Химическая модификация и биологическая активность флавоноида дигидрокверцетина1

ХИМИЧЕСКАЯ МОДИФИКАЦИЯ И БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ФЛАВОНОИДА ДИГИДРОКВЕРЦЕТИНА1

CHEMICAL MODIFICATION AND BIOLOGICAL ACTIVITY OF DIHYDROQUERCETIN FLAVONOID

Э. Е. Нифантьев, М. П. Коротеев, Т. С. Кухарева, А. М. Коротеев, Н. М. Пугашова, С. Е. Мосюров, Н. М. Кутузова, Г. З. Казиев

Получены комплексы включения дигидрокверцети-на в циклодекстрины. Осуществлено его ацилиро-вание, фосфорилирование и аминометилирование. Изучена биологическая активность полученных соединений.

Ключевые слова: флавоноиды, дигидрокверцетин, циклодекстрин, ацилирование, фосфорилирование, аминометилирование, биологическая активность.

Флавоноиды составляют обширную группу природных соединений, имеющих одинаковый молекулярный скелет, который состоит из трех шестичленных колец, два из которых - ароматические, а третье, как правило, имеет пираноидную природу.

Рис. 1. Дигидрокверцетин таксифолин

Различия заключаются только в числе и положении кислородсодержащих заместителей (уровень окисления). Кольцо А обычно гидроксилировано в положениях, расположенных через одно звено (5 и 7), в то время как в кольце В обычно гидроксилированы соседние положения (в первую очередь 3' и 4'). Этот тип гидроксилирова-ния отражает разное биосинтетическое происхождение двух указанных колец. В природе флавоноиды содержатся исключительно в растениях, нет никаких сведений о том, что их продуцируют животные. Многие члены этого класса природных соединений ярко окрашены и потому играют жизненно важную роль в экологии растений, делая привлекательными для пчел и птиц цветы и плоды со-

E. E. Nifantiev, M. P. Koroteev, T. S. Kukhareva, A. M. Koroteev, N. M. Pugashova, S. E. Mosyurov, N. M. Kutuzova, G. Z. Kaziev

The inclusion complexes of dihydroquercetin and cyclo-dextrin were obtained. Acylation, phosphoryletion and aminomethylation of dihydroquercetin was performed. The biological activity of obtained compounds was studied.

Keywords: flavonoids, dihydroquercetin, cyclodextrin, acylation, phosphorylation, aminomethylation, biological activity.

ответственно. Встречаются и бесцветные флавоноиды. Интересно отметить, что, хотя флавоноиды широко распространены в высших растениях, они отсутствуют у низших форм, таких как лишайники и мхи. Нет никаких данных, что они продуцируются грибами и бактериями. Еще одной причиной разнообразия структур является образование гликозидов, а также метокси- и метилендиокси-групп на более поздних стадиях биосинтеза флавоноидов. Наиболее часто в природе флавоноиды связаны с моносахаридами глюкозой или рамнозой, а также с некоторыми дисахаридами, например рутинозой.

Большой интерес к флавоноидным соединениям вызван тем, что в 1936 г. А. Сент-Дьёрди и группа немецких ученых показали, что целый ряд флавоноидов обладает ярко выраженной биологической активностью, свойственной витаминам. Они частично снимают остроту авитаминоза С, уменьшают проницаемость и ломкость капиллярных кровеносных сосудов. По этой причине фла-воноидные соединения называют также витамином Р (от англ. permeability 'проницаемость'). Типичными представителями веществ с этой активностью являются катехин, кверцетин (флавонон желтых цветов) и его гликозид рутин. Они широко используются при лечении гипо- и авитаминозов, а также при лечении многих заболеваний кровеносных сосудов, гипертонии, кори, скарлатины, сыпного тифа, лучевой болезни и т. д.

В конце 1940-х гг. из коры дугласовой пихты был выделен и охарактеризован дигидрокверцетин

1 Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ 12-03-00326-а.

(таксифолин) (далее - ДГК) [1-2], аналог кверцетина, гидрированный в положениях 2 и 3, также обладающий Р-витаминозной активностью и, кроме того, еще целым рядом других важных и полезных свойств, отсутствующих у большинства биофлавоноидов. Например, для него характерны:

1. Инактивация цитотоксических веществ [3].

2. Антидиабетическое действие [4].

3. Связывание свободных радикалов и предохранение от перекисного окисления [5-6].

4. Снижение содержания липопротеинов в печени и в плазме крови [7].

5. Противоопухолевое воздействие [8].

6. Антимутагенное действие [9].

7. Противорадиационное действие [10].

8. Иммунорегулирующее (антиаллергическое) и противовоспалительное действие [11-12].

9. Нормализующее воздействие на ферментативные системы клетки [13].

10. Обезболивающее и противоотечное действие [14].

11. Низкая мутагенная активность и токсичность [15-16].

12. Противовирусное действие [17].

В 2002-2004 гг. нами были разработаны и запатентованы простые и удобные способы выделения ДГК из отходов древесины сибирской лиственницы (комлевая часть, пеньки) [18-19]. Вещество охарактеризовано современными физико-химическими методами ЯМР и РСА.

Методом рентгеноструктурного анализа (см. рис. 2) показано, что получаемый продукт оптически чистый (пространственная группа С2). Доказана полная идентичность вещества фармакопейному препарату.

Рис. 2. Молекула ДГК: а) фармакопейный препарат

Обладая уникальными биологическими свойствами, ДГК имеет один недостаток, это плохая растворимость флавоноида в воде при нормальной температуре, что является препятствием для приготовления его инъекционной формы. Отсутствие хорошей растворимости свободного ДГК в воде и физиологическом растворе препятствует его усвоению организмом и при пероральном приеме.

