ФЕРМЕНТАЦИЯ И ОЧИСТКА ГЕПАРОСАНА К5

1. Способ получения по существу чистого гепаросана из E.coli К5, включающий:
(а) культивирование клеток E.coli K5 в заданной среде, содержащей глюкозу в качестве основного источника углерода,
(б) осуществление связывания гепаросана с твердофазным носителем с последующим элюированием и
(в) осаждение гепаросана из элюата;
при этом указанный по существу чистый гепаросан является по меньшей мере на 90% чистым.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что культивирование включает фазу периодического культивирования и фазу периодического культивирования с подпиткой, при этом
2
4
4
2
4
4
2
4
2
2
4
2
4
2
4
2
4
6
7
24
2
2
4
7
2
(а) среда, применяемая на стадии периодического культивирования, содержит (на литр) примерно 20 г глюкозы, 10-300 мг тиамина, примерно 13,5 г КНРО, примерно 4,0 г (NH)HPO примерно 1,4 г MgSO·7HO, примерно 1,7 г лимонной кислоты, и примерно 10,0 мл раствора микроэлементов, при этом раствор микроэлементов по существу состоит из (на 1 л 5М HCl) 10,0 г FeSO·7HO, 2,0 г CaCl, 2,2 г ZnSO·7HO, 0,5 г MnSO·4HO, 1,0 г CuSO·5HO, 0,1 г (NH)MoO·4HO и 0,02 г NaBO·10HO и при этом;
4
2
4
(б) среда для подпитки, применяемая на стадии периодического культивирования с подпиткой, содержит (на литр): 250-1000 г глюкозы, 20 г MgSO, 0,15-0,5 г тиамина, и возможно 47 г KHPO и
(в) при этом снабжение кислородом осуществляют путем барботирования воздуха с дополнительной подачей или без дополнительной подачи кислорода.
3. Способ по п.2, отличающийся тем, что содержание растворенного кислорода поддерживают на уровне примерно 20%.
4. Способ по п.2, отличающийся тем, что температуру поддерживают на уровне примерно 37°С, а рН поддерживают на уровне примерно 7.
5. Способ по п.4, отличающийся тем, что рН поддерживают путем добавления 29%-ным раствора аммиака.
6. Способ по п.2, отличающийся тем, что среду, применяемую на стадии периодического культивирования с подпиткой, подают со скоростью, определяемой по формуле:
<mrow><mi>M</mi><mi>s</mi><mo stretchy="false">(</mo><mi>t</mi><mo stretchy="false">)</mo><mo>=</mo><mi>F</mi><mo stretchy="false">(</mo><mi>t</mi><mo stretchy="false">)</mo><msub><mi>S</mi><mrow><mi>F</mi><mo stretchy="false">(</mo><mi>t</mi><mo stretchy="false">)</mo></mrow></msub><mo>=</mo><mrow><mo>(</mo><mrow><mfrac><mi>μ</mi><mrow><msub><mi>Y</mi><mrow><mfrac><mi>X</mi><mi>S</mi></mfrac></mrow></msub></mrow></mfrac><mo>+</mo><mi>m</mi></mrow><mo>)</mo></mrow><mi>X</mi><mo stretchy="false">(</mo><msub><mi>t</mi><mn>0</mn></msub><mo stretchy="false">)</mo><mi>V</mi><mo stretchy="false">(</mo><msub><mi>t</mi><mn>0</mn></msub><mo stretchy="false">)</mo><mi>exp</mi><mrow><mo>[</mo><mrow><mi>μ</mi><mrow><mo>(</mo><mrow><mi>t</mi><mo>−</mo><msub><mi>t</mi><mn>0</mn></msub></mrow><mo>)</mo></mrow></mrow><mo>]</mo></mrow></mrow>
,
S
F
0
x/s
-1
где M представляет собой скорость потока источника углерода (г/ч), F - скорость подачи раствора для подпитки (л/ч); S представляет собой концентрацию источника углерода в подпитке (г/л); Х - концентрация клеток (г/л с.м.к.), m - удельный коэффициент поддержания (г/г DCW/ч), V - объем культуры (л); t - время начала подпитки; t - время процесса; µ - удельная скорость роста (ч) и Y - выход клеток па количество источника углерода (г/г).
7. Способ по п.2, отличающийся тем, что выход гепаросана составляет более 12 г/л супернатанта культуры.
8. Способ по п.7, отличающийся тем, что ферментацию проводят в течение менее 48 ч, без учета роста стартовой культуры.
9. Способ по п.1, отличающийся тем, что стадия осуществления связывания и элюирования включает (I) удаление клеток, (II) смешивание анионной смолы с супернатантом культуры и удаление супернатанта, (III) промывку смолы с помощью 50 мМ хлорида натрия в натрий-ацетатном буфере при рН 4, (IV) элюирование 1 М хлорида натрия в натрий-ацетатном буфере при рН 4.
10. Способ по п.1, отличающийся тем, что стадия осуществления связывания и элюирования включает (I) удаление клеток, (II) смешивание раствора хитозана с супернатантом культуры, (III) осаждение хитозана и выделение осадка; (III) промывку хитозана. (IV) элюирование гепаросаиа с помощью примерно 1 М раствора NaOH.
11. Способ по п.1, отличающийся тем, что осаждение гепаросана из элюата включает осаждение с помощью этанола.
12. Способ по п.1, дополнительно включающий депирогенизацию с помощью перекиси водорода.
13. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный гепаросан содержит менее 1% ДНК и менее 2% белка.
14. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный гепаросан имеет среднечисленный молекулярный вес примерно 58000 Да, средневесовой молекулярный вес 84000 Да и индекс полидисперсности (ИПД) примерно 1,4.
15. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный гепаросан является по меньшей мере на 95% чистым.
16. Гепаросан, полученный с помощью способа по любому из пп.1-15.
17. Гепарин, изготовленный из гепаросана по п.16.
18. Применение гепаросана, полученного с помощью способа по любому из пп.1-15.