Влияние комплекса иммуноактивных пептидов - тинростима - на активность протеолитических ферментов

2008

Известия ТИНРО

Том 154

УДК 577.15

Т.А. Кузнецова1, Т.Н. Пивненко2, Л.М. Эпштейн2, Н.Н. Беседнова1*

1 Научно-исследовательский институт эпидемиологии

и микробиологии СО РАМН, 690087, г. Владивосток, ул. Сельская, 1;

2 Тихоокеанский рыбохозяйственный научный центр,

690990, г. Владивосток, пер. Шевченко, 4

ВЛИЯНИЕ КОМПЛЕКСА ИММУНОАКТИВНЫХ ПЕПТИДОВ — ТИНРОСТИМА — НА АКТИВНОСТЬ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ

Исследовано действие комплекса иммуноактивных пептидов — тинростима, выделенного из ганглиев кальмара, на активность сериновых протеаз. Установлена слабая ингибиторная активность тинростима в отношении панкреатических сериновых протеиназ — трипсина и химотрипсина. При высоких концентрациях тинростима отмечается антиплазминовая активность, наблюдается торможение фибринолиза in vitro, что является проявлением ингибиторной активности комплекса в отношении факторов свертывания крови и ферментов плазминовой системы, являющихся сериновыми протеазами. Полученные результаты свидетельствуют о способности тинростима регулировать активность сериновых протеаз, что раскрывает новые аспекты механизмов его иммуномодулирующего действия.

Ключевые слова: иммуноактивные пептиды, сериновые протеазы, гемостаз.

Kuznetsova T.A., Pivnenko T.N., Epshtein L.M., Besednova N.N. Immu-

noactive peptide complex Tinrostim influence on activity of proteolytic enzymes // Izv. TINRO. — 2008. — Vol. 154. — P. 372-378.

Tinrostim is an immunoactive peptide complex from squid nerve tissue belonged to regulatory peptides — cytomedins. It is applied for immune modulation as biologically active supplement to food. The cytomedins ability to regulate activity of serine enzymes is their important characteristic for clinical practice. However, the Tinrostim influence on the activity of proteolytic enzymes and on the system of hemostasis was not investigated before. In the investigation of inhibition kinetics for the major pro-teolytic enzymes hydrolytic activity, Tinrostim was weak inhibitor of trypsin and chymotripsin acting with non-concurrent type. Tinrostim in high concentrations showed anticoagulant activity for healthy donor plasma in vitro. Tinrostim influenced on the system of fibrinolysis by decreasing the level of its basic component — plazminogen that depressed fibrinolytic activity. Our results show that Tinrostim has inhibitory activity to the factors of coagulation and the plazmin system enzymes, which are serine proteases. Thus, Tinrostim is able to regulate the activity of serine proteases

* Кузнецова Татьяна Алексеевна, кандидат медицинских наук, ведущий научный сотрудник, e-mail: niiem_vl@mail.ru; Пивненко Татьяна Николаевна, доктор биологических наук, заведующая сектором, e-mail: pivnenko@tinro.ru; Эпштейн Леонид Мендельевич, доктор биологических наук, главный научный сотрудник; Беседнова Наталия Николаевна, академик РАМН, директор института.

that opens up new aspects of its immunomodulation mechanisms and expands the list of its indications to clinical application.

Kew words: immunoactive peptides, serine protease, hemostasis.

