Научно-методические подходы к развитию технологии белковых гидролизатов для специального питания. Часть 1. Технология производства и технические характеристики гидролизатов

УДК 542.938

Научно-методические подходы к развитию технологии

белковых гидролизатов для специального питания.

Часть 1. Технология производства и технические характеристики гидролизатов

Ю. Я. Свириденко, д-р биол. наук, профессор, академик РАН;

Д. С. Мягконосов, канд. техн. наук; Д. В. Абрамов, канд. биол. наук; Е. Г. Овчинникова

Всероссийский научно-исследовательский институт маслоделия и сыроделия, г. Углич, Ярославская обл.

Гидролизаты белков - это смеси отдельных белковых веществ (пептидов и свободных аминокислот), образуемые в результате реакции гидролиза белка, происходящей с поглощением воды (от греческого: «гидро» - вода + «лизис» - разложение), схема которой приведена на рис. 1.

В процессе гидролиза белковая молекула, представляющая собой цепь, состоящую из аминокислот, расщепляется на фрагменты меньшего размера. При этом белок утрачивает свои свойства, но образовавшаяся гидролизованная смесь может

приобрести ряд полезных свойств. Гидролиз белков является хорошо известным методом модификации их функциональных свойств: растворимости, вязкости, эмульгирующих и пенообразующих свойств и, что более важно, повышения их биологической ценности в результате расщепления белка на фрагменты разной молекулярной массы [1].

В сравнении с исходными, нерас-щепленными белками, гидролизаты белков обладают следующими преимуществами:

создают существенно более низкую нагрузку на органы пищеварения

Пептидная связь Пептидная связь Пептидная связь

Пептид Свободные аминокислоты

Свободная Пептидная Связанная Свободная Свободная

аминогруппа связь аминогруппа аминогруппа аминогруппа

Рис. 1. Гидролитическое расщепление белковой молекулы

для переваривания перед усвоением;

быстро усваиваются организмом после приема;

доступны для питания людей с различными нарушениями и заболеваниями органов пищеварения, делающих невозможными переваривание обычных белков;

не содержат нативных белков, которые способны вызвать аллергенные реакции;

имеют лучшую растворимость, термоустойчивость и высокую устойчивость содержащихся в них белковых веществ к осаждению такими агентами, как кислоты и ионы металлов.

Технология производства гидролизатов. Технически белок может быть гидролизован при помощи кислот или щелочей (химический гидролиз) либо при помощи протео-литических ферментов (ферментативный гидролиз). Общая технологическая схема показана на рис. 2.

Химический (кислотный и щелочной) гидролиз с трудом поддается регулированию. В результате химического гидролиза получается продукт с ухудшенными питательными и биологическими свойствами. При химическом гидролизе возможно разрушение 1_-форм аминокислот, образование й-форм аминокислот и формирование ряда токсичных веществ, таких как дипептид лизин-аланин. Ферментативный гидролиз протекает в мягких условиях: при рН 6-8, температуре 40...60 °С, что исключает возникновение условий, при которых происходит разрушение и трансформация аминокислот и другие нежелательные побочные реакции. Аминокислотный состав в гидролизате белка, полученного методом ферментативного гидролиза, идентичен аминокислотному составу исходного белка [1].

Источники белка для производства гидролизатов. Свойства гидролиза-та в значительной степени зависят от вида белкового сырья, используемого для получения гидролизата (животных или растительных белков), которое содержит разные наборы аминокислот (табл. 1).

