СПОСОБ ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКИХ БИОМОЛЕКУЛ, УСТРОЙСТВО ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ И ЕГО ВАРИАНТ
METHOD FOR ELECTROCHEMICAL DETECTION OF SPECIFIC BIOMOLECULES, DEVICE FOR IMPLEMENTATION THEREOF AND VERSION THEREOF

Изобретение относится к области медицины, биотехнологии, а именно к способам лабораторных исследований и анализов различных биологических жидкостей, проводимых с целью медицинской диагностики, в частности для диагностики инфаркта миокарда.
Известен способ количественного электрохимического анализа биомолекул (см. патент № 2161653 от 28.04.98). Данный способ предусматривает формирование биосенсора путем нанесения на поверхность потенциометрического электрода в ходе электрохимического синтеза из раствора мономера пленки электропроводящего полимера, осуществление контакта биосенсора с образцом исследуемой жидкости, составление электрохимической измерительной ячейки из погруженных в буферный раствор и связанных измерительным устройством биосенсора и электрода сравнения, регистрацию посредством измерительного устройства потенциала биосенсора относительно электрода сравнения в буферном растворе, регистрацию посредством измерительного устройства изменения потенциала биосенсора при скачкообразном изменении ионной силы буферного раствора при постоянном значении величины его pH. В способе допируют электропроводящий полимер на стадии электрохимического синтеза анионами, обладающими наибольшей способностью к ионному обмену с окружающим полимер раствором, иммобилизуют в/на пленку электропроводящего полимера авидин или стрептавидин, для иммобилизации на пленку электропроводящего полимера используют биотинилированные аффинные биорецепторы, используют дополнительные меченые биорецепторы, перед составлением электрохимической ячейки осуществляют контакт биосенсора с биотинилированными аффинными биорецепторами, перед измерением потенциала биосенсора в буферном растворе осуществляют контакт биосенсора с дополнительными мечеными биорецепторами, регистрацию изменения потенциала биосенсора осуществляют при изменении состава буферного раствора.
Существенным недостатком всех потенциометрических систем, основанных на описанных принципах, является их чувствительность к буферной емкости раствора, что заметно ограничивает их применение (в частности и для инфакрта миокарда, т. к. фермент в периферическую кровь выбрасывается в малых количествах, для определения которых необходимо обеспечить максимально возможную чувствительность при минимальной погрешности). Чувствительность потенциометрического метода невысока. Также к недостаткам стоит отнести сложность и невысокую технологичность процесса изготовления биосенсора.
Самым близким, принятым за прототип, является способ электрохимического определения специфических антител в сыворотке крови с помощью белков, меченных металлом (см. патент № 2249217 от 18.06.2003). Способ включает образование иммунокомплекса на поверхности электрода, причем для образования иммунокомплекса инкубируют в сыворотке крови антиген, иммобилизованный на поверхности толстопленочного графитового электрода, промывают электрод буферным раствором и инкубируют с раствором белка не иммунного происхождения, меченного металлом, с последующей повторной промывкой буферным раствором и помещают в трехэлектродную ячейку, в которой определяют специфические антитела по реакции окисления металла.
Недостатком данного способа является длительность и сложность процесса измерения, необходимость предварительной обработки пробы при строго обозначенных температурных условиях.
Известно устройство для электрохимических измерений (см. патент № 2097754 от 25.05.95). Устройство содержит измерительную камеру, включающую рабочий электрод, вспомогательный электрод и электрод сравнения. Устройство снабжено подающим и приемным барабанами, приводом и токосъемом, измерительная камера выполнена проточной щелевой и оснащена плавающими валиками, огибаемыми петлеобразно гибким рабочим электродом.
Недостатком данного устройства является то, что оно не предусматривает его использования для обнаружения биологически активных веществ. Также к недостаткам относятся его сравнительно большие габариты. Т. е. это стационарное устройство, не предусматривающее его транспортировку (мобильность). Устройство сложно в эксплуатации вследствие наличия подающих барабанов, а также в обслуживании и ремонте.
Задачей предлагаемого изобретения является создание способа и устройства, обеспечивающего точное электрохимическое определение биомолекул в биологической пробе, в частности для диагностики инфаркта миокарда на ранних стадиях, при микроинфарктах, при формах инфаркта с нетипичной локализацией боли либо ее отсутствием, при невозможности диагностики при помощи ЭКГ (отсутствие прибора, отсутствие специалиста, нетипичный инфаркт). Также необходимо создание устройства, простого в использовании и обслуживании.
