N-гликолилнейраминовые кислоты (NeuGc).
В настоящее время, сиаловые кислоты часто применяются в области детского питания. Например, возможное участие SiAc в когнитивном развитии детей было резюмировано в работе Wang (Wang, В. and Brand-Miller, J. (2003) Eur. J. Clin. Nutr. Nov; 57(11): 1351-69). Вкратце, исследования, в которых сравнивали младенцев, вскармливаемых грудным молоком и детской смесью, продемонстрировали, что более высокое содержание NeuAc в грудном молоке, по сравнению с нормальной детской смесью, коррелирует с повышенным содержанием NeuAc в слюне и мозге младенцев. Однако поведенческие эффекты при дополнении диеты NeuAc у людей отсутствуют. Тем не менее, предполагается, что добавление к коровьему молоку NeuAc будет придавать коровьему молоку атрибуты человеческого молока, что может оказывать влияние на развитие мозга у детей.
Естественными источниками, богатыми NeuAc, являются человеческое молоко, слоновье молоко, молоко индийского буйвола, мясо, яйца и рыба.
Авторы изобретения, обнаружили, что с успехом сиаловую кислоту можно вводить не только младенцам, но также она является особенно эффективной при укреплении иммунной системы в пожилом возрасте.
Введение композиции настоящего изобретения пожилым животным приводит к улучшению клеточного иммунного ответа, что измеряется по гиперчувствительности замедленного типа. Одновременно, в печени животных, получавших композицию настоящего изобретения, повышалась экспрессия генов, кодирующих антивоспалительные молекулы или молекулы, вовлеченные в защиту от окислительного повреждения, по сравнению с контрольной группой.
Не желая быть связанными теорией, авторы в настоящее время допускают, что улучшение иммунного ответа может быть объяснено уменьшением воспаления и окислительного повреждения, обнаруженных в печени, которые, по всей видимости, увеличиваются с возрастом и могут быть снижены при введении указанной композиции, обогащенной сиаловой кислотой.
Было бы предпочтительнее, если бы для этой цели можно быть использовать N-ацетилнейраминовую кислоту, поскольку она является сиаловой кислотой, естественно образуемой у человека.
P. Gorog et al, описывают антивоспалительный эффект сиаловой кислоты (Agents and Actions, vol.8, no.5, 1987, 543-545).
В WO 2005/056047 описывается применение сиаловой кислоты и его аналогов в качестве антивоспалительных агентов.
В JP 2048529A раскрывается факт того, что N-ацетилнейраминат (I) обладает эффектом ингибирования аллергии I-типа.
Однако введение N-ацетилнейраминовой кислоты как таковой приводит к очень быстрому, «резкому» поглощению, а системное повышение концентрации N-ацетилнейраминовой кислоты запускает быстрое восстановление уровней циркулирующей N-ацетилнейраминовой кислоты путем повышенной экскреции ее в мочу.
Было бы желательно обеспечить N-ацетилнейраминовую кислоту в форме, которая позволяла бы избегать образования пика N-ацетилнейраминовой кислоты и происходящего в результате увеличения экскреции N-ацетилнейраминовой кислоты.
Вследствие этого задача настоящего изобретения заключалась в улучшении уровня техники и в обеспечении естественного, усиливающего иммунитет агента, остающегося биодоступным в течение продолжительных периодов времени и являющегося, в частности, полезным в пожилом возрасте.
Авторы добились выполнения этой задачи с помощью объекта изобретения независимых пунктов. Зависимые пункты дополнительно развивают настоящее изобретение.
Следовательно, одно воплощение настоящего изобретения заключается в композиции, содержащей белковую фракцию, содержащую N-ацетилнейраминовую кислоту, связанную с пептидным/белковым каркасом, обогащенным треонином, для лечения и профилактики заболеваний, связанных с измененной иммунной системой.
Настоящее изобретение также относится к применению композиции, содержащей белковую фракцию, содержащую N-ацетилнейраминовую кислоту, связанную с пептидным/белковым каркасом, обогащенным треонином, для приготовления композиции для лечения и профилактики заболеваний, связанных с измененной иммунной системой.
