Способ лечения онкологических заболеваний с помощью инъекций лекарственного препарата
METHOD OF TREATING ONCOLOGICAL DISEASES BY DRUG INJECTIONS

Способ лечения онкологических заболеваний с помощью инъекций лекарственного препарата.
Изобретение относится к области медицины и ветеринарии, и может быть использовано при лечении онкологических заболеваний у человека и животных с помощью инъекций противоопухолевого лекарственного препарата, предварительно инкапсулированного в липосомы.
Известен способ лечения онкологических заболеваний с помощью внутривенных инъекций раствора лекарственного противоопухолевого препарата - Доксорубицина пациенту с онкологическим заболеванием [Doxorubicin hydrochloride // European Pharmacopoeia. Sixth Edition: монография. 2005. С. 1389-1390.].
Данный способ содержит признаки, совпадающие с существенными признаками предлагаемого технического решения, такие, как использование внутривенных инъекций раствора лекарственного препарата для лечения онкологических заболеваний.
Известен способ лечения онкологических заболеваний людей с помощью внутривенных инъекций суспензии липосом с инкапсулированным противоопухолевым лекарственным препаратом (Цисплатином) [Boulikas Т., Clinical overview on Lipoplatin™: a successful liposomal formulation of cisplatin // Expert Opinion on Investigational Drugs. 2009. V. 18(8). P. 1197-1218. doi:10.1517/13543780903114168].
Данный способ содержит признаки, совпадающие с существенными признаками предлагаемого технического решения, такие, как лечение онкологических заболеваний с помощью инъекций лекарственного препарата путем внутривенного введения суспензии липосом с инкапсулированным противоопухолевым лекарственным препаратом.
Наиболее близким к заявляемому является известный способ лечения онкологических заболеваний с помощью инъекций лекарственного препарата путем введения водосодержащей суспензии липосом одинакового диаметра с инкапсулированным противоопухолевым лекарственным препаратом [Mikhaylov G., Mikac U., Magaeva A.A., Itin V.I., Naiden E.P., Psakhye I., Babes L., Reinheckel Т., Peters C, Zeiser R., Bogyo M., Turk V., Psakhye S.G., Turk В., Vasiljeva O.. Ferri-liposomes as an MRI-visible drug delivery system for targeting tumours and their microenviroment // Nat.Nanotechnol. 2011. V. 6(9). P. 594-602. см. стр. 600, Фиг. 4 (С)] - прототип.
3
3
3
В данном способе осуществляют лечение онкологического заболевания рака молочной железы in vivo на ортотопически трансплантированной мышиной модели вышеуказанной опухоли (опухолевые клетки линии MMTV-PyMT, полученные из трансгенных мышей) с помощью инъекций противоопухолевого лекарственного препарата JPM 565, являющегося ингибитором цистеиновой протеазы катепсина и замедляющего скорость роста опухоли, предварительно инкапсулированного в липосомы со средним диаметром 92,3 нанометров (нм), имеющие липидный состав, при котором содержание яичного фосфатидилхолина составляет 95% и содержание 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[метокси-(полиэтиленгликоля)-2000] равно 5%. В данном способе лечение проводят в течение 20 дней путем внутрибрюшинного введения лекарственного препарата в количестве 100 мг/кг тела животного каждые два дня при содержании препарата JPM 565 в водосодержащей суспензии липосом 12,5 мг/мл. При этом используют липосомы, которые кроме лекарственного препарата дополнительно содержат магнитные наночастицы магнетита, имеющие средний диаметр 5-7 нм, используемые для визуализации опухоли и фокусировки (концентрирования) препарата в опухоли с помощью наложения (воздействия) внешнего постоянного магнитного поля. В данном способе об эффективности лечения судят по замедлению скорости роста опухоли. Так, для опухоли, имеющей объем 125 мм на момент начала лечения, спустя 18 дней после начала лечения объем опухоли составил 400 мм, в то время, как без использования противоопухолевого препарата (контрольная группа мышей) объем опухоли возрастал до 950 мм. Таким образом, известный способ лечения за 18 дней замедлял скорость роста опухоли в 2,4 раза.
Недостатком известного способа является то, что он не позволяет обеспечить достаточно высокую эффективность лечения онкологического заболевания. Кроме того, данный способ неизбежно приводит к появлению побочного эффекта, обусловленного комбинацией относительной длительности противоопухолевого лечения и присутствием во всех липосомах кроме лекарственного препарата также наночастиц магнетита, медленно выводящихся из организма, накапливающихся в печени и требующих для их выведения из организма использования дополнительных препаратов.
Техническая проблема изобретения заключается в разработке способа лечения онкологических заболеваний с помощью инъекций лекарственного препарата, лишенного вышеуказанного недостатка.