Поставленная задача решается тем, что в способе электрохимического определения специфических биомолекул в биологической пробе с помощью меченых антител образуют иммунокомплекс на поверхности электрода, промывают электрод буферным раствором, добавляют меченые антитела. При этом образование иммунокомплекса на поверхности электрода, промывание электрода буферным раствором, добавление меченых антител осуществляют непосредственно в измерительной ячейке. Затем обеспечивают контакт биосенсора с образцом биологической пробы, повторно промывают ячейку, детектируют появление тока на рабочем электроде, осуществляют контроль температуры биологической пробы. Все действия начиная от образования иммунокомлекса и заканчивания измерением производят при одновременном перемешивании пробы. В качестве специфической биомолекулы можно использовать тропонин.
Устройство для электрохимического определения биомолекул содержит измерительную камеру, включающую рабочий электрод, вспомогательный электрод и электрод сравнения, а также температурный датчик. Как вариант может присутствовать еще один температурный датчик, расположенный в непосредственной близости от рабочего электрода. Для изготовления пленки биосенсора применяют ацетатцеллюлозу, или лавсан, или кальку, или нитратцеллюлозу, или желатин.
Предложенный способ и устройство позволяют быстро и достоверно осуществить электрохимическое определение биомолекул, в том числе и с целью определения инфаркта миокарда.
Предлагаемый способ реализуется в конструкции устройства, представленного на следующих чертежах.
Фиг.1 - разрез общего вида устройства.
Фиг.2 - вид А устройства.
Фиг.3 - вид Б устройства.
Устройство для электрохимического определения биомолекул имеет корпус 1, группу электродов, включающих в себя рабочий электрод 2, электрод сравнения 3 и вспомогательный электрод 4; датчик температуры 5. Рабочий электрод выполнен из благородных металлов, не поддающихся коррозии (платина, золото), либо из графита. Электрод сравнения выполнен, например, хлорсеребряным в виде полукольца. Вспомогательный электрод выполнен из титана. Рабочий электрод 2 соприкасается с пленкой 6, на которую иммобилизированны антитела. Антитела могут быть также иммобилизованы непосредственно на рабочий электрод 2 (в этом случае пленки 6 нет). Рабочий электрод 2, электрод сравнения 3 и пленка 6 образуют биосенсор. Между пленкой 6 и электродами 2 и 3 имеется зазор 7, который заполняется буферным раствором для осуществления контакта между пленкой и электродами. Во втором варианте устройства дополнительный термодатчик 9 устанавливается в непосредственной близости от рабочего электрода 2. Электроды и термодатчики находятся в рабочей зоне ячейки, в которую помещают исследуемую биологическую пробу.
Устройство для электрохимического определения биомолекул работает следующим образом.
Пленка (например, из нитратцеллюлозы) 6 с иммбилизированными антителами (например, тропонина) устанавливается на рабочий электрод 2, на который предварительно наносится буферный раствор (капается капля) для заполнения зазора 7. Биосенсор устанавливается в измерительную ячейку, заполненную буферным раствором. При постоянном перемешивании в рабочую зону ячейки вводят исследуемую биологическую пробу (например, кровь пациента). Перемешивание пробы производят для увеличения скорости химической реакции. Перемешивание можно осуществить, например, посредством установки в рабочую зону ячейки стержня, приводимого во вращение магнитом, установленного на оси электродвигателя (не показаны). В присутствии искомых специфических биомолекул в пробе на поверхности пленки образуются комплексы антиген-антитело. Затем измерительную ячейку промывают буферным раствором, удаляя не связавшиеся антигены, и вводят в рабочую зону ячейки меченые антитела (например, ферментом, пероксидазой хрена). На поверхности пленки происходит образование комплексов антитело-антиген-меченое антитело. На вспомогательный электрод 4 подается рабочее напряжение с генератора (не показан), величина которого достаточна для прохождения реакции. Напряжение наводится на рабочий электрод 2. После чего в рабочую зону вводят раствор, содержащий вещество, которое в присутствии меченых антител дает химическую реакцию (например, перекись водорода), приводящую к изменению потенциала и температуры на рабочем электроде 2 и порождающую появление тока. Потенциал электрода сравнения 3 используется как опорный, он не зависит от химической реакции, но изменяется в зависимости от температуры. Для обеспечения точности измерения температура раствора отслеживается с помощью температурного датчика 5, что дает возможность снизить погрешность измерений. Используемая химическая реакция осуществляется двустадийно (иммунная реакция). При достижении максимума значения снимаемого с рабочего электрода тока рассчитывается значение концентрации исследуемых биомолекул, например, по калибровочной кривой, затем генератор отключают. Также останавливают электродвигатель и прекращается перемешивание пробы. Сигнал регистрируется методом амперометрии. Измерение можно проводить с помощью микроконвертера, полученные данные выводятся на компьютер.
Таким образом можно, например, в организме пациента обнаружить специфическое для инфаркта миокарда вещество тропонин.
