ВАКЦИНА ПРОТИВ ДИЗЕНТЕРИИ СВИНЕЙ
SWINE DYSENTERY VACCINE

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к композиции, включающей бактерии Brachyspira hyodysenteriae, в особенности, в области иммунизации против дизентерии свиней.
Уровень техники
Дизентерия свиней (SD), вызываемая инфекцией толстого кишечника спирохетой Brachyspira hyodysenteriae, остается серьезной проблемой во всем мире. В основном, она поражает свиней в период откорма. Brachyspira hyodysenteriae представляет собой грамотрицательную, устойчивую к кислороду, анаэробную спирохету, которая колонизирует толстый кишечник свиней, вызывая дизентерию свиней (SD). Это состояние характеризуется тяжелой мукогеморрагической диареей, что в первую очередь влияет на животных в период доращивания и на заключительной стадии откорма, и о которой сообщают из всех основных свиноводческих стран (Hidalgo, A. et al., Journal of clinical microbiology (2010), 48(8):2859-2865).
SD представляет собой заболевание, широко распространенное по всему миру, хотя исследования, касающиеся эпидемиологии, немногочисленны, и сообщаемая в них частота заболеваний значительно варьирует. Так, указанная частота заболеваний для В. hyodysenteriae варьируют от 0% до приблизительно 40%. Разброс в частоте заболеваний может быть связан с применением различных диагностических методов или с различиями между странами в режимах содержания, ухода, кормления и т.п. Кроме того, в то время как во многих странах частота заболеваний может быть скрыта как результат применения противомикробных препаратов в качестве кормовых добавок, в других запрет антибиотиков в качестве стимуляторов роста может привести к увеличению частоты заболеваний SD (, A. et al., International Journal of Environmental Research and Public Health (2013), 10:1927-1947).
Свиньи-носители играют основную роль в эпидемиологии дизентерии свиней и считаются основным источником передачи возбудителя между стадами. В. hyodysenteriae выживает в окружающей среде в течение длительного времени, особенно, в жидких фекалиях, содержащихся в навозосборниках и отстойниках, где она может оставаться заразной в течение вплоть до 60 дней. Например, она может выжить в течение нескольких месяцев в фекалиях свиней при низких температурах. Эта спирохета может в природных условиях колонизировать мышей, нанду, кур и диких уток, а также с механическими переносчиками или фомитами, это увеличивает пути, по которым В. hyodysenteriae может распространяться в стадах и между ними (Hidalgo, A. et al., Journal of Clinical Microbiology (2010), 48(8):2859-2865).
Данное заболевание приводит к значительным прямым финансовым потерям, особенно в интенсивных свиноводческих хозяйствах, возникающим вследствие уменьшения эффективности конверсии корма, смертности, удлинения периода откорма, а также к непрямым потерям, таким как увеличение ветеринарных расходов, расходов на лечение и т.п. Искоренить заболевание с помощью лекарств достаточно сложно, так как многие выздоровевшие после лечения животные продолжают выделять организм в течение длительного времени, выступая в качестве носителей.
Лечение SD включает применение антибиотиков. Для этой цели в Европейском Союзе (EU) применяют плевромутилины (тиамулин и валнемулин). Тиамулин и валнемулин представляют собой полусинтетические производные природного дитерпенового антибиотика плевромутилина, демонстрирующие превосходную активность против анаэробных бактерии, и их применяют исключительно на животных, в основном, на свиньях. В терапевтические стратегии, направленные на SD свиней, также широко включают макролиды (тилозин и, в последнее время, тилвалозин) и тесно связанный с ними линкомицин (линкозамид). Однако в нескольких странах было подтверждено возникновение штаммов В. hyodysenteriae со сниженной чувствительностью к одному или нескольким из этих антибиотиков и наличие генетически различных мультиустойчивых изолятов. Этот факт затрудняет лечение и контроль SD и должен предупреждать ветеринарных врачей и свиноводов о необходимости такого стратегического подхода для выбора антибиотиков, который следует применять только по строгим показаниям, следуя соответствующим полевым и лабораторным диагностикам для того, чтобы гарантировать их долгосрочную эффективность при лечении SD (, A. et al., International Journal of Environmental Research and Public Health (2013), 10:1927-1947).
Высокая стоимость лекарственных препаратов, вместе с тем фактом, что во многих случаях невозможно полностью искоренить инфекцию, и возрастающая обеспокоенность присутствием остатков лекарственных препаратов как в мясных продуктах, так и в окружающей среде, служит основанием для развития эффективных иммунопрофилактических методов контроля SD (Diego, R. et al., Vaccine (1995), 13(7):663-667).
Были предприняты большие усилия для развития вакцин, контролирующих SD, с того момента как Joens и соавторы (Joens, L.A., et al., American Journal of Veterinary Research (1979), 40:1352-1354) сообщили, что свиньи, которые выздоровели после острой SD, были защищены от заболевания, если впоследствии вновь подвергались воздействию В. hyodysenteriae, следовательно, инфекция может вызвать защитный иммунный ответ (, A. et al., International Journal of Environmental Research and Public Health (2013), 10:1927-1947). Однако попытки разработать вакцины для контроля SD имели лишь ограниченный успех. Hudson (Hudson, M.J. et al., British Veterinary Journal (1974), 130:37-40; Hudson, M.J. et al., Research in Veterinary Science (1976), 21:366-367) разработал ослабленную живую вакцину, которая не смогла защитить от последующего контрольного заражения. Glock (Glock, R.D. et al., Proceedings of the 6th International Pig Veterinary Society Congress (1980), сообщил об определенной степени защиты при заражении после шести внутривенных инъекций, с шестидневными интервалами, инактивированной вакцины. Ослабленные или генетически модифицированные живые авирулентные вакцины могут показывать пониженную колонизацию и вызывают меньшую иммунную стимуляцию (, A. et al., International Journal of Environmental Research and Public Health (2013), 10:1927-1947).
Альтернативный подход заключается в создании субъединичных вакцин, которые могут быть доставлены с помощью экспрессии рекомбинантных белков В. hyodysenteriae на бактериальном векторе доставки. Были предприняты усилия для выявления белков В. hyodysenteriae для применения в субъединичных вакцинах, но вакцинация рекомбинантным 38 кДа флагеллярным белком не смогла предотвратить колонизацию экспериментально инфицированных свиней (Gabe et al., Infection and Immunity (1995), 63:142-148). С другой стороны, вакцинация рекомбинантным 29,7 кДа липопротеином внешней мембраны (Bhlp29.7) привела к частичной защите, с меньшим количеством животных с развившимся заболеванием, чем в контрольных группах. Авторы этого исследования пришли к выводу, что вакцинация также имела тенденцию задерживать появления фекальных выделений спирохет, но не обязательно останавливала их появление (La, Т. et al, Veterinary Microbiology (2004), 102:97-109). В исследовании, проведенном Holden et al., оценивали эффективность вакцинации с smpB (белок внешней мембраны В. hyodysenteriae). Однако, судя по ответу, появившемуся после вакцинации белком, была получена только умеренная защита от заболевания (Holden, J. et al., Veterinary Microbiology (2008), 128:354-363). В большинстве случаев протестированные рекомбинантные вакцины не смогли обеспечить достаточную защиту у свиней (, A. et al., International Journal of Environmental Research and Public Health (2013), 10:1927-1947).
th
Вакцины, состоящие из цельноклеточных бактеринов, вызывают ответы сывороточных антител к Brachyspira hyodysenteriae, пока в целом не в состоянии защитить свиней от заболевания. Применение бактеринов В. hyodysenteria, полученных из лизатов целых клеток, могут даже обострить заболевание при заражении (Waters, W.R. et al., Vaccine (2000), 18:711-719). Кроме того, бактериновые вакцины, как правило, представляют собой вакцины, специфичные к липополисахаридной серогруппе, которая затем требует применения аутогенных бактеринов. Помимо этого, бактерины В. hyodysenteriae относительно трудно и затратно производить в больших масштабах, из-за прихотливых требований к росту анаэробной спирохеты (La, Т. et al., Veterinary Microbiology (2004), 102:97-109). В некоторых странах, бактериновые вакцины для SD коммерчески доступны, и обеспечивают некоторую степень защиты. Однако, как указано выше, они имеют тенденцию представлять собой серогруппу, специфическую к липоолигосахариду (LOS), которая затем требует применения аутогенных или поливалентных препаратов (Hampson, D.J. et al., Diseases of Swine (2006), 10 Edition, Blackwell Publishing Professional, Ames, Iowa, U.S.A., pp. 687-688). Прочие отсылки к вакцинам против SD в этой области техники можно найти в следующей патентной литературе:
US 4748019: Авторы обнаружили, что эффективный режим вакцинации включает парентеральное введение свиньям примирующей дозы убитых вирулентных или патогенных Т. hyodysenteriae, эффективной для стимуляции иммунного ответа у свиней (штамм «Р18А», NCTC 11615) перед последующей дозой живого авирулентного или непатогенного штамма Т. hyodysenteriae (штамм «VSI», NCTC 11628) и примерно в то же время или после введения данного живого штамм перорально.
US 5750118: Изобретение относится к вакцине против SD, включающей эффективное количество инактивированного и содержащего адъювант антигена Т. hyodysenteriae (вирулентный или ослабленный штамм), для внутрикожного введения. Вакцинный антиген получают из штамма No. 27164 ATCC, который был инактивирован.
US 5281416: Изобретение относится к способу вакцинации свиньи против SD, который характеризуется парентеральным, предпочтительно, внутримышечным введением свинье живого штамма или обработанного кислородом нежизнеспособного штамма Т. hyodysenteriae. Типичные штаммы, которые могут быть применены, представляют собой референтные вирулентные штаммы АТСС 31287, АТСС 31212 и референтный авирулентный штамм АТСС 27164.
