Сравнительное гистологическое исследование Cucumaria japonica и Cucumaria okhotensis

2004

Известия ТИНРО

Том 136

УДК 591.8:593.961.3

А.Е.Карлина, Г.Н.Тимчишина, И.В.Матросова

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ГИСТОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

CUCUMARIA JAPONICA И CUCUMARIA OKHOTENSIS

Установлено, что содержание коллагена — белка соединительной ткани — для C. japónica составляет 70 %, для C. okhotensis — 60 %. Изучена микроструктура мышечной ткани кукумарий C. japónica и C. okhotensis. Данные гистологического исследования показали схожесть структуры двух видов кукумарии, заключающуюся в морфологическом строении, количестве и расположении коллаге-новых волокон, а также протеогликанов.

Karlina A.E., Timchishina G.N., Маtrosova I.V. Comparative histological research of Cucumaria japonica and Cucumaria okhotensis // Izv. TINRO. — 2004. — Vol. 136. — P. 334-338.

Microstructure of the tissues of sea cucumber C. japonica and C. okhotensis is investigated. The protein of connective tissue — collagen forms 70 % of tissues for C. japonica and 60 % — for C. okhotensis. The data of histological research showed similarity of two species of sea cucumber by their morphological structure , quantity and an arrangement of collagenic fibers and proteoglicans.

Исследование новых объектов промысла является актуальным в связи со снижением на Дальнем Востоке запасов основных массовых объектов лова (тихоокеанские лососи, треска, морские окуни и др.) (Леваньков, Якуш, 2002). Перспективной для хозяйственного использования является кукумария C. okhotensis, обитающая в районе западного побережья Камчатки, запасы которой оцениваются в 3 тыс. т (Левин, 2003).

Вследствие того что C. okhotensis — новый объект промысла, целью работы было сравнительное исследование ее микроструктуры и микроструктуры соединительной ткани известного промыслового вида кукумарии дальневосточных морей — C. japonica.

Объектом изучения являлась мороженая кукумария двух видов.

Исследование проводили при помощи светового микроскопа Olympus BH-2 (объектив 40х, окуляр 10х). Фотографирование препаратов осуществляли цифровой фотокамерой Olympus.

Гистологические срезы готовили общепринятым методом (Меркулов, 1969): фиксированные в 10 %-ном формалине кусочки мышечной ткани кукумарии заключали в парафин, полученные из них продольные срезы толщиной 5-7 мкм окрашивали по методу Ван-Гизона. При этом коллагеновые волокна соединительной ткани имеют ярко-красный цвет, а эластические волокна — буровато-желтый или желто-зеленый (Пирс, 1956).

Для гистохимического обнаружения протеогликанов срезы окрашивали альциановым синим. В основе этого метода лежит принцип гистохимической реакции — образование химической связи между кислотными группами проте-огликанов с альциановым синим (Меркулов, 1969).

Помимо гистологических исследований в образцах C. okhotensis и C. japónica определяли содержание соединительной ткани химическим методом, который основан на количественном определении оксипролина, являющегося маркером коллагена (Крылова, Лясковская, 1965).

Согласно ранее полученным данным, мышечная ткань C. okhotensis и C. japónica содержит 7-9 % белка (Афанасьева, 2003). По содержанию белкового компонента разные виды кукумарии не подвержены существенным колебаниям (Слуцкая, 1975; Толкачева, 1997; Лебская, 2001). С равнительное определение доли соединительнотканных белков, проведенное нами, показало, что белки C. japonica на 70 %, а C. okhotensis — на 60 % представлены коллагеном. Наличие значительного количества данного белка, а также выявленные различия в его содержании в тканях кукумарий должны оказывать большое влияние на многие свойства сырья и продукции из него. Коллаген является пластическим материалом, структурным элементом тканей, участвует в процессе регенерации клеток. Недостаток его в организме или значительный дисбаланс может привести к серьезным нарушениям структуры и функций тканей (Sho, 2001; Suzuki et al., 2001; Caras, 2002). Известно, что после тепловой обработки коллаген на 60-70 % переваривается пищеварительными ферментами (Loewit, 1970), поэтому, несмотря на пищевую неполноценность (Савватеева и др., 1983), его можно рекомендовать в качестве дополнительного поставщика азота, который будет являться сырьем для построения белка организма-потребителя (Слуцкая, 1973).

По химическому составу C. okhotensis подобна C. japonica (Тимчишина, Афанасьева, 2003), поэтому можно предположить, что и специфические особенности их структуры будут схожи.

Данные гистологического анализа соединительной ткани мускульного мешка исследуемых видов кукумарий подтверждают результаты химического исследования.

