КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ДИАГНОСТИКИ БОЛЕЗНИ ЛАЙМА И ПРОГНОЗА ЭЛИМИНАЦИИ СПИРОХЕТ, ВЫЗЫВАЮЩИХ БОЛЕЗНЬ ЛАЙМА, ПОСЛЕ ЛЕЧЕНИЯ
COMPOSITIONS AND METHODS FOR DIAGNOSING LYME DISEASE AND PREDICTING ELIMINATION OF LYME DISEASE-CAUSING SPIROCHETES AFTER TREATMENT

Заявление касательно перечня последовательностей
Перечень последовательностей, связанный с настоящей заявкой, представлен в текстовом формате и тем самым включен в настоящий документ посредством ссылки в описание. Текстовый файл, содержащий Перечень последовательностей, называется 770025_466WO_SEQUENCE_LISTING.txt. Текстовый файл составляет 12,3 KB, был создан 14 сентября 2016 г., и подается в электронном виде посредством EFS-Web.
Область техники
Настоящее раскрытие в целом относится к композициям и способам диагностики болезни Лайма и оценки эффективности лечения болезни Лайма. Более конкретно, предусмотрены комбинации нескольких пептидов, содержащих Т-клеточный эпитоп, происходящих из различных полипептидных антигенов Borrelia, которые экспрессируются на различных стадиях болезни Лайма, для применения в анализе чувствительности при вторичном in vitro иммунном ответе в случае специфической по отношению к Borrelia чувствительности Т-клеток.
Уровень техники
Болезнь Лайма представляет собой передаваемое клещами инфекционное заболевание, вызываемое патогенными спирохетами рода Borrelia, в том числе В. burgdorferi, В. afzelii, В. garinii и другими Borrelia spp. Инфекционные микроорганизмы передаются из слюны клещей в укушенные раны, а «ранняя локализованная» стадия, первая из трех клинически определяемых стадий заболевания, обычно появляется в течение двух недель после укуса клеща. Ранняя локализованная стадия часто, хотя и не всегда, сопровождается мигрирующей эритемой (ЕМ), эритематозным поражением кожи в месте укуса клеща. Заболевание прогрессирует до второй, «ранней диссеминированной» стадии, когда патогенные бактерии Borrelia распространяются системно через кровоток и/или лимфатическую циркуляцию, и может сопровождаться одним или более из дополнительных поражений кожи, усталости, миалгии, артралгии, неврологических или кардиальных симптомов. При отсутствии лечения заболевание может прогрессировать далее до «поздней стадии» болезни Лайма, характеризующейся артритом, энцефаломиелитом и/или периферической нейропатией, и потенциально другими симптомами, в том числе хронической болезнью Лайма. Ежегодно в Соединенных Штатах Америки сообщается о примерно 25000-30000 случаях болезни Лайма, при этом по оценкам CDC, фактическая заболеваемость составляет в десять раз более этого количества, учитывая незарегистрированные случаи; о дополнительных случаях также сообщалось в Европе и Азии (Wright et al., 2012 Am. Fam. Physician 85:1086; Shapiro, 2014 N. Engl. J. Med. 370:1724).
Измененные закономерности экспрессии антигенных белков Borrelia spp. сопровождают динамику прогрессирования болезни Лайма и лежат в основе механизмов иммунной эвазии, которые могут объяснять хроническую болезнь Лайма (например, Drecktrah et al., 2013 PLoS One 8(7):e68799; Schmit et al., 2011 Front. Microbiol. 2:141; Salo et al., 2011 J. Infect. Dis. 204:65; Liang et al., 2004 Infect. Immun. 72:5759; Aberer, 2007 J. Dtsch. Dermatol. Ges. 5 (5): 406).
Эффективное лечение болезни Лайма (LD) зависит от точного выявления ранней инфекции, вызываемой Borrelia spp. В некоторых случаях, когда заболевание еще характеризуется ранней локальной стадией, наличие характерного поражения кожи в виде мигрирующей эритемы (ЕМ) достаточно для точного диагноза (например, Nadelman et al., 1996 Am J Med 100:502-508). Однако у значительного числа пациентов не развивается поражение в виде ЕМ или сыпь остается невыявленной или неправильно определенной. В этих случаях традиционное серологическое тестирование в целях выявления ответов антител IgM и/или IgG к Borrelia является наиболее распространенной процедурой для подтверждения заболевания (например, Dattwyler et al., 2010 Clin Infect Dis 50:521-522; Johnson et al., 1996 J. Infect. Dis. 174:346).
В настоящее время отсутствует лабораторный тест, который может достоверно прогнозировать успешное лечение LD после введения стандартного терапевтического курса (например, режима введения антибиотиков). Циркулирующие антитела, которые были вызваны инфекцией Borrelia, могут сохраняться в течение нескольких лет, даже после успешной антибиотикотерапии в целях устранения инфекции. Таким образом, тестирование на специфические к Borrelia антитела имеет ограниченную применимость, например, поскольку спирохеты Borrelia spp. могут колонизировать несколько тканей млекопитающих и вызывать многочисленные неспецифические нарушения, такие как боли в суставах и/или мышцах или общее недомогание. Эти симптомы сложно отличить от сходных клинических проявлений, которые не связаны с хронической инфекцией, вызываемой Borrelia, приводя к значительной неопределенности и повышенным затратам по оказанию медицинской помощи. Таким образом, было бы чрезвычайно полезно, если бы можно было клинически подтвердить эффективную элиминацию патогенных спирохет Borrelia spp. после лечения LD.
В WO 2013/116668 описаны пептидные антигены, которые распознаются антителами, которые были образованы в ответ на Borrelia spp. Однако антитела к Borrelia обычно не вырабатываются на подлежащих выявлению уровнях в течение нескольких недель после инфекции, таким образом, многие ранние случаи LD пропускают. Как также отмечено выше, уровни антител, которые вырабатываются в ответ на инфекцию, вызываемую спирохетами при болезни Лайма, могут оставаться повышенными в течение нескольких лет после инфекции, даже после успешной антибиотикотерапии, которая элиминирует спирохет Borrelia. Таким образом, определение ответов антител к Borrelia характеризуется недостаточной чувствительностью и надежностью в качестве диагностических тестов на патогенные Borrelia spp., и является малопригодным в качестве прогностических тестов после лечения инфекции, вызываемой Borrelia.
Инфекции, вызываемые Borrelia, могут также вызывать Т-клеточный иммунный ответ. Glickstein et al. (2003 Infect. Immun. 71:6051) и Dattwyler et al. (1988 N. Engl. J. Med. 319:1441) показали, что у субъектов-людей, подвергшихся воздействию Borrelia burgdorferi, развивался сильный и длительный Т-клеточный ответ, свидетельствовавший о присутствии воспалительных цитокинов, сопровождающих ЕМ на ранней локальной стадии заболевания. Этот Т-клеточный ответ предшествовал какому-либо подлежащему выявлению измеримому ответу антител. Например, Т-клетки, активированные в ответ на спирохеты при болезни Лайма, достоверно вырабатывали интерферон-γ (Ekerfelt et al., 1999 Clin Exp. Immunol. 115:498; Sikand et al., 1999 Clin. Diagnost. Lab. Immunol. 6:445). Активированные Т-клетки появлялись с одинаковой частотой в двух популяциях пациентов: (i) таковых, которые не проявляли клинически никаких симптомов LD, однако у которых антитела к Borrelia подлежали выявлению, и (ii) пациентов, которые проявляли характерные клинические признаки инфекции, вызываемой Borrelia (т.е., симптомы LD) (Ekerfelt et al., 1999). В WO 2012/039614 описаны in vitro Т-клеточные ответы цитокинов, которые были вызваны лейкоцитами периферической крови от зараженного Borrelia индивидуума после инкубации с целыми, фиксированными или грубо фракционированными клетками Borrelia. Однако в WO 2012/039614 отсутствует раскрытие, в котором можно обнаружить какую-либо определенную стадию инфекции, вызываемой Borrelia (например, раннюю локальную, раннюю диссеминированную, позднюю диссеминированную), при которой патоген Borrelia мог бы быть распознан Т-клетками, а также какие-либо антигены Borrelia, которые способны вызывать такие ответы, или структуры каких-либо антигенных эпитопов Borrelia, которые распознаются Т-клетками. Таким образом, значимость и специфичность Т-клеточных иммунных ответов при ранней LD остается неясной, в частности, в случаях, когда никакие специфические антигены Borrelia spp., которые распознаются Т-клетками, не были идентифицированы в патогенезе LD, и в случаях, когда Borrelia-специфические Т-клеточные эпитопы неизвестны.
Очевидно, что сохраняется потребность улучшенной диагностической и прогностической оценки болезни Лайма, в том числе раннего и более чувствительного выявления LD, и способности контролировать терапевтическую эффективность назначаемого лечения для LD. Раскрываемые в настоящем изобретении варианты осуществления направлены на эти потребности и предусматривают другие соответствующие преимущества.
Сущность изобретения
В соответствии с определенными вариантами настоящего изобретения, которое раскрывается в настоящем документе, предусмотрена композиция для диагностики или прогноза болезни Лайма, которую выбирают из первой композиции и второй композиции: (I) при этом первая композиция содержит: (а) 1, 2, 3, 4 или 5 выделенных пептидов FlaB, каждый из которых содержит Т-клеточный эпитоп Borrelia и их выбирают из пептидов FlaB, имеющих аминокислотные последовательности, изложенные в SEQ ID NO: 1-5, или их одного или более вариантов, на по меньшей мере 80% идентичных по аминокислотной последовательности аминокислотным последовательностям, изложенным в SEQ ID NO: 1-5; (b) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или 13 выделенных пептидов DbpB, каждый из которых содержит Т-клеточный эпитоп Borrelia и их выбирают из пептидов DbpB, имеющих аминокислотные последовательности, изложенные в SEQ ID NO: 6-18, или их одного или более вариантов, на по меньшей мере 80% идентичных по аминокислотной последовательности аминокислотным последовательностям, изложенным в SEQ ID NO: 6-18; (с) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или 13 выделенных пептидов р66, каждый из которых содержит Т-клеточный эпитоп Borrelia и их выбирают из пептидов р66, имеющих аминокислотные последовательности, изложенные в SEQ ID NO: 19-31, или их одного или более вариантов, на по меньшей мере 80% идентичных по аминокислотной последовательности аминокислотным последовательностям, изложенным в SEQ ID NO: 19-31; и (d) 1 или 2 выделенных пептида OspC, каждый из которых содержит Т-клеточный эпитоп Borrelia и их выбирают из пептидов OspC, имеющих аминокислотные последовательности, изложенные в SEQ ID NO: 32-33, или их одного или более вариантов, на по меньшей мере 80% идентичных по аминокислотной последовательности аминокислотным последовательностям, изложенным в SEQ ID NO: 32-33, где композиция, после приведения в контакт с цельной кровью, полученной от субъекта, зараженного видом Borrelia, ассоциированным с болезнью Лайма, способна вызывать вторичный in vitro иммунный ответ со стороны Т-клеток; и (II) при этом вторая композиция содержит: (а) 5 выделенных пептидов FlaB, каждый из которых содержит Т-клеточный эпитоп Borrelia и их выбирают из пептидов FlaB, имеющих аминокислотные последовательности, изложенные в SEQ ID NO: 1-5, или их одного или более вариантов, на по меньшей мере 80% идентичных по аминокислотной последовательности аминокислотным последовательностям, изложенным в SEQ ID NO: 1-5; (b) 13 выделенных пептидов DbpB, каждый из которых содержит Т-клеточный эпитоп Borrelia и их выбирают из пептидов DbpB, имеющих аминокислотные последовательности, изложенные в SEQ ID NO: 6-18, или их одного или более вариантов, на по меньшей мере 80% идентичных по аминокислотной последовательности аминокислотным последовательностям, изложенным в SEQ ID NO: 6-18; (с) 13 выделенных пептидов р66, каждый из которых содержит Т-клеточный эпитоп Borrelia и их выбирают из пептидов р66, имеющих аминокислотные последовательности, изложенные в SEQ ID NO: 19-31, или их одного или более вариантов, на по меньшей мере 80% идентичных по аминокислотной последовательности аминокислотным последовательностям, изложенным в SEQ ID NO: 19-31; и (d) 2 выделенных пептида OspC, каждый из которых содержит Т-клеточный эпитоп Borrelia и их выбирают из пептидов OspC, имеющих аминокислотные последовательности, изложенные в SEQ ID NO: 32-33, или их одного или более вариантов, на по меньшей мере 80% идентичных по аминокислотной последовательности аминокислотным последовательностям, изложенным в SEQ ID NO: 32-33.
В соответствии с определенными дополнительными вариантами осуществления предусмотрено по меньшей мере одно из: (а) композиция содержит по меньшей мере приблизительно один нанограмм каждого пептида и не более приблизительно 100 нанограмм каждого пептида, (b) композиция содержит по меньшей мере приблизительно 100, 200, 300 или 400 нанограмм и не более приблизительно 500 нанограмм каждого пептида, (с) композиция содержит по меньшей мере приблизительно 500, 600, 700, 800 или 900 нанограмм и не более приблизительно 1000 нанограмм каждого пептида, (d) композиция содержит по меньшей мере приблизительно 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8 или 1,9 микрограмм и не более приблизительно 2 микрограмм каждого пептида, или (е) композиция содержит по меньшей мере приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 микрограмм и не более 10 микрограмм каждого пептида.
В соответствии с другим вариантом осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ выявления болезни Лайма у субъекта или контроля эффективности лечения болезни Лайма у субъекта, предусматривающий: (А) приведение в контакт in vitro (i) первого биологического образца, полученного в первой временной точке у субъекта, который имеет болезнь Лайма или предположительно подвержен риску таковой, где биологический образец содержит Т-клетки и антиген-представляющие клетки, и (ii) пептидной композиции для диагностики или прогноза болезни Лайма с получением первой исследуемой инкубационной смеси; (В) инкубирование первой исследуемой инкубационной смеси в условиях и в течение времени, достаточных для специфического распознавания указанными Т-клетками Т-клеточного эпитопа Borrelia, который присутствует в указанной пептидной композиции, в целях стимуляции образования индикатора Т-клеточного иммунного ответа; и (С) выявление первого уровня индикатора Т-клеточного иммунного ответа в первой исследуемой инкубационной смеси, где наличие инфекции, вызываемой Borrelia, у субъекта определяется по выявлению в (С) указанного первого уровня индикатора Т-клеточного иммунного ответа, который является повышенным по отношению к первому контрольному уровню индикатора Т-клеточного иммунного ответа в результате инкубирования первого биологического образца при первой контрольной инкубации без пептидной композиции для диагностики или прогноза болезни Лайма, и где пептидная композиция для диагностики или прогноза болезни Лайма содержит: (а) 1, 2, 3, 4 или 5 выделенных пептидов FlaB, каждый из которых содержит Т-клеточный эпитоп Borrelia и их выбирают из пептидов FlaB, имеющих аминокислотные последовательности, изложенные в SEQ ID NO: 1-5, или их одного или более вариантов, на по меньшей мере 80% идентичных по аминокислотной последовательности аминокислотным последовательностям, изложенным в SEQ ID NO: 1-5; (b) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или 13 выделенных пептидов DbpB, каждый из которых содержит Т-клеточный эпитоп Borrelia и их выбирают из пептидов DbpB, имеющих аминокислотные последовательности, изложенные в SEQ ID NO: 6-18, или их одного или более вариантов, на по меньшей мере 80% идентичных по аминокислотной последовательности аминокислотным последовательностям, изложенным в SEQ ID NO: 6-18; (с) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или 13 выделенных пептидов р66, каждый из которых содержит Т-клеточный эпитоп Borrelia и их выбирают из пептидов р66, имеющих аминокислотные последовательности, изложенные в SEQ ID NO: 19-31, или их одного или более вариантов, на по меньшей мере 80% идентичных по аминокислотной последовательности аминокислотным последовательностям, изложенным в SEQ ID NO: 19-31; и (d) 1 или 2 выделенных пептида OspC, каждый из которых содержит Т-клеточный эпитоп Borrelia и их выбирают из пептидов OspC, имеющих аминокислотные последовательности, изложенные в SEQ ID NO: 32-33, или их одного или более вариантов, на по меньшей мере 80% идентичных по аминокислотной последовательности аминокислотным последовательностям, изложенным в SEQ ID NO: 32-33, и тем самым выявление болезни Лайма у субъекта или контроль эффективности лечения болезни Лайма у субъекта.
В соответствии с дополнительными определенными вариантами осуществления первая временная точка находится перед введением субъекту лечения болезни Лайма.
В соответствии с определенными связанными вариантами осуществления пептидная композиция для диагностики или лечения болезни Лайма содержит: (а) 5 выделенных пептидов FlaB, каждый из которых содержит Т-клеточный эпитоп Borrelia и их выбирают из пептидов FlaB, имеющих аминокислотные последовательности, изложенные в SEQ ID NO: 1-5, или их одного или более вариантов, на по меньшей мере 80% идентичных по аминокислотной последовательности аминокислотным последовательностям, изложенным в SEQ ID NO: 1-5; (b) 13 выделенных пептидов DbpB, каждый из которых содержит Т-клеточный эпитоп Borrelia и их выбирают из пептидов DbpB, имеющих аминокислотные последовательности, изложенные в SEQ ID NO: 6-18, или их одного или более вариантов, на по меньшей мере 80% идентичных по аминокислотной последовательности аминокислотным последовательностям, изложенным в SEQ ID NO: 6-18; (с) 13 выделенных пептидов р66, каждый из которых содержит Т-клеточный эпитоп Borrelia и их выбирают из пептидов р66, имеющих аминокислотные последовательности, изложенные в SEQ ID NO: 19-31, или их одного или более вариантов, на по меньшей мере 80% идентичных по аминокислотной последовательности аминокислотным последовательностям, изложенным в SEQ ID NO: 19-31; и (d) 2 выделенных пептида OspC, каждый из которых содержит Т-клеточный эпитоп Borrelia и их выбирают из пептидов OspC, имеющих аминокислотные последовательности, изложенные в SEQ ID NO: 32-33, или их одного или более вариантов, на по меньшей мере 80% идентичных по аминокислотной последовательности аминокислотным последовательностям, изложенным в SEQ ID NO: 32-33.
В соответствии с дополнительными вариантами осуществления вышеописанных способов способ дополнительно предусматривает (D) приведение в контакт in vitro (i) второго биологического образца, полученного от субъекта во второй временной точке, которая находится после первой временной точки и после введения субъекту лечения болезни Лайма, где второй биологический образец содержит Т-клетки и антиген-представляющие клетки, и (ii) пептидной композиции для диагностики или прогноза болезни Лайма с получением второй исследуемой инкубационной смеси; (Е) инкубирование второй исследуемой инкубационной смеси в условиях и в течение времени, достаточных для специфического распознавания указанными Т-клетками Т-клеточного эпитопа Borrelia, который присутствует в указанной пептидной композиции в целях стимуляции образования индикатора Т-клеточного иммунного ответа; и (F) выявление второго уровня индикатора Т-клеточного иммунного ответа во второй исследуемой инкубационной смеси, где наличие инфекции, вызываемой Borrelia, у субъекта определяется по выявлению в (F) указанного второго уровня индикатора Т-клеточного иммунного ответа, который является повышенным по отношению к второму контрольному уровню индикатора Т-клеточного иммунного ответа в результате инкубирования второго биологического образца при второй контрольной инкубации без пептидной композиции для диагностики или прогноза болезни Лайма, и где эффективность лечения болезни Лайма определяется по выявлению в (F) указанного второго уровня индикатора Т-клеточного иммунного ответа, который является сниженным по отношению к первому уровню индикатора Т-клеточного иммунного ответа, который выявляется в (С).