Однако эффективность данных вакцин оказалась вариабельной. Аутогенные препараты (также известные как «аутовакцины», которые можно определить как вакцины, полученные из культур организмов, изолированных из собственных тканей или секретов больных животных) применяли для дальнейшего улучшения данных вакцин. Этот подход, хотя и эффективный, требует высоких затрат и слишком много времени и предоставляет защиту только для единственного штамма В. hyodysenteriae. Кроме того, вакцинация происходит через некоторое время после того, как штамм, вызывающий заболевание, идентифицируют, что может занять несколько недель (например, при стандартных процедурах, процесс выделения из образцов с фермы, получение исходной культуры и аутовакцины может занять, по меньшей мере, 6 недель). Эта задержка во времени часто приводит к размножению бактерий в других животных из стада, или, в экстремальных условиях, даже на других свинофермах. Это также провоцирует серьезные экономические потери и само по себе представляет дорогостоящую процедуру для применения на регулярной основе. Таким образом, SD остается важным эндемичным инфекционным заболеванием во многих странах, где выращивают свиней. Существует огромная необходимость в эффективной и экономически доступной вакцине для SD.
Раскрытие изобретения
Дизентерия свиней (SD) представляет собой тяжелое мукогеморрагическое кишечное заболевание свиней, вызываемое Brachyspira hyodysenteriae, имеющее значительное воздействие на свиноводство и приводящее к значительным потерям из-за смертности и сниженной производительности. Принимая во внимание возникновение полирезистентных штаммов и обеспокоенность тем, что остатки лекарственных препаратов могут присутствовать в мясных продуктах или окружающей среде, крайне необходимы эффективные иммунопрофилактические способы контроля SD. Однако имеющиеся вакцины не обеспечивают удовлетворительной степени защиты против инфекции и, даже придавая определенную степень защиты, они не обеспечивают адекватного перекрестного иммунитета против штаммов различных серогрупп. Кроме того, изготовление и развертывание серийного производства аутовакцины создает много неудобств. Соответственно, существует необходимость в вакцине против SD, которая обеспечивает сильную защиту против штаммов различных серогрупп, а именно, в эффективной и универсальной вакцине против SD.
Авторы изобретения разработали вакцину против SD, которая, неожиданно, оказалась настолько же эффективной, как аутовакцина, несмотря на отсутствие в ее композиции штамма, который вызывает инфекцию. Этот эффект весьма удивителен, поскольку он противоречит теории аутовакцины. Данное изобретение обеспечивает вакцину с эффективной и общей защитой против Brachyspira hyodysenteriae, а именно «универсальную вакцину».
В первом аспекте, настоящее изобретение обеспечивает композицию, включающую бактерии, по меньшей мере, из двух генетически различных штаммов Brachyspira hyodysenteriae. Композиция изобретения может включать инактивированные штаммы, и генетическое разнообразие может быть придано путем выбора, по меньшей мере, двух генетически различных штаммов Brachyspira hyodysenteriae из различных клональных комплексов. В предпочтительном аспекте, генетически различные штаммы, по меньшей мере, были обнаружены в пропорции 1% по отношению к общему числу обнаруженных штаммов в представляющей интерес области. Представляющая интерес область может представлять собой любой регион, предпочтительно, Испанию.
Во втором аспекте, настоящее изобретение относится к композиции изобретения для ее применения в качестве вакцины, предпочтительно, вакцины против дизентерии свиней, вызываемой Brachyspira hyodysenteriae.
8
9
Кроме того, изобретение обеспечивает способ получения композиции изобретения, включающий отбор, по меньшей мере, двух генетически различных штаммов и смешивание их в равном количестве для достижения концентрации, равной, по меньшей мере, от 10 до 10 бактерий/мл.
Краткое описание чертежей
Фигура 1. Дендрограмма 44 MLVA-типов В. hyodysenteriae, обнаруженных в настоящем исследовании и кластеризованных с помощью UPGMA. Римскими цифрами от I до VI обозначены клональные комплексы, определенные на уровне однолокусного варианта. Масштабная линейка обозначает генетическое расстояние как абсолютное число различий в маркерных аллелях между генотипами. Показаны бутстреп-значение ≥40%.
Фигура 2. MLVA-типы (в кружках) и обнаруженные между ними взаимоотношения в соответствии с алгоритмом goeBURST. Сплошные линии показывают уровень однолокусного варианта, пунктирные линии показывают уровень двулокусного варианта, и точечные линии показывают уровень трехлокусного варианта. Группы на уровне однолокусного варианта указаны римскими цифрами от I до VI.
Фигура 3. Отбор штаммов универсальной вакцины примеров («Тип 3» (например, штамм с регистрационным номером CNCM I-4720), «Тип 14» (например, штамм с регистрационным номером CNCM I-4721) и «Тип 20» (например, штамм с регистрационным номером CNCM I-4722). Отбирали предковый тип штамма референтных клональных комплексов (II, V и I). Отобранные штаммы были обнаружены в пропорции, по меньшей мере, 1% по отношению к общему числу штаммов, обнаруженных в Испании.
Фигура 4. Кривые выживаемости для сравнения групп, вакцинированных аутовакциной (темно-серый), универсальной вакциной (черный) и невакцинированных (контроль, светло-серый), с помощью теста логарифмических рангов при α=0,05.
Фигура 5. Уничтожение В. hyodysenteriae во времени после заражения (процент положительных ректальных мазков в неделю) (черный, аутовакцина; темно-серый, универсальная вакцина; светло-серый, невакцинированные животные (контроль)).
Фигура 6. Инкубационный период (число дней между заражением и появлением диареи или бактерий в фекальных выделениях) в разных группах (черный, аутовакцина; темно-серый, универсальная вакцина; светло-серый, невакцинированные животные (контроль)).
Фигура 7. Процент свиней с диареей (а) и с кровавой диареей (b) после заражения (черный, аутовакцина; темно-серый, универсальная вакцина; светло-серый, невакцинированные животные (контроль)).
Фигура 8. Среднесуточный привес (ADG) на дни после заражения (черный, аутовакцина; темно-серый, универсальная вакцина; светло-серый, невакцинированные животные (контроль)).
Фигура 9. Ежедневный прирост веса (DWG) в первые 9 дней после заражения (от дня 0 до дня 9) (черный, аутовакцина; темно-серый, универсальная вакцина; светло-серый, невакцинированные животные (контроль)).
Фигура 10. Измерение реакции антител (оптическая плотность при 450 нм находится в прямой зависимости от количества полученных антител) гипериммунизированных кроликов со штаммами А, В и С против LPS штамма A (CNM 1-4720) на протяжении эксперимента (анализ действенности).
Фигура 11. Измерение реакции антител (оптическая плотность при 450 нм находится в прямой зависимости от количества полученных антител) гипериммунизированных кроликов со штаммами А, В и С против LPS штамма В (CNM 1-4721) на протяжении эксперимента (анализ действенности).
Фигура 12. Измерение реакции антител (оптическая плотность находится в прямой зависимости от количества полученных антител) гипериммунизированных кроликов со штаммами А, В и С против LPS штамма С (CNM 1-4722) на протяжении эксперимента (анализ действенности).
Осуществление изобретения
Композиция изобретения
Настоящее изобретение относится к композиции, включающей бактерии, по меньшей мере, из двух генетически различных штаммов Brachyspira hyodysenteriae. Термин «генетически различный» как применен в настоящем изобретении относится к определенному набору генетических, различимых с помощью измерений характеристик в генетическом составе вида. Для определения разнообразия микроорганизмов в определенных окружающих средах (экосистемах) или для выявления распространения конкретных штаммов между хозяевами, применяют методики генетического типирования, способные различить разные организмы одного и того же вида. Важно отметить, что когда сравнивают разнообразие одного и того же вида между различными экосистемами, то необходим надежный статистический подход, позволяющий дать объективную оценку. В этой связи, показатели разнообразия определяют математическими методами, которые основаны на частоте, с которой организмы определенного типа встречаются в популяции, или они могут быть распознаны с помощью данного инструмента типирования (Grundmann, Н. et al, Journal of Clinical Microbiology (2001), 39:4190-4192).
Относительно высокое разнообразие среди изолятов В. hyodysenteriae было описано классическим образом. Возможность понимать эпидемиологию SD и прогресс в ее контроле будет зависеть от наличия надежных способов типирования штаммов для характеристики изолятов. На основании анализа частично очищенных липополисахаридов (LPS), Baum & Joens идентифицировали четыре различных серотипа (Baum, D.H. et al., Infection and immunity (1979), 25:792-796), хотя дальнейшие исследования, в конечном счете, дифференцировали в общей сложности 11 серогрупп, которые включают несколько серотипов (Hampson, D.J. et al., Epidemiology and Infection (1989), 102:75-84; Hampson, D.J. et al., Epidemiology and Infection (1990), 105:79-85; Hampson, D.J. et al, Swine dysentery. In: Intestinal Spirochaetes in Domestic Animals and Humans, pp. 175-209, edited by D.J. Hampson & Т.B. Stanton. Wallingford: CAB International, 1997).
Вскоре после того были продемонстрированы различия в географическом распределении В. hyodysenteriae. Референтные штаммы из США были классифицированы в рамках серотипов 1 и 2, в то время как более высокая изменчивость в отношении классификации серотипов была описана для изолятов из Европы и Австралии (Harris et al., Swine Dysentery. In: Straw, B.E., D'Allaire, S.D., Mengeling, W.D. & Taylor, D.J. (Eds.) Disease of Swine. Iowa State University Press (1999), Ames Iowa USA, pp. 579-600). Однако практически нет никакой свежей информации относительно распределения серотипа изолятов В. hyodysenteriae. Вследствие перекрестных реакций, методики, необходимые для определения серотипа, требуют много времени, они трудоемки и дают неоднозначные результаты на очень большом числе изолятов. По этой причине, данные методики были заменены рядом молекулярных способов.
