СПОСОБ АКТИВИЗАЦИИ РОСТА ЛЕЙКОЦИТАРНОЙ МАССЫ И КОМПЛЕКСНОЙ КОРРЕКЦИИ СОСТАВА КРОВИ В АКУСТИЧЕСКОМ ПОЛЕ IN VITRO
METHOD FOR ACTIVATION OF WHITE-CELL-RICH SUSPENSION GROWTH AND COMPLEX CORRECTION OF BLOOD COMPOSITION IN ACOUSTIC FIELD IN VITRO

Изобретение относится к медицине и биологии, касается способа активизации роста лейкоцитарной массы и комплексной коррекции состава крови в акустическом поле in vitro и может использоваться в научно-исследовательских центрах, лабораториях, станциях переливания крови, биотехнологических комбинатах и в различных лечебно-профилактических учреждениях.
Наиболее близким является способ коррекции состояния свертывающей системы крови человека (RU 2336098, МПК A61M 21/00, опубликовано 20.10.2008).
Известный способ музыкально-акустической коррекции свертывающей системы крови заключается в направленном изменении у пациента состояния свертывающей системы крови средствами музыкально-акустического воздействия на него, в качестве музыкального воздействия используют специально составляемые музыкально-акустические программы, а перед сеансом музыкально-акустической коррекции диагностируют показатели свертывающей системы крови и психофизиологическое состояние пациента, и по полученным результатам формируют программу музыкального воздействия, закодированную различными сочетаниями элементов музыкального языка и акустических сигналов в частотном диапазоне 20 Гц - 20000 Гц, при этом в осуществлении музыкально-акустической коррекции свертывающей системы крови используют два методологических подхода: прямое воздействие акустическими сигналами на кровь пациента in vitro с целью повысить показатели свертывающей системы крови у лиц с пониженными или нормальными показателями для снижения интенсивности или остановки кровотечения в случае травматических или послеоперационных ран и непосредственное воздействие на пациента рецептивным методом для лечебно-профилактического снижения показателей свертывающей системы крови у лиц, склонных к тромбообразованию, либо для повышения показателей свертывающей системы крови у лиц со сниженными показателями.
Недостатком данного способа является то, что при прямом воздействии акустическими сигналами на кровь пациента in vitro преследуется цель - повысить показатели свертывающей системы крови у лиц с пониженными или нормальными показателями для снижения интенсивности или остановки кровотечения в случае травматических или послеоперационных ран, при этом поставленная клиническая цель является узко ограниченной, не учитываются количественные и качественные изменения в клеточном составе крови in vitro, возникающие в ответ на музыкально-акустические воздействия, а следовательно, медико-биологический потенциал возникающих изменений недооценивается и неоправданно сужает возможности лечебно-профилактического применения способа.
Достигаемым техническим результатом являются активизация роста лейкоцитарной массы и комплексная коррекция состава крови в акустическом поле in vitro.
Способ осуществляется следующим образом.
о
о
У прошедших предварительное обследование пациентов осуществляют забор венозной крови, путем венепункции из локтевой вены в специальные банки, ампулы или полиэтиленовые мешки, заполненные стабилизирующим раствором, емкостью от 5 мл и выше, но не более 500 мл. При необходимости из цельной крови, используя существующие аппаратные методы, получают отдельные фракции клеток крови, например лейкоцитов или гемопоэтических стволовых клеток, которые перед процедурой также размещают в стерильные емкости со стабилизирующим раствором. Акустическое воздействие на емкость (емкости) с кровью или ее фракциями проводят при температуре от 4C до 38C в течение времени от 10 до 300 минут через 2 и более транслятора (наушники или акустические колонки), которые могут располагаться вплотную (рис.1) к емкостям или на расстоянии до 1 м, но не менее чем с двух сторон, при этом само воздействие может осуществляться: а) открытым способом (рис.1) или б) закрытым способом, под плотной сферой (рис.2) или внутри емкости, например термостата (для большей концентрации акустических волн). Для активизации жизнедеятельности и ускорения роста биомассы клеток крови in Vitro используются широкополосные колеблющиеся акустические сигналы в частотном диапазоне 16-20000 Гц, характеризующиеся доминирующим уровнем звукового давления более 45 дБ, но менее 60 дБ, с темпом 60-80 уд/мин, или последовательным чередованием акустических сигналов с доминирующим уровнем звукового давления ≤45 дБ, темпом <60 уд/мин с акустическими сигналами, характеризующимися доминирующим уровнем звукового давления более 65 дБ, но менее 90 дБ и темпом >80 уд/мин.
