СПОСОБ ЭКСПРЕСС-ОЦЕНКИ СТЕПЕНИ ПОТЕНЦИАЛЬНОЙ ГЕНОТОКСИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ВЕЩЕСТВ И ФАКТОРОВ СРЕДЫ ПО НАЛИЧИЮ АНЕУПЛОИДИИ В ЛИМФОЦИТАХ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА, ОБРАЗОВАВШИХСЯ В РЕЗУЛЬТАТЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ  В УСЛОВИЯХ ЦИТОКИНЕТИЧЕСКОГО БЛОКА
METHOD FOR INSTANT ASSESSMENT OF DEGREE OF POTENTIAL GENOTOXIC SUBSTANCE ACTIVITY AND ENVIRONMENTAL FACTORS BY PRESENCE OF ANEUPLOIDY IN HUMAN PERIPHERAL BLOOD LYMPHOCYTES FORMED BY CULTURE IN CYTOKINETIC BLOCK

Изобретение относится к биологии и медицине, а именно - к области цитогенетического анализа - оценке анеуплоидии при определении генотоксических эффектов.
Анеуплоидия - изменение количества генетического материала в клетке по сравнению с нормой, возникающее при неравновесном делении - аномальной репликации целой хромосомы, как, например, при синдроме Дауна, либо при утрате одной или нескольких хромосом.
Морфометрия - количественная характеристика формы (длина, площадь, объем и т.д.).
Доза - количество вещества (фактора среды), введенное или попавшее в исследуемый объект, выражается в весовых, объемных или условных (биологических) единицах.
Из литературы известны следующие цитогенетические методы оценки генотоксических эффектов:
- микроядерный тест на клетках, культивированных в присутствии цитохалазина В, оценивающий частоту двуядерных клеток с микроядрами (Fenech, Morley, 1985; Yager et al., 1988; Pascoe, Stemp, 1990; Kocisova, Sram, 1990; Fenech et al., 2003);
- модифицированный микроядерный тест (микроядерный тест на клетках, культивированных в присутствии цитохалазина В, оценивающий - дополнительно к частоте двуядерных клеток с микроядрами - частоту делящихся клеток с микроядрами и нуклеоплазменными мостами, а также степень асимметрии деления клеток, особенности пролиферации клеток в культуре и частоту апоптоза) (Ингель, 2006; Ингель и др., 2006);
- метод оценки частоты хромосомных аберраций (изменения структуры хромосом, вызванные их разрывами, с последующим перераспределением, утратой или удвоением генетического материала). (Agence Internationale de l'Energie Atomique, 1984; Doloy, Malarbet, Guedency et al., 1991; Ludwików, Yun Xiao, Hoebe et al., 2002);
- метод оценки частоты сестринских хроматидных обменов (Tucker, Ashworth, Johnson et al., 1988; Sonmez, Kaya, Aktas et al., 1998; Lei, Hwang, Chang et al., 2002).
Нарушения числа хромосом могут быть выражены отсутствием одной из пары гомологичных хромосом (моносомия) или появлением добавочной, третьей, хромосомы (трисомия). Общее количество хромосом в кариотипе в этих случаях отличается от модального числа и для человека равняется 45 или 47.
Оценка степени анеуплоидии производится путем:
- подсчета количества хромосом на рутинно окрашенных метафазных пластинках, полученных в результате культивирования митогенстимулированных клеток крови с последующим накоплением клеток на стадии метафазы в присутствии колхицина (Agence Internationale de l'Energie Atomique, 1984; Doloy, Malarbet, Guedeney et. al., 1991; Ludwików, Yun Xiao, Hoebe et al., 2002). Недостаток метода связан с методикой приготовления цитогенетических препаратов - клетки, набухшие в гипотоническом растворе хлорида калия, фиксируют и раскапывают на влажные стекла. При этом цитоплазма лопается, в результате чего возможна потеря одной или нескольких хромосом из клеток, находящихся в стадии метафазы. Поэтому анеуплоидия в этом методе определяется только как увеличение числа хромосом по сравнению с модальным;
- подсчета количества люминесцирующих маркеров целых хромосом или центромерных районов хромосом с использованием FISH-окраски (fluorescence in situ hybridization; Y.B.Yurov, S.G.Vorsanova, I.Y.Iourov, I.A.Demidova, A.K.Beresheva, V.S.Kravetz, V.V.Monakhov, A.D.Kolotii, V.Y.Voinova-Ulas, N.L.Gorbachevskaya; Unexplained autism is frequently associated with low-level mosaic aneuploidy. J. Med. Genet., 2007; v.44, P.521-525). В рутинных медико-генетических исследованиях метод используется для оценки небольшого количества хромосом, являющихся маркерами определенных синдромов (например, синдрома Дауна - трисомия по 21 хромосоме, синдром Эдвардса - трисомия по 18 хромосоме, или синдром Тернера - генотип Х0, при котором в клетке присутствует 45 хромосом). Недостатком метода является невозможность определять весь хромосомный набор без использования сложной и дорогой техники и дорогих маркеров.
