ИЗОЛИРОВАННЫЙ ПОЛИПЕПТИД И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАКОВОГО ЗАБОЛЕВАНИЯ ИЛИ СТИМУЛЯЦИИ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ ТАКОЙ ПОЛИПЕПТИД И СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ РАКА.
ISOLATED POLYPEPTIDE AND USING IT FOR TREATING MALIGNANT DISEASE AND STIMULATING IMMUNE SYSTEM, PHARMACEUTICAL COMPOSITION CONTAINING SUCH POLYPEPTIDE AND METHOD OF TREATING CANCER

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к новому белку и его применению в терапии.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Заболевания, которыми страдает человек, могут классифицироваться в зависимости от механизма, который лежит в основе этих заболеваний. Например, заболевания, включающие иммунологический компонент или этиологию, включают инфекционные заболевания, острые и хронические воспалительные заболевания, раковые заболевания, осложнения при трансплантации и аутоиммунные заболевания.
Примеры аутоиммунных заболеваний включают рассеянный склероз (PC), аутоиммунный увеит, аутоиммунный увеоретинит, аутоиммунный тиреоидит, тиреоидит Хашимото, инсулит, синдром Шегрена, самопроизвольные аборты (выкидыши), экспериментальный аутоиммунный миокардит, ревматоидный артрит (РА), воспалительное заболевание кишечника (ВЗК), болезнь Крона, волчанку (системную красную волчанку (СКВ)), псориаз и диабет, в частности диабет I типа.
Дополнительные примеры аутоиммунных заболеваний включают острый некротический геморрагический лейкоэнцефалит, болезнь Аддисона, агаммаглобулинемию, аллергическую астму, аллергический ринит, гнездную алопецию, амилоидоз, анкилозирующий спондилоартрит (болезнь Бехтерева), Анти-GBM/Анти-ТВМ нефрит, антифосфолипидный синдром (АФЛС), аутоиммунную гипопластическую анемию, аутоиммунную вегетативную дистонию, аутоиммунный гепатит, аутоиммунную гиперлипидемию, аутоиммунный иммунодефицит, аутоиммунное заболевание внутреннего уха (АЗВУ), аутоиммунный миокардит, аутоиммунную тромбоцитопеническую пурпуру (АТП), аксональную и нейрональную невропатии, болезнь Баля (Bal's disease), болезнь Бенета (Behnet's disease), буллезный пемфигоид, кардиомиопатию, болезнь Кастлемена, целиакию-спру (нетропическую энтеропатию), болезнь Чагаса, синдром хронической усталости, хроническую воспалительную демиелинизирующую полинейропатию (ХВДП), синдром Черджа-Строса, рубцовый пемфигоид /доброкачественный пемфигоид слизистой оболочки, синдром Когана, болезнь холодовых агглютининов, врожденную блокаду сердца, миокардит коксаки, синдром Тибьержа-Ейсенбаха, основную криоглобулинемию смешанного типа демиелинизирующие нейропатии, дерматомиозит (болезнь Вагнера-Унферрихта-Хеппа), болезнь Девика, дискоидную волчанку, синдром Дресслера, эндометриоз, эозинофильный фасциит, нодозную эритему, экспериментальный аллергический энцефаломиелит, синдром Эвана, фибромиалгию, фиброзирующий альвеолит, гигантоклеточный артериит (височный артериит), синдром Гудпасчера, базедову болезнь (болезнь Грейвса), синдром Гийена-Барре, гемолитическую анемию, пурпуру (болезнь) Шенлейна-Геноха, герпес беременных, гипогаммаглобулинемию (синдром дефицита антител), геморрагическую пурпуру (идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру), первичную нефропатию IgA-типа, иммунорегуляторные липопротеины, миозит с включенными тельцами, инсулинозависимый диабет (тип 1), интерстициальный цистит, юношеский (ювенильный) артрит, юношеский (ювенильный) диабет, синдром Кавасаки, синдром Итона-Ламберта, лейкоцистокластический васкулит, лишай Вильсона, склероатрофический лишай, деревянистый конъюнктивит, IgA-зависимый линейный дерматоз (LAD), лаймскую болезнь, болезнь Меньера (водянка лабиринта внутреннего уха), микроскопическую ангиопатию, синдром Шарпа (смешанное поражение соединительной ткани), разъедающую язву роговицы, острый лихеноидный оспенновидный парапсориаз, тяжелую псевдопаралитическую миастению, миозит, нарколепсию, агранулоцитоз (нейтропению), рубцовый пемфигоид глаза, остеоартрит, мигрирующий артрит, паранеопластическую мозжечковую дегенерацию, ночную пароксизмальную гемоглобинурию (ПНГ), синдром Парсонажа и Турнера, Pars planitis (периферический увеит), пемфигус (обыкновенную пузырчатку), периферическую нейропатию, перивенозный энцефаломиелит, пернициозную анемию, синдром POEMS (полиневропатия (полинейропатия) с органомегалией), узелковый полиартериит, аутоиммунные плюригландулярные синдромы типов I, II и III, ревматическую полимиалгию, полимиозит (болезнь Вагнера-Унферрихта-Хеппа), постинфарктный синдром, синдром осложнений после перикардиотомии, прогестероновый дерматит, билиарный первичный цирроз печени, псориатический артрит, идиопатический легочный фиброз, гангренозную приодермию, истинную эритроцитарную аплазию, феномен Рейно, симпатическую рефлекторную дистрофию, триаду Рейтера (уретроокулосиновиальный синдром), рецидивирующий полихондрит, синдром усталых ног, ревматический полиартрит (острую ревматическую лихорадку), доброкачественный гранулематоз (синдром Бенье-Бека-Шауманна), синдром Шмидта, склерит, склеродермию, аутоиммунитет против спермы и яичек, синдром скованного человека, подострый септический эндокардит (ПСЭ), метастатическую офтальмию, синдром дуги аорты (синдром Такаясу), темпоральный артериит /гигантоклеточный артериит, тромбоцитопеническую пурпуру (ТТП), аутоиммунное заболевание щитовидной железы, синдром Толоса-Ханта, поперечный миелит и некротическую миелопатию, язвенный колит, недифференцированную болезнь соединительной ткани (НДСТ), васкулит (воспаление кровеносных сосудов), везикулезно-буллезный дерматоз, Витилиго и синдром Вегенера (системный некротизирующий гранулематозный васкулит).
