КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ СНИЖЕНИЯ СПОСОБНОСТИ МЛЕКОПИТАЮЩИХ К РАЗМНОЖЕНИЮ
COMPOSITIONS AND METHODS OF REDUCING THE REPRODUCTIVE CAPACITY OF MAMMALS

ИНФОРМАЦИЯ О ПРОДОЛЖАЮЩЕЙ ЗАЯВКЕ
Для настоящей заявки испрашивается приоритет по предварительной патентной заявке США с регистрационным №61/692624, поданной 23 августа 2012 года и включенной в настоящий документ посредством ссылки.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к композициям и способам для снижения способности млекопитающих к размножению. Композиции и способы включают использование и введение (a) дитерпеноидного эпоксида, содержащего триптолидный каркас и вызывающего истощение овариальных фолликулов у самок млекопитающих в комбинации с (b) органическим диэпоксидом, вызывающим истощение овариальных фолликулов у самок млекопитающих.
ОПИСАНИЕ УРОВНЯ ТЕХНИКИ, ПРЕДШЕСТВУЮЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЮ
Композиции, которые снижают способность млекопитающих к размножению, в частности, которые индуцируют истощение овариальных фолликулов, могут быть желательны по различным причинам. Такие композиции можно использовать для индукции стерильности у вредителей, таких как грызуны, для контроля популяции вредителей, и для получения моделей на животных для исследований. Например, животных, таких как крысы, с индуцированным истощением фолликулов можно использовать для получения моделей на животных, которые можно использовать для исследования менопаузы и ее действия на других животных, таких как люди.
Грызуны-вредители являются основной причиной порчи сельскохозяйственных культур и продовольственных складов в мире. Грызуны поедают и загрязняют запасы продовольствия, переносят заболевания, повреждают инфраструктуру и могут подрывать местные дикую природу и экосистемы. В течение десятилетий в попытках контроля популяций грызунов использовали родентициды, однако, к настоящему времени показано, что популяции грызунов контролировать трудно и ущерб от грызунов широко распространен. Одной из причин того, что популяции грызунов трудно контролировать является то, что у грызунов, как правило, существуют относительно короткие периоды беременности (например, порядка нескольких недель), и таким образом, если не уничтожить всю популяцию, популяция может восстановиться сами после израсходования или исчерпания родентицида. Кроме того, яды могут поражать вредителей неспецифически и могут действовать на других животных, включая людей. Таким образом, использование пестицидов может быть ограничено другими экологическими факторами.
Скорость размножения крыс зависит от количества доступной пищи и качества пищевых источников. Таким образом, в то время как применение ядов уменьшает популяцию, оно также снижает конкуренцию за пищу так, что размножение выживших может проходить беспрепятственно.
Многообещающая альтернатива использованию родентицидов включает использование составов, которые ускоряют истощении овариальных фолликулов с контроля популяциями грызунов-вредителей посредством контроля фертильности. Эффективным являлся эпоксид диэпоксид 4-винилциклогексена (VCD), вызывая невосстановимое истощение примордиальных фолликулов у крыс Sprague Dawley (Rattus norvegicus) при принудительном кормлении. Однако для достижения эффективного контроля популяции, желательно чтобы целью для истощения являлось несколько, например, все овариальные фолликулы так, чтобы происходило непосредственное действие на фертильность и воспроизводство детенышей. Таким образом, желательны улучшенные композиции, которые индуцируют истощение овариальных фолликулов на нескольких стадиях, и способы использования этих композиций.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Задачей настоящего изобретения является предоставление композиции, которую можно использовать для снижения способности млекопитающих к размножению. В частности, композиции по настоящему изобретению при введении самкам млекопитающих, а также самцам млекопитающих, индуцируют истощение овариальных фолликулов. Другой задачей настоящего изобретения является предоставление способов уменьшения популяции млекопитающих композициями по настоящему изобретению.
Задачи по настоящему изобретению можно выполнять с использованием композиции, подходящей для истощения овариальных фолликулов у самок млекопитающих, содержащей:
(a) дитерпеноидный эпоксид, содержащий триптолидный каркас и вызывающий истощение овариальных фолликулов у самок млекопитающих, и
(b) органический диэпоксид, вызывающий истощение овариальных фолликулов у самок млекопитающих.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения дитерпеноидный эпоксид, содержащий триптолидный каркас (a), представлен формулой:
где
1
1
1
X представляет собой H, R, OH или OR,
2
1
1
X представляет собой H, R, OH, OR, =O или Y,
3
X представляет собой H или OH,
4
1
X представляет собой H, OH или OR,
1
1-4
R представляет собой C-алкильную группу,
2
3
-
+
n
2
Y представляет собой (CRRO)P(O)(OZ),
2
1-6
1-6
3-6
каждый R независимо представляет собой H, C-алкил, арил-C-алкил-, C-циклоалкил или арил,
3
1-6
1-6
3-6
каждый R независимо представляет собой H, C-алкил, арил-C-алкил-, C-циклоалкил или арил,
2
3
3-7
или R и R, вместе с атомом углерода, с которым они связаны, формируют C-циклоалкильную группу,
2
3
a
b
1-6
где любая алкильная или циклоалкильная группа в R или R необязательно может быть замещена одним-пятью заместителями, выбранными из группы, состоящей из галогена, C-алкокси и NRR,
2
3
a
b
1-6
1-6
где любая арильная группа в R или R необязательно может быть замещена одним-пятью заместителями, выбранными из группы, состоящей из C-алкила, C-алкокси, NRR, нитро и циано,
n представляет собой 1, 2 или 3,
каждый Z представляет собой H,
a
b
1-6
3-6
каждый из R и R независимо представляет собой H, C-алкил, C-циклоалкил или арил,
a
b
или R и R, вместе с атомом азота, с которым они связаны, формируют пирролидинoвую, пиперидинoвую, пипераниновую, азетидиновую, морфолиновую или тиоморфолиновую группу,
или ее солью.
