СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ СИНДРОМА ПОЛИКИСТОЗНЫХ ЯИЧНИКОВ НА ОСНОВАНИИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ МОДЕЛИ КРЫС ЛИНИИ WISTAR
METHOD FOR TREATMENT OF POLYCYSTIC OVARIAN SYNDROME BASED ON EXPERIMENTAL MODEL OF WISTAR RATS

Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к акушерству и гинекологии, и может быть использовано для лечения синдрома поликистозных яичников (СПЯ) на основании экспериментальной модели крыс линии Wistar.
Синдром поликистозных яичников (СПЯ) представляет собой распространенную эндокринную патологию среди женщин репродуктивного возраста, с частотой встречаемости 8-21% [Neven ACH, Laven J, Teede HJ, Boyle JA. A Summary on Polycystic Ovary Syndrome: Diagnostic Criteria, Prevalence, Clinical Manifestations, and Management According to the Latest International Guidelines. Semin. Reprod. Med. 2018; 36(1): 5-12]. Известно, что СПЯ ассоциирован с метаболическими нарушениями, резистентностью к инсулину (ИР), нарушением толерантности к глюкозе (НГТ), сахарным диабетом (СД) и значительным повышением риска развития сердечнососудистых заболеваний [Murri М, Luque-ram'irez М, Insenser MM, Ojeda-Ojeda М, Escobar-Morreale HF. Circulating markers of oxidative stress and polycystic ovary syndrome (PCOS): a systematic review and meta-analysis. Hum Reprod Update. 2013; 19(3): 268-88; Zhang J, Fan P, Liu H, Bai H, Wang Y, Zhang F. Apolipoprotein A-I and В levels, dyslipidemia and metabolic syndrome in south-west Chinese women with PCOS. Hum Reprod. 2012; 27(8): 2484-93]. Патогенез повреждающего действия нарушений углеводного обмена (гипергликемии, инсулинорезистентности) связан с инициацией полиолового пути метаболизма глюкозы, накоплением в тканях ранних и конечных продуктов гликирования (КПГ), к которым относятся продукты неферментативного гликирования и окисления белков. КПГ представляют собой гетерогенную по химическому составу группу соединений - гликотоксинов. Патологические процессы гликирования приводят к необратимому перекрестному связыванию белков, потере структуры и функции белка с последующим апоптозом клетки. Повреждающее действие КПГ проявляется как самостоятельно (рецептор-независимое), так и посредством связывания с рецепторами конечных продуктов гликирования (RAGE - receptor for advanced glycation end products). Исследования последних лет показали, что конечные продукты гликирования участвуют в патогенезе развития метаболических нарушений при СПЯ [Diamanti-Kandarakis Е, Chatzigeorgiou A, Papageorgiou Е, Koundouras D, Koutsilieris M. Advanced glycation end-products and insulin signaling in granulosa cells. Exp Biol Med (Maywood). 2016 Jul; 241 (13): 1438-45. doi: 10.1177/1535370215584937. Epub 2015 May 7. PMID: 25956684; PMCID: РМС4994916].