1. Водорастворимый дигидрокверцетин

В связи со сказанным мы разработали способ получения неизвестных ранее аддуктов ДГК. С этой целью были синтезированы комплексы включения ДГК в а- и в-цикло-декстрины. Эти супрамолекулярные представители обладают повышенной водорастворимостью, пролонгирован-

ным действием в организме и устойчивостью при транспортировке в кровяном русле. Процесс получения комплекса ДГК с в-циклодекстрином протекает по следующей схеме:

С Н О- 2,5 НО + С Н О • 6 НО ^ С Н О • п НО

15 12 7 '-•-'"2 42 70 35 57 82 42 2

Таксифолин (1) в-циклодекстрин Комплекс

включения

Было показано, что растворимость в воде при 20 °С выделенного супрамолекулярного соединения состава ДГК : в-циклодекстрин 1:1 по сравнению со свободным ДГК (0,3 г/л) и свободным в-циклодекстрином (18,5 г/л) заметно увеличивается и составляет 53,2 г/л.

Полученные соединения включения были изучены на сравнительную со свободным ДГК скорость диффузии (проникновения) через бислой стандартных двухслойных липосом из яичного лецитина, являющихся хорошей моделью клеточных мембран. Установлено, что «невключен-ный» (индивидуальный) ДГК сильно связывается с мембранами и внутрь клеток практически не поступает. В то же время «включенный» таксифолин в течение нескольких часов дозированно поступает в клетки, то есть является препаратом пролонгированного действия.

Наиболее показательным способом исследования проницаемости ДГК через биомембраны является определение его содержания в крови после перорального введения в желудок в виде пищевой добавки. Через 2,53 ч после введения чистого ДГК и его производных а-циклодекстрин + ДГК и в-циклодекстрин + ДГК в плазме крови крыс был обнаружен ДГК только в случае использования препарата в-циклодекстрин + ДГК. Следовательно, можно утверждать, что введение указанного препарата обеспечивало эффективное проведение ДГК в кровяное русло крыс.

При введении чистого несвязанного ДГК в желудок крыс он накапливается в их печени и при большой концентрации может вызывать аллергию и другие виды токсикации. В то же время ДГК в комплексе с в-циклодекстрином в печени не накапливается и не вызывает побочного токсического действия.

Строение инкапсулированного ДГК (2) исследовано методом РСА. Результат рентгенодифракционного исследования монокристаллического комплекса включения подтверждает его состав ДГК : в-циклодекстрин в соотношении 1:1. В проекции на плоскость его структура выглядит следующим образом (рис. 3).

Таким образом, найден способ получения неизвестных ранее комплексов включения флавоноида ДГК с а- и в-ци-клодекстринами путем взаимодействия гостя и хозяина.

Показано, что использование ДГК в виде комплекса с в-циклодекстрином более перспективно в медикаментозном аспекте, чем чистого ДГК. На данное изобретение нами был получен патент РФ № 2396077 в 2010 г. [20].

б)

Рис. 3. Проекция соединения включения ДГК в в-циклодекстрине

2. Модифицированные производные дигидрокверцетина

2.1. Синтез сложных эфиров дигидрокверцетина

Наиболее ранними исследованиями в области получения сложных эфиров таксифолина следует признать его ацетилирование. При обработке ДГК уксусным ангидридом с высокими выходами были синтезированы ацетильные производные ДГК: тетраацетат (3) и пентаацетат (4) дигидрокверцетина [21]. Подробное изучение структуры ацетатов проводили при помощи УФ-, ИК-, ЯМР-спектроскопии [21-22]. Различием в способах получения служили условия проведения реакций, так как для получения пентаацетата дигидрокверцетина нужны более жесткие условия, способствующие разрыву водородной связи, в частности более высокая температура (120°С) и катализатор (рис. 4).

В настоящее время структура (3) исследована при помощи метода рентгеноструктурного анализа (рис. 5) [23]. Геометрические характеристики молекулы после ацети-лирования по сравнению с таковыми для исходного фла-воноида практически не изменяются. В молекуле тетра-ацетата дигидрокверцетина сохраняется водородная связь между атомом кислорода карбонильной группы и атомом водорода гидроксильной группы в пятом положении. Угол поворота ароматического кольца B также практически не изменяется.

Позднее при использовании тех же реагентов другими авторами были подобраны условия выделения из реакционной смеси хроматографическим путем триацетата ДГК - 3',4',7-триацетата дигидрокверцетина (5) [23].

Более сложные ацильные производные ДГК были получены в нашей лаборатории обработкой флавоноида

серией смешанных ангидридов карбоновых кислот. При этом были выбраны кислоты, являющиеся синтетическими предшественниками лекарственных средств: бензойная, ацетилсалициловая, никотиновая, п-нитробензойная, фенилуксусная, пальмитиновая и триметилуксусная. Перациль-ные производные ДГК (6-11) получали при обработке ДГК 10%-ным избытком хлорангидридов перечисленных ароматических и алифатических кислот при комнатной температуре или слабом нагревании (40-60°С) по схеме (рис. 6.).

Были выделены и охарактеризованы следующие сложные эфиры: 3,3',4',5,7-пентабензоил-2,3-дигидрокверцетин (6а), 3,3',4',5,7-пентаацетил-салицил-2,3-дигидрокверцетитин (6б), 3,3',4',5,7-пентаникотиноил-2,3-дигидрокверцетин (7), 3,3', 4',5,7-пента-п-нитробензоил-2,3-дигид-рокверцетин (8), 3,3',4',5,7-пентафенилацитил-2,3-дигидрокверцетин(9),3,3',4',5,7-пентапальмитоил-2,3-дигидрокверцетин (10), 3,3',4',5,7-пентатриме-тилацетил-2,3-дигидрокверцетин (11).

