МОДИФИЦИРОВАННАЯ ДНК С ЗАМКНУТЫМИ КОНЦАМИ (зкДНК)

1. Невирусный бескапсидный ДНК-вектор с ковалентно-замкнутыми концами (зкДНК-вектор), характеризующийся тем, что указанный зкДНК-вектор содержит по меньшей мере одну гетерологичную нуклеотидную последовательность, функционально расположенную между последовательностями асимметричных инвертированных концевых повторов (асимметричными ITR), причем по меньшей мере один из асимметричных ITR содержит функциональный сайт концевого разрешения и сайт связывания Rep.
2. ЗкДНК-вектор по п. 1, где указанный зкДНК-вектор при расщеплении рестрикционным ферментом, имеющим один сайт распознавания на указанном зкДНК-векторе, анализируемый с применением как нативного, так и денатурирующего гель-электрофореза, демонстрирует характеристические полосы линейной и непрерывной ДНК, по сравнению с линейными и прерывистыми ДНК-контролями.
3. ЗкДНК-вектор по пп. 1 или 2, где одна или более из последовательностей асимметричных ITR взяты из вируса, выбранного из парвовируса, депендовируса и аденоассоциированного вируса (AAV).
4. ЗкДНК-вектор по п. 3, где указанные асимметричные ITR взяты из разных вирусных серотипов.
5. ЗкДНК-вектор по п. 4, где указанные один или более асимметричных ITR взяты из серотипа AAV, выбранного из AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 и AAV12.
6. ЗкДНК-вектор по любому из пп. 1-3, где одна или более из последовательностей асимметричных ITR являются синтетическими.
7. ЗкДНК-вектор по любому из пп. 1-3 и 6, где один или более из указанных ITR не является ITR дикого типа.
8. ЗкДНК-вектор по любому из пп. 1-7, где один или оба асимметричных ITR модифицированы делецией, инсерцией и/или заменой по меньшей мере в одной из областей ITR, выбранных из A, A’, B, B’, C, C’, D и D’.
9. ЗкДНК-вектор по п. 8, где указанная делеция, инсерция и/или замена приводит к делеции всей или части структуры «петля на стебле», в норме образуемой областями A, A’, B, B’ C или C’.
10. ЗкДНК-вектор по п. 8 или 9, где один или оба асимметричных ITR модифицированы делецией, инсерцией и/или заменой, которая приводит к делеции всей или части структуры «петля на стебле», в норме образуемой областями B и B’.
11. ЗкДНК-вектор по любому из пп. 8-10, где один или оба асимметричных ITR модифицированы делецией, инсерцией и/или заменой, которая приводит к делеции всей или части структуры «петля на стебле», в норме образуемой областями C и C’.
12. ЗкДНК-вектор по п. 10 или 11, где один или оба асимметричных ITR модифицированы делецией, инсерцией и/или заменой, которая приводит к делеции части структуры «петля на стебле», в норме образуемой областями B и B’, и/или частью структуры «петля на стебле», в норме образуемой областями C и C’.
13. ЗкДНК-вектор по любому из пп. 1-12, где один или оба асимметричных ITR содержат одну структуру «петля на стебле» в области, которая в норме содержит первую структуру «петля на стебле», образованную областями B и B’, и вторую структуру «петля на стебле», образованную областями C и C’.
14. ЗкДНК-вектор по п. 13, где один или оба асимметричных ITR содержат один «стебель» и две «петли» в области, которая в норме содержит первую структуру «петля на стебле», образованную областями B и B’, и вторую структуру «петля на стебле», образованную областями C и C’.
15. ЗкДНК-вектор по п. 13 или 14, где один или оба асимметричных ITR содержат один «стебель» и одну «петлю» в области, которая в норме содержит первую структуру «петля на стебле», образованную областями B и B’, и вторую структуру «петля на стебле», образованную областями C и C’.
16. ЗкДНК-вектор по любому из пп. 1-15, где по меньшей мере один асимметричный ITR представляет собой модифицированный ITR AAV2, содержащий нуклеотидную последовательность, выбранную из: ITR на фиг. 26A или 26B, SEQ ID NOS: 101-499 или 545-547, ITR, имеющую последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную последовательности ITR на фиг. 26A или 26B, и ITR, имеющую последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную SEQ ID NO: 101-499 и 545-547.
