Координационное соединение кобальт бис(цитрато)станнат - результат поиска новых противогриппозных лекарственных средств

Координационное соединение кобальт бис(цитрато)станнат — результат поиска новых противогриппозных лекарственных средств

Матюшкина М.В.1, Годован В.В.1, Сейфуллина И.И.2, Гридина Т.Л.3

1 — Кафедра общей и клинической фармакологии Одесского национального

медицинского университета, г. Одесса, Украина

2 — Одесский национальный университет им. И.И. Мечникова, г. Одесса, Украина

3 — НИИ «Украинский научно-исследовательский противочумный институт

им. И.И. Мечникова» МЗ Украины

Резюме. Изучены фармакологические свойства нового координационного соединения — биологически активного вещества — кобальт бис(цитрато)станната. В результате проведённых исследований установлено, что соединение проявляло выраженную противовирусную активность в отношении вируса гриппа человека штаммов А/Гонконг/1/68 (H3N2), А^/8/34 (H1N1) М и вируса гриппа птиц H5N3 на культуре ткани хорион-алантоисных оболочек (ХАО) 11-12 суточных куриных эмбрионов и монослой-ной культуре клеток MDCK. Соединение относится к малотоксичным (при внутрибрюшинном введении крысам LD50 = 206,63 мг/кг; пероральном — LD50 = 1836,76), что дает перспективу для дальнейшего его доклинического исследования как противовирусного средства.

Ключевые слова: координационное соединение, олово, кобальт, лимонная кислота, вирус гриппа.

Coordination compounds cobalt bis(citrate)stannate — are results of searching new antiinfluenza drugs

Matyushkina M.V.1, Godovan V.V.1, Seyfullina I.I.2, Grydina T.L.3

1 — Odessa State Medical University

2 — I.I. Mechnikov National University

3 — RI «Ukrainian Research Institute antiplague I.I. Mechnikov» Ministry of Health of Ukraine

Summary. The pharmacological properties of new coordination compound — the biologically active substance — cobalt bis(citrate) stannate was studied. The result of researching are: the compound has antiviral activity against human influenza virus strains A/ Honghong/1/68 (H3N2), A/PR/8/34 (H1N1), and influenza virus H5N3 in tissue culture chorio-allantoic membranes (CAM) of chick embryos 11-12 daily and monolayer culture of MDCK cells used. Compound has a low toxicity (by intraperitoneal injection LD50 = 206,63 mg/kg; orally — LD50 = 1836,76), that gives perspective to further his preclinical studies as an antiviral agent.

Keywords: coordination compound, tin, cobalt, citric acid, virus of influenza.

Автор, ответственный за переписку:

Матюшкина Марина Владимировна — аспирант, кафедра общей и клинической фармакологии Одесского национального медицинского университета, г. Одесса, Украина; тел. (+38)050-416-64-62; e-mail: shemonayeva_56@mail.ru

Введение

По данным ВОЗ, грипп занимает первое место по частоте и количеству случаев в мире, что предопределяет социальное и экономическое значение данной проблемы. По статистике гриппом ежегодно в мире заболевает до 500 млн. человек [1]. Смертность вследствие постгриппозных осложнений составляет 7,5-23 на 100 тыс. населения, причём большая часть этих смертей приходится на детей до 5 лет и людей старше 65 лет. Ежегодные эпидемии гриппа приводят к развитию или обострению имеющихся в анамнезе хронических заболеваний [2]. Естественно, что огромным является и экономический ущерб от эпидемий гриппа. Проблема заболеваемости

гриппом усугубляется еще и тем, что вспышки и эпидемии гриппа прогнозируются с трудом; вирусы гриппа А и В отличаются чрезвычайной антигенной изменчивостью, а наблюдающаяся реассортация между штаммами вируса гриппа А человека, млекопитающих и птиц увеличивает риск возникновения новых пандемических штаммов [3]. Кроме того, в течение 10-15 последних лет вирусы гриппа птиц в результате мутаций изменили свои биологические свойства, приобрели возможность инфицировать людей и вызывать очень тяжёлые клинические формы заболевания, значительный процент которых заканчивается летально [4]. Это сказывается на эффективности вакцинации, рекомендованной ВОЗ в качестве основного средства борьбы против гриппа.

