Т-КЛЕТОЧНЫЕ РЕЦЕПТОРЫ, СПЕЦИФИЧНЫЕ В ОТНОШЕНИИ КОМПЛЕКСА ОПУХОЛЕВЫЙ АНТИГЕН NY-ESO-1/HLA-A*02
T-CELL RECEPTORS SPECIFIC RELATIVELY TO COMPLEX OF TUMOR ANTIGEN NY-ESO-1/HLA-A*02

В настоящем изобретении предложены Т-клеточные рецепторы (TCR), которые связываются с рестриктированным по HLA-A*02 пептидом SLLMWITQC, происходящим из ракового антигена NY-ESO-1. Указанные TCR могут содержать мутации в пределах вариабельных доменов их альфа- и/или бета-цепей по сравнению с нативным TCR, специфичным по отношению к NY-ESO-1. TCR согласно настоящему изобретению, в частности, подходят для применения в качестве новых иммунотерапевтических реагентов для лечения злокачественного заболевания.
Уровень техники
+
+
+
Т-клеточные рецепторы (TCR) в естественных условиях экспрессируются CD4 и CD8 Т-клетками. TCR предназначены для распознавания коротких пептидных антигенов, представленных на поверхности антиген-презентирующих клеток в комплексе с молекулами главного комплекса гистосовместимости — МНС (у людей молекулы МНС также известны как человеческие лейкоцитарные антигены, или HLA, Davis, et al., (1998), Annu Rev Immunol 16: 523-544.). CD8 Т-клетки, которые также называют цитотоксическими Т-клетками, специфично распознают пептиды, связанные с МНС I класса и, в целом, отвечают за обнаружение и содействие в уничтожении инфицированных или раковых клеток.
+
+
Антиген NY-ESO-1 принадлежит семейству антигенов рака, кодируемых клеткам зародышевой линии (Chen, et al., (1997), Cytogenet Cell Genet 79(3-4): 237-240; публикация международной заявки WO 9814464) и имеет номер доступа в базе данных Uniprot Р78358. Было обнаружено, что такие эмбриональные антигены (антигены зародышевой линии) часто экспрессируются в различных видах рака, тогда как их экспрессия в нормальных тканях ограничивается яичками взрослых мужчин и другими иммунологически привилегированными областями. Специфичность указанных антигенов в отношении рака делает их идеальными мишенями для противораковых терапевтических средств. Точная функция NY-ESO-1 остается неизвестной, но его экспрессия была обнаружена в яичках эмбрионов и взрослых мужчин (Satie, et al., (2002), Lab Invest 82(6): 775-780), миометрии яичников и матки, а также в большом количестве разных видов рака, включая миелому (Andrade, et al., (2008), Cancer Immun 8: 2), рак яичников (Odunsi, et al., (2003), Cancer Res 63(18): 6076-6083), немелкоклеточный рак легких (Konishi, et al., (2004), Oncol Rep 11(5): 1063-1067) и меланому (Barrow, et al., (2006), Clin Рак Res 12(3 Pt 1): 764-771). 9-мерный пептид SLLMWITQC (SEQ ID NO 1) соответствует аминокислотам 157- 165 полноразмерного белка NY-ESO-1. Такой же пептид также обнаружен в LAGE-1A (номер доступа 075638-2) - другом раковом антигене (Lethe, et al., (1998), Int J Cancer 76(6): 903-908). Указанный пептид связывается с HLA-A*02, и комплекс пептид-HLA способен стимулировать цитотоксические Т-клетки, приводя к лизису NY-ESO-1HLA-A*02 опухолевых клеток (Duffour, et al., (1999), Eur J Immunol 29(10): 3329-3337 и публикация международной заявки WO2000020445). Комплекс SLLMWITQC/HLA-А*02, таким образом, представляет собой антиген-мишень, подходящий для иммунотерапевтического вмешательства.
Идентификация конкретных последовательностей TCR, которые связываются с комплексом SLLMWITQC/HLA-A*02, является перспективной в отношении разработки новых иммунотерапевтических средств. Такие терапевтические TCR можно применять, например, в качестве растворимых агентов с возможностью нацеливания для доставки цитотоксических или иммунных эффекторных агентов к опухоли (Lissin, et al., (2013). «High-Affmity Monocloncal T-cell Receptor (mTCR) Fusions. Fusion Protein Technologies for Biophamaceuticals: Applications and Challenges". S. R. Schmidt, Wiley; Boulter, et al., (2003), Protein Eng 16(9): 707-711; Liddy, et al., (2012), Nat Med 8: 980-987), или, в качестве альтернативы, их можно применять для конструирования Т-клеток для адоптивной терапии (June, et al., (2014), Cancer Immunol Immunother 63(9): 969-975). Желательно, чтобы TCR для иммунотерапевтического применения были способны активно распознавать антиген-мишень, что означает, что указанный TCR должен обладать высокой аффинностью и/или характеризоваться большим полупериодом связывания с антигеном-мишенью для индукции сильного ответа. TCR в естественных условиях, как правило, обладают низкой    аффинностью    в    отношении   антигена-мишени    (диапазон низких микромолярных концентраций), таким образом, часто является необходимым идентифицировать мутации, включая, но не ограничиваясь указанными, замены, инсерции и/или делеции, которые можно вводить в данную последовательность TCR для улучшения связывания антигена. Для применения в качестве растворимых агентов с возможностью нацеливания предпочтительной является аффинность связывания TCR с антигеном, находящаяся в наномолярном - пикомолярном диапазоне, и полупериод связывания, составляющий несколько часов. Также желательно, чтобы терапевтические TCR демонстрировали высокий уровень специфичности в отношении антигена-мишени для уменьшения риска токсичности, являющейся результатом нецелевого связывания, при клиническом применении. Достижение такой высокой специфичности может представлять особую сложность, учитывая естественную вырожденность распознавания антигена TCR (Wooldridge, et al., (2012), J Biol Chem 287(2): 1168-1177; Wilson, et al., (2004), Mol Immunol 40(14-15): 1047-1055). Наконец, желательно, чтобы указанные терапевтические TCR было возможно экспрессировать и очищать в высоко стабильной форме.
Последовательности TCR, определенные в настоящей заявке, описаны в соответствии с номенклатурой IMGT, которая широко известна и доступна специалистам, работающим в области изучения TCR. См., например: LeFranc and LeFranc, (2001). «Т-cell Receptor Factsbook», Academic Press; Lefranc, (2011), Cold Spring Harb Protoc 2011(6): 595-603; Lefranc, (2001), Curr Protoc Immunol Appendix 1: Appendix 1O; Lefranc, (2003), Leukemia 17(1): 260-266. **-TCR состоят из двух связанных дисульфидными связями цепей. В целом считается, что каждая цепь (альфа и бета) содержит два домена, а именно, вариабельный и константный домен. Короткий связывающий участок соединяет вариабельный и константный домены и, как правило, считается частью вариабельного участка. Кроме того, бета-цепь обычно содержит короткую область вариабельности между вариабельным и соединяющим участком.
Вариабельный домен каждый цепи расположен на N-конце и содержит три определяющих комплементарность участка (CDR), встроенных в каркасную последовательность. CDR содержат сайт распознавания связывания пептид-МНС.
Несколько генов кодируют вариабельные участки альфа-цепи (Va), и несколько генов кодирует вариабельные участки бета-цепи (VP). Указанные гены различаются по их каркасным последовательностям CDR1 и CDR2 и по частично определенной CDR3-последовательности. Гены Va и VP в соответствии с номенклатурой IMGT обозначаются с помощью приставки 'TRAV и 'TRBV соответственно (Folch and Lefranc, (2000), Exp Clin Immunogenet 17(1): 42-54; Scaviner and Lefranc, (2000), Exp Clin Immunogenet 17(2): 83-96; LeFranc and LeFranc, (2001), «Т-cell Receptor Factsbook», Academic Press). Подобным образом, существует несколько соединительных, или J, генов, называемых 'TRAJ' или 'TRBJ' для альфа и бета-цепи соответственно, и ген вариабельности, или ген D, для бета-цепи, называемый 'TRBD' (Folch and Lefranc, (2000), Exp Clin Immunogenet 17(2): 107-114; Scaviner and Lefranc, (2000), Exp Clin Immunogenet 17(2): 97-106; LeFranc and LeFranc, (2001), «T-Cell Receptor Factsbook», Academic Press). Огромное разнообразие последовательностей вариабельных участков альфа- и бета-цепей является результатом комбинаторных реаранжировок различных генов V, J и D, которые включают аллельные варианты, и дополнительного разнообразия J-сегментов (Arstila, et al., (1999), Science 286(5441): 958-961; Robins et al., (2009), Blood 114(19): 4099-4107.) Константные участки, или С-участки, альфа- и бета-цепей TCR называются 'TRAC и 'TRBC соответственно (Lefranc, (2001), Curr Protoc Immunol Appendix 1: Appendix 1O).
В настоящей заявке и формуле изобретения термин «вариабельный домен альфа-цепи (или а-цепи) TCR» относится к соединенным участкам TRAV и TRAJ; только участку TRAV или участку TRAV и частично TRAJ-участку, а термин «константный домен альфа-цепи (или а-цепи) TCR» относится к внеклеточному TRAC-участку или к С-концевой укороченной или полноразмерной последовательности TRAC. Подобным образом, термин «вариабельный домен бета-цепи (или Р-цепи) TCR» может относиться к соединенным участкам TRBV и TRBD/TRBJ; только к участкам TRBV и TRBD; только к участкам TRBV и TRBJ или к участку TRBV и частично участкам TRBD и/или TRBJ, а термин «константный домен бета-цепи (или р-цепи) TCR» относится к внеклеточному участку TRBC или С-концевой укороченной или полноразмерной последовательности TRBC.
TCR, которые направлены на NY-ESO-1, были ранее описаны (публикации международных заявок WO05113595 и WO08039818; источник McCormack, et al., (2013), Cancer Immunol Immunother 62(4): 773-785).
Авторы настоящего изобретения идентифицировали альтернативные последовательности вариабельных доменов альфа- и бета-цепей TCR, которые связываются с комплексом NY-ESO-1/HLA-A*02. Такие последовательности, в частности, подходят для применения в качестве терапевтических TCR для направленной иммунотерапии типов рака, при которых презентируется комплекс SLLMWITQC/HLA-A*02.
Авторы изобретения идентифицировали нативный TCR, включающий использование
следующих цепей:
Альфа-цепь: TRAV3*01/TRAJ28*01
Бета-цепь: TRBV29-1*01 /TRBD2*01 /TRBJ2-3*01
(Замечание: обозначение '*01' относится к аллельному варианту для указанной последовательности, как обозначено в соответствии с номенклатурой IMGT) Указанный нативный TCR использовали в качестве матрицы, на основе которой получали мутантные последовательности согласно настоящему изобретению.
Краткое описание изобретения
Настоящее изобретение согласно первому аспекту обеспечивает Т-клеточный рецептор (TCR), обладающий свойством связываться с комплексом SLLMWITQC (SEQ ID NO: 1)/HLA-A*02 и содержащий вариабельный домен альфа-цепи TCR и/или вариабельный домен бета-цепи TCR, где
указанный вариабельный домен альфа-цепи содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90%, например, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотам 1-117 последовательности SEQ ID NO: 2, и/или
указанный вариабельный домен бета-цепи содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90%, например, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотам 1-115 последовательности SEQ ID NO: 3.
Согласно второму аспекту изобретение обеспечивает TCR, который связывается с комплексом SLLMWITQC (SEQ ID NO: 1)/HLA-A*02 с аффинностью, превышающей 50 мкМ, где: CDR альфа-цепи 1, 2 и 3 содержат последовательности SEQ ID NO: 41, 42 и 43 соответственно, и/или CDR бета-цепи 1, 2 и 3 содержат последовательности SEQ ID NO: 44, 45 и 46 соответственно, и/или по меньшей мере один из CDR содержит одну или более консервативных замен по отношению к последовательностям SEQ ID NO: 41-46; и/или по меньшей мере один из CDR содержит до трех допустимых замен по отношению к последовательностям SEQ ID NO: 41-46.
Вариабельный домен альфа-цепи согласно первому или второму аспекту может содержать по меньшей мере одну из следующих мутаций (в соответствии с нумерацией последовательности SEQ ID NO: 2):
и/или вариабельный домен бета-цепи согласно первому или второму аспекту может содержать по меньшей мере одну из следующих мутаций (в соответствии с нумерацией последовательности SEQ ID NO: 3):
Вариабельный домен альфа-цепи может содержать по меньшей мере одну из следующих мутаций (в соответствии с нумерацией последовательности SEQ ID NO:2):
и/или вариабельный домен бета-цепи может содержать по меньшей мере одну из следующих мутаций (в соответствии с нумерацией последовательности SEQ ID NO:3):
Вариабельный домен альфа-цепи может содержать от 2 до 6 следующих мутаций (в соответствии с нумерацией последовательности SEQ ID NO: 2):
и/или вариабельный домен бета-цепи может содержать от 3 до 9 следующих мутаций (в соответствии с SEQ ID NO: 3):
Вариабельный домен альфа-цепи может содержать по меньшей мере одну из
следующих групп мутаций:
Группа 1:I51L, T52G, G53D, D54S, N55A
Группа 2:I51L, T52G, G53D, D54S, N55A, N97D
Группа 3:I51L, T52G, G53D, D54S, N55A, N97R
Группа 4:I96S, N97D, S98Q, G99H
Группа 5: D95S, I96S, N97R, S98Q, G99H
Группа 6:I51L, G53D,
и/или вариабельный домен бета-цепи может содержать по меньшей мере одну из следующих групп мутаций:
Группа 1: N50W, Q51T, S53G
Группа 2: S27K, Q28R, V29L, Т30А, M31L, N50W, Q51T, S53G
Группа 3: S27K, Q28R, V29L, Т30А, M31L, N50W, Q51T, S53G, G100A
Группа 4: S27K, Q28R, V29L, Т30А, N50W, Q51T
Группа 5: S27K, Q28R, V29L, Т30А, N50W, Q51T S53G
Группа 6: S27K, Q28R, V29L, Т30А, N50W, Q51T S53G, G100A
Группа 7: S27K, Q28R, V29L, Т30А, M31L, N50W, Q51T
Группа 8: Т30А, N50W, G100A.
Вариабельный домен альфа-цепи и вариабельный домен бета-цепи могут содержать следующие группы мутаций соответственно:
TCR согласно настоящему изобретению может содержать вариабельный домен альфа-цепи, который содержит следующую мутацию (в соответствии с нумерацией последовательности SEQ ID NO: 2):
и/или вариабельный домен бета-цепи может содержать по меньшей мере одну из следующих мутаций (в соответствии с нумерацией последовательности SEQ ID NO: 3):
В вариабельном домене альфа-цепи последовательность аминокислотных остатков 27 -32, 50 - 57 и 91 - 107 выбрана из следующих последовательностей:
Вариабельный домен альфа-цепи TCR может содержать аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90%, например, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 12.
В вариабельном домене бета-цепи последовательность аминокислотных остатков 27-31, 49-55 и 93-106 выбрана из следующих последовательностей:
Вариабельный домен бета-цепи TCR может содержать аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90%, например, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 15.
Вариабельный домен альфа-цепи может содержать последовательность аминокислотных остатков 27-32, 50-57 и 91-107, и вариабельный домен бета-цепи может содержать последовательность аминокислотных остатков 27-31, 49-55 и 93-106, выбранную из следующих последовательностей:
Вариабельный домен альфа-цепи может содержать аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90%, например, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 12, и вариабельный домен бета-цепи может содержать аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90%, например, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 15.
Вариабельный домен альфа-цепи может быть выбран из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6-12 или 51, и вариабельный домен бета-цепи может быть выбран из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 13-23 или 52.
Вариабельный домен альфа-цепи и вариабельный домен бета-цепи могут быть выбраны из следующих аминокислотных последовательностей:
TCR согласно настоящему изобретению может представлять собой альфа-бета-гетеродимер, содержащий последовательность константного домена альфа-цепи TRAC и последовательность константного домена бета-цепи TRBC1 или TRBC2.