Для активизации роста лейкоцитарной массы и комплексной коррекции состава крови в акустическом поле in vitro может использоваться кровь практически здоровых людей с последующим применением полученного биоматериала в клинической практике и экспериментах. По показаниям может использоваться также кровь больных для последующей реинфузии, аутогемотерапии или для экспериментальных исследований.
Наиболее частыми показаниями для использования предлагаемой методики являются: 1) клиническая или экспериментальная необходимость увеличения лейкоцитарной массы крови в целом; 2) клиническая или экспериментальная необходимость увеличения массы отдельных популяций лейкоцитов: гранулоцитов, нейтрофилов, лимфоцитов и пр. 3) клиническая или экспериментальная необходимость увеличения массы гемопоэтических стволовых клеток.
Для объективной оценки эффективности способа активизации роста лейкоцитарной массы и комплексной коррекции состава крови в акустическом поле in vitro была осуществлена экспериментальная исследовательская программа.
Материалы и методы исследований.
Для исследований были отобраны 30 практически здоровых лиц различного возраста и пола.
У всех обследуемых лиц натощак из локтевой вены был осуществлен забор крови в количестве 20 мл. 3-5 мл крови, было использовано для морфологического и биохимического анализа исходных образцов. Оставшаяся кровь была распределена на 3 части по 5 мл, каждая из которых была размещена в соответствующие стерильные емкости со °°стабилизирующим раствором.
В экспериментальной серии кровь (30 пробирок) озвучивалась в течение 90 мин при температуре 23°С открытым способом широкополосными колеблющимися акустическими сигналами в частотном диапазоне 16-20000 Гц, характеризующимися доминирующим уровнем звукового давления более 45 дБ, но менее 60 дБ, с темпом 60-80 уд/мин, которые последовательно чередовались с акустическими сигналами с доминирующим уровнем звукового давления менее 45 дБ, темпом менее 60 уд/мин, а также с акустическими сигналами, характеризующимися доминирующим уровнем звукового давления более 65 дБ, но менее 90 дБ и темпом более 80 уд/мин. Музыкально-акустическая программа воздействия была записана на компакт-диск и транслировалась с помощью аппаратно-программного комплекса через студийные наушники, которые прилегали к емкостям с кровью.
В контрольной серии №1 кровь тех же обследуемых лиц (30 пробирок) озвучивалась в течение 90 мин при температуре 23°C открытым способом, при этом использовали простые восходящие модулированные тоны до 22 кГц.
В контрольной серии №2 кровь обследуемых лиц (30 пробирок) находилась в тех же условиях в течение 90 мин но без озвучивания.
По завершению эксперимента все образцы крови были подвергнуты повторному морфологическому и биохимическому исследованию.
Методы исследования.
Для акустических замеров экспериментальных музыкально-акустических программ был использован универсальный прибор Экофизика-110А (Россия).
Для исследований морфологического состава крови использовали гематологический анализатор Sysmex XE-2100, Sysmex Corporation (Япония).
Для исследований биохимических показателей крови использовали биохимический анализатор Stat Fax 3300 (США).
Результаты исследований обрабатывались методами вариационной статистики. При сравнении распределений различных показателей использовался U-критерий Манна-Уитни.
Результаты исследования
Особенности влияния музыкально-акустических воздействий на элементы лейкоцитарной системы крови представлены в таблице №1.
В соответствие с данными таблицы №2, после МАВ в экспериментальной серии морфологических анализов крови выявлены достоверные изменения следующих показателей белой крови:
9
эмп
WBC - общее число лейкоцитов возросло в 4,7 раза, достигнув показателя 20,6±10,73 10/L (полученное эмпирическое значение U(9) находится в зоне значимости р≤0,01).
9
эмп
NE - число нейтрофилов увеличилось с 3,0±1,17 10/L в 4,7 раза (полученное эмпирическое значение U(10.5) находится в зоне значимости р≤0,01).
9
эмп
SEG - число сегментоядерных лейкоцитов с уровня 2,94±1,16 10/L возросло в 4,5 раза (полученное эмпирическое значение U(11.5) находится в зоне значимости p≤0,01).