Обогащение треонином означает, что содержание треонина выше, чем средняя распространенность его в белковой массе у человека. Например, содержание треонина может быть повышено, по меньшей мере, на 10% по сравнению со средним содержанием треонина в белковой массе у человека.
Таким образом, треонин может составлять, по меньшей мере, 6,3 молярных % аминокислот в белковой фракции.
Например, треонин может присутствовать в количестве от около 8 до 22% от общего числа аминокислот.
Белковая фракция может дополнительно содержать N-ацетилнейраминовую кислоту от около 7 до 25 масс.%.
N-ацетилнейраминовая кислота может быть представлена в гликансвязанной форме. Например, N-ацетилнейраминовая кислота может быть представлена в форме, связанной с гликопротеинами и/или протеогликанами.
В соответствии с особенно предпочтительным воплощением настоящего изобретения, содержащая N-ацетилнейраминовую кислоту (NeuAc) белковая фракция характеризуется пептидным/белковым каркасом, обогащенным треонином (содержание которого составляет от 8 до 22% от общего числа аминокислот) и NeuAc, содержание которой составляет от 7 до 25 масс.%.
N-ацетилнейраминовая кислота может быть представлена в виде олигосахаридного ингредиента, который, например, содержит гликокозилированные аминокислоты и пептиды общей формулы, RnSacm, где R является аминокислотным остатком; Sac является моносахаридом, выбранным из группы содержащей N-ацетилнейраминовую кислоту, N-ацетилгалактозамин и галактозу; n имеет значение от 1 до 10 с той оговоркой, что если значение n имеет значение 1, то R является остатком треонина или серина, а если n имеет значение от 2 до 10, то пептид содержит, по меньшей мере, один остаток треонина или серина; m имеет значение от 2 до 4; а на N-ацетилнейраминовую кислоту приходится по меньшей мере 15 молярных % ингредиента.
Предпочтительно, если n имеет значение от 1 до 3, a m имеет значение 3 или 4.
Ингредиент содержит, по меньшей мере, 15 молярных % сиаловой кислоты, как части сахаридной цепи, связанной с гидроксильной группой треонина или серина. Сиаловая кислота может стать частью цепи или может сама по себе быть заместителем моносахаридной единицы в цепи.
Предпочтительно, если олигосахаридный ингредиент содержит следующие моносахариды: -
Соединение
молярный %
N-ацетилгалактозамин (GalNAc)
20-25
галактоза (Gal)
20-25
N-ацетилнейраминовая кислота (NeuAc)
40-17,5
Олигосахаридный ингредиент может содержать от 20 до 25 молярных % смеси серина и треонина.
Олигосахаридный ингредиент может содержать следующие гликозилированные аминокислоты или пептиды: -
n
NeuAc-α-2,3-Gal-β-1,3-(NeuAc-α-2,6-)-GalNAc-R
n
NeuAc-α-2,3-Gal-β-1,3-GalNAc-R
n
Gal-β-1,3-(NeuAc-α-2,6-)-GalNAc-R
n
Gal-β-1,3-GalNAc-R
Олигосахаридный ингредиент изобретения может быть приготовлен с помощью либо совместного, либо последовательного гидролиза CGMP экзопротеазой и эндопротеазой для получения смеси свободных аминокислот и пептидов с длиной цепи от 2 до 10 и с помощью нанофильтрации гидролизованной смеси для сохранения фракции, обладающей молекулярной массой от 1000 до 2000 Дальтон.
CGMP сам по себе является побочным продуктом сыроварения, при котором цельное молоко обрабатывается ферментом реннином для осаждения казеина. В этом процессе CGMP отщепляется от К-казеина и остается в растворе с сывороточными белками. Этот продукт известен как сладкая сыворотка. CGMP может быть отделен от сыворотки любым способом, известным в данной области. Подходящий способ описан в Европейском Патенте No. 986312.
