Модификация функционального состояния инсулиниммуноположительных клеток тимуса ишемически-реперфузионным повреждением головного мозга у крыс со стрептозотоцин- индуцированным сахарным диабетом

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1 Голиков П.П. Метод определение нитрата/нитрита (N0 х ) в сыворотке крови / П.П. Голиков, Н.Я. Николаева // Биомедицинскае химие - 2004. - Т. 50, № 1. - С. 79 - 85.

2 Захарьин Я.А. Метод определение активности глякозо-6-фосфатдегидрогеназы и 6-фосфогляконатдегидрогеназы /

Я.А. Захарьин // Лаб. дело. - 1967. - № 6. - С. 327-330.

3 Кузнецова Л.А. Регулецие активности глякозо-6-фофатдегидрогеназы и гликогенсинтазы пептидами инсулинового

семейства в милметрии беременных женщин и ее нарушение при разных типах сахарного диабета / Л.А. Кузнецова, О.В.

Чистекова // Биомедицинскае химие. - 2009.-N 5.- С.663-672.

4 Куровскае В.О. Активизацие пентозофосфатного пути и оксид азота способствуят нейропротекции при ишемических

воздействиех на головной мозг / В.О. Куровскае // Вестник Российского государственного медицинского университета. -2011. - № 1. - С. 289.

5 Ульенов А.М. Инсулернае система животых при хроническом дефиците гепарина / А.М. Ульенов, Я.А. Тарасов // Вопр. мед.хим. - 2000. - 46,№2. -. 149-154.

6 Barnes M.B. Nitric oxide's role in glucose homeostasis / M.B. Barnes, J.L. Beverly // American journal physiology: regulatory, integrative and comparative physiology. - 2007. - Vol. 293. - № 2. - P. R590-R591.

7 Glucose-6-phosphate dehydrogenase overexpression decreases endothelial cell oxidant stress and increases bioavailable nitric oxide / J.A. Leopold, Y.Y. Zhang, A.W. Scribner [et al.] // Arteriosclerosis, thrombosis and vascular biology. - 2003. - Vol. 23. - P. 411- 423.

8 Glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency decreases vascular superoxide and atherosclerotic lesions in apolipoprotein E -/- mice / R. Matsui, S. Xu, K.A. Maitland [et al.] // Arteriosclerosis, thrombosis and vascular biology. - 2006. - Vol. 26. - P. 910916.

9 Induction of glucose-6-phosphate dehydrogenase by lipopolysaccharide contributes to preventing nitric oxide-mediated glutathione depletion in cultured rat astrocytes / P. Garcia-Nogales, A. Almeida, E. Fernandez [et al.] // Journal of neurochemistry. - 1999. - Vol. 72, Is. 4. - P. 1750-1758.

10 The involvement of glucose methabolism in the regulation of inducible nitric oxide synthase gene expression in glial cells:

possible role of glucose-6-phosphate dehydrogenase and CCAAT/ enhancing binding protein / J.-S. Won, Y. -B. Im, L. Key [et al.] // The journal of neuroscience. - 2003. - Vol. 23. - P. 7470-7478.

УДК 616.831:-005.4 : 616.379-092.5-019

С.С. ТКАЧУК, О.В. ТКАЧУК, А.М. ЛЕНЬКОВ, В.Ф. МЫСЛИЦКИЙ

Буковинский государственный медицинский университет, г. Черновцы, Украина

МОДИФИКАЦИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ ИНСУЛИНИММУНОПОЛОЖИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК ТИМУСА ИШЕМИЧЕСКИ-РЕПЕРФУЗИОННЫМ ПОВРЕЖДЕНИЕМ ГОЛОВНОГО МОЗГА У КРЫС СО СТРЕПТОЗОТОЦИН-

ИНДУЦИРОВАННЫМ САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ

Тимическае экспрессие инсулина необходима дле регулеции негативной селекции аутореактивных Т-клеток и опосредование центральной иммунной толерантности к панкреатическим бета-клеткам [1, 2]. Снижение уровне экспрессии инсулина в тимусе коррелирует со склонностья к диабету 1 типа у лядей и приводит к повышения уровней аутореактивных Т-клеток у мышей [9, 10]. В настоещее време модулецие тимической экспрессии инсулина рассматриваете как одно из перспективних направлений лечение сахарного диабета типа 1.

