МОДУЛИРОВАНИЕ ЭКСПРЕССИИ 11БЕТА-ГИДРОКСИСТЕРОИДНОЙ ДЕГИДРОГЕНАЗЫ 1 ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ГЛАЗНЫХ БОЛЕЗНЕЙ
11 BETA-HYDROXYSTEROID DEHYDROGENASE 1 EXPRESSION MODULATION FOR TREATING EYE DISEASES

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к способам и композициям для лечения и/или профилактики глазных болезней, связанных с высоким уровнем экспрессии или активностью 11бета-гидроксистероидной дегидрогеназы 1 (11beta-HSD1); в том числе, но не только, для лечения глаукомы. В предпочтительных вариантах осуществления изобретение относится к применению технологии РНКи для снижения экспрессии 11beta-HSD1.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Глаукома является одной из главных причин слепоты. В мире приблизительно 15% случаев слепоты являются следствием глаукомы. Наиболее распространенный тип, частота встречаемости первичной открытоугольной глаукомы составляет 1/200 в общей популяции в возрасте свыше 40 лет. Глаукома определена как процесс разрушения глазной ткани, вызванный постоянным повышением внутриглазного давления (ВГД) выше физиологических пределов. Хотя несколько этнологических причин заболевания могут быть включены в группу глаукомы, выбор терапии всегда определяется величиной первичного и/или вызванного изменения давления внутри угла передней камеры глазного яблока.
Использующиеся способы терапии включают лекарственные средства или хирургическое вмешательство, нацеленные на снижение давления, хотя неизвестны патофизиологические механизмы, посредством которых ВГД приводит к повреждению нейронов при глаукоме. Лечебное подавление повышенного ВГД может быть достигнуто с помощью четырех типов лекарственных средств: (1) супрессоров образования глазной жидкости (таких, как ингибиторы карбоновой ангидразы, бета-адренергических блокаторов и агонистов альфа2-адренорецептора); (2) миотиков (таких, как парасимпатомиметики, включая холинергики и ингибиторы антихолинэстеразы); (3) усилителей увеосклерального оттока; и (4) гиперосмотических средств (которые создают градиент осмотического давления через гематоофтальмический барьер внутри эпителия ресничного тела). К пятой категории лекарственных средств относятся нейропротекторные средства, которые являются важным дополнением к терапии, и включают, например, ингибиторы NO-синтетазы, антагонисты возбуждающих аминокислот, антагонисты глутаматного рецептора, ингибиторы апоптоза и блокаторы кальциевых каналов.
Обзоры различных глазных болезней и их лечение можно найти в следующих ссылках: Bunce et al., 2005, Associations between the deletion polymorphism of the angiotensin 1-converting enzyme gene and ocular signs of primary open-angle glaucoma. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol.; 243(4):294; Costagliola et al., 2000, Effect of oral losartan potassium administration on intraocular pressure in normotensive and glaucomatous human subjects. Exp Eye Res 71(2):167; Costagliola et al., 1995, Effect of oral captopril (SQ 14225) on intraocular pressure in man. Eur J Ophthalmol., 5(1):19; Cullinane et al., 2002, Renin-angiotensin system expression and secretory function in cultured human ciliary body non-pigmented epithelium. Br J Ophthalmol., 86(6):676; Sakaguchi et al., 2002, Chymase and angiotensin converting enzyme activities in a hamster model of glaucoma filtering surgery. Curr Eye Res. 24(5):325; Shah et al., 2000, Oculohypotensive effect of angiotensin-converting enzyme inhibitors in acute and chronic models of glaucoma. J Cardiovasc Pharmacol., 36(2):169 и Wang et al., 2005, Effect of CS-088, an angiotensin AT1 receptor antagonist, on intraocular pressure in glaucomatous monkey eyes. Exp Eye Res., 80(5):629.
Под РНК-интерференцией понимают процесс пост-трансляционного, зависимого от нуклеотидной последовательности молчания гена, опосредуемого короткими интерферирующими РНК (киРНК). После открытия этого феномена в растениях в начале 1990-х годов Andy Fire и Craig Mello продемонстрировали, что двухцепочечная РНК (дцРНК) специфически и избирательно ингибирует экспрессию высокоэффективным образом в Caenorhabditis elegans (Fire et al., 1998, Potent and specific genetic interference by double stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature, 391:806). Последовательность первой цепи (смысловая РНК) соответствовала области мишеневой матричной РНК (мРНК). Вторая цепь (антисмысловая РНК) была комплементарна мРНК. Оказалось, что полученная дцРНК была на несколько порядков более эффективна, чем соответствующие одноцепочечные молекулы РНК (в частности, антисмысловые РНК).
Процесс РНКи начинается со взаимодействия фермента DICER с дцРНК, который разрезает ее на кусочки, называемые короткими интерферирующими РНК (киРНК). Этот белок относится к семейству рибонуклеазы III (РНКазы III). Комплекс белков собирает эти остатки РНК и использует их как код для поиска и разрушения любой РНК в клетке, совпадающей с последовательностью, такой как мРНК-мишень (см. Bosher & Labouesse, 2000, RNA interference: genetic wand and genetic watchdog. Nat Cell Biol, 2000, 2(2):E31 и Akashi et al., 2001, Suppression of gene expression by RNA interference in cultured plant cells. Antisense Nucleic Acid Drug Dev, 11(6):359).
При попытках использовать РНКи для нокдауна генов было обнаружено, что в клетках млекопитающих возникают различные защитные механизмы против вирусных инфекций, которые могут препятствовать этому подходу. На самом деле, присутствие чрезвычайно низкого количества дцРНК запускает интерфероновый ответ, приводящий к глобальной неспецифической супрессии трансляции, что в свою очередь запускает апоптоз (Williams, 1997, Role of the double-stranded RNA-activated protein kinase (PKR) in cell regulation. Biochem Soc Trans, 25(2):509; Gil & Esteban, 2000, Induction of apoptosis by the dsRNA-dependent protein kinase (PKR): mechanism of action. Apoptosis, 5(2):107-14).
В 2000 году было опубликовано, что дцРНК специфически ингибируют три гена в мышиных ооцитах и эмбрионах ранних стадий развитий. Блокирование и PKR-ответ не наблюдались, так как эмбрионы продолжали развиваться (Wianny & Zernicka-Goetz, 2000, Specific interference with gene function by double-stranded RNA in early mouse development. Nat Cell Biol, 2(2):70). В исследованиях компании Ribopharma AG (Kulmbach, Germany) было продемонстрировано функционирование РНКи в клетках млекопитающих с использованием коротких (20-24 пар оснований) дцРНК для выключения генов в клетках человека без инициации острофазового ответа. Похожие эксперименты, проведенные другими группами исследователей, подтвердили эти результаты (Elbashir et al., 2001, RNA interference is mediated by 21- and 22-nucleotide RNAs. Genes Dev, 15(2):188; Caplen et al., 2001, Specific inhibition of gene expression by small double stranded RNAs in invertebrate and vertebrate systems. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98: 9742). Было установлено, что протестированные на ряде нормальных и раковых клеточных линий мыши и человека короткие шпилечные РНК (кшРНК) могут приводить к молчанию генов также эффективно, как и их киРНК аналоги (Paddison et al, 2002, Short hairpin RNAs (shRNAs) induce sequence-specific silencing in mammalian cells. Genes Dev, 16(8):948). Недавно было показано, что другая группа коротких РНК (21-25 пар оснований) может опосредовать подавление экспрессии генов. Такие РНК, короткие временные РНК (stРНК) регулируют время экспрессии генов в ходе развития Caenorhabditis elegans (обзор см. в Banerjee & Slack, Control of developmental timing by small temporal RNAs: a paradigm for RNA-mediated regulation of gene expression. Bioessays, 2002, 24(2):119-29 и в Grosshans & Slack, 2002, Micro-RNAs: small is plentiful. J Cell Biol, 156(1):17).