Известными методами лечения СПЯ являются модификация образа жизни, медикаментозная терапия, которая рассматривается в качестве первой линии - комбинированные оральные контрацептивы (КОК), метформин, а также лапароскопический дриллинг [Teede HJ, Misso ML, Costello MF, Dokras A, Laven J, Moran L, Piltonen T, Norman RJ; International PCOS Network. Recommendations from the international evidence-based guideline for the assessment and management of polycystic ovary syndrome. Fertil Steril. 2018 Aug; 110(3): 364-379]. У женщин с СПЯ, не заинтересованных в беременности, первая линия терапии - КОК с антиандрогенным эффектом с учетом приемлемости назначения контрацепции ВОЗ [World Health Organization. 2015 Quick Reference Chart for the WHO Medical Eligibility Criteria for Contraceptive Use. Adapted from Medical Eligibility Criteria for Contraceptive Use, 5th Edition 2015]. Однако следует также учитывать, что СПЯ ассоциирован с рядом сопутствующих состояний: ожирением, гиперлипидемией, артериальной гипертензией, при которых может быть противопоказано назначение КОК вследствие возможного развития осложнений. При этом показанием к лапароскопическому дриллингу является наличие бесплодия или резистентности к препаратам, используемым для стимуляции овуляции [Bordewijk ЕМ, Ng KYB, Rakic L, et al. Laparoscopic ovarian drilling for ovulation induction in women with anovulatory polycystic ovary syndrome. Cochrane Database Syst Rev 2020; 2: CD001122], но не рекомендуется прибегать к хирургическому лечению для регуляции менструального цикла и устранения гиперандрогенемии в отсутствии вышеуказанных показаний [Lepine S, Jo J, Metwally M, Cheong YC. Ovarian surgery for symptom relief in women with polycystic ovary syndrome. Cochrane Database Syst Rev. 2017; 11(11): CD009526].
В настоящее время не существует единого подхода и универсального метода лечения СПЯ, учитывая крайне полиморфную клиническую картину и выделение четырех фенотипов заболевания. Перспективным является изучение эффективности применения различных лекарственных препаратов на течение заболевания в рамках доклинических испытаний с использованием экспериментальных моделей на крысах.
Большинство экспериментальных моделей СПЯ создается на крысах с применением андрогенов. Моделирование СПЯ на крысах, по нашему мнению, является наиболее приемлемым, так как эти лабораторные животные имеют схожее течение физиологических и патологических процессов с человеком, что позволяет использовать полученные результаты исследований на животных для создания новых методов лечения данного заболевания у людей. Использование андрогенов для инициирования СПЯ обусловлено тем, что гиперандрогенемия является одним из основных критериев данного заболевания [Ota Н., Fukushima М., Maki М. Endocrinological and Histological Aspects of the Process of Polycystic Ovary Formation in the Rat Treated with Testosterone Propionate. Tohoku J. exp. Med., 1983, 140, 121-131; Wu X.Y., Li Z.L., Wu C.Y., Liu Y.M., Lin H., Wang S.H., Xiao W.F. Endocrine Traits of Polycystic Ovary Syndrome in Prenatally Androgenized Female Sprague-Dawley Rats. Endocrine Journal 2010, 57 (3), 201-209; Tyndall V., Broyde M., Sharpe R., Welsh M., Drake A.J. and McNeilly A.S. Effect of androgen treatment during foetal and/or neonatal life on ovarian function in prepubertal and adult rats. Reproduction, 2012, 143 21-33].
Известен способ лечения синдрома СПЯ на основании экспериментальной модели, в котором на модели крыс был применен метформин в качестве единственного терапевтического лекарственного средства, а также в комбинации с ресвератролом [Rencber S.F., Sema Kurnaz Ozbek S.K, Eraldemir C, Sezer Z., Kum Т., Ceylan S., Guzel E. Effect of resveratrol and metformin on ovarian reserve and ultrastructure in PCOS: an experimental study. Furat Rencber et al. Journal of Ovarian Research (2018) 11:55 https://doi.org/l0.1186/s 13048-018-0427-7]. Метформин (1,1-диметилбигуанид гидрохлорид) является сенсибилизатором инсулина, применяющийся для лечения сахарного диабета 2го типа [Kai Y., Kawano Y., Yamamoto H., Narahara H. A possible role for AMP - activated protein kinase activated by metformin and AICAR in human granulosa cells. Reprod Biol Endocrinol. 2015; 13(1): 1] и синдрома поликистозных яичников [Patel R., Shah G. Effect of metformin on clinical, metabolic and endocrine outcomes in women with polycystic ovary syndrome: a metaanalysis of randomized controlled trials. Curr Med Res Opin. 2017: 1-13]. В ходе применения метформина как основного лекарственного средства, либо в комбинации с ресвератролом, было отмечено снижение массы тела крыс, а также нормализация морфологии яичников. На фоне применения только ресвератрола достоверных изменений авторами выявлено не было. Применение метформина в экспериментальной модели было взято нами за прототип.
