СРЕДСТВО ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЙ ШЕЙКИ МАТКИ, АССОЦИИРОВАННЫХ С ВИРУСОМ ПАПИЛЛОМЫ ЧЕЛОВЕКА, В ВИДЕ ВАГИНАЛЬНЫХ КАПСУЛ
MEDICINE FOR TREATMENT OF UTERUS NECK DISEASES, ASSOCIATED WITH HUMAN PAPILLOMA VIRUS, IN FORM OF VAGINAL CAPSULES

Изобретение относится к медицине, в частности к гинекологии, и может найти применение для лечения предраковых и раковых заболеваний шейки матки. В настоящее время можно считать доказанной роль ВПЧ в развитии остроконечных кондилом и цервикального рака. Оказалось, что в большинстве случаев во всем мире (65-77%) выявляются вирусы папилломы человека - ВПЧ 16/18 типов, относящихся к вирусам высокого онкогенного риска.
Распространение инфекции происходит преимущественно половым путем, достигая максимума инфицирования до 30 лет. Более 50% сексуально активного населения мира в течение жизни инфицируется вирусом папилломы человека, и это является «первичным» событием в патогенезе РШМ. Большинство случаев инфицирования заканчивается спонтанным выздоровлением. Однако в некоторых случаях развивается персистирующая инфекция, способная запускать механизмы клеточной трансформации эпителиальных клеток. Так при CIN 1 наблюдается активная репликация вируса и его бессимптомное выделение. Превращение CIN 1 в инвазивный рак происходит с большой частотой и, как правило, сопровождается интеграцией вирусной ДНК в геном клетки хозяина [Киселев В.И. (2004) Вирусы папилломы человека в развитии рака шейки матки. - М.: Компания «Димитрейд График Групп»].
ВПЧ высокой степени онкогенного риска (преимущественно 16 и 18 типов) обнаруживают в 50-80% образцов умеренной и тяжелой дисплазии плоского эпителия шейки матки и в 90% инвазивного рака. Важным обстоятельством является то, что клинические проявления ВПЧ-инфекции не обнаруживаются достаточно длительное время, однако последствия персистенции вируса от этого не становятся более легкими. Развитие легкой и умеренной дисплазии в тяжелую происходит, соответственно, в 10 и 20% случаев.
В связи с простотой организации вирусного генома оказалось довольно сложно разработать лекарственное средство, избирательно ингибирующее репродукцию вируса. По этой причине основные усилия направлены на создание вакцинных препаратов, так как хорошо обоснована роль иммунитета в спонтанной регрессии клинических проявлений вирусной инфекции.
В патенте РФ №2229307 описана разработка вакцины на основе гибридных белков Е7 и Hsp 70 М.tuberculosis. Авторы описывают инъекционную лекарственную форму, с помощью которой удается добиться регрессии опухолей индуцированных вирусом на экспериментальных моделях с перевиваемыми опухолями. Продемонстрированная эффективность вакцинации на этих моделях подтверждает правильность выбора белка Е7 как молекулярной мишени, против которой индуцируются иммунные реакции.
В заявке на патент №2008146809 от 27.11.08 описана рекомбинантная композиция белков Е7 вируса папилломы человека 16 и 18 типов, соединенных с аминокислотной последовательностью белка теплового шока м.м. 70 кДа из М.tuberculosis в виде вагинальных суппозиториев. Недостатками данной композиции является использование масла какао и твердого жира типа А в качестве основы для суппозиториев, так как данные основы не стабильны при высоких температурах, дают метастабильные модификации и не могут быть использованы повторно на стадиях технологического процесса, что значительно повышает стоимость производства. Также в данной заявке не рассмотрены вопросы стабильности рекомбинантной композиции белков Е7 вируса папилломы человека 16 и 18 типов, соединенных с аминокислотной последовательностью белка теплового шока м.м. 70 кДа из М.tuberculosis в суппозиториях.
В патенте РФ 2377305 описаны мукозальные вакцины местного применения при заболеваниях, ассоциированных с вирусом папилломы человека, в том числе рака шейки матки. Отмечается, что вакцина в комплексе с хитозаном может использоваться в виде суппозиториев состава:
- раствор рекомбинантных белков, E716-Hsp 70, E718-Hsp 70;
- Хитозан со степенью деацетиллирования 86%;
- ПЭГ 1500;
- твердый жир типа А;
- витепсол HW;
- TRIS фирмы МР Biomedicals Inc. cat. 195605.
Данный источник не раскрывает конкретно капсульную форму, но близок по эффекту и составу, поэтому он может быть указан в качестве наиболее близкого аналога-прототипа.