Неограничивающие примеры типов раковых заболеваний включают рак коры надпочечников (адренокортикальный); злокачественную меланому; немеланомный рак кожи; Т-клеточную лимфому кожи; саркому Капоши; рак мочевого пузыря; рак прямой кишки; колоректальный рак; ректальный рак; нейроэктодермальный рак и рак шишковидного тела; глиому ствола головного мозга детского возраста; мозжечковую астроцитому детского возраста; астроцитому мозга детского возраста; медуллобластому детского возраста; глиому зрительных путей детского возраста; менингиому; смешанную глиому; олигодендроглиому; астроцитому; эпендимальную глиому; аденому гипофиза; метастазированную аденокарциному; невриному слухового нерва; околопозвоночную злокачественную тератому; рак груди; протоковую (дуктальную) карциному; новообразование молочной железы; рак яичников; карциноидную опухоль; цервикальный рак (рак шейки матки); рак матки; рак эндометрия; рак влагалища; рак вульвы; гестационный трофобластический рак; рак фаллопиевых труб; саркому матки; лейкемию; лимфому (лимфому Ходжкина и не-ходжкинскую лимфому); нейробластому; ретинобластому; саркомы мягких тканей; нефробластому (опухоль Вильмса); анемию Фанкони; гранулематоз из клеток Лангерганса; злокачественную стержнеобразную опухоль почки; рак печени; нейробластому; ретинобластому; хориокарциному; раковые заболевания эндокринных желез; рак эндометрия; рак пищевода; саркому Юинга; рак глаз; рак желудка; раковые заболевания желудочно-кишечного тракта; раковые заболевания мочеполовых органов; глиому; раковые заболевания женских половых органов; рак головы и шеи; печеночно-клеточный рак; подглоточный рак; рак островковых клеток; рак почки; рак гортани; рак легкого; лимфому; рак груди у мужчин; меланому; мезотелиому; плазмоклеточную миелому; носоглоточный рак; немеланомный рак кожи; рак пищевода; остеосаркому; рак яичников; рак поджелудочной железы; рак гипофиза; рак предстательной железы; почечно-клеточную карциному; ретинобластому; рабдомиосаркому; саркому; рак кожи; плоскоклеточный рак; рак желудка; рак яичка; рак вилочковой железы; рак щитовидной железы; переходно-клеточный рак; трофобластический рак; рак матки; острый лимфолейкоз; острую миелоидную лейкемию; аденокистозную карциному; рак анального канала; рак костной ткани; рак кишечника; протоковую (дуктальную) карциному; липосаркому; нейробластому; нефробластому и остеосаркому.
Воспалительные заболевания включают сепсис, эндотоксикоз, панкреатит, увеит, гепатит, перитонит, кератит, SIRS (Systemic Inflammation Response Syndrome - синдром системной воспалительной реакции) и воспаление, вызываемое повреждением.
Заболевания, связанные с фертильностью (репродуктивной способностью) включают мужское бесплодие и женское бесплодие.
Мужское бесплодие может быть вызвано рядом проблем. Ниже перечислен ряд наиболее часто встречающихся нарушений.
- Недостаточная выработка сперматозоидов: Девяносто процентов мужского бесплодия вызваны неспособностью к выработке достаточного количества сперматозоидов. Азооспермию диагностируют при полном отсутствии жизнеспособных сперматозоидов в сперме, в то время как олигоспермию диагностируют при очень низкой концентрации сперматозоидов в семенной жидкости, и, поскольку большая часть спермы разрушается, еще не достигнув яйцеклетки, то чем больше количество сперматозоидов в сперме, тем больше шансов, что один из них успешно оплодотворит яйцеклетку. Тем не менее, низкое количество сперматозоидов или общее количество сперматозоидов, составляющее менее 5 миллионов/мл, не обязательно означает, что мужчина бесплоден, если его сперматозоиды здоровы, правильно сформированы и подвижны.
- Варикоцеле (варикозное расширение вен семенного канатика): Варикозное расширение вены вокруг одного из двух семенных канатиков вызывает застой крови в яичках; это, в свою очередь, вызывает повышение температуры в этой области. Повышение температуры снижает выработку спермы и может приводить к бесплодию. К счастью, эта проблема устраняется хирургическим вмешательством.
