Динамика показателей перекисного окисления липидов при воздействии препарата двухвалентного железа по данным эксперимента

ДИНАМИКА П0КАЗАТЕЛ1 ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ ПРИ В1 ПРЕПАРАТА ДВУХВАЛЕНТНОГО ПО ДАННЫМ ЭКСПЕРИМЕНТА

УДК 615.03:577.158 Поступила 13.03.2010 г.

В.Б. Кузин, д.м.н., профессор, зав. кафедрой общей и клинической фармакологии; Л.В. Ловцова, к.м.н., доцент кафедры общей и клинической фармакологии; Т.И. Соловьева, к.б.н., доцент, и.о. зав. отделом биохимии ЦНИЛ

Нижегородская государственная медицинская академия, Н. Новгород

Цель исследования — изучить динамику показателей перекисного окисления липидов и антиоксидантной защиты в крови экспериментальных животных при повторном длительном введении препарата двухвалентного железа сульфата с серином.

Материалы и методы. Эксперимент проведен на 120 нелинейных крысах-самцах. Определяли показатели индуцированной биохе-милюминесценции, содержание малонового диальдегида, активность супероксиддисмутазы и каталазы, концентрацию церулоплазми-на в крови экспериментальных животных при введении препарата двухвалентного железа сульфата с серином (Актиферрин) в эквите-рапевтической дозе 17,14 мг/кг в сутки (в пересчете на Fe2t) в течение 30 суток.

Результаты. Препарат Актиферрин активирует процесс перекисного окисления липидов через 1 сут после введения, что проявляется в виде увеличения свободно-радикальной активности плазмы крови экспериментальных животных, замедления роста общей антиоксидантной активности и повышения скорости спада процесса свободно-радикального окисления. Отмечается этапность в динамике всех изученных показателей в течение периода наблюдения.

Заключение. Современный подход к оценке влияния препаратов железа, в том числе двухвалентного, на показатели перекисного окисления липидов должен предусматривать их динамический контроль в течение всего срока применения ферропрепарата. Полученные результаты свидетельствуют о необходимости сочетанного назначения антиоксидантов, с учетом этапности изменений указанных показателей.

Ключевые слова: железодефицитная анемия, препараты железа, перекисное окисление липидов.

English

Dynamics of the lipid peroxidation values at a divalent iron preparation effect according to the experiment data

V.B. Kuzin, M.D., professor, head of a general and clinical pharmacology chair;

L.V. Lovtsova, c.m.s., assistant professor of a general and clinical pharmacology chair;

T.I. Soloviyova, c.b.s., assistant professor, acting head of the CSRL biochemistry department

Nizhny Novgorod state medical academy, N. Novgorod

Aim of investigation is a study of the lipid peroxidation and antioxidant protection value dynamic in blood of experimental animals at a repeated durative infusion of a sulfate with serine divalent iron preparation.

Materials and methods. An experiment is made on 120 nonlinear male-rats. The values of induced biochemiluminescence, a content of a malone dialdehyde, an activity of a superoxidedismutase and catalase, a concentration of a ceruplasmin in blood of experimental animals at infusion of a sulfate with serine divalent iron preparation (Actiferrin) have been detected in the equitherapeutic dose of 17.14 mg/kg a day (counting a Fe2+) during 30 days.

Results. The Actiferrin preparation activates a process of the lipid peroxidation in a day after infusion, which is manifested in a form of the experimental animal blood plasma free-radical activity increase, delaying of a general antioxidant activity growth and an increase of a free-radical oxidation process abatement rate. The stages in dynamics of all the studied values during a period of observation are marked.

Для контактов: Ловцова Любовь Валерьевна, тел. раб. (831) 436-54-01; тел. моб. +7 960-196-86-58; e-mail: farmnnov@mail.ru.

Conclusion. The modern approach to assessment of the iron preparation influence, including a divalent one, on the lipid peroxidation values must foresee their dynamic control during all the date of a ferropreparation use. The received results testify to a necessity of a combined designation of antioxidants considering the stages of the indicated value alterations.

Key words: ferrodeficient anemia, iron preparations, lipid peroxidation.

Клиническая картина железодефицитной анемии чрезвычайно разнообразна и включает анемический, а также сидеропенический синдромы. Это обусловлено участием железа в различных физиологических и биохимических процессах, в частности в транспорте кислорода, окислительно-восстановительных, иммунобиологических и адаптационно-защитных реакциях [1, 2].

