Изучение ксантана, полученного при культивировании Xanthomonas campestris на модифицированных средах методами ИК-спектроскопии и ЯМР-релаксометрии

М. Р. Хисаметдинов, А. Ю. Крыницкая, В. С. Гамаюрова,

П. П. Суханов, М. Н. Астраханцева

ИЗУЧЕНИЕ КСАНТАНА, ПОЛУЧЕННОГО ПРИ КУЛЬТИВИРОВАНИИ

XANTHOMONAS CAMPESTRIS НА МОДИФИЦИРОВАННЫХ СРЕДАХ

МЕТОДАМИ ИК-СПЕКТРОСКОПИИ И ЯМР-РЕЛАКСОМЕТРИИ

Ключевые слова: ксантан, экзополисахарид, культивирование, вязкость. xanthan,

exopolysaccharid, cultivation, viscosity

Произведен синтез экзополисахарида ксантана при культивировании X. campestris на модифицированных средах с добавлением фумаровой кислоты. Анализ полученных образцов ксантана методами ИК-спектроскопии и ЯМР-релаксометрии показал, что состав питательных сред существенным образом сказывается на составе и структуре биополимера. Ксантан, полученный на среде, содержащей мочевину и фумарат, имеет большую степень разветвлен-ности, имеет плотную упаковку, обусловленную сильными межмолекулярными взаимодействиями. Выращивание продуцента на среде с гидролизатом казеина приводит к образованию полисахарида с неупорядоченной структурой, и, соответственно, с низкими реологическими характеристиками.

The influence of carbon, nitrogen and organic acids sources in nutrient medium composition on the process of Xanthomonas campestris ВКМ B - 611 (xanthan exopolysaccharid'producer) cultivation is investigated. It is revealed, that among carbohydrates stimulating influence on culture growth render saccharase, starch, and among sources of nitrogen - urea, caseine hydrolyzate and asparagine.

The biochemical circuit explaining fumaric acid influence on xanthan biosynthesis is offered. Xanthan exopolysaccharid' synthesis by X. campestris cultivation on modified medium containing fumaric acid is realized. Infrared Spectroscopy and Nuclear Magnetic Resonance analysis of produced Xanthan samples revealed, that nutrient medium composition essentially influence biopolymer' composition and structure.

Экспериментальная часть

Объектом исследования являлся ксантан, продуцируемый штаммом Xanthomonas campestris ВКМ В-611. Биосинтез ксантана осуществляли в условиях двухстадийного качалочного культивирования при температуре 26 °С. Подпитку в виде 5% (об.) раствора сахарозы вносили после 72 часов ферментации и продолжали культивирование еще 24 часа. В качестве контроля использовали синтетическую среду [6]. В процессе культивирования контролировали морфологические характеристики микроорганизмов. Концентрацию абсолютно сухой биомассы определяли по методике, описанной в [7], а также нефелометрическим методом. Кинематическую вязкость (v) культуральной жидкости определяли с использованием капиллярного вискозиметра ВПЖ-2. Выделение ксантана проводили по методике, описанной в [6]. Изучение химической структуры полученных в ходе ферментации образцов ксантана проводили методами ИК-спектроскопии и ЯМР-релаксометрии. ИК-спектры снимали на спектрометре UR-20 в виде суспензии твердых образцов в осушенном вазелиновом масле. ЯМР-релаксометрический анализ выделенных по методике [6] образцов проводился при комнатной температуре по спадам свободной индукции (ССИ) на ядрах водорода на частоте 19 МГц на лабораторном ЯМР-релаксометре со временем парализации приемо-передающего тракта 7 мкс.

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с использованием стандартного пакета статистических программ редактора Microsoft Office Excel. О достоверности различий судили по значению критерия Стьюдента при уровне достоверности Р, равном 0,05.

Результаты и их обсуждение

Предыдущие эксперименты показали, что рост культуры X. campestris стимулируется некоторыми источниками азота (мочевина, гидролизат казеина), а синтез ксантана - органическими кислотами (фумаровой кислотой). Представляется интересным изучение влияния данных компонентов питательной среды не только на выход ксантана, но и на молекулярное строение этого ЭПС.

