Способ снижения токсичности криоконсервирующего раствора на основе диметилсульфоксида после размораживания гемопоэтических стволовых клеток
METHOD FOR REDUCING TOXICITY OF CRYOPRESERVATION SOLUTION BASED ON DIMETHYL SULFOXIDE AFTER THAWING OF HEMATOPOIETIC STEM CELLS

Изобретение относится к медицине, в частности к клинической трансфузиологии. Решение вопросов долгосрочного хранения клеток крови в условиях низких и ультранизких температур стало возможным при введении в биологические системы криопротекторов - веществ, которые обладают способностью предупреждать повреждение биологических объектов и обеспечивать их сохранность в жизнеспособном и функционально полноценном состоянии после замораживания-отогревания. С 2003 г. при криоконсервировании трансплантационного материала начал применяться высокоочищенный диметилсульфоксид (ДМСО) в конечной концентрации 5,0-7,5%. [1] Наиболее эффективной для криоконсервации гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) и применения в клинической практике признана 10% концентрация ДМСО. Замораживание ГСК до ультранизких температур считается эффективным и надежным технологическим решением, обеспечивающим долговременное хранение до трансплантации.
ДМСО относится к оксидам, представляет собой молекулу (молекулярная масса - 78,13 г/моль) со свойствами амфифильности (гидрофильная группу сульфоксида и две гидрофобные метиловые группы). Вещество является высокополярным, хорошо проникает в клетки, связывает молекулы воды в растворе посредством водородных связей, что, в свою очередь, блокирует отток воды из цитоплазмы и предотвращает дегидратацию клеток во время замораживания. При кристаллизации растворов, содержащих ДМСО, получается близкая к аморфной, мелкоячеистая структура, которая малотравматична для клеток. ДМСО относится к хладоограждающим веществам внутриклеточного типа [2]. Для компенсации токсического действия и повышения цитопротективных свойств ДМСО необходим подбор оптимальной его концентрации, обеспечивающей максимальные криопротекторные свойства при минимальном повреждающем действии на ядерные клетки крови (ЯКК). Рядом авторов проведены исследования по уменьшению конечной концентрации ДМСО [4]. В результате данных работ было показано, что снижение концентрации ниже 7-5% приводит к значительным потерям стволовых клеток, что является существенным недостатком указанного методического подхода [2, 3].
В качестве прототипа изобретения использована работа группы авторов [5], которые предлагают отмывание биоматериала от ДМСО. Для удаления криопротектора из взвеси декриоконсервированных стволовых клеток авторы используют раствор, содержащий 2,5% человеческого альбумина и 5% Декстран 40 в изотоническом растворе натрия хлорида, в объеме равном объему взвеси клеток, с последующим центрифугированием при 400 g в течении 10 мин. Затем супернатант удаляют, а осажденные клетки медленно ресуспендируют в новой порции раствора содержащего 2,5% альбумина и 5% Декстрана до объема, подходящего для инфузии пациентам. Из представленных в прототипе результатов следует, что предложенный способ обеспечивает удовлетворительные результаты сохранности клеток, однако количество жизнеспособных лейкоцитов снижается на 39%.
Предлагаемый способ снижения токсичности криоконсервирующего раствора заключается в уменьшении (минимизации) количества ДМСО, вводимого в организм реципиента при трансплантации ГСК.
Указанная цель достигается благодаря уменьшению объема концентрата ГСК и, соответственно, снижению объема криоконсерванта, а также за счет отмывания криопротектора (ДМСО) от взвеси ядерных клеток непосредственно перед введением реципиенту. Способ позволяет сохранить 87,8±13,2% жизнеспособных ГСК.
ПРИМЕР ИСПОЛЬЗОВАНИЯ СРЕДСТВА
Заявляемый способ снижения токсичности криоконсервирующего раствора на основе диметилсульфоксида после размораживания гемопоэтических стволовых клеток включает в себя несколько этапов и отличается тем, что непосредственно перед процедурой отмывания готовят смесь 10% альбумина и 6% раствора полиглюкина в соотношении 1:4. Часть полученного раствора в объеме 50 мл по магистральной трубке переводят во второй контейнер (спутник) и закрывают пластикатным зажимом, третий контейнер оставляют пустым.
В контейнер с размороженными ГСК вводят смесь альбумина и полиглюкина при соотношении ГСК к смеси 1:4 при постоянном помешивании содержимого криопакета. Строенный комплект помещают в центрифужный стакан и уравновешивают на весах «LEadCORe», затем центрифугируют при 2000 g в течение 6 минут при температуре от 4 до 6°С (центрифуга для разделения донорской крови «ROTO SILENTA 630R»).
