Методы идентификации клонов сосны обыкновенной на лесосеменных плантациях

ЛЕСНОЕ ХОЗЯЙСТВО

стволика, которые были выше в вариантах с весенним посевом. По остальным показателям, в том числе и весовым, достоверных различий не установлено.

Разное происхождение семян не сказалось на размерно-весовых показателях сеянцев. На основании изложенного можно сделать следующие выводы:

- несмотря на то, что на территории Подмосковья недостаточное количество объектов кедра корейского, находящихся в репродуктивной фазе, полученные семена отличаются высокими показателями качества (масса 1000 = 800 г, грунтовая всхожесть 67-77 %);

- не выявлено различий как в сроках и динамике появления всходов, так и в размерно-весовых показателях 1-летних сеянцев из местных семян и из ареала вида;

- для получения стандартных сеянцев кедра корейского в наиболее короткие сроки целесообразно выращивать их в закрытом грунте с применением удобрений.

В целом результаты опытов свидетельствуют о возможности репродукции в условиях Подмосковья.

Библиографичекий список

1. Дроздов, И.И. Выращивание кедра корейского в зоне смешанных лесов / И.И. Дроздов, А.А. Ко-женкова // Сб.: Лесная геоботаника и биология древесных растений. - Брянск, 1986. - С.39-48.

2. Дроздов, И.И. Лесная интродукция / И.И. Дроздов, Ю.И. Дроздов - М.: МГУЛ, 2000. - 135 с.

3. Дроздов, И.И. Выращивание посадочного материала кедра корейского / И.И. Дроздов, М.М, Вой-тюк // Лесное хозяйство, 1989. - № 4. - С. 34-35.

4. Коженкова, А.А. Способы размножения пятихвойных сосен для целей лесовыращивания в зоне смешанных лесов: дисс.... канд. с.-х. наук / А.А. Коженкова - М.: МЛТИ, 1986. - 122 с.

5. Войтюк, М.М. Выращивание кедра корейского в культурах зоны хвойно-широколиственных лесов: дисс.. канд. с.-х. наук / М.М. Войтюк - М.: МЛТИ, 1989 - 151 с.

6. ОСТ 56-98-93. Сеянцы и саженцы основных древесных и кустарниковых пород - М: Изд-во стандартов, 1993. - 93 с.

МЕТОДЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ КЛОНОВ СОСНЫ ОБЫКНОВЕННОЙ НА ЛЕСОСЕМЕННЫХ Плантациях

А.С. РАБЦУН, асп. каф. селекции, генетики и дендрологии МГУЛ

За последние годы широкое распространение получила так называемая плюсовая селекция на повышение продуктивности, качества и устойчивости создаваемых лесов [1]. Она включает выделение лесных генетических резерватов и лучших (плюсовых) насаждений, отбор в них лучших (плюсовых) деревьев по комплексу хозяйственно ценных признаков и их генетическую оценку по семенному потомству в испытательных культурах, выделение элиты, закладку лесосеменных плантаций первого (ЛСП-1) и второго порядка (ЛСП-2) [1].

В настоящее время во всех регионах нашей страны по основным лесообразующим видам древесных растений создано множество объектов единого генетико-селекционного комплекса (ЕГСК). В том числе выделены лесные генетические резерваты, плюсовые

zhu4ok69@rambler.ru насаждения, отобраны плюсовые деревья, заложены ЛСП-1, постоянные лесосеменные участки (ПЛСУ), архивы клонов и испытательные культуры плюсовых деревьев. В некоторых регионах Российской Федерации ЛСП-1 и ПЛСУ стали являться основным поставщиком семенного материала для лесокультурных работ [2].

Однако в целом по стране за сорок лет, прошедших с момента создания первых объектов ЕГСК, в лесном хозяйстве накопилось много нерешенных проблем, возникших, прежде всего, из-за резкого сокращения его бюджетного финансирования и, как следствие, спада производства в связи с затяжным экономическим кризисом, явившимся следствием распада СССР в начале 90-х годов.

