Цикл развития таежных клещей в условиях лабораторной колонии

Таблица

Результаты исследования погадок птиц и помета хищных млекопитающих на туляремию

на о. Врангеля

Годы Количество исследованных образцов Из них с положительным результатом

Абс. % (±V Титры в РНАт

2002 326 11 3,4 (±1,6) 1:12-1:160

2003 100 - - -

2004 212 24 11,3 (±4,2) 1:12-1:40

2005 121 6 5,0 (±3,9) 1:12-1:40

2006 189 6 3,2 (±2,5) 1:12-1:20

2007 128 2 1,6 (±2,2) 1:40

2008 32 5 15,6 (±12,5) 1:12-1:40

2009 523 46 8,8 (±2,4) 1:12-1:80

2010 726 40 5,5 (±1,6) 1:12-1:80

геля» (В.В. Баранюк, И.В. Менюшина), цикл изменения численности леммингов в последние 10 лет с 4-5 лет растянулся до 7-8 лет, что, по всей видимости, связано с климатическими изменениями (показатели температуры, влажности и др.).

Количество собранных погадок зависело от численности леммингов в каждом году. Положительные результаты в РНАт получены практически во всех обследованных районах: пос. Сомнительная, район р. Мамонтовой - руч. Хрустальный, руч. Перкаткун, руч. Веселый, стационар Среднемамонтовая; район р. Тундровой -руч. Двурогий, руч. Сыроечковского, руч. Прямой; стационар Пик Тундровый, река Лемминговая.

Наибольшая эпизоотическая активность природных очагов туляремии выявлена в 2004, 2008, 2009 гг., процент положительных находок составил от 8,8 до 15,6 %.

По нашим многолетним наблюдениям, эпизоотическая активность природных очагов туляремии на о. Врангеля происходит как на фоне роста численности

популяции леммингов, так и в период ее депрессии. В годы депрессии жизнедеятельность леммингов можно наблюдать в одних и тех же районах острова: в районе р. Мамонтовой, в нижнем течении р. Тундровой, верхнем течении р. Неизвестной, Тундра Академии - в районе Знака, районе г. Пик Тундровый. Почти все серопо-зитивные образцы в такие годы получены из этих районов. Важным моментом является фактически постоянное обнаружение серопозитивных образцов в одних и тех же районах из года в год, даже в годы депрессии численности леммингов.

Таким образом, нами охарактеризованы тундровые очаги туляремии на острове Врангеля, выявлена практически ежегодная их эпизоотическая активность, связанная с численностью основного носителя возбудителя туляремии - леммингов. Полученные данные свидетельствуют о стабильном и длительном существовании природных очагов туляремии тундрового типа, функционирующих при отсутствии на них антропогенного или техногенного воздействия.

ЦИКЛ РАЗВИТИЯ ТАЕЖНЫХ КЛЕЩЕЙ В УСЛОВИЯХ ЛАБОРАТОРНОЙ КОЛОНИИ

Н.В. Яковчиц, М.А. Хаснатинов, Е.В. Арбатская, Г.А. Данчинова НЦ ПЗСРЧ СО РАМН, Иркутск

В Восточной Сибири наиболее важным переносчиком целого ряда заболеваний вирусной, бактериальной и протозойной природы является таежный клещ Ixodes persulcatus (Schulze, 1930), обитающий на огромной территории от Прибалтики (Jääskeläinen et al., 2006) до Японии и Сахалина (Коренберг, 1979; Таежный клещ...,

1985). Из-за его существенного эпидемического значения таежный клещ уже несколько десятилетий является объектом интенсивного изучения. С каждым годом все более актуальным инструментом исследований ик-содовых клещей и переносимых ими патогенных микроорганизмов становятся лабораторные колонии этих

НАЦИОНАЛЬНЫЕ ПРИОРИТЕТЫ РОССИИ. 2011. № 2 (5). СПЕЦИАЛЬНЫЙ ВЫПУСК

членистоногих. Аналогичных исследований по экспериментальному изучению колоний таежного клеша существует очень мало, поэтому целью данной работы стало выяснение особенностей содержания таежных клещей и установление динамики развития клещей в лабораторных условиях.

