Бета-ситостерин: свойства, подходы к количественному определению

Круглякова А.А., Раменская Г.В. БЕТА-СИТОСТЕРИН: СВОЙСТВА, ПОДХОДЫ К КОЛИЧЕСТВЕННОМУ ОПРЕДЕЛЕНИЮ

БЕТА-СИТОСТЕРИН: СВОЙСТВА, ПОДХОДЫ К КОЛИЧЕСТВЕННОМУ ОПРЕДЕЛЕНИЮ

Круглякова А.А., Раменская Г.В. УДК: 577.1

Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова, Москва

Резюме

Фитостерины являются биологически активными компонентами многих растений. Наиболее распространен среди них бета-ситостерин, который обладает рядом перспективных фармакологических свойств. В данном обзоре приведены характеристики биологических и химических свойств бета-ситостерина, а также методов его количественного определения.

Ключевые слова: фитостерины, бета-ситостерин, биологическая активность, ВЭЖХ.

BETA-SITOSTERIN: PROPERTIES, APPROACHES TO QUANTITATIVE ANALYSIS

Kruglyakova A.A., Ramenskaya G.V.

Phytosterols are biologically active components of many plants. The most common among them is beta-sitosterin, which has potential pharmacological properties. This overview shows the characteristics of the biological and chemical properties of beta-sitosterin and methods for its quantification.

Keywords: phytosterols, beta-sitosterin, biological activity, HPLC.

Фитостерины (фитостеролы) являются биологически активными компонентами всех продуктов растительного происхождения [1].

Первый фитостерин был описан Ф. Бенеке в 1862 году. Бенеке обнаружил стероидное соединение в горохе, но из-за несовершенных аналитических методик того времени ошибочно предположил, что это был холестерол. Потребовалось более 50 лет, пока было установлено, что соединение, которое открыл Бенеке, на самом деле являлось бета-ситостерином. В 1897 году Г.Томс установил, что все стерины растительного происхождения относятся к фитостеринам [2].

В растениях эти вещества существуют как в виде свободных соединений, так и в виде конъюгатов [3]. Свободная гидрокси группа у С3 атома углерода дает возможность свободным фитостеринам взаимодействовать с фосфолипидами и белками в клеточных мембранах [4].

Известно, что в природе существует более 200 фито-стеринов, самым распространенным среди них является бета-ситостерин. Бета-ситостерин структурно подобен холестерину. Сравнение формул холестерина и бета-си-тостерина представлены на рисунке 1.

Гипохолестеринемическое действие фитостеринов известно на протяжении многих лет. В 1980 году японским ученым удалось выделить насыщенные формы фитостеринов, известные как фитостанолы, показавшие более сильную способность понижать уровень холестерина в крови [5].

Рис. 1. Формулы бета-ситостерина и холестерина

В начале 1990 годов была описана этерификация стеринов, что значительно увеличило возможность включать фитостерины в состав пищевых продуктов. Первые коммерческие продукты, содержащие этерифицирован-ные станолы, были выпущены в 1995 году в Финляндии под торговой маркой Бенекол. Позже во всем мире стали выпускать множество продуктов, обогащенных фитосте-ринами и фитостанолами. Среди них: йогурты, энергетические батончики, молоко, майонез и др. Финляндия до сих пор является страной, выпускающей наибольшее количество продуктов, обогащенных фитостеринами и фитостанолами [6].

Фитостерины считаются безопасными биологическими добавками (GRAS - Generally Recognized As Safe). Главным противопоказанием для употребления фитосте-ринов является болезнь «фитостеролемия», генетическое заболевание, связанное с мутациями белка-переносчика ABCG5/G8, который играет важную роль в поступлении стеринов в энтероциты и гепатоциты.

Источники бета-ситостерина

Бета-ситостерин выделяют различными хроматогра-фическими методами из разнообразных растительных семейств. Больше всего бета-ситостерин содержат растения семейств: бобовые, липовые, пасленовые, волчниковые, крушиновые, гречишные и т.д.

Бета-ситостерин содержится в больших количествах в таких продуктах как: рис, зародыши пшеницы, семечки тыквы, орехи, соя и др.

Бета-ситостерин содержится в растениях: эхина-цея бледная (Echinaceapallida), эхинацея пурпурная (Echinaceapurpurea), слива африканская (PrunusAfricana) и пальма ползучая (Serenoarepens), которые входят в состав европейской фармакопеи [7].

На данный момент источником для промышленного получения фитостеринов является растение соя культурная (GlycineMax). Семена сои содержат большое количество различных растительных фитостеринов:

Круглякова А.А., Раменская Г.В.