Для различения полевых изолятов В. hyodysenteriae и обеспечения лучшего понимания молекулярной эпидемиологии возбудителя были разработаны различные инструменты типирования. Среди них, полезный инструмент для типирования штаммов патогенных микроорганизмы, который был введен в употребление в течение последних нескольких лет, представляет собой мультилокусный анализ числа вариабельных тандемных повторов или MLVA. Он был разработан в качестве важного эпидемиологического инструмента для типирования штаммов патогенных микроорганизмов. MLVA основан на ПЦР-амплификации ряда хорошо отобранных и охарактеризованных локусов, которые содержат короткие повторяющиеся последовательности (множественные локусы мини-сателлитов, называемые вариабельные числа тандемных повторов (VNTR)). Данный тип мини-сателлитов состоит из уникальных прямых повторов ДНК голова к хвосту, которые могут быть обнаружены во всех бактериальных геномах и могут быть применены для определения конкретных изолятов бактериальных видов. Кроме того, VNTR применяют для выведения структуры бактериальной популяции и филогении разнообразных бактериальных видов. В каждом локусе с повторяющимися последовательностями, число повторяющихся копий может варьировать между различными штаммами. Измерением размера каждого амплифицированного с помощью ПЦР локуса, может быть выведено число повторяющихся звеньев. Hidalgo и соавторы разработал и протестировали способ мультилокусного анализа числа вариабельных тандемных повторов (MLVA), который может быть применен в основных ветеринарных диагностических микробиологических лабораториях, оснащенных оборудованием для проведения ПЦР, или в более современных лабораториях с доступом к капиллярному электрофорезу. Основанная на восьми локусах, и выполненная на изолятах из различных фермерских хозяйств в различных странах, а также на типовых и референтные штаммах, разработанная методика MLVA была высокоселективной (индекс дискриминации Хантера и Гастона, 0,938 [95% доверительный интервал, от 0,9175 до 0,9584]) при сохранении высокого филогенетического значения. При применении методики, было показано, что вид характеризуется разнообразием (44 MLVA-типа из 172 изолятов и штаммов), хотя изоляты оставались стабильными в стадах в течение долгого времени. Структура популяции, вероятно, была клональной. Обнаружение MLVA типа 3 В. hyodysenteriae в свинарниках в трех Европейских странах, а также других, родственных, штаммов в различных странах, позволяет предположить, что весьма вероятно распространение возбудителя посредством свиней-носителей. MLVA позволяет преодолеть недостатки, связанные с предыдущими методиками типирования, применяемыми для В. hyodysenteriae, и представляет собой высокоэффективный способ для эпидемиологических исследований и исследований структуры популяций для данной важной патогенной спирохеты (Hidalgo, A. et al., Journal of Clinical Microbiology (2010), 48(8):2859-2865).
Авторы изобретения и другие участники проекта применили этот способ на международной коллекции изолятов В. hyodysenteriae, включая 115 испанских полевых изолятов, а также референтные штаммы и изоляты из Австралии, Канады, США, Великобритании и Нидерландов.
MLVA-анализ выявил, что испанские полевые изоляты В. hyodysenteriae гетерогенны и что популяция имеет клональную структуру. Среди испанских изолятов идентифицировали всего 15 MLVA-типов. Кроме того, изоляты с одним и тем же типом по MLVA идентифицировали в Испании, Великобритании и Нидерландах. С другой стороны, было сделано заключение, что изоляты из Австралии или США не имеют общих черт по MLVA с испанскими изолятами.
Путем группирования MLVA-типов на уровне однолокусного варианта, было установлено общее число шести клональных комплексов (от I до VI) (фигура 2).
Композиция изобретения может включать два, или три, или четыре, или пять, или несколько генетически различных штаммов. Предпочтительно, генетическое разнообразие штаммов композиции изобретения присваивается путем отбора, по меньшей мере, двух генетически различных штаммов Brachyspira hyodysenteriae из различных клональных комплексов. Термин «клональный комплекс», как применен в настоящем изобретении, относится к нескольким группам, установленным путем группирования MLVA-типов на уровне однолокусного варианта, как описано выше. Более предпочтительно, чтобы, по меньшей мере, один штамм принадлежал к клональному комплексу II, и/или, по меньшей мере, один штамм принадлежал к клональному комплексу V, и/или, по меньшей мере, один штамм принадлежал к клональному комплексу I.
В композиции настоящего изобретения, генетически различные штаммы предпочтительно принадлежат к предковому типу клонального комплекса.
Общего предка в рамках каждого клонального комплекса предсказывали с помощью алгоритма goeBUST, доступного на http://goeburst.phyloviz.net/#Software, глобальной реализации алгоритма eBURST. Для получения дополнительной информации, смотри публикации Feil et al., 2004 и Francisco et al., 2009, в свободном доступе на http://goeburst.phyloviz.net/#Publications.
Композиция настоящего изобретения может дополнительно включать штамм, который принадлежит к третьему клональному комплексу. Предпочтительно, третий клональный комплекс выбирают из группы, состоящей из клонального комплекса I, клонального комплекса II и клонального комплекса V.
Соответственно, композиция настоящего изобретения включает, по меньшей мере, два, предпочтительно, три, генетически различных штамма Brachyspira hyodysenteriae, в которой, по меньшей мере, один из штаммов принадлежит к клональному комплексу I, и/или, по меньшей мере, один из штаммов принадлежит к клональному комплексу II и/или, по меньшей мере, один из штаммов принадлежит к клональному комплексу V. Предпочтительно, композиция изобретения включает три генетически различных штамма Brachyspira hyodysenteriae, в которой один из штаммов принадлежит к клональному комплексу I, один из штаммов принадлежит к клональному комплексу II и один из штаммов принадлежит к клональному комплексу V.
Предпочтительно, в композиции настоящего изобретения, по меньшей мере, один из штаммов представляет собой штамм, депонированный в национальной коллекции культур микроорганизмов (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM)), в институте Пастера, 14 марта 2013, с регистрационным номером CNCM I-4720, по меньшей мере, один из штаммов представляет собой штамм, депонированный на аналогичную дату в CNCM с регистрационным номером CNCM I-4721 и/или, по меньшей мере, один из штаммов представляет собой штамм, депонированный на аналогичную дату в CNCM с регистрационным номером CNCM I-4722.
Соответственно, настоящее изобретение также обеспечивает штаммы, депонированные в национальной коллекции культур микроорганизмов (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM)), в институте Пастера, 14 марта 2013, с регистрационными номерами CNCM I-4720, CNCM I-4721 и CNCM I-4722.
Штамм с регистрационным номером CNCM I-4720 принадлежит к клональному комплексу II. Штамм с регистрационным номером CNCM I-4721 принадлежит к клональному комплексу V. Штамм с регистрационным номером CNCM I-4722 принадлежит к клональному комплексу I.
В композиции настоящего изобретения генетически различные штаммы предпочтительно эпидемиологически релевантны. В контексте настоящего изобретения, «эпидемиологически релевантный» означает, что штаммы, по меньшей мере, были обнаружены в пропорции 1-100%, предпочтительно, по меньшей мере, 1%, по меньшей мере, 2%, по меньшей мере, 3%, по меньшей мере, 4%, по меньшей мере, 5%, по меньшей мере, 10%, по меньшей мере, 15%, по меньшей мере, 20%, по меньшей мере, 25%, по меньшей мере, 30%, по меньшей мере, 50%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 90% или 100% по отношению к общему количеству обнаруженных штаммов в представляющей интерес области. Предпочтительно, 1% генетически различных штаммы, по меньшей мере, был обнаружен по отношению к общему количеству обнаруженных штаммов в представляющей интерес области. В контексте настоящего изобретения, термин «обнаруженный» означает, что указанные штаммы идентифицировали в представляющей интерес области. Обнаружение бактерий Brachyspira hyodysenteriae может быть проведено, например, в ректальных мазках, образцах слизистой толстой кишки и/или фекалий свиней. Например, образцы можно культивировать и ДНК может быть экстрагирована, следуя ранее описанным способам (смотри, например, Hidalgo, A. et al., Journal of Clinical Microbiology (2010), 48(8):2859-2865). Наличие В. hyodysenteriae может быть обнаружено способами ПЦР. Наличие В. hyodysenteriae также может быть подтверждено штрихованием бактериологических мазков, взятых из фекалий или со стенок толстого кишечника свиней, на селективных агаровых чашках. После инкубации чашек в анаэробном окружении, может быть зарегистрировано наличие медленного скудного расходящегося роста спирохет на чашке и гемолиз вокруг зон роста (La, Т. et al., Veterinary Microbiology (2004), 102:97-109). Альтернативно, определения B. hyodysenteriae может быть выполнено путем суспендирования образцов в PBS и детектирования присутствия бактерий с помощью косвенного иммунофлюоресцентного теста (IFT) (смотри, например, Diego, R. et al., Vaccine (1995), 13(7):663-667). Другие способы обнаружения присутствия В. hyodysenteriae, известные в этой области техники, могут быть применены.
Термин «представляющая интерес область», как применен в настоящем изобретении, относится к демаркированной области Земли, т.е. к географическому региону или к географической области, в которой оценивают присутствие В. hyodysenteriae. Не существует конкретного ограничения в отношении представляющей интерес географической области. Она может варьировать от нескольких тысяч километров на континентальном уровне до нескольких километров на местном уровне. Например, представляющая интерес область может быть частью страны, целой страной или более чем одной страной. Предпочтительно, представляющая интерес область представляет собой страну или группу стран. Например, представляющая интерес область может представлять собой Европу. Предпочтительно, представляющая интерес область может представлять собой Испанию, более предпочтительно, испанскую территорию Пиренейского полуострова, в особенности, Кастилию и Леон, Андалусию и/или Эстремадуру. Другие предпочтительные представляющие интерес области - это Италия, Нидерланды, Великобритания, Австралии, Канады и/или Соединенные Штаты.
Кроме того, бактерии, включающие композицию настоящего изобретения, могут быть инактивированы, т.е. они могут быть инактивированы химическим или физическим способом. Инактивация включает уничтожение бактерий с помощью химических соединений, нагревания и/или облучения. Бактерии композиции могут быть инактивированы с помощью любой процедуры инактивации, известной в этой области техники. Предпочтительно, бактерии композиции изобретения инактивируют, обрабатывая бактерии формальдегидом. Наиболее предпочтительно, формальдегид вводят с помощью инъекции в бактериальную культуру в концентрации 0,5% и затем инкубируют в течение ночи (приблиз. 18 часов) при 37°С при мягком перемешивании.
7
12
7
8
8
9
10
11
12
8
10
8
9
8
В соответствии с настоящим изобретением, бактерии композиции, предпочтительно инактивированные, могут присутствовать в концентрации, равной, по меньшей мере, от 10 до 10 бактерий/мл, предпочтительно, в концентрации, равной, по меньшей мере, 10, или 10, или 5⋅10, или 10, или 10, или 10 или 10 бактерий/мл, предпочтительно в концентрации, равной от 10 до 10 бактерий/мл, более предпочтительно, в концентрации, равной от 10 до 10 бактерий/мл, еще более предпочтительно, в концентрации, равной 5⋅10 бактерий/мл.
