ПРИМЕНЕНИЕ КАРНОЗОЛА И/ИЛИ РОЗМАНОЛА ДЛЯ ПОВЫШЕНИЯ АКТИВНОСТИ НЕЙРОРЕЦЕПТОРОВ
USE OF CARNOSOL AND ROSMANOL FOR IMPROVING NEURORECEPTOR ACTIVITY

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение касается применения карнозола и розманола в качестве лекарственных веществ для лечения заболеваний, связанных с нарушенной, например, ослабленной передачей нервного сигнала (нервного возбуждения). Кроме того, настоящее изобретение касается пищевых и фармацевтических композиций, содержащих карнозол и/или розманол, и их применения.
Уровень техники
Хорошо известно, что нарушенная передача нервного сигнала, например, при низких уровнях нейротрансмиттеров, связана с психическими заболеваниями, такими как депрессия и генерализованное тревожное расстройство (ГТР), повышенная чувствительность к стрессу и когнитивные нарушения.
Соединения, которые увеличивают уровни нейротрансмиттеров в мозге и, таким образом, усиливают их передачу, могут обладать свойствами антидепрессантов и оказывать благотворное влияние при широком круге других психических расстройств {Neurotransmitters, Drugs and Brain Function R.A. Webster (ed), John Wiley & Sons, New York, 2001, p.187-211, 289-452, 477-498). Главными нейротрансмиттерами являются серотонин, дофамин, норадреналин (или норэпинефрин), ацетилхолин, глутамат и гамма-аминомасляная кислота (ГАМК). Нейротрансмиттерами, которые имеют прямое отношение к расстройствам, связанным с настроением, являются серотонин, норадреналин и дофамин, тогда как передача нервного сигнала с участием глутамата и ацетилхолина вовлечена в когнитивную функцию. Усиленная или пролонгированная нейротрансмиссия достигается путем увеличения концентрации нейротрансмиттера в синаптической щели за счет ингибирования его обратного захвата в пресинаптическое нервное окончание или путем предотвращения катаболизма нейротрансмиттера за счет ингибирования разрушающих его ферментов, таких как моноаминоксидазы (МАО) А и В. Большой интерес также представляют нейропептиды, такие как пептид, кодируемый геном кальцитонина (calcitonin gene-related peptide, CGRP).
Антидепрессанты и расстройства, связанные с настроением (аффективные расстройства)
Трициклические антидепрессанты (ТЦА), такие как имипрамин, амитриптилин и кломипрамин, ингибируют обратный захват серотонина и норадреналина. Они рассматриваются как одни из наиболее эффективных среди доступных антидепрессантов, однако они имеют целый ряд недостатков, поскольку дополнительно взаимодействуют с мускариновыми ацетилхолиновыми, гистаминовыми и серотониновыми рецепторами. Побочные эффекты, являющиеся результатом такого действия, включают сухость во рту, затуманенное зрение, запоры и задержку мочеиспускания, а также артериальную гипотензию. Наиболее важно то, что ТЦА не являются безопасными, так как при передозировке часто наблюдается острая кардиотоксичность.
Другим классом лекарств-антидепрессантов являются так называемые SSRIs (селективные ингибиторы обратного захвата серотонина), включающие флуоксетин, пароксетин, сертралин, циталопрам и флувоксамин, которые блокируют переносчик серотонина (serotonin transporter, SERT) - зависимый от хлорида натрия переносчик нейротрансмиттеров с высоким сродством, который терминирует серотонинергическую передачу нервного сигнала за счет обратного захвата серотонина. Было доказано, что они также эффективны в лечении депрессии и тревожных состояний, как и ТЦА, но обычно лучше переносятся. Эти лекарства обычно назначаются в малых дозах, после чего дозы увеличиваются до достижения терапевтического уровня. Обычным побочным эффектом является тошнота. Другие возможные побочные эффекты включают ухудшение аппетита, сухость во рту, потливость, чувствительность к инфекциям, запор, тремор, зевоту, сонливость и сексуальную дисфункцию.
Кроме того, эффектом антидепрессантов обладают соединения, которые блокируют катаболизм более широкого круга нейротрансмиттеров за счет ингибирования A- и B-MAO. MAO катализирует окисление нейротрансмиттеров, содержащих аминогруппу, таких как серотонин, норадреналин и дофамин.
Более того, модуляторы передачи нервного сигнала могут оказывать плейотропное действие на умственные и когнитивные функции.
Существует потребность в соединениях для профилактики и/или лечения психических заболеваний и/или расстройств, которые не обладают отрицательными побочными эффектами известных антидепрессантов. Многие пациенты заинтересованы в альтернативном лечении, которое могло бы минимизировать побочные эффекты, связанные с высокими дозами принимаемых лекарств, и обеспечивало бы дополнительные клинические преимущества. Тяжелая депрессия представляет собой долговременное, периодически повторяющееся заболевание, которое обычно плохо поддается диагнозу. Более того, многие пациенты страдают от слабой или умеренно тяжелой депрессии. Таким образом, имеется растущий интерес к разработке соединений, а также фармацевтических и/или пищевых композиций, которые могли бы применяться для лечения психических заболеваний/расстройств, таких как депрессия и дистимия, у склонных к таким заболеваниям людей для стабилизации настроения и достижения эмоциональной устойчивости.
Пациенты часто страдают либо от сопутствующих депрессии заболеваний, либо от самого по себе генерализованного тревожного расстройства (ГТР), которое представляет собой крайне распространенное тревожное состояние и хроническую болезнь при первичном обращении за медицинской помощью (-10% пациентов) (Wittchen, et al., 2005 Eur. Neuropsychopharm. 15:357-376). При визите к врачу за первой помощью пациенты описывают свое состояние с помощью разнообразных физических симптомов. ГТР характеризуется хроническим напряженным состоянием, тревожным беспокойством с напряженностью (>6 месяцев), которые мешают работать и не поддаются контролю, и сопровождается характерным синдромом гипервигильности (сверхбдительности), который включает в себя беспокойство, мышечное напряжение и проблемы со сном. При отсутствии лечения ГТР протекает как хроническое, флуктуирующее заболевание и имеет тенденцию принимать с возрастом более тяжелую форму. Пациенты с ГТР страдают от субсиндромной депрессии и вносят самый высокий вклад в общую прямую и непрямую нагрузку на экономику здравоохранения среди всех заболеваний, связанных с тревожностью и депрессией. Несмотря на высокую частоту встречаемости ГТР, только немногим пациентам, страдающим от этого заболевания, ставят правильный диагноз, прописывают лекарства и направляют их к психиатру; поэтому необходимы простые способы для помощи в выявлении таких пациентов и врачебного наблюдения за ними. Несмотря на конкретный диагноз, врачам необходимы эффективные способы лечения симптомов ГТР. SSRIs, такие как пароксетин, являются эффективными в лечении ГТР (Stocchi et al. 2003, J. Clin. Psych, 63(3):250-258). Кроме того, систематические обследования и плацебо-контролируемые рандомизированные клинические испытания показывают, что некоторые SSPJs (эсциталопрам, пароксетин и сертралин), селективный ингибитор обратного захвата норадреналина (SNRI) венлафаксин, некоторые бензодиазепины (апразолам и диазерам), ТЦА имипрамин и частичный агонист 5-HTia буспирон, все являются эффективными при остром лечении. В целом, эффективность лечения часто остается умеренной и, когда период лечения прерывается, симптомы возвращаются. Таким образом, непрерывное длительное лечение или профилактика с применением соединений, которые имеют более слабые побочные эффекты по сравнению с SSRIs и могут приниматься в течение продолжительного времени, может быть предпочтительным по сравнению с лечением с помощью лекарств.
Аффективные расстройства и профессиональный стресс могут приводить к нарушениям сна, бессоннице, плохому качеству сна и общему нарушению циркадных ритмов, так называемых биоритмов, причем такие состояния часто являются хроническими и устойчивыми по своей природе. Кроме того, дисрегуляция циркадных ритмов, индуцируемая дальними рейсами (расстройство биоритмов в связи с перелетом через несколько часовых поясов), и работа в разные смены могут вызывать сходные симптомы и расстройства. Таким образом, наиболее желательным для поддержания нормального циркадного ритма (к которому привыкают люди и животные) и/или для смягчения или профилактики симптомов, связанных с нарушением циркадного ритма, таких как ослабление когнитивной функции и памяти, психическое и физическое утомление, было бы лечение с помощью биологически активных добавок, которые в целом улучшают качество жизни и придают жизненные силы индивидууму, который в этом нуждается.
