АДИПОНЕКТИН ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЙ ЛЕГКИХ
ADIPONECTIN FOR TREATING LUNG DISEASES

Область техники
Настоящее изобретение относится к средству для лечения заболеваний легких, которое ингибирует патологическое увеличение воздушного пространства альвеол, ассоциированное с деструктивными изменениями стенок альвеол, вызванными их хроническим повреждением, и/или которое ингибирует деструктивные изменения стенок альвеол.
Предшествующий уровень техники изобретения
Различные известные болезни легких (БЛ (PD)) включают острый бронхит из-за острого воспаления, вызванного вирусами или бактериями; бронхиальную астму, преимущественно вызванную воспалительным ответом дыхательных путей из-за эозинофилов; интерстициальную пневмонию, вызванную воспалением эпителия альвеол; рак легких, вызванный раковым клетками; и хронические обструктивные болезни легких (ХОБЛ (COPD)), которые известны как заболевания, характеризуемые хроническим воспалением легких, вызванным различными факторами, особенно курением, приводящими к деструкции стенок альвеол и гипертрофии слизистых желез бронхов, приводящих к одышке, увеличению кашля и мокроты и др. В частности, заболевание, ранее называемое эмфиземой, часто осложняет заболевание, ранее называемое хроническим бронхитом, в различной степени. В настоящее время обструктивные болезни легких, в отношении таких двух заболеваний, называют ХОБЛ.
Известно, что ХОБЛ характеризуются прогрессирующим развитием ограничения воздушного потока (обструкции воздушного потока) (Непатентный документ 1).
В отличие от хронического бронхита, при котором гиперсекреция и инфекция дыхательных путей не включают ограничение воздушного потока, необратимое ограничение воздушного потока расценивают как результат патологических изменений периферических дыхательных путей. Такие заболевания легких включают, в добавление к вышеупомянутым обструктивным болезням легких, включающим эмфизему и хронический бронхит, муковисцидоз, бронхоэктаз, туберкулез, пневмокониоз и подобные.
К настоящему времени в отношении лекарственной терапии заболеваний легких, включая ХОБЛ, сопровождаемых необратимым ограничением воздушного потока, лекарственные препараты, такие как стимуляторы β2, антихолинергические средства и подобные, обладающие бронхорасширяющей активностью, используют для временного предупреждения или подавления симптомов. Однако, такие лекарственные средства, обладающие бронхорасширяющей активностью, не могут уменьшать в течение длительного периода времени ухудшение функции легких, что является наиболее важным клиническим показателем.
Во множестве крупных клинических исследований изучали эффекты терапии с использованием в качестве ингаляторов стероидов, обладающих сильным ингибирующим эффектом на продукцию цитокинов; однако, в некоторых документах сообщают, что стероиды могут не снижать ухудшение функции легких в течение длительного периода времени (см. Непатентные документы 2-4).
Относительно эффектов терапии БЛ с использованием лекарственных средств, обладающих ингибирующими эффектами на продукцию активного кислорода, не было проведено надежных клинических исследований.
В соответствии с клиническим исследованием, N-ацетилцистеин, антиоксидант, который расценивается как имеющий механизм действия, сходный с таковым средств для ингибирования продукции активного кислорода, может снижать частоту обострений ХОБЛ (Непатентный документ 5). Однако, ни в одном документе не сообщают о том, что N-ацетилцистеин проявляет эффект уменьшения ухудшения функции легких в течение длительного периода времени.
Кроме того, для лечения БЛ обсуждалось применение лекарственных средств, ингибирующих активность фосфодиэстеразы IV. Однако, сообщают, что такие лекарственные средства обладают нежелательными побочными эффектами, такими как тошнота, рвота и секреция желудочной кислоты (Непатентный документ 6).
Как описано выше, не было разработано лекарственных средств, которые обладают удовлетворительным эффектом в качестве лекарственного средства для лечения хронических болезней легких и которые уменьшают необратимое ухудшение функции легких, т.е. которые ингибируют патологическое увеличение воздушного пространства альвеол, ассоциированное с деструктивными изменениями стенок альвеол из-за их хронического повреждения и/или которые ингибируют деструктивные изменения стенок альвеол.
Список ссылок
Патентная литература
PTL 1: WO1996/39429
PTL 2: WO1999/21577
PTL 3: Японский патент № 3018186
PTL 4: Японский патент № 4147220
PTL 5: Японский нерассмотренный патент № 2004-16074
Непатентная литература
NPL 1: Pauwell, R.A. et.al., Am. J. Respir. Crit. Care Med., 2001(163), 1256-1276
NPL 2: Pauwels R.A., Lodahl C.G., Laitinen L.A., Schouten J.P., Postma D.S., Pride N.B., et al. N. Engl. J. Med., l999(340), 1948-1953
NPL 3: Vestbo J., Sorensen T., Lange P., Brix A., Torre P., Viskum K., Lancet, 1999(353)1819-1823
NPL 4: Burge PS, Calverley PM, Jones PW, Spencer S, Anderson JA, Maslen TK, BMJ, 2000(320), 1297-1303
NPL 5: C. Stey, J. Steurer, S. Bachmann, T.C. Medici, M.R. Tramer, Eur. Respir. J., 2000(16), 253-262
NPL 6: Peter J. Barnes, N. Engl. J. Med., 2000(343) No. 4, 269-280
NPL 7: Maeda, K. et al., Biocjem. Biophys. Res. Commun., 1996(221), 286-289
Сущность изобретения
Техническая проблема
Задачей настоящего изобретения является обеспечение высокобезопасного лекарственного средства, которое является применимым для лечения пациента с заболеванием легких, чья функция легких необратимо нарушена.
Решение проблемы
Авторы настоящего изобретения получили животную модель, которая отражает патогенетические характеристики, клинически очень сходные с ХОБЛ, сопровождаемые необратимым ухудшением функции легких, и провели обширные исследования с использованием такой модели на животных. В результате авторы обнаружили, что адипонектин, который известен как коллагеноподобный секреторный белок, специфически секретируемый жировыми клетками, ингибирует эмфизему легких и расстройства функции легких, вызванные обработкой эластазой, и обнаружили высокобезопасное новое терапевтическое средство, которое проявляет очень выраженный эффект лечения заболеваний легких, сопровождаемых необратимым ухудшением функции легких, с небольшим количеством нежелательных побочных эффектов, таких как тошнота, рвота и секреция желудочной кислоты. Настоящее изобретение было осуществлено на основании таких открытий.
Настоящее изобретение обеспечивает адипонектинсодержащее средство для ингибирования увеличения воздушного пространства альвеол и адипонектинсодержащее средство для ингибирования деструкции стенок альвеол.
Пункт 1. Средство для ингибирования увеличения воздушного пространства альвеол, включающее адипонектин.
Пункт 2. Средство по п.1, где адипонектин содержится в количестве, эффективном для ингибирования увеличения воздушного пространства альвеол, ассоциированного с деструктивными изменениями стенок альвеол.
Пункт 3. Средство по п.1 или 2, где адипонектин содержится в количестве от 0,01 до 70% масс.
Пункт 4. Средство по любому из пп.1-3, для применения в лечении эмфиземы, хронического бронхита, муковисцидоза, бронхоэктаза, туберкулеза, пневмокониоза или хронических обструктивных болезней легких.
Пункт 5. Средство для ингибирования деструкции стенок альвеол, включающее адипонектин.
Пункт 6. Средство по п.5, где адипонектин содержится в количестве, эффективном для ингибирования деструктивных изменений стенок альвеол.
Пункт 7. Средство по любому из пп.5 или 6, где адипонектин содержится в количестве от 0,01 до 70% масс.
Пункт 8. Средство по любому из пп.5-7, для применения для лечения эмфиземы, хронического бронхита, муковисцидоза, бронхоэктаза, туберкулеза, пневмокониоза или хронических обструктивных болезней легких.
