СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИБРИДНОГО ПРЕПАРАТА БРОМЕЛАЙНА И КАРБОКСИМЕТИЛЦЕЛЛЮЛОЗЫ В ВИДЕ ГУСТОГО РАСТВОРА
METHOD FOR PRODUCING HYBRID PREPARATION OF BROMELAIN AND CARBOXYMETHYLCELLULOSE IN THE FORM OF A DENSE SOLUTION

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в пищевой и химико-фармацевтической промышленности, медицинской практике, косметологии и исследовательских целях. Изобретение может применяться при создании лекарственных препаратов в виде густого раствора ранозаживляющего и противоожогового назначения, рекомендованного для предотвращения образования шрамов и рубцов.
Бромелайн (КФ 3.4.22.32) - протеолитический фермент растительного происхождения класса гидролаз, выделенный из ананаса (Ananas comosus). Бромелайн присутствует почти во всех надземных частях растения - в кожуре, листьях, стеблях и плодах, но только плоды и стебли богаты бромелайном. Бромелайн состоит из одной полипептидной цепи длиной 212 аминокислотных остатков, в активном центре присутствуют цистеин и гистидин. Его молекулярная масса составляет 23 кДа, изоэлектрическая точка (pI) - 9,5. Применение бромелайна в медицине и фармакологии набирает обороты, и причина такого высокого интереса в клинической сфере связана с его противовоспалительными, противоотечными, ранозаживляющими, фибринолитическими, противоопухолевыми, антикоагулянтными и антитромботическими свойствами. Кроме того, этот фермент используется в других сферах промышленности, включая косметологию, пивоварение, переработку и тендеризацию мяса и текстильную промышленность [A. Colletti, S. Li, М. Marengo et al. Fecent advances and insights into bromelain processing, pharmacokinetics and therapeutic uses // Applied Sciences. - 2021. V. 11. - P. 20].
Ферменты являются весьма универсальными биокатализаторами, имеющими потенциал для использования в различных технологиях. Однако свойства свободных энзимов сильно зависят от микроокружения молекул. Иммобилизация ферментов приводит к улучшению их каталитических свойств, термической стабильности и стабильности при хранении, также становится возможным повторно использовать ферменты в каталитических процессах [S. Aggarwal, A. Chakravarty, S. Ikram A comprehensive review on incredible renewable carriers as promising platforms for enzyme immobilization & thereof strategies // International Journal of Biological Macromolecules. - 2021. V. 167. - P. 962-986].
При выборе носителя для иммобилизации важно обращать внимание на его характеристики, такие как биосовместимость, нетоксичность, доступность реакционных групп. Кроме того, они должны обладать уникальными физико-химическими свойствами, включая высокую удельную поверхность, гидрофобность или гидрофильность (в зависимости от задач технолога), селективность, что делает их подходящими носителями для иммобилизации ферментов. Одним из множества полимеров, обладающих данными характеристиками, является карбоксиметилцеллюлоза.
Карбоксиметилцеллюлоза (КМЦ) представляет собой водорастворимое производное целлюлозы, полученное химическим воздействием алкилирующих реагентов на активированные некристаллические участки целлюлозы. Это первое производное целлюлозы, которое может подвергаться желаемым химическим модификациям. Подобно целлюлозе, КМЦ также находит применение в бумажной, текстильной, фармацевтической, косметической и пищевой промышленности. Однако КМЦ предпочтительнее целлюлозы из-за ее загущающих, суспендирующих, связывающих и эмульгирующих свойств. Эти функциональные свойства делают ее полезной в фармацевтической, пищевой и других видах промышленности. КМЦ используют в качестве покрытия или суспендирующего агента в различных лекарственных формах, таких как таблетки, капсулы, инъекции, суспензии, пасты и гели. Кроме того, КМЦ чувствительна к ионной силе и рН среды из-за своей полиэлектролитной природы, следовательно, она обладает совместимостью при смешивании с другими полимерными растворами. Это свойство очень важно для приготовления каркасов из биоматериалов, гидрогелей и наночастиц для инкапсуляции лекарств [A. Zennifer, P. Senthilvelan, S. Sethuraman, О. Sundaramurthi Key advances of carboxymethyl cellulose in tissue engineering & 3D bioprinting applications // Carbohydrate Polymers. - 2021. V. 256. - Р. 18].
