GP41-НЕЙТРАЛИЗУЮЩИЕ АНТИТЕЛА И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
gp41-NEUTRALIZING ANTIBODIES AND THEIR APPLICATION

Перекрестная ссылка на родственные заявки
В настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной заявки на патент США No.61/702703, поданной 18 сентября 2012; предварительной заявки на патент США No.61/698480, поданной 7 сентября, 2012; предварительной заявки на патент США No.61/672708, поданной 17 июля 2012; и предварительной заявки на патент США No.61/556660, поданной 7 ноября 2011. Каждая из этих предварительных заявок вводится в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.
Область, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к идентификации моноклональных нейтрализующих антител, таких как, но не ограничивающихся ими, антитела, которые связываются с мембрано-проксимальной областью gp41 ВИЧ-1.
Предшествующий уровень техники
Для индукции нейтрализующих антител (NAb), которые блокируют проникновение вируса иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1) в клетки человека необходимо получить эффективную вакцину на основе ВИЧ-1. Эффективными антителами, индуцируемыми вакциной, являются такие антитела, которые будут обладать активностью против большинства штаммов ВИЧ-1 в кровотоке. К сожалению, существующие в настоящее время вакцины против ВИЧ-1 не способны индуцировать активные NAb широкого спектра. Главная проблема при разработке более эффективных вакцин заключается в том, что в настоящее время имеется лишь ограниченная информация о том, какая именно область оболочечных гликопротеинов ВИЧ-1, таких как gp120 и gp41, распознается нейтрализующими антителами (NAb). У ВИЧ-1-инфицированных индивидуумов было выделено несколько нейтрализующих моноклональных антител (mAb), и эти mAb распознают специфические области (эпитопы) на вирусе, который является восприимчивым к действию NAb.
Хотя гликопротеины оболочки являются иммуногенными и индуцируют ряд антител, однако, такие индуцируемые нейтрализующие антитела являются штамм-специфическими, а большинство иммунных ответов переключается на не-нейтрализующие детерминанты (Weiss, R.A., et al., Nature, 1985. 316 (6023): p. 69-72; Wyatt, R. and J. Sodroski, Science, 1998. 280 (5371): p. 1884-8). Нейтрализующие антитела широкого спектра лишь в редких случаях были выделены от индивидуумов, инцифированных природным ВИЧ. Можно привести три примера нейтрализующих антител широкого спектра, которые связываются с gp41, а именно, антител 2F5, 4E10 и Z13E1. Эти gp41-нейтрализующие антитела распознают мембрано-проксимальную область (MPER) гликопротеина gp41 ВИЧ-1. К сожалению, эти антитела ограничены по своей перекрестной реактивности с различными штаммами или по своей активности, а поэтому, пока не существует практически осуществимой альтернативы для их применения в целях терапии. Таким образом, необходимо разработать способы получения моноклональных нейтрализующих антител широкого спектра, которые могли бы обеспечить защиту от действия инфекционного агента, такого как ВИЧ.
Описание сущности изобретения
Настоящее изобретение относится к выделенным моноклональным нейтрализующим антителам человека, которые специфически связываются с gp41. В некоторых примерах была оптимизирована связывающая и/или нейтрализующая способность этих антител. Настоящее изобретение также относится к композициям, содержащим описанные в настоящем документе антитела, которые специфически связываются с gp41; к нуклеиновым кислотам, кодирующим эти антитела; к векторам экспрессии, содержащим нуклеиновые кислоты; и к выделенным клеткам-хозяевам, экспрессирующим такие нуклеиновые кислоты. Настоящее изобретение также относится к антигенсвязывающим фрагментам выделенных антител.
1
2
3
4
В некоторых вариантах осуществления изобретения, выделенное моноклональное антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент содержат тяжелую и легкую цепь, где тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере приблизительно на 80% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с gp41 и контактируют с L, WF, LW и R в аминокислотной последовательности LWNWFDITNWLWYIR (SEQ ID NO: 26, остатки 14-28), являются нейтрализующими. В дополнительных вариантах осуществления изобретения, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с gp41 и контактируют с NWF, T и R в аминокислотной последовательности NWFDITNWLWYIR (SEQ ID NO: 13, остатки 7-19), являются нейтрализующими. В своих ⋅дополнительных вариантах осуществления, настоящее изобретение также относится к выделенному моноклональному антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которые содержат тяжелую цепь и легкую цепь, где тяжелая цепь содержит аминокислоты 26-33 (гипервариабельная область тяжелой цепи 1 (HCDR1)), 51-60 (HCDR2), или 99-120 (HCDR3) последовательности SEQ ID NO: 11, где X представляет собой Q или R, Xпредставляет собой V или A, Xпредставляет собой S или Y, а Xпредставляет собой T или I. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент специфически связываются с gp41 ВИЧ-1 и являются нейтрализующими. В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенное моноклональное антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент содержат тяжелую цепь, содержащую одну или более аминокислот 26-33 (HCDR1), 51-60 (HCDR2) и 99-120 (HCDR3) любой из SEQ ID NO: 1, 3, 5, 147-149, 189-192 или 200-204. В некоторых варианта осуществления тяжелая цепь выделенного моноклонального антитела человека содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности любой из SEQ ID NO: 1, 3, 5, 147-149, 189-192 или 200-204. В других вариантах осуществления изобретения тяжелая цепь выделенного моноклонального антитела человека или его антигенсвязывающего фрагмента содержит любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 1, 3, 5, 147-149, 189-192 или 200-204.
4
5
6
7
8
9
10
11
В дополнительных вариантах осуществления изобретения выделенное моноклональное антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент содержат легкую цепь, которая по меньшей мере приблизительно на 80% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2. В других вариантах осуществления изобретения, легкая цепь содержит аминокислоты 26-31 (гипервариабельная область легкой цепи 1 (LCDR1)), 49-51 (LCDR2) и 88-99 (LCDR3) последовательности SEQ ID NO: 12, где Х представляет собой Е или D, Х представляет собой Y или Н, Х представляет собой K или I, Х представляет собой V или I, X представляет собой S или Т, Х представляет собой D или Е, Х представляет собой Е или D, а Х представляет собой Т или I. В дополнительных вариантах осуществления изобретения, легкая цепь содержит аминокислоты 26-31 (LCDR1), 49-51 (LCDR2) или 88-99 (LCDR3) любой из SEQ ID NO: 2, 4, 6, 12, 150-152 или 164-186. В некоторых вариантах осуществления изобретения, легкая цепь выделенного моноклонального антитела человека или его антигенсвязывающего фрагмента содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере 90% идентична аминокислотной последовательности любой из SEQ ID NO: 2, 4, 6, 12, 150-152 или 164-186. В одном из вариантов осуществления изобретения, легкая цепь выделенного моноклонального антитела человека или его антигенсвязывающего фрагмента содержит любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 2, 4, 6, 12, 150-152 или 164-186.
В некоторых своих вариантах осуществления настоящее изобретение относится к выделенному моноклональному антителу человека или к его антигенсвязывающему фрагменту, в которых тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, а легкая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. Антитело специфически связывается с gp41 ВИЧ-1 и является нейтрализующим. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к выделенному моноклональному антителу человека или к его антигенсвязывающему фрагменту, в которых тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 154, а легкая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 152. Антитело специфически связывается с gp41 ВИЧ-1 и является нейтрализующим. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к выделенному моноклональному антителу человека или к его антигенсвязывающему фрагменту, в которых тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 192, а легкая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 152. Антитело специфически связывается с gp41 ВИЧ-1 и является нейтрализующим.
Описанные в настоящем документе антитела и композиции могут быть использованы в различных целях, например, для детекции присутствия ВИЧ-1 в биологическом образце или для диагностики СПИД'а. Эти способы могут включать приведение в контакт образца, взятого у индивидуума, с моноклональным антителом человека, которое специфически связывается с gp41, и детекцию связывания антитела с образцом. Повышение уровня связывания антитела с образцом, по сравнению с уровнем связывания антитела с контрольным образцом, позволяет выявить у индивидуума ВИЧ-1-инфекцию и/или СПИД. В некоторых неограничивающих примерах, повышение уровня связывания антитела с образцом, по сравнению с уровнем связывания антитела с контрольным образцом, указывает на присутствие ВИЧ-1.
Также описан способ лечения индивидуума с ВИЧ-инфекцией, такого как, но не ограничивающегося им, индивидуум со СПИД'ом. Способы содержат введение индивидууму терапевтически эффективного количества описанного выше моноклонального антитела.
Вышеуказанные и другие признаки и преимущества настоящего изобретения будут более очевидны из нижеследующего подробного описания некоторых вариантов осуществления изобретения, которые приводятся со ссылками на прилагаемый графический материал.
Краткое описание графического материала
50
50
50
На фиг. 1A-1C приводится серия таблиц и диаграмм, где проиллюстрированы анализы последовательности антитела 10E8 и анализы на нейтрализацию. (A) Приводятся гены зародышевой линии, кодирующие вариабельные области антител 10E8, 7H6 и 7N16. (B) Проиллюстрирована нейтрализующая активность антител против белка оболочки (Env) изолята 181 панели псевдовирусов ВИЧ-1. На дендрограммах показана генетическая удаленность белка gp160 от первичного изолята Env ВИЧ-1. (C) В приведенных ниже данных дендрограммы указано число тестируемых вирусов, процент нейтрализованных вирусов и геометрическое среднее IC для нейтрализованных вирусов с IC<50 мкг/мл. Средние титры были получены по всем тестируемым вирусам, включая титры с IC>50 мкг/мл, которые принимаются за 100.
672
673
676
683
683
На фиг. 2A и 2B проиллюстрирована специфичность связывания 10E8. (A) Твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) на связывание mAb 10E8 или 4E10 с пептидом gp140, gp120, gp41 или с пептидом для 4E10. Величины ошибок означают одну стандартную ошибку среднего (ср. кв. откл.). (B) Ингибирование нейтрализации вируса C1 ВИЧ-2/ВИЧ-1 MPER антителами mAb 10E8 или 4E10 под действием аланин-сканирующих пептидов 4E10. Пептиды инкубировали с mAb 4E10 или 10E8 за один час до инфицирования клеток TZM-bl. На оси Y указаны проценты нейтрализации для каждого условия. Остатки W, F, T и R присутствуют в положениях, в которых мутантный по аланину пептид не блокирует нейтрализацию (R только для антитела 10E8). Показаны остатки 16-28 SEQ ID NO: 26.
На фиг. 3A и 3B представлена серия графиков и серия цифровых изображений, на которых проиллюстрированы анализы на аутореактивность 10E8. (A) Анализ, проводимый методом поверхностного плазмонного резонанса (ППР) на связывание 10E8 с анионными фосфолипидами. 10E8 инъецировали поверх липосом PC-CLP или липосомы PC-PS, иммобилизованных на сенсорном чипе BIACORE L1. 4E10 и 2F5 использовали в качестве положительного контроля, а 13H1, 17b и антитело против белка RSVF использовали в качестве отрицательного контроля. (B) Реактивность 10E8 с эпителиальными клетками HEP-2. Выше контроль с VRC01 добавлен как дополнительный отрицательный контроль. Концентрация антитела составляла 25 мкг/мл. Все фотографии были получены с увеличением 400x.
656
683
На фиг. 4A-4H представлена серия ленточных диаграмм, иллюстрирующих кристаллическую структуру антитела 10E8 в комплексе с его эпитопом MPER gp41. (A) 10E8 распознает высококонсервативную спираль gp41 и нейтрализует ВИЧ-1. Fab-фрагмент 10E8 показан на ленточной диаграмме (темно-серым показана тяжелая цепь, а светло-серым показана легкая цепь) в комплексе с пептидом gp41 (показан темно-серым), который охватывает MPER (Asn-Arg; NEQELLELDKWASLWNWFDITNWLWYIR (SEQ ID NO:26)). (B) Граница между 10E8 и gp41 с выбранными боковыми цепями 10E8 и боковыми цепями gp41 показана в виде прямых черточек. Если провести аналогию с рукой, то шарнирная область имеет такой вид, как будто она сжата большим пальцем (представлена CDR H2), C-концевая спираль как бы подвешена вдоль соответствующего удлиненного указательного пальца (представлена CDR H3), а остатки, с которых начинается С-концевая спираль, как бы захвачены большим и указательным пальцами (представлены стыком петель CDR). (C-D) Скрытые контактные поверхности и консервативность эпитопа. Оценка поверхности скрытого контакта на gp41 (серый; C) показала, что остатки эпитопа (помеченные, D), которые непосредственно контактируют с 10E8, являются в высокой степени консервативными во всех 2870 оцененных штаммах (проценты консервативности показаны в скобках; см. также фиг. 26-28). E-H. Аланиновый мутагенез паратопа и эпитопа. Остатки, находящиеся на конце петли CDR H3 10E8 и в гидрофобной щели, играют важную роль в распознавании gp41 и в нейтрализации вируса (фиг. 31-32), и эти остатки были картированы на скрытой 10E8-контактирующей поверхности (E, G). Эти результаты отражают эффекты аланин-сканирующего мутагенеза эпитопа для 10E8 (фиг. 18-19), картированного по поверхности скрытого gp41-контакта (F, H). Сравнение эффектов аланин-сканирующего мутагенеза паратопа и эпитопа показано, что остатки эпитопа, имеющие наиболее важное значение для распознавания антителом 10E8 и нейтрализации вируса, также являются в высокой степени консервативными (D).
50
80
На фиг. 5A и 5B представлены таблица, серия графиков и схематическая диаграмма, на которых проиллюстрирован сайт восприимчивости к gp41. (A) Влияние вариабельности последовательностей на нейтрализацию антителом 10E8. Также представлены предсказанные аминокислотные последовательности в эпитопе, связывающимся с 10E8, для трех 10E8-резистентных вирусов и вируса, выделенного у пациента. Связывающая область 10E8 и отличие последовательности от последовательности вируса JR2 показаны светло-серым. Величины ICи IC, которые более чем в 20 раз превышают величины для псевдовируса JR2 дикого типа, выделены светло-серым. Величины ошибок означают одно ср. кв. откл. (B) Определение структуры высококонсервативной области gp41, распознаваемой нейтрализующими антителами. Атомы высококонсервативных остатков, которые непосредственно контактируют с 10E8, представлены серым цветом средней интенсивности и показаны в виде черточек; атомы, закрытые антителом 10E8, показаны темно-серым, а главные атомы, контактирующие с цепью, показаны светло-серым. Полупрозрачные поверхности MPER gp41 заштрихованы в соответствии с имеющимися там атомами. На правой панели показан вид связанного антитела 10Е8, перевернутый на 90°. CDR H3 10E8 взаимодействует с высококонсервативными гидрофобными остатками, а CDR H2 контактирует с главными атомами цепи в положении стыка между N- и C-концевыми спиралями. Многие несвязанные остатки MPER (серые) являются гидрофобными, а особенно в С-концевой спирали. В структуре позднего промежуточного гибрида (фиг. 16), эти остатки обращены к внешней стороне суперспирализованной структуры, а в предгибридной конформации вирусного шипа, эти остатки могут взаимодействовать с вирусной мембраной или с другими гидрофобными областями Env.
На фиг. 6A и 6B проиллюстрировано выравнивание последовательностей тяжелой и легкой цепей анти-gp41 антител 10E8 (SEQ ID NO: 1 и 2), 7H6 (SEQ ID NO: 3 и 4), 7N16 (SEQ ID NO: 5 и 6), IGHV3-15*05 (SEQ ID NO: 7) и последовательности зародышевой линии IGLV3-19*01 (SEQ ID NO: 8). Остатки, показанные светло-серым цветом, означают замены в последовательности зародышевой линии. Точки означают делеции остатков. Нумерация остатков приводится по Кэбату и IMGT, и такая нумерация была использована для идентификации специфических остатков в тяжелой и легкой цепях 10E8.
На фиг. 7 представлен график, иллюстрирующий корреляцию нейтрализующей активности сыворотки, взятой у донора N152, и антитела 10E8. Представлен график зависимости нейтрализующей ID50 сыворотки донора N152 от нейтрализующей ID50 антитела 10E8, протестированных на панели из 20 псевдовирусов. Для оценки корреляции между IC50 10E8 и ID50 N152 была применена непараметрическая корреляция Спирмана.
На фиг. 8A-8C представлены график и серия таблиц, на которых проиллюстрирована специфичность связывания с 10E8. (A) ELISA-анализ на связывание mAb с пептидами MPER, 2F5, Z13e1, 4E10 и 4E10.19. Также представлены аминокислотные последовательности этих пептидов (сверху вниз: SEQ ID NO: 26 с тремя лизинами у N- и C-конца; остатки 1-16 SEQ ID NO: 26, остатки 11-21 SEQ ID NO: 26 с тремя C-концевыми лизинами; остатки 16-24 SEQ ID NO: 26 с тремя C-концевыми лизинами и остатки 16-28 SEQ ID NO: 26 с N-концевым цистеином и с тремя С-концевыми лизинами). (B-C) Ингибирование mAb-нейтрализации MPER C1 химерного вируса ВИЧ-2/ВИЧ-1 путем добавления пептидов MPER, 2F5, Z13e1, 4E10 и 4E10.19. Эффект кратности вычисляли как отношение нейтрализующей IC50 при добавлении пептида-имитатора/IC50 (B) или отношение нейтрализующей IC80 при добавлении пептида-имитатора/IC80 (C) для пептида. Величины >5 выделены светло-серым.
На фиг. 9A и 9B проиллюстрирован анализ, проводимый методом поверхностного плазмонного резонанса, на связывание антитела 10E8, 2F5 и 4E10 с пептидом MPER gp41. (A) Биотинилированный пептид MPER, состоящий из остатков 656-683 gp41, иммобилизовали на чипе со стрептавидином SA (GE Healthcare), и антитело Fab наносили проточным методом поверх аналита при 2-кратном серийном увеличении концентрации в пределах 3,9-125 нМ (10E8), 0,49-31,25 нМ (2F5) и 0,25 нМ - 62,5 нМ (4E10). Были проведены фазы ассоциации и диссоциации в течение трех минут и пяти минут, соответственно, при скорости потока 30 мкл/минуту, где аналит в каждой концентрации использовали с тремя повторностями. (B) Перечисленные константы связывания получали путем построения сенсорограмм по лангмюровской модели 1:1. Представлена аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 26.
+
50
На фиг. 10 представлена секторная диаграмма, иллюстрирующая частоту встречаемости ВИЧ-1-сыворотки с данной специфичностью. В этом анализе использовали сыворотку от 78 здоровых ВИЧ-1-инфицированных доноров. Частоту измеряли по способности сыворотки пациента нейтрализовать ВИЧ-2/ВИЧ-1-химеры, содержащие части MPER, и подтверждали путем блокирования пептида. Нейтрализующие ID50 сыворотки показаны на фиг. 21. Кратность изменения ID после блокирования пептида проиллюстрирована на фиг. 22. Шесть пациентов с сывороткой, содержащей 10E8-подобные антитела, не отличались от остальных 72 пациентов с точки зрения вирусной нагрузки (6748 копий/мл с 10E8 и 5446 копий без 10E8; p>0,05), числа CD4 (437 клеток/мкл и 557 клеток/мкл; p>0,05), количества лет, прошедших со времени установления диагноза (20 лет и 13 лет; p>0,05), или среднего титра нейтрализации (302 и 156; p>0,05).
JR-FL
На фиг. 11A-11C проиллюстрирована доступность 10E8 к MPER. (A) Связывание 10E8, 4E10 и 2F5 с шипами полноразмерной оболочки ВИЧ, и связывание мутантного 4E10 (Phe673Ser) или мутантного 2F5 (Lys665Glu), экспрессируемых на поверхности клеток 293T, определяли с помощью проточной цитометрии. Серийно разведенное антитело инкубировали с клетками в течение одного часа. Антитела 2G12 и b12 использовали в качестве положительного контроля, а F105 использовали в качестве отрицательного контроля. VRC01 использовали в качестве дополнительного контроля на JR-FL-трансфицированных клетках. Относительный процент связывания вычисляли как среднюю интенсивность флуоресценции (MFI), деленную на максимальную MFI положительного контроля 2G12 X 100. (B) Доступность MPER определяли путем промывки смеси «антитело-вирион» перед инфицированием клеток TZM-b1. Псевдовирусы инкубировали с антителами при 37°C в течение 30 минут, и перед инфицированием клеток-мишеней, смесь «антитело-вирион» либо промывали, либо не промывали. (C) Влияние промывки на нейтрализацию антителом оценивали по площади под кривой (AUC) или по IC80. Для BaL и JRFl, IC80 не достигалась в условиях без промывки, а поэтому была использована наивысшая ингибирующая концентрация (IC60 и IC75, соответственно).
На фиг. 12A и 12B схематически представлены диаграммы, иллюстрирующие сравнение двух копий MPER gp41 в кристаллической асимметрической ячейке. (A) Пептиды gp41 от двух комплексов 10E8-gp41 в кристаллической асимметрической ячейке показаны палочками (комплекс 1, темно-серый; комплекс 2, серый средней интенсивности) в окружении электронов 2fo-fc с плотностью в пределах 1у (темно-серый). Даны изображения, перевернутые относительно друг друга на 180°, и эти изображения даны в такой же ориентации, как и на фиг. 4C и 4D. (B) Выравнивание пептидов в двух кристаллических комплексах. Изображение, перевернутое на 90°, представляет собой суперпозицию двух пептидов в асимметрической ячейке после выравнивания всех атомов остатков 671-683. При таком выравнивании, N-концевая спираль в комплексе 2 сдвинута на 45° относительно первой спирали в комплексе 1. Хотя отличающиеся ориентации N-концевой спирали в двух комплексах позволяют предположить о наличии определенной степени структурной пластичности, однако, было обнаружено, что остатки шарнирной области и С-концевой спирали в двух комплексах являются высококонсервативными и участвуют в наиболее важных взаимодействиях с антителом.
На фиг. 13A-13C представлена серия графиков, иллюстрирующих анализ аланиновых вариантов паратопа 10E8, проводимый методом поверхностного плазмонного резонанса. Показаны сенсорограммы связывания пептида MPER с 25 вариантами паратопа 10E8, а также с 10E8 дикого типа (wt). Варианты IgG иммобилизовали на поверхности биосенсорного чипа со связанным с ним антителом против IgG человека с плотностью 1000-2000 единиц отклика, а затем пептид MPER (указан) наносили впрыскиванием поверх аналита с двукратными серийными разведениями, начиная с 500 нМ (за исключением HCD 30A, W100bA, S100cA, P100fA, начальное серийное разведение которых составляло 250 нМ). Были проведены фазы ассоциации и диссоциации в течение трех минут и пяти минут, соответственно, при скорости потока 30 мкл/минуту. Сенсорограммы были построены по лангмюровской модели 1:1 с использованием компьютерной программы BIACORE BIAEVALUATION (GE Healthcare). Константы связывания указаны на фиг. 31. Аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 26 представлена на фиг. 13C.
D
D
На фиг. 14 представлен график, иллюстрирующий корреляцию между связыванием с вариантом 10E8 и нейтрализацией этим вариантом. K связывания аланиновых вариантов паратопа 10E8 представлены на графике в зависимости от средних IC50 и IC80 для нейтрализации. Для оценки взаимосвязи между связыванием и нейтрализацией была применена непараметрическая корреляция Спирмана. Kи нейтрализующие IC50 и IC80 указаны на фиг. 31-32.
На фиг. 15A-15H проиллюстрировано распознавание структурно консервативной С-концевой спирали MPER антителами 10E8 и 4E10. Антитела 10E8 и 4E10 действуют, в основном, по различным механизмам распознавания посредством связывания со структурно консервативной спиралью у С-конца MPER gp41. (A) Конформация MPER и скрытая поверхность для нейтрализующих антител 10E8, 2F5 (данные банка белков Protein DataBank (PDB) ID No. 1TJI вводятся в настоящее описание посредством ссылки как данные, имеющиеся в базе данных на 22 октября 2012), Z13e1 (данные PDB ID No. 3FN0 вводятся в настоящее описание посредством ссылки как данные, имеющиеся в базе данных на 22 октября 2012), и 4E10 (данные PDB ID No. 2FX7 вводятся в настоящее описание посредством ссылки как данные, имеющиеся в базе данных на 22 октября 2012). Приводится ленточное Cα-представление MPER gp41, связанного с каждым из антител, вместе с гистограммами, где указана площадь скрытой поверхности на остаток. Аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 26 представлена ниже под каждой гистограммой. Последовательность кристаллизованного эпитопа показана прописными буквами. (B) Суперпозиция С-концевой спирали MPER в 10E8-связанной (темно-серый) и 4E10-связанной (светло-серый) конформации показана в ориентации, перевернутой на 90°. Приводится ленточное Cα-представление, где боковые цепи показаны в виде черточек. (C-F) Сравнение распознавания С-концевой спирали MPER антителами 10E8 и 4E10, где молекулы даны в виде Cα-ленточного представления. (C) Вариабельные домены 10E8 в комплексе с MPER заштрихованы, как показано на фиг. 4A. (D) Вариабельные домены 4E10 в комплексе с MPER (данные PDB ID No. 2FX7 вводятся в настоящее описание посредством ссылки как данные, имеющиеся в базе данных на 22 октября 2012) даны в ориентации, созданной исходя из выравнивания С-концевых спиралей gp41, описанных в (B) (левая панель). gp41 окрашен не совсем белым цветом, тяжелая цепь 4E10 окрашена темно-серым, а легкая цепь 4E10 окрашена серым средней интенсивности. (E-F) Перевернутые на 90° виды (C) и (D), если смотреть от C-конца до N-конца консервативной С-концевой спирали MPER. (G,H) Спирально-кольцевые представления 10E8- и 4E10-связанных С-концевых спиралей MPER, отражающие ориентацию, представленную в (B) (правая панель). Показаны контактирующие с антителом поверхности, построенные на основе наблюдаемых прямых контактов между антителами и gp41, как описано на фиг. 35.
На фиг. 16 представлена ленточная диаграмма, иллюстрирующая gp41-сайт восприимчивости, картированный на gp41 в «поздней промежуточной» конформации. gp41-сайт восприимчивости, определенный по футпринту в месте контакта антитела 10E8 на gp41, картировали на 10E8-связанной пептидной структуре MPER (слева, ориентация аналогична показанной на фиг. 6B) и на gp41 в поздней промежуточной 6-спиральной пучковой конформации (данные PDB ID No. 2XR7 (справа) вводятся в настоящее описание посредством ссылки как данные, имеющиеся в базе данных на 22 октября 2012). Атомы, распознаваемые антителом 10E8, закрашены темно-серым и показаны черточками. Атом или остаток, контактирующие исключительно с антителами 2F5, Z13e1 и 4E10, показаны черточками светло-сером цветом или серым цветом средней интенсивности. Определенный с помощью 10E8 сайт восприимчивости обращен наружу от центральной оси пучка, и, вероятно, является наиболее доступным в этой конформации. Потенциальный сайт N-связанного гликозилирования в положении 674 не должен быть совместимым с поздней промежуточной конформацией, поскольку боковая цепь остатка 674 обращена вовнутрь 6-спирального пучка.
a
На фиг. 17A-17F представлен набор таблиц, иллюстрирующих нейтрализующие свойства 10E8. (A) Способность антител 10E8 и 7H6 нейтрализовать минипанель из 5 изолятов Env псевдовируса. Величины IC50, составляющие менее, чем 1 мкг/мл, показаны серым. (B) Профиль нейтрализации сывороткой пациента N152 и моноклональными антителами. Данные для сыворотки пациента N152 представляют собой ID50 (доза вируса, необходимая для 50% инфицирования) для каждого вируса. ID50>1000 выделены темно-серым, 500<ID50<1000 выделены серым средней интенсивности, а 100<ID50<500 выделены светло-серым. Данные для моноклональных антител представлены как IC50. IC50<1 мкг/мл показана серым средней интенсивности; IC50=1-10 мкг/мл показана светло-серым, а IC50=10-50 мкг/мл показана темно-серым. (C-F) Данные по нейтрализации 181 Env-псевдовируса ВИЧ-1 антителами. IC50<1 мкг/мл показана серым средней интенсивности; IC50=1-10 мкг/мл показана светло-серым, а IC50=10-50 мкг/мл показана темно-серым.
На фиг. 18 представлена таблица, иллюстрирующая связывание 10E8 и 4E10 с аланин-сканированными пептидами MPER gp41, оцененное с помощью ELISA. Кратность изменения вычисляли как отношение IC50 в присутствии пептида/IC50 в присутствии пептида-имитатора. Величина кратности изменения >10 показана светло-серым.
JR2
На фиг. 19 представлена таблица, в которой приводятся данные по нейтрализации аланиновых мутантов MPER псевдотипированного ВИЧ-1 антителом 10Е8. Концентрация дана в мкг/мл. Величины IC50 и IC90, которые в >20 раз превышают величины для нейтрализации JR2 дикого типа антителом 10E8 или в >100 раз для нейтрализации антителом 4E10, показаны светло-серым.
На фиг. 20 представлена таблица, в которой приводится список последовательностей химер ВИЧ-2/ВИЧ-1, используемых в анализах на нейтрализацию. Представлены последовательности 7312A, C1, C1C, C3, C7, C6, C4, C4GW и C8 (SEQ ID NO: 15-22, соответственно). Фрагменты последовательности MPER, которые соответствуют последовательности MPER ВИЧ-1, подчеркнуты.
a
b
На фиг. 21 представлена таблица, в которой проиллюстрировано картирование нейтрализующих анти-MPER антител/сывороток с химерами ВИЧ-2/ВИЧ-1. Представлены IC50 (мкг/мл). Представленывеличины ID50. Цифры выделены жирным и светло-серым, если ID50 для химеры ВИЧ-2/ВИЧ-1 в 3 раза превышают ID50 для контрольного ВИЧ-2 дикого типа и составляют >100. «-» означает отсутствие нейтрализации. «ND» означает, что классификация сыворотки не была определена.
b
c
На фиг. 22 представлена таблица, в которой проиллюстрировано блокирование нейтрализации ВИЧ-2/ВИЧ-1-химеры С1, опосредуемой mAb- и сывороткой, с использованием мутантных пептидов MPER. Последовательность блокирующих пептидов представлена на фиг. 8A. Кратность изменения IC50 означает отношение IC50 в присутствии пептида/IC50 в присутствии пептида-имитатора. Кратность изменения ID50 означает отношение ID50 в присутствии пептида-имитатора/ID50 в присутствии пептида. Серым цветом показано 3-кратное изменение отношения IC50/ID50 по сравнению с контрольным пептидом.
На фиг. 23 представлена таблица, в которой проиллюстрирована реактивность 10E8 с аутоантигенами. Реактивность 10E8 с аутоантигенами детектировали с помощью анализа Luminex. Моноклональное анти-RSV антитело Synagis (Medlmmune, Gaithersburg, MD) использовали в качестве отрицательного контроля. Для сравнения также тестировали антитела 4E10, 2F5, VRC01 и 17b. SSA означает антиген A, вызывающий синдром Сьегрена; SSB означает антиген B, вызывающий синдром Сьегрена; Sm означает антиген Смита; RNP означает рибонуклеопротеин; Sc1 70 означает склеродермию 70; Jo1 означает антиген; CentrB означает центромер B.
На фиг. 24 представлена таблица, в которой указаны собранные данные и статистические данные по уточнению кристаллической структуры 10E8, полученные в проведенных исследованиях. Данные для самого высокого разрешения указаны в скобках. Набор данных был собран для одного кристалла.
a
b
На фиг. 25 представлена таблица, в которой указаны углы фи-пси для пептидов gp41, связанных с антителом. Для комплекса 4E10:gp41 использовали структурные данные PDB ID No. 2FX7 (вводимые в настоящее описание посредством ссылки как данные, имеющиеся в базе данных на 22 октября, 2012). Для комплекса Z13e1:gp41 использовали структурные данные PDB ID No. 3FN0 (вводимые в настоящее описание посредством ссылки как данные, имеющиеся в базе данных на 22 октября 2012).
§
2
На фиг. 26 представлена таблица, в которой указана общая площадь скрытой поверхности на 10E8 и gp41. Все взаимодействия осуществляли с использованием PISA (ebi.ac.uk/msd-srv/prot_int/cgi-bin/piserver). BSA означает площадь скрытой поверхности, Å.
£
2
§
2
§§
i
На фиг. 27 представлена таблица, в которой указаны площади скрытой поверхности на границе между тяжелой цепью 10E8 и gp41, по остатку. Все взаимодействия осуществляли с использованием PISA (ebi.ac.uk/msd-srv/prot_int/cgi-bin/piserver). Процент идентичности этих остатков в анализе 2870 штаммов ВИЧ, депонированных в базе данных последовательностей ВИЧ в Лос-Аламосе (12/2011). ‡ASA означает площадь доступной поверхности, Å. BSA означает площадь скрытой поверхности, Å. Черточками обозначен процент площади скрытой поверхности, одна черточка на 10%. ДG означает эффект энергии сольватации, ккал/моль.
Ј
2
2
i
На фиг. 28 представлена таблица, в которой указаны площади скрытой поверхности на границе между легкой цепью 10E8 и gp41 по остатку. Все взаимодействия осуществляли с использованием PISA (ebi.ac.uk/msd-srv/prot_int/cgi-bin/piserver). Процент идентичности этих остатков в анализе 2870 штаммов ВИЧ, депонированных в базе данных последовательностей ВИЧ в Лос-Аламосе (12/2011). ASA означает площадь доступной поверхности, Å. BSA означает площадь скрытой поверхности, Å. Черточками обозначен процент площади скрытой поверхности, одна черточка на 10%. ДG означает эффект энергии сольватации, ккал/моль.
.
.
На фиг. 29 представлена таблица, в которой указаны водородные связи и солевые мостики, образованные между 10E8 и gp41. Водородные связи определяли с использованием программы Ligp1ot (McDonald et al., JMol. Biol 238, 777-793, 1994). Цепь H означает комплекс тяжелой цепи 1; цепь В означает комплекс тяжелой цепи 2; цепь P означает комплекс пептида gp41 1; цепь F означает комплекс пептида gp41 2.
.,
.
.
На фиг. 30 представлена таблица, в которой указаны ван-дер-ваальсовы взаимодействия между 10E8 и gp41. Ван-дер-ваальсовы взаимодействия определяли с помощью программы Ligp1ot (McDonald et alJMol. Biol 238, 777-793, 1994). Цепь H и цепь L означают комплекс тяжелой и легкой цепей 1, соответственно; цепь P означает комплекс пептида gp41 1; Цепь В и цепь D означают комплекс тяжелой и легкой цепей 2, соответственно; цепь F означает комплекс пептида gp41 2.
^
$
#
HС
HС
HC
HC
HC
HC
НС
HС
HС
HС
HС
На фиг. 31 представлена таблица, в которой указаны аффинности связывания аланиновых вариантов 10E8 с растворимым пептидом MPER. SE означает стандартную ошибку; nb означает слабое или недетектируемое связывание в используемом интервале концентраций. Кратность определена как кратное изменение по сравнению с отдельным 10E8 дикого типа, осуществляемое одновременно с использованием вариантов. Среднее для трех отдельных экспериментов, проводимых с использованием 10E8 дикого типа. Только те мутации, которые дают в 10 раз больший эффект, картировали на скрытой поверхности 10E8, как показано на фиг. 4E (серый средней интенсивности, >100x; светло-серый, 50x<100x; темно-серый, 10x<50x). Остатки тяжелой цепи Y99A и G100hA почти не связывались с растворимым пептидом, тогда как мутации дополнительных остатков CDR H3 (F100aA, G100dA, P100fA, P100gA, E100iA и E100jA) снижали аффинность в 50-120 раз (для идентификации специфических остатков в тяжелой и легкой цепях 10E8 использовалась нумерация по Кэбату). Петля CDR H1 и каркасная область 2 с мутациями W33A и R50A, соответственно, которые присутствуют в гидрофобной щели, также не связывались с пептидом MPER, а мутация E53A в CDR H2, присутствующая в щели, снижала аффинность связывания с пептидом MPER в 60 раз. Остаток легкой цепи R91LC, локализованный в основании гидрофобной щели и обеспечивающий прямые взаимодействия с остатками CDR H3, не связывался в том случае, если он был заменен на аланин, что, вероятно, обусловлено дестабилизацией самой щели.
^
&
HС
HС
HС
НС
HС
HС
HС
HС
LC
На фиг. 32 представлена таблица, в которой указаны нейтрализующие IC50 и IC80 аланин-сканированных вариантов 10Е8. В тех случаях, когда нейтрализующие IC50 и IC80 не достигались при наивысшей концентрации антитела, то при вычислении среднего использовали наивысшую концентрацию. Среднюю кратность изменения активности определяли как среднее кратности изменения наблюдаемой активности против каждого вирусного штамма. Все мутации Y99A, F100aA, W100bA и G100hA оказывали негативное воздействие на нейтрализацию, что снижало активность более чем в 1000 раз. Другие мутации также оказывали большое влияние на нейтрализацию, включая мутации P100gA и E100iA CDR H3, и W33A и R50A в гидрофобной щели. Мутация в легкой цепи R91A, аналогично ее влиянию на связывание с пептидом, также снижала нейтрализующую активность более чем в 1000 раз.
На фиг. 33 представлена таблица, в которой указаны среднеквадратические отклонения (RMSD) в определении структур gp41, связанных с антителом. Выравнивание осуществляли с использованием программы LSQKAB (Winn, M. D. et al. Acta Crystallogr DBiol Crystallogr, 67, 235-242, 2011). Для комплекса 4E10:gp41 использовали структурные данные PDB ID No. 2FX7 (вводимые в настоящее описание посредством ссылки как данные, имеющиеся в базе данных на 22 октября, 2012). Для комплекса Z13e1:gp41 использовали структурные данные PDB ID No. 3FN0 (вводимые в настоящее описание посредством ссылки как данные, имеющиеся в базе данных на 22 октября, 2012). Для комплекса 2F5:gp41 использовали структурные данные PDB ID No. ITJI.
На фиг. 34 представлена таблица, в которой проиллюстрировано сравнение скрытых поверхностей MPER-специфического антитела на gp41. Исследования по взаимодействию осуществляли с помощью программы PISA (ebi.ac.uk/msd-srv/prot_int/cgi-bin/piserver). Величины в скобках относятся к комплексу 2. Для комплекса 4E10:gp41 использовали структурные данные PDB ID No. 2FX7 (вводимые в настоящее описание посредством ссылки как данные, имеющиеся в базе данных на 22 октября, 2012). Для комплекса Z13e1:gp41 использовали структурные данные PDB ID No. 3FN0 (вводимые в настоящее описание посредством ссылки как данные, имеющиеся в базе данных на 22 октября, 2012). Для комплекса 2F5:gp41 использовали структурные данные PDB ID No. ITJI (вводимые в настоящее описание посредством ссылки как данные, имеющиеся в базе данных на 22 октября, 2012). Несмотря на распознавание более широкого ряда остатков, 10E8 имеет меньший футпринт gp41, чем 4E10. Если сравнение было ограничено перекрывающимися остатками пептидов в пределах 671-683, то различия в футпринтах были даже еще более выраженными, причем 10E8 имело приблизительно на 25% меньшую площадь скрытой поверхности на gp41, чем 4E10.
На фиг. 35 представлена таблица, в которой проиллюстрировано сравнение прямых контактов антител 10E8 и 4E10 с gp41. Прямые контакты были определены с использованием программы Ligp1ot (McDonald at al., J. Mol. Biol. 238, 777-793, 1994). H означает водородную связь; N означает ван-дер-ваальсовы контакты.
На фиг. 36 представлена серия таблиц, в которых проиллюстрированы результаты нейтрализации мутантов MPER оболочечного псевдотипированного COT6.15 (кладотипа C) антителами 10E8 и 4E10.
На фиг. 37 представлена таблица, в которой проиллюстрированы результаты анализов на нейтрализацию, проводимых с использованием перекрестно-комплементарных комбинаций тяжелой и легкой цепей антител 10E8, 7H6 и 7N16.
На фиг. 38 представлена диаграмма, на которой схематически проиллюстрирована кристаллическая структура антитела 10E8 в комплексе с пептидом gp41, где указан электростатический поверхностный заряд антитела.
На фиг. 39 представлена диаграмма, на которой схематически проиллюстрирована кристаллическая структура антитела 10E8 в комплексе с пептидом gp41, где указан электростатический поверхностный заряд пептида.
На фиг. 40 представлена диаграмма, на которой схематически проиллюстрирована кристаллическая структура антитела 10E8 в комплексе с пептидом gp41, где указаны положения модифицированных остатков в вариантах антител 10E8, а именно, 7H6 и 7N16.
На фиг. 41 представлены цифровые изображения кристаллических структур антител 2F5, 4E10 и Z13E1 в комплексе с пептидами gp41, и представлена схема gp41, где проиллюстрированы относительные сайты связывания антител 2F5, 4E10, Z13E1 и 10E8. Указана аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 26.
+
-
-
-
На фиг. 42A и 42B представлены диаграммы рассеяния, на которых указаны результаты FACS-выделения CD19IgAIgDIgMB-клеток из пробы МКПК.
На фиг. 43 представлены таблица и серия ленточных диаграмм, где проиллюстрирован аланиновый скан остатков 10E8 (положения по Кэбату), как описано в примерах 1 и 8.
На фиг. 44A и 44B представлены серии ленточных диаграмм, иллюстрирующих структурный мутагенез 10E8, проводимый в целях усиления гидрофобных взаимодействий с gp41.
На фиг. 45 представлена таблица, в которой проиллюстрированы результаты анализов на нейтрализацию панелей вирусов ВИЧ-1 с использованием структурных мутантов 10E8 как описано на фиг. 44A и 44B и в примере 8 (нумерация по Кэбату).
На фиг. 46 представлена диаграмма, на которой схематически проиллюстрировано конструирование вариантов антител с частичной реверсией.
На фиг. 47 проиллюстрировано выравнивание последовательностей и представлена ленточная диаграмма, где указаны частичные ревертанты тяжелой и легкой цепей 10E8 зародышевой линии. Последовательностями являются SEQ ID NO: 7 (10E8_germ_H), SEQ ID NO: 147 (10E8gH01), SEQ ID NO: 148  (10E8gH02), SEQ ID NO: 149 (10E8gH03), SEQ ID NO: 1 (10E8_HEAVY), SEQ ID NO: 8 (10E8_germ_L), SEQ ID NO: 150 (10E8gL01), SEQ ID NO: 151 (10E8gL02), SEQ ID NO: 152 (10E8gL03), SEQ ID NO: 2 (10E8_LIGHT).
На фиг. 48 представлена серия таблиц, в которых проиллюстрированы результаты анализов на нейтрализацию панели вирусов ВИЧ-1 с использованием частичных ревертантов антитела 10E8 зародышевой линии, как описано на фиг. 47 и в примере 8. «10E8-R1» означает тяжелую цепь 10E8gH01 (SEQ ID NO: 147), спаренную с легкой цепью 10E8gL01 (SEQ ID NO: 150). «10E8-R3» означает тяжелую цепь 10E8gH03 (SEQ ID NO: 149), спаренную с легкой цепью 10E8gL03 (SEQ ID NO: 152).
На фиг. 49 представлена серия таблиц, в которых проиллюстрированы результаты анализов на нейтрализацию панели вирусов ВИЧ-1 с использованием серии мутантов 10E8 на исходной тяжелой цепи 10E8gH03 (SEQ ID NO: 149) или на исходной легкой цепи 10E8gL03 (SEQ ID NO: 152), как показано на фиг. 47 и описано в примере 8.
dN152
dN152
На фиг. 50A-50F представлены серии блок-схем, иллюстрирующих идентификацию соматических вариантов антитела 10E8, проводимую путем тотального секвенирования, и сетчатый график выборки. (A) графики идентичности/расхождений в 10E8 для репертуара («antibodyome») тяжелых цепей от донора N152 (слева), и сетчатый график выборки (справа). Идентичность 10E8 отложена на вертикальной оси, а отличия от ориджина гена V зародышевой линии отложены на горизонтальной оси, при этом, частота встречаемости антител представлена на тепловой карте. Представлен сетчатый график выборки, где выбранные антитела, которые не экспрессируются под действием MPER или не связываются с MPER, показаны незаштрихованными кружками; выбранные связывающиеся антитела показаны заштрихованными кружками, а закрашенные участки означают филогенетическую удаленность от 10E8 в (C). (B) Графики идентичности/расхождений в 10E8 для репертуара («antibodyome») тяжелых цепей для донора N152 (слева), и сетчатый график выборки (справа). Оси и закрашенные участки являются такими же, как в (A). (C/D) Филогенетические деревья для вариантов тяжелой цепи (C) и легкой цепи (D), идентифицированных на сетчатом графике выборки. (E-F) Анализ на нейтрализацию 6 изолятов ВИЧ-1 10E8 и вариантами 10E8 проводили с двумя повторностями с использованием вариантов тяжелой цепи (E) и вариантов легкой цепи (F). Средние IC50 для gVRC-H1: 10E8L и gVRC-H11:10E8L приблизительно в 6 раз превышали IC50 для исходного матричного 10E8. Варианты расположены в определенном порядке и обозначены в соответствии с их генетической удаленностью от 10E8, а окрашенные участки указаны в соответствии с их филогенетической удаленностью.
dN152
dN152
dN152
dN152
dN152
dN152
dN152
dN152
dN152
dN152
dN152
dN152
dN152
dN152
dN152
dN152
dN152
dN152
dN152
dN152
dN152
dN152
dN152
dN152
dN152
dN152
dN152
dN152
На фиг. 51A-51D представлен ряд выровненных последовательностей и ленточные диаграммы, на которых проиллюстрированы последовательности и смоделированные структуры вариантов 10E8, которые нейтрализуют ВИЧ-1. (A) Последовательности тяжелой цепи (SEQ ID NO: 1 и 153-163, сверху вниз: gVRC-H1 (SEQ ID NO: 153); gVRC-H2(SEQ ID NO: 154); gVRC-H3 (SEQ ID NO: 155); gVRC-H4 (SEQ ID NO: 156); gVRC-H5 (SEQ ID NO: 157); gVRC-H6 (SEQ ID NO: 158); gVRC-H7 (SEQ ID NO: 159); gVRC-H8 (SEQ ID NO: 160); gVRC-H9 (SEQ ID NO: 161); gVRC-Hl0 (SEQ ID NO: 162); gVRC-H11 (SEQ ID NO: 163)). Последовательности расположены в соответствии с их генетической удаленностью от 10Е8, где последовательности 10Е8 с модификациями подчеркнуты. Остатки каркасной области и CDR закрашены, и такими остатками являются остатки, которые взаимодействуют с эпитопом MPER gp41 (незаштрихованные кружки - взаимодействие остатков главной цепи; незаштрихованные кружки с лучами - взаимодействие остатков боковой цепи; заштрихованные кружки - взаимодействие остатков главной и боковой цепей). (В) Смоделированные структуры вариантов тяжелой цепи в комплексе с эпитопом gp41. Варианты 10Е8 с повышенной способностью к распознаванию (с тяжелыми цепями, закрашенными в соответствии с их генетической удаленностью как в 1 В) были смоделированы на структуре 10Е8, имеющей полноразмерную область MPER gp41 ВИЧ-1 (не совсем белый). Структуры представлены в виде Cα-лент, где боковые аминокислотные цепи, отличающиеся от 10Е8, представлены в виде черточек темно-серого цвета. (С) Последовательности легкой цепи (SEQ ID NO: 2 и 164-182, сверху вниз: gVRC-L1 (SEQ ID NO: 164); gVRC-L2 (SEQ ID NO: 165); gVRC-L3 (SEQ ID NO: 166); gVRC-L4 (SEQ ID NO: 167); gVRC-L5 (SEQ ID NO: 168); gVRC-L6 (SEQ ID NO: 169); gVRC-L7 (SEQ ID NO: 170); gVRC-L8 (SEQ ID NO: 171); gVRC-L9 (SEQ ID NO: 172); gVRC-L10 (SEQ ID NO: 173); gVRC-L11 (SEQ ID NO: 174); gVRC-L12 (SEQ ID NO: 175); gVRC-Ll3 (SEQ ID NO: 176); gVRC-L14 (SEQ ID NO: 177); gVRC-L15 (SEQ ID NO: 178); gVRC-L16 (SEQ ID NO: 179); gVRC-Ll7 (SEQ ID
dN152
dN152
NO: 180); gVRC-L18 (SEQ ID NO: 181); gVRC-L19 (SEQ ID NO: 182). Последовательности расположены в соответствии с их генетической удаленностью от 10Е8, где последовательности 10Е8 с модификациями подчеркнуты. Остатки каркасной области и CDR закрашены, и такими остатками являются остатки, которые взаимодействуют с эпитопом MPER gp41 (как показано в (А)). (D) Смоделированные структуры вариантов легкой цепи в комплексе с эпитопом gp41. Варианты 10Е8 с повышенной способностью к распознаванию (с легкими цепями, закрашенными в соответствии с их филогенетической удаленностью как в 1С) были смоделированы на структуре 10Е8, имеющей полноразмерную область MPER gp41 ВИЧ-1 (не совсем белый). Структуры представлены в виде Cα-лент, где боковые аминокислотные цепи, отличающиеся от 10Е8, представлены в виде черточек темно-серого цвета.
На фиг. 52A-52D представлены таблица и серия графиков, иллюстрирующие филогенетическую ветвь, соответствующую вариантам тяжелой и легкой цепей 10Е8. (А) Соответствие филогенетических ветвей. На филогенетических деревьях антител, идентифицированных по сетчатой диаграмме (фиг. 1C, D), ветви были обозначены исходя из их удаленности от 10Е8, b1-Н - для тяжелой цепи и b1-L - для легкой цепи на ветви, содержащей 10Е8, и далее вниз по порядку, b2-Н (b2-L), b3-Н (b3-L) и b4-Н для самой дальней ветви. Был выбран вариант от каждой ветви, который обладает наибольшей способностью нейтрализовать партнера дикого типа для 10Е8, и была сконструирована полноразмерная матрица из 12 антител. (В) Нейтрализация ВИЧ-1. Нейтрализацию оценивали по 5 изолятам для вариантов 10E8 от соответствующих и несоответствующих пар ветвей. (C) Окрашивание клеток Hep2. Аутореактивность оценивали путем окрашивания клеток Hep2 на варианты 10E8 от соответствующих и несоответствующих пар ветвей.
На фиг. 53 представлена таблица, на которой проиллюстрированы моноклональные антитела 10E8, состоящие из вариантов тяжелой и легкой цепей, исходя из нейтрализующей активности вариантов, если они присутствуют в комбинации с комплементарной цепью 10E8 дикого типа.
На фиг. 54 представлена таблица, на которой проиллюстрированы антитела 10E8, состоящие из филогенетически спаренных вариантов тяжелой и легкой цепей.
На фиг. 55A-55C представлена серия таблиц, в которых проиллюстрированы результаты анализов на нейтрализацию панели вирусов ВИЧ-1, проводимых с использованием серии пар вариантов 10E8, подобранных по их нейтрализующей активности или их филогенетике, как показано на фиг. 53 и 54 и описано в примере 8.
На фиг. 56 представлена серия таблиц, в которых проиллюстрированы результаты анализов на аутореактивность панели вирусов ВИЧ-1, проводимых с использованием серии пар вариантов 10E8, подобранных по их нейтрализующей активности или их филогенетике, как показано на фиг. 53 и 54 и описано в примере 8.
На фиг. 57 представлена серия таблиц, в которых проиллюстрированы результаты анализов на нейтрализацию панели вирусов ВИЧ-1, проводимых с использованием серии пар вариантов 10E8, подобранных по их нейтрализующей активности или их филогенетике, как показано на фиг. 53 и 54 и описано в примере 8.
