Способ идентификации функционального М1 и М2 фенотипа макрофагов человека, генерированных in vitro из моноцитов крови
METHOD FOR IDENTIFYING FUNCTIONAL M1 AND M2 PHENOTYPE OF HUMAN MACROPHAGES GENERATED IN VITRO FROM BLOOD MONOCYTES

Изобретение относится к медицине и биологии, а именно клеточной иммунологии, и касается способа идентификации функционального М1 и М2 фенотипа макрофагов человека, генерированных in vitro из моноцитов крови. Предложенный способ позволяет повысить эффективность определения макрофагов человека первого и второго типа с целью их последующего использования в фундаментальных исследованиях, а также при разработке новых клеточных технологий, в том числе в области регенеративной медицины.
Макрофаги (Mϕ), являясь клетками врожденного иммунитета, выполняют в организме множество функций, что обусловлено их функциональной гетерогенностью и высокой пластичностью (Gordon S., Taylor P.R. Monocyte and macrophage heterogeneity // Nat Rev Immunol. - 2005. - V. 5. - P. 953-964). Резидентные макрофаги обнаруживаются практически во всех тканях, где они могут составлять до 10-15% от общего числа клеток. Мϕ различной тканевой локализации обозначаются, как остеокласты (кости), альвеолярные макрофаги (легкие), микроглиальные клетки (ЦНС), гистиоциты (соединительная ткань), клетки Купфера (печень) и т.д. Поскольку эти популяции характеризуются специфическими транскрипционными профилями, то их можно рассматривать как множество разных и уникальных классов Мϕ (Gautier E.L., Shay Т., Miller J., et al. Gene expression profiles and transcriptional regulatory pathways that underlie the identity and diversity of mouse tissue macrophages // Nat Immunol. - 2012. - V. 13. - P. 1118-1128). С другой стороны, основные функции макрофагов универсальны. Они играют ключевую роль в развитии тканей (формируя их архитектуру), в иммунном ответе на патогены (участвуя в запуске и разрешении воспалительной реакции), в контроле и мониторинге возможных нарушений в тканях (действуя в качестве «дозорных» и эффекторных клеток), и особенно, в поддержании тканевого гомеостаза (путем фагоцитоза апоптотических или стареющих клеток, а также участвуя в процессах ремоделирования и репарации тканей).
Пул резидентных Мϕ может пополняться за счет дифференцировки циркулирующих моноцитов при их попадании в ткани из кровотока. Макрофагальный колониестимулирующий фактор (M-CSF) и гранулоцитарномакрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) являются основными регуляторами дифференцировки моноцитов в макрофаги. При этом M-CSF стимулирует дифференцировку моноцитов в Мϕ, характеризующиеся М2/противовоспалительным фенотипом (про-М2 клетки), тогда как GM-CSF индуцирует дифференцировку моноцитов в Мϕ с М1/провоспалительным фенотипом (про-М1 клетки) (Jaguin М., Houlbert N., Fardel О., Lecureur V. Polarization profiles of human M-CSF-generated macrophages and comparison of M1-markers in classically activated macrophages from GM-CSF and M-CSF origin // Cell. Immunol. - 2013. -V. 281. - P. 51-61; Fleetwood A.J., Lawrence Т., Hamilton J.A., Cook A.D. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (CSF) and macrophage CSF-dependent macrophage phenotypes display differences in cytokine profiles and transcription factor activities: implications for CSF blockade in inflammation // J Immunol. - 2007. - V. 178. - P. 5245-5252).
high
high
low
2A
Как про-М1, так и про-М2 клетки могут быть поляризованы в Мϕ 1 или 2 типа под влиянием различных факторов микроокружения (поляризующих стимулов) (Roszer Т. Understanding the mysterious М2 macrophage through activation markers and effector mechanisms // Mediators of Inflammation. - 2015. - Article ID 816460; Tarique A.A., Logan J., Thomas E., et al. Phenotypic, functional, and plasticity features of classical and alternatively activated human macrophages // Am J Respir Cell Mol Biol. - 2015. - V. 53. - P. 676-688). В культуре in vitro в качестве M1-поляризующих сигналов могут выступать различные инфекционные агенты (например, липополисахарид [ЛПС] или провоспалительные цитокины (TNF-α или IFN-γ, по отдельности или в комбинации). М1 макрофаги характеризуются in vitro фенотипом IL-12IL-23IL-10; активно секретируют реактивные метаболиты кислорода и оксид азота (ROS и NO) и воспалительные цитокины (IL-1β, TNF, IL-6); участвуют в развитии Th1-опосредованных иммунных реакций, обеспечивающих устойчивость к внутриклеточным патогенам и опухолям. В качестве М2-поляризующих сигналов могут выступать Th2-цитокины (IL-4 или IL-13 по отдельности или в комбинации); иммунные комплексы, которые одновременно связываются с Fc-γ и Toll-подобными рецепторами; различные иммуносупрессорные цитокины (IL-10, TGF-β), глюкокортикоиды и витамины (дексаметазон, витамин Д3). В 2008 г было предложено М2 макрофаги, поляризованные теми или иными стимулами, обозначать как М2а (IL-4, IL-13), М2b (иммунные комплексы) и М2с (IL-10, TGF-b, дексаметазон, витамин Д3) (Martinez F.O., Sica A., Mantovani A., Locati M. Macrophage activation and polarization // Front Biosci. - 2008. - V. 13. - P. 453-461). Выделяют также M2d фенотип, который индуцируется в результате аденозин-зависимого "переключения" провоспалительных М1 макрофагов в М2 клетки с выраженными проангиогенными свойствами (Grinberg S., Hasko G., Wu D., Leibovich S.J. Suppression of PLCβ2 by endotoxin plays a role in the adenosine А receptor-mediated switch of macrophages from an inflammatory to an angiogenic phenotype // Am J Pathol. - 2009. - V. 175. - P. 2439-2453). Поскольку M2 поляризация Мϕ может происходить также в результате фагоцитоза апоптотических клеток, отдельно можно выделить М2апо фенотип М2 макрофагов (Fadok V.A, Bratton D.L., Konowal A., et al. Macrophages that have ingested apoptotic cells in vitro inhibit proinflammatory cytokine production through autocrine/paracrine mechanisms involving TGF-beta, PGE2, and PAF // J Clin Invest. - 1998. - V. 101. - P. 890-898; De Oliveira Fulco Т., Andrade P.R., de Mattos Barbosa M.G., et al. Effect of apoptotic cell recognition on macrophage polarization and mycobacterial persistence // Infect Immunol. - 2014. - V. 82. - P. 3968-3978).