При данной патологии основой заместительной фармакотерапии являются препараты железа, которые классифицируют в зависимости от способа введения: для приема внутрь (содержат двух- или трехвалентное железо, могут быть монокомпонентными или комбинированными), а также для парентерального введения (содержат трехвалентное железо в виде комплекса с декстраном, сахарозой или глюконатом натрия) [3].

Особенности фармакокинетики препаратов двухвалентного железа заключаются в том, что в слизистой оболочке желудочно-кишечного тракта содержащееся в них железо подвергается окислению с образованием свободных радикалов и активных форм кислорода, инициирующих реакции свободно-радикального окисления [4], что имеет существенное значение в развитии побочных эффектов при применении указанных препаратов [5, 6]. Вместе с тем данные литературы о влиянии таких препаратов на процесс свободно-радикального окисления неоднозначны. Рядом авторов показано, что соли двухвалентного железа активируют перекисное окисление липидов (ПОЛ) [4, 7]. Другие исследования свидетельствуют о том, что не все препараты, содержащие двухвалентное железо, обладают указанной способностью [8, 9].

Таким образом, вопрос о влиянии препаратов двухвалентного железа на процесс свободно-радикального окисления, в частности на показатели ПОЛ, а также на процесс антиоксидантной защиты, особенно при повторном длительном введении этих препаратов, требует более детального изучения.

Цель исследования — изучить динамику показателей перекисного окисления липидов и антиоксидантной защиты в крови экспериментальных животных при повторном длительном введении препарата двухвалентного железа сульфата с серином.

Материалы и методы. Работа выполнена на кафедре общей и клинической фармакологии с использованием экспериментально-лабораторной базы ЦНИЛ НижГМА.

Эксперименты проведены на 120 белых нелинейных крысах-самцах с исходной массой 70—75 г, у которых первоначально определялись гематологические показатели (уровень гемоглобина, количество эритроцитов, содержание сывороточного железа) и создавалась модель алиментарной железодефицитной анемии [10].

В последующем животным опытной группы (n=60) перорально через зонд вводили препарат двухвалентного железа сульфата с серином (Актиферрин) в экви-терапевтической дозе 17,14 мг/кг в сутки (в пересчете на Fe2+) в течение 30 сут; животным контрольной группы (n=60) — перорально 0,5 мл воды дистиллированной.

Забой животных осуществляли через 1, 3, 5, 10, 20 и 30 сут введения препарата железа. Объектом исследования являлись кровь и свежеприготовленная плазма. При этом исследовали вышеуказанные гематологические показатели, а также показатели ПОЛ и антиоксидантной защиты.

Определение уровня гемоглобина, количества эритроцитов и сывороточного железа проводилось с помощью фотометрического метода.

Интенсивность процесса ПОЛ и общую антиоксидант-ную активность (АОА) плазмы крови исследовали методом индуцированной биохемилюминесценции. При этом определяли показатели: максимальную интенсивность хемилюминесцентного (ХЛ) свечения (Imax), которая характеризует потенциальную способность биологического объекта к ПОЛ или его свободно-радикальную активность, светосумму ХЛ (S), обратно пропорциональную общей АОА, а также тангенс угла наклона кинетической кривой ХЛ (tga2), характеризующий скорость спада кинетической кривой ХЛ на биохемилюминометре БХЛ-06 [11].

Анализ содержания малонового диальдегида (МДА) проводился по реакции с тиобарбитуровой кислотой по методу J.B. Smith [12]. Исследование активности супероксиддисмутазы (СОД) выполнялось по методу M. Nischikimi [13], каталазы — по методу Y. Aebi [14].

Изучение концентрации церулоплазмина осуществлялось с помощью иммунотурбидиметрического метода на биохимическом автоматическом анализаторе Olympus AU640.

Статистическая обработка полученных результатов проводилась с использованием лицензионного статистического пакета STADIA 7.0/prof (номер копии 1434) и оценкой уровня значимости различий между двумя выборками с помощью параметрических и непараметрических критериев [15]. Результаты представлялись в виде М±1Г1, где М — среднее арифметическое, m — стандартная ошибка средней величины.

