ПЕСТИЦИДНАЯ КОМПОЗИЦИЯ, ВКЛЮЧАЮЩАЯ ИЗОЛИРОВАННЫЙ ШТАММ BURKHOLDERIA SP., СОЕДИНЕНИЯ, ВЫДЕЛЕННЫЕ ИЗ BURKHOLDERIA SP., ИХ СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ
PESTICIDAL COMPOSITION COMPRISING ISOLATED STRAIN OF BURKHOLDERIA SP, COMPOUNDS ISOLATED FROM BURKHOLDERIA SP, METHODS FOR PRODUCTION AND USE THEREOF

В настоящем изобретении предложены виды Burkholderia sp, не обладающие известной патогенностью в отношении позвоночных животных, таких как млекопитающие, рыбы и птицы, но обладающие пестицидной активностью против растений, насекомых, грибов и нематод. Также предложены природные продукты, происходящие из культуры указанных видов, и способы борьбы с появлением и/или ростом двудольных, однодольных и осоковых сорняков, модуляции роста грибов и борьбы с вредителями, такими как насекомые и нематоды, с использованием указанных природных продуктов.
Предшествующий уровень техники
Природные продукты представляют собой вещества, продуцируемые микробами, растениями и другими организмами. Микробные природные продукты представляют собой богатый источник химического разнообразия, и имеется длительная история использования природных продуктов для фармацевтических задач. Одно из таких соединений представляет собой FR901228, выделенное из Chromobacterium, и обнаружено, что он полезен в качестве антибактериального агента и противоопухолевого агента (смотри, например, Ueda et al., патент US 7396665).
Тем не менее, обнаружено, что вторичные метаболиты, продуцируемые микробами, успешно используют для борьбы с сорняками и вредителями в сельскохозяйственных применениях (смотри, например, Nakajima et al. 1991; Duke et al., 2000; Lydon & Duke, 1999; Gerwick et al., патент US 7393812). Микробные природные продукты также успешно разработаны в области сельскохозяйственных инсектицидов (смотри, например, Salama et al. 1981; Thompson et al., 2000; Krieg et al. 1983). Иногда, такие природные продукты комбинированы с химическими пестицидами (смотри, например, Gottlieb, патент US 4808207).
Burkholderia
Род Burkholderia, β-подгруппа протеобактерий, включает более чем 40 видов, которые населяют различные экологические ниши (Compant et al., 2008). Бактериальные виды рода Burkholderia представляют собой распространенные организмы в почве и ризосфере (Coenye and Vandamme, 2003; Parke and Gurian-Sherman, 2001). Традиционно, они известны как растительные патогены, причем В. cepacia является первым, раскрытым и идентифицированным как патоген, вызывающий заболевание у луковичных растений (Burkholder, 1950). Несколько видов Burkholderia устанавливают благоприятные взаимодействия с хозяевами-растениями (смотри, например, Cabballero-Mellado et al., 2004, Chen et al., 2007). Также обнаружено, что некоторые виды Burkholderia представляют собой оппортунистические человеческие патогены (смотри, например, Cheng and Currie, 2005 и Nierman et al., 2004). Дополнительно, обнаружено, что некоторые виды Burkholderia обладают потенциалом в качестве биоконтрольных продуков (смотри, например, Burkhead et al., 1994; Knudsen et al., 1987; Jansiewicz et al., 1988; Gouge et al., заявка на патент US 2003/0082147; Parke et al., патент US 6,077,505; Casida et al., патент US 6689357; Jeddeloh et al., WO 2001055398; Zhang et al., патент US 7141407). Некоторые виды этого рода эффективны для биовосстановления для деконтаминации загрязненной почвы или грунтовых вод (смотри, например, Leahy et al. 1996). Кроме того, обнаружено, что некоторые виды Burkholderia секретируют разнообразие внеклеточных ферментов, обладающих протеолитическими, липолитическими и гемолитическими активностями, а также токсинов, антибиотиков и сидерофоров (смотри, например, Ludovic et al., 2007; Nagamatsu, 2001).
Оксазолы, тиазолы и индолы
Оксазолы, тиазолы и индолы широко распространены у растений, водорослей, губок и микроорганизмов. Значительное количество природных продуктов содержат один или более чем один из пятичленных оксазольных, тиазольных и индольных ядер/группировок. Эти природные продукты демонстрируют широкий спектр биологической активности с проявляемым терапевтическим значением. Например блеомицин A (Tomohisa et al.), широко предписываемое противораковое лекарство, осуществляет окислительную деградацию ДНК и использует битиазольную группировку для связи с последовательностями-мишенями ДНК (Vanderwall et al., 1997). Бацитрацин (Ming et al., 2002), тиазолин-содержащий пептидный антибиотик, нарушает новый биосинтез бактериальной клеточной стенки путем образования комплекса с С55-бактопренолпирофосфатом. Тиангазол (Kunze et al., 1993) содержит тандемную последовательность из одного оксазола и трех тиазолинов и демонстрирует противовирусную активность (Jansen et al., 1992). Другие оксазол/тиазол-содержащие природные продукты, такие как тиострептон (Anderson et al., 1970) и GE2270A (Selva et al., 1997) ингибируют стадии трансляции в синтезе бактериального белка. Более чем о 1000 алкалоидах с индольным скелетом сообщали для микроорганизмов. Одну-треть из этих соединений представляют собой пептиды, обладающие массами за пределами 500 Да, где индол происходит из триптофана. Структурное разнообразие оставшихся двух третей выше, и их биологическая активность по-видимому покрывает более широкий диапазон, включающий антимикробную, противовирусную, цитотоксическую, инсектицидную, антитромботическую или ингибирующую фермент активности.
Краткое изложение сущности изобретения
В изобретении предложен изолированный штамм Burkholderia sp., отличающийся от Burkholderia cepacia, отличающийся от Burkholderia plantari, отличающийся от Burkholderia gladioli, который обладает следующими характеристиками:
а. Имеет последовательность гена 16S рРНК, содержащую прямые последовательности, имеющие по меньшей мере 99,0% идентичности с последовательностями, представленными в SEQ ID NO: 8, 11 и 12, и обратную последовательность, имеющую по меньшей мере 99,0% идентичности с SEQ ID NO: 9, 10, 13-15;
b. Обладает пестицидной, в частности, гербицидной, инсектицидной, фунгицидной и нематицидной активностью;
с.Продуцирует по меньшей мере одно из соединений, выбранных из группы, состоящей из:
1
13
3
(i) соединения, обладающего следующими свойствами: (а) молекулярной массой приблизительно 525-555, определенной при помощи жидкостной хроматографии/масс-спектрометрии (LC/MS); (б) Значениями H ЯМР (ядерного магнитного резонанса): 6,22, 5,81, 5,69, 5,66, 5,65, 4,64, 4,31, 3,93, 3,22, 3,21, 3,15, 3,10, 2,69, 2,62, 2,26, 2,23, 1,74, 1,15, 1,12, 1,05, 1,02; (в) значениями C ЯМР: 172,99, 172,93, 169,57, 169,23, 167,59, 130,74, 130,12, 129,93, 128,32, 73,49, 62,95, 59,42, 57,73, 38,39, 38,00, 35,49, 30,90, 30,36, 29,26, 18,59, 18,38, 18,09, 17,93, 12,51 и (г) временем удерживания в жидкостной хроматографии высокого давления (HPLC) приблизительно 10-15 минут на обращенно-фазовой колонке для HPLC C-18 с использованием градиента вода:ацетонитрил (CHCN);
(ii) соединения, имеющего оксазолил-индольную структуру, содержащую по меньшей мере одну индольную группировку, по меньшей мере одну оксазольную группировку, по меньшей мере одну замещенную алкильную группу и по меньшей мере одну карбоксильную эфирную группу; по меньшей мере 17 атомов углерода и по меньшей мере 3 атома кислорода и 2 атома азота;
(iii) соединения, имеющего оксазолил-бензильную структуру, содержащую по меньшей мере одну бензильную группировку, по меньшей мере одну оксазольную группировку, по меньшей мере одну замещенную алкильную группу и по меньшей мере одну амидную группу; по меньшей мере 15 атомов углерода и по меньшей мере 2 атома кислорода и 2 атома азота;
(iv) соединения, имеющего по меньшей мере одну сложноэфирную, по меньшей мере одну амидную, по меньшей мере три метиленовые группы, по меньшей мере одну тетрагидропиранозную группировку и по меньшей мере три олефиновые двойные связи, по меньшей мере шесть метильных групп, по меньшей мере три гидроксильные группы, по меньшей мере двадцать пять атомов углерода и по меньшей мере восемь атомов кислорода и один атом азота и
d. не является патогенным (не инфекционен) для позвоночных животных, таких как млекопитающие, птицы и рыбы;
е. чувствителен к канамицину, хлорамфениколу, ципрофлоксацину, пиперациллину, имипенему и комбинации сульфаметоксазола и триметоприма и
f. содержит жирные кислоты 16:0, цикло 17:0, 16:0 3-OH, 14:0, цикло 19:0 ω8c, 18:0.
В конкретном воплощении штамм обладает идентифицирующими характеристиками штамма Burkholderia A396 (NRRL №В-50319).
Здесь раскрыты изолированные соединения, которые возможно получают или происходят из видов Burkholderia, или альтернативно, организмы, способные продуцировать эти соединения, которые могут быть использованы для контроля различных вредителей, в частности фитопатогенных вредителей растений, примеры которых включают насекомых, нематод, бактерии, грибы, но не ограничиваются ими. Эти соединения также могут быть использованы в качестве гербицидов.
В частности, изолированные пестицидные соединения могут включать без ограничения:
1
13
3
(A) соединение, обладающее следующими свойствами: (1) молекулярной массой приблизительно 525-555, определенной при помощи жидкостной хроматографии/масс-спектрометрии (LC/MS); (2) значениями δ в Н ЯМР 6,22, 5,81, 5,69, 5,66, 5,65, 4,64, 4,31, 3,93, 3,22, 3,21, 3,15, 3,10, 2,69, 2,62, 2,26, 2,23, 1,74, 1,15, 1,12, 1,05, 1,02; (3) значениями δ С ЯМР 172,99, 172,93, 169,57, 169,23, 167,59, 130,74, 130,12, 129,93, 128,32, 73,49, 62,95, 59,42, 57,73, 38,39, 38,00, 35,49, 30,90, 30,36, 29,26, 18,59, 18,38, 18,09, 17,93, 12,51, и (4) временем удерживания в жидкостной хроматографии высокого давления (HPLC) приблизительно 10-15 минут на обращенно-фазовой колонке для HPLC С-18 с использованием градиента вода:ацетонитрил (CHCN);
(B) соединение, имеющее оксазолил-индольную структуру, содержащую по меньшей мере одну индольную группировку, по меньшей мере одну оксазольную группировку, по меньшей мере одну замещенную алкильную группу и по меньшей мере одну карбоксильную эфирную группу; по меньшей мере 17 атомов углерода и по меньшей мере 3 атома кислорода и 2 атома азота;
(C) соединение, имеющее оксазолил-бензильную структуру, содержащую по меньшей мере одну бензильную группировку, по меньшей мере одну оксазольную группировку, по меньшей мере одну замещенную алкильную группу и по меньшей мере одну амидную группу; по меньшей мере 15 атомов углерода и по меньшей мере 2 атома кислорода и 2 атома азота;
(D) соединение, имеющее по меньшей мере одну сложноэфирную, по меньшей мере одну амидную, по меньшей мере три метиленовые группы, по меньшей мере одну тетрагидропиранозную группировку и по меньшей мере три олефиновые двойные связи, по меньшей мере шесть метильных групп, по меньшей мере три гидроксильные группы, по меньшей мере двадцать пять атомов углерода и по меньшей мере восемь атомов кислорода и один атом азота, и
(Е) соединение, имеющее по меньшей мере одну сложноэфирную, по меньшей мере одну амидную, эпоксиметиленовую группу, по меньшей мере одну тетрагидропиранозную группировку, по меньшей мере три олефиновые двойные связи, по меньшей мере шесть метильных групп, по меньшей мере три гидроксильные группы, по меньшей мере 25 атомов углерода, по меньшей мере 8 атомов кислорода и по меньшей мере 1 атом азота.
В конкретном воплощении изолированные соединения могут включать без ограничения:
1
13
3
(A) соединение, имеющее оксазолил-индольную структуру, содержащую по меньшей мере одну индольную группировку, по меньшей мере одну оксазольную группировку, по меньшей мере одну замещенную алкильную группу, по меньшей мере одну карбоксильную эфирную группу, по меньшей мере 17 атомов углерода, по меньшей мере 3 атома кислорода и по меньшей мере 2 атома азота; и которое обладает по меньшей мере одним из следующих: (i) молекулярной массой приблизительно 275-435; (ii) значениями δ в H ЯМР 8,44, 8,74, 8,19, 7,47, 7,31, 3,98, 2,82, 2,33, 1,08; (iii) значениями δ в С ЯМР 163,7, 161,2, 154,8, 136,1, 129,4, 125,4, 123,5, 123,3, 121,8, 121,5, 111,8, 104,7, 52,2, 37,3, 28,1, 22,7, 22,7; (iv) временем удерживания в жидкостной хроматографии высокого давления (HPLC) приблизительно 10-20 минут на обращенно-фазовой колонке для HPLC C-18 с использованием вода:ацетонитрил (CHCN) с градиентной системой растворителей и УФ обнаружением при 210 нм; (v) полосами УФ поглощения при приблизительно 226, 275,327 нм;
1
13
3
(B) соединение, имеющее оксазолил-бензильную структуру, содержащую по меньшей мере одну бензильную группировку, по меньшей мере одну оксазольную группировку, по меньшей мере одну замещенную алкильную группу и по меньшей мере одну амидную группу; по меньшей мере 15 атомов углерода и по меньшей мере 2 атома кислорода, по меньшей мере 2 атома азота; и по меньшей мере одну из следующих характеристик: (i) молекулярную массу приблизительно 240-290, определенную при помощи жидкостной хроматографии/масс-спектрометрии (LC/MS); (ii) значения δ в H ЯМР при приблизительно 7,08, 7,06, 6,75, 3,75, 2,56, 2,15, 0,93, 0,93; (iii) значения δ в С ЯМР 158,2, 156,3, 155,5, 132,6, 129,5, 129,5, 127,3. 121,8, 115,2, 115,2, 41,2, 35,3, 26,7, 21,5, 21,5; (iv) время удерживания в жидкостной хроматографии высокого давления (HPLC) приблизительно 6-15 минут, на обращенно-фазовой колонке для HPLC C-18 с использованием градиента вода:ацетонитрил (CHCN) и (v) Полосы поглощения в УФ при приблизительно 230, 285, 323 нм;
1
13
3
28
45
10
(C) отличающееся от эпоксида соединение, содержащее по меньшей мере одну сложноэфирную, по меньшей мере одну амидную, по меньшей мере три метиленовые группы, по меньшей мере одну тетрагидропиранозную группировку и по меньшей мере три олефиновые двойные связи, по меньшей мере шесть метильных групп, по меньшей мере три гидроксильные группы, по меньшей мере двадцать пять атомов углерода, по меньшей мере восемь атомов кислорода и один атом азота, и по меньшей мере одну из следующих характеристик: (i) молекулярную массу приблизительно 530-580, определенную при помощи жидкостной хроматографии/масс-спектрометрии (LC/MS); (ii) значения δ в H ЯМР 6,40, 6,39, 6,00, 5,97, 5,67, 5,54, 4,33, 3,77, 3,73, 3,70, 3,59, 3,47, 3,41, 2,44, 2,35, 2,26, 1,97, 1,81, 1,76, 1,42, 1,37, 1,16, 1,12, 1,04; (iii) значения δ в С ЯМР 173,92, 166,06, 145,06, 138,76, 135,71, 129,99, 126,20, 123,35, 99,75, 82,20, 78,22, 76,69, 71,23, 70,79, 70,48, 69,84, 60,98, 48,84, 36,89, 33,09, 30,63, 28,55, 25,88, 20,37, 18,11, 14,90, 12,81, 9,41; (iv) время удерживания в жидкостной хроматографии высокого давления (HPLC) приблизительно 7-12 минут, на обращенно-фазовой колонке для HPLC C-18 с использованием вода:ацетонитрил (CHCN) с градиентной системой растворителей и УФ обнаружением при 210 нм; (v) молекулярную формулу CHNO, определенную путем интерпретации ESIMS (масс-спектрометрия с ионизацией путем распыления электронов) и анализа данных ЯМР; (vi) полосы УФ поглощения при приблизительно 210-450 нм;
13
1
28
45
9
3
(D) соединение, содержащее (i) по меньшей мере одну сложноэфирную, по меньшей мере одну амидную, эпоксидную метиленовую группу, по меньшей мере одну тетрагидропиранозную группировку и по меньшей мере три олефиновые двойные связи, по меньшей мере шесть метильных групп, по меньшей мере три гидроксильные группы, по меньшей мере 25 атомов углерода, по меньшей мере 8 атомов кислорода и по меньшей мере 1 атом азота, (ii) значения δ в С ЯМР 174,03, 166,12, 143,63, 137,50, 134,39, 128,70, 126,68, 124,41, 98,09, 80,75, 76,84, 75,23, 69,87, 69,08, 68,69, 68,60, 48,83, 41,07, 35,45, 31,67, 29,19, 27,12, 24,55, 19,20, 18,95, 13,48, 11,39, 8,04, (iii) молекулярную формулу CHNO и по меньшей мере одну из характеристик: (i) значения δ в H ЯМР при приблизительно 6,41, 6,40, 6,01, 5,97, 5,67, 5,55, 4,33, 3,77, 3,75, 3,72, 3,64, 3,59, 3,54, 3,52, 2,44, 2,34, 2,25, 1,96, 1,81, 1,76, 1,42, 1,38, 1,17, 1,12, 1,04; (ii) время удерживания в жидкостной хроматографии высокого давления (HPLC) приблизительно 6-15 минут, на обращенно-фазовой колонке для HPLC С-18 с использованием градиента вода:ацетонитрил (CHCN); (iii) полоса УФ поглощения при приблизительно 210-450 нм и конкретней при приблизительно 234 нм.