low
low
high
high
В целом, M2 макрофаги характеризуются in vitro фенотипом IL-12IL-23IL-10TGF-β; как правило, высоко экспрессируют акцепторные (scavenger), маннозные и галактозные рецепторы; участвуют в развитии Th2-опосредованных иммунных реакций, в ограничении воспаления, иммунорегуляции, ремоделировании тканей и ангиогенезе (Sica A., Mantovani А. Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas // J Clin Invest. - 2012. - V. 122. - P. 787-795).
Развитие многих физиологических процессов невозможно без соответствующей поляризации Мϕ. Нарушение или отклонение дифференцировочной программы Мϕ может иметь потенциально опасные последствия. Например, неконтролируемая активация провоспалительных макрофагов 1 типа может вызывать деструкцию тканей, или способствовать опухолевой трансформации или нарушать метаболизм глюкозы, стимулируя резистентность к инсулину. В свою очередь, противовоспалительные макрофаги 2 типа, которые должны обеспечивать заживление ран, в условиях неконтролируемой активации и экспансии могут усиливать фиброгенез, провоцировать аллергические реакции, способствовать выживанию внутриклеточных патогенов, и опухолевой прогрессии.
В настоящее время отработаны различные протоколы генерации из моноцитов крови макрофагов 1 и 2 типа на основе использования соответствующих дифференцировочных факторов (GM-CSF или M-CSF) и/или поляризующих стимулов. Генерированные in vitro макрофаги предлагается использовать при разработке новых медицинских клеточных технологий. Так, M1-клетки могут быть использованы с целью усиления противоинфекционного, противовирусного или противоопухолевого иммунного ответа. В свою очередь, М2-клетки могут быть использованы с целью стимуляции репарации/регенерации, например, при лечении хронических, вялотекущих раневых процессов (при диабете, остеомиелите и т.д.) или для стимуляции нейрорегенерации у больных с органическими поражениями мозга, например, последствиями инсульта, хронической ишемией мозга и т.д. (RU 2637407, А61К 38/18, 2017; Останин А.А., Давыдова М.Н., Старостина Н.М., и др. Интраназальные ингаляции биоактивных факторов, продуцируемых М2 макрофагами, в лечении больных с органическими поражениями головного мозга // Мед иммунология. - 2018. - Т. 20. - С. 577-588). При этом принципиально важно, чтобы в конкретной клинической ситуации были использованы Мϕ определенного фенотипа - или М1/провоспалительного, или М2/противовоспалительного, поскольку по своим ключевым характеристикам они являются по сути оппозитными.
Важно отметить, что разрабатываемые клеточные технологии относятся, как правило, к «персонализированной» медицине, и являются пациент-зависимыми, поскольку предполагают использование аутологичных Мϕ, генерированных in vitro из моноцитов периферической крови конкретного больного. Однако в силу различных причин (генетических особенностей, возраста, наличия сопутствующей патологии, количественных и/или функциональных нарушений в популяции циркулирующих моноцитов, и т.д.) может происходить нарушение процессов дифференцировки/поляризации Мϕ. В этом случае даже в условиях выполнения стандартов культуральных протоколов генерации и при использовании соответствующих М1 или М2 дифференцировочных/поляризующих факторов, получаемая популяция макрофагов по своим ключевым свойствам может не соответствовать ожидаемому функциональному фенотипу.
Очевидно, что использование таких «дефектных» Мϕ в лечебных целях может быть либо недостаточно эффективным, либо сопровождаться развитием нежелательных побочных реакций.
Вышесказанное диктует необходимость поиска маркера(-ов), позволяющих с высокой диагностической точностью идентифицировать М1 и М2 функциональные фенотипы макрофагов человека, генерированных in vitro из моноцитов крови.
Известен метод идентификации типа макрофагов по экспрессии генов, который осуществляется при помощи полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Согласно данному методу, М1 и М2 макрофаги различаются по уровню экспрессии мРНК Arg1, Ym1, Fizz1, iNOS, CD38, Fpr2, Gpr18 (Raes G., De Baetselier P., Noe W., al. Differential expression of FIZZ1 and Ym1 in alternatively versus classically activated macrophages // J Leukoc Biol. - 2002. - V. 71. - P. 597-602; Jablonski K.A., Amici S.A., Webb L.M., et al. Novel markers to delineate murine M1 and M2 macrophages // PLoS One. - 2015. - V. 10: e0145342). Однако данный подход существенно ограничен возможностью использования для идентификации различных типов макрофагов только у мышей, поскольку у человека указанные маркеры не определяются (Raes G., Van den Bergh R., De Baetselier P., et. al. Arginase-1 and Ym1 are markers for murine, but not human, alternatively activated myeloid cells // J Immunol. - 2005. - V. 174. - P. 6561-6562).
