СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЛКОВ В РАСТЕНИЯХ
METHODS OF OBTAINING PROTEINS IN PLANTS

Настоящее изобретение относится к способам транзиентной экспрессии целевых белков, в особенности фармацевтически ценных белков, в растениях.
Крупномасштабное производство рекомбинантных белков является важной областью применения трансгенных растений. Хотя для производства рекомбинантных белков может успешно применяться множество растений, немногие системы обладают потенциалом для продукции существенных количеств рекомбинантного белка в течение короткого периода времени.
Транзиентная экспрессия генов в клетках растений была разработана в качестве быстрого способа получения небольших количеств данного белка и для тестирования генетических конструкций. Способы транзиентной продукции белка в клетке растения включают, например, доставку на частицах с помощью генной пушки молекулы нуклеиновой кислоты, которая включает ген, кодирующий нужный белок в экспрессируемой форме, агробактериальную доставку бинарного вектора, включающего экспрессируемый ген, электропорацию протопластов и полиэтиленгликоль-опосредованную доставку "голой" ДНК в растительные протопласты.
Бомбардировка частицами обычно достигает лишь нескольких клеток, при этом ДНК должна достичь ядра клетки для того, чтобы проходила транскрипция, и, таким образом, не слишком эффективна для транзиентной экспрессии.
Использование агробактерии, доставляемой путем инфильтрации (агроинфильтрации), может обеспечивать доставку чужеродных генов в значительно более высокое количество клеток. Оригинальная система агробактериальной инфильтрации для транзиентной экспрессии была описана Kapila et al., Plant Sci. 122:101-108 (1997) и была разработана для быстрой проверки функциональности белка, представляющегося полезным для устойчивости растительной ткани к болезням. Для такого применения белок не нужно очищать или анализировать, поскольку вся ткань растения может использоваться в биоанализе. Такую систему позже использовали для экспрессии фармацевтически важных белков (Vaquero et al., Mol. Biotechnol. 5:209-21 (1996)). Впрочем, продуктивность такой системы была относительно низкой.
В WO 99/48355 раскрыт способ генетической трансформации растений, включающий этапы (a) погружения ткани растения в среду, включающую инфекционный трансформирующий вектор, например, агробактериальный; (b) уменьшения давления на указанную ткань до -10 - -100 кПа по манометру; (c) поддержания указанного давления в течение 10-60 минут, и (d) повышения указанного давления до атмосферного давления или выше, где трансформирующий вектор обеспечивает селекцию для проведения отбора растительных клеток или тканей, в которых трансформирующий вектор интегрирован в геном указанных растительных тканей или клеток. Также описано, что растительный материал может быть подвергнут чередующимся циклам пониженного и избыточного давления, где давление, как указано, должно находиться в диапазоне 10-500 кПа (0,1-5 бар).
В EP 1662002 раскрыты способы агробактериальной генной трансдукции и трансформации, включающие получение растительного материала, заражение растительного материала агробактерией, несущей вектор, содержащий нужный трансген. Следующая часть способа заключается в воздействии на растительный материал повышенного давления в ходе процесса получения растительного материала, или до получения, но перед заражением агробактерией.
В WO 01/12828 описано устройство, которое включает вакуумную камеру, приспособление для создания вакуума и соединитель между приспособлением для создания вакуума и вакуумной камерой, и дополнительно приспособление для закрепления или удерживания растения в вакуумной камере.
Существует потребность в системах и способах, которые могут производить существенное количество рекомбинантного белка в коммерческом масштабе в течение короткого периода времени, такого как, например, субъединичные вакцины для предотвращения пандемических вспышек или появления болезней.
В настоящем изобретении предложены приспособления и способы, удовлетворяющие такую потребность. В частности, настоящее изобретение обеспечивает в одном варианте осуществления способ получения гетерологичного целевого пептида или белка, включающий:
(i) контакт целого растения, в частности целого и интактного растения или части целого и интактного растения, или множества целых и интактных растений, или множества частей целых и интактных растений, с клетками Agrobacterium, суспендированными в жидкости, где клетки агробактерии включают экспрессируемую, в частности, экспрессируемую растениями, конструкцию, кодирующую гетерологичный целевой пептид или белок;
(ii) обработку указанного растения или части растения, или множества растений или частей растений и клеток Agrobacterium в одном или более циклах давления, в результате чего клетки Agrobacterium инфильтрируют в целое растение или часть растения, и
где экспрессируемая конструкция выбрана для обеспечения транзиентной экспрессии гетерологичного целевого пептида или белка, и по меньшей мере один из циклов давления включает повышение давления относительно атмосферного давления.
В некоторых вариантах осуществления изобретения растения обрабатывают в одном или более циклах давления, которые включают повышение давления относительно атмосферного давления.
В определенном варианте осуществления давление в каждом цикле поддерживают в течение периода продолжительностью 0,5-60 секунд.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает способ инфильтрации агробактерии в растение или часть растения, или множество растений или частей растений, включающий:
(i) контакт целого растения, в частности целого и интактного растения или части целого и интактного растения, или множества целых и интактных растений, или множества частей целых и интактных растений, с клетками агробактерии, суспендированными в жидкости;
(ii) обработку указанного растения или части растения, или множества растений или частей растений и клеток Agrobacterium в одном или более циклах давления,
где экспрессируемая конструкция выбрана для обеспечения транзиентной экспрессии гетерологичного целевого пептида или белка, и по меньшей мере один из циклов давления включает увеличение давления относительно атмосферного давления.
В некоторых вариантах осуществления изобретения растения обрабатывают в одном или более циклах давления, которые включают увеличение давления относительно атмосферного давления.
В определенном варианте осуществления давление в каждом цикле поддерживают в течение периода продолжительность 0,5-60 секунд.
В одном варианте осуществления изобретения целое растение, в частности, целое и интактное растение или часть целого и интактного растения, или множество целых и интактных растений или частей целых и интактных растений, и клетки Agrobacterium обрабатывают в одном или более циклах давления в закрытой системе, в частности системе, включающей в себя камеру, предназначенную для помещения в нее целого растения, в частности, целого и интактного растения или части целого и интактного растения, и приспособление для регулируемого повышения давления воздуха и/или текучей среды в камере.
В одном варианте осуществления изобретения камера имеет такую конфигурацию, что все растение, включая его наземные и подземные части, погружено в инфильтрационную среду, содержащую клетки Agrobacterium, и подвергнуто воздействию давления, приложенного в ходе одного или более циклов давления.
В другом варианте осуществления изобретения камера имеет такую конфигурацию, что только все или часть наземных частей растения погружены в инфильтрационную среду, содержащую клетки Agrobacterium, но при этом все растение, включая наземные части, а также подземные части растения, подвергнуто воздействию давления, приложенного в ходе одного или более циклов давления.
В еще одном варианте осуществления изобретения камера имеет такую конфигурацию, что все или часть наземных частей растения погружены в инфильтрационную среду, содержащую клетки Agrobacterium, и подвергнуты воздействию давления в одном или более циклах давления, тогда как подземные части растения, в частности корень растения, расположены вне камеры таким образом, что они не погружены в инфильтрационную среду, содержащую клетки Agrobacterium, и не подвергнуты воздействию давления, приложенного в ходе одного или более циклов давления.
В одном варианте осуществления изобретения производят обработку давлением, включающую один или более циклов давления, целого и интактного растения или части целого и интактного растения, при этом указанное растение или часть растения находится в контакте с клетками Agrobacterium в суспензии бактериальных клеток.
В одном варианте осуществления изобретения суспензия клеток Agrobacterium включает OD600 по меньшей мере 1,0, в частности по меньшей мере 1,5, в частности по меньшей мере 2,0, в частности по меньшей мере 2,5, в частности по меньшей мере 3,0, в частности по меньшей мере 3,5, в частности по меньшей мере 4,0, в частности по меньшей мере 4,5.
В одном варианте осуществления изобретения по меньшей мере один из циклов давления включает обработку целого растения, в частности целого и интактного растения или части целого и интактного растения, или множества целых и интактных растений или частей целых и интактных растений, давлением, которое повышено относительно атмосферного давления, в частности, целое и интактное растение или часть целого и интактного растения подвергают воздействию давления по меньшей мере 0,5 бар, в частности по меньшей мере 1,0 бар, в частности по меньшей мере 1,5 бар, в частности по меньшей мере 2,0 бар, в частности по меньшей мере 2,5 бар, в частности по меньшей мере 3,0 бар, в частности по меньшей мере 3,5 бар, в частности по меньшей мере 4,0 бар, в частности по меньшей мере 4,5 бар, в частности по меньшей мере 5,0 бар, в частности по меньшей мере 5,5 бар, в частности по меньшей мере 6,0 бар, в частности по меньшей мере 7,0 бар, в частности по меньшей мере 8,0 бар, в частности по меньшей мере 9,0 бар, в частности по меньшей мере 10,0 бар, в частности по меньшей мере 11,0 бар и в частности по меньшей мере 12,0 бар.
Оптимальное давление, которое обеспечивает максимальную инфильтрацию бактериальной суспензии в растение или часть растения, не вызывая повреждения растения, может изменяться в зависимости от вида растения и, в пределах данного вида растения, также от сорта, используемого в способе инфильтрации. Оптимальные условия режима давления могут быть легко определены специалистом, квалифицированным в данной области, с применением тестовой системы, описанной в Примерах ниже.
В одном варианте осуществления изобретения этап обработки целого растения, в частности целого и интактного растения или части целого и интактного растения, или множества целых и интактных растений, или частей целых и интактных растений, включает по меньшей мере 2 цикла, в частности по меньшей мере 3 цикла, в частности по меньшей мере 4 цикла, в частности по меньшей мере 5 циклов, в частности по меньшей мере 6 циклов, в частности по меньшей мере 7 циклов, в частности по меньшей мере 8 циклов, в частности по меньшей мере 9 циклов, в частности по меньшей мере 10 циклов, в частности по меньшей мере 11 циклов, где по меньшей мере один из указанных циклов или, в определенном варианте осуществления, все указанные циклы включают давление по меньшей мере 0,5 бар, в частности по меньшей мере 1,0 бар, в частности по меньшей мере 1,5 бар, в частности по меньшей мере 2,0 бар, в частности по меньшей мере 2,5 бар, в частности по меньшей мере 3,0 бар, в частности по меньшей мере 3,5 бар, в частности по меньшей мере 4,0 бар, в частности по меньшей мере 4,5 бар, в частности по меньшей мере 5,0 бар, в частности по меньшей мере 5,5 бар, в частности по меньшей мере 6,0 бар, в течение по меньшей мере 0,1 секунды/цикл, в частности в течение по меньшей мере 0,2 секунды/цикл, в частности в течение по меньшей мере 0,3 секунды/цикл, в частности в течение по меньшей мере 0,4 секунды/цикл, в частности в течение по меньшей мере 0,5 секунды/цикл, в частности в течение по меньшей мере 1 секунды/цикл, в частности в течение по меньшей мере 1,5 секунды/цикл, в частности в течение по меньшей мере 2,0 секунды/цикл, в частности в течение по меньшей мере 2,5 секунды/цикл, в частности в течение по меньшей мере 3,0 секунды/цикл, в частности в течение по меньшей мере 3,5 секунды/цикл, в частности в течение по меньшей мере 5,0 секунды/цикл.
В одном варианте осуществления изобретения этап обработки целого растения или множества целых растений, или части растения, или множества частей растения включает по меньшей мере 2 цикла.
В одном варианте осуществления изобретения этап обработки целого растения или множества целых растений, или части растения, или множества частей растения включает по меньшей мере 4 цикла.
В одном варианте осуществления изобретения этап обработки целого растения или множества целых растений, или части растения, или множества частей растения включает по меньшей мере 5 циклов.
В одном варианте осуществления изобретения этап обработки целого растения или множества целых растений, или части растения или множества частей растения включает по меньшей мере 6 циклов.
В одном варианте осуществления изобретения этап обработки целого растения или множества целых растений, или части растения, или множества частей растения включает по меньшей мере 7 циклов.
В одном варианте осуществления изобретения этап обработки целого растения или множества целых растений, или части растения, или множества частей растения включает по меньшей мере 8 циклов.
В одном варианте осуществления изобретения по меньшей мере один из циклов давления включает обработку целого растения или множества целых растений, или части растения, или множества частей растения давлением по меньшей мере 2,5 бар.
В одном варианте осуществления изобретения по меньшей мере один из циклов давления включает обработку целого растения или множества целых растений, или части растения, или множества частей растения давлением по меньшей мере 3,5 бар.
В одном варианте осуществления изобретения по меньшей мере один из циклов давления включает обработку целого растения или множества целых растений, или части растения, или множества частей растения давлением по меньшей мере 4,5 бар.
В одном варианте осуществления изобретения по меньшей мере один из циклов давления включает обработку целого растения или множества целых растений, или части растения, или множества частей растения давлением по меньшей мере 6 бар.
В одном варианте осуществления изобретения по меньшей мере один из циклов давления включает обработку целого растения или множества целых растений, или части растения, или множества частей растения давлением по меньшей мере 8 бар.
В одном варианте осуществления изобретения по меньшей мере один из циклов давления включает обработку целого растения или множества целых растений, или части растения, или множества частей растения давлением по меньшей мере 12 бар.
В одном варианте осуществления изобретения давление приложено в течение от 0,5 секунды/цикл до 10 секунд/цикл.
В одном варианте осуществления изобретения давление приложено в течение от 1 секунды/цикл до 5 секунд/цикл.
В одном варианте осуществления изобретения давление приложено в течение от 0,5 секунды/цикл до 1 секунды/цикл.
В одном варианте осуществления изобретения этап обработки целого растения, в частности, целого и интактного растения или части целого и интактного растения, или множества целых и интактных растений, или частей целых и интактных растений, давлением, которое повышено относительно атмосферного давления, включает по меньшей мере 5 циклов при давлении по меньшей мере 3,0 бар, в течение по меньшей мере 0,5 секунды/цикл.
В одном варианте осуществления изобретения этап обработки целого растения, в частности, целого и интактного растения или части целого и интактного растения, или множества целых и интактных растений, или частей целых и интактных растений, давлением, которое повышено относительно атмосферного давления, включает по меньшей мере 8 циклов при давлении по меньшей мере 4,5 бар, в течение по меньшей мере 1 секунды/цикл.
В одном варианте осуществления изобретения этап обработки целого растения, в частности, целого и интактного растения или части целого и интактного растения, или множества целых и интактных растений, или частей целых и интактных растений, давлением, которое повышено относительно атмосферного давления, включает по меньшей мере 1 цикл при давлении по меньшей мере 8,0 бар, в течение по меньшей мере 0,5 секунды/цикл.