Введение

Полипептиды, содержащиеся в различных органах и тканях макроорганизма (нервной ткани, надпочечниках, сердце, легких, желудочно-кишечном тракте, печени, почках, тимусе, селезенке и др.), получили название цитомедины. Роль этих пептидов в организме заключается в регуляции функций гомеостаза, а их полифункциональность определяется местом происхождения. Они обладают рядом общих характеристик и сходных функций и специфичны к тканям, органам, клеткам, из которых выделены, но не видоспецифичны, в связи с чем цитомеди-ны, полученные из тканей млекопитающих, способны оказывать регулирующее влияние на человеческий организм (Кузник, 1998). Помимо выполнения специфических функций цитомедины имеют ряд общих неспецифических свойств, к которым относится влияние на иммунную систему, систему гемостаза, комплемента, на фагоцитарные процессы, перекисное окисление липидов. Выявлены цитомедины, усиливающие и угнетающие функции иммунной системы, повышающие и понижающие кровяное давление, усиливающие и ослабляющие функцию гладких мышц, ускоряющие и замедляющие свертывание крови и др. (Морозов, 1996; Кузник, 1998; Кузник и др., 2005).

Из различных тканей млекопитающих выделен целый ряд иммуноактивных цитомединов, нашедших широкое применение при терапии ряда заболеваний инфекционной и соматической природы (Морозов, 1996; Кузник, 1998; Абдуллаев и др., 2001; Михайлова, 2001; Кузник и др., 2002, 2005; Цепелев, 2003; Беседнова, 2004).

Важной характеристикой цитомединов является их способность регулировать активность сериновых протеаз. Выявлены соединения (полипептиды из эндотелия сосудов, печени, почек, тромбоцитов), ингибирующие сериновые проте-азы (Кузник, 1998).

Из органов и тканей гидробионтов также выделены пептидные соединения, обладающие различными типами биологической активности, в том числе тинро-стим, оказывающий иммуномодулирующее и противовоспалительное действие и применяющийся в качестве иммунокорректора в составе БАД "Тинростим-СТ" (Беседнова, 2003, 2004). Влияние тинростима на активность протеолитических ферментов до настоящего времени не исследовано.

Целью настоящей работы явилось изучение влияния тинростима, как представителя цитомединов, на активность сериновых протеиназ различных подклассов.

Материалы и методы

Объектами исследования явились полипептидные препараты тинростим, гепалин, кутикулин, апротинин.

Тинростим — комплекс пептидов, выделенных из оптических ганглиев кальмара. Он содержит 84 % низкомолекулярных пептидов с м.м. от 1,0 до 12,5 кДа и 16 % свободных аминокислот, представленных в основном аспарагиновой, глутаминовой кислотами и лизином. Около 10 % общего количества аминокислот составляет таурин (Пат. № 2222337).

Для сравнения исследовали влияние других цитомединов — гепалина, кути-кулина, апротинина — на активность протеолитических ферментов. Гепалин — полипептид, выделенный нами из печени кальмара (Пат. № 2222337), кутику-лин — полипептид, полученный из кутикулы куриного желудка тем же методом (Пат. № 2222337). Апротинин — коммерческий препарат фирмы "S igma" (США), представляет собой полипептид, выделенный из легких млекопитающих, является одним из наиболее изученных белковых ингибиторов и использовался нами в качестве положительного контроля ингибиторной активности.

Эффективность торможения активности сериновых протеиназ исследовали по изменению активности трипсина и химотрипсина. Для определения эстераз-ной активности химотрипсина использовали метод Шверта и Такенака (Shwert and Takenaka, 1955) и модификацию этого метода, предложенную Хаммелем (Hummel, 1959). Определение амидазной активности трипсина проводили методом Эрлангера (Erlanger et al., 1969). В качестве субстратов использовали аце-тил^-тирозин этиловый эфир ( АТЭЭ) и Na-бензоил-L-аргинин-р-нитроанилид (БАр-НА) производства "Sigma", США.

Принцип обоих методов состоит в том, что под действием испытуемого фермента происходит расщепление субстратов с образованием спирта (или нитро-анилида) и производных аминокислот, которые имеют более высокое, чем исходный эфир (или нитроанилид), значение оптической плотности при длине волны 237 (или 405) нм.

Кинетические константы ферментного гидролиза субстратов KM и Vmax и тип ингибирования определяли по методу Лайнуивера-Берка по графикам двойных обратных величин (Диксон, 1982; Крупянко, 1996).

