ДВУХФОТОННЫЙ СКАНИРУЮЩИЙ МИКРОСКОП
TWO-PHOTON SCANNING MICROSCOPE

Изобретение относится к области физических и химических исследований свойств материалов, в частности касается конструкции автоматизированного цифрового микроскопа для исследования микро- и наноструктур на длинах волн второй оптической гармоники и двухфотонной люминесценции.
Двухфотонная микроскопия является частным случаем многофотонной микроскопии и находит широкое применение при изучении различных физических и биологических явлений и объектов, как правило, в конфокальной геометрии. Данный метод диагностики материалов включает в себя такие методики, как генерация второй оптической гармоники (ГВГ) и двухфотонная люминесценция (ДФЛ).
На сегодняшний день основное применение многофотонной конфокальной микроскопии - биология. Это связано с тем, что данная методика позволяет получать трехмерные изображения тканей за счет изменения фокусировки лазерного излучения (W.Denk, J.Н.Strickler, and W.W.Webb, Science 248, 73-1990), что оказывается возможным в связи с существенно большей глубиной проникновения излучения на основной длине волны (700-1000 нм) в биологические ткани (биологическое окно прозрачности - B.J.Tromberg, N.Shah, R.banning, A Cerussi, J.Espinoza, T.Pham, L.Svaasand, J.Butler. Neoplasia. 2000, 2(1-2). Для исследования материалов методом двухфотонной микроскопии разработаны коммерческие образцы двухфотонных микроскопов. Такого рода приборы присутствуют в модельном ряду компаний, занимающихся изготовлением оптических микроскопов и комплектующих к ним, например Nikon(AlR MP), Olympus (FV1000 MPE), Carl Zeiss (LSM 510 NLO). Для исследования твердотельных микроструктур (для микроэлектроники) выпускаются конфокальные профилометры, однако эти приборы являются однофотонными, и их функциональные возможности достаточно ограничены.
Так, например, известен конфокальный сканирующий микроскоп, характеризующийся тем, что содержит платформу для размещения исследуемого образца, источник лазерного излучения для направления излучения через ориентировано расположенные под утлом к направлению излучения зеркала для последующей передачи излучения на образец, размещенный на платформе, кроме того, в системе присутствует большое количество направляющих зеркал и фокусирующих линз для передачи отраженного излучения в блоке его приема и обработки (US №7180661, G02B 21/06, G01J 3/30, F21V 9/16, опубл. 20.02.2007). Принято в качестве прототипа. Особенностью данного микроскопа является также то, что часть направляющих излучение зеркал выполнены с автономными приводами, используемыми для регулировки положения этих зеркал при настройке пара метров излучения по отношению к исследуемому образцу.
В исследовательских лабораториях двухфотонная микроскопия используется для получения изображения полупроводниковых металлических наноструктур (Shuhua Yue, Mikhail N.Slipchenko, and Ji-Xin Cheng, Multimodal nonlinear optical microscopy, Laser Photonics Rev., 1-17 (2011), а также доменной структуры (V.Kirilyuk, A.Kirilyuk, and Th.Rasing. Appl. Phys. Lett. 70 (17), 28 April 1997; Th. Lottermoser, D.Meier, R.V.Pisarev, and M.Fiebig, Phys. Rev. В 80, 100101(R) (2009) в сегнетоэлектрических и мультиферроидных пленках. Очевидно, что для полноценного анализа параметров неорганических твердотельных структур функции микроскопов, ориентированных на биологические объекты, недостаточно. Это связано с особенностями генерации второй оптической гармоники и двухфотонной люминесценции в неорганических твердотельных микро- и наноструктурах.
Большое количество твердотельных микро- и наноструктур являются эпитаксиальными, то есть в них сохраняются кристаллографические направления (в отличие от биологических объектов, которые, как привило, изотропны, хотя есть и исключения (Benedicto de CamposVidal, Maria Luiza S.Mello, Acta histochemica 112 (2010) 53-61). В свою очередь, векторное поле второй гармоники определяется векторным полем накачки  и тензором нелинейной восприимчивости второго порядка
Данное выражение определят векторное поле второй гармоники в простейшем случае нецентросимметричной среды. Однако в случае центросимметричных объектов, а также магнитных материалов выражения для поля ВГ более сложные (М. Fiebig, V. V. Pavlov, and R.V. Pisarev JOSA B, Vol.22, Issue 1, pp.96-118 (2005).