Технический результат изобретения состоит в повышении эффективности лечения онкологических заболеваний.
Предварительно были проведены эксперименты с различными способами лечения онкологических заболеваний, которые показали, что указанный технический результат достигается в том случае, когда в способе лечения онкологических заболеваний с помощью инъекций лекарственного препарата, включающем введение водосодержащей суспензии липосом одинакового диаметра с инкапсулированным противоопухолевым лекарственным препаратом, перед введением суспензии липосом одинакового диаметра с инкапсулированным противоопухолевым лекарственным препаратом вводят три суспензии липосом различного диаметра, содержащих внутри магнитные наночастицы с одинаковым значением параметра Т2-релаксивности у каждой суспензии липосом, первую суспензию получают путем пропускания через экструдер, снабженный мембраной с диаметром пор 200 нм, вторую суспензию получают путем пропускания через экструдер, снабженный мембраной с диаметром пор 100 нм, третью суспензию получают путем пропускания через экструдер, снабженный мембраной с диаметром пор 50 нм, введение каждой последующей суспензии липосом с магнитными наночастицами осуществляют через 20-26 ч после введения предыдущей суспензии, после введения каждой суспензии липосом методом магнитно-резонансной томографии (МРТ) определяют степень накопления липосом в опухолевой ткани в зависимости от диаметра липосом, затем выбирают диаметр липосом с наибольшей степенью накопления в опухолевой ткани, и лекарственный препарат вводят внутривенно, инкапсулированным в липосомы с тем же липидным составом и диаметром, обеспечивающим их наибольшую степень накопления в опухолевой ткани.
Предлагаемый способ является новым и не описан в патентной и научно-технической литературе.
Предлагаемый способ может быть использован для лечения различных онкологических заболеваний, поверхностной или глубокой локализации, так и на его кожных покровах, например, таких как рак молочной железы, глиома, рак простаты и т.д. При этом при лечении могут быть использованы различные лекарственные препараты, например, такие, как JPM 565, Цисплатин, Иринотекан и т.д. Следует отметить, что в предлагаемом способе используемые лекарственные препараты обязательно должны селективно (избирательно) действовать на подлежащий лечению тип опухоли и быть предварительно инкапсулированы в липосомы, причем для лечения онкологических заболеваний пациенту или больному животному внутривенно необходимо вводить водосодержащую суспензию таких липосом, поскольку механизм всасывания липосом из желудочно-кишечного тракта при пероральном их  введении до конца не ясен. При этом липосомы могут быстро деградировать под действием желудочного сока, либо ферментов желчи, в результате чего лекарственный препарат, не обладающий селективностью (избирательностью) по отношению к клеткам опухоли, но обладающий высокой токсичностью (например, Доксорубицин), неизбежно будет воздействовать как на опухолевые клетки, так и на здоровые клетки организма. Внутримышечное введение используемых липосом также может быть нецелесообразным ввиду того, что при этом создается депо липосом в месте введения, а скорость элиминации из депо зависит от размера липосом и составляет от нескольких часов (при диаметре липосом менее 50 нм) до нескольких дней (при диаметре липосом более 50 нм), что замедляет процесс лечения, а в некоторых случаях даже при минимальном диаметре липосом 30-50 нм такие липосомы ввиду малого диаметра капилляров организма могут вообще не дойти из мышцы до пораженного опухолью органа.
В предлагаемом техническом решении, так же, как и в прототипе, используют водосодержащую суспензию липосом, которая в качестве дисперсионной среды может содержать воду или водные растворы различных добавок, например, таких, как компоненты буфера, соли, например, NaCl, сахара и т.д. При этом концентрация липосом с инкапсулированным в них лекарственным препаратом в каждом курсе лечения может быть различна.
Следует отметить, что получение липосом с инкапсулированным в них лекарственным препаратом описано в литературе [см. прототип]. Кроме того, коммерчески доступен ряд противоопухолевых препаратов, которые уже инкапсулированны в липосомы [Upendra Bulbake, Sindhu Doppalapudi, Nagavendra Kommineni and Wahid Khan. Liposomal Formulations in Clinical Use: An Updated Review // Pharmaceutics. 2017. V. 9. Р. 1-33].
Липидный состав используемых липосом может быть различен и определяется качественным и количественным соотношением смеси липидов, используемых в процессе получения липосом, однако в пределах одного курса лечения липидный состав всегда должен быть одинаков, поскольку степень и скорость накопления липосом зависят от их липидного состава. В предлагаемом способе перед курсом лечения больного человека или животного им предварительно необходимо внутривенно ввести три суспензии липосом различного диаметра, которые могут быть получены путем пропускания суспенизии липосом через экструдер, снабженный мембраной с круглыми порами, диаметр которых выбран из группы, включающей 200, 100 и 50 нм. Экспериментально было показано, что полученные липосомы имеют сферическую форму и достаточно узкое распределение по размеру, причем их средний диаметр близок к диаметру пор в использованной мембране. Вводимые липосомы не должны содержать лекарственного препарата, но должны содержать внутри магнитные наночастицы и иметь одинаковые значения параметра Т2-релаксивности.
