ВВЕДЕНИЕ ЭРИТОРАНА ИЛИ ЕГО ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИ ПРИЕМЛЕМЫХ СОЛЕЙ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ОРТОМИКСОВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ
INTRODUCTION OF ERYTHORANE OR ITS PHARMACEUTICALLY ACCEPTABLE SALTS FOR ORTHOMYXOVIRAL INFECTIONS TREATMENT

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
Настоящая заявка испрашивает приоритет согласно §119 раздела 35 Кодекса Соединенных Штатов Америки (U.S.C.) на основании предварительной заявки на патент США №61/616784, поданной 28 марта 2012 года, и предварительной заявки США на патент №61/771339, поданной 1 марта 2013 г., содержание каждой из которых специально полностью во всех отношениях включено в настоящую заявку посредством ссылки, и право на каждую из которых передано правообладателю настоящей заявки.
ЗАЯВЛЕНИЕ О ФИНАНСИРОВАНИИ
Настоящее изобретение было сделано при поддержке Правительства США, оказанной посредством предоставления Гранта №АН 8797, присужденного Национальным Институтом Здоровья (National Institutes of Health). Правительство США имеет определенные права на настоящее изобретение.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
В северном полушарии вирусные эпидемии вызывают до 80% всех заболеваний дыхательных путей. Наиболее распространенные инфекции вызываются шестью группами вирусов: риновирус (RVs), респираторно-синцитиальный вирус, вирус гриппа, вирус парагриппа, коронавирус и аденовирус.
Грипп является респираторным заболеванием, вызванным группой вирусов, которые являются частью семейства вирусов ортомиксовирусов (Orthomyxoviridae). Вирусы гриппа являются патогенами, оказывающими значительное действие на дыхательную систему человека, которые вызывают как сезонные, эндемичные инфекции, так и периодические, непредсказуемые пандемии. Худшая пандемия в истории, случившаяся в 1918 году, унесла жизни около 50 миллионов человек по всему миру. Инфекции человека, вызванные высокопатогенными вирусами птичьего гриппа H5N1, вызывают обеспокоенность относительно возникновения еще одной пандемии. Вирусы гриппа вызывают эпидемические респираторные заболевания каждую зиму в большинстве стран на планете. Грипп часто начинается с симптомов, подобных симптомам простуды, и прогрессирует, затрагивая легкие. У большинства пациентов развивается хронический кашель, который может длиться в течение нескольких недель. Может развиваться пневмония, и она является частой причиной смерти среди более восприимчивых людей. Это может вызвать от легкой до тяжелой формы болезни, а порой может привести к смерти. Некоторые группы субъектов, такие как очень юные, очень старые, а также субъекты с иммунодефицитом, имеют более высокий риск заражения вирусом гриппа и развития серьезных осложнений от инфекции.
Предыдущие попытки лечения инфекции гриппа были сосредоточены на применении ингибиторов нейраминидазы для предотвращения высвобождения нового инфекционного вируса и препятствования репликации вируса. Другие попытки были сосредоточены на применении адамантанов - блокаторах ионных М2-каналов, таких как амантадин и ремантадин. Однако возникли проблемы с резистентностью вируса к лечению. Вирусы гриппа постоянно мутируют. Кроме того, каждый год происходят антигенные изменения в доминирующем в текущем году штамме гриппа. В результате вакцины, полученные для стимуляции иммунного ответа на вирусные антигены, должны быть подготовлены ежегодно. Для всех лиц, подвергающихся риску, рекомендуются ежегодные прививки от гриппа, но данные вакцины основаны на вирусных штаммах прошлых лет без гарантии того, что они будут защищать от вновь возникающих вирусов. Во время зимнего сезона гриппа людям, у которых развивается респираторное заболевание, требуется терапевтическое лечение, чтобы уменьшить их способность к распространению болезни. Таким образом, существует потребность в новых терапевтических лекарственных средствах, которые ограничивают воздействие инфекции вируса гриппа путем нацеленного действия на аспекты иммунного ответа хозяина.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В основу настоящего изобретения был положен, по крайней мере частично, факт обнаружения того, что соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемые соли могут быть применены для лечения ортомиксовирусных инфекций у инфицированного субъекта. Более конкретно, настоящее изобретение относится к обнаруженному факту, что эриторан или его фармацевтически приемлемая соль может быть применена для лечения пациентов, инфицированных гриппом, чтобы ограничить воздействия и продолжительность инфекции. Было показано, что соединение формулы (I) может, например, снизить выработку индуцированных вирусом гриппа цитокинов, уменьшить связанную с вирусом гриппа патологию и предотвратить смерть у мышей.
В одном из вариантов реализации настоящее изобретение относится к способу лечения пациента, инфицированного вирусом гриппа, включающему введение инфицированному пациенту терапевтически эффективного количества эриторана или его фармацевтически приемлемой соли.
В другом варианте реализации настоящее изобретение относится к способу лечения пациента, инфицированного ортомиксовирусом, включающему введение инфицированному пациенту композиции, содержащей активный ингредиент и фармацевтически приемлемый носитель, где активный ингредиент содержит эриторан или его фармацевтически приемлемую соль.
В другом варианте реализации настоящее изобретение относится к способу ослабления заболевания, вызванного гриппом, включающему введение инфицированному животному терапевтически эффективного количества антагониста толл-подобного рецептора 4 (TLR4), где указанный антагонист TLR4 содержит эриторан или его фармацевтически приемлемую соль.
В другом варианте реализации настоящее изобретение относится к способу, дополнительно включающему введение инфицированному пациенту терапевтически эффективного количества противовирусного соединения.
В другом варианте реализации настоящее изобретение относится к способу, в котором инфицированному пациенту вводят терапевтически эффективное количество эриторана или его фармацевтически приемлемой соли после получения положительного результата теста на наличие инфекции гриппа.
В другом варианте реализации настоящее изобретение относится к способу, в котором для инфицированного пациента тест на наличие инфекции гриппа проводят с применением полимеразной цепной реакции (ПЦР), прямых тестов на выявление антигенов посредством ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР, rt-PCR), выделения вируса в культуре клеток или их комбинаций.
В другом варианте реализации настоящее изобретение относится к способу, дополнительно включающему обеспечение снижения уровней мРНК (mRNA) индуцированных вирусом гриппа цитокинов у инфицированного пациента.
В другом варианте реализации настоящее изобретение относится к способу; дополнительно включающему обеспечение снижения уровней мРНК индуцированных вирусом гриппа цитокинов у инфицированного пациента, где цитокины включают в себя фактор некроза опухоли а (ФНО-α), ИЛ-1β, ИЛ-6, СОХ-2, ИЛ-12 р40, КС, ИЛ-10, ИЛ-5, фактор роста опухоли β (ФРО-β) или их комбинации.
