ДРОЖЖЕВЫЕ БЕЛКИ
YEAST PROTEINS

Настоящее изобретение относится к области белков, происходящих из микроорганизмов, а более конкретно, полученных из дрожжей, которые могут широко использоваться в питании, здоровье и благополучии человека и животных.
ЦИТИРОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА
Белки представляют собой главный компонент тканей человека и животных. С точки зрения питания белки гидролизуются протеазами и пептидазами до пептидов и аминокислот. Аминокислоты обеспечивают организм необходимыми элементами, такими как азот, углеводы и сера. Организм не фиксирует минеральный азот для включения его в органические молекулы: поэтому азот обеспечивается аминокислотами. Серосодержащие аминокислоты обеспечивают серу, важную для обмена веществ. Аминокислоты также являются важными элементами для синтеза белков, пептидов и веществ с низкой молекулярной массой, которые являются физиологически важными, таких как глутатион, креатин, дофамин, серотонин и т. д. Потребности в белке для питания людей и животных растут соответственно с увеличением населения мира. Следовательно, существует необходимость в поиске дополнительных и/или альтернативных источников белка для белков животного происхождения. Белки уже получают из растений (злаки, бобовые) или насекомых. Получение белков микробного происхождения зависит от механизмов ферментации, которые известны веками. Микробные белки являются либо компонентами всей клетки или клеточной стенки, либо выделенными белками. Одним из недостатков белков микробного происхождения для питания человека является содержание нуклеиновых кислот в изолятах. Это содержание должно быть низким, потому что одним из конечных продуктов метаболизма нуклеиновых кислот является мочевая кислота, которую человеческий организм не может расщепить из-за недостатка фермента уриказы, необходимого для ее катаболизма. Другими недостатками являются, например, выход экстракции или чистота белков, полученных путем выделения из микроорганизмов.
После лизиса клеток, например, дрожжевых клеток, белки обычно выделяются в «благородной» фазе, то есть в растворимой фазе, которая соответствует дрожжевым экстрактам и содержит соединения с превосходным вкусом. Однако вкус может быть недостатком в зависимости от предполагаемого применения полученного белкового экстракта.
Три патента одной и той же группы касаются получения концентрированных белков экстрактов.
Патент US 3867555 раскрывает способ, позволяющий получать белковые экстракты с низким содержанием нуклеиновых кислот. Клетки разрушаются механически (высокое давление, ультразвук) или химически (автолиз, внешние ферменты), так что белки остаются в растворимой фракции. Однако эти белки смешиваются с результатом гидролиза, то есть с аминокислотами, пептидами и полисахаридами или простыми сахарами. После центрифугирования для отделения и удаления нерастворимой фракции белки осаждаются, и щелочная обработка обеспечивает гидролиз нуклеиновых кислот, которые впоследствии удаляются фильтрацией. Однако общий выход «негидролизованных» белков низкий.
Патент US 3887431 раскрывает использование эндогенной нуклеазы, обнаруженной в растворимой фракции после лизиса дрожжей, для разложения нуклеиновых кислот. Стадия вакуумного концентрирования позволяет получить как концентрированный белковый экстракт, так и продукт, имеющий слабый вкус и запах.
Патент US3991215 раскрывает способ, при котором после разрыва клетки к растворимой цитоплазматической фракции применяют нагревание ультравысокой температуры, что позволяет получить богатый белком экстракт с небольшим количеством нуклеиновых кислот.
Наконец, можно следовать нескольким направлениям для улучшения методов выделения белков из микроорганизмов с целью получения более высокой чистоты, лучшего выхода и/или белковых экстрактов, которые можно использовать непосредственно для питания или в качестве пищевых добавок.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Вопреки направлению, принятому в традиционных методах, авторы изобретения разработали способ выделения белков микроорганизмов из нерастворимой фракции, полученной после лизиса указанных микроорганизмов. Этот новый способ позволяет получать концентрированные экстракты негидролизованных белков с низким содержанием нуклеиновых кислот, ароматом и запахом и с хорошим выходом.
Способ по настоящему изобретению начинается с лизиса клеток, предпочтительно путем термического плазмолиза, который приводит к инактивации ферментов микроорганизмов и высвобождению в среду свободных аминокислот, включая глутаминовую кислоту. Их подвергают воздействию фермента типа глюканазы и фермента типа рибонуклеазы с последующим разделением, после которого нерастворимая фракция представляет интересующий продукт, имеющий содержание истинных белков, составляющее по меньшей мере 72%. В другом варианте осуществления изобретения первое разделение проводят после фазы термического плазмолиза, и только нерастворимая фракция, содержащая белки, полисахариды и РНК, подвергается действию глюканазы и рибонуклеазы, а затем снова разделяется для сохранения богатой белком нерастворимой фракции.
