Оптическая диагностика и лазерная гипертермия опухолей с применением плазмонно-резонансных наночастиц

ОПТИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА И ЛАЗЕРНАЯ ГИПЕРТЕРМИЯ ОПУХОЛЕЙ С ПРИМЕНЕНИЕМ ПЛАЗМОННО-РЕЗОНАНСНЫХ

НАНОЧАСТИЦ

М.А. Сироткина12, В.В. Елагин12, М.Л. Бугрова1, М.В. Ширманова1, В.А. Надточенко3, Е.В. Загайнова12

1ГОУ ВПО Нижегородская государственная медицинская академия

2Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского 3Институт химической физики РАН им. Н.Н. Семенова, Москва

Представлены результаты предварительного исследования локальной лазерной гипертермии опухолей с золотыми наночастицами. В исследовании использованы бифункциональные плазмонно-резонансные наночастицы, которые одинаково хорошо подходят для визуализации методом оптической когерентной томографии и лечения с помощью лазерного нагрева на длине волны 810 нм. Подобран оптимальный режим лазерной гипертермии, который оказал выраженный терапевтический эффект на экспериментальные опухоли после внутривенного введения золотых наночастиц. Эффективность лечения обусловлена проведением гипертермии в период максимального накопления наночастиц в опухоли, который был установлен in vivo с помощью оптической когерентной томографии. Коэффициент торможения роста опухоли на 5-й день после гипертермии составил 66%.

Ключевые слова: диагностика и лечение опухолей, плазмонно-резонансные наночастицы, оптическая когерентная томография, лазерная гипертермия, опухолевая модель.

OPTICAL DIAGNOSTICS AND LASER HYPERTHERMIA OF TUMORS USING PLASMON RESONANT NANOPARTICLES

M.A. Sirotkina12, V.V. Elagin12, M.L. Bugrova1, M.V. Shirmanova1, V.A. Nadtochenko3, E.V. Zagaynova12

1Nizhny Novgorod State Medical Academy

2Lobachevsky State University of Nizhny Novgorod

3N.N. Semenov Institute of Chemical Physics, Moscow

In the current work we presented preliminary study results of a local laser hyperthermia of tumors using gold nanoparticles. Bifunctional Plasmon resonant nanoparticles that are suitable for both optical coherent tomography (OCT) visualization and laser heating therapy at the wavelength of 810 nm were applied in the study. An optimal regime of laser therapy was selected that ensured pronounced therapeutic effect on experimental tumor after intravenous infusion of gold nanoparticles. The efficiency of treatment was due to hyperthermia performed in time when nanoparticle content in tumor reached maximum that was assessed in vivo by means of OCT. The coefficient of tumor growth inhibition formed 66% on the 5th day after hyperthermia.

Key words: diagnostics and therapy of tumor, Plasmon resonant nanoparticles, optical coherent tomography, laser hyperthermia, in vivo, tumor model.

Проблема борьбы со злокачественными новообразованиями остается одной из приоритетных для современного общества. По данным статистики, смертность от онкологических заболеваний по-прежнему остается стабильно высокой [5]. В 60% случаев болезнь выявляют на ПМУ стадиях. Это приводит к увеличению смертности и значительной инвалидизации больных.

Поэтому внимание ученых во всем мире привлекает проблема поиска новых методов диагностики и лечения рака.

В последние годы бурное развитие в медицине получило такое направление, как тераностика - комбинация новейшей оптической диагностики и лечения рака, объединенных в единый комплекс через