В другом варианте реализации настоящее изобретение относится к способу, дополнительно включающему обеспечение снижения уровней мРНК индуцированных вирусом гриппа интерферона бета или интерферона гамма у инфицированного пациента.
В другом варианте реализации настоящее изобретение относится к способу, в котором инфицированному пациенту вводят терапевтически эффективное количество эриторана или его фармацевтически приемлемой соли после возникновения клинических симптомов, где указанные клинические симптомы включают в себя кашель, лихорадку, пневмонию или их комбинации.
В другом варианте реализации настоящее изобретение относится к способу, в котором композицию вводят одним из путей, включающих в себя внутривенное введение, внутрибрюшинное введение, внутримышечное введение, внутрикоронарное введение, внутриартериальное введение, внутрикожное введение, подкожное введение, чрескожное введение, внутритрахеальное введение, подкожное введение, внутрисуставное введение, внутрижелудочковое введение, ингаляции, внутримозговое введение, назальное введение, введение через пупок, пероральное, внутриглазное введение, введение в легкие, введение через вставленный катетер, введение с помощью суппозиториев и путем инъекции непосредственно в ткани, или местное введение с системным всасыванием, или введение через слизистую оболочку.
В другом варианте реализации настоящее изобретение относится к способу, в котором эффекты от введения эриторана или его фармацевтически приемлемых солей вызывают снижение титров вируса у инфицированного пациента.
В другом варианте реализации настоящее изобретение относится к способу, в котором инфицированному пациенту вводят терапевтически эффективное количество эриторана или его фармацевтически приемлемой соли в диапазоне от примерно 1 мкг до примерно 240 мг на дозу.
В другом варианте реализации настоящее изобретение относится к способу, в котором пациент инфицирован ортомиксовирусом, выбранным из группы, включающей вирус гриппа типа А, вирус гриппа типа В, вирус гриппа типа С или их комбинации.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На фигурах 1a, 1b и 1с показано, как эриторан защищает мышей от летальной инфекции гриппа.
На фигурах 2а, 2b, 2с показано опосредованное эритораном лечение гриппа в зависимости от времени.
На фигурах 3а и 3b показана опосредованная эритораном защита от гриппа в зависимости от дозы.
На фигурах 4а, 4b и 4с показано, как опосредованная эритораном защита преодолевается повышенными дозами вируса гриппа.
На фигуре 4d показана защита эритораном от pH1N1 2009 года.
На фигурах 5а и 5b показано, как лечение эритораном снижает титры вируса у инфицированных субъектов.
На фигурах 6а-6е показано, как лечение эритораном способствует смягчению вызванной вирусом гриппа патологии легких.
На фигурах 7а, 7b и 7с показано, как лечение эритораном снижает выработку индуцированных вирусом гриппа цитокинов.
На фигурах 8а и 8b показаны результаты лечения эритораном при более низких уровнях индуцированных вирусом гриппа ферментов печени.
На фигуре 9 показано, как лечение эритораном ингибирует активацию ТLR4-зависимых клеток посредством ОхРАРС.
На фигурах 10а и 10b показано, как лечение эритораном сокращает выработку окисленных фосфолипидов после инфицирования гриппом.
На фигуре 11 показано, что эриторан не в состоянии защитить инфицированных PR8 мышей с выключенным интерфероном бета (interferon-β).
На фигуре 12 показано, что МД1 (MD1) не является альтернативной мишенью для эриторана.
На фигурах 13а и 13b показаны молекулярные требования к вызванной эритораном защите.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Врожденная иммунная система является первой линией защиты против вторжения микроорганизмов. Иммунокомпетентные клетки, такие как макрофаги, дендритные клетки, нейтрофилы и эндотелиальные клетки, распознают на поверхности патогенов патоген-ассоциированные молекулярные паттерны (PAMPs), такие разнообразные, как грамположительные и грамотрицательные бактерии, вирусы, грибки и микроплазма (Mycoplasma). Толл-подобные рецепторы (TLRs) представляют собой семейство тесно связанных рецепторов, которые запускают врожденные клеточные иммунные сигнальные пути в ответ на ненавязчивые раздражители, заданные консервативными PAMPs. На сегодняшний день определено десять разных TLRs человека. Ранее было показано, что один из этих TLRs, TLR3, индуцирует выработку противовирусных цитокинов в ответ на двухцепочечную РНК, выработанную при гриппозной инфекции. TLR4, как правило, связан с активацией врожденной иммунной сигнализации в ответ на липополисахарид (LPS), выработанный во время инфицирования грамотрицательными бактериями. Ранее было показано, однако, что TLR4-дeфицитныe мыши были сильно устойчивы к инфекции с помощью адаптированного к мышам штамма вируса гриппа, A/PR/8/34. (Q.M. Nhu et al., Mucosal Immunology, Vol. 3, No. 1: 29-39, (2010)). Также было показаны TLR4 мутантные мыши, чтобы отобразить естественную устойчивость к вызванному кислотой острому поражению легких. (Y. Imai et al, Cell, 133: 235-249 (2008)). Однако нет никаких исследований, указывающих, может ли ингибирование TLR4 у инфицированных субъектов обеспечить потенциальные терапевтические эффекты после инфицирования вирусом.
Ранее было показано, что эриторан (также известный как Е5564, соединение 1287, SGEA или (α-D-глюкопираноза, 3-O-дeцил-2-дeзoкcи-6-O-[(3R)-3-мeтoкcидeцил]-6-O-мeтил-2-[[(11Z)-1-oкco-11-октадеценил)амино]-4-O-фосфоно-β-D-глюкопиранозил]-2-[(1,3-диоксотетрадецил)амино]-1-(дигидрофосфат) является эффективным антагонистом TLR4. Это лекарственное средство описано как соединение 1 в патенте США №5681824, включенном в настоящее описание посредством ссылки на описание соединения 1 и способов его получения.
Эриторан имеет структуру формулы (I):
и может быть представлен в виде одной из нескольких фармацевтически приемлемых солей. Соединение формулы I может быть получено в форме мицеллы, как описано в патенте США №6906042, полностью включенном в настоящее описание посредством ссылки на описание таких мицелл и способов их получения.
Настоящее изобретение относится к способам лечения респираторных вирусных инфекций и, в частности, лечения инфекций, вызванных ортомиксовирусами. В другом варианте реализации настоящее изобретение относится к способу лечения инфекции вируса гриппа в организме животного путем введения животному ингибитора TLR4. Один из вариантов реализации настоящего изобретения относится к способам лечения инфекции вируса гриппа в организме животного путем введения животному терапевтически эффективного количества эриторана или его фармацевтически приемлемой соли. Другой вариант реализации настоящего изобретения относится к способам лечения инфекции вируса гриппа путем уменьшения репликации вируса у инфицированного хозяина путем ингибирования TLR4.