В конкретном воплощении предложены соединения, включающие без ограничения:
(А) соединение, имеющее структуру ##STR001##
или его пестицидно приемлемую соль или стереоизомеры, где М равен 1, 2, 3 или 4; n равен 0, 1, 2, или 3; p и q независимо равны 1 или 2; X представляет собой О, NH или NR; R1, R2 и R3 являются одинаковыми или отличающимися и независимо представляют собой боковую группировку аминокислоты или производное боковой цепи аминокислоты и R представляет собой низшую алкильную, арильную или арилалкильную группировку;
(В) соединение, имеющее структуру ##STR002##
1
1
1
10
1
2
где каждый из X, Y и Z независимо представляет собой --О, --NR, или --S, где R представляет собой --Н или C-Cалкил; каждый из R, R и m независимо представляет собой --Н, алкил, замещенный алкил, алкенил, замещенный алкенил, алкинил, замещенный алкинил, арил, замещенный арил, гетероарил, замещенный гетероарил, гетероциклическую группу, замещенную гетероциклическую группу, циклоалкил, замещенный циклоалкил, алкокси, замещенную алкокси, тиоалкил, замещенный тиоалкил, гидрокси, галоген, амино, амидо, карбоксил, --С(O)Н, ацил, оксиацил, карбамат, сульфонил, сульфонамид или сульфурил и "m" может располагаться где угодно на оксазольном кольце;
(С) соединение, имеющее структуру ##STR002a##
1
1
10
2
где R представляет собой --Н или C-Салкил; R представляет собой алкильный сложный эфир;
(D) соединение, имеющее структуру ##STR003##
1
1
1
10
1
2
где: каждый из Х и Y независимо представляет собой --ОН, --NR, или --S, где R представляет собой --Н или C-Салкил; каждый из R, R и m, заместитель на оксазольном кольце, независимо представляет собой --Н, алкил, замещенный алкил, алкенил, замещенный алкенил, алкинил, замещенный алкинил, арил, замещенный арил, гетероарил, замещенный гетероарил, гетероциклическую группу, замещенную гетероциклическую группу, циклоалкил, замещенный циклоалкил, алкокси, замещенную алкокси, тиоалкил, замещенный тиоалкил, гидрокси, галоген, амино, амидо, карбоксил, --С(O)Н, ацил, оксиацил, карбамат, сульфонил, сульфонамид или сульфурил;
(Е) соединение, имеющие структуру ##STR003a##
1
1
10
где R представляет собой --Н или C-Салкил;
(F) соединение, имеющее структуру ##STR004a##
1
10
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
где каждый из X, Y и Z независимо представляет собой -О, -NR, или -S, где R представляет собой Н или C-Салкил; каждый из R, R, R, R, R, R, R, R, R, R, R, R и R независимо представляет собой Н, алкил, замещенный алкил, алкенил, замещенный алкенил, алкинил, замещенный алкинил, арил, замещенный арил, гетероарил, замещенный гетероарил, гетероциклическую группу, замещенную гетероциклическую группу, циклоалкил, замещенный циклоалкил, алкокси, замещенную алкокси, тиоалкил, замещенный тиоалкил, гидрокси, галоген, амино, амидо, карбоксил, -С(O)Н, ацил, оксиацил, карбамат, сульфонил, сульфонамид или сульфурил.
(G) соединение, имеющее структуру ##STR004b##
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
где каждый из R, R, R, R, R, R, R, R, R, R, R, R и Rнезависимо представляет собой Н, алкил, замещенный алкил, алкенил, замещенный алкенил, алкинил, замещенный алкинил, арил, замещенный арил, гетероарил, замещенный гетероарил, гетероциклическую группу, замещенную гетероциклическую группу, циклоалкил, замещенный циклоалкил, алкокси, замещенную алкокси, тиоалкил, замещенный тиоалкил, гидрокси, галоген, амино, амидо, карбоксил, -С(O)Н, ацил, оксиацил, карбамат, сульфонил, сульфонамид, или сульфурил;
(Н) соединение, имеющее структуру ##STR004c##
1
2
3
4
5
6
7
8
11
где каждый из R, R, R, R, R, R, R, R, R независимо представляет собой Н, алкил, замещенный алкил, алкенил, замещенный алкенил, алкинил, замещенный алкинил, арил, замещенный арил, гетероарил, замещенный гетероарил, гетероциклическую группу, замещенную гетероциклическую группу, циклоалкил, замещенный циклоалкил, алкокси, замещенную алкокси, тиоалкил, замещенный тиоалкил, гидрокси, галоген, амино, амидо, карбоксил, -С(O)Н, ацил, оксиацил, карбамат, сульфонил, сульфонамид или сульфурил;
(I) соединение, имеющее структуру ##STR005##
1
1
2
1
10
где каждый из Х и Y независимо представляет собой --ОН, --NR, или --S, где каждый из R, R независимо представляет собой --Н, алкил (например C-Салкил), замещенный алкил, алкенил, замещенный алкенил, алкинил, замещенный алкинил, арил, замещенный арил, гетероарил, замещенный гетероарил, гетероциклическую группу, замещенную гетероциклическую группу, циклоалкил, замещенный циклоалкил, алкокси, замещенную алкокси, тиоалкил, замещенный тиоалкил, гидрокси, галоген, амино, амидо, карбоксил, --C(O)Н, ацил, оксиацил, карбамат, сульфонил, сульфонамид или сульфурил;
(J) соединение, имеющее структуру ##STR006a##
1
10
1
2
3
4
5
6
7
8
11
12
13
где каждый из X, Y и Z независимо представляет собой -О, -NR, или -S, где R представляет собой Н или C-Cалкил; каждый из R, R, R, R, R, R, R, R, R, R и R независимо представляет собой Н, алкил, замещенный алкил, алкенил, замещенный алкенил, алкинил, замещенный алкинил, арил, замещенный арил, гетероарил, замещенный гетероарил, гетероциклическую группу, замещенную гетероциклическую группу, циклоалкил, замещенный циклоалкил, алкокси, замещенную алкокси, тиоалкил, замещенный тиоалкил, гидрокси, галоген, амино, амидо, карбоксил, -С(0)Н, ацил, оксиацил, карбамат, сульфонил, сульфонамид или сульфурил.
В конкретном воплощении соединения могут включать без ограничения:
(i) темплазол А;
(ii) темплазол В;
(iii) темпламид А;
(iv) темпламид В;
(v) FR90128;
(vi)
(vii)
(viii)
(ix)
(x)
(xi)
(xii)
(xvi)
(xv)
(xvi)
(xxii)
(xviii)
(xix)
(xx)
(xxi)
(xxii)
(xxiii)
(xl) FR901465
Также предложены способы получения вышеприведенных соединений. В частности, в способе осуществляют выращивание раскрытого здесь штамма Burkholderia и продукцию соединения. Также предложен способ выделения этих соединений путем выделения соединения(ий), продуцируемых штаммом Burkholderia, при котором выделяют соединения, продуцируемые из супернатанта культуры указанного штамма Burkholderia.
Дополнительно предложена комбинация, содержащая (а) первое вещество, выбранное из группы, состоящей из (1) чистой культуры, клеточной фракции или супернатанта, полученного из представленного выше штамма Burkholderia или его экстракта для применения возможно в качестве пестицида; (2) одного или более чем одного приведенного выше соединения (б) возможно второе вещество, где указанное второе вещество представляет собой химический или биологический пестицид, и (в) возможно по меньшей мере одно вещество, выбранное из носителя, разбавителя, поверхностно-активного вещества, адъюванта или пестицида. В конкретном воплощении комбинация представляет собой композицию. В связанном аспекте здесь предложено семя, покрытое указанной композицией.
В связанном аспекте здесь раскрыт способ модулирования заражения растения вредителями, при котором применяют в отношении растения и/или его семян, и/или субстрата, используемого для роста указанного растения, и/или способ модулирования появления и/или роста однодольных, осоковых или двудольных сорняков, при котором применяют в отношении указанного сорняка или почвы количество:
(I) (а) выделенных представленных выше соединений и (b) возможно еще одного вещества, где указанное вещество представляет собой пестицид (например, нематоцид, гербицид, фунгицид, инсектицид) или
(II) композицию или комбинацию, представленную выше
в количестве, эффективном для модулирования заражения вредителями и/или появления или роста однодольных, осоковых или двудольных сорняков.
В еще одном связанном аспекте предложено применение штаммов, культур, экстрактов, супернатантов, комбинаций, перечисленных выше соединений для модулирования заражения вредителями растений, при котором применение осуществляют в отношении растения и/или их семян, и/или субстрата, используемого для выращивания указанного растения, и/или способ для модулирования появления и/или роста однодольных, осоковых или двудольных сорняков.
Краткое описание графических материалов
Фиг.1 демонстрирует сравнение скорости роста Burkholderia A396 и Burkholderia multivorans ATCC 17616.
Фиг.2 демонстрирует действие экстракта Burkholderia A396 на вьюнок. Фиг.3 демонстрирует действие экстракта Burkholderia A396 на амарант.Фиг.4 демонстрирует действие экстракта Burkholderia A396 на совку ни (Tricoplusia ni).
Фиг.5 демонстрирует действие культурального бульона Burkholderia A396 на совку малую (Spodoptera exigua).
Фиг.6 демонстрирует действие культурального бульона Burkholderia
A396 на подвижность ювенильных клубеньковых нематод (Meloidogyne incognita).
Фиг.7 представляет собой схематическое представление способа очистки для получения соединений темплазола и темпламида.
Фиг.8 демонстрирует результаты анализа in vitro для тестирования фунгицидного действия FR90128 на Botrytis cinerea (слева) и Phytophtora sp. (справа).
Фиг.9 демонстрирует действие культурального бульона Burkholderia А396 на средний индекс галлов (% относительно контроля) корней огурца сорта Toschka, инокулированных 3000 яйцами Meloidogyne sp.через 14 суток после инокуляции и применения.
Фиг.10 Действие культурального бульона Burkholderia A396 на средний индекс галлов корней огурца сорта Toschka, инокулированных 3000 яйцами Meloidogyne sp.через 14 суток после инокуляции и применения.
Подробное описание воплощений
Хотя вышеприведенные композиции и способы могут быть подвергнуты различным модификациям и альтернативным формам, примеры воплощений здесь будут описаны подробно. Тем не менее, понятно, не предполагается ограничение изобретения конкретными раскрытыми формами, а наоборот, изобретение охватывает все модификации, эквиваленты и альтернативы, оказывающиеся в пределах сущности и объема изобретения, определенных в формуле изобретения.
Когда предложен диапазон значений, понятно, что здесь включено каждое промежуточное значение до десятой доли единицы нижнего предела, если в контексте ясно не указано иное, расположенное между верхним и нижним пределом диапазона, и любое иное указанное или промежуточное значение в указанном диапазоне. Меньшие диапазоны также включены. Здесь также включены верхний и нижний пределы этих меньших диапазонов, подчиняющиеся любому специфически исключаемому пределу в указанном диапазоне.
Если не определено иное, то все используемые здесь технические и научные термины имеют то же самое значение, которое обычно понимают любой из специалистов в данной области техники, к которой относится данное изобретение. Хотя любые способы и материалы, похожие или эквивалентные описанным здесь, также могут быть использованы при практической реализации изобретения или тестировании настоящего изобретения, здесь описаны предпочтительные способы и материалы.
Следует отметить, что используемые здесь и в формуле изобретения формы единственного числа также включают обозначение множественного числа, если в контексте ясно не указано иное.
Определенный здесь термин "происходят из" обозначает непосредственно выделенный или полученный из конкретного источника или альтернативно обладающий идентифицирующими характеристиками вещества или организма, выделенного или полученного из конкретного источника.
Определенное здесь "выделенное соединение" по существу не содержит другие соединения или вещества, например, является по меньшей мере приблизительно на 20% чистым, предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 40% чистым, более предпочтительно приблизительно на 60% чистым, еще более предпочтительно приблизительно на 80% чистым, наиболее предпочтительно приблизительно на 90% чистым, и наиболее предпочтительно приблизительно на 95% чистым, что определяестя при помощи аналитических способов, включающих без ограничения хроматографические способы, электрофоретические способы.
Используемый здесь термин "алкил" относится к одноцепочечной или разветвленной углеводородной группе, имеющей от одного до приблизительно 12 атомов углерода, включающих метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, трет-бутил, н-гексил и т.п.
Используемый здесь термин "замещенный алкил" относится к алкильным группам, дополнительно несущим один или более чем один заместитель, выбранный из гидрокси, алкокси, меркапто, циклоалкила, замещенного циклоалкила, гетероциклической, замещенной гетероциклической, арила, замещенного арила, гетероарила, замещенного гетероарила, арилокси, замещенной арилокси, галогена, циано, нитро, амино, амидо, -C(O)H, ацила, оксиацила, карбоксила, сульфонила, сульфонамида, сульфурила и т.п.
Используемый здесь термин "алкенил" относится к прямоцепочечным или разветвленным гидрокарбильным группам, имеющим одну или более чем одну углерод-углеродную двойную связь, и имеющим приблизительно от 2 до 12 атомов углерода, и "замещенный алкенил" относится к алкенильным группам, дополнительно несущим один или более чем один заместитель, представленный выше.
Используемый здесь термин "алкинил" относится к прямоцепочечным или разветвленным гидрокарбильным группам, имеющим по меньшей мере одну углерод-углеродную тройную связь, и имеющим от приблизительно 2 до 12 атомов углерода, и "замещенный алкинил" относится к алкинильным группам, дополнительно несущим один или более чем один заместитель, представленный выше.
Используемый здесь термин "арил" относится к ароматическим группам, имеющим от 6 до 14 атомов углерода, и "замещенный арил" относится к арильным группам, дополнительно несущим один или более чем один заместитель, представленный выше.
Используемый здесь термин "гетероарил" относится к ароматическим кольцам, содержащим один или более чем один гетероатом (например N, О, S, и т.п.) как часть кольцевой структуры, и имеющим от 3 до 14 атомов углерода, и "замещенный гетероарил" относится к гетероарильным группам, дополнительно несущим один или более чем один заместитель, представленный выше.
Используемый здесь термин "алкокси" относится к группировке --O-алкил-, где алкил является таким, как определено выше, и "замещенная алкокси" относится к алкоксильным группам, дополнительно несущим один или более чем один заместитель, представленный выше.
Используемый здесь термин "тиоалкил" относится к группировке --S-алкил-, где алкил является таким, как определено выше, и "замещенный тиоалкил" относится к тиоалкильным группам, дополнительно несущим один или более чем один заместитель, представленный выше.
Используемый здесь термин "циклоалкил" относится к содержащим кольцо алкильным группам, содержащим от приблизительно 3 до 8 атомов углерода, и "замещенный циклоалкил" относится к циклоалкильным группам, дополнительно несущим один или более чем один заместитель, представленный выше.
Используемый здесь термин "гетероциклическая" относится к циклическим (т.е. содержащим кольцо) группам, содержащим один или более чем один гетероатом (например, N, О, S и т.п) как часть кольцевой структуры, и имеющим от 3 до 14 атомов углерода, и "замещенная гетероциклическая" относится к гетероциклическим группам, дополнительно несущим один или более чем один заместитель, представленный выше.
Штамм Burkholderia
Представленный здесь штамм Burkholderia отличается от комплекса Burkholderia cepacia, отличается от Burkholderia plantari, отличается от Burkholderia gladioli, Burkholderia sp и не является патогенным в отношении позвоночных животных, таких как птицы, млекопитающие и рыбы. Этот штамм может быть выделен из образца почвы с использованием способов, известных в области техники и описанных Lorch et al., 1995. Штамм Burkholderia может быть выделен из множества отличающихся типов почвы или ростовой среды. Образец затем высевают на картофельно-декстрозном агаре (PDA). Бактерии являются грамотрицательными и образуют округлые непрозрачные колонии кремового цвета, который меняется на розовый и розово-коричневый и слизеподобный или вязкий с течением времени.
Колонии выделяют из планшет с картофельно-декстрозным агаром и отбирают колонии, обладающие биологическими, генетическими, биохимическими и/или энзиматическими характеристиками штамма Burkholderia по настоящему изобретению, изложенными в нижеприведенных примерах. В частности, штамм Burkholderia имеет ген 16S рРНК, содержащий прямую последовательность, которая, по меньшей мере приблизительно на 99,0%, предпочтительно приблизительно на 99,5%, более предпочтительно приблизительно на 99,9%, и наиболее предпочтительно приблизительно на 100% идентична последовательности, представленной в SEQ ID NO: 8, 11 и 12, и прямую последовательность, которая по меньшей мере приблизительно на 99,0%, предпочтительно приблизительно на 99,5%, более предпочтительно приблизительно на 99,9% и наиболее предпочтительно приблизительно на 100% идентична последовательности, представленной в SEQ ID NO: 9, 10, 13, 14 и 15, определенной при помощи программного обеспечения Clustal. Кроме того, как представлено ниже, этот штамм Burkholderia может, как представлено ниже, обладать пестицидной активностью, в частности, вироцидной, гербицидной, гермицидной, фунгицидной, нематицидной, бактерицидной и инсектицидной и конкретней, гербицидной, инсектицидной, фунгицидной и нематицидной активностью. Он не патогенен для позвоночных животных, таких как млекопитающие, птицы, и рыбы.
Дополнительно, штамм Burkholderia продуцирует по меньшей мере пестицидные соединения, представленные в данном описании.
Штамм Burkholderia чувствителен к канамицину, хлорамфениколу, ципрофлоксацину, пиперациллину, имипенему и комбинации сульфаметоксазола и триметоприма, и содержит жирные кислоты 16:0, цикло 17:0, 16:0 3-ОН, 14:0, цикло 19:0, 18:0.
Этот штамм Burkholderia может быть получен путем культивирования микроорганизма, обладающего идентифицирующими характеристиками Burkholderia A396 (NRRL Accession No. B-50319), на картофельно-декстрозном агаре (PDA) или в ферментирующей среде, содержащей определенные источники углерода, такие как глюкоза, мальтоза, фруктоза, галактоза и неопределенные источники азота, такие как пептон, триптон, сойтон и NZ амин.
Пестицидные соединения
1
13
1
13
13
1
3
3
3
3
3
24
36
4
6
2
Раскрытое здесь пестицидное соединение может обладать следующими свойствами: (а) получено из новых видов рода Burkholderia, например, A396; (b) в частности, токсично для большинства обычных сельскохозяйственных вредителей-насекомых; (с) обладает молекулярной массой приблизительно 525-555 и конкретней, 540, определенной при помощи жидкостной хроматографии/масс-спектрометрии (LC/MS); (d) обладает значениями δ H ЯМР 6,22, 5,81, 5,69, 5,66, 5,65, 4,64, 4,31, 3,93, 3,22, 3,21, 3,15, 3,10, 2,69, 2,62, 2,26, 2,23, 1,74, 1,15, 1,12, 1,05, 1,02; (d) обладает значениями δ C ЯМР 172,99, 172,93, 169,57, 169,23, 167,59, 130,74, 130,12, 129,93, 128,32, 73,49, 62,95, 59,42, 57,73, 38,39, 38,00, 35,49, 30,90, 30,36, 29,26, 18,59, 18,38, 18,09, 17,93, 12,51 (е) обладает временем удерживания в жидкостной хроматографии высокого давления (HPLC) приблизительно 10-15 минут, конкретней приблизительно 12 минут и конкретней приблизительно 12,14 мин на обращенно-фазовой колонке С-18 HPLC (Phenomenex, Luna 5µ C18 (2) 100А, 100×4,60 мм) с использованием вода:ацетонитрил (CHCN) с градиентной системой растворителей (0-20 мин 90-0% водный CHCN, 20-24 мин 100% CHCN, 24-27 мин, 0-90% водный CHCN, 27-30 мин 90% водный CHCN) со скоростью 0,5 мл/мин и УФ обнаружением при 210 нм (f) обладает молекулярной формулой CHNOS, которую определяют путем интерпретации данных H, C ЯМР и LC/MS (g) спектром C ЯМР с сигналами для всех 24 атомов углерода, включая 5 метил, 4 метилен, 9 метин и 6 четвертичных атомов углерода и (g) спектром H ЯМР, отображающим характеристики типичного депсипептида, иллюстрирующим три амино протона [4,63, 4,31, 3,93], и один протон сложноэфирного карбинола [5,69]. В конкретном воплощении соединение имеет структуру ##STR001##:
или его пестицидно приемлемая соль или стереоизомеры, где М равен 1, 2, 3 или 4; n равен 0, 1, 2 или 3; p и q независимо равны 1 или 2; X представляет собой O, NH или NR; R1, R2 и R3 являются одинаковыми или отличаются, и независимо представляют собой боковую группировку аминокислоты или производное боковой группы аминокислоты, и R представляет собой низшую алкильную, арильную или арилалкильную группировку.