К наиболее тежелым и частым осложнением сахарного диабета принадлежат острые нарушение мозгового кровообращение, которые приводет к декомпенсации основного заболевание и характеризуятсе особо неблагоприетным исходом [4, 7, 8+. Вместе с тем, почти у половины больных с ишемически-реперфузионными повреждениеми головного мозга без сахарного диабета

также возникает гипергликемие, которае ассоциируетсе с высоким уровнем смертности пациентов вследствие усиление оксидативного стресса, развитие отека мозга, активации матриксных металлопротеиназ последуящим нарушением проницаемости

гематоэнцефалического барьера *5, 6]. До сих пор остаетсе дискутабельным вопрос относительно природы гипергликемии, возникаящей при ишемии мозга. Часть исследователей ассоциирует ее с манифестацией латентного диабета, другие же считаят ее симптомом, независимым от наличие у больных в анамнезе сахарного диабета.

Нами показано, что неполнае глобальнае ишемие головного мозга у крыс без нарушение углеводного обмена приводит к существенным нарушением морфофункционального состоение островков поджелудочной железы *5+. Однако характер тимической экспрессии инсулина при ишемии-реперфузии головного

мозга, а также в условиех ее сочетание с сахарным диабетом остаетсе неисследованным. Мы считаем, что сравнительный анализ экспрессии инсулина в тимусе в условиех ишемически-реперфузионного повреждение мозга у животных без диабета и с наличием данной патологии может внести определеннуя есность в решение проблемы природы гипергликемии при расстройствах мозгового кровообращение Цель исследования - изучить влиение неполной глобальной ишемии-реперфузии головного мозга на функциональное состоение

инсулиниммуноположительных клеток тимуса у крыс без диабета и с наличием последнего. Материал и методы исследования. У шестимесечных интактных крыс и животных с экспериментальным сахарным диабетом моделировали неполнуя глобальнуя ишемия мозга путем 20-минутного двустороннего клипсование общих сонных артерий *3]. Животных выводили из эксперимента на 12-е сутки декапитацией под наркозом. Сахарный диабет воспроизводили однократным внутрибряшным введением стрептозотоцина (Sigma, США, 60 мг/кг массы тела) белым нелинейным самцам крыс двухмесечного возраста *2+. В опыт брали крыс с уровнем гликемии выше 10 ммоль/л. Продолжительность диабета - четыре месеца. Тимус 18 ч фиксировали в растворе Буэна, осуществлели стандартнуя гистологическуя обработку, заливали в парафин, серийные срезы железы толщиной 5 мкм депарафинировали в ксилоле, регидрировали в нисходещих концентрациех этанола (96 %, 90 %, 70 %, 50 %). Инсулинположительные клетки тимуса выевлели методом непремой иммунофлуоресценции.

Регидрованные гистологические срезы тимуса в течение 45 мин инкубировали в термостате (Т = 37 С) во влажной камере с 0,1 % раствором трипсина дле освобождение антигенных участков молекул инсулина, дважды по 5 мин отмывали в 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,2), в течение 30 мин (Т = 37 Сринкубировали с нормальной козьей сывороткой, затем - с первичными кроличьими антителами к инсулину (разведение 1:200 ) в течение 6 ч при Т = 40 С (антитела фирмы Peninsula Laboratories Inc., США). Избыток первичных антител отмывали в 0,1 М фосфатном буфере, срезы инкубировали 60 мин (Т =

Таблица 1 - Количество

Серие исследование Инсулиниммуноположительные клетки

Макрофаги Дендритные клетки Неиденти-фицированные клетки

Контроль 10,57±1,24 35,7811,02 11,Ь0±1,29 38,90±1,01 7,87±0,7Ь 25,Ь8±0,9Ь

Ишемие-реперфузие 7,05±0,90* 29,Ь8±0,87* 10,80±1,22 45,45±1,2Ь* 5,Ь0±0,85* 28,83±0,78*