При реализации способа исходная суспензия липосом может быть получена методом обращения фаз с последующей гомогенизацией суспензии методом экструзии. В качестве магнитных наночастиц используют наночастицы сферической формы с достаточно узким распределением по размеру. Загрузку наночастиц в липосомы проводят на стадии получения липосом. Для этого наночастицы предварительно диспергируют в 0,5 М растворе NaOH (рН=10), затем к ним добавляют раствор лимонной кислоты с концентрацией 20 мг/мл. В круглодонной колбе диспергируют смесь липидов в смеси хлороформ - метанол состава 3:1 по объему, затем к этому раствору добавляют полученную дисперсию наночастиц. Смесь обрабатывают ультразвуком на ультразвуковой бане до образования устойчивого коллоидного раствора, затем колбу присоединяют к роторному испарителю для отгонки органических растворителей. При этом частота ультразвука может быть различной. К образовавшемуся гелю добавляют аликвоту водосодержащего натрий-фосфатного буфера и встряхивают до получения суспензии. Для получения гомогенных по размеру липосом суспензию пропускают через экструдер, снабженный мембраной с определенным диаметром пор. Способ получения липосом с различным диаметром и достаточно узким распределением по размеру известен [Ong S., Chitneni М., Lee К., Ming L., Yuen K. Evaluation of Extrusion Technique for Nanosizing Liposomes // Pharmaceutics. 2016. V. 8(4), P. 1-12. doi:10.3390/pharmaceutics8040036]. Мембраны с диаметром пор 50, 100 и 200 нм коммерчески доступны [https://avantilipids.com/divisions/equipment-products].
3
4
2
3
2
4
В предлагаемом способе перед началом лечения используют три типа липосом различного диаметра, не содержащие инкапсулированного противоопухолевого лекарственного препарата, но содержащие внутри магнитные наночастицы, в качестве которых могут быть использованы, например, наночастицы магнетита (FeO маггемита (FeO), кобальтового феррита (CoFeO) и т.д. При этом размер используемых наночастиц может быть различным и составлять, например, 5-12 нм. В каждом примере используют наночастицы с узким распределением по размерам, при котором наибольший и наименьший диаметр частиц может отличаться друг от друга на 1-2 нм. Способы получения таких наночстиц известны [Hemant M.Vishwasrao, Alyssa М. Master, YounGeeSeo, Xinming M. Liu, Nikorn Pothayee, Zhengyuan Zhou, Dongfen Yuan, Michael D. Boska, Tatiana K. Bronich, Richey M. Davis, Judy S. Riffle, Marina Sokolsky-Papkov, and Alexander V. Kabanov. Luteinizing Hormone Releasing Hormone-Targeted Cisplatin-Loaded Magnetite Nanoclusters for Simultaneous MR Imaging and Chemotherapy of Ovarian Cancer // Chemistry of Materials. 2016. V. 28 (9). P. 3024-3040.; Daniele Bonacchi' Claudia Innocenti' Giada Lorenzi' Claudio Sangregorio. Cobalt ferrite nanoparticles: The control of the particle size and surface state and their effects on magnetic properties // Journal of magnetism and magnetic materials. 2007. V. 311. P. 10-16]. Также описаны способы введения магнитных наночастиц в липосомы [S.V. German, N.A. Navolokin, N.R. Kuznetsova, V.V. Zuev, O.A. Inozemtseva, A.A. Anis, E.K. Volkova, A.B. Bucharskaya, G.N. Maslyakova, R.F. Fakhrullin, G.S. Terentyuk, E.L. Vodovozova, D.A. Gorin. Liposomes Loaded with Hydrophilic Magnetite Nanoparticles: Preparation and Application as Contrast Agents for Magnetic Resonance Imaging // Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 2015. V. 135. P. 109-115.].
