Микробная модель Halobacterium salinarum в отборе синтетических аналогов антибиотика турбомицина а, обладающих противоопухолевым действием

Микробная модель Halobacterium salinarum в отборе синтетических аналогов антибиотика турбомицина А, обладающих противоопухолевым действием

А. С. ТРЕНИН, Е. А. ЦВИГУН, О. П. БЫЧКОВА, С. Н. ЛАВРЕНОВ

ФГБУ «НИИ по изысканию новых антибиотиков им. Г. Ф. Гаузе» РАМН, Москва

Microbial Model Halobacterium salinarum in Screening of Synthetic Analogues of Antibiotic Turbomycin A with Anticancer Activity

A. S. TRENIN, E. A. TSVIGUN, O. P. BYCHKOVA, S. N. LAVRENOV

G. F. Gause Institute of New Antibiotics, Russian Academy of Medical Sciences, Moscow

Тест-система, основанная на использовании бактериальной культуры Halobacterium salinarum, разработанная для поиска ингибиторов биосинтеза стеролов и продемонстрировавшая ранее потенциальную возможность отбора противоопухолевый антибиотиков, оказалась эффективной в выявлении противоопухолевый соединений среди трис(1-алкилиндол-3-ил)метилиев — синтетических аналогов антибиотика турбомицина А. Изучение метансульфонатных и хлоридных солей указанной группы соединений с помощью такой тест-системы показало, что при отсутствии заметной активности у большинства испытанных веществ (МПК>32 мкМ) ряд производнык, содержащих N-бутильные и N-пентильные заместители, обладают выдеаженной активностью в отношении H.salinarum. Их МПК составила 8,0 мкМ при полном и 1,0 мкМ при частичном ингибировании роста тест-культуры. Приведённые результаты коррелируют с результатами, полученными в других исследованиях при оценке противоопухолевого действыия указанных соединений с использованием опухолевых клеток. Таким образом, бактериальная тест-система H.salinarum показала свою перспективность в отборе соединений, обладающих противоопухолевым действием.

Ключевые слова: ингибиторы биосинтеза стеролов, антимикробные и противоопухолевые соединения, Archaea, Halobacterium salinarum, микробные модели в поиске антибиотиков, ГМГ-КоАредуктаза, ловастатин, мевалонат, соли трис(1-алкилиндол-3-ил)метилия, турбомицин А.

The microbial test-system based on cultivation of Halobacterium salinarum developed earlier for screening inhibitors of sterol biosynthesis and proposed for screening anticancer antibiotics, proved to be efficient in revealing anticancer compounds among derivatives of tris(1-alkylindol-3-yl)methylium, synthetic analogues of antibiotic turbomycin A. Most of the methane sulfonate and chloride salts of such compounds, investigated with the help of the H.salinarum test-system, showed no activity (MIC>32 mcM), while several derivatives, containing N-butyl or N-pentyl substituents were rather active against the bacterial strain. The MICs of them against H.salinarum were 8 mcM for total and 1 mcM for partial inhibition of the bacterial growth. The results of the study correlated with the results of other investigations that revealed anticancer activity of such compounds in tumor cell cultures. Therefore, the H.salinarum test-system demonstrated its availability for screening compounds with anticancer activity.

Key words: inhibitors of sterol biosynthesis, antimicrobial and anticancer compounds, Archaea, Halobacterium salinarum, microbial models for screening, HMG-CoA reductase, lovastatin, mevalonate, tris(1-alkylindol-3-yl)methylium salts, turbomycin A.

Введение

Для отбора противоопухолевых антибиотиков широко применяются различные модельные тест-системы, основанные главным образом на использовании опухолевых клеток [1—3]. Вместе с тем наличие у отдельных линий опухолевых клеток существенных различий в чувствительности к противоопухолевым препаратам, низкая чувствительность некоторых линий, а также известная сложность в их культивировании, значительно за© Коллектив авторов, 2013

Адрес для корреспонденции: 119021 г. Москва, Большая Пироговская, 11. ФГБУ НИИНА

трудняет их применение в качестве модельных тест-систем, в особенности при проведении масштабного скрининга противоопухолевых антибиотиков среди продуктов микробного вторичного метаболизма [4, 5]. В этом случае значительно более удобным может стать использование микробных тест-культур, менее требовательных к условиям культивирования и действию посторонних примесей, что особенно важно на начальных этапах поисковых работ при анализе грубоочищен-ных экстрактов, получаемых из культуральной жидкости и мицелия микробных продуцентов.

