Способ прогнозирования риска прогрессии рецидивирующих цервикальных интраэпителиальных неоплазий низкой степени онкогенного риска, ассоциированных с папилломавирусной инфекцией
METHOD FOR PREDICTING THE RISK OF PROGRESSION OF RECURRENT CERVICAL INTRAEPITHELIAL NEOPLASIAS OF LOW DEGREE OF ONCOGENIC RISK ASSOCIATED WITH HUMAN PAPILLOMAVIRUS INFECTION

Изобретение относится к области медицины, а именно к гинекологии, и может быть использовано для оценки риска прогрессии рецидивирующих цервикальных интраэпителиальных неоплазий низкой степени онкогенного риска (LSIL), ассоциированных с папилломавирусной инфекцией в предраковое состояние (высокую степень онкогенного риска – HSIL). Изобретение обеспечивает возможность повышения эффективности лечения женщин с LSIL, за счет выбора персонифицированной коррекции иммунологических нарушений.
В настоящее время отмечается тенденция к увеличению частоты цервикальных интраэпителиальных неоплазий высокой степени онкогенного риска (HSIL), несмотря на достаточно хорошо оптимизированную систему скрининга. Вероятно, подобная ситуация связана не только с отсутствием специфических клинических проявлений и высокой распространенностью папилломовирусной инфекции (ПВИ), но и нарушением работы определенных звеньев иммунитета. Существующие на  сегодняшний  день  методы  лечения ВПЧ-ассоциированных  цервикальных интраэпителиальных неоплазий, не  всегда дают долгосрочный эффект. В связи с этим проводится активный поиск путей воздействия на иммунитет, что является чрезвычайно важным для снижения не только рецидивирования, но и малигнизации данной патологии.
Онкогинекология.
BMCInfectDis
По данным литературы, у женщин репродуктивного возраста цервикальные интраэпителиальные неоплазии (SIL) занимают от 10,7%  до 38,8% в структуре гинекологических заболеваний [Аксель Е. М. Заболеваемость и смертность от злокачественных новообразований органов женской репродуктивной системы в России.  2015;1:6–15; Давыдов М. И., Д. И. Максимович, Заридзе Д. Г. Динамика заболеваемости и смертности от злокачественных новообразований в России. Вестник РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН. 2015; 26:1-5]. Кроме того, ряд исследований  показывает, что  резко выраженная дисплазия шейки матки в 0,2-0,4% случаев в течение 1 года прогрессирует с развитием карцином [Motamedi M., Böhmer G, Neumann H.H., Wasielewski R.CIN IIl esionsandregression: retrospective analysis of 635 cases. . 2015;21(15):541].
В Российской Федерации по состоянию на 2018 г. рак шейки матки занимает 5-е место в структуре онкопатологии, несмотря на то, что для предотвращения данного заболевания активно внедряются скрининг и профилактические мероприятия [Каприн А.Д., Старинский В.В., Петрова Г.В. Злокачественные новообразования в России в 2018 году (заболеваемость и смертность), М.: МНИОИ им. П.А. Герцена - филиал ФГБУ «НМИРЦ» Минздрава России. 2019; 250].
Gynecology.
Гинекология
Именно с вирусом папилломы человека (ВПЧ) связано 9% всех новых случаев рака шейки матки (РШМ) у женщин [Каприн А.Д., Старинский В.В., Петрова Г.В. Состояние онкологической помощи населению России в 2016 году. М: МНИОИ им. П.А.Герцена – филиал ФГБУ НМИЦР. 2017; 236; Тихомиров А.Л., Сарсания С.И., Филатова Г.А. Вирус папилломы человека: от понимания иммунопатогенеза к рациональной тактике ведения. 2018; 20(3): 5–11] Данные исследований по анализу результатов длительно текущих ВПЧ–ассоциированных SIL показали, что при цервикальных интраэпителиальных неоплазиях низкой степени онкогенного риска (LSIL) наблюдаются достаточно высокие показатели регресса до 57%, прогрессирование процесса зарегистрировано в 11%, персистенция в 32% и лишь в 1% случаев отмечена онкотрансформация. При HSIL показатели менее позитивные, так как регресс предракового процесса наблюдается только в 32% случаев, при этом, малигнизация происходит в 12% случаев [Абакарова П.А., Прилепская В.Н. ВПЧ-ассоциированные заболевания шейки матки. Возможности комплексной терапии. . 2017;19(5): 4-9; Сухих Г.Т., Прилепская В.Н. Профилактика рака шейки матки: руководство для врачей. Изд. 3-е, Москва: МЕД пресс-информ. 2012; 190].