Выходы соединений в зависимости от кислотного остатка составляли от 61 до 82%. Оказалось, что после введения в молекулу ДГК ациль-ных групп, ее можно рассматривать как потенциальную биоактивную структуру, которая существенно расширяет спектр биологического действия данного флавоноида. Это подтвердили проведенные биологические тесты (см. раздел 3).

Строение всех продуктов, ранее неизвестных, доказано методом спектроскопии ЯМР 1Н и 13С и подтверждено данными элементного анализа [24].

АсО

Ас2О

Ру

20 0С

Ас2О -

СН3СОО№ 1

АсО

ОАс ОАс

ОАс ОАс

АсО

Рис. 4. Производные ДГК - тетраацетат (3) и пентаацетат (4) дигидрокверцетина

Рис. 5. Независимая молекула 3,3',4,7-тетраацетил-2,3-дигидрокверцетина

I

HO

HO

O

OH OH

%

5.5 R-

- I

CH

3

O Cl

N

V/R

R

^ R

NO2

Рис. 6. Получение перацильных производных ДГК

C15H31

С

HO

.OH

OH

OH

OH O

PX3

a: X=NEt2; b: X=

X2P

.O

OH O

OH

OH [Z]

Z

К X2P

.O

OH OH

OH O

Рис. 7. Получение фосфорсодержащих производных ДГК

2.2. Синтез фосфорсодержащих дигидрокверцетинов

Исследование реакций фосфорилирования ДГК помимо научного интереса имеет и практическое значение, так как в результате взаимодействия образуются новые органические соединения, которые могут обладать потенциальной антиоксидантной, противовоспалительной и противоопухолевой активностью. Мы исследовали возможность фосфо-рилирования ДГК различными по природе производными фосфористой кислоты (хлорангидридами, амидофосфита-ми) и хлорангидридами фосфорной кислоты.

А. Фосфорилирование триамидами фосфористой кислоты

В молекулы фосфотриамидов включены три активных реакционных центра, благодаря чему возможен ши-

рокий диапазон особенностей фосфорилирования ДГК данными реагентами.

Фосфорилирование ДГК гексаметилтриамидом фосфористой кислоты в соотношении реагентов 1:1 проводили в диоксане при охлаждении. По окончании процесса в спектре ЯМР 31Р реакционной смеси наблюдали несколько сигналов с химическими сдвигами в области 149-151 и 133-134 м. д.2 Согласно этим данным, фосфорилирование проходит неселективно по нескольким фенольным гидроксильным группам.

Таким образом, гексаметилтриамид фосфористой кислоты, по-видимому, являлся слишком активным реагентом для селективного фосфорилирования ДГК.

Принимая во внимание данный факт, мы решили использовать менее активные фосфотриамиды - гексаэтил-триамид и трипиперидид фосфористой кислоты [25].

М. д. - миллионная доля частоты прибора.

2

Получение тетраэтилдиамидо- и дипиперидилфосфи-тов ДГК в чистом виде явилось результатом сложной работы по подбору условий проведения региоселективного процесса. Фосфорилирование осуществляли при более низкой температуре (10°С), сильном разбавлении реакционной смеси (Спг„ 0,01М) и очень медленном добавлении реагента к раствору ДГК (рис. 7).

Далее без выделения из реакционной смеси полученные амидофосфиты дигидрокверцетина (12a-b) подвергались сульфуризации с образованием продуктов (13a-b) и селенизации с образованием продуктов (14a-b), которые очищали методом колоночной хроматографии на силикагеле. Они представляли собой порошки светло-желтого цвета. Их строение доказано методом спектроскопии ЯМР 1Н и 13С, а состав подтвержден данными элементного анализа. В спектрах присутствуют все необходимые сигналы протонов и атомов углерода флавоноидной матрицы и заместителей (см. рис. 8).

Б. Фосфорилирование диамидоэфирами фосфористой кислоты

В продолжение исследований в области синтеза фосфорсодержащих флавоноидов было изучено фосфорили-рование ДГК диамидоэфирами фосфористой кислоты.

В качестве фосфорилирующих реагентов были использованы этиловый, бутиловый и изопропиловый эфи-ры тетраэтилдиамида фосфористой кислоты [21].

В спектрах ЯМР 31Р реакционных смесей наблюдались синглеты с химическими сдвигами 144,9 м. д. (15a), 146,4 м. д. (15b) и 145,3 м. д. (15с).

Образующиеся промежуточные производные трехвалентного фосфора на основе ДГК (15а-с) без выделения из реакционной смеси переводили в соответствующие тион- и се-ленонфосфатные производные (16а-с) и (17а-с). В спектрах ЯМР 31Р наблюдались синглеты с соответствующими химическими сдвигами. Образование только одного стереоизомера, а не их смеси, вероятно, объясняется большим объемом заместителя и, как следствие, значительной разницей энергетических уровней двух возможных стереоизомеров. Очистку соединений проводили методом колоночной хроматографии.

Строение полученных соединений однозначно доказано методом спектроскопии ЯМР 1Н, а состав подтвержден данными элементного анализа. В спектре присутствовали все необходимые сигналы протонов молекулы фла-воноида и заместителей.

В. Фосфорилирование моноамидодиэфирами фосфористой кислоты

В продолжение работы была изучена возможность фосфорилирования ДГК менее активным типом фосфори-лирующих реагентов - моноамидодиэфирами фосфористой кислоты.