При этом именно компоненты тензора χ несут информацию об особенностях твердотельных структур (это могут быть как абсолютные величины компонент тензора χ, так и их зависимости от приложенных внешних воздействий, например, электрического и магнитного полей) и определяют контраст нелинейно-оптического изображения. Это означает, что особую важность приобретают поляризационные изображения, которые отличаются от случая однофотонного микроскопа. В последнем достаточно получить изображения при скрещенной и параллельной ориентации поляризатора и анализатора. В случае двухфотонной микроскопии твердотельных кристаллических структур важную роль играет также ориентация векторов электрического поля накачки и второй оптической гармоники относительно кристаллографических осей нано- и микроструктур.
При исследовании микро- и наноструктур, формирующих упорядоченные массивы, необходимо иметь возможность изменять углы падения и регистрации излучения, поскольку такие структуры могут обладать запрещенной фотонной зоной (ЗФЗ), которая определяет возможные направления распространения света при отражении и пропускании света (J.D.Joannopoulos, R.D.Meade, and J.N.Winn, Photonic Crystals, Princeton University Press, Princeton, NJ, 1995). Однако и в случае неупорядоченных структур исследование угловых зависимостей может оказаться необходимым. При случайной ориентации нанокристаллитов возможно изменение характера пространственного распределения интенсивности второй гармоники (ВГ) и двухфотонной люминесценции. Также при рассеянии света в массиве микро- и наноструктур (например, оксида цинка - J.Fallert, R.J.B.Dietz, M.Hauser, F.Stelzl, C.Klingshirn, H.Kalt, Journal of Luminescence, 129, 2009, 1685-1688) возможно формирование замкнутых траекторий света, что может привести к эффекту, называемому случайной лазерной генерацией. Формирование резонатора происходит случайным образом. Это приводит к тому, что результирующее лазерное излучение не имеет выделенного направления, поэтому для полноценного исследование случайной лазерной генерации необходимо исследование диаграмм рассеяния.
Настоящее изобретение направлено на достижение технического результата, заключающегося в повышении эксплуатационных характеристик за счет возможности проведения сканирования поверхности и регистрации излучения на определенной длине волны с помощью фотоэлектронного умножителя (ФЭУ) и сканирования с регистрацией спектрального состава излучения в отдельной точке с помощью ПЗС-матрицы, а также возможности измерения угловых зависимостей излучения.
Указанный технический результат достигается тем, что двухфотонный сканирующий микроскоп содержит платформу для размещения исследуемого образца, выполненную с возможностью перемещения по крайней мере в вертикальном и горизонтальном направлениях, источник лазерного излучения для направления излучения через оптико-механический прерыватель, используемый для модуляции и предварительного снижения мощности излучения, падающего на исследуемый образец, и оптический вентиль с полуволновой пластиной к системе ориентировано расположенных под углом к направлению излучения зеркал для последующей передачи излучения через другую полуволновую пластинку и фокусирующую линзу на исследуемый образец для приема отраженного от исследуемого образца излучения приемной частью, включающей в себя детектор, используемый для приема отраженного излучения через фильтр и короткофокусную линзу на входную апертуру оптического волокна, при этом детектор установлен с возможностью изменения своего углового положения по отношению к поверхности платформы для размещения исследуемого образца и связан с монохроматором, имеющим поворотное зеркало для переключения между выходом, связанным с ПЗС-матрицей, используемой для регистрации спектральных зависимостей, и выходом, связанным с фотоэлектронным умножителем, связанным с синхронным детектором, синхронизированным с оптико-механическим прерывателем для регистрации или регистрации световых потоков низкой интенсивности в режиме счета фотонов.
Указанные признаки являются существенными и взаимосвязаны с образованием устойчивой совокупности существенных признаков, достаточной для получения требуемого технического результата.