Если композиция включает бактерии, принадлежащие к двум штаммам, то они могут присутствовать в композиции в соотношении 1:(0,5-2). Если композиция включает бактерии, принадлежащие к трем штаммам, то они могут присутствовать в композиции в соотношении 1:(0,5-2):(0,5-2). Если композиция включает бактерии, принадлежащие к четырем штаммам, то они могут присутствовать в композиции в соотношении 1:(0,5-2):(0,5-2):(0,5-2). Если композиция включает бактерии, принадлежащие к пяти штаммам, то они могут присутствовать в композиции в соотношении 1:(0,5-2):(0,5-2):(0,5-2):(0,5-2). Предпочтительно, композиция включает бактерии в равной смеси отобранных штаммов, а именно в соотношении 1:1, 1:1:1, 1:1:1:1, 1:1:1:1:1, в зависимости от того, как много различных штаммов включает композиция. В данном контексте, «соотношение» означает количество бактерий/мл.
Концентрация бактерии в композиции может быть вычислена с применением любого способа, известного в этой области техники. Например, для оценки количество бактерий, присутствующих в композиции изобретения, может быть применена счетная камера с сеткой Нейбауэра.
8
9
Композиция настоящего изобретения предпочтительно включает общее количество от 10 до 10 инактивированных бактерий/мл в равной смеси отобранных штаммов, в которой бактерии принадлежат к трем генетически различающимся штаммам Brachyspira hyodysenteriae, в которой один из штаммов принадлежит к клональному комплексу I, один из штаммов принадлежит к клональному комплексу II и один из штаммов принадлежит к клональному комплексу V, и в которой предпочтительно генетически различные штаммы представляют собой штаммы эпидемиологически релевантные в представляющей интерес области, т.е. присутствуют в Испании, по меньшей мере, в пропорции, равной 1% по отношению к общему количеству обнаруженных штаммов.
Предпочтительно, генетически различные штаммы, эпидемиологически релевантны в представляющей интерес области, каждый присутствует в пропорции, по меньшей мере, от 9% по отношению к общему количеству обнаруженных штаммов. Предпочтительно, один из штаммов присутствует в пропорции, по меньшей мере, 13% по отношению к общему количеству обнаруженных штаммов. Более предпочтительно два их этих штаммов присутствуют в пропорции, по меньшей мере, 13% по отношению к общему количеству обнаруженных штаммов. Наиболее предпочтительно, один из штаммов присутствует в пропорции, по меньшей мере, 24% по отношению к общему количеству обнаруженных штаммов.
Композиция настоящего изобретения может дополнительно включать адъювант. Адъювант представляет собой компонент, который усиливает иммунный ответ на антиген и/или модулирует его в сторону желаемых иммунных ответов. Это может быть неорганическое или органическое химическое соединение, макромолекула или целые клетки определенных убитых бактерий, которые усиливают иммунный ответ на данный антиген. В контексте настоящего изобретения, адъювант, который может присутствовать в композиции изобретения может представлять собой любой подходящий адъювант, который, например, усиливает, ускоряет и продлевает конкретный иммунный ответ, как известно на настоящий момент в данной области техники.
Адъюванты могут включать, например:
- Минеральные соли, например, гели гидроксида алюминия и фосфаты алюминия или кальция.
- Композиции на основе масляных эмульсий и поверхностно-активных веществ, например, MF59 (микрофлюидизированный детергент стабилизированная эмульсия масло-в-воде), QS21 (очищенный сапонин), AS02 [SBAS2] (эмульсия масло-в-воде + MPL + QS-21), Montanide™ ISA-51, ISA-720, IMS (стабилизированная эмульсия масло-в-воде).
- Конкретные адъюванты, например, виросомы (однослойные липосомальные носители в которые заключен гемагглютинин гриппа), AS04 ([SBAS4] соль Al с MPL), ISCOMS (структурированный комплекс сапонинов и липидов), полилактид-ко-гликолид (PLG).
- Микробные производные (природные и синтетические), например, монофосфориллипид A (MPL), Detox (MPL + скелет клеточной стенки М. Phlei), AGP [RC-529] (синтетический ацилированный моносахарид), DC_Chol (липоидные иммуностимуляторы, способные к самоорганизации в липосомы), ОМ-174 (производное липида А), CpG-мотивы (синтетические олигонуклеотиды, содержащие иммуностимулирующие мотивы CpG), модифицированные LT и СТ (генетически модифицированные бактериальное токсины для обеспечения нетоксических эффектов адъювантов).
- Эндогенные иммуномодуляторы человека, например, hGM-CSF или hIL-12 (цитокины, которые могут быть введены или в виде белка, или кодирующей плазмиды), Immudaptin (C3d тандемный повтор)
- Инертные частицы, такие как частицы золота, для желаемой реакции на антигены вакцины.
Наиболее предпочтительные адъюванты представляют собой соли алюминия (гидроксид алюминия или фосфат алюминия) и минеральные масла. При инокуляции они приводят к образованию небольшой гранулемы, что позволяет задерживать освобождение антигена (пролонгированная антигенная стимуляция) и привлекать антиген-презентирующие клетки. Это существенно повышает иммунный ответ. Например, адъювант может представлять собой HAVLOGEN™ или Montanide™. Наиболее предпочтительно, адъювант может представлять собой коммерческий масляный адъювант, такой как Montanide™ IMS 251 С VG (SEPPIC).
Адъювант предпочтительно присутствует в конечной композиции в концентрации в конечном составе от 5 до 50% объем/объем по отношению к конечному объему инъекции, предпочтительно, 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50% или более (объем/объем, т.е. объем по отношению к конечному объему инъекции). Более предпочтительно, концентрация адъюванта в конечной композиции равна 20% объем/объем (т.е. объем по отношению к конечному объему инъекции).
Композиция изобретения может дополнительно включать другие компоненты. Например, композиция может включать антисептические и/или противогрибковые средства. Например, композиция может дополнительно включать тимеросал («Sigma»), также известный как тиомерсал. Предпочтительно, тимеросал включают в количестве от 0,005 до 1 г на 100 мл, предпочтительно, в количестве 0,5, или 0,3 или 0,1, или 0,05 или 0,03 или 0,02 или 0,01 или 0,005 г на 100 мл. Более предпочтительно, тимеросал включают в количестве 0,01 г на 100 мл. Дополнительно, композиция изобретения также может включать буферные растворы, в виде солей. Предпочтительно, композиция изобретения может включать буфер в концентрации, равной от 0,01 до 0,5 М, предпочтительно в концентрации, равной 0,5 М или 0,4 М или 0,3 М или 0,2, или 0,1 М или 0,05 М или 0,01М. Буфер может представлять собой любой подходящий буфер, описанный в этой области техники. Например, буфер может представлять собой фосфатно-солевой буферный раствор (PBS) или ацетат натрия. Предпочтительно, буфер представляет собой 0,1М ацетат натрия.
Вакцина изобретения
Композиция настоящего изобретения может быть предпочтительно применена в качестве вакцины. Вакцина представляет собой биологический препарат, который повышает устойчивость к конкретному заболеванию. В соответствии с настоящим изобретением, вакцина предпочтительно представляет собой вакцину против дизентерии свиней (SD). Предпочтительно, дизентерию свиней вызывает Brachyspira hyodysenteriae.
Композиция изобретения для применения в качестве вакцины (далее вакцина изобретения) может представлять собой композицию, подходящую для введения свиньям в конкретной представляющей интерес географической области. Как описано выше, представляющая интерес область в особенности не ограничена, и может включать одну или нескольким стран. Например, представляющая интерес область может представлять собой Европу. Предпочтительно, представляющая интерес область может представлять собой Испанию, более предпочтительно испанскую территорию Пиренейского полуострова, в особенности, Кастилию и Леон, Андалусию и/или Эстремадуру. Другие предпочтительные представляющие интерес области - это Италия, Нидерланды, Великобритания, Австралия, Канада и/или Соединенные Штаты.
Вакцина изобретения может быть введена перед инфекцией и/или сразу после нее. Например, вакцина изобретения может быть введена через от 1 до 20 дней после возникновения заболевания, предпочтительно, через 1, или 2, или 3, или 4, или 5, или 6, или 7, или 8, или 9, или 10, или 15, или 20 дней после возникновения инфекции. Вакцина также может быть введена через 1-4 недели после возникновения заболевания, предпочтительно, 1, 2, 3 или 4 недели спустя после возникновения инфекции.
Вакцина изобретения может быть введена путем парентерального введения и/или перорального введения. Предпочтительно, вакцину изобретения вводят путем парентерального введения, более предпочтительно, путем подкожного и/или внутримышечного и/или внутрикожного введения, и еще более предпочтительно, путем внутримышечного введения. Например, вакцина изобретения может быть введена с помощью внутримышечной инъекции в мышцы шеи свиней.
Вводимая доза вакцины изобретения может варьировать от 1 мл до 5 мл. Например, одна доза вакцины изобретения может быть равна 1 мл. Например, одна доза вакцины изобретения может быть равна 2 мл.
7
12
8
10
9
8
9
9
8
Вводимая доза вакцины изобретения может включать от 10 до 10 бактерий/дозу, предпочтительно от 10 до 10 бактерий/дозу, более предпочтительно 10 бактерий/дозу. Вводимая доза вакцины изобретения может включать от 10 до 10 бактерий/мл. Вводимая доза вакцины изобретения может включать 10 бактерий/мл. Вводимая доза вакцины изобретения может включать 5⋅10 бактерий/мл в 2 мл/дозу.
9
Соответственно, предпочтительное общее количество бактерий на дозу, которое может быть введено свиньям равно 10 бактерий.
Вакцина настоящего изобретения предпочтительно представляет собой вакцину, вводимую с помощью инъекции.
Протокол вакцинации
В соответствии с настоящим изобретением, вакцина изобретения может быть предпочтительно введена свиньям после отъема, наиболее предпочтительно, через две недели после отъема. Например, свинья может быть вакцинирована с четвертой недели жизни. В соответствии с настоящим изобретением, свинья может быть вакцинирована дважды (ревакцинирована). Свинью предпочтительно ревакцинируют через две недели после первой вакцинации. Например, свинья может быть вакцинирована через две недели после отъема, например, в возрасте четырех недель. Затем, вторая вакцинация (ревакцинация) может быть осуществлена в возрасте шести недель (т.е. через две недели после введения первой вакцины). Например, свинья может быть вакцинирована через две недели после отъема, например, в возрасте пяти недель. Затем, вторая вакцинация (ревакцинация) может быть осуществлена в возрасте семи недель. Например, свинья может быть вакцинирована через две недели после отъема, например, в возрасте шести недель. Затем, вторая вакцинация (ревакцинация) может быть осуществлена в возрасте восьми недель. Вакцинация в первый раз в возрасте четырех недель предпочтительна.