На фиг. 58A и 58B представлена серия графиков, иллюстрирующих результаты анализов на нейтрализацию, в которых были протестированы нейтрализующие свойства серий антител, содержащих тяжелые и легкие цепи 10E8, или вариантов тяжелой и легкой цепей 10E8, где анализы проводили на панели из 20 вирусов ВИЧ.
На фиг. 59 представлена таблица, где указаны номенклатура и последовательности SEQ ID NO для тяжелой и легкой цепей некоторых вариантов антител 10E8.
На фиг. 60A и 60B представлена серия таблиц, в которых приводятся систематизированные данные для вариантов тяжелой цепи 10E8. Такие мутанты, как «ревертанты зародышевой линии», мутант «454», мутант «аланиновый скан», «структурный» и «дополнительные» мутанты означают мутанты с заменами в тяжелой цепи 10E8, проиллюстрированные в примере 8.
На фиг. 61A и 61B представлена серия таблиц, в которых приводятся систематизированные данные для вариантов легкой цепи 10E8. Такие мутанты, как «ревертанты зародышевой линии» и мутант «454» означают мутанты с заменами в легкой цепи 10E8, проиллюстрированные в примере 8.
Список последовательностей
Последовательности нуклеиновой кислоты и аминокислотные последовательности, представленные ниже в списке последовательностей, указаны стандартными буквенными кодами, используемыми для обозначения нуклеотидных оснований, и трехбуквенными кодами, используемыми для обозначения аминокислот в соответствии со статьей 37 Кодекса законов США 1.822. Причем, представлена только одна цепь каждой последовательности нуклеиновой кислоты, а комплементарная ей цепь приводится для этой цепи в виде ссылки. Список последовательностей имеется в виде текстового файла ASCII под названием «Sequence.txt» (~ 160 т.п.н.), который был создан 22 апреля 2014 и вводится в настоящее описание посредством ссылки. Далее приводится список последовательностей:
SEQ ID NO: 1 представляет собой аминокислотную последовательность тяжелой цепи gp41-специфического антитела 10Е8.
SEQ ID NO: 2 представляет собой аминокислотную последовательность легкой цепи gp41-специфического антитела 10Е8.
SEQ ID NO: 3 представляет собой аминокислотную последовательность тяжелой цепи gp41-специфического антитела 7Н6.
SEQ ID NO: 4 представляет собой аминокислотную последовательность легкой цепи gp41-специфического антитела 7Н6.
SEQ ID NO: 5 представляет собой аминокислотную последовательность тяжелой цепи gp41-специфического антитела 7N16.
SEQ ID NO: 6 представляет собой аминокислотную последовательность легкой цепи gp41-специфического антитела 7N16.
SEQ ID NO: 7 представляет собой аминокислотную последовательность тяжелой цепи IGHV3-15*05.
SEQ ID NO: 8 представляет собой аминокислотную последовательность легкой цепи IGLV3-19*01.
SEQ ID NO: 9 и 10 представляют собой эпитопы в MPER gp41.
SEQ ID NO: 11 представляет собой аминокислотную последовательность тяжелой цепи gp41-специфического антитела.
SEQ ID NO: 12 представляет собой аминокислотную последовательность легкой цепи gp41-специфического антитела.
SEQ ID NO: 13 представляет собой аминокислотную последовательность эпитопа gp41, который специфически связывается с 10E8 и 10E8-подобными антителами.
SEQ ID NO: 14-25 представляют собой аминокислотные последовательности мутантных последовательностей MPER gp41.
SEQ ID NO: 26 представляет собой аминокислотную последовательность области MPER gp41.
SEQ ID NO: 27-34 представляют собой нуклеиновокислотные последовательности секвенирующих праймеров.
SEQ ID NO: 35-115 представляют собой последовательности нуклеиновых кислот тяжелых цепей репрезентативного 10E8-подобного антитела.
SEQ ID NO: 116-145 представляют собой последовательности нуклеиновых кислот легких цепей репрезентативного 10E8-подобного антитела.
SEQ ID NO: 146 представляет собой консенсусную аминокислотную последовательность тяжелой цепи gp41-специфического антитела.
SEQ ID NO: 147-149 представляют собой аминокислотные последовательности тяжелых цепей ревертантов моноклонального антитела 10E8 зародышевой линии.
SEQ ID NO:150-152 представляют собой аминокислотные последовательности вариабельных областей легкой цепи ревертантов моноклонального антитела 10E8 зародышевой линии.
SEQ ID NO: 153-163 представляют собой аминокислотные последовательности вариабельных областей тяжелой цепи gp41-специфических антител.
SEQ ID NO: 164-186 представляют собой аминокислотные последовательности вариабельных областей легкой цепи gp41-специфических антител.
SEQ ID NO: 187 представляет собой консенсусную аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи gp41-специфического антитела.
SEQ ID NO: 188 представляет собой консенсусную аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи gp41-специфического антитела.
SEQ ID NO: 189-192 представляют собой аминокислотные последовательности вариабельных областей тяжелой цепи gp41-специфических антител.
SEQ ID NO: 193-196 представляют собой нуклеиновокислотные последовательности праймеров.
SEQ ID NO: 197-199 представляют собой аминокислотные последовательности вариабельных областей легкой цепи gp41-специфических антител.
SEQ ID NO: 200-205 представляют собой аминокислотные последовательности вариабельных областей тяжелой цепи gp41-специфических антител.
SEQ ID NO: 205-209 представляют собой аминокислотные последовательности вариабельных областей легкой цепи gp41-специфических антител.
Подробное описание изобретения
1. Краткое описание терминов
:
Если это не оговорено особо, используемые в настоящем документе технические термины имеют свои общепринятые значения. Определения общих терминов, используемых в молекулярной биологии, можно найти в работе Benjamin Lewin, Genes VII, опубликованной в Oxford University Press, 1999; Kendrew et al. (eds.), в энциклопедии The Encyclopediaof Molecular Biology, опубликованной в Blackwell Science Ltd., 1994; и в справочном руководстве Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnologya Comprehensive Desk Reference, опубликованном в VCH Publishers, Inc., 1995; и в других аналогичных источниках.
В настоящем описании, существительные в единственном числе подразумеваются, что эти существительные могут означать множество объектов, если это не оговорено особо. Так, например, термин «антиген» содержит один или множество антигенов и может рассматриваться как эквивалент выражения «по меньшей мере один антиген».
Используемый в настоящем документе термин «содержит» означает «содержит». Так, например, словосочетание «содержащий антиген» означает «содержащий антиген», но при этом, не исключается присутствие других элементов.
Следует также отметить, что любые и все размеры оснований или аминокислот и все величины молекулярных масс, для нуклеиновых кислот или полипептидов, являются приблизительными и приводятся лишь в описательных целях, если это не оговорено особо. Хотя может быть применено множество методов и материалов, аналогичных или эквивалентных описанным в настоящем документе методам и материалам, однако, особенно подходящие методы и материалы описаны ниже. В случае возникновения каких-либо разночтений, следует отдать предпочтение определениям, данным в настоящей заявке. Кроме того, материалы, методы и примеры приводятся лишь в иллюстративных целях и не должны рассматриваться как ограничение настоящего изобретения.
Для лучшего понимания различных вариантов осуществления изобретения ниже приводится объяснение терминов:
Введение: Введение композиции индивидууму выбранным способом. Введение может быть местным или системным. Так, например, если способ введения является внутривенным, то это означает, что данную композицию вводят индивидууму в вену. В некоторых примерах, индивидууму вводят описанное в настоящем документе антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, специфичные к полипептиду gp41 ВИЧ.
Средство: Любое вещество или любая комбинация веществ, которые могут быть использованы для достижения нужной цели или нужного результата, например, вещество или комбинация веществ, которые могут быть использованы для ингибирования ВИЧ-инфекции у индивидуума. Средствами являются белки, молекулы нуклеиновой кислоты, соединения, небольшие молекулы, органические соединения, неорганические соединения или другие представляющие интерес молекулы. Средством может быть терапевтическое средство (такое как антиретровирусное средство), диагностическое средство или фармацевтическое средство. В некоторых вариантах осуществления изобретения, средством является полипептидный агент (такой как ВИЧ-нейтрализующее антитело) или противовирусное средство. Следует отметить, что конкретные средства могут быть использованы для получения более, чем одного результата.
Аминокислотная замена: Замена одной аминокислоты в полипептиде другой аминокислотой.
Амплификация: Метод увеличения числа копий молекулы нуклеиновой кислоты (такой как РНК или ДНК). Примером амплификации является полимеразная цепная реакция, при которой биологический образец приводят в контакт с парой олигонуклеотидных праймеров в условиях, способствующих гибридизации праймеров с нуклеиновокислотной матрицей в образце. Эти праймеры удлиняют в соответствующих условиях, подвергают реакции диссоциации из матрицы, а затем снова гибридизуют, удлиняют и диссоциируют для увеличения числа копий нуклеиновой кислоты. Продукт амплификации может быть охарактеризован с помощью электрофореза, методом расщепления рестриктирующими эндонуклеазами, путем гибридизации или лигирования олигонуклеотидов и/или секвенирования нуклеиновых кислот стандартными методами. Другими примерами амплификации являются амплификация с замещением цепи, описанная в патенте США No.5744311; изотермальная амплификация без транскрипции, описанная в патенте США No.6033881; амплификация с репарацией цепи, описанная в WO 90/01069; амплификация посредством реакции лигазной цепи, описанная в EP-A-320308; амплификация посредством реакции лигазной цепи с заполнением брешей, описанная в патенте США No.5427930; и амплификация без транскрипции РНК NASBA™, описанная в патенте США No.6025134.
Животное: Многоклеточные позвоночные, относящиеся к категории, например, млекопитающих и птиц. Термин «млекопитающие» включает человека и млекопитающих, не являющихся человеком. Аналогичным образом, термин «индивидуум» включает человека и животных.
Антитело: Полипептид, в основном, кодируемый геном или генами иммуноглобулина, или антигенсвязывающие фрагменты такого полипептида, которые специфически связываются с аналитом (антигеном), таким как gp41, или с иммуногенным фрагментом gp41, например, с мембрано-проксимальной областью gp41, и распознают их. Генами иммуноглобулинов являются гены константной области каппа, лямбда, альфа, гамма, дельта, эпсилон и мю, а также мириады генов вариабельной области иммуноглобулина.
rd
Антитела существуют, например, в форме интактных иммуноглобулинов, и ряда хорошо охарактеризованных антигенсвязывающих фрагментов, продуцируемых посредством расщепления различными пептидазами. Так например, Fab, Fv, scFv, которые специфически связываются с gp41 или с фрагментами gp41, могут представлять собой gp41-специфические связывающие средства. Белком scFv является слитый белок, в котором вариабельная область легкой цепи иммуноглобулина и вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина связаны посредством линкера, а в dsFv, цепи были мутированы с введением дисульфидной связи для стабилизации ассоциации цепей. Этот термин также включает генетически сконструированные формы, такие как химерные антитела и гетероконъюгированные антитела, такие как биспецифические антитела. См., также Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, IL); Kuby, Immunology, 3 Ed., W.H. Freeman & Co., New York, 1997.
2
2
Фрагментами антител являются, но не ограничиваются ими, следующие фрагменты: (1) Fab, то есть, фрагмент, который содержит одновалентный антигенсвязывающий фрагмент молекулы антитела, продуцируемый посредством гидролиза целого антитела ферментом папаином, с образованием интактной легкой цепи и части одной тяжелой цепи; (2) Fab', фрагмент молекулы антитела, полученный путем обработки целого антитела пепсином с последующим восстановлением и с образованием интактной легкой цепи и части тяжелой цепи, причем два Fab'-фрагмента содержатся в одной молекуле антитела; (3) (Fab'), фрагмент антитела, полученный путем обработки целого антитела ферментом пепсином без последующего восстановления; (4) F(ab'), димер из двух Fab'-фрагментов, связанных друг с другом двумя дисульфидными связями; (5) Fv, генетически сконструированный фрагмент, содержащий вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи, экспрессирующиеся в виде двух цепей; и (6) одноцепочечное антитело («SCA»), генетически сконструированнaя молекула, содержащая вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи, связанные подходящим полипептидным линкером, который может служить в качестве генетически сцепленной одноцепочечной молекулы.
de novo
Используемый в настоящем документе термин «антитело» также включает фрагменты антитела, полученные либо путем модификации целых антител, либо путем их синтеза  методами рекомбинантных ДНК. В некоторых примерах, термин «антитело» включает аминокислотные последовательности одной или более CDR, происходящих от антитела, присоединенного к каркасу.
Обычно, природный иммуноглобулин имеет тяжелые цепи (H) и легкие цепи (L), связанные между собой дисульфидными связями. Существует два типа легких цепей, лямбда (л) и каппа (к). Существует пять основных классов тяжелых цепей (или изотипов), которые определяют функциональную активность молекулы антитела: IgM, IgD, IgG, IgA и IgE. Описанные антитела могут переключаться на другой класс.
Каждая тяжелая и легкая цепь содержит константную область и вариабельную область (эти области также называются «доменами»). В некоторых вариантах осуществления изобретения, вариабельные домены тяжелой и легкой цепи объединяют для специфического связывания с антигеном. В дополнительных вариантах осуществления изобретения, необходимым является только вариабельный домен тяжелой цепи. Так например, природные верблюжьи антитела, состоящие только из тяжелой цепи, являются функциональными и обладают стабильностью в отсутствии легкой цепи (см., например, Hamers-Casterman at al., Nature, 363:446-448, 1993; Sheriff et al., Nat. Struct. Biol, 3:733-736, 1996). Вариабельные домены легкой и тяжелой цепи содержат «каркасную область», прерывающуюся тремя гипервариабельными областями, также называемыми «комплементарность-определяющей областью» или «CDR» (см., например, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1991). Последовательности каркасных областей различных легких или тяжелых цепей являются относительно консервативными у различных видов. Каркасные области антитела, которые представляют собой объединенные каркасные области, состоящие из легкой и тяжелой цепей служат для определения положения и выравнивания CDR в трехмерном пространстве.
CDR ответственны, главным образом, за связывание с эпитопом антигена. Границы аминокислотных последовательностей данной CDR могут быть легко определены любыми хорошо известными методами, включая методы, описанные Кэбатом и др. («Sequences of Proteins of Immunological Interest». 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991; “Kabat» numbering scheme), Al-Lazikani et al. (JMB 273,927-948, 1997; «Сhothia» numbering scheme) и Lefranc, et al. («IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig Superfamily V-like domains» Dev. Comp. Immunol., 27:55-77, 2003; «IMGT» numbering scheme).
H
L
CDR каждой цепи обычно обозначают CDR1, CDR2 и CDR3 (от N-конца до С-конца), а также обычно идентифицируют по цепи, в которой локализована конкретная CDR. Таким образом, CDR3 Vлокализована в вариабельном домене тяжелой цепи антитела, в которой она присутствует, тогда как CDR1 Vпредставляет собой CDR1 от вариабельного домена легкой цепи антитела, в которой она присутствует. CDR легкой цепи иногда обозначают CDR L1, CDR L2, и CDR L3. CDR тяжелой цепи иногда обозначают CDR H1, CDR H2 и CDR H3.
H
L
Обозначения «V» или «VH» относятся к вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина, включая вариабельную область фрагмента антитела, такого как Fv, scFv, dsFv или Fab. Обозначения «V» или «VL» относятся к вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина, включая вариабельную область фрагмента антитела, такого как Fv, scFv, dsFv или Fab.
«Моноклональное антитело» представляет собой антитело, продуцируемое одним клоном В-лимфоцитов или клеткой, в которую были введены гены легкой и тяжелой цепей одного антитела. Моноклональные антитела получают методами, известными специалистам, например, путем создания гибридных антитело-образующих клеток после слияния миеломных клеток с иммунными клетками селезенки. Эти слитые клетки и их потомство называются «гибридомами». Моноклональными антителами являются гуманизированные моноклональные антитела. В некоторых примерах, моноклональные антитела выделяют у индивидуума. Могут быть также определены аминокислотные последовательности таких выделенных моноклональных антител.
«Гуманизированным» иммуноглобулином является иммуноглобулин, содержащий каркасную область человека и одну или более CDR иммуноглобулина, не принадлежащего человеку (такого как иммуноглобулин, происходящий от мыши или крысы, или полученный путем синтеза). Не-человеческий иммуноглобулин, обеспечивающий такие CDR, называется «донором», а иммуноглобулин человека, обеспечивающий каркасную область, называется «акцептором». В одном из вариантов осуществления изобретения, все CDR в гуманизированном иммуноглобулине происходят от донорного иммуноглобулина. При этом, константные области необязательно должны присутствовать, но если они присутствуют, то они должны быть, в основном, идентичны константным областям иммуноглобулина человека, например, по меньшей мере приблизительно на 85-90%, например, приблизительно на 95% или более. Следовательно, все части гуманизированного иммуноглобулина, за исключением, возможно, только CDR, в основном, идентичны соответствующим частям природных последовательностей иммуноглобулина человека. «Гуманизированным антителом» является антитело, содержащее гуманизированную легкую цепь и гуманизированную тяжелую цепь иммуноглобулина. Гуманизированное антитело связывается с тем же антигеном, с которым связывается донорное антитело, обеспечивающее присутствие CDR. Акцепторная каркасная область гуманизированного антитела иммуноглобулина или антитела может иметь ограниченное число аминокислотных замен, введенных в донорную каркасную область. Гуманизированные или другие моноклональные антитела могут иметь дополнительные консервативные аминокислотные замены, которые, по существу не влияют на связывание с антигеном или на другие функции иммуноглобулина. Гуманизированные иммуноглобулины могут быть сконструированы методами генной инженерии (см., например, патент США No. 5585089).
Аутореактивность антитела: Свойства антитела, заключающиеся в способности антитела реагировать с аутоэпитопами, то есть, с эпитопами белков и/или липидов, продуцируемых у индивидуума. Так, например, антитело, такое как 10E8, которое не обладает аутореактивностью, не связывается с липидами, присутствующими на клеточной мембране индивидуума, например, на клетке, инфицированной ВИЧ и/или экспрессирующей gp41 на своей поверхности. Методы определения способности антитела реагировать с аутоэпитопам известны специалистам и описаны в настоящей заявке (например, в примерах 1 и 8). В одном из примеров, аутореактивность антитела оценивают с помощью анализа на антитело против кардиолипина или анализа на антитело против ядерного антигена (ANA).
Каркас антитела: Каркас антитела означает гетерологичный белок, который был присоединен к одной или более CDR представляющего интерес антитела, присутствующих на его поверхности. Присоединение CDR может быть осуществлено на компьютере, что позволяет сохранить их релевантную структуру и конформацию. Для облегчения присоединения CDR, в каркас акцептора вводят мутации.
Antibodyome: Полный репертуар экспрессируемой последовательностей тяжелой и легкой цепей антитела, экспрессируемого у индивидуума. Индивидуумом может быть индивидуум, инфицированный патогеном, например, ВИЧ.
Антиген: Полипептид, который может стимулировать продуцирование антител или вырабатывание Т-клеточного ответа у животного, включая полипептиды, которые были инъецированы или абсорбированы животному. Антиген взаимодействует с продуктами специфического гуморального или клеточного иммунного ответа, включая продукты, индуцированные гетерологичными антигенами, такими как описанные антигены. Термины «эпитоп» или «антигенная детерминанта» означают область антигена, которая вырабатывает В- и/или Т-клеточный ответ. В одном из вариантов осуществления изобретения, Т-клетки взаимодействуют с эпитопом, если этот эпитоп презентируется в комбинации с молекулой MHC. Эпитопы могут быть образованы аминокислотами, непрерывно следующими друг за другом, или аминокислотами ряда, прерываемого в юкстаположении третичной укладкой белка. Эпитопы, образованные смежными аминокислотами, обычно сохраняются после обработки денатурирующими растворителями, а эпитопы, образованные посредством третичной укладки, обычно элиминируются после обработки денатурирующими растворителями. Эпитоп обычно содержит по меньшей мере 3, а чаще всего по меньшей мере 5, приблизительно 9 или приблизительно 8-10 аминокислот, находящихся в уникальной пространственной конформации. Методы определения пространственной конформации эпитопов содержат, например, рентгеновскую кристаллографию и ядерный мaгнитный резонанс.
Неограничивающими примерами антигенов являются иммуногенные полипептиды и иммуногенные пептиды. В некоторых примерах, антигенами являются полипептиды, происходящие от представляющего интерес патогена, такого как вирус. Антиген, который может стимулировать продуцирование антител или вырабатывание у индивидуума Т-клеточного ответа против полипептида, экспрессируемого вирусом, представляет собой вирусный антиген. «Антиген ВИЧ» может стимулировать у индивидуума продуцирование антител или Т-клеточного ответа, индуцируемого полипептидом, экспрессируемым ВИЧ. В некоторых вариантах осуществления изобретения, антигеном ВИЧ является полипептид, экспрессируемый ВИЧ, такой как gp160 или его фрагмент, такой как gp145, gp140, gp120 или gp41.
«Эпитоп-мишень» представляет собой специфический эпитоп на антигене, который специфически связывается с представляющим интерес антителом, таким как моноклональное антитело. В некоторых примерах, эпитопом-мишенью являются аминокислотные остатки, контактирующие с представляющим интерес антителом, и такой эпитоп-мишень может быть отобран по аминокислотным остаткам, определенным как остатки, контактирующие с представляющим интерес антителом.
Антиретровирусное средство: Средство, которое специфически ингибирует ретровирус, реплицирующийся в клетках или инфицирующий эти клетки. Неограничивающими примерами антиретровирусных лекарственных средств являются ингибиторы проникновения вируса в клетки (например, энфувиртид), антагонисты рецепторов CCR5 (например, аплавирок, викривирок, маравирок), ингибиторы обратной транскриптазы (например, ламивудин, зидовудин, абакавир, тенофовир, эмтрицитабин, эфавиренс), ингибиторы протеазы (например, лопивар, ритонавир, ралтегравир, дарунавир, атазанавир), ингибиторы созревания (например, альфа-интерферон, бевиримат и вивекон).
Антиретровирусная терапия (АРТ): Терапевтическое лечение ВИЧ-инфекции, включающее введение по меньшей мере одного антиретровирусного средства (например, одного, двух, трех или четырех антиретровирусных средств) ВИЧ-инфицированному индивидууму во время проведения курса терапии. Неограничивающими примерами антиретровирусных лекарственных средств являются ингибиторы проникновения вируса в клетки (например, энфувиртид), антагонисты рецепторов CCR5 (например, аплавирок, викривирок, маравирок), ингибиторы обратной транскриптазы (например, ламивудин, зидовудин, абакавир, тенофовир, эмтрицитабин, эфавиренс), ингибиторы протеазы (например, лопивар, ритонавир, ралтегравир, дарунавир, атазанавир), ингибиторы созревания (например, альфа-интерферон, бевиримат и вивекон). Один из примеров схемы АРТ включает лечение комбинацией тенофовира, эмтрицитабина и эфавиренца. В некоторых примерах, АРТ включает высокоэффективную антиретровирусную терапию (ВЭАРТ).
Атомные координаты или структурные координаты: Математические координаты, выведенные из математических уравнений, относящихся к структурам, полученным методом дифракции монохроматического луча рентгеновского излучения, испускаемого атомами (рассеивающими центрами), такими как атомы антигена или антигена в комплексе с антителом. В некоторых примерах, антигеном может быть gp41, комплекс «gp41:антитело» или их комбинации в кристалле. Данные дифракции используют для вычисления карты электронной плотности повторяющихся элементарных ячеек кристалла. Карты электронной плотности используют для определения положений отдельных атомов в элементарной ячейке кристалла. В одном из примеров, термин «структурные координаты» означает декартовы координаты, выведенные из математических уравнений, относящихся к структурам, полученным методом дифракции монохроматического луча рентгеновского излучения, испускаемого атомами gp41 в кристаллической форме.
Специалисту в данной области известно, что серия структурных координат, определяемых методом рентгеновской кристаллографии, имеет стандартные ошибки. В соответствии с настоящим изобретением, любые серии структурных координат, имеющих среднеквадратические ошибки в атомах белкового остова (N, Cα, C и 0), составляющие менее чем приблизительно 1,0 ангстрем, при их суперпозиции, например, приблизительно 0,75 или приблизительно 0,5 или приблизительно 0,25 ангстрем, будут рассматриваться (если это не оговорено особо) как идентичные.
hi
+
+
hi
lo
lo
lo
hi
hi
B-клетки и В-клетки памяти: B-клетки представляют собой субсерию лимфоцитов, то есть лейкоцитов. Зрелые В-клетки дифференцируются в клетки плазмы, продуцирующие антитела, и в В-клетки памяти. «B-клеткой-предшественником» является клетка, которая может развиваться в зрелую В-клетку. B-клетками-предшественниками являются стволовые клетки, ранние про-В-клетки, поздние про-В-клетки, крупные пре-B-клетки, небольшие пре-B-клетки, незрелые B-клетки и переходные B-клетки. Обычно ранние про-В-клетки (которые экспрессируют, например, CD43 или B220) подвергаются реаранжировке тяжелых цепей иммуноглобулина и превращаются в поздние про-В-клетки и пре-B-клетки, а затем они подвергаются реаранжировке легких цепей иммуноглобулина и превращаются в незрелые B-клетки. У человека, незрелыми B-клетками (например, незрелыми периферическими переходными B-клетками) являются CD38-, IgD-, CD10-, CD24-, CD44-, CD23- и CD1-клетки. Так, например, незрелыми B-клетками являются B220 (CD45R)-экспрессирующие клетки, в которых происходит реаранжировка генов легкой и тяжелой цепей иммуноглобулина. В одном из вариантов осуществления изобретения, незрелые В-клетки экспрессируют CD45R, IgM класса II, CD19 и CD40. Незрелые B-клетки могут развиваться в зрелые В-клетки, которые могут продуцировать иммуноглобулины (например, IgA, IgG или IgM). Зрелые B-клетки имеют приобретенные поверхностные IgM и IgD, и обладают способностью реагировать на антиген и экспрессировать характеристические маркеры, такие как CD21 и CD23 (CD23CD21-клетки). Клетки плазмы представляют собой В-клетки на терминальной стадии дифференцировки, которыми преимущественно являются антитело-секретирующие клетки.
После стимуляции В-клетки-предшественника (например, пре-коммитированного небольшого лимфоцита) антигеном, эта клетка дифференцируется в бластную клетку, которая впоследствии дифференцируется в незрелую клетку плазмы, и эта клетка уже может дифференцироваться в зрелую клетку плазмы или в B-клетку памяти. «Зрелая клетка плазмы» секретирует иммуноглобулины в ответ на действие специфического антигена.
B-клетки могут активироваться под действием средств, таких как липополисахарид (ЛПС) или IL-4, и антител против IgM. Наиболее распространенными биологическими источниками В-клеток и В-клеток-предшественников являются костный мозг, периферическая кровь, селезенка и лимфоузлы.
+
-
-
-
«В-клетки памяти» представляют собой В-клетки, в которых индуцируется переключение изотипов и соматическая гипермутация, происходящие обычно во время продуцирования вторичного иммунного ответа (последующей обработки антигеном после первой обработки), но они могут быть также детектированы во время первичного ответа, продуцируемого антигеном. Для продуцирования В-клеток памяти обычно необходимы хелперные Т-клетки. Вырабатывание В-клеток памяти происходит в зародышевых центрах (GC) лимфоидных фолликулов, где антиген-продуцирующие лимфоциты подвергаются соматической гипермутации и аффинному отбору, преимущественно под влиянием хелперных Т-клеток. Обычно В-клетки памяти экспрессируют на своей поверхности высокоаффинный антигенспецифический иммуноглобулин (B-клеточный рецептор). В одном из вариантов осуществления изобретения, В-клетками памяти являются клетки, которые экспрессируют CD19, но не экспрессируют IgA, IgD или IgM (CD19IgAIgDIgМ-клетки).
Биспецифическое антитело: Рекомбинантная молекула, состоящая из двух различных антигенсвязывающих доменов, которые затем связываются с двумя различными антигенными эпитопами. Биспецифическими антителами являются химически связанные или генетически сцепленные молекулы, состоящие из двух антигенсвязывающих доменов. Антигенсвязывающие домены могут быть связаны посредством линкера. Антигенсвязывающими доменами могут быть моноклональные антитела, антигенсвязывающие фрагменты (например, Fab, scFv), eAd, биспецифические одноцепочечные антитела или их комбинации. Биспецифическое антитело может содержать, но необязательно, один или более константных доменов. Примером биспецифического антитела является биспецифическое одноцепочечное антитело, содержащее scFv-фрагмент, который специфически связывается с gp41, присоединенным (посредством пептидного линкера) к scFv, который специфически связывается с антигеном, не являющимся gp41. Другим примером антитела является биспецифическое антитело, содержащее Fab-фрагмент, который специфически связывается с gp41, присоединенным к scFv, который специфически связывается с антигеном, не являющимся gp41.
Репертуар В-клеток: В-клетки в образце или у индивидуума, вырабатывающие антитело, специфичное к представляющему интерес антигену.
CD40: Костимулирующий белок, присутствующий на антигенпрезентирующих клетках и необходимый для их активации. Связывание лиганда CD40 (CD40L), также известного как CD154, с CD40, приводит к активации антигенпрезентирующих клеток. Было обнаружено, что этот рецептор играет важную роль в опосредовании иммунного и воспалительного ответов широкого ряда, включая зависимое от T-клеток переключение класса иммуноглобулинов, образование B-клеток памяти и формирование зародышевого центра. Примеры аминокислотных последовательностей CD40 и репрезентативных последовательностей мРНК, кодирующих CD40, можно найти в базе данных GENBANK рег. No. NM_001250 (10 июня 2012), которая вводится в настоящее описание посредством ссылки.
Лиганд CD40 (CD40L): Лиганд, который также обозначается CD154 и экспрессируется на активированных Т-клетках, а также является членом суперсемейства молекул некроза опухоли. Этот лиганд связывается с CD40 на антигенпрезентирующих клетках, что приводит к вырабатыванию множества эффектов в зависимости от типа клеток-мишеней. Вообще говоря, CD40L играет роль костимулирующей молекулы и индуцирует активацию антигенпрезентирующих клеток в комбинации со стимуляцией Т-клеточного рецептора молекулами MHC, присутствующими на антигенпрезентирующих клетках. В целом, CD40L имеет три партнера по связыванию: CD40, б5в1-интегрин и бIIbв3. CD154 экспрессируется на поверхности Т-клеток. Он регулирует В-клеточную функцию посредством связывания с CD40 на В-клеточной поверхности. Примеры аминокислотных последовательностей CD40 и последовательности мРНК, кодирующей CD40, можно найти в базе данных GENBANK рег. No. NM_000074.2, (10 июня 2012), которая вводится в настоящее описание посредством ссылки.
Химерное антитело: Антитело, которое содержит последовательности, обычно происходящие от антител двух различных видов. В некоторых примерах, химерное антитело содержит одну или более CDR и/или каркасные области, происходящие от одного антитела человека, и CDR и/или каркасные области, происходящие от другого антитела человека. В некоторых примерах, химерное антитело получают путем присоединения одной или более CDR к каркасу антитела.
Клональный вариант: Любая последовательность, которая отличается одним или более нуклеотидами или одной или более аминокислотами, присутствием V-области с мутациями, идентичными мутациям, имеющимся в зародышевой линии, идентичной встречаемостью генов VDJ или VJ и идентичной длиной D и J. Последовательность «зародышевой линии» означает последовательность, кодирующую антитело/иммуноглобулин (или любой их фрагмент), в которых отсутствуют мутации, например, соматические мутации. Процент гомологии является показателем присутствия мутаций, которые были введены в часть тяжелой цепи любого типа после их контактирования с антигеном.
Считываемые компьютером носители данных: Любой носитель или носители, которые могут считываться компьютером и непосредственно доступны для компьютера, то есть, носители, которые являются подходящими для использования в компьютерной системе. Такими носителями являются, но не ограничиваются ими: магнитные носители данных, такие как гибкие диски, жесткие диски и магнитные ленты; оптические носители данных, такие как оптические диски или CD-ROM; электронные носители данных, такие как RAM и ROM; и носители, представляющие собой комбинации носителей этих категорий, такие как магнитные/оптические носители данных.
Компьютерная система: Аппаратные средства, которые могут быть использованы для анализа атомных координат и/или для конструирования антигена с использованием данных атомных координат или для анализа аминокислотной последовательности или последовательности нуклеиновой кислоты, например, для сравнения двух или более последовательностей и вычисления сходства и/или вариабельности последовательностей. Такие аппаратные средства компьютерной системы обычно включают, как минимум, центральный процессор (CPU), входное устройство, например, мышь, клавиатуру и т.п., выходное устройство и носитель данных. Для визуализации структурных данных желательно иметь монитор. Носителем данных могут быть RAM (оперативная память) или другие средства, доступные для считывания компьютером. Примерами таких систем являются автоматизированное рабочее место, оборудованное персональным компьютером, поставляемым корпорациями Silicon Graphics Incorporated и Sun Microsystems и работающим с операционными системами Windows NT на основе Unix, или IBM OS/2.
Конъюгат: Комплекс, состоящий из двух молекул, связанных вместе, например, посредством ковалентной связи. В одном из вариантов осуществления изобретения, антитело связано с эффекторной молекулой, например, такое антитело специфически связывается с gp41, ковалентно связанным с эффекторной молекулой или с токсином. Связывание может быть осуществлено химическими или рекомбинантными методами. В одном из вариантов осуществления изобретения, такое связывание осуществляют посредством химической реакции между молекулой антитела и эффекторной молекулой, где в результате такой реакции, между двумя молекулами образуется ковалентная связь, объединяющая эти молекулы в одну молекулу. Между антителом и эффекторной молекулой может быть встроен, но необязательно, пептидный линкер (короткая пептидная последовательность). Поскольку конъюгаты могут быть получены из двух молекул с различными функциональными аминокислотными последовательностями, таких как антитело и эффекторная молекула, то такие конъюгаты также иногда называют «химерными молекулами». В одном из вариантов осуществления изобретения, антитело, связанное с эффекторной молекулой, затем присоединяют к липиду или к другой молекуле, такой как белок или пептид, в целях увеличения времени полужизни такого конъюгата в организме.
Приведение в контакт: Введение молекул в твердой и жидкой форме в прямое физическое взаимодействие, которое может происходить in vivo или in vitro. Контактирование включает контакт между одной молекулой и другой молекулой, например, аминокислотой на поверхности одного полипептида, такого как антиген, который контактирует с другим полипептидом, таким как антитело. Контактирование между полипептидами может включать прямые контакты между аминокислотами двух или более полипептидов (например, посредством водородных связей или ван-дер-ваальсовых взаимодействий между полипептидами), а также другие взаимодействия, продуцирующие граничную область между полипептидами с пониженной доступностью для растворителя (в отсутствии всех аминокислот граничной области, необходимых для образования прямых связей). В некоторых вариантах осуществления изобретения, прямой контакт означает образование водородных связей или ван-дер-ваальсовы взаимодействия с конкретно идентифицированным остатком или остатками в последовательности, но не с другими остатками в этой последовательности. Специалисту в данной области известны методы определения контактов между полипептидами (см., например, пример 1). Контактирование может также включать приведение в контакт клетки, например, посредством прямой физической ассоциации этого антитела с клеткой. В некоторых вариантах осуществления изобретения, антитело (например, 10E8) контактирует только с конкретными остатками эпитопа на антигене, такого как описанный в настоящем документе эпитоп для 10E8 на gp41.
Контроль: Эталонный стандарт. В некоторых вариантах осуществления изобретения, контролем является образец, взятый у здорового пациента. В других вариантах осуществления изобретения, контролем является образец ткани, взятый у пациента с диагностированной ВИЧ-инфекцией. В других вариантах осуществления изобретения, контролем являются данные истории болезни или стандартная эталонная величина или ряд величин (таких как величины, полученные исходя из ранее протестированных контрольных образцов, взятых у группы ВИЧ-инфицированных пациентов с известным прогнозом или исходом заболевания, или группы образцов, которые представляют фоновые или нормальные величины).
Различия между тест-образцом и контролем могут увеличиваться, или наоборот, уменьшаться. Такие различия могут быть качественными или количественными, например, статистически значимыми. В некоторых примерах, различия, по сравнению с контролем, могут быть больше или меньше, например, по меньшей мере приблизительно на 5%, например, по меньшей мере приблизительно на 10%, по меньшей мере приблизительно на 20%, по меньшей мере приблизительно на 30%, по меньшей мере приблизительно на 40%, по меньшей мере приблизительно на 50%, по меньшей мере приблизительно на 60%, по меньшей мере приблизительно на 70%, по меньшей мере приблизительно на 80%, по меньшей мере приблизительно на 90%, по меньшей мере приблизительно на 100%, по меньшей мере приблизительно на 150%, по меньшей мере приблизительно на 200%, по меньшей мере приблизительно на 250%, по меньшей мере приблизительно на 300%, по меньшей мере приблизительно на 350%, по меньшей мере приблизительно на 400%, по меньшей мере приблизительно на 500% или более, чем на 500%.
Цитокин/Интерлейкин (IL): Родовое название для различных групп растворимых белков и пептидов, которые действуют как регуляторы гуморального ответа в нано-пикомолярных концентрациях, и которые в нормальных или в патологических условиях модулируют функциональные активности отдельных клеток и тканей. Эти белки также опосредуют прямые взаимодействия между клетками и регулируют процессы, происходящие во внеклеточной среде. Многие факторы роста и цитокины действуют как факторы выживаемости клеток благодаря предотвращению запрограммированной клеточной гибели. Цитокинами и интерлейкинами являются природные пептиды и варианты, которые полностью или частично сохраняют биологическую активность. Хотя специфические цитокины/интерлейкины описаны в настоящей заявке, однако, они не ограничиваются конкретно описанными в настоящем документе пептидами.
Цитотоксичность: Токсичность молекулы, такой как иммунотоксин, для клеток-мишеней, но не для остальных клеток организма. В противоположность этому, в одном из вариантов осуществления изобретения, термин «токсичность» означает токсичность иммунотоксина по отношению к клеткам, не являющимся клетками-мишенями, на которые нацелена данная молекула иммунотоксина, а термин «токсичность» по отношению к животному означает токсическое воздействие иммунотоксина на животное, вызываемое токсическим действием данного иммунотоксина на другие клетки, которые не являются клетками-мишенями для данного иммунотоксина.
35
131
Детектируемый маркер: Детектируемая молекула (также называемая меткой), которая непосредственно или опосредованно была конъюгирована со второй молекулой, такой как антитело, для облегчения детекции этой второй молекулы. Так, например, детектируемый маркер может быть детектирован с помощью ELISA, спектрофотометрическими методами, методами проточной цитометрии, микроскопии или диагностической визуализации (такими как КТ-сканирование, МРТ, ультразвуковая диагностика, анализ с помощью оптиковолоконных устройств и лапароскопия). Конкретными неограничивающими примерами детектируемых маркеров являются флуорофоры, флуоресцентные белки, хемилюминесцентные агенты, ферментативные связи, радиоактивные изотопы и тяжелые металлы или соединения (например, нанокристаллы оксида железа, обладающие сверхпарамагнитными свойствами и используемые для детекции методом МРТ). В одном из примеров, «меченое антитело» означает антитело, в которое была введена другая молекула. Так, например, метка представляет собой детектируемый маркер, такой как радиоактивно меченая аминокислота, включение которой в полипептид из биотинильных групп или ее присоединение к этому полипептиду может быть детектировано с помощью меченного авидина (например, стрептавидина, содержащего флуоресцентный маркер или обладающего ферментативной активностью, которая может быть детектирована оптическими или колориметрическими методами). Могут быть применены различные методы мечения полипептидов и гликопротеинов, известные специалистам. Примерами меток для полипептидов являются, но не ограничиваются ими: радиоизотопы или радионуклиды (такие как S или I), флуоресцентные метки (такие как флуоресцеинизоцианат (ФИТЦ), родамин, фосфорилирующие вещества лантанидной группы), ферментативные метки (такие как пероксидаза хрена, бета-галактозидаза, люцифераза, щелочная фосфатаза), хемилюминесцентные маркеры, биотинильные группы, предварительно определенные полипептидные эпитопы, распознаваемые вторым репортером (такие как последовательности, имеющие пару «лейциновых молний», сайты связывания для «вторых» антител, домены связывания с металлами, эпитопные метки), или магнитные соединения, такие как хелатные комплексы гадолиния. В некоторых вариантах осуществления изобретения, метки присоединяют посредством спейсерных групп различной длины для снижения возможного стерического затруднения. Методы применения детектируемых маркеров и рекомендации по выбору детектируемых маркеров, которые могут быть использованы в различных целях, обсуждаются в руководстве Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1989) and Ausubel et al. (In Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1998).
Детекция: Идентификация существования или присутствия какого-либо вещества или какого-либо события. Общие методы детекции известны специалистам и могут быть осуществлены в соответствии с описанными в настоящем документе протоколами и с использованием описанных в настоящем документе реагентов. Так, например, в настоящей заявке описаны способы детекции клетки, которая экспрессирует gp41 у индивидуума.
Секвенирование ДНК: Способ определения нуклеотидной последовательности данной молекулы ДНК. Общая методика «тотального секвенирования» включает амплификацию генетического материала, например, посредством полимеразной цепной реакции, и последующее присоединение амплифицированных продуктов к твердой поверхности. Затем параллельно проводят секвенирование амплифицированного нужного генетического материала, и данные такого секвенирования заносят в компьютер. Вообще говоря, секвенирование может быть осуществлено автоматизированным методом секвенирования по Сэнгеру (на геномном анализаторе AB 13730x1), пиросеквенирования на твердом носителе (секвенирование 454, Roche), секвенирования путем синтеза с обратимой терминацией (на геномном анализаторе ILLUMINA), секвенирования путем лигирования (ABI SOLiD) или секвенирования путем синтеза с использованием виртуальных терминаторов (HELISCOPE).
В некоторых вариантах осуществления изобретения, секвенирование ДНК осуществляют методом терминации цепи, разработанным Фредериком Сэнгером, а поэтому такой метод называется «секвенированием по Сэнгеру» или «SBS». В этом методе используется последовательность-специфическая терминация в реакции синтеза ДНК, проводимого с использованием модифицированных нуклеотидных субстратов. Удлинение цепи инициируется в специфическом сайте матричной ДНК с использованием короткого олигонуклеотидного праймера, комплементарного матрице в этой области. Олигонуклеотидный праймер удлиняют с использованием ДНК-полимеразы в присутствии четырех дезоксинуклеотидных оснований (структурных блоков ДНК), а также низкой концентрации нуклеотида для терминации цепи (чаще всего ди-дезоксинуклеотида). Ограниченное включение нуклеотида для терминации цепи посредством ДНК-полимеразы приводит к образованию серии родственных ДНК-фрагментов, которые прерываются только в тех положениях, в которых присутствует конкретный нуклеотид. Затем фрагменты фракционируют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле или в узкой стеклянной (капиллярной) пробирке, заполненной вязким полимером. В качестве альтернативы использованию меченного праймера применяются меченные терминаторы, и такой метод обычно называется «секвенированием с использованием красителя для терминации цепи».
«Пиросеквенирование» представляет собой метод с применением массивов, разработанный компанией 454 Life Sciences (Branford, CT). В некоторых вариантах методов с применением массивов, одноцепочечную ДНК подвергают гибридизации со сферами и амплифицируют с помощью EmPCR. Затем эти связанные с ДНК сферы помещают в лунки на оптиковолоконный чип вместе с ферментом, который излучает свет в присутствии ATФ. После обработки этого чипа свободными нуклеотидами, по мере прохождения реакции ПЦР-амплификации излучается свет, а при связывании этих нуклеотидов с комплементарными им парами оснований продуцируется АТФ. Добавление одного или более нуклеотидов приводит к инициации реакции образования светового сигнала, который регистрируют на камеру, подсоединенную к устройству с зарядовой связью (УЗС). Интенсивность сигнала пропорциональна числу нуклеотидов, например, гомополимерных фрагментов, включенных в одну нуклеотидную последовательность.
Эффективное количество: Количество средства (такого как CD40L, IL-21 или IL-2), которое, при его введении отдельно или вместе с одним или более дополнительными средствами, индуцирует вырабатывание желаемого ответа.
Эффекторная молекула: Часть химерной молекулы, которая, как предполагается, оказывает желаемое воздействие на клетку, на которую направлена такая химерная молекула. Эффекторная молекула также известна как эффекторная группа, терапевтическое средство, диагностическое средство или т.п.
Эпитоп: Антигенная детерминанта. Эпитопы представляют собой конкретные химические группы или пептидные последовательности, которые присутствуют на молекуле, и которые являются антигенными, то есть, вырабатывают специфический иммунный ответ, например, эпитопом является область антигена, которая вырабатывает B- и/или T-клеточный ответ. В некоторых примерах, описанное антитело специфически связывается с эпитопом на поверхности gp41 ВИЧ.
Эпитопы могут быть образованы аминокислотами, непрерывно следующими друг за другом, или аминокислотами ряда, прерываемого в юкстаположении третичной укладкой белка. Эпитопы, образованные смежными аминокислотами, обычно сохраняются после обработки денатурирующими растворителями, а эпитопы, образованные посредством третичной укладки, обычно элиминируются после обработки денатурирующими растворителями. Эпитоп обычно содержит по меньшей мере 3, а чаще всего, по меньшей мере 5, приблизительно 9 или приблизительно 8-10 аминокислот, находящихся в уникальной пространственной конформации. Методы определения пространственной конформации эпитопов содержат, например, рентгеновскую кристаллографию и ядерный мaгнитный резонанс.
2
3
2
3
Fc-полипептид: Полипептид содержит константную область антитела, за исключением первого домена константной области иммуноглобулина. Fc-область обычно представляет собой последние два домена константной области иммуноглобулина IgA, IgD и IgG, и последние три домена константной области иммуноглобулина IgE и IgM. Fc-область может также содержать часть гибкой шарнирной области, присоединенной к этим доменам у N-конца, или всю эту область. Для IgA и IgM, Fc-область может содержать, а может и не содержать, хвостовую часть, и может быть присоединена, а может и не быть присоединена посредством J-цепи. Для IgG, Fc-область содержит домены иммуноглобулина C-гамма 2 и C-гамма 3 (Cγ2 и Cγ3) и нижнюю часть шарнирной области, расположенную между C-гамма 1 (Cγ1) и Cγ2. Хотя границы Fc-области могут варьироваться, однако, Fc-область тяжелой цепи IgG человека обычно определяют как область, содержащую остатки C226 или P230, и расположенную у его карбокси-конца, а также пронумерованную в соответствии с Европейской нумерацией, предложенной Кэбатом. Для IgA, Fc-область содержит домены иммуноглобулина C-альфа 2 и C-альфа 3 (Cα2 и Cα3) и нижнюю часть шарнирной области, расположенную между C-альфа 1 (Cα1) и Cα2. В определение термина «Fc-область» входят также функционально эквивалентные аналоги и варианты Fc-области. Функционально эквивалентным аналогом Fc-области может быть вариант Fc-области, содержащий одну или более аминокислотных модификаций, введенных в Fc-область дикого типа или в природную Fc-область. Варианты Fc-области по меньшей мере на 50%, например, приблизительно на 80%, приблизительно на 90% или по меньшей мере приблизительно на 95% гомологичны природной Fc-области. Функционально эквивалентные аналоги Fc-области могут содержать один или более аминокислотных остатков, добавленных или делетированных у N- или C-конца белка, например, такая область может содержать не более чем 30 или не более чем 10 добавлений и/или делеций. Функционально эквивалентными аналогами Fc-области являются Fc-области, функционально присоединенные к партнеру по связыванию. Функционально эквивалентные аналоги Fc-области должны содержать большинство доменов Ig, составляющих Fc-область, определенную выше, так, например, Fc-области IgG и IgA, определенные в настоящей заявке, должны содержать большую часть последовательностей, содержащих CH, и большую часть последовательностей, содержащих CH. Таким образом, сам по себе домен CH, или сам по себе домен CHне считаются Fc-областью. Fc-область может представлять собой отдельно взятую область или область, входящую в состав Fc-гибридного полипептида (иммуноадгезина, см. ниже).
Каркасная область: Аминокислотные последовательности, расположенные между CDR. Каркасными областями являются каркасные области вариабельной легкой и тяжелой цепей. Каркасные области служат для поддержания CDR в соответствующей ориентации, подходящей для связывания с антигеном.
in vivo
gp41: Специфический белок ВИЧ. Белок оболочки ВИЧ-1 сначала синтезируется как более длинный белок-предшественник размером в 845-870 аминокислот, обозначаемый gp160. gp160 образует гомотример и подвергается гликозилированию в аппарате Гольджи. Затем он  расщепляется клеточной протеазой на gp120 и gp41. Аминокислотная последовательность репрезентативного gp41 представлена в базе данных GENBANK рег. No. CAD20975 (созданной 16 октября, 2009), которая вводится в настоящее описание посредством ссылки. Следует отметить, что последовательность gp41 может отличаться от последовательности, имеющейся в базе данных GENBANK рег. No. CAD20975. gp41 содержит трансмембранный домен и обычно сохраняет трехмерную конфигурацию, а также взаимодействует с gp120 посредством нековалентного связывания.
in vivo
Белок оболочки ВИЧ (Env): Белок оболочки ВИЧ сначала синтезируется как более длинный белок-предшественник размером в 845-870 аминокислот, обозначаемый gp160. gp160 образует гомотример и подвергается гликозилированию в аппарате Гольджи. Затем он  расщепляется клеточной протеазой на gp120 и gp41. gp120 содержит большинство расположенных на внешней поверхности доменов гликопротеинового комплекса оболочки ВИЧ, и связывается с клеточными рецепторами CD4 и с клеточными хемокиновыми рецепторами (такими как CCR5). gp41 содержит трансмембранный домен и обычно сохраняет трехмерную конфигурацию, а также взаимодействует с gp120 посредством нековалентного связывания.
Клетки-хозяева: Клетки-хозяева, в которых может происходить амплификация вектора и экспрессия ДНК, и тем самым, экспрессия описанного в настоящем документе антитела. Клетка может быть прокариотической или эукариотической. Этот термин также содержит любое потомство рассматриваемой клетки-хозяина. При этом, следует отметить, что все потомство не может быть идентичным родительской клетке, поскольку оно может иметь мутации, которые появляются в процессе репликации. Однако такое потомство также входит в понятие «клетка-хозяин».
Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ): Ретровирус, который подавляет иммунный ответ у человека (заболевание, вызываемое ВИЧ), что приводит к возникновению комплекса заболеваний, известного как синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД). «Заболевание, вызываемое ВИЧ» хорошо известно как сложный симптомокомплекс (содержащий развитие условно-патогенной инфекций) у человека, инфицированного вирусом ВИЧ, как было определено в исследованиях с использованием антител или в вестерн-блот-анализах. Лабораторные данные, связанные с этим заболеванием, содержат прогрессирующее снижение числа Т-клеток. ВИЧ содержит ВИЧ типа 1 (ВИЧ-1) и ВИЧ типа 2 (ВИЧ-2). Родственными вирусами, используемыми для инфицирования животных-моделей, являются обезьяний вирус иммунодефицита (SIV) и кошачий вирус иммунодефицита (FIV). Лечение заболевания, вызываемого ВИЧ-1, методом HAART, является эффективным в отношении снижения вирусной нагрузки и улучшения состояния индивидуумов, инфицированных ВИЧ-1.
Система нумерации HXB2: Стандартная система нумерации последовательностей белка и нуклеиновой кислоты ВИЧ, в которой используются последовательности штамма HXB2 ВИЧ-1 как эталонные последовательности для определения последовательностей всех других штаммов ВИЧ. Система нумерации HXB2 известна специалистам в данной области и описана в публикациях «Numbering Positions in ВИЧ Relative to HXB2CG», Bette Korber et al., Human Retroviruses и AIDS 1998: A Compilation and Analysis of Nucleic Acid and Amino Acid Sequences. Korber B, Kuiken CL, Foley B, Hahn B, McCutchan F, Mellors JW and Sodroski J, Eds. Theoretical Biology and Biophysics Group, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM, которые во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки. HXB2 также известен как: HXBc2, для клона 2 HXB 2; HXB2R, имеющийся в базе данных ВИЧ в Лос-Аламосе, где R изменен, поскольку он слегка отличается от исходной последовательности HXB2; и HXB2CG в GENBANK™, для полного генома HXB2. Нумерация, используемая в описанных в настоящем документе полипептидах gp41, соответствует схеме нумерации HXB2.
