СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ КОКЦИДИОЗА (ЭЙМЕРИОЗА) СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ И ПТИЦ
METHOD OF TREATING COCCIDIOSIS (EUMERIOSIS) IN FARM ANIMALS AND POULTRY

Изобретение относится к сельскому хозяйству и медицинской химии, а именно к способам лечения заболеваний животных.
Известен способ лечения кокцидиоза животных, основанный на применении кокцидиостатического препарата кокцидина ([1], стр.378).
Известен способ лечения кокцидиоза животных и птиц, основанный на применении кокцидиостатического препарата ампролиума ([1], с.377).
Известен способ лечения кокцидиоза животных, выбранный нами в качестве прототипа, включающий применение кокцидиостатического препарата байкокса ([2], с.354).
Известные способы лечения часто не дают нужного эффекта ввиду легко развивающейся резистентности кокцидий по отношению к применяемым препаратам.
Целью изобретения является разработка нового эффективного способа лечения кокцидиозов животных и птиц.
Поставленная цель достигается тем, что в качестве активно действующего вещества в разработанном нами способе применяют 2-имино-1-(β-фенокси)этил-3-(3,4-дихлорбензил)бензимидазолин формулы I в виде гидробромида:
Протистоцидная активность соединения I обнаружена нами впервые, что послужило основой для создания способа лечения кокцидиоза животных и птиц.
Пример 1.
Определение протистоцидной активности соединения I в сравнении с известными кокцидиостатическими препаратами.
Активность изучали in vitro методом серийных разведений в отношении Paramecia caudatum, Tetrachimena piriformis и полевых изолятов простейших (отнесены к отряду инфузорий Holotricha, выделены из кишечника кроликов) по следующей методике: в лунках микропланшета смешивали равные объемы раствора испытуемого вещества определенной концентрации и культуры простейших. Препаратами сравнения служили известные кокцидиостатики ампролиум, сульфадиметоксин, трихопол, фуразолидон и байкокс. Результаты представлены в таблице 1.
Таблица 1.
Сравнительные испытания протистоцидной активности соединения I и известных кокцидиостатиков (учет через 18 часов)
Вещество
Учитываемая концентрация веществ, мкг/мл
500
250
125
62,5
31,25
15,62
7,81
3,91
1,95
0,98
0,49
0,24
Соединение I·HBr
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
+
Ампролиум
-
-
-
-+
+
+
+
+
+
+
+
+
Сульфадиметоксин
+
+
+
+
+
+
+
+
+
4-
+
+
Фуразолидон
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Трихопол
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Байкокс
-
-
-
-+
+
+
+
+
+
+
+
+
Вода
+
4-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Обозначения:
(-) - простейшие погибли все
(+) - простейшие живы, активны
(-+) - простейшие живы, потеряли подвижность, сохранились манежные движения.
Из данных таблицы видно, что соединение I активно более чем в 200 раз разбавленном растворе, чем известные препараты байкокс и ампролиум. При этом фуразолидон, трихопол и сульфадиметоксин, все еще используемые в качестве протистоцидных средств, практически не обнаружили искомой активности.
Пример 2.
Изучение терапевтической активности соединения I при кокцидиозе кроликов.
Место проведения испытаний - экспериментальная база ГНУ СКЗНИВИ. Диагноз установили по клиническим признакам, патологоанатомическим изменениям у погибших животных и результатам микроскопии соскобов слизистой оболочки кишечника. У больных животных отмечали периодические запоры, диареи и метеоризм, впоследствии - резкое угнетение. У погибших животных отмечали признаки колиэнтерита, инъецирование сосудов брыжейки, метеоризм тонкого отдела кишечника, геморрагии и участки гиперемии в разных отделах кишечника. У некоторых погибших кроликов обнаружили изменения в печени: помимо небольших участков дегенеративно-дистрофических изменений, расположенных по поверхности долей в виде серовато-белых пятен размером 3×5 мм, наблюдали потемневшие до угольной черноты края печени - каждая доля была окружена такого вида каймой шириной от 1 до 2 см. Микроскопия соскобов слизистой оболочки тощей, подвздошной, слепой и ободочной кишок показала наличие в местах поражения (геморрагии, участки гиперемии) большого количества ооцист преимущественно яйцевидной и правильной овальной формы. Ооцисты находили в количестве от 50 до 200 в поле зрения (при малом увеличении). Все признаки заболеваний говорили о том, что у животных был острый кокцидиоз.
Схема применения соединения I.