Значение параметра Т2-релаксивности у суспензии липосом разного диаметра представляет собой величину, нормированную на концентрацию железа в наночастицах, загруженных в липосомы. При этом каждый тип суспензии липосом приводят к одинаковой концентрации железа. Следует отметить, что введение ограниченного количества липосом, содержащих наночастицы на основе железа, не оказывает токсического действия на живые организмы [S.V. German, N.A. Navolokin, N.R. Kuznetsova, V.V. Zuev, O.A. Inozemtseva, A.A. Anis, E.K. Volkova, A.B. Bucharskaya, G.N. Maslyakova, R.F. Fakhrullin, G.S. Terentyuk, E.L. Vodovozova, D.A. Gorin. Liposomes Loaded with Hydrophilic Magnetite Nanoparticles: Preparation and Application as Contrast Agents for Magnetic Resonance Imaging. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 2015. V. 135. P. 109-115.], в то время, как введение токсичных противоопухолевых лекарственных препаратов, не доходящих ввиду неоптимального диаметра используемых липосом до пораженного опухолью органа, оказывает негативное влияние на организм.
Экспериментально было показано, что внутривенное введение каждой последующей суспензии липосом с одинаковым значением параметра Т2-релаксивности, не содержащих внутри липосом лекарственного препарата, необходимо осуществлять через 20-26 ч после введения предыдущей суспензии липосом. За указанный промежуток времени большая часть ранее введенных наночастиц выводится из организма и не создает помех при последующих исследованиях пораженного опухолью органа методом МРТ.
В предлагаемом способе после каждой инъекции суспензии липосом с наночастицами методом МРТ с помощью специальной программы определяют наибольшую степень накопления липосом в опухолевой ткани в зависимости от диаметра липосом. Накопление липосом в опухолевой ткани обусловлено известным эффектом повышенной проницаемости кровеносных сосудов опухоли и удерживания наночастиц (EPR-эффектом) [Nichols J.W.; Bae Y. Н. EPR: Evidence and fallacy // Journal of Controlled Release. 2014. V. 190. Р. 451-464]. После этого выбирают диаметр липосом с наибольшей степенью накопления в опухолевой ткани и лекарственный препарат вводят инкапсулированным в липосомы с тем же липидным составом и диаметром, обеспечивающим их наибольшую степень накопления в опухолевой ткани.
Из научно-технической литературы известно, что накопление липосом зависит как от размеров самих липосом, так и от размера пор сосудов в опухолевой ткани и стадии онкологического заболевания. Поскольку накопление липосом варьируется от пациента к пациенту, заранее нельзя достоверно предсказать оптимальную методику лечения [Гуревич Д.Г., Меерович И.Г., Меерович Г.А., Воробьев С.И., Певгов В.Г., Смирнова З.С, Оборотова Н.А., Лукьянец Е.А., Барышников А.Ю. Влияние размеров липосом на уровень и селективность накопления тиосенса в опухоли // Российский биотерапевтический журнал. 2007. Т. 2. С. 45-49]. При использовании описанного в прототипе способа в клинической практике могут наблюдаться случаи нерационального введения лекарственного препарата, инкапсулированного в липосомы, одновременно содержащие магнитные наночастицы. Учитывая относительную длительность курса лечения вышеописанными противоопухолевыми препаратами это неизбежно может приводить к накоплению в организме критических концентраций железа и лекарственного препарата, требующих дополнительных манипуляций по их выведению из организма, что осложняет известный вышеописанный способ лечения. В предложенном способе препарат, содержащий в наночастицах железо, вводят всего 3 раза, что исключает вероятность накопления предельно допустимой концентрации железа в организме, сокращает курс лечения и повышает эффективность лечения за счет оптимального выбора диаметра используемых в процессе лечения липосом.
При реализации предлагаемого способа диаметр и степень полидисперсности используемых липосом контролируют методом динамического светорассеяния. Концентрацию железа в липосомах определяют методом атомно-эмиссионной спектроскопии. Параметр Т2-релаксивности определяют путем измерения времени поперечной релаксации (Т2) водных суспензии липосом с различной концентрацией магнитных наночастиц. При этом параметр Т2-релаксивности рассчитывают как производную линейной зависимости величины R2=1/Т2 от концентрации железа. Степень выведения содержащих железо наночастиц контролируют методом МРТ. Степень накопления магнитных наночастиц и липосом в опухоли определяют на изображениях, полученных методом МРТ, по отношению модуля разницы усредненного сигнала для ткани до и после введения суспензии липосом с магнитными наночастицами к стандартному отклонению шума фона изображения.
2
Об эффективности лечения судят либо по уменьшению скорости роста опухоли в процессе лечения, либо по уменьшению объема опухоли в процессе лечения. При этом объем опухоли рассчитывают по формуле V=(a×b)/2, где а и b - это самый большой и самый маленький диаметры опухоли. Начинать лечение целесообразно после выхода липосом с магнитными наночастицами из организма.
Преимущества предлагаемого способа иллюстрируют следующие примеры.
Пример 1.
В опыте используют подопытных животных - иммунокомпетентных FVB/N мышей с привитой опухолью молочной железы мыши (опухолевые клетки линии MMTV-PyMT, полученные из трансгенной мыши). Подопытных животных с привитой опухолью делят на две группы по 6 особей в каждой - контрольную (мыши, которых не лечат) и опытную (мыши, которых лечат). Об эффективности лечения заболевания следят по замедлению скорости роста опухоли.