Ученые использовали РНКи в нескольких системах, включая Caenorhabditis elegans, Drosophilа, трипаносомы и других беспозвоночных. Некоторые группы недавно показали специфическое подавление биосинтеза белка в различных клеточных линиях млекопитающих (особенно в клетках HeLa), продемонстрировав, что РНКи представляет собой широко применяемый способ достижения молчания генов in vitro. На основе этих результатов РНКи быстро стала хорошо известным инструментом для проверки (идентификации и определения) функции генов. РНКи, использующая короткие дцРНК-олигонуклеотиды, обеспечивает понимание функции генов, нуклеотидная последовательность которых определена только частично.
Как уже было указано, ВГД поддерживается в результате баланса между продукцией внутриглазной жидкости (ВЖ) (в зависимости от транспорта натрия через двойной слой эпителия цилиарного тела) и оттоком (преимущественно через трабекулярную сеть). ВЖ секретируется в заднюю камеру глаза, вытекая из эпителия цилиарного тела между радужкой и хрусталиком, через зрачковую апертуру входя в переднюю камеру и в конце проходя радиально к периферии, где она уходит преимущественно через шлеммов канал в трабекулярной сети (ТС) и в меньшей степени через пути увеосклерального оттока (Davson H. The aqueous humour and intraocular pressure. In: Davson's Physiology of the Eye, 5th edn. London, Macmillan Press, 1990:3-95; Hart WM. Intraocular pressure. In: Hart WM, ed. Adler's Physiology of the Eye. St Louis, Mosby-Year Book Inc, 1992:248-267).
В периферических эпителиальных тканях транспорт натрия и воды регулируется кортикостероидами и изоферментами 11бета-гидроксистероидной дегидрогеназы 1 (11beta-HSD) (11бета-гидроксистероидной дегидрогеназой 1 (11beta-HSD1), активирующей кортизол из кортизона, и 11бета-гидроксистероидной дегидрогеназой 2 (11beta-HSD2), инактивирующей кортизол до кортизона). 11beta-HSD1 экспрессируется повсеместно, особенно широко во многих тканях, мишенях глюкокортикоидов, включая печень, жировую ткань, кость, а также легкие, сосудистую сеть, яичники и центральную нервную систему.
Экспрессия 11beta-HSD1 была описана для глаза человека. 11beta-HSD2 экспрессируется в эндотелии роговицы, тогда как 11beta-HSD1 более представлена в трабекулярной сети, эпителии хрусталика и эпителии роговицы (Tomlinson JW. 11 Beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 in human disease: a novel therapeutic target. Minerva Endocrinol. 2005 Mar; 30(1):37-46).
В непигментированных нейроэпителиальных клетках или NPE была локализована 11beta-HSD1, а не 11beta-HSD2 (Rauz S, Walker EA, Shackleton CHL, Hewison M, Murray PI, Stewart PM. Expression and putative role of 11beta-hydroxysteroid dehydrogenase isozymes within the human eye. Invest Ophthalmol Vis Sci 2001; 42:2037-42; Suzuki T, Sasano H, Kaneko C, Ogawa S, Darnel AD, Krozowski ZS. Immunohistochemical distribution of 11beta-hydroxysteroid dehydrogenase in human eye. Mol Cell Endocrinol 2001; 173:121-5; Mirshahi M, Nicolas C, Mirshahi A, Hecquet C, d'Hermies F, Faure JP, et al. The mineralocorticoid hormone receptor and action in the eye. Biochem Biophys Res Commun 1996; 219:150-6; Stokes J, Noble J, Brett L, Philips C, Seckl JR, O'Brien C, et al. Distribution of glucocorticoid and mineralocorticoid receptors and 11beta-hydroxysteroid dehydrogenases in human and rat ocular tissues. Invest Ophthalmol Vis Sci 2000; 41:1629-38). С помощью гибридизации in situ была определена экспрессия 11beta-HSD1 в эпителии цилиарного тела, в то время как ОТ-ПЦР-анализ ткани ресничного тела подтвердил экспрессию 11beta-HSD1, а также глюкокортикоидного рецептора и минералокортикоидного рецептора (Rauz S, Cheung CM, Wood PJ, Coca-Prados M, Walker EA, Murray PI, Stewart PM. Inhibition of 11beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 lowers intraocular pressure in patients with ocular hypertension. QJM,, 2003 Jul; 96(7):481-90). Фермент 11beta-HSD1 играет главную роль в определении внутриклеточных концентраций глюкокортикоидов за счет регенерации в обратимой реакции активного глюкокортикоида (кортизола у людей, кортикостерона у крыс и мышей) из неактивного кортизона и 11-дегидрокортикостерона. Высокое соотношение кортизол/кортизон, равное 14:1, было найдено для внутриглазной жидкости, что согласуется с такой локальной системой, продуцирующей кортизол (Rauz S, Walker EA, Shackleton CHL, Hewison M, Murray PI, Stewart PM. Expression and putative role of 11beta-hydroxysteroid dehydrogenase isozymes within the human eye. Invest Ophthalmol Vis Sci 2001; 42:2037-42).
Пероральный прием карбеноксолона (СВХ), ингибитора 11beta-HSD1, добровольцами в предварительном неконтролируемом исследовании привел к снижению ВГД на 17,5%, что позволяет предположить, что действие 11beta-HSD1 может частично регулировать транспорт натрия через NPE-пигментированный бислой и, соответственно, секрецию внутриглазной жидкости (Rauz S, Walker EA, Shackleton CHL, Hewison M, Murray PI, Stewart PM. Expression and putative role of 11beta-hydroxysteroid dehydrogenase isozymes within the human eye. Invest Ophthalmol Vis Sci 2001; 42:2037-42). Далее в рандомизированных исследованиях с плацебо-контролем здоровых добровольцев и пациентов с повышенным внутриглазным давлением (повышенное ВГД, но без зрительной нейропатии) была проведена оценка CBX на ВГД (Rauz S, Cheung CM, Wood PJ, Coca-Prados M, Walker EA, Murray PI, Stewart PM. Inhibition of 11 beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 lowers intraocular pressure in patients with ocular hypertension. QJM., 2003 Jul; 96(7):481-90).
Вышеизложенное относится к одной из областей применения РНКи. Обсуждение дано только для понимания изобретения, описанного далее, и не является утверждением того, что любая из описанных работ представляет собой прототип заявленного изобретения.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В настоящем изобретении авторы предоставляют способы и композиции для модулирования экспрессии и/или активности 11бета-гидроксистероидной дегидрогеназы 1 (11beta-HSD1) путем применения киРНК для лечения глазных болезней. В предпочтительных вариантах осуществления глазные болезни отличаются изменением ВГД у животных, включая человека. В частности, глазная болезнь представляет собой глаукому.
Другой аспект настоящего изобретения относится к выделенному соединению киНК, содержащему последовательность, комплементарную нуклеотидной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 61 или содержащей нуклеотидные последовательности, выбранные из группы SEQ ID NO: 62 - SEQ ID NO: 122.
Еще один аспект настоящего изобретения относится к фармацевтическим композициям, содержащим соединения киНК, мишенью которых является 11beta-HSD1.