Опыт №1. Использовали две группы кроликов одного возраста, по 5 голов в каждой. Масса тела животных по 0,5 кг. Животным опытной группы препарат задавали групповым способом с кормом 1 раз в сутки в дозе 20 мг на 1 животное, для чего 100 мг соединения I перемешивали с 50 г корма тонкого помола, затем добавляли 450 г дерти ячменной, тщательно перемешивали и задавали в общую кормушку. Таким образом, доза составляла (20 мг/0,5 кг) 40 мг на 1 кг массы тела животного в сутки. Кролики поедали корм охотно, без остатка. Длительность применения 7 дней.
Контрольные животные содержались на аналогичном рационе, но без применения лечебных препаратов. Перед опытом и по окончании его провели копрологические исследования методом флотации. В пробах фецес у всех кроликов до опыта находили большое количество ооцист кокцидий: от 75 до 200 в мазке 24×24 мм (раздавленная капля объемом 50 мкл). Результаты в таблице 2.
Таблица 2.
Результаты копрологических исследований до и после применения соединения I групповым способом с кормом.
Группа
Препарат
№№ животных
Количество ооцист в пробах фецес кроликов
До опыта
После окончания введения препарата
Опытная
Соединение I·HBr
1
75
2
2
115
19
3
175
0
4
80
2
5
180
0
Контрольная
Не вводили
1
200
Пал
2
100
150
3
75
120
4
80
Пал
5
117
120
Таким образом, введение соединения I в дозе 20 мг/гол с кормом в течение 7 дней приводит к резкому сокращению числа ооцист в фецес кроликов: от 75…180 до единиц или полного отсутствия. О положительном эффекте применения соединения I говорило отсутствие падежа животных в группе, а также общее удовлетворительное состояние кроликов (хороший аппетит и упитанность, явная прибавка в весе).
Опыт 2. Использовали 2 группы кроликов: опытная - 5 голов, контрольная - 3 головы. Масса тела животных составляла по 0,7-0,8 кг. Диагноз установили по клиническим признакам: диареи, запоры, метеоризм. Гибель животных отмечали среди молодняка возрастом 2-2,5 месяца (1-2 кролика в сутки). Микроскопия соскобов слизистой оболочки кишечника с мест поражения показывала наличие большого количества ооцист кокцидий.
Схема испытаний: кроликам опытной группы вводили соединение I индивидуально 1 раз в сутки по 20 мг в смеси с 100 мг сахарной пудры. Препарат засыпали в рот, 1 раз в сутки в течение 7 дней. Кролики контрольной группы содержались на аналогичном рационе, лечебных препаратов не получали. До опыта и по окончании введения соединения I проводили копрологические исследования фецес кроликов методом флотации. Количество ооцист подсчитывали в мазке площадью 24×24 мм (раздавленная капля объемом 50 мкл). Результаты испытаний представлены в таблице 3.
Таблица 3.
Результаты копрологических исследований методом флотации до и после применения соединения I индивидуальным способом.
Группа
Препарат
№№ животных
Количество ооцист в пробах фецес кроликов
До опыта
После окончания введения препарата
Опытная
Соединение I·HBr
1
100
0
2
50
0
3
100
14
4
140
17
5
160
12
Контрольная
Не вводили
1
50
112
2
50
146
3
50
171
В опытной группе после 1-2 приемов соединения I у животных прекратился метеоризм, улучшился аппетит. После 3-4 введения прекратились запоры и диспепсические проявления. Признаков угнетения, отказа от корма у кроликов опытной группы не наблюдали. В контрольной группе признаки проявления кокцидиоза нарастали: развился метеоризм, участились диспепсические явления, развивалось угнетение, аппетит ухудшился.
Таким образом, введение соединения I в дозе 20 мг на 1 кролика предохраняет животных от развития кокцидиоза даже в случае интенсивного заражения кокцидиями, что проявляется улучшением состояния здоровья животных и снижением числа выделяемых ооцист в десятки раз.
Пример 3.
Определение токсичности соединения I при внутрижелудочном введении лабораторным крысам.
«Острую» токсичность соединения I изучали при введении в желудок через зонд на лабораторных крысах массой по 180-200 г. Испытаны дозы: 100 мг/кг, 200 мг/кг и 300 мг/кг массы тела. Каждая доза испытана на 5 крысах. Объем введения составлял 1,5 мл суспензии. Результаты испытания представлены в таблице 4.
Обозначения: «0/5» - число погибших/число живых крыс на день учета.
На третий день после введения в группе животных, которым ввели соединение I в дозе 300 мг/кг массы тела, погибла 1 крыса. Причина смерти аспирационная пневмония, развившаяся в результате погрешности при введении суспензии. Другие животные оставались живы, общее состояние и аппетит их были удовлетворительными, поведенческие реакции адекватными; расстройства системы пищеварения не отмечено. Таким образом, соединение I при введении в желудок через зонд в дозе 300 мг/кг массы тела в виде водной суспензии не оказывает «острого» токсического действия на лабораторных крыс и может быть отнесено к среднетоксичным соединениям.
