Роль проточной цитофлюориметрии в цитологической диагностике неходжкинских лимфом

ЦИТОЛОГИЯ

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012

УДК 616-006.441.04-076.5-073.537-078.33

Н. Н. Волченко, Е. Н. Славнова, Е. В. Наумова

РОЛЬ ПРОТОЧНОЙ ЦИТОФЛЮОРИМЕТРИИ В ЦИТОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКЕ НЕХОДЖКИНСКИХ ЛИМФОМ

ФГУ Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П. А. Герцена Минздравсоцразвития РФ, Москва

Методами проточной цитофлюориметрии и иммуноцитохимии в комбинации с рутинным цитологическим методом установлены диагнозы злокачественных лимфом и определены их иммунофенотипы у 81 больного с неходжкинскими лимфома-ми. Точность предложенной комбинации методов в установлении диагноза злокачественной лимфомы составляет 98%, а в определении иммунофенотипа - 90%. Представленная комбинация рутинного цитологического метода в сочетании с методами проточной цитофлюориметрии и иммуноцитохимии является экспресс-методом, позволяющим установить диагноз лимфомы и ее иммунофенотип в день обращения больного к врачу, что значительно повышает роль цитологического метода в диагностике лимфом. Методика позволяет исследовать одновременно большое количество лимфатических узлов, в том числе и глубоко расположенные, а не только поверхностные лимфатические узлы.

Ключевые слова: неходжкинские лимфомы, проточная цитофлюориметрия, иммуноцитохимия, цитологическая диагностика

N.N. Voltchenko, Ye.N. Slavnova, Ye.V. Naumova THE ROLE OF FLOW CYTOFLUOROMETRY IN CYTOLOGICAL DIAGNOSTIC OF NON-HODGKIN'S

LYMPHOMAS

The techniques of flow cytofluorometry and immune cytochemistry combined with routine cytological analysis were applied to 81 patients with non-Hodgkin's lymphomas to diagnose the malignant lymphomas and to determine their immune phenotypes. The accuracy of proposed techniques combination to diagnose the ma-lignant lymphoma consists 98% and to determine the immune phenotype - 90%. The presented combination of routine cytological analysis combined with tech-niques offlow cytofluorometry and immune cytochemistry is the express-technique to diagnose lymphoma and its immune phenotype the day of patient visit to the doctor. This approach .significantly increases the role of cytological method in diagnostics of lymphomas. The technique makes it possible to analyze simulta-neously huge quantity number of lymph nodes, including deep-seated and not on-ly the superficial lymph nodes.

Key words: non-Hodgkin's lymphoma, flow cytofluorometry, immune cytochemistry, cytological diagnostic

Успехи в иммуноморфологии и молекулярной генетике во многом определяют прогресс в изучении опухолей лим-фоидной системы [9, 11, 12, 15-17, 21]. Первую классификацию 1956 г, базировавшуюся только на морфологических данных, опубликовал H. Rappoport. На смену морфологическому подходу пришли иммуноморфологический и молеку-лярно-генетический подходы, составляющие основу REAL (Пересмотренная Европейско-Американская классификация лимфоидных опухолей) - классификации 1994 г. и классификаций ВОЗ 1997, 2001 и 2008 гг. [1-4, 16, 22].

В основе современной классификации опухолевых заболеваний лимфоидной системы ВОЗ лежат представления о стадиях дифференцировки лимфоидных клеток [16]. В большинстве случаев опухолевые клетки являются аналогами нормальных клеток, т. е. экспрессируют те же антигены, которые появляются на мембране или в цитоплазме клеток в процессе их дифференцировки на разных этапах созревания. Сходство между опухолевыми и нормальными клетками позволяет установить линейность (В-, Т- или NK-клеточные) и стадию созревания патологических клеток, что необходимо для

Для корреспонденции:

Волченко Надежда Николаевна, д-р мед. наук, проф., рук. отд-ния онкоцитологии

Адрес: 125284, Москва, 2-й Боткинский пр., 3 Телефон: 943-88-14 Е-таП:тшою1@таП.га