52

ФШШШ1ТШ И ФМЩШМШ

Другим способом профилактики и лечения гриппа является фармакотерапевтическое воздействие, включающее средства этиотропной, иммунокорригирующей и симптоматической терапии. Среди приоритетной группы этиотропных препаратов ведущее место на сегодня занимают те, которые оказывают прямое противовирусное действие. Однако арсенал противогриппозных средств на современном фармацевтическом рынке невелик и представлен фактически двумя группами: ингибиторы нейраминидазы (осельтамивир, занами-вир) и блокаторы М2-каналов (амантадин, ремантадин). К сожалению, эти препараты не идеальны: имеют достаточно широкий спектр противопоказаний и нежелательных эффектов, ограничения применения (возраст, беременность, лактация), быстрое возникновение фар-макорезистентности, достаточно высокая стоимость и другие [5, 6]. Можно выделить и третью группу противогриппозных препаратов, которые одновременно обладают противовирусной и иммуномодулирующей активностью (умифеновир, инозин пранобекс, альтабор, интерфероны и другие) [7], но они также не лишены недостатков [8]. В связи с вышеизложенным сегодня продолжается интенсивный поиск эффективных и безопасных противогриппозных средств.

В этом плане внимание исследователей привлекают металлокомплексы, ряд которых обладает достаточно широким спектром антибактериальной и противовирусной активности [7, 9, 10]. В частности, установлено, что металлокомплексы могут действовать на вирус различными путями: инактивировать вирус, заняв на его поверхности активные центры; проникать через ли-пидную оболочку вируса; препятствовать его размножению в клетке; разрушать вирус вне клетки [11, 12].

Цель исследования

Цель данного исследования — это изучение противогриппозной активности нового биологически активного вещества (БАВ) — кобальт бис(цитрато)станната.

Материалы и методы

БАВ — кобальт бис (цитрат) станната формулы [Со(Н20)6][8и(На1г)2]-4Н20 (М = 735,7 г/моль) синтезировано на кафедре общей химии и биополимеров Одесского национального университета имени И. И. Мечникова под руководством заслуженного деятеля науки и техники Украины, проф. И.И. Сей-фуллиной. По данным рентгеноструктурного анализа (РСА), соединение построено с центросимметриче-ских октаэдрических катионов [Со(Н20)6]2+, анионов [8и(НСИг)2]2- и кристаллизационных молекул воды. В кристаллах комплексные катионы и анионы объединены непосредственно между собой и через кристаллизационные молекулы воды водородными связями в трёхмерный каркас [13]. Структурная формула нового соединения представлена на рис. 1.

[Co(H2O)6]

O

H2C

O O—C

O

Ъол / \

^C—h2C—C^ ^srí-—^_-C-CH2-C:

O

HO

\ / Vo /

OH

O*

\ ZCH2

C 0е

4H20

Рис. 1. Структурная формула кобальта бис(цитрато)станната

Изучение безвредности нового БАВ in vivo показало, что соединение относится к малотоксичным веществам (IV класс) [14] — LD50 при внутрибрюшинном введении крысам составило 206,63 мг/кг; пероральном — 1836,76.

Однако перед изучением специфического действия против вирусов гриппа человека и птиц нового БАВ первоначально определяли степень цитотоксичности соединения на трех клеточных моделях.

По первой модели методика проведения исследования заключалась в создании контакта водных растворов исследуемого вещества в различных концентрациях с тест-клетками — инфузориями Colpoda steinii (ООО «Возрождение М», Одесса, Украина) [15]. Это позволило определить максимально переносимую концентрацию (МПК) соединения по показателям их жизнеспособности через 3 ч после начала контакта и тем самым установить степень цитотоксичности БАВ. Вторая модель определения степени цитотоксичности нового БАВ проведена стандартно на культуре ткани хорион-а-лантоисных оболочек (ХАО) 11-14-суточных куриных эмбрионов [16]. Третьей моделью с использованием культуры клеток MDCK (культура клеток почки собаки) определялась МПК исследуемого БАВ, которую рассчитывали, исходя из наибольшей концентрации соединения, не вызывавшей дегенерацию клеток [17].

Противогриппозную активность БАВ изучали в отношении штаммов вируса гриппа А/Гонконг/1/6 8 (H3N2) и A/PR/8/34 (H1N1), а также вируса гриппа птиц H5N3, с использованием культуры ткани ХАО 11-12 суточных куриных эмбрионов [16]. Эта культура считается наиболее приближенной к уровню целого организма, которым является куриный эмбрион. Кроме того, использование культуры ткани ХАО является более экономичным методом по сравнению с использованием куриных эмбрионов для определения противовирусного действия веществ [16].