1
3
3
В предпочтительном варианте осуществления изобретения X представляет собой H, CH, OH или OCH.
2
3
3
В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения X представляет собой H, CH, OH, OCH или =O.
2
В другом предпочтительном варианте осуществления X представляет собой Y.
3
В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения X представляет собой H.
4
3
В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения X представляет собой H, OH или OCH.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения (a) представляет собой триптолид, трипдиолид, 16-гидрокситриптолид, триптонид или миннелид.
В особенно предпочтительном варианте осуществления (a) представляет собой триптолид.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения органический диэпоксид содержит от 8 до 14 атомов углерода.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения органический диэпоксид содержит от двух до четырех колец.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения органический диэпоксид содержит по меньшей мере один член, выбранный из группы, состоящей из диэпоксида 4-винилциклогексена (VCD), простой диглицидиловый эфир глицерина, 3,4-эпоксициклогексилметил-3,4-эпоксициклогексилкарбоксилат, простой диглицидиловый эфир 1,4-циклогександиметанола, простой диглицидиловый эфир этиленгликоля, простой диглицидиловый эфир резорцинола и простой диглицидиловый эфир 1,4-бутандиола.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения органический диэпоксид содержит диэпоксид 4-винилциклогексена.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения (a) представляет собой триптолид и (b) представляет собой диэпоксид 4-винилциклогексена.
Настоящее изобретение также относится к способу индукции истощения овариальных фолликулов у самки млекопитающего, включающему введение самке млекопитающего эффективного количества композиции, описанной выше.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения млекопитающее представляет собой человека или не являющееся человеком млекопитающее.
Настоящее изобретение также относится к способу снижения способности млекопитающего к размножению, включающему введение млекопитающему эффективного количества композиции, описанной выше.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения млекопитающее является самкой.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения млекопитающее является самцом.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения млекопитающее стерилизовано посредством введения композиции.
Настоящее изобретение также относится к способу контроля численности популяции не являющихся человеком млекопитающих, включающему введение популяции не являющихся человеком млекопитающих эффективного количества композиции, описанной выше.
Настоящее изобретение также относится к способу индукции истощения овариальных фолликулов у самки млекопитающего, включающему введение самке млекопитающего эффективного количества
(a) дитерпеноидного эпоксида, содержащего триптолидный каркас и вызывающего истощение овариальных фолликулов у самок млекопитающих, и
(b) органического диэпоксида, вызывающего истощение овариальных фолликулов у самок млекопитающих.
В одном из вариантов осуществления изобретения (a) и (b) вводят в виде отдельных композиций.
Настоящее изобретение также относится к способу снижения способности млекопитающего к размножению, включающему введение млекопитающему эффективного количества
(a) дитерпеноидного эпоксида, содержащего триптолидный каркас и вызывающего истощение овариальных фолликулов у самок млекопитающих, и
(b) органического диэпоксида, вызывающего истощение овариальных фолликулов у самок млекопитающих.
Настоящее изобретение также относится к способу контроля численности популяции не являющихся человеком млекопитающих, включающему введение популяции не являющихся человеком млекопитающих эффективного количества
(a) дитерпеноидного эпоксида, содержащего триптолидный каркас и вызывающего истощение овариальных фолликулов у самок млекопитающих, и
(b) органического диэпоксида, вызывающего истощение овариальных фолликулов у самок млекопитающих.
Настоящее изобретение также относится к способу получения композиции, описанной выше, содержащей комбинацию (a) и (b).
Можно легко получить более полное описание изобретения и многих сопутствующих ему преимуществ, как станет более понятно со ссылкой на приведенные ниже фигуры в сочетании с приведенным ниже описанием.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Иллюстративные варианты осуществления настоящего изобретения описаны в сочетании с прилагаемыми чертежами.
На фиг. 1 и 2 проиллюстрированы культивируемые контрольные яичники.
На фиг. 3 проиллюстрирована культуральная система in vitro. A. Сбор яичников детеныша крысы на сутки 4 после рождения. B. Удаление избыточной ткани из яичника под препаровальной лупой. C. Выделенный яичник помещают на мембрану, помещенную на среду.