Для оценки влияния тинростима на сериновые протеазы крови в модельных опытах in vitro использовали пулированную плазму крови. Тинростим вносили в плазму в концентрации от 1 до 1000 мкг/мл и инкубировали 10 мин при комнатной температуре. Исследование проводили в сравнении с гепарином, который вносили в концентрации 1,0 Ед/мл (что соответствует 7,2 мкг/мл).

Базовыми тестами для исследования состояния коагуляционного гемостаза являются АПТВ-, ПВ- и ТВ-тесты. АПТВ-тест (активированное парциальное тром-бопластиновое время) служит для оценки внутреннего механизма свертывания; ПВ-тест (протромбиновое время) — для оценки внешнего механизма свертывания; ТВ-тест (тромбиновое время) для оценки конечного этапа свертывания (превращение фибриногена в фибрин под влиянием тромбина); индекс стимуляции используется как интегральный показатель эффективности процесса.

Определение активности плазминогена и плазмина оценивали по состоянию фибринолитической системы крови, которая обеспечивает лизис фибрина, образующегося в процессе формирования фибринового тромба. В процессе лизиса происходит превращение неактивного предшественника плазминогена в активную форму — плазмин. Состояние системы фибринолиза оценивается по активности плазминогена методом, основанным на гидролизе хромогенного субстрата. При добавлении стрептокиназы к образцу плазмы образуется плазми-ноген-стрептокиназный комплекс, обладающий способностью расщеплять хро-могенный субстрат, при этом скорость расщепления пропорциональна концентрации плазминогена.

Измерения проводились на коагулометре CD-4 фирмы "DiaMed" (Швейцария) и на фотометре RA-50 "Bayer Diagnostics" (Германия) с применением наборов "Технология-Стандарт" (г. Барнаул) в соответствии с прилагаемой инструкцией (Баркаган, 2001).

Результаты и их обсуждение

Исследования предыдущих лет показали, что ряд пептидных иммуномодуля-торов — цитомединов, выделенных из различных органов гидробионтов, а также лекарственные препараты этой же группы из органов млекопитающих обладают способностью регулировать активность сериновых протеиназ (Кузник, 1998).

В табл. 1 и 2 приведены данные по кинетике торможения гидролитической активности соответственно трипсина и химотрипсина. Так как установить константу ингибирования в случае суммарных пептидных препаратов затруднительно, для рассмотрения была взята равновесная константа ингибирования I численно равная концентрации ингибитора, вызывающей 50 %-ное торможение активности фермента.

Таблица 1

Изменение кинетических параметров гидролиза Na-бензоил-Ь-аргинин-р-нитроанилидгидрохлорида трипсином под влиянием пептидных препаратов

Table 1

The change of kinetic parameters of hydrolysis of Na-benzoil-L-arginin-p-nitroanilidhydroclorid by tripsin under influence of peptide preparations

Пептидный препарат Соотношение I : E Км, мМ Vmax, М/мин I50

Тинростим 0,13 0,27 1,56 2,5 2,1 0,8 0,30 0,26 0,13 1,100

Гепалин о о о 7 2 1 ОО СО 2,6 2,5 2,2 0,26 0,25 0,16 0,730

Кутикулин 0,13 0,27 2,6 2,6 0,26 0,23 0,580

Апротинин (положительный контроль) 0,03 0,18 2,3 1,3 0,16 0,19 0,036

Без ингибитора (контроль) - 2,6 0,32 0

Примечание. Здесь и в табл. 2 I : E — массовое соотношение.