БЕТА-СИТОСТЕРИН: СВОЙСТВА, ПОДХОДЫ К КОЛИЧЕСТВЕННОМУ ОПРЕДЕЛЕНИЮ

стигмастерин (около 20%), бета-ситостерин (около 50%), кампестерин (около 20%). В семени сои 40% бета-ситостерина содержится в свободной форме, а остальное в форме гликозидов или сложных эфиров с жирными кислотами. Масло обычно экстрагируют из высушенных семян гексаном.

Бета-ситостерин получают этерификацией с жирными кислотами из сои, для получения липофильного продукта.

Бета-ситостерин используют для лечения хронического простатита, так в настоящее время в России зарегистрировано несколько препаратов на основе экстракта плодов пальмы ползучей, таких как: Пермиксон (Пьер Фабр, Франция), Простамол-Уно (Берлин-Хеми, Германия), Простагут моно (Доктор ВилльмарШвабе, Германия), Простаплант (Доктор Вилльмар Швабе, Германия), Серпенс (Лизафарма, Италия), Палпростес (СвиссКэпс, Швейцария). Основным действующим веществом пальмы ползучей является бета-ситостерин .

Также бета-ситостерин входит в состав многих биологически активных добавок: Проста-Стронг (IrwinNaturals США), Овесол (Эвалар, Россия), Бетуланорм (Березовый мир, Россия), Гепалексин (Байфлор, Россиия), Фитопростан (HANKINTATUKU Финляндия) и др.

Фармакологические свойства

Бета-ситостерин обладает различными фармакологическими действиями: гипохолестеринемическим, снижает риск возникновения рака толстой кишки, простаты, молочной железы, желудка, легких, влияет на состояние иммунной системы и патологические воспалительные реакции.

Следует знать, что свободные фитостерины имеют низкую биодоступность, а благодаря этерификации, т.е. образованию эфиров фитостеринов и высших жирных кислот, этот недостаток удается устранить, и повысить их функциональность.

В пятнадцати рандомизированных плацебо-кон-тролируемых исследованиях в разных странах, а также в крупномасштабных программах в Дании, Финляндии и США было установлено, что при дозе 2 г в день (рекомендовано U.S. National Cholesterol Education Program) фитостерины устойчиво снижают уровень общего холестерина у взрослых и детей на 9,6-11,3%, ЛПНП - на 10%, при этом не влияют на уровень липопротеидов высокой плотности (ЛПВП) и триглицеридов [8], действие их не зависит от приема статинов [9].

Механизм гипохолестеринемического действия фи-тостеринов изучен не до конца [10]. Однако, имеющиеся в настоящее время данные показывают, что фитостерины подавляют всасывание холестерина в тонкой кишке [11]. Предполагается, что из-за дополнительных метильной и этильной групп в фитостеринах их гидрофобность выше, чем у холестерина. Повышение гидрофобности увеличивает сродство к мицеллам, тем самым замещая холестерин [12]. Молекулы фитостеринов блокируют проникновение

«вредного холестерина» за счет уменьшения его включения в мицеллы с желчными кислотами. Всасывание холестерина в кишечнике снижается на 30-50%.

Так же фитостерины обладают онкопрофилактиче-ской активностью. Механизм онкопрофилактического действия этих веществ связан с их влиянием на структуру клеточных мембран и регуляцию клеточных сигналов, способностью тормозить опухолевый рост и вызывать самопроизвольную гибель раковых клеток, а также стимулировать реакции противоопухолевого клеточного иммунитета (активность клеток-киллеров). В различных исследования было продемонстрировано, что дополнительное включение в рацион питания фитостеринов ингибировало рост раковых клеток.

Одним из уникальных свойств фитостеринов является их способность влиять на состояние иммунной системы и патологические воспалительные реакции. Исследования показали, что под их воздействием восстанавливается уровень и соотношение ТЫ - и ^2-лим-фоцитов (повышается образование иммуноактивных ТЫ-цитокинов и снижается уровень противовоспалительных Т^ -цитокинов), значительно усилив ается отв ет Т-лимфоцитов на митогены, активизируются клетки-киллеры по отношению к раковым клеткам.

Было установлено, что фитостерины в высоких концентрациях способны подавлять секрецию противовоспалительных цитокинов, уровень которых повышается при таких заболеваниях, как астма, ревматоидный артрит, красная волчанка, других аутоиммунных заболеваниях, а также при физических перегрузках. Торможение продукции противовоспалительных эйкозаноидов (простагландинов) служит основным механизмом снижения воспаления и аллергии при действии фитостеринов, сравнимый с действием аспирина, индометацина и даже кортизона [12].