Соединения, пригодные для применения в соответствии со способами по настоящему изобретению, включают в себя ингибиторы TLR4. В предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения, способы по настоящему изобретению осуществляются с применением эриторана или его фармацевтически приемлемой соли для ингибирования TLR4 сигнализации. Эриторан является синтетическим аналогом липида А, что препятствует LPS сигнализации через TLR4. Эриторан и его фармацевтически приемлемые соли конкурентно ингибируют LPS для связывания гидрофобного кармана MD-2. При связывании эриторан или его фармацевтически приемлемая соль предотвращают димеризацию TLR4 и внутриклеточную сигнализацию.
В одном из вариантов реализации настоящего изобретения лечение эритораном или его фармацевтически приемлемой солью уменьшает вызванную гриппом патологию. Симптомы, связанные с респираторной вирусной инфекцией, и, в частности, связанные с инфекцией гриппа, среди прочих, включают в себя кашель, лихорадку и пневмонию. Часто инфекции гриппа приводит к разрушению клеток в легких. В соответствии с настоящим изобретением, лечение инфицированного субъекта эритораном или его фармацевтически приемлемой солью резко снижает повреждение клеток в легочной ткани. Кроме того, лечение эритораном или его фармацевтически приемлемой солью в первые дни после инфекции в соответствии с раскрытым здесь настоящим изобретением может также привести к снижению системных воздействий инфекции гриппа. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения вызванное гриппом увеличение уровней ферментов печени уменьшается путем лечения эритораном или его фармацевтически приемлемой солью.
Острая респираторная вирусная инфекция (особенно из подтипа вируса гриппа H5N1) приводит к экспрессии большого количества различных цитокинов, способных влиять на легкие, и последующее повреждение альвеол и легочных тканей приводит к летальности, наблюдаемой при более тяжелых инфекциях гриппа, особенно такие смертельные исходы наблюдаются среди молодых здоровых взрослых. Чрезмерное воспаление, вызванное вирусной инфекцией, может привести к значительной патологии. В другом варианте реализации настоящего изобретения TLR4 подвергается действию антагониста для уменьшения вызванной гриппом экспрессии РНК цитокинов у субъектов, инфицированных гриппом. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения антагонист TLR4 эриторан или его фармацевтически приемлемая соль могут привести к снижению выработки продуктов вызванной гриппом экспрессии РНК цитокинов у инфицированных субъектов. Не желая быть связанными какой-либо конкретной теорией, авторы настоящего изобретения полагают, что вирусы гриппа инфицируют клетки и активируют клеточные сигнальные пути, которые ведут выработку цитокинов. В соответствии с настоящим изобретением, эриторан может быть нацелен на путь TLR4 для уменьшения выработки воспалительных цитокинов у пациентов, инфицированных вирусами гриппа. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения эриторан или его фармацевтически приемлемую соль применяют для уменьшения вызванной гриппом экспрессии РНК интерферона бета у субъектов, инфицированных гриппом. В другом варианте реализации настоящего изобретения эриторан или его фармацевтически приемлемую соль применяют для уменьшения вызванной гриппом экспрессии РНК интерферона гамма у субъектов, инфицированных гриппом. В другом варианте реализации настоящего изобретения лечение эритораном субъектов, инфицированных гриппом, не уменьшает вызванную гриппом экспрессию интерферона-альфа 4. В другом варианте реализации настоящего изобретения лечение эритораном субъектов, инфицированных гриппом, не уменьшает вызванную гриппом экспрессию интерферона-дельта 2. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения лечение эритораном инфицированных субъектов может быть применено для уменьшения вызванной гриппом экспрессии специфических видов интерферона, не влияя на экспрессию других видов интерферона. Способы по настоящему изобретению также могут быть применены для уменьшения опосредованной TLR4 экспрессии ФНО-α, ИЛ-Iβ, ИЛ-6, СОХ-2, ИЛ-12 р40, КС, ИЛ-10, ИЛ-5 и ФРО-β.
В еще одном варианте реализации настоящего изобретения воздействия эриторана или его фармацевтически приемлемой соли приводят к снижению репликации вируса гриппа у инфицированных субъектов по сравнению с субъектами, не подвергающимися лечению. Не желая быть связанными какой-либо конкретной теорией, авторы настоящего изобретения полагают, что ингибирующие действия эриторана или его фармацевтически приемлемой соли, направленные на сигнализацию TLR4, вырабатывают клеточную среду, менее пригодную для роста вируса.
Способы, относящиеся к настоящему изобретению, могут быть применены для лечения любого штамма инфекции гриппа. В соответствии с одним из вариантов реализации настоящего изобретения способы относятся к лечению штаммов гриппа типа А. В соответствии с одним из вариантов осуществления настоящего изобретения способы относятся к лечению штаммов гриппа типа В.
В соответствии с одним из вариантов реализации настоящего изобретения способы относятся к лечению штаммов гриппа типа С.Кроме того, способы по настоящему изобретению могут быть также применены для лечения других ортомиксовирусов.
В соответствии с одним из вариантов реализации настоящего изобретения способ по настоящему изобретению включает обнаружение присутствия инфекции гриппа в образцах из дыхательных путей субъекта. Ряд различных лабораторных диагностических тестов может быть применен для обнаружения присутствия вирусов гриппа в образцах из дыхательных путей, включая тесты прямого выявления антигенов, выделение вируса в культуре клеток, выявление характерных для гриппа РНК с помощью полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в режиме реального времени (ОТ-ПЦР-РВ) или другие.
В соответствии со способами, относящимися к настоящему изобретению, лечение может начаться в течение примерно до 6 дней после инфицирования гриппом или от появления клинических симптомов.
В соответствии с предпочтительным вариантом реализации настоящего изобретения лечение может начаться в течение примерно до 4 дней после инфицирования гриппом. В соответствии с более предпочтительным вариантом реализации настоящего изобретения, лечение может начаться в течение примерно до 2 дней после инфицирования гриппом. Настоящее изобретение относится к способам лечения субъектов, страдающих от вирусной инфекции, или, более конкретно субъектов, страдающих от инфекции вируса гриппа.