классификации, диагноза и прогностической оценки течения лимфомы. Каждой стадии дифференцировки гемопоэтиче-ских клеток соответствует свой набор дифференцировочных антигенов, разделенных на кластеры дифференцировки, обозначенные СБ. Это обозначение принято в 1982 г в Париже на I рабочем совещании по созданию единой номенклатуры моноклональных антител (МАТ), на котором МАТ со сходной специфичностью были объединены в группы - кластеры. Со временем "кластер дифференцировки" стал обозначать саму структуру на клеточной мембране, отражающую фенотип клетки. К настоящему времени известно более 363 антигенных структур - СБ, локализованных на мембране клеток различных ростков гемопоэза. Совокупность таких молекул отражает фенотип опухолевых клеток, позволяет установить их линейную принадлежность, стадию дифференцировки, метаболическую и пролиферативную активность [4-6]. В соответствии с классификацией ВОЗ 2001 г при диагностике лимфом особенно важно определение иммунофенотипа клеток опухоли, так как этим определяются дальнейшее лечение и прогноз заболевания.

Иммунофенотип клеток опухолей лимфоидной ткани можно определить разными способами и прежде всего проточной цитофлюориметрией, иммуноцитохимическим или иммуногистохимическим исследованием [4, 7, 8, 10, 13, 16, 19, 23]. Одним из перспективных способов является проточная цитофлюориметрия, в основе которой лежит проведение фотометрических и флюоресцентных измерений отдельных клеток, пересекающих одна за другой вместе с потоком жидкости лазерный луч монохроматического света. Преиму-

щества проточной цитофлюориметрии заключаются в следующем: исследование большого количества клеток за минимальное время (более 10 000 клеток за 1 с), возможность их сортировки по молекулярным свойствам, одновременное изучение нескольких антигенных структур на одной клетке.

В последнее время наблюдается рост удельного веса тонкоигольных пункционных биопсий лимфатических узлов, выполняющихся, как правило, под контролем ультразвукового исследования (УЗИ). Достоинство этого метода забора клеточного материала заключается во взятии биоптатов из глубоко расположенных лимфатических узлов без использования хирургического вмешательства. Большинство гистологов исследуют поверхностные лимфатические узлы. Наш опыт и данные литературы [8, 14, 20], однако, показывают, что точный диагноз может быть установлен при исследовании большого количества поверхностных и глубоко расположенных лимфатических узлов с помощью пункционной биопсии, и этот вид получения цитологического материала становится все более распространенным ввиду легкости получения материала и низкой частоты осложнений. Преимущества тонкоигольной пункционной биопсии под контролем УЗИ заключаются в следующем:

• не требуется госпитализации больного и наблюдения хирурга;

• практически не имеет осложнений;

• осуществляется прицельно и позволяет изучить максимально измененные, в том числе и глубоко расположенные, а не только поверхностные лимфатические узлы;

• при неудовлетворительной или малоклеточной тонкоигольной биопсии ее можно повторить;

• получение дополнительного клеточного материала для молекулярно-генетических, иммуноцитохимических и цитологических исследований;

• максимальная быстрота проведения исследования - по сути это экспресс-диагностика;

• "открытая" биопсия может быть запасным вариантом при неудаче пункционной биопсии.

Недостатком тонкоигольной аспирационной биопсии может быть недостаточное количество клеточного материала для диагностики или иммунофенотипирования лимфом.

Внедрение проточной цитофлюориметрии, имму-ноцитохимии в сочетании с цитологическим исследованием полноценных биоптатов позволяет не только максимально быстро и безопасно для больного установить диагноз лимфомы, но и определить ее иммунофе-нотип [10, 13, 14, 18, 19, 23].

Целью нашего исследования явилось определение роли цитологического метода в сочетании с проточной цитофлюориметрией в иммунофенотипировании и диагностике лимфом.

Материалы и методы. Материалом для исследования послужили биоптаты, полученные при тонкоигольной аспирационной биопсии лимфатических узлов у 81 больного, под контролем УЗИ. Часть клеточного материала, полученного при пункции, помещали на предметные стекла, окрашивали азур-эозином и подвергали рутинному цитологическому исследованию. Большую часть клеточного материала помещали в среду Хенкса и использовали для проведения проточной цитофлюориметрии и иммуноцитохимии. Иммунофе-нотипирование проводили на проточном цитофлюори-метре FACSCalibur (Becton Dikinson, США). Клеточные суспензии окрашивали МАТ с 2- и 3-цветными флюоресцентными метками (Becton Dikinson, США; DAKO, Дания). Анализ проводили с помощью специальной компьютерной программы Cell Quest. Параллельно проводили иммуноцитохимическое исследование методом Ultra Vision. Использована широкая панель монокло-нальных антител для иммунофенотипирования лимфом.