Известен метод идентификации типа макрофагов по особенностям метаболизма L-аргинина, а именно, по анализу баланса активности аргиназы и NO-синтазы (Modolell М., Corraliza I.M., Link F., et al. Reciprocal regulation of the nitric oxide synthase/arginase balance in mouse bone marrow-derived macrophages by TH1 and TH2 cytokines // Eur J Immunol. - 1995. - V. 25. - P. 1101-1104; Munder M., Eichmann K., Modolell M. Alternative metabolic states in murine macrophages reflected by the nitric oxide synthase/arginase balance: competitive regulation by CD4+ T cells correlates with Th1/Th2 phenotype // J Immunol. - 1998. - V. 160. - P. 5347-5354). Согласно этому методу, формирование М1 фенотипа сопровождается сдвигом метаболизма аргинина в сторону активации NO-синтазы (iNOS) и увеличения продукции оксида азота (NO), которому принадлежит важная роль в микробицидной активности М1-клеток. Формирование М2 фенотипа сопровождается сдвигом метаболизма аргинина в сторону активации аргиназы-1, которая конкурирует с iNOS за L-аргинин и расщепляет его до орнитина и мочевины. М2-продуцируемый орнитин стимулирует пролиферацию и восстановление клеток посредством синтеза полиамина и коллагена, фиброза и активации других функций тканевого ремоделирования. Недостатком данного способа также является возможность его использования только для определения различных типов макрофагов мышей, но не Мϕ человека.
Известен метод идентификации типа Мϕ по морфологической характеристике генерируемых клеточных популяций. Так, М1-клетки преимущественно имеют округлую или овоидную форму, а М2 - преимущественно представляют собой фибробластоподобные клетки или клетки с «fried-egg» морфологией. Это сравнительно простой метод диагностики, не требующий наличия сложного оборудования и больших временных затрат (Ploeger D.T., Hosper N.A., Schipper М., et al. Cell plasticity in wound healing: paracrine factors of М1/ M2 polarized macrophages influence the phenotypical state of dermal fibroblasts // Cell Commun Signal. - 2013. - V. 11: 29). Недостатком данного способа является качественный, субъективный характер оценки и его неточность, поскольку в общей популяции генерируемых in vitro макрофагов могут содержаться клетки, различающееся по своей морфологии.
Известен метод определения типа макрофагов по экспрессии различных поверхностных молекул, осуществляемый при помощи проточной цитометрии. Данный подход является одним из самых распространенных и достаточно простых методов оценки функционального фенотипа макрофагов. Так, например, показано, что М1 отличаются от М2-клеток повышенной экспрессией молекул, вовлеченных в активацию и ко-стимуляцию Т-лимфоцитов (HLA-DR, CD86, CD40), тогда как М2 макрофаги характеризуются повышенной экспрессией акцепторных scavenger-рецепторов (CD36, CD163) и маннозного CD206-рецептора (Lolmede K., Campana L, Vezzoli М., et al. Inflammatory and alternatively activated human macrophages attract vessel-associated stem cells, relying on separate HMGB1- and MMP-9-dependent pathways. J Leukoc Biol. - 2009. - V. 85. - P. 779-787). Для M2a клеток, генерированных из моноцитов под действием поляризующих стимулов IL-4/IL-13, характерным признаком является повышенная экспрессия CD200R и DC-SIGN (CD209) (Koning N., van Eijk M., Pouwels W., et al. Expression of the inhibitory CD200 receptor is associated with alternative macrophage activation. J Innate Immun. - 2010. - V. 2. - P. 195-200; Relloso M.,  Pello O.M., et al. DC-SIGN (CD209) expression is IL-4 dependent and is negatively regulated by IFN, TGF-beta, and anti-inflammatory agents. J Immunol. - 2002. - V. 168. - P. 2634-2643; Stein M., Keshav S., Harris N., Gordon S. Interleukin 4 potently enhances murine macrophage mannose receptor activity: a marker of alternative immunologic macrophage activation. J Exp Med. - 1992. - V. 176. - P. 287-292).
Существенным недостатком данного метода является отсутствие уникальных поверхностных маркеров, высоко специфичных для определенного фенотипа Мϕ. Так, например, экспрессия маннозного рецептора CD206 считается отличительным признаком М2-клеток, однако М1 макрофаги также экспрессируют этот антиген, хотя и с меньшей интенсивностью. Кроме того, уровень экспрессии CD206 может варьировать в зависимости от используемого дифференцировочного фактора. Например, экспрессия CD206 повышается на М-CSF-дифференцированных М2 макрофагах, однако GM-CSF также индуцирует экспрессию этого антигена М1-клетками на уровне, превышающем значения GM-CSF-дифференцированных М2-макрофагов.
Недостатком данного метода является также то, что для идентификации типа макрофагов необходима сравнительная характеристика между собой двух (или более) клеточных популяций по уровню экспрессии (больше/меньше) тех или иных молекул. При этом не определены пороговые значения экспрессии каких-либо маркеров, которые позволяли бы с высокой специфичностью (SP) и чувствительностью (SN) верифицировать М1 и М2 функциональные фенотипы генерированных in vitro макрофагов человека.
Известен способ идентификации М1-подобных и М2-подобных макрофагов (поляризованных с помощью IFN-γ и IL-4, соответственно) по экспрессии поверхностных антигенов (US 2015057161, C12N5/0786, 2015). В качестве M1-специфических маркеров предлагается использовать CD120b, TLR2 и SLAMF7; в качестве М2-ассоциированных маркеров - CD1a, CD1b, CD93 и CD226. Несмотря на то, что эти паттерны поверхностных антигенов были выделены после проведения РНК-секвенирования и определения в качестве маркеров идентификации наиболее вероятных генов-кандидатов, предложенный способ имеет ряд ограничений и недостатков.
