Влияние бактерий рода Lactobacillus на клеточные тест-системы in vitro

БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ

УДК 573.6.086.835:579.8

Влияние бактерий рода Lactobacillus на клеточные тест-системы in vitro

В. А. БУДАЕВА; Н. Г. МАШЕНЦЕВА, д-р хим. наук, академик РАН; М. Б. ЗЯНКИН, канд. техн. наук Московский государственный университет пищевых производств

В настоящее время во всем мире стремительно растет интерес к функциональным продуктам питания, оказывающим регулирующее действие на организм человека. Из всего разнообразия продуктов функционального питания внимание исследователей привлекают в первую очередь пробиотики и продукты, созданные на их основе. Одним из ключевых родов пробиотических микроорганизмов являются бактерии Lactobacillus.

В настоящее время известны разнообразные положительные эффекты влияния молочнокислых бактерий, подтвержденные многочисленными клиническими исследованиями. Необходимо отметить, что эти бактерии играют важную роль в поддержании колонизационной резистентности, то есть оказывают выраженную антагонистическую активность в отношении патогенных микроорганизмов, продуцируя различные органические кислоты, перекись водорода, антибиотики и бактериоцины [1].

Несмотря на то, что еще в начале прошлого века И. И. Мечников предположил, что молочнокислые бактерии способны повышать устойчивость организма человека к различным заболеваниям, лишь в последние десятилетия была доказана теория об иммуномодулирующем влиянии этих микроорганизмов [2, 3]. Кроме того, известно об ингибирующем воздействии молочнокислых бактерий в отношении рака кишечника, что свидетельствует о возможном противоопухолевом эффекте [4].

Именно поэтому они являются важной группой микроорганизмов для исследований. Молочнокислые бактерии довольно часто используют для создания пробиотических препаратов и пищевых продуктов. Однако для определения безопасности того или иного ингредиента необходим его тщательный анализ. Для определения безопасности и эффективности БАД к пище и оценки безвредности пробиотических микроорганизмов используют лабораторных животных с пероральным введением стандартных и аггравированных доз веществ, что является дорогим, трудоемким и недопустимым с позиции этики процессом [5]. Поэтому актуальны исследования и разработки, направленные на ускорение и удешевление процесса без потери высокой степени достоверности. Таким подходом является использование культур клеток in vitro.

В качестве тест-систем были выбраны следующие клеточные линии (ООО «БиолоТ», ФГБУ науки Институт цитологии РАН, г. Санкт-Петербург):

• NCTC, мышь C3H/An, подкожная соединительная ткань (рисунок, а);

• VERO, африканская зеленая мартышка, почка (рисунок, б);

• HEK293, человек, клетки почки эмбриона (рисунок, в). Выбор клеточных линий обусловлен несколькими причинами:

• эти клетки способны делиться в течение длительного времени, причем в результате каждого деления образуются две идентичные клетки;

• эти клетки растут монослойным способом, т. е. они способны прикрепляться к поверхности флакона, в котором они растут, что облегчает замену питательной среды по сравнению с суспензионным способом;

• они не так сильно реагируют на изменения окружающей среды, а именно на температуру и подачу CO2. Поскольку выбранные клетки растут монослойным

способом, имеется возможность проводить их прижизненное изучение и микроскопирование. Отметив время формирования монослоя в культуральном матрасе площадью 25 см2, можно судить об интенсивности роста линии в целом. По окончании периода пролиферации клетки монослоя начинают округляться, терять взаимодействие с соседними клетками и субстратом, что приводит к их откреплению от поверхности флакона и гибели.

Объекты исследований — штаммы молочнокислых бактерий из коллекции МГУПП: Lactobacillus plantarum 100 (ВКПМ В-8654), Lactobacillus sakei 35 (ВКПМ В-8886), Lactobacillus sakei 45 (ВКПМ В-8896).

В ходе исследований фенотипических свойств штаммов были изучены возможности культивирования исследуемых микроорганизмов на питательных средах различного состава. Проведено определение чистоты культуры и морфологических свойств, в том числе окраска по Граму, цвет, размер, форма отдельно растущих колоний. Данные молочнокислые бактерии обладают следующими свойствами: положительно окрашиваются по Граму, не образуют спор, неподвижны, не образуют каталазы, нуждаются во множестве питательных компонентов, микроэлементов и витаминов, не вызывают разложения белков молока, не разжижают желатин.