Химические свойства

Формально фитостерины (фитостеролы) можно отнести к производным тетрациклических тритерпенов, но они составляют особую группу соединений, входящих в состав стероидов. Все стероиды имеют в молекуле циклическую структуру циклопентанпергидрофенантрена. У фитостеринов этот углеродный скелет дополнен у С17 алифатическим заместителем, и они представляют собой циклические спирты [13] .

Бета-ситостерин (бета-ситостерол) - белый или слегка желтоватый кристаллический порошок, нерастворимый в воде, растворимый в эфире и хлороформе. Молекулярная масса - 414.7067 г/моль. Температура плавления - 130-145° С.

Хотя бета-ситостерин не был до сих пор синтезирован, его получают из стигмастерина. Схема получения представлена на рисунке 2.

Первый этап: получение из стигмастерина (1) стигмастеринатозилата (2) путем замещения водорода в гидроксильной группе на тозил. Реакцию проводят в пиридине. Потом получают метиловый эфир сигма-

Круглякова А.А., Раменская Г.В. БЕТА-СИТОСТЕРИН: СВОЙСТВА, ПОДХОДЫ К КОЛИЧЕСТВЕННОМУ ОПРЕДЕЛЕНИЮ

н,со

55% yield,

6, 37% yield trom 1 2 steps 5

Рис. 2. Схема получения бета-ситостерина

стерина (4) и изо-метиловый эфир сигмастерина (3). Реакцию проводят в абсолютном метаноле в присутствии пиридина. Полученные изомеры разделяют препаративной хроматографией. Далее проводят гидрирование на платиновом катализаторе в растворе этилового спирта. Последний этап гидролиз в водном диоксане при температуре 80° С, в присутствии пара - тозиловой кислоты, происходит миграция OH группы в 3 положение с образованием бета-ситостерина (6). Совокупный выход продуктов - 55%, [14].

Биосинтез бета-ситостерина осуществляется преимущественно по меваланатному пути. Биосинтез фито-стеринов несколько отличается от биосинтеза стероидов животного происхождения. В растениях первоначальным продуктом циклизации 2,3 - эпоксисквалена и предшественником фитостеринов является циклоартенол [15].

Химические свойства фитостеринов мало отличаются от свойств алициклических спиртов или алкенов.

Анализ фитостеринов основан на сочетании хро-матографических и спектральных методов. Чаще всего используется: хромато - масс - спектрометрия, позволяющая в процессе анализа фракции идентифицировать ее по типу фрагментации. Цветные реакции представляют лишь теоретический интерес.

Выделение и идентификация бета - ситостерина из растительных экстрактов и в биологических жидкостях

Бета-ситостерин подвергается окислению, аналогично холестерину, что приводит к образованию оксида бета-ситостерина. Это делает выделение бета-ситостерина в

чистом виде сложной задачей [16]. Для экстракции фито-стеринов из растений широко используют органические растворители: гексан, хлороформ и метанол [17]. Обычный метод извлечения - приготовление хлороформного экстракта из растения, с последующим хроматографическим разделением на колонке с силикагелем.Чаще всего фракцию, содержащую бета-ситостерин, растворяют в смеси хлороформ: этанол (2:3) при последующем нагревании на водяной бане. При медленном охлаждении могут выпасть игольчатые кристаллы [17]. Использование больших количеств вредных органических растворителей может привести к проблемам со здоровьем, поэтому в некоторых случаях используют более «безопасный» метод сверхкритической флюидной экстракции ^Е).Сверхкритическая флюидная экстракция - процесс экстракции с использованием сверхкритического флюида в качестве растворителя. Производится контактированием смеси разделяемых компонентов с газообразным экстрагентом при температуре и давлении выше критической точки. Наибольшее распространение в качестве экстрагента (растворителя) получил СО2 т.к он нетоксичен, негорюч, невзрывоопасен, химически инертен, обладает низкой стоимостью [16].

Количественное определение бета-ситостерина в растениях чаще всего проводят методом ЖХ-МС с химической ионизацией при атмосферном давлении. В таблице 1 приведены различные методы количественного определения и пробоподготовки бета - ситостерина в различных растениях.

