Актуальные проблемы изучения нейроглиальных взаимоотношений коры большого мозга человека в постишемическом периоде

жимом, увеличение частоты реакции повышенной активации без признаков напряжённости. Данный тип неспецифической адаптации характеризуется гармоничной деятельностью желёз внутренней секреции, систем, ответственных за иммунную защиту, отсутствием явлений перераздражения или угнетения центральной нервной системы. При таком состоянии человек лучше справляется со стрессом, имеет устойчивое состояние здоровья [3]. В настоящей работе эта реакция неспецифической адаптации сопровождалась и с меньшей скоростью старения организма, что существенно дополняет выполненные ранее исследования. Кроме того, указанные факты наряду с показателями нагрузочного тестирования, демонстрирующими его наилучшие результаты у лиц с реакциями повышенной активации, свидетельствуют о соответствии ей более высокого уровня функциональных резервов организма, несмотря на то, что у взрослых гармоничные реакции тренировки и спокойной активации считаются нормой [4]. Причем,

в процессе дозированной мышечной деятельности частота первых уменьшалась, а вторых - оставалась постоянной. Возможно, полученные результаты могут служить основанием для рассматривания появления реакции повышенной активации у пожилых лиц в процессе тренировочных программ в качестве маркера особенностей функционального состояния организма.

Таким образом, оценка характера развивающихся в организме неспецифических адаптационных реакций даёт возможность дополнительного анализа его функциональных резервов и скорости геронтогенеза. Физические дозированные оздоровительные тренировки в пожилом возрасте являются фактором, стимулирующим неспецифическую адаптацию организма за счёт мощности стресс-лимитирующих систем. Степень активационных реакций неспецифической адаптации определяется не столько количеством прожитых лет, сколько скоростью старения организма и может служить индикатором эффективности тренировочных программ в пожилом возрасте.

ЛИТЕРАТУРА

1. Абрамович С.Г. Основы физиотерапии в гериатрии: Учебное пособие. - Иркутск: РИО ИГИУВа, 2008. - 190 с.

2. Войтенко В.П., Токарь А.В., Полюхов А.М. Методика определения биологического возраста человека // Геронтология и гериатрия. - Киев: Ин-т геронтологии, 1984.

- С.133-137.

3. Гаркави Л.Х., Квакина Е.Б., Уколова М. А. Адаптационные реакции и резистентность организма. - Ростов-на-Дону, 1990. - 222 с.

4. Гаркави Л.Х., Квакина Е.Б., Кузьменко Т.С. Сигнальные показатели антистрессорных адаптационных реакций и стресса у детей // Педиатрия. - 1996. - №5. - С.107-109.

Информация об авторах: 664049, г. Иркутск, Юбилейный 100, кафедра медицинской реабилитации, тел. (3952) 231312, е-шаП: цк_йа@ mail.ru, Власова Ирина Андреевна - доцент, к.м.н.

© МЫЦИК А.В., СТЕПАНОВ С.С., ЛАРИОНОВ П.М., ГОРБАЧЕВА С.М., АКУЛИНИН В.А. - 2012 УДК: 616.8-091.81-005.4:616.831.31

АКТУАЛЬНЫЕ ПРОБЛЕМЫ ИЗУЧЕНИЯ НЕЙРОГЛИАЛЬНЫХ ВЗАИМООТНОШЕНИЙ КОРЫ БОЛЬШОГО МОЗГА ЧЕЛОВЕКА В ПОСТИШЕМИЧЕСКОМ ПЕРИОДЕ

Алексей Владимирович Мыцик1, Сергей Степанович Степанов1, Петр Михайлович Ларионов2,

Светлана Михайловна Горбачева3, Виктор Александрович Акулинин1

Резюме. Рассмотрены основные проблемы получения объективной информации о нейроглиальных взаимоотношениях в различных слоях коры большого мозга человека в постишемическом периоде. Предложены возможные пути решения этих проблем с помощью комплексного использования методов автоматизированного компьютерного анализа изображений, морфометрии, иммуногистохимии и статистического анализа.