Последовательности константных доменов альфа- и бета-цепи можно модифицировать путем их укорочения или введения замены с удалением нативной дисульфидной связи между Cys4 экзона 2 TRAC и Cys2 экзона 2 TRBC1 или TRBC2, и/или последовательность (последовательности) константного домена альфа- и/или бета-цепи можно модифицировать путем замены Thr 48 TRAC и Ser 57 TRBC1 или TRBC2 на цистеиновые остатки, где указанные цистеиновые остатки образуют не нативную дисульфидную связь между константными доменами альфа- и бета-цепи TCR.
TCR согласно настоящему изобретению может быть представляет в одноцепочечной форме типа Va-L-Vp, Vp-L-Va, Va-Ca-L-Vp, Va-L-Vp-Cp, где Va и VP представляют собой вариабельные участки а- и Р-цепей TCR соответственно, Са и Ср представляют собой константные области а- и Р-цепей TCR соответственно, и L представляет собой линкерную последовательность.
TCR согласно настоящему изобретению может быть связан с поддающейся выявлению меткой, терапевтическим агентом или фрагментом, модифицирующим фармакокинетические (ФК) свойства.
Изобретение также обеспечивает гибрид TCR/анти-CD3, содержащий TCR согласно настоящему изобретению и антитело против CD3, ковалентно связанное с С- или N-концом альфа- или бета-цепи указанного TCR, и такой гибрид TCR/анти-СD3 может содержать вариабельный домен альфа-цепи, выбранный из любой из последовательностей SEQ ID NO: 6-12 или 51, и вариабельный домен бета-цепи, выбранный из любой из последовательностей SEQ ID NO: 13-23 или 52. Бета-цепь может быть связана с последовательностью антитела против CD3 через линкерную последовательность. Указанная линкерная последовательность может быть выбрана из группы, состоящей из GGGGS (SEQ ID NO: 24), GGGSG (SEQ ID NO: 25), GGSGG (SEQ ID NO: 26), GSGGG (SEQ ID NO: 27), GSGGGP (SEQ ID NO: 28), GGEPS (SEQ ID NO: 29), GGEGGGP (SEQ ID NO: 30) и GGEGGGSEGGGS (SEQ ID NO: 31).
Гибрид TCR/анти-CD3 согласно настоящему изобретению может содержать пары аминокислотной последовательности альфа-цепи и аминокислотной последовательности бета-цепи, которые по меньшей мере на 90%, например, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичны парам аминокислотных последовательностей, представленным в Таблице ниже.
Изобретение также обеспечивает нуклеиновую кислоту, кодирующую TCR или гибрид TCR/анти-CD3 согласно настоящему изобретению.
Также предложена не встречающаяся в природе и/или очищенная и/или сконструированная клетка, презентирующая TCR или гибрид TCR/анти-CD3 согласно настоящему изобретению, содержащая (а) вектор экспрессии TCR, который содержит нуклеиновую кислоту согласно настоящему изобретению в одной открытой рамке считывания или двух отдельных открытых рамках считывания, кодирующих альфа-цепь и бета-цепь соответственно; или (b) первый вектор экспрессии, который содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую альфа-цепь TCR или гибрид TCR/анти-CD3 согласно настоящему изобретению, и второй вектор экспрессии, который содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую бета-цепь TCR или гибрида TCR/анти-CD3 согласно настоящему изобретению.
Клетка, презентирующая TCR или гибрид TCR/анти-CD3, или клетка, содержащая вектор (векторы) экспрессии, может представлять собой Т-клетку.
Изобретение также обеспечивает фармацевтическую композицию, содержащую TCR или гибрид TCR/анти-CD3 согласно настоящему изобретению, или клетку согласно настоящему изобретению вместе с одним или более фармацевтически приемлемыми носителями или вспомогательными веществами.
Изобретение также обеспечивает TCR, гибрид TCR/анти-CD3 или нуклеиновую кислоту или клетку согласно настоящему изобретению для применения в медицине. TCR, гибрид TCR/анти-CD3, клетка или нуклеиновая кислота может быть обеспечена для применения в способе лечения рака у субъекта, представляющего собой человека.
Субъект, представляющий собой человека, может иметь опухоль, которая экспрессирует NY-ESO-1 и/или LAGE-1A, и указанная опухоль может представлять собой солидную опухоль и быть выбрана из синовиальной саркомы, немелкоклеточной карциномы легкого (НМККЛ), рака мочевого пузыря, рака желудка, рака предстательной железы, колоректального рака, рака молочной железы, рака яичника, рака пищевода, меланомы, множественной миеломы, гепатоклеточной карциномы и рака головы и шеи. Субъект, представляющий собой человека, может представлять собой субъекта с подтипом HLA-A*02.
Подробное описание изобретения
Согласно первому аспекту настоящее изобретение обеспечивает Т-клеточный рецептор (TCR), обладающий свойством связываться с комплексом SLLMWITQC (SEQ ID NO: 1)/HLA-A*02 и содержащий вариабельный домен альфа-цепи TCR и/или вариабельный домен бета-цепи TCR, где указанный вариабельный домен альфа-цепи содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90%, например, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотам 1-117 последовательности SEQ ID NO: 2, и/или вариабельный домен бета-цепи содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90%, например, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотам 1-115 последовательности SEQ ID NO: 3. TCR может быть выделенным, свободным от клеток и/или растворимым, т.е. он может не представлять собой TCR, встречающийся в его естественном состоянии в Т-клетке тела человека.
Изобретение также обеспечивает TCR, который связывается с комплексом SLLMWITQC (SEQ ID NO: 1)/HLA-A*02 с аффинностью, превышающей 50 мкМ, где:
CDR альфа-цепи 1, 2 и 3 содержат последовательности SEQ ID NO: 41, 42 и 43 соответственно, и/или CDR бета-цепи 1, 2 и 3 содержат последовательности SEQ ID NO: 44, 45 и 46 соответственно; и/или по меньшей мере один из CDR содержит одну или более консервативных замен по отношению к последовательностям SEQ ID NO: 41 - 46; и/или по меньшей мере один из CDR содержит до трех допустимых замен по отношению к последовательностям SEQ ID NO: 41-46. Аффинность TCR в отношении комплекса SLLMWITQC/HLA-A*02 может составлять в диапазоне от 50 мкМ до 100 нМ. Предпочтительно, указанные замены изменяют аффинность связывания не более чем на +/- 50% или, более предпочтительно, не более чем на +/-20% по сравнению с незамещенным TCR.
Для получения стабильных растворимых TCR согласно настоящему изобретению растворимый вариант нативного TCR использовали в качестве исходной последовательности, имеющей последовательность, показанную на Фигуре 2. Для этой цели цистеиновые замены вводили в участки TRAC и TRBC таким образом, чтобы могла образовываться не нативная межцепочечная дисульфидная связь. Подходящие положения для размещения указанных цистеиновых замен описаны в публикации международной заявки WO 03020763. Не Фигуре 2 показаны внеклеточные последовательности дикого типа альфа- и бета-цепей TCR в растворимой форме соответственно. Последовательность SEQ ID NO: 4 идентична нативной внеклеточной последовательности альфа-цепи SEQ ID NO: 2, за исключением замещения Thr48 TRAC на Cys. Подобным образом, последовательность SEQ ID NO: 5 идентична нативной внеклеточной последовательности бета-цепи SEQ ID NO: 3, за исключением замещения Ser57 TRBC на Cys, Cys75 на Ala и Asn201 на Asp. Растворимый TCR дикого типа, описанный выше, можно использовать для обеспечения эталонного образца, с которым можно сравнивать профиль связывания мутантных TCR. TCR согласно первому аспекту также может представлять собой TCR согласно второму аспекту.
Рецепторы TCR согласно любому или обоим аспектам изобретения могут быть не встречающимися в природе и/или очищенными и/или сконструированными. TCR согласно  настоящему  изобретению  могут  содержать  более  одной мутации,
присутствующей в вариабельном домене альфа-цепи и/или вариабельном домене бета-цепи, по отношению к нативному TCR NY-ESO-1.
Термины «сконструированный TCR» и «мутантный TCR» используются в настоящей заявке как синонимы и в целом означают TCR, который содержит одну или более введенных мутаций по отношению к TCR NY-ESO-1 дикого типа, в частности, в вариабельном домене альфа-цепи и/или вариабельном домене бета-цепи. Мутации предпочтительно вводят в пределах CDR. Указанные мутации (мутация), как правило, приводят к улучшению аффинности связывания TCR с комплексом SLLMWITQC (SEQ ID NO: 1)/HLA-A*02. Вариабельный домен альфа-цепи может содержать по меньшей мере одну, две, три, четыре, пять или шесть из следующих мутаций (в соответствии с нумерацией последовательности SEQ ID NO: 2):
и/или вариабельный домен бета-цепи может содержать по меньшей мере одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь или девять из следующих мутаций (в соответствии с нумерацией последовательности SEQ ID NO: 3):
Вариабельный домен альфа-цепи может содержать по меньшей мере одну из следующих мутаций (в соответствии с нумерацией последовательности SEQ ID NO:
1) :
и/или вариабельный домен бета-цепи может содержать по меньшей мере одну из следующих мутаций (в соответствии с нумерацией последовательности SEQ ID NO:
1) :
Вариабельный домен альфа-цепи содержит по меньшей мере одну из следующих групп мутаций:
Группа 1:I51L, T52G, G53D, D54S, N55A
Группа 2:I51L, T52G, G53D, D54S, N55A, N97D
Группа 3:I51L, T52G, G53D, D54S, N55A, N97R
Группа 4:I96S, N97D, S98Q, G99H
Группа 5: D95S, I96S, N97R, S98Q, G99H
Группа 6:I51L, G53D;
и/или вариабельный домен бета-цепи содержит по меньшей мере одну из следующих
групп мутаций:
Группа 1: N50W, Q51T, S53G
Группа 2: S27K, Q28R, V29L, Т30А, M31L, N50W, Q51T, S53G
Группа 3: S27K, Q28R, V29L, Т30А, M31L, N50W, Q51T, S53G, G100A
Группа 4: S27K, Q28R, V29L, Т30А, N50W, Q51T
Группа 5: S27K, Q28R, V29L, Т30А, N50W, Q51T S53G
Группа 6: S27K, Q28R, V29L, Т30А, N50W, Q51T S53G, G100A
Группа 7: S27K, Q28R, V29L, Т30А, M3IL, N50W, Q51T
Группа 8: Т30А, N50W, G100A.
Конкретные комбинации групп мутаций могут быть такими, как представлено в таблице ниже:
В TCR согласно настоящему изобретению могут присутствовать конкретные комбинации мутаций, как представлено в таблицах ниже:
В частности, вариабельные домены альфа- и бета-цепи могут содержать следующие комбинации аминокислотных последовательностей:
Согласно конкретным вариантам реализации изобретения, в CDR альфа-цепи присутствует 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 мутаций, например, 2-6 мутаций, и/или в CDR
бета-цепи присутствует 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 мутаций, например, 3-9 мутаций. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, вариабельный домен а-цепи TCR согласно настоящему изобретению может содержать аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98 % или по меньшей мере на 99% идентична последовательности аминокислотных остатков 1-117 последовательности SEQ ID NO: 2, при условии что вариабельный домен а-цепи содержит по меньшей мере одну из мутаций, описанных выше. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, вариабельный домен Р-цепи TCR согласно настоящему изобретению может содержать аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98 % или по меньшей мере на 99% идентична последовательности аминокислотных остатков 1-115 последовательности SEQ ID NO: 3, при условии что вариабельный домен р-цепи содержит по меньшей мере одну из мутаций, описанных выше. Вариабельный домен альфа-цепи может содержать аминокислотную последовательность любой из последовательностей SEQ ID NO: 6-12 или 51. Вариабельный домен бета-цепи может содержать аминокислотную последовательность любой из последовательностей SEQ ID NO: 13-23 или 52.
Мутации также можно вводить за пределами участков CDR. Такие мутации могут улучшать связывание, но предпочтительно повышают выход очищенного продукта и стабильность. Примеры таких мутаций в вариабельном домене альфа-цепи (в соответствии с нумерацией последовательности SEQ ID NO: 2) могут представлять собой следующие мутации:
и/или вариабельный домен бета-цепи может содержать по меньшей мере одну из следующих мутаций (в соответствии с нумерацией последовательности SEQ ID NO: 3):
D
Мутации в исходном TCR могут включать мутации, способные повышать аффинность связывания (kи/или полупериод связывания) TCR с SLLMWITQC. Мутации могут включать такие мутации, которые способны снижать частоту неспецифичного связывания, т.е. снижать связывание с другими антигенами помимо связывания с SLLMWITQC, или повышать специфичность связывания TCR с SLLMWITQC. Мутации могут включать такие мутации, которые повышают эффективность фолдинга и/или продукции. Некоторые мутации могут влиять на каждую из указанных характеристик, другие могут влиять, например, на аффинность, но не специфичность, или специфичность, но не аффинность, и т.д.
D
D
D
Фенотипически не проявляющиеся («молчащие») варианты любого TCR согласно настоящему изобретению, описанные в настоящей заявке, включены в объем изобретения. При использовании в настоящей заявке термин «фенотипически не проявляющийся («молчащий») вариант» относится к TCR, который содержит одну или более дополнительных аминокислотных замен помимо замен, перечисленных выше, где фенотип указанного TCR подобен фенотипу соответствующего TCR, не содержащего указанную замену (замены). В рамках настоящей заявки фенотип TCR включает аффинность связывания антигена (K и/или полупериод связывания) и антигенную специфичность. K и/или полупериод связывания с комплексом SLLMWITQC (SEQ ID NO: 1)/HLA-A*02 указанного фенотипически не проявляющегося («молчащего») варианта может составлять в пределах 20% от измеренной K и/или полупериода связывания соответствующего TCR, не содержащего указанной замены (замен), при измерении в идентичных условиях (например, при температуре 25°С и на одной и той же SPR-матрице). Подходящие условия дополнительно определены в Примере 3. Антигенная специфичность
дополнительно определена ниже. Как известно специалисту в данной области техники, возможно получать TCR, содержащие замены в вариабельных доменах по отношению к TCR, подробно описанным выше, без изменения аффинности взаимодействия с комплексом SLLMWITQC (SEQ ID NO: 1)/HLA-A*02. В частности, такие «молчащие» мутации могут быть включены в части последовательности, которые, как известно, непосредственно не вовлечены в связывание антигена (например, части за пределами CDR или части CDR, не контактирующие с пептидным антигеном). Такие обычные варианты включены в объем настоящего изобретения. TCR, в которых были сделаны одна или более консервативных и/или допустимых замен, также формируют часть настоящего изобретения. Допустимые замены также являются фенотипически «молчащими», но могут не являться консервативными, как определено ниже. Допустимые замены могут приводить к снижению аффинности в отношении комплекса SLLMWITQC/HLA-A*02 по сравнению с TCR, не содержащим указанные допустимые замены. Аффинность может снижаться на 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40% или 50% по сравнению с аффинностью TCR, не содержащего указанную допустимую замену. Снижение аффинности не приводит к аффинности, составляющей менее (т.е. являющейся более слабой чем) 50 мкМ.
TCR согласно настоящему изобретению могут также содержать одну или более консервативных замен, которые имеют сходную аминокислотную последовательность и/или которые сохраняют такую же функцию. Специалисту в данной области техники известно, что различные аминокислоты обладают сходными свойствами и, таким образом, являются «консервативными». Одна или более таких аминокислот белка, полипептида или пептида часто могут быть замещены на одну или более других таких аминокислот без подавления желаемой активности указанного белка, полипептида или пептида.
Таким образом, аминокислоты глицин, аланин, валин, лейцин и изолейцин часто замещают друг на друга (аминокислоты, содержащие алифатические боковые цепи). Из указанных возможных замен глицин и аланин предпочтительно используются для замещения друг друга (поскольку они имеют относительно короткие боковые цепи), и валин, лейцин и изолейцин используют для замещения друг друга (поскольку они
имеют более объемные алифатические боковые цепи, которые являются гидрофобными). Другие аминокислоты, которые могут часто замещать друг друга, включают: фенилаланин, тирозин и триптофан (аминокислоты, имеющие ароматические боковые цепи); лизин, аргинин и гистидин (аминокислоты, имеющие основные боковые цепи); аспартат и глутамат (аминокислоты, имеющие кислотные боковые цепи); аспарагин и глутамин (аминокислоты, имеющие амидные боковые цепи); и цистеин и метионин (аминокислоты, имеющие сера-содержащие боковые цепи).