Однако в клинической практике при применении метформина следует помнить о наличии часто встречающихся побочных эффектов в виде диспептических явлений.
Следовательно, необходимо дальнейшее изучение патогенеза СПЯ с разработкой альтернативных методов патогенетически обоснованной терапии.
Техническим результатом изобретения является расширение арсенала лекарственных препаратов, используемых для терапии СПЯ, возможность использования природного фитоалексина ресвератрола, восстановление эстрального цикла, снижение массы тела, нормализация морфологической структуры яичников - достоверное уменьшение кистозных изменений, увеличение слоя гранулярных клеток, а также, появление ооцитов (преимущественно при использовании дозировки ресвератрола 30 мг/кг/сут).
Указанный технический результат достигается в способе лечения СПЯ на основании экспериментальной модели крыс линии Wistar, в котором на гистологически подтвержденной экспериментальной модели лекарственно индуцированного СПЯ, сформированной с применением летрозола в дозировке 400 мкг/сут или 800 мкг/сут в течение 60 дней, выполняют пероральное введение природного фитоалексина ресвератрола в дозировке соответственно 30 мг/кг/сут или 20 мг/кг/сут в течение 30 дней.
Способ иллюстрируется фиг. 1-3, где:
на фиг. 1 - морфологические изменения в яичнике крысы линии Wistar на фоне применения летрозола: кистозное изменение фолликулов, уплощение слоя гранулярных клеток, отсутствие ооцитов, Г-Э, ×500 мкм;
на фиг. 2 - морфология яичников крыс контрольной группы, Г-Э ×500 мкм;
на фиг. 3 - увеличение слоя гранулярных клеток, появление ооцитов после терапии ресвератролом у крыс с синдромом поликистозных яичников, Г-Э ×500 мкм.
Для гистологического подтверждения формирования модели СПЯ выполнялась односторонняя овариоэктомия. При этом после проведения хирургического вмешательства в первые 4 дня от момента операции с целью профилактики послеоперационных осложнений внутримышечно вводился антибактериальный препарат - цефтриаксон 100 мг/кг два раза в сутки и нестероидный противовоспалительный препарат - кетопрофен 40 мг/кг два раза в сутки. Кроме того, до начала эксперимента, а также спустя 60 дней от начала ежедневного применения неселективного ингибитора ароматазы-летрозола, всем крысам проводился забор крови из периферической части хвоста для определения уровня растворимых рецепторов конечных продуктов гликирования (sRAGE).
После получения гистологического подтверждения формирования модели СПЯ в течение 30 дней выполняют пероральное введение раствора природного фитоалексина - ресвератрола в дозировке 20 мг/кг/сут и 30 мг/кг/сут. Затем, по истечении 30 дней проводится повторное оперативное вмешательство, овариоэтомия.