ХИРУРГИЯ ЭКСТРЕННАЯ И ПЛАНОВАЯ - ИННОВАЦИИ И ОПЫТ

ХИРУРГИЯ ЭКСТРЕННАЯ И ПЛАНОВАЯ - ИННОВАЦИИ И ОПЫТ

использование нетоксичных наночастиц, например, металлических плазмонно-резонансных наночастиц [14]. Такие наночастицы представляют особый интерес, поскольку они способны усиленно поглощать и (или) рассеивать оптическое излучение определенной длины волны [13]. Это позволяет им, с одной стороны, быть потенциальными агентами для обеспечения контраста изображений в современных оптических методах диагностики, в частности, оптической когерентной (ОКТ) и оптической диффузионной томографии, оптоакустической томографии [6, 9, 10, 11, 15]. С другой стороны, плазмонно-резонансные наночастицы могут служить термосенсибилизаторами для лечения опухолей путем локальной лазерной гипертермии [7, 12]. При воздействии на опухоль, содержащую наночастицы, лазерным излучением с длиной волны, соответствующей максимуму плаз-монного резонанса частиц, происходит их быстрый разогрев до высокой температуры, что приводит к повреждению опухолевых клеток. Локальность гипертермии обусловлена воздействием лазера только на патологическую ткань, которая содержит наночастицы. Наночастицы селективно накапливаются и удерживаются в опухоли после системного введения в организм за счет повышенной проницаемости кровеносных сосудов [1, 3] и недостаточной дренажной функции лимфатической системы [8]. Однако совершенно очевидно, что эффективность воздействия будет тем выше, чем выше концентрация наночастиц в опухолевом узле. Поэтому неотъемлемой частью задачи гипертермии является контроль накопления наночастиц в зоне патологии.

Цель исследования - разработка методики селективной лазерной гипертермии опухолей с применением нанотермосенсибилизаторов с контролем максимального накопления частиц в опухоли методом ОКТ.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Исследование проводилось на 16 самках мышей линии СВА массой 22-25 г. Экспериментальная опухоль рака шейки матки (РШМ-5) была трансплантирована подкожно в подмышечную область по стандартной методике перевивки солидных опухолей [2]. Линейный размер опухолевого узла к началу эксперимента (7-8-й день после перевивки) составлял 7-10 мм. Животным в опытной группе (п=12) внутривенно вводили коллоидный раствор наночастиц в объеме 0,2 мл. В контрольной группе (п=4) это был физиологический раствор в том же объеме.

Наночастицы были синтезированы по модифицированной методике двухстадийного роста наночастиц из зародышей [4] и представляли собой золотые бипирамиды, стабилизированные полиэтиленгликолем. Их размер составлял 200-250 нм, концентрация - 109 частиц/мл. Пик плазмонного резонанса находился на длине волны 800 нм, так что по своим оптическим свойствам они одинаково хорошо подходили как для визуализации методом ОКТ, так и для лазерного нагрева (рис. 1).

Процесс накопления золотых наночастиц в опухоли контролировали прижизненно и неинвазивно методом ОКТ. Изображения получали на оптическом когерентном томографе (ИПФ РАН, Нижний Новгород), оснащенном съемным гибким зондом с внешним диаметром 2,7 мм и имеющим следующие технические характеристики: длина волны излучения - 900 нм, мощность источника излучения - 2 мВт, пространственное разрешение - 15-20 мкм, глубина сканирования - до 1,5 мм. Для получения изображения ОКТ-зонд подносили к поверхности опухолевого узла с небольшим дозированным прижимом. Изображения регистрировали до введения наночастиц, а затем каждые 30 минут в течение 5 часов до получения максимально высокого уровня ОКТ-сигнала.

а б

Рис. 1. Золотые плазмонно-резонансные наночастицы: а - электронная микрофотография (х8900), размер бара 0,5 мкм; б - зависимость экстинкции коллоидного раствора наночастиц от длины волны

Накопление наночастиц в опухоли подтверждали трансмиссионной электронной микроскопией. Образцы опухолевой ткани забирали через 6 часов после инъекции наночастиц.

В период наиболее высокого содержания наночастиц на опухоль воздействовали лазером (ЛСП-АЗОР, Россия) с длиной волны 810 нм. Плотность мощности составляла 1,3-1,5 Вт/см2 в зависимости от размера опухолевого узла. Нагрев проводили в течение 20 минут, поддерживая температуру 44-45°С. Измерение температуры осуществляли непрерывно в течение всего сеанса с помощью ИК-термографа (ЮТ!Б-2000МЕ, Россия).