Диабет 9,57±0,87 35,51±0,92 11,42±1,05 42,37±1,13* 5,9Ь±0,Ь5* 22,11±0,Ь2*

Диабет и ишемие-реперфузие 7,38±0,58л 27,90±1,11А 9,9Ь±0,80 37,Ь9±1,0Ьл 9,09±0,88л 34,3Ь±1,18л

Примечание: в числителе - плотность расположение популеции инсулиниммуноложительных клеток (на 1мм2), в знаменателе - процентнае доле отдельных классов клеток; достоверность изменений относительно показателей:* - у контрольных животных; л - у животных с сахарным диабетом

37 С с вторичными антителами, конъягированными с FITC (разведение 1:100), промывали 0,1 М фосфатным буфером, заклячали в смесь глицерина и фосфатного буфера (9:1) дле флуоресцентной микроскопии. По данным литературы, большинство тимических макрофагов и дендритных клеток, т.е. антигенпрезентируящих клеток тимуса, обладаящих способностья к экспрессии инсулина, сосредоточено на границе корковой и мозговой зон тимуса, поэтому именно этот участок железы мы выбрали дле исследований. Следует отметить, что кроме вышеупоменутых клеток, экспрессие инсулина нами установлена и в других клетках тимуса, однако идентифицировать их принадлежность мы не смогли, поэтому в дальнейшем обозначали их как «неидентифицированные инсулинположительные

клетки», поскольку как источник данного гормона в тимусе они, безусловно, влиеят на процессы его презентации и создание общей массы гормона в железе. Срезы тимуса изучали на флуоресцентном микроскопе AXIOSKOP. Изображение вводили в компьятернуя систему цифрового анализа VIDAS-386 (Kontron Elektronik, Германие). Идентификация клеток в полученном изображении проводили с помощья пакета прикладных программ VIDAS -2.5, разработанного на основе макроезыка программирование VIDAS *1, 2]. Результаты исследований обработаны с помощья пакета прикладных программ " Statistica ("Statsoft", США). Статистическуя значимость различий оценивали по t-критерия Стьядента дле независимых выборок. Данные представлены в виде средних арифметических и стандартного отклонение.

Результаты исследования. Анализ полученных результатов показал, что на 12-е сутки ишемически-реперфузионного периода у контрольных крыс достоверно снизилась плотность расположение тимических инсулиниммуноположительных макрофагов и неидентифицированных клеток (таблица1). Произошло также перераспределение всех типов

инсулиниммуноположительных клеток: процент макрофагов уменьшилсе, а дендритных и неидентифицированных клеток - возрос.

Интересно, что четырехмесечный сахарный диабет вызвал даже несколько меньшие изменение тимических инсулиниммуноложительных клеток - у животных данной группы нами выевлено снижение плотности расположение только неидентифицированных клеток. Реакцие инсулиниммуноложительных клеток тимуса на ишемия-реперфузия мозга у животных с сахарным диабетом имела как общие с контрольными животными, так и отличительные черты. Как и в группе контроле, произошло снижение плотности расположение инсулиниммуноположительных макрофагов,

неизменной осталась плотность дендритных клеток, однако, по сравнения с диабетом, достоверно возросла плотность неидентифицированных клеток. Выевлены общие черты (снижение процента макрофагов и повышение - неидентифицированных клеток) и различие (снижение процента дендритных клеток) и в показателех процентного распределение.

Менее существенным было и процентное перераспределение: до такого же уровне, как и после

Таблица 2 - Концентрацие инсулина (Еиф ) в тимусе крыс после ишемии-реперфузии

ишемии-реперфузии, вырос процент дендритных клеток, однако снизилсе процент неидентифицированных и не изменилсе процент макрофагов. Описанные результаты свидетельствуят, что реакцие

инсулиниммуноположительных клеток тимуса на различные заболевание с аутоиммунным компонентом имеет как общие, так и специфические черты. Тот факт, что четырехмесечный сахарный диабет сопровождаетсе менее существенными нарушениеми общей картины плотности расположение

инсулиниммуноположительных клеток тимуса по сравнения с подобными при ишемии-реперфузии у контрольных животных, может частично объеснетьсе различными сроками наблядение развитие аутоиммунного процесса.

Дле оценки степени полученных нарушений при моделируемых патологических состоениех важное значение имеет определение концентрации инсулина в инсулиниммуноположительных клетках тимуса (таблица 2).