Так, фосфорилирование эквимолярным количеством неопентилендиэтиламидофосфита в диоксане при охлаждении протекало достаточно медленно - порядка 36 ч. При этом в спектре ЯМР 31Р наблюдали синглет с химическим сдвигом 115,4 м. д. (рис. 11).

Выдерживание реакционной смеси при 40 °С позволило сократить время реакции до 7 ч. Увеличение температуры процесса до 60°С сопровождалось фосфорили-

Рис. 8. Спектр ЯМР 1Н 7-тетраэтилдиамидотионфосфата ДГК

HO

OH OH

ROV /Ov P

ROP(NEt2)2 Et2N"

O

-OH

^/^OH OH

OH O

OH O

(15 a-c) a) R=Et;

b) R=r-Pr;

c) R=Bu

Рис. 9. Фосфорилирование ДГК диамидоэфирами фосфористой кислоты

>

Et2N

OH OH

OH O

[Z]

RO

Et2N

Z ~P

,O

OH O

Рис. 10. Получение тион- и селенфосфатных производных ДГК

OH OH

(16 a-c: Z=S); (17 a-c: Z=Se).

HO

OH

OH

OH

OH O

+

H3C /—O

'XI)

H'C O

P—NEt2

H'C H'C

O

p— O

O

OH OH

OH O

Рис. 11. Первый этап фосфорилирования ДГК моноамидодиэфирами фосфористой кислоты

H'C H'C

O

p— O

O

OH

OH O

OH OH

H'C H'C

[Z]

O Z

p-— O

/ O

OH O

OH

OH 1'

Рис. 12. Второй этап - взаимодействие с серой и селеном

рованием спиртовой гидроксильной группы, о чем свидетельствовало появление нового синглета в фосфорном спектре с химическим сдвигом 122,3 м. д. Применение же более высокой температуры привело к деструктивным процессам.

Вещество (19) из реакционной смеси не выделяли вследствие его лабильности, а сразу вводили во взаимодействие с серой и селеном (рис. 12).

После сульфуризации и селенизации, проведенных в течение 3 ч и нагревании до 40оС, в реакционной смеси фиксировали синглеты с химическими сдвигами 53,9 м. д. (20а) и 66,3 м. д. (20Ь).

Аналогично проводили синтез с использованием N-метил-, N-фенилдиэтиламидофосфитов.

После присоединения серы целевой продукт (20а) выделяли методом колоночной хроматографии (выход 45%).

Строение полученных тионфосфатов (20а) и (23) доказано методом спектроскопии ЯМР 1Н и 31Р. В фосфорных спектрах наблюдались синглеты с химическими сдвигами 53,9 и 61,2 м. д. соответственно. В спектрах ЯМР 1Н отсутствовал сигнал от протона в положении 7 молекулы флавоноида и наблюдались все необходимые сигналы протонов заместителей.

ТО

OH

OH

^О^Р-К

,Ме

^О^Р'

„О.

OH в

OH

ОН

ОН О

(КО^Р^

О

ОН ОН

Н3С /— (19^= 3

Н3С

ОН О

(20 а:

Н3С

а: R= 3)Г

Н3С

Рис. 13. Общая схема получения конечного продукта

I + + NHRR'

NRR' OH O

(24): R=R-z-Pr;

(25): R = Me, R' = CH2C6H5.

CH2

I + 2CH2O + 2HNRR-

HO

H2C

OH

NRR' OH O

(26): R=R-^Pr;

(27): R = Me, R' = CH2C6H5.

Рис. 14. Синтез аминометилированных производных ДГК

8

8

)

8

)

2.3. Синтез аминометилированных производных дигидрокверцетина

ДГК хорошо вступает в реакцию Манниха с участием формальдегида и аминов различного строения. Как показали наши исследования, продукты реакции самопроиз-

вольно с хорошими выходами выделяются из реакционной смеси (рис. 14).

Многие выделенные вещества обладают высокой биологической активностью, например нейротропным [26] и антипролиферативным [27] действием.

3. Биологическая активность модифицированных производных дигидрокверцетина

3.1. Биологическая активность перацилирован-ных производных дигидрокверцетина

На кафедре молекулярной фармакологии и радиобиологии медико-биологического факультета Российского государственного медицинского университета (г. Москва) исследовали фармакологическая активность некоторых из синтезированных перацильных производных ДГК [27].

Так изучали влияние пентабензоата (6a), пента-п-нитро-бензоата (8), пентаацетилсалицилата (6b) и пентаникотината дигидрокверцетина (7) на жизнеспособность нормальных и опухолевых клеток на культуре фибробластов кожи новорожденных крысят и культуре клеток MCF-7 (рак молочной железы человека). Действие препаратов на клеточный рост определяли микроколориметрическим методом при помощи МТТ-теста [28], который основан на способности дегидрогеназ живых клеток восстанавливать бесцветную форму соли тетразо-лия (3-[4,5-диметилтиазол 2-ил]-2,5-дифенилтетразолия бромид, МТТ-реагент) с образованием голубых кристаллов фор-мазана, растворимого в диметилсульфоксиде. Оптическое поглощение растворенного в диметилсульфоксиде формазана пропорционально количеству живых клеток в пробе. Ингиби-рование роста клеток в пробе определяли по формуле ИК% = (1 - N/N>100.

v ok'

Соединение считали активным, если концентрация 100 мкМ вызывала ингибирование роста клеток > 50%.

Исследование показало наличие зависимости цитоток-сического эффекта от концентрации исследуемого соединения и его химического строения. Наибольшей активностью обладали пента-п-нитробензоат, пентаацетилсалицилат и пентаникотинат дигидрокверцетина (см. табл. 1 и 2). Наибо-

Примечание: С - концентрация, % - процент жизнеспособных клеток.