В последнее время большой интерес исследователей привлекает к себе группа архебактерий. Несо-

мненно относящиеся к прокариотному типу, клетки архебактерий, обладают многими биохимическими процессами, отличающими их от эубактерий и сближающими с высшими эукариотными организмами [6, 7]. Они могут быть применены для разработки моделей поиска биологически активных соединений. Несколько видов галофильных архе-бактерий, в первую очередь представители рода Halobacterium, являются отличными модельными организмами, используемыми для изучения многих биологических вопросов, включая поддержание структуры и репликацию хромосом, регуляцию транскрипции, экспорт и деградацию белков [7].

Предложенная тест-система, основанная на использовании бактериальной культуры Halobac-terium salinarum, оказалась малочувствительной к микробному загрязнению. Она показала высокую эффективность в поиске ингибиторов биосинтеза стеролов [8]. Сведения, представленные в настоящем исследовании, показывают, что указанная тест-система может быть с успехом использована для отбора соединений, обладающих выраженным противоопухолевым действием.

Антибиотик турбомицин А был впервые выделен в качестве продукта микробного метаболизма дрожжей Saccharomyces cerevisiae [9]. Этот антибиотик и его аналог турбомицин В удалось также получить с помощью метагеномного подхода путём клонирования в E.coli генетического материала, содержавшегося в образцах почвы [10—12]. В НИИНА им. Г. Ф. Гаузе этот антибиотик и его многочисленные производные получены путём полного химического синтеза [13, 14]. Ранее проведённое изучение антибиотических свойств этих соединений показало наличие у отдельных производных выраженного антибактериального и противогрибкового действия [14, 15].

В настоящем исследовании изучено действие солей производных трис(1-алкилиндол-3-ил)ме-тилия — синтетических аналогов антибиотика тур-бомицина А на бактериальную тест-систему H.sali-narum [8, 16, 17]. Отдельные производные, показавшие высокую активность в отношении указанной микробной модели, были отобраны как потенциальные противоопухолевые антибиотики.

Материал и методы

Реактивы и материалы. В работе использовали препараты антибиотиков зарубежных и отечественных компаний, а также антибиотики, полученные в НИИНА им. Г. Ф. Гаузе, РАМН. Получение и очистка солей трис(1-алкилиндол-3-ил)метилия описаны ранее [13,14].

Используемый в тест-системе препарат лактона D^-ме-валоновой кислоты («Sigma», США) подвергали сапонифика-ции — выдерживали в слабощелочной среде для получения кислотной формы: 1 М раствор лактона в 0,1 н. NaOH инкубировали при 50°С в течение 2 ч, либо при 37°С в течение 4 ч.

Препаратами сравнения служили ловастатин («MSD», США) и бриллиантовый зеленый (оксалат) (ООО «Омская фармацевтическая фабрика», Россия).

Тест-система для выявления противоопухолевых соединений. Работу с бактериальной культурой Halobacterium salinarum (по прежней классификации Halobacterium halobium ATCC 29341) проводили, как описано ранее [8]. Для выращивания культуры H.salinarum использованы следующие питательные среды (в %): среда 1 (NaCl -15,6; MgCl2x6H2O - 1,3; MgSO4x7H2O - 2,0; CaCl2x2H2O - 0,1; KCl - 0,4; NaHCO3

— 0,02; NaBr — 0,05; дрожжевой экстракт — 0,5; глюкоза — 0,1; вода — до 100; рН 7,0); среда 2 (NaCl — 25,0; MgCl2x6H2O

— 2,0; CaCl2x2H2O — 0,02; KCl — 0,2; гидролизат казеина — 0,5; дрожжевой экстракт — 0,5; вода — до 100; рН 7,4); среда 3 (NaCl — 25,0; MgSO4x7H2O — 0,1; K2HPO4 — 0,1; дрожжевой экстракт — 1,0; вода — до 100; рН 7,0—7,2); среда 4 (NaCl — 18,0; MgSO4x7H2O — 0,1; K2HPO4 — 0,1; дрожжевой экстракт

— 1,0; вода — до 100; рН 7,0—7,2). Плотные питательные среды содержали 2% агара.

