СПОСОБ КОНТРОЛЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ИММУНОТЕРАПИИ ПОЛЛИНОЗА
METHOD OF EFFICIENCY CONTROL FOR POLLINOSIS SPECIFIC IMMUNOTHERAPY

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической аллергологии, и предназначено для диагностики эффективности терапии поллиноза.
Поллинозы - это аллергические заболевания, вызываемые пыльцой растений. Наиболее эффективным способом лечения поллиноза является устранение контакта пациента с аллергенами (пыльцой растений, вызвавшей сенсибилизацию пациентов). Диагностика поллинозов путем выявления растений, к пыльце которых возникла сенсибилизация, позволяет пациентам избегать мест произрастания этих растений во время их цветения, что в свою очередь предупреждает появление клинических признаков заболевания. Наиболее распространима диагностика пыльцевой аллергии путем постановки внутрикожных проб с аллергенами (разведениями экстракта пыльцы растений), а также различных провокационных проб (назальной, конъюктивальной, бронхиальной) [Зисельсон А.Д. Поллиноз у детей. - М., 1989, стр.159; Пыцкий В.И., Адрианова Н.В., Артомасова А.В. Аллергические заболевания. - М., 1991, стр.197-207).
Перечисленные способы являются достаточно информативными, однако их существенным недостатком является проведение аллергологических проб с экстрактами пыльцы растений in vivo. Поэтому их постановка сопровождается неприятными субъективными ощущениями пациентов, а также риском развития осложнений. Вместе с тем, аллергологические пробы in vivo являются достаточно трудоемкими,требуют специального обучения медицинского персонала, их проведение возможно только в условиях специализированного аллергологического кабинета.
Известен способ диагностики и эффективности терапии поллиноза путем спектрофотометрического определения коэффициента пропускания инфракрасного излучения слюной до и после инкубации слюны с экстрактами пыльцы растений (RU 2153171, C1 G01N 33/483, опуб. 20.07.2000 г.) Достоинством способа являются простота и быстрота выполнения исследования (в среднем 5 минут на 1 пробу), небольшое количество биологического материала (0,1 мл слюны) для постановки одной пробы, возможность проведения исследования с любым числом аллергенов, объектом исследования является слюна, что обеспечивает легкость ее забора пациентами самостоятельно без участия медицинских работников, постановка реакции с аллергеном осуществляется in vitro, что делает метод безопасным для больных.
Однако метод не достаточно точный и специфичный, так как дает перекрестные реакции между различными аллергенами, что затрудняет диагностику, выбор методов лечения и оценку их эффективности.
В качестве прототипа заявляемого способа выбран способ контроля эффективности специфической иммунотерапии поллиноза (атопических заболеваний), основанный на выполнении аллергологического обследования со стандартным набором внутрижилищных и пыльцевых аллергенов, или с традиционным набором аллергенов (бытовые, эпидермальные, пыльцевые), или проведение сравнения эффективности иммунотерапии аллергенами и аллергоидами пыльцы у детей (Шевелюк И.М. Сравнительная оценка лечения поллиноза у детей аллергенами и аллергоидами Аллергология; научно-практический журнал, 2002, 32, стр.50-53).
Однако…способ позволяет оценивать (регистрировать) поливалентную сенсибилизацию, включая как пыльцевую аллергию, так и сенсибилизацию к внутрижилищным аллергенам, при этом он не дает точных результатов при оценке терапии в группе пациентов, которые не обладают широким спектром (помимо пыльцевой) сенсибилизации аллергенами, а также различающихся "стажем" заболевания.
Задачей, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, является расширение арсенала средств, используемых для контроля эффективности терапии поллиноза.
Техническим результатом, который может быть получен при осуществлении изобретения, является контроль эффективности терапии поллиноза с большой клинической достоверностью.
Поставленная задача достигается тем, что способ контроля эффективности специфической иммунотерапии (СИТ) поллиноза включает проведение аллергологической пробы «in vitro» в образцах крови до и после лечения. Новизна способа заключается в том, что аллергологическую пробу проводят определением антител к эндогенным биорегуляторам, выбранным из ряда гистамин, брадикинин, вазопрессин или серотонин, с помощью твердофазного иммуноферментного анализа, сравнивают показатели оптической плотности уровня антител OD492 в индивидуальных образцах исследуемых и здоровых доноров, и при снижении этого показателя до лечения на величину трехкратного стандартного отклонения от среднего значения OD492 для группы здоровых доноров и приближении уровня антител к уровню среднедонорского значения после курса лечения СИТ диагностируют эффективность терапии поллиноза.
Ранее было установлено наличие в сыворотках крови здоровых людей естественных антител к эндогенным биорегуляторам, а также то, что такие антитела выполняют важную защитную функцию в организме.