Расчёт lg ТИД50 (дозы, которая вызывает инфицирования 50% и более фрагментов ткани ХАО) в экспериментах in vitro проводили по методу Кербера Б.А. в модификации Ашмарина И.П. [18].

Оценку противовирусной активности соединения с использованием метода торможения развития ви-рус-индуцированного цитопатического эффекта проводили на монослойной культуре клеток MDCK, согласно общепринятой методики [17].

В качестве референс-препарата использовали Та-мифлю (осельтамивир), порошок для приготовления

N»1.2014!

53

1ФМШШШ И ФМЩШМШ

суспензии для приема внутрь по 12 мг в 1 мл во фл. по 30 мл фирмы Хоффманн-Ля Рош (Швейцария) в концентрации 410 мкг/мл, что соответствует 1х10-3 Моль.

Статистическую значимость антивирусной активности БАВ (р>0,05) определяли по непараметрическому критерию знаков для связанных выборок ф по критерию знаков — К.З.) [19].

Результаты и обсуждения

В результате проведённых исследований выявлено, что МПК кобальта бис(цитрато)станната на культуре инфузорий Со1ройа з1етп, тканевой культуре ХАО и культуре клеток МDСК составила 7000, 7000 и 368 мкг/ мл, соответственно. Вследствие полученных данных по цитотоксичности нового БАВ, для определения его противогриппозной активности в отношении штамма вируса гриппа А/Гонконг/1/6 8 (Ю№) на тканевой культуре ХАО были отобраны следующие дозы: 7000, 3500 и 735 мкг/мл, что соответствует 1,0х10-2, 0,5х10-3 и 1,0х10-3 Моль. Результаты исследований приведены в табл. 1.

Установлено, что новое соединение в концентрации 7000 мкг/мл полностью подавляло репродукцию штамма вируса гриппа А/Гонконг/1/68 (Ю№) на тканевой культуре ХАО по сравнению с контролем (без применения БАВ), несколько даже превышая эффективность референс-препарата Тамифлю, который в концентрации 410 мкг/мл подавлял репродукцию вируса на 4,17 ^ ТИД50.

В концентрациях 3500 и 735 мкг/мл кобальт бис(ци-трато)станнат статистически достоверно относительно контроля подавлял репродукцию вируса гриппа (на 2,50 и 1,75 ^ ТИД50 соответственно), однако уступал по активности препарату сравнения.

Учитывая полученные в отношении штамма вируса гриппа А/Гонконг/1/68 (Ю№) результаты, для определения антивирусной активности нового БАВ относительно штамма вируса гриппа А/PR/8/34 (ШШ) были выбраны концентрации 1750 и 184 мкг/мл. Приведённые в табл. 2 результаты свидетельствуют о том, что новое соединение в концентрациях 1750 и 184 мкг/ мл в значительной степени подавляло репродукцию вируса А^/8/34 (ШШ) — на 3,08 и 3,33 ^ ТИД50, соответственно, по сравнению с контролем (р<0,05), однако несколько уступая по эффективности Тамифлю (410 мкг/мл), который полностью подавлял репродукцию данного вируса — на 4,17 ^ ТИД50 (р<0,05).

В отношении штамма птичьего гриппа уста-

новлено, что новое соединение в концентрациях 1750 и 368 мкг/мл полностью ингибировало его репродукцию на тканевой культуре ХАО — на 4,25 и 4,08 ^ ТИД50 соответственно (р>0,05), превышая действие Тамифлю (410 мкг/мл) — 3,75 ^ ТИД50 (табл. 3).

Противовирусная активность нового соединения и препарата сравнения на модели клеточной культуры МDСК представлена в табл. 4.

Поскольку МПК кобальт бис(цитрато)станната на этой модели ниже (368 мкг/мл), противогриппозное действие вещества изучали именно в этой концентрации.

Результаты исследований показали, что репродукция вируса гриппа человека штаммов А/Гонконг/1/68 (Ю№) подавлялась изучаемым соединением достоверно относительно контроля на 2,2 ^ ТИД50, однако БАВ практически в 2 раза уступало по активности ре-ференс-препарату (4,33 ^ ТИД50). В отношении штамма А/PR/8/34 (ШШ) ингибирование репродукции был несколько ниже при использовании и нового БАВ, и Тамифлю (1,6 и 3,33 ^ ТИД50, соответственно). Но в обоих случаях торможение репродукции было статически достоверным (р> 0,05 по К.З.) по отношению к контролю.

