ИММУНОГЕННАЯ КОМПОЗИЦИЯ ЦИТОМЕГАЛОВИРУСА ЧЕЛОВЕКА
IMMUNOGENIC COMPOSITION OF HUMAN CYTOMEGALOVIRUS

Изобретение относится к иммуногенной композиции, содержащей антиген гликопротеин B цитомегаловируса человека (антиген HCMV gB), пентамерный сложный антиген HCMV gH/gL/UL128/UL130/UL131 и Th1-индуцирующий адъювант. Дополнительно изобретение относится к иммуногенной композиции для применения в качестве вакцины против цитомегаловируса человека (HCMV-вакцины).
Уровень техники
Цитомегаловирус человека (HCMV) представляет собой повсеместно распространенный вирус, принадлежащий к семейству вирусов герпеса. Этот вирус состоит из линейной двухцепочечной дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), содержащейся в капсиде, окруженном оболочкой и заключенным в липидный бислой, на поверхности которого имеются гликопротеиновые отростки. Подобно другим членам этого семейства HCMV обладает свойствами латентности и реактивации. HCMV способен инфицировать многие клетки и находиться в них в латентном состоянии.
Большинство HCMV-инфекций в организме иммунокомпетентного хозяина являются бессимптомными или проявляются очень слабо в виде некоторых неспецифических симптомов, таких как слабость, недомогание, умеренная лихорадка, лимфаденопатия, гепатомегалия или небольшое повышение уровня ферментов печени. Вместе с тем, приблизительно у 10% ранее здоровых индивидуумов наблюдается гетерофил-отрицательный мононуклеоз.
Напротив, у внутриутробно инфицированных новорожденных и у взрослых с иммуносупрессией, обусловленной СПИДом или трансплантацией солидного органа или костного мозга, клинические проявления могут быть очень тяжелыми.
Распространенность HCMV-инфекции увеличивается с возрастом и зависит от социально-экономических факторов. По результатам серологических исследований более высокая распространенность выявлена в развивающихся странах и в нижних социально-экономических группах развитых стран. Среди женщин репродуктивного возраста доля сероположительных по HCMV женщин составляет приблизительно от 50% в развитых странах в группах с высоким и средним доходом до более 80% в популяциях с низким уровнем дохода. Исследования, проведенные в различных западноевропейских странах в течение двух последних десятилетий в общей популяции, включающей различные возрастные группы женщин и мужчин, в целом показали, что серологическая распространенность HCMV у детей и подростков составляет от 40 до 50%, тогда как у взрослых субъектов (40 лет и старше) серологическая распространенность HCMV превышает 80%.
Инфицированные люди выделяют HCMV в течение длительного периода, в том числе при секреции слюны, молока, мочи, спермы, генитальных секретов; таким образом, передача HCMV происходит или по горизонтали (через тесный контакт от ребенка к ребенку, от ребенка к родителям и между половыми партнерами), или по вертикали от матери к плоду или младенцу через плаценту или при рождении через контакты с жидкостями организма, и при кормлении грудью или при воздействии продуктов крови или трансплантированных органов.
Цитомегаловирус человека является наиболее распространенной причиной врожденной инфекции в развитых странах. К врожденным инфекциям относятся инфекции, передаваемые от матери к плоду до рождения ребенка. Установлено, что ежегодно в Соединенных Штатах Америки появляется 8000 новорожденных с обусловленными врожденным инфицированием HCMV патологиями, включающими задержку умственного развития, слепоту и нейросенсорную глухоту.
От 5% до 10% новорожденных с врожденной инфекцией имеют основные симптомы при рождении, такие как микроцефалия, хориоретинит, интракраниальные кальцинозы, гепатоспленомегалия, гепатит, желтуха, прямая гипербилирубинемия, тромбоцитопения, петехии и анемия. Смертность среди этих новорожденных с симптоматической врожденной HCMV-инфекцией составляет приблизительно 10% в раннем возрасте, а среди выживших детей от 50 до 90% имеют последствия, такие как задержка умственного развития, церебральный паралич, нейросенсорная глухота или нарушение зрения.
У многих младенцев с врожденной HCMV-инфекцией при рождении отсутствует симптоматика. Последующие исследования показали, что приблизительно у 15% младенцев с отсутствием симптоматики при рождении и подтвержденным с помощью вирусологического скрининга HCMV-сероположительным ответом в периоде новорожденности, будут наблюдаться последствия, такие как нарушения слуха или нарушения центральной нервной системы.
В целом в Европе и в США постоянные последствия этой инфекции выявляют приблизительно у 17000 новорожденных ежегодно.
Врожденные HCMV-инфекции возникают чаще и протекают в более тяжелой форме, если первичное инфицирование происходит в первом триместре беременности, в отличие от первичного инфицирования на более позднем сроке беременности. В целом, риск передачи инфекции плоду при первичном инфицировании HCMV во время беременности составляет40%.
В настоящее время не существует эффективных средств профилактики или лечения HCMV-инфекции матери во время беременности или при врожденном инфицировании HCMV.
Также HCMV является серьезным вирусным патогеном для больных СПИДом и для реципиентов при трансплантации органов и костного мозга. Уровень обусловленной HCMV заболеваемости у сероотрицательных по HCMV реципиентов после трансплантации органов приближается к 60%. При трансплантации солидных органов заболевание протекает наиболее тяжело в случае пересадки трансплантата сероотрицательным пациентам от HCMV-положительного донора. В противоположность этому, наиболее тяжелая степень заболевания отмечается у HCMV-сероположительных пациентов при трансплантации костного мозга или стволовых клеток от сероотрицательного донора, свидетельствуя о том, что возникновение HCMV-инфекции представляет собой реактивацию эндогенной инфекции.
Приблизительно у 15% реципиентов после аллотрансплантации цитомегаловирус человека вызывает пневмонию, гепатит, заболевание желудочно-кишечного тракта, супрессию костного мозга и ретинит. В дополнение к этим непосредственным заболеваниям органов-мишеней, HCMV-инфекция является причиной опосредованных эффектов, таких как отторжение трансплантата, ускоренное развитие атеросклероза и иммуносупрессия, которая может приводить к бактериальной или грибковой инфекции.
et al.
et al.
th
Таким образом, разработка вакцины против HCMV считается важной задачей здравоохранения, согласно отчетам Института Медицины о назначении приоритета в разработке вакцин ((Institute of Medicine: Kathleen R, Stratton, Jane S, Durch, Lawrence RS. Editors committee to study priorities for Vaccine Development Division of Health Promotion and Disease Prevention Institute of Medicine. В издании: Vaccines for the 21st century: A tool for decision making. Washington D.C.: National Academy Press; 2000). Было описано множество вакцин-кандидатов, но до настоящего времени ни одна из таких вакцин не была лицензирована (Plotkin , Vaccines, 6edition, Ed. Elsevier, 2013, Schleiss , Cytomegalovirus vaccines, стр. 1032-1041).
Содержащая гликопротеин-B вакцина против цитомегаловируса с адъювантом MF59 показала многообещающие результаты во II фазе рандомизированного плацебо-контролируемого исследования у реципиентов после трансплантации (Griffiths et al., Lancet, 2011, 377(9773):1256-63). Во II фазе двойного слепого рандомизированного плацебо-контролируемого исследования среди женщин репродуктивного возраста оценивали такую вакцину, состоящую из рекомбинантного оболочечного гликопротеина B HCMV с адъювантом MF59, по сравнению с плацебо. Результаты показали 50%-ную эффективность в предотвращении первичного заражения HCMV. Вместе с тем, при исследовании иммуногенности было показано, что уровень нейтрализующих антител (Ab), индуцированных композицией gB/MF59, выходит на пиковый уровень через один месяц после введения третьей дозы, а затем быстро снижается (Pass et al., The New England Journal of Medecine, 2009, 360: 1191-9).
В этой связи, существует потребность в улучшении эффективности вакцины против HCMV, в частности, в разработке вакцины, которая повышает уровень нейтрализующих антител и создает длительную защиту путем индукции устойчивого иммунного ответа. Также существует потребность в создании вакцины против HCMV, которая более эффективно индуцирует более широкий иммунный ответ.
Описание изобретения
Авторы настоящего изобретения неожиданно нашли новую иммуногенную композицию, которая соответствует указанным требованиям.
Таким образом, настоящее изобретение относится к иммуногенной композиции, содержащей антиген HCMV gB, пентамерный сложный антиген HCMV gH/gL/UL128/UL130/UL131 и Th1-индуцирующий адъювант.
В частности, указанный Th1-индуцирующий адъювант включает:
- агонист TLR-4; или
- полимер полиакриловой кислоты с усредненной молекулярной массой Mw в диапазоне от 350 до 650 кДА.
В одном варианте осуществления указанный Th1-индуцирующий адъювант включает агонист TLR-4.
В частности, указанный агонист TLR-4 представлен в комбинации с системой доставки, такой как водная наносуспензия, фосфат кальция, липосомы, виросомы, конъюгаты с вакцинными свойствами (ISCOM), микрочастицы и наночастицы или эмульсии.
Более конкретно, указанная система доставки представляет собой эмульсию типа "масло-в-воде".
В частности, указанный агонист TLR-4 выбран из агонистов TLR-4: Е6020 (номер CAS: 287180-63-6) и GLA (номер CAS 1246298-63-4).
В одном варианте осуществления указанный Th1-индуцирующий адъювант содержит полимерную соль линейной или разветвленной полиакриловой кислоты с усредненной молекулярной массой Mw в диапазоне от 350 до 650 кДа, в частности, PAA225000.
В частности, указанный антиген HCMV gB несет одну или несколько мутаций в сайте эндопротеолитического расщепления.
В частности, указанный антиген HCMV gB представляет собой полноразмерный полипептид gB, полноразмерный полипептид gB с отсутствием по меньшей мере части трансмембранного домена, полноразмерный полипептид gB с отсутствием по существу всего трансмембранного домена, полноразмерный полипептид gB с отсутствием по меньшей мере части внутриклеточного домена, полноразмерный полипептид gB с отсутствием по существу всего внутриклеточного домена или полноразмерный полипептид gB с отсутствием по существу как трансмембранного домена, так и внутриклеточного домена.
Более конкретно, указанный антиген HCMV gB представляет собой gBdTm.
В частности, в указанном пентамерном сложном антигене HCMV gH/gL/UL128/UL130/UL131 отсутствует по меньшей мере часть трансмембранного домена в gH-антигене, предпочтительно в gH-антигене по существу отсутствует трансмембранный домен.
Более конкретно, указанный gH включает эктодомен полноразмерного gH, кодируемый геном UL75.
В частности, в иммуногенной композиции согласно изобретению HCMV gB и пентамерный сложный антиген HCMV gH/gL/UL128/UL130/UL131 являются единственными антигенами HCMV.
Дополнительно, настоящее изобретение относится к иммуногенной композиции по изобретению для применения в качестве вакцины против HCMV.
В частности, указанная вакцина повышает уровень и/или устойчивость нейтрализующих антител.
Иммуногенная композиция
Как упоминалось ранее, иммуногенная композиция согласно изобретению содержит:
- антиген HCMV gB;
- пентамерный сложный антиген Th1/gL/UL128/UL130/UL131; и
- Th1-индуцирующий адъювант.
Термин "HCMV" используется для обозначения цитомегаловируса человека и относится к любому штамму цитомегаловируса человека.
Выражения "содержащий"/"содержит" / "содержать" объединяют в себе выражения "включающий" /"включает"/"включать", соответственно, а также "состоящий из" / "состоит из" / "состоять из", соответственно. Например, композиция, "содержащая" X, может состоять исключительно из X или может включать в себя что-либо дополнительное, например, X+Y.
Используемый в изобретении термин "антиген" имеет обычное значение, известное специалистам в данной области. В частности, этот термин относится к любой молекуле, содержащей один или несколько эпитопов (или линейных, или конформационных, или оба типа эпитопов), которая вызывает иммунологический ответ.
Согласно настоящему изобретению, антиген дополнительно включает белок, имеющий модификации в нативной последовательности, такие как делеции, добавления и замены, при условии, что белок сохраняет достаточную иммуногенность. Эти модификации могут сделаны умышленно, например, посредством сайт-направленного мутагенеза, или могут быть случайными, такими как мутации, которые происходят в ходе экспрессии антигенов в клетке-хозяине. Антиген может также представлять собой белок или его фрагмент, кодируемый консенсусной последовательностью.
Антиген (антигены), которые можно использовать в иммуногенной композиции по изобретению, представляют собой, в частности, антиген HCMV gB и пентамерный сложный антиген HCMV gH/gL/UL128/UL130/UL131.
Антиген HCMV gB
Антиген HCMV gB по настоящему изобретению представляет собой полноразмерный полипептид gB или полученный из gB полипептид, который индуцирует нейтрализующие антитела.
Et al.
etal.
et al.
Антиген gB кодируется геном UL55 из генома HCMV. Размер нативной формы gB (или gp130) зависит от размера открытой рамки считывания (ORF), которая имеет незначительную вариабельность в зависимости от штамма. Например, ORF штамма AD169 длиной 2717 пар нуклеотидов (п.н.) кодирует полноразмерный gB из 906 аминокислот, а ORF штамма Towne кодирует полноразмерный gB из 907 аминокислот. Последовательности белков этих двух штаммов описаны в US 2002/0102562 (фигура 2), включенном в настоящее изобретение в качестве ссылки. Нативная форма gB содержит аминокислотную сигнальную последовательность, длина которой обычно составляет от 23 до 25 аминокислот, за которой следует внеклеточный домен, содержащий сайт эндопротеолитического расщепления между остатками аргинина 460 и серина 461, затем трансмембранный домен и внутриклеточный домен. Обычно полноразмерный gB обеднен аминокислотной сигнальной последовательностью в результате посттрансляционных механизмов, которые происходят в клетках. Следует понимать, что подходящий полноразмерный gB для целей изобретения охватывает как полноразмерный gB из HCMV штаммов Towne и AD169, так и другие эквивалентные штаммы. Было описано несколько антигенных доменов, индуцирующих нейтрализующие антитела. В частности, к ним относится домен, который расположен между аминокислотными остатками 461 и 680 в gp 130, причем этот домен разделен на два прерывистых домена, домен между остатками 461 и 619 и домен между остатками 620 и 680 (патент US 5547834). К таким доменам также относятся антигенный домен 1 (AD-1), расположенный между аминокислотными остатками 560 и 640 (Schoppel K. , Virology, 1996, 216:133-45),или антигенный домен 2 (AD-2), расположенный между аминокислотными остатками 65 и 84 (Axelsson F, Vaccine, 2007, 26:41-6),или между аминокислотными остатками 27 и 84 (Burke HG , PLoSpathogens, 2015, 11:e1005227). Следовательно, для целей настоящего изобретения также подходит полипептид, который содержит в своей аминокислотной последовательности последовательность, гомологичную одному или нескольким указанным выше антигенным доменам. Понятие "последовательность, гомологичная …" относится к аминокислотной последовательности, идентичной по меньшей мере на 80% аминокислотной последовательности антигенного домена, которая считается происходящей из нативного gB из штамма Towne или AD169 (см. описание в US 2002/0102562). Обычно гомология последовательности основана на идентичности последовательности, составляющей по меньшей мере 90%, и более конкретно, гомология последовательности является полной (идентичность последовательности составляет 100%).
Согласно изобретению, уровень по меньшей мере х % идентичности первой последовательности со второй последовательностью означает, что х % отражает количество аминокислот в первой последовательности, которые идентичны соответствующим аминокислотам во второй последовательности, при этом обе последовательности оптимально выровнены по принципу глобального выравнивания относительно всей длины второй аминокислотной последовательности. Обе последовательности оптимально выровнены, если значение х является максимальным. Выравнивание и определение процента идентичности можно выполнять вручную или автоматически с использованием алгоритма глобального выравнивания, например, алгоритма Нидлмана-Вунша, описанного в статье Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48, 443-453, (1970), например, используя следующие параметры для сравнения полипептидных последовательностей: матрица сравнения: BLOSUM62, см. Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 89, 10915-10919 (1992), штраф за промежуток: 8 и штраф длины промежутка: 2; и следующие параметры для сравнения полинуклеотидной последовательности: матрица сравнения: совпадения = +10, несовпадения=0; штраф за промежуток: 50 и штраф длины промежутка: 3.
Программа, которую можно использовать с указанными выше параметрами, является общедоступной программой "gap" от Genetics Computer Group, Madison WI. Вышеупомянутые параметры представляют собой параметры по умолчанию, соответственно, для сравнения пептидов (при отсутствии штрафа для концевых пробелов) и для сравнений нуклеиновых кислот.
В число полученных из gB пептидов или полипептидов, которые подходят для целей настоящего изобретения, входит gp55, описанный в патенте US 5547834. Этот гликопротеин55 получают путем расщепления gB в сайте эндопротеолитического расщепления; его аминокислотная последовательность соответствует последовательности, которая находится между сериновым остатком 461 и С-концом. Можно также использовать усеченные формы gp55, такие как gp55, полностью или частично обедненный трансмембранной последовательностью, и полностью или частично обедненный внутриклеточным C-концевым доменом (например, пептид, имеющий последовательность, которая гомологична аминокислотной последовательности нативного gB между остатками 461 и 646) или gp55 с полным или частичным отсутствием внутриклеточного C-концевого домена (например, пептид, имеющий последовательность, которая гомологична аминокислотной последовательности нативного gB между остатками 461 и 680). Такие усеченные формы gp55 также описаны в патенте US 5547834, включенном в настоящее изобретение путем ссылки.
Также можно использовать мутированную форму полноразмерного gB, которая несет одну или несколько мутаций в сайте эндопротеолитического расщепления, таким образом, что такая форма становится непродуктивной. В частности, мутация (мутации) находится между остатками 457 и 460 последовательности gp130 и, более конкретно, расположена рядом с аргинином 460 и/или лизином 459 и/или аргинином 457. В этом аспекте мутированная форма полноразмерного gB несет весь внеклеточный домен со всеми доменами, которые являются мишенями для нейтрализующих антител. Такие мутированные формы могут быть вторично обедненными в отношении всей или части трансмембранной последовательности и/или всего или части внутриклеточного C-концевого домена для того, чтобы они могли секретироваться в клетке-хозяине и продуцироваться в виде рекомбинантных белков, и для их последующей легкой очистки. Такие gB-производные являются предпочтительными, поскольку по существу все домены, которые являются мишенями для нейтрализующих антител, являются консервативными.
Таким образом, в одном аспекте изобретения полипептид HCMV gB содержит одну или несколько мутаций в сайте эндопротеолитического расщепления, и, в частности, дополнительно полипептид HCMV gB выбран из группы полноразмерного HCMV gB, полноразмерного HCMV gB с отсутствием по меньшей мере части трансмембранного домена, полноразмерного полипептида gB с отсутствием по существу всего трансмембранного домена, полноразмерного полипептида gB с отсутствием по меньшей мере части внутриклеточного домена, полноразмерного HCMV gB с отсутствием по существу всего внутриклеточного домена, и полноразмерного полипептида HCMV gB с отсутствием по существу как трансмембранного домена, так и внутриклеточного домена.
Выражение "отсутствие практически всего внутриклеточного домена" или "отсутствие практически всего трансмембранного домена" означает, что удаляется по меньшей мере 80% аминокислотной последовательности, соответствующей указанному домену.
Согласно настоящему изобретению, "отсутствие по меньшей мере части домена" подразумевает отсутствие по меньшей мере 10% домена, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60% или по меньшей мере 70%, но не менее чем 80% домена.
В одном варианте осуществления антиген HCMV gB представляет собой эктодомен gB, то есть полноразмерный gB, обедненный в отношении всей трансмембранной последовательностью и всего внутриклеточного C-концевого домена. "Эктодомен" представляет собой часть трансмембранного заякоренного белка, который выступает за пределы мембраны во внеклеточное пространство.
Антиген HCMV gB по настоящему изобретению может также содержать другие мутации и/или делеции и/или добавления. Например, антиген HCMV gB может содержать по меньшей мере одну аминокислотную делецию или замену, по меньшей мере в одном из доменов: домен 1 слияния (FL1) и домен 2 слияния (FL2), расположенных во внеклеточном домене, как описано в ЕР 2627352. Альтернативно или дополнительно указанный антиген может содержать делецию по меньшей мере части лидерной последовательности, как описано в ЕР 2627352. Антиген HCMV gB по настоящему изобретению может также содержать мутацию, которая проявляется в сайте гликозилирования в гидрофобной поверхности 1 (аминокислотные остатки 154-160 и 236-243), как описано в WO 2016092460. В частности, указанный сайт гликозилирования представляет собой сайт N-гликозилирования, содержащий мотив N-X-S/T/C, в котором X представляет собой любой аминокислотный остаток (но предпочтительно не пролин). Антиген HCMV gB может содержать мутацию, которая проявляется в сайте гликозилирования, при этом указанный сайт гликозилирования расположен: 1) в гидрофобной поверхности 2 (аминокислотные остатки 145-167 и 230-252); или 2) в остатке, который находится в пределах 20 ангстрем от петли слияния 1 (FL1) (аминокислотные остатки 155-157) и/или петли слияния 2 (FL2) (аминокислотные остатки 240-242), как описано В WO 2016092460. Антиген HCMV gB может содержать гетерологичную последовательность, которая имеет по меньшей мере 12 остатков на C-конце, как описано в WO 2016092460. В частности, белок gB может представлять собой слитый белок, в котором гетерологичная последовательность слита на С-конце эктодомена.
et al.,
et al.,
Можно предположить, что нативный HCMV gB представляет собой гомотример, исходя из трехмерной кристаллографической структуры белков gB в родственных вирусах, а именно белка gB вируса простого герпеса 1 (Herpes Simplex -1 или HSV-1) и белка gB вируса Эпштейна-Барра (EBV), которые представляют собой гомотримеры (Heldwein Science, 2006, 313: 217-220; Baceovic PNAS, 2009, 106 (8): 2880-2885). Антиген HCMV gB по настоящему изобретению может представлять собой тримерную форму (нативную форму), и/или гексамерную форму (димер тримерной нативной формы), и/или додекамерную форму (димер гексамерной формы). В частности, антигенная часть HCMV-gB иммуногенной композиции по изобретению по существу не является мономерной формой, более конкретно, является немономерной формой. Выражение "по существу не мономерная форма" означает, что в мономерной форме находится менее чем 20% антигена HCMV gB, в частности менее чем 10%, в частности менее чем 5% антигена HCMV gB.
Согласно одному варианту осуществления, антиген gB содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична SEQ ID NO: 1. В частности, указанный антиген gB содержит аминокислотную последовательность, идентичность которой с SEQ ID NO: 1 составляет по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 97% идентичность, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99%, или которая даже на 100% идентична SEQ ID NO: 1:
SSTRGTSATHSHHSSHTTSAAHSRSGSVSQRVTSSQTVSHGVNETIYNTTLKYGDVVGVNTTKYPYRVCSMAQGTDLIRFERNIVCTSMKPINEDLDEGIMVVYKRNIVAHTFKVRVYQKVLTFRRSYAYIHTTYLLGSNTEYVAPPMWEIHHINSHSQCYSSYSRVIAGTVFVAYHRDSYENKTMQLMPDDYSNTHSTRYVTVKDQWHSRGSTWLYRETCNLNCMVTITTARSKYPYHFFATSTGDVVDISPFYNGTNRNASYFGENADKFFIFPNYTIVSDFGRPNSALETHRLVAFLERADSVISWDIQDEKNVTCQLTFWEASERTIRSEAEDSYHFSSAKMTATFLSKKQEVNMSDSALDCVRDEAINKLQQIFNTSYNQTYEKYGNVSVFETTGGLVVFWQGIKQKSLVELERLANRSSLNLTHNTTQTSTDGNNATHLSNMESVHNLVYAQLQFTYDTLRGYINRALAQIAEAWCVDQRRTLEVFKELSKINPSAILSAIYNKPIAARFMGDVLGLASCVTINQTSVKVLRDMNVKESPGRCYSRPVVIFNFANSSYVQYGQLGEDNEILLGNHRTEECQLPSLKIFIAGNSAYEYVDYLFKRMIDLSSISTVDSMIALDIDPLENTDFRVLELYSQKELRSSNVFDLEEIMREFNSYKQRVKYVEDKRLCMQPLQNLFPYLVSADGTTVTSGNTKDTSLQAPPSYEESVYNSGRKGPGPPSSDASTAAPPYTNEQAYQMLLALVRLDAEQRAQQNGTDSLDGQTGTQDKGQKPNLLDRLRHRKNGYRHLKDSDEEENV.
