УСТРОЙСТВО ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ВСАСЫВАЕМОСТИ ВЕЩЕСТВ КИШЕЧНИКОМ ЖИВОТНЫХ

Устройство изучения всасываемости веществ кишечником животных относится к ветеринарии, в частности к скоростному и количественному анализу поступления минеральных веществ из пищеварительного тракта животных во внутреннюю среду организма и может быть использовано, например, при оценке фармакокинетического профиля и биодоступности вновь создаваемых соединений-кандидатов в ветеринарные препараты.
Исследование процессов поступления микроэлементов из пищеварительного тракта человека и животных во внутреннюю среду организма имеет уже более чем вековую историю, при этом методы и устройства, используемые для количественных оценок всасывания, отличаются определенным разнообразием и служат предметом научных диспутов. Экспериментально всасывание изучается в условиях in vivo, in situ и in vitro. Каждые из перечисленных условий имеют свои преимущества и недостатки, выбор метода изучения в большой мере зависит от цели и характера исследуемых закономерностей.
Исследования в условиях in vivo осуществляется путем вживления хронических фистул в кишечную стенку и хронических катетеров на воротной и брыжеечной венах [1]. Опыты in situ в основном проводятся на наркотизированных животных, при этом на определенные участки кишки накладывают лигатуры и вводят в энтеральный просвет соответствующие модельные растворы, содержащие одно или несколько веществ (субстратов), затем проводят перфузию кишки и катетеризацию портальной и брыжеечной вен.
Недостатком указанных методов является многообразие и сложность различных факторов, которые в таких условиях эксперимента необходимо учитывать, что значительно, а иногда критично, затрудняют их использование. В опытах in vivo и in situ движение ионов и молекул воды через кишечную стенку осуществляется как из просвета кишечника в кровь, так и в обратном направлении, т.е. не является односторонним, т.е. во внимание должен приниматься «эндогенный пул» микроэлементов, регулируемый гомео-статическими механизмами, что в условиях экспериментов учесть достаточно сложно. Более того, исходная обеспеченность организма элементами, существенно влияет на эффективность абсорбции для многих микроэлементов по типу обратной связи [3].
К настоящему времени сформировался ряд позиций, ограничивающих возможность проведения изучения процессов всасываемости in vivo и in situ. Наряду с этическими причинами, эксперименты на животных обладают рядом и других недостатков: цена, время, трудоемкости т.п., кроме того, ввиду межвидовых различий, необходимо использовать несколько видов. Количество особей должно составлять значительное число, для достижения статистической достоверности.
Известные методы исследования транспорта in vitro отличаются определенным разнообразием - на аккумулирующем препарате слизистой оболочки, изолированных энтероцитах на апикальной и базолатеральной мембранах энтероцитов и др. [2], что же касается устройств для количественного изучения всасываемости веществ кишечником, то их перечень в патентной и научной литературе вовсе весьма скуден.
Известно устройство [5] для оценки функции кишечника, которое включает дисплей для демонстрации численной аналоговой шкалы, приемный блок и интерфейс, передающий величину и/или интенсивность указанных параметров на единый контрольный пункт. Устройство позволяет осуществлять контроль некоторых функции кишечника, т.е. обладает относительным сходством с заявляемым.
Недостатком этого устройства является косвенное суждение о всасывании веществ кишкой, невозможность широкого использования модели в научных экспериментах, медицинская направленность использования преимущественно терапевтического характера, невозможность использования в практике работы ветеринарных фармацевтических предприятий.
Также известно устройство [6] для определения скорости всасывания питательных веществ, которое включает две относительно подвижные емкости, разделенные полупроницаемой мембраной, в качестве которой выступает стенка тонкого отдела кишечника. Устройство позволяет судить о способности кишечника, как к диффузному, так и к активному переносу питательных веществ в рецепторную среду.
Недостатком этого устройства является отсутствие возможности количественной оценки всасываемости вещества и невозможность исследования всасываемости вещества от разных животных в одних и тех же кинетических условиях.