Головная боль и мигрень
Основными причинами головной боли являются: напряжение, мигрень, чрезмерное напряжение зрения, обезвоживание, низкий уровень сахара в крови и синусит. Головные боли могут классифицироваться как первичные и вторичные головные боли. Первичные головные боли, которые не связаны с какими-либо патологическими изменениями, включают мигрень, связанные с напряжением головные боли и сильные приступообразные головные боли с периодическими рецидивами (cluster headaches). Вторичные головные боли, т.е. такие, которые вызваны патологическим состоянием, включают любую головную боль, происхождение которой связано с инфекцией, неопластическим изменением, сосудами, приемом лекарств, или идиопатические боли. Первичные головные боли, такие как мигрень и сильные приступообразные головные боли с периодическими рецидивами, затрагивают до 20% населения Земли и оказывают существенное влияние на качество жизни. Такие состояния характеризуются повторяющимися односторонними головными болями, сопровождающимися тошнотой, рвотой и светобоязнью.
Во время приступов мигрени нервы ганглия тройничного нерва активируются и выделяют нейропептид CGRP, что приводит к расслаблению гладких мышц сосудов и дегрануляции тучных клеток с последующим высвобождением воспалительных агентов. Происходит сенситизация нейронов тройничного нерва, и возникающая передача болевых сигналов к ЦНС вносит свой вклад в развитие боли, тошноты и светобоязни, связанных с мигренью (см. Durham and Russo (1999), J. NeuroscL, 19 (9), 3423-3429). Таким образом, существует явная связь между головной болью и высвобождением CGRP; было показано, что как мигрень, так и сильные приступообразные головные боли с периодическими рецидивами связаны с повышенными уровнями CGRP в плазме крови, и нормальные уровни восстанавливаются после облегчения боли.
1B/1D
Более того, активация болевого пути тройничного нерва может усиливаться низкой серотонинергической активностью (Hamel (2007), Cephalalgia, 27 (11): 1293-1300), тогда как лечение триптанами (например, суматриптаном), которые активируют рецепторы 5-HT, может облегчать приступы острой мигрени за счет снижения уровней CGRP (Edvinsson, L. et al., 2007, CNS Neurol. Disord. Drug Targets, 6(4): 240-246). Кроме того, было показано, что для лечения мигрени эффективными являются небольшие молекулы антагонистов CGRP, которые не обладают побочными эффектами на сердечно-сосудистую систему (Edvinsson, L., 2007, Expert Opin. Ther. Targets, 11 (9): 1179-88).
Блокирование рецептора CGRP также эффективно для предотвращения и лечения связанных с менопаузой приливов.
Когнитивная способность, способность к обучению и память
Как отмечалось выше, в поддержание и модуляцию настроения, в первую очередь, вовлечены нейротрансмиттерные системы серотонина, норадреналина и дофамина, тогда как ацетилхолин, действуя на никотиновые и мускариновые рецепторы, играет важную роль в когнитивном процессе, включая сознательное понимание, внимание и рабочую память. Известно, что холинергические агонисты улучшают память, тогда как антагонисты, в целом, память ухудшают. Важно, что помимо участия ацетилхолиновой рецепторной системы в нейропсихиатрических заболеваниях, таких как синдром дефицита внимания и гиперактивности, болезни Альцгеймера и Паркинсона, имеются указания на опосредованное никотиновыми рецепторами повышение когнитивных способностей у здоровых, не страдающих психическими расстройствами, людей, тогда как усиленные когнитивные нарушения могут проявляться вслед за совместным введением мускариновых и никотиновых антагонистов. Подобным образом, ингибирование ацетилхолинэстеразы, фермента, метаболизирующего ацетилхолин, может быть эффективно для лечения связанных с болезнью Альцгеймера когнитивных расстройств, а также для улучшения когнитивных проявлений у здоровых субъектов.
Более того, долговременная потенциация - термин, применяемый для обозначения долговременного усиления синаптической передачи, которая (потенциация) рассматривается как один из основных механизмов, с помощью которых память формируется и сохраняется в мозге, в первую очередь включает рецепторный комплекс рецептора N-метил-D-аспартата (NMDA) и рецептора α-амино-3-гидрокси-5-метил-изоксазолпропионовой кислоты (AMPА), которые (рецепторы) оба связывают главный возбуждающий нейротрансмиттер глутамат. Помимо глутамата NMDA-рецепторам требуется ко-агонист глицин, который модулирует функции рецептора. Переносчики глицина (GlyT-1 и -2) играют важную роль в терминации постсинаптических глицинергических эффектов и в поддержании низких внеклеточных концентраций глицина за счет обратного транспорта глицина в пресинаптические нервные окончания или клетки глии.
Таким образом, существует растущий интерес к разработке соединений, а также нутрицевтических композиций, которые могут применяться для улучшения способности к обучению, памяти или бдительности как у пожилых, так и у молодых людей, индивидуумов, которые особенно нуждаются в хорошей памяти и повышенном внимании в их ежедневной работе, включая студентов, рабочих строительных специальностей, водителей транспорта, пилотов, врачей, продавцов, представителей исполнительной власти, домохозяек, «профессионалов высшей квалификации» и людей, которые испытывают психический или ежедневный стресс, а также тех, кто предрасположен к психиатрической нестабильности, такой как шизофрения.
Таким образом, особенно желательными были бы соединения или нутрицевтические композиции, которые усиливают функции NMDA-рецептора, обеспечивая улучшение способности к обучению, памяти или бдительности, в дополнение к усилению активности серотонина, норадреналина и дофамина, обеспечивающей улучшение психического состояния.
Раскрытие изобретения
В соответствии с настоящим изобретением было обнаружено, что карнозол, розманол или их смеси могут применяться в качестве лекарственных средств для лечения расстройств, связанных с ослабленной передачей нервного сигнала.
В другом аспекте настоящее изобретение касается применения эффективного количества карнозола или розманола или любой их смеси для производства композиции для лечения расстройства, связанного с ослабленной передачей нервного сигнала, в частности, для производства антидепрессанта, композиции, улучшающей настроение и придающей энергию, композиции, снимающей стресс, композиции, улучшающей общее состояние, композиции, снижающей тревожность, композиции, снимающей обсессивно-компульсивный (навязчивый) невроз, релаксанта, композиции, улучшающей сон и/или средства против бессонницы и усилителя когнитивных способностей. Более того, такая композиция может также применяться в качестве средства против головной боли и/или мигрени.
В еще одном аспекте настоящее изобретение касается пищевой композиции, содержащей эффективное количество карнозола и/или розманола, а также фармацевтической композиции, содержащей, по меньшей мере, эффективное количество карнозола и/или розманола и обычный фармацевтический носитель.
Более того, настоящее изобретение касается способа для лечения расстройства, связанного с ослабленной передачей нервного сигнала у животных, включая людей, где указанный способ включает введение эффективного количества карнозола и/или розманола животным, включая людей, которые нуждаются в таком лечении.
Животные в контексте настоящего изобретения включают людей и находящихся на их попечении животных, рыб и птиц. Предпочтительные животные представляют собой людей, домашних животных и сельскохозяйственных животных. Примерами домашних и одомашненных животных являются собаки, кошки, птицы, аквариумные рыбки, морские свинки, кролики, зайцы и хорьки. Примерами сельскохозяйственных животных являются рыбы, свиньи, лошади, жвачные животные (коровы, овцы и козы) и домашняя птица.
Краткое описание фигур
Фиг.1 демонстрирует структуру карнозола (соединение с формулой I) и розманола (соединение с формулой II).
Более предпочтительными являются (4aR,9S,10aS)-карнозол и (4aR,9S,10aS)-розманол.
Термин «розманол»/«карнозол» также включает в себя любой материал или растительный экстракт, содержащий это соединение или эти соединения в количестве, по меньшей мере, 30% по массе (например, от 30 до 100% по массе), предпочтительно в количестве, по меньшей мере, 50% по массе (например, от 50 до 100% по массе), более предпочтительно в количестве, по меньшей мере, 70% по массе (например, от 70 до 100% по массе), наиболее предпочтительно в количестве, по меньшей мере, 90% по массе (например, от 90 до 100% по массе), по отношению к общей массе растительного материала или экстракта. Термины «материал из растений» или «растительный материал» применяются в контексте настоящего изобретения для обозначения любой части растения.