- Другие нарушения: Другие нарушения, которые могут вызывать мужское бесплодие, включают аномалии развития или повреждение яичек (вызываемые эндокринными нарушениями или воспалением), нарушения добавочных (придаточных) желез, нарушения при коитусе, воздействие диэтилстилбестрола (DES), синтетического эстрогена, применявшегося в 1950-х и 1960-х годах, который вызывает образование кист в мужских половых путях, неопустившиеся яички и, в редких случаях, генетические нарушения, например хромосомные аномалии.
Женское бесплодие также может быть вызвано рядом проблем. Ниже перечислен ряд наиболее часто встречающихся нарушений.
- Поликистоз яичников: Это заболевание представляет собой наиболее часто встречающуюся причину нарушений овуляции у женщин и характеризуется наличием множества мелких кист в яичниках, избыточной выработкой андрогенов и редкими менструациями (облиоменорея (опсоменорея)) или отсутствием менструаций (аменорея). Неспособность к овуляции представляет собой наиболее часто встречающуюся причину женского бесплодия и может происходить по неизвестным причинам или в результате стресса, гормонального дисбаланса и различных заболевании и нарушений репродуктивной системы (некоторые из них описаны ниже).
- Воспалительные заболевания органов таза: Такая инфекция половых путей может приводить к закупорке или повреждению фаллопиевых труб и обычно вызывается заболеванием, передающимся половым путем, выкидышами, абортами, рождением детей или наличием внутриматочного противозачаточного средства.
- Овуляторные нарушения: Эти нарушения возникают, если в яичниках женщины не вырабатываются яйцеклетки или вырабатывается меньшее количество яйцеклеток в силу возраста, гормонального дисбаланса или других проблем.
- Фиброиды матки: Такие доброкачественные опухоли матки имеются у 40% женщин и могут мешать имплантации эмбриона или росту плода.
- Эндометриоз: Это нарушение возникает, если ткань, выстилающая полость матки (эндометрий) образует выросты или нарушения вне матки (обычно на яичниках, фаллопиевых трубах и связках, поддерживающих матку; в области между влагалищем и задним проходом; на наружной поверхности матки; на ткани, выстилающей полость таза; на мочевом пузыре, кишечнике, влагалище, шейке матки, вульве и на шрамах, оставшихся после хирургических операций в брюшной полости). Эта ткань вырастает, разрушается и отделяется каждый месяц в фазе с менструальным циклом, но, к сожалению, она не имеет возможности покинуть организм. В результате это приводит к внутренним кровотечениям, истечению крови и отрыву тканей из пораженных участков, и часто вызывает воспаление, сопровождаемое болями, бесплодием, образованием рубцовой ткани, спайками и проблемами с кишечником.
- Иммунологическое бесплодие: Это нарушение возникает, если организм женщины вырабатывает антиспермальные антитела, которые разрушают сперму ее партнера.
Нарушения углеводного обмена имеют множество форм. Наиболее часто встречающиеся нарушения - приобретенные. Приобретенные или вторичные расстройства углеводного обмена, такие как диабетический кетоацидоз, гиперосмолярная кома и гипогликемия, воздействуют на центральную нервную систему. При диабете также наблюдаются многие формы и варианты нервных периферических заболеваний. Остальные нарушения углеводного обмена представляют собой редкие врожденные формы нарушений метаболизма (т.е. генетические дефекты).
Приобретенные нарушения углеводного обмена встречаются часто, как в США, так и во всем мире. Гипогликемия представляет собой обычную причину неврологических заболеваний, в частности острых психических нарушений, потери памяти, дезориентации, притупления болевой чувствительности и комы, как среди алкоголиков, так и среди пациентов, страдающих диабетом, которые получают инсулин. Гиперинсулинемия, имеющая другие причины, встречается редко; тем не менее, ее могут вызывать опухоли поджелудочной железы. Наиболее часто встречающимся нарушением у взрослых пациентов является диабет и его различные неврологические осложнения. Диабетический кетоацидоз все еще встречается, несмотря на то, что знания в этой области и тщательное медицинское наблюдение делает его более редким осложнением, чем несколько десятилетий назад. Гиперосмолярная кома в настоящее время также представляет собой меньшую проблему, чем в то время, когда внимание к ней было впервые привлечено в классической монографии интернистов Plum и Posner: Diagnosis of Stupor and Coma. Гиперосмолярная кома все еще встречается, и ей следует уделять внимание при обследовании пациентов, страдающих притуплением болевой чувствительности.
Наследственные нарушения углеводного обмена встречаются редко. Серьезные дефекты в комплексе пируватдегидрогеназы (PDH) и доброкачественная химическая аномалия, называемая пентозурией, были обнаружены лишь у нескольких (2-6) пациентов.