1
2
IgA: Полипептид, принадлежащий к классу антител, которые, в основном, кодируются разпознаваемым геном иммуноглобулина альфа. У человека, этот класс или изотип включает IgA и IgA. Антитела IgAn могут существовать в форме мономеров, полимеров (обозначаемых pIgA) преимущественно в димерной форме и секреторных IgA. Константная цепь IgA дикого типа имеет удлинение в 18 аминокислот у C-конца, называемое хвостовой частью (tp). Полимерный IgA секретируется клетками плазмы и содержит 15-кДа пептид, называемый J-цепью, связывающей два мономера IgA посредством консервативного цистеинового остатка, присутствующего в хвостовой части.
1
2,
3
4
IgG: Полипептид, принадлежащий к классу или изотипу антител, которые, в основном, кодируются распознаваемым геном иммуноглобулина гамма. У человека этот класс включает IgG, IgGIgGи IgG.
Иммунный комплекс: Связывание антитела с растворимым антигеном приводит к образованию иммунного комплекса. Образование иммунного комплекса может быть детектировано стандартными методами, известными специалистам, например, иммуногистохимическим методом, методом иммунопреципитации, проточной цитометрии, иммунофлуоресцентной микроскопии, ELISA, иммуноблотинга (например, вестерн-блот-анализа), ядерного магнитного резонанса, КТ-сканирования, рентгенографии и аффинной хроматографии. Иммунологические связывающие свойства выбранных антител могут быть количественно оценены методами, хорошо известными специалистам.
2
3
2
3
Иммуноадгезин: Молекулярный гибрид белка с Fc-областью иммуноглобулина, в котором иммуноглобулин сохраняет свои специфические свойства, такие как связывание с Fc-рецептором и увеличение времени полужизни. Fc-гибрид объединяет Fc-область иммуноглобулина с партнером по связыванию, которым, по существу могут быть любой белок, полипептид, пептид или небольшая молекула. В одном из примеров, иммуноадгезин включает шарнирную область, домены CHи CHконстантной области тяжелой цепи иммуноглобулина гамма 1. В другом примере иммуноадгезин включает домены CHи CH IgG.
Иммуноген: Соединение, композиция или вещество (например, белок или его часть), обладающие способностью индуцировать иммунный ответ у млекопитающего, например, у млекопитающего, инфицированного патогеном, или у млекопитающего с риском инфицирования патогеном. Введение иммуногена может приводить к вырабатыванию протективного иммунитета и/или проактивного иммунитета против представляющего интерес патогена. В некоторых примерах, иммуногеном является антиген ВИЧ. Примерами иммуногенов являются, но не ограничиваются ими, пептиды, липиды, полисахариды, их комбинации, а также нуклеиновые кислоты, содержащие антигенные детерминатны, распознаваемые иммунными клетками. В некоторых примерах, иммуногенами являются пептиды, происходящие от представляющего интерес патогена. Репрезентативными патогенами являются бактерии, грибы, вирусы и паразиты. В конкретных примерах, иммуноген происходит от ВИЧ, такого как полипептид gp41, происходящий от ВИЧ или его антигенный фрагмент.
Иммунологический зонд: Молекула, которая может быть использована для отбора антител сыворотки, направленных против специфического эпитопа, включая антитела, выделенные из сыворотки человека. Каркасы эпитопа вместе с соответствующими точковыми мутациями могут быть использованы в качестве иммунологических зондов для положительного и отрицательного отбора антител против присоединенного эпитопа. В некоторых примерах, иммунологическими зондами являются сконструированные варианты gp120.
Условия проведения иммунологических реакций: Условия, способствующие вырабатыванию антитела против конкретного эпитопа, которое связывается с этим эпитопом на значительно более детектируемом уровне, чем со всеми другими эпитопами, и/или которое, по существу, не связывается со всеми другими эпитопами. Условия проведения иммунологических реакций зависят от формата реакций связывания с антителом, и такими условиями обычно являются условия, применяемые в протоколах иммуноанализов или условия in vivo. Описание форматов и условий проведения иммуноанализов приводится в публикации Harlow & Lane, см. ниже. Условия проведения иммунологических реакций, используемые в этих методах, представляют собой «физиологические условия», которые содержат стандартные условия (например, температуру, осмомолярность и pH), характерные для живого организма, то есть, млекопитающего, или для клетки млекопитающего. Хотя известно, что некоторые органы могут находиться в экстремальных условиях, однако, среда внутри организма и внутри клетки обычно имеет pH приблизительно 7 (например, от pH 6,0 до pH 8,0, а чаще всего pH 6,5-7,5), содержит воду в качестве преобладающего растворителя и может выдерживать температуру выше 0°C и ниже 50°C. Осмомолярность составляет в пределах величин, способствующих поддержанию жизнеспособности и пролиферации клеток.
Подавление развития заболевания или его лечение: Полное подавление развития заболевания или состояния, например, у индивидуума с риском развития заболевания, такого как синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД). «Лечение» означает терапевтическое вмешательство, которое приводит к ослаблению признаков или симптомов заболевания или патологического состояния после начала их развития. Термин «ослабление», если он относится к заболеванию или патологическому состоянию, означает какой-либо наблюдаемый благоприятный эффект от такого лечения. Благоприятный эффект может проявляться, например, замедлением начала развития клинических симптомов заболевания у индивидуума, восприимчивого к такому заболеванию; снижением тяжести некоторых или всех клинических симптомов заболевания; замедлением прогрессирования заболевания, снижением вирусной нагрузки, улучшением общего состояния здоровья или самочувствия индивидуума или других параметров, хорошо известных специалистам и являющихся характерными для данного заболевания. «Профилактическим» лечением является лечение индивидуума, которое предотвращает появление признаков заболевания или допускает появление только ранних признаков заболевания, и которое проводят в целях снижения риска развития патологии.
Интерлейкин-2 (IL-2): IL-2 представляет собой цитокин, который является необходимым для роста и функционирования Т-клеток. Связывание антигена с Т-клеточным рецептором (TCR) стимулирует секрецию IL-2 и экспрессию рецепторов IL-2, то есть, IL-2R. Взаимодействие IL-2/IL-2R стимулирует рост, дифференцировку и выживание антигенспецифических цитотоксических Т-клеток посредством активации экспрессии специфических генов. Сам IL-2 необходим для развития Т-клеточной иммунологической памяти, которая зависит от увеличения числа и функции антигенспецифических Т-клеточных клонов. IL-2 также необходим в процессе развития Т-клеток в тимусе для созревания субпопуляции Т-клеток, называемых регуляторными Т-клетками. Репрезентативная аминокислотная последовательность IL-2 человека имеется в базе данных GENBANK рег. No. NM_000586 (10 июня, 2012), которая вводится в настоящее описание в качестве ссылки.
+
Nature
Интерлейкин-21 (IL-21): Цитокин, клонированный из библиотеки кДНК, происходящей от активированных CD3-T-клеток (Parrish-Novak et al..,  408:57-63, 2000). кДНК IL-21 кодирует секретированный белок из 131 аминокислоты, который является наиболее близкородственным IL-2 и IL-15. Ген IL-21 был картирован на хромосоме человека 4q26-q27 рядом с геном IL-2.
+
Было продемонстрировано, что мРНК IL-21 экспрессируется в активированных CD4-клетках, но не в других Т-клетках, В-клетках или моноцитах (Parrish-Novak et al., Nature 408:57-63, 2000). Однако было продемонстрировано, что IL-21 стимулирует пролиферацию В-клеток, которые стимулируются перекрестным связыванием антигена CD40, и пролиферацию В-клеток, стимулируемых IL-4, помимо анти-IgM антитела. Было также показано, что IL-21 стимулирует пролиферацию «необученных» (CD45RA (+))-клеток, опосредуемую присоединением CD3. Было также показано, что IL-21 стимулирует пролиферацию клеток-предшественников костного мозга и усиливает экспрессию маркера CD56 NK-клеток в присутствии IL-15. (общее описание см. в публикации Horst Ibelgaufts' COPE: Cytokines Online Pathfinder Encyclopedia, доступной в интернете). Аминокислотная последовательность репрезентативного IL-21 человека представлена SEQ ID NO: 1 в опубликованной заявке на патент США No.2003/0003545, которая вводится в настоящее описание посредством ссылки. Репрезентативный клон, содержащий всю последовательность или большую часть последовательности IL-21 (обозначенный HTGED19), был депонирован в Американской коллекции типовых культур («ATCC») 5 марта 1998 под депозитарным номером ATCC 209666 (см., например, опубликованную заявку на патент США No.2003/0003545).
+
Был выделен рецептор IL-21 и было обнаружено, что он экспрессируется CD23-B-клетками, В-клеточными линиями, Т-клеточными линиями лейкоза и клеточными линиями NK. Ген рецептора был картирован на хромосоме 16pl2 человека (см. Parrish-Novak et al., Nature 408:57-63, 2000; Ozaki et al., Proc. Natl. Acad. Sci.USA 97: 11439-11444, 2000).
Интерлейкин 15 (IL-15): Цитокин, имеющий структурное сходство с IL-2. IL-15 связывается и передает сигналы посредством бета-цепи IL-2/IL-15 (CD122) и общей гамма-цепи (гамма-C, CD132). IL-15 секретируется мононуклеарными фагоцитами (и некоторыми другими клетками) после их инфицирования вирусом(ами). Этот цитокин индуцирует пролиферацию природных клеток-киллеров, то есть, клеток иммунной системы, играющих главную роль в уничтожении инфицированных вирусом клеток.
Выделенный: «Выделенный» биологический компонент (такой как антитело, например, антитело, которое специфически связывается с gp41; нуклеиновая кислота; пептид; белок или антитело) представляет собой компонент, который был, по существу, отделен, продуцирован отдельно от других биологических компонентов или очищен из других биологических компонентов клетки организма, в которой этот компонент присутствует в природе, такой как другие хромосомные и внехромосомные ДНК и РНК, и белки. Нуклеиновыми кислотами, пептидами и белками, которые были «выделены» таким образом, являются нуклеиновые кислоты и белки, очищенные стандартными методами очистки. Этот термин также охватывает нуклеиновые кислоты, пептиды и белки, полученные методами рекомбинантной экспрессии в клетках-хозяевах, а также химически синтезированные нуклеиновые кислоты или полипептиды. В некоторых примерах, антитело, такое как антитело, специфичное к gp41, может быть выделено, например, у ВИЧ-инфицированного индивидуума.
«Выделенная» клетка представляет собой клетку, которая была очищена от других клеточных компонентов ткани. Клетки могут быть выделены механическими методами (например, с использованием FACS) и/или ферментативными методами. В некоторых вариантах осуществления изобретения, выделенная популяция клеток (таких как репертуар В-клеток) включает более чем приблизительно 80%, приблизительно 85%, приблизительно 90%, приблизительно 95% или 99% представляющих интерес клеток. В другом варианте осуществления изобретения, выделенная популяция клеток представляет собой популяцию клеток, в которой не могут быть обнаружены клетки другого фенотипа. В другом варианте осуществления изобретения, выделенная популяция клеток представляет собой популяцию клеток, которая содержит менее чем приблизительно 20%, приблизительно 15%, приблизительно 10%, приблизительно 5% или менее чем приблизительно 1% клеток другого фенотипа от всего количества представляющих интерес клеток.
D
K: Константа диссоциации для данного взаимодействия, такого как взаимодействие «полипептид - лиганд» или взаимодействие «антитело - антиген». Так, например, для бимолекулярного взаимодействия антитела (такого как описанное в настоящем документе антитело) и антигена (такого как gp41), такая константа диссоциации представляет собой концентрацию отдельных компонентов бимолекулярного взаимодействия, деленную на концентрацию комплекса.
Линкер: Бифункциональная молекула, которая может быть использована для связывания двух молекул в одну целую молекулу, например, для связывания эффекторной молекулы с антителом. В некоторых вариантах осуществления изобретения, конъюгат содержит линкер между эффекторной молекулой или детектируемым маркером и антителом. В некоторых вариантах осуществления изобретения, этот линкер может расщепляться во внутриклеточной среде, и расщепление такого линкера приводит к отделению эффекторной молекулы или детектируемого маркера от антитела во внутриклеточной среде. В другом варианте осуществления изобретения, линкер не расщепляется, и эффекторная молекула или детектируемый маркер могут высвобождаться, например, благодаря деградации антитела. В некоторых случаях, линкер представляет собой пептид в антигенсвязывающем фрагменте (таком как Fv-фрагмент), который служит для опосредованного связывания вариабельной тяжелой цепи с вариабельной легкой цепью.
Термины «конъюгирование», «присоединение», «связывание» или «лигирование» означают объединение двух полипептидов в одну целую полипептидную молекулу путем ковалентного присоединения радионуклида или другой молекулы к данному полипептиду, такой как антитело, которое специфически связывается с gp41, или его антигенсвязывающий фрагмент. В данном контексте описания, термины означают присоединение лиганда, такого как молекула антитела, к эффекторной молекуле. Такое связывание может быть осуществлено методами химического синтеза или рекомбинантными методами. «Химический синтез» означает реакцию между молекулой антитела и эффекторной молекулой, в результате которой эти две молекулы связываются друг с другом ковалентной связью с образованием одной молекулы.
Мембрано-проксимальная внешняя область (MPER) gp41: Область, которая находится непосредственно у N-конца трансмембранной области gp41. MPER является в высокой степени гидрофобной (50% остатков являются гидрофобными) и в высокой степени консервативной в ВИЧ многих кладотипов (Zwick, M.B., et al., J. Virol, 75 (22): p. 10892-905, 2001). Консервативная MPER gp41 ВИЧ-1 является мишенью для двух нейтрализующих моноклональных антител человека, 2F5 и 4E10. Было показано, что сердцевина эпитопа для 2F5 имеет последовательность ELDKWAS (SEQ ID NO:9). Было обнаружено, что в этом эпитопе, остатки D, K и W играют очень важную роль в распознавании антителом 2F5. Сердцевина эпитопа для 4E10, NWFDIT (SEQ ID NO:10), была картирована непосредственно у C-конца эпитопа для 2F5 на эктодомене gp41.
Нейтрализующее антитело: Антитело, которое снижает инфекционный титр инфицирующего средства посредством связывания со специфическим антигеном на инфицирующем средстве. В некоторых примерах, инфицирующим средством является вирус. В некоторых примерах, антитело, которое является специфичным к gp41, нейтрализует инфекционный титр ВИЧ. «Нейтрализующее антитело широкого спектра» представляет собой антитело, которое связывается с родственными антигенами и ингибирует функцию антигенов, таких как антигены, которые по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичны антигенной поверхности данного антигена. Что касается антигена, происходящего от патогена, такого как вирус, то в этой связи следует отметить, что антитело может связываться с антигеном и ингибировать функцию антигена, происходящего от патогена более чем одного класса и/или подкласса. Так например, в случае вируса иммунодефицита человека, антитело может связываться с антигеном и ингибировать функцию этого антигена, например, такого как gp41, происходящего от более, чем одного кладотипа. В одном из вариантов осуществления изобретения, ВИЧ-нейтрализующие антитела широкого спектра отличаются от других антител против ВИЧ тем, что они нейтрализуют высокий процент ВИЧ многих типов в кровотоке.
Нуклеиновая кислота: Полимер, состоящий из нуклеотидных звеньев (рибонуклеотидов, дезоксирибонуклеотидов, их родственных природных структурных вариантов и синтетических неприродных аналогов), связанных фосфодиэфирными связями, а также их родственных природных структурных вариантов и синтетических неприродных аналогов. Таким образом, этот термин включает нуклеотидные полимеры, в которых нуклеотидами и их связями являются неприродные синтетические аналоги, такие как, например, но не ограничивающиеся ими, фосфортиоаты, фосфорамидаты, метилфосфонаты, хиральные метилфосфонаты, 2-О-метилрибонуклеотиды, связанные с пептидом нуклеиновые кислоты (РNA) и т.п. Такие полинуклеотиды могут быть синтезированы, например, на автоматическом синтезаторе ДНК. Термин «олигонуклеотид» обычно означает короткие полинуклеотиды, обычно длиной не более чем приблизительно 50 нуклеотидов. Следует отметить, что если нуклеотидная последовательность представлена последовательностью ДНК (то есть, A, T, G, C), то она также содержит последовательность РНК (то есть, A, U, G, C), в которой вместо «Т» присутствует «U».
При описании нуклеотидных последовательностей используется стандартная форма записи: левый конец одноцепочечной нуклеотидной последовательности представляет собой 5'-конец; в двухцепочечной нуклеотидной последовательности, направление слева направо означает направление от 5'-конца. Направление 5'→3' присоединения нуклеотидов к растущим РНК-транскриптам называется направлением транскрипции. ДНК-цепь, имеющая такую же последовательность, как и мРНК, называется «кодирующей цепью»; последовательности на ДНК-цепи, которые аналогичны последовательности мРНК, транскрибируемой из этой ДНК, и которые локализованы со стороны 5'-конца по отношению к РНК-транскрипту, называются «вышерасположенными последовательностями», а последовательности на ДНК-цепи, которые аналогичны последовательности мРНК, и которые локализованы со стороны 3'-конца по отношению к РНК-транскрипту, называются «нижерасположенными последовательностями»;
Термин «кДНК» означает ДНК, которая комплементарна или идентична мРНК и имеет одноцепочечную или двухцепочечную форму.
Термин «кодирующий» относится к природной способности специфических последовательностей нуклеотидов в полинуклеотиде, таком как ген, кДНК или мРНК, играть роль матрицы для синтеза других полимеров и макромолекул в биологических процессах, где полимеры и макромолекулы имеют определенную последовательность нуклеотидов (то есть рРНК, тРНК и мРНК) или определенную последовательность аминокислот, а также к биологическим свойствам таких полимеров и макромолекул. Таким образом, ген кодирует белок, если в результате транскрипции и трансляции мРНК, продуцируемой этим геном, в клетке или в другой биологической системе образуется белок. Обе кодирующие цепи, нуклеотидная последовательность которых идентична последовательности мРНК и приводится в списке последовательностей, и не-кодирующая цепь, используемая в качестве матрицы для транскрипции гена или кДНК, могут называться цепями, кодирующими белок или другой продукт гена или кДНК. Если это не оговорено особо, то термин «нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность» содержит все нуклеотидные последовательности, которые представляют собой вырожденные варианты и кодируют одну и ту же аминокислотную последовательность. Нуклеотидные последовательности, кодирующие белки и РНК, могут включать интроны.
Термин «рекомбинантная нуклеиновая кислота» означает нуклеиновую кислоту, имеющую нуклеотидные последовательности, которые не связаны друг с другом в природе. Этот термин включает нуклеиновокислотные векторы, содержащие амплифицированную нуклеиновую кислоту или нуклеиновую кислоту, сконструированную путем сборки, которые могут быть использованы для трансформации подходящей клетки-хозяина. Клетка-хозяин, содержащая рекомбинантную нуклеиновую кислоту, называется «рекомбинантной клеткой-хозяином». После экспрессии гена в рекомбинантной клетке-хозяине продуцируется «рекомбинантный полипептид». Рекомбинантная нуклеиновая кислота может быть также не-кодирующей (например, она может быть промотором, ориджином репликации, сайтом связывания с рибосомой и т.п.).
Первая последовательность является «антисмысловой» по отношению ко второй последовательности, если полинуклеотид первой последовательности специфически гибридизуется с полинуклеотидом второй последовательности.
Функционально присоединенный: Первая последовательность нуклеиновой кислоты функционально присоединена ко второй последовательности нуклеиновой кислоты, если первая последовательность нуклеиновой кислоты находится в функциональной взаимосвязи со второй последовательностью нуклеиновой кислоты. Так, например, промотор, такой как промотор CMV, функционально присоединен к кодирующей последовательности, если этот промотор влияет на транскрипцию или экспрессию кодирующей последовательности. Вообще говоря, функционально присоединенные последовательности ДНК являются смежными и, если это необходимо, могут быть присоединены к двум белок-кодирующим областям с сохранением рамки считывания.
Фармацевтическое средство: Химическое соединение или композиция, способные индуцировать нужный терапевтический или профилактический эффект при их соответствующем введении индивидууму или в клетку. В некоторых примерах, фармацевтическое средством содержит одно или более описанных антител.
th
Фармацевтически приемлемые носители: Фармацевтически приемлемые носители обычно представляют собой широко используемые носители. В руководстве Remington's Pharmaceutical Sciences, by E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 19 Edition, 1995, описаны композиции и препараты, подходящие для фармацевтического введения описанных в настоящем документе антител.
Вообще говоря, выбор носителя зависит от конкретного способа введения. Так, например, препаратами для парентерального введения обычно являются жидкости для инъекций, которые представляют собой фармацевтически и физиологически приемлемые жидкости, такие как вода, физиологический раствор, сбалансированные солевые растворы, водная декстроза, глицерин или другие компоненты, используемые в качестве носителя. Для твердых композиций (например, в форме порошков, драже, таблеток или капсул), стандартными нетоксичными твердыми носителями могут быть, например, маннит фармацевтической чистоты, лактоза, крахмал или стерат магния. Фармацевтические композиции могут содержать, помимо биологически нейтральных носителей, небольшие количества нетоксичных вспомогательных веществ, таких как смачивающие или эмульгирующие средства, консерванты и рН-забуферивающие средства и т.п., например, ацетат натрия или сорбитанмонолаурат.
Полипептид: Любая аминокислотная цепь, независимо от ее длины или посттрансляционной модификации (например, гликозилирования или фосфорилирования). В одном из вариантов осуществления изобретения, полипептидом является gp41. В одном из вариантов осуществления изобретения, полипептидом является описанное в настоящем документе антитело или его фрагмент. «Остаток» означает аминокислоту или аминокислотный миметик, введенные в полипептид посредством амидной связи или связи, имитирующей амидную связь. Полипептид имеет амино-конец (N-конец) и карбокси-конец (C-конец).
Промотор: Промотор представляет собой набор нуклеиновокислотных регуляторных последовательностей, которые регулируют транскрипцию нуклеиновой кислоты. Промотор содержит необходимые последовательности нуклеиновой кислоты, расположенные поблизости от сайта инициации транскрипции, например, в случае промотора полимеразы типа II, такой последовательностью является элемент TATA. Промотор также содержит, но необязательно, дистальные энхансерные или репрессорные элементы, которые могут быть расположены от сайта инициации транскрипции на расстоянии до нескольких тясяч пар оснований. Такие промоторы могут быть как конститутивными, так и индуцибельными (см., например, Bitter et al., Methods in Enzymology 153:516-544, 1987).
Конкретными неограничивающими примерами промоторов, которые могут быть использованы, являются промоторы, происходящие от генома клеток млекопитающих (такие как промотор металлотионеина) или от вирусов млекопитающих (такие как ретровирусный длинный концевой повтор; поздний промотор аденовируса; промотор вируса коровьей оспы 7.5K). Могут быть также использованы промоторы, полученные методами рекомбинантных ДНК или методами синтеза. Полинуклеотид может быть встроен в вектор экспрессии, содержащий промоторную последовательность, которая индуцирует эффективную транскрипцию встроенной генетической последовательности хозяина. Вектор экспрессии обычно содержит ориджин репликации, промотор, а также специфические последовательности нуклеиновой кислоты, позволяющие осуществлять фенотипический отбор трансформированных клеток.
Очищенный: Термин «очищенный» необязательно означает абсолютную чистоту, чаще всего этот термин относится к относительной чистоте. Так, например, очищенным пептидным препаратом является препарат, в котором пептид или белок (такой как антитело) присутствует в большем количестве, чем пептид или белок, находящийся в природной клеточной среде. В одном из вариантов осуществления изобретения, препарат является очищенным, если этот белок или пептид составляет по меньшей мере 50% от общего пептида или белка, содержащегося в препарате.
Рекомбинантный: Рекомбинантная нуклеиновая кислота представляет собой нуклеиновую кислоту, которая имеет последовательность, не существующую в природе, или последовательность, которая была получена с использованием искусственной комбинации двух так или иначе разделенных сегментов последовательности. Такую искусственную комбинацию часто получают путем химического синтеза, а еще чаще, путем искусственной модификации выделенных сегментов нуклеиновых кислот, например, методами генной инженерии.
Идентичность последовательностей: Сходство аминокислотных последовательностей может быть определено термином «сходство между последовательностями», или иначе, «идентичность» последовательностей. Идентичность последовательностей часто определяют по проценту идентичности (или сходства или гомологии), и чем выше такой процент, тем больше сходство между двумя последовательностями. Гомологи или варианты полипептида имеют относительно высокую степень идентичности последовательностей при их выравнивании стандартными методами.
.
.
.
.
.
.
Методы выравнивания последовательностей для их сравнения хорошо известны специалистам. Различные программы и алгоритмы выравнивания описаны в публикациях: Smith and Waterman, Adv. Appl. Math 2:482, 1981; Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol 48:443, 1970; Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. SciU.S.A 85:2444, 1988; Higgins and Sharp, Gene 73:237, 1988; Higgins and Sharp, CABIOS 5: 151, 1989; Corpet al., Nucleic AcidsResearch 16:10881, 1988; и Pearson and Lipman, Proc. Natl. AcadSci. U.S.A 85:2444, 1988. Altschul et al., Nature Genet. 6:119, 1994, где подробно обсуждаются методы выравнивания последовательностей и методы вычисления гомологии.
.
.
Пакет программ NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., JMol. Biol 215:403, 1990) может быть получен из нескольких источников, включая Национальный центр биотехнологической информации (NCBI, Bethesda, MD) и интернет, и применяется в комбинации с программами для анализа последовательностей, такими как blastp, blastn, blastx, tblastn и tblastx. Описание способа определения идентичности последовательностей с использованием этой программы имеется в интернете на web-сайте NCBI.
L
H
Гомологи и варианты Vили Vантитела, которое специфически связывается с полипептидом, обычно характеризуются тем, что они по меньшей мере приблизительно на 75%, например, по меньшей мере приблизительно на 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичны представляющей интерес аминокислотной последовательности, как было вычислено при выравнивании полноразмерных последовательностей. Белки, которые имеют еще большее сходство с эталонными последовательностями, обнаруживают более высокий процент идентичности, как было оценено с применением такого метода, например, идентичность их последовательностей составляет по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%. Если для определения идентичности проводят сравнение неполных последовательностей, где такую идентичность определяют по небольшим «окнам» из 10-20 аминокислот, то идентичность гомологов и вариантов может составлять по меньшей мере 80% или по меньшей мере 90% или 95%, в зависимости от сходства с эталонной последовательностью. Методы определения идентичности последовательности по таким небольшим «окнам» можно найти на web-сайте NCBI в интернете. Совершенно очевидно, что интервалы идентичности этих последовательностей приводятся в рекомендательных целях, при этом, вполне возможно, что могут быть получены гомологи с очень высокими процентами идентичности, выходящими за пределы данных интервалов значений.
.
d
-6
-6
-7
-8
-9
-10
Специфически связывается: В случае антитела, этот термин относится к реакции связывания, которая позволяет определить присутствие белка-, пептида- или полисахарида-мишени в гетерогенной популяции белков и других биологических молекул. Так, например, в определенных условиях, антитело связывается преимущественно с конкретным белком-, пептидом- или полисахаридом-мишенью (таким как антиген, присутствующий на поверхности патогена, например, gp41) и не связывается на значимом уровне с другими белками или полисахаридами, присутствующими в образце или в организме индивидуума. Специфическое связывание может быть определено известными методами, например, путем измерения аффинности связывания антитела с антигеном. В одном из вариантов осуществления изобретения, аффинность вычисляют модифицированным методом Скэтчарда, описанным Frankel et al., Mol. Immunol, 16: 101-106, 1979. В другом варианте осуществления изобретения, аффинность связывания измеряют по скорости диссоциации антигена/антитела. В еще одном варианте изобретения, высокий уровень аффинности связывания измеряют с помощью радиоиммуноанализа на конкурентное связывание. В случае использования комплекса «антитело-антиген», специфическое связывание антигена с антителом происходит при Kменее чем приблизительно 10M, например, менее чем приблизительно 10M, 10M, 10M, 10или даже менее чем приблизительно 10M.
В основном, очищенный: Термин «в основном, очищенный» означает, что у индивидуума, по существу, отсутствуют другие молекулярные или клеточные компоненты, обычно присутствующие в природе. Таким образом, в основном, очищенная популяция клеток (таких как В-клетки, предшественники В-клеток, зрелые В-клетки, В-клетки памяти, плазматические клетки и т.п.), по существу, не содержит других клеточных компонентов ткани, в которых они обычно присутствуют в природе, такой как костный мозг, периферическая кровь, селезенка, лимфатический узел и т.п. Так, например, по существу, очищенная популяция В-клеток (например, предшественники В-клеток, незрелые В-клетки, зрелые В-клетки, В-клетки памяти, плазматические клетки и т.п.) по меньшей мере на 50%, например, по меньшей мере приблизительно на 80% или альтернативно, по меньшей мере приблизительно на 90% не содержат других клеточных компонентов. В одном из вариантов осуществления изобретения, популяция В-клеток по меньшей мере приблизительно на 95% не содержит других клеток. Так, например, популяция очищенных В-клеток, выделенных из ткани, такой как периферическая кровь, в основном, не содержит эритроцитов, Т-клеток, тромбоцитов и других клеток, обычно присутствующих в периферической крови.
+
+
+
+
+
T-клетки: Лейкоциты, играющие решающую роль в иммунном ответе. Т-клетками являются, но не ограничиваются ими, CD4-Т-клетки и CD8-T-клетки. CD4-Т-лимфоцит представляет собой иммунную клетку, несущую на своей поверхности маркер, известный как «кластер дифференцировки 4» (CD4). Эти клетки, также известные как хелперные Т-клетки, регулируют иммунный ответ, включая гуморальный ответ, а также Т-клеточный ответ клеток-киллеров. CD8-T-клетки содержат маркер «кластера дифференцировки 8» (CD8). В одном из вариантов осуществления изобретения, CD8-T-клетки представляют собой цитотоксические Т-лимфоциты. В другом варианте осуществления изобретения, CD8-клетки представляют собой супрессорные Т-клетки.
Терапевтическое средство: В своем общепринятом смысле, этот термин включает средства для лечения, профилактические средства и средства для заместительной терапии. Терапевтическое средство используется для ослабления симптомов конкретного набора состояний у индивидуума, страдающего заболеванием или расстройством.
Терапевтически эффективное количество или эффективное количество: Количество конкретного вещества, такого как описанное в настоящем документе антитело, где количество является достаточным для достижения желаемого эффекта у индивидуума, подвергаемого лечению. Так, например, таким количеством может быть количество, необходимое для ингибирования репликации ВИЧ или для лечения СПИД'а. В некоторых вариантах осуществления изобретения терапевтически эффективным количеством является количество, необходимое для ослабления признаков или симптомов СПИД'а и/или для снижения титра вируса у индивидуума. При введении индивидууму должна быть использована такая доза, которая позволяет достичь нужной концентрации в ткани-мишени, при которой наблюдается нужный эффект in vitro.
Токсин: Эффекторная молекула, которая индуцирует цитотоксичность при ее контакте с клеткой. Конкретными неограничивающими примерами токсинов являются, но не ограничиваются ими, абрин, рицин, ауристатины (такие как монометилауристатин Е (MMAE; см., например, Francisco et al., Blood, 102: 1458-1465, 2003)) и монометилауристатин F (MMAF; см., например, Doronina at al., BioConjugate Chem., 17: 114-124, 2006), майтанзиноиды (такие как DM1; см., например, Phillips et al., Cancer Res., 68:9280-9290, 2008), экзотоксин Pseudomonas (PE, такой как PE35, PE37, PE38, и PE40), дифтерийный токсин (DT), ботулинический токсин, сапонин, рестриктоцин или гелонин, или модифицированные токсины или другие токсические средства, которые прямо или опосредованно ингибируют рост клеток или уничтожают эти клетки. Так, например, PE и DT представляют собой в высокой степени токсичные соединения, которые обычно приводят к летальному исходу в результате их токсического действия на печень. Однако PE и DT могут быть модифицированы с получением формы, которая может быть использована в качестве иммунотоксина, путем удаления природного нацеливающего компонента токсина (такого как домен Ia PE и B-цепь DT) и его замены другой нацеливающей молекулой, такой как антитело.
В условиях, достаточных для: Это выражение используется для описания любой среды, обеспечивающей желаемую активность. В одном из примеров, такой желаемой активностью является образование иммунного комплекса. В конкретных примерах, желаемой активностью является лечение опухоли.
Вектор: Молекула нуклеиновой кислоты, вводимая в клетку-хозяина с получением трансформированной клетки-хозяина. Вектор может содержать последовательности нуклеиновой кислоты, позволяющие этому вектору реплицироваться в клетке-хозяине, такие как ориджин репликации. Вектор может также содержать один или более селективных маркерных генов и другие генетические элементы, известные специалистам.
Вирус: Микроскопический инфекционный организм, который репродуцируется внутри живых клеток. Вирус состоит, в основном, из одной коровой нуклеиновой кислоты, окруженной белковой оболочкой, и обладает способностью реплицироваться только внутри живых клеток. «Репликация вируса» представляет собой продуцирование дополнительного вируса по меньшей мере за один жизненный цикл вируса. Вирус может подавлять нормальные функции клеток-хозяев, в результате чего поведение клетки определяется самим вирусом. Так, например, вирусная инфекция может сообщать клетке способность продуцировать цитокин или реагировать на цитокин, тогда как неинфицированная клетка обычно не обладает такой функцией.
«Ретровирусы» представляют собой РНК-вирусы, где вирусным геномом является РНК. При инфицировании клеток-хозяев ретровирусом, геномная РНК подвергается обратной транскрипции с образованием промежуточной ДНК, которая очень активно интегрируется в хромосомную ДНК инфицированных клеток. Такая интегрированная промежуточная ДНК называется «провирусом». Термин «лентивирус», используемый в своем общепринятом смысле, относится к роду вирусов, содержащих обратную транскриптазу. Лентивирусами являются «вирусы иммунодефицита», которые содержат вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) типа 1 и типа 2 (ВИЧ-I и ВИЧ-II), обезьяний вирус иммунодефицита (SIV) и кошачий вирус иммунодефицита (FIV).
Подходящие методы и материалы, применяемые для практического осуществления изобретения или проведения анализов, описаны ниже. Такие методы и материалы приводятся лишь в целях иллюстрации и не рассматриваются как ограничение объема изобретения. При этом могут быть применены и другие методы и материалы, аналогичные или эквивалентные методам и материалам, описанным в настоящей заявке. Так, например, стандартные методы, хорошо известные специалистам в области, к которой относится настоящее изобретение, описаны в различных общих руководствах и в специальной литературе, включая, например, руководства Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d ed., Cold Spring Harbor Press, 2001; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, 1992 (и дополнения на 2012 г.); Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, 4th ed., Wiley & Sons, 1999; Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1990; и Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999.
II. Описание некоторых вариантов осуществления изобретения
A. Нейтрализующие моноклональные антитела
В настоящей заявке описаны выделенные моноклональные антитела человека, которые специфически связываются с gp41. Описанные в настоящем документе антитела специфически связываются с мембрано-проксимальной областью (MPER) gp41. В настоящей заявке также описаны композиции, содержащие моноклональные антитела человека и фармацевтически приемлемый носитель. Настоящее изобретение также относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим антитела, к векторам экспрессии, содержащим нуклеиновые кислоты, и к выделенным клеткам-хозяевам, которые экспрессируют нуклеиновые кислоты.
Композиции, содержащие моноклональные антитела человека, специфичные к gp41, могут быть использованы в целях исследования, диагностики и терапии. Так, например, описанные в настоящем описании моноклональные антитела человека могут быть использованы для детекции ВИЧ-1 в биологическом образце или для подавления активности ВИЧ-1, например, для установления диагноза или для лечения индивидуума, инфицированного ВИЧ-1 и/или страдающего СПИД'ом. Так, например, антитела могут быть использованы для определения титра ВИЧ-1 у индивидуума. Описанные в настоящем документе антитела могут быть также использованы для исследования биологических свойств вируса иммунодефицита человека.
Описанные в настоящем документе антитела, специфически связывающиеся с gp41, связываются с мембрано-проксимальной внеклеточной областью (MPER) gp41 в ранее не охарактеризованном эпитопе, то есть, в эпитопе, называемом в настоящем документе эпитопом для 10E8, а именно, для первого члена класса антител, рассматриваемых в настоящей заявке (10E8-подобных антител). Кристаллическая структура антитела 10E8 была охарактеризована в комплексе с пептидом gp41 (см. пример 1), что позволило провести детальный анализ на связывание антитела 10E8 этого класса с gp41 и описать связывание 10E8-подобных антител (таких как 10E8) с эпитопом для 10E8 на атомном уровне. Этот эпитоп, а значит и антитела этого класса (10E8-подобные антитела), могут отличаться от других антител, которые связываются с gp41, по их связыванию с эпитопом для 10E8. В некоторых вариантах осуществления изобретения, эпитоп для 10E8, например, KWASLWNWFDITNWLWYIR (SEQ ID NO: 13), представляет собой C-концевое удлинение эпитопа для 2F5 (хотя и с некоторым перекрыванием) на эктодомене gp41 и отличается от эпитопа для 4E10 и Z13E1 повышенным уровнем связывания благодаря его связыванию с C-концевыми остатками, которые ранее считались недоступными (например, эти остатки, вероятно, были скрыты в липидном бислое). Для специалиста в данной области очевидно, что антитела 10E8 могут специфически связываться с остатками MPER gp41, простирающимися от N-конца до вышеуказанной последовательности. В некоторых вариантах осуществления изобретения, описанные 10E8-подобные антитела специфически связываются с полипептидом, содержащим аминокислотную последовательность как остатки 1-28, 2-28, 3-28, 4-28, 5-28, 6-28, 7-28, 8-28, 9-28, 10-28, 11-28, 12-28, 13-28 или 14-28 SEQ ID NO: 26, которые соответствуют остаткам gp41 656-683, 657-683, 658-683, 659-683, 660-683, 661-683, 662-683, 663-683, 664-683, 665-683, 666-683, 667-683, 668-683 или 669-683, соответственно (система нумерации HXB2).
,
В некоторых вариантах осуществления изобретения, остатками, которые, вероятно, контактируют с антителом 10E8, являются остатки K, SLWNWF, TN, LW и IRпоказанные выше жирным шрифтом. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления изобретения, 10E8-подобное антитело специфически связывается с одним или более остатками K, SLWNWF, TN, LW и IR SEQ ID NO: 13, например, по меньшей мере с 1, по меньшей мере с 2, по меньшей мере с 3, по меньшей мере с 4, по меньшей мере с 5, по меньшей мере с 6, по меньшей мере с 7, по меньшей мере с 8, по меньшей мере с 9, по меньшей мере с 10, по меньшей мере с 11, по меньшей мере с 12 остатками или даже со всеми 13 этими остатками. В некоторых примерах, 10E8-подобное антитело связывается с остатками NWF, T и R, показанными жирным шрифтом в последовательности NWFDITNWLWYIR (остатки 7-19 SEQ ID NO: 13).
В дополнительных вариантах осуществления изобретения, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент контактирует с остатками L, WF, LW и R, показанными жирным шрифтом в аминокислотной последовательности LWNWFDITNWLWYIR (SEQ ID NO: 26, остатки 14-28). В дополнительных вариантах осуществления изобретения, описанное антитело контактирует с остатками LW, WF, LW и R, показанными жирным шрифтом в аминокислотной последовательности LWNWFDITNWLWYIR (SEQ ID NO: 26, остатки 14-28). В дополнительных вариантах осуществления изобретения, описанное антитело контактирует с остатками SLW, WF, LW и R, показанными жирным шрифтом в аминокислотной последовательности SLWNWFDITNWLWYIR (SEQ ID NO: 26, остатки 13-28). В дополнительных вариантах осуществления изобретения, описанное антитело контактирует с остатками L, DK, SLWNWF, TN, LW и IR, показанными жирным шрифтом в аминокислотной последовательности LELDKWASLWNWFDITNWLWYIR (SEQ ID NO: 26, остатки 6-28). В дополнительных вариантах осуществления изобретения, описанное антитело контактирует с остатками NWF, T и R, показанными жирным шрифтом в аминокислотной последовательности NWFDITNWLWYIR (SEQ ID NO: 13, остатки 7-19). В дополнительных вариантах осуществления изобретения, описанное антитело контактирует с остатками K, SLNWF, T и IR, показанными жирным шрифтом в аминокислотной последовательности KWASLWNWFDITNWLWYIR (SEQ ID NO: 13). В дополнительных вариантах осуществления изобретения, описанное антитело специфически связывается с остатками NWF, T и R, показанными жирным шрифтом в аминокислотной последовательности NWFDITNWLWYIR (SEQ ID NO: 13, остатки 7-19). В дополнительных вариантах осуществления изобретения, описанное антитело специфически связывается с остатками K, SLNWF, T и IR, показанными жирным шрифтом в аминокислотной последовательности KWASLWNWFDITNWLWYIR (SEQ ID NO: 13). В некоторых таких вариантах осуществления изобретения, антитело непосредственно контактирует с gp41 MPER в положениях остатков, если оно специфически связано с gp41, например, посредством водородных связей и/или ван-дер-ваальсовых контактов. В дополнительных вариантах осуществления изобретения, антитело контактирует с gp41 MPER в положениях остатков, если оно специфически связано с gp41, например, посредством водородных связей, ван-дер-ваальсовых контактов и/или взаимодействий, которые снижают доступ растворителя между антителом и gp41 (то есть, в скрытую область поверхности). Как показано на фиг. 27 и 28, остатками в антителе 10E8 и в 10E8-подобном антителе, которые играют важную роль в связывании с эпитопом для 10E8, являются остатки по Кэбату 28, 31, 33, 50, 52, 52B, 52C, 53, 56, 58 и 97-100J тяжелой цепи и остатки по Кэбату 91 и 95B легкой цепи. Эти остатки соответствуют остаткам 28, 31, 33, 50, 52, 54, 55, 56, 59, 61, 103-116 тяжелой цепи (номера остатков даны в соответствии с SEQ ID NO: 1), и остаткам 91 и 97 легкой цепи (номера остатков даны в соответствии с SEQ ID NO: 2). В некоторых вариантах осуществления изобретения, 10E8-подобное антитело специфически связывается с gp41, и один или более остатков 28, 31, 33, 50, 52, 54, 55, 56, 59, 61 и/или 103-116 тяжелой цепи (в соответствии с SEQ ID NO: 1), например, по меньшей мере 1, по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19, по меньшей мере 20, по меньшей мере 21, по меньшей мере 22, по меньшей мере 23, по меньшей мере 24, по меньшей мере 25, по меньшей мере 26 или даже все 27 этих остатков контактируют с gp41. В некоторых вариантах осуществления изобретения, 10E8-подобное антитело специфически связывается с gp41, и по меньшей мере один из остатков 91 и 97 легкой цепи (в соответствии с SEQ ID NO: 2) контактирует с gp41.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, 10E8-подобные антитела этого класса не обладают аутореактивностью, то есть, они не связываются с аутоантигенами, такими как белок человека. Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, авторы лишь отмечают, что анализ кристаллической структуры 10E8 в комплексе с пептидом MPER gp41 показал, что 10E8 связывается с MPER по механизму, для осуществления которого не требуется какого-либо гидрофобного взаимодействия с мембраной. Другие известные нейтрализующие антитела, которые связываются с MPER gp41, такие как 2F5 и 4E10, содержат гидрофобные остатки в CDR H3, которые не контактируют с эпитопом и, очевидно, специфически контактируют с липидной мембраной, содержащей gp41.
Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, авторы лишь отмечают, что спектр нейтрализации 10E8-подобных антител может допускать консервативные изменения в эпитопе с сохранением уровня связывания. Так, например, если C-концевым остатком является аргинин, то в антителах этого класса, остаток в этом сайте может быть заменен лизином, что позволяет сохранить высокую аффинность связывания. Кроме того, для специалиста в данной области очевидно, что можно получить консенсусную последовательность эпитопа для 10E8 с использованием последовательности всех вариантов gp41 изолятов ВИЧ, перечисленных на фиг. 17B или на фиг. 17C-17F. В некоторых вариантах осуществления изобретения, антитела этого класса (10E8-подобные антитела) могут также отличаться по своему спектру нейтрализации. В некоторых вариантах осуществления изобретения, 10E8-подобное антитело может нейтрализовать по меньшей мере 95% (например, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%) изолятов ВИЧ-1, перечисленных на фиг. 17B или на фиг. 17C-17F, с IC50 менее, чем 50 мкг/мл. В некоторых вариантах осуществления изобретения, 10E8-подобное антитело может нейтрализовать по меньшей мере 65% (например, по меньшей мере 66%, по меньшей мере 67%, по меньшей мере 68%, по меньшей мере 69%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 71%, по меньшей мере 72%, по меньшей мере 73%, по меньшей мере 74%, по меньшей мере 75% или по меньшей мере 80%) изолятов ВИЧ-1, перечисленных на фиг. 17B или на фиг. 17C-17F, с IC50 менее, чем 1 мкг/мл. В конкретных вариантах осуществления изобретения, 10E8-подобным антителом не является антитело Z13E1, 4E10 или 2F5.
Ниже обсуждаются выделенные моноклональные антитела, содержащие вариабельные домены тяжелой и легкой цепей, включая CDR1, CDR2 и CDR3. Для специалиста в данной области очевидно, что при определении положений CDR могут быть использованы различные схемы нумерации CDR (такие как схемы нумерации по Кэбату, Чотия или IMGT). Положения CDR тяжелой цепи моноклонального антитела 10E8, пронумерованные в соответствии со схемой нумерации Кэбата и IMGT, представлены на фиг. 6A (Кэбат) и фиг. 6B (IMGT). В некоторых вариантах осуществления изобретения, при указании на конкретные аминокислотные замены в тяжелой и легкой цепях описанных антител имеется в виду, что эти замены сделаны по схеме нумерации Кэтата или IMGT. Так, например, аминокислотная замена S74W в описанном в настоящем документе 10E8 дана по схеме нумерации Кэбата. При использовании схемы нумерации IMGT, эта замена будет обозначаться S82W. В обоих случаях эта замена означает замену серинового остатка в положении 77 SEQ ID NO:1. Специалисту в данной области совершенно очевидно, что при ссылке на конкретные аминокислоты описанных в настоящем документе антител могут быть использованы различные схемы нумерации CDR.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, выделенное антитело, которое специфически связывается с gp41, содержит тяжелую цепь, имеющую одну или более из аминокислот 26-33 (гипервариабельная область 1 (CDR1)), аминокислот 51-60 (CDR2), и/или 99-120 (CDR3) SEQ ID NO:11:
X
X
X
X
X
X
X
1
2
3
4
1
2
3
4
EVLXESGGGLVKPGGSLRLSCSASGFDFDNAWMTWVRQPPGKGLEWVGRITGPGEGWSVDYAAPVEGRFTISRLNINFLYLEMNNLRMEDSGLYFCARTGKYYDFWSGYPPGEEYFQDWGRGTLVVSS (SEQ ID NO: 11), где  представляет собой Q или R, представляет собой V или A, представляет собой S или Y, а представляет собой T или I. В некоторых вариантах осуществления изобретения, выделенное моноклональное антитело человека, которое специфически связывается с gp41, содержит тяжелую цепь, имеющую аминокислоты 26-33 (CDR1), 51-60 (CDR2) и 99-120 (CDR3) SEQ ID NO: 11. В конкретных примерах, тяжелая цепь моноклонального антитела человека содержит SEQ ID NO: 11.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, выделенное антитело, которое специфически связывается с gp41, содержит тяжелую цепь, имеющую одну или более из аминокислот 26-33 (гипервариабельная область 1 (CDR1)), аминокислот 51-60 (CDR2) и/или 99-120 (CDR3) SEQ ID NO: 146:
1
2
3
4
5
6
7
1
2
3
4
5
6
7
EVXLXESGGGLVKPGGSLRLSCSASGFXFXXAWMTWVRQPPGKGLEWVGRITGPGEXWSVDYAAPVEGRFTISRLNSINFLYLEMNNLRMEDSGLYFCARTGKYYDFWSGYPPGEEYFQDWGRGTLVXVSS (SEQ ID NO: 146), где X представляет собой Q или R, Xпредставляет собой V или A, Xпредставляет собой D или W, Xпредставляет собой D или W, Xпредставляет собой N или W, X представляет собой G или W, а Xпредставляет собой T или I. В некоторых вариантах осуществления изобретения, выделенное моноклональное антитело человека, которое специфически связывается с gp41, содержит тяжелую цепь, имеющую аминокислоты 26-33 (CDR1), 51-60 (CDR2) и 99-120 (CDR3) SEQ ID NO: 146. В конкретных примерах, тяжелая цепь моноклонального антитела человека содержит SEQ ID NO:146.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
51
52
53
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
В некоторых вариантах осуществления изобретения, выделенное антитело, которое специфически связывается с gp41, содержит тяжелую цепь, имеющую одну или более из аминокислот 26-33 (гипервариабельная область 1 (CDR1)), аминокислот 51-60 (CDR2) и/или 99-120 (CDR3) SEQ ID NO: 187. SEQ ID NO: 187 представлена как EXXLXESGGXLVXPGGSLRLSCXASGFXFXXXWMTWVRQXPGKGLEWVGRIX-GXGXXWXXXYAXXVXGRFXISRXXXXXXXYLXMNXXXXXDXXXYXCXXTXKXYXFWXGXPPGEEYXXXWGX50GTXVXVXS, где Xпредставляет собой V или I; Xпредставляет собой Q или R; Xпредставляет собой V или A; Xпредставляет собой G, R или D; Xпредставляет собой K или R; Xпредставляет собой S или A; Xпредставляет собой D, N, S, A или W; Xпредставляет собой D, K, W или A; Xпредставляет собой N, S, D, A, W, F или Y; Xпредставляет собой A, T или Q; Xпредставляет собой P или A; Xпредставляет собой T, S или A; Xпредставляет собой P или W; Xпредставляет собой E, A, F, L, M, V или W; Xпредставляет собой G или W; Xпредставляет собой S, T, A или H; Xпредставляет собой V или S; Xпредставляет собой D, G или A; Xпредставляет собой A или E; Xпредставляет собой P, S или T; Xпредставляет собой E, K или Q; Xпредставляет собой T или I; Xпредставляет собой L, D, M, I или N; Xпредставляет собой N или D; Xпредставляет собой S, M, W, F, L или M; Xпредставляет собой I или K; Xпредставляет собой N или D; Xпредставляет собой F, T или M; Xпредставляет собой L или F; Xпредставляет собой E или Q; Xпредставляет собой N, S или R; Xпредставляет собой L или V; Xпредставляет собой R или K; Xпредставляет собой M, T, I или P; Xпредставляет собой E или D; Xпредставляет собой S, T или W; Xпредставляет собой G, A или W; Xпредставляет собой L, V, S или Y; Xпредставляет собой F или Y; Xпредставляет собой A, T или V; X представляет собой R, T или H; Xпредставляет собой G или E; Xпредставляет собой Y или H; X представляет собой D, A или N; X представляет собой S, G или R; Xпредставляет собой Y или A; Xпредставляет собой F или L; Xпредставляет собой Q или E; Xпредставляет собой D или H; X представляет собой R или Q; Xпредставляет собой L или Q; Xпредставляет собой T или I; и Xпредставляет собой S или P). В некоторых вариантах осуществления изобретения, выделенное моноклональное антитело человека, которое специфически связывается с gp41, содержит тяжелую цепь, имеющую аминокислоты 26-33 (CDR1), 51-60 (CDR2) и 99-120 (CDR3) SEQ ID NO: 187. В дополнительных вариантах осуществления изобретения, выделенное антитело, которое специфически связывается с gp41, содержит вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 187.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, выделенное антитело, которое специфически связывается с gp41, является нейтрализующим и содержит тяжелую цепь, содержащую одну или более гипервариабельных областей (CDR) тяжелой цепи, имеющих одну из последовательностей вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO:1, 3, 5, 11, 146, 147-149, 187, 189-192 и 200-204, пронумерованные по системе нумерации Кэбата, IMGT или Чотия. В некоторых вариантах осуществления изобретения, выделенное антитело, которое специфически связывается с gp41 и является нейтрализующим, содержит тяжелую цепь, содержащую CDR1, CDR2 и CDR3 одной из последовательностей вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO:1, 3, 5, 11, 146, 147-149, 187, 189-192 и 200-204, пронумерованные по системе нумерации Кэбата, IMGT или Чотия.