На фиг. 4 проиллюстрирован культивируемый яичник, обрабатываемый 30 мкм VCD.
На фиг. 5 проиллюстрирован культивируемый яичник, обрабатываемый 30 мкм VCD и 5 нм триптолида.
На фиг. 6 проиллюстрирован культивируемый яичник, обрабатываемый 30 мкм VCD и 10 нм триптолида.
На фиг. 7 проиллюстрировано потребление корма/приманки исследуемыми крысами.
На фиг. 8 проиллюстрировано увеличение массы тела исследуемыми крысами.
На фиг. 9 проиллюстрировано количество фолликулов у крыс, которых кормили приманкой, содержащей VCD и триптолид.
На фиг. 10 проиллюстрированы изображения яичников крыс, которых кормили приманкой, содержащей VCD и триптолид.
На фиг. 11 проиллюстрированы массы яичников исследуемых крыс.
На фиг. 12 проиллюстрированы результаты потребления неполовозрелыми самками крыс приманки с постоянным VCD (концентрация 0,099%), комбинируемым с увеличивающимися концентрациями триптолида.
На фиг. 13 проиллюстрированы результаты потребления неполовозрелыми самками крыс неограниченных количеств корма и воды в течение всего периода обработки.
Фиг. 14 иллюстрирует, что действие на детенышей, рождаемых в потомстве, зависело от дозы триптолида. Ось x означает общий потребляемый триптолид, мг/кг массы тела.
На фиг. 15 проиллюстрированы результаты потребления неполовозрелыми самками крыс контрольной приманки без активных ингредиентов и потребления обработанными самками приманки с VCD при 0,099% и высокой дозой триптолида в течение 15 суток.
На фиг. 16 проиллюстрированы результаты биоанализа истощения фолликулов in vitro.
Следует понимать, что фигуры не обязательно приведены в масштабе. Например, размеры некоторых элементов на фигурах относительно других элементов могут быть преувеличены, чтобы помощь улучшить понимание иллюстрируемых вариантов осуществления настоящего изобретения.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к композиции, подходящей для истощения овариальных фолликулов у самок млекопитающих, содержащей:
(a) дитерпеноидный эпоксид, содержащий триптолидный каркас и вызывающий истощение овариальных фолликулов у самок млекопитающих при добавлении в композицию, т.е. при использовании в комбинации с эпоксидом (b), и
(b) органический диэпоксид, вызывающий истощение овариальных фолликулов у самок млекопитающих.
Триптолид представляет собой хорошо известный дитерпеноидный эпоксид, а также хорошо известны и можно использовать в настоящем изобретении множество производных и аналогов этого соединения.
В качестве примера, триптолидный каркас может быть представлен следующей структурой:
Понятно, что соединения по настоящему изобретению содержат на каркасе множество различных заместителей. Ниже описаны примеры таких соединений.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения дитерпеноидный эпоксид, содержащий триптолидный каркас (a) представлен формулой (I):
где
1
1
1
X представляет собой H, R, OH или OR,
2
1
1
X представляет собой H, R, OH, OR, =O или Y,
3
X представляет собой H или OH,
4
1
X представляет собой H, OH или OR,
1
1-4
R представляет собой C-алкильную группу,
2
3
-
+
n
2
Y представляет собой (CRRO)P(O)(OZ),
2
1-6
1-6
3-6
каждый R независимо представляет собой H, C-алкил, арил-C-алкил-, C-циклоалкил или арил,
3
1-6
1-6
3-6
каждый R независимо представляет собой H, C-алкил, арил-C-алкил-, C-циклоалкил или арил,
2
3
3-7
или R и R, вместе с атомом углерода, с которым они связаны, формируют C-циклоалкильную группу,
2
3
a
b
1-6
где любая алкильная или циклоалкильная группа в R или R необязательно может быть замещена одним-пятью заместителями, выбранными из группы, состоящей из галогена, C-алкокси и NRR,
2
3
a
b
1-6
1-6
где любая арильная группа в R или R необязательно может быть замещена одним-пятью заместителями, выбранными из группы, состоящей из C-алкила, C-алкокси, NRR, нитро и циано,
n представляет собой 1, 2 или 3,
каждый Z представляет собой H,
a
b
1-6
3-6
каждый из R и R независимо представляет собой H, C-алкил, C-циклоалкил или арил,
a
b
или R и R, вместе с атомом азота, с которым они связаны, формируют пирролидинoвую, пиперидинoвую, пипераниновую, азетидиновую, морфолиновую или тиоморфолиновую группу,
или ее солью.
1
3
3
В предпочтительном варианте осуществления изобретения X представляет собой H, CH, OH или OCH.
2
3
3
В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения X представляет собой H, CH, OH, OCH или =O.
2
2
1
3
4
В другом предпочтительном варианте осуществления X представляет собой Y. В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения, когда X представляет собой Y, X, X и X представляют собой H.
3
В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения X представляет собой H.
4
3
В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения X представляет собой H, OH или OCH.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения (a) представляет собой триптолид, трипдиолид, 16-гидрокситриптолид, триптонид или миннелид, включая их соли.