В качестве ближайшего аналога (прототипа) выбрано устройство для определения скорости всасывания питательных веществ [4], состоящее из двух емкостей, имеющих относительную подвижность и разделенных полупроницаемой мембраной, выполненной из стенки тонкого отдела кишечника, устройство снабжено поршнем с приводом, установленным в сосуде с питательной средой. Прототип, аналогично заявляемому устройству, позволяет осуществлять констатацию скорости всасывания веществ кишкой.
К недостаткам этого устройства-прототипа относятся: низкая технологичность использования в работе ветеринарных фармакологических предприятий; невозможность одномоментного использования устройства для смежных участков кишечника при одних и тех же условиях инкубации; отсутствие возможности анализа всасываемости вещества от разных животных в одних и тех же кинетических условиях; невозможность количественных характеристик всасываемости веществ.
Других технических решений со сходными, аналогичными заявляемому признакам в патентной и научно-технической литературе не обнаружено. Таким образом, заявляемое техническое решение соответствует критерию «новизна».
Задача, на решение которой направлено заявленное техническое решение заключается в решении актуальной для ветеринарной науки и фармацевтической практики проблемы - определение скорости и количества всасывания, созданных или вновь создающихся лекарственных веществ кишечником животных, т.е. предложение «промышленно применимо».
Поставленная задача решается благодаря тому, что в устройстве изучения всасываемости веществ кишечником животных, подобно прототипу имеется корпус и полупроницаемая мембрана, представляющая собой стенку тонкого отдела кишечника, предусмотрены, следующие отличия - корпус устройства выполнен из оргстекла и выполняет функцию водяной бани, имеет отверстие для погружного циркуляционного термостата, внутри корпуса, перпендикулярно его продольной оси находятся автономные рабочие камеры из оргстекла, внутрь которых помещается специальная, герметично фиксирующая на штуцер участок тонкой кишки животного пластина, устройство монтируется на платформе, позволяющей осуществлять слив содержимого кишечника.
Наличие причинно-следственной связи между совокупностью существенных признаков заявляемого объекта и достигаемым техническим результатом показано в табл.1.
Таблица 1
Причинно-следственная связь между совокупностью существенных признаков заявляемого объекта и достигаемым техническим результатом
№ пп
Виды технического результата
Показатели
Объяснение, за счет чего стало возможным улучшение показателей предложенного объекта по сравнению с прототипом
прототипа
заявляемого объекта
1
2
3
4
5
Оценка скорости всасывания веществ кишечником
Да
Да
Конструктивные характеристики предлагаемого устройства позволяют одновременно оценивать скорость всасывания 6 испытуемых веществ или проводить оценку разности скорости всасывания одного и того же вещества у 6 различных животных
Продолжение таблицы 1
1
2
3
4
5
1.
Количественная оценка всасываемости вещества кишечником
Нет
Да
Результат достижим в виду оригинальной методики проведения испытания путем сопоставления результатов анализа мукозного, серозного растворов и кишечной стенки на предмет содержания испытуемого вещества.
2.
Возможность одновременного анализа скорости и количества всасывания вещества в разных его концентрациях
Нет
Да
Результат достижим в виду сопоставления причин по пп.1 и 2 настоящей таблицы
3.
Единовременное использования устройства для анализа смежных участков кишечника при одних и тех же условиях инкубации
Нет
Да
Оригинальная конструкция прибора позволяет исследовать скорость и количество всасываемого вещества заданной концентрации различными участками кишечника, что дает возможность быстрого суждения об особенностях фармакокинетики вещества
4.
Количество проб, для одновременного анализа в собранной установке
1
6
В силу конструктивных особенностей устройства
5.
Технологичность в работе ветеринарных фармакологических предприятий
Нет
Да
В силу возможности анализа всасываемости вещества кишечником разных животных в одних и тех же кинетических условиях
Таким образом, техническое решение позволяет осуществлять точную скоростную и количественную оценку всасываемости микроэлементов кишечником животных за счет одномоментного использования устройства для смежных участков кишечника при одних и тех же условиях инкубации, высокую технологичность оценки фармакопрофиля вновь создаваемых ветеринарных препаратов для энтерального применения, а также изучать всасывательные свойства веществ разных концентраций или/или разных испытуемых веществ.