Таким образом, в некоторых вариантах осуществления изобретения, выделенное антитело, которое специфически связывается с gp41, содержит одну или более из аминокислот 26-33 (CDR1), аминокислот 51-60 (CDR2) и/или 99-120 (CDR3) любой из SEQ ID NO:1, 3, 5, 11, 146, 147-149, 187, 189-192 и 200-204. В некоторых вариантах осуществления изобретения, выделенное моноклональное антитело человека, которое специфически связывается с gp41, содержит тяжелую цепь, имеющую аминокислоты 26-33 (CDR1), 51-60 (CDR2) и/или 99-120 (CDR3) любой из SEQ ID NO: 1, 3, 5, 11, 146, 147-149, 187, 189-192 и 200-204. В конкретных примерах, тяжелая цепь моноклонального антитела человека содержит одну из SEQ ID NO: 1, 3, 5, 11, 146, 147-149, 187, 189-192 и 200-204.
Так, например, в некоторых вариантах осуществления изобретения, выделенное антитело, которое специфически связывается с gp41, содержит тяжелую цепь, содержащую одну или более гипервариабельных областей тяжелой цепи (CDR) анти-gp41 антитела 10E8, 7H6 и/или 7N16. Тяжелая цепь анти-gp41 антитела 10E8 представлена SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления изобретения, выделенное антитело, которое специфически связывается с gp41, содержит одну или более из аминокислот 26-33 (27-38 на фиг. 6B) (CDR1), аминокислот 51-60 (56-65 на фиг. 6B) (CDR2) и/или 99-120 (105-126 на фиг. 6B) (CDR3) SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления изобретения, выделенное моноклональное антитело человека, которое специфически связывается с gp41, содержит тяжелую цепь, имеющую аминокислоты 26-33 (CDR1), 51-60 (CDR2) и 99-120 (CDR3) SEQ ID NO: 1. В конкретных примерах, тяжелая цепь моноклонального антитела человека содержит SEQ ID NO: 1. Тяжелая цепь анти-gp41 антитела 7H6 представлена SEQ ID NO: 3. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления изобретения, выделенное антитело, которое специфически связывается с gp41, содержит одну или более из аминокислот 26-33 (CDR1), 51-60 (CDR2) и/или 99-120 (CDR3) SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах осуществления изобретения, выделенное моноклональное антитело человека, которое специфически связывается с gp41, содержит тяжелую цепь, имеющую аминокислоты 26-33 (CDR1), 51-60 (CDR2) и 99-120 (CDR3) SEQ ID NO: 3. В конкретных примерах, тяжелая цепь моноклонального антитела человека содержит SEQ ID NO: 3. Тяжелая цепь анти-gp41 антитела 7N16 представлена SEQ ID NO: 5. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления изобретения, выделенное антитело, которое специфически связывается с gp41, содержит одну или более из аминокислот 26-33 (CDR1), 51-60 (CDR2) и/или 99-120 (CDR3) SEQ ID NO: 5. В некоторых вариантах осуществления изобретения, выделенное моноклональное антитело человека, которое специфически связывается с gp41, содержит тяжелую цепь, имеющую аминокислоты 26-33 (CDR1), 51-60 (CDR2) и 99-120 (CDR3) SEQ ID NO: 5. В конкретных примерах, тяжелая цепь моноклонального антитела человека содержит SEQ ID NO: 5.
В дополнительных вариантах осуществления изобретения, выделенное антитело, которое специфически связывается с gp41, содержит тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность любой из описанных в настоящем документе тяжелых цепей 10E8-подобного антитела, и дополнительно имеет аминокислотную замену в положении 77 (в положении 74 в соответствии с нумерацией по Кэбату), такую как замена S77Y (S74Y в соответствии с нумерацией по Кэбату). В дополнительных вариантах осуществления изобретения, выделенное антитело, которое специфически связывается с gp41, содержит тяжелую цепь, содержащую одну или более гипервариабельных областей (CDR) любой из описанных в настоящем документе тяжелых цепей 10E8-подобного антитела, а также имеет аминокислотную замену в положении 77 (в положении 74 в соответствии с нумерацией по Кэбату), такую как замена S77Y (S74Y в соответствии с нумерацией по Кэбату). В дополнительных вариантах осуществления изобретения, выделенное антитело, которое специфически связывается с gp41, содержит тяжелую цепь, содержащую одну или более гипервариабельных областей (CDR) тяжелой цепи одного из анти-gp41 антител gVRC-H2dN152 или gVRC- H2dN152 с аминокислотной заменой в положении 77 (в положении 74 в соответствии с нумерацией по Кэбату). В некоторых примерах, аминокислотной заменой является замена серина на тирозин. Тяжелая цепь анти-gp41 антитела gVRC-H2dN152 представлена SEQ ID NO: 154. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления изобретения, выделенное антитело, которое специфически связывается с gp41, содержит одну или более из аминокислот 26-33 (CDR1), 51-60 (CDR2) и/или 99-120 (CDR3) SEQ ID NO: 154. В некоторых вариантах осуществления изобретения, выделенное моноклональное антитело человека, которое специфически связывается с gp41, содержит тяжелую цепь, имеющую аминокислоты 26-33 (CDR1), 51-60 (CDR2) и 99-120 (CDR3) SEQ ID NO: 154. В конкретных примерах, тяжелая цепь моноклонального антитела человека содержит SEQ ID NO: 154. Тяжелая цепь анти-gp41 антитела gVRC-H2dN152 с заменой серина на тирозин в положении 77 (в положении 74 в соответствии с нумерацией по Кэбату) представлена SEQ ID NO: 192. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления изобретения, выделенное антитело, которое специфически связывается с gp41, содержит одну или более из аминокислот 26-33 (CDR1), 51-60 (CDR2) и/или 99-120 (CDR3) SEQ ID NO: 192. В некоторых вариантах осуществления изобретения, выделенное моноклональное антитело человека, которое специфически связывается с gp41, содержит тяжелую цепь, имеющую аминокислоты 26-33 (CDR1), 51-60 (CDR2) и 99-120 (CDR3) SEQ ID NO: 192. В конкретных примерах, тяжелая цепь моноклонального антитела человека содержит SEQ ID NO: 192.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, выделенное антитело, которое специфически связывается с gp41, содержит одну или более гипервариабельных областей легкой цепи (CDR), имеющих аминокислоты 26-31 (CDR1), 49-51 (CDR2) и/или 88-99 (CDR3) SEQ ID NO: 12:
1
2
3
4
5
6
7
8
1
2
3
4
5
6
7
8
SYELTQXTGVSVALGRTVVTITCRGDSLRSHXASWYQKKPGQAPXLLFYGKNNRPSGXPDR FSGSASGNRASLTIXGAQAEDXAXYYCSSRDKSGSRLSVFGGGTKLXVL (SEQ ID NO: 12), где X представляет собой E или D, X представляет собой Y или Н, Х представляет собой V или I, Х представляет собой V или I, Х представляет собой S или Т, Х представляет собой D или Е, Х представляет собой Е или D, а Х представляет собой Т или I. В некоторых вариантах осуществления изобретения, выделенное моноклональное антитело человека, которое специфически связывается с gp41, содержит легкую цепь, имеющую аминокислоты 26-31 (CDR1), 49-51 (CDR2) и 88-99 (CDR3) SEQ ID NO: 12. В конкретных примерах, легкая цепь моноклонального антитела человека содержит SEQ ID NO: 12.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, выделенное антитело, которое специфически связывается с gp41, содержит одну или более гипервариабельных областей легкой цепи (CDR), имеющих аминокислоты 26-31 (CDR1), 49-51 (CDR2) и/или 88-99 (CDR3) SEQ ID NO: 188:
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
2l
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
XXXLTQXXXVSVAXXXTVXITCXGDSLRXXYXXWYQXXXXQAPXLXXYXXXXRPSXXXDRFSXXXSGNXASLTIXGAXXXDXAXYYCSSRDKSGSRLXXFGXGTXXXXX, где X представляет собой S или А; Х представляет собой Y или S; Х представляет собой Е или D; Х представляет собой Е или D; Х представляет собой Т или Р; Х представляет собой G, А или Т; Х представляет собой L или F; Х представляет собой G, K или Е; Х представляет собой R, Q или K; Х представляет собой Т или R; Х представляет собой R или Q; X представляет собой S, R или N; X представляет собой Н или Y; Х представляет собой А, V или Т; X представляет собой S или G; X представляет собой K, Е или Q; Х представляет собой K или R; X представляет собой Р или Т; X представляет собой G или R; Х представляет собой I, V или K; X представляет собой L или V; Х представляет собой F, V или I; Х представляет собой G или Р; Х представляет собой K или R; Х представляет собой N, D или Н; Х представляет собой N или I; Х представляет собой G или Р; Х представляет собой V или I; Х представляет собой Р, Н или S; Х представляет собой G или A; X представляет собой S или F; Х представляет собой А, Т или S; Х представляет собой R или Т; Х представляет собой S, А или Т; Х представляет собой Q или Е; Х представляет собой А или G; Х представляет собой Е или D; Х представляет собой D, Е или I; Х представляет собой Е или D; Х представляет собой S, V; Х представляет собой V, Т; Х представляет собой G, R; Х представляет собой K или Е; Х представляет собой L, V или R; Х представляет собой Т, S или А; Х представляет собой V, Т или G; а Х представляет собой L, V или Р. В некоторых вариантах осуществления изобретения, выделенное моноклональное антитело человека, которое специфически связывается с gp41, содержит легкую цепь, имеющую аминокислоты 26-31 (CDR1), 49-51 (CDR2) и 88-99 (CDR3) SEQ ID NO: 188. В дополнительных вариантах осуществления изобретения, выделенное моноклональное антитело человека, которое специфически связывается с gp41, содержит вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 188.
Некоторые варианты осуществления изобретения содержат выделенное антитело, которое специфически связывается с gp41 и является нейтрализующим, а также содержит легкую цепь, содержащую одну или более из гипервариабельных областей легкой цепи (CDR) одной из последовательностей вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO: 2, 4, 6, 12, 150-152, 164-186, 188 или 197-199, и пронумерованных по системе нумерации Кэбата, IMGT или Чотия. В некоторых вариантах осуществления изобретения, выделенное антитело, которое специфически связывается с gp41, является нейтрализующим и содержит легкую цепь, содержащую CDR1, CDR, и CDR3 одной из последовательностей вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO: 2, 4, 6, 12, 150-152, 164-186, 188 или 197-199, и пронумерованных по системе нумерации Кэбата, IMGT или Чотия. В дополнительных вариантах осуществления изобретения, выделенное антитело, которое специфически связывается с gp41, содержит одну или более из аминокислот 26-31 (27-38 на фиг. 6B) (CDR1), 49-51 (56-65 на фиг. 6B) (CDR2), и/или 88-99 (105-116 на фиг. 6B) (CDR3) одной из последовательностей SEQ ID NO: 2, 4, 6, 12, 150-152, 164-186, 188 или 197-199. В других вариантах осуществления изобретения, выделенное моноклональное антитело человека, которое специфически связывается с gp41, содержит легкую цепь, имеющую аминокислоты 26-31 (CDR1), 49-51 (CDR2) и 88-99 (CDR3) любой из SEQ ID NO: 2, 4, 6, 12, 150-152, 164-186, 188 или 197-199. В конкретных примерах, легкая цепь моноклонального антитела человека содержит одну из SEQ ID NO: 2, 4, 6, 12, 150-152, 164-186, 188 или 197-199.
Так, например, в некоторых вариантах осуществления изобретения, выделенное антитело, которое специфически связывается с gp41, содержит одну или более гипервариабельных областей легкой цепи (CDR) анти-gp41 антитела 10Е8, 7Н6 и/или 7N16. Легкая цепь анти-gp41 антитела 10Е8 представлена SEQ ID NO: 2. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления изобретения, выделенное антитело, которое специфически связывается с gp41, содержит одну или более из аминокислот 26-31 (27-38 на фиг. 6B) (CDR1), 49-51 (56-65 на фиг. 6B) (CDR2) и/или 88-99 (105-116 на фиг. 6B) (CDR3) SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления изобретения, выделенное моноклональное антитело человека, которое специфически связывается с gp41, содержит легкую цепь, имеющую аминокислоты 26-31 (CDR1), 49-51 (CDR2) и 88-99 (CDR3) SEQ ID NO: 2. В конкретных примерах, легкая цепь моноклонального антитела человека содержит SEQ ID NO: 2. Легкая цепь анти-gp41 антитела 7Н6 представлена SEQ ID NO: 4. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления изобретения, выделенное антитело, которое специфически связывается с gp41, содержит одну или более из аминокислот 26-31 (CDR1), 49-51 (CDR2) и 88-99 (CDR3) SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления изобретения, выделенное моноклональное антитело человека, которое специфически связывается с gp41, содержит легкую цепь, имеющую аминокислоты 26-31 (CDR1), 49-51 (CDR2) и 88-99 (CDR3) SEQ ID NO: 4. В конкретных примерах, легкая цепь моноклонального антитела человека содержит SEQ ID NO: 4. Легкая цепь анти-gp41 антитела 7N16 представлена последовательностью SEQ ID NO: 6. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления изобретения, выделенное антитело, которое специфически связывается с gp41, содержит одну или более из аминокислот 26-31 (CDR1), 49-51 (CDR2) и 88-99 (CDR3) SEQ ID NO: 6. В некоторых вариантах осуществления изобретения, выделенное моноклональное антитело человека, которое специфически связывается с gp41, содержит тяжелую цепь, имеющую аминокислоты 26-31 (CDR1), 49-51 (CDR2) и 88-99 (CDR3) SEQ ID NO: 6. В конкретных примерах, тяжелая цепь моноклонального антитела человека содержит SEQ ID NO: 6.
В дополнительных вариантах осуществления изобретения, выделенное антитело, которое специфически связывается с gp41, содержит тяжелую цепь, содержащую одну или более
гипервариабельных областей тяжелой цепи (CDR) анти-gp41 антитела 10E8gL03. Легкая цепь анти-gp41 антитела 10Е8gH03 представлена последовательностью SEQ ID NO: 152. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления изобретения, выделенное антитело, которое специфически связывается с gp41, содержит одну или более из аминокислот 26-31 (CDR1), 49-51 (CDR2) и/или 88-99 (CDR3) SEQ ID NO: 152. В некоторых вариантах осуществления изобретения, выделенное моноклональное антитело человека, которое специфически связывается с gp41, содержит тяжелую цепь, имеющую аминокислоты 26-31 (CDR1), 49-51 (CDR2) и 88-99 (CDR3) SEQ ID NO: 152. В конкретных примерах, тяжелая цепь моноклонального антитела человека содержит SEQ ID NO: 152.
Дополнительные варианты осуществления изобретения содержат выделенное антитело, которое специфически связывается с gp41 и является нейтрализующим, а также содержит тяжелую цепь, содержащую одну или более из гипервариабельных областей тяжелой цепи (CDR) одной из последовательностей вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO: 1, 3, 5, 11, 146, 147-149, 187, 189-192 и 200-204 и пронумерованных по системе нумерации Кэбата, IMGT или Чотия, и одну или более гипервариабельных областей легкой цепи (CDR) одной из последовательностей вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO: 2, 4, 6, 12, 150-152, 164-186, 188 или 197-199, и пронумерованных по системе нумерации Кэбата, IMGT или Чотия, соответственно. Дополнительные варианты осуществления изобретения содержат выделенное антитело, которое специфически связывается с gp41 и является нейтрализующим, а также содержит тяжелую цепь, содержащую одну или более из гипервариабельных
областей тяжелой цепи 1 (HCRD1), HCRD2 и HCDR3 одной из последовательностей вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO: 1, 3, 5, 11, 146, 147-149, 187, 189-192 и 200-204 и пронумерованных по системе нумерации Кэбата, IMGT или Чотия, и гипервариабельную область легкой цепи 1 (HCRD1), HCRD2, и HCDR3 одной из последовательностей вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO: 2, 4, 6, 12, 150-152, 164-186, 188 или 197-199, и пронумерованных по системе нумерации Кэбата, IMGT или Чотия, соответственно.
Таким образом, в некоторых вариантах осуществления изобретения, выделенное антитело, которое специфически связывается с gp41, содержит тяжелую цепь, имеющую аминокислоты 26-33 (27-38 на фиг. 6B) (CDR1), аминокислоты 51-60 (56-65 на фиг. 6B) (CDR2) и/или 88-99 (105-126 на фиг. 6B) (CDR3) любой из SEQ ID NO: 1, 3, 5, 11, 146, 147-149, 187, 189-192 и 200-204, и легкую цепь, имеющую аминокислоты 26-31 (27-38 на фиг. 6B) (CDR1), 49-51 (56-65 на фиг. 6B) (CDR2) и/или 88-99 (105-116 на фиг. 6B) (CDR3) любой из SEQ ID NO: 2, 4, 6, 12, 150-152, 164-186, 188 или 197-199. В дополнительных вариантах осуществления изобретения, выделенное антитело, которое специфически связывается с gp41, содержит тяжелую цепь, имеющую аминокислоты 26-33 (27-38 на фиг. 6B) (CDR1), аминокислоты 51-60 (56-65 на фиг. 6B) (CDR2) и 99-120 (105-126 на фиг. 6B) (CDR3) любой из SEQ ID NO: 1, 3, 5, 11, 146, 147-149, 187, 189-192 и 200-204, и легкую цепь, имеющую аминокислоты 26-31 (27-38 на фиг. 6B) (CDR1), 49-51 (56-65 на фиг. 6B) (CDR2) и 87-98 (105-116 на фиг. 6B) (CDR3) любой из SEQ ID NO: 2, 4, 6, 12, 150-152, 164-186, 188
или 197-199.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, выделенное антитело, которое специфически связывается с gp41, содержит тяжелую цепь, имеющую аминокислоты 26-33 (27-38 на фиг. 6B) (CDR1), аминокислоты 51-60 (56-65 на фиг. 6B) (CDR2) и/или 99-120 (105-126 на фиг. 6B) (CDR3) SEQ ID NO: 1, и легкую цепь, имеющую аминокислоты 26-31 (27-38 на фиг. 6B) (CDR1), 49-51 (56-65 на фиг. 6B) (CDR2) и/или 88-99 (105-116 на фиг. 6B) (CDR3) SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления изобретения, выделенное антитело, которое специфически связывается с gp41, содержит тяжелую цепь, имеющую аминокислоты 26-33 (27-38 на фиг. 6B) (CDR1), аминокислоты 51-60 (56-65 на фиг. 6B) (CDR2) и 99-120 (105-126 на фиг. 6B) (CDR3) SEQ ID NO: 154, и легкую цепь, имеющую аминокислоты 26-31 (27-38 на фиг. 6B) (CDR1), 49-51 (56-65 на фиг. 6B) (CDR2) и 88-99 (105-116 на фиг. 6B) (CDR3) SEQ ID NO: 152. В некоторых вариантах осуществления изобретения, выделенное антитело, которое специфически связывается с gp41, содержит тяжелую цепь, имеющую аминокислоты 26-33 (27-38 на фиг. 6B) (CDR1), аминокислоты 51-60 (56-65 на фиг. 6B) (CDR2) и/или 99-120 (105-126 на фиг. 6B) (CDR3) SEQ ID NO: 192, и легкую цепь, имеющую аминокислоты 26-31 (27-38 на фиг. 6B) (CDR1), 49-51 (56-65 на фиг. 6B) (CDR2) и/или 88-99 (105-116 на фиг. 6B) (CDR3) SEQ ID NO: 152.
В дополнительных примерах, выделенное антитело, которое специфически связывается с gp41, является нейтрализующим и содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где вариабельная область тяжелой цепи содержит любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 1, 3, 5, 11, 146, 147-149, 187, 189-192 или 200-204, а вариабельная область легкой цепи содержит любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 2, 4, 6, 12, 150-152, 164-186, 188 или 197-199. В одном из примеров, вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, а вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. В другом примере, вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 192, а вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 152. В другом примере, вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 154, а вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 152.
В других вариантах осуществления изобретения, выделенное антитело, которое специфически связывается с gp41, содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую не более чем 10 (например, более чем 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или не более чем 9) аминокислотных замен по сравнению с любой из SEQ ID NO: 1, 3, 5, 11, 146, 147- 149, 187, 189-192 и 200-204. В дополнительных вариантах осуществления изобретения, выделенное антитело, которое специфически связывается с gp41, содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую не более чем 10 (например, более чем 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или не более чем 9) аминокислотных замен по сравнению с любой из SEQ ID NO: 2, 4, 6, 12, 150-152, 164-186, 188 или 197-199. В других вариантах осуществления изобретения, выделенное антитело, которое специфически связывается с gp41, содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую не более чем 10 (например, более чем 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или не более чем 9) аминокислотных замен по сравнению с любой из SEQ ID NO: 1, 3, 5, 11, 146, 147-149, 187, 189-192, и 200-204, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую не более чем 10 (например, более чем 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или не более чем 9) аминокислотных замен по сравнению с любой из SEQ ID NO: 2, 4, 6, 12, 150-152, 164-186, 188 или 197-199.
В других вариантах осуществления изобретения, выделенное антитело, которое специфически связывается с gp41, содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую не более чем 10 (например, более чем 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или не более чем 9) аминокислотных замен по сравнению с SEQ ID NO:1, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую не более чем 10 (например, более чем 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или не более чем 9) аминокислотных замен по сравнению с SEQ ID NO: 2.
В других вариантах осуществления изобретения, выделенное антитело, которое специфически связывается с gp41, содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 187, где аминокислотная последовательность содержит не более чем 25 (например, более чем 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или не более чем 24) аминокислотных замен по сравнению с SEQ ID NO: 1. В дополнительных вариантах осуществления изобретения, выделенное антитело, которое специфически связывается с gp41, содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 188, где аминокислотная последовательность содержит не более чем 33 (например, более чем 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 35, 36, 37, 38, 39, 30, 31, 32 или не более чем 33) аминокислотных замен по сравнению с SEQ ID NO:2. В других вариантах осуществления изобретения, выделенное антитело, которое специфически связывается с gp41, содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 187, где аминокислотная последовательность содержит не более, чем 25 (например, более чем 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или не более чем 24) аминокислотных замен по сравнению с SEQ ID NO: 1, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность как SEQ ID NO: 188, где аминокислотная последовательность содержит не более чем 33 (например, более чем 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 35, 36, 37, 38, 39, 30, 31, 32 или не более чем 33) аминокислотных замен по сравнению с SEQ ID NO: 2.
В других вариантах осуществления изобретения, выделенное антитело, которое специфически связывается с gp41, содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую не более чем 10 (например, более чем 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или не более чем 9) аминокислотных замен по сравнению с любой из SEQ ID NO: 1, 3, 5, 11, 146, 147-149, 187, 189-192 и 200-204, где замены выбраны из аминокислотных замен, перечисленных на фиг. 60A и 60B. В дополнительных вариантах осуществления изобретения, выделенное антитело, которое специфически связывается с gp41, содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую не более чем 10 (например, более чем 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или не более чем 9) аминокислотных замен по сравнению с одной из аминокислотных последовательностей, представленных любой из SEQ ID NO: 2, 4, 6, 12, 150-152, 164-186, 188 или 197-199, где замены выбраны из аминокислотных замен, перечисленных на фиг. 61A и 61B. В других вариантах осуществления изобретения, выделенное антитело, которое специфически связывается с gp41, содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую не более чем 10 (например, более чем 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или не более, чем 9) аминокислотных замен по сравнению с любой из SEQ ID NO: 1, 3, 5, 11, 146, 147-149, 187, 189-192, и 200-204, где замены выбраны из аминокислотных замен, представленных на фиг. 60A и 60B, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую не более чем 10 (например, более чем 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или не более чем 9) аминокислотных замен по сравнению с любой из SEQ ID NO: 2, 4, 6, 12, 150-152, 164-186, 188 или 197-199, где замены выбраны из аминокислотных замен, перечисленных на фиг. 61A и 61B. В других вариантах осуществления изобретения, выделенное антитело, которое специфически связывается с gp41, содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую не более чем 10 (например, более чем 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или не более чем 9) аминокислотных замен по сравнению с SEQ ID NO: 1, где замены выбраны из аминокислотных замен, перечисленных на фиг. 60A и 60B, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую не более чем 10 (например, более чем 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или не более чем 9) аминокислотных замен по сравнению с SEQ ID NO: 2, где замены выбраны из аминокислотных замен, перечисленных на фиг. 61A и 61B.
В других вариантах осуществления изобретения, выделенное антитело, которое специфически связывается с gp41, содержит тяжелую цепь, имеющую максимум одну, максимум две, максимум три или максимум четыре аминокислотных замены в положениях аминокислот 26-31 (CDR1), 49-51 (CDR2) и 87-98 (CDR3) SEQ ID NO: 11, и легкую цепь. В некоторых вариантах осуществления изобретения, выделенное антитело, которое специфически связывается с gp41, содержит тяжелую цепь, имеющую максимум одну, максимум две, максимум три, максимум четыре или максимум пять аминокислотных замен в положениях аминокислот 26-33 (CDR1), 51-60 (CDR2) и 99-120 (CDR3) SEQ ID NO: 1.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, антитело может содержать тяжелую цепь, имеющую максимум одну, максимум две, максимум три, максимум четыре или максимум пять аминокислотных замен в положениях аминокислот 26-33 (CDR1), 51-60 (CDR2) и 99-120 (CDR3) SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах осуществления изобретения, антитело может содержать тяжелую цепь, имеющую максимум одну, максимум две, максимум три, максимум четыре или максимум пять аминокислотных замен в положениях аминокислот 26-33 (CDR1), 51-60 (CDR2) и 99-120 (CDR3) SEQ ID NO: 5. В некоторых вариантах осуществления изобретения, антитело может содержать тяжелую цепь, имеющую максимум одну, максимум две, максимум три, максимум четыре или максимум пять аминокислотных замен в положениях аминокислот 26-33 (CDR1), 51-60 (CDR2) и 99-120 (CDR3) SEQ ID NO: 154.
В других вариантах осуществления изобретения, выделенное антитело, которое специфически связывается с gp41, содержит легкую цепь, имеющую максимум одну, максимум две, максимум три или максимум четыре аминокислотных замены в положениях аминокислот 26-31 (CDR1), 49-51 (CDR2) и 88-99 (CDR3) SEQ ID NO: 12. В других вариантах осуществления изобретения, выделенное антитело, которое специфически связывается с gp41, содержит легкую цепь, имеющую максимум одну, максимум две, максимум три или максимум четыре аминокислотных замены в положениях аминокислот 26-31 (CDR1), 49-51 (CDR2) и 88-99 (CDR3) SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления изобретения, антитело может содержать легкую цепь, имеющую максимум одну, максимум две, максимум три или максимум четыре аминокислотных замены в положениях аминокислот 26-31 (CDR1), 49-51 (CDR2) и 88-99 (CDR3) SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления изобретения, антитело может содержать легкую цепь, имеющую максимум одну, максимум две, максимум три или максимум четыре аминокислотных замены в положениях аминокислот 26-31 (CDR1), 49-51 (CDR2) и 88-99 (CDR3) SEQ ID NO: 6. В некоторых вариантах осуществления изобретения, антитело может содержать легкую цепь, имеющую максимум одну, максимум две, максимум три или максимум четыре аминокислотных замены в положениях аминокислот 26-31 (CDR1), 49-51 (CDR2) и 88-99 (CDR3) SEQ ID NO: 152.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, выделенное антитело, которое специфически связывается с описанным в настоящем документе gp41, содержит до 10 аминокислотных замен (например, до 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или до 9 аминокислотных замен) в каркасных областях (например, в соответствии с системой нумерации по Кэбату, Чотия или IMGT) тяжелой цепи антитела, легкой цепи антитела или тяжелой и легкой цепей антитела.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, выделенное антитело, которое специфически связывается с описанным в настоящем документе gp41, содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую не более чем 10 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9) аминокислотных замен в каркасных областях любой из SEQ ID NO: 1, 3, 5, 11, 146, 147-149, 187, 189-192 и 200-204. Каркасные области SEQ ID NO: 1, 3, 5, 11, 146, 147-149, 187, 189-192 и 200-204 содержат аминокислоты 1-25 (FR1), 34-50 (FR2), 61-66 (FR3) и 121-131 (FR4) SEQ ID NO: 1, 3, 5, 11, 146, 147-149, 187, 189-192 и 200-204, соответственно (в соответствии с нумерацией по Кэбату). В некоторых вариантах осуществления изобретения, выделенное антитело, которое специфически связывается с описанным в настоящем документе gp41, содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую не более чем 10 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9) аминокислотных замен в каркасных областях SEQ ID NO: 2, 4, 6, 12, 150-152, 164-186, 188 или 197-199, соответственно. Каркасные области SEQ ID NO: 2 содержат аминокислоты 1-25 (LFR2), 32-48 (LFR2), 52-86 (LFR3) и 99-108 (OFR4) SEQ ID NO: 2, 4, 6, 12, 150-152, 164-186, 188 или 197-199, соответственно (в соответствии с нумерацией по Кэбату).
В других вариантах осуществления изобретения, выделенное антитело, которое специфически связывается с gp41, содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую не более чем 10 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9) аминокислотных замен в каркасных областях SEQ ID NO: 1 и вариабельную область легкой цепи, содержащую не более чем 10 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9) аминокислотных замен в каркасных областях SEQ ID NO: 2. В других вариантах осуществления изобретения, выделенное антитело, которое специфически связывается с gp41, содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую не более чем 10 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9) аминокислотных замен в каркасных областях SEQ ID NO: 154 и вариабельную область легкой цепи, содержащую не более чем 10 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9) аминокислотных замен в каркасных областях SEQ ID NO: 152. В других вариантах осуществления изобретения, выделенное антитело, которое специфически связывается с gp41, содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую не более чем 10 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9) аминокислотных замен в каркасных областях SEQ ID NO: 192 и вариабельную область легкой цепи, содержащую не более чем 10 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9) аминокислотных замен в каркасных областях SEQ ID NO: 152.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, тяжелая цепь моноклонального антитела человека содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% (например, по меньшей мере на 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или по меньшей мере на 99%) идентична аминокислотной последовательности любой из SEQ ID NO: 1, 3, 5, 11, 146, 147-149, 187, 189-192 или 200-204. В дополнительных примерах, тяжелая цепь содержит любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 1, 3, 5, 11, 146, 147-149, 187, 189-192 или 200-204. В некоторых примерах, легкая цепь моноклонального антитела человека содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% (например, по меньшей мере на 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или по меньшей мере на 99%) идентична аминокислотной последовательности любой из SEQ ID NO: 2, 4, 6, 12, 150-152, 164-186, 188 или 197-199. В других вариантах осуществления изобретения, выделенное антитело, которое специфически связывается с gp41, содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% (например, по меньшей мере на 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или по меньшей мере на 99%) идентична аминокислотной последовательности любой из SEQ ID NO: 1, 3, 5, 11, 146, 147-149, 187, 189-192 или 200-204, а вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% (например, по меньшей мере на 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или по меньшей мере на 99%) идентична аминокислотной последовательности любой из SEQ ID NO: 2, 4, 6, 12, 150-152, 164-186, 188 или 197-199.
Как описано в настоящей заявке, тотальное секвенирование проводили для идентификации дополнительных антител, которые связываются, в основном, с аналогичными эпитопами на поверхности gp41, по существу, в такой же ориентации, как и 10E8, 7H6 и/или 7N16. Репрезентативные последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие тяжелые цепи антитела, представлены SEQ ID NO: 35-115 в прилагаемом списке последовательностей. Эти последовательности кодируют вариабельные области тяжелой цепи антитела, которые по меньшей мере приблизительно на 80% идентичны вариабельной области тяжелой цепи антитела 10E8 (SEQ ID NO: 1). Таким образом, в настоящей заявке описаны молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие вариабельные области тяжелой цепи антитела, которые по меньшей мере приблизительно на 80%, например, по меньшей мере приблизительно на 80%, по меньшей мере приблизительно на 81%, по меньшей мере приблизительно на 82%, по меньшей мере приблизительно на 83%, по меньшей мере приблизительно на 84%, по меньшей мере приблизительно на 85% по меньшей мере приблизительно на 86%, по меньшей мере приблизительно на 87%, по меньшей мере приблизительно на 88% или даже по меньшей мере приблизительно на 89%, по меньшей мере приблизительно на 90%, по меньшей мере приблизительно на 91%, по меньшей мере приблизительно на 92%, по меньшей мере приблизительно на 93%, по меньшей мере приблизительно на 94%, по меньшей мере приблизительно на 95%, по меньшей мере приблизительно на 96%, по меньшей мере приблизительно на 97%, по меньшей мере приблизительно на 98% или даже по меньшей мере приблизительно на 99% идентичны вариабельной области тяжелой цепи, представленной SEQ ID NO: 1. Репрезентативные последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие легкие цепи 10Е8-подобного антитела, представлены SEQ ID NO: 116-145 в прилагаемом списке последовательностей. Репрезентативные последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие легкие цепи антитела, представлены SEQ ID NO: 116-145 в прилагаемом списке последовательностей. Эти последовательности кодируют вариабельные области легкой цепи антитела, которые по меньшей мере приблизительно на 80% идентичны вариабельной области легкой цепи антитела 10E8 (SEQ ID NO: 2). Таким образом, в настоящей заявке описаны молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие вариабельные области легкой цепи антитела, которые по меньшей мере приблизительно на 80%, например, по меньшей мере приблизительно на 80%, по меньшей мере приблизительно на 81%, по меньшей мере приблизительно на 82%, по меньшей мере приблизительно на 83%, по меньшей мере приблизительно на 84%, по меньшей мере приблизительно на 85% по меньшей мере приблизительно на 86%, по меньшей мере приблизительно на 87%, по меньшей мере приблизительно на 88% или даже по меньшей мере приблизительно на 89% по меньшей мере приблизительно на 90%, по меньшей мере приблизительно на 91%, по меньшей мере приблизительно на 92%, по меньшей мере приблизительно на 93%, по меньшей мере приблизительно на 94%, по меньшей мере приблизительно на 95% по меньшей мере приблизительно на 96%, по меньшей мере приблизительно на 97%, по меньшей мере приблизительно на 98% или даже по меньшей мере приблизительно на 99% идентичны вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO: 2.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, выделенное антитело, которое специфически связывается с gp41, содержит одну или более гипервариабельных областей тяжелой цепи (CDR), кодируемых последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной любой из SEQ ID NO: 35-115. В некоторых вариантах осуществления изобретения, выделенное моноклональное антитело человека, которое специфически связывается с gp41, содержит тяжелую цепь со всеми CDR, кодируемыми последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной любой из SEQ ID NO: 35-115. В конкретных примерах, тяжелая цепь моноклонального антитела человека содержит аминокислотную последовательность, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной любой из SEQ ID NO: 35-115.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, выделенное антитело, которое специфически связывается с gp41, содержит одну или более гипервариабельных областей легкой цепи (CDR), кодируемых последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной любой из SEQ ID NO: 116-145. В некоторых вариантах осуществления изобретения, выделенное моноклональное антитело человека, которое специфически связывается с gp41, содержит легкую цепь со всеми CDR, кодируемыми последовательностью нуклеиновой кислоты любой из SEQ ID NO: 116-145. В конкретных примерах, легкая цепь моноклонального антитела человека содержит аминокислотную последовательность, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты любой из SEQ ID NO: 116-145.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, выделенное антитело, которое специфически связывается с gp41, содержит вариабельную область тяжелой цепи, кодируемую нуклеиновой кислотой, происходящей от аллельного ориджина зародышевой линии IGHV3-15, например, аллельного ориджина зародышевой линии IGHV3-15*01, IGHV3-15*02, IGHV3-15*03, IGHV3-15*04, IGHV3-15*05, IGHV3-15*06, IGHV3-15*07, IGHV3-15*08, IGHV3-15*09, IGHV3-15*10, IGHV3-15*11, IGHV3-15*12, IGHV3-15*13, IGHV3-15*14 или IGHV3-15*15. В некоторых вариантах осуществления изобретения, вариабельная область тяжелой цепи кодируется нуклеиновой кислотой, происходящей от аллельного ориджина зародышевой линии IGHV3-15, например, аллельного ориджина зародышевой линии IGHV3-15*01, IGHV3-15*02, IGHV3-15*03, IGHV3-15*04, IGHV3-15*05, IGHV3-15*06, IGHV3-15*07, IGHV3-15*08, IGHV3-15*09, IGHV3-15*10, IGHV3-15*11, IGHV3-15*12, IGHV3-15*13, IGHV3-15*14 или IGHV3-15*15, и приблизительно на 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% или 40%, например, приблизительно на 15%-40% отличается от соответствующей последовательности тяжелой цепи зародышевой линии.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, выделенное антитело, которое специфически связывается с gp41, содержит вариабельную область легкой цепи, кодируемую нуклеиновой кислотой, происходящей от аллельного ориджина зародышевой линии IGLV3-19, например, аллельного ориджина зародышевой линии IGLV3-19*01. В некоторых вариантах осуществления изобретения, легкая цепь кодируется нуклеиновой кислотой, происходящей от аллельного ориджина зародышевой линии IGLV3-19, например, аллельного ориджина зародышевой линии IGLV3-19*01, и приблизительно на 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% или 40%, например, приблизительно на 15%-40% отличается от соответствующей последовательности легкой цепи зародышевой линии.
В некоторых примерах, вариабельным доменом тяжелой цепи является клональный вариант, полученный от донора N152 и имеющий тяжелую цепь, кодируемую геном VH3-15 и генами VJ-1J. В других примерах, вариабельным доменом легкой цепи является клональный вариант, полученный от донора N152 и имеющий легкую цепь, кодируемую геном LV3-19V и геном LJ-3J. Выделенное моноклональное антитело может содержать тяжелую цепь и легкую цепь, где вариабельной областью тяжелой цепи является клональный вариант, полученный от донора N152 и имеющий аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO: 1. Тяжелая цепь происходит от гена VH3-15 и генов LJ-3J. Вариабельным доменом легкой цепи является клональный вариант, полученный от донора N152 и имеющий аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO: 2. Легкая цепь происходит от гена LV3-19V и гена LJ-3J, а моноклональное антитело специфически связывается с gp41, конкурирует с 10E8 за связывание с gp41 и является нейтрализующим.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, тяжелая цепь 10E8-подобного антитела может быть комплементирована с легкой цепью антитела 10E8, 7H6 и/или 7N16, и при этом, может сохранять способность связываться с gp41, например, специфически связываться с эпитопом для 10E8. В некоторых вариантах осуществления изобретения, легкая цепь 10E8-подобного антитела может быть комплементирована с тяжелой цепью антитела 10E8, 7H6 и/или 7N16, и при этом, может сохранять способность связываться с gp41, например, специфически связываться с эпитопом для 10E8. Таким образом, описанные в настоящем документе антитела представляют собой 10E8-подобные антитела, которые могут быть идентифицированы по комплементации с тяжелой или легкой цепью 10E8, 7H6 и/или 7N16.
D
D
-8
-9
-10
-8
-9
-10
После идентификации представляющего интерес вариабельного домена тяжелой или легкой цепи, связывание с gp41 или с представляющим интерес эпитопом (таким как эпитоп для 10E8) может быть определено с помощью анализа на перекрестную комплементацию. Вкратце, если представляющим интерес вариабельным доменом является вариабельный домен тяжелой цепи, то продуцируют аминокислотную последовательность этого вариабельного домена тяжелой цепи. Затем вариабельный домен тяжелой цепи подвергают спариванию со стандартной последовательностью вариабельного домена легкой цепи, такого как вариабельный домен легкой цепи антител 10E8 (SEQ ID NO: 2), 7H6 (SEQ ID NO: 4) и/или 7N16 (SEQ ID NO: 6), и определяют, может ли это антитело специфически связываться с антигеном (или с эпитопом) с определенной аффинностью, такой как K=10, 10или 10. Аналогичным образом, если представляющим интерес вариабельным доменом является вариабельный домен легкой цепи, то продуцируют аминокислотную последовательность этого вариабельного домена легкой цепи. Затем вариабельный домен легкой цепи подвергают спариванию со стандартной последовательностью вариабельного домена тяжелой цепи, такого как вариабельный домен тяжелой цепи антител 10E8 (SEQ ID NO: 1), 7H6 (SEQ ID NO: 3) и/или 7N16 (SEQ ID NO: 5), и определяют, может ли это антитело специфически связываться с антигеном (или с эпитопом) с определенной аффинностью, такой как K=10, 10или 10.
Полностью моноклональные антитела человека содержат каркасные области человека. Таким образом, любое антитело, которое специфически связывается с описанным в настоящем документе gp41, может содержать каркасную область человека и каркасные области, имеющие аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 1-6, 11, 12 и/или 146-192 или кодируемую любой из SEQ ID NO: 35-145. Однако каркасные области могут происходить и от другого источника. Дополнительными примерами каркасных последовательностей, которые могут быть использованы, являются аминокислотные последовательности каркасных областей тяжелой и легкой цепей, описанные в публикации заявки PCT No. WO 2006/074071 (см., например, SEQ ID NO: 1-16), которая вводится в настоящее описание посредством ссылки.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, одна или более гипервариабельных областей (CDR) тяжелой и/или легкой цепи анти-gp41 антитела, представленных любой из SEQ ID NO: 1-6, 11, 12 и/или 146-192 или кодируемых SEQ ID NO: 35-145, экспрессируются на поверхности другого белка, такого как каркасный белок. Экспрессия доменов антител на поверхности каркасного белка известна специалистам (см., например, Liu at al., J. Virology 85(17): 8467-8476, 2011). В результате такой экспрессии образуется химерный белок, сохраняющий способность связываться с gp41, например, специфически связываться с эпитопом для 10E8. Как описано в примере 1, антитела класса 10E8 контактируют чаще всего посредством CDR тяжелой цепи (см., например, таблицы, представленные на фиг. 27-30, и молекулярные модели, представленные на фиг. 4, 5, 12, 15, 16 и 39-41A). Таким образом, в некоторых конкретных вариантах осуществления изобретения, одну или более CDR тяжелой цепи, например, одну или более CDR1, CDR2 и/или CDR3 тяжелой цепи любой из SEQ ID NO: 1, 3, 5, 11, 146-149, 153-163, 187, 189-192 или 200-204 или кодируемые любой из SEQ ID NO: 35-115, присоединяют к каркасному белку.
1,
2
3
4
L
H
Моноклональным антителом может быть моноклональное антитело любого изотипа. Моноклональным антителом может быть, например, антитело IgM или IgG, такое как IgGIgG, IgGили IgG. Класс антитела, которое специфически связываться с gp41, может быть переключен на другой класс. В одном из аспектов изобретения, молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую Vили V, выделяют хорошо известными методами, так, чтобы она не содержала каких-либо последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих константную область легкой или тяжелой цепи, соответственно.
H
L
L
H
L
H
L
H
1
2
3
4
В конкретных примерах, аминокислотная последовательность Vпредставлена любой из SEQ ID NO: 1, 3, 5, 11, 146-149, 153-163, 187, 189-192 или 200-204 или кодируется любой из SEQ ID NO: 35-115. В других примерах, аминокислотная последовательность Vпредставлена любой из SEQ ID NO: 2, 4, 6, 12, 150-152, 164-186, 188 или 197-199 или кодируется любой из SEQ ID NO: 116-145. Затем молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую Vили V, функционально присоединяют к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей Cили Cмолекулы иммуноглобулина другого класса. Это может быть достигнуто с использованием вектора или молекулы нуклеиновой кислоты, которые содержат цепь Cили C, как известно специалистам. Так, например, антитело, которое специфически связывается с gp41, и которое изначально представляет собой IgM, может быть переключено на класс IgG. Переключение классов может быть использовано для превращения IgG одного подкласса в другой, например, превращения IgGвIgG, IgGили IgG.
В некоторых примерах, описанными антителами являются олигомеры антител, такие как димеры, тримеры, тетрамеры, пентамеры, гексамеры, септамеры, октомеры и т.п. В некоторых примерах, антителами являются пентамеры.
В некоторых примерах, антитела или их антигенсвязывающий фрагмент модифицируют так, чтобы они оказывали прямое цитотоксическое действие на инфицированные клетки или использовали природные защитные механизмы, такие как комплемент-зависимая клеточная цитотоксичность, антитело-зависимая клеточная цитотоксичность (ADCC) или фагоцитоз, опосредуемый макрофагами.
2
В настоящей заявке рассматриваются также фрагменты антител, такие как Fab, F(ab')и Fv, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи и легкой цепи и специфически связываются с gp41. Эти фрагменты антител сохраняют способность селективно связываться с антигеном и называются «антигенсвязывающими» фрагментами. Такими фрагментами являются:
(1) Fab; фрагмент, который содержит одновалентный антигенсвязывающий фрагмент молекулы антитела, может быть получен путем расщепления целого антитела ферментом папаином с образованием интактной легкой цепи и части одной тяжелой цепи;
(2) Fab'; фрагмент молекулы антитела может быть получен путем обработки целой молекулы антитела пепсином с последующим восстановлением и образованием интактной легкой цепи и части тяжелой цепи; при этом, два Fab'-фрагмента были получены в одной молекуле антитела;
2
2
(3) (Fab'); фрагмент молекулы антитела может быть получен путем обработки целого антитела ферментом пепсином без последующего восстановления; при этом, F(ab')представляет собой димер, состоящий из двух Fab'-фрагментов, связанных друг с другом двумя дисульфидными связями;
(4) Fv; генетически сконструированный фрагмент содержит вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи, экспрессируемые в виде двух цепей;
(5) Одноцепочечное антитело (такое как scFv); это антитело определено как генетически сконструированная молекула, содержащая вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи, которые связаны друг с другом подходящим полипептидным линкером, и которые представляют собой генетически сконструированую гибридную одноцепочечную молекулу; и
2
(6) Димер одноцепочечного антитела (scFv), определенный как димер scFv. Этот димер также называется «миниантителом».
Методы получения фрагментов известны специалистам (см., например, Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988).
H
L
H
L
H
L
В другой группе вариантов осуществления изобретения, антитела представляют собой Fv-антитела, которые обычно имеют размер приблизительно 25 кДа и содержат полноразмерный антигенсвязывающий сайт с тремя CDR на каждую тяжелую цепь и каждую легкую цепь. Для продуцирования этих антител, Vи Vмогут быть экспрессированы из двух отдельных конструкций нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине. В конкретных примерах, аминокислотная последовательность Vсодержит одну из SEQ ID NO: 1, 3, 5, 11, 146-149, 153-163, 187 или 189-192 или кодируется любой из SEQ ID NO: 35-115. В других примерах, аминокислотная последовательность Vсодержит CDR SEQ ID NO: 2, 4, 6, 12, 150-152, 164-186, 188 или 197-199 или CDR, кодируемые любой из SEQ ID NO: 116-145. В дополнительных примерах, аминокислотная последовательность Vсодержит любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 1, 3, 5, 11, 146-149, 153-163, 187 или 189-192 или кодируемую любой из SEQ ID NO: 35-115. В других примерах, аминокислотная последовательность Vсодержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, 4, 6, 12, 150-152, 164-186, 188 или 197-199 или кодируемую любой из SEQ ID NO: 116-145.
H
L
Если Vи Vэкспрессируются по отдельности, то цепи Fv-антитела обычно присоединяют друг к другу посредством нековалентных взаимодействий. Однако эти цепи имеют тенденцию к диссоциации после разведения, а поэтому были разработаны методы перекрестного связывания таких цепей посредством глутаральдегида, межмолекулярных дисульфидов или пептидного линкера. Таким образом, в одном из примеров, Fv может представлять собой стабилизированный дисульфидом Fv (dsFv), где вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи химически связаны друг с другом дисульфидными связями.
H
L
H
L
2
E. coli
В дополнительном примере, Fv-фрагменты содержат цепи Vи V, связанные пептидным линкером. Эти одноцепочечные антигенсвязывающие белки (scFv) получают путем конструирования структурного гена, содержащего последовательности ДНК, кодирующие домены Vи V, связанные посредством олигонуклеотида. Этот структурный ген встраивают в вектор экспрессии, который затем вводят в клетку-хозяина, такую как . Рекомбинантные клетки-хозяева синтезируют одну полипептидную цепь с линкерным пептидом, который связан мостиковой связью с двумя V-доменами. Способы получения scFv известны специалистам (см. Whitlow et al., Methods: a Companion to Methods in Enzymology, Vol. 2, page 97, 1991; Bird et al., Science 242:423, 1988; патент США No.4946778; Pack et al., Bio/Technology 11:1271, 1993; и Sandhu, см. выше). Рассматриваются также димеры одноцепочечного антитела (scFV).
2
Фрагменты антитела могут быть получены путем протеолитического гидролиза антитела или экспрессии ДНК, кодирующей фрагмент, в E. coli. Фрагменты антитела могут быть получены путем гидролиза целых антител пепсином или папаином стандартными методами. Так, например, фрагменты антитела могут быть получены путем ферментативного расщепления антител пепсином с образованием 5S-фрагмента, обозначаемого F(ab'). Этот фрагмент может быть затем расщеплен с использованием восстанавливающего тиолового агента, после чего сульфгидрильные группы, полученные в результате расщепления дисульфидных связей, могут быть, но необязательно, блокированы с образованием одновалентных 3.5S Fab'-фрагментов. Альтернативно, после ферментативного расщепления пепсином непосредственно образуются два одновалентных Fab'-фрагмента и Fc-фрагмент (см. патент США No.4036945 и патент США No.4331647, и имеющиеся там ссылки; Nisonhoff et al., Arch. Biochem. Biophys. 89:230, 1960; Porter, Biochem. J. 73: 119, 1959; Edelman et al., Methods in Enzymology, Vol. 1, page 422, Academic Press, 1967; и Coligan et al., разделы 2.8.1-2.8.10 и 2.10.1-2.10.4).
Могут быть также использованы и другие методы расщепления антител, такие как разделение тяжелых цепей с образованием одновалентных фрагментов легкой-тяжелой цепей и с последующим расщеплением этих фрагментов, или другие ферментные, химические или генетические методы, при условии, что такие фрагменты будут связываться с антигеном, распознаваемым интактным антителом.