В предпочтительном варианте осуществления антиген gB содержит аминокислотную последовательность, которая на 100% идентична SEQ ID NO: 1.
Антиген HCMV gB, который особенно подходит для настоящего изобретения, представляет собой усеченную форму полноразмерного gB, обедненного в отношении всего С-концевого домена или его части, и/или обедненного в отношении всей трансмембранной последовательности или ее части, и имеет неэффективный сайт расщепления. Особенно предпочтительная усеченная форма gB соответствует форме, которая описана под названием gBdM в патенте US 6100,064, включенном в настоящее изобретение путем ссылки. Согласно патенту US 6100064, предполагаемая длина сигнальной последовательности составляет 24 аминокислоты, и положения аминокислот указаны соответственно на фигуре 10. Авторы изобретения обнаружили, что фактическая длина этой сигнальной последовательности составляет 25 аминокислот. На фиг.10 в патенте US 6100064 все положения аминокислот, обозначающие С-конец на Ser-1 (т.е. С-конец по отношению к сигнальной последовательности), должны быть уменьшены на 1. Соответственно, gBdTM несет три мутации в сайте расщепления (аргинин 432 заменен треонином, лизин 434 заменен глютамином и аргинин 435 заменен треонином; с учетом перенумерованных положений) и одну делецию в трансмембранной области между аминокислотными остатками валин 676 и аргинин 751 (с учетом перенумерованных положений), так что внеклеточный домен непосредственно соединяется с цитоплазматическим доменом. Такой полученный из gB полипептид легче подвергается очистке, поскольку он продуцируется рекомбинантными клетками, экспрессирующими этот продукт в секретируемой форме. В случае получения из штамма gB Towne, такая полученная форма представляет собой полипептид длиной 806 аминокислот, имеющий делецию в его сигнальной последовательности и его трансмембранной области.
Белок HCMV gB, описанный в изобретении, или полученные из него пептиды или полипептиды, могут быть синтезированы любым способом, хорошо известным специалистам в данной области. Такие способы включают общепринятый химический синтез в твердой фазе (R. B. Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85 (14), 2149-2154 (1963)), или ферментативный синтез в жидкой фазе (K. Morihara, Trends in Biotechnology, 5 (6), 164-170 (1987)) из конститутивных аминокислот или их производных, бесклеточный синтез белка (Katzenetal., Trends in Biotechnology, 23 (3), 150-156 (2005)), а также биологические способы получения с помощью рекомбинантной технологии.
Например, антиген HCMV gB может быть получен биологическим способом с использованием рекомбинантной клетки-хозяина. В таком способе экспрессионную кассету, содержащую нуклеиновую кислоту, которая кодирует антиген HCMV gB, согласно изобретению, переносят в клетку-хозяина, которую культивируют в условиях, способствующих экспрессии соответствующего белка. Затем полученный таким образом белок может быть выделен и очищен. Способы очистки белков хорошо известны специалистам. Полученный рекомбинантный белок можно очищать из лизатов и клеточных экстрактов или из супернатанта культуральной среды способами, которые применяются по отдельности или в комбинации, такими как фракционирование, хроматография, иммуноаффинные методики с использованием специфических моно-или поликлональных антител и другие способы. В частности, очистку полученного рекомбинантного белка осуществляют из супернатанта культуральной среды.
Белок HCMV gB или полученные из него пептиды или полипептиды обычно получают способами рекомбинантной ДНК и очищают способами, хорошо известными специалистам в данной области. В частности, можно использовать способы, описанные в патенте US № 6100064 и в патенте US 2002/0102562, которые включены в настоящее изобретение путем ссылки.
Например, антиген gB по настоящему изобретению представляет собой рекомбинантный гликопротеин, который продуцируется в клеточных культурах яичника китайского хомячка (СНО). На ген gB из штамма Towne HCMV можно воздействовать мутагенезом для удаления сайта расщепления и трансмембранного участка молекулы с целью облегчения секреции в культуре клеток, как описано в патенте US6100064. Секретированная молекула представляет собой полипептид из 806 аминокислот, сохраняющий 19 потенциальных N-связанных сайтов гликозилирования, и также называется gBdTm. Процесс очистки включает стадии аффинной и ионообменной хроматографии
Пентамерный сложный антиген HCMVgH/gL/UL128/UL130/UL131
Другая антигенная часть иммуногенной композиции согласно изобретению представляет собой пентамерный сложный антиген HCMV gH/gL/UL128/UL130/UL131.
et al.
et al.
Указанный пентамерный комплекс собирают посредством дисульфидных связей и нековалентных взаимодействий между пятью компонентами с образованием функционального комплекса, способного представить конформационные эпитопы (Ciferri , PNAS, 2015, 112(6):1767-1772; Wen , Vaccine, 2014, 32(30):3796-3804).
Указанный комплекс ранее описан и известен специалистам в данной области. В частности, он описан авторами Rykman et al. (Journal of Virology, January 2008, стр.60-70) и в патентной заявке WO 2014/005959. Указанный пентамерный комплекс HCMV gH/gL/UL128/UL130/UL131 может, в частности, содержать модифицированный HCMV gH полипептид, при этом в указанном полипептиде отсутствует по меньшей мере часть трансмембранного (ТМ) домена. В некоторых вариантах осуществления полипептид gH может сохранять часть нативного домена ТМ, но это недостаточно для того, чтобы белок оставался в липидном бислое. В предпочтительном варианте осуществления полипептид gH по существу полностью лишен всего трансмембранного домена. В более предпочтительном варианте осуществления в полипептиде gH отсутствует полноразмерный нативный домен ТМ.
Таким образом, полипептид gH может содержать до 10 аминокислот (например,1,2, 3,4,5, 6,7,8,9 или 10 аминокислот) природного домена gH ТМ.
В контексте настоящего изобретения "отсутствие по меньшей мере части домена" подразумевает отсутствие по меньшей мере 10% домена, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60% или по меньшей мере 70%, но не менее чем 80% домена.
Выражение "отсутствие по существу всего внутриклеточного домена" или "отсутствие по существу всего трансмембранного домена" означает делецию по меньшей мере 80% аминокислотной последовательности, соответствующей указанному домену.
Альтернативно или в дополнение к отсутствию части или всего домена ТМ, в полипептиде может отсутствовать внутриклеточный домен HCMV gH частично, или по существу весь указанный домен или отсутствовать полностью.
В предпочтительном варианте осуществления в полипептиде gH отсутствуетпо существу весь внутриклеточный домен. В более предпочтительном варианте осуществления в полипептиде gH отсутствует полноразмерный нативный внутриклеточный домен.
В предпочтительном варианте осуществления в полипептиде gH полностью отсутствует домен ТМ и полностью отсутствует внутриклеточный домен.
В одном варианте осуществления указанный gH содержит эктодомен полноразмерного gH, кодируемого геном UL75.
Гликопротеин HCMV H (gH), кодируемый геном UL75, представляет собой гликопротеин вириона, который является незаменимым для инфекционности и сохраняет свое присутствие у представителей альфа-, бета-и γ-вирусов герпеса. Он образует стабильный комплекс с gL, и образование этого комплекса облегчает клеточную поверхностную экспрессию gH. На основе кристаллических структур комплексов HSV-2 и EBV gH/gL, gL-субъединица и N-концевые остатки gH образуют глобулярный домен на одном из концов структуры ("голова"), которая вовлечена во взаимодействие с gB и активацию мембранного слияния. Проксимальный к вирусной мембране С-концевой домен gH ("хвост") также участвует в мембранном слиянии. В одном варианте осуществления полипептид gH в пентамерном комплексе по изобретению содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична SEQ ID NO: 2. В частности, gH-антиген содержит аминокислотную последовательность, идентичность которой с SEQ ID NO: 2 составляет по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или даже 100% идентичности с SEQ ID NO: 2:
YGAEAVSEPLDKAFHLLLNTYGRPIRFLRENTTQCTYNNSLRNSTVVRENAISFNFFQSYNQYYVFHMPRCLFAGPLAEQFLNQVDLTETLERYQQRLNTYALVSKDLASYRSFSQQLKAQDSLGEQPTTVPPPIDLSIPHVWMPPQTTPHGWTESHTTSGLHRPHFNQTCILFDGHDLLFSTVTPCLHQGFYLIDELRYVKITLTEDFFVVTVSIDDDTPMLLIFGHLPRVLFKAPYQRDNFILRQTEKHELLVLVKKDQLNRHSYLKDPDFLDAALDFNYLDLSALLRNSFHRYAVDVLKSGRCQMLDRRTVEMAFAYALALFAAARQEEAGAQVSVPRALDRQAALLQIQEFMITCLSQTPPRTTLLLYPTAVDLAKRALWTPNQITDITSLVRLVYILSKQNQQHLIPQWALRQIADFALKLHKTHLASFLSAFARQELYLMGSLVHSMLVHTTERREIFIVETGLCSLAELSHFTQLLAHPHHEYLSDLYTPCSSSGRRDHSLERLTRLFPDATVPATVPAALSILSTMQPSTLETFPDLFCLPLGESFSALTVSEHVSYVVTNQYLIKGISYPVSTTVVGQSLIITQTDSQTKCELTRNMHTTHSITAALNISLENCAFCQSALLEYDDTQGVINIMYMHDSDDVLFALDPYNEVVVSSPRTHYLMLLKNGTVLEVTDVVVDATDSR.
В предпочтительном варианте осуществления полипептид gH содержит аминокислотную последовательность, которая на 100% идентична SEQ ID NO: 2.
Гликопротеин L HCMV (gL) кодируется геном UL115. Считается, что gL является незаменимым для вирусной репликации, и все известные функциональные свойства gL непосредственно связаны с его димеризацией с gH. Комплекс gL/gH необходим для слияния вирусных и плазматических мембран, что приводит к проникновению вируса в клетку-хозяина.
В одном варианте осуществления полипептид gL в пентамерном комплексе по изобретению содержит аминокислотную последовательность, идентичность которой с SEQ ID NO: 3 составляет по меньшей мере 80%. В частности, gL антиген содержит аминокислотную последовательность, которая идентична SEQ ID NO: 3 по меньшей мере на 85%, идентична по меньшей мере на 90%, идентична по меньшей мере на 95%, идентична по меньшей мере на 97%, идентична по меньшей мере на 98%, идентична по меньшей мере на 99% или даже на 100% идентична SEQ ID NO:
3AAVSVAPTAAEKVPAECPELTRRCLLGEVFQGDKYESWLRPLVNVTGRDGPLSQLIRYRPVTPEAANSVLLDEAFLDTLALLYNNPDQLRALLTLLSSDTAPRWMTVMRGYSECGDGSPAVYTCVDDLCRGYDLTRLSYERSIFTEHVLGFELVPPSLFNVVVAIRNEATRTNRAVRLPVSTAAAPEGITLFYGLYNAVKEFCLRHQLDPPLLRHLDKYYAGLPPELKQTRVNLPAHSRYGPQAVDAR.
В предпочтительном варианте осуществления gL полипептид содержит аминокислотную последовательность, которая на 100% идентична SEQ ID NO: 3.
В одном варианте осуществления полипептид UL128 в пентамерном комплексе по изобретению содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична SEQ ID NO: 4. В частности, антиген UL128 содержит аминокислотную последовательность, которая идентична SEQ ID NO: 4 по меньшей мере на 85%, идентична по меньшей мере на 90%, идентична по меньшей мере на 95%, идентична по меньшей мере на 97%, идентична по меньшей мере на 98%, идентична по меньшей мере на 99% или даже на 100% идентична SEQ ID NO: 4:
EECCEFINVNHPPERCYDFKMCNRFTVALRCPDGEVCYSPEKTAEIRGIVTTMTHSLTRQVVHNKLTSCNYNPLYLEADGRIRCGKVNDKAQYLLGAAGSVPYRWINLEYDKITRIVGLDQYLESVKKHKRLDVCRAKMGYMLQ.
В предпочтительном варианте полипептид UL128 содержит аминокислотную последовательность, которая на 100% идентична SEQ ID NO: 4.
Ген UL130 представляет собой центральный и самый большой (214 кодонов) ген в локусе UL131A-28. Концептуальная трансляция гена предсказывает длинную (25 аминокислот) N-концевую сигнальную последовательность, которая предшествует гидрофильному белку, содержащему два потенциальных N-связанных сайтов гликозилирования (Asn85 и Asn118) в предполагаемом домене хемокина (аминокислоты 46-120), и дополнительный сайт N-гликозилирования (Asn201), расположенный ближе к концу уникальной С-концевой области. Предполагается, что UL130 не имеет домена ТМ.
et al.
Ранее сообщалось, что ген UL130 представляет собой гликопротеин просвета, который неэффективно секретируется из инфицированных клеток, но вставлен в оболочку вириона в виде свернутой зрелой формы Гольджи (Patrone, : “Human Cytomegalovirus UL130 Protein Promotes Endothelial Cell Infection through a Producer Cell Modiﬁcation of the Virion.”, Journal of Virology 79 (2005): 8361-8373).
В частности, антиген UL130 содержит аминокислотную последовательность, которая идентична SEQ ID NO: 5 по меньшей мере на 85%, идентична по меньшей мере на 90%, идентична по меньшей мере на 95%, идентична по меньшей мере на 97%, идентична по меньшей мере на 98%, идентична по меньшей мере на 99%, или даже на 100% идентична SEQ ID NO: 5:
SPWSTLTANQNPSPLWSKLTYSKPHDAATFYCPFIYPSPPRSPLQFSGFQRVLTGPECRNETLYLLYNREGQTLVERSSTWVKKVIWYLSGRNQTILQRMPRTASKPSDGNVQISVEDAKIFGAHMVPKQTKLLRFVVNDGTRYQMCVMKLESWAHVFRDYSVSFQVRLTFTEANNQTYTFCTHPNLIV.
В предпочтительном варианте полипептид UL130 содержит аминокислотную последовательность, которая на 100% идентична SEQ ID NO: 5.
Функционирование UL131, также называемого UL131A, необходимо для репликации HCMV не только в эндотелиальных клетках, но также в эпителиальных клетках. В одном варианте осуществления полипептид UL131A в пентамерном комплексе по изобретению содержит аминокислотную последовательность, которая идентична SEQ ID NO: 6 по меньшей мере на 80%. В частности, антиген UL131A содержит аминокислотную последовательность, которая идентична по меньшей мере на 85%, идентична по меньшей мере на 90%, идентична по меньшей мере на 95%, идентична по меньшей мере на 97%, идентична по меньшей мере на 98%, идентична по меньшей мере на 99%, или даже на 100% идентична SEQ ID NO: 6:
QCQRETAEKNDYYRVPHYWDACSRALPDQTRYKYVEQLVDLTLNYHYDASHGLDNFDVLKRINVTEVSLLISDFRRQNRRGGTNKRTTFNAAGSLAPHARSLEFSVRLFAN.
В предпочтительном варианте полипептид UL131 содержит аминокислотную последовательность, которая на 100% идентична SEQ ID NO: 6.
et al.,
Последовательности SEQIDNO: 2-6 получены из штамма BE/28/2011 (Genbank ID KP745669, Kremkow  2015).
В пентамерной сложной антигенной части иммуногенной композиции по изобретению белки gH, gL и UL128 могут быть связаны дисульфидными связями, а UL130 И UL131A могут быть вставлены в пентамерный комплекс посредством нековалентных взаимодействий. Например, белок UL130 и/или белок UL131A вводят в пентамерный комплекс путем нековалентных взаимодействий. Кроме того, белок UL130 и/или белок UL131A могут быть связаны между собой нековалентными связями.
al
Известен ряд конформационных эпитопов, используемых для пентамерного комплекса. Например, в исследованиях Macagno (Macagno et .: “Isolation of human monoclonal antibodies that potently neutralize human cytomegalovirus infection by targeting different epitopes on the gH/gL/UL128-131A complex.”, Journal of Virology 84 (2010): 1005-13) выделена группа моноклональных человеческих антител, которые нейтрализуют HCMV-инфекцию эндотелиальных, эпителиальных и миелоидных клеток. В одном варианте осуществления пентамерная сложная антигенная часть в иммуногенной композиции по изобретению обладает одним или несколькими конформационными эпитопами, идентифицированными Macagno (2010).
Каждый белок пентамерного сложного антигена может нести мутации, такие как инсерции, делеции и замены, при условии, что эти мутации не являются препятствием для использования белков в качестве антигенов. Дополнительно, такие мутации не должны нарушать способность белков к образованию пентамерного комплекса по изобретению. Можно тестировать способность белков к образованию пентамерного комплекса по изобретению путем очистки белков и анализа белков с помощью вестерн-блоттинга, электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) в невосстанавливающих условиях и/или эксклюзионной хроматографии с разделением по размеру. Если белки образуют часть комплекса, то они могут быть представлены в одной полосе на нативном ПААГ-геле и/или отображаться в виде единого пика на эксклюзионной хроматограмме.
Указанный пентамерный комплекс можно экспрессировать с помощью способов, известных специалистам в данной области. Например, можно упомянуть способ, описанный Hofmann et al. (Biotechnology and Bioengineering, 2015).
Подходящие для применения экспрессионные системы, согласно настоящему изобретению, хорошо известны специалистам в данной области, и многие из них подробно описаны в монографии Doyle (Doyle, ed. High Throughput Protein Expression and Purification: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology). Humana Press, 2008). В общем, можно использовать любую систему или вектор, пригодный для поддержания, репродукции и экспрессии молекул нуклеиновой кислоты для получения полипептида в желательной клетке-хозяине. Подходящая нуклеотидная последовательность может быть встроена в систему экспрессии любым из множества хорошо известных и рутинных способов, например, с помощью способов, описанных в монографии Sambrook (Sambrook, J. Molecular Cloning: a Laboratory Manual. 3rd. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2000). Обычно можно располагать кодирующий ген под контролем управляющего элемента, такого как промотор, и, необязательно, пол контролем оператора, чтобы в РНК в трансформированной клетке-хозяине транскрибировалась последовательность ДНК, кодирующая нужный пептид. Примеры подходящих систем экспрессии включают, например, хромосомные, эписомные системы и системы вирусного происхождения, включающие, например, векторы, полученные из бактериальных плазмид, бактериофагов, транспозонов, эписом дрожжей, инсерционных элементов, хромосомных элементов дрожжей, вирусов, таких как бакуловирусы, например, описанные в патентной заявке WO 2015170287, вирусы papova, такие как SV40, вирусы коровьей оспы (vaccinia), аденовирусы, вирусы оспы домашней птицы, вирусы псевдобешенства и ретровирусы, или их комбинации, такие как производные из плазмидных и бактериофаговых генетических элементов, включающие космиды и фагемиды. Также можно использовать искусственные хромосомы человека (HAC) для доставки крупных фрагментов ДНК, если их размер превышает предел, позволяющий им находиться и экспрессироваться в плазмиде.
et al.
et al.
et al.
Существует несколько возможных вариантов для одновременной и эквимолярной экспрессии пяти разных рекомбинантных белков пентамерного сложного антигена HCMV gH/gL/UL128/UL130/UL131. В первом варианте (1) для пентамерной сложной антигенной части HCMV/gL/UL128/UL130/UL130/UL131 иммуногенной композиции по изобретению можно создать единственный вектор, содержащий все пять ORF под контролем одних и тех же или сходных регуляторных элементов (промотор, энхансер, сигнал сплайсинга, сигнал терминации), и, необязательно, систему селекции для отбора клеточной линии. Вектор может содержать пять кассет экспрессии (например, как описано авторами Albers , J. Clin. Invest., 2015, 125(4): 1603-1619; или Cheshenko , Gene Ther., 2001, 8(11): 846-854), или пять компонентов (gH, gL, UL128, UL130 и UL131) могут быть слиты в одной ORF с элементами, запускающими правильное созревание полипротеина в пять белков пентамерного сложного антигена HCMV gH/gL/UL128/UL130/UL131 (например, саморасщепляемые последовательности, описанные авторами Szymczak-Workman , Cold Spring Harb. Protoc., 2012, 2012 (2): 199-204). В этом втором случае эквимолярность гарантируется при условии, что все расщепление происходит правильно. Во втором варианте (2) для пентамерной сложной антигенной части HCMV/gL/UL128/UL130/UL131 иммуногенной композиции по изобретению можно создать пять векторов, каждый из которых экспрессирует один компонент пентамерного сложного антигена HCMV gH/gL/UL128/UL130/UL131, и необязательно систему селекции для отбора клеточной линии. Пять векторов совместно трансфицируют в целевую клеточную линию. Также можно разработать любую промежуточную систему между вариантом (1) и вариантом (2) для минимизации количества необходимых векторов и поддержания приемлемого размера каждого вектора (например, менее 12 т.п.н).
Подходящие экспрессионные системы включают микроорганизмы, такие как бактерии, трансформированные рекомбинантным бактериофагом; плазмидные или космидные ДНК-векторы экспрессии, дрожжи, трансформированные экспрессионными векторами дрожжей; системы клеток насекомых, инфицированные или трансфицированные вирусными векторами экспрессии (например, из бакуловируса, описанного в патентной заявке WO 2015170287); клеточные системы растений, трансформированные вирусными векторами экспрессии (например, из вируса мозаики цветной капусты, CaMV; вируса табачной мозаики, TMV) или бактериальные векторы экспрессии (например, плазмиды Ti или pBR322); или системы клеток животных. Для получения белков можно также использовать бесклеточные системы трансляции.
Примеры подходящих генетических экспрессирующих систем из растительных клеток включают системы, описанные в патенте US 5693506, патенте US 5659122, патенте US 5608143 и в публикации Zenk (1991):”Chasing the enzymes of secondary metabolism: Plant cell cultures as a potofgoal. Phytochemistry, 30(12), pp 3861-3863. Zess Nauk UMKTornu, 13: 253-256. В частности, можно использовать все растения, из которых могут быть выделены и культивированы протопласты для получения целых регенерированных растений, таким образом регенерируются целые растения, содержащие перенесенный ген. Практически все растения можно регенерировать из культивируемых клеток или тканей, включая без ограничения все основные виды сахарного тростника, сахарной свеклы, хлопчатника, плодовые и другие деревья, бобовые и овощные культуры.
al.
Клетки Нек293 подходят для транзиторной экспрессии белков HCMV из пентамерного комплекса по изобретению благодаря их высокой способности к трансфекции с помощью разных способов, включающих использование фосфата кальция и полиэтиленимина (PEI). Подходящей клеточной линией HEK293 является линия, которая экспрессирует белок EBNA1 из вируса EBV, например, 293-6E ((Loignon, et :“Stable hig hvolumetric production of glycosylated human recombinant IFNalpha 2bin HEK293 cells”, BMC Biotechnology 8 (2008): 65). Было показано, что трансформированные клетки Нек293 секретируют в ростовую среду большое количество белка, обеспечивая таким образом очистку таких белковых комплексов непосредственно от среды роста.