Таблица 1
Динамика средних значений показателей лейкоцитарной системы крови после музыкально-акустических воздействий (МАВ)
Экспериментальная серия
Контроль-1
ПОКАЗАТЕЛИ
До МАВ
После МАВ
До МАВ
После МАВ
WBC 10<sup>9</sup>/L
4.41±0.29↑
20.6±10.73
6.51±0.29
6.49±0.28
NE 10<sup>9</sup>/L
3.0±1.17↑
14.07±8,18
3.73±0.09
3.72±0.14
SEG 10<sup>9</sup>/L
2.94±1.16↑
13.27±7.98
3.7±0.06
3.65±0.14
EO %
4.65±3.45
5.38±3.57
2.56±0.36
2.51±0.2
BA %
0.41±0.29↑
7.6±2.16
0.22±0.06
0.21±0.03
LY 10<sup>9</sup>/L
0.72±0.59↑
2.84±2.24
1.98±0.16
2.09±0.14
MO 10<sup>9</sup>/H
0.52±0.21
0.88±0.39
0.56±0.04
0.55±0.05
ImGr %
0.42±0.31↑
7.7±2.04
0.22±0.06
0.21±0.06
BAND %
0.92±0.30<sub>(1)</sub>↑
3.72±2.15
0.36±0.21
0.28±0.09
эмп
BA - процентное содержание базофилов по отношению к исходному уровню 0,4±0,29% увеличилось в 18,5 раз (полученное эмпирическое значение U(1) находится в зоне значимости р≤0,01).
9
эмп
LY - число лимфоцитов увеличилось 3,9 раза, достигнув уровня 2,84 10/L (полученное эмпирическое значение U(12.5) находится в зоне значимости p≤0,01).
Существенно увеличились показатели процентного содержания незрелых клеток:
эмп
ImGr - в 18, 3 раза с исходного уровня 0,42±0,31 (полученное эмпирическое значение U(1) находится в зоне значимости p≤0,01);
эмп
BAND - в 4,04 раза с исходного уровня 0,92±0,30 (полученное эмпирическое значение U(7) находится в зоне значимости p≤0,01).
Изменения в показателях моноцитов и эозинофилов были недостоверными.
В контрольных сериях №1 и №2 выявлены несущественные колебания показателей белой крови (p≥0,05).
Реакция показателей эритроцитарной системы крови после МАВ представлена в таблице 2.
Таблица 2
Динамика средних значений показателей эритроцитарной системы крови после музыкально-акустических воздействий.
Экспериментальная серия
Контроль-1
ПОКАЗАТЕЛИ
До МАВ
После МАВ
До МАВ
После МАВ
RBC 10<sup>12</sup>/L
4.52±0.5
4.63±0.57
5.09±0.4
5.02±0.06
HGB g/L
136.9±18.16
135.6±18.3
150.4±17.92
149.9±17.94
HCT %
40.63±5.00
41.34±5.19
44.79±5.61
44.21±5.22
MCV fL
89.84±4.53
89.5±5.15
88.04±0.32
87.86±0.08
MCH Pg
30.25±1.81
29.32±1.66
29.56±0.27
29.8±0.15
MCHC g/L
336.6±4.6↓
328.8±5.1
335.8±4.12
340.3±4.11
RDW % CV
12.73±0.91↑
14.69±1.28
11.55±0.1
11.51±0.21
Как следует из данных таблицы 2, эритроцитарная система оказалась довольно инертной к акустическим воздействиям, т.к. из 7 исследуемых показателей, достоверные изменения были выявлены только в экспериментальной серии по двум показателям:
эмп
MCHC - показатель средней концентрации гемоглобина в эритроцитах снизился на 2% с 336.6±4.6 до 328.8±5.1 g/L (полученное эмпирическое значение U(14) находится в зоне значимости p≤0,05);
эмп
RDW - коэффициент вариации среднего объема эритроцитов, напротив, возрос на 15% с 12.73±0.91 до 14.69±1.28% (полученное эмпирическое значение U(10,5) находится в зоне значимости p≤0,01).
В контрольных сериях №1 и №2 выявлены несущественные колебания показателей эритроцитарной системы крови (p≥0,05). Динамика отдельных биохимических показателей крови после МАВ представлены в таблице №3.