Пример 4. Синтез соединения I.
Гидробромид 2-имино-1-(β-фенокси)этил-3-(3,4-дихлорбензил)бензимидазолина(I) получен алкилированием 2-аминобензимидазола(II) [4] (β-феноксиэтилбромидом(III) [5] с последующей кватеринизацией образующегося 2-амино-1-β-(феноксиэтил)бензимидазола(IV) 3,4-дихлорбензилбромидом(V) по схеме:
Гидробромид 2-имино-1-(β-фенокси)этил-3-(3,4-дихлорбензил)бензимидазолина(I).
Стадия 1. 1-(β-Фенокси)этил-2-аминобензимидазол(IV).
К раствору 1,33 г (10 ммоль) 2-аминобензимидазола(II) и 1,3 г (20 ммоль) КОН (в расчете на 85% содержание КОН) в 1,5 мл воды добавляют 10 мл ацетона и в полученную двухфазную систему порциями вносят 2,0 г (10 ммоль) β-феноксиэтилбромида(III) так, чтобы температура реакционной массы не превышала 15°С. По окончании прибавления смесь перемешивают 2 часа при 40°С, охлаждают, отделяют ацетоновый слой, ацетон упаривают на роторном испарителе до половины объема, а затем реакционную массу выливают в 20 мл воды. Выпавшие слегка розоватые кристаллы амина IV отфильтровывают, промывают 5 мл воды. Выход 2,0 г (79%). Т.пл. 167-168°С (из i-PrOH).
1
3
2
2
2
Спектр ЯМР H, (300 МГц), ν, м.д. (CDCl): 4,28 (т, 2Н, NCH); 4,36 (т, 2Н, ОСН); 4,96 (с, 2Н, NH); 6,82 (д, 2Н, o-Н ArO); 6,95 (т, 1Н, р-Н ArO); 7,08-7,16 (м, 4Н, 2m-H ArO + 5,6 - Н бензимидазола); 7,22-7,48 (м, 1Н, 7-Н бензимидазола); 7,44 (д, 1Н, 4-Н бензимидазола).
Найдено (%): С 69,89; Н 5,99; N 16,40.
15
15
3
CHNO. Вычислено (%): С 71,13; Н 5,97; N 16,59.
Стадия 2. Гидробромид 2-имино-1-(β-фенокси)этил-3-(3,4-дихлорбензил)бензимидазолина(I).
3
Сплавляют 1,26 г (5 ммоль) 1-(β-фенокси)этил-2-аминобензимидазола(IV) и 1,2 г (5 ммоль) 3,4-дихлорбензилбромида при 110°С в течение 1 часа. По охлаждении плав обрабатывают 10 мл ацетона и фильтруют 2,1 г (85%) четвертичной соли I. Бесцветные кристаллы с т.пл. 251-251,5°С (из СНОН).
1
6
2
2
2
2
2
2
CH
CH
CH
Спектр ЯМР Н, (300 МГц), ν, м.д. в DMSO-d: 4,32 (т, 2Н, NCH, OAr); J=5); 4,70 (т, 2Н, Bn); 5,02 (т, 2Н, CHOAr, J=5); 6,75 (д, 2Н, о-Н ArO, J=8.9); 6,90 (т, 1H, p-H ArO); 7,18-7,34 [м, 5Н, 2 m-H ArO + 5,6-Н бензимидазола) + m-H Bn)]; 7,42-4,50 (м, 2Н, о-Н Bn); 7,60-7,70 (м, 2Н, 4,7-Н бензимидазола); 9,25 (с, 2Н, NH).
Найдено (%): С 53.22; Н 4.32; N 8.79.
22
20
2
3
CHBrClNO. Вычислено (%): С 53.57; Н 4.09; N 8.52.
Список литературы.
1. Червяков Д.К., Евдокимов П.Д., Вишкер А.С. Лекарственные средства в ветеринарии. Справочник. Изд. 2-е. - М.: «Колос», 1977.
2. Липин А.В., Санин А.В., Зинченко Е.В. Ветеринарный справочник. - М, 2002.
3. Лапшин И.М., Манжос А.Ф., Коломацкий А.И., Пономаренко А.И. Методические рекомендации по применению кокцидиостатиков при кокцидиозах сельскохозяйственных животных. - Украинский НИИ экспериментальной ветеринарии. - Харьков, 1980, с.5
4. Пожарский А.Ф., В.А.Анисимова, Е.Б.Цупак. Практические работы по химии гетероциклов. Изд-во Рост. ун-та, 1988.
5. М.В.Рубцов, А.Г.Байчиков. Синтетические химико-фармацевтические препараты. М.: Медицина, 1971.