В еще более конкретном воплощении соединение имеет структуру FR90128:
В настоящем изобретении предложены соединения, представленные ##STR002##:
1
1
1
10
1
2
где: каждый из X, Y и Z независимо представляет собой --О, --NR, или --S, где R представляет собой --Н или C-Cалкил; каждый из R, R и m независимо представляет собой --Н, алкил, замещенный алкил, алкенил, замещенный алкенил, алкинил, замещенный алкинил, арил, замещенный арил, гетероарил, замещенный гетероарил, гетероциклическую группу, замещенную гетероциклическую группу, циклоалкил, замещенный циклоалкил, алкокси, замещенную алкокси, тиоалкил, замещенный тиоалкил, гидрокси, галоген, амино, амидо, карбоксил, --С(O)Н, ацил, оксиацил, карбамат, сульфонил, сульфонамид или сульфурил.
В еще одном конкретном воплощении соединения семейства ##STR002## могут представлять собой соединения, изложенные в (vi)-(xix).
Они происходят из природных материалов или соединений, полученных из коммерческих источников или путем химического синтеза. Природные источники соединений семейства ##STR002## включают без ограничения микроорганизмы, водоросли и губки. В более конкретном воплощении микроорганизмы, которые включают соединения семейства ##STR002##, включают без ограничения, или альтернативно, соединения семейства ##STR002## могут происходить из видов, таких как Streptoverticillium waksmanii (соединение 6) (Umehara, et al„ 1984), Streptomyces pimprina (соединение 7) (Naiket at., 2001), Streptoverticillium olivoreticuli (соединения 8, 9, 10) (Koyama Y., et al., 1981), Streptomyces sp (соединения 11, 12) (Watabe et al, 1988), Pseudomonas syringae (соединения 13, 14) (Pettit et al., 2002). Семейство соединений ##STR002## также может быть получено из водорослей, включающих без ограничения красные водоросли (соединение xv) (N'Diaye, et al., 1996), красные водоросли Martensia fragilis (соединение xvi) (Takahashi S. et al., 1998), Diazona chinensis (соединения xvii и xviii) (Lindquist N. et al., 1991), Rhodophycota haraldiophyllum sp (соединение xix) (Guella et al., 1994). Также предложено ##STR003##:
1
1
1
10
1
2
где: каждый из X и Y независимо представляет собой --ОН, --NR, или --S, где R представляет собой --Н или C-Cалкил; R, R и m, заместитель на оксазольном кольце, каждый независимо представляет собой --Н, алкил, замещенный алкил, алкенил, замещенный алкенил, алкинил, замещенный алкинил, арил, замещенный арил, гетероарил, замещенный гетероарил, гетероциклическую группу, замещенную гетероциклическую группу, циклоалкил, замещенный циклоалкил, алкокси, замещенную алкокси, тиоалкил, замещенный тиоалкил, гидрокси, галоген, амино, амидо, карбоксил, --C(O)H, ацил, оксиацил, карбамат, сульфонил, сульфонамид или сульфурил.
Также предложен ##STR005##:
1
1
2
1
10
где каждый из Х и Y независимо представляет собой --OH, --NR или --S, где каждый из R, R независимо представляет собой -Н, алкил (например, C-Cалкил), замещенный алкил, алкенил, замещенный алкенил, алкинил, замещенный алкинил, арил, замещенный арил, гетероарил, замещенный гетероарил, гетероциклическую группу, замещенную гетероциклическую группу, циклоалкил, замещенный циклоалкил, алкокси, замещенную алкокси, тиоалкил, замещенный тиоалкил, гидрокси, галоген, амино, амидо, карбоксил, --C(O)H, ацил, оксиацил, карбамат, сульфонил, сульфонамид или сульфурил.
В конкретном воплощении соединения семейства ##STR005##, такие как соединения xx-xxiii, изложенные ниже, могут происходить из природных или коммерческих источников, или путем химического синтеза:
(xx)
(xxi)
(xxii)
(xxiii)
Природные источники соединений семейства ##STR005## включают без ограничения растения, кораллы, микроорганизмы и губки. Микроорганизмы включают без ограничения Streptomyces griseus (соединение xx) (Hirota et al., 1978), Streptomyces albus (соединение xxi) (Werner et al., 1980). Соединения семейства STR004 также могут происходить из водорослей, включающих без ограничения Haraldiophyllum sp (соединение xxii) (Guella et al., 2006), и красные водоросли (соединение xxiii) (N'Diaye et al., 1994).
В одном из воплощений соединение может происходить из или получено из микроорганизма, и в частности из видов рода Burkholderia и охарактеризовано как имеющее структуру, содержащую по меньшей мере один сложный эфир, по меньшей мере один амид, по меньшей мере три метиленовые группы, по меньшей мере одну тетрагидропиранозную группировку и по меньшей мере три олефиновые двойные связи, по меньшей мере шесть метильных групп, по меньшей мере три гидроксильные группы, по меньшей мере двадцать пять атомов углерода и по меньшей мере восемь атомов кислорода и один атом азота. Соединение дополнительно обладает по меньшей мере одной из следующих характеристик:
(a) пестицидными свойствами и в частности, нематицидными, фунгицидными, инсектицидными и гербицидными свойствами;
(b) молекулярной массой приблизительно 530-580 и конкретней, 555, определенной при помощи жидкостной хроматографии/масс-спектрометрии (LC/MS);
1
(c) значениями H ЯМР δ 6,40, 6,39, 6,00, 5,97, 5,67, 5,54, 4,33, 3,77, 3,73, 3,70, 3,59, 3,47, 3,41, 2,44, 2,35, 2,26, 1,97, 1,81, 1,76, 1,42, 1,37, 1,16, 1,12, 1,04;
13
(d) значениями C ЯМР δ 173,92, 166,06, 145,06, 138,76, 135,71, 129,99, 126,20, 123,35, 99,75, 82,20, 78,22, 76,69, 71,23, 70,79, 70,48, 69,84, 60,98, 48,84, 36,89, 33,09, 30,63, 28,55, 25,88, 20,37, 18,11, 14,90, 12,81, 9,41;
3
3
3
3
3
(e) временем удерживания в жидкостной хроматографии высокого давления (HPLC) приблизительно 7-12 минут, конкретней приблизительно 10 минут и конкретней приблизительно 10,98 мин на обращенно-фазовой колонке С-18 HPLC (Phenomenex, Luna 5р С18(2) 100 А, 100×4,60 мм) с использованием вода:ацетонитрил (CHCN) с градиентной системой растворителей (0-20 мин; 90-0% водный CHCN, 20-24 мин; 100% CHCN, 24-27 мин; 0-90% водный CHCN, 27-30 мин; 90% водный CHCN) при скорости потока 0,5 мл/мин и УФ обнаружении при 210 нм;
13
2
(f) спектром C ЯМР, который демонстрирует 28 отдельных сигналов углерода, которые могут быть отнесены к шести метилам, четырем метиленовым атомам углерода, и тринадцати метинам, включающим пять sp, четыре четвертичные атомы углерода;
28
45
10
(g) молекулярной формулой CHNO, которую определяли путем интерпретации ESIMS и анализа данных ЯМР;
(h) полосами поглощения в УФ при приблизительно 210-450 нм и в частности при приблизительно 234 нм.
Также предложены соединения, имеющие структуру ##STR004a##:
1
1
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
где каждый из X, Y и Z независимо представляет собой -О, -NR, или -S, где R представляет собой Н или C-Cалкил; каждый из R, R, R, R, R, R, R, R, R, R, R, R и R независимо представляет собой Н, алкил, замещенный алкил, алкенил, замещенный алкенил, алкинил, замещенный алкинил, арил, замещенный арил, гетероарил, замещенный гетероарил, гетероциклическую группу, замещенную гетероциклическую группу, циклоалкил, замещенный циклоалкил, алкокси, замещенную алкокси, тиоалкил, замещенный тиоалкил, гидрокси, галоген, амино, амидо, карбоксил, -C(O)H, ацил, оксиацил, карбамат, сульфонил, сульфонамид или сульфурил.
В конкретном воплощении соединение имеет структуру, представленную в ##STR004b##:
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
где R, R, R, R, R, R, R, R, R, R, R, R и R являются такими как определено ранее для ##STR004a##.
В более конкретном воплощении соединение представляет собой темпламид А, имеющий следующую структуру:
В еще одном воплощении предложено соединение, имеющее формулу ##STR004c##:
4
2
3
4
5
6
7
8
11
где R, R, R, R, R, R, R, R, и R являются такими как ранее определено для ##STR004a##.
В еще одном воплощении предложено соединение, которое может происходить из видов рода Burkholderia и характеризоваться как имеющее структуру, содержащую по меньшей мере один сложный эфир, по меньшей мере один амид, эпоксидную метиленовую группу, по меньшей мере одну тетрагидропиранозную группировку и по меньшей мере три олефиновые двойные связи, по меньшей мере шесть метильных групп, по меньшей мере три гидроксильные группы, по меньшей мере 25 атомов углерода и по меньшей мере 8 атомов кислорода и 1 атом азота, и обладающее пестицидной активностью соединение дополнительно обладает по меньшей мере одной из следующих характеристик:
(a) пестицидными свойствами, и в частности, инсектицидными, фунгицидными, нематоцидными и гербицидными свойствами;
(b) молекулярной массой приблизительно 520-560 и, в частности, 537, определенной при помощи жидкостной хроматографии/масс-спектрометрии (LC/MS);
1
(c) значениями H ЯМР δ при приблизительно 6,41, 6,40, 6,01, 5,97, 5,67, 5,55, 4,33, 3,77, 3,75, 3,72, 3,64, 3,59, 3,54, 3,52, 2,44, 2,34, 2,25, 1,96, 1,81, 1,76, 1,42, 1,38, 1,17, 1,12, 1,04;
13
(d) значениями C ЯМР δ 174,03, 166,12, 143,63, 137,50, 134,39, 128,70, 126,68, 124,41, 98,09, 80,75, 76,84, 75,23, 69,87, 69,08, 68,69, 68,60, 48,83, 41,07, 35,45, 31,67, 29,19, 27,12, 24,55, 19,20, 18,95, 13,48, 11,39, 8,04;
3
3
3
3
3
3
(e) Временем удерживания в жидкостной хроматографии высокого давления (HPLC) приблизительно 6-15 минут, конкретней приблизительно 8 минут на обращенно-фазовой колонке для HPLC C-18 с использованием градиента вода:ацетонитрил (CHCN), в частности, временем удерживания в жидкостной хроматографии высокого давления (HPLC) приблизительно 8-15 минут, конкретней приблизительно 11 минут и конкретней приблизительно 11,73 мин на обращенно-фазовой колонке C-18 HPLC (Phenomenex, Luna 5µ С18(2) 100 А, 100×4,60 мм) с использованием вод а:ацето нитрил (CHCN) с градиентной системой растворителей (0-20 мин; 90-0% водный CHCN, 20-24 мин; 100% CHCN, 24-27 мин; 0-90% водный CHCN, 27-30 мин; 90% водный CHCN) при скорости потока 0,5 мл/мин и УФ обнаружением при 210 нм;
28
43
9
(f) молекулярной формулой CHNO, которую определяли путем интерпретации ESIMS и анализа данных ЯМР;
(g) полосами поглощения в УФ при приблизительно 210-450 нм и в частности при приблизительно 234 нм.
В конкретном воплощении соединение имеет структуру ##STR006a##:
1
10
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
где каждый из X, Y и Z независимо представляет собой -О, -NR, или -S, где R представляет собой Н или C-Cалкил; каждый из R, R, R, R, R, R, R, R, R, R, R, R и R независимо представляет собой Н, алкил, замещенный алкил, алкенил, замещенный алкенил, алкинил, замещенный алкинил, арил, замещенный арил, гетероарил, замещенный гетероарил, гетероциклическую группу, замещенную гетероциклическую группу, циклоалкил, замещенный циклоалкил, алкокси, замещенную алкокси, тиоалкил, замещенный тиоалкил, гидрокси, галоген, амино, амидо, карбоксил, -C(O)H, ацил, оксиацил, карбамат, сульфонил, сульфонамид или сульфурил.
В конкретном воплощении соединение имеет структуру:
В еще одном воплощении предложено соединение, имеющее формулу ##STR006b##:
1
2
3
4
5
6
7
8
11
где R, R, R, R, R, R, R, R, и R являются такими, как ранее определено для ##STR006a##.
В более конкретном воплощении соединение представляет собой темпламид В, имеющий следующую структуру;
В еще одном конкретном воплощении соединение может происходить из видов рода Burkholderia и характеризоваться, как имеющее структуру, содержащую по меньшей мере одну сложноэфирную, по меньшей мере одну амидную, эпоксидную метиленовую группу, по меньшей мере одну тетрагидропиранозную группировку и по меньшей мере три олефиновые двойные связи, по меньшей мере шесть метильных групп, по меньшей мере три гидроксильные группы, по меньшей мере 25 атомов углерода и по меньшей мере 8 атомов кислорода и по меньшей мере 1 атом азота. Соединение дополнительно обладает по меньшей мере одной из следующих характеристик:
(a) пестицидными свойствами и, в частности, инсектицидными, фунгицидными, нематицидными и гербицидными свойствами;
(b) молекулярной массой приблизительно 510-550 и, в частности, приблизительно 523, определенной при помощи жидкостной хроматографии/масс-спектрометрии (LC/MS);
1
(c) значениями H ЯМР δ при приблизительно 6,41, 6,40, 6,01, 5,98, 5,68, 5,56, 4,33, 3,77, 3,75, 3,72, 3,65, 3,59, 3,55, 3,50, 2,44, 2,26, 2,04, 1,96, 1,81, 1,75, 1,37, 1,17, 1,04;
13
(а) значениями C ЯМР δ 172,22, 167,55, 144,98, 138,94, 135,84, 130,14, 125,85, 123,37, 99,54, 82,19, 78,28, 76,69, 71,31, 70,13, 69,68, 48,83, 42,52, 36,89, 33,11, 30,63, 25,99, 21,20, 20,38, 18,14, 14,93, 12,84;
3
3
3
3
3
2
(е) временем удерживания в жидкостной хроматографии высокого давления (HPLC) приблизительно 6-15 минут, конкретней приблизительно 8 минут на обращенно-фазовой колонке для HPLC C-18 с использованием градиента вода:ацетонитрил (CHCN), в частности, временем удерживания в жидкостной хроматографии высокого давления (HPLC) приблизительно 8-15 минут, конкретней приблизительно 10 минут и конкретней приблизительно 10,98 мин на обращенно-фазовой колонке С-18 HPLC (Phenomenex, Luna 5 м С18(2) 100 А, 100×4,60 мм) с использованием вода:ацетонитрил (CHCN) с градиентной системой растворителей (0-20 мин; 90-0% водный CHCN, 20-24 мин; 100% CHCN, 24-27 мин; 0-90% водный CHCN, 27-30 мин; 90% водный CHCN) при скорости потока 0,5 мл/мин и УФ обнаружением при 210 нм;
27
41
9
(f) молекулярной формулой CHNO, которую определяли путем интерпретации ESIMS и анализа данных ЯМР;
(g) полосами поглощения в УФ при приблизительно 210-450 нм и, в частности, при приблизительно 234 нм.
В более конкретном воплощении соединение представляет собой известное соединение FR901465, которое выделили ранее из культурального бульона бактерии Pseudomonas sp.No. 2663 (Nakajima et al. 1996) и сообщалось о том, что оно обладает противоопухолевой активностью, имеющее следующее структуру:
В еще одном конкретном воплощении соединения семейства ##STR006a## могут представлять собой соединения, представленные в xxiv-xxxix. Они происходят из природных материалов или соединений, полученных из коммерческих источников, или путем химического синтеза. Природные источники соединений семейства ##STR006a## включают без ограничения микроорганизмы, водоросли и губки. В более конкретном воплощении микроорганизмы, которые включают соединения семейства ##STR006a##, могут происходить из видов, таких как Pseudomonas sp.No. 2663 (соединения xxiv-xxvi) (Nakajima et al„ 1996). Синтетические аналоги FR901464 (xxvii-xxxix) синтезированы и запатентованы как противоопухолевые соединения (смотри Koide et al., заявка на патент США 2008/0096879 А1).
Композиции
По существу чистая культура, клеточная фракция или супернатант и соединения, продуцируемые штаммом Burkholderia по настоящему изобретению, могут быть использованы для получения пестицидных композиций.
Вещества, представленные выше, могут быть приготовлены любым образом. Не ограничивающие объем изобретения примеры включают без ограничения эмульгируемые концентраты (ЕС), смачиваемые порошки (WP), растворимые жидкости (SL), аэрозоли, концентрируемые растворы в сверхмалом объеме (ULV), растворимые порошки (SP), микроинкапсуляции, диспергируемые в воде гранулы, жидкотекучие (FL), микроэмульсии (ME), наноэмульсии (NE) и т.д. В частности, концентрат, порошки, гранулы и эмульсии могут быть лиофилизированы. В любой из описанных здесь композиций процентная доля активного ингредиента находится в диапазоне от 0,01% до 99,99%.
Композиции могут находиться в форме жидкости, геля или твердого вещества. Жидкие композиции содержат пестицидные соединения, происходящие из указанного штамма Burkholderia, например штамма, обладающего идентифицирующими характеристиками Burkholderia A396 (NRRL Accession No. B-50319).
Твердая композиция может быть получена путем суспендирования твердого носителя в растворе пестицидных соединений и высушивания суспензии в мягких условиях, таких как упаривание при комнатной температуре или упаривание в вакууме при 65°C или меньшей температуре.
Композиция по изобретению может содержать инкапсулированные в геле соединения, происходящие из штамма Burkholderia по настоящему изобретению. Такие инкапсулированные в геле материалы могут быть получены путем смешивания гелеобразующего агента (например желатина, целлюлозы или лигнина) с раствором пестицидных соединений, используемых в способе по изобретению; и индукции образования геля агентом.
Композиция дополнительно может содержать поверхностно-активное вещество, используемое для эмульгирования, диспергирования, увлажнения, распределения, интеграции, контроля разрушения, стабилизации активных ингредиентов, и улучшения текучести или ингибирования коррозии. В конкретном воплощении поверхностно-активное вещество, не являющееся фитотоксичным, отличается от ионного поверхностно-активного вещества, которое предпочтительно относится к ЕРА List 4B. В еще одном конкретном воплощении неионное поверхностно-активное вещество представляет собой полиоксиэтилен (20) монолаурат. Концентрация поверхностно-активных веществ может находиться в диапазоне 0,1-35% от массы всей композиции, предпочтительно находясь в диапазоне 5-25%. Выбор диспергирующих и эмульгирующих агентов, таких как неионных, анионных, амфотерных и катионных диспергирующих и эмульгирующих агентов, и используемое количество определяют в соответствии с природой композиции и способности агента облегчать диспергирование этих композиций.
