СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ЦИРКОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ СВИНЕЙ ВТОРОГО ТИПА ПРЯМЫМ ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИМ АНАЛИЗОМ НА ОСНОВАНИИ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ
DIAGNOSTIC TECHNIQUE FOR SWINE CIRCOVIRUS DISEASE OF THE SECOND TYPE WITH DIRECT IMMUNOHISTOCHEMICAL ANALYSIS ON THE BASIS OF MONOCLONAL ANTIBODIES

Данное изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и может быть использовано в научно-исследовательских учреждениях и лабораториях, для диагностики заболеваний, в том числе цирковирусной болезни свиней 2 типа с выявлением антигена возбудителя в инфицированных клетках системы фагоцитирующих мононуклеаров при иммуногистохимическом исследовании криотомных срезов подвздошных лимфатических узлов и легких, на основе моноклональных антител.
Уровень техники
Для диагностики цирковирусной болезни свиней 2 типа (ЦВС-2) применяют множество современных, лабораторных методов направленных на определение присутствия вирусного агента в организме и выделение антител против вируса. Для осуществления данных исследований применяют следующие методики: полимеразную цепную реакцию (ПНР), в том числе в реальном времени (РТ ПЦР), позволяющую выявить РНК вируса и многократно размножить ее, данный метод не дает количественных данных о наличии возбудителя в организме; флюоресцентную гибридизацию in situ, которая применяется на гистологических срезах и требует множество дорогостоящих компонентов для диагностики; иммуноферментный анализ (ИФА) сывороток крови для определения специфических антител к цирковирусу свиней 2 типа (ЦВС-2), в результате данного анализа выявляются только антитела к возбудителю ЦВС-2, но не определяет само наличие вируса; реакцию иммунофлюоресценции (РИФ), которая применяется на культуре монослоя культивируемых клеток с последующим их заражением и применением антител с флюоресцнтной меткой [Luo W, Ge М, Jiang D, Li R, Zhao W, Chen G, Yang X, Yu X. Development and application of a double-antigen sandwich enzyme-linked immunosorbent assay for detection of antibodies to porcine circovirus 2// Clin Vaccine Immunol. 2012. Vol. 19(9). P. 1480-1486.; Liu C, Liu Y, Chen H, Feng H, Chen Y, Wang Y, Wang J, Liu D, Deng R, Zhang G. Genetic and immunogenicity analysis of porcine circovirus type 2 strains isolated in central China // Arch Virol. 2018. P. 1-10.; S. Krakowka, J.A. Ellis, F. Mcneilly, S. Ringler, D.M. Rings, G. Allan Activation of the Immune System is the Pivotal Event in the Production of Wasting Disease in Pigs Infected with Porcine Circovirus-2 (PCV-2) // Vet Pathol. 2001. Vol. 38. P. 31-42.; Стаффорд В.В. Патоморфологические изменения паренхиматозных органов поросят, экспериментально зараженных вирусом репродуктивно-респираторного синдрома и цирковирусом свиней типа 2/ Стаффорд В.В., Забережный А.Д., Гулюкин М.И. // Ветеринария №9, 2016, стр. 24-27.].
На территории Российской Федерации, для диагностики заболеваний вызываемых цирковирусом свиней 2 типа, используют ПЦР, ИФА и иммуноцитохимическое исследование [Раев С.А. Получение рекомбинантного капсидного белка цирковируса свиней второго типа (генотип 2b) в бакуловирусной системе и использование его для изготовления вакцины / Раев С.А., Алексеев К.П., Шемельков Е.В., Булгаков А.Д., Мусиенко М.И., Орлянкин Б.Г., Верховский О.А., Алипер Т.И. // РВЖ СХЖ. - 2012. - №3. - С. 17-19; Стаффорд В.В. Патоморфологические изменения паренхиматозных органов поросят, экспериментально зараженных вирусом репродуктивно-респираторного синдрома и цирковирусом свиней типа 2/ Стаффорд В.В., Забережный А.Д., Гулюкин М.И. // Ветеринария №9, 2016, стр. 24-27.]. А также, используют антитела для диагностики цирковируса свиней 2 типа в сэндвич-ИФА. Для применения данного метода используется сыворотка крови животного, в которой ищут антиген к цирковирусу 2 типа, или используют суспензию лимфатического узла животного подозреваемого на заболевание. [Козлов А.Ю. Получение моноклональных антител к цирковирусу свиней второго типа (ЦВС-2) и их применение для диагностики цирковирусной инфекции / А.Ю. Козлов, кандидат биологических наук, Л.В. Костина, кандидат биологических наук, К.П. Алексеев, кандидат биологических наук, М.А. Арутюнова, Ю.О. Терехова, В.В. Цибезов, кандидат биологических наук. Т.И. Алипер, доктор биологических наук, О.А. Верховский // РВЖ СХЖ. - 2013. - №2. - С. 20-22]. Данный метод также не дает понимания о диссеминации вируса в организме животного. Это прототип.