Эффективная фармакотерапия.
Лечебное дело.
Фарматека.
Lancet Infec Dis
Gynecol.
Вестник последипломного медицинского образования
Достаточно активно проводят исследования относительно углубленной оценки параметров состояния иммунной системы в крови при ВПЧ-ассоциированных цервикальных интраэпителиальных неоплазиях. По результатам которых, анализ уровня экспрессии маркеров (CD3, CD4, CD8, CD4/CD8, CD20, CD16), цитокинов (ИФН-γ, ФНО-α), иммуноглобулинов (IgG, IgА, IgМ) демонстрирует отклонения показателей Т-клеточного иммунитета [Доброхотова, Ю.Э., Венедиктова М.Г., Гришин И.И., Саранцев А.Н., Зыков А.Е., Хасан А.Ш., Панова Н.П., Савина Ю.А., Морозова К.В. Комплексный подход к лечению  вирусиндуцированого истинного предрака шейки матки. 2016;22:10-15; Доброхотова Ю.Э., Венедиктова М.Г., Саранцев А.Н., Морозова К.В., Суворова В.А. Комплексный подход к лечению  вирусиндуцированого истинного предрака шейки матки.  2016;4:52-56]. Обобщая данные многочисленных исследований в этом направлении, можно сделать вывод, что именно от ответной реакции организма хозяина на внедрение вируса и будет зависеть степень риска развития SIL и рака шейки матки. Это в свою очередь определяется индивидуальным генетическим портретом иммунной системы и прежде всего ее реактивностью в плане  локальной защиты органов урогенитального тракта [Доброхотова Ю.Э., Венедиктова М.Г., Гришин И.И., Саранцев А.Н. , Морозова К.В., Луценко Н.Н. Эффективность комплексного подхода к лечению дисплазии эпителия шейки матки умеренной и тяжелой степени на фоне инфицирования вирусом папилломы человека. 2015;3:44-47; Einstein M.H., Schiller J.T., Viscidi R.P., Strickler H.D., Coursaget  Р., Tan Т., Halsey N., Jenkins D. Clinician’s guide to human papillomavirus immunology: knowns and unknowns. . 2009;9(6):347-356; Stanley M. A practitioner’s guide to understanding immunity to human papillomavirus.USObstet.2009;4(1):10-15]. Однако характер иммунного ответа определяется тем, по какому пути он будет происходить Th1 или  Th2. Кроме того, именно дисбаланс Th1 или Th2, приводит к развитию не только аутоиммунных, но и хронических процессов, их прогрессированию, что позволяет  ожидать более тяжелое и осложненное течение вирусного процесса при  переключении c клеточного иммунитета на гуморальный [Абрамовских О.С, Зиганшин О.Р., Летяева О.И, Телешева Л.Ф.  Иммунологические методы исследования в диагностике папилломавирусной инфекции. . 2014; 4: 78-79; Кишкун А.А. Иммунологические исследования и методы диагностики инфекционных заболеваний в клинической практике. М. [б.и.]. 2009; 712; Черешнев В.А., Шмагель К.В.  Иммунология: учебник. 4-е изд., перераб. и доп. М: НП «Центр стратегического партнерства». 2014; 520].
DoctorRu.