Ключевые слова: человек, ишемия, неокортекс, нейроглиальные взаимоотношения, морфометрия, иммуногистохимия, автоматизированный компьютерный анализ.

ACTUAL PROBLEMS IN THE STUDY OF NEUROGLIAL RELATIONSHIP IN THE CEREBRAL CORTEX OF HUMAN DURING POSTISCHEMIC PERIOD

A.V Mytsik1, S.S. Stepanov1, P.M. Larionov2, S.M. Gorbacheva3, V.A. Akulinin1

('Omsk State Medical Academy, Russia; ^Novosibirsk Research Institute of Traumatology and Orthopaedics, Russia;

3Irkutsk State Medical Academy of Continuing Education)

Summary. There have been considered the main problems of obtaining objective information about the neuroglial relationship in the different layers of human cerebral cortex during postischemic period. The possible solutions of these problems through the integrated use of computer-aided methods for image analysis, morphometry, immunohistochemistry and statistical analysis have been suggested.

Key words: human, ischemia, neocortex, neuroglial relationship, morphometry, immunohistochemistry, automated computer analysis.

Исследование нейроглиальных взаимоотношений в различных слоях коры большого мозга человека после ишемии обусловлено необходимостью изучения закономерностей пространственной реорганизации двух ее основных клеточных популяций в процессе деструк-

тивных и компенсаторно-восстановительных изменений для разработки средств их коррекции [6,7].

В настоящее время для принятия объективного заключения о характере изменений нейроглиальных взаимоотношений необходимо несколько гистологических

и иммуногистохимических методов, а также проведение соответствующего морфометрического исследования на репрезентативной выборке [1,5]. Кроме того, на результаты исследования существенное влияние оказывает субъективный фактор, что требует привлечения других специалистов и расчета индекса соответствия. Все это существенно увеличивает объем информации и требует применения автоматического анализа графических изображений [2].

Проведенный нами поиск литературных данных показал, что в настоящее время для решения рутинных задач морфометрии лидирует программа автоматического анализа изображений ImageJ [3,4,7]. Однако работ, основанных на использовании данной программы для анализа нейроглиальных взаимоотношений в коре большого мозга человека, в доступных базах данных нами не выявлено.

Целью настоящей работы является решение проблемы получения объективной информации при изучении нейроглиальных взаимоотношений различных слоев неокортекса человека с помощью комплексного использования гистологических, иммуногистохимических, морфометрических методов и автоматизированного компьютерного анализа изображений.

Материалы и методы

Работа выполнена на базе Омской государственной медицинской академии; Омского областного онкологического диспансера; Les НфрИаих Universitaires de STRASBOURG (HUS), Hфpital de Hautepierre; лаборатории молекулярно-генетических и морфологических методов исследований Новосибирского научноисследовательского института травматологии и ортопедии. Интраоперационный материал забирался в отделении нейрохирургии Омской областной клинической больницы, аутопсийный материал - Омском областном бюро судебно-медицинской экспертизы. Данное исследование одобрено этическим комитетом Омской государственной медицинской академии.

Для исследования были выбраны пациенты (n=11) с хронической ишемией головного мозга (возраст 23-62 года, 6 мужчин и 5 женщин). Причиной хронической ишемии были различные опухоли головного мозга. В силу глубокого расположения опухолей в удаляемый материал попадали участки коры большого мозга из перифокальной зоны и частично неповрежденная кора. Все пациенты были выписаны из стационара в удовлетворительном состоянии. Контролем служил мозг погибших в результате несчастных случаев (n=7). Аутопсийный материал забирали из левого полушария спустя 5-10 ч после смерти. Во всех случаях исследовалось поле 10 лобной доли коры большого мозга (по Бродману).

