СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ МИКРОВОДОРОСЛЕЙ
METHOD OF IDENTIFICATION OF MICROALGAE

Изобретение относится к области биологии и гидробиологии и предназначено для определения вида одноклеточных микроводорослей, присутствующих в воде.
Известен способ определения вида микроводоросли путем рассмотрения пробы воды под микроскопом (И.Г. Радченко, В.И. Капков, В.Д. Федоров. Практическое руководство по сбору и анализу проб морского фитопланктона: Учебно-методическое пособие для студентов биологических специальностей университетов. - М.: Мордвинцев, 2010. - 60 с.), в котором обнаруженные экземпляры сравниваются с эталонными изображениями в каталоге-определителе. При этом требуется специальная обработка пробы воды с целью окраски и обездвиживания клеток микроводорослей, кроме того, требуются специальные кюветы для уменьшения толщины слоя жидкости, в которой находятся исследуемые клетки микроводорослей. Персонал, выполняющий подготовку проб и распознавание вида микроводоросли, должен пройти соответствующее обучение. Применение специальных приспособлений и химических реагентов существенно снижает практичность и оперативность выполнения анализа. Известный способ практически не поддается автоматизации.
Наиболее близким по технической сущности к заявляемому изобретению является выбранный в качестве прототипа способ лазерной индуцированной флуоресценции (ЛИФ) (В.В. Фадеев, Д.К. Бунин, П.С. Венедиктов. Методы лазерного мониторинга фотосинтезирующих организмов. Квантовая электроника, 23, №11, 1996. С. 963-973), при котором возбуждение флуоресценции одноклеточных микроводорослей осуществляется с помощью лазерного облучения с последующим измерением спектра флуоресцентного излучения пигментов, содержащихся в клетках. Метод ЛИФ позволяет обнаруживать в водной среде присутствие пигментов, характерных для разных групп микроводорослей.
a
a
a
а
а
а
а
а
Так, например, Н.А. Гаевский в своей докторской диссертации (Гаевский Н.А. Критериии методология оценки структурно-функционального состояния альгоценоза на основе флуоресцентного анализа: Дис. д-ра биол. наук. - Красноярск: Кр ГУ, 2003. - 286 с. 2003) выделяет шесть таких групп: зеленые, эвгленовые, харовые, содержащие хлорофилл  и хлорофилл b; ксантофитовые и рафидофитовые (хлорофилл  и хлорофилл с); диатомовые, динофитовые, золотистые, бурые (хлорофилл , хлорофилл с, фукоксантин); криптофитовые (хлорофилл , хлорофилл с, фикобилины); красные (хлорофилл , хлорофилл d, фикобилины); сине-зеленые (хлорофилл а, фикобилины). Три группы выделяет Д.Г. Дундфорф с соавторами (Dumforf D.G., Deane J.A., TanS. etal. Phylogenetic assessment of the eucariotic light-harvesting antenna proteins with implications for plastide evolution // J. Mol. Evol. - 1999. - 48, N 1. - P. 59-68.): зеленые, эвгленовые (хлорофилл , хлорофилл b); диатомовые, динофитовые, золотистые, бурые (хлорофилл , хлорофилл с, фукоксантин); криптофитовые, сине-зеленые, красные (фикобилинпротеины). Статистически достоверные различия спектров возбуждения флуоресценции хлорофилл  и фикобилинов у водорослей разных отделов позволяют количественно оценивать их вклад в сигнал флуоресценции.
Недостаток известного способа (прототипа) в том, что он не позволяет отличить, например, зеленые водоросли от эвгленовых и харовых, диатомовые от динофитовых и золотистых и т.п. Кроме того, таким методом нельзя различить разные виды микроводорослей в пределах одного отдела.
Задачей заявляемого изобретения является устранение недостатков прототипа, а именно создание способа, позволяющего по измеренным спектрам ЛИФ определять вид микроводоросли.