В современный период многие специалисты в области лесной селекции правомерно

ЛЕСНОЙ ВЕСТНИК 3/2013

7

ЛЕСНОЕ ХОЗЯЙСТВО

заостряют вопрос о необходимости паспортизации лесосеменных плантаций (ЛСП). Однако не менее важной задачей, которая должна решаться на первом этапе этой работы, является проверка точности маркировки всех деревьев на ЛСП и в архивно-маточных плантациях. Без уборки «генетического мусора» на объектах дальнейшая селекция невозможна, а их паспортизация не имеет смысла [5].

В данной статье будут рассмотрены несколько наиболее распространенных и перспективных методов для идентификации клонов сосны обыкновенной.

Несмотря на разность подхода к вопросу идентификации клонов, все эти методы объединяет наличие специального маркера, способного доподлинно определить клоно-вую принадлежность и указать на их генетическое родство.

1) Фенетический метод.

В результате масштабирования и оценки межгрупповой изменчивости признаков А.И. Видякиным (2007) были отобраны маркеры популяционной структуры сосны с высокой генотипической детерминированностью, установлены масштабы их, выделены наиболее информативные маркеры. В процессе изучения индивидуальной изменчивости морфологических признаков шишек, семян, микростробилов разработана методика выделения фенов и выявлено несколько элементарных вариаций, отвечающих понятию фена. Она включает 4 этапа: первый - создание коллекций генеративных органов; второй - проверка имеющихся классификаций признаков и оценка выделяемых по ним вариаций на соответствие понятию фена; третий - выявление элементарных признаков, описание и выделение дискретных вариаций; четвертый - косвенная оценка генотипической детерминированности отобранных дискретных вариаций.

Маркерами популяционного уровня структурной организации вида являются фены окраски семян первого слоя; третьего - наличие или отсутствие его, фены окраски шишек: серо-зеленая, коричневая, песочная, фены окраски микростробилов- желтая и красная; фены типа развития апофиза - передний (ПТРА) и задний (ЗТРА). Наиболее

информативны из них фены третьего слоя окраски семян.

Использованный подход позволил проанализировать 91 клон из 118, представленных на плантациях, т.е. 77 % выборки клонов. По мере анализа других плантаций этот показатель возрастет, поскольку клоны, представленные на изученных объектах одной единственной раме-той, будут идентифицированы при сравнении с одноименными клонами на других объектах. Вероятно, фенетической паспортизацией может быть охвачено свыше 80 % клонов, за исключением неплодоносящих и клонов с нечетко идентифицируемыми фенами шишек.

Однако необходимо учесть, что, во-первых, даже и при 4 % ошибок без идентификации родословных дальнейшая селекция невозможна, поскольку любая вероятность ошибки в селекционном процессе должна быть полностью исключена.

Во-вторых, доля неверно маркированных деревьев на отдельных объектах достигает 12,6 %. В-третьих, клоновые плантации 1980 и 1988 гг. являются показательными объектами, на которых научными сотрудниками Института леса СО РАН совместно с Центром защиты леса по Алтайскому краю отрабатывались методы «селекционного ремонта» и селективного изре-живания плантаций, при которых непривитые, больные, «сомнительные» и неверно маркированные деревья были удалены при изрежива-ниях или по возможности заменены на лучшие достоверно маркированные экземпляры. В-четвертых, на архиве клонов еще не проводились дополнения взамен отпавших деревьев, во время которых преимущественно и возникают ошибки в маркировке. В-пятых, не осуществлялась оценка идентичности одноименных клонов с разных плантаций, а также не проводился этап паспортизации методами биохимической генетики. Поэтому, к сожалению, полученный результат показывает лишь нижний предел ошибок в маркировке родословных на производственных генетико-селекционных объектах единого генетико-селекционного комплекса [5].

Несмотря на ряд этих нюансов, в целом исследования показали, что фенотипические методы популяционно-хореологической структуры сосны обыкновенной могут

8

ЛЕСНОЙ ВЕСТНИК 3/2013

ЛЕСНОЕ ХОЗЯЙСТВО

быть вполне информативными при соблюдении определенных принципов и методов выбора генетически детерминированных альтернативных признаков-маркеров и достаточно высокой пространственной плотности популяционных выборок в исследуемой части ареала вида (Видякин, 2001).

