Разработан метод получения iPS-клеток с помощью рекомбинантных белков

ИМИ!

Новости клеточных технологий

21

ПЦР-анализом и Саузерн-блот гибридизацией. В ядерной ДНК мышей второго поколения тоже присутствовал трансген БРР, что доказывало их происхождение от трансплантированных стволовых клеток яичников.

Чтобы выяснить, являются ли описанные клетки плю-ри- или мультипотентными, и не способны ли они провоцировать онкогенез, исследователи инъецировали суспензию этих клеток под кожу иммунодефицитным мышам. В течение 8 недель наблюдения ни в одном случае не было замечено формирования опухолей.

Стволовые клетки яичника, по заключению авторов работы, имеют много общего со стволовыми спермато-гениальными клетками, находящимися в семенниках

мужских особей. Однако количество стволовых клеток в яичнике на порядки меньше, нежели количество спер-матогониальных клеток в семеннике, и они существенно медленнее пролиферируют.

Результаты этой работы могут найти клиническое применение для сохранения репродуктивной функции, например, для пациенток, которым показана химиотерапия. Есть высокая вероятность того, что у человека в яичниках также сохраняются стволовые клетки, которые возможно выделить перед проведением химиотерапии, культивировать in vitro, а затем трансплантировать после проведения курса химиотерапии, восстановив тем самым функцию органа.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Zuckerman S. The number of oocytes in the mature ovary. Recent Prog. Horm. Res. 1951; 6: 63-108.

2. Borum K. Oogenesis in the mouse. A study of meiotic prophase. Exp. Cell Res. 1961; 24: 495—507.

3. Peters H. Migration of gonocytes into the mammalian gonad and their differentiation. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 1970; 259: 91-101.

4. McLaren A. Meiosis and differentiation of mouse germ cells. Symp. Soc. Exp. Biol. 1984; 38: 7-23.

5. Anderson L.D., Hirshfield A.N. An overview of follicular development in the ovary: from embryo to the fertilized ovum in vitro. Md. Med. J. 1992; 41: 614-20.

6. Johnson J., Canning J., Kaneko T. et al. Germline stem cells and follicular renewal in the postnatal mammalian ovary. Nature 2004; 428: 145-50.

7. Johnson J.J. Oocyte generation in adult mammalian ovaries by putative germ cells in bone marrow and peripheral blood. Cell 2005; 122: 303-15.

8. Eggan K., Jurga S., Gosden R., Min I.M., Wagers A.J. Ovulated oocytes in adult mice derived from non-circulating germ cells. Nature 2006; 441: 1109-14.

9. Telfer E.E. On regenerating the ovary and generating controversy. Cell 2005; 122: 821-2.

10. Honda A. Isolation, characterization, and in vitro and in vivo differentiation of putative thecal stem cells. PNAS 2007; 101: 16489-94.

11. Gosden R. G. Germline stem cells in the postnatal ovary: is the ovary more like a testis? Hum. Reprod. Update 2004; 10: 193-5.

12. Feng L. Generation and in vitro differentiation of a spermatogonial cell line. Science 2002; 297: 392-5.

13. Ruggiu M. The mouse Dazla gene encodes a cytoplasmic protein essential for gametogenesis. Nature 1997; 389: 73-7.

14. Scholer H.R., Ruppert S., Suzuki N. et al. New type of POU domain in germ line-specific protein Oct-4. Nature 1990; 344: 435-9.

28. Ravindranath N.. Dalai R., Solomon B. et al. Loss of. telomerase activity during male germ cell differentiation. Endocrinology 1997; 138: 4026-9.

29. Shiromizu K., Thorgeirsson S.S., Mattison D.R. Effect of cyclophosphamide on oocyte and follicle number in Sprague-Dawley rats, C57BL/6N and DBA/2N mice. Pediatr. Pharmacol. 1984; 4: 213-21.