Настоящее изобретение поясняется конкретным примером исполнения, который, однако, не является единственно возможным, но наглядно демонстрирует возможность достижения требуемого технического результата.
На фиг.1 представлена блок-схема экспериментальной установки микроскопа согласно изобретению;
на фиг.2 - схема регистрации излучения от пептидных трубок;
на фиг.3 представлены изображения топографии пептидных трубок на подложке Аu, изображение получено с помощью оптического микроскопа;
на фиг.4 - то же, что на фиг.3, изображение, полученное с помощью сканирования лазерным лучом на длине волны второй гармоники (400 нм, размер изображения 480 мкм шаг сканирования 10 мкм);
на фиг.5 представлен спектр, полученный при накачке 800 нм с помощью экспериментальной установки микроскопа согласно изобретению;
на фиг.6 - изображения пептидной трубки, зарегистрированные при различных углах детектирования (-100 00 150), (под положением 00 понимается такое положение детектора, при котором оптическая ось детектора перпендикулярна поверхности образца, размер изображения 120×120 мкм, сканирование проведено с шагом 10 мкм);
на фиг.7 - изображения пептидной трубки, полученные при поляризации падающего лазерного излучения, ориентированного перпендикулярно вертикальной трубке;
на фиг.8 - изображения пептидной трубки, полученные при поляризации падающего лазерного излучения, ориентированного под углом 45°;
на фиг.9 представлена блок-схема устройства сбора излучения от образца (от оксида цинка);
на фиг.10 представлены спектры излучения, полученные при сканировании образца (боковой части массива из микротрубок), спектры люминесценции микротрубок оксида цинка;
на фиг.11 - топография оксида цинка (размер изображения 200×200 мкм, сканирование проведено с шагом 20 мкм).
Настоящее изобретение рассматривает конструкцию автоматизированного цифрового микроскопа для исследования микроструктур на длинах волн второй оптической гармоники и двухфотонной люминесценции. Микроскоп позволяет исследовать зависимость изображений от угла падения и азимута, угла приема излучения, а также поляризационные характеристики в органических и неорганических структурах. В качестве примеров проведены исследования нелинейно-оптических свойств пептидных трубок и микроструктур на основе оксида цинка.
Микроскоп предназначен для детектирования спектров излучения на длинах волн в видимой области спектра (фиг.1). В качестве источника лазерного излучения использовался фемтосекундный Ti:Sap лазер 1 с частотой повторения импульсов 100 МГц и длительностью импульсов не более 100 фс. Лазер позволяет автоматически перестраивать рабочую длину волны в диапазоне от 690 до 1040 нм. Средняя выходная мощность излучения составляет 1,6 Вт. Для модуляции, а также для предварительного снижения мощности, падающего на образец излучения, был использован оптико-механический прерыватель 2. После лазера установлен оптический вентиль 3, в состав которого входит полуволновая пластинка, установленная на автоматизированной вращающейся платформе, для предотвращения попадания лазерного излучения обратно в резонатор за счет отражения оптических элементов. Контроль за ориентацией падающей поляризации излучения осуществляется с помощью полуволновой пластинки, установленной на автоматически вращающейся платформе для выбора падающей поляризации и входящей в состав оптического вентиля 3. Далее излучение проходит через последовательно стоящие друг за другом зеркала 4 (систему зеркал) к другой полуволновой пластинке 5. Излучение фокусируется на образце 6 фокусирующей линзой 8 с фокусным расстоянием 3 см, закрепленной на микрометрической подвижке (образец закреплен на трехкоординатной или двухкоординатной трансляционной платформе 7, установленной на гониометре для поворота приемной части световода). Фокусирующая линза 8 изготовлена из стекла с градиентным показателем преломления. Такая конструкция линзы позволяет получить меньший диаметр лазерного пятна в перетяжке по сравнению с линзами, изготовленными из однородного стекла при аналогичных фокусных расстояниях. В данной экспериментальной установке диаметр пятна в перетяжке составляет 2 мкм. На фиг.2 представлена схема регистрации излучения от образца. Приемная система расположена перпендикулярно поверхности образца на трехкоординатной или двухкоординатной трансляционной платформе 7, что позволяет точно позиционировать детектор. Приемная часть этой системы включает в себя поляризатор с функцией анализатора состояния