Выращивание микробной культуры проводили в стерильных 96-луночных полистироловых планшетах с круглым дном, предназначенных для проведения иммунологических реакций («Медполимер», C-Пб.). Объём питательной среды в каждой лунке (пробе) составлял 150 мкл. Инкубирование проводили в термостате при 37°С в течение 5—22 суток. Для предотвращения высыхания проб в термостате создавали условия повышенной влажности.

В качестве посевного материала использовали культуру H.salinarum, выращенную на агаризованных питательных средах в течение 1 недели. Клетки суспендировали в жидкой питательной среде с использованием вибратора «Вортекс ELMI» (Латвия) и разводили питательной средой до нужного объёма. Начальная оптическая плотность посевного материала, контролируемая в микрокалориметре МКМФ-1 (Россия), составляла 0,005—0,015 (в 1 см кюветах при 570 нм).

Препарат мевалоновой кислоты вносили в конечной концентрации 3 мМ непосредственно в питательную среду в начале культивирования.

Исследуемые препараты растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО) с начальной концентрацией 6,4 мМ, в том же растворителе готовили серии двукратных разведений 6400 до 12,5 мкМ и вносили в среду культивирования H.salinarum. При внесении в каждую ячейку препарата из расчёта 1,5 мкл на 150 мкл среды конечное содержание ДМСО в эксперименте не превышало 1%. Концентрацию препаратов рассчитывали в мкМ.

Каждый препарат в эксперименте присутствовал не менее чем в трёх повторах. В панель эксперимента в качестве контроля включали лунки, не содержащие тестируемых препаратов или растворителя.

Оценку роста проводили фотометрически с помощью микроплейтфотометра вертикального сканирования (ИФКО-2, Россия) после перемешивания содержимого лунок, а также визуально, оценивая рост клеток H.salinarum в виде плотного осадка красного цвета на дне лунки [8].

МПК определяли как минимальную концентрацию препарата, полностью предотвращающую рост тест-организма (МПК-1, шкала роста = 0). Для выявления тонких различий между препаратами в ряде случаев МПК оценивали как минимальную концентрацию, при которой допускался умеренный (50% от уровня контроля) (МПК-2, шкала роста = 2) рост тест-организма [18].

Статистическая обработка результатов исследований проводилась с использованием компьютерных программ Statgraf и Microsoft Ехсе!, рассчитывая средние арифметические значения, доверительные интервалы и стандартное отклонение. Достоверность различий между средними величинами оценивали с использованием t-критерия Стьюдента (р<0,05).

Результаты исследований

При проведении поиска биологически активных соединений с использованием тест-системы H.salinarum было показано, что ингибиторы био-

синтеза стеролов выявляются в ней как соединения, подавляющие рост тест-культуры. Применение мевалоновой кислоты позволяло уже на начальных этапах поиска успешно выявлять метаболиты, способные к подавлению ранних этапов биосинтеза стеролов [8, 17]. Вместе с тем модель оказалась чувствительной также к большинству противоопухолевых антибиотиков, что позволило высказать предположение о возможности её использования для отбора противоопухолевых препаратов [8]. В настоящем исследовании оценивается действие на модель H.salinarum новых антибиотиков — солей трис(1-алкилин-дол-3-ил)метилия — синтетических аналогов антибиотика турбомицина А.

Турбомицин А состоит из трёх индольных циклов, связанных воедино центральным атомом углерода, имеющим одну незаполненную связь, что позволяет рассматривать его в качестве триа-рильного катиона.

В НИИНА им. Г. Ф. Гаузе получены разнообразные синтетические аналоги турбомицина

Активность солей производных трис(1-алкилиндол-3 narum в сравнении с ловастатином и бриллиантовым

А [13]. Эти соединения, также являющиеся три-арильными катионами, получены в виде стабильных солей, среди которых наилучшей растворимостью в воде обладают метансульфонаты. Степень чистоты указанных соединений превышала 95%. Необходимо было установить, обладают ли эти соединения активностью в отношении H.salinarum.

В экспериментах с H.salinarum обнаружено, что некоторые соединения обладают способностью к подавлению роста тест-культуры (таблица). Наиболее активно рост H.salinarum подавляли соединения 1e, 1f, 1g, и 1h. Их действие на тест-культуру было сопоставимо с действием бриллиантового зеленого и в высокой концентрации приводило к лизису клеток тест-культуры. В отличие от ловастатина, подавление роста H.salinarum, вызванное солями трисиндолилметилия, не снималось, а в случае соединений 1e, 1f, и 1g даже несколько усиливалось в присутствии мева-лоновой кислоты.