Культивирование X. campestris производили на средах следующего состава:

Среда №1 (контроль) (г/л): глюкоза - 50; К2НРО4 - 5,0; (NH4)2SO4 - 3,0; лимонная кислота - 2,0; HзBOз - 0,00б; ZnO - 0,00б; FeClз•бH2O - 0,0024; CaCOз - 0,02.

Среда №2 (г/л): глюкоза - 50; К2НРО4 - 5,0; мочевина - 3,0; фумаровая кислота -2,0; HзBOз - 0,00б; ZnO - 0,00б; FeClз•бH2O - 0,0024; Ca^ - 0,02.

Среда №3 (г/л): глюкоза - 50; К2НРО4 - 5,0; гидролизат казеина - 3,0; фумаровая кислота - 2,0; HзBOз - 0,00б; ZnO - 0,00б; FeCh^^O - 0,0024; CaCOз - 0,02.

Результаты эксперимента представлены в таблице i.

Таблица 1 - Рост культуры X.campestris и величина кинематической вязкости пост-ферментационной жидкости в зависимости от состава среды

Среда Прирост биомассы Уровень достоверности, Р 2 vcp, мм /с Уровень достоверности, Р

Среда №1 22,1±0,3 - 15,1±0,04 -

Среда №2 13,3±0,2 5,5E-10 35,4±0,0б 5,92E-13

Среда №3 50,0±0,2 3,5E-10 2,б5±0,04 8,9E-13

Подбор оптимальной среды для производства ксантана должен обеспечить компромисс между ростом клеток и продукцией ксантана.

Как видно из таблицы 1, наибольшее значение прироста биомассы зафиксировано при культивировании на среде № 3, максимальное значение кинематической вязкости - на среде № 2. Сравнение полученных результатов показывает, что, несмотря на более значительный прирост биомассы при использовании среды № 1, кинематическая вязкость в этом варианте оказалась в 2,3 раза ниже, чем в случае использования среды № 2. Это позволило предположить, что в присутствии фумаровой кислоты и мочевины в составе среды № 2 происходит усиление биосинтеза ЭПС. Вместе с тем, как демонстрируют данные таблицы

1, большое значение имеет природа источника азота, т.к. наличие гидролизата казеина в среде привело к стимулированию роста биомассы, в то время как синтез ЭПС, даже в присутствии фумарата не достиг уровня контроля. Избыток азота или его легкая усвояемость, как в случае использования в качестве источника азота гидролизата казеина (среда №3), приводит к снижению продукции ксантана при увеличении роста культуры. Обычно это объясняется тем, что интенсивный рост, как более энергоемкий процесс, привел в данном случае к быстрому истощению питательной среды, вследствие чего замедлился биосинтез ксантана. Наблюдаемые отличия в вязкости культуральной жидкости исследуемых образцов могут быть связаны и с изменениями в молекулярно-массовом распределении фракций в молекуле ксантана.

Для сравнительного исследования структуры ЭПС из культуральных сред № 1-3, были выделены образцы ксантана, анализ которых проводили с использованием методов ИК-спектроскопии и ЯМР-релаксометрии.

ИК-спектры исследованных образцов представлены на рисунках 1-3.

Длина вопиы, см-1

Рис. 1 - ИК спектры образца №1

аР

Длина волны, см"1

Длина волны, см*1

Рис. 3 - ИК спектры образца №3

Как видно из представленных данных, все три образца ксантана близки по характеру спектров ИК. На наличие пиранозных колец указывают пики поглощения 700-950 см-1, а также 1114-1025 см-1, соответствующие колебаниям гликозидных связей, подтверждающих, что остатки циклических структур связываются друг с другом через атом кислород-а1 по типу простых эфирных связей (v С-ОС). Колебания 1025-1080 см- и 1115-1157 см-1 обусловлены поглощением vas C1-O-C4, одна из связей которого входит в пиранозное кольцо, а вторая присоединена к гликозидному кислороду. Во всех спектрах присутствуют широкие и интенсивные полосы 2723-2926 см-1, соответствующие валентным колебаниям v СН, входящим в СН, СН 2 и СНз-группы, и полосы 3425-3306 см-1, соответствующие валентным колебаниям v ОН. Во всех спектрах наблюдаются интенсивные пики 1600-1635 см-1, соответствующие валентным колебаниям v СОО-, свидетельствующие о наличии во всех образцах солевых форм. Валентные колебания v С=О глюкуроновой и пировиноградной кислот проявляются в виде слабо выраженного плеча 1731-1719 см-1.