В пищевой промышленности известно использование КМЦ в качестве загустителя в продуктах на фруктовой основе. Она способна улучшать желирующие свойства, текучесть и стабильность продукта. Кроме того, КМЦ растворима как в горячей, так и в холодной воде. Это выгодно по сравнению, например, с пектином, поскольку КМЦ растворяется без дополнительного нагревания, что приводит к значительной экономии энергии и к уменьшению, связанных с этим, затрат [Патент RU 2322085 С2, МПК A23L 1/0534, A23L 1/212, A23L 2/02, A23L 1/06, опубл. 24.04.2008, Бюл. №11].
Существует способ получения гетерогенного препарата на основе бромелайна, обладающего ранозаживляющими свойствами [Патент RU 2677343 С2, МПК A61L 15/38, A61K 38/56, C12N 11/08, А61Р 17/02, опубл. 16.01.2019, Бюл. №2], включающий обработку матрицы ионообменных волокон ВИОН АН-1 или ВИОН КН-1 раствором бромелайна, инкубирование, отличающийся тем, что для иммобилизации на ВИОН КН-1 используют 0,05 М глициновый буфер (рН 9,0-10,5) или 0,05 М боратный буфер без добавления KCl (рН 8,0), а для иммобилизации на ВИОН АН-1 - 0,2 М ацетатный буфер (рН 5,0) в расчете 20 мл раствора фермента в концентрации 2 мг/мл на 1 г волокон, инкубирование проводится в течение 24 ч при комнатной температуре, образовавшийся осадок промывают использованным при иммобилизации буфером до отсутствия в промывных водах белка.
Известен способ получения гетерогенного биокатализатора на основе бромелайна, иммобилизованного на ионообменных смолах [Патент RU 2770208 С1, МПК C12N 11/10, C12N 9/50, опубл. 14.04.2022, Бюл. №11], включающий адсорбционную иммобилизацию бромелайна в буферном растворе на матрицу ионообменной смолы в соотношении 20 мл раствора бромелайна в концентрации 5 мг/мл на 1 г носителя, инкубацию при комнатной температуре с периодическим перемешиванием, промывку образовавшегося осадка буфером до отсутствия в промывных водах белка, отличающийся тем, что иммобилизацию проводят на матрицу воздушно-сухой ионообменной смолы АВ-16-ГС, а в качестве буферного раствора для иммобилизации используют 0,05 М фосфатный буфер (рН 11,0), инкубацию осуществляют в течение 2 часов, промывку образовавшегося осадка проводят 0,05 М трис-HCl буфером (рН 7,5).
Существует способ получения гетерогенного препарата различной дисперсности на основе бромелайна и хитозана [Патент RU 2677232 С2, МПК A61K 38/48, A61K 47/36, А61Р 17/02 опубл. 10.01.2019, Бюл. №1], включающий адсорбционную иммобилизацию бромелайна в буферном растворе на матрицу хитозана в соотношении 20 мл раствора бромелайна в концентрации 5 мг/мл на 1 г носителя, инкубацию при комнатной температуре с периодическим перемешиванием, промывку образовавшегося осадка буфером до отсутствия в промывных водах белка, отличающийся тем, что иммобилизацию проводят на матрицу среднемолекулярного хитозана или высокомолекулярного хитозана; в качестве буферного раствора для иммобилизации используют либо 0,05 М трис-глициновый буфер (рН 8,5-9,0) для среднемолекулярного или 0,05 М трис-глициновый буфер (рН 8,5) для высокомолекулярного хитозана; инкубация проводится в течение 4 часов для среднемолекулярного и 5 часов для высокомолекулярного хитозана.
