Препарат бактериальный протеолитический для производства ферментированных мясных изделий
BACTERIAL PROTEOLYTIC PREPARATION FOR PRODUCTION OF FERMENTED MEAT PRODUCTS

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой новый бактериальный препарат на основе штаммов с протеолитической активностью для использования в производстве ферментированных мясных продуктов.
Известны бактериальные препараты для производства сырокопченых и сыровяленых мясных изделий БП-СК, АЦИД-СК-1, АЦИД-СК-2, содержащие ацидофильные палочки и микрококк.
Известен бактериальный препарат «LMP №7525» от Scheid-Rusal (6038 Gisikon, Switzerland), представляющий собой смесь, состоящую, по меньшей мере, из одного Pediococcus pentosaceus, одного Staphylococcu sxylosus и одной Lactobacillus carnis (RU2181017 С2, 10.04.2002). Однако он используются с целью получения интенсивного вкуса и запаха салями и не направлен на снижение содержания в продукте таких опасных для организма потребителя веществ, как биогенные амины, которые образуются в процессе производства мясных продуктов вследствие протекания автолитических процессов в мясе, несоблюдения санитарно-гигиенических условий производства, наличия декарбоксилазной активности естественной микрофлоры мясного сырья.
Наиболее близким по технической сущности и достигаемым результатам является препарат бактериальный для производства ферментированных мясных изделий и биотрансформации мясного сырья, представляющий собой смесь штаммов молочнокислых бактерий: Lactobacillus sakei ВКПМ В-8936 (104), Lactobacillus plantarum ВКПМ В-1616 (22/2), Staphylococcus xylosus ВКПМ В-8945 (45), Pediococcus pentosaceus ВКПМ В-8955 (55), выделенных из сырокопченых колбас, взятых в равном процентном соотношении. Это способствует преобразованию компонентов мясного сырья в соединения, обуславливающие свойства продукта, цветообразованию и повышению его пищевой и биологической ценности (RU 2367685 С1 от 20.09.2009), а также снижению уровня содержания биогенных аминов в готовом продукте. Тем не менее, данный препарат не обладает потенциалом к образованию биологически активных пептидов в ферментируемом мясном сырье и/или мясном продукте.
Задача изобретения - разработка нового бактериального препарата, способного преобразовывать основные компоненты мяса и мясного сырья в соединения, обуславливающие свойства продукта, повышающие его пищевую и биологическую ценность за счет интенсификации протеолиза мышечной ткани иобразования биологически активных пептидов, снижения уровня биогенных аминов, цветообразования и создания неблагоприятных условий для развития нежелательной микрофлоры (снижение рН сырья и синтез бактериоцинов).
Технический результат изобретения заключается вповышении пищевой ценности ферментированных мясных продуктов за счет формирования в них биологически активных компонентов, в том числе биологически активных пептидов, а также, в сокращении продолжительности их выработки и увеличения срока годности.
Штаммы Pediococcus acidilactici 38, Lactobacillus curvatus 1, Staphylococcus carnosus 108, выделены из сырокопченых колбас и идентифицированы в ФГБОУ ВО «МГУПП». Штаммы находятся на национальном патентном депонировании в Национальной Биоресурсной Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика под номерами ВКПМ В-8902 (Pediococcus acidilactici 38), ВКПМ В-8889 (Lactobacillus curvatus 1), ВКПМ В-8953 (Staphylococcus xylosus 108).
Препарат бактериальный представляет собой светло-кремовый однородный сухой порошок. Микроскопическая картина препарата представляет смесь палочек с закругленными концами, кокков, располагающихся гроздьями, и кокков, делящихся в плоскостях с образованием тетраэдров.
Пояснение изобретения сопровождается результатами протеомного исследования направленного на определение влияния штаммов рода Pediococcus и бактериальной композиции на основе штаммов Lactobacillus, Pediococcus и Staphylococcus на белковый профиль мышечной ткани крупного рогатого скота (КРС).