Таблица 2

Влияние производных ДГК на жизнеспособность фибробластов крыс

Исследуемые соединения С, мг/мл

1,0 0,1 0,01

Пента-га-нитробензоат ДГК (8) 26% 85% 110%

Пентаацетилсалицилат ДГК (6b) 70% 98% 102%

Пентаникотинат ДГК (7) 22% 88% 104%

Примечание: С - концентрация, % - процент жизнеспособных клеток.

лее выраженное цитостатическое действие в концентрации 1 мг/мл проявлял пентаникотинат дигидрокверцетина.

Для изучения антиоксидантной активности производных использовали метод хемилюминесценции на модели гомогената мозга крысы [5; 29]. Для индукции перекис-ного окисления липидов (ПОЛ) в систему добавляли ионы двухвалентного железа, что инициировало процесс ПОЛ, сопровождаемый хемилюминесценцией.

Исследование показало, что изученные соединения неоднозначно влияют на процессы ПОЛ в гомогенате мозга крыс. Наибольшей ингибирующей активностью обладали дигидрокверцетин и пентаникотинат дигидрокверцетина, которые уменьшали амплитуду медленной вспышки на 60% (см. табл. 3).

Кроме того, впервые синтезированные соединения: 3,3,4,5,7-пентаацетилсалицилат-2,3-дигидрокверцетина (6b) и 3,3,4,5,7-пента-п-нитробензоат-2,3-дигидрокверцетина (8) и 3,3,4,5,7-пентаникотинат-2,3-дигидрокверцетина (7) были исследованы на противовоспалительную активность.

В качестве модели для исследования противовоспалительных свойств этих соединений мы взяли модель ожогового поражения, так как она обладает наибольшей выраженностью окислительного стресса и воспалительной реакции у животных.

Исследуемые препараты вводили в виде аппликаций на ожоговую поверхность кожи лабораторных мышей в определенной концентрации. После проведения лечения у животных определялись показатели интенсивности процессов ПОЛ и исследовались концентрации первичных и третичных продуктов ПОЛ - диеновых конъюгат (ДК) и малонового диальдегида (МДА) в исследуемых тканях (печень и почки) по сравнению с контролем.

Определение концентрации малонового диальдегида МДА проводили по методу, описанному в работе [30]. Концентрацию ТБК-продуктов рассчитывали согласно методике, описанной в статье [31]. Определение концентрации диеновых конъюгатов (ДК) в гомогенатах тканей и гемолизате эритроцитов осуществляли по методике, описанной в работе [32].

Показано, что применение данных препаратов достоверно снижает проявления окислительного стресса, процессы ПОЛ и, следовательно, подтверждает их противовоспалительное действие.

Значительный интерес представляла оценка взаимосвязи между антиоксидантной активностью изученных соединений и их химической структурой. Производные ДГК по структуре представляют собой систему фенольных остатков, связанных с различными заместителями. Фе-нольное кольцо, благодаря системе сопряженных двойных связей, легко передает электроны свободным радикалам, превращаясь при этом в феноксирадикал, который является достаточно стабильным и в дальнейшем продолжении цепи не участвует. Известно, что значительной антиоксидантной активностью обладают пространственно-затрудненные фенолы, реагирующие в основном с радикалами ROO. и прерывающие цепь окисления.

Определяющим для антиоксидантной активности фактором в структуре фенолов является строение О-ацильных

Таблица 1

Влияние производных ДГК на жизнеспособность клеток MCF-7

Исследуемые соединения С, мг/мл

1,0 0,1 0,01

Пента-га-нитробензоат ДГК (8) 40% 91% 96%

Пентаацетилсалицилат ДГК (6b) 65% 90% 105%

Пентаникотинат ДГК (7) 14% 98% 97%

Таблица 3

Влияние производных ДГК на амплитуду медленной

вспышки кривой Ре2+-индуцированной хемилюминесценции гомогената мозга крыс (% по отношению к контролю); растворитель - ДМСО

Группа Н

Дигидрокверцетин (1) 100

Пентабензоат ДГК (6а) 13 ± 8

Пента-га-нитробензоат ДГК (8) 20 ± 9

Пентаацетилсалицилат ДГК (6b) 9 ± 5

Пентаникотинат ДГК (7) 60 ± 5

Примечание: Н - амплитуда медленной вспышки хемилюминесценции; концентрация производных дигидрокверцетина 10-4М.

радикалов, а также характер пара-заместителя. Введение в пара-положение пространственно-затрудненных фенолов электронодонорных заместителей увеличивает их антиок-сидантную активность, в то время как введение электроно-акцепторных заместителей - уменьшает.

Так, в случае с пентаникотинатом дигидрокверцетина можно предположить, что его высокая антиоксидантная активность связана со смещением электронной плотности от центральных колец в сторону переферических благодаря наличию у них связи с азотом.

Таким образом, применение в качестве ацилирующих реагентов хлорангидридов ароматических карбоновых кислот, содержащих в своем составе электроноакцептор-ные заместители, позволяет получить сложные эфиры ДГК и существенно улучшить их фармакодинамику при биологических испытаниях.

3.2. Биологическая активность фосфорилирован-ных производных дигидрокверцетина

Известно, что фосфорилирование природных соединений, таких как углеводы, липиды, нуклеозиды, приводит к усилению и расширению спектра биологического действия, в том числе появлению антипролиферативных свойств [33]. Именно поэтому мы использовали фосфорилирование ДГК для получения соединений с цитотоксиче-ской и противоопухолевой активностью.