поляризации излучения на удвоенной частоте (не показан на фиг.1 и 2), детектор, используемый для приема отраженного излучения через фильтр и короткофокусную линзу на входную апертуру оптического волокна. При этом детектор установлен на гониометре с возможностью изменения своего углового положения по отношению к поверхности образца с целью получения изображений с произвольной угловой направленностью и связан с монохроматором. Исследуемый образец 6 закреплен на трехкоординатной или двухкоординатной трансляционной платформе 7, которая перемещает образец в вертикальном и горизонтальном направлениях с точностью до 500 нм, а также позволяет вращать образец относительно оси, перпендикулярной плоскости образца. Любое тело при попадании на него излучения переизлучает его на основной частоте (то, что мы видим и в обычной жизни, и в линейной оптике), но также на частотах гармоник. При этом интенсивность каждой следующей гармоники на 5-8 порядков ниже, чем основного излучения. Если основное излучение заблокировать (для этой цели служит монохроматор), то будет видно следующее за ним по интенсивности, то есть излучение на частоте второй оптической гармоники. То есть в данном приборе важен «не элемент, связанный с обеспечением излучения на удвоенной частоте», а элемент, обеспечивающий блокировку основной частоты и выделение излучения на частоте второй гармоники.
Излучение от образца проходит через фильтр 9 (Schott Glass BG-39, область пропускания от 320 до 650 нм) для того, чтобы отсечь излучение на основной частоте, затем с помощью короткофокусной линзы 10 собирается на входной апертуре 11 оптического волокна диаметром около 1 мм. Волокно представляет собой пучок из 19 волноводов диаметром 200 мкм (245 мкм с обкладкой).
На одном конце волокна волноводы формируют линейку, что позволяет снизить потери при сопряжении со щелью монохроматора 12. На другом конце волноводы формируют круг для лучшего сопряжения с собирающей линзой. Перед входной щелью установлен еще один фильтр BG-39. Монохроматор 12 за счет поворотного зеркала позволяет переключаться между выходом, связанным с ПЗС-матрицей 13, используемой для регистрации спектральных зависимостей, и выходом 14, связанным с ФЭУ, используемым для регистрации сигнала на определенной длине волны. Монохроматор 12 снабжен автоматизированной турелью, позволяющей программно менять дифракционные решетки. На турели установлены решетки 150, 300 и 600 штр/мм. Для снижения уровня шумов ПЗС-матрица охлаждается при помощи жидкого азота до температуры -1200°С. Сигнал от ПЗС-матрицы, направляется на плату регистрации, подключенную к компьютеру.
В микроскопе элементами отсечения являются «фильтр 9 (Schott Glass BG-39, область пропускания от 320 до 650 нм) для того, чтобы предварительно отсечь излучение на основной частоте, затем с помощью короткофокусной линзы 10 собирается на входной апертуре 11 монохроматора 12, дополнительно позволяющего анализировать спектральный состав излучения двухфотонной люминесценции (то есть отсекающие элементы - это фильтр 9 и монохроматор 12).
Сигнал, зарегистрированный фотоэлектронным умножителем, поступает на синхронный детектор 15, синхронизированный с оптико-механическим прерывателем. ФЭУ работает в режиме регистрации фототока, однако, для регистрации световых потоков низкой интенсивности возможна работа в режиме счета фотонов. Для этого в установку должны быть включены счетчик фотонов и предусилитель сигнала. Сбор данных от синхронного детектора 15 или счетчика фотонов осуществляется через интерфейс GPIB в компьютере 16. Положение лазерного пятна на образце контролируется с помощью камеры 17 с увеличивающим объективом и микроскопом. Автоматизация экспериментальной установки осуществлена в программной среде LabView. Установка позволяет проводить сканирование поверхности образца и регистрацию в отдельной точке как спектров, так и излучения на отдельных длинах волн. Полученные экспериментальные данные могут дать представление о спектральном составе излучения в различных точках образца, а также свойствах кристаллической структуры материала. Программа позволяет управлять такими параметрами сканирования, как область сканирования, шаг сканирования и получать предварительные данные о топографии поверхности. Также она позволяет контролировать параметры лазера (длина волны, мощность накачки) и монохроматора. В частности, можно управлять шириной входной щели монохроматора, временем выдержки, сменой дифракционных решеток.
