СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОБОГАЩЕННОЙ ПОПУЛЯЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК

1. Способ получения композиции, содержащей функциональные мезенхимальные стволовые клетки, подходящие для введения в терапии, причем указанный способ включает следующие этапы
6
6
а. суспендирование образца мезенхимальных стволовых клеток костного мозга ex vivo в криопротективной среде, содержащей от 5% до 10% диметилсульфоксида в концентрации от 5×10 до 10×10 клеток/мл;
b. криоконсервацию образца мезенхимальных стволовых клеток костного мозга, охлаждение их вначале от -70°C до -90°C в течение по меньшей мере 24 часов перед хранением образца в жидком азоте;
c. восстановление образца мезенхимальных стволовых клеток костного мозга выполнением следующих этапов:
c1. размораживание образца мезенхимальных стволовых клеток костного мозга путем постепенного повышения температуры до 35-39°C в течение 1-5 минут;
c2. разбавление образца в 10-30 раз по отношению к исходному объему образца подходящей питательной средой;
c3. центрифугирование образца, удаление супернатанта и ресуспендирование осадка мезенхимальных стволовых клеток в подходящей питательной среде;
c4. отбор мезенхимальных стволовых клеток с жизнеспособностью по меньшей мере 70%;
2
2
c5. посев мезенхимальных стволовых клеток, выбранных на этапе (c4), на пластиковый носитель и инкубирование указанных мезенхимальных стволовых клеток в подходящей питательной среде, содержащей от 7,5% до 10% CO и по меньшей мере 5% фетальной бычьей сыворотки при концентрации клеток от 1000 до 5000 клеток/см, при подходящих условиях культивирования при 35-39°C,
2
c6. замена подходящей свежей питательной средой, содержащей от 7,5% до 10% CO и по меньшей мере 5% фетальной бычьей сыворотки через равные промежутки времени и выделение мезенхимальных стволовых клеток с носителя, когда клетки занимают от 80 до 100% поверхности носителя;
c7. отбор мезенхимальных стволовых клеток, которые
демонстрируют адгезию к пластику; и