Гипогликемия, диабетический кетоацидоз и гиперосмолярная кома представляют собой потенциально фатальные, но также и потенциально излечимые состояния.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В настоящее время, на основе новой кДНК, был обнаружен новый белок, названный KTPAF50. Пептид, кодируемый этой кДНК, содержит 74 аминокислоты и включает сигнальный пептид, содержащий 24 аминокислоты в N-терминальной концевой группе. Последовательность кДНК (SEQ. ID. NO:1) и аминокислотная последовательность (SEQ. ID. NO:2) для KTPAF50 представлены ниже:
atgccaggc cattctagg cttctgtct atcctggtt tctggtctg tgcgttgtg ggtagcagc attggcgta ttacgccgg agggagcag gctgagcga ggctccaga aggtgcgca atagccgga gaggaaagg gcgatgctg tcacctagc cccctccct gagactcca ttcagccca gaaaaagga gctgctttc tcccccatc taccctagg agaaaa (SEQ. ID. NO:1)
MPGHSRLLSILVSGLCVVGSSIGVLRRREQAERGSRRCAIAGEERAMLSPSPLPET PFSPEKGAAFSPIYPRRK (SEQ. ID. NO:2)
Таким образом, настоящее изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, соответствующей SEQ. ID. NO:1, и пептиду, соответствующему SEQ. ID. NO:2. Полипептид, соответствующий SEQ. ID. NO:2, в настоящем описании называется "полный KTPAF50 пептид".
Полный KTPAF50 пептид также включает сигнальную последовательность, которая, как полагают, состоит из 24 аминокислот. Таким образом, изобретение также относится к пептиду, включающему последовательность полного KTPAF50 пептида, не содержащую сигнальный пептид, и состоящему из следующей последовательности (SEQ ID. NO:4):
LRRREQAERGSRRCAIAGEERAMLSPSPLPETPFSPEKGAAFSPIYPRRK (SEQ ID. NO:4)
KTPAF50 пептид, не содержащий сигнальной последовательности (SEQ. ID. NO:4), в настоящем описании называется "KTPAF50 пептид" или "KTPAF50".
Изобретение также относится к молекуле нуклеиновой кислоты, включающей последовательность, кодирующую KTPAF50 пептид. Она включает следующую последовательность (SEQ. ID. NO:3);
ttacgccgg agggagcag gctgagcga ggctccaga aggtgcgca atagccgga gaggaaagg gcgatgctg tcacctagc cccctccct gagactcca ttcagccca gaaaaagga gctgctttc tcccccatc taccctagg agaaaa (SEQ. ID. NO:3)
Изобретение также относится к модифицированным молекулам нуклеиновых кислот, соответствующим SEQ. ID. NO:1 или SEQ. ID. NO:3, и модифицированным пептидам, соответствующим SEQ. ID. NO:2 или SEQ. ID. NO:4, в которых один или более нуклеотидов или аминокислотных остатков, соответственно, добавлен, удален или замещен без значительного изменения биологических характеристик модифицированной молекулы по сравнению с немодифицированной молекулой.
В настоящем описании термин "пептид" означает пептид, полипептид или белок. Пептид может быть получен синтетическим способом, способами генной инженерии, экспрессией в клетке-хозяине или любым другим подходящим способом. Если не указано иное, пептид в основном состоит из L-аминокислот, встречающихся в природе.
Термин "биологические характеристики", относящийся к молекуле пептида, означает способность пептида оказывать по меньшей мере либо in vitro, либо in vivo воздействие, которое может обеспечиваться полным KTPAF50 пептидом или KTPAF50 пептидом, и неограничивающие примеры такого воздействия включают биологическую активность, рассмотренную в настоящем описании. Например, биологические характеристики включают способность лечить рак, заболевания, связанные с иммунной системой, вирусные заболевания и заболевания, связанные с воспалением. Термин "биологические характеристики", относящийся к молекуле нуклеиновой кислоты, означает ее способность кодировать пептид, имеющий биологические характеристики, аналогичные характеристикам полного KTPAF50 пептида или KTPAF50 пептида, и относится, в частности: (i) к молекуле нуклеиновой кислоты, которая имеет последовательность, отличающуюся от последовательности SEQ. ID. NO:1 или SEQ. ID. NO:3, но, благодаря избыточности генетического кода, кодирует полный KTPAF50 пептид или KTPAF50 пептид, соответственно; и (ii) к молекуле нуклеиновой кислоты, которая кодирует молекулу аминокислоты с последовательностью, отличающейся от последовательности полного KTPAF50 пептида или KTPAF50 пептида, но имеет биологические характеристики, аналогичные характеристикам полного KTPAF50 пептида или KTPAF50 пептида соответственно.
Термин "без значительного изменения биологических характеристик модифицированной молекулы по сравнению с немодифицированной молекулой" означает, что модифицированная молекула сохраняет биологическую активность, качественно аналогичную активности немодифицированной молекулы. В отношении модифицированного пептида это означает, что он сохраняет одну или более из биологических характеристик пептида, соответствующего SEQ. ID. NO:2 или SEQ. ID. NO:4, неограничивающие примеры которых включают его диагностические и терапевтические свойства, рассмотренные ниже, а также его активность in vitro и in vivo, рассмотренную в настоящем описании. Для определения того, сохраняет ли пептид биологическую активность, качественно аналогичную активности немодифицированной молекулы, могут быть проведены одно или более испытаний, например in vitro, in vivo или клинический эксперимент, в которых модифицированный пептид сравнивают с соответствующим немодифицированным пептидом (а именно, с полным KTPAF50 пептидом или KTPAF50 пептидом), анализируя параллельно; или эксперимент, в котором модифицированный пептид анализируют, чтобы понять, оказывает ли он биологическое действие, аналогичное действию немодифицированного пептида, определенное в отдельно проведенном эксперименте. Такой эксперимент может быть проведен, например, способом, аналогичным описанному ниже в Примерах. В отношении модифицированной молекулы нуклеиновой кислоты, термин "без значительного изменения биологических характеристик модифицированной молекулы по сравнению с немодифицированной молекулой" означает способность кодировать модифицированный пептид, имеющий любую из вышеописанных характеристик.