В одном варианте осуществления изобретения этап обработки целого растения, в частности, целого и интактного растения или части целого и интактного растения, или множества целых и интактных растений, или частей целых и интактных растений, давлением, которое повышено относительно атмосферного давления, включает по меньшей мере 2 цикла при давлении по меньшей мере 6,0 бар, в течение по меньшей мере 0,5 секунды/цикл.
В одном варианте осуществления изобретения этап контакта целого растения, в частности, целого и интактного растения или части целого и интактного растения, или множества целых и интактных растений, или частей целых и интактных растений, с клетками Agrobacterium включает: (i) погружение растения или его части в суспензию клеток Agrobacterium, где суспензия включает OD600 по меньшей мере 1,0, в частности по меньшей мере 1,5, в частности по меньшей мере 2,0, в частности по меньшей мере 2,5, в частности по меньшей мере 3,0, в частности по меньшей мере 3,5, в частности по меньшей мере 4,0, в частности по меньшей мере 4,5; (ii) контакт растения или его части с аэрозолем, полученным при использовании суспензии клеток Agrobacterium, включающей OD600 по меньшей мере 1,0, в частности по меньшей мере 1,5, в частности по меньшей мере 2,0, в частности по меньшей мере 2,5, в частности по меньшей мере 3,0, в частности по меньшей мере 3,5, в частности по меньшей мере 4,0, в частности по меньшей мере 4,5.
В одном варианте осуществления изобретения растение является видом Nicotiana, в частности видом Nicotiana tabacum, на стадии развития 8, 9 или 10.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения предложена система для инфильтрации агробактерии в целое растение, в частности, целое и интактное растение или часть целого и интактного растения, или множество целых и интактных растений, или частей целых и интактных растений, и/или для получения гетерологичного пептида или белка, включающая камеру, предназначенную для помещения в нее целого растения, в частности целого и интактного растения или части растения, и приспособление, предназначенное для регулируемого повышения давления воздуха и/или текучей среды в камере.
В одном варианте осуществления изобретения система включает в себя компрессор и редуктор давления.
В одном варианте осуществления изобретения система включает в себя множество впускных отверстий, выпускных отверстий и трубопроводов для создания линии потока текучей среды между внутренним и внешним пространством камеры, где поток текучей среды регулируется.
В одном варианте осуществления изобретения камера включает, во внутреннем пространстве, множество форсунок, которые имеют размеры, позволяющие разбрызгивать или распылять жидкость.
В одном варианте осуществления изобретения камера имеет такую конфигурацию, что все растение, включая его наземные и подземные части, погружено в инфильтрационную среду, содержащую клетки Agrobacterium, и подвергнуто воздействию давления, приложенного в ходе одного или более циклов давления.
В одном варианте осуществления изобретения камера имеет такую конфигурацию, что только все или часть наземных частей растения погружены в инфильтрационную среду, содержащую клетки Agrobacterium, но при этом все растение, включая наземные части, а также подземные части растения, подвергнуто воздействию давления, приложенного в ходе одного или более циклов давления.
В одном варианте осуществления изобретения камера имеет такую конфигурацию, что все или часть наземных частей растения погружены в инфильтрационную среду, содержащую клетки Agrobacterium, и подвергнуты воздействию давления в одном или более циклах давления, тогда как подземные части растения, в частности корень растения, расположены вне камеры таким образом, что они не погружены в инфильтрационную среду, содержащую клетки Agrobacterium, и не подвергнуты воздействию давления, приложенного в ходе одного или более циклов давления.
В одном варианте осуществления изобретения камера включает одно или более отверстий, обеспечивающих проход наземных частей растений в ходе установки или извлечения, где по краям отверстий расположено эластичное уплотнение, в частности, эластичное пневматическое или гидравлическое уплотнение.
В одном варианте осуществления изобретение относится к применению системы согласно изобретению и как описано в настоящей заявке для инфильтрации бактерий Agrobacterium в целое растение, в частности целое и интактное растение или часть растения, и/или для получения гетерологичного пептида или белка.
Определения
Технические термины и выражения, используемые в рамках настоящей заявки, как правило, имеют такое значение, которое обычно относится к ним в релевантной области биологии растений.
Все следующие определения терминов относятся к полному содержанию настоящей заявки. Слово "включающий" не исключает другие элементы или этапы, а употребление единственного числа в оригинальном тексте описания не исключает множество. Один этап может выполнять функции нескольких признаков, указанных в формуле изобретения. Термины "по существу", "около", "приблизительно" и т.п. в сочетании с показателем или значением, в частности, также точно определяют показатель или точно определяют значение, соответственно. Термин "приблизительно" в контексте данного числового значения или диапазона относится к значению или диапазону, который составляет в пределах 20%, в пределах 10%, в пределах 5% или в пределах 2% от приведенного значения или диапазона.
"Растение", используемое в рамках настоящего изобретения, относится к интактному растению, по существу интактному растению, или к множеству интактных или по существу интактных растений; целому растению, по существу целому растению или множеству целых, или по существу целых растений, и к их потомству, на любой стадии их развития. В рамках настоящей заявки интактное растение, как понимают, относится к растению, включающему по существу интактную и замкнутую сосудистую систему, которая не демонстрирует выхода жидкости из сосудов вследствие повреждений.
"Часть растения", используемая в рамках настоящего изобретения, относится к любой части растения, включая черенки, органу растения, ткани растения или клетке растения, где такая часть растения может быть отдельной частью растения или частью целого и интактного растения.
"Часть целого и интактного растения", как подразумевается, относится к такой части растения, которая, даже при ее инфильтрации отдельно от остальной части растения, представляется функциональным компонентом растения с сосудистой системой, которая остается полностью интегрированной в интактную и замкнутую сосудистую систему интактного растения.
"Клетка растения", используемая в рамках настоящего изобретения, относится к структурной и физиологической единице растения, включая пыльцу, семяпочки и зиготы. Клетка растения может быть в форме протопласта без клеточной стенки, одной выделенной клетки, культивируемой клетки или клетки как части более высокоорганизованной единицы, такой как, помимо прочего, ткань растения, орган растения или целое растение, включая целое и интактное растение.
"Ткань растения", используемая в настоящем описании, означает множество клеток растения, которые организованы в структурные или функциональные единицы. Она включает любую ткань растения in planta или в культуре.
"Орган растения", используемый в настоящем описании, относится к отдельной или дифференцированной части растения, такой как, помимо прочего, корень, стебель, лист, цветок, часть цветка, бутон, зародыши, семена или плоды. Он включает любой орган растения in planta или в культуре.
"Растительный материал", используемый в рамках настоящего изобретения, относится к любой твердой, жидкой или газообразной композиции или их комбинации, включающей, помимо прочего, секреты или экстракты, получаемые из растения, его тканей и органов, in planta или в культуре, включая листья, стебли, корни, цветки или части цветков, плоды, пыльцу, семяпочки, зиготы, семена, черенки и любые другие части растения.
"Культура клеток растения", используемая в рамках настоящего изобретения, охватывает культуры клеток растений, такие как, помимо прочих, протопласты, клетки культуры клеток, клетки в культивируемых тканях растений, клетки в эксплантах и культуры пыльцы.
"Растение табака", используемое в рамках настоящего изобретения, относится к растению вида, относящегося к роду Nicotiana, включая, помимо прочих, Nicotiana tabacum (или N. tabacum). Некоторые варианты осуществления изобретения описаны в настоящей заявке с использованием термина "растение табака", без указания Nicotiana tabacum, при этом следует считать, что такие описания прямо включают Nicotiana tabacum.
Термин "полинуклеотид" используется в настоящем описании для обозначения полимера нуклеотидов, которые могут быть немодифицированной или модифицированной дезоксирибонуклеиновой кислотой (ДНК) или рибонуклеиновой кислотой (РНК). Таким образом, полинуклеотид может без ограничения являться геномной ДНК, комплементарной ДНК (кДНК), мРНК или антисмысловой РНК. Кроме того, полинуклеотид может являться однонитевой или двунитевой ДНК, ДНК, которая является смесью однонитевых и двунитевых областей, гибридной молекулой, включающей ДНК и РНК, или гибридной молекулой со смесью однонитевых и двунитевых областей. Кроме того, полинуклеотид может состоять из тринитевых областей, включающих ДНК, РНК, или и то, и другое. Полинуклеотид может содержать одно или более модифицированных оснований, таких как фосфотиоаты, и может быть пептидонуклеиновой кислотой (ПНК). Как правило, полинуклеотиды, предложенные в настоящем изобретении, могут быть собраны из выделенных или клонированных фрагментов кДНК, геномной ДНК, олигонуклеотидов или одиночных нуклеотидов, или комбинаций предыдущего.
Термин "нуклеотидная последовательность" относится к базовой последовательности полимера нуклеотидов, включая, помимо прочего, рибонуклеотиды и дезоксирибонуклеотиды.
Термин "последовательность гена", используемая в настоящем описании, относится к нуклеотидной последовательности молекулы нуклеиновой кислоты или полинуклеотиду, который кодирует полипептид или биологически активную РНК, и охватывает нуклеотидную последовательность неполной кодирующей последовательности, которая кодирует только фрагмент белка. Последовательность гена также может включать последовательности, обладающие регуляторной функцией в отношении экспрессии гена, которые расположены перед или после кодирующей последовательности, а также интронные последовательности гена.
Термин "промотор" относится к нуклеотидной последовательности на 5'-конце гена, которая направляет инициацию транскрипции гена. Как правило, промоторные последовательности необходимы, но не всегда достаточны для направления экспрессии гена, с которым они функционально связаны. При дизайне экспрессируемой генной конструкции, ген помещают в достаточной близости и в подходящей ориентации относительно промотора, при этом промоторная последовательность управляет экспрессией гена. Промотор располагается предпочтительно перед геном и на некотором расстоянии от сайта начала транскрипции, которое приблизительно равно расстоянию между промотором и геном, который он регулирует в своем естественном окружении. Как известно из уровня техники, некоторое изменение данного расстояния допускается без потери функции промотора. Используемый в настоящем описании термин "функционально связанный" означает, что промотор связан с кодирующей областью таким образом, что транскрипцию указанной кодирующей области контролирует и регулирует данный промотор. Способы функционального связывания промотора с кодирующей областью известны в уровне техники.
Используемая в настоящем описании "последовательность регуляции экспрессии" включает промотор и может включать, без ограничения: одну или более энхансерных последовательностей, последовательности терминации транскрипции, последовательности полиаденилирования, 3'- или 5'-нетранслируемые последовательности, интронные последовательности, сайты связывания рибосомы и другие последовательности, которые могут стабилизировать или иным образом регулировать экспрессию гена в клетке растения. Последовательности регуляции экспрессии могут быть эндогенными (то есть, присутствующими в растении-хозяине в естественных условиях) или экзогенными (не присутствующими в растении-хозяине в естественных условиях). Экзогенные последовательности регуляции экспрессии могут быть или могут не быть последовательностями растения, при условии, что они функциональны в растительной клетке при выбранных условиях.
"Гетерологичный ген" или "гетерологичная кодирующая последовательность" относятся к гену или кодирующей последовательности, которая является экзогенной, или не присутствующей в естественных условиях, по отношению к трансформируемому или обрабатываемому растению, и которая кодирует "гетерологичный полипептид" или его биологически активный фрагмент. Гетерологичные последовательности генов включают вирусные, прокариотические и эукариотические последовательности. Прокариотические кодирующие последовательности включают, помимо прочих, микробные последовательности, бактериальные последовательности или вирусные последовательности (например, для получения антигенов, которые можно вводить в качестве вакцин). Эукариотические кодирующие последовательности включают последовательности млекопитающих или человека, но также могут включать последовательности не млекопитающих, даже других растений, включая, без ограничения ими, лидерные последовательности или последовательности сигнала секреции, направляющие последовательности и т.п. В одном предпочтительном аспекте нуклеиновая кислота гетерологичного гена кодирует человеческий белок. Термин "гетерологичный ген" или "гетерологичная кодирующая последовательность" включает, без ограничения ими, природную, мутированную, вариант, химически синтезированную, геномную, кДНК или любую комбинацию таких последовательностей. Отсылка к "гену" охватывает полноразмерные гены или их фрагменты, кодирующие биологически активные белки.
Термин "гетерологичный пептид" или "гетерологичный белок", используемый в настоящем описании, относится к пептиду, включая олиго- и полипептиды, или к белку, который экспрессирован с "гетерологичного гена" или "гетерологичной кодирующей последовательности", как определено выше. Таким образом, "гетерологичный пептид" или "гетерологичный белок", полученный в растении, является экзогенным по отношению к растению или не присутствующим в растении в природе. "Гетерологичный пептид" или "гетерологичный белок" может быть пептидом или белком млекопитающего или человека. "Гетерологичный пептид" или "гетерологичный белок" может быть даже пептидом или белком растения, если он является вариантом или мутантной формой растительного пептида или белка, или пептидом или белком, обычно не присутствующим в продуцирующих видах, линии или сорте растения.
Используемый в настоящем описании "T-ДНК бордер" относится к фрагменту ДНК, включающему последовательность длиной приблизительно 25 нуклеотидов, которую способны узнавать продукты вирулентных генов штамма агробактерии, такого как штамм A. tumefaciens или A. rizogenes, или его модифицированную или мутированную форму, и который является достаточным для переноса последовательности ДНК, с которой он связан, в эукариотические клетки, предпочтительно клетки растения. Данное определение включает, без ограничения ими, все природные T-ДНК бордеры из Ti-плазмид дикого типа, а также их любое функциональное производное, и включает химически синтезированные T-ДНК бордеры. В одном аспекте кодирующая последовательность и последовательность регуляции экспрессии экспрессионной конструкции согласно изобретению расположены между двумя T-ДНК бордерами.
Термин "выбранный для обеспечения транзиентной экспрессии" относится к экспрессионной конструкции, которая была специально создана для транзиентной экспрессии гена в растениях, в частности, путем удаления элементов обычных бинарных векторов, необходимых для стабильной трансформации, таких как селективные гены трансформации (см., например, RP Hellens et al., Plant Methods 205, 1:13).
Используемый в настоящем описании термин "поверхностно-активное вещество" относится к поверхностному-активному агенту, который обычно содержит гидрофобную часть и гидрофильную часть (см., например, Bhairi, A Guide to the Properties and Uses of Detergents in Biological Systems, Calbiochem-Novabiochem Corp. 1997).