Кроме лечения глаукомы способ по настоящему изобретению также может использоваться для лечения других болезней передней камеры глаза. В частности, способ может использоваться для лечения болезней, отличающихся измененными образованием или оттоком внутриглазной жидкости в глазе. Примеры заболеваний, для которых способ лечения по изобретению может быть эффективен, включают местные заболевания, такие как инфекции или воспаления, и общие заболевания, такие как увеит или проявления системных болезней. Кроме того, определенные варианты осуществления изобретения относятся к лечению для диабетической ретинопатии.
Снижение экспрессии может быть осуществлено путем применения двухцепочечных элементов нуклеиновых кислот, именуемых киНК или короткие интерферирующие НК, которые нацелены на вмешательство в экспрессию мРНК 11beta-HSD1. киНК представляют собой преимущественно киРНК, хотя модифицированные нуклеиновые кислоты или похожие химически синтезированные элементы также входят в объем изобретения.
Предпочтительные варианты осуществления относятся к местному применению киНК. Варианты осуществления изобретения также относятся к фармацевтическим композициям для применения в лечении глазных болезней. Изобретение может быть использовано для местного лечения глаз, в области генов-мишеней, вовлеченных в патогенез глаукомы, а также для применения химически синтезированных элементов для лечения животных (включая людей).
ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На фиг.1 показаны номера доступа в базу данных GenBank для двух альтернативных транскриптов 11beta-HSD1.
На фиг.2 показаны короткие фрагменты последовательности гена-мишени, выбранные в качестве последовательностей-мишеней киНК изобретения.
На фиг.3 представлены молекулы киНК изобретения.
CCACAUCACCAACGCUUCUdTdT
CGUCAAUGUAUCAAUCACUdTdT
На фиг.4 показан максимальный эффект двух киРНК на уменьшение ВГД у нормотензивных новозеландских кроликов. Значения представляют собой среднее процента снижения ВГД по сравнению с контролем (противоположный глаз с одним носителем) и их стандартную ошибку (SD). Используемые киРНК представляют собой 11HSD/01:  (SEQ ID NO:133; последовательность кролика, гомологичная последовательности человека SEQ ID NO: 100) и 11 HSD/02:  (SEQ ID 134; последовательность кролика с наилучшей оценкой и без соответствующей описанной последовательности человека).
На фиг.5 показан эффект in vivo киРНК 11HSD/02 на снижение ВГД у нормотензивных новозеландских кроликов в течение времени. Четыре последовательных нанесения киРНК по 265 мкг дали снижение ВГД на 20,34 по сравнению с контролем. В отличие от этого, рандомизированная (с перестановленным расположением нуклеотидов) киРНК не имела эффекта на уровень ВГД.
Каждое значение представляет собой среднее процента снижения ВГД по сравнению с контролем (противоположный глаз с одним носителем) у четырех различных животных.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В первом аспекте изобретение относится к применению киНК для получения лекарственного средства для лечения глазной болезни, где указанная киНК способна ингибировать экспрессию 11бета-гидроксистероидной дегидрогеназы 1 (11beta-HSD1).
Термин ингибировать, используемый в настоящем изобретении, охватывает понижение экспрессии 11beta-HSD1. В одном из вариантов осуществления изобретения глазная болезнь по изобретению отличается измененным внутриглазным давлением (ВГД) у пациента. В другом варианте осуществления изобретения глазная болезнь выбрана из группы, состоящей из глаукомы, инфекции, воспаления, увеита и проявления системных болезней. Глазная болезнь может выбираться из глаукомы или диабетической ретинопатии. В соответствии с изобретением экспрессия гена-мишени может быть ингибирована в глазу пациента.
В одном из вариантов осуществления изобретения киНК по изобретению представляют собой киРНК. Предпочтительно, киРНК представляет собой дцРНК.
Хотя механизмы РНКи остаются неизвестными, очевидны шаги, необходимые для создания специфических дцРНК-олигонуклеотидов. Было показано, что цепи дцРНК-дуплекса, имеющие в длину 21-26 нуклеотидов, работают наиболее эффективно для получения РНК-интерференции. Соответственно, в одном из вариантов осуществления изобретения киНК по изобретению представляет собой 21-26 нуклеотидов в длину. Однако длина соединения киНК по изобретению не ограничена. Также важен выбор подходящей области гомологии внутри гена. При создании дцРНК для РНКи важны такие факторы, как расстояние от старт-кодона, содержание G/C и расположение аденозиновых димеров. Одним из последствий этого, однако, является то, что может быть необходимо протестировать несколько различных последовательностей для эффективной РНКи, и это может являться довольно затратным.
В 1999 году Tuschl et al. (Targeted mRNA degradation by double-stranded RNA in vitro. Genes Dev., 1999; 13(24):3191-7) обнаружили молчащий эффект киРНК, показав, что их эффективность является функцией длины дуплекса, длины 3'-выступающих концов и последовательности этих выступающих концов. На базе этой основополагающей работы компания Eurugentec рекомендует выбирать область-мишень мРНК и, следовательно, последовательность киРНК-дуплекса, используя следующие указания.
Поскольку РНКи зависит от установления взаимодействий в белковом комплексе, очевидно, что мРНК-мишень должна быть свободна от посторонних связанных с ней факторов. В этом контексте следует избегать как 5'-, так и 3'-нетранслируемых областей (UTR) и областей, расположенных близко к старт-кодону, поскольку они могут нести много сайтов связывания для регуляторных белков. Поэтому последовательность киРНК выбирается, как указано ниже.
В последовательности мРНК выбирается область, расположенная на расстоянии от 50 до 100 нуклеотидов ниже AUG старт-кодона или выше стоп-кодона.
В этой области проводится поиск следующих последовательностей: АА(N19), СА(N19). Вычисляется процентное содержание G/C для найденной последовательности. В идеале, содержание G/C равно 50%, но оно должно быть меньше 70% и выше 30%. Предпочтительно избегать последовательностей, содержащих следующие повторы: AAA, CCC, GGG, TTT, AAAA, CCCC, GGGG, TTTT.
Также проводится анализ возможности доступа к мРНК в соответствии с вторичной структурой. Также проводится поиск программой BLAST (а именно, в базе данных NCBI EST) с нуклеотидной последовательностью, в наибольшей степени удовлетворяющей предыдущим критериям, для того, чтобы убедиться, что инактивироваться будет только один ген.
Для того чтобы максимально повысить интерпретацию результата, при использовании киРНК должны применяться следующие предосторожности.
Всегда тестируйте смысловые и антисмысловые цепи в отдельных экспериментах.
Проверьте рандомизированный киРНК-дуплекс. Он должен иметь одинаковую нуклеотидную композицию, как и данная киРНК, но не должен иметь значительной гомологии по последовательности с любым другим геном (включая данный).
Если возможно, проведите нокдаун одного и того же гена с двумя независимыми киРНК-дуплексами для контроля специфичности процесса молчания гена.
На практике каждый из отобранных генов вводится в виде последовательности нуклеотидов в программу для предсказания, которая принимает во внимания все переменные, описанные выше, для разработки оптимальных олигонуклеотидов. Эта программа сканирует нуклеотидную последовательность любой мРНК для областей, восприимчивых к тому, чтобы быть мишенью для киРНК. Результатом этого анализа является оценка возможных киРНК-олигонуклеотидов. Наиболее высокие оценки используются для разработки двухцепочечных РНК-олигонуклеотидов (обычно 21 п.о. в длину, хотя другая длина также возможна), которые обычно изготавливаются при помощи химического синтеза.