результаты и обсуждение. Анализ полученных данных показал, что препарат железа сульфата с серином (Актиферрин) уже через 1 сут его введения на фоне смоделированной железодефицитной анемии вызывает статистически значимое по сравнению с исходным уровнем увеличение показателя Imax на 18,89% (р<0,01), в отличие от снижения данного показателя в группе контроля (р<0,01). Через 3, 5 и 10 сут после введения

//////////////////////^^^^

18 СТМ J 2010 - 2 В.Б. Кузин, Л.В. Ловцова, Т.И. Соловьева

препарата повышение I,™« относительно исходного значения также регистрируется, причем через 10 сут — статистически значимое (на 28,73%; р<0,01), но оно является менее выраженным, чем у животных контрольной группы (р<0,01 через 3 сут после введения). Через 20 и 30 сут, напротив, отмечается снижение указанного показателя по сравнению с исходным значением на 15,08 и 5,08% соответственно (р<0,05 на обоих этапах), однако это снижение не отличается от группы контроля (табл. 1). Таким образом, препарат Актиферрин увеличивает свободно-радикальную активность плазмы крови экспериментальных животных через 1 сут после введения, вызывая «ранний» оксидативный стресс.

Изучаемый препарат через 1 сут после введения повышает общую АОА по сравнению с исходным уровнем,

0 чем свидетельствует снижение показателя S на 7,80% (р<0,05). Вместе с тем уровень АОА в опытной группе несколько ниже, чем в группе контроля. Через 3, 20 и 30 сут после введения Актиферрина АОА повышается существенно по сравнению с исходным значением (снижение показателя S на 10,92 (р<0,05), 23,03 (р<0,001) и 14,26% (р<0,01) соответственно), однако указанные изменения практически не отличаются от таковых в группе контроля.

Исследования показали также, что препарат увеличивает показатель 1да2 относительно исходного уровня на всех изученных этапах — на 53,72; 41,49; 38,83; 65,43; 39,36 и 30,32% соответственно (р<0,01 — через 30 сут после введения и р<0,001 — на всех остальных этапах). Причем через 1 сут увеличение 1да2 является более существенным, чем у животных группы контроля (р<0,001) (см. табл. 1).

Через 1 сут после введения Актиферрин обусловливает повышение концентрации МДА на 8,64% по сравнению с исходным уровнем (р<0,05), которое, однако, меньше такового в группе контроля (р<0,05). Через 5 и 30 сут препарат вызывает снижение содержания МДА по сравнению с исходным уровнем на 38,27 (р<0,001) и 40,74% (р<0,001) соответственно, которое на обоих этапах является более существенным, чем в группе контроля (р<0,05 в обоих случаях). Через 10 сут Актиферрин приводит также к снижению концентрации МДА, но оно не только несущественно по сравнению с исходным значением, но и менее выражено, чем в группе контроля (р<0,01) (см. рисунок).

Полученные результаты свидетельствуют о ступенчатом изменении содержания МДА на фоне введения препарата железа сульфата с серином в течение периода наблюдения, что согласуется с данными литературы [8, 9].

Активность СОД под влиянием Актиферрина через

1 сут после введения повышается по сравнению с исходным уровнем на 23,85% (р<0,001), что при этом практически не отличается от группы контроля. Через 10 сут также отмечается увеличение этого показателя, однако уже меньше, чем в группе контроля (р<0,05). Через 3 и 20 сут активность СОД снижается по сравнению с исходным значением на 35,31 (р<0,001) и 32,53% (р<0,01) соответственно, причем уменьшение через 3 сут практически не отличается, а через 20 сут являет-

Таблица 1

Динамика значений индуцированной биохемилюминесценции плазмы при введении препарата железа сульфата с серином

Этап исследования, сутки Группы экспериментальных животных

Актиферрин Контрольная

Максимальная интенсивность ХЛ (1тах), мВ

Исходный уровень 6,30±0,22 6,30±0,22

1-е 7,49±0,25*+ 6,24±0,18

3-и 6,80±0,23+ 7,20±0,43

5-е 6,98±0,34 7,12±0,20

10-е 8,11±0,42* 8,71±0,47

20-е 5,35±0,33* 4,98±0,42

30-е 5,98±0,47* 6,18±0,27

Светосумма ХЛ мВ

Исходный уровень 47,33±1,40 47,33±1,40

1-е 43,64±0,96* 38,57±1,09

3-и 42,16±1,68* 44,33±2,00

5-е 43,35±2,30 41,64±0,92

10-е 49,64±1,84 48,88±2,08

20-е 36,43±1,09* 37,02±1,25

30-е 40,58±1,79* 39,07±1,79

Тангенс угла наклона кинетической кривой ХЛ ^да2)

Исходный уровень 1,88±0,06 1,88±0,06

1-е 2,89±0,13*+ 2,24±0,06

3-и 2,66±0,08* 2,65±0,12

5-е 2,61±0,13* 2,79±0,09

10-е 3,11±0,16* 3,29±0,22

20-е 2,62±0,09* 2,49±0,12

30-е 2,45±0,16* 2,49±0,04

* — статистическая значимость различий по сравнению с исходным значением показателя; + — по сравнению с группой контроля.