Интраоперационный и аутопсийный материал фиксировали в 4% растворе параформа на 0,1М фосфатном буфере (pH 7,2-7,4) при температуре +4оС (в течение 1 сут) и заключали в парафин. Изготавливали серийные фронтальные срезы толщиной 4 мкм через все слои коры большого мозга, помещали их на предметные стекла. Срезы окрашивали тионином по Нисслю, а также с помощью иммуногистохимических методов на нейрон-специфическую енолазу, глиальный фибриллярный кислый белок. Для визуализации клеточных ядер использовали DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole). Цифровые микрофотографии делались на микроскопах Leica DM 1000, Axioskop 40 (Karl Zeiss), имеющих необходимые насадки. Для захвата изображений использовалась программа ImageJ 1.46 (световая микроскопия) и Axio Vision (при окраске DAPI) [2]. На полученных микрофотографиях проводили общую и морфометрическую оценку нейроглиальных взаимоотношений. Определяли численную плотность нейронов, глиальных клеток их размеры (периметр, площадь) и форму, интенсивность окраски (тинкториальные свойства).

Проверку статистических гипотез проводили при помощи программы STATISTICA 8.0 с использованием непараметрического U-критерия Манна-Уитни (для парного сравнения) и ANOVA Краскела-Уоллиса (для множественного сравнения). В каждом сравниваемом случае количество измерений и полей зрения клеток определялось требованиями выявления статистической значимости при p<0,05.

Результаты и обсуждение

Непременными условиями программной дискриминации нейронов и глиальных клеток является: 1) стандартизация приготовления препаратов, 2) режимов микрофотосъемки и ориентации экранных образований головного мозга, 3) исходных порогов и установок программы, 4) увеличения и 5) использование цифровой камеры со сходными характеристиками и размером матрицы.

Общий алгоритм работы с ImageJ заключался в следующем. Открывался файл, устанавливались пороговые значения цвета, яркости, контрастности, количественного распределения пикселей по цвету и яркости. Эти действия выделяли объекты для анализа по тинкто-риальным свойствам, например, позволяли выделить только ядра или только цитоплазму, или только межклеточное вещество. После выделения объектов, имеющих заданную окраску, запускался апплет «Analyze Particles» для разделения объектов по следующим параметрам: размер (позволял исключить объекты, имеющие площадь больше или меньше заданной), циркулярность (при высокой степени отмечалась только овальная глия, при низкой - только пирамидные нейроны). Для визуального контроля указывалась необходимость наложения оверлейной маски полученных данных на исходное изображение. После выполнения апплета формировалась таблица, которая содержала: имя графического файла, количество объектов, площадь, периметр, длину, ширину каждой частицы, общую площадь поля, на котором производился подсчет [5].

ImageJ 1.46 использовалась для дефиниции общей численной плотности нейронов и глиальных клеток в неокортексе, определения их площади, периметра, продольного и поперечного диаметров, содержания реактивно, дистрофически и некробиотически измененных клеток, ядерно-цитоплазматического отношения, распределения специфической енолазы и фибриллярного кислого белка. На препаратах с DAPI определялись количественные характеристики частиц флюорохромов: количество, интенсивность окраски, площадь, периметр, длина, ширина ядра.

ImageJ позволяла очень хорошо дискриминировать ядра нейронов и глиальных клеток при окраске препаратов на DAPI по различной интенсивности окраски, размеру и форме ядра (рис. 1 б). Ядра глиальных клеток были более мелкие и имели эллипсоидную геометрическую форму (рис. 1 а, в). В норме форма ядер нейронов приближалась к окружности и они, были статистически значимо крупнее (рис. 1б, г). При анализе изображения сегрегация ядер нейронов и ядер глиальных клеток происходила сразу по всем этим значимым признакам, а именно: средней яркости, размеру и эксцентриситету исследуемой частицы, что позволяло уверенно разделять нейроны и глиальные клетки с автоматическим определением параметров ядра (рис. 1).

