Способ прогнозирования эффективности терапии больных сахарным диабетом 2 типа
METHOD PREDICTION OF THERAPY EFFECIENCY FOR PATIENTS WITH TYPE 2 SUGAR DIABETES

Изобретение относится к области медицины, а именно к исследованию биологических жидкостей с помощью физических и химических методов исследования, и может быть использовано в эндокринологии для прогнозирования течения и эффективности терапии сахароснижающим препаратом больных сахарным диабетом 2 типа.
Сахарный диабет 2 типа (СД 2 типа) является широко распространенным заболеванием и приравнивается к неинфекционной эпидемии. На сегодняшний день 347 миллионов человек во всем мире больны диабетом (Бюллетень ВОЗ №312, октябрь 2013 года, Danaei G, Finucane MM, Lu Y, Singh GM, Cowan MJ, Paciorek CJ et al. National, regional, and global trends in fasting plasma glucose and diabetes prevalence since 1980: systematic analysis of health examination surveys and epidemiological studies with 370 country-years and 2.7 million participants. Lancet, 2011, 378(9785):31-40). По данным IDF (Международной диабетической ассоциации) к 2030 году будет насчитываться около 439 млн человек с сахарным диабетом. Основной прирост числа больных идет за счет диабета 2 типа, количество которых в 3-4 раза превышает официальные данные (Фармакоэкономика сахарного диабета второго типа/Р.И. Ягудина, А.Ю. Куликов, Е.Е. Аринина. - М.: МИА, 2011. - С. 9-10).
Контроль терапии СД 2 типа на сегодняшний день производится несколькими общепризнанными мировым научным сообществом методами. Они заключаются в определении уровня глюкозы плазмы крови натощак и при глюкозной нагрузке и определении процентного содержания гликированного гемоглобина. Данные, полученные этими способами, являются и показателем декомпенсации углеводного обмена при терапии сахарного диабета (Алгоритмы специализированной медицинской помощи больным сахарным диабетом / Под редакцией И.И. Дедова, М.В. Шестаковой // издание шестое. - М.: ФГБУ ЭНЦ, 2013. - 120 с.). Однако данные способы не применимы для прогнозирования эффективности терапии, а только констатируют факт успешной или, наоборот, неподходящей схемы лечения.
Известен способ прогнозирования эффективности лечения больных хронической ишемией мозга и сахарным диабетом 2 типа фармакологическим препаратом милдронат (РФ Патент №2427367, МПК A61K 31/205, G01N 33/50, опубл. 27.08.2011).
Известный способ осуществляют следующим образом.
Больному хронической ишемией мозга и СД 2 типа до назначения препарата милдронат определяют активность глутатиопероксидазы (ГПО) в эритроцитах крови. При значениях активности ГПО ниже 23,7±2,23 нмоль/мин на 1 мг белка прогнозируют эффективное лечение милдронатом. При значении активности ГПО выше указанной величины - лечение милдронатом не эффективно.
Использование способа, по мнению авторов, обеспечивает возможность индивидуального прогноза эффективности лечения фармакологическим препаратом милдронат больных хронической ишемией мозга и сахарным диабетом 2 типа.
Однако вышеуказанный фармпрепарат обычно применяют в составе комплексной терапии ИБС (стенокардия, инфаркт миокарда), хронической сердечной недостаточности, дисгормональной кардиомиопатии; в составе комплексной терапии острых и хронических нарушений мозгового кровообращения и др. Противопоказанием к приему милдроната является повышение внутричерепного давления, с осторожностью у людей с артериальной гипертонией, так как могут наблюдаться скачки артериального давления. Таким образом, известный фармпрепарат не является сахароснижающим препаратом и предназначен для применения в комплексной терапии. Поэтому говорить о высоком проценте точности прогноза не представляется возможным. Кроме того, уровень ГПО может варьировать в зависимости от многочисленных факторов - возраст, пол, сопутствующих осложнений - в отличие от таких показателей, как генетически маркеры.
За прототип изобретения выбран известный способ прогнозирования эффективности терапии сахарного диабета 2 типа, включающий забор периферической венозной крови, выделение ДНК и проведение полиморфного анализа (РФ патент №2533286, МПК G01N 33|68, опубл. 20.11.2014).
Известный способ осуществляют следующим образом.