Поверхностно-активные вещества могут быть разделены на анионные, неионные, цвиттерионные или катионные в зависимости от того, содержат ли они одну или более заряженных групп. Анионные поверхностно-активные вещества содержат отрицательно заряженную группу и имеют отрицательный суммарный заряд. Неионные поверхностно-активные вещества содержат незаряженные полярные группы и не имеют заряда. Такие поверхностно-активные вещества обычно являются продуктами реакции алкиленоксида с алкилфенолом или первичными или вторичными спиртами, или являются аминоксидами, фосфиноксидами или диалкилсульфоксидами.
Поверхностно-активные вещества, которые могут предпочтительно использоваться в системах инфильтрации растения, например, раскрыты в WO/2005/076766.
в частности примерные неионные поверхностно-активные вещества включают, помимо прочих: трет-октилфеноксиполиэтоксиэтанол (Triton X-100), полиоксиэтиленсорбитан монолаурат (Tween 20), полиоксиэтиленсорбитан монолаурат (Tween 21), полиоксиэтиленсорбитан монопальмитат (Tween 40), полиоксиэтиленсорбитан моностеарат (Tween 60), полиоксиэтиленсорбитан моноолеат (Tween 80), полиоксиэтиленсорбитан монотриолеат (Tween 85), (октилфенокси)полиэтоксиэтанол (IGEPAL CA-630/NP-40), триэтиленгликольмонолауриловый эфир (Brij 30) и сорбитан монолаурат (Span 20).
Цвиттерионное поверхностно-активное вещество содержит положительно заряженную группу и отрицательно заряженную группу, и не имеет суммарного заряда. Подходящие цвиттерионные поверхностно-активные вещества включают, без ограничения ими: бетаины, такие как карбоксибетаины, сульфобетаины (также известные как сультаины), амидобетаины и сульфоамидобетаины, которые могут включать C8-C18, предпочтительно C10-C18, алкилбетаины, сульфобетаины, амидобетаины и сульфоамидобетаины, например, бетаины лауриламидопропилбетаинового (LAB) типа, н-алкилдиметиламмонио-метанкарбоксилат (DAMC), н-алкилдиметиламмонио-этанкарбоксилат (DAEC) и н-алкилдиметиламмонио-пропанкарбоксилат (DAPC), н-алкилсультаины, н-алкилдиметиламмонио-алкилсульфонаты, N-алкилдиметиламмонио-этансульфонат (DAES), н-алкилдиметиламмонио-пропансульфонат (DAPS) и н-алкилдиметиламмонио-бутансульфонат (DAPS), гексадецилдиметиламмонио-пропансульфонат, н-алкиламидометан-диметиламмонио-метанкарбоксилат, н-алкиламидометан-диметиламмонио-этанкарбоксилат, лауриламидопропилбетаин (LAB), н-алкиламидометан-диметиламмонио-метансульфонат, н-алкиламидоэтан-диметиламмонио-этансульфонат и н-алкиламидопропан-диметиламмонио-пропансульфонат, 3-[(3-холамидопропил)диметиламмонио]-1-пропансульфонат (CHAPS) и 3-[(3-холамидопропил)диметиламмонио]-2-гидрокси-1-пропансульфонат (CHAPSO), фосфолипиды (например, фосфатидилэтаноламины, фосфатидилглицерины, фосфатидилинозиты, диацилфосфатидилхолины, диалкилфосфатидилхолины, лизофосфатидилхолины, лизофосфатидилэтаноламины, лизофосфатидилглицерины, лизофосфатидилинозиты, производные насыщенных и ненасыщенных жирных кислот (например, сложные этилэфиры, сложные пропилэфиры, сложные холестерилэфиры, сложные эфиры кофермента A, сложные нитрофенилэфиры, сложные нафтилэфиры, моноглицериды, диглицериды и триглицериды, жирные спирты, ацетаты жирных спиртов и т.п.), липополисахариды, глико- и сфинголипиды (например, церамиды, цереброзиды, галактозилдиглицериды, ганглиозиды, лактоцереброзиды, лизосульфатиды и т.п.).
"Катионное поверхностно-активное вещество" имеет положительно заряженную группу в условиях инфильтрации. Подходящие катионные поверхностно-активные вещества включают, помимо прочих: четвертичные амины или третичные амины. Примерные поверхностно-активные четвертичные амины включают, без ограничения ими, цетилпиридиния хлорид, цетилтриметиламмония бромид (CTAB; Calbiochem #B22633 или Aldrich #85582-0), цетилтриметиламмония хлорид (CTAC1; Aldrich #29273-7), додецилтриметиламмония бромид (DTAB, Sigma #D-8638), додецилтриметиламмония хлорид (DTACI), октилтриметиламмония бромид, тетрадецилтриметиламмония бромид (TTAB), тетрадецилтриметиламмония хлорид (TTACI), додецилэтилдиметиламмония бромид (DEDTAB), децилтриметиламмония бромид (DTAB), додецилтрифенилфосфония бромид (DTPB), октадецилилтриметиламмония бромид, стеароалкония хлорид, олеалкония хлорид, цетримония хлорид, алкилтриметиламмония метосульфат, пальмитамидопропилтриметилхлорид, кватерний 84 (Mackernium NLE; Mcintyre Group, Ltd.) и эпоксид липидов пшеницы (Mackernium WLE; Mcintyre Group, Ltd.).
Примерные поверхностно-активные третичные амины включают, помимо прочих, октилдиметиламин, децилдиметиламин, додецилдиметиламин, тетрадецилдиметиламин, гексадецилдиметиламин, октилдецилдиметиламин, октилдецилметиламин, дидецилметиламин, додецилметиламин, триацетиламмония хлорид, цетримония хлорид и алкилдиметилбензиламмония хлорид. Дополнительные классы катионных поверхностно-активных веществ включают, без ограничения ими, фосфоний, имидазолин и этилированные аминогруппы.
Анионные поверхностно-активные вещества обычно являются водорастворимыми солями щелочных металлов и органических сульфатов и сульфонатов. Они включают, без ограничения ими, лаурат калия, лаурилсульфат натрия, додецилсульфат натрия, алкилполиоксиэтиленсульфаты, альгинат натрия, диоктилсульфосукцинат натрия, фосфатидилхолин, фосфатидилглицерин, фосфатидилинозин, фосфатидилсерин, фосфатидную кислоту и ее соли, сложные глицериловые эфиры, натрийкарбоксиметилцеллюлозу, холевую кислоту и другие желчные кислоты (например, холевую кислоту, дезоксихолевую кислоту, гликохолевую кислоту, таурохолевую кислоту, гликодезоксихолевую кислоту), а также их соли (например, дезоксихолат натрия и т.д.).
Дополнительно могут использоваться вспомогательные поверхностно-активные вещества, такие как спирты с короткой цепью, такие как этанол, 1-пропанол и 1-бутанол.
Могут использоваться комбинации любых из вышеуказанных поверхностно-активных веществ. Поверхностно-активные вещества, прямо не указанные выше, также включены в объем изобретения.
Количества используемых поверхностно-активных веществ изменяются в зависимости от типа поверхностно-активного вещества и обрабатываемой ткани растения (то есть, толщины воскового покрытия на поверхности листа и т.д.).
Как правило, поверхностно-активные вещества используются в концентрациях в пределах от 0,005% до приблизительно 1% от объема суспензии Agrobacterium. Предпочтительно, концентрации изменяются в пределах от 0,005% до приблизительно 0,5% и, более предпочтительно приблизительно от 0,005% до приблизтельно 0,05%. Обычно используются более низкие уровни ионных поверхностно-активных веществ, чем неионных поверхностно-активных веществ.
Термин "вакуумная инфильтрация", используемый в настоящем описании, относится к способу, который обеспечивает проникновение патогенных бактерий, например, Agrobacterium, в межклеточное или интерстициальное пространство, и, таким образом, позволяет изучать взаимодействие между растениями и патогенными бактериями. Фактически, вакуум создает отрицательное атмосферное давление, которое вызывает уменьшение воздушных пространств между клетками в ткани растения. Чем дольше продолжительность и ниже давление вакуума, тем меньше воздушное пространство, остающееся в ткани растения. Повышение давления позволяет проникать инфильтрационной среде, содержащей инфекционный трансформирующий вектор, в ткань растения. Для трансформации растения вакуум можно приложить к части растения в присутствии Agrobacterium в течение некоторого периода времени.
Используемый в настоящей заявке термин "атмосферное давление" определяет силу на единицу площади, с которой на поверхность действует вес воздуха, находящегося над данной поверхностью в земной атмосфере. Давление - это сила, или вес, действующая на единицу площади поверхности и измеряемая в паскалях (Па). Давление, с которым килограмм массы действует на поверхность, равно 9,8 Па. Давление, которое оказывает вся атмосфера над поверхностью Земли, составляет приблизительно 100000 Па. Обычно атмосферное давление указывают в миллибарах (мбар). 1 мбар равен 100 Па, таким образом, стандартное атмосферное давление равно приблизительно 1000 мбар. Фактически, реальные значения атмосферного давления изменяются в зависимости от местоположения, высоты и погодных условий. На уровне моря наблюдаемые значения обычно изменяются в пределах от 970 мбар до 1040 мбар. Поскольку давление падает с увеличением высоты, давление, наблюдаемое в различных местоположениях, необходимо приводить к одному уровню, обычно уровню моря.
Давление, оказываемое в покое на жидкость, заключенную в закрытую емкость, передается без потери каждой части жидкости и стенкам емкости. Для жидкости в покое разница в давлении между двумя его точками зависит только от плотности жидкости и различия в глубине между двумя точками. Соответственно, жидкость оказывает на все тела, погруженные в нее, давление, которое равно давлению, приложенному извне на поверхность жидкости, плюс статическое давление жидкости от веса жидкости.
Технические и научные термины, используемые в настоящем описании, имеют стандартные значения, под которыми их обычно понимают средние специалисты в области техники, к которой относится настоящее изобретение, если не определено иное. В настоящем описании указываются различные методики, известные специалистам. Публикации и другие материалы, в которых описаны такие известные методики, на которые приводится ссылка, полностью включены в настоящую заявку путем отсылки, как если бы были изложены полностью. При практическом осуществлении изобретения будут использоваться, если не указано иное, стандартные методы химии, молекулярной биологии, микробиологии и биологии растений, которые находятся в рамках уровня техники.
Любые подходящие материалы и/или методы, известные специалистам, могут использоваться при осуществлении настоящего изобретения, впрочем, описаны предпочтительные материалы и/или методы. Материалы, реактивы и т.п., к которым сделана отсылка в следующем описании и примерах, доступны из коммерческих источников, если не указано иное.
Настоящее изобретение относится к системам и способам экспрессии целевых пептидов и/или белков, в особенности транзиентной экспрессии фармацевтически ценных пептидов и/или белков в растениях. В частности, в изобретении предложен усовершенствованный способ введения клеток Agrobacterium в целое и интактное растение или множество целых растений, или части целого и интактного растения, включая орган растения или ткань in planta. Способ согласно изобретению обеспечивает эффективную агроинфильтрацию многих растений, отдельно или одновременно, с более высоким выходом рекомбинантных белков, чем в случае других способов. Способы могут быть легко масштабированы и автоматизированы для удовлетворения изменяющихся потребностей в рекомбинантном белке.
Агроинфильтрацию растений в настоящее время проводят согласно одному из двух приводимых ниже методов.
В первом методе используют шприц, наполненный суспензией клеток Agrobacterium, и вводят бактерии в каждый отдельный лист. Шприц помещают снизу листа и мягко нажимают на плунжер, при этом суспензия бактерий распространяется по всему листу. Данный метод трудоемок и не подходит для масштабирования.
Второй метод включает использование вакуума, способствующего абсорбции бактерий растением. Как правило, растение помещают в перевернутом положении в камеру и его листья полностью погружают в бактериальную суспензию. Давление в камере доводят до приблизительно нескольких десятых миллибара. Воздух первоначально вытягивают из листа под действием вакуума, и когда воздух подают повторно, листья втягивают жидкость. Вакуумный процесс имеет по меньшей мере два недостатка, он медленный, поскольку требуется несколько минут, чтобы снизить давление до необходимого низкого давления. Вакуум вызывает некоторый существенный стресс в инфильтрируемых растениях, что приводит к трудностям при восстановлении растений или выживании после процесса инфильтрации.
В одном аспекте изобретения предложен усовершенствованный способ введения клеток Agrobacterium в целое растение или множество целых растений, в особенности целое и интактное растение или часть целого и интактного растения, включая орган растения или ткань растения in planta. Способ согласно изобретению обеспечивает положительное давление текучей среды или комбинацию положительного и отрицательного давления текучей среды, способствующие инфильтрации клеток Agrobacterium в целое растение или множество целых растений, в частности, целое и интактное растения или часть целого и интактного растения, включая орган растения или ткань растения in planta, в отличие от способов, известных в уровне техники, в которых применяют вакуум или отрицательное давление. В изобретении также предложены системы и приспособления для подвода положительного давления текучей среды к целым растениям или множеству целых растений, в особенности целых и интактных растений, или части целого и интактного растения, включая органы растения или ткани растения in planta, которые контактируют или контактировали с клетками Agrobacterium.
Согласно изобретению положительное давление текучей среды подводят, когда целое растение или множество целых растений, в частности, целое и интактное растение или часть целого и интактного растения, и бактерии подвергают обработке в одном или более циклах давления в закрытых условиях. Давление текучей среды является давлением в некоторой точке текучей среды, такой как вода или воздух. Например, в закрытых условиях объем, в котором содержится текучая среда, является постоянным. В различных вариантах осуществления изобретения, спецификации давления текучей среды относятся к давлению воздуха в камере фиксированного объема.
Давление текучей среды указывают как положительное давление, когда оно превышает давление окружающего воздуха вне закрытой системы, в местоположении, где осуществляют способ изобретения. Положительное давление или избыточное давление создается, когда целое растение или множество целых растений, в частности, целое и интактное растение или часть целого и интактного растения, включая орган растения или ткань растения in planta, и бактерии были подвергнуты целевому давлению, которое превышает давление окружающего воздуха. Термины избыточное давление и положительное давление используются в настоящем описании попеременно. Давление окружающего воздуха изменяется в зависимости от высоты в местоположении, где осуществляют способ, и от погодных условий на момент осуществления способа, и может быть с легкостью определено с помощью методов и оборудования, известных в уровне техники.
Для выражения значения давления могут использоваться многие единицы. Например, бар является единицей давления, равной 100 килопаскалям, и примерно равен атмосферному давлению на Земле на уровне моря. Атмосферное давление воздуха часто приводят в миллибарах, где стандартное давление на уровне моря (1 атм) определяют как 1013,25 мбар (гПа), равное 1,01325 бар.