Гинекология
SeminReprodMed
Также необходимо отметить, что по данным литературы, именно хроническое  воспаление, вне зависимости от вирусной или бактериальной природы, достаточно тесно связано с развитием и онкотрансформацией цервикальных интраэпителиальных неоплазий [Белокриницкая Т.Е., Фролова Н.И.,  Тарбаева Д.А., Глотова Е.Ю., Золотарева А.А., Мальцева Т.В. Ассоциации генитальных инфекций и вируса папилломы человека как конфаундинг-факторы цервикальной интраэпителиальной неоплазии. 2015;2(12):14–17; Пестрикова Т.Ю., Панфилова Ю.О. Чувствительность патогенной микрофлоры цервикального канала к антибактериальным препаратам у пациенток с хроническим цервицитом и ВПЧ. . 2015; 7(1): 18 – 21; Reid G., Hons B.S. Modulating the Vaginal Microbiome: The Need for a Bridge between Science and Practice.. 2014;32(1):28–34].
В патентной литературе описан «Способ прогнозирования предраковых заболеваний шейки матки у женщин с папилломавирусной инфекцией» (патент на изобретение RU 2310 197,опубликован: 10.11.2007). Он заключается в иммуногистохимическом исследовании с оценкой PCNA, BCL-2 в биоптатах шейки матки женщин с  папилломавирусной инфекцией и последующим расчетом коррелятивного индекса пролиферации (КИП). По данным авторов, результаты КИП более 114,0 у пациентов с CINI демонстрируют высокий риск перехода в CINII, а при цифрах КИП выше 208,0 в CINIII или онкотрансформацию.
Известен также «Способ тактики ведения пациенток с умеренными дисплазиями шейки матки» (патент на изобретение RU 2 704 798 C1,опубликован: 31.10.2019), где предлагается выполнение прицельной точечной биопсии шейки матки с проведением иммуногистохимического исследования и определением экспрессии маркеров Ki-67, CK7. По данным авторов, данный способ позволяет прогнозировать течение CIN II.
Недостатками вышеописанных способов является отсутствие учета иммунологических предикторов, что не дает возможность выработать тактику ведения пациентов с целью снижения рисков прогрессирования неопластического процесса и его онкотрансформации, снижая эффективность применения данных методов.
Наиболее близким аналогом (прототипом) является «Способ использования иммунологических маркеров для прогноза прогрессии цервикальных интраэпителиальных неоплазий, ассоциированных с папилломавирусной инфекцией» (патент на изобретение RU 2520 746 C1, опубл. 31.10.2019). Он заключается в определении иммунологических показателей в крови и цервикальном секрете пациента.
Недостатками этого способа, при достаточно широком спектре иммунологических показателей, является отсутствие возможности оценить путь (механизм) развития хронического воспалительного процесса, тесно связанного с возникновением и онкотрансформацией цервикальных интраэпителиальных неоплазий, что затрудняет выбор корректной иммуномодулирующей терапии и тем самым ограничивает возможности адекватных мероприятий по снижению рисков прогрессирования неопластического процесса.
Задачей изобретения является разработка способа прогнозирования риска прогрессии рецидивирующих цервикальных интраэпителиальных неоплазий низкой степени онкогенного риска, ассоциированных с папилломавирусной инфекцией на основании данных иммуногистохимического исследования биоптата шейки матки.
Технический результат: заявляемый способ позволяет прогнозировать прогрессирование патологического процесса у женщин с рецидивирующими LSIL и риск перехода в высокую степень онкогенного риска.
Указанный технический результат достигается тем, что заявляется способ прогнозирования риска прогрессии рецидивирующих цервикальных интраэпителиальных неоплазий низкой степени онкогенного риска, ассоциированных с папилломавирусной инфекцией на основании иммуногистохимических данных, полученных с использованием двухэтапного стрептавидин-биотин-пероксидазного метода отличающийся тем, что в биоптатах шейки матки проводят оценку уровня экспрессии колониестимулирующего фактора макрофагов (M-CSF), плазматических клеток (CD138) в строме, а также Т-лимфоцитов (CD3) и натуральных киллеров (CD56) в цервикальном эпителии с последующим вычислением прогностического индекса (PI) по формуле:
PI = 0,095 Х1+0,053× Х2+0,782× Х3 – 0,387× Х4 – 5,789, где
Х1 – количество CD3 клеток, %;
Х2 – количество CD138 клеток в строме, %;
Х3 – количество CD56 клеток, %;
Х4 – количество M-CSF клеток в строме, %;
5,789 – константа.