Однако дискриминацию по форме и размерам компонентов клеток можно использовать только на этапе предварительного анализа нейроглиальных отношений и преимущественно в норме, когда нет выраженных признаков деформации ядер нейронов. Для объективной оценки нейроглиальных отношений в мелкоклеточных популяциях при ишемии необходимо проведение дополнительно иммуногистохимических реакций на специфические белки (нейрон-специфическую енолазу, глиальный фибриллярный кислый белок). Однако, на

Рис. 1. Дискриминация нейронов и глиальных клеток слоя V поля 10 лобной коры (пациент С-в, норма). Ядра глиальных клеток выглядят как мелкие овалы, а нейронов - крупные круги. а - окраска по Нисслю; б - окраска на DAPI; в - выделение ядер глиальных клеток средствами программы ImageJ 1.46; г - итоговая маска ядер нейронов (или глиальных клеток) для морфометрии. Об. х40 (размер поля зрения 41360 мкм2).

иммуногистохимических препаратах проведение автоматической оценки количества глиальных клеток затруднено в силу сложной многоотросчатой формы этих клеток, ручной подсчет дает очень точные данные (табл. 1).

Сравнение различных методов верификации нейронов (при использовании программы ImageJ 1.46) показало наличие статистически значимых различий по показателю их общей численной плотности норме и при хронической ишемии. Результаты морфометрии, прежде всего, определялись сложностью программной дискриминации различных типов мелких клеток. В итоге при использовании DAPI в мелкоклеточном слое III существенно завышалась общая численная плотность клеток, которые были идентифицированы как мелкие пирамидные нейроны (табл. 1). Это связано с тем, что размеры ядер мелких пирамидных и непирамидных нейронов, а также астроцитов, особенно реактивно измененных, были приблизительно равны. Кроме этого, менялись тинкториальные свойства ядерного вещества. В норме общая численная плотность енолаза-позитивных нейронов в слое III было незначительно меньше, чем при окраске по Нисслю. Вполне вероятно, что при окраске по Нисслю количество пирамидных нейронов несколько завышалось за счет мелких клеток иной природы. Все это свидетельствовало о том, что в норме наиболее объективные результаты оценки общей численной плотности нейронов получались при подсчете количества енолаза-позитивных нейронов в сочетании с контрольной окраской по Нисслю. Необходимо учитывать также и то, что при разных увеличениях объектива (х10, х20, х40) доля клеток в поле зрения различна. Наибольшая плотность клеток характерна для большего увеличения. Вероятно, это обусловлено систематической ошибкой, связанной с субъективным выбором полей зрения. По нашим данным, оптимальным для анализа является увеличение х20 (табл. 1).

Таблица 1

Общая численная плотность клеток

Метод исследования Контроль Хроническая ишемия

Ниссль -нейроны -глия 183,6 (175; 212) 202,0 (168; 215) 134,0 (119; 148)# 241,2 (223; 254)##

DAPI -нейроны -глия 220,3 (210; 238)** 242,0 (215; 256)* 174,2 (163; 187)*## 313,0 (289,5; 325)**##

Енолаза -нейроны -глия 162,5 (145; 172)* 102,8 (95; 126)***##

ГФКБ -нейроны -глия 225,5 (198; 232) 278 (264; 297)##

ANOVA -нейроны -глия H=8,5; df=2; p=0,02* H=7,8; df=2; p=0,04* H=12,4; df=2; p=0,004* H=9,6; df=2; p=0,01*

Примечание: * - различия статистически значимы в сравнении с методом Ниссля при р<0,05; ** - при р<0,01, *** - при р<0,001 (критерий Манна-Уитни для парных сравнений); Л - различия между методами верификации нейронов статистически значимы при р<0,05 (дисперсионный анализ ANOVA Краскела-Уоллиса); # - различия статистически значимы в сравнении с контролем при р<0,05; ## - при р<0,01 (критерий Манна-Уитни для парных сравнений). Материал представлен как медиана (нижний и верхний квартили); ГФКБ - глиальный фибриллярный кислый белок.

При хронической ишемии появлялись качественно новые факторы (например, реактивно измененные клетки глии, крови), влияющие на получение и интерпретацию морфометрических данных при различных методах окраски клеток. Кроме того, при ишемии в не-окортексе статистически значимо уменьшалось количество нейронов и увеличивалось количество глиальных клеток (табл. 1). Вероятно, это оказывало влияние на то, что расхождение результатов анализа общей численной плотности клеток при ишемии увеличивалось. Особенно это касалось количества енолаза- и DAPI- позитивных нейронов (табл. 1).