Изофлавон ресвератрол (транс-3,4',5-тригидроксистильбен) может быть выделен из кожуры винограда и ряда других продуктов, включая шелковицу и цветы некоторых растений [I В, Shi С, Meng J, et al. Resveratrol alleviates ethanol-induced neuroinflammation in vivo and in vitro: involvement of TLR2-MyD88-NF-jB pathway. Int J Biochem Cell Biol. 2018; 103: 56-64; Gao Y, Kang L, Li C, et al. Resveratrol ameliorates diabetes-induced cardiac dysfunction through AT1R-ERK/p38 МАРК signaling pathway. Cardiovasc. Toxicol. 2016; 16(2): 130-137]. Согласно литературным данным, ресвератрол обладает противовоспалительной, антидиабетической активностью [Guo S, Yao Q, Ke Z, et al. Resveratrol attenuates high glucoseinduced oxidative stress and cardiomyocyte apoptosis through AMPK. Mol Cell Endocrinol. 2015; 412: 85-94], а также, способен индуцировать [Harati K, Slodnik P, Chromik AM, et al. Resveratrol induces apoptosis and alters gene expression in human fibrosarcoma cells. Anticancer Res. 2015; 35(2): 767-774; Wu XP, Xiong M, Xu CS, et al. Resveratrol induces apoptosis of human chronic myelogenous leukemia cells in vitro through p38 and JNK-regulated H2AX phosphorylation. Acta Pharmacol Sin. 2015; 36(3): 353-361], либо ингибировать [Singh CK, Kumar A, Hitchcock DB, et al. Resveratrol prevents embryonic oxidative stress and apoptosis associated with diabetic embryopathy and improves glucose and lipid profile of diabetic dam. Mol Nutr Food Res. 2011; 55(8): 1186-1196; MacCarrone M, Lorenzon T, Guerrieri P, et al. Resveratrol prevents apoptosis in K562 cells by inhibiting lipoxygenase and cyclooxygenase activity. Eur J Biochem. 1999; 265(1): 27-34] апоптоз.
Заявляемый способ основан на экспериментальных исследованиях на 24 самках крыс линии Wistar. Все лабораторные животные были выведены в ФГУП Питомник лабораторных животных «Рапполово» и содержались в регламентированных условиях вивария при соблюдении всех правил содержания лабораторных животных (время и порядок проведения карантина, маркировка всех особей, постоянный санитарный контроль, стандартный рацион питания, свободный доступ к воде и пище, автоматический режим освещения «день/ночь»). Уход за животными и проведение экспериментов осуществлялись согласно основным морально-этическим принципам проведения биомедицинских экспериментов на животных, сформулированных в следующих документах: «Правила лабораторной практики в РФ» утвержденные приказом Министерства Здравоохранения РФ №199н от 01.04.2016 г. «Об утверждении правил надлежащей лабораторной практики» и Европейской конвенции от 22.09.2010 г.
Исследование включало 2 этапа.
Проведена рандомизация крыс, сформировано 3 группы: 1-ая, получающая нестероидный ингибитор ароматазы летрозол в дозировке 800 мкг/сут (n=11); 2-ая, получающая нестероидный ингибитор ароматазы летрозол в дозировке 400 мкг/сут (n=9); 3-я - контрольная, получающая физиологический раствор перорально (n=4).
На первом этапе эксперимента было проведено формирование модели синдрома поликистозных яичников у крыс линии Wistar, имеющих средний вес 203,67±12,3 грамм, с пероральным применением нестероидного ингибитора ароматазы - летрозола в дозировке 400 и 800 мкг/сут в течение 60 дней. Включение самок крыс в эксперимент проводилось в фазу эструса, затем, на протяжении 2х месяцев, исследовалась вагинальная цитология мазков крыс, показавшая нерегулярную эстральную цикличность на фоне применения ингибиторов ароматазы, тем самым подтверждая успешное моделирование синдрома поликистозных яичников. Появление нерегулярной эстральной цикличности рассматривается как фактор, свидетельствующий о формировании СПЯ на основании литературных данных [Furat Rencber, S., Kurnaz Ozbek, S., Eraldemir, C, Sezer, Z., Kum, Т., Ceylan, S., & Guzel, E. (2018). Effect of resveratrol and metformin on ovarian reserve and ultrastructure in PCOS: an experimental study. Journal of Ovarian Research, 11(1). doi:10.1186/sl3048-018-0427-7]. Кроме того, было отмечено достоверное повышение веса тела крыс, получающих летрозол в сравнении с группой контроля (287,24±12,12 грамм - при приеме 800 мкг/сут; 268,75±32.27 грамм - при приеме 400 мкг/сут и 210,00±15,81 грамм, р<0,05 соответственно), также вес крыс был достоверно выше, чем на этапе до начала приема летрозола (287,24±12,12 грамм - при приеме 800 мкг/сут; 268,75±32.27 грамм - при приеме 400 мкг/сут и 203,45±11,35 грамм, р<0,05). Также, нами были исследованы уровни растворимых рецепторов конечных продуктов гликирования (sRAGE) в периферической крови крыс методом иммуноферментного анализа с помощью тест-системы RayBio Rat RAGE ELISA Kit, США. Забор крови проводился из периферической части хвоста до начала эксперимента, а также после окончания введения нестероидного ингибитора ароматазы летрозола. Уровень sRAGE в периферической крови крыс при приеме летрозола был достоверно ниже (464,17±14,96 пг/мл при приеме 800 мкг/сут и 462,27±12,92 пг/мл при приеме 400 мкг/сут), чем в контрольной группе (897,5±98,45 пг/мл), а также, чем в группе до приема ингибитора ароматазы (733,8±198.35 пг/мл), р<0,05. Данные результаты также свидетельствуют об успешном формировании модели синдрома поликистозных яичников.