Замены указанного типа часто называют «консервативными» или «полуконсервативными» аминокислотными заменами. Настоящее изобретение, таким образом, распространяется на применение TCR, содержащего аминокислотную последовательность, описанную выше, но содержащую одну или более консервативных замен в последовательности, таким образом, что аминокислотная последовательность указанного TCR по меньшей мере на 90%, например, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична TCR, содержащему аминокислоты 1-117 последовательностей SEQ ID NO: 2, 6-12 или 51 и/или аминокислоты 1-115 последовательностей SEQ ID NO: 3, 13-23 или 52.
Конкретные комбинации вариабельного домена альфа-цепи и вариабельного домена бета-цепи могут быть следующими:
Аминокислотные замены по отношению к последовательностям, приведенным выше, можно осуществлять с применением подходящего метода, например, с использованием сайт-направленного мутагенеза или твердофазного синтеза.
Следует понимать, что в пределах настоящего изобретения возможны аминокислотные замены с использованием природных или не встречающихся в природе аминокислот. Например, в настоящей заявке предполагается, что метальная группа аланина может быть замещена на этильную группу, и/или что минорные изменения могут быть внесены в пептидный остов. Независимо от использования природных или синтетических аминокислот, предпочтительно, чтобы присутствовали только L- аминокислоты.
«Идентичность», как известно в данной области техники, представляет собой сходство между двумя или более полипептидными последовательностями или двумя или более полинуклеотидными последовательностями по результатам сравнения указанных последовательностей. В данной области техники идентичность также означает степень родства последовательностей между полипептидными или полинуклеотидными последовательностями (в зависимости от ситуации) по результатам определения совпадений между цепями таких последовательностей. В то время как существует ряд методов для измерения идентичности между двумя полипептидными или двумя полинуклеотидными последовательностями, способы, которые обычно используются для определения идентичности, закодированы в компьютерных программах. Предпочтительные компьютерные программы для определения идентичности между двумя последовательностями включают, но не ограничиваются указанными, пакет программ GCG (Devereux, et al., Nucleic Acids Research, 12, 387 (1984), BLASTP, BLASTN, и FASTA (Atschul et al., J. Molec. Biol. 215, 403 (1990)).
Можно использовать программу, такую как программа CLUSTAL, для сравнения аминокислотных последовательностей. Указанная программа сравнивает аминокислотные последовательности и находит оптимальное выравнивание путем введения промежутков в любую последовательность при необходимости. Возможно рассчитывать идентичность или подобие по аминокислотам (идентичность плюс консервативность типа аминокислот) для оптимального выравнивания. Программа типа   BLASTx   выравнивает   сходные   последовательности   с максимальной
протяженностью и присваивает значение соответствию. Таким образом, возможно получать результаты сравнения, в которых обнаруживается несколько областей подобия, все из которых имеют разную оценку. Оба типа анализа идентичности рассматриваются согласно настоящему изобретению.
Процентную идентичность двух аминокислотных последовательностей или двух последовательностей нуклеиновых кислот определяют путем выравнивания последовательностей для оптимального сравнения (например, можно вводить пропуски в первую последовательность для наилучшего выравнивания с последовательностью) и сравнения аминокислотных остатков или нуклеотидов в соответствующих положениях. «Наилучшее выравнивание» представляет собой выравнивание двух последовательностей, которое приводит к максимальной процентной идентичности. Процентную идентичность определяют на основе числа идентичных аминокислотных остатков или нуклеотидов в сравниваемых последовательностях (т.е. % идентичность = число идентичных положений/общее число положений х100).
Определение процентной идентичности между двумя последовательностями можно осуществлять с применением математического алгоритма, известного специалистам в данной области техники. Пример математического алгоритма для сравнения двух последовательностей представляет собой алгоритм Карлина и Алтшуля (Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268), модифицированный в соответствии с источником Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877). Программы NBLAST и XBLAST по Алтшулю и др. (Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410) включают указанный алгоритм. Поиск нуклеотидов с помощью BLAST-анализа можно осуществлять с использованием программы NBLAST (оценка = 100, «длина слова» = 12) для получения нуклеотидных последовательностей, гомологичных молекулам нуклеиновой кислоты. Поиск белков с помощью BLAST-анализа можно осуществлять с использованием программы XBLAST (оценка = 50, «длина слова» = 3) для получения аминокислотных последовательностей, гомологичных белковым молекулам для применения согласно настоящему изобретению. Для получения выровненных последовательностей с
http://www.ncbi.nlm.nih.gov
пробелами для их сравнения можно применять Gapped BLAST, как описано в источнике Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402. Альтернативно, PSI-Blast можно использовать для осуществления итерационного поиска, который выявляет отдаленные сходства между молекулами (тот же источник). При использовании программ BLAST, Gapped BLAST и PSI-Blast можно использовать параметры, установленные по умолчанию в соответствующих программах (например, XBLAST и NBLAST). См. . Другой пример математического алгоритма, используемого для сравнения последовательностей, представляет собой алгоритм Майерса и Миллера (Myers and Miller, CABIOS (1989). Программа ALIGN (версия 2,0), которая является частью пакета программ для выравнивания последовательностей CGC, включает такой алгоритм. Другие алгоритмы для анализа последовательностей, известные в данной области техники, включают ADVANCE и ADAM, как описано в источнике Torellis and Robotti (1994) Comput. Appl. Biosci., 10 :3-5; и FASTA, описанный в источнике Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444-8. В случае алгоритма FASTA ktup представляет собой контрольный параметр, который устанавливает чувствительность и скорость поиска.
rd
Curr Opin Biotechnol
Мутации можно осуществлять с применением подходящего способа, включая, но не ограничиваясь указанными, способы на основе методов полимеразной цепной реакции (ПЦР), рестрикционного клонирования на основе фермента или независимого от лигирования клонирования (НЛК). Указанные способы подробно описаны во многих стандартных текстах по молекулярной биологии. Дополнительные подробности относительно полимеразной цепной реакции (ПЦР) и рестрикционного клонирования на основе фермента можно найти в источнике Sambrook & Russell, (2001) Molecular Cloning - A Laboratory Manual (3 Ed.) CSHL Press. Дополнительную информацию по методам независимого от лигирования клонирования (LIC) можно найти в источнике Rashtchian, (1995) 6(1): 30-6.
TCR согласно второму аспекту может содержать каркасный участок 2 (FM2) альфа-цепи и каркасный участок 3 (FM3) альфа-цепи, где FM2- и FM3-участки содержат SEQ
ID NO: 47 и 48 соответственно и/или содержат одну или более консервативных замен и/или вплоть до трех допустимых замен.
TCR согласно второму аспекту может содержать FM2-участок бета-цепи и FM3-участок бета-цепи, где указанные FM2- и FM3-участки содержат последовательности SEQ ID NO:49 и 50 соответственно и/или содержат одну или более консервативных замен и/или вплоть до трех допустимых замен.
TCR согласно второму аспекту может содержать аминокислоты 1-117 последовательности SEQ ID NO: 2 и/или аминокислоты 1-115 последовательности SEQ ID NO: 3, каждая из которых может содержать одну или более консервативных замен и/или до трех допустимых мутаций и/или одну или более из мутаций, определенных в Таблице 1 или Таблице 2.
TCR согласно настоящему изобретению обладают свойством связываться с комплексом SLLMWITQC (SEQ ID NO: 1)/HLA-A*02. Было обнаружено, что TCR согласно настоящему изобретению являются высоко специфичными в отношении указанного эпитопа по сравнению с другими, нерелевантными, эпитопами и, таким образом, подходят, в частности, для применения в качестве направляющих векторов для доставки терапевтических агентов или поддающихся выявлению меток к клеткам и тканям, презентирующим указанные эпитопы. Специфичность в контексте TCR согласно настоящему изобретению относится к их способности распознавать экспрессирующие HLA-A*02 клетки-мишени, содержащие пептид SLLMWITQC, при минимальной способности распознавать экспрессирующие HLA-A*02 клетки-мишени, не содержащие указанный пептид. Для оценки специфичности TCR могут быть представлены в растворимой форме и/или могут экспрессироваться на поверхности Т-клеток. Распознавание можно определить путем измерения уровня Т-клеточной активации в присутствии TCR и клетки-мишени. В этом случае минимальное распознавание не содержащих пептид клеток-мишеней определяется как уровень Т-клеточной активации, составляющий менее 20%, предпочтительно, менее 10%, более предпочтительно, менее 5%, от уровня Т-клеточной активации, наблюдаемого в присутствии содержащих пептид клеток-мишеней, при измерении в
-9
одинаковых условиях. Специфичность растворимых TCR согласно настоящему изобретению можно определять как терапевтически значимую концентрацию TCR. Терапевтически значимая концентрация может быть определена как концентрация TCR, составляющая 10 М или менее, и/или концентрация TCR, до 100 или до 1000 раз превышающую соответствующее значение ЕС50. Содержащие пептид клетки могут быть получены путем примирования указанным пептидом или, более предпочтительно, указанные клетки могут презентировать указанный пептид в естественных условиях. Предпочтительно, как содержащие пептид, так и не содержащие пептид клетки представляют собой клетки человека. Специфичность можно измерять, например, в клеточных анализах, таких как анализы, описанные в Примерах 6-8. Специфичность может также относиться к способности связываться с комплексом NY-ESO-1/HLA-A*02 и не связываться с многочисленными презентируемыми в естественных условиях комплексами пептид/HLA по результатам определения с помощью Biacore, например. Предпочтительно, связывание с комплексом NY-ESO-1/HLA-A*02 по меньшей мере в 400 раз превышает связывание с другими презентируемыми в естественных условиях комплексами пептид/HLA.
D
D
D
K TCR согласно настоящему изобретению для комплекса NY-ESO-1/HLA-A*02 может составлять более (т.е. быть сильнее чем) 50 мкМ, например, между 50 мкМ и 1 пкМ. K конкретных TCR согласно настоящему изобретению для указанного комплекса может составлять от примерно 1 пкМ до примерно 50 нМ, от примерно 1 пкМ до примерно 400 пкМ, от примерно 20 пкМ до примерно 200 пкМ. Полупериод связывания  TCR согласно настоящему изобретению с комплексом может составлять в диапазоне от примерно 1 сек до примерно 60 ч или более, от примерно 30 мин до примерно 60 ч или более или от примерно 6 ч до примерно 60 ч или более. K TCR, предназначенных для применения в качестве растворимых терапевтических средств и/или диагностических средств с сочетании с поддающейся выявлению меткой или терапевтическим агентом, для комплекса предпочтительно составляет от примерно 1 пкМ до примерно 200 пкМ или от примерно 20 пкМ до примерно 100 пкМ по результатам определения с использованием способа BIAcore Примера 3, и/или полупериод связывания указанных TCR для комплекса может составлять от примерно 2 ч до 60 ч или более или от примерно 20 ч до примерно 60 ч или более по результатам
D
определения с использованием способа BIAcore Примера 3. Конкретные TCR согласно настоящему изобретению могут быть подходящими для применения в адоптивной терапии; K таких TCR для комплекса может составлять от примерно 50 нМ до примерно 50 мкМ или от примерно 100 нМ до примерно 1 мкМ и/или полупериод связывания таких TCR для комплекса может составлять от примерно 3 сек до примерно 12 мин.
Аффинность связывания и/или полупериод связывания конкретных TCR согласно настоящему изобретению для комплекса SLLMWITQC/HLA-A*02 по существу превышает аффинность связывания нативного TCR. Повышение аффинности связывания нативного TCR часто приводит к снижению специфичности указанного TCR в отношении его лиганда пептид/МНС, как показано в источнике Zhao Yangbing et al., The Journal of Immunology, The American Association of Immunologists, US, vol. 179, No,9, 1 November 2007, 5845-5854. Однако TCR согласно настоящему изобретению могут сохранять специфичность в отношении комплекса SLLMWITQC/HLA-A*02, несмотря на существенно более высокую аффинность связывания по сравнению с нативным TCR.
D
2
D
2
off
2
off
D
off
1
1
1
Т
/
Аффинность связывания (обратно пропорциональная константе равновесия K) и полупериод связывания (выраженный как Т/) можно определить с помощью поверхностного плазмонного резонанса (BIAcore) и/или способа Octet Примера 3 в настоящей заявке. Следует понимать, что удвоение аффинности TCR приводит к уменьшению K в два раза.  рассчитывается как ln2, деленный на скорость диссоциации (k). Таким образом, удвоение Т'/ приводит к уменьшению k в два раза. Значения K и k для TCR обычно измеряют для растворимых форм TCR, т.е. для форм TCR, укороченных с удалением остатков цитоплазматического и трансмембранного домена. Предпочтительно аффинность связывания или полупериод связывания данного TCR измеряют несколько раз, например, 3 или более, с использованием одного и того же аналитического протокола и берут среднее от полученных результатов.
TCR для применения в качестве направляющего агента для доставки терапевтических агентов к антиген-презентирующей клетке может быть представлен в растворимой форме (т.е. не содержать трансмембранные или цитоплазматические домены). В TCR согласно настоящему изобретению, предпочтительно, растворимые **-гетеродимерные TCR, для их стабильности может быть встроена дисульфидная связь между остатками соответствующих константных доменов, как описано, например, в публикации международной заявки WO 03/020763. Один или два из константных доменов, присутствующих в аР-гетеродимере согласно настоящему изобретению, могут быть укорочены на С-конце или С-концах, например, укорочены на вплоть до 15 или 10 или 8 или менее аминокислот. С-конец внеклеточной константной области альфа-цепи может быть укорочен на 8 аминокислот. Для применения в адоптивной терапии оф-гетеродимерный TCR можно, например, трансфицировать в виде полноразмерных цепей, содержащих как цитоплазматические, так и трансмембранные домены. TCR для применения в адоптивной терапии могут содержать дисульфидную связь, соответствующую встречающейся в естественных условиях дисульфидной связи между соответствующими константными доменами альфа- и бета-цепи. Дополнительно или альтернативно, может присутствовать не нативная дисульфидная связь.
TCR согласно настоящему изобретению могут представлять собой сф-гетеродимеры или могут быть одноцепочечными. Одноцепочечные формы включают полипептиды ap-TCR типов Va-L-Vp, Vp-L-Va, Va-Ca-L-Vp или Va-L-Vp-Cp, где Va и Vp представляют собой вариабельные области а- и р-цепи TCR соответственно, Са и Ср представляют собой константные области а- и р-цепи TCR соответственно и L представляет собой линкерную последовательность. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения одноцепочечные TCR согласно настоящему изобретению могут содержать дисульфидную связь, встроенную между остатками соответствующих константных доменов, как описано в публикации международной заявки WO 2004/033685. Одноцепочечные TCR дополнительно описаны в публикациях международных заявок WO2004/033685; W098/39482; WO01/62908 и источниках Weidanz et al. (1998) J Immunol Methods 221(1-2): 59-76; Hoo et al. (1992) Proc Natl Acad Sci U S A 89(10): 4759-4763; Schodin (1996) Mol Immunol 33(9): 819-829).
Специалисту в данной области техники будет понятно, что возможно укорачивать предложенные последовательности на С-конце и/или N-конце на 1, 2, 3,4, 5 или более остатков, по существу не оказывая влияния на характеристики связывания TCR. Все такие стандартные варианты включены в настоящее изобретение.
Альфа/бета-гетеродимерные TCR согласно настоящему изобретению обычно содержат последовательность константного домена альфа-цепи TRAC и/или последовательность константного домена бета-цепи TRBC1 или TRBC2. Последовательности константных доменов альфа- и бета-цепи можно модифицировать путем их укорочения или введения замены с удалением нативный дисульфидной связи между Cys4 экзона 2 TRAC и Cys2 экзона 2 TRBC1 или TRBC2. Последовательность (последовательности) константного домена альфа- и/или бета-цепи также может быть модифицирована путем замены Thr 48 TRAC и Ser 57 TRBC1 или TRBC2 на цистеиновые остатки, где указанные цистеиновые остатки образуют дисульфидную связь между константными доменами альфа- и бета-цепи TCR.