В соответствии с определенными еще одними дополнительными вариантами осуществления пептидная композиция для диагностики или лечения болезни Лайма содержит: (а) 5 выделенных пептидов FlaB, каждый из которых содержит Т-клеточный эпитоп Borrelia и их выбирают из пептидов FlaB, имеющих аминокислотные последовательности, изложенные в SEQ ID NO: 1-5, или их одного или более вариантов, на по меньшей мере 80% идентичных по аминокислотной последовательности аминокислотным последовательностям, изложенным в SEQ ID NO: 1-5; (b) 13 выделенных пептидов DbpB, каждый из которых содержит Т-клеточный эпитоп Borrelia и их выбирают из пептидов DbpB, имеющих аминокислотные последовательности, изложенные в SEQ ID NO: 6-18, или их одного или более вариантов, на по меньшей мере 80% идентичных по аминокислотной последовательности аминокислотным последовательностям, изложенным в SEQ ID NO: 6-18; (с) 13 выделенных пептидов р66, каждый из которых содержит Т-клеточный эпитоп Borrelia и их выбирают из пептидов р66, имеющих аминокислотные последовательности, изложенные в SEQ ID NO: 19-31, или их одного или более вариантов, на по меньшей мере 80% идентичных по аминокислотной последовательности аминокислотным последовательностям, изложенным в SEQ ID NO: 19-31; и (d) 2 выделенных пептида OspC, каждый из которых содержит Т-клеточный эпитоп Borrelia и их выбирают из пептидов OspC, имеющих аминокислотные последовательности, изложенные в SEQ ID NO: 32-33, или их одного или более вариантов, на по меньшей мере 80% идентичных по аминокислотной последовательности аминокислотным последовательностям, изложенным в SEQ ID NO: 32-33.
В соответствии с определенными вариантами осуществления любого из вышеописанных способов болезнь Лайма представляет собой инфекцию, вызываемую по меньшей мере одним патогенным видом Borrelia, и в соответствии с определенными дополнительными вариантами осуществления патогенный вид Borrelia является патогенным у человека. В соответствии с определенными еще одними дополнительными вариантами осуществления вид Borrelia, который является патогенным у человека, выбирают из Borrelia burgdorferi, Borrelia burgdorferi sensu stricto (в буквальном смысле), Borrelia azfelii, Borrelia garinii, Borrelia valaisiana, Borrelia spielmanii, Borrelia bissettii, Borrelia lusitaniae и Borrelia bavariensis.
В соответствии с определенными вариантами осуществления любого из вышеописанных способов лечение болезни Лайма предусматривает введение субъекту антибиотика. В соответствии с определенными дополнительными вариантами осуществления антибиотик выбирают из тетрациклинов; окситетрациклина, тетрациклина, доксициклина или миноциклина; пенициллинов; амоксициллина или пенициллина; цефалоспоринов; цефаклора, цефбуперазона, цефминокса, цефотаксима, цефотетана, цефметазола, цефокситина, цефуроксима аксетила, цефуроксима ацетила, цефтина или цефтриаксона; макролидов; азитромицина, кларитромицина или эритромицина.
В соответствии с определенными вариантами осуществления любого из вышеописанных способов биологический образец содержит по меньшей мере одно из цельной крови, спинномозговой жидкости или синовиальной жидкости. В соответствии с определенными вариантами осуществления любого из вышеописанных способов биологический образец содержит по меньшей мере одно из (а) цельной крови, (b) клеточной фракции цельной крови, (с) выделенных лейкоцитов периферической крови или (d) выделенных мононуклеарных клеток периферической крови.
В соответствии с определенными вариантами осуществления любого из вышеописанных способов индикатор Т-клеточного иммунного ответа представляет собой интерферон-гамма (IFN-γ). В соответствии с определенными дополнительными вариантами осуществления IFN-γ представляет собой растворимый IFN-γ, высвобождаемый Т-клетками. В соответствии с определенными вариантами осуществления любого из вышеописанных способов индикатор Т-клеточного иммунного ответа содержит по меньшей мере одно из пролиферации Т-клеток и экспрессии Т-клеточного цитокина. В соответствии с определенными дополнительными вариантами осуществления Т-клеточный цитокин выбирают из IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-10, IL-12, IL-17, TNF-α, TNF-β и IFN-γ. В соответствии с определенными вариантами осуществления экспрессию Т-клеточного цитокина выявляют в виде растворимого Т-клеточного цитокина, высвобождаемого Т-клетками. В соответствии с определенными дополнительными вариантами осуществления Т-клеточный цитокин выбирают из IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-10, IL-12, IL-17, TNF-α, TNF-β и IFN-γ. В соответствии с определенными вариантами осуществления Т-клеточный цитокин выявляют в результате определения подлежащего выявлению специфического связывания связывающего средства с Т-клеточным цитокином. В соответствии с определенными дополнительными вариантами осуществления связывающее средство содержит по меньшей мере одно антитело, которое специфически связывается с Т-клеточным цитокином. В соответствии с определенными дополнительными вариантами осуществления по меньшей мере одно антитело выбирают из моноклонального антитела и поликлонального антитела. В соответствии с определенными вариантами осуществления по меньшей мере одно антитело является иммобилизованным на твердой фазе.
В соответствии с определенными вариантами осуществления любого из вышеописанных способов болезнь Лайма представляет собой инфекцию, вызываемую по меньшей мере одним патогенным видом Borrelia. В соответствии с определенными вариантами осуществления патогенный вид Borrelia является патогенным у человека. В соответствии с определенными дополнительными вариантами осуществления вид Borrelia, который является патогенным у человека, выбирают из Borrelia burgdorferi, Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia azfelii, Borrelia garinii, Borrelia valaisiana, Borrelia spielmanii, Borrelia bissettii, Borrelia lusitaniae и Borrelia bavariensis.
В соответствии с определенными дополнительными вариантами осуществления вышеописанных способов (например, таковых, которые предусматривают стадии (D)-(F), относящиеся к второму биологическому образцу) лечение болезни Лайма предусматривает введение субъекту антибиотика. В соответствии с определенными дополнительными вариантами осуществления антибиотик выбирают из тетрациклинов; окситетрациклина, тетрациклина, доксициклина или миноциклина; пенициллинов; амоксициллина или пенициллина; цефалоспоринов; цефаклора, цефбуперазона, цефминокса, цефотаксима, цефотетана, цефметазола, цефокситина, цефуроксима аксетила, цефуроксима ацетила, цефтина или цефтриаксона; макролидов; азитромицина, кларитромицина или эритромицина. В соответствии с определенными вариантами осуществления биологический образец содержит по меньшей мере одно из цельной крови, спинномозговой жидкости или синовиальной жидкости. В соответствии с определенными вариантами осуществления биологический образец содержит по меньшей мере одно из (а) цельной крови, (b) клеточной фракции цельной крови, (с) выделенных лейкоцитов периферической крови или (d) выделенных мононуклеарных клеток периферической крови. В соответствии с определенными вариантами осуществления индикатор Т-клеточного иммунного ответа представляет собой интерферон-гамма (IFN-γ), который в соответствии с определенными дополнительными вариантами осуществления представляет собой растворимый IFN-γ, высвобождаемый Т-клетками. В соответствии с определенными вариантами осуществления индикатор Т-клеточного иммунного ответа содержит по меньшей мере одно из пролиферации Т-клеток и экспрессии Т-клеточного цитокина, который в соответствии с определенными дополнительными вариантами осуществления выбирают из IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-10, IL-12, IL-17, TNF-α, TNF-β и IFN-γ. В соответствии с определенными вариантами осуществления экспрессию Т-клеточного цитокина выявляют в виде растворимого Т-клеточного цитокина, высвобождаемого Т-клетками. В соответствии с определенными вариантами осуществления Т-клеточный цитокин выбирают из IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-10, IL-12, IL-17, TNF-α, TNF-β и IFN-γ. В соответствии с определенными дополнительными вариантами осуществления Т-клеточный цитокин выявляют в результате определения подлежащего выявлению специфического связывания связывающего средства с Т-клеточным цитокином. В соответствии с определенными дополнительными вариантами осуществления связывающее средство содержит по меньшей мере одно антитело, которое специфически связывается с Т-клеточным цитокином. В соответствии с определенными дополнительными вариантами осуществления по меньшей мере одно антитело выбирают из моноклонального антитела и поликлонального антитела. В соответствии с определенными дополнительными вариантами осуществления по меньшей мере одно антитело является иммобилизованным на твердой фазе. В соответствии с определенными дополнительными вариантами осуществления способ предусматривает повторение стадий (D), (Е) и (F) во множестве вторых временных точек, которые отличаются друг от друга и которые находятся после первой временной точки и после введения субъекту лечения болезни Лайма. В соответствии с определенными вариантами осуществления множество вторых временных точек предусматривает 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50 временных точек.
В соответствии с другим вариантом осуществления предусмотрена композиция, которую выбирают из первой композиции на основе нуклеиновой кислоты и второй композиции на основе нуклеиновой кислоты: (I) при этом первая композиция на основе нуклеиновой кислоты содержит одну или множество молекул выделенной нуклеиновой кислоты, которые кодируют: (а) 1, 2, 3, 4 или 5 выделенных пептидов FlaB, каждый из которых содержит Т-клеточный эпитоп Borrelia и их выбирают из пептидов FlaB, имеющих аминокислотные последовательности, изложенные в SEQ ID NO: 1-5, или их одного или более вариантов, на по меньшей мере 80% идентичных по аминокислотной последовательности аминокислотным последовательностям, изложенным в SEQ ID NO: 1-5; (b) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или 13 выделенных пептидов DbpB, каждый из которых содержит Т-клеточный эпитоп Borrelia и их выбирают из пептидов DbpB, имеющих аминокислотные последовательности, изложенные в SEQ ID NO: 6-18, или их одного или более вариантов, на по меньшей мере 80% идентичных по аминокислотной последовательности аминокислотным последовательностям, изложенным в SEQ ID NO: 6-18; (с) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или 13 выделенных пептидов р66, каждый из которых содержит Т-клеточный эпитоп Borrelia и их выбирают из пептидов р66, имеющих аминокислотные последовательности, изложенные в SEQ ID NO: 19-31, или их одного или более вариантов, на по меньшей мере 80% идентичных по аминокислотной последовательности аминокислотным последовательностям, изложенным в SEQ ID NO: 19-31; и (d) 1 или 2 выделенных пептида OspC, каждый из которых содержит Т-клеточный эпитоп Borrelia и их выбирают из пептидов OspC, имеющих аминокислотные последовательности, изложенные в SEQ ID NO: 32-33, или их одного или более вариантов, на по меньшей мере 80% идентичных по аминокислотной последовательности аминокислотным последовательностям, изложенным в SEQ ID NO: 32-33, где пептиды FlaB, DbpB, р66 и OspC, после приведения в контакт с цельной кровью, полученной от субъекта, зараженного видом Borrelia, ассоциированным с болезнью Лайма, способны вызывать вторичный in vitro иммунный ответ со стороны Т-клеток; и
(II) при этом вторая композиция на основе нуклеиновой кислоты содержит одну или множество молекул выделенной нуклеиновой кислоты, которые кодируют: (а) 5 выделенных пептидов FlaB, каждый из которых содержит Т-клеточный эпитоп Borrelia и их выбирают из пептидов FlaB, имеющих аминокислотные последовательности, изложенные в SEQ ID NO: 1-5, или их одного или более вариантов, на по меньшей мере 80% идентичных по аминокислотной последовательности аминокислотным последовательностям, изложенным в SEQ ID NO: 1-5; (b) 13 выделенных пептидов DbpB, каждый из которых содержит Т-клеточный эпитоп Borrelia и их выбирают из пептидов DbpB, имеющих аминокислотные последовательности, изложенные в SEQ ID NO: 6-18, или их одного или более вариантов, на по меньшей мере 80% идентичных по аминокислотной последовательности аминокислотным последовательностям, изложенным в SEQ ID NO: 6-18; (с) 13 выделенных пептидов р66, каждый из которых содержит Т-клеточный эпитоп Borrelia и их выбирают из пептидов р66, имеющих аминокислотные последовательности, изложенные в SEQ ID NO: 19-31, или одного или более их вариантов, на по меньшей мере 80% идентичных по аминокислотной последовательности аминокислотным последовательностям, изложенным в SEQ ID NO: 19-31; и (d) 2 выделенных пептида OspC, каждый из которых содержит Т-клеточный эпитоп Borrelia и их выбирают из пептидов OspC, имеющих аминокислотные последовательности, изложенные в SEQ ID NO: 32-33, или одного или более их вариантов, на по меньшей мере 80% идентичных по аминокислотной последовательности аминокислотным последовательностям, изложенным в SEQ ID NO: 32-33, где пептиды FlaB, DbpB, р66 и OspC, после приведения в контакт с цельной кровью, полученной от субъекта, зараженного видом Borrelia, ассоциированным с болезнью Лайма, способны вызывать вторичный in vitro иммунный ответ со стороны Т-клеток. В соответствии с другим вариантом осуществления предусмотрена композиция на основе вектора, содержащая один или более векторов на основе нуклеиновой кислоты, которые содержат вышеописанную первую композицию на основе нуклеиновой кислоты и/или вышеупомянутую вторую композицию на основе нуклеиновой кислоты. В соответствии с другим вариантом осуществления предусмотрена клетка-хозяин, содержащая вышеописанную композицию на основе вектора.
Эти и другие аспекты и варианты осуществления настоящего изобретения будут очевидны при отсылке на следующее подробное описание и прилагаемые чертежи. Все из патентов США, публикаций заявки на патент США, заявок на патент США, иностранных патентов, иностранных заявок на патент и непатентных публикаций, которые упоминают в настоящем описании и/или которые приведены в информационном листке заявки, включены в настоящий документ посредством ссылки во всей своей полноте, как если бы каждое было включено отдельно. Аспекты и варианты осуществления настоящего изобретения можно модифицировать, при необходимости, для применения концепций различных патентов, заявок и публикаций в целях получения других дополнительных вариантов осуществления настоящего изобретения.
Краткое описание чертежей
На фигуре 1 показано выявление IFN-γ после вторичной in vitro активации Т-клеток пептидным пулом (SEQ ID NO: 1-33) в образцах крови, собранных до лечения и примерно через 60 дней после лечения.
Подробное описание изобретения
Раскрываемые в настоящем документе варианты осуществления настоящего раскрытия относятся к искусственной композиции, которая обеспечивает неожиданным образом чувствительную диагностику и прогноз болезни Лайма (LD), и которая содержит не встречающуюся в природе комбинацию определенных пептидов. Таким образом, как описано в настоящем документе, предусмотрена композиция, содержащая комбинацию пептидов, которая включает один или более пептидов из каждого из раскрываемых в настоящем документе происходящих от патогенных Borrelia spp. пептидных участков флагеллина (FlaB) [SEQ ID NO: 1-5], декорин-связывающего белка (DbpB) [SEQ ID NO: 6-18], общего антигена (р66) [SEQ ID NO: 19-31] и белка наружной поверхности С (OspC) [SEQ ID NO: 32-33] или их вариантных пептидов. Каждый пептид содержит Borrelia spp.-специфический Т-клеточной эпитоп, как впервые раскрыто в настоящем документе. Также предусмотрены соответствующие способы, в том числе способы диагностики болезни Лайма у субъекта и контроля элиминации патогенных микроорганизмов Borrelia spp. после лечения субъекта.
Описанные в настоящем документе комбинации пептидов не встречаются в природе, учитывая, что FlaB, DbpB, р66 и OspC, как известно, экспрессируются на различных стадиях прогрессирования болезни Лайма (обычно обозначаемых как ранняя локальная, ранняя диссеминированная и поздняя диссеминированная стадии) и, таким образом, в естественной среде не были бы одновременно подвержены воздействию иммунной системы зараженного хозяина. Например, OspC экспрессируется бактериями Borrelia во время ранней локальной стадии инфекции, DbpB и р66 экспрессируются после диссеминации инфекции, вызываемой Borrelia, и FlaB экспрессируется по время поздней диссеминированной и ранней локальной стадий. Раскрываемый в настоящем документе пептидный коктейль может также содержать искусственные пептиды, которые отличаются от встречающихся в природе процессированных антигенных фрагментов Borrelia spp., которые предъявляются антиген-представляющими клетками in vivo. Кроме того, не все раскрываемые в настоящем документе пептиды FlaB, DbpB, р66 и OspC встречаются в природе в одном патогенном виде Borrelia и, таким образом, не предполагается, что они были бы атакованы иммунной системой одного пациента с болезнью Лайма. Соответственно, варианты осуществления настоящего изобретения неожиданным образом предусматривают раннее выявление болезни Лайма у широкого диапазона субъектов, имеющих или предположительно имеющих болезнь Лайма, которое можно достичь по выявлению вторичного in vitro ответа на композиции настоящего изобретения со стороны Т-клеток от таких субъектов.
Например, как описано ниже, все образцы, содержащие Т-клетки от субъектов с LD, отвечали на по меньшей мере один пептид из по меньшей мере одного из описанных в настоящем документе содержащих Т-клеточный эпитоп Borrelia полипептидов FlaB, DbpB, р66 и OspC (см. таблицы 1 и 2), даже в случае, если Т-клетки определенных образцов не отвечали на пептиды из всех четырех из FlaB, DbpB, р66 и OspC. Кроме того, все образцы, содержащие Т-клетки от субъектов с LD, отвечали на пептидный коктейль, содержащий по меньшей мере один пептид из всех четырех из FlaB, DbpB, р66 и OspC. Таким образом, в соответствии с неограничивающей теорией, настоящие варианты осуществления предусматривают быстрое и чувствительное выявление Borrelia spp. - специфических Т-клеток в образце независимо от конкретного патогена Borrelia spp., которым субъект может быть заражен, или независимо от стадии прогрессирования заболевания (ранняя локальная, ранняя диссеминированная или поздняя диссеминированная), на которой Т-клетки были получены. Варианты осуществления настоящего изобретения дополнительно предусматривают выявление Borrelia spp.-специфических Т-клеток в образце даже в случаях, когда неизвестно, имеет ли субъект LD, в результате применения ранее не встречающейся комбинации пептидов, содержащих Т-клеточный эпитоп Borrelia, которая включает типичные эпитопы, присутствующие на всех стадиях прогрессирования болезни Лайма. Раскрываемые в настоящем изобретении варианты осуществления пригодны при выявлении болезни Лайма, которая может возникнуть в результате инфекции, вызываемой любым из множества видов Borrelia, которые являются патогенными, такими как виды Borrelia, которые являются патогенными у человека, в том числе Borrelia burgdorferi, Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia azfelii, Borrelia garinii, Borrelia valaisiana, Borrelia spielmanii, Borrelia bissettii, Borrelia lusitaniae и Borrelia bavariensis (см., например, Wright et al., 2012 Am. Fam. Physician 85:1086; Shapiro, 2014 N. Engl. J. Med. 370:1724; Schutzer et al., 2012 J. Bacteriol. 194(2):545).
Как описано в настоящем документе, композиции настоящего изобретения, содержащие комбинацию по меньшей мере одного из раскрываемых пептидов, содержащих Т-клеточный эпитоп Borrelia spp., из каждого из FlaB, DbpB, р66 и OspC (например, SEQ ID NO: 1-33, как изложено в таблице 2), обладают свойствами, которые заметно отличаются от таковых любого отдельного входящего в состав пептида или любой подгруппы одновременно экспрессируемых пептидов, которая не включает по меньшей мере одно из пептида FlaB [SEQ ID NO: 1-5], DbpB [SEQ ID NO: 6-18], р66 [SEQ ID NO: 19-31] и OspC [SEQ ID NO: 32-33], предусмотренных в настоящем документе. Композиции настоящего изобретения неожиданным образом вызывают более устойчивые вторичные in vitro иммунные ответы со стороны Т-клеток от пораженных LD субъектов (в том числе при ранней стадии LD), чем любой из отдельных входящих в состав пептидов (или неполные подгруппы, в которых отсутствует по меньшей мере одно из пептида FlaB, DbpB, р66 или OspC), тем самым обеспечивая ранее не встречающуюся чувствительность выявления, в том числе раннего выявления LD. Таким образом, в результате облегчения более раннего выявления LD, чем можно достичь при одном лишь определении вторичного in vitro Т-клеточного ответа на любой из отдельных входящих в состав пептидов, описанных в настоящем документе (или на неполную подгруппу пептидов, которая содержит лишь пептиды, происходящие из одновременно экспрессируемых полипептидов Borrelia spp., но в которой отсутствует по меньшей мере одно из пептида FlaB, DbpB, р66 или OspC), варианты осуществления настоящего изобретения предусматривают значимо более высокую эффективность, чем можно достичь с помощью любых встречающихся в природе подкомбинаций полипептидов Borrelia spp.