Противоопухолевый эффект гипертермии оценивали по критериям торможения роста опухоли (ТРО, %) и регрессии (%), которые рассчитывали по стандартным формулам [2]. Размер опухолевого узла измеряли штангенциркулем ежедневно в течение 7 дней. Объем опухоли рассчитывали как произведение длины, ширины и высоты.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

ОКТ-изображения опухоли до применения наночастиц представляли собой однородную бесструктурную область со средним уровнем сигнала и небольшой глубиной проникновения зондирующего излучения (рис. 2,а). Первые 2 часа после инъекции наночастиц никаких изменений на ОКТ-изображениях опухоли не наблюдалось. Через 2,5 часа после внутривенного введения наночастиц зафиксировано увеличение ОКТ-сигнала и возрастание глубины визуализации. Максимальная выраженность этих изменений отмечалась через 4-5 часов (рис. 2,б), что соответствовало максимальному накоплению наночастиц в опухоли. Этот период времени был выбран как оптимальный для начала лазерной гипертермии.

Методом электронной микроскопии золотые наночастицы были обнаружены внутри опухолевых клеток. Через 6 часов после внутривенного введения

наночастицы встречались в цитоплазме, в ядре и в аппарате Гольджи (рис. 3).

В период максимального накопления наночастиц проводили лазерное воздействие на опухоль. Начальная мощность лазера, при которой происходил нагрев опухоли до нужной температуры, составляла 1,2 Вт. При лазерной гипертермии опухоли с наночастицами необходимая температура устанавливалась через 3-3,5 минуты. Затем, чтобы она не превышала 45 °С, мощность уменьшали до 1 Вт. Это позволило поддерживать постоянную температуру в опухоли на протяжении всего сеанса гипертермии в течение 20 минут. При нагреве опухоли без наночастиц мощность лазера была постоянной в течение всего времени воздействия и составляла 1,2 Вт. Отмечено, что нагрев опухоли до 44 °С при равных условиях воздействия у животных опытной группы происходил в 5 раз быстрее, чем в контрольной.

При проведении с помощью ИК-термографа гипертермии опухоли, меченной золотыми наночастицами, опухолевый узел нагревался локально, в то время как при отсутствии наночастиц наблюдалось диффузное распространение тепла из зоны опухоли на окружающие здоровые ткани (рис. 4). Видимых повреждений опухоли (ожог, гиперемия) во время проведения сеанса и после него не наблюдалось.

На рис. 5 представлена диаграмма изменения объема опухолей после лазерной гипертермии. На 5-е и 6-е сутки после воздействия наблюдалось заметное уменьшение объема опухолей у животных опытной группы. Коэффициент ТРО в этот период составил 66%, а регрессия опухоли имела положительное значение (+26%), в то время как в контрольной группе отмечался стабильный рост опухоли, а регрессия носила отрицательный характер и на 5-е сутки составляла 77%.

Представленная работа демонстрирует эффективность проведения прижизненного и неинвазивного исследования накопления плазмонно-резонансных золотых наночастиц в экспериментальной опухолевой модели методом ОКТ. Анализ оптических изменений

а б

Рис. 2. ОКТ-изображения опухоли РШМ-5: а - до применения плазмонно-резонансных наночастиц; б - через 4 часа после внутривенного введения наночастиц

ХИРУРГИЯ ЭКСТРЕННАЯ И ПЛАНОВАЯ - ИННОВАЦИИ И ОПЫТ

ХИРУРГИЯ ЭКСТРЕННАЯ И ПЛАНОВАЯ - ИННОВАЦИИ И ОПЫТ

аб Рис. 3. Электронная микрофотография опухолевой клетки через 6 часов после внутривенного введения наночастиц: а - наночастицы в ядре (х14000); б - наночастицы в цитоплазме рядом с митохондриями (х28000).