Технический результат предлагаемого способа заключается в возможности идентификации присутствующих в воде микроводорослей разных отделов и разного вида, с улучшенными техническими характеристиками, высоким быстродействием и с возможностью автоматизации процесса измерения.
Сущность заявляемого технического решения заключается в том, что в отличие от прототипа, где измерение флуоресценции осуществляется при одной температуре, значение которой не контролируется и не учитывается в дальнейшем анализе, в предлагаемом способе измерение флуоресценции в пробе водной среды с находящимися в ней клетками микроводоросли осуществляется в термокамере, температура в которой изменяется в диапазоне от 5°С до 80°С. Измеренные температурные зависимости интенсивности флуоресценции пигментов клеток микроводоросли в указанном диапазоне температур сравниваются с соответствующими значениями для известных микроводорослей. В результате сравнения определяется вид водоросли, присутствующий в исследуемой пробе воды.
а
а
В работе (С.С. Вознесенский, А.Ю. Попик, Е.Л. Гамаюнов, Т.Ю. Орлова, Ж.В. Маркина. Влияние температуры среды на спектры лазерно-индуцированной флуоресценции микроводорослей. Вестник Дальневосточного отделения Российской академии наук, 3 (181), 2015. С. 30-35.) приведены результаты исследования температурной зависимости спектров ЛИФ хлорофилла  для культур микроводорослей, принадлежащих разным отделам, в которой авторами показано, что функция температурной зависимости интенсивности ЛИФ хлорофилла  может быть представлена выражением (1):
где  - интенсивность флуоресценции без температурного тушения;
а
- температурный коэффициент флуоресценции;
Т - температура среды.
Значения температурного коэффициента флуоресценции а для разных микроводорослей в разных температурных диапазонах (С.С. Вознесенский, А.Ю. Попик, Е.Л. Гамаюнов, Т.Ю. Орлова, Ж.В. Маркина. Влияние температуры среды на спектры лазерно-индуцированной флуоресценции микроводорослей. Вестник Дальневосточного отделения Российской академии наук, 3 (181), 2015. С. 30-35.) авторы статьи определили путем аппроксимации функцией (1) экспериментальных температурных зависимостей интенсивности ЛИФ. Вычисленные значения температурного коэффициента флуоресценции а для исследованных водорослей приведены в таблице 1.
а
Очевидно, что численные значения коэффициента  различаются для разных микроводорослей из разных отделов и, следовательно, могут служить характерными признаками для распознавания.
Заявителями замечено, что в диапазоне температур 5-30°С аппроксимирующая кривая мало отличается от прямой линии, и, следовательно, можно использовать аппроксимацию более простой - линейной функцией, уравнение которой имеет вид:
a
1
где  - параметр, определяющий наклон прямой, и b - параметр сдвига.
a
a
1
1
Параметр  является тангенсом угла наклона прямой и в рассматриваемой задаче характеризует быстроту (скорость) изменения интенсивности ЛИФ с ростом температуры. Для разных микроводорослей параметр  имеет разные значения, поэтому в дальнейшем используется как информативный признак для идентификации.
Параметр b зависит от конструкции измерительной установки и условий нормировки при построении графиков, поэтому в настоящей методике для идентификации не используется.
а
1
Значения коэффициента , вычисленные для исследованных в работе (С.С. Вознесенский, А.Ю. Попик, Е.Л. Гамаюнов, Т.Ю. Орлова, Ж.В. Маркина. Влияние температуры среды на спектры лазерно-индуцированной флуоресценции микроводорослей. Вестник Дальневосточного отделения Российской академии наук, 3 (181), 2015. С. 30-35.) микроводорослей, также приведены в таблице 1.
а
1
Можно заметить, что у красных и криптофитовых микроводорослей коэффициент  имеет одинаковое значение, что не позволяет однозначно идентифицировать присутствие в среде одной из них. В таком случае предлагается увеличить температуру нагрева пробы с микроводорослью вплоть до 80°С.