Соответственно, раскрываемые в настоящем документе композиции содержат пептиды FlaB, DbpB, р66 и OspC Borrelia spp. или их варианты, которые содержат Borrelia-специфический Т-клеточный эпитоп в комбинациях, которые не встречаются в природе, и в соответствии с определенными вариантами осуществления раскрываемые в настоящем документе композиции содержат пептиды FlaB, DbpB, р66 и OspC Borrelia spp. или их варианты в не встречающихся в природе количествах по отношению друг к другу, тем самым (и дополнительно в соответствии с неограничивающей теорией) достигают определенных из описанных в настоящем документе преимуществ.
Таким образом, в настоящем документе раскрыт альтернативный подход к любому подходу, ранее известному для подтверждения наличия болезни Лайма (LD) у субъекта, имеющего или предположительно имеющего LD, в результате проведения теста, в котором выявляется индикатор иммунного ответа (например, интерферон-γ), вырабатываемый Т-клетками, которые были активированы в результате воздействия на них специфических участков отдельных белков спирохет, вызывающих болезнь Лайма. Специфические Т-клеточные реактивные эпитопы в отдельных белковых антигенах Borrelia spp. FlaB (номер доступа в GenBank ACI49679.1), DbpB (номер доступа в GenBank ААС70029.1), р66 (номер доступа в GenBank ААС66949.1) и OspC (номер доступа в GenBank ABQ42983.1) описаны в настоящем документе и в соответствии с неограничивающей теорией находят применение в композициях и способах настоящего изобретения в результате распознания Т-клетками линейных антигенных пептидных эпитопов.
Тест на LD, основанный на этой стратегии, обеспечивает по меньшей мере два важных преимущества. Во-первых, активированные Т-клетки пролиферируют быстрее, чем В-клетки, вырабатывающие антитела, поэтому тест может обеспечивать более высокую чувствительность по сравнению с любым тестом на выявление антител во время ранних стадий инфекции, вызываемой патогенными Borrelia.
Во-вторых, уровни антител, вырабатываемых в ответ на наличие спирохет, вызывающих болезнь Лайма, обычно остаются повышенными в течение нескольких месяцев и лет, несмотря на успешное лечение, в то время как регуляция Т-клеток обычно проявляется в виде ослабления уровней Т-клеточной активности после элиминации провокационного стимула (например, инфекционного агента). Таким образом, раскрываемые в настоящем изобретении прогностические способы могут обеспечивать более эффективную оценку того, что в результате курса лечения LD ослабилась (например, уменьшилась статистически значимым образом по отношении к соответствующему контролю) или элиминировалась инфекция, вызываемая патогенными Borrelia. Эти преимущества появляются в связи с тем, что Т-клетки обычно остаются активированными в течение очень коротких периодов времени после регрессии инфекции, вызываемой Borrelia. Таким образом, невозможность выявления повышенного уровня индикатора Т-клеточного иммунного ответа (например, высвобождения интерферона-γ активированными Т-клетками) в ответ на вторичную in vitro стимуляцию раскрываемой в настоящем документе композицией со стороны Т-клеток, которые присутствуют в образце, полученном от пациента с LD после терапии LD, может также обеспечивать точный прогноз успешности лечения.
Как описано в настоящем документе, специфические пептиды на основе клинически важных отдельных белков Borrelia spp.(например, В. garinii, В. burgdorferi, В. burgdorferi В 31), содержащихся в мультипептидном коктейле, оценивали в отношении их способности при вторичном in vitro иммунном ответе вызывать выработку интерферона-γ (иллюстративного индикатора Т-клеточного иммунного ответа) активированными Т-клетками, полученными от пациентов с LD. В качестве доказательства концепции способности такого коктейля, состоящего из пептидов, содержащих Borrelia spp.-специфический Т-клеточный эпитоп, индуцировать интерферон-γ специфическими для болезни Лайма активированными Т-клетками, определенным образом оценивали в образцах крови от пациентов с инфекциями ранней стадии, вызываемыми В. burgdorferi. Уровни интерферона-γ, вырабатываемого Т-клетками, собранными от пациентов с LD непосредственно перед антибиотикотерапией, также сравнивали с уровнями интерферона-γ, вырабатываемого Т-клетками, собранными от пациентов с LD через примерно 60 дней после того, как пациентов эффективно лечили антибиотиками.
Пептиды, содержащие Т-клеточный эпитоп Borrelia
В соответствии с определенными вариантами осуществления настоящее раскрытие предусматривает композицию для диагностики или прогноза болезни Лайма, которую выбирают из первой композиции и второй композиции:
(I) при этом первая композиция содержит: (а) 1, 2, 3, 4 или 5 выделенных пептидов FlaB, каждый из которых содержит Т-клеточный эпитоп Borrelia и их выбирают из пептидов FlaB, имеющих аминокислотные последовательности, изложенные в SEQ ID NO: 1-5, или их одного или более вариантов, на по меньшей мере 80% идентичных по аминокислотной последовательности аминокислотным последовательностям, изложенным в SEQ ID NO: 1-5; (b) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или 13 выделенных пептидов DbpB, каждый из которых содержит Т-клеточный эпитоп Borrelia и их выбирают из пептидов DbpB, имеющих аминокислотные последовательности, изложенные в SEQ ID NO: 6-18, или их одного или более вариантов, на по меньшей мере 80% идентичных по аминокислотной последовательности аминокислотным последовательностям, изложенным в SEQ ID NO: 6-18; (с) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или 13 выделенных пептидов р66, каждый из которых содержит Т-клеточный эпитоп Borrelia и их выбирают из пептидов р66, имеющих аминокислотные последовательности, изложенные в SEQ ID NO: 19-31, или их одного или более вариантов, на по меньшей мере 80% идентичных по аминокислотной последовательности аминокислотным последовательностям, изложенным в SEQ ID NO: 19-31; и (d) 1 или 2 выделенных пептида OspC, каждый из которых содержит Т-клеточный эпитоп Borrelia и их выбирают из пептидов OspC, имеющих аминокислотные последовательности, изложенные в SEQ ID NO: 32-33, или их одного или более вариантов, на по меньшей мере 80% идентичных по аминокислотной последовательности аминокислотным последовательностям, изложенным в SEQ ID NO: 32-33, где композиция, после приведения в контакт с цельной кровью, полученной от субъекта, зараженного видом Borrelia, ассоциированным с болезнью Лайма, способна вызывать вторичный in vitro иммунный ответ со стороны Т-клеток; и
(II) при этом вторая композиция содержит: (а) 5 выделенных пептидов FlaB, каждый из которых содержит Т-клеточный эпитоп Borrelia и их выбирают из пептидов FlaB, имеющих аминокислотные последовательности, изложенные в SEQ ID NO: 1-5, или их одного или более вариантов, на по меньшей мере 80% идентичных по аминокислотной последовательности аминокислотным последовательностям, изложенным в SEQ ID NO: 1-5; (b) 13 выделенных пептидов DbpB, каждый из которых содержит Т-клеточный эпитоп Borrelia и их выбирают из пептидов DbpB, имеющих аминокислотные последовательности, изложенные в SEQ ID NO: 6-18, или их одного или более вариантов, на по меньшей мере 80% идентичных по аминокислотной последовательности аминокислотным последовательностям, изложенным в SEQ ID NO: 6-18; (с) 13 выделенных пептидов р66, каждый из которых содержит Т-клеточный эпитоп Borrelia и их выбирают из пептидов р66, имеющих аминокислотные последовательности, изложенные в SEQ ID NO: 19-31, или их одного или более вариантов, на по меньшей мере 80% идентичных по аминокислотной последовательности аминокислотным последовательностям, изложенным в SEQ ID NO: 19-31; и (d) 2 выделенных пептида OspC, каждый из которых содержит Т-клеточный эпитоп Borrelia и их выбирают из пептидов OspC, имеющих аминокислотные последовательности, изложенные в SEQ ID NO: 32-33, или их одного или более вариантов, на по меньшей мере 80% идентичных по аминокислотной последовательности аминокислотным последовательностям, изложенным в SEQ ID NO: 32-33.
Пептид FlaB, DbpB, р66 или OspC Borrelia spp., который содержит Т-клеточный эпитоп Borrelia для применения в соответствии с определенными вариантами осуществления, предусмотренными в настоящем документе, может содержать аминокислотную последовательность, изложенную в случае пептида FlaB в любой из SEQ ID NO: 1-5, в случае пептида DbpB в любой из SEQ ID NO: 6-18, в случае пептида р66 в любой из SEQ ID NO: 19-31 и в случае пептида OspC в любой из SEQ ID NO: 32-33, и может в соответствии с определенными другими вариантами осуществления представлять собой содержащий Т-клеточный эпитоп Borrelia пептидный вариант, содержащий пептид, имеющий аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична по меньшей мере одному из таких пептидов под SEQ ID NO: 1-33, и который способен специфически распознаваться Т-клеткой, которая способна реагировать по меньшей мере с одним патогенным видом Borrelia, предпочтительно видом Borrelia, который является патогенным у человека, при этом патогенные виды Borrelia могут включать без ограничения Borrelia burgdorferi, Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia azfelii, Borrelia garinii, Borrelia valaisiana, Borrelia spielmanii, Borrelia bissettii, Borrelia lusitaniae и Borrelia bavariensis.
Пептиды, содержащие Т-клеточный эпитоп Borrelia, под SEQ ID NO: 1-33 изложены в таблице 1.
Пептидные варианты, содержащие Т-клеточный эпитоп Borrelia пептида, содержащего Т-клеточный эпитоп Borrelia, такие как любые из пептидов, изложенные в SEQ ID NO: 1-33, могут содержать одну или более аминокислотных замен, добавлений, делеций и/или вставок по отношению к нативной пептидной последовательности, содержащей Т-клеточный эпитоп Borrelia, изложенной в SEQ ID NO: 1-33 (например, дикого типа или преобладающих или встречающихся в природе аллельных форм). Варианты предпочтительно на по меньшей мере приблизительно 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88% или 89% идентичны по аминокислотной последовательности и более предпочтительно на по меньшей мере приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичны по аминокислотной последовательности соответствующей части нативного участка полипептидной последовательности, содержащей Т-клеточный эпитоп Borrelia spp., например, участки, показанные в настоящем документе впервые (таблица 2), содержат Т-клеточный эпитоп из полипептидных антигенов Borrelia FlaB Borrelia burgdorferi (номер доступа в GenBank ACI49679.1), DbpB Borrelia burgdorferi (номер доступа в GenBank ААС70029.1), р66 Borrelia burgdorferi (номер доступа в GenBank ААС66949.1) и OspC Borrelia burgdorferi (номер доступа в GenBank ABQ42983.1). Процент идентичности можно легко определить при сравнении последовательностей пептидных вариантов с соответствующим полноразмерным полипептидом, где соответствующие участки можно легко идентифицировать в соответствии с общепринятыми способами, например, с помощью выравнивания участков последовательностей, которые характеризуются высокой степенью идентичности последовательностей или гомологии последовательностей, необязательно учитывая гэпы из коротких последовательностей, которые могут появляться в результате вставок или делеций, или в случае консервативных замен или в случае коротких ошибочно спаренных участков и т.п. Некоторые методики сравнения последовательностей предусматривают применение компьютерных алгоритмов, хорошо известных специалистам в данном области, таких как Align или алгоритм BLAST (Altschul, J. Mol. Biol. 219:555-565, 1991; Henikoff and Henikoff, USA 89:10915-10919, 1992), который доступен на веб-сайте NCBI (см. [онлайн] в интернете: <URL: http://www/ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST). Можно использовать параметры по умолчанию или пользовательские параметры.
Кроме того, в данной области доступны компьютерные алгоритмы, которые дают возможность специалисту в данной области прогнозировать пространственную структуру белка или пептида в целях определения функциональных вариантов определенного полипептида. Например, можно идентифицировать варианты, где вся пространственная структура или часть таковой является фактически неизмененной в результате одной или более модификаций, замен, делеций и/или вставок (см., например, Seemayer et al., 2014 Bioinformat. 30:3128; Raman et al., 2010 ScienceExpress 4 February 2010 10.1126/science. 1183649; Gribenko et al., 2009 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 106:2601; Bradley et al., Science 309: 1868-1871 (2005); Schueler-Furman et al., Science 310:638 (2005); Dietz et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 103:1244 (2006); Dodson et al., Nature 450:176 (2007); Qian et al., Nature 450:259 (2007); Baker, 2014 Biochem. Soc. Trans. 42:225; Correia et al., 2014 Nature 507:201; King et al., 2014 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 111:8577; Roche et al., 2012 PLoS One 7(5):e38219; Zhang et al., 2013 Meths. Enzymol. 523:21; Khoury et al., 2014 Trends Biotechnol. 32:99; O'Meara et al., 2015 J. Chem. Theory Comput. 11:609; Park et al., 2015 Structure 23:1123; Bale et al., 2015 Protein Sci. doi:10.1002/pro.2748 Epub PMID 26174163; Park et al., 2015 Proteins doi: 10.1002/prot.24862 Epub PMID 26205421; Lin et al., 2015 Proc. Nat. Acad. Sci. USA pii:201509508 Epub PMID 26396255). В этом отношении специалист в данной области может легко определить, сохраняет ли определенный пептидный вариант, содержащий Т-клеточный эпитоп Borrelia, или его функциональный фрагмент достаточную структуру эпитопов, чтобы быть способным специфически распознаваться Т-клеткой, которая способна реагировать с по меньшей мере одним патогенным видом Borrelia.
Пептид, содержащий Т-клеточный эпитоп Borrelia, может представлять собой пептид из по меньшей мере 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 смежных аминокислот и в соответствии с определенными вариантами осуществления может обычно составлять не более 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55 или 50 аминокислот в длину. В соответствии с определенными вариантами осуществления пептид, содержащий Т-клеточный эпитоп Borrelia, может представлять собой пептид из 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50 смежных аминокислот в длину.
Следует понимать, что Т-клеточный эпитоп обозначает структурный участок антигена, который может специфически распознаваться Т-клеточным рецептором к антигену («Т-клеточный рецептор»), обычно в контексте соответствующей молекулы I или II класса основного комплекса гистосовместимости (МНС), которая представляет эпитоп Т-клеточному рецептору. Пептиды, содержащие Т-клеточный эпитоп из приблизительно 8-13 аминокислот в длину, обычно представляют CD8 Т-клеточным рецепторам молекулы I класса МНС; пептиды, содержащие Т-клеточный эпитоп из приблизительно 15-25 аминокислот в длину, обычно представляют CD4 Т-клеточным рецепторам молекулы II класса МНС. Т-клеточные рецепторы не являются абсолютными по своей специфичности, а, наоборот, рассматриваются как промискуитетные; иными словами, определенный Т-клеточный рецептор может быть способен к распознанию определенной структуры Т-клеточного эпитопа и также ряда близко расположенных эпитопных структур. Специфическое распознавание соответствующим образом представленного Т-клеточного эпитопа Т-клеткой может подлежать выявлению в виде стимуляции образования индикатора Т-клеточного иммунного ответа, такого как таковые, описанные в настоящем документе (например, высвобождение цитокинов Т-клетками, например, высвобождение IFN-γ). Таким образом, пептид, содержащий Т-клеточный эпитоп Borrelia, может означать пептидный антиген, который способен, при вторичном in vitro иммунном ответе, стимулировать Т-клетку, которая была примирована (например, активирована), с распознанием антигена Borrelia spp., включая ситуации, в которых пептид, содержащий Т-клеточный эпитоп Borrelia, не является идентичным антигену Borrelia spp., которым Т-клетка могла быть примирована in vivo.
Все методики разработки, получения и исследования пептидов, содержащих Т-клеточный эпитоп Borrelia, и их вариантов и функциональных фрагментов, предусмотренных в настоящем документе, доступны с незначительной модификацией к существующим знаниям в данной области, например, применению стандартных способов вирусологии, иммунологии, микробиологии, молекулярной биологии и методик рекомбинантной ДНК, которые в полном объеме объясняются в литературе. См., например, Sambrook, et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Maniatis et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds., 1985); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, eds., 1984); Animal Cell Culture (R. Freshney, ed., 1986); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984).
Термины «полипептид», «белок» и «пептид» используются взаимозаменяемо и означают полимер из аминокислот, не ограниченный какой-либо определенной длиной. Данный термин не исключает модификации, такие как миристилирование, сульфатирование, гликозилирование, фосфорилирование, формилирование и добавление или делецию сигнальных последовательностей. Термин «полипептид» или «белок» означает одну или более цепей из аминокислот, где каждая цепь содержит аминокислоты, ковалентно связанные пептидными связями, и где указанный полипептид или белок может содержать множество цепей, нековалентно и/или ковалентно связанных вместе пептидными связями, при этом они имеют последовательность нативных белков, то есть, белков, вырабатываемых встречающимися в природе и, в частности, нерекомбинантными клетками, или генетически созданными или рекомбинантными клетками, и представляют собой молекулы, имеющие аминокислотную последовательность нативного белка, или молекулы, имеющие делеции одной или более аминокислот нативных последовательностей, добавления к таковым и/или замены таковых. Таким образом, «полипептид» или «белок» может представлять собой одну (называемую «мономер») или более (называемую «мультимер») аминокислотных цепей. Термины «пептид», «полипептид» и «белок» определенным образом охватывают пептиды по настоящему раскрытию или последовательности, которые имеют делеции одной или более аминокислот описанного в настоящем документе пептида, добавления к таковым и/или замены таковых.
Термин «выделенный» означает, что материал удален из своего первоначального окружения (например, природного окружения, если он встречается в природе). Например, встречающийся в природе полипетид или нуклеиновая кислота, присутствующая в живом животном, не является выделенной, однако тот же полипептид или нуклеиновая кислота, отделенная от некоторых или всех из совместно существующих материалов в природной системе, является выделенной. Такая нуклеиновая кислота могла бы быть частью вектора и/или такая нуклеиновая кислота или полипептид могли бы быть частью композиции (например, клеточного лизата), и по-прежнему быть выделенными в том смысле, что такой вектор или композиция не является частью природного окружения для нуклеиновой кислоты или полипептида. Термин «ген» означает сегмент ДНК, участвующий в образовании полипептидной цепи; он включает участки, предшествующие кодирующему участку «лидерной и трейлерной последовательности» и следующие за таковым, а также промежуточные последовательности (интроны) между отдельными кодирующими сегментами (экзонами).
Термины «выделенный белок», «выделенный полипептид» и «выделенный пептид», упоминаемые в данном документе, означают, что исследуемый белок, пептид или полипептид (1) не содержит по меньшей мере некоторых других белков, пептидов или полипептидов, с которыми он обычно встречается в природе, (2) фактически не содержит других белков, пептидов или полипептидов из того же самого источника, например, от того же самого вида, (3) экспрессируется клеткой от другого вида, (4) был отделен из по меньшей мере 50 процентов полинуклеотидов, липидов, углеводов или других материалов, с которыми он связан в природе, (5) не связан (с помощью ковалентного или нековалентного взаимодействия) с участками белка или полипептида, с которыми выделенный белок, выделенный пептид или выделенный полипептид может быть связан в природе, (6) функционально связан (с помощью ковалентного или нековалентного взаимодействия) с полипептидом, с которым он не связан в природе или (7) не встречается в природе. Такой выделенный белок, пептид или полипептид может кодироваться геномной ДНК, кДНК, мРНК или другой РНК, или может быть синтетического происхождения в соответствии с любой из ряда общеизвестных химических структур для синтеза искусственных пептидов или белков или их любой комбинацией. В соответствии с определенными вариантами осуществления выделенный белок, пептид или полипептид фактически не содержит белков или других примесей, которые встречаются в его природном окружении, которые бы нарушили его применение (терапевтическое, диагностическое, профилактическое, исследовательское или иное).