-1
-1
В качестве магнитных наночастиц используют частицы магнетита сферической формы с диаметром 8-10 нм, полученные путем термического разложения ацетилацетоната железа (III) в бензиловом спирте при 207°С в течение 48 ч. Перед введением в липосомы навеску наночастиц (12 мг) диспергируют в 1,6 мл 0,5 М водного раствора NaOH (рН=10), затем к полученной дисперсии добавляют 0,4 мл водного раствора лимонной кислоты с концентрацией 20 мг/мл. Липосомы с тем же липидным составом, что и в прототипе, получают методом обращения фаз путем диспергирования в круглодонной колбе 95 мг фосфатидилхолина и 5 мг 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[метокси-(полиэтиленгликоля)-2000] в смеси, содержащей 7,5 мл хлороформа и 2,5 мл метанола, после чего в полученный раствор добавляют 2 мл дисперсии вышеописанных наночастиц магнетита. Полученную смесь в течение 5 мин обрабатывают ультразвуком с частотой 16 кГц на ультразвуковой бане до образования устойчивого коллоидного раствора, затем на роторном испарителе отгоняют органические растворители. К полученному гелю добавляют 3 мл водосодержащего 10 мМ натрий-фосфатного буфера (рН=7.4) и перемешивают до получения суспензии. Неинкапсулированные наночастицы отделяют от суспензии липосом с магнитными наночастицами воздействием на суспензию в течение 3 мин постоянного магнитного поля от магнита. Для получения трех суспензий липосом с различным диаметром весь объем исходной суспензии липосом, предварительно загруженных наночастицами магнетита, вначале пропускают через экструдер с мембраной с диаметром пор 200 нм. Треть прошедшей через мембрану суспензии оставляют для проведения эксперимента, а оставшиеся две трети прошедшей через мембрану суспензии повторно пропускают через экструдер с мембраной с другим диаметром пор 100 нм. Половину прошедшей через мембрану суспензии оставляют для проведения эксперимента, а оставшуюся половину суспензии снова пропускают через экструдер с мембраной с другим диаметром пор 50 нм. Прошедшую через мембрану суспензию также используют для проведения эксперимента. Методом динамического светорассеяния было показано, что в опыте были получены три различные дисперсии липосом, имеющие средние диаметры 197, 110 и 51 нм, с индексом полидисперсности, равном или меньшем 0,1. Концентрация железа в полученных дисперсиях, определенная методом атомно-эмиссионной спектроскопии, составляла 400 мкг/мл суспензии. Значение параметра Т2-релаксивности у каждой суспензии липосом, определенное описанным выше методом, было равно 450 смМ.
Перед началом лечения на 5-й день после привития опухоли животным из опытной группы внутривенно вводят 150 мкл суспензии липосом со средним диаметром 197 нм, содержащих наночастицы, после чего методом МРТ определяют степень накопления липосом в опухоли. При этом максимальную степень накопления, равную 7%, наблюдают через 12 ч после введения суспензии липосом. Через 24 ч после введения вышеуказанной суспензии липосом внутривенно вводят другую суспензию липосом со средним диаметром 110 нм и тем же значением параметра Т2-релаксивности. Максимальное значение степени накопления суспензии липосом в опухоли, равное 10%, наблюдают через 10 ч после инъекции. Через 20 ч после введения второй суспензии липосом внутривенно вводят третью суспензию липосом со средним диаметром 51 нм и с тем же значением параметра Т2-релаксивности. Максимальное значение степени накопления суспензии липосом в опухоли, равное 20%, наблюдают через 6 ч после инъекции.
Сравнение полученных результатов показало, что наибольшей степенью накопления в опухолевой ткани обладают липосомы, имеющие средний диаметр 51 нм.
После этого получают липосомы с вышеописанным липидным составом и оптимальным средним диаметром, близким к 50 нм, не содержащие наночастиц магнетита, но содержащие внутри противоопухолевый препарат - ингибитор цистеиновой протеазы катепсина JPM-565. Получение данных липосом осуществляют путем упаривания на роторном испарителе раствора липидов в смеси хлороформ-метанол в соотношении 3:1 по объему до образования на стенках колбы равномерной пленки. Полученную пленку суспендируют в водном растворе противоопухолевого препарата, содержащего 12,5 мг JPM-565 в 1 мл раствора, до образования суспензии липосом, которую после этого пропускают через экструдер с мембраной с диаметром пор 50 нм. Для очистки от незагрузившегося в липосомы противоопухолевого препарата полученную суспензию пропускают через обессоливающую колонку марки NAP-25 (GE Healthcare illustra™ NAP™ Columns) с подвижной фазой, представляющей собой 10 мМ натрий-фосфатный буфер (рН=7,4).