Термин «карнозол» обозначает рацематную смесь, а также чистый (4aR,9S,10aS)-карнозол или чистый (4aS,9R,10aR)-карнозол, или любую их смесь или диастереоизомер. Карнозол может быть выделен из растений, включая шалфей, шалфей кустарниковый и розмарин. Таким образом, любой материал или экстракт из этих растений или любой другой растительный материал или экстракт, содержащий карнозол в количестве, по меньшей мере, 30% по массе (например, от 30 до 100% по массе), предпочтительно в количестве, по меньшей мере, 50% по массе (например, от 50 до 100% по массе), более предпочтительно в количестве, по меньшей мере, 70% по массе (например, от 70 до 100% по массе), наиболее предпочтительно в количестве, по меньшей мере, 90% по массе (например, от 90 до 100% по массе), по отношению к общей массе растительного материала или экстракта также охватывается этим термином. «Карнозол» означает как «натуральный» (вьщеленный), так и «синтетический» (полученный искусственным путем) карнозол.
Синтез карнозола описан в нескольких статьях, например, в Tetrahedron 2003, 59(18): 3297-3305.
Термин «розманол» обозначает рацематную смесь, а также чистый (4aR,9S,10aS)-розманол или чистый (4aS,9R,10aR)-розманол, или любую их смесь или диастереоизомер. Розманол может быть выделен из растений, включая шалфей, майоран, розмарин, тимьян (чабрец) и представителей родов Salvia и Lepechinia. Таким образом, любой материал или экстракт из этих растений или любой другой растительный материал или экстракт, содержащий розманол в количестве, по меньшей мере, 30% по массе (например, от 30 до 100% по массе), предпочтительно в количестве, по меньшей мере, 50% по массе (например, от 50 до 100% по массе), более предпочтительно в количестве, по меньшей мере, 70% по массе (например, от 70 до 100% по массе), наиболее предпочтительно в количестве, по меньшей мере, 90% по массе (например, от 90 до 100% по массе), по отношению к общей массе растительного материала или экстракта также охватывается этим термином. «Розманол» означает как «натуральный» (вьщеленный), так и «синтетический» (полученный искусственным путем) розманол.
Синтез розманола описан, например, в J. Nat. Prod. 2002, 65 (7): 986-989.
Карнозол и/или розманол, либо как чистые соединения, либо как компоненты растительного материала или растительного экстракта, могут применяться в пищевых и фармацевтических композициях для лечения нарушений, связанных с ослабленной передачей нервного сигнала.
В контексте настоящего изобретения термин «лечение» также включает сопутствующее (комбинированное) лечение, а также профилактику. Термин «профилактика» может относиться либо к первому проявлению расстройства (первичная профилактика), либо к рецидиву (вторичная профилактика).
Таким образом, настоящее изобретение также направлено на способ для профилактики расстройства, связанного с ослабленной передачей нервного сигнала у животных, включая людей, где указанный способ включает введение эффективного количества карнозола или розманола или любой их смеси животным, включая людей, которые нуждаются в таком лечении. В этом отношении эффективное количество карнозола и/или розманола может в особенности применяться для поддержания хорошего психического состояния, для поддержания устойчивой когнитивной функции, в качестве помощи для снижения риска перепадов настроения (эмоциональной лабильности), в качестве помощи для поддержки хорошего настроения и для поддержки когнитивного здоровья, в качестве помощи для поддержания хорошего качества сна и в качестве помощи для минимизирования симптомов, связанных с головной болью и/или мигренью.
В контексте настоящего изобретения термин «расстройство» также включает в себя заболевание (болезнь).
Лекарства/композиции для лечения расстройств, связанных с ослабленной передачей нервного сигнала, включают в себя антидепрессанты, композиции, улучшающие настроение и придающие энергию, композиции, снимающие стресс, композиции, улучшающие общее состояние, композиции, усиливающие когнитивное состояние, композиции, снижающие тревожность и снимающие обсессивно-компульсивный (навязчивый) невроз, релаксанты, композиции, улучшающие сон и/или средства против бессонницы и средства против головной боли и/или мигрени. Все они улучшают, усиливают и поддерживают передачу нервного сигнала, особенно в центральной нервной системе, и таким образом, смягчают психические расстройства.
Антидепрессанты представляют собой лекарства/композиции для лечения психических, поведенческих и эмоциональных/аффективных, невротических, нейродегенеративных, связанных с потреблением пищи и связанных со стрессом расстройств, таких как униполярная депрессия, биполярная депрессия, острая депрессия, хроническая депрессия, субхроническая депрессия, дистимия (расстройство без видимой причины), послеродовая депрессия, синдром предменструальной дисфории (PMS), климактерические депрессивные симптомы, агрессия, синдром нарушения внимания, расстройства, связанные с социальной тревожностью, сезонные эмоциональные расстройства и тревожности (расстройства), такие как ГТР, синдром фибромиалгии, синдром посттравматического стресса, расстройства панического типа и обсессивно-компульсивные (навязчивые) неврозы, синдром беспокойных ног, нервозность (повышенная возбудимость), мигрень/первичные головные боли и боль в целом, рвота, булимия («волчий» голод), нервно-психическая анорексия, синдром переедания (binge eating disorder), расстройства пищеварения, синдром нервного истощения и раздражительность.
Антидепрессанты также могут применяться для (производства композиций для) первичной и вторичной профилактики и/или лечения ослабления нейрокогнитивной функции. Более того, они также эффективны для лечения симптомов депрессии или других симптомов, связанных с нарушенной передачей нервного сигнала, являющейся результатом хронических заболеваний, таких как инфаркт (инсульт), рак, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и другие.
Карнозол и/или розманол, а также содержащие их (смеси) растительные материалы и экстракты, содержащие их (особенно в количестве, по меньшей мере, 30% по массе, предпочтительно в количестве, по меньшей мере, 50% по массе, более предпочтительно в количестве от 70 до 90% по массе, наиболее предпочтительно в количестве, по меньшей мере, 90% по массе, по отношению к общей массе растительного материала или экстракта), и содержащие их пищевые/фармацевтические композиции являются, таким образом, пригодными для лечения животных, включая людей.
В другом воплощении настоящего изобретения карнозол и/или розманол находят применение как вещества, улучшающие настроение в целом, а также для производства композиций для применения в таком качестве (растительные материалы/экстракты, содержащие их в количестве, по меньшей мере, 70% по массе, предпочтительно в количестве, по меньшей мере, 90% по массе, по отношению к общей массе растительного материала или экстракта; пищевые/фармацевтические композиции). Термины «вещество, улучшающее настроение», «усилитель эмоционального здоровья» или «вещество, придающее энергию» означают, что настроение индивидуума, который их употребил, улучшается, самооценка повышается и/или плохие мысли и/или плохое настроение проходит/проходят. Это также означает, что эмоции приходят в состояние гармонии, и/или что общее, особенно психическое, самочувствие и жизнестойкость улучшаются или поддерживаются на постоянном уровне, а также что риск перепадов настроения (эмоциональной лабильности) (как можно надеяться) снижается и что хорошее настроение (как можно надеяться) сохраняется.
Карнозол или розманол или любая их смесь может также применяться в целом для уменьшения тревожности и/или для снятия обсессивно-компульсивного поведения у животных, включая людей, домашних животных и сельскохозяйственных животных.
Термин «вещество, снижающее тревожность («подавитель тревожности»), означает, что при его приеме хроническое напряжение и тревожные ожидания снижаются или устраняются. Синдром сверхбдительности, который включает возбужденное состояние, мышечное напряжение и проблемы со сном, смягчается или устраняется. Социальные и другие фобии уменьшаются или устраняются. В целом, социальное окружение воспринимается как менее угрожающее. Индивидуум эмоционально расслабляется, ощущает комфорт и получает удовольствие от окружения и общения с другими людьми.
Термин «релаксант», «вещество, улучшающее сон» или «вещество, устраняющее бессонницу» означает, что это вещество улучшает качество сна, помогает индивидууму легко заснуть и сохранять непрерывный сон в течение всей ночи. Это также означает, что корректируются нарушения сна, связанные с циркадным ритмом из-за смены часовых поясов или работы в разные смены, и что устраняются или проходят симптомы, связанные с бессонницей, например ухудшение когнитивной функции и памяти, психическое и физическое утомление, задумчивость, сонливость, и в целом улучшаются качество жизни и жизненная энергия.
Более того, карнозол или розманол, а также композиции, включающие эффективные количества этого вещества (веществ), являются пригодными для лечения, профилактики и облегчения симптомов, связанных со стрессом, для лечения, профилактики и облегчения симптомов, связанных с переутомлением на работе, истощением и/или перенапряжением, для повышения устойчивости или толерантности к стрессу и/или для помощи и способствования расслаблению у нормальных здоровых индивидуумов, то есть такие композиции обладают действием, направленным на «избавление от стресса».