Белки коровьего молока в силу их высокой питательной ценности и оптимального аминокислотного состава наиболее часто используются для производства белковых гидролизатов, предназначенных для специального питания. Долгое время основным источником белка для производства гипоаллергенных белковых гидролизатов служил казеин. Глубокие гидролизаты казеина в течение нескольких десятилетий с успехом применялись при лечении аллергии на белки коровьего

Рис. 2. Схема технологии производства гидролизатов: 1 - ферментативный гидролиз; 2 - химический гидролиз

Таблица 1

Среднее содержание незаменимых аминокислот в различных источниках белка, г/100 г белка [2]

Незаменимые аминокислоты Изолят молочного белка Изолят сывороточного белка Казеин Яичный белок Изолят соевого белка

Изолейцин 4,4 6,1 4,7 5,7 4,9

Лейцин 10,3 12,2 8,9 8,4 8,2

Лизин 8,1 10,2 7,6 6,8 6,3

Метионин 3,3 3,3 3,0 3,4 1,3

Фенилаланин 5,0 3,0 5,1 5,8 5,2

Треонин 4,5 6,8 4,4 4,6 3,8

Триптофан 1,4 1,8 1,2 1,2 1,3

Валин 5,7 5,9 5,9 6,4 5,0

Всего незаменимых аминокислот 42,7 49,2 40,7 42,3 36,0

молока. Однако казеин не в полной мере удовлетворяет потребности детей раннего возраста. Если в пище взрослого человека обязательно должны присутствовать восемь незаменимых аминокислот - метионин, лизин, триптофан, фенилаланин, лейцин, изолейцин, треонин и ва-лин, то для детей раннего возраста незаменимыми аминокислотами являются еще гистидин и аргинин. Данные аминокислоты не синтезируются в детском организме в необходимом количестве, однако они

содержатся в грудном молоке [3]. По современным научным представлениям, питательные смеси для детей раннего возраста должны быть обогащены альфа-лактальбумином, что делает аминокислотный состав искусственной питательной смеси близким по аминокислотному составу к грудному молоку (содержание альфа-лактальбумина в грудном молоке до 80%). Также установлено, что аминокислоты и пептиды, происходящие из белков молока, обеспечивают бифидогенный эффект,

стимулирующий деятельность би-фидобактерий в толстом кишечнике

[4]. Эти факторы определяют выбор сывороточных белков в качестве предпочтительных источников белка для изготовления продуктов детского питания.

В последнее время растительные белки находят применение в составе ряда пищевых продуктов, в качестве альтернативы белкам животного происхождения. Главное их преимущество - более низкая по сравнению с животными белками цена, а главный недостаток - низкое содержание некоторых незаменимых аминокислот. Особым случаем, когда гидролизаты растительных белков не имеют альтернативы, являются продукты для питания детей с гиперчувствительностью к белкам молока

[5], поскольку в растительных белках отсутствуют вещества, вызывающие у подобных больных аллергенные реакции.

Количественные и качественные характеристики глубины гидролиза. Для обеспечения требуемых свойств гидролизатов и стандартизации их качества, процесс гидролиза белка необходимо контролировать. Наиболее часто используемыми критериями характеристики обширности и специфики гидролиза, являются: содержание аминного азота, степень гидролиза и молекулярно-массовое распределение продуктов гидролиза. В процессе гидролиза пептидных связей в белке образуются свободные аминогруппы, по одной новой свободной аминогруппе на каждую расщепленную пептидную связь (см. рис. 1). Количество образовавшихся аминогрупп пропорционально показателю «содержание аминного азота» (в иностранной литературе - Amino Nitrogen (AN)) в гидролизате. Содержание аминного азота обычно определяют методом формольного титрования, однако могут использоваться и другие методы. Оно отражает количество всех аминогрупп в гидролизате или в белке, включая свободные аминогруппы аминокислот, пептидов, белков и боковые аминогруппы аминокислоты лизина. Кроме содержания аминного азота в гидролизате измеряют также содержание общего азота (в иностранной литературе - Total Nitrogen (TN)). Количественное определение общего азота выполняют методом Къель-даля. Это полное содержание азота в продукте, включая небелковые вещества, аминокислоты и боковые цепи аминокислот.

В США для характеристики глубины гидролиза белка в соответствии с требованиями FDA (Food And Drug

Administration) используют отношение количества аминного азота (AN) в ги-дролизате к количеству общего азота (TN) в гидролизате. Гидролизаты, имеющие соотношение AN: TN > 0,62, классифицируют как «гидролизаты с высокой степенью гидролиза». Ги-дролизаты с меньшей степенью гидролиза, имеющие соотношение AN: TN < 0,62, классифицируют как «гидролизаты с низкой степенью гидролиза» или «частичные гидролизаты» [6].