Значения положительного давления, применимые в изобретении, могут быть, таким образом, выражены в единицах процентного значения от давления окружающего воздуха, например и без ограничения, 110%, 125%, 150%, 175%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 350%, 500%, 550%, 600%, 650%, 700%, 750%, 800%, 850%, 900%, 950%, 1000%, 1050%, 1110%, 1150%, 1200% или любого промежуточного значения, или любого значения, превышающего указанное выше. Подобное правило может использоваться для описания отрицательного давления, которое является значением давления ниже давления окружающего воздуха.
Положительное давление альтернативно может быть выражено в единицах абсолютного значения, например и без ограничения, 1,1 атм, 1,5 атм, 2 атм, 2,5 атм, 3 атм, 3,5 атм, 4 атм, 4,5 атм, 5 атм, 5,5 атм, 6 атм, 6,5 атм, 7 атм, 7,5 атм, 8 атм, 8,5 атм, 9 атм, 9,5 атм, 10 атм, 10,5 атм, 11 атм, 11,5 атм, 12 атм и так далее; или 1,1 бар, 1,5 бар, 2 бар, 2,5 бар, 3 бар, 3,5 бар, 4 бар, 4,5 бар, 5 бар, 5,5 бар, 6 бар, 6,5 бар, 7 бар, 7,5 бар, 8 бар, 8,5 бар, 9 бар, 9,5 бар, 10 бар, 10,5 бар, 11 бар, 11,5 бар, 12 бар или любого промежуточного значения, или любого значения, превышающего указанное выше. В тех случаях, когда давление окружающего воздуха не приводят для сравнения в настоящем описании, предполагается, что давление окружающего воздуха является стандартным атмосферным давлением на Земле на уровне моря.
Термин "цикл давления", используемый в настоящей заявке, относится к ряду изменений давления в течение некоторого периода времени. В одном варианте осуществления цикл давления включает целевое давление, то есть давление, которое требуется достичь в пределах данного периода времени. Например, в течение цикла давления требуемое давление в камере начинается с давления, уравновешенного с давлением окружающего воздуха, изменяется на целевое давление и возвращается к давлению окружающего воздуха. Соответственно, камера, применяемая в изобретении, может начинать цикл давления с увеличения давления выше атмосферного давления воздуха и заканчивать цикл давления в равновесии с атмосферным давлением воздуха.
В различных вариантах осуществления изобретения начальное давление и конечное давление могут быть различными и могут отличаться от давления окружающего воздуха. Например, импульс положительного давления воздуха является одним циклом давления. Цикл давления может в некоторых вариантах осуществления включать несколько целевых давлений, например, первое целевое давление, второе целевое давление, третье целевое давление и т.д. Таким образом, различные циклы давления могут иметь разное начальное давление и конечное давление, и любое число дискретных промежуточных целевых давлений или непрерывный переход от начального давления до конечного давления.
В способах согласно изобретению может быть применено множество различных циклов давления, при этом каждый может быть применен один или более раз, например, без ограничения, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или десять раз. Соответственно, в способе изобретения, или даже в цикле давления, изменение давления с течением времени может быть выражено графиком или формой волны, такой как синусоида, прямоугольная волна, треугольная волны или пилообразная волна, или любой формы волны, которая приближена к одному из предыдущего.
В различных вариантах осуществления изобретения любые спецификации давления текучей среды в отношении продолжительности или степени относятся к полной продолжительности цикла давления и пиковому значению давления, приложенному к целому и интактному растению или множеству целых растений, или части целого и интактного растения. Например, ссылка на цикл давления, включающий обработку целого растения или части растения давлением по меньшей мере 4,5 бар в течение 0,5 секунд, означает, что общая продолжительность воздействия давления на растение составляет 0,5 секунды, что может включать в себя период повышения давления выше атмосферного давления воздуха и окончание цикла давления при уравновешивании с атмосферным давлением воздуха, с пиковым значением 4,5 бар.
Предпочтительно, цикл давления по изобретению включает целевое давление, которое является положительным давлением. В некоторых вариантах осуществления способ по изобретению не включает целевое давление, которое является отрицательным давлением. В других вариантах осуществления способы по изобретению включают первое целевое давление, которое является положительным давлением, а также второе целевое давление, которое является отрицательным давлением. В других вариантах осуществления способы по изобретению включают первое целевое давление, которое является отрицательным давлением, а также второе целевое давление, которое является положительным давлением. В способ изобретения между циклами давления может быть включен необязательный перерыв.
Такой перерыв между циклами может продолжаться в течение приблизительно 0,01, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5 или 5 и до 10 или более секунд.
В некоторых вариантах осуществления клетки Agrobacterium, включающие экспрессионную конструкцию, инфильтрируют в целое растение или множество целых растений, в особенности целое и интактное растение или часть целого и интактного растения, включая орган растения или ткань растения in planta. В одном варианте осуществления инфильтрацию проводят в присутствии поверхностно-активного вещества, включая анионные, катионные, неионные и цвиттерионные поверхностно-активные вещества.
Неограничивающими примерами поверхностно-активного вещества, которое может использоваться, являются Triton X-100 или Silwet L-77, сильное поверхностно-активное вещество, которое проявляет относительно низкую токсичность в растениях.
После инкубирования растения или ткани растения при подходящих условиях, которые позволяют экспрессионной конструкции экспрессировать целевой пептид или белок во множестве клеток растения, белок может быть детектирован и определен количественно в растении или части растения, такой как орган растения или ткань растения, или в его клетках. После сбора может быть выполнено выделение пептида или белка с использованием стандартных методов из уровня техники. Например, по меньшей мере, часть биомассы может быть гомогенизирована, а рекомбинантный пептид или белок экстрагированы и дополнительно очищены. Экстракция может включать пропитку или погружение гомогената в подходящий растворитель. Методы очистки включают, без ограничения ими, иммуноаффинную очистку и процедуры очистки, основанные на определенном размере пептида, белка или белкового комплекса, электрофоретической подвижности, биологической активности и/или суммарном заряде выделяемого пептида или белка, или основанные на присутствии в белке молекулы-метки. Анализ выделенного пептида или белка может быть проведен с помощью иммуноанализа или других методов, известных в уровне техники. Например, пептиды или белки могут быть проанализированы на ДСН-ПААГ электрофорезных гелях с помощью Вестерн-блоттинга или окрашивания Кумасси синим, когда пептид или белок являются по существу очищенными.
В другом варианте осуществления изобретения предложены системы для обработки интактных целых растений, в особенности целых и интактных растений или частей растения, таких как органы растения или ткани растения, которые были подвергнуты контакту с клетками Agrobacterium с приложением положительного давления текучей среды. Системы согласно изобретению включают в себя камеру для помещения целого растения, в частности, целого и интактного растения или части растения, такой как орган растения или ткань растения, или множества таких целых растений или частей растения, и приспособление для подвода положительного давления текучей среды. Камера может быть изготовлена из любых материалов, известных в уровне техники, которые сохраняют определенную форму в соответствии с изобретением и непроницаемы для текучих сред, применяемых в изобретении. Камера включает множество впускных и выпускных отверстий, включая по меньшей мере одно отверстие, через которое целое растение или часть растения, такая как ткань растения, может быть введена и извлечена, при этом давление в камере регулируется. В некоторых вариантах осуществления камера включает в себя отверстие и крышку, предназначенную для герметизирующего соединения с камерой с целью закрытия камеры, приспособления, формирующие отверстие клапана через боковую стенку камеры или крышку, и фиксирующие приспособления для разъемного поддержания камеры и крышки в герметизирующем соединении в положении фиксации, и по меньшей мере одно гибкое клапанное приспособление, установленное относительно отверстия клапана, для создания потока текучей среды между внутренним и внешним пространством камеры.
Системы необязательно могут обеспечивать приспособление, посредством которого множество целых растений или частей растения подвергаются контакту с клетками Agrobacterium. Предпочтительно, контакт целых растений или частей растения с клетками Agrobacterium производят в камере, в которую подводят положительное давление. Положительное давление текучей среды можно подводить любым способом, известным в уровне техники.
В одном варианте осуществления изобретения предложено, что целое и интактное растение помещают в перевернутом положении в камеру, при этом его листья полностью погружаются в жидкость, включающую клетки Agrobacterium. Камера подсоединена к источнику сжатого воздуха через редуктор давления и впускной клапан. Камера также включает выпускной клапан, установленный на одной из стенок, предпочтительно на крышке, камеры. Редуктор давления и впускной клапан используются для регулировки давления в камере таким образом, что в камере может быть создано одно или более целевых давлений. Например, чтобы начать подачу положительного давления, камеру закрывают, впускной клапан переводят в закрытое положение и устанавливают редуктор давления на заданное давление. После погружения растения в жидкость, впускной клапан открывают на первый период времени, достаточный для того, чтобы в камере создавалось заданное давление, и второй период времени, когда заданное давление поддерживается в камере. По истечении указанных периодов времени впускной клапан закрывают и открывают выпускной клапан, позволяя камере возвратиться к давлению окружающего воздуха.
В другом варианте осуществления изобретения предложено, что целое и интактное растение помещают в камере, которая включает в себя множество форсунок и выпускной клапан на боковых стенках камеры. Форсунки соединены общей коллекторной трубкой, которая, в свою очередь, подсоединена через первый впускной клапан с емкостью для жидкости, содержащей клетки Agrobacterium. Источник сжатого воздуха подсоединен к форсункам через редуктор давления и второй клапан давления. Редуктор давления используется для установки заданного давления, которое требуется создать в камере. Например, чтобы начать подачу положительного давления, камеру закрывают, впускной клапан, клапан давления и выпускной клапан перекрывают, и устанавливают редуктор давления на заданное давление. Затем впускной клапан и клапан давления согласованно открывают таким образом, что жидкость, содержащая бактерии, разбрызгивается или превращается в аэрозоль под действием сжатого воздуха и распыляется через форсунки на растение в камере. Впускной клапан и клапан давления, или клапан давления открывают на первый период времени, достаточный для того, чтобы в камере создавалось заданное давление, и второй период времени, когда заданное давление поддерживается в камере. По истечении указанных периодов времени, впускной клапан и/или клапан давления перекрывают, и открывают выпускной клапан, позволяя камере возвратиться к давлению окружающего воздуха.
В других вариантах осуществления изобретения предполагается, что давление жидкости (или гидравлическое давление) прикладывают к закрытому объему инфильтрационной среды, в которую погружено целое и интактное растение или часть целого и интактного растения. Давление жидкости может подаваться любыми обычными приспособлениями, такими как, без ограничения ими, гидравлические насосы, включая зубчатый насос, лопастной насос и поршневой насос.
В дополнение к вышеуказанному оборудованию, системы по изобретению могут дополнительно включать в себя другое различное оборудование, такое как клапаны (например, предохранительные клапаны, запорные клапаны, клапаны с ручным управлением, приводные клапаны, игольчатые клапаны и т.п., а также комбинации, включающие по меньшей мере один из предыдущих клапанов), фильтры (например, бактериальные фильтры, механические фильтры и т.п., а также их комбинации), датчики (например, давления, температуры, потока, влажности, проводимости, газовой смеси, уровня жидкости и т.п., а также комбинации, включающие по меньшей мере один из предыдущих датчиков), средства регулирования температуры (такие как нагреватели, теплообменники, холодильники, сушилки и т.п.), средства регулирования давления (такие как компрессоры и т.п.), средства регулирования потока (такие как насосы, вентиляторы, воздуходувки и т.п.), а также комбинации, включающие по меньшей мере одно из предыдущих средств регулирования, и трубопроводы (например, жидкостные трубопроводы, кабелепроводы и т.п.), а также комбинации, включающие по меньшей мере один из предыдущих трубопроводов.
В дополнение к вышеуказанному оборудованию, системы по изобретению необязательно могут также включать в себя средства для транспортировки множества целых растений или частей растений, таких как органы растения или ткани растения, из некоторого местоположения до камеры, средства для облегчения контакта множества целых растений или тканей растения с клетками Agrobacterium, средства для помещения множества целых растений или тканей растения в камеру, средства для размещения и изменения положения множества целых растений или частей растения, таких как органы растений или ткани растений, в камере, средства для извлечения множества целых растений или частей растений из камеры. Предпочтительно, одно или несколько предыдущих средств представляют собой автоматизированные электромеханические системы и включают в себя, помимо прочего, автотранспортные системы, автоматизированные системы управления предприятием, системы безопасности, системы управления производственным процессом, системы передачи данных, системы хранения данных и вычислительные системы.
В одном варианте осуществления изобретения камера включает в себя средства для установки и размещения множества целых и интактных растений в камере таким образом, что все растение приходит в контакт с инфильтрационной средой, содержащей клетки Agrobacterium. В частности, множество растений размещают так, чтобы все растение, включая его наземные и подземные части, было погружено в инфильтрационную среду, содержащую клетки Agrobacterium. В такой конфигурации все растение, включая как наземные части, как и подземные части растения, приходит в контакт с инфильтрационной средой, содержащей клетки Agrobacterium. Погруженные растения подвергают одному или более циклам давления, где по меньшей мере один из циклов давления, включает повышение давления относительно атмосферного давления и в определенном варианте осуществления давление поддерживают в течение периода продолжительностью 0,5-60 секунд. В течение одного или более циклов давления камеру закрывают и герметизируют, предпочтительно без или с незначительным количеством воздуха в ней, и, когда давление прикладывают к закрытой инфильтрационной среде, в камере создается давление из-за сопротивления стенок камеры, при этом по существу однородное давление передается по всей камере, содержащей погруженные растения. В такой конфигурации давление, действующее на погруженные растения, по существу является таким же, как давление, приложенное к системе.
В другом варианте осуществления изобретения камера включает средства для установки и размещения множества целых и интактных растений в камере таким образом, что только часть растения приходит в контакт с инфильтрационной средой, содержащей клетки Agrobacterium. В частности, множество растений размещают так, что все или часть наземных частей растения погружаются в инфильтрационную среду, содержащую клетки Agrobacterium, тогда как подземные части растения, в особенности корни растения, не погружены в инфильтрационную среду. В такой конфигурации все растение, включая наземные части, а также подземные части растения, подвергают одному или более циклам давления, где по меньшей мере один из циклов давления включает повышение давления относительно атмосферного давления, и в определенном варианте осуществления давление поддерживается в течение периода продолжительностью 0,5-60 секунд.
На Фигуре 5 показан пример такого варианта осуществления изобретения. Система 10 включает в себя камеру 11, имеющую крышку 12. Крышкой 12 камера 11 может быть герметично закрыта. Как показано на Фиг. 5, в данном примере целые и интактные растения 13 расположены в перевернутом положении в камере, при этом наземные части растения полностью погружены в жидкость. Система 10 также включает емкость для жидкости 14, которая подсоединена к камере 11 через трубопровод 15. Емкость для жидкости 14 включает шток 16, соединенный с поршнем 17. При перемещении поршня 17 вниз, жидкость из емкости для жидкости 14 нагнетается в камеру 11 по трубопроводу 5. Уровень жидкости и также давление в камере 11 повышается так, чтобы листья растений были погружены и подвергнуты воздействию давления, которое относится к атмосферному давлению.