Полученный белковый экстракт не имеет вкуса и запаха и содержит мало нуклеиновых кислот.
2
Белковый экстракт, все еще содержащий липиды, полученные из мембраны, может быть делипидирован методами, известными специалистам в данной области, такими как экстракция растворителем типа гексана или этанола, сверхкритическим CO или путем обработки липазами или фосфолипазами с последующим отделением от солюбилизированной фазы.
Полученные белки могут быть использованы непосредственно для питания, пищевых добавок и т. д.
ОПРЕДЕЛЕНИЯ
Saccharomyces, Candida, Pichia, Kluyveromyces
Под микроорганизмом подразумевается живой организм, невидимый невооруженным глазом, но видимый под микроскопом. В настоящем изобретении микроорганизмы предпочтительно представляют собой бактерии (прокариотические микроорганизмы) или дрожжи (эукариотические микроорганизмы). Дрожжи в единственном или множественном числе - это общий термин, обозначающий эукариотические микроорганизмы, способные вызывать ферментацию органических веществ. Среди дрожжей неисчерпывающим образом упоминаются дрожжи рода .
Дрожжевая суспензия означает суспензию дрожжей, полученную после размножения в сосуде и после центрифугирования, позволяющую отделить указанную суспензию от окружающей жидкости, также называемой суслом. Размножение также можно назвать культурой или, в более широком смысле, ферментацией.
Белки представляют собой макромолекулы, состоящие из последовательности аминокислот, связанных вместе пептидными связями. Они входят в число главных основных компонентов всех клеток животных и растений. Они составляют до 50% сухого веса живого организма и составляют от 15 до 20% нашей суточной потребляемой энергии. Пища и белки организма являются основными источниками азота и аминокислот, которые выполняют несколько основных метаболических функций: они являются субстратами синтеза белка, предшественниками важных азотсодержащих соединений в организме (нуклеиновые кислоты, монооксид азота, глутатион и т. д.) и субстратами энергетического обмена.
В целом, в агропродовольственных товарах под содержанием белка считается уровень азота, умноженный на 6,25 (коэффициент 6,25 получается из среднего содержания азота в белке, которое составляет 100/6,25, т.е. 16%). Под истинными белками подразумевается содержание белка, близкое к реальному, с поправкой на смещение, вызванное небелковым азотом, например азот нуклеиновых кислот. Таким образом, можно сказать, что содержание истинных белков представляет собой общий азот за вычетом азота нуклеиновых кислот и аммиачного азота, умноженный на 6,25. Альтернативно, содержание истинных белков можно оценить с помощью анализа общего количества аминокислот. Под интактными нативными белками подразумеваются белки микроорганизма в том состоянии, в котором они находятся в живом микроорганизме. По сути, денатурированные нативные белки имеют потенциально измененную пространственную конформацию за счет фолдинга или коагуляции. Белки также могут быть частично или полностью гидролизованы.
Под плазмолизом подразумевается нарушение непроницаемости микроорганизма, предпочтительно дрожжей, или его компартментного аспекта. Далее происходит потеря воды из-за проницаемости мембраны.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ И ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
На Фигуре 1 показаны два основных варианта осуществления способа по изобретению. На фигуре 1A показан способ, в котором нет стадии разделения между плазмолизом и ферментативным гидролизом. На Фигуре 1B показан способ, в котором разделение проводят после стадии плазмолиза, и где ферментативный гидролиз проводят на нерастворимой фракции, полученной в результате этого разделения.
На Фигуре 2 представлены соответствующие профили белков белкового экстракта, полученного способом по изобретению, и так называемого традиционного белкового экстракта, полученного с помощью известного способа экстракции белков из растворимой фракции, полученной на стадии плазмолиза.
Saccharomyces, Pichia, Candida, Kluyveromyces, Yarrowia или Wickerhamomyces
Saccharomyces cerevisiae, Pichia jadinii
Candida utilis), Pichia pastoris, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus, Yarrowia lipolytica, Wickerhamomyces anomalus
Способ по настоящему изобретению можно применять к любому типу дрожжей, более конкретно к любым дрожжам, имеющим базовое применение в питании человека или животных. С промышленной точки зрения, способ согласно изобретению реализуется на дрожжевой суспензии, такой как определено выше, то есть на суспензии дрожжей. Предпочтительно дрожжи выбирают из дрожжей рода . Более предпочтительно дрожжи выбирают из  (также называемого  и т. д. Эти дрожжи содержат от 6 до 11% азота. Азот измеряется методом Кьельдаля, известным специалистам. Как указано выше, истинное содержание белка экстраполировано из этого анализа азота с использованием коэффициента множителя 6,25.