Не будучи связанными теорией, авторы предполагают, что белковая фракция, содержащая N-ацетилнейраминовую кислоту, связанную с пептидным/белковым каркасом, обогащенным треонином, например, гликансвязанную N-ацетилнейраминовую кислоту, является предпочтительной по сравнению со свободной N-ацетилнейраминовой кислотой, по следующим причинам. Свободная N-ацетилнейраминовая кислота приводит к очень быстрому, «резкому» поглощению, а системное повышение концентрации N-ацетилнейраминовой кислоты запускает быстрое восстановление уровней циркулирующей N-ацетилнейраминовой кислоты путем повышенной экскреции ее в мочу. Белковая фракция, содержащая N-ацетилнейраминовую кислоту, связанную с пептидным/белковым каркасом, обогащенным треонином, позволяет избежать этого. Например, гликансвязанная N-ацетилнейраминовая кислота достигает всех сегментов кишечника что приводит (i) к медленному "затяжному". поглощению N-ацетилнейраминовой кислоты по всей длине кишечника, включая нижний отдел тонкой кишки и толстую кишку, и (ii) к стимуляции полезной кишечной микробиоты. Полезная кишечная микробиота, такая как некоторые бифидобактерии, отщепляет N-ацетилнейраминовую кислоту от каркаса, например, гликанового каркаса, способствуя поглощению N-ацетилнейраминовой кислоты в нижней части кишечника, а затем использует каркас в своих целях, например, гликановый каркас, который рассматривается как обладающий дополнительным, стимулирующим иммунитет хозяина посредством благоприятной микробиоты, эффектом. Таким образом, видна синергичная польза от N-ацетилнейраминовой кислоты связанной с пептидным/белковым каркасом, обогащенным треонином, например, гликансвязанной N-ацетилнейраминовой кислотой, по сравнению со свободной N-ацетилнейраминовой кислотой.
Композиция может быть введена пожилым пациентам.
Настоящее изобретение также относится к применению N-ацетилнейраминовой кислоты для приготовления композиции для укрепления иммунной системы пожилых пациентов.
Настоящее изобретение также относится к применению N-ацетилнейраминовой кислоты для приготовления композиции для лечения или профилактики заболеваний, связанных с измененной иммунной системой.
Измененная иммунная система может быть нарушением регуляции иммунной системой, при котором отмечено снижение клеточного иммунного ответа с сопутствующим повышением гуморальной иммунной дисфункции, как это часто случается у пожилых пациентов.
Это может приводить к снижению ответа на вакцины. Композиция по настоящему изобретению может применяться для получения стимулирующего эффекта в ответ на вакцину. Следовательно, она может использоваться для повышения эффекта вакцинации.
Типичными вакцинациями, которые могут стать более эффективными с помощью композиции настоящего изобретения, являются применение вакцин против заболеваний, таких как грипп, пневмония, гепатит В, туберкулез, дифтерия и столбняк.
Композиция настоящего изобретения может быть, следовательно, введена совместно с вакциной. Для целей настоящего изобретения совместное введение включает введение композиции настоящего изобретения за три месяца до периода вакцинации и три месяца после периода вакцинации.
Предпочтительно, если композиция настоящего изобретения вводится в течение периода вакцинации.
Настоящее изобретение в следствие этого также относится к композиции, содержащей белковую фракцию, содержащую N-ацетилнейраминовую кислоту, связанную с пептидным/белковым каркасом, обогащенным треонином, которая вводится с вакциной против гриппа, гепатита В, туберкулеза, дифтерии или столбняка для предотвращения гриппа, гепатита В, туберкулеза, дифтерии, или столбняка, соответственно.
Пациент считается «пожилым», если он преодолел первую половину его среднеожидаемой в стране происхождения продолжительности жизни, предпочтительно, если он преодолел первые две трети среднеожидаемой в стране происхождения продолжительности жизни, более предпочтительно, если он преодолел первые три четверти среднеожидаемой в его стране происхождения продолжительности жизни, наиболее предпочтительно, если он преодолел первые четыре пятых среднеожидаемой в его стране происхождения продолжительности жизни.
Композиция может быть введена людям или животным, в частности, комнатным животным, домашним животным и/или домашнему скоту.
Настоящее изобретение также относится к композиции, обогащенной N-ацетилнейраминовой кислотой.
N-ацетилнейраминовая кислота имеет следующие синонимы и сокращения: о-сиаловая кислота; 5-ацетамидо-3,5-дидезокси-D-глицеро-D-галакто-2-нонулосоновая кислота, 5-ацетамидо-3,5-дидезокси-D-глицеро-D-галактононулосоновая кислота; ацетилнейраминовая кислота, N-ацетил-нейраминат, N-ацетилнейраминовая кислота; NANA и Neu5Ac.