17. ЗкДНК-вектор по любому из пп. 1-16, где по меньшей мере один асимметричный ITR представляет собой модифицированный ITR AAV2, содержащий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO. 2, 52, 63 или 64, или нуклеотидную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную SEQ ID NO. 2, 52, 63 или 64.
18. ЗкДНК-вектор по любому из пп. 1-16, где 5’-ITR представляет собой ITR AAV дикого типа, а 3’-ITR содержит последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2, 64, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128,130, 132, 134, 469-483 и 546 и последовательностей ITR, показанных на фиг. 26A, и последовательностей, по меньшей мере на 95% идентичных любым из указанных выше последовательностей.
19. ЗкДНК-вектор по любому из пп. 1-16, где 3’-ITR представляет собой ITR AAV дикого типа, а 5’-ITR содержит последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 52, 63, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 484-499, 545 и 547 и последовательностей ITR, показанных на фиг. 26B, и последовательностей, по меньшей мере на 95% идентичных любым из указанных выше последовательностей.
20. ЗкДНК-вектор по любому из пп. 1-16, где 5’-ITR содержит последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 52, 63, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 484-499, 545 и 547, последовательностей ITR, показанных на фиг. 26B, и последовательностей, по меньшей мере на 95% идентичных любым из указанных выше последовательностей; а 3’-ITR содержит последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2, 64, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128,130, 132, 134, 469-483 и 546, последовательностей ITR, показанных на фиг. 26A, и последовательностей, по меньшей мере на 95% идентичных любым из указанных выше последовательностей.
21. ЗкДНК-вектор по п. 1, содержащий по меньшей мере два асимметричных ITR, выбранных из:
а. SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO:52; и
b. SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 51.
22. ЗкДНК-вектор по п. 1, содержащие пару асимметричных ITR, выбранных из:
a. SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:52; и
b. SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:51.
23. ЗкДНК-вектор по любому из пп. 1-20, где один или оба асимметричных ITR содержат последовательность, отличную от SEQ ID NO: 2, 52, 63 64, 113, 114 и 557.
24. ЗкДНК-вектор по любому из пп. 1-23, где вся гетерологичная нуклеотидную последовательность или ее часть находится под контролем по меньшей мере одного регуляторного переключателя.
25. ЗкДНК-вектор по п. 24, где по меньшей мере один регуляторный переключатель выбран из регуляторных переключателей, приведенных в таблице 11.
26. ЗкДНК-вектор по любому из пп. 1-25, где указанный вектор находится в наноносителе.
27. ЗкДНК-вектор по п. 26, где указанный наноноситель содержит липидную наночастицу (ЛНЧ).
28. Невирусный бескапсидный ДНК-вектор с ковалентно-замкнутыми концами (зкДНК-вектор) по любому из пп. 1-25, который получают способом, включающим следующие этапы:
a. инкубация популяции клеток насекомых, несущих экспрессионную конструкцию зкДНК, в присутствии по меньшей мере одного белка Rep, причем указанная экспрессионная конструкция зкДНК кодирует зкДНК-вектор, в условиях, эффективных для, и на протяжении времени, достаточного для того чтобы индуцировать продуцирование указанного зкДНК-вектора в клетках насекомых; и
b. выделение указанного зкДНК-вектора из клеток насекомых.
29. ЗкДНК-вектор по п. 28, где указанную экспрессионную конструкцию зкДНК выбирают из зкДНК-плазмиды, зкДНК-бакмиды и зкДНК-бакуловируса.
30. ЗкДНК-вектор по п. 28 или 29, где указанная клетка насекомого экспрессирует по меньшей мере один белок Rep.
31. ЗкДНК-вектор по п. 30, где по меньшей мере один белок Rep взят из вируса, выбранного из парвовируса, депендовируса и аденоассоциированного вируса (AAV).
32. ЗкДНК-вектор по п. 31, где по меньшей мере один белок Rep взят из серотипа AAV, выбранного из AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 и AAV12.
33. Экспрессионная конструкция зкДНК, которая кодирует зкДНК-вектор по любому из пп. 1-25.
34. Экспрессионная конструкция зкДНК по п. 33, которая представляет собой зкДНК-плазмиду, зкДНК-бакмиду или зкДНК-бакуловирус.
35. Клетка-хозяин, содержащая экспрессионную конструкцию зкДНК по п. 33 или 34.
36. Клетка-хозяин по п. 35, которая экспрессирует по меньшей мере один белок Rep.