В данных способах иммобилизация бромелайна проводится путем адсорбции на нерастворимых носителях в соотношении 20 мл раствора бромелайна в концентрации 2 мг/мл и 5 мг/мл на 1 г носителя при периодическом перемешивании, что не позволяет полностью автоматизировать процесс. Кроме того, получается нерастворимая форма фермента, которая, безусловно, имеет свои преимущества, но не дает возможность проводить реакции на твердых субстратах.
Известен способ получения препарата полибромелайна с применением глутарового альдегида [Патент RU 2711790 С1, МПК C12N 11/04, C12N 11/10 опубл. 22.01.2020, Бюл. №3], включающий растворение бромелайна в 0,05 М трис-глициновом буфере (рН 9,0) в концентрации 1 мг/мл; сополимеризацию с применением глутарового альдегида в качестве сшивающего агента в концентрации 2% или 10% в объеме, равном объему трис-глицинового буферного раствора; инкубация проводится до образования пленки; промывку осуществляют 0,05 М трис-HCl буферным раствором (рН 7,5) до отсутствия в промывных водах белка.
Существует способ получения гетерогенного препарата бромелайна, ковалентно связанного с матрицей хитозана [Патент RU 2711786 С1, МПК C12N 11/10, C12N 9/50 опубл. 22.01.2020, Бюл. №3], включающий иммобилизацию бромелайна в буферном растворе на матрицу среднемолекулярного хитозана (200 кДа) или высокомолекулярного хитозана (350 кДа) в соотношении 18 мл раствора бромелайна в концентрации 1 мг/мл на 900 мг носителя; в качестве буферного раствора для иммобилизации используют 0,05 М трис-глициновый буфер (рН 9,0) для среднемолекулярного хитозана или 0,05 М трис-глициновый буфер (рН 8,5) для высокомолекулярного хитозана; затем добавляют 10 мл глутарового альдегида с 15% концентрацией для среднемолекулярного или 10% концентрацией для высокомолекулярного хитозана; инкубацию проводят с периодическим перемешиванием в течение 1 часа; далее суспензию центрифугируют при 1500 g в течение 10 мин, промывку образовавшегося осадка проводят 0,05 М трис-HCl буфером (рН 7,5) до отсутствия в промывных водах белка.
Недостатком изобретений является использование глутарового альдегида, что ограничивает применение препарата в фармацевтической промышленности и медицине.
Известен способ стабилизации протеаз для применения в косметологических целях [US 2011/0177052]. Недостатком способа является использование 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида, который вызывает серьезные ожоги кожи и повреждение глаз, может приводить к аллергическим кожным реакциям, при вдыхании может вызывать аллергию, симптомы астмы или затруднение дыхания, что ограничивает применение препарата в косметологии.
Существует способ получения иммобилизованного ферментного препарата на основе бромелайна, гиалуроновой кислоты и полисахаридов, модифицированных виниловыми мономерами [Патент RU 2750377 С1, МПК A61K 38/00, A61K 38/56, A61K 47/36, C12N 11/08, А61Р 17/02 опубл. 28.06.2021, Бюл. №19], включающий растворение бромелайна в водном растворе низкомолекулярной гиалуроновой кислоты 300 кДа или среднемолекулярной гиалуроновой кислоты 500 кДа или высокомолекулярной гиалуроновой кислоты 800 кДа в соотношении 10 мг бромелайна на 2 мл водного раствора низкомолекулярной гиалуроновой кислоты 300 кДа или среднемолекулярной гиалуроновой кислоты 500 кДа или высокомолекулярной гиалуроновой кислоты 800 кДа в концентрации 1,5%, при этом осуществляют перемешивание до полного растворения при комнатной температуре; затем ведут иммобилизацию бромелайна путем добавления к полученной смеси графт-сополимера карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) или хитозана (ХТЗ) с N-винилимидазолом (ВИ) или N,N-диметиламиноэтилметакрилатом (ДМАЭМА) при молекулярной массе полисахарида 50-100 кДа в количестве от 100 до 290 мг для получения жидкого препарата или от 300 до 500 мг для получения геля.