Введение эриторана или его фармацевтически приемлемой соли в соответствии с настоящим изобретением, как правило, осуществляется в течение нескольких дней. Как было показано, эффективность способов, относящихся к настоящему изобретению, увеличивается в зависимости от дозы, более высокие дозы обеспечивают более эффективное лечение инфекции. Однократную дозу можно вводить в промежутке между 1 мкг и примерно 240 мг. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения однократную дозу можно вводить в промежутке между 1 мкг до примерно 50 мг. В другом варианте реализации настоящего изобретения однократную дозу можно вводить в промежутке между 1 мкг до примерно 70 мг. В еще одном варианте реализации настоящего изобретения однократную дозу можно вводить в промежутке между 1 мкг до примерно 90 мг. В еще одном варианте реализации настоящего изобретения однократную дозу можно вводить в промежутке между 1 мкг до примерно 125 мг. В еще одном варианте реализации настоящего изобретения однократную дозу можно вводить в промежутке между 1 мкг до примерно 150 мг. В еще одном варианте реализации настоящего изобретения однократную дозу можно вводить в промежутке между 1 мкг до примерно 200 мг. Подходящие количества эриторана или его фармацевтически приемлемой соли могут быть определены специалистом в данной области техники в соответствии с характеристиками инфицированного субъекта и предпочтительного способа введения. В способах, относящихся к настоящему изобретению, эриторан или его фармацевтически приемлемую соль также можно вводить пациентам путем внутривенной инфузии в течение 12-100 часов, например, 60-80 или 72 часов. Скорость дозирования инфузии может варьироваться, например, 0,001-0,5 мг/кг массы тела/час, например, 0,01-0,2 мг/кг/час или 0,03-0,1 мг/кг/час. Инфузии эриторана или его фармацевтически приемлемой соли может, при желании, предшествовать болюсная инъекция эриторана или его фармацевтически приемлемой соли, которые можно давать в дозировке 0,001-0,5 мг/кг массы тела. Общее количество эриторана или его фармацевтически приемлемой соли, вводимой пациенту, может быть, например, 50-600 мг лекарственного средства, например, 150-500 мг, путем инфузии в течение 60-80 часов. В другом варианте реализации настоящего изобретения эриторан или его фармацевтически приемлемую соль можно вводить пациентам путем внутривенной инфузии в течение 1-10 часов при общей суточной дозе в промежутке 1 -20 мг; Например, общее количество эриторана или его фармацевтически приемлемой соли, вводимой пациенту, может быть в пределах от примерно 1 до примерно 10 мг в суточной дозе, вводимой путем внутривенной инфузии в течение до 5 часов. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения общее количество эриторана или его фармацевтически приемлемой соли, вводимой пациенту, составляет 5 мг в суточной дозе, вводимой путем внутривенной инфузии в течение приблизительно 1 часа. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения общее количество эриторана или его фармацевтически приемлемой соли, вводимой пациенту, составляет 5 мг в суточной дозе, вводимой путем внутривенной инфузии в течение примерно 4 часов. Количество и способ введения может изменяться в течение курса лечения. Например, пациент может сначала получить эриторан или его фармацевтически приемлемую соль путем внутривенной инъекции в течение начальной стадии инфекции, а затем должны следовать ингаляционные способы введения в течение нескольких дней, в том числе до 14 дней после инфицирования.
Соответствующую частоту введения также может определить специалист в данной области техники. Например, лекарственное средство можно вводить 1-4 раза в день, предпочтительно 2-4 раза в день. Введение может быть непрерывным в течение выбранного периода времени или может быть сериями разнесенных доз. Введение лекарственного средства может продолжаться до тех пор, пока симптомы инфекции не исчезли. В некоторых случаях может быть предпочтительным продолжить введение в течение нескольких дней. В, одном из вариантов реализации настоящего изобретения введение может продолжаться в течение нескольких дней после того, как клинические симптомы инфекции исчезли. Следует понимать, что конкретные диапазоны доз и фармацевтические составы могут варьироваться в зависимости от способа введения и конкретных физических характеристик субъекта, которого лечат.
Для того чтобы более ясно и точно описать объект изобретения, следующие определения предназначены для того, чтобы дать указания в отношении значений терминов, используемых в данном документе.
В контексте настоящего описания формы единственного числа означают "один или более", или "по крайней мере один", если не указано иное. То есть, ссылка на любой элемент по настоящему изобретению с использованием формы единственного числа не исключает возможности того, что присутствует более одного элемента.
Значения и диапазоны описаны в сочетании с различными вариантами реализации настоящего изобретения, например, количество соединения формулы (I), присутствующего в композиции. Следует понимать, что все значения и диапазоны, которые попадают между указанными значениями и диапазонами, охватываются настоящим изобретением, если явно не указано иное.
Термин "эффективное количество" соединения относится к достаточному количеству соединения, которое обеспечивает желаемый эффект, но при отсутствии токсичности или с приемлемой токсичностью. Это количество может изменяться от субъекта к субъекту в зависимости от вида, возраста и физического состояния субъекта, тяжести заболевания, которое лечат, от конкретного применяемого соединения, способа его введения и тому подобное. Подходящее эффективное количество может быть определено специалистом в данной области техники.
"Лечение", "лечить" или "лечащий" в контексте настоящего описания определены как применение или введение терапевтического агента субъекту, или ткани или клеточной линии, выделенной из субъекта. Субъект обычно имеет заболевание или расстройство, симптом заболевания или расстройства или предрасположенность к заболеванию или расстройству (например, грипп). В частности, в контексте настоящего описания лечение направлено на субъектов, уже инфицированных вирусом, таким как грипп, в отличие от субъектов, которые еще не были инфицированы. Целью лечения, как правило, является вылечить, залечить, смягчить, облегчить, излечить, улучшить или поправить такие заболевания, расстройства или симптомы. Термин "подвергнутые лечению" в контексте настоящего описания относится к излеченному, зажившему, смягченному, облегченному, устраненному, уменьшенному или улучшенному заболеванию или расстройству.
Соединения, пригодные для использования со способами по настоящему изобретению, вводят в терапевтически эффективных дозах. Термин "терапевтически эффективное количество" применяется для обозначения количества активного вещества, или фармацевтического агента, которое вызывает показанный биологический или медицинский ответ. Этот ответ, которого в настоящее время добивается исследователь, ветеринар, врач или другой клиницист, может возникать в ткани, системе (животных, включая человека).