Из уровня техники наиболее близкого аналога предлагаемому техническому решению не выявлено.
Технической задачей предлагаемого способа является сокращение времени и упрощение процедуры оценки степени анеуплоидии в системе анализа генотоксической активности факторов любой природы (физических, химических, биологических), включая наноматериалы и воду с измененной структурой.
Технический результат достигается тем, что в способе экспресс-оценки потенциальной генотоксической активности веществ и факторов среды по наличию анеуплоидии в лимфоцитах периферической крови человека, образовавшихся в результате культивирования в условиях цитокинетического блока, включающем в себя культивирование лимфоцитов крови человека в условиях цитокинетического блока в присутствии изучаемого вещества, фиксацию клеток, приготовление и окраску цитогенетических препаратов, на которых после окраски для каждого препарата при помощи светового микроскопа со встроенной цифровой камерой при увеличении 10×40 проводится регистрация изображений 100 клеток, содержащих два отдельно лежащих ядра и не имеющих видимых, в т.ч. генетических, повреждений, по этим изображениям вычисляется сумма и отношение площадей ядер в каждой такой клетке. На основании полученных данных вычисляются медианы, верхний и нижний квартили, их отношение и разность, проводится статистическое сравнение препаратов по этим параметрам, в случае обнаружения значимых различий при уровне значимости р≤0,05, а также при обнаружении дозовой зависимости делается вывод о способности изучаемого вещества индуцировать анеуплоидию, которая ассоциируется с потенциальной генотоксической активностью.
Предлагаемый способ осуществляется следующим образом.
200 мкл цельной венозной крови человека культивируется стандартным образом в условиях цитокинетического блока в присутствии цитохалазина В, что приводит к образованию лимфоцитов, содержащих два и более ядра. Через 24 часа от начала культивирования в культуру добавляется исследуемое вещество или оказывается воздействие изучаемым фактором. Всего исследуются не менее пяти культур, в четыре из них добавляется исследуемое вещество в разных концентрациях, а одна культура используются для контроля. Цитохалазин В добавляется в каждую культуру на 44 часу от начала культивирования до конечной концентрации 6 мкг/мл. Еще через 28 часов культивирования клетки крови стандартно фиксируются в холодной смеси метанол-уксусная кислота (3:1). Затем нанесением нескольких капель суспензии зафиксированных клеток на сухие охлажденные предметные стекла стандартно готовятся цитогенетические препараты, которые рутинно окрашиваются азур-эозином по методу Романовского. Далее при помощи светового микроскопа со встроенной цифровой камерой при увеличении 10×40 или более на каждом препарате выбираются и фотографируются 100 двуядерных лимфоцитов без видимых, в т.ч. генетических, повреждений с отдельно лежащими четко очерченными ядрами. Полученные изображения анализируются на персональном компьютере: для каждой двуядерной клетки вычисляются сумма ([∑S]=S1+S2) и отношение (S1/S2) площадей ядер. Затем для каждого препарата формируются массивы значений этих параметров (т.о. каждой дозе и контролю соответствует два массива данных по 100 значений в каждом). Массивы значений соответствующих параметров статистически сравниваются при помощи методов непараметрического анализа (Н критерий Краскела-Уоллеса). В случае обнаружения статистически значимых различий между опытом и контролем (уровень значимости p≤0,05), а также при обнаружении дозовой зависимости исследуемое вещество (фактор) признается обладающим потенциальной генотоксической активностью. Также для указанных параметров вычисляются медианы (Med[∑S], Med[S1/S2]), верхний (75‰) и нижний (25‰) квартили, их отношение (75‰/25‰) и разность (75‰-25‰). В случае обнаружения зависимости этих параметров от дозы вещества или обнаружения различий с контролем, превышающих погрешности измерения, исследуемое вещество (фактор) признается обладающим потенциальной генотоксической активностью.