ся менее выраженным, чем в группе контроля (р<0,05). Обращает на себя внимание, что через 30 сут Актиферрин обусловливает хотя и несущественное по сравнению с исходным уровнем, но отличающееся от снижения в группе контроля (р<0,05) повышение активности СОД (табл. 2).

Активность каталазы при введении Актиферрина хотя и снижается по сравнению с исходной величиной на всех исследованных этапах, причем через 3, 10, 20 и 30 сут — статистически значимо, соответственно на 30,91 (р<0,05); 60,81 (р<0,001); 64,91 (р<0,001) и 55,88% (р<0,01), но это снижение существенно не отличается от такового в группе контроля (см. табл. 2).

Динамика концентрации МДА при введении препарата железа сульфата с серином; * — статистическая значимость различий по сравнению с исходным значением показателя; + — по сравнению с группой контроля

МДА, нмоль/мл

1,2

0,8 -0,6 -0,4 0,2 0

— ——i— ——i— ——i— ——i— ——i— ——i— —— Исходный 1-е 3-и 5-е 10-е 20-е 30-е Сутки

уровень

- Актиферрин;  — контроль

Таблица 2

Динамика активности эндогенных антиоксидантов при введении препарата железа сульфата с серином

Этап исследования, сутки Группы экспериментальных животных

Актиферрин Контрольная

Активность супероксиддисмутазы (СОД), ед. акт./г Hb мин

Исходный уровень 57,98±2,53 57,98±2,53

1-е 71,81±8,70* 74,53±5,23

3-и 37,51±2,44* 38,94±5,97

5-е 58,24±6,16 72,43±9,55

10-е 59,18±8,49+ 66,85±4,61

20-е 39,12±4,80*+ 26,31±2,21

30-е 62,60±5,20+ 48,45±3,64

Активность каталазы, ед. акт./г Hb с

Исходный уровень 104,40±12,06 104,40±12,06

1-е 79,59±11,12 58,65±12,70

3-и 72,13±6,57 * 70,77±10,23

5-е 74,68±11,82 66,09±13,19

10-е 40,91±3,64 * 38,90±4,02

20-е 36,63±2,48 * 24,73±3,30

30-е 46,06±9,05 * 32,08±5,99

Концентрация церулоплазмина, мг/л

Исходный уровень 19,20±1,46 19,20±1,46

1-е 9,26±0,93* 8,16±1,10

3-и 8,85±0,77* 7,95±0,95

5-е 8,87±1,27* 9,97±1,37

10-е 10,28±1,47* 6,05±0,91

20-е 8,10±1,57* 9,28±1,58

30-е 10,70±1,44* 9,83±1,36

* — статистическая значимость различий по сравнению с исходным значением показателя; + — по сравнению с группой контроля.

Аналогичные изменения выявлены и по содержанию церулоплазмина, снижение которого по сравнению с исходным уровнем зарегистрировано на всех этапах исследования — на 51,77; 53,91; 53,80; 46,46; 57,81 и

44,27% соответственно (р<0,001 на всех этапах). Вместе с тем эти изменения не отличаются статистически значимо от изменений в группе контроля. Это, по-видимому, обусловлено тем, что при введении Актифер-рина в эквитерапевтических дозах концентрация ионов железа в крови не превышает физиологических значений, и содержание церулоплазмина, обладающего феррооксидазной активностью и катализирующего реакцию окисления Fe2+ в Fe3+, под влиянием указанного препарата изменяется практически так же, как в группе контроля.

Таким образом, препарат двухвалентного железа сульфата с серином (Актиферрин) уже через 1 сут после его введения увеличивает свободно-радикальную активность плазмы. При этом общая АОА несколько ниже, чем в группе контроля. Повышение свободно-радикальной активности сопровождается некоторым увеличением концентрации МДА на этом этапе исследования. Однако увеличение скорости спада процесса свободно-радикального окисления в этот же период, по-видимому, приводит к тому, что содержание МДА уже через 5 сут снижается, что свидетельствует об уменьшении интенсивности процесса ПОЛ. Активность фермента первого этапа антиоксидантной защиты (СОД) при этом несколько увеличивается.

