Growth Behavior of Phytopathogen Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus Treated with Selenium Biocomposites of Mushroom Origin

Journal of Stress Physiology & Biochemistry, Vol. 12 No. 1 2016, pp. 13-20 ISSN 1997-0838 Original Text Copyright © 2015 by Perfileva, Tsivileva and Koftin

ORIGINAL ARTICLE

Growth Behavior of Phytopathogen Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus Treated with Selenium Biocomposites of Mushroom Origin

A.I. Perfileva1*, O.M. Tsivileva2, O.V. Koftin2

1 Siberian Institute of Plant Physiology and Biochemistry, SB RAS, Irkutsk, Russia

2 Institute of Biochemistry and Physiology of Plants and Microorganisms, RAS, Saratov, Russia

*E-Mail: alla.lieht@mail.ru

Received November 26, 2015

The results of studying the effect of biologically obtained selenium nanocomposites on the bacterium Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus (Cms) are presented. Cms is a Gram-positive bacterium, which causes one of the most dangerous potato diseases, ring rot. The effective alongside ecologically safe methods for combating Cms are lacking. As the agents feasible for use in this purpose, we examined the selenium nanocomposites obtained from the macrobasidiomycetes' submerged cultures. For exploring the bionanocomposites effect on Cms, the methods of agar well diffusion, the suspension turbidity measurement, and the colony-forming units count were applied. The results showed that all the nanocomposites under study lowered the bacterial suspension's absorption values compared to the reference specimen, that testified to the observation of bacteriostatic effect of the agents tested. The suppression action of nanocompostes was elucidated by means of both agar well diffusion assay and colony-forming units count. Thus, the results obtained demonstrate the occurrence of bacteriostatic and bactericidal effects of the substances under study, and favor the supposition on advisability of further research into the selenium nanocomposites as the agents for agricultural recovery from the bacterial pathogens.

Key words: Clavibacter michiganensis subsp. Sepedonicus, antibacterial activity, biocomposites, mushrooms, selenium

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 12 No. 1 2016

14

Growth Behavior of Phytopathogen Clavibacter michiganensis...

Инфекции картофеля (Solanum tuberosum), свойствам. Особый интерес представляют

одной из важнейших пищевых культур мирового гибридные органо-неорганические биокомпозиты

значения, приводят к потерям, достигающим 65 потенциально антимикробного элементного селена

млн. тонн (16 млрд долларов) ежегодно (Shabuer et (Khiralla and El-Deeb, 2015), получаемые на основе

a/., 2015). Широко распространенное заболевание внеклеточных метаболитов лекарственных

кольцевая гниль картофеля вызывается базидиомицетов (Tsymbal et a/., 2015).

грамположительной бактерией - Clavibacter В настоящей работе мы исследовали

michiganensis ssp. sepedonicus (Cms). антибактериальную активность гибридных органо-

Эффективные методы регуляции численности неорганических биокомпозитов селена в

этого фитопатогена отсутствуют, а все имеющиеся отношении кольцевой гнили картофеля.

способы являются профилактическими и сводятся MATERIALS AND METHODS

к обеззараживанию тары, инвентаря и Использовали штамм Ac 1405 возбудителя

посадочного материала агрессивными агентами кольцевой гнили картофеля Clavibacter

(раствор формальдегида, пероксид водорода, michiganensis ssp. sepedonicus, Cms (получен из

соляная кислота и др.) (Secor et a/., 1988). Всероссийской коллекции микроорганизмов, г.

Представляется перспективным связать Пущино, Московская обл.). Бактериальную

разработку эффективных и безопасных способов культуру выращивали в темноте при 26°С на

оздоровления картофеля от Cms с применением качалке (80 об./мин) в колбах, содержащих жидкую

препаратов на основе природных соединений. питательную среду YPGA, содержащую: пептон

В настоящее время природные полимеры («Биотехновация», Россия) - 10 г/л, дрожжевой

широко используются для получения новых гидролизат («Sigma», США) - 5 г/л, СаСОз

композитных материалов разнообразного («Реахим», Россия) - 5 г/л, глюкозу («Реахим»,