Культивирование дрожжей осуществляется известными специалистам методами. Один протокол описан в справочной работе «Yeast technology» Gerald Reed and Tilak W. Nagodawithana (ISBN 0-442-31892-8), 284-293. Указанная культура, также называемая биомассой, собирается центрифугированием или фильтрацией и может быть промыта. Получается дрожжевая суспензия.
Затем клетки подвергаются механическому или химическому разрушению с использованием известных методов, таких как гомогенизация под высоким давлением, механическое измельчение, ультразвуковая дезинтеграция, повторяющиеся циклы замораживания-оттаивания, осмотический шок или ферментативный лизис. В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения дрожжи подвергают термическому плазмолизу при температуре от 70 до 95°C в зависимости от типа дрожжей. Температура предпочтительно составляет от 80 до 90 °C. Специалист в данной области может отрегулировать температуру и/или время лизиса, например, в зависимости от устойчивости клеток и/или ферментов на этой стадии желательна инактивация. Время составляет от 30 секунд до 3 часов, до 4 часов, более предпочтительно 1 минуту, 5 минут, 10 минут, 30 минут, 45 минут, 1 час, 1 час 30 минут или 2 часа, до 3 часов, даже 4 часа. Эта стадия плазмолиза позволяет денатурировать дрожжи, инактивировать эндогенные ферменты и повысить проницаемость мембраны, обеспечивая высвобождение растворимой фракции. Растворимая фракция по существу содержит свободные аминокислоты, низкомолекулярные пептиды, минералы и, среди прочего, некоторые аминокислоты, которые влияют на вкус, например глутаминовую кислоту.
В первом варианте осуществления изобретения все количество, полученное на стадии плазмолиза и содержащее растворимую фракцию и нерастворимую фракцию, подвергается одной или более ферментативным активностям. Цель этой стадии - солюбилизировать максимальное количество компонентов, не являющихся белками, без воздействия на белки. Предпочтительно используют рибонуклеазную активность (ЕС 3.1.4.1) и глюканазную активность (ЕС 3.2.1). Ферментативные активности можно осуществлять последовательно или одновременно. Активность рибонуклеазы преобразует РНК в 5’-нуклеотиды и солюбилизирует последние, заставляя их переходить в растворимую фракцию. Можно использовать несколько рибонуклеаз, например смесь эндо- и экзонуклеаз. Необязательно, дезаминазу можно использовать для превращения AMP в IMP с целью восстановления свойства улучшения вкуса растворимой фракции. Действие одной или более глюканаз позволит солюбилизировать полисахариды стенок до растворимых олигосахаридов. Время и температура должны регулироваться в зависимости от характеристик используемых ферментов. Температура составляет от 40 до 65 °C, предпочтительно 60 °C. Время составляет от 8 до 24 часов, предпочтительно от 16 до 24 часов, более предпочтительно 18 часов. Эта ферментативная стадия, во-первых, позволяет получить новую растворимую фракцию, включающую нуклеотиды, полисахариды (примерно 60% от общего количества углеводов) и небольшую долю аминокислот, а во-вторых, нерастворимую фракцию, в основном содержащую белки.
Последняя стадия - разделение растворимой фракции и нерастворимой фракции.
Во втором варианте осуществления изобретения разделяют растворимые и нерастворимые фракции, полученные на стадии плазмолиза. Растворимая фракция откладывается, удаляется и может быть восстановлена в виде дрожжевого экстракта. Нерастворимая фракция включает оболочки (или стенки), полимеры, полисахариды, РНК и белки, коагулирующие при нагревании. Эта нерастворимая фракция сохраняется. Она подвергается ферментативной активности рибонуклеазы и глюканазы, такой как указано выше, в соответствии с аналогичным протоколом инкубации (температура, время) и разделению растворимых и нерастворимых фракций.
Конечная растворимая фракция может быть отложена и использована.
2
Конечная нерастворимая фракция, полученная в результате ферментативного расщепления, имеет содержание «истинных» белков больше или равное 70%, предпочтительно больше или равное 72%, 80% и до 85%. В целом дрожжи содержат от 50 до 55% «истинных» белков. С помощью способа по изобретению можно удалить многие элементы и получить продукт с более высокой концентрацией белка. Необязательно, количество липидов в этой нерастворимой фракции можно уменьшить либо за счет действия растворителей (этанол, гексан), либо за счет сверхкритического CO, либо за счет действия липазы или фосфолипазы. Таким образом, можно достичь истинной чистоты белка более 80%.
В одном варианте осуществления изобретения соответствующие действия рибонуклеаз и глюканаз осуществляются последовательно в любом порядке. В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения рибонуклеазная и глюканазная активности применяются одновременно.
Полученный продукт может быть лиофилизирован, высушен способом, известным специалистам, например распылительной сушкой или вакуумной сушкой, и может храниться с сохранением его качества и свойств.