Клетки СНО являются особенно подходящими клетками-хозяевами млекопитающих для промышленного производства белков HCMV и, в частности, для промышленного производства пентамерной сложной антигенной части HCMV gH/gL/UL128/UL130/UL131, являющейся частью иммуногенной композиции согласно изобретению.
Трансфекцию можно осуществлять с помощью ряда способов, хорошо известных в данной области, включающих использование фосфата кальция, электропорацию или путем смешивания материала с катионным липидом для получения липосом, которые сливаются с клеточной мембраной и вносят свой груз внутрь.
Способы очистки рекомбинантных белков из клеточного супернатанта или из телец включения хорошо известны в данной области. В частности, можно проводить очистку пентамерной сложной антигенной части HCMV gH/gL/UL128/UL130/UL131 в иммуногенной композиции по изобретению с помощью эксклюзионной хроматографии.
В частности, иммуногенная композиция согласно изобретению не содержит вируса HCMV.
В частности, иммуногенная композиция согласно изобретению представляет собой описанную иммуногенную композицию, в которой HCMV gB и пентамерный комплекс HCMV gH/gL/UL128/UL130/UL131 являются единственными антигенами HCMV.
Th1-индуцирующий адъювант
Используемый в изобретении термин "адъювант" имеет значение, общеизвестное специалистам в данной области. В частности, этот термин относится к агентам или веществам, которые модулируют иммуногенность антигена. "Модуляция иммуногенности" включает увеличение интенсивности и/или длительности иммунного ответа, создаваемого антигеном. Более конкретно, адъюванты можно также классифицировать по типу иммунного ответа, который они индуцируют в присутствии антигена. Адъювант (адъюванты), который можно использовать в иммуногенной композиции по изобретению, представляет собой адъювант, индуцирующий Th1.
"Th1-индуцирующий адъювант" можно определить, как адъювант, который усиливает ответ Th1 на антиген или комбинацию антигенов.
et al.
et al.
in vitro
Иммунный ответ в широком смысле можно разделить на две диаметрально противоположные категории, а именно, на гуморальный и клеточно-опосредованный иммунный ответ (которые обычно отличаются механизмом защиты, а именно, наличием антител и клеточного эффекторного механизма, соответственно). Эти категории ответов называются иммунными ответными реакциями типа Th1 (клеточно-опосредованный ответ) и типа Th2 (гуморальный ответ). У мышей ответы типа Th1 часто характеризуются образованием антител подтипов IgG2a или IgG2c (в зависимости от линии мышей), тогда как у человека ответы могут соответствовать антителам типов IgG1 и IgG3. Иммунные ответы типа Th2 характеризуются образованием большого разнообразия изотипов иммуноглобулинов, включая мышиные IgG1, IgA и IgM. Иммунные ответы Th1-типа и Th2-типа также отличаются по характеру секреции цитокинов (Mosmann , Annual Review of Immunology, 1989, 7: 145-173; Constant , Annual Review of Immunology, 1997, 15: 297-322). Иммунный ответ Th1-типа обусловлен повышенной продукцией T-лимфоцитами цитокинов IFN-γ и/или IL-2, тогда как иммунный ответ Th2-типа обусловлен повышенной продукцией цитокинов IL-4, IL-5, IL-6, IL-13 и/или IL-10. Различия в ответах типов Th1 и Th2 не являются абсолютными. В действительности, наблюдаемый у субъекта иммунный ответ можно описать как ответ преимущественно Th1-типаили преимущественно Th2-типа. Обычно лучшие индикаторы пропорции Th1 : Th2 иммунного ответа после вакцинации или инфицирования включают прямое измерение продуцируемых Т-лимфоцитами Th1- или Th2-цитокинов  после стимуляции антигеном и/или измерение (по меньшей мере, у мышей) соотношения антиген-специфических антител к антителам IgG1 : IgG2a, c.
Также, применительно к иммуногенной композиции по изобретению, адъювант, который индуцирует в основном иммунный ответ Th1-типа, считается Th1-индуцирующим адъювантом. Предпочтительно адъювант (адъюванты), который можно использовать в иммуногенной композиции по изобретению, индуцирует преимущественно иммунный ответ Th1-типа.
Как упоминалось ранее, преобладающий ответ можно определять путем измерения соотношения IgG1 : IgG2a у мышей. Увеличение содержания IFN-γ является дополнительным показателем преобладания ответа Th1. Предпочтительно также наблюдается снижение продукции IL-5.
Предпочтительно, Th1-индуцирующие адъюванты, которые могут быть использованы в иммуногенной композиции по изобретению, содержащей антиген HCMV gB и пентамерный сложный антиген HCMV gH/gL/UL128/UL130/UL131, индуцируют более смещенный к типу Th1 ответ, чем MF59, в композиции, содержащей указанный антиген HCMV gB и указанный пентамерный сложный антиген HCMV gH/gL/UL128/UL130/UL131.
et al.
MF59 представляет собой эмульсию масло-в-воде на основе сквалена, описанную в патентной заявке WO 90/14837, в патентах US № 6299884 и 6453325, и в публикации Ott , "MF59 - Design and Evaluation of a Safe and Potent Adjuvant for Human Vaccines" из руководства Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (Powell, M.F. and Newman, M.J. eds.) Plenum Press, New York, 1995, pp. 277-296).
В частности, Th1-индуцирующие адъюванты, которые могут быть использованы в иммуногенной композиции по изобретению, содержащей антиген HCMV gB и пентамерный сложный антиген HCMV gH/gL/UL128/UL130/UL131, у мышей индуцируют IgG1 : IgG2a, c в более низком соотношении, чем MF59, в композиции, содержащей указанный антиген HCMV gB и указанный пентамерный сложный антиген HCMV gH/gL/UL128/UL130/UL131.
Более конкретно, Th1-индуцирующие адъюванты, которые могут быть использованы в иммуногенной композиции по изобретению, содержащей антиген HCMV gB и пентамерный сложный антиген HCMV gH/gL/UL128/UL130/UL131, у мышей индуцируют IFN-γ на более высоком уровне, чем MF59, в композиции, содержащей указанный антиген HCMV gB и указанный пентамерный сложный антиген HCMV gH/gL/UL128/UL130/UL131.
Более конкретно, Th1-индуцирующие адъюванты, которые могут быть использованы в иммуногенной композиции по изобретению, содержащей антиген HCMV gB и пентамерный сложный антиген HCMV gH/gL/UL128/UL130/UL131, у мышей индуцируют IL-5 на более низком уровне, чем MF59, в композиции, содержащей указанный антиген HCMV gB и указанный пентамерный сложный антиген HCMV gH/gL/UL128/UL130/UL131.
Еще более конкретно, Th1-индуцирующие адъюванты, которые могут быть использованы в иммуногенной композиции по изобретению, содержащей антиген HCMV gB и пентамерный сложный антиген HCMV gH/gL/UL128/UL130/UL131, у мышей индуцируют IgG1 : IgG2a, c в более низком соотношении и IFN-γ на более высоком уровне, чем MF59, в композиции, содержащей указанный HCMV gB и указанный пентамерный сложный антиген HCMV gH/gL/UL128/UL130/UL131.
В частности, Th1-индуцирующие адъюванты, которые могут быть использованы в иммуногенной композиции по изобретению, содержащей антиген HCMV gB и пентамерный сложный антиген HCMV gH/gL/UL128/UL130/UL131, у мышей индуцируют IgG1 : IgG2a, c в более низком соотношении и IL-5 на более низком уровне, чем MF59, в композиции, содержащей указанный антиген HCMV gB и указанный пентамерный сложный антиген HCMV/GL/UL128/UL131/UL131.
Более конкретно, Th1-индуцирующие адъюванты, которые могут быть использованы в иммуногенной композиции по изобретению, содержащей антиген HCMV gB и пентамерный сложный антиген HCMV gH/gL/UL128/UL130/UL131, у мышей индуцируют IgG1 : IgG2a, c в более низком соотношении, IFN-γ на более высоком уровне и IL-5 на более низком уровне, чем MF59, в композиции, содержащей указанный антиген HCMV gB иуказанный пентамерный сложный антиген HCMV gH/gL/UL128/UL130/UL131.
В частности, иммуногенная композиция согласно изобретению представляет собой иммуногенную композицию, содержащую:
-антиген HCMV gB;
- пентамерный сложный антиген HCMV/gL/UL128/UL130/UL131; и
- Th1-индуцирующий адъювант,
при этом указанный Th1-индуцирующий адъювант индуцирует у мышей IgG1 : IgG2a, c в более низком соотношении, IFN-γ на более высоком уровне и IL-5 на более низком уровне, чем MF59, в композиции, содержащей указанный антиген HCMV gB и указанный пентамерный сложный антиген HCMV gH/gL/UL128/UL130/UL131.
В частности, Th1-индуцирующий адъювант согласно изобретению содержит:
- агонист TLR-4; или
- линейную или разветвленную полимерную соль полиакриловой кислоты с усредненной молекулярной массой Mw в диапазоне от 350 до 650 кДа.
В частности, иммуногенная композиция по изобретению представляет собой иммуногенную композицию, содержащую:
- антиген HCMV gB;
- пентамерный сложный антиген HCMV/gL/UL128/UL130/UL131; и
- Th1-индуцирующий адъювант,
при этом указанный Th1-индуцирующий адъювант содержит:
O
- агонист TLR-4, выбранный из группы, состоящей из липополисахарида, монофосфорил-липида А (MPL), 3-де--ацилированного монофосфорил-липида А (3D-MPL), глюкопиранозил-липидного адъюванта (GLA), липидного адъюванта второго поколения (SLA), фосфолипидного димера, соединенного с неуглеводным скелетом, и аминоалкил-глюкозаминидфосфата, или из их производного; или
-полимер полиакриловой кислоты с усредненной молекулярной массой Mw в диапазоне от 350 до 650 кДа.
В одном варианте осуществления указанный Th1-индуцирующий адъювант содержит агонист TLR-4.
Следует понимать, что термин "агонист TLR" (toll-подобный рецептор) означает природный лиганд TLR, мимик лиганда TLR, синтетический или химический лиганд TLR, клетку или частицу, включающую ассоциированную с патогеном молекулярную структуру, микробный патоген, бактерию, вирус и вирусоподобную частицу.
TLR-4 (toll-подобный рецептор типа 4) представляет собой рецептор, экспрессируемый антиген-презентирующими клетками иммунной системы; он вовлечен в механизмы ранней защиты против грам-бактериальных инфекций. Липополисахарид (LPS) грам-бактерий является природным лигандом для TLR-4; он активирует рецептор, который запускает каскад биохимических событий, в частности, активацию фактора транскрипции Nf-Kappa B и продукцию провоспалительных цитокинов.Способность соединения стимулировать путь TLR-4 может быть оценена с помощью известных специалистам в данной области способов, описанных, например, в журнале Journal of Biological Chemistry, (2001, том 276 (3), стр. 1873-1880.
O
Примеры агонистов TLR-4 включают монофосфориллипид A (MPL) или его производное, в частности 3-де--ацилированный монофосфориллипид A (3D-MPL), описанный в патентах GB 2211502 или US 4912094, или его производное, фосфорилированный гексаацилдисахарид, называемый глюкопиранозил-липидным адъювантом или GLA (CAS номер 1246298-63-4) или его производное, липидный адъювант второго поколения (SLA), например, описанный в публикации Carter et al., Clin. Transl. Immunology, 2016, 5(11):e108 или в патентах EP2437753 или US9480740, или его производное, аминоалкил-глюкозаминидфосфаты (AGP), описанные в WO 98/50399 или в WO 01/034617, или их производное, в частности, RC529, описанный в US 6113918 или его производное, и химические соединения или димер фосфолипида (гомодимер или гетеродимер), связанные неуглеводным скелетом, как описано в US 2003/0153532 или в US 2005/0164988, или их производное, в частности, соединения, идентифицированные и указанные в качестве примера в патенте US 2003/0153532 под следующими наименованиями: ER803022 (номер CAS: 287180-56-7), ER803058 (номер CAS: 287180-57-8), ER803732 (номер CAS: 287106-29-0), ER803789 (номер CAS: 287180-61-4), ER804053 (номер CAS: 287180-62-5), ER804057 (номер CAS: 287180-63-6), ER804058 (номер CAS: 287180-65-8), ER804059 (номер CAS: 287180-64-7), ER8044442 (номер CAS: 287180-78-3), ER 804764 (номер CAS: 287180-87-4), ER111232 (номер CAS: 287180-48-7), ER112022 (номер CAS: 287180-46-5), ER112048 (номер CAS: 287106-02-9), ER112065 (номер CAS: 287180-49-8), ER112066 (номер CAS: 287180-50-1), ER113651 (номер CAS: 287180-51-2), ER118989 (номер CAS: 287180-52-3), ER119327 (номер CAS: 287180-54-5) и ER119328 (номер CAS: 287180-55-6) или их производные. В этих соединениях обычно присутствует один или несколько асимметричных атомов углерода. Если в этих соединениях присутствует один или несколько асимметричных атомов углерода, они могут использоваться в виде смеси оптических изомеров или в форме конкретного изомера.
В частности, указанный агонист TLR-4 выбран из фосфолипидного димера, соединенного с неуглеводным скелетом, и агонистом TLR-4 GLA.
В частности, агонист TLR4 представляет собой фосфолипидный димер, соединенный с неуглеводным скелетом.
В частности, агонист TLR-4 представляет собой химическое соединение или фосфолипидный димер, соединенный неуглеводным скелетом, представленным формулой I, II, III или IV.
Соединение или фосфолипидный димер, соединенный неуглеводным скелетом, формула I:
Соединение или фосфолипидный димер, соединенный неуглеводным скелетом, формула II:
Соединение или фосфолипидный димер, соединенный неуглеводным скелетом, формула III:
Соединение или фосфолипидный димер, соединенный неуглеводным скелетом, формула IV:
в которой для каждой из формул I, II, III или IV элемент R1 выбран из группы, состоящей из:
а) C(O);
1
4
1
4
1
5
1
5
1
5
1
5
1
5
1
5
1
5
1
5
1
5
1
5
1
5
1
5
1
5
1
5
1
5
1
5
1
5
b) C (O)-(C-Cалкил))-C(O), при этом указанный C-Cалкил необязательно замещен гидроксильной группой, C-Cалкокси, C-Cалкилендиокси, (C-Cалкил)амино или (C-Cалкил)арил, при этом указанный арильный фрагмент указанного (C-Cалкил)арила необязательно замещен C-Cалкокси, (C-Cалкил)амино, (C-Cалкокси)амино, (C-Cалкил)амино(C-Cалкокси), -O-(C-Cалкил)амино (C-Cалкокси),-O-(C-Cалкил)амино-C(O)-(C-Cалкил)-C(O)OH, или -O-(C-Cалкил)амино-C(O)-(C-Cалкил)-C(O)-(C-C)алкил;
2
15
c) алкил, содержащий линейную или разветвленную цепь С-С, необязательно замещенный гидроксилом или алкокси; и
6
12
d)-C(O)-(C-Cарилен)-C(O)-, в котором указанный арилен необязательно замещен гидроксильной группой, галогеном, нитрогруппой или аминогруппой;
значения a и b независимо составляют 0,1,2, 3 или 4;
значения d, d', d", e, e' и e" независимо составляют 0,1,2, 3 или 4;
1
2
1
2
1
4
1
4
X, X, Y и Yнезависимо выбраны из группы, состоящей из нуля, кислорода, NH и N (C(O)(C-C алкил)) и N(C-C алкил);
1
2
W и W независимо выбраны из группы, состоящей из карбонила, метилена, сульфона и сульфоксида;
2
5
R и R независимо выбраны из группы, состоящей из следующего:
2
20
a) линейный или разветвленный C-Cалкил, который необязательно замещен оксо, гидрокси или алкокси;
2
20
b) линейный или разветвленный C-Cалкенил или диалкенил, который необязательно замещен оксо, гидрокси или алкокси;
2
20
c) линейный или разветвленный C-Cалкокси, который необязательно замещен оксо, гидрокси или алкокси;
2
20
d) NH-(C-Cалкил с прямой или разветвленной цепью), в котором указанная алкильная группа необязательно замещена оксо, гидрокси или алкокси; и
e)
2
20
в котором Z выбран из группы, состоящей из O и NH, и M и N независимо выбраны из группы, состоящей из алкила, алкенила, алкокси, ацилокси, алкиламино и ациламино, содержащего линейную или разветвленную цепь C-C;
3
6
2
20
Rи R независимо выбраны из группы, содержащей линейный или разветвленный алкил или алкенил C-C, необязательно замещенный оксо или фтором;
4
7
2
20
2
20
2
20
2
20
1
5
R и R независимо выбраны из группы, состоящей из C(O)-(C - C алкила или алкенила с прямой или разветвленной цепью), линейного или разветвленного C - C алкила, линейного или разветвленного C-C алкокси, и линейного или разветвленного C-Cалкенила;при этом указанные алкильные, алкенильные или алкоксигруппы могут быть независимо и необязательно замещены гидроксилом, фтором или C-Cалкокси;
1
2
3
4
1
4
G, G, G и G независимо выбраны из группы, состоящей из кислорода, метилена, амино, тиола, -C(O)NH-,-NHC(O)-и-N(C(O)(C-C-алкил))-;
2
4
4
7
или GR или GR вместе могут представлять собой атом водорода или гидроксильную группу;
и при этом в формуле III:
значения a'и b' независимо составляют 2,3,4, 5, 6, 7 или 8, предпочтительно равны 2
1
8
8
9
9
2
2
1
4
2
2
2
2
3
2
3
1
4
Z выбран из группы, состоящей из -OP(O)(OH), -P(O)(OH), -OP(O)(OR)(OH), при этом R представляет собой алкильную цепь C-C, -OS(O)OH, -S(O)OH, -COH, -OB(OH), -OH, -CH, -NH и -NR, и где Rпредставляет собой алкильную цепь C-C;
2
10
10
11
11
2
2
1
4
2
2
2
2
3
2
1
4
Z выбран из группы, состоящей из OP(O)(OH), -P(O)(OH), -OP(O)(OR)(OH), при этом Rпредставляет собой алкильную цепь C-C, -OS(O)OH, -S(O)OH, -COH, -OB(OH), -OH, -CH, -NH и -NR, где Rпредставляет собой алкильную цепь C-C;
и при этом в формуле IV:
12
1
4
R представляет собой Н или алкильную цепь C-C;
или фармацевтически приемлемую соль этого соединения или фосфолипидного димера, соединенного с неуглеводным скелетом, имеющим формулу I, II, III или IV.
В частности, агонист TLR-4 по изобретению представляет собой химическое соединение или фосфолипидный димер, соединенный с неуглеводным скелетом, формула I:
или фармацевтически приемлемую соль этого соединения или фосфолипидного димера, соединенного с неуглеводным скелетом.
Предпочтительно, если
1
Rпредставляет собой C(O) или C(O)-(CH2)n-C(O), при этом значение n составляет 1, 2, 3 или 4,
значения a, b, d, d', d", e, e' и e" независимо составляют 1 или 2
X1, X2, Y1 и Y2 представляют собой NH,
W1 и W2 представляют собой С(O),
2
5
10
15
10
15
R и R независимо выбраны из группы, состоящей из C-C линейного алкила, необязательно замещенного оксо, NH-(C-Cлинейный алкил), и
2
20
при этом M и N независимо представляют собой C-Слинейный алкил или алкенил,
3
6
5
10
R и R представляют собой С-Слинейные алкилы,
4
7
8
12
8
12
R и R выбраны из группы, состоящей из водорода, C (O)-(C-C- линейный алкил) или C(O)-(C-Cлинейный алкенил),
G1 и G3 представляют собой кислород или-NH(CO)-,
G2 и G4 представляют собой кислород
В частности, агонист TLR-4 по изобретению представляет собой симметричный фосфолипидный димер (гомодимер), соединенный с неуглеводным скелетом. Более конкретно, симметричный фосфолипидный димер, соединенный с неуглеводным скелетом, представляет собой димер триацил-фосфолипида. Более конкретно, указанный агонист TLR-4 представляет собой E6020 (номер CAS: 287180-63-6).
В частности, указанным агонистом TLR-4 является GLA (CAS номер 1246298-63-4).
Такие агонисты TLR-4 можно также комбинировать с системой доставки, например, с фосфатом кальция, липосомами, виросомами, конъюгатами с вакцинными свойствами (ISCOM), микрочастицами и наночастицами или эмульсии.
В частности, агонист TLR-4 по изобретению представлен в комбинации с системой доставки, такой как водная наносуспензия, фосфат кальция, липосомы, виросомы, ISCOM, микро-и наночастицы или эмульсии.
Такие системы доставки описаны ранее и хорошо известны специалистам в данной области.
В частности, указанный агонист TLR-4 выбран из агонистов TLR-4 Е6020 (номер CAS: 287180-63-6) и GLA (номер CAS 1246298-63-4).
В качестве примера подходящей композиции агониста TLR-4 в комбинации с системой доставки можно назвать эмульсию масло-в-воде, содержащую в качестве агониста TLR-4 соединение ER 804057 (именуемое в настоящее время E6020) (номер CAS: 287180-63-6), которое представляет собой динатриевую соль соединения с указанной ниже химической формулой:
R
R, R, R, R
Все четыре асимметричных атома углерода E6020 находятся в -конфигурации (). Такая эмульсия может быть получена, например, способом микрофлюидизации, как описано в WO 2004/060396, или посредством способа с температурной инверсией фаз (PIT-способ), описанного в WO 2007/080304.
В частности, агонист TLR-4 по изобретению находится в комбинации с эмульсией масло-в-воде, более конкретно, в комбинации с эмульсией масло-в-воде на основе сквалена.
Эмульсия масло-в-воде, подходящая для целей изобретения, содержит метаболизируемое масло (при этом объем масла составляет от 0,5 до 20% от общего объема эмульсии (об/об), в частности от 1 до 10% (об/об), и более предпочтительно от 1 до 5% (об/об)), водный раствор (при этом объем водного раствора составляет от 80 до 99,5% от общего объема (об/об), в частности от 90 до 99% (об/об)) и один или несколько эмульгирующих агентов (при этом общее количество эмульгирующего агента составляет от 0,001 до 5% от общего количества эмульсии по массе (в/в), в частности от 0,001 до 2% (в/в), и более предпочтительно от 0,01 до 2% (в/в)). Метаболизируемое масло обычно содержит приблизительно от 6 приблизительно до 30 атомов углерода, включая без ограничения алканы, алкены, алкины и их соответствующие кислоты и спирты, простые эфиры и сложные эфиры и их смеси.
Масло может представлять собой по существу любое растительное масло, рыбий жир, животное масло или синтетически полученное масло, способное метаболизироваться организмом человека, которому предназначено вводить эмульсионные композиции, и по существу нетоксичное для человека. Метаболизируемое масло может представлять собой ненасыщенный углеводород, содержащий от 20 до 40 атомов углерода, или разветвленный, полиненасыщенный углеводород, содержащий от 20 до 40 атомов углерода, например, терпеноиды. Часто предпочтительными являются ненасыщенный терпеноид, известный как сквален,2,6,10,15,19,23-гексаметил-2,6,10,14,18,22-тетракозагексаен и его насыщенный аналог, сквалан. Рыбий жир, включая сквален и сквалан, легко доступен из коммерческих источников или может быть получен известными в данной области способами. Другим обычно используемым маслом является токоферол. Если в композицию входит токоферол, можно использовать любой из токоферолов: альфа-, бета-, гамма-, дельта-, эпсилон- или зет-токоферол, но предпочтительными являются альфа-токоферолы. В фармации используется значительное количество подходящих эмульгирующих агентов (также называемых поверхностно-активными веществами, детергентами и т.д.), многие из которых являются полезными в композиции эмульсии по изобретению, при условии достаточной степени их нетоксичности. Существует ряд эмульгирующих агентов, специально разработанных и обычно используемых для биологического применения. Например, Sigma Chemical поставляет ряд биологических детергентов (поверхностно-активных веществ). Выделяют четыре основных типа поверхностно-активных веществ (ПАВ): анионные, катионные, цвиттер-ионные и неионогенные ПАВ.