Согласно дополнительному аспекту, настоящее изобретение обеспечивает нуклеиновую кислоту, кодирующую TCR согласно первому и/или второму аспекту изобретения. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, нуклеиновая кислота представляет собой кДНК. Согласно некоторым вариантам реализации, изобретение обеспечивает нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность, кодирующую вариабельный домен а-цепи TCR согласно настоящему изобретению. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, изобретение обеспечивает нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность, кодирующую вариабельный домен Р-цепи TCR согласно настоящему изобретению. Нуклеиновая кислота может быть не встречающиеся в природе и/или очищенной и/или сконструированной.
Согласно другому аспекту, изобретение обеспечивает вектор, который содержит нуклеиновую кислоту согласно настоящему изобретению. Предпочтительно, вектор представляет собой вектор экспрессии TCR.
Изобретение также обеспечивает клетку, содержащую вектор согласно настоящему изобретению, предпочтительно, вектор экспрессии TCR. Вектор может содержать нуклеиновую кислоту согласно настоящему изобретению, кодирующую в одной открытой рамке считывания или двух отдельных открытых рамках считывания альфа-цепь и бета-цепь соответственно. Согласно другому аспекту, изобретение обеспечивает клетку, содержащую первый вектор экспрессии, который содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую альфа-цепь TCR согласно настоящему изобретению, и второй вектор экспрессии, который содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую бета-цепь TCR согласно настоящему изобретению. Такие клетки, в частности, применимы для адоптивной терапии. Клетки согласно настоящему изобретению могут быть выделенным и/или рекомбинантными и/или не встречающимися в природе и/или сконструированными.
et al.,
J Immunol.
et al,
Nat Rev Cancer
Поскольку TCR согласно настоящему изобретению применимы в адоптивной терапии, изобретение включает не встречающуюся в природе и/или очищенную и/или сконструированную клетку, в частности, Т-клетку, презентирующую TCR согласно настоящему изобретению. Изобретение также обеспечивает размножаемую популяцию Т-клеток, презентирующих TCR согласно настоящему изобретению. Существует ряд методов, подходящих для трансфекции Т-клеток нуклеиновой кислотой (такой как, ДНК, кДНК или РНК), кодирующей TCR согласно настоящему изобретению (см., например, Robbins (2008) 180: 6116-6131). T-клетки, экспрессирующие TCR согласно настоящему изобретению, подходят для применения в лечении рака на основе адоптивной терапии. Как известно специалисту в данной области техники, существует ряд подходящих методов, с помощью которых можно проводить адоптивную терапию (см., например, Rosenberg (2008) 8(4): 299-308).
Растворимые TCR согласно настоящему изобретению применимы для доставки поддающихся выявлению меток или терапевтических агентов к антиген-презентирующим клеткам и тканям, содержащим указанные антиген-презентирующие клетки. Таким образом, указанные растворимые TCR могут быть связаны (ковалентно или другим образом) с поддающейся выявлению меткой (для
диагностических целей, где TCR используется для выявления наличия клеток, презентирующих комплекс SLLMWITQC/HLA-A*02); терапевтическим агентом или фрагментом, модифицирующим фармакокинетические (ФК) свойства (например, путем ПЭГилирования).
Поддающиеся выявлению метки для диагностических целей включают, например, флуоресцентные метки, радиоактивные метки, ферменты, нуклеиновокислые зонды и контрастирующие реагенты.
Терапевтические агенты, которые могут быть связаны с TCR согласно настоящему изобретению, включают иммуномодуляторы, радиоактивные соединения, ферменты (например, перфорин) или химиотерапевтические агенты (например, цисплатин). Для гарантии того, что токсическое действие развивается в желаемой области, токсин может быть помещен внутрь липосомы, связанной с TCR, таким образом, чтобы происходило медленное высвобождение соединения, что позволяет предотвращать повреждающее действие во время транспорта в теле и гарантировать, что указанный токсин оказывает минимальное воздействие после связывания TCR с релевантными антиген-презентирующими клетками.
Другие подходящие терапевтические агенты включают:
• низкомолекулярные цитотоксические агенты, т.е. соединения, обладающие способностью уничтожать клетки млекопитающих и имеющие молекулярную массу, составляющую менее 700 Дальтон. Такие соединения также могут содержать токсичные металлы, способные оказывать цитотоксическое действие. Более того, необходимо понимать, что указанные низкомолекулярные цитотоксичные агенты также включают про-лекарственные средства, т.е. соединения, которые разрушаются или преобразуются при физиологических условиях с высвобождением цитотоксических агентов. Примеры таких агентов включают цисплатин, производные майтансина, рахелмицин, калихеамицин, доцетаксел, этопозид, гемцитабин, ифосфамид, иринотекан, мелфалан, митоксантрон, порфимер
натрий (фотофрин II), темозоломид, топотекан, триметреат глюкуронат, ауристатин Е, винкристин и доксорубицин;
• пептидные цитотоксины, т.е. белки или их фрагменты, способные уничтожать клетки млекопитающих. Например, рицин, дифтерийный токсин, экзотоксин А бактерий рода Pseudomonas, ДНКаза и РНКаза;
• радионуклиды, т.е. нестабильные изотопы элементов, распад которых сопровождается испусканием одной или более а- или Р- частиц или у-лучей. Например, йод-131, рений 186, индий 111, иттрий 90, висмут 210 и 213, актиний 225 и астат 213; хелатирующие агенты можно использовать для облегчения соединения указанных радионуклидов с высокоаффинными TCR или их мультимерами;
• иммуностимуляторы, т.е. эффекторные молекулы иммунной системы, стимулирующие иммунный ответ. Например, цитокины, такие как IL-2 и IFN-γ;
• суперантигены и их мутантные формы;
• гибриды TCR/HLA, например, слияние в комплекс пептид/HLA, где указанный пептид происходит из обычного патогена человека, такого как вирус Эпштейна-Барра (EBV);
• хемокины, такие как IL-8, тромбоцитарный фактор 4, стимулирующий рост меланомы белок и т.д.;
• антитела или их фрагменты, включая антитела против детерминанты Т-клеток или NK-клеток (например, антитела против CD3, CD28 или CD 16);
• альтернативные белковые каркасы, обладающие подобными антителу характеристиками связывания;
• активаторы комплемента;
• ксеногенные белковые домены, аллогенные белковые домены, вирусные/бактериальные белковые домены, вирусные/бактериальные пептиды.
Один предпочтительный вариант реализации обеспечивает гибрид TCR/aHTH-CD3, содержащий TCR согласно настоящему изобретению, связанный (как правило, путем слияния с N- или С-концом альфа- или бета-цепи) с антителом против CD3 или его
функциональным фрагментом или вариантом (такие гибриды TCR/aHTH-CD3 могут называться молекулами ImmTAC™). При использовании в настоящей заявке, термин TCR включает гибриды TCR, такие как гибрид TCR/aHTH-CD3. При использовании в настоящей заявке, термин «антитело» включает указанные фрагменты и варианты. Примеры антител против CD3 включают, но не ограничиваются указанными, ОКТЗ, UCHT-1, ВМА-031 и 12F6. Фрагменты антител и варианты/аналоги, подходящие для применения в композициях и способах, описанных в настоящей заявке, включают минитела, Fab-фрагменты, F(аb')2-фрагменты, dsFv- и scFv-фрагменты, нанотела (nanobodies™ - конструкции, которые поставляются компанией Ablynx (Бельгия) и содержат единственный синтетический вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина, произошедший из антитела верблюдовых, например, верблюда или ламы) и доменные антитела (Domantis, Бельгия), содержащие единственный вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина или вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина с созревшей аффинностью), или альтернативные белковые каркасы, обладающие подобными антителу характеристиками связывания, такие как аффитела (Affibody, Швеция, содержащие сконструированный каркас белка А), или антикалины (Pieris, Германия, содержащие сконструированные антикалины), среди прочих.
Связывание TCR и антитела против CD3 может быть прямым или не прямым - через линкерную последовательность. Линкерные последовательности, как правило, являются гибкими, поскольку они состоят главным образом из таких аминокислот, как глицин, аланин и серии, которые не имеют объемных боковых цепей, вероятно, ограничивающих подвижность. Применимую или оптимальную длину линкерных последовательностей легко определить. Длина линкерной последовательности часто составляет менее чем примерно 12, например, менее 10 или от 5 до 10 аминокислот. Подходящие линкеры, которые можно использовать в гибридах TCR/aHTH-CD3 согласно настоящему изобретению, включают, но не ограничиваются указанными: GGGGS (SEQ ID NO: 24), GGGSG (SEQ ID NO: 25), GGSGG (SEQ ID NO: 26), GSGGG (SEQ ID NO: 27), GSGGGP (SEQ ID NO: 28), GGEPS (SEQ ID NO: 29), GGEGGGP (SEQ ID NO: 30) и GGEGGGSEGGGS (SEQ ID NO: 31), как описано в публикации международной заявки WO2010/133828.
Конкретные варианты реализации конструктов гибридов aHTH-CD3/TCR согласно настоящему изобретению включают пары альфа- и бета-цепей, как показано в таблице ниже.
Особо предпочтительный гибрид aHTH-CD3/TCR содержит альфа-цепь SEQ ID NO: 37 и бета-цепь SEQ ID NO: 38.
et al.
in vitro
in vivo,
Для некоторых целей TCR согласно настоящему изобретению можно объединять в комплекс, содержащий несколько TCR, с получением мультивалентного TCR-комплекса. Существует ряд человеческих белков, содержащих домен мультимеризации, которые можно применять в продукции мультивалентных TCR-комплексов, например, домен тетрамеризации р53, который использовали для получения тетрамеров scFv-фрагментов антитела, обладающих повышенной стабильностью в сыворотке и значительно сниженной скоростью диссоциации по сравнению с мономерным scFv-фрагментом (Willuda (2001) J. Biol. Chem. 276 (17) 14385-14392). Гемоглобин также содержит домен тетрамеризации, который можно использовать для применения указанного типа. Мультивалентный комплекс TCR согласно настоящему изобретению может обладать повышенной способностью связывания комплекса SLLMWITQC/HLA-A*02 по сравнению с не мультимерным TCR дикого типа или гетеродимером Т-клеточного рецептора согласно настоящему изобретению. Таким образом, мультивалентные комплексы TCR согласно настоящему изобретению также включены согласно настоящему изобретению. Такие мультивалентные TCR-комплексы согласно настоящему изобретению, в частности, применимы для отслеживания или нацеливания на клетки, презентирующие конкретные антигены или и также полезны в качестве промежуточных
соединений для получения дополнительных мультивалентных TCR-комплексов, которые можно применять таким образом.
in vivo,
in vitro
Как хорошо известно в данной области техники, TCR можно подвергать посттрансляционным модификациям. Гликозилирование представляет собой одну из таких модификаций, которая включает ковалентное присоединение олигосахаридных фрагментов к определенной аминокислоте в цепи TCR. Например, аспарагиновые остатки или серин/треониновые остатки представляют собой хорошо известные положения присоединения олигосахарида. Статус гликозилирования конкретного белка зависит от ряда факторов, включая белковую последовательность, конформацию белка и доступность конкретных ферментов. Более того, статус гликозилирования (т.е. тип олигосахарида, ковалентная связь и общее количество присоединений) может влиять на функцию белка. Таким образом, при получении рекомбинантных белков часто является желательным контролировать гликозилирование. Контролируемое гликозилирование использовали для улучшения терапевтических средств на основе антител (Jefferis R., Nat Rev Drug Discov. 2009 Mar;8(3):226-34.). Для растворимых TCR согласно настоящему изобретению гликозилирование можно контролировать например, с использованием конкретных клеточных линий, или путем химической модификации. Такие модификации являются желательными, поскольку гликозилирование может улучшать фармакокинетические свойства, снижать иммуногенность и позволять более точную имитацию нативного человеческого белка (Sinclair AM and Elliott S., Pharm Sci. 2005 Aug;94(8):1626-35).
TCR или гибриды TCR/aHTH-CD3 согласно настоящему изобретению (предпочтительно связанные с поддающейся выявлению меткой или терапевтическим агентом или экспрессируемые на трансфицированной Т-клетке) или клетки согласно настоящему изобретению для введения пациентам могут быть представлены в фармацевтической композиции вместе с одним или более фармацевтически приемлемыми носителями или вспомогательными веществами. Терапевтические TCR или TCR для визуализации, TCR-гибриды или клетки в соответствии с изобретением обычно обеспечиваются как часть   стерильной   фармацевтической   композиции,   которая   обычно содержит
фармацевтичеки приемлемый носитель. Указанная фармацевтическая композиция может быть представлена в любой подходящей форме (в зависимости от желаемого способа ее введения пациенту). Указанная композиция может обеспечиваться в единичной форме дозирования и в целом обеспечивается в запечатанном контейнере и может быть представлена как часть набора. Такой набор обычно (но не обязательно) содержит инструкции по применению. Указанный набор может включать множество указанных единичных форм дозирования.
Фармацевтическая композиция может быть адаптирована для введения с помощью любого подходящего способа, такого как парентеральное (включая подкожное, внутримышечное или внутривенное), кишечное (включая пероральное или ректальное), ингаляционное или интраназальное введение. Такие композиции могут быть получены с помощью любого метода, известного в области фармацевтики, например, путем смешивания активного ингредиента с носителем (носителями) или вспомогательным веществом (веществами) в стерильных условиях.
Дозы веществ согласно настоящему изобретению могут варьировать в широких пределах в зависимости от заболевания или расстройства, подлежащего лечению, возраста и состояние субъекта, подлежащего лечению, и т.д. Подходящий диапазон доз для растворимого TCR согласно настоящему изобретению, связанного с антителом против CD3, может составлять между 25 нг/кг и 50 мкг/кг. В конечном итоге подходящие дозы для применения определяет врач.
TCR, фармацевтические композиции, векторы, нуклеиновые кислоты и клетки согласно настоящему изобретению могут быть представлены по существу в чистой форме, например, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85 %, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100% чистой форме.
Изобретение также обеспечивает:
• TCR, гибрид TCR/aHTH-CD3, нуклеиновую кислоту или клетку согласно настоящему изобретению для применения в медицине, предпочтительно для применения в способе лечения рака.
• применение TCR, гибрида TCR/aHTH-CD3, нуклеиновой кислоты или клетки согласно настоящему изобретению в изготовлении лекарственного средства для лечения рака;
• способ лечения рака у пациента, включающий введение указанному пациенту TCR, гибрида TCR/aHTH-CD3, нуклеиновой кислоты или клетки согласно настоящему изобретению.
Рак, подлежащий лечению, может представлять собой синовиальную саркому, немелкоклеточную карциному легкого (НМККЛ), рак мочевого пузыря, рак желудка, рак предстательной железы, колоректальный рак, рак молочной железы, рак яичника, рак пищевода, меланому, множественную миелому, гепатоклеточную карциному и рак головы и шеи.
Предпочтительные признаки каждого аспекта изобретения соответствуют предпочтительным признакам каждого из других аспектов с соответствующими изменениями. Документы согласно предшествующему уровню техники, упомянутые в настоящей заявке, включены в максимальной степени, разрешенной законом.
Изобретение описано далее со ссылкой на следующие неограничивающие фигуры и примеры, где:
На Фигуре 1 представлены аминокислотные последовательности внеклеточных участков нативных вариабельных доменов альфа- и бета-цепей согласно настоящему изобретению;
На Фигуре 2 представлены аминокислотные последовательности растворимых внеклеточных участков нативных альфа- и бета-цепей согласно настоящему изобретению;
На Фигуре 3 представлены аминокислотные последовательности мутантных вариабельных участков альфа-цепи TCR согласно настоящему изобретению;
На Фигуре 4 представлены аминокислотные последовательности мутантных вариабельных участков бета-цепи TCR согласно настоящему изобретению;
На Фигуре 5 представлены аминокислотные последовательности молекул ImmTAC, содержащих последовательности TCR согласно настоящему изобретению;
На Фигуре 6 представлены аминокислотные последовательности молекул ImmTAC, содержащих последовательности TCR согласно настоящему изобретению;
На Фигуре 7 представлены аминокислотные последовательности молекул ImmTAC, содержащих последовательности TCR согласно настоящему изобретению;
На Фигуре 8 представлены аминокислотные последовательности молекул ImmTAC, содержащих последовательности TCR согласно настоящему изобретению;
На Фигуре 9 показано активное и специфичное связывание молекул ImmTAC согласно настоящему изобретению;
На Фигуре 10 показано дополнительное исследование активности для 2 молекул ImmTAC согласно настоящему изобретению;
На Фигуре 11 показано дополнительное исследование специфичности для 3 молекул ImmTAC согласно настоящему изобретению; и
На Фигуре 12 показано уничтожение опухолевых клеток ImmTAC-перенаправленными Т-клетками.