По истечении 60 дней от начала приема ингибитора ароматазы, для подтверждения формирования модели СПЯ проводилось хирургическое вмешательство. Операции выполнялись под общей анестезией животных с использованием золазепама гидрохлорида 100 в дозировке 30 мг/кг внутримышечно. После освобождения места хирургического доступа от шерстяного покрова с помощью химического средства депиляции («Veet»), выполнялась лапаротомия с последующей левосторонней овариоэктомией. В первые 4 дня от момента операции с целью профилактики послеоперационных осложнений внутримышечно вводился антибактериальный препарат - цефтриаксон 100 мг/кг один раз в сутки и нестероидный противовоспалительный препарат - кетопрофен 40 мг/кг два раза в сутки.
Полученный материал подвергался фиксации в 10% нейтральном забуференном формалине. Материал окрашивали гематоксилином и эозином, затем с помощью световой микроскопии оценивали изменение морфологии яичников в виде кистозно-измененных фолликулов и уменьшения слоя гранулярных клеток. Световую микроскопию проводили на микроскопе Olympus СХ31 (Olympus, Япония) при увеличении ×200, ×500.
Были исследованы образцы яичников крыс после применения ингибиторов ароматазы, а также контрольной группы. Морфологические изменения структуры яичников были выявлены в 18 (90%) образцах яичников крыс, принимающих летрозол. В 2 образцах яичников крыс, получающих дозировку летрозола 400 мкг/сут, морфологические изменения структуры обнаружены не были (фиг. 1). В исследуемых образцах контрольной группы наблюдалось наличие ооцитов, увеличение слоя гранулярных клеток, а также отсутствие кистозных изменений фолликулов (фиг. 2).
Второй этап заключался в терапии СПЯ на экспериментальной модели крыс линии Wistar с применением природного фитоалексина-ресвератрола.
После подтверждения формирования модели и оценки морфологических изменений структуры яичников (n=18) была проведена рандомизация крыс. В ходе рандомизации было сформировано 3 группы: в 1ую группу вошли животные с СПЯ, получающие раствор природного фитоалексина ресвератрола в дозировке 30 мг/кг/сут (n=8); во 2ую группу - крысы со сформированным СПЯ, получающие раствор природного фитоалексина ресвератрола в дозировке 20 мг/кг/сут (n=6); в 3-ю группу - сравнения, были включены животные с СПЯ, получающие физиологический раствор перорально (n=4). Терапия ресвератролом проводилась в течение 30 дней, по истечении которых животные выводились из эксперимента. После вскрытия проводилась визуальная оценка морфологических изменений яичников, выполняли правостороннюю овариоэктомию. Материал фиксировали в нейтральном 10%-ом растворе формалина для последующего гистологического исследования.