Показатель «степень гидролиза» (degree of hydrolysis - DH, %) определяют как долю (в %) пептидных связей, расщепленных в процессе гидролиза, в общем количестве пептидных связей в гидролизуемом белке. Чем обширнее расщепление белка, тем выше степень гидролиза. Однако на практике невозможно определить точное количество расщепленных пептидных связей в гидролизате. Поэтому для расчета DH используют разного рода эмпирические формулы. Например, согласно методу Adler-Nissen [7], степень гидролиза белка может быть рассчитана по формуле:

AfJ - А Д/

14.!,".,; '  i;i:;,

Npb

где DH - степень гидролиза, %;

AN] - содержание аминного азота в продукте до гидролиза, мг/г;

AN2 - содержание аминного азота в продукте после гидролиза, мг/г;

Npb - содержание азота пептидных

Таблица 2

Молекулярно-массовое распределение в гидролизатах сывороточных белков, полученных при помощи разных ферментов

Молекулярная масса, кДа Рис. 3. Молекулярно-массовое распределение в гидролизатах сывороточных белков: 1) гидролизат, полученный с помощью ферментного препарата Alcalase

Молекулярная масса, Да Доля площади пика в общей площади хроматограммы, %

Гидролизат № 1

> 10 GGG 1,04 0,22

10 000-5 GGG 3,34 2,80

5000-2GGG 21,31 15,75

2 000-1 000 27,59 10,03

1 000-500 25,33 21,55

< 500 21,38 49,65

Сумма площади 100,00 100,00

связей в гидролизуемом белке, мг/г (для казеина МрЬ=114,8мг/ г; для сывороточного белка Npb=123,2MT/ г).

Также могут использоваться и другие методы расчета DH.

Даже точно определенная степень гидролиза не дает точной характеристики гидролизата. В зависимости от разновидности ферментов, используемых для производства ги-дролизатов, гидролизованная смесь будет содержать разный набор пептидов и аминокислот. Два белковых гидролизата, полученных по разной технологии, могут иметь одинаковую степень гидролиза, но совершенно разное содержание отдельных белковых веществ. Например, один гидролизат может содержать длинноцепочечные пептиды и значительное количество свободных аминокислот, а другой состоять в основном из ди- и трипептидов. В результате пищевые, биологические и технологические свойства таких гидролизатов будут существенно отличаться.

Для более подробной характеристики свойств гидролизата в плане содержания в нем отдельных белковых веществ используется профиль молекулярно-массового распределения. Для измерения молекулярно-массового распределения используют хроматографические методы, такие как жидкостная хроматография высокого давления, гель-фильтрация и ряд других. Пример профилей молекулярно-массового распределения двух разных гидролизатов сывороточных белков, полученных с помощью метода гель-фильтрации высокого разрешения, приведен на рис. 3.

Молекулярно-массовое распределение выражают в виде доли площади (%), занимаемой определенной азотистой фракцией в общей площади хроматограммы. Содержание азотистых фракций при этом выражается в определенных диапазонах (например, <500; 500-1000; 1000-2000; 2000-5000; 5000-10000 и >10000

Да, где Да (дальтон) - единица измерения молекулярной массы, равная 1/12 массы атома углерода).

Для примера молекулярно-массовое распределение в гидроли-затах, определенное на основании их профиля молекулярно-массового распределения (рис. 3), приведено в табл. 2.

Гидролизат № 1, полученный с помощью ферментного препарата Alcalase, более чем на 70% состоит из пептидов со средней массой менее 2000 Да, в основном имеющих длину цепи от 4 до 10 аминокислот [8]. Гидролизат № 2, полученный с помощью комплекса ферментных препаратов Панкреатин + Flavourzyme, почти на 50% состоит из азотистых веществ с молекулярной массой менее 500 Да. В основном это свободные аминокислоты и, отчасти, пептиды, состоящие из 2 или 3 аминокислот.