3
Лечение подопытных животных так же, как и в прототипе, проводят после того, как объем опухоли достигнет 125 мм, и начинают через 24 ч после последней инъекции суспензии липосом с магнитными наночастицами. Лечение проводят путем внутривенного введения водосодержащей суспензии липосом, содержащих противоопухолевый препарат в дозе 100 мг/кг тела мыши (по количеству JPM-565). Контрольной группе мышей вместо суспензии липосом с лекарственным препаратом внутривенно вводят вышеописанный раствор натрий-фосфатного буфера. Внутривенные инъекции проводят каждые два дня, при этом общее количество инъекций в каждой группе мышей было равно 10. Объем опухоли у мышей измеряют каждый день и об эффективности лечения судят по изменению скорости роста опухоли.
3
Опыт показал, что в экспериментальной группе мышей объем опухоли на 18-й день лечения составлял 300 мм, что в 4,5 раза меньше, чем у контрольной группы мышей, не получающих лекарство. При этом достигнутый в прототипе эффект замедления скорости роста опухоли в 2,4 раза в нашем случае наблюдают уже на 12-й день лечения.
Пример 2.
В опыте используют подопытных животных - мышей с привитой опухолью предстательной железы человека (клеточная линия 22Rv1). Подопытных животных с привитой опухолью делят на две группы по 6 особей в каждой - контрольную (мыши, которых не лечат) и опытную (мыши, которых лечат). Об эффективности лечения заболевания следят по замедлению скорости роста опухоли.
-1
-1
В качестве магнитных наночастиц используют частицы кобальтового феррита сферической формы со средним диаметром 5-7 нм, полученные путем термического разложения смеси ацетатов кобальта (II) и железа (III), взятых в мольных соотношениях 1:2, в диэтиленгликоле при 180°С. Перед введением в липосомы 40 мг наночастиц диспергируют в смеси 2,5 мл диметилформамида и 2,5 мл орто-хлортолуола с помощью ультразвука, затем к полученной дисперсии добавляют 300 мг лимонной кислоты и оставляют на 24 ч при постоянном перемешивании. По истечении 24 ч полученную дисперсию 3 раза промывают ацетоном, затем высушивают с помощью роторного испарителя. 12 мг наночастиц диспергируют в течение 10 мин с помощью ультразвука на ультразвуковой бане в 2 мл воды. Липосомы получают методом обращения фаз путем диспергирования в круглодонной колбе 80 мг лецитина, 15 мг холестерина и 5 мг 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[метокси-(полиэтиленгликоля)-2000] в смеси, содержащей 7,5 мл хлороформа и 2,5 мл метанола, после чего в полученный раствор добавляют 2 мл дисперсии вышеописанных наночастиц. Полученную смесь в течение 5 мин обрабатывают ультразвуком с частотой 10 кГц на ультразвуковой бане с образованием устойчивого коллоидного раствора, затем на роторном испарителе отгоняют вышеописанные органические растворители. К полученному гелю добавляют 3 мл водосодержащего 10 мМ натрий-фосфатного буфера (рН=7,4) и перемешивают до получения суспензии. Неинкапсулированные наночастицы отделяют от суспензии липосом с магнитными наночастицами воздействием на суспензию в течение 5 мин постоянного магнитного поля от магнита. Для получения трех суспензий с различными диаметрами липосом весь объем исходной суспензии липосом, предварительно загруженных наночастицами, вначале пропускают через экструдер с мембраной с диаметром пор 200 нм. Треть прошедшей через мембрану суспензии оставляют для проведения эксперимента, а оставшиеся две трети прошедшей суспензии повторно пропускают через экструдер с мембраной с другим диаметром пор 100 нм. Половину прошедшей через мембрану суспензии оставляют для проведения эксперимента, а оставшуюся половину суспензии снова пропускают через экструдер с мембраной с другим диаметром пор 50 нм. Прошедшую через мембрану суспензию также используют для проведения эксперимента. Методом динамического светорассеяния было показано, что в ходе опыта были получены три различные дисперсии липосом, имеющие средние диаметры 205, 95 и 55 нм, с индексом полидисперсности, равном или меньшем 0,1. Концентрация железа в полученных дисперсиях, определенная методом атомно-эмиссионной спектроскопии, составляла 400 мкг/мл суспензии. Значение параметра Т2-релаксивности у каждой суспензии липосом, определенное описанным выше методом, было равно 570 смМ.