H
L
H
L
H
L
Специалисту в данной области известно, что могут быть продуцированы консервативные варианты антител. Такие консервативные варианты, используемые для получения фрагментов антител, таких как dsFv-фрагменты или scFv-фрагменты, будут сохранять нужные аминокислотные остатки, необходимые для «правильной» укладки и стабилизации областей Vи V, и зарядные характеристики таких остатков, позволяющие поддерживать низкий pI и низкую токсичность молекул. В области Vи Vмогут быть введены аминокислотные замены (например, максимум одна, максимум две, максимум три, максимум четыре или максимум пять аминокислотных замен) для увеличения выхода. В конкретных примерах, последовательность Vпредставляет собой SEQ ID NO: 1, 3, 5, 11, 146-149, 153-163, 187 или 189-192 или кодируется любой из SEQ ID NO: 35-115. В других примерах, последовательность Vпредставляет собой SEQ ID NO: 2, 4, 6, 12, 150-152, 164-186, 188 или 197-199 или кодируется любой из SEQ ID NO: 116-145. В таблице консервативных аминокислотных замен приводятся функционально подобные аминокислоты, хорошо известные специалистам. Ниже представлены шесть групп аминокислот, которые могут рассматриваться как аминокислоты, подходящие для осуществления консервативных замен внутри группы аминокислот:
1) аланин (A), серин (S), треонин (T);
2) аспарагиновая кислота (D), глутаминовая кислота (E);
3) аспарагин (N), глутамин (Q);
4) аргинин (R), лизин (K);
5) изолейцин (I), лейцин (L), метионин (M), валин (V); и
6) фенилаланин (F), тирозин (Y), триптофан (W).
Описанные в настоящем документе антитела могут быть выделены с использованием скрытых антигенов, описанных в публикации заявки PCT No. WO 2009/100376. Вкратце, антигены были замаскированы в целях обеспечения нужной антигенности для специфического эпитопа, который специфически связывается с представляющим интерес антителом, таким как нейтрализующее антитело.
Дополнительные рекомбинантные нейтрализующие антитела человека, которые специфически связываются с тем же самым эпитопом gp41, с которым связывается описанные в настоящем документе антитела, специфически связывающиеся с gp41, могут быть выделены путем скрининга рекомбинантной комбинаторной библиотеки антител, такой как библиотека фагового представления Fab (см., например, публикацию заявки на патент США No. 2005/0123900). В некоторых случаях, библиотеки фагового представления получают с использованием кДНК вариабельных областей тяжелой и легкой цепей, продуцированных из мРНК, выделенной из лимфоцитов человека. Методы получения и скрининга таких библиотек известны специалистам. Существуют коммерчески доступные наборы для получения библиотек фагового представления (например, Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, Catalog No. 27-9400-01; и набор для фагового представления Stratagene SurfZAP™, номер по каталогу 240612). Существуют также и другие методы и реагенты, которые могут быть применены для получения и скрининга библиотек представления антител (см., например, патент США No. 5223409; публикацию заявки РСТ No. WO 92/18619; публикацию заявки PCT No. WO 91/17271; публикацию заявки PCT No. WO 92/20791; публикацию заявки PCT No. WO 92/15679; публикацию заявки PCT No. WO 93/01288; публикацию заявки PCT No. WO 92/01047; публикацию заявки PCT No. WO 92/09690; Fuchs at al., Bio/Technology 9:1370-1372, 1991; Hay at al., Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85, 1992; Huse et al., Science 246: 1275-1281, 1989; McCafferty at al., Nature 348:552-554,1990; Griffiths at al., EMBO J. 12:725-734, 1993).
В одном из вариантов осуществления изобретения, для выделения дополнительных антител человека, которые специфически связываются с gp41, нейтрализующее антитело, которое специфически связывается с описанным в настоящем документе gp41, сначала используют для отбора последовательностей тяжелой и легкой цепей человека, имеющих аналогичную активность связывания с gp41, например, с применением методов импринтинга эпитопов, как описано в публикации заявки PCT No. WO 93/06213. Библиотеками антител, используемыми в этом методе, являются библиотеки scFv, полученные и скринированные методами, описанными в публикации заявки PCT No. WO 92/01047, и в публикациях McCafferty et al., Nature 348:552-554, 1990; и/или Griffiths at al., EMBO J. 12:725-734, 1993, и проводимыми с использованием gp120.
L
H
L
H
L
H.
L
H
H
L
H
L
H
L
H
L
H
L
in vivo
После предварительного отбора сегментов вариабельного домена легкой цепи (V) и вариабельного домена тяжелой цепи (V) человека, были проведены эксперименты по скринингу методом «попарного связывания», в которых различные пары предварительно отобранных сегментов Vи Vскринировали на связывание с gp41 для отбора представляющих интерес пар V/VКроме того, для повышения аффинности связывания антител, сегменты Vи Vмогут быть подвергнуты рандомизированной мутации, например, в области H-CDR3 или в области L-CDR3, методом, аналогичным методу введения соматических мутаций , ответственных за созревание аффинности антител в процессе вырабатывания природного иммунного ответа. Таким образом, созревание аффинности in vitro может быть достигнуто путем амплификации областей Vи Vс использованием ПЦР-праймеров, комплементарных областям H-CDR3 или L-CDR3, соответственно. В этом методе в праймеры «вставляли» рандомизированную смесь из четырех нуклеотидов в определенные положения так, чтобы полученные ПЦР-продукты содержали сегменты Vи V, в которые были введены случайные мутации в областях Vи/или VCDR3. Эти сегменты Vи Vсо случайными мутациями могут быть протестированы для определения аффинности связывания с gp41. В конкретных примерах, аминокислотная последовательность Vпредставлена SEQ ID NO: 1, 3, 5 или 11, 146-149, 153-163, 187, 189-192 или 200-204 или кодируется любой из SEQ ID NO: 35-115. В других примерах аминокислотная последовательность Vпредставлена SEQ ID NO: 2, 4, 6, 12, 150-152, 164-186, 188 или 197-199 или кодируется любой из SEQ ID NO: 116-145.
После скрининга и выделения антитела, которое связывается с gp41, из рекомбинантной библиотеки представления иммуноглобулинов, нуклеиновая кислота, кодирующая выбранное антитело, может быть выделена из упаковки для конструирования библиотеки представления (например, из фагового генома) и субклонирована в другие векторы экспрессии стандартными методами рекомбинантных ДНК, описанными в настоящей заявке. Если это необходимо, то нуклеиновая кислота может быть дополнительно модифицирована для получения других фрагментов антител, также описанных в настоящей заявке. Для экспрессии рекомбинантного антитела, выделенного путем скрининга комбинаторной библиотеки, ДНК, кодирующую антитело, клонируют в рекомбинантный вектор экспрессии и вводят в клетки-хозяева млекопитающих, как описано в настоящей заявке.
2
Эффекторные молекулы, такие как терапевтические, диагностические или детектирующие молекулы, могут быть присоединены к представляющему интерес антителу любыми различными методами, известными специалистам. Могут быть применены методы как ковалентного, так и нековалентного связывания. Выбор способа присоединения эффекторной молекулы к антителу зависит от химической структуры эффектора. Полипептиды обычно содержат различные функциональные группы, такие как группы карбоновой кислоты (COOH), свободные аминогруппы (-NH) или сульфгидрильные группы (-SH), которые являются доступными для взаимодействия с подходящей функциональной группой на антителе, ответственной за связывание с эффекторной молекулой. Альтернативно, для обеспечения доступа к реакционно-способным функциональным группам или присоединения дополнительных реакционноспособных функциональных групп, антитело дериватизируют. Дериватизация может включать присоединение любых различных линкерных молекул, таких как молекулы, поставляемые компанией Pierce Chemical Company, Rockford, IL. Линкером может быть любая молекула, используемая для связывания антитела с эффекторной молекулой. Линкер может образовывать ковалентные связи с антителом и с эффекторной молекулой. Подходящие линкеры хорошо известны специалистам, и такими линкерами являются, но не ограничиваются ими, углеродные линкеры с прямой или разветвленной цепью, гетероциклические углеродные линкеры или пептидные линкеры. Если антитело и эффекторная молекула являются полипептидами, то линкеры могут быть присоединены к содержащимся в них аминокислотам посредством их боковых цепей (например, посредством дисульфидной связи с цистеином) или к альфа-углероду амино- и карбоксильной групп концевых аминокислот.
В некоторых случаях, когда иммуноконъюгат достигает своего сайта-мишени, желательно, чтобы эффекторная молекула не была присоединена к антителу. Поэтому, в этих случаях, иммуноконъюгаты должны содержать связи, которые отщепляются возле сайта-мишени. Расщепление линкера с высвобождением эффекторной молекулы из антитела может быть достигнуто посредством ферментативной активности или в условиях, при которых иммуноконъюгат доставляется вовнутрь клетки-мишени или в область, находящуюся в непосредственной близости от сайта-мишени.
Если учесть, что в литературе описано много методов присоединения различных радиодиагностических соединений, радиотерапевтических соединений, меток (таких как ферменты или флуоресцентные молекулы), лекарственных средств, токсинов и других агентов к антителам, то очевидно, что специалист в данной области может самостоятельно выбрать подходящий метод присоединения данного агента к антителу или другому полипептиду.
Описанные в настоящем документе антитела или фрагменты антител могут быть дериватизированы другой молекулой или связаны с другой молекулой (такой как другой пептид или белок). Вообще говоря, антитело или его часть дериватизируют так, чтобы такая дериватизация или мечение не оказывали негативного влияния на связывание с gp41. Так, например, антитело может быть функционально присоединено (путем химического связывания, генетического сцепления, нековалентного связывания или как либо иначе) к одной или более другим молекулам, таким как другое антитело (например, биспецифическое антитело или диатело), детектирующее средство, фармацевтическое средство и/или белок или пептид, которые могут опосредовать связывание антитела или его части с другой молекулой (такой как коровая область стрептавидина или полигистидиновая метка).
Дериватизированное антитело одного типа получают путем перекрестного связывания двух или более антител (того же самого типа или различных типов для создания биспецифических антител). Подходящими сшивающими линкерами являются гетеробифункциональные линкеры, имеющие две различные реакционно-способные группы, разделенные соответствующим спейсером (таким как сложный эфир м- малеимидобензоил-N-гидроксисукцинимида), или гомобифункциональные линкеры (такие как дисукцинимидилсуберат). Такие линкеры поставляются компанией Pierce Chemical Company (Rockford, IL).
Антитело, которое специфически связывается с gp41, может быть помечено детектируемой молекулой. Подходящими детектирующими средствами являются флуоресцентные соединения, включая флуоресцеин, флуоресцеинизотиоционат, родамин, 5-диметиламино-1-нафталинсульфонилхлорид, фикоэритрин, флуоресцирующие вещества лантанидной группы и т.п. Могут быть также использованы биолюминесцентные маркеры, такие как люцифераза, белок, флуоресцирующий в зеленом диапазоне спектра; и белок, флуоресцирующий в желтом диапазоне спектра. Антитело может быть также помечено ферментами, используемыми для детекции, такими как пероксидаза хрена, в-галактозидаза, люцифераза, щелочная фосфатаза, глюкозооксидаза и т.п. Если антитело было помечено детектируемым ферментом, то оно может быть детектировано путем добавления дополнительных реагентов, используемых ферментом для продуцирования продукта реакции, который может быть детектирован. Так, например, если присутствует такой агент, как пероксидаза хрена, то добавление пероксида водорода и диаминобензидина будет приводить к получению продукта цветной реакции, который может детектироваться визуально. Антитело может быть также помечено биотином и детектировано путем непрямого измерения уровня связывания с авидином или стрептавидином. Следует отметить, что сам авидин может быть помечен ферментом или флуоресцентной меткой.
Антитело может быть помечено магнитным средством, таким как гадолиний. Антитела могут быть также помечены элементами лантанидной группы (такими как европий и диспрозий) и марганцем. В качестве меток могут быть также использованы парамагнитные частицы, такие как оксид железа, обладающий сверхпарамагнитными свойствами. Антитело может быть также помечено предварительно определенными полипептидными эпитопами, распознаваемыми вторичным репортером (таким как последовательности, имеющие пару «лейциновых молний», сайты связывания для «вторых» антител, домены связывания с металлами, эпитопные метки). В некоторых вариантах осуществления изобретения, метки присоединяют посредством спейсерных групп различной длины для снижения возможного стерического затруднения.
3
14
15
35
90
99
111
125
131
Антитело может быть также помечено радиоактивно меченой аминокислотой. Такая радиоактивная метка может быть использована для диагностики и терапии. Примерами меток для полипептидов являются, но не ограничиваются ими, нижеследующие радиоизотопы или радионуклиды: H, C, N, S, Y, Tc, In, I, I.
Антитело может быть также дериватизировано химической группой, такой как полиэтиленгликоль (ПЭГ), метильная группа, этильная группа или углеводная группа. Эти группы могут быть использованы для улучшения биологических свойств антитела, таких как увеличение времени полужизни в сыворотке или повышение уровня связывания с тканью.
Способы детекции таких меток хорошо известны специалистам. Так, например, радиоактивные метки могут быть детектированы с использованием фотопленки или сцинтилляционных счетчиков, а флуоресцентные маркеры могут быть детектированы с использованием фотодетекторов, детектирующих испускаемое излучение. Ферментативные метки обычно детектируются посредством реакции фермента с субстратом, где под действием фермента на субстрат происходит образование продукта реакции, а колориметрические метки детектируются путем простого визуального наблюдения окрашенной метки.
В настоящем изобретении также рассматриваются кристаллы, полученные от антител 10E8, 7H6 и/или 7N16 или их частей в комплексе с gp41 (или с пептидами gp41); кристаллические структуры антител 10E8, 7H6 и/или 7N16 или их частей в комплексе с gp41 (или с пептидами gp41); трехмерные координаты антител 10E8, 7H6 и/или 7N16 или их частей в комплексе с gp41 (или с пептидами gp41); и трехмерные структуры моделей антител 10E8, 7H6 и/или 7N16 или их частей в комплексе с gp41 (или с пептидами gp41).
Для специалиста в данной области очевидно, что система структурных координат для антител 10E8, 7H6 и/или 7N16 или их частей в комплексе с gp41 или его частью представляет собой относительное точечное множество, которое определяют форму этих антител в трехмерном пространстве. При этом, возможно, что абсолютно отличающаяся система координат может определять аналогичную или идентичную форму. Более того, небольшие отклонения в отдельных координатах могут оказывать незначительное влияние на всю форму. Отклонения в координатах, обсуждаемые выше, могут быть следствием математических преобразований структурных координат.
Это обсуждение также относится к системам, таким как компьютерные системы, предназначенные для конструирования структур и/или разработки рационального лекарственного средства или соединения для получения антигенного соединения, способного вырабатывать иммунный ответ у индивидуума. Такая система может содержать один или более из следующих данных, или все эти данные, а именно, данные об атомных координатах для комплекса антител 10E8, 7H6 и/или 7N16 или их субпопуляции и об их конфигурации, полученной путем моделирования исходя из структур гомологичных антител; данные, определяющие трехмерную структуру комплекса антител 10E8, 7H6 и/или 7N16 или по меньшей мере одного их субдомена; либо данные о структурных параметрах для gp41; и данные о структурных параметрах, полученные исходя из атомных координат для комплекса антител 10E8, 7H6 и/или 7N16 или их субпопуляции и их изображения.
B. Полинуклеотиды и экспрессия
Молекулы нуклеиновой кислоты (также называемые полинуклеотидами), кодирующие описанные в настоящем документе полипептиды (включая, но не ограничиваясь ими, антитела), могут быть легко получены специалистами. Так, например, эти нуклеиновые кислоты могут быть получены с использованием описанных в настоящем документе аминокислотных последовательностей (таких как последовательности CDR, последовательности тяжелой цепи и последовательности легкой цепи).
L
H
Для конструирования ряда функционально эквивалентных нуклеиновых кислот, таких как нуклеиновые кислоты, отличающиеся своими последовательностями, но кодирующие одну и ту же последовательность антитела или кодирующие конъюгат или слитый белок, включая последовательность нуклеиновой кислоты Vи/или V, может быть использован генетический код.
Последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие антитела, которые специфически связываются с gp41, могут быть получены любым подходящим методом, включая, например, клонирование соответствующих последовательностей или прямой метод химического синтеза, такой как фосфотриэфирный метод, описанный Narang еt al., Meth. Enzymol. 68:90-99, 1979; фосфодиэфирный метод, описанный Brown et al., Meth. Enzymol. 68:109-151, 1979; диэтилфосфорамидитный метод, описанный Beaucage et al., Tetra. Lett. 22:1859-1862, 1981; твердофазный метод с использованием триэфира фосфорамидита, описанный Beaucage & Caruthers, Tetra. Letts. 22(20):1859-1862, 1981, проводимый, например, на автоматическом синтезаторе, и описанный, например, Needham-VanDevanter et al., Nucl. Acids Res. 12:6159-6168, 1984; и метод, осуществляемый на твердом носителе и описанный в патенте США No.4458066. В результате химического синтеза продуцируется одноцепочечный олигонуклеотид. Этот олигонуклеотид может быть превращен в двухцепочечную ДНК посредством гибридизации с комплементарной последовательностью или посредством полимеризации с ДНК-полимеразой с использованием одной цепи в качестве матрицы. Совершенно очевидно, что химический синтез ДНК ограничивается, главным образом, последовательностями приблизительно из 100 оснований, а более длинные последовательности могут быть получены путем лигирования более коротких последовательностей.
Репрезентативные нуклеиновые кислоты могут быть получены методами клонирования. Примеры соответствующих методов клонирования и секвенирования, а также инструкции по осуществлению множества экспериментов по клонированию можно найти в руководстве Sambrook et al., см. выше, Berger and Kimmel (eds.), см. выше, и Ausubel, см. выше. Информацию о продукте можно также получить у производителей биологических реагентов и экспериментального оборудования. Такими производителями являются компании SIGMA Chemical Company (Saint Louis, MO), R&D Systems (Minneapolis, MN), Pharmacia Amersham (Piscataway, NJ), CLONTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA), Chem Genes Corp., Aldrich Chemical Company (Milwaukee, WI), Glen Research, Inc., GIBCO BRL Life Technologies, Inc. (Gaithersburg, MD), Fluka Chemica-Biochemika Analytika (Fluka Chemie AG, Buchs, Switzerland), Invitrogen (Carlsbad, CA), а также многие другие коммерческие фирмы, известные специалистам.
in vitro
Нуклеиновые кислоты могут быть также получены методами амплификации. Методы амплификации содержат полимеразную цепную реакцию (ПЦР), лигазную цепную реакцию (ЛЦР), систему амплификации на основе транскрипции (TAS) и систему ауторепликации последовательностей (3SR). Методы клонирования широкого ряда, клетки-хозяева и методы амплификации  хорошо известны специалистам.
H
L
H
L
H
L
Любые нуклеиновые кислоты, кодирующие любые описанные в настоящем документе антитела, Vи/или V(или их фрагменты) могут быть экспрессированы в рекомбинантно сконструированных клетках, таких как клетки бактерий, растений, дрожжей, насекомых и млекопитающих. Эти антитела могут быть экспрессированы в виде отдельной цепи Vи/или V, либо они могут быть экспрессированы в виде слитого белка. Может быть также экспрессирован иммуноадгезин. Таким образом, в некоторых примерах, настоящее изобретение относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим Vи V, и иммуноадгезин. Последовательности нуклеиновой кислоты могут, но необязательно, кодировать лидерную последовательность.
H
L
4
3
H
L
L
H
Для создания одноцепочечного антитела (scFv), V- и V-кодирующие ДНК-фрагменты функционально присоединяют к другому фрагменту, кодирующему гибкий линкер, например, аминокислотную последовательность (Gly-Ser), так, чтобы последовательности Vи Vмогли экспрессироваться в виде непрерывного одноцепочечного белка, содержащего домены Vи V, связанные гибким линкером (см., например, Bird et al., Science 242:423-426, 1988; Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883, 1988; McCafferty et al., Nature 348:552-554, 1990). В линкер может быть включен, но необязательно, сайт расщепления, такой как сайт расщепления фурином.
H
L
1
3
Нуклеиновая кислота, кодирующая Vи/или V, может кодировать, но необязательно, Fc-домен (иммуноадгезин). Fc-доменом может быть Fc-домен IgA, IgM или IgG. Fc-доменом может быть оптимизированный Fc-домен, описанный в опубликованной заявке на патенте США No.20100/093979, которая вводится в настоящее описание посредством ссылки. В одном из примеров, иммуноадгезином является Fc IgG. В одном из примеров, иммуноадгезином является Fc IgG.
H
L
H
L
H
L
H
L
H
L
Одноцепочечное антитело может быть одновалентным, если используется только один из Vи V, двухвалентным, если используются оба Vи V, или поливалентным, если используются более, чем два Vи V. Могут быть получены биспецифические или поливалентные антитела, которые специфически связываются с gp120 и с другой молекулой, такой как gp41. Кодируемые Vи Vмогут содержать, но необязательно, сайт расщепления фурином, расположенный между доменами Vи V.
E. coli
Предполагается, что специалист в данной области владеет информацией о различных экспрессионных системах, подходящих для экспрессии белков, включая , другие бактериальные хозяева, дрожжи и различные высшие эукариотические клетки, такие как COS, CHO, HeLa и миеломные клеточные линии.
Клетками-хозяевами могут быть грамположительные бактерии, включая, но не ограничиваясь ими, Bacillus, Streptococcus, Streptomyces, Staphylococcus, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Clostridium, Geobacillus и Oceanobacillus. Методы экспрессии белка в грамположительных бактериях, таких как Lactobaccillus, хорошо известны специалистам, см., например, опубликованную заявку на патент США No.20100/080774. Векторы экспрессии для lactobacillus описаны, например, в патенте США No.6100388 и в патенте США No.5728571. Лидерные последовательности могут быть включены для экспрессии в Lactobacillus. Грамотрицательными бактериями являются, но не ограничиваются ими, E. coli, Pseudomonas, Salmonella, Campylobacter, Helicobacter, Flavobacterium, Fusobacterium, Ilyobacter, Neisseria и Ureaplasma.
Одна или более последовательностей ДНК, кодирующих антитело или его фрагмент, могут быть экспрессированы in vitro путем переноса ДНК в подходящую клетку-хозяина. Такая клетка может быть прокариотической или эукариотической. Этот термин также содержит любое потомство рассматриваемой клетки-хозяина. Очевидно, что все потомство не может быть идентично родительской клетке, поскольку оно может иметь мутации, возникающие во время репликации. Методы стабильного переноса, означающего, что чужеродная ДНК поддерживается в хозяине на постоянном уровне, известны специалистам. В настоящем изобретении также рассматриваются гибридомы, экспрессирующие представляющие интерес антитела.
Экспрессия нуклеиновых кислот, кодирующих описанные в настоящем документе выделенные белки, может быть достигнута путем функционального присоединения ДНК или кДНК к промотору (который является конститутивным или индуцибельным) с последующим их введением в экспрессионный кластер. Промотором может быть любой представляющий интерес промотор, включая промотор цитомегаловируса и промотор лимфотропного вируса Т-клеток человека (HTLV)-1. В конструкцию может быть включен, но необязательно, энхансер, такой как энхансер цитомегаловируса. Такие кластеры могут быть использованы для репликации и интеграции в прокариотах или эукариотах. Типичные экспрессионные кластеры содержат специфические последовательности, подходящие для регуляции экспрессии ДНК, кодирующей белок. Так, например, экспрессионные кластеры могут содержать соответствующие промоторы, энхансеры, терминаторы транскрипции и трансляции, последовательности инициации транскрипции и трансляции, старт-кодон (то есть, ATG), находящийся перед белок-кодирующим геном; сигнал сплайсинга интронов, последовательности, необходимые для сохранения «правильной» рамки считывания этого гена и для «правильной» трансляции мРНК, и стоп-кодоны. Вектор может кодировать селективный маркер, такой как маркер, кодирующий резистентность к лекарственному средству (например, резистентность к ампициллину или к тетрациклину).
,
Для достижения высокого уровня экспрессии клонированного гена желательно сконструировать экспрессионные кластеры, содержащие, как минимум, сильный промотор для прямой транскрипции, сайт связывания с рибосомой для инициации трансляции (внутренние последовательности связывания с рибосомой) и терминатор транскрипции/трансляции. Для E. coli, такой кластер содержит промотор, такой как промоторы T7, trp, lac или лямбда, сайт связывания с рибосомой, а предпочтительно, сигнал терминации транскрипции. Для эукариотических клеток, регуляторные последовательности могут содержать промотор и/или энхансер, происходящий, например, от гена иммуноглобулина, HTLV, SV40 или цитомегаловируса, и последовательность полиаденилирования, а также донорные и/или акцепторные последовательности сплайсинга (например, акцепторные и донорные последовательности сплайсинга CMV и/или HTLV). Кластеры могут быть перенесены в выбранную клетку-хозяина хорошо известными методами, такими как трансформация или электропорация для E. coli и обработка фосфатом кальция, электропорация или липофекция для клеток млекопитающих. Клетки, трансформированные этими кластерами, могут быть отобраны по их резистентности к антибиотикам, сообщаемой генами, содержащимися в кластерах, такими как гены ampgpt, neo и hyg.
Если хозяином является эукариот, то могут быть применены такие методы трансфекции ДНК, как копреципитация фосфатом кальция, стандартные механические операции, такие как микроинжекция, электропорация, встраивание плазмиды, заключенной в липосомы, или методы с использованием вирусных векторов. Эукариотические клетки могут быть также ко-трансформированы полинуклеотидными последовательностями, кодирующими антитело, меченное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, и другой чужеродной молекулой ДНК, кодирующей селективный фенотип, такой как молекула гена тимидинкиназы вируса простого герпеса. Другим методом является метод, проводимый с использованием эукариотического вирусного вектора, такого как обезьяний вирус 40 (SV40) или вирус коровьей папиломы, для транзиентного инфицирования или трансформации эукариотических клеток и экспрессии белка (см., например, Eukaryotic Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, Gluzman ed., 1982). Специалист в данной области может легко выбрать экспрессионные системы, такие как плазмиды и векторы, для их использования в целях продуцирования белков в клетках, включая высшие эукариотические клетки, такие как COS, CHO, HeLa и миеломные клеточные линии.
В нуклеиновую кислоту, кодирующую описанный в настоящем документе полипептид, могут быть внесены модификации, которые не снижают его биологическую активность. Некоторые модификации могут быть введены для облегчения клонирования, экспрессии или включения нацеливающей молекулы в слитый белок. Такие модификации хорошо известны специалистам, и ими являются, например, модификации кодонов терминации; введение метионина у амино-конца для инициации трансляции; модификации сайтов; введение дополнительных аминокислот у любого конца для создания обычно присутствующих рестрикционных сайтов; или введение дополнительных аминокислот (таких как поли-His) для облегчения проведения стадий очистки. Помимо рекомбинантных методов, иммуноконъюгаты, эффекторные молекулы и антитела согласно изобретению могут быть также полностью или частично сконструированы стандартными методами пептидного синтеза, хорошо известными специалистам.
После экспрессии, рекомбинантные иммуноконъюгаты, антитела и/или эффекторные молекулы могут быть очищены стандартными методами, включая преципитацию сульфатом аммония, очистку на аффинных колонках, колоночную хроматографию и т.п. (в общих чертах см., R. Scopes, PROTEIN PURIFICATION, Springer-Verlag, N.Y., 1982). Антитела, иммуноконъюгаты и эффекторные молекулы необязательно должны иметь 100% чистоту. Полипептиды, если они используются в терапии, после их очистки, частичной очистки или очистки до гомогенности, если это необходимо, по существу, не должны содержать эндотоксинов.
Методы экспрессии антител из бактерий, таких как E. coli, и/или их рефолдинга с получением антител в соответствующей активной форме, включая одноцепочечные антитела, описаны в литературе, хорошо известны и могут применяться для описанных в настоящем документе антител. См., Buchner et аl., Anal. Biochem. 205:263-270, 1992; Pluckthun, Biotechnology 9:545, 1991; Huse at al., Science 246: 1275, 1989 и Ward at al., Nature 341:544, 1989.
В большинстве случаев, функциональные гетерологичные белки, происходящие от E. coli или других бактерий, выделяют из телец включения, после чего они должны быть солюбилизированы с использованием сильных денатурирующих средств, а затем подвергнуты рефолдингу. Как хорошо известно специалистам, при проведении стадии солюбилизации должен присутствовать восстановитель, необходимый для расщепления дисульфидных связей. Репрезентативным буфером с восстановителем является: 0,1 M трис pH 8, 6 M гуанидин, 2 мM EDTA, 0,3 M DTE (дитиоэритритол). Переокисление дисульфидных связей может происходить в присутствии низкомолекулярных тиоловых реагентов в восстановленной и окисленной форме, как описано в публикации Saxena et al., Biochemistry 9:5015-5021, 1970, и, в основном, как описано Buchner et al., см. выше.
Ренатурацию обычно осуществляют путем разведения (например, 100-кратного разведения) денатурированного и восстановленного белка в буфере для рефолдинга. Репрезентативным буфером является 0,1 M трис, pH 8,0, 0,5 M L-аргинина, 8 мM окисленного глутатиона (GSSG) и 2 мM EDTA.
В протокол очистки двух цепей антитела могут быть внесены изменения, а именно, области тяжелой и легкой цепей отдельно солюбилизируют и восстанавливают, а затем их объединяют в растворе для рефолдинга. Хороший выход достигается в случаях, когда эти два белка смешивают в таком молярном отношении, при котором количество одного белка не превышает количество другого белка более, чем в 5 раз. Избыток окисленного глутатиона или других низкомолекулярных окислителей может быть добавлен в раствор для рефолдинга после перестановки цепей, осуществляемой посредством окислительно-восстановительных реакций.
Помимо рекомбинантных методов, антитела, меченые антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в настоящей заявке, могут быть также сконструированы полностью или частично стандартным методом пептидного синтеза. Твердофазный синтез полипептидов длиной менее чем приблизительно 50 аминокислот, может быть осуществлен путем присоединения C-концевой аминокислоты последовательности к нерастворимому носителю с последующим добавлением остальных аминокислот в определенной последовательности. Методы твердофазного синтеза описаны в публикации Barany & Merrifield, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology. Vol. 2: Special Methods in Peptide Synthesis, Part A. pp. 3-284; Merrifield et al., J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2156, 1963, и Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed., Pierce Chem. Co., Rockford, 111., 1984. Более длинные белки могут быть синтезированы путем реакции конденсации амино- и карбокси-концов более коротких фрагментов. Методы создания пептидных связей путем активации карбокси-концов (например, с использованием связывающего реагента, такого как N,N'-дициклогексилкарбодиимид) хорошо известны специалистам.
C. Композиции и способы терапии
В настоящей заявке описаны способы профилактики или лечения ВИЧ-инфекции, такой как инфекция, вызываемая ВИЧ-1. Профилактика ВИЧ-инфекции может включать ингибирование инфекции, вызываемой ВИЧ-1. Способы включают приведение в контакт клеток с эффективным количеством описанных в настоящем документе моноклональных антител человека, которые специфически связываются с gp41, или их антигенсвязывающих фрагментов, или нуклеиновой кислоты, кодирующей такие антитела или их антигенсвязывающие фрагменты. Такой способ может дополнительно включать введение индивидууму терапевтически эффективного количества моноклональных антител человека или их антигенсвязывающих фрагментов или нуклеиновой кислоты, кодирующей такие антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, где антигенсвязывающим фрагментом может быть, например, одна или более CDR, присоединенные к белковому каркасу. В некоторых примерах, антитела или их антигенсвязывающие фрагменты или нуклеиновая кислота, кодирующая такие антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, могут быть использованы для профилактики после инфицирования. В некоторых примерах, антитела или их антигенсвязывающие фрагменты или нуклеиновая кислота, кодирующая такие антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, могут быть использованы для элиминации вирусного резервуара инфекции. Так, например, терапевтически эффективное количество антител или их антигенсвязывающих фрагментов или нуклеиновой кислоты, кодирующей такие антитела или их антигенсвязывающих фрагментов, может быть введено индивидууму, подвергаемому противовирусной терапии. В некоторых примерах, антитела или их антигенсвязывающие фрагменты модифицируют так, чтобы они оказывали прямое цитотоксическое действие на инфицированные клетки или использовали природные защитные механизмы, такие как комплемент-зависимая клеточная цитотоксичность, антитело-зависимая клеточная цитотоксичность (ADCC) или фагоцитоз, опосредуемый макрофагами.
Методами анализа на нейтрализующую активность являются, но не ограничиваются ими, анализ на инфицирование в один цикл, описанный в публикации Martin et al. (2003) Nature Biotechnology 21:71-76. В этом анализе уровень вирусной активности измеряют с использованием селективного маркера, активность которого является показателем количества жизнеспособного вируса в образце, и определяют IC50. В других анализах может быть проведен мониторинг острой инфекции в клеточной линии PM1 или в первичных клетках (обычно в МКПК). В этом анализе может быть проведен мониторинг уровня вирусной активности путем определения концентрации p24 с помощью ELISA. См., например, Martin et al. (2003) Nature Biotechnology 21:71-76.
Эффективная композиция необязательно должна полностью элиминировать ВИЧ-инфекцию. Так, например, композиция может снижать уровень ВИЧ-инфекции до желаемого уровня, например, по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или даже по меньшей мере на 100% (уничтожение детектируемых ВИЧ-инфицируемых клеток) по сравнению с ВИЧ-инфекцией в отсутствии такой композиции. Так, например, клетка может быть также подвергнута контакту с эффективным количеством дополнительного средства, такого как противовирусное средство. Такой клеткой может быть клетка in vitro или in vivo. Такие методы могут включать введение одного или более дополнительных средств, известных специалистам. В дополнительных примерах, репликация ВИЧ может быть снижена или ингибирована аналогичными методами. Эффективная композиция необязательно должна полностью элиминировать репликацию ВИЧ. Так, например, композиция может снижать репликацию ВИЧ до нужного уровня, например, по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или даже по меньшей мере на 100% (элиминация детектируемого ВИЧ) по сравнению с репликацией ВИЧ в отсутствии композиции. В одном из примеров, клетка также контактирует с эффективным количеством дополнительного средства, такого как противовирусное средство. Такой клеткой может быть клетка in vitro или in vivo.
Рассматриваются композиции, содержащие одно или более описанных в настоящем документе антител, которые специфически связываются с gp41, или их антигенсвязывающие фрагменты или нуклеиновую кислоту, кодирующую такие антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, в носителе. Композиции могут быть получены в виде единичных лекарственных форм для введения индивидууму. Количество и время введения, необходимые для достижения желаемых целей, могут быть установлены лечащим врачом. Антитело может быть получено для системного или местного введения. В одном из примеров, антитело, которое специфически связывается с gp41 или его антигенсвязывающий фрагмент или нуклеиновую кислоту, кодирующую такие антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, приготавливают для парентерального введения, такого как внутривенное введение.
Композиции для введения могут содержать раствор антитела, которое специфически связывается с gp41 или его антигенсвязывающий фрагмент или нуклеиновой кислоты, кодирующей такие антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, в фармацевтически приемлемом носителе, таком как водный носитель. При этом, могут быть использованы различные водные носители, например, забуференный физиологический раствор и т.п. Эти растворы являются стерильными и, по существу, не содержат нежелательных компонентов. Эти композиции могут быть стерилизованы стандартными хорошо известными методами стерилизации. Такие композиции могут содержать фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, необходимые для сообщения условий, близких к физиологическим, такие как pH-корректирующие средства, забуферивающие средства, средства для регуляции токсичности и т.п., например, ацетат натрия, хлорид натрия, хлорид калия, хлорид кальция, лактат натрия и т.п. Концентрация антитела в этих композициях может значительно варьироваться, и такую концентрацию выбирают, главным образом, в зависимости от объема жидкости, вязкости, массы тела и т.п., а также от конкретно выбранных способов введения и потребностей индивидуума.
th
Типичная фармацевтическая композиция для внутривенного введения содержит приблизительно 0,1-10 мг антитела на индивидуума в день. При этом могут быть использованы дозы, составляющие от 0,1 и приблизительно до 100 мг на индивидуума в день, особенно, если средство вводят в удаленный участок, например, в полость тела или в просвет органа, а не в кровоток или в лимфосистему. Практические методы получения вводимых композиций известны или понятны специалистам, и более подробно описаны в таких публикациях как руководство Remington's Pharmaceutical Science, 19 ed., Mack Publishing Company, Easton, PA (1995).
Антитела или их антигенсвязывающие фрагменты или нуклеиновая кислота, кодирующая такие антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, могут быть получены в лиофилизованной форме и могут быть регидратированы стерильной водой до их введения, хотя они могут быть также получены в виде стерильных растворов в известной концентрации. Раствор антитела или их антигенсвязывающих фрагментов или нуклеиновой кислоты,кодирующей такие антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, добавляют в инфузионный пакет, содержащий 0,9% хлорид натрия, USP, и обычно вводят в дозе от 0,5 до 15 мг/кг массы тела. В литературе обсуждаются известные способы введения антитело-содержащих лекарственных средств, которые поступили на фармацевтический рынок в США под торговым знаком RITUXAN после разрешения на их применение, полученного в 1997. Антитела или их антигенсвязывающие фрагменты или нуклеиновая кислота, кодирующая такие антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, могут быть введены путем медленного вливания, но не путем внутривенной инъекции или внутривенного введения ударной дозы. В одном из примеров вводят более высокую нагрузочную дозу с последующим введением поддерживающих доз на более низком уровне. Так, например, начальная нагрузочная доза 4 мг/кг может быть введена путем инфузии в течение приблизительно 90 минут, а затем еженедельно в течение 4-8 недель могут быть введены поддерживающие дозы 2 мг/кг путем инфузии в течение 30 минут, если такая доза ранее хорошо переносилась пациентом.
Терапевтически эффективное количество gp41-специфического антитела человека или его антигенсвязывающего фрагмента или нуклеиновой кислоты, кодирующей такие антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, зависит от тяжести заболевания и/или инфекции и от общего состояния здоровья пациента. Терапевтически эффективным количеством антитела является такое количество, которое дает либо субъективное ослабление симптома(ов), либо объективно улучшает состояние здоровья индивидуума, наблюдаемого у врача-клинициста или у другого квалифицированного врача. Эти композиции могут быть введены в комбинации с другим терапевтическим средством либо одновременно, либо последовательно.
В одном из вариантов осуществления изобретения, введение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента или нуклеиновой кислоты, кодирующей такие антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, приводит к ослаблению ВИЧ-инфекции и/или к замедлению прогрессирования заболевания, вызываемого ВИЧ-инфекцией у индивидуума. Ослабление ВИЧ-инфекции и/или замедление прогрессирования заболевания, вызываемого ВИЧ-инфекцией, содержит любое статистически значимое снижение активности ВИЧ. В некоторых вариантах осуществления изобретения описаны способы лечения индивидуума с ВИЧ-1-инфекцией. Эти способы включают введение индивидууму терапевтически эффективного количества антитела или нуклеиновой кислоты, кодирующей такое антитело, и тем самым, профилактику или лечение ВИЧ-1-инфекции.
Исследования показали, что риск передачи ВИЧ-инфекции от матери к ребенку значительно снижается при введении зидовудина ВИЧ-инфицированным женщинам во время беременности и родов, и его введении ребенку после рождения (Connor et al., 1994 Pediatr Infect Dis J. 14:536-541). Некоторые исследования по передаче ВИЧ-инфекции от матери к ребенку продемонстрировали корреляцию между вирусной нагрузкой во время родов и риском передачи ВИЧ-инфекции ребенку. В настоящей заявке рассматриваются выделенные моноклональные антитела человека, которые используются для снижения риска передачи ВИЧ-инфекции от матери к ребенку. Таким образом, в некоторых примерах, терапевтически эффективное количество gp41-специфического антитела человека или его антигенсвязывающего фрагмента или нуклеиновой кислоты, кодирующей такие антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, вводят в целях профилактики передачи ВИЧ-инфекции или снижения риска передачи ВИЧ-инфекции от матери к ребенку. В некоторых примерах, терапевтически эффективное количество антитела или его антигенсвязывающего фрагмента или нуклеиновой кислоты, кодирующей такие антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, вводят матери и/или ребенку после его рождения. В других примерах терапевтически эффективное количество антитела вводят матери и/или ребенку до кормления грудью в целях профилактики передачи вируса ребенку или снижения риска передачи вируса ребенку. В некоторых вариантах осуществления изобретения, матери и/или ребенку вводят терапевтически эффективное количество антитела и терапевтически эффективное количество другого средства, такого как зидовудин.
Для применения в любых целях, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент или нуклеиновая кислота, кодирующая такие антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, могут быть введены в комбинации с антиретровирусной терапией. Антиретровирусные лекарственные средства были широко классифицированы по фазе жизненного цикла ретровирусов, ингибируемого лекарственными средствами. Описанные антитела могут быть введены в комбинации с нуклеозидными аналогами ингибиторов обратной транскриптазы (такими как зидовудин, диданозин, зальцитабин, ставудин, ламивудин, абакавир, эмтрицитабин, энтекавир и априцитабин), нуклеотидными аналогами ингибиторов обратной транскриптазы (такими как тенофовир и адефовир), не-нуклеозидными ингибиторами обратной транскриптазы (такими как эфавиренц, невирапин, делавирдин, этравирин и рилпивирин), ингибиторами протеазы (такими как саквинавир, ритонавир, индинавир, нелфинавир, ампренавир, лопинавир, фозампренавир, атазанивир, типранавир и дарунавир), ингибиторами внедрения вируса в клетку или слияния с клеткой (такими как маравирок и энфувиртид), ингибиторами созревания (такими как бевиримат и вивекон) или ингибиторами широкого спектра, такими как природные противовирусные средства. В некоторых примерах, описанные антитела или их активные фрагменты или нуклеиновые кислоты, кодирующие антитела и их фрагменты, вводят в комбинации с IL-15 или в виде конъюгата с IL-15.
В некоторых примерах, индивидууму также вводят одно или более дополнительных антител, которые связываются с гликопротеинами ВИЧ, такими как gp120 и gp41. Примеры нейтрализующих антител, которые могут быть введены в комбинации с описанными антителами, можно найти в публикации международной патентной заявки No. WO 2011/038290, опубликованной 31 марта 2011, которая вводится в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.
Одноразовое или многоразовое введение композиций, содержащих описанные в настоящем документе антитела, осуществляют в зависимости от дозы и частоты введения в соответствии с потребностью и переносимостью такой дозы пациентом. В любом случае, композиция должна содержать определенное количество по меньшей мере одного описанного в настоящем документе антитела, достаточное для эффективного лечения пациента. Доза может быть введена один раз, но она может также вводиться периодически вплоть до достижения нужного терапевтического результата или до вынужденного прекращения терапии, вызванного появлением побочных эффектов. В одном из примеров, дозу антитела вводят путем вливания в течение тридцати минут через день. В этом примере может быть введено приблизительно от одной до десяти доз, например, приблизительно три или шесть доз через день. В другом примере, непрерывное вливание может быть осуществлено приблизительно в течение 5-10 дней. Индивидуум может проходить лечение через регулярные интервалы времени, например, раз в месяц, вплоть до достижения нужного терапевтического результата. В основном, дозы достаточно, чтобы устранить или ослабить симптомы или признаки заболевания без продуцирования нежелательной токсичности у пациента.
Препараты для парентерального введения с регулируемым высвобождением могут быть получены в виде имплантатов, масляных инъекции или систем, состоящих из микрочастиц. Подробное описание систем для доставки белков можно найти в руководстве Banga, A.J., Therapeutic Peptides and Proteins: Formulation, Processing, and Delivery Systems, Technomic Publishing Company, Inc., Lancaster, PA, (1995). Системами, состоящими из микрочастиц, являются микросферы, микрокапсулы, нанокапсулы, наносферы и наночастицы. Микрокапсулы, в своей центральной части, содержат терапевтический белок, такой как цитотоксин или лекарственное средство. В микросферах, терапевтическое средство диспергировано по всей микросфере. Более мелкие частицы, микросферы и микрокапсулы, размер которых составляет приблизительно менее 1 мкм, обычно называют наночастицами, наносферами и нанокапсулами, соответственно. Капилляры имеют диаметр приблизительно 5 мкм, а поэтому только наночастицы могут быть введены внутривенно. Микрокапсулы обычно имеют диаметр приблизительно 100 мкм и могут быть введены подкожно или внутримышечно. См., например, Kreuter, J., Colloidal Drug Delivery Systems, J. Kreuter, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, NY, pp. 219-342 (1994); и Tice & Tabibi, Treatise on Controlled Drug Delivery, A. Kydonieus, ed., Marcel Dekker, Inc. New York, NY, pp. 315-339, (1992).
Полимеры могут быть использованы для высвобождения описанных в настоящем документе антитело-содержащих композиций, регулируемых на ионном уровне. Различные разлагаемые и неразлагаемые полимерные матрицы, используемые для регулируемой доставки лекарственного средства, известны специалистам (Langer, Accounts Chem. Res. 26:537-542, 1993). Так, например, блок-сополимер, полоксамер 407, существует в виде вязкой, но все же подвижной жидкости при низких температурах, и образует полутвердый гель при температуре тела. Было показано, что он является эффективным носителем для получения препарата и пролонгированной доставки рекомбинантного интерлейкина-2 и уреазы (Johnston et al., Pharm. Res. 9:425-434, 1992; и Pec et al., J. Parent. Sci. Tech. 44(2):58-65, 1990). Альтернативно, в качестве микроносителя для регулируемого высвобождения белков был использован гидроксиапатит (Ijntema et al., Int. J. Pharm. 112:215-224, 1994). В другом аспекте изобретения, для регулируемого высвобождения, а также для доставки инкапсулированного в липиде лекарственного средства используют липосомы (Betageri et al., Liposome Drug Delivery Systems, Technomic Publishing Co., Inc., Lancaster, PA (1993)). Известно множество других систем регулируемой доставки терапевтических белков (см. патент США No.5055303; патент США No.5188837; патент США No.4235871; патент США No.4501728; патент США No.4837028; патент США No.4957735; патент США No.5019369; патент США No.5055303; патент США No.5514670; патент США No.5413797; патент США No.5268164; патент США No.5004697; патент США No.4902505; патент США No.5506206; патент США No.5271961; патент США No.5254342 и патент США No.5534496).
in vivo
В некоторых примерах, индивидууму вводят ДНК, кодирующую антитело или его антигенсвязывающие фрагменты, которыми могут быть, например, одна или более CDR, присоединенных к белковому каркасу, с последующим продуцированием антитела  в соответствии с клеточным механизмом индивидуума. Иммунизация конструкциями нуклеиновой кислоты хорошо известна специалистам и описана, например, в патенте США No.5643578, в патенте США No.5593972 и в патенте США No.5817637. В патенте США No.5880103 описано несколько методов доставки кодирующих нуклеиновых кислот в организм. Эти методы содержат липосомную доставку нуклеиновых кислот. Такие методы могут быть применены специалистом для продуцирования антитела или его антигенсвязывающих фрагментов.
Одним из способов введения нуклеиновых кислот является прямое введение с использованием плазмидной ДНК, такой как экспрессионная плазмида млекопитающего. Нуклеотидная последовательность, кодирующая описанное антитело или его антигенсвязывающие фрагменты, может находиться под контролем промотора, что будет способствовать повышению уровня экспрессии.
В другом способе, проводимом с использованием нуклеиновых кислот, описанное в настоящем документе антитело или его антигенсвязывающие фрагменты могут также экспрессироваться аттенюированными вирусными хозяевами, векторами или бактериальными векторами. Для экспрессии антитела могут быть использованы рекомбинантный вирус коровьей оспы, аденосвязанный вирус (AAV), герпесвирус, ретровирус, цитомегаловирус или другие вирусные векторы. Так, например, векторы на основе вируса коровьей оспы и протоколы проведения методов с использованием этих векторов описаны в патенте США No.4722848. Другим вектором для экспрессии описанных антител является БКГ (бацилла Кальметта-Герена) (см. Stover, Nature 351:456-460, 1991).
В одном из вариантов осуществления изобретения, нуклеиновую кислоту, кодирующую описанное антитело или его антигенсвязывающие фрагменты, вводят непосредственно в клетки. Так, например, нуклеиновая кислота может быть нанесена на золотые микросферы стандартными методами и введены в кожу с помощью такого приспособления, как Bio-Rad's HELIOS™ Gene Gun. Нуклеиновые кислоты могут быть «оголенными» и могут состоять из плазмид, находящихся под контролем сильного промотора.
Обычно ДНК инъецируют в мышцу, хотя она может быть также инъецирована непосредственно в другие участки. Доза для инъекций обычно составляет приблизительно 0,5 мкг/кг - 50 мг/кг, а, в основном, приблизительно 0,005 мг/кг - 5 мг/кг (см., например, патент США No.5589466).
D. Диагностические методы и наборы
Настоящее изобретение относится к способу детекции экспрессии gp41 in vitro или in vivo. В одном из примеров, экспрессию gp41 детектируют в биологическом образце для обнаружения ВИЧ-1-инфекции, которая указывает на присутствие ВИЧ-1 в образце. Образцом может быть любой образец, включая, но не ограничиваясь ими, ткани, полученные путем биопсии, аутопсии и морфологической биопсии. Биологическими образцами также являются срезы тканей, например, замороженные срезы, взятые для гистологического анализа. Биологическими образцами также являются физиологические жидкости, такие как кровь, сыворотка, плазма, мокрота, цереброспинальная жидкость или моча.
В некоторых вариантах осуществления изобретения описан способ выявления СПИД'а и/или ВИЧ-1-инфекции у индивидуума. Настоящее изобретение относится к способу детекции ВИЧ-1 в биологическом образце, где способ включает приведение в контакт биологического образца с антителом в условиях, способствующих образованию иммунного комплекса, и детекцию иммунного комплекса в целях обнаружения gp41 в биологическом образце. В одном из примеров, наличие gp41 в образце указывает на присутствие у индивидуума ВИЧ-инфекции. В другом примере, присутствие gp41 в образце указывает на наличие у индивидуума СПИД'а. В другом примере, обнаружение gp41 в образце подтверждает диагноз СПИД'а и/или ВИЧ-1-инфекции у индивидуума.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, описанные антитела используют для тестирования вакцин. Так например, эти антитела используют для того, чтобы определить, имеет ли вакцинная композиция такую же конформацию, как и пептид gp41. Таким образом, настоящее изобретение относится к способу тестирования вакцины, где способ включает приведение в контакт образца, содержащего вакцину, такую как иммуноген gp41, с антителом в условиях, способствующих образованию иммунного комплекса, и детекцию такого иммунного комплекса в целях обнаружения вакцины в образце. В одном из примеров, присутствие иммунного комплекса в образце указывает на то, что вакцинный компонент, такой как иммуноген gp41, имеет конформацию, обеспечивающую связывание антитела.
В одном из вариантов осуществления изобретения, антитело подвергают прямому мечению детектируемой меткой. В другом варианте осуществления изобретения, используется немеченое антитело, которое связывается с gp41 («первое» антитело) и «второе» антитело или другая молекула, которые могут связываться с антителом, связывающимся с gp41. Как хорошо известно специалисту в данной области, «второе» антитело выбирают так, чтобы оно было способно специфически связываться с «первым антителом определенного вида и класса. Так, например, если «первым» антителом является IgG человека, то «вторым» антителом может быть антитело против IgG человека. Другими молекулами, которые могут связываться с антителами, являются, но не ограничиваются ими, белок A и G-белок, которые являются коммерчески доступными.
125
131
35
3
Подходящие метки для антитела или «второго» антитела описаны выше, и такими метками являются различные ферменты, простетические группы, флуоресцентные вещества, люминесцентные вещества, магнитные вещества и радиоактивные вещества. Неограничивающими примерами подходящих ферментов являются пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза, бета-галактозидаза или ацетилхолинэстераза. Неограничивающими примерами подходящих комплексов простетических групп являются стрептавидин/биотин и авидин/биотин. Неограничивающими примерами подходящих флуоресцентных веществ являются умбеллиферон, флуоресцеин, флуоресцеинизотиоцианат, родамин, дихлортриазиниламин-флуоресцеин, данзилхлорид или фикоэритрин. Неограничивающими примерами люминесцентных веществ являются люминол, неограничивающими примерами магнитных веществ являются гадолиний, а неограничивающими примерами радиоактивных меток являются I, I, S или H.
