Способ борьбы с личинками кактусовой щитовки (Diaspis echinocacti Bouche)
METHOD FOR COMBATING OF LARVAE OF THE CACTUS SCALE (DIASPIS ECHINOCACTI BOUCHE)

Изобретение относится к области защиты растений в части борьбы с сосущим насекомым кактусовой щитовкой (Diaspis echinocacti Bouche) из семейства щитовок (Diaspididae) отряда равнокрылые (Homoptera), которое является одним из самых значительных вредителей растений во всем мире.
Взрослые особи и личинки данного представителя наносят вред растению весь год, они питаются клеточным соком. Кактусовая щитовка живет на стеблях, кладодиях и плодах кактусов, часто образуя плотные колонии. Поврежденные растения отстают в росте, желтеют, листья часто опадают, молодые побеги вянут. Насекомое наносит значительный вред, особенно кактусам из родов мамиллярия, опунция, эхинокактус, цереус.
Химический контроль играет важную роль в борьбе с кактусовой щитовкой. Однако неизбирательное действие химических инсектицидов негативно влияет на регуляцию численности естественных врагов данного вида и других нецелевых организмов, а также на здоровье человека. Специализированных химических инсектицидов для борьбы со щитовкой нет, как правило применяют инсектициды с наиболее широким спектром действия, например, "Актеллик", "Арриво", "Фитоверм", перметрин и фуфанон. Поэтому многие современные химические средства оказываются неэффективными для данного представителя.
На сегодняшний день на стадии разработки для борьбы с насекомыми-вредителями находятся препараты на основе коротких немодифицированных антисмысловых ДНК-олигонуклеотидов, которые способны объединить наилучшие характеристики современных препаратов - доступность и избирательность. Это связано с тем, что синтез ДНК становится все более доступным, а комбинация азотистых оснований в каждом отдельном ДНК-олигонуклеотиде (ДНК-инсектициде) уникальна и обеспечивает безопасность для нецелевых организмов. Кроме этого, ДНК является полимером природного происхождения и не будет накапливаться в окружающей среде.
Известен способ борьбы с фиолетовой щитовкой Lepidosaphes beckii Newman (Hemiptera: Coccoidea) при помощи химического инсектицида «Адмирал» из класса ювеноидов [Dewer Y. Comparative efficacy of some insecticides against purple scale insect, Lepidosaphes beckii (Hemiptera: Coccoidea) and its parasitoid in citrus orchard in Egypt / Y. Dewer, S. Abdel-Razak, A. Barakat // Egyptian Academic Journal of Biological Sciences. - 2012. №5. - P. 121-127], в котором используется действующее вещество пирипроксифен. Действует на эндокринную систему насекомых, имитируя ювенильный гормон, тем самым препятствуя линьке и, как следствие, нарушает размножение.
Недостатком этого метода является то, что пирипроксифен обладает низкой растворимостью и высокой стойкостью в окружающей среде. Тем не менее, его восприимчивость к фотодеградации в водной среде и метаболический распад в аэробных условиях могут приводить к его быстрому исчезновению из экосистем. В анаэробных условиях, таких как солоноватые воды или отложения, пирипроксифен гораздо более стабилен, неизменен и токсичен для водных беспозвоночных [Sullivan J.J. Environmental fate and properties of pyriproxyfen / J.J. Sullivan, K.S. Goh // Journal of Pesticide Science. - 2008. №33. - P. 339-350.].
В качестве прототипа выбран способ борьбы с гусеницами непарного шелкопряда (Lymantria dispar) [Патент РФ №2691614, МПК: A01N 63/00, СПК: A01N 63/00, автор - Оберемок В.В., опубл. 14.06.2019 Бюл. №17], в котором используется инсектицид на основе нуклеиновой кислоты, избирательно действующий на личинок насекомых определенного вида с использованием короткого (11 нуклеотидов) одноцепочечного антисмыслового фрагмента ДНК гена 5,8S рибосомальной РНК непарного шелкопряда с последовательностью 5'-TGCGTTGAAA-3' в концентрации 200 пмоль/мкл таким образом, чтобы на гусеницу I-II возраста попало не менее 0,3 мкл раствора. Изобретение позволяет повысить смертность гусениц непарного шелкопряда (Lymantria dispar L.).
Способ-прототип не предназначен для борьбы с кактусовой щитовкой, так как применяемый антисмысловой фрагмент может быть эффективен лишь под определенного целевого насекомого-вредителя - непарного шелкопряда; наблюдается более низкая смертность насекомого в результате применения антисмыслового фрагмента ДНК, чем в заявляемом способе.
Техническим результатом изобретения является увеличение универсальности предлагаемого подхода, а также повышение смертности насекомых в результате применения антисмыслового фрагмента ДНК.