Таблица 2

Изменение кинетических параметров гидролиза ацетил-Ь-тирозин-этилового эфира химотрипсином под влиянием пептидных препаратов

Table 2

The change of kinetic parameters of hydrolysis of acetyl-L-tirozineaetil-ether by chimotripsin under influence of peptide preparations

Пептидный препарат Соотношение I : E Км, мМ м Vmax, М/мин I50

Тинростим 0,13 0,27 0,52 1,56 2,50 2,40 0,60 1,95 11,9 8,9 8,0 4,7 0,585

Гепалин 0,13 0,27 0,52 1,89 2,10 2,00 13,7 11,9 8,5 0,920

Кутикулин 0,26 0,52 1,56 2,10 2,10 2,20 15.7 14.8 14,7 Активация

Апротинин (положительный контроль) 0,10 0,18 1,85 1,71 13,2 11,2 0,320

Без ингибитора (контроль) - 1,86 14,1 0

По данным табл. 1, апротинин проявил себя как сильный ингибитор трипсина, действующий по смешанному типу. Для достижения 50 %-ного ингибирова-ния было достаточно 0,036 мг апротинина на 1 мг фермента. Апротинин является поливалентным ингибитором различных сериновых протеиназ, обеспечивая торможение фибринолиза.

Для других испытанных препаратов показатели 50 %-ного ингибирования на порядок выше, при этом наименее активным оказался тинростим. Доза тинро-стима, необходимая для достижения 50 %-ного ингибирования, составляет 1,1 мг. Гепалин и кутикулин тормозят активность трипсина по неконкурентному типу, тинростим — по бесконкурентному (табл. 1).

По отношению к химотрипсину все исследуемые препараты, включая апроти-нин, оказались слабыми ингибиторами. При этом тинростим, гепалин и апротинин вызывают торможение фермента по неконкурентному типу, а кутикулин при низких концентрациях оказывает активирующее действие на химотрипсин (табл. 2).

Известно, что низкомолекулярные белки, пептиды и даже аминокислоты могут выступать в качестве ингибиторов или активаторов для протеолитических ферментов, так как они способны связываться с субстратсвязывающим участком активного центра ферментов и тем самым препятствовать или способствовать ферментативному катализу (Колодзейская, Веревка, 1990). В настоящее время предложены следующие механизмы активации протеолитических ферментов: активация по сорбционному механизму, когда происходит достраивание субстрата с N- или С-конца, при этом и субстрат, и активатор должны содержать N- или С-незащищенные аминокислоты; активация по механизму синтеза-гидролиза, соответствующая тем же требованиям. Наиболее эффективными реагентами, способными вызывать активацию протеиназ, считаются низкомолекулярные субстраты или их аналоги (Румш, 1994).

Результаты изучения влияния тинростима на сериновые протеиназы плазмы крови in vitro в АПТВ-, ПВ- и ТВ-тестах, служащих базовыми при оценке показателей системы свертывания крови, представлены в табл. 3. Статистически значимых изменений показателей свертывания при внесении в плазму тинростима в концентрациях 0,01-100,00 мкг/мл не выявлено. Внесение тинростима в больших концентрациях приводило к удлинению временных показателей свертывания. Так, под влиянием тинростима в концентрации 500-1000 мкг/ мл наблюдалось возрастание времени свертывания в базовых коагуляционных тестах (р < 0,05), что свидетельствует о замедлении процессов свертывания крови, или гипокоагуляции (табл. 3).

Таблица 3

Влияние тинростима in vitro на показатели АПТВ-, ТВ- и ПВ-тестов

Table 3

The influence of tinrostim in vitro on values of APTT-, TT and PT-tests

Концентрация тинростима, мкг/мл АПТВ Время свертывания плазмы крови, с ИС ТВ ИС ПВ ИС

