Способ прогнозирования развития преэклампсии в поздние сроки беременности
METHOD FOR FORECASTING DEVELOPMENT OF PRE-ECLAMPSIA IN LATE PREGNANCY

Изобретение относится к медицине, в частности к акушерству и гинекологии, и может найти применение при прогнозировании преэклампсии у пациенток из группы риска по развитию осложнений беременности в третьем триместре.
Преэклампсия до настоящего времени остается одним из грозных осложнений беременности. Примерно 2-8% беременных страдают от преэклампсии, являющейся второй ведущей причиной материнской смертности во всем мире [Alves Е., 2013; Amin S.V., 2014]. По результатам последнего анализа данных системы надзора центра по контролю за беременностью и профилактике заболеваний около 9% материнской смертности связано с преэклампсией и эклампсией [Anderson U.D., 2015].
Основное лечение преэклампсии - родоразрешение. В связи с этим она является основной причиной индуцированных преждевременных родов и, как следствие, низкого веса плода при рождении. Исследования в данной области показывают, что при преэклампсии 6% из общего числа родов преждевременные, а 19% отмеченных случаев - преждевременные роды с патологией плода [Jillian Т. Henderson, 2017]. Большинство случаев преэклампсии наблюдаются после 34 недели беременности, но заболеваемость и смертность выше при раннем начале заболевания [Baschat А.А., 2014; Bateman В.Т., 2012]. Концепция раннего (≥20 - ≤34 нед беременности), или позднего (≥34 нед беременности) начала отображает различия в патофизиологии преэклампсии [Steegers Е.А., 2010].
Ранняя преэклампсия характеризуется высокой частотой плацентарной недостаточности [Metcalfe А., 2013; Nanda S., 2013], аномальным кровотоком пупочной и маточных артерий [Liang S., 2012; Poon L.C., 2010], аномальным ангиогенным/антиангиогенным профилем [Blankley R., 2009; Takeuchi F., 2012], ограничением роста плода [Jelin А.С, 2010; Lisonkova S., 2013].
Поздняя преэклампсия, как полагают, является результатом несоответствия между поступлением питательных веществ со стороны матери и метаболических потребностей плода в конце беременности [Valensise Н., 2008]. При поздней преэклампсии обычно как плацента [van der Merwe J.L., 2010], так и плод [Eskild А., 2009; Espinoza J., 2014] имеют нормальный вес, допплер маточных и пупочной артерий в большинстве случаев находится в пределах нормы [Valensise Н., 2008]. Поздняя преэклампсия чаще встречается у пациенток с ожирением [Durst J.K., 2016; Ornaghi S., 2013].
С целью снижения осложнений здоровья матери и плода, связанных с преждевременными родами, важно чтобы врач имел в своем распоряжении маркеры, способные помочь принять решения о пролонгировании беременности при раннем начале развития преэклампсии.
Поиск биохимических маркеров доклинической диагностики преэклампсии по-прежнему остается одной из важных научно-практических задач современного акушерства.
Известен способ оценки тяжести преэклампсии с помощью изучения содержания тромбоцитов в венозной крови, когда по уровню тромбоцитопении судят о степени тяжести преэклампсии (Доклад рабочей группы по артериальной гипертензии при беременности (Национальный Институт здоровья США, Национальный институт сердца, легких и крови, 2000). Intermedinfo. Сибирское Медицинское Агентство. Том Акушерство и гинекология, №1, 2001, с. 5-16).
Недостатком данного способа является низкая его специфичность из-за наличия многочисленных механизмов тромбоцитопении (аутоимунный, связанный с ДВС, анемией, изменением ОЦК и другими), в том числе и не характерных для беременности, а также отсутствие четкой зависимости между степенью тяжести преэклампсии и выраженностью тромбоцитопении (Шифман Е.М. Преэклампсия, эклампсия, HELLP-синдром. - Петрозаводск: Изд-во "ИнтелТек", 2002, с. 142-158).
Известным иммунологическим методом определяют индекс цитотоксичности эндотелиальных антител и активность парных гликолитических ферментов в моноцитах периферической крови. Их нарастание во втором и третьем триместрах беременности в 2-3 раза по отношению к физиологическому происходит за 1-2 недели до клинических проявлений тяжелого гестоза (В.А. Мельников и др. Акт. вопросы акуш. и гинек. Т 1, 1, 2001-2002, с. 93).