В особенно предпочтительном варианте осуществления (a) представляет собой триптолид.
Подробные описания и способы получения соединения (a) предоставлены в разных источниках, таких как патенты США 6294546, 7626044, 6548537, 6004999, 8268882 и WO 2010/129918, каждый из которых включен в настоящий документ в качестве ссылки. В настоящее изобретение входят примеси различных соединений в объеме (a).
Компонент (b) композиции по изобретению представляет собой органический диэпоксид, который способен вызывать истощение овариальных фолликулов у самок млекопитающих. В предпочтительном варианте осуществления изобретения органический диэпоксид содержит от 8 до 14 атомов углерода. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения органический диэпоксид содержит от двух до четырех колец, включая два эпоксидных кольца.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения органический диэпоксид содержит по меньшей мере один член, выбранный из группы, состоящей из диэпоксида 4-винилциклогексена (VCD), простого диглицидилового эфира глицерина, 3,4-эпоксициклогексилметил-3,4-эпоксициклогексилкарбоксилата, простого диглицидилового эфира 1,4-циклогександиметанола, простого диглицидилового эфира этиленгликоля, простого диглицидилового эфира резорцинола и простого диглицидилового эфира 1,4-бутандиола. В объем изобретения входят смеси диэпоксидов.
Другие органические диэпоксиды, которые можно использовать по настоящему изобретению, включают 1,2,3,4-диэпоксибутан, 1,2,4,5-диэпоксипентан, 1,2,5,6-диэпоксипентан, 1,2,6,7-диэпоксипентан, 1,2,7,8-диэпоксиоктан, 1,2,3,4-диэпоксициклогексан, 1,2,5,6-диэпоксициклооктан, 9,10,12,13-диэпоксистеариновую кислоту, 3,4-эпокси-6-метилциклогексилметил-3,4-эпокси-6-метилциклогексанкарбоксилат, резорциновый диглицидиловый простой эфир, гексаэпоксисквален, простой бис-(2,3-эпокси-2-метилпропиловый) эфир, простой бис-(3,4-эпоксибутиловый) эфир, простой бис-(2,3-эпокси-2-метилпропиловый) эфир этиленгликоля, 2,3-эпокси-2-этилгексил-9,10-эпоксистеарат, 2-этил-1,3-гександиолбис-(9,10-эпоксистеарат), 2,3-бис(глицидилокси)-1,4-диоксан, бис-(3,4-эпоксициклогексилметил)адипат, бис-(3,4-эпоксиметилциклогексилметил)адипат, 3,4-эпокси-6-метилциклогексилметил-3-4-эпокси-6-метилциклогексанкарбоксилат, диоксид лимонена и простой бис-(2,3-эпоксициклопентиловый) эфир. Такие соединения описаны, например, в Weil, Industrial Hygiene Journal, July-August 1963, pp. 305-325 и Van Duuren, Annals New York Academy of Sciences, 1969, pp. 633-651, которые обе включены в настоящий документ в качестве ссылки.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения органический диэпоксид содержит диэпоксид 4-винилциклогексена. В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения (a) представляет собой триптолид и (b) представляет собой диэпоксид 4-винилциклогексена.
Химическую реакционноспособность эпоксидов можно определять в анализе алкилирования способом на основе 4-(п-нитробензил)пиридина (NBP), опубликованном в "Detection of epoxides with 4-(p-nitrobenzyl) pyridine". Agarwal et. al. 1979, Bull. Environm. Contam. Toxicol. 23, 825-829, включенной в настоящий документ в качестве ссылки.
Биологическую активность эпоксидов можно оценивать в биоанализе in vitro способом на основе яичников детенышей крысы, опубликованном в "Characterization of a rat in vitro ovarian culture system to study the ovarian toxicant 4-vinylcyclohexene diepoxide". Devine et. al. 2002, Toxicol. Appl. Pharmacol. 184, 107-115, включенной в настоящий документ в качестве ссылки. Биологическую активность можно определять посредством количеств фолликулов в срезах яичников через неделю культивирования с микромолярными концентрациями эпоксида. Как правило, биологически активные эпоксиды также являются химически активными, но не наоборот.
Настоящее изобретение также относится к способу индукции истощения овариальных фолликулов у самки млекопитающего, включающему введение самке млекопитающего эффективного количества композиции, описанной выше.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения млекопитающее представляет собой человека или не являющееся человеком млекопитающее. Примеры не являющихся человеком млекопитающих включают, например, грызунов (например, крыс, мышей, белок, луговых собачек, сусликов, сурков, хомяков, нутрий, бобровых, полевок), ондатр, кошек, собак, свиней, лошадей, крупный рогатый скот, койотов, лис, овец, оленей, коз, горностаев, поссумов, опоссумов, кроликов, зайцев, кенгуру, кенгуру-валлаби, барсуков, верблюдов, слонов, ослов, енотов, медведей, сурков, кротов, летучих мышей и кабанов.
Млекопитающих, перечисленных выше, можно использовать в любом варианте осуществления изобретения, описываемом в настоящем документе.