Для проточной цитофлюориметрии применяли моно-клональные мышиные антитела, меченные флюоресцентной меткой: CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD10, CD15, CD19, CD20, CD21, CD23, CD30, CD34, CD38, CD43, CD45, CD4, CD56, CD57, CD79a, CD 13 8, HLA-DR, TdT, BCL2 Oncoprotein, Lambda Light Chains, Kappa Light Chains.

Иммуноцитохимические исследования проводили с использованием перечисленных антител и дополнительно изучали экспрессию Cyclin D1, белка пролиферативной активности Ki-67, эпителиального мембранного антигена ЭМА, киназы анапластической лимфомы ALK1 фирмы DAKO.

После выполнения тонкоигольной аспирационной биопсии в случае установления цитологического диагноза лимфомы в утвердительной или предположительной форме проводили иммунофенотипирование методом проточной цитофлюориметрии. При дифференциальной диагностике лимфаденопатий неясного генеза и В-клеточных лимфом основным признаком злокачественности является клональ-ность, которая может быть установлена при наличии одного из типов легких цепей иммуноглобулинов (каппа или лямбда) на опухолевых клетках.

Нами было выполнено цитологическое исследование в сочетании с методами проточной цитофлюориметрии и им-муноцитохимии у 81 больного с различными неходжкински-ми злокачественными лимфомами.

Результаты и обсуждение. При рутинном цитологическом исследовании решалась важная задача - определение дальнейшей тактики обследования и лечения больного. Основные цитологические признаки лимфом хорошо известны:

• высокая клеточность препарата;

• "грязный" фон мазка, наличие большого количества "голых" ядер, нити ядерного детрита, "отшнурование" цито-плазматических глобул;

• мономорфность цитологической картины с редко выявляемыми реактивными фоновыми изменениями;

• для бластных вариантов характерно наличие полей как сохранившихся, так и полуразрушенных бластных клеток, могут определяться митозы;

Таблица 1

Дифференциальная диагностика В-клеточных неходжкинских злокачественных лимфом с использованием методов проточной цитофлюориметрии и иммуноцитохимии

Антиген

Гистологический тип лимфомы Пан-В (CD20, CD79a, CD19) BCL-2 CD5 CD10 CD23 Cyclin D1 другие

Хронический лимфолейкоз/ лимфома из малых лимфоцитов + + + + CD38+/-CD43+

Лимфома из клеток зоны мантии + +/- + + CD43-

Фолликулярная лимфома + +/- - + -/+ - -

Диффузная крупноклеточная В-клеточная лимфома + +/- CD30-/+ BCL-6+

МЛЬТ-лимфома + + - - -/+ -/- -

Примечание случаев позитивны.

Здесь и в табл. 2: (+/-) - 90% случаев позитивны; (-/+) - 10%

Рис. 1. Лимфома из клеток зоны мантии. Окраска по Лейшману. Об. 10.

• при небластных вариантах лимфом в отличие от гипер-плазий характерны скопления-"слепки" разрушенных опухолевых клеток, митозы не наблюдаются.

Цитологическое исследование и иммунофенотипирова-ние в диагностике В-клеточных лимфом. В-клеточные лим-фомы диагностированы в 66 наблюдениях. Определены их характерные иммунофенотипы (табл. 1).

Хронический лимфоцитарный лейкоз/В-клеточная лимфома из малых лимфоцитова диагностированы у 10 больных. При В-клеточной лимфоме из малых лимфоцитов цитограм-ма достаточно мономорфна, основной тип клеток составляют малые лимфоциты, имеющие скудную цитоплазму и округлое ядро с грубым комковатым хроматином, ядрышки не определяются. На этом фоне в небольшом количестве могут встречаться и более крупные клетки среднего и крупного размера. Следует иметь в виду наличие варианта лимфомы с плазмо-цитоидной дифференцировкой; при этом опухолевые клетки будут иметь ядра неправильной формы и более обильную цитоплазму. Проведенное иммунофенотипирование с помощью проточной цитофлюориметрии позволило в 10 наблюдениях верифицировать В-клеточную лимфому из малых лимфоцитов. Иммунофенотип В-клеточной лимфомы из малых лимфоцитов характеризовался экспрессией пан-В-клеточных маркеров CD19, CD20 и CD79a, а также коэкспрессией CD5 и CD23. Отсутствие экспрессии CD10 отличает В-клеточную лимфому из малых лимфоцитов от фолликулярной лимфомы, а отсутствие экспрессии Cyclin D1 и наличие CD23 позволяет исключить лимфому из клеток зоны мантии.