Следовательно, в одном варианте осуществления изобретение относится к способу получения дрожжевых белков, включающему следующие стадии:
a) обеспечение дрожжевой суспензии;
b) воздействие на дрожжевую суспензию термического плазмолиза при температуре от 70 до 95°C в течение периода времени от 1 минуты до 3 часов, предпочтительно в течение от 40 минут до 2 часов;
c) воздействие на все количество по меньшей мере одной рибонуклеазы и одной глюканазы, последовательно или одновременно, при температуре от 40 до 65°C в течение периода времени от 8 до 24 часов;
d) разделение нерастворимой фракции и растворимой фракции,
где нерастворимая фракция, собранная на стадии d), не имеет вкуса, имеет содержание нуклеотидов менее чем 3%, и истинное содержание белка составляет по меньшей мере 72%.
В другом варианте осуществления изобретение относится к способу получения дрожжевых белков, включающему следующие стадии:
a) обеспечение дрожжевой суспензии;
b) воздействие на эту дрожжевую суспензию термического плазмолиза при температуре от 70 до 95 °С в течение периода времени от 1 минуты до 3 часов, предпочтительно от 40 минут до двух часов;
b’) разделение нерастворимой фракции и растворимой фракции;
c) воздействие на нерастворимую фракцию активности по меньшей мере одной рибонуклеазы и глюканазы, последовательно или одновременно, при температуре от 40 до 65°C в течение периода времени от 8 до 24 часов;
d) отделение нерастворимой фракции от растворимой фракции,
где нерастворимая фракция, собранная на стадии d), не имеет вкуса, имеет содержание нуклеотидов менее чем 3% и содержание истинного белка, составляющее по меньшей мере 72%.
В остальной части настоящего описания нерастворимая фракция, собранная на стадии d), также может называться «(дрожжевым) белковым экстрактом по изобретению». Напротив, экстракт дрожжевых белков, полученный известным способом из растворимой фракции, полученной в результате плазмолиза, можно назвать «традиционным белковым экстрактом».
Saccharomyces cerevisiae, Pichia
Pichia jadinii, Kluyveromyces
Kluyveromyces marxianusor Kluyveromyces lactis, Yarrowia
Yarrowia lipomoltichamomyces
Wickrowia lipomergyhamomyces
Saccharomyces cerevisiae, Pichia jadinii
Kluyveromyces marxianus
Saccharomyces cerevisiae
В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения дрожжевую суспензию на стадии а) получают в результате ферментации дрожжей, выбранных из , предпочтительно , предпочтительно , предпочтительно , или . Преимущественно дрожжи выбирают из  или . Предпочтительными дрожжами являются .
В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения стадия термического плазмолиза а) проводится при температуре от 80 до 90 °C.
В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения глюканазная и рибонуклеазная активности применяются одновременно.
Необязательно также может применяться дезаминазная активность.
Преимущественно дрожжевая суспензия, используемая на стадии а), содержит дрожжи, обогащенные селеном. Культивирование дрожжей, обогащенных селеном, можно проводить по методу, известному специалистам в данной области, например, по методу, описанному в заявке EP 1478732. В этом случае содержание селена в дрожжевой культуре может достигать 3000 м.д. или даже выше.
Продукт, полученный в нерастворимой фракции, имеет исключительно азот белкового происхождения в количестве выше или равном 11,5% сухого вещества, т. е. 72% истинных белков (используя коэффициент превращения 6,25, приведенный выше). Обычно дрожжи имеют максимальное содержание азота 11%, что дает 69% потенциальных белков. Дрожжи также содержат небелковый азотный материал (нуклеиновые кислоты, РНК, ДНК). При вычитании азота нуклеиновых кислот из общего азота дрожжи содержат только от 50 до 55% белков. Следовательно, минимальное содержание 72% белков, полученных в конечной нерастворимой фракции, является характеристикой способа по изобретению. В этой же нерастворимой фракции общее содержание нуклеотидов составляет от 0,8 до 1,5% и до 3%, общее содержание углеводов составляет от 1 до 8% (антроновый анализ, известный специалистам в данной области), с соответствующим содержанием от 0,2 до 4% для глюканов, от 0,2 до 4% для маннанов, от 7 до 15% для липидов, от 1 до 7% для минеральных веществ.
Было бы интересно провести различие между экстрактом дрожжевого белка, полученным способом по изобретению, и экстрактом согласно предшествующему уровню техники, а именно экстрактом белка, полученным из растворимой фракции после стадии лизиса и концентрирования клеток, который будет иметь содержание белка, составляющее по меньшей мере 72% и, возможно, содержание нуклеотидов менее чем 3%.