Термины «пептидный фрагмент» или «полипептидный фрагмент» относятся к пептиду или полипептиду, который может быть мономерным или мультимерным, который имеет аминоконцевую делецию, карбоксиконцевую делецию и/или внутреннюю делецию или замену встречающегося в природе или полученного рекомбинантно полипептида. Используемый в данном документе термин «смежные аминокислоты» обозначает ковалентно связанные аминокислоты, соответствующие непрерываемому линейному участку раскрываемой аминокислотной последовательности. В соответствии с определенными вариантами осуществления полипептидный фрагмент может содержать аминокислотную цепь из по меньшей мере от 5 до приблизительно 100 аминокислот в длину. Следует принимать во внимание, что в соответствии с определенными вариантами осуществления фрагменты составляют по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100 аминокислот в длину.
Определенные предпочтительные варианты осуществления предусматривают полностью искусственный синтез раскрываемых в настоящем документе пептидов (например, пептида, содержащего Т-клеточный эпитоп Borrelia) в соответствии с любой из ряда принятых методик, таких как таковые, описанные в Amino Acid and Peptide Synthesis (Jones, J., 2002 Oxford Univ. Press USA, New York), Ramakers et al. (2014 Chem. Soc. Rev. 43:2743), Verzele et al. (2013 Chembiochem. 14:1032), Chandrudu et al. (2013 Molecules 18:4373), и/или  et al. (2004 Beilstein J. Org. Chem. 10:1197). Например, ручной или предпочтительно автоматизированный твердофазный синтез пептидов на основе метода Меррифильда или другие методики твердофазного синтеза пептидов и последующие усовершенствования (например, Merrifield, 1963 J. Am. Chem. Soc. 85:2149; Mitchell et al., 1978 J. Org. Chem. 43:2485; Albericio, F. (2000). Solid-Phase Synthesis: A Practical Guide (1 ed.). Boca Raton: CRC Press; Nilsson et al., 2005 Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 34; Schnolzer et al., Int. J. Peptide Res. Therap. 13 (1-2): 31; Li et al. 2013 Molecules 18:9797) являются стандартными в области синтеза пептидов и могут применяться для химического синтеза описанных в настоящем документе пептидов.
Полипептид или пептид может содержать сигнальную (или лидерную) последовательность на N-концевой части белка, которая котрансляционно или посттрансляционно направляет перенос белка. Полипептид или пептид может быть также слит в рамке или конъюгирован с линкером или другой последовательностью для облегчения синтеза, очистки или идентификации полипептида (например, поли-His) или для усиления связывания полипептида или пептида с твердой подложкой. Полипептиды со слитыми доменами могут быть присоединены к полипептиду или пептиду на N-конце и/или на С-конце, и могут включать в качестве неограничивающих примеров происходящие из иммуноглобулинов последовательности, такие как последовательности константного участка Ig или их участки, аффинные метки, такие как His-метка (например, гистидин или другой полигистидин), FLAG™ или туе или другие пептидные аффинные метки, подлежащие выявлению полипептидные фрагменты, такие как зеленый флуоресцентный белок (GFP) или его варианты (например, желтый флуоресцентный белок (YFP), синий флуоресцентный белок (BFP), другие экворины или их производные и др.) или другие подлежащие выявлению полипептидные слитые домены, ферменты или их участки, такие как глутатион-S-трансфераза (GST) или другие известные домены с ферментативной детекцией и/или домен слияния с репортерами и т.п., как будет известно специалисту в данной области.
Системы рекомбинантной экспрессии пептидов, полипептидов и белков известны в данной области и в соответствии с определенными вариантами осуществления могут применяться для получения описанных в настоящем документе пептидов. Например, определенные бактериальные системы экспрессии, такие как системы экспрессии рекомбинантных белков Е. coli, образуют полипептидные продукты, имеющие N-концевой формилированный метионин. Таким образом, в некоторых ситуациях получаемый рекомбинантно пептид может содержать N-концевой метиониновый остаток (который может представлять собой немодифицированный метионин или формилметионин или другой метиониновый аналог, вариант, миметик или производное, как предусмотрено в настоящем документе), иногда называемый инициирующим метионином, непосредственно предшествующим необходимой пептидной последовательности (например, пептид, содержащей Т-клеточный эпитоп Borrelia). Таким образом, также предусмотрены варианты осуществления, в которых образуются один или более из описанных в настоящем документе пептидов, содержащих Т-клеточный эпитоп Borrelia, содержащих N-концевой метионин (например, в виде метионина или N-формилметионина), и которые могут экспрессироваться в соответствии с принятой в данной области практикой в клетке-хозяине, которая также экспрессирует метионинаминопептидазу (MAP), фермент, который способен отделять N-концевой метионин с удалением его от образующегося полипептидного продукта. См., например, Natarajan et al., 2011 PLoS ONE 6(5): e20176; Shen et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8108; Shen et al., 1997 Prot. Eng. 10:1085. Альтернативно фермент MAP сам по себе может быть получен рекомбинантно (например, Tsunasawa et al., 1997 J. Biochem. 122:843; Bradshaw et al., 1998 Trends Bioch. Sci. 23:263; Ben-Bassat et al., 1987 J. Bacteriol. 169:751) или получен коммерчески (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, например, номер по каталогу М6435) и использован для удаления N-концевого метионина из пептидов настоящего изобретения после синтеза.
В соответствии с определенными предпочтительными вариантами осуществления пептид, содержащий Т-клеточный эпитоп Borrelia, может представлять собой пептид, полипептид или пептидомиметик, который включает или который имеет высокую идентичность последовательностей или структурные свойства с полипептидом из по меньшей мере 5 и не более 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7 или 6 аминокислот, содержащим аминокислотную последовательность, изложенную в любой из SEQ ID NO: 1-33, где пептид, в котором присутствует Т-клеточный эпитоп Borrelia, способен специфически распознаваться Т-клеткой, которая способна реагировать с по меньшей мере одним патогенным видом Borrelia, предпочтительно видом Borrelia, который является патогенным у человека, при этом патогенные виды Borrelia могут включать без ограничения Borrelia burgdorferi, Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia azfelii, Borrelia garinii, Borrelia valaisiana, Borrelia spielmanii, Borrelia bissettii, Borrelia lusitaniae и Borrelia bavariensis. Аналитические способы определения такой Т-клеточной реактивности описаны в настоящем документе и также известны в целом в данной области, за исключением идентичностей белков и пептидов, содержащих Т-клеточный эпитоп Borrelia, которые раскрыты в настоящем документе впервые.
Как в целом упоминается в данной области и как используется в настоящем документе, идентичность последовательностей и гомология последовательностей могут быть использованы взаимозаменяемо и в целом относятся к проценту нуклеотидов или аминокислотных остатков в кандидатной последовательности, которые соответственно идентичны нуклеотидам или аминокислотным остаткам в эталонной полинуклеотидной или полипептидной последовательности, после выравнивания последовательностей и введения гэпов, при необходимости, для достижения максимального процента идентичности последовательностей, и необязательно без учета любых консервативных замен как части идентичности последовательностей. В соответствии с определенными вариантами осуществления вариант пептида, такой как раскрываемый в настоящем документе пептид, содержащий Т-клеточный эпитоп Borrelia spp.(например, пептид в соответствии с одной из SEQ ID NO: 1-33), разделяет по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, 91%, 92%, 93% или 94%, или по меньшей мере приблизительно 95%, 96%, 97%, 98% или 99% аминокислотных остатков (или нуклеотидов в полинуклеотиде, кодирующем такой пептид) с последовательностью пептида любой из SEQ ID NO: 1-33. Такую идентичность последовательностей можно определить в соответствии с распространенными алгоритмами анализа последовательностей, как также отмечено выше, и включающими таковые, доступные от Genetics Computer Group Висконсинского университета (Мадисон, Висконсин), такие как FASTA, Gap, Bestfit, BLAST или другие.
Термин «природная или не встречающаяся в природе аминокислота» включает любую из распространенных встречающихся в природе аминокислот, которые выступают в качестве строительных блоков для биосинтеза пептидов, полипептидов и белков (например, аланин (А), цистеин (С), аспарагиновая кислота (D), глутаминовая кислота (Е), фенилаланин (F), глицин (G), гистидин (Н), изолейцин (I), лизин (K), лейцин (L), метионин (М), аспарагин (N), пролин (Р), глутамин (Q), аргинин (R), серии (S), треонин (Т), валин (V), триптофан (W), тирозин (Y)), а также включает модифицированные, дериватизированные, энантиомерные, редкие и/или необычные аминокислоты, встречающиеся в природе или синтетические, например, N-формилметионин, гидроксипролин, гидроксилизин, десмозин, изодесмозин, ε-N-метиллизин, ε-N-триметиллизин, метил гистидин, дегидробутирин, дегидроаланин, α-аминомасляную кислоту, β-аланин, γ-аминомасляную кислоту, гомоцистеин, гомосерин, цитрулин, орнитин и другие аминокислоты, которые можно выделить из природного источника и/или которые можно химически синтезировать, например, как можно найти в Proteins, Peptides and Amino Acids Sourcebook (White, J.S. and White, D.C., 2002 Humana Press, Тотова, Нью-Джерси) или в Amino Acid and Peptide Synthesis (Jones, J., 2002 Oxford Univ. Press, США, Нью-Йорк) или в Unnatural Amino Acids, ChemFiles Vol. 1, No. 5 (2001 Fluka Chemie GmbH; Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури) или в Unnatural Amino Acids II, ChemFiles Vol. 2, No. 4 (2002 Fluka Chemie GmbH; Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури). Дополнительные описания природных и/или не встречающихся в природе аминокислот можно найти, например, в Kotha, 2003 Асе. Chem. Res. 36:342; Maruoka et al., 2004 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 101:5824; Lundquist et al., 2001 Org. Lett. 3:781; Tang et al., 2002 J. Org. Chem. 67:7819; Rothman et al., 2003 J. Org. Chem. 68:6795; Krebs et al., 2004 Chemistry 10:544; Goodman et al., 2001 Biopolymers 60:229; Sabat et al., 2000 Org. Lett. 2:1089; Fu et al., 2001 J. Org. Chem. 66:7118; и Hruby et al., 1994 Meths. Mol. Biol. 35:249. Стандартные трехбуквенные аббревиатуры и однобуквенные символы используют в настоящем документе для обозначения природных и не встречающихся в природе аминокислот.
Другие не встречающиеся в природе аминокислоты или аналоги аминокислот известны в данной области и включают без ограничения не встречающиеся в природе L-или D-производные (такие как D-аминокислоты, присутствующие в пептидах и/или пептид о миметиках, таких как таковые, представленные выше и в других разделах настоящего документа), аминокислоты с флуоресцентной меткой, а также конкретные примеры, включающие О-метил-L-тирозин, L-3-(2-нафтил)аланин, 3-метилфенилаланин, 3-йодтирозин, О-пропаргилтирозин, гомоглутамин, O-4-аллил-L-тирозин, 4-пропил-L-тирозин, 3-нитро-L-тирозин, три-O-ацетил-GlcNAcβ-серин, L-ДОФА, фторированный метилаланин, изопропил-L-фенилаланин, n-азидо-L-фенилаланин, n-ацил-L-фенилаланин, n-ацетил-L-фенилаланин, м-ацетил-L-фенилаланин, селенометионин, теллурометионин, селеноцистеин, алкинфенилаланин, О-аллил-L-тирозин, O-(2-пропил)-L-тирозин, n-этилтиокарбонил-L-фенилаланин, n-(3-оксобутаноил)-L-фенилаланин, n-бензоил-L-фенилаланин, L-фосфосерин, фосфоносерин, фосфонотирозин, гомопропаргилглицин, азидогомоаланин, n-йод-фенилаланин, n-бром-L-фенилаланин, дигидроксифенилаланин, дигидроксил-L-фенилаланин, n-нитро-L-фенилаланин, м-метокси-L-фенилаланин, n-йод-фенилаланин, n-бромофенилаланин, n-амино-L-фенилаланин и изопропил-L-фенилаланин, трифторлейцин, норлейцин («Nle»), D-норлейцин («dNle» или «D-Nle»), 5-фтортрипрофан, пара-галофенилаланин, гомофенилаланин («гомо-Phe»), селенометионин, этионин, S-нитрозогомоцистеин, тиапролин, 3-тиенилаланин, гомоаллилглицин, трифторизолейцин, транс- и цис-2-амино-4-гексеневую кислоту, 2-бутинилглицин, аллилглицин, пара-азидофенилаланин, пара-цианофенилаланин, пара-этинилфенилаланин, гексафторлейцин, 1,2,4-триазол-3-аланин, 2-фторгистидин, L-метилгистидин, 3-метил-L-гистидин, β-2-тиенил-L-аланин, β-(2-тиазолил)-DL-аланин, гомопропаргилглицин (HPG) и азидогомоаланин (AHA) и т.п.
В соответствии с определенными вариантами осуществления может присутствовать природная или не встречающаяся в природе аминокислота, которая содержит ароматическую боковую цепь, как обнаружено, например, в фенилаланине или триптофане или их аналогах, в том числе в других природных и не встречающихся в природе аминокислотах, на основании структур которых специалист в данной области легко поймет, когда присутствует ароматическая циклическая система, обычно в виде ароматической моноциклической или полициклической углеводородной циклической системы, состоящей только из водорода и углерода и содержащей от 6 до 19 атомов углерода, где циклическая система может быть частично или полностью насыщенной, и которая может присутствовать в виде группы, которая включает без ограничения группы, такие как флуоренил, фенил и нафтил.
В соответствии с определенными вариантами осуществления может присутствовать природная или не встречающаяся в природе аминокислота, которая содержит гидрофобную боковую цепь, как обнаружено, например, в аланине, валине, изолейцине, лейцине, пролине, фенилаланине, триптофане или метионине или их аналогах, в том числе в других природных или не встречающихся в природе аминокислотах, на основании структур которых специалист в данной области легко поймет, когда присутствует гидрофобная боковая цепь (например, как правило, такая, которая является неполярной, находясь в физиологической среде). В соответствии с определенными вариантами осуществления может присутствовать природная или не встречающаяся в природе аминокислота, которая содержит основную боковую цепь, как обнаружено, например, в лизине, аргинине или гистидине или их аналогах, в том числе в других природных или не встречающихся в природе аминокислотах, на основании структур которых специалист в данной области легко поймет, когда присутствует основная боковая цепь (например, как правило, полярная и имеющая положительный заряд, находясь в физиологической среде).
Пептиды, раскрываемые в настоящем документе, в соответствии с определенными вариантами осуществления могут включать L- и/или D-аминокислоты при условии, что биологическая активность пептида сохраняется (например, пептид, содержащий Т-клеточный эпитоп Borrelia spp., способен распознаваться при вторичном in vitro иммунном ответе Т-клетками от субъекта, зараженного видом Borrelia, который ассоциирован с болезнью Лайма, что подтверждается стимуляцией образования индикатора Т-клеточного иммунного ответа, как описано в настоящем документе). Пептиды также могут содержать в соответствии с определенными вариантами осуществления любую из ряда известных природных и искусственных посттрансляционных или постсинтетических ковалентных химических модификаций в результате реакций, которые могут включать гликозилирование (например, присоединение N-связанных олигосахаридов к остаткам аспарагина, присоединение О-связанных олигосахаридов к остаткам серина или треонина, гликирование или тому подобное), ацилирование жирной кислотой, ацетилирование, формилирование, пегилирование и фосфорилирование. Пептиды, раскрываемые в настоящем документе, могут дополнительно включать аналоги, аллели и аллельные варианты, которые могут содержать делеций аминокислот или вставки или замены одной или более аминокислотных остатков другими встречающимися в природе аминокислотными остатками или не встречающимися в природе аминокислотными остатками.
2
2
Пептиды и непептидные аналоги могут называться пептидными миметиками или пептид о миметиками, и известны в фармацевтической отрасли (Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986); Evans et al. J. Med. Chem. 30: 1229 (1987)). Эти соединения могут содержать один или более не встречающихся в природе аминокислотных остатков, один или более фрагментов с химическими модификациями (например, гликозилирование, пегилирование, фрагмент с флуоресценцией, радиоактивностью или другой фрагмент), и/или одну или более не встречающихся в природе пептидных связей (например, восстановленную пептидную связь: --CH-NH--). Пептидомиметики можно разрабатывать с помощью различных способов, в том числе с помощью компьютерного молекулярного моделирования, случайного или сайт-направленного мутагенеза, стратегий на основе ПЦР, химического мутагенеза и других.
Как также описано выше, определенные варианты осуществления также связаны с пептид о миметиками или «искусственными» полипептидами. Такие полипептиды могут содержать одну или более аминокислотных вставок, делеций или замен, одну или более измененных или искусственных пептидных связей, один или более химических фрагментов (таких как полиэтиленгликоль, гликозилирование, подлежащая выявлению метка или другой фрагмент) и/или одна или более не встречающихся в природе аминокислот. Синтез пептидомиметиков хорошо известен в данной области и может включать изменение встречающихся в природе белков или полипептидов с помощью химического мутагенеза, направленного мутагенеза в одном или более сайтах, ПЦР-шаффлинга, применения измененных молекул аминоацил-тРНК или аминоацил-тРНК-синтетазы, применения «стоп»-кодонов, таких как амбер-супрессоры, применения кодонов для четырех или пяти пар оснований или других средств.
В таблице 2 показаны источники Borrelia spp., идентичности исходных белков и участков аминокислотной последовательности, из которых все или части пептидов, содержащих Т-клеточный эпитоп Borrelia spp., под SEQ ID NO: 1-33 (показано в таблице 3) получены или происходят.
Любую комбинацию из пептидов таблицы 3 можно использовать в соответствии с определенными предусмотренными в настоящем изобретении вариантами осуществления раскрываемых в настоящем документе композиций, и, в частности, в соответствии с предпочтительными вариантами осуществления присутствует по меньшей мере один пептид из каждого из четырех раскрываемых участков полипептидов Borrelia, FlaB, DbpB, р66 и OspC: FlaB [SEQ ID NO: 1-5], DbpB [SEQ ID NO: 6-18], р66 [SEQ ID NO:19-31] и OspC [SEQ ID NO: 32-33]. Количества нескольких пептидов друг по отношению к другу и абсолютные количества одного или более из указанных пептидов могут варьировать в зависимости от схемы анализа и определенной методики, в которой предполагается применение композиции, как будет знакомо специалисту в данной области в зависимости от определенных иммунохимических, иммунологических и/или биохимических методик. В качестве примера и без ограничения в соответствии с определенными вариантами осуществления композиция может содержать по меньшей мере приблизительно один нанограмм каждого пептида и не более приблизительно 100 нанограмм каждого пептида; в соответствии с определенными вариантами осуществления композиция может содержать по меньшей мере приблизительно 100, 200, 300 или 400 нанограмм и не более приблизительно 500 нанограмм каждого пептида; в соответствии с определенными вариантами осуществления композиция может содержать по меньшей мере приблизительно 500, 600, 700, 800 или 900 нанограмм и не более приблизительно 1000 нанограмм каждого пептида; в соответствии с определенными вариантами осуществления композиция может содержать по меньшей мере приблизительно 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8 или 1,9 микрограмм и не более приблизительно 2 микрограмм каждого пептида, и в соответствии с определенными вариантами осуществления композиция может содержать по меньшей мере приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 микрограмм и не более приблизительно 10 микрограмм каждого пептида.
Способы диагностики или прогноза болезни Лайма
Как раскрыто в настоящем документе, в соответствии с определенными вариантами осуществления композиции и способы выявления болезни Лайма у субъекта или контроля эффективности лечения болезни Лайма у субъекта, основанные отчасти на обнаружении того, что пептидный коктейль, содержащий по меньшей мере один пептид, содержащий. Borrelia-специфический Т-клеточный эпитоп, из каждого из идентифицированных в настоящее время участков белков FlaB, DbpB, р66 и OspC Borrelia spp. (например, таблицы 2 и 3), предусматривают композицию, с которой Т-клетки от фактически всех пациентов с LD будут реагировать во вторичном in vitro иммунном ответе, в результате образования индикатора Т-клеточного иммунного ответа (например, высвобождения интерферона-γ), как предусмотрено в настоящем документе.