Другое воплощение настоящего изобретения касается применения карнозола и/или розманола и применения композиции, содержащей это вещество (вещества) (растительные материалы/экстракты, содержащие это вещество (вещества) в количестве, по меньшей мере, 70% по массе, предпочтительно в количестве, по меньшей мере, 90% по массе, по отношению к общей массе растительного материала или экстракта; пищевые/фармацевтические композиции), в качестве агента, «улучшающего общее состояние», то есть такого агента, который устраняет раздражительность и усталость, для снижения, профилактики или смягчения физического и психологического утомления и для увеличения уровня энергии в более широком смысле слова, особенно для увеличения продукции энергии в мозге у больных или здоровых индивидуумов. Более того, оно касается применения (композиции) для улучшения когнитивного состояния в целом, то есть в качестве агента, «усиливающего когнитивную функцию», и особенно для поддержания или улучшения внимания, концентрации, памяти и способности к запоминанию, способности к обучению, способности к обработке лингвистической информации, к решению задач и умственной (интеллектуальной) деятельности), для улучшения кратковременной памяти, для усиления живости ума, усиления остроты ума, для снижения умственного (психического) утомления, для поддержания хорошего когнитивного состояния и для поддержания устойчивой когнитивной функции. Кроме того, такие композиции могут применяться в качестве «болеутоляющих средств при головной боли и/или мигрени», то есть для смягчения симптомов, связанных с головной болью и/или мигренью, таких как головная боль, тошнота, нарушение зрения и светобоязнь, а также для регуляции чувства голода и насыщения и для регуляции двигательной активности.
Применение в ветеринарии
Домашние и сельскохозяйственные животные могут находиться в условиях, при которых необходима усиленная или улучшенная передача нервного сигнала, что может быть обеспечено настоящим изобретением. Животные могут проявлять враждебные поведенческие и/или физиологические реакции в стрессовых ситуациях; животные, выращиваемые в условиях массового производства или транспортируемые в неблагоприятных условиях, могут демонстрировать снижение количества и качества мяса и молока; находящаяся в условиях стресса домашняя птица может начать выщипывать перья, снижать количество откладываемых яиц и заниматься каннибализмом. Многие животные могут стать агрессивными и проявлять стереотипное, тревожное и обсессивно-компульсивное поведение в неблагоприятных условиях содержания или транспортировки.
Таким образом, другой аспект настоящего изобретения представляет собой применение в ветеринарии карнозола и/или розманола и композиций, содержащих это вещество (вещества), в качестве пищевых/фармацевтических композиций.
В предпочтительном воплощении настоящего изобретения карнозол и/или розманол или растительные материалы или экстракты, содержащие любое из указанных или оба эти вещества, применяются для профилактики стресса у сельскохозяйственных животных в условиях массового производства сельскохозяйственной продукции, при перевозке на бойни, и/или для предотвращения снижения качества мяса указанных сельскохозяйственных животных при таких обстоятельствах. Сельскохозяйственные животные предпочтительно представляют собой домашнюю птицу, крупный рогатый скот, овец, коз и свиней.
В другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения карнозол и/или розманол или растительные материалы или экстракты, содержащие любое из указанных или оба эти вещества, применяются для профилактики выщипывания перьев и каннибализма у домашней птицы, что приводит, например, к снижению качества мяса и яйценоскости.
Другой аспект настоящего изобретения представляет собой способ для профилактики и/или смягчения стресса в условиях аквакультуры, включающий введение карнозола и/или розманола, или растительных материалов, или экстрактов, содержащих любое из указанных или оба эти вещества, животным, которые в этом нуждаются, где указанные животные представляют собой рыб или креветок.
В другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения карнозол и/или розманол, или растительные материалы, или экстракты, содержащие любое из указанных или оба эти вещества, вводятся домашним животным или животным, содержащимся в качестве домашних животных, для снижения стресса, напряжения и компульсивного поведения, проявляемого в стрессовых условиях, в таких как расставание, смена или потеря хозяина, при разлуке во время праздников (отпусков) и содержании в так называемых «гостиницах для животных», а также при содержании в приютах или местах передержки.
Еще один аспект настоящего изобретения представляет собой способ для профилактики/смягчения симптомов, связанных со стрессовыми условиями для животных, используемых в пушном производстве, предпочтительно норок, лис и кроликов (зайцев).
Предпочтительные дозировки и композиции настоящего изобретения
Для людей подходящая ежедневная доза карнозола и/или розманола или их любой смеси для целей настоящего изобретения может находиться в диапазоне от 0,001 мг на кг веса тела до примерно 20 мг на кг веса тела в день. Более предпочтительной является дневная доза от примерно 0,01 мг на кг веса тела до примерно 10 мг на кг веса тела в день, и особенно предпочтительной является дневная доза от примерно 0,05 мг на кг веса тела до примерно 5,0 мг на кг веса тела в день. Количество растительного материала или растительного экстракта, содержащего либо карнозол, либо розманол, или их смесь, может быть рассчитано в соответствии с указанными выше цифрами.
Термин «пищевые композиции» включает любой тип обогащенной пищи/корма и напитков, включая также лечебное или диетическое питание и биологически активные добавки. Пищевые композиции согласно настоящему изобретению могут дополнительно включать защитные гидроколлоиды, связующие вещества, агенты, формирующие пленки, инкапсулирующие агенты/материалы, материалы, образующие стенку/оболочку, соединения, выступающие в качестве матрицы, покрытия, эмульгаторы, поверхностно активные агенты, солюбилизирующие агенты (масла, жиры, воска, лецитины и т.д.), адсорбенты, носители, наполнители, вспомогательные вещества, диспергирующие агенты, смачивающие агенты, технологические добавки (растворители), агенты, придающие текучесть, агенты, маскирующие вкус, утяжелители, желирующие агенты, гель-формирующие агенты, антиоксиданты и противомикробные вещества.
Помимо фармацевтически приемлемого носителя и, по меньшей мере, либо карнозола, либо розманола фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению может дополнительно содержать обычные фармацевтические добавки и вспомогательные вещества, наполнители или разбавители, ароматизаторы, консерванты, стабилизаторы, эмульгирующие агенты, буферные агенты, смазывающие агенты, красители, смачивающие агенты, наполнители и тому подобное. Вещество-носитель может представлять собой органическое или неорганическое вещество-носитель, пригодное для введения перорально, парентерально или в виде инъекций.
Пищевые и фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению могут находиться в любой форме, пригодной для введения животному, включая человека, особенно в любой форме, которая является стандартной для перорального введения, например в твердой форме, заранее подмешиваемой (как добавка/дополнение) к пищевому продукту или корму, в виде таблеток, пилюль, гранул, драже, капсул и шипучих композиций, таких как порошки или таблетки, или в жидкой форме, такой как растворы, эмульсии или суспензии в виде, например, напитков, паст и масляных суспензий. Пасты могут быть помещены в капсулы с твердыми или мягкими оболочками. Примерами других лекарственных форм являются такие, которые пригодны для трансдермального, парентерального введения и для инъекций. Пищевые и фармацевтические композиции могут готовиться в форме для контролируемого (замедленного) высвобождения.
Примерами обогащенных пищевых продуктов являются зерновые батончики и хлебобулочные изделия, такие как кексы и печенье.
Напитки включают в себя безалкогольные и алкогольные напитки, а также жидкие композиции, которые добавляются в питьевую воду и жидкую пищу. Безалкогольными напитками являются, например, прохладительные напитки, напитки для спортсменов, фруктовые соки, лимонады, различные воды (то есть, напитки на основе воды с низким содержанием калорий), напитки на основе чая и молока. Жидкая пища представляет собой, например, супы и молочные продукты (например, напитки с мюсли).
В твердых порционных композициях для людей карнозол и/или розманол, или любая их смесь присутствует в количестве в диапазоне от примерно 0,1 мг до примерно 1000 мг, предпочтительно в диапазоне от примерно 1 мг до примерно 500 мг на одну порцию.
В пищевых композициях, особенно в продуктах питания и напитках для людей, карнозол и/или розманол или любая их смесь присутствует в количестве в диапазоне от, примерно, 0,0001 (1 мг/кг) до примерно 5% по массе (50 г/кг), предпочтительно в диапазоне от, примерно, 0,001 (10 мг/кг) до, примерно, 1% по массе (10 г/кг), более предпочтительно в диапазоне от, примерно, 0,01 (100 мг/кг) до, примерно, 0,5% по массе (5 г/кг), по отношению к общей массе пищевого продукта или напитка.
В пищевых продуктах и напитках диапазон составляет от 10 до 30 мг на одну порцию, то есть 120 мг на кг пищевого продукта или напитка.
Для животных, включая людей, подходящая дневная доза карнозола или розманола или любой их смеси может находиться в диапазоне от 0,001 мг на кг веса тела до, примерно, 1000 мг на кг веса тела в день. Более предпочтительной является дневная доза от, примерно, 0,1 мг до, примерно, 500 мг на кг веса тела, и особенно предпочтительной является дневная доза от, примерно, 1 мг до 100 мг на кг веса тела.