Недостатком способа является высокая стоимость гиалуроновой кислоты и полисахаридов, модифицированных виниловыми мономерами. Использование карбоксиметилцеллюлозы позволит сократить расходы.
В качестве прототипа служил способ получения препарата бромелайна в геле на основе пищевого хитозана и сукцината хитозана [Патент RU 2691611 С1, МПК C12N 11/04, C12N 11/10, опубл. 14.06.2019, Бюл. №17], включающий иммобилизацию бромелайна в буферном растворе на матрицу хитозана в соотношении 20 мл раствора фермента в концентрации 5 мг/мл на 1 г носителя; инкубацию при комнатной температуре с периодическим перемешиванием; промывку образовавшегося осадка 50 мМ трис-HCl буфером (рН 7,5) до отсутствия в промывных водах белка, отличающийся тем, что иммобилизацию проводят на матрицу пищевого хитозана с молекулярной массой менее 100 кДа или сукцината хитозана; в качестве буферного раствора для иммобилизации используют либо 0,05 М глициновый буфер с рН 8,5 для пищевого хитозана или с рН 9,0-9,5 для сукцината хитозана; либо 0,05 М ацетатный буфер с рН 5,5 для пищевого хитозана или 5,0 для сукцината хитозана; инкубация проводится в течение 2 часов.
В отличие от прототипа наш способ позволяет получить иммобилизованный бромелайн в другой форме, т.е. не в виде геля, а в форме густого раствора, включающего только иммобилизованный (стабилизированный) бромелайн и полностью отмытого от его нестабилизированной (неиммобилизованной) формы. Заявляемое и обретение предназначено для расширения числа полисахаридов, используемых для стабилизации препаратов бромелайна. Кроме того, карбоксиметилцеллюлоза является водорастворимым носителем, что позволяет работать с ней в широком диапазоне значений рН среды.
Технический результат заявленного изобретения заключается в разработке способа получения гибридного препарата иммобилизованного бромелайна и карбоксиметилцеллюлозы в виде густого раствора с абсолютной вязкостью 200-220 МПа×с, включающего только иммобилизованный (стабилизированный) бромелайн и полностью отмытого от его нестабилизированной (неиммобилизованной) формы, при этом в ходе иммобилизации активный центр бромелайна защищен от окисления путем добавления цистеина в концентрации 0,04 М.
Технический результат достигается тем, что в способе получения гибридного препарата бромелайна и карбоксиметилцеллюлозы в виде густого раствора, включающем иммобилизацию ферментного препарата бромелайна в буферном растворе с носителем, инкубирование при комнатной температуре в течение 2 часов и промывку, согласно изобретению, иммобилизацию бромелайна проводят путем комплексообразования в густой раствор натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы в соотношении 10 мл раствора бромелайна в концентрации 26 мг/мл, полученного растворением в буфере, на 1 г натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы, предварительно растворенной в 10 мл буфера, при постоянном перемешивании со скоростью 250 об/мин; в качестве буферного раствора для иммобилизации используют 0,05 М глициновый буфер с рН 8,6, содержащий цистеин в концентрации 0,04 М; образовавшийся в процессе инкубирования препарат в виде густого раствора промывают с помощью диализа с использованием целлофанового мешочка шириной 34 мм, вместимостью 3,7 мл на 10 мм длины, с диаметром пор 25 кДа против 50 мМ трис-HCl буфера с рН 7,5, из расчета, что для промывки 21 мл полученного препарата используют 400 мл 50 мМ трис-HCl буфера с рН 7,5, диализ ведут в течение 8 часов, после чего буфер меняют на порцию свежего в объеме 400 мл и продолжают диализ еще в течение 16 часов до отсутствия в промывном растворе свободного бромелайна.