Наночастицы показаны стрелками

123.06 _____________________________

а б

Рис. 4. ИК-термограммы через 15 минут после начала гипертермии животных контрольной (а) и опытной (б) групп

2.5

01234567 время, дни

опытная группа контрольная группа

Рис. 5. Изменение объема опухоли РШМ-5 после лазерной гипертермии

позволил установить время максимального накопления наночастиц в опухоли, которое соответствует 4-5 часам после внутривенной инъекции наночастиц. Это дает возможность наиболее эффективно и прицельно осуществить лазерное воздействие на опухоль. Применяемые наночастицы обеспечили локальность воздействия и позволили снизить мощность лазерного излучения. Полученные значения коэффициентов регрессии роста опухолей и ТРО свидетельствуют о положительном лечебном эффекте лазерной гипертермии в сочетании с плазмонно-резонансными наночастицами.

ЛИТЕРАТУРА

1. Блохин Н.Н., Петерсон Б.Е. Клиническая онкология. М.: Медицина, 1971. Т.1. 440 с.

2. Вончель Ц., Смирнова З.С., Кубасова И.Ю., Барышников А.Ю. Изучение противоопухолевой активности безал-лергенного экстракта из RHUS VERNICIFLURA // Рос. био-терапевтич. журн. 2002. №4. С.39-43.

3. Жданов Д.А., Этинген Л.Е., Ахмедов Б.П. Анатомия сосудов опухолей. Душанбе: Ирфон, 1974. 192 с.

4. Озерни А.Н., Зеленецкий А.Н., Акопова Т.А. и др. Нанокомпозиты на основе хитозана и модифицированного оксида титана // Высокомолекул. соединения. Серия А. 2006. №6. С.983-989.

5. Чиссов В.И., Старинский В.В., Петрова Г.В. Злокачественные новообразования в России. М., 2006. С.47-50.

6. Copland J.A., Eghtedari M., Popov V.L. et al. Bioconjugated gold nanoparticles as a molecular based contrast agent: implications for imaging of deep tumors using optoacoustic tomography // Mol. Imaging Biol. 2004. V.6, No.5. P.341-349.

7. Gobin A.M., Lee M.H., Halas N.J. et al. Near-Infrared Resonant Nanoshells for combined Optical imaging and photothermal cancer // NanoLetters. 2007. V.7, No.7. P.1929-1934.

8. Jain R.K. Physiological barriers to delivery of monoclonal antibodies and other macromolecules in tumors // Cancer Res. 1990. V.50, No.3, P.814s-819s.

9. Kah J.C.Y., Chow T.H., Ng B.K. et al. Concentration dependence of gold nanoshells on the enhancement of optical coherence tomography images: a quantitative study // Appl. Optics. 2009. V.48, No.10. P.D96-D108.

10. Kim C.S., Wilder-Smith P., Ahn Y-C. et al. YJ Enhanced detection of early-stage oral cancer in vivo by optical coherence tomography using multimodal delivery of gold nanoparticles // J. Biomed. Optics. 2009. V.14 (3), No.034008. P.1-8.

11. Kirillin M., Shirmanova M., Sirotkina M. et al. Contrasting properties of gold nanoshells and titanium dioxide nanoparticles for OCT imaging of skin: Monte Carlo simulations and in vivo study // J. Biomed. Optics. 2009. V.14 (2), No.021017. P.1-11.

12. Liu H., Chen D., Tang F. et al. Photothermal therapy of Lewis lung carcinoma in mice using gold nanoshells on carboxylated polystyrene spheres // Nanotechnology. 2008. No.19. P.1-7.

13. Wijayaa A., Brownb K.A. et al. Magnetic field heating study of Fe-doped Au nanoparticles // J. Magnet. Magn. Materials. 2007. V.309. P.15-19.

14. Xie J., Lee S., Chen X. Nanoparticle-based theranostic agents // Adv. Drud. Deliv. Rev. 2010. V.62, No.11. P.1064-1079.

15. Zaman R.T., Diagaradjane P., Krishnan S., Tunnell J.W. In Vivo Detection of Gold Nanoshells in Tumors Using Diffuse Optical Spectroscopy // IEEE J. Sel. Top. Quant. Elec. 2007. V.13, No.6. P.1715-1720.

ХИРУРГИЯ ЭКСТРЕННАЯ И ПЛАНОВАЯ - ИННОВАЦИИ И ОПЫТ