Способ профилактики пролиферативной витриоретинопатии, развивающейся при отслойке сетчатки в эксперименте на крысах
METHOD FOR PREVENTING PROLIFERATIVE VITRIORETINOPATHY DEVELOPING IN RETINAL DETACHMENT IN EXPERIMENT ON RATS

Предлагаемое изобретение относится к области экспериментальной медицины, а именно к офтальмологии и может быть использовано для профилактики развития пролиферативной витриоретинопатии при отслойке сетчатки. Актуальность изобретения определяется социальной значимостью данной патологии, так как отслойка сетчатки - одна из главных причин инвалидизации населения вследствие полной или частичной утраты зрения, поскольку ведет к пролиферативной витриоретинопатии - реорганизации ткани сетчатки и стекловидного тела, обусловленной пролиферацией глиальных клеток сетчатки, приводящей к дальнейшему снижению остроты зрения.
Снабжение сетчатки кислородом и питательными веществами осуществляется с помощью сосудов, расположенных в ее пигментном эпителии. Отслойка сетчатки ведет к гипоксии, которая запускает каскад реакций, ведущих к некрозу и апоптозу клеток, воспалению, дальнейшей атрофии сетчатки и, соответственно, прогрессирующей потере зрения. После отслойки сетчатки в ходе, вызванной гипоксическим повреждением, воспалительной реакции, происходит активная пролиферация глиальных клеток и синтез ряда провоспалительных (ИЛ-1, ИЛ-6, ФНО-α) и противовоспалительных цитокинов (ТФР1β и ИЛ-10). Данные биологически активные вещества приводят к повышению проницаемости гематоретинального барьера, прогрессированию гиперплазии глиальных (мюллеровых) клеток и пролиферации других клеточных компонентов хориоретинального рубца. Процесс формирования пролиферативной витриоретинопатии имеет много общего с механизмами заживления ран в других тканях, где воспаление играет важную роль (Garweg J.G., Tappeiner С, Halberstadt М. Pathophysiology of proliferative vitreoretinopathy in retinal detachment // Survey of ophthalmology. - 2013. - V. 58. - №. 4. - P. 321-329.).
В настоящее время, хирургические способы лечения отслойки сетчатки считаются основными. После введения в клиническую практику широкоугольных линз и других оптических систем для хирургических микроскопов, предложены следующие способы хирургического лечения отслойки сетчатки: лазерная коагуляция, пломбирование склеры, баллонирование склеры и заместительная витрэктомия с тампонадой глазного яблока сбалансированным физиологическим раствором, различными воздушно-газовыми смесями, силиконовым маслом (Fu J. L. et al. A systematic review on delayed absorption of subretinal fluid after scleral buckling for rhegmatogenous retinal detachment // Journal of biological regulators and homeostatic agents. - 2017. - V. 31. - №. 3. - P. 639-643; Chhablani J. et al. Restorative retinal laser therapy: present state and future directions // Survey of ophthalmology. - 2017. DOI: 10.1016/j.survophthal.2017.09.008).
Но и современные хирургические способы лечения отслойки сетчатки не лишены недостатков (Bonnet М, Guenoun S. Surgical risk factors for severe postoperative proliferative vitreoretinopathy (PVR) in retinal detachment with grade В PVR // Graefe's archive for clinical and experimental ophthalmology. - 1995. - V. 233. - №. 12. - P. 789-791.). Лазерная коагуляция сетчатки зачастую сопровождается такими серьезными побочными эффектами как: разрастание ретинального рубца, увеличение дефектов полей зрения, расстройства цветовосприятия, уменьшение контрастности зрения, субретинальный фиброз и хороидальная неоваскуляризация (Chhablani J. et al. Restorative retinal laser therapy: present state and future directions // Survey of ophthalmology. - 2017. DOI: 10.1016/j.survophthal.2017.09.008).