Saccharomyces cerevisiae
Для этой цели суммарные липиды анализировали на белковых экстрактах, полученных из , с использованием гравиметрического метода после кислотного гидролиза и экстракции гексаном на аппарате Сокслета. Уровень липидов был систематически выше чем 7%. Таким образом, нерастворимая фракция, собранная на стадии d) в способе экстракции по изобретению имеет содержание липидов выше чем 7%. Для сравнения, в «традиционном» экстракте дрожжевых белков содержание липидов составляет ниже чем 1%. Содержание липидов может различаться в зависимости от вида или штамма дрожжей. Как правило, для промышленного продукта исходный микроорганизм указывается в техническом паспорте. Специалисты в данной области смогут экстраполировать и вывести комбинацию видов/содержания липидов в белковом экстракте.
Для экстракта дрожжевого белка по изобретению, подвергнутого стадии делипидирования, содержание липидов может быть недостаточным, чтобы различить два происхождения. Затем сравнительный анализ можно завершить путем оценки профиля растворимости белка в белковом экстракте. Процент растворимости определяется по следующему уравнению:
где N% обозначает процентное содержание азота, определяемое по методу Кьельдаля.
Растворимость белкового экстракта по настоящему изобретению составляет менее чем 3,5% в воде.
Для сравнения, «традиционный» экстракт дрожжевых белков считается растворимым и содержит только от 5 до 10% нерастворимых элементов.
С той же целью сравнивали профили молекулярной массы между экстрактом дрожжевого белка по изобретению и экстрактом белка из предшествующего уровня техники. У экстракта дрожжевого белка, полученного согласно изобретению, отсутствует пик с низкой молекулярной массой. Большая часть белкового профиля распределяется около 40-45 кДа. Наименьшие соединения обнаруживаются при примерно 500 Да, что соответствует низкомолекулярным пептидам. Для сравнения, профиль «традиционного» дрожжевого белка демонстрирует несколько пиков молекулярной массы и существенное количество для низкомолекулярных масс. Эти профили можно экстраполировать и измерить соотношение:
(аминокислоты, проанализированные традиционным методом определения аминокислот в продуктах питания, например, официальным методом Регламента Комиссии (ЕС) № 152/2009). Это соотношение близко к 1, всегда выше 0,9 для экстракта дрожжевого белка по изобретению, тогда как оно может составлять от 0,30 до 0,85 для «традиционных» экстрактов дрожжевого белка.
Продукт, полученный способом по изобретению, отличается от известных белковых экстрактов своим микробным происхождением, другими словами, он не растительный и не животный, своим высоким содержанием белка, низким содержанием нуклеиновых кислот и остаточным присутствием липидов клеточной мембраны, если не применяется делипидирующая обработка. Кроме того, он не имеет вкуса. Его микробное происхождение также имеет то преимущество, что он получено из сырья, которое, как известно, не является аллергенным.
Основным преимуществом дрожжевых белков является их питательность. Таким образом, продукт, полученный способом по настоящему изобретению, является источником белков, который имеет одно главное преимущество: его качество, представленное шкалой PDCAAS (оценка аминокислот с поправкой на усвояемость белков), соответствует 1, то есть аналогично показателям контрольного животного белка, такого как казеин и овальбумин. Оценка качества белка позволяет определить его способность удовлетворять метаболическим потребностям. В результате любое применение, связанное с питанием и пищевыми добавками, или спортивными добавками, может использовать белковый экстракт, полученный способом по изобретению. Применения, приведенные в настоящем описании заявки, не являются всеобъемлющими.
В контексте питания, здоровья и благополучия человека указанный белковый экстракт можно использовать для контроля веса, в качестве добавки для спортсменов или пожилых людей, в качестве пищевой добавки или в форме батончика или напитка с высоким содержанием белка. Например, указанный белковый экстракт можно использовать в качестве источника неживотного белка для диет веганского типа, например, в молочных коктейлях, гамбургерах, наггетсах, мясных деликатесах на растительной основе, начинках для равиоли, фрикадельках, овсяных хлопьях, ароматизаторах для макарон. Точно так же в богатых белком хлебе или хлебопекарных изделиях можно использовать белковые экстракты, полученные способом по настоящему изобретению. Как указывалось ранее, эти белковые экстракты обладают тем преимуществом, что они не придают вкуса, горечи или привкуса, характерных для некоторых современных белков растительного происхождения или водорослей. С точки зрения здоровья человека указанный белковый экстракт можно использовать для питания младенцев или лечебного питания, то есть для перорального или энтерального питания, для устранения дисбаланса питания. Преимущественно, когда белковый экстракт получают из дрожжевой суспензии, обогащенной селеном, его можно использовать в качестве пищевой добавки, стимулирующей иммунитет и/или улучшающей качество кожи, волос и/или ногтей.
Наконец, указанный белковый экстракт можно использовать в качестве источника белка в кормах для животных. Преимущественно, когда белковый экстракт получают из дрожжевой суспензии, обогащенной селеном, животные будут иметь преимущество комбинированного поступления белков и селена, причем указанный селен является биодоступным, поскольку он интегрирован в белки в форме селенометионина.