Наличие антигена в сыворотке крове не всегда говорит о наличии вируса, таким образом, технической проблемой является необходимость создания действенного способа диагностики цирковируса свиней 2 типа, для определения вирусного антигена в тканях и органах свиней, легко выполняемого в гистологических лабораториях, без использования дорогой, специализированной аппаратуры и расходных материалов.
Раскрытие сущности изобретения
Техническим результатом является точное выявление антигена к вирусу ЦВС-2 в моноцитарных клетках органов свиней при помощи моноклональных антител меченных пероксидазой хрена. Данный способ позволяет точно выявить вирус ЦВС-2 в организме свиней и определить его количественные показатели, что способствует точной дифференциальной диагностике заболеваний. Данный способ прост и менее затратен.
Предложенный способ заключается в следующем.
Для выполнения ИГХ исследования гистологических срезов из органов свиней использовали мышиные моноклональные антитела (6h12) к рекомбинантному белку С вируса ЦВС 2 типа, меченные пероксидазой хрена. Данные МАТ были получены в Научно-исследовательском институте диагностики и профилактики болезней человека и животных.
Получение и характеристика МАТ. Для иммунизации мышей линии BALB/c использовали лизат клеток Sf-21, содержащий рекомбинантный белок С. Мышей иммунизировали трехкратно с интервалом 2 недели, по 500 мкг белка на мышь в смеси с адъювантом Фрейнда. Начиная со второй иммунизации сыворотки мышей тестировали методом непрямого ИФА на наличие специфических антител, используя в качестве антигена белок С, очищенный методом металлоаффинной хроматографии. Гибридомные клеточные линии получали путем слияния спленоцитов мыши с перевиваемой клеточной линией миеломы Sp2/0-Ag14. Первичный скрининг гибридом проводили на основе результатов непрямого ИФА с использованием в качестве антигена очищенного белка С. Позитивные гибридомы реклонировали и наращивали в культуральных флаконах, увеличивая объем. Асцитные жидкости, содержащие МКА, получали после введения гибридомных клеток в брюшную полость праймированных пристаном мышей линии BALB/c. Очистку МКА из асцитных жидкостей осуществляли методом аффинной хроматографии с использованием Белок-А-агарозы («Sigma», США) по протоколу фирмы-изготовителя. Субклассы МКА определяли посредством ИФА с помощью набора «Mouse-Hybridoma-Subtyping Kit» («Sigma», США). Конъюгат МКА с пероксидазой хрена получали периодатным методом. Иммунохимическую специфичность антител выявляли посредством иммуноблоттинга. [Козлов А.Ю. Получение моноклональных антител к цирковирусу свиней второго типа (ЦВС-2) и их применение для диагностики цирковирусной инфекции / А.Ю. Козлов, кандидат биологических наук, Л.В. Костина, кандидат биологических наук, К.П. Алексеев, кандидат биологических наук, М.А. Арутюнова, Ю.О. Терехова, В.В. Цибезов, кандидат биологических наук. Т.И. Алипер, доктор биологических наук, О.А. Верховский // РВЖ СХЖ. - 2013. - №2. - С. 20-22].