В качестве другого метода прогнозируют тяжелые формы гестоза с помощью изучения состояния клеточных мембран, где у беременных, имеющих высокие скорости Na+ - Li+риск развития гестоза увеличивается в 2,5 раза (И.Ф. Фаткуллин и др. Акуш. и гинек. 4, 2007, с. 19-23).
Известен способ оценки тяжести преэклампсии у беременных (патент РФ №2250468, 20.04.2005.) путем исследования сыворотки крови иммуноферментным методом, отличающийся тем, что у беременных женщин определяют в сыворотке крови содержание циркулирующего иммунного комплекса основного белка миелина с иммуноглобулином класса G в сроки беременности после 20 недели и при его значениях менее 0,1 мкг/мл судят о неосложненной беременности, при уровне от 0,1 до 0,2 мкг/мл - о преэклампсии легкой степени, при уровне от 0,2 до 0,5 мкг/мл - о преэклампсии тяжелой степени.
Недостаток данного метода в том, что прогнозирование не предусмотрено, а оценивается только степень тяжести состояния гестоза при беременности на доклинической стадии и в достаточно поздние сроки - после 20 недель.
Известен способ доклинической диагностики преэклампсии (патент РФ №2408259, 10.01.2011) путем измерения параметров кровотока в различные сроки беременности, отличающийся тем, что регистрируют сфигмограмму, рассчитывают скорость распространения пульсовой волны в м/с (а) по формуле: где lотр - длина аорты от подключичной или сонной артерий до бифуркации аорты или до бедренной артерии, м; П - частота пульса в минуту; расстояние между двумя максимумами анакротической и дикротической волн по оси времени, мм; Т' - расстояние между максимумами анакротических волн по оси времени, мм, и, если при увеличении срока беременности скорость распространения пульсовой волны снижается - диагностируют физиологическое развитие беременности, а при отсутствии снижения или при нарастании скорости - прогнозируют развитие преэклампсии.
Однако эти методы трудоемки, дорогостоящи, не всегда могут быть использованы в широкой практике и используется только во второй половине беременности.
По патенту РФ №2481578 (10.05.2013) прогнозируют развитие тяжелой преэклампсии с помощью анализа крови, отличающийся тем, что у беременной во втором триместре рассчитывают лейкоцитарный индекс интоксикации и при его значении выше 1,6 прогнозируют развитие тяжелой преэклампсии.
Недостатком данного способа является позднее определение прогностического показателя только во втором триместре, повышение которого выше нормативных величин в этот период рассматривают как риск развития тяжелой преэклампсии. Окончательный диагноз: тяжелая преэклампсия выставляется только в третьем триместре. Кроме того, по данному способу прогнозируют развитие только тяжелой степени преэклампсии.
Известен способ диагностики тяжелой преэклампсии у беременных (патент РФ№2587781, 20.06.2016), включающий иммунологическое исследование периферической венозной крови в 22-37 недель беременности, отличающийся тем, что определяют относительное содержание CD62L+ клеток в популяции нейтрофилов и при его значении, равном или менее 57%, диагностируют тяжелую преэклампсию.
Таким образом, главным минусом всех вышеперечисленных методов является невозможность осуществить прогнозирование развития преэклампсии на сроках 12-13 недель беременности.
Прототипом заявляемого изобретения нами выбран Способ прогнозирования преэклампсии во втором триместре беременности путем исследования крови, отличающийся тем, что в сыворотке крови женщин в 7-8 недель беременности определяют активность кислых и нейтральных протеиназ и при значении активности кислых протеиназ выше 5,6 мкмоль/л и активности нейтральных протеиназ выше 3,9 мкмоль/л прогнозируют развитие преэклампсии во втором триместре беременности, (патент РФ №2 552 931, 10.06.2015).
Недостаток данного метода в том, что он дорогостоящий и прогнозирует только раннюю преэклампсию. Несмотря на то, что частота осложнений при развитии преэклампсии в этом периоде в 1,5-3,4 раза выше, поздняя преэклампсия встречается чаще в 75-80% случаев всех преэклампсий.
Указанные недостатки устраняются в заявляемом техническом решении.
Задача заявляемого изобретения: разработка более простого и достоверного способа прогноза развития преэклампсии у женщины репродуктивного возраста в третьем триместре беременности, что будет способствовать выбору адекватной акушерской тактики и снижению осложнений беременности и родов.
Технический результат, получаемый при использовании способа прогнозирования преэклампсии на 12-13 недели беременности: высокая точность, простота, доступность, возможность проведения своевременных профилактических мероприятий.