Отлучение можно производить в возрасте 21 дня (La, Т. et al., Veterinary Microbiology (2004), 102:97-109). Отлучение также можно производить в возрасте 15 дней или в любом другом возрасте, в зависимости в зависимости от услышанного.
Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает следующие пункты:
1. Композиция, включающая бактерии, по меньшей мере, из двух генетически различных штаммов Brachyspira hyodysenteriae.
2. Композиция по пункту 1, в которой бактерии инактивированы.
8
9
3. Композиция по пунктам 1 и/или 2, в которой бактерии присутствуют в концентрации, равной, по меньшей мере, от 10 до 10 всех бактерий/мл.
4. Композиция по одному или нескольким предыдущим пунктам, в которой генетическое разнообразие присваивают путем отбора, по меньшей мере, двух генетически различных штаммов Brachyspira hyodysenteriae из различных клональных комплексов.
5. Композиция по одному или нескольким предыдущим пунктам, в которой, по меньшей мере, один штамм принадлежит к клональному комплексу II.
6. Композиция по одному или нескольким предыдущим пунктам, в которой, по меньшей мере, один штамм принадлежит к клональному комплексу V.
7. Композиция по одному или нескольким предыдущим пунктам, в которой, по меньшей мере, один штамм принадлежит к клональному комплексу I.
8. Композиция по одному или нескольким предыдущим пунктам, в которой генетически различных штаммы обнаружены в пропорции, по меньшей мере, 1% в представляющей интерес области по отношению к общему количеству обнаруженных штаммов.
9. Композиция по пункту 8, в которой представляющая интерес область - это Испания.
10. Композиция по одному или нескольким предыдущим пунктам, в которой генетически различные штаммы принадлежат к предковому типу из каждого клонального комплекса.
11. Композиция по одному или нескольким предыдущим пунктам, в которой композиция дополнительно включает штамм, принадлежащий к третьему клональному комплексу.
12. Композиция по пункту 11, в которой третий клональный комплекс выбирают из группы, включающей клональный комплекс I, клональный комплекс II и клональный комплекс V.
13. Композиция по одному или нескольким предыдущим пунктам, в которой, по меньшей мере, один из штаммов принадлежит к клональному комплексу I, по меньшей мере, один из штаммов принадлежит к клональному комплексу II и/или, по меньшей мере, один из штаммов принадлежит к клональному комплексу V.
14. Композиция по пункту 13, в которой, по меньшей мере, один из штаммов представляет собой штамм с регистрационным номером CNCM I-4720, по меньшей мере, один из штаммов представляет собой штамм с регистрационным номером CNCM I-4721 и/или, по меньшей мере, один из штаммов представляет собой штамм с регистрационным номером CNCM I-4722.
15. Композиция по одному или нескольким предыдущим пунктам, дополнительно включающая адъювант.
16. Композиция по пункту 15, в которой адъювант выбирают из группы, состоящей из солей алюминия (предпочтительно гидроксида алюминия и/или фосфата алюминия) и минеральных масел.
17. Композиция по пункту 16, в которой адъювант представляет собой масляный адъювант, предпочтительно, Montanide™ 251 С VG.
18. Композиция по одному или нескольким предыдущим пунктам для применения в качестве вакцины.
19. Композиция по пункту 18, в которой вакцина представляет собой вакцину против дизентерии свиней.
20. Композиция по пункту 19, в которой дизентерию свиней вызывает Brachyspira hyodysenteriae.
21. Композиция по одному или нескольким пунктам 18-20, в которой вакцина предназначена для введения свиньям в представляющей интерес области.
22. Композиция по пункту 21, в которой представляющая интерес область - это Испания.
23. Композиция по одному или нескольким пунктам 18-22, в которой генетически различные штаммы обнаруживают в пропорции, по меньшей мере, 1% по отношению к общему количеству обнаруженных штаммов в представляющей интерес области.
24. Композиция по одному или нескольким пунктам 18-23, в которой вакцину вводят с помощью парентерального введения.
25. Композиция по пункту 24, в которой вакцину вводят с помощью внутримышечного введения.
26. Композиция по одному или нескольким пунктам 18-25, в которой свинью вакцинируют через две недели после отъема.
27. Композиция по пункту 26, в которой свинью ревакцинируют через две недели после первой вакцинации.
8
9
28. Способ получения композиция по одному или нескольким пунктам 1-27, включающей отбор, по меньшей мере, двух генетически различных штаммов и смешивание их в равном количестве для достижения концентрации, равной, по меньшей мере, от 10 до 10 всех бактерий/мл.
29. Способ по пункту 28, в котором, по меньшей мере, два генетически различные штаммов также эпидемиологически релевантны.
30. Способ по одному или нескольким пунктам 28-29, дополнительно включающий инактивацию бактерий.
31. Способ по одному или нескольким пунктам 28-30, в котором генетическое разнообразие присваивают путем отбора каждого штамма из различных клональных комплексов.
32. Способ по одному или нескольким пунктам 29-31, в котором эпидемиологическую значимость присваивают путем отбора штаммов, которые обнаруживают в пропорции, по меньшей мере, 1% по отношению к общему количеству обнаруженных штаммов в представляющей интерес области.
33. Способ по пункту 32, в котором представляющая интерес область - это Испания.
Примеры
Пример 1. Мультилокусный анализ числа вариабельных тандемных повторов Brachyspira hyodysenteriae
MVLA-анализ
R
R
R
T
Набор из 172 свиных изолятов и штаммов В. hyodysenteriae, примененный в данном исследовании, включал три референтных штамма B204 (АТСС 31212), B234 (АТСС 31287) и WA1 (АТСС 49526) и типовой штамм B78 (АТСС 27164).
R
T
Дубликаты штаммов B204 и B78 получали из бактериальных коллекций, поддерживаемых в университете Леона и университете Мердока. Штаммы и полевые изоляты были из Испании (n=115), Австралии (n=36), Канады (n=3), Соединенных Штатов (n=7), Великобритании (n=4) и Нидерландов (n=7), их получали с 1970-х годов до 2009 года. Двадцать три изолята были получены из иберийских свиней, местной испанской породы. Эти свиньи внести свой вклад в сохранение «dehesa», специфической Средиземноморской экосистемы, расположенной в западных регионах страны (Кастилия и Леон, Эстремадура и Андалузия), где их традиционно выращивают в больших хозяйствах. Полевые изоляты были получены из различных стад, за исключением 26 испанских изолятов, которые были дополнительно выделены из 11 стад при различных случаях отбора проб. Изоляты В. hyodysenteriae из бактериальных коллекций университета Леона и университета Мердока идентифицировали и культивировали, и ДНК экстрагировали в каждой лаборатории известными способами. Рабочие разведения экстрагированной ДНК получали путем доведения их до концентрации от 1 до 20 нг/мкл помощью UV-Vis-спектрофотометра, производящего измерения в ультрафиолетовой и видимой частях спектра, NanoDrop 1000 («Thermo Scientific», Wilmington, DE).
Идентификация тандемных повторов и конструирование праймеров
R
Последовательность хромосомной ДНК В. hyodysenteriae WA1 получали из GenBank (код доступа NC_012225) и проверяли на наличие потенциальных тандемных повторов, применяя параметры по умолчанию в программе поиска тандемных повторов (Tandem Repeat Finder), доступной в виде веб-сервиса (http://tandem.bu.edu/). Отобранные локусы тандемных повторов были ранжированы по длине консенсуса, и те, которые имели длину от 25 до 300 п.о. применяли для конструирования праймеров в пределах фланкирующих участков. Локусы были названы Bhyo, с последующим указанием номера ранжирования длины повтора (от 1 до 23), отделенного знаком подчеркивания.
Скрининг тандемных повторов и условия проведения MLVA
R
R
T
R
На предварительной стадии ДНК, экстрагированную из штамма B204 В. hyodysenteriae, применяли для оценки эмпирических температур отжига для 23-х отобранных пар праймеров в градиентной ПЦР. ПЦР проводили в амплификаторе Mastercycler Gradient («Eppendorf» Scientific Inc., Westbury, NY) с начальной стадией 95°C в течение 5 мин, с последующими 30 циклами по протоколу трехстадийного цикла, состоящему из 94°С в течение 30 сек, 56±8°С в течение 30 сек и 72°С в течение 1 мин и конечной стадии удлинения 72°С в течение 10 мин. Для скрининга пригодности в качестве эпидемиологических маркеров 23-х отобранных локусов применяли образцы ДНК штаммов B204 и B78 В. hyodysenteriae и изолятов 3, 19, 23, 53, 64, Н9 и Н72, для которых в предыдущем исследовании методами PFGE и RAPD были показаны генетические различия (Hidalgo, . et al, Epidemiology & Infection (2010), 138:76-85). Кроме того, были приняты во внимание данные по тандемным повторам, созданные для штамма WA1 В, hyodysenteriae. Каждый локус амплифицировали индивидуально, и длину продукта анализировали с помощью общепринятого электрофореза в агарозном геле, применяя 100-п.о. ДНК-лэддер («Invitrogen», Carlsbad, СА). Локусы отбирали в соответствии с полиморфизмом их длины и их способностью генерировать ампликоны для большинства протестированных образцов ДНК. Для подтверждения длины ПЦР-продукта, а также числа повторов, консенсусных образцов и размеров фланкирующих участков, ампликоны очищали, применяя набор AxyPrep ПЦР Cleanup («Axygen Biosciences», Union City, СА), и секвенировали, применяя методику с флуоресцентно меченными дидеоксинуклеотидами в соответствии с рекомендациями производителя («Applied Biosystems», Foster City, СА). На основании этого, восемь локусов VNTR отбирали для применения в конечном инструменте для типирования.