Композиция может дополнительно содержать другой микроорганизм и/или пестицид (например, нематоцид, фунгицид, инсектицид). Микроорганизм может включать без ограничения агент, происходящий из Bacillus sp., Pseudomonas sp., Brevabacillus sp., Lecanicilliuin sp., отличающийся от Ampelomyces sp., Pseudozyma sp., Streptomyces sp, Burkholderia sp, Trichoderma sp, Gliocladium sp.Альтернативно, агент может представлять собой природное масло или маслянистый продукт, обладающий фунгицидной и/или инсектицидной активностью (например, парафиновое масло, масло чайного дерева, лемонграссовое масло, гвоздичное масло, коричное масло, цитрусовое масло, розмариновое масло).
Композиция, в частности, может дополнительно содержать инсектицид. Инсектицид может включать без ограничения авермектин, Bacillus thuhngiensis, масло семян маргозы и азадирактин, спиносадс, Chromobacterium subtsugae, эвкалиптовый экстракт, энтомопатогенную бактерию или грибы, такие как Beauveria bassiana, и Metarrhizium anisopliae, и химические инсектициды, включающие без ограничения хлорорганические соединения, фосфорорганические соединения, карбаматы, пиретроиды и неоникотиноиды.
Композиция дополнительно может содержать нематицид. Нематицид может включать без ограничения химические нематициды, такие как фенамифос, алдикарб, оксамил, карбофуран, природный продукт неамтицид, авермектин, грибы Paecilomyces lilacinas и Muscodor spp., бактерии Bacillus firmus и другие Bacillus spp. и Pasteuria penetrans.
Композиция может дополнительно содержать биофунгицид, такой как экстракт R. sachalinensis (Regalia) или фунгицид. Такие фунгициды включают без ограничения моносайтовый противогрибковый агент, который может включать без ограничения бензимидазол, ингибитор деметилирования (DM1) (например имидазол, пиперазин, пиримидин, триазол), морфолин, гидроксипиримидин, анилинопиримидин, фосфоротиолят, хиноновый внешний ингибитор, хинолин, дикарбоксимид, карбоксимид, фениламид, анилинопиримидин, фенилпиррол, ароматический углеводород, коричную кислоту, гидроксианилид, антибиотик, полиоксин, ациламин, фталимид, бензеноид (ксилилаланин). В еще одном воплощении противогрибковый агент представляет собой ингибитор деметилирования, выбранный из группы, состоящей из имидазола (например трифлумизола), пиперазина, пиримидина и триазола (например битертанола, миклобутанила, пенконазола, пропиконазола, триадимефона, бромуконазола, ципроконазола, диниконазола, фенбуконазола, гексаконазола, тебуконазола, тетраконазола, пропиконазола).
Антимикробный агент могут также представлять собой мультисайтовый, не являющийся неорганическим, химический фунгицид, выбранный из группы, состоящей из нитрила (например хлорнитрила или флудиоксонила), хиноксалина, сульфамида, фосфоната, фосфита, дитиокарбамата, хлоралкитиоса, фенилпиридин-амина, циано-ацетамид оксима.
Композиции могут быть применены с использованием способов, известных в области техники. Конкретно, эти композиции могут быть применены к растениям или частям растений. Понятно, что растения, подразумеваемые в контексте настоящего изобретения, представляют собой все растения и популяции растений, такие как желательные и нежелательные дикие растения или хлебные злаки (включающие встречающиеся в природе хлебные злаки). Хлебные злаки могут представлять собой растения, которые могут быть получены при помощи обычных способов скрещивания растений и способов оптимизации, или при помощи биотехнологических способов и способов генетической инженерии, или путем комбинации этих способов, включающих трансгенные растения, и включающих культурные сорта растений, защищаемые или не защищаемые правами растениеводов-селекционеров. Части растений следует понимать как все части и органы растений над и под поверхностью почвы, такие как побег, лист, цветок и корень, примеры, которые могут быть упомянуты, представляют собой листья, иглы, цветоносы, стебель, цветы, плодовые тела, фрукты, семена, корни, клубни и корневища. Части растений также включают собранный материал, и материал, образовавшийся путем вегетативного и генеративного размножения, например опилки, клубнеплоды, корневища, ответвления и семена.
Обработка растений и частей растений представленными выше композициями может быть осуществлена непосредственно или путем действия композиций на их окружение, среду обитания или область хранения путем, например погружения, распыления, испарения, обработкой туманом, рассеяния, окрашивания, инъекции. В случае, когда композицию применяют в отношении семени, композиция может быть применена в отношении семени в виде одного или более чем одного покрытия перед прорастанием семени с использованием одной или более чем одной оболочки с использованием способов, известных в области техники.
Как указано выше, композиции могут представлять собой гербицидные композиции. Композиция может дополнительно содержать один или более чем один гербицид. Они могут включать без ограничения биогербицид и/или химический гербицид. Биогербицид может быть выбран из группы, состоящей из гвоздики, корицы, лемонграсса, цитрусовых масел, масла апельсиновой корки, тентоксина, корнексистина, AAL-токсина, лептоспермона, такстомина, сарментина, момилактона В, сорголеона, аскаулатоксина и аскаулатоксина агликона. Химический гербицид может включать без ограничения дифлюфензопир и его соли, дикамба и его соли, топрамезон, темботрион, S-метолахлор, атразин, мезотрион, примисульфурон-метил, 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту, никосульфурон, тифенсульфурон-метил, асулам, метрибузин, диклофоп-метил, флуазифоп, феноксапроп-лара-этил, асулам, оксифлуорфен, римсульфурон, мекопроп и хинклорак, тиобенкарб, кломазон, цихалофоп, пропанил, бенсульфурон-метил, пеноксулам, триклопир, имазетапир, галосульфурон-метил, пендиметалин, биспирибак-натрий, карфентразон этил, натрий бентазон/натрий ацифлуорфен, глифосат, глуфосинат и ортосульфамурон.
Гербицидные композиции могут быть применены в жидкой или твердой форме в качестве довсходных или послевсходных композиций.
Для довсходных безводных композиций размер гранулы носителя типично составляет 1-2 мм (диаметр), но гранулы могут быть меньше или больше в зависимости от требуемого покрытия почвы. Гранулы могут содержать пористые частицы или частицы, отличающиеся от пористых.
Для послевсходовых композиций используемые компоненты могут содержать смектитовые глины, аттапульгитовые глины и похожие набухающие глины, загустители, такие как ксантановые смолы, аравийская камедь и другие полисахаридные загустители, а также стабилизаторы дисперсии, такие как неионные поверхностно-активные вещества (например полиоксиэтилен (20) монолаурат).
Применения
Композиции и пестицидные соединения, происходящие из штамма Burkholderia, представленного здесь, могут быть использованы в качестве пестицидов, в частности в качестве инсектицидов, нематоцидов, фунгицидов и гербицидов.
В частности, нематоды, которые можно контролировать с использованием способа, представленного выше, включают без ограничения паразитическую нематоду, такую как галловая, круглая, острая, тонкая, свекловичная и повреждающая нематода, включающая без ограничения Meloidogyne, Heterodera и Globodera spp; в частности Meloidogyne incognita (клубеньковая нематода), а также Globodera rostochiensis и globodera pailida (картофельная нематода); Heterodera glycines (соевая нематода); Heterodera schachtii (свекловичная нематода); и Heterodera avenae (злаковая цистообразующая нематода).
Фитопатогенные насекомые, контролируемые при помощи способа по настоящему изобретению, включают без ограничения насекомых отряда (а) Lepidoptera, например Acleris spp., Adoxophyes spp., Aegeria spp., Agrotis spp., Alabama argillaceae, Amylois spp., Anticarsia gemmatalis, Archips spp., Argyrotaenia spp., Autographa spp., Busseola fusca, Cadra cautella, Carposina nipponensis, Chilo spp., Choristoneura spp., Clysia ambiguella, Cnaphalocrocis spp., Cnephasia spp., Cochylis spp., Coleophora spp., Crocidolomia binotalis, Cryptophlebia leucotreta, Cydia spp., Diatraea spp., Diparopsis castanea, Ear/as spp., Ephestia spp., Eucosma spp., Eupoecilia ambiguella, Euproctis spp., Euxoa spp., Grapholita spp., Hedya nubiferana, Heliothis spp., Hellula undalis, Hyphantria cunea, Keiferia lycopersicella, Leucoptera scitella, Lithocollethis spp., Lobesia botrana, Lymantria spp., Lyonetia spp., Malacosoma spp., Mamestra brassicae, Manduca sexta, Operophtera spp., Ostrinia nubilalis, Pammene spp., Pandemis spp., Panolis flammea, Pectinophora gossypiella, Phthorimaea operculella, Pieris rapae, Pieris spp., Plutella xylostella, Prays spp., Scirpophaga spp., Sesamia spp., Sparganothis spp., Spodoptera spp., Synanthedon spp., Thaumetopoea spp., Tortrix spp., Trichoplusia ni и Yponomeuta spp.;
(b) Coleoptera, например, Agriotes spp., Anthonomus spp., Atomaria linearis, Chaetocnema tibialis, Cosmopolites spp., Curculio spp., Dermestes spp., Diabrotica spp., Epilachna spp., Eremnus spp., Leptinotarsa decemlineata, Lissorhoptrus spp., Melolontha spp., Orycaephilus spp., Otiorhynchus spp., Phlyctinus spp., Popillia spp., Psylliodes spp., Rhizopertha spp-, Scarabeidae, Sitophilus spp., Sitotroga spp., Tenebho spp., Tribolium spp.и Trogoderma spp.; (c) Orthoptera, например, Blatta spp., Blattella spp., Gryllotalpa spp., Leucophaea maderae, Locusta spp., Periplaneta spp. и Schistocerca spp.; (d) Isoptera, например, Reticulitermes spp.; (e) Psocoptera, например, Liposcelis spp.; (f) Anoplura, например, Haematopinus spp., Linognathus spp., Pediculus spp., Pemphigus spp.и Phylloxera spp.; (g) Mallophaga, например, Damalinea spp.и Trichodectes spp.; (h) Thysanoptera, например, Frankliniella spp., Hercinotnrips spp., Taeniothhps spp., Thrips palmi, Thrips tabaci и Scirtothrips aurantii; (i) Гemepoptera, например, Cimex spp., Distantiella theobroma, Dysdercus spp., Euchistus spp., Eurygasterspp., Leptocorisa spp., Nezara spp., Piesma spp., Rhodnius spp., Sahlbergella singularis, Scotinophara spp.и Tniatoma spp.; (j) Homoptera, например, Aleurothrixus floccosus, Aleyrodes brassicae, Aonidiella spp., Aphididae, Aphis spp., Aspidiotus spp., Bemisia tabaci, Ceroplaster spp., Chrysomphalus aonidium, Chrysomphalus dictyospermi, Coccus hesperidum, Empoasca spp., Eriosoma larigerum, Erythroneura spp., Gascardia spp., Laodelphax spp., Lecanium corni, Lepidosaphes spp., Macrosiphus spp., Myzus spp., Nephotettix spp., Nilaparvata spp., Paratoria spp., Pemphigus spp., Planococcus spp., Pseudaulacaspis spp., Pseudococcus spp., Psylla spp., Pulvinaha aemuopica, Quadraspidiotus spp., Rhopalosiphum spp., Saissetia spp., Scaphoideus spp., Schizaphis spp., Sito6uon spp., Trialeurodes vaporariorum, Trioza erytreae и Unaspis citri; (k) Hymenoptera, например, Acromyrmex, Atta spp., Cephus spp., Diprion spp., Diprionidae, Gilpinia polytoma, Hoplocampa spp., Lasius spp., Monomorium pharaonis, Neodiprion spp., Solenopsis spp.и Vespa spp.; (l) Diptera, например, Aedes spp., Antherigona soccata, Bibio hortulanus, Calliphora erythrocephala, Ceratitis spp., Chrysomyia spp., Culex spp., Cuterebra spp., Dacus spp., Drosophila melanogaster, Fannia spp., Gastrophilus spp., Glossina spp., Hypoderma spp., Hyppobosca spp., Liriomyza spp., Lucilia spp., Melanagromyza spp., Musca spp., Oestrus spp., Orseolia spp., Oscinella frit, Pegomyia hyoscyami, Phorbia spp., Rhagoletis pomonella, Sciara spp., Stomoxys spp., Tabanus spp., Tannia spp.и Tipula spp.; (m) Siphonaptera, например, Ceratophyllus spp.и Xenopsylla cheopis и (n) отряда Thysanura, например, Lepisma saccharina. Активные ингредиенты в соответствии с изобретением дополнительно могут быть использованы для борьбы с блошкой крестоцветной (Phyllotreta spp.), корневыми личинками (Delia spp.), рапсовым семенным скрытнохоботником (Ceutorhynchus spp.) и тлей в семенах масличных культур, таких как канола (рапс), горчичное зерно и их гибридах, и также риса и маиса.
В конкретном воплощении насекомое может представлять собой Spodoptera, конкретней, Spodoptera exigua, Myzus persicae, Plutella xylostella или Euschistus sp.
Вещества и композиции также могут быть использованы для модулирования всхожести при применении довсходной или послевсходной композиции для однодольных, осоковых или двудольных сорняков. В конкретном воплощении сорняки могут представлять собой Chenopodium album, Abutilon theophrasti, Helianthus annuus, Ambrosia artemesifolia, Amaranthus retroflexus, Convolvulus arvensis, Brassica kaber, Taraxacum officinale, Solanum nigrum, Malva neglect,, Setaria lutescens, Bromus tectorum, Poa annua, Poa pratensis, Lolium perenne L. var. Pace, Festuca arundinaceae Schreb. var. Aztec II, Anthem II, LS1100, Echinochloa crus-galli, Lactuca sativa. Представленные выше соединения и композиции штамма Burkholderia также могут быть использованы в качестве фунгицида. Гриб-мишень может представлять собой Fusarium sp., Botrytis sp., Monilinia sp., Colletotrichum sp, Verticillium sp.; Microphomina sp., Phytophtora sp, Mucor sp., Podosphaera sp., Rhizoctonia sp., Peronospora sp., Geotrichum sp., Phoma и Penicillium. В еще одном конкретном воплощении бактерии представляют собой Xanthomonas.
Изобретение далее будет описано более подробно путем ссылки на следующие не ограничивающие объем изобретения примеры.
ПРИМЕРЫ
Представленные выше композиции и способы дополнительно проиллюстрированы в следующих примерах, не ограничивающих объем изобретения. Примеры проиллюстрированы только в различных воплощениях и не ограничивают заявленное изобретение в отношении приведенных здесь материалов, условий, массовых отношений, параметров процесса и т.п.
1. Пример 1. Выделение и идентификация микроба
1.1 Выделение микроорганизма
Микроба выделяют с использованием традиционных способов, известных в области техники, из образца почвы, собранного под вечнозеленым деревом в Храме Риннодзи, Никко, Япония. Выделение осуществляют с использованием картофельно-декстрозного агара (PDA) с использованием способа, описанного подробно Lorch et al., 1995. В этом способе образец почвы сначала разводили в стерильной воде, после чего его высевали на твердую агаровую среду, такую как картофельно-декстрозный агар (PDA). Планшеты выращивали при 25°С в течение пяти суток, после чего отдельные микробные колонии разделяли на отдельные планшеты PDA. Выделенная бактерия является грамотрицательной, и образует круглые, непрозрачные колонии кремового цвета, который меняется на розовый и розово-коричневый и слизоподобный или жирный с течением времени.
1.2. Идентификация микроорганизма
Микроб идентифицируют на основе генного секвенирования с использованием универсальных бактериальных праймеров для амплификации области 16S рРНК. Используют следующий протокол: Burkholderia sp A396 выращивают на планшетах с картофельно-декстрозным агаром. Выращенный материал с планшета через 24 часа соскребают при помощи стерильной петли и ресуспендируют в буфере для экстракции ДНК. ДНК экстрагируют с использованием набора для экстракции ДНК MoBio Ultra Clean Microbial. Экстракт ДНК проверяют в отношении качества/количества путем анализа 5 мкл на 1% агарозном геле.
Реакции ПЦР (полимеразно-цепная реакция) осуществляют следующим образом: 2 мкл экстракта ДНК, 5 мкл буфера для ПЦР, 1 мкл dNTP (дезоксинуклеотидтрифосфат) (10 мМ каждого), 1,25 мкл прямого праймера (27F; 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' (SEQ ID NO: 1), 1,25 мкл обратного праймера (907R; 5'-CCGTCAATTCCTTTGAGTTT-3' (SEQ ID NO: 2)) и 0,25 мкл фермента Taq. Реакционный объем доводят до 50 мкл с использованием стерильной воды без нуклеазы. Реакция ПЦР включает исходную стадию денатурации при 95°С в течение 10 минут, а затем 30 циклов при 94°С/30 с, 57°С/20 с, 72°С/30 с, и конечную стадию элонгации при 72°С в течение 10 минут.
Приблизительную концентрацию и размер продукта рассчитывают путем анализа 5 мкл на 1% агарозном геле и сравнения полосы продукта с контролем по массе.
Избыток праймеров, dNTP и фермента удаляют из продукта ПЦР при помощи набора для очистки MoBio PCR clean up kit. Очищенный продукт ПЦР непосредственно секвенируют с использованием праймеров 27F (как выше), 530F (5'-GTGCCAGCCGCCGCGG-3' (SEQ ID NO: 3)), 1114F (5'-GCAACGAGCGCAACCC (SEQ ID N0:4)) и 1525R (S'-AAGGAGGTGWTCCARCC-3' (SEQ ID NO :5)), 1100R (5'-GGGTTGCGCTCGTTG-3' (SEQ ID NO: 6)), 519R (5'-GWATTACCGCGGCKGCTG-3' (SEQ ID NO: 7).
Последовательность гена 16S pPHK штамма А396 сравнивают с доступной последовательностью гена 16S pPHK представителей (3-протеобактерий с использованием алгоритма BLAST. Штамм А395 А396 близко расположен к членам комплекса Burkholderia cepacia, с 99% или большим сходством с несколькими изолятами Burkholderia multivorans, Burkholderia vietnamensis и Burkholderia cepacia. Поиск с помощью BLAST, исключающий комплекс В. cepacia, демонстрировал 98% сходство с изолятами В. plantahi, В. gladioli и Burkholderia sp.
Дерево расстояний для результатов с использованием способа ближайшего связывания продемонстрировал, что А396 родственен Burkholderia multivorans и другим изолятам комплекса Burkholderia cepacia. Burkholderia plantarii и Burkholderia glumae сгруппированы в отдельную ветку дерева.