Нуклеотиды по изобретению могут содержать один или больше модифицированных нуклеотидов. Одна или более модификаций направлены на увеличение стабильности или доступности киРНК. Примеры подходящих модификаций описаны в публикациях, на которые даны ссылки ниже, каждая из которых включена в настоящее описание посредством ссылки. Примеры таких модификаций по изобретению включают, но не ограничены этим, фосфотиоатные связи между нуклеотидами, 2'-О-метил-рибонуклеотиды, 2'-дезокси-фтор-рибонуклеотиды, 2'-дезокси-рибонуклеотиды, нуклеотиды с «универсальным основанием», 5-С-метил-нуклеотиды и инвертированные дезокси-остатки, лишенные нуклеозидного основания, химическую кросс-сшивку между двумя комплементарными цепями киРНК и химическую модификацию 3'-конца цепи киРНК, внутренние модификации, например модификации сахара, модификации нуклеозидных оснований и модификации каркаса, 2'-фтор модифицированные рибонуклеотиды и 2'-дезоксирибонуклеотиды.
Исследования показывают, что замещение 3'-концевых нуклеотидных перекрывающихся сегментов из 21-членного киРНК-дуплекса, имеющего два нуклеотидных 3'-перекрывающихся конца дезоксирибонуклеотидами, не имеет отрицательного эффекта на активность РНКи. Было опубликовано, что замещение до четырех нуклеотидов на каждом конце киРНК переносится хорошо, в то время как полное замещение дезоксирибонуклеотидами приводит к отсутствию РНКи активности (Elbashir 2001). В дополнение Elbashir et al. опубликовали, что замещение киРНК 2'-О-метил-нуклеотидами полностью аннулирует РНКи активность.
Могут быть использованы нуклеозиды с модифицированной аффинностью, описанные в WO 2005/044976. Эта публикация описывает олигонуклеотиды, содержащие нуклеозиды, модифицированные таким образом, что они имеют увеличенную или уменьшенную аффинность к их комплементарному нуклеотиду в мРНК-мишени и/или в комплементарной цепи киНК.
В GB 2406568 описаны модифицированные альтернативным образом олигонуклеотиды, модифицированные химически с целью обеспечения улучшенной сопротивляемости к деградации или улучшенного поглощения. Примеры таких модификаций включают фосфотиоатные связи между нуклеотидами, 2'-О-метил-рибонуклеотиды, 2'-дезокси-фтор-рибонуклеотиды, 2'-дезокси-рибонуклеотиды, нуклеотиды с «универсальным основанием», 5-С-метил-нуклеотиды и инвертированные дезокси-остатки, лишенные нуклеозидного основания.
В WO 2004/029212 описаны олигонуклеотиды, модифицированные для усиления стабильности киРНК или для увеличения эффективности нахождения мишени. Модификации включают химическую кросс-сшивку между двумя комплементарными цепочками киРНК и химическую модификацию 3'-конца цепи киРНК. Предпочтительные модификации представляют собой внутренние модификации, например модификации сахара, модификации нуклеозидов и/или модификации каркаса. Описаны 2'-фтор модифицированные рибонуклеотиды и 2'-дезоксирибонуклеотиды.
В WO 2005/040537, кроме того, перечислены модифицированные олигонуклеотиды, которые могут быть использованы в изобретении.
Так же как использование дцНК и модифицированных дцНК, в настоящем изобретении можно использовать короткие шпилечные НК (кшНК); две цепи киНК молекулы могут быть соединены линкерной областью, которая может представлять собой нуклеотидный линкер или линкер, состоящий не из нуклеотидов.
В дополнение к киНК по изобретению, которая комплементарна последовательности в области мРНК-мишени, могут использоваться вырожденные киНК, мишенью которых по изобретению являются гомологичные области. Вырожденные последовательности киНК могут быть созданы по способам, известным опытному специалисту. Например, в WO 2005/045037 описана разработка молекул киНК, мишенью которых являются такие гомологичные последовательности, например, посредством включения неканонических пар оснований, например несовпадений и/или неоднозначных пар оснований, которые могут предоставить дополнительные последовательности-мишени. В примерах, где найдено несовпадение, могут использоваться неоднозначные пары оснований (например, несовпадающие или неоднозначные основания) для создания киНК молекул, мишенью которых является более чем одна последовательность гена. В неограничивающем примере, неканонические пары оснований, такие как UU и СС пары оснований, используются для создания киНК молекул, способных распознавать последовательности различных мишеней, которые имеют гомологию по последовательности. Как таковое, одно из преимуществ применения киНК изобретения представляет собой то, что одиночная киНК может быть разработана так, чтобы она включала последовательность нуклеиновой кислоты, комплементарной нуклеотидной последовательности, являющейся консервативной у гомологичных видов. В этом подходе единственная киНК может использоваться для ингибирования экспрессии более чем одного гена вместо использования более чем одной киНК молекулы для нацеливания на разные гены.
Предпочтительные киРНК-молекулы по изобретению являются двухцепочечными. киНК-молекула по изобретению может содержать тупые концы, то есть концы, которые не включают никаких выступающих нуклеотидов. В одном из вариантов осуществления изобретения киНК-молекула изобретения может содержать один или более тупых концов. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения киНК-молекулы имеют 3'-выступающие концы. киНК молекулы изобретения могут содержать дуплекс молекул нуклеиновой кислоты с 3'-выступающими концами из n нуклеотидов (5≥n≥1). Elbashir (2001) показала, что киРНК-дуплексы длиной 21 нуклеотид являются наиболее активными, когда содержат 3'-концевые выступающие динуклеотиды.
Подходящие олигонуклеотиды далее фильтруются на сохранение последовательности между видами для облегчения перехода от животных к клиническим испытаниям на человеке. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения используются консервативные олигонуклеотиды; это позволяет использовать единственную олигонуклеотидную последовательность как в моделях на животных, так и в клинических испытаниях на людях.
Настоящее изобретение может включать введение одной или более разновидностей молекулы киНК одновременно. Эти одна или более из разновидностей могут быть выбраны так, чтобы их мишенью были одинаковые или разные виды мРНК. Предпочтительно, чтобы мишенью киНК была последовательность, выбранная из SEQ ID NO:1-61, или последовательность, содержащая SEQ ID NO:1-61.
Номера доступа в базе данных GenBank, соответствующие двум альтернативным транскриптам 11beta-HSD, представлены в таблице 1. В соответствии с настоящим изобретением можно выбирать мишенью каждую транскрипционную форму отдельно. Поэтому, в одном из вариантов осуществления изобретения, мишенью киНК выбрана сплайсинговая форма 11beta-HSD1, представленная в таблице 1.
Выбранные олигонуклеотидные последовательности, против которых направлена РНКи, показаны в таблице 2. Представленные последовательности являются ДНК-последовательностями, являющимися мишенями киНК. Поэтому изобретение использует НК-дуплексы с последовательностями, комплементарными указанным ДНК-последовательностям.
Последовательности, показанные в таблице 2, не являются ограничивающими. ДНК-мишени необязательно должны предшествовать АА или СА. Кроме того, ДНК-мишень может состоять из последовательностей, включенных в таблицу 2, фланкированных любой непрерывной последовательностью.
В другом аспекте изобретение относится к способу лечения глазной болезни, включающему введение киНК, где указанная киНК способна ингибировать экспрессию 11beta-HSD1. киНК определена по изобретению.
