СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ РЕЦЕССИВНЫХ ФАКТОРОВ НАСЛЕДСТВЕННОЙ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ К РАКУ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
METHOD FOR IDENTIFYING RECESSIVE FACTORS OF GENETIC PREDISPOSITION TO BREAST CANCER

Изобретение относится к области медицины, в частности к молекулярной онкологии, молекулярной медицинской генетике, молекулярной диагностике, и может быть использовано для выявления факторов наследственной предрасположенности к раку молочной железы (РМЖ).
Известен способ выявления факторов наследственной предрасположенности к раку молочной железы, включающий выявление новых мутаций в высокопенетрантных генах РМЖ (BRCA1, BRCA2, CHEK2, PALB2, BRIP1 и др.) путем прямого секвенирования кодирующей последовательности генов-кандидатов (Blay P, Santamaría I, Pitiot AS, Luque M, Alvarado MG, Lastra A, Fernández Y, Paredes A, Freije JM, Balbín M. Mutational analysis of BRCA1 and BRCA2 in hereditary breast and ovarian cancer families from Asturias (Northern Spain). BMC Cancer. 2013 May 17; 13:243).
Известен способ выявления факторов наследственной предрасположенности к РМЖ, включающий детекцию повторяющихся мутаций BRCA1, BRCA2, NBS1, CHEK2 5382insC, BRCA1 185delAG, BRCA2 6174delT с помощью ПЦР (Sokolenko АР, Rozanov ME, Mitiushkina NV, Sherina NY, Iyevleva AG, Chekmariova EV, Buslov KG, Shilov ES, Togo AV, Bit-Sava EM, Voskresenskiy DA, Chagunava OL, Devilee P, Cornelisse C, Semiglazov VF, Imyanitov EN. Founder mutations in early-onset, familial and bilateral breast cancer patients from Russia. Fam Cancer. 2007; 6(3):281-6).
Известен способ выявления факторов наследственной предрасположенности к РМЖ, включающий анализ родословных и поиск наследственных мутаций в семейных случаях. (Walsh Т, Casadei S, Coats KH, Swisher E, Stray SM, Higgins J, Roach KC, Mandell J, Lee MK, Ciernikova S, Foretova L, Soucek P, King MC. Spectrum of mutations in BRCA1, BRCA2, CHEK2, and TP53 in families at high risk of breast cancer. JAMA. 2006 Mar 22; 295(12):1379-88).
Известные гены наследственного РМЖ - BRCA1, BRCA2, CHEK2, NBS1, PALB2 и т.д. - отвечают менее чем за 20% случаев семейной агрегации заболевания. Несмотря на все усилия, большая часть случаев врожденной высокой предрасположенности к РМЖ до сих пор не имеет объяснения. Интересно, что все описанные на сегодняшний день гены наследственного РМЖ являются доминантными, до сих пор не удалось открыть ни одного рецессивного гена, опосредующего высокий риск РМЖ.
Применяемые в настоящее время методики выявления наследственной предрасположенности к РМЖ оказались неэффективными в плане поиска рецессивных раковых генов. Все дело в том, что большинство известных раковых мутаций были открыты либо путем анализа передачи аллелей в семьях с множественными случаями онкологической патологии, либо посредством генетического тестирования больных с семейной историей. Мы полагаем, что предпочтительное использование больных с семейной историей полностью оправдано при поиске доминантных мутаций, ассоциированных с наследственным раком, однако случаи заболевания, связанные с наличием рецессивных мутаций в гомозиготном состоянии, при таком подходе могут быть легко упущены. Напротив, пациенты с множественными новообразованиями представляют из себя выборку, значительно обогащенную наследственными случаями, обусловленными в равной степени как доминантными, так и рецессивными генами предрасположенности.
Известен способ выявления факторов генетической предрасположенности к РМЖ, включающий секвенирование всей кодирующей части генома пациентов с семейным РМЖ с помощью метода массивного параллельного секвенирования (NGS - "Next Generation Sequencing") (Walsh T, Lee MK, Casadei S, Thornton AM, Stray SM, Pennil C, Nord AS, Mandell JB, Swisher EM, King MC. Detection of inherited mutations for breast and ovarian cancer using genomic capture and massively parallel sequencing. Proc Nati Acad Sci USA. 2010 Jul 13; 107(28):12629-33.). Этот способ принят авторами за прототип.
Недостатком прототипа является выборочный анализ только семейных случаев, что практически исключает возможность обнаружить рецессивные раковые гены.
Техническим результатом изобретения является возможность выявления рецессивных генов РМЖ за счет принципиально нового подхода к исследованию, уменьшение времени и стоимости экспериментов.
Указанный технический результат достигается тем, что в способе выявления факторов наследственной предрасположенности к РМЖ, включающем регистрацию генетических маркеров путем массивного параллельного секвенирования с последующим отбором и детальным анализом только вредоносных мутаций среди больных РМЖ, согласно изобретению, для выявления рецессивных факторов наследственной предрасположенности к РМЖ в исследование включают больных, имеющих в анамнезе ранний возраст начала заболевания, первично-множественный рак и не имеющих в семье родственников, больных РМЖ или раком яичников, при этом анализируют только те мутации, которые присутствуют в гомозиготном состоянии.
а
Проведенные расчеты доказывают, что если рецессивный аллель  имеет частоту в популяции 0.1 и пенетрантность, равную 100%, то только у небольшой категории пациентов, составляющей менее 0,2%, может быть зарегистрирована семейная история.