Иммуноанализы и описанные в настоящем документе методы могут быть применены в различных целях. Наборы для детекции полипептида обычно содержат антитело, которое связывается с gp41, например, любое из описанных в настоящем документе антител. В некоторых вариантах осуществления изобретения, набор содержит фрагмент антитела, такой как Fv-фрагмент или Fab-фрагмент. В другом варианте осуществления изобретения, антитело является меченным (например, флуоресцентной, радиоактивной или ферментной меткой).
В одном из вариантов осуществления изобретения, набор содержит инструкции по его применению. Такие инструкции могут быть представлены в текстовой форме, в электронной форме (такой как компьютерная дискета или компакт-диск) или в визуальной форме (такой как видеофайлы). Данные наборы могут также содержать дополнительные компоненты, облегчающие достижение цели применения данного набора. Так, например, этот набор может дополнительно содержать средства для детекции метки (такие как субстраты для ферментных меток, наборы фильтров для детекции флуоресцентных меток, соответствующие вторичные метки, такие как «второе» антитело или т.п.). Такие наборы могут дополнительно содержать буферы и другие реагенты, которые обычно используются для практического осуществления данного метода. Наборы и их соответствующие компоненты хорошо известны специалистам.
В одном из вариантов осуществления изобретения, диагностический набор содержит компоненты для иммуноанализа. Хотя компоненты для иммуноанализов могут варьироваться в зависимости от конкретного формата их проведения, однако, в основном, способ детекции gp41 в биологическом образце включает стадии приведения в контакт биологического образца с антителом, которое специфически реагирует с gp41 в условиях проведения иммунологических реакций. Антитело подвергают реакции специфического связывания в условиях проведения иммунологических реакций, способствующих образованию иммунного комплекса, а затем проводят прямую или опосредованную детекцию иммунного комплекса (связанного антитела).
E. Методы идентификации представляющих интерес антител
+
-
-
-
Настоящее изобретение относится к способам продуцирования моноклонального антитела, которое специфически связывается с антигеном-мишенью. Способы включают выделение популяции В-клеток памяти у индивидуума, которому был введен данный антиген-мишень, где В-клетками памяти являются CD19IgAIgDIgMB-клетки. Популяцию выделенных В-клеток памяти приводят в контакт с эффективным количеством IL-21, IL-2 и лиганда CD40 (CD40L), а затем из популяции выделенных В-клеток памяти выделяют мРНК. После этого из клеток выделяют нуклеиновые кислоты, кодирующие вариабельные области тяжелой цепи и вариабельные области легкой цепи антител, и эти вариабельные области тяжелой цепи и вариабельные области легкой цепи экспрессируют. Затем, из комбинаций вариабельных областей тяжелой цепи и вариабельных областей легкой цепи отбирают моноклональное антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, которые специфически связываются с антигеном-мишенью.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, популяцию В-клеток памяти выделяют из биологического образца, взятого у индивидуума, который ранее подвергался воздействию представляющего интерес антигена. Популяцию В-клеток памяти разделяют на субпопуляции, которые приводят в контакт с эффективным количеством CD40L, IL-2 и IL-21 в течение периода времени, достаточного для деления В-клеток памяти и продуцирования ими антител. Присутствие или отсутствие антител, специфически связывающихся с представляющим интерес антигеном, определяют для субпопуляции В-клеток памяти. Если было определено, что субпопуляция В-клеток памяти продуцирует антитела, специфически связывающиеся с представляющим интерес антигеном, то отбирают именно эту субпопуляцию. Может быть определена последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая вариабельные домены тяжелой и легкой цепей антител, продуцированных выбранной субпопуляцией В-клеток памяти, а затем могут быть получены моноклональные антитела, содержащие вариабельные области тяжелой и легкой цепей антител, продуцированных выбранной субпопуляцией В-клеток памяти. Моноклональные антитела анализируют на специфическое связывание с представляющим интерес антигеном, а затем отбирают антитела, которые специфически связывающиеся с представляющим интерес антигеном, и тем самым, идентифицируют антитело, которое специфически связывается с представляющим интерес антигеном.
+
-
-
-
Настоящее изобретение относится к способам выделения репертуара В-клеток, специфичных к антигену-мишени, у индивидуума. Способы включают выделение популяции В-клеток памяти у индивидуума, которому был введен данный антиген-мишень, где В-клетками памяти являются CD19IgAIgDIgMB-клетки. Популяцию выделенных В-клеток памяти приводят в контакт с эффективным количеством IL-21, IL-2 и CD40, а затем из этой популяции отбирают В-клетки, экспрессирующие антитела, которые специфически связываются с антигеном-мишенью. Способы дополнительно включают выделение библиотеки нуклеиновых кислот, кодирующих вариабельные области тяжелой цепи и вариабельные области легкой цепи иммуноглобулинов. Затем экспрессируют библиотеку вариабельных областей тяжелой цепи и вариабельных областей легкой цепи для выделения репертуара В-клеток, специфичных к антигену-мишени, у индивидуума.
Репертуар гуморальных антител, включая, но не ограничиваясь им, репертуар полностью гуморальных антител против таких мишеней, как патоген или вакцина, может давать многоаспектную информацию (например, информацию о специфичности, аффинности, стабильности, предпочтительности последовательностей генных сегментов и т.п.), которая может рассматриваться как «профиль» гуморального ответа у индивидуума. Количественная оценка этих параметров (Story et al., 2008 PNAS 105(46):17902-17907) может быть использована для установления взаимосвязи этих параметров с наличием защиты от патогена или ее отсутствием. Затем, на основе эти данных можно получить информацию для конструирования вакцины в итеративном режиме, и для разработки многопараметрического диагностического анализа на специфические антигены, либо такая информация может быть непосредственно использована для идентификации одного или множества нейтрализующих антител против данного патогена.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, антитела могут быть охарактеризованы. Так, например, может быть собран набор многопараметрических данных о предпочтительных свойствах, например, о специфичности, аффинности, стабильности, изотипах и предпочтительных последовательностях генных сегментов (Story et al., 2008 PNAS 105(46):17902-17907. В некоторых репрезентативных неограничивающих вариантах изобретения, профиль или многопараметрический набор данных могут быть использованы в целях получения информации для конструировании вакцины в итеративном режиме и для разработки, на этой основе, многопараметрического диагностического анализа на специфические антигены, либо они могут быть непосредственно использованы в целях идентификации одного или множества нейтрализующих антител против данного патогнена.
Таким образом, описанные в настоящем документе способы могут быть применены для выделения одного или нескольких моноклональных антител, которые специфически связываются с антигеном-мишенью и/или для выделения репертуара B-клеток, которые связываются с антигеном-мишенью в образце или у индивидуума. Такой антиген-мишень может происходить от патогена, включая вирусы, паразиты, грибы и бактерии. В некоторых вариантах осуществления изобретения, патогеном является вирус, такой как, но не ограничивающийся ими, вирус, принадлежащий к одному из следующих семейств, таких как: Retroviridae (например, вирус иммунодефицита человека (ВИЧ); вирусы Т-клеточного лейкоза человека (HTLV); Picornaviridae (например, полиовирус, вирус гепатита А, вирус гепатита С, энтеровирусы, коксакивирусы человека, риновирусы, эховирусы, вирус ящура); Calciviridae (такие как штаммы, вызываюшие гастроэнтерит); Togaviridae (например, вирус лошадиного энцефалита, вируса коревой краснухи); Flaviridae (например, вирусы денге; вирусы желтой лихорадки; вирус Западного Нила; вирус энцефалита Сент Луис; вирус японского энцефалита и другие вирусы энцефалита); Coronaviridae (например, коронавирусы; вирус, вызывающий острый респираторный синдром (SARS)); Rhabdoviridae (например, вирусы везикулярного стоматита, вирусы бешенства); Filoviridae (например, вирусы Эбола); Paramyxoviridae (например, вирусы парагриппа, вирусы паротита, вирус кори, респираторно-синцитиальный вирус (RSV)); Orthomyxoviridae (например, вирусы гриппа); Bunyaviridae (например, вирусы Хантаан; вирус Син Номбре, вирус лихорадки долины реки Рифт; буньявирусы, флебовирусы и найровирусы); Arenaviridae (вирусы геморрагической лихорадки; вирус Мачупо; вирус Юнин); Reoviridae (например, реовирусы, орбивирусы и ротавирусы); Birnaviridae; Hepadnaviridae (вирус гепатита B); Parvoviridae (парвовирусы); Papovaviridae (папилломавирусы, полиомавирусы; BK-вирус); Adenoviridae (большинство аденовирусов); Herpesviridae (вирус простого герпеса (HSV)-1 и HSV-2; цитомегаловирус (CMV); вирус Эпштейна-Барра (EBV); вирус опоясывающего лишая (VZV); и другие герпесвирусы, включая HSV-6); Poxviridae (вирусы натуральной оспы, вирусы коровьей оспы, вирусы оспы); и Iridoviridae (такой как вирус африканской лихорадки свиней); Filoviridae (например, вирус Эбола; вирус Марбург); Caliciviridae (например, вирусы норуолк) и неклассифицированные вирусы (например, этиологические факторы, вызывающие спонгиформную энцефалопатию; фактор, вызывающий гепатит дельта (вероятно дефектный сателлит вируса гепатита В); и астровирусы).
В других вариантах осуществления изобретения, антигеном-мишенью является бактериальный антиген, происходящий от бактерий, таких как, но не ограничивающихся ими, Helicobacter pyloris, Borelia burgdorferi, Legionella pneumophilia, Mycobacteria sps. (такие как M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, M. kansaii, M. gordonae), Staphylococcus aureus, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Listeria monocytogenes, Streptococcus pyogenes (стрептококки группы A), Streptococcus agalactiae (стрептококки группы В), Streptococcus (группа viridans), Streptococcus faecalis, Streptococcus bovis, Streptococcus (анаэробные бактерии), Streptococcus pneumoniae, pathogenic Campylobacter sp., Enterococcus sp., Haemophilus influenzae, Bacillus anthracis, corynebacterium diphtheriae, corynebacterium sp., Erysipelothrix rhusiopathiae, Clostridium perfringers, Clostridium tetani, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae, Pasturella multocida, Bacteroides sp., Fusobacterium nucleatum, Streptobacillus moniliformis, Treponema pallidium, Treponema pertenue, Leptospira или Actinomyces israelli.
В других вариантах осуществления изобретения, антиген происходит от грибов, таких как Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatitidis, Chlamydia trachomatis или Candida albicans. В других вариантах осуществления изобретения, антиген происходит от паразитов, таких как, но не ограничивающихся ими, Plasmodium falciparum или Toxoplasma gondii.
В некоторых вариантах осуществления изобретения антигеном является раковый антиген. Злокачественное новообразование может представлять собой солидную опухоль или гематогенный рак. В конкретных примерах, солидной опухолью является саркома или карцинома, такая как фибросаркома, миксосаркома, липосаркома, хондросаркома, остеогенная саркома, или другая саркома; синовиома, мезотелиома, опухоль Юинга, лейомиосаркома, рабдомиосаркома, карцинома толстой кишки, лимфоидная злокачественная опухоль, рак поджелудочной железы, рак молочной железы, рак легких, рак яичника, рак предстательной железы, гепотоцеллюлярная карцинома, плоскоклеточная карцинома, базальноклеточная карцинома, аденокарцинома, карцинома потовых желез, карцинома сальных желез, папиллярная карцинома, папиллярная аденокарцинома, карцинома коры головного мозга, бронохогенная карцинома, почечно-клеточная карцинома, гепатома, карцинома желчных протоков, хориокарцинома, опухоль Вильмса, рак шейки матки, опухоль яичек, карцинома мочевого пузыря или опухоль ЦНС (такая как глиома, астроцитома, медуллобластома, краниофарингиома, эпендимома, пинеалома, гемангиобластома, неврома уха, олигодендроглиома, менангиома, меланома, нейробластома или ретинобластома).
В некоторых примерах гематогенным раковым заболеванием является лейкоз, такой как острый лейкоз (например, острый лимфоцитарный лейкоз, острый миелоцитарный лейкоз, острый миелогенный лейкоз и миелобластный лейкоз, промиелоцитарный лейкоз, миеломоноцитарный лейкоз, моноцитарный лейкоз и эритроцитарный лейкоз), хронический лейкоз (такой как хронический миелоцитарный (гранулоцитарный) лейкоз, хронический миелогенный лейкоз и хронический лимфоцитарный лейкоз), настоящая полицитемия, лимфома, болезнь Ходжкина, неходжкинская лимфома (в бессимптомной и в высокозлокачественной формах), множественная миелома, макроглобулинемия Вальденстрема, болезнь тяжелых цепей, миелодиспластический синдром, ретикулоэндотелиоз или миелодисплазия.
Опухолевые антигены хорошо известны специалистам, и такими антигенами являются, например, карциноэмбриональный антиген (CEA), хорионический гонадотропин человека (HCG), альфа-фетопротеин (AFP), реагирующий с лектином AFP, (AFP-L3), тироглобулин, RAGE-1, MN-CA IX, теломераза-обратная транскриптаза человека (hTERT), RU1, RU2 (AS), кишечная карбоксилэстераза, mut hsp70-2, M-CSF, простаза, антиген, специфичный для предстательной железы (PSA), PAP, NY-ESO-1, LAGE-1a, p53, простеин, PSMA, Her2/neu, сурвивин и теломераза, опухолевый антиген карциномы предстательной железы-1 (PCTA-1), антиген, связанный с меланомой (MAGE), ELF2M, эластаза нейтрофилов, эфрин B2 и CD22. Молекулы CH2- или CH3-доменов могут также связываться с любым белком, связанным с раковой опухолью, таким как IGF-I, IGF-II, IGR-IR или мезотелин. Дополнительные опухолесвязанные антигены представлены в нижеследующей таблице.
Репрезентативные опухоли и антигены этих опухолей
Опухоль
Связанные с опухолью антигены-мишени
Острый миелогенный лейкоз
Опухоль Вильмса (WT1), преимущественно экспрессируемый антиген меланомы (PRAME), PR1, протеиназа 3, эластаза, катепсин G
Хронический миелогенный лейкоз
WT1, PRAME, PR1, протеиназа 3, эластаза, катепсин G
Миелодиспластический синдром
WT1, PRAME, PR1, протеиназа 3, эластаза, катепсин G
Острый лимфобластный лейкоз
PRAME
Хронический лимфоцитарныйлейкоз
Сурвивин
Неходжкинская лимфома
Сурвивин
Множественная миелома
Антиген пищевода, Нью-Йорк 1 (NY-Eso1)
Злокачественная меланома
MAGE, MART, тирозиназа, PRAME GP100
Рак молочной железы
WT1, герцептин
Рак легких
WT1
Рак предстательной железы
Антиген, специфичный для предстательной железы (PSA)
Рак толстой кишки
Карциноэмбриональный антиген (CEA)
Почечно-клеточная карцинома (ПКК)
Фактор роста фибробластов 5 (FGF-5)
В некоторых вариантах осуществления изобретения, антигеном является аутоантиген. Антигеном может быть антиген, связанный с аутоиммунным заболеванием, таким как ревматоидный артрит, ювенильный олигоартрит, артрит, индуцированный коллагеном, артрит, индуцированный адъювантами, синдром Сьегрена, рассеянный склероз, экспериментальный аутоимунный энцефаломиелит, воспалительное заболевание кишечника (например, болезнь Крона, язвенный колит), аутоимунная атрофия желудка, вульгарная пузырчатка, псориаз, витилиго, диабет типа 1, диабет, не связанный с ожирением, тяжелая миастения, болезнь Грейвса, тиреоидит Хашимото, склерозирующий холангит, склерозирующий сиаладенит, системная красная волчанка, аутоимунная тромбоцитопеническая пурпура, синдром Гудпасчера, болезнь Аддисона, системный склероз, полимиозит, дерматомиозит, аутоимунная гемолитическая анемия или пернициозная анемия.
Выделение В-клеток
+
-
-
-
В некоторых вариантах осуществления изобретения, популяцию клеток, включая В-клетки памяти, получают от индивидуума. Обычно, выделяют, по существу чистую популяцию В-клеток памяти (таких как CD19IgA, IgD, IgM B-клетки). В основном, выделенная популяция клеток обогащена В-клетками памяти.
Популяция клеток, включая В-клетки памяти, может быть выделена из биологического образца, взятого у представляющего интерес индивидуума. Репрезентативными биологическими образцами, используемыми в способах согласно изобретению, являются костный мозг, селезенка, лимфоузлы, кровь, например, периферическая кровь. Однако, биологическим образцом может быть также любой другой источник, из которого могут быть выделены В-клетки памяти, включая тканевый биоптат; хирургические образцы; аспираты, полученные с помощью тонкой иглы; материал, полученный при аутопсии, и т.п. В некоторых вариантах осуществления изобретения, биологический образец берут у индивидуума, который был подвергнут воздействию представляющего интерес антигена. Индивидуумами могут быть любые животные, а предпочтительно, млекопитающие или человек. Индивидуум может страдать заболеванием или состоянием, включая опухоль, инфекционное заболевание или аутоиммунное заболевание, либо такой индивидуум может быть иммунизованным. В некоторых аспектах изобретения, индивидуум может пройти курс реабилитации или полностью излечиться от такого заболевания или состояния, как опухолевое заболевание, инфекционное заболевание или аутоиммунное заболевание. В других аспектах изобретения, индивидуум может проходить или уже прошел курс профилактического или терапевтического лечения заболевания или состояния, такой как противораковая терапия или лечение инфекционного заболевания, либо ему проводят вакцинацию, либо ему уже была проведена вакцинация. Так, например, индивидуум подвергается или подвергался воздействию антигена, который представляет собой инфекционное средство, опухолевый антиген, опухолевая клетка, аллерген или аутоантиген. Такими инфекционными средствами могут быть любые средства, такие как патогенные вирусы, патогенные бактерии, грибы, простейшие, многоклеточные паразиты и модифицированные белки, такие как прионы, а также нуклеиновые кислоты или антигены, происходящие от антигенов. Аллергеном могут быть любые непаразитарные антигены, способные стимулировать реакцию гиперчувствительности типа I у индивидуумов, такие как множество наиболее распространенных антигенов окружающей среды.
Клеточный сортинг с активированной флуоресценцией (FACS) может быть использован для сортировки (выделения) клеток, таких как популяция B-клеток памяти, посредством приведения в контакт клеток с соответствующим образом меченым антителом и сортировки клеток по их связыванию с меченым антителом. В одном из вариантов осуществления изобретения, несколько антител (таких как антитела, которые связываются с CD19, IgA, IgD и/или IgM) и FACS-сортинг могут быть использованы для продуцирования, по существу, очищенных популяций B-клеток памяти. Эти методы известны специалистам, и протоколы осуществления этих методов описаны в настоящей заявке.
В методе FACS используется множество каналов для красителей, каналов для детекции малоуглового рассеяния света и рассеяния света под тупым углом, и каналов сопротивления, а также и другие усложненные системы детекции, предназначенные для разделения или сортинга клеток, немеченных или меченных детектируемым маркером. При этом может быть применен любой FACS-метод, при условии, что он не будет оказывать негативное влияние на жизнеспособность нужных клеток. (Репрезентативные FACS-методы описаны в патенте США No.5061620). В одном из примеров используется клеточный сортер FACSARIA III (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Антитела могут быть конъюгированы с биотином, например, с авидином или стрептавидином, который связан с носителем, и который может быть затем удален, или с флуорохромами, которые могут быть использованы в FACS-методе для разделения клеток.
Однако, для очистки и выделения нужных популяций клеток могут быть применены и другие методы с различной эффективностью. Применяемые методы разделения должны обеспечивать максимальное сохранение жизнеспособности фракций собранных клеток. Очевидно, что выбор конкретного метода зависит от эффективности разделения; цитотоксичности, вносимой этим методом; простоты и скорости разделения и типа необходимого оборудования, и/или от компетенции технического персонала.
Способы разделения включают магнитное разделение с использованием магнитных сфер, покрытых антителом; аффинную хроматографию, разделение с использованием цитотоксических средств, либо связанных с моноклональным антителом, либо взятых в комбинации с комплементом; и «пэннинг», в котором применяется моноклональное антитело, присоединенное к твердой матрице, или другой стандартный метод. Для прямого разделения используются антитела, связанные с магнитными сферами и другими твердыми матрицами, такими как агарозные сферы, полистироловые сферы, мембраны из полого волокна и пластиковые чашки Петри. Клетки, связанные с антителом, могут быть удалены из клеточной суспензии путем простого физического отделения твердого носителя от клеточной суспензии. Конкретные условия и время инкубирования клеток с антителами, связанными с твердой фазой, зависят от ряда факторов, относящихся к используемой системе. Однако выбор соответствующих условий может быть с успехом сделан самим специалистом.
Затем несвязанные клетки собирают (при негативном отборе на связывание с иммунными сферами) или отмывают физиологическим буфером (при положительном отборе, который является предпочтительным в анализе на связывание с иммунными сферами), после чего их оставляют на определенный период времени, достаточный для того, чтобы клетки, экспрессирующие представляющий интерес маркер (например, CD19), связывались с антителами, присоединенными к твердой фазе. Затем связанные клетки отделяют от твердой фазы любым подходящим методом, в зависимости, главным образом, от природы твердой фазы и от типа используемого антитела. После проведения первого раунда отбора с использованием магнитных сфер может быть проведен второй раунд (и дополнительные раунды) для последующего выделения представляющей интерес клеточной популяции.
+
+
+
+
В некоторых вариантах осуществления изобретения клетки, экспрессирующие CD19, отделяют от других клеток посредством положительного отбора на экспрессию CD19 на клеточной поверхности. В одном из конкретных неограничивающих примеров, CD19-клетки подвергают положительному отбору FACS-методом путем мечения CD19-клеток CD19-специфическим антителом, конъюгированным с детектируемым маркером, а затем клетки, меченные антителом, конъюгированным с детектируемым маркером, подвергают FACS-отбору. CD19-специфические антитела, конъюгированые с детектируемыми маркерами, известным специалистам и могут быть закуплены, например, у компании BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ. В другом конкретном неограничивающем примере, CD19-клетки подвергают положительному отбору путем разделения на магнитных сферах, где магнитные сферы покрывают моноклональными антителами, реагирующими с CD19, и собирают клетки, иммобилизованные на иммунных сферах, реагирующих с CD19. После этого, CD19-клетки удаляют с магнитных сфер.
-
+
-
В других вариантах осуществления изобретения клетки, которые не экспрессируют IgA на клеточной поверхности, отделяют от других клеток путем отбора на отсутствие экспрессии IgA на клеточной поверхности. В одном из конкретных неограничивающих примеров, IgA-клетки подвергают негативному отбору FACS-методом путем мечения IgA-клеток IgA-специфическим антителом, конъюгированным с детектируемым маркером, а затем клетки, которые не были помечены IgA-специфическим антителом, конъюгированным с детектируемым маркером, подвергают FACS-отбору. IgА-специфические антитела, конъюгированные с детектируемыми маркерами, известны специалистам и могут быть закуплены, например, у компании Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. West Grove, PA. В другом конкретном неограничивающем примере, IgA-клетки подвергают негативному отбору путем разделения на магнитных сферах, где магнитные сферы покрывают моноклональным антителом, реагирующим с IgА, и собирают клетки, которые не были иммобилизованы на иммунных сферах.
-
+
-
В других вариантах осуществления изобретения клетки, которые не экспрессируют IgD на клеточной поверхности, отделяют от других клеток путем отбора на отсутствие экспрессии IgD на клеточной поверхности. В одном из конкретных неограничивающих примеров, IgD-клетки подвергают негативному отбору FACS-методом путем мечения IgD-клеток IgD-специфическим антителом, конъюгированным с детектируемым маркером, а затем клетки, которые не были помечены IgD-специфическим антителом, конъюгированным с детектируемым маркером, подвергают FACS-отбору. IgD-специфические антитела, конъюгированные с детектируемыми маркерами, известны специалистам и могут быть закуплены, например, у компании BD Pharmingen, Franklin Lakes, NJ. В другом конкретном неограничивающем примере, IgD-клетки подвергают негативному отбору путем разделения на магнитных сферах, где магнитные сферы покрывают моноклональным антителом, реагирующим с IgD, и собирают клетки, которые не были иммобилизованы на иммунных сферах.
-
+
-
В других вариантах осуществления изобретения клетки, которые не экспрессируют IgM на клеточной поверхности, отделяют от других клеток путем отбора на отсутствие экспрессии IgM на клеточной поверхности. В одном конкретном неограничивающем примере, IgM-клетки подвергают негативному отбору FACS-методом путем мечения IgM-клеток IgM-специфическим антителом, конъюгированным с детектируемым маркером, а затем клетки, которые не были помечены IgМ-специфическим антителом, конъюгированным с детектируемым маркером, подвергают FACS-отбору. IgМ-специфические антитела, конъюгированные с детектируемыми маркерами, известны специалистам и могут быть закуплены, например, у компании Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. West Grove, PA. В другом конкретном неограничивающем примере, IgM-клетки подвергают негативному отбору путем разделения на магнитных сферах, где магнитные сферы покрывают моноклональным антителом, реагирующим с IgМ, и собирают клетки, которые не были иммобилизованы на иммунных сферах.
+
-
-
-
+
-
-
-
+
-
-
-
+
-
-
-
В других вариантах осуществления изобретения клетки, которые экспрессируют CD19, но не экспрессируют IgA, IgD или IgM на своей поверхности, отделяют от других клеток путем положительного отбора на экспрессию CD19 на клеточной поверхности и негативного отбора на экспрессию IgA, IgD и IgM на клеточной поверхности. С применением таких методов могут быть собраны CD19IgAIgDIgM-клетки. В одном конкретном неограничивающем примере, CD19IgAIgDIgM-клетки отбирают с помощью FACS путем мечения клеток четырьмя антителами, специфичными к CD19, IgA, IgD и IgM, каждое из которых конъюгировано с детектируемым маркером, который может быть дифференциально детектирован с помощью FACS-анализа. Затем проводят FACS для сортинга CD19IgAIgDIgM-клеток. Специалист в данной области может легко провести FACS-анализ и установку соответствующих гейтов (заданных диапазонов отображения данных) для выделения CD19IgAIgDIgM-клеток.
Приведение в контакт B-клеток с CD40L, IL-2 и IL-21
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенные В-клетки памяти приводят в контакт с CD40L, IL-2 и IL-21 в течение периода времени, достаточного для деления В-клеток памяти и продуцирования ими антител. В некоторых вариантах осуществления изобретения, популяцию выделенных В-клеток памяти приводят в контакт с CD40L, IL-2 и IL-21 путем инкубирования популяции В-клеток памяти с CD40L, IL-2 и IL-21 в течение приблизительно 10-15 дней. В дополнительных вариантах осуществления изобретения, популяцию выделенных В-клеток памяти инкубируют с CD40L, IL-2 и IL-21 приблизительно в течение 13 дней. В некоторых вариантах осуществления изобретения, В-клетки приводят в контакт с CD40L, IL-2 и IL-21 в течение периода времени, достаточного для деления В-клеток памяти и продуцирования ими антител. В соответствии с этим, достаточное количество времени может составлять по меньшей мере 5 дней, а именно, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 дней, 21 день или 22 дня, например, 5-22, 5-21, 10-20, 10-15, 11-16 или 13-15 дней. B-клетки могут быть приведены в контакт с CD40L, IL-2 и IL-21 в среде для культивирования, такой как модифицированная по способу Дульбекко среда Исков (IMDM) с 10% фетальной бычьей сывороткой или в другой среде для культивирования ткани, используемой для культивирования B-клеток. Такие среды известны специалистам в данной области.
CD40L (также известный как лиганд CD40 или CD154) представляет собой белок, который, главным образом, экспрессируется, например, на активированных T-клетках, но он также может присутствовать и в растворимой форме. CD40L связывается с CD40 на поверхности В-клеток, и такое связывание может приводить к активации В-клеток, дифференцировке зрелых В-клеток в плазматические клетки и клетки памяти, и к продуцированию антител. CD40L известен специалистам и является коммерчески доступным (см., например, Life Technologies Cat. No. PHP0024). В некоторых вариантах осуществления изобретения, B-клетки приводят в контакт с CD40L путем культивирования В-клеток с клеточной линией, которая экспрессирует CD40L, такой как CD40L-экспрессирующая клеточная линия-фидер. CD40L-экспрессирующая клеточная линия-фидер известна специалистам (см., например, Kershaw et al., Cancer Res., 61:7920-7924, 2001). Типичные концентрации CD40L, используемые в описанных методах, составляют 1-2000 Международных единиц на миллилитр, например, 100 Международных единиц на миллилитр. Репрезентативные последовательности нуклеиновой кислоты и полипептидные последовательности CD40L человека имеются на web-сайте NCBI в GENBANK рег. № NM_000074.2 и GENBANK рег. № NP_000065.1, соответственно (созданных 13 июня, 2012), которые вводятся в настоящее описание посредством ссылки.
IL-2 является коммерчески доступным (см., например, Life Technologies, Grand Island, NY, Cat. No. PHP0021). Репрезентативные последовательности нуклеиновой кислоты и полипептидные последовательности IL-2 человека имеются на web-сайте NCBI в GENBANK рег. №. NM_000586.3 и GENBANK рег. № NP_000577.2, соответственно (созданных 13 июня, 2012), которые вводятся в настоящее описание посредством ссылки. Типичные концентрации IL-2, используемые в описанных методах, составляют 10-200 Международных единиц на миллилитр, например, 100 Международных единиц на миллилитр.
IL-21 также является коммерчески доступным (см., например, Life Technologies, Grand Island, NY, Cat. No. PHP0021). Репрезентативные последовательности нуклеиновой кислоты и полипептидные последовательности IL-21 человека имеются на web-сайте NCBI в GENBANK рег. №. NM021803 и GENBANK рег. № AF254069, соответственно. Эти web-сайты GENBANK вводятся в настоящее описание посредством ссылки. В некоторых вариантах осуществления изобретения, выделенные B-клетки приводят в контакт приблизительно с 10-100 нг/мл IL-21, например, приблизительно 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 нг/мл IL-21, например, В-клетки памяти могут быть приведены в контакт с 10-100, 20-90, 30-80, 40-70, 40-60 или 45-55 нг/мл IL-21. Типичные концентрации IL-21, используемые в описанных методах, составляют 5-500 нг/мл IL-21, например, 50 нг/мл IL-21.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, приведение в контакт В-клеток памяти с комбинацией CD40L, IL-2 и IL21 дает синергический эффект, то есть, уровни деления клеток и продуцирования антител, наблюдаемые для В-клеток памяти, контактируемых с этими тремя молекулами, взятыми в комбинации друг с другом, превышают суммарный уровень, наблюдаемый с использованием этих молекул по отдельности.
Отбор В-клеток, продуцирующих представляющее интерес антитело
В некоторых вариантах осуществления изобретения, субпопуляции В-клеток, которые приводят в контакт с CD40L, IL-2 и IL-21 в течение периода времени, достаточного для деления В-клеток памяти и продуцирования ими антител, анализируют на экспрессию антител, специфически связывающихся с представляющим интерес антигеном. Методы определения уровня связывания антитела с представляющим интерес антигеном известны специалистам и содержат ELISA-анализы и анализы на нейтрализацию.
Существует три общих класса репрезентативных методов скрининга, которые могут быть проведены, а именно: (a) анализы на захват антитела; (b) анализы на захват антигена; и (c) функциональный скрининг. Могут быть также применены комбинации этих методов. В анализах на захват антитела, антиген может быть связан с твердой фазой, а затем моноклональные антитела могут быть протестированы на связывание с антигеном, после чего несвязанные антитела могут быть удалены путем промывки с последующей детекцией связанных антител, например, с использованием второго реагента, такого как меченое антитело, которое специфически распознает данное антитело. В анализе на захват антигена, антиген может быть подвергнут прямому мечению. В одном из вариантов осуществления изобретения, тестируемые моноклональные антитела могут быть связаны с твердой фазой, а затем подвергнуты взаимодействию с необязательно меченным антигеном. Альтернативно, комплекс антитело-антиген может быть образован путем иммунопреципитации с последующим связыванием тестируемого моноклонального антитела с твердой фазой. После связывания комплексов антитело-антиген с твердой фазой, несвязанный антиген может быть удален путем промывки, и положительные комплексы могут быть идентифицированы путем детекции антигена.
Для идентификации моноклональных антител с нужной активностью применяются различные методы функционального скрининга. Примерами таких методов являются анализ на нейтрализацию вируса; анализ на агонистическую активность и анализ на блокирование; анализ на адгезию монослоя кератиноцитов и анализ на смешанный лимфоцитарный (MLR) ответ (Werther et al. J. Immunol. 157:4986-4995 (1996)); анализы на ингибирование роста опухолевых клеток (например, описанные в публикации заявки PCT No. WO 89/06692); анализы на антитело-зависимую клеточную цитотоксичность-1 (ADCC) и комплемент-опосредованную цитотоксичность (CDC) (патент США No.5500362); и анализы на гемопоэз (см. WO 95/27062). Класс/подкласс этих антител может быть определен, например, с помощью анализа методом двойной диффузии; анализа на захват антитела на планшетах, покрытых антигеном; и/или анализ на захват антитела анти-IgG антителами.
Для скрининга антител, которые связываются с конкретным эпитопом на представляющем интерес антигене, может быть проведен рутинный анализ на перекрестное блокирование, например, анализ, описанный в публикации Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988). Альтернативно, для того, чтобы определить, может ли антитело связываться с представляющим интерес эпитопом, может быть осуществлено картирование эпитопов, например, описанное в публикации Champe et al. (J. Biol. Chem. 270:1388-1394 (1995)).
Если было определено, что субпопуляция В-клеток памяти продуцирует антитела, которые специфически связываются с представляющим интерес антигеном, то могут быть проведены дополнительные стадии выделения из данной субпопуляции моноклонального антитела, специфически связывающегося с представляющим интерес антигеном. Так, например, из субпопуляции выделяют В-клетки, содержащие вариабельную область тяжелой цепи и легкой цепи гена иммуноглобулина, а затем получают моноклональные антитела, содержащие вариабельную область тяжелой цепи и легкой цепи, и анализируют уровень специфического связывания моноклональных антител с представляющим интерес антигеном (например, путем проведения ELISA-анализа или анализа на нейтрализацию).
В некоторых аспектах изобретения может быть получена информация о последовательностях нуклеиновой кислоты. Метод получения информации о последовательности нуклеиновой кислоты может включать определение последовательности нуклеиновой кислоты. Для определений последовательностей нуклеиновой кислоты могут быть применены любые методы секвенирования нуклеиновых кислот, известные специалистам, включая выскоэффективный метод секвенирования ДНК. Неограничивающими примерами выскоэффективных методов секвенирования являются секвенирование путем синтеза (например, секвенирование 454), секвенирование путем лигирования, секвенирование путем гибридизации, секвенирование одной молекулы ДНК, мультиплексное секвенирование ПЦР-колоний (в англоязычной литературе называемых polony), секвенирование нанопор или их комбинации.
В другом варианте осуществления изобретения способ может включать (a) выделение РНК из субпопуляции В-клеток; (b) транскрипцию РНК в кДНК; (c) амплификацию из кДНК первого пула молекул ДНК с использованием первой смеси олигонуклеотидов, содержащей по меньшей мере два олигонуклеотида, обладающих способностью амплифицировать области, кодирующие вариабельный домен тяжелой цепи; (d) амплификацию из кДНК второго пула молекул ДНК с использованием второй смеси олигонуклеотидов, содержащей по меньшей мере два олигонуклеотида, обладающих способностью амплифицировать области, кодирующие вариабельный домен легкой цепи, и необязательно, (e) связывание образцов первой и второй молекул ДНК-пула друг с другом посредством ДНК, кодирующей указанную линкерную область (LR).
Клонирование вариабельных областей представляет собой стандартную процедуру, по существу, известную специалистам и описанную применительно к различным видам, включая человека, приматов, не являющихся человеком, мышей, кроликов и кур. Описание можно найти в публикациях Barbas III et al. (eds.), Phage Display-A Laboratory manual, Cold Spring Harbour Press, 2001, в частности, в главе Andris-Widhopf et al., Generation of Antibody Libraries: PCR Amplification and Assembly of Light- and Heavy-chain Coding Sequences. Andris-Widhopf и сотрудниками описаны последовательности олигонуклеотидов, способные амплифицировать области, кодирующие вариабельную область (VR-кодирующие области), предпочтительно, области, кодирующие вариабельный домен тяжелой цепи, или области, кодирующие вариабельный домен легкой цепи. Кроме того, олигонуклеотиды, способные амплифицировать области, кодирующие вариабельный домен тяжелой цепи, или области, кодирующие вариабельный домен легкой цепи, а предпочтительно, области, кодирующие вариабельный домен тяжелой цепи человека, или области, кодирующие вариабельный домен легкой цепи человека, могут быть сконструированы путем сравнения известных последовательностей антитело-кодирующих областей, которые могут быть взяты из баз данных, таких как, например, Immunogenetics (imgt.cines.fr/), Kabat (Kabatdatabase.com), и Vbase (vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/), и путем идентификации консенсусных последовательностей, которые могут быть использованы для создания праймеров. Олигонуклеотиды, способные амплифицировать области, кодирующие вариабельный домен тяжелой цепи, или области, кодирующие вариабельный домен легкой цепи, где праймеры могут содержать рестрикционные сайты, подходящие для клонирования амплифицированных продуктов, и где олигонуклеотиды также кодируют линкерную область, известны специалистам. Дополнительные стратегии по амплификации и клонированию вариабельных доменов описаны в публикациях Sblattero & Bradbury (1998) Immunotechnology 3:271-278 и Weitkamp et al. (2003), J. Immunol. Meth. 275:223-237.
H
L
H
L
В некоторых примерах, гены вариабельной области тяжелой цепи и легкой цепи иммуноглобулина могут быть амплифицированы с помощью ОТ-ПЦР известными методами (см., например, Tiller et al., J. Immunological Methods, 329:112-124, 2008). ПЦР-продукт, содержащий ДНК V-или V-области, может быть клонирован в соответствующие Igγ1-, Igk- и Igλ-векторы экспрессии, которые могут быть использованы для совместного переноса в пермиссивную клеточную линию (такую как клетки 293T) для экспрессии и продуцирования моноклонального антитела. В некоторых примерах, полноразмерный IgG1 может быть очищен стандартными методами, а затем протестирован на связывание с представляющим интерес антигеном (например, с помощью ELISA-анализа или анализа на нейтрализацию). Для специалиста в данной области очевидно, что векторы экспрессии могут быть экспрессированы в любой пермиссивной клеточной линии или у индивидуума для тестирования (например, в клеточной линии млекопитающего, в клеточной линии растения), либо эти вирусные векторы экспрессии могут быть использованы для экспрессии в клеточной линии или в организме. Кроме того, белки, содержащие последовательность, кодируемую ДНК V-или V-области, могут быть продуцированы путем синтеза для тестирования.
Некоторые варианты осуществления изобретения, относящиеся к способам идентификации представляющих интерес антител
+
-
-
-
Некоторые варианты осуществления изобретения включают способ получения моноклонального антитела, специфически связывающегося с антигеном-мишенью, где способ включает: (a) выделение популяции В-клеток памяти у индивидуума, который был подвергнут воздействию антигена-мишени, где В-клетками памяти являются CD19IgAIgDIgM-В-клетки; (b) приведение в контакт выделенной популяции В-клеток памяти с эффективным количеством IL-21, IL-2 и CD40; (c) выделение молекул нуклеиновой кислоты из выделенной популяции В-клеток памяти; (d) амплификацию нуклеиновых кислот, кодирующих вариабельные области тяжелой цепи и вариабельные области легкой цепи; (e) экспрессию вариабельных областей тяжелой цепи и вариабельных областей легкой цепи из нуклеиновых кислот с получением молекул антитела, состоящих из вариабельных областей тяжелой цепи и вариабельных областей легкой цепи; и (f) отбор моноклонального антитела, специфически связывающегося с антигеном-мишенью.
+
-
-
-
Некоторые варианты осуществления изобретения включают способ выделения репертуара В-клеток, специфичных к антигену-мишени, у индивидуума, где способ включает: (a) выделение популяции В-клеток памяти у индивидуума, который был подвергнут воздействию антигена-мишени, где В-клетками памяти являются CD19IgAIgDIgM-В-клетки; (b) приведение в контакт выделенной популяции В-клеток памяти с эффективным количеством IL-21, IL-2 и CD40; и (c) отбор В-клеток из популяции В-клеток, экспрессирующих антитела, которые специфически связываются с антигеном-мишенью, и тем самым, выделение репертуара В-клеток, специфичных к антигену-мишени, у индивидуума.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, антигеном-мишенью является антиген, представляющий от патогена, такого как вирусы, грибы, паразиты или бактерии. Антиген может происходить от вируса, например, вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), такого как ВИЧ-1. В некоторых вариантах осуществления изобретения, антигеном может быть gp41 ВИЧ-1. В некоторых вариантах осуществления изобретения, в которых антигеном-мишенью является антиген ВИЧ, индивидуумом является индивидуум, инфицированный ВИЧ, таким как ВИЧ-1. В других вариантах осуществления изобретения, антигеном-мишенью является раковый антиген. В некоторых таких вариантах осуществления изобретения, индивидуумом является индивидуум, страдающий злокачественным новообразованием. В других вариантах осуществления изобретения, антигеном-мишенью является аутоантиген. Так, например, в некоторых вариантах осуществления изобретения, антигеном-мишенью является токсин, такой как бактериальный токсин, например, токсин сибирской язвы. В других вариантах осуществления изобретения, антигеном-мишенью является антиген, введенный в вакцину. Специалисту в данной области совершенно очевидно, что антигеном-мишенью может быть любой антиген, против которого у индивидуума вырабатывается В-клеточный ответ, приводящий к продуцированию В-клеток памяти, способствующих вырабатыванию антитела, специфически связывающегося с антигеном-мишенью.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, выделенной популяцией В-клеток памяти является репрезентативный репертуар В-клеток у индивидуума, специфичных к антигену-мишени.
В некоторых вариантах описанных в настоящем документе способов, приведение в контакт выделенной популяции В-клеток памяти с CD40L включает инкубирование выделенных В-клеток памяти с клетками-фидерами, экспрессирующими CD40L.
В дополнительных вариантах осуществления описанных в настоящем документе способов приведение в контакт выделенной популяцией В-клеток памяти с CD40L, IL-2 и IL-21 содержит инкубирование выделенной популяции В-клеток памяти с CD40L, IL-2 и IL-21 в течение приблизительно 10-15 дней, например, приблизительно 13 дней.
Примеры
Нижеследующие примеры приводятся для иллюстрации конкретных признаков некоторых вариантов осуществления изобретения, однако, объем настоящего изобретения не должен ограничиваться этими признаками.
Пример 1
Выделение и характеризация нейтрализующих MPER-специфических моноклональных антител широкого спектра
В этом примере проиллюстрированы выделение и характеризация связывающих антител, специфичных к gp41 ВИЧ-1, у индивидуума, инфицированного ВИЧ-1.
Краткое описание. Характеризация моноклональных антител человека позволяет лучше понять механизмы нейтрализации ВИЧ-1 широкого спектра. В этом примере описано выделение антитела, специфичного к мембрано-проксимальной внешней области (MPER) gp41 ВИЧ-1, где антитело было обозначено 10E8, и это антитело нейтрализует ~98% тестируемых вирусов. Анализ сыворотки, взятой у 78 здоровых ВИЧ-1-инфицированных доноров показал, что у 27% доноров присутствовали MPER-специфические антитела, а у 8% доноров присутствовали 10E8-подобные антитела. В отличие от других нейтрализующих MPER-специфических антител, 10E8 не связывается с фосфолипидами, не является аутореактивным и связывается с оболочкой клеточной поверхности. Анализ структуры 10E8 в комплексе с полноразмерной MPER выявил сайт восприимчивости, содержащий короткий фрагмент из высококонсервативных гидрофобных остатков gp41 и имеющие важное значение остатки Arg/Lys, расположенные непосредственно перед трансмембранной областью. Анализ резистентных вариантов ВИЧ-1 подтвердил важную роль этих остатков в нейтрализации. Высококонсервативная MPER является мишенью для активных и не обладающих аутореактивностью нейтрализующих антител, что дает основание предположить, что вакцины на основе ВИЧ-1 должны индуцировать вырабатывание антител против этой области Env ВИЧ-1.
Введение. Индуцирование гуморального ответа, способного нейтрализовать различные изоляты ВИЧ-1, является решающим фактором при получении вакцин, обеспечивающих защиту от ВИЧ-1-инфекции. Самым главным препятствием для достижения этой цели является возможное появление чрезвычайно большого разнообразия мишеней для нейтрализующих антител, а именно, оболочечного гликопротеина (Env). Хотя вакцины обычно не способны индуцировать нейтрализующие гуморальные ответы широкого спектра, однако, имеются примеры хронически инфицированных пациентов, сыворотка которых нейтрализовала очень большое разнообразие изолятов ВИЧ-1. Наличие таких индивидуумов свидетельствует о возможности вырабатывания человеческих гуморальных ответов, нейтрализующих широкое разнообразие штаммов ВИЧ-1, хотя механизмы индуцирования или опосредования таких ответов пока еще полностью не изучены (Haynes et al., Nat. Biotechnol. 30, 423-433, 2012; Walker et al., Curr. Opin. Immunol. 22, 358-366, 2010).
В последнее время, выделение и характеризация моноклональных антител человека из клеток, взятых у хронически инфицированных пациентов, послужили значительному прогрессу в понимании специфичности и механизмов, лежащих в основе вырабатывания нейтрализующих гуморальных ответов против ВИЧ-1 широкого спектра. Env присутствует на вирионе и на поверхности инфицированной клетки в виде тримера гетеродимеров, состоящих из субъединиц gp120 и gp41. До настоящего времени было выделено лишь небольшое число нейтрализующих моноклональных антител широкого спектра (mAb), а именно, одно антитело, которое связывается с CD4-связывающим сайтом на gp120 (b12); одно антитело, которое связывается с гликаном, локализованном на внешнем домене gp120 (2G12); и три антитела, которые связываются с мембрано-проксимальной внешней областью (MPER) на gp41 (2F5, Z13e1 и 4E10; Zwick et al., J. Virol. 75, 10892-10905, 2001; Burton et al., Science 266, 1024-1027, 1994; Muster et al., J. Virol. 67, 6642-6647, 1993). Совсем недавно были обнаружены антитела, имеющие значительно более широкий спектр нейтрализации и более высокую активность, направленную на CD4-связывающий сайт оболочечного белка (прототипом которого является VRC01; Bonsignori et al., J. Virol. 86, 4688-4692, 2012; Wu at al., Science 333, 1593-1602, 2011; Scheid et al., Science 333, 1633-1637, 2011; Wu et al., Science 329, 856-861, 2010), и на гликан-содержащие области V1/V2 и V3 gp120 (прототипами которых являются PG9 и PGT128; Walker et al., PLoS Pathog 6, el001028, 2010; Walker et al., Nature 477, 466-470, 2011; Bonsignori et al., J. Virol. 85, 9998-10009, 2011; Walker et al., Science 326, 285-289, 2009). Специфичность этих новых антител позволяет получить важную информацию об антигенах-мишенях на Env, против которых вырабатывается гуморальный иммунный ответ, опосредующий нейтрализацию широкого спектра с высокой эффективностью. Однако в настоящее время отсутствуют данные о таких специфичностях для многих хронически инфицированных пациентов данной группы, что позволяет предположить, что эффективная нейтрализация широкого спектра может опосредоваться антителами с другой специфичностью.
В этом примере описано выделение активного MPER gp41-специфического mAb человека широкого спектра, 10E8, у ВИЧ-1-инфицированного индивидуума с высокими титрами нейтрализации. 10E8 представляет собой одно из самых активных антител широкого спектра, описанных в настоящее время, однако, многие свойства MPER-специфических антител, включая связывание с липидом и аутореактивность, пока еще не изучены, а поэтому, для вакцинной или пассивной терапии, MPER-специфические антитела не могут быть применены с достаточной эффективностью. Кроме того, исследования кристаллической структуры 10E8, наряду с другими биохимическими связывающими свойствами, продемонстрировали, что спектр действия 10E8 опосредуется его уникальным механизмом распознавания структурно консервативного сайта восприимчивости в MPER gp41.
+
-
-
-
Выделение и нейтрализующие свойства 10E8. Для определения специфичности и связывающих свойств, которые лежат в основе вырабатывания нейтрализующего гуморального ответа широкого спектра, были разработаны методы, позволяющие выделять моноклональные антитела человека без учета информации об их специфичности (Walker at al.,. Science 326, 285-289, 2009). Сыворотка, взятая у одного донора, N152, обнаруживала самый широкий спектр нейтрализации и самую высокую активность у 1% индивидуумов данной группы по отношению к панели псевдовирусов 20 перекрестных кладотипов (фиг. 17; Doria-Rose et al., J. Virol. 84, 1631-1636, 2010). CD19IgAIgDIgM-В-клетки памяти, выделенные из периферической крови данного пациента, сортировали и размножали в течение 13 дней с использованием клеток-фидеров, экспрессирующих IL-2, IL-21 и CD40-лиганд. Супернатанты ~16500 B-клеточных культур скринировали, и гены IgG в лунках с нейтрализующей активностью клонировали и снова экспрессировали (Tiller at al., Journal of immunological methods 329, 112-124, 2008), в результате чего было выделено два новых антитела (10E8 и 7H6).
Анализ нуклеотидной последовательности ДНК, кодирующей 10E8 и 7H6, показал, что оба этих антитела представляют собой антитела IgG3 и являются соматическими вариантами одного и того же клона IgG. Эти антитела происходили от генов IGHV3-15*05 и IGLV3-19*01 зародышевой линии и, по сравнению с зародышевой линией, имели высокий уровень соматических мутаций в генах вариабельных областей тяжелой цепи (21%) и легкой цепи лямбда (14%). Эти антитела также имели длинную петлю гипервариабельной области тяжелой цепи (CDR H3), состоящую из 22 аминокислот (фиг. 1A). Тяжелые цепи 10E8 и 7H6 были идентичными, а их легкие цепи отличались только двумя остатками (фиг. 6).
Для оценки нейтрализующей активности клональных вариантов, эти варианты были сначала протестированы на 5 Env-псевдовирусов (фиг. 17A), а затем было отобрано mAb 10E8 для дальнейших исследований. Для того чтобы определить, является ли нейтрализующая активность 10E8 характерной для всех нейтрализующих антител, присутствующих в сыворотке пациента-донора N152, панель специфичности нейтрализующих антител расширяли до 20 Env-псевдовирусов, и 10E8 тестировали одновременно с сывороткой донора N152. Хотя профили нейтрализации в высокой степени резистентных вариантов имели некоторое сходство, однако, корреляция нейтрализующей IC50 mAb 10E8 и ID50 сыворотки N152 не достигала статистической значимости (p=0,11; фиг. 7 и 17B). Эти данные позволяют предположить, что, хотя 10E8 может играть главную роль в нейтрализации, однако, полный спектр нейтрализации сывороткой N152, очевидно, опосредуется смесью 10E8-подобных или других антител.
50
50
Затем, для сравнения активности и спектра нейтрализующего действия 10E8 с активностью и спектром нейтрализующего действия других анти-ВИЧ-1 антител, 10E8 было протестировано на панели из 181 изолята Env-псевдовируса одновременно с 4E10, 2F5, VRC01, NIH45-46, 3BNC117, PG9 и PG16 (фиг. 1B и фиг. 17C-17F). При IC50 ниже 50 мкг/мл, 10E8 нейтрализовало 98% тестируемых псевдовирусов, а антитело 4E10 нейтрализовало 98% тестируемых псевдовирусов, и VRC01 нейтрализовало 89% тестируемых псевдовирусов. Однако при IC ниже 1 мкг/мл 10E8 нейтрализовало 72% тестируемых вирусов, а антитело 4E10 нейтрализовало 37% тестируемых вирусов. Среднее и геометрическое среднее IC для 10E8 составляло ниже 1 мкг/мл. Таким образом, 10E8 опосредует активную нейтрализацию широкого спектра вирусов, и такая активность была сравнима с активностью некоторых наиболее доступных моноклональных антител.