В контексте настоящего описания термин "фармацевтически приемлемая соль" относится к тем солям, которые являются, в пределах погрешности медицинской оценки, пригодными для применения в контакте с тканями людей и низших животных без чрезмерной токсичности, раздражения, аллергической реакции и т.п.и соизмеримыми с разумным соотношением польза/риск. Фармацевтически приемлемые соли хорошо известны в данной области техники. Например, S. М. Berge, et al, описали фармацевтически приемлемые соли подробно в J. Pharmaceutical Sciences, 66: 1-19 (1977). Соли могут быть получены на месте во время конечного выделения и очистки описанных здесь соединений или отдельно путем взаимодействия функциональной группы свободного основания или свободной кислоты с подходящим реагентом, как описано в общих чертах ниже. Например, функциональная группа свободного основания может подвергнуться взаимодействию с соответствующей кислотой. Кроме того, когда описанные здесь соединения несут кислотную группу, подходящие фармацевтически приемлемые соли могут содержать соли металлов; такие как соли щелочных металлов, например, натриевые или калиевые соли; и соли щелочноземельных металлов, например, соли кальция или соли магния. Натриевые соли соединений в объеме формулы I, описаны, например, в заявке на патент США сер. №12/516082 и заявке на патент США №2008/0227991. Примерами фармацевтически приемлемых нетоксичных кислотно-аддитивных солей являются соли, образованные с неорганическими кислотами, такими как соляная кислота, бром истово дородная кислота, фосфорная кислота, серная кислота и хлорная кислота, или с органическими кислотами, такими как уксусная кислота, щавелевая кислота, малеиновая кислота, винная кислота, лимонная кислота, янтарная кислота или малоновая кислота, или с помощью других способов, применяемых в данной области техники, таких как ионообмен. Другие фармацевтически приемлемые соли включают в себя такие соли, как адипат, альгинат, аскорбат, аспартат, бензолсульфонат, бензоат, бисульфат, борат, бутират, камфорат, камфорсульфонат, цитрат, циклопентанпропионат, диглюконат, додецилсульфат, этансульфонат, формиат, фумарат, глюкогептонат, глицерофосфат, глюконат, гемисульфат, гептаноат, гексаноат, гидроиодид, 2-гидрокси-этансульфонат, лактобионат, лактат, лаурат, лаурилсульфат, малат, малеат, малонат, метансульфонат, 2-нафталинсульфонат, никотинат, нитрат, олеат, оксалат, пальмитат, памоат, пектинат, персульфат, 3-фенилпропионат, фосфат, пикрат, пивалат, пропионат, стеарат, сукцинат, сульфат, тартрат, тиоцианат, паратолуолсульфонат, ундеканоат, валерат и тому подобные.
Типичные соли щелочных или щелочноземельных металлов включают в себя соли натрия, лития, калия, кальция, магния и тому подобные. Кроме того, фармацевтически приемлемые соли включают в себя, в соответствующих случаях, нетоксичный аммоний, четвертичный аммоний и катионы аминов, образованные с применением противоионов, таких как галогенид, гидроксид, карбоксилат, сульфат, фосфат, нитрат, низший алкилсульфонат и арилсульфонат. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения соединение формулы (I) представляет собой натриевую соль, например, тетранатриевую соль.
Термин "субъект" относится к животному, предпочтительно млекопитающему, наиболее предпочтительно - к человеку, который является объектом лечения, наблюдения или эксперимента. Млекопитающее может быть выбрано из группы, состоящей из мышей, крыс, хомяков, песчанок, кроликов, морских свинок, собак, кошек, овец, коз, коров, лошадей, жирафов, утконосов, приматов, таких как низшие обезьяны, шимпанзе и высшие обезьяны. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения субъектом является человек.
В контексте настоящего описания термины "антагонист" и "ингибитор" относятся к молекулам или соединениям, которые ингибируют действие "нативных" или "естественных" молекул или соединений.
В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения описанные здесь соединения вводят системно. В контексте настоящего описания "системное введение" относится к любым средствам, с помощью которых соединения, описанные здесь, могут быть сделаны системно доступными. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения системное введение включает в себя внутривенное введение, внутрибрюшинное введение, внутримышечное введение, внутрикоронарное введение, внутриартериальное введение (например, в сонную артерию), внутрикожное введение, подкожное введение, чрескожную доставку, введение в трахею, подкожное введение, внутрисуставное введение, внутрижелудочковое введение, ингаляции (например, аэрозоль), внутримозговое, назальное введение, введение через пупок, пероральное, внутриглазное введение, введение в легкие, введение через вставленный катетер, введение с помощью суппозиториев и путем инъекции непосредственно в ткани, или местное введение с системным всасыванием, или введение через слизистую оболочку. Введение через слизистую оболочку включает в себя введение в дыхательные ткани, например, путем ингаляции, капли в нос, глазные капли, и т.д.; анальные или вагинальные пути введения, например, суппозитории; и тому подобное. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения описанные здесь соединения вводят внутривенно. В других вариантах реализации настоящего изобретения описанные здесь соединения вводят перорально. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения описанные здесь соединения могут быть введены внутривенно от одного до пяти раз в неделю. В некоторых других вариантах реализации настоящего изобретения описанные здесь соединения могут быть введены перорально один или несколько раз в день (например, один раз в день, два раза в день или три раза в день).
Фармацевтические композиции, пригодные для использования в настоящем изобретении, могут также содержать вспомогательные вещества, консерванты, фармацевтически приемлемые носители и их комбинации, термин "фармацевтически приемлемый носитель или вспомогательное вещество" означает носитель или вспомогательное вещество, которые являются подходящими для получения фармацевтической композиции, которая обычно безопасна, нетоксична и не является ни биологически, ни иным образом нежелательной, и содержит носитель или вспомогательное вещество, приемлемые для применения в ветеринарии, а также в фармацевтических целях для человека. Термин "фармацевтически приемлемый носитель или вспомогательное вещество", применяемый в описании и формуле изобретения, включает в себя как один, так и более чем один такой носитель или вспомогательное вещество.
Примеры подходящих вспомогательных веществ включают в себя, но не ограничиваются ими, лактозу, декстрозу, сахарозу, сорбит, маннит, крахмалы, камедь акации, фосфат кальция, альгинаты, трагакант, желатин, силикат кальция, микрокристаллическую целлюлозу, поливинилпирролидон, целлюлозу, воду, физиологический раствор, сироп, метилцеллюлозу, этилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу и полиакриловые кислоты, такие как карбополы. Композиции могут дополнительно содержать лубриканты, такие как тальк, стеарат магния и минеральное масло; смачивающие агенты; эмульгаторы; суспендирующие агенты; консерванты, такие как метил-, этил- и пропилгидроксибензоаты; регулирующие рН агенты, такие как неорганические и органические кислоты и основания; подсластители; и вкусовые агенты.
Способы по настоящему изобретению могут быть также применены в сочетании с другими режимами лечения. Например, один вариант реализации настоящего изобретения относится к комбинированной терапии, в которой эриторан или его фармацевтически приемлемую соль применяют в комбинации с одним или более антивирусным препаратом, известным в данной области техники.
В настоящее время существует два основных класса противовирусных препаратов, применяемых против гриппа: ингибиторы нейраминидазы, такие как занамивир и озелтамивир, или ингибиторы вирусного белка М2, такие как амантадин и римантадин. Настоящее изобретение относится к способам лечения, которые сочетают эриторан или его фармацевтически приемлемую соль с ингибиторами нейраминидазы, ингибиторами вирусного белка М2 или их комбинацией.