Таким образом, эти и связанные варианты осуществления обеспечивают выявление LD у субъекта в момент времени, который наступает ранее в прогрессировании заболевания, чем время, при котором может быть выявлено появление у субъекта Borrelia-специфических антител. Кроме того, и как также отмечено выше, настоящее раскрытие обеспечивает оценку эффективности лечения LD на основании снижения подлежащих выявлению Borrelia-специфического Т-клеточного ответа в результате циркуляции Т-клеток, полученных от субъекта, который прошел успешное лечение LD в целях эрадикации спирохет Borrelia, в отличие от оценки подлежащих выявлению Borrelia-специфических антител, которые могут оставаться в кровотоке в течение многих месяцев или даже лет после успешного лечения LD, и, таким образом, будет маскировать эффекты успешной эрадикации спирохет Borrelia.
Соответственно и в соответствии с определенными вариантами осуществления предусмотрен способ выявления болезни Лайма у субъекта или контроля эффективности лечения болезни Лайма у субъекта, предусматривающий (А) приведение в контакт in vitro (i) первого биологического образца, полученного в первой временной точке у субъекта, который имеет болезнь Лайма или предположительно подвержен риску таковой, где биологический образец содержит Т-клетки и антиген-представляющие клетки, и (ii) пептидной композиции для диагностики или прогноза болезни Лайма с получением первой исследуемой инкубационной смеси; (В) инкубирование первой исследуемой инкубационной смеси в условиях и в течение времени, достаточных для специфического распознавания указанными Т-клетками Т-клеточного эпитопа Borrelia, который присутствует в указанной пептидной композиции, в целях стимуляции образования индикатора Т-клеточного иммунного ответа; и (С) выявление первого уровня индикатора Т-клеточного иммунного ответа в первой исследуемой инкубационной смеси, где наличие инфекции, вызываемой Borrelia, у субъекта определяется по выявлению в (С) указанного первого уровня индикатора Т-клеточного иммунного ответа, который является повышенным по отношению к первому контрольному уровню индикатора Т-клеточного иммунного ответа в результате инкубирования первого биологического образца при первой контрольной инкубации без пептидной композиции для диагностики или прогноза болезни Лайма, и где пептидная композиция для диагностики или прогноза болезни Лайма содержит пептидный коктейль, содержащий по меньшей мере один пептид, содержащий Borrelia-специфический Т-клеточный эпитоп, из каждого из идентифицированных в настоящее время участков белков FlaB, DbpB, р66 и OspC Borrelia spp.(например, таблицы 2 и 3), например:
(а) 1, 2, 3, 4 или 5 выделенных пептидов FlaB, каждый из которых содержит Т-клеточный эпитоп Borrelia и их выбирают из пептидов FlaB, имеющих аминокислотные последовательности, изложенные в SEQ ID NO: 1-5, или их одного или более вариантов, на по меньшей мере 80% идентичных по аминокислотной последовательности аминокислотным последовательностям, изложенным в SEQ ID NO: 1-5; (b) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или 13 выделенных пептидов DbpB, каждый из которых содержит Т-клеточный эпитоп Borrelia и их выбирают из пептидов DbpB, имеющих аминокислотные последовательности, изложенные в SEQ ID NO: 6-18, или их одного или более вариантов, на по меньшей мере 80% идентичных по аминокислотной последовательности аминокислотным последовательностям, изложенным в SEQ ID NO: 6-18; (с) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или 13 выделенных пептидов р66, каждый из которых содержит Т-клеточный эпитоп Borrelia и их выбирают из пептидов р66, имеющих аминокислотные последовательности, изложенные в SEQ ID NO: 19-31, или их одного или более вариантов, на по меньшей мере 80% идентичных по аминокислотной последовательности аминокислотным последовательностям, изложенным в SEQ ID NO: 19-31; и (d) 1 или 2 выделенных пептида OspC, каждый из которых содержит Т-клеточный эпитоп Borrelia и их выбирают из пептидов OspC, имеющих аминокислотные последовательности, изложенные в SEQ ID NO: 32-33, или их одного или более вариантов, на по меньшей мере 80% идентичных по аминокислотной последовательности аминокислотным последовательностям, изложенным в SEQ ID NO: 32-33, и тем самым выявление болезни Лайма у субъекта или контроль эффективности лечения болезни Лайма у субъекта.
В соответствии с определенными предпочтительными вариантами осуществления первая временная точка находится перед введением субъекту лечения болезни Лайма.
В соответствии с дополнительными вариантами осуществления способ дополнительно предусматривает (D) приведение в контакт in vitro (i) второго биологического образца, полученного от субъекта во второй временной точке, которая находится после первой временной точки и после введения субъекту лечения болезни Лайма, где второй биологический образец содержит Т-клетки и антиген-представляющие клетки, и (ii) пептидной композиции для диагностики или прогноза болезни Лайма с получением второй исследуемой инкубационной смеси; (Е) инкубирование второй исследуемой инкубационной смеси в условиях и в течение времени, достаточных для специфического распознавания указанными Т-клетками Т-клеточного эпитопа Borrelia, который присутствует в указанной пептидной композиции в целях стимуляции образования индикатора Т-клеточного иммунного ответа; и (F) выявление второго уровня индикатора Т-клеточного иммунного ответа во второй исследуемой инкубационной смеси, где наличие инфекции, вызываемой Borrelia, у субъекта определяется по выявлению в (F) указанного второго уровня индикатора Т-клеточного иммунного ответа, который является повышенным по отношению к второму контрольному уровню индикатора Т-клеточного иммунного ответа в результате инкубирования второго биологического образца при второй контрольной инкубации без пептидной композиции для диагностики или прогноза болезни Лайма, и где эффективность лечения болезни Лайма определяется по выявлению в (F) указанного второго уровня индикатора Т-клеточного иммунного ответа, который является сниженным по отношению к первому уровню индикатора Т-клеточного иммунного ответа, который выявляется в (С).
В соответствии с этими и определенными связанными вариантами осуществления, таким образом, будет понятно, что первая временная точка находится перед введением субъекту определенного лечения болезни Лайма, в то время как вторая или последующая временные точки будут находиться после введения субъекту определенного лечения LD, таким образом, что эффективность лечения может быть определена на основании, например, снижения (например, статистически значимого снижения по отношению к соответствующему контролю) второго уровня индикатора Т-клеточного иммунного ответа, который выявляется. В качестве неограничивающей теории, такой результат означал бы, что во второй или в последующей временной точке второй биологический образец содержит более низкие уровни Borrelia-специфической Т-клеточной реактивности при анализе в отношении стимуляции образования индикатора Т-клеточного иммунного ответа по отношению к первой временной точке, как следствие отрицательно регулируемой и/или отсутствующей Т-клеточной реактивности во втором образце в результате последующего устранения инфекции, вызываемой Borrelia, у субъекта после лечения LD.
Таким образом, будет понятно, что тяжесть инфекции, вызываемой Borrelia, ассоциированной с LD, можно контролировать в течение различных периодов времени, например, в течение одной или более вторых временных точек, в целях определения прогрессирования заболевания на основании уровня индикатора Т-клеточного иммунного ответа, в качестве видимого индикатора бактериальной нагрузки Borrelia у субъекта, и также в целях оценки эффективности одного или более видов лечения LD. В некоторых случаях может быть желательным повторно исследовать несколько биологических образцов, полученных от субъекта, во второй или последующих временных точках в целях контроля Borrelia-специфической Т-клеточной активности у субъекта. Соответственно в соответствии с определенными вариантами осуществления описанные в настоящем документе стадии приведения в контакт, инкубирования и выявления можно повторять любое количество раз в ситуациях, когда может быть желательным контролировать LD у субъекта в течение длительного периода времени, например, во множестве нескольких вторых временных точек, например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50 или более вторых временных точек, которые могут быть разделены друг от друга различными промежутками из нескольких дней, недель, месяцев или лет.
Таким образом, определенные варианты осуществления, описанные в настоящем документе, могут предусматривать композиции и способы, которые относятся к одному или более антибиотическим соединениям, которые, как известно из уровня техники, являются подходящими для лечения болезни Лайма, например, на основании антибиотика, имеющего эффективный профиль активности по отношению к патогенному виду Borrelia, такому как любой из Borrelia spp., упоминаемый в настоящем документе, особенно в отношении к патогенным для человека Borrelia spp. Как понятно специалисту в области медицины, термины «лечить» и «лечение» относятся к медицинскому контролю заболевания, нарушения или состояния субъекта (например, пациента, хозяина, который может быть человеком или не относящимся к человеку животным) (см., например, медицинский словарь Стедмана).
Антибиотики известны в данной области и обычно представляют собой лекарственное средство, изготовленное из соединения, вырабатываемого одним видом микроорганизма в целях уничтожения другого вида микроорганизма, или синтетического продукта, имеющего идентичную или аналогичную химическую структуру и механизм действия, например, лекарственное средство, которое разрушает микроорганизмы в или на теле живого организма, в том числе лекарственное средство при наружном применении.
nd
Антибиотики, которые известны из уровня техники в качестве подходящих для лечения болезни Лайма, могут включать без ограничения один или более из тетрациклинов; окситетрациклина, тетрациклина, доксициклина или миноциклина; пенициллинов; амоксициллина или пенициллина; цефалоспоринов; цефаклора, цефбуперазона, цефминокса, цефотаксима, цефотетана, цефметазола, фетокситина, цефуроксима аксетила, цефуроксима ацетила, цефтина или цефтриаксона; макролидов; азитроцимицина, кларитромицина или эритромицина (см., например, Cameron et al., 2014 Expert Rev Anti Infect Ther. 12(9): 1103-1135; Shapiro, 2014 N. Engl. J. Med. 370(18):1724-31; Wright et al., 2012 Am. Fam. Physician 85:1086.). Компендиумы по этим и другим клинически применимым антибиотикам доступны и известны специалистам в данной области (например, медицинский университет Вашингтонского университета, The Washington Manual of Medical Therapeutics (32 Ed.), 2007 Lippincott, Williams and Wilkins, Филадельфия, Пенсильвания; Hauser, AL, Antibiotic Basics for Clinicians, 2007 Lippincott, Williams and Wilkins, Филадельфия, Пенсильвания).
Для применения в способах, описанных в настоящем документе, биологический образец может быть получен от субъекта для определения наличия и уровня индикатора Т-клеточного иммунного ответа, как раскрыто в настоящем документе. Подходящий биологический образец может представлять собой, например, образец цельной крови или образец спинномозговой жидкости или образец синовиальной жидкости, любой из которых может быть получен от субъекта (например, субъекта-человека или субъекта-животного, в соответствии с предпочтительными вариантами осуществления человека), имеющего болезнь Лайма или предположительно подверженного риску таковой, такого как пациент, который перенес укус клеща или который представляет клинически мигрирующую эритему или который иным образом имеет один или более факторов риска болезни Лайма, как будет понятно специалистам в данной области (см., например, Shapiro, 2014 N. Engl. J. Med. 370:1724; Wright et al., 2012 Am. Fam. Physician 85:1086). В соответствии с определенными вариантами осуществления биологический образец может содержать по меньшей мере одно из цельной крови (необязательно с антикоагулянтом), или клеточной фракции цельной крови, или выделенных лейкоцитов периферической крови или выделенных мононуклеарных клеток периферической крови. Биологические образцы могут быть получены от субъекта в первой временной точке, которая находится перед введением субъекту лечения LD, при этом биологический образец можно применять в диагностических целях и/или в качестве контроля для установления данных исходного уровня (например, до терапии); дополнительные биологические образцы могут быть получены от субъекта в одной или более из вторичных временных точек, которые находятся после введения субъекту лечения LD.
Выявление индикаторов Т-клеточного иммунного ответа
In vitro антиген-специфические Т-клеточные ответы обычно определяют в результате сравнений наблюдаемых Т-клеточных ответов в соответствии с любым числом описанных подлежащих измерению параметров функционирования Т-клеток (например, пролиферации, экспрессии цитокинов, биосинтеза цитокинов, высвобождения цитокинов, измененного фенотипа маркеров клеточной поверхности и др.), которые могут быть получены между Т-клетками, которые подвержены воздействию когнатного антигена в соответствующем контексте (например, антигена, используемого для примирования или активации Т-клеток при представлении иммуносовместимыми антиген-представляющими клетками), и Т-клетками из той же самой исходной популяции, которые подвержены вместо этого воздействию структурно отличающегося или иррелевантного контрольного антигена. Ответ на когнатный антиген, который является большим, со статистической значимостью, чем ответ на контрольный антиген, означает специфичность антигена.
Уровень вторичного in vitro Borrelia spp.-специфического иммунного ответа можно определять с помощью любого из многочисленных иммунных способов, описанных в настоящем документе и/или обычно осуществляемых на практике в данной области. Уровень вторичного in vitro Borrelia spp.-специфического иммунного ответа можно определять в одной или более временных точках, в том числе временных точках, которые находятся перед введением или после введения субъекту, от которого получают биологический образец, содержащий Т-клетки и антиген-представляющие клетки (например, субъекту, который имеет или предположительно имеет болезнь Лайма), любого одного или более из описанных в настоящем документе видов лечения болезни Лайма (например, одного или более антибиотиков).
Как описано в примерах, раскрываемая в настоящем документе композиция для диагностики или прогноза, содержащая пептиды, содержащие Т-клеточный эпитоп Borrelia spp. (например, один или более пептидов FlaB, DbpB, р66 и OspC под SED ID NO: 1-33 или их варианты, описанные в настоящем документе) способна стимулировать подлежащее выявлению образование индикатора Т-клеточного иммунного ответа при исследуемой инкубации in vitro с помощью биологического образца, содержащего Т-клетки и антиген-представляющие клетки от субъекта с ранней стадией инфекции, вызываемой видом Borrelia, ассоциированным с болезнью Лайма. Уровень индикатора Т-клеточного иммунного ответа, который выявляли, был повышен по отношению к контрольному уровню индикатора, который получали в результате инкубирования биологического образца при контрольной инкубации, которая в остальном была идентичной исследуемой инкубации, за исключением того, что исключали композицию на основе пептидов Borrelia spp.
Таким образом, повышенный уровень индикатора Т-клеточного иммунного ответа, как предусмотрено в настоящем документе, в соответствии с определенными вариантами осуществления может приобретать форму статистически значимого повышения уровня индикатора, который подлежит выявлению после инкубации Т-клеток и антиген-представляющих клеток с описанной в настоящем документе пептидной композицией, содержащей Т-клеточный эпитоп Borrelia (FlaB, DbpB, р66, OspC), в условиях и в течение времени, достаточных для специфического распознавания антигенов Т-клетками, по отношению к уровню индикатора, который подлежит выявлению в соответствующих контрольных условиях (например, без присутствующей композиции на основе пептидов Borrelia).
В качестве иллюстрации и без ограничения в соответствии с предпочтительными вариантами осуществления индикатор Т-клеточного иммунного ответа, который образуется в результате стимуляции Т-клеток пептидной композицией, содержащей Т-клеточный эпитоп Borrelia, представляет собой по меньшей мере один Т-клеточный цитокин, который индуцируется, экспрессируется и/или высвобождается Т-клетками после инкубации in vitro. Предпочтительно Т-клеточный цитокин выбирают из IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-10, IL-12, IL-17, TNF-α, TNF-β и IFN-γ. В соответствии с определенными вариантами осуществления высвобожденный IFN-γ представляет собой индикатор Т-клеточного иммунного ответа, который образуется в результате стимуляции Т-клеток пептидной композицией, содержащей Т-клеточный эпитоп Borrelia. Однако предусмотренные варианты осуществления не носят такого ограничивающего характера и, таким образом, могут предусматривать любой из большого разнообразия способов оценки биологического образца, как предусмотрено в настоящем документе, в отношении его способности повышать вторичный in vitro антиген-специфический ответ на описанную в настоящем документе пептидную композицию, содержащую Т-клеточный эпитоп Borrelia. Различные конфигурации и методики анализов известны из уровня техники (например, Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York, N.Y. (2009)) и могут быть адаптированы к способам настоящего изобретения по отношению к настоящему раскрытию. Таким образом, уровни цитокинов можно определить в соответствии со способами, описанными в настоящем документе и осуществляемыми на практике в данной области, в том числе, например, ELISA, ELISPOT, внутриклеточным окрашиванием цитокинов и/или проточной цитометрией.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления индикатор Т-клеточного иммунного ответа представляет собой IFN-γ, высвобождаемый Т-клетками из биологического образца во время стадии инкубирования образца с описанной в настоящем документе пептидной композицией, содержащей Т-клеточный эпитоп Borrelia, и уровень высвобождаемого IFN-γ определяется с помощью любого числа in vitro методик, с помощью которых IFN-γ выявляют в результате определения подлежащего выявлению специфического связывания связывающего средства с Т-клеточным цитокином (например, IFN-γ). Таким образом, связывающее средство может содержать по меньшей мере одно антитело, которое специфически связывается с цитокином (например, IFN-γ), при этом антитело может представлять собой по меньшей мере одно моноклональное антитело или может вместо этого представлять собой поликлональное антитело. В соответствии с определенными вариантами осуществления индикатор Т-клеточного иммунного ответа представляет собой цитокин, который высвобождается Т-клетками, и выявляется в результате связывания антитела, которое является иммобилизованным на твердой поверхности.
Иллюстративный иммунометрический анализ IFN-γ представляет собой анализ QUANTIFERON (доступен от Cellestis, Ltd., Карнеги, Виктория, Австралия), который признан в качестве золотого стандарта для определения IFN-γ в широко используемом тесте на туберкулез (например, Pai et al., 2004 Lancet Infect Dis 4:761) и из которого количественное выявление IFN-γ можно адаптировать для применения с описанными в настоящем документе антигенами Borrelia вместо антигенов возбудителя туберкулеза (см. также, например, Yun et al., 2014 J. Clin. Microbiol. 52:90; Belknap et al., 2014 Clin. Lab. Med. 34:337; Ferguson et al., 2015 Transplantation 99:1084; Ruan et al. 2014 Clin. Rheumatol. Epub PMID 25376466.)
4
-1
5
-1
6
-1
7
-1
8
-1
-4
-5
-6
-7
-8
D
D
Связывающий партнер или антитело является «иммуноспецифическим», «специфическим в отношении» или «специфически связывается» с антигеном, представляющим интерес (например, цитокином, который анализируют в качестве подлежащего выявлению индикатора Т-клеточного иммунного ответа, например, IFN-γ), если антитело реагирует при подлежащем выявлению уровне с антигеном, предпочтительно с константой аффинности, Ka, составляющей более или равной приблизительно 10 М, или составляющей более или равной приблизительно 10 М, составляющей более или равной приблизительно 10 М, составляющей более или равной приблизительно 10 М, или составляющей более или равной приблизительно 10 М. Аффинность антитела в отношении своего когнатного антигена также обычно выражается в виде константы диссоциации K, и антитело специфически связывается с антигеном, представляющим интерес, если оно связывается с K, составляющей менее или равной 10 М, составляющей менее или равной приблизительно 10 М, составляющей менее или равной приблизительно 10 М, составляющей менее или равной 10 М, или составляющей менее или равной 10 М.
Аффинности связывающих партнеров или антител можно легко определить с помощью стандартных методик, например, таковых, описанных Scatchard et al. (Ann. N.Y. Acad. Sci. USA 51:660 (1949)) и с помощью поверхностного плазмонного резонанса (SPR; BIAcore™, Biosensor, Пискатевей, Нью-Джерси). В случае поверхностного плазмонного резонанса целевые молекулы иммобилизуют на твердой поверхности и подвергают воздействию связывающего партнера (или лиганда) в подвижной фазе, передвигающегося вдоль проточной кюветы. Если происходит связывание лигандов с иммобилизованной мишенью, то изменяется локальный показатель преломления, приводя к изменению угла SPR, который можно контролировать в реальном времени с помощью выявления изменений интенсивности отражаемого света. Скорости изменения сигнала SPR можно анализировать в целях получения констант кажущейся скорости для фаз ассоциации и диссоциации реакции связывания. Соотношение этих значений дает константу кажущегося равновесия (аффинность) (см., например, Wolff et al., Cancer Res. 53:2560-2565 (1993)).
Используемый в настоящем документе термин «поликлональное антитело» обозначает антитело, полученное из популяции антиген-специфических антител, которые распознают более одного эпитопа конкретного антигена. «Антиген» или «иммуноген» обозначает пептид, липид, полисахарид или полинуклеотид, который распознается адаптивной иммунной системой. Антигены могут быть «своими» и «чужими» молекулами. Примеры антигенов включают без ограничения компоненты бактериальной клеточной стенки, пыльцу или Rh-фактор. Участок антигена, который специфически распознается специфическим антителом или специфическим Т-клеточным рецептором, представляет собой «эпитоп» или «антигенную детерминанту». Один антиген может иметь несколько эпитопов.