Специфичность к эпитопу для 10E8 и связывание с этим эпитопом. В целях картирования эпитопа для антитела 10E8, связывание с различными субобластями Env анализировали с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). 10E8 сильно связывалось с gp140, gp41 и с пептидом MPER, специфичным для 4E10, но не с gp120 (фиг. 2A). В целях дополнительного картирования эпитопа для 10E8 в MPER оценивали связывание 10E8 с перекрывающимися пептидами, специфичными для 2F5 (656-671), Z13e1 (666-677) и 4E10 (671-683). 10E8 связывалось с полноразмерной MPER и с 4E10-специфичными пептидами, но не с 2F5- или Z13e1-специфичными пептидами. Что касается эпитопа для 4E10, то при тестировании пептида с усеченным С-концом, 4E10.19 (671-680), связывание 10E8 было значительно более слабым, что позволяет предположить, что три концевых аминокислоты MPER, Tyr681, Ile682 и Arg683, играют решающую роль в связывании 10E8 (фиг. 8A). В соответствии с этими результатами можно сделать вывод, что лишь полноразмерный MPER и 4E10-специфичные пептиды блокировали 10E8-опосредуемую нейтрализацию химерного вируса C1, содержащего Env ВИЧ-2 и MPER ВИЧ-1 (фиг. 8B). В целом, эти данные позволяют предположить, что минимальный эпитоп для 10E8 расположен в положениях остатков 671-683 MPER, хотя нельзя исключать присутствия дополнительных контактов с амино-концом MPER.
JR2
90
50
Для более точного картирования эпитопа для 10E8 панель мутантных аланин-сканирующих пептидов MPER в остатках 671-683 использовали для блокирования 10E8-нейтрализации химерного вируса C1 в анализе TZM-bl (фиг. 2B; Brunei at al., J. Virol. 80, 1680-1687, 2006). Для этих анализов, основным пептидом был пептид MPER 4E10.22 (CNWFDITNWLWYIRKKK; SEQ ID NO: 14) с аланиновыми заменами. Пептиды MPER с аланиновыми заменами в положениях Trp672, Phe673 или Thr676 не блокировали нейтрализацию антителами 4E10 или 10E8, что позволяет предположить, что эти остатки играют решающую роль в связывании с 4E10 и 10E8. Было обнаружено, что остаток Asn671 и остаток Arg683, которые не являются необходимыми для связывания с 4E10, играют решающую роль в связывании с 10E8 и нейтрализации антителом 10Е8 (фиг. 2B и 18). Была также протестирована способность 10E8 нейтрализовать псевдовирусы ВИЧ-1с аланиновыми заменами в MPER в положениях остатков 660-683 (фиг. 19). Влияние аланиновых замен на связывание с пептидом указывало на то, что остатки Asn671 и Arg683 играют важную роль в нейтрализующей активности антитела 10E8, но не антитела 4E10. Введение отдельных аланиновых замен в положениях остатков 671-673, 680 и 683 приводило к снижению восприимчивости к нейтрализующей активности 10E8, которое было наиболее заметным при концентрации IC, но не при концентрации IC. Хотя механизм такого феномена пока не ясен, однако, аналогичный эффект наблюдался в том случае, когда мутации в MPER вызывали частичную резистентность к 4E10 (Zwick at al., J. Virol. 79, 1252-1261, 2005). В целом, полученные результаты позволяют предположить, что 10E8 распознает новый эпитоп, который перекрывается с эпитопами для известных 4E10 и Z13e1, но отличается своей большой зависимостью от связывания с остатком Asn671 и с остатком Arg683, являющимся последним остатком MPER.
D
D
Затем было проведено исследование для того, чтобы определить, может ли более высокая нейтрализующая активность 10E8, по сравнению с активностью других анти-MPER антител, ассоциироваться с более высокой аффинностью связывания с MPER. Кинетику связывания Fab 10E8, 2F5 и 4E10 оценивали путем иммобилизации биотинилированного пептида, содержащего полноразмерную MPER (656-683), на чипе методом поверхностно-плазмонного резонанса. В отличие от его более высокой нейтрализующей активности, Kдля антитела 10E8 против этого пептида MPER была ниже, чем Kдля 2F5 и 4E10, то есть, она составляла 17 нМ для 10E8; 3,8 нМ для 2F5 и 0,74 нМ для 4E10 (фиг. 9). Поэтому аффинность 10E8 по отношению к MPER, которая представлена в форме растворимого пептида, не может служить объяснением его более высокой нейтрализующей активности по сравнению с активностью других MPER-специфических антител.
Преобладание 10E8-подобных антител. Затем было проведено исследование на преобладание MPER-специфических и 10E8-подобных нейтрализующих антител у группы ВИЧ-1-инфицированных доноров. После этого было отобрано 78 сывороток у группы индивидуумов с концентрацией ID50>100, нейтрализующей по меньшей мере один псевдовирус в мини-панели из 5 вирусов (Doria-Rose et al., J. Virol. 84, 1631-1636, 2010). Среднее время после установления диагноза у этих доноров составляло 13,5 лет, среднее число CD4-клеток составляло 557 клеток/мкл, среднее число копий РНК ВИЧ в плазме составляло 5573 копий/мл, и эти доноры не проходили антиретровирусную терапию. Была протестирована нейтрализация химерного вируса C1 ВИЧ-2/ВИЧ-1 (фиг. 20). Из 78 сывороток, 21 сыворотка обнаруживала нейтрализующую активность против вируса С1 ВИЧ-2/ВИЧ-1 (фиг. 21). Для картирования области, которая является мишенью для этих сывороток, оценивали уровень нейтрализации с использованием 7 химер ВИЧ-2/ВИЧ-1, содержащих субдомены MPER (фиг. 20; Gray et al., J. Virol. 81, 6187-6196, 2007). Из 21 сыворотки, обладающей нейтрализующей активностью против полноразмерного MPER, 8 сывороток обнаруживали профиль нейтрализации, аналогичный профилю, наблюдаемому для 10E8, который приводил к нейтрализации только тех химерных вирусов ВИЧ-2/ВИЧ-1, которые содержали концевой остаток Arg683 MPER (C4, C4GW и C8; фиг. 21). Для дополнительного подтверждения этих результатов использовали пептиды, соответствующие различным частям MPER и блокирующие нейтрализацию химеры C1 ВИЧ-2/ВИЧ-1 этой сывороткой (фиг. 22). Было обнаружено, что из 8 сывороток, которые имели профиль нейтрализации химер 10E8-подобным антителом, 3 сыворотки с 10E8-подобной активностью были блокированы пептидами. Другие 3 из 8 10E8-подобных сывороток были блокированы пептидами с профилями, соответствующими профилям комбинации 10E8- и Z13e1-подобных антител. 6 пациентов, у которых сыворотка обладала 10E8-подобной активностью, не отличались от остальных 72 пациентов в отношении клинического течения болезни или уровня нейтрализации ВИЧ (см. надписи к фиг. 10). В целом, 27% из всех протестированных сывороток пациентов обладали MPER-нейтрализующей активностью. Такое преобладание было значительно выше, чем это наблюдалось ранее в предшествующих исследованиях, что, возможно, связано с выбором доноров, у которых, как известно, наблюдалась нейтрализующая активность (Gray et al., J. Virol. 83, 8925-8937, 2009; Tomaras et al., J. Virol. 85, 11502-11519, 2011; Morris at al., PLoS ONE 6, e23532, 2011; Gray et al., J. Virol. 83, 11265-11274, 2009). Кроме того, 8% из протестированных сывороток имели 10E8-подобные антитела (фиг. 10), что позволяет предположить, что 10E8-подобные антитела являются не такими уж редкими.
Анализ на аутореактивность 10E8. Общим свойством ранее охарактеризованных анти-MPER mAb 2F5 и 4E10 является их перекрестная реактивность с аутоантигенами (Haynes at al., Science 308, 1906-1908, 2005). Кроме того, очевидно, что связывание с клеточной мембраной и с Env-тримером играет важную роль в оптимальной нейтрализации этими антителами, и что такая аутореактивность может препятствовать вырабатыванию аналогичных антител вакциной (Haynes at al., Science 308, 1906-1908, 2005; Alam et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 106, 20234-20239, 2009). Анализ, проводимый методом поверхностно-плазмонного резонанса, показал, что 10E8 не связывается с анионными фосфолипидами, такими как липосомы, содержащие фосфатидилхолин-кардиолипин (PC-CLP) и фосфатидилхолин-фосфатидилсерин (PC-PS) (фиг. 3A). 10E8 также не связывалось с эпителиальными клетками HEР-2, в отличие от антител 2F5 и 4E10, которые связывались в цитоплазме и ядре (фиг. 3B). Кроме того, антитело 10E8 не связывалось с аутоантигенами, такими как антигены А и В, связанные с синдромом Сьегрена; антиген Смита, рибонуклеопротеин, антиген 70, связанный со склеродермией, антиген Jo1, центромер В и гистон (фиг. 23). В целом, эти результаты позволяют предположить, что 10E8, в отличие от других анти-MPER антител, не является аутореактивным.
JRFL
JRFL
Доступность вириона для 10E8. Было обнаружено, что антитела 2F5 и 4E10 относительно плохо связываются с шипом оболочки ВИЧ-1 на поверхности инфицированных клеток или с не-клеточными вирионами, и более эффективно реагируют с Env после его связывания с рецептором CD4 (Chakrabarti et al., J. Virol. 85, 8217-8226, 2011). Был определен уровнь связывания с расщепленными шипами всей оболочки на ВИЧ-трансфицированных клетках (фиг. 11A). Хотя антитело 10E8, в том случае, если оно является доступным, связывается менее эффективно, чем другие антитела, такие как VRC01 или F105, однако, это антитело связывается более эффективно, чем 2F5 или 4E10. В отличие от результатов, полученных в случае аланиновых замен, мутация в области 4E10 (F673S), связывающейся с шипами полноразмерной оболочки ВИЧ, приводит к усилению связывания 10E8, несмотря на то, что механизм такого усиления остается неясным. Мутация в области 2F5 (K665E) не влияет на связывание 10E8. Эти данные позволяют предположить, что 10E8 имеет несколько больший доступ к эпитопу MPER на клеточной поверхности, чем 2F5 или 4E10.
Для анализа на связывание с не-клеточным вирусом, вирионы инкубировали с антителом, а затем несвязанное антитело удаляли путем промывки и тестировали на нейтрализацию (Chakrabarti et al., J. Virol. 85, 8217-8226, 2011; Frey at al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 105, 3739-3744, 2008; Rathinakumar et al., J. Virol. 86, 1820-1831, 2012). Во время промывки, антитела, которые не могли иметь доступа к их Env-мишени на свободных вирионах, главным образом, удалялись, а поэтому уровень нейтрализации снижался. Нейтрализация изолята HXBc2, используемого в качестве контроля, не снижалась после промывки, поскольку область MPER находилась на этом лабораторном адаптированном изоляте (Chakrabarti et al., J. Virol. 85, 8217-8226, 2011). Промывка также оказывала незначительное влияние на нейтрализацию JRFL антителом VRC01. Как и в предыдущих исследованиях, 2F5- и 4E10-нейтрализация большинства протестированных вирусных изолятов значительно снижалась после промывки (фиг. 11B). В отличие от 2F5 и 4E10, промывка оказывала меньшее воздействие на 10E8-нейтрализацию большинства протестированных вирусов, как было измерено по площади под кривой или с помощью анализа на кратное изменение нейтрализации при фиксированной ингибирующей концентрации (фиг. 11C). Хотя 10E8 не имеет такого полного доступа к эпитопу на нативном вирусном шипе, как VRC01, однако, во многих условиях проведения эксперимента, оно было более доступно к эпитопу, чем 2F5 или 4E10.
cryst
free
10
Структура комплекса 10E8-gp41. Для лучшего понимания взаимодействия 10E8 с ВИЧ-1 на атомном уровне, антигенсвязывающий фрагмент (Fab) антитела 10E8 кристаллизовали в комплексе с пептидом, содержащим полноразмерную MPER gp41, состоящую из 28 остатков (остатки 656-683). Дифракция моноклинных кристаллов имела разрешение 2,1 Å, и такое разрешение и уточнение структуры до R=18,01% (R=21,76%) выявило два комплекса в асимметрической ячейке (далее называемых комплексами 1 и 2) (фиг. 24). В целом, 10E8 связывалось с одной стороной пептида MPER, что приводило к образованию двух спиралей, каждая из которых имела длину 15-20 Å и была повернута относительно другой спирали на 100° (фиг. 4A). Электронную плотность оценивали для полноразмерной MPER в положениях остатков Asn656-Arg683 (Leu660-Arg683 для комплекса 2), причем наибольшая степень упорядоченности наблюдалась в пределах от остатка Trp666 N-концевой спирали до остатка Arg683 C-концевой спирали (фиг. 12). Анализ двугранных углов главной цепи (фиг. 25) показал, что N-концевая б-спираль простирается от остатка Asn657 до остатка Ala667, прикрепляется к 3-спирали между остатками Ser668 и Leu669, а затем образует виток в положениях остатков Trp670 и Asn671. C-концевая б-спираль, кэпированная остатком Asn671, начинается с положения остатка Trp672 и простирается до остатка Arg683, который является концевым остатком MPER (фиг. 4A, B).
Антитело 10E8 контактирует с MPER gp41, главным образом, посредством своей тяжелой цепи, хотя наиболее важные контакты также опосредуются CDR L3 легкой цепи (фиг. 4C и 26-28). Между антителом и gp41 наблюдалось три доминирующих локуса взаимодействия (фиг. 29-30), то есть, один локус находится между остатками на конце петли CDR H3 и на конце С-концевой спирали пептида; второй локус находится между остатками петли CDR H2 и остатками шарнирной области пептида, а третий локус находится в области стыка трех петель CDR тяжелой цепи и CDR L3 легкой цепи, которые образуют гидрофобную щель, содержащую остатки, начинающиеся с С-концевой спирали MPER (фиг. 4B).
Граничная область 10E8-gp41. В дополнение к результатам, полученным для мутагенеза высококонсервативного эпитопа для 10E8 (фиг. 4D и 18), каждый остаток паратопа 10E8, определенного исходя из кристаллической структуры, был отдельно заменен аланином, и полученные 25 вариантов 10E8 оценивали на аффинность по отношению к растворимому пептиду MPER. В целом, наиболее заметное влияние аланиновых мутаций на аффинность связывания антитела 10E8 с растворимым пептидом MPER наблюдалось в остатках петли CDR H3, хотя мутации в гидрофобной щели также также давали значительный эффект (фиг. 4E, 13 и 31). Было установлено, что остатки 10E8, идентифицированные посредством аланинового сканирования как наиболее важные для взаимодействия с gp41, простираются от щели и до конца CDR H3 (фиг. 4E), и был проведен мониторинг соответствующего фрагмента из остатков gp41, которые оказывают значительное влияние на связывание антитела 10E8, если в нем имеются аланиновые мутации (фиг. 4F).
D
Ту же самую панель антител 10E8 с аланиновыми мутациями тестировали на нейтрализующую активность против панели из пяти Env-псевдовирусов, содержащей вирусы Tier 1 и Tier 2 (фиг. 32). Аналогично полученным данным по связыванию, остатки CDR H3 10E8 оказывали очень большое влияние на нейтрализацию, как это наблюдалось в случае остатков в гидрофобной щели (фиг. 4g). В общих чертах, Kпаратропных мутантов корелировали с уровнем нейтрализации (фиг. 14). Каркасные взаимодействия (на 10E8 и gp41) также участвовали в образовании граничной области, а в частности, между CDR H2 антитела 10E8 и шарнирной областью MPER, хотя в анализе, проводимом путем аланинового сканирования, они не выявлялись. В целом, в 10E8 используется узкий интервал остатков (~20× 5 Å), которые начинаются от CDR H1 и H2 и простираются почти по всей CDR H3, и которые распознают фрагмент высококонсервативных гидрофобных остатков gp41 и наиболее важный заряженный остаток, Arg/Lys683, который находится непосредственно перед трансмембранной областью (фиг. 4F, H).
Консервативная детерминанта нейтрализации gp41. Несколько структур нейтрализующих антител в комплексе с MPER gp41 были описаны ранее, включая структуры для антител 2F5, Z13e1 и 4E10 (фиг. 15A; Julien et al., J. Mol. Biol. 384, 377-392, 2008; Cardoso et al., J. Mol. Biol 365, 1533-1544, 2007; Cardoso et al., Immunity 22, 163-173, 2005; Ofek et al., J. Virol. 78, 10724-10737, 2004; Pejchal et al., J. Virol. 83, 8451-8462, 2009). MPER принимает различные конформации петли при связывании с 2F5 и Z13e1 и α-спирали при связывании с 4E10. Сравнение эпитопов для 2F5, Z13e1 и 4E10 с 10E8-связанным gp41 показало, что лишь эпитоп 4E10 имел аналогичную вторичную структуру при суперпозиции с RMSD=2,49 Å для всех атомов остатков 671-683 и с RMSD=0,98 Å для атомов главной цепи (фиг. 15B и 33).
Для последующего сравнения распознавания антител 10E8 и 4E10 оценивали их углы доступа к эпитопу. Как показано на фиг. 15C-15F, выравнивание спиралей MPER, распознаваемых антителами 10E8 и 4E10, проводили в тех же самых общих положениях пространственной структуры. Однако относительные ориентации распознаваемой спирали и тяжелой и легкой цепей этих двух антител резко отличались. В случае антитела 10E8, его C-концевая спираль была перпендикулярна плоскости, разделяющей тяжелую и легкую цепи напополам (фиг. 15C, E), а в случае антитела 4E10, его распознаваемая спираль находилась на границе между тяжелой и легкой цепями (фиг. 15D, F). Это, вероятно, обусловлено тем, что в 10E8, петли CDR используются почти исключительно для его распознавания gp41, тогда как в антителе 4E10 происходит, в основном, в складчатые взаимодействия с gp41 на границе между тяжелой и легкой цепями.
Отличие механизмов распознавания консервативной С-концевой спирали MPER антителами 10E8 и 4E10 приводило к различию в соотношении распознаваемых остатков на поверхности спирали: 10E8 контактирует приблизительно с третью поверхности спирали, а 4E10 контактирует с половиной поверхности спирали (фиг. 15G, 15H и 34-35). Меньшая контактная поверхность антитела 10E8 может служить объяснением более низкого уровня распознавания липидных поверхностей этим антителом 10Е8, по сравнению с антителом 4E10, что, в свою очередь, если исходить из потенциальной структуры, может служить объяснением пониженнной аутореактивности 10E8.
50
Вариабельность последовательностей и нейтрализация антителом 10E8. Исходя из данных о специфичности и структуре известных вариантов MPER были проанализированы вирусные последовательности, резистентные к нейтрализации антителом 10E8 (фиг. 5A). Из 183 тестируемых вирусов, только три вируса имели высокую резистентность к 10E8 с IC50 >50 мкг/мл. Каждый из этих вирусов имел замены в положениях, которые, как было обнаружено с помощью аланин-сканирующего анализа, влияют на нейтрализацию (Asn671, Trp672, Phe673 и Trp680). Вирус в плазме пациента N152, от которого был получен клон 10E8, вероятно, также был резистентным к 10E8-опосредуемой нейтрализации (Wu et al., J. Virol. 86, 5844-5856, 2012). Анализ последовательности вирусной РНК в плазме выявил редко встречающиеся замены в положениях Trp680 и Lys/Arg683 (фиг. 5A). Эти остатки обычно являются высококонсервативными с вариациями, встречающимися лишь в 1,17% последовательностей 3730 Env ВИЧ, имеющихся в базе данных в Лос-Аламосе (hiv.lanl.gov). Замены, введенные в 3 резистентных вируса, и замены, введенные в исходный чувствительный вирус JR2, выделенный у пациента, а именно, замены Asn671Thr, Trp672Leu и Phe673Leu оказывали незначительное влияние на IC, однако, величина IC80 превышала 20 мкг/мл. В структурном анализе, прямые контакты 10E8 не наблюдались в положении 671, что позволяет предположить, что влияние замен Thr или Ala в этом положении на нейтрализацию опосредуется конформационными или другими эффектами в gp41. Комбинация Trp672Leu и Phe673Leu сообщала высокий уровень резистентности при IC50 и IC80. Замены, соответствующие доминантному вирусу в кровотоке пациента, давали аналогичный эффект. Хотя резистентность при IC80 сообщали только замены Lys/Arg683Gln, однако, комбинация Trp680Arg и Lys/Arg683Gln приводила к повышению резистентности к 10E8 (фиг. 5A). Эти данные, вместе с данными анализа паратопа 10E8, позволяют предположить, что помимо остатков Trp672, Phe673, и Trp680, присутствующих в эпитопе для 4E10, важную роль в нейтрализации также играет дополнительный 10E8-связанный остаток Lys/Arg683. Помимо других различий в связывании, которые были обнаружены после проведения вышеописанных структурных анализов, возможно, что дополнительная активность 10E8, по сравнению с активностью 4E10, направленной против природных вирусных вариантов, может опосредоваться связыванием высококонсервативных остатков Trp680 и Lys/Arg683, которые непосредственно взаимодействуют с CDRH3 10E8.
Обсуждение. 10E8 представляет собой активное нейтрализующее антитело широкого спектра, что является важным фактором, послужившим толчком к разработке вакцин, содержащих такое антитело. Ранее используемые анти-MPER антитела имели относительно ограниченную активность и еще более ограниченный доступ к MPER на Env первичных изолятов. Кроме того, считается, что связывание с липидом и аутореактивность является теми свойствами анти-MPER антител, которые значительно затрудняют их вырабатывание вакцинами. Однако 10E8 не обладает ни одним из этих свойств. Кроме того, антитела с аналогичной специфичностью часто вырабатываются у хронически инфицированных пациентов. Это позволяет предположить, что 10E8-подобные антитела не были исключены из репертуара антител из-за аутореактивности. Полученные результаты также позволяют предположить, что 10E8-подобные антитела могут вырабатываться у большего числа пациентов, не инфицированных ВИЧ, у которых отсутствуют В-клетки, обычно присутствующие при хронической ВИЧ-инфекции, и которым была введена вакцина, сконструированная так, чтобы она вырабатывала эти антитела. Конструирование такой вакцины, очевидно, потребует не только презентации интактного эпитопа для 10E8, но также создания условий иммуногенности, достаточных для инициации вырабатывания 10E8-подобных антител.
Исключительная активность и очень широкий спектр действия 10E8, вероятно, обусловлены способностью этого антитела связываться с высококонсервативными остатками в MPER. Хотя эпитоп для 10E8 имеет последовательность, перекрывающуюся с последовательностями известных mAb, таких как 4E10, однако он отличается по поверхности распознавания, углу доступа, связыванию с липидом и аутореактивности. Каждый из таких анализов, как аланин-сканирующий анализ, структурный анализ и анализ паратопа, также показал, что 10E8 имеет важные контакты с высококонсервативными остатками Trp672, Phe673, Trp676 и Lys/Arg683. Исключительно широкий спектр действия некоторых активных mAb, например, антител, которые связываются с CD4-связывающим сайтом, вероятно, сообщается блокированием функционально важного сайта, играющего решающую роль в проникновении вируса в клетку. Остается определить, оказывает ли 10E8 негативное влияние на функцию Env или просто действует посредством связывания с высококонсервативными остатками. Тем не менее, широкий спектр действия и активность 10E8 выявили присутствие консервативного сайта восприимчивости gp41 (фиг. 5B), который является важным антигеном-мишенью для нейтрализации ВИЧ, и который, вероятно, представляет особый интерес при конструировании вакцины, направленной против MPER ВИЧ.
Методы
+
-
-
-
+
MN.03
Bal26
Краткое описание методов. CD19IgAIgDIgM-В-клетки, выделенные из периферической крови, сортировали методом проточной цитометрии, высевали при плотности 4 клетки на лунку, и размножали в присутствии цитокинов и клеток-фидеров. Супернатанты B-клеточной культуры скринировали посредством микро-нейтрализации псевдовирусов ВИЧ и ВИЧ. Гены IgG из лунок с нейтрализующей активностью клонировали и снова экспрессировали в клетках 293T. Спектр нейтрализующей активности подтверждали с использованием панели из 181 изолята Env-псевдовирусов. Специфичность определяли с помощью аланин-сканирующих пептидов и мутантных Env-псевдовирусов. Связывание с липидами и аутореактивность 10E8 определяли методом поверхностно-плазмонного резонанса, непрямым иммунофлуоресцентным методом, проводимым на клетках HЕР-2, и методом с использованием массивов сфер. Связывание оболочек ВИЧ на трансфицированных клетках 293 детектировали с помощью проточной цитометрии. После предварительного инкубирования с антителом, доступ к вирусной MPER оценивали по эффекту промывки вирионов до инфицирования клеток TZM-bl. Частоту встречаемости ВИЧ-1-сыворотки с данной специфичностью опеределяли по способности нейтрализовать химеры ВИЧ-2/ВИЧ-1, содержащие части MPER. Успешная совместная кристаллизация 10E8 с gp41 достигалась в том случае, когда пептид содержал полноразмерную MPER gp41 из 28 остатков (остатки 656-683). Определение структуры выявило присутствие двух комплексов в кристаллической асимметрической ячейке. Анализ различий между двумя комплексами позволил выявить основные взаимодействия. Паратоп, определенный по остаткам антитела, которые обнаруживают пониженный доступ к растворителям, если он присутствует в комплексе с gp41, подвергали тотальному аланин-сканирующему анализу, где каждый из 25 аланиновых мутантов 10E8 оценивали методом ППР на распознавание gp41 и на нейтрализацию панели из 5 псевдотипированных вирусов. Последовательность вирусной РНК в плазме пациента была получена с помощью ОТ-ПЦР с лимитирующим разведением.
Обследование пациентов. Клетки плазмы и мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) брали у ВИЧ-1-инфицированных пациентов, включенных в протокол клинических испытаний, проводимый специалистами Национального института здравоохранения и одобренный Комитетом по контролю за соблюдением этических норм в ходе исследований при Национальном институте аллергии и инфекционных заболеваний (NIAID-IRB). Все участники испытаний дали информированное согласие на проведение испытаний по протоколу, одобренному NIAID-IRB. При этом, использовали следующие критерии включения: пациенты, у которых детектировалась вирусная нагрузка; пациенты, у которых стабильное число CD4-T-клеток превышало 400 клеток/мкл; пациенты, у которых была диагностирована ВИЧ-инфекция по меньшей мере 4 года назад, и пациенты, которые не проходили антиретровирусную (ARV) терапию по меньшей мере за 5 лет до начала испытаний. Исходя из настоящего и предыдущего места проживания пациентов, предполагалось, что все пациенты были инфицированы вирусом кладотипа B. Донор N152 был выбран для участия в эксперименте по сортингу В-клеток и продуцированию антител, поскольку нейтрализующая активность его сыворотки была наиболее высокой и имела более широкий спектр действия по сравнению с другими пациентами данной группы. У этого пациента наблюдалось медленное прогрессирование заболевания, как было установлено по описанным ранее критериям (Migueles at al., Immunity 29, 1009-1021, 2008). На время лейкафереза, этот пациент уже 20 лет назад был инфицирован ВИЧ-1, причем его число CD4-T-клеток составляло 325 клеток/мкл, а число копий РНК ВИЧ-1 в плазме составляло 3811 копий/мл, и этот пациент не подвергался антиретровирусной терапии.
+
-
-
-
5
MN.03
Bal.26
2
Окрашивание B-клеток памяти, сортинг и клонирование антител. Окрашивание и сортинг моноколоний В-клеток памяти осуществляли следующим образом. МКПК от ВИЧ-1-инфицированного донора N152 окрашивали смесью антител, состоящей из антитела против CD19-ФЭ-Cy7 (BD Bioscience), IgA-APC (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.), IgD-ФИТЦ (BD Pharmingen) и IgM-PE (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.), при 4°C в темноте в течение 30 минут. Затем клетки промывали 10 мл PBS-BSA-буфера и ресуспендировали в 500 мкл PBS-BSA. 66000 CD19IgAIgDIgM-В-клеток памяти сортировали на клеточном сортере FACSAria III (Becton Dickinson) и ресуспендировали в среде IMDM с 10% FBS, содержащим 100 ед./мл IL-2, 50 нг/мл IL-21 и 1Ч10/мл клеток-фидеров, облученных 3T3-msCD40L (Kershaw et al., Cancer Res. 61, 7920-7924, 2001). B-клетки высевали в 384-луночные микротитрационные планшеты при плотности 4 клетки/лунку в конечном объеме 50 мкл. После 13-дневного инкубирования, 40 мкл супернатантов культуры от каждой лунки собирали и скринировали на нейтрализующую активность с помощью высокоэффективного анализа на микро-нейтрализацию ВИЧ-1и ВИЧ-1. B-клетки в каждой лунке подвергали лизису с использованием 20 мкл буфера для лизиса, содержащего 0,25 мкл ингибитора РНКазы (New England Biolabs Inc.), 0,3 мкл 1M триса, pH 8 (Quality Biological Inc.) и 19,45 мкл DEPC-обработанной HО. Планшеты с В-клетками хранили при -80°C.
MN.03
Bal.26
Ген вариабельной области тяжелой цепи и легкой цепи иммуноглобулина амплифицировали с помощью ОТ-ПЦР в лунках, которые были оценены как положительные в анализе на нейтрализацию ВИЧ-1и ВИЧ-1. кДНК-продукт использовали в качестве матрицы в ПЦР-реакции. Для амплификации гена иммуноглобулина с большим количеством соматических мутаций, два набора праймеров, описанных ранее (Tiller at al., Journal of immunological methods 329, 112-124, 2008), были использованы в двух независимых ПЦР. Один набор праймеров состоял из прямых праймеров и обратных праймеров, специфичных к лидерной области и к константной области IgH, Igκ или Igλ, соответственно. Другой набор праймеров состоял из смеси прямых праймеров, специфичных к FWR1, и соответствующих обратных праймеров, специфичных к J-генам IgH, Igκ и Igλ. Все ПЦР проводили в 96-луночных ПЦР-планшетах в полном объеме 50 мкл, содержащих 20 нМ каждого праймера или смеси праймеров, 10 нМ каждого dNTP (Invitrogen), 10 мкл 5x Q-раствора (Qiagen) и 1,2 ед. ДНК-полимеразы Taq HotStar (Qiagen). Пулы ДНК VH или VL-области, полученные из положительных ПЦР-реакций, лигировали с вектором pCR2.1-Topo-TA (Invitrogen) для секвенирования, а затем клонировали в соответствующий Igγ1-, Igk- и Igλ-вектор экспрессии. 10 мкг плазмид с тяжелой и легкой цепью, клонированных в одной и той же лунке и объединенных во всех возможных парах тяжелой и легкой цепей, смешивали с 40 мкл FuGENE 6 (Roche) в 1500 мкл DMEM (Gibco) и совместно переносили в клетки 293T. Полноразмерный IgG очищали на колонке с рекомбинантным белком A (GE Healthcare).
.
Анализы на нейтрализацию Нейтрализацию моноклональными антителами оценивали на клетках TZM-bl, подвергнутых одному раунду инфицирования псевдовирусами Env ВИЧ-1 (Li et al., J. Virol. 79, 10108-10125, 2005). Псевдовирусы Env ВИЧ-1 получали путем ко-трансфекции клеток 293T остовом pSG3ΔEnv, содержащим люциферазный ген-репортер и вторую плазмиду, экспрессирующую Env ВИЧ-1. Через 72 часа после трансфекции, супернатанты, содержащие псевдовирус, собирали, замораживали при -80°C и хранили до их использования. В анализе на нейтрализацию, 10 мкл 5-кратного серийного разведения сыворотки или mAb пациента инкубировали с 40 мкл псевдовируса в 96-луночном планшете при 37°C в течение 30 минут, а затем добавляли клетки TZM-bl. После инкубирования в течение 2 дней, клетки подвергали лизису и оценивали инфекционность вируса путем количественного измерения люциферазной активности на люминометре Victor Light (Perkin Elmer). 50% ингибирующую концентрацию (IC50) вычисляли как концентрацию антитела, которая снижает уровнь инфицирования на 50%. Эпитопы для антител картировали с использованием аланиновых мутантов MPER псевдовирусов JR2 ВИЧ-1 в анализе, проводимом на клетках TZM-bl.
Нейтрализация химеры ВИЧ-2/ВИЧ-1. Химеру ВИЧ-2/ВИЧ-1 C1 (вирус ВИЧ-2 7312A с MPER gp41 вируса ВИЧ-1; Gray et al., J. Virol. 81, 6187-6196, 2007) использовали в анализе на конкурентное связывание. Пептид MPER с фиксированной концентрацией инкубировали с серийно разведенным антителом 2F5, 4E10, Z13e1 или 10E8 при 37°C в течение 30 минут, а затем инкубировали с химерой ВИЧ-2/ВИЧ-1 C1. Вирус ВИЧ-2 7312A дикого типа использовали в качестве контроля. Картирование эпитопов для антител осуществляли путем добавления 10 мкл mAb 10E8 к 5 мкл серийного разведения пептида 4E10 или его аланиновых мутантов при 37°C в течение 30 минут с последующим добавлением химеры ВИЧ-2/ВИЧ-1 C1. Достигаемую степень блокирования пептидами антитело-опосредуемой нейтрализации вычисляли как кратность изменения величины IC50 антитела в присутствии аланиновых мутантов 4E10 по сравнению с пептидом дикого типа. Точное определение области связывания в MPER, которая является мишенью для сыворотки или антител пациента, осуществляли с использованием химер ВИЧ-2/ВИЧ-1, содержащих различные части MPER ВИЧ-1, такие как C1 (Env ВИЧ-1 с MPER ВИЧ-1), C1C (Env ВИЧ-2 с MPER кладотипа С), C3 (Env ВИЧ-2 с эпитопом для 2F5), C4 (Env ВИЧ-2 с эпитопом для 4E10), C6 (Env ВИЧ-2 с коротким эпитопом для 4E10, NWFDIT), C7 (Env ВИЧ-2 с коротким эпитопом для 2F5, ALDKWA) и C8 (Env ВИЧ-2 с эпитопами для Z13 и 4E10). 5-кратное серийное разведение сыворотки или mAb инкубировали с химерой в 96-луночном планшете при 37°C в течение 30 минут, а затем добавляли клетки TZM-bl. Специфичность сыворотки пациента подтверждали путем блокирования нейтрализации химеры C1 под действием 25 мкг/мл 2F5, 4E10, MPER, Bal.V3 и контрольного пептида, или 50 мкг/мл пептида Z13.
ELISA-анализы. Каждый антиген в количестве 2 мкг/мл наносили на 96-луночные планшеты, и эти планшеты оставляли на ночь при 4°C. Планшеты блокировали буфером BLOTTO (PBS, 1% FBS, 5%-ное обезжиренное молоко) в течение одного часа при комнатной температуре (КТ), а затем инкубировали с антителом, серийно разведенным в буфере для дизрупции (PBS, 5% FBS, 2% BSA, 1% твин-20), в течение одного часа при комнатной температуре. После этого, в течение одного часа при комнатной температуре добавляли разведение 1:10000 козьего антитела против IgG человека, конъюгированного с пероксидазой хрена (ПХ). После каждой стадии, планшеты промывали 0,2% твина 20 в PBS. Планшеты проявляли с использованием 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (TMB) (Sigma) и считывали на 450 нм.
Анализы на аутореактивность. Связывание 10E8 с фосфолипидом оценивали методом ППР, проводимым на оборудовании BIACORE 3000, и полученные данные анализировали с помощью компьютерной программы BIAevaluation 4.1 software (BIACORE), описанной ранее (Alam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 106, 20234-20239, 2009). Фосфолипид-содержащие липосомы иммобилизовали на сенсорном чипе BIACORE L1, где для заякоривания липидов использовался алкильный линкер. Перед иммобилизацией липидов, поверхность чипа L1 очищали путем 60-секундного впрыскивания 40 мM октил-в-D-глюкопиранозида со скоростью 100 мкл/минуту, а затем чип и проточные кюветы промывали избыточным количеством буфера для удаления любых следовых количеств детергента. После этого, впрыскивали mAb в количестве 100 мкг/мл при скорости потока 30 мкл/минуту. После каждого впрыскивания Ab, поверхность снова очищали октил-в-D-глюкопиранозидом, делали 5-секундные впрыскивания каждый раз 5 мM HC1, а затем впрыскивали 5 мM NaOH, для удаления любого белка, прилипшего к чипу.
Science
Способность реагировать с ВИЧ-1-негативными эпителиальными клетками человека (HEР-2) определяли путем непрямого иммунофлуоресцентного анализа, проводимого на предметных стеклах с использованием голубого Эванса в качестве контрастного красителя и ФИТЦ-конъюгированного козьего антитела против IgG человека (Zeus Scientific, Raritan N.J.; Haynes at al., Science 308, 1906-1908, 2005). Предметные стекла фотографировали на флуоресцентном микроскопе Nikon Optiphot. Как показано на фиг. 3B, для каждого связывания MAb с клетками HEР-2 брали предметные стекла Kodachrome c 32-секундной экспозицией, после чего предметные стекла сканировали в цифровом формате. Для анализа на реактивность MAb с SSA/Ro, SS-B/La, Sm, рибонуклеопротеином (RNP), Jo-1, двухцепочечной ДНК (дцДНК), центромером B и гистоном проводили тест Luminex AtheNA Multi-Lyte ANA (Wampole Laboratories, Princeton, NJ), и этот тест осуществляли в соответствии с инструкциями производителей как описано ранее (Haynes et al.,  308, 1906-1908, 2005). Пронализированные концентрации MAb составляли 50, 25, 12,5 и 6,25 мкг/мл. 10 мкл антитела в каждой из этих концентраций инкубировали с флуоресцентными сферами Luminex и проводили тест в соответствии с инструкциями производителей.
Окрашивание Env ВИЧ-1 клеточной поверхности, оцениваемое методом клеточного сортинга с активированной флуоресценцией (FACS). FACS-окрашивание осуществляли как описано ранее (Chakrabarti et al., J. Virol. 85, 8217-8226, 2011; Koch at al., Virology 313, 387-400, 2003). Через 48 часов после трансфекции, клетки собирали и промывали в FACS-буфере (PBS, 5% HIFBS, 0,02% азид) и окрашивали моноклональными антителами. Трансфицированные клетки суспендировали в FACS-буфере и инкубировали с антителами в течение одного часа при комнатной температуре. Смесь моноклонального антитела и клеток интенсивно промывали в FACS-буфере, и «второе» козье анти-человеческое антитело, конъюгированное с фикоэритрином (ФЭ) добавляли в течение одного часа при разведении 1:200, а после интенсивной промывки, несвязанное «второе» антитело удаляли. Клетки, окрашенные ФЭ-антителом, помещали в прибор BD LSRII и анализировали с использованием реагента Flow Jo.
2
Эксперименты по промывке комплекса «антитело-вирус». Из исходной концентрации 2 мг/мл брали 12,5 мкл антител, подвергнутых 5-кратному серийному разведению в PBS, и добавляли к 487,5 мкл DMEM, содержащей 10% HIFCS и 15 мкл псевдовируса, так, чтобы конечная концентрация антител составляла 50 мкг/мл - 0,08 мкг/мл в общем объеме 500 мкл. Для получения контроля «без ингибитора», добавляли тот же самый объем PBS, вместо антитела. Реакционную смесь инкубировали в течение 30 минут при 37°C. 250 мкл реакционной смеси разводили до 10 мл полной средой DMEM и центрифугировали при 25000 об/мин на роторе SW41 в течение 2 часов при 4°C. Затем вирусный осадок промывали еще два раза 10 миллилитрами PBS. Во время стадий промывки, комплекс «вирус-антитело» центрифугировали при 40000 об/мин в течение 20 минут при 4°C. После конечной промывки, к промытому вирусному осадку добавляли 250 мкл DMEM и ресуспендировали, слегка помешивая при 4°C в течение 30 минут. 100 мкл суспендированного вируса использовали для инфицирования 100 мкл клеток TZM-bl (0,2 миллионов/мл) в дубликате. Из оставшихся 250 мкл реакционной смеси брали равный объем смеси антитела и вируса, и использовали его в качестве контроля «без промывки». Планшеты инкубировали при 37°C в CО-инкубаторе в течение 2 дней. Через 2 дня проводили люциферазный анализ, описанный ранее (Mascola et al., J. Virol. 76, 4810-4821, 2002). Затем по полученным данным строили кривую для определения уровня нейтрализации, опосредованной антителами в условиях «промывки» и «без промывки».
2R-3R
Определение структуры и анализ. Антигенсвязывающий фрагмент антитела 10E8 (Fab) получали путем LysC-гидролиза, как было описано ранее (Ofek et al., Proc. Natl. Aca. Sci. U.S.A., 107, 17880-17887, 2010). IgG сначала восстанавливали с использованием 100 мМ DTT в течение одного часа при 37°C, а затем диализовали в течение одного часа в Hepes, pH 7,6, для доведения концентрации DTT до 1 мМ. Затем антитела диализовали против 2 мМ иодацетамида в течение 48 часов при 4°C, и подвергали конечному диализу против Hepes, pH 7,6, в течение 2 часов. После восстановления и алкилирования, антитела гидролизовали Lys-C (Roche), пропускали через колонку с белком A для отделения Fc-фрагмента, а затем подвергали ионообменной хроматографии (Mono S) и эксклюзионной хроматографии (S200). Очищенный Fab 10E8 инкубировали с 10-кратным избытком пептида RRR-NEQELLELDKWASLWNWFDITNWLWYIR(SEQ ID NO: 26)-RRR (American Peptide, CA), после чего комплекс подвергали капельной кристаллизации методом паровой диффузии при 20°C на роботе Honeybee 963. В кристаллизаторах было выращено 576 кристаллов в условиях, адаптированных для получения коммерчески доступных кристаллов в лабораториях Hampton (Hampton Research), Precipitant Synergy (Emerald Biosystems) и Wizard (Emerald Biosystems), а затем эти кристаллы фотографировали на Rockimager (Formulatrix), после чего наилучшие кристаллы оптимизировали вручную. Кристаллы выращивали в 40% ПЭГ 400, 0,1M Na-цитрата, 0,1 M триса, pH 7,5, с дифракционным разрешением 2,1 Е в криозащитном растворе, состоящем из маточного раствора, в который был добавлен 15% -бутандиол и избыток пептида. После выращивания кристаллов на петле, их быстро охлаждали, и проводили сбор данных на длине волны 1,00 Е собирали на лучевой установке SER CAT ID-22 или BM-22 (APS), после чего эти данные обрабатывали с использованием HKL-2000 (Otwinowski et al., Macromolecular Crystallography, Pt A 276, 307-326, 1997). Разрешение структуры проводили посредством молекулярного замещения на приборе Phaser (McCoy et al., J. Appl. Crystallogr. 40, 658-674, 2007; Winn et al., Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 67, 235-242, 2011) с использованием предварительно полученной свободной структуры 10E8 в качестве модели для поиска. Уточнение структуры проводили на Phenix (Adams et al., Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 58, 1948-1954, 2002) с использованием итеративной структурной модели, созданной на приборе Coot (Emsley, P. & Cowtan, K. Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 60, 2126-2132 (2004). Структуру подтверждали с использованием MolProbity (Davis et al., Nucleic Acids Res 35, W375-383, 2007), в результате чего получали 97% и 99,8% остатков, входящих в наиболее предпочтительные области Рамахандрана и в допустимые области Рамахандрана, соответственно. Структуру анализировали с помощью APBS (Baker et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 98, 10037-10041, 2001) на электростатические свойства (Ligp1ot; McDonald et al., J. Mol. Biol. 238, 777-793, 1994), на прямые контакты, PISA (Krissinel et al., J. Mol. Biol. 372, 774-797, 2007), на скрытые площади поверхности, и LSQKAB (пакет программ ccp4 Package; Winn, M. D. et al. Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr., 67, 235-242, 2011) для вычисления RMSD выравнивания. Спирально-круговые диаграммы строили с использованием программы Pepwheel (150.185.138.86/cgi-bin/emboss/pepwheel). Все графики строили с использованием программы Pymol (PyMOL Molecular Graphics System).
Оценка аффинности связывания антител 10E8 и вариантов антитело 10E8 с MPER gp41. Поверхностно-плазмонный резонанс (ППР) (BIACORE T200, GE Healthcare) проводили для оценки аффинности связывания 10E8 дикого типа с пептидом MPER gp41. Биотинилированный пептид, состоящий из остатков 656-683 MPER gp41 (RRR-NEQELLELDKWASLWNWFDITNWLWYIR(SEQ ID NO: 26)-RRK-биотин; American Peptide, CA), иммобилизовали на чипе BIACORE SA с поверхностной плотностью 20-50 единиц отклика (RU). Затем антигенсвязывающий фрагмент 10E8 (Fab) впрыскивали поверх аналита в концентрациях от 0,25 нМ до 125 нМ с 2-кратными серийными разведениями, после чего осуществляли фазы ассоциации и диссоциации в течение 1-5 минут при скорости потока 30 мл/минуту. Связывание контрольных Fab 2F5 и 4E10 с одним и тем же пептидом оценивали в аналогичных условиях.
Аффинности связывания аланиновых мутантов паратопа 10E8 с MPER также оценивали методом ППР с захватом антител. На чипе BIACORE CM5 иммобилизовали связанное с амином антитело против Fc человека с высокой поверхностной плотностью ~10000 RU. Затем вариант IgG паратопа 10E8 иммобилизовали на поверхности с плотностью 1500-2500 RU, и пептид, состоящий из остатков 656-683 MPER gp41 (RRR-NEQELLELDKWASLWNWFDITNWLWYIR(SEQ ID NO: 26)-RRR), впрыскивали поверх аналита при 2-кратном серийном разведении, начиная с концентрации 500 нМ (за исключением HC D30A, W100bA, S100cA, P100fA, начальная концентрация которых составляла 250 нМ). Продолжительность фаз ассоциации и диссоциации составляла три минуты и пять минут, соответственно, при скорости потока 30 мкл/мин. Сенсорограммы связывания строили по лангмюровским моделям 1:1 с помощью программы BIACORE BiaEvaluation Software (GE Healthcare). Во всех случаях использовали буфер BIACORE HBSEP+ (10 мМ Hepes, pH 7,4, 150 мМ NaCl, 3 мМ EDTA, 0,1% P-20).
ПЦР-амплификация и секвенирование. Экстракцию вирусной РНК из плазмы и синтез кДНК осуществляли, как описано в литературе (Imamichi et al., J. Infect. Dis. 183, 36-50, 2001). Отдельные молекулы фрагмента размером 588 п.н., охватывающие ген области MPER оболочки ВИЧ-1 и полученные путем лимитирующего разведения, подвергали ПЦР-амплификации с помощью системы ПЦР Expand High Fidelity PCR System (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) с использованием нижеследующих серий праймеров: +7789 (смыслового) 5'-TCTTAGGAGCAGCAGGAAGCACTATGGG-3' (SEQI ID NO: 193) и -8524 (антисмыслового) 5'-GTAAGTCTCTCAAGCGGTGGTAGC-3' (SEQI ID NO:194) в первом раунде реакции; и +7850 (смыслового) 5'-ACAATTATTGTCTGGTATAGTGCAACAGCA-3'(SEQI ID NO: 195) и -8413 (антисмыслового) 5'-CCACCTTCTTCTTCGATTCCTTCGG-3' (SEQI ID NO: 196) во втором раунде реакции. Каждый раунд ПЦР состоял из 25 циклов, где начальную денатурацию осуществляли при 94°C в течение двух минут, и последующих 25 циклов, содержащих денатурацию при 94°C в течение 15 секунд, отжиг при 50°C в течение 30 секунд и удлинение при 72°C в течение 1 минуты, и конечное удлинение при 72°C в течение 7 минут. ПЦР-продукты очищали с помощью набора для ПЦР-очистки QIA quick (QIAGEN, Valencia, CA), а затем клонировали в вектор pCR2.1-TOPO (TOPO TA Cloning it, Invitrogen, Carlsbad, CA) для анализа последовательности отдельных молекулярных клонов. ДНК от 18 независимых клонов секвенировали с помощью набора для секвенирования ABI BigDye Terminator v3.1 Ready Reaction Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA) и анализировали на генном анализаторе ABI PRISM 3130×1 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA).
Статистический анализ. Корреляцию между активностью сыворотки пациента N152 и антитела 10E8, и корреляцию между связыванием варианта 10E8 и нейтрализацией этим вариантом оценивали ранговым методом Спирмана.
Депозиты. Нуклеотидные последовательности тяжелой и легкой цепей антитела 10E8 были помещены в GenBank под регистрационными номерами JX645769 и JX645770, каждый из которых вводится в настоящее описание посредством ссылки как данные, имеющиеся в GenBank на 18 сентября 2012. Координаты и структурные параметры для Fab 10E8 в комплексе с MPER gp41 были депонированы в банке данных белков под рег. № 4G6F и вводятся в настоящее описание посредством ссылки как данные, имеющиеся в базе данных GenBank на 18 сентября 2012.
Пример 2
Анализы на нейтрализацию
В этом примере описан метод тестирования спектра и активности нейтрализации для описанных в настоящем документе антител.
50
50
Нейтрализацию под действием моноклональных антител оценивали путем проведения одного раунда инфицирования клеток-мишеней TZM-bl Env-псевдовирусами ВИЧ-1. Env-псевдовирусы ВИЧ-1 продуцировали путем котрансфекции клеток 293T остовом pSG3AEnv, содержащим репортерный ген люциферазы, и второй плазмидой, экспрессирующей Env ВИЧ-1. Через 72 часа после трансфекции, супернатант, содержащий псевдовирусы, собирали, замораживали и хранили при -80°C до их использования. Активность сыворотки пациента и антител, направленную против мембрано-проксимальной внешней области (MPER) gp41, измеряли с использованием химер MPER ВИЧ-2/ВИЧ-1. ВИЧ-2 дикого типа 7312A использовали в качестве контроля. 50% ингибирующую концентрацию (IC) вычисляли как концентрации антитела/ингибитора, обеспечивающие 50% снижение инфекции. Для проведения анализа на конкурентное связывание, пептид в фиксированной концентрации инкубировали с серийно разведенными Ab 2F5, 4E10, Z13E1 или 10E8 при 37°C в течение 30 минут, а затем инкубировали с химерой 7312A-C1. Анализ, проводимый посредством картирования эпитопов, осуществляли путем добавления 0,5 мкг/мл Ab 10E8 к серийным разведениям пептида 4E10 или его аланиновых мутантов при 37°C в течение 30 минут с последующим добавлением химеры 7312A-C1. Эффект блокирования нейтрализации пептидами вычисляли как кратность изменения величины IC антитела в присутствии аланиновых мутантов 4E10 по сравнению с пептидом 4E10 дикого типа. Нейтрализующее действие антитела 10E8 против псевдовирусов с аланиновыми мутациями COT6.15 ВИЧ-1 также оценивали с помощью анализа клеток TZM-bl (фиг. 36). Кроме того, нейтрализацию нескольких штаммов ВИЧ-1 оценивали с использованием антитела 10E8, а также антител, содержащих тяжелые и легкие цепи перекрестно-комплементированных 10E8, 7H6 и 7N16 (фиг. 37).