В другом аспекте изобретение также относится к способу ингибирования экспрессии 11beta-HSD1, включающему введение соединения киНК, способного ингибировать экспрессию 11beta-HSD1. киНК определена по изобретению.
В другом аспекте изобретение относится к выделенному соединению киНК, мишенью которого является 11beta-HSD1, где соединение киНК содержит последовательность, комплементарную нуклеотидной последовательности, выбранной из SEQ ID NO:1-61. Соединение киНК в одном из вариантов осуществления изобретения может содержать нуклеотидные последовательности, выбранные из группы SEQ ID NO:62-122. В частности, изобретение относится к выделенной молекуле киНК, содержащей последовательность, комплементарную нуклеотидной последовательности, выбранной из SEQ ID NO:1-61 или SEQ ID NO:62-122, для применения в качестве лекарственного средства.
В последнем аспекте изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей выделенное соединение киНК, описанное в настоящем документе. В одном из вариантов осуществления изобретения фармацевтическая композиция содержит выделенное соединение киНК, мишенью которого является 11beta-HSD1, где соединение киНК содержит последовательность, комплементарную нуклеотидной последовательности, выбранной из SEQ ID NO:1-61, или содержащую нуклеотидную последовательность, выбранную из группы SEQ ID NO:62-122.
Молекулы киНК изобретения и их рецептура или композиция могут вводиться напрямую или поверхностно (т.е. местно) на глаз, как принято в данной области. Например, молекула киНК может содержать носитель для доставки, включая липосомы, для введения индивиду. Носители и разбавители и их соли могут присутствовать в фармацевтически приемлемых рецептурах. Молекулы нуклеиновых кислот могут вводиться в клетки с помощью ряда способов, известных специалистам в данной области, включающих, но не ограниченных этим, заключение в липосомы, электрофорез или включение в другие носители, такие как биоразлагаемые полимеры, гидрогели, циклодекстрины сополимер молочной и гликолевой кислот (PLGA) и PLCA микросферы, биоразлагаемые нанокапсулы и биоадгезивные микросферы, или с помощью белковых векторов. В другом варианте осуществления изобретения молекулы нуклеиновой кислоты изобретения могут также быть введены в рецептуру или в комплекс с полиэтиленимином и его производными, такими как полиэтиленимин-полиэтиленгликоль-N-ацетилгалактозамин (PEI-PEG-GAL) или полиэтиленимин-полиэтиленгликоль-три-N-ацетилгалактозамин (PEI-PEG-triGAL) производные.
Может быть создан комплекс молекулы киНК со средствами, разрушающими мембрану, и/или катионным липидом или вспомогательной липидной молекулой.
Системы доставки, которые могут использоваться с изобретением, включают, например, водные и неводные гели, кремы, гетерогенные эмульсии, микроэмульсии, липосомы, мази, водные и неводные растворы, лосьоны, аэрозоли, углеводородные основания и порошки и могут содержать вспомогательные вещества, такие как солюбилизирующие агенты, усилители проникновения (например, жирные кислоты, сложные эфиры жирных кислот, жирные спирты и аминокислоты) и гидрофильные полимеры (например, поликарбофил и поливинилпирролидон). В одном варианте осуществления изобретения фармацевтически приемлемый носитель представляет собой липосому или трансдермальный усилитель.
Фармацевтическая рецептура изобретения находится в форме, подходящей для введения, например системного или местного введения, в клетку или индивиду, включая, например, человека. Подходящие формы, отчасти, зависят от использования или пути введения, например перорального, трансдермального или посредством инъекции. В данной области известны другие факторы и включают такие факторы, как токсичность, и формы, которые предохраняют композицию или рецептуру от проявления своего эффекта.
Настоящее изобретение также относится к композициям, полученным для хранения или введения, которые включают фармацевтически эффективное количество желаемых соединений в фармацевтически приемлемом носителе или растворителе. Приемлемые носители или растворители для терапевтического применения хорошо известны в фармацевтике. Например, консерванты, стабилизаторы, красители и вкусовые агенты могут быть предоставлены. Они включают бензоат натрия, сорбиновую кислоту и эфиры п-гидроксибензойной кислоты. В дополнение могут использоваться антиоксиданты и ресуспендирующие агенты.
Фармацевтически эффективная доза представляет собой дозу, требуемую для того, чтобы предотвратить, ингибировать возникновение или вылечить (облегчить симптом до некоторой степени, предпочтительно, все симптомы) состояние болезни. Фармацевтически эффективная доза зависит от типа болезни, используемой композиции, пути введения, вида млекопитающего, которое подвергается лечению, физических характеристик данного млекопитающего, сопутствующих лекарств и других факторов, которые знает специалист в данной области медицины.
В общем вводится количество активных ингредиентов между 0,1 мг/кг и 100 мг/кг веса тела в день.
Композиции по изобретению могут вводиться в стандартных лекарственных формах, содержащих обычные нетоксичные фармацевтически приемлемые носители, адьюванты и/или среды-носители. Рецептуры могут представлять собой форму, подходящую для перорального применения, например, в качестве таблеток, пастилок, таблеток для рассасывания, водных или масляных суспензий, дисперсных порошков или гранул, эмульсии, жестких или мягких капсул, сиропов или эликсиров. Композиции, предназначенные для перорального применения, могут быть получены по любому способу, известному в данной области для изготовления фармацевтических композиций, и такие композиции могут содержать одно или более из таких веществ, как подсластители, вкусовые агенты, красители или консерванты, для препаратов, выглядящих привлекательно и обладающих приятным вкусом. Таблетки содержат активный ингредиент в смеси с нетоксичными фармацевтически приемлемыми формообразующими веществами, которые подходят для изготовления таблеток.
Эти формообразующие вещества могут быть, например, инертными разбавителями: такими как карбонат кальция, карбонат натрия, лактоза, фосфат кальция или фосфат натрия; гранулирующими или дезинтегрирующими агентами, например кукурузным крахмалом или альгиновой кислотой; связывающими агентами, например крахмалом, желатином или камедью; и смазочными агентами, например стеаратом магния, стеариновой кислотой или тальком. Таблетки могут быть без оболочки, или они могут быть покрыты оболочкой с помощью известных методик. В некоторых случаях такие оболочки могут быть получены при помощи известных методик так, чтобы отложить дезинтеграцию и абсорбцию в желудочно-кишечном тракте и, таким образом, обеспечить непрерывное действие в течение более длительного периода. Например, может быть использовано замедляющее вещество, такое как моностеарат глицерина или дистеарат глицерина.
Рецептуры для перорального применения могут также быть представлены в виде твердых желатиновых капсул, где действующий ингредиент смешан с инертным твердым разбавителем, например карбонатом кальция, фосфатом кальция или каолином, или в виде мягких желатиновых капсул, где действующий ингредиент смешан с водной или масляной средой, например арахисовым маслом, жидким парафином или оливковым маслом.
Водные суспензии содержат действующие вещества в смеси с формообразующими веществами, подходящими для изготовления водных суспензий. Такие формообразующие вещества являются ресуспендирующими агентами, например натриевой карбоксиметилцеллюлозой, метилцеллюлозой, гидроксипропил-метилцеллюлозой, альгинатом натрия, поливинилпирролидоном, трагакантовой камедью и гуммиарабиком; диспергирующие или увлажняющие агенты могут быть природными фосфатидами, например лецитином или продуктами конденсации алкиленоксида с жирными кислотами, например полиоксиэтиленстеаратом, или продуктами конденсации этиленоксида с длинноцепочечными алифатическими спиртами, например гептадекаэтиленоксицетанолом, или продуктами конденсации этиленоксида с неполными сложными эфирами, полученными из жирных кислот и гекситола, такими как полиоксиэтиленсорбита моноолеат, или продуктами конденсации этиленоксида с неполными сложными эфирами, полученными из жирных кислот и ангидридов гекситола, например полиэтиленсорбитана моноолеат. Водные суспензии могут также содержать один или более консервантов, например этил или н-пропил п-гидроксибензоат, один или более из красителей, один или более из вкусовых агентов и один или более из подсластителей, таких как сахароза или сахарин.