Средство для ингибирования увеличения воздушного пространства альвеол по настоящему изобретению, содержащее адипонектин в количестве, эффективном для ингибирования увеличения воздушного пространства альвеол, ассоциированного с деструктивными изменениями стенок альвеол, и средство для ингибирования деструкции стенок альвеол по настоящему изобретению содержит адипонектин в количестве, эффективном для ингибирования деструкции стенок альвеол.
Адипонектин, который является активным ингредиентом средства для ингибирования увеличения воздушного пространства альвеол или средства для ингибирования деструкции стенок альвеол по настоящему изобретению, представляет собой коллагеноподобный белок, секретируемый жировыми клетками.
Адипонектин, который является активным ингредиентом средства для ингибирования увеличения воздушного пространства альвеол или средства для ингибирования деструкции стенок альвеол (далее в настоящем описании сокращаемого как "средства для лечения болезней легких") по настоящему изобретению, является легко доступным и хорошо известным веществом. Коммерчески доступный адипонектин или адипонектин, полученный известным способом, показанным в справочном примере, описанном позже, может быть обычно использован в изобретении.
Гены адипонектина человека и мыши описаны в Патентном документе 1, как человеческий Acrp30 и мышиный Acrp30, и человеческий адипонектин описан как apM1 в Непатентном документе 7 и Патентном документе 2. Предполагаемая последовательность аминокислот полипептида адипонектина, используемого в средствах для лечения болезней легких по настоящему изобретению в качестве активного ингредиента, описана в Патентном документе 2; однако, Патентный документ 2 относится единственно к ингибирующему эффекту полипептида на рост гладкомышечных клеток и его доступности в качестве средства для предотвращения или улучшения атеросклероза, средства для предотвращения или лечения рестеноза после ангиопластики и противовоспалительного средства.
Кроме того, Патентный документ 3 показывает применимость адипонектина, который подавляет, без макрофагов или лимфоцитов, клональный рост относительно зрелых моноцитарных клеток-предшественников в стадии дифференцировки, в качестве противовоспалительного средства и супрессора воспроизводства моноцитарных клеток. Более того, Патентный документ 4 указывает, что С-концевой боковой сферический домен адипонектина (соответствующий последовательности аминокислот SEQ ID NO: 114-239 человеческого адипонектина, и последовательностям аминокислот SEQ ID NO: 111-242 мышиного адипонектина) обладает эффектом снижения экспрессии фагоцитарного рецептора A и может быть использован в качестве профилактического и терапевтического средства при атеросклерозе. Сходным образом Патентный документ 5 относится к доступности С-концевого бокового сферического домена адипонектина в качестве активатора АМФ-активируемой протеинкиназы.
Следующий адипонектин является коммерчески доступным от Bio Vendor (Czechoslovakia; http://www.biovendor.com/products/proteins): глобулярный рекомбинантный адипонектин (Adiponectine Globular Human (E. coli)), рекомбинантный адипонектин, продуцируемый E. coli (Adiponectine Human E. coli His), рекомбинантный адипонектин, продуцируемый человеческими эмбриональными клетками почек (Adiponectine Human HEK293 Flag), тримерный рекомбинантный адипонектин, продуцируемый человеческими эмбриональными клетками почек (Adiponectine Human Trimeric form (HEK)), низко- и высокомолекулярный адипонектин, продуцируемый человеческими эмбриональными клетками почек (Adiponectine LMW и MMW oligomer-rich Human (HEK)), средне- и высокомолекулярный адипонектин, продуцируемый человеческими эмбриональными клетками почек (Adiponectine MMW и HMW oligomer-rich Human (HEK)), и др.
Специфическим примером полипептида, используемого в средствах для лечения болезней легких по настоящему изобретению в качестве активного ингредиента, является полипептид, известный как "адипонектин", кодируемый продуктом ПЦР и показанный в примерах, описанных позднее. Полноразмерная последовательность ДНК человеческого адипонектина имеет 4517 п.н. в длину, и последовательность ДНК, кодирующая открытую рамку считывания (ORF), имеет 732 п.н. в длину, как показано в SEQ ID NO: 2. Последовательность аминокислот, кодирующая ORF, состоит из последовательности 244 аминокислот, как показано в SEQ ID NO: 1, и последовательность гена зарегистрирована как GenBank номер по каталогу NM_004797. Кроме того, полноразмерная последовательность ДНК мышиного адипонектина имеет 1276 п.н. в длину, как показано в SEQ ID NO: 5, и последовательность ДНК, кодирующая ORF, имеет 741 п.н. в длину, как показано в SEQ ID NO: 4. Последовательность аминокислот, кодирующая ORF, состоит из последовательности 247 аминокислот, как показано в SEQ ID NO: 3, и последовательность гена зарегистрирована как GenBank номер по каталогу AF304466. Более того, была установлена экспрессия гена человеческого и мышиного адипонектина, специфическая для жировой ткани.
Гомология последовательности аминокислот между человеческим адипонектином и мышиным адипонектином составляет 83,61%, и гомология последовательности ДНК ORF составляет 79,78%. Такой заметно высокий уровень гомологии указывает, что оба имеют одинаковую активность.
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что адипонектин ингибирует патологическое увеличение воздушного пространства альвеол, ассоциированное с деструктивными изменениями стенок альвеол из-за хронического повреждения или проявляет улучшение функции легких, достигаемое путем ингибирования деструктивных изменений стенок альвеол, и авторы заключили, что адипонектин может предпочтительно использоваться в качестве лекарственного средства.
Как описано выше, так как адипонектин может ингибировать патологическое увеличение воздушного пространства альвеол, ассоциированное с деструктивными изменения стенок альвеол из-за хронического повреждения, он может быть использован для лечения болезней легких, таких как эмфизема, хронический бронхит, муковисцидоз, бронхоэктазы, туберкулез, пневмокониоз и ХОБЛ.
Патентный документ 1: WO1996/39429
Патентный документ 2: WO1999/21577
Непатентный документ 7: Maeda, K. et al., B.B.R.C., (1996) Vol. 221 No.2, pp286-289
Далее описано получение адипонектина для использования в качестве активного ингредиента средств для лечения болезней легких по изобретению, получение средств для лечения болезней легких с использованием адипонектина в качестве активного ингредиента, и др.
Обозначения аминокислот, пептидов, последовательностей нуклеотидов, нуклеиновых кислот и др. посредством сокращений в настоящей спецификации соответствуют правилам номенклатуры, рекомендованной IUPAC-IUB (IUPAC-IUB Communication on Biological Nomenclature, Eur. J. Biochem., 138, 9(1984)), "The Guidelines for Drafting of Specifications Etc. Containing Nucleotide Sequence or Amino Acid Sequence Information" (Edited by the Japanese Patent Office, (July, 1998) и конвенциям в соответствующей области техники.
Адипонектин может быть представлен в форме рекомбинантного белка, полученного путем установленных генно-инженерных методик [например, Science, 224, 1431(1984): Biochem. Biophys. Res. Comm., 130, 692(1985); Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 80, 5990 (1983)]. В таком случае в качестве гена адипонектина (apM1) может быть использован ген, который был ранее установлен авторами настоящего изобретения [Biochem. Biophys. Res. Commun., 221, 286-289 (1996)].
В качестве альтернативы, адипонектин может быть получен обычным способом химического синтеза в соответствии с информацией о последовательности аминокислот, кодируемой указанным геном.
Получение адипонектина посредством генно-инженерных методик может быть проведено в соответствии со способом, описанным в ссылочном примере 1 ниже. В частности, получение включает создание рекомбинантной ДНК, с которой ген, кодирующий белок по изобретению, может быть экспрессирован в клетке-хозяине, введение ДНК в клетку-хозяин для получения трансформанта и культивирование трансформанта.
В описании полинуклеотид (молекула ДНК) охватывает не только двухцепочечную ДНК, но также одноцепочечную ДНК, включая смысловые последовательности или антисмысловые последовательности, которые их составляют, и не ограничивается их длиной. Следовательно, полинуклеотид, кодирующий адипонектин, включает двухцепочечную ДНК и одноцепочечную ДНК (смысловая цепь), включая кДНК, и одноцепочечную ДНК (антисмысловая цепь), имеющую последовательность, комплементарную смысловой цепи, и синтетические фрагменты ДНК, если не упомянуто иначе.