Примеры
Пример 1 - Экспрессия, рефолдинг и очистка растворимых TCR
Molecular cloning.
Е. coli
Последовательности ДНК, кодирующие внеклеточные участки альфа- и бета-цепей растворимых TCR согласно настоящему изобретению клонировали раздельно в экспрессионные плазмиды на основе pGMT7 с применением стандартных методов (как описано в источнике Sambrook, et al. Vol. 2. (1989) New York: Cold spring harbor laboratory press). Экспрессивные плазмиды трансформировали раздельно в штамм Rosetta (BL21pLysS) и одиночные ампициллин-устойчивые колонии растили при температуре 37°С в среде TYP (+ ампициллин, 100 мкг/мл) до достижения СЮбоо -0,6-0,8 с последующей индукцией экспрессии белка с помощью 0,5 мМ IPTG. Клетки собирали через три часа после индукции посредством центрифугирования. Клеточные осадки лизировали с помощью реагента для белковой экстракции BugBuster (Merck Millipore) в соответствии с инструкциями производителя. Осадки, содержащие тельца включения, восстанавливали путем центрифугирования. Осадки промывали два раза в Тритон-содержащем буфере (50 мМ Трис-HCl рН 8,1, 0,5% Тритон-Х100, 100 мМ NaCl, 10 мМ Na-ЭДТА) и, наконец, ресуспендировали в не содержавшем детергент буфере (50 мМ Трис-HCl рН 8,1, 100 мМ NaCl, 10 мМ Na-ЭДТА). Белковый выход телец включения определяли количественно путем солюбилизирования с помощью 6 М гуанидина-HCl и измерения OD280. Затем рассчитывали концентрацию белка с использованием коэффициента экстинкции. Чистоту телец включения измеряли путем солюбилизирования с помощью 8 М мочевины и нанесения ~2 мкг на 4-20% ДСН-ПААГ при восстанавливающих условиях. Затем оценивали или рассчитывали чистоту с применением денситометрической программы (Chemidoc, Biorad). Тельца включения хранили при +4°С для кратковременного хранения и при -20°С или -70°С для более длительного хранения.
Для рефолдинга растворимых TCR содержащие α- и β-цепи тельца включения сначала перемешивали и разводили в 10 мл буфера для солюбилизирования/денатурирования (6 М гидрохлорид гуанидина, 50 мМ Трис НСl рН 8,1, 100 мМ NaCl, 10 мМ ЭДТА, 20 мМ DTT) с последующим инкубированием в течение 30 мин при 37°С. Затем инициировали рефолдинг путем дополнительного разведения в 1 л буфера для
2
рефолдинга (100 мМ Трис рН 8,1,400 мМ L-аргинин-НCl, 2 мМ ЭДТА, 4 М мочевина, 10 мМ гидрохлорид цистеамина и 2,5 мМ дигидрохлорид цистамина) и раствор хорошо перемешивали. Подвергнутую рефолдингу смесь диализовали против 10 л НО в течение 18-20 часов при 5 °С ± 3 °С. После этого диализный буфер дважды замещали на 10 мМ Трис, (рН 8,1, 10 л) и продолжали диализовать в течение дополнительных 15 часов. Подвергнутую рефолдингу смесь затем фильтровали через целлюлозные фильтры (0,45 мкм).
Очистку растворимых TCR инициировали путем нанесения диализированного продукта рефолдинга на анионообменную колонку POROS 50HQ и вымывания связанного белка с помощью градиента 0-500 мМ NaCl в 20 мМ Трис рН 8,1 с использованием 50 колоночных объемов с применением очистителя Akta (GE Healthcare). Пиковые фракции TCR идентифицировали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецил-сульфата натрия (ДСН-ПААГ) с их последующим объединением и концентрированием. Концентрированный образец затем наносили на колонку для гель-фильтрации Superdex 75HR (GE Healthcare), предварительно уравновешенную в ФСБ-буфере Дульбекко. Пиковые фракции TCR объединяли и концентрировали и рассчитывали конечный выход очищенного материала.
Пример 2 - Экспрессия, рефолдинг и очистка молекул ImmTAC (растворимых гибридов TCR/aHTH-CD3)
ImmTAC получали, как описано в Примере 1, за исключением того, что бета-цепь TCR гибридизовали через линкер с одноцепочечным антителом против CD3. Кроме того, этап катионного обмена осуществляли во время очистки после анионного обмена. В этом случае пиковые фракции, полученные в результате анионного обмена, разводили в 20 раз в 20 мМ MES (рН 6,5) и наносили на катионообменную колонку POROS 50HS. Связанный белок вымывали с помощью градиента 0-500 мМ NaCl в 20 мМ MES. Пиковые фракции ImmTAC объединяли и доводили до рН 8,1 с помощью 50 мМ раствора Tris, затем концентрировали и наносили непосредственно на матрицу для гель-фильтрации, как описано в Примере 1.
Пример 3 - Характеристика связывания
Анализ связывания очищенных растворимых TCR и молекул ImmTAC с комплекстом релевантный пептид/HLA проводили с помощью поверхностного плазмонного резонанса с применением инструмента BIAcore 3000 или BIAcore Т200 или с помощью биослойной интерферометрии с применением инструмента ForteBio Octet). Биотинилированные молекулы I класса HLA-A*02 подвергали рефолдингу с интересующим пептидом и очищали с помощью методов, известных специалистам в данной области техники (O'Callaghan et al. (1999). Anal Biochem 266(1): 9-15; Garboczi, et al. (1992). Proc Natl Acad Sci USA 89(8): 3429-3433). Все измерения проводили при температуре 25 °С в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) Дульбекко с добавлением 0,005% Р20.
BIAcore
Анализ
Биотинилированные мономеры пептид-HLA иммобилизировали на связанных со стрептавидином сенсорных чипах СМ-5. Равновесные константы связывания определяли путем пропускания растворимых TCR/ImmTAC в серийных разведениях при постоянной скорости потока, составляющей 30 мкл/мин, через проточную кювету, покрытую комплексом пептид/НЕА-А*02 (-200 единиц ответа, RU). Равновесные ответы нормировали для каждой концентрации TCR путем вычитания ответа для объемного буфера в контрольной проточной кювете, содержащей нерелевантный пептид-HLA. Значение Kd получали с помощью нелинейной аппроксимации кривой с использованием программы Prism и изотермы связывания Ленгмюра: связывание = С*Мах/(С + KD), где «связывание» представляет собой равновесное связывание в RU, С представляет собой концентрацию вводимого TCR и Мах представляет собой максимальное связывание.
Для высокоаффинных взаимодействий параметры связывания определяли с помощью кинетического анализа с одним циклом. Растворимые TCR/ImmTAC в пяти различных концентрациях пропускали через проточную кювету, покрытую комплексом пептид-HLA (-100 - 200 RU), при скорости потока, составляющей 50-60 мкл/мин. Как правило,  60-120  мкл  растворимых  TCR/ImmTAC   вводили   в максимальной
off
on
концентрации, составляющей 100-200 нМ, с последующими 2-кратными разведениями, которые использовали для других четырех инъекций. Минимальную концентрацию вводили первой. Затем вводили буфер для измерения фазы диссоциации до тех пор, пока не происходило > 10% диссоциации, как правило, через 1 - 3 часа. Кинетические параметры рассчитывали с помощью программы BIAevaluation. Фазу диссоциации приводили к единому уравнению экспоненциального распада, обеспечивая расчет полупериода. Константу равновесия Kd рассчитывали из k/k.
Octet
Анализ
Биотинилированные мономеры пептид/HLA захватывали на стрептавидиновые (SA) биосенсоры размером 1 нм (Pall ForteBio), предварительно иммобилизированные со стрептавидином. Сенсоры блокировали свободным биотином (2 мкМ) в течение 2 минут. Равновесные константы связывания определяли путем помещения нагруженных биосенсоров в серийные разведения растворимого TCR/ImmTAC в 96-луночный или 384-луночный планшет для образцов. Скорость перемешивания планшета устанавливали на 1000 об/мин. Для низкоаффинных взаимодействий (мкМ диапазон) использовали короткое время ассоциации (~2 минуты) и короткое время диссоциации (~2 минуты). Кривые связывания обрабатывали путем двукратного вычитания эталонного значения для референсных биосенсоров, нагруженных нерелевантным pHLA, с применением программы анализа данных Octet (Pall ForteBio). Ответы (нм) при равновесном состоянии использовали для оценки значения Kd из графиков для состояния покоя, приведенных к уравнению: ответ = Rmax*конц./(KD + конц.), где «ответ» представляет собой равновесное связывание в нм для каждой концентрации TCR (конц.), и Rmax представляет собой ответ, соответствующий максимальному связыванию, при насыщении pHLA.
Для взаимодействий с высокой аффинностью (диапазон нМ - пкМ) кинетические параметры определяли из кривых связывания при концентрации > 3 TCR/ImmTAC, составляющей, как правило, 10 нМ, 5 нМ и 2,5 нМ. Время ассоциации составляло 30 минут, и время диссоциации составляло 1 - 2 часа. Кривые связывания обрабатывали путем двукратного вычитания референсных значений для референсных биосенсоров, нагруженных нерелевантным pHLA и блокированных биотином. Кинетические
оn
off
off
on
1/2
off
параметры к и k рассчитывали путем общей аппроксимации непосредственно к кривым связывания с применением программы анализа данных Octet (Pall ForteBio). Kd рассчитывали из k/k и полупериод диссоциации рассчитывали из уравнения t = 0,693/k.
Пример 4 - Характеристика связывания растворимого немутантного TCR согласно настоящему изобретению
Растворимый TCR дикого типа готовили в соответствии со способами, описанными в Примере 1, и связывание с pHLA анализировали в соответствии с Примером 3. Аминокислотные последовательности альфа- и бета-цепей соответствовали последовательностям, показанным на Фигуре 2. Растворимый биотинилированный HLA-A*02 готовили либо с пептидом NY-ESO-1 дикого типа (SLLMWITQC), либо гетероклитическим пептидом NY-ESO-1 (SLLMWITQV SEQ ID NO: 34), и иммобилизировали на сенсорном чипе BIAcore. Определенные значения Kd составляли 5,2 мкМ и 4,3 мкМ соответственно. Не было выявлено значительного связывания с 15 нерелевантными пептидными комплексами HLA-A*02. Полученные данные указывают на то, что TCR связывается с мишенью с подходящей аффинностью и специфичностью. Указанные цепи TCR, таким образом, обеспечивают каркас, пригодный для идентификации дополнительных TCR согласно настоящему изобретению.
Пример 5 - Характеристика связывания растворимых высокоаффинных TCR и молекул ImmTAC согласно настоящему изобретению
Растворимые мутантные TCR и молекулы ImmTAC получали, как описано в Примерах 1 и 2, и характеристики связывания определяли в соответствии с Примером 3. Альфа- и бета-цепи TCR содержали мутации по меньшей мере в одном CDR по отношению к последовательностям CDR, показанным на Фигуре 2 (SEQ ID N0:41 -46). Аминокислотные последовательности конкретных вариабельных участков альфа-и бета-цепей мутантных TCR согласно настоящему изобретению представлены на Фигурах 4 и 5 соответственно. В Таблице ниже представлены характеристики
связывания для растворимых TCR и/или молекул ImmTAC, содержащих указанные вариабельные участки альфа- и бета-цепей. Связывание измеряли с использованием гетероклитического пептида NY-ESO-1 (SLLMWITQV).
НО = не определено
1
Соответствует ImmTAC 1 из Примера 6, полноразмерные последовательности альфа-и бета-цепи представлены на Фигуре 5
2
Соответствует ImmTAC2 из Примера 6, полноразмерные последовательности альфа-и бета-цепи представлены на Фигуре 6
3
Соответствует ImmTAC3 из Примера 6, полноразмерные последовательности альфа-и бета-цепи представлены на Фигуре 7
4
Соответствует ImmTAC4 из Примера 6, полноразмерные последовательности альфа-и бета-цепи представлены на Фигуре 8
Указанные данные демонстрируют, что последовательности альфа- и бета-цепей TCR согласно настоящему изобретению приводят к получению растворимых TCR и молекул ImmTAC, обладающих характеристиками связывания, подходящими для разработки иммунотерапевтических реагентов.
Пример 6 - Активное и специфичное перенаправление Т-клеток с помощью молекул ImmTAC согласно настоящему изобретению
Исследовали способность молекул ImmTAC, содержащих последовательности вариабельных участков альфа- и бета-цепи согласно настоящему изобретению, опосредовать активное и специфичное перенаправление CD3+ Т-клеток с помощью анализа ELISPOT с использованием секреции интерферона-γ (IFN-γ) в качестве регистрируемого показателя активации Т-клеток.
Последовательности альфа и бета-цепей четырех исследованных молекул ImmTAC представлены на Фигурах 5-8.
6
Анализы проводили с применением набора для ELISPOT-анализа IFN-y человека (BD Biosciences). Клетки-мишени готовили в плотности 1х10/мл в аналитической среде (RPMI 1640, содержащей 10% термоинактивированной ЭБС и 1% смеси пенициллин-стрептомицин-Ь-глутамин) и высевали в плотности 50,000 клеток на лунку в объеме 50 мкл. В настоящем примере использовали следующие клеточные линии-мишени:
+ve
+ve
• клеточная линия рака легких человека NCI-H1755 (NY-ESO-l; HLA-A*02) (получены из Американской коллекции типовых культур, АТСС, каталожный номер: CRL-5892)
ve
+ve
• клетки сердца человека НАо5 (NY-ESO-l"; HLA-A*02) (получены из компании Promocell, каталожный номер: С-12271)
Мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК), выделенные из свежей крови донора, использовали в качестве эффекторных клеток и помещали в концентрации 40,000 клеток на лунку в объеме 50 мкл. Использовали различающиеся концентрации ImmTAC, охватывающие предполагаемый клинически значимый диапазон, которые добавляли в лунку в объеме 50 мкл.
2
Планшеты готовили в соответствии с инструкциями производителя. Клетки-мишени, эффекторные клетки и молекулы ImmTAC добавляли в соответствующие лунки и доводили до конечного объема, составляющего 200 мкл аналитической среды. Все реакции проводили в трех повторениях. Также готовили контрольные лунки с отсутствием ImmTAC, эффекторных клеток или клеток-мишеней. Планшеты затем инкубировали в течение ночи (37°С/5%СO). На следующий день планшеты промывали три раза промывочным буфером (пакетик для приготовления lxPBS,
содержащий 0,05% Р20, разведенный в деионизированной воде). Затем в каждую лунку добавляли первичные антитела для выявления в объеме 50 мкл. Планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 2 часов до повторной трехкратной промывки. Вторичное выявление осуществляли путем добавления 50 мкл разведенного конъюгата стрептавидин-HRP в каждую лунку и инкубирования при комнатной температуре в течение 1 часа и повторяли этап промывки. Планшеты затем промывали два раза 200 мкл PBS (рН 7,4). Не более чем за 15 мин до использования на каждый 1 мл субстрата АЕС добавляли одну каплю (20 мкл) хромогена АЕС и перемешивали. 50 мкл полученной смеси добавляли в каждую лунку. Постоянно отслеживали появление точек и планшеты промывали в водопроводной воде для остановки проявления. Планшеты высушивали при комнатной температуре в течение по меньшей мере 2 часов с последующим подсчетом точек при помощи анализатора CTL с программным обеспечением Immunospot (Cellular Technology Limited).