Пломбирование склеры ведет к послеоперационным осложнениям, среди которых могут быть воспалительные заболевания, глаукома и рецидив отслойки сетчатки. Заместительная витрэктомия с эндовитреальной тампонадой силиконовым маслом является основным способом лечения отслойки сетчатки в современной клинической практике. При этом использование данного способа зачастую осложняется развитием контактной кератопатии, вторичной гипертензии и катаракты, причинами которых может стать эмульсификация силиконового масла в ответ на макрофагальную реакцию. Существует также риск развития перисиликоновой пролиферации, так как внутренняя поверхность силикона является субстратом для роста глии и сопутствующих клеточных элементов. Помимо патологических реакций на пролонгированное пребывание масла в полости, возможны осложнения при его удалении, например, рецидивирующая отслойка сетчатки. Кроме того, хирургическое лечение должно быть своевременным, так как хориоретинальный рубец препятствует естественному приживлению сетчатки и значительно осложняет оперативное вмешательство.
Ближайшим аналогом предлагаемого способа профилактики является интравитреальное введение препаратов на основе ингибиторов фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), таких как, бевацизумаб, ранибизумаб и афлиберцепт. За счет связывания данных препаратов с фактором роста эндотелия сосудов, достигается его перевод в неактивную форму. Таким образом, блокируется неоангиогенез в зоне формирующегося хориоретинального рубца, снижается проницаемость гематоретинального барьера, уменьшается воспаление и, следовательно, выраженность формирующейся пролиферативной витриоретинопатии ( М. et al. Safety of bilateral same-day intravitreal injections of anti-vascular endothelial growth factor agents // Clinical ophthalmology (Auckland, NZ). - 2017. - V. 11. - P. 299.).
Бевацизумаб - это рекомбинантные гиперхимерные моноклональные IgGl антитела, которые селективно связываются и ингибируют фактор роста эндотелия сосудов (VEGF). Получают его, как и аналоги (ранибизумаб, афлиберцепт), по технологии рекомбинантной ДНК. Данный препарат эффективно тормозит неоангиогенез, но при его использовании, отмечен ряд жизнеугрожающих побочных эффектов, что ограничивает его применение в офтальмологии (Ranpura V., Hapani S., Wu S. Treatment-related mortality with bevacizumab in cancer patients: a meta-analysis // Jama. - 2011. - V. 305. - №. 5. - P. 487-494.).
Ранибизумаб - это препарат, содержащий фрагменты (Fab) моноклональных гуманизированных антител к фактору роста эндотелия сосудов A (VEGF-A), избирательно связывается со следующими его изоформами: VEGF ПО, VEGF121, VEGF 165. Ранибизумаб предотвращает взаимодействие VEGF-A с его рецепторами на поверхности эндотелия сосудов, что приводит к торможению неоваскуляризации.
Афлиберцепт - это рекомбинантный гибридный протеин, состоящий из фрагментов внеклеточных доменов человеческих рецепторов VEGF 1 соединенных с Fc-фрагментом человеческого иммуноглобулина G. Афлиберцепт производится культурой клеток К1 яичника китайского хомячка по технологии рекомбинантной ДНК. Афлиберцепт ингибирует циркулирующие в крови VEGF-A (сосудистый эндотелиальный фактор роста А) и РЮР(плацентарный фактор роста) с более высокой аффинностью, в сравнении с их рецепторами, и, таким образом, ингибирует неоангиогенез (Не L. et al. Aflibercept for the treatment of retinal pigment epithelial detachments // Retina. - 2016. - V. 36. - №. 3. - P. 492-498.).
Препараты из группы ингибиторов фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) имеют следующие побочные эффекты:
Со стороны сердечно-сосудистой системы: повышение артериального давления, артериальная тромбоэмболия; тромбоз глубоких вен, хроническая сердечная недостаточность. Со стороны органов кроветворения: лейкопения, нейтропения, анемия. Со стороны пищеварительной системы: боль в животе, диарея, запоры, кровотечение из прямой кишки, стоматит, кровоточивость десен, перфорация желудочно-кишечного тракта. Со стороны дыхательной системы: носовое кровотечение, одышка, ринит. Со стороны кожных покровов: сухость кожи; эксфолиативный дерматит, изменение цвета кожи. Со стороны нервной системы: извращение вкуса, анорексия, обморок, ишемия сосудов головного мозга. Со стороны органов чувств: нарушение зрения. Местные реакции: боль в месте введения, эндофтальмит. Прочие: астения, абсцесс, сепсис, повышение температуры тела, вагинальные кровотечения. Лабораторные синдромы: протеинурия, гипокалиемия, гиперкалиемия, гипонатриемия, гипофосфатемия, гипергликемия и повышение активности щелочной фосфатазы.