1000 40,0 ± 0,7* р < 0,05 1,14 19,0 ± 0,7* р < 0,05 1,3 16,5 ± 0,5* р < 0,05 1,2

500 39,0 ± 0,5* р < 0,05 1,11 18,5 ± 0,6* р < 0,05 1,3 16,0 ± 0,4* р < 0,05 1,2

100 38,5 ± 0,3 р > 0,05 1,10 17,0 ± 0,8 р > 0,05 1,2 15,0 ± 0,3 р > 0,05 1,1

10 35,5 ± 0,4 р > 0,05 1,00 15,5 ± 0,4 р > 0,05 1,1 15,0 ± 0,3 р > 0,05 1,1

1,0 35,0 ± 0,3 р > 0,05 1,00 16,5 ± 0,5 р > 0,05 1,1 14,0 ± 0,5 р > 0,05 1,0

0,1 35,5 ± 0,3 р > 0,05 1,00 15,0 ± 0,3 р > 0,05 1,0 12,5 ± 0,5 р > 0,05 1,0

0,01 34,5 ± 0,4 р > 0,05 1,00 14,5 ± 0,5 р > 0,05 1,0 13,0 ± 0,5 р > 0,05 1,0

Гепарин 735,0 ± 41,0* р < 0,05 21,00 405,0 ± 30,0* р < 0,05 28,0 393,0 ± 28,0* р < 0,05 29,0

Контроль 35,0 ± 0,3 14,5 ± 0,5 13,5 ± 0,5

Примечание. Здесь и в табл. 4: n = 6; использован непараметрический Q-критерий Данна; ИС — индекс стимуляции — рассчитан как отношение времени свертывания в опыте и контроле; р — значимость различий по результатам дисперсионного анализа показателей в опыте по сравнению с контролем. * Различие значимо (p < 0,05).

Влияние тинростима на систему ферментов фибринолиза также изучали в тестах in vitro по уровню плазминогена. Внесение тинростима в концентрациях от 1 до 100 мкг/мл не оказывало существенного влияния на уровень плазмино-гена. При увеличении концентрации тинростима до 250 мкг/мл выявлена тен-

376

денция к снижению (82,0 ± 4,6 по сравнению с 92,0 ± 3,5 в контроле, р > 0,05), а при концентрации 500 мкг/мл — снижение уровня плазминогена (р < 0,05), что свидетельствует об угнетении процессов фибринолиза (табл. 4).

Таблица 4

Влияние тинростима in vitro на уровень плазминогена

Table 4

The influence of tinrostim in vitro on the plazminogen level

Концентрация тинростима, мкг/мл Концентрация плазминогена, % ИС

500 72,0 ± 4,4* р < 0,05 0,80

250 82,0 ± 4,6 р > 0,05 0,90

100 90,0 ± 3,3 р > 0,05 0,97

10 90,0 ± 4,6 р > 0,05 0,97

1 96,0 ± 3,8 р > 0,05 1,00

Контроль 92,0 ± 3,5

Аналогичный эффект (снижение времени свертывания и торможение активности плазминогена в больших концентрациях in vitro) демонстрировали пептиды тималин (комплекс полипептидных фракций из вилочковой железы) и гепа-лин (комплекс полипептидов печени), что также связывают с наличием антипро-теазной активности (Витковский, 1990; Чиркунов, 2000).

Заключение

Таким образом, выявлена слабая ингибиторная специфичность тинростима по отношению к важнейшим пищеварительным протеолитическим ферментам — трипсину и химотрипсину. Кроме того, тинростим в больших концентрациях проявляет противосвертывающую активность и приводит к снижению уровня плаз-миногена in vitro, что также можно считать проявлением ингибиторной активности в отношении факторов свертывания крови и ферментов плазминовой системы, являющихся по своей природе сериновыми протеазами.

На модельных системах показано, что исследованные пептидные комплексы способны связываться с субстратсвязывающими участками активных центров ферментов и тем самым регулировать активность сериновых протеаз различного происхождения. Полученные нами результаты раскрывают новые аспекты механизмов биологической активности пептидных препаратов.

Список литературы

Абдуллаев P.A., Абдуллаев Х.Р., Витковский Ю.А. и др. Влияние тималина, эпиталамина и вилона на иммунитет и гемостаз у больных с перитонитом и парапрокти-том // Int. J. Immunoreh. — 2001. — Vol. 3, № 1. — С. 100.

Баркаган З.С. Диагностика и контролируемая терапия нарушений гемостаза : монография / З.С. Баркаган, А.П. Момот. — М. : Ньюдиамед, 2001. — 296 с.