а
Было обнаружено, что при дальнейшем нагревании образцов с микроводорослями температурная зависимость интенсивности ЛИФ хлорофилла  перестает быть монотонной. На температурной кривой видны характерные интервалы, ограниченные точками локальных максимумов и минимумов, в которых существенно изменяется скорость спада или роста интенсивности ЛИФ.
Сущность изобретения поясняется чертежами, где на фиг. 1 изображена температурная зависимость интенсивности ЛИФ хлорофилла а микроводоросли Chroomonas salina; на фиг. 2 - температурная зависимость интенсивности ЛИФ Heterosigma akashiwo; на фиг. 3 показана температурная зависимость интенсивности ЛИФ Plagioselmis prolonga; на фиг. 4 изображена температурная зависимость интенсивности ЛИФ Tisochrysis lutea.
В качестве примеров рассмотрим экспериментальные графики температурной зависимости интенсивности ЛИФ для некоторых микроводорослей, полученных заявителями.
Пример 1
а
На фиг. 1 приведены результаты измерений интенсивности ЛИФ хлорофилла  микроводоросли Chroomonas salina, в диапазоне температур 20-80°С, где видны характерные участки изменения интенсивности ЛИФ от температуры:
1) В диапазоне 20-35°С наблюдается монотонное уменьшение интенсивности флуоресценции, аналогичное рассмотренному выше в диапазоне 5-30°С.
2) Диапазон 35-39°С характеризуется увеличением скорости снижения интенсивности флуоресценции хлорофилла а.
3) В диапазоне 39-49°С наблюдается увеличение интенсивности флуоресценции с достижением выраженного максимального значения.
4) В диапазоне 49-70°С происходит быстрый спад интенсивности флуоресценции;
5) В диапазоне 70-80°С происходит медленный спад интенсивности флуоресценции с монотонным асимптотическим приближением к минимальному уровню.
Уменьшение интенсивности флуоресценции наблюдаемое в диапазоне 20-35°С с ростом температуры, так называемое температурное тушение флуоресценции, так же как и в ранее рассмотренном диапазоне 5-30°С, объясняется повышением колебательной энергии молекул вещества, которое приводит к дезактивации возбужденных уровней в результате безызлучательной колебательной релаксации молекул.
а
а
а
1
В рассматриваемом случае уменьшение интенсивности флуоресценции вызвано воздействием температуры на молекулы хлорофилла , входящего в состав клеток микроводорослей. Уменьшение интенсивности ЛИФ хорошо аппроксимируется экспоненциальной функцией (1) с соответствующим температурным коэффициентом =-0,007, или линейной функцией с температурным коэффициентом =-0,006 (таблица 1).
Достижение выраженного минимума интенсивности флуоресценции в диапазоне температур 35-39°С связано с началом денатурации белковых структур в клетках микроводорослей и нарушением работы цепи транспорта электронов. В результате происходит уменьшение передачи на хлорофилл а энергии, поглощенной другими пигментами.
а
2
Уменьшение интенсивности ЛИФ в диапазоне температур 35-39°С может быть аппроксимировано линейной функцией (2) с температурным коэффициентом =-0,04.
а
а
а
3
Дальнейшее повышение температуры до 49°С приводит к гибели клеток, сопровождающейся интенсивным разрушением их оболочек и внутренних компонентов. В результате высвобождаются молекулы свободного хлорофилла интенсивность флуоресценции которого выше флуоресценции хлорофилла , связанного в хлоропластах клеток. Поэтому в данном диапазоне температур наблюдается интенсивный рост флуоресценции до выраженного максимального значения. Увеличение интенсивности ЛИФ в диапазоне температур 39-49°С хорошо аппроксимируется линейной функцией (2) с температурным коэффициентом =0,06.
а
a
4
Дальнейшее увеличение температуры приводит к спаду флуоресценции вследствие увеличения безызлучательной релаксации и разрушения молекул хлорофилла . Уменьшение интенсивности ЛИФ в диапазоне температур 49-70°С хорошо аппроксимируется линейной функцией (2) с температурным коэффициентом =- 0,04.