Подготовила А.С. Гоигорян

По материалам: Zou КYuan Z„ Yang Z. et al. Production of offspring from a germline stem cell line derived

from neonatal ovaries. Nature Cell Biology, Published online April 2009

Разработан метод получения iPS-клеток с помощью рекомбинантных белков

В 2006 г. было показано, что у соматических клеток мыши может быть индуцировано плюрипотентное состояние с помощью ретровирусной трансдукции генов четырех факторов: 0й4, К1!4, Бох2 и 1Мапод [1]. Годом позже аналогичные результаты были получены для клеток человека [2, 3]. Это стало не только настоящим прорывом в области генной инженерии, но и открыло совершенно новые перспективы для клеточной терапии. Был разработан надежный и воспроизводимый метод для получения линий аутогенных плюрипотентных стволовых клеток, которые могут применяться для клеточной терапии разных заболеваний. В то же время, внесение в клетку чужеродного генетического материала ретровирусов может быть потенциально опасным, так как сопровождается высоким риском злокачественной трансформации при трансплантации производных таких плюрипотентных клеток в организм реципиента [4].

К настоящему времени разработано несколько стратегий получения !РБ-клеток, не требующих встраивания в их геном чужеродной ДНК. Это внесение в сомати-

ческую клетку необходимых генов в составе векторов на основе аденовирусов, не интегрирующихся в геном [5]; применение плазмид, которые спонтанно удаляются из клеток после их перепрограммирования и многократного деления [6]; применение в качестве носителя генов плюрипотентности транспозона PiggyBac, который также спонтанно удаляется из клеток после их перепрограммирования [7, 8]; внесение в клетку генов плюрипотентности в составе интегрирующихся в геном вирусов, которые затем удаляются из хромосом при помощи рекомбиназы Сге [9]; использование не интегрирующихся в геном плазмидных векторов на основе ядерного антигена-1 вируса Эпштейна — Барр [10]. Тем не менее, ни один из перечисленных методов не исключает необходимости внесения в клетку чужеродного генетического материала, пусть и не встраиваемого непосредственно в ядерную ДНК.

В апреле 2009 г. в журнале Cell Stem Cell появилось сообщение о работе научной группы Н. Zhou, которой был разработан новый подход к получению iPS-клеток.

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, № 2, 2009

ИМИ!

Новости клеточных технологий

Исследователи сочли, что для получения iPS-клеток, по свойствам не отличимых от эмбриональных стволовых клеток (ЗСК), достаточно присутствие в ядре клетки не самих генов плюрипотентности, но лишь их продуктов. Из более ранних исследований было известно, что в клетку и в ее ядро можно доставить белки, соединив их с короткими пептидами, опосредующими белковую трансдукцию, такими как поли-аргинин [11, 12]. Н. Zhou и соавт. использовали для получения рекомбинантных белков поли-аргинин (11R), который присоединяли к С-концу белков 0ct4, Sox2, Klf4 и с-Мус. Рекомбинантные белки экспрессировались в культурах Е. coli, затем их выделяли, очищали и идентифицировали с помощью масс-спектрометрии и Вестерн-блот гибридизации.

После этого полученные белки в разных концентрациях добавляли в культуральную среду к мышиным эмбриональным фибробластам. Оказалось, что для успешной транслокации в ядра клеток достаточно присутствия белков в среде культивирования в течение 6 час. в концентрациях от 0,5 до 8 мкг/мл. При этом белки в клетке оставались стабильными в течение 48 час. Поскольку для репрограммирования соматических клеток в плюрипотентные требуется экспрессия факторов плюрипотентности в течение 7^10 сут., авторы разработали протокол, по которому клетки, меченные геном флуоресцентного белка GFP (ген gfp был встроен в геном клеток под промотором гена 0ct4, соответственно, белок GFP начинал продуцироваться при экспрессии 0ct4; плотность посева составляла 5x104 клеток на 0,5 см2), по 12 час. культивировали в среде, содержащей 8 мкг/мл рекомбинантного белка и 1мМ вальпроевой килоты — вещества, значительно повышающего эффективность репрограммирования [13]. Протокол репрограммирования был следующим: клетки инкубировали сначала с одним фактором, затем помещали на 36 час. в среду культивирования без рекомбинантных белков и вальпроевой кислоты, после этого подвергали аналогичному воздействию другого фактора плюрипотентности. То есть цикл перепрограммирования повторяли по отдельности с каждым из четырех факторов плюрипотентности.

После этого обработанные белками клетки высевали на фидерный слой, состоящий из облученных мышиных эмбриональных фибробластов, и культивировали в условиях, принятых для ЗСК. Через 30^35 сут.

появились первые колонии, положительные по маркеру GFP. Из 5 x

получалось до трех колоний, по внешнему виду ничем не отличавшихся от колоний обычных мышиных ЗСК. Клетки в течение более 30 пассажей сохраняли свою морфологию и стабильно пролиферировали.