Данный технический результат достигается тем, что на 12 неделе беременности у женщин в группе риска производят забор 2 мл венозной крови, определяют концентрацию ADAM12 и RBP 4. При увеличении концентрации данных маркеров: ADAM12 более 2,33 нг/мл и RBP 4 более 87,90 мкг/мл прогнозируют развитие преэклампсии, которая развивается после 34 недель беременности.
Наши собственные исследования показали, что к прогностическим маркерам развития преэклампсии, можно отнести ADAM12, который является цинкзависимой мембраносвязанной протеазой, представитель семейства белков ADAM. ADAM-протеазы классифицируются как шеддазы, так как они отщепляют внеклеточный фрагмент мембранных белков.
ADAM12 участвует в расщеплении белка, связывающий инсулиноподобный фактор роста, влияющий на взаимодействие в межклеточных пространствах между зародышевым трофобластом и материнскими децидуальными клетками, при развитии плаценты и ее функционировании, и тем самым вносит свой вклад в механизмы регуляции формирования полноценной сосудистой системы хориона. Недавние исследования выявили ассоциацию между повышенным уровнем ADAM12 и преэклампсией [Matwejew Е., 2010; Myatt L., 2012].
Также секретируемые адипоцитами факторы, называемые адипокинами, могут играть важную роль в патогенезе преэклампсии из-за их роли в развитии резистентности к инсулину, метаболизме липидов, атеросклерозе и системном воспалительном ответе.
Одним из адипокинов является RBP4 - специфический белок, связывающий ретинол в крови, стабилизирующий и растворяющий гидрофобные молекулы ретиноидов в интра- и экстрацеллюлярном пространстве.
Ретинолсвязывающий протеин 4 (RBP4) наряду с РАРР-А вовлечен в развитие плаценты, а его альтерация и дисфункция могут играть роль в развитии преэклампсии
Жировая ткань - наибольший ресурс RBP4, его повышение характерно для воспалительного статуса, что может быть связано с регуляцией иммунного ответа, ассоциированного с патогенезом преэклампсии.
Нашими исследованиями показано, что чем больше концентрация данных маркеров, тем больше вероятность развития преэклампсии.
Подробное описание метода и примеры его клинического выполнения.
Определение биохимических маркеров необходимо в первую очередь женщинам, с первой беременностью, женщинам, планирующим беременность с преэклампсией в анамнезе, беременным женщинам из группы риска.
Заявляемый способ осуществляется следующим образом: у беременной женщины, на 12-13 неделе беременности осуществляют забор крови из локтевой вены в количестве 2 мл и проводят иммуноферментный анализ (ИФА).
Для изучения концентрации биохимических маркеров ADAM12 и RBP4 используют ИФА метод тест-системами Cloud-Clone Corp (США) и ИФА тест-системамы BioVendor (Чехия).
Уровень дизинтегрина и металлопротеиназы 12 (ADAM12) в сыворотке крови пациентов определяли ИФА методом тест-системами Cloud-Clone Corp (США). Промывочный и рабочий буфер, растворы стандартов, контролей, коньюгатов готовили согласно инструкции к набору. В соответствующие лунки планшета, покрытые антителами к ADAM12 человека, вносили по 100 мкл растворов стандартов, контролей или разведенных исследуемых образцов. Накрывали планшет пленкой и инкубировали при 37°C в течение 1 часа. Удаляли жидкость из каждой лунки и не промывая добавляли во все лунки по 100 мкл рабочего раствора коньюгата А. Накрывали планшет пленкой и инкубировали в течение 1 часа при температуре 37°C. Промывали планшет трижды промывочным буфером на промывочном устройстве для микропланшетов TECAN HYDROFLEX ELISA (Австрия). Во все лунки планшета вносили по 100 мкл рабочего раствора коньюгата. Накрывали планшет пленкой и инкубировали в течение 30 минут при температуре 37°C. Проводили промывку, как описано выше. В каждую лунку вносили по 90 мкл раствора тетраметилбензидина (ТМБ) и инкубировали в течение 15 минут при комнатной температуре, защищая от света. Останавливали цветную реакцию добавлением 50 мкл останавливающего раствора в каждую лунку. Результаты ИФА регистрировали и оценивали с помощью фотометра SUNRISE TECAN (Австрия) при длине волны 450 нм.
В компьютерное обеспечение прибора вводили численные значения концентраций ADAM12 в стандартных растворах и получали после измерения концентрацию ADAM12 в исследуемых сыворотках пациентов в нг/мл.