Композиция настоящего изобретения может быть пищевой композицией, нутрицевтиком, напитком, пищевой добавкой или лекарственным средством. Например, пищевая добавка или лекарственное средство могут быть в форме таблеток, капсул, пастилок или жидкостей. Пищевые добавки или лекарственные средства предпочтительно предоставляются в виде составов с замедленным высвобождением, позволяющих постоянное поступление N-ацетилнейраминовой кислоты в течение длительного периода времени.
Композиция предпочтительно выбирается из группы, состоящей из продуктов на основе сухого молока, быстрорастворимых напитков, готовых к употреблению питьевых составов, питательных порошков, продуктов на основе молока, в частности йогуртов или мороженного, зерновых продуктов, напитков, воды, кофе, каппучино, солодовых напитков, ароматизированных шоколадом напитков, кулинарных продуктов, супов, кремов местного действия, суппозиториев, таблеток, сиропов, и составов для трансдермального применения.
Молоко может быть любым молоком доступным из животных и растительных источников, и предпочтительно является коровьим молоком, человеческим молоком, овечьим молоком, козьим молоком, лошадиным молоком, верблюжьим молоком, рисовым молоком или соевым молоком.
Вместо молока также могут использоваться белковые фракции, полученные из молока, или молозиво.
Композиция может дополнительно содержать защитные гидроколлоиды (такие как камеди, белки, модифицированные крахмалы), связующие, пленкообразующие агенты, инкапсулирующие агенты/материалы, стенкообразующие/оболочечные материалы, матричные соединения, покрытия, эмульгаторы, поверхностно-активные соединения, солюбилизирующие агенты (масла, жиры, воски, лецитины и т.п.), адсорбенты, носители, наполнители, со-соединения, диспергирующие агенты, увлажняющие агенты, технологические добавки (растворители), антислеживающие агенты, вкусомаскирующие агенты, утяжелители, желирующие агенты, гельформирующие агенты, антиоксиданты и антимикробные агенты. Она также может содержать обычные фармацевтические добавки, адъюванты и разбавители, включая, в частности, воду, желатин любого происхождения, растительные камеди, лигнинсульфонат, тальк, сахара, крахмал, гуммиарабик, растительные масла, полиалкиленгликоли, ароматизаторы, консерванты, стабилизаторы, эмульгаторы, буферы, смазочные материалы, красители, увлажнители, наполнители и т.п. Кроме того, она может содержать органический и неорганический материал, подходящий для перорального или энтерального введения, а также витамины, микроэлементы, и другие питательные микроэлементы в соответствии с рекомендациями Правительства, такими как USRDA.
Например, композиция может содержать ежедневную дозу одного или нескольких следующих питательных микроэлементов в данных диапазонах: 300-500 мг кальция, 50-100 мг магния, 150-250 мг фосфора, 5-20 мг железа, 1-7 мг цинка, 0,1-0,3 мг меди, 50-200 мкг йода, 5-15 мкг селена, 1000-3000 мкг бета-каротина, 10-80 мг витамина С, 1-2 мг витамина В1, 0,5-1,5 витамина В6, 0,5-2 мг витамина В2, 5-18 мг ниацина, 0,5-2,0 мкг витамина В12, 100-800 мкг фолиевой кислоты, 30-70 мкг биотина, 1-5 мкг витамина D, 3-10 мкг витамина Е.
Композиция настоящего изобретения может содержать источник белков, источник углеводов и/или источник жиров.
Может быть использован любой подходящий диетический белок, например, животные белки (такие как молочные белки, мясные белки и яичные белки); растительные белки (такие как соевый белок, пшеничный белок, рисовый белок и гороховый белок); смеси свободных аминокислот; или их комбинации. Молочные белки,, такие как казеин и сыворотка, и соевые белки являются особенно предпочтительными. Весьма положительные результаты для этих целей настоящего изобретения были получены с белковой фракцией, содержащей треонин в количестве от около 8 до 22% от общего числа аминокислот в белковой фракции.