Результаты

1. Кобальт бис(цитрато)станнат в концентрации 7000 мкг/мл полностью подавлял репродукцию штамма вируса гриппа А/Гонконг/1/68 (Ю№). В концентрациях 1750 и 184 мкг/мл в значительной степени подавлял репродукцию вируса А/PR/8/34 (Ш№), а в концентрациях 1750 и 368 мкг/мл полностью подавлял репродукцию штамма вируса гриппа птиц на тканевой культуре ХАО.

2. Во всех трех вышеперечисленных сериях экспериментов новое соединение по противовирусной активности было сопоставимо с препаратом сравнения тамифлю, статистичеки недостоверное несколько уступая или превышая его действие.

3. На тканевой культуре МDCK кобальт бис(ци-трато)станнат в концентрации 368 мкг/мл проявлял статистически значимое относительно контроля тормозящее действие на репродукцию вируса гриппа человека штаммов А/Гонконг/1/68 (ЮШ) и А/PR/8/34 (Ш№), однако уступало по эффективности рефе-ренс-препарату.

Основные выводы

Новое биологически активное вещество — кобальт бис(цитрато)станнат оказывает отчётливое дозозави-симое противовирусное действие в отношении вируса гриппа человека штаммов А/Гонконг/1/68 (Ю№) и А/ PR/8/34 (Ш№), а также вируса гриппа птиц ЮЮ на обоих применяемых моделях.

Выявленная противовирусная активность кобальт бис(цитрат)станната, наряду с его низкой токсичностью, раскрывает перспективу дальнейшего доклинического исследования данного БАВ.

N»1.2014!

54

1ФМИШШ И ФМЩШМШ

Таблица 1

Влияние кобальт бис(цитрато)станната на репродукцию штамма вируса гриппа А/Гонконг/1/68 (И3М2) на тканевой культуре ХАО

Вещества Молярная масса, г/моль Концентрация, мкг/мл (соответственно в Моль) Подавление репродукции вируса, 1д ТИД50

7000 (1x10-2) 4,33*

Кобальт бис(цитрато)станнат 735 3500 (0,5x10-2) 2,50*#

735 (к10-3) 1,75*#

Тамифлю 410 410 (1x10-3) 4,17*

Примечание: * — достоверность различий по отношению к контролю

Таблица 2 Влияние кобальт бис(цитрат)станната на репродукцию штамма вируса гриппа А/РМ8/34 (И1И1) на тканевой культуре ХАО

Вещества Молярная масса, г/моль Концентрация, мкг/мл (соответственно в Моль) Подавление репродукции вируса, 1д ТИД50

Кобальт бис(цитрато)станнат 735 1750 (0,25x10^) 3,08*

184 (0,75x10^) 3,33*

Тамифлю 410 410 (1x10-3) 4,17*

Примечание: * — достоверность различий по отношению к контролю

Таблица 3 Влияние кобальт бис(цитрат)станната на репродукцию штамма вируса птичьего гриппа И5№ на тканевой культуре ХАО

Вещества Молярная масса, г/моль Концентрация, мкг/мл (соответственно в Моль) Подавление репродукции вируса, 1д ТИД50

Кобальт бис(цитрато)станнат 735 1750 (0,25x10^) 4,25*

368 (0,5x10^) 4,08*

Тамифлю 410 410 (1x10-3) 3,75*

Примечание: * — достоверность различий по отношению к контролю

Таблица 4

Влияние кобальт бис(цитрато)станната на репродукцию штаммов вируса гриппа человека штаммов А/Гонконг/1/68 (И3№) и А/РР/8/34 (ИШ) на тканевой культуре МDCK

Вещества Молярная масса, г/моль МПК, мкг/мл (соответственно в Моль) Концентрация, мкг/мл (соответственно в Моль) Подавление репродукции вируса И3И2, |д ТИД50 Подавление репродукции вируса ИШ, |д ТИД50

Кобальт бис(цитрато) станнат 735 368 мкг/мл (0,5x10^) 368 мкг/мл (0,5x10^) 2,20*# 1,60*#

Тамифлю 410 410 мкг/мл (1,0х10-3М) 205 мкг/мл (0,5х10-3М) 4,33* 3,33*

Примечание: * — достоверность различий по отношению к контролю

# — достоверность различий по отношению к референс-препарату

Литература

1. Петров Р.В. Вакцинация против гриппа: проблемы и успехи. // Лечащий врач. — 2007. — №9. — С. 93—96.