Примеры анионных детергентов включают альгиновую кислоту, каприловую кислоту, холевую кислоту, 1-декансульфоновую кислоту, дезоксихолевую кислоту, 1-додекансульфоновую кислоту, N-лауроилсаркозин и таурохолевую кислоту.
Катионные детергенты включают додецилтриметил-аммоний бромид, бензалконий хлорид, бензилдиметилгексадецил-аммоний хлорид, цетилпиридиний хлорид, метилбензэтоний хлорид и 4-пиколин додецилсульфат.
Примеры цвиттер-ионных детергентов включают 3-[(3-холамидопропил) диметиламмонио]-1-пропансульфонат (обычно сокращенно называемый CHAPS), 3-[(холамидопропил)диметиламмониол-2-гидрокси-1-пропансульфонат (обычно сокращенно называемый CHAPSO), N-додецил-N, N-диметил-3-аммонио-1-пропансульфонат, фосфатидилхолин и лизо-альфа-фосфатидилхолин.
Примеры неионных детергентов включают деканоил-N-метилглюкамид, диэтиленгликоль-монопентиловый эфир, n-додецил-бета-D-глюкопиранозид, полоксамеры, этиленоксидные конденсаты жирных спиртов (например, под торговым названием Lubrol), полиоксиэтиленовые эфиры жирных кислот (в частности, C12-C20 жирные кислоты), сложные эфиры полиоксиэтилен сорбитана и жирных кислот (например, под торговым названием Tween) и сложные эфиры сорбитана и жирных кислот (например, под торговым названием Span).
Особенно полезной группой поверхностно-активных веществ являются неионные ПАВ на основе сорбитана. Эти поверхностно-активные вещества обычно получают путем дегидратации сорбита с получением 1,4-сорбитана, который затем подвергают взаимодействию с одним или несколькими эквивалентами жирной кислоты. Функциональная группа с замещением жирной кислотой может быть дополнительно введена в реакцию с оксидом этилена с получением второй группы ПАВ.
Замещенные производные жирных кислот сорбитана в качестве ПАВ обычно получают путем взаимодействия 1,4-сорбитана с жирной кислотой, такой как лауриновая кислота, пальмитиновая кислота, стеариновая кислота, олеиновая кислота или подобная длинноцепочечная жирная кислота, с получением моноэфира 1,4-сорбитана, 1,4-сорбитан-сесквиэфира или 1,4-сорбитана триэфира. Общепринятые названия некоторых из этих ПАВ включают, например, монолаурат сорбитана, монопальмитат сорбитана, моностеарат сорбитана, моноолеат сорбитана, сесквиолеат сорбитана и триолеат сорбитана. Эти ПАВ коммерчески доступны под названиями SPAN или ARLACEL. Поверхностно-активные вещества SPAN и ARLACEL являются липофильными и обычно способны растворяться или диспергироваться в масле. Они также растворимы в большинстве органических растворителей. В воде они обычно нерастворимы, но способны диспергироваться. Обычно значение гидрофильно-липофильного баланса (ГЛБ) этих ПАВ находится в диапазоне от 1,8 до 8,2. Такие ПАВ могут быть легко получены с помощью известных в данной области техники или коммерчески доступных способов.
Родственная группа поверхностно-активных веществ включает сложные моноэфиры полиоксиэтиленсорбитана и триэфиры полиоксиэтиленсорбитана. Эти ПАВ обычно получают добавлением этиленоксида к моноэфиру 1,4-сорбитана или триэфиру. Добавление полиоксиэтилена превращает липофильное сорбитан-моноэфирное или триэфирное ПАВ в гидрофильное ПАВ, обычно растворимое или диспергируемое в воде и растворимое в различной степени в органических жидкостях. Поверхностно-активные вещества TWEEN можно объединять, например, с родственным сорбитан-моноэфирным или триэфирным ПАВ, чтобы увеличить стабильность эмульсии. Поверхностно-активные вещества TWEEN обычно имеют значение ГЛБ в диапазоне от 9,6 и 16,7. Поверхностно-активные вещества TWEEN коммерчески доступны от ряда производителей, например, ICI America's Inc. Wilmington, Del. под зарегистрированным знаком "сурфактанты ATLAS".
Другая группа неионных поверхностно-активных веществ, которые могут быть использованы отдельно или в комбинации с ПАВ SPAN, ARLACEL и/или TWEEN, представляют собой полиоксиэтиленовые жирные кислоты, полученные взаимодействием этиленоксида с длинноцепочечной жирной кислотой. Наиболее распространенным ПАВ этого типа является твердое вещество под названием MYRJ, представляющее собой полиоксиэтилированное производное стеариновой кислоты. Поверхностно-активные вещества MYRJ являются гидрофильными и растворимыми или диспергируемыми в воде, как и ПАВ TWEEN. Для использования в целях получения эмульсий поверхностно-активные вещества MYRJ можно смешивать, например, с ПАВ TWEEN или с TWEEN/SPAN или со смесями ПАВ ARLACEL. Поверхностно-активные вещества MYRJ коммерчески доступны от ICI America's Inc. или их можно получать известными в данной области способами.
Другой группой неионных поверхностно-активных веществ на основе полиоксиэтилена являются полиоксиэтиленовые эфиры жирных кислот, полученные из лаурилового, ацетилового, стеарилового и олеилового спиртов. Эти вещества обычно получают, как описано выше, путем добавления этиленоксида к жирному спирту. Эти ПАВ известны под коммерческим названием BRIJ; вещества BRIJ могут быть гидрофильными или липофильными в зависимости от размера полиоксиэтиленового остатка в ПАВ. Способы получения этих соединений известны в данной области техники, вместе с тем, их также легко приобрести из коммерческих источников, например, ICI America's Inc.
Другие неионные поверхностно-активные вещества, которые можно использовать для осуществления настоящего изобретения, представляют собой, например, полиоксиэтилены, сложные эфиры полиолов и жирных кислот, полиоксиэтиленовые эфиры, полиоксипропиленовые жирные эфиры, содержащие полиоксиэтилен производные пчелиного воска, полиоксиэтиленовые производные ланолина, полиоксиэтиленовые жирные глицериды, сложные эфиры глицерина и жирных кислот или другие спирты полиоксиэтиленовых кислот или производные простых эфиров длинноцепочечных жирных кислот с 12-22 атомами углерода. Предпочтительно, полиоксиэтиленовый алкиловый эфир выбран из группы, состоящей из следующего: цетеарет-12 (коммерчески доступный под названием Eumulgin B1), цетеарет-20 (Eumulgin B2), стеарет-21 (Eumulgin S21), цетет-20 (Simulsol 58 или Brij 58), цетет-10 (Brij 56), стеарет-10 (Brij 76), стеарет-20 (Brij 78), олет-10 (Brij 96 или Brij 97) и олет-20 (Brij 98 или Brij 99). Число, добавленное к каждому химическому названию, соответствует числу звеньев этиленоксида в химической формуле. В конкретном аспекте полиоксиэтиленовый алкиловый эфир представляет собой BRIJ 56 или полиоксиэтилен (12) цетостеариловый эфир, предоставленный компанией Cognis под названием Eumulin™ B1. Среди поверхностно-активных веществ на основе сложного эфира сорбитана и сложного эфира маннида с ГЛБ менее 9, которые особенно подходят для изобретения, можно назвать моноолеат сорбитана, коммерчески доступный под названием Dehymuls SMOM или Span80. Среди поверхностно-активных веществ на основе сложного эфира маннида можно назвать моноолеатманнита, коммерчески доступный от компании Sigma или компании Seppic под названием Montanide 80™.
Два или несколько поверхностно-активных вещества можно комбинировать в эмульсионной части композиции по настоящему изобретению.
Водный раствор эмульсионной части типа масло-в-воде (М/В) композиции по настоящему изобретению представляет собой буферный солевой раствор или беспримесную воду. Поскольку композиция по изобретению предназначена для парентерального введения, для ее использования в качестве вакцины предпочтительно, чтобы конечные буферные растворы по показателям тоничности, т.е. осмоляльности были изготовлены по существу аналогичными обычным физиологическим жидкостям, для предотвращения набухания после введения или быстрого всасывания композиции из-за разницы концентраций ионов между композицией и физиологическими жидкостями. Также предпочтительно буферизовать солевой раствор для поддержания уровня рН, соответствующего нормальному физиологическому состоянию. Также, в некоторых случаях может быть необходимо поддерживать конкретный уровень рН, чтобы обеспечить стабильность антигена gB и пентамерного сложного антигена HCMV gH/gL/UL128/UL130/UL131, при их наличии в эмульсии М/В.
Можно использовать любой физиологически приемлемый буфер, но предпочтительными являются фосфатные буферы. В качестве заменителей фосфатных буферов можно использовать другие приемлемые буферы, такие как ацетат, Трис, бикарбонат, карбонат, цитрат или тому подобное. Значение рН водного компонента предпочтительно должно составлять от 6,0 до 8,0.
Эмульсионная (М/В) часть композиции по настоящему изобретению может содержать дополнительные компоненты, которые могут быть добавлены во время изготовления эмульсии масло/в воде или добавлены после изготовления этой эмульсии М/В.
Примером может быть соединение AF04: эмульсия масло-в-воде (М/В) на основе сквалена с содержанием E6020, которая была получена в соответствии со способом, описанным в WO 2007/080308.
Агонист TLR-4 GLA (номер CAS 1246298-63-4) представляет собой соединение со следующей химической формулой:
Агонист TLR-4 GLA коммерчески доступен, например, по каталогу Avanti Polar, № 699800 (Avanti Polar Lipids Inc., Alabaster, USA).
В частности, глюкопиранозил-липидный адъювант (GLA)представлен в комбинации с системой доставки, такой как фосфат кальция, липосомы, виросомы, ISCOM, микро-и наночастицы или эмульсии. Предпочтительно GLA представлен в комбинации с эмульсией масло-в-воде (М/В), более конкретно, в комбинации с эмульсией масло-в-воде на основе сквалена.
Примером может быть GLA-SQEM, эмульсия масло-в-воде (М/В) на основе сквалена, которая содержит GLA
В приведенной ниже таблице 1 указано количество различных исходных материалов, используемых для получения 100 мл эмульсии GLA-SQEMс концентрацией сквалена 10%. Конечная эмульсия содержит 4% (об/об) сквалена (34 мг/мл) и 100 г/мл GLA в 22,5 мМ фосфата аммония.
Таблица 1
Рецептура при 10% сквалена
% массы (вес/об)
Кол-во на 100 мл
Примечания
Водная фаза (90%):
25 мМ фосфат аммония, рН 6,1 qsp* 90 мл
87,7 мл
Полоксамер 188 (Pluronic F68)
0,09
90,0 мг
P5556 от фирмы SIGMA
Глицерол
2,25
24388238 Normapur от VWR Prolabo
Масляная фаза (10%)
Сквален 10% об/об (85,6 мг/мл)
8,56
10,0 мл
1208076 от фирмы SOPHIM, редистиллированный для удаления пероксидов
Димиристоил-фосфатидилхолин (DMPC)
1,9
850345P от Avanti Polar Lipids
GLA
0,025
25,0 мг
699800P от Avanti Polar Lipids
*qsp=количество, достаточное для…
Масляную фазу получают путем обработки ультразвуком в ванне при 55-60°С. Затем водную фазу добавляют к масляной фазе (с взвешиванием). Предварительную эмульсию получают после гомогенизации на устройстве Ultra Turrax T25 (IKA) при 9500 об/мин в течение 2 циклов по 30 секунд. Затем осуществляют микрофлюидизацию на устройстве Emulsiflex С3 в течение 20 пассажей при давлении воздуха 55 фунт/кв. дюйм (2633,415 Па) (давление гомогенизации от 1450 до 1600 бар). Затем эмульсию разбавляют в 25 мМ аммоний-фосфатного буфера в 2,5 раза для получения конечной эмульсии GLA-SQEM с содержанием сквалена 4%. Эмульсию подвергают стерилизующей фильтрации при температуре приблизительно 40°С с помощью шприца объемом 10 мл и мембранного фильтра 0,8-0,2 мкм Acrodisk Supor Membrane (PALL № PN4187).
Другие подходящие адъюванты, содержащие агонист TLR-4, представляют собой адъювант AS01, который содержит 3D-MPL и QS21 влипосомальной композиции, или AS02, который содержит 3D-MPL и QS21 в композиции эмульсии масло-в-воде (Garcon et al.,Exp. Rev. Of Vaccines, 2007, 6 (5): 723-739, EP0671948).
В одном варианте осуществления указанный Th1-индуцирующий адъювант содержит полимерную соль линейной или разветвленной полиакриловой кислоты с усредненной молекулярной массой Mw в диапазоне от 350 до 650 кДа.
Указанный полимер представляет собой линейный или разветвленный полимер полиакриловой кислоты, но не является сшитым полимером.
Понятие "полимер полиакриловой кислоты" относится к полимеру, который состоит исключительно из звеньев акриловой кислоты. Таким образом, в форме соли указанная полимерная соль полиакриловой кислоты состоит исключительно из звеньев, соответствующих соли акриловой кислоты, или состоит исключительно из звеньев, соответствующих такой форме акриловой кислоты как свободная кислота, и из звеньев, соответствующих соли акриловой кислоты.
Линейный или разветвленный полимер полиакриловой кислоты получают путем полимеризации исключительно акриловой кислоты в качестве мономера. В большинстве случаев полимеризация проводится радикально с использованием окисляющего вещества в качестве инициатора или катализатора. Чаще всего используют такие окислители как персульфат (пероксидисульфат), например, персульфат натрия или калия. Разветвленные полимеры полиакриловой кислоты описаны, например, в издании Macromolecules 2011, 44, 5928-5936. Коэффициент Марка-Хаувинка для линейного полимера по изобретению составляет 0,7 или выше (Yan J.K., Pei J.J., Ma H.L., Wang Z.B. 2015. Effects of ultrasound on molecular properties, structure, chain conformation and degradation kinetics of carboxylic curdlan. Carb. Polymers. 121, 64-70).
Полимерная соль полиакриловой кислоты может быть представлена в твердой форме (преципитат или порошок) или предпочтительно в жидкой композиции. Жидкая композиция содержит соль полиакриловой кислоты и водный раствор. Предпочтительно, уровень рН такой композиции находится в диапазоне от 5,5 до 8,0. Этот уровень рН может быть получен путем введения в водный раствор основания, такого как NaOH. Водный раствор может представлять собой буферный водный раствор, полученный с таким буфером как фосфатный буфер, Трис (TRIS, или 2-амино-2-гидроксиметил-1,3-пропандиол), Hepes (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота), гистидин или цитратный буфер. Жидкая композиция может также содержать одну или несколько дополнительных солей, например, NaCl.
В частности, указанная линейная или разветвленная полимерная соль полиакриловой кислоты состоит исключительно из звеньев, соответствующих соли акриловой кислоты, или состоит исключительно из звеньев, соответствующих такой форме акриловой кислоты как свободная кислота, и звеньев, соответствующих соли акриловой кислоты.
Предпочтительно, указанная полимерная соль полиакриловой кислоты содержит менее 0,005%, предпочтительно менее 0,001% вес/вес окисляющих веществ в пересчете на общую сухую массу указанной полимерной соли полиакриловой кислоты и/или содержит менее 0,005%, предпочтительно менее 0,001% вес/вес персульфатов в пересчете на общую сухую массу указанной полимерной соли полиакриловой кислоты.
В более конкретном варианте осуществления полимер полиакриловой кислоты представляет собой соль с Na+.
В конкретных вариантах осуществления индекс полидисперсности указанной полимерной соли полиакриловой кислоты составляет приблизительно 4 или ниже, предпочтительно приблизительно 2,5 или ниже.
В конкретных вариантах осуществления указанная полимерная соль полиакриловой кислоты имеет усредненную молекулярную массу Mw в диапазоне от 380 до 620 кДа и индекс полидисперсности 4 или ниже; или имеет усредненную молекулярную массу Mw в диапазоне от 400 до 600 кДа и индекс полидисперсности 4 или ниже; или имеет усредненную молекулярную массу Mw в диапазоне от 380 до 620 кДа и индекс полидисперсности 2,5 или ниже; или имеет усредненную молекулярную массу Mw в диапазоне от 400 до 600 кДа и индекс полидисперсности 2 или ниже.
Предпочтительно, указанная полимерная соль полиакриловой кислоты содержит менее 0,005% вес/вес мономера акриловой кислоты в форме свободной кислоты или ее соли в пересчете на общую сухую массу указанной полимерной соли полиакриловой кислоты.
В соответствии с предпочтительными вариантами осуществления указанная полимерная соль полиакриловой кислоты находится в жидкой композиции, уровень рН которой составляет от 5,5 до 8,0.
В соответствии с предпочтительными вариантами осуществления указанная полимерная соль полиакриловой кислоты находится в буферном водном растворе, в частности в фосфатном буфере, или в буфере Трис, Hepes, гистидиновом или цитратном буфере.
В соответствии с предпочтительными вариантами осуществления изобретения указанная полимерная соль полиакриловой кислоты подвергается диафильтрации и стерилизации.
Если проводится диафильтрация полимерной соли полиакриловой кислоты или жидкой композиции полимерной соли полиакриловой кислоты, то стерилизацию осуществляют после диафильтрации.
Согласно изобретению, усредненная молекулярная масса Mw определяется посредством эксклюзионной хроматографии с разделением по размеру. Предпочтительно использовать три детектора после колоночной гель-эксклюзионной хроматографии: детектор рассеяния света с прямым углом, детектор показателя преломления и четырех капиллярный дифференциальный вискозиметр. Значение приращения показателя преломления dn/dc, используемое для определения Mw, предпочтительно определяют с помощью детектора показателя преломления в серии полимеров полиакриловой кислоты с известной концентрацией. Содержание персульфата и содержание мономера акриловой кислоты в форме свободной кислоты или в солевой форме можно определить с помощью высокоэффективной анионообменной хроматографии с использованием кондуктометрического определения.
Способ получения такого полимера включает, например, следующие последовательные стадии:
a) получение раствора полимера полиакриловой кислоты,
b) очистку раствора полимера полиакриловой кислоты для удаления примесей,
и
c) стерилизацию очищенного раствора полимера полиакриловой кислоты.
Способ хранения раствора такой полимерной соли включает, например, вышеупомянутый способ получения, за которым следует стадия хранения в растворе полученного полимера.
В частности, указанная линейная или разветвленная полимерная соль полиакриловой кислоты с усредненной молекулярной массой Mw в диапазоне от 350 до 650 кДа представляет собой PAA225000.
Продукт под названием PAA225000 (реф. № 18613, натриевая соль) может быть предоставлен фирмой Polysciences Europe (Eppelheim, Germany) в форме концентрированного раствора. Его можно разбавлять водой до концентрации 20 мг/мл и оставлять с перемешиванием при комнатной температуре в течение 12 часов. Значение рН можно довести до 7,55 с помощью HCl и раствор можно подвергать диализу при комнатной температуре против 150 мМ водного раствора NaCl (3 последовательных ванны) с использованием диализных кассет с отсечкой 2 кДа (Thermo Fischer Scientific, Courtastoeuf, France). Затем раствор можно фильтровать через PVDF мембрану 0,22 мкм для стерилизации. Затем можно определять молекулярную массу полимерной соли, составляющую 488550 Да. Значение Mn может составлять 129070 Да, и значение IP 3,8.
Затем полимер можно хранить при +4°С в виде раствора, содержащего 20 мг/мл полимера в 150 мМ водном растворе NaCl. После этого раствор можно смешивать с фосфатно-буферным раствором (ФБР) 1C, разбавленным в 10 раз стерильной водой, для получения солевого раствора, содержащего 2 мг/мл полимерной соли.
et al.
et al.
et al.
В композиции по изобретению может быть использован любой другой Th1-индуцирующий адъювант. В качестве примеров адъювантов, которые достоверно индуцируют иммунный ответ типа Th1, можно назвать следующие: адъюванты или комбинации адъювантов, содержащие сапонин, например, описанные в WO 8809336 или в US5057540, в частности QS21 и его синтетические или полусинтетические аналоги, агонист TLR-3, например, Poly:C и его производные, агонист TLR-5, например, флагеллин и его производные, агонист TLR-7 или агонист TLR-7/8, такой как имидазохинолин и его производные, например, описанные в ЕР 1318835, агонист TLR-8, такой как мотолимод, также известный как VTX-2337 (как описано Lu ,Clin. Cancer Res. 2012, 18(2):499-509) и его производные или агонисты TLR-8, разработанные Dynavax, агонист TLR-9, например, олигодезоксинуклеотиды CpG и их производные, например, описанные авторами Vollmer , Expert Opin. Biol. Ther., 2005, 5(5):673-682, в частности, ISS1018 или CpG 7909, агонист RIG-I-подобного рецептора (RLR), такой как агонист RIG-I, в частности 5'-трифосфат-РНК или низкомолекулярные агонисты от фирмы Kineta, или агонист STING (стимулятор генов интерферона), в частности, циклические динуклеотиды (например, c-di-AMP, c-di-GMP, c-di-GMP), поли[ди(карбоксилатофенокси)фосфазен] (PCPP), описанный авторами Payne , Dev Biol Stand. 1998, 92:79-87), поли[ди(натрий карбоксилатометилфенокси)]фосфазен (PEP), описанный авторами Dar A et al.,Vet.Immunol.Immunopathol. 2012, 146(3-4):289-95, или карбопол (Carbopol).
Упомянутые Th1-индуцирующие адъюванты можно объединять с системой доставки, такой как водная наносуспензия, фосфат кальция, липосомы, виросомы, ISCOM, микрочастицы и наночастицы, эмульсии.
Адъювант и антигены иммуногенной композиции по изобретению можно включать в рецептуру с любым фармацевтически приемлемым носителем. В контексте настоящего изобретения понятие "фармацевтически приемлемый носитель" относится к носителю, который является физиологически приемлемым для введения человеку, и при этом сохраняет физиологическую активность иммуногенной композиции по изобретению, т.е. способность индуцировать иммунный ответ. Одним из примеров фармацевтически приемлемого носителя является физиологический солевой буферный раствор. Другие физиологически приемлемые носители известны специалистам в данной области и описаны, например, в Remington's Pharmaceutical Sciences (18-е изд.), под ред. A.Gennaro, 1990, Mack Publishing Company, Easton, Pa.
Иммуногенная композиция по изобретению может необязательно содержать фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, необходимые для создания физиологических условий, такие как буферные вещества, вещества, регулирующие рН, вещества, регулирующие тоничность, смачивающие вещества и т.п., например, ацетат натрия, лактат натрия, хлорид натрия, хлорид калия, хлорид кальция, сорбитанмонолаурат, триэтаноламинолеат, человеческий сывороточный альбумин, заменимые аминокислоты, незаменимые аминокислоты, L-аргинингидрохлорид, сахароза, дигидрат D-трегалозы, сорбит, трис(гидроксиметил) аминометан и/или мочевина. Дополнительно, вакцинная композиция может необязательно содержать фармацевтически приемлемые добавки, включающие, например, разбавители, связующие вещества, стабилизаторы и консерванты.
Значение рН иммуногенной композиции обычно составляет от 5,5 до 8 и более предпочтительно от 6,5 до 7,5 (например, приблизительно 7). Стабильность уровня рН можно поддерживать с помощью буфера, например, Трис-буфера, цитратного буфера, фосфатного буфера, буфера Hepes или гистидинового буфера. Таким образом, иммуногенная композиция обычно содержит буфер. Иммуногенные композиции могут быть изотоническими по отношению к человеческому организму. Иммуногенная композиция может также содержать одну или несколько дополнительных солей, например, NaCl.