Если композиция включает источник жира, то более предпочтительно, если источник жира обеспечивает от 5% до 40% энергии смеси, например, 20-30% энергии. Может быть добавлена DHA. Подходящий профиль жира может быть получен с помощью смеси масла канолы, кукурузного масла и подсолнечного масла с высоким содержанием олеиновой кислоты.
Более предпочтительно, если источник углеводов может обеспечивать 40%-80% энергии композиции. Может быть использован любой подходящий углевод, например, сахароза, лактоза, глюкоза, фруктоза, сухая кукурузная патока, мальтодекстрин или их смеси.
Композиция настоящего изобретения может быть использована для лечения или профилактики изменений иммунной системы и/или для улучшения измененных клеточного и гуморального иммунных ответов.
Изменения иммунной системы может быть выбрано из группы, состоящей из: инфекций, в частности, из бактериальных, вирусных, грибковых и/или паразитических инфекций; аутоиммунно-подобных заболеваний; заболеваний врожденного иммунитета, например, дефицита NK-клеток, дефицита фагоцитов, такого как нарушение адгезии лейкоцитов, циклическая нейтропения; и их комбинаций. Аутоиммунно-подобные заболевания включают аутоиммунные заболевания.
Композиция настоящего изобретения может также быть использована для лечения или профилактики инфекционных заболеваний. N-ацетилнейраминовая кислота, например, будет укреплять иммунную систему тела которая в свою очередь будет бороться с инфекциями.
Иммуностимулирующий эффект композиции также может быть усилен добавлением по меньшей мере одного дополнительного иммуностимулирующего агента.
Композиция также может содержать пробиотический микроорганизм и/или пребиотик такой как, например, фруктоолигосахариды, галактоолигосахариды, пектины и/или их гидролизаты.
«Пробиотик» означает препараты микробных клеток или компоненты микробных клеток с благоприятным эффектом, оказываемым на здоровье или самочувствие организма-хозяина. (Salminen S, Ouwehand A. Benno Y. et al "Probiotics: how should they be defined" Trends Food Sci. Technol. 1999:10 107-10).
Все пробиотические микроорганизмы могут использоваться в соответствии с настоящим изобретением. Предпочтительно, они выбираются из группы, состоящей из Bifidobacterium, Lactobacillus, Streptococcus и Saccharomyces или их смесей, в частности, выбираются из группы, состоящей из Bifidobacterium longum, Bifidobacterium lactis, Lactobacillus Acidophilus, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus salivarius, Enterococcus faecium, Saccharomyces boulardii и Lactobacillus reuteri или их смесей, предпочтительно выбираются из группы, состоящей из Lactobacillus johnsonii (NCC533; CNCM 1-1225), Bifidobacterium longum (NCC490; CNCM 1-2170), Bifidobacterium longum (NCC2705; CNCM 1-2618), Bifidobacterium lactis (2818; CNCM 1-3446), Lactobacillus paracasei (NCC2461; CNCM 1-2116), Lactobacillus rhamnosus GG (ATCC53103), Lactobacillus rhamnosus (NCC4007; CGMCC 1,3724), Enterococcus faecium SF 68 (NCIMB101415) и их смесей.
Композиция настоящего изобретения может также содержать обезболивающий агент, стабилизирующий агент, ароматизирующий агент, краситель, смазывающее вещество и/или пребиотик.
Пребиотики являются, в частности, предпочтительными в композиции содержащей пробиотики, поскольку присутствие пробиотиков и пребиотиков производит синергичный эффект.
Под «пребиотиком» понимаются пищевые субстанции, которые способствуют росту пробиотиков в кишечнике. Они не разрушаются в желудке и в верхней части кишечника или не адсорбируются в ЖК-тракте принимающих их персоны, но они ферментируются желудочно-кишечной микрофлорой и/или пробиотиками. Пребиотики, например, определены в работе Glenn R. Gibson and Marcel В. Roberfroid, Dietary Modulation of the Human Colonic Microbiota: Introducing the Concept of Prebiotics, J. Nutr. 1995 125: 1401-1412.