Обнаружено, что выделенный штамм Burkholderia содержит следующие последовательности:
прямую последовательность, последовательность ДНК с праймером 27F, 815 нуклеотидов (SEQ ID N0:8);
обратную последовательность, 1453 п.о. (пар оснований), с использованием праймеров 1525R, 1100R, 519R (SEQ ID NO: 9);
обратную последовательность 824 п.о. с использованием праймера 907R (SEQ NO: 10); прямую последовательность 1152 п.о. с использованием праймера 530F (SEQ ID NO: 11); прямую последовательность 1067 п.о. с использованием праймера 1114F (SEQ ID NO: 12); обратную последовательность 1223 п.о. с использованием праймера 1525R (SEQ NO: 13);
обратную последовательность 1216 п.о. с использованием праймера 1100R (SEQ ID NO: 14); обратную последовательность 1194 п.о. с использованием праймера 519R (SEQ ID NO: 15).
1.3. Подтверждение того, что Burkholderia A396 не относится к комплексу Burkholderia cepacia
1.3.1 Молекулярно-биологическое исследование с использованием специфических праймеров для ПЦР
Чтобы подтвердить идентификацию Burkholderia A396 как Burkholderia multivorans, производили дополнительное секвенирование генов домашнего хозяйства. Burkholderia multivorans - известный член комплекса Burkholderia cepacia. Усилия сосредоточены на ПЦР генов recA, как описано Mahenthiralingam et al., 2000. Используются следующие праймеры: (a) BCR1 и BCR2, представленные Mahenthiralingam et al., 2000, чтобы подтвердить соответствие комплексу В. cepacia и (б) BCRBM1 и BCRBM2, представленные Mahenthiralingam et al., 2000, чтобы подтвердить соответствие б. multivorans. Продукт реакции ПЦР для первого набора праймер подтвердил бы, что микроб принадлежит комплексу В. cepacia. Продукт реакции ПЦР для второго набора праймеров подтвердил бы, что микроб действительно представляет собой В. multivorans.
Ни один из продуктов ПЦР не получен ни для одной пары праймеров. Эффективность реакции ПЦР и праймеров проверяют с использованием Burkholderia multivorans ATCC 17616 (положительный контроль) и Pseudomonas fluorescens (отрицательный контроль). Сильные полосы наблюдаются для В. multivorans с использованием обоих наборов праймеров. Никакие полосы не наблюдаются для Pseudomonas fluorescens. Результаты указывают на то, что A396 представляет собой Burkholderia, но не член комплекса В. cepacia, и не Burkholderia multivorans. Последнее также продемонстрировано в эксперименте с культурой, используемой для сравнения, в котором A396 и культуру типа В. multivorans выращивают бок о бок при встряхивании, и рост ежедневно проверяется с использованием измерений оптической плотности при 600 нм. В наборе условий новые разновидности A396 растут намного быстрее, чем штамм типа В. multivorans (Фиг.1).
1.3.2 Гибридизация ДНК-РНК
Чтобы подтвердить, что изолят A396 представляет собой новые виды Burkholderia, проводят эксперимент по гибридизации ДНК-ДНК с Burkholderia multivorans (самые близкие последовательности 168 рРНК). Биомассу для А396 и В. multivorans продуцируют в бульоне ISP2, выращивая в течение 48 часов при 200 об./мин/25°С в колбах Фернбаха. Биомассу асептически собирают путем центрифугирования. Бульон сливают и клеточный осадок ресуспендируют в 1:1 растворе вода:изопропиловый спирт.Эксперименты по гибридизации ДНК-ДНК выполнены DSMZ - немецкой коллекцией микроорганизмов и клеточных культур в Германии. ДНК выделяют с использованием French pressure cell (Thermo Spectronic) и очищают путем хроматографии на гидроксиапатите, как описано Cashion et al., 1977. Гибридизацию ДНК-ДНК осуществляют, как описано De Ley et al., 1970 с учетом модификаций, описанных Huss et al. 1983 с использованием модели спектрофотометра в Уф/видимом свете Сагу 100 Bio, оборудованного термостатируемым элементами Пелтье мультикюветным переключателем 6х6 и температурным контроллером с температурным датчиком in-situ (Varian). DSMZ сообщило о 37,4% сходства ДНК между А396 и Burkholderia multivorans. Результаты указывают на то, что Burkholderia sp штамм А396 не принадлежит видам Burkholderia multivorans, если учитывают рекомендации порогового значения 70% сходства ДНК-ДНК для определения бактериальных видов специальным комитетом (Wayne et al., 1987).
1.4. Биохимический профиль с использованием планшет Biolog GN2 Для определения профиля утилизации источника углерода А396 выращивают в течение ночи на картофельно-декстрозном агаре (PDA). Культуру переносят на агар BUG, чтобы продуцировать соответствующую культуру для экспериментов Biolog как рекомендовано производителем (Biolog, Hayward, CA).
Биохимический профиль микроорганизма определяют путем инокуляции на планшете Biolog GN2 и считывания с планшета после 24-часовой инкубации с использованием автоматизированной микростанции MicroLog 4. Идентификацию неизвестных бактерий осуществляют путем сравнения его профиля утилизации углерода с базой данных грамотрицательных организмов Microlog 4.
Никакие ясные определяющие совпадения не обнаружены для профиля Biolog. Все самые близкие совпадения имели менее чем 35% сходства с А396: Pseudomonas spinosa (Burkholderia), Burkholderia cepacia, и Burkholderia pseudomallei. Результаты представлены в Таблице 1.
Таблица 1
Биохимический профиль А396
Субстрат
Результат
Субстрат
Результат
Циклодекстрин
-
L-арабиноза
-
Декстрин
-
D-арабит
-
Гликоген
-
D-целлобиоза
-
Tween 40
+
Эритрит
-
Tween 80
+
D-Фруктоза
-
N-ацетил-D-Галактозамин
-
L-фукоза
-
N-ацетил-D-глюкозамин
-
D-Галактоза
+/-
Адонит
-
Гентибиоза
-
Мон-метиловый сложный эфир янтарной кислоты
-
D-глюкоза
+
Уксусная кислота
-
m-Инозит
-
Цис-аконитовая кислота
-
D-Лактоза
-
Лимонная кислота
-
Лактулоза
-
Муравьиная кислота
+
Мальтоза
-
D-галактоновой кислоты лактон
-
D-маннит
-
D-галактуроновая кислота
-
D-манноза
-
D-глюконовая кислота
-
D-мелибиоза
-
D-глюкозаминовая кислота
-
β-метил-D-глюкозид
-
D-глюкуроновая кислота
-
D-псикоза
-
α-гидроксимасляная кислота
-
D-раффиноза
-
β-гидроксимасляная кислота
+
L-рамноза
-
γ-гидроксимасляная кислота
-
D-сорбит
-
p-гидроксифенилуксусная кислота
-
Сахароза
-
Итаконовая кислота
-
D-трегалоза
+
α-кетомасляная кислота
-
Тураноза
-
α-кетоглутаровая кислота
-
Ксилит
-
α-кетвалериановая кислота
-
Метиловый эфир пировиноградной кислоты
-
D,L-молочная кислота
-
Уридин
-
Малоновая кислота
-
Тимидин
-
Пропионовая кислота
+
Фенилэтиламин
-
Хинная кислота
-
Путресцин
-
D-Сахарная кислота
-
2-аминоэтанол
-
Себациновая кислота
-
2,3-Бутандиол
-
Янтарная кислота
+
Глицерол
+/-
Бромянтарная кислота
-
D,L-a-глицеролфосфат
+/-
Сукцинамидная кислота
-
α-D-глюкозо-1-фосфат
-
Глюкуронамид
-
D-глюкозо-6-фосфат
+
L-аланинамид
+
γ-аминомасляная кислота
+
D-Аланин
-
Уроканиновая кислота
-
L-аланин
+
Инозин
-
L-аланил-глицин
-
L-фенилаланин
+
L-аспарагин
+
L-пролин
-
L-аспарагиновая кислота
+/-
L-пироглутаминовая кислота
-
L-глутаминовая кислота
+
D-серин
-
Глицил-L-аспарагиновая кислота
-
L-серин
-
Глицил-L-глутаминовая кислота
-
L-треонин
-
L-гистидин
-
D,L-карнитин
-
Гидрокси-L-пролин
+
L-орнитин
-
L-лейцин
-
1.5. Композиция жирной кислоты
После инкубации в течение 24 часов при 28°С собирают петлей выращенные клетки, и затем получают, отделяют и идентифицируют метиловые эфиры жирной кислоты с использованием системы идентификации микробов Sherlock (MIDI), как описано (см. Vandamme et al., 1992). Преобладающие жирные кислоты, представленные в Burkholderia A396, являются следующие: 16:0 (24,4%), цикло 17:0 (7,1%), 16:0 3-ОН (4,4%), 14:0 (3,6%), 19:0 ω8 с (2,6%) цикло, 18:0 (1,0%). Суммарный признак 8 (включающий 18:1 о)7 с) и суммарный признак 3 (включающий 16:1 ω7с и 16:1 ω6c), соответствуют 26,2% и 20,2% общей площади пика, соответственно. Суммарный признак 2, включающий 12:0 ALDE (альдегид), 16:1 изо I, и 14:0 3-ОН), соответствовал 5,8% полной области пика, тогда как суммарный признак 5, включающий 18:0 ANTE (анте) и 18:2 ω6,9с, соответствовал 0,4%. Другие жирные кислоты, обнаруженные в A396 в незначительных количествах, включали: 13:1 в 12-13 (0,2%), 14:1 ω5с (0,2%), 15:0 3-ОН (0,13%), 17:1 ω7с (0,14%), 17:0 (0,15%), 16:0 iso 3-ОН (0,2%), 16:0 2-OH (0,8%), 18:1 ω7с 11-метил (0,15%), и 18:1 2-OH (0,4%).
Сравнение композиции жирной кислоты A396 с композицией из известных микробных штаммов в базе данных MIDI свидетельствует о том, что жирные кислоты в новом штамме A396 наиболее близки к жирным кислотам Burkholderia cenocepacia.
1.6 Устойчивость к антибиотикам
Чувствительность к антибиотикам Burkholderia A396 тестируют с использованием антибиотических дисков на среде Мюллера-Хинтона, как описано в PML Microbiological's technical data sheet #535. Результаты, полученные после 72-часовой инкубации при 25°С, представлены в Таблице 2 ниже.
Таблица 2
Чувствительность МВ1-206 к различным антибиотикам. +++ очень чувствительные, ++ чувствительные, - резистентные
Концентрациями (мкг)
Чувствительность
Тетрациклин
30
-
Канамицин
30
+++
Эритромицин
15
-
Стрептомицин
10
-
Пенициллин
10
-
Ампициллин
10
-
Окситетрациклин
30
-
Хлорамфеникол
30
++
Ципрофлоксацин
5
++
Гентамицин
10
-
Пиперациллин
100
+++
Цефуроксим
30
-
Имипенем
10
+++
Сульфаметоксазол-
Триметоприм
23,75/25
++
Результаты указывают на то, что спектр чувствительности к антибиотикам Burkholderia A396 весьма отличается от патогенных штаммов комплекса В. cepacia. Burkholderia A396 чувствителен к канамицину, хлорамфениколу, ципрофлоксацину, пиперациллину, имипенему и комбинации сульфаметоксазола и триметоприма. Для сравнения Zhou et al., 2007 проверил чувствительность 2621 различных штаммов в комплексе S. cepacia, выделенном у больных муковисцедозом, и обнаружил, что только 7% и 5% всех штаммов были чувствительны к имипенему или ципрофлоксацину, соответственно. Они также обнаружили, что 85% всех штаммов были устойчивы к хлорамфениколу (15% чувствительных), и 95% устойчивы (5% чувствительных) к комбинации сульфаметоксазола и триметоприма. Результаты Zhou et al., 2007 подобны данным Pitt et al., 1996, который определил устойчивость к антибиотику среди 366 изолятов В. cepacia и, сообщил о том, что большинство из них устойчивы к ципрофлоксацину, цефуроксиму, имипенему, хлорамфениколу, тетрациклину и сульфаметоксазолу.
2. Пример 2. Burkholderia sp.в качестве гербицида
2.1 Исследование #1
Чтобы подтвердить активность, обнаруженную в исходном гербицидном отборе, исследование in vivo проводят с использованием экстракта адсорбентом Amberlite XAD-7, полученного из 5-дневной среды с целыми клетками новых видов рода Burkholderia. Высушенный неочищенный экстракт ресуспендируют в 4% этаноле и 0,2% неионном поверхностно-активном веществе (гликосперс) до концентрации 10 мг/мл, и далее разводят до концентрации 5,0 мг/мл. Эти два образца распыляют на 4-недельные вьюнки (Convolvulus arvensis), и растения поддерживают под светом для роста при 25°С в течение 2 недель, после чего осуществляют оценки фитотоксичности. В том же самом исследовании 2-недельные щирицы колосистые опрыскивают увеличивающимися концентрациями неочищенного экстракта, полученного из бактериальной культуры. Тестируемые концентрации составляли 1,25, 2,5, 5,0 и 10,0 мг/мл, и растения инкубируют как описанного выше перед оценками фитотоксичности.
Результаты, представленные на Фиг.2 (вьюнок) и 3 (щирица), показывают фитотоксический эффект неочищенного экстракта Burkholderia в различных концентрациях, и они показывают хороший гербицидной эффект в отношении щирицы даже при низких концентрациях экстракта. Обе обработки экстрактом (5 и 10 мг/мл) приводят к остановке роста вьюнка.
2.2 Исследование #2
Новый штамм Burkholderia sp.A396 выращивают в неопределенной минеральной среде в течение 5 суток (25°С, 200 об/мин). Цельноклеточный бульон экстрагируют с использованием адсорбента XAD-7. Высушенный неочищенный экстракт ресуспендируют в 4% этаноле и 0,2% неионном поверхностно-активном веществе до концентрации 10 мг/мл, и дополнительно разбавляют до концентраций 5,0, 2,5 и 1,25 мг/мл. Все четыре тестируемых раствора затем тестируют на следующих широколиственных и травянистых сорняках, перечисленных в Таблице 3:
Таблица 3
Широколистные и травянистые тестируемые сорняки
Обычное название
Научное название
Марь белая
Chenopodium album
Мелколепестник канадский
Conyza canadensis
Щавель курчавый
Rumex crispus
Росичка кровяная
Digitaha sanguinalis
Мятлик луговой
Poa annua
Одуванчик лекарственный
Taraxacum officinale
Паслен
Solarium nigrum
Горчица
Brassica kaber
Просвирник
Malva neglecta
Дурнишник обыкновенный
Xanthium pensylvanicum
Бермудская трава
Cynodon dactylon
Лисохвост
Setaria lutescens
Осот огородный
Sonchus oleraceus
Раствор 0,2% гликосперс и Раундап со скоростью 6 жидких унций на галлон используется в качестве отрицательных и положительных контролей, соответственно.
Все виды растений тестируют в 4”×4” пластмассовых горшках в трех повторах. Необработанные контрольные растения опрыскивают раствором носителя (4% этанол, 0,2% гликосперс), а растения-положительные контроли - Раундапом со скоростью, соответствующей 6 жидким унциям на акр. Обработанные растения хранят в оранжерее в условиях 12 ч свет/12 ч темнота. Данные фитотоксичности, полученные на 22 сутки после обработки видов №1-8 и 12 сутки для видов №9-12, представлены в Таблицах 5 и 6, соответственно. Шкала оценок для обоих таблиц представлена в Таблице 4:
Таблица 4
Шкала оценок
Шкала оценок
% от контроля
0
0
1
<10
2
25
3
50
4
75
5
100
Таблица 5
Данные по фитотоксичности для видов #1-8
Обработка
Мелколепестник канадский
Марь белая
Одуванчик лекарственный
Щавель курчавый
Росичка кровяная
Горчица
Паслен
Мятлик луговой
UTC (необработанный контроль)
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,7
0,0
0,0
1,25 мг/мл
0,0
4,7
0,0
0,0
0,0
4,3
0,0
0,0
2,5 мг/мл
0,7
4,5
0,0
0,0
0,0
4,7
0,0
0,0
5 мг/мл
4,3
5,0
0,0
0,0
0,0
5,0
0,0
0,0
10 мг/мл
4,7
5,0
0,0
0,0*
0,0
5,0
1,5
0,0
Раундап
5,0
5,0
5,0
5,0
5,0
5,0
5,0
5,0
* остановка роста, приводящая к тому, что растения имели половинный размер относительно необработанных
Таблица 6
Данные по фитотоксичности для видов #9-12
Обработка
Дурнишник обыкновенный
Лисохвост
Бермудская трава
Осот огородный
Просвирник
UTC
0,0
0,7
0,0
0,0
2,8
1,25 мг/мл
05
0,3
0,3
0,0
2,0
2,5 мг/мл
05
0,7
0,5
0,0
2,7
5 мг/мл
0,8
0,3
0,2
0,0
2,2
10 мг/мл
0,7
0,7
0,3
0,2
1,7
Roundup
4,7
4,8
4,7
5,0
5,0
Основываясь на результатах, полученных в этих исследованиях, соединения, экстрагированные из сред, ферментированных изолятом Burkholderia, обладают гербицидной активностью против нескольких видов протестированных сорняков. Из двенадцати проверенных видов марь белая и горчица являются самыми чувствительными, затем просвирник и мелколепестник канадский. Концентрации в экстракте всего 1,25 мг/мл достаточно для обеспечения почти полного контроля над марью белой и горчицей, тогда как более высокая концентрация требуется для просвирника и мелколепестника канадского.
В отдельном эксперименте, с использованием той же самой схемы, как описано выше, проверяли системную активность. 10 мг/мл супернатанта неочищенных экстрактов из Burkholderia sp.A396 наносили на первые листья амброзии, горчицы, паслена, росички, пшеницы и ежовника. Проростки оценивали через 7 суток после обработки. Наблюдаемые признаки, включающие: ожоги, деформируемость, выцветание, обнаруживались у следующего листа выше обрабатываемого у амброзии, горчицы и паслена. Никакая системная активность не наблюдается в проверенных травах. Во втором эксперименте пять фракций того же самого необработанного экстракта (10 мг/мл) оценивали с использованием той же самой схемы эксперимента, какая описана выше. Обрабатывали проростки горчицы, пшеницы и росички. Через семь и 20 суток после обработки признаки гербицидной активности обнаруживали в горчице в четырех из пяти фракций (091113B4F6, 091113B4F7, 091113B4F8 и 091113B4F9) с использованием колонки С-18 (Phenomenex Sepra С18-Е, 50 мкм, 65А). Признаки обнаруживали в следующем листе выше обрабатываемого листа. Никакой системной активности не обнаруживали в протестиронных травах.