Иммуногенные композиции можно стерилизовать обычными способами стерилизации или можно применять стерилизующую фильтрацию. Полученные водные растворы можно упаковывать и хранить в жидком виде или подвергать лиофилизации, при этом лиофилизированный препарат разбавляют стерильным водным носителем перед введением. В предпочтительном варианте осуществления иммуногенные композиции упаковывают и хранят в виде микрогранул, полученных способом гранулирования, как описано в WO 2009109550. Каждая микрогранула может содержать антиген gB, пентамерный сложный антиген gH/gL/UL128/UL130/UL131 и Th1-индуцирующий адъювант необязательно с эмульсией масло-в-воде. Альтернативно, антиген gB, антиген gH/gL/UL128/UL130/UL131 и Th1-индуцирующий адъювант, необязательно с эмульсией масло-в-воде, могут содержаться в разных микрогранулах по отдельности или в любой комбинации, и могут смешиваться до или после восстановления водного раствора для получения композиции по изобретению.
Адъювант и антигенная часть иммуногенной композиции по изобретению обычно смешиваются друг с другом при условии отсутствия несовместимости между продуктами, или, альтернативно, адъювант можно добавлять непосредственно для немедленного введения субъекту.
В одном варианте осуществления иммуногенную композицию по изобретению делают в виде готовой к применению смеси антигена HCMV gB, пентамерного сложного антигена HCMV gH/gL/UL128/UL130/UL131 и Th1-индуцирующего адъюванта.
В другом варианте осуществления иммуногенную композицию по изобретению готовят непосредственно перед введением человеку. Таким образом, изобретение относится к наборам, включающим разные готовые для смешивания компоненты. Набор позволяет хранить по отдельности антиген HCMV gB, пентамерный сложный антиген HCMV gH/gL/UL128/UL130/UL131, Th1-индуцирующийадъювант и, необязательно, эмульсию масло-в-воде до момента использования.
Эти компоненты физически отделены друг от друга в наборе, и это разделение может быть достигнуто различными способами. Например, они могут находиться в отдельных контейнерах, таких как флаконы. В некоторых вариантах осуществления все компоненты хранятся по отдельности до момента использования. Предпочтительно, если антиген gB и пентамерный сложный антиген HCMV gH/gL/UL128/UL130/UL131 находятся в одном контейнере, а Th1-индуцирующий адъювант и, необязательно, эмульсия масло-в-воде находятся в другом контейнере. Затем содержимое флаконов можно смешивать, например, путем забора содержимого одного флакона и добавления его в другой флакон, или путем раздельного удаления содержимого всех флаконов и смешивания их в новом контейнере. В одном примере один или несколько компонентов набора находятся в шприце (шприцах), а другой находится в контейнере (контейнерах), например, во флаконе. Шприц можно использовать (например, с иглой) для введения содержимого этого шприца в другой контейнер для смешивания, после чего полученную смесь можно набрать в шприц. Затем смешанное содержимое шприца можно вводить пациенту, обычно через новую стерильную иглу. В другом варианте осуществления компоненты набора хранятся совместно в одном и том же шприце, но в раздельных камерах. Когда шприц приводится в действие (например, во время введения пациенту), содержимое камер смешивается. Такая компоновка исключает необходимость в отдельной стадии смешивания во время применения. Компоненты набора обычно находятся в водной форме. В некоторых вариантах осуществления один или несколько компонентов находится в сухой форме (например, в лиофилизированной форме или в виде микрогранул), при этом другой компонент (компоненты) находится в водной форме. Компоненты можно смешивать для реактивации сухого компонента и получения водной композиции для введения пациенту. Один или несколько лиофилизированных компонентов могут находиться внутри флакона или в шприце. Сухие компоненты могут включать стабилизаторы, такие как маннит, сахароза или додецилмальтозид, а также их смеси, например, смеси лактоза/сахароза, смеси сахароза/маннит и т.д. В некоторых вариантах осуществления все компоненты находятся в сухой форме (например, в лиофилизированной форме или в виде микрогранул), хранятся в одном и том же контейнере или по отдельности в нескольких контейнерах, и в набор входит другой контейнер, содержащий водный раствор для восстановления вакцины.
Таким образом, изобретение относится к набору, содержащему: (i) первый набор компонентов, который содержит антиген HCMV gB и пентамерный сложный антиген HCMV gH/gL/UL128/UL130/UL131, и (ii) второй набор компонентов, который содержит Th1-индуцирующий адъювант и, необязательно, содержит эмульсию масло-в-воде; и к применению такого набора для профилактики инфекции HCMV.
В предпочтительном варианте осуществления иммуногенная композиция по изобретению представлена в одном флаконе/шприце в качестве готовой к использованию смеси антигена HCMV gB, пентамерного сложного антигена HCMV gH/gL/UL128/UL130/UL131 и Th1-индуцирующего адъюванта.
Иммуногенную композицию по изобретению можно вводить любым подходящим путем, таким как введение через слизистую (например, интраназально или сублингвально), парентерально (например, внутримышечным, подкожным, чрескожным или интрадермальным путем) или путем перорального введения. Специалисту в данной области следует понимать, что композиция вакцины по настоящему изобретению предусматривает совместимость с предполагаемым способом введения.
Иммуногенную композицию по изобретению можно вводить в качестве единственного средства или с подходящими фармацевтическими носителями, и указанная композиция может находиться в твердой или жидкой форме, такой как таблетки, капсулы, порошки, растворы, суспензии или эмульсии.
Для использования в аэрозольной форме иммуногенная композиция по изобретению в растворе или суспензии может быть упакована в аэрозольный герметичный контейнер под давлением вместе с подходящими пропеллентами, например, углеводородными пропеллентами, такими как пропан, бутан или изобутан, вместе с общепринятыми адъювантами. Вещества по настоящему изобретению также можно вводить в форме с атмосферным давлением, такой как небулайзер или распылитель.
Применения
Как упоминалось ранее, изобретение также относится к иммуногенной композиции, описанной здесь, для применения в качестве вакцины против HCMV.
В частности, вакцина против HCMV согласно изобретению является субъединичной вакциной.
Дополнительно, изобретение относится к способу профилактики HCMV-инфекции у нуждающегося в этом пациента, и указанный способ включает введение иммунологически эффективного количества иммуногенной композиции по изобретению.
Используемый в изобретении термин "HCMV" описан выше. HCMV-инфекция может, в частности, относиться к материнской HCMV инфекции во время беременности или к врожденной инфекции.
В частности, указанная вакцина/иммуногенная композиция повышает уровень и/или устойчивость нейтрализующих антител. Более конкретно, указанная вакцина/иммуногенная композиция, содержащая антиген HCMV gB, пентамерный сложный антиген HCMV/gL/UL128/UL130/UL131 и Th1-индуцирующий адъювант, более эффективно повышает уровень и/или устойчивость нейтрализующих антител, чем вакцина/иммуногенная композиция, содержащая тот же антиген HCMV gB, тот же пентамерный сложный антиген HCMV gH/gL/UL128/UL131/UL131 и адъювант MF59.
Используемый в изобретении термин "вакцина" означает иммуногенную композицию, которую вводят для индукции иммунного ответа, призванного защищать или лечить субъекта от болезни, в частности, обусловленной упомянутым вирусом. Вакцина согласно настоящему изобретению предназначена для использования в качестве превентивной (профилактической) вакцины для введения субъекту перед инфицированием с целью предотвращения начальной (и/или рецидивирующей) инфекции. В конкретном случае врожденного HCMV-инфицирования настоящее изобретение предназначено для применения в качестве профилактической вакцины для девушек и женщин репродуктивного возраста перед беременностью для предотвращения вертикальной передачи HCMV от матери к плоду или новорожденному.
Иммуногенная композиция по изобретению содержит иммунологически эффективное количество антигенов и адъювантов, описанных в настоящем изобретении. "Иммунологически эффективное количество" представляет собой количество, которое при введении субъекту является эффективным для индукции иммунного ответа против используемого антигена. Это количество может варьировать в зависимости от состояния здоровья и физического состояния пациента, подлежащего лечению, его возраста, способности иммунной системы человека продуцировать антитела, от желаемой степени защиты, композиции вакцины, оценки клинической ситуации со стороны лечащего врача. Специалисты в данной области могут определять это количество обычными способам.
Согласно изобретению, понятие "субъект" используется аналогично понятию "пациент", и относится к человеку, в частности, к женщинам репродуктивного возраста (от 16 до 45 лет) и девушкам подросткового возраста (11-15 лет) независимо от их ЦМВ-серологического статуса, а также к мужчинам, детям или пациентам, которым планируется трансплантация солидного органа или стволовых клеток. В частности, указанный пациент или субъект восприимчивы к инфекции HCMV.
Используемое в изобретении понятие "нейтрализующее антитело" имеет значение, известное специалистам в данной области и относится к антителу, которое напрямую нейтрализует свою мишень, например, путем блокирования проникновения вируса в клетку-хозяина, а также путем блокирования распространения вируса из клетки в клетку. Нейтрализующими антителами являются функциональные антитела, которые способны защищать от своей мишени. В разделе примеров настоящего изобретения представлен ряд иллюстративных способов, разработанных для определения повышения уровня содержания и/или устойчивости нейтрализующих антител.
Вакцину по изобретению можно вводить любым путем, обычно применяемым для введения вакцин. Следует применять схему, приводящую к индукции ожидаемого иммунного ответа. Обычно схема иммунизации включает несколько введений. Количество вводимой иммуногенной композиции достаточно для получения желаемого иммунного ответа и определяется специалистом в данной области.
Вакцину согласно настоящему изобретению можно вводить по схеме многократных доз. Например, вакцину по изобретению можно вводить в однократной дозе и в двух или трех дозах. Если вакцину по изобретению вводят в трех дозах, то первая доза и третья доза предпочтительно вводятся приблизительно в течение 12 месяцев. Например, схема введения вакцины по изобретению может включать первую дозу, вторую дозу и третью дозу, при этом указанная вторая доза должна вводиться с интервалом приблизительно от одного до трех месяцев после первой дозы, а третья доза должна вводиться с интервалом приблизительно от шести до двенадцати месяцев после первой дозы. Альтернативно, три дозы можно вводить в течение 0 месяцев, в течение от одного до двух месяцев (например, приблизительно в течение полутора месяцев) и в течение приблизительно шести месяцев.
Вакцину согласно настоящему изобретению можно вводить по схеме двух доз. Предпочтительно первая доза и вторая доза вводятся приблизительно с интервалом один, три, шесть, восемь или девять месяцев.
Вакцину согласно настоящему изобретению можно вводить в виде единичной дозы.
Необязательно, можно применять бустерное введение вакцины по изобретению, например, с интервалом от шести месяцев до десяти лет, например, с интервалом шесть месяцев, один год, три года, пять лет или десять лет после начальной иммунизации (т.е. после введения последней дозы, запланированной по схеме начальной иммунизации).
Все цитируемые в изобретении ссылки, включая журнальные статьи или рефераты, опубликованные патентные заявки, выданные патенты или любые другие ссылки, полностью включены в настоящее изобретение путем ссылки, включая все данные, таблицы, фигуры и текст, представленные в цитированных ссылках.
В свете настоящего изобретения следует понимать, что понятие "иммуногенная композиция для использования" эквивалентно понятию "применение иммуногенной композиции" и, в частности, понятие "иммуногенная композиция для использования в качестве вакцины" эквивалентно понятию "применение иммуногенной композиции в качестве вакцины" и "применение иммуногенной композиции для производства лекарственного средства, предназначенного для использования в качестве вакцины".
Следующие фигуры и примеры представлены для дополнительного объяснения изобретения.
ФИГУРЫ
Фигура 1:
План исследования
Фигура 2:
Кинетика титров нейтрализующих антител, специфичных для штамма HCMV BAD-rUL131-Y4, измеренная с помощью анализа серологической нейтрализации на эпителиальных клетках с комплементом (схема А) или без комплемента (схема В) в сыворотках, собранных в период от дня 20 до дня 257 от мышей, иммунизированных в дни 0, 20 и 227 путем введения 2 мкг CMV-gB и пентамера с различными адъювантами или без адъювантов.
Фигура 3:
Титры нейтрализующих антител, специфичных для штамма HCMV BAD-rUL131-Y4 GFP, измеренные с помощью анализа серологической нейтрализации на эпителиальных клетках с комплементом (схема А) или без комплемента (схема В) и на фибробластах с комплементом (схема С) или без комплемента (схема D) в сыворотках, собранных на 34 день от мышей, иммунизированных в дни 0 и 20 путем введения 2 мкг CMV-gB и пентамера с различными адъювантами или без адъювантов.
Фигура 4:
Титры нейтрализующих антител, специфичных для штамма HCMV BAD-rUL131-Y4, измеренные с помощью анализа серологической нейтрализации на эпителиальных клетках с комплементом (схема А) или без комплемента (схема В) и на фибробластах с комплементом (схема С) или без комплемента (схема D) в сыворотках, собранных в день 208 от мышей, иммунизированных в дни 0 и 20 путем введения 2 мкг CMV-gB и пентамера с различными адъювантами или без адъювантов.
Фигура 5:
Титры нейтрализующих антител, специфичных для штамма HCMV BAD-rUL131-Y4, измеренные с помощью анализа серологической нейтрализации на эпителиальных клетках с комплементом (схема А) или без комплемента (схема В) и на фибробластах с комплементом (схема С) или без комплемента (схема D) в сыворотках, собранных в день 257 от мышей, иммунизированных в дни 0, 20 и 227 путем введения 2 мкг CMV-gB и пентамера с различными адъювантами или без адъювантов.
Фигура 6:
Титры антител против gB lgG1 и IgG2c, специфичные для CMV-gB (таблица A) или для CMV-пентамера (таблица B), измеренные с помощью анализа ELISA в сыворотках, собранных в дни 34, 208 и 257 от мышей, иммунизированных в дни 0, 21 и 227 путем введения 2 мкг CMV-gB и пентамера с различными адъювантами или без адъювантов.
Фигура 7:
Средние соотношения антител IgG1/IgG2c, рассчитанные в дни 34, 208 и 257 для каждой группы мышей, иммунизированных в дни 0, 21 и 227 путем введения 2 мкг CMV-gB и пентамера с MF59 или с другими адъювантами.
Фигура 8:
6
ex vivo
Частота встречаемости клеток, секретирующих цитокины IL-5 и IFN-γ (цитокин-секретирующие клетки/10 спленоцитов) после стимуляции  рекомбинантным CMV-gB (таблица А) или CMV-пентамером (таблица В), которую определяли на 34, 208 и 257 день в спленоцитах от мышей, иммунизированных в дни 0, 20 и 227 путем введения 2 мкг CMV-gB и пентамера с различными адъювантами или без адъювантов.
Фигура 9:
Процентное содержание IgG1 и IgG2c в антитело-секретирующих плазмабластах, специфичных или для CMV-gB (таблица A), или для CMV-пентамера (таблица B) в дни 34, 208 и 257, измеренное у мышей, иммунизированных в дни 0, 20 и 227 путем введения 2 мкг CMV-gB и пентамера с различными адъювантами или без адъювантов.
Фигура 10:
Процентное содержание IgG1 и IgG2c в антитело-секретирующих В-клетках памяти, специфичных или для CMV-gB (таблица A), или для CMV-пентамера (таблица B) в дни 34, 208 и 257, измеренное у мышей, иммунизированных в дни 0, 20 и 227 путем введения 2 мкг CMV-gB и пентамера с различными адъювантами или без адъювантов.
Фигура 11:
Титры нейтрализующих антител, специфичные для штамма HCMV BAD-rUL131-Y4 GFP, измеренные с помощью анализа серологической нейтрализации на эпителиальных клетках ARPE-19 или на фибробластах MRC-5 в присутствии комплемента в сыворотках, собранных на 20 день у мышей, иммунизированных разными дозами CMV-gB и пентамера CMV-gH/gL/UL128/UL130/UL131 в композиции с адъювантом PAA.
Фигура 12:
Титры нейтрализующих антител, специфичные для штамма HCMV BAD-rUL131-Y4 GFP, измеренные с помощью анализа серологической нейтрализации на эпителиальных клетках ARPE-19 в присутствии (12A) или в отсутствие (12B) комплемента в сыворотках, собранных на 35 день у мышей, иммунизированных в дни 0 и 21 путем введения разных доз CMV-gB и пентамера CMV-gH/gL/UL128/UL130/UL131 в композиции с адъювантом PAA.
Фигура 13:
ex vivo
Количественное определение клеток, продуцирующих IFN-γцитокины в спленоцитах мышей после стимуляции введением или CMV-gB, или пентамера CMV-gH/gL/UL128/UL130/UL131 (диаграмма А), или пептидных пулов CMV-пентамера (диаграмма В), выполненное с помощью анализа ELISPOT в спленоцитах, собранных на 35 день от мышей, иммунизированных в дни 0 и21 путем введения 3 мкг CMV-gB и 3 мкг пентамера CMV-gH/gL/UL128/UL130/UL131 в композиции с адъювантом PAA.
ПРимеры
Таблица 2
Список сокращений
Аббревиатура
Обозначение/описание
CMV
цитомегаловирус
д (D)
день
ELISA
иммуноферментный анализ
EU
единица ELISA
IFN-γ
интерферон-гамма
Ig
иммуноглобулин
IL
интерлейкин
в/м (IM)
внутримышечно
и/п (IP)
интраперитонеально
мес. (М)
месяц
Н/Р (N/A)
не применимо
СН (SN)
серологическая нейтрализация
нед. (W)
неделя
С
комплемент
Пример 1
Материалы и способы
Материал
Вещество (вещества), исследованные в примерах
Вещества указаны в таблице 3 ниже. Самки 7-недельных мышей C57BL/6J были иммунизированы путем внутримышечного (в/м) введения указанных веществ в четырехглавую мышцу задней лапы в объеме 50 мкл в день 0, день 20 и день 227.
Таблица 3
Название вещества
Концентрация
Источник или композиция
Пентамер CMV
1 мг/мл
The Native Antigen company, Oxford UK
gB (CMV)
685,5 мкг/мл
gBdTM, представляет собой полипептид длиной 806 аминокислот; получен в соответствии с US 6100064
PAA225000 (PAA)
8 мг/мл PAA225000
Polysciences Europe GmbH, Hirschberg an der Bergstrasse, Germany
MF59
4% сквален
Количество на 1 мл:Сквален 39,0 мгПолисорбат 80 4,7 мгТриолеат сорбита 4,7 мгЦитрат натрия, дигидрат 2,65 мгЛимонная кислота, моногидрат 0,17 мгВода для инъекций qsp 1 мл
AF04
5% сквален 0,4 мг/мл Е6020
Получен в соответствии со способом, описанным в WO 2007/080308
GLA-SQEM
4% сквален0,1 мг/мл GLA
GLA от Avanti Polar Lipids Inc., Alabaster, СШАGLA-SQEM получен в соответствии со способом, описанным выше в описании изобретения
Способы
Описание групп
Группы исследования представлены в таблице 4 ниже. Мышей случайным образом распределяли в одну из следующих 7 групп. Каждая группа подразделялась на 3 подгруппы, т.е. группа A состояла из подгрупп A1, A2 и A3, в зависимости момента времени анализа, требующего умерщвления мышей для забора селезенки (дни 34, 208 и 257), что отражено в схеме исследования на фиг. 1. В каждую группу были включены по тридцать пять мышей следующим образом: 10 мышей в подгруппах 1 и 2 и 15 мышей в подгруппах 3 для компенсации возможных интеркуррентных случаев смерти, которые могли произойти в течение восьми месяцев. В контрольных группах в подгруппы A1, A2 и A3 были включены только по 5 мышей на подгруппу, в группу B были включены только 5 мышей в подгруппы В1 и В2 и 10 мышей в подгруппу В3.
Таблица 4
<b>Группы</b>
<b>Подгруппы (число мышей)</b>
<b>Исследуемые вещества</b>
<b>Действующее вещество</b>
<b>Адъювант</b>
<b>Путь введения</b>
Название
доза
Название
доза
A1 (5)
в/м50 мкл в дни 0, 21
A
A2 (5)
(15)
ФБР
-
-
-
в/м50 мкл в дни 0,21, мес.7
A3 (5)
B1 (5)
gB+Пентамер
2 мкг2 мкг
в/м50 мкл в дни0, 21
B2 (5)
B(20)
-
-
в/м50 мкл в дни 0, 21, мес.7
B3 (10)
C1 (10)
gB+Пентамер
2 мкг2 мкг
в/м50 мкл в дни 0,21
C(35)
C2 (10)
2%сквален
MF59
в/м50 мкл в дни 0, 21, мес.7
C3 (15)
D1 (10)
gB+Пентамер
PAA
200 мкг
в/м50 мкл в дни 0, 21
D(35)
D2 (10)
2 мкг2мкг
в/м50 мкл в дни 0, 21, мес.7
D3 (15)
E1 (10)
gB+ Пентамер
2 мкг2 мкг
AF04
1 мкгE6020,2,5%сквален
в/м50 мкл в дни 0, 21
E(35)
E2 (10)
в/м50 мкл в дни 0,21, мес.7
E3 (15)
F1 (10)
gB+ Пентамер
2мкг2мкг
GLA-SQEM
2,5 мкг GLA,2%сквален
в/м50 мкл в дни 0, 21
F2 (10)
F(35)
в/м50 мкл в дни 0,21, мес.7
F3(15)
Биологические пробы и аналитические тесты
Отбор биологических проб
Образцы крови отбирали у всех животных под анестезией. Анестезию выполняли путем интраперитонеального введения 1,6 мг кетамина (Imalgene) и 0,32 мг ксилазина (Rompun), в объеме 200 мкл. Приблизительно 1 мл крови собирали во флаконы, содержащие активатор свертывания и сепаратор сыворотки (BD Vacutainer SST, Ref. № 367783). Образцы оставляли на ночь при температуре +4°C, после чего кровь центрифугировали при 3000 об/мин в течение 20 минут и сыворотку собирали и хранили до анализа при -20°C.
Для анализов клеточного ответа селезенки собирали в стерильных условиях и после взятия образцов селезенки максимально быстро выделяли спленоциты.
Аналитические тесты
Анализы серологической нейтрализации
Эта методика используется для титрования функциональных нейтрализующих антител, присутствующих в сыворотке животных, иммунизированных по схеме CMV-gB+пентамер+адъювант. Исходя из способности цитомегаловируса инфицировать MRC5-фибробласты и клетки ARPE-19 (эпителиальные клетки человека), сыворотка, содержащая специфические функциональные антитела против CMV-gB и/или CMV-пентамера, может ингибировать инфицирование клеток вирусом.
4
2
2
Коротко, фибробласты MRC5 или клетки ARPE-19 в количестве 2,5×10клеток помещали в 96-луночные темные планшеты за 1 день перед анализом микронейтрализации (MN). В день 0 сыворотку подвергали термоинактивации при 56°C в течение 30 минут. Образцы сыворотки последовательно в два раза разводили средой DMEM/F12 с 1% фетальной бычьей сыворотки (FBS), начиная от разведения 1/10 до 1/10240 в 96-луночном планшете, и инкубировали с 4,2 log FFU/мл штамма вируса BADrUL131-Y4 CMV (поставляемого фирмой Thomas Shenk, как описано авторами Wang et al., J.Virol. 2005, 79 (16):10330-10338), титрованного 4,89 или 4,71 log FFU/мл на клетках ARPE-19 или MRC5 соответственно) в течение 60 минут при 37°C в инкубаторе для клеток с 5% CO. Затем смеси сыворотки/вируса переносили на клетки MRC5 или ARPE-19 и инкубировали при 37°C в инкубаторе для клеток с 5% CO. Инкубирование проводили в течение 3 дней для клеток MRC5 ив течение 4 дней для клеток ARPE.