Молекулярно-массовое распределение тесно связано с другими показателями, характеризующими глубину гидролиза белка. Содержание аминного азота составляет для гидролизата № 1-41 мг/г, для гидролизата № 2-88 мг / г. Степень гидролиза (DH) для гидролизата № 1 составляет 25%, для гидролизата № 2-63%. При примерно равном содержании общего азота в гидро-лизатах № 1 и № 2 (TN и 120мг / г), гидролизат № 1 (AN/TN и 34%) можно охарактеризовать как «частичный», а гидролизат № 2 (AN/TN и 73%) как «глубокий».

ЛИТЕРАТУРА

1. Clemente, A. Enzymatic protein hydro Lysates in human nutrition/A. Clemente // Trends in Food Science & Technology. - 2000. - № 11. -P. 254-262.

2. Hulmi, J. J. Effect of protein/essential amino acids and resistance training on skeletal muscle hypertrophy: A case for whey protein/J. J. Hulmi, C. M. Lockwood, J. R. Stout // Nutrition & Metabolism. -2010. - № 7. - P. 51-62.

3. WHO/FAO / UNU, Protein and amino acid requirements in human nutrition [Электронныйресурс] // Wo r Id H e a It h O rg a n Te c h R e pS e r. -2007 (935) - Режим доступа: http://apps.who.int / iris/ bitstream/ 10 665/43411/ 1/ WHO_TRS_935_eng. pdf свободный.

4. Brück, W. M. Effects of Bovine a-Lactalbumin and Casein Glycomacropeptide - enriched Infant Formulae on FaecalMicrobiota in Healthy Term Infants/ W. M. Brück [et al] // Journal of Pediatric Gastroenterology and

Nutrition. - 2006. - № 43. - P. 673-679.

5. Terracciano, L. Use of hydrolysates in the treatment of cow's milk aUergy/L. Terracciano [et al] // Annals of Allergy, Asthma & Immunology. - 2002. -№ 89 (6). -P. 86-90.

6. United States Department of Agriculture Food Safety and Inspection Service. Labeling and Consumer Protection. Proprietary Mixture Suppliers and Manufacturers Questions and Answers (March 17, 1995). [Электронный ресурс] - Режим доступа: https: // www.fsis.usda.gov/ OPPDE/ larc/ Ingr

edients/ PMC_QA. htm#PROTEIN%20 HYDROLYSATES свободный. - Заглавие с экрана.

7. Adler-Nissen, J. Enzymic hydrolysis of food proteins. New York: Elsevier Applied Science Publishers, 1986. - P. 9-17 and P. 146-147.

8. Doucet, D. E n zym e-In d u ce d Gelation of Extensively Hydrolyzed Whey Proteins by Alcalase: Peptide Identification and Determination of Enzyme Specificity/D. Doucet [et al] // J. Agric. Food Chem. - 2003. - № 51. -P. 6300-6308.

Научно-методические подходы к развитию технологии белковых гидролизатов для специального питания. Часть 1. Технология производства и технические характеристики гидролизатов

Ключевые слова

аминный азот; белки; гидролизаты; молекулярно-массовое распределение; общий азот; степень гидролиза; ферментативный гидролиз; химический гидролиз