Модифицированный пептид может представлять собой пептид, который включает непрерывную последовательность из по меньшей мере 8, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40 или по меньшей мере 45 аминокислотных остатков, имеющую степень идентичности с соответствующей последовательностью, состоящей из по меньшей мере 8, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40 или по меньшей мере 45 аминокислотных остатков, включенных в KTPAF50 пептид, составляющую по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 90% и в частности по меньшей мере 95%.
Изобретение также относится к пептиду, содержащему часть непрерывной последовательности, содержащейся в полном KTPAF50 пептиде, включающую по меньшей мере 8 аминокислотных остатков, и при этом указанная непрерывная последовательность включена в непрерывную последовательность указанного полного KTPAF50 пептида. В настоящем описании такой пептид называется "частичным KTPAF50 пептидом". Неограничивающие примеры частичного KTPAF50 пептида включают SEQ. ID. NO:7 и SEQ. ID. NO:8, описанные ниже в Примере VI.
Изобретение также относится к белку или полипептиду, включающему аминокислотную последовательность полного KTPAF50 пептида, KTPAF50 пептида, модифицированного пептида или частичного KTPAF50 пептида (такой белок или полипептид в настоящем описании называется "белок, включающий KTPAF50"). Белок, включающий KTPAF50, может, например, представлять собой гибридный белок, который включает полный KTPAF50 пептид, KTPAF50 пептид, модифицированный пептид или частичный KTPAF50 пептид; он может представлять собой конъюгат белка или другой пептид или полипептид, содержащий полный KTPAF50 пептид, KTPAF50 пептид, модифицированный пептид или частичный KTPAF50 пептид; и т.д.
Изобретение также относится к олигонуклеотиду, включающему по меньшей мере 24 нуклеотида, который представляет собой: (i) олигонуклеотид, который кодирует частичную непрерывную последовательность, содержащуюся в KTPAF50 пептиде, включающую по меньшей мере 8 аминокислотных остатков, который может включать непрерывную последовательность из 24 нуклеиновых кислот, содержащихся в SEQ. ID. NO:1; (ii) нуклеотидную последовательность, которая может в жестких условиях подвергаться гибридизации с нуклеотидной последовательностью, соответствующей SEQ. ID. NO:1; (iii) олигонуклеотид, который включает последовательность, состоящую по меньшей мере из 24 непрерывно расположенных нуклеотидов, имеющий степень идентичности с соответствующей непрерывной последовательностью нуклеотидов, содержащихся в SEQ. ID. NO:1, составляющую по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, и в частности по меньшей мере 95%.
Изобретение также относится к молекуле нуклеиновой кислоты, например вектору переноса или вектору экспрессии, включающей любую из вышеуказанных молекул нуклеиновой кислоты.
Изобретение также относится к модифицированным пептидам, полученным из любого пептида, определение которого дано выше, например, к модифицированным пептидам, в которых одна или более аминокислот замещены другими аминокислотами посредством консервативного замещения. Используемый в настоящем описании термин "консервативное замещение" означает замещение аминокислоты одного класса аминокислотой, соответствующей тому же классу, и при этом класс определяется общими физико-химическими свойствами боковых цепочек аминокислот и высокой частотой замещения в гомологичных белках, имеющихся в природе. Было выделено шесть общих классов боковых цепочек аминокислот, которые включают: Класс I (Cys); Класс II (Ser, Thr, Pro, Ala, Gly); Класс III (Asn, Asp, Gln, Glu); Класс IV (His, Arg, Lys); Класс V (Ile, Leu, Val, Met); и Класс VI (Phe, Tyr, Trp). Например, замещение Asp другим остатком класса III, например Asn, Gln или Glu, представляет собой консервативное замещение.
В одном из примеров осуществления, в аминокислотной последовательности имеется только одно замещение. В другом примере осуществления, в аминокислотной последовательности имеются два замещения. В еще одном примере осуществления, в аминокислотной последовательности имеются три замещения. Максимальное количество замещений не должно превышать такое количество аминокислот, при котором в незамещенной последовательности сохраняется по меньшей мере 70%, желательно по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 90%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 95% аминокислот. В одном из предпочтительных примеров осуществления, замещения, включающие до 3, иногда до 6 аминокислотных остатков, замещенных другими аминокислотными остатками, представляют собой консервативные замещения.
В другом примере осуществления одна или более аминокислот может быть замещена D-аминокислотами, предпочтительно соответствующими D-аминокислотами. В предпочтительном примере осуществления, все аминокислоты представляют собой D-аминокислоты.
В другом примере осуществления изобретение также включает последовательности, имеющие обратный порядок по отношению к указанным выше последовательностям.
Таким образом, изобретение также относится к полным KTPAF50 пептидам, имеющим последовательность SEQ ID NO:2, или предпочтительно к KTPAF50 пептидам, имеющим последовательность SEQ ID NO:4, или к частичным KTPAF50 последовательностям указанных пептидов, модифицированным одним или более консервативными замещениями.