2
ДНК выделяют из образцов периферической венозной крови больных сахарным диабетом 2-го типа в 2 этапа. На первом этапе к 4 мл крови добавляют 25 мл лизирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% тритон Х-100, 5 мМ MgCl, 10 мМ трис-HCl (рН 7,6). Полученную смесь перемешивают и центрифугируют при 4°С, 4000 об./мин в течение 20 минут. После центрифугирования надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 4 мл раствора, содержащего 25 мМ ЭДТА (рН 8,0) и 75 мМ NaCl, ресуспензируют. Затем прибавляют 0,4 мл 10% SDS, 35 мкл протеиназы K (10 мг/мл) и инкубируют образец при 37°С в течение 16 часов. На втором этапе из полученного лизата последовательно проводят экстракцию ДНК равными объемами фенола, фенол-хлороформа (1:1) и хлороформа с центрифугированием при 4000 об./мин в течение 10 минут. После каждого центрифугирования производят отбор водной фазы. ДНК осаждают из раствора двумя объемами охлажденного 96% этанола. Сформированную ДНК растворяют в бидистиллированной, деионизованной воде и хранят при -20°С. Выделенную ДНК подвергают полимеразной цепной реакции с использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров. Выявляют полиморфный вариант +250A/G гена лимфотоксина α(Ltα). В случае выявления генотипа +250GG Ltα прогнозируют благоприятное течение сахарного диабета 2-го типа и получение положительного эффекта от проведения терапии пероральными сахароснижающими препаратами.
Изобретение, по мнению его авторов, обеспечивает получение новых критериев оценки течения заболевания и оценку эффективности проводимой терапии у индивидуумов русской национальности, страдающих сахарным диабетом 2 типа.
Недостатком известного способа является то, что не учитывается сам фармакологический препарат. Известно, что пероральные сахароснижающие препараты осуществляют свое воздействие с помощью разных механизмов и влияют на разные звенья патогенеза. Также было доказано, что существуют разные генетические маркеры (Stratified medicine for the use of antidiabetic medication in treatment of type II diabetes and cancer: where do we go from here? (Review) / Emami-Riedmaier A. [et al.] // J Intern Med. - 2015. - Vol. 277. - P. 235-247), ассоциированные с разными препаратами, и список маркеров еще далеко не полон.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является повышение точности прогноза продолжительной эффективности монотерапии сахароснижающим препаратом метформин больных с впервые выявленным сахарным диабетом 2 типа с помощью новых критериев, а именно однонуклеотидного полиморфизма гена эндотелиальной синтезы оксида азота С786Т rs 2070744 и выявления гаплотипа СС или СТ.
Технический результат достигается тем, что в известном способе прогнозирования эффективности терапии сахарного диабета 2 типа, включающем забор периферической венозной крови, выделение ДНК и проведение полиморфного анализа, у пациентов до назначения метформина определяют уровень гликированного гемоглобина и уровень С-пептида, после чего проводят генетическое типирование однонуклеотидного полиморфизма гена эндотелиальной синтазы оксида азота С786Т rs 2070744 и при выявлении гаплотипа СС или СТ прогнозируют эффективность монотерапии метформином в дозе 850 мг 2 раза в сутки и снижение уровня гликированного гемоглобина и возрастание уровня С-пептида относительно исходных уровней за 3 месяца.
Предлагаемое изобретение отвечает критерию изобретения «новизна», так как проведенные патентно-информационные исследования не выявили источники патентной и научно-медицинской информации, которые бы порочили новизну предлагаемого способа, равно как и технических решений с существенными признаками предлагаемого изобретения, что говорит о соответствии предлагаемого изобретения критерии «изобретательский уровень».
Из уровня техники не известна возможность прогноза эффективности монотерапии метформином в зависимости от наличия полиморфного варианта СС и СТ.
Степень компенсации углеводного обмена достигается при помощи различных комбинаций медикаментозной терапии и сочетания диетотерапии с физической активностью. Но не всегда возможно подобрать сразу корректную схему терапии из-за различных индивидуальных особенностей организма и переносимости того или иного лекарства. Эффективность принятой схемы определяется по уровню глюкозы плазмы крови и гликированного гемоглобина.
Известен лекарственный препарат метформин - таблетированное сахароснижающее лекарственное средство класса бигуанидов для приема внутрь. Этот препарат применяется при лечении сахарного диабета 2-го типа, особенно у лиц с избыточным весом и ожирением и при этом сохраненной нормальной функцией почек. Препарат исследован и для других заболеваний, при которых резистентность к инсулину может быть важным фактором. При правильном назначении метформин вызывает мало побочных эффектов (среди которых чаще возникают желудочно-кишечные расстройства) и связан с низким риском гипогликемии. Метформин способствует снижению уровня холестерина ЛПНП и триглицеридов и не связан с увеличением веса, и это единственный антидиабетический препарат, который способен снизить смертность от сердечно-сосудистых осложнений при сахарном диабете. Входит в список важнейших лекарственных препаратов Всемирной организации здравоохранения и назначается в первую очередь при сахарном диабете 2 типа.