Уровень RBP 4 в сыворотке крови пациентов определяли методом ИФА тест-системами AssayPro (США). Промывочный и рабочий буфер, растворы стандартов, контролей, коньюгатов готовили согласно инструкции к набору.
Сыворотки пациентов предварительно разводили буфером для разведения в 500 раз. В соответствующие лунки планшета, покрытые поликлональными антителами к RBP4 человека, вносили по 50 мкл растворов стандартов, контролей или разведенных исследуемых образцов. Накрывали планшет пленкой и инкубировали при 25°C в течение 2 часов. Промывали планшет четыре раза промывочным буфером на промывочном устройстве для микропланшетов TECAN HYDROFLEX ELISA (Австрия). Во все лунки вносили по 50 мкл раствора биотинового коньюгата. Накрывали планшет пленкой и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. Промывали планшет четырехкратно промывочным буфером на промывочном устройстве для микропланшетов TECAN HYDROFLEX ELISA (Австрия). Во все лунки планшета вносили по 50 мкл стрептавидин-пероксидазного коньюгата. Накрывали планшет пленкой и инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре. Проводили промывку как описано выше. В каждую лунку вносили по 50 мкл раствора ТМБ и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 минут, защищая от света. Останавливали цветную реакцию добавлением 50 мкл останавливающего раствора в каждую лунку. Результаты ИФА регистрировали и оценивали с помощью фотометра SUNRISE TECAN (Австрия) при длине волны 450 нм. В компьютерное обеспечение прибора вводили численные значения концентраций RBP4 в стандартных растворах и получали после измерения концентрацию RBP4 в опытных образцах, умножали результаты на фактор разведения (500) и получали уровень RBP4 в исследуемых сыворотках пациентов в нг/мл, затем переводили в мкг/мл делением на 1000.
Наибольшей предсказательной ценностью для преэклампсии средней тяжести, развивающейся в третьем триместре беременности, является правило, предполагающее использование двух маркеров - RBP4 и ADAM12. При увеличении концентрации данных маркеров: ADAM12 более 2,33 нг/мл и RBP более 87,90 мкг/мл беременных женщин относят в группу высокого риска по развитию преэклампсии средней тяжести, развивающуюся в третьем триместре беременности. Прогноз преэклампсии при данном методе осуществляется с чувствительностью 87,5% и специфичностью 85%>при отношении шансов OR=39,667 [3,498; 49,83].
Пример 1.
Беременная К-ва, 34 года, рост - 162 см, вес - 90 кг. ИМТ=34. Цифры среднего артериального давления на сроке 12-13 недель - 86 мм. рт.ст. Из анамнеза: настоящая беременность 4-я. 1-ая беременность отягощена преэклампсией, 2 и 3-яя - невынашивание. В анамнезе - артериальная гипертензия. На учете в женской консультации с 10-11 недель беременности. Женскую консультацию посещала регулярно.
Исследование крови по заявляемому методу на 12 неделе беременности: RBP4 - 91,28 мкг/мл и ADAM12 - 2,45 нг/м, что согласно нашей методике позволяет прогнозировать развитие преэклампсии в третьем триместре беременности.
Течение настоящей беременности: ранний токсикоз; анемия, общая прибавка в весе 10 кг. Поступила в родильное отделение с диагнозом: Беременность 37-38 недель. Преэклампсия средней тяжести. ОАА, невынашивание, ожирение 2 ст. ОСА. Клинические проявления преэклампсии: АД 140/90 мм рт.ст., белок в моче 0,33 г/л. Родоразрешение через естественные родовые пути. Родоразрешилась мальчиком массой 3050 г, длиной 57 см.
Данный клинический пример убедительно показывает, что увеличение концентрации RBP4 и ADAM12 свидетельствует о возможности развития преэклампсии в третьем триместре с высокой точностью.
Пример 2.
Беременная Г-ва, 28 лет, повторнобеременная, рост - 159 см, вес - 72 кг. ИМТ - 30. Из анамнеза выявлено, что первая беременность срочные роды, преэклампсия; 2 беременность закончилась медицинским абортом. Настоящая беременность - 2-я. С 27 недели беременности железодефицитная анемия легкой степени, находилась на стационарном лечении по поводу угрозы прерывания беременности. Общая прибавка в весе 16 кг. В анамнезе - артериальная гипертензия. В 12 недель беременности при исследовании крови определены концентрации RBP4 - 87,92 мкг/мл и ADAM12 - 2,34 нг/м, что согласно нашей методике позволяет прогнозировать развитие преэклампсии в третьем тримесре беременности.
