СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СРЕДСТВА, ОБЛАДАЮЩЕГО ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТЬЮ
METHOD FOR PRODUCTION OF PREPARATION WITH ANTI-INFLAMMATORY ACTIVITY

Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно фармации, и касается способа получения средства из растительного сырья, обладающего противовоспалительной активностью.
В настоящее время существует большое количество противовоспалительных лекарственных средств и проводятся многочисленные исследования по разработке, изучению и внедрению в практику лекарственных средств для лечения и профилактики воспалительных заболеваний. Наиболее широко представлена группа нестероидных противовоспалительных средств, например диклофенак, индометацин, ибупрофен, ацетилсалициловая кислота и другие, которые при их выраженном терапевтическом эффекте не лишены побочного действия, имеют противопоказания и ограничения к применению, а именно вызывают иммуносупрессию, геморрагические осложнения, увеличение риска возникновения язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки и ее осложнений [Фармакология: учебник. - 10-е изд., испр., перераб. и доп. - Харкевич Д.А. 2010. - 752 с.; Каратеев А.Е., Насонова В.А. Проблема НПВП-индуцированной гастропатии: прошлое и настоящее // РМЖ. Приложение «Болезни органов пищеварения». - 2004. - №.1. - С. 36-43; Schacke Н., Docke W.D., Asadullah К. Mechanisms involved in the side effects of glucocorticoids // Pharmacology & therapeutics. - 2002. - T. 96. - №1. - C. 23-43].
Расширение исследований по изысканию источников для получения новых эффективных и безопасных лекарственных средств, в том числе растительного происхождения, является актуальной задачей медицины. Большой интерес в этом направлении представляют лекарственные растения как потенциальные источники получения новых противовоспалительных препаратов. Преимуществом лекарственных растений является широкий спектр их лечебного и профилактического действия, низкая токсичность, мягкость действия, способность быстро устранять симптомы обострения, предупреждать рецидивы [Машковский, М.Д. Лекарственные средства / М.Д. Машковский. - 15-е изд., перераб., испр. и доп. - М.: ООО «Изд-во Новая волна», 2005. - 1200 с.].
Известно растительное средство «Калефлон», содержащее экстракт из цветков календулы, которое применяется в качестве противовоспалительного, стимулирующего репаративные процессы средства; растительное средство «Ромазулан», представляющее собой жидкий экстракт из цветков ромашки аптечной и применяющийся как противовоспалительное, антисептическое, спазмолитическое средство [Справочник Видаль. Лекарственные средства, 2016]. Недостатками этих средств являются возможность развития побочных эффектов в виде аллергических реакций при непереносимости компонентов, ощущение жжения и боли в эпигастральной области, горечь во рту.
Известны растительные средства на основе выделенных из растений индивидуальных компонентов, например, применение производного урсоловой кислоты в качестве средства, обладающего противовоспалительными, антиоксидантными, гепатопротекторными свойствами, которое проявляет высокую биологическую активность, однако недостатком этого соединения является низкая растворимость в полярных и неполярных растворителях, что может приводить к низкой биодоступности [Патент РФ №2436793 «Средство, обладающее антиоксидантными, гепатопротекторными и противовоспалительными свойствами», Сорокина А.А. и др., 12.20.2011]. Средство на основе дигидрокверцетина, обладающее противовоспалительным, капилляроукрепляющим, антиоксидантным и антигистаминным действием. Однако данное соединение не является водорастворимым, что отрицательно сказывается на биодоступности [Патент РФ №2014841 «Способ получения препарата растворимого дигидрокверцитина», Соколов и др., 30.06.1994].
Известен способ получения средства, обладающего противовоспалительной и ранозаживляющей активностью, включающий экстрагирование этанолом травы люцерны, которое проводят трехкратно, последовательно в трех перколяторах при соотношении сырье:экстрагент 1:2 при комнатной температуре, первичное настаивание в каждом перколяторе проводят в течение 6-7 ч, объединенные экстракты отстаивают и фильтруют [заявка RU 97105729, опубликована 20.04.1999].
Известен способ получения средства, обладающего противовоспалительной активностью, путем экстрагирования растительного материала, при этом в качестве растительного материала используют сбор лекарственных растений, состоящий из надземной части панцерины шерстистой и какалии копьевидной, который экстрагируют 50-60%-ным этиловым спиртом при трехкратной экстракции в соотношении растительный материал - экстрагент, равном 1:(14-16) (с учетом коэффициента водопоглощения), первый и второй раз по 60 мин, третий - 30 мин при температуре 60-65°C [заявка RU 2013114909, опубликована 10.10.2014].
Известен способ получения средства, обладающего противовоспалительной активностью, путем экстрагирования растительной смеси, содержащей, мас.ч.: черные листья бадана толстолистного - 3,0; цветы ромашки аптечной - 2,8; траву тысячелистника обыкновенного - 2,4; листья мяты перечной - 1,8. Растительную смесь, измельченную до размера частиц 0,5-2,0 мм, дважды экстрагируют 80%-ным этанолом при комнатной температуре при соотношении сырье:экстрагент 1:(10-12) в течение 2 ч, затем дважды 40%-ным этанолом при температуре 90±5°C в течение 1 ч, отфильтрованные спиртовые извлечения упаривают, объединяют, концентрируют, высушивают в вакуум-сушильном шкафу для получения сухого экстракта и измельчают [патент RU 2331429, 2008 г.].