-ил)метилия в отношении микробной культуры H.sali-

зеленым

Соединение R Название заместителя МПК, мкМ

МПК-1» МПК-22)

1a 1b 1c 1d 1e 1f

1g 1h

1i 1j

1k 1m

-H -CH3 -CH2CH3 -CH2CH2CH3 -CH2CH2CH2CH3 — CHCHjCHj

I

CH3

-CH2(CH2)3CH3 CH,

—СН7СЙХН

\h

-CH2(CH2)4CH3

Метил Этил n-Пропил n-Бутил втор-Бутил

n-Пентил Изоамил

n-Гексил Бензил

ч f

-С10Н21 —а

' * * ©

Ловастатин Бриллиантовый зеленый

n-Децил

Л?-Диметиламинопропил гидрохлорид

>64 >64 >64 >64 8 8

>64 >64

>64 >64

>64 >64 >64 32 1 1

32 64

>64 >64

0,7 1

Примечание.1 МПК-1 - определена как минимальная концентрация препарата, полностью предотвращающая рост тест-культуры; 2) МПК-2 - определена как минимальная концентрация препарата, при которой происходит подавление роста на 50%.

Активность бутильных и пентильных производных, обладающих разветвленными радикалами (соединения 1f и 1h), оказалась примерно на таком же высоком уровне, что и активность соответствующих им соединений, несущих неразветв-ленные радикалы с тем же количеством атомов углерода (С4 и С5) (соединения 1e и 1g).

Результаты, полученные в тест-системе H.sali-narum, чувствительной к противоопухолевым антибиотикам, позволяют высказать предположение о том, что соли трис(1-алкилиндол-3-ил) метилия, имеющие бутильные и пентильные радикалы (С4 и С5), обладают противоопухолевым действием. Впоследствии это предположение нашло подтверждение в экспериментах с культурами опухолевых клеток in vitro.

Обсуждение результатов

Действие производных трисиндолилметилия было изучено в других работах с использованием различных линий опухолевых клеток [13, 14]. Обнаружилось, что цитотоксичность солей трис(1-алкилиндол-3-ил)метилия в отношении опухолевых клеток зависит от длины заместителя при атоме азота гетероцикла и возрастает от незамещённого по атому азота производного (соединение 1а, аналог антибиотика турбомицина А) до N-бутил- и N-пентилпроизводных (соединения 1e и 1g). Дальнейшее увеличение длины N-алкильного заместителя приводило к уменьшению цитоток-сичности. При этом соли трис(1-алкилиндол-3-ил)метилия оказались значительно менее токсичными в отношении использованных линий неопухолевых клеток (лимфоциты здоровых доноров и клеточной линии эндотелия сосудов мыши SVEC-4-10), чем в отношении опухолевых клеток. В экспериментах на мышах показано противоопухолевое действие соединения 1g in vivo [13, 14].

Можно высказать предположение, что механизм гибели опухолевых клеток под воздействием солей трис(1-алкилиндол-3-ил)метилия связан с процессами апоптоза. Наиболее активные соединения 1e и 1g в концентрации 1 мкМ вызывали апоптоз примерно половины опухолевых клеток линии Jurkat в культуре. В аналогичных условиях трис(1-бензилиндол-3-ил)метилий (соединение 1j) вызывал апоптотическую гибель свыше 80% клеток. Под действием соединения 1g отмечены характерные для апоптоза нарушения целостности ДНК, в частности деградация клеточных ядер [14].

Соли трис(1-алкилиндол-3-ил)метилия проявили также способность к воздействию на гете-родимерный белок NF^, вовлечённый в регуляцию апоптоза. Как известно, в активированном состоянии этот белок транслоцируется в ядро, где активирует транскрипцию различных генов, в том числе ингибиторов апоптоза. Выяснилось,

что соли трис(1-алкилиндол-3-ил)метилия, в частности соединения 1е и использованные в нетоксических концентрациях, значительно снижают уровень субъединицы р65 белка МБкВ, способствуя тем самым развитию апоптоза и гибели опухолевых клеток [14].