В еще одном варианте осуществления изобретения множество растений помещают в камеру таким образом, что все или часть наземных частей растения погружаются в инфильтрационную среду, содержащую клетки Agrobacterium, и подвергают одному или более циклам давления, где по меньшей мере один из циклов давления включает повышение давления относительно атмосферного давления, и в определенном варианте осуществления давление поддерживают в течение периода продолжительностью 0,5-60 секунд. В такой конфигурации подземные части растения, в особенности, корень растения, расположены вне камеры так, что они не погружены в инфильтрационную среду, содержащую клетки Agrobacterium, и не подвергаются воздействию давления, приложенного в течение одного или более циклов давления. В течение одного или более циклов давления камера закрыта и герметизирована, предпочтительно без или с незначительным присутствием воздуха в ней, при этом, когда давление приложено к закрытой инфильтрационной среде, в камере создается давление из-за сопротивления стенок камеры, и по существу однородное давление передается по всей камере, содержащей погруженные наземные части растений. В такой конфигурации давление, действующее на погруженные растения, по существу является таким же, как давление, приложенное к системе.
Для помещения наземных частей целого и интактного растения(й) в камеру, тогда как подземные части помещены вне камеры, одна стенка, обычно верхняя, камеры может включать одно или более отверстий, которые позволяют проходить наземным частям растений в процессе установки или извлечения. Размеры отверстия изменяются из-за присутствия частей целого и интактного растения в отверстии. Отверстие расположено в линию с эластичными уплотнениями, такими, что отверстие может быть закрыто, несмотря на изменяемые размеры отверстия. Эластичность уплотнений может способствовать защите частей растения от механического повреждения. Как правило, целые интактные растения размещают таким образом, что уплотнение сформировано вокруг главных стеблей благодаря эластичности уплотнений. Эластичные уплотнения могут иметь такую конфигурацию, что они расположены напротив и скользят в направлении друг к другу, закрывая отверстие, эффективно формируя временно воздухонепроницаемое или водонепроницаемое соединение. В течение цикла давления в камере может быть временно создано давление, тогда как инфильтрационная среда и наземные части растений закрыты эластичными уплотнениями.
Пример такого варианта осуществления показан на Фигуре 6. Фиг. 6 представляет собой схематическое изображение камеры 20 в разрезе. Камера 20 имеет две стенки 21 и 22, которые соединены друг с другом посредством шарнира 23. На изображении слева на Фиг. 6 показана камера 20 в открытом положении. На свободных концах двух стенок 21 и 22 имеются надувные уплотнения 24. На изображении справа на Фиг. 6 показана камера 20 в закрытом положении, при этом два уплотнения 24 надуты так, чтобы камера была плотно закрыта.
На Фиг. 7 показано схематическое изображение в перспективе камеры 26. Камера 26, показанная на изображении слева, находится в открытом положении, при этом два надувных уплотнения 24 отведены друг от друга. Каждое уплотнение находится на краю створки 25. Створки 25 могут двигаться друг к другу и друг от друга, например, путем скольжения. Когда растение вставляют частично (см. изображение вверху справа на Фиг. 7), две створки 25 смыкаются вокруг стебля растения, и уплотнения 24 надуваются, герметично закрывая камеру 26.
Квалифицированному специалисту очевидно, что показанная конструкция с подвижными створками и продольными уплотнениями 24 является лишь примером осуществления, и изобретение охватывает другие конфигурации. Например, вместо цилиндрической или трубчатой формы, камера 26 может иметь сферическую форму с круглым отверстием для установки части растения. По краю круглого отверстия может быть расположено одно кольцевое уплотнение, которое может надуваться до такой степени, что оно перекрывает все отверстие камеры вокруг стебля растения, обеспечивая воздухонепроницаемое или водонепроницаемое уплотнение.
В конкретном варианте осуществления изобретения предложены эластичные пневматические или гидравлические уплотнения, где каждое уплотнение имеет полость, в которую поступает сжатый воздух или инертный газ, или гидравлическая жидкость под давлением накачивания. Давление накачивания вызывает эластичное расширение спущенного в ином случае уплотнения в зазорах, которые присутствуют между уплотнением и частью целого интактного растения, эффективно формируя временно воздухонепроницаемое или водонепроницаемое соединение. В одной конкретной конфигурации по меньшей мере два противоположных уплотнения расположены вдоль отверстия, в которое помещен главный стебель одного или более целых интактных растений. При накачивании противоположные уплотнения расширяются в пространстве между ними, пока они не будут прижаты друг к другу и не зафиксируют главный стебель(ли) растений между собой, сформировав временно воздухонепроницаемое или водонепроницаемое соединение. При сбросе давления накачивания из уплотнения, уплотнение возвращается в свое спущенное положение, эффективно снижая давление в камере. Предполагается, что в одном варианте осуществления приложение давления накачивания к эластичным уплотнениям и приложение гидравлического давления к инфильтрационной среде в камере может быть выполнено последовательно. Предпочтительно, приложение давления накачивания к эластичным уплотнениям выполняют перед приложением гидравлического давления, при этом соединение формируется до того, как в камере создается давление.

Обычно в качестве среды накачивания используют сжатый воздух, хотя в некоторых случаях могут быть применены гидравлические (жидкостные) способы. Надувные уплотнения обеспечивают универсальные конфигурации в трех различных плоскостях: радиально внутрь, радиально наружу и аксиально. Уплотнения в форме замков могут формировать закрытые концы, скошенные концы и непрерывные петли. Пневматические уплотнения или гидравлические уплотнения могут быть изготовлены из различных эластомеров, включая силикон, бутадиенстирол (БСК), хлоропрен (неопрен), этиленпропилен (EPDM) и фторированный углеводород (Viton).
Специалистам, квалифицированным в данной области, будет очевидно, что различные варианты осуществления, описанные в настоящей заявке, могут быть осуществлены, отдельно и/или вместе, с помощью различных типов электромеханических систем, содержащих целый ряд электрических компонентов, таких как аппаратные средства, программные средства, программно-аппаратные средства или фактически любую комбинацию перечисленного; и целый ряд компонентов, которые могут передавать механическое усилие или движение, такие как твердые тела, пружинные или крутящие тела, гидравлика и устройства с электромагнитным приводом или их любую комбинацию перечисленного. Следовательно, используемая в настоящем описании "электромеханическая система" включает, без ограничения ими, электрическую схему, функционально соединенную с преобразователем (например, приводом, двигателем, пьезоэлектрическим кристаллом и т.д.), электрическую схему, имеющую по меньшей мере один дискретный электрический контур, электрическую схему, имеющую по меньшей мере одну интегральную схему, электрическую схему, имеющую по меньшей мере одну специализированную интегральную схему, электрическую схему, формирующую вычислительное устройство общего назначения, настраиваемое компьютерной программой (например, компьютер общего назначения, настраиваемый компьютерной программой, которая, по меньшей мере частично, реализует способы и/или устройства, описанные в настоящей заявке, или микропроцессор, настраиваемый компьютерной программой, которая, по меньшей мере частично, реализует способы и/или устройства, описанные в настоящей заявке), электрическую схему, формирующую запоминающее устройство (например, формы оперативного запоминающего устройства), электрическую схему, формирующую устройство связи (например, модем, коммутационный переключатель или оптико-электрическое оборудование), а также их любой неэлектрический аналог, такой как оптический или другой аналоги.
В различных вариантах осуществления клетки Agrobacterium, несущие экспрессионные конструкции с целевым геном или генами, в особенности, гетерологичным целевым геном или генами, применяются для доставки гена(ов) в целое и интактное растение или часть растения, такую как орган растения или ткань растения, для транзиентной экспрессии в клетках и/или внеклеточных пространствах растения или частей растений. Как правило, подходящая экспрессионная конструкция включает: по меньшей мере одну T-ДНК бордерную последовательность, последовательность регуляции экспрессии (например, промотор, который может быть индуцируемым или конститутивным, промотор, активность которого является тканеспецифичной) и целевой ген, функционально связанный с последовательностью регуляции экспрессии. В некоторых вариантах осуществления экспрессионная конструкция дополнительно включает селективный маркерный ген, находящийся под контролем подходящего промотора, и дополнительные последовательности регуляции экспрессии. В некоторых вариантах осуществления экспрессионная конструкция является частью вектора, включающего один или более сайтов начала репликации, по меньшей мере один сайт начала репликации, подходящий для репликации вектора, включающего экспрессионную конструкцию, в видах Agrobacterium.
Виды Agrobacterium, которые могут применяться в изобретении, включают, помимо прочих, Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium rhizogenes, Agrobacterium radiobacter, Agrobacterium rubi, Agrobacterium vitis, но особенно Agrobacterium tumefaciens и Agrobacterium rhizogenes. В одном варианте осуществления по меньшей мере один штамм Agrobacterium включает Agrobacterium tumefaciens. Применяемые виды Agrobacterium могут быть штаммом дикого типа (например, вирулентным) или неонкогенным штаммом. Подходящие штаммы Agrobacterium включают штаммы дикого типа (например, такие как Agrobacterium tumefaciens) или штаммы, в которых один или более генов мутированы с целью повышения эффективности трансформации, например, такие как штаммы Agrobacterium, в которых изменена экспрессия и/или индукция vir-генов вследствие присутствия мутантных или химерных virA или virG генов (например, Chen and Winans, 1991, J. Bacteriol. 173:1139-1144; и Scheeren-Groot et al., 1994, J. Bacteriol. 176:6418-6246), штаммы Agrobacterium, включающие дополнительные копии гена virG, такие как супер virG ген, полученный из pTiBo542, предпочтительно связанный с многокопийной плазмидой, как, например, описано в патенте США № 6483013. Другие подходящие штаммы включают, без ограничения ими: A. tumefaciens C58C1 (Van Larebeke et al., Nature 252:169-170 (1974)), A136 (Watson et al., J. Bacteriol 123:255-264 (1975)); LBA4011 (Klapwijk et al., J. Bacteriol 141:128-136 (1980)), LBA4404 (Hoekema et al., Nature 303:179-180 (1983)); EHA101 (Hood et al., J. Bac. 168:1291-1301 (1986)); EHA105 (Hood et al., Trans Res. 2:208-218 (1993)); AGL1 (Lazo et al., Bio/Technology 2:963-967 (1991)); A281 (Hood et al., выше (1986)).
Многие штаммы Agrobacterium, каждый из которых экспрессирует различные гены, могут применяться для получения отдельных белков или гетеромультимерного белка, или для повышения выхода целевого пептида или белка. Неограничивающим примером другого гена, который может экспрессироваться, является ген, который кодирует супрессор сайленсинга вирусного происхождения. В альтернативе, или дополнительно, один штамм Agrobacterium может включать множество последовательностей, включающих различные целевые гены, в частности, гетерологичные целевые гены. Различные гены могут содержаться в одной молекуле нуклеиновой кислоты (например, одном векторе) или могут присутствовать в различных векторах.
Способы согласно изобретению могут применяться для агробактериальной инфильтрации и транзиентной экспрессии во многих видах растений, включая, без ограничения ими: табак (виды Nicotiana), салат, люцерну, золотистую фасоль, шпинат, одуванчик, радиккьо, рукколу, эндивий, эскариоль, цикорий, артишок, кукурузу, картофель, рис, сою, хлопок, мелкозерные злаки, пшеницу, ячмень, сорго, сахарную свеклу, канолу, крестоцветные (например, капуста, резуховидка), ряску и томат.
Подходящий орган растения или ткань обычно могут быть любой частью растения. В одном предпочтительном аспекте ткань растения является тканью листа. В одном аспекте ткань растения является тканью листа растения, включающего листья размером по меньшей мере приблизительно 7-8 см по меньшей мере в одном измерении.
В различных вариантах осуществления выбран вид, сорт растения или даже орган растения, клетки которого включают недетектируемые или низкие уровни протеаз, которые расщепляют гетерологичные белки, например, меньше чем приблизительно 5%, меньше чем приблизительно 1%, меньше чем приблизительно 0,1% гетерологичных белков, экспрессируемых в растении, расщепляются в течение периода времени от введения нуклеиновых кислот, экспрессирующих гетерологичный белок, до по меньшей мере примерно того времени, когда белок выделяют из ткани растения. Уровни протеаз могут быть проанализированы с использованием стандартных методов из уровня техники, включая Вестерн-блот анализ экспрессии гетерологичного белка.
Примеры видов рода Nicotiana включают, без ограничения ими: Nicotiana africana, Nicotiana amplexicaulis, Nicotiana arentsii, Nicotiana benthamiana, Nicotiana bigelovii, Nicotiana corymbosa, Nicotiana debneyi, Nicotiana excelsior, Nicotiana exigua, Nicotiana glutinosa, Nicotiana goodspeedii, Nicotiana gossei, Nicotiana hesperis, Nicotiana ingulba, Nicotiana knightiana, Nicotiana maritima, Nicotiana megalosiphon, Nicotiana miersii, Nicotiana nesophila, Nicotiana noctiflora, Nicotiana nudicaulis, Nicotiana otophora, Nicotiana palmeri, Nicotiana paniculata, Nicotiana petunioides, Nicotiana plumbaginifolia, Nicotiana repanda, Nicotiana rosulata, Nicotiana rotundifolia, Nicotiana rustica, Nicotiana setchelli, Nicotiana stocktonii, Nicotiana eastii, Nicotiana suaveolens или Nicotiana trigonophylla. Предпочтительно первым растением табака является Nicotiana amplexicaulis, Nicotiana benthamiana, Nicotiana bigelovii, Nicotiana debneyi, Nicotiana excelsior, Nicotiana glutinosa, Nicotiana goodspeedii, Nicotiana gossei, Nicotiana hesperis, Nicotiana knightiana, Nicotiana maritima, Nicotiana megalosiphon, Nicotiana nudicaulis, Nicotiana paniculata, Nicotiana plumbaginifolia, Nicotiana repanda, Nicotiana rustica, Nicotiana suaveolens или Nicotiana trigonophylla.