Суспензии в масле могут быть составлены путем ресуспендирования действующих ингредиентов в растительном масле, например арахисовом масле, оливковом масле, кунжутном масле или кокосовом масле, или в минеральном масле, таком как жидкий парафин. Масляные суспензии могут содержать загуститель, например пчелиный воск, твердый парафин или цетиловый спирт. Подсластители и вкусовые агенты могут быть добавлены, чтобы обеспечить приятные на вкус пероральные препараты. Эти композиции могут быть сохранены посредством добавления антиоксидантов, таких как аскорбиновая кислота.
Дисперсные порошки и гранулы, подходящие для получения водной суспензии путем добавления воды, предоставляют действующий ингредиент в смеси с диспергирующим или увлажняющим агентом, ресуспендирующим агентом и одним или несколькими консервантами. Примерами подходящих диспергирующих или увлажняющих агентов или ресуспендирующих агентов являются вещества, упомянутые выше. Дополнительные вспомогательные вещества, например подсластители, вкусовые агенты и красители, также могут присутствовать.
Фармацевтические композиции по изобретению могут также быть в виде эмульсий масло в воде. Масляная фаза может представлять собой растительное масло, или минеральное масло, или их смеси. Подходящие эмульгирующие агенты могут представлять собой природные камеди, например гуммиарабик или трагакантовую камедь, природные фосфатиды, например соевый лецитин, и сложные эфиры или неполные сложные эфиры, полученные из жирных кислот и ангидридов гекситола, например сорбитана моноолеата, и продукты конденсации указанных неполных эфиров с этиленоксидом, например полиоксиэтиленсорбитана моноолеат. Эмульсии могут также содержать подсластители и вкусовые агенты.
Сиропы и эликсиры могут быть составлены с подсластителями, например глицерином, пропиленгликолем, сорбитом, глюкозой или сахарозой. Такие рецептуры могут также содержать смягчающие агенты, консерванты, вкусовой агент и краситель. Фармацевтические композиции могут находиться в форме стерильных водных или масляных суспензий для инъекций.
Эта суспензия может быть составлена по известному методу с использованием подходящих диспергирующих или увлажняющих агентов и ресуспендирующих агентов, которые упомянуты выше.
Стерильный препарат для инъекций может также быть стерильными раствором или суспензией для инъекций в нетоксичном, исходно приемлемом разбавителе или растворителе, например, как раствор 1,3-бутандиола. Среди приемлемых сред и растворителей, которые могут использоваться, находятся вода, раствор Рингера и изотонический раствор хлорида натрия. В дополнение, стерильные нелетучие масла обычно используются в качестве растворителя или среды для ресуспендирования. Для этой цели может использоваться любое легкое нелетучее масло, включая синтетические моно- или диглицериды. В дополнение, в препаратах для инъекций находят применение жирные кислоты, такие как олеиновая кислота.
Молекулы нуклеиновых кислот могут также вводиться в форме суппозиториев, например, для ректального введения лекарства. Эти композиции могут быть получены путем смешения лекарства с подходящим, не вызывающим раздражение формообразующим веществом, которое является твердым при обыкновенных температурах, но жидким при ректальной температуре, и, поэтому, будет плавиться в прямой кишке, высвобождая лекарство. Такие вещества включают какао-масло и полиэтиленгликоли.
Молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению могут вводиться парентерально в стерильной среде. Лекарство в зависимости от носителя и используемой концентрации может или быть ресуспендировано или растворено в среде-носителе. Преимущественно, адьюванты, такие как местные анестетики, консерванты и буферные агенты, могут быть растворены в среде-носителе.
Понятно, что определенный уровень дозировки для любого конкретного индивида зависит от ряда факторов, включая активность используемого определенного соединения, возраст, вес тела, общее здоровье, пол, питание, время введения, путь введения и скорость выделения, комбинацию лекарств и тяжесть конкретного заболевания, подвергающегося лечению.
Для введения животным (кроме человека) композиция также может быть добавлена к корму или питьевой воде. Может быть удобным создание композиций корма или питьевой воды таким образом, чтобы животное принимало внутрь терапевтически подходящее количество композиции вместе с питанием. Также может быть удобным представить композицию в виде заранее приготовленной смеси для того, чтобы добавить ее в корм или питьевую воду.
Молекулы нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению могут также вводиться индивиду в сочетании с другими терапевтическими соединениями для того, чтобы увеличить общий терапевтический эффект. Применение нескольких соединений для лечения симптома может увеличить полезные эффекты, одновременно уменьшая наличие побочных эффектов.
В качестве альтернативы определенные молекулы киНК могут экспрессироваться с эукариотических промоторов внутри клеток. Рекомбинантные векторы, способные к экспрессии молекул киНК, могут быть доставлены в клетки-мишени и сохраняться в них. В качестве альтернативы векторы могут использоваться для обеспечения транзиентной экспрессии молекул нуклеиновых кислот. Такие векторы могут вводиться повторно по необходимости. После того как молекула киНК экспрессирована, она может взаимодействовать с мРНК-мишенью и вызывать РНКи ответ. Доставка векторов, экспрессирующих молекулу киНК, может быть системной, такой как внутривенное или внутримышечное введение, путем введения в клетки-мишени, забранные из индивида с последующим возвращением клеток в индивида, или другими средствами, которые могли бы позволить введение в желаемую клетку-мишень.
Примеры
Получение дуплексов киРНК
Предпочтительно РНК синтезируют химическим способом с использованием соответствующих защищенных рибонуклеозид фосфоамидитов и обычного ДНК/РНК-синтезатора. Замена одной или обеих цепей из киРНК дуплекса 2'-дезокси- или 2'-О-метил-олигорибонуклеотидами уничтожает эффект молчания генов в экстракте дрозофилы (Elbashir et al. 2001). В клетках млекопитающих, однако, похоже возможно заменить смысловую киРНК на 2'-O-метил-олигорибонуклеотид (Ge et al. RNA interference of influenza virus production by directly targeting mRNA for degradation and indirectly inhibiting all viral RNA transcription. Proc Natl Acad Sci U S A, 2003; 100(5):2718-23).
Наиболее удобным является получение киРНК от коммерческих поставщиков синтезированных РНК-олигонуклеотидов, которые продают продукты РНК-синтеза различного качества и с различной стоимостью. В общем, РНК-цепочку длиной 21 нуклеотид не так трудно синтезировать и легко обеспечить качество, подходящее для РНКи.
Поставщики синтезированной РНК включают Proligo (Hamburg, Germany), Dharmacon Research (Lafayette, CO, USA), Glen Research (Sterling, VA, USA), ChemGenes (Ashland, MA, USA) и Cruachem (Glasgow, UK), Qiagen (Germany), Ambion (USA) и Invitrogen (Scotland). Предшествующие компании, синтезирующие РНК по заказу, имеют право предоставлять киРНК с лицензией на проверку мишени. В частности, поставщиками авторов изобретения являются Ambion, Dharmacon и Invitrogen, компании, которые предлагают для киРКН услугу традиционного химического синтеза на заказ и поставляют киРНК, очищенную через ВЭЖХ, в сухом виде, с водой, свободной от РНКаз. Центральный интернет-ресурс для РНКи и методики киРНК вместе со ссылками на дополнительную продукцию и услуги, имеющие отношение к киРНК, можно найти на интернет-страницах вышеупомянутых поставщиков.