3. Пример 3. Burkholderia sp.в качестве инсектицида
3.1. Исследования по контактной активности
Следующее испытание используется в начальной фазе скрининга, чтобы определить, обладают ли соединения, полученнные из культуры новых видов рода Burkholderia, контактной активностью против бабочек-вредителей (личинок). Далее оно используется в качестве инструмента для фракционирования, зависящего от биологического анализа, чтобы определить активные фракции и пики, полученные из экстракта бульона клеток. Тест проводится в отдельных пластмассовых чашках объемом 1,25 унций с использованием личинок совки ни (Thcoplusia ni) третьей возрастной стадии или личинок совки малой (Spodoptera exigua) третьей возрастной стадии. Кусочки 1 см×1 см твердой диеты совки малой помещали в центр каждой чашки вместе с одной личинкой. 1 мкл аликвоту каждого обрабатывающего раствора (бульон целых клеткок или экстракт из 5-дневной культуры Burkholderia A396) вводили в грудной отдел каждой личинки (спинная сторона) с использованием шприца Hamilton. Каждую обработку повторяли десять раз. Воду использовали в качестве отрицательного контроля и малатион в качестве положительного контроля. После инжекции каждую чашку покрывали парафильмом с вентиляционным отверстием, и чашки инкубировали в течение трех суток при 26°С. Оценки смертности производились ежесуточно, начиная с 24 часов после обработки.
На Фиг.4 и 5 представлены результаты тестов контактной активности. В соответствии с результатами стерилизованный путем фильтрации бульон культуры Burkholderia sp убивал приблизительно 40% всех тестируемых насекомых в течение 3 суток. Разбавленный бульон (50%) обладал пониженной активностью, приводящий к приблизительно 10% контролю у обоих протестированных насекомых.
3.2. Активность против личинок при кормлении
Прямая токсичность через кормление проверена с использованием тестов наложением на диету в соответствии с форматом исследования в 96-луночных планшетах с использованием микротитровальных планшет с 200 мкл твердой искусственной диеты совки малой в каждой лунке. Сто (100) микролитров каждого тестируемого образца пипетировали на верхнюю часть корма (один образец в каждой лунке), и образец оставляли высыхать под потоком воздуха до достижения сухой поверхности. Каждый образец (стерилизованный путем фильтровавния через 0,2 микронный фильтр) тестировали в шести параллелях, и воду и коммерческий Bt (B. thuringiensis), продукт использовали в качестве отрицательных и положительных контролей, соответственно. Одну личинку третьей возрастной стадии для каждого тестируемого насекомого (совки ни - Trichoplusia ni; совки малой - Spodoptera exiqua; капустной моли - Plutella xylostella), помещали в каждую лунку, и планшет покрывали пластмассовой крышкой с вентиляционными решетками. Планшеты с насекомыми инкубировали при 26°С в течение 6 суток с ежедневными оценками смертности.
Фиг.5 представляет данные для исследования наложения диеты для тестируемых личинок третьей возрастной стадии совки малой {Spodoptera exigua), проведенного при четырех различных концентрациях бульонов: 1×(100%), 1/4×(25%), 1/8×(12,5%), 1/16×(6,125%). Данные демонстрируют, что чистый, стерилизованный путем фильтрации бульон в состоянии обеспечить 100% контроль в конце 7-суточного инкубационного периода. Аналогичный контроль получен для 4-кратного разведения бульона, и в конце исследования, как неразведенный, так и 4-х разбавленный бульон сравнимы с Bt, используемым в качестве положительного контроля. Тем не менее, действие Bt значительно быстрее, чем действие бульонов из Burkholderia. Эффективность против гусениц зависит от концентрации бульона, и две самых низких концентрации бульона (12,5% и 6,125%) обеспечивали меньший контроль чем две самых высоких. Тем не менее, эффективность 12,5%-разведения не намного ниже, чем 25%-разведения. 16-кратное разведение бульона очевидно не достаточно эффективно, и обеспечивает только частичный (33%) контроль над гусеницами во время этого 7-суточного исследования. Соответствующие уровни смертности для того же самого разведения бульона, используемого для совки ни и личинок капустной моли, немного выше для 6,125% бульон, убивающего 80% и 50% личинок, соответственно.
3.3. Активность in vitro против сосущих насекомых
Пять взрослых щитников (Euschistus sp.) помещали в каждый из пластмассовых контейнеров на 16 унций, выстланных куском бумажного полотенца. Микроцентрифужную пробирку, содержащую 2 мл каждого тестируемого образца (цельный бульон, стерилизованный путем фильтрования), затыкали хлопковым шаром, и устанавливали на дно пластмассового контейнера. Одно семя подсолнечника помещали рядом с пробиркой в качестве приманки. Воду и коммерческий продукт со смесью пиретрина и РВО (пиперонил бутоксид) в рекомендованной дозе использовали в качестве отрицательных и положительных контролей, соответственно. Каждый контейнер закрывали крышкой и инкубировали при 25°С в течение 7 суток с ежесуточными проверками смертности.
Результаты представлены ниже в Таблице 7, и они демонстрируют приблизительно 80% уничтожение сосущих насекомых (щитник) на 7 сутки в этой системе in vitro с 50%-разбавленным бульоном. В этом исследовании разбавленный ферментационный бульон Burkholderia А396 более эффективен для борьбы с щитником по сравнению с коммерческим продуктом, используемым в качестве положительного контроля. Интересно, что неразбавленный бульон привел к замене эффективной борьбе с насекомым, который мог бы быть признаком антифидинговых (ингибирование кормления) свойств активных вторичных метаболитов, продуцируемых этими новыми видами рода Burkholderia.
4. Пример 4.
Тестирование в отношении сосущих насекомых in vivo
В естественных условиях эффективность фильтрованного бульона целых клеток тестировали в исследовании с горчицей и зеленой персиковой тлей (Myzus persicae) в качестве тестируемого насекомого. На флоридскую широколистенную горчицу в возрасте приблизительно один месяц (Brassica sp.) опрыскивали стерилизованным путем фильтрования бульоном целых клеток Burkholderia sp.двух различных концентраций (1× и 0,5×) с использованием распылителя Paasche. Воду и коммерческий продукт авермектин (Avid) использовали в качестве отрицательных и положительных контролей, соответственно. Растениям дают высохнуть на столе, после чего их помещают в пластмассовый контейнер с 6 чашками с крышками, несущими вентиляционные отверстия. Десять тлей в различных стадиях развития помещали на каждое тестируемое растение, и растения инкубировали под лампами для роста в течение 7 суток при 25°С. Проводили ежедневные оценки для множества тлей на каждом растении (обобщение в Таблице 8 ниже) и результаты регистрировали в портативном компьютере.
Таблица 8
Эффективность in vivo A396 в отношении зеленой персиковой тли
Обработка
# живых тлей на 0 сутки
# живых тлей на 2 сутки
# живых тлей на 4 сутки
# живых тлей на 7 сутки
A396 неразведенный бульон (1х)
10
36
88
145
A396 разведенный бульон (0,5х)
10
47
138
217
Авермектин (положит. контроль)
10
0
0
0
Вода (отрицат. контроль)
10
140
364
393
В соответствии с результатами, обе концентрации стерилизованного путем фильтрования бульона, полученного из культуры новых видов рода Burkholderia, пригодны для контроля прироста популяции сосущего насекомого, М. persicae.
5. Пример 5. Нематоцидная активность
5.1 Исследование #1
Чтобы оценить действие стерилизованного путем фильтрования культурального бульона Burkholderia sp A396 на подвижность (и последующее восстановление) ювенильных (J2) клубеньковых нематод (Meloidogyne incognita VW6) следующий тест проводили в 24-луночных пластмассовых культуральных планшетах.
300-мкл аликвоту каждого тестируемого раствора (1х или 0,5х стерилизованного путем фильтрования бульона) добавляли в соответствующие лунки, после чего пятнадцать нематод, распределенные в 10 мкл деионизированной воды добавляли в каждую лунку, планшет закрывали крышкой, и инкубировали при 25°С в течение 24 часов. Воду и Avid в 20000х разведении использовали в качестве отрицательных и положительных контролей, соответственно. Действие каждого соединения на подвижность нематод проверяли через 24 часа путем укалывания каждой нематоды иглой, и долю неподвижных нематод для каждой обработки регистрировали в портативном компьютере с использованием процентной шкалы. Чтобы оценить восстановление подвижности для каждой обработки объем 200 мкл отбирали из каждой лунки, и оставшийся раствор в каждой лунке разводили путем добавления 2 мл деионизированной воды. Планшеты вновь инкубировали в течение 24 часов, как описано выше, после чего осуществляли вторую оценку подвижности.
Результаты, представленные на Фиг.6, показывают, что стерилизованный путем фильтрования бульон обеих тестируемых концентраций может иммобилизовать свободноживущих ювенильных клубеньковых нематод. Этот эффект длится по меньшей мере в течение 24 часов, что предполагает что бульон Burkholderia A396 может быть использован для предотвращения инфицирования растений нематодами.
5.2 Исследование #2
Материалы и методы
Мини-тест пропитывания: бульон целых клеток Burkholderia A396 тестировали в тепличном анализе, проводимом в 45 мл горшках. Семена огурца сорта Toshka сеяли непосредственно в горшки, наполненные песчаной суглинистой почвой. Через десять суток каждый из горшков обрабатывают 5 мл суспензии. Определенные используемые количества представлены в Таблице 9.
Таблица 9
Соединения
Burkholderia штамм A396
Фостиазат (Стандартный, ЕС 150) (положительный контроль)
Тестируемые
Meloidogyne sp.no 3000 яиц на горшок для минитеста
виды
пропитывания (в 2 мл)
Тестируемое
Cucumis sativus (огурец сорта Toschka)
растение
Тестируемая
100% жидкая композиция
композиция
Тестируемые
100, 50, 25, 12.5, 6, 3, 1,5 мл/л
концентрации
Применение
Пропитывание
Как указано в Таблице 9, горшки инокулировали 3000 яйцами М. incognita, Четыре повторности проводили для каждой обработки и концентрации. Исследование проводили через четырнадцать суток после нанесения и инокуляции. Образование клубеньков на корнях оценивали в соответствии с индексом образования клубеньков по Зеку (Zeck, 1971). Фитотоксичность измеряли как уменьшение образования клубеньков в корне по сравнению с контролем. Результаты представлены на Фиг. 9 и 10.
-1
В мини-тесте пропитывания №1 (см. Фиг. 9) активность обработки была очень высокой и, уменьшение почти на 100% обнаружено при применении концентрации 100 мл/л Burkholderia А396. Фостиазат действовал как обычно (100% контроль при 20 млн).
-1
В мини-тесте пропитывания №2 (см. Фиг. 10) 100% сокращение образование клубеньков в корне достигнуто при самой высокой концентрации 100 мл/л, уменьшаясь приблизительно до 50% в 1,5 мл/л. Фостиазат действовал как обычно (100% контроль при 20 млн).
5.3 Исследование #3
Чтобы продемонстрировать нематицидную активность Burkholderia А396 осуществляли тепличное исследование на огурцах (Cucumis sativus) с использованием бульона целых клеток Burkholderia А396 в качестве тестируемого продукта для борьбы с галловыми корневыми нематодами (Meloidogyne incognita). Один огурец на горшок сажали в почву и выращивали в теплице при искусственном освещении при 28°С. Каждый горшок с растением обрабатывают определенным количеством (приблизительно 80 мл) любого неразбавленного тестируемого продукта или тестируемого продукта, разбавленного до 5% водой. Каждую обработка Burkholderia А396, а также обработку положительным контролем препаратом Temik (при указанной на упаковке концентрации) и отрицательным контролем без добавок осуществляли в пяти повторностях. Растения выращены в теплице в течение 60 суток, после чего каждое растение собирали и оценивали в отношении массы свежего побега и корня. Регистрировали количество яиц нематод в каждом горшке и рассчитывали параметр, указывающий на количество яиц на грамм корневой массы. Осуществляли статистический анализ (ANOVA) и рассчитывали статистическую значимость между обработками при р<0,1. Данные, представленные в Таблице 10 ниже, демонстрируют, что даже при том, что отсутствует статистически значимое отличие от необработанной контрольной группы, горшки, обработанные бульоном целых клеток А396, содержали меньше яиц нематод по сравнению с необработанными контрольными горшками. Действие, вычисленное как количество яиц на массу корня, более явно, когда неразбавленный бульон использовали в качестве обработки.
Таблица 10
Действие бульона целых клеток А396 на массу побега и корня огурца, общее количество яиц М. incognita на горшок и количество яиц на грамм корневой массы
Масса свежих побегов
Свежая корневая масса
#яиц
# яиц/г корня
Необработанные
15,22 b
11,76 be
67693 а
5252,0 ab
А396 5 об.%
11,89 b
6,914 с
56084 а
8419,4 а
А 396 неразвед.
15,66 b
11,09 be
40463 а
3929,2 ab
Temik 15 G 5 фунт/а
29,54 a
29,74 a
68907 а
2604,4 b
LSD (минимально значимое различие) при p<0,1
5,34
6,9879
36509,2
3317,07
6. Пример 6. Выделение темплазола А и В
Методы и материалы
Следующий способ используют для очистки темплазола А и В, экстрагированных из культуры клеток Burkholderia sp (смотри Фиг.7):
2
3
Культуральный бульон, полученный из 10 л объема ферментации Burkholderia (А396) в среде для роста Ну soy, экстрагируют адсорбентом Amberlite XAD-7 (Asolkaret al., 2006) путем встряхивания клеточной суспензии с адсорбентом при 225 об/мин в течение двух часов при комнатной температуре. Адсорбент и клеточную массу собирают путем фильтрования через марлю и промывают деионизированной водой для удаления солей. Адсорбент, клеточную массу и марлю затем вымачивают в течение 2 ч в ацетоне, после чего ацетон фильтруют и сушат в вакууме с использованием роторного испарителя с получением неочищенного экстракта. Неочищенный экстракт затем фракционируют с использованием обращенно-фазовой С-18 вакуумной жидкостной хроматографии (HO/CHOH; градиент от 90:20 до 0:100%) с получением 10 фракций. Эти фракции затем концентрируют досуха с использованием роторного испарителя, и образующиеся в результате безводные остатки отбирают в отношении биологической активности с использованием анализа с засевом салата в 96-луночном планшете. Активные фракции затем подвергают обращенно-фазовой HPLC (Spectra System P4000 от Thermo Scientific) с получением чистого соединения, которое затем отбирают в вышеупомянутых биологических анализах для локализации/идентификации активных соединений. Для подтверждения идентичности соединения регистрируют дополнительные спектроскопические данные, такие как LC/MS и ЯМР.
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
Активную фракцию 4 дополнительно очищают с использованием колонки HPLC С-18 (Phenomenex, Luna 10u C18(2) 100 А, 250×30), градиент вода:ацетонитрил в качестве системы растворителей (0-10 мин; 80% водный CHCN, 10-25 мин; 80-65% водный CHCN, 25-50 мин; 65-50% водный CHCN, 50-60 мин; 50-70% CHCN, 60-80 мин; 70-0% водный CHCN, 80-85 мин; 0-20% водный CHCN) при скорости потока 8 мл/мин и УФ обнаружением при 210 нм, с получением темплазола В, время удержания 46,65 мин. Другую активную фракцию 6 также очищают с использованием колонки HPLC C-18 (Phenomenex, Luna 10u С18(2) 100 А, 250×30), градиент вода:ацетонитрил в качестве системы растворителей (0-10 мин; 80% водный CHCN, 10-25 мин; 80-60% водный CHCN, 25-50 мин; 60-40% водный CHCN, 50-60 мин; 40% CHCN, 60-80 мин; 40-0% водный CHCN, 80-85 мин; 0-20% водный CHCN) при скорости потока 8 мл/мин и УФ обнаружением при 210 нм, с получением темплазола А, время удержания 70,82 мин.
plus
Масс-спектрометрический анализ чистого соединения осуществляют на приборе Then-no Finnigan LCQ Deca XP Plus electrospray (ESI) с использованием положительного и отрицательного режимов ионизации в полномасштабном режиме сканирования (m/z 100-1500 Да) на масс-спектрометре LCQ DECAXP (Thermo Electron Corp., San Jose, CA). Прибор для высокоэффективной жидкостной хроматографии Thermo (HPLC) оборудован детектором на основе диодной матрицы Finnigan Surveyor PDA plus, автосамплером plus, насосом для MS и колонкой 4,6 мм×100 мм Luna C18 5 мкм (Phenomenex). Система растворителей состоит из воды (растворитель А) и ацетонитрила (растворитель В). Подвижная фаза начинается при 10% растворителя В и линейно увеличивается до 100% растворителя B в течение 20 мин и затем поддерживается в течение 4 мин, и наконец возвращается до 10% растворителя B в течение 3 мин и поддерживается в течение 3 мин. Скорость потока составляет 0,5 мл/мин. Инжектируемый объем составлял 10 мкл и образцы поддерживают при комнатной температуре в автосэмплере. Соединения анализируют при помощи LC-MS с использованием LC и обращенно-фазовой хроматографии. Масс-спектрометрический анализ соединений по настоящему изобретению осуществляют в следующих условиях:
Скорость потока газа-азота фиксировали при 30 и 15 arb (произвольных единиц измерения) для скорости потока газа в оболочке и вспомогательного/продувочного газа, соответственно. Ионизацию путем распыления электронов осуществляли при напряжении распыления, установленном при 5000 В, и напряжении в капилляре, установленном при 35,0 В. Температуру в капилляре устанавливали при 400°С. Данные анализировали при помощи программного обеспечения Xcalibur. Активное соединение темплазол А имеет молекулярную массу 298 и демонстрирует m/z ион при 297,34 в режиме отрицательной ионизации. LC-MS хроматограмма для темплазола В свидетельствует о молекулярной массе 258 и демонстрирует m/z ион при 257,74 в режиме отрицательной ионизации.
1
13
-1
Н, С и 2D ЯМР спектры измеряли на спектрометре с градиентом поля Bruker 500 МГц и 600 МГц. Для сравнения используется внутренний стандарт тетраметилсилан (TMS, 0,00 млн).
1
13
1
13
+
13
1
1
1
1
1
1
13
17
18
2
3
17
19
2
3
2
3
2
Для выявления структуры темплазола А очищенное соединение с молекулярной массой 298 дополнительно анализируют с использованием ЯМР прибора 500 МГц, и имеет H ЯМР δ значения при 8,44, 8,74, 8,19, 7,47, 7,31, 3,98, 2,82, 2,33, 1,08 и имеет С ЯМР δ values при 163,7, 161,2, 154,8, 136,1, 129,4, 125,4, 123,5, 123,3, 121,8, 121,5, 111,8, 104,7, 52,2, 37,3, 28,1, 22,7, 22,7. Темплазол А имеет полосы поглощения в УФ при 226, 275, 327 нм, что свидетельствует о присутствии индольного и оксазольного колец. Молекулярную формулу CHNO определяли путем интерпретации данных H, C ЯМР и HRESI (ESI высокого разрешения) MS m/z 299.1396 (M+H) (Вычисл. для CHNO, 299,1397), которые указывают на высокую степень ненасыщенности, представленной 10 двойными связями. Спектр С ЯМР выявил сигналы для всех 17 атомов углерода, включающих два метила, метокси, метиленовый углерод, алифатический метин, сложноэфирный карбонил, и одиннадцать ароматических атомов углерода. Присутствие 3'-замещенного индола выявили в результате данных спектра H-Н COSY и НМВС. Н-H COSY и НМВС также указывали на присутствие метильной сложноэфирной группы карбоновой кислоты и боковой цепи -CH-XH-(CH). В результате подробного анализа данных H-H COSY (корреляционная спектроскопия), С, и НМВС (гетероядерная корреляционная спектроскопия кратных связей) выявили, что соединение содержало оксазольное ядро. В результате 2D анализа обнаружено, что изобутильная боковая цепь присоединена в позиции С-2, метильный сложный эфир карбоновой кислоты в позиции С-4 и индольная единица в позиции С-5 с получением темплазола А.