Наличие пиков поглощения 892-927 см-1 в образцах № 1 и № 2 указывают на наличие в - гликозидных связей, а 1060-1157 см-1 во всех образцах указывает на наличие а-гликозидных связей. Таким образом, полученные ИК спектры препаратов ксантана свидетельствуют о том, что входящие в состав ЭПС моносахариды находятся в форме пиранозных колец. Остатки мономеров соединены между собой по типу простой диэфирной связи. В образцах обнаружены а и в-гликозидные связи. Однако существуют различия в составе изучаемых образцов. В первую очередь они касаются пиков поглощения в диапазоне частот 814-690 см-1, которые характеризуют наличие а-(1,3)-гликозидных связей в молекуле ксантана. Эта связь используется в молекуле полисахарида для присоединения первого углеводного остатка боковой цепи D-маннопиранозы к D-глюкопиранозе основного кора. Подобные полосы поглощения для препарата № 3 выражены слабо. Поэтому представляется логичным незначительное количество а-(1,3)-гликозидных связей в этом образце. Подобные связи принимают участие в создании и удлинении боковых цепей ксантана, в частности в-1,2-гликозидная связь соединяет D-маннопиранозу с остатком глюкуроновой кислоты (рис.4). Незначительное содержание глюкуроновой и пировиноградной кислот в этом образце подтверждает вывод о меньшем количестве боковых цепей в образце № 3.

Рис. 4 - Первичная структура ЭПС ксантана

1

Для образца № 2 интенсивность поглощения в области 814-690 см выше контрольного образца. Как отмечалось ранее, в этом препарате отмечено существование пиков поглощения, характерных как для а, так и для в-гликозидных связей. Кроме того, в этом

случае наблюдается самое большое поглощение в области, характерной для глюкуроновой и пировиноградной кислот. Это позволяет сделать вывод о том, что образец № 2 обладает большой разветвленностью, при этом контрольный образец, соответственно, занимает промежуточное положение. Также следует отметить небольшое смещение пика поглощения ОН-групп в более высокочастотную область для образца № 2 (3423 см-1 против 3333 см-1 для контроля), что свидетельствует о незначительном уменьшении доли водородных связей с участием гидроксилов. Для образца № 3 подобного смещения не наблюдается.

В ходе проведения работы образцы полученного ксантана были также подвергнуты исследованию методом ЯМР-релаксометрии. В таблице 2 представлены результаты соответствующего структурно-динамического анализа образцов ксантана.

Таблица 2 - Параметры ЯМР-релаксации образцов ксантана

Образец Т21, мс Т22, мкс * Т2з , мкс Р21, % % % ,2 2 Р % % ,з 2 Р

1 9,0 35 20,5 2,5 23,5 74

2 43 39 19,5 0,5 29,5 70

3 4,4 39 18 6 40 54

* - в связи с неэкспоненциальной (Гауссоподобной) формой спада поперечной намагниченности данное время релаксации определялось по изменению амплитуды сигнала в е раз.

Из табл. 2 следует, что представленные образцы ксантанов заметно различаются по составу. Это может быть связано с наличием низкомолекулярных примесей и/или с широким молекулярно-массовым распределением полимера, а также с особенностями строения и упаковки макромолекул. В данном случае появление наиболее подвижной фазы, судя по значениям ее параметров (Т21 и Р21), обусловлено наличием в образце низкомолекулярных соединений и/или относительно большого свободного объема вокруг концевых макромо-лекулярных фрагментов, что позволяет им двигаться более свободно и независимо от соседей. При этом доля подобных фрагментов пропорциональна наблюдаемой в эксперименте протонной населенности Р21.

Различия высокомолекулярных компонентов по характеру их структурнодинамического поведения описывают ЯМР-фазы с более короткими временами поперечной релаксации (Т22 и Т23). При этом в данном ряду ксантанов существенно выделяется образец № 3. Для него характерно значительное падение доли протонов (уменьшение Р23) и увеличение плотности упаковки и/или жесткости цепей в составе наиболее высокомолекулярной компоненты (падение Т23) при соответствующем увеличении доли (рост Р22) более подвижной и/или менее плотно упакованной высокомолекулярной фазы, а также доли (Р21) относительно низкомолекулярной компоненты. Для образца № 2, наоборот, значительно повышается жесткость наиболее подвижной фазы при одновременном снижении доли протонов в ней по сравнению с контролем. Одновременно происходит рост населенности (Р22) и более жесткоцепной фазы, т.е. в целом этот препарат становится более упорядоченным.