Гликированный гемоглобин отражает гипергликемию на протяжении периода жизни эритроцитов до 120 суток. Эритроциты, циркулирующие в крови, имеют разный возраст, поэтому принимается среднее значение - от 60 до 90 суток (Calisti L, Tognetti S. (2005) Measure of glycosylated hemoglobin. Acta Biomed Ateneo Parmense. 76 Suppl 3:59-62).
С-пептид - белок, отщепляющийся от молекулы проинсулина в процессе синтеза инсулина. По количеству С-пептида можно условно судить о сохранности инсулиносекреторной способности β-клеток поджелудочной железы. Количество циркулирующего С-пептида эквивалентно количеству инсулина (Сахарный диабет: диагностика, лечение, профилактика / Под ред. И.И. Дедова, М.В. Шестаковой. - М.: ООО «Издательство «Медицинское информационное агентство»», 2011. - С. 119.: ил.).
Эндотелиальная синтаза оксида азота (eNOS) - одна из синтаз человека, кодируемая геном NOS3 на 7-й хромосоме. Фермент eNOS и ген eNOS3 были описаны в 1992-1993 гг. (Marsden Р.А. et al. Structure and chromosomal localization of the human constitutive endothelial nitric oxide synthase gene // J. Biol. Chem. 1993. Vol. 268. P. 17478-17488). Полиморфизмы гена eNOS определены в 11 местах, 8 из которых выступают в качестве возможных факторов риска сердечно-сосудистых заболеваний. Изученными являются полиморфизм 4а/b интрона, полиморфизм G894T (Glu298Asp) 7-го экзона и полиморфизм С786Т (rs 2070744) промотора гена eNOS. В 2013 г. опубликованы данные об ассоциации eNOS3 4b/a, Т-786С и G894T с МС (Liu C.S. et al. Association between endothelial nitric oxide synthase polymorphisms and risk of metabolic syndrome // Dis. Markers. 2013. Vol. 34, №3. P. 187-197). Полиморфизм G894T имеет различное значение в зависимости от этнической принадлежности пациента (азиаты и европейцы) и имеет неоднозначный характер, в то время как нет функциональных различий ОНП С786Т для разных этнических групп (Association of the genetic variants of endothelial nitric oxide synthase gene with angiographically defined coronary artery disease and myocardial infarction in South Indian patients with type 2 diabetes mellitus / P. Name [et al.] // J Diabetes Complications. - 2013. - Vol. 27(3). - P. 255-261. doi: 10.1016/j.jdiacomp.2012.10.009). Тем не менее, в некоторых исследованиях была выявлена ассоциация генотипа гомозиготы по аллели Т с инсулинорезистентностью у пациентов с СД 2 типа и кардиомиопатиями среди европейцев и японцев, а также с повышенным уровнем глюкозы в крови у жителей Саудовской Аравии (Variants of endothelial nitric oxide synthase gene are associated with components of metabolic syndrome in an Arab population / K.M. Alkharfy, N.M. Al-Daghri, O.S. Al-Attas [et al.] // Endocr J. - 2012. - Vol. 59(3). - P. 253-263. Epub 2012 Jan 12). Было показано, что ОНП С786Т, ОНП Glu298Asp, 4b/a ассоциирован с диабетической нефропатией (Association of endothelial nitric oxide synthase Glu298Asp, 4b/a, and - 786T>C gene variants with diabetic nephropathy I. Ezzidi [et al.] //J Diabetes Complications. - 2008. - Vol. 22(5). - P. 331-338. doi: 10.1016/j.jdiacomp.2007.11.011) и ретинопатией (Endothelial nitric oxide synthase Glu298Asp, 4b/a, and T-786C polymorphisms in type 2 diabetic retinopathy /I. Ezzidi [et al.] // Clin Endocrinol (Oxf). - 2008. - Vol. 68(4). - P. 542-546).