назначения, имея минимальные экологические Россия) - 5 г/л, рН 7.2. В настоящей работе были

последствия (Волкова, 2015). Базидиальные использованы три методики: метод диффузии в

культивируемые грибы рассматриваются как агар (анализ размеров зон ингибирования),

перспективное экологически чистое сырье для определение плотности бактериальной суспензии

создания разнообразных препаратов широкого и высевы для определения КОЕ. Выбор методик

спектра действия. Внимание исследователей обоснован возможностью выявления с их помощью

привлекают олиго- и полисахариды грибного бактериостатического и бактерицидного эффекта

происхождения благодаря их доступности, исследуемых агентов.

биосовместимости, доказанной биологической Для исследования эффекта биокомпозитов на

активности, в том числе антибактериальным бактерии по методу диффузии в агар (Sagdic et a/.,

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 12 No. 1 2016

Perfileva et al.

15

2006) в агаризованной среде YPGA стерильным активный красный селен являются

пробойником (диаметр 6 мм) были сделаны лунки, в перспективными объектами исследования.

которые вносили 150 мкл биокомпозита, затем на Скрининг биопродуцентов более активных и менее

среду наносилась бактериальная суспензия Cms. токсичных антибактериальных субстанций

Спустя 4 суток инкубации влияние биокомпозитов продолжается, в том числе среди ксилотрофных

определяли по наличию и величине зоны базидиомицетов, которые являются одними из

ингибирования вокруг лунки. наиболее биотехнологически ценных высших

Исследование влияния биокомпозитов на грибов съедобных и/или лекарственных видов,

плотность бактериальной суспензии проводили источников антимикробных соединений (De S.

путем измерения оптического поглощения Pereira et al., 2013). Актуальны разработки

бактериальной суспензии после добавления методологий извлечения и характеризации таких

нанокомпозитов. Оптическую плотность (OD) субстанций грибного происхождения.

бактериальной суспензии измеряли через 0, 2, 6, Нами установлено, что образцы мицелиальной

24, 32 и 50 ч с момента посева Cms и внесения суспензии на основе Ganoderma applanatum с

биокомпозитов (в количестве 1 мл на 20 мл среды). элементным красным селеном, полученным

Оптическую плотность фиксировали при 595 нM на биовосстановлением из нетоксичной

планшетном спектрофотометре фирмы BIO-RAD селенорганической формы с помощью метаболитов

model 680 (США). гриба, проявляли бактерицидный эффект в

Наличие бактерицидного эффекта у отношении Staphylococcus aureus (Tsivileva et al.,

исследуемых агентов выявляли с помощью высевов 2015). Указанная активность в тех же

бактериальной суспензии, инкубируемой сутки с экспериментальных условиях у мицелиальных

биокомпозитом, на агаризованную среду. Подсчет образцов, выращенных без добавок соединения-

колоний производили спустя 4 суток инкубации. источника селена, как и у самих добавок,

Полученные результаты были статистически отсутствовала. В настоящей работе нами изучена

обработаны с использованием пакета программ антибактериальная активность Se-содержащих

Excel. биокомпозитов, полученных на основе культур

RESULTS AND DISCUSSION грибов родов Ganoderma, Grifola, Laetiporus,

В связи с сохраняющейся необходимостью Lentinula, Pleurotus, в отношении возбудителя

поиска новых антимикробных препаратов кольцевой гнили картофеля.

синтетические селеноорганические соединения При добавлении Se-биополимерных

(Chan et al., 2007; Pietka-Ottlik et al., 2008; композиций в питательные среды Cms наблюдали

Rusetskaya and Borodulin, 2013) и биологически ухудшение роста бактерий (рис. 1).

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 12 No. 1 2016

16

Growth Behavior of Phytopathogen Clavibacter michiganensis...

Установлено определяющее влияние проявляются в аспекте противомикробного

селенового компонента биополимерных композитов действия в отношении Cms.