Изобретение поясняется следующими фигурами:
Фиг. 1 - 1ДЭ-электрофореграмма образцов мышечной ткани КРС, ферментированной бактериями рода Pediococcus.
Фиг. 2 - 1ДЭ-электрофореграмма образцов мышечной ткани КРС, ферментированной бактериальной композицией.
Культурально-морфологические особенности штамма Pediococcus acidilactici 38. Кокки диаметром 0,6-1 мкм, делящиеся в плоскости с образованием тетрад. Грамположительны, неподвижны, спор и капсул не образуют. В среде MRS через 24 ч штамм образует сильное помутнение и плотный белый трудноразбивающийся осадок. На твердых питательных средах образует точечные колонии круглой формы с ровными краями, выпуклые, беловато-кремовые, полупрозрачные, диаметром 1-2 мм. Поверхность колоний гладкая, блестящая. Растет на MRS-агаре + 2-4% NaCl. Наблюдается слабый рост на MRS-агаре + 2-8% NaCl. Устойчив к 0,8% раствору фенола, 20% желчи. Ферментирует маннит, ксилозу фруктозу, целлобиозу, мальтозу, лактозу, сахарозу, рамнозу, салицин. Оптимальная температура роста 37°C. Кислотность на 2-е сутки - 68°Т, на 7-е сутки - 144°Т. Проявляет аминоксидазную активность по отношению к гистамину. Образует бактериоцины, подавляющие санитарно-показательную микрофлору.
При проведении полимеразной цепной реакции (ПЦР) у штамма обнаружены протеолитические гены семейства Р15С/Р06С и PRTB10/PRTB20, отвечающие за протеолитическую активность. Протеолитическая активность по Ансону клеточного экстракта штамма составляет 42,17±1,478 ед/мг белка. Результаты протеомного исследования образцов мышечной ткани, ферментированных данным штаммом представлены на фиг. 1. Наиболее явное воздействие данный штамм оказывает на миоген, пируваткиназу, десмин, актина, фосфоглицератмутазы 2, карбоангидразы 3 и β-хемокинов.
Культурально-морфологические особенности штамма Lactobacillus curvatus 1. Имеет форму толстых коротких палочек со слегка закругленными концами, располагающихся по одной, две, короткими цепочками по 3-4 клетки. Палочки, изогнутые в форме бобов, грамположительны, неподвижны, спор и капсул не образуют. В MRS через 24 ч штамм образует сильное помутнение, исчезающее на 2-е сутки. На твердых питательных средах образует мелкие каплевидные колонии круглой формы с ровными краями, беловато-кремовые. Поверхность колоний гладкая, блестящая. Растет на MRS-агаре + 2-8% NaCl. Ферментирует эскулин, галактозу, фруктозу, целлобиозу, мальтозу, лактозу. Оптимальная температура роста 37°C. Кислотность через 3 суток - 80°Т, через 7 суток - 200°Т. Обладает аминоксидазной активностью по отношению к кадаверину и путресцину.
При проведении полимеразной цепной реакции (ПЦР) у штамма обнаружены протеолитические гены семейства prti2/IP6Xba, отвечающие за протеолитическую активность. Протеолитическая активность по Ансону клеточного экстракта штамма составляет 91,07±0,905 ед/мг белка.
Культурально-морфологические особенности штамма Staphylococcus carnosus 108. Имеет сферическую форму клеток диаметром 1,5 мкм, которые располагаются парами или гроздями. Бактерии грамположительны, неподвижны, спор и капсул не образуют. Синтезирует каталазу. В среде MRS через 24 ч штамм образует сильное помутнение и плотный белый трудноразбивающийся осадок. На твердых питательных средах образует колонии круглой формы с ровными краями, выпуклые, непрозрачные, белого цвета, диаметром 2 мм. Поверхность колоний гладкая. Оптимальная температура роста 37°C. Растет на MRS-агаре + 2-12% NaCl. Ферментирует галактозу, маннит, фруктозу, лактозу, рамнозу. Оптимальная температура роста 37°C. Кислотность через 2 суток - 82°Т, через 7 суток - 130°Т. Обладает аминоксидазной активностью по отношению к гистамину. кадаверину и путресцину. Является денитрифицирующим, образует бактериоцины по отношению к санитарно-показательной микрофлоре, способствует цветообразованию.