Желатиновые капсулы для вагинального применения более перспективны по сравнению с суппозиториями с технологической, биофармацевтической и экономической точек зрения. Желатиновая оболочка предохраняет лекарственные вещества от воздействия факторов внешней среды. В частности, они выдерживают температуры более 40 градусов в отличие от свечей.
Высвобождение лекарственного вещества происходит быстрее и легче, чем у суппозиториев, так как под влиянием слабощелочной среды (рН 7,3-7,6) слизистых оболочек желатиновые оболочки набухают, и в таком состоянии даже слабого воздействия на них достаточно для ее разрыва и высвобождения содержимого. Количество лекарственного вещества в капсуле, оказывающее необходимый терапевтический эффект, может быть значительно выше, чем в суппозиториях.
Таким образом, производство вагинальных средств на основе белков в желатиновой оболочке позволяет значительно расширить ассортимент средств для лечения заболеваний шейки матки, ассоциированных с вирусом папилломы человека.
Задачей данного изобретения является создание средства, эффективного в применении, исключающего инъекционный путь введения как травматичный и небезопасный, а также обеспечивающего стабильность рекомбинантных белков, входящих в его состав, на протяжении длительного времени в различных климатических регионах.
Задача решается вагинальной мягкой желатиновой капсулой, которая содержит рекомбинантную композицию белков Е7 вируса папилломы человека 16 и 18 типов, соединенных с аминокислотной последовательностью белка теплового шока м.м. 70 кДа из М.tuberculosis, желатин, глицерин, моноглицериды дистиллированные, воду очищенную, хитозан со степенью деацетилирования 86%, лактозу, декстран 40000, консервант, масло растительное, при следующем сочетании компонентов на 1 капсулу, вес.ч.:
- Рекомбинантная композиция белков Е7 вируса папилломы человека 16 и 18 типов, соединенных с аминокислотной последовательностью белка теплового шока м.м. 70 кДа из:
М.tuberculosis
3,0-6,0
- Желатин
10,0-12,5
- Глицерин
20,0-30,0
- Моноглицериды дистиллированные
0,35-0,65
- Вода очищенная
30,6-36,0
- Хитозан со степенью деацетилирования 86%
18,0
- Лактоза
50,-100,0
- Декстран 40000
150,0-200,0
- Консервант
5,0-10,0
- Масло растительное
до 1000
Желатин, глицерин и моноглицериды дистиллированные и вода очищенная используются для формирования оболочки капсулы. В заявленном соотношении они обеспечивают необходимую структурную целостность и эластичность оболочки. При изменении соотношения оболочка либо не формируется, либо время ее распадаемости превышает 30 минут.
Хитозан со степенью деацетилирования 86%, консервант, лактоза, декстран 40000 и масло растительное используются для формирования внутреннего содержимого капсулы. В заявленном соотношении они образуют суспензию с рекомбинантной композицией белков Е7 вируса папилломы человека 16 и 18 типов, соединенных с аминокислотной последовательностью белка теплового шока м.м. 70 кДа из М.tuberculosis, обладающую необходимой консистенцией для задержки рекомбинантной композиции белков на клетках слизистой влагалища в течение необходимого времени для проявления терапевтического эффекта.
Хитозан со степенью деацетилирования 86% способен усиливать абсорцию гидрофильных соединений, например белковых и пептидных лекарственных препаратов, на эпителии. Он увеличивает проницаемость апикальных клеточных мембран и перераспределяет белки цитоскелета вследствие своей катионной природы. Его взаимодействие с клеточной мембраной приводит к структурной реорганизации белков, связанных с плазматическими мембранами, что, в свою очередь, увеличивает проницаемость для лекарственных препаратов.
Кроме того, введение хитозана со степенью деацетилирования 86% в состав лекарственных препаратов с белковыми соединениями обеспечивает повышение их стабильности в лекарственной форме за счет образования комплекса между белком и хитозаном.
В качестве консерванта используют любые физиологически приемлемые консерванты, проявляющие антигрибковое и антибактериальное свойства. Предпочтительно в качестве консерванта могут быть использованы нипагин, нипазол, бензалконий хлорид и т.п.
В качестве растительного масла может быть использовано оливковое, подсолнечное, соевое и другие масла. Предпочтительно используется соевое масло. Капсулы готовят общепринятыми в фармации методами. Например, следующим образом.