Наиболее близким аналогом изобретения является способ получения средства, обладающего желчегонной и противовоспалительной активностью, заключающийся в том, что корневища и корни девясила высокого, корневища и корни софоры желтоватой, корневища и корни кровохлебки лекарственной, корневища имбиря лекарственного, древесину бузины сибирской, плоды боярышника кроваво-красного и плоды яблони ягодной экстрагируют 25-30%-ным этиловым спиртом в соотношении сырье - экстрагент, равном 1:(18-20), при 60-65°C и постоянном перемешивании. Процесс повторяют трижды. Время экстракции при 1-м контакте фаз - 120 мин, при 2-м и 3-м контактах фаз - 60 мин. Извлечения фильтруют, объединяют, упаривают и очищают сепарированием. Очищенный экстракт доупаривают, высушивают в вакуумной сушилке и измельчают [патент RU 2159123, 2000 г.]. Недостатками данного способа являются длительная экстракция, при которой могут частично разрушаться биологически активные вещества, а также применение комплекса лекарственных растений разностороннего фармакологического действия, которые могут мешать выделению основной группы дубильных веществ, максимально содержащихся в кровохлебке лекарственной, и обеспечивающих в большей степени противовоспалительное действие.
Задачей изобретения является расширение ассортимента противовоспалительных лекарственных средств на основе лекарственных растений.
Технический результат - повышение противовоспалительной активности, упрощение способа за счет применения одного вида лекарственного растения, максимально содержащего дубильные вещества, которые при взаимодействии с воспаленной поверхностью обеспечивают ее уплотнение и активное уменьшение площади воспалительного процесса.
Указанный технический результат достигается тем, что в способе получения средства, обладающего противовоспалительной активностью, включающем трехкратную экстракцию спиртом этиловым кровохлебки лекарственной, фильтрацию, упаривание, концентрирование и высушивание спиртового экстракта, согласно изобретению используют траву кровохлебки лекарственной, измельченную до размера частиц 2,0 мм, экстракцию проводят 70%-ным спиртом при 90°C при соотношении сырье - экстрагент 1:50 в течение 2 ч, при этом первую экстракцию проводят в течение 60 мин, вторую и третью - по 30 мин.
Предлагаемый способ получения суммы экстрактивных веществ достаточно прост, не требует трудоемких затрат, позволяет получить продукт постоянного состава.
Rhizoma et radices Sanguisorbae
Для доказательства существенности предложенных условий способа получения средства, обладающего противовоспалительной активностью, а именно концентрации экстрагента, степени измельчения сырья, соотношения сырья и экстрагента, длительности и кратности процесса экстракции, были проведены серии экспериментов, в сравнении с известным и применяемым сырьем кровохлебки лекарственной - корневищами и корнями (), данные которых представлены в таблицах 1-4.
Одним из показателей качества лекарственного растительного сырья, характеризующим содержание всего комплекса веществ (действующих, сопутствующих и балластных), является определение суммы экстрактивных веществ, которое проводили по фармакопейной методике [Государственная фармакопея РФ XIII издания, ОФС.1.5.3.0006.15]. При изучении этого показателя использовали различные экстрагенты (воду очищенную и спирт этиловый в концентрации от 30 до 96%), с целью определить, какой из них наиболее полно извлекает экстрактивные вещества (табл. 1). Установлено, что оптимальными экстрагентами являются 70%-ный спирт этиловый и вода (при 100°C), позволяющие извлечь наибольшее количество экстрактивных веществ.
Особенность извлечения биологически активных веществ из лекарственного растительного сырья связана с тем, что на пути к веществам, содержащимся в клетке, находится клеточная стенка, являющаяся полупроницаемой перегородкой. Поэтому на извлечение действующих веществ из растительного материала особое значение оказывает степень его измельченности. Для оценки эффективности экстракции определяли содержание экстрактивных веществ (табл. 2). При этом установлено, что измельчение сырья до размера частиц более 2,0 мм нежелательно из-за снижения выхода экстрактивных веществ.
На выход экстрактивных веществ оказывает влияние соотношение сырье - экстрагент. Проведены эксперименты по определению оптимального соотношения сырья к экстрагенту (табл. 3). В результате анализа установлено, что оптимальным является соотношение 1:50, дальнейшее увеличение нецелесообразно, поскольку при значительном увеличении объема экстрагента содержание экстрактивных веществ существенно не повышается.
Изучено влияние времени и кратности экстракции на выход суммы биологически активных веществ (табл. 4). На основании проведенных экспериментов установлено, что равновесное состояние в системе по доминирующим компонентам при первом контакте фаз достигается за 60 минут, при втором и третьем контакте фаз - за 30 минут. Следовательно, трехкратная экстракция обеспечивает истощение сырья по основным компонентам в среднем на 80-90% от исходного содержания в сырье.