ПРИМЕРЫ
Мыши
Были приобретены WT C57B L/6J мыши 6-8-недельного возраста (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME). Все эксперименты на животных проводили с одобрения соответствующих инстанций.
Вирус
Адаптированный к мышам вирус гриппа H1N1 A/PR/8/34 ("PR8") (АТСС, Manassas, VA) выращивали в аллантоисной жидкости 10-дневных оплодотворенных куриных яиц, как описано ранее (J.R. Tejaro et al, J. Immunol., 182: 634-6843 (2009)). Данный вирус был предоставлен доктором Donna Farber (Колумбийский университет). Неадаптированный человеческий штамм вируса гриппа A/Wuhan359/95 (H3N2) получали и выращивали, как описано ранее (Ottolini et al, J. Gen. Virol., 86:2523-2830 (2005)). Неадаптированный человеческий штамм вируса гриппа A/California/07/2009 (человеческая пандемия H1N1) был любезно предоставлен Ted Ross (Университет Питтсбурга).
Заражение вирусом и лечение
50
Мышей C57B L/6J WT инфицировали адаптированным к мышам вирусом гриппа, штамм А/ PR/8/34 (PR8; ~7500 TCID, интраназально, 25 мкл/ноздрю; эта доза, как было установлено в предварительных экспериментах, убивает ~90% инфицированных мышей). Через два дня после инфицирования мыши получали либо плацебо, либо эриторан (200 мкг/мышь в 100 мл стерильной воды, внутривенно) в день (от дня 2 до дня 6). Там, где указано, эриторан вводили за 3 ч до инфицирования в течение 5 дней подряд. В некоторых экспериментах некоторые группы мышей подвергали лечению эритораном, начиная с 4-го дня или 6-го дня после инфицирования и подвергали лечению в течение 5 или 3 последовательных дней соответственно. Проводили ежедневный мониторинг мышей на предмет выживаемости, потери веса, и клинических признаков болезни (например, вялости, пилоэрекции, потрепанности меха, выгибания спины, быстрого поверхностного дыхания) в течение 14 дней. Клиническая оценка, находящаяся в пределах от 0 (нет симптомов) до 5 (умирающие), была приписана каждой мыши ежедневно. В некоторых экспериментах мышей умерщвляли в указанные промежутки времени после инфицирования до сбора сыворотки для уровней ферментов печени или легких для анализа экспрессии генов, патологии легких или титров вируса.
Эриторан защищает мышей от смертельного заражения гриппом
50
На фигуре 1а показан первоначальный протокол. На "День 0" 6-8 недельных самок мышей инфицировали интраназально (и.н.) дозой PR8, которая была определена такой, чтобы убить ~90% мышей (7500 TCID). Начиная с 2 дней после инфицирования мыши получали либо эриторан (200 мкг/мышь в 100 мкл стерильной воды, внутривенно) или плацебо (производства Eisai) один раз в день в течение 5 последовательных дней (со дня 2 до дня 6). Каждую мышь взвешивали и записывали клинические симптомы (например, вялость, пилоэрекцию, потрепанность меха, выгибание спины, быстрое поверхностное дыхание, слышимые хрипы) ежедневно в течение 2 недель. Эриторан и соответствующее плацебо (производства Eisai Inc.; Andover, MA) приготовили при 2,33 мг/мл в стерильной, не содержащей эндотоксинов воде, и разбавили для инъекции 5% водным раствором декстрозы с добавлением бикарбоната натрия в качестве буфера. Как показано на фиг. 1b, мониторинг выживаемости проводили ежедневно. На фигуре 1 с приведены результаты измерения массы в течение 14-дневного периода. Результаты представлены в виде двух отдельных экспериментов, каждый с 5 мышей/лечение/эксперимент.
Опосредованное эритораном лечение гриппа зависит от времени
50
Мышей инфицировали PR8 (PR8; ~7500 TCID, интраназально). Мышей подвергали лечению или не подвергали лечению эритораном, начиная от дней 2, 4, или 6 после инфицирования. Мыши, получавшие эриторан в дни 2 или 4, получали пять лечений в последующие дни. Мыши, получавшие эриторан на 6-й день, получали лечение в течение трех дней подряд.
Дополнительное лечение не было возможно для мышей на 6-й день из-за тяжести инфекции. На фиг. 2а показан процент выживаемости (дни 2 и 4, р<0,01, день 6, р<0,05) у мышей, получавших лечение начиная со дней 2, 4, и 6 по сравнению с мышами, не получавшими лечение. На фиг. 2с показано процентное снижение массы у мышей, получавших лечение начиная со дней 2, 4, 6 по сравнению с мышами, не получавшими лечение. На фиг. 2b показаны клинические показатели (на основе определенных критериев, например, потрепанность меха, вялость и т.д.) для каждого подмножества мышей (M.D. Tate, el al; Respiratory Research, 9:57, 1-13 (2008)). Результаты представлены в виде объединенных результатов от двух до трех отдельных экспериментов с 5 мышами на лечение на эксперимент.
Опосредованное эритораном лечение гриппа зависит от дозы
50
50
Мышей инфицировали (интраназально) 7500 TCID PR8. Мышей оставляли без лечения или подвергали лечению эритораном (200 мкг/мышь или 20 мкг/мышь), начиная со 2 дня в течение 5 дней подряд. Как показано на фигурах 3а и 3b, мыши, инфицированные 7500 TCID и подвергнутые лечению эритораном 200 мкг/мышь, показали улучшенную выживаемость (4/5 мыши выжили) по сравнению с мышами, получившими только 20 мкг/мышь (4/10 выжили) с 1/5 выживаемости в группе без лечения. Таковы результаты одного эксперимента.
Опосредованная эритораном защита преодолевается повышенными дозами вируса гриппа
50
50
50
50
50
50
7
Мышей инфицировали (интраназально) либо 7500 TCID, либо 10000 ТСID, либо 20000 TCID PR8. Мышей оставляли без лечения или подвергали лечению эритораном, начиная со 2 дня после инфицирования. Мыши, инфицированных 7500 TCID и подвергнутые лечению эритораном, показали выживаемость 88% (фиг. 4а), в то время как мыши, которых инфицировали 10000 (фиг. 4б) или 20000 (фиг. 4в) TCID и подвергали лечению эритораном, показали 55% и 22% выживаемость соответственно. Результаты представлены в виде объединенных результатов двух отдельных экспериментов с 4-5 мышей/группа лечения/эксперимент. Мышей инфицировали (интраназально) 10 ТСID A/California/07/2009 H1N1 (фиг. 4d). Мышей оставляли без лечения или подвергали лечению эритораном начиная со 2 дня после инфицирования и подвергали лечению в течение 5 дней подряд. Мониторинг выживаемости мышей проводили в течение 14 дней. Это объединенные результаты 2 отдельных экспериментов, каждый из которых проводился с 4-5 особями/группа лечения/эксперимент.
