Применение метода краткосрочного культивирования опухолевых клеток для определения индивидуальной чувствительности глиом головного мозга к химиопрепаратам

Украгнський неейрохгрурггчний журнал, №4, 2000

УДК 616. 831—006.484:615.28

Применение метода краткосрочного культивирования опухолевых клеток для определения индивидуальной чувствительности глиом головного мозга к химиопрепаратам

Зозуля Ю.А., Васильева И.Г., Розуменко В.Д., Олексенко Н.П., Главацкий А.Я., Чувашова О.Ю.

Институт нейрохирургии им. акад А.П. Ромоданова АМН Украины, Киев, Украина Ключевые слова: глиома, индивидуальная чувствительность, Н3 -тимидин

Введение. Успех лечения глиом головного мозга во многом зависит от выбора хирургической тактики и эффективности химиотера-певтических препаратов. Необходимость индивидуального подхода к назначению химиопре-паратов подтверждается рядом исследований,-свидетельствующих о различной чувствительности глиом мозга к противоопухолевым средствам [6,7,9]. Результаты научных исследований последнего десятилетия во многом объясняют молекулярные механизмы индивидуальной чувствительности и устойчивости трансформированных клеток к лекарствам [6,7,11]. В настоящее время доказано значение глутатиона, глу-татионтрансферазы , алкилтрансферазы, а также ферментов, участвующих в репарации ДНК, в повышении устойчивости опухолей к медикаментозной терапии [8,11]. Определена роль в формировании фенотипа, устойчивого к противоопухолевым препаратам, белков МКИ и Р-гликопротеина [5]. В то же время установлено, что среди глиом встречаются дефицитные по алкилтрансферазе популяции, особенно чувствительные к алкилирующим препаратам [8]. Многообразие механизмов резистентности и ее индивидуальной выраженности в клетках различных видов опухолей определяет разную их чувствительность к химиопрепаратам. В связи с этим существует необходимость создания адекватных тестов для определения индивидуальной чувствительности глиом к химиопрепара-там [9]

Целью нашего исследования была оценка метода краткосрочного органного культивирования опухолевых клеток для определения чувствительности глиом головного мозга человека к химиопрепаратам с различным механизмом действия: карбоплатину, флюороурацилу, вин-кристину, ломустину . Выбор этих препаратов обусловлен принадлежностью каждого из них к одному из четырех типов соединений (лекарства, генерирующие разрывы ДНК, антимета-

болиты, алкилирующие соединения и растительные вещества, вызывающие денатурацию тубулина), наиболее широко используемых при химиотерапии внутримозговых опухолей [4].

Для тестов использовали ткань внутримозговых глиальных опухолей человека, удаленных во время операции. Чувствительность клеток этих опухолей к химиопрепаратам определяли по снижению интенсивности включения 3Н-тимидина в ДНК опухолевых клеток в культуре. Меченый нуклеотид, включившийся во вновь синтезирующуюся ДНК, позволяет оценить митоз в клетке. Снижение интенсивности его включения адекватно торможению деления клетки и, следовательно, роста опухоли.

Материал u методы. В ходе исследования было протестировано 13 образцов опухолей головного мозга человека, преимущественно глиом разной степени злокачественности. Ткань удаленной в ходе операции опухоли до начала исследований (сроком до 24 ч) помещали в пени-циллиновый флакон с инкубационной средой "Игла" при температуре 37°С. Перед культивированием с 3Н-тимидином ткань освобождали от сосудов и измельчали до получения тканевых эксплантатов массой 10—15 мг, просушивали с помощью фильтровальной бумаги, взвешивали и помещали в пенициллиновые флаконы с культуральной средой "Игла", содержащей 3Н-тимидин (75 мк Ci / мл) и хими-опрепараты (19 мкг/мл карбоплатина, 107 мкг/ мл флюороурацила, 1,5 мкг/мл винкристина, 16 мкг/мл ломустина). При расчете концентрации препарата для проведения тестов in vitro учитывали допустимые его уровни в крови при назначении в клинике. Клетки опухоли культивировали при температуре 37°С в течение 4 ч [4].

Включение 3Н-тимидина определяли с помощью сцинтилляционного счетчика "Бета-1"

Результаты и обсуждение. Индивидуаль-

Применение метода краткосрочного культивирования опухолевых клеток.

ную чувствительность опухоли к химиопрепа-ратам необходимо учитывать при разработке стратегии химиотерапии. Определяется чувствительность к химиопрепаратам генетически детермированной активностью систем резистентности клетки к инородным молекулам [3, 10]. Доказано, что в формировании резистентности опухолевой клетки к химиопрепаратам имеют значение глутатионтрансфераза, алкилтрансфе-раза, ДНК-лигаза, глутатион , белки МКИ и Р-гликопротеин [5,8,9,11,12]. Однако, при выборе эффективного препарата обычно руководствуются только данными токсикологических тестов, направленных на определение толерантности пациента к данному препарату.