В результате проведенных анализов установлено, что оптимальными условиями экстрагирования травы кровохлебки лекарственной являются: экстрагент - 70%-ный спирт этиловый, его соотношение к сырью 1:50, степень измельчения сырья - 2,0 мм, температура экстракции - 90°C, время первой экстракции - 60 мин, второй - 30 мин, третьей - 30 мин.
Способ иллюстрируется нижеследующими примерами:
Herba Sanguisorbae, Sanguisorba officinalis L., Rosaceae
Пример 1. 1,0 г (точная навеска) измельченного лекарственного растительного сырья кровохлебки лекарственной (), просеянной сквозь сито с отверстиями размером 2 мм, помещают в коническую колбу вместимостью 250 мл, прибавляют 50 мл 70%-ного спирта этилового, колбу закрывают пробкой, взвешивают с погрешностью ±0,01 г и оставляют на 1 ч. Затем колбу соединяют с обратным холодильником, нагревают на водяной бане, поддерживая слабое кипение в течение 1 ч. После охлаждения колбу с содержимым вновь закрывают той же пробкой, взвешивают и потерю в массе восполняют растворителем. Содержимое колбы фильтруют через сухой бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 150 мл. Фильтр с навеской снова помещают в исходную колбу и повторяют процедуру кипячения на водяной бане с обратным холодильником еще 2 раза по 30 мин, каждый раз фильтруя экстракт в ту же колбу и доводят раствор до метки тем же растворителем. Объединенный спиртовый экстракт упаривали на роторном испарителе для удаления спирта. Конечный продукт получают высушиванием концентрированного экстракта в вакуум-сушильном шкафу.
Приготовление водного извлечения из сырья кровохлебки проводили в соответствии с требованиями Государственной фармакопеи РФ XIII издания, статья «Настои и отвары» (ОФС.1.4.1.0018.15).
Пример 2. 10,0 г (точная навеска) измельченного лекарственного растительного сырья кровохлебки лекарственной, просеянного сквозь сито с отверстиями размером 2 мм, помещают в инфундирный аппарат, заливают 100 мл воды очищенной комнатной температуры, настаивают на кипящей водяной бане в течение 15 мин (трава) и в течение 30 мин (корневища и корни), затем траву охлаждают при комнатной температуре 45 мин, а корневища и корни процеживают горячими, чтобы избежать выпадения дубильных веществ в осадок, отжимают растительное сырье и прибавляют воду до требуемого объема извлечения.
Для сравнительной оценки противовоспалительной активности водных и спиртовых извлечений из сырья кровохлебки применяли скрининговую модель формалинового отека лапы у мышей [Хабриев Р.У. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Р.У. Хабриев. - М.: Медицина, 2005. - 832 с.]. Исследования проводились на 36 взрослых белых мышах - самцах массой 19-25 г. Для экспериментов отбирали животных со средней двигательной активностью, преобладающих в популяции, и, следовательно, можно утверждать, что у этих мышей будет развиваться наиболее типичная реакция на любое воздействие. Подопытных животных содержали в условиях вивария (с естественным режимом освещения; при температуре 22-24°C) и свободным доступом к воде и пище. Перед постановкой эксперимента животные проходили карантин в течение 10-14 дней. Затем животным вводили внутрижелудочно с помощью специального зонда извлечения, приготовленные из травы, корневищ и корней кровохлебки, в количестве 0,08-0,1 мл в превентивном режиме курсом в течение 7 дней (высушенный спиртовый экстракт перед введением растворяли в воде в соотношении 1:10). Контрольная группа получала воду. В качестве препарата сравнения использовали диклофенак-натрия «Хемофарм А.Д.» в дозе 10 мг/кг. В последний день через час после введения извлечений вводили флогоген. Острое воспаление индуцировали введением под подошвенный апоневроз правой лапки мыши 0,05 мл 1% раствора формалина. Это вызвало развивающийся во времени отек лапки. Через 5 ч животных усыпляли под эфирным наркозом, соблюдая «Правила работы с лабораторными животными» (приложение к приказу МЗ СССР от 12.08.1977 г. №755). Противовоспалительный эффект оценивали по уменьшению отека лапок и проводили статистическую обработку результатов исследования (табл. 5). [Гланц С. Медико-биологическая статистика / С. Гланц. - М.: Практика, 1998. - 459 с.].
В результате установлено, что все протестированные извлечения кровохлебки лекарственной при внутрижелудочном введении проявляли противовоспалительную активность, но более выраженной она была для спиртовых экстрактов в отличие от водных, а учитывая принадлежность к морфологической группе сырья более выраженный эффект отмечался у травы по сравнению с корневищами и корнями. Так, при использовании извлечений из травы кровохлебки лекарственной достоверно уменьшался отек лапок у мышей на 26,7% при применении водного раствора и на 33,3% при использовании спиртового экстракта. При применении извлечений из корневищ и корней отек лапок уменьшался в меньшей степени: на 10% при использовании водного раствора и на 14,4% при применении спиртового экстракта.