СПОСОБЫ РАФИНИРОВАНИЯ МАСЛА

1. Способ гидратации негидратируемых фосфолипидов в масле, включающий:
i-a) смешение водного раствора кислоты с маслом с получением кислотной смеси, имеющей pH менее чем приблизительно 4; и
i-b) смешение основания с кислотной смесью с получением прореагировавшей смеси, имеющей pH приблизительно 6-9, где смешение на стадиях i-a) и/или i-b) обеспечивает эмульсию, которая содержит по меньшей мере приблизительно 60% водной фазы по объему с размером капель приблизительно 15 мкм до приблизительно 45 мкм.
2. Способ по п.1, в котором эмульсия содержит по меньшей мере приблизительно 90% водной фазы по объему с размером капель приблизительно 15-40 мкм.
3. Способ по п.1, в котором кислота выбрана из группы, состоящей из фосфорной кислоты, уксусной кислоты, лимонной кислоты, виннокаменной кислоты, янтарной кислоты и их смеси.
4. Способ по п.1, в котором pH кислотной смеси на стадии i-a) составляет от приблизительно 1 до приблизительно 4.
5. Способ по п.1, в котором pH реакционной смеси на стадии i-b) составляет от приблизительно 6 до приблизительно 9.
6. Способ по п.1, дополнительно включающий стадию рафинирования гидратацией или ферментативного рафинирования с получением рафинированного масла.
7. Способ по п.6, в котором фермент выбран из фосфолипазы A, фосфолипазы C, фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы C или их комбинации.
8. Способ по п.6, в котором фермент выбран из фосфолипазы C, фермента, содержащего SEQ ID NO: 8, или их комбинации.
9. Способ по п.6, в котором фермент содержит SEQ ID NO: 8.
10. Способ по п.7, в котором фермент фосфолипаза кодируется выделенной, синтетической или рекомбинантной нуклеиновой кислотой (полинуклеотидом), содержащей последовательность нуклеиновой кислоты:
(a) кодирующую полипептид, имеющий активность фермента фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы C (PI-PLC), и
(i) обладающую по меньшей мере приблизительно 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более, или 100% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 5 и кодирующей полипептид, имеющий по меньшей мере одно, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать, пятнадцать, шестнадцать, семнадцать, восемнадцать, девятнадцать, двадцать, двадцать одно, двадцать два, двадцать три, двадцать четыре, двадцать пять, двадцать шесть, двадцать семь, двадцать восемь, двадцать девять или тридцать или более или все из аминокислотных изменений (мутаций), состоящих из изменений, описанных в таблице 12, таблице 13, таблице 14 и/или таблице 15, или эквивалентных аминокислотных замен или мутаций, или любую их комбинацию,
или состоящей из нее,
и необязательно идентичность последовательностей определяют анализом с помощью алгоритма сравнения последовательностей или визуальным исследованием,
и необязательно алгоритм сравнения последовательностей представляет собой алгоритм BLAST версии 2.2.2 где установлены параметры фильтрования: blastall-p blastp-d "nr pataa" -F F, и все другие параметры установлены как параметры по умолчанию;
(ii) кодирующей полипептид, обладающий аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 6, и имеющий по меньшей мере одно, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать, пятнадцать, шестнадцать, семнадцать, восемнадцать, девятнадцать, двадцать, двадцать одно, двадцать два, двадцать три, двадцать четыре, двадцать пять, двадцать шесть, двадцать семь, двадцать восемь, двадцать девять или тридцать или более, или все из аминокислотных изменений или замен (мутаций), состоящих из изменений, описанных в таблице 12, таблице 13, таблице 14 и/или таблице 15, или эквивалентных аминокислотных изменений или замен (мутаций) или любую их комбинацию; или