Настоящее изобретение далее иллюстрируется с помощью приведенных ниже примеров.
Примеры
Карнозол и розманол, применяемые в приведенных ниже экспериментах, были синтезированы химиками из DSM Nutritional Products Ltd., Kaiseraugst, Швейцария. Все соединения имели чистоту >95%.
Действие моноаминных нейротрансмиттеров - серотонина, дофамина и норадреналина, регулируется путем их быстрого обратного захвата и удаления из синаптической щели транспортными белками плазматической мембраны. Переносчики моноаминов в моноаминергических нейронах центральной нервной системы отвечают за удаление до 90% освобожденного нейротрансмиттера и являются мишенями с высоким сродством для большого числа психоактивных агентов, таких как кокаин, амфетамин и антидепрессанты. Эти агенты путем блокирования переносчиков и, как следствие, путем предотвращения обратного нейронального захвата, повышают внеклеточные концентрации нейротрансмиттеров как в центральной, так и в периферической нервных системах, что обеспечивает их влияние на поведение и их автономное действие. Таким образом, ингибирование обратного захвата серотонина, дофамина и норадерналина карнозолом и/или розманолом иллюстрируется следующими далее тремя примерами.
Пример 1. Ингибирование транспорта серотонина карнозолом и розманолом
2
3
Клетки почек эмбриона человека (НЕК-293), стабильно экспрессирующие переносчик серотонина человека, обеспечивающий его обратный захват (hSERT), были получены от R.Blakely, Vanderbilt University, США. Клетки выращивали стандартным способом в модифицированной Дукльбекко среде Игла (Bioconcept), содержащей 10% диализованной фетальной сыворотки теленка (Invitrogen), пенициллин, стрептомицин, L-глутамин и антибиотик G418, и пересевали с помощью обработки трипсином. В день измерения клетки из колб на стадии от 80% конфлуентности собирали путем мягкого промывания теплым фосфатным буфером (PBS). Клетки промывали один раз путем центрифугирования и ресуспендировали в бикарбонатном буфере Кребса-Рингера (Sigma) с добавлением 35 мкМ паргилина, 2,2 мМ CaCl, 1 мМ аскорбиновой кислоты и 5 мМ N-2-гидроксиэтилпиперазин-N'-2-этансульфоновой кислоты (буфер HEPES) до концентрации 10000 клеток в 160 мкл буфера, после чего в круглодонные 96-луночные планшеты (Corning) вносились аликвоты по 10000 клеток на лунку. Транспорт серотонина в клетки измеряли путем добавления радиоактивно-меченого [Н]-серотонина (GE Healthcare) в концентрации 20 нМ и последующей инкубации в течение 40 мин при 37°C при аккуратном встряхивании. После окончания инкубации невключившаяся метка была удалена путем фильтрации через планшеты Unifilter 96 GF7B (Perkin Elmer) с помощью устройства для сбора клеток Tomtec Mach III М. Включившийся в клетки серотонин, оставшийся в лунках планшетов, количественно определяли с помощью жидкостного счетчика радиоактивности Microscint-40/Topcount (Perkin Elmer).
3
50
Влияние карнозола, розманола и вещества сравнения флуоксетина на поглощение серотонина определялось после их введения в разных концентрациях (карнозол и розманол: 0,003-100 мкМ; флуоксетин: 0,03 нМ - 1 мкМ) в среду измерения за 10 мин до добавления и в момент добавления [H]-серотонина. Поглощение серотонина за счет работы переносчика ингибировалось каждым из этих соединений дозо-зависимым способом. Рассчитанные значения IC для ингибирования поглощения серотонина каждым из этих соединений показаны в Таблице 1.
Таблица 1
Ингибирование поглощения серотонина трансфицированными клетками НЕК-293 карнозолом, розманолом и веществом сравнения флуоксетином. Данные представлены как средние значения ±s.e.m. (стандартная ошибка среднего значения) (n=2).
Соединение
IC<sub>50</sub>
Карнозол
26,6±6,9 мкМ
Розманол
23,2±9,7 мкМ
Флуоксетин
5нМ
Пример 2. Ингибирование карнозолом поглощения дофамина
5
3
2
4
Клетки яичников китайского хомячка (CHO)-Kl, экспрессирующие переносчик дофамина человека (hDAT), перед началом измерения помещали в планшеты. Клетки (2×10/мл) инкубировали с карнозолом и/или носителем в модифицированном Tris-HEPES буфере (5 мМ Tris-HCl, 7,5 мМ HEPES, pH 7,1), дополнительно содержащем 120 мМ NaCl, 5,4 мМ КСl, 1,2 мМ CaCl, 1,2 мМ MgSO, 5 мМ D-глюкозы и 1 мМ аскорбиновой кислоты, при 25°C в течение 20 минут перед добавлением 50 нМ [H]-дофамина и в течение 10 минут инкубации с ним. Специфический сигнал был определен в присутствии 10 мкМ номифенсина (ингибитор обратного захвата дофамина). После этого клетки солюбилизировали в буфере для лизиса, содержащем 1% SDS. Снижение поглощения [H]-дофамина на 50 процентов или более (≥50%) по отношению к контрольному соединению указывает на достоверную ингибирующую активность. Карнозол тестировался в десяти концентрациях (0,00316-100 мкМ), номифенсин - в пяти концентрациях (0,001-0,1 мкМ). Такие же концентрации параллельно добавлялись к отдельным группам клеток для определения возможной цитотоксичности, индуцируемой этими соединениями, только в том случае, если наблюдалось достоверное ингибирование транспорта.
Таблица 2
Измеренные значения IC<sub>50 </sub>для ингибирования обратного захвата дофамина в трансфицированные клетки CHO-Ki карнозолом и веществом сравнения номифенсином
Соединение
IC<sub>50</sub>
Карнозол
10,3 мкМ
Номифенсин
0,0104 мкМ
Пример 3. Ингибирование карнозолом поглощения норадреналина
5
3
3
3
2
4
Клетки почек собаки Madin Darby (MDCK), стабильно экспрессирующие переносчик норадреналина человека (hNAT), вносили в планшеты за один день до эксперимента. Клетки (2×10/мл) преинкубировали с карнозолом и/или носителем в модифицированном буфере Tris-HEPES (5 мМ Tris-HCl, 7,5 мМ HEPES, pH 7,1), дополнительно содержащем 120 мМ NaCl, 5,4 мМ КС1, 1,2 мМ CaCl, 1,2 мМ MgSO, 5 мМ D-глюкозы и 1 мМ аскорбиновой кислоты, при 25°C в течение 20 минут, после чего было добавлено 25 нМ [H]-норадреналина для 10-минутной инкубации. После этого клетки в каждой лунке планшета промывались 2 раза, солюбилизировались в буфере для лизиса, содержащем 1% SDS, и лизат анализировался для определения поглощения [H]-норадреналина. Специфический сигнал определяли в присутствии 10 мкМ десипрамина (трициклический антидепрессант, который ингибирует обратный захват норадреналина). Снижение поглощения [H]-норадерналина на 50 процентов или более (≥50%) по отношению к контрольному соединению указывает на достоверную ингибирующую активность. Карнозол тестировался в десяти концентрациях (0,00316-100 мкМ), десипрамин - в пяти концентрациях (0,5-50 нМ). Такие же концентрации параллельно добавлялись к отдельным группам клеток для определения возможной цитотоксичности, индуцируемой этими соединениями, только в том случае, если наблюдалось достоверное ингибирование транспорта.
Таблица 3
Измеренные IC<sub>50</sub> для ингибирования карнозолом и веществом сравнения, десипрамином, обратного захвата норадреналина трансфицированными клетками MDCK
Соединение
IC<sub>50</sub>
Карнозол
30,6 мкМ
Десипрамин
1,93 нМ
Пример 4. Ингибирование карнозолом и розманолом моноаминоксидазы
2
2
В качестве субстратов для ферментов моноаминоксидазы A (MAO-A) и B (MAO-B) были использованы органические амины n-тирамин или бензиламин, соответственно. Образующаяся в этой реакции HO была количественно определена в реакции с ванилиновой кислотой, катализируемой пероксидазой хрена (HRP).