Для исследования угловых зависимостей люминесценции и второй гармоники (диаграмм направленности) возможна модификация установки. Возможно использование двухкоординатной платформы, которую устанавливают на поворотную платформу. Детектор располагается на выносной консоли, помещенной на вторую поворотную платформу. И детектор, и образец могут вращаться относительно друг друга независимо. Такая конструкция позволяет изменять положение детектора относительно точки поверхности образца. Положение платформы 7 осуществляется через контроллер 18. Входная апертура оптического волокна, доставляющего излучение в спектрометр, которое дальше попадает или на ФЭУ или на ПЗС-матрицу, располагается на выносной консоли, помещенной на вторую поворотную платформу гониометра.
Для тестовых измерений в качестве образцов 6 были использованы пептидные трубки на подложках из золота и кремния. Диаметр трубок составляет от сотен нанометров до десятков микрометров, длина может доходить до единиц миллиметров. Учитывая размер структур, при исследовании их оптических свойств, необходимо убедиться, что во время эксперимента лазерное излучение попадает на конкретную трубку. Также важно знать, как меняется спектральный состав излучения вдоль единичной трубки.
При изучении оптических свойств структур, имеющих размеры в несколько микрометров, необходимо убедиться, что сигнал регистрируется непосредственно от исследуемого объекта, а не от подложки. В данной установке для этого можно произвести сканирование поверхности. Произведя сравнение полученного изображения с изображением, полученным, например, методом оптической микроскопии, можно определить, связан ли полученный сигнал с исследованными структурами.
На фиг.3-5 представлены изображения топографии пептидных трубок на подложке Au, полученные с помощью автоматизированного двухфотонного сканирующего микроскопа и оптического микроскопа. На фиг.3 представлено оптическое изображение поверхности. На фиг.4 представлено изображение той же области, полученное методом сканирования. Изображение было получено при средней мощности излучения 40 мВт, длина волны накачки составила 800 нм. Регистрация производилась фотоэлектронным умножителем на длине волны 400 нм, что соответствует длине волны второй гармоники. Область сканирования представляет собой квадрат со сторонами, равными 480 мкм, шаг сканирования составляет 10 мкм. Из полученных изображений можно оценить диаметр трубок, он в среднем составляет 20 мкм. На фиг.5 представлен спектр, полученный с помощью экспериментальной установки. Пик в области 400 нм соответствует второй оптической гармонике. Широкий пик от 425 до 600 нм с максимумом в области 485-490 нм соответствует двухфотонной люминесценции. Из полученных результатов видно, что сигнал ВГ вдоль одной трубки меняется неоднородно.
На фиг.6 представлены изображения трубки, полученные при различных углах детектирования сигнала второй гармоники. Изображения трубки зарегистрированы при различных углах детектирования (-100 00 150). Под положением 00 понимается такое положение детектора, при котором оптическая ось детектора перпендикулярна поверхности образца. Размер изображений составляет 120×120 мкм шаг, сканирования 10 мкм. Из графиков видно, что для различных областей трубки существуют выделенные направления, вдоль которых трубка наиболее эффективно генерирует вторую гармонику.
Для получения полной информации о нелинейно-оптических свойствах кристаллических структур были проведены поляризационные исследования. Из полученных экспериментальных данных можно определить тип кристаллической структуры исследуемого образца. На фиг.7 и 8 представлены изображения трубки, полученные при различных ориентациях поляризации падающего лазерного излучения, размер изображения 300×300 мкм. При этом на фиг.7 - поляризация перпендикулярна вертикальной трубке; а на фиг.8 - поляризация ориентирована под углом 45°.
Представленные изображения трубки измерены при различных ориентациях падающего излучения перпендикулярно вертикальной трубке (фиг.7) и под углом 45° (фиг.8). Изменение поляризации приводит к тому, что трубка, относительно которой направление поляризации перпендикулярно, видна лучше. Для получения изображения, полностью соответствующего реальному расположению трубок на поверхности подложки, необходимо проводить сканирование при различных ориентациях поляризации падающего излучения.