+ve
+ve
Данные, представленные на Фигуре 9, показывают, что молекулы ImmTAC, содержащие вариабельные последовательности альфа- и бета-цепи согласно настоящему изобретению, способны опосредовать активное перенаправление Т-клеток против раковых клеток HLA-A*02, экспрессирующих антиген-мишень. Не наблюдалось активности в отношении антиген-отрицательных клеток, экспрессирующих HLA-A*02. Полученные данные указывают на то, что молекулы ImmTAC являются специфичными в отношении клеток-мишеней в пределах диапазона клинически значимых концентраций (< 1 нМ).
13
8
Проводили дополнительную оценку активности молекул ImmTAC 3 и 4 для определения значений ЕС50. ELISpot-анализы проводили, как описано выше, с использованием концентраций ImmTAC, варьирующих от 10" М до 10" М. Данные анализировали с помощью программы Prism 5,0 (GraphPad) для расчета значений ЕС50. Определенные значения составляли 95 пкМ и 121 пкМ для молекул ImmTAC 3 и 4 соответственно (Фигура 10). Указанные данные подтверждают способность указанных молекул ImmTAC опосредавать активное перенаправление Т-клеточного ответа.
Пример 7 - Дополнительное исследование специфичности молекул ImmTAC согласно настоящему изобретению
Проводили дополнительное исследование специфичности молекул ImmTAC на панели нормальных клеток. В указанном примере использовали молекулы ImmTAC 2-4 (Фигуры 6-8). Секрецию интерферона-γ (IFN-γ) использовали в качестве регистрируемого показателя Т-клеточной активации.
Анализы проводили с применением набора для ИФА DuoSet ELISA для IFN-γ (R&D Systems, каталожный номер: DY285) в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, IFN-y разводили до 10,000 пкг/мл и готовили 2-кратные разведения для получения стандартной кривой. Клетки-мишени подсчитывали и высевали в концентрации 10,000 клеток на лунку в 10 мкл аналитической среды. Молекулы ImmTAC разводили с получением конечной концентрации 2 нМ и 1 нМ в 10 мкл на лунку. Также готовили контрольный образец без ImmTAC. Эффекторные МКПК размораживали и высевали в концентрации 10,000 клеток на лунку в 10 мкл. Планшеты инкубировали в течение 48 ч, после чего их проявляли и анализировали.
+ve
В данном примере в качестве антиген-положительного контроля использовали клетки NCl-H1755 и в качестве антиген-отрицательного контроля использовали клетки НТС-116. Клеточная панель включала кардиомиоциты (СМ12, СМ5 и СМ10), эндотелиальные клетки аорты (НАо5), клетки эпителия дыхательных путей (НСАЕС2 и НСАЕС5), миобласты скелетно-мышечной ткани (HSkMM3) и клетки HPF9. Все клеточные линии представляли собой HLA-А*02-клетки. Анализы проводили в трех повторениях.
Данные, представленные на Фигуре 11, демонстрируют минимальную продукцию IFN-γ в присутствии клеточных линий, полученных из нормальных тканей, по сравнению с антиген-положительными линиями раковых клеток, в пределах диапазона терапевтически значимых концентраций ImmTAC. Эти данные указывают,
что молекулы ImmTAC согласно настоящему изобретению обладают высоким уровнем специфичности и, таким образом, являются, в частности, подходящими для терапевтического применения.
Пример 8 - Активное уничтожение опухолевых клеток ImmTAC-перенаправленными Т-клетками
Способность молекул ImmTAC согласно настоящему изобретению опосредовать активное перенаправленное уничтожение Т-клетками антиген-положительных опухолевых клеток исследовали с использованием платформы IncuCyte (Essen Bioscience). Указанный анализ позволяет выявление высвобождения каспазы-3/7 -маркера апоптоза - в реальном времени с помощью микроскопии.
+ve
+ve
ve
+ve
2
Анализы проводили с использованием набора для анализа апоптоза на основе каспазы-3/7 CellPlayer для 96-луночго планшета (Essen Bioscience, каталожный номер: 4440) в соответствии с протоколом производителя. Вкратце, клетки-мишени (NCl-H1755 - NYESO HLA A*02 или НСТ-116 - NYESO" HLA A*02) высевали в концентрации 5000 клеток на лунку и инкубировали в течение ночи, чтобы позволить им прикрепиться. Растворы ImmTAC готовили в концентрации от 2,16 нМ до 8,8 пкМ. 25 мкл раствора в каждой концентрации добавляли в соответствующую лунку. МКПК использовали в качестве эффекторных клеток и высевали в концентрации 50,000 на лунку в 50 мкл. Также готовили контрольный образец, не содержавший ImmTAC. Реагент для анализа NucView, приготовленный в концентрации 30 мкМ в 25 мкл, добавляли в каждую лунку (с получением конечной концентрации 5 мкМ). Планшет помещали в прибор IncuCyte и изображения получали каждые 2 часа (1 изображение на лунку) в течение 3 дней. Количество апоптотических клеток на каждом изображении определяли и записывали как количество объектов на мм. Анализы проводили в трех повторениях.
Данные, представленные на Фигуре 12, демонстрируют уничтожение опухолевых клеток ImmTAC-перенаправленными Т-клетками в реальном времени. Результаты представлены для молекул ImmTAC3 и ImmTAC4. Для обеих молекул ImmTAC было
показано перенаправленное уничтожение Т-клетками антиген-положительных опухолевых клеток в концентрации, составляющей всего 26 пкМ. Для ImmTAC3 было показано перенаправленное уничтожение Т-клетками антиген-положительных опухолевых клеток в концентрации, составляющей менее 10 пкМ. Низкий уровень уничтожения антиген-отрицательных клеток наблюдался только при самой высокой концентрации (2,16 нМ).
Указанные данные подтверждают, что ImmTAC3 и ImmTAC4 опосредуют активное перенаправленное уничтожение Т-клетками антиген-положительных опухолевых клеток в пределах терапевтически значимого диапазона концентраций.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  Immunocore Limited
<120>  T-КЛЕТОЧНЫЕ РЕЦЕПТОРЫ, СПЕЦИФИЧНЫЕ В ОТНОШЕНИИ КОМПЛЕКСА
ОПУХОЛЕВЫЙ АНТИГЕН NY-ESO-1/HLA-A*02
<130>  P100579WO
<150>  1522592.3
<151>  2015-12-22
<160>  52
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  9
<212>  Белок
<213>  Homo sapiens
<400>  1
Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Cys
1               5
<210>  2
<211>  211
<212>  Белок
<213>  Homo sapiens
<400>  2
Ala Gln Ser Val Ala Gln Pro Glu Asp Gln Val Asn Val Ala Glu Gly
1               5                   10                  15
Asn Pro Leu Thr Val Lys Cys Thr Tyr Ser Val Ser Gly Asn Pro Tyr
20                  25                  30
Leu Phe Trp Tyr Val Gln Tyr Pro Asn Arg Gly Leu Gln Phe Leu Leu
35                  40                  45
Lys Tyr Ile Thr Gly Asp Asn Leu Val Lys Gly Ser Tyr Gly Phe Glu
50                  55                  60
Ala Glu Phe Asn Lys Ser Gln Thr Ser Phe His Leu Lys Lys Pro Ser
65                  70                  75                  80
Ala Leu Val Ser Asp Ser Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Val Arg Asp Ile
85                  90                  95
Asn Ser Gly Ala Gly Ser Tyr Gln Leu Thr Phe Gly Lys Gly Thr Lys
100                 105                 110
Leu Ser Val Ile Pro Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln
115                 120                 125
Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp
130                 135                 140
Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr
145                 150                 155                 160
Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser
165                 170                 175
Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn
180                 185                 190
Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro
195                 200                 205
Glu Ser Ser
210
<210>  3
<211>  245
<212>  Белок
<213>  Homo sapiens
<400>  3
Ser Ala Val Ile Ser Gln Lys Pro Ser Arg Asp Ile Cys Gln Arg Gly
1               5                   10                  15
Thr Ser Leu Thr Ile Gln Cys Gln Val Asp Ser Gln Val Thr Met Met
20                  25                  30
Phe Trp Tyr Arg Gln Gln Pro Gly Gln Ser Leu Thr Leu Ile Ala Thr
35                  40                  45
Ala Asn Gln Gly Ser Glu Ala Thr Tyr Glu Ser Gly Phe Val Ile Asp
50                  55                  60
Lys Phe Pro Ile Ser Arg Pro Asn Leu Thr Phe Ser Thr Leu Thr Val
65                  70                  75                  80
Ser Asn Met Ser Pro Glu Asp Ser Ser Ile Tyr Leu Cys Ser Val Gly
85                  90                  95
Gly Ser Gly Gly Ala Asp Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu
100                 105                 110
Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val
115                 120                 125
Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu
130                 135                 140
Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp
145                 150                 155                 160
Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln
165                 170                 175
Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser
180                 185                 190
Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His
195                 200                 205
Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp
210                 215                 220
Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala
225                 230                 235                 240
Trp Gly Arg Ala Asp
245
<210>  4
<211>  211
<212>  Белок
<213>  Homo sapiens
<400>  4
Ala Gln Ser Val Ala Gln Pro Glu Asp Gln Val Asn Val Ala Glu Gly
1               5                   10                  15
Asn Pro Leu Thr Val Lys Cys Thr Tyr Ser Val Ser Gly Asn Pro Tyr
20                  25                  30
Leu Phe Trp Tyr Val Gln Tyr Pro Asn Arg Gly Leu Gln Phe Leu Leu
35                  40                  45
Lys Tyr Ile Thr Gly Asp Asn Leu Val Lys Gly Ser Tyr Gly Phe Glu
50                  55                  60
Ala Glu Phe Asn Lys Ser Gln Thr Ser Phe His Leu Lys Lys Pro Ser
65                  70                  75                  80
Ala Leu Val Ser Asp Ser Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Val Arg Asp Ile
85                  90                  95
Asn Ser Gly Ala Gly Ser Tyr Gln Leu Thr Phe Gly Lys Gly Thr Lys
100                 105                 110
Leu Ser Val Ile Pro Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln
115                 120                 125
Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp
130                 135                 140
Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr
145                 150                 155                 160
Ile Thr Asp Lys Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser
165                 170                 175
Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn
180                 185                 190
Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro
195                 200                 205
Glu Ser Ser
210
<210>  5
<211>  245
<212>  Белок
<213>  Homo sapiens
<400>  5
Ser Ala Val Ile Ser Gln Lys Pro Ser Arg Asp Ile Cys Gln Arg Gly
1               5                   10                  15
Thr Ser Leu Thr Ile Gln Cys Gln Val Asp Ser Gln Val Thr Met Met
20                  25                  30
Phe Trp Tyr Arg Gln Gln Pro Gly Gln Ser Leu Thr Leu Ile Ala Thr
35                  40                  45
Ala Asn Gln Gly Ser Glu Ala Thr Tyr Glu Ser Gly Phe Val Ile Asp
50                  55                  60
Lys Phe Pro Ile Ser Arg Pro Asn Leu Thr Phe Ser Thr Leu Thr Val
65                  70                  75                  80
Ser Asn Met Ser Pro Glu Asp Ser Ser Ile Tyr Leu Cys Ser Val Gly
85                  90                  95
Gly Ser Gly Gly Ala Asp Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu
100                 105                 110
Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val
115                 120                 125
Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu
130                 135                 140
Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp
145                 150                 155                 160
Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln
165                 170                 175
Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Ala Leu Ser
180                 185                 190
Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asp Pro Arg Asn His
195                 200                 205
Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp
210                 215                 220
Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala
225                 230                 235                 240
Trp Gly Arg Ala Asp
245
<210>  6
<211>  117
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Мутантная альфа-цепь (a12)
<400>  6
Ala Gln Ser Val Ala Gln Pro Glu Asp Gln Val Asn Val Ala Glu Gly
1               5                   10                  15
Asn Pro Leu Thr Val Lys Cys Thr Tyr Ser Val Ser Gly Asn Pro Tyr
20                  25                  30
Leu Phe Trp Tyr Val Gln Tyr Pro Asn Arg Gly Leu Gln Phe Leu Leu
35                  40                  45
Lys Tyr Ile Thr Gly Asp Asn Leu Val Lys Gly Ser Tyr Gly Phe Glu
50                  55                  60
Ala Glu Phe Asn Lys Ser Gln Thr Ser Phe His Leu Lys Lys Pro Ser
65                  70                  75                  80
Ala Leu Val Ser Asp Ser Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Val Arg Asp Ser
85                  90                  95
Asp Gln His Ala Gly Ser Tyr Gln Leu Thr Phe Gly Lys Gly Thr Lys
100                 105                 110
Leu Ser Val Ile Pro
115
<210>  7
<211>  117
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Мутантная альфа-цепь (a24)
<400>  7
Ala Gln Ser Val Ala Gln Pro Glu Asp Gln Val Asn Val Ala Glu Gly
1               5                   10                  15
Asn Pro Leu Thr Val Lys Cys Thr Tyr Ser Val Ser Gly Asn Pro Tyr
20                  25                  30
Leu Phe Trp Tyr Val Gln Tyr Pro Asn Arg Gly Leu Gln Phe Leu Leu
35                  40                  45
Lys Tyr Leu Gly Asp Ser Ala Leu Val Lys Gly Ser Tyr Gly Phe Glu
50                  55                  60
Ala Glu Phe Asn Lys Ser Gln Thr Ser Phe His Leu Lys Lys Pro Ser
65                  70                  75                  80
Ala Leu Val Ser Asp Ser Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Val Arg Asp Ile
85                  90                  95
Asn Ser Gly Ala Gly Ser Tyr Gln Leu Thr Phe Gly Lys Gly Thr Lys
100                 105                 110
Leu Ser Val Ile Pro
115
<210>  8
<211>  117
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Мутантная альфа-цепь (a24l)
<400>  8
Ala Gln Ser Val Ala Gln Pro Glu Asp Leu Val Asn Val Ala Glu Gly
1               5                   10                  15
Asn Pro Leu Thr Val Lys Cys Thr Tyr Ser Val Ser Gly Asn Pro Tyr
20                  25                  30
Leu Phe Trp Tyr Val Gln Tyr Pro Asn Arg Gly Leu Gln Phe Leu Leu
35                  40                  45
Lys Tyr Leu Gly Asp Ser Ala Leu Val Lys Gly Ser Tyr Gly Phe Glu
50                  55                  60
Ala Glu Phe Asn Lys Ser Gln Thr Ser Phe His Leu Lys Lys Pro Ser
65                  70                  75                  80
Ala Leu Val Ser Asp Ser Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Val Arg Asp Ile
85                  90                  95
Asn Ser Gly Ala Gly Ser Tyr Gln Leu Thr Phe Gly Lys Gly Thr Lys
100                 105                 110
Leu Ser Val Ile Pro
115
<210>  9
<211>  117
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Мутантная альфа-цепь (a28)
<400>  9
Ala Gln Ser Val Ala Gln Pro Glu Asp Gln Val Asn Val Ala Glu Gly
1               5                   10                  15
Asn Pro Leu Thr Val Lys Cys Thr Tyr Ser Val Ser Gly Asn Pro Tyr
20                  25                  30
Leu Phe Trp Tyr Val Gln Tyr Pro Asn Arg Gly Leu Gln Phe Leu Leu
35                  40                  45
Lys Tyr Ile Thr Gly Asp Asn Leu Val Lys Gly Ser Tyr Gly Phe Glu
50                  55                  60
Ala Glu Phe Asn Lys Ser Gln Thr Ser Phe His Leu Lys Lys Pro Ser
65                  70                  75                  80
Ala Leu Val Ser Asp Ser Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Val Arg Ser Ser
85                  90                  95
Arg Gln His Ala Gly Ser Tyr Gln Leu Thr Phe Gly Lys Gly Thr Lys
100                 105                 110
Leu Ser Val Ile Pro
115
<210>  10
<211>  117
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Мутантная альфа-цепь (a78l)
<400>  10
Ala Gln Ser Val Ala Gln Pro Glu Asp Leu Val Asn Val Ala Glu Gly
1               5                   10                  15
Asn Pro Leu Thr Val Lys Cys Thr Tyr Ser Val Ser Gly Asn Pro Tyr
20                  25                  30
Leu Phe Trp Tyr Val Gln Tyr Pro Asn Arg Gly Leu Gln Phe Leu Leu
35                  40                  45
Lys Tyr Leu Gly Asp Ser Ala Leu Val Lys Gly Ser Tyr Gly Phe Glu
50                  55                  60
Ala Glu Phe Asn Lys Ser Gln Thr Ser Phe His Leu Lys Lys Pro Ser
65                  70                  75                  80
Ala Leu Val Ser Asp Ser Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Val Arg Asp Ile
85                  90                  95
Asp Ser Gly Ala Gly Ser Tyr Gln Leu Thr Phe Gly Lys Gly Thr Lys
100                 105                 110
Leu Ser Val Ile Pro
115
<210>  11
<211>  117
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Мутантная альфа-цепь (a82l)
<400>  11
Ala Gln Ser Val Ala Gln Pro Glu Asp Leu Val Asn Val Ala Glu Gly
1               5                   10                  15
Asn Pro Leu Thr Val Lys Cys Thr Tyr Ser Val Ser Gly Asn Pro Tyr
20                  25                  30
Leu Phe Trp Tyr Val Gln Tyr Pro Asn Arg Gly Leu Gln Phe Leu Leu
35                  40                  45
Lys Tyr Leu Gly Asp Ser Ala Leu Val Lys Gly Ser Tyr Gly Phe Glu
50                  55                  60
Ala Glu Phe Asn Lys Ser Gln Thr Ser Phe His Leu Lys Lys Pro Ser