•ч-

о

Korotchenkova070809.004

т о-

ш

О-СЧ

о ::

1 i ' ; л'% л ><' -  .: Vtew «И ] ' * Ч •{ * . . и . 1  * '..45 ЙЙГ

--V^iiiiftj''' I—1 1  ill L............I'll! ""

CD20 FITC

Лимфома из клеток зоны мантии диагностирована у 6 больных. Цитограмма лимфом из клеток зоны мантии представлена клетками небольшого или среднего размера с неправильными контурами ядер, напоминающими центроциты (рис. 1). Хроматин умеренно плотный, ядрышки малозаметны. Центробласты и иммунобласты не встречаются. В целом клеточная картина достаточно мономорфная и напоминает хронический лимфоцитарный лейкоз или лимфому из малых лимфоцитов. Следует иметь в виду, что существует несколько морфологических вариантов лимфомы из клеток мантии: классический, мелкоклеточный, бластоидный (крупноклеточный) и плеоморфный. Трудности морфологической диагностики в установлении типа лимфомы могут возникнуть при бластоидном варианте лимфомы из клеток мантии. Разнообразие морфологических вариантов определяет необходимость проведения иммунофенотипирования для установления этого типа лимфомы. При проведении иммунофенотипирования опухолевые клетки экспрессировали пан-В-клеточные антигены CD19, CD20 и CD79a, CD5 (рис. 2) и отсутствовала экспрессия CD23 и CD10. Иммуноцитохимически определялась гиперэкспрессия Cyclin D1 в ядрах опухолевых клеток (рис. 3).

При фолликулярной лимфоме (20 больных) цитограмма представлена двумя типами опухолевых клеток: центроцита-ми и центробластами. Центроцит (маленькие клетки) - клетка несколько крупнее малого лимфоцита с неправильным ядром, имеющим глубокую выемку (расщелину), встречаются угловатые ядра с неровными волнистыми краями ядерной мембраны; ядра светлые, ядрышки практически неразличимы. Центробласт (большие клетки) - клетка в 2-3 раза больше малого лимфоцита; ядро округло-овальное, имеет 2-3 хорошо различимых ядрышка, расположенных у края ядерной мембраны. Цитоплазма узкая, слабобазофильная, может быть вакуолизирована. В классификации ВОЗ выделено три степени злокачественности фолликулярных лимфом в зависимости от числа центробластов, подсчитанных в 10 или 1 поле зрения гистологического препарата при большом увеличении микроскопа (об. 40): 0-5 центробластов на поле зрения - I степень, 6-15 центробластов на поле зрения - II степень и более 15 центробластов на поле зрения - III степень.

При иммунофенотипировании опухолевых клеток фолликулярной лимфомы наблюдалась экспрессия пан-В-клеточных маркеров CD19, CD20 и CD79a, а также CD10, отсутствовала экспрессия CD5 и CD23. Иммуноцитохимиче-ски определялась экспрессия белка - антагониста апоптоза BCL-2. Эту особенность можно использовать для дифференциальной диагностики фолликулярной лимфомы и фолликулярной гиперплазии, при которой центры фолликулов негативны по BCL-2.

Рис. 2. Коэкспрессия В-клеточного маркера CD20 и CD5 клетками лимфомы зоны мантий. Проточная цитофлюориметрия.

Рис. 3. Выраженная экспрессия Cyclin D1 клетками лимфо-мы зоны мантии. Иммуноцитохимия. Об. 40.