Техническая сущность и принцип действия предложенного устройства поясняются чертежом, на котором: Фиг.1 Корпус устройства для изучения всасываемости веществ кишечником животных; Фиг.2 Фиксирующая пластина устройства для изучения всасываемости веществ кишечником животных; Фиг.3 Станина устройства для изучения всасываемости веществ кишечником животных.
Возможность осуществления заявляемого технического решения показано следующими примерами.
Пример 1. Демонстрация функциональной способности устройства.
В качестве примера реализации данной цели исследований нами проведена серия опытов с использованием в качестве испытуемого вещества меди сульфата, который растворяли в изотоническом растворе натрия хлорида. Концентрация исходного раствора рассчитывалась исходя из ориентировочного уровня элемента в химусе при даче животному терапевтической дозы соли.
Для осуществления опыта корпус устройства (1), для выполнения им функций водяной бани, устанавливали на платформу (13) и заполняли водой, затем в отверстие (2) помещали погружной циркуляционный термостат, определив на нем значение поддерживаемой температуры - 38,5°С. В таком состоянии прибор оставался в течение времени, необходимого для достижения водой, находящейся в корпусе заданной температуры, а также отбора проб тонкого кишечника у животных и доставки материала в лабораторию. Полученные сегменты тонкого кишечника закрепляли на штуцерах (8 и 9) фиксирующей пластины (5), заполняли рабочую камеру раствора испытуемым веществом, внутрь заливали определенный объем растворителя и инкубировали в течение заданного времени, после чего отбирались пробы мукозного и серозного растворов, а также кишечной стенки для количественного определения меди. По разности количества испытуемого вещества в мукозной и серозной жидкостях, уровню его в кишечной стенке и количеству вещества в контрольных растворах и тканях кишечника судили о степени всасываемости испытуемого вещества.
Исследования показали (табл.2), что после рабочей экспозиции прибора концентрация меди в анализируемых растворах претерпела изменения. Так, в серозном растворе, уровень меди составил 0,05 мг/кг (95% ДИ = от 0,046 до 0,057). При этом обращает на себя внимание достаточно низкий коэффициент вариации, что свидетельствует о малой дисперсии значений в выборке. Вместе с тем в «мукозном» растворе, концентрация данного элемента уменьшилась на 28% в сравнении с контролем, коэффициент вариации в данной выборке опять-таки достаточно приемлем. Следует отметить, что количество «серозного» раствора, также не претерпело существенных изменений.
Таблица 2
Концентрация меди (мг/кг) в испытуемых растворах и кишечнике в конце опыта
Биологический субстрат
Биометрический показатель
Среднее
Стандартная ошибка
Стандартное отклонение
Медиана
Коэффициент вариации
НГ 95% ДИ
ВГ 95% ДИ
Контрольный раствор
4,93
0,267
1,600
4,98
32
4,39
5,46
«Мукозный» раствор
3,51
0,212
1,271
3,49
36
3,09
3,94
«Серозный» раствор
0,05
0,003
0,017
0,051
33
0,046
0,057
Контрольный кишечник
3,96
0,243
1,457
4,07
37
3,48
4,45
Опытный кишечник
11,89
0,736
4,419
12,08
37
10,42
13,36
Примечание: НГ 95% ДИ и ВГ 95% ДИ - нижняя и верхняя граница (соответственно) 95% доверительного интервала.
Вместе с тем, по завершении опыта, происходит практически 3-х кратное увеличение концентрации испытуемого элемента в кишечной стенке, что иллюстрирует ее способность к реализации механизмов всасывания.
Таким образом, опыт демонстрирует наличие у устройства функциональных качеств в отношении заявляемого технического результата.
Пример 2. Демонстрация возможности суждения о скорости всасывания и количестве всосавшегося вещества посредством использования заявляемого устройства.