Термин «моноклональное антитело» (mAb), как используется в настоящем документе, обозначает антитело, получаемое из популяции фактически однородных антител, т.е., отдельные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными, за исключением возможных встречающихся в природе мутаций, которые могут присутствовать в незначительных количествах. Моноклональные антитела являются высокоспецифичными, при этом они направлены на один антигенный сайт. Кроме того, в отличие от препаратов на основе поликлональных антител, которые включают разные антитела, направленные на разные эпитопы, каждое моноклональное антитело направлено на один эпитоп антигена. Кроме своей специфичности, моноклональные антитела являются предпочтительными, потому что их можно синтезировать неконтаминированными другими антителами. Модификатор «моноклональное» не следует понимать как требующее получения антитела каким-либо конкретным способом. Например, моноклональные антитела можно получить с помощью методики гибридомы, впервые описанной Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), или можно изготовить с помощью методов рекомбинантной ДНК в бактериальных, эукариотических животных или растительных клетках (см., например, патент США №4816567). «Моноклональные антитела» можно также выделить из библиотек фаговых антител с помощью методик, описанных, например, в Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991), и Marks et al., J. Mol. Biol, 222:581-597 (1991).
Нуклеиновые кислоты и полинуклеотиды
Полипептиды и пептиды, содержащие Т-клеточный эпитоп Borrelia spp., как предусмотрено в настоящем документе, и кодирующие молекулы нуклеиновых кислот и векторы, могут быть выделены и/или очищены, например, от своего природного окружения, в фактически чистой или гомогенной форме, или в случае нуклеиновой кислоты не содержащими или фактически не содержащими нуклеиновых кислот или генов с происхождением, отличным от последовательности, кодирующей полипептид с желаемой функцией. Нуклеиновая кислота может представлять собой ДНК или РНК и может быть полностью или частично синтетической. Отсылка на нуклеотидную последовательность, изложенную в настоящем документе, охватывает молекулу ДНК с определенной последовательностью, и охватывает молекулу РНК с определенной последовательностью, в которой U заменено на Т, если контекст не требует иного.
Таким образом, настоящее изобретение дополнительно предусматривает в соответствии с определенными вариантами осуществления выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую любой из пептидов, содержащих Т-клеточный эпитоп Borrelia spp., имеющий аминокислотные последовательности, изложенные в SEQ ID NO: 1-33.
Термин «функционально связанный» означает, что компоненты, по отношению к которым термин применяется, находятся в связи, которая способствует тому, что они выполняют свойственные им функции в подходящих условиях. Например, последовательность контроля транскрипции «функционально связана» с кодирующей белок последовательностью, лигирована с ней таким образом, что экспрессия кодирующей белок последовательности достигается в условиях, совместимых с транскрипционной активностью контрольных последовательностей.
Термин «последовательность контроля», используемый в настоящем документе, обозначает полинуклеотидные последовательности, которые могут влиять на экспрессию, процессинг или внутриклеточную локализацию кодирующих последовательностей, с которыми они лигированы или функционально связаны. Природа таких последовательностей контроля может зависеть от организма-хозяина. В соответствии с определенными вариантами осуществления последовательности контроля в случае прокариот могут включать промотор, сайт связывания рибосом и последовательность терминации транскрипции. В соответствии с другими вариантами осуществления последовательности контроля транскрипции в случае эукариот могут включать промоторы, содержащие один или более сайтов распознавания факторов транскрипции, энхансерные последовательности транскрипции, последовательности терминации транскрипции и последовательности полиаденилирования. В соответствии с определенными последовательностями «последовательности контроля» могут включать лидерные последовательности и/или последовательности партнеров по слиянию.
Термин «полинуклеотид», упоминаемый в настоящем документе, означает полимеры однонитевых или двунитевых нуклеиновых кислот. В соответствии с определенными вариантами осуществления нуклеотиды, составляющие полинуклеотид, могут представлять собой рибонуклеотиды или дезоксирибонуклеотиды или модифицированную форму любого типа нуклеотида. Такие модификации могут включать модификации оснований, такие как бромуридин, модификации рибозы, такие как арабинозид и 2',3'-дидезоксирибоза, и модификации межнуклеотидных связей, такие как фосфотиоат, фосфодитиоат, фосфоселеноат, фосфодиселеноат, фосфоанилотиоат, фосфоаниладат и фосфоамидат. Термин «полинуклеотид» специфически включает однонитевые и двунитевые формы ДНК.
Термин «встречающиеся в природе нуклеотиды» включает дезоксирибонуклеотиды и рибонуклеотиды. Термин «модифицированные нуклеотиды» включает нуклеотиды с модифицированными или замещенными группами сахара и т.п. Термин «олигонуклеотидные связи» включает олигонуклеотидные связи, такие как фосфотиоат, фосфодитиоат, фосфоселеноат, фосфодиселеноат, фосфоанилотиоат, фосфоаниладат и фосфоамидат и т.п. См., например, LaPlanche et al., 1986, Nucl. Acids Res., 14:9081; Stec et al., 1984, J. Am. Chem. Soc, 106:6077; Stein et al., 1988, Nucl. Acids Res., 16:3209; Zon et al., 1991, Anti-Cancer Drug Design, 6:539; Zon et al., 1991, Olignonucleotdies and Analogues: A Practical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed.), Oxford University Press, Oxford England; Stec et al., патент США №5151510; Uhlmann and Peyman, 1990, Chemical Reviews, 90:543, раскрытия которых тем самым включены посредством ссылки для любой цели. Олигонуклеотид может включать подлежащую выявлению метку в целях обеспечения выявления олигонуклеотида или его гибридизации.
Термин «вектор» применяется для обозначения любой молекулы (например, нуклеиновой кислоты, плазмиды или вируса), используемой для переноса кодирующей информации клетке-хозяину. Термин «вектор экспрессии» обозначает вектор, который является подходящим для трансформации клетки-хозяина и содержит последовательности нуклеиновой кислоты, которые направляют и/или контролируют экспрессию вставленных гетерологичных последовательностей нуклеиновой кислоты. Экспрессия включает без ограничения процессы, такие как транскрипция, трансляция и сплайсинг РНК, в случае, если присутствуют интроны.
Как будет понятно специалистам в данной области полинуклеотиды могут включать геномные последовательности, внегеномные и кодирующие плазмиды последовательности и более мелкие разработанные генные последовательности, которые экспрессируют белки, полипептиды, пептиды и т.п. или могут быть адаптированы для экспрессии таковых. Такие сегменты могут быть выделены естественным путем или модифицированы синтетически опытным специалистом.
Как также будет понятно специалисту в данной области, полинуклеотиды могут быть однонитевыми (кодирующими или антисмысловыми) или двунитевыми, и могут представлять собой молекулы ДНК (геномную, кДНК или синтетическую) или РНК. Молекулы РНК могут включать молекулы HnRNA, которые содержат интроны и взаимнооднозначно соответствуют молекуле ДНК, и молекулы мРНК, которые не содержат интроны. Дополнительные кодирующие или некодирующие последовательности могут, но не обязательно должны присутствовать в полинуклеотиде в соответствии с настоящим раскрытием и полинуклеотид может, но не обязательно должен быть связан с другими молекулами и/или вспомогательными материалами. Полинуклеотиды могут представлять собой нативную последовательность или могут представлять собой последовательность, которая кодирует вариант или производное такой последовательности.
Таким образом, в соответствии с этими и связанными вариантами осуществления настоящее раскрытие также предусматривает последовательности, кодирующие пептиды, содержащие Т-клеточный эпитоп Borrelia spp., описанные в настоящем документе. В соответствии с определенными вариантами осуществления предусмотрены полинуклеотиды, которые содержат некоторую часть или все из полинуклеотидной последовательности, кодирующей пептид, как описано в настоящем документе, и комплементы таких полинуклеотидов.
В соответствии с другими связанными вариантами осуществления варианты полинуклеотидов могут быть в значительной степени идентичными полинуклеотидной последовательности, кодирующей пептид, содержащий Т-клеточный эпитоп Borrelia spp., описанный в настоящем документе. Например, полинуклеотид может представлять собой полинуклеотид, идентичный на по меньшей мере 80% последовательности, предпочтительно идентичный на по меньшей мере 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% последовательности или выше, по отношению к эталонной нуклеотидной последовательности, такой как последовательность, кодирующая пептид, содержащий Т-клеточный эпитоп Borrelia spp., описанный в настоящем документе (например, пептид, имеющий одну из SEQ ID NO: 1-33 в качестве своей аминокислотной последовательности), с помощью способов, описанных в настоящем документе (например, анализ BLAST с применением стандартных параметров, как описано ниже). Специалисту в данной области будет понятно, что эти значения можно соответствующим образом скорректировать для определения соответствующей идентичности полипептидов или пептидов, кодируемых двумя нуклеотидными последовательностями, учитывая вырожденность кода, сходство аминокислот, расположение рамки считывания и т.п.
В соответствии с другим вариантом осуществления предусмотрены полинуклеотиды, которые способны к гибридизации в умеренных или строгих условиях с полинуклеотидной последовательностью, кодирующей пептид, содержащий Т-клеточный эпитоп Borrelia spp. или, его вариант, предусмотренный в настоящем документе, или его фрагмент, или его комплементарную последовательность. Методики гибридизации хорошо известны в области молекулярной биологии. В целях иллюстрации подходящие умеренно строгие условия исследования гибридизации полинуклеотида, предусмотренные в настоящем документе, с другими полинуклеотидами, включают предварительное промывание в растворе 5 × SSC, 0,5% SDS, 1,0 мМ EDTA (рН 8,0); гибридизацию при 50°С-60°С, 5 × SSC в течение ночи; последующее промывание дважды при 65°С в течение 20 минут каждым из 2×, 0,5× и 0,2× раствором SSC, содержащим 0,1% SDS. Специалист в данной области легко поймет, что строгость гибридизации можно легко регулировать, например, с помощью изменения содержания соли раствора для гибридизации и/или температуры, при которой гибридизация выполняется. Например, в соответствии с другим вариантом осуществления подходящие очень строгие условия гибридизации включают таковые, описанные выше, за исключением того, что температура гибридизации повышается, например, до 60°С-65°С или 65°С-70°С.
Как также описано в других разделах настоящего документа, определение пространственных структур типичных пептидов, содержащих Т-клеточный эпитоп Borrelia spp. (например, SEQ ID NO: 1-33 или их вариантов, предусмотренных в настоящем документе), можно выполнить с помощью стандартных способов, таких как замена, добавление, делеция или вставка одной или более аминокислот, при этом некоторые природные или не встречающиеся в природе аминокислоты можно виртуально моделировать в целях определения того, сохраняет ли производный структурный вариант пространственные свойства раскрываемых в настоящем документе молекул. Ряд компьютерных программ известны специалистам в данной области для определения соответствующих аминокислотных замен (или соответствующих полинуклеотидов, кодирующих аминокислотную последовательность) в пептиде, таким образом, что, например, сохраняется распознавание Borrelia-специфических Т-клеток.
Полинуклеотиды, описанные в настоящем документе, или их фрагменты, независимо от длины самой кодирующей последовательности, можно комбинировать с другими последовательностями ДНК, такими как промоторы, сигналы полиаденилирования, дополнительные сайты рестрикционных ферментов, сайты множественного клонирования, другие кодирующие последовательности и т.п., таким образом, что их суммарная длина может значительно варьировать. Таким образом, предполагается, что можно использовать фрагмент нуклеиновой кислоты почти любой длины, при этом суммарная длина предпочтительно ограничена легкостью получения и применения в протоколе предполагаемой рекомбинантной ДНК в целях получения раскрываемых в настоящем документе пептидов, содержащих Т-клеточные эпитопы Borrelia. Например, предполагается, что иллюстративные полинуклеотидные фрагменты с суммарными длинами, составляющими приблизительно 10000, приблизительно 5000, приблизительно 3000, приблизительно 2000, приблизительно 1000, приблизительно 500, приблизительно 200, приблизительно 100, приблизительно 50 пар оснований в длину и т.п. (в том числе все промежуточные длины), являются применимыми.
При сравнении полинуклеотидных последовательностей две последовательности являются «идентичными», если последовательность из нуклеотидов в этих двух последовательностях является одинаковой при выравнивании в целях максимального соответствия, как описано ниже. Сравнения двух последовательностей обычно выполняют с помощью сравнения последовательностей в окне сравнения в целях выявления и сравнения локальных участков сходства последовательностей. «Окно сравнения», как используется в настоящем документе, обозначает сегмент, состоящий из по меньшей мере приблизительно 20 смежных положений, обычно от 30 до приблизительно 75, от 40 до приблизительно 50, в котором последовательность можно сравнивать с эталонной последовательностью из того же числа смежных положений после того, как две последовательности оптимально выравнены.
Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения можно выполнять с помощью программы Megalign в комплекте программного обеспечения по биоинформатике (DNASTAR, Inc., Мадисон, Висконсин) с применением параметров по умолчанию. Эта программа включает в себя несколько схем выравнивания, описанных в следующих источниках литературы: Dayhoff, М.О. (1978) A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships. В Dayhoff, M.O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345-358; Hein J., Unified Approach to Alignment and Phylogenes, pp. 626-645 (1990); Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D.G. and Sharp, P.M., CABIOS 5:151-153 (1989); Myers, E.W. and Muller W., CABIOS 4:11-17 (1988); Robinson, E.D., Comb. Theor 77:105 (1971); Santou, N. Nes, M., Mot. Biol. Evol. 4:406-425 (1987); Sneath, P.H.A. and Sokal, R.R., Numerical Taxonomy - the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA (1973); Wilbur, W.J. and Lipman, D.J., Proc. Natl. Acad, Sci. USA 80:726-730 (1983).
Альтернативно оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения можно выполнить с помощью локального алгоритма идентичности Smith and Waterman, Add. APL. Math 2:482 (1981), с помощью локального алгоритма идентичности Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), с помощью способов поиска сходства Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988), с помощью компьютеризированных внедрений этих алгоритмов (GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA и TFASTA в Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Мадисон, Висконсин) или с помощью проверки.
Одним предпочтительным примером алгоритмов, которые являются подходящими для определения процентной идентичности последовательностей и сходства последовательностей, являются алгоритмы BLAST и BLAST 2.0, которые описаны в Altschul et al, Nucl. Acids Res. 25:3389-3402 (1977), и Altschul et al, J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990) соответственно. BLAST и BLAST 2.0 можно применять, например, с параметрами, описанными в настоящем документе, для определения процентной идентичности последовательностей среди двух или более полинуклеотидов. Программное обеспечение для проведения анализов BLAST общедоступно благодаря Национальному центру биотехнологической информации. В одном иллюстративном примере можно рассчитать совокупные баллы с применением, в случае нуклеотидных последовательностей, параметров М (поощрительный балл для пары совпадающих остатков; всегда >0) и N (штрафной балл для несовпадающих остатков; всегда <0). Продление совпадений «слов» в каждом направлении прекращается, когда совокупный показатель выравнивания снижается на величину X от его максимального достигнутого значения, при этом совокупный показатель падает до нуля или ниже в результате накопления одного или более выравниваний остатков с отрицательными показателями, либо в случае достижения конца одной из последовательностей. Параметры алгоритма BLAST W, Т и X определяют чувствительность и скорость выравнивания. Программа BLASTN (в случае нуклеотидных последовательностей) применяет по умолчанию длину «слова» (W), составляющую 11, и среднее значение (Е), составляющее 10, а также выравнивания матрицы замен BLOSUM62 (см. Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)), (В), составляющее 50, среднее значение (Е), составляющее 10, М=5, N=-4 и сравнение обоих нитей.
В соответствии с определенными вариантами осуществления «процент идентичности последовательностей» определяют с помощью сравнения двух оптимально выравненных последовательностей в окне сравнения, состоящем из по меньшей мере 20 положений, где часть полинуклеотидной последовательности в окне сравнения может содержать добавления или делеции (т.е., гэпы) на 20 процентов или менее, обычно на 5-15 процентов или 10-12 процентов, по сравнению с эталонной последовательностью (которая не содержит добавления или делеции) в целях оптимального выравнивания этих двух последовательностей. Процент рассчитывается с помощью определения числа положений, в которых встречаются идентичные основания нуклеиновой кислоты в обеих последовательностях, с получением числа совпадающих положений, разделяя число совпадающих положений на суммарное число положений в эталонной последовательности (т.е., размере окна) и умножая результаты на 100 с получением процента идентичности последовательностей.
Специалистам в данной области будет понятно, что в результате вырожденности генетического кода существует много нуклеотидных последовательностей, которые кодируют пептид, содержащий Т-клеточный эпитоп Borrelia spp., описанный в настоящем документе. Некоторые из этих полинуклеотид о в разделяют минимальную идентичность последовательностей с нуклеотидной последовательностью нативной или исходной полинуклеотидной последовательности, которая кодирует пептиды, содержащие Т-клеточный эпитоп Borrelia spp., описанные в настоящем документе. При этом полинуклеотиды, которые различаются благодаря различиям в использовании кодонов, явным образом предусмотрены настоящим раскрытием. В соответствии с определенными вариантами осуществления специально предусмотрены последовательности, которые были кодон-оптимизированы для экспрессии у млекопитающих.
Таким образом, в соответствии с другим вариантом осуществления настоящего изобретения подход на основе мутагенеза, такого как сайт-специфический мутагенез, можно применять для получения различных вариантов и/или производных пептидов, содержащих Т-клеточный эпитоп Borrelia, описанных в настоящем документе. На основании этого подхода конкретные модификации в полипептидной последовательности можно выполнить в процессе мутагенеза лежащих в основе полинуклеотидов, которые кодируют их. Эти методики обеспечивают эффективный подход к получению и исследованию вариантов последовательностей, например, включающих один или более из вышеизложенных аспектов, с помощью введения одного или более изменений нуклеотидных последовательностей в полинуклеотид.
Сайт-специфический мутагенез обеспечивает получение мутантов в результате применения специфических олигонуклеотидных последовательностей, которые кодируют последовательность ДНК желаемой мутации, а также достаточное число смежных нуклеотидов, в целях получения праймерной последовательности достаточного размера и сложности последовательности для образования стабильного дуплекса на обеих сторонах соединения делеции, подлежащей перемещению. Мутации можно применять в определенной полинуклеотид ной последовательности для улучшения, изменения, снижения, модификации или иного изменения свойств самого полинуклеотида, и/или изменения свойств, активности, состава, стабильности или первичной последовательности кодируемого полипептида.
В соответствии с определенными связанными вариантами осуществления предусмотрена рекомбинантная клетка-хозяин, которая содержит одну или более конструкций, описанных в настоящем документе; нуклеиновая кислота, кодирующая пептид, содержащий Т-клеточный эпитоп Borrelia spp., или его вариант; и способ получения кодируемого продукта, при этом способ предусматривает экспрессию кодирующей его нуклеиновой кислоты. Экспрессию можно легко достичь с помощью культивирования в соответствующих условиях рекомбинантных клеток-хозяев, содержащих нуклеиновую кислоту. После получения экспрессии пептид, содержащий Т-клеточный эпитоп Borrelia spp., можно выделить и/или очистить с помощью любой подходящей методики и затем применять, при необходимости.
Системы клонирования и экспрессии полипептида в ряде клеток-хозяев являются хорошо известными. Подходящие клетки-хозяева включают бактерий, клетки млекопитающих, системы дрожжей и бакуловирусные системы. Клеточные линии млекопитающих, доступные в данной области для экспрессии гетерологичного пептида, включают клетки яичника китайского хомяка, клетки HeLa, клетки почки новорожденного хомяка, клетки меланомы мыши NSO и многие другие. Распространенным предпочтительным бактериальным хозяином является Е. coli. Рекомбинантная экспрессия пептидов в прокариотических клетках, таких как Е. coli, является общепризнанной в данной области, также как и экспрессия в эукариотических клетках в культуре.