Для определения оксида или сложных эфиров бета-ситостерина применяется метод газовой хроматографии с массселективным детектором. Когда в растительном экстракте содержится одновременно бета-ситостерин и стигмастерин, их извлечение осложнено. Экстракт бета-ситостерина и стигмастерина в петролейном эфире делят хроматографическими методами с добавлением метанола. При разделении гексанового или петролейно-эфирного экстракта из растений методом ТСХ в качестве элюента могут быть использованы: петролейный эфир, хлороформ, гексан, этилацетат, хлороформ, метанол. Хроматограммы покажут характерные зоны для веществ стероидной структуры с реактивами Либермана-Бухарда, ванилин-серная кислота и анисовый альдегид-серная кислота. Подтверждение структуры бета-ситостерина осуществляется различными методами 1Н ЯМР, 13С ЯМР, ИК, масс - спектроскопии [17].

Среди опубликованных методов количественного определения бета-ситостерина в различных биобъектах приведены методы: ВЭЖХ, ГЖХ, ГХ-МС, ЖХ-МС. Описан метод количественного определения фитостеринов в плазме крови методом ГХ-МС в режиме селективного мониторинга (SIM). Образцы плазмы омыляли раствором KOH в этаноле, экстракцию проводили смесью гексан: этанол (20:1) , перед анализом фитостерины переводили в силильные производные, придел количественного опре-деления(LOQ)бета-ситостерина составлял 0,7 ммоль/л -1, придел детектирования (LOD) 0,2ммоль/л-1[22].

37

Круглякова А.А., Раменская Г.В.

БЕТА-СИТОСТЕРИН: СВОЙСТВА, ПОДХОДЫ К КОЛИЧЕСТВЕННОМУ ОПРЕДЕЛЕНИЮ

Табл. 1. Методы количественного определения и пробоподготовки бета-ситостерина

Параметры сравненйя-^^^^ Плоды и экстракт пальмы ползучей

Метод количественного определения 1 метод: ЖХ-МС с химической ионизацией при атмосферном давлении 2 метод: ГЖХ с пламенно-ионизационным детектором ВЭЖХ с диодно-ма-тричным детектором и испарительным детектором по светорассеянию ЖХ-МС с химической ионизацией при атмосферном давлении ЖХ-МС с химической ионизацией при атмосферном давлении

Пробоподготовка Для 1 метода сначала проводили кислотный гидролиз 6М раствором HCL с последующим омылением этанольным раствором КОН. Далее проводили экстракцию толуолом. Для 2 метода пробопод-готовка проводилась аналогино, за исключением того, что перед анализом фитостерины переводили в силильные производные гексаметилдисиланом и триметилхлорсиланом Измельченные корневища банана высушивали до постоянной массы, двухкратно экстрагировали метанолом из расчета 50 мл экстрагента на 1 г. сухого сырья. Экстракт концентрировали до 10 мл Образец омыляли 2 N раствором KOHb этаноле, неомыляемую фракцию экстрагировали диэтиловым эфиром. Экстракт анализировали методом ТСХ, фитостерины выделяли экстракцией метанолом с пластины селикагеля Высушенный гомогенезированный образец 1,2 г. экстрагировали 6 мл гексана или хлороформа 3 раза. Полученный экстракт упаривали на роторном испарителе при 30градусах. Остатки растворителя удаляли продувкой азотом. Сухой остаток экстрагировали сверхкритичным диоксидом углерода 2 часа при 55 градусах и 450 атм. После экстракции проводили омыление спиртовым раствором КОН. Неомыляемую фракцию экстрагировали петролейным эфиром Органический слой объединяли и упаривали при 40 градусах. Сухой остаток растворяли в смеси гексан-этилацетата. Полученный раствор очищали методом твердофазной экстракции на катриджах с силикагелем

Аналитический диапазон 0,06-960 нг 6,4-448 мг/мл 0,05-200 мг л-1 0,05-5 мг мл-1

Предел детектирования (LOD) 0,06 нг 0,03 мг/мл 123-677 нгмл-1 0,0023 мг мл-1

Предел количественного определения (LOQ) 0,2 нг 0,47 мг/мл 500-2515 нгмл-1 0,0076 мг мл-1

Источник литературы [18] [19] [20] [21]

Заключение

Наиболее изученным фитостерином является бета-ситостерин. Он обладает высоким потенциалом для лечения различных болезней. Основное фармакологическое свойство бета-ситостерина - гипохолестеринемическое. В литературе описаны различные методы количественного определения бета-ситостерина в растениях и в плазме крови: ВЭЖХ, ГХ-МС, ЖХ-МС. Поэтому актуальной является разработка различных методик пробоподговки и количественного определения бета-ситостерина в лекарственном растительном сырье и биообьектах.

Литература

1. Weihrauch J.L., Gardner J.M. Sterol content of foods of plant origin // Journal of the American dietetic association. 1978; 73(1): 39-47.