Разработанный способ борьбы с личинками кактусовой щитовки включает использование инсектицида на основе антисмыслового фрагмента ДНК, избирательно действующего на особей насекомого, и отличается тем, что контактную обработку особей насекомого проводят пульверизатором водным раствором короткого антисмыслового фрагмента ДНК гена 28S рибосомальной РНК целевого насекомого-вредителя в концентрации не менее 25 нг/мкл таким образом, чтобы на поверхность растения-хозяина попало не менее 0,5 мг ДНК на 1 квадратный метр листвы.
В классической защите растений применение инсектицидных препаратов не всегда эффективно, т.к. у насекомого вырабатывается генетическая устойчивость к химическим агентам. Поэтому мы предлагаем использовать для борьбы с кактусовой щитовкой (Diaspis echinocacti) препарат на основе соответствующего короткого консервативного антисмыслового ДНК-олигонуклеотида, который способен заменить неизбирательно действующие химические инсектициды, в частности ювеноиды. Предлагаемый нами ДНК-инсектицид на основе природного полимера является экологически чистым, имеет целевой характер и к нему медленней вырабатывается генетическая устойчивость насекомого за счет использования консервативной антисмысловой последовательности генома вредителя.
Впервые выявлен тот факт, что обработка насекомого-вредителя кактусовой щитовки соответствующим антисмысловым фрагментом гена 28S рибосомальной РНК достоверно увеличивает смертность насекомого по сравнению с контролем. И поскольку влияние ДНК-фрагментов на D. echinocacti выявлено впервые, это доказывает существенность отличий и изобретательский уровень технического решения.
Причинно-следственная связь между отличительными признаками изобретения и достигаемым техническим результатом заключается в том, что соответствующий антисмысловой фрагмент гена 28S рибосомальной РНК целевого насекомого-вредителя блокирует соответствующий комплементарный участок 28S рибосомальной РНК целевого насекомого-вредителя и инициирует ее расщепление при участии РНКазы Н, тем самым вызывая ингибирование биосинтеза белка, что в конечном итоге приводит к гибели насекомого. Тонкие детали механизма действия ДНК-инсектицидов на сегодняшний день изучаются, но предполагается, что антисмысловые фрагменты гена 28S рибосомальной РНК работают по механизму классического действия немодифицированных антисмысловых олигонуклеотидов, вызывающих разрушение целевой молекулы РНК.
Способ осуществляют следующим образом.
Проводят контактную обработку опрыскивателем, например пульверизатором, личинок насекомого водным раствором одноцепочечного ДНК-фрагмента гена 28S рибосомальной РНК насекомого-вредителя таким образом, чтобы на поверхность листьев растения-хозяина попало не менее 0,5 мг ДНК на 1 квадратный метр листвы, норма применения ДНК-инсектицида (Cactus-NBG) 1,0 г/10,0 л.
Пример конкретного осуществления способа.
2
Эксперимент проводился на личинках кактусовой щитовки (Diaspis echinocacti) находящихся на листве растений-хозяев. Все насекомые находились на листьях растений-хозяев при средней температуре 25-27°С. Последовательность примененного антисмыслового фрагмента из гена 28S рибосомальной РНК D. echinocacti, была следующая: 5'-ATCGCTGCGGA-3' - Cactus-NBG. Личинки контрольной группы, находящиеся на поверхности листьев, были обработаны водой и препаратом Танрек ВК, ВРК - инсектицид из класса неоникотиноидов. В ходе эксперимента на растение-хозяин попадало не менее 0,5 мг ДНК на 1 квадратный метр листвы. Фрагмент был синтезирован на лабораторном ДНК-синтезаторе ASM-800E (БИОССЕТ, Россия). Статистическая обработка данных проведена с помощью компьютерной программы «STATISTICA 13.0». Был использован χ-критерий Пирсона с поправкой Йетса для оценивания инсектицидного действия фрагмента ДНК. Эксперимент провели в трехкратной повторности.
Антисмысловой фрагмент гена 28S рибосомальной РНК D. echinocacti проявил достоверное инсектицидное действие на личинок этого насекомого.
В группе, обработанной водой, препаратом Танрек ВК, Cactus-NBG, мы наблюдали смертность личинок D. echinocacti на растении Opuntia ficus-indica L. (Mill.) 7,7%, 8,02%, 11,2; 75,7%, 81,5%, 86% и 43,2%, 53,2%, 84,2%, соответственно, на 3-е, 7-е и 14-е сутки после обработки.
Преимущество технического решения заключается в увеличении универсальности предлагаемого подхода, а также обеспечении повышения смертности насекомых в результате применения антисмыслового фрагмента ДНК.