На 7-й день после привития опухоли животным из опытной группы внутривенно вводят 150 мкл суспензии липосом со средним диаметром 205 нм, содержащей магнитные наночастицы, после чего методом МРТ определяют степень накопления липосом в опухоли. При этом максимальную степень накопления, равную 11%, наблюдают через 16 ч после введения (инъекции) суспензии липосом. Через 20 ч после введения вышеуказанной суспензии липосом внутривенно вводят другую суспензию липосом со средним диаметром 95 нм и тем же значением параметра Т2-релаксивности у суспензии. Максимальное значение степени накопления суспензии липосом в опухоли, равное 20%, наблюдают через 12 ч после внутривенной инъекции суспензии. Через 20 ч после введения второй суспензии липосом внутривенно вводят третью суспензию липосом со средним диаметром 55 нм и с тем же значением параметра Т2-релаксивности. Максимальное значение степени накопления суспензии липосом в опухоли, равное 7%, наблюдают через 6 ч после инъекции суспензии.
Сравнение полученных результатов показало, что наибольшей степенью накопления в опухолевой ткани обладают липосомы, имеющие средний диаметр 95 нм.
4
2
4
После этого получают липосомы с вышеописанным липидным составом и оптимальным средним диаметром, близким к 100 нм, не содержащие наночастицы кобальтового феррита, но содержащие внутри противоопухолевый препарат - доксорубицин. Получение данных липосом осуществляют путем упаривания на роторном испарителе раствора липидов в смеси хлороформ-метанол, взятых в соотношении 3:1 по объему, до образования на стенках колбы равномерной пленки. Полученную пленку суспендируют 120 мМ водным раствором (NH)SO, до образования суспензии липосом, которую после этого пропускают через экструдер, снабженный мембраной с диаметром пор 100 нм. Далее полученную суспензию очищают от сульфата аммония во внешнем буфере с помощью обессоливающей колонки марки NAP-25 (GE Healthcare illustra™ NAP™ Columns), затем к ней добавляют водный раствор доксорубицина с концентрацией 12 мг/мл и инкубируют в течение 2 ч. Для очистки от незагрузившегося в липосомы противоопухолевого препарата полученную суспензию пропускают через обессоливающую колонку марки NAP-25 (GE Healthcare illustra™ NAP™ Columns) с подвижной фазой, представляющей собой 10 мМ натрий-фосфатный буфер (рН=7,4).
Лечение подопытных животных начинают через 20 ч после последней инъекции суспензии липосом с магнитными наночастицами. Лечение проводят путем внутривенного введения водосодержащей суспензии липосом, содержащих противоопухолевый препарат в дозе 9 мг/кг тела животного (по концентрации доксорубицина). Суспензию липосом внутривенно вводят на 7, 12 и 17 дни после имплантации опухоли. Контрольной группе мышей вместо суспензии липосом с лекарственным препаратом внутривенно вводят вышеописанный раствор натрий-фосфатного буфера. Объем опухоли у мышей измеряют каждый день и об эффективности лечения судят по изменению скорости роста опухоли.
Опыт показал, что в экспериментальной группе мышей объем опухоли на 17-й день лечения оказался в 4 раза меньше, чем у контрольной группы мышей. При этом в среднем опухоль у мышей, получающих противоопухолевый препарат, с момента лечения уменьшилась на 80%.
Пример 3.
В опыте используют подопытных животных - крыс с привитой опухолью глиомы головного мозга (клеточная линия С6). Подопытных животных с привитой опухолью делят на две группы по 6 особей в каждой - контрольную (крысы, которых не лечат) и опытную (крысы, которых лечат). Об эффективности лечения заболевания следят по замедлению скорости роста опухоли.
В качестве магнитных наночастиц используют частицы маггемита сферической формы с диаметром 5-6 нм, полученные путем термического разложения ацетилацетоната железа (III) в бензиловом спирте при 207°С в течение 1 ч. Перед введением в липосомы 60 мг наночастиц диспергируют в 8 мл 0,5 М водного раствора NaOH (рН=10), затем к полученной дисперсии добавляют 2 мл водного раствора лимонной кислоты с концентрацией 20 мг/мл.
