Ферментативное получение олигосахаридов посредством общей ферментации с использованием смешанного сырья

1. Генетически модифицированная микробная клетка для получения лактозы или интересующего олигосахарида, который содержит галактозо-р1,4-глюкозную группировку на своем восстанавливающем конце, где указанная микробная клетка имеет:
- по меньшей мере один глюкозный транспортер для переноса глюкозы из культуральной среды в цитоплазму микробной клетки;
- путь биосинтеза уридиндифосфатгалактозы (УДФ-галактозы); и
по меньшей мере одну β-1,4-галактозилтрансферазу, способную осуществлять галактозилирование свободной глюкозы с внутриклеточной продукцией лактозы.
2. Генетически модифицированная микробная клетка по п. 1, в которой по меньшей мере один глюкозный транспортер выбран из группы, состоящей из белков, облегчающих диффузию глюкозы и пермеаз, переносящих глюкозу.
3. Генетически модифицированная микробная клетка по п. 1 или 2, где указанная микробная клетка экспрессирует или сверхэкспрессирует по меньшей мере один ген, кодирующий глюкозный транспортер, предпочтительно по меньшей мере один ген, выбранный из группы, состоящей из glf, galP и их функциональных вариантов.
4. Генетически модифицированная микробная клетка по любому из пп. 1-3, где указанная микробная клетка имеет фосфоглюкомутазу, УТФ-глюкозо-1-фосфат-уридилтрансферазу и УДФ-глюкозо-4-эпимеразу.
5. Генетически модифицированная микробная клетка по любому из пп. 1-4, в которой β-1,4-галактозилтрансфераза кодируется геном, выбранным из группы, состоящей из IgtB Neisseria meningitidis, lex-1 Aggregatibacter aphrophilus, galTpm1141 Pasteurella multocida и их функциональных вариантов.
6. Генетически модифицированная микробная клетка по любому из пп. 1-5, где указанная микробная клетка имеет по меньшей мере одну дополнительную гликозилтрансферазу, предпочтительно гликозилтрансферазу, выбранную из группы, состоящей из фукозилтрансфераз, сиалилтрансфераз, глюкозаминилтрансфераз и галактозилтрансфераз.
7. Генетически модифицированная микробная клетка по любому из пп. 1-6, где указанная микробная клетка содержит фосфотрансферазную систему переноса глюкозы.
8. Генетически модифицированная микробная клетка по любому из пп. 1-7, где указанная микробная клетка имеет транспортер фруктозы.
9. Генетически модифицированная микробная клетка по любому из пп. 1-8, где микробная клетка имеет фосфотрансферазную систему, специфичную в отношении фруктозы, и где указанная клетка дополнительно содержит 1-фосфофруктокиназу.
10. Генетически модифицированная микробная клетка по п. 8, где указанная микробная клетка содержит активность фруктокиназы-6 и активность 6-фосфофруктокиназы-1.
11. Генетически модифицированная микробная клетка по п. 9, где микробная клетка содержит фруктозо-1,6-бисфосфатазу.
12. Генетически модифицированная микробная клетка по п. 9 или 11, где указанная микробная клетка содержит делецию или функциональную инактивацию своей глюкозо-6фосфатизомеразы.
13. Генетически модифицированная микробная клетка по любому из пп. 6-12, в которой дополнительная гликозилтрансфераза представляет собой фукозилтрансферазу и где в указанной микробной клетке имеются маннозо-6-фосфатизомераза, фосфоманномутаза, маннозо-1-фосфат-гуанилилтрансфераза, гуанозиндифосфат-маннозо-4,6-дегидратаза (ГДФ-маннозо-4,6-дегидратаза), ГДФ-L-фукозосинтаза.
14. Генетически модифицированная микробная клетка по любому из пп. 1-13, где указанная микробная клетка содержит белок-экспортер или пермеазу, экспортирующую интересующий олигосахарид из клетки, предпочтительно эффлюксный транспортер сахаров.
15. Генетически модифицированная микробная клетка по любому из пп. 1-14, где указанная микробная клетка представляет собой бактериальную клетку, выбранную из группы, состоящей из бактерий родов Escherichia, Lactobacillus, Corynebacterium, Bacillus, Streptococcus, Enterococcus, Lactococcus и Clostridium, предпочтительно бактериальную клетку, которая выбрана из группы видов бактерий, состоящей из Escherichia coll, Corynebacterium glutamicum, Clostridium cellulolyticum, Clostridium ljungdahlii, Clostridium autoethanogenum, Clostridium acetobutylicum, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Lactobacillus casei, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii и Lactococcus iactis.
16. Применение генетически модифицированной микробной клетки по любому из пп. 1-15 для получения лактозы или олигосахарида, который содержит галактозо-β1,4-глюкозную группировку на своем восстанавливающем конце.
17. Способ получения лактозы или интересующего олигосахарида, который содержит галактозо-β1,4-глюкозную группировку на своем восстанавливающем конце, включающий следующие стадии:
a) предоставление генетически модифицированной микробной клетки по любому из пп. 1-15;
b) культивирование указанной микробной клетки в культуральной среде и в условиях, которые являются пермиссивными в отношении получения указанной лактозы или интересующего олигосахарида, где в культуральной среде содержится смесь глюкозы и по меньшей мере одного дополнительного соединения, выбранного из группы, состоящей из фруктозы, галактозы, маннозы, ксилозы, рамнозы, глицерина, сукцината, пирувата и малата в качестве основного источника углерода; и
b) выделение лактозы или интересующего олигосахарида из культуральной среды и/или микробной клетки.
18. Способ по п. 17, в котором интересующий олигосахарид представляет собой олигосахарид грудного молока, выбранный из группы, состоящей из 2'-фукозиллактозы, 3-фукозиллактозы, 2',3-дифукозиллактозы, 3'-сиалиллактозы, 6'-сиалиллактозы, 3-фукозил-3'-сиалиллактозы, лакто-N-тетраозы, лакто-N-неотетраозы, лакто-N-фукопентаозы I, лакто-N-фукопентаозы II, лакто-N-фукопентаозы III, лакто-N-фукопентаозы V, лакто-N-дифукозилгексозы I, лакто-N-дифукозилгексаозы II, лакто-N-сиалилпентаозы LSTa, LSTb, LSTc.
19. Способ по п. 17 или 18, в котором смесь глюкозы и по меньшей мере одного дополнительного моносахарида представляет собой смешанное сырье из глюкозы и фруктозы, предпочтительно полученное посредством гидролиза сахарозы.
20. Способ по любому из пп. 17-19, в котором указанная микробная клетка культивируется без подачи лактозы извне.