Таким образом, проведенные исследования показали, что состав питательной среды существенным образом сказывается на составе и структуре биополимера. Образец № 2, обладающей большей кинематической вязкостью, несмотря на большую степень ветвления, имеет более плотную упаковку, что, очевидно, связано с повышением роли межмоле-кулярных взаимодействий в нем. Имеющиеся в литературе данные [6] подтверждают необходимость более жесткой упорядоченной структуры биополимера для получения более

высокой вязкости раствора. Кроме того, показано, что за поведение ксантана в растворе в первую очередь ответственны процессы денатурации и ренатурации [9]. Электронное мик-роскопирование обнаружило, что в нативном ксантане большинство молекул закручено двойные спиральные нити, в связи с чем Holzwarth предположил, что ксантан в растворе находится в виде жесткой стержнеподобной структуры.

В образце № 3 наблюдается усиление вклада межмолекулярных взаимодействий в центральной части биополимера при одновременном снижении упорядоченности состава и количества боковых цепей, что приводит к ухудшению реологических параметров раствора. Можно предположить, что сжимание центральной части молекулы ксантана в этом случае происходит за счет реализации взаимодействий ацетата боковой цепи и кора ксан-тана [8].

Литература

1. Бирюков, В.В. Оптимизация периодических процессов микробиологического синтеза / В.В. Бирюков, В.М. Кантере. - М.: Наука, 1985. - 296 с.

2. Кочетков, Н.К. Синтез полисахаридов / Н.К. Кочетков. - М.: Наука, 1994. - 219 с.

3. Leela, J.K. Studies on xanthan production from Xanthomonas campestris / J.K. Leela, G. Sharma // Bioprocess Eng. - 2000. - Vol. 23. - P. 689.

4. Letisse, F. Kinetic analysis of growth and xanthan gum production with Xanthomonas comprestris on sucrose, using sequentially consumed nitrogen sources / F. Letisse, P. Chevallereau, J.L. Simon JL // Appl Microb Biotechnol. - 2001. - Vol. 55. - P. 417-422.

5. Гвоздяк, Р.И. Влияние источников азота на синтез экзополисахарида штаммом Xanthomonas campestris 8162 / Р.И. Гвоздяк, Е.Ф. Григорьев, М.С. Матышевская // Микробиологический журнал. - 1986. - № 3. - С. 14 - 17.

6. Гвоздяк, Р.И. Микробный полисахарид ксантан / Р.И. Гвоздяк, М.С. Матышевская, Е.Ф. Григорьев. - Киев: Наук думка, 1989. - 212 с.

7. Герхардт, Ф. Методы общей бактериологии / Ф. Герхардт. - М.:Мир, 1984. - T.3. - 264 с.

8. Holzwarth, G.M. Multistranded helix on xathan polysaccharide / G. M. Holzwarth, E.B. Prestridge // Science. - 1977. -Vol 197. - № 4305. - P. 757 - 759.

9. Tako, M. Reological properties оf deacetilated xanthan in aqutous media/ M. Tako, S. Nakamura // Agricaltur and biological chemistry. - 1984. - №12 - P.2987-2993.

© М. Р. Хисаметдинов - зав. лабораторией отдела увеличения нефтеотдачи пластов института «ТатНИПИнефть», e-mail: bio@tatnipi.ru; А. Ю. Крыницкая - канд. биол. наук, доц. каф. пищевой биотехнологии КГТУ, Paulalla@yandex.ru; В. С. Гамаюрова - - д-р хим. наук, проф., зав. каф. пищевой биотехнологии КГТУ, gamaur@kstu.ru; П. П. Суханов - д-р техн. наук, проф. каф. процессов и аппаратов химической технологии КГТУ; М. Н. Астраханцева - канд. техн. наук, асс. каф. пищевой биотехнологии КГТУ, astrahantzeva@ mail.ru.