Таким образом, изобретение также относится к применению экстракта дрожжевого белка с истинным содержанием белка, составляющим по меньшей мере 72%, полученного в соответствии с любым из вариантов осуществления способа по изобретению, в качестве пищевой добавки для контроля веса для пожилых людей или спортсменов, к использованию указанного белкового экстракта в качестве источника неживотных белков в напитках, хлебопродуктах или мясных деликатесах на растительной основе, к использованию указанного белкового экстракта в пероральном или энтеральном лечебном питании, или к использованию указанного белкового экстракт для питания животных. Другими словами, в одном варианте осуществления изобретение относится к способу дополнения питания для питания людей и/или животных, включающему стадии:
- получения экстракта дрожжевого белка путем реализации любого из вариантов осуществления способа получения дрожжевых белков согласно изобретению; и
- введения указанного белкового экстракта, соответственно, человеку в качестве пищевой добавки для контроля веса, пожилым людям или спортсменам и/или животным в качестве потребляемого белка.
Как упоминалось ранее, конечная растворимая фракция способа по изобретению также может быть отложена и использована. Благодаря высокому содержанию углеводов ее можно сравнить со сладким соком. Общее содержание углеводов составляет от 45 до 70%. Эти углеводы находятся в форме глюканов (от 25 до 40%) и маннанов (от 25 до 35%), что позволяет использовать эту растворимую фракцию для иммуностимуляции, в частности, для здоровья животных. В зависимости от типа используемой глюканазы также может высвобождаться свободная глюкоза. Эта растворимая фракция богата общим количеством нуклеотидов, в частности 5’-GMP и 5’-IMP, когда AMP превращается в IMP дезаминазой. Поэтому его можно использовать как усилитель вкуса. Когда AMP не превращается в IMP, продукт можно использовать для маскировки горечи или второстепенных запахов, как раскрыто в заявке на патент FR1762074. Его состав также делает его хорошим субстратом для роста различных микроорганизмов и, в частности, бактерий.
Приведенные ниже примеры могут проиллюстрировать настоящее изобретение. Их нельзя истолковывать как ограничение объема изобретения.
ПРИМЕРЫ
Saccharomyces cerevisiae
Пример 1: Приготовление концентрированного белкового экстракта (> 75%) из
Saccharomyces cerevisiae
Проводят ферментацию  в условиях, позволяющих достичь высокого содержания азота в дрожжах, около 10% сухого вещества азота. Используют разделение на центрифуге сусла этой ферментации, чтобы получить дрожжевую суспензию с содержанием дрожжей 16-18% сухого вещества, и промывают суспензию.
В лаборатории проводят термический плазмолиз 3 кг этой богатой азотом промытой суспензии: доводят температуру суспензии до температуры от 70 до 95 ° C с помощью теплообменника, затем оставляют 3 кг суспензии инкубироваться в химическом стакане, погруженном в баню с горячей водой. Оставляют суспензию перемешиваться и поддерживают температуру суспензии в стакане в течение 2 ч. Затем снижают температуру реакционной среды до 60 °C. Перенесите фракцию в колбу Эрленмейера на 500 мл. Погружают колбу Эрленмейера в баню с горячей водой, температура которой установлена на 60 °C. Добавляют следующие дозы ферментов: 0,2% (г на 100 г суспензии) смеси двух глюканаз и 0,1% смеси эндо- и экзо-рибонуклеаз. Оставляют инкубироваться 18 часов при перемешивании. Центрифугируют после инкубации. Откладывают растворимую фракцию, содержащую свободные нуклеотиды, полисахариды и небольшую часть аминокислот. Нерастворимая фракция - это экстракт дрожжевых белков. После 3 промывок она имеет следующий состав: 13,0% азота, 3% суммарных нуклеотидов и 4,7% суммарных углеводов, то есть 77% истинных белков.
Saccharomyces cerevisiae
Пример 2: Приготовление концентрированного белкового экстракта (75%) из  в соответствии с вариантом способа 1.
В варианте способа, описанном в Примере 1, после термического плазмолиза отделяют нерастворимую фракцию от супернатанта, содержащего свободные аминокислоты, центрифугированием. Нерастворимую фракцию помещают в объем водопроводной воды, эквивалентный объему отброшенного супернатанта, и снова центрифугируют. Эта операция проводится суммарно 3 раза. Наконец, извлекают 2 кг нерастворимой фракции с содержанием сухого вещества 16%, содержащей белки, полисахариды и материал нуклеиновых кислот. Переносят фракцию в 500 мл Эрленмейера. Погружают колбу Эрленмейреа в баню с горячей водой, имеющую температуру, отрегулированную до 60 °C, и применяют к ней оставшуюся часть метода, такого как описано в предыдущем примере.