Выполнение ИГХИ с полученными МАТ к рекомбинантному белку С ЦВС-2:
В качестве патологического материала, для проведения исследования, от павших животных брали подвздошные лимфатические узлы, легкое. Дополнительно отбирали почку, печень, селезенку и миокард для определения тропности вируса. Образцы, размером 0,5×0,5×1,0 см, помещали в морозильную камеру при -15°C с предварительной выдержкой образцов органов в холодильной камере при +2°С в течение 6 часов. Для более длительного хранения материала рекомендуется использовать низкотемпературные холодильные камеры с температурой -70°С.
Далее образцы органов размещали на предметных столиках криостата при помощи криогеля Neg-50 и замораживали в камере криотома при температуре -35°С. Затем нарезали блоки толщиной 5 микрон и наклеивали на предметные стекла с поляризационным покрытием. После этого, срезы помещали в смесь изопропилового спирта 30 мл и физиологического раствора 70 мл, при +4°С - 60 минут. Затем ополаскивали в фосфатносолевом буфере (ФСБ) рН 7,6 3 раза по 3-5 минут при комнатной температуре (22°С). Для удаления эндогенной пероксидазы на срезы наносили 3% раствор перекиси водорода и помещали в термостат при +37°С на 40 минут. Затем ополаскивали в ФСБ рН 7,6 3 раза по 3-5 минут при комнатной температуре. Для предотвращения неспецифического связывания готовили блокирующий 5% раствор обезжиренного сухого молока в ФСБ рН 7,6 и инкубируют при 37°С, 40 минут. После инкубации ополаскивали в ФСБ рН 7,6 3 раза по 3-5 минут при комнатной температуре. Пока идет процесс ополаскивания, готовили раствор рабочей концентрации антител меченых пероксидазой хрена 6h12 к рекомбинантному белку С вируса ЦВС-2. Рабочий раствор антител готовили на ФСБ рН 7,6. Данный раствор подбирается опытным путем в соответствии с чувствительностью антител. Обычно разведение антител составляет от 1:200 до 1:400. На стекла наносили по 200 мкл рабочего разведения антител и помещали в термостат во влажную камеру при 37°С на 80 минут. Промывали в ФСБ рН 7,6 3 раза по 3-5 минут при комнатной температуре. Во время инкубации срезов с антителами, для специфического окрашивания пероксидазной метки, перед использованием готовили рабочий раствор субстрата на Na-фосфатном буфере рН 5,0. Рабочий раствор готовится непосредственно перед работой, годен 12 час. Маточный раствор хранится при +4°С в течении 3 месяцев.
Маточный раствор: 0,02 г 3-амино-9-этилкарбазола растворяют в 3 мл диметилформамида. Работу необходимо выполнять в перчатках и в вытяжном шкафу. Необходимо помнить, что данный раствор обладает канцерогенными свойствами.
Рабочий раствор готовят на 0,02 М Na-фосфатном буфере, рН 5,0-5 мл, с добавлением 300 мкл маточного раствора и 1 мкл 3% раствора перекиси водорода.
Рабочий раствор наносят на срезы в количестве 200 мкл, стекла помещали во влажную камеру в термостат при 37°С на 30 минут. По истечении времени инкубации, для остановки реакции, срезы аккуратно промывают в 3 этапа, каждый по 3-5 минут: 1 раз в дистиллированной воде, последующие 2 раза в ФСБ рН 7,6. После этого для дифференциальной окраски и лучшей визуализации клеточных элементов на срезы наносили гематоксилин Майера на 5-10 минут. Срезы помещали в дистиллированную воду для проявления гематоксилина, и затем наносили монтирующую альбуминовую среду и закрывают покровным стеклом.
Приведенный способ рассчитан на проведение иммуногистохимического анализа криотомных срезов подвздошных лимфатических узлов, легких и других органов с применением моноклональных антител меченых пероксидазой хрена 6h12 к ЦВС-2. Обнаружение антигена вирусного агента осуществляется на цитоплазме свободных макрофагов подвздошных лимфатических узлов, легких с окрашиванием метки пероксидазы хрена, которое характеризуется образованием конгломератов буро-коричневого оттенка. Окраску гематоксилином Майера в ИГХИ проводят для дифференциации клеток, четкости визуализации ядер мононуклеарной системы лимфатических узлов, легкого и других органов.