Методы и материалы. Материалом для исследований послужило потомство клещей I. рersulcatus, отловленных в Иркутской области в 2009-2010 гг. Клещей всех стадий развития прокармливали на беспородных белых мышах и содержали в идентичных условиях в изолированном от внешней среды боксе в режиме «длинного дня» (16 ч светлого времени, 8 ч темноты) при постоянной температуре 23-25 °C и относительной влажности >80 %.

Для верификации вида клещей и оценки их филогенетических взаимосвязей проводили анализ нукле-отидной последовательности транслируемого рибо-сомального спейсера (ITS2). Полноразмерный спейсер ITS2 амплифицировали согласно (Fukunaga et al., 2000) с праймерами 5.8S F3/1 (5N-GGG TCG ATG AAG AAC GCA GCC AGC-3") и 28S R1/1 (5N-TTC AGG GGG TTG TCT CGC CTG ATG -3N). Полученная последовательность «Ip20n-IRK2009» депонирована в GenBank под номером JF501021.

Для филогенетического анализа использовали структуры фрагментов спейсера ITS2 клещей I.ricinus, I.pav-lovskyi, I.nipponensis, I.pacificus и I.persulcatus, опубликованные в базе данных GenBank (GenBank, 2010). В качестве аутгруппы использовали последовательность ITS2 (GenBank № L22277). Для расчета эволюционных дистанций использовали модель Tamura-Nei, 1993 (Tamura and Nei, 1993). Топологию древа устанавливали с помощью метода neighbor-joining. Достоверность реконструкции оценивали с помощью бутстреп-анализа на основе 1000 псевдовыборок. Расчеты проводили с помощью программы MEGA 4 (Kumar S. et al., 2004).

Для оценки вариабельности результатов рассчитывали стандартное отклонение средних значений. Для оценки нормальности распределения использовали тест Колмогорова-Смирнова, для оценки достоверности различий применяли дисперсионный анализ Краскела-Уоллеса и медианный анализ. Расчеты проводили с использованием пакета программ Statistica 6.1 (StatSoft Inc., 1984-2004).

Результаты. Как родительские самки, так и их потомство на основании морфологических признаков были отнесены к виду I.persulcatus Schulze, 1930. Для подтверждения правильности определения вида была расшифрована и проанализирована первичная нуклеотид-ная последовательность ITS2 (GenBank № JF501021). Филогенетический анализ этой последовательности показал, что клещи с высокой степенью вероятности (бут-стреп-поддержка 100 %) принадлежат к виду I.persulcatus. Кроме того, филогенетический анализ указывает на взаимосвязь между восточносибирскими таежными клещами и клещами из Северо-Западного Китая (Тянь-Шань).

Продолжительность питания самок составила в среднем 6,4±1,4 дня, вес напитавшихся самок составлял 0,2±0,1 грамма, и через 6,2±3 дня они начинали откладывать яйца. Среднее время инкубации яиц составило 35,2 дня, период доразвития личинок варьировал от 0,5 до 14 суток (7,4±5,0), и в среднем из одной яйцекладки нам удавалось получить 84,3±3,4 актив-

ных и готовых к питанию личинки. Питание личинок занимало 3,5 дня.

Отмечено 2 типа развития напитавшихся личинок в нимфу - большинство клещей имели короткий период метаморфоза продолжительностью 27,5±4,5 дня, однако часть клещей отличалась длительным периодом метаморфоза в 76,9±10,4 дня (Р<0,0001, тест Краскела-Уоллеса). Среднее время прокормления нимф составило 4,5 дня.