К сожалению, в научной литературе не представлены достоверные данные о способности немодифицированного ДГК прямо влиять на рост опухолевых клеток. Поэтому мы синтезировали соединения, в которых молекула нативного ДГК использовалась в качестве носителя активных цитоток-сических фосфорсодержащих фармакофорных групп.

В РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН (г. Москва) проведен анализ цитотоксического эффекта ряда фосфорсодержащих производных ДГК [34]: 7-неопентилентионфосфата (20а), 7-неопентиленселенонфосфата (20Ь), 7-диэтилами-доэтилтионфосфат (16а), 7-диэтиламидоэтилселенонфос-фата (17а), 7-тетраэтилдиамидотионфосфата (13а), 7-тетр аэтилдиамидоселенонфосфата (14а), 7-дипиперидилти-онфосфата (13Ь) и 7-дипиперидилселенонфосфата (14Ь).

В опытах в качестве объектов исследования использовали линии опухолевых клеток человека - карциному яичника СэОу и Т-лимфому .1игка1:. Клеточные культуры

выращивали в среде RPMI 1640, содержащей 10% эмбриональной сыворотки теленка.

Цитотоксическую активность препаратов оценивали по способности соединений подавлять рост опухолевых клеток. Влияние на рост опухолевых клеток оценивали с помощью стандартного МТТ-теста с использованием МТТ-реагента (3,4,5-диметилтиазол-2-ил-2,5-дифенилтетразолиум бромид). Соединение считали активным, если концентрация 100 мкМ вызывала подавление роста клеток не менее 50%. Ошибка измерений не превышала 5%. Активные соединения исследовали на экспериментальных опухолях мышей in vivo.

Противоопухолевую активность оценивали in vivo на перевиваемых опухолях мышей-гибридов первого поколения BDF1 массой 18-25 г. Перевиваемые опухоли входят в число обязательных моделей опухолей животных, которые используются при отборе новых противоопухолевых веществ - лимфоцитарной лейкемии Р-388, аденокарциноме Са-755 и эпидермоидной карциноме легкого Льюис (LCC).

Противоопухолевый эффект оценивали по торможению роста опухоли (ТРО) и по увеличению продолжительности жизни леченых животных (УПЖ). Минимальные критерии активности ТРО > 50%, УПЖ > 25%.

Токсичность препаратов оценивали по ранней гибели мышей по сравнению с гибелью контрольных животных и состоянию внутренних органов животных (селезенка, легкие, наличие метастаз в легких), изменению массы тела по отношению к исходной массе. 7-диэтиламидоэтилти-онфосфат (16а) растворяли в ДМСО и разводили физиологическим раствором, чтобы концентрация ДМСО составляла не более 10%. Соединение вводили ежедневно внутри-брюшинно в течение 5 дней в дозах 10 мг/кг, 25 мг/кг, 50 мг/ кг, 75 мг/кг, 100 мг/кг, 125 мг/кг и 150 мг/кг. Лечение начинали через 48 ч после перевивки солидных опухолей (Са-755 и LCC) и через 24 ч после перевивки Р-388.

Из результатов, представленных в таблицах 4 и 5, следует, что 7-диэтиламидоэтилтионфосфат дигидрокверцетина в концентрации 100 мкМ ингибировал рост клеток линий СaOv и Jurkat на 83.9% и 84.8%, соответственно. ИК50 в обоих случаях составила 50 мкМ.

Данное соединение было рекомендовано для изучения противоопухолевой активности in vivo. При изучении противоопухолевой активности соединения на Р-388 было показано, что препарат при введении в дозах от 10 до 100 мг/кг не оказывал противоопухолевого действия, то есть не вызывал УПЖ.

Противоопухолевая активность соединения также изучена на Са-755 в широком диапазоне доз от 25 мг/кг до 125 мг/кг. 7-диэтиламидоэтилтионфосфат дигидрокверцетина был неэффективен в дозах 25, 50 и 75 мг/кг. В то же время соединение в дозах 100 мг/кг и 125 мг/кг проявило умеренный противоопухолевый эффект непосредственно после окончания ежедневного внутрибрюшинного введения в течение 5 дней: ТРО = 51% и ТРО = 57% соответственно.

На LCC выявлен высокий терапевтический эффект изучаемого вещества, который зависел от введенной дозы соединения. Максимальное торможение роста LCC соединение проявило в дозах 75 мг/кг и 100 мг/кг: ТРО = 89% и 88% соответственно, после окончания введения.

Таблица 4

Цитотоксический эффект производных ДГК в концентрации 100 мкМ на клетках линии CaOv in vitro

Соединение Ингибирова-ние пролиферации клеток (ИК), % ИК50, мкМ

ДГК (1) 0

7-диэтиламидоэтилтионфосфат ДГК (16а) 83,9 50

7-тетраэтилдиамидотионфосфат ДГК (13а) 85,3 50

7-тетраэтилдиамидоселенонфосфат ДГК (14а) 79,2 60

7-дипиперидилтионфосфат ДГК (13b) 76,3 65

7-дипиперидилселенонфосфат ДГК (14b) 77,0 70

того, было выявлено, что полученные производные существенно усиливают антиоксидантные свойства ДГК [35-36].

Подводя общий итог, следует отметить, что в результате химической модификации ДГК существенно расширяется спектр биологического действия этого уникального флавоноида.