Эндогенные пептидные биорегуляторы и моноаминовые соединения играют также важную роль в механизме возникновения ряда заболеваний, связанных с изменением деятельности защитных функций иммунной системы.
Известно, насколько трудоемка разработка специфического метода обнаружения пептидных и моноаминовых биорегуляторов, которые существуют в организме человека в небольших концентрациях и быстро метаболизируются.
Заявляемый способ контроля эффективности специфической иммунотерапии (СИТ) поллиноза основан на установленном нами снижении уровня естественных антител к эндогенным биорегуляторам в результате заболевания поллинозом.
Для медицинской практики представляет интерес разработка методов определения естественных антител к данным эндогенным биорегуляторам, которые участвуют в патогенезе аллергических заболеваний.
Параллельно для подтверждения результатов было проведен контроль эффективности СИТ поллиноза с помощью известных методов.
Ранее было установлено наличие в сыворотках крови здоровых людей естественных антител к эндогенным биорегуляторам, а также то, что такие антитела играют важную роль в механизме возникновения ряда заболеваний, связанных с изменением деятельности защитных функций иммунной системы.
Известно, насколько трудоемка разработка специфического метода обнаружения эндогенных (пептидных и моноаминовых) биорегуляторов, которые существуют в организме человека в небольших концентрациях и быстро метаболизируются.
Заявляемый способ диагностики основан на установленном нами снижении уровня естественных антител к эндогенным биорегуляторам в результате заболевания поллинозом.
Для медицинской практики представляет интерес разработка методов определения естественных антител к данным эндогенным биорегуляторам, которые участвуют в патогенезе аллергических заболеваний.
Параллельно, для подтверждения результатов было проведено диагностирование поллиноза с помощью известных методов.
В таблице 1 приведены результаты иммуноферментного анализа сыворотки больных поллинозом при исследовании данных образцов на наличие антител к эндогенным биорегуляторам.
Материалы и методы.
В работе использованы следующие реагенты и приборы: конъюгаты антител против IgM человека, меченные пероксидазой хрена ("Sigma"), ИФА проводили на 96-луночных планшетах "Nunc" (Дания). Результаты ИФА учитывали на спектрофотометре с вертикальным ходом луча фирмы "Multiscan" (Финляндия) при длине волны 492 нм.
Для разработки метода ИФА применяли пул образцов крови практически здоровых людей и больных поллинозом. Для постановки одной пробы брали 0,1 мл крови.
Обследованы 20 здоровых лиц (контрольная группа) и 23 пациентов в возрасте от 20 до 45 лет (12 мужчин, 11 женщин) страдающих поллинозом и имеющих гиперчувствительность к аллергенам. Клинические проявления поллиноза были сочетанными и характеризовались чаще всего риноконьюнктивальным синдромом (85%). Явления бронхоспазма отмечены у 35% больных. Другие проявления поллиноза встречались в единичных случаях.
Все больные прошли полное аллергологическое обследование, которое включало сбор аллергологического анамнеза, определение общего и аллергенспецифических IgE-антител, постановку кожных проб методом pric-теста с использованием набора пыльцевых аллергенов ("СЕВАФАРМА", Чехия).
У больных собирали кровь утром натощак. Далее образцы крови центрифугировали (3 тыс.об/мин) в течение 15 минут, собирали сыворотку и хранили при температуре - 20°С.
В день постановки иммуноферментного анализа образцы размораживали. ИФА образцов проводили с использованием конъюгированных антигенов вазопрессина, брадикинина, гистамина, серотонина.
Пример 1. Получение конъюгированного антигена гистамина на основе полимерной матрицы
Синтез конъюгированного антигена гистамина (ГА) на основе поли(4-нитрофенил)акрилата выполняли следующим образом. К раствору 3 мг (0,018 ммоль) поли(4-нитрофенил)акрилата в 1 мл абсолютного диметилформамида (ДМФАабс.), добавляли 1,1 мг (0,009 ммоль) ГА и выдерживали реакционную смесь в течение суток при температуре 20°С, затем добавляли для инактивации не прореагировавшего активированного эфира 5% раствор аммиака. Растворитель упаривали в вакууме. Оставшееся масло многократно промывали эфиром и растворяли в 1 мл ДМФАабс., оставляли на хранение при температуре минус 20°С.
Количество моль ГА, связавшихся с полимерной матрицей, определяли спектрофотометрически по выделяющемуся в процессе реакции п-нитрофенолу. В синтезированном конъюгате содержалось 15 моль ГА на моль полимерного носителя.