Таким образом, было выявлено противоопухолевое действие солей трис(1-алкилиндол-3-ил)метилия, предсказанное на основании результатов их изучения в бактериальном тесте Н^аИпатит, а указанная микробная модель, в свою очередь, подтвердила свою способность к выявлению не только ингибиторов биосинтеза стеролов, но и противоопухолевых антибиотиков. При этом закономерность в изменении активности в зависимости от длины радикала в отношении опухолевых клеток в целом совпадала с той зависимостью, которая наблюдалась при изучении действия солей трис(1-алкилиндол-3-ил)метилия на грибные и бактериальные культуры [14, 15], что, по-видимому, свидетельствует об общности механизмов цитотоксичности этих соединений для клеток про- и эукариотов.

Тот факт, что соединения, несущие разветвленные бутильные и пентильные радикалы (соединения И и 1Ь), обладают не менее высокой активностью в отношении Н^аИпагит, чем соединения с неразветвлёнными радикалами (1е и позволяет высказать предположение о том, что они также могут обладать противоопухолевой активностью. Такие соединения нуждаются в дальнейшей проверке и детальном изучении с применением культур опухолевых клеток.

Несомненно, архебактерии (АсИаеа) являются уникальной группой микроорганизмов. Способные к росту в экстремальных условиях внешней среды, в условиях повышенной концентрации соли, они встречаются всюду, где оказываются подходящими температура, рН и концентрация №С1: в природных солёных водоёмах, бассейнах для выпаривания соли, белковых материалах, консервируемых с помощью соли (рыба, мясо, шкуры) и т. д. Их сходство по многим параметрам с высшими эукариотными организмами несомненно вызывает повышенный интерес [6, 7].

Синтез липидов, осуществляемый галобакте-риями по мевалонатному, а не по более обычному для бактерий малонатному пути, позволяет рассматривать культуру Н.тИпагит в качестве уникальной и вместе с тем весьма удобной биологической модели, предоставляющей хорошую возможность проведения поиска микробных метаболитов — ингибиторов биосинтеза стеролов и параллельного изучения действия препаратов, способных к подавлению ГМГ-КоА редуктазы [8, 16, 19, 20].

Отличие белков галобактерий от белков нега-лофильных организмов, связанное с высоким содержанием кислотных остатков и низким содер-

жанием основных, приводит к резкому снижению изоэлектрической точки белков и, как результат, к их адаптации к высокой концентрации соли, что позволяет при исследовании белков галобактерий лучше понять функционирование соответствующих им белков млекопитающих [7].

Важной отличительной особенностью гало-бактерий является также то, что их клеточные стенки не содержат диаминопимелиновой и му-рамовой кислот, а состоят главным образом из липопротеида. Таким образом, клеточная стенка галобактерий, представляющая собой поверхностный монослой (S-слой), сформированный из идентичных гексагональных гликопротеиновых субъединиц, имеет белковую природу [21].

При биосинтезе S-слоя те модификации, которым подвергается первоначально синтезируемый незрелый предшественник (в первую очередь изопренилирование), происходят только после транслокации белка через плазматическую мембрану. Этот факт позволяет провести чёткую па-

ЛИТЕРАТУРА

1. Сазыкин Ю.О., Бибикова М.В., Иванов В.П. и др. Технология скрининга вторичных микробных метаболитов: к эволюции методологии. Антибиотики и химиотер 2002; 47: 10: 25—31.

2. Koehn F.E. High impact technologies for natural products screening. Prog. Drug Res 2008; 65: 177—210.

3. Zanella F, Lorens J.B., Link W. High content screening: seeing is believing. Trends Biotechnol 2010; 28: 5: 237—245.

4. Brana M.F., Sanchez-Migallon A. Anticancer drug discovery and pharmaceutical chemistry: a history. Clin. Transl. Oncol 2006; 8: 10: 717—728.

5. Sharma S.V., Haber D.A., Settleman J. Cell line-based platforms to evaluate the therapeutic efficacy of candidate anticancer agents. Nat Rev Cancer 2010; 10: 4: 241—253.

6. Ventosa A., Nieto J.J., Oren A. Biology of moderately halophilic aerobic bacteria. Microbiol Mol Biol Rev 1998; 62: 2: 504—544.

7. Soppa J. From genomes to function: Haloarchaea as model organisms. Microbiology 2006; 152: 3: 585—590.

8. Тренин А.С. Микробная модель Halobacterium salinarum для поиска ингибиторов биосинтеза стеролов. Антибиотики и химиотер 2013; 58: 5—6: 3—10.

9. Budzikiwicz H, Eckau H, Ehrenberg M. Bis (3-indolyl-)-3H-indolyli-den-methan, ein von Saccharomyces cerevisiae Gebildeter Farbstoff. Tetrahedron Lett 1972; 36: 3807-3810.