а б в

Монослой клеточных линий при 10 х увеличении: а - HEK 293; б - VERO; в - NCTC

Таблица 1 Таблица 2

Оценка токсичности штаммов Оценка токсичности штаммов

Штамм Жизнеспособность клеточных систем, % Штамм Жизнеспособность клеточных систем, %

молочнокислого HEK VERO NCTC молочнокислого HEK VERO NCTC

микроорганизма 107 108 109 107 108 109 107 108 109 микроорганизма 107 108 109 107 108 109 107 108 109

Lactobacillus plantarum 100 81 77 83 76 71 70 75 73 70 Lactobacillus plantarum 100 72 72 68 79 78 74 82 81 80

Lactobacillus sakei 45 88 86 83 75 71 68 66 63 60 Lactobacillus sakei 45 73 72 70 82 77 76 83 76 72

Lactobacillus sakei 35 84 85 80 70 73 69 69 67 64 Lactobacillus sakei 35 73 74 69 82 80 79 83 80 74

К микроорганизмам, предлагаемым для использования в качестве пищевых ингредиентов и пробиотиков, в обязательном порядке предъявляются требования по отсутствию таких показателей как токсигенность и токсичность. Поэтому было проведено исследование данных показателей для штаммов на заявленные клеточные тест-системы по методикам, описанным в патентах № 2604804 и № 2604802 РФ [6, 7].

Для исследования токсичности штамм микроорганизма выращивали на MRS-агаре в течение 24 ч при 37 °С. После смытые с агара микробные клетки разводили стерильным 0,9%-ным раствором натрия хлорида до необходимого количества (по оптическому стандарту мутности МакФарланда) и затем инактивировали нагреванием при 100 °С в течение 1 ч.

Сформировавшийся монослой клеточных линий обрабатывали инактивированной бактериальной суспензией в количестве 107, 108, 109 КОЕ / 0,5 мл в течение 1 ч. После чего производили замену питательной среды во флаконе. Через 24 ч после смены среды производили подсчет живых и мертвых клеток с использованием 0,4% красителя трипанового синего в камере Горяева.

Для изучения токсигенности штаммы бактерий выращивали в течение 10 сут на жидкой среде MRS при температуре 37 °С. По истечении срока культуральную жидкость центрифугировали при 4000 мин-1 в течение 30 мин. Затем надосадочную жидкость (супернатант) вводили во флаконы со сформировавшимся монослоем клеток по 0,25; 0,5 и 1,0 мл и выдерживали в течение 1 ч. Спустя 24 ч производили замену среды и анализ жизнеспособности клеток путем подсчета живых и мертвых клеток окраской трипановым синим с помощью камеры Горяева.

Результаты исследований влияния трех штаммов молочнокислых бактерий представлены в табл. 1 и 2.

Литература

1. Тюрин, М. В. Антибиотикорезистентность и антагонистическая активность лактобацилл. Дисс. канд. мед. наук. — М., 1990. — 146 с.

2. Klebanoff, S. J. Viricidal effect of Lactobacillus acidophilus on human immunodeficiency virus type 1: possible role in heterosexual transmission / S. J. Klebanoff, R. W Coombs // J. Exp. Med. — 1991. — V. 174. — № 1. — IP 289-292.

3. Miettinen, M. Production of human tumor necrosis factor-alpha, interleukin-6 and interleukin-10 is induced by lactic acid bacteria / M. Miettinen, J. Vuopio-Varkila, K. Varkila // Infect Immun. — 1996. — V 64. — II 5403-5405.

Проанализировав табл. 1, можно сделать вывод, что с увеличением количества инактивированных нагреванием бактериальных клеток происходит уменьшение числа мертвых животных клеток. Проанализировав табл. 2, можно сделать вывод, что надосадочная жидкость, полученная при центрифугировании бактериальных штаммов, несущественно влияет на состояние клеточных линий.