на изучаемую биологическую активность. Условия Для сравнительной оценки антимикробной

образования полимерных компонентов Se- активности полимерных композиций грибного

содержащих и Se-несодержащих грибных происхождения нами был использован метод

субстанций унифицированы по физико- диффузии в агар (способ цилиндрических лунок,

химическим параметрам культивирования; «колодцев») по отношению к Cms как тест-

предшествующего процедуре выделения культуре. Оценку результатов проводили по

композитов. Использовали посевной глубинный радиусу зон задержки роста Cms вокруг лунки, не

мицелий одной исходной культуры каждого учитывая диаметр самого цилиндра. Ширину зон

штамма. При этом Se-композиты, в сравнении с ингибирования измеряли с помощью

биополимерными субстанциями, полученными из миллиметровой бумаги. В некоторых опытах зоны

того же гриба, обладали несравненно более угнетения имели овальную форму, - в таких случаях

выраженным антибактериальным эффектом (рис. измеряли наибольший и наименьший радиусы зоны

1). и вычисляли среднюю величину, которая и

Обнаружена зависимость антимикробного принималась за показатель.

действия селенсодержащих опытных образцов от Результаты исследования методом диффузии в

биологического вида гриба, глубинную культуру агар представлены на рис. 2.

которого использовали для получения этих Определение чувствительности фитопатогена

образцов. Максимальной активностью обладали к биокомпозитам также проводили, используя

биокомпозиты на основе внеклеточных метод измерения оптического поглощения

метаболитов Lentinula edodes, Ganoderma lucidum. бактериальных суспензий. Полученные данные

Следует отметить очень умеренную способность отражены на рис. 3.

угнетения роста тест-микроорганизма, выявленную Из представленных данных видно, что

при использовании биокомпозита на основе композиты на основе биополимеров грибов

Laetiporus sulphureus (НК5). Трутовик серно- различаются по степени выраженности

желтый - гриб бурой гнили, в отличие от остальных бактерицидного действия в отношении кольцевой

макробазидиомицетов - грибов белой гнили, гнили картофеля, прежде всего в зависимости от

вовлеченных в наш эксперимент. Вполне возможно, уровня селена в составе композита. Ясно, что само

что принадлежность к данной экологической по себе увеличение массовой доли Se не приводит

подгруппе ксилотрофов и связанные с этим у усилению эффекта. Биокомпозит на основе

биохимические особенности L. sulphureus Grifola umbellata (НК2) характеризуется

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 12 No. 1 2016

Perfileva et al.

17

максимальным уровнем Se, но не максимальной в эксперименте способностью подавлять Cms. Несколько меньшее по сравнению с НК2 относительное содержание Se имеет место в композитах на основе Pleurotus ostreatus (НК3), Lentinula edodes (НК4), Laetiporus sulphureus

(НК5). Однако при равных величинах массовой доли Se в композитах НК3, НК4 и НК5 антимикробная активность выше в НК4, что связано, по-видимому, с особенностями внеклеточных метаболитов гриба шиитаке (L. edodes) (рис. 2).

Figure 1. Рост Cms на агаризованных средах в присутствии нанокомпозитов селена

Figure 2. Влияние нанокомпозитов селена на Cms (метод диффузии в агар).

По оси абсцисс - условные обозначения композитов, по оси ординат - ширина зоны ингибирования, мм

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 12 No. 1 2016

18

Growth Behavior of Phytopathogen Clavibacter michiganensis...

Получение биополимерных тестируемых субстанций К1, К2 при исключении прекурсора селена из питательных сред базидиомицетов приводит к резко сниженной способности подавлять Cms (рис. 2, 3). При этом особенности культуры Ganoderma lucidum, использованной при изготовлении и К2, и НК1, по-видимому, благоприятствуют обсуждаемой биологической активности грибных изолятов в отношении Cms таким образом, что даже при минимальном в условиях нашего эксперимента относительном уровне селена в своем составе композит НК1 занимает промежуточное положение в аспекте проявления антибактериального действия (рис. 2).