В сроке 34 недели беременности - симптомы преэклампсии: отеки, повышение АД. Поступила в роддом с диагнозом: Беременность 38 недель. Преэклампсия умеренной тяжести на фоне хронической артериальной гипертензии. Железодефицитная анемия легкой степени. Хронический гастрит. Клинические проявления преэклампсии при поступлении в родильное отделение: АД 140/90 мм рт.ст., отеки, протеинурия 0,33 г/л. В стационаре проведено обследование, начата магнезиальная, седативная, гипотензивная терапия. Родоразрешение операцией кесарево сечение. Родоразрешилась мальчиком 3500 грамм, длиной 56 см.
Данный клинический пример убедительно показывает, что увеличение концентрации RBP 4 и ADAM12 свидетельствует о возможности прогнозирования развития преэклампсии после 34 недель беременности высокой точностью.
Пример 3.
Беременная А-ва, 26 лет.Рост-158 см; вес - 46 кг, ИМТ=19. Первая беременность - замершая беременность, 2-настоящая. Наследственность не отягощена, встала на учет по поводу беременности в сроке 8 недель, регулярно посещала женскую консультацию.
В женской консультации беременная была полностью обследована. Патологии не выявлено. При исследовании крови в 12 недель: концентрация RBP4 - 87,90 мкг/мл и ADAM12 - 2,33 нг/мл, т.е. не повышена, что свидетельствует об отсутствии угрозы преэклампсии.
В родильное отделение поступила в сроке беременности 40 недель в родах.
Родоразрешение через естественные родовые пути, без осложнений. Родоразрешилась живым доношенным мальчиком массой 3770 г, длиной 53 см.
Данный клинический пример убедительно показывает, что отсутствие повышения концентрации RBP 4 и ADAM12 предполагает развитие беременности без преэклампсии.
Данные клинические случаи показывает эффективность прогнозирования преэклампсии с помощью данных маркеров.
В нашем исследовании на 1 этапе производился анализ клинико-анамнестических показателей и данных гинекологического осмотра, а также скрининговый забор крови у 645 беременных женщин в сроке беременности 12-13 недель. В венозной крови беременной методом ИФА исследовали уровни концентрации биохимических маркеров ADAM12 и RBP4.
Затем до родоразрешения осуществлялось проспективное наблюдение с целью установить факт наличия или отсутствия преэклампсии средней тяжести. У всех беременных преэклампсия развилась в третьем триместе беременности. После родов больные были разделены на группы согласно МКБ-10 и Федеральным клиническим рекомендациям «Гипертензивные расстройства во время беременности, в родах и послеродовом периоде. Преэклампсия. Эклампсия» (2016 год):
I (основная) группа - 25 женщин в сыворотке крови которых в сроки 12-13 недель уровни концентрации RBP4 были более 87,90 мкг/мл и ADAM12 более 2,33 нг/мл. У 23 из них наблюдалась преэклампсия средней тяжести (шифр МКБ-10 О 14.0), развившаяся после 34 недель беременности. Во II-ую (контрольную) группу методом случайной выборки включены 63 женщин в сыворотке крови которых в сроки 12-13 недель уровни концентрации RBP4 были менее 87,90 мкг/мл и ADAM12 менее 2,33 нг/мл. У всех этих женщин беременность протекала без преэклампсии.
Таким образом, у беременных с преэклампсией средней тяжести, развивающейся после 34 недель беременности, были выявлены статистически значимые различия уровней RBP4 и ADAM12; р=0,0003) в сравнении с беременными без преэклампсии. Наши исследования показали, что заявляемый способ, основанный на определении биохимических маркеров RBP4 и ADAM12, точен, прост в исполнении, не требует дорогостоящего оборудования.
Таким образом, нами разработана методика прогнозирования развития преэклампсии с целью проведения профилактических и своевременных лечебных мероприятий, направленных на снижение частоты преэклампсии.
Для этого необходимо осуществлять тщательный мониторинг беременной в женской консультации, своевременную госпитализацию и рациональное ведение беременной и своевременное родоразрешение при наличии неуправляемых факторов риска.
Заявляемый способ прогнозирования развития преэклампсии позволяет своевременно проводить превентивную терапию этой акушерской патологии, что в конечном итоге будет благоприятно влиять на перинатальные исходы и снижение заболеваемости новорожденных.
Способ апробирован на достаточном клиническом материале и может быть рекомендован к широкому применению в акушерской практике.