Пробиотические бактерии широко используются для профилактики и лечения различных заболеваний желудочно-кишечного тракта, дыхательных путей, кожи и репродуктивной системы, для восстановления кишечного микробиоценоза и др. Форма приема этих микроорганизмов разнообразна (кисломолочные продукты, лекарственные препараты, биологически активные добавки), причем при выборе необходимо руководствоваться прежде всего тем, что положительное действие и безопасность для организма должны быть доказаны не только для самих молочнокислых бактерий, но и для готовых продуктов, содержащих эти бактерии.

В данном исследовании в результате оценки токсического и токсигенного воздействия штаммов бактерий в отношении тест-культур было выявлено, что наибольшее воздействие в отношении опухолевых клеточных линий оказывали бактериальные штаммы Lactobacillus sakei 45 и Lactobacillus plantarum 100. Установлено, что ни один из исследуемых микроорганизмов не обладает токсичностью и токсигенностью в отношении выбранных тест-систем, поскольку ингибирующее воздействие незначительно. Все штаммы безопасны и могут использоваться в пищевой промышленности в качестве стартовых культур.

Работа выполнена в рамках проекта №15.7831.2017/БЧ «Поиск живых систем и субстанций природного происхождения с анализом их биологической активности для создания функциональных продуктов питания и кормов».

References

1. Tyurin M. V Antibiotikorezistentnost' i antagonisticheskaya aktivnost' lak-tobatsill. Diss. kand. med. nauk [Antibiotic resistance and antagonistic activity of lactobacilli: Cand. Diss. (Med. Sci.)]. Moscow, 1990. 146 p.

2. Klebanoff S. J., Coombs R. W Viricidal effect of Lactobacillus acidophilus on human immunodeficiency virus type 1: possible role in heterosexual transmission. J.Exp. Med., 1991, vol. 174, no. 1, pp. 289-292.

3. Miettinen M., Vuopio-Varkila J., Varkila K. Production of human tumor necrosis factor-alpha, interleukin-6 and interleukin-10 is induced by lactic acid bacteria. Infect Immun., 1996, vol. 64, pp. 5403-5405.

4. Клабукова, Д. Л. Определение адгезивности и безопасности штамма Lactobacillus plantarum на клеточных культурах животных и человека /Д.Л. Клабукова [и др.] // Биофармацевтический журнал. — 2016. — Т 8. — № 1. — С. 20-25.

5. Основы биотехнологии [Электронный ресурс]. — Электрон. дан. — 2011. — Режим доступа: http://wwwibiotechnolog.ru/acell/ acell1_1. htm. — Загл. с экрана.

6. Патент № 2604802 РФ. MnKC12N 5/071, C12N 5/16, G01N 33/02, G01N 33/03. Способ определения безопасности пищевых ингредиентов с помощью клеточных тест-систем. Д. Л. Клабукова [и др.]. Заявл. 25.12.2015. Опубл. 10.12.2016, Бюл. №34.

7. Патент № 2604804 РФ. МПК C12N 5/071, C12N 5/16, G01N 33/569. Способ определения безопасности пробиотических микроорганизмов с помощью клеточных тест-систем. Д.Л. Клабукова [и др.] Заявл. 25.12.2015. Опубл. 10.12.2016, Бюл. № 34.

Влияние бактерий рода Lactobacillus на клеточные тест-системы in vitro

Ключевые слова

кисломолочные продукты; клеточные линии; Lactobacillus. Реферат

Кисломолочные продукты обладают приятным вкусом, запахом, консистенцией, характеризуются высокой степенью усвояемости, а также обладают широким спектром медико-биологических свойств. В последние годы стремительно расширяется ассортимент продуктов с дополнительными пробиотическими свойствами. Употребление их в рационе питания воздействует на состояние микрофлоры, способствует профилактике заболеваний желудочно-кишечного тракта, благоприятно сказывается на общем самочувствии. Эти эффекты продуктов обусловлены присутствием пробиотических микроорганизмов, в том числе рода Lactobacillus. Молочнокислые бактерии играют ключевую роль в технологии пробиотических продуктов питания: осуществляют биомодификацию растительного и животного сырья, изменяя физико-химические показатели исходных компонентов и формируя органолептические показатели продуктов; повышают пищевую, в том числе и биологическую ценность; ингибируют развитие посторонней технически вредной и патогенной микрофлоры. Для подтверждения возможного противоопухолевого эффекта молочнокислых бактерий актуальны исследования, направленные на изучение цитостатических свойств бактериальных штаммов. С этой целью в данной статье оценивали токсическое и токсигенное воздействия трех штаммов молочнокислых бактерий (Lactobacillus plantarum 100, Lactobacillus sakei 35, Lactobacillus sakei 45) в отношении трех клеточных линий человека и животных (NCTC, VERO и HEK293), принятых в качестве модельных. Результаты данного биотестирования могут быть использованы для оценки безопасности применения данных штаммов в пищевой промышленности, например, в качестве заквасочных культур для кисломолочных продуктов. Исследования проводили в Московском государственном университете пищевых производств.