Полинуклеотид (молекула ДНК) в настоящем описании не определяется функциональным участком и может включать, по меньшей мере, один участок подавления экспрессии, кодирующий участок, лидер-последовательность, экзон и интрон.
Полинуклеотид также включает РНК и ДНК. Полинуклеотид, включающий определенную последовательность аминокислот, и полинуклеотид, включающий определенную последовательность ДНК, включает ее фрагменты, гомологи, производные и мутации.
Мутанты полинуклеотида (мутантные ДНК) включают естественные аллельные мутанты, неестественные мутанты и мутанты, имеющие делеции, замены, добавления и вставки. Но такие мутанты кодируют полипептид, имеющий по существу ту же функцию, как функция полипептида, кодируемого полинуклеотидом до мутации.
Мутация полипептида (модификация последовательности аминокислот) необязательно возникает естественно, например, мутация или посттрансляционная модификация, и могут быть таковыми, искусственно произведенными путем использования натурального белка (например, человеческого адипонектина). Вышеуказанные мутанты полипептида включают аллельные варианты, гомологи и натуральные мутанты, имеющие по меньшей мере 80%, предпочтительно 95% и более предпочтительно 99% гомологию с полипептидом до мутации.
Гомология полипептида или полинуклеотида может быть проанализирована путем оценки с использованием программы FASTA (Clustal, V., Methods MoI. Biol., 25, 307-318(1994)). Как наиболее предпочтительный и простой метод для анализа гомологии возможно проиллюстрировать метод, в котором последовательность хранится на носителе (например, гибком диске, CD-ROM, жестком диске, внешнем диске, DVD, и др.), способном к считыванию компьютером, и затем ее ищут в известной базе данных последовательностей в соответствии с хорошо известной методикой поиска с использованием хранящейся последовательности. Специфические примеры известных баз данных последовательностей включают следующие:
- база данных ДНК Японии (DDBJ) (http://www.ddbj.nig.ac.jp/); - Genebank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/web/Genebank/Index.htlm); и
- База данных последовательностей нуклеиновых кислот Европейской лаборатории молекулярной биологии (EMBL) (http://www.ebi.ac.uk/ebi docs/embl db.html).
Множество алгоритмов поиска для анализа гомологии доступны специалисту в области техники. Один пример включает программу, называемую программой BLAST. Существует 5 методик BLAST в этой программе. Среди них три (BLASTN, BLASTX и TBLASTX) были созданы для проверки последовательности нуклеотидов. Оставшиеся две были созданы для проверки последовательности белка (Coulson, Trends in Biotechnology, 12:76-80(1994); Birren, et al., Genome Analysis, 1:543-559(1997)).
Кроме того, дополнительные программы, например программа выравнивания последовательности и программа для идентификации последовательностей, более дистанционно разделенных, доступны в области техники для анализа идентифицированной последовательности.
Мутантная ДНК является молчащей (отсутствие изменений остатков аминокислот, кодируемых мутантной последовательностью аминокислот) или консервативной для аминокислот, кодируемых ею. Примеры консервативных замен аминокислот показаны ниже.
Исходный остаток аминокислоты
Консервативно замещенный остаток аминокислоты
Ala
Ser
Arg
Lys
Asn
Gln или His
Asp
Glu
Cys
Ser
Gln
Asn
Glu
Asp
Gly
Pro
His
Asn или Gln
Ile
Leu или Val
Leu
Ile или Val
Lys
Arg, Asn или Glu
Met
Leu или Ile
Phe
Met, Leu или Tyr
Ser
Thr
Thr
Ser
Trp
Tyr
Tyr
Trp или Phe
Val
Ile или Leu
Обычно один или более кодонов, кодирующих остаток Cys, влияет на дисульфидную связь определенного полипептида.
Обычно считают, что замена остатка аминокислоты, влияющая на характеристики белка, включает следующие:
a) замена гидрофобного остатка гидрофильным остатком, например, замена Leu, Ile, Phe, Val или Ala с помощью Ser или Thr;
b) замена остатка аминокислоты, иных чем Cys и Pro, с помощью Cys или Pro;
c) замена остатка, имеющего электрически положительную боковую цепь, например, Lys, Arg или His, с помощью электрически отрицательного остатка, например, Glu или Asp; и
d) замена остатка аминокислот, имеющего крайне крупную боковую цепь, например, Phe, с помощью остатка аминокислоты, не имеющего боковой цепи, например, Gly.
Адипонектин включает последовательность аминокислот SEQ ID NO:1 или 3 или последовательность аминокислот, имеющую одну или более делеций, вставок, замен или добавлений аминокислот в последовательности аминокислот SEQ ID NO:1 или 3, и обладает активностью ингибирования увеличения воздушного пространства альвеол и/или эффектом улучшения функции легких.
Адипонектин может быть полипептидом, экспрессируемым в системе экспрессии белка с использованием Escherichia coli или системе экспрессии белка с использованием бакуловируса (AcNPV), показанных в примерах, описанных позже посредством генно-рекомбинантной методики, или полипептидом, полученным химическим синтезом.
В качестве одного специфического примера последовательности аминокислот адипонектина возможно проиллюстрировать одну из SEQ ID NO:1 или 3. Последовательность аминокислот адипонектина не ограничена одной из SEQ ID NO:1 или 3 и может быть таковой (гомологичной), имеющей определенную гомологию с ней. Гомологичные последовательности могут включать полипептиды, включающие последовательность аминокислот, имеющие одну или более делеций, вставок, замен или добавлений аминокислот в последовательности аминокислот SEQ ID NO:1 или 3 и обладающие активностью ингибирования увеличения воздушного пространства альвеол и/или активностью ингибирования деструкции стенок альвеол и эффектом улучшения функции легких (активность ингибирования патологического увеличения воздушного пространства альвеол, ассоциированного с деструктивными изменениями стенок альвеол из-за хронического повреждения, и/или активность ингибирования деструктивных изменений стенок альвеол).
Специфически, эффекты улучшения функции легких адипонектина включают эффект улучшения или уменьшения снижения дыхательной способности легких, или увеличения сопротивления дыханию в дыхательном тракте (особенно бронхоальвеолярном тракте) млекопитающих, таких как человек.
В качестве клетки-хозяина могут быть использованы клетки, полученные от эукариот и прокариот. Эукариотные клетки включают клетки позвоночных и клетки эукариотных микроорганизмов. В качестве клеток позвоночных часто используют клеточную линию обезьян COS (Cell, 23, 175 (1981)), клеточную линию клеток яичника китайского хомячка и соответствующую клеточную линию, дефицитную по дигидрофолатредуктазе (Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 77, 4216 (1980)) и подобные, но они не являются единственным выбором.
В качестве вектора экспрессии позвоночного происхождения обычно может использоваться вектор, имеющий последовательность промотора, расположенную ниже в экспрессируемом гене, участок сплайсинга РНК (предшественник), участок полиаденилирования и последовательность терминирования транскрипции. Если необходимо, вектор может дополнительно иметь репликационное происхождение. В качестве примера такого вектора экспрессии может быть упомянут pSV2dhfr, содержащий ранний промотор SV40 (Mol. Cell. Biol., 1, 854 (1981)).
В качестве эукариотных микроорганизмов обычно используют дрожжи. Из них с преимуществом могут быть использованы дрожжи рода Saccharomyces. В качестве вектора экспрессии, полученного от эукариотных микроорганизмов, таких как дрожжи, может быть использован pAM82, имеющий промотор для гена кислой фосфатазы (Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 80, 1 (1983)).
В качестве прокариотного организма-хозяина обычно используют Escherichia coli и Bacillus subtilis. Когда их используют в качестве организмов-хозяев с использованием плазмидного вектора, способного реплицироваться в микроорганизме-хозяине, возможно подходящим образом использовать плазмиду экспрессии, полученную путем включения последовательности промотора и SD (Shain и Dalgarano) и кодона инициации (например, ATG), требуемого для инициации синтеза белка выше гена, так что ген может экспрессироваться в таком векторе. Как указано, Escherichia coli в качестве организма-хозяина обычно используют E. coli K12, и в качестве вектора обычно используют pBR322 или его модифицированный продукт. Однако они не являются единственным выбором, а также могут использоваться различные известные бактериальные штаммы и векторы. Примерами промотора, которые могут быть использованы, являются триптофановый промотор (trp), lpp промотор, lac промотор и PL/PR промотор.