Таблица 2

Дифференциальная диагностика Т-клеточных неходжкинских лимфом с использованием проточной цитофлюориметрии и иммуноцитохимии

Гистологический Антиген

тип лимфомы CD3 CD4 CD5 CD7 CD8 CD30 CD56 другие

Лимфома с иммунофенотипом периферических Т-лимфоцитов, неуточненная +/- +/- + +/- -/+ -/+ -/+

Анапластическая крупноклеточная лимфома -/+ +/- + -/+ ALK+/-EMA+/-

При диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфо-ме - ДКВЛ (27 больных) цитограмма представлена различными крупными лимфоидными клетками, в среднем в 2 раза и более превышающими размер малого лимфоцита: центро-бластами, иммунобластами, клетками с многодольчатыми ядрами. Цитологически этот тип лимфомы отличается выраженным полиморфизмом, что позволяет выделить несколько морфологических вариантов: центробластный, иммуно-бластный, лимфому с обилием Т-лимфоцитов и гистиоцитов, анапластический. При центробластном типе ДКВЛ (15 больных) опухоль состоит из крупных лимфоидных клеток, имеющих везикулярную структуру хроматина, 2-4 ядрышка, расположенных у ядерной мембраны, и умеренно развитую базофильную цитоплазму. При иммунобластном типе ДКВЛ (5 больных) более 90% опухолевых клеток представлены иммунобластами, ядра которых имеют одно центрально расположенное крупное ядрышко и базофильную цитоплазму. Лимфома с обилием Т-лимфоцитов и гистиоцитов (5 больных) содержит менее 10% опухолевых В-лимфоцитов, имеющих вид центробластов, иммунобластов либо клеток, напоминающих клетки Березовского-Штернберга. При этом типе лимфомы важна как ее морфологическая диагностика, так и проведение иммунофенотипирования. Опухолевые клетки экспрессируют CD20, а также реактивные малые Т-лимфоциты-СБ3. Анапластический вариант (2 больных) представлен крупными овальными, круглыми, угловатыми клетками с плеоморфными ядрами, имеющими сходство с клетками Березовского-Штернберга. Иногда цитограмма может напоминать метастазы недифференцированного рака.

Иммунофенотип опухолевых клеток диффузной крупноклеточной лимфомы характеризовался экспрессией панк-В-клеточных антигенов - CD19, CD20, CD79a. При анапла-стическом варианте большинство клеток экспрессировали CD30, а в прочих вариантах он отсутствовал. В 50% наблюдений диффузных крупноклеточных лимфом отмечалась экспрессия CD10, в 10% - CD5. Во всех случаях Cyclin D1 не экспрессировался, отмечалась высокая пролиферативная активность (Ki-67 экспрессировался в 40-90% опухолевых клеток). В ряде случаев оценка пролиферативной активности (Ki-67) опухолевых клеток с использованием проточной цитофлюориметрии или иммуноцитохимии по мазкам позволяет провести дифференциальную диагностику между ДККЛ (менее 85% клеток) и лимфомой Беркитта (более 90% клеток). Диффузную крупноклеточную В-клеточную лимфому с обилием Т-лимфоцитов и гистиоцитов следует дифференцировать с лимфомой Ходжкина. В большинстве случаев при лимфоме Ходжкина опухолевые клетки характеризуются коэкспрессией CD15 и CD30 и отсутствием экспрессии CD20. Кроме того, обнаруживается клональность В-клеток при лимфоме ДККЛ.

Экстранодальная В-клеточная лимфома маргинальной зоны, связанная с лимфоидной тканью слизистых оболочек - MALT выявлена у 3 больных. Этот тип лимфомы может возникнуть в желудке, легких, слюнной железе, орбите,

щитовидной и молочной железах. До половины MALT-лимфом возникают в желудке. В нашем исследовании были MALT-лимфомы желудка, слюнной железы, орбиты. Цитологически опухоль достаточно сложно диагностировать, поскольку она представлена центроцитоподобными клетками преимущественно мелкого, реже среднего размера с неправильным контуром ядерной мембраны, умеренно плотным хроматином, малозаметным ядрышком, небольшим ободком светлой цитоплазмы. Возможна незначительная примесь больших клеток типа центробластов и иммунобластов, что может облегчить цитологическую диагностику.

Иммунофенотипически опухолевые клетки экспрессировали поверхностные иммуноглобулины, CD19, CD20, CD22 и CD79a, были негативны к CD5, CD10, Cyclin D1. Обращает на себя внимание невысокий уровень пролиферативной активности (Ki-67 до 20%).