CONCLUSIONS

Представленные результаты можно

рассматривать как первую информацию о биологической активности нанобиокомпозитов элементного селена на основе полимерных матриц внеклеточных метаболитов глубинных культур высших грибов. Выявлена бактериостатическая и бактерицидная активность исследованных

субстанций в отношении фитопатогена Cms. Показаны видоспецифические особенности проявления антибактериального эффекта селеновых биокомпозитов, полученных на основе культур разных родов и видов грибов. Изученные виды макробазидиомицетов могут служить перспективным источником антибактериальных агентов в отношении кольцевой гнили картофеля, в связи с чем мы продолжаем исследования с целью оптимизации условий культивирования

продуцентов, процедур изготовления

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 12 No. 1 2016

Perfileva et al.

19

биокомпозитов, приемов их применения.

ACKNOWLEDGMENT

Исследование выполнено при поддержке

Российского фонда фундаментальных

исследований (грант № 15-34-51309_мол-нр).

REFERENCES

Chan G., Hardej D., Santoro M., Lau-Cam C., Billack B. (2007) Evaluation of the antimicrobial activity of ebselen: role of the yeast plasma membrane H+-ATPase. J. Biochem. Mol. Toxicol., 21 (5), 252-264.

De S. Pereira-Jr J.A., Rodrigues D.P., Peixoto-Filho R.C., Bastos I.V.G.A., De Oliveira G.G., AraCijo J.M., Melo S.J. (2013) Contribution to Pharmacognostic and Morphoanatomical Studies, Antibacterial and Cytotoxic Activities of Ganoderma parvulum Murrill (Basidiomycota, Polyporales, Ganodermataceae). Latin American Journal of Pharmacy, 32 (7), 9961003.

Eichenlaub R., Gartemann K.H. (2011) The Clavibacter michiganensis subspecies: molecular investigation of gram-positive bacterial plant pathogens. Annu. Rev. Phytopathol., 49, 445-464.

Khiralla G.M., El-Deeb B.A. (2015) Antimicrobial and antibiofilm effects of selenium nanoparticles on some foodborne pathogens. LWT-Food Science and Technology, 63 (2), 1001-1007.

Pietka-Ottlik M, Wojtowicz-Mlochowska H, Kolodziejczyk K, Piasecki E, Mlochowski J. (2008) New organoselenium compounds active

against pathogenic bacteria, fungi and viruses. Chem. Pharm. Bull. (Tokyo), 56(10), 1423-1427.

Rusetskaya N.Yu., Borodulin V.B. (2013) Antibacterial

effect of the organoselenium compound 1,5-di-

(p-fluorinophenyl)-3-selenopentanedione-1,5 on

the clinical strains of Pseudomonas aeruginosa. International Journal of Applied and Basic

Research, 10, 260-262.

Sagdic O., Aksoy A., Ozkan G. (2006) Evaluation of the antibacterial and antioxidant potentials of gilaburu (Viburnum opulus L.) fruit extract. Acta Alimentaria, 35(4), 487-492.

Secor G.A., DeBuhr L., Gudmestad N.C. (1988) Susceptibility of Corynebacterium sepedonicum to disinfectants in vitro. Plant disease, 72(7), 585-588.

Shabuer G., Ishida K., Pidot S.J., Roth M., Dahse H.M., Hertweck C. (2015) Plant pathogenic anaerobic bacteria use aromatic polyketides to access aerobic territory. Science, 350(6261), 670-674.

Tsivileva O.M., Malyshina M.S., Tsymbal О.А., Koftin O.V. (2015) Antibacterial effect of mycelial suspensions of mushrooms grown with warfarin and organic selenide. In Shkurat T.P., Panich A.E. (eds.), Actual problems of biology, nanotechnology and medicine. Southern Federal University Press, Rostov-on-Don, Russia, pp. 291-292.

Tsymbal O.A., Tsivileva O.M., Pankratov A.N., Markin A.V. (2015) Promising biomedical potential of the mushrooms mycelia enriched with selenium.

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 12 No. 1 2016

20

Growth Behavior of Phytopathogen Clavibacter michiganensis...

Russian Immunological Journal, 9[18](2[1]), 767-769.

Volova T.G. (2015) Degradable

Polyhydroxyalkanoates of Microbial Origin as a

Technical Analog of Polyolefines. Journal of University. Biology, 8(2), 131

Non-Degradable Siberian Federal 151.

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 12 No. 1 2016