Для решения задачи индивидуального подбора химиопрепарата мы применяли культивирование опухолевых клеток, полученных непосредственно во время операции, в присутствии противоопухолевых лекарств. Основанием для оценки эффективности лекарства была степень угнетения под его воздействием включения 3Н- тимидина в синтезирующуюся ДНК, поскольку этот показатель отражает интенсивность роста ткани опухоли и широко используется для определения ее чувствительности к химиопрепаратам [1,2].

В ходе экспериментальных исследований было установлено, что для получения надежных и воспроизводимых результатов очень важно соблюдать следующие условия культивирования тканевых эксплантатов.

1. Образец опухоли необходимо сразу поместить в культуральную среду стандартного состава. До проведения эксперимента допускается выдерживание этого образца в течение 24 ч в термостате при температуре 37 °С .

2. Масса инкубируемых эксплантатов должна равняться в среднем 10 мг.

С целью определения оптимального размера тканевых эксплантатов в культуральную среду с 3Н-тимидином помещали эксплантаты одной и той же опухоли разной массы и культивировали в течение 24 часов (таблица 1). В результате этого эксперимента было выявлено, что оптимальная масса культивируемых эксплантатов составляет 7—12 мг. При этом допустимые границы колебания уровня включения 3Н-тимидина в ДНК опухолевой клетки не превышают 10% .

3. Оптимальное время культивирования — 4—24 ч.

Для определения оптимальной продолжительности культивирования образцы одной и той же опухоли культивировали 1 ч, 4 ч, 24 ч в присутствии 3Н-тимидина. Установлено, что если уровень включения 3Н тимидина через 24 ч принять за 100%, то через 1 ч он включается

Таблица 1. Влияние массы эксплантата опухолевой ткани на интенсивность включения 3Н- тимидина в ДНК опухолевой клетки

Масса эксплантата, мг Интенсивность включения 3Н-тимидина

имп/мин имп/мин/мг ткани

11 4077 370

9 2753 305

8 2132 354

М±м 343±25

43 7612 177

55 15042 273

57 11717 205

М±м 218±36

67 8881 132

94 6080 64

М±м 98±34

на 34%, через 2 ч — на 45%, а через 4 ч — на 68% метки (рис.).

4. Однородность образцов для культивирования.

Образец опухолевой ткани нередко содержит значительное количество соединительнотканных тяжей, что не позволяет получить однородные по составу участки и обусловливает разноречивость данных относительно уровня

150

100 --

50

100% £

34%

45%

68% г-

+

2 4

время культивирования

24

Рис. Накопление 3Н-тимидина в опухолевых клетках через 1, 2, 4, 24 ч культивирования

включения тимидина, выходящую за допустимые границы стандартного отклонения. Поэтому вано получить однородную клеточную суспензию, чтобы вносить в культуральную среду до 10Ч106 клеток (подсчет проводят в камере Горяева).

Исследования показали, что в культуре клетки глиом с включением 3Н-тимидина проявляют различную чувствительность к карбоп-латину, флюороурацилу, винкристину, лому-стину (табл. 1). Через 4 ч культивирования под влиянием химиопрепарата достигается подавление включения 3Н-тимидина на 20—50% и

0

Зозуля Ю.А., Васильева И.Г., Розуменко В.Д., Олексенко Н.П., Главацкий Aß, Чувашова О.Ю.

Таблица 2. Влияние химиопрепаратов карбоплатина, флюороурацила, винкристина, ломустина на включение 3Н-тимидина в клетки нейроглиом в культуре

Диагноз Контроль Карбоплатин Винкристин Флуоро-урацил Ломус-тин

Анапластическая олигодендро-астроцитома Снижение интенсивности включения 3Н-тимидина 248 130 >40% 98 >50% 147 —

Анапластическая олигодендро-астроцитома III степени Снижение интенсивности включения 3Н-тимидина 170 75 >60% 132 169 160

Анапластическая олигодендро-астроцитома III степени Снижение интенсивности включения 3Н-тимидина 156 146 115 79 >50 57 >70

Анапластическая астроцитома Снижение интенсивности включения 3Н-тимидина 262 214 206 79 >70 73 >70

Анапластическая астроцитома Снижение интенсивности включения 3Н-тимидина 392 446 277 >40 270 >40 392

Олигодендроастроцитома Снижение интенсивности включения 3Н-тимидина 303 332 146 >50 236 407

Олидендроастроцитома II степени Снижение интенсивности включения 3Н-тимидина 913 1042 665 >30 682 949

Астроцитома III степени Снижение интенсивности включения 3Н-тимидина 185 122 119 118 74 >50

Астроцитама II-III степени Снижение интенсивности включения 3Н-тимидина 358 333 362 325 263 >20

Субэпендимная астроцитома Снижение интенсивности включения 3Н-тимидина 305 345 187 126 >50 392

Глиобластома Снижение интенсивности включения 3Н-тимидина 906 487 538 378 >50 766

Ганглионейробластома Снижение интенсивности включения 3Н-тимидина 474 454 511 258 >40 316

Астроцитома III степени Снижение интенсивности включения 3Н-тимидина 511 431 329 275 >40 433

более. При этом флюороурацил оказался наиболее эффективным в 7 случаях, винкристин — в 4 случаях, ломустин — в 4 случаях и карбоплатин — в 2 случаях. Некоторые образцы опухоли были чувствительны к двум препаратам. При этом чувствительность опухоли к тому или иному препарату от гистологического диагноза не зависела (табл.2).