(iii) гибридизующейся в жестких условиях с нуклеиновой кислотой, содержащей SEQ ID NO: 5, и кодирующей полипептид, имеющий по меньшей мере одно, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать, пятнадцать, шестнадцать, семнадцать, восемнадцать, девятнадцать, двадцать, двадцать одно, двадцать два, двадцать три, двадцать четыре, двадцать пять, двадцать шесть, двадцать семь, двадцать восемь, двадцать девять или тридцать или более, или все из аминокислотных изменений (мутаций), состоящих из изменений, описанных в таблице 12, таблице 13, таблице 14 и/или таблице 15, или эквивалентных аминокислотных изменений или замен (мутаций), или любую их комбинацию,
где жесткие условия включают стадию промывания, включающую промывание в 0,2X SSC при температуре приблизительно 65°C в течение приблизительно 15 минут;
(iv) представляющей собой нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10; или
(v) обладающей по меньшей мере приблизительно 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более, или 100% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10;
(b) последовательность нуклеиновой кислоты согласно (a), кодирующая полипептид, имеющий активность фермента PI-PLC, но лишенная нативной сигнальной последовательности или аминокислотной последовательности пробелка;
(c) последовательность нуклеиновой кислоты согласно (a) или (b) кодирующая полипептид, обладающий активностью фермента PI-PLC, но лишенная нативной промоторной последовательности;
(d) нуклеиновая кислота согласно (c), дополнительно содержащая гетерологичную промоторную последовательность или другую последовательность регуляции транскрипции;
(e) последовательность нуклеиновой кислоты по любому из (a)-(d), дополнительно содержащая нуклеиновую кислоту, кодирующую гетерологичную аминокислотную последовательность, или дополнительно содержащая гетерологичную нуклеотидную последовательность;
(f) нуклеиновая кислота согласно (e), в которой нуклеиновая кислота, кодирующая гетерологичную аминокислотную последовательность, содержит или состоит из последовательности, кодирующей гетерологичную (лидерную) сигнальную последовательность, или метку или эпитоп, или гетерологичная нуклеотидная последовательность содержит гетерологичную промоторную последовательность;
(g) нуклеиновая кислота согласно (d), (e) или (f), в которой гетерологичная нуклеотидная последовательность кодирует гетерологичную (лидерную) сигнальную последовательность, содержащую или состоящую из N-концевого и/или C-концевого удлинения для направления в эндоплазматическую сеть (ER) или эндомембрану, или в растительную эндоплазматическую сеть (ER) или эндомембранную систему, или гетерологичная последовательность кодирует участок рестрикции;
(h) нуклеиновая кислота согласно (d), (e) или (f), в которой гетерологичная промоторная последовательность содержит или состоит из конститутивного или индуцибельного промотора, или специфического для типа клеток промотора или специфического для растения промотора или специфического для бактерий промотора;
(i) нуклеиновая кислота согласно любому из (a)-(h), в которой активность PI-PLC является термостабильной;
(j) нуклеиновая кислота согласно любому из (a)-(h), в которой активность PI-PLC является термоустойчивой;
(k) последовательность нуклеиновой кислоты, полностью комплементарная нуклеотидной последовательности согласно любому из (a)-(j).
11. Способ по п.7, в котором фермент фосфолипаза
(a) содержит аминокислотную последовательность:
(i) обладающую по меньшей мере 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более, или 100% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 6, и имеющую по меньшей мере одно, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать, пятнадцать, шестнадцать, семнадцать, восемнадцать, девятнадцать, двадцать, двадцать одно, двадцать два, двадцать три, двадцать четыре, двадцать пять, двадцать шесть, двадцать семь, двадцать восемь, двадцать девять или тридцать или более, или все из аминокислотных изменений или замен (мутаций), состоящих из изменений, описанных в таблице 12, таблице 13, таблице 14 и/или таблице 15, или эквивалентных аминокислотных изменений или замен (мутаций), или любую их комбинацию,