Обсуждение. Анализируя опубликованные данные по динамике развития таежных клещей в разных частях ареала (Хейсин, 1955; Хейсин и др., 1955; Таежный клещ..., 1985; Konnai et а!., 2008; Шихарбеев, 1965), можно отметить, что динамика развития таежных клещей из Восточной Сибири практически полностью совпала с динамикой развития клещей из других частей ареала на всех стадиях преимагинального развития, кроме стадии метаморфоза личинок в нимф.

Согласно литературным данным, продолжительность развития личинок таежного клеща в природных условиях колеблется от 22 в Хабаровском крае до 123 суток в Латвии. Считается, что основным фактором, определяющим продолжительность развития личинок, является сезон питания личинок (Таежный клещ., 1985; Хейсин, 1955; Шихарбеев, 1965). В нашей работе отлов и все последующие стадии жизненного цикла проходили в стандартизованных и идентичных для всех клещей условиях. Таким образом, наблюдаемое расщепление не может быть объяснено различиями в фотопериодичности, температурном режиме, продолжительности «голодного» периода или других физическими сигналами, которые могут вызывать адаптивные изменения сроков развития личинок в нимф. Влияние технических погрешностей на результат эксперимента также маловероятно, поскольку все клещи содержались в изолированном помещении со стабильными климатическими условиями в компактной установке, обрабатывались и поддерживались одним и тем же персоналом по стандартной процедуре, что минимизирует вариабельность условий внутри колонии. Мы видим два возможных объяснения наблюдаемого явления. Во-первых, можно предположить, что скорость метаморфоза регулируется на генетическом уровне и существует две внутривидовые группы таежных клещей - длиннопериодичная, характеризующаяся долгим метаморфозом и повышенной склонностью к входу в диапаузу, и короткоперио-дичная, возможно, характеризующаяся короткими периодами метаморфоза и бездиапаузным циклом жизни. Во-вторых, не исключено, что продолжительность метаморфоза регулируется определенными физиологическими параметрами личинки, например, продолжительностью периода между вылуплением из яйца и началом питания или степенью напитанности личинки. Эти параметры не отслеживались в ходе нашей работы, поэтому не исключено, что личинки в группе № 6 были неоднородны по этим показателям. В случае реализации обоих сценариев формируются два независимых способа существования вида в природе, что способствует повышенной выживаемости вида в нестабильных климатических условиях. В итоге возможны увеличение внутривидового разнообразия за счет поведенческой изоляции двух групп и, в перспективе, дивергенция таежного клеща на два новых вида. В данном случае также используется два способа существования вида

в природе, однако генетического разделения по продолжительности жизненного цикла нет, вид является генетически однородным, а продолжительность стадий жизненного цикла определяется для каждой особи случайным образом.

Полученные данные могут быть полезны при создании и поддержании жизнеспособных лабораторных колоний клещей Lpersulcatus, а также помогут в планировании экспериментальных исследований с использованием колоний таежных клещей.

ЛЕПТОСПИРОЗЫ: СЛЕЖЕНИЕ ЗА ЦИРКУЛЯЦИЕЙ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ В ОМСКОЙ ОБЛАСТИ

А.М. Стрекаль

ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Омской области»

Лептоспирозы - группа природно-очаговых нетрансмиссивных зоонозов, сходных по этиологии, патогенезу, клиническим проявлениям, эпидемиологическим и эпизоотологическим особенностям.

Лептоспирозы выделены комитетом экспертов ВОЗ из большого числа зоонозов как наиболее значимые в социально-экономическом отношении нозологические формы наряду с бешенством и бруцеллезом. При средних показателях летальности от лептоспирозов в России 3-4 % на отдельных территориях, эндемичных по иктерогеморрагическому и каникулярному лептоспиро-зам, они достигают 20 % и более. Заболеваемость леп-тоспирозом повсеместно тесно связана с хозяйственными очагами. Однако в последние годы наблюдается тенденция к урбанизации лептоспирозов. Увеличение численности сельскохозяйственных животных индивидуального сектора в последние десятилетия, нарушения режимов вакцинации и санитарно-ветеринарных правил их содержания привели к росту вспышечной заболеваемости в РФ на фоне спорадической. В Сибирском федеральном округе зарегистрировано 114 случаев лептоспирозов за 2001-2006 гг. Заболеваемость в округе в 8,1 раза ниже общероссийской, на долю округа приходится 1,6 % от заболеваемости в РФ. В Омской области заболеваемость лептоспирозом среди людей не регистрируется более 5 лет.