Недостатком является, во-первых, то, что, для генерации М2-подобных макрофагов в качестве поляризующего стимула использовали IL-4, что является общепринятым подходом для получения М2а макрофагов. Следовательно, предлагаемый паттерн М2-ассоциированных маркеров (CD1a, CD1b, CD93, CD226) позволяет идентифицировать только одну популяцию М2 макрофагов М2а фенотипа. Эффективность предложенного метода в отношении идентификации других субпопуляций М2 макрофагов (про-М2-клеток, М2b, М2с, М2апо) не исследована. Во-вторых, в состав паттерна М1-специфических маркеров включен TLR2 (Toll-подобный рецептор бактериальных пептидогликанов), тогда как в ряде в ряде работ показано, что экспрессия TLR2 и, соответственно, способность отвечать на TLR2-агонисты (Pam3, Pam2CSK4) характерна не только для М1, но также и для М2 макрофагов (Quero L, Hanser Е., Manigold Т., Tiaden A.N., Kyburz D. TLR2 stimulation impairs anti-inflammatory activity of M2-like macrophages, generating a chimeric M1/M2 phenotype. Arthritis Res Ther. - 2017. - V. 19: 245; Schlaepfer E., Rochat M-A., Duo L, Speck R.F. Triggering TLR2, -3, -4, -5, and -8 Reinforces the Restrictive Nature of M1- and M2-Polarized Macrophages to HIV. J Virology. - 2014. - V. 88. - P. 9769-9781). Недостатком данного метода является также отсутствие установленных пороговых значений экспрессии М1- и М2-ассоциированных маркеров, а также каких-либо данных о диагностической точности (SP, SN) предложенного подхода.
Известен метод идентификации М2с клеток по экспрессии мертирозинкиназы (MerTK), которая появляется на макрофагах в результате контакта с апоптотическими клетками и вовлекается в их фагоцитоз (Zizzo G., Hilliard В.А., Monestier М., Cohen P.L. Efficient clearance of early apoptotic cells by human macrophages requires M2c polarization and MerTK induction. J Immunol. - 2012. - V. 189. - P. 3508-3520). Было показано, что экспрессия MerTK является специфичным маркером М2с клеток, дифференцированных в присутствии M-CSF с последующей поляризацией с помощью дексаметазона, или неполяризованных про-М2-клеток, имеющих фенотип CD14+CD16+CD163+CD204+CD206+CD209-. В то же время использование про-М1 дифференцирующего фактора (GM-CSF) не сопровождается значимым усилением экспрессии MerTK, в том числе в ответ на поляризующую стимуляцию дексаметазоном.
Недостатком метода является ограниченная сфера применения исключительно только в отношении M-CSF-дифференцированных М2с макрофагов, неполяризованных или поляризованных глюкортикоидами.
Известен метод идентификации типа макрофагов по характеру и уровню продукции ими цитокинов и хемокинов, которые определяются методами иммуноферментного и/или мультиплексного протеомного анализа. Согласно этому методу М1 макрофаги характеризуются продукцией TNFα, IL-1β, IFN-λ, IL-6, IL-8, IL-12, IL-23 и хемокинов CXCL9, CXCL10, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL8, CCL9, CCL10, CCL11, CCL15, CCL19, CCL20. Для М2а макрофагов характерна продукция TGF-β, IL-4, IL-10, IL-13, IGF-1, CCL13, CCL17, CCL22, CCL23, CCL24, CCL26. М2b макрофаги продуцируют IL-1, IL-6, IL-10, TNF-α, CCL1, CCL20, CXCL1, CXCL2, CXCL3; для М2с - IL-10, TGF-β, IGF-1, PGE-2, CCL8, CCL17, CCL18, CCL22, CCL24, а M2d - IL-10, IL-12, TNFα, TGF-β, CCL5, CXCL10, CXCL16 (Mantovani A., Sica A., Sozzani S., Allavena P., Vecchi A., Locati M. The chemokine system in diverse forms of macrophage activation and polarization. Trends Immunol. - 2004. - V. 25. - P. 677-686; Verreck F.A.W., de Boer T, Langenberg D.M.L., et al. Human IL-23-producing type 1 macrophages promote but IL-10-producing type 2 macrophages subvert immunity to (myco)bacteria. Proc Natl Acad Sci USA. - 2004. - V. 101.-P. 4560-4565).
Основным недостатком такого подхода является вариабельность продукции цитокинов/хемокинов, а также значительные технические сложности, связанные с необходимостью определения большого количества аналитов с использованием соответствующего оборудования и реагентики для мультиплексного анализа. Кроме того, при таком подходе опять же не определены пороговые значения уровня продукции тех или иных цитокинов/хемокинов, которые бы позволяли с высокой диагностической точностью различать секреторные паттерны, специфичные для М1 или М2 функциональных фенотипов Мϕ человека.
Известен метод идентификации типа макрофагов по маркерам липидного метаболизма, которые оцениваются методом матричной лазерной десорбционно/ионизационной масс-спектрометрии (MALDI MSI) (Khamehgir-Silz Р., Schnitter F., Wagner А.Н., et al. Strategy for marker-based differentiation of pro- and anti-inflammatory macrophages using matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging. Analyst. - 2018. - V. 143. - P. 4273-4282).
Главным недостатком предложенного метода является то, что он не позволяет определить универсальные маркеры М1- и М2-клеток на метаболическом уровне из-за выраженной гетерогенности моноцитов/макрофагов, полученных от разных доноров. Кроме того, существенными недостатками предложенного метода являются значительная техническая сложность и, соответственно, высокая стоимость.
Известен метод идентификации типа макрофагов на основе оценки спектральной характеристики Мϕ после их взаимодействия с органическим соединением (JP 2015006173, C12N5/0786, 2015). Особенностью данного органического соединения является то, что его окрашиваемость меняется при добавлении его к тому или иному типу Мϕ (М1 или М2), в результате чего регистрируются М1- или М2-специфичные спектральные характеристики.
К недостаткам предложенного способа можно отнести значительную сложность его практического применения, связанную с необходимостью проведения спектрального анализа, а также недостаточно данных в патенте об «авторском» органическом соединении, что не позволяет оценить диагностическую точность идентификации типа макрофагов.