Пребиотики, которые могут быть использованы в соответствии с настоящими изобретениями, ничем особенным не ограничены и включают все пищевые субстанции, которые способствуют росту пробиотиков в кишечнике. Предпочтительно, они могут быть выбраны из группы, состоящей из олигосахаридов, необязательно содержащих фруктозу, галактозу, маннозу; пищевых волокон, в частности, растворимых волокон, соевых волокон; инулин; или их смесей. Предпочтительными пребиотиками являются фруктоолигосахариды, галактоолигосахариды, изомальтоолигосахариды, ксилоолигосахариды, олигосахариды сои, гликозилсахароза, лактосахароза, лактулоза, палатинозоолигосахариды, мальтоолигосахариды, камеди и/или их гидролизаты, пектины и/или их гидролизаты.
Было обнаружено, что эффект N-ацетилнейраминовой кислоты в композиции настоящего изобретения будет является, по существу, дозозависимым. Малые количества будут производить меньшие эффекты, а большие количества могут быть настолько большими, что тело не сможет использовать всю предоставленную N-ацетилнейраминовую кислоту. Например, точное количество предоставляемой N-ацетилнейраминовой кислоты будет зависеть от пациента, подлежащего лечению, и от его состояния. Хотя в целом любое количество N-ацетилнейраминовой кислоты будет производить благоприятное воздействие, было обнаружено, что особенно предпочтительно, если N-ацетилнейраминовая кислота присутствует в композиции в количестве 1-250 мг/г сухой массы композиции.
N-ацетилнейраминовая кислота может быть введена в ежедневном количестве 1 мг-2 г /кг массы тела, предпочтительно, 0,025 г - 0,8 г массы тела подлежащего лечению пациента.
Специалист в данной области поймет, что можно свободно комбинировать все признаки описанного здесь настоящего изобретения, не отходя от раскрытого объема изобретения. В частности, признаки, описанные для применений настоящего изобретения, могут быть применены к композиции настоящего изобретения и наоборот.
Дополнительные преимущества и признаки настоящего изобретения наглядно представлены в приведенных ниже Примерах и Фигурах.
Фигуры:
На Фигуре 1 показан ответ опосредованной клеточным иммунитетом гиперчувствительности замедленного типа (DTH) у старых мышей не получавших (AIN-93, n=10) или получавших SiAc (SiAc, n=10).
На фигуре 2 показана экспрессия мРНК, кодирующих молекулы, которые вовлечены в антивоспалительный процесс (TGF-β2) и которые играют роль в защите от окислительного повреждения (НО-1 и SOD-2) в печени старых мышей не получавших (AIN-93, n=8) или получавших SiAc (SiAc, n=8) в течение 42 дней.
Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения
Старение связано с нарушением регуляции иммунной системы, такими как отмеченное снижение клеточного иммунного ответа с сопутствующим усилением гуморальной иммунной дисфункции (например, более слабым ответом на вакцину). Кроме того, старение связано со статусом слабо выраженного воспаления и статусом повышенного окислительного стресса. Следовательно, в частности, большое количество пожилых пациентов имеют повышенный риск инфекционных и неинфекционных заболеваний, что вносит вклад в заболеваемость и смертность.
План исследования для оценки модуляции иммунитета у старых мышей
Специфические беспатогенные самцы мышей C57BL/6J (4-х недельные) были приобретены у «Janvier» (Франция). Мышей размещали в обычной среде (12 часовой светотемновой цикл, температура 22 С, влажность 56%) и давали воду и неограниченно полусинтетическую диету «Kliba 3436». До возраста 5 месяцев, мышей содержали по 5 на клетку и затем их рассаживали индивидуально. Все условия и обращение с животными были одобрены «Nestle» и государственными этическими комитетами, с согласия советника швейцарской федеральной службы по ветеринарии. 19-месячных старых мышей рандомизировали в 2 группы по 10 животных и кормили полусинтетической диетой «AIN-93», либо без добавления (контрольная группа AIN-93, n=10), либо с добавлением SiAc (0,8 масс.% N-ацетилнейраминовой кислоты в диете) (группа SiAc, n=10). В течение 42 дней исследования, всем мышам было позволено пить и есть без ограничений.