На 3 или 4 день после удаления культурального супернатанта клетки фиксировали 100 мкл 1% формалина в ФБР в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем планшеты три раза промывали ФБР и оставляли для высыхания на воздухе при комнатной температуре перед анализом на флуоресцентном планшетном ридере Microvision для подсчета инфицированных клеток в каждой лунке.
В качестве контроля на каждом планшете были две лунки контрольных клеток (без вируса) и шесть лунок с клетками, инфицированными половиной вирусного разведения, содержащего 4,2 log FFU/мл. Среднее значение из этих шести лунок составляло пороговое значение серологической нейтрализации, определенное как 50% от значения специфичного сигнала. Конечные точки титрования до нейтрализации определяли как обратную величину последнего разведения, которая была ниже рассчитанного значения 50% специфичного сигнала. Нейтрализующие титры (μPRNT50) определяли для каждой отдельной сыворотки как последнее разведение, индуцирующее 50%-ное уменьшение инфицированных клеток, т.е. последнее разведение, которое индуцировало меньше инфицированных клеток, чем рассчитанное значение специфичного сигнала 50%. Среднее геометрическое значение титров нейтрализующих антител рассчитывали для каждой группы.
Анализ ELISA
Сыворотки IgG1 и IgG2c, действующие против антигена CMV-gB или против антигена CMV-пентамера, титровали с помощью автоматизированного анализа ELISA в соответствии со следующей методикой.
На96-луночные микропланшеты Dynex наносили CMV-gB или CMV-пентамер в количестве 1 мкг на лунку в 0,05 М карбонатном/бикарбонатном буфере, рН 9,6 (Sigma) и оставляли на ночь при 4°C. Затем планшеты блокировали в течение по меньшей мере 1 часа при 37°C внесением раствора PBS Tween-milk в количестве 150 мкл на лунку (ФБР, уровень рН 7,1+0,05% Tween 20, 1% (вес/об.) порошкообразного обезжиренного молока (DIFCO)). Все последующие стадии инкубирования проводили в конечном объеме 100 мкл, после чего 3 раза промывали смесью ФБР, рН 7,1 и 0,05% Tween20. В лунки добавляли образцы сыворотки и проводили серийное двукратное разведение с использованием ФБР/Tween-milk (начиная с разведения 1/1000 или 1/10000). Планшеты инкубировали в течение 90 минут при 37°C. После промывания в лунки добавляли конъюгированные с пероксидазой хрена козьи антитела против мышиных IgG1 или IgG2c (Southern Biotech), в разведении1/2000 в ФБР/Tween-milk, и планшеты инкубировали в течение 90 минут при 37°C. Затем планшеты промывали и инкубировали в темноте в течение 30 минут при 20°C с добавлением 100 мкл на лунку готового к использованию субстратного раствора тетраметилбензидина (ТМВ) (TEBU). Реакцию останавливали добавлением 1 М HCl (Prolabo) в объеме 100 мкл на лунку.
Оптическую плотность (ОП) измеряли при 450-650 нм с помощью планшетного ридера (Versa Max - Molecular Devices). Титры антител IgG1 или IgG2 рассчитывали с помощью программного обеспечения CodUnit для диапазона значений OD от 0,2 до 3,0 от кривой титрования (стандартная мышиная гипериммунная сыворотка, внесенная на каждый планшет). Стандарт-титры IgG1 или IgG2c, выраженные в произвольных единицах ELISA (EU), соответствуют Iog10 обратного разведения, давая ОП 1,0. Порог обнаружения антител составляет 10 единиц ELISA (1,0 Iog10). Все окончательные титры выражены как log 10 (Log).
Соотношения IgG1 или IgG2c рассчитывали с помощью отдельных арифметических значений, и для каждой группы рассчитывали среднее геометрическое значение отдельных соотношений IgG1/IgG2c.
FLUOROSPOT
Анализ с использованием флуоресцентно-меченых антител FLUOROSPOT используют для выявления и подсчета отдельных клеток, секретирующих цитокины IFN-γ и IL-5.
В день 0 мембрану 96-луночных микропланшетов с плоским дном (Multiscreen) предварительно увлажняли в течение 1 минуты раствором 35% этанола в объеме 25 мкл. Затем этанол удаляли и каждую лунку дважды промывали 200 мкл ФБР 1X. Затем на микропланшеты наносили крысиные антитела против мышиного IFN-γ или крысиные антитела против мышиного IL-5 (10 мкг/мл, Pharmingen), в разведении 1/100 и 1/50 соответственно, и инкубировали в течение ночи при 4°C.
5
В день 1 планшеты промывали ФБР и затем блокировали по меньшей мере 2 часа при 37°C с использованием среды RPMI+10% FBS. После промывания планшетов свежевыделенные спленоциты в количестве 5×10/на лунку инкубировали в течение ночи с антигеном CMV-gB (0,1 мкг/мл), CMV-пентамером (0,1 мкг/мл) или конканавалином А (ConА, 2,5 мкг/мл) в качестве положительного контроля в присутствии мышиного IL-2 (10 ед/мл).
В день 2 планшеты промывали 6 раз PBS 1X-BSA 0,1% (200 мкл/на лунку). После стадии промывки добавляли биотинилированные антитела против мышиного IFN-γ или мышиного IL-5 в объеме 100 мкл/лунку в 4 мкг/мл ФБР 1X-BSA 0,1% в течение 2 часов при комнатной температуре в темноте. Планшеты снова промывали 3 раза ФБР 1X-BSA 0,1% (200 мкл/на лунку). Затем стрептавидин-РЕ в объеме 100 мкл/лунку в 1 мкг/мл ФБР 1X-BSA 0,1% инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре в темноте.
После этого планшеты промывали 6 раз раствором ФБР 1X-BSA 0,1% (200 мкл/лунку). Планшеты хранили при 5°C ± 3°C в темноте до считывания.
6
Каждое пятно, которое соответствует клетке, секретирующей IFN-γ или IL-5 (IFN-γSC или IL-5 SC), было подсчитано с помощью автоматического планшетного ридера FLUOROSPOT (Microvision). Результаты выражены в виде количества секретирующих IFN-γ или IL-5 клеток на 10 спленоцитов.
FLUOROSPOT анализ IqG, lgG1 и lqG2c
Анализ с использованием флуоресцентно-меченых антител FLUOROSPOT используют для выявления и подсчета отдельных В-клеток, секретирующих антитела, независимо от специфичности антигена (IgG1, IgG2c или общего IgG).
В день 0 мембрану 96-луночных микропланшетов с плоским дном (Multiscreen) предварительно увлажняли в течение 1 минуты раствором 35% этанола в объеме 25 мкл. Затем этанол удаляли и каждую лунку дважды промывали 200 мкл ФБР 1X. Затем на микропланшеты наносили антиген CMV-gB (10 мкг/мл, Sanofi), CMV-пентамер (10 мкг/мл, NAC) или общее антитело IgG (10 мкг/мл, KPL) в разведении 1/68, 1/100 и 1/100 соответственно, и инкубировали в течение ночи при 4°C.
5
5
В день 1 планшеты промывали ФБР и затем блокировали по меньшей мере 2 часа при 37°C с использованием среды RPMI+10% FBS. После промывания планшетов свежевыделенные спленоциты в количестве 5×10/на лунку для антигена CMV-gB или CMV-пентамера и 2,5 ×10/на лунку свежевыделенных спленоцитов для общего антитела IgG инкубировали в течение 5 часов. Через 5 часов планшеты промывали три раза PBS 1X и оставляли на ночь при температуре 4°C.
В день 2 планшеты промывали 6 раз PBS 1X - BSA 0,1% (200 мкл/на лунку). После стадии промывки добавляли антитела против мышиного IgG1PE, или мышиного IgG2c FITC, или мышиного общего IgG в объеме соответственно 4, 2 или 0,5 мкг/мл в ФБР 1X-BSA 0,1% и оставляли на 2 часа при комнатной температуре в темноте. Планшеты снова промывали 6 раз ФБР 1X-BSA 0,1% (200 мкл/на лунку). Планшеты хранили при 5°C ± 3°C в темноте до считывания.
6
Каждое пятно, которое соответствует секретирующей антитело клетке (ASC) (IgG1 ASC, IgG2c ASC или общий IgG ACS), было подсчитано с помощью автоматического планшетного ридера FLUOROSPOT (Microvision). Результаты выражены в виде количества секретирующих антитело клеток на 10 спленоцитов.
Результаты
Гуморальный ответ
Продольный анализ реакции нейтрализующего антитела на эпителиальные клетки ARPE-19 в период между днем 20 и днем 257
Нейтрализующую активность против штамма вируса BADrUL131-Y4 CMV на эпителиальных клетках (ARPE-19) изучали с помощью анализа серологической нейтрализации в отдельных промежуточных образцах сыворотки, собранных ежемесячно от всех животных в подгруппах 3 от дня 20 до дня 257 (т.е. в дни 20,34,62, 90, 118,153,187, 226 и 257). Методика серологической нейтрализации подробно описана в разделе "Материалы и способы", а необработанные данные приведены в таблицах 5 a - b.
Таблицы 5 a - b
А - подгруппа 3. Промежуточные данные серологической нейтрализации клеток ARPE с использованием комплемента (С)
<b>Группа</b>
<b></b><b><i>Сыворотка</i></b><b></b>
<b>ARPE </b><b>День 20 +C</b>
<b>ARPE </b><b>Мес.1 +C</b>
<b>ARPE </b><b>Мес.2 +C</b>
<b>ARPE </b><b>Мес.3 +C</b>
<b>ARPE </b><b>Мес.4 +C</b>
<b>ARPE </b><b>Мес.5 +C</b>
<b>ARPE </b><b>Мес.6 +C</b>
<b>ARPE </b><b>Мес.7 +C</b>
<b>ARPE </b><b>Мес.8 +C</b>
<b>A</b>
ФБР
<b>GMT</b>
<b>24</b>
<b>16</b>
<b>25</b>
<b>29</b>
<b>23</b>
<b>21</b>
<b>17</b>
<b>22</b>
<b>16</b>
<b>B</b>
Пентамер:2 мкгgB :2 мкг
<b>GMT</b>
<b>33</b>
<b>133</b>
<b>212</b>
<b>183</b>
<b>191</b>
<b>136</b>
<b>164</b>
<b>90</b>
<b>1026</b>
<b>C</b>
Пентамер:2 мкгgB : 2 мкгMF59 : 2,3% сквален
<b>GMT</b>
<b>220</b>
<b>3625</b>
<b>3516</b>
<b>3748</b>
<b>3562</b>
<b>2034</b>
<b>2973</b>
<b>1058</b>
<b>6792</b>
<b>D</b>
Пентамер:2 мкгgB : 2 мкгPAA : 200 мкг
<b>GMT</b>
<b>879</b>
<b>15990</b>
<b>11598</b>
<b>10962</b>
<b>10724</b>
<b>10266</b>
<b>8681</b>
<b>5792</b>
<b>37166</b>
<b>E</b>
Пентамер :2 мкгgB : 2 мкгAF04 :1мкг E6020,2,5% сквален
<b>GMT</b>
<b>383</b>
<b>12648</b>
<b>9288</b>
<b>7833</b>
<b>9048</b>
<b>5653</b>
<b>4494</b>
<b>3559</b>
<b>17936</b>
<b>F</b>
Пентамер:2 мкгgB : 2 мкгGLA-SQEM :2,5мкг GLA,2% сквален
<b>GMT</b>
<b>976</b>
<b>30755</b>
<b>20844</b>
<b>15957</b>
<b>17068</b>
<b>11231</b>
<b>11156</b>
<b>8505</b>
<b>35897</b>
Промежуточные данные серологической нейтрализации клеток ARPE без использования комплемента (С)_
b - подгруппа 3.
<b>Группа</b>
<b></b><b><i>Сыворотка</i></b><b></b>
<b>ARPE </b><b>День 20 </b><b>- C</b>
<b>ARPE </b><b>Мес.1 - C</b>
<b>ARPE </b><b>Мес.2 - C</b>
<b>ARPE </b><b>Мес.3 - C</b>
<b>ARPE </b><b>Мес.4 - C</b>
<b>ARPE </b><b>Мес.5 - C</b>
<b>ARPE </b><b>Мес.6 - C</b>
<b>ARPE </b><b>Мес.7 +C</b>
<b>ARPE </b><b>Мес.8 +C</b>
<b>A</b>
ФБР
<b>GMT</b>
<b>30</b>
<b>16</b>
<b>18</b>
<b>13</b>
<b>71</b>
<b>22</b>
<b>12</b>
<b>12</b>
<b>13</b>
<b>B</b>
Пентамер:2 мкгgB : 2 мкг
<b>GMT</b>
<b>32</b>
<b>94</b>
<b>138</b>
<b>170</b>
<b>109</b>
<b>122</b>
<b>92</b>
<b>65</b>
<b>815</b>
<b>C</b>
Пентамер:2 мкгgB : 2 мкгMF59 :2,3% сквален
<b>GMT</b>
<b>74</b>
<b>2020</b>
<b>1973</b>
<b>1928</b>
<b>1264</b>
<b>1174</b>
<b>1028</b>
<b>655</b>
<b>5449</b>
<b>D</b>
Пентамер:2 мкгgB : 2 мкгPAA : 200 мкг
<b>GMT</b>
<b>83</b>
<b>3297</b>
<b>4890</b>
<b>3768</b>
<b>3589</b>
<b>3289</b>
<b>3580</b>
<b>2201</b>
<b>28657</b>
<b>E</b>
Пентамер:2 мкгgB : 2 мкгAF04 :1мкг E6020,2,5% сквален
<b>GMT</b>
<b>91</b>
<b>3734</b>
<b>3354</b>
<b>3918</b>
<b>2728</b>
<b>2344</b>
<b>2359</b>
<b>1274</b>
<b>11910</b>
<b>F</b>
Пентамер:2 мкгgB : 2 мкгGLA-SQEM :2,5мкг GLA,2% сквален
<b>GMT</b>
<b>106</b>
<b>8048</b>
<b>7446</b>
<b>7774</b>
<b>5392</b>
<b>4812</b>
<b>3459</b>
<b>2883</b>
<b>9150</b>
Среднее геометрическое значение титра (GMT), а также отдельные нейтрализующие титры показаны на фигуре 2.
Мес. 1=день 34, мес. 2=день 62, мес. 3=день 90, мес. 4=день 118, мес. 5=день 153, мес. 6=день 187, мес. 7=день 226, мес. 8=день 257.
Аналогичные кинетические профили титров нейтрализующих антител были определены в присутствии и в отсутствие комплемента в анализе нейтрализации на эпителиальных клетках, как показано на фиг. 2, схемы А и В, соответственно.
В группе введения CMV-gB и пентамера без адъюванта был выявлен слабый ответ нейтрализующего антитела в день 20 (GMT=33 и 32, с комплементом или без комплемента, соответственно), затем до дня 62 этот ответ увеличивался до достижения плато значения GMT в интервале от 90 до 212или от 65 до 170, в присутствии или в отсутствие комплемента, в интервале от дня 62 до дня 226. Введение 3-ей дозы в день 226 повышало титры нейтрализующих антител, что было выявлено в день 257 при значении GMT 1026 или 815, в присутствии или в отсутствие комплемента, соответственно. Для всех групп с адъювантом (MF59, PAA, AF4 и GLA-SQEM) титры нейтрализующих антител определяли в присутствии или в отсутствие комплемента на 20-й день (т.е. день 20 после первого введения), при этом значения GMT составляли 220 или 74, соответственно для группы С3 с введением CMV-gB и пентамера с адъювантом MF59; и значения GMT составляли ≥383 и ≥83 в группах D3-F3, которым вводили другие адъювантные композиции. В день 34 (т.е. через 14 дней после второго введения) во всех группах с адъювантом наблюдался пик ответа после двух инъекций, при этом значения GMP составляли от 3625 до 30755 или от 2020 до 8048, в присутствии или в отсутствие комплемента, соответственно.
В течение 6месяцев (между днем 34 и днем 226) титры нейтрализующих антител в эпителиальных клетках слегка снижались до титров в диапазоне от 1058 до 8505 или от 655 до 2883, в присутствии или в отсутствие комплемента, соответственно. Аналогично, введение 3-ей дозы в день 226 повышало титры нейтрализующих антител, что было выявлено в день 257, при этом значения GMT составляли от 6792 (для групп с адъювантом mf59) до 37166 (для групп с адъювантом РАА) или от 5449 (для групп с адъювантом mf59 до 28657 (для групп с адъювантом PAA), в присутствии или в отсутствие комплемента, соответственно.
Для сравнения разных групп с адъювантами, т.е. SPA09, AF04 и GLA-SQEM, с контрольной группой MF59 была создана статистическая смешанная модель с 2 фиксированными факторами (группа и время) при повторяющихся значениях титров нейтрализующих антител от дня 34 до дня 226.
В таблице 6 приведены данные по сравнению групп. В присутствии комплемента титры нейтрализующих антител, полученные от мышей, которым вводили CMV-gB и пентамер с адъювантом MF59, не были значительно выше, чем титры нейтрализующих антител, полученные от мышей, которым вводили CMV-gB и пентамер без адъюванта, в то время как во всех других группах с введением адъюванта (т.е. PAA, AF04 И GLA-SQEM) выявлено значительное превышение титров нейтрализующих антител, полученных от мышей, которым вводили CMV-gB и пентамер с адъювантом MF59 (все значения p < 0,001).
В отсутствие комплемента титры нейтрализующих антител, полученные от мышей, которым вводили CMV-gB и пентамер с адъювантом MF59, не были значительно выше, чем титры нейтрализующих антител, полученные от мышей, которым вводили CMV-gB и пентамер без адъювантов. Значения титров нейтрализующих антител, полученных от мышей, которым вводили CMV-gB и пентамер с адъювантом AF04, не были значительно выше, чем титры нейтрализующих антител, полученные от мышей, которым вводили CMV-gB и пентамер с адъювантом MF59, тогда как во всех других адъювантных группах (т.е. в группах с введением PAA и GLA-SQEM) было выявлено значительное превышение титров нейтрализующих антител, полученных от мышей, которым вводили CMV-gB и пентамер с адъювантом MF59 (все значения p ≤ 0,009). Титры нейтрализующих антител, полученные от мышей, которым вводили CMV-gB и пентамер с адъювантом AF04, значительно превышали титры нейтрализующих антител, полученные от мышей, которым вводили CMV-gB и пентамер без адъюванта (все значения p< 0,001).
Таблица 6
<b>Анализ нейтрализации </b><b>APRE-19</b>
<b>В присутствии комплемента</b>
<b>В отсутствие комплемента</b>
<b>Сравнение</b>
<b>p-значение*</b>
<b>p-значение*</b>
(B3) без адъюванта vs (C3) MF59
1,000 (NS)
1,000 (NS)
(D3) PAA vs (C3) MF59
<b><0,001 (S) </b><i>x4,2</i>
<b>0,009 (S) </b><i>x2,4</i>
(E3) AF04 vs (C3) MF59
<b><0,001 (S) </b><i>x2.8</i>
0,077 (NS)
(F3) GLA-SQEM vs (C3) MF59
<b><0,001 (S) </b><i>x6,6</i>
<b><0,001 (S) </b><i>x4,0</i>
Статистическое сравнение разных групп в пределах оцененных повторяющихся титров нейтрализующих антител в дни от 34 до 226 (Исследование превосходства: *значения p с поправкой по Даннету (Dunnett);
NS=не значительно, S =значительное превосходство, в этом случае кратность значительного увеличения указана курсивом.
Подробное описание ответов нейтрализующих антител на эпителиальные клетки (ARPE-19) и фибробласты (MRC-5) в день 34 (мес.1), день 208 (мес.7) и день 257 (мес.8)
Нейтрализующую активность против штамма вируса BADrUL131-Y4 CMV на эпителиальных клетках (ARPE-19) и фибробластах (MRC-5) исследовали с помощью анализа серологической нейтрализации в отдельных пробах сыворотки, собранных от всех животных из подгрупп 1, 2 и 3 соответственно в день 34 (2 недели после второй иммунизации), день 208 (7 месяцев после первичной вакцинации) и день 257 (1 месяц после бустер-инъекции на 7 месяце). Методика серологической нейтрализации подробно описана в разделе "Материалы и способы", а необработанные данные показаны в таблицах 7 a-f.
Таблицы 7 a-f
Таблица a - подгруппа 2. Серологическая нейтрализация ARPE день 234 (день 208)
Группа
Сыворотка
ARPE д34 +C
ARPE д34-C
A
ФБР
GMT
12
12
B
Пентамер : 2 мкг gB : 2 мкг
GMT
46
43
C
Пентамер : 2 мкг gB : 2 мкг MF59 : 2,3% сквален
GMT
4168
1934
D
Пентамер : 2 мкг gB : 2 мкг PAA : 200 мкг
GMT
14698
3862
E
Пентамер: 2 мкг gB : 2 мкг AF04 : 1мкг E6020, 2,5% сквален
GMT
7179
2919
F
Пентамер : 2 мкг gB : 2 мкг GLA-SQEM : 2,5мкг GLA, 2% сквален
GMT
13302
3146
Таблица b - подгруппа 2. Серологическая нейтрализация ARPE мес.7 (день 208)
Группа
Сыворотка
ARPE мес.7 +C
ARPE мес.7-C
A
ФБР
GMT
14
17
B
Пентамер : 2 мкг gB : 2 мкг
GMT
46
51
C
Пентамер : 2 мкг gB : 2 мкг MF59 : 2,3% сквален
GMT
3739
1834
D
Пентамер : 2 мкг gB : 2 мкг PAA : 200 мкг
GMT
4484
2230
E
Пентамер: 2 мкг gB : 2 мкг AF04 : 1мкг E6020, 2,5% сквален
GMT
6101
2718
F
Пентамер : 2 мкг gB : 2 мкг GLA-SQEM : 2,5мкг GLA, 2% сквален
GMT
7719
1758
Таблица c - подгруппа 3. Серологическая нейтрализация ARPE мес.8 (день 257)
Группа
Сыворотка
ARPE мес.8 +C
ARPE мес.8 -C
A
ФБР
GMT
16
13
B
Пентамер : 2 мкг gB : 2 мкг
GMT
1026
815
C
Пентамер : 2 мкг gB : 2 мкг MF59 : 2,3% сквален
GMT
6792
5449
D
Пентамер : 2 мкг gB : 2 мкг PAA : 200 мкг
GMT
37166
28657
E
Пентамер: 2 мкг gB : 2 мкг AF04 : 1мкг E6020, 2,5% сквален
GMT
17936
11910
F
Пентамер : 2 мкг gB : 2 мкг GLA-SQEM : 2,5мкг GLA, 2% сквален
GMT
8505
9150
Таблица d - подгруппа 1. Серологическая нейтрализация MRC5 (день 34)
Группа
Сыворотка
MRC5 д34+C
MRC5 д34-C
A
ФБР
GMT
5
5
B
Пентамер : 2 мкг gB : 2 мкг
GMT
8
5
C
Пентамер : 2 мкг gB : 2 мкг MF59 : 2,3% сквален
GMT
636
71
D
Пентамер : 2 мкг gB : 2 мкг PAA : 200 мкг
GMT
2699
84
E
Пентамер: 2 мкг gB : 2 мкг AF04 : 1мкг E6020, 2,5% сквален
GMT
1477
153
F
Пентамер : 2 мкг gB : 2 мкг GLA-SQEM : 2,5мкг GLA, 2% сквален
GMT
3131
146
Таблица е - подгруппа 2. Серологическая нейтрализация MRC5 мес.7 (день 208)
Группа
Сыворотка
MRC5 мес.7 +C
MRC5 мес.7 -C
A
ФБР
GMT
5
5
B
Пентамер : 2 мкг gB : 2 мкг
GMT
5
5
C
Пентамер : 2 мкг gB : 2 мкг MF59 : 2,3% сквален
GMT
147
27
D
Пентамер : 2 мкг gB : 2 мкг PAA : 200 мкг
GMT
500
39
E
Пентамер: 2 мкг gB : 2 мкг AF04 : 1мкг E6020, 2,5% сквален
GMT
451
48
F
Пентамер : 2 мкг gB : 2 мкг GLA-SQEM : 2,5мкг GLA, 2% сквален
GMT
913
14
Таблица f - подгруппа 3. Серологическая нейтрализация MRC5 мес.8 (день 257)
Группа
Сыворотка
MRC5 мес.8 +C
MRC5 мес.8 -C
A
ФБР
GMT
5
5
B
Пентамер : 2 мкг gB : 2 мкг
GMT
29
15
C
Пентамер : 2 мкг gB : 2 мкг MF59 : 2,3% сквален
GMT
695
151
D
Пентамер : 2 мкг gB : 2 мкг PAA : 200 мкг
GMT
6645
536
E
Пентамер: 2 мкг gB : 2 мкг AF04 : 1мкг E6020, 2,5% сквален
GMT
1977
438
F
Пентамер : 2 мкг gB : 2 мкг GLA-SQEM : 2,5мкг GLA, 2% сквален
GMT
6152
427
Среднее геометрическое значение титра (GMT), а также отдельные нейтрализующие титры показаны на фигуре 3, фигуре 4 и фигуре 5.