Установлено, что снаружи стенка тела кукумарии покрыта тонкой бесструктурной кутикулой, под которой находится однослойный цилиндрический эпителий. Ядра последнего расположены в 1 ряд благодаря тому, что лежат в клетках на одном уровне. В эпителии встречаются железистые и чувствительные клетки. Далее идет основной толстый слой — плотная неоформленная соединительная ткань, состоящая из переплетающихся между собой пучков коллагеновых волокон различной толщины и сети эластических волокон (рис. 1). Эластические волокна тонки, ветвисты, при большом их скоплении возникает характерная желтая окраска (рис. 1, а). Среди волокон, разбросанных в основном веществе, находятся соединительнотканные клетки веретеновидной или звездчатой формы, которые окрашиваются гематоксилином Вейгерта в буро-черный цвет (рис. 2). Кроме того, вблизи от поверхности следует отметить отложения пигмента, придающего окраску всей кукумарии.

Структура соединительной ткани C. okhotensis и C. japonica имеет как общие черты при сравнении друг с другом (принцип строения), так и специфические. У обоих видов кукумарии коллагеновые волокна, правильно сплетаясь, образуют густую сеть. Волокна искривлены, плотно прилегают друг к другу и примерно одной толщины. Но микроструктура мышечной ткани C. japonica характеризуется более высоким содержанием коллагена (на рис. 1 красные линии), что подтверждается интенсивностью окраски гистологических срезов, а также плотностью расположения волокон (см. рис. 1, б). Для C. okhotensis характерна желтоватая окраска срезов, что свидетельствует о более высоком количестве эластических волокон (рис. 1, а), которые представляют по существу многокомпонентную систему. Одним из компонентов являются гликопротеины, которые участвуют в образовании волокон эластина и влияют на их размер и пространственную организацию (Мусил и др., 1981).

Рис. 1. Микроструктура соединительной ткани C. okhotensis (а) и С. japónica (б), окраска по Ван-Гизону: 1 — коллагеновые волокна, 2 — эластические волокна, 3 — межуточное вещество

Fig. 1. Microstructure of connective tissue of C. okhotensis (a) and С. japónica (б), van Giesons stain: 1 — collagen fibres, 2 — elastic fibres, 3 — intermediate substanse

Рис. 2. Микроструктура соединительной ткани С. japonica, окраска гематоксилином на наличие соединительнотканных клеток: 1 — коллагеновые волокна, 2 — фиброциты, 3 — эластические волокна, 4 — межуточное вещество

Fig. 2. Microstructure of connective tissue of С. japónica, hematoxylin stain for the presence of connective-tissue cells: 1 — collagen fibres, 2 — fibrocytes, 3 — elastic fibres, 4 — intermediate substanse

Высокое содержание в мышечной ткани кукумарии коллагена сопровождается наличием большого количества другого структурного элемента соединительной ткани — основного (межуточного) вещества, которое является местом локализации протеогликанов. Взаимодействия между коллагеном и протеогли-канами приводят к образованию коллагеновых фибрилл, образование, форма, направление и свойства которых зависят от состава и количества протеогликанов (Мусил и др., 1981).

Являясь существенным компонентом основного вещества соединительной ткани, протеогликаны играют важную роль в обеспечении нормальных физиологических процессов (Виноградова и др., 1998).

Проведенными ранее исследованиями установлено высокое содержание в мышечной ткани C. japonica одного из структурных элементов межуточного вещества — хондроитинсульфата, количество которого определяли по содержанию глюкозамина (Слуцкая, Леванидов, 1977). Наряду с хондроитинсульфатом, содержащим глюкоз- или галактозамины, в составе межуточного вещества обнаружен хондроитинсульфат, содержащий фукозу, который выполняет роль регулятора изменения длины коллагеновых волокон (Landeira-Fernandez et al., 2000).

По результатам нашего исследования, протеогликаны, окрашиваемые альци-ановым синим в сине-зеленый цвет, локализованы в соединительной ткани. Учитывая интенсивность окраски, условно можно предположить, что большее

количество протеогликанов характерно для C. japónica (рис. 3). Светлее окрашены срезы у С. okhotensis, что, вероятно, свидетельствует об их меньшем содержании (рис. 3). Однако данные гистологических исследований необходимо подтвердить количественным определением содержания протеогликанов в тканях кукумарии.

Рис. 3. Микроструктура соединительной ткани C. okhótensis (а) и С. japónica (б); окраска альциановым синим: 1 — коллагеновые волокна, 2 — межуточное вещество

Fig. 3. Microstructure of connective tissue of C. okhótensis (а) and С. japónica (б); alcian blue stain: 1 — collagen fibres, 2 — intermediate substanse

В целом, одной из главных функций протеогликанов является способность придавать коллагену определенную конфигурацию, которая состоит из концевого связывания коллагеновых волокон между собой при отсутствии боковых связей (Graham et al., 2000).

В соединительной ткани кукумарии коллагеновые волокна связаны гликоп-ротеином — степарином, ответственным за жесткость структуры ткани кукума-рии (Trotter et al., 1996). Интересно отметить, что, как и в любой живой системе, обнаружено присутствие ингибитора степарина, препятствующего агрегации коллагена. Судя по окраске с альциановым синим, данное вещество относится к гликопротеинам (Trotter et al., 1999).