Таким образом, изобретение также относится к пептиду, включающему по меньшей мере 10, или 15, или 20, или 25, или 30, или 35, или 40 аминокислотных остатков или полную последовательность KTPAF50 пептида.
Изобретение также включает способы лечения, способы диагностики и фармацевтические композиции, в которых использован KTPAF50 пептид, полный KTPAF50 пептид, частичный KTPAF50 пептид, модифицированный пептид или белок, включающий KTPAF50, или любая молекула нуклеиновой кислоты, упомянутая выше. Способы лечения, способы диагностики и фармацевтические композиции могут быть применены в отношении одного или более заболеваний и нарушений, перечисленных выше в вводной части.
Фармацевтическая композиция, предлагаемая согласно настоящему изобретению, включает KTPAF50 пептид, полный KTPAF50 пептид, частичный KTPAF50 пептид, модифицированный пептид или белок, включающий KTPAF50, или любую молекулу нуклеиновой кислоты, упомянутую выше, а также фармацевтически приемлемый носитель.
Термин "фармацевтически приемлемый носитель" означает любой инертный нетоксичный материал, который не реагирует с активным ингредиентом. Иногда носитель выбирают в соответствии с требуемой формой состава. В некоторых случаях, носитель может улучшать доставку или проникновение активного ингредиента в целевую ткань, повышать стабильность лекарственного средства, замедлять скорость клиренса, придавать свойства, необходимые для медленного высвобождения, снижать нежелательные побочные эффекты и т.д. Носитель также может представлять собой вещество, стабилизирующее состав (например, консервант), обеспечивающее пищевые особенности состава и т.д. Носители могут представлять собой любые традиционно используемые носители; ограничения накладывают только физико-химические параметры, такие как растворимость и реакционная способность по отношению к полипептиду, а также способ введения состава. Носитель может включать добавки, красители, разбавители, буферные агенты, вещества, регулирующие распадаемость, увлажняющие средства, консерванты, вкусовые добавки и фармакологически совместимые носители. Кроме того, носитель может представлять собой вспомогательное средство, которое по определению представляет собой вещество, известным образом влияющее на действие активного ингредиента. Типичные примеры носителей включают: (а) жидкие растворы, в которых эффективное количество активного вещества растворено в разбавителях, таких как вода, солевой раствор, натуральные соки, спирты, сиропы и т.д.; (b) капсулы (например, обычные твердые или мягкие желатиновые капсулы, содержащие, например, поверхностно-активные вещества, скользящие средства (лубриканты) и инертные наполнители), таблетки, пастилки (в которых активное вещество находится во вкусовой основе, такой как сахароза и аравийская камедь или трагакантовая камедь, или активное вещество находится в инертной основе, такой как желатин и глицерин), и драже, и каждый из них содержит определенное количество активного средства в виде твердого вещества или гранул; (с) порошки; (d) суспензии в подходящей жидкости; (е) подходящие эмульсии; (f) липосомные составы; и другие носители.
Потенциальное диагностическое и терапевтическое применение KTPAF50 пептида может включать одно или более из следующих применений:
1. KTPAF50 может служить инструментом для диагностики отсутствия иммунологической активности (иммунологической компетентности) после подкожной инъекции токсинов, полученных из различных организмов.
2. Определение уровней KTPAF50 в крови может служить индикатором уровня активности иммунной системы.
3. Уровень KTPAF50 может служить индикатором аутоиммунных заболеваний.
4. KTPAF50 может служить стимулятором иммунной системы. Например, KTPAF50 может быть использован для лечения недостаточной иммунологической активности по отношению к бактериям, паразитам и вирусным токсинам.
5. KTPAF50 может быть использован в качестве терапевтического инструмента для снижения аллергических и воспалительных ответных реакций. Например, KTPAF50 может быть использован для снижения частоты возникновения приступов астмы или ее симптомов.
6. KTPAF50 может быть использован в качестве терапевтического инструмента для лечения иммунодефицитных заболеваний, например СПИД и комбинированного иммунодефицита.
7. KTPAF50 может быть использован в качестве терапевтического инструмента для лечения нарушений метаболизма глюкозы.
9. KTPAF50 может быть использован для лечения некоторых других заболеваний. Например, KTPAF50 может служить супрессором иммунной системы, применяемым при лечении аутоиммунных патологий, например ВЗК, тяжелой псевдопаралитической миастении, рассеянного склероза, диабета I типа, ревматоидного артрита, системной красной волчанки, склеродермы, хронической аутоиммунной гемолитической анемии, колита и болезни Крона и т.д.
10. KTPAF50 может служить стимулятором иммунной системы, применяемым для лечения раковых заболеваний, таких как рак легкого, карцинома глотки, карцинома головы и шеи и груди, лимфома Ходжкина, не-ходжкинская лимфома, рак груди, печеночно-клеточный рак, меланома.
11. KTPAF50 может усиливать иммунную ответную реакцию у более молодых или взрослых пациентов или пациентов с нарушенной иммунной системой.