При PI более 0 делают заключение о высоком риске прогрессии рецидивирующей цервикальной интраэпителиальной неоплазии низкой степени онкогенного риска в высокую. При PI менее 0 прогнозируют низкий риск прогрессии в HSIL.
Способ осуществляют следующим образом: после гистологического исследования, на полученных парафиновых срезах,  проводится иммуногистохимическое исследование по стандартной методике с окраской растворами антител фирмы «Bond RTU Primary» США, специфичных к одному из исследуемых маркеров (CD3, CD56, CD138, M-CSF).
Проявление реакции осуществляется системой визуализации «Dako Cytomation». Для визуализации первичных антител используют безбиотиновую систему детекции Super Sensitive Polymer-HPR Detection System (Biogenex). Оценка полученных результатов осуществлялась по степени флюоресценции и количеству образованных комплексов «антиген-антитело» в процентном эквиваленте. Подсчет количества позитивных клеток выполняют при увеличении ×400 не менее чем в 10 полях зрения.
Для M-CSF процент положительных клеток подсчитывают следующим образом: 0, окрашивание отсутствует; (1), 1–10%; (2) 11–50%; (3) 51–80%; и (4) 81–100%. Окончательный показатель иммунореактивности рассчитывают путем умножения показателя интенсивности окрашивания на показатель положительного процента клеток в диапазоне от 0 до 12, где 0 обозначает отсутствие иммунореактивности, 1–4 обозначает слабую иммунореактивность, 5–8 обозначает умеренную иммунореактивность и 9–12 указывает на сильную иммунореактивность.
Для выполнения поставленной задачи проведено когортное сравнительное исследование женщин с ВПЧ-ассоциированными  цервикальными интраэпителиальными неоплазиями низкой (LSIL, n=40) и высокой (НSIL, n=40) степенью онкогенного риска, включая подгруппы с рецидивирующим течением заболевания.
Методом пошагового дискриминантного анализа с исключением переменных определены наиболее значимые иммуногистохимические параметры биоптатов шейки матки, определяющие принадлежность (таблица 1).
Таблица 1
Discriminant Function Analysis Summary (ПатентШмакова) Step 4, N of vars in model: 4; Grouping: NewVar (2 grps) Wilks' Lambda: ,49758 approx. F (4,37)=9,3400 p< ,0000
<b>Wilks'</b>
<b>Partial</b>
<b>F-remove</b>
<b>p-level</b>
<b>Toler.</b>
<b>1-Toler.</b>
<b>CD138 строма</b>
0,612058
0,812960
8,51268
0,005966
0,968513
0,031487
<b>CD3</b>
0,641591
0,775539
10,70877
0,002314
0,928100
0,071900
<b>CD56</b>
0,574893
0,865516
5,74909
0,021658
0,930582
0,069418
<b>Мф строма</b>
0,560176
0,888254
4,65475
0,037531
0,958383
0,041617
Количество шагов - 4
Число переменных в модели: 4
Последняя введенная переменная: Макрофаги (M-CSF) строма F (1,37) = 4,654747 р<, 0375, Лямбда Уилкса: ок. 4975786 F (4,37) = 9,340028 р <, 0000.
С помощью выявленных показателей была разработана математическая модель позволяющая прогнозировать прогрессирование данного патологического процесса у женщин с рецидивирующими LSIL и переход в высокую степень онкогенного риска (НSIL), отличающаяся тем, что в биоптатах шейки матки проводят оценку уровня экспрессии колониестимулирующего фактора макрофагов (M-CSF), плазматических клеток (CD138) в строме, а также Т-лимфоцитов (CD3) и натуральных киллеров (CD56) в цервикальном эпителии с последующим вычислением прогностического индекса (PI) по формуле:
PI = 0,095 × Х1+0,053× Х2+0,782× Х3 – 0,387 × Х4 – 5,789, где
Х1 – количество CD3 клеток, %;
Х2 – количество CD138 клеток в строме, %;
Х3 – количество CD56 клеток, %;
Х4 – количество M-CSF клеток в строме, %;
5,789 – константа.