3
В качестве прототипа предлагаемого изобретения рассматривается способ идентификации функционального М1 и М2 фенотипа макрофагов человека, генерированных in vitro из моноцитов крови, заключающийся в оценке влияния клеток, полученных путем культивирования моноцитов периферической крови здоровых доноров в присутствии М1- или М2-поляризующих стимулов, на пролиферативный ответ Т-лимфоцитов в смешанной культуре лейкоцитов (СКЛ) (Mia S., Warnecke A., Zhang Х.-М., Malmstrom V., Harris RA. An optimized protocol for human M2 macrophages using M-CSF and IL-4/IL-10/TGF-β yields a dominant immunosuppressive phenotype. Scand J Immunol. - 2014. - V. 79. - P. 305-314). В способе-прототипе моноциты выделяют из мононуклеарных клеток (МНК) крови методом магнитной сепарации на бусах, покрытых анти-CD14-моноклональными антителами. Выделенные CD14-позитивные моноциты культивируют в течение 24 ч в присутствии поляризующих стимулов. В качестве М1-поляризующих сигналов используют комбинацию ЛПС и IFN-γ. В качестве М2-поляризующих стимулов используют 3 комбинации цитокинов: либо IL-4/IL-10, либо IL-4/IL-13, либо IL-4/IL-10/TGF-β. М1 и М2 макрофаги человека, генерированные in vitro из моноцитов крови, идентифицируют по их влиянию на пролиферативный ответ аутологичных Т-клеток в СКЛ. Для этого, генерированные М1- или М2-макрофаги со-культивируют с аутологичными МНК в соотношении 1:4-1:8 в течение 72 ч в присутствии моноклональных анти-CD3-антител. Уровень анти-CD3-стимулированного пролиферативного ответа аутологичных Т-клеток оценивают радиометрически по включению Н-тимидина. Согласно способу-прототипу M1(ЛПС/IFN-γ) макрофаги, генерированные из моноцитов крови здоровых доноров, усиливают пролиферацию Т-лимфоцитов, тогда как, M2(IL-4/IL-10) и M2(IL-4/IL-10/TGF-β) макрофаги снижают пролиферативный ответ аутологичных Т-клеток. Однако, М2 макрофаги, поляризованные с помощью IL-4/IL-13, значимо не влияют на интенсивность пролиферации в ауто-СКЛ. Способ-прототип был использован также для идентификации М1 и М2 макрофагов у пациентов с рассеянным склерозом (PC) и спондилоартритом (СпА). У больных с аутоиммунной патологией M2(IL-4/IL-10/TGF-β) макрофаги снижают пролиферацию аутологичных Т-клеток. Однако М1(ЛПС/IFN-γ) макрофаги больных СпА не усиливают, а у больных PC даже супрессируют пролиферацию Т-клеток в ауто-СКЛ, т.е. проявляют М2-подобные свойства. При этом какие-либо данные об эффектах двух других подтипов М2 макрофагов больных РС/СпА, поляризованных с помощью IL-4/IL-10 или IL-4/IL-13, в способе-прототипе отсутствуют.
Недостатком данного способа является сам способ генерации макрофагов человека, в котором исключен этап дифференцировки моноцитов в про-М1 или про-М2 макрофаги под влиянием GM-CSF или M-CSF, соответственно. Авторы сразу используют краткосрочную, 24-часовую инкубацию CD14-позитивных моноцитов крови с М1- (ЛПС/IFN-γ) или М2- (IL-4/IL-10; IL-4/IL-13; IL-4/IL-10/TGF-β) поляризующими стимулами. В результате в культуре in vitro генерируются скорее всего М1- и М2-подобные активированные моноциты (но не дифференцированные макрофаги), что признают и сами авторы. Кроме того, для выделения моноцитов из периферической крови не обязательно использовать относительно дорогостоящий метод магнитной сепарации. Обогащенную популяцию моноцитов можно получить также более простым способом путем адгезии МНК периферической крови на пластике. Также недостатком способа-прототипа является то, что авторы предлагают идентифицировать М1 и М2 макрофаги человека, генерированные in vitro из моноцитов крови, по их влиянию на пролиферативный ответ аутологичных Т-клеток в СКЛ. В этом случае уровень пролиферации в ауто-СКЛ будет определяться не только М1/провоспалительным или М2\противовспалительным фенотипом макрофагов, но и функциональным состоянием самих Т-лимфоцитов, что особенно актуально при какой-либо патологии. Очевидно, что именно по этой причине предложенный подход оказался малоэффективным у больных с аутоиммунными заболеваниями. Также к недостаткам способа-прототипа можно отнести то, что авторы не показали его универсальности в отношении идентификации не только про-М1 или про-М2 клеток (т.е. макрофагов, генерированных из моноцитов крови в присутствии дифференцировочных GM-CSF или M-CSF факторов), но и в отношении идентификации других подтипов М2 макрофагов, поляризованных с помощью других известных стимулов (например, дексаметазона, или в результате фагоцитоза апоптотических клеток). Наконец, существенным недостатком способа-прототипа является также отсутствие установленных пороговых значений уровня пролиферативного ответа Т-клеток в СКЛ, которые позволяли бы с высокой диагностической точностью (специфичностью и чувствительностью) верифицировать М1 и М2 функциональные фенотипы генерированных in vitro макрофагов человека.
Задачей изобретения является повышение диагностической точности способа идентификации макрофагов человека первого (М1) и второго (М2) типа.
Поставленная задача достигается тем, что в способе идентификации функционального М1 и М2 фенотипа макрофагов человека, генерированных in vitro из моноцитов крови, заключающегося в оценке влияния клеток, полученных путем культивирования моноцитов периферической крови здоровых доноров в присутствии М1- или М2-поляризующих стимулов, на пролиферативный ответ Т-лимфоцитов в смешанной культуре лейкоцитов (СКЛ), сначала генерируют про-М1 и про-М2 макрофаги в течение 5 суток в присутствии GM-CSF и M-CSF, соответственно, затем в течение 2 суток индуцируют их поляризацию в М1 фенотип с помощью липополисахаридов (ЛПС), а также в М2а, М2с и М2апо фенотип с помощью IL-4, дексаметазона и апоптотических нейтрофилов, соответственно, после чего оценивают стимуляторную активность про-М1 и про-М2, а также поляризованных М1 и М2 макрофагов в отношении аллогенных Т-клеток, полученных от 2-3 здоровых доноров.