По мнению Беликовой А.Ф. и Кара-цупы О.А. (1997), результаты анализа одновременного использования ряда морфологических признаков генеративных органов в их совокупности носят вероятностный характер, так как они основаны на использовании комбинаций (наборе) морфологических признаков, каждый из которых должен обнаруживать определенное сходство с генетически родственной особью. Чтобы это сходство приближалось к тождественности (абсолютному сходству), приходится привлекать возможно больший набор морфопризнаков. В результате устанавливается сходство с определенной степенью вероятности, но не полное.

В качестве более эффективной альтернативы они предлагают собственное изобретение, согласно которому идентификация осуществляется с помощью нового фена-текстуры кожуры семян сосны. Являясь признаком, передающимся по матери, выявленный морфофен-текстура семенной кожуры играет роль не фенетического, а генетического маркера отдельной особи. Благодаря этому предлагаемый способ может найти применение в научно-исследовательских работах в области генетики и селекции леса при изучении структуры популяции сосны, генетическом анализе семенного потомства различных скрещиваний.

2) Биохимический метод. Сущность его заключается в оценке степени химического состава отдельных частей дерева.

В.В. Тараканов и др. в 2007 г. провели анализ генетической гетерогенности клонов сосны обыкновенной по особенностям элементного состава их хвои.

При анализе элементарного состава учеными было включено в выборку 75 рамет (привоев) 25 клонов - по 3 раметы на клон. Оценивались результаты 29 элементов, из которых надежно диагностировались 15: Ca, K, Mn, Zn, Sr, Br, Cu, Ni, Pb, Rb, Bi, U, Fe, Se, Y.

Для элементов Fe, Se, Y межклоновых различий не было обнаружено, но при определении количества других веществ, содержащихся в хвое, по меньшей мере Ca, K, Zn наследуются более строго и в перспективе могут применяться в качестве генетических маркеров.

Также группой этих ученых была исследована изменчивость химического состава пыльцы у клонов сосны обыкновенной. Обнаружено достоверное влияние клонов на содержание в пыльце Fe, Cu, Zn, Pb. Для анализа биохимического состава пыльцы были использованы формы сосны, отличающиеся по окрасу микростробилов - «желтая» и «красная». По содержанию большинства компонентов (аскорбиновой кислоты, сахаров, дубильных веществ, флавонолов, катехинов, протопектинов, сапонинов) межклоновая изменчивость существенно перекрывает межформовую. Лишь по содержанию кислот имеет место обратное соотношение. Предварительный результат сводится к тому, что изменчивость элементного состава пыльцы по некоторым компонентам имеет наследственную природу.

По мнению Н.Н. Бессчетновой, плюсовые деревья сосны обыкновенной, представленные своими клонами в их архивах и на лесосеменных плантациях, существенно различаются по способности накапливать сахара в тканях годичных побегов. На основании собранных и проанализированных ею данных оказалось, что выявленная дифференциация ассортиментного состава объектов ПЛСБ и ЕГСК устойчива и проявляется в течение всего года на каждом из обследованных участков. Отмеченная неоднородность вегетативного потомства плюсовых деревьев в значительной мере обусловлена генотипически, что подтвердили результаты дисперсионного анализа. Компонент дисперсии, связанной с различиями между раметами, также достаточно велик, а его возникновение объясняется преимущественно разнокачественностью прививок. Наследственный характер контрастных различий между плюсовыми деревьями по накоплению сахаров в тканях побегов предопределяет целесообразность привлечения данного признака для осуществления многомерной идентификации объектов лесной селекции.

ЛЕСНОИ ВЕСТНИК 3/2013

9

ЛЕСНОЕ ХОЗЯЙСТВО

3) Молекулярно-генетический метод.

В настоящее время существует два основных метода генетической идентификации объекта: анализ изоферментов растений и анализ их ДНК. С помощью белков был сделан настоящий прорыв в исследованиях популяционной генетики. Однако со временем стали заметны и существенные ограничения белковых маркеров, основным из которых можно считать тот факт, что анализ белков позволяет тестировать изменения только в белоккодирующих последовательностях, а также их зависимость от модифицирующих условий среды, в том числе органа, ткани и фазы развития растения.