Фиг. 1. Диаграмма значений содержания белка (в мг на 1 г носителя) в гибридных препаратах в виде густого раствора бромелайна и карбоксиметилцеллюлозы с использованием следующих буферов: 1 - 0,05 М ацетатный, 2 - 0,05 М фосфатный, 3 - 0,05 М боратный с добавлением 0,1 М KCl, 4 - 0,05 М трис-глициновый, 5 - 0,05 М глициновый.
Фиг. 2. Диаграмма значений общей активности (в ед на 1 мл раствора) гибридных препаратов в виде густого раствора бромелайна и карбоксиметилцеллюлозы с использованием следующих буферов: 1 - 0,05 М ацетатный, 2 - 0,05 М фосфатный, 3 - 0,05 М боратный с добавлением 0,1 М KCl, 4 - 0,05 М трис-глициновый, 5 - 0,05 М глициновый.
Фиг. 3. Диаграмма значений удельной активности (в ед на 1 мг белка в пробе) гибридных препаратов бромелайна в виде густого раствора с использованием следующих буферов: 1 - 0,05 М ацетатный, 2 - 0,05 М фосфатный, 3 - 0,05 М боратный с добавлением 0,1 М KCl, 4 - 0,05 М трис-глициновый, 5 - 0,05 М глициновый.
Пример реализации способа.
В качестве объекта исследования был выбран бромелайн фирмы «Sigma-Aldrich», субстратом для гидролиза служил азоказеин фирмы «Sigma-Aldrich». В качестве носителя для комплексообразования применяли натриевую соль карбоксиметилцеллюлозы фирмы «Sigma-Aldrich» с молекулярной массой 90 кДа и степенью замещения 0,7.
Комплексообразование бромелайна и карбоксиметилцеллюлозы осуществляли следующим образом. К 1 г натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы, предварительно растворенной в 10 мл буфера, добавляли 10 мл раствора фермента в концентрации 26 мг/мл, полученного растворением в 0,05 М глициновом буфере с рН 8,6, содержащем цистеин в концентрации 0,04 М для предотвращения процессов окисления активного центра бромелайна; инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре при постоянном перемешивании со скоростью 250 об/мин. После окончания инкубации образовавшийся препарат в виде густого раствора очищали от несвязанного фермента с помощью диализа с использованием целлофанового мешочка Spectra/Por 6 Standard RC, шириной 34 мм, вместимостью 3,7 мл на 10 мм длины, изготовленного из регенерированной целлюлозы, с диаметром пор 25 кДа против 400 мл 50 мМ трис-HCl буфера с рН 7,5 в течение 8 часов, после чего буфер меняли на 400 мл свежего и продолжали диализ еще в течение 16 часов до отсутствия в промывном растворе свободного бромелайна. Для промывки 21 мл полученного препарата использовали 800 мл 50 мМ трис-HCl буфера с рН 7,5. По истечении этого времени осуществляли контроль наличия белка в промывных водах с помощью спектрофотометра СФ-2000 при λ=280 нм.
Содержание белка в гибридных препаратах бромелайна определяли методом Лоури [Lowry О.Н., Rosebrough N.J., Faar A.L., Randall R.J. Protein measurement with folin-phenol reagent // J. Biol. Chem. - 1951. - V.193. - P. 265-275.].