Пример 2. Получение конъюгата брадикинина на основе полимерной матрицы
Синтез конъюгированного антигена брадикинина на основе поли(4-нитрофенил)акрилата выполняли аналогично примеру 1. Содержание исходных компонентов в реакционной смеси составляло: 3 мг (0,018 ммоль) полинитрофенилакрилата и 2 мг (0,0025 ммоль) брадикинина. В синтезированном конъюгате содержалось 11 моль брабикинина на 1 моль полимерного носителя
Пример 3. Получение конъюгата серотонина на основе полимерной матрицы
Синтез конъюгированного антигена серотонина на основе поли(4-нитрофенил) акрилата выполняли аналогично примеру 1. С использованием приведенных в примере мольных соотношений реагентов. В синтезированном конъюгате содержалось 12 моль серотонина на моль 1 полимерного носителя.
Пример 4. Получение конъюгата вазопрессина на основе полимерной матрицы
Синтез конъюгированного антигена вазопрессина на основе поли(4-нитрофенил) акрилата выполняли аналогично примеру 1. Определение содержания вазопрессина, связавшегося с полимерной матрицей, проводили спктрофотометрически (пример 1). В синтезированном конъюгате содержалось 18 моль вазопрессина на 1 моль полимерного носителя.
Пример 5. Иммуноферментный анализ (ИФА) определения антител к гистамину в сыворотке крови человека
Планшет сенсибилизировали раствором конъюгатом гистамина (по 100 мкл в лунку) в концентрации 2 мкг/мл в 0.02 М карбонатном буфере (pH 9.5) в течение 18 часов при температуре 4°С.
После сорбции планшет отмывали трижды (3·100 мкл) 0.005% раствором твин-20 в забуференном физиологическом растворе (ЗФР), (pH 7.2), и вносили в лунки в двух повторах по 100 мкл исследуемой сыворотки в ЗФР, содержащем 0.01% твин-20, в разведении 1/400. Планшет инкубировали в течение 1 часа при температуре 37°С.
После инкубации планшет отмывали, как описано выше, и добавляли в лунки по 100 мкл раствора антител против IgM человека, меченных пероксидазой хрена в разведении 1/1000. Планшет инкубировали в течение 1 часа при температуре 37°С.
2
2
После инкубации планшет промывали, как описано выше, и заполняли (по 100 мкл в лунку) субстратной смесью, содержащей 0.4% о-фенилендиамина и 0.4% HO в 0.05 М фосфатно-цитратном буфере. Планшет инкубировали в течение 20 минут в темноте.
2
4
492
После инкубации останавливали ферментативную реакцию добавлением в лунки по 50 мкл 10% HSO и измеряли оптическую плотность (OD) на спектрофотометре при длине волны 492 нм.
На основании результатов ИФА проводили анализ содержания иммуноглобулинов класса М (IgM) в индивидуальных сыворотках больных и здоровых доноров, определяя достоверное изменение уровня антител.
492
492
За величину порогового уровня, разделяющего сыворотки доноров и больных, имеющих пониженный уровень антител к исследуемым антигенам, принимали значение OD в ИФА, отличающееся от среднего значения OD в ИФА для группы доноров, на величину трехкратного стандартного отклонения полученные данные обработали статистически по критерию Стьюдента.
Пример 6. Иммуноферментный анализ (ИФА) определения антител к серотонину
Иммуноферментный анализ проводили по аналогии, как в примере 5, только планшет сенсибилизировали раствором конъюгата серотонина, полученным в примере 3, в концентрации 0,3 мкг/мл в 0,02 М карбонатном буфере (pH 9,5) в течение 18 часов при температуре 4°С. Исследуемые образцы сыворотки вносили в разведении 1:800. Все стадии ИФА выполняли аналогично примеру 5.
Пример 7. Иммуноферментный анализ (ИФА) определения антител к вазопрессину
Иммуноферментный анализ проводили так же, как в примере 5, только планшет сенсибилизировали раствором конъюгата возопрессина, полученным по описанию в примере 3, в концентрации 0,1 мкг/мл в 0,02 М карбонатном буфере (pH 9,5) в течение 18 часов при температуре 4°С. Далее проводили стадии отмывки и вносили исследуемую сыворотку в разведении 1:200. Учет результатов проводили аналогично описанному выше.
Пример 8. Иммуноферментный анализ (ИФА) определения антител к брадикинину
Иммуноферментный анализ проводили аналогично описанному в примере 5, при этом планшет сенсибилизировали раствором конъюгата брадикинина, полученным по методу в примере 2, используя концентрацию 2 мкг/мл в 0,02 М карбонатном буфере (pH 9,5) в течение 18 часов при температуре 4°С. Далее проводили все стадии, касающиеся процедуры ИФА. Исключение составляла операция с анализируемой пробой: исследуемую сыворотку вносили в разведении 1:400. На основе применения этих методов в сыворотке крови доноров и больных обнаружены антитела к указанным эндогенным биорегуляторам. Установлено уменьшение уровня антител к вазопрессину, серотонину, гистанину и брадикинину по сравнению с нормой, в случае возникновения в организме человека патологических процессов.