Примерные варианты Nicotiana tabacum включают коммерческие сорта, такие как DAC Mata Fina, PO2, BY-64, AS44, RG17, RG8, HB04P, Basma Xanthi BX 2A, Coker 319, Hicks, McNair, 944 (MN 944), Burley 21, K149, Yaka JB 125/3, Kasturi Mawar, NC 297, Coker 371 Gold, Wislica, Simmaba, Turkish Samsun, AA37-1, B13P, F4 от скрещивания BU21 × Hoja Parado, линия 97, Samsun, PO1BU 64, CC 101, CC 200, CC 27, CC 301, CC 400, CC 500, CC 600, CC 700, CC 800, CC 900, Coker 176, Coker 319, Coker 371 Gold, Coker 48, CU 263, DF911, Galpao tobacco, GL 26H, GL 350, GL 737, GL 939, GL 973, HB 04P, K 149, K 326, K 346, K 358, K 394, K 399, K 730, KT 200, KY 10, KY 14, KY 160, KY 17, KY 171, KY 907, KY 160, Little Crittenden, McNair 373, McNair 944, msKY 14×L8, Narrow Leaf Madole, NC 100, NC 102, NC 2000, NC 291, NC 297, NC 299, NC 3, NC 4, NC 5, NC 6, NC 606, NC 71, NC 72, NC 810, NC BH 129, OXFORD 207, табак Perique, PVH03, PVH09, PVH19, PVH50, PVH51, R 610, R 630, R 7-11, R 7-12, RG 17, RG 81, RG H4, RG H51, RGH 4, RGH 51, RS 1410, SP 168, SP 172, SP 179, SP 210, SP 220, SP G-28, SP G-70, SP H20, SP NF3, TN 86, TN 90, TN 97, TN D94, TN D950, TR (Tom Rosson) Madole, VA 309, VA 309 или VA 359.
Могут применяться растения табака на любой стадии, в особенности растения табака на стадии 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15. В определенном варианте осуществления изобретения применяются растения на стадии 8, 9 или 10, когда растения имеют среднюю высоту приблизительно от 6,5 см до приблизительно 16,5 см. На стадии 10 растения имеют возраст 5-6 недель и высоту приблизительно 15 см, с хорошо распустившимися листьями и максимум одним раскрытым цветком.
Альтернативная система, которая идентифицирует ключевые стадии роста табака по шкале от 1 до 9, описана в руководстве CORESTA №7 от февраля 2009 года, "A Scale For Coding Growth Stages In Tobacco Crops", Task Force Growth Stages and Identification Keys for Tobacco, pp. 1-15, Centre de Co-operation pour tes Recherches Scientifiques au Tabac. (http://www.coresta.org/Guides/Guide-No7-Growth-Stages_Feb09.pdf). Согласно системе CORESTA могут использоваться растения на стадиях роста 2-8, но особенно растения на стадиях роста 3-5.
Растение табака с большой площадью поверхности листа предпочтительно. Конкретным преимуществом изобретения является то, что уже выращенные растения могут применяться в способах по изобретению или применяться в качестве источника тканей растения.
В изобретении предложены системы и способы, которые позволяют пользоваться преимуществом получения белка в выращенных, коммерчески доступных растениях, в частности табаке, и обеспечивают новое решение проблемы получения необходимых количеств рекомбинантных гетерологичных пептидов или белков для терапевтических или профилактических применений за короткий период времени.
В одном аспекте изобретения способ включает введение экспрессионной конструкции, включающей последовательность, кодирующую гетерологичный целевой пептид или белок, или его биологически активный фрагмент, в целое растение или часть растения, такую как ткань растения, и транзиентную экспрессию белка в растении или части растения. Кодирующая последовательность функционально связана с последовательностью регуляции экспрессии, способной направлять транскрипцию кодирующей последовательности в клетках и/или во внеклеточных пространствах растения или части растения. Предпочтительно, экспрессионная конструкция включает по меньшей мере одну T-бордерную последовательность из T-ДНК большой опухолеобразующей ("Ti") плазмиды. Кроме того, предпочтительно, экспрессионная конструкция содержится в векторе, способном к репликации, по меньшей мере, в клетках вида Agrobacterium, такого как Agrobacterium tumefaciens. В одном аспекте целое растение или часть растения включает ткань листа уже выращенного растения. Предпочтительно, растение включает относительно большие листья (например, больше чем приблизительно 7-8 см по меньшей мере в одном измерении), например, Nicotiana tabacum).
Экспрессионная конструкция может быть частью вектора экспрессии и может включать дополнительные нужные последовательности, такие как бактериальные сайты начала репликации (начало репликации из Agrobacterium и/или E. coli), репортерные гены, которые функционируют в бактериях, таких как Agrobacterium, и/или клетках растений (например, GUS, GFP, EGFP, BFP, бета-галактозидаза и их модифицированные формы), и селективные маркерные гены (например, гены устойчивости к антибиотикам и т.п.). С этой целью чужеродная ДНК, применяемая в способе по настоящему изобретению, может также включать маркерный ген, экспрессия которого обеспечивает отделение трансформированных клеток от нетрансформированных клеток на начальных стадиях клонирования. Такой маркерный ген обычно кодирует белок, который позволяет фенотипически отличать трансформированные клетки от нетрансформированных клеток. Впрочем, преимуществом способов транзиентной продукции белка согласно изобретению является то, что маркерные гены не требуются для выделения гетерологичных пептидов или белков из тканей растения, в которые введены экспрессионные конструкции/векторы.
Экспрессионные конструкции могут быть также дополнены супрессором сайленсинга, в частности вирусными супрессорами сайленсинга, включая, без ограничения ими, белок p25 из PVX, белок P1-HcPro вируса гравировки табака и белок p19 вируса кустистой карликовости томата.
Используемый в настоящем описании уровень транзиентной экспрессии относится к способности экспрессировать по меньшей мере приблизительно 250 микрограммов, по меньшей мере приблизительно 500 микрограммов, по меньшей мере приблизительно 750 микрограммов, по меньшей мере приблизительно 1 мг, по меньшей мере приблизительно 2 мг, по меньшей мере приблизительно 3 мг, по меньшей мере приблизительно 4 мг, по меньшей мере приблизительно 5 мг, по меньшей мере приблизительно 10 мг, по меньшей мере приблизительно 15 мг, по меньшей мере приблизительно 25 мг, по меньшей мере приблизительно 50 мг, по меньшей мере приблизительно 75 мг, по меньшей мере приблизительно 100 мг, по меньшей мере приблизительно 150 мг, по меньшей мере приблизительно 200 мг, по меньшей мере приблизительно 500 мг, по меньшей мере приблизительно 1000 мг, по меньшей мере приблизительно 1,5 г, по меньшей мере приблизительно 2 г, по меньшей мере приблизительно 2,5 г, по меньшей мере приблизительно 5 г, по меньшей мере приблизительно 7,5 г, по меньшей мере приблизительно 10 г, по меньшей мере приблизительно 15 г или по меньшей мере приблизительно 20 г на кг массы ткани растения. Используемый в настоящем описании "транзиентный" относится к периоду времени, который является достаточно длительным, чтобы обеспечивать выделение белка из подходящей ткани растения. Предпочтительно, экспрессия белка остается на достаточно высоких уровнях в течение по меньшей мере приблизительно 1 дня, по меньшей мере приблизительно 2 дней, по меньшей мере приблизительно 3 дней, по меньшей мере приблизительно 4 дней, по меньшей мере приблизительно 5 дней, по меньшей мере приблизительно 6 дней, по меньшей мере приблизительно 7 дней, по меньшей мере приблизительно 8 дней, по меньшей мере приблизительно 9 дней, по меньшей мере приблизительно 10 дней, по меньшей мере приблизительно 11 дней, по меньшей мере приблизительно 12 дней, по меньшей мере приблизительно 13 дней, по меньшей мере приблизительно 14 дней или через по меньшей мере приблизительно 15 дней после введения экспрессионной конструкции в ткань растения. В одном аспекте достаточно высокие уровни получают в течение 3-7 или 5-10 дней и более предпочтительно в течение 3-5 или 5-7 дней после введения экспрессионной конструкции в ткань растения.
Рекомбинантные белки, полученные способами по изобретению, могут применяться в качестве фармацевтических препаратов и могут быть экспрессированы для их применения в качестве пищевых и косметических продуктов, поскольку такие продукты применяются людьми для непосредственного приема в пищу, инъекции или нанесения (например, местного применения). Также могут быть экспрессированы рекомбинантные белки, которые могут применяться в производстве аналогичным образом контролируемой ветеринарной продукции. Примеры белков, которые могут быть получены, включают, без ограничения ими: факторы роста, рецепторы, лиганды, сигнальные молекулы, киназы, ферменты, гормоны, супрессоры опухолей, факторы свертывания крови, белки клеточного цикла, метаболические белки, нейронные белки, сердечные белки, белки, дефицитные при некоторых заболеваниях, антитела, антигены, белки, которые обеспечивают резистентность к заболеваниям, антибактериальные белки, интерфероны и цитокины.
В одном аспекте последовательности, кодирующие антигены, включают последовательности для индукции защитных иммунных ответов (например, как в случае вакцинной композиции). Такие подходящие антигены включают, помимо прочего, микробные антигены (включая вирусные антигены, бактериальные антигены, грибковые антигены, паразитарные антигены и т.п.); антигены из многоклеточных организмов (таких как многоклеточные паразиты); аллергены и антигены, ассоциированные с патологиями человека или животных (например, таких как рак, аутоиммунные заболевания и т.п.). В одном предпочтительном аспекте вирусные антигены включают, без ограничения ими: антигены ВИЧ; антигены, придающие защитный иммунитет против гриппа; ротавирусные антигены; антигены сибирской язвы; антигены бешенства и т.п.
Антигены вакцин могут кодироваться в виде мультивалентных пептидов или полипептидов, например, включающих различные или одинаковые антигенные кодирующие последовательности, повторяющиеся в экспрессионной конструкции и необязательно разделенные одним или несколькими линкерными последовательностями.
Способы по изобретению также могут применяться для экспрессии одного или более генов с целью воспроизведения ферментативных путей для химического синтеза или для промышленных процессов.
Настоящее изобретение далее описано посредством следующих неограничивающих фигур, таблиц и примеров.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР И ТАБЛИЦ
На фигуре 1 показано схематическое изображение компоновки системы повышенного давления, включающей в себя камеру давления. V1, V2, V3: клапаны; M1: манометр; S1: глушитель.
На фигуре 2 показан двумерный контурный график в пределах фактического диапазона значений флуоресцентного сигнала (PMF015).
На фигуре 3 показан двумерный контурный график в пределах фактического диапазона значений флуоресцентного сигнала (PMF132).
На фигуре 4 показан двумерный контурный график в пределах фактического диапазона значений флуоресцентного сигнала (PMF204).
На фигуре 5 показано схематическое изображение системы для инфильтрации бактерий Agrobacterium в целое и интактное растение под давлением.
На фигуре 6 показано схематическое изображение камеры 20 в разрезе.
На фигуре 7 показано схематическое изображение камеры 26 в перспективе.
В таблице 1 показаны экспериментальные данные по композициям A91 (штамм AGL1, несущий ген флуоресцентного белка TurboGFP) и A17 (штамм AGL1, несущий ген p19 супрессора сайленсинга), применяемым в приготовлении инокулята Agrobacterium.
В таблице 2 показаны экспериментальные данные по композициям A91 (штамм AGL1, несущий ген флуоресцентного белка TurboGFP) и A17 (штамм AGL1, несущий ген p19 супрессора сайленсинга), применяемым в приготовлении инокулята Agrobacterium.
В таблице 3 показаны шесть различных условий с параметрами, используемыми в эксперименте инфильтрации.
В таблице 4 показаны девять различных условий с параметрами, используемыми в другом эксперименте инфильтрации.
В таблице 5 показаны стандартные разведения контрольного белка TurboGFP (rTurbo GFP, Evrogen #FP552) в растительном экстракте (контрольный экстракт из образца листа N.b., инфильтрированного только A17, который не экспрессирует TurboGFP).
В таблице 6 показан анализ различий между условиями на основе концентрации GFP, выраженной в мкг GFP на г замороженной массы с доверительным интервалом 95%.
В таблице 7 показан анализ различий между условиями на основе концентрации GFP, выраженной в % СРБ ("Суммарный Растворимый Белок") с доверительным интервалом 95%.
В таблице 8 показан анализ различий между условиями на основе мкг GFP/г замороженной массы инфильтрированных листьев с доверительным интервалом 95%.
В таблице 9 показан анализ различий между условиями на основе мг GFP на растение с доверительным интервалом 95%.
В таблице 10 показан анализ различий между условиями на основе концентрации GFP в процентах от концентрации СРБ ("Суммарный Растворимый Белок") с доверительным интервалом 95%.
В таблице 11 показан ANOVA, в котором сравнивают повышенное давление при оптимальных условиях и контроль.
В таблице 12 показаны средние значения с индивидуальными 95% доверительными интервалами для оптимальных условий и контроля.
Предыдущее описание будет понято в более полной мере при обращении к следующим примерам. Такие примеры, впрочем, являются примерными способами осуществления настоящего изобретения и не рассматриваются как ограничение объема изобретения.
ПРИМЕРЫ
Часть A: Оценка эффективности агроинфильтрации под действием положительного давления по сравнению с вакуумом для трансфекции N. benthamiana
Пример 1: Общая схема:
Растения инфильтрировали бактериальной суспензией, состоящей из смеси A91 (штамм Agrobacterium AGL1, несущий ген флуоресцентного белка TurboGFP) и A17 (штамм Agrobacterium AGL1, несущий ген p19 супрессора сайленсинга).
TurboGFP является улучшенным вариантом зеленого флуоресцентного белка CopGFP, клонированного из копеподы Pontellina plumata (Членистоногие; Ракообразные; Челюстеногие; Копеподы) [Shagin D.A., et al., GFP-like proteins as ubiquitous metazoan superfamily: evolution of functional features and structural complexity. Mol Biol Evol. 2004; 21 (5):841-50]. Он обладает яркой зеленой флуоресценцией (пики возбуждения/эмиссии=482/502 нм), которая проявляется раньше, чем флуоресценция других зеленых флуоресцентных белков. TurboGFP доступен от Evrogen (ЗАО Евроген; ул. Миклухо-Маклая 16/10, 117997, Москва, Россия).
Экспрессию TurboGFP в инфильтрированных растениях:
1) регулярно контролировали при визуализации целых растений или отделенных инфильтрированных листьев при освещении синим светом в течение периода, начинающегося через два дня после инфильтрации и до дня сбора, и
2) анализировали количественно в флуоресцентном сканере для микропланшетов после экстракции.