Определение протеазной активности бромелайна проводили на субстрате азоказеине (Sigma, США) [Sabirova A.R., Rudakova N.L., Balaban N.P., Ilyinskaya O.N., Demidyuk I.V., Kostrov S.V., Rudenskaya G.N., Sharipova M.R. A novel secreted metzincin metalloproteinase from Bacillus intermedius // FEBS Lett. - 2010 - V. 584 (21), P. 4419-4425]. К 50 мг образца добавляли 200 мкл 0,05 М трис-HCl буфера с рН 7,5, 800 мкл азоказеина (0,5% масс. в 0,05 М трис-HCl буфере, рН 7,5) и инкубировали 2 часа при 37°С. Далее добавляли 800 мкл трихлоруксусной кислоты (ТХУ) (5% масс.), инкубировали 10 минут при 4°С, затем центрифугировали в течение 3 мин при 11700 g для удаления негидролизованного азоказеина. К 1200 мкл супернатанта добавляли 240 мкл раствора NaOH (3% масс.) для нейтрализации кислоты, после чего измеряли оптическую плотность опытной пробы при 410 нм в 10 мм кювете. Контрольная проба содержала 800 мкл азоказеина, 800 мкл ТХУ, 50 мг образца и 200 мкл буфера (комплексообразованный фермент в контрольную пробу вносили последним, остальные операции для нее делали аналогично опытным пробам).
Единицей протеазной активности служило количество бромелайна, которое в условиях эксперимента гидролизует 1 мкМ азоказеина за 1 мин. Удельную протеазную активность рассчитывали по формуле:
A=D*1000/120/200/С,
где А - протеазная активность препарата, мкМ/мин на 1 мг белка,
D - оптическая плотность раствора при 410 нм,
С - концентрация белка в пробе, мг/мл, измеренная по метод) Лоури,
120 - время инкубации в минутах,
200 - объем пробы, мкл,
1000 - коэффициент для пересчета в мкМ.
Все экспериментальные исследования осуществляли минимум в 8-кратной повторности. Статистическая обработка полученных результатов проводилась при уровне значимости 5% с использованием t-критерия Стьюдента.
Для получения гибридных препаратов на основе бромелайна и карбоксиметилцеллюлозы, в качестве среды для комплексообразования мы использовали следующие буферы: 0,05 М боратный с добавлением 0,1 М KCl с рН 8,0-10,0, 0,05 М ацетатный с рН 4,0-5,8, 0,05 М глициновый с рН 8,6-10,5, 0,05 М трис-глициновый с рН 8,5-9,0, 0,05 М фосфатный с рН 5,8-7,5. Результаты отражены на фиг. 1-3.
Анализ содержания белка в гибридных препаратах показал, что наибольшее количество бромелайна (в мг на г носителя) наблюдается при использовании 0,05 М ацетатного буфера с диапазоном рН 4,0-5,8 (фиг. 1).
Общая активность (в ед на мл раствора) бромелайна оказалась выше при применении 0,05 М ацетатного буфера с рН 4,5 (фиг. 2).
Наибольшую удельную активность показали препараты бромелайна, полученные при использовании 0,05 М фосфатного буфера с рН 5,8-7,5 и 0,05 М глицинового с рН 8,6 (фиг. 3).
Мы сравнили полученные результаты по определению каталитической активности и содержания белка для препаратов бромелайна в густом растворе карбоксиметилцеллюлозы. Оптимальное соотношение содержания белка (мг на г носителя), общей активности (в ед на мл раствора) и удельной активности (в ед на мг белка) получено при стабилизации бромелайна путем включения в густой раствор натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы при использовании 0,05 М глицинового буфера с рН 8,6.
Таким образом, была разработана методика получения гибридного препарата на основе бромелайна и карбоксиметилцеллолозы в виде густого раствора с абсолютной вязкостью 200-220 МПа×с, включающего только иммобилизованный (стабилизированный) бромелайн и полностью отмытого от его нестабилизированной (неиммобилизованной) формы, т.к. после диализа 21 мл препарата против 800 мл 50 мМ трис-HCl буфера с рН 7,5 исключается переход фермента из фазы носителя в раствор, что позволяет проводить реакции, получая продукт, не "загрязненный" ферментом. Кроме того, в ходе иммобилизации активный центр бромелайна защищен от окисления путем добавления цистеина в концентрации 0,04 М.