65                  70                  75                  80
Ala Leu Val Ser Asp Ser Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Val Arg Asp Ile
85                  90                  95
Arg Ser Gly Ala Gly Ser Tyr Gln Leu Thr Phe Gly Lys Gly Thr Lys
100                 105                 110
Leu Ser Val Ile Pro
115
<210>  12
<211>  117
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Мутантная альфа-цепь (a82)
<400>  12
Ala Gln Ser Val Ala Gln Pro Glu Asp Gln Val Asn Val Ala Glu Gly
1               5                   10                  15
Asn Pro Leu Thr Val Lys Cys Thr Tyr Ser Val Ser Gly Asn Pro Tyr
20                  25                  30
Leu Phe Trp Tyr Val Gln Tyr Pro Asn Arg Gly Leu Gln Phe Leu Leu
35                  40                  45
Lys Tyr Leu Gly Asp Ser Ala Leu Val Lys Gly Ser Tyr Gly Phe Glu
50                  55                  60
Ala Glu Phe Asn Lys Ser Gln Thr Ser Phe His Leu Lys Lys Pro Ser
65                  70                  75                  80
Ala Leu Val Ser Asp Ser Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Val Arg Asp Ile
85                  90                  95
Arg Ser Gly Ala Gly Ser Tyr Gln Leu Thr Phe Gly Lys Gly Thr Lys
100                 105                 110
Leu Ser Val Ile Pro
115
<210>  13
<211>  115
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Мутантная бета-цепь (b5)
<400>  13
Ser Ala Val Ile Ser Gln Lys Pro Ser Arg Asp Ile Lys Gln Arg Gly
1               5                   10                  15
Thr Ser Leu Thr Ile Gln Cys Gln Val Asp Ser Gln Val Thr Met Met
20                  25                  30
Phe Trp Tyr Arg Gln Gln Pro Gly Gln Ser Pro Thr Leu Ile Ala Thr
35                  40                  45
Ala Trp Thr Gly Gly Glu Ala Thr Tyr Glu Ser Gly Phe Val Ile Asp
50                  55                  60
Lys Phe Pro Ile Ser Arg Pro Asn Leu Thr Phe Ser Thr Leu Thr Val
65                  70                  75                  80
Ser Asn Met Ser Pro Glu Asp Ser Ser Ile Tyr Leu Cys Ser Val Gly
85                  90                  95
Gly Ser Gly Gly Ala Asp Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu
100                 105                 110
Thr Val Leu
115
<210>  14
<211>  115
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Мутантная бета-цепь (b12)
<400>  14
Ser Ala Val Ile Ser Gln Lys Pro Ser Arg Asp Ile Lys Gln Arg Gly
1               5                   10                  15
Thr Ser Leu Thr Ile Gln Cys Gln Val Asp Lys Arg Leu Ala Leu Met
20                  25                  30
Phe Trp Tyr Arg Gln Gln Pro Gly Gln Ser Pro Thr Leu Ile Ala Thr
35                  40                  45
Ala Trp Thr Gly Gly Glu Ala Thr Tyr Glu Ser Gly Phe Val Ile Asp
50                  55                  60
Lys Phe Pro Ile Ser Arg Pro Asn Leu Thr Phe Ser Thr Leu Thr Val
65                  70                  75                  80
Ser Asn Met Ser Pro Glu Asp Ser Ser Ile Tyr Leu Cys Ser Val Gly
85                  90                  95
Gly Ser Gly Gly Ala Asp Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu
100                 105                 110
Thr Val Leu
115
<210>  15
<211>  115
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Мутантная бета-цепь (b52)
<400>  15
Ser Ala Val Ile Ser Gln Lys Pro Ser Arg Asp Ile Lys Gln Arg Gly
1               5                   10                  15
Thr Ser Leu Thr Ile Gln Cys Gln Val Asp Lys Arg Leu Ala Leu Met
20                  25                  30
Phe Trp Tyr Arg Gln Gln Pro Gly Gln Ser Pro Thr Leu Ile Ala Thr
35                  40                  45
Ala Trp Thr Gly Gly Glu Ala Thr Tyr Glu Ser Gly Phe Val Ile Asp
50                  55                  60
Lys Phe Pro Ile Ser Arg Pro Asn Leu Thr Phe Ser Thr Leu Thr Val
65                  70                  75                  80
Ser Asn Met Ser Pro Glu Asp Ser Ser Ile Tyr Leu Cys Ser Val Gly
85                  90                  95
Gly Ser Gly Ala Ala Asp Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu
100                 105                 110
Thr Val Leu
115
<210>  16
<211>  115
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Мутантная бета-цепь (b56)
<400>  16
Ser Ala Val Ile Ser Gln Lys Pro Ser Arg Asp Ile Lys Gln Arg Gly
1               5                   10                  15
Thr Ser Leu Thr Ile Gln Cys Gln Val Asp Lys Arg Leu Ala Met Met
20                  25                  30
Phe Trp Tyr Arg Gln Gln Pro Gly Gln Ser Pro Thr Leu Ile Ala Thr
35                  40                  45
Ala Trp Thr Gly Gly Glu Ala Thr Tyr Glu Ser Gly Phe Val Ile Asp
50                  55                  60
Lys Phe Pro Ile Ser Arg Pro Asn Leu Thr Phe Ser Thr Leu Thr Val
65                  70                  75                  80
Ser Asn Met Ser Pro Glu Asp Ser Ser Ile Tyr Leu Cys Ser Val Gly
85                  90                  95
Gly Ser Gly Gly Ala Asp Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu
100                 105                 110
Thr Val Leu
115
<210>  17
<211>  115
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Мутантная бета-цепь (b56l)
<400>  17
Ser Ala Val Ile Ser Gln Lys Pro Ser Arg Asp Ile Lys Gln Arg Gly
1               5                   10                  15
Thr Ser Leu Thr Ile Gln Cys Gln Val Asp Lys Arg Leu Ala Met Met
20                  25                  30
Phe Trp Tyr Arg Gln Gln Pro Gly Gln Ser Leu Thr Leu Ile Ala Thr
35                  40                  45
Ala Trp Thr Gly Gly Glu Ala Thr Tyr Glu Ser Gly Phe Val Ile Asp
50                  55                  60
Lys Phe Pro Ile Ser Arg Pro Asn Leu Thr Phe Ser Thr Leu Thr Val
65                  70                  75                  80
Ser Asn Met Ser Pro Glu Asp Ser Ser Ile Tyr Leu Cys Ser Val Gly
85                  90                  95
Gly Ser Gly Gly Ala Asp Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu
100                 105                 110
Thr Val Leu
115
<210>  18
<211>  115
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Мутантная бета-цепь (b65)
<400>  18
Ser Ala Val Ile Ser Gln Lys Pro Ser Arg Asp Ile Lys Gln Arg Gly
1               5                   10                  15
Thr Ser Leu Thr Ile Gln Cys Gln Val Asp Lys Arg Leu Ala Leu Met
20                  25                  30
Phe Trp Tyr Arg Gln Gln Pro Gly Gln Ser Pro Thr Leu Ile Ala Thr
35                  40                  45
Ala Trp Thr Gly Ser Glu Ala Thr Tyr Glu Ser Gly Phe Val Ile Asp
50                  55                  60
Lys Phe Pro Ile Ser Arg Pro Asn Leu Thr Phe Ser Thr Leu Thr Val
65                  70                  75                  80
Ser Asn Met Ser Pro Glu Asp Ser Ser Ile Tyr Leu Cys Ser Val Gly
85                  90                  95
Gly Ser Gly Gly Ala Asp Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu
100                 105                 110
Thr Val Leu
115
<210>  19
<211>  115
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Мутантная бета-цепь (b65l)
<400>  19
Ser Ala Val Ile Ser Gln Lys Pro Ser Arg Asp Ile Lys Gln Arg Gly
1               5                   10                  15
Thr Ser Leu Thr Ile Gln Cys Gln Val Asp Lys Arg Leu Ala Leu Met
20                  25                  30
Phe Trp Tyr Arg Gln Gln Pro Gly Gln Ser Leu Thr Leu Ile Ala Thr
35                  40                  45
Ala Trp Thr Gly Ser Glu Ala Thr Tyr Glu Ser Gly Phe Val Ile Asp
50                  55                  60
Lys Phe Pro Ile Ser Arg Pro Asn Leu Thr Phe Ser Thr Leu Thr Val
65                  70                  75                  80
Ser Asn Met Ser Pro Glu Asp Ser Ser Ile Tyr Leu Cys Ser Val Gly
85                  90                  95
Gly Ser Gly Gly Ala Asp Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu
100                 105                 110
Thr Val Leu
115
<210>  20
<211>  115
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Мутантная бета-цепь (b67)
<400>  20
Ser Ala Val Ile Ser Gln Lys Pro Ser Arg Asp Ile Lys Gln Arg Gly
1               5                   10                  15
Thr Ser Leu Thr Ile Gln Cys Gln Val Asp Lys Arg Leu Ala Met Met
20                  25                  30
Phe Trp Tyr Arg Gln Gln Pro Gly Gln Ser Pro Thr Leu Ile Ala Thr
35                  40                  45
Ala Trp Thr Gly Gly Glu Ala Thr Tyr Glu Ser Gly Phe Val Ile Asp
50                  55                  60
Lys Phe Pro Ile Ser Arg Pro Asn Leu Thr Phe Ser Thr Leu Thr Val
65                  70                  75                  80
Ser Asn Met Ser Pro Glu Asp Ser Ser Ile Tyr Leu Cys Ser Val Gly
85                  90                  95
Gly Ser Gly Ala Ala Asp Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu
100                 105                 110
Thr Val Leu
115
<210>  21
<211>  115
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Мутантная бета-цепь (b67l)
<400>  21
Ser Ala Val Ile Ser Gln Lys Pro Ser Arg Asp Ile Lys Gln Arg Gly
1               5                   10                  15
Thr Ser Leu Thr Ile Gln Cys Gln Val Asp Lys Arg Leu Ala Met Met
20                  25                  30
Phe Trp Tyr Arg Gln Gln Pro Gly Gln Ser Leu Thr Leu Ile Ala Thr
35                  40                  45
Ala Trp Thr Gly Gly Glu Ala Thr Tyr Glu Ser Gly Phe Val Ile Asp
50                  55                  60
Lys Phe Pro Ile Ser Arg Pro Asn Leu Thr Phe Ser Thr Leu Thr Val
65                  70                  75                  80
Ser Asn Met Ser Pro Glu Asp Ser Ser Ile Tyr Leu Cys Ser Val Gly
85                  90                  95
Gly Ser Gly Ala Ala Asp Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu
100                 105                 110
Thr Val Leu
115
<210>  22
<211>  115
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Мутантная бета-цепь (b68)
<400>  22
Ser Ala Val Ile Ser Gln Lys Pro Ser Arg Asp Ile Lys Gln Arg Gly
1               5                   10                  15
Thr Ser Leu Thr Ile Gln Cys Gln Val Asp Lys Arg Leu Ala Met Met
20                  25                  30
Phe Trp Tyr Arg Gln Gln Pro Gly Gln Ser Pro Thr Leu Ile Ala Thr
35                  40                  45
Ala Trp Thr Gly Ser Glu Ala Thr Tyr Glu Ser Gly Phe Val Ile Asp
50                  55                  60
Lys Phe Pro Ile Ser Arg Pro Asn Leu Thr Phe Ser Thr Leu Thr Val
65                  70                  75                  80
Ser Asn Met Ser Pro Glu Asp Ser Ser Ile Tyr Leu Cys Ser Val Gly
85                  90                  95
Gly Ser Gly Gly Ala Asp Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu
100                 105                 110
Thr Val Leu
115
<210>  23
<211>  115
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Мутантная бета-цепь (b68l)
<400>  23
Ser Ala Val Ile Ser Gln Lys Pro Ser Arg Asp Ile Lys Gln Arg Gly
1               5                   10                  15
Thr Ser Leu Thr Ile Gln Cys Gln Val Asp Lys Arg Leu Ala Met Met
20                  25                  30
Phe Trp Tyr Arg Gln Gln Pro Gly Gln Ser Leu Thr Leu Ile Ala Thr
35                  40                  45
Ala Trp Thr Gly Ser Glu Ala Thr Tyr Glu Ser Gly Phe Val Ile Asp
50                  55                  60
Lys Phe Pro Ile Ser Arg Pro Asn Leu Thr Phe Ser Thr Leu Thr Val
65                  70                  75                  80
Ser Asn Met Ser Pro Glu Asp Ser Ser Ile Tyr Leu Cys Ser Val Gly
85                  90                  95
Gly Ser Gly Gly Ala Asp Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu
100                 105                 110
Thr Val Leu
115
<210>  24
<211>  5
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Линкерная последовательность
<400>  24
Gly Gly Gly Gly Ser
1               5
<210>  25
<211>  5
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Линкерная последовательность
<400>  25
Gly Gly Gly Ser Gly
1               5
<210>  26
<211>  5
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Линкерная последовательность
<400>  26
Gly Gly Ser Gly Gly
1               5
<210>  27
<211>  5
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Линкерная последовательность
<400>  27
Gly Ser Gly Gly Gly
1               5
<210>  28
<211>  6
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Линкерная последовательность
<400>  28
Gly Ser Gly Gly Gly Pro
1               5
<210>  29
<211>  5
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Линкерная последовательность
<400>  29
Gly Gly Glu Pro Ser
1               5
<210>  30
<211>  7
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Линкерная последовательность
<400>  30
Gly Gly Glu Gly Gly Gly Pro
1               5
<210>  31
<211>  12
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Линкерная последовательность
<400>  31
Gly Gly Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser
1               5                   10
<210>  32
<211>  203
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  альфа-цепь ImmTAC (содержащая последовательность SEQ ID NO:
7(a24) и константный  домен,имеющий последовательность SEQ ID NO: 4,
укороченную на 8 аминокислот)
<400>  32
Ala Gln Ser Val Ala Gln Pro Glu Asp Gln Val Asn Val Ala Glu Gly
1               5                   10                  15
Asn Pro Leu Thr Val Lys Cys Thr Tyr Ser Val Ser Gly Asn Pro Tyr
20                  25                  30
Leu Phe Trp Tyr Val Gln Tyr Pro Asn Arg Gly Leu Gln Phe Leu Leu
35                  40                  45
Lys Tyr Leu Gly Asp Ser Ala Leu Val Lys Gly Ser Tyr Gly Phe Glu
50                  55                  60
Ala Glu Phe Asn Lys Ser Gln Thr Ser Phe His Leu Lys Lys Pro Ser
65                  70                  75                  80
Ala Leu Val Ser Asp Ser Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Val Arg Asp Ile
85                  90                  95
Asn Ser Gly Ala Gly Ser Tyr Gln Leu Thr Phe Gly Lys Gly Thr Lys
100                 105                 110
Leu Ser Val Ile Pro Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln
115                 120                 125
Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp
130                 135                 140
Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr
145                 150                 155                 160
Ile Thr Asp Lys Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser
165                 170                 175
Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn
180                 185                 190
Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr
195                 200
<210>  33
<211>  503
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  бета-цепь ImmTAC (содержащая scFv-фрагмент антитела против CD3,
слитый через линкер с бета-цепью TCR, содержащей SEQ ID NO: 15(b52) и
константный домен, имеющий последовательность SEQ ID NO: 3)
<400>  33
Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100                 105                 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115                 120                 125
Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
130                 135                 140
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe
145                 150                 155                 160
Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
165                 170                 175
Glu Trp Val Ala Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn
180                 185                 190
Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn
195                 200                 205
Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
210                 215                 220
Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe
225                 230                 235                 240
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
245                 250                 255
Gly Ser Ser Ala Val Ile Ser Gln Lys Pro Ser Arg Asp Ile Lys Gln
260                 265                 270
Arg Gly Thr Ser Leu Thr Ile Gln Cys Gln Val Asp Lys Arg Leu Ala
275                 280                 285
Leu Met Phe Trp Tyr Arg Gln Gln Pro Gly Gln Ser Pro Thr Leu Ile
290                 295                 300
Ala Thr Ala Trp Thr Gly Gly Glu Ala Thr Tyr Glu Ser Gly Phe Val
305                 310                 315                 320
Ile Asp Lys Phe Pro Ile Ser Arg Pro Asn Leu Thr Phe Ser Thr Leu
325                 330                 335
Thr Val Ser Asn Met Ser Pro Glu Asp Ser Ser Ile Tyr Leu Cys Ser
340                 345                 350
Val Gly Gly Ser Gly Ala Ala Asp Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr
355                 360                 365
Arg Leu Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val
370                 375                 380
Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala
385                 390                 395                 400
Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu
405                 410                 415
Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp
420                 425                 430
Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Ala
435                 440                 445
Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asp Pro Arg
450                 455                 460
Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp
465                 470                 475                 480
Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala
485                 490                 495
Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp
500
<210>  34
<211>  9
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Гетероклитический пептид NY-ESO-1
<400>  34
Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Val
1               5
<210>  35
<211>  203
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  альфа-цепь ImmTAC (содержащая последовательность SEQ ID NO:
7(a24) и константный домен, имеющий последовательность
SEQ ID NO: 4, укороченную на 8 аминокислот)
<400>  35
Ala Gln Ser Val Ala Gln Pro Glu Asp Gln Val Asn Val Ala Glu Gly
1               5                   10                  15
Asn Pro Leu Thr Val Lys Cys Thr Tyr Ser Val Ser Gly Asn Pro Tyr
20                  25                  30
Leu Phe Trp Tyr Val Gln Tyr Pro Asn Arg Gly Leu Gln Phe Leu Leu
35                  40                  45
Lys Tyr Leu Gly Asp Ser Ala Leu Val Lys Gly Ser Tyr Gly Phe Glu
50                  55                  60
Ala Glu Phe Asn Lys Ser Gln Thr Ser Phe His Leu Lys Lys Pro Ser
65                  70                  75                  80
Ala Leu Val Ser Asp Ser Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Val Arg Asp Ile
85                  90                  95
Asn Ser Gly Ala Gly Ser Tyr Gln Leu Thr Phe Gly Lys Gly Thr Lys
100                 105                 110
Leu Ser Val Ile Pro Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln
115                 120                 125
Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp
130                 135                 140
Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr
145                 150                 155                 160
Ile Thr Asp Lys Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser
165                 170                 175
Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn
180                 185                 190
Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr
195                 200
<210>  36
<211>  503
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  бета-цепь ImmTAC (содержащая scFv-фрагмент антитела против CD3,
слитый через линкер с бета-цепью TCR, содержащей последовательность SEQ
ID NO: 18(b65) и константный домен, имеющий последовательность
SEQ ID NO: 5)
<400>  36
Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100                 105                 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115                 120                 125
Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
130                 135                 140
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe
145                 150                 155                 160
Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
165                 170                 175
Glu Trp Val Ala Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn
180                 185                 190
Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn
195                 200                 205
Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
210                 215                 220
Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe
225                 230                 235                 240
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
245                 250                 255
Gly Ser Ser Ala Val Ile Ser Gln Lys Pro Ser Arg Asp Ile Lys Gln
260                 265                 270
Arg Gly Thr Ser Leu Thr Ile Gln Cys Gln Val Asp Lys Arg Leu Ala
275                 280                 285
Leu Met Phe Trp Tyr Arg Gln Gln Pro Gly Gln Ser Pro Thr Leu Ile
290                 295                 300
Ala Thr Ala Trp Thr Gly Ser Glu Ala Thr Tyr Glu Ser Gly Phe Val
305                 310                 315                 320
Ile Asp Lys Phe Pro Ile Ser Arg Pro Asn Leu Thr Phe Ser Thr Leu
325                 330                 335
Thr Val Ser Asn Met Ser Pro Glu Asp Ser Ser Ile Tyr Leu Cys Ser
340                 345                 350
Val Gly Gly Ser Gly Gly Ala Asp Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr
355                 360                 365
Arg Leu Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val
370                 375                 380
Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala
385                 390                 395                 400
Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu
405                 410                 415
Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp
420                 425                 430
Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Ala
435                 440                 445
Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asp Pro Arg
450                 455                 460
Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp
465                 470                 475                 480
Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala
485                 490                 495
Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp
500
<210>  37
<211>  203
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  альфа-цепь ImmTAC (содержащая последовательность SEQ ID NO:
12(a82) и  константный домен, имеющий последовательность SEQ ID NO: 4,
укороченную на 8 аминокислот)
<400>  37
Ala Gln Ser Val Ala Gln Pro Glu Asp Gln Val Asn Val Ala Glu Gly
1               5                   10                  15
Asn Pro Leu Thr Val Lys Cys Thr Tyr Ser Val Ser Gly Asn Pro Tyr
20                  25                  30
Leu Phe Trp Tyr Val Gln Tyr Pro Asn Arg Gly Leu Gln Phe Leu Leu
35                  40                  45
Lys Tyr Leu Gly Asp Ser Ala Leu Val Lys Gly Ser Tyr Gly Phe Glu
50                  55                  60
Ala Glu Phe Asn Lys Ser Gln Thr Ser Phe His Leu Lys Lys Pro Ser
65                  70                  75                  80
Ala Leu Val Ser Asp Ser Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Val Arg Asp Ile
85                  90                  95
Arg Ser Gly Ala Gly Ser Tyr Gln Leu Thr Phe Gly Lys Gly Thr Lys
100                 105                 110
Leu Ser Val Ile Pro Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln
115                 120                 125
Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp
130                 135                 140
Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr
145                 150                 155                 160
Ile Thr Asp Lys Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser
165                 170                 175
Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn
180                 185                 190
Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr
195                 200
<210>  38
<211>  503
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  бета-цепь ImmTAC (содержащая scFv-фрагмент антитела против CD3,
слитый через линкер с бета-цепью TCR, содержащей последовательность SEQ
ID NO: 15(b52) и  константный домен, имеющий последовательность SEQ ID
NO: 5)
<400>  38
Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100                 105                 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115                 120                 125
Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
130                 135                 140
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe
145                 150                 155                 160
Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
165                 170                 175
Glu Trp Val Ala Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn
180                 185                 190
Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn
195                 200                 205
Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
210                 215                 220
Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe
225                 230                 235                 240
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
245                 250                 255
Gly Ser Ser Ala Val Ile Ser Gln Lys Pro Ser Arg Asp Ile Lys Gln
260                 265                 270
Arg Gly Thr Ser Leu Thr Ile Gln Cys Gln Val Asp Lys Arg Leu Ala
275                 280                 285
Leu Met Phe Trp Tyr Arg Gln Gln Pro Gly Gln Ser Pro Thr Leu Ile
290                 295                 300
Ala Thr Ala Trp Thr Gly Gly Glu Ala Thr Tyr Glu Ser Gly Phe Val
305                 310                 315                 320
Ile Asp Lys Phe Pro Ile Ser Arg Pro Asn Leu Thr Phe Ser Thr Leu
325                 330                 335
Thr Val Ser Asn Met Ser Pro Glu Asp Ser Ser Ile Tyr Leu Cys Ser
340                 345                 350
Val Gly Gly Ser Gly Ala Ala Asp Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr
355                 360                 365
Arg Leu Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val
370                 375                 380
Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala
385                 390                 395                 400
Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu
405                 410                 415
Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp
420                 425                 430
Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Ala
435                 440                 445
Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asp Pro Arg
450                 455                 460
Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp
465                 470                 475                 480
Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala
485                 490                 495
Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp
500
<210>  39
<211>  203
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  альфа-цепь ImmTAC (содержащая последовательность SEQ ID NO:
12(a82) и константный домен, имеющий последовательность SEQ ID NO: 4,
укороченную на 8 аминокислот)
<400>  39
Ala Gln Ser Val Ala Gln Pro Glu Asp Gln Val Asn Val Ala Glu Gly
1               5                   10                  15
Asn Pro Leu Thr Val Lys Cys Thr Tyr Ser Val Ser Gly Asn Pro Tyr
20                  25                  30
Leu Phe Trp Tyr Val Gln Tyr Pro Asn Arg Gly Leu Gln Phe Leu Leu
35                  40                  45
Lys Tyr Leu Gly Asp Ser Ala Leu Val Lys Gly Ser Tyr Gly Phe Glu
50                  55                  60
Ala Glu Phe Asn Lys Ser Gln Thr Ser Phe His Leu Lys Lys Pro Ser
65                  70                  75                  80
Ala Leu Val Ser Asp Ser Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Val Arg Asp Ile
85                  90                  95
Arg Ser Gly Ala Gly Ser Tyr Gln Leu Thr Phe Gly Lys Gly Thr Lys
100                 105                 110
Leu Ser Val Ile Pro Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln
115                 120                 125
Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp
130                 135                 140
Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr
145                 150                 155                 160
Ile Thr Asp Lys Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser
165                 170                 175
Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn
180                 185                 190
Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr
195                 200
<210>  40
<211>  503
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  бета-цепь ImmTAC (содержащая scFv-фрагмент антитела против CD3,
слитый через линкер с бета-цепью TCR, содержащей последовательность SEQ
ID NO: 18(b65) и константный домен, имеющий последовательность SEQ ID
NO: 5)
<400>  40
Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100                 105                 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115                 120                 125
Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
130                 135                 140
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe
145                 150                 155                 160
Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
165                 170                 175
Glu Trp Val Ala Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn
180                 185                 190
Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn
195                 200                 205
Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
210                 215                 220
Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe
225                 230                 235                 240
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
245                 250                 255
Gly Ser Ser Ala Val Ile Ser Gln Lys Pro Ser Arg Asp Ile Lys Gln
260                 265                 270
Arg Gly Thr Ser Leu Thr Ile Gln Cys Gln Val Asp Lys Arg Leu Ala
275                 280                 285
Leu Met Phe Trp Tyr Arg Gln Gln Pro Gly Gln Ser Pro Thr Leu Ile
290                 295                 300
Ala Thr Ala Trp Thr Gly Ser Glu Ala Thr Tyr Glu Ser Gly Phe Val
305                 310                 315                 320
Ile Asp Lys Phe Pro Ile Ser Arg Pro Asn Leu Thr Phe Ser Thr Leu
325                 330                 335
Thr Val Ser Asn Met Ser Pro Glu Asp Ser Ser Ile Tyr Leu Cys Ser
340                 345                 350
Val Gly Gly Ser Gly Gly Ala Asp Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr
355                 360                 365
Arg Leu Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val
370                 375                 380
Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala
385                 390                 395                 400
Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu
405                 410                 415
Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp
420                 425                 430
Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Ala
435                 440                 445
Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asp Pro Arg
450                 455                 460
Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp
465                 470                 475                 480
Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala
485                 490                 495
Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp
500
<210>  41
<211>  6
<212>  Белок
<213>  Homo sapiens
<400>  41
Val Ser Gly Asn Pro Tyr
1               5
<210>  42
<211>  8
<212>  Белок
<213>  Homo sapiens
<400>  42
Tyr Ile Thr Gly Asp Asn Leu Val
1               5
<210>  43
<211>  17
<212>  Белок
<213>  Homo sapiens
<400>  43
Cys Ala Val Arg Asp Ile Asn Ser Gly Ala Gly Ser Tyr Gln Leu Thr
1               5                   10                  15
Phe
<210>  44
<211>  5
<212>  Белок
<213>  Homo sapiens
<400>  44
Ser Gln Val Thr Met
1               5
<210>  45
<211>  7
<212>  Белок
<213>  Homo sapiens
<400>  45
Ala Asn Gln Gly Ser Glu Ala
1               5
<210>  46
<211>  14
<212>  Белок
<213>  Homo sapiens
<400>  46
Cys Ser Val Gly Gly Ser Gly Gly Ala Asp Thr Gln Tyr Phe
1               5                   10
<210>  47
<211>  17
<212>  Белок
<213>  Homo sapiens
<400>  47
Leu Phe Trp Tyr Val Gln Tyr Pro Asn Arg Gly Leu Gln Phe Leu Leu
1               5                   10                  15
Lys
<210>  48
<211>  33
<212>  Белок
<213>  Homo sapiens
<400>  48
Lys Gly Ser Tyr Gly Phe Glu Ala Glu Phe Asn Lys Ser Gln Thr Ser
1               5                   10                  15
Phe His Leu Lys Lys Pro Ser Ala Leu Val Ser Asp Ser Ala Leu Tyr
20                  25                  30
Phe
<210>  49
<211>  17
<212>  Белок
<213>  Homo sapiens
<400>  49
Met Phe Trp Tyr Arg Gln Gln Pro Gly Gln Ser Leu Thr Leu Ile Ala
1               5                   10                  15
Thr
<210>  50
<211>  37
<212>  Белок
<213>  Homo sapiens
<400>  50
Thr Tyr Glu Ser Gly Phe Val Ile Asp Lys Phe Pro Ile Ser Arg Pro
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Phe Ser Thr Leu Thr Val Ser Asn Met Ser Pro Glu Asp
20                  25                  30
Ser Ser Ile Tyr Leu
35
<210>  51
<211>  117
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Мутантная альфа-цепь (a86)
<400>  51
Ala Gln Ser Val Ala Gln Pro Glu Asp Gln Val Asn Val Ala Glu Gly
1               5                   10                  15
Asn Pro Leu Thr Val Lys Cys Thr Tyr Ser Val Ser Gly Asn Pro Tyr
20                  25                  30
Leu Phe Trp Tyr Val Gln Tyr Pro Asn Arg Gly Leu Gln Phe Leu Leu
35                  40                  45
Lys Tyr Leu Thr Asp Asp Asn Leu Val Lys Gly Ser Tyr Gly Phe Glu
50                  55                  60
Ala Glu Phe Asn Lys Ser Gln Thr Ser Phe His Leu Lys Lys Pro Ser
65                  70                  75                  80
Ala Leu Val Ser Asp Ser Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Val Arg Asp Ile
85                  90                  95
Asn Ser Gly Ala Gly Ser Tyr Gln Leu Thr Phe Gly Lys Gly Thr Lys
100                 105                 110
Leu Ser Val Ile Pro
115
<210>  52
<211>  115
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Мутантная бета-цепь (b71)
<400>  52
Ser Ala Val Ile Ser Gln Lys Pro Ser Arg Asp Ile Lys Gln Arg Gly
1               5                   10                  15
Thr Ser Leu Thr Ile Gln Cys Gln Val Asp Ser Gln Val Ala Met Met
20                  25                  30
Phe Trp Tyr Arg Gln Gln Pro Gly Gln Ser Pro Thr Leu Ile Ala Thr
35                  40                  45
Ala Trp Gln Gly Ser Glu Ala Thr Tyr Glu Ser Gly Phe Val Ile Asp
50                  55                  60
Lys Phe Pro Ile Ser Arg Pro Asn Leu Thr Phe Ser Thr Leu Thr Val
65                  70                  75                  80
Ser Asn Met Ser Pro Glu Asp Ser Ser Ile Tyr Leu Cys Ser Val Gly
85                  90                  95
Gly Ser Gly Ala Ala Asp Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu
100                 105                 110
Thr Val Leu
115
<---