Цитологическое иммунофенотипирование в диагностике Т-клеточных лимфом. Т-клеточные лимфомы верифицированы у 14 больных. Определены характеризующие их иммуно-фенотипы (табл. 2).

Лимфома с иммунофенотипом периферических Т-лимфо-цитов, неуточненная, названная так в связи с отсутствием каких-либо характерных клинико-морфологических черт (8 больных). В цитологическом препарате преобладали клетки крупного и среднего размера с неправильной формой ядер; хроматин мелкодисперсный или гиперхромный, определяются ядрышки. Встречались клетки со светлой цитоплазмой и сходные с клетками Березовского-Штернберга. Имеются морфологические варианты, в которых основную массу составляют клетки мелкого размера. Полиморфно-клеточный вариант периферической Т-клеточной лимфомы включает реактивно-клеточный компонент: пролиферацию эозинофилов, плазматических клеток, эпителиоидных гистиоцитов. При периферических Т-клеточных лимфомах имму-нофенотип характеризовался экспрессией Т-клеточных антигенов: CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD45RO. В крупных клетках определялся CD30.

Анапластическая крупноклеточная лимфома (6 случаев). Описаны 3 морфологических варианта анапластической крупноклеточной лимфомы: классический, лимфогистиоци-тарный и мелкоклеточный. Обязательным является наличие "диагностических" клеток с эксцентрично расположенным ядром подковообразной или почкообразной формы крупного размера и эозинофильно окрашенной зоной в перинуклеарной зоне цитоплазмы (рис. 4). В некоторых клетках могут наблюдаться инвагинации цитоплазмы в ядро, при этом ядро может

Рис. 4. Анапластическая крупноклеточная лимфома. Окраска по Лейшману. Об. 100.

Рис. 5. Экспрессия СБ30 клетками анапластической крупноклеточной лимфомы.

Проточная цитофлюориметрия.

напоминать бублик. Встречаются многоядерные клетки, причем ядра могут располагаться в виде венка по периферии цитоплазмы, иногда многоядерные клетки напоминают клетки Березовского-Штернберга. В ядрах определяются ядрышки. Диагностика крупноклеточной анапластической лимфомы невозможна без проведения иммунофенотипирования. В 5 случаях опухолевые клетки экспрессировали Т-клеточные антигены (рис. 7) - СБ3, СБ2, СБ7, СБ45Я0, а также СБ30 (рис. 5, 6, 7). Иммуноцитохимически опухолевые клетки были позитивны к ЕМА. В 2 случаях определялся СБ15. Согласно данным литературы [16], при анапластической крупноклеточной лимфоме возможна утрата части пан-Т-клеточных антигенов или даже всех из них на мембране опухолевых клеток, что приводит к тому, что опухоль, по данным иммуноцитохимии, имеет "нулевой" фенотип. Мы наблюдали один случай с "нулевым" иммунофенотипом. Клетки экспрессировали общий лейкоцитарный антиген, СБ30, АЬК1 и К1-67 (99% клеток). В 60-85% случаев при анапластической крупноклеточной лимфоме (АКЛ) выявляется белок АЬК1 (киназа анапластиче-ской лимфомы), появление которого связано с цитогенетиче-ской аномалией - транслокацией между 2-й и 5-й хромосомой. Все крупноклеточные лимфомы следует дифференцировать с метастазами низкодифференцированного аденогенного или плоскоклеточного рака, с нейроэндокринными опухолями, ме-ланомой. Для этих целей использовали общий лейкоцитарный антиген СБ45, эпителиальный маркер БегБР4, те1ап А или ме-ланосомный маркер НМБ45.

Т-клеточная лимфобластная лимфома диагностирована при цитологическом исследовании пунктата лимфатического узла в одном наблюдении - у мальчика 16 лет. Цитограмма лимфатического узла отличалась относительно мономорф-ным клеточным составом. В мазке обнаружены бластные клетки округлой или овальной формы с узким ободком умеренно базофильной цитоплазмы, не содержащей зернистости. Ядерный хроматин мелкогранулярный или более плотной консистенции. В ядрах одно-два крупных ядрышка. По диаметру клеток выделяют мелкоклеточную (8-12 мкм) и крупноклеточную (12-15 мкм) формы. Обычно в препарате определяются оба типа клеток с преобладанием одного из типов. У наблюдаемого больного преобладали микролим-фобласты, более крупные клетки встречались в небольшом количестве. При проведении иммунофенотипирования выявлялась ТОТ, экспрессировались Т-клеточные антигены СБ3, СБ4, СБ5, СБ7.