где необязательно идентичность последовательностей определяют анализом с помощью алгоритма сравнения последовательностей или визуальным исследованием;
(ii) обладающую по меньшей мере приблизительно 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более, или 100% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 8;
(b) полипептид согласно (a), но лишенный нативной сигнальной последовательности и/или пробелковой последовательности;
(c) полипептид согласно (a) или (b), дополнительно содержащий гетерологичную аминокислотную последовательность или гетерологичную часть;
(d) полипептид согласно (c), в котором гетерологичная аминокислотная последовательность или гетерологичная часть содержит или состоит из гетерологичной (лидерной) сигнальной последовательности, маркера, поддающейся детекции метки или эпитопа;
(e) полипептид согласно (d), в котором гетерологичная (лидерная) сигнальная последовательность содержит или состоит из N-концевого и/или C-концевого удлинения для направления в эндоплазматическую сеть (ER) или эндомембрану, или в растительную эндоплазматическую сеть (ER) или эндомембранную систему;
(f) полипептид согласно любому из (a)-(e), в котором PI-PLC катализирует реакцию, включающую:
2
2
3
1-фосфатидил-1D-миоинозитол 4,5-бифосфат (также называемый PIP, фосфатидилинозитолбифосфатом)+HO↔1D-миоинозитол 1,4,5-трифосфат (также называемый IP, инозитолтрифосфатом) + диацилглицерин;
(g) полипептид согласно (a)-(f), в котором активность PI-PLC является термостабильной;
(h) полипептид согласно (a)-(f), в котором активность PI-PLC является термоустойчивой;
P. pastoris
S. pombe
(i) полипептид согласно любому из (a)-(h), в котором: (i) полипептид является гликозилированным, или полипептид содержит по меньшей мере один участок гликозилирования, (ii) полипептид согласно (i), в котором гликозилирование представляет собой N-связанное гликозилирование или O-связанное гликозилирование; (iii) полипептид согласно (i) или (ii), в котором полипептид является гликозилированным после экспрессии в дрожжевой клетке; или (iv) полипептид согласно (iii), в котором дрожжевая клетка представляет собой  или ;
(j) полипептид согласно любому из (a)-(i), дополнительно содержащий или содержащийся в композиции, содержащей по меньшей мере один второй фермент, или по меньшей мере один второй фермент фосфолипазу; или
(k) полипептид согласно (j), в котором по меньшей мере один второй фермент фосфолипаза содержит полипептид, имеющий последовательность, указанную в SEQ ID NO: 2 и/или SEQ ID NO: 4, или по меньшей мере один из их вариантных ферментов PLC, как описано в таблицах 8 и 9.
12. Способ гидратации негидратируемых фосфолипидов в масле, включающий:
i-a) смешение водного раствора кислоты с маслом с получением смеси, имеющей pH менее чем приблизительно 4; и
i-b) смешение основания с кислотной смесью с получением прореагировавшей смеси, имеющей pH приблизительно 6-9, где смешение на стадиях i-a) и/или i-b) обеспечивает эмульсию, которая содержит водную фазу со средним размером капель приблизительно 15-35 мкм.
13. Способ получения фосфолипида, включающий:
i-a) смешение водного раствора кислоты с маслом с получением кислотной смеси, имеющей pH менее чем приблизительно 4;
i-b) смешение основания с кислотной смесью с получением прореагировавшей смеси, имеющей pH приблизительно 6-9, где смешение на стадиях i-a) и/или i-b) обеспечивает эмульсию, которая содержит по меньшей мере приблизительно 60% водной фазы по объему с размером капель приблизительно 15 мкм до приблизительно 45 мкм;
i-c) примешивание фермента фосфолипазы; и
i-d) выделение фосфолипида.
14. Способ по п.13, в котором фосфолипид представляет собой фосфатидилинозитол.