а
5
При дальнейшем росте температуры продолжается распад структур, в состав которых входят молекулы хлорофилла, наблюдается постепенное снижения интенсивности флуоресценции. В диапазоне температур 70-80°С наблюдаемая зависимость хорошо аппроксимируется линейной функцией (2) с температурным коэффициентом =-0,008. Совокупность значений характерных температур и температурных коэффициентов для микроводоросли Chroomonas salina сведены в таблицу 2.
Пример 2
На фиг. 2 приведены результаты измерений интенсивности ЛИФ микроводоросли Heterosigma akashiwo в диапазоне температур 20-80°С.
График температурной зависимости интенсивность ЛИФ для этой микроводоросли похож на рассмотренный в примере 1. При этом отличаются значения температурных диапазонов и температурных коэффициентов флуоресценции, численные значения которых приведены в таблице 2.
Пример 3
На фиг. 3 приведены результаты измерений интенсивности ЛИФ микроводоросли Plagioselmisprolonga в диапазоне температур 20-80°С.
Температурная зависимость интенсивность ЛИФ для этой микроводоросли мало отличается от рассмотренной в примерах 1 и 2. При этом отличаются значения температурных диапазонов и температурных коэффициентов флуоресценции, численные значения которых приведены в таблице 2.
Пример 4
На фиг. 4 приведены результаты измерений интенсивности ЛИФ микроводоросли Tisochrysis lutea в диапазоне температур 20-80°С.
Аналогично рассмотренным в примерах 1-3 на температурной кривой видны неярко выраженные максимумы интенсивности флуоресценции при температурах 34°С и 43°С.
Численные значения температурных диапазонов и коэффициентов флуоресценции микроводоросли Tisochrysis lutea приведены в таблице 2, а также приведены характерные диапазоны температур и соответствующие им значения температурных коэффициентов для микроводорослей Nannochloris maculata и Porphyridium purpureum.
Из приведенных примеров видно, что характер зависимости интенсивности флуоресценции от температуры и значения температуры, при которых наблюдаются минимальные и максимальные уровни интенсивности флуоресценции, отличаются для разных культур микроводорослей. Это позволяет использовать выявленные экспериментально температурные диапазоны и значения температурных коэффициентов флуоресценции как отличительные признаки для идентификации отдельных видов микроводорослей.
Заявляемый способ идентификации микроводорослей реализован следующим образом.
а
Исходная проба воды с идентифицируемой культурой микроводоросли помещается в термостатирующую камеру, в которой обеспечивается возбуждение флуоресценции пигментов клеток микроводоросли одним из известных методов, например методом лазерной индуцированной флуоресценции (ЛИФ). Измерение интенсивности флуоресценции одного или нескольких пигментов, например хлорофилла , выполняется при изменении температуры в диапазоне 5-80°С.
Измеренные температурные зависимости интенсивности флуоресценции пигментов клеток микроводоросли в указанном диапазоне температур сравниваются с образцовыми зависимостями для известных видов микроводорослей. Для упрощения процедуры сравнения и автоматизации процесса идентификации в измеренных температурных зависимостях интенсивности флуоресценции пигментов клеток микроводоросли выявляются характерные температурные диапазоны, границы которых определяются по максимальным и минимальным значениям интенсивности флуоресценции пигментов. В каждом характерном температурном диапазоне вычисляются температурные коэффициенты флуоресценции. Вычисленные значения температурных коэффициентов и характерные температурные диапазоны сравниваются с соответствующими значениями для известных микроводорослей. В результате сравнения определяется вид водоросли, присутствующий в исследуемой пробе воды.
Заявляемый способ позволяет идентифицировать присутствующие в воде одноклеточные микроводоросли без необходимости предварительной химической обработки пробы воды, сократить время и автоматизировать процесс идентификации микроводорослей.