В качестве вектора для клеток насекомых возможно проиллюстрировать бакуловирусный вектор (Takara), в который включена кДНК адипонектина. В частности, продукт экспрессии по настоящему изобретению может быть получен путем введения бакуловирусного вектора экспрессии, в который включена кДНК адипонектина, в культивируемые клетки BmN4 или гусеницы шелкопряда (Bombyx mori) с использованием ядерного вируса полигедроза (BmNPV) шелкопряда для экспрессии и выделения из культуральной среды или жидкости тела шелкопряда путем хроматографии.
Экспрессируемый продукт по настоящему изобретению также может быть получен путем включения кДНК адипонектина в ядерный вирус полигедроза (AcNPV) Autographa californica, экспрессируемый в клетках Sf9 Spodoptera frugiperda или клетках Tn5 Trichoplusia ni, и иным образом очистки из надосадочной культуральной жидкости путем хроматографии.
Введение полученной рекомбинантной ДНК в клетку-хозяин для трансформации может проводиться в соответствии с известным способом.
Полученный трансформант может культивироваться в соответствии со стандартными методами, посредством чего рекомбинантный белок по изобретению экспрессируется и продуцируется (накапливается и секретируется) внутриклеточно, внеклеточно или на мембране клеток. В качестве среды, используемой для культивирования, различные обычно используемые среды могут быть соответствующим образом выбраны и использованы в соответствии с используемой клеткой-хозяином. Культивирование также может проводиться в других условиях, подходящих для роста клеток-хозяев.
Если необходимо, адипонектин, полученный вышеуказанным способом, может быть выделен и очищен различными процедурами разделения с использованием его физических, химических и других характеристик (Biochemical Data Book II, 1175-1259, First Edition, 1st impression, Jun. 23, 1980, published by Tokyo Kagaku Dojin, K.K.; Biochemistry, 25 (25), 8274 (1986); Eur. J. Biochem., 163, 313 (1987), etc.). В частности, указанное выделение и очистка могут быть достигнуты путем обычного восстановления, обработки с помощью средства, осаждающего белок (высаливание), центрифугирования, метода шока осмотического давления, обработки ультразвуком, ультрафильтрации, различными типами жидкостной хроматографии, такими как хроматография с молекулярным ситом (гель-фильтрация), адсорбционная хроматография, ионообменная хроматография, аффинная хроматография, высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), и др., и диализом, при использовании отдельно или в комбинации.
Альтернативно адипонектин, упомянутый выше, также может быть получен обычным методом химического синтеза, основанным на информации о последовательности аминокислот. Способ включает обычные жидкофазные и твердофазные методы пептидного синтеза. Более подробно, каждый из таких способов включает так называемую методику пошаговой элонгации, которая включает конденсацию компонентов аминокислот одна после другой для удлинения цепи в соответствии с информацией о последовательности аминокислот, и методику конденсации фрагмента, которая включает предварительный синтез фрагментов пептидов, каждый состоящий из нескольких остатков аминокислот и связывание их вместе друг за другом в соответствии с указанной информацией.
Метод конденсации, используемый для пептидного синтеза, также может проводиться в соответствии со стандартными методами. Примеры стандартных методов включают азидный метод, метод смешанного кислого ангидрида, метод DCC, метод активного эфира, метод окисления и восстановления, метод DPPA (дифенилфосфорилазида), метод DDC + добавки (1-гидроксибензотриазол, N-гидроксисукцинамид, N-гидрокси-5-норборнен-2,3-дикарбоксиимид) и метод Вудворта.
Растворитель, который может быть использован в таких методах, может быть соответственно выбран из растворителей, которые хорошо известны как используемые в реакциях конденсации с образованием пептидов. Их примеры включают N,N-диметилформамид (DMF), диметилсульфоксид (DMSO), гексафосфорамид, диоксан, тетрагидрофуран (THF), этилацетат, и др., и их смеси.
Во время вышеуказанной реакции пептидного синтеза аминокислота не включается в реакцию или карбоксильная группа в пептиде может быть защищена как сложный эфир низшего алкила, такой как метиловый эфир, этиловый эфир и трет-бутиловый эфир, и сложный аралкиловый эфир, такой как бензиловый эфир, п-метоксибензиловый эфир и п-нитробензиловый эфир, обычно путем этерификации.
Гидроксильная группа в аминокислоте, такой как остаток тирозина, имеющий функциональную группу в боковой цепи, может быть защищена ацетилом, бензилом, бензилоксикарбонилом, трет-бутилом или подобным, хотя такая защита не является обязательно необходимой.
Более того, гуанидиновая группа аргининового остатка может быть защищена соответствующей группой, такой как нитро, тозил, п-метоксибензолсульфонил, метилен-2-сульфонил, бензилоксикарбонил, изоборнилоксикарбонил или адамантилоксикарбонил.
Реакции для удаления таких защитных групп из защищенных аминокислот или пептидов или из конечного белка могут проводиться в соответствии с обычно используемыми способами, такими как метод катализируемой реакции или метод с использованием жидкого аммония/металла натрия, фторводорода, бромводорода, соляной кислоты, трифторуксусной кислоты, уксусной кислоты, муравьиной кислоты или метансульфоновой кислоты и подобного.
Полученный таким образом адипонектин может быть очищен различными методами, такими как методы с использованием ионообменной смолы, распределительная хроматография и гель-хроматография, и метод противоточного распределения, обычно используемый в области пептидной химии.
Средства для лечения болезней легких по настоящему изобретению включают адипонектин или его фармацевтически приемлемую соль в качестве активного ингредиента. Соли включают таковые с щелочными металлами, щелочноземельными металлами и аммонием, такие как соли натрия, калия, лития, кальция, магния, бария и аммония. Такие соли могут быть получены способами, хорошо известными в области техники. Вышеупомянутые соли включают аддитивные соли кислот, которые могут быть получены путем реакции адипонектина с подходящей органической или неорганической кислотой обычным известным методом. Примерами аддитивных солей кислот являются гидрохлорид, гидробромид, сульфат, бисульфат, ацетат, оксалат, валерат, олеат, лаурат, борат, бензоат, лактат, фосфат, п-толуолсульфонат (тозилат), цитрат, малеат, фумарат, сукцинат, тартрат, сульфонат, гликолат, аскорбат, бензолсульфонат, напсилат и подобные соли.
Средства для лечения болезней легких по изобретению обычно обеспечивают и применяют в форме фармацевтического препарата, содержащего фармакологически эффективное количество активного ингредиента вместе с соответствующим фармацевтическим носителем.
Носитель, который может быть использован в таких фармацевтических препаратах, включает различные разбавители и/или вспомогательные вещества, такие как наполнители, разбавители, вяжущие средства, увлажнители, дезинтегрирующие средства, поверхностно-активные вещества, смазывающие средства и подобные. Такие носители необязательно используют в соответствии со стандартной лекарственной формой конечной композиции.
Стандартные лекарственные формы фармацевтических препаратов могут быть выбраны из различных форм в соответствии с целью терапии. Типичные примеры включают твердые формы, такие как таблетки, пилюли, порошки, тонкоизмельченные порошки, гранулы и капсулы, и жидкие формы, такие как растворы, суспензии, эмульсии, сиропы и эликсиры. Такие препараты классифицируют по пути введения на пероральные препараты, парентеральные препараты, трансназальные препараты, вагинальные препараты, ректальные препараты, сублингвальные таблетки, мази и подобные, и каждая может быть рецептирована и прессована или иным образом обработана с помощью установленных фармацевтических методик. Более того, такие фармацевтические препараты могут содержать различные добавки, которые могут быть рецептированы в обычных фармацевтических препаратах, такие как стабилизаторы, антибактериальные средства, буферные вещества, изотонические средства, комплексообразующие средства, средства, регулирующие рН, и поверхностно-активные вещества.