Этап отжига является необходимым при работе с одноцепочечными молекулами РНК. Важно, чтобы все этапы работы с РНК проводились в стерильных условиях, свободных от РНКаз. Для отжига РНК сначала должно быть проведено определение количества олигонуклеотидов посредством УФ-поглощения при 260 нанометрах (нм). Следующий протокол на основе статьи Elbashir et al. (2001) затем использовался для отжига.
Отдельно сделать аликвоты и развести каждый РНК-олигонуклеотид до концентрации 50 мкМ.
Смешать 30 мкл раствора каждого РНК-олигонуклеотида и 15 мкл 5Х буфера для отжига.
Конечная концентрация буфера представляет собой: 100 мМ ацетат калия; 30 мМ HEPES-KOH рН 7,4, 2 мМ ацетат магния. Конечный объем равен 75 мкл.
Инкубировать раствор 1 минуту при 90°С, центрифугировать 15 секунд, дать постоять 1 час при 37°С, затем использовать при комнатной температуре. Раствор может храниться замороженным при -20°С, и его можно замораживать-оттаивать до 5 раз. Конечная концентрация киРНК-дуплекса обычно равна 20 мкМ.
В качестве альтернативы у поставщиков уже можно приобрести дцРНК, для которых отжиг уже проведен.
Также могут использоваться химически модифицированные нуклеиновые кислоты. Например, обзор типов модификаций, которые могут быть использованы, дан в WO 03/070744, содержание которого включено в настоящее описание посредством ссылки. Особое внимание следует обратить на страницы 11-21 этой публикации. Другие возможные модификации представляют собой описанные выше. Специалист будет осведомлен о других типах химических модификаций, которые могут быть включены в молекулы РНК.
«In vitro» система
Для того чтобы проверить специфичность киРНК-интерференции, использовали различные клеточные культуры, которые экспрессируют гены-мишени, такие как клетки непигментированного эпителия ресничного тела NPE, клетки эпителия ресничного тела OMDC или клетки почки эмбриона НЕК293. В качестве альтернативы используются клетки из клеточной линии карциномы мочевого пузыря Т-24, клеточная линия карциномы легкого А549 или кератиноциты эмбриона человека НЕК.
Клетки инкубируют с соответствующими дуплексами киРНК и проводят анализ подавления экспрессии гена-мишени. Для того чтобы связать вызванный киРНК нокдаун с определенным фенотипом в культивируемых клетках, необходимо продемонстрировать снижение уровня белка-мишени или, по крайней мере, продемонстрировать снижение мРНК-мишени.
Уровень мРНК гена-мишени оценивали количественно с помощью количественного ПЦР в реальном времени (РВ-ПЦР). Далее уровень белка может быть определен различными способами, хорошо известными в данной области, такими как Вестерн-блот со специфическими антителами к различным мишеням позволяет прямое наблюдение за снижением уровня целевого белка.
Трансфекция киРНК-дуплексов
Ниже приведены несколько хорошо известных в данной области методик: авторы изобретения могут провести одну трансфекцию киРНК-дуплекса с применением катионных липидов, таких как RNAiFect Transfection Reagent (Qiagen) и Lipofectamine 2000 Reagent (Invitrogen), и провести анализ на «молчание» гена в 24, 48 и 72 часа после трансфекции.
5
5
2
2
Типичный протокол трансфекции может быть выполнен, как описано ниже. Для одной лунки 6-луночной плашки проводят трансфекцию с использованием 100мМ конечной концентрации киРНК. Следуя протоколу RNAiFect, высевают за день до трансфекции 2-4×10 клеток на лунку в 3 мл подходящей культуральной среды, содержащей DMEM, 10% сыворотки, антибиотики и глутамин, и инкубируют клетки при нормальных условиях для роста клеток (37°С и 5% СО). В день трансфекции клетки имеют плотность порядка 30-50%. Разводят 15 мкл из 20 мкМ раствора киРНК-дуплекса (соответствует 100 мМ конечной концентрации) в 85 мкл буфера ЕС-R до конечного объема 100 мкл и смешивают на вортексе. Для образования комплекса добавляют к разведенной киРНК 19 мкл RNAiFect Transfection Reagent и смешивают при помощи пипетирования или на вортексе. После инкубирования образцов в течение 10-15 минут при комнатной температуре для того, чтобы позволить образоваться трансфекционным комплексам, добавляют комплексы по каплям к клеткам в 2,9 мл свежей культуральной среды с низким содержанием антибиотиков. Для того чтобы обеспечить равномерное распределение трансфекционных комплексов, плашки аккуратно вращают и инкубируют клетки при условиях для их нормального роста. На следующий день удаляют комплексы и добавляют полную культуральную среду. Для наблюдения «молчания» генов клетки собирают в 24, 48 и 72 часа после трансфекции. Протокол для Lipofectamine 2000 Reagent является аналогичным. За день до трансфекции высевают 2-4×10 клеток на лунку в 3 мл подходящей культуральной среды, содержащей DMEM, 10% сыворотки, антибиотики и глутамин, и инкубируют клетки при нормальных условиях для роста клеток (37°С и 5% СО). В день трансфекции клетки должны иметь плотность порядка 30-50%. Разводят 12,5 мкл 20 мкл раствора киРНК-дуплекса (соответствует 100 нМ конечной концентрации) в 250 мкл DMEM, что дает конечный объем 262,5 мкл, и перемешивают. Также разводят 6 мкл Lipofectamine в 250 мкл DMEM и смешивают. После инкубации в течение 5 минут при комнатной температуре соединяют разведенный олигомер и разведенный Lipofectamine для того, чтобы позволить образоваться комплексам в течение 20 минут при комнатной температуре. После по каплям добавляют комплексы к клеткам в 2 мл свежей культуральной среды с пониженным содержанием антибиотиков и аккуратно смешивают, покачивая плашку вперед-назад для того, чтобы обеспечить равномерное распределение трансфекционных комплексов. Клетки инкубируют при нормальных условиях для их роста и на следующий день удаляют комплексы, и добавляют свежую культуральную среду. Для того чтобы наблюдать «молчание» генов, клетки собирают в 24, 48 и 72 часа после трансфекции.
Эффективность трансфекции может зависеть от типа клеток, но также зависит от числа пассажей и плотности клеток. Также важными являются время и способ образования комплексов киРНК с липосомами (например, переворачивание пробирки в сравнении с встряхиванием на вортексе). Низкая эффективность трансфекции является наиболее частой причиной отсутствия эффекта «молчания гена». Хорошая трансфекция не является простым делом и требует тщательного изучения при использовании каждой новой клеточной линии. Эффективность трансфекции может быть протестирована путем трансфекции репортерных генов, например плазмиды, экспрессирующей ЕGFP под контролем CMV-промотора (например, от компании Clonthech) или экспрессирующей B-Gal, и затем оценивая экспрессию при помощи фазово-контрастной или флуоресцентной микроскопии на следующий день.
Тестирование киРНК-дуплексов
В зависимости от распространенности и времени жизни (или обновления) белка-мишени, нокдаун-фенотип может проявиться от 1 до 3 дней после трансфекции или даже позже. В случае если не наблюдается никакого фенотипа, истощение по белку можно наблюдать при помощи иммунофлуоресценции или Вестерн-блоттинга.
