СРЕДСТВА И СПОСОБЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ПОЛИПЕПТИДОВ НЕЙРОТОКСИНА В КЛЕТКАХ

1. Способ прямого определения биологической активности полипептида нейротоксина в клетках, включающий этапы:
a) инкубации клеток, чувствительных к интоксикации нейротоксином, с полипептидом нейротоксина в течение периода времени и при условиях, обеспечивающих проявление биологической активности указанного полипептида нейротоксина;
b) фиксации клеток и, необязательно, пермеабилизации клеток с помощью детергента;
c) приведения клеток в контакт по меньшей мере с первым связывающим антителом, специфически связывающимся с нерасщепленным и расщепленным нейротоксином субстратом, и по меньшей мере со вторым связывающим антителом, специфически связывающимся с сайтом расщепления субстрата, расщепленного нейротоксином, при условиях, обеспечивающих связывание указанных связывающих антител с указанными субстратами;
d) приведения клеток в контакт по меньшей мере с первым детектирующим антителом, специфически связывающимся с первым связывающим антителом, при условиях, обеспечивающих связывание указанного первого детектирующего антитела с указанным первым связывающим антителом с образованием, таким образом, первых детектируемых комплексов, и по меньшей мере со вторым детектирующим антителом, специфически связывающимся со вторым связывающим антителом, при условиях, обеспечивающих связывание указанного второго детектирующего антитела с указанным вторым связывающим антителом с образованием, таким образом, вторых детектируемых комплексов;
e) определения количества первых и вторых детектируемых комплексов из этапа d); и
f) расчет количества субстрата, расщепленного указанным полипептидом нейротоксина в указанных клетках, с помощью вторых детектируемых комплексов с определением, таким образом, биологической активности указанного полипептида нейротоксина в указанных клетках.
2. Способ по п. 1, где указанный способ представляет собой флуоресцентный способ.
3. Способ по п. 1 или 2, в котором указанный полипептид нейротоксина представляет собой BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, BoNT/F или TeNT.
4. Способ по любому из пп. 1-2, в котором указанный субстрат представляет собой VAMP/синаптобревин, SNAP-25 или синтаксин.
5. Способ по любому из пп. 1-2, в котором указанные клетки представляют собой нейрональные клетки или дифференцированные нейрональные клетки, выбранные из группы, состоящей из: первичных нейрональных клеток, опухолевых клеток, способных дифференцироваться в нейрональные клетки, таких как клетки нейробластомы, клетки Р19 или нейроны, полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (IPS).
6. Способ по любому из пп. 1-2, в котором фиксацию клеток осуществляют путем добавления фиксирующего агента, выбранного из группы, состоящей из: метанола, этанола, ацетона, формальдегида или их смесей.
7. Способ по любому из пп. 1-2, в котором указанное первое связывающее антитело, специфически связывающееся с нерасщепленным или расщепленным нейротоксином субстратом, обеспечивает определение общего количества субстрата нейротоксина в клетках.
8. Способ по п. 7, в котором указанное первое связывающее антитело, специфически связывающееся с нерасщепленным или расщепленным нейротоксином субстратом, представляет собой кроличье поликлональное антитело анти-SNAP-25 S9684, кроличье поликлональное антитело анти-SNAP-25 РА5-19708 (антитела Pierce) или кроличье поликлональное антитело анти-SNAP-25 РА5-19701 (антитела Pierce).
9. Способ по любому из пп. 1-2, в котором указанное второе связывающее антитело представляет собой клон 20-2-5 мышиного моноклонального антитела или мышиное моноклональное антитело МС-6053 (R&D Systems).
10. Способ по любому из пп. 1-2, в котором указанное первое и/или второе связывающее антитело является иммобилизованным.
11. Способ по любому из пп. 1-2, в котором указанное первое детектирующее антитело представляет собой антитело, конъюгированное со щелочной фосфатазой (АР), антитело, конъюгированное с пероксидазой хрена (HRP) или антитело, конъюгированное с флуоресцентным красителем.
12. Способ по любому из пп. 1-2, в котором указанное второе детектирующее антитело представляет собой антитело, конъюгированное со щелочной фосфатазой (АР), антитело, конъюгированное с пероксидазой хрена (HRP), антитело, конъюгированное с глюкозооксидазой, антитело, конъюгированное с тирозиназой, или антитело, конъюгированное с β-галактозидазой.
13. Способ по любому из пп. 1-2, в котором субстрат HRP представляет собой Amplex UltraRed, 10-ацетил-3,7-дигидроксифеноксазин (ADHP) или 3-(4-гидроксифенил)пропионовую кислоту (НРРА).
14. Способ по любому из пп. 1-2, в котором субстрат АР представляет собой производное 4-метилумбеллиферилфосфата, такое как 6,8-дифтор-4-метилумбеллиферилфосфат (DiFMUP), или флуоресцеина дифосфат (FDP).
15. Набор для осуществления способа по любому из пп. 1-14, содержащий:
a) совокупность первого связывающего антитела, второго связывающего антитела, первого детектирующего антитела и второго детектирующего антитела, при этом указанная совокупность обеспечивает осуществление способов по любому из пп. 1-14;
b) средства для расчета количества субстрата, расщепленного указанным нейротоксином, на основании количеств первого и второго детектируемых комплексов, определяемых с помощью совокупности согласно п. a); и
c) инструкции для осуществления указанного способа.