Во втором варианте исполнения устройства предусмотрена установка второго температурного датчика 9 в непосредственной близости к рабочему электроду 2. Это позволяет, с одной стороны, устранить погрешность измерений математической корректировкой потенциала опорного электрода с учетом зависимости потенциала от температуры, тем самым повысить точность определения концентрации, а с другой стороны, отследить исправность рабочего электрода. Также при наличии двух датчиков возможно измерение концентрации вещества двумя способами одновременно, как по нарастанию температуры, так и по изменению тока, что позволит контролировать исправность работы электродов, правильность снимаемых данных.
В зависимости от выбранной калибровочной кривой применяют скачкообразное, линейное или развернутое напряжение. При подаче линейной развертки на графике i=f(E) мы получим сначала возрастание тока, а затем его постепенное падение. При циклической развертке потенциала графически получим циклическую вольтамперограмму с двумя пиковыми значениями. При скачкообразном изменении потенциала графически мы получим резкое возрастание тока, а затем постепенное его падение.
Способ иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1
Формируют чувствительную мембрану 6 иммобилизацией антител (тропонина) на пленочном носителе (нитратцеллюлоза). На рабочую поверхность электрода 2 (платина) устанавливается чувствительная мембрана 6. Полученный биосенсор с иммобилизированными антителами помещается в измерительную ячейку, где находятся вспомогательный электрод - титановый, электрод сравнения - хлорсеребряный, температурный датчик - медьконстантановая термопара, стержень магнитной мешалки, фон - буферный раствор. При постоянном перемешивании в рабочую зону ячейки вводят исследуемую пробу (кровь пациента), на поверхности чувствительной мембраны образуются комплексы антиген-антитело. Затем промывают ячейку буферным раствором и добавляют антитела, меченные ферментом (пероксидаза хрена). Затем электрод промывают раствором, содержащим перекись водорода, и регистрируют сигнал методом амперометрии. Измерение проводят с помощью микроконвертера, полученные данные выводят на компьютер. При концентрации тропонина в пробе крови пациента выше 0,1 нг/мл диагностируют инфаркт миокарда.
Пример 2
Формируют чувствительную мембрану 6 иммобилизацией антител (натрийуретического гормона (pro-BNP)) на пленочном носителе (ацетатцеллюлоза). На рабочую поверхность электрода 2 (графит) устанавливается чувствительная мембрана 6. Полученный биосенсор с иммобилизированными антителами помещается в измерительную ячейку, где находятся вспомогательный электрод - титановый, электрод сравнения - хлорсеребряный, температурный датчик - медьконстантановая термопара, стержень магнитной мешалки, фон - буферный раствор. При постоянном перемешивании в рабочую зону ячейки вводят исследуемую пробу (кровь пациента), на поверхности чувствительной мембраны образуются комплексы антиген-антитело. Затем промывают ячейку буферным раствором и добавляют антитела, меченные ферментом (каталаза). Затем электрод промывают раствором, содержащим перекись водорода, и регистрируют сигнал при линейной развертке потенциала рабочего электрода методом вольтамперометрии. Измерение проводят с помощью микроконвертера, полученные данные выводят на жидкокристаллический дисплей. При концентрации натрийуретического гормона (pro-BNP) в пробе крови пациента выше 6 пмоль/л диагностируют инфаркт миокарда.
Пример 3
Формируют чувствительную мембрану 6 иммобилизацией антител (IgG) на пленочном носителе (нитратцеллюлоза). На рабочую поверхность электрода 2 (платина) устанавливается чувствительная мембрана 6. Полученный биосенсор с иммобилизированными антителами помещается в измерительную ячейку, где находятся вспомогательный электрод - титановый, электрод сравнения - хлорсеребряный, температурный датчик - медьконстантановая термопара, стержень магнитной мешалки, фон - буферный раствор. При постоянном перемешивании в рабочую зону ячейки вводят исследуемую пробу (кровь пациента), на поверхности чувствительной мембраны образуются комплексы антиген-антитело. Затем промывают ячейку буферным раствором и добавляют антитела, меченные ферментом (каталаза). Затем электрод промывают раствором, содержащим перекись водорода, и регистрируют сигнал методом циклической вольтамперометрии. Измерение проводят с помощью микроконвертера, полученные данные выводят на компьютер. Превышение референсных значений IgG ( выше 1,1 Ед/л) свидетельствует о предшествующей или текущей инфекции.
Таким образом, предлагаемое изобретение позволяет реализовать точное электрохимическое определение биомолекул в биологической пробе, в частности, для диагностики инфаркта миокарда на ранних стадиях. Также в изобретении реализуется возможность мобильного, упрощенного анализа, снижение его стоимости, повышение достоверности результатов диагностирования, расширение спектра определяемых объектов. Заявленное устройство просто в использовании и обслуживании.