Для проверки наших расчетов мы исследовали частоту потенциально значимой гомозиготной мутации c.2515_2519delAAGTT в гене GEN1 в группах больных билатеральным раком молочной железы (БРМЖ), монолатеральным РМЖ и здоровых женщин. Оказалось, что в выборке пациентов БРМЖ частота гомозигот по исследуемой мутации действительно превышает таковую в выборке здоровых контролей (11/360 (3.1%) vs. 18/1305 (1.4%); отношение шансов (OR)=2.25 (1.02-4.75); p=0.031). В подтверждение приведенных выше соображений, все пациенты с биаллельными мутациями c.2515_2519delAAGTT оказались в группе без признаков вертикальной передачи предрасположенности к РМЖ. Интересно, что, как и в случае с БРМЖ, так и в случае монолатерального РМЖ, биаллельные мутации GEN1 встречались только у тех пациенток, матери которых не страдали данным заболеванием. При объединении данных по монолатеральному и билатеральному РМЖ, ассоциация между гомозиготностью по аллелю c.2515_2519delAAGTT и отсутствием РМЖ у матери достигла порога статистической значимости (тест Мантеля-Ханзеля, p=0.041).
По результатам метода массивного параллельного секвенирования (NGS) в дальнейшее рассмотрение следует принимать только мутации, чье влияние на функцию гена, несомненно - сдвиги «рамки считывания», нонсенс-мутации, повреждения сплайс-сайтов и т.д. При этом из полученного списка мутаций должны быть удалены те варианты, которые уже присутствуют в базе данных полиморфизмов.
Валидация частоты обнаруженных вредоносных наследственных мутаций (c.2515_2519delAAGTT) в группах РМЖ высокого риска из популяции Северо-Запада России с выраженным «эффектом основателя» позволит прогнозировать наследственную предрасположенность к РМЖ в данной популяции.
Таким образом, проведенное исследование подтверждает изобретательский уровень изобретения и дает основание утверждать, что включение в исследование пациентов с первично-множественными опухолями, ранним возрастом начала заболевания и отсутствием в семье родственников, больных РМЖ или раком яичников, позволяет выявить рецессивные факторы наследственной предрасположенности к раку молочной железы.
Способ осуществляют следующим образом.
Материал для исследования: ДНК лейкоцитов периферической крови, полученной от тестируемых лиц, выделяют стандартным соль-хлороформным методом.
Коллекция образцов ДНК для исследования: не менее 25 женщин с билатеральным РМЖ. Для дальнейшего исследования должны быть выбраны образцы ДНК, которые не содержат известные РМЖ-ассоциированные мутации (в генах BRCA1, BRCA2, CHEK2, NBS1, BLM, PALB2, RAD50, BRIP1, ATM, TP53, BLM).
Используют следующие методы исследования.
1. Секвенирование генома человека с использованием_технологии NGS на платформе Illumina MiSeq System: не менее 50 образцов проб биологического происхождения, полученных от пациентов, и не менее 2 контрольных образцов с охватом не менее 5% генома с покрытием кратностью ×6 или выше.
На основании результатов секвенирования для дальнейших исследований должны быть выбраны только те мутации, чье влияние на функцию гена представляется несомненным, - сдвиги «рамки считывания», нонсенс-мутации, повреждения сплайс-сайтов и т.д. При этом из полученного списка мутаций должны быть удалены те варианты, которые уже присутствуют в базе данных полиморфизмов.
Все представляющие интерес мутации должны пройти процедуру верификации посредством стандартного секвенирования исходных образцов ДНК. В результате сортировки, фильтрации и ранжирования обнаруженных мутаций, а также секвенирования исходных образцов ДНК, должно быть обнаружено примерно 200 представляющих интерес гетерозиготных и гомозиготных мутаций.
2. Молекулярно-эпидемиологическое исследование. Частоту гетерозиготных мутаций оценивают на панели, состоящей из 190 образцов «семейных» РМЖ. Частота гомозиготных мутаций может быть установлена на аналогичной выборке, состоящей из билатеральных РМЖ. Дальнейшее молекулярно-эпидемиологическое исследование проводят на выборке из 200 образцов ДНК здоровых женщин. В дальнейшее исследование должны быть включены только те мутации, которые продемонстрируют нулевую (или значительно меньшую по сравнению с группой РМЖ) встречаемость в контролях. Должно быть проведено генотипирование всех оставшихся случаев РМЖ (не менее 2000 штук) и всех доступных здоровых контролей (не менее 2000 образцов ДНК от здоровых женщин среднего возраста и не менее 1000 пожилых (>75 лет) онкологически-здоровых женщин).
3. Фенотипическая и молекулярно-генетическая характеристика опухолей, ассоциированных с новыми мутациями. Те гены, которые будут расценены как причастные к возникновению наследственных раков по результатам молекулярно-эпидемиологического исследования, должны быть подвергнуты дальнейшим экспериментам уточняющего характера, а именно:
а) анализ фенотипических характеристик опухолей с мутациями (TNM-статус, гистологический тип, степень дифференцировки, экспрессия рецепторов ER, PR и HER2, и т.д.);
б) анализ соматического статуса вовлеченного гена, в частности, тест на «потерю гетерозиготности» (утрату оставшегося (нормального) аллеля);
При необходимости, в отношении наиболее интересных генов должно быть выполнено секвенирование всей кодирующей последовательности на расширенной панели (100-200 случаев) РМЖ высокого риска.
Предлагаемое изобретение позволяет выявить новый класс генов предрасположенности к РМЖ - рецессивные гены РМЖ. Это в свою очередь поможет выявить здоровых лиц с высокой предрасположенностью к развитию данной онкологической патологии, а также оптимизировать терапевтические подходы к лечению больных носителей мутаций, нуждающихся в особых, отличных от «спорадических» случаев, схемах лечебных воздействий. Способ позволяет сократить время и стоимость экспериментов.