СПИСОК ИСТОЧНИКОВ И ЛИТЕРАТУРЫ

Таблица 5

Цитотоксический эффект производных ДГК в концентрации 100 мкМ на клетках Т-лимфомы линии Jurkat in vitro

Соединение Ингибирова-ние пролиферации клеток (ИК), % ИК50, мкМ

ДГК (1) 0

7-неопентилентионфосфат ДГК (20а) 16,3 >>100

7-неопентиленселенонфосфатДГК (20b) 16,3 >>100

7-диэтиламидоэтилтионфосфат ДГК (16а) 84,8 50

7-диэтиламидоэтилселенонфосфат ДГК (17а) 66,9 80

Высокий терапевтический эффект сохранялся еще в течение 10 дней: 74% и 68% соответственно.

Кроме того, соединение проявило антиметастатическое действие. Однако статистически значимый антиметастатический эффект соединение проявило только в дозе 25 мг/кг и торможение роста метастаз составило 37%.

Также установлено, что 7-диэтиламидоэтилтионфос-фат дигидрокверцетина (16а) обладает низкой токсичностью при терапевтической дозе 75-100 мг/кг. LD50 для мышей-самцов при ежедневном внутрибрюшинном введении в течение 5 дней составила 150 мг/кг.

Из приведенных выше результатов исследований следует, что активность по отношению к клеткам рака яичников человека CaOv проявили тионфосфаты, содержащие в своем составе связь P-N; цитотоксическое действие селенон-фосфатов аналогичного строения немного меньше (при этом их ИК50 гораздо выше) либо вообще отсутствовало. При замене атомов азота, серы (селена) на атомы кислорода, а также атомов азота на атомы углерода, цитотоксическая активность соединений, к сожалению, не проявлялась.

Таким образом, установлено, что 7-диэтиламидоэтил-тионфосфат дигидрокверцетина (16а) является новым оригинальным соединением с противоопухолевым эффектом на некоторых перевиваемых солидных опухолях мышей при низкой токсичности, а также обладает антиметастатическим действием.

3.3. Биологическая активность аминометилиро-ванных производных дигидрокверцетина

Показано, что 6-изопропиламинометилдигидроквер-цетин (24) обладает актопротекторным действием, кроме

1. Rew J. C. A flavonone from Douglas-fir heartwood // J. Am. Chem. Soc. 1948. Vol. 70, № 9. P. 3031-3034.

2. Kurth E. F., Chan F. L. Extraction of tannin and dihydroquercetin from Douglas-fir bark // J. Amer. Leather Chem. Assoc. 1953. Vol. 48, № 1. P. 20-32.

3. Habtemariam S. Flavonoids as inhibitors or enhancers of the cytotoxicity of tumor necrosis factor-alpha in L-929 tumor cells // J. Nat. Prod. 1997. Vol. 60, № 8. Р. 775-778.

4. Haraguchi H, Ohmi I., Fukuda A., et al. Inhibition of aldosereductase and

sorbitol accumulation by astilbin and taxifolin dihidro-flavols in Engelhardtia chrysolepis // Biosci. Biotech-nol. Biochem. 1997. Vol. 61, № 4. Р. 651-654. Колхир В. К., Тюкавкина Н. А., Быков В. А. [и др.] Диквертин - новое антиоксидантное и ка-пилляропротективное средство // Хим.-фарм. журн. 1995. № 9. С. 775-778. Теселкин Ю. О., Жамбалова Б. А., Бабенкова И. В. [и др.] Антиоксидантные свойства дигидрокверцетина // Биофизика. 1996. Т. 41, № 3. С. 620-624. Igarashi K, Uchida Y, Murakami N, et al. Effect of astilbin in tea processed from leaves of Engelhardtia chrysolepis on the serum and liver lipid concentrations and on the erythrocyte and liver antioxidative enzyme activities of rats // Biosci. Biotechnol. Biochem. 1996. Vol. 60, № 3. Р. 513-515. Chu S.C., Hsieh Y.S., Lin J.Y. Inhibitory effects of flavonoids on Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase activity // J. Nat. Prod. 1992. Vol. 55, № 2. Р. 179-183. Huang M. T, Wood A. W., Newmark H. L, et al. Inhibition of mutagenicity of bay-region diol epoxides of polycyclic aromatic hydrocarbons by tannic acid, hydroxylated anthraquinones and hydroxylated cinnamic acid derivatives // Carcinogenesis. 1983. Vol. 4, № 12. Р. 1631-1637.

10. Ильюченок Т. Ю., Хомченко А. И., Фригидова Л. М. [и др.] // Фармокология и токсикология. 1975. Т. 38, № 5. С. 607.

11. Bronner C., Landry Y. Kinetics of the inhibitory effect of flavonoids on histamine secretion from

5.

6.

7.

9.

mast cells // Agents Actions. 1985. Vol. 16, № 3-4. Р.147-151.

12. Schwartz A., Middleton E. Jr. Comparison of the effects of quercetin with those of other flavonoids on the generation and effector function of cytotoxic T-lymphocytes // Immunopharmacology. 1984. Vol. 7, № 2. Р. 115-126.

13. Vladutiu G. D, Middleton E. Jr. Effects of flavonoids on enzyme secretion and endocytosis in normal and mucolipidosis fibroblasts // Life Sci. 1986. Vol. 39, № 8. Р. 717-726.

14. Cechinel-Filno V., Vaz Z. R, Zunino L. Antinocicep-tive and anti-oedematogenic properties of astilbin, taxifolin and some related compounds // Arznem.-Forsc. Drug Res. 2000. Vol. 50, № 3. Р. 517-719.

15. Jurado J., Alejandre-Duran E, Alonso-Moraga A., et al. Study on the mutagenic activity of 13 bioflavonoids with the Salmonella Ara test // Mutagenesis. 1991. Vol. 6, № 4. Р. 289-295.