12. KTPAF50 может быть использован в качестве терапевтического инструмента для лечения мужского или женского бесплодия.
13. KTPAF50 может служить общим стимулятором или ингибитором различных иммунных реакций и также может непосредственно или опосредовано влиять на другие органы, например сердце, легкие и т.д.
14. KTPAF50 может служить в качестве образца для идентификации определенных клеток иммунной системы и их использования в клеточной терапии.
15. Последовательность нуклеиновых кислот, кодирующая KTPAF50 или его часть, может служить в качестве образца для идентификации конкретных последовательностей ДНК и кДНК человека.
Для перечисленных выше диагностических и терапевтических целей также может быть использован полный KTPAF50 пептид, частичный KTPAF50 пептид или белок, включающий KTPAF50, или его модифицированный пептид.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
Для понимания изобретения и возможности его осуществления на практике, ниже рассмотрены варианты осуществления с помощью неограничивающих примеров, сопровождаемые графическими материалами, в которых:
На Фиг.1 представлен график, показывающий секрецию IL-17 (пикограмм/мл) периферическими лейкоцитами человека, обработанными указанными концентрациями (нанограмм/мл) KTPAF50;
На Фиг.2 представлен график, показывающий секрецию INF-γ (пикограмм/мл) периферическими лейкоцитами человека, обработанными указанными концентрациями (нанограмм/мл) KTPAF50;
На Фиг.3 представлен график, показывающий секрецию TNF-α (пикограмм/мл) периферическими лейкоцитами человека, обработанными указанными концентрациями (нанограмм/мл) KTPAF50;
На Фиг.4 представлена гистограмма, показывающая зависимость % жизнеспособных клеток (нормированого по контрольному количеству) от концентрации KTPAF50 (нанограмм/мл);
На Фиг.5 представлена гистограмма, показывающая степень индукции KTPAF50 мРНК (матричной РНК) в клетках различных типов, вовлеченных в иммунную цитотоксическую ответную реакцию;
3
На Фиг.6 представлен график, на котором изображена зависимость объема опухоли U937 (мм) у голых мышей (nude mice), получавших лечение () и не получавших лечение () (контроль) от времени; и
На Фиг.7 представлена гистограмма, показывающая зависимость % жизнеспособных клеток (нормированного по контрольному количеству) от концентрации (нанограмм/мл) KTPAF50 пептида и его фрагментов.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ПРИМЕРОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Пример I
Из библиотек кДНК человека была выделена новая кДНК.
Для анализа ПЦР с обратной транскрипцией были использованы следующие праймеры:
5' - GCT TCT GTC TAT CCT GGT TTC TGG - 3' (SEQ. ID. NO:5)
5' - ТТТ СТС СТА GGG TAG ATG GG - 3' (SEQ. ID. NO:6)
Были использованы следующие условия ПЦР:
95°С в течение 2 мин
40 следующих циклов:
95°С в течение 45 сек
59°С в течение 45 сек
72°С в течение 5 мин
Конечные циклы:
72°С в течение 5 мин
Продукт ПЦР секвенировали.
После ПЦР анализа на агарозном геле и окрашивания Cybar Green (Invitrogene), интенсивность продукта ПЦР была оценена при помощи анализатора BioRad ChemiDoc. Результаты представлены ниже:
Библиотека кДНК
Сигнальная
G3PDH
(Сигнальная/G3pdh)
минимальное отношение
Сердце
3675
5434
0,676297
1,209034
Мозг
3340
5971
0,55937
1,000001
Плацента*
6029
4668
1,29156
2,308954
Легкое
2929
4116
0,711613
1,272169
Печень
4809
6002
0,801233
1,432385
Скелетная мускулатура
5849
6273
0,932409
1,666891
Почки*
8272
4069
2,032932
3,634324
Поджелудочная железа*
8384
3898
2,150847
3,845123
Эмбриональный мозг
3721
5583
0,666488
1,522944
Эмбриональное легкое
4592
5554
0,826792
1,889243
Эмбриональная печень
4424
5525
0,800724
1,829678
Эмбриональная почка*
4635
3729
1,242961
2,840202
Эмбриональное сердце
2291
5235
0,437631
1,000001
Эмбриональная селезенка
3845
6827
0,563205
1,28694
Эмбриональная вилочковая железа
3013
5133
0,586986
1,341281
Эмбриональная скелетная мускулатура
2821
4754
0,593395
1,355926
Селезенка
5476
22116
0,247604
1,179064
Вилочковая железа
4678
20038
0,233456
1,111697
Предстательная железа
4685
19662
0,238277
1,134652
Яичко*
5710
19003
0,300479
1,430852
Яичник
4435
18072
0,245407
1,168606
Тонкий кишечник
3247
15424
0,210516
1,002458
Прямая кишка
2779
11847
0,234574
1,11702
* - значимые результаты
Покоящийся CD14
1185
11165
0,106135
1,061352
Покоящийся CD8*
1132
10042
0,112727
1,127265
Покоящийся CD4
1946
8932
0,217868
2,178683
Мононуклеарный*
869
8204
0,105924
1,059239
активированный CD8*
2406
8535
0,281898
2,818981
активированный CD4
1979
9065
0,218312
2,183122
активированный мононуклеарный*
1695
7082
0,239339
2,393392
покоящийся CD19*
2668
6365
0,419167
4,191673
активированный CD19*
1635
7140
0,228992
2,289916
* - значимые результаты
Можно отметить, что основные ткани, в которых экспрессируется кДНК представляют собой почки, поджелудочную железу, яички и плаценту. Интересно отметить, что продукт также экспрессируется в лейкоцитах, и его экспрессия варьируется в зависимости от активации клеток.