Таким образом, получение объективной информации о нейроглиальных отношениях коры большого мозга человека - сложный процесс, требующий комплексной оценки большого объема разнообразных качественных и количественных данных. Это существенно увеличивает продолжительность анализа и снижает его объективную точность. Решение этой проблемы может быть за счет комплексного использования методов морфометрии, иммуногистохимии и возможностей программы ImageJ 1.46, которая обеспечивает быстрый и качественный анализ простых графических объектов. Особое значение имеет автоматический анализ ядер клеток, окрашенных DAPI. Однако в процессе подобного анализа необходима стандартизация приготовления препаратов, режимов микрофотосъемки, ориентации экранных образований головного мозга, исходных порогов и установок программы, использование цифровой камеры со сходными характеристиками и размером матрицы. Наиболее точно при окраске препаратов на DAPI ImageJ 1.46 позволяет дискриминировать ядра нейронов и глиальных клеток в норме. При этом существует возможность автоматической стандартной обработки пакета данных (многочисленных серий полей зрения) по соответствующим макросам. То есть, дискриминацию по форме и размерам компонентов клеток можно использовать только на этапе предварительного анализа нейроглиальных отношений и преимущественно в норме. При ишемии, когда происходят выраженные реактивные и деструктивные изменения формы клеток, необходимо проведение дополнительного параллельного иммуногистохимического исследования на специфические белки нейронов и глиальных клеток, а возможности автоматического анализа с помощью программы ImageJ ограничиваются.

ЛИТЕРАТУРА

1. Автандилов Г.Г. Основы количественной патологической анатомии. - М.: Медицина, 2002. - G.240.

2. Мыцик А.В., Степанов С.С., Ларионов П.М. и др. Актуальные проблемы изучения структурнофункционального состояния нейронов коры большого мозга человека в постишемическом периоде // Журнал анатомии и гистопатологии. - 2012. - Т. 1. №1. - C.37-48.

3. Худоерков Р.М., Воронков Д.Н. Количественная оценка нейронов и нейроглии с помощью компьютерной морфоме-трии // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2010. - Т. 149. №1. - G.109-112.

4. Ferreira T.A., Rasband W The ImageJ User Guide Version 1.43. - 2010. http:// rsbweb.nih.gov/ij/docs/user-guide.pdf.

5. Lyck L., Dalmau I., Chemnitz J., et al. Immunohistochemical markers for quantitative studies of neurons and glia in human neocortex // Journal of Histochemistry & Cytochemistry. - 2008.

- Vol. 56. №3. - P.201-221.

6. Pelvig D.P., Pakkenberg H., Regeur L., et al. Neocortical glial cell numbers in Alzheimers disease // Dement Geriatr Cogn Disord. - 2003. - Vol. 16. - P.212-219.

7. Ho S-Y., Chao C-Y., Huang H-L., et al. NeurphologyJ: An automatic neuronal morphology quantification method and its application in pharmacological discovery // BMC Bioinformatics.

- 2011. - Vol. 12. - P.1-18.

Информация об авторах: Мыцик Алексей Владимирович - ассистент кафедры, 644043, г.Омск, ул. Ленина,12, тел.: (3812)239298, факс: (3812)230414; e-mail: elysei@mail.ru; Степанов Сергей Степанович - д.м.н., с.н.с., e-mail: serg_stepanov@mail.ru; Ларионов Пётр Михайлович - д.м.н., профессор, заведующий лабораторией, 630091, г.Новосибирск, ул. Фрунзе,17, e-mail: ptrl@mail.ru; Горбачева Светлана Михайловна - д.м.н., профессор, заведующий кафедрой, e-mail: irkmapo@irk.ru; Акулинин Виктор Александрович - д.м.н., профессор, заведующий