10. Gillespie D.E., Brady S.F., Bettermann A.D. et al. Isolation of antibiotics turbomycin A and B from a metagenomic library of soil microbial DNA. Appl Environ Microbiol 2002; 68: 9: 4301—4306.

11. Handelsman J. Metagenomics: application of genomics to uncultured microorganisms. Microbiol Mol Biol Rev 2004; 68: 4: 669—685.

12. Brady S.F., Simmons L, Kim J.H., Schmidt E.W. Metagenomic approaches to natural products from free-living and symbiotic organisms. Nat Prod Rep 2009; 26: 11: 1488—1503.

13. Lavrenov S.N., Luzikov Y.N., Bykov E.E. et al. Synthesis and cytotoxic potency of novel tris(1-alkylindol-3-yl)methylium salts: role of N-alkyl substituents. Bioorg Med Chem 2010; 18; 18: 6905—6913.

14. Степанова Е.В., Штиль A.A., Лавренов С.Н. и др. Соли трис(1-ал-килиндол-3-ил)метилия — новый класс противоопухолевых соединений. Извест Акад наук. Сер хим 2010; 12: 1—9.

раллель с эукариотическими клетками, где липид-ная модификация белков происходит также после их транслокации через мембрану эндоплазмати-ческого ретикулюма [22—24]. Приведённые факты, совместно с результатами, представленными в предыдущих работах [8, 25], а также в настоящем исследовании относительно чувствительности H.salinarum к соединениям, обладающим противоопухолевым действием, заставляют думать о существовании возможного сходства галобактерий с опухолевыми клетками.

Заключение

Таким образом, полученные данные ярко демонстрируют потенциальные возможности модели H.salinarum в оценке биологически активных соединений, а также целесообразность её применения в дальнейшем поиске антибиотиков, имеющих различный механизм действия, в том числе соединений, обладающих противоопухолевой активностью.

15. Тренин A.C., Лавренов С.Н., Преображенская М.Н. Фунгицидное действие новых производных трииндолилметана: роль n-алкиль-ных заместителей в проявлении активности препаратов. Иммунопатология, аллергология, инфектология. Труды междисципл. микол. форума: Новые антимикотики и перспективные фунгициды. 2010; 1: 229.

16. Тренин A.C., Цвигун E.A., Терехова Л.П. и др. Микробные модели в поиске ингибиторов биосинтеза атеросклероза. Тез. докл. 1 Все-росс. конференции по проблемам атеросклероза. М.: 1999; 167.

17. Тренин A.C. Микробные модели для поиска ингибиторов биосинтеза стеролов. Антибиотики и химиотер 2013; 58: 7—8: 3—11.

18. Wayne P. A. 2002. Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of filamentous fungi; Approved Standard. NCCLS Document M38-A. NCCLS. ISBN 1-56238-470-8.

19. Cabrera J.A., Bolds J., Shields P.E. et al. Isoprenoid synthesis in Halobacterium halobium. Modulation of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme a concentration in response to mevalonate availability. J Biol Chem 1986; 261: 8: 3578—3583.

20. Fitch M.E., Mangels A.R., Altmann W.A. et al. Microbiological screening of mevalonate-suppressive minor plant constituents. J Agric Food Chem 1989; 37: 687—691.

21. Jarrell K.F., Jones G.M., Kandiba L. et al. S-Layer glycoproteins and flagellins: reporters of archaeal posttranslational modifications. Archaea. 2010. Jul 20. Published online. Режим доступа: http://www.ncbi.nlm. nih.gov/pmc/articles/PMC2913515.

22. Eichler J. Facing extremes: archaeal surface-layer (glyco)proteins. Microbiology 2003; 149: 12: 3347—3351.

23. Eichler J., Adams M.W. Posttranslational protein modification in Archaea. Microbiol Mol Biol Rev 2005; 69: 3: 393—425.

24. Eichler J., Maupin-Furlow J., Soppa J. Archaeal protein biogenesis: posttranslational modification and degradation. Archaea. 2010. Sep 30. pii: 643046. Режим доступа: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/arti-cles/PMC2948886.

25. Sioud M, Baldacci G, Forterre P., de Recondo A.M. Antitumor drugs inhibit the growth of halophilic archaebacteria. Eur J Biochem 1987; 169: 2: 231—236.