3
1.1 Вакуумная инфильтрация: Вакуумную инфильтрацию выполняли с помощью вакуумной камеры Labconco с внутренними размерами 30×30×30 см, модифицированной путем добавления вакуумного предохранительного клапана (диаметром 5 мм) и насоса V-710 Büchi (3,8 м/час)+регулятор V-855. Применяли следующие параметры вакуума:
- уменьшение давления от атмосферного до абсолютного значения 50 мбар за 3 минуты,
- выдерживание 1 минуту при 50 мбар,
- быстрый сброс приблизительно за 3 секунды.
Для этого эксперимента растения инфильтрировали по одному, путем погружения наземной части в 1- или 2-л химический стакан, наполненный бактериальной суспензией.
1.2 Повышенное давление: Установка повышенного давления показана на Фигуре 1. Растения помещали в перевернутом положении в одну камеру давления (объемом приблизительно 10 литров) с помощью специального держателя, присоединенного к верхней крышке. Положение держателя регулировали, чтобы минимизировать зазор между поверхностью жидкости и держателем. Как только крышку закрывали, выполняли следующую последовательность операций для обработки растений и Agrobacterium положительным давлением:
1. При закрытых ручных шаровых клапанах V2 и V3 регулирующий клапан V1 устанавливали на требуемое давление сжатого воздуха.
2. V2 открывали на 10 с, и давление, создаваемое в резервуаре, контролировали по манометру М1.
3. V2 закрывали, и резервуар возвращался к атмосферному давлению при открытии V3 и продувке системы через глушитель S1.
4. Крышку открывали, растение извлекали из держателя.
Пример 2: Приготовление инокулята Agrobacterium
Приготавливали 6x концентрированный инокулят, состоящий из смеси A91 (штамм AGL1, несущий ген флуоресцентного белка TurboGFP) и A17 (штамм AGL1, несущий ген p19 супрессора сайленсинга) (таблица 1 и 2), и хранили при 4°C до дня инфильтрации.
Таблица 1
Состав
A91-A17
Объем
OD600 нм
1,926
Концентрация
6×
Нужно разбавить в x л инфильтрационного раствора
Состав инфильтрационного раствора
5 мМ MES, 10 мМ MgCl<sub>2</sub>, pH 5,6
Глицерин 1
A91.393 09.09.09 JBE
Глицерин 2
A17.1 16.06.09 SRO
Конечная OD600 культуры 1
3,3
Конечная OD600 культуры 2
3,1
Таблица 2
Состав
A91-A17
Объем
2×1 л
OD600 нм
2,0
Концентрация
6×
Нужно разбавить в x л инфильтрационного раствора
2×5 л
Состав инфильтрационного раствора
5 мМ MES, 10 мМ MgCl<sub>2</sub>, pH 5,6
Глицерин 1
A91.393 09.09.09 JBE
Глицерин 2
A17.1 24.09.09 SRO
Конечная OD600 культуры 1
A91: 2,27
Конечная OD600 культуры 2
A17: 2,25
2
600 нм
Концентрированный инокулят разводили до 1× конечной концентрации в инфильтрационном растворе (5 мМ MES, 10 мМ MgCl, pH 5,6) при комнатной температуре (~20°C) за ~1 час до начала инфильтрации. 1× конечная концентрация соответствует конечной OD 0,3 при соотношении A91 и A17 1:1.
Для 2-го эксперимента 1% (об./об.) стоковый раствор Triton X-100 приготавливали в инфильтрационном растворе и, когда указано, добавляли к инокуляту в резервуаре для инфильтрации при разведении 1:100 с получением конечной концентрации Triton X-100 0,01% (об/об).
Пример 3: Получение биомассы
2
2
Растения Nicotiana benthamiana MIM выращивали в теплице в условиях 20 ч светового периода, дневной/ночной температуры 26°C/20°C и дневной/ночной относительной влажности 70%/50%. Искусственное освещение включалось автоматически на период от 02:00 до 22:00, когда интенсивность естественного света падала ниже 200 Вт/м (20 часов света), с использованием системы освещения 15000 или 20000 люкс, дающей ФАР порядка 100 мкмоль/м/с. Растения выращивали в блоках Rockwool (Grodan Delta Grow Blocks размера 6.5). Внесение жидких удобрений производили путем подпочвенного орошения каждые 2 дня: 25 мм воды в течение 30 минут. Удобрение доводили до ЭП 2,5 мСм/см и pH 5,8.
Пример 4: Параметры инфильтрации
В эксперименте инфильтрации сравнивали шесть различных условий. Используемые параметры приведены в таблице 3.
Таблица 3
Порядок
Условие
Заданное давление [бар]
Время выдерживания [с]
Число повторов
# растения
1
Вакуум
абсолютное 0,05
60
6
1-6
2
Повышенное давление
1
10
6
7-12
3
Повышенное давление
2,5
10
6
13-18
4
Повышенное давление
0,5
10
6
19-24
5
Повышенное давление
1,5
10
6
25-30
6
Повышенное давление
2
10
6
31-36
Во втором эксперименте инфильтрации сравнивали девять различных условий. Использованные параметры приведены в таблице 4.
Таблица 4
Порядок
Условие
Заданное давление [бар]
Время выдерживания [с]
Число повторов
# растения
1
Шприц
неизвестно
-
6
1-6
2
Вакуум
абсолютное0,5
60
6
7-12
3
Повышенное давление
2,5
10
6
13-18
4
Повышенное давление
1,5
10
6
19-24
5
Повышенное давление
2,0
10
6
25-30
6
Повышенное давление
3,5
10
6
31-36
7
Повышенное давление
3,0
10
6
37-42
8
Повышенное давление+ 0,01% Triton
2,5
10
6
43-48
9
Вакуум+ 0,01% Triton
абсолютное 0,05
60
6
49-54
Растения взвешивали непосредственно перед началом процесса инфильтрации. В конце инфильтрации растения извлекали из камер и держали в перевернутом положении в "стойке для стекания". Определение веса проводили соответственно через 2 и 10 минут после завершения этапа вентиляции. В перерыве между двумя указанными взвешиваниями растения снова помещали в перевернутом положении в стойку, при этом в конце последнего взвешивания их помещали в зону восстановления. Разница в весе до и после инфильтрации может использоваться в качестве показателя объема инокулята, инфильтрированного в растение.
Пример 5: Условия восстановления и инкубирования
После инфильтрации растения помещали на полки в теплице в отсеке S2 до сбора растений. Воду и удобрения подводили к растениям по мере необходимости, используя систему капельного орошения. Климатические условия, такие как удобрение, световой период и температура, используемые в ходе фазы восстановления и инкубирования, были такими же, какие использовали для выращивания растений (см. выше). Растения не инкубировали в темноте, потому что ранее было показано, что это не влияет на экспрессию turboGFP.
Пример 6: Схема визуализации флуоресценции
Транзиентную экспрессию TurboGFP контролировали посредством фотосъемки растений под синим светом через 5 или 6 дней после инфильтрации. Использовали лампу Dark reader (HL32T Hand Lamp, Clare Chemical Research, USA), которая испускает свет в пределах диапазона возбуждения turboGFP (максимум возбуждения при 482 нм). Фотоснимки делали в темноте с использованием цифровой камеры, оборудованной желтым светофильтром, предоставляемым производителем лампы.
Пример 7: Сбор растений
Растения затем помещали под синий свет и собирали все распустившиеся и инфильтрированные листья, показывающие флуоресценцию. Листья на вершине главного и пазушных побегов, показывающие флуоресценцию только на конце, не собирали. Собранные листья сначала помещали под пластиковый лист для визуализации флуоресценции. Затем их помещали в пакет с застежкой и переносили на 4°C до окончания сбора. Затем все пакеты отправляли обратно в лабораторию и помещали на минус 80°C до обработки листьев для анализа.
Пример 8: Количественная оценка флуоресценции
Содержание каждого пакета измельчали в тонкий порошок, применяя метод с использованием кофемолки/сухого льда, чтобы один образец, полностью гомогенизированный, соответствовал всем инфильтрированным листьям, собранным с одного растения. Суб-образцы 1,00 г +/-0,05 г замороженной массы порошка приготавливали на сухом льду для экстракции. Экстракцию проводили в соотношении 1 г замороженной массы на 3 мл экстракционного буфера (50 мМ Трис-основание; 100 мМ NaCl; 1 мМ ЭДТА; 0,2% Triton X-100; pH 7,5) в два этапа со встряхиванием на вортексе в течение 20 секунд и последующим центрифугированием при 20000 g в течение 15 мин. Растворимые экстракты хранили на льду для анализа.
Концентрацию TurboGFP (пик возбуждения 482 нм/пик эмиссии 502 нм) в экстрактах определяли при измерении флуоресценции на сканере для микропланшетов Modulus (Turner Biosystems) в режиме флуоресценции с набором Blue optical (возбуждение: 490 нм/эмиссия 510-570 нм). Экстракты разбавляли 1:100 в буфере для экстракции и вносили 200 мкл в трех повторах в черный 96-луночный планшет. Стандартную кривую получали при добавлении разных количеств контрольного белка TurboGFP (rTurbo GFP, Evrogen #FP552) в холостой экстракт, разбавленный до конечного разведения 1:100 в буфере для экстракции (экстракт из образца листа N.b., инфильтрированного только A17, и приготавливали при таких же условиях, как описано для образцов). Флуоресценция образцов, разведенных 1:100, изменялась в пределах от 0,4 до 1,3×10000 единиц в первом эксперименте и от 1,4 до 2,5×10000 единиц во втором эксперименте, с коэффициентом вариации (CV) <2% между 3 повторами.
Таблица 5
Конц. TurboGFP в мкг/мл
Объем rTurboGFP при 10 мкг/мл
Объем холостого экстракта, разведенного 1:50
Объем буфера для экстракции
Std 1
4,0
320 мкл
400 мкл
80 мкл
Std 2
3,0
240 мкл
400 мкл
160 мкл
Std 3
2,5
200 мкл
400 мкл
200 мкл
Std 4
2,0
160 мкл
400 мкл
240 мкл
Std 5
1,5
120 мкл
400 мкл
280 мкл
Std 6
1,0
80 мкл
400 мкл
320 мкл
Std 7
0,5
40 мкл
400 мкл
360 мкл
Std 8
0,25
20 мкл
400 мкл
380 мкл
Std 9
0,125
10 мкл
400 мкл
390 мкл
Холостой
0
0 мкл
400 мкл
400 мкл
Стандартная кривая единиц флуоресценции как функция концентрации TurboGFP. Данную кривую получали при считывании флуоресценции на сканере для микропланшетов Modulus (Turner Biosystems) в режиме флуоресценции с набором Blue optical в 200 мкл стандартных разведений контрольного белка TurboGFP (rTurboGFP, Evrogen #FP552) в растительном экстракте (контрольный экстракт из образца листьев N.b., инфильтрированных только A17, которые не экспрессировали TurboGFP), приготовленном, как указано в таблице. Каждое разведение считывали в 3 повторах и вычисляли стандартную ошибку среднего (SE) (<0,01×10000 единиц флуоресценции, не представлено). Указанную стандартную кривую использовали для количественного определения концентрации TurboGFP в растворимых экстрактах, приготовленных из инфильтрированного растительного материала, экспрессирующего TurboGFP.
Пример 9: Количественный анализ суммарного растворимого белка
Суммарный растворимый белок в экстрактах определяли с использованием реактива Coomassie-Plus Assay производства Pierce (#24236) при измерении оптического поглощения на сканере для микропланшетов при 595 нм. Экстракты разбавляли 1:10 или 1:20 в воде сверхвысокой очистки и наносили 10 мкл в трех повторах в микропланшет с плоским дном. Стандартную кривую получали на основе серийных разведений бычьего сывороточного альбумина (BSA) в диапазоне концентраций 100-400 мкг/мл. Результаты считали достоверными, если коэффициент вариации (CV) между 3 повторами был ниже 8%.
Результаты
Первый эксперимент инфильтрации выполняли для сравнения эффективности инфильтрации в вакууме (абсолютное значение 50 мбар) со значениями положительного давления в пределах 0,5-2,5 бар (Таблица 3).
Эффективность инфильтрации первоначально оценивали при наблюдении распределения инокулята по поверхности листьев сразу после инфильтрации. При осмотре абаксиальной поверхности листьев, инфильтрированные области выглядели темно-зелеными. На растениях, инфильтрированных в вакууме, почти 100% поверхности всех листьев было однородно инфильтрировано. Растения, инфильтрированные с применением положительного давления в пределах 0,5-1,5 бар, демонстрировали довольно неоднородное распределение прививочного материала по поверхности листьев. Нижние листья были инфильтрированы в меньшей степени. Растения, инфильтрированные с применением положительного давления в пределах 2,0-2,5 бар, показали более равномерное распределение инокулята, хотя инфильтрация не была настолько полной, как на растениях, инфильтрированных в вакууме.
Второй эксперимент проводили с использованием положительного давления в пределах 1,5-3,5 бар (Таблица 4) для улучшения инфильтрации инокулята в лист. Также тестировали добавление 0,01% Triton X-100 в инокулят в комбинации с условиями повышенного давления 2,5 бар. Добавление детергентов, как сообщали, повышало эффективность инфильтрации и Agrobacterium-опосредованной транзиентной экспрессии в нескольких растительных системах. Использовались три контрольных условия: растения инфильтрировали в вакууме при 50 мбар, с или без 0,01% Triton X-100, и с использованием шприца.
В данном втором эксперименте используемые растения достигали более высокой стадии развития (стадия 10, средняя высота 16,5 см, по сравнению со всего 6,5 см в первом эксперименте, что соответствовало стадии 8) с более распустившимися листьями. Растения в целом лучше подвергались инфильтрации, чем в ходе первого эксперимента, даже при минимальном используемом положительном давлении, которое составляло 1,5 бар. Здесь может быть две основных причины: 1) по практическим причинам, размер растений способствовал тому, что все листья были полностью погружены в инокулят в резервуаре повышенного давления, и 2) распустившиеся листья могли подвергаться более эффективной инфильтрации из-за структуры тканей листа, которая отличалась наличием большего межклеточного пространства, что способствует распространению инокулята. Была обнаружена такая же тенденция, какую отмечали и в первом эксперименте, что чем выше избыточное давление, тем более однородной и полной является инфильтрация. Растения, инфильтрированные при 3,0 или 3,5 бар, демонстрировали весьма однородное распределение инокулята, что казалось сопоставимым с результатами растений, инфильтрированных в вакууме. На данном этапе никакого определенного эффекта от применения 0,01% Triton X100 выявить не удалось.
После инфильтрации контролировали фенотип растений в течение фазы восстановления и инкубирования. Во время сбора наблюдали небольшое снижение содержания хлорофилла (количественно не анализировали) в инфильтрированных листьях, то есть их более бледный зеленый цвет, независимо от условий, используемых при инфильтрации. Никаких других обусловленных стрессом признаков, таких как увядание, сильный хлороз или некроз, ни в одном из условий инфильтрации не наблюдали.
