Методика насыщения биорезорбируемого дренажа циклоспорином а в профилактике послеоперационного рубцевания в хирургии глаукомы

http://dx.doi.org/10.26787/nydha-2226-7425-2018-20-1-29-33

УДК 617.7-007.681-089: 616-003.92-085

МЕТОДИКА НАСЫЩЕНИЯ БИОРЕЗОРБИРУЕМОГО ДРЕНАЖА ЦИКЛОСПОРИНОМ А В ПРОФИЛАКТИКЕ ПОСЛЕОПЕРАЦИОННОГО РУБЦЕВАНИЯ

В ХИРУРГИИ ГЛАУКОМЫ

Германова1 В.Н., Карлова1'2 Е.В., Коригодский3А.Р.

ФГБОУ ВО Самарский государственный медицинский университет, г. Самара, Российская Федерация 2ГБУЗ Самарская областная клиническая офтальмологическая больница им. Т.И. Ерошевского, г. Самара,

Российская Федерация 3ООО ХайБиТек, г. Москва, Российская Федерация

Аннотация. Рядом авторов в качестве антипролиферативного агента при выполнении гипотензивных вмешательств было предложено использование циклоспорина А - иммуномодулирующего противовоспалительного препарата, избирательно ин-гибирующего функцию Т-лимфоцитов. Однако однократное местное применение данного вещества или его инстилляции в конъюнктивальную полость после операции не приносят желаемого эффекта. Мы предположили, что циклоспорин А при замедленном высвобождении из биорезорбируемого дренажа может стать эффективным и в то же время безопасным агентом в борьбе с послеоперационным рубцеванием. Целью исследования стала разработка методики насыщения ex tempore дренажа на основе полимолочной кислоты данным препаратом для обеспечения постепенного его высвобождения в терапевтических концентрациях в течение периода времени, достаточного для ослабления интенсивности процесса пролиферации. С помощью хромато-масс-спектрометрии было определено оптимальное разведение и необходимое время экспозиции для насыщения дренажа циклоспорином А. Определена скорость десорбции действующего вещества из материала дренажа в условиях, приближенных к реальным. Разработанная методика позволяет достигнуть поддержания терапевтических концентраций циклоспорина А в зоне хирургического вмешательства в течение 7-8 дней после вмешательства - наиболее критического промежутка времени в отношении интенсивности воспаления и запуска процесса рубцевания. Ключевые слова: циклоспорин А, хирургия глаукомы, рубцевание, дренаж, воспаление

Введение. Согласно данным Всемирной Организации Здравоохранения глаукома устойчиво занимает второе место в мире среди причин необратимой слепоты и третье место среди причин слабовидения [1]. В настоящее время основной причиной неэффективности хирургического лечения глаукомы является послеоперационное рубцевание. Изолированный механический подход - интраопера-ционное применение дренажей и имплантов, препятствующих рубцеванию сформированных путей оттока водянистой влаги, не позволил полностью решить данную проблему. Другим способом добиться антипролифера-тивного эффекта является применение лекарственных веществ, препятствующих рубцеванию [2]. Довольно широкое распространение получило применение антиметаболитов и цитостатиков, таких как митомицин-С и 5-фтору-рацил. Однако их использование зачастую приводит к тяжелым осложнениям, значительно ухудшающим прогноз для выздоровления и увеличивающим сроки лечения [3]. Рядом зарубежных авторов в качестве альтернативы было предложено использование циклоспорина А, иммуномо-дулирующего противовоспалительного препарата, избирательно ингибирующего функцию Т-лимфоцитов, что

приводит к прерыванию каскада воспалительной реакции и к уменьшению интенсивности процессов рубцевания. Однако однократное местное применение данного вещества или его инстилляции в конъюнктивальную полость после операции не приносят желаемого эффекта [4]. Критическим периодом в отношении развития процессов рубцевания является первая неделя после вмешательства, когда происходит наиболее активная миграция и пролиферация клеток воспаления, в том числе и Т-лимфоцитов [2]. Поэтому необходимо добиться пролонгированного высвобождения данного препарата в месте хирургического вмешательства в течение как минимум одной недели. Для пролонгированной доставки лекарственных веществ были предложены различные дренажи и импланты, насыщаемые растворами лекарственных препаратов. В частности, была отмечена хорошая способность к сорбции и десорбции лекарственных веществ биорезорбируемыми дренажами с пористой структурой [5].