Сходные профили нейтрализующих антител наблюдались в анализах нейтрализации и на эпителиальных клетках, и на фибробластах, при этом более высокие титры нейтрализующих антител выявлены в анализе нейтрализации на эпителиальных клетках, которые показали увеличение по меньшей мере от 5-кратного до 11-кратного уровня GMT в присутствии или в отсутствие комплемента, соответственно.
На 34-й день исследования, т.е. через 14 дней после 2-й инъекции, у иммунизированных CMV-gB и пентамером без адъюванта мышей (GMT ≤ 8 на клетках MRC-5 и GMT≤ 46 на клетках ARPE-19, соответственно) не определялись титры нейтрализующих антител, или определялись низкие титры. Во всех группах, содержащих CMV-gB и пентамер с адъювантом, наблюдался заметный адъювантный эффект, а именно 14-кратное увеличение титров серологической нейтрализации на клетках MRC-5 и увеличение на клетках ARPE-19 от 44-кратного до 319-кратного, независимо от присутствия или отсутствия комплемента, по сравнению с группой без адъюванта.
При анализе титров нейтрализующих антител на эпителиальных клетках ARPE-19 в присутствии комплемента (фигура 3, схема А) выявлен адъювантный эффект со значительно более высокими, чем в случае MF59, титрами нейтрализующих антител с РАА и GLA-SQEM (превышение по меньшей мере от 3 до 4,2 раз в исследовании превосходства, односторонняя поправка по Даннету, все значения p< 0,001), в отличие от показателей AF04 (превышение только в 1,7 раз, p-значение=0,08).
Напротив, при анализе титров нейтрализующих антител на клетках ARPE-19 в отсутствие комплемента (фигура 3, схема В) выявлено, что адъюванты РАА, AF04 и GLA-SQEM только слегка увеличивали титры нейтрализующих антител по сравнению с MF59 (увеличение титров нейтрализующих антител в 1,5-2 раза по сравнению с титрами, индуцированными MF59), но наблюдаемые различия не были статистически значимыми (все значения p > 0,091).
При анализе титров нейтрализующих антител на фибробластах MRC-5 в присутствии комплемента (фигура 3, схема С) наблюдался адъювантный эффект со значительно более высокими титрами нейтрализующих антител, чем в случае MF59, со всеми тестируемыми адъювантами РАА, AF04 и GLA-SQEM (превышение по меньшей мере от 2,3 до 6 раз в исследовании превосходства, односторонняя поправка по Даннету, все значения p ≤ 0,002).
Наконец, при анализе титров нейтрализующих антител на фибробластах MRC-5 в отсутствие комплемента (фигура 3, схема D) было обнаружено, что титры нейтрализующих антител, индуцированных РАА, AF4 и GLA-SQEM, незначительно выше, чем титры антител, полученные с MF59 (значения p > 0,093). В день 208 (фиг. 4), т.е. через 7 месяцев после 2-й инъекции, было обнаружено отсутствие или низкие титры нейтрализующих антител у мышей, иммунизированных CMV-gB и пентамером без адъюванта (GMT ≤ 5 на клетках MRC-5 и ≤ 50 на клетках ARPE-19 соответственно). В подгруппах 2 с адъювантом не выявлено значимого снижения титров нейтрализующих титров на эпителиальных клетках ARPE-19 по сравнению с титрами, выявленными в день 34 (у мышей из подгрупп 1), независимо от присутствия или отсутствия комплемента, при этом наблюдалось значительное снижение титров нейтрализующих антител на фибробластах MRC-5 (от 2,3 до 5,4-кратного уменьшения в присутствии комплемента, все значения p ≤ 0,016; от 3 до 10-кратного уменьшения в отсутствие комплемента, все значения p > 0,001).
В анализе титров нейтрализующих антител на эпителиальных клетках ARPE-19 в присутствии или в отсутствие комплемента (фигура 4, схемы А и В) не было обнаружено существенного различия между тестируемыми адъювантами и исходными показателями MF59. Анализы титров нейтрализующих антител на фибробластах MRC-5 в присутствии комплемента (фигура 4, схема С) показали, что титры нейтрализующих антител, индуцированные РАА и GLA-SQEM, были значительно выше, чем титры антител, индуцированные MF59 (по меньшей мере от 3,4- до 11,9-кратного увеличения в исследовании превосходства, односторонняя поправка по Даннету, все значения p ≤ 0,015)
Также, в анализе титров нейтрализующих антител на фибробластах MRC-5 в отсутствие комплемента (фигура 4, схема D) выявлено значительное увеличение титров нейтрализующих антител, индуцированных PAA и AF04 по сравнению с показателями титров антител, индуцированных MF59 (увеличение от 2- до 4,4-кратного в исследовании превосходства, односторонняя поправка по Даннету, все значения p ≤ 0,019).
В день 257 (фиг. 5), т.е. через 30 дней после 3-й инъекции, титры нейтрализующих антител у мышей, иммунизированных CMV-gB и пентамером без адъюванта, значительно увеличились по сравнению с титрами, выявленными в день 34 на клетках ARPE-19 (GMT=1062 или 815 на клетках ARPE-19 с комплементом и без комплемента, соответственно). Напротив, титры нейтрализующих антител у мышей, иммунизированных CMV-gB и пентамером без адъюванта, оставались низкими на фибробластах MRC-5 (GMT=29 или 15 на фибробластах MRC-5 с комплементом и без комплемента, соответственно).
Во всех подгруппах 3 с введением адъюванта, за исключением MF59, титры нейтрализующих антител, определяемые в день 257 после 3-й инъекции, были значительно выше, чем титры нейтрализующих антител, определяемые в день 34 после 2-й инъекции, независимо от типа клеток и независимо от присутствия или отсутствия комплемента (все значения p ≤ 0,002).
В день 257 в анализе сравнения адъюванта со стандартом MF59 все упомянутые адъюванты (PAA и AF04), за исключением GLA-SQEM, индуцировали более высокие титры нейтрализующих антител, чем MF59, независимо от типа клеток и независимо от присутствия или отсутствия комплемента (исследование превосходства, односторонняя поправка по Даннету, все значения p≤ 0,05). В анализе с GLA-SQEM титры индуцированных комплемент-зависимых нейтрализующих антител были значительно выше, чем титры, индуцируемые MF59 (превышение в 5,3или в 89 раз в клетках ARPE-19 или MRC-5, соответственно, в исследовании превосходства, односторонняя поправка по Даннету, все значения p < 0,001), при этом в отсутствие комплемента индуцированная нейтрализация существенно не зависела от типа клеток.
В день 208, т.е. в период до 7 месяцев после 2-й инъекции, в анализе композиции, содержащей gB+пентамер+AF04 или PAA или GLA-SQEM, выявлены более высокие уровни нейтрализующих антител, чем в композиции, содержащей gB+пентамер+MF59, что демонстрирует более высокую функциональную устойчивость антител. В день 257, через 1 месяц после бустер-иммунизации, определяемое увеличение нейтрализующих антител отражает вторичный иммунный ответ и показывает более высокие титры для композиций, содержащих gB+пентамер+AF04 или PAA или GLA-SQEM, в отличие от композиции, содержащей gB+пентамер+MF59.
Все эти результаты показывают, что иммуногенная композиция, содержащая gB+пентамер+AF04 или PAA или GLA-SQEM, создает более высокий уровень устойчивости и количества нейтрализующих антител, чем композиция, содержащая gB+пентамер+MF5.
Ответы антител lgG1 и IgG2c
Ответы CMV gB-специфичных и пентамер-специфичных антител IgG1 и IgG2c, индуцированные антигенами CMV gB и пентамерами, которые вводились с разными адъювантами или без адъювантов, измеряли с помощью анализа ELISA в отдельных образцах сыворотки, собранных от всех животных из подгрупп 1, 2 и 3, соответственно, в день 34 (2 недели после второй иммунизации), день 208 (7 месяцев после первичной вакцинации) и день 257 (1 месяц после бустерной инъекции на 7 месяце). Средние титры антител ELISA (log 10 EU) показаны на фигуре 6. Способ ELISA подробно описан в разделе "Материалы и способы".
При изучении ответов антител IgG1 и IgG2c были получены аналогичные профили независимо от специфичности CMV-антигена (как gB, так и пентамера) и независимо от анализируемой точки времени.
В анализе титров антител IgG1 все тестируемые адъюванты показали значительное повышение титров антител IgG1 по сравнению с группой без адъюванта. Не было обнаружено какого-либо значимого различия для AF04 по сравнению с MF59, независимо от антигена и точки времени. Адъювантный эффект со значительно более низкими титрами IgG1, по сравнению с MF59, наблюдался в отношении PAA в день 34 и день 208 (по меньшей мере, 2,4-кратное уменьшение, все значения p ≤ 0,045, критерий различия, односторонняя поправка по Даннету), но не в день 257 после 3-ей бустерной инъекции. По сравнению со стандартом MF59, GLA-SQEM индуцировал значительно более низкие титры антитела IgG1 против gB (по меньшей мере, 2,5-кратное уменьшение, все значения p ≤ 0,033, критерий разницы, односторонняя поправка по Даннету) во всех протестированных временных точках, и более низкие титры IgG1 против пентамера (по меньшей мере, 2,7-кратное уменьшение, все значения p ≤ 0,005, критерий различия, односторонняя поправка по Даннету) на 208 и 257 день.
В анализе титров антител IgG2c все тестируемые адъюванты значительно повышают титры антител IgG2c по сравнению с контрольной группой. Адъювантный эффект со значительно более высокими титрами IgG2c, по сравнению с MF59, наблюдался для всех тестируемых адъювантов, т.е. PAA, AF04 и GLA-SQEM (увеличение по меньшей мере в 11 раз; все значения p < 0,001, критерий различия, односторонняя поправка по Даннету), независимо от специфичности IgG2c для gB или пентамера и независимо от точки времени.
Соотношение ELISA lqG1/IgG2c
Для анализа направленности Th2/Th1 рассчитывали соотношения IgG1/IgG2c во всех группах с адъювантом, и подробные результаты представлены на фигуре 7.
Как показано на фиг.7, соотношения IgG1/IgG2, рассчитанные для CMV-пентамера, были ниже, чем соотношения, рассчитанные для CMV-gB, и имели склонность к постоянству независимо от точки времени. Для композиции эмульсии сквалена и MF59 был определен профиль ответа, смещенный в сторону Th2, при этом соотношение IgG1/IgG2 было ≥ 85 для CMV-gB или ≥ 18 для CMV-пентамера, независимо от точки времени. Для всех других тестируемых адъювантов были получены более низкие соотношения IgG1/IgG2, по сравнению с MF59, при этом для AF04 соотношение специфичных к gB IgG1/IgG2c было ≥ 7,1 специфичных к пентамеру ≥ 2, 1, и для PAA и GLA-SQEM это соотношение было ниже или равно 2,4 или 0,8 (специфичных для gB и пентамера, соответственно), указывая на то, что профиль ответа больше смещен в сторону Th1, чем в присутствии MF59, и что AF04, PAA и GLA-SQEM представляют собой Th1-индуцирующие адъюванты.
Клеточный ответ
Определение клеток, секретирующих цитокины IL-5 и IFN-γ, способом FLUOROSPOT
ex vivo
Частоту встречаемости клеток, секретирующих IL5 и IFN-γ, определяли с помощью FLUOROSPOT на спленоцитах, собранных от всех животных из подгрупп 1, 2 и 3 соответственно в день 34 (2 недели после второй иммунизации), день 208 (7 месяцев после первичной вакцинации) и день 257 (1 месяц после бустер-инъекции на 7 месяце). Во время анализа FLUOROSPOT каждую суспензию спленоцитов подвергали стимуляции  в течение ночи или рекомбинантным CMV-gB, или CMV-пентамером в объеме 0,1 мкг/мл.
Методика FLUOROSPOT подробно описана в разделе "Материалы и способы".
6
6
6
Как показано на фиг. 8, в день 34 после стимуляции CMV-gB (таблица А), было выявлено отсутствие или очень низкая встречаемость клеток, секретирующих IL-5 (SC) во всех группах (среднее геометрическое значение < 22 IL-5-секретирующих клеток/10 спленоцитов), за исключением группы с адъювантом MF59 к CMV-gB и пентамеру (среднее геометрическое значение составляет 60 IL-5-секретирующих клеток/10 спленоцитов). Аналогично, во всех группах было обнаружено отсутствие или малое число клеток, секретирующих IFN-γ (среднее геометрическое значение < 20 клеток, секретирующих IFN-γ/10 спленоцитов).
6
Напротив, высокая встречаемость цитокин-секретирующих клеток была обнаружена при стимуляции CMV-пентамером (фигура 8, таблица В). В анализе IL-5 секретирующих клеток высокая частота IL-5 SC была выявлена у мышей, которым вводили MF59 (444 IL-5 SC/10 спленоцитов). Секреция IL-5, обнаруженная в группах, которым вводили PAA и GLA-SQEM, была значительно ниже, чем у мышей, получавших MF59 (значения p ≤ 0,002, критерий различия, односторонняя поправка по Даннету, при этом не было обнаружено значительных различий с показателями AF04.
В анализе встречаемости IFN-γ-секретирующих клеток все тестируемые адъюванты, т.е. PAA, AF04 и GLA-SQEM, показали значительное 8-кратное увеличение продукции IFN-γ по сравнению с MF59 (все значения p ≤ 0,001, критерий различия, односторонняя поправка по Даннету).
В день 208, как показано на фигуре 8, количество и IL-5-секретирующих клеток и IFN-γ-секретирующих клеток было низким, независимо от стимулирующего антигена.
6
В день 257 день и IL-5 ответы, и IFN-γ ответы на стимуляцию CMV-gB и CMV-пентамером увеличивались по сравнению с днем 34, однако профили Th1/Th2 оставались постоянными. В анализе IL-5-секретирующих клеток высокая встречаемость IL-5 SC была обнаружена у мышей, которым вводили MF59 (268 и 2284 IL-5 SC/10 спленоцитов при стимуляции CMV-gB или пентамером, соответственно).
Секреция IL-5, обнаруженная в группах, которым вводили PAA, AF04 и GLA-SQM, была значительно ниже, чем в группах мышей, получавших MF59 (значения p ≤ 0,003, критерий различия, односторонняя поправка по Даннету).
В анализе встречаемости клеток, секретирующих IFN-γ, все тестируемые адъюванты, т.е. PAA, AF04 и GLA-SQEM, показали значительное увеличение встречаемости IFN-γ SC по сравнению с адъювантом MF59 (все значения p ≤ 0,001, критерий различия, односторонняя поправка по Даннету). В общем, все тестируемые адъюванты индуцировали ответ, более близкий по общему профилю к Th-1, в отличие от MF59, что соответствует тенденции, обусловленной соотношением IgG1/IgG2c.
В соответствии с тенденцией, обусловленной соотношением IgG1/IgG2c, все тестируемые адъюванты индуцировали клеточный ответ, близкий по общему профилю к Th-1, тогда как MF59 индуцировал клеточный ответ, сдвинутый по общему профилю к Th2.
Определение секретирующих антитела IgG1 и IgG2c плазмабластов способом ELISPOT
ex vivo
Частоту встречаемости плазмабластов, секретирующих антитела IgG1 и IgG2c, определяли способом FLUOROSPOT на спленоцитах, собранных от всех животных из подгрупп 1, 2 и 3, соответственно, в день 34 (2 недели после второй иммунизации), в день 208 (7 месяцев после серии первичных вакцинаций) и в день 257 (через 1 месяц после бустерной инъекции на 7 месяце). Для анализа ELISPOT каждую суспензию спленоцитов вносили в лунки, покрытые рекомбинантным CMV-gB или CMV-пентамером, для захвата специфичных антител IgG1 или IgG2c, представленных на поверхности клеток плазмабластов. Клетки, секретирующие CMV-gB-специфичные и пентамер-специфичные IgG1 и IgG2 cантитела, были подсчитаны и показаны в результатах по отношению к общему числу клеток, секретирующих IgG; таким образом, был рассчитан процент и IgG1 и IgG2c от общего числа IgG. Методика FLUOROSPOT подробно описана в разделе "Материалы и способы".
Средние значения частоты встречаемости клеток, секретирующих антитело IgG1 (ASC), как показано на фигуре 9, в день 34 составляют от 3,8% до 20,12% без значительных различий между всеми тестированными адъювантами. При подсчете встречаемости IgG2c ASC было обнаружено, что низкий % соответствует введению мышам CMV-gB и пентамера с адъювантом MF59. Напротив, CMV-gB и пентамер в присутствии адъюванта PAA, AF04 и GLA-SQEM индуцировали IgG2c ASC на значительно более высоком % уровне, чем MF59 (все значения p < 0,001, критерий различия, односторонняя поправка по Даннету), независимо от антигенной специфичности: или CMV-gB или CMV-пентамер.
Как предполагалось, по результатам подсчета ASC в день 208 ответы были низкими, указывая на то, что через 6 месяцев после серии первичных вакцинаций в селезенках мышей содержание циркулирующих плазмацитов является низким.
Через тридцать дней после 3-й инъекции (в день 257) встречаемость ASC, секретирующих как IgG1, так и IgG2c, специфичных для CMV-gB или CMV-пентамера, возрастала по сравнению с днем 208. Средние значения частоты встречаемости lgG1 ASC в день 257 варьировались между 3,1% и 9% без значительных различий между всеми тестированными адъювантами. При подсчете встречаемости IgG2c ASC было обнаружено, что низкий % соответствуют введению мышам CMV-gB и пентамера с адъювантом MF59. Напротив, CMV-gB и пентамер в присутствии адъювантов PAA, AF04 и GLA-SQEM индуцировали IgG2c ASC на значительно более высоком процентном уровне, чем MF59 (все значения p < 0,001, критерий различия, односторонняя поправка по Даннету), независимо от антигенной специфичности: или CMV-gB, или CMV-пентамер.
Определение IgG1- и IgG2c-секретирующих В-клеток памяти способом FLUOROSPOT
in vitro
Среднее значение частоты встречаемости lgG1-и IgG2c-секретирующих клеток определяли с помощью анализа FLUOSPOT на 34, 208 и 257 день на активированных и обогащенных В-клетках спленоцитах, культивируемых в течение 4 дней после стимуляции путем воздействия IL-2 и R848. Методика FLUOROSPOT подробно описана в разделе "Материалы и способы".
Как представлено на фигуре 10, средние значения частоты встречаемости клеток, секретирующие антитело IgG1 (ASC) в день 34 находятся в диапазоне от 1,24% до 4,68% без значительных различий между всеми тестируемыми адъювантами и со сходными профилями в отношении антигенной специфичности: или CMV-gB, или CMV-пентамер. При определении частоты встречаемости IgG2c ASC было обнаружено, что низкий % соответствует введению мышам CMV-gB и пентамера с адъювантом MF59. Напротив, CMV-gB и пентамер в присутствии адъювантов PAA, AF04 и GLA-SQEM индуцировали IgG2c ASC на значительно более высоком % уровне, чем MF59 (все значения p < 0,001, критерий различия, односторонняя поправка по Даннету), независимо от антигенной специфичности: или CMV-gB, или CMV-пентамер.
По результатам подсчета ASC вдень 208 обнаружено, что B-клетки памяти присутствуют главным образом в случае lgG1 ASC, специфичных к CMV-пентамеру, с % встречаемости в диапазоне от 1,6% до 3,24% независимо от тестируемого адъюванта. В отношении частоты встречаемости IgG2c ASC было обнаружено, что низкий % соответствует введению мышам CMV-gB и пентамера с адъювантом MF59. Напротив, CMV-gB и пентамер в присутствии адъювантов PAA, AF04 и GLA-SQEM индуцировали IgG2c ASC на значительно более высоком % уровне, чем MF59 (все значения p < 0,001, критерий различия, односторонняя поправка по Даннету).
Через тридцать дней после 3-й инъекции (в день 257), средние значения частоты встречаемости lgG1 ASC варьировались от 1,1% до 3,75% без значительных различий между всеми тестированными адъювантами.
При определении частоты встречаемости IgG2c ASC было обнаружено, что низкий % соответствует введению мышам CMV-gB и пентамера с адъювантом MF59. Напротив, CMV-gB и пентамер в присутствии адъювантов PAA и GLA-SQEM индуцировали IgG2c ASC на значительно более высоком % уровне, чем MF59 (все значения p < 0,001, критерий различия, односторонняя поправка по Даннету), независимо от антигенной специфичности: или CMV-gB, или CMV-пентамер.
Эти результаты показывают более высокий уровень вторичного иммунного ответа при использовании композиции, содержащей gB+пентамер+PAA или AF04 или GLA-SQEM, по сравнению с композицией, содержащей gB+пентамер+MF59. Также очевидно, что упомянутая более высокая частота встречаемости клеток памяти является медиатором устойчивости защиты, поддерживая преобладание профиля ответа типа Th1.
Пример 2
Комплементарный эффект двух антигенов
in vitro
По плану эксперимента авторы изучали комбинированное воздействие подбора дозы двух антигенов в присутствии адъюванта РАА. Для этой цели в 11 группах из 10 самок мышей C57/BI6J в день 0 и день 22 этим мышам внутримышечно вводили пентамер CMV-gH/gL/UL128/UL130/UL131 в диапазоне доз от 0 до 5 мкг с дозами CMV-gB в присутствии адъюванта РАА в диапазоне этих доз от 1,2 до 5 мг, или без этих доз. Ответ антител оценивали с помощью анализа ELISA, специфичного для gB и пентамеров gH/gL/UL128/UL130/UL131 (подклассов IgG1/IgG2c), и анализов нейтрализации в день 22 (с комплементом, на эпителиальных клетках ARPE-19) ив день 35 (с комплементом и без комплемента, на фибробластах MRC5 и эпителиальных клетках ARPE-19). Клеточный ответ оценивали в день 35 с помощью анализа IFN-γELISPOT после стимуляции  с использованием gB, пентамерных рекомбинантных белков и пулов пентамерных пептидов.