Известно, что метформин ограничивает окислительный стресс, в частности активируя АМФК (АМФ-активируемую протеинкиназу), что приводит к увеличению фосфорилирования эндотелиальной синтазы оксида азота, повышению продукции NO, что в конечном итоге обусловливает компенсацию эндотелиальной дисфункции. Также известно, что метформин является структурным аналогом асимметричного диметиларгинина (АДМА), который подавляет выработку NO, и по механизму конкурентного ингибирования не допускает образования неактивного комплекса «синтаза оксида азота - АДМА», одновременно повышая активность фермента (Bestermann, W.H. Jr. The ADMA-Metformin Hypothesis: Linking the Cardiovascular Consequences of the Metabolic Syndrome and Type 2 Diabetes / W.H. Jr Bestermann // Cardiorenal Med. - 2011 - Vol. 1(4). - P. 211-219).
Информация о возможности прогнозировании эффективности метформина с учетом полиморфизма eNOS3 С786Т (rs 2070744) в доступной литературе отсутствует.
Предлагаемый способ позволяет при персонифицированном применении метформина получить следующий положительный эффект: определение уровня гликированного гемоглобина и уровня С-пептида, проведение типирования однонуклеотидного полиморфизма гена эндотелиальной синтазы оксида азота C786T rs 2070744 и выявление гаплотипа СС или СТ до лечения метформином позволяют с высокой точностью сделать прогноз эффективности лечения метформином больных с впервые выявленным сахарным диабетом 2. Маркером положительного эффекта от проводимой терапии пероральным сахароснижающим препаратом метформин у больных сахарным диабетом 2 типа являются однонуклеотидный полиморфизм гена эндотелиальной синтазы оксида азота C786T rs 2070744 и выявленные полиморфные варианты СС или СТ, что может быть использовано в эндокринологическрх стационарах при обследовании пациентов с сахарным диабетом 2 типа для оптимизации дальнейшей тактики ведения пациентов. При выявлении полиморфного варианта ТТ у пациентов с впервые выявленным сахарным диабетом 2 типа целесообразно назначать препарат метформин сразу в составе комбинированной сахароснижающей терапии.
Для подтверждения высокой точности предлагаемого способа авторами заявки были проведены клинические исследования.
Возможность использования предлагаемого способа для прогноза эффективности терапии сахарного диабета 2-го типа подтверждает анализ результатов наблюдений 80 больных сахарным диабетом и 80 человек популяционного контроля. В исследуемую группу включались индивидуумы русской национальности, с уровнем гликированного гемоглобина от 6,5% до 8,0%, без тяжелых осложнений, требующих интенсифицированной фармакотерапии. Пациенты включались в соответствующую группу больных только после установления диагноза заболевания, подтвержденного с помощью клинических и лабораторно-инструментальных методов обследования. В группу популяционного контроля включались индивидуумы без заболеваний эндокринной системы. В рассматриваемой выборке пациентов установленный диагноз сахарный диабет 2 типа - не более 1 года, а также отсутствие ранее применяемой сахароснижающй терапии. Пациенты находились на диетотерапии.
При проведении исследований выявлено, что у представителей гомозиготы по аллелю 2 (ТТ) отмечен более высокий исходный уровень глюкозы плазмы натощак (ГПН), а у представителей гомозиготы по аллелю 1 (СС) - более низкий исходный уровень гликированного гемоглобина по сравнению с аналогичными показателями у двух других гаплотипов данного ОНП. В то же время исходный уровень С-пептида не отличается у представителей трех гаплотипов (таблица 1).
c
На фиг. 1 представлена динамика гликированного гемоглобина попарно (СС-СТ-ТТ представители), %. (Примечание: HbA1,% - гликированный гемоглобин, * - уровень статистической значимости различий между показателями до и через 3 месяца терапии p<0,05.)
На фиг. 2 представлена динамика С-пептида попарно (СС-СТ-ТТ представители), нг/л. (Примечание: * - уровень статистической значимости различий между показателями до и через 3 месяца терапии (р<0,05.)
В динамике 3 месяцев наблюдения пациентов уровень гликированного гемоглобина и ГПН снижаются статистически значимо во всех подгруппах обследованных (фиг. 1).
1c
Обращает на себя внимание, что у представителей гомозиготы по аллелю 1 (СС) и гетерозиготы (СТ) происходит статистически более выраженное снижение уровня гликированного гемоглобина на 1,05% (р=0,011) и 0,85% (р=0,036) соответственно, при этом у представителей ТТ гаплотипа A HbA составляет 0,37% за 3 месяца наблюдений.
У представителей гомозиготы по аллелю 2 (ТТ) уровень С-пептида (фиг. 2) значимо снижается на 10%, в то время как в подгруппах СС и СТ данный показатель статистически значимо возрастает на 22% и 35% соответственно относительно результатов первого обследования (таблица 1).