ПЦР-амплификации для MLVA
2
Изоляты, полученные с бактериальной коллекцией, отобранной для данного исследования, анализировали путем независимой амплификации восьми отобранных локусов VNTR в амплификаторе Mastercycler («Eppendorf»). Примененные праймеры для ПЦР и условия термоциклирования описаны в таблице 1. ПЦР-смеси получали, применяя 0,2-миллилитровые стерильные пробирки, содержавшие 1х ПЦР-буфер (20 мМ Tris HCl [pH 8,4], 50 мМ KCl), 5 мМ MgCl, 1 Ед. ДНК-полимеразы Platinum Taq («Invitrogen»), смесь 200 мкМ дезоксинуклеозидтрифосфатов («Invitrogen»), по 0,2 мкМ каждого из прямого и обратного праймеров, 2 мкл рабочего разведения ДНК и стерильную дистиллированную воды до конечного объема 50 мкл. ПЦР-продукты разделяли в агарозном геле, и их аллельные размеры оценивали, применяя 100-п.о. ДНК-лэддер («Invitrogen»). Ампликоны аллелей, не обнаруженные на стадии подпора условий, секвенировали как описано выше. Кроме того, в целях обеспечения воспроизводимости методики, случайным образом отбирали 28 образцов ДНК и тестировали повторно. Воспроизводимость между лабораториями оценивали путем независимого определения типов VNTR 14-ти изолятов в университете Леона и университете Мердока.

Восемь пар праймеров, примененных в индивидуальных ПЦР, сгруппировали в два набора (набор 1 и набор 2); метили флуоресцентно с 6-карбоксифлуоресцеином (6-FAM™), VIC, PET или NED™ («Applied Biosystems») по 5'-концу прямых праймеров; и объединяли перед выполнением мультиплексной ПЦР, применяя набор для мультиплексной ПЦР (Qiagen Multiplex PCR) в соответствии с рекомендациями производителя («Qiagen», Germantown, MD).
Таблицы 2 и 3. Наборы праймеров
Объем в 25 мкл применяли для мультиплексной ПЦР-амплификации со следующим протоколом термоциклирования: 95°С в течение 15 мин; 30 трехстадийных циклов 94°С в течение 30 сек, 55/53°С (набор 1/набор 2) в течение 90 сек и 72°С в течение 90 сек; и конечная стадия удлинения при 72°С в течение 10 мин. Продукты мультиплексной ПЦР разводили 1:10 в дистиллированной воде перед тем, как 1 мкл этого разведения смешивали с 0,5 мкл 1200 LIZ Size Standard («Applied Biosystems») и 10,5 мкл формамида. После того, как смеси нагревали в течение 3 мин при 96°С и быстро охлаждали на льду, проводили анализ GeneScan, применяя ДНК-анализатор ABI 3730 («Applied Biosystems»). Для определения размера ПЦР-фрагментов для каждого локуса применяли имеющуюся в свободном доступе программу Peak Scanner Software v 1.0 («Applied Biosystems»).
Анализ данных
Число повторов рассчитывали по следующей формуле:
Число повторов = [Размер фрагмент (п.о.) × Фланкирующий участки (п.о.)]/Размер повтора (п.о.).
Результаты были аппроксимированы до ближайшего меньшего целого числа и последовательно оценены в баллах (Bhyo_6, Bhyo_7, Bhyo_12, Bhyo_17, Bhyo_21, Bhyo_22, Bhyo_10 и Bhyo_23) для создания численного профиля, позволяющего определить каждый штамм. Если ПЦР-амплификация не определялась, то назначенное число повторов было равно 99. Профили MLVA приписывали типам MLVA, назначая целое число. Изоляты считаются генетически идентичными, если было найдено соответствие в численных профилях для всех восьми локусов. Для измерения полиморфизма индивидуальных локусов применяли индекс разнообразия Хантера-Гастона, и индекс различения способа типирования MLVA применяли для восьми комбинированных VNTR локусов (Hunter, P.R. and М.A. Gaston, Journal of Clinical Microbiology (1988), 26:2465-2466). Приблизительные 95% доверительные интервалы (CI) рассчитывали как описано в работе Grundmann et al. (Journal of Clinical Microbiology (2001), 39:4190-4192). Избыточные изоляты (n=26) удаляли до расчета предыдущих индексов. Для анализа протестированных профилей MLVA и типов спирохет применяли программу для анализа типа последовательности и рекомбинационных тестов (START2), свободно доступную по адресу http://pubmlst.org/software/анализ/start2/. Филогенетическое дерево типов MLVA строили невзвешенным попарно-групповым методом, применяя стратегию кластеризации методом средней связи (UPGMA). Был проведен бутстрэп-анализ для 1000 повторов с помощью программы FreeTree, доступной по адресу http://web.natur.cuni.cz/flegr/programs/freetree.htm. Алгоритм goeBURST, доступный по адресу http://goeburst.phyloviz.net/#Software, общедоступную реализацию алгоритма eBURST (Feil, Е.J. et al., Journal of Bacteriology (2004), 186:1518-1530), применяли для идентификации группы родственных генотипов В. hyodysenteriae на уровне одно-, дву- и трехлокусных вариантов. Структуру популяции анализировали в соответствии с предложением Smith et al (Feil, Е.J. et al, Journal of Bacteriology (2004), 186:1518-1530.), принимая во внимание модификации, предложенные Haubold et al. (Genetics (1998), 150:1341-1348.) для расчета критического значения (LMC) распределения дисперсии попарных различий (VD), и выражали как стандартизированный индекс ассоциации (ISA).
Результаты
Идентификация маркеров VNTR
R
Исследование хромосомной последовательности В. hyodysenteriae WA1 с помощью программы для отбора тандемных повторов позволило идентифицировать 404 повтора в тандеме на протяжении всей хромосомы, со 135 повторами/Mbp. Последующий отбор наиболее подходящих маркеров тандемных повторов снизил число для включения в MLVA до 23, которые были последовательно названы от Bhyo_1 до Bhyo_23 и применены для конструирования праймеров в пределах фланкирующих участков. Пятнадцать локусов, которые были мономорфны или не были в состоянии амплифицировать все или большинство из девяти отобранных изолятов с конкретными праймерами, были отброшены. Остальные восемь локусов были полиморфными, с различными размерами аллелей. Секвенирование продуктов ПЦР подтвердило, что полиморфизм длины обусловлен различиями в числе копий тандемного повтора и что структура консенсуса, размер его периода и фланкирующих участки стабильны (таблица 4). Таким образом, в схему MLVA для В. hyodysenteriae включили восемь локусов (Bhyo_6, Bhyo_7, Bhyo_12, Bhyo_17, Bhyo_21, Bhyo_22, Bhyo_10 и Bhyo_23). Данные локусы были распределены с положения 1236667 до положения 2949421 генома WA1R (таблица 4). Четыре локуса, Bhyo_6, Bhyo_10, Bhyo_21 и Bhyo_22, поместили в открытые рамки считывания, кодирующие гипотетические белки, в то время как другие четыре были локализованы в межгенных участках. Bhyo_7 поместили между генами для метилакцептирующего белка хемотаксиса МсрА и гипотетического белка. Bhyo_12 был помещен между генами предполагаемого белка гликозилтрансферазы семейства 2 и гипотетического белка. Bhyo_17 был между генами для глицерол-3-фосфат дегидрогеназы и ферредоксином. Bhyo_23 был между генами для гипотетического белка и гипотетического RarR, по расчетам представляющим собой пермеазу.
MLVA-типирование
T
R
Набор из восьми маркеров VNTR применяли для типирования полной коллекции из 174 штаммов и изолятов В. hyodysenteriae, полученных из свиней в нескольких странах (включая дубликаты B78 и B204). Штаммы и изоляты были эффективно амплифицированы, и длины продуктов ПЦР были переведены в числа повторов. Секвенирование новых аллелей, которые идентифицировали на данной стадии, подтвердило, что различия в длине представляют собой вариации в число ранее обнаруженных повторных мотивов. Маркер Bhyo_10 представлял собой наиболее разнообразный VNTR, с восемью различными числами повторов (99, 2, 3, 5, 6, 7, 8 и 10), с назначенным числом повторов, равным 99, из-за отсутствия амплификации. Семь чисел повторов было обнаружено для локуса Bhyo_17, тогда как каждый из маркеров Bhyo_6, Bhyo_7 и Bhyo_21 представил шесть чисел повторов. Локусы Bhyo_12 и Bhyo_22 показали прерывистое распределение четырех чисел повторов. VNTR-маркер Bhyo_23 показал меньше разнообразия, только с двумя различными обнаруженными числами повторов, 1 и 2. Точной оценки степени полиморфизма локусов достигали, применяя индекс разнообразия Хантера-Гастона, с дискриминационной способностью локусов, варьирующей от 0,141 до 0,764. Локус Bhyo_10 был наиболее дискриминационным, со значением, равным 0,764, за ним следовали локусы Bhyo_7, Bhyo_6, Bhyo_17 и Bhyo_21, со значениями 0,761, 0,718, 0,71, и 0,699, соответственно. Локусы Bhyo_12 и Bhyo_23 имели индексы разнообразия, равные 0,472 и 0,318, соответственно, в то время как наиболее консервативным локусом был Bhyo_22, с индексом полиморфизма, равным 0,141.
R
R
R
T
R
T
R
Индекс разнообразия Хантера-Гастона способа типирования MLVA на восьми локусах для 146 штаммов и изолятов из различных стад, был равен 0,938 (95% CI, от 0,9175 до 0,9584). Анализ комбинации восьми VNTR-локусов для всех изолятов и штаммов В. hyodysenteriae показал 44 MLVA-типа, которые отличались, по меньшей мере, по одному повтору для одного из восьми локусов среди двух различных типов. MLVA-типы референтных штаммов представляли собой тип 35 для WA1, тип 23 для B204 и тип 10 для B234, тогда как тип штамма B78 был назначен MLVA-типом 28. Анализ различных MLVA-типов в каждой стране показал существование значительного разнообразия. Существует 15 типов (1, 2, 3, 5, 9, 11, 12, 13, 14, 18, 19, 20, 22, 24 и 37), обнаруженных среди 89 испанских изолятов из различных стад, 16 типов (15, 16, 17, 25, 26, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 38, 39,42, 43, и 44) среди 36 австралийских изолятов, 2 типа (21 и 27) для трех канадских изолятов, 3 типа (3, 6 и 41) для семи изолятов из Нидерландов, 4 типа (3, 8, 29, и 30) для четырех штаммов из Великобритании и 6 типов (4, 7, 10, 23, 28, и 40) для семи изолятов и штаммов из Соединенных Штатов. MLVA-тип 3 был разделен между изолятами из Испании, Великобритании и Нидерландов. MLVA-типы стабильны для стад, где при различны случаях отбора образцов был выделен более чем один изолят. Штамм WA1 В. hyodysenteriae показал несоответствие для локуса Bhyo_6 между длиной продукта ПЦР, 780 п.о. (четыре числа повторов), и данными, полученными при секвенировании генома, 1092 п.о. (шесть чисел повторов). Изоляты и штаммы, включенные в тесты на повторяемость и воспроизводимость, имели одинаковые MLVA-типы при различных временах тестирования. Кроме того, каждый из дубликатов типа В. hyodysenteriae и референтные штаммы, B78 и B204 из коллекции университета Леона и университета Мердока, давали одинаковые образцы MLVA.