Стабилизатор включает человеческий альбумин сыворотки и L-аминокислоты, сахариды и производные целлюлозы. Они могут быть использованы каждый отдельно или в комбинации с поверхностно-активным веществом или подобными. В частности, такая комбинация может участвовать в усилении стабильности активного ингредиента.
L-аминокислоты особо не ограничены и включают глицин, цистеин, глютаминовую кислоту и др.
Сахариды особо не ограничены, но включают моносахариды, такие как глюкоза, манноза, галактоза и фруктоза; сахарные спирты, такие как маннит, инозит и ксилит; дисахариды, такие как сахароза, мальтоза и лактоза; и полисахариды, такие как декстран, гидроксипропилкрахмал, хондроитинсульфат и гиалуроновая кислота и их производные.
Поверхностно-активные вещества особо не ограничены и могут быть использованы и ионные и неионные поверхностно-активные вещества. Примерами поверхностно-активных веществ являются алкильные эфиры полиоксиэтиленгликольсорбитана, алкильные эфиры полиоксиэтилена, моноациловые эфиры сорбитана и глицериды жирных кислот.
Производные целлюлозы особо не ограничиваются, но включают метилцеллюлозу, этилцеллюлозу, гидроксиэтилцеллюлозу, гидроксипропилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, карбоксиметилцеллюлозу натрия и др.
Сахариды могут быть использованы в количестве, по меньшей мере, около 0,0001 мг, и предпочтительно в диапазоне от около 0,01 до около 10 мг на 1 мкг активного ингредиента. Поверхностно-активные вещества могут быть использованы в количестве, по меньшей мере, около 0,00001 мг, и предпочтительно в диапазоне от около 0,0001 до около 0,01 мг на 1 мкг активного ингредиента. Человеческий альбумин сыворотки может быть использован в количестве, по меньшей мере, около 0,0001 мг, и предпочтительно в диапазоне от около 0,001 до около 0,1 мг на 1 мкг активного ингредиента. Аминокислоты могут быть использованы в количестве в диапазоне от около 0,001 до около 10 мг на 1 мкг активного ингредиента. Производные целлюлозы могут быть использованы в количестве, по меньшей мере, около 0,00001 мг, и предпочтительно в диапазоне от около 0,001 до около 0,1 мг на 1 мкг активного ингредиента.
Количество активного ингредиента, содержащееся в фармацевтических препаратах по настоящему изобретению, может быть соответствующим образом выбрано из широкого диапазона. Приемлемо, когда количество активного ингредиента составляет обычно от около 0,00001 до около 70% масс, и предпочтительно от около 0,0001 до около 5% масс.
Буферное вещество, которое может быть необязательно включено в фармацевтические препараты, включает борную кислоту, фосфорную кислоту, уксусную кислоту, лимонную кислоту, ε-аминокапроновую кислоту, глутаминовую кислоту и соответствующие соли (например, соли с щелочными металлами или щелочноземельными металлами, такие как соли натрия, калия, кальция и магния). Изотонические средства включают хлорид натрия, хлорид калия, сахара и глицерин. Комплексообразующие средства включают эдетат натрия и лимонную кислоту.
Фармацевтические препараты по изобретению могут быть получены как жидкие препараты и дополнительно могут быть преобразованы в лиофилизированные лекарственные формы, полученные лиофилизацией фармацевтической композиции, которую получают в соответствующей концентрации для использования путем растворения в солевом растворе, содержащем буферное вещество.
При прессовании фармацевтической композиции по изобретению в форму таблетки могут быть использованы в качестве носителя различные вспомогательные вещества, такие как лактоза, сахароза, хлорид натрия, глюкоза, мочевина, крахмал, карбонат кальция, каолин, кристаллическая целлюлоза, кремниевая кислота и фосфат калия; вяжущие вещества, такие как вода, этанол, пропанол, простой сироп, раствор глюкозы, раствор крахмала, раствор желатина, карбоксиметилцеллюлоза, гидроксипропилцеллюлоза, метилцеллюлоза и поливинилпирролидон; дезинтегрирующие средства, такие как натрий-карбоксиметилцеллюлоза, кальций-карбоксиметилцеллюлоза, гидроксипропилцеллююлоза с низкой степенью замещения, сухой крахмал, альгинат натрия, порошок агара, порошок ламинарии, гидрокарбонат натрия и карбонат кальция; поверхностно-активные вещества, такие как сложный эфир полиоксиэтиленсорбитана и жирных кислот, лаурилсульфат натрия и стеарилмоноглицерид; ингибиторы дезинтеграции, такие как сахароза, стеарин, масло какао и гидрогенизированное масло; усилители абсорбции, такие как четвертичные основания аммония и лаурилсульфат натрия; увлажнители, такие как глицерин и крахмал; адсорбенты, такие как крахмал, лактоза, каолин, бентонит и коллоидная кремниевая кислота; и смазывающие средства, такие как очищенный тальк, соли стеариновой кислоты, порошок борной кислоты и полиэтиленгликоль.
Более того, если необходимо, полученные таблетки могут быть покрыты оболочкой с помощью обычных материалов оболочки для получения таблеток, покрытых сахаром, таблеток, покрытых желатином, кишечнорастворимых таблеток, таблеток, покрытых пленкой, или двух- или многослойных таблеток.
Пилюли могут быть получены с использованием в качестве носителя вспомогательных веществ, таких как глюкоза, лактоза, крахмал, масло какао, гидрогенизированное растительное масло, каолин и тальк; вяжущих веществ, таких как порошок гуммиарабик, порошок трагакантовой камеди, желатин и этанол, и дезинтегрирующих средств, таких как ламинария и агар.
В общем, капсулы могут быть получены путем смешивания активного ингредиента с вышеупомянутыми носителями в соответствии с обычным способом для заключения последнего в твердые желатиновые капсулы или подобные.
Жидкие препараты для перорального введения включают растворы, эмульсии, суспензии, сиропы и эликсиры. Каждый может быть получен с использованием обычного инертного разбавителя, например, фармакологически приемлемого носителя, включающего воду. Жидкий препарат может также быть дополнен различными вспомогательными средствами, такими как увлажняющее средство, эмульгатор и/или суспендирующее средство, и может быть получен установленной методикой.
Жидкий препарат для парентерального введения, например, стерильный водный или неводный раствор, эмульсия или суспензия, может быть получен с использованием разбавителя, такого как вода, этиловый спирт, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, этоксилированный изостеариловый спирт, полиоксилированный изостеариловый спирт, полиэтоксилированные сложные эфиры сорбитана и жирных кислот и растительные масла, такие как оливковое масло. Жидкий препарат может быть дополнен органическим эфиром, который может быть введен посредством инъекции или инфузии, таким как этилолеат. Такие препараты могут быть также дополнены растворителем, буферным веществом, увлажняющим средством, эмульгатором, суспендирующим средством, консервантом, диспергирующим средством и другими добавками.
Такие фармацевтические препараты могут быть стерилизованы путем фильтрации через бактериальный фильтр, включением бактерицида, лучевой обработкой, тепловой обработкой или подобным. Более того, такие фармацевтические препараты могут, каждый, быть обеспечены в форме стерильной твердой композиции, которая может быть растворена в стерилизованной воде или подходящей стерилизуемой среде для непосредственной стерилизации перед применением.
Ректальные суппозитории и вагинальные препараты могут быть получены с использованием носителей, таких как полиэтиленгликоль, масло какао, высшие спирты, сложные эфиры высших спиртов, желатин и полусинтетический глицерид.
Мази, такие как пасты, кремы и гели, могут быть получены с использованием такого разбавителя или разбавителей, как белый вазелин, парафин, глицерин, производные целлюлозы, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, кремнийорганические вещества, бентонит и растительные масла, такие как оливковое масло.
Фармацевтические препараты для трансназального или сублингвального введения могут быть получены с использованием хорошо известного вспомогательного вещества или веществ обычным образом.