1
13
1
13
13
1
13
1
1
1
1
13
15
18
2
2
Второе, обладающее гербицидной активностью соединение, темплазол В, с молекулярной массой 258 дополнительно анализируют с использованием прибора ЯМР 500 МГц, и оно имеет H ЯМР δ значения при 7,08, 7,06, 6,75, 3,75, 2,56, 2,15, 0,93, 0,93 и C ЯМР значения δ 158,2, 156,3, 155,5, 132,6, 129,5, 129,5, 127,3, 121,8, 115,2, 115,2, 41,2, 35,3, 26,7, 21,5, 21,5. Молекулярную формулу устанавливают как CHNO, которую определяют путем интерпретации данных H, С ЯМР и масс-спектрометрии. Спектр С ЯМР выявил сигналы для всех 15 атомов углерода, включающих два метила, два метиленовых атома углерода, один алифатический метин, один амидный карбонил и девять ароматических атомов углерода. Общую структуру вывели в результате анализа спектров H и С ЯМР, которые демонстрируют пара-замещенное ароматическое кольцо [δ 7,08 (2Н, d, J=8,8 Гц), 6,75 (2Н, d, J=8,8 Гц), и 132,7, 129,5, 115,2, 127,3, 115,2, 129,5]. Спектр H ЯМР этой структуры вместе со спектрами H-Н COSY и HSQC демонстрировал характеристические сигналы для изобутильной группировки [δ 0,93 (6Н, d, J=6,9 Гц), 2,15 (1Н, септ., J=6,9 Гц), 2,57 (2Н, d, J=6,9 Гц). Дополнительно олефиновый/ароматический протон при (δ 7,06, s), и группа карбонильного углерода (δ 158,9) также обнаружены в спектрах H и С ЯМР. При исследовании спектра НМВС Н-Г сигнал в изобутильной группировке коррелировал с олефиновым углеродом (С-2, δ 156,3), и олефиновый протон Н-4 коррелировал с (С-5, δ 155,5; С-2, δ 156,3 и С-1”, 41,2), Метиленовый сигнал при 5 3,75 коррелировал с С-5, С-4, а также С-2” пара-замещенной ароматической группировкой. Все эти обнаруженные корреляции свидетельствуют о связи между изобутильной и пара-замещенной бензильной группировками для скелета представленной структуры. Кроме того, считают, что карбоксамидная группа находится в пара-положении бензильной группировки на основе НМВС корреляции для ароматического протона в позиции Н-4” и Н-6”. Таким образом, на основе вышеприведенных данных структура обозначена как темплазол В.
7. Пример 7. Выделение FR90128
2
3
Бульон целых клеток в результате ферментации Burkholderia sp.в неопределенной ростовой среде экстрагируют с адсорбентом Amberlite XAD-7 (Asolkar et al., 2006) путем встряхивания клеточной суспензии с адсорбентом при 225 об/мин в течение двух часов при комнатной температуре. Адсорбент и клеточную массу собирают путем фильтрования через марлю и промывают деионизированной водой для удаления солей. Адсорбент, клеточную массу и марлю затем вымачивают в течение 2 ч в ацетоне, после чего ацетон фильтруют и сушат в вакууме с использованием роторного испарителя с получением неочищенного экстракта. Неочищенный экстракт затем фракционируют с использованием обращенно-фазовой С18 вакуумной жидкостной хроматографии (HO/CHOH; градиент от 90:20 до 0:100%) с получением 10 фракций. Эти фракций затем концентрируют досуха с использованием роторного испарителя, и образующиеся в результате безводные остатки отбирают в отношении биологической активности с использованием биологического анализа против насекомых, а также гербицидного биологического анализа. Активные фракции затем подвергают обращеннофазовой/нормальнофазовой HPLC (Спектры System P4000; Thermo Scientific) с получением чистого соединения, которое затем отбирают в гербицидном, инсектицидном и нематицидном биологических анализах, описанных ниже для локализации/идентификации активного соединения. Для подтверждения идентичности соединения регистрируют дополнительные спектроскопические данные, таких как LC/MS и ЯМР.
plus
Масс-спектрометрический анализ активных пиков осуществляют на приборе Thermo Finnigan LCQ Deca XP Plus electrospray (ESI) с использованием положительного и отрицательного режимов ионизации в полномасштабном режиме сканирования (m/z 100-1500 Да) на масс-спектрометре LCQ DECAXP(Thermo Electron Corp., San Jose, CA). Прибор для высокоэффективной жидкостной хроматографии Thermo (HPLC) оборудован детектором на основе диодной матрицы Finnigan Surveyor PDA plus, автосамплером plus, насосом для MS и колонкой 4,6 мм×100 мм Luna С18 5 мкм (Phenomenex). Система растворителей состоит из воды (растворитель А) и ацетонитрила (растворитель В). Подвижная фаза начинается при 10% растворителя В и линейно увеличивается до 100% растворителя В в течение 20 мин, и затем поддерживается в течение 4 мин, и наконец возвращается до 10% растворителя В в течение 3 мин и поддерживается в течение 3 мин. Скорость потока составляет 0,5 мл/мин. Инжектируемый объем составляет 10 мкл, и образцы поддерживают при комнатной температуре в автосэмплере. Соединения анализируют при помощи LC-MS с использованием LC и обращенно-фазовой хроматографии. Масс-спектрометрический анализ соединений по настоящему изобретению осуществляют в следующих условиях:
скорость потока газа-азота фиксировали при 30 и 15 arb для скорости потока газа в оболочке и вспомогательного/продувочного газа, соответственно. Ионизацию путем распыления электронов осуществляют при напряжении распыления, установленном при 5000 В, и напряжении в капилляре, установленном при 35,0 В. Температуру в капилляре устанавливают равной 400°С. Данные анализируют при помощи программного обеспечения Xcalibur. На основе анализа LC-MS активное инсектицидной соединение из фракции 5 имеет молекулярную массу 540 в режиме отрицательной ионизации.
1
13
Для выявления структуры очищенное инсектицидной соединение из фракции 5, имеющее молекулярную массу 540, дополнительно анализируют с использованием прибора ЯМР 500 МГц, и оно обладает H ЯМР значениями при 6,22, 5,81, 5,69, 5,66, 5,65, 4,64, 4,31, 3,93, 3,22, 3,21, 3,15, 3,10, 2,69, 2,62, 2,26, 2,23, 1,74, 1,15, 1,12, 1,05, 1,02; и обладает С ЯМР значениями 172,99, 172,93, 169,57, 169,23, 167,59, 130,74, 130,12, 129,93, 128,32, 73,49, 62,95, 59,42, 57,73, 38,39, 38,00, 35,49, 30,90, 30,36, 29,26, 18,59, 18,38, 18,09, 17,93, 12,51. Данные ЯМР указывают на то, что соединение содержит амино, сложноэфирные, карбоновой кислоты, алифатические метильные, этиловые, метиленовые, оксиметиленовые, метиновые, оксиметиновые и серные группы. Подробный 1D и 2D ЯМР анализ подтвердил, что структура соединения соответствует известному соединению FR90128.
8. Пример 8. Гербицидная активность FR90128
Гербицидную активность активного соединения FR90128 (ММ 540) тестируют в лабораторном анализе с использованием однонедельных проростков ежовника (Echinochloa crus-galli) на платформе 96-луночного планшета. Один проросток травы помещали в каждую из лунок, содержащую 99 микролитров деионизированной воды. Аликвоту, равную один микролитр, чистого соединения в этаноле (10 мг/мл) добавляют в каждую лунку, и планшет закрывают крышкой. Один микролитр этанола в 99 микролитрах воды используют в качестве отрицательного контроля. Обработки осуществляют в восьми повторностях, и закрытый планшет инкубируют в теплице при искусственном освещении (12 ч световой/темновой цикл). Через пять суток регистрируют результаты. Проростки травы во всех восьми лунках, которые получали активное соединение, погибли, причем не осталось зеленой ткани, тогда как проростки в лунках с отрицательным контролем активно росли.
9. Пример 9. Инсектицидная активность FR90128
2
50
Инсектицидную активность активного соединения FR90128 (ММ 540) тестируют в лабораторном анализе с использованием системы контактного биологического анализа. Соединение растворяют в 100% этаноле до концентраций 0,001, 0,005, 0,01, 0,025, 0,05, 0,1, 0,25 и 0,5 мкг/мкл. Отдельные личинки ранней 3-й стадии совки малой Spodoptera exigua помещают в пластиковые колпачки на 1,25 унций с куском искусственной диеты 1 см (Bio-Serv). Микропипетку Hamilton используют для нанесения 1 мкл соединения в грудной отдел каждой личинки. Колпачки покрывают тянущимся парафильмом и для аэрации в парафильме прорезают единичное отверстие. Обрабатывают по десять личинок на концентрацию. Анализ осуществляют при 25°С, 12 ч свет/12 ч темнота. Личинок подсчитывали через 48 и 72 часа после применения. Анализ Probit осуществляют для оценки средней смертельной концентрации LC, которая, как обнаружено для соединения (ММ 540), составляет 0,213.
10. Пример 10. Выделение темпламида А, В, FR901465 и FR90128
Методы и материалы
Следующий способ используют для очистки соединения, экстрагированного из клеточной культуры Burkholderia sp (смотри Фиг.7):
2
3
Культуральный бульон, полученный из 10 л объема ферментации Burkholderia (A396) в среде для роста Ну soy, экстрагируют с адсорбентом Amberlite XAD-7 (Asolkar et al., 2006) путем встряхивания клеточной суспензии с адсорбентом при 225 об./мин в течение двух часов при комнатной температуре. Адсорбент и клеточную массу собирают путем фильтрования через марлю и промывают деионизированной водой для удаления солей. Адсорбент, клеточную массу и марлю затем вымачивают в течение 2 ч в ацетоне, после чего ацетон фильтруют и сушат в вакууме с использованием роторного испарителя с получением неочищенного экстракта. Неочищенный экстракт затем фракционируют с использованием обращенно-фазовой С-18 вакуумной жидкостной хроматографии (HO/CHOH; градиент от 90:20 до 0:100%) с получением 10 фракций. Эти фракций затем концентрируют досуха с использованием роторного испарителя, и образующиеся в результате безводные остатки отбирают в отношении биологической активности с использованием анализа засевания латука в 96-луночном планшете (гербицидный) и личинки ранней 3-й стадии совки малой (инсектицидный). Активные фракции затем подвергают повторному разделению при помощи обращенно-фазовой HPLC (Spectra System P4000 (Thermo Scientific) с получением чистого соединения, которое затем отбирают в вышеупомянутых биологических анализах для локализации/идентификации активного соединения. Для подтверждения идентичности соединения регистрируют дополнительные спектроскопические данные, такие как LC/MS, HRMS и ЯМР.
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
Активную фракцию 5 дополнительно очищают с использованием колонки HPLC C-18 (Phenomenex, Luna 10u C18(2) 100 А, 250×30), градиент вода:ацетонитрил в качестве системы растворителей (0-10 мин; 80% водный CHCN, 10-25 мин; 80-65% водный CHCN, 25-50 мин; 65-50% водный CHCN, 50-60 мин; 50-70% водный CHCN, 60-80 мин; 70-0% водный CHCN, 80-85 мин; 0-20% водный CHCN) при скорости потока 8 мл/мин и УФ обнаружением при 210 нм, с получением темпламида А, время удержания 55,64 мин, и FR901465, время удержания 63,59 мин, и FR90128, время удержания 66,65 мин, соответственно. Другую активную фракцию 6 также очищают с использованием колонки HPLC С-18 (Phenomenex, Luna 10u C18(2) 100 А, 250×30), градиент вода:ацетонитрил в качестве системы растворителей (0-10 мин; 70-60% водный CHCN, 10-20 мин; 60-40% водный CHCN, 20-50 мин; 40-15% водный CHCN, 50-75 мин; 15-0% CHCN, 75-85 мин; 0-70% водный CHCN) при скорости потока 8 мл/мин и УФ обнаружением при 210 нм, с получением темпламида В, время удержания 38,55 мин.
+
+
+
+
Масс-спектрометрический анализ чистого соединения осуществляют на приборе Thermo Finnigan LCQ Deca XP Plus electrospray (ESI) с использованием положительного и отрицательного режимов ионизации в полномасштабном режиме сканирования (m/z 100-1500 Da) на масс-спектрометре LCQ DECA Xppius (Thermo Electron Corp., San Jose, CA). Используют прибор для высокоэффективной жидкостной хроматографии Thermo (HPLC), оборудованный детектором на основе диодной матрицы Finnigan Surveyor PDA plus, автосэмплером plus, насосом для MS и колонкой 4,6 мм×100 мм Luna C18 5 мкм (Phenomenex). Система растворителей состоит из воды (растворитель А) и ацетонитрила (растворитель В). Подвижная фаза начинается при 10% растворителя В и линейно увеличивается до 100% растворителя В в течение 20 мин, и затем поддерживается в течение 4 мин, и наконец возвращается до 10% растворителя В в течение 3 мин, и поддерживается в течение 3 мин. Скорость потока составляет 0,5 мл/мин. Инжектируемый объем составляет 10 мкл, и образцы поддерживают при комнатной температуре в автосэмплере. Соединения анализируют при помощи LC-MS с использованием LC и обращенно-фазовой хроматографии. Масс-спектрометрический анализ соединений по настоящему изобретению осуществляют в следующих условиях: скорость потока газа-азота фиксировали при 30 и 15 arb для скорости потока газа в оболочке и вспомогательного/продувочного газа, соответственно. Ионизацию путем распыления электронов осуществляют при напряжении распыления, установленном при 5000 В, и напряжении в капилляре, установленном при 45,0 В. Температуру в капилляре устанавливают равной 300°С. Данные анализируют при помощи программного обеспечения Xcalibur. Активное соединение темпламид А имеет молекулярную массу 555 на основе m/z пика при 556,41 [М+H] и 578,34 [М+Na] в режиме положительной ионизации. Анализ LC-MS в режиме положительной ионизации для темпламида В указывает на молекулярную массу 537 на основе т/т.ионов при 538,47 [М+Н] и 560,65 [М+Na]. Молекулярная масса для соединений FR901465 и FR90128 составляет 523 и 540, соответственно, на основе анализа LCMS.
1
13
-1
H, С и 2D ЯМР спектры измеряют при помощи спектрометра с градиентом поля Bruker 600 МГц. Для сравнения используется внутренний стандарт тетраметилсилан (TMS, 0,00 млн).
1
13
13
2
1
13
1
1
28
45
10
Для выявления структуры темпламида А очищенное соединение, обладающее молекулярной массой 555, дополнительно анализируют с использованием прибора ЯМР 600 МГц, и обладает H ЯМР δ значением при 6,40, 6,39, 6,00, 5,97, 5,67, 5,54, 4,33, 3,77, 3,73, 3,70, 3,59, 3,47, 3,41, 2,44, 2,35, 2,26, 1,97, 1,81, 1,76, 1,42, 1,37, 1,16, 1,12, 1,04 и обладает С ЯМР значением δ 173,92, 166,06, 145,06, 138,76, 135,71, 129,99, 126,20, 123,35, 99,75, 82,20, 78,22, 76,69, 71,23, 70,79, 70,48, 69,84, 60,98, 48,84, 36,89, 33,09, 30,63, 28,55, 25,88, 20,37, 18,11, 14,90, 12,81, 9,41. С ЯМР спектр демонстрирует 28 отдельных сигналов углерода, которые относятся к шести метилам, четырем метиленовым атомам углерода, и тринадцати метинам, включающим пять sp, четыре четвертичных атома углерода. Молекулярную формулу CHNO определяют путем интерпретации данных Н, С ЯМР и HRESI MS. Подробный анализ данных спектров H-Н COSY, HMBC и HMQC выявил следующие субструктуры (I-IV) и две отдельные метиленовые и синглетные метильные группы. Эти субструктуры связаны позже с использованием ключевых HMBC корреляций с получением плоской структуры для соединения, которая не приведена в литературе и обозначена как темпламид А. Данная поликетидная молекула содержит два тетрагидропиранозных кольца, и один конъюгированный амид.
Субструктуры I-IV определяли путем анализа данных 1D и 2D ЯМР спектроскопии.
+
+
1
13
13
28
43
9
2
(+) ESIMS анализ для второго гербицидного соединения демонстрирует m/z ионы при 538,47 [М+H] и 560,65 [M+Na], соответствующие молекулярной массе 537. Молекулярную формулу CHNO определяют путем интерпретации анализа данных ESIMS и ЯМР. H и C ЯМР для этого соединения близок результатам для темпламида А за исключением того, что новый выделенный -CH- появляется вместо несвязанной метиленовой группы в темпламиде А. Небольшая герминальная константа связывания, равная 4,3 Гц, характерна для присутствия эпоксидной метиленовой группы. Присутствие этого эпоксида дополнительно подтверждается сдвигом С ЯМР с 60,98 для темпламида А до 41,07 для соединения с ММ 537. Различие в молекулярных формулах между этими двумя соединениями объясняется устранением молекулы воды с последующим образованием эпоксида. Таким образом, на основе анализа ЯМР и MS структура для нового соединения определена и обозначена как темпламид В.
1
13
1
13
Для выявления структуры очищенное соединение из фракции 5, обладающее молекулярной массой 523, дополнительно анализируют с использованием прибора ЯМР 600 МГц, и обладает H ЯМР δ значениями при 6,41, 6,40, 6,01, 5,98, 5,68, 5,56, 4,33, 3,77, 3,75, 3,72, 3,65, 3,59, 3,55, 3,50, 2,44, 2,26, 2,04, 1,96, 1,81, 1,75, 1,37, 1,17, 1,04; и обладает C ЯМР δ значениями 172,22, 167,55, 144,98, 138,94, 135,84, 130,14, 125,85, 123,37, 99,54, 82,19, 78,28, 76,69, 71,31, 70,13, 69,68, 48,83, 42,52, 36,89, 33,11, 30,63, 25,99, 21,20, 20,38, 18,14, 14,93, 12,84. Подробный анализ H и C ЯМР соединения свидетельствет о том, что это соединение весьма близко соединению темпламиду В; единственное различие состояло в боковой цепи сложного эфира; ацетатная группировка представлена вместо пропионатной группировки в боковой цепи. Подробный 1D и 2D ЯМР анализ подтвердил, что структура соединения соответствует известному соединению FR901465.