Таблица 3
Динамика биохимических показателей крови после музыкально-акустических воздействий
Экспериментальная серия
Контроль-1
ПОКАЗАТЕЛИ
До МАВ
После МАВ
До МАВ
После МАВ
Total Protein 65-85 g\l
68.52±1.16↑
72.27±1.09
71.5
71.7
HDL 1.05-2.10 umol\l
1.41±0.03↑
1.48±0.03
1.47
1.47
Total Bilirubin 5.0-21 umol\l
4.13±0.68↓
2.23±1.02
4.25±0.91
3.68±0.79
ALT 1.6-40.0 U\l
13.26±0.52↑
14.93±0.98
13.61±0.90
13.57±0.58
AST 1.6-37.0 U\l
121.37±3.22↑
27.77±2.7
19.04±1.21
20.01±0.71
LDH 0.0-248.0 U\l
188.02±16.06↑
321.57±22.91
147.33±4.41
149.62±21.43
Glucose 3.90-6.10 mmol\l
4.09±0.11↓
2.35±0.23
5.26±0.82
5.06±0.48
В соответствии с данными таблицы 3, в экспериментальной серии анализов произошли следующие достоверные изменения биохимических показателей крови:
эмп
Total Protein - общий белок от исходного значения 68.52±1.16 g\l возрос на 5,5% (полученное эмпирическое значение U(0) находится в зоне значимости p≤0,01);
эмп
HDL - уровень HDL-холестерола (липопротеиды высокой плотности) от исходного значения 1,41±0,03 umol\l увеличился на 5% (полученное эмпирическое значение U(1,5) находится в зоне значимости p≤0,01);
эмп
Total Bilirubin - общий билирубин снизился со значения 4.13±0.68 umol\l в 1,9 раза (полученное эмпирическое значение U(5,5) находится в зоне значимости p≤0,01);
эмп
ALT - уровень аланинаминотрансферазы вырос на 12,6% от исходного значения 13.26±0.52 U\l (полученное эмпирическое значение U(7) находится в зоне значимости p≤0,01);
эмп
AST - значение аспартатаминотрансферазы увеличилось от 21.37±3.22 U\l на 29,9% (полученное эмпирическое значение U(7) находится в зоне значимости p≤0,01);
эмп
LDH - показатель лактатдегидрогеназы от значения 188.02±16.06 U\l вырос на 83% (полученное эмпирическое значение U(0) находится в зоне значимости p≤0,01);
эмп
Glucose - уровень глюкозы снизился с 4.09±0.11 до 2.35±0.23 mmol\l, что составило 43% (полученное эмпирическое значение U(0) находится в зоне значимости p≤0,01).
В контрольных сериях №1 и №2 выявлены несущественные колебания вышеприведенных биохимических показателей крови (p≥0,05).
Динамика уровня микроэлементов в плазме крови после МАВ представлена в таблице №4.
Таблица 4
Динамика уровня микроэлементов в плазме крови после МАВ
Экспериментальная
Контроль-1
ПОКАЗАТЕЛИ
До МАВ
После МАВ
До МАВ
После МАВ
Iron 6.6-28.3 mmol\l
8.81±0.17
9.97±0.35
8.23±0.13
8.79±0.19
Phosphorus 0.81-1.45 mmol\l
1.34±0.06
1.45±0.09
1.39±0.04
1.37±0.02
Magnium0.7-1.00 mmol\l
0.93±0.04
1.04±0.05
0.94±0.04
0.9±0.06
Na 136.0-146.0 mmol\l
136.58±0.47
33.68±0.55
137.24±0.4
136.67±0.77
К 3.50-5.10 mmol\l
5.19±0.12
8.77±0.21
4.22±0.02
4.16±0.1
Как следует из данных, представленных в таблице 4, показатели уровня содержания микроэлементов плазмы крови в экспериментальной серии исследований претерпели существенные изменения.
эмп
Iron - показатель содержания железа вырос на 13% с 8.81±0.17 до уровня 9.97±0.35 mmol\l (полученное эмпирическое значение U(0) находится в зоне значимости p≤0,01).
эмп
Phosphorus - уровень фосфора вырос на 8% со значения 1.34±0.06 до 1.45±0.09 mmol\l (полученное эмпирическое значение U(7,5) находится в зоне значимости p≤0,01).
эмп
Magnium - уровень магния вырос на 12% с 0.93±0.04 до 1.04±0.05 mmol\l (полученное эмпирическое значение U(3) находится в зоне значимости p≤0,01).
эмп
Na - снижение показателя натрия с 146.58±0.47 до 133.68±0.55 mmol\l составило 9% от исходного уровня (полученное эмпирическое значение U(0) находится в зоне значимости p≤0,05).
эмп
K - значение калия выросло с 5.19±0.12 до 8.77±0.21 mmol\l, что составило 69% от исходного уровня (полученное эмпирическое значение U(0) находится в зоне значимости p≤0,01).