1c
При изучении показателей у представителей разных гаплотипов ОНП С786Т гена эндотелиальной синтазы оксида азота установлено, что у пациентов с впервые выявленным сахарным диабетом 2 типа с гаплотипом СС отмечается более низкий исходный уровень гликированного гемоглобина и более высокое содержание ЛПВП по сравнению с гаплотипами СТ и ТТ. Через 3 месяца применения препарата метформин у пациентов всех гаплотипов регистрируется статистически значимое относительно данных первого обследования снижение уровня гликированного гемоглобина, ГПН, а повышение содержания С-пептида - только в подгруппах СС или СТ, тогда как в подгруппе ТТ отмечается снижение данного показателя. Динамика только такого показателя гликемии, как HbA, является более выраженной у представителей СС и СТ гаплотипов по сравнению с аналогичным показателем у гаплотипа ТТ. Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.
Забор и анализ материала проводится стандартно в соответствии с инструкцией [Зорина В.В. Основы полимеразной цепной реакции. - М.: 2012. - 80 с.].
У больного сахарным диабетом 2 типа у пациентов до назначения метформина определяют уровень гликированного гемоглобина и уровень С-пептида. Выделяют ДНК из периферической крови и проводят ПЦР анализ. Осуществляют генетическое типирование однонуклеотидного полиморфизма гена эндотелиальной синтазы оксида азота С786Т rs 2070744 и при выделении гаплотипа СС или СТ прогнозируют эффективность монотерапии метфорнином в дозе 850 мг 2 раза в сутки и снижение уровня гликированного гемоглобина и возрастание уровня С-пептида относительно исходных уровней за 3 месяца.
Примеры конкретного осуществления способа даны в виде выписок из истории болезни
Пример 1.
Пациентка Г. 58 лет. Установленный диагноз СД 2 - 8 месяцев. Целевой уровень гликированного гемоглобина <6,5%. До начала лечения метформином уровень гликированного гемоглобина 7,2%. Глюкоза плазмы натощак (ГПН) - 7,2 ммоль/л. Осложнений нет. Уровень С-пептида - 1,19 нг/мл. Генетическое типирование однонуклеотидного полиморфизма гена эндотелиальной синтазы оксида азота С786Т rs 2070744, определен гаплотип СС. Назначено лечение метформином в дозе по 850 мг 2 раза в сутки. Через 3 месяца проведенной терапии метформином были получены следующие результаты: гликированный гемоглобин 6,0% (снижен), ГПН - 6,3 ммоль/л, С пептид - 2,4 нг/мл (возрастание). Заключение: при использовании метформина у данной пациентки клинико-лабораторная эффективность оптимальная.
Пример 2.
Пациентка Л. 62 года. Установленный диагноз СД 2 - 10 месяцев. Целевой уровень гликированного гемоглобина <6,5%. До начала лечения метформином уровень гликированного гемоглобина 7,4%. Глюкоза плазмы натощак (ГПН) - 7,9 ммоль/л. Осложнений нет. Уровень С-пептида - 2,18 нг/мл. Генетическое типирование однонуклеотидного полиморфизма гена эндотелиальной синтазы оксида азота С786Т rs 2070744, определен гаплотип СТ. Назначено лечение метформином в дозе по 850 мг 2 раза в сутки. Через 3 месяца проведенной терапии были получены следующие результаты: гликированный гемоглобин 6,9% (снижен), ГПН - 6,8 ммоль/л, С пептид - 3,00 нг/мл (возрос). Заключение: при использовании метформина у данной пациентки клинико-лабораторная эффективность оптимальная.
Пример 3.
Пациентка Ч. 57 лет. Установленный диагноз СД 2 - 1 год. До начала лечения метформином уровень гликированного гемоглобина 6,8%. Глюкоза плазмы натощак (ГПН) - 8,0 ммоль/л. Осложнений нет. Уровень С-пептида - 2,9 нг/мл. Генетическое типирование однонуклеотидного полиморфизма гена эндотелиальной синтазы оксида азота С786Т rs 2070744, определен гаплотип ТТ. Назначено лечение метформином в дозе по 850 мг 2 раза в сутки. Через 3 месяца проведенной терапии были получены следующие результаты: гликированный гемоглобин 6,6%, ГПН - 7,2 ммоль/л, С пептид - 2,78 нг/мл. Заключение: при использовании метформина у данной пациентки клинико-лабораторная эффективность минимальна.