Можно выбрать или сконструировать подходящие векторы, содержащие соответствующие регуляторные последовательности, в том числе промоторные последовательности, терминаторные последовательности, последовательности полиаденилирования, энхансерные последовательности, маркерные гены и другие последовательности, при необходимости. Векторы могут представлять собой плазмиды, вирусные, например, фаговые, или фагмидные, при необходимости. Для более подробной информации см., например, Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 4th edition, Green and Sambrook, 2012, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. Многие известные методики и протоколы для работы с нуклеиновой кислотой, например, при получении конструкций на основе нуклеиновой кислоты, мутагенезе, секвенировании, введении ДНК в клетки и экспрессии генов, а также анализе белков, подробно описаны в Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, NY, 2015, или последующих обновленных редакциям к ним.
Термин «клетка-хозяин» используется для обозначения клетки, в которую была введена или которая способна к тому, чтобы в нее ввести последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую один или более из описанных в настоящем документе пептидов, содержащих Т-клеточный эпитоп Borrelia, и которая дополнительно экспрессирует или способна экспрессировать определенный ген, представляющий интерес, такой как ген, кодирующий любой описанный в настоящем документе пептид, содержащий Т-клеточный эпитоп Borrelia. Термин включает потомство родительской клетки, независимо от того, является ли потомство идентичным по морфологии или организации генома исходному родителю, при условии, что определенный ген присутствует. Соответственно, также предусмотрен способ, предусматривающий введение такой нуклеиновой кислоты в клетку-хозяина. Введение может предусматривать любую доступную методику. В случае эукариотических клеток подходящие методики могут включать трансфекцию с помощью фосфата кальция, трансфекцию с помощью DEAE-декстрана, электропорацию, трансфекцию, опосредованную липосомами, и трансдукцию с помощью ретровируса или другого вируса, например, вируса осповакцины, или в случае клеток насекомых бакуловируса. В случае бактериальных клеток подходящие методики могут включать трансформацию с использованием хлорида кальция, электропорацию и трансфекцию с помощью бактериофага. Введение может сопровождаться инициацией или обеспечением экспрессии со стороны нуклеиновой кислоты, например, при культивировании клеток-хозяев в условиях экспрессии гена. В соответствии с одним вариантом осуществления нуклеиновую кислоту интегрируют в геном (например, хромосому) клетки-хозяина. Интеграцию можно активировать с помощью включения последовательностей, которые активируют рекомбинацию с геномом, в соответствии со стандартными методиками.
Настоящее изобретение также предусматривает в соответствии с определенными вариантами осуществления способ, который предусматривает применение конструкции, как указано выше, в системе экспрессии в целях экспрессии определенного полипептида, такого как пептид, содержащий Т-клеточный эпитоп Borrelia spp., описанный в настоящем документе. Термин «трансдукция» применяется для обозначения переноса генов от одной бактерии к другой, обычно с помощью фага. «Трансдукция» также обозначает получение и перенос последовательностей эукариотических клеток ретровирусами. Термин «трансфекция» применяется для обозначения захвата чужеродной или экзогенной ДНК клеткой, и клетку «трансфицировали», если экзогенную ДНК ввели внутрь клеточной мембраны. Несколько методик трансфекции хорошо известны в данной области и раскрыты в настоящем документе. См., например, Green and Sambrook, Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 4th edition, 2012, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, NY, 2015, или последующие обновленные редакции к ним. Такие методики можно применять для введения одного или более экзогенных фрагментов ДНК в подходящие клетки-хозяева.
Термин «трансформация», как используется в данном документе, обозначает изменение генетических характеристик клетки, и клетку трансформировали, если ее модифицировали с целью содержания новой ДНК. Например, клетку трансформируют, если ее генетически модифицируют из ее нативного состояния. После трансфекции или трансдукции трансформирующая ДНК может рекомбинировать с таковой клетки с помощью физической интеграции в хромосому клетки или может сохраняться временно в качестве эписомального элемента без репликации или может реплицироваться независимо в качестве плазмиды. Считается, что клетка является стабильно трансформированной, если ДНК реплицируется с делением клетки. Термин «встречающийся в природе» или «нативный» при использовании в связи с биологическими материалами, такими как молекулы нуклеиновой кислоты, полипептиды, клетки-хозяева и т.п., означает материалы, которые встречаются в природе и не обрабатываются человеком. Аналогично «не встречающийся в природе» или «ненативный», как используется в настоящем документе, обозначает материал, который не встречается в природе или который структурно не модифицирован или не синтезирован человеком.
rd
Будет понятно, что при практическом осуществлении некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения будут применяться, если конкретно не указано противоположное, стандартные способы вирусологии, иммунологии, молекулярной биологии и методики рекомбинантной ДНК, которые находятся в пределах компетенции специалиста в данной области, и многие из которых описаны ниже в целях иллюстрации. Такие методики в полном объеме объясняются в литературе. См., например, Green and Sambrook, Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 4th edition, 2012, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, NY, 2015; Current Protocols in Molecular Biology or Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York, NY (2009); Ausubel et al, Short Protocols in Molecular Biology, 3 ed., Wiley & Sons, 1995; Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd Edition, 2001); Maniatis et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds., 1985); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, eds., 1984); Animal Cell Culture (R. Freshney, ed., 1986); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984) и другие аналогичные источники литературы.
Каждый вариант осуществления, описанный в настоящем описании, применим, с необходимыми изменениями, по отношению ко всем остальным вариантам осуществления, если явно не указано иное.
rd
Стандартные методики можно применять для биохимических, иммунохимических и иммунологических анализов, рекомбинантной ДНК, синтеза олигонуклеотидов, культуры клеток и тканей микроорганизмов и млекопитающих и трансформации (например, электропорации, липофекции). Ферментативные реакции и методики очистки можно выполнять в соответствии с описаниями производителей или как обычно выполняют в данной области или как описано в настоящем документе. Эти и связанные методики и процедуры можно в целом выполнять в соответствии со стандартными способами, хорошо известными в данной области, и как описано в различных общих и более конкретных источниках литературы в микробиологических методиках, методиках молекулярной биологии, биохимических, молекулярно-генетических методиках, методиках клеточной биологии, вирусологических и иммунологических методиках, которые упоминаются и обсуждаются в настоящем описании. См., например, Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, updated July 2008); Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience; Glover, DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (IRL Press, Oxford Univ. Press USA, 1985); Current Protocols in Immunology (под редакцией John E. Coligan, Ada M. Kruisbeek, David H. Margulies, Ethan M. Shevach, Warren Strober 2001 John Wiley & Sons, NY, NY); Real-Time PCR: Current Technology and Applications, Edited by Julie Logan, Kirstin Edwards and Nick Saunders, 2009, Caister Academic Press, Norfolk, UK; Anand, Techniques for the Analysis of Complex Genomes, (Academic Press, New York, 1992); Guthrie and Fink, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology (Academic Press, New York, 1991); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, Ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, Eds., 1985); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, Eds., 1984); Animal Cell Culture (R. Freshney, Ed., 1986); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); Next-Generation Genome Sequencing (Janitz, 2008 Wiley-VCH); PCR Protocols (Methods in Molecular Biology) (Park, Ed., 3 Edition, 2010 Humana Press); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); трактат Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M.P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Harlow and Lane, Antibodies, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1998); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, тома I-IV (D. M. Weir and C.C. Blackwell, eds., 1986); Riott, Essential Immunology, 6-е издание (Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1988); Embryonic Stem Cells: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology) (Kurstad Turksen, Ed., 2002); Embryonic Stem Cell Protocols: Volume I: Isolation and Characterization (Methods in Molecular Biology) (Kurstad Turksen, Ed., 2006); Embryonic Stem Cell Protocols: Volume II: Differentiation Models (Methods in Molecular Biology) (Kurstad Turksen, Ed., 2006); Human Embryonic Stem Cell Protocols (Methods in Molecular Biology) (Kursad Turksen Ed., 2006); Mesenchymal Stem Cells: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology) (Darwin J. Prockop, Donald G. Phinney, and Bruce A. Bunnell Eds., 2008); Hematopoietic Stem Cell Protocols (Methods in Molecular Medicine) (Christopher A. Klug, and Craig T. Jordan Eds., 2001); Hematopoietic Stem Cell Protocols (Methods in Molecular Biology) (Kevin D. Bunting Ed., 2008) Neural Stem Cells: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology) (Leslie P. Weiner Ed., 2008).
Если не предусмотрены конкретные определения, номенклатура, используемая в связи с молекулярной биологией, аналитической химией, синтетической органической химией и медицинской и фармацевтической химией и лабораторные процедуры и методики таковых, описанные в настоящем документе, хорошо известны и широко распространены в данной области. Стандартные методики можно применять для рекомбинантной технологии, молекулярно-биологического, микробиологического, химического синтеза, химического анализа, фармацевтического получения, составления и доставки, а также лечения пациентов.
Если контекст не требует иного, в настоящем описании и формуле изобретения слово «содержать» и его вариации, такие как «содержит» и «содержащий», подразумевают открытый, инклюзивный смысл, то есть, «в том числе без ограничения». Под словом «состоящий из» подразумевают включающий и обычно ограниченный всем тем, что следует за фразой «состоящий из». Под словом «состоящий фактически из» подразумевают включающий любые элементы, перечисляемые после фразы, и ограниченный другими элементами, которые не нарушают или не влияют на активность иди действие, описанное в настоящем раскрытии в случае перечисляемых элементов. Таким образом, фраза «состоящий фактически из» означает, что перечисленные элементы требуются или необходимы, однако никакие другие элементы не требуются и они могут присутствовать или могут не присутствовать в зависимости от того, влияют ли или не влияют ли они на активность или действие перечисляемых элементов.
В настоящем описании и прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа включают отсылки к множественным числам, если содержание явно не диктует иное. Используемый в данном документе в соответствии с определенными вариантами осуществления термин «приблизительно» или «примерно», когда предшествует числовому значению, указывает на значение плюс или минус диапазон, составляющий 5%, 6%, 7%, 8% или 9%. В соответствии с другими вариантами осуществления термин «приблизительно» или «примерно», когда предшествует числовому значению, указывает на значение плюс или минус диапазон, составляющий 10%, 11%, 12%, 13% или 14%. В соответствии с еще одними вариантами осуществления термин «приблизительно» или «примерно», когда предшествует числовому значению, указывает на значение плюс или минус диапазон, составляющий 15%, 16%, 17%, 18%, 19% или 20%.
Отсылка в настоящем описании на «один вариант осуществления» или «вариант осуществления» или «аспект» означает, что определенное свойство, структура или характеристика, описанная в связи с вариантом осуществления, включена в по меньшей мере один вариант осуществления настоящего изобретения. Таким образом, появление фраз «в соответствии с одним вариантом осуществления» или «в соответствии с вариантом осуществления» в различных местах в настоящем описании не обязательно во всех случаях означает один и тот же вариант осуществления. Кроме того, определенные свойства, структуры или характеристики можно комбинировать любым подходящим образом в одном или более вариантах осуществления.
ПРИМЕРЫ
Пример 1. Выявление болезни Лайма и контроль эффективности лечения с помощью вторичного in vitro Т-клеточного ответа на композицию искусственных пептидов
В настоящем примере описывали оценку способности конкретных пептидов, происходящих из участков отдельных белков Borrelia spp. и содержащихся в мультипептидном коктейле, индуцировать выработку интерферона-γ in vitro активированными Т-клетками, полученными от пациентов с LD. В частности, коктейль, состоящий из Borrelia spp.-специфических пептидов, исследовали в отношении его способности индуцировать высвобождение интерферона-γ in vitro специфическими для болезни Лайма активированными Т-клетками в образцах крови, полученных от пациентов с очень ранними стадиями инфекций, вызываемых В. burgdorferi. Уровни выработки in vitro интерферона-γ также определяли с помощью Т-клеток, собранных в первой временной точке от пациентов с LD непосредственно перед антибиотикотерапией, и повторно с помощью Т-клеток, собранных во второй временной точке, которая наступала примерно через 60 дней после того, как пациентов эффективно лечили антибиотиками.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Отбор и получение специфических для болезни Лайма белковых пептидов. Флагеллин (FlaB), декорин-связывающий белок (DbpB), общий антиген (р66) и белок наружной поверхности С (OspC) Borrelia экспрессируются в большом количестве на поверхности Borrelia spp. в различные моменты времени во время инфекции млекопитающих. В частности, FlaB является основным филаментным белком жгутиков, который заметным образом экспрессируется во время поздних диссеминированных и ранних локальных стадий инфекции. DbpB представляет собой адгезии, который активируется во время питания клеща и/или вскоре после передачи и появляется во время ранней диссеминированной стадии инфекции, и р66 представляет собой интегрин-связывающий белок, который способствует прикреплению бактерий к иммунным клеткам и экспрессируется после диссеминации инфекции. Кроме того, экспрессия OspC возникает во время ранней локальной стадии и считается необходимой для установления инфекции у млекопитающих, а OspC-специфические антитела являются преобладающими во время ранней стадии LD у человека. Каждый из FlaB, DbpB, р66 и OspC Borrelia spp. использовали достоверно для выявления антител, вырабатываемых в ответ на инфекцию спирохетами, вызывающими LD.
Коктейль из пептидов, состоящий из Borrelia-специфических пептидных участков, выбранных изнутри каждого из таких белков Borrelia (таблицы 2-3), оценивали в целях активации Т-клеток в образцах периферической крови, полученных от пациентов с LD вскоре после заражения спирохетами, вызывающими болезнь Лайма. В целях повышения специфичности пептидной композиции для потенциальной стимуляции LD-релевалентных Т-клеток, полные последовательности белков вначале анализировали с помощью алгоритма BLAST с идентификацией соответствующих. Borrelia-специфических участков (таблица 4). Затем синтетические пептиды синтезировали из специфических участков в каждом белке; каждый пептид составлял примерно 15-25 аминокислот в длину с перекрывающимися 10-15 аминоконцами (таблица 3).
Набор пациентов. Пациентам с предположительной ранней стадией болезни Лайма, характеризующейся воздействием клеща и последующим развитием кожного поражения с характеристиками, соответствующими мигрирующей эритеме (ЕМ), впоследствии предлагали принять участие в исследовании для подтверждения концепции. Информированное согласие получали от каждого добровольца, и каждый субъект имел предположительный диагноз болезни Лайма, который требовал лечения 100 мг доксициклина дважды в день в течение как минимум 10 дней, за исключением одного субъекта (№6), которого лечили в течение лишь одного дня.
Сбор и обработка образцов крови. Во время визитов, предшествующих лечению (исходное представление), и визитов через 60 дней после окончания лечения образцы крови собирали в гепаринизированные (литий-гепарин) пробирки и незамедлительно обрабатывали. Кровь в одной пробирке центрифугировали для отделения плазмы и отделенную плазму удаляли и хранили при -80°С до исследования. Отдельный объем крови на один миллилитр также переносили незамедлительно в стерильную не содержащую пирогенов пробирку (Cellestis Ltd, Карнеги, Виктория, Австралия), в которую предварительно загружали 10 мкл объем набора из 33 пептидов Borrelia [SEQ ID NO: 1-33], показанных в таблице 3 (1 мкг каждого пептида). Кроме того, отдельные объемы крови на один миллилитр добавляли в отдельные пробирки, которые не содержали пептида (нулевые) или в которые предварительно загружали митогенный контроль. Содержимое каждой пробирки затем тщательно смешивали и инкубировали при 37°С в течение 18-24 часов.
а
Выявление интерферона-γ. После инкубации плазму крови собирали после центрифугирования при 3000 × g в течение 15 минут с удалением клеток, а уровень интерферона-γ в плазме количественно определяли иммунохимически с помощью набора QuantiFERON-TB Gold ELISA (Cellestis Ltd) в соответствии с инструкциями производителя. Анализ QuantiFERON широко известен для исследования образцов крови от пациентов с туберкулезом (ТВ) для подтверждения инфекции, вызываемой Mycobacterium tuberculosis, в результате выявления IFN-γ, вырабатываемого вторичными in vitro активированными Т-клетками, полученными после того, как Т-клетки стимулировали в результате воздействия специфических пептидов Mycobacterium spp. В настоящем документе платформу QuantiFERON адаптировали также для выявления IFN-γ, вырабатываемого Т-клетками, активированными в ответ на инфекцию, вызываемую В. burgdorferi вместо М. tuberculosis. Перед оценкой образцов плазмы значимую пороговую величину реактивности сначала определяли с помощью исследования сывороток от восьми субъектов-добровольцев, не имеющих ранее в анамнезе или предположительно не имеющих болезни Лайма. Кровь собирали с помощью венопункции в пробирки с активатором свертывания и сыворотку удаляли и исследовали незамедлительно. Затем рассчитывали среднее из полученных значений и величины OD≥2 стандартных отклонений по отношению к среднему значению (≥0,452) считали значимыми ("").
а
Серодиагностическое подтверждение LD. Попарные (перед лечением и после лечения от одного и того же субъекта) образцы плазмы также исследовали на наличие антител к С6 и реактивность на основании вестерн-блоттинга. Антитела к С6 выявляли с помощью ELISA, как описано ранее (Jobe et al., 2008). Значительно повышалась точность диагностики болезни Лайма с помощью пептидного твердофазного иммуноферментного анализа на основании эпитопа боррелиацидного антитела Borrelia burgdorferi OspC (Clin Vacc Immunol 15:981-985). Перед оценкой значимые пороговые величины реактивности определяли с помощью исследования 15 хорошо описанных сывороток от субъектов-добровольцев с отсутствием в анамнезе или предположительно с отсутствием LD. Кровь собирали с помощью венопункции в пробирки с активатором свертывания и сыворотку удаляли и исследовали незамедлительно. Затем рассчитывали среднее из полученных значений оптической плотности (OD) и величины OD≥2 стандартных отклонений по отношению к среднему (IgM≥0,534, IgG≥0,140) считали значимыми (""). Соответствующую сыворотку положительного контроля и нормального контроля также включали в отдельные лунки на планшете ELISA.
Реактивность на основании вестерн-блоттинга сывороточных иммуноглобулинов по отношению к электрофоретически отделенным антигенам Borrelia (Mogilyanski et al., 2004 Clin Diag Lab Immunol 11:924) выявляли с помощью коммерчески доступного набора (Marblot™, Trinity Biotech, Брей, графство Уиклоу, Ирландия) в соответствии с рекомендациями производителя. Критерии, рекомендованные Центрами по контролю за заболеваниями (CDC, Атланта, Джорджия, США) использовали для определения положительной пробы (IgM - по меньшей мере две из 23, 39 или 41 выявляемых полос, IgG - по меньшей пять из 18, 23, 28, 30, 39, 41, 45, 58, 66 или 93 выявляемых полос).
РЕЗУЛЬТАТЫ
Когорта для исследования. В общей сложности 21 пациент (в возрасте 18 лет или старше) завершил исследование. Каждого осматривали на наличие клещей Ixodes scapularis или каждый заявлял об укусах клещей в течение 30 дней перед выявлением предположительного одного или множественного поражения, представленного мигрирующей эритемой, и за исключением субъекта №6, который получал антибиотикотерапию (доксициклином) в течение только одного дня, каждого субъекта лечили доксициклином в течение по меньшей мере 10 дней, что представляло собой режим лечения, который почти повсеместно приводил к успешной элиминации спирохет во время ранних стадий заболевания (Kowalski et al., 2010 Clin Infect Dis 50:512-520). В качестве дополнительного подтверждения эффективности терапии, каждого субъекта опрашивали во время предоставления образца крови на стадии выздоровления, при этом никто из индивидуумов не предъявлял жалобы по поводу продолжающихся нарушений.
Серодиагностическое подтверждение LD. Сыворотки от каждого субъекта в острой стадии и на стадии выздоровления изначально оценивали на наличие антител к С6 или реактивности на основании вестерн-блоттинга в целях получения серодиагностического подтверждения того, что каждый участник исследования был заражен В. burgdorferi. Сыворотки от 10 (48%) субъектов в острой стадии заболевания содержали значимые уровни антител IgM к С6, и два (10%) дополнительных субъекта характеризовались сероконверсией на стадии выздоровления (таблица 5). Кроме того, сыворотки от 12 (57%) субъектов в острой стадии содержали антитела IgG к С6, и восемь пациентов, вырабатывающих антитела IgG, вырабатывали антитела IgM. Кроме того, значимые уровни антител IgG выявляли в сыворотке от четырех (19%) дополнительных субъектов на стадии выздоровления. Совокупные результаты обеспечивали серодиагностическое подтверждение болезни Лайма у 17 (81%) из 21 участников исследования.