Вышеуказанный способ позволяет с точностью выявлять антигены ЦВС-2 и дифференцировать их от патологических агентов, схожих по симптомокомплексу заболеваний, так как обладает высокой специфичностью и чувствительностью к цирковирусу свиней второго типа. Результаты положительного диагноза на ЦВС-2 представлены на фиг. 1 и фиг. 2.
Сектор патоморфологии ФГБНУ ВИЭВ им. Я.Р. Коваленко успешно занимался испытанием предложенного способа в 2017 году, подтверждая, что данный способ исследования может быть рекомендован для применения в ветеринарных лабораториях и научно-исследовательских учреждениях.
Осуществление изобретения иллюстрируется следующими примерами:
При выполнении ИГХ реакции брали патологический материал из легкого и подвздошного лимфатического узла. Выполнили криотомию, и на полученных срезах органов выполнили ИГХ реакцию описанную выше. При положительном диагнозе на ЦВС-2 была получена картинка, представленная на фигурах 1 и 2, откуда видно буро-коричневое окрашивание на клетках в исследуемых органах. В случае отрицательного результата на заболевание данного окрашивания не было, пример представлен на фигурах 3 и 4.
Учет результатов прилагается.
Список литературы:
1. Козлов А.Ю. Получение моноклональных антител к цирковирусу свиней второго типа (ЦВС-2) и их применение для диагностики цирковирусной инфекции / А.Ю. Козлов, кандидат биологических наук, Л.В. Костина, кандидат биологических наук, К.П. Алексеев, кандидат биологических наук, М.А. Арутюнова, Ю.О. Терехова, В.В. Цибезов, кандидат биологических наук. Т.Н. Алипер, доктор биологических наук, О.А. Верховский // РВЖ СХЖ. - 2013. - №2. - С. 20-22.
2. Раев С.А. Получение рекомбинантного капсидного белка цирковируса свиней второго типа (генотип 2b) в бакуловирусной системе и использование его для изготовления вакцины / Раев С.А., Алексеев К.П., Шемельков Е.В., Булгаков А.Д., Мусиенко М.И., Орлянкин Б.Г., Верховский О.А., Алипер Т.И. // РВЖ СХЖ. - 2012. - №3. - С. 17-19
3. Стаффорд В.В. Патоморфологические изменения паренхиматозных органов поросят, экспериментально зараженных вирусом репродуктивно-респираторного синдрома и цирковирусом свиней типа 2/ Стаффорд В.В., Забережный А.Д., Гулюкин М.И. // Ветеринария №9, 2016, стр. 24-27.
4. S. Krakowka, J.A. Ellis, F. Mcneilly, S. Ringler, D.M. Rings, G. Allan Activation of the Immune System is the Pivotal Event in the Production of Wasting Disease in Pigs Infected with Porcine Circovirus-2 (PCV-2) // Vet Pathol. 2001. Vol. 38. P. 31-42.
5. Luo W, Ge M, Jiang D, Li R, Zhao W, Chen G, Yang X, Yu X. Development and application of a double-antigen sandwich enzyme-linked immunosorbent assay for detection of antibodies to porcine circovirus 2// Clin Vaccine Immunol. 2012. Vol. 19(9). P. 1480-1486.
6. Liu C, Liu Y, Chen H, Feng H, Chen Y, Wang Y, Wang J, Liu D, Deng R, Zhang G. Genetic and immunogenicity analysis of porcine circovirus type 2 strains isolated in central China // Arch Virol. 2018. P. 1-10.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 Препарат легкого с докраской ядер клеток гематоксилином Майера. Стрелочки указывают на скопления конгломератов буро-коричневого цвета.
Фиг. 2 Препарат подвздошного лимфатического узла, с докраской клеток гематоксилином Майера. Стрелочки указывают на скопления конгломератов буро-коричневого цвета.
Фиг. 3 Отрицательный результат на препарате без докраски ядер
Фиг. 4 Отрицательный результат на препарате с докраской ядер.