15. Способ по п.13, где фермент фосфолипаза кодируется выделенной, синтетической или рекомбинантной нуклеиновой кислотой (полинуклеотидом), содержащей последовательность нуклеиновой кислоты:
(a) кодирующую полипептид, имеющий активность фермента фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы C (PI-PLC), и
(i) обладающую по меньшей мере приблизительно 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более, или 100% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 5 и кодирующей полипептид, имеющий по меньшей мере одно, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать, пятнадцать, шестнадцать, семнадцать, восемнадцать, девятнадцать, двадцать, двадцать одно, двадцать два, двадцать три, двадцать четыре, двадцать пять, двадцать шесть, двадцать семь, двадцать восемь, двадцать девять или тридцать или более или все из аминокислотных изменений (мутаций), состоящих из изменений, описанных в таблице 12, таблице 13, таблице 14 и/или таблице 15, или эквивалентных аминокислотных замен или мутаций, или любую их комбинацию,
или состоящей из нее,
и необязательно идентичность последовательностей определяют анализом с помощью алгоритма сравнения последовательностей или визуальным исследованием,
и необязательно алгоритм сравнения последовательностей представляет собой алгоритм BLAST версии 2.2.2 где установлены параметры фильтрования: blastall-p blastp-d "nr pataa" -F F, и все другие параметры установлены как параметры по умолчанию;
(ii) кодирующей полипептид, обладающий аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 6, и имеющий по меньшей мере одно, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать, пятнадцать, шестнадцать, семнадцать, восемнадцать, девятнадцать, двадцать, двадцать одно, двадцать два, двадцать три, двадцать четыре, двадцать пять, двадцать шесть, двадцать семь, двадцать восемь, двадцать девять или тридцать или более, или все из аминокислотных изменений или замен (мутаций), состоящих из изменений, описанных в таблице 12, таблице 13, таблице 14 и/или таблице 15, или эквивалентных аминокислотных изменений или замен (мутаций), или любую их комбинацию; или
(iii) гибридизующейся в жестких условиях с нуклеиновой кислотой, содержащей SEQ ID NO: 5 и кодирующей полипептид, имеющий по меньшей мере одно, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать, пятнадцать, шестнадцать, семнадцать, восемнадцать, девятнадцать, двадцать, двадцать одно, двадцать два, двадцать три, двадцать четыре, двадцать пять, двадцать шесть, двадцать семь, двадцать восемь, двадцать девять или тридцать или более, или все из аминокислотных изменений (мутаций), состоящих из изменений, описанных в таблице 12, таблице 13, таблице 14 и/или таблице 15, или эквивалентных аминокислотных изменений или замен (мутаций), или любую их комбинацию,
где жесткие условия включают стадию промывания, включающую промывание в 0,2X SSC при температуре приблизительно 65°C в течение приблизительно 15 мин;
(iv) представляющей собой нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10; или
(v) обладающей по меньшей мере приблизительно 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более, или 100% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10;
(b) последовательность нуклеиновой кислоты согласно (a), кодирующая полипептид, имеющий активность фермента PI-PLC, но лишенный нативной сигнальной последовательности или пробелковой аминокислотной последовательности;
(c) последовательность нуклеиновой кислоты согласно (a) или (b) кодирующая полипептид, имеющий активность фермента PI-PLC, но лишенная нативной промоторной последовательности;
(d) нуклеиновая кислота согласно (c), дополнительно содержащая гетерологичную промоторную последовательность или другую последовательность регуляции транскрипции;
(e) последовательность нуклеиновой кислоты согласно любому из (a)-(d), дополнительно содержащая нуклеиновую кислоту, кодирующую гетерологичную аминокислотную последовательность, или дополнительно содержащая гетерологичную нуклеотидную последовательность;
(f) нуклеиновая кислота согласно (e), в которой нуклеиновая кислота, кодирующая гетерологичную аминокислотную последовательность, содержит последовательность, кодирующую гетерологичную (лидерную) сигнальную последовательность или маркер, или эпитоп, или состоит из нее, или гетерологичная нуклеотидная последовательность содержит гетерологичную промоторную последовательность;
(g) нуклеиновая кислота согласно (d), (e) или (f), в которой гетерологичная нуклеотидная последовательность кодирует гетерологичную (лидерную) сигнальную последовательность, содержащую или состоящую из N-концевого и/или C-концевого удлинения для направления в эндоплазматическую сеть (ER) или эндомембрану, или растительную эндоплазматическую сеть (ER) или эндомембранную систему, или гетерологичная последовательность кодирует участок рестрикции;
(h) нуклеиновая кислота согласно (d), (e) или (f), в которой гетерологичная промоторная последовательность содержит или состоит из конститутивного или индуцибельного промотора, или специфичного для типа клетки промотора, или специфичного для растений промотора, или специфичного для бактерий промотора;
(i) нуклеиновая кислота согласно любому из (a)-(h), в которой активность PI-PLC является термостабильной;
(j) нуклеиновая кислота согласно любому из (a)-(h), в которой активность PI-PLC является термоустойчивой;
(k) последовательность нуклеиновой кислоты, полностью комплементарная нуклеотидной последовательности согласно любому из (a)-(j).