Более того, если необходимо, фармацевтические препараты по изобретению могут быть дополнены красителями, консервантами, ароматизаторами, подсластителями или другими фармацевтическими композициями.
Способ введения фармацевтического препарата не ограничен, но его выбирают в соответствии с лекарственной формой, возрастом, полом и другими состояниями пациента и состоянием заболевания. Например, таблетки, пилюли, растворы, суспензии, эмульсии, гранулы и капсулы вводят перорально. Инъекции вводят внутривенно или отдельно или в смеси с обычным инфузионным раствором, таким как глюкоза и аминокислота, и если необходимо, вводят отдельно внутримышечно, внутрикожно, подкожно или интраперитонеально. Суппозитории вводят интраректально. Вагинальные препараты вводят во влагалище, назальные препараты вводят в нос, сублингвальные препараты вводят в полость рта и мази наносят местно на кожу.
Для преобразования активного ингредиента по настоящему изобретению в порошкообразную форму ингредиент может быть распылен в соответствии с обычными способами. Например, активный ингредиент может быть распылен с использованием лактозы, крахмала или подобного и затем перемешан для получения однородной смеси.
Из методов введения легочное введение (ингаляция) является наиболее преимущественным, чем пероральное введение, так как альвеолы легких являются органами-мишенями лечения, и возможно непосредственное воздействие на поврежденную область ткани альвеол, что предотвращает генерализованные побочные эффекты.
Количество адипонектина, содержащееся в терапевтическом средстве по настоящему изобретению, не ограничивается и может быть соответствующим образом выбрано из широкого диапазона. Адипонектин обычно содержится в количестве от около 0,01 до около 70% масс, предпочтительно от около 0,1 до около 50% масс, и более предпочтительно от около 0,3 до около 30% масс фармацевтической композиции.
Количество активного ингредиента, содержащееся в фармацевтическом препарате и дозировка особо не ограничиваются, но могут быть выбраны из широкого диапазона в соответствии с желаемым терапевтическим эффектом, способом введения, периодом лечения и возрастом, полом и другими состояниями пациента. Дозировку обычно выбирают так, что концентрация активного ингредиента в крови составляет предпочтительно от около 0,1 до около 500 мкг/мл, и более предпочтительно от около 1 до около 50 мкг/мл. Такой препарат можно вводить один раз или в несколько отдельных доз в сутки.
Дозировку терапевтического средства по изобретению соответствующим образом выбирают в соответствии со способом применения, возрастом, полом и другими состояниями пациента и тяжестью заболевания. Количество адипонектина обычно составляет от около 0,1 мкг до около 20 мг.
Преимущественные эффекты изобретения
Адипонектинсодержащее средство для ингибирования увеличения воздушного пространства альвеол или адипонектинсодержащее средство для ингибирования деструкции стенок альвеол по настоящему изобретению обладает превосходным эффектом снижения ухудшения функции легких, такого как обструкция дыхательных путей, и является высоко эффективным для лечения болезней легких, сопровождаемых необратимым ухудшением функции легких.
Адипонектинсодержащее средство для ингибирования увеличения воздушного пространства альвеол или адипонектинсодержащее средство для ингибирования деструкции стенок альвеол по настоящему изобретению является высоко безопасным лекарственным препаратом с несколькими побочными эффектами, такими как тошнота, рвота, секреция желудочной кислоты и др.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 представляет собой график, показывающий, что адипонектин обладает дозозависимым ингибирующим действием на увеличение воздушного пространства альвеол, вызванное прогрессирующими деструктивными изменениями стенок альвеол.
На фиг. 2 показаны сечения тканей, представляющие прогрессирующие деструктивные изменения стенок альвеол и ингибирующую активность адипонектина на прогрессирующую деструкцию стенок альвеол.
Описание вариантов осуществления изобретения
Пример получения 1
Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению в инъекционной композиции получали путем добавления и смешивания 100 мкг/мл человеческого адипонектина (имеющего последовательность аминокислот SEQ ID NO:1), 0,01 мг/мл Tween 80 (моноолеат полиоксиэтилен (20) сорбита; Полисорбат 80), 15 мг/мл декстрана 40, 0,1 мг/мл цистеина, и 1,0 мг/мл HSA (человеческого альбумина сыворотки) в 0,01M буфере лимонной кислоты-цитрата натрия (pH 6,0), фильтрации смеси (с использованием мембранного фильтра 0,22 мкм), затем стерильного введения фильтрата по 1 мл во флаконе, и его лиофилизации. Композиция может быть использована при применении путем растворения в 1 мл солевого раствора.
Пример получения 2
Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению в инъекционном препарате получали путем добавления 10 мкг/0,1 мл человеческого адипонектина (имеющего последовательность аминокислот SEQ ID NO: 1), 5 мг цистеиновой кислоты, и 1 мг человеческого альбумина сыворотки (HSA) на флакон в дистиллированной воде для инъекции, заполнения полученного раствора в один флакон по 1 мл и его лиофилизации.
Пример получения 3
Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению в инъекционной композиции получали путем добавления 0,5 мг адипонектина, 80 мг хлорида натрия, 20 мг маннита, 34,5 мг фосфата натрия, и 45 мг PEG в 10 мл дистиллированной воды для инъекций, заполнения фильтрата по 1 мл в асептический флакон и его лиофилизации.
Ссылочный пример 1
Получение рекомбинантного человеческого адипонектина
(1) Экспрессия человеческого адипонектина в Escherichia coli
1) ПЦР человеческого адипонектина
Ген человеческого адипонектина и последовательность аминокислот, кодируемая им, хранятся в GenBank под номером по каталогу NM_004797 и D45371, соответственно. Кодирующий участок (CDS) показан в виде последовательности от 27-го до 761-го последовательности нуклеотидов. Его установленная последовательность аминокислот показана в SEQ ID NO:1. В указанной последовательности 1-14-й остатки составляют сигнальный пептид и 15-244-й остатки представляют собой зрелый человеческий адипонектин.
Ген человеческого адипонектина амплифицировали посредством ПЦР с использованием плазмиды, данной Dr. Funahashi, the Second Department of Internal medicine, Osaka University School of Medicine в качестве матрицы.
Создавая так, что последовательность 693 п.н. от 69-го до 761-го последовательности нуклеотидов человеческого адипонектина амплифицировали с NdeI сайтом на 5'-конце и BamHI сайтом на 3'-конце, получали праймеры ПЦР с использованием автоматического синтезатора ДНК. Последовательности праймеров ПЦР показаны в SEQ ID NO:6 (прямая) и NO:7 (обратная).
2) Субклонирование гена человеческого адипонектина (apM1)
Продукт ПЦР, полученный на вышеуказанной стадии 1), субклонировали в вектор pT7 Blue T (Novagen) и подтверждали, что в его последовательности нуклеотидов не было мутаций (pT7-apM1).
3) Создание вектора экспрессии
Вектор экспрессии pET3c (Novagen) перерабатывали с NdeI и BamHI для восстановления фрагмента приблизительно 4600 п.н. С другой стороны, pT7-apM1, полученный на вышеуказанной стадии 1), перерабатывали с NdeI и BamHI для восстановления фрагмента приблизительно 700 п.н. Такие фрагменты лигировали, и полученный таким образом вектор экспрессии называли pET3c-apM1.
4) Экспрессия в Escherichia coli
Штамм хозяин E. coli BL21(DE3)pLysS трансформировали с помощью pET3c-apM1, созданного на вышеуказанной стадии 3), и культивировали в 2xT.Y.Amp. (триптон 16 г, экстракт дрожжей 10 г и NaCl 5 г). Когда организм вводили в логарифмическую фазу роста, IPTG (изопропил β-D-тиогалактопиранозид) добавляли для индукции продукции рекомбинантного человеческого адипонектина (apM1). Клетки E. coli до и после такой индукции IPTG и вирусные включения (нерастворимая фракция E. coli) после указанной индукции IPTG забирали и подвергали SDS-PAGE и вестерн-блоттингу для подтверждения экспрессии человеческого адипонектина.