После центрифугирования контейнер с осажденными клетками помещают в плазмоэкстрактор «ПЭК-3» для удаления надосадочного слоя. Надосадок переводят в пустой контейнер, отсоединяют и утилизируют. В полученную взвесь клеток вводят при постоянном помешивании отмывающий раствор. В результате процедуры отмывания в биопродукте происходит частичная замена криоконсервирующего раствора, содержащего ДМСО, на смесь альбумина и полиглюкина, сокращается время контакта размороженных ядросодержащих клеток (ЯСК) с внеклеточным ДМСО [4, 5].
Экспериментальные исследования выполнены на базе отделения трансфузиологии и процессинга ГСК, лабораторий клеточных технологий и клеточной и молекулярной иммунологии ФГБУН КНИИГиГЖ ФМБА России.
Оценивали общее количество лейкоцитов (до замораживания, после размораживания и отмывания). Подсчет числа жизнеспособных кроветворных клеток-предшественников проводили методом проточной цитометрии по наличию экспрессии маркера CD34. Сохранность ЯСК и ГСК определяли как соотношение абсолютного количества лейкоцитов и CD34-позитивных клеток после размораживания (отмывания) к аналогичному показателю до криоконсервирования.
9
9
6
6
9
9
6
6
9
9
Количество ЯСК до замораживания варьировало от 3,4 до 79,8×10 (медиана - 29,6×10), а содержание криоконсервированных CD34-положительных клеток - от 15,5 до 1895,5×10 (медиана - 328,1×10). После размораживания при отсутствии отмывания от криофилактика содержание ЯКК составило 5,8-76,9×10 (медиана 26,7×10), a CD34+ клеток - от 17,2 до 1226,5×10 (медиана - 107,0×10). Сохранность лейкоцитов и ГСК равнялась соответственно 91,8±7,4% и 87,8±13,2% (n=200) от их исходного уровня. В случае проведения процедуры отмывания от криофилактика размороженных ЯКК их количество составило 3,3-50,9×10 (медиана 24,5×10). Сохранность содержания лейкоцитов и ГСК равнялась соответственно 83,4±9,4% и 86,3±13,5% (n=65) от уровня до криоконсервирования. Достоверных отличий в сохранности ГСК в отсутствие и при проведении процедуры отмывания от криоконсерванта не обнаружено (р>0,05).
Несмотря на меньшую сохранность общего количества лейкоцитов, процедура удаления ДМСО не оказывает существенного влияния на сохранность ГСК, не влияет на качество получаемого трансплантационного продукта.
ЛИТЕРАТУРА
1. Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 25 июля 2003 г. №325 «О развитии клеточных технологий». - URL: http://www.rba.ru (дата обращения: 06.05.2019).
2. Kostyaev A.A., Utyomov S.V., Andreev A.A., Polezhaeva Т.V., Martusevich А.K, Isaeva N.V., Sherstnyov P.S., Vetoshkin K.A., Kalinina E.N., Knyazev M.G. A four class systematization of biocryoconservants. The first class of cold preserving solutions - endocellular cryoprotectants. Vestnik gematologii. 2016; 12 (3); 28-35. (inRuss.)].
3. Консервирование живых тканей или органов Патентообладатель А01N1/02: Лобынцева Г.С (UA) Приоритеты: публикация патента: 10.08.2004.
4. Патент RU 2563117 "Комбинированный криопротектор диметилсульфоксид/реополиглюкин" для криоконсервации стволовых клеток и способ их криоконсервации для клинического применения, авторы патента: Астрелина Т.A. (RU), Кобзева И.В RU. https://findpatent.ru/patent/256/2563117.html) 2012-2019.
5. Processing and cryopreservation of placental/umbilical cord blood for unrelated bone marrow reconstitution / P. Rubinstein, L. Dobrila, R. Rosenfield., et. al. // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 1995. - Vol. 92, №22. - P. 10119-10122.
6. Влияние отмывания криопротектора диметилсульфоксида на свойства гемопоэтических стволовых клеток трансплантационного материала / Степанов А.А., Коротаев Е.В., Бессмельцев С.С2, Рабинович В.И., Астахова Л.П., Пономарев С.А. www.medline.ru Т., 14, Гематология 25 мая 2013.
7. Сохранность количества размороженных гемопоэтических стволовых клеток после процедуры отмывания от диметилсульфоксида / К.А Ветошкин, Н.В. Минаева, Н.А. Зорина [и др.] // Трансфузиология. Тезисы IV Московской международной конференции специалистов производственной и клинической трансфузиологии. - 2018. - С. 32-34.