16. Способ по п.13, фермент фосфолипаза
(a) содержит аминокислотную последовательность:
(i) обладающую по меньшей мере 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более, или 100% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 6, и имеющую по меньшей мере одно, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать, пятнадцать, шестнадцать, семнадцать, восемнадцать, девятнадцать, двадцать, двадцать одно, двадцать два, двадцать три, двадцать четыре, двадцать пять, двадцать шесть, двадцать семь, двадцать восемь, двадцать девять или тридцать или более, или все из аминокислотных изменений или замен (мутаций), состоящих из изменений, описанных в таблице 12, таблице 13, таблице 14 и/или таблице 15, или эквивалентных аминокислотных изменений или замен (мутаций), или любую их комбинацию,
где необязательно идентичность последовательностей определяют анализом с помощью алгоритма сравнения последовательностей или визуальным исследованием;
(ii) обладающую по меньшей мере приблизительно 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более, или 100% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 8;
(b) полипептид согласно (a), но лишенный нативной сигнальной последовательности и/или пробелковой последовательности;
(c) полипептид согласно (a) или (b), дополнительно содержащий гетерологичную аминокислотную последовательность или гетерологичную часть;
(d) полипептид согласно (c), в котором гетерологичная аминокислотная последовательность или гетерологичная часть содержит гетерологичную (лидерную) сигнальную последовательност, маркер, поддающуюся детекции метку или эпитоп, или состоит из нее;
(e) полипептид согласно (d), в котором гетерологичная (лидерная) сигнальная последовательность содержит N-концевое и/или C-концевое удлинение для направления в эндоплазматическую сеть (ER) или эндомембрану, или в растительную эндоплазматическую сеть (ER) или эндомембранную систему, или состоит из них;
(f) полипептид согласно любому из (a)-(e), в котором PI-PLC катализирует реакцию, включающую:
2
2
3
1-фосфатидил-1D-миоинозитол 4,5-бифосфат (также называемый PIP, фосфатидилинозитолбифосфатом)+HO↔1D-миоинозитол 1,4,5-трифосфат (также называемый IP, инозитолтрифосфатом)+диацилглицерин;
(g) полипептид согласно (a)-(f), в котором активность PI-PLC является термостабильной;
(h) полипептид согласно (a)-(f), в котором активность PI-PLC является термоустойчивой;
P. pastoris
S. pombe
(i) полипептид согласно любому из (a)-(h), в котором: (i) полипептид является гликозилированным, или полипептид содержит по меньшей мере один участок гликозилирования, (ii) полипептид согласно (i), в котором гликозилирование представляет собой N-связанное гликозилирование или O-связанное гликозилирование; (iii) полипептид согласно (i) или (ii), в котором полипептид является гликозилированным после экспрессии в дрожжевой клетке; или (iv) полипептид согласно (iii), в котором дрожжевая клетка представляет собой  или ;
(j) полипептид согласно любому из (a)-(i), дополнительно содержащий или содержащийся в композиции, содержащей по меньшей мере один второй фермент, или по меньшей мере один второй фермент фосфолипазу; или
(k) полипептид согласно (j), в котором по меньшей мере один второй фермент фосфолипаза содержит полипептид, имеющий последовательность, указанную в SEQ ID NO: 2 и/или SEQ ID NO: 4, или по меньшей мере один из их вариантных ферментов PLC, как описано в таблицах 8 и 9.
17. Способ получения фосфолипида, включающий:
i-a) смешение водного раствора кислоты с маслом с получением кислотной смеси, имеющей pH менее чем приблизительно 4;
i-b) смешение основания с кислотной смесью с получением прореагировавшей смеси, имеющей pH приблизительно 6-9, где смешение на стадиях i-a) и/или i-b) обеспечивает эмульсию, которая содержит водную фазу со средним размером капель приблизительно 15-35 мкм;
i-c) примешивание фермента фосфолипазы; и
i-d) выделение фосфолипида.
18. Способ по п.17, в котором фермент фосфолипаза представляет собой фосфатидилинозитол-специфическую фосфолипазу C.