37. Клетка-хозяин по п. 36, отличающаяся тем, что по меньшей мере один белок Rep взят из вируса, выбранного из парвовируса, депендовируса и аденоассоциированного вируса (AAV).
38. Клетка-хозяин по п. 37, отличающаяся тем, что по меньшей мере один белок Rep взят из серотипа AAV, выбранного из AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 и AAV12.
39. Клетка-хозяин по любому из пп. 35-38, представляющая собой клетку насекомого.
40. Клетка-хозяин по п. 39, представляющая собой клетку Sf9.
41. Способ получения зкДНК-вектора, включающий:
a. инкубацию клетки-хозяина по любому из пп. 35-40 в условиях, эффективных для, и на протяжении времени, достаточного для того чтобы индуцировать продуцирование зкДНК-вектора; и
b. выделение указанной зкДНК из клеток-хозяев.
42. Способ лечения, предотвращения, облегчения, мониторинга или диагностики заболевания или нарушения у субъекта, включающий: введение нуждающемуся в этом субъекту композиции, содержащей зкДНК-вектор по любому из пп. 1-25, где по меньшей мере одну гетерологичную нуклеотидную последовательность выбрана для лечения, предотвращения, облегчения, диагностики или мониторинга указанного заболевания или нарушения.
43. Способ по п. 42, где указанная по меньшей мере одна гетерологичная нуклеотидная последовательность при транскрипции или трансляции корректирует аномальное количество эндогенного белка у указанного субъекта.
44. Способ по п. 42, где указанная по меньшей мере одна гетерологичная нуклеотидную последовательность при транскрипции или трансляции корректирует аномальную функцию или активность эндогенного белка или пути у указанного субъекта.
45. Способ по любому из пп. 42-44, где указанная по меньшей мере одна гетерологичная нуклеотидная последовательность кодирует или содержит нуклеотидную молекулу, выбранную из РНКи, миРНК, микроРНК, днкРНК, и антисмыслового олиго- или полинуклеотида.
46. Способ по любому из пп. 42-44, где указанная по меньшей мере одна гетерологичная нуклеотидная последовательность кодирует белок.
47. Способ по п. 42, где указанная по меньшей мере одна гетерологичная нуклеотидная последовательность кодирует маркерный белок.
48. Способ по любому из пп. 42-46, где указанная по меньшей мере одна гетерологичная нуклеотидная последовательность кодирует агонист или антагонист эндогенного белка или пути, ассоциированного с указанным заболеванием или нарушением.
49. Способ по любому из пп. 42-46, где указанная по меньшей мере одна гетерологичная нуклеотидная последовательность кодирует антитело.
50. Способ по пп. 42-49, где указанный зкДНК-вектор вводят в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем.
51. Способ доставки терапевтического белка субъекту, включающий введение субъекту композиции, содержащей зкДНК-вектор по любому из пп. 1-25, где по меньшей мере одна гетерологичная нуклеотидная последовательность кодирует терапевтический белок.
52. Способ по п. 51, где указанный терапевтический белок представляет собой терапевтическое антитело.
53. Набор, содержащий зкДНК-вектор по любому из пп. 1-25 и наноноситель, упакованные в контейнер с вкладышем в упаковку.
54. Набор для получения зкДНК-вектора, содержащий:
a. экспрессионную конструкцию, содержащую по меньшей мере один сайт рестрикции для инсерции по меньшей мере одной гетерологичной последовательности нуклеотидов, или регуляторного переключателя, или обоих, причем указанный по меньшей мере один сайт рестрикции функционально расположен между последовательностями асимметричных инвертированных концевых повторов (асимметричных ITR), и по меньшей мере один из асимметричных ITR содержит функциональный сайт концевого разрешения и сайт связывания Rep.
55. Набор по п. 54, который подходит для получения зкДНК-вектора по любому из пп. 1-25.
56. Набор по п.54 или 55, дополнительно содержащий популяцию клеток насекомых, лишенную кодирующих последовательностей вирусного капсида, где в присутствии белка Rep может индуциррваться продуцирование зкДНК-вектора.
57. Набор по любому из пп. 54-56, дополнительно содержащий вектор, содержащий последовательность полинуклеотидов, которая кодирует по меньшей мере один белок Rep, где указанный вектор подходит для экспрессии указанного по меньшей мере одного белка Rep в клетке насекомого.