Цель исследования: разработка методики насыщения биодеградируемого антиглаукоматозного дренажа раствором циклоспорина А ex tempore для обеспечения

The Journal of scientific articles "Health and Education Millennium", 2018. Vol. 20. No 1

http://dx.doi.org/10.26787/nydha-2226-7425-2017-20-l —--—

постепенного высвобождения лекарственного вещества в терапевтических концентрациях.

Материалы и методы. В качестве субстрата для насыщения был выбран биорезорбируемый антиглауко-матозный дренаж «Глаутекс» (модель DDA) в виде муфты, изготовленный из пористой пленки на основе полимолочной кислоты (вес 0,6-0,7 мг). Данный дренаж обладает высокой биосовместимостью, ареактивен и предупреждает как склеро-склеральное, так и склеро-конъюнк-тивальное рубцевание [6]. Для насыщения дренажа использовали концентрат циклоспорина А для приготовления раствора для внутривенных инфузий с содержанием действующего вещества 50 мг/мл (Сандиммун, Новартис Фарма АГ, Швейцария). Препарат представляет собой микроэмульсию, в которой гидрофобной фазой является циклоспорин А, поверхностно-активным веществом (ПАВ) - полиоксиэтилированное касторовое масло (650 мг/мл), вторичным ПАВ - этанол 96% (278 мг/мл). Для определения способности дренажа к сорбции циклоспорина А образцы были помещены в раствор препарата Сан-диммун в сбалансированном солевом растворе в различных разведениях: 1:1, 1:3, 1:7, 1:15, 1:30. Экспозиция составила 15 минут. Образцы дренажей после их обработки препаратом Сандиммун промокались фильтровальной бумагой и сушились до постоянного веса в вакуум-сушильном шкафу при 30°С.

Определение содержания циклоспорина А в дренаже проводился методом хромато-масс-спектрометрии в лаборатории физико-химических методов анализа строения вещества МГУ. Хромато-масс-спектральное определение количества циклоспорина А в образцах проводили на хро-матографической системе Prelude SPLC, сопряженной с тройным квадрупольным масс-спектром TSQ Endura (оба прибора фирмы Thermo Fisher Scientific). Хроматографи-ческий анализ выполняли на колонке Accucore PFP (2,1*50 мм, размер частиц 2,6 мкм) в градиентном режиме. Подвижная фаза А - вода + 0,1% муравьиной кислоты, подвижная фаза В - ацетонитрил + 0,1% муравьиной кислоты. Масс-спектрометр работал в режиме ММР. Калибровочные растворы были приготовлены из навески в 10 мг циклоспорина А (98,5%, Sigma). Образцы исследуемых дренажей были помещены в 1,5 мл смеси ацето-нитрил - вода в соотношении 50:50. Данные растворы затем были разбавлены в 100 раз. Концентрации циклоспорина А определены масс-спектрометрически с погрешностью +/-15%, т.е. с погрешностью самого метода. Для определения динамики высвобождения циклоспорина А из дренажа в условиях, приближенных к реальным, образцы, насыщенные циклоспорином А, выдерживали в закрытых емкостях с 9 мл сбалансированного солевого раствора (BSS) при температуре 37 градусовв течение 12 ч, 18 ч, 24ч, 2 сут, 4 сут, 6 сут, и 10 сут с последующим определением остаточного количества циклоспорина А в образцах. Количественный анализ проводился масс-спек-трометрически по вышеуказанной методике.