Таким образом, совокупность полученных нами результатов и сравнение их с данными литературы свидетельствуют о перспективности использования кукумарии в качестве источника физиологически активных соединений — про-теогликанов, а также соединительнотканных белков. Данные гистологических исследований подтвердили схожесть микроструктуры C. japónica и С. ókhótensis, заключающуюся в строении и расположении коллагеновых волокон. Установлено, что C. japónica характеризуется более высоким содержанием коллагена по сравнению с C. ókhótensis, для последней характерно значительное количество эластических волокон.

Литература

Афанасьева A.E. Технология производства сушеной кукумарии // Хранение и переработка сельхозсырья. — 2003. — № 8. — С. 194-198.

Виноградова Т.А., Гажев Б.Н., Виноградов B.M. и др. Практическая физиотерапия / Под общ. ред. Б.Н.Гажева. — М.: "Олма-пресс"; СПб.: Издательский дом "Нева", " Валери С ПБ", 1998. — 640 с.

Крылова H.H., Лясковская Ю.Н. Физико-химические методы исследования продуктов животного происхождения. — М.: Пищ. пром-сть, 1965. — 316 с.

Лебская Т.К. Комплексная переработка баренцевоморской кукумарии // Рыб. хоз-во. — 2001. — № 6. — С. 50-51.

Леваньков С.В., Якуш Е.В. Современные тенденции в технологии обработки рыбных объектов промысла прибрежных вод // Мат-лы науч.-практ. конф. "Приморье — край рыбацкий". — Владивосток: ТИНРО-центр, 2002. — С. 123-125.

Левин В.С. Cucumaria okhotensis (Echinodermata: Holothurioidea) — новый вид голотурий из Охотского моря // Биол. моря. — 2003. — Т. 29, № 3. — С. 202-205.

Меркулов Г.А. Курс патологической техники. — Л.: Медицина, 1969. — 420 с.

Мусил Я., Новакова О., Кунц К. Современная биохимия в схемах. — М.: Мир, 1981. — 216 с.

Пирс Э. Гистохимия теоретическая и прикладная. — М.: Иностр. лит-ра, 1956. — 488 с.

Савватеева Л.Ю., Маслова М.Г., Володарский В.Л. Дальневосточные голотурии и асцидии как ценное пищевое сырьё. — Владивосток: ДВГУ, 1983. — 184 с.

Слуцкая Т.Н. Особенности химического состава иглокожих // Рыб. хоз-во. — 1973. — № 7. — С. 18-20.

Слуцкая Т.Н. Исследования по химии и технологии трепанга и кукумарии: Авто-реф. дис. ... канд. техн. наук. — Владивосток, 1975. — 24 с.

Слуцкая Т.Н., Леванидов И.П. Гексозаминосодержащие вещества голотурий и количественные изменения их в процессе производства пищевых продуктов // Исслед. по технол. рыб. продуктов. — Владивосток: ТИНРО, 1977. — Вып. 7. — С. 32-36.

Тимчишина Г.Н., Афанасьева А.Е. Перспективы использования нового вида кукумарии — Cucumaria okhotensis при производстве пищевой продукции // Нетрадиционные природные ресурсы, инновационные технологии и продукты: Сб. науч. тр. — М., 2003. — Вып. 8. — С. 167-173.

Толкачева В.Ф. Морской огурец Баренцева моря — новый источник пищевого сырья и лечебно-профилактической продукции // Рыб. хоз-во. — 1997. — № 2. — С. 48-49.

Caras J. Lose weight , improve skin and support your joints… … while you sleep? // Better Nutrition. — 2002. — Vol. 64, № 3. — P. 10-11.

Graham H .K., H olmes D .F., W atson R .B., Kadler K.E. Identification of collagen fibril fusion during vertebrate tendon morphogenesis. The process relies on unipolar fibrils and is regulated by collagen-proteoglycan interaction // J. Mol. Biol. — 2000. — Vol. 295, № 4. — Р. 891-902.

Landeira-Fernandez A.M., Aiello K.R., Aquino R.S. et al. A sulfated polysac-charide from the sarcoplasmic reticulum of sea cucumber smooth muscle is an endogenous inhibitor of the Ca(2+)-ATPase // Glycobiology. — 2000. — Vol. 10, № 8. — P. 773-779.

Loewit K. Untersuchung and Forsch // Lebensmittel. — 1970. — Bd. 1. — S. 143.

Sho H. History and characteristics of Ocinawan longevity food // Asia Pasific Journ. Clin. Nutr. — 2001. — Vol. 10, № 2. — P. 159-164.

Suzuki M., Wilcox B.J., Wilcox C.D. Implication from and for food cultures for cardiovascular disease: longevity // Asia Pasific Journ. Clin. Nutr. — 2001. — Vol. 10, № 2. — P. 165-171.

Trotter J .A., Ly ons-Levy G., C hino K. e t al. Stiparin: a glycoprotein from sea cucumber dermis that aggregates collagen fibrils // Matrix Biol. — 1996. — Vol. 15, № 2. — P. 99-110.

Trotter J.A., Lyons-Levy G., Chino K. et al. Collagen fibril aggregation-inhibitor from sea cucumber dermis // Matrix Biol. — 1999. — Vol. 18, № 6. — P. 569-578.

Поступила в редакцию 4.03.04 г.