Беседнова H.H. Биологически активная добавка к пище тинростим (в помощь практическому врачу) : монография / Н.Н. Беседнова, Л.М. Эпштейн. — Владивосток : ТИНРО-центр, 2003. — 47 с.

Беседнова H.H. Иммуноактивные пептиды из гидробионтов и наземных животных : монография / Н.Н. Беседнова, Л.М. Эпштейн. — Владивосток : ТИНРО-центр, 2004. — 248 с.

Витковский Ю.А. Влияние полипептидов печени на иммунитет, гемостаз и неспецифическую резистентность организма в эксперименте : автореф. дис. ... канд. мед. наук. — М., 1990. — 16 с.

Диксон М. Ферменты : монография / М. Диксон, Р. Уэбб. — М. : Мир, 1982. — Т. 2. — 520 с.

Колодзейская М.В., Веревка С.В. Гидрофобные взаимодействия а-химотрипси-на с низкомолекулярными соединениями // Укр. биохим. журн. — 1990. — Т. 62, № 5. — С. 3-14.

Крупянко Р.И. Возможности использования векторного метода представления ферментативных реакций в анализе данных ингибирования ферментов // Прикл. биохимия и микробиология. — 1996. — Т. 32, № 1. — С. 155-164.

Кузник Б.И. Цитомедины: 25-летний опыт экспериментальных и клинических исследований : монография / Б.И. Кузник, В.Г. Морозов, В.Х. Хавинсон. — СПб. : Наука, 1998. — 310 с.

Кузник Б.И., Патеюк А.В., Джулай М.А. и др. Пептидные механизмы регуляции иммунитета и гемостаза // Аллергол. и иммунол. — 2005. — Т. 6, № 2. — С. 160-161.

Кузник В.И., Витковский Ю.А., Сазоненко В.А. и др. Влияние тималина на иммунитет, гемостаз и уровень провоспалительных и противовоспалительных цитокинов при ожоговой болезни // Гематол. и трансфузиол. — 2002. — Т. 47, № 1. — С. 17-21.

Михайлова А.А. Регуляторные пептиды костного мозга — иммуномодуляторы нового поколения // Аллергол. и иммунол. — 2001. — Т. 2, № 1. — С. 46-52.

Морозов В.Г. Пептидные биорегуляторы (25-летний опыт экспериментального и клинического изучения) : монография / В.Г. Морозов, В.Х. Хавинсон. — СПб. : Наука, 1996. — 74 с.

Пат. № 2222337 РФ. Способ получения иммуностимулятора / Л.М. Эпштейн, Г.А. Боровская, Н.Н. Ковалев и др. Заявл. 2004.07.03; Опубл. 2004.01.27. Бюл. № 3.

Румш Л.Д. Химия протеолиза // Биоорган. химия. — 1994. — Т. 20, № 2. — С. 85-99.

Цепелев В.Л. Механизмы действия регуляторных пептидов при иммунодефицит-ных состояниях и воспалении : автореф. дис. ... д-ра мед. наук. — Чита, 2003. — 41 с.

Чиркунов А.В. Влияние тималина, тимогена и вилона на некоторые показатели иммунитета и гемостаза : дис. ... канд. мед. наук. — Чита, 2000. — 141 с.

Erlanger B.F., Kokowski N., Cohen W. The preparation and properties of two chro-mogenic substrutes of trypsin // Arch. Biohem. Biophys. — 1969. — Vol. 95. — P. 217-278.

Hummel B.C.W. A modified spectrophotometry determination of chymotrypsin, trypsin and trombine // Can. J. Biochem. Physiol. — 1959. — Vol. 37, № 12. — P. 1393-1399.

Shwert G.W. and Takenaka Y. A spectrophotometry determination of trypsin and chymotrypsin // Biochem. Biophys. Acta. — 1955. — Vol. 16, № 4. — P. 570-575.

Поступила в редакцию 5.12.07 г.