Ответ гиперчувствительности замедленного типа использовали в качестве меры измерения клеточного иммунитета in vivo. Измерения толщины уха (отек уха) проводили до, и в период 24 часа-6 дней после, выявления, позволяющего определять способность образовывать ответ гиперчувствительности замедленного типа. Вкратце, на 15 день исследования, мышей иммунизировали подкожной инъекцией (100 мкл) 100 мкг инертного антигена «Keyhole Limpet Haemocyanin» («KLH», Sigma) в 1% квасцах (Brenntag Biosector, Фредерикссунд, Дания). Через семь дней после иммунизации, ответ гиперчувствительности замедленного типа выявляли инъекцией диагностического антигена «KLH» (10 мкл 0,5 мкг/мл) в правом ухе каждой мыши. Левые уши инъецировали только носителем (раствор солей = PBS) и использовали в качестве внутренних контролей для каждого животного. Через 24 часа после выявления, и в течение последующих 5 дней, измеряли ухо без ответа (левое ухо) и ухо с ответом (правое ухо). Ответы гиперчувствительности замедленного типа (KLH-PBS) выражали в виде величины опухания уха, т.е. по изменению толщины уха с помощью следующей формулы: Δ толщины уха = [толщина уха с ответом (правое, «KLH»] - толщина уха без ответа (левое, PBS)], где Δ толщины уха = [толщина уха после выявления - толщина уха до выявления].
Мышей умерщвляли на 42 день исследования. Экспрессию генов, вовлеченных в воспалительные процессы, определяли в печени стареющих мышей, которым давали или не давали SiAc вы течение 42 дней.
При аутопсии, печень удаляли и кусок ее немедленно замораживали в жидком азоте и затем хранили при -80 С до дальнейшего анализа.
Образцы печени переносили в 1 мл лизирующего буфера для выделения РНК ((Macherey-Nagel, Дюрен, Германия) и гомогенизировали с помощью «Ribolyzer» (Hybaid, Валтхом, Массачусетс, США) со следующими настройками: мощность 6, в течение 20 секунд. Экстракцию РНК проводили с помощью коммерчески доступного набора (NucleoSpin RNA II Kit; Macherey-Nagel, Дюрен, Германия). Количественное определение РНК проводили с помощью набора «Ribogreen RNA Quantitation Kit» (Molecular Probes; Юджин, Орегон, США), а качество РНК проверяли с помощью набора «Agilent RNA 6000 Nano LabChip Kit» (Agilent Technologies, Пало Алто, США). Тотальную РНК (2 мкг) обратно транскрибировали с помощью обратной транскриптазы «Multiscribe» следуя инструкциям производителя (Applied biosystems, Biosystems; Роткреуз, Швейцария).
-ΔCt
6
Изготовленные по заказу эрреи с низкой плотностью (LDA) с зондами «TaqMan» были приобретены у «Applied Biosystems» (Фостер Сити, США) и использованы в соответствии с инструкциями производителя. Экспрессию генов вычисляли с помощью способа относительного количественного анализа «ΔΔCt» с помощью программного обеспечения «SDS 2.2.2» (Applied Biosystems). Полученные циклические пороговые значения (Ct) экспортировали в «MS Excel» (Microsoft, США) для дальнейшего анализа. Вкратце, вначале рассчитывали значение ΔCt (т.е. значение Ct целевого гена - значение Ct гена домашнего хозяйства GAPDH), а затем относительную экспрессию мРНК определяли с помощью следующей формулы: 2×10. Данные анализировали с помощью средних значений +/- стандартная средняя ошибка и теста Стьюдента (непарного) или при необходимости с помощью двухфакторного теста ANOVA. Значения вероятности меньше чем 5% были признаны значащими.
Результаты:
Иммуностимулирующие эффекты добавления SiAc в диету старых мышей
Диетическая добавка с SiAc (0,8% масс.% N-ацетилнейраминовой кислоты включенной в диету) улучшала клеточный иммунный ответ (Фигура 1) у старых мышей. Эта добавка облегчает возрастное слабовыраженное воспаление и окислительное повреждение (Фигура 2), что наблюдается по увеличению экспрессии генов, кодирующих антивоспалительную молекулу (например, TGF-β2) или молекул, вовлеченных в процесс защиты от окислительного повреждения (например, НО-1 и SOD2).