Сопоставление полученных данных с гистологическим и иммуногистохимическим исследованием показало, что точ-

Рис. 6. Экспрессия CD30 клетками анапластической крупноклеточной лимфомы. Мембранная экспрессия и паранукле-арное пятно. Иммуноцитохимия. Об. 10.

ность проточной цитофлюориметрии в сочетании с цитологическим методом в установлении диагноза злокачественного поражения лимфатических узлов составляет 100%, в диагностике злокачественных неходжкинских лимфом - 98%, в установлении иммунофенотипа и варианта неходжкинской злокачественной лимфомы - 90%. Основными трудностями в определении варианта неходжкинской злокачественной лимфомы при проведении иммунофенотипирования клеточной суспензии лимфатических узлов, полученной с помощью аспирационной биопсии, являются:

• малое количество клеточного материала, не позволяющего использовать широкую панель МАТ, особенно при отсутствии многоцветного анализа;

• сходство иммунофенотипа при некоторых вариантах НХЛ (например, фолликулярной лимфоме III степени злокачественности и ДККЛ; ДККЛ и лимфоме Беркитта);

• при диффузной крупноклеточной В-клеточной лим-фоме с обилием Т-лимфоцитов и гистиоцитов опухолевых В-клеток может быть менее 10% в цитологическом препарате, и при иммунофенотипировании основная популяция кле-

Рис. 7. Экспрессия Т-клеточного маркера CD3 клетками АКЛ.

Иммуноцитохимия. Об. 100.

ток будет экспрессировать CD3 (маркер Т-лимфоцитов). Тем не менее наличие небольшой моноклональной популяции В-лимфоцитов позволяет исключить Т-клеточную лимфому;

• АКЛ следует дифференцировать с диффузной В-кле-точной лимфомой и лимфомой Ходжкина. При АКЛ опухолевые клетки в большинстве случаев будут экспрессировать Т-клеточные антигены и анапластическую лимфомную ки-назу (ALK).

Таким образом, комбинация цитологического исследования с иммуноцитохимическим и методом проточной цитоф-люориметрии имеет ряд преимуществ, позволяющих повысить роль цитологического исследования в диагностике не-ходжкинских злокачественных лимфом.

Внедрение таких высокотехнологичных методов, как проточная цитофлюориметрия и иммуноцитохимия, позволяет пересмотреть роль цитологического метода в диагностике лимфом.

ЛИТЕРАТУРА

1. Гранов А. М., ИльинН. В. Лимфомы. - СПб., 2010.

2. Ковригина А. М., Пробатова Н. А. // Тезисы докл. IV конф. Рос. об-ва патологоанатомов "Новые методы и разработки в онкомор-фологии", посвящ. 100-летию со дня рождения академика АМН СССР Н. А. Краевского. - М., 2005. - С. 15.

3. Ковригина А. М., Пробатова Н. А. Лимфома Ходжкина и крупноклеточные лимфомы. - М., 2007.

4. КриволаповЮ. А., Леенман Е. Е. Морфологическая диагностика неходжкинских лимфом. - Алмата, 2005.

5. Луговская С. А., ПочтарьМ. Е. Гематологический атлас. - Тверь, 2004.

6. Луговская С. А., Почтарь М. Е., Тупицин Н. Н. Иммунофеноти-пирование в диагностике гемобластозов. - М., 2005.

7. Петров С. В., Райхлин Н. Т. Руководство по иммуногистохими-ческой диагностике опухолей человека. - Казань, 2004.

8. Райт Д., Леонг Э., Эддис Б. Морфологическая диагностика патологии лимфатических узлов. - М., 2008.