В качестве второго тестового образца был использован массив стержней оксида цинка. Диаметр отдельных стержней варьируется от единиц до десятков микрометров. На фиг.9 представлена схема сбора излучения от образца. Излучение лазера 1 фокусировалось на боковой части массива из микротрубок (образец 6), люминесценция детектировалось с торцевой части образца. При исследовании таких структур сканирование использовалось для того, чтобы определить положение образца, при котором интенсивность люминесценции будет максимальной. На фиг.10 представлены спектры излучения, полученные при сканировании образца. Как видно из экспериментальных данных, обнаружено изменение положения максимумов спектральных зависимостей, а также интенсивности сигнала при изменении положения образца относительно детектора. На фиг.11 представлена топография оксида цинка (размер изображения 200×200 мкм, сканирование проведено с шагом 20 мкм).
Полученные экспериментальные данные позволяют провести сравнение разработанной установки с коммерчески доступными приборами. Последние позволяют получать изображения биологических объектов с высокой скоростью и большим разрешением (эта характеристика зависит от числовой апертуры объектива и от рабочей длины волн). Несмотря на малую скорость сканирования и невысокое разрешение по сравнению с коммерчески доступными двухфотонными микроскопами, установка позволяет проводить ряд исследований, недоступных коммерческим приборам. Конфокальная конфигурация, которая лежит в основе коммерческих приборов, предполагает расположение объектива на расстояниях сотни микрометров от образца, что ограничивает функциональные возможности прибора. Это приводит к тому, что отсутствует, например, возможность изменения утла регистрации сигнала. В экспериментальной установке присутствует фокусирующая линза с рабочим расстоянием 3 см, что совместно с поворотными платформами, на которых закреплены образец и детектор, позволяет проводить измерения угловых зависимостей излучения. Присутствие в конструкции разработанного прибора спектрометра позволяет исследовать спектральный состав излучения в каждой точке образца. Наличие в установке поворотной платформы для образца позволяет проводить исследования анизотропных характеристик образца методом генерации второй оптической гармоники. В таблице 1 приведены данные сравнения характеристик разработанной установки с коммерческими образцами.
Таблица 1
Характеристики
Разработанная установка
Nikon (AIR MP)
Olympus (FV 1000 MPE)
Carl Zeiss (LSM 510 NLO)
Скорость сканирования
Единицы минут (15×15 пикселей)
единицы секунд (512×512 пикселей)
единицы секунд (256×256 пикселей)
единицы секунд
Разрешение (зависит от объектива) (мкм)
2
0.4-0.8 (0.3)
0.4-0.8 (0.3)
0.4-0.8 (0.3)
Источник излучения
Ti:Sap лазер
Ti:Sap лазер
Ti:Sap лазер
Ti:Sap лазер
Диапазон изменения угла детектирования (от нормали к поверхности)
от -50 до 50°
Недоступно
Недоступно
Недоступно
Область сканирования(диагональ, мм)
21
18
Нет
Нет
информации
информации
Детектор
ФЭУ, ПЗС
ФЭУ
ФЭУ
ФЭУ
Детектируемый диапазон длин волн (нм)
300-1000
400-750
400-750
400-750
Возможность измеренияанизотропных зависимостей
Есть
Нет
Нет
Нет
Автоматизированный цифровой микроскоп позволяет проводить сканирование поверхности и регистрировать излучение на определенной длине волны с помощью ФЭУ. Также возможно сканирование с регистрацией спектрального состава излучения в отдельной точке с помощью ПЗС-матрицы. С помощью разработанной экспериментальной установки проведены исследования нелинейно-оптических и спектральных свойств пептидных трубок и микротрубок на основе оксида цинка. Для пептидных трубок была получена корреляция между оптическим изображением и изображением, полученным с помощью сканирования на длине волны второй оптической гармоники. Исследованы угловые зависимости генерации второй оптической гармоники. Измерены спектры излучения от пептидных трубок. Для образцов микротрубок оксида цинка получены спектральные зависимости для различных областей образца.