Низкая стимуляторная активность про-М2 макрофагов в алло-СКЛ при значениях ИС<3,0 расч. ед. отличает их от про-М1 клеток со специфичностью 92% и чувствительностью 80%.
Низкая стимуляторная активность М2 (М2а, М2с, М2апо) макрофагов, поляризованных из GM-CSF-дифференцированных про-М1 клеток, в алло-СКЛ при значениях ИС<3,7 расч. ед. отличает их от М1 макрофагов, поляризованных из GM-CSF-дифференцированных про-М1 клеток, со специфичностью 91% и чувствительностью 80.4%.
Низкая стимуляторная активность М2 (М2а, М2с) макрофагов, поляризованных из M-CSF-дифференцированных про-М2 клеток, в алло-СКЛ при значениях ИС<2.95 расч. ед. отличает их от М1 макрофагов, поляризованных из M-CSF-дифференцированных про-М2 клеток, со специфичностью 89% и чувствительностью 81%.
По нашему мнению предлагаемый способ является новым и обладает изобретательским уровнем.
В современной литературе отсутствуют указания на предлагаемый способ идентификации функционального М1 и М2 фенотипа макрофагов человека, генерированных in vitro из моноцитов крови, и по использованию данного способа для идентификации про-М1 и про-М2, генерированных из моноцитов крови в присутствии дифференцировочных факторов (GM-CSF и M-CSF, соответственно), а также М1 и М2 макрофагов, генерированных из про-М1 или про-М2 клеток под влиянием различных поляризующих сигналов (ЛПС для М1, и IL-4, дексаметазон, эффероцитоз для М2).
Как в способе-прототипе, так и в способах-аналогах для идентификации М1 и М2 макрофагов предлагается оценивать те или иные отдельные фенотипические и/или функциональные параметры. Либо уровень экспрессии антигенов гистосовместимости II класса (HLA-DR), ко-стимуляторных молекул (CD86, CD40), акцепторных scavenger-рецепторов (CD36, CD163) и маннозного CD206-рецептора, либо уровень и спектр секретируемых цитокинов/хемокинов, либо уровень экспрессии и активности различных ферментативных систем. Однако, диагностическая точность таких подходов остается неопределенной, поскольку не установлены пороговые значения тех или иных параметров, которые позволяли бы с высокой специфичностью и чувствительностью верифицировать М1 и М2 функциональные фенотипы генерированных in vitro макрофагов человека.
Нами предлагается оценивать только один параметр, а именно, выраженность стимуляторной активности макрофагов в алло-СКЛ. По нашему мнению именно этот показатель является интегративным, поскольку детерминируется совокупностью вышеперечисленных клеточных параметров. Очевидно, что макрофаги М1/провоспалительного фенотипа, которые высоко экспрессируют молекулы, вовлеченные в активацию и ко-стимуляцию Т-лимфоцитов (HLA-DR, CD86, CD40), а также активно секретируют иммунорегуляторные (IL-12, IL-23), но не иммуносупрессорные (IL-10, TGF-β) цитокины будут индуцировать более выраженный пролиферативный ответ Т-лимфоцитов на аллоантигены в СКЛ, чем макрофаги оппозитного М2/противовоспалительного фенотипа.
В способе-прототипе совсем не оценивают про-М1 и про-М2 клетки, генерированные из моноцитов крови в присутствии дифференцировочных GM-CSF или M-CSF факторов, а для поляризации моноцитов в М1 и М2 макрофаги используют достаточно дорогостоящие реактивы, а именно различные рекомбинантные цитокины (ЛПС/IFN-γ - для поляризации в М1-макрофаги; IL-4/IL-10/IL-13/TGF-β - для поляризации в М2-макрофаги). Предложенный способ позволяет оценивать практически все известные на сегодняшний день популяции М1 и М2 клеток, включая как про-М1 и про-М2 клетки, а также полученные из них поляризованные М1 и М2 (М2а, М2с, М2апо) макрофаги, используя при этом более доступные средства. Поляризацию про-М1 и про-М2 клеток в М1 макрофаги осуществляют с помощью ЛПС (без IFN-γ), в М2 макрофаги М2а фенотипа - с помощью IL-4, в М2с фенотипа - с помощью дексаметазона и М2апо фенотипа - с помощью апоптотических нейтрофилов.
В способе-прототипе М1 и М2 макрофаги идентифицируют в смешанной культуре лейкоцитов (СКЛ) по их влиянию на пролиферацию аутологичных Т-клеток, т.е. тестируемые макрофаги со-культивируют с Т-лимфоцитами, полученными от одного и того же человека. Такой подход не исключает вероятности того, что уровень пролиферативного ответа в СКЛ и, соответственно, точность определения фенотипа тестируемых макрофагов будет во многом зависеть, в том числе, от функционального состояния самих Т-клеток. Наличие каких-либо Т-клеточных дисфункций может приводить к искажению результатов идентификации. В предложенном способе тестируемые макрофаги со-культивируют в СКЛ с аллогенными Т-лимфоцитами, полученными от 2-3 здоровых доноров, что исключает возможность негативного влияния функционального статуса Т-клеток на результат оценки функционального М1 и М2 фенотипа макрофагов.
На основе полученных нами данных предлагается изобретение, направленное на повышение диагностической точности идентификации макрофагов человека первого (М1) и второго (М2) типа.
Предложенный способ идентификации макрофагов человека первого (М1) и второго (М2) типа осуществляется следующим образом.