9. AielloA., DeliaD, GiardiniR. et al. // Mol. Pathol. - 2003. - Vol. 6, N 3. - P. 154-160.

10. Clatch R. J., Foreman J. R., Walloch J. L. // Cytometry. - 2008. - Vol. 34. - P. 3-16.

11. DabbsD. J. Diagnostic immunohistochemistry. - New York, 2002.

12. Davey D. D., KamarD, Zaleski S. et al. // Acta Cytol. - 2001. - Vol. 33. - P. 583-590.

13. Dunphy C. H., RamosR. // Diagn. Cytopathol. - 2004. - Vol. 16, N 3. - P. 200-206.

14. Frable W. J., Kardos T. F. // Am. J. Surg. Pathol. - 2004. - Vol. 12. -P. 62-72.

15. Gerders J., Schwab U., LemkeH., Stein H. // Int. J. Cancer. - 2001. -Vol. 31. - P. 13-20.

16. Jaffe E. S., Harris N. L., Stein H., Vardiman J. W. Pathology and genetics of tumours of haematopoietic and lymphoid tissues. - Lyon, 2001.

17. Jeffers M. D., McCorristion J., Farquharson M. A. et al. // Cytopathology. - 2003. - Vol. 8, N 2. - P. 114-120.

18. Orell S. R., SkinnerJ. M. // Pathology. - 2001. - Vol. 14. - P. 389-394.

19. Saddik M., ei Dabbagh L., Mourad W. A. // Diagn. Cytopathol. -2004. - Vol. 16, N 2. - P. 126-131.

20. Tani E., Lowhaagen T., NasiellK. et al. // Acta Cytol. - 2001. - Vol. 331. - P. 359-362.

21. Vianello F., Tison T., Radossi P. et al. // Leuk. Lymphoma. - 2004. -Vol. 29, N 1. - P. 179-185.

22. WHO. Classification of tumours of hematopoietic and lymphoid tissues / Steven H. Swerdlow, Elias Campo, Nancy Lee Harris et al.

- Lyon: International Agency for Research on Cancer, 2008.

23. Young N. A., Ai-Salem T. I., Ehya H., Smith M. R. // Cancer. - 2002.

- Vol. 84. - P. 252-261.

Поступила 20.12.11

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012

УДК 616.155.392.2-036.12-076.5-073.537

Д. Г. Кисиличина1, С. А. Луговская1, М. Е. Почтарь1, Е. В. Наумова1, Б. В. Бидерман2, А. Б. Судариков2, Е. А. Никитин2, В. В. Долгов1

ОСОБЕННОСТИ ОЦЕНКИ ЭКСПРЕССИИ ZAP-70 В ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТКАХ ПРИ В-КЛЕТОЧНОМ ХРОНИЧЕСКОМ ЛИМФОЛЕЙКОЗЕ МЕТОДОМ ПРОТОЧНОЙ ЦИТОФЛЮОРИМЕТРИИ

1Кафедра клинической лабораторной диагностики ГБОУ ДПО Российской медицинской академии последипломного образования Минздравсоцразвития РФ, 2ФГБУ Гематологический научный центр Минздравсоцразвития РФ, Москва

Среди всех лимфопролиферативных заболеваний В-клеточный хронический лимфолейкоз (В-ХЛЛ) является самым распространенным и характеризуется значительной вариабельностью клинического течения. Наиболее надежным прогностическим фактором, предсказывающим время до начала терапии при В-ХЛЛ, является мутационный статус генов вариабельного региона тяжелый: цепей иммуноглобулинов ^УИ), однако его определение на сегодняшний день остается недоступным для рутинной диагностики. Среди суррогатных маркеров мутационного статуса предлагается использовать показатель экспрессии 1АР-70 опухолевыми клетками В-ХЛЛ, оцениваемый с помощью проточной цитофлюориметрии. В литературе, однако, встречаются разные рекомендации к методике определения указанного маркера. С целью установления оптимального подхода для оценки экспрессии 1АР-70 быти исследованы образцы периферической крови 51 больного В-ХЛЛ и 10 условно здоровых лиц. Сопоставление с результатами определения мутационного статуса УИ-генов выявило преимущество использования метода вычисления соотношений МЕ1 при интерпретации данных экспрессии 1АР-70, полученный: с помощью проточной цитофлюориметрии. С использованием указанного подхода показатель экспрессии 1АР-70 можно применять для прогнозирования течения заболевания и времени до начала терапии В-ХЛЛ.

Ключевые слова: В-клеточный хронический лимфолейкоз, прогностические маркеры СБ38 и 1АР-70, проточная цитофлюориметрия