Настоящее изобретение также относится к способу снижения способности млекопитающего к размножению, включающему введение млекопитающему эффективного количества композиции, описанной выше.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения млекопитающее представляет собой самку. В другом варианте осуществления изобретения млекопитающее представляет собой самца. Следует отметить, что известно, что пероральное введение триптолида снижает фертильность самцов крыс до полной стерильности. Таким образом, по настоящему изобретению обрабатывать можно и самцов, и самок. В предпочтительном варианте осуществления изобретения млекопитающее стерилизовано обработкой по настоящему изобретению, т.е., животное теряло свою способность к размножению.
Настоящее изобретение также относится к способу контроля численности популяции не являющихся человеком млекопитающих, включающему введение популяции не являющихся человеком млекопитающих эффективного количества композиции, описанной выше. В этом аспекте изобретения группу животных, т.е., популяцию, намечают для обработки в пределах определенной области, например, в парке или заповеднике, сельскохозяйственном производстве, при производстве концентрированных кормов для животных, торговле, местах проживания, государственных землях. Этот вариант осуществления изобретения особенно пригоден для контроля популяции грызунов (например, крыс) в системе городского общественного транспорта. Например, системе городского метро. Например, хорошо известно, что в системе метро Нью-Йорка существует большая популяция грызунов. В этом варианте осуществления изобретения на всем протяжении системы предоставляют композицию по изобретению для поедания грызунами. Ожидается, что такая обработка снизит численность популяции животных и, возможно, уничтожит популяцию.
Настоящее изобретение также относится ко всем способам, описанным выше, в которых (a) и (b) при желании вводят раздельно, т.е. (a) и (b) не включены в одну композицию. Кроме того, хотя (a) и (b) предпочтительно вводить одновременно, в отношении этого варианта осуществления в объем настоящего изобретения также входит то, что (a) и (b) можно вводить в различные моменты времени с пониманием того, что для обеспечения синергического действия, предусмотренного настоящим изобретением, (a) и (b) должны присутствовать совместно. Предпочтительно, (a) и (b) вводят в пределах 24, 12, 6, 3, 2 или 1 часа или менее друг от друга.
По различным вариантам осуществления композиция по настоящему изобретению сконфигурированы так, чтобы обеспечивать стерильность у млекопитающих, индуцируя истощение фолликулов в яичниках. По различным аспектам этих вариантов осуществления мишенью являются фолликулы на всех стадиях. Для обеспечения постоянной потери функции яичников мишенью является конечный примордиальный пул фолликулов. Для обеспечения быстрого снижения производства потомства мишенью являются растущие фолликулы.
Компонент (b) по настоящему изобретению (например, VCD) используют для поражения примордиальных/первичных фолликулов, а компонент (a) (например, триптолид) используют для поражения растущих фолликулов. Комбинацию используют для постоянного подавления воспроизведения у млекопитающих, обработанных таким образом по настоящему изобретению. Кроме того, известно, что триптолид снижает фертильность самцов млекопитающих, и, таким образом, композиция снижает фертильность и у самцов, и у самок млекопитающих. Композицию также можно использовать для ускорения недостаточности яичников у млекопитающих, таких как женщины в менопаузе.
Дозу активного средства можно варьировать в соответствии с целью обработки и видом. Однако в соответствии с иллюстративными вариантами осуществления изобретения композиция содержит приблизительно от 1 мМ до приблизительно 750 мМ, или приблизительно от 1 мМ до приблизительно 500 мМ, или приблизительно от 10 мМ до приблизительно 100 мМ (b) и приблизительно от 1 нМ до приблизительно 10 мМ, или приблизительно от 5 нМ до приблизительно 1 мМ, или приблизительно от 5 нМ до приблизительно 20 нМ (a). Эти диапазоны включают все конкретные значения и поддиапазоны между ними, такие как 10 нМ, 25 нМ, 50 нМ, 100 нМ, 250 нМ, 500 нМ, 5 мМ, 25 нМ, 50 мМ и 250 мМ. Неожиданно и внезапно выявлено, что композиции по настоящему изобретению истощают овариальные фолликулы на всех стадиях. Полагают, что истощение является результатом действия синергической комбинации (b) и (a), которая, как полагают, обеспечивает возможность использования меньших концентраций каждого из средств, по сравнению с композициями, которые не содержат комбинации, и которая приводит к более высокой доле истощения фолликулов.
Для применений в культуре in vitro молярное отношение (a) к (b) может находиться в диапазоне от 1/5 до 1/75000, включая все конкретные значения и поддиапазоны между ними, такие как 1/10, 1/25, 1/50, 1/100, 1/250, 1/500, 1/1000, 1/2500, 1/5000, 1/10000, 1/25000 и 1/50000. Для применения in vivo (например, приманки) соответствующее молярное отношение, как правило, составляет от 1/5 до 1/500, включая все конкретные значения и поддиапазоны между ними, такие как 1/10, 1/25, 1/50, 1/100 и 1/250.