Результаты и обсуждение. Условиями успешного насыщения дренажа циклоспорином А, были определены

следующие положения: сохранение формы и пористой структуры дренажа, т.е. физико-механических свойств, обеспечивающих его успешное применение в хирургическом лечении глаукомы; соблюдение безопасных концентраций компонентов препарата в готовом дренаже. Согласно данным литературы, концентрация циклоспорина А более 5 мкг/мл в эксперименте снижала жизнеспособность клеток конъюнктивы и заднего эпителия роговицы [7]. Скорость тока внутриглазной жидкости через фильтрационную подушку, содержащую дренаж, примерно равен скорости продукции внутриглазной жидкости, т.е. в среднем, 0,002 мл/мин или 0,125 мл/час [8]. Следовательно, за любой час после момента имплантации дренажа скорость высвобождения циклоспорина А не должна превышать 0,625 мкг/час. Что касается других компонентов препарата, явная токсичность этанола прослеживается при его концентрации более 20%. Токсическая концентрация для полиоксиэтилированного касторового масла - 15% [9]. Следовательно, в используемом для насыщения дренажа разведении концентрации данных веществ должны быть заведомо меньше. Также необходимо поддержание терапевтических концентраций циклоспорина А в условиях, приближенных к реальным, в течение одной недели, т.е. в течение времени наиболее активной инициации процессов послеоперационного рубцевания. Терапевтические концентрации циклоспорина А составляют 0,05-0,1 мкг/мл [10].

При помещении дренажа в концентрат циклоспорина А Сандиммун происходило мгновенное набухание и разрушение структуры дренажа из-за высокой концентрации этанола в неразбавленном концентрате (278 мг/мл). При этом не выполнялись условия успешного насыщения ex tempore дренажа лекарственным препаратом. Экспозиция дренажа в растворе Сандиммуна в разведениях 1:1 и 1:3 также приводила к нежелательной пластификации и деформации дренажа. Наименьшим разведением, при котором не наблюдалось нарушения структуры дренажа, было таковое с соотношением Сандиммун: BSS = 1:7. При этом концентрация этанола в растворе для насыщения составляла 3,3%, а полиоксиэтилированного касторового масла 8%, что заведомо меньше токсических концентраций. Однако в первые часы после выдержки дренажа в растворах Сандиммуна в разведениях 1:7 и 1:15 скорость десорбции циклоспорина А превышала 0,625 мкг/час, что при применении в хирургическом лечении глаукомы могло бы привести к нежелательным токсическим эффектам. Наиболее безопасным и оптимальным для поддержания в последующем терапевтической концентрации препарата в течение необходимого срока стало разведение 1:30. При экспозиции дренажа весом 0,7 мг в течение 15 минут в указанном разведении сорбция циклоспорина А составила 3,87 мкг. При увеличении времени экспозиции дренажа в растворе количество сорбируемого циклоспорина А не увеличивалось. При изучении динамики высвобождения циклоспорина А из дренажа получены следующие результаты: в первые 12 часов десорбция лекарственного

The Journal of scientific articles "Health and Education Millennium", 2018. Vol. 20. No 1

http://dx.doi.org/10.26787/nydha-2226-7425-2018-20-l —--—

вещества составила 0,96 мкг, что соответствует концентрации препарата 0,64 мкг/мл. Концентрация рассчитана исходя из объема внутриглазной жидкости, проходящей через фильтрационную подушку за 12 часов - 1,5 мл. Данная концентрация значительно меньше токсической и, в то же время, превышает терапевтическую. Терапевтическая концентрация препарата поддерживалась в течение 1

недели и составила на 6-е сутки 0,08 мкг/мл (0,49 мкг за сутки). Динамика высвобождения циклоспорина А из биорезорбируемого дренажа, выдержанного в растворе циклоспорина А в разведении Сандиммун :BSS = 1:30, представлена в таблице 1.