6
2
2
2
Мононуклеарные клетки (МНК) человека получают центрифугированием гепаринизированной венозной крови (из расчета 50 Ед/мл гепарина) в градиенте плотности фиколла-верографина в течение 20 мин при 3000 об/мин. Собранные из интерфазы МНК двукратно отмывают, подсчитывают количество, и ресуспендируют в культуральной среде RPMI-1640, дополненной 0,05 мМ 2-меркаптоэтанола, 2 мМ пирувата натрия, 0,3 мг/мл L-глутамина, 1% незаменимых аминокислот, 10% фетальной телячьей сыворотки (FBS, Биолот, Россия), в присутствии рекомбинантного GM-CSF человека (для генерации про-М1 Мϕ) или рекомбинантного M-CSF человека (для генерации про-М2 Мϕ) в дозе 50 нг/мл. Затем МНК в концентрации 4×10/мл инкубируют в течение 1 часа при 37°С и 5% СО в стерильных пластиковых чашках Петри или флаконах площадью 25 см (Falcon), в зависимости от количества выделенных клеток. После удаления неприлипших к пластику клеток, адгезивные клетки, из которых не менее 90-93% экспрессируют CD14 - линейный маркер моноцитов, культивируют в полной культуральной среде в течение 7 сут при 37°С и 5% СО.
Для генерации М1 и М2 макрофагов в культуры GM-CSF-дифференцированных про-М1 клеток или M-CSF-дифференцированных про-М2 клеток на 5-й день добавляют поляризующие стимулы: для генерации М1 макрофагов используют липополисахарид (ЛПС; 10 мкг/мл), для М2а -интерлейкин-4 (ИЛ-4; 20 нг/мл), для М2с - дексаметазон (Декс; 50 нг/мл).
+
-
+
+
6
2
Для генерации М2апо Мϕ к монослою GM-CSF-дифференцированных про-М1 клеток добавляют нейтрофилы, подвергшиеся спонтанному апоптозу (количество AnnexinVPI клеток на ранних стадиях апоптоза и AnnexinVPI клеток на поздних стадиях апоптоза составляло в среднем 61 и 12%, соответственно), в количестве 1-2×10/мл (из расчета ≈ 10 нейтрофилов на макрофаг) и инкубируют в течение 60 мин при 37°С и 5% CO.
По окончании срока генерации культуральную среду удаляют, а полученные про-М1 и про-М2 клетки, а также поляризованные М1 и М2 макрофаги отделяют от пластика при помощи механической диссоциации, подсчитывают количество клеток и определяют их жизнеспособность (по исключению трипанового синего).
5
Аллостимуляторную активность макрофагов определяют по их способности стимулировать пролиферацию аллогенных Т-клеток в смешанной культуре лейкоцитов (алло-СКЛ). Для этого МНК (1×10/лунку), полученные от 2-3 здоровых доноров крови, культивируют в 96-луночном круглодонном планшете в RPMI-1640, содержащей 10% инактивированной сыворотки AB(IV) группы, в отсутствие (контроль) или присутствии различных типов макрофагов (в соотношении МНК:Мϕ=10:1). Пролиферацию Т-клеток оценивают радиометрически на 5 сутки по включению [3Н]-тимидина, который вносят за 18 часов до окончания культивирования в дозе 1 мкКю/лунку. Аллостимуляторную активность Мϕ выражают в виде индекса стимуляции (ИС), который рассчитывают как отношение пролиферативного ответа МНК в присутствии Мϕ к уровню спонтанной пролиферации МНК (без макрофагов).
Приведенные ниже примеры конкретной реализации способа иллюстрируют диагностическую точность предложенного способа идентификации функционального М1 и М2 фенотипа макрофагов человека, генерированных in vitro из моноцитов крови.
Пример 1.
U
Из моноцитов крови здоровых доноров генерировали GM-CSF-дифференцированные про-М1 и M-CSF-дифференцированные про-М2 макрофаги, после чего оценили их стимуляторную активность в алло-СКЛ. На рис. 1 показана аллостимуляторная активность GM-CSF-дифференцированных про-М1 и M-CSF-дифференцированных про-М2 макрофагов. Данные представлены в виде M±SEM. Видно, что по сравнению с про-М1 клетками индекс стимуляции про-М2 клеток в алло-СКЛ был в 2 раза ниже, составляя в среднем 2,28 против 4,6 расч. ед. (p<0,05).
На рис. 2 представлена ROC-кривая (receiver-operator curve, ROC), иллюстрирующая отношение между чувствительностью и специфичностью для различных точек разделения индекса стимуляции GM-CSF-дифференцированных про-М1 и M-CSF-дифференцированных про-М2 макрофагов в алло-СКЛ. ROC-анализ операционных характеристик теста и построенная характеристическая ROC-кривая показали, что площадь под кривой (AUC) для данного теста составила 0.90 (95% ДИ 0,76-1,03, р=0,001). В соответствии с классификацией Swets J.A. площадь под ROC-кривой от 0,5 до 0,7 свидетельствует об относительно невысокой точности диагностического теста (Swets J.A. Measuring the accuracy of diagnostic systems. Science. - 1988. - V. 240. - P. 1285-1293). Если площадь под ROC-кривой варьирует от 0,7 до 0,9, то предложенный тест может быть использован в диагностических целях. Площадь под ROC-кривой выше 0,9 характеризует тест, обладающий наиболее высокой диагностической точностью. Поскольку в нашем случае площадь под ROC-кривой составляла 0,90, это свидетельствует о том, что оценка уровня аллостимуляторной активности Мϕ, генерированных in vitro из моноцитов крови, может быть использована для идентификации GM-CSF-дифференцированных про-М1 и M-CSF-дифференцированных про-М2 клеток.
Построение характеристической ROC-кривой обеспечивает не только понимание того, что определенный тест является диагностически полезным и информативным, но позволяет также определить наиболее оптимальную точку разделения, т.е. такое пороговое значение теста, выше (или ниже) которого можно наиболее эффективно проводить диагностическую процедуру (Петри А., Сэбин К. Наглядная медицинская статистика. Москва: Издательская группа «ГЭОТАР-Медиа», 2009. - С. 108-110).
Поэтому следующим шагом в оценке построенной ROC-кривой стало определение чувствительности, специфичности и отношения правдоподобия для различных точек разделения. Для индекса стимуляции про-М1 и про-М2 клеток в алло-СКЛ точкой разделения, соответствующей максимальным показателям чувствительности (80%) и специфичности (92%) было пороговое значение <3,0 расч. ед. (отношение правдоподобия 9,60).