Были обнаружены сходные профили нейтрализующей активности, определяемые или на эпителиальных клетках ARPE-19, или на фибробластах MRC-5, при этом более высокие нейтрализующие титры отмечены на эпителиальных клетках, по сравнению с фибробластами (титр в клетках ARPE-19 в 2,5 раза выше, чем в клетках MRC-5). В день 20 (см. фиг.11), т.е. на 20-й день после 1-го введения, титры нейтрализующих антител, ингибирующих инфицирование как эпителиальных клеток, так и фибробластов, в присутствии комплемента крольчат, увеличивались в зависимости от введенной дозы пентамера gB и gH/gL/UL128/UL130/UL131. Более высокие титры нейтрализующих антител были выявлены при повышении концентрации gB. Как показано на фиг. 11, круговая диаграмма построена в соответствии с дозой gB, и не учитывает дозу пентамера. Поэтому добавление gB поверх пентамера gH/gL/UL128/UL130/UL131 оказывает на нейтрализующую активность значительное линейное влияние, наблюдаемое на эпителиальных клетках и на фибробластах (p=0,014 на эпителиальных клетках и p=0,006 на фибробластах).
Таким образом, добавление gB поверх пентамера в присутствии комплемента позволяет повысить титры СН и в эпителиальных клетках, и в фибробластах.
В день 35, т.е. через 14 дней после 2-го введения, были обнаружены высокие титры нейтрализующих антител, ингибирующие как эпителиальные клетки, так и фибробласты в присутствии комплемента крольчат, независимо от введенных доз gB или gH/gL/UL128/UL130/UL131 пентамера. Кривая выявленной нейтрализующей активности представляла собой плато без существенного эффекта дозы как пентамера, так и gB (все значения p ≥ 0,240) (фиг. 12А).
В день 35 также наблюдалась комплемент-независимая нейтрализующая активность, ингибирующая инфицирование и эпителиальных клеток, и фибробластов в отсутствие комплемента крольчат.
Как показано на фиг.12В, в отсутствие комплемента круговая диаграмма построена в соответствии с дозами пентамеров, и не учитывает дозы gB, поэтому титры комплемент-независимых нейтрализующих антител значительно повышаются с увеличением дозы пентамера gH/gL/UL128/UL130/UL131. Не было обнаружено значимого эффекта дозы gB, в то время как был подтвержден значительный линейный и квадратичный эффект для возрастающих доз gH/gL/UL128/UL131/UL131 (p ≤ 0,009 для обоих нейтрализующих титров на клетках ARPE-19 и MRC-5).
Таким образом, добавление пентамера поверх gB в отсутствие комплемента позволяет повысить титры СН и на эпителиальных клетках, и на фибробластах.
Таким образом, был подтвержден комплементарный эффект двух антигенов, исходя из их соответствующего влияния на качество ответной реакции нейтрализующего антитела. В отношении анализа функциональных гуморальных ответов, то есть комплемент-зависимых и независимых нейтрализующих антител, было показано, что комбинация двух антигенов обеспечивает расширенный механизм действия для нейтрализации вируса. CMV-gB позволяет повысить титры нейтрализующих антител на эпителиальных клетках и фибробластах в присутствии комплемента, и пентамер CMV-gH/gL/UL128/UL130/UL131 дает доступ комплемент-независимому нейтрализующему антителу к эпителиальным клеткам и фибробластам.
ex vivo
ex vivo
Кроме того, эти расширенные свойства комбинации CMV-gB и пентамера CMV-gH/gL/UL128/UL130/UL131 также влияют на индуцируемые клеточные ответы. Как показано на фиг.13 (диаграмма А), специфичный клеточный ответ IFN-γ был обнаружен в спленоцитах от мышей, которым вводили CMV-gB и пентамер CMV-gH/gL/UL128/UL130/UL131 в композиции с адъювантом PAA. Более выраженный специфичный клеточный ответ IFN-γ был обнаружен при стимуляции  с использованием рекомбинантного пентамера CMV-gH/gL/UL128/UL130/UL131, по сравнению с рекомбинантным белком CMV-gB. Для определения клеточных эпитопов в пентамере CMV-gH/gL/UL128/UL130/UL131 спленоциты от мышей, которым вводили CMV-gB и пентамер CMV-gH/GL/UL128/UL130/UL131 в композиции с адъювантом PAA, также стимулировали  с использованием пулов 15-мерных пептидов, покрывающих последовательность каждого составляющего пентамер отдельного белка, т.е. gH, gL, UL128, UL130 и UL131. Как показано на фиг.13 (диаграмма В), продолжительный специфичный клеточный ответ IFN-γбыл выявлен для всех пулов пептидов, покрывающих последовательность каждого составляющего пентамер отдельного белка, за исключением UL128, для которого обнаруженный клеточный ответ IFN-γ был низким у большинства испытуемых мышей.
Таким образом, добавление пентамера поверх gB позволяет увеличить клеточный ответ IFN-γ путем увеличения числа клеточных эпитопов.
--->
СПИСКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  Sanofi Pasteur
<120>  Имунногенная композиция цитомеголовируса человека
<130>  BET17L3240
<160>  6
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  806
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>   Антиген gB
<400>  1
Ser Ser Thr Arg Gly Thr Ser Ala Thr His Ser His His Ser Ser His
1               5                   10                  15
Thr Thr Ser Ala Ala His Ser Arg Ser Gly Ser Val Ser Gln Arg Val
20                  25                  30
Thr Ser Ser Gln Thr Val Ser His Gly Val Asn Glu Thr Ile Tyr Asn
35                  40                  45
Thr Thr Leu Lys Tyr Gly Asp Val Val Gly Val Asn Thr Thr Lys Tyr
50                  55                  60
Pro Tyr Arg Val Cys Ser Met Ala Gln Gly Thr Asp Leu Ile Arg Phe
65                  70                  75                  80
Glu Arg Asn Ile Val Cys Thr Ser Met Lys Pro Ile Asn Glu Asp Leu
85                  90                  95
Asp Glu Gly Ile Met Val Val Tyr Lys Arg Asn Ile Val Ala His Thr
100                 105                 110
Phe Lys Val Arg Val Tyr Gln Lys Val Leu Thr Phe Arg Arg Ser Tyr
115                 120                 125
Ala Tyr Ile His Thr Thr Tyr Leu Leu Gly Ser Asn Thr Glu Tyr Val
130                 135                 140
Ala Pro Pro Met Trp Glu Ile His His Ile Asn Ser His Ser Gln Cys
145                 150                 155                 160
Tyr Ser Ser Tyr Ser Arg Val Ile Ala Gly Thr Val Phe Val Ala Tyr
165                 170                 175
His Arg Asp Ser Tyr Glu Asn Lys Thr Met Gln Leu Met Pro Asp Asp
180                 185                 190
Tyr Ser Asn Thr His Ser Thr Arg Tyr Val Thr Val Lys Asp Gln Trp
195                 200                 205
His Ser Arg Gly Ser Thr Trp Leu Tyr Arg Glu Thr Cys Asn Leu Asn
210                 215                 220
Cys Met Val Thr Ile Thr Thr Ala Arg Ser Lys Tyr Pro Tyr His Phe
225                 230                 235                 240
Phe Ala Thr Ser Thr Gly Asp Val Val Asp Ile Ser Pro Phe Tyr Asn
245                 250                 255
Gly Thr Asn Arg Asn Ala Ser Tyr Phe Gly Glu Asn Ala Asp Lys Phe
260                 265                 270
Phe Ile Phe Pro Asn Tyr Thr Ile Val Ser Asp Phe Gly Arg Pro Asn
275                 280                 285
Ser Ala Leu Glu Thr His Arg Leu Val Ala Phe Leu Glu Arg Ala Asp
290                 295                 300
Ser Val Ile Ser Trp Asp Ile Gln Asp Glu Lys Asn Val Thr Cys Gln
305                 310                 315                 320
Leu Thr Phe Trp Glu Ala Ser Glu Arg Thr Ile Arg Ser Glu Ala Glu
325                 330                 335
Asp Ser Tyr His Phe Ser Ser Ala Lys Met Thr Ala Thr Phe Leu Ser
340                 345                 350
Lys Lys Gln Glu Val Asn Met Ser Asp Ser Ala Leu Asp Cys Val Arg
355                 360                 365
Asp Glu Ala Ile Asn Lys Leu Gln Gln Ile Phe Asn Thr Ser Tyr Asn
370                 375                 380
Gln Thr Tyr Glu Lys Tyr Gly Asn Val Ser Val Phe Glu Thr Thr Gly
385                 390                 395                 400
Gly Leu Val Val Phe Trp Gln Gly Ile Lys Gln Lys Ser Leu Val Glu
405                 410                 415
Leu Glu Arg Leu Ala Asn Arg Ser Ser Leu Asn Leu Thr His Asn Thr
420                 425                 430
Thr Gln Thr Ser Thr Asp Gly Asn Asn Ala Thr His Leu Ser Asn Met
435                 440                 445
Glu Ser Val His Asn Leu Val Tyr Ala Gln Leu Gln Phe Thr Tyr Asp
450                 455                 460
Thr Leu Arg Gly Tyr Ile Asn Arg Ala Leu Ala Gln Ile Ala Glu Ala
465                 470                 475                 480
Trp Cys Val Asp Gln Arg Arg Thr Leu Glu Val Phe Lys Glu Leu Ser
485                 490                 495
Lys Ile Asn Pro Ser Ala Ile Leu Ser Ala Ile Tyr Asn Lys Pro Ile
500                 505                 510
Ala Ala Arg Phe Met Gly Asp Val Leu Gly Leu Ala Ser Cys Val Thr
515                 520                 525
Ile Asn Gln Thr Ser Val Lys Val Leu Arg Asp Met Asn Val Lys Glu
530                 535                 540
Ser Pro Gly Arg Cys Tyr Ser Arg Pro Val Val Ile Phe Asn Phe Ala
545                 550                 555                 560
Asn Ser Ser Tyr Val Gln Tyr Gly Gln Leu Gly Glu Asp Asn Glu Ile
565                 570                 575
Leu Leu Gly Asn His Arg Thr Glu Glu Cys Gln Leu Pro Ser Leu Lys
580                 585                 590
Ile Phe Ile Ala Gly Asn Ser Ala Tyr Glu Tyr Val Asp Tyr Leu Phe
595                 600                 605
Lys Arg Met Ile Asp Leu Ser Ser Ile Ser Thr Val Asp Ser Met Ile
610                 615                 620
Ala Leu Asp Ile Asp Pro Leu Glu Asn Thr Asp Phe Arg Val Leu Glu
625                 630                 635                 640
Leu Tyr Ser Gln Lys Glu Leu Arg Ser Ser Asn Val Phe Asp Leu Glu
645                 650                 655
Glu Ile Met Arg Glu Phe Asn Ser Tyr Lys Gln Arg Val Lys Tyr Val
660                 665                 670
Glu Asp Lys Arg Leu Cys Met Gln Pro Leu Gln Asn Leu Phe Pro Tyr
675                 680                 685
Leu Val Ser Ala Asp Gly Thr Thr Val Thr Ser Gly Asn Thr Lys Asp
690                 695                 700
Thr Ser Leu Gln Ala Pro Pro Ser Tyr Glu Glu Ser Val Tyr Asn Ser
705                 710                 715                 720
Gly Arg Lys Gly Pro Gly Pro Pro Ser Ser Asp Ala Ser Thr Ala Ala
725                 730                 735
Pro Pro Tyr Thr Asn Glu Gln Ala Tyr Gln Met Leu Leu Ala Leu Val
740                 745                 750
Arg Leu Asp Ala Glu Gln Arg Ala Gln Gln Asn Gly Thr Asp Ser Leu
755                 760                 765
Asp Gly Gln Thr Gly Thr Gln Asp Lys Gly Gln Lys Pro Asn Leu Leu
770                 775                 780
Asp Arg Leu Arg His Arg Lys Asn Gly Tyr Arg His Leu Lys Asp Ser
785                 790                 795                 800
Asp Glu Glu Glu Asn Val
805
<210>  2
<211>  694
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>   Полипептид gH
<400>  2
Arg Tyr Gly Ala Glu Ala Val Ser Glu Pro Leu Asp Lys Ala Phe His
1               5                   10                  15
Leu Leu Leu Asn Thr Tyr Gly Arg Pro Ile Arg Phe Leu Arg Glu Asn
20                  25                  30
Thr Thr Gln Cys Thr Tyr Asn Asn Ser Leu Arg Asn Ser Thr Val Val
35                  40                  45
Arg Glu Asn Ala Ile Ser Phe Asn Phe Phe Gln Ser Tyr Asn Gln Tyr
50                  55                  60
Tyr Val Phe His Met Pro Arg Cys Leu Phe Ala Gly Pro Leu Ala Glu
65                  70                  75                  80
Gln Phe Leu Asn Gln Val Asp Leu Thr Glu Thr Leu Glu Arg Tyr Gln
85                  90                  95
Gln Arg Leu Asn Thr Tyr Ala Leu Val Ser Lys Asp Leu Ala Ser Tyr
100                 105                 110
Arg Ser Phe Ser Gln Gln Leu Lys Ala Gln Asp Ser Leu Gly Glu Gln
115                 120                 125
Pro Thr Thr Val Pro Pro Pro Ile Asp Leu Ser Ile Pro His Val Trp
130                 135                 140
Met Pro Pro Gln Thr Thr Pro His Gly Trp Thr Glu Ser His Thr Thr
145                 150                 155                 160
Ser Gly Leu His Arg Pro His Phe Asn Gln Thr Cys Ile Leu Phe Asp
165                 170                 175
Gly His Asp Leu Leu Phe Ser Thr Val Thr Pro Cys Leu His Gln Gly
180                 185                 190
Phe Tyr Leu Ile Asp Glu Leu Arg Tyr Val Lys Ile Thr Leu Thr Glu
195                 200                 205
Asp Phe Phe Val Val Thr Val Ser Ile Asp Asp Asp Thr Pro Met Leu
210                 215                 220
Leu Ile Phe Gly His Leu Pro Arg Val Leu Phe Lys Ala Pro Tyr Gln
225                 230                 235                 240
Arg Asp Asn Phe Ile Leu Arg Gln Thr Glu Lys His Glu Leu Leu Val
245                 250                 255
Leu Val Lys Lys Asp Gln Leu Asn Arg His Ser Tyr Leu Lys Asp Pro
260                 265                 270
Asp Phe Leu Asp Ala Ala Leu Asp Phe Asn Tyr Leu Asp Leu Ser Ala
275                 280                 285
Leu Leu Arg Asn Ser Phe His Arg Tyr Ala Val Asp Val Leu Lys Ser
290                 295                 300
Gly Arg Cys Gln Met Leu Asp Arg Arg Thr Val Glu Met Ala Phe Ala
305                 310                 315                 320
Tyr Ala Leu Ala Leu Phe Ala Ala Ala Arg Gln Glu Glu Ala Gly Ala
325                 330                 335
Gln Val Ser Val Pro Arg Ala Leu Asp Arg Gln Ala Ala Leu Leu Gln
340                 345                 350
Ile Gln Glu Phe Met Ile Thr Cys Leu Ser Gln Thr Pro Pro Arg Thr
355                 360                 365
Thr Leu Leu Leu Tyr Pro Thr Ala Val Asp Leu Ala Lys Arg Ala Leu
370                 375                 380
Trp Thr Pro Asn Gln Ile Thr Asp Ile Thr Ser Leu Val Arg Leu Val
385                 390                 395                 400
Tyr Ile Leu Ser Lys Gln Asn Gln Gln His Leu Ile Pro Gln Trp Ala
405                 410                 415
Leu Arg Gln Ile Ala Asp Phe Ala Leu Lys Leu His Lys Thr His Leu
420                 425                 430
Ala Ser Phe Leu Ser Ala Phe Ala Arg Gln Glu Leu Tyr Leu Met Gly
435                 440                 445
Ser Leu Val His Ser Met Leu Val His Thr Thr Glu Arg Arg Glu Ile
450                 455                 460
Phe Ile Val Glu Thr Gly Leu Cys Ser Leu Ala Glu Leu Ser His Phe
465                 470                 475                 480
Thr Gln Leu Leu Ala His Pro His His Glu Tyr Leu Ser Asp Leu Tyr
485                 490                 495
Thr Pro Cys Ser Ser Ser Gly Arg Arg Asp His Ser Leu Glu Arg Leu
500                 505                 510
Thr Arg Leu Phe Pro Asp Ala Thr Val Pro Ala Thr Val Pro Ala Ala
515                 520                 525
Leu Ser Ile Leu Ser Thr Met Gln Pro Ser Thr Leu Glu Thr Phe Pro
530                 535                 540
Asp Leu Phe Cys Leu Pro Leu Gly Glu Ser Phe Ser Ala Leu Thr Val
545                 550                 555                 560
Ser Glu His Val Ser Tyr Val Val Thr Asn Gln Tyr Leu Ile Lys Gly
565                 570                 575
Ile Ser Tyr Pro Val Ser Thr Thr Val Val Gly Gln Ser Leu Ile Ile
580                 585                 590
Thr Gln Thr Asp Ser Gln Thr Lys Cys Glu Leu Thr Arg Asn Met His
595                 600                 605
Thr Thr His Ser Ile Thr Ala Ala Leu Asn Ile Ser Leu Glu Asn Cys
610                 615                 620
Ala Phe Cys Gln Ser Ala Leu Leu Glu Tyr Asp Asp Thr Gln Gly Val
625                 630                 635                 640
Ile Asn Ile Met Tyr Met His Asp Ser Asp Asp Val Leu Phe Ala Leu
645                 650                 655
Asp Pro Tyr Asn Glu Val Val Val Ser Ser Pro Arg Thr His Tyr Leu
660                 665                 670
Met Leu Leu Lys Asn Gly Thr Val Leu Glu Val Thr Asp Val Val Val
675                 680                 685
Asp Ala Thr Asp Ser Arg
690
<210>  3
<211>  248
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Полипептид gL
<400>  3
Ala Ala Val Ser Val Ala Pro Thr Ala Ala Glu Lys Val Pro Ala Glu
1               5                   10                  15
Cys Pro Glu Leu Thr Arg Arg Cys Leu Leu Gly Glu Val Phe Gln Gly
20                  25                  30
Asp Lys Tyr Glu Ser Trp Leu Arg Pro Leu Val Asn Val Thr Gly Arg
35                  40                  45
Asp Gly Pro Leu Ser Gln Leu Ile Arg Tyr Arg Pro Val Thr Pro Glu
50                  55                  60
Ala Ala Asn Ser Val Leu Leu Asp Glu Ala Phe Leu Asp Thr Leu Ala
65                  70                  75                  80
Leu Leu Tyr Asn Asn Pro Asp Gln Leu Arg Ala Leu Leu Thr Leu Leu
85                  90                  95
Ser Ser Asp Thr Ala Pro Arg Trp Met Thr Val Met Arg Gly Tyr Ser
100                 105                 110
Glu Cys Gly Asp Gly Ser Pro Ala Val Tyr Thr Cys Val Asp Asp Leu
115                 120                 125
Cys Arg Gly Tyr Asp Leu Thr Arg Leu Ser Tyr Glu Arg Ser Ile Phe
130                 135                 140
Thr Glu His Val Leu Gly Phe Glu Leu Val Pro Pro Ser Leu Phe Asn
145                 150                 155                 160
Val Val Val Ala Ile Arg Asn Glu Ala Thr Arg Thr Asn Arg Ala Val
165                 170                 175
Arg Leu Pro Val Ser Thr Ala Ala Ala Pro Glu Gly Ile Thr Leu Phe
180                 185                 190
Tyr Gly Leu Tyr Asn Ala Val Lys Glu Phe Cys Leu Arg His Gln Leu
195                 200                 205
Asp Pro Pro Leu Leu Arg His Leu Asp Lys Tyr Tyr Ala Gly Leu Pro
210                 215                 220
Pro Glu Leu Lys Gln Thr Arg Val Asn Leu Pro Ala His Ser Arg Tyr
225                 230                 235                 240
Gly Pro Gln Ala Val Asp Ala Arg
245
<210>  4
<211>  144
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Полипептид UL128
<400>  4
Glu Glu Cys Cys Glu Phe Ile Asn Val Asn His Pro Pro Glu Arg Cys
1               5                   10                  15
Tyr Asp Phe Lys Met Cys Asn Arg Phe Thr Val Ala Leu Arg Cys Pro
20                  25                  30
Asp Gly Glu Val Cys Tyr Ser Pro Glu Lys Thr Ala Glu Ile Arg Gly
35                  40                  45
Ile Val Thr Thr Met Thr His Ser Leu Thr Arg Gln Val Val His Asn
50                  55                  60
Lys Leu Thr Ser Cys Asn Tyr Asn Pro Leu Tyr Leu Glu Ala Asp Gly
65                  70                  75                  80
Arg Ile Arg Cys Gly Lys Val Asn Asp Lys Ala Gln Tyr Leu Leu Gly
85                  90                  95
Ala Ala Gly Ser Val Pro Tyr Arg Trp Ile Asn Leu Glu Tyr Asp Lys
100                 105                 110
Ile Thr Arg Ile Val Gly Leu Asp Gln Tyr Leu Glu Ser Val Lys Lys
115                 120                 125
His Lys Arg Leu Asp Val Cys Arg Ala Lys Met Gly Tyr Met Leu Gln
130                 135                 140
<210>  5
<211>  189
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>   Полипептид UL130
<400>  5
Ser Pro Trp Ser Thr Leu Thr Ala Asn Gln Asn Pro Ser Pro Leu Trp
1               5                   10                  15
Ser Lys Leu Thr Tyr Ser Lys Pro His Asp Ala Ala Thr Phe Tyr Cys
20                  25                  30
Pro Phe Ile Tyr Pro Ser Pro Pro Arg Ser Pro Leu Gln Phe Ser Gly
35                  40                  45
Phe Gln Arg Val Leu Thr Gly Pro Glu Cys Arg Asn Glu Thr Leu Tyr
50                  55                  60
Leu Leu Tyr Asn Arg Glu Gly Gln Thr Leu Val Glu Arg Ser Ser Thr
65                  70                  75                  80
Trp Val Lys Lys Val Ile Trp Tyr Leu Ser Gly Arg Asn Gln Thr Ile
85                  90                  95
Leu Gln Arg Met Pro Arg Thr Ala Ser Lys Pro Ser Asp Gly Asn Val
100                 105                 110
Gln Ile Ser Val Glu Asp Ala Lys Ile Phe Gly Ala His Met Val Pro
115                 120                 125
Lys Gln Thr Lys Leu Leu Arg Phe Val Val Asn Asp Gly Thr Arg Tyr
130                 135                 140
Gln Met Cys Val Met Lys Leu Glu Ser Trp Ala His Val Phe Arg Asp
145                 150                 155                 160
Tyr Ser Val Ser Phe Gln Val Arg Leu Thr Phe Thr Glu Ala Asn Asn
165                 170                 175
Gln Thr Tyr Thr Phe Cys Thr His Pro Asn Leu Ile Val
180                 185
<210>  6
<211>  111
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>   Полипептид UL131A
<400>  6
Gln Cys Gln Arg Glu Thr Ala Glu Lys Asn Asp Tyr Tyr Arg Val Pro
1               5                   10                  15
His Tyr Trp Asp Ala Cys Ser Arg Ala Leu Pro Asp Gln Thr Arg Tyr
20                  25                  30
Lys Tyr Val Glu Gln Leu Val Asp Leu Thr Leu Asn Tyr His Tyr Asp
35                  40                  45
Ala Ser His Gly Leu Asp Asn Phe Asp Val Leu Lys Arg Ile Asn Val
50                  55                  60
Thr Glu Val Ser Leu Leu Ile Ser Asp Phe Arg Arg Gln Asn Arg Arg
65                  70                  75                  80
Gly Gly Thr Asn Lys Arg Thr Thr Phe Asn Ala Ala Gly Ser Leu Ala
85                  90                  95
Pro His Ala Arg Ser Leu Glu Phe Ser Val Arg Leu Phe Ala Asn
100                 105                 110
<---