Задачи:
1) Устранение побочных эффектов профилактики пролиферативной витриоретинопатии.
2) Снижение себестоимости профилактики пролиферативной витриоретинопатии.
3) Достижение не меньшего эффекта профилактики пролиферативной витриоретинопатии.
4) Расширение базы препаратов для профилактики пролиферативной витриоретинопатии.
Сущностью предлагаемого способа профилактики пролиферативной витриоретинопатии, развивающейся при отслойке сетчатки в эксперименте на крысах является однократное интравитреальное введение 0,02 мл 0,5% водного раствора D-аспарагина с 1-х по 6-е сутки от начала заболевания. Препарат содержит растворенный сухой порошок D-аспарагина в высокоочищенной воде, масс. %:
- D-аспарагин - 0,5,
- Высокоочищенная вода - 99,5.
Техническим результатом предлагаемого способа является получение бюджетного способа профилактики пролиферативной витриоретинопатии, развивающейся после отслойки сетчатки в эксперименте на крысах, лишенного побочных эффектов традиционных видов терапии, а также снижение риска развития пролиферативной витриоретинопатии.
D-аспарагин - это правовращающий изомер моноамида аспарагиновой кислоты, представляет собой белый кристаллический порошок без запаха, растворимый в воде.
Препарат получают путем растворения 0,5 г сухого порошка D-аспарагина в 99,5 г высокоочищенной воды, при этом D-аспарагин является целевым компонентом.
Технической характеристикой действия препарата является торможение образования хореоретинального рубца, за счет чего достигается профилактика развития пролиферативной витриоретинопатии при отслойке сетчатки.
У млекопитающих D-аспарагиновая кислота является одним из метаболитов аминокислотного обмена, определяется в незначительном количестве (в сравнении с ее левовращающим изомером), в том в числе, в тканях глазного яблока (Armstrong D. W. et al. DD amino acid levels in human physiological fluids // Chirality. - 1993. - T. 5. - №. 5. - C. 375-378.).
Предполагается, что в основе антипролиферативного эффекта D-аспарагина лежит ингибирование специфических трансаминаз и лактат-дегидрогеназы ( A. et al. Biological role of D-amino acid oxidase and D-aspartate oxidase. Effects of D-amino acids // Journal of Biological Chemistry. - 1993. - V. 268. - №. 36. - P. 26941-26949.).
Важным механизмом антипролиферативного эффекта D-аминокислот является торможение ими белкового синтеза, за счет аминоацилирования тРНК D-аминокислотами, что подтверждается значительным его угнетением при инактивации либо низкой экспрессии D-аминоацил-тРНК дезацилазы (Yamane Т., Miller D.L., Hopfield J.J. Discrimination between D- and L-tyrosyl transfer ribonucleic acids in peptide chain elongation //Biochemistry. - 1981. - V. 20. - №. 25. - P. 7059-7064.).
У млекопитающих уровень D-аспарагиновой кислоты поддерживается за счет его инактивации ферментом D-аспартат-оксидазой (Wolosker Н.,  A., Snyder S.Н. D-aspartate disposition in neuronal and endocrine tissues: ontogeny, biosynthesis and release // Neuroscience. - 2000. - V. 100. - №. l. - P. 183-189.).
D-аспартат накапливающийся в составе белков в результате спонтанной рацемизации L-аспартата может восстанавливать свою исходную хиральную форму с помощью фермента L-изоаспартат DL-аспартат О-метил-трансферазы либо реакций спонтанного деметилирования, функционирование данного фермента критично для нормального деления и дифференцировки клеток, в особенности для функционирования ЦНС и ее производных (Kim Е. et al. Phenotypic analysis of seizure-prone mice lacking L-isoaspartate (D-aspartate) O-methyltransferase // Journal of Biological Chemistry. - 1999. - V. 274. - №. 29. - P. 20671-20678.).