В конечном итоге полученный белковый экстракт имеет следующий состав: 12. 2% азота, 1,4% суммарных нуклеотидов и 2,9% суммарных углеводов, то есть 75% истинных белков.
Saccharomyces cerevisiae
Пример 3: Приготовление концентрированного белкового экстракта (> 80%) из
Saccharomyces cerevisiae
С помощью стадий термического плазмолиза, разделения на центрифуге и промывки готовят нерастворимую фракцию , содержащую белки, полисахариды и материал нуклеиновых кислот, следуя протоколу, описанному в примере 2.
Регулируют сухой экстракт этой фракции до 14% и pH до оптимального pH ферментов. Инкубируют 200 г этой фракции при перемешивании в колбе Эрленмейера, погруженной в баню с горячей водой при 60°C в течение 18 часов в присутствии следующих доз ферментов: 0,2% очищенного жидкого препарата глюканазы и 0,1% смеси эндо и экзо-рибонуклеазы. Собирают нерастворимую фракцию центрифугированием и промывают 3 раза. Полученный белковый экстракт содержит 13,6% азота, 2,4% суммарных нуклеотидов и 4,2% суммарных углеводов, то есть 83% истинных белков.
Saccharomyces cerevisiae
Пример 4: Быстрое приготовление концентрированного белкового экстракта (75%) из
В одном из вариантов способа, описанного в Примере 2, время инкубации можно сократить до 8 часов. Полученный белковый экстракт содержит 12,5% азота, 3% суммарных нуклеотидов и 4,4% суммарных углеводов, то есть 75% истинных белков.
Saccharomyces cerevisae
Пример 5: Приготовление концентрированного белкового экстракта (80%) из
В одном из вариантов способа, описанного в Примере 2, белковый экстракт сушат перед экстракцией пятью объемами этанола, промывают, осушают и снова сушат в вакууме. Полученный белковый экстракт содержит 13,3% азота, 2% суммарных нуклеотидов и 3,1% суммарных углеводов, то есть 81% истинных белков.
Pichia jadinii
Пример 6: Приготовление концентрированного белкового экстракта из .
Pichia jadinii
Проводят ферментацию  в условиях, позволяющих достичь содержания азота в дрожжах около 9% сухого вещества. Применяют разделение на центрифуге к суслу этой ферментации, чтобы получить дрожжевую суспензию с содержанием сухого вещества 11-13%, и суспензию промывают.
Saccharomyces cerevisiae
В лаборатории выполняют термический плазмолиз 3 кг этой богатой азотом суспензии при температуре от 70 до 95°C в течение 2 часов, следуя тому же протоколу, что и для штамма . Собирают нерастворимую фракцию центрифугированием и промывают 3 раза.
Регулируют сухой экстракт этой фракции до 11-13% и pH до оптимального pH ферментов. Инкубируют 200 г этой фракции при перемешивании в колбе Эрленмейера, погруженной в баню с горячей водой при 60°C в течение 18 часов в присутствии следующих доз ферментов: 0,2% очищенного жидкого препарата глюканазы и 0,1% смеси эндо и экзо-рибонуклеазы. Собирают нерастворимую фракцию центрифугированием и промывают 3 раза. Полученный белковый экстракт содержит 12,5% азота, 3% суммарных нуклеотидов и 4,4% суммарных углеводов, то есть 75% истинных белков.
Kluyveromyces marxianus
Пример 7: Приготовление концентрированного белкового экстракта из .
Kluyveromyces marxianus
Проводят ферментацию  в условиях, позволяющих достичь содержания азота в дрожжах примерно 8% сухого вещества. Применяют разделение на центрифуге к суслу этой ферментации, чтобы получить дрожжевую суспензию, и суспензию промывают. Применяют термический плазмолиз, центрифугируют, промывают нерастворимую фракцию и инкубируют со смесью ферментов, содержащих глюканы, эндо- и экзорибонуклеазы, следуя ранее описанному протоколу. Еще раз центрифугируют и промывают нерастворимую фракцию, содержащую белки.
Полученный белковый экстракт содержит 11,8% азота, 1,3% суммарных нуклеотидов и 8,8% суммарных углеводов, то есть 72% истинных белков.
Пример 8: Анализ суммарных липидов в «нерастворимом» белковом экстракте, полученном способом по изобретению, и сравнение с содержанием липидов в «традиционном» экстракте дрожжевых белков, экстрагированном из растворимой части дрожжей после лизиса клеток в соответствии с предшествующим уровнем техники.