Пример II
Для определения потенциального воздействия KTPAF50 на различные заболевания, проводили инкубацию KTPAF50 с периферическими лейкоцитами человека (pWBC), и измеряли количества панели цитокинов.
KTPAF50 был синтезирован химическим способом в Компании Anaspec Inc.
Все лейкоциты человека культивировали в среде, содержащей РНА (фитогемагглютинин) (Biological Industries INC - номер по каталогу - 01-201-1) (2 миллиона клеток/лунка в 2 мл среды). Клетки обрабатывали KTPAF50 в течение 3 суток при концентрациях KTPAF50, указанных на фигурах. Контрольные клетки не обрабатывали.
На 3 сутки среду собирали и анализировали способом ELISA с использованием набора e-Bioscience для анализа человеческого IL-17 (номер по каталогу: 88-7176), человеческого INF-γ (номер по каталогу: 88-7316) и человеческого TNF-α (номер по каталогу: 88-7346). Результаты представлены на Фиг.1, 2 и 3.
Можно отметить, что добавление KTPAF50 стимулирует секрецию всех трех определяемых цитокинов лейкоцитами pWBC. Секреция IL-17 показывает, что KTPAF50 может оказывать провоспалительное действие. Секреция INF-γ показывает, что KTPAF50 может оказывать противовирусное, противораковое и провоспалительное действие. Секреция TNF-α показывает, что KTPAF50 может играть определенную роль в стимуляции иммунной системы.
Пример III
Также, для определения влияния KTPAF50 на раковые заболевания, проводили инкубацию KTPAF50 с раковыми клеточными линиями.
Клетки U937 острой миелоидной лейкемии и раковые клетки РС3 предстательной железы выращивали по отдельности в среде 10% FCS (телячья сыворотка крови) + RPMI и инокулировали по 4 пробы на 96-луночный планшет по 20000 клеток/лунка.
Инкубацию KTPAF50 с клетками проводили в течение одних суток и затем жизнеспособные клетки детектировали при помощи резазурина (R&D System) и спектрофотометра. Результаты представлены на Фиг.4.
Можно отметить, что KTPAF50 вызывает значительное уменьшение количества жизнеспособных клеток этих двух типов рака.
Пример IV
Для исследования роли KTPAF50 в иммунной ответной реакции, было определено присутствие KTPAF50 в различных иммунных цитотоксических клетках.
Библиотеки кДНК человека, полученные из следующих клеток, были приобретены у Clontech Ltd:
1. моно - покоящиеся (R) и активированные (А) моноциты (клетки были активированы действием LPS (липосахарида) или РНА (фитогемагглютинин));
2. CD8 - R и А цитотоксические CD8 Т-клетки;
3. CD19 - R и A CD19 B-клетки;
4. CD4 - R и A CD4 клетки Т-хелперы.
Количественный анализ KTPAF50 мРНК в этих клетках проводили способами ПЦР с обратной транскрипцией, используя специфические праймеры KTPAF50. Результаты представлены на Фиг.5.
Можно отметить, что активация моноцитов и цитотоксических Т-клеток приводит к значительному повышению экспрессии KTPAF50, в то время как активация В-клеток приводит к понижению экспрессии KTPAF50. Активация или дезактивация клеток Т-хелперов не влияет на экспрессию KTPAF50. Таким образом, KTPAF50 может быть использован в качестве маркера активации клеточной иммунной ответной реакции и для идентификации ТН1 в зависимости от путей Th2.
Пример V
Действие KTPAF50 на раковые клетки также испытывали in vivo.
6
14 самок голых (мутация по гену "nude") бестимусных мышей возрастом 8-9 недель были приобретены у Компании Harlan Biotech, Израиль. Мышам подкожно вводили 15×10 клеток U937. Опухоли начинали расти, и на 9 сутки мышей разделяли на 2 группы:
- Контрольную группу, получавшую инъекции солевого раствора.
- Группу, получавшую инъекции KTPAF50 (25 ултраграммов/мышь).
На 20 сутки 4 мышей контрольной группы умертвили по этическим причинам, поскольку их опухоли были огромными. Результаты представлены на Фиг.6.
Поразительные результаты показывают, что KTPAF50 полностью предотвращает рост опухоли.
Пример VI
Для определения того, весь ли KTPAF50 пептид необходим для достижения активности, эксперимент, описанный выше в Примере III, повторяли, используя клетки U937, и полный KTPAF50 пептид, а также его фрагменты.
Были использованы следующие пептиды KTPAF50:
А - KTPAF50 пептид (50 аминокислот);
В - N-терминальные 36 аа пептида KTPAF50
(LRRREQAERGSRRCAIAGEERAMLSPSPLPETPFSP) (SEQ. ID. NO:7);
С - С-терминальные 14 аа пептида KTPAF50 (EKGAAFSPIYPRRK) (SEQ. ID. NO:8).
Результаты представлены на Фиг.7.
Можно отметить, что фрагменты KTPAF50 проявляют противораковую активность, аналогичную действию KTPAF50 пептида.