D-аспарагин способен затормозить пролиферацию незрелых клеток, из-за низкой экспресии в них ферментов его обезвреживающих ( A. et al. Biological role of D-amino acid oxidase and D-aspartate oxidase. Effects of D-amino acids // Journal of Biological Chemistry. - 1993. - V. 268. - №. 36. - P. 26941-26949.).
Применение D-аспарагина тормозит пролиферацию клеток глии и, за счет этого, уменьшает выраженность глиозной трансформации после острого повреждения спинного мозга у крыс (Трофименко А.И. Влияние D-аспарагина на формирование глиального рубца при остром повреждении спинного мозга в эксперименте у крыс // Современные проблемы науки и образования. - 2017. - №3.; URL: https://www.science-education.ru/ru/article/view?id=26420; Chitanava Т. The Influence of D-Asparagine on the Glial Cicatrix Formation in Experimental Spinal Stroke // American Journal of Clinical and Experimental Medicine. - V.5. - №3. - 2017. -P. 93-96. doi: 10.11648/j.ajcem.20170503.15).
Использование предлагаемого способа профилактики пролиферативной витриоретинопатии, развивающейся при отслойке сетчатки в эксперименте на крысах, основано на антипролиферативных свойствах D- аспарагина, за счет его применения достигается эффективное торможение хориоретинальго рубца.
D-аспарагин является естественным метаболитом в организме млекопитающих, в отличие от препаратов ингибиторующих фактор роста эндотелия сосудов (бевацизумаб, ранибизумаб и афлиберцепт), практически лишен побочных эффектов за исключением реакций индивидуальной непереносимости и возможных осложнений, связанных с интравитреальным путем введения средства.
В связи с тем, что цена на препараты ингибирующие фактор роста эндотелия сосудов, составляет около 30 тысяч рублей за ампулу, использование предлагаемого способа является бюджетным, так как предполагаемая стоимость 1 ампулы, содержащей 1 мл 0,5% раствора D-аспарагина, составляет около 20 рублей.
Эксперименты проведены на 50 белых нелинейных самцах крыс средней массой 182±25 гр. Характеристика групп животных: группа №1 (сравнения) - из 25 крыс, которым выполнялось моделирование отслойки сетчатки, без использования D-аспарагина; группа №2 (опытная) - из 25 крыс, которым проводили моделирование отслойки сетчатки, с однократным введением раствора D-аспарагина в период с 1-х по 6-е сутки. D-аспарагин у крыс из группы №2 применялся интравитреально по 0,02 мл в виде 0,5% раствора, приготовленного на высокоочищенной воде.
Моделирование отслойки сетчатки проводили путем субретинального введения 0,02 мл 1% гиалуроната натрия (ООО Арт Эстель, Россия). Все операции проведены под золетил-ксилазиновым наркозом: золетил (Vibrac Sante Animale, Франция) в/м в дозировке 8 мг/кг веса тела, ксиланит (ООО НИТА-ФАРМ, Россия) в/м в дозировке 8 мг/кг веса тела и атропина сульфат (Белмедпрепараты, Россия) п/к в дозировке 0,1 мг/кг веса тела. С целью расширения зрачка, закапывали на коньюнктиву глаза 2% тропикамид (Варшавский фармацевтический завод Польфа, Польша) и 1% мезатон (ОАО Дальхимфарм, Россия) (Hisatomi Т. et al. Relocalization of apoptosis-inducing factor in photoreceptor apoptosis induced by retinal detachment in vivo // The American journal of pathology. - 2001. - V. 158. - №. 4. - P. 1271-1278.).
После эвтаназии животных и забора глазных яблок, их помещали в цинк-формалиновый фиксатор с сульфатом цинка (Kierman J.A. Histological and histochemical methods. Theory and practice. - London: Scion Publishing Ltd. - 2008. - 606 p.). Выполняли проводку полученных образцов через изопропанол, с последующей их заливкой в парафин. Парафиновые блоки нарезали на срезы толщиной 10 мкм на микротоме МПС-2 (СССР). Окрашивание микропрепаратов проводили гематоксилином и эозином. Для фотографии микропрепаратов использовали микроскоп Микмед-5 (Россия) и окулярную камеру Levenhuk-230 (США).