Для применения в культуре in vitro соотношение масс (a) и (b), как правило, находится в диапазоне от 1/2 до 1/50000, включая все конкретные значения и поддиапазоны между ними, такие как 1/10, 1/25, 1/50, 1/100, 1/250, 1/500, 1/1,000, 1/2500, 1/5000, 1/10000 и 1/25000. Для применения in vivo (например, приманки) соответствующее соотношение масс, как правило, составляет от 1/5 до 1/500, включая все конкретные значения и поддиапазоны между ними, такие как 1/10, 1/25, 1/50, 1/100 и 1/250.
Хотя композиции, содержащие VCD исследовали на индукцию истощения фолликулов, выявлено, что VCD отдельно, в качестве единственного активного ингредиента, не вызывает преждевременной недостаточности яичников при низких концентрациях или кратковременных воздействиях < 15 суток. Преждевременная недостаточность яичников происходит тогда, когда больше не происходит овуляций, несмотря на то, что в яичнике находятся яйцеклетки/фолликулы. Для композиций и способов, чтобы функционировать в качестве средств контроля популяций, желательно, чтобы недостаточность яичников происходила быстро, например, в пределах 10 суток обработки для грызунов.
По различным вариантам осуществления способ индукции истощения овариальных фолликулов включает этапы получения композиции, содержащей VCD и триптолид, где композиция индуцирует истощение овариальных фолликулов на нескольких стадиях. Например, композиция может вызывать истощение примордиальных, вторичных и третичных фолликулов и желтых тел. По дополнительным аспектам комбинация может вызывать усиление истощения примордиальных фолликулов и более полное разрушение примордиальных фолликулов по сравнению с композициями, содержащими только VCD.
Композицию и способ, описываемые в настоящем документе, можно использовать для стерилизации различных млекопитающих (например, грызунов, свиней, койотов, собак, кошек, лошадей и других животных, описанных выше), контроля популяции таких животных и т.п. посредством кормления композицией популяций млекопитающих. Как указано выше, композиция снижает фертильность у самцов млекопитающих так, что полагают, что введение композиции самцам и самкам в популяции дополнительно уменьшит популяцию по сравнению с композициями, которые действуют на фертильность только самцов или только самок.
По дополнительным вариантам осуществления предоставлены самки не являющихся человеком млекопитающих с истощением овариальных фолликулов, индуцированным введением композиции, содержащей VCD и триптолид, где композиция индуцирует истощение овариальных фолликулов на нескольких стадиях. Животное можно использовать, например, для исследования климактерических и постклимактерических воздействий и можно использовать в качестве модели на животных для таких животных, как люди.
Кормление млекопитающих можно проводить различными способами, такими как принудительное кормление и с использованием приманки. Когда используют принудительное кормление, концентрация (b) (например, VCD), как правило, находится в диапазонах приблизительно от 50 до приблизительно 200 мг/кг/сутки кормления, а количество (a) (например, триптолида) находится в диапазоне приблизительно от 25 мкг композиции/кг массы тела до приблизительно 100 мкг композиции/кг массы тела. Эти диапазоны включают все конкретные значения и поддиапазоны между ними, включая 35, 60, 75, 90, 125, 150 и 175 мкг/кг массы тела.
Когда в соответствии с иллюстративными вариантами осуществления используют приманку, приманку формулируют так, что: потребляемые активные ингредиенты не вызывают вредных побочных эффектов, потребление приманки происходит в присутствии других источников пищи, приманка является экологически безвредной, т.е. активные ингредиенты не сохраняются в окружающей среде и не происходит остаточного накопления в тканях, что может приводить ко вторичному воздействию на не являющихся мишенью животных, активные ингредиенты не должны подвергать риску людей, и получение приманки должно быть масштабируемо для производства. Приманка может быть твердой, полутвердой или жидкой.
Композиции по настоящему изобретению может содержать ингредиенты, описываемые в настоящем документе, а также дополнительные и/или альтернативные инертные вещества, консерванты и другие составляющие, как правило, содержащиеся в подобных композициях. В случае, когда перечисляют иллюстративные инертные вещества и/или консерванты, эти ингредиенты являются только иллюстративными, и следует понимать, что вещества в приведенных ниже примерах можно заменять другими сходными ингредиентами.
ПРИМЕРЫ
После описания настоящего изобретения в общих чертах дальнейшее понимание можно получать на основании определенных конкретных примеров, которые предоставлены в настоящем документе только с целью иллюстрации и, если не указано иначе, не предназначены для ограничения.
In Vitro
Сравнительный пример 1
На фиг. 1 и 2 проиллюстрированы изображения яичников детенышей крысы в возрасте 4 суток. Контрольные яичники иллюстрируют многочисленные примордиальные/первичные и развивающиеся вторичные фолликулы.
Сравнительный пример 2
На фиг. 3 проиллюстрирована культуральная система in vitro для оценки эффективности истощающих фолликулы композиций (разработанная Patrick J. Devine). Как указано в различных примерах в настоящем документе, яичники культивируют с VCD c триптолидом или без в не содержащей сыворотку среде в течение 8 суток, гонадотропины не присутствуют, среды не заменяют и активные ингредиентов добавляют однократно в начале культивирования. Яичники собирают и обрабатывают на гистологию для проведения подсчета фолликулов.