После трансфекций фракции тотальной РНК, выделенной из клеток, обрабатывают ДНКазой I и проводят реакцию обратной транскрипции с набором случайных праймеров. Проводят ПЦР-амплификацию с парой специфических праймеров, которые перекрывают, по крайней мере, одну границу между экзонами для того, чтобы проконтролировать амплификацию пре-мРНК. Также в качестве контроля необходимо проведение РВ-ПЦР мРНК, не являющейся мишенью. Эффективное истощение мРНК при том, что уровень белка мишени не понижается, может свидетельствовать о том, что в клетке присутствует большой запас стабильного белка. В качестве альтернативы амплификация с помощью РВ-ПЦР может использоваться для более точного тестирования снижения уровня мРНК или ее исчезновения. ПЦР в реальном времени на матрице, полученной с помощью обратной транскрипции, количественно оценивает начальное количество матрицы более специфично, чувствительно и воспроизводимо. С помощью ПЦР в реальном времени определяют флуоресценцию, испускаемую в ходе реакции, как индикатор получения амплификата в ходе каждого цикла ПЦР. Этот сигнал увеличивается в прямой пропорции от количества ПЦР-продукта в реакции. Регистрируя количество испускаемой флуоресценции в каждом цикле, возможно наблюдать ход ПЦР-реакции в экспоненциальной фазе, где первое значительное увеличение количества ПЦР-продукта коррелирует с начальным количеством матрицы-мишени.
Чтобы подтвердить картину интерференции дифференциально экспрессирующихся генов, идентифицированных в клеточных культурах, проводят кРВ-ПЦР по инструкциям изготовителя. Для количественной РВ-ПЦР (кРВ-ПЦР) использовали приблизительно 250 нг тотальной РНК для обратной транскрипции с последующей ПЦР-амплификацией со специфическими праймерами для каждого гена в реакционной смеси, содержащей Master SYBR Green I. Общие условия проведения ПЦР содержат начальный этап из 30 минут при 91°С, с последующими 40 циклами из 5 с при 95°С, 10 с при 62°С и 15 с при 72°С. Используются определенные последовательности праймеров, соответствующие каждому гену-мишени. Количественная оценка мРНК бета-актина используется в качестве контроля для нормализации данных. Сравнения относительной экспрессии генов работают наилучшим образом, когда экспрессия гена выбранного эндогенного/внутреннего контроля является более распространенной и остается постоянной по отношению к тотальной РНК среди образов. При использовании инвариантного эндогенного контроля в качестве активного эталона количественная оценка мРНК-мишени может быть нормализована в отношении разницы в количестве тотальной РНК, добавленной в каждую реакцию.
Исследования на животных
Новозеландские кролики являются золотым стандартом в экспериментальных платформах, разработанных для исследования ВГД. Они легки в обращении и имеют большие глаза, похожие по размеру на человеческие. В дополнение, современное оборудование для измерения ВГД не годится для использования на животных с маленьким глазами, таких как мыши или крысы. Наконец, кролики имеют ВГД (около 23 мм рт. ст.), которое может быть снижено до 40% при использовании доступного в продаже местного лекарственного средства для снижения давления. Поэтому, хотя возможно создание модели глаукомы на кроликах (например, блокируя хирургическим путем эписклеральные вены или искусственно закупоривая трабекулярную сеть), авторы использовали нормотензивных кроликов, поскольку в данном случае фармакологическое снижение ВГД можно было легко и воспроизводимо измерить.
Протокол эксперимента
Использовали нормотензивных новозеландских белых кроликов (самцов 2-3 кг). Животных содержали в отдельных клетках со свободным доступом к еде и питью. Животных содержали в искусственном режиме 12-часовых темных/светлых циклов для того, чтобы избежать неконтролируемых суточных колебаний ВГД. Обращение и эксперименты с животными проводили по директиве (86/609/EEC) от European Communities Council и указанию от Association for Research in Vision and Ophthalmology по использованию животных в офтальмологических исследованиях.
Введение лекарств обычно проводили, закапывая небольшой объем (обычно 40 мкл) на поверхность роговицы. На противоположные глаза наносили один носитель, и их можно было использовать в качестве контроля в каждом эксперименте, чтобы не было феномена взаимного влияния с другим глазом. Множественные эксперименты на одном и том же животном должны быть прекращены.
Измерения ВГД проводились с использованием контактного тонометра (TONOPEN XL, Mentor, Norwell, Massachusetts). Тонометр TonoPen является очень удобным благодаря своей точности и маленькому размеру. Измерения с помощью этого прибора проводили, аккуратно прикладывая сенсор тонометра к поверхности роговицы. Было показано, что этот тонометр является наиболее популярным для измерения внутриглазного давления в пределах от 3 до 30 мм рт.ст. у кроликов (Abrams et al. Comparison of three tonometers for measuring intraocular pressure in rabbits. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1996 Apr; 37(5):940-4.). Все измерения попадали внутрь этого интервала: среднее базовое значение внутриглазного давления было равно 17,0±0,39 мм рт.ст. (n=10). Поскольку ВГД изменяется от ночи к дню, все эксперименты проводились в одно и тоже время, чтобы ВГД было более стабильным и чтобы позволить объективное сравнение с обработкой носителем. Для того чтобы избежать стресса у животных, кроликам вводили местную анестезию (оксибупрокаином/тетракаином 0,4%/1% в физиологическом растворе (1/4 по объему)). Раствор (10 мкл) наносили на роговицу перед каждым измерением внутриглазного давления. киРНК или физиологический раствор наносили на поверхность роговицы в объеме 40 мкл.
Стандартный протокол для нанесения киРНК у кроликов приведен ниже. Дозы киРНК в физиологическом растворе (0,9% вес/объем) в конечном объеме 40 мкл наносили на один глаз каждый день постоянно в течение 4 дней. ВГД измеряли перед каждым нанесением и в 2, 4 и 6 часов после закапывания в течение 10 дней. Максимальный ответ наблюдался между вторым и третьим днем. Чтобы сравнить эффект киРНК и других соединений, понижающих давление, проводили анализ препаратов Ксалатан (латанопрост 0,005%) и Трустоп (Дорзоламид 2%) и измеряли ВГД в тех же условиях.
CCACAUCACCAACGCUUCUdTdT
CGUCAAUGUAUCAAUCACUdTdT
Кролики получали лечение на основе протокола, описанного выше. Эти эксперименты показали максимальный эффект двух киРНК на снижение ВГД у нормотензивных новозеландских кроликов. Значения на фиг.4 представляют средний процент снижения ВГД над контролем (противоположный глаз с нанесенным носителем) и стандартную ошибку (SD). Используемые киРНК представляют собой 11HSD/01:  (SEQ ID NO:133; последовательность кролика, гомологичная SEQ ID NO:100 человека) и 11HSD/02:  (SEQ ID NO:134; последовательность кролика с наилучшей оценкой и без соответствующей описанной последовательности человека).
В результатах также показан in vivo эффект киРНК 11HSD/02 на снижение ВГД у нормотензивных новозеландских кроликов в течение времени (фиг.5). Четыре последовательных нанесения 265 мкг киРНК дали снижение ВГД на 20,34 над контролем. В отличие от этого случайная киРНК не имела никакого эффекта на уровень ВГД. Каждое значение представляет средний процент снижения ВГД над контролем (противоположный глаз с нанесенным носителем) у четырех различных животных.