19. Способ по п.17, где фермент фосфолипаза кодируется выделенной, синтетической или рекомбинантной нуклеиновой кислотой (полинуклеотидом), содержащей последовательность нуклеиновой кислоты:
(a) кодирующую полипептид, имеющий активность фермента фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы C (PI-PLC), и
(i) обладающую по меньшей мере приблизительно 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более, или 100% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 5 и кодирующей полипептид, имеющий по меньшей мере одно, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать, пятнадцать, шестнадцать, семнадцать, восемнадцать, девятнадцать, двадцать, двадцать одно, двадцать два, двадцать три, двадцать четыре, двадцать пять, двадцать шесть, двадцать семь, двадцать восемь, двадцать девять или тридцать или более или все из аминокислотных изменений (мутаций), состоящих из изменений, описанных в таблице 12, таблице 13, таблице 14 и/или таблице 15, или эквивалентных аминокислотных замен или мутаций, или любую их комбинацию,
или состоящей из нее,
и необязательно идентичность последовательностей определяют анализом с помощью алгоритма сравнения последовательностей или визуальным исследованием,
и необязательно алгоритм сравнения последовательностей представляет собой алгоритм BLAST версии 2.2.2 где установлены параметры фильтрования: blastall-p blastp-d "nr pataa" -F F, и все другие параметры установлены как параметры по умолчанию;
(ii) кодирующей полипептид, обладающий аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 6, и имеющий по меньшей мере одно, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать, пятнадцать, шестнадцать, семнадцать, восемнадцать, девятнадцать, двадцать, двадцать одно, двадцать два, двадцать три, двадцать четыре, двадцать пять, двадцать шесть, двадцать семь, двадцать восемь, двадцать девять или тридцать или более, или все из аминокислотных изменений или замен (мутаций), состоящих из изменений, описанных в таблице 12, таблице 13, таблице 14 и/или таблице 15, или эквивалентных аминокислотных изменений или замен (мутаций), или любую их комбинацию; или
(iii) гибридизующейся в жестких условиях с нуклеиновой кислотой, содержащей SEQ ID NO: 5 и кодирующей полипептид, имеющий по меньшей мере одно, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать, пятнадцать, шестнадцать, семнадцать, восемнадцать, девятнадцать, двадцать, двадцать одно, двадцать два, двадцать три, двадцать четыре, двадцать пять, двадцать шесть, двадцать семь, двадцать восемь, двадцать девять или тридцать или более, или все из аминокислотных изменений (мутаций), состоящих из изменений, описанных в таблице 12, таблице 13, таблице 14 и/или таблице 15, или эквивалентных аминокислотных изменений или замен (мутаций), или любую их комбинацию,
где жесткие условия включают стадию промывания, включающую промывание в 0,2X SSC при температуре приблизительно 65°C в течение приблизительно 15 мин;
(iv) представляющей собой нуклеиновую кислоту, содержащую или состоящую из последовательности SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10; или
(v) обладающей по меньшей мере приблизительно 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более, или 100% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10;
(b) последовательность нуклеиновой кислоты согласно (a), кодирующая полипептид, имеющий активность фермента PI-PLC, но лишенный нативной сигнальной последовательности или пробелковой аминокислотной последовательности;
(c) последовательность нуклеиновой кислоты согласно (a) или (b) кодирующая полипептид, имеющий активность фермента PI-PLC, но лишенная нативной промоторной последовательности;
(d) нуклеиновая кислота согласно (c), дополнительно содержащая гетерологичную промоторную последовательность или другую последовательность регуляции транскрипции;
(e) последовательность нуклеиновой кислоты согласно любому из (a)-(d), дополнительно содержащая нуклеиновую кислоту, кодирующую гетерологичную аминокислотную последовательность, или дополнительно содержащая гетерологичную нуклеотидную последовательность;
(f) нуклеиновая кислота согласно (e), в которой нуклеиновая кислота, кодирующая гетерологичную аминокислотную последовательность, содержит последовательность, кодирующую гетерологичную (лидерную) сигнальную последовательность или маркер, или эпитоп, или состоит из нее, или гетерологичная нуклеотидная последовательность содержит гетерологичную промоторную последовательность;
(g) нуклеиновая кислота согласно (d), (e) или (f), в которой гетерологичная нуклеотидная последовательность кодирует гетерологичную (лидерную) сигнальную последовательность, содержащую или состоящую из N-концевого и/или C-концевого удлинения для направления в эндоплазматическую сеть (ER) или эндомембрану, или растительную эндоплазматическую сеть (ER) или эндомембранную систему, или гетерологичная последовательность кодирует участок рестрикции;
(h) нуклеиновая кислота согласно (d), (e) или (f), в которой гетерологичная промоторная последовательность содержит или состоит из конститутивного или индуцибельного промотора, или специфичного для типа клетки промотора, или специфичного для растений промотора, или специфичного для бактерий промотора;
(i) нуклеиновая кислота согласно любому из (a)-(h), в которой активность PI-PLC является термостабильной;
(j) нуклеиновая кислота согласно любому из (a)-(h), в которой активность PI-PLC является термоустойчивой;
(k) последовательность нуклеиновой кислоты, полностью комплементарная нуклеотидной последовательности согласно любому из (a)-(j).