2. Viboud C., Bolle P.Y., Cauchemez S., at all. Risk factors of influenza transmission in households. // Br. J. Gen. Prac. — 2004. — № 54 (506). — P.684-689.

3. Осидак Л.В. Дриневский В.П., Ерофеева М.К. Грипп как проблема XXI века. // Детские инфекции. — 2009. — Т. 8. №3. — С. 3—9.

4. Sturm-Ramirez. K.M., Ellis T., Bousfield B., et al. Re-emerging H5N1 influenza viruses in Hong Kong in 2002 are higly pathogenic to ducks. // J.Virol. — 2004. — №78. — P. 4892-4901.

5. Whitley R. J., Hayden F.G., Reisinger K.S. Oral oseltamivir treatment in children. // Ped. Inf. Dis. — 2001. — N 2. — P. 127—133.

6. Bright R.A., Shay D., Shu B., et al. Adamantane resistance among influenza A voruses isolated early during the 2005-2006 influenza season in the Unated States. // Jornal of the American Medical Association. — 2006. — vol.295 (doi:10.1001/jama.295.8.joc60020).

7. Добра Е.А. Противовирусные лекарственные средства в фармакотерапии гриппа и ОРВИ. // Провизор. — 2011. — № 2. — С. 33—36.

8. Ершов Ф.И., Романцов М.Г. Лекарственные средства, применяемые при вирусных заболеваниях. — М.: «Гэотар-Медиа», 2007. 320 с.

9. Бурачева С.А., Прискарь И.И., Цапилов В.И. Синтез и противомикробная активность координационных соединений меди с тиосеми-карбазонами замещенных салицилового альдегида. Бурачева. // Химико-фармацевтический журнал, 2005. — Т. 6. — №39. — С. 30—33.

10. Леглер Е.В., Казаченко A.C., Казбанов В.И. Синтез и антимикробная активность комплексных соединений серебра с аргинином и глу-таминовой кислотой. // Хим-фарм.журнал. — 2001. — Т.35. — №9 — С.35—36.

11. Eds. M. Gielen, E. R. T. Tiekink. Metallotherapeutic Drugs and Metal-Based Diagnostic Agents. The Use of Metals in Medi-cine. Weinheim: Wiley-VCH, 2005. 598 p

12. Зинченко А. И., Паруль Д.А. Основы молекулярной биологии вирусов и антивирусной терапии. — Мн.: Выш. шк., 2005. 214 с.

13. Марцинко Е.Э., Миначева Л.Х., Чебаненко Е.А., Сейфуллина И.И. и др. Условия образования гетерометаллических комплексов в системах GeCl4 (SnCl4) — лимонная кислота — M(CH3COO)2 — H2O. Кристаллическая и молекулярная структура [M(H2O)6] [Ge(HCit)2]?4H2O (M= Mg, Mn, Co, Cu, Zn) и [M(H2O)6][Sn(HCit)2]-4H2O (M= Mg, Co, Ni) // Журн. неорган. химии. — 2013. — Т. 58, № 5. — С.588-595.

14. Доклинические исследования лекарственных средств: метод. Рекомендации / под. ред. чл.- кор. АМН Украины А.В. Стефанова — К. Авщена. 2002. 567 с.

15. Пат. 15629 А Укра1на, МПК G01N 33/15, C12Q 1/18. Спомб ощнки ступени цитотоксичносп бюлопчно активних сполук та фарма-колопчних препарапв. Лозицький В.П., Григорашева 1.М., Федчук А.С. [та ш.]; заявник-патентоутримувач Украгнський наук.-досл. Протичумний ш.-т, ТОВ „Вщродження М". — №u2005 12542; заявл. 26.12.05; опубл. 17.07.06, Бюл. №7.

16. Ильенко В.И. Методы испытания и оценки противовирусной активности химических соединений в отношении вируса гриппа: методические рекомендации. Всесоюзный НИИ гриппа МЗ СССР. — Ленинград, 1977. 36 с.

17. Kaverin N.V., Webster R.G. Impairment of multicycle influenza virus growth in Ver (WHO) cells by loss of trypsin activity. J Virol, 1995; 69: 4: 2700—2703.

18. Ашмарин И.П. Вычисление ЕД50 при малом числе подопытных животных. // Ж. микробиол. — 1959. — №2. — С.102—108.

19. Гублер Е.В. Применение непараметрических критериев статистики в медико-биологических исследованиях / Е.В.Гублер, А.А.Генкин. — Л.: Медицина, 1973. — 142с.

56

Фдрмдкпкинетикд и Фдрмдщиндмикд