Значительная устойчивость возбудителей лепто-спироза во внешней среде и достаточно большой круг животных - основных хозяев - обеспечивают существование лептоспир в природе. Животные-лептоспиро-носители выделяют возбудителей во внешнюю среду с мочой, инфицируя воду открытых водоемов, почву, пищевые продукты, корма и другие объекты внешней среды. Лептоспиры проникают в организм человека через повреждения кожи и неповрежденные слизистые оболочки. Основной путь передачи инфекции -водный, меньшее значение имеют контактный и пищевой. Больной человек является «тупиком» для возбудителя инфекции и не имеет практического значения как его источник.

Патогенным лептоспирам свойственна гостальная (хозяинная) специфичность. Возбудители отдельных се-роваров циркулируют в популяциях одного или ограниченного круга видов животных, являющихся основными резервуарами инфекции (например, серовар har-djo - крупный рогатый скот, сатга1а - собаки, tarassovi -свиньи и крупный рогатый скот, grippotyphosa - серые полевки, copenhageni - серая крыса). Однако госталь-

ная специфичность носит относительный характер, например, лептоспиры серовара canicola могут выделяться у серых крыс, свиней, крупного рогатого скота.

Лептоспирозам свойственна летне-осенняя сезонность, однако заболевания, связанные с профессиональным заражением или в домашних очагах (например, от собак), возможны в любое время года.

Современная лабораторная диагностика лептоспи-розов основана на совокупности нескольких методов исследования: бактериоскопический, бактериологический, иммунологический, биологический, молекулярно-генетический, которые используются в различных комбинациях в зависимости от фазы заболевания и диагностических возможностей лаборатории.

Лаборатория особо опасных и природно-очаговых инфекций ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Омской области» проводит исследования на обнаружение патогенных лептоспир во внешней среде с 2000 г. Наиболее приемлемым и общепринятым методом исследования, отличающимся высокой специфичностью и чувствительностью, является реакция микроскопической агглютинации лептоспир (РМА). Этот метод диагностики использовался в лаборатории до 2009 г. С 2009 г. начали применять молекулярно-генетический метод.

При использовании РМА материалом для исследования служила кровь мелких млекопитающих, высушенная на фильтровальной бумаге. При таком способе консервации крови и хранении высушенных проб в запаянных полиэтиленовых пакетах при температуре +4-6 °С антитела сохраняются до 6 месяцев. В качестве антигена в РМА используются живые культуры лептоспир 10-14-суточного культивирования на сывороточной среде, содержащие не менее 50-100 лептоспир в поле зрения микроскопа и без признаков спонтанной агглютинации. Для этого в лаборатории имелся набор эталонных штаммов, состоящий из культур лептоспир 10 се-рогрупп. РМА ставили согласно МУ 3.1.1128-02 «Эпидемиология, диагностика и профилактика заболеваний людей лептоспирозами».

За 2000-2008 гг. было исследовано 2866 проб крови мелких млекопитающих, в 351 пробе были обнаружены антитела лептоспир различных серогрупп (выявляемость составила 12,4 %). Преобладали антитела серогруппы Grippotyphosa - 78 %. В оставшихся 22 % серопозитивных случаев обнаруживались антитела серогрупп Pomona, Icterohaemorrhagiae, Javanica, Sejroe. Серопозитивные пробы регистрировались на территории Крутинского, Называевского, Тюкалинского, Тев-