При PI более 0 делают заключение о высоком риске прогрессии рецидивирующей цервикальной интраэпителиальной неоплазии низкой степени онкогенного риска в высокую. При PI менее 0 прогнозируют низкий риск прогрессии  в HSIL.
92,3%
83,7%
Чувствительность метода составляет 75%, специфичность – ,эффективность – .
Клинические примеры
Пример 1. Н. 32 года. Обратилась на первичный прием в связи с наличием LSIL (CIN I) по результатами цитологического исследования. Гинекологический анамнез: 1 год назад получала консервативное лечение по поводу папиллома-вирусной инфекции (ВПЧ 18, 33 генотипов) и LSIL (CIN I), с контрольным цитологическим исследованием сразу после окончания лечения без патологии.
На первичном приеме молекулярно-биологический анализ выявил наличие вируса папилломы человека 18, 33 генотипов в клинически значимой концентрации. Данные кольпоскопии продемонстрировали аномальные признаки 1 степени тяжести на фоне зоны трансформации 1 типа. Пациентке выполнена прицельная мультифокальная биопсия шейки матки. Гистологическое заключение: LSIL (CIN I). При ИГХ исследовании: CD3-70%, CD138 в клетках стромы – 83%, CD56-0,5%, M-CSF в клетках стромы – 4.
По формуле определили значение прогностического индекса:
PI = 0,095× 70+0,053× 83+0,782× 0,5 – 0,387 × 4 – 5,789 = 4,103
PI>0, что свидетельствовало о высоком риске прогрессии цервикальной интраэпителиальной неоплазии низкой степени онкогенного риска в высокую.
Был поставлен клинический диагноз: слабовыраженная дисплазия шейки матки.
Пациентке была рекомендована противовирусная и иммуномодулирующая терапия согласно результатам иммуногистохимического исследования, которое она не провела. Через год цитологическое исследование выявило HSIL (CIN II), данные молекулярно-генетического исследования –  обнаружен ВПЧ 18, 33 генотипов.
Пример 2. О. 24 лет. Обратилась на первичный прием в связи с наличием LSIL (CIN I) по результатами цитологического исследования. Гинекологический анамнез: 1 год назад получала консервативное лечение по поводу ВПЧ-инфекции 45 генотипа и LSIL (CIN I), с контрольным цитологическим исследованием сразу после окончания лечения без патологии.
На первичном приеме молекулярно-биологический анализ выявил наличие вируса папилломы человека 31 генотипа в клинически значимой концентрации. Данные кольпоскопии продемонстрировали аномальные признаки 1 степени тяжести на фоне зоны трансформации 1 типа. Пациентке выполнена прицельная мультифокальная биопсия шейки матки. Гистологическое заключение: CIN I. При иммуногистохимическом  исследовании: CD3-32%, CD138 в клетках стромы – 0,5%, CD56-0,5%, M-CSF в клетках стромы – 9.
По формуле определили значение прогностического индекса:
PI = 0,095× 32+0,053× 0,5+0,782× 0,5 – 0,387 × 9 – 5,789 = - 5,814
PI<0, что свидетельствует о низком риске прогрессии цервикальной интраэпителиальной неоплазии низкой степени онкогенного риска в высокую.
Был поставлен клинический диагноз: слабовыраженная дисплазия шейки матки. Пациентке была назначена противовирусная и иммуномодулирующая терапия, которую она успешно прошла. Через год женщина пришла на прием с результатами цитологического исследования, который вновь демонстрировал LSIL (CIN I), молекулярно-биологическое исследование – вирус папилломы человека не обнаружен.
Источники информации
Онкогинекология.
1. Аксель Е.М. Заболеваемость и смертность от злокачественных новообразований органов женской репродуктивной системы в России.  2015;1:6–15.
2. Давыдов М.И., Д.И. Максимович, Заридзе Д.Г. Динамика заболеваемости и смертности от злокачественных новообразований в России. Вестник РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН. 2015;26:1—5.