Экспрессию TurboGFP в растениях после совместной инфильтрации A91 и A17 регулярно проверяли в ходе фазы инкубирования (начиная с 2 дней после инфильтрации до дня сбора) путем помещения растений в черный ящик под синий свет и наблюдения или визуализации флуоресценции TurboGFP с использованием желтого светофильтра.
Участки листьев, в которых экспрессируется GFP, испускают зеленую флуоресценцию. Участки листьев, в которых GFP не экспрессируется или экспрессируется с низкими концентрациями, выглядят красными вследствие естественной аутофлуоресценции тканей растения.
Относительно всех условий инфильтрации, низкую экспрессию GFP наблюдали уже через 2 дня после инфильтрации, при этом она усиливалась со временем в инфильтрированных листьях, при этом, в то же самое время, растения продолжали развиваться и только что распустившиеся листья на верхушке, которая не подвергалась инфильтрации, не показывали флуоресценции GFP и казались красными. В первом и втором экспериментах (не показан, поскольку из-за размера растений визуализация целых растений технически невозможна) четкие различия в экспрессии GFP наблюдали у растений, инфильтрированных в различных условиях.
Такие различия можно более удобно наблюдать из изображений отделенных листьев, полученных в день сбора. В первом эксперименте для листьев растений, инфильтрированных с использованием минимального избыточного давления (0,5-1,5 бар), наблюдали крайне неоднородную структуру флуоресценции GFP с очень слабой флуоресценцией нижних листьев. У листьев растений, инфильтрированных в вакууме, наблюдали более интенсивную флуоресценцию GFP, чем у листьев растений, инфильтрированных в любом из условий положительного давления, включая максимальное значение 2,5 бар. В данном эксперименте с использованием небольших растений (в среднем высота составляла 6,5 см) лишь малое количество листьев (обычно 4-6) с каждого растения показало флуоресценцию GFP во время сбора, и их собрали для количественного анализа.
Количественный анализ проводили после полной экстракции суммарного растворимого белка из замороженного порошка, полученного из листьев, собранных с каждого растения. Результаты и статистический анализ (таблицы 6 и 7) четко показывают, что экспрессия GFP в растениях, инфильтрированных при положительном давлении, была значительно более низкой, чем в растениях, инфильтрированных в вакууме, даже при максимальном избыточном давлении, используемом в данном эксперименте (2,5 бар). Общую тенденцию также наблюдали: чем выше используемое избыточное давление, тем выше экспрессия GFP в инфильтрированных листьях.
Уже было отмечено, что растения, используемые во втором эксперименте, находились на более высокой стадии развития (Стадия 10, средняя высота 16,5 см) и лучше подвергались инфильтрации, чем растения в первом эксперименте. Это отражалось количеством листьев, эффективно экспрессирующих TurboGFP и собранных с каждого растения, более высоким выходом TurboGFP на единицу биомассы, который в среднем был в два раза выше, чем выход, полученный в первом эксперименте. Важно отметить, что меньшее количество материала собрали с растений, инфильтрированных шприцем, поскольку с помощью такого метода можно было инфильтрировать только распустившиеся листья, что приводило, в общем, к меньшему числу инфильтрированных листьев, чем в случае другого способа. Данные количественного анализа (таблицы 8-10) указывают, что экспрессия TurboGFP в растениях, инфильтрированных при повышенном давлении 3,0 бар, существенно не отличалась от экспрессии в растениях, инфильтрированных шприцем или в вакууме (без Triton). Различия в экспрессии в растениях, инфильтрированных при значениях давления в пределах 2,0-3,0 бар, не были статистически значимыми. Впрочем, значительно более низкую экспрессию GFP наблюдали в растениях, инфильтрированных при 1,5 бар. Добавление 0,01% Triton X-100 к инокуляту привело к значительному, но умеренному увеличению (<15% увеличение в каждом растении) накопления TurboGFP в растениях, инфильтрированных в вакууме. Эффект от добавления 0,01% Triton X-100 в сочетании с положительным давлением 2,5 бар не был столь очевиден.
Таблица 6Анализ различий между условиями с доверительным интервалом 95%
Условие
Среднее
Группы
V50
435,415
A
OP2.5
258,117
B
OP2.0
250,960
B
OP1.5
230,440
B
C
OP1.0
229,236
B
C
OP0.5
167,226
C
Группировка условий инфильтрации, основанная на концентрации GFP, экспрессируемого в мкг GFP на г замороженной массы, с использованием каждой пары t-критерия Стьюдента с доверительным интервалом 95% (уровни, не объединенные одной и той же буквой, отличаются значительно).
Таблица 7Анализ различий между условиями с доверительным интервалом 95%
Категория
LS среднее
Группы
V50
5,083
A
OP2.0
3,213
B
OP2.5
3,106
B
OP1.5
2,740
B
C
OP1.0
2,571
B
C
OP0.5
2,066
C
Группировка условий инфильтрации, основанная на концентрации GFP, экспрессируемого в % СРБ, с использованием каждой пары t-критерия Стьюдента с доверительным интервалом 95% (уровни, не объединенные одной и той же буквой, отличаются значительно).
Таблица 8Анализ различий между условиями с доверительным интервалом 95%
Условие
Среднее
Группы
V50 с Triton
790,751
A
V50
723,700
B
Шприц
649,413
C
OP3.0
627,456
C
D
OP2.5 с Triton
606,548
C
D
OP2.0
601,443
C
D
OP3.5
580,485
D
OP2.5
576,924
D
OP1.5
494,170
E
Группировка условий инфильтрации, основанная на отношении микрограмм GFP/г замороженной массы инфильтрированных листьев, с использованием каждой пары t-критерия Стьюдента с доверительным интервалом 95% (уровни, не объединенные одной и той же буквой, отличаются значительно).
Таблица 9Анализ различий между условиями с доверительным интервалом 95%
Условие
Среднее
Группы
V50 с Triton
18,637
A
V50
15,923
B
OP3.0
14,760
B
C
Шприц
13,777
B
C
OP3.5
13,377
C
OP2.0
13,093
C
D
OP2.5 с Triton
13,065
C
D
OP2.5
12,304
C
D
OP1.5
10,610
D
Группировка условий инфильтрации, основанная на мг GFP на растение, с использованием каждой пары t-критерия Стьюдента с доверительным интервалом 95% (уровни, не объединенные одной и той же буквой, отличаются значительно).
Таблица 10Анализ различий между условиями с доверительным интервалом 95%
Условие
Среднее
Группы
V50 с Triton
9,668
A
V50
8,618
B
Шприц
8,514
B
OP3.0
7,891
B
C
OP2.5 с Triton
7,535
C
D
OP2.0
7,214
C
D
OP2.5
6,857
D
OP3.5
6,679
D
E
OP1.5
5,785
E
Группировка условий инфильтрации, основанная на концентрации GFP в процентах от концентрации СРБ, с использованием каждой пары t-критерия Стьюдента с доверительным интервалом 95% (уровни, не объединенные одной и той же буквой, отличаются значительно).
Заключения
Эффективность повышенного давления в пределах 2,0-3,0 бар для агроинфильтрации целых растений N. benthamiana и транзиентной экспрессии рекомбинантных TurboGFP подобна эффективности применяемого в настоящее время метода вакуумной инфильтрации, когда используемая биомасса достигает стадии развития, используемой в настоящее время для агроинфильтрации (стадия 10, растения возрастом 5-6 недель, высота приблизительно 15 см, хорошо распустившиеся листья и максимум один раскрытый цветок). Эффективность инфильтрации при повышенном давлении была ниже, чем в случае инфильтрации в вакууме, если использовали повышенное давление 1,5 бар или ниже, или когда растения, используемые для инфильтрации, находились на более низкой стадии развитием, то есть стадии 8.
Неблагоприятного эффекта, выражаемого в видимых признаках стресса растений, при использовании положительного давления до 3,5 бар в процессе восстановления и инкубирования после инфильтрации не наблюдали.
С учетом возможности применения специализированного оборудования, повышенное давление потенциально может значительно уменьшать длительность цикла инфильтрации, поскольку повышенное давление, подводимое в резервуар сжатым воздухом, и сама инфильтрация кратковременны (в данном случае положительное давление поддерживали в течение 10 секунд), тогда как полный вакуумный цикл требует в среднем 4-5 минут.
Добавление 0,01% Triton к инфильтрационному раствору не повышало эффективности инфильтрации под действием повышенного давления при тестируемом давлении 2,5 бар. Впрочем, применение данного детергента при такой же концентрации в процессе вакуумной инфильтрации приводило к существенному повышению экспрессии GFP в инфильтрированных листьях.
ЧАСТЬ B: Инфильтрация с применением положительного давления с Nicotiana tabacum
Пример 10: Процедура и способ
Прямое сравнение вакуумной инфильтрации и способов изобретения с применением положительного давления проводили для трех сортов табака. В данном эксперименте проращивали в общей сложности 150 растений табака (по 50 каждого сорта табака) и выращивали в стандартных тепличных условиях: 24°C и 20 часов света. Растения N. tabacum трансформировали культурами Agrobacterium (Agl1), содержащими зеленый флуоресцентный белок TurboGFP в комбинации с супрессором сайленсинга (SoS) из вируса табака. Вакуумную инфильтрацию применяли при использовании стандартного набора условий (50 мбар, время выдерживания 60 секунд) и 7 различных условий положительного давления. В частности, тестировали два фактора - значения положительного давления [1,5-4,5 бар] и число циклов давления ("импульсов") [1-8], при этом продолжительность поддерживания давления/импульса оставляли со значением 1 секунда, чтобы сохранить общую продолжительность процесса на минимальном уровне.
Инфильтрированные растения собирали через 5 дней после инфильтрации и анализировали экспрессию GFP качественно и количественно. Качественные оценки GFP проводили при фотосъемке листьев после инфильтрации при освещении синим светом. Количественный анализ присутствия GFP в листьях определяли с помощью измерения флуоресценции на сканере для микропланшетов Modulus (Turner Biosystems) в режиме флуоресценции с набором Blue optical (возб.: 490 нм/эм.: 510-570 нм). Диски листьев весом приблизительно 80 мг собирали с помощью выбойки с трех листьев на каждом растении (полностью распустившиеся листья из положений 1-3, где 0 обозначает апикальную меристему побега) для всех обработанных растений. Затем образцы с трех листьев одного растения объединяли и растирали в TissueLyser (Qiagen) в течение приблизительно 2,5 минут в присутствии 1 мл буфера для экстракции GFP (50 мМ Трис, 1 мМ ЭДТА, 100 мМ NaCl, 0,2% Triton X-100, pH 7,5). 10 мкл супернатанта разбавляли 1:20 буфером для экстракции GFP, и количественно измеряли флуоресценцию. Концентрацию GFP вычисляли с использованием стандартной кривой, построенной при использовании коммерческого белка tGFP Evrogen. Стандартную кривую получали путем добавления различных количеств контрольного белка TurboGFP (Turbo GFP, Evrogen #FP552) к не содержащим GFP экстрактам листьев, разведенных 1:40 в буфере для экстракции.
10.1 Результаты
Отдельный двухфакторный ANOVA для каждого сорта проводили с целью проверки равенства средних значений флуоресценции и проверки, имеется ли существенное подтверждение взаимодействий и основных эффектов. Существенное подтверждение взаимодействия давления*импульсов для альфа уровня 0,05 (стандартный уровень риска для ошибки I типа) отсутствовало, но имелось существенное подтверждение основных эффектов давления и импульсов для растения 1 и растения 2, и только основного эффекта давления для растения 3. Вычисляли также аддитивную модель, исключив эффект взаимодействия из модели, но без релевантного различия. Растение 1 показало значительно более высокое различие средних значений флуоресценции при давлении 4,5 бар и цикле из 8 импульсов.
Простой ANOVA использовали для сравнения измерений флуоресценции при оптимальных условиях с контрольными измерениями, полученными с применением вакуумного метода (см. таблицу 11). Для растения 2 на основе p-значения и величины вариации в наблюдаемых значениях ответа (R2 и корректированное R2 - см. таблицу 10) было получено, что имеются статистически значимые отличия от контроля.
Таблица 11
Растение 3в сравнении с контролем
Источник
DF
SS
MS
F
P
Давление
1
1103834
1103834
0,10
0,754
Ошибка
8
84243951
10530494
Всего
9
85347785
S=3245
R-Sq=1,29%
R-Sq(корр)=0,00%
Растение 1в сравнении с контролем
Источник
DF
SS
MS
F
P
Давление
1
69691378
69691378
1,21
0,308
Ошибка
7
403771649
57681664
Всего
8
473463026
S=7595
R-Sq=14,72%
R-Sq(корр)=2,54%
Растение 2в сравнении с контролем
Источник
DF
SS
MS
F
P
Давление
1
351389652
351389652
6,74
0,036
Ошибка
7
365030615
52147231
Всего
8
716420267
S=7221
R-Sq=,05%
R-Sq(корр)=41,77%
Сравнение исследовали далее, взяв доверительные интервалы для различия между средними с вероятностью систематической ошибки 0,05 для контроля вероятности ошибки I типа. Оба интервала для давлений 0,05 (вакуум) и 4,5 (повышенное давление) в качестве конечной точки имеют ноль, что указывает на то, что данные различия являются значимыми, причем повышенное давление лучше в данном конкретном случае.
Таблица 12
Растение 2 при оптимальных условиях в сравнении с контролем
Уровень
Нижнее
Центральное
Верхнее
-------+-------+-------+-------+-
0,05
-21753
-12575
0
(-------*---------)
4,50
0
12575
21753
(---------*-------)
-------+-------+-------+---- --+-
-12000
0
12000
24000
Представленные выше наблюдения подтверждаются качественным GFP количественным анализом, в котором можно визуально наблюдать, что более высокое давление и увеличенное число импульсов приводят к повышению экспрессии GFP.
Двумерные контурные графики, показанные на фигурах 2, 3 и 4, показали прогнозируемые значения откликов флуоресценции, обусловленных двумя факторами, на контурном графике откликов в том же диапазоне, что и эксперимент (то есть, нет никаких внешних прогнозов).
10.2 Выводы
Данные демонстрируют значительно более высокие показатели флуоресценции для растения 2 при повышенном давлении 4,5 бар и цикле из 8 импульсов по сравнению с показателями, полученными при использовании вакуумного метода. Три сорта N. tabacum демонстрируют повышение показателей флуоресценции при повышении давления и увеличении числа импульсов, что заставляет прийти к такому выводу, что увеличение давления и числа циклов давления может повысить эффективность инфильтрации.