Следует отметить, что контрольные образцы опухолей характеризовались различной интенсивностью включения 3Н-тимидина, что, по-видимому, связано с генетически детерминированными различиями активности ферментов, участвующих в синтезе ДНК и регуляции клеточного цикла.

Таким образом, проведенные исследования свидетельствуют об эффективности метода краткосрочного органного культивирования опухолевых клеток для определения индивидуальной чувствительности внутримозговых глиом к химиопрепаратам.

Список литературы 1. Бондарь Г.В., Кайряк О.В., Лисовская Н.Ю. и др. Определение чувствительности к 5-фто-рурацилу у больных злокачественными опухолями различных локализаций // Антибиотики и химиотерапия. — 1999 — Т.44.— №2. — С.25—29.

2. Культура животных клеток. Методы/ Под. ред. Р. Фрешни. М.: Мир, 1989. — С. 256— 302.

3. Лихтенштейн А.В., Шапот B.C. Опухолевый рост: ткани, клетки, молекулы // Патофизиология и экспериментальная химиотерапия. — 1998. — №3.— С.25—49.

4. Противоопухолевая терапия /Под ред. Н.И. Переводчиковой.— М.: Медицина, 1993. — С.121—122.

5.Abe T., Hasegawa S., Taniguchi K., Yokomizo A., Kuwano T, ono M., Mori T, Hori S, Kohno K.., Kuwano M. Possible involvement of multidrug-resistance-associated protein (MRP) gene expression in spontaneous drug resistance to vincristine, etoposide and adriamycin in human glioma cells// Cancer Res.—1992— V. 52.— N11.— P.3029—3034.

6. Alvarez M., Robey R., Sandor V., Nishiyama K.., Hatsumoto Y., Paull K., Bates S, Fojo T . Using the national cancer institute anticancer drug screen to assess the effect of MRP expression on drug sensitivity profiles // Mol. Pharmacol. — 1998.— V.54.— N5.— P.802—814.

7. Balmaceda C. Advances in brain tumor

chemosensitivity // Tumori. — 1999.— Sep— Kct;83 —. P.17—20

8.Barranco S.C.,Kurm M.E. Kirect drug sensitivity

Применение метода краткосрочного культивирования опухолевых клеток..

test (KKS)// Cell proliferation.— 1993.— V.26.— N 4.— P.369.

9.Jordan J.P., Hand C.M., Markowitz R.S., Black P. Test for chemotherapeutic sensitivity of cerebral gliomas: use of colorimetric MTT assay// J Neurooncol.— 1992.— V.14.— N1.— P.19—35.

10. Molecula genetics of drug resistens. Ed. by JK. Hayes and C.R. Wolf. Amsterdam, Harwood Academic Publishers. — V.1997.— 412p.

11.Petrini M., Galimberti S. Treatment of multidrug resistance in oncology and hematology //Tumori.— 1997.— 83(5 Suppl).— P.17—20.

12.Schold S.C,Friedman H.S,Brent T.P. et al. k6-alkylguanine-KNA alkyltransferase in primary central nervous system neoplasm// J. Neurooncol. —1989.— Suppl.— P.25.

Застосування короткострокового культивування пухлинних кл1тин для визначення шдивщуально! чутливост глюм головного мозку до х1мюпрепарат1в

Зозуля Ю.П, Васильеа 1.Г., Розуменко В.Д., Олексенко Н.П., Главацький Oß, Чувашова О.Ю. Глюми людини мають чггко виражену шдивщуальну чутливють до х1мюпрепарат1в. Для визначення найбшьш ефективних протипухлинних препаратав доцшьно прово-дити тестування тканини пухлини. Ми пропонуемо вико-ристовувати для цього тест i3 включенням Н3 -тимщину в пухлинш клiтини в умовах коротких строгав культивування тканинних трансплантаив. Отримат результати можуть застосовуватись у клШчнш практицi.

Using short-term organ culture for the human brain gliomas individual drug sensitivity.

Zozulia Y.A, Vasilyeva I.G., Rozumenko V.K., olexenko N.P., Glavatsky A.Y., Chuvashova o.Y. Human gliomas have clear expressed individual drug sensitivity. For determination most effective medicine tumor tissue mast be tested. We propose to use for this matter H3—thymidine incorporation test on the short-term cultures. Received results can be used in the clinical practis.