Желатин в реакторе заливают водой (температура 15-18°С) на 1,5-2 часа, затем расплавляют его при t=45-75°С при перемешивании в течение 1 часа, добавляют глицерин, моноглицериды дистиллированные и воду, продолжая перемешивание еще 30 мин. Затем отключают обогрев и мешалку, оставляют массу в реакторе на 1,5-2 часа с подключением вакуума для удаления из массы пузырьков воздуха. Приготовленную массу передают в термостат и выдерживают при t=60°C для стабилизации 2,5-3 часа. Готовят суспензию рекомбинантной композицией белков Е7 вируса папилломы человека 16 и 18 типов, соединенных с аминокислотной последовательностью белка теплового шока м.м. 70 кДа из М.Tuberculosis, хитозана со степенью деацетилирования 86%, консерванта, лактозы, декстрана 40000 и масла растительного. Наполняют капсулы с помощью дозатора. Дозатор представляет собой поршневой насос с регулятором объема рабочего цилиндра и электронным регулятором паузы. При всасывающем ходе поршне дозатора жидкость попадает в шприц. При обратном ходе она выталкивается в резиновую трубку, которая заканчивается пипеткой, которую вводят в пустые оболочки. После наполнения желатиновые капсулы тотчас поступают на запайку. Проверяют качество запайки. Сушат капсулы в шкафу с принудительной циркуляцией воздуха при t=+23…+26°С в течение 20 часов. Шлифуют капсулы.
Предлагаемая лекарственная форма и соотношение действующих и вспомогательных веществ обеспечивают необходимое качество и эффективное терапевтическое действие, а также удобство применения.
Предлагаемые средства отвечают всем требованиям, предъявляемым к лекарственным формам: высокая биодоступность и стабильность активных ингредиентов, термо- и коллоидная стабильность, удобство применения.
Пример 1
Состав мягкой капсулы
- Рекомбинантная композиция белков Е7 вируса папилломы человека 16 и 18 типов, соединенных с аминокислотной последовательностью белка теплового шока м.м. 70 кДа из:
М.tuberculosis
4,0
- Желатин
10,0
- Глицерин
30,0
- Моноглицериды дистиллированные
0,65
- Вода очищенная
30,6
- Хитозан со степенью деацетилирования 86%
18,0
- Лактоза
70,0
- Декстран 40000
180,0
- Нипагин
7,0
- Масло соевое
до 1000
Пример 2
Состав мягкой капсулы
- Рекомбинантная композиция белков Е7 вируса папилломы человека 16 и 18 типов, соединенных с аминокислотной последовательностью белка теплового шока м.м. 70 кДа из:
M.tuberculosis
6,0
- Желатин
12,5
- Глицерин
25,0
- Моноглицериды дистиллированные
0,55
- Вода очищенная
36,0
- Хитозан со степенью деацетилирования 86%
18,0
- Лактоза
100,0
- Декстран 40000
150,0
- Лимонная кислота
5,0
- Масло оливковое
до 1000
Пример 3
Сравнительное исследование стабильности рекомбинантных белков Е7-16-Hsp и E7-18-Hsp
Определение содержания рекомбинантных белков проводили методом иммуноферментного анализа, описанного в статье «Разработка диагностической системы для определения онкобелков Е7 вируса папилломы человека 16-го и 18-го типов методом твердофазного иммуноферментного анализа» Киселев В.И., Солопова О.Н., Свешников П.Г и другие. Молекулярная медицина, 2010, №2, стр.52-57.
Стабильность рекомбинантных белков в различных лекарственных формах. Хранение при комнатной температуре
Суппозитории
Капсулы по примеру 1
Сроки измерений (дни)
Е7-16 (мкг)
Е7-18 (мкг)
Е7-16 (мкг)
Е7-18 (мкг)
250
250
250
250
1
154
120
250
250
14
110
70
210
200
30
60
40
180
160
60
50
35
100
90
90
Пример 4
Результаты фармакокинетических исследований
Исследования проведены на экспериментальных животных (кроликах) в соответствии с Каркищенко Н.Н., Хоронько В.В., Сергеева С.А. «Фармакокинетика», Ростов, 2001.
Было установлено, что максимальный уровень концентрации рекомбинантного белка E7-16-Hsp 70 (в пределах 180-250 нг/мл) в крови экспериментальных животных при интравагинальном введении достигается через час после интравагинального введения в дозе, соответствующей составу капсул по примеру 1, в то время как при инъекционном пути введения этот показатель составляет 0,5 часа при той же величине концентрации.
Длительность действия препарата в капсулах составляет около 10.5 часов. Данные фармакологических испытаний подтверждают сохранение фармакологических свойств активного начала. Состав может быть эффективно применен для лечения различных ассоциированных с вирусом папилломы человека заболеваний шейки матки, таких как дисплазия, рак шейки матки, кандиломы.