Пример 3
ELISA-анализы
Каждый антиген в количестве 2 мкг/мл наносили на 96-луночные планшеты, и эти планшеты оставляли на ночь при 4°C. Планшеты с покрытием блокировали буфером BLOTTO (PBS, 1% FBS, 5%-ное обезжиренное молоко) в течение одного часа при комнатной температуре, а затем инкубировали с антителом, серийно разведенным в буфере для дизрупции (PBS, 5% FBS, 2% BSA, 1% твин-20), в течение одного часа при комнатной температуре. После этого в течение одного часа при комнатной температуре добавляли разведение 1:10000 антитела козы против IgG человека, конъюгированного с пероксидазой хрена (ПХ). После каждой стадии, планшеты промывали 0,2% твина 20 в PBS. Планшеты проявляли с использованием 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (TMB) (Sigma) и считывали на 450 нм.
Пример 4
ВИЧ-1-нейтрализующие моноклональные антитела, специфичные к gp41 и используемые для детекции ВИЧ-1 в образце или у индивидуума
В этом примере описано использование моноклональных ВИЧ-1-нейтрализующих gp41-специфических антител для детекции ВИЧ-1 в образце или у индивидуума. В этом примере также описано применение этих антител для диагностики ВИЧ-1 у индивидуума.
Биологический образец, такой как проба крови, брали у пациента, у которого была диагностирована ВИЧ-1-инфекция, у пациента, проходящего обследование на ВИЧ-1-инфекцию, или у пациента с подозрением на ВИЧ-1-инфекцию. Пробу крови, взятую у неинфицированного пациента, использовали в качестве контроля, хотя в качестве контроля может быть также использован и стандартный результат. Для детекции присутствия ВИЧ-1 в пробе крови проводили ELISA-анализ. Белки, присутствующие в пробах крови (в пробе, взятой у пациента, и в контрольной пробе), иммобилизовали на твердом носителе, таком как 96-луночный планшет, методами, хорошо известными специалистам (см., например, публикацию Robinson et al., Lancet 362:1612-1616, 2003, которая вводится в настоящее описание посредством ссылки). После иммобилизации, ВИЧ-1-нейтрализующие моноклональные антитела против gp41, которые непосредственно метили флуоресцентным маркером, наносили на планшет с иммобилизованным на нем белком. Планшет промывали в соответствующем буфере, таком как PBS, для удаления любого несвязанного антитела и для минимизации неспецифического связывания антитела. Флуоресценция может быть детектирована на флуоресцентном планшет-ридере стандартными методами. Повышение интенсивности флуоресценции пробы, взятой у пациента, по сравнению с контрольной пробой, указывает на то, что анти-gp41 антитело специфически связывается с белками пробы крови, что позволяет детектировать присутствие белка ВИЧ-1 в пробе. Обнаружение белка ВИЧ-1 в пробе, взятой у пациента, означает, что данный пациент инфицирован ВИЧ-1, или подтверждает диагноз ВИЧ-1-инфекции у индивидуума.
Пример 5
ВИЧ-1-нейтрализующие моноклональные антитела, специфичные к gp41 и используемые для лечения ВИЧ-1-инфекции
В этом примере описан конкретный метод, который может быть применен для лечения ВИЧ-инфекции у человека путем введения одного или более нейтрализующих gp41-специфических mAb человека. Хотя в данном примере описаны конкретные методы, дозы и способы введения этих антител, однако, специалист в данной области может внести в них изменения, не оказывающие отрицательного влияния на результаты лечения.
Как описано в настоящей заявке, лечение ВИЧ-1-инфекции может быть осуществлено путем введения терапевтически эффективного количества одного или более описанных в настоящем документе нейтрализующих mAb, и тем самым уменьшения уровня ВИЧ-инфекции или ее устранения.
+
Обследование индивидуумов. В конкретных примерах, сначала проводят обследование индивидуумов для выявления у них ВИЧ-инфекции. Репрезентативные методы, которые могут быть применены для скрининга на ВИЧ-инфекцию, содержат комбинированное определение числа CD4-Т-клеток у индивидуума и уровня ВИЧ-инфекции в пробах сыворотки. Дополнительные методы, проводимые с использованием описанных в настоящем документе gp41-специфических mAb, могут быть также применены для скрининга на ВИЧ.
В некоторых примерах, тест на ВИЧ состоит из первичного скрининга, проводимого с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) для детекции антител против ВИЧ, такого как ВИЧ-1. Образцы, которые, после проведения предварительного ELISA-анализа, давали результаты, указывающие на отсутствие реакции, расматривались как ВИЧ-отрицательные, если только данный партнер не подвергался новому контакту с инфицированным партнером или с партнером с неизвестным ВИЧ-статусом. Образцы, которые давали положительный результат на реакцию в ELISA-анализе, были снова протестированы в дубликатах. Если результат теста любого дубликата давал положительную реакцию, то этот образец рассматривался как повторно положительный и подвергался тесту на подтверждение, то есть, дополнительному более специфическому тесту (например, вестерн-блот-анализу или иммунофлуоресцентному анализу (ИФА)). Образцы, которые повторно давали положительный результат в ELISA-анализе и положительный результат в ИФА-анализе или положительную реакцию в вестерн-блот-анализе, рассматривались как ВИЧ-положительные и указыывали на наличие ВИЧ-инфекции. Образцы, которые повторно обнаруживали положительную реакцию в ELISA, иногда давали неопределенный результат в вестерн-блот-анализе, что может быть обусловлено неполным гуморальным ответом на ВИЧ у инфицированного индивидуума, или неспецифическими реакциями у неинфицированного индивидуума. В таких неоднозначных случаях, для подтверждения инфекции может быть проведен ИФА. В некоторых случаях, второй образец может быть взят через месяц и повторно протестирован у индивидуумов с неопределенными результатами вестерн-блот-анализа. В дополнительных примерах, анализ на нуклеиновые кислоты (проводимый, например, методом амплификации вирусной РНК или провирусной ДНК) может, в некоторых ситуациях, облегчить установление диагноза.
+
Детекция ВИЧ в крови индивидуума указывает на то, что данный индивидуум инфицирован ВИЧ и является кандидатом на введение ему терапевтических композиций, описанных в настоящей заявке. Кроме того, если число CD4-Т-клеток составляет менее, чем 350 на микролитр, например, 200 клеток на микролитр, то это также означает, что данный индивидуум, вероятно, является ВИЧ-инфицированным.
Перед введением описанных в настоящем документе терапевтических композиций не требуется проведения предварительного скрининга.
Предварительное лечение индивидуумов. В конкретных примерах, индивидуум, перед введением ему терапевтического средства, проходил лечение, содержащее проведение одного или более курсов антиретровирусной терапии, известных специалистам. Однако такое предварительное лечение является необязательным, но может быть назначено врачом-клиницистом.
Введение терапевтических композиций. После отбора индивидуумов таким индивидуумам (например, взрослому человеку или новорожденному с риском ВИЧ-инфицирования или, как известно, уже ВИЧ-инфицированному) вводят терапевтически эффективную дозу описанного в настоящем документе gp41-специфического нейтрализующего mAb. Дополнительные средства, такие как противовирусные средства, могут быть также введены индивидууму до, во время или после введения описанных средств. Такое введение может быть осуществлено любым известным методом, таким как пероральное введение, введение путем ингаляции, внутривенное введение, внутримышечное введение, внутрибрюшинное введение или подкожное введение.
Количество композиции, вводимой для профилактики, снижения уровня, ингибирования и/или лечения ВИЧ-инфекции или состояния, связанного с ВИЧ-инфекцией, зависит от индивидуума, подвергаемого лечению, тяжести расстройства и способа введения терапевтической композиции. В идеальном случае, терапевтически эффективное количество средства представляет собой количество, достаточное для профилактики, снижения уровня, ингибирования и/или лечения состояния (например, ВИЧ-инфекции) у индивидуума, и не вызывающего у индивидуума какого-либо явного цитотоксического эффекта. Эффективное количество может быть легко определено самим специалистом, например, путем проведения рутинных экспериментов, по данным которых могут быть построены кривые доза-ответ. Сами эти композиции могут быть получены так, чтобы они содержали инертный разбавитель или фармацевтически приемлемый носитель.
В одном из конкретных примеров, антитела вводят в количестве 5 мг/кг через каждые две недели или 10 мг/кг через каждые две недели в зависимости от конкретной стадии ВИЧ-инфекции. В одном из конкретных примеров, антитела вводят непрерывно. В другом примере, антитела или их фрагменты вводят в количестве 50 мкг/кг два раза в неделю в течение 2-3 недель.
Введение терапевтических композиций может быть осуществлено в течение длительного периода времени (например, в течение нескольких месяцев или лет).
+
+
Оценка. После проведения одного или более курсов терапии может быть проведен мониторинг индивидуума с ВИЧ на снижение уровня ВИЧ-инфекции, увеличение числа CD4-Т-клеток или на ослабление одного или более клинических симптомов, связанных с ВИЧ. В конкретных примерах, индивидуумы были обследованы один или более раз через 7 дней после начала лечения. Обследование индивидуумов может быть проведено любым методом, известным специалистам. Так, например, у индивидуума могут быть взяты биологические образцы, включая пробы крови, которые затем анализируют на изменение уровня ВИЧ-инфекции или количества CD4-Т-клеток.
+
Дополнительное лечение. В конкретных примерах, если индивидуумы имеют стабильное состояние или обнаруживают незначительный, смешанный или частичный ответ на проводимое лечение, то они могут быть подвергнуты повторному лечению после повторного обследования по той же самой схеме, либо им могут быть снова введены препараты средств, которые уже были им введены ранее, в течение нужного периода времени, например, на протяжении всей жизни. Частичный ответ представляет собой снижение уровня ВИЧ-инфекции, репликации ВИЧ или их комбинаций по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50% или по меньшей мере на 70%. Частичный ответ может также означать увеличение числа CD4-Т-клеток, например, число таких Т-клеток может составлять по меньшей мере 350 на микролитр.
Пример 6
ПЦР для секвенирования последовательности 454 в клетках пациента N152
В этом примере описан ПЦР-анализ, содержащий амплификацию образца ДНК для фундаментального секвенирования. Этот способ включает получение кДНК из клеток пациента посредством ОТ-ПЦР с последующей амплификацией генов VH3 и VL3 полученной кДНК.
Образец, взятый у пациента N152, содержал 33-36 миллионов клеток МКПК/мл.
мРНК получали с использованием набора Qiagen Oligotex (в соответствии с инструкциями производителей).
ОТ-ПЦР проводили на мРНК с использованием реагентов Invitrogen (которые содержали олиго-dT в качестве праймера и обратную транскриптазу Superscript II).
После проведения ОТ-ПЦР-реакций, кДНК подвергали амплификации с использованием праймеров, специфичных для генов VH3 и VL3, а именно, амплификации из лидерных последовательностей аллелей IGHV3-15*05 и IGLV3-19*01, которые являются предполагаемыми предшественнниками 10E8.
Были использованы следующие праймеры:
5'-тяжелая цепь
>XLR-A_5L-VH3 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGAAGGTGTCCAGTGTGARGTGCAG (SEQ ID NO: 28)
>XLR-A_VH3-L1-MP CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGGCTATTTTAAAAGG-TGTCCAATGT (SEQ ID NO:  29)
>XLR-A_VH3/4_L1_MP CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGGTGGCAGCTCCCAGATG-GGTCCTGTC (SEQ ID NO: 30)
>XLR-A_VH3/4_L3_MP CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGGTTGCAGTTTTAAA-AGGTGTCCAGTG (SEQ ID NO: 31)
5'-легкая цепь
>XLR-A_5L-VL3CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGGCTCTGTGACCTCCTATGAGCTG (SEQ ID NO: 32)
>XLR-A_5MP-VL3-1 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGGCTTACTGCACA-GGATCCGTGGCC (SEQ ID NO: 33)
>XLR-A_5MP-VL3-19 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGACTCTTTGCAT-AGGTTCTGTGGTT (SEQ ID NO: 34)
>XLR-A_5MP-VL3-21 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTCTCACTGCACAGGC-TCTGTGACC (SEQ ID NO: 35).
Образцы подвергали гель-экстракции и очистки фенолом-хлороформом.
Конечный выход: 1,15 мкг тяжелой цепи; 0,9 мкл легкой цепи 0,5 мкг каждой цепи отдавали в лабораторию для секвенирования 454.
Общее число последовательностей, полученных со всего чипа 454 для каждой цепи: тяжелая цепь: 843084 исходных последовательностей, 37669 последовательностей, принадлежащих к семейству IGHV3-15; легкая цепь: 1219214 исходных последовательностей, 91951 последовательностей, принадлежащих к семейству IGKV3-15.
Пример 7
Способ выделения и получения моноклональных антител без какой-либо имеющейся информации о специфичности к антигену
В этом примере описан способ выделения и продуцирования организмом всех антител против антигена-мишени, такого как вирионы, раковые антигены или токсины. Современные методы выделения и продуцирования моноклональных антител разработаны на основе специфических известных эпитопов, которые используются для выделения и продуцирования новых моноклональных антител. В этих способах В-клетки подвергают сортировке и выделяют гены иммуноглобулина исходя из специфичности к эпитопу. Однако такая методика может давать неточные результаты, поскольку она основана на использовании уже известных эпитопов или уже имеющейся информации о специфичности антител. Кроме того, поскольку такая методика основана на использовании антител с уже известной специфичностью или уже известных эпитопов, то она не позволяет разработать новые моноклональные антитела с неизвестными специфичностями к эпитопу. В отличие от современной методики, эта методика основана на выделении популяции B-клеток из организма, в котором имеются все В-клетки, продуцируемые данным организмом. Эту популяцию размножают и скринируют на активность, направленную против функциональных свойств или представляющего интерес антигена, такого как вирион, токсин, белок или раковый антиген. Это позволяет выделять полный репертуар В-клеток памяти, продуцируемых организмом и специфичных к антигену без какой-либо предварительной информации о специфичности или связывании. Так, например, В-клетки памяти в этом репертуаре могут быть скринированы на функциональную активность (такую как нейтрализующая активность) и использованы для продуцирования моноклональных антител, специфичных к антигену.
Методы
Окрашивание и сортинг моноколоний В-клеток памяти осуществляли следующим образом.
Выделение В-клеток
+
-
-
-
+
-
-
-
МКПК, взятые у пациента, который ранее подвергался воздействию антигена-мишени (например, у индивидуума с ВИЧ-1-инфекцией, если антигеном-мишенью является антиген ВИЧ-1), окрашивали смесью антител, состоящей из антител против CD19-ФЭ-Cy7 (BD Bioscience), IgA-АФЦ (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.), IgD-ФИТЦ (BD Pharmingen), и IgM-ФЕ (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.), при 4°C в темноте в течение 30 минут. Затем клетки промывали 10 мл PBS-BSA-буфера и ресуспендировали в 500 мкл PBS-BSA. CD19IgAIgDIgM-В-клетки памяти сортировали на клеточном сортере FACSAria III (Becton Dickinson). На фиг. 42 проиллюстрированы результаты FACS-выделения CD19IgAIgDIgM-В-клеток из образца МКПК.
Дополнительное описание выделения В-клеток
1. Подготовьте клеточный сортер FACSARIA III (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ):
a. включите прибор, подождите пока он не нагреется, запустите CST; выполните автоматическую установку для задержки капли (дальнейшие стадии выполняйте вручную);
b. подготовьте бутыль со стерильным PBS-BSA (или повторно отфильтруйте уже имеющуюся бутыль)
c. простерилизуйте пробирки: (1) загрузите образец 15% Сontrad (детергента) и запустите 5-минутную программу со скоростью потока 8; (2) загрузите образец 10% отбеливателя и запустите 5-минутную программу со скоростью потока 8; (3) загрузите образец стерильного PBS-BSA (в стерильной пробирке) и запустите программу на несколько минут со скоростью потока 8; (4) переключите на скорость потока 1
d. перейдите к подаче потока для сортировки: (1) поставьте пустую пробирку Guava в блок для сортировки и подсоедините блок; (2) откройте створку для подачи потока; (3) Diva: в окне боковых потоков (запросите «70 микрон»), откройте отсек для отработанного материала; убедитесь, что предметные стекла 1, 3, 4 установлены на «ноль», предметное стекло 2 должно быть установлено на позиции 48; (4) щелкните «Voltage», а затем «Test Sort»; (5) откройте створку для потока - и посмотрите, проходит ли сортируемый поток прямо по центру пробирки; (6) используйте контейнеры для отходов в окне боковых потоков для корррекции бокового потока так, чтобы он проходил по центру; (7) щелкните «Voltage» для его отключения; закройте отсек для отходов
е. DIVA (программа Aria): скопируйте старую матрицу, выбрав «previous sort», а затем «Duplicate without data» или проведите новый эксперимент с гейтированием, как описано ниже;
f. Подсоедините аппарат с охлаждающим трубопроводом к блоку сортировки; включите холодильный аппарат.
2. Приготовьте клетки:
a. до запуска, тщательно промойте вытяжной шкаф и пипетки этанолом
b. приготовьте по меньшей мере 400 мл среды IMDM (с глутамаксом)/10 FBS/Mycozap
c. нагрейте две 15-миллилитровые конические пробирки с 7,5 мл IMDM/10% FBS с 15 мкл бензоназы
d. введите краситель Master mix в пробирку Эппендорфа:
центрифугируйте антитела IgM и IgA в течение 1 минуты, а затем возьмите аликвоты смеси Master mix: 50 мкл антитела на 50 миллионов клеток
Для 1х
Для 2,5х
CD19-ФЭ-Cy7
0,5 мкл
1,25 мкл
IgM-ФЭ
1,0 мкл
2,5 мкл
IgA-AФЦ
2,5 мкл
6,25 мкл
IgD-ФИТЦ
2,5 мкл
6,25 мкл
PBS-BSA
43,5 мкл
108,75 мкл
центрифугируйте 20 минут при 4°C в микроцентрифуге: FACS-красители (ФЭ: фикоэритрин; Cy7: цианиновый краситель; АФЦ: аллофикоцианин; ФИТЦ: флуоресцеин-изотиоцианат; CD19-PE-Cy7 (конъюгированное с красителем анти-CD19 mAb, специфичное к В-клеткам (за исключением В-клеток плазмы); IgA: анти-IgA mAb; IgD: анти-IgD mAb; IgM: анти-IgM mAb
e. проведите оттаивание 2 сосудов с клетками пациентов: (1) нагревайте сосуд в водяной бане до тех пор, пока не будет заметно таяние льда; (2) добавьте в сосуд 1 мл предварительно нагретой среды/бензоназы и оставьте сосуд на 15 секунд; (3) переместите все содержимое сосуда в 15-миллилитровую коническую пробирку с теплой средой; (4) осадите центрифугированием при 1200 об/мин в течение 10 минут; (5) ресуспендируйте каждую пробирку в 1 мл PBS-BSA, затем содержимое объедините, и 50 мкл смеси поместите в каждую из 5 конических пробирок; (6) центрифугируйте все 6 конических пробирок; (7) Примечание - если требуется только один сосуд, то стадии v. и vi. можно не проводить
f. ресуспендируйте клеточный осадок: (1) главный образец: в 100 мкл Master mix; (2) объедините в 50 мкл PBS-BSA, добавьте один из красителей (0,5 мкл CD19-PE-Cy7 и т.п.)
g. оставьте на 30 минут при 4°C, оберните в фольгу
h. промойте: добавьте 1000 мкл PBS-BSA с P1000, хорошо перемешайте, добавьте еще 2 мл PBS-BSA
i. осадите центрифугированием, при этом вскройте новую упаковку фильтровальных пробирок с колпачком, поместите в вытяжной шкаф и промаркируйте их
j. ресуспендируйте в 500 мкл PBS-BSA и перенесите в стерильные фильтровальные пробирки с колпачком путем впрыскивания клеток через колпачок (удерживайте кончик колпачка при впрыскивании)
k. пробирки держите на холоде до начала проведения проточной цитометрии
3. Сортировка клеток: (1) загрузите на Aria, проведите гейтирование, как описано в примере; используйте старую компенсацию напряжения, если напряжение включено, на что указывает OK, в противном случае, скорректируйте напряжение и проведите компенсацию; (2) доведите скорость потока между 1-2 так, чтобы эта скорость, по возможности, не превышала 13000 событий/сек и проводите мониторинг во время всей процедуры сортировки; (3) запустите программу сортинга (щелкните на «Sort > New sort layout; Purity 1.5; Sort: continuous»; выберите гейт P6 для сортировки into on Left); (4) поместите 250 мкл среды в 2 мл o-кольцевую пробирку, загрузите в блок для сортинга e. Протестируйте отсортированные 500 клеток; (5) выньте образец и снова поместите на холод; (6) подайте образец на линию обратного потока на 1-2 минуты, а затем загрузите в пробирку свежий PBS-BSA в проточном режиме; (7) установите скорость 8 на две минуты для очистки главного образца; (8) выньте отсортированную пробирку из блока для сортировки и используйте реагент P1000 для мягкой промывки предметных стекол с использованием среды, содержащейся в пробирке; (9) переместите все содержимое в проточную пробирку; (10) включите «Flow» и зарегистрируйте чистоту после сортировки; (12) загрузите главный образец на Aria и отсортируйте 20000-30000 B-клеток; (13) повторите стадии 5-7; (14) возьмите 10 мкл, добавьте к 100 мкл PBS-BSA в проточной пробирке, подайте поток жидкости и зарегистрируйте чистоту после сортировки; (15) поместите 270 мкл Guava ViaCount в пробирку Guava, добавьте 30 мкл отсортированных клеток, подождите две минуты, затем подсчитайте клетки на Guava (регистрируйте только концентрацию; для объема 0,25 мл опция подсчета недоступна); (16) вычислите количество клеток, необходимое для культивирования при нужной плотности.
Обработка клеток факторами роста для индуцирования деления клеток
+
-
-
-
5
CD19IgAIgDIgM-В-клетки памяти ресуспендировали в модифицированной по способу Исков среде Дульбекко (IMDM) с 10% FBS, содержащей 100 ед/мл IL-2, 50 нг/мл IL-21 и 1Ч10/мл 3T3-msCD40L-облученных клеток-фидеров, полученных как описано ранее (Kershaw et al., Cancer Res., 61: 7920-7924, 2001). B-клетки высевали в 384-луночные микротитрационные планшеты при плотности 4 клетки/лунку в конечном объеме 50 мкл.
Дополнительное описание обработки клеток факторами роста
6
1. Подготовьте условия для посева: (1) проведите оттаивание 1 сосуда с 35Ч10 3T3-msCD40L-облученных клеток (метод с использованием бензоназы), ресуспендированных в 10 мл IMDM/10%FBS; (2) подсчитайте количество реагентов
5
(a) Концентрации (смесь клеток-фидеров): 3T3-msCD40L: 5000 клеток/50 мкл/лунку = 10клеток/мл; IL2, 100 ед/мл; IL21, 50 ед/мл; среда IMDM для культивирования клеток/10% FBS (см. выше); для 20 планшетов = 350 мл: 336 мл IMDM/10%FBS; 3,5 мл IL2 (10000 u/мл); 175 мкл IL21; 10 мл 3T3msCD40L (b) приготовьте смесь подсчитанных клеток-фидеров; для 10 планшетов: отложите 12,5 мл для контроля, не являющегося B-клетками.
2
2. Засейте клетки: (1) используйте 384-луночные планшеты; пометьте их на крышке и с боковой части планшета; (2) Используйте 12-канальные пипетки; (3) может оказаться полезным держать планшет под углом; (4) осторожно поместите 100 мкл стерильной деионизованной HО во внешние лунки (необходимо 7,7 мл/планшет); (5) перед добавлением В-клеток в смесь, поместите 50 мкл/лунку смесь фидеров в ряд D всех планшетов (то есть, (6) контроль без антитела); (7) добавьте соответствующее количество В-клеток к смеси остальных фидеров (для 10 планшетов, 2,5 B-клеток/лунку = 50 клеток/мл, необходимо 8125 B-клеток); (8) переместите клеточную смесь в большие стерильные ванночки и поместите 50 мкл/лунку этой смеси во внутренние 308 лунок (за исключением ряда D); (9) убедитесь, что смесь клеток в ванночке является однородной; (10) засейте внешнюю четверть планшета для последующего ELISA-анализа; (11) переместите обратно в инкубатор и не трогайте в течение 13 дней.
3. Фирмы-поставщики: IL2 - Roche - 11147528001 (50 мл); IL21 - Invitrogen - PHC0215 (25 мкг); IMDM + Glutamax - Invitrogen - 31980-097 (1×10 btls)
Инкубирование и скрининг супернатантов на нейтрализацию
После 13-дневного инкубирования, 40 мкл супернатантов культуры от каждой лунки собирали и скринировали на нейтрализующую активность с использованием представляющего интерес функционального антигена-мишени (например, если антигеном ВИЧ-1 является антиген-мишень, то анализ на нейтрализацию может представлять собой высокоэффективный анализ на микро-нейтрализацию ВИЧ-1MN.03 и ВИЧ-1Bal.26).
Дополнительное описание сбора супернатанта для анализа на нейтрализацию
1. Сбор супернатанта для анализа на нейтрализацию:
a. Приготовьте ELISA-планшет заранее (покройте планшет Maxisorp™ анти-IgG антителом); очистите вытяжной шкаф и пипетки этанолом, а затем RNaseAway™; пометьте все 384-луночные белые планшеты, которые вы приготовили на день 11
b. Введите 40 мкл, взятые из каждой лунки планшета на день 11, в соответствующую лунку свежеприготовленного планшета: (1) Используйте 12-канальные пипетки; (2) введите кончик как можно глубже в лунку - Ok, так, чтобы он слегка касался дна, а затем слегка сдвиньте и вытяните; (3) раскапайте в новый планшет; (4) покройте планшеты с супернатантами термофольгой и накройте крышкой; четверть планшета доведите до 4°C; (5) оставьте планшеты с супернатантами на хранение при -80°C до их использования в анализе на нейтрализацию.
2
c. Приготовьте буфер для захвата-лизиса - достаточное количество для 308 лунок *1,15 * число планшетов: для 1 лунки (0,3 мкл триса, pH 8, 1M; 0,25 мкл ингибитора РНКазы; 19,45 мкл DEPC-обработанной HО); поместите 20 мкл буфера для захвата-лизиса во все лунки с B-клетками (раскапайте многоканальной пипеткой; покройте термофольгой и накройте крышкой; положите на хранение при -80°C); проведите ELISA-анализ с использованием 10 мкл супернатанта из четверти планшета для измерения концентрации IgG и определения числа наилучших событий.
Получение моноклональных антител
2
B-клетки в каждой лунке лизировали с использованием 20 мкл буфера для лизиса, содержащего 0,25 мкл ингибитора РНКазы; (New England Biolabs Inc.), 0,3 мкл 1M триса, pH 8 (Quality Biological Inc.) и 19,45 мкл DEPC-обработанной HО. Планшеты с В-клетками хранили при -80°C. Вариабельную область тяжелой цепи и легкой цепи гена иммуноглобулина амплифицировали с помощью ОТ-ПЦР в лунках, которые рассматривались как положительные в анализе на нейтрализацию. кДНК-продукт использовали в качестве матрицы в ПЦР-реакции. Для амплификации гена иммуноглобулина с большим количеством соматических мутаций использовали два набора праймеров, описанных ранее (Tiller et al., J. Immunological Methods, 329:112-124, 2008), в двух независимых ПЦР. Один набор праймеров содержал прямые праймеры и обратные праймеры, специфичные к лидерной области и к константной области IgH, Igk или Igλ, соответственно. Другой набор праймеров содержал смеси прямых праймеров, специфичных к FWR1, и соответствующих обратных праймеров, специфичных к J-генам IgH, Igk и Igλ. Все ПЦР проводили в 96-луночных ПЦР-планшетах в полном объеме 50 мкл, содержащих 20 нМ каждого праймера или смеси праймеров, 10 нМ каждого dNTP (Invitrogen), 10 мкл 5x Q-раствора (Qiagen) и 1,2 единиц ДНК-полимеразы Taq HotStar (Qiagen). Пулы ДНК VH или VL-области, полученные из положительных ПЦР-реакций, лигировали с вектором pCR2.1-Topo-TA (Invitrogen) для секвенирования, а затем клонировали в соответствующий Igγ1-, Igk- и Igλ-вектор экспрессии. 10 мкг плазмид с тяжелой и легкой цепью, клонированных в одной и той же лунке и объединенных во всех возможных парах тяжелой и легкой цепей, смешивали с 40 мкл FuGENE 6 (Roche) в 1500 мкл DMEM (Gibco) и совместно переносили в клетки 293T. Полноразмерный IgG очищали на колонке с рекомбинантным белком A (GE Healthcare).
Анализы на нейтрализацию моноклональными антителами
После очистки полноразмерного IgG продуцированные антитела тестировали на нейтрализующую активность.
Так, например, если представляющим интерес антигеном является антиген ВИЧ-1, то нейтрализующая активность моноклональных антител может быть оценена на клетках TZM-bl, подвергнутых одному раунду инфицирования Env-псевдовирусами ВИЧ-1. Env-псевдовирусы ВИЧ-1ВИЧ-1 получали путем ко-трансфекции клеток 293T остовом pSG3 Env и второй плазмидой, экспрессирующей Env ВИЧ-1. Через 72 часа после трансфекции, супернатанты, содержащие псевдовирус, собирали, замораживали при -80°C и хранили до их использования. В анализе на нейтрализацию, 10 мкл 5-кратного серийного разведения сыворотки или mAb пациента инкубировали с 40 мкл псевдовируса в 96-луночном планшете при 37°C в течение 30 минут, а затем добавляли клетки TZM-bl. После инкубирования в течение 2 дней, клетки подвергали лизису и оценивали инфекционность вируса путем количественного измерения люциферазной активности на люминометре VICTOR Light (Perkin Elmer). 50% ингибирующую концентрацию (IC50) вычисляли как концентрацию антитела, которая снижает уровнь инфицирования на 50%.
Пример 8
Модификации антитела 10E8
В этом примере проиллюстрированы модификации антитела 10E8, вносимые для повышения аффинности к gp120, но без повышения аутореактивности. Как описано ниже, было испробовано несколько подходов идентифицировать антитело 10E8 и внести модификации для улучшения его структуры, включая структурный аланин-сканирующий мутагенез паратопа 10E8; структурный мутагенез для усиления гидрофобных взаимодействий; частичную реверсию зародышевой линии; комбинацию этих подходов и тотальное пиросеквенирование 454 В-клеток пациента N152 для идентификации филогенетических вариантов 10E8 с повышенной активностью. Кроме того, были испробованы комбинации этих четырех подходов с последующим объединением наилучших элементов и результатов от каждого из них. Ниже приводится краткое описание каждого из этих четырех подходов, а также приводится обоснование целесообразности осуществления каждого из таких подходов.
(1) Структурный аланин-сканирующий мутагенез паратопа 10E8
Исходя из кристаллической структуры комплекса Fab 10E8 с MPER gp41 (описанного выше), остатки тяжелой цепи паратопа 10E8 заменяли аланином. Мутантные конструкции антител получали стандартными методами, и эти антитела экспрессировали и очищали, как описано в примере 1. Все остатки паратопа 10E8 заменяли аланином (см. фиг. 43), и такие замены в нескольких положениях остатков приводили к усилению 10E8-опосредуемой нейтрализации вируса (см. фиг. 32 и 49). Такими остатками 10E8 являются остатки D28, D30, N31, T52, E53, S56, D58 и Y100e (нумерация по Кэбату). Анализы на нейтрализацию осуществляли, как описано в примере 2.
(2) Структурный мутагенез для усиления гидрофобных взаимодействий
Исходя из кристаллической структуры комплекса Fab 10E8 с MPER gp41, остатки, которые, как, предполагалось, были копланарными с эпитопом для 10Е8, подвергали мутагенезу путем их замены на гидрофобные остатки (см. фиг 44A и 44B). Мутантные конструкции антитела создавали стандартными методами, и эти антитела экспрессировали и очищали, как описано в примере 1. Как показано на фиг. 45, замены остатков в нескольких положениях, как отдельно, так и в комбинации друг с другом, приводили к усилению нейтрализующей активности 10E8. Из всех мутантов, перечисленных на фиг. 45, мутант с заменой остатка S74 триптофаном давал наибольшее повышение уровня нейтрализации, а за ним шли двойной мутант D30-N31 и одиночный мутант D28. Анализы на нейтрализацию осуществляли как описано в примере 2.
(3) Частичная реверсия зародышевой линии
Присоединение CDR проводили в целях реверсии замен части зрелой последовательности 10E8 обратно в последовательность зародышевой линии. Присоединение CDR представляет собой процедуру, которую обычно проводят для гуманизации антител, происходящих от животного, не являющегося человеком (например, мыши), а именно: в этой процедуре проводят выравнивание последовательностей не-человеческого антитела с последовательностями человеческого аналога (обычно гена зародышевой линии человека) и сохраняют CDR исходного антитела, но заменяют выбранные каркасные остатки соответствующими человеческими остатками. Каркасные остатки отбирают для мутации, вносимой исходя из структурного анализа и анализа последовательностей. В некоторых случаях не все наблюдаемые замены для созревания антитела могут быть благоприятными, однако, частичная реверсия в зародышевую линию может оказаться полезной для улучшения некоторых свойств антител, таких как более продолжительное время полужизни, пониженная иммуногенность или повышенная активность. Путем присоединения CDR к 10E8 были получены три различных ревертанта тяжелой цепи и три различных частичных ревертанта легкой цепи (см. фиг. 47). На аминокислотном уровне, число мутаций было снижено с 28% дo 12-20% для тяжелой цепи и с 21% до 7-14% для легкой цепи. Мутированные антитела были сконструированы и получены стандартными методами, описанными в примере 1. Различные комбинации ревертантов тяжелой и легкой цепей были протестированы на связывание с MPER и на нейтрализацию (см. фиг. 48). Наибольшее повышение уровня нейтрализации (в <2 раза) наблюдалось для ревертанта, который содержал реверсии тяжелой и легкой цепей, наиболее близкие к зрелому антителу («10E8-R3», который содержит тяжелую цепь 10E8gH03 (SEQ ID NO: 149) и легкую цепь 10E8gL03 (SEQ ID NO: 152)). Дополнительные улучшения наблюдались в том случае, когда ревертанты были спарены с тяжелой/легкой цепями, происходящми от других источников (как показало тотальное секвенирование, обсуждаемое ниже).
(4) Дополнительные мутации
Исходя из данных по нейтрализации, анализа ревертантов, аланин-сканирующего анализа паратопов и данных по повышению уровня гидрофобности конструкций, описанных выше, в вариант антитела 10E8 с тяжелой цепью 10E8gH03 и в вариант антитела 10E8 с легкой цепью 10E8gL03 были введены дополнительные мутации, и на этой основе были сконструированы и получены антитела стандартными методами, описанными в примере 1, а затем эти антитела были протестированы на нейтрализующую активность методами, описанными в примере 2 (фиг. 49).
Таблица 1Дополнительные варианты тяжелой и легкой цепей 10Е8
Название на фиг. 51
Тяжелая цепь 10E8gH03(SEQ ID NO:149) с дополнительными мутациями”
Легкая цепь 10E8gL03(SEQ ID NO:152) с дополнительными мутациями
10E8H3_1F+L3
1F
-
10E8H3_1L+L3
1L
-
10E8H3_1W+L3
1W
-
10E8H3_A32Q+L3
A32Q
-
10E8H3_D30AE56A+L3
D30A+E53A
-
10E8H3_D30AE56AS77W+L3
D30A+E53A+S74W
-
10E8H3_D30WN31F+L3
D30W+N31F
-
10E8H3_D30WN31FE56A+L3
D30W+N31F+E53A
-
10E8H3_E56A+L3
E53A
-
10E8H3_E56F+L3
E53F
-
10E8H3_E56L+L3
E53L
-
10E8H3_E56M+L3
E53M
-
10E8H3_E56V+L3
E53V
-
10E8H3_E56W+L3
1E53W
-
10E8H3_N31F+L3
10N31F
-
10E8H3_N31Y+L3
N31Y
-
10E8H3_S59H+L3
S56H
-
10E8H3_S77F+L3
S74F
-
10E8H3_S77L+L3
S74L
-
10E8H3_S77M+L3
S74M
-
10E8H3_S77W+L3
S74W
-
10E8L3_2L+H3
-
2L
10E8L3_3W+H3
-
3W
10E8L3_G94W+H3
-
G94W
10E8L3_S93W+H3
-
S93W
(5) Тотальное пиросеквенирование 454 для идентификации филогенетических вариантов 10E8 с повышенной активностью
В этом примере проиллюстрированы идентификация и функциональное спаривание последовательностей тяжелой и легкой цепей 10E8-подобного антитела, определенных в отдельных реакциях пиросеквенирования 454. Исходя из последовательности нейтрализующего антитела 10E8 дикого типа были идентифицированы клональные варианты тяжелой и легкой цепей, и эти варианты были проанализированы на их функциональные свойства путем спаривания с комплементарной цепью 10E8 дикого типа. Филогенетические деревья тяжелой и легкой цепей обнаруживали топологию ветвей, близкую к топологии последовательностей 10E8 дикого типа, и было выявлено, что ветви филогенетических деревьев тяжелой и легкой цепей соответствовали друг другу по их относительной удаленности от 10E8. Путем анализа матрицы антител, реконструированной из соответствующих и несоответствующих ветвей с точки зрения нейтрализации ВИЧ-1 и реактивности с аутоантигенами было оценено влияние филогенетического спаривания на функциональные свойства.
Антитело 10E8 с нейтрализующей активностью широкого спектра было идентифицировано у ВИЧ-1-инфицированного донора N152, и было установлено, что оно распознает спираль в мембрано-проксимальной внешней области (MPER), расположенной непосредственно перед трансмембранной областью гликопротеина gp41 ВИЧ-1, и нейтрализует 98% различных изолятов ВИЧ-1 при 50% ингибирующей концентрации (IC50) 0,32 мкг/мл. Тяжелая цепь антитела 10E8 происходит от IgHV3-15 и IgHJ1 и имеет третью гипервариабельную область (CDR H3) из 22 аминокислот и 21% соматических мутаций. Легкая цепь 10E8 происходит от IgVL3-19 и IgLJ3 и имеет CDR L3 из 12 аминокислот и 14% соматических мутаций. Тотальное секвенирование транскриптов В-клеток донора, проводимое с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) для амплификации последовательностей тяжелой цепи IgG, принадлежащих к семейству IgHV3, и для амплификации последовательностей легкой цепи IgG, принадлежащих к семейству IgVL3, осуществляли, как описано в примере 6. мРНК, выделенную приблизительно из 5 миллионов мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК), использовали для реакции обратной транскрипции с получением матричной кДНК, и в обоих случаях были использованы праймеры, расположенные выше от начала лидерной последовательности V-гена и ниже от конца цепи J.
После пиросеквенирования Roche 454 получали 843084 «ридов» тяжелой цепи и 1219214 «ридов» легкой цепи для донора N152 (см. фиг. 50). После первичного анализа, проводимого с использованием биоинформационной базы данных, 36318 последовательностей тяжелой цепи было отнесено к аллельному семейству IgHVl-3, а 54583 последовательностей легкой цепи было отнесено к аллельным семействам IgVL3-IgJ3 (см., например, Wu et al., Science, 333, 1593-1602, 2011, и Zhu et al., Frontiers in microbiology, 3, 315-315, 2012). «Риды» анализировали на идентичность к антителу 10E8 и на отличие от немутированных V-генов, а затем строили сетчатый график зависимости частоты встречаемости от идентичности/отличия (фиг. 50A и 50B, левые панели). Примечательно то, что для тяжелой цепи наблюдалось несколько хорошо различимых «островков» высокой идентичности и приблизительно 25% различий, а для легкой цепи наблюдался один хорошо различимый «островок» высокой идентичности и приблизительно 15% различий. После отбора областей с высокой идентичностью - областей с различиями, проводимого по сетчатому графику, была выбрана 61 последовательность тяжелой цепи и 48 последовательностей легкой цепи. Было проанализировано филогенетическое сходство этих последовательностей с последовательностью 10E8 (фиг. 50C и 50D), и эти последовательности были также синтезированы, реконструированы вместе с комплементарной цепью 10E8 дикого типа и экспрессированы посредством временной трансфекции в 96-луночном формате. В результате твердофазных иммуноферментных анализов (ELISA) экспрессированных вариантов 10E8 было идентифицировано 11 тяжелых цепей и 24 легких цепи (номенклатура и последовательности этих тяжелой и легкой цепей представлены на фиг. 51 и фиг. 59), которые, в случае их спаривания с цепями-партнерами 10E8, связывались с пептидом, соответствующим полноразмерной MPER gp41 ВИЧ-1 (фиг. 50A и 50B, правые панели). На панели из 6 изолятов ВИЧ-1 наблюдалось ~5-кратное увеличение нейтрализующей активности (фиг. 50E и 50F).
dN152
dN152
Функциональные тяжелые цепи 10E8 происходили от трех отдельных «островков», как показано на графиках идентичности/отличий (фиг. 50A), и имели последовательности и характер мутаций, соответствующие последовательностям и характеру мутаций общего клонального ориджина (фиг. 51A). Мутации группировались в областях CDR H1 и H3, а также в первой, третьей и четвертой каркасных областях (FR1, FR3 и FR4). Наиболее отличающаяся последовательность, gVRC-H11, имела 25 аминокислотных замен, что соответствовало 19,1% отличию от тяжелой цепи 10E8 дикого типа. Функциональные легкие цепи 10E8 происходили от нескольких областей, представленных на графиках идентичности/отличий, включая один отдельный «островок» и несколько областей, перекрывающихся с популяцией первой легкой цепи (фиг. 50B). Аналогично тяжелой цепи, функциональные легкие цепи имели характер мутаций, соответствующий характеру мутаций в общем клональном ориджине (фиг. 51C). Мутации группировались в областях CDR L1 и CDR L2, и во всех каркасных областях. Наиболее отличающаяся последовательность, gVRCL23, имела 33 аминокислотных замены, что соответствовало 30,3% отличию от легкой цепи 10E8 дикого типа.
Хотя варианты 10E8, реконструированные с комплементарными цепями 10E8 дикого типа, являются функциональными, однако, они не являются природными парами. Известный недостаток метода тотального секвенирования антитела заключается в том, что для тяжелой и легкой цепей необходимы отдельные реакции секвенирования, и при осуществлении этого метода теряется важная информация о природном онтогенезе и функциональном фенотипе. А поэтому для получения информации, достаточной для рекапитуляции аппроксимации природного спаривания был проведен анализ на основе эволюции. Созревание/эволюция тяжелых и легких цепей должны быть взаимосвязаны, что обусловлено их физической ассоциацией как белков, присутствием их эволюционно родственных генов в тех же самых клетках индивидуума, подвергающихся тем же самым процессам ферментативной мутации, и требованием кооперативного структурного изменения под действием того же самого иммуногена. Кроме того, отбор пар тяжелой и легкой цепей в одной библиотеке кДНК популяции мРНК транскриптов антитела должен быть в высокой степени скоррелирован, поскольку эти цепи происходят от одних и тех же клеток. В принципе, такое сходство при отборе должно обеспечивать корреляцию частоты встречаемости соответствующих ветвей тяжелой и легкой цепей в филогенетических деревьях.
dN152
Филогенетический анализ отобранных по сетчатому графику и экспериментально протестированных тяжелой и легкой цепей 10E8 позволил выявить большинство нейтрализующих антител, которые занимают три ветви, близки к матричным 10E8, и содержат матричные 10E8 (фиг. 50C и 50D). Ветвь b1-H для тяжелой цепи (или b1-L для легкой цепи) содержит 10E8, ветвь b2-H (b2-L) является наиболее близкой к b1-H, а ветвь b3-H (b3-L) является следующей из самых близких к b1-Hh. Одна нейтрализующая последовательность (gVRCH11) занимает более удаленную ветвь (b4-H). Так как пиросеквенирование 454 дает в среднем приблизительно 5 ошибок на вариабельный домен антитела, то наиболее активное антитело от каждой ветви было выбрано как репрезентативное, поскольку большинство функциональных антител, вероятно, имеет по меньшей мере те ошибки, которые были внесены пиросеквенированием 454. Было реконструировано двенадцать антител, включая полноразмерную матрицу, состоящую из пар тяжелая цепь/легкая цепь, происходящих от 4 ветвей тяжелой цепи и 3 ветвей легкой цепи (фиг 52A). 11 из 12 реконструированных антител экспрессировали IgG на уровне, достаточном для оценки нейтрализации, которую проводили на панели из пяти изолятов ВИЧ-1. Все 11 экспрессированных антител были нейтрализующими. Пары тяжелой и легкой цепи, которые филогенетически удалены от 10E8 (например, b1-H-b1-L, b2-H-b2-L, и b3-H-b3-L), в среднем, были несколько более активными, чем их несоответствующие пары, однако, такое различие не было статистически значимым (фиг. 52B).
р
Была также протестирована реактивность соответствующих и несоответствующих пар с аутоантигенами. Примечательно то, что соответствующие пары обнаруживали значительно более низкую интенсивность Hep2-окрашивания (=0,049) (фиг. 52C).
in vivo
Результаты, полученные для 10E8 и сыворотки донора N152, проиллюстрировали, что (i) отбор на идентичность/различие по сетчатому графику может быть проведен для идентификации соматических вариантов, (ii) архитектура филогенетического дерева может быть использована для аппроксимации природных пар, и что (iii) антитела, спаренные в соответствии с филогенетическим сходством, обнаруживают меньшую аутореактивность. Такая пониженная аутореактивность, вероятно, связана с отбором , которому подвергаются природные антитела. Что касается антитела, такого как 10E8, которое механистически более склонно к аутореактивности, чем другие антитела, то для этого антитела может быть применена рекапитуляция природных пар. Хотя при тотальном секвенировании информация о природных парах теряется, однако, исходя из вышесказанного можно предположить, что их аппроксимация может быть осуществлена по топологическому сходству между тяжелой и легкой цепями на филогенетических деревьях. Таким образом, такой подход позволяет использовать филогенетическое сходство или анализ на сцепление между генными локусами в качестве методов отбора, которые предоставляют исключительную возможность применения компьютерной технологии для идентификации соматических вариантов.
(5) Дополнительные варианты и комбинации
Были получены дополнительные комбинации идентифицированных тяжелых и легких цепей, а также идентифицированных вариантов тяжелых и легких цепей для проведения анализа на нейтрализацию и аутореактивность. На фиг. 53-54 указаны комбинации некоторых тяжелых и легких цепей, включая комбинации, полученные исходя из данных о нейтрализации в присутствии комплементарной цепи 10E8 дикого типа, а также комбинации, полученные исходя из информации о филогенетических парах. Номенклатура и информация о последовательностях этих пар представлены на фиг. 59, за исключением «rL3», который соответствует ревертанту легкой цепи 10E8gL03 зародышевой линии, указанному на фиг. 47 и представленному последовательностью SEQ ID NO:149. Величины нейтрализации (IC50, мкг/мл) для панели из шести вирусов представлены на фиг. 55A-55C, а величины аутореактивности представлены на фиг. 56. Величины нейтрализации (IC50, мкг/мл) для панели из двадцати вирусов представлены на фиг. 57. Результаты указывают на присутствие нескольких пар тяжелой и легкой цепи, включая пары тяжелой цепи HC6 (gVRC-H2dnl52; SEQ ID NO: 154) и легкой цепи 10E8gL03 (rL3; SEQ ID NO: 152), которые обладают более высокой нейтрализующей активностью по сравнению с 10E8 дикого типа, но не обладают повышенной аутореактивностью.
Были также получены варианты тяжелой цепи, которые были комплементированы с легкой цепью 10E8 или с вариантами легкой цепи 10E8, и эти варианты были протестированы на нейтрализующую активность (см. фиг. 58A и 58B). Сериновый остаток в положении 74 (нумерация по Кэбату) тяжелой цепи HC6 (gVRC-H2dnl52; SEQ ID NO: 154) варианта 10E8 был дополнительно заменен на аланин, аргинин, валин или тирозин. Последовательности этих вариантов представлены SEQ ID NO: 189 (HC6 S74A), SEQ ID NO: 190 (HC6 S74R), SEQ ID NO: 191 (HC6 S74V), SEQ ID NO: 192 (HC6 S74Y). Эти тяжелые цепи варианта 10E8 были комплементированы с вариантом легкой цепи «rL3» 10E8 (10E8gL03; SEQ ID NO: 149), и полученное антитело было протестировано на нейтрализующую активность против панели 20 вирусов ВИЧ, включая 6, 8, 4, 1 и 1 вирусов кладотипов A, B, C, AG, и G, соответственно. Анализ на нейтрализацию осуществляли, как описано в примере 1, а график, на котором систематизированы результаты этих анализов, представлен на фиг. 58A (указаны величины IC50) и на фиг. 58B (указаны величины IC80).
Дополнительные мутации тяжелой и легкой цепей были введены для продуцирования gp41-связывающих антител с повышенной растворимостью путем уменьшения числа гидрофобных остатков, доступных для растворителя. Остатки, которые не требуются для распознавания эпитопа (исходя из данных тотального секвенирования 454, а также из данных структурного реконструирования белка), были заменены полярными или заряженными остатками. Были сконструированы нижеследующие тяжелые и легкие цепи 10E8-подобного антитела (путем введения, согласно нумерации Кэбата, аминокислотных замен в тяжелые и легкие цепи HC6 (SEQ ID NO:154) и rL3 (SEQ ID NO:152), соответственно).
Легкая цепь:
10E8gL03_hp_L01 (SEQ ID NO: 197; I44K)
10E8gL03_hp_L02 (SEQ ID NO: 198; S2Y, V10T, L14A, I44V, L106P)
10E8gL03_hp_L03 (SEQ ID NO: 199; V10T, L14A, I44K, L106P)
Тяжелая цепь:
HC6_S77Y_hp_H01 (SEQ ID NO: 200; L18Q, S74Y)
HC6_S77Y_hp_H02 (SEQ ID NO: 201; L72D, S74Y, I75K, F77T, M84T)
HC6_S77Y_hp_H03 (SEQ ID NO: 202; L18Q, W55K, S74Y, M84T)
HC6_S77Y_hp_H04 (SEQ ID NO: 203; L18Q, W55K, L72D, S74Y, I75K, F77T, M84T)
Была также получена конструкция неполного ревертанта HC6 зародышевой линии: HC6rH03S77Y (SEQ ID NO: 204; S23A, N73D, S74Y, E81Q, N82bS, R83K, M84T, S87T, L89V, F91Y, R105Q).
Были сконструированы дополнительные варианты легкой цепи 10E8. Такими вариантами являются варианты легкой цепи 10E8 дикого типа, неполный ревертант rL3 легкой цепи 10E8 зародышевой линии и указанные выше три растворимых мутанта легкой цепи. Эти конструкции содержат одну мутацию R23Q, которая позволяет удалять потенциальный сайт связывания с интегрином. Q означает идентичность в положении 23 легкой цепи l0E8 зародышевой линии. Дополнительные мутанты представлены как: 10E8_L_R23Q (SEQ ID NO: 205); 10E8gL03_R23Q (SEQ ID NO: 206); 10E8gL03_hp_L01_R23Q (SEQ ID NO: 207); 10E8gL03_hp_L02_R23Q (SEQ ID NO: 208); 10E8gL03_hp_L03_R23Q (SEQ ID NO: 209). Для специалиста в данной области очевидно, что 10E8 или любые описанные в настоящем документе вариабельные области легкой цепи варианта 10E8 могут иметь, но необязательно, замену R23Q.
(6) Краткое описание мутаций 10E8.
Описанные выше замены в 10E8 систематизированы в таблицах, представленных на фиг. 60A и 60B (замены в тяжелой цепи) и на фиг. 61A и 61B (замены в легкой цепи).
Совершенно очевидно, что в методы или композиции, подробно описанные в настоящей заявке, могут быть внесены изменения или модификации, не выходящие за рамки существа описанных в настоящем документе вариантов осуществления изобретения. Авторами настоящего изобретения заявлены все модификации и изменения, которые не выходят за рамки существа и объема нижеследующей формулы изобретения.