4
Серия экспериментов по достижению стабильных и статистически значимых результатов в отношении определенной цели методически была построена аналогично, указанному в примере 1, за исключением того, что реализация данной серии исследований осуществлялась путем разного времени (от 5 до 60 минут) инкубации тонкого кишечника в растворе CuSO заданной концентрации. В результате нескольких серий практической реализации данной модели опыта установлено (табл.3), что способность кишечника к активному трансмембранному транспорту микроэлементов наиболее выражена в течение первых 30 минут инкубации.
Таблица 3
Концентрация меди (мг/кг) в кишечной стенке в зависимости от времени инкубации
Время инкубации, мин
Биометрический показатель
Среднее
Стандартная ошибка
Стандартное отклонение
Коэффициент вариации
НГ 95% ДИ
ВГ 95% ДИ
5
2,02
0,097
0,584
29
1,82
2,21
10
3,03
0,132
0,795
26
2,76
3,29
15
3,90
0,163
0,978
25
3,58
4,23
20
4,36
0,167
1,002
23
4,03
4,69
25
4,91
0,197
1,179
24
4,51
5,30
30
5,35
0,233
1,400
26
4,89
5,82
40
5,15
0,215
1,292
25
4,72
5,58
50
4,71
0,233
1,401
30
4,24
5,18
60
5,22
0,203
1,221
23
4,81
5,62
Примечание: НГ 95% ДИ и ВГ 95% ДИ - нижняя и верхняя граница (соответственно) 95% доверительного интервала
При этом таблица 3 демонстрирует, что заявляемое устройство дает возможность суждения о скорости всасывания вещества и его количестве, всосавшегося кишечником в каждый конкретный момент времени эксперимента. Обращает также на себя внимание тот факт, что практически весь период наблюдений показал относительно небольшую вариативность числового ряда исследуемой переменной при коэффициенте вариации от 23 до 30%.
Предложенное устройство для изучения всасываемости веществ кишечником животных состоит из корпуса, фиксирующей пластины и станины, при этом корпус (1), имеет отверстие (2) для погружного циркуляционного термостата и автономные рабочие камеры (3); фиксирующая пластина (4) состоит из собственно пластины (5), имеющей на концах нижнее (6) и верхнее (7) отверстия для размещения в них нижнего (8) и верхнего (9) штуцеров, нижний штуцер (8) имеет резьбу (17), уплотнительные кольца (10) и глухую гайку (11); станина (12) имеет платформу (13);
Перечисленные выше конструктивные элементы выполнены следующим образом:
Корпус (1) - представляет собой полый прямоугольный параллелепипед, выполненный из оргстекла, внутри корпуса (1), перпендикулярно его продольной оси смонтированы автономные (от корпуса) рабочие камеры, представляющие собой также полые прямоугольные параллелепипеды из оргстекла (3), герметично совмещенные с верхним (14) и нижним (15) основаниями корпуса, нижняя часть рабочей камеры имеет отверстие (16) для нижнего штуцера (8), а верхнее основание корпуса (1) - отверстие (2) для погружного циркуляционного термостата.
Фиксирующая пластина (4) состоит из собственно пластины (5), выполненной из оргстекла имеющей на концах нижнее (6) и верхнее (7) отверстия для размещения в них пластмассовых нижнего (8) и верхнего (9) штуцеров, нижний штуцер (8) имеет резьбу (17), уплотнительные кольца (10) и глухую гайку (11). Фиксирующая пластина (4) размещается в автономной рабочей камере (3), герметично фиксируясь в ней посредством сочленения через отверстие (16) в нижнем (15) основании корпуса нижним (резьбовым) штуцером (8) глухой гайкой (11).
Станина (12) представляет собой металлическое неподвижное основание, на котором располагаются платформа (13) для размещения нижнего основания корпуса (15).
Описанным выше устройством для изучения всасываемости веществ кишечником животных пользуются следующим образом:
1. Устанавливают корпус (1) прибора на станину (12).
2. Заполняют корпус (1) прибора водой.