На фиг. 4 проиллюстрирован яичник, обработанный 30 мкм VCD. Как показано, яичник демонстрирует 38% снижение количества примордиальных фолликулов. Другие стадии фолликулов обработкой значимо не затронуты.
Пример 3
На фиг. 5 проиллюстрирован культивируемый яичник, обрабатываемый 30 мкм VCD и 5 нм триптолида с использованием системы и способа из сравнительного примера 2. Яичник не содержит видимых здоровых фолликулов и демонстрирует глубокую атрезию и пикноз. Как показано, применение композиции для яичника in vitro вызывало 100% истощение фолликулов на всех стадиях.
Пример 4
На фиг. 6 проиллюстрирован культивируемый яичник, обрабатываемый 30 мкм VCD и 10 нм триптолида. Как показано, применение композиции для яичника in vitro вызывало 100% истощение фолликулов на всех стадиях
In Vivo
Пример 5
Исследования In vivo проводили с использованием опыта с кормлением в течение 15 суток неполовозрелых самок крыс Sprague-Dawley. Концентрацию VCD поддерживали постоянной при 75 мМ и концентрацию триптолида варьировали, как указано ниже. Схема эксперимента была следующей:
Контроль без активных ингредиентов (n=6)
VCD + триптолид 25 мкг/кг массы тела (n=7)
VCD + триптолид 50 мкг/кг массы тела (n=7)
VCD + триптолид 100 мкг/кг массы тела (n=7)
Эксперимент разрабатывали для оценки: вкусовой привлекательности и количества потребляемой приманки, здоровья крыс (массу тела регистрировали ежесуточно) и собирали яичники для анализа фолликулов. Крысы в течение 15 последовательных суток наряду с контролем или приманкой для обработки имели доступ к стандартному корму. На фиг. 7 проиллюстрировано среднее ежесуточное потребление/массу тела для каждой группы и на фиг. 8 проиллюстрированы направления изменения массы тела для каждой группы.
На фиг. 9 проиллюстрированы количества примордиальных фолликулов, количества вторичных фолликулов, количества антральных фолликулов и количества желтых тел для каждой из групп. По сравнению с контрольной группой, группа, обработанная триптолидом в количестве 50 мкг/кг массы тела продемонстрировала 50% истощение количества примордиальных фолликулов, 64% истощение количества вторичных фолликулов, 80% истощение количества антральных фолликулов и 100% истощение количества желтых тел. На фиг. 10 проиллюстрированы изображения яичников каждой группы, а на фиг. 11 проиллюстрированы массы яичников для каждой группы.
Эффективность in vivo
Композицию приманки, содержащей два активных ингредиента, диэпоксид 4-винилциклогексена с 0,099% по массе и триптолид с 0,0012%, предоставляли неполовозрелым самкам крыс Sprague Dawley в течение 15 последовательных ночей в присутствии неограниченных количеств воды и корма для лабораторных крыс и они потребляли > 10% от их массы тела/ночь. На следующие сутки после окончания дозирования самок-крыс скрещивали в течение 21 суток с необработанными, подтвержденными взрослыми самцами-производителями. Контрольные крысы, которые потребляли эмульсию без активных ингредиентов, давали потомство со средним количеством потомства 12,2 детенышей крыс в среднем через 39,7 суток от начала дозирования. У крыс, которые потребляли композиция приманки по изобретению, среднее количество потомства составляло 4,3 детеныша в среднем через 55,9 суток от начала дозирования. Однако 2 из 8 крыс, которые пили композицию по изобретению, никогда не давали потомства, и другие 2 крысы давали потомство из 1 детеныша.
Дополнительно в группе, которую кормили приманкой по изобретению, крыса, которая потребляла наименьшее количество из всех 8 крыс, 8 мг/кг массы тела в сравнении с 16 мг/кг массы тела у других 7 крыс, дала потомство из 15 детенышей, что явно указывает на обратную зависимость дозы-ответа между потребляемой композицией и количеством детенышей/потомстве. Эти результаты соответствуют данным, представленным выше, где уменьшалось количество фолликулов после потребления приманки по изобретению. В этом наборе данных наблюдали более выраженное действие приманки на растущие фолликулы и желтые тела, из чего можно было заключить о меньшем количестве овуляций. Таким образом, потребление композиции по настоящему изобретению самками крыс уменьшало количество овариальных овуляций до такой степени, что рождалось на 65% меньше детенышей и задержанные овуляции значительно увеличивали время до рождения. Комбинация этих двух эффектов у крыс с коротким временем жизни, менее 1 года в природе, в целом оказывает сильное действие на количество детенышей крыс, рождаемых у одной самки крысы, и, в конечном итоге, на общую численность популяции.
Пример 6: Применение композиции приманки in vivo
Получали композиции приманок с постоянной концентрацией VCD и увеличивающимися концентрациями триптолида.