эмп
В контрольной серии исследований №1 достоверные изменения произошли только по уровню содержания железа на 6,3% от исходного уровня с 8.23±0.13 до 8.79±0.19 mmol\l (полученное эмпирическое значение U(16,5) находится в зоне значимости p≤0,05).
В контрольной серии исследований №2 существенных изменений не установлено.
Обсуждение полученных результатов
В результате произведенных исследований установлено, что музыкально-акустические воздействия на кровь in vitro, использованные в экспериментальной серии опытов, оказывают существенное влияние на клеточный состав и биохимические показатели крови. Так общее число лейкоцитов возросло в 4,7 раза, число нейтрофилов - в 4,7 раза, число сегментоядерных лейкоцитов в 4,5 раза, процентное содержание базофилов по отношению к исходному уровню увеличилось в 18,5 раз, число лимфоцитов - в 3,9 раза.
За счет каких ресурсов и механизмов столь существенно возрос уровень практически всех видов зрелых лейкоцитов в пробирках экспериментальной серии, не способных в обычных условиях к делению? Нет ли здесь противоречия?
Установлено, что из всех видов зрелых клеток крови только лейкоциты могут приобрести способность к делению, которая проявляется у них исключительно в культурах in vitro и вновь исчезает при попадании внутрь организма в кровяное русло.
Причем в условиях наших экспериментов сами лейкоциты могли получить как физические, так и химические активизирующие стимулы. К физическим факторам мы относим сами широкополосные акустические сигналы, сопровождающиеся инфразвуками, различные частоты которых могут влиять непосредственно на клетки и внутриклеточные структуры, вызывая активизацию жизнедеятельности, которая усиливается одновременно возникающими механическими колебаниями крови, являющейся, как известно, жидкостью. Эти сложные колебания могут приводить к лизису некоторой части клеток крови, что способствует выделению в плазму внутреннего химического содержимого клеток, в том числе так называемых факторов роста, которые содержатся в тромбоцитах. В наших более ранних работах было показано, что акустические сигналы влияют на свертывающую систему крови in vitro (RU 2336098, МПК A61M 21/00, опубликовано 20.10.2008) и на электрохимические показатели воды, о которых судят по изменениям концентрации супероксидного и пероксидного ион-радикалов (RU 2195655, G01N 33/48 опубликовано 27.12.2002), составляющей 90-92% плазмы крови. Весь этот комплекс физико-химических процессов, очевидно, способствует усилению проницаемости клеточных мембран, что в совокупности с лизисом части клеток, приводит в итоге к повышению уровня содержания общего белка, микроэлементов (железо, фосфор, марганец, калий и др.) и ферментов (ALT, AST и др.) в крови, которое мы и выявили в наших экспериментах.
Такая химически активная среда, находящаяся в акустическом поле, является комплексным стимулом для усиленного деления зрелых лейкоцитов всех форм.
Однако, на наш взгляд это не единственный источник увеличения клеточной массы. Как известно, в периферической крови постоянно циркулирует некоторое количество стволовых гемопоэтических клеток. Мы полагаем, что стволовые клетки, находящиеся в крови in vitro, также внесли свою лепту в столь существенный рост числа лейкоцитов. Прямым доказательством данной гипотезы является увеличение показателей процентного содержания незрелых клеток: BAND - в 4,04 раза, а незрелых гранулоцитов (ImGr) - в 18, 3 раза  от исходного уровня.
Косвенным подтверждением является снижение показателя средней концентрации гемоглобина в эритроцитах (МСНС) на 2%, которое может быть объяснено ростом объема эритроцитов. В свою очередь, рост коэффициента вариации среднего объема эритроцитов (RDW) на 15% может быть объяснен присутствием нескольких популяций эритроцитов, что вряд ли возможно в условиях нашего эксперимента без участия стволовых клеток.
И, наконец, снижение уровня глюкозы в крови на 43% говорит о том, что увеличение клеточной массы лейкоцитов потребовало значительных энергетических ресурсов.
При этом в контрольной серии №1, где на кровь воздействовали простыми восходящими модулированными тонами до 22 кГц, из исследуемых показателей достоверно изменился только один, возрос уровень содержания железа на 6,3% от исходного уровня, остальные колебания показателей были на уровне значимости p≥0,05.
В контрольной серии №2, где кровь не подвергалась акустическому воздействию, особой динамики показателей крови к исходному состоянию не установлено.
Выводы. Предлагаемый способ воздействия на кровь в акустическом поле in vitro вызывает активизацию роста лейкоцитарной массы и °комплексную коррекцию состава крови.