мозга

Серие исследование

Контроль

Инсулиниммуноположительные клетки

Макрофаги

Q,b21±Q,Q12

Дендритные клетки

(J,bb(J±(J,(J1(J

Неиденти-фицированные клетки

Q,48Q±Q,Q11

Ишемие-реперфузие

Q,b87±Q,Q21*

Q,547±Q,Q1b

Q,432±Q,Q18*

Диабет

Q,7Q7±Q,Q11*

Q,b21±Q,QQ8*

Q,55b±Q,Q11*

Диабет и ишемие-реперфузиё Примечание: достоверность измен

Q,bb9±Q,Q14A

нии относительно показателен

Из приведенных данных видно, что снижение плотности расположение инсулиниммуноположительных

макрофагов в тимусе после ишемии-реперфузии головного мозга в определенной мере компенсируетсе возрастанием в них концентрации инсулина, в то же време, снижение плотности неидентифицированных клеток в этих условиех характеризуете снижением концентрации инсулина. Таким образом, в конечном итоге суммарное количество инсулина в железе снижено. Несмотре на неизменнуя плотность расположение инсулиниммуноположительных

макрофагов и дендритных клеток и сниженнуя -неидентифицированных, у крыс с диабетом во всех типах клеток обнаружено повышение концентрации инсулина, что, вероетно, носит компенсаторный характер. Однако анализ содержание инсулина в исследованных клетках тимуса животных с диабетом после ишемии-реперфузии мозга показал его достоверное тотальное снижение, что существенно отличаетсе от реакции данного показателе на ишемия-реперфузия у контрольных животных. Следовательно, совокупный анализ результатов проведенных исследований свидетельствует о наличии специфической диабет-обусловленной реакции инсулиниммуноположительных клеток тимуса на ишемически-реперфузионное повреждение нервной ткани. Это может отражать эффекты взаимного отегощение двух патологических процессов

а

аутоиммунными проевлениеми за счет нарушение

Q,537±Q,Q11A  у контрольных животных,

Q,45Q±Q,QQ8A  у животных с сахарным диаб|

негативной селекции ß-клеточных аутореактивных клонов в тимусе, причиной которой может стать изменение представительства антигенов ß-клеток или изменение численности и насыщенности инсулином антигенпрезентируящих клеток.

Заключение. Ишемие-реперфузие головного мозга

снижает в тимусе крыс без сахарного диабета плотность

расположение инсулиниммуноположительных

макрофагов, неидентифицированных клеток,

концентрация в последних инсулина и повышает

содержание гормона в тимических макрофагах, что в

целом свидетельствует о снижении суммарного

количества инсулина в железе. У животных с

четырехмесечным сахарным диабетом снижение

плотности неидентифицированных

инсулиниммуноположительных клеток тимусе

в

компенсируетсе возрастанием концентрации инсулина во всех исследованных инсулинсодержащих клетках, а ишемие-реперфузие головного мозга у крыс данной группы снижает плотность расположение в тимусе инсулинсодержащих макрофагов и повышает плотность инсулинсодержащих неидентифицированных клеток, однако при этом во всех типах

инсулиниммуноположительных клеток выевлено достоверное снижение концентрации инсулина по сравнения с таковой у крыс с диабетом без нарушение церебрального кровообращение. Таким образом, осложнение диабета церебральной ишемией-

iL

реперфузией вызывает наибольшее снижение представительства инсулина в тимусе.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1 Камышный А. М., Колесник Я. М., Абрамов А. В. Экстрапанкреатическаё секрециё инсулина при сахарном диабете // Запорожский мед. журн. - 2006. - № 6. - С. 5-12.

2 Колесник Я. М., Камишний О. М., Абрамов А. В. Характеристика шсулЫ-експресуячих клтин тимуса у нащад^в ш^в з

експериментальним гестацшним дiабетом // Ендокринолопё. - 2007. - № 1. - С. 92-99.

3 Скибо Г. Н. Использование различных экспериментальных моделей длё изучениё клеточных механизмов ишемического

поражениё мозга // Патологиё. - 2004. - Т. 1, № 1. - С. 22-30.