3. В отверстие (2) корпуса (1) помещают циркуляционный термостат, включают его, устанавливая рабочую температуру 38-39°С.
4. Экспозиция собранной установки в течение времени, необходимого для достижения заданной температуры.
5. Приготовление растворов испытуемых веществ для рабочих камер и подогрев их до заданной (38-39°С) температуры.
6. Получение участка тонкой кишки животного, аккуратное удаление из него содержимого путем промывания прохладной (18-20°С) водой;
7. Выворачивание промытого участка тонкой кишки животного слизистой оболочкой наружу посредством водной струи умеренной силы.
8. Помещение полученного участка кишечника в емкость с прохладным (18-20°С) физиологическим раствором для транспортировки в лабораторию.
9. Транспортировка емкостей с кишечником для исследования.
10. Отбор контрольной пробы кишечника для исследований.
11. Монтаж участка кишечника (18) на штуцера (8 и 9) фиксирующей пластины (4).
12. Установка фиксирующей пластины (4) в автономной рабочей камере (3), навинчивание уплотнительных колец (10) и глухой гайки (11).
13. Заполнение автономной рабочей камеры (3) испытуемым раствором с отбором контрольного образца для количественного исследования растворенного вещества.
14. Заполнение внутренней полости кишечника веществом-растворителем с отбором контрольного образца для исследования.
15. Инкубация в течение заданного времени.
16. Слив внутреннего содержимого кишки (со стороны серозной оболочки) посредством отвинчивания глухой гайки (11) и измерение объема полученной жидкости;
17. Отбор проб жидкости рабочих камер для исследования;
18. Отбор проб кишечника для исследования.
19. Исследование контрольных жидкостей и кишечника, полученных растворов со стороны слизистой и серозной оболочек, определение концентрации исследуемого вещества в кишечной стенке.
20. По разности количества испытуемого вещества в мукозной и серозной жидкостях, уровню его в кишечной стенке и количеству вещества в контрольных растворах и тканях кишечника, а так же этим показателям в зависимости от заданного времени эксперимента судят о степени и скорости всасываемости испытуемого вещества.
Источники информации
1. Алиев, А.А. Методы фистулирования пищеварительного тракта и взятия крови у птиц. - Калуга 1970. - С.45-49.
2. Всасывание и секреция в тонкой кишке: субмикроскопические аспекты / И.А.Морозов [и др.], АМН СССР. - М.: Медицина, 1988. - 224 с.
3. Микроэлементозы человека / А.П.Авцын [и др.]. - М.: Медицина, 1991. - 496 с.: ил.
4. Мосягин В.В. Устройство для определения скорости всасывания питательных веществ (патент) / В.В.Мосягин, Ю.В.Фурман, Н.И.Тригуб, Е.И.Битюков, Е.Н.Манжосов, Ю.В.Майданов // Российская Федерация. ПАТЕНТ на изобретение №51337, заявка №2005129472, 20.09.2005. Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 10.02.2006 г. Опубл.: 10.02.2006, Бюл. №4.
5. Заявка 2007135992/14 Российская Федерация, МПК А61В 5/00 (2006.01) С2. Способ и устройство для оценки функции кишечника / Л.Петра (DE), X.Михаель (DE), Д.Аксель (DE); заявитель и патентообладатель ЕУРО-СЕЛТИК С.A. (LU), пат. пов. В.Н.Дементьева, рег. №1; заявл. 28.02.2006; опубл. 10.04.2009, Бюл. №10; приоритет 28.02.2005 ЕР 05004378.5
7
6. Заявка 2002101095/20 Российская Федерация МПК A61D 7/00 (2006.01) U1. Устройство для определения скорости всасывания питательных веществ / Ю.В.Фурман (RU), А.Ф.Бурцев, Е.И.Битюков (RU), Н.А.Чепелев (RU), Е.Г.Яковлева (RU), В.В.Эсауленко (RU); заявитель и патентообладатель Курская государственная сельскохозяйственная академия им. проф. И.И.Иванова (RU); заявл. 15.01.2002; опубл. 10.08.2002, приоритет 15.01.2002.