При проведении полимеразной цепной реакции (ПЦР) у штамма обнаружены протеолитические гены семейства prti2/IP6Xba, отвечающие за протеолитическую активность. Протеолитическая активность по Ансону клеточного экстракта штамма составляет 114,88±2,162 ед/мг белка.
Все входящие в препарат микроорганизмы подавляют развитие санитарно-показательной микрофлоры за счет синтеза молочной кислоты и бактериоцинов.
Перечисленные выше свойства составляющих штаммов препарата позволяют использовать его в производстве ферментированных продуктов в целях интенсификации технологического процесса и улучшения показателей качества продукции, а также при его пищевой и биологической ценностиза счет интенсификации протеолиза мышечной ткани и образования биологически активных пептидов.
Анализ протеома показал усиливающий эффект от совместного применения бактерий рода Pediococcus, Lactobacillus и Staphylococcus - наиболее полно происходила деструкция всех мышечных белков, что, в свою очередь, будет способствовать улучшению органолептических и функциональных свойств мясных продуктов, в т.ч. значительному гидролизу подверглись белки в диапазоне молекулярных масс 150-300 кДа. Белковые полосы в этом диапазоне практически отсутствуют во всех опытных образцах. Фрагменты в области α-актинина подвергаются постепенной деструкции на протяжении всего эксперимента. Аналогичная ситуация наблюдается и в областях молекулярных масс, соответствующих расположению пируваткиназы (58 кДа), десмину (53-55 кДа), α-актину, тропонинам Т быстрого и медленного типов (32-37 кДа), миоглобину (18 кДа) и гемоглобину (15 кДа). Данные представлены на фиг. 2.
Ниже представлены примеры выработки сухого бактериального препарата (пример 1) и использования его при выработке ферментированного мясного изделия (пример 2).
9
Пример 1. Для выработки сухого бактериального препарата проводят раздельное культивирование на питательной среде MRS штаммов Pediococcus acidilactici 38, Lactobacillus curvatus 1, Staphylococcus carnosus 108, в течение (14,0±2,0) ч при температуре 37°C, а затем - совместное культивирование штаммов 33% Pediococcus acidilactici 38, 33% Lactobacillus curvatus 1 и 33% Staphylococcus carnosus 108 в ферментере, смешивают бактериальные клетки с протекторной средой (обезжиренное молоко, сахароза, лимоннокислый натрий, поваренная соль, желатоза, никотиновая кислота, дистиллированная вода), замораживают при температуре минус (35±5)°C в течение (4,5±0,5) ч, высушивают в лиофильной установке и упаковывают. Готовый бактериальный препарат содержит не менее 10 КОЕ. Кислотность готового бакпрепарата не менее 70°Т.
Бактериальный препарат используют при производстве ферментированных мясных продуктов. Это позволяет получить высококачественные продукты, обладающие повышенной пищевой и биологической ценностью за счет интенсификации протеолиза мышечной ткани иобразования биологически активных пептидов, сократить сроки выработки ферментированных продуктов и увеличить сроки годности.
Пример 2. Для выработки колбасного изделия берут бактериальный препарат из расчета 50 г на 100 кг сырья. Перед использованием сухой препарат разводят в холодной подсоленной воде с 1% поваренной соли (50 г препарата в 0,25 л воды). Бактериальный препарат вносят в фарш в самом начале куттерования на нежирное сырье. Дальнейшую выработку продукта проводят в соответствии с принятой рецептурой.