MLVA-типы и анализ бактериальной популяции
На фиг. 1 показано эволюционное дерево, основанное на профилях MLVA и построенное в соответствии со стратегией кластеризации UPGMA для 44 MLVA-типов В. hyodysenteriae, определенных в данном исследовании. Взаимосвязи между MLVA-типами на уровнях одно-, дву- и трехлокусных вариантов, изображенные с помощью алгоритма goeBURST, показаны на фиг. 2. Шесть клональных комплексов (от I до VI) были установлены на уровне однолокусного варианта. Три новые группы появились при исследовании двулокусных вариантов, тогда как три группы однолокусных вариантов (II, III, и IV) были кластеризованы вместе на данном уровне. Если для исследования взаимосвязи на уровне трехлокусного варианта были представлены высокоуровневые края, то появлялся большой кластер, который включала группы от I до IV, и группа V была расширена за счет еще двух типов. MLVA-типы 4, 5, 10 и 15 не были связаны ни с каким из других типов, обнаруженных на любом из исследованных уровней. Дисбаланс связей в популяции был обнаруженный для 146 изолятов из различных стад (; Р<0,001) и для различных MLVA-типов (; Р=0,005).
Пример 2: Отбор и культивирование штаммов универсальной вакцины
Отбирали три штамма Brachyspira hyodysenteriae, каждый из которых принадлежал к различным клональным комплексам (клональный комплекс I, II и V). Каждый из генетически различных отобранных штаммов принадлежал к предковому типу из каждого клонального комплекса. Кроме того, каждый из отобранных штаммом был равен, по меньшей мере, 1% из обнаруженных по отношению к общему количеству штаммов, обнаруженных в Испании (фигура 3). Эти штаммы представляли собой штаммы, депонированные в национальной коллекции культур микроорганизмов (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM)), в институте Пастера, 14 марта 2013, с регистрационными номерами CNCM I-4720, CNCM I-4721 и CNCM I-4722.
Штамм с регистрационным номером CNCM I-4720 принадлежал к клональному комплексу II. Штамм с регистрационным номером CNCM I-4721 принадлежал к клональному комплексу V. Штамм с регистрационным номером CNCM I-4722 принадлежал к клональному комплексу I.
Доля обнаруженного CNCM I-4720 была равна 24,7% по отношению к общему количеству обнаруженных штаммов на испанской территории Пиренейского полуострова. Доля обнаруженного CNCM I-4721 была равна 13,5% по отношению к общему количеству обнаруженных штаммов на испанской территории Пиренейского полуострова. Доля обнаруженного CNCM I-4722 была равна 9% по отношению к общему количеству обнаруженных штаммов на испанской территории Пиренейского полуострова.
Изолированные бактерии (свободные от примесей) инокулировали на чашки с кровяным агаром. Чашки хранили в анаэробных условиях при 39,5°С в течение 4-5 дней, пока не наблюдали гемолиз на всей чашке. Фрагменты агара на границах гемолиза инокулировали в новую чашку с кровяным агаром, инкубировали в тех же условиях. Бактерии пересевали в новую чашку с кровяным агаром и, параллельно, в чашку с агаром для требовательных анаэробных бактерий (Fastidious Anaerobe Agar (FAA)), и бактерии культивировали в тех же условиях в течение 3-4 дней. Бактерии можно перенести в жидкую среду роста и культивировать в ней.
9
Для ферментации, бактерии инкубируют в приблиз. 4 л подходящей культуральной среды (такой как среда с сердечно-мозговым экстрактом от компании «Merck») при 38,5°С при мягком перемешивании (50 rpm) в бескислородной атмосфере. Ферментацию проводят до тех пор, пока величина оптической плотности не достигнет приблиз. 1,6 (или до тех пор, пока концентрация бактерий не станет равной около 10 КОЕ/мл (как правило, от 15 и 30 часов)).
Пример 3: Инактивация бактерий
9
10
После ферментации, 4 л (приблиз.) культуры закачивали в стерильный сосуд и центрифугировали (2×7000 rpm, 10 минут). Полученные осадки суспендировали в 1 л натрий ацетатного буфера 0,1 М. Инактивацию культуры проводили с инъекцией 0,5% формальдегида и инкубацией в течение 24-х часов при 37°С при мягком перемешивании (50 rpm). На следующий день суспензию центрифугировали и ресуспендировали в стерильном 0,1 М натрий ацетате. Антиген (10-10 бактерий/мл, приблиз.) хранили при 4°С до смешивания с адъювантом и вспомогательными веществами для изготовления вакцины.
Пример 4: Композиция вакцины (универсальная вакцина изобретения)
9
Вакцина включает следующие компоненты. Термин антиген относится к вышеупомянутым отобранным штаммам Brachyspira hyodysenteriae, и конечная концентрация антигена равна 10 бактерий/мл в равной смеси трех отобранных штаммов.
Компоненты смешивали взбалтыванием при 4°С в течение ночи.
Пример 5: Сопоставление эффективной аутовакцины с универсальной вакциной изобретения
Применяли следующие условия:
1. Свиньи, примененные в данном примере, были из фермы, свободной от инфекций, вызываемых спирохетами, и с низким статусом здоровья, из-за трудностей в достижении хорошего заражения свиней с высоким статусом здоровья.
2. Для того чтобы вызвать очень сильный дисбактериоз в кишечнике, манипулировали диетой. Важность диеты в дизентерии свиней также хорошо известна. В этом эксперименте корм смешивали с 50% соевой муки, которая имела 46% белка. Свиньи получали эту диету со дня заражения (в общей сложности 10 дней).
3. Штамм, примененный для заражения, представлял собой референтный штамм В204 (номер в АТСС: 31212). Штамм предварительно пассировали три раза в свиньях для полного поддержания его патогенности и для того, чтобы убедиться, что экспериментальная инфекция будет соответствующей. Это гарантировало, что примененный штамм имеет высокую патогенность и вызывает развитие тяжелого заболевания у инфицированных свиней.
Применяли следующие три группы по шесть свиней в каждой:
9
- Группа 1 (аутовакцина): поросят вакцинировали внутримышечно (i.m.) аутовакциной (инактивированный В204 и адъювант, такой же протокол как приведен выше, но с инактивированным В204 в качестве антигена) на 6-ой недели жизни и ревакцинировали на 8-ой неделе жизни. Каждая доза содержала 10 бактерии.
9
- Группа 2 (универсальная вакцина): поросят вакцинировали i.m. универсальной вакциной (поливалентная инактивированная и адъювантная вакцина, включавшая три отобранных полевых штамма). Протокол вакцинации был таким же, как приведен выше (поросят вакцинировали на 6-ой неделе жизни и ревакцинировали на 8-ой неделе). Доза также была равна 10 бактерии в равной смеси из трех отобранных штаммов.
- Группа 3 (контрольная группа, невакцинированная): тот же адъювант (без бактериального антигена) вводили с помощью инъекции i.m. поросятам на 6-ой и 8-ой неделях жизни (такой протокол же, как приведен выше).
Вакцинацию и ревакцинацию выполняли на ферме. Поросят содержали на ферме до 10-ой недели жизни и затем перемещали в оборудованные исследовательские лаборатории университета Леона. Поросят, принадлежавших к трем экспериментальным группам, смешивали в данных лабораториях.
9
Экспериментальную инфекцию проводили через 3 недели после введения второй дозы, когда поросята были в возрасте 11-ти недель. Каждая свинья из каждой группы получала перорально по 100 мл свежей культуры штамма типа В204, содержащего 10бактерий/мл, в течение 3-х последовательных дней. Диету модифицировали на первый день заражения, как указано выше.
С первого дня заражения (PID 1) у свиней ежедневно путем сбора ректальных мазков отбирали образцы, и контролировали В. hyodysenteriae в фекальных выделениях путем микробиологического культивирования. Начиная с PID 1, регистрировали общий статус здоровья и наличие диареи или характеристики фекалий.
Результаты:
1. Смертность
В группе свиней, вакцинированных универсальной вакциной, один поросенок умер на 17-й день после экспериментальной инфекции. В этом случае, смерть была вызвана пневмонией. Умершая свинья не выделяла Brachyspira hyodysenteriae в фекалиях перед своей смертью.
Смертность, вызванная дизентерией свиней, была одинаковой в группе свиней, вакцинированных универсальной вакциной, и свиней, вакцинированных аутовакциной, (1 свинья в каждой группе) и в три раза выше, чем в контрольной группе невакцинированных свиней (3 свиньи умерли).
Принимая во внимание отношение шансов, риск смертности был в 6 раз выше у животных из контрольной группы по сравнению с теми, которых вакцинировали универсальной вакциной или аутовакциной (OR=6; CI 95% 0,28-246,02).
В обеих группах вакцинированных свиней (вакцинированных универсальной вакциной и вакцинированных аутовакциной) смерть свиньи произошла на 29-ый день после заражения, в то время как в контрольной группе три свиньи умерли на день 7, 9 и 13 после заражения (фигура 4).
Как и ожидалось, не наблюдали никакой разница между кривыми выживаемости животных, вакцинированных универсальной вакциной и аутовакцинированных (р=0,9372).
2. Инкубационный период
Инкубационный период, определяемый как число дней от заражения до появления диареи или выделения бактерий в фекалиях, был значительно больше у свиней из контрольной группы по сравнению с аутовакцинированными животными (F=7,36; р=0,024). Данный инкубационный период также был больше для вакцинированных свиней по сравнению с контролями. Никаких статистически значимых различий не было найдено между обеими группами вакцинированных и аутовакцинированных свиней (F=1,7; р=0,228) (фигура 6).