2. Akihisa T., Kokke W., Tamura T. Naturally occurring sterols and related compounds from plants // Physiology and Biochemistry of Sterols, American Oil Chemists' Society, Champaign. 1991; 172-228.

3. Norman C.W., Wong M.D. The beneficial effects of plant sterol on serum cholesterol // Canadian Journal of Cardiology. 2001; 17(1): 715-721.

4. PiironenV., Lindsay D.G., Miettinen T.A., Toivo J., Lampi A.M. Plant sterols: biosynthesis, biological function and their importance to human nutrition // Journal of the Science of Food and Agriculture. 2000; 80(2): 939-966.

5. Miettinen T.A., Gylling H. Non-nutritive bioactive constituents of plants // Phytost-erols. International Journal for Vitamin and Nutrition Research. 2003; 73(1): 127-134.

6. Dutta P.C. Phytosterols as Functional Food Components and Nutraceuticals. New York. 2004. 441 p.

7. European Pharmacopoeia 8th Edition. 2014

8. Gylling H., Miettinen T.A. Plant sterol in nutrition // Scandinavian Journal of Nutrition 2000; 44(1): 155-157.

9. Blair S.N., Capuzzi D.M., Gottlieb S.O., Nguyen T. et al. Incremental reduction of serum total cholesterol and low-density lipoprotein cholesterol with the addition of plant stanol ester-containing spread to statin therapy // The American Journal of Cardiology. 2000; 86(2): 46-52.

10. Wester I. Cholesterol-lowering effect of plant sterols // European Journal of Lipid Science and Technology. 2000; 102(1): 37-44.

11. Normen L. Phytosterols - effects of intake on cholesterol absorption and colorectal cancer risk. PhD Thesis. Department of Clinical Nutrition, Göteborg University, Göteborg, 2001.

12. Normen L., Fröhlich J., Trautwein E. Role of plant sterols in cholesterol lowering. In Phytosterols as Functional Food Components and Nutraceuticals, Edited by Dutta, P. C., Marcel Dekker Inc., Champaign, 2004; 243-316.

13. Азаров В.И., Буров А.В., Оболенская А.В. Химия древесины и синтетических полимеров: Учебник для вузов. СПб.: СПбЛТА, 1999. 628 с. [c.514]

14. McCarthy F.O., Chopra J., Ford A., Hogan S.A. et al. Synthesis, isolation and characterisation of beta-sitosterol and beta-sitosterol oxide derivatives // Organic & biomolecular chemistry. 2005; 3(16): 3059-3065.

15. Boutte'Y., Frescatada-Rosa M., Men S., Chow C.M. et al. Endocytosis restricts Arabidopsis KNOLLE syntaxin to the cell division plane during late cytokinesis // EMBO. 2009; № 29 (1): 546-558.

16. Marshall J.A., Dennis A.L., Kumazawa T., Haynes A.M. et al. Soybean sterol composition and utilization Phytophthorasojae // Phytochemistry 2001; 58(1): 423.

17. Soodabeh S., Azadeh M., Ahmad R., Mohammad A. The story of Beta-sitoster-ol - A Review // Europen Journal of Medical Plants. 2014; 4(5): 591-609.

18. Bedner M., Schantz M.M., Sander L.C. Development of liquid chromatographic methods for determination of phytosterols in Standart reference Materials containing saw palmetto // Journal of Chromatography A. 2000; 74-80.

19. Xu F., Wu H., Wang Y., Yang Y. et al. Determination of lupenone and beta-sitos-terolin rhizome Musae by UPLC with DAD and ELSD // Journal of Chromatographic Science, Oxford. 2015; 1(1): 1-6.

20. Canabate-diaz B., Segura Carretero A., Fernandez-Gutierrez A. Separation and determination of sterols in olive oil by HPLC-MS // Food Chemistry. 2007; 102(2): 593-598.

21. Lu B., Zhang Y., Wu X., Shi J. Separation and determination of diversiform phytosterols in food materialsusing supercritical carbon dioxide extraction and ultra-performanceliquid chromatography-atmospheric pressure chemicalionization-mass spectrometry // AnalyticaChimicaActa. 2007; 588(1):50-63.

22. Ahmida H.S., Bertucci P., Franzo L., MassoudM. et al. Simultaneous determination of plasmatic phytosterols and cholesterol precursors using gas chromatography - mass spectrometry (GC-MS) with selective ion monitoring // Journal of Chromatography B. 2006; 15(2): 43-47.

КОНТАКТНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

e-mail: nasty2003@list.ru

38