Предлагаемый способ прошел успешную апробацию в 4-й Городской больнице г.Пензы как для первоначального диагностирования больных поллинозом, так и для оценки эффективности их лечения с помощью специфической иммунотерапии (СИТ).
Показаниями для проведения СИТ служили следующие критерии: наличие симптомов поллиноза у больных в период цветения причинно значимых растений, наличие у больных положительных кожных тестов с аллергеном "Осенняя смесь трав", наличие специфических IgE к полыни.
Курс лечения состоял из 38 приемов аллергена per os в возрастающих дозах от 0,05 PNU до введения пороговой дозы аллергена в разведении 10000 PNU и продолжался 146 дней.
Было проведено исследование образцов крови на содержание антител к эндогенным пептидам (гистамину, серотонину, вазопрессину, брадикинину) для более достоверного описания изменения состояния больных до курса СИТ и после проведенного лечения.
Выявлена следующая закономерность: у 20 человека до курса был сильно занижен уровень антител к гистамину, брадикинину, вазопрессину и серотонину, 3 человека из анализируемой группы имели значение OD значительно выше уровня среднедонорского значения оптической плотности группы сравнения. После проведенного лечения наблюдалось явное увеличение количества антител к гистамину, серотонину, вазопрессину и брадикинину. Уровень антител приблизился к уровню среднедонорского значения (см. Таблицу 1).
У данных больных, по описанию врача, после проведенного курса СИТ уменьшились симптомы поллиноза, период сезонного обострения стал в два раза короче. В 7 случаях симптомов болезни не наблюдалось.
Найдена корреляционная взаимосвязь между уровнем естественных антител к исследованным биорегуляторам в сыворотке крови больных и течением заболевания. Определение естественных антител к гистамину, серотонину, вазопрессину и брадикинину при аллергических заболеваниях (в частности, при поллинозе) может использоваться для оценки эффективности проводимой терапии.
Таким образом, проведенные клинико-иммуннологические исследования позволяют рассматривать предположение о возможности и целесообразности использования предложенной методики в качестве простого, доступного для клинической практики способа диагностики поллиноза и метода контроля эффективности СИТ при использовании пероральных аллергенов (в частности препарата «Осенняя смесь»).
Способ диагностики поллиноза «in vitro» в образцах крови.
Таблица 1.
№
Значение OD больных на различных антигенах до курса СИТ
Значение OD больных на различных антигенах после курса СИТ
Серотонин
Гистамин
Вазопрессин
Брадикинин
Серотонин
Гистамин
Вазопрессин
Брадикинин
сывор.
сывор
сывор
сывор
сывор
сывор
сывор
сывор
1
0,348
0,284
0,296
0,275
0,579
0,479
0,585
0,540+
2
0,431
0,304
0,328
0,295
0,603
0,482
0,583
0,620+
3
0,685
0,672
0,724
0,649
0,650
0,520
0,620
0,585+
4
0,375
0,397
0,460
0,341
0,583
0,501
0,597
0,603+
5
0,314
0,284
0,372
0,295
0,630
0,479
0,630
0,563+
6
0,467
0,305
0,394
0,400
0,573
0,496
0,639
0,583+
7
0,530
0,390
0,295
0,328
0,630
0,560
0,648
0,584+
8
0,398
0,461
0,362
0,375
0,589
0,524
0,543
0,538+
9
0,468
0,403
0,410
0,285
0,530
0,482
0,594
0,496+
10
0,463
0,508
0,527
0,310
0,617
0,484
0,682
0,620+
11
0,482
0,364
0,385
0,284
0,628
0,531
0,597
0,573+
12
0,696
0,683
0,710
0,630
0,583
0,564
0,618
0,590+
13
0,459
0,369
0,530
0,274
0,682
0,532
0,640
0,496+
14
0,397
0,438
0,385
0,327
0,583
0,530
0,598
0,594+
15
0,437
0,296
0,285
0,275
0,649
0,529
0,486
0,537+
16
0,720
0,627
0,690
0,674
0,693
0,539
0,598
0,620+
17
0,342
0,438
0,420
0,372
0,678
0,542
0,597
0,621+
18
0,528
0,462
0,350
0,410
0,649
0,573
0,630
0,595+
18
0,528
0,462
0,350
0,410
0,649
0,573
0,630
0,595+
19
0,438
0,287
0,397
0,372
0,612
0,486
0,583
0,589+
20
0,337
0,307
0,386
0,329
0,468
0,499
0,540
0,580+
21
0,472
0,365
0,428
0,285
0,480
0,479
0,593
0,497+
22
0,461
0,421
0,482
0,395
0,470
0,531
0,640
0,529+
23
0,368
0,465
0,538
0,580
0,430
0,563
0,639
0,610+
Среднее по группе здоровых доноров
0,603
0,507
0,652
0,595