Рема к жрованпе

_П рол нфера имя

Воспаление

f 0,64

12 ч. 1 Д. 2 дм. 3 дн. 4 ли. 5 дм. 7 дм. 10 дм. 14 дм. I мес. )мк. 6 м«. I юд 2юи

Условные обозначения ф ф График расчеты* концентраций инк лоснорина Л (мкт/мл), высвобож,таемою ит дренажа

с течением времени

- Кривая относительною — _ Кривая относительного

^ количества нейтрофилов количества фибробластов

- Кривая относительного .............. Кривая относительною

количества макрофаюв количества коллагена

—- Кривая относительною

9 Ф количества Т- и В* лимфоцитов

Рис. 1. Соотношение хода воспалительного процесса с участием иммунокомпетентных клеток и расчетные концентраций циклоспорина А (CsA), высвобождаемого из дренажа в условиях, приближенных к реальным.

Таблица 1.

Динамика высвобождения циклоспорина А из биорезорбируемого дренажа (среда - сбалансированный

солевой раствор, 36оС)

Время выдержки Количество остаточ- Процентное содержание Высвобождение циклоспорина А из

дренажа в водной ного циклоспорина А остаточного циклоспо- дренажа (за время после предыду-

среде, сут. на дренаже, мкг рина А на дренаже, % щего измерения, вычислено), мкг

0 3,87 100 -

0,5 2,91 73 0,96

0,75 2,50 64 0,41

1 2,03 52 0,47

2 1,32 33 0,71

4 0,72 18 0,60

6 0,23 6 0,49

10 0,007 2 0,22

The Journal of scientific articles "Health and Education Millennium", 2018. Vol. 20. No 1

http://dx.doi.org/10.26787/nydha-2226-7425-2017-20-1 —--—

Обоснование достаточности периода высвобождения циклоспорина А из материала дренажа представлено на рисунке 1, на котором изображен ход воспалительного процесса с графиком относительного количества клеток в каждый промежуток времени.

Изначально в зоне оперативного вмешательства представлены все виды клеток воспаления, т.к. предшествующая операции гипотензивная медикаментозная терапия приводит к развитию субклинического воспалительного процесса в тканях глазного яблока, в первую очередь, в конъюнктиве [11]. Операционная травма является мощным триггером процессов пролиферации и дифференцировки иммунокомпетентных клеток. В первую очередь, увеличивается количество нейтрофилов. Пик их концентрации приходится на 1-2 сутки после операционной травмы. Количество макрофагов достигает своего максимума к 3 дню с постепенным уменьшением к 14 дню. Количество лимфоцитов, в том числе, и Т-лимфоцитов, являющихся мишенью действия циклоспорина А, постепенно нарастает к 5-6 дню и плавно уменьшается к 14 дню. Процесс пролиферации фибробластов, достигающий своего максимума к 7-10 дню, и коллагеногенеза стимулируется ци-токинами, высвобождаемыми вышеперечисленными иммунокомпетентными клетками, в том числе и Т-лимфоцитами [12].

На рисунке 1 на фоне хода воспалительного процесса с участием иммунокомпетентных клеток изображен график изменения расчетных концентрации циклоспорина А, высвобождаемого из дренажа, с течением времени. Полученные данные свидетельствуют о том, что биорезорбируемый дренаж на основе полимолочной кислоты, насыщенный циклоспорином А, обеспечивает высвобождение действующего вещества в терапевтических концентрациях (0,05-0,1 мкг/мл) в течение первых 7-8 дней после вмешательства - именно в тот промежуток времени, когда концентрация Т-лим-фоцитов постепенно нарастает и достигает своего максимума, а также интенсифицируется разрастание соединительной ткани. Таким образом, насыщение био-резорбируемого антиглаукоматозного дренажа на основе полимолочной кислоты циклоспорином А может обеспечить ослабление интенсивности процессов воспаления, в том числе и нежелательной пролиферации, в зоне хирургического вмешательства.