Лечение эритораном снижает титры вируса у инфицированных субъектов
50
Мышей инфицировали (интраназально) 50 мкл PR8 (~7500 ТСID/мышь). Лечившиеся мыши получали 100 мкл эриторана (200 мкг/мышь) внутривенно начиная со 2 дня после инфицирования. Титры вируса получали из супернатантов гомогенатов легких PR8-инфицированных мышей и выражали в виде TCIDso/мл, как описано выше (Shirey КА et al., J. Leukoc. Biol., 89(3):351-7 (2011)). На фиг. 5a и 5b показаны взятые для исследования легкие в дни 2, 4, 6 и 7 после инфицирования. На фиг. 5а представлены объединенные результаты двух экспериментов с 5 мышей/группа/эксперимент. Лечение эритораном привело к статистически значимому снижению титров вируса в легких. Как можно видеть на фиг. 5b, титры вирусов в легких дополнительно снизились в группе лечения эритораном на 7-й день.
Лечение эритораном смягчает вызванную гриппом патологию легких
50
Мышей инфицировали (интраназально) 50 мкл PR8 (~7500 ТСID/мышь). Затем мышам вводили внутривенно 100 мкл эриторана (200 мкг/мышь) начиная со 2 дня после инфицирования. Затем мышей умерщвляли на 7 день после инфицирования (день 2 после лечения эритораном) и извлекали легкие для исследования патологии легких (4 мыши/группа лечения). Мышиные легкие накачивали воздухом, заливали раствором и фиксировали в 4% PFA. Зафиксированные участки (8 мкл) из залитых в парафин легких окрашивали гематоксилином и эозином (Н&Е). Срезы рандомизировали, вслепую снимали показания и исследовали на наличие повреждения тканей, некроза, апоптоза и провоспалительной клеточной инфильтрации. На фиг. 6а показаны изображения патологии легких в 10-кратном увеличении. Легкие с PR8+эритораном были почти нормальными в ~80% участков легких; однако в ~20% участков легких наблюдались воспалительные инфильтраты, хотя и в значительно меньшей степени, чем наблюдалось для PR8-инфициpoвaнныx мышей контрольной группы. Эти результаты подкреплены слепой гистологической оценкой (фиг. 6b). Измерения пульсоксиметрии выполняли, чтобы подтвердить эти наблюдения. К 6 дню после инфицирования уровни насыщения крови кислородом, наблюдаемые между ложно-инфицированными и PR8-инфициpoвaнными мышами, продемонстрировали значительную десатурацию оксигемоглобина до 78%, что свидетельствует о функциональном следствии альвеолярной травмы, продемонстрированном гистологически (фиг. 6с).
Чтобы определить, распространяется ли терапевтический эффект на другие животные модели инфекции гриппа человека, эксперименты по инфицированию проводили на хлопковых хомяках. A/Wuhan/359/95 (H3N2), неадаптированный к человеку штамм вируса гриппа, размножается в легких хлопковых хомяков на 1-ый день и обеспечивает пиковую патологию легких на 4-й день после инфицирования (фиг. 6d, панель b и фиг. 6е, только H3N2). Животные, подвергнутые лечению эритораном после H3N2-заражения, показали значительное снижение легочной патологии на 4-й день (фиг. 6d, панель с и фиг. 6е, H3N2/E5564).
Лечение эритораном снижает индуцированную гриппом выработку цитокинов
50
Мышей инфицировали (интраназально) 50 мкл PR8 (-7500 TCID/мышь). Мышам вводили внутривенно 100 мкл эриторана (200 мкг/мышь) начиная со 2 дня после инфицирования. Мышей умерщвляли в дни 2, 4 и 6 после инфицирования и извлекали легкие для исследования тотальной РНК. Проводили выделение тотальной РНК и ПЦР в реальном времени, как описано ранее (Shirey КА et al, J. Immunol., 181 (6):4159-67 (2008); Shirey KA et al, Mucosal Immunology, 3(3):291-300 (2010)). Уровни мРНК для специфических генов представляли в виде относительной экспрессии гена, стандартизированной к ложно-инфицированным легким. Результаты вывели из двух экспериментов (4 мыши/группа лечения). Мыши, подвергнутые лечению эритораном, показали значительно сниженную экспрессию генов цитокинов в каждый момент времени (фиг. 7а).
Подвергнутые лечению эритораном мыши показали различные уровни выработки интерферона по сравнению с контрольными мышами в зависимости от вида измеренного интерферона мРНК (фиг. 7b). Лечение эритораном у хлопковых хомяков, инфицированных не адаптированным к человеку штаммом Wuhan H3N2, показало сниженную легочную экспрессию ИЛ-6 и ИЛ-10 (фиг. 7c ).
Результаты лечения эритораном при более низких уровнях индуцированных вирусом гриппа ферментов печени
50
Мышей инфицировали (интраназально) 50 мкл PR8 (~7500 TCID/мышь). Мышам вводили внутривенно 100 мкл эриторана (200 мкг/мышь) начиная со 2 дня после инфицирования. Сыворотку собирали на 7-й день от C57B L/6J WT мышей, которые были либо ложно-инфицированы физиологическим раствором, либо инфицированы PR8, и либо остались без лечения, либо были подвергнуты лечению эритораном начиная со 2 дня после инфицирования. Были измерены аланинамино-трансаминаза (ALT) и Аспартатамино-трансаминаза (AST) (Siemens Healthcare Diagnostics, Ltd.). Как показано на фиг. 8а и 8b, мыши, подвергнутые лечению эритораном, показывали более низкие уровни ферментов печени после инфицирования. Данные представлены в виде 2 отдельных экспериментов с 4 мышами на лечение на эксперимент.
Эриторан подавляет индуцированные гриппом окисленные фосфолипиды хозяина (ОхРL)
-/-
-/-
-/-
-/-
Перитонеальные макрофаги дикого типа C57B L/6J, TLR4 и TLR2 предварительно обрабатывали эритораном (10 нг/мл) в течение 1 часа, а затем подвергали лечению только средой, LPS (20 нг/мл), РЗС (300 нг/мл) и ОхРАРС (20 мкг/мл), и была измерена экспрессия РНК. Коммерчески приобретенный ОхРАРС активировал экспрессию гена ИЛ-6 в мышиных перитонеальных макрофагах WT и TLR2, но не в клетках, взятых у мышей TLR4 (фиг. 9). Эриторан существенно подавлял TLR4-зависимую активацию клеток посредством ОхРАРС.