Реакции проводили при 37°C в полистирольных планшетах для микротитрования. Ферменты МАО (конечная концентрация 2 Ед/мл) смешивались соответственно либо с п-тирамином (Sigma, конечная концентрация 0,5 мМ), либо с бензиламином (Sigma, конечная концентрация 0,5 мМ), и с хромогенным раствором (содержащим ванилиновую кислоту (Fluka), 4-аминоантипирин (Fluka) и пероксидазу хрена (Sigma), конечные концентрации 0,25 мМ, 0,125 мМ и 1 Ед/мл соответственно) в 0,2 М калий-фосфатном буфере, pH 7,6. После 40 мин инкубации планшеты анализировались в приборе для измерения поглощения в планшетах для микротитрования, например Spectramax М5 (Molecular Devices Corporation), при 495 нм.
2
2
50
Влияние карнозола и розманола на ферменты моноаминоксидазы определялось после их введения в среду для измерения в диапазоне концентраций от 0,03 до 100 мкМ за 10 минут до начала и во время инкубации с субстратом. Для определения влияния соединений на катализируемую пероксидазой часть реакции, фермент МАО был заменен на HO (Molecular Probes, конечная концентрация 50 мкМ). Обе катализируемые NAO-A и MAO-B реакции ингибировались карнозолом и розманолом дозо-зависимым образом, тогда как контрольная реакция не ингибировалась. Измеренные значения IC для ингибирования активности моноаминоксидазы карнозолом и розманолом приведены в Таблице 4.
Таблица 4
Ингибирование МАО-А и МАО-В карнозолом и розманолом. Данные представлены как среднее значение ±s.e.m. (стандартная ошибка среднего значения)
Соединение
MAO-A(IX<sub>50</sub>)
MAO-B(IC<sub>50</sub>)
Карнозол
4,0±0,1 мкМ (n=3)
106,5±19,9 мкМ (n=2)
Розманол
3,02±0,48 мкМ (n=3)
73,3±11,3 мкМ (n=2).
Пример 5. Ингибирование карнозолом и розманолом переносчика глицина 1
2
2
Клетки СНО, стабильно экспрессируюгцие кДНК переносчика глицина lb человека (GlyTl), выращивали стандартным способом в модифицированной Дульбекко среде Игла (Invitrogen, Carlsbad, США), содержащей 10% диализованной фетальной сыворотки теленка, пенициллин, стрептомицин, пролин и антибиотик G418. Клетки собирали с помощью обработки трипсином за один день до проведения измерения, и среда заменялась на буфер для измерения поглощения, содержащий 150 мМ NaCl, 1 мМ CaCl, 2,5 мМ KCl, 2,5 мМ MgCl, 10 мМ глюкозы и 10 мМ N-2-гидроксиэтилпиперазин-N'-2-этансульфоновой кислоты (буфер HEPES).
3
Поглощение глицина клетками определяли после добавления 60 нМ радиоактивно меченого [H]-глицина (Amersham Biosciences GE Healthcare, Slough, Великобритания) и их инкубации в течение 30 минут при комнатной температуре. После удаления невключившейся метки путем аккуратного трехкратного промывания буфером указанного выше состава, включившийся в клетки глицин количественно измеряли в жидкостном счетчике радиоактивности.
Поглощение глицина через переносчик GlyTl ингибировалось при добавлении карнозола (0,00316-100 мкМ) дозо-зависимым способом. Однако в этих опытах розманол был неактивен. Соединения саркозин, ORG24598 и ALX5407 (все от Sigma, St. Louis, США) применялись в качестве известных ингибиторов GlyTl. Измеренные значения IC50 для ингибирования поглощения глицина и соответствующие кривые доза-ответ представлены в Таблице 5 и на Фиг.2 соответственно.
Таблица 5
Измеренные значения IC<sub>50</sub> для ингибирования карнозолом, розманолом, саркозином, ORG24598 и ALX5407 поглощения глицина клетками СНО
Вещество
IC<sub>50</sub> для поглощения меченого тритием глицина
Карнозол
29,33 мкМ
Розманол
неактивен
Саркозин
35,9 мкМ
ORG24598
0,02 мкМ
ALX5407
6,46 нМ
Пример 6. Влияние карнозола и розманола на долговременную потенциацию (LTP) в культурах срезов гиппокампа
2
4
2
2
4
4
2
3
Семидневные крысы линии Вистар обезглавливались с помощью гильотины. Менее чем за 1 минуту вскрывался череп, извлекались полушария головного мозга, выделялись оба гиппокампа, которые переносились в ледяной буфер, содержащий 137 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 0,85 мМ NaHPO, 1,5 мМ CaCl, 0,66 мМ KHPO, 0,28 мМ MgSO, 1 мМ MgCl, 2,7 мМ NaHCO, 1 мМ кинуреновой кислоты и 0,6% D-глюкозы.
2
Поперечные срезы гиппокампа (400 мкм) получали с помощью микротома с вибрирующим лезвием (VT1200S; Leica Microsystems (Schweiz) AG, Heerbrugg, Швейцария) в буфере того же состава. Срезы гиппокампа были по одному помещены на мембранные вставки (Millicell Culture Plate Inserts, 0,4 мкм) и культивировались при 35°C, 5% CO, 95% влажности в среде, содержащей смесь сред ВМЕ и MEM в соотношении 1:1 (обе среды от Invitrogen), содержащей 25% инактивированной нагреванием лошадиной сыворотки, 1 × GlutaMAX, 1 × пенициллин/стрептомицин, 0,6% глюкозы и 1 мМ кинуреновой кислоты (Stoppini, Buchs and Muller (1991), J. Neurosci. Methods, 37 (2), 173-82).
2
Через 48 часов культивирования синаптические NMDA-рецепторы были активированы путем добавления карнозола или розманола в течение 15 мин в присутствии 140 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 1,3 мМ CaCl, 25 мМ HEPES (рН 7,3), 33 мМ D-глюкозы и 0,02 мМ йодметилата бикукулина. В качестве позитивных контролей обычно применялись саркозин (100 мкМ) и ALX5407 (20 нМ). Дополнительный положительный контроль включал добавление 200 мкМ глицина к сестринским культурам. После обработки срезы промывались и фиксировались для иммуногистохимического анализа. Были количественно определены маркеры повышенной синаптической активности, обычно ассоциированные с долговременной потенциацией, представляющие собой ex vivo модель обучения и памяти (см. ниже Таблицу 6).
Таблица 6
Относительная активация синаптических маркеров после обработки карнозолом и розманолом по сравнению с сестринскими культурами, обработанными буфером. Активации любого из этих маркеров (или их комбинации) наблюдается в классических экспериментах LTP.
Вещество
pCREB
рМАРК
GIuRl
Карнозол
±
++
608%
Розманол
±
+
320%
++++ показывает качественно максимальную активацию, ++ и + обозначают полумаксимальную и умеренную активацию соответственно, тогда как ± показывает отсутствие изменений в иммунореактивности; для GluRl значения представлены в процентах от контрольных значений.
Обработка культур гиппокампа карнозолом и розманолом индуцирует один или более биохимический маркер, типичный для LTP (pCREB: активированная форма чувствительного к цАМФ связывающего белка (cAMP response element binding protein); рМАРК: активированная форма митоген-активированной протеинкиназы; GluRl: глутаматный AMP А рецептор 1, присутствующий на клеточной поверхности).
Пример 7. Ингибирование карнозолом рецептора CGRP
CGRP представляет собой сильный сосудорасширяющий агент в сосудах головного мозга, который вовлечен в патогенез связанной с мигренью головной боли. Рецептор CGRP особенно широко представлен в тройничной сосудистой сети - сети внутричерепных сосудов, ассоциированных с сенсорными нейронами тройничного ганглия. Активация тройничных сенсорных нейронов и высвобождение CGRP является эффективным средством при профилактике и лечении мигрени, головной боли и связанных с менопаузой приливов.
Влияние карнозола на участок связывания агонистов рецептора пептида, кодируемого геном кальцитонина человека (hCGRP), в трансфицированных клетках СНО исследовалось с помощью анализа связывания радиолигандов по адаптированному способу Aiyar et al. (1996, J. Biol. Chem., 271: 11325-11329).
125
2
Вкратце: мембранные гомогенаты (10 мг белка) инкубировались в течение 90 мин при 22°C в присутствии 0,03 нМ [I]h-CGRPα в отсутствие или в присутствии карнозола (10 мкМ) в буфере, содержащем 50 мМ HEPES-NaOH (pH 7,4), 10 мМ MgCl, 4 мМ KCl, 10 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1 мкМ фосфорамидона, 0,3% БСА и 0,04% бацитрацина. Неспецифическое связывание определяли в присутствии 1 мкМ h-CGRPα. После инкубации образцы быстро фильтровали под вакуумом через фильтры из стекловолокна (GF/B, Packard), предварительно промытые 0,3% полиэтиленимином (PEI), и промывали несколько раз ледяным 50 мМ Tris-HCl с помощью 96-луночного устройства для сбора клеток (Unifilter, Packard). Фильтры высушивали, после чего измеряли их радиоактивность в жидкостном счетчике радиоактивности (Topcount, Packard) с применением сцинтилляционной смеси (Microscint 0, Packard). Результаты выражены в процентах ингибирования специфического связывания контрольного радиолиганда. В качестве стандартного соединения для сравнения применялся h-CGRPα, природный агонист рецептора hCGRP.