кафедрой, e-mail: akulinin@omsk-osma.ru

© ТРОФИМЕНКО И.Н., БАТУНОВА Е.В., ЧЕРНЯК Б.А. - 2012 УДК 616.24-002:616.233-008.61

ВЗАИМОСВЯЗЬ БРОНХИАЛЬНОЙ ГИПЕРРЕАКТИВНОСТИ И ВОСПАЛЕНИЯ ПРИ ХРОНИЧЕСКОЙ ОБСТРУКТИВНОЙ БОЛЕЗНИ ЛЁГКИХ

Ирина Николаевна Трофименко, Елена Владимировна Батунова, Борис Анатольевич Черняк

Резюме. Целью исследования явилась сравнительная оценка выраженности воспаления нижних дыхательных путей и системного воспаления у больных хронической обструктивной болезнью лёгких (ХОБЛ) в зависимости от уровня бронхиальной реактивности. У 42 амбулаторных больных ХОБЛ, стратифицированных на 2 группы, проанализированы цитологические особенности индуцированной мокроты и концентрация в крови цитокинов, характеризующих уровень системного воспаления. В 1 группу вошли 22 больных ХОБЛ с бронхиальной гиперреактивностью (БГР), во 2 - 20 больных без БГР. Больные с БГР по сравнению с больными без нее характеризовались большей степенью выраженности воспаления нижних дыхательных путей по показателям общего цитоза, макрофагов и лимфоцитов (p<0,05). Концентрации системных цитокинов (ИЛ-6 и ИЛ-8) в крови у больных ХОБЛ с БГР были также существенно выше (p<0,05). Таким образом, БГР у больных ХОБЛ можно рассматривать в качестве предиктора выраженности локального воспаления и его системных проявлений.

Ключевые слова: хроническая обструктивная болезнь легких, бронхиальная гиперреактивность, воспаление.

ASSOCIATION OF BRONCHIAL HYPERREACTIVITY AND INFLAMMATION IN CHRONIC OBSTRUCTIVE PULMONARY DISEASE

I.N. Trofimenko, E.V. Batunova, B.A. Chernyak

Summary. The aim of the study was to compare local and systemic inflammation intensity in COPD patients depending on a bronchial reactivity level. In 42 COPD outpatients induced sputum samples and serum concentrations of inflammatory cytokines have been analyzed. Bronchial hyperreactivity (BHR) was assessed in metacholine challenge. Patients were divided in 2 groups: 22 patients with BHR and 20 patients without BHR. COPD patients with BHR had significantly higher numbers of total cell counts, macrophages and lymphocytes in induced sputum than COPD patients without BHR (p<0,05). Serum IL-6 and IL-8 in COPD patients with BHR were higher in comparison to COPD patients without BHR (p<0,05). Thus, BHR in COPD is associated with more intensive local inflammation and its systemic manifestation.

Key words: chronic obstructive pulmonary disease, bronchial hyperreactivity, inflammation.

Бронхиальная гиперреактивность (БГР) является высоко чувствительным признаком бронхиальной астмы (БА) и рассматривается в качестве косвенного маркера выраженности воспаления, степени тяжести и уровня контроля над заболеванием [9,18]. Однако результаты эпидемиологических исследований показали, что БГР может присутствовать при ряде других воспалительных заболеваний респираторной системы и часто ассоциируется с хронической обструктивной болезнью лёгких (ХОБЛ). Распространенность БГР среди больных ХОБЛ по данным современных исследований составляет 55-87% [3,18,20]. Эпидемиологические исследования демонстрируют, что БГР является независимым предиктором развития ХОБЛ [6] и вторым по значимости

фактором риска этого заболевания, уступая только табакокурению [7]. Кроме того, БГР может модифицировать течение ХОБЛ. В частности, у больных с данным фенотипом заболевания отмечается больший темп снижения легочной функции, более выраженная одышка, меньшая толерантность к физической нагрузке, снижение качества жизни (КЖ), неблагоприятный прогноз и повышенная летальность по сравнению с пациентами без БГР [3,6,12].

Патогенетические механизмы БГР при ХОБЛ остаются недостаточно изученными, но вероятнее всего, как и при астме, являются многокомпонентными. В отдельных исследованиях БГР связывают со степенью ограничения бронхиальной проходимости при ХОБЛ [11,19], с