BMC Infect Dis
3. Motamedi M., Böhmer G, Neumann H.H., Wasielewski R. CIN III lesions and regression: retrospective analysis of 635 cases. . 2015;21(15):541.
https://doi.org/10.1186/s12879-015-1277-1
4. Каприн А.Д., Старинский В.В., Петрова Г.В. Злокачественные новообразования в России в 2018 году (заболеваемость и смертность). М.: МНИОИ им. П.А. Герцена - филиал ФГБУ «НМИРЦ» Минздрава России. 2019;250.
5. Каприн А.Д., Старинский В.В., Петрова Г.В. Состояние онкологической помощи населению России в 2016 году. М: МНИОИ им. П.А.Герцена – филиал ФГБУ НМИЦР. 2017; 236.
Gynecology.
6. Тихомиров А.Л., Сарсания С.И., Филатова Г.А. Вирус папилломы человека: от понимания иммунопатогенеза к рациональной тактике ведения. 2018; 20(3):5–11.
Гинекология
7. Абакарова П.А., Прилепская В.Н. ВПЧ-ассоциированные заболевания шейки матки. Возможности комплексной терапии. . 2017;19(5): 4-9.
8. Сухих Г.Т., Прилепская В.Н. Профилактика рака шейки матки: руководство для врачей. Изд. 3-е. Москва: МЕДпресс-информ. 2012;190.
Эффективная фармакотерапия.
9. Доброхотова, Ю.Э., Венедиктова М.Г., Гришин И.И., Саранцев А.Н., Зыков А.Е., Хасан А.Ш., Панова Н.П., Савина Ю.А., Морозова К.В. Комплексный подход к лечению  вирусиндуцированого истинного предрака шейки матки. 2016;22:10-15.
Лечебное дело.
10. Доброхотова Ю.Э., Венедиктова М.Г., Саранцев А.Н., Морозова К.В., Суворова В.А. Комплексный подход к лечению  вирусиндуцированого истинного предрака шейки матки.  2016;4:52-56.
Фарматека.
11. Доброхотова Ю.Э., Венедиктова М.Г., Гришин И.И., Саранцев А.Н. , Морозова К.В., Луценко Н.Н. Эффективность комплексного подхода к лечению дисплазии эпителия шейки матки умеренной и тяжелой степени на фоне инфицирования вирусом папилломы человека.  2015;3:44-47.
Lancet Infec Dis
12. Einstein M.H., Schiller J.T., Viscidi R.P., Strickler H.D., CoursagetР., Tan Т., Halsey N., Jenkins D. Clinician’s guide to human papillomavirus immunology: knowns and unknowns. . 2009;9(6):347-356. https://doi.org/10.1016/s1473-3099(09)70108-2
Gynecol.
13. Stanley M. A practitioner’s guide to understanding immunity to human papillomavirus. USObstet.  2009;4(1):10-15.
Вестник последипломного медицинского образования
14. Абрамовских О.С, Зиганшин О.Р., Летяева О.И, Телешева Л.Ф.  Иммунологические методы исследования в диагностике папилломавирусной инфекции. . 2014;4:78-79.
15. Кишкун А.А. Иммунологические исследования и методы диагностики инфекционных заболеваний в клинической практике. М. [б.и.]. 2009;712.
16. Черешнев В.А., Шмагель. К.В.  Иммунология: учебник. 4-е изд., перераб. и доп. М: НП «Центр стратегического партнерства». 2014;520.
DoctorRu.
17. Белокриницкая Т.Е., Фролова Н.И.,  Тарбаева Д.А., Глотова Е.Ю., Золотарева А.А., Мальцева Т.В. Ассоциации генитальных инфекций и вируса папилломы человека как конфаундинг-факторы цервикальной интраэпителиальной неоплазии.  2015;2(12):14–17.
Гинекология
18. Пестрикова Т.Ю., Панфилова Ю.О. Чувствительность патогенной микрофлоры цервикального канала к антибактериальным препаратам у пациенток с хроническим цервицитом и ВПЧ. . 2015; 7(1):18 – 21.
SeminReprodMed
19. Reid G., Hons B.S. Modulating the Vaginal Microbiome: The Need for a Bridge between Science and Practice. . 2014;32(1):28–34.