Проведено гистологическое исследование образцов яичников крыс, получивших ресвератрол, а также животных из группы сравнения.
При исследовании образцов яичников крыс группы сравнения наблюдалось уплощение слоя гранулярных клеток, а также наличие кистозно-измененных фолликулов.
В исследованиях образцов яичников групп животных (после терапии ресвератролом) отмечено достоверное уменьшение кистозных изменений, увеличение слоя гранулярных клеток, появление ооцитов в 87,5% случаев у самок крыс (n=7), получающих ресвератрол в дозировке 30 мг/кг/сут, и в 66,7% случаев у самок крыс (n=5), получающих препарат в дозировке 20 мг/кг/сут (фиг. 3).
Полученные результаты продемонстрировали дозозависимую эффективность применения природного фитоалексина ресвератрола в терапии лекарственно-индуцированного синдрома поликистозных яичников на основании экспериментальной модели у крыс. Представленные данные являются основанием продолжения дальнейших экспериментальных исследований с целью оценки наиболее эффективных минимальных доз, длительности терапии, а также возможности применения ресвератрола в клинической практике у пациенток с СПЯ.
Пример осуществления способа.
При заборе мазков у крыс №5 и №12 весом 200 и 196 грамм была подтверждена фаза эструса. Был произведен забор крови из периферического отдела хвоста для определения уровня растворимых рецепторов конечных продуктов гликирования (610 пг/мл у крысы №5 и 500 пг/мл - крыса №12), затем, в течение 60 дней крыса №5 получала 800 мкг/сут неселективного ингибитора ароматазы летрозола, крыса №12 получала 400 мкг/сут вышеуказанного лекарственного средства. В течение 60 дней крысам также проводился забор мазков для определения изменений астрального цикла - наблюдалась нерегулярная эстральная цикличность, 1 раз в неделю проводилось измерение веса - отмечено достоверное его увеличение крыс (285 грамм - крыса №5 и 290 грамм - крыса №12) на фоне применения неселективного ингибитора ароматазы летрозола. По истечении 60 дней крысам произведен забор крови из периферической части хвоста для определения уровня растворимых рецепторов конечных продуктов гликирования (крыса №5 - 470 пг/мл; крыса №12 - 438 пг/мл), затем, после анестезии животных и подготовки операционного поля, выполнена лапаротомия с помощью срединного вертикального разреза. Далее произведена визуальная оценка морфологии яичников, выполнена левосторонняя овариоэтомия. Следующие 4 суток после операции для профилактики осложнений вводился цефтриаксон 9 ЕД, используя инсулиновый шприц на 100 ЕД-1 мл, кетопрофен 40 ЕД два раза в сутки. Затем, после получения гистологического подтверждения создания модели синдрома поликистозных яичников, в течение 30 дней животным вводился раствор природного фитоалексина рествератрола в дозировке: крысе №5-30 мг/кг/сут, крысе №12- 20 мг/кг/сут. Далее, в течение 30 дней применения лекарственного средства у крыс исследовалась вагинальная цитология на предмет регулярности эстрального цикла, а также 1 раз в неделю проводилось измерение веса тела крыс. Спустя 30 дней крысы выводились из эксперимента, для оценки эффективности применения ресвератрола в отношении изменения морфологии яичников проводилась лапаротомия, правосторонняя овариоэктомия. По результатам гистологического исследования отмечено достоверное уменьшение кистозных изменений, увеличение слоя гранулярных клеток, появление ооцитов.
Заявляемый способ расширяет арсенал лекарственных препаратов для терапии синдрома поликистозных яичников, позволяет изучить эффективность применения ресвератрола в качестве лекарственного препарата для лечения данного синдрома, улучшить персонификацию лечения заболевания, проводить исследования в отношении оценки наиболее эффективных минимальных доз, длительности терапии, а также возможности применения ресвератрола в клинической практике у пациенток с синдромом поликистозных яичников.