3. Диарея и кровавая диарея
2
2
Доля дней с диареей была значительно выше в контрольной группе по сравнению со свиньями, вакцинированными универсальной вакциной (Chi=8,37; р=0,004), и с аутовакцинированными свиньями (Chi=4,27; р=0,038).
2
2
Подобный результат получали относительно доли дней с кровавой диареей. Значение было значительно выше в контрольной группе по сравнению с группой, вакцинированной универсальной вакциной (Chi=7,25; р=0,007), и аутовакцинированной группой (Chi=16,6; p<0,001).
Кроме того, кровавая диарея началась раньше в контрольной группе (через два дня после заражения). В данной группе все свиньи имели кровавую диарею на 6-ой день после заражения, и в течение 5-ти дней кровавая диарея поразила более 50% свиней (фигура 7).
2
2
Никаких статистически значимых различий не было найдено между свиньями, вакцинированными универсальной вакциной и аутовакцинированными свиньями, ни в доле дней с диареей (Chi=0,57; р=0,45), ни в доле дней с кровавой диареей (Chi=1,92; р=0,165).
4. Среднесуточный привес
В первые 9 дней после заражения, почти не наблюдали увеличения веса у свиней из группы, вакцинированной универсальной вакциной, а у животных из аутовакцинированной группы определили среднесуточный привес, равный 0,27 кг. Однако никаких существенных различий не было продемонстрировано при сравнении обеих групп. Данные группы не показали потерю веса в каком-либо моменте времени в течение всего исследования.
Животные из контрольной группы показали явную потерю веса в течение первых 9 дней после заражения. Средняя потеря веса была равна 0,29 кг/день. После этих 9-ти дней, не было обнаружено существенных различий в среднесуточном привесе (ADG) выживших свиней из контрольной группы по сравнению со свиньями, вакцинированными универсальной вакциной, и свиными аутовакцинированной группы (фигуры 8 и 9).
Животные их аутовакцинированной группы показали сниженный среднесуточный привес, при анализе на 24-ый день после заражения, вероятно, вследствие более продолжительного инкубационного периода заболевания у данных животных. С другой стороны, животные из вакцинированной универсальной вакциной группы и контрольной группы показали явное восстановление ежедневного прироста веса на данный момент, так как ранее они были поражены клиническим заболеванием.
Выводы
Цель данного исследования заключалась в сравнении эффективности универсальной вакцины (в данном случае, составленной из трех отобранных штаммов, ни один из которых не представлял собой штамм, вызывающий инфекцию) с эффективностью аутовакцины в очень жестких условиях.
9
- Инфекция свиней штаммом В204, с применением трех ежедневных доз по 10бактерии, индуцирующая сильный дисбактериоз в кишечнике, вызывает тяжелую дизентерию свиней и 50%-ную смертность у не получавших лечения свиней в контрольной группе.
- Нет никакой разницы в эффективности универсальной вакцины и аутовакцины в снижении смертности, вызываемой дизентерией свиней.
- Нет статистически значимых различий в эффективности универсальной вакцины и аутовакцины в снижении клинических признаков дизентерии свиней (диарея и кровавая диарея).
- Не было потери веса ни у свиней, вакцинированных универсальной вакциной, ни у свиней, вакцинированных аутовакциной.
Эффективность универсальной вакцины сравнима с эффективностью эффективной аутовакцины. Универсальная вакцина имеет хорошее отношение затраты/выгоды для контроля дизентерии свиней в полевых условиях, учитывая протестированную эффективность аутовакцины.
Пример 6. Исследование липополисахарида (LPS) из гипериммунизированных кроликов методом ELISA
Цель следующего исследования заключалась в демонстрации качественных различий, обнаруженных между серологическим иммунным ответом каждого из трех штаммов (А, В и С, смотри ниже для точной ссылки), содержавшихся в композиции трехвалентной вакцины Brachyspira hyodysenteriae (универсальная вакцина).
Материал и способы
10
Для эксперимента, девять кроликов были разделены на три группы по трое животных, и каждой группе внутривенно инокулировали один из штаммов в течение шесть дней (D1, D2, D3, D4, D5 и D10 исследования) с 0, 5 мл бактериальной суспензии. Таким образом, для каждой бактерии было необходимо приготовить по 0,5 мл × 3 животных на штамм × 6 дней = 9 мл культуры с 10 бактерий/мл.
9
10
Инокулят готовили из чистой жидкой культуры каждого штамма в 100 мл BHI (сердечно-мозговым экстракт) с 6% BFS (фетальная бычья сыворотка). Жидкую культуру центрифугировали и промывали три раза PBS-буфером; исходную суспензию (рост до приблиз. 10 бактерий/мл) концентрировали в десять раз до конечной суспензии 10бактерий/мл.
От каждого животного на дни D15, D18, D21, D24, D27 и D36 собирали кровь. Сыворотки немедленно отправляли в специально оборудованную лабораторию Aquilon для анализа на антитела
Планшеты для ELISA были покрыты отдельно 0,5 мкг LPS-антигена для каждого штамма, полученного как описано в работе Hassan et al. (Antibody response to experimental Salmonella typhimurium infection in chickens measured by ELISA (1990). Vet rec. 126(21):519-22) и анализ ELISA проводили, следуя способу для Salmonella, описанному в работе Collazos (Aportaciones al  у control de la salmonelosis porcina (2008). Tesis Doctoral. Universidad de ).
Результаты. Результаты можно видеть на фигурах 10, 11 и 12. Можно наблюдать различия между планшетами ELISA, покрытыми LPS, который был получен от трех штаммов спирохет против сывороток группы кроликов, гипериммунизированных данными тремя штаммами по отдельности. Было показано, что иммунный ответ сывороток, полученный от каждого из примененных здесь штаммов спирохет (А, В и С), различается в зависимости от того, было ли покрытие LPS на планшете для ELISA гомологичным или гетерологичным штамму сыворотки (смотри фигуры 10, 11 и 12). Данные результаты подтверждают тот факт, что генетически разделенные штаммы демонстрируют продукцию специфического антитела. Соответственно, авторы изобретения смогли, к удивлению, обнаружить различия в иммунном ответе/ продукции антител животным в результате иммунизации бактериями, которых отбирали на основе их генетического разнообразия, как описано в заявке, и данные критерии генетического разнообразия не определяются функциональной последовательностью. Эти неожиданные результаты обосновывают включение нескольких антигенных образцов в композицию вакцины, в особенности принимая во внимание тот факт, что примененные генетические критерии не представляют собой критерии, «определяемые геном», а основаны только на полиморфизме генома.
Дополнительные пункты настоящего изобретения
1. Композиция, включающая бактерии, по меньшей мере, из двух генетически различных штаммов Brachyspira hyodysenteriae.
2. Композиция по пункту 1, в которой бактерии инактивированы.
8
9
3. Композиция по пунктам 1 и/или 2, в которой бактерии присутствуют в концентрации, равной от 10 до 10 бактерий/мл.
4. Композиция по одному или нескольким предыдущим пунктам, в которой генетическое разнообразие присваивают путем отбора, по меньшей мере, двух генетически различных штамма Brachyspira hyodysenteriae из различных клональных комплексов.
5. Композиция по одному или нескольким предыдущим пунктам, в которой, по меньшей мере, один штамм принадлежит к клональному комплексу II, и/или в которой, по меньшей мере, один штамм принадлежит к клональному комплексу V, и/или в которой, по меньшей мере, один штамм принадлежит к клональному комплексу I.
6. Композиция по одному или нескольким предыдущим пунктам, в которой генетически различные штаммы обнаруживают в пропорции, по меньшей мере, 1% по отношению к общему количеству обнаруженных штаммов в представляющей интерес области.
7. Композиция по пункту 6, в которой представляющая интерес область - это Испания.
8. Композиция по одному или нескольким предыдущим пунктам, в которой генетически различные штаммы принадлежат к предковому типу каждого из клональных комплексов.
9. Композиция по одному или нескольким предыдущим пунктам, в которой композиция дополнительно включает штамм, принадлежащий к третьему клональному комплексу, и в которой третий клональный комплекс выбирают из группы, состоящей из клонального комплекса I, клонального комплекса II и клонального комплекса V.
10. Композиция по одному или нескольким предыдущим пунктам, в которой, по меньшей мере, один из штаммов принадлежит к клональному комплексу I, по меньшей мере, один из штаммов принадлежит к клональному комплексу II и/или, по меньшей мере, один из штаммов принадлежит к клональному комплексу V.
11. Композиция по пункту 10, в которой, по меньшей мере, один из штаммов представляет собой штамм с регистрационным номером CNCM I-4720, по меньшей мере, один из штаммов представляет собой штамм с регистрационным номером CNCM I-4721 и/или, по меньшей мере, один из штаммов представляет собой штамм с регистрационным номером CNCM I-4722.
12. Композиция по одному или нескольким предыдущим пунктам, дополнительно включающая адъювант, предпочтительно отобранный из группы, состоящей из солей алюминия (предпочтительно, алюминия гидроксида и/или алюминия фосфата) и минеральных масел.
13. Композиция по пункту 12, в которой адъювант представляет собой масляный адъювант, предпочтительно Montanide™ IMS 251 С VG.
14. Композиция по одному или нескольким предыдущим пунктам для применения в качестве вакцины, предпочтительно против дизентерии свиней, в которой дизентерию свиней необязательно вызывает Brachyspira hyodysenteriae.
15. Композиция по пункту 14, в которой вакцина предназначена для введения свиньям в представляющей интерес области.
16. Композиция по пункту 15, в которой представляющая интерес область - это Испания.
17. Композиция по одному или нескольким пунктам 14-16, в которой вакцину вводят с помощью парентерального введения, предпочтительно с помощью внутримышечного введения.
18. Композиция по одному или нескольким пунктам 14-17, в которой свинью вакцинируют через две недели после отъема и, необязательно, ревакцинируют через две недели после первой вакцинации.
8
9
9
19. Композиция по одному или нескольким пунктам 15-18, в которой общее количество бактерий на дозу, вводимую свиньям, равно от 10 до 10 бактерий, предпочтительно, 10 бактерий.
20. Штамм бактерий, отобранных из штаммов, депонированных в национальной коллекции культур микроорганизмов (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM)), в институте Пастера, с регистрационными номерами CNCM I-4720, CNCM I-4721 и CNCM I-4722.