В отличие от этого, сыворотки только от двух (10%) субъектов в острой стадии давали достаточные реактивности антител IgM для удовлетворения критериев Центров по контролю за заболеваниями (CDC) для подтверждения инфекции, вызываемой В. burgdorferi (таблица 6). Кроме того, ответ возрастал (более реактивные полосы IgM и IgG) до подтверждающих уровней только у четырех дополнительных субъектов через 60 дней. Вестерн-блоттинг обеспечивал серодиагностическое подтверждение только у шести (29%) из 21 участника исследования. Кроме того, субъекты, у которых не вырабатывались антитела к С6, также были отрицательными в соответствии с вестерн-блоттингом. Объединенные результаты из исследования С6 и вестерн-блоттинга не обеспечивали серодиагностического подтверждения LD у четырех (19%) исследуемых субъектов. Более значимо было то, что уровни антител, выявляемых с помощью каждой процедуры исследования, часто повышались в сыворотках на стадии выздоровления после лечения, даже несмотря на то, что спирохет, вызывающих LD, почти определенно элиминировали в результате антибиотикотерапии. Таким образом, на исследование С6 или вестерн-блоттинг нельзя было рассчитывать с точки зрения точного прогноза успешности лечения.
Выявление интерферона-γ после стимуляции Т-клеток пептидным пулом Borrelia. Уровни интерферона-γ определяли с помощью иммунодетекции высвобожденного IFN-γ после in vitro стимуляции, с применением пула из 33 пептидов Borrelia, показанных в таблице 2, из Т-клеток периферической крови, которые собирали в острой стадии заболевания и на стадии выздоровления от 17 субъектов, у которых подтверждали с помощью серодиагноза (выше) инфекцию, вызываемую LD. Значимые уровни интерферона-γ выявляли (таблица 7, в острой стадии, «+») в исследуемых инкубационных смесях от 10 (59%) субъектов (таблица 5), от которых получали сыворотку в острой стадии, как определяли с помощью исследования антител. Кроме того, ответ интерферона-γ не выявляли ни у каких дополнительных субъектов после выздоровления (таблица 7, на стадии выздоровления) и, в отличие от результатов исследований С6 и вестерн-блоттинга на наличие антител в образцах, уровни интерферона-γ у исходных 10 пациентов с положительным диагнозом либо заметно снижались (n=4, таблица 7, на стадии выздоровления, «+»), либо ответ IFN-γ более не подлежал выявлению (n=6).
Затем изучали возможность совпадения отсутствия подлежащих выявлению активированных (на основании высвобождения IFN-γ в ответ на пептидный пул Borrelia) Т-клеток в образце крови, собранном после антибиотикотерапии, с элиминацией спирохет после такого лечения LD. Для изучения этого вопроса средние реактивности интерферона-γ, которые выявляли непосредственно перед антибиотикотерапией (см. фигуру 1, «IFN-γ до лечения»), сравнивали со средними реактивностями интерферона-γ, которые выявляли после лечения (см. фигуру 1, «IFN-γ после лечения»). Было замечено, что средняя реактивность значимо снижалась (р-значение = 0,0002), что совпадало с введением лечения и клинической регрессией симптомов. Эти результаты убедительно доказывали, что количественное определение выработки интерферона-γ Т-клетками при вторичном in vitro ответе на раскрываемый в настоящем документе пептидный пул Borrelia, было полезным для подтверждения LD во время ранних стадий заболевания. Кроме того, активированные Т-клетки уменьшались в количестве, что совпадало с успешной элиминацией спирохет в результате антибиотикотерапии, о чем свидетельствовал сниженный уровень подлежащего выявлению IFN-γ в исследуемых инкубационных смесях, образованных in vitro Т-клетками, собранными после антибиотикотерапии, в ответ на описанный в настоящем документе пептидный пул Borrelia.
Различные варианты осуществления, описанные выше, можно комбинировать для представления дополнительных вариантов осуществления. Все из патентов США, публикаций заявок на патент США, заявок на патент США, иностранных патентов, иностранных заявок на патент и не относящихся к патентам публикаций, упоминаемых в данном описании и/или приведенных в информационном листке заявки, в том числе предварительной заявки на патент США №62/233192, поданной 25 сентября 2015 г., включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. Аспекты вариантов осуществления можно модифицировать, при необходимости, для применения концепций различных патентов, заявок и публикаций в целях получения других дополнительных вариантов осуществления.
Эти и другие изменения можно выполнить с вариантами осуществления в свете представленного выше подробного описания. Как правило, в следующей формуле изобретения используемые термины не предусмотрены ограничивать формулу изобретения конкретными вариантами осуществления, раскрытыми в описании и формуле изобретения, вместо этого они предусмотрены в целях включения всех возможных вариантов осуществления вместе с полным набором эквивалентов, к которым приписывают эту формулу изобретения. Соответственно, формула изобретения не ограничена настоящим раскрытием.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> КИАДЖЕН САЙЕНСИЗ ЛЛС
БИОПЕПТИДС КОРП.
ГЮНДЕРСЕН ЛЮТЕРАН МЕДИКАЛ ФАУНДЕЙШН, ИНК.
КАЛЛИСТЕР, Стивен М.
БОЙЛ, Джефф
МИЙАМАСУ, Мисато
ДЭТТВАЙЛЕР, Реймонд Дж.
АРНАБОЛДИ, Пол М.
<120> КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ДИАГНОСТИКИ БОЛЕЗНИ ЛАЙМА И ПРОГНОЗА ЭЛИМИНАЦИИ
СПИРОХЕТ, ВЫЗЫВАЮЩИХ БОЛЕЗНЬ ЛАЙМА, ПОСЛЕ ЛЕЧЕНИЯ
<130> 770025.466WO
<140> PCT
<141> 2016-09-15
<150> US 62/233,192
<151> 2015-09-25
<160> 40
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 25
<212> PRT
<213> Borrelia sp.
<400> 1
Asn Val Arg Thr Ala Glu Glu Leu Gly Met Gln Pro Ala Lys Ile Asn
1               5                  10                  15
Thr Pro Ala Ser Leu Ser Gly Ser Gln
20                  25
<210> 2
<211> 20
<212> PRT
<213> Borrelia sp.
<400> 2
Asn Thr Pro Ala Ser Leu Ser Gly Ser Gln Ala Ser Trp Thr Leu Arg
1               5                  10                  15
Val His Val Gly
20
<210> 3
<211> 20
<212> PRT
<213> Borrelia sp.
<400> 3
Leu Ser Gly Ser Gln Ala Ser Trp Thr Leu Arg Val His Val Gly Ala
1               5                  10                  15
Asn Gln Asp Glu
20
<210> 4
<211> 20
<212> PRT
<213> Borrelia sp.
<400> 4
Gln Asp Glu Ala Ile Ala Val Asn Ile Tyr Ala Ala Asn Val Ala Asn
1               5                  10                  15
Leu Phe Ser Gly
20
<210> 5
<211> 19
<212> PRT
<213> Borrelia sp.
<400> 5
Ser Leu Ala Lys Ile Glu Asn Ala Ile Arg Met Ile Ser Asp Gln Arg
1               5                  10                  15
Ala Asn Leu
<210> 6
<211> 20
<212> PRT
<213> Borrelia sp.
<400> 6
Ser Ile Val Met Val Leu Phe Phe Asp Leu Leu Val Ala Cys Ser Ile
1               5                  10                  15
Gly Leu Val Glu
20
<210> 7
<211> 20
<212> PRT
<213> Borrelia sp.
<400> 7
Leu Phe Phe Asp Leu Leu Val Ala Cys Ser Ile Gly Leu Val Glu Arg
1               5                  10                  15
Thr Asn Ala Ala
20
<210> 8
<211> 25
<212> PRT
<213> Borrelia sp.
<400> 8
Ile Gly Leu Val Glu Arg Thr Asn Ala Ala Leu Glu Ser Ser Ser Lys
1               5                  10                  15
Asp Leu Lys Asn Lys Ile Leu Lys Ile
20                  25
<210> 9
<211> 25
<212> PRT
<213> Borrelia sp.
<400> 9
Lys Asp Leu Lys Asn Lys Ile Leu Lys Ile Lys Lys Glu Ala Thr Gly
1               5                  10                  15
Lys Gly Val Leu Phe Glu Ala Phe Thr
20                  25
<210> 10
<211> 25
<212> PRT
<213> Borrelia sp.
<400> 10
Gly Lys Gly Val Leu Phe Glu Ala Phe Thr Gly Leu Lys Thr Gly Ser
1               5                  10                  15
Lys Val Thr Ser Gly Gly Leu Ala Leu
20                  25
<210> 11
<211> 25
<212> PRT
<213> Borrelia sp.
<400> 11
Ser Lys Val Thr Ser Gly Gly Leu Ala Leu Arg Glu Ala Lys Val Gln
1               5                  10                  15
Ala Ile Val Glu Thr Gly Lys Phe Leu
20                  25
<210> 12
<211> 25
<212> PRT
<213> Borrelia sp.
<400> 12
Gln Ala Ile Val Glu Thr Gly Lys Phe Leu Lys Ile Ile Glu Glu Glu
1               5                  10                  15
Ala Leu Lys Leu Lys Glu Thr Gly Asn
20                  25
<210> 13
<211> 25
<212> PRT
<213> Borrelia sp.
<400> 13
Glu Ala Leu Lys Leu Lys Glu Thr Gly Asn Ser Gly Gln Phe Leu Ala
1               5                  10                  15
Met Phe Asp Leu Met Leu Glu Val Val
20                  25
<210> 14
<211> 25
<212> PRT
<213> Borrelia sp.
<400> 14
Ala Met Phe Asp Leu Met Leu Glu Val Val Glu Ser Leu Glu Asp Val
1               5                  10                  15
Gly Ile Ile Gly Leu Lys Ala Arg Val
20                  25
<210> 15
<211> 25
<212> PRT
<213> Borrelia sp.
<400> 15
Val Gly Ile Ile Gly Leu Lys Ala Arg Val Leu Glu Glu Ser Lys Asn
1               5                  10                  15
Asn Pro Ile Asn Thr Ala Glu Arg Leu
20                  25
<210> 16
<211> 25
<212> PRT
<213> Borrelia sp.
<400> 16
Asn Asn Pro Ile Asn Thr Ala Glu Arg Leu Leu Ala Ala Lys Ala Gln
1               5                  10                  15
Ile Glu Asn Gln Leu Lys Val Val Lys
20                  25
<210> 17
<211> 25
<212> PRT
<213> Borrelia sp.
<400> 17
Gln Ile Glu Asn Gln Leu Lys Val Val Lys Glu Lys Gln Asn Ile Glu
1               5                  10                  15
Asn Gly Gly Glu Lys Lys Asn Asn Lys
20                  25
<210> 18
<211> 25
<212> PRT
<213> Borrelia sp.
<400> 18
Leu Lys Val Val Lys Glu Lys Gln Asn Ile Glu Asn Gly Gly Glu Lys
1               5                  10                  15
Lys Asn Asn Lys Ser Lys Lys Lys Lys
20                  25
<210> 19
<211> 25
<212> PRT
<213> Borrelia sp.
<400> 19
Phe Gly Leu Ser Gly Ala Tyr Gly Asn Glu Thr Phe Asn Asn Ser Ser
1               5                  10                  15
Ile Thr Tyr Ser Leu Lys Asp Lys Ser
20                  25
<210> 20
<211> 25
<212> PRT
<213> Borrelia sp.
<400> 20
Ser Ile Thr Tyr Ser Leu Lys Asp Lys Ser Val Val Gly Asn Asp Leu
1               5                  10                  15
Leu Ser Pro Thr Leu Ser Asn Ser Ala
20                  25
<210> 21
<211> 25
<212> PRT
<213> Borrelia sp.
<400> 21
Leu Leu Ser Pro Thr Leu Ser Asn Ser Ala Ile Leu Ala Ser Phe Gly
1               5                  10                  15
Ala Lys Tyr Lys Leu Gly Leu Thr Lys
20                  25
<210> 22
<211> 20
<212> PRT
<213> Borrelia sp.
<400> 22
Gly Ala Lys Tyr Lys Leu Gly Leu Thr Lys Ile Asn Asp Lys Asn Thr
1               5                  10                  15
Tyr Leu Ile Leu
20
<210> 23
<211> 20
<212> PRT
<213> Borrelia sp.
<400> 23
Leu Gly Leu Thr Lys Ile Asn Asp Lys Asn Thr Tyr Leu Ile Leu Gln
1               5                  10                  15
Met Gly Thr Asp
20
<210> 24
<211> 20
<212> PRT
<213> Borrelia sp.
<400> 24
Thr Tyr Leu Ile Leu Gln Met Gly Thr Asp Phe Gly Ile Asp Pro Phe
1               5                  10                  15
Ala Ser Asp Phe
20
<210> 25
<211> 20
<212> PRT
<213> Borrelia sp.
<400> 25
Gln Met Gly Thr Asp Phe Gly Ile Asp Pro Phe Ala Ser Asp Phe Ser
1               5                  10                  15
Ile Phe Gly His
20
<210> 26
<211> 25
<212> PRT
<213> Borrelia sp.
<400> 26
Phe Ala Ser Asp Phe Ser Ile Phe Gly His Ile Ser Lys Ala Ala Asn
1               5                  10                  15
Phe Lys Lys Glu Thr Pro Ser Asp Pro
20                  25
<210> 27
<211> 25
<212> PRT
<213> Borrelia sp.
<400> 27
Asn Phe Lys Lys Glu Thr Pro Ser Asp Pro Asn Lys Lys Ala Glu Ile
1               5                  10                  15
Phe Asp Pro Asn Gly Asn Ala Leu Asn
20                  25
<210> 28
<211> 25
<212> PRT
<213> Borrelia sp.
<400> 28
Ile Phe Asp Pro Asn Gly Asn Ala Leu Asn Phe Ser Lys Asn Thr Glu
1               5                  10                  15
Leu Gly Ile Ala Phe Ser Thr Gly Ala
20                  25
<210> 29
<211> 20
<212> PRT
<213> Borrelia sp.
<400> 29
Glu Leu Gly Ile Ala Phe Ser Thr Gly Ala Ser Ile Gly Phe Ala Trp
1               5                  10                  15
Asn Lys Asp Thr
20
<210> 30
<211> 20
<212> PRT
<213> Borrelia sp.
<400> 30
Phe Ser Thr Gly Ala Ser Ile Gly Phe Ala Trp Asn Lys Asp Thr Gly
1               5                  10                  15
Glu Lys Glu Ser
20
<210> 31
<211> 25
<212> PRT
<213> Borrelia sp.
<400> 31
Phe Ser Thr Gly Ala Ser Ile Gly Phe Ala Trp Asn Lys Asp Thr Gly
1               5                  10                  15
Glu Lys Glu Ser Trp Ala Ile Lys Gly
20                  25
<210> 32
<211> 15
<212> PRT
<213> Borrelia sp.
<400> 32
Lys Glu Met Leu Ala Asn Ser Val Lys Glu Leu Thr Ser Pro Ile
1               5                  10                  15
<210> 33
<211> 21
<212> PRT
<213> Borrelia sp.
<400> 33
Ala Thr Lys Ala Ile Gly Lys Lys Ile Gln Gln Asn Gly Gly Leu Ala
1               5                  10                  15
Val Glu Ala Gly His
20
<210> 34
<211> 40
<212> PRT
<213> Borrelia burgdorferi
<400> 34
Asn Val Arg Thr Ala Glu Glu Leu Gly Met Gln Pro Ala Lys Ile Asn
1               5                  10                  15
Thr Pro Ala Ser Leu Ser Gly Ser Gln Ala Ser Trp Thr Leu Arg Val
20                  25                  30
His Val Gly Ala Asn Gln Asp Glu
35                  40
<210> 35
<211> 20
<212> PRT
<213> Borrelia  burgdorferi
<400> 35
Gln Asp Glu Ala Ile Ala Val Asn Ile Tyr Ala Ala Asn Val Ala Asn
1               5                  10                  15
Leu Phe Ser Gly
20
<210> 36
<211> 19
<212> PRT
<213> Borrelia  burgdorferi
<400> 36
Ser Leu Ala Lys Ile Glu Asn Ala Ile Arg Met Ile Ser Asp Gln Arg
1               5                  10                  15
Ala Asn Leu
<210> 37
<211> 180
<212> PRT
<213> Borrelia burgdorferi
<400> 37
Ser Ile Val Met Val Leu Phe Phe Asp Leu Leu Val Ala Cys Ser Ile
1               5                  10                  15
Gly Leu Val Glu Arg Thr Asn Ala Ala Leu Glu Ser Ser Ser Lys Asp
20                  25                  30
Leu Lys Asn Lys Ile Leu Lys Ile Lys Lys Glu Ala Thr Gly Lys Gly
35                  40                  45
Val Leu Phe Glu Ala Phe Thr Gly Leu Lys Thr Gly Ser Lys Val Thr
50                  55                  60
Ser Gly Gly Leu Ala Leu Arg Glu Ala Lys Val Gln Ala Ile Val Glu
65                  70                  75                  80
Thr Gly Lys Phe Leu Lys Ile Ile Glu Glu Glu Ala Leu Lys Leu Lys
85                  90                  95
Glu Thr Gly Asn Ser Gly Gln Phe Leu Ala Met Phe Asp Leu Met Leu
100                 105                 110
Glu Val Val Glu Ser Leu Glu Asp Val Gly Ile Ile Gly Leu Lys Ala
115                 120                 125
Arg Val Leu Glu Glu Ser Lys Asn Asn Pro Ile Asn Thr Ala Glu Arg
130                 135                 140
Leu Leu Ala Ala Lys Ala Gln Ile Glu Asn Gln Leu Lys Val Val Lys
145                 150                 155                 160
Glu Lys Gln Asn Ile Glu Asn Gly Gly Glu Lys Lys Asn Asn Lys Ser
165                 170                 175
Lys Lys Lys Lys
180
<210> 38
<211> 150
<212> PRT
<213> Borrelia burgdorferi
<400> 38
Phe Gly Leu Ser Gly Ala Tyr Gly Asn Glu Thr Phe Asn Asn Ser Ser
1               5                  10                  15
Ile Thr Tyr Ser Leu Lys Asp Lys Ser Val Val Gly Asn Asp Leu Leu
20                  25                  30
Ser Pro Thr Leu Ser Asn Ser Ala Ile Leu Ala Ser Phe Gly Ala Lys
35                  40                  45
Tyr Lys Leu Gly Leu Thr Lys Ile Asn Asp Lys Asn Thr Tyr Leu Ile
50                  55                  60
Leu Gln Met Gly Thr Asp Phe Gly Ile Asp Pro Phe Ala Ser Asp Phe
65                  70                  75                  80
Ser Ile Phe Gly His Ile Ser Lys Ala Ala Asn Phe Lys Lys Glu Thr
85                  90                  95
Pro Ser Asp Pro Asn Lys Lys Ala Glu Ile Phe Asp Pro Asn Gly Asn
100                 105                 110
Ala Leu Asn Phe Ser Lys Asn Thr Glu Leu Gly Ile Ala Phe Ser Thr
115                 120                 125
Gly Ala Ser Ile Gly Phe Ala Trp Asn Lys Asp Thr Gly Glu Lys Glu
130                 135                 140
Ser Trp Ala Ile Lys Gly
145                 150
<210> 39
<211> 21
<212> PRT
<213> Borrelia burgdorferi
<400> 39
Ala Thr Lys Ala Ile Gly Lys Lys Ile Gln Gln Asn Gly Gly Leu Ala
1               5                  10                  15
Val Glu Ala Gly His
20
<210> 40
<211> 15
<212> PRT
<213> Borrelia burgdorferi
<400> 40
Lys Glu Met Leu Ala Asn Ser Val Lys Glu Leu Thr Ser Pro Ile
1               5                  10                  15
<---