16. Solimani R. Quercetin and DNA in solution: analysis of the dynamics of their interaction with a linear dichroism study // Int. J. Biol. Macromol. 1996. Vol. 18, № 4. Р. 287-295.

17. Biziagos E, Crance J. M., Passagot J., et al. Effect of antiviral substances on hepatitis A virus replication in vitro // J. Med. Virol. 1987. Vol. 22, № 1. Р.57-66.

18. Нифантьев Э. Е, Коротеев М. П., Казиев Г. З., Уминский А А. Способ выделения дигидрокверце-тина / ПАТЕНТ РФ на изобретение № 6153271. За-рег. в Гос. реестре изобретений РФ 15 мая 2002 г.

19. Нифантьев Э. Е, Коротеев М. П., Казиев Г. З., Кухарева Т. С. Способ комплексной переработки древесины лиственницы / ПАТЕНТ РФ на изобретение № 2233858. Зарег. в Гос. реестре изобретений РФ 10 августа 2004 г.

20. Коротеев А. М., Казиев Г. З., Коротеев М. П., Ни-фантьев Э. Е., Шутов В.М. Водорастворимое комплексное соединение включения дигидрокверце-тино-0-циклодекстрин и способ его получения / ПАТЕНТ РФ на изобретение № 2396077. Зарег. в Гос. реестре изобретений РФ 10 августа 2010 г.

21. Aft H. Chemistry of dihydroquercetin. I. Acetate derivatives // J. Org. Chem. 1961. Vol. 26. P. 1958-1963.

22. Weinges T. Carbon-13 NMR of flavonoids // Phytochemistry. 1971. № 10. P. 829-832.

23. Kiehlmann E., Biradha K., Domasevitch K. V., Za-worotko M. J. Crystal structures of dihydroquercetin 3-acetate and dihydroquercetin 3,3',4',7-tetraace-tate: hydrogen bonding in 5-hydroxyflavanones // Can. J. Chem. 1999. Vol. 77, № 8. P. 1436-1443.

24. Нифантьев Э. Е., Крымчак М. С., Коротеев М. П., Коротеев А. М., Кухарева Т. С. Полное аци-лирование дигидрокверцетина // Журн. Общ. хим. 2011. Т. 81, Вып. 1. С. 106-109.

25. Nifant'ev E. E., Kukhareva T. S., Dzgoeva Z. M., Vasyanina L. K., Koroteev M. P., Kaziev G. Z.

Selective Phosphorylation of Dihydroquercetin with Trivalent Phosphorus Reagents // Heteroatom Chemistry. 2003. Vol. 4. P. 399-403.

26. Сергиевич А. А., Баталова Т. А., Пласти-нин М. Л., Коротеев М. П., Коротеев А. М., Кухарева Т. С., Нифантьев Э. Е. Актопротекторные и нейротропные эффекты нового производного дигидрокверцетина // Вестн. новых мед. технологий. 2011. Т. XVIII, № 2. C. 77.

27. Роговский В. С., Матюшин А. И., Шиманов-ский Н. Л., Семейкин А. В., Кухарева Т. С., Короте-ев А. М., Коротеев М. П., Нифантьев Э. Е. Анти-пролиферативная и антиоксидантная активность новых производных дигидрокверцетина // Экспе-рим. и клин. фармакология. 2010. № 9. С. 39-42.

28. Хабриев Р. У. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. М.: Медицина, 2005. С. 832.

29. Казаков В. П. Хемилюминесценция уранила, лантаноидов и других элементов. М.: Наука, 1980.С.176.

30. Uchiyama M., Mihara M. Determination of malon-aldehyde precursor in tissues by thiobarbituric acid test // Anal. Biochem. 1978. Vol. 86. Р. 271.

31. Гаврилов В. Б., Гаврилова А. Р., Мажуль Л. М. Анализ методов определения продуктов пере-кисного окисления липидов в сыворотке крови по тесту с тиобарбитуровой кислотой // Вопр. мед. химии. 1987. Т. 33, № 1. С. 116-122.

32. Стальная Е. А. Метод определения диеновой конъюгации ненасыщенных высших жирных кислот // Совр. методы в биохимии. М.: Меди-цина,1977. С.63-64.

33. Зинченко В. П., Коротеев М. П., Нифантьев Э. Е., Кочетков Н. К. Эффект понижения ионов кальция Ph-стимулированных митогенами тимоцитов при действии амидофосфатов углеводов // Докл. АН СССР. 1987. Т. 297. Вып. 7. С. 1482-1490.

34. Нифантьев Э. Е., Коротеев М. П., Казиев Г. З., Кухарева Т. С., Жукова О. С., Смирнова З. С. Средство, обладающее противоопухолевым действием и способ его получения / ПАТЕНТ РФ на изобретение № 2349317. Зарег. в Гос. реестре изобретений РФ 20 марта 2009 г.

35. Сергиевич А А., Баталова Т. А., Доровских В. А., Пластинин М. Л., Нифантьев Э. Е., Слепцова Л. С., Коротеев М. П., Коротеев А. М. Способ коррекции состава нормальной микрофлоры в эксперименте / ПАТЕНТ РФ на изобретение № 2366418. Зарег. в Гос. реестре изобретений РФ от 10 сентября 2009 г.

36. Баталова Т. А, Доровских В. А, Сергеевич А. А., Пластинин М. Л., Коротеев М. П., Короте-ев А. М., Нифантьев Э. Е. Способ повышения уровня работоспособности у лабораторных животных в эксперименте / ПАТЕНТ РФ на изобретение № 2371175. Зарег. в Гос. реестре изобретений РФ 27 октября 2009 г.