Таким образом, низкая стимуляторная активность про-М2 макрофагов в алло-СКЛ при значениях ИС<3,0 расч. ед. отличает их от про-М1 клеток со специфичностью 92% и чувствительностью 80%.
Пример 2.
лпс
ил-4
декс
апо
Лпс
ил-4
декс
Апо
ил-4
декс
апо
ил-4
декс
Апо
лпс
U
Из моноцитов крови здоровых доноров генерировали GM-CSF-дифференцированные про-М1, которые затем были поляризованы в М1 макрофаги с помощью ЛПС (М1), или в М2 макрофаги с помощью или ИЛ-4 (М2а, М2), или дексаметазона (М2с, М2) или фагоцитоза апоптотических нейтрофилов (М2), после чего оценили их стимуляторную активность в алло-СКЛ. На рис. 3 показана аллостимуляторная активность М1 (М1) и М2 (М2, - М2, М2) макрофагов, поляризованных из GM-CSF-дифференцированных про-М1 клеток. Данные представлены в виде M±SEM. Видно, что по сравнению с поляризованными М1 макрофагами индекс стимуляции всех трех субтипов поляризованных М2 макрофагов (М2, М2, М2) в алло-СКЛ был более чем в 5 раз ниже, составляя в среднем 2,25, 2,21 и 2,58 расч. ед. для М2, М2, М2, соответственно, против 12,4 расч. ед. для М1 (p<0,001).
апо
На рис. 4 представлена ROC-кривая, иллюстрирующая отношение между чувствительностью и специфичностью для различных точек разделения индекса стимуляции М1 и М2 (М2а, М2с и М2) макрофагов, поляризованных из GM-CSF-дифференцированных про-М1 клеток, в алло-СКЛ. ROC-анализ операционных характеристик теста и построенная характеристическая ROC-кривая показали, что площадь под кривой (AUC) для данного теста составила 0.96 (95% ДИ 0,92-0,99, p<0,0001).
Определение чувствительности, специфичности и отношения правдоподобия для различных точек разделения показало, что для индекса стимуляции в алло-СКЛ М1 и М2 (М2а, М2с, М2апо) макрофагов, поляризованных из GM-CSF-дифференцированных про-М1 клеток, точкой разделения, соответствующей максимальным показателям чувствительности (80,4%) и специфичности (91%) было пороговое значение <3,7 расч. ед. (отношение правдоподобия 9,04).
Таким образом, низкая стимуляторная активность М2 (М2а, М2с, М2апо) макрофагов, поляризованных из GM-CSF-дифференцированных про-М1 клеток, в алло-СКЛ при значениях ИС<3,7 расч. ед. отличает их от М1 макрофагов, поляризованных из GM-CSF-дифференцированных про-М1 клеток, со специфичностью 91% и чувствительностью 80.4%.
Пример 3.
Лпс
ил-4
декс
Из моноцитов крови здоровых доноров генерировали M-CSF-дифференцированные про-М2, которые затем были поляризованы в М1 макрофаги с помощью ЛПС (М1), или в М2 макрофаги с помощью ИЛ-4 (М2а, М2), или дексаметазона (М2с, М2), после чего оценили их стимуляторную активность в алло-СКЛ.
лпс
ил-4
декс
Ил-4
ДЕкс
Лпс
U
На рис. 5 показана аллостимуляторная активность М1 (М1) и М2 (М2, М2) макрофагов, поляризованных из M-CSF-дифференцированных про-М2 клеток. Данные представлены в виде M±SEM. Видно, что по сравнению с поляризованными М1 макрофагами индекс стимуляции М2 макрофагов, поляризованных с помощью ИЛ-4 или дексаметазона, в алло-СКЛ был почти в 3 раз ниже, составляя в среднем 2,42 и 2,41 расч. ед. для М2 и М2, соответственно, против 6,56 расч. ед. для М1 (p<0.01).
На рис. 6 представлена ROC-кривая, иллюстрирующая отношение между чувствительностью и специфичностью для различных точек разделения индекса стимуляции М1 и М2 (М2а и М2с) макрофагов, поляризованных из M-CSF-дифференцированных про-М2 клеток, в алло-СКЛ. ROC-анализ операционных характеристик теста и построенная характеристическая ROC-кривая показали, что площадь под кривой (AUC) для данного теста составила 0.89 (95% ДИ 0,79-0,99, р<0,0001).
Определение чувствительности, специфичности и отношения правдоподобия для различных точек разделения показало, что для индекса стимуляции в алло-СКЛ М1 и М2 (М2а, М2с) макрофагов, поляризованных из М-CSF-дифференцированных про-М2 клеток, точкой разделения, соответствующей максимальным показателям чувствительности (81%) и специфичности (89%) было пороговое значение <2,95 расч. ед. (отношение правдоподобия 7,3).
Таким образом, низкая стимуляторная активность М2 (М2а, М2с) макрофагов, поляризованных из M-CSF-дифференцированных про-М2 клеток, в алло-СКЛ при значениях ИС<2.95 расч. ед. отличает их от М1 макрофагов, поляризованных из M-CSF-дифференцированных про-М2 клеток, со специфичностью 89% и чувствительностью 81%.
Приведенные примеры представлены для иллюстрации, но не для ограничения объема заявленного изобретения. Другие варианты изобретения будут полностью очевидны специалистам в данной области.
Данное изобретение предлагает достаточно эффективный способ идентификации функционального М1 и М2 фенотипа макрофагов человека, генерированных in vitro из моноцитов крови, который отличается высокой диагностической точностью (специфичность на уровне 89-92% и чувствительность на уровне 80-81%), а также универсальностью подхода, поскольку позволяет идентифицировать различные популяции М1 и М2 макрофагов, включая про-М1 и про-М2 клетки, а также поляризованные различными стимулами М1 и М2 макрофаги. Упрощение способа идентификации функционального М1 и М2 фенотипа макрофагов человека достигается за счет оценки только одного, интегрального параметра - индекса стимуляторной активности тестируемых макрофагов в алло-СКЛ.