Используемый метод представляет собой гравиметрический метод после кислотного гидролиза и экстракции гексаном на аппарате Сокслета. Этот метод описан в Постановлении ЕС № 152/2009. Результаты представлены в Таблице 1 ниже. Из трех партий белкового экстракта, полученного согласно изобретению, эти результаты показывают содержание липидов, близкое к 10-11 г на 100 г экстракта. Для сравнения, экстракт дрожжевого белка предшествующего уровня техники, полученный из растворимой фракции лизированных дрожжей, демонстрирует содержание липидов менее чем 1 г на 100 г экстракта.
Белковый экстракт по изобретению(из нерастворимой фракции)
Белковый экстракт предшествующего уровня техники (из растворимой фракции)
партия 1
партия 2
партия 3
Суммарные липиды (г/100г)
11,2
10,8
11,1
<1
Пример 9: Определение профиля растворимости белка
На образце, полученном из партии 1 белкового экстракта согласно изобретению (см. Пример 8) профиль растворимости белка определяли при трех различных значениях pH в водном растворе и с использованием конечной концентрации белка 2% (мас./об.). После 60 минут солюбилизации при перемешивании при температуре окружающей среды супернатант собирали центрифугированием и определяли общее содержание азота в супернатанте методом Кьельдаля в соответствии со стандартом NF EN ISO 5983-2. Для каждого значения pH процент растворимости определяли по следующему уравнению:
Полученный результат был ниже чем 3,5%.
Пример 10: Определение профилей соответствующих молекулярных масс белкового экстракта по изобретению и «традиционного» белкового экстракта.
Как и во всем вышеизложенном, «белковый экстракт по изобретению» обозначает экстракт дрожжевых белков, полученный из нерастворимой фракции лизированных дрожжевых клеток. Напротив, «традиционный» экстракт дрожжевых белков »обозначает дрожжевые белки, полученные экстракцией из растворимой фракции лизированных дрожжевых клеток. Экстракцию проводят методами, известными специалистам в данной области.
Как указано в Примере 9, белковый экстракт по изобретению не растворим в водных условиях. Были разработаны специальные условия для солюбилизации и анализа с помощью эксклюзионной хроматографии. Протокол следующий (метод SEC1 на Фигуре 2):
- солюбилизация 10 мг образца в 5 мл подвижной фазы (при перемешивании в течение 48 часов при 90 ° C),
- анализ раствора, полученного на колонке Agilent PLgel, 20 мкм MIXED-A (от 2000 до 40000 000 г/моль, эквивалент PS) при 40° C.
Подвижная фаза: ДМСО/LiCl 0,25 М.
Детекторы RI (показатель преломления) и УФ (280 нм).
Метод (метод SEC2 на Фигуре 2), использованный для «традиционного» экстракта дрожжевого белка, был взят из монографии OIV (Международная организация вина и винограда):
- солюбилизация образца в воде;
- анализ на колонке SUPERDEX 200 10/300 GL (от 10000 до 600000 Да, эквивалент глобулярного белка; от 1000 до 100000 г/моль, эквивалент декстрана).
Подвижная фаза: фосфатный буфер+0,25 М NaCl, pH 7,2.
УФ-детектирование при 214, 260 и 280 нм.
Соответствующие белковые профили представлены на Фигуре 2.
Профиль экстракта дрожжевых белков по изобретению распределен около 45 кДа и не имеет пика с низкой молекулярной массой (диапазон 2-10 кДа). Для сравнения, профиль белкового экстракта «традиционных» дрожжей значительно отличается: он показывает два различных пика в диапазоне низких молекулярных масс, 2-10 кДа, и в целом профиль с пиками, которые более отличны и более широкие.
Анализ общего количества аминокислот и свободных аминокислот в соответствии с официальным методом, приведенным в Регламенте EU EC № 152/2009, также позволяет определить соотношение:
Это очень близко к 1 (или 100%) и всегда выше 0,9 (или 90%) для экстракта дрожжевых белков по изобретению (определение для 3 партий, для которых анализировали липиды в Примере 8). Обычно он составляет от 0,30 до 0,85 (от 30 до 85%) для «традиционных» экстрактов дрожжевых белков Заявителя и коммерчески доступных экстрактов.
Saccharomyces cerevisiae
Пример 11: Приготовление концентрированного белкового экстракта (> 75%) из культуры , обогащенной селеном.
Партию дрожжевой суспензии, обогащенной селеном, подвергали способу экстракции белка, описанному в Примере 1 или Примере 2. Содержание селена в этих дрожжевых сливках было близко к 3200 м. д.
Общее содержание азота в полученном белковом экстракте составило 13,5%, содержание истинных белков - 76,7%. Суммарное содержание селена составило 4750 м.д. (мг Se/кг, в сухом виде). Содержание селенометионина составило 84% (экв. Se/Se суммарного). Для сравнения: селенизированные дрожжи SelSaf3000, источник биодоступного органического селена, содержат 63% селенометионина.