+/-
Данные представлены в виде среднего стандартная ошибка среднего из 1 эксперимента с образцами, полученными в трех повторностях (*р<0,001, #р<0,05).
Для оценки действия эриторана по выработке окисленных фосфолипидов во время инфицирования, применяли MALDI-IMS для определения изменения в липидном составе легких мышей после PR8, с или без лечения эритораном.
Продукты окисления были обнаружены в большем количестве и интенсивности в PR8-инфицированных мышах по сравнению с мышами, которых после инфицирования подвергали лечению эритораном, или ложно-инфицированными мышами. (Фиг. 10а). Результаты являются репрезентативами 4-х повторных экспериментов. Показаны структуры молекул и молекулярные массы имеющегося в избытке фосфатидилхолина (ФХ) и окисленного (согласно предположению) фосфатидилхолина (окФХ): 1-пальмитоил-2-линолеил-ФХ (РАРС), m/z 757,6; L-пальмитоил-2-арахидонил-ФХ (РАРС), m/z 782,1 и структур (согласно предположению) молекул и молекулярной массы окисленных ФХ, 1-пальмитоил-2-(9-оксо) нонаноил ФХ (PONPC) m/z 649,4, (PEIPC) 1-пальмитоил-2-(5,6-эпоксиизопростан-Е2-оил)-ФХ m/z 828,1 (Фиг. 10b).
50
Как описано выше, лечение эритораном инфицированных гриппом мышей защищало мышей от вызванной гриппом летальности. Чтобы показать, что защита не была вызвана прямым действием эриторана на репликацию вируса, вирусный материал A/California/07/2009, H1N1 (титр 106 TCID/мл) титровали эритораном в MDC клетках (10 нг/мл) или без эриторана (носитель). Эриторан применяли за 1 час до или одновременно с тем, когда засеивали вирус в клеточную пластинку. Эксперименты 1 и 2 представляют собой два независимых эксперимента, выполненных с двумя отдельными вирусными материалами.
Эриторан не способен обеспечить защиту РR8-инфицированным мышам с выключенным IFN-β
-/-
-/-
-/-
50
Лечение эритораном не вызывает защиту у инфицированных PR8 IPNβ мышей. Мышей дикого типа и IPNβ мышей инфицировали ~7500 TCID PR8 и либо оставляли без лечения (кружки), либо подвергали лечению эритораном через 2 дня после инфицирования в течение 5 дней подряд (квадраты). (Фиг. 11). Данные представлены в виде объединенных результатов 2-х отдельных экспериментов (6 мышей на лечение на эксперимент; WT: те, которых оставляли без лечения, против тех, которых подвергали лечению эритораном (р<0,0013); IPNβ: те, которых оставляли без лечения, против тех, которых подвергали лечению эритораном (p=ns).
MD1 не является альтернативной мишенью для эриторана
MD-1 не может заменить MD-2 для стимуляции LPS. Клетки НЕК293, в которых стабильно экспрессируются CD14 и TLR4 (НЕК293-CD14-TLR4) были трансфицированы MD-2, MD-1 или пустым вектором (ПВ). (Фиг. 12). Через 48 или 72 часа после трансфекции клетки были ложно стимулированы PBS или стимулировали Е. coli К235 LPS (10 нг/мл). Супернатанты собирали через 24 часа после стимуляции и анализировали на общих ИЛ-8 уровнях посредством ELISA. Данные представлены в виде среднего и стандартной ошибки среднего для культур в одном эксперименте и отражают n=3 в эксперименте (**р<0,005, ***р<0,001).
Требования к молекулам для индуцированной эритораном защите
-/-
-/-
-/-
Нормальных мышей (WT), TLR4, TLR2, и CD14 инфицировали гриппом, а затем оставляли без лечения (закрашенные кружки) или подвергали лечению эритораном (кружки) через 2 дня после инфицирования в течение 5 дней подряд. (Фиг. 13а). Как можно видеть, вызванная гриппом летальность была ТLR4-зависимой, но не СD14-зависимой или TLR2-зависимой.
-/-
-/-
-/-
-/-
-/-
-/-
-/-
Кроме того, лечение эритораном через 2 дня после инфицирования было неэффективным относительно индуцирования защиты ни у TLR2, ни у CD14 мышей. Данные WT были объединены из 5-ти отдельных экспериментов (5-6 мышей на лечение на эксперимент), данные TLR4 были объединены из 3-х отдельных экспериментов (5-6 мышей на лечение на эксперимент), данные CD14 были объединены из 2-х отдельных экспериментов (4-5 мышей на лечение на эксперимент). WT: оставленные без лечения в сравнении с подвергнутыми лечению эритораном (р, 0,0001); TLR4: оставленные без лечения в сравнении с подвергнутыми лечению эритораном (p=ns); CD14: оставленные без лечения в сравнении с подвергнутыми лечению эритораном (p=ns); TLR2: оставленные без лечения в сравнении с подвергнутыми лечению эритораном (p=ns).
3
3
3
3
3
3
3
На фигуре 13b показана способность эриторана связывать in vitro CD14 и MD2, как измерено опосредованным эритораном ингибированием LBP-зависимой передачи тритированного липоолигосахарида (H-LOS; the LPS of Neisseria) в CD14 (фиг 13b, графики слева), а также передачи H-LOS из CD14 в MD2 (фиг. 13b, графики справа). Образцы, содержащие агрегаты [H]LOS (0,2 нМ), IIis6-sCD14 (~0,5 нМ), а также увеличенные концентрации, как указано, эриторана или немаркированного LOS (графики слева), или 2 нМ [H]LOS.sCD14, приблизительно 2 нМ His6-MD2, и увеличенные концентрации эриторана (или носителя)±LBP (50 пМ) и sCD14 (2 нМ) (графики справа) инкубировали в течение 30 мин при 37°С с последующим добавлением и инкубацией с гранулами NiFF Sepharose для захвата His-меченных белков. Формирование комплексов [H]LOS с His6-sCD14 (слева) или MD2 (справа) анализировали путем измерения со-захвата [H]LOS посредством NiFF Sepharose, как ранее было описано 25. Данные выражены в виде процента со-захвата [H]LOS, наблюдаемого в отсутствии добавленного эриторана. Показанные результаты представлены в виде среднего±стандартная ошибка среднего из 3 отдельных экспериментов с дублированными образцами для каждой дозы.
Статистика
Статистические различия между двумя группами были определены с применением двухвыборочного непарного критерия Стьюдента со значением, установленным при р<0,05. Для сравнений между тремя или более группами анализ провели с помощью одностороннего дисперсионного анализа с последующим применением критерия Тьюки для множественных сравнений со значением, определенным при р<0,05.