Неполовозрелые самки крыс потребляли приманку с постоянной концентрацией VCD (концентрация 0,099%) в комбинации с увеличивающимися концентрациями триптолида, низкой 3,99 мкг/мл, средней 7,96 мкг/мл и высокой 11,92 мкг/мл, в течение 15 суток. Фиг. 12A представляет собой среднее ± SEM количество триптолида, потребляемого в сутки группами с низкой, средней и высокой дозами. Фиг. 12B представляет собой среднее ± SEM количество VCD, потребляемого в сутки группами с низкой, средней и высокой дозами.
Неполовозрелые самки крыс имели неограниченный доступ к корму и воде в течение всего периода обработки. Сутки 0 представляют собой первую ночь доступности приманки с активными ингредиентами триптолидом и VCD, предоставляемых в течение временного периода без света. На следующее утро измеряли количество потребленной приманки и крыс оценивали на общее состояние здоровья и взвешивали. Результаты представлены на фиг. 13. Данные, представленные на фиг. 13, демонстрируют, что в течение времени, когда крысы потребляли приманку, они продолжали расти со сходными скоростями. Кроме того, общее состояние крыс было хорошим, и они потребляли приманку в постоянном количестве в течение всех 15 суток, приблизительно 8-10% от их массы тела.
Неполовозрелые самки крыс потребляли приманку с высокой концентрацией триптолида и VCD с 0,099% в течение 15 суток. Через сутки после поедания последней приманки самок крыс скрещивали с необработанными, подтвержденными взрослыми самцами-производителями крыс. Количество детенышей в потомстве подсчитывали на сутки 4 после рождения. Результаты представлены на фиг. 14. Данные, представленные на фиг. 14, демонстрируют, что действие триптолида на детенышей, рожденных в потомстве, зависело от дозы. Существует сильная обратная зависимость между количеством триптолида в дозе и количеством детенышей, рожденных в потомстве.
Неполовозрелые самки крыс потребляли контрольную приманку без активных ингредиентов, а обработанные самки потребляли приманку с VCD при 0,099% и высокой дозой триптолида в течение 15 суток. Через сутки после окончания кормления приманкой обработанных самок крыс скрещивали с подтвержденными взрослыми самцами-производителями крыс. Подсчитывали количество суток до рождения потомства, начиная от суток скрещивания 0 до рождения. Данные представлены на фиг. 15, где символы представляют собой среднее для каждой группы ± SEM.
Пример 7: Анализ in vitro
Биоанализ истощения фолликулов in vitro, яичники культивировали в течение 8 суток с различными химическими веществами
Контроль - отсутствие химических веществ, Триптолид - 5 нМ (Trip), диэпоксиды, RDE, CHDE, Quetol, ERL 4221, BDE, GDE, каждый при 30 мкМ + Trip 5 нМ
Получали яичники для гистологического анализа для определения истощения фолликулов
Сравнивали химическую (реакционноспособность в анализе эпоксида) и биологическую активность (истощение фолликулов)
Химическая реакционноспособность
Диэпоксид
Биологическая активность
4
RDE
1
5
GDE
2
6
BDE
3
3
CHDE
4
2
Quetol
5
1
ERL 42221
6
Ранжирование: 1 – минимальная химическая реакционноспособность/биологическая активность, 6 – наибольшая химическая реакционноспособность/биологическая активность
Выводы:
1. В приведенном выше эксперименте ни один из этих тестируемых диэпоксидов при 30 мкМ не вызывал значимого истощения фолликулов.
2. В этом эксперименте триптолид (Trip) при 5 нМ не вызывал значимого истощения фолликулов.
3. Только когда триптолид и GDE, BDE, CHDE, Quetol и ERL 4221 комбинировали, наблюдали значимое истощение фолликулов. Комбинация триптолида + RDE не вызывала значимого истощения фолликулов.
4. ERL 4221 является лучшей иллюстрацией взаимосвязи между химической и биологической активностью. ERL 4221 являлся наименее химически реакционноспособным при этом наиболее биологически активным при комбинации с Trip.
5. Очевидно, что комбинация Trip и этих диэпоксидов GDE, BDE, CHDE, Quetol, ERL 4221 вызывала значимое истощение фолликулов посредством синергетических взаимодействий.
Настоящее изобретение описано выше на основе ряда иллюстративных вариантов осуществления и примеров. Следует учитывать, что конкретные варианты осуществления, представленные и описываемые в настоящем документе, являются иллюстративными вариантами предпочтительных вариантов осуществления изобретения и его лучшим способом осуществления, и не предназначены для ограничения объема изобретения как оно указано в формуле изобретения. Понятно, что с вариантами осуществления, описываемыми в настоящем документе, можно проводить изменения и модификации без выхода за пределы настоящего изобретения. Эти и другие изменения или модификации предназначены для включения в объем настоящего изобретения, как оно сформулировано в приводимой ниже формуле изобретения и ее законных эквивалентов.
Очевидно, в свете приведенных выше указаний возможно множество модификаций и вариаций настоящего изобретения. Таким образом, следует понимать, что в объеме прилагаемой формулы изобретения практически изобретение можно осуществлять иначе, чем конкретно описано в настоящем документе.