Авторы

Будаева Валентина Александровна;

Машенцева Наталья Геннадьевна, д-р хим. наук, академик РАН; Зянкин Михаил Борисович, канд. техн. наук Московский государственный университет пищевых производств, 125080, Москва, Волоколамское шоссе, д. 11, bwal1307@rambler.ru, natali-mng@yandex.ru, mzan@bk.ru

4. Klabukova D. L. et al. [Determination of the adhesiveness and safety of the strain Lactobacillus plantarum on cell cultures of animals and humans]. Biofarmatsevticheskii zhurnal, 2016, vol. 8, no. 1, pp. 20-25. (In Russ).

5. Fundamentals ofBiotechnology [Electronic resource], 2011. Access mode: http://wwwibiotechnolog.ru/acell/acell1_1. htm.

6. Klabukova D. L. et al. Sposob opredeleniya bezopasnostipishchevykh ingredientov spomoshch yu kletochnykh test-sistem [Method for determining the safety of food ingredients using cellular test systems]. Patent RF No. 2604802. MPKC12N 5/071, C12N 5/16, G01N 33/02, G01N 33/03; 10.12.2016.

7. Klabukova D. L. et al. Sposob opredeleniya bezopasnosti probiot-icheskikh mikroorganizmov s pomoshchyu kletochnykh test-sistem [A method for determining the safety ofprobiotic microorganisms using cell test systems]. Patent RF No. 2604804 RF. MPK C12N 5/071, C12N 5/16, G01N 33/569; 10.12.2016.

Influence of Lactobacillus sp. to the Cellular Test Systems In Vitro

Key words

dairy products; cell lines; Lactobacillus. Abstract

It has long been known that dairy products have a pleasant taste, smell and consistency and are characterized by a high degree of digestibility, as well as possess a wide spectrum of biomedical properties. In recent years, rapidly expanding the product range with additional probiotic properties. Their use in the diet affects the state of the microflora, contributes to the prevention of diseases of the gastrointestinal tract, has a beneficial effect on General health. These effects of products due to the presence of probiotic microorganisms, including the genus Lactobacillus. Lactic acid bacteria play a key role in the technology of probiotic foods are biomodification plant and animal raw materials by modifying the physico-chemical characteristics of initial components and the forming of organoleptic indicators of products; increase food and biological value; inhibit the development of extraneous technically harmful and pathogenic microorganisms. In addition, from literature it is known about the vast influence of the bacteria of the genus Lactobacillus in relation to colon cancer. To confirm a possible antitumor effect of lactic acid bacteria recent studies aimed at studying the cytotoxic properties of the bacterial strains. With this purpose, this paper evaluated the toxic and antigenic effects of three strains of lactic acid bacteria (Lactobacillus plantarum 100, 35 Lactobacillus sakei, Lactobacillus sakei45) against three human cell lines and animals (NCTC, VERO and HEK293), taken as a model. The results of this bioassay can be used to assess the safety of application of these strains in the food industry, for example as starter cultures for fermented milk products.

Authors

Budaeva Valentina Alexandrovna;

Mashentseva Natalya Gennadievna,

Doctor of Chemical Sciences, Academician of RAS;

Zyankin Mikhail Borisovich, Candidate of Technical Sciences

Moscow State University of Food Production,

11 Volokolamskoe shosse, Moscow, 125080, Russia,

bwal1307@rambler.ru, natali-mng@yandex.ru, mzan@bk.ru