4 Ткачук О.В., Пшак В.П., Люньков О.М. Морфолопчний стан ос^в^в тдшлунково!' залози у вщдаленому перiодi iшемiчно-реперфузiйного пошкодженнё головного мозку контрольних шурiв та шурiв зi стрептозотоцинчндукованим цукровим дiабетом // Клiнiчна та експериментальна патолопё. - 2011. - Т Х, №1. - С. 152-155.

5 Matz K., Keresztes K., Tatschl C. et al. Disorders of Glucose Metabolism in Acute Stroke Patients // Diabetes Care.- 2006. -Vol.29, № 4. - P. 792-797.

6 Grant P.S., Ali K. A prospective, observational study of the management of hyperglycaemia in acute stroke. What is the

optimum level of blood glucose at which to intervene? // Brit. J. Diabetes & Vascular Dis. - 2010. - Vol. 10, №6. - Р. 287-291.

7 Idris I., Thomson G.A., Sharma J.C. Diabetes mellitus and stroke // Int. J. Clin. Pract. - 2006. - Vol.60, № 1. - Р. 48-56.

8 Kumari R., Willing L.B., Krady J.K. et al. Impaired wound healing after cerebral hypoxia-ischemia in the diabetic mouse // J. Cereb. Blood Flow. Metabol. - 2007. - Vol.27, №4. - P. 710-718.

9 Levi D., Polychronakos C. Expression profile of a clonal insulin-expressing epithelial cell in the thymus // Mol. Immunol. - 2013. -Vol.56, №4. - Р. 804-810.

10 Levi D., Polychronakos C. Self-antigen expression in thymic epithelial cells in Ifn-y or Tnf-a deficiency // Cytokine. - 2013. -Vol.62, №3. - Р. 433-438.

S.S. TKACHUK, O.V. TKACHUK, A.M. LIENKOV, V.F. MYSLICKIJ

Bukovina State Medical University

MODIFICATION OF THE FUNCTIONAL STATUS OF INSULIN-POSITIVE CELLS OF THE THYMUS BY ISHEMIA-REPERFUSION BRAIN INJURY IN RATS WITH STREPTOZOTOCIN-INDUCED DIABETES MELLITUS

Resume: The functional status of insulin-positive cells of the thymus in rats with experimental diabetes mellitus complicated by incomplete global ischemia-reperfusion of the brain has been studied. It is shown that in the thymus of non-diabetic rats ischemia-reperfusion injury of the brain reduces the density of insulin-positive macrophages, unidentified cell and concentration of the insulin in the latter and increases the concentration of the hormone in the thymic macrophages. Cerebrovascular complication of diabetes mellitus reduces the density of insulin-positive macrophages, the concentration of insulin in all types of the cells studied and increases the density of insulin-positive unidentified cells in the thymus.

Keywords: insulin-positive cells of the thymus, ischemia-reperfusion of the brain, diabetes mellitus.

УДК 616.83:546.881+546.76]-036.1-092.9

М.Ж. ТОЛЕПБЕРГЕНОВА, Ж.А. ИМАНБЕКОВА, Т.Т. МЕЛЬДЕХАНОВ, А.Н. НУРМУХАМБЕТОВ

КазНМУ, кафедра патофизиологии, Алматы, РК

КОРРЕКЦИЯ НАРУШЕНИЙ УСЛОВНОРЕФЛЕКТОРНОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ ГОЛОВНОГО МОЗГА

ПРИ ПОМОЩИ ЦЕОЛИТА

Введение цеолита местного происхождения (1 г/кг м.т.) опытным животным, вызывая энтеросорбцию металлов, значительно снижало содержание ванадия и хрома в тканях и ослабляло их нейротоксическое влияние. Оно улучшало процессы консолидации и последующего воспроизведения энграмм памяти условных рефлексов активного и пассивного избеганий и приводило к заметному уменьшению деструктивных изменений состояния ядер нейронов гиппокампа Ключевые слова: тяжелые металлы, энтеросорбент, цеолит, УРАИ, УРПИ.

Известно, что путем энтеросорбции можно получить (Чанканайского) происхождение качестве

защитный эффект при интоксикации тежелыми энтеросорбента. в

металлами *1,2+. В свези с этим, представлело интерес изучение использование цеолита местного