На исследуемых микропрепаратах глазных яблок у крыс группы №1 (сравнения) структура сетчатки значительно повреждена, послойное строение сетчатки проследить невозможно, видны остатки клеток зернистых слоев, внутренняя пограничная мембрана полностью разрушена (см. фигура 1, окрашено гематоксилин-эозином, при увеличении объектива Х10). В области стекловидного тела прослеживается рыхлая волокнистая структура, содержащая скопление клеток (фибробласты, макрофаги, немного эритроцитов) (см. фигура 1, окрашено гематоксилин-эозином, при увеличении объектива Х10, фигура 2, окрашено гематоксилин-эозином, при увеличении объектива Х40).
При исследовании микропрепаратов глазного яблока у крыс из группы №2 (опытная) выявлена умеренная отслойка сетчатки от склеры в области пигментного и фотосенсорного слоев, видны признаки умеренной деструкции данных слоев, определяются единичные участки сохранного фотосенсорного слоя. Наружный и внутренний зернистые слои имеют рыхлую, комковатую структуру, разделены набухшим сплетениевидным слоем. Внутренний сплетениевидный слой разбухший, наблюдается расслоение его от внутреннего зернистого слоя. Четко прослеживается ганглионарный слой, отмечается гиперхромия, а у части его клеток - набухание (см. фигура 3, окрашено гематоксилин-эозином, при увеличении объектива X10, фигура 4, окрашено гематоксилин-эозином, при увеличении объектива Х40). Внутренняя пограничная мембрана сохранена, на всем протяжении отграничивает сетчатку от стекловидного тела. Участков разрастания клеток в области стекловидного тела не обнаружено (см. фигура 4, окрашено гематоксилин-эозином, при увеличении объектива Х40).
Пример 1. Нелинейный самец крысы, массой 186 гр. был прооперирован, выполнено моделирование отслойки сетчатки путем субретинального введения 0,02 мл 1% гиалуроната натрия (ООО Арт Эстель, Россия). Процедура проведена под золетил-ксилазиновым наркозом: золетил (Vibrac Sante Animale, Франция) в/м в дозировке 8 мг/кг веса тела, ксиланит (ООО НИТА-ФАРМ, Россия) в/м в дозировке 8 мг/кг веса тела и атропина сульфат (Белмедпрепараты, Россия) и/к в дозировке 0,1 мг/кг веса тела. С целью расширения зрачка, закапывали на коньюнктиву глаза 2% тропикамид (Варшавский фармацевтический завод Польфа, Польша) и 1% мезатон (ОАО Дальхимфарм, Россия). На 2-е сутки после операции, интравитреально вводили 0,02 мл 0,5% раствор D-аспарагина, при этом предварительно, с целью расширения зрачка, закапывали на коньюнктиву глаза 2% тропикамид (Варшавский фармацевтический завод Польфа, Польша) и 1% мезатон (ОАО Дальхимфарм, Россия). Эвтаназия была проведена на 30 сутки, после чего проводили забор глазных яблок для гистологического анализа и их фиксацию в цинк-формалиновом фиксаторе с сульфатом цинка. Затем, выполнили проводку образца через изопропанол до парафина, изготовили парафиновый блок, провели его нарезку на срезы толщиной 5 мкм на микротоме МПС-2 (СССР), смонтировали срезы на предметные стекла и окрасили полученные микропрепараты гематоксилином-эозином, заключили в полистирол под покровное стекло и сфотографировали с помощью камеры Levenhuk-230 (США). Результаты эксперимента показаны фигурах 3-4. Видна сетчатка глаза в поперечном разрезе, определяются признаки ее отслойки, но, в области стекловидного тела, пролиферативной витриоретинопатии не выявлено, под увеличением в X10 (фигура 3, окраска гематоксилином эозином), также не наблюдается признаков пролиферативной витриоретинопатии, под увеличением Х40 (фигура 4, окраска гематоксилином эозином).
Таким образом, однократное интравитреальное введение D-аспарагина в период с 1-х по 6-е сутки от начала экспериментальной отслойки сетчатки у крыс приводит к значительному сокращению развития пролиферативной витриоретинопатии и повышению сохранности сетчатки к 30 суткам от начала эксперимента, в сравнении с животными, не получавшими лечение D-аспарагином.