Связывание с рецептором hCGRP значительно ингибировалось (на 54%) в присутствии 10 мкМ карнозола. Таким образом, карнозол может применяться для профилактики и лечения мигрени, головной боли и связанных с менопаузой приливов.
Пример 8. Ингибирование карнозолом ацетилхолинэстеразы
Основная роль ацетилхолинэстеразы заключается в терминации передачи нервного сигнала в холинергических синапсах путем быстрого гидролиза ацетилхолина. Ингибирование этого ключевого фермента рассматривается в качестве полезной стратегии для лечения когнитивных дисфункций и нарушений памяти.
2
4
2
4
4
2
4
50
Влияние карнозола на активность рекомбинантной ацетилхолинэстеразы человека было определено путем измерения образования 5-тио-2-нитробензойной кислоты из ацетил-6-метилтиохолина (AMTCh) согласно модифицированному способу Ellman et а1. (1961, Biochem. Pharmacol, 7: 88-90). Вкратце: карнозол (10 мкМ) вещество сравнения или вода (контроль) были добавлены в буфер, содержащий 200 мМ NaHPO/NaHPO (pH 8,0), 5 мг/мл (NH)SO, 0,4 мМ DTNB и 5 Ед фермента. Ферментативная реакция начиналась путем добавления субстрата AMTCh в концентрации 50 мкМ. Поглощение измеряли сразу после добавления субстрата (t=0) при λ=405 нм с помощью устройства для работы с микропланшетами (MRX, Dynatech или Ultra, Тесаn). Эти измерения применялись для определения влияния любых соединений на спектрофотометрическое измерение при данной длине волны. Через 30 мин инкубации при 37°C (t=30) проводили второе измерение поглощение при λ=405 нм. Активность фермента рассчитывали путем вычитания сигнала, измеренного при t=0, из значения, измеренного при t=30. Результаты были выражены как процент ингибирования контрольной активности фермента. В качестве стандартного вещества-ингибитора применялся неостигмин, который в каждом эксперименте был взят в нескольких концентрациях для получения кривой ингибирования, из которой рассчитывалось значение IC.
Активность ацетилхолинэстеразы значительно ингибировалась (на 53%) в присутствии 10 мкМ карнозола. Таким образом, карнозол показал себя эффективным ингибитором ацетилхолинэстеразы, и может быть полезен для профилактики или лечения умеренных когнитивных нарушений и потери памяти.
Пример 9. Плавательный тест Порсолта
Принудительный плавательный тест (Forced Swim Test, FST) был впервые предложен в 1977 году для скрининга соединений, обладающих антидепрессантной активностью, в опытах на крысах (Porsolt et al., 1977 Nature, 266: 730-732) и позднее был модифицирован для работы с мышами (Porsolt et al., 1977 Arch. Int. Pharmacodynamiе, 229: 327-336). С помощью этого теста было продемонстрировано «поведенческое отчаяние», когда вынужденные плавать в цилиндре с водой, из которого невозможно спастись, крысы или мыши сначала демонстрировали отчаянную, направленную на спасение, активность, но, в конечном счете, совершали только минимальные движения, необходимые для удержания головы над поверхностью воды. Было показано, что данный тест был чувствителен к большому числу веществ, обладающих терапевтической активностью против депрессии, некоторые из которых ранее не проявляли активности в имеющихся поведенческих моделях.
В двух отдельных экспериментах мыши тестировались после внутрибрюшинного или перорального введения карнозола. Мыши индивидуально помещались в цилиндр с водой (22°C), из которого они не могли вылезти. Мыши выдерживались в воде в течение 6 минут, при этом измерялось время неподвижного состояния в течение последних 4 минут. В каждой группе тестировалось от десяти до пятнадцати мышей. Карнозол вводился в дозах 3, 10, 30 мг/кг веса тела (внутрибрюшинно, за 30 мин перед началом теста) или 200, 400, 600 мг/кг веса тела (перорально, за 24, 5 и 1 час перед началом тестирования), данные сравнивались с контрольной группрй, получавшей только носитель. В качестве вещества сравнения применялся имипрамин (32 мг/кг внутрибрюшинно или перорально соответственно), который вводился в тех же экспериментальных условиях.
Таблица 7
Влияние карнозола и имипрамина в принудительном плавательном тесте (FST) на мышах после внутрибрюшинного (-30 мин) или перорального (-24, -5, -1 час) введения. Длительность неподвижного состояния показана как % изменения по сравнению с контролем, где NS=недостоверно, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 (согласно t-критерию Стьюдента)
Дозировка
Длительность неподвижности (% изменения от контроля)
карнозол
3 мг/кг
внутрибрюшинно, -30 мин
-26%
**
карнозол
10 мг/кг
внутрибрюшинно, -30 мин
-21%
*
карнозол
30 мг/кг
внутрибрюшинно, -30 мин
-18%
*
имипрамин
32 мг/кг
внутрибрюшинно, -30 мин
-80%
***
карнозол
200 мг/кг
перорально, -24, -5, -1 час
-9%
NS
карнозол
400 мг/кг
перорально, -24, -5, -1 час
-53%
**
карнозол
600 мг/кг
перорально, -24, -5,-1 час
-3%
NS
имипрамин
32 мг/кг
перорально, -24, -5, -1 час
-48%
**
Таким образом, после внутрибрюшинного введения все протестированные дозировки карнозола в тесте FST достоверно снижали время неподвижности, тогда как после перорального введения только промежуточная доза (400 мг/кг) достоверно снижала неподвижность. Таким образом, эти данные показывают, что карнозол обладает антидепрессант-подобной активностью.
Пример 10. Тест закапывания стеклянных шариков (Marble burying test)
Поведение «защитного (оборонительного) закапывания» демонстрируют крысы, закапывающие опасные объекты, такие как поилки, заполненные жидкостью с неприятным вкусом (Wilkie et al., 1979 J. Exp. Anal. Behav. 31:299-306.), или электроды, ударяющие током (Pinel et al. J. Сотр. Phys. Psych 92:708-712). Тест с закапыванием стеклянных шариков был разработан как модификация теста на такое поведение (Poling et al., 1981. J. Expl. Anal. Behav. 35:31-44). Крысы помещались в индивидуальные клетки, каждая из которых содержала 25 шариков, ежедневно в течение 10 или 21 следующих один за другим дней. Подсчитывалось количество закопанных шариков в каждый из дней 10-дневного периода или через 24 часа после экспозиции на 21 день. Авторы сообщают, что закапывание шариков не связано с их необычностью и не определяется каким-либо неприятным стимулом.
Сообщается, что у мышей поведение с закапыванием шариков является чувствительным к ряду малых (например, диазепаму) и больших (например, галоперидолу) транквилизаторов (Broekkamp et al., 1986 Eur. J. Pharm., 126:223-229), a также к SSRIs (например, флувоксамину, флуорсетину, циталопраму), трициклическим антидепрессантам (например, имипрамину, десипрамину) и селективным ингибиторам транспорта норадреналина (например, ребоксетину) в дозах, которые не обладают седативным действием. Модель может отражать либо тревожное, либо обсессивно-компульсивное поведение (см. De Boer et al., 2003 Eur. J. Pharm. 463: 145-161).
Применяемый здесь тест основан на тесте, описанном в работе Broekkamp et al. (1986). Мыши (n=15 в каждой группе) помещались по одной в прозрачные пластиковые клетки (33×21×18 см) со слоем опилок на полу толщиной 5 см и 25 стеклянными шариками (диаметр 1 см) в центре клетки. Вторая перевернутая клетка использовалась в качестве крышки. Количество шариков, закопанных в опилки (по меньшей мере, на две трети), подсчитывалось через 30 мин, в течение которых продолжался тест. Тестирование проводили исследователи, не знакомые с протоколом введения лекарств (слепой тест).
Перед тестированием все клетки для испытаний и шарики были «импрегнированны» путем помещения в каждую клетку на 15 мин 10 мышей, которые не использовались в данном тесте.
Карнозол (3, 10 и 30 мг/кг) и розманол (10, 30 и 100 мг/кг) вводили внутрибрюшинно за 30 мин перед началом теста, и проводили сравнение с контрольной группой, получавшей только носитель. Флуоксетин (32 мг/кг), вводимый в тех же экспериментальных условиях, был взят в качестве вещества сравнения.