Реферат

Гидролизаты белков - это смеси отдельных белковых веществ (пептидов и свободных аминокислот), образующиеся в результате реакции гидролиза белка. Гидролиз белков является хорошо известным методом модификации их функциональных свойств: растворимости, вязкости, эмульгирующих и пенообразующих свойств и, что более важно, повышения их биологической ценности в результате расщепления белка на фрагменты разной молекулярной массы. Технически белок может быть гидролизован при помощи кислот или щелочей (химический гидролиз) либо при помощи протеолитических ферментов (ферментативный гидролиз).В результате химического гидролиза получается продукт с ухудшенными питательными и биологическими свойствами. Ферментативный гидролиз исключает нежелательные побочные реакции и позволяет получить продукт, идентичный по аминокислотному составу исходному белку. Свойства гидролизатов в значительной степени зависят от вида белкового сырья, используемого для получения гидролизата - животных или растительных белков, которые содержат разные наборы аминокислот. Белки коровьего молока (казеин и белки молочной сыворотки) в силу их высокой питательной ценности и оптимального аминокислотного состава наиболее часто используются для производства белковых гидролизатов, предназначенных для специального питания. В особых случаях для питания детей с гиперчувствительностью к белкам молока используют гидролизаты растительных белков. Для обеспечения требуемых свойств гидролизатов и стандартизации их качества процесс гидролиза белка необходимо контролировать. Традиционно глубину гидролиза контролируют по содержанию аминного азота, общего азота и по степени гидролиза. Однако данные показатели не дают точной характеристики гидролизата. Два белковых гидролизата, полученных по разной технологии, могут иметь одинаковую степень гидролиза, но совершенно разное содержание отдельных белковых веществ. Более полную характеристику специфичности гидролиза дает молекулярно-массовое распределение азотистых веществ в гидролизате.

Авторы

Свириденко Юрий Яковлевич, д-р биол. наук, профессор, академик РАН,

Мягконосов Дмитрий Сергеевич, канд. техн. наук, Абрамов Дмитрий Васильевич, канд. биол. наук, Овчинникова Елена Григорьевна Всероссийский научно-исследовательский институт маслоделия и сыроделия, 152613, Ярославская обл., г. Углич, Красноармейский бульвар, д. 19, uglich-cheese@mail.ru

Theoretical and practical aspects of development technology of manufacturing protein hydrolyzates for special nutrition use. Part 1. Technology of production and technical characteristics of hydrolysates

Key words

amino nitrogen; proteins, hydrolysates; molecular-mass distribution; total nitrogen; degree of hydrolysis; enzymatic hydrolysis; chemical hydrolysis

Abstracts

Protein hydrolysates are a mix of separate protein substances (peptides and free amino acids) formed by a protein hydrolysis reaction. Protein hydrolysis is a well-known method for modifying their functional properties: solubility, viscosity, emulsifying and foaming properties, and more importantly, improving their biological value by protein breakdown into fragments of different molecular mass. Technically, a protein can be hydrolysed with acids and alkali (chemical hydrolysis) or with proteolytic enzymes (enzymatic hydrolysis). Chemical hydrolysis yields a product with degraded nutritional and biological properties. Enzymatic hydrolysis excludes undesirable adverse reactions and yields a product identical to the source protein as per amino acid composition. The properties of hydrolysates depend by far on the kind of raw protein materials used for obtaining the hydrolysate - animal or vegetable proteins that contain different sets of amino acids. Cow milk proteins (casein and whey proteins), due to their high nutritional value and optimal amino acid composition, are the most often used protein sources for producing protein hydrolysates for special nutritional use. In special cases, vegetable protein hydrolysates are used for feeding children with hypersensitivity to milk proteins. The protein hydrolysis process should be controlled to ensure the required properties of hydrolysates and standardize their quality. Conventionally, hydrolysis depth is controlled by the content of amine nitrogen, overall nitrogen and the degree of hydrolysis. However, these indicators are inaccurate in characterizing a hydrolysate. Two protein hydrolysates produced with different technologies can have the same degree of hydrolysis, but a completely different content of individual protein substances. The molecular-mass distribution of nitrogen substances in a hydrolysate is a more thorough characteristic of hydrolysis specificity.

Authors

Sviridenko Yuriy Yakovlevich, Doctor Of Biological Sciences, Professor, Academician,

Myagkonosov Dmitriy Sergeevich, Candidate of Technical Sciences, Abramov Dmitriy Vasilievich, Candidate Of Biological Sciences, Ovchinnikova Elene Grigorievna,

All-Russian research Institute of butter-making and cheese-making, Krasnoarmeyskaya Bulvar, D. 19, Uglich, Yaroslavl region., 152613, uglich-cheese@mail.ru