Иммуноцитохимический анализ показал, что GFP-положительные клетки экспрессируют маркеры плюрипотентности, такие как ALP, 0ct4, Nanog, Sox2 и SSEA1, что было подтверждено также полуколичественным RT-PCR анализом. Промоторы генов Nanog и 0ct4 в полученных клетках были деметилированы, как и в ЗСК, в то время как в дифференцированных клетках промоторы данных генов находятся в гиперметилированном состоянии, обеспечивая блокирование экспрессии эмбриональных генов. Таким образом, было показано, что в iPS-клетках происходит реактивация экспрессии характерных для ЗСК факторов.

Сравнение экспрессии геномов iPS-клеток, ЗСК и эмбриональных фибробластов также продемонстрировало, что экспрессия генома iPS-клеток практически не отличается от экспрессии генома ЗСК, не совпадая при этом с экспрессией генома эмбриональных фибробластов.

В суспензии iPS-клетки, как и ЗСК, образовывали эмбриоидные тельца, в которых шла спонтанная разнонаправленная дифференцировка клеток в производные трех зародышевых листков. Более того, при трансплантации в бластоцисту мыши iPS-клетки включались в состав внутренней клеточной массы, дифференцируясь затем в клетки самых разных тканей зародыша, в том числе, давая начало первичным половым клеткам.

Таким образом, в работе были приведены доказательства того, что новый метод индукции плюрипотентности у соматических клеток без внесения чужеродного генетического материала позволяет получить плюрипотентные клетки, не отличающиеся по свойствам in vitro и in vivo от ЗСК. Авторы работы не проверяли стабильность генома и туморогенность дифференцированных производных iPS-клеток, поэтому нельзя сделать окончательного заключения о перспективе применения iPS-клеток человека, полученных аналогичным методом, в клинике. Тем не менее, в настоящее время данный метод, по-видимому, является самым многообещающим для получения индивидуальных линий плюрипотентных клеток для клеточной терапии.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Takahashi К., Yamanaka S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell 2006; 126: 663-76.

2. Takahashi K., Tanabe K., Ohnuki M. et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell 2007; 131: 861-72.

3. Yu J., Hu K., Smuga-Otto K. et al. Human Induced Pluripotent Stem Cells Free of Vector and Transgene Sequences. Science. Published online March 2009.

4. Yamanaka S. Afresh look at iPS cells. Cell 2009; 137: 13-7.

5. Stadtfeld М., Nagaya М., Utikal J. et al. Induced pluripotent stem cells generated without viral integration. Science 2008; 322: 945-9.

6. Okita K., Nakagawa М., Hyenjong H. et al. Generation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors. Science 2008; 322: 949-53.

7. Woltjen K., Michael I.P., Mohseni P. et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature 2009; 458: 766-70.

8. Kaji K., Norrby K., Paca A. et al. Virus-free induction of pluripotency and subsequent excision of reprogramming factors. Nature 2009; 458: 771-5.

9. Soldner F., Hockemeyer D., Beard C. et al. Parkinson’s disease patient-derived induced pluripotent stem cells free of viral reprogramming factors. Cell 2009; 136: 964-77.

10. Yu J., Vodyanik M.A., Smuga-Otto K. et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science 2007; 318: 1917-20.

11. Inoue M., Tomizawa K., Matsushita M. et al. Endothelial nitric oxide synthase-11R protein therapy for prevention of cerebral vasospasm in rats: a preliminary report. Eur. Urol. 2006; 49: 161-8.

12. Michiue H., Tomizawa K., Wei F.Y. et al. NH2-terminal of influenza virus hemagglutinin-2 subunit peptides enhance the anti-tumor potency of poly-arginine-mediated p53 protein transduction. J. Biol. Chem. 2005; 280: 8285-9.

13. Huangfu D., Osafune K., Maehr R. et al. Induction of pluripotent stem cells from primary human fibroblasts with only 0ct4 and Sox2. Nat. Biotechnol. 2008; 26: 1269-75.

Подготовила А.С. Гоигорян

По материалам: Zhou Н„ Wu S., Joo J.Y. et al. Generation of induced pluripotent stem cells using recombinant proteins.

Cell Stem Cell. Published online April 2009

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, hl< 2, 2009