В последнее десятилетие в связи со стремительным развитием ДНК-технологий белковые маркеры оказались практически вытесненными из популяционной генетики изучением полиморфизма на уровне ДНК, что позволяет тестировать генетическую изменчивость не на уровне продуктов экспрессии гена, а на уровне генома (Мухина, 2011).

Различные методы анализа ДНК позволяют идентифицировать от одного до сотен локусов генов.

Для работы по генетической паспортизации многие ученые используют метод амплификации ДНК с произвольными праймерами (RAPD - анализ), который позволяет определить порядка 120 локусов генов. Метод прост в исполнении, обладает хорошей повторяемостью и не требует применения дорогостоящих реактивов. В частности, этот метод применяется для идентификации клонов организацией ФГУ «РОСЛЕСОЗАЩИТА».

Метод случайного амплифицирования полиморфной ДНК (RAPD) основан на полимеразной цепной реакции выделенной ДНК с использованием короткого праймера, для получения анонимных отрезков ДНК таким образом, что каждый праймер присоединяется к фрагменту ДНК случайно. Поэтому неизвестно, какой продукт будет получен в результате. Затем полученные фрагменты ДНК разделяются и определяются посредством гель-электрофореза и проводится анализ полученных электрофореграмм.

Несмотря на разность подходов к решению такой важной задачи, как идентифика-

ция клонов, пока довольно трудно опираться на какой-то конкретный способ из всех, предложенных современной наукой. Одни методы требуют проверки или доработки, другие оказываются дорогостоящими при больших объемах работ. Однако следует отметить, что итоги уже проведенных исследований значительно облегчили возможности решения такой важной задачи и позволяют надеяться, что уже в ближайшей перспективе будет разработан универсальный метод идентификации.

Библиографический список

1. Указания по лесному семеноводству в Российской Федерации. - М.: ВНИИЦлесресурс, 2000.

2. Видякин, А.И. Эффективность плюсовой селекции древесных растений / А.И. Видякин // Хвойные бореальной зоны, 2010. - Т 27, 1/2. - С. 18-24.

3. Кальченко, Л.И. Поэтапная паспортизация деревьев на клоновых плантациях сосны: использование методов фенетики / Л.И. Кальченко, В.В. Тараканов // Хвойные бореальной зоны, 2009. - № 4-5.

- Т. 26. - С. 6.

4. Видякин, А.И. Фенетика, популяционная структура и сохранение генетического фонда сосны обыкновенной (Pirns sylvestris L.) / А.И. Видякин // Хвойные бореальной зоны, 2007.- № 2. - С. 159-166.

5. Тараканов, В.В. Селекционное семеноводство сосны обыкновенной в Сибири / В.В. Тараканов,

B. П. Демиденко, Я.Н. Ишутин и др. - Новосибирск: Наука, 2001. - 229 с.

6. Видякин, А.И. Фены лесных древесных растений: выделение, масштабирование и использование в популяционных исследованиях (на примере Pinus sylvestris L.) / А.И. Видякин. - Экология, 2001.

- № 3. - С. 197-202.

7. http://ru-patent.info/20/65-69/2065265.html

8. Тараканов, В.В. Элементарный состав хвои в разных клонах сосны обыкновенной / В.В. Тараканов, Л.И. Милютин, К.П. Куценогий и др. // Лесоведение. - 2007. - № 1. - С 28-35.

9. Киров, Е.И. Биохимический и элементный состав пыльцы разных клонов сосны обыкновенной / Е.И. Киров, В.В. Тараканов, Т.А. Кукушкина и др. // Хвойные бореальной зоны. - 2007. - № 2-3. -

C. 197-200.

10. Бессчетнова, Н.Н. Содержание водорастворимых сахаров в клетках побегов плюсовых деревьев сосны обыкновенной / Н.Н. Бессчетнова. - Монография, 2011. - 5 с.

11. Мухина, Ж.М. Молекулярные маркеры и их использование в селекционно- генетических исследованиях / Ж.М. Мухина, Е.В. Дубина // Политематический сетевой электронный научный журнал КубанскогоГАУ - 2011. - № 66(02). - 14 с.

10

ЛЕСНОЙ ВЕСТНИК 3/2013