-1
-1
Липосомы получают методом обращения фаз путем диспергирования в круглодонной колбе 250 мг фосфатидилхолина, 225 мг дипальмитоилфосфатидилхолина и 25 мг 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[метокси-(полиэтиленгликоля)-2000] в смеси, содержащей 37,5 мл хлороформа и 12,5 мл метанола, после чего в полученный раствор добавляют 10 мл вышеописанной дисперсии наночастиц маггемита. Полученную смесь в течение 5 мин обрабатывают ультразвуком с частотой 20 кГц на ультразвуковой бане до образования устойчивой эмульсии, затем на роторном испарителе отгоняют вышеописанные органические растворители. К полученному гелю добавляют 15 мл водосодержащего 10 мМ натрий-фосфатного буфера (рН=7,4) и перемешивают до получения суспензии. Неинкапсулированные наночастицы отделяют от суспензии липосом с магнитными наночастицами воздействием на суспензию в течение 3 мин постоянного магнитного поля от магнита. Для получения трех суспензий липосом с различным диаметром весь объем исходной суспензии липосом, предварительно загруженных магнитными наночастицами, вначале пропускают через экструдер, снабженный мембраной с диаметром пор 200 нм. Треть прошедшей через мембрану суспензии оставляют для проведения эксперимента, а оставшиеся две трети прошедшей суспензии повторно пропускают через экструдер с мембраной с другим диаметром пор 100 нм. Половину прошедшей через мембрану суспензии оставляют для проведения эксперимента, а оставшуюся половину суспензии снова пропускают через экструдер с мембраной с другим диаметром пор 50 нм. Прошедшую через мембрану суспензию также используют для проведения эксперимента. Методом динамического светорассеяния было показано, что в опыте были получены три различные дисперсии липосом, имеющие средние диаметры 210, 98 и 46 нм, с индексом полидисперсности, равном или меньшем 0,1. Концентрация железа в полученных дисперсиях, определенная методом атомно-эмиссионной спектроскопии, составляла 400 мкг/мл суспензии. Значение параметра Т2-релаксивности у каждой суспензии липосом было равно 530 смМ.
На 7-й день после привития опухоли животным из опытной группы внутривенно вводят 1 мл суспензии липосом со средним диаметром 210 нм, содержащей магнитные наночастицы, после чего методом МРТ определяют степень накопления липосом в опухоли. При этом максимальную степень накопления, равную 3%, наблюдают через 15 ч после введения суспензии липосом. Через 26 ч после введения вышеуказанной суспензии липосом внутривенно вводят другую суспензию липосом со средним диаметром 98 нм и тем же значением параметра Т2-релаксивности. Максимальное значение степени накопления суспензии липосом в опухоли, равное 8%, наблюдают через 12 ч после инъекции суспензии. Через 26 ч после введения второй суспензии липосом внутривенно вводят третью суспензию липосом со средним диаметром 46 нм и с тем же значением параметра Т2-релаксивности. Максимальное значение степени накопления суспензии липосом в опухоли, равное 15%, наблюдают через 10 ч после инъекции.
Сравнение полученных результатов показало, что наибольшей степенью накопления в опухолевой ткани обладают липосомы, имеющие средний диаметр 46 нм.
После этого получают липосомы с вышеописанным липидным составом и оптимальным средним диаметром, близким к 50 нм, не содержащие наночастиц маггемита, но содержащие внутри противоопухолевый препарат - Иринотекан. Получение данных липосом осуществляют путем упаривания на роторном испарителе раствора вышеуказанных липидов общей массой липидов 4,0 г в смеси хлороформ-метанол, взятых в соотношении 3:1 по объему, до образования на стенках колбы равномерной пленки. Полученную пленку суспендируют в водном раствором противоопухолевого препарата, содержащего 750 мг Иринотекана в 50 мл водного 5% раствора декстрозы с рН=6,2. При этом проводят три цикла, каждый из которых включает заморозку и разморозку смеси, до образования суспензии липосом, которую после этого пропускают через экструдер, снабженный мембраной с диаметром пор 50 нм. Для очистки от незагрузившегося в липосомы противоопухолевого препарата полученную суспензию пропускают через обессоливающую колонку марки NAP-25 (GE Healthcare illustra™ NAP™ Columns) с подвижной фазой, представляющей собой 10 мМ натрий-фосфатный буфер (рН=7,4).
Лечение подопытных животных проводят через 26 ч после последней инъекции суспензии липосом с магнитными наночастицами. Лечение проводят путем внутривенного введения водосодержащей суспензии липосом, содержащих противоопухолевый препарат в дозе 50 мг/кг тела (по концентрации Иринотекана). Суспензию липосом вводят по схеме 2 раза в неделю в течение 4-х недель. Контрольной группе крыс вместо суспензии липосом с лекарственным препаратом внутривенно вводят вышеописанный раствор натрий-фосфатного буфера. Объем опухоли у крыс измеряют каждый день и об эффективности лечения судят по изменению скорости роста опухоли.
Объем опухоли у леченых крыс на 28-й день лечения оказался в 4 раза меньше, чем у контрольных нелеченных крыс.
3
3
Таким образом, из приведенных примеров видно, что предложенный способ по сравнению с прототипом на 18-й день лечения замедляет рост опухоли с 400 мм (в прототипе) до 300 мм, действительно повышая тем самым эффективность лечения онкологического заболевания в 1,6 раза.