Таблица 8
Влияние карнозола, розманола и флуоксетина в тесте на мышах с закапыванием стеклянных шариков. Поведение с закапыванием (то есть, количество шариков, по меньшей мере, на две трети покрытых опилками) показано как % изменения по сравнению с контролем, где NS=недостоверно, **р<0,01, ***р<0,001 (согласно t-критерию Стьюдента).
Дозировка (внутрибрюшинно, -30 мин)
Количество закопанных шариков (% изменения по сравнению с контролем)
карнозол
3 мг/кг
-12%
NS
карнозол
10 мг/кг
-10%
NS
карнозол
30 мг/кг
-41%
**
розманол
10 мг/кг
-21%
NS
розманол
30 мг/кг
-12%
NS
розманол
100 мг/кг
-55%
***
флуоксетин
32 мг/кг
-92%
***
Самые высокие из протестированных дозы карнозола (30 мг/кг) и розманола (100 мг/кг) однозначно и достоверно снижали поведение с закапыванием шариков подобно тому, как это наблюдалось при применении SSRI флуоксетина, что говорит о седативной (анксиолитической) активности обоих соединений.
Пример 11. Влияние карнозола в Тесте Четырех Площадок (Four Plates Test)
Данный тест, который позволяет выявить анксиолитическую активность, построен на основе способа, описанного в работе Aron et al. (1971, Neuropharmacology, 10:459-469). Анксиолитики (бензодиазепины) повышают количество наказываемых перемещений (перемещений, за которыми следует наказание). Животные помещались по одному в белый пластиковый контейнер, пол которого состоял из четырех металлических пластинок, связанных с генератором электрического тока (Apelex: type 011346). Каждую мышь оставляли на 15 секунд для свободного обследования контейнера. После этого, каждый раз, когда мышь перемещалась с одной пластинки на другую, она получала слабый электрический удар (2,5 мА, 1,5 сек). Количество наказываемых перемещений подсчитывалось за 1 минуту, в течение которой продолжался тест. В каждой исследуемой группе было по 15 животных. Тест проводили вслепую.
Исследовались 3 дозировки карнозола (200, 400, 600 мг/кг), которые вводились перорально за 24 часа, 5 часов и 1 час до начала теста; сравнение проводили с контрольной группой, получавшей только носитель (кукурузное масло).
В качестве вещества сравнения применялся клобазам (32 мг/кг перорально), который вводили за 1 час перед проведением теста. В этой группе мыши дополнительно получали носитель за 24 часа и 5 часов до начала теста для того, чтобы поддержать чистоту эксперимента.
Таблица 9
Влияние карнозола на мышей в Тесте Четырех Площадок. Количество наказываемых перемещений показано как среднее значение±s.e.m. (стандартная ошибка среднего значения) и как % изменения по сравнению с контролем, где NS=недостоверно, * p<0,05 and ***p <0,001 (t-критерий Стьюдента)
Дозировка (мг/кг) перорально -24 ч и -5 ч
Дозировка (мг/кг) перорально -1 ч
Количество наказываемых перемещений
среднее ±s.e.m.
p-значение
% изменения по сравнению с контролем
Носитель
Носитель
2,8
±
0,2
-
-
Карнозол (200)
Карнозол (200)
3,5
±
0,3
NS
0,0713
+25%
Карнозол (400)
Карнозол (400)
3,7
±
0,3
*
0,0196
+32%
Карнозол (600)
Карнозол (600)
3,1
±
0,4
NS
0,4406
+11%
Носитель
Клобазам (32)
6,1
±
0,5
***
<0,0001
+118%
Карнозол (200, 400 и 600 мг/кг) в целом увеличивал количество наказываемых перемещений по сравнению контролем (носителем) (+25%, +32% и +11% соответственно), достоверно в дозировке 400 мг/кг (р<0.05). Эти данные говорят о том, что карнозол обладает слабой, но достоверной анксиолитической активностью при дозировке 400 мг/кг перорально.
Пример 12. Приготовление мягких желатиновых капсул
Были получены мягкие желатиновые капсулы, включающие следующие ингредиенты:
Ингредиент
Количество на капсулу
Карнозол или Розманол
200 мг
Лецитин
50 мг
Соевое масло
250 мг
Взрослые люди могут принимать две капсулы ежедневно для лечения умеренной хронической дистимии.
Пример 13. Приготовление мягких желатиновых капсул
Были получены мягкие желатиновые капсулы, включающие следующие ингредиенты:
Ингредиент
Количество на капсулу
Карнозол
100 мг
Розманол
100 мг
Масло энотеры
300 мг
Витамин B<sub>6</sub>
100 мг
Необходимо принимать по одной капсуле в день, предпочтительно во второй половине менструального цикла, в течение 14 дней для лечения предменструального синдрома и предменструального дисфорического расстройства.
Пример 14. Приготовление таблеток
Были получены таблетки, включающие следующие ингредиенты:
Ингредиент
Количество на таблетку
Карнозол или Розманол
100 мг
Стандартизованный экстракт пассифлоры
150 мг
Экстракт зеленого чая, например, TEAVIGO от DSM Nutritional Products, Kaiseraugst, Швейцария
150 мг
Для хорошего общего самочувствия, энергетического подъема и ослабления стресса принимать по одной таблетке два раза в день в течение 3 месяцев.
Пример 15. Приготовление быстрорастворимого ароматизированного безалкогольного напитка
Ингредиент
Количество [г]
Карнозол или Розманол
0,9
Сахароза, тонкомолотый порошок
922,7
Аскорбиновая кислота, тонкомолотый порошок
2,0
Лимонная кислота, безводный порошок
55,0
Лимонный ароматизатор
8,0
Тринатриевая соль лимонной кислоты, безводный порошок
6,0
Трикальцийфосфат
5,0
β-Каротин 1% CWS от DNP AG, Kaiseraugst, Швейцария
0,4
Общее количество
1000
Все ингредиенты смешиваются и просеиваются через сито с размером ячейки 500 мкм. Полученный порошок помещается в подходящую емкость и перемешивается в трубчатом смесителе (блендере) в течение, по меньшей мере, 20 минут. Для получения напитка к 125 г полученного перемешанного порошка добавляется достаточное количество воды, чтобы приготовить до одного литра напитка.
Готовый к употреблению напиток содержит примерно 30 мг карнозола или розманола на одну порцию (250 мл). В качестве общеукрепляющего средства и для хорошего самочувствия следует выпивать две порции в день (240 мл).
Пример 16. Приготовление обогащенного не выпеченного зернового батончика
Ингредиент
Количество [г]
Карнозол или Розманол
0,95
Сахар
114,55
Вода
54,0
Соль
1,5
Глюкозный сироп
130,0
Инвертный сахарный сироп
95,0
Сироп сорбита
35,0
Пальмоядровое масло
60,0
Кулинарный жир
40,0
Лецитин
1,5
Твердое пальмовое масло
2,5
Сушеные яблоки
63,0
Кукурузные хлопья
100,0
Рисовые хлопья
120,0
Пшеничные хлопья
90,0
Жареный лесной орех
40,0
Сухое обезжиренное молоко
45,0
Яблочный ароматизатор 74863-33
2,0
Лимонная кислота
5,0
Общее количество
1000
Карнозол или розманол смешиваются с обезжиренным сухим молоком и помещаются в вальцовый смеситель. Добавляются кукурузные хлопья и рисовые хлопья и все аккуратно перемешивается. После этого добавляются сушеные резаные яблоки. В первой кастрюле смешиваются сахар, вода и соль в количествах, указанных выше (раствор 1). Во второй кастрюле смешиваются глюкоза, инвертный сахарный сироп и сироп сорбита в количествах, указанных выше (раствор 2). Смесь из кулинарного жира, косточкового пальмового масла, лецитина и эмульгатора представляет собой жировую фазу. Раствор 1 нагревается до 110°C. Раствор 2 нагревается до 113°C, после чего охлаждается в бане с холодной водой. После этого растворы 1 и 2 объединяются. Жировая фаза расплавляется при 75°C на водяной бане. Жировая фаза добавляется к объединенной смеси растворов 1 и 2. К смеси сахаров и жиров добавляется яблочный ароматизатор и лимонная кислота. Жидкая масса прибавляется к сухим ингредиентам и все хорошо перемешивается в вальцовом смесителе. Масса выкладывается на мраморное блюдо и раскатывается до желаемой толщины. Масса охлаждается до комнатной температуры и разрезается на куски. Не выпеченный зерновой батончик содержит примерно 25 мг карнозола или розманола на одну порцию (30 г). Для хорошего самочувствия и в качестве общеукрепляющего средства следует съедать 1-2 зерновых батончика в день.