1
13
На основе анализа LC-MS другое соединение из фракции 5 обладает молекулярной массой 540 в режиме отрицательной ионизации. Для выявления структуры очищенное соединение из фракции 5 с молекулярной массой 540 дополнительно анализируют с использованием прибора ЯМР 500 МГц, и обладает H ЯМР δ значением при 6,22, 5,81, 5,69, 5,66, 5,65, 4,64, 4,31, 3,93, 3,22, 3,21, 3,15, 3,10, 2,69, 2,62, 2,26, 2,23, 1,74, 1,15, 1,12, 1,05, 1,02; и обладает С ЯМР значениями 172,99, 172,93, 169,57, 169,23, 167,59, 130,74, 130,12, 129,93, 128,32, 73,49, 62,95, 59,42, 57,73, 38,39, 38,00, 35,49, 30,90, 30,36, 29,26, 18,59, 18,38, 18,09, 17,93, 12,51. Данные ЯМР свидетельствуют о том, что соединение содержит амино, сложноэфирную, карбоновой кислоты, алифатическую метильную, этильную, метиленовую, оксиметиленовую, метиновую, оксиметиновую и серную группы. Подробный 1D и 2D ЯМР анализ подтвердил, что структура соединения соответствует известному соединению FR90128.
11. Пример 11. Гербицидная активность темпламида А, темпламида В, FR901465 и FR90128
Гербицидную активность темпламида А, В, FR901465 и FR90128 тестируют в лабораторном анализе с использованием однонедельных проростков ежовника (Echinochloa crus-galli) и латука (Lactuca sativa L.) на платформе 96-луночного планшета. Один проросток травы помещали в каждую из лунок, содержащую 99 микролитров деионизированной воды. Аликвоту, равную один микролитр, чистого соединения в этаноле (10 мг/мл) добавляют в каждую лунку, и планшет закрывают крышкой. Один микролитр этанола в 99 микролитрах воды используют в качестве отрицательного контроля. Обработки осуществляли в восьми повторностях, и закрытый планшет инкубируют в теплице при искусственном освещении (12 ч световой/темновой цикл). Через пять суток регистрируют результаты. Проростки травы во всех восьми лунках, которые получали активное соединение, погибли, причем не осталось зеленой ткани, тогда как проростки в лунках с отрицательным контролем активно росли. Гербицидная активность темпламида А против проростков латука несколько меньшей чем для травы. С другой стороны, темпламид В обеспечивает более эффективную (100%) борьбу с побегами латука (используемого в качестве модельной системы для широколистных сорняков) по сравнению с темпламидом А (Таблица 11).
Пример 12. Инсектицидная активность активных соединений
Инсектицидную активность темпламида А, В, FR901465 и FR90128 тестируют в лабораторном анализе с использованием 96-луночного формата анализа с наложением рациона с личинками 1-й стадии совки малой с использованием микротитровальных планшет с 200 мкл твердой искусственной диеты совки малой в каждой лунке. Сто (100) мкл каждого тестируемого образца пипетируют на поверхность диеты (один образец в каждой лунке), и образцу дают возможность высыхать в потоке воздуха до получения сухой поверхности. Каждый образец тестировали в шести повторностях, и воду и имеющийся в продаже продукт Bt (B. thuringiensis) используют в качестве отрицательного и положительного контролей, соответственно. Одну личинку первой стадии тестируемого насекомого (совки малой - Spodoptera exiqua) помещали в каждую лунку, и планшет закрывали пластиковой крышкой с воздушными отверстиями. Планшеты с насекомыми инкубировали при 26°С в течение 6 суток с ежесуточными оценками смертности. На основе результатов, представленных в Таблице 12, темпламид А и В приводит в результате к 40% и 80% смертности, соответственно.
Таблица 12
Данные инсектицидного биологического анализа для темпламида А, В, FR901465 и FR90128 против 1-й стадии совки малой (Spodoptera exigua)
Соединения<sup>1</sup>
(% смертности)
Темпламид А
40
Темпламид В
80
FR901465
50
FR90128
90
Bt
100
Контроль
0
<sup>1</sup>Концентрация 10 мкг/мл на лунку
Пример 13. Фунгицидная активность FR90128 (MM 540)
Фунгицидную активность FR90128 (MM 540) против трех патогенных для растений грибов (Botrytis cinerea, Phytophtora sp., Monilinia fructicola) тестируют в планшетном анализе PDA (картофельно-декстрозный агар) in vitro. Планшеты инокулируют грибом с использованием контактного метода. После того, как гриб приживался и начинал расти на ростовой среде, восемь стерильных дисков фильтровальной бумаги помещали на каждый планшет приблизительно на 1 см от края по окружности. По десять микролитров этанольного раствора, содержащего 20, 15, 10, 7,5, 5, 2,5 1,25 мг FR90128/мл добавляют на диски фильтровальной бумаги, и раствор оставляют испаряться. Один диск, помещенный в 10 мкл чистого этанола, используют в качестве отрицательного контроля. Анализ осуществляют в трех повторностях. Планшеты инкубируют при комнатной температуре в течение 5 суток, после чего фунгицидной активностью регистрируют путем измерения зоны ингибирования вокруг каждого диска из фильтровальной бумаги, соответствующего различным концентрациям FR90128. В соответствии с результатами FR90128 не оказывает действия на рост Monilinia, но эффективен при борьбе с ростом гиф Botrytis и Phytophtora. По видимому имеется зависимое от дозы ингибирование с пороговыми концентрациями 10 мг/мл и 1,25 мг/мл для Botrytis и Phytophtora, соответственно (Фиг. 8).
ДЕПОНИРОВАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА
Следующий биологический материал депонирован в соответствии с правилами Будапештского договора в Коллекции культур службы сельскохозяйственных исследований (NRRL), 1815 N. University Street, Peoria, Illinois 61604 USA, и ему присвоен следующий номер:
Штамм размещен в условиях, которые обеспечивают доступ к культуре при рассмотрении настоящей заявки на патент, определяемые Комиссаром по патентам и товарным знакам в соответствии с 37 C.F.R. (Code of Federal Regulations) §1.14 и 35 U.S.C. (United States Code) §122. Депонированный материал представляет собой по существу чистую культуру штамма. Депонированный материал доступен в соответствии с требованием иностранных патентных законодательств в странах, где подана настоящая заявка или ее производные. Тем не менее, следует понимать, что доступность депонированного материала не предоставляет разрешение для практического применения объекта изобретения, что умаляет патентные права, предоставляемые решением государственных органов.
Изобретение, описанное и заявленное здесь, не должно быть ограничено в объеме конкретными раскрытыми здесь аспектами, так как эти аспекты предназначены как иллюстрации нескольких аспектов изобретения. Предполагается, что любые эквивалентные аспекты находятся в объеме изобретения. Действительно, различные модификации изобретения, дополнительные к представленным и описанным здесь, будут понятны специалистам в данной области техники из предшествующего описания. Предполагается, что такие модификации также оказываются в объеме формулы изобретения. В случае конфликта следует руководствоваться настоящим описанием, включающим определения.
В настоящем описании цитированы различные документы, описания которых включены здесь полностью путем ссылки.
Цитированная литература:
Anderson, et al. "The structure of thiostrepton", Nature 225: 233-235. 1970.
Andra, "Endotoxin-like properties of a rhamnolipid exotoxin from Burkholderia (Pseudomonas) plantarii: immune cell stimulation and biophysical characterization." Biol. Chem. 387: 301-310. 2006.
Arena, et al. "The mechanism of action of avermectins in Caenorhabditis elegans - correlation between activation of glutamate-sensitive chloride current, membrane binding and biological activity." J Parasitol. 81: 286-294. 1995.
Asolkar, et al., "Weakly cytotoxic polyketides from a marine-derived Actinomycete of the genus Streptomyces strain CNQ-085." J. Nat. Prod. 69:1756-1759.2006.
Burkhead, et al., "Pyrrolnitrin production by biological control agent Pseudomonas cepacia B37w in culture and in colonized wounds of potatoes." Appl. Environ. Microbiol. 60: 2031-2039. 1994.
Burkholder, W. H "Sour skin, a bacterial rot of onion bulbs." Phytopathology 40: 115-117. 1950.
Caballero-Mellado et al., "Burkholderia unamae sp. nov., an N2-fixing rhizospheric and endophytic species." Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 54: 1165-1172. 2004.
Cashion et al. "Rapid method for base ratio determination of bacterial DNA." Anal. Biochem. 81: 461-466. 1977.
Casida, et al., US 6689357.
Chen et al., "Burkholderia nodosa sp.nov., isolated from root nodules of the woody Brazilian legumes Mimosa bimucronata and Mimosa scabrella " Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 57: 1055-1059. 2007.
Cheng, А.С. and Currie, B.J. "Melioidosis: epidemiology, pathophysiology, and management." Clin. Microbiol. 18: 383-416.2005.
Coenye, Т. and P. Vandamme, P. "Diversity and significance of Burkholderia species occupying diverse ecological niches." Environ. Microbiol. 5: 719-729. 2003.
Compant, et al. "Diversity and occurence of Burkholderia spp.in the natural environment." FEMS Microbiol. Rev. 32: 607-626. 2008.
De Ley et al. "The quantitative measurement of DNA hybridization from renaturation rates." Eur. J. Biochem. 12: 133-142. 1970.
Duke et al. "Natural products as sources for herbicides: current status and future trends." Weed Res 40: 99-111. 2000.
Gerwick et al., US 7393812.
Gottlieb et al., US 4808207.
Gouge et al., US 2003/0082147.
Guella et al. "Almazole C, a new indole alkaloid bearing an unusually 2,5-disubstituted oxazole moiety and its putative biogenetic precursors, from a Senegalese Delesseriacean sea weed." Helv. Chim. Acta 77: 1999-2006. 1994.
Guella et al. "Isolation, synthesis and photochemical properties of almazolone, a new indole alkaloid from a red alga of Senegal." Tetrahedron. 62: 1165-1170. 2006.
Henderson, P.J. and Lardy H.A. "Bongkrekic acid. An inhibitor of the adenine nucleotide translocase of mitochondria." J. Biol. Chem. 245: 1319-1326. 1970.
Hirota et al. "Isolation of indolmycin and its derivatives as antagonists of L-tryptophan. "Agri. Biol Chem. 42: 147-151. 1978.
Hu, F.-P. and Young, J.M. "Biocidal activity in plant pathogenic Acidovorax, Burkholderia, Herbaspirillum, Ralstonia, and Xanthomonas spp." J. Appl. Microbiol. 84:263-271. 1998.
Huss et al. "Studies of the spectrophotometric determination of DNA hybridization from renaturation rates." System. Appl. Microbiol. 4: 184-192. 1983.
Jansiewicz, W.J. and Roitman J. "Biological control of blue mold and gray mold on apple and pear with Pseudomonas cepacia." Phytopathology 78: 1697-1700. 1988.
Jeddeloh et al., W02001/055398.
Jansen et al. "Thiangazole: a novel inhibitor of HIV-1 from Polyangium Spec." Liebigs Ann. Chem. 4: 357-3359. 1992.
Jeong et al. "Toxoflavin produced by Burkholderia glumae causing rice grain rot is responsible for inducing bacterial wilt in many field crops." Plant Disease 87: 890-895. 2003.
Knudsen, G.R. and Spurr, J. "Field persistence and efficacy of five bacterial preparations for control of peanut leaf spot." Plant Disease 71: 442-445. 1987.
Koga-Ban et al. "cDNA sequences of three kinds of beta-tubulins from rice." DNA Research 2: 21-26. 1995.
Koide et al. US 2008/0096879.
Koyama et al. "Isolation, characterization, and synthesis of pimprinine, pimrinrthine, and pimprinaphine, metabolites of Streptoverticillium olivoreticuli." Agri. Biol.Chem.45: 1285-1287. 1981.
Krieg et al. "Bacillus thuringiensis var. tenebrionis: Ein neuer, gegenuber Larven von Coleopteren wirksamer Pathotyp." Z. Angew. Entomol._96:500-508. 1983.
Kunze et al. "Thiangazole, a new thiazoline antibiotic from Polyangium sp (Myxobacteria Production, antimicrobial activity and mechanism of action." J. Antibiot, 46: 1752-1755. 1993.
Leahy et al. "Comparison of factors influencing trichloroethylene degradation by toluene-oxidizing bacteria." Appl. Environ. Microbiol. 62: 825-833. 1996.
Lessie et al. "Genomic complexity and plasticity of Burkholderia cepacia." FEMS Microbiol. Lett. 144: 117-128. 1996.
Lindquist, N. et al. "Isolation and structure determination of diazonamides A and B, unusual cytotoxic metabolites from the marine ascidian Diazona chinensis." J. Am Chem. Soc. 113: 2303-2304. 1991.
Lorch, H et al. "Basic methods for counting microoganisms in soil and water. In Methods in applied soil microbiology and biochemistry. K. Alef and P. Nannipieri. Eds. San Diego, CA, Academic Press: pp.146-161. 1995.
Ludovic et al. "Burkholderia diveristy and versatility: An inventory of the extracellular products." J. Microbiol. Biotechnol. 17: 1407-1429. 2007.
Lydon, J. and Duke, S. "Inhibitors of glutamine biosynthesis." in Plant amino acids: Biochemistry and Biotechnology. B. Singh., Ed, New York, USA, Marcel Decker, pp.445-464. 1999.
Mahenthiralingam et al. "DNA-based diagnostic approaches for identification of Burkholderia cepacia complex, Burkholderia vietnamiensis, Burkholderia multivorans, Burkholderia stabilis, and Burkholderia cepacia genomovars I and III." J.Clin. Microbiol. 38: 3165-3173. 2000.
Ming, L.-J. and Epperson. "Metal binding and structure-activity relationship of the metalloantibiotic peptide bacitracin." Biochemistry 91: 46-58. 2002.
Morita et al. "Biological activity of tropolone." Biol. Pharm. Bull. 26: 1487-1490. 2003.
Nagamatsu, Т. "Syntheses, transformation, and biological activities of 7-azapteridine antibiotics: toxoflavin, fervenulin, reumycin, and their analogs". Recent Res. Devel. Org. Bioorg. Chem. 4: 97-121.2001.
Naik et al., "Pimprine, an extracellular alkaloid produced by Streptomyces CDRIL-312: fermentation, isolation and pharmacological activity. " J. Biotech. 88: 1-10. 2001.
Nakajima et al., "Antitumor Substances, FR901463, FR901464 and FR901465. I. Taxonomy, Fermentation, Isolation, Physico-chemical Properties and Biological Activities." J. Antibiot. 49: 1196-1203. 1996.
Nakajima et al. US 5545542.
Nakajima et al., "Hydantocidin: a new compound with herbicidal activity." J Antibiot. 44: 293-300. 1991.
N'Diaye, I. et al., "Almazole A and amazole B, unusual marine alkaloids of an unidentified red seaweed of the family Delessen'aceae from the coasts of Senegal." Tet Lett. 35: 4827-4830. 1994.
N'Diaye, I. et al., "Almazole D, a new type of antibacterial 2,5-disubstituted oxazolic dipeptide from a red alga of the coast of Senegal." Tet Lett. 37: 3049-3050. 1996.
Nierman et al., "Structural flexibility in the Burkholderia mallei genome." Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101: 14246-14251. 2004.
Okazaki et al., "Rhizobial strategies to enhance symbiotic interaction: Rhizobitoxine and 1-aminocyclopropane-l-carboxylate deaminase." Microbes Environ. 19: 99-111. 2004.
Parke, J.L. and D.Gurian-Sherman, D. 2001. "Diversity of the Burkholderia cepacia complex and implications for risk assessment of biological control strains." Annual Reviews in Phytopathology 39; 225-258. 2001.
Parke, et al. US 6077505.
Pettit, G. et al. "Isolation of Labradorins 1 and 2 from Pseudomonas syringae" J. Nat. Prod. 65: 1793-1797. 2002.
Pitt, et al., "Type characterization and antibiotic susceptibility of Burkholderia (Pseudomonas) cepacia isolates from patients with cystic fibrosis in the United Kingdom and the Republic of Ireland." J. Med. Microbiol. 44: 203-210. 1996.
Ramette et al., "Species abundance and diversity of Burkholderia cepacia complex in the environment." Appl. Environ. Microbiol. 71: 1193-1201. 2005.
Resi et al., "Burkholderia tropica sp.nov., a novel nitrogen-fixing, plant-associated bacterium."lnt. J. Syst. Evol. Microbiol. 54: 2155-2162. 2004.
Salama et al. "Potency of spore-gamma-endotoxin complexes of Bacillus thuringiensis against some cotton pests." Z. Angew. Entomol. 91: 388-398. 1981.
Selva et al., "Targeted screening for elongation factor Tu binding antibiotics." J. Antibiot. 50: 22-26. 1997.
Takahashi, S. et al. "Martefragin A, a novel indole alkaloid isolated from a red alga, inhibits lipid peroxidation." Chem Pharm. Bull. 46: 1527-1529. 1998.
Thompson et al. "Spinosad - a case study: an example from a natural products discovery programme." Pest Management Science 56: 696-702. 2000.
Takita et al., "Chemistry of Bleomycin. XIX Revised structures of bleomycin and phleomycin." J. Antibiot. 31: 801-804. 1978.
Tran Van et al., "Repeated beneficial effects of rice inoculation with a strain of Burkholderia vietnamiensis on early and late yield component in low fertility sulphate acid soils of Vietnam." Plant and Soil 218: 273-284. 2000.
Tsuruo et al., "Rhizoxin, a macrocyclic lactone antibiotic, as a new antitumor agent against human and murine tumor cells and their vincristine-resistant sublines." Cancer Res. 46: 381-385. 1986.
Uedaetal, US 7,396,665.
Umehara, K. et al. "Studies of new antiplatelet agents WS-30581 A and B." J. Antibiot. 37: 1153-1160. 1984.
Vandamme et al. Polyphasic taxonomic study of the emended genus Arcobacter with Arcobacter butzleri comb. nov. and Arcobacter skin-own sp. nov., an aerotolerant bacterium isolated from veterinary specimens." Int. J. Syst. Bacteriol. 42: 344-356. 1992.
Vanderwall et al., "A model of the structure of HOO-Co·bleomycin bound to d(CCAGTACTGG): recognition at the d(GpT)site and implications for double-stranded DNA cleavage, Chem. Biol. 4: 373-387. 1997.
Vermis K., et al. "Evaluation of species-specific recA-based PCR tests for genomovar level identification within the Burkholderia cepacia complex." J. Med. Microbiol 51:937-940. 2002.
Watanabe, H. et al. "A new antibiotic SF2583A, 4-chloro-5-(3'indoly)oxazole, produced by Streptomyces." Meiji Seika Kenkyu Nenpo 27: 55-62. 1988.
Wayne et al., "Report of the Ad Hoc committee on reconciliation of approaches to bacterial systematics." Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 37: 463-464. 1987.
Werner et al., "Uptake of indolmycin in gram-positive bacteria." Antimicrob Agents Chemotherapy 18: 858-862. 1980.
Wilson et al. "Toxicity of rhizonin A, isolated from Rhizopus microsporus, in laboratory animals." Food Chem. Toxicol. 22: 275-281. 1984.
Zeck W.M. "Ein Bonitierungsschema zur Feldauswertung von Wurzelgallenbefall. Pflanzenschutznachrichten." Bayer24,1: 144-147. 1971.
Zhang et al., US 7141407.
Zhou et al., "Antimicrobial susceptibility and synergy studies of Burkholderia cepacia complex isolated from patients with cystic fibrosis." Antimicrobial Agents and Chemotherapy 51: 1085-088. 2007.