Заключение. Проведенный эксперимент показывает, что биорезорбируемый антиглаукоматозный дренаж «Глаутекс» на основе полимолочной кислоты способен сорбировать на своей поверхности циклоспорин А из раствора. Время, необходимое для сорбции, составляет 15 минут, что позволяет проводить насыщение дренажа данным лекарственным препаратом непо-

средственно до и во время оперативного вмешательства по поводу глаукомы с соблюдением всех условий асептики и антисептики. Выявлено наиболее оптимальное разведение для насыщения дренажа циклоспорином А: разведение 1 мл препарата Сандиммун в 30 мл сбалансированного солевого раствора. После экспозиции в течение 15 минут в данном разведении дренаж сохраняется все свои физико-механические свойства и может быть применен в хирургическом лечении глаукомы. При выдержке дренажа в данном разведении также исключается токсическое местное действие препарата ввиду того, что концентрации действующего и вспомогательных веществ заведомо ниже токсических. Дренаж «Глаутекс» после депонирования ex tempore лекарственного препарата обеспечивает высвобождение циклоспорина А в терапевтических концентрациях в течение 1 недели, критической в отношении инициации процессов рубцевания. Учитывая вышесказанное, биорезорбируемый антиглаукоматозный дренаж на основе полимолочной кислоты, насыщенный циклоспорином А, может стать безопасным и эффективным средством в борьбе с послеоперационным рубцеванием.

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

[1] Tham YC, Li X, Wong TY, Quigley HA, Aung T, Cheng CY. Global prevalence of glaucoma and projections of glaucoma burden through 2040: a systematic review and meta-analysis //Ophthalmology. 2014. Nov;121(11):2081-90.

[2] YamanakaO., Kitano-IzutaniA., TomoyoseK., ReinachP. Pathobiologyofwoundhealingafterglaucomafiltrationsur-gery // BMC Ophthalmology 2015, № 15 (suppl. 1) P. 1927

[3] Руссков К.Н., Золотарев А.В., Милюдин Е.С. Фармацевтическая композиция для профилактики пролифера-тивной клеточной реакции «Митомицин-О». // Практическая медицина. 2012, 4-2(59), стр. 260-262

[4] Fakhraie G,_Lopes JF, Spaeth GL, Almodin J, Ichhpujani P, Moster MR. Effects of postoperative cyclosporine ophthalmic emulsion 0.05% (Restasis) following glaucoma surgery. Clinical and Experimental Ophthalmology. 12/2009; 37(9):842-8.

[5] Rodriguez-Agirretxe I, Vega SC, Rezola R. The PLGA implant as an antimitotic delivery system after experimental trabeculectomy // Investigative Ophthalmologyand Visual Science. 2013 Aug 5;54(8):5227-35.

[6] Слонимский А.Ю., Алексеев И.Б., Долгий С.С. Новые возможности профилактики избыточного рубцевания в хирургии глауком // Офтальмология. 2012;9(3):36-40.

[7] Garweg JG, Wegmann-Burns M, Goldblum D. Effects of daunorubicin, mitomycin C, azathioprine and cyclosporinA on human retinal pigmented epithelial, corneal endothelial and conjunctival cell lines // Graefe's Archive for Clinical

The Journal of scientific articles "Health and Education Millennium", 2018. Vol. 20. No 1

http://dx.doi.org/10.26787/nydha-2226-7425-2018-20-1 —--—

and Experimental Ophthalmology. 2006 Mar;244(3):382-9.

[8] ManikGoel, Renata G Picciani, Richard K Lee. Aqueous Humor Dynamics: A Review // The Open Ophthalmology Journal. 2010; 4: 52-59.

[9] Knagenhjelm SK, Frayland K, Ringvold A. Toxicological evaluation of cyclosporine eyedrops // ActaOphthalmolog-icaScandinavica. 1999 Apr;77(2):200-3

[10] Faulds D, Goa KL, Benfield P.Cyclosporin. A review of its pharmacodynamic and pharmacokinetic properties, and

therapeutic use in immunoregulatory disorders // Drugs. 1993 Jun;45(6):953-1040.

[11] B. Cvenkel, A.N.a. Kopitar, A. Ihan, Inflammatory molecules in aqueous humour and on ocular surface and glaucoma surgery outcome // Mediators of Inflammation. 2010 (2010), Article ID 939602, 7 pages.

[12] R.A.F. Clark, p.M. Henson. The molecular and cellular biology of wound repair, 2nd edition. 1996. New York : Plenum Press. 611 p.