Примеры реализации способа
1. При исследовании генотоксической активности N-метил-N-нитро-N-нитрозогуанидина (МННГ, Aldrich) - соединения, обладающего мутагенной и канцерогенной активностями, которое используется в экспериментах как стандартный мутаген (индуктор нестабильности генома) (Рис.1 - Рис.3)
Проверка распределения морфометрических данных на нормальность критерием Шапиро-Уилка показала, что распределения отличаются от нормального с максимальным уровнем значимости р=0,01097. Методом Краскела-Уоллеса выявлено, что существуют статистически значимые различия между морфометрическими показателями, вычисленными для разных доз МННГ. При этом для Med[∑S] уровень значимости р=0,0000, а для Med[S1/S2] р=0,0031. С ростом дозы МННГ наблюдается стабильное уменьшение значений Med[S1/S2] и Med[∑S]norm (Рис.1). Цитогенетический анализ выявил выраженное дозозависимое снижение % 2-ядерных клеток в пролиферативном пуле и спектре делящихся клеток, а также рост % 1-ядерных клеток. Ярко выражены индукция МЯ в 2-ядерных клетках с увеличением дозы МННГ (характерный признак генотоксической активности), снижение % клеток в состоянии апоптоза (закрепление генетических повреждений). Проявляются эффекты увеличения асимметрии деления во 2-м митозе (увеличение частоты 3-ядерных клеток - маркер анеуплоидии), а также снижение % клеток в состоянии митоза. Эти результаты демонстрируют связь размеров и функционального состояния клеточного ядра и позволяют рассматривать морфометрию клеточных ядер как перспективный метод экспресс-оценки генотоксической активности веществ, в т.ч. - анеуплоидии.
3
2
3
2
2. При исследовании потенциальной генотоксической активности нановолокон гидроксида алюминия (AHN) (тип материала - IPC (AlOOH - 55%, Al(ОН) - 33%, AlO - 5%, Al≤5%, HO≤2%, другие компоненты <0,55%), изготовлен ООО «Передовые порошковые технологии», РФ) (Рис.4 - Рис.6)
Проверка распределения морфометрических данных на нормальность критерием Шапиро-Уилка показала, что распределения отличаются от нормального с максимальным уровнем значимости р=0,04633. Методом Краскела-Уоллеса выявлены статистически значимые различия между показателями Med[∑S], вычисленными для разных доз AHN (р=0,0000). Различий по показателям Med[S1/S2] обнаружено не было (р=0,2467). С ростом дозы AHN наблюдается увеличение значений Med[∑S] и (75‰-25‰)∑[S], со скачком на малой дозе (Рис.4, Рис.5). В целом морфометрический анализ показывает тенденцию к увеличению размеров клеточных ядер и доли 2-ядерных клеток с асимметричными ядрами с увеличением дозы AHN. Цитогенетический анализ в модифицированном микроядерном тесте лимфоцитов крови из тех же культур выявил дозозависимое увеличение % 2-ядерных клеток в пролиферативном пуле и спектре делящихся клеток, а также снижение % 3- и 4-ядерных клеток. Наблюдается тенденция к дозозависимому снижению уровня повреждений во всех типах клеток, снижению % клеток в состоянии апоптоза и митоза. Проявляются эффекты снижения асимметрии деления во 2-м митозе (маркер анеуплоидии) и снижения % 3-ядерных клеток с микроядрами. То есть результаты цитогенетических исследований во всем диапазоне доз противоположны результатам морфометрии. В то же время цитогенетические эффекты минимальной из использованных доз AHN демонстрируют повышение генотоксичности по сравнению с контролем практически по всем параметрам (что полностью соответствуют данным морфометрии). При больших уровнях воздействия AHN наблюдаются цитотоксические эффекты, связанные с гибелью - в первую очередь - поврежденных клеток, что статистически проявляется в снижении генотоксических эффектов. Таким образом, результаты морфометрического анализа не противоречат данным цитогенетических исследований.
3. Исследование влияния нано- и микрочастиц диоксида титана на морфометрические показатели и показатели микроядерного теста на культуре цельной крови человека (Рис.7)
Исследования проводили на крови двух доноров. Нано-ДТ вызывал дозозависимое увеличение асимметрии ядер в двуядерных клетках культур обоих доноров. При этом между морфометрическими показателями и несколькими показателями цитогенетического анализа выявлены значимые (p≤0,05) корреляции. Это доказывает перспективность использования морфометрии ядер для предварительного скрининга генотоксических эффектов в микроядерном тесте с цитохалазином В. Асимметрия ядер в двуядерных клетках может свидетельствовать о наличии анеуплоидии либо о различиях в компактности хроматина, возникших в результате экспозиции ДТ. Индукция любого из этих событий указывает на наличие генотоксической активности у изучаемого фактора.
2
В качестве примера на рисунке (Рис.7) для обоих доноров приведена динамика соотношения площадей ядер в двуядерных клетках по сравнению с изменением частоты 3-ядерных клеток с микроядрами (r=0,988, p≤0,05).