5) Результаты и обсуждение
15
244
Продуктом экспрессии в E. coli, полученным вышеуказанным способом, был белок из 230 остатков, соответствующий Gly-Asn, исключительно сигнальной последовательности, последовательности аминокислот человеческого адипонектина, с добавлением Met, полученного из кодона инициации на N-конце.
E. coli, полученные вышеуказанной методикой, анализировали посредством SDS-PAGE. В результате после индукции IPTG была подтверждена полоса приблизительно 30 кДа в клетках E. coli и вирусные включения.
Затем проводили вестерн-блоттинг с использованием двух типов антител (поликлональные антитела (синтетические пептиды)). Оба антитела реагировали с указанной полосой приблизительно 30 кДа, тогда как совершенно не определяли реакции с организмом-хозяином E. coli.
Вышеуказанную полосу приблизительно 30 кДа удаляли для изучения последовательности ее 10 аминокислот на N-конце. Последовательность была такой же, как ожидаемая последовательность с обнаруженной делецией Met на N-конце в минимальной популяции.
Стало очевидно из вышеуказанных результатов, что рекомбинантный человеческий адипонектин экспрессировался как белок приблизительно 30 кДа. Большая часть экспрессируемого рекомбинантного человеческого адипонектина накапливалась внутриклеточно в виде вирусных частиц.
(2) Очистка рекомбинантного человеческого адипонектина (apM1) из E. coli
Очистку рекомбинантного человеческого адипонектина из E. coli проводили, следуя 5-стадийной методике.
1) Культура E. coli
E. coli BL21(DE3)pLysS (Novagen), трансформированные с помощью вектора экспрессии pET3c-apM1, предварительно культивировали в 2xT.Y.Amp.Cm. (триптон 16 г, экстракт дрожжей 10 г, хлорамфеникол 25 мкг/мл, и NaCl 5 г) (37°C, культивирование с использованием перемешивания). На следующий день культуру разводили 100 объемами 2xT.Y.Amp. и дополнительно инкубировали. После 2-3 часов инкубации, когда OD550 культуральной жидкости становилась 0,3-0,5, IPTG добавляли до окончательной концентрации 0,4 мМ для индукции продукции рекомбинантного человеческого адипонектина (apM1). Через примерно 3-5 часов после добавления IPTG культуральную жидкость центрифугировали (5000 об./мин, 20 мин, 4°C) и осадок E. coli, полученный таким образом, консервировали замораживанием.
2) Получение вирусных включений из E. coli
Осадок E. coli суспендировали в 50 мМ Tris-HCl (pH 8,0) и обрабатывали лизозимом при 37°C в течение 1 часа. Затем добавляли Тритон X-100 (Katayama Kagaku) до окончательной концентрации 0,2%. Полученный раствор обрабатывали ультразвуком (Branson Sonifier, управление выходом 5, 30 сек) и центрифугировали (12000 об./мин, 30 мин, 4°C) и осадок восстанавливали. Полученный осадок суспендировали в 25 мл 0,2% Тритон X-100-дополненного 50 мМ Tris-HCl (pH 8,0) и суспензию обрабатывали ультразвуком (в таких же условиях, как указано выше).
Полученный раствор центрифугировали и осадок промывали такой же методикой, как указано выше. Полученный таким образом осадок брали как вирусные включения.
3) Рефолдинг вирусных включений
Вирусные включения растворяли с небольшим количеством 7 M гуанидина HCl, 100 мМ Tris-HCl (pH 8,0) и 1% 2ME. Полученный раствор добавляли по каплям в 200-кратный объем 2 M мочевины, 20 мМ Tris-HCl (pH 8,0), разводили и позволяли стоять при 4°C в течение 3 ночей.
4) Концентрация сложного раствора
Раствор после вышеуказанного рефолдинга центрифугировали (9000 об./мин, 30 мин, 4°C) и надосадочную жидкость концентрировали до около 1/100 путем ультрафильтрации с использованием мембраны Amicon YM-10. Полученный концентрат диализировали относительно 20 мМ Tris-HCl (pH 8,0) и диализат фильтровали через фильтр 0,45 мкм.
5) DEAE-5PW анионообменная ВЭЖХ
Образец, полученный на вышеуказанной стадии 4), выделяли и очищали анионообменной высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) с DEAE-5PW (Tosoh Corporation). В качестве начального буфера использовали 20 мМ Tris-HCl (pH 7,2) и элюцию проводили с градиентом NaCl (0→1M NaCl/60 мл) при мониторинге поглощения при 280 нм. Элюат собирали в фракции по 1 мл и каждую фракцию анализировали посредством SDS-PAGE.
6) Результаты и обсуждение
Так как рекомбинантный человеческий адипонектин (apM1) выражали как вирусное включение в E. coli, его очистку проводили путем солюбилизации и рефолдинга вирусных частиц. В результате, рекомбинантный человеческий адипонектин растворяли и отделяли на анионообменной колонке. Пиковые фракции (фракции № 30-37) анализировали SDS-PAGE. В результате наблюдали полосу приблизительно 30 кДа. В таком анализе на подложке определяли слабую размытую полоску, но так как большую часть белка расценивали как рекомбинантный человеческий адипонектин (apM1), такую полосу приблизительно 30 кДа (рекомбинантный человеческий адипонектин) использовали в качестве антигена в последующей иммунизации кроликов и мышей и активного ингредиента средств для лечения болезней легких по изобретению.
(3) Получение античеловеческих поликлональных и моноклональных антител
1) Получение поликлонального антитела
Рекомбинантный человеческий адипонектин, 100 мкг/организм, смешивали с полным адъювантом в соотношении 1:1 и 5 кроликов иммунизировали смесью 8 раз с 2-недельными интервалами для получения античеловеческого поликлонального антитела к адипонектину (коды идентификации: OCT9101-OCT9105).
2) Получение моноклонального антитела
Рекомбинантный человеческий адипонектин, 20 мкг/организм, смешивали с полным адъювантом в соотношении 1:1, и мышей иммунизировали смесью 3 раза с 2-недельными интервалами. Затем проводили окончательную иммунизацию без адъюванта за 3 дня до слияния клеток. Слияние клеток между мышиными клетками селезенки и клетками миеломы проводили методом PEG, и гибридому отбирали в HAT среде.
Скрининг в отношении клеточной линии, продуцирующей антитела к человеческому адипонектину, проводили путем ELISA с использованием иммунопланшета, покрытого антигенами (рекомбинантным человеческим адипонектином), и гибридому клонировали путем метода ограниченного разведения.
Вышеуказанным образом получали 11 линий гибридомы, продуцирующей антитела к человеческому адипонектину, называемых KOCO9101-KOCO9111. Одну гибридому, среди них, хранили в National Institute of Bioscience и Human Technology, the Ministry of International Trade and Industry, Japan (NIBH, Higashi 1-1-3, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japan) по данным на 8 июня 1998 (дата первичного хранения) (код идентификации, назначенный депозитором: KOCO9108) и запрос на изменение на хранение под Budapest Treaty подавали по данным на 7 октября 1998. Номер по каталогу окончательного хранения был FERM BP-6542.
Гибридомы в виде отдельных клонов соответственно вводили интраперитонеально мышам, получавшим заранее пристан, и собирали асцитическую жидкость (коды идентификации: ANOC9101-9111).
3) Очистка антител
Кроличью антисыворотку (поликлональные антитела) и мышиную асцитическую жидкость (моноклональное антитело) соответственно очищали с использованием колонки белка A.
4) Экспрессия человеческого адипонектина в клетках животных
кДНК адипонектина иссекали с помощью EcoRI и вставляли в сайт EcoRI вектора экспрессии pCIneo (Promega Corp.). Клетки COS-1 (ATCC CRL1650) трансфицировали вышеуказанным pCIneo-человеческим адипонектином с использованием LlipofectAMINE (GIBCO BRL), и надосадочную жидкость культуры и клетки собирали через 72 часа.