ENRICHMENT OF A BIODEGRADABLE GLAUCOMA DRAINAGE WITH CYCLOSPORINE A IN PREVENTION OF POSTOPERATIVE SCARRING

Germanova1 V.N., Karlova12E.V., Korigodskiy3A.R.

1Samara State Medical University, Samara, Russian Federation 2Eroshevskiy Eye Hospital, Samara, Russian Federation 3HiBiTech, Moscow, Russian Federation

Annotation. Some authors suggested to use cyclosporine A (CsA) (an immunomodulatory and anti-inflammatory drug) as an antiproliferative agent in glaucoma surgery. It selectively inhibits T-lymphocytes function. But single local application of CsA during operation or its conjunctival instillation after surgery are not very effective. We developed a method of enrichment of biodegradable glaucoma drainage with CsA in order to maintain therapeutic concentration of the drug in the surgery area for a period of time essential in terms of scarring triggering and acceleration. Optimal concentration of CsA solution and exposure time were established by means of chromatography-mass spectrometry. The speed of CsA desorption from a drainage was evaluated in close to real conditions. The method allows to maintain therapeutic concentrations of CsA in surgery area for 7-8 days - the most crucial period in terms of scarring triggering.

Key words: cyclosporine A, glaucoma surgery, scarring, glaucoma drainage, inflammation

REFERENCES

[1] Tham YC, Li X, Wong TY, Quigley HA, Aung T, Cheng CY. Global prevalence of glaucoma and projections of glaucoma burden through 2040: a systematic review and meta-analysis // Ophthalmology. 2014. Nov;121(11):2081-90.

[2] Yamanaka O., Kitano-Izutani A., Tomoyose K., Reinach P. Pathobiology of wound healing after glaucoma filtration surgery // BMC Ophthalmology 2015, № 15 (suppl. 1) P. 19-27

[3] Russkov K.N., Zolotarev A.V., Milyudin E.S. Pharmaceutical composition for the prevention of proliferative cellular response «Mitomycin-O» // Practical Medicine. 2012, 4-2

[4] Fakhraie G,_Lopes JF, Spaeth GL, Almodin J, Ichhpujani P, Moster MR. Effects of postoperative cyclosporine ophthalmic emulsion 0.05% (Restasis) following glaucoma surgery. Clinical and Experimental Ophthalmology. 12/2009; 37(9):842-8.

[5] Rodriguez-Agirretxe I, Vega SC, Rezola R. The PLGA implant as an antimitotic delivery system after experimental trabeculectomy // Investigative Ophthalmologyand Visual Science. 2013 Aug 5;54(8):5227-35.

[6] Slonimskiy A.Y., Alekseyev I.B., Dolgiy S.S. New possibilities of excessive postoperative scarring prophylaxis by

glaucoma surgery // Ophthalmology. 2012;9

[7] Garweg JG, Wegmann-Burns M, Goldblum D. Effects of daunorubicin, mitomycin C, azathioprine and cyclosporinA on human retinal pigmented epithelial, corneal endothelial and conjunctival cell lines // Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 2006 Mar;244(3):382-9.

[8] ManikGoel, Renata G Picciani, Richard K Lee. Aqueous Humor Dynamics: A Review // The Open Ophthalmology Journal. 2010; 4: 52-59.

[9] Knagenhjelm SK, Frayland K, Ringvold A. Toxicological evaluation of cyclosporine eyedrops // ActaOphthalmolog-icaScandinavica. 1999 Apr;77(2):200-3

[10] Faulds D, Goa KL, Benfield P.Cyclosporin. A review of its pharmacodynamic and pharmacokinetic properties, and therapeutic use in immunoregulatory disorders // Drugs. 1993 Jun;45(6):953-1040.

[11] B. Cvenkel, A.N.a. Kopitar, A. Ihan, Inflammatory molecules in aqueous humour and on ocular surface and glaucoma surgery outcome // Mediators of Inflammation. 2010 (2010), Article ID 939602, 7 pages.

[12] R.A.F. Clark, p.M. Henson. The molecular and cellular biology of wound repair, 2nd edition. 1996. New York : Plenum Press. 611 p.