20. Способ по п.17, фермент фосфолипаза
(a) содержит аминокислотную последовательность:
(i) обладающую по меньшей мере 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более, или 100% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 6, и имеющую по меньшей мере одно, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать, пятнадцать, шестнадцать, семнадцать, восемнадцать, девятнадцать, двадцать, двадцать одно, двадцать два, двадцать три, двадцать четыре, двадцать пять, двадцать шесть, двадцать семь, двадцать восемь, двадцать девять или тридцать или более, или все из аминокислотных изменений или замен (мутаций), состоящих из изменений, описанных в таблице 12, таблице 13, таблице 14 и/или таблице 15, или эквивалентных аминокислотных изменений или замен (мутаций), или любую их комбинацию,
где необязательно идентичность последовательностей определяют анализом с помощью алгоритма сравнения последовательностей или визуальным исследованием;
(ii) обладающую по меньшей мере приблизительно 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более, или 100% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 8;
(b) полипептид согласно (a), но лишенный нативной сигнальной последовательности и/или пробелковой последовательности;
(c) полипептид согласно (a) или (b), дополнительно содержащий гетерологичную аминокислотную последовательность или гетерологичную часть;
(d) полипептид согласно (c), в котором гетерологичная аминокислотная последовательность или гетерологичная часть содержит гетерологичную (лидерную) сигнальную последовательност, маркер, поддающуюся детекции метку или эпитоп, или состоит из нее;
(e) полипептид согласно (d), в котором гетерологичная (лидерная) сигнальная последовательность содержит N-концевое и/или C-концевое удлинение для направления в эндоплазматическую сеть (ER) или эндомембрану, или в растительную эндоплазматическую сеть (ER) или эндомембранную систему, или состоит из них;
(f) полипептид согласно любому из (a)-(e), в котором PI-PLC катализирует реакцию, включающую:
2
2
3
1-фосфатидил-1D-миоинозитол 4,5-бифосфат (также называемый PIP, фосфатидилинозитолбифосфатом)+HO↔1D-миоинозитол 1,4,5-трифосфат (также называемый IP, инозитолтрифосфатом)+диацилглицерин;
(g) полипептид согласно (a)-(f), в котором активность PI-PLC является термостабильной;
(h) полипептид согласно (a)-(f), в котором активность PI-PLC является термоустойчивой;
P. pastoris
S. pombe
(i) полипептид согласно любому из (a)-(h), в котором: (i) полипептид является гликозилированным, или полипептид содержит по меньшей мере один участок гликозилирования, (ii) полипептид согласно (i), в котором гликозилирование представляет собой N-связанное гликозилирование или O-связанное гликозилирование; (iii) полипептид согласно (i) или (ii), в котором полипептид является гликозилированным после экспрессии в дрожжевой клетке; или (iv) полипептид согласно (iii), в котором дрожжевая клетка представляет собой  или ;
(j) полипептид согласно любому из (a)-(i), дополнительно содержащий или содержащийся в композиции, содержащей по меньшей мере один второй фермент, или по меньшей мере один второй фермент фосфолипазу; или
(k) полипептид согласно (j), в котором по меньшей мере один второй фермент фосфолипаза содержит полипептид, имеющий последовательность, указанную в SEQ ID NO: 2 и/или SEQ ID NO: 4, или по меньшей мере один из их вариантных ферментов PLC, как описано в таблицах 8 и 9.