5) Вестерн-блоттинг человеческого адипонектина
Сначала экстракт жировой ткани, клетки COS-1, надосадочную жидкость культуры клеток COS-1, здоровую человеческую плазму и рекомбинантный человеческий адипонектин подвергали воздействию 2 ME(+) SDS-PAGE и переносили на нитроцеллюлозную мембрану.
Полученная мембрана реагировала с античеловеческим моноклональным антителом к человеческому адипонектину (ANOC9104) и, затем, с HRP-меченным антителом, и определение проводили с помощью ECL (реагент, определяющий Вестерн-блот, Amersham).
В результате, полосу приблизительно 35 кДа определяли для экстракта жировой ткани, pCIneo-человеческого адипонектина/COS-1 клеток, и здоровой человеческой плазмы, но не наблюдали для клеток pCIneo/COS-1 или надосадочной жидкости культуры клеток pCIneo/COS-1.
С надосадочной жидкостью культуры клеток pCIneo-человеческого адипонектина/COS-1, подтверждали полосу 35 кДа, хотя она была слишком слабой по интенсивности для легкого различения.
Ссылочный пример 2
Клетки CHO, которые экспрессируют N концевой His-Tag слитый мышиный адипонектин (клон № 5), культивировали в большом масштабе и собирали полученную надосадочную жидкость. С использованием смолы Ni-NTA очищали His-меченный адипонектин.
Ссылочный пример 3
Полноразмерную ДНК, как показано в SEQ NO:5, мышиного адипонектина встраивали в вектор экспрессии и экспрессировали в E. coli, обеспечивая большое количество экспрессируемого мышиного адипонектина. Надосадочную жидкость разрушенных E. coli наносили на открытую колонку из DEAE-сефарозы и проводили элюцию с использованием градиента от 0M до 1M NaCl. Элюированные фракции затем собирали и подвергали фракционированию с 30% насыщенным сульфатом аммония. Надосадочную жидкость наносили на открытую колонку Butyl-Toyopearl и элюцию проводили с градиентом от 30% до 0% насыщенного сульфата аммония. Наконец проводили гель-фильтрацию для чистки мышиного адипонектина.
Пример 1
С использованием модели на мышах (C57BL/6J), у которых развивались болезни легких в результате лечения эластазой, адипонектин исследовали в отношении терапевтических эффектов при хронических обструктивных болезнях легких, характеризуемых необратимым ограничением воздушного потока.
Когда стенки альвеол модели на мышах разрушали посредством однократного интратрахеального введения эластазы, деструкция стенок альвеол хронически продолжалась после этого, усиливая эмфизематозные поражения (контроль на фиг. 2). Такие изменения указаны средним линейным отрезком, который является обычно используемым индексом оценки (Dunnill. M.S. Thorax (1962) 17, p320-328). Степень деструкции стенок альвеол оценивали путем измерения размера отдельных альвеол.
Следовательно, в модели на мышах обработка эластазой вызывала деструкцию стенок альвеол, таким образом приводя к увеличению диаметра альвеол, что является эквивалентом эмфизематозных повреждений и нарушения функции легких.
Однократное интратрахеальное введение эластазы мышам приводило к деструкции стенок альвеол и последующему разрушению кровеносных сосудов, вызывая преходящее кровотечение и инфильтрацию нейтрофилов в альвеолы; однако, такое воспаление исчезало за три дня. Следовательно, в эксперименте может быть подтверждено, что эффект адипонектина не является результатом эффекта ингибирования эластазы.
Самок мышей 6 или 7-недельного возраста (C57BL/6L, Japan Charles River Co., Ltd.) распределяли на 4 группы (A-D, 6 мышей на группу) на основании массы тела с использованием стратифицированной рандомизации (SAS Institute Japan, R8.1), как показано в таблице 1. Каждую мышь подвергали пентобарбиталовой анестезии.
Таблица 1
Группа
Обработка эластазой
Вводимое вещество (концентрация)
Доза адипонектина (мг/мышь) (50 мкл)
Количество мышей
A
Не проводили
-
-
6
B
Проводили
Обычный солевой раствор
-
6
C
Проводили
Адипонектин(0,02 мг/мл)
0,001
6
D
Проводили
Адипонектин(0,2 мг/мл)
0,01
6
Впоследствии с использованием пульверизатора (продукта Penn Century Inc.) обычный солевой раствор (обычный солевой раствор Otsuka, производимый Otsuka Pharmaceutical Factory Inc.) и эластазу человеческих нейтрофилов (производимую Elastin Products Co., Inc.) вводили интратрахеально через гортань мышам в группе A и мышам в группах B-D, соответственно, в объеме 50 мкл/мышь. Дозировка эластазы была 20 ЕД/мышь. Через три дня после интратрахеального введения эластазы адипонектин вводили интратрахеально один раз в сутки в течение 18 дней мышам в группе C в дозе 0,001 мг/мышь и мышам в группе D в дозе 0,01 мг/мышь. Адипонектин, используемый при введении, получали путем растворения в растворителе (50 мМ Tris-HCl (pH 8,0) 0,5M NaCl) мышиного адипонектина, полученного из клеток CHO в ссылочном примере 2 выше. Адипонектин разводили подходящим количеством обычного солевого раствора до концентрации 0,2 мг/мл или 0,02 мг/мл для применения. Растворы в каждой концентрации делили на суточные дозы лекарственного вещества и консервировали замораживанием при -20°C до момента введения. В момент введения замороженный раствор оттаивали. В контрольной группе эластазы (Группа B) обычный солевой раствор вводили вместо адипонектина в течение того же периода. Адипонектин или обычный солевой раствор вводили интратрахеально через гортань мышам под ингаляционной анестезией изофлураном в объеме 50 мкл/мышь с использованием пульверизатора. После 18 дней непрерывного интратрахеального введения каждую мышь умерщвляли путем кровопускания из абдоминальной аорты под ингаляционной анестезией изофлураном. Легкие иссекали и подвергали перфузионной фиксации с помощью 10% нейтрального буферного раствора формалина. Фиксированную ткань легкого затем подвергали заливке в парафин, тонкой нарезке, окрашиванию Masson Trichrome, и окрашиванию HE в Bio Pathology Institute Co., Ltd. Патологические ткани оценивали путем измерения среднего линейного отрезка, который является объективным показателем повреждения альвеол.
Средний линейный отрезок (Lm) рассчитывали с использованием формулы: Lm=N×L/m, где N представляет собой количество секущих линий, L представляет собой длину секущей линии, и m представляет собой общее количество стенок альвеол, пересекаемых секущими линиями.
Статистический анализ
Для оценки активности лекарственных средств, проводили тест Даннета путем сравнения контрольной группы эластазы (Группа B) с группами C и D. Каждый тест проводили в соответствии с двухсторонним критерием, и уровень достоверности устанавливали как 5%. Тест проводили с использованием программного обеспечения SAS (SAS Institute Japan, R8.1). Результаты показаны на фиг. 1.
Измеренный линейный отрезок составил 152,5±14,7 мкм в группе B, при 115,2±17,3 мкм в группе C и 81,7±20,4 мкм в группе D. Существенная ингибирующая активность была продемонстрирована в соответствии с дозировкой адипонектина (среднее ± S.D., P<0,05). В группе A линейный отрезок составил 73,0±6,6 мкм.
Результаты выявили, что непрерывное легочное введение адипонектина имеет дозозависимую активность уменьшения увеличения среднего линейного отрезка, вызванного обработкой эластазой.
В частности было подтверждено, что непрерывное введение адипонектина подавляло увеличение воздушного пространства альвеол, вызванное прогрессирующими деструктивными изменениями стенок альвеол.
На фиг. 2 показаны сечения тканей, которые демонстрируют прогрессирующие деструктивные изменения стенок альвеол. Это выявило, что прогрессирующая деструкция стенок альвеол в группах, получавших непрерывное введение адипонектина (группы C и D) очевидно ингибировалась в большей степени, чем таковая в контрольной группе (группа B), и такая ингибирующая активность была больше в группе D.
В частности, было подтверждено, что непрерывное введение адипонектина подавляло развитие деструктивных изменений стенок альвеол.