Через 20 сут введения Актиферрина АОА хотя и повышается по сравнению с исходным уровнем, но это увеличение существенно не отличается от такового в группе контроля. Вместе с тем через 20 сут введения, так же как и на раннем этапе (через 1 сут), Актифер-рин несколько повышает концентрацию МДА, которая через 30 сут статистически значимо снижается, а активность СОД при этом увеличивается.

На активность фермента второго этапа антиокси-дантной защиты, водной фазы — каталазы, а также на концентрацию фермента липидной фазы — церулоплазмина Актиферрин на протяжении исследованного срока существенно не влияет.

Заключение. Препарат Актиферрин активирует процесс перекисного окисления липидов через 1 сут после введения, что проявляется в виде увеличения свободно-радикальной активности плазмы крови экспериментальных животных, замедления роста общей

/////////////////////^^^^

20 СТМ | 2010 - 2 В.Б. Кузин, Л.В. Ловцова, Т.И. Соловьева

антиоксидантной активности и повышения скорости спада процесса свободно-радикального окисления. При этом отмечается этапность в динамике всех изученных показателей в течение периода наблюдения. Следовательно, современный подход к оценке влияния препаратов железа, в том числе двухвалентного, на показатели перекисного окисления липидов должен предусматривать их динамический контроль в течение всего срока применения ферропрепарата. Полученные результаты свидетельствуют также о необходимости коррекции выявленных изменений показателей пере-кисного окисления липидов с помощью лекарственных средств, обладающих антиоксидантной активностью, с учетом этапности этих изменений.

Литература

1. Воробьев П.А. Анемический синдром в клинической практике. М: Ньюдиамед; 2001; 168 с.

2. Боровков Н.Н., Волкова С.А., Евдокимова Н.М., Лебедева А.И. Болезни системы крови: механизмы развития, диагностические критерии и принципы терапии. Н. Новгород; 2002; 138 с.

3. Клиническая фармакология. Национальное руководство. Под ред. Ю.Б. Белоусова, В.Г. Кукеса, В.К. Лепа-хина, В.И. Петрова. М: ГЭОТАР-Медиа; 2009; 976 с.

4. Блошанский Ю.М., GeisserP., Хасабов Н.Н. Анемия беременных. Гинекология 2006; 8(2): 47—50.

5. Dimitrov J.D., Vassilev T.L., Andre S. et al. Functional variability of antibodies upon oxidative processes. Autoimmun Rev 2008; 7(7): 574—578. Mozuraityte R., Rustad T., Storro I. The role of iron in

peroxidation of polynn saturated fatty acids in liposomes. J Agric Food Chem 2008; 56(2): 537—543.

7. Weinberg E.D. Iron out of balance: arisk factor for acute and chronic diseases. Hemoglobin 2008; 32(1—2): 117—122.

8. Заспа Е.А. Свободно-радикальные процессы у больных железодефицитной анемией на фоне лечения препаратами железа. Автореф. дис. ... канд. мед. наук. М; 2006.

9. Литвицкий П.Ф., Дворецкий А.И., Заспа Е.А., Боле-вич С.Б. Свободнорадикальные процессы у больных железодефицитной анемией. Клиническая патофизиология 2006; 1: 10—14.

10. МУК 2.3.2.721-98. Пищевые продукты и пищевые добавки. Определение безопасности и эффективности биологически активных добавок к пище. М; 1998; 30 с.

11. Кузьмина Е.Н., Нелюбин А.С, Щенникова М.К. Применение индуцированной ХЛ для оценок свободноради-кальных реакций в биологических субстратах. В кн.: Биохимия и биофизика микробиологов. Горький; 1983; с. 41-48.

12. Smith J.B., Jngerman C.M., Silver M.I. Malondialdehyde formathionas an indicathion of prostoglandin production byhyman pleteles. I Lab Clin Med 1976; 88(4): 167—172.

13. Nischikimi M., Roo A, XagiK. The occurence of superoxide anion in the reactions of redused phenaxide metasulfate and molecular oxygen. Biochem Biophys Res Commun 1972; 146(2): 849—854.

14. Aebi Y. Methoden der enzymatischen analyses. Verlag Chemie. Academic Press Inc 1970; 2: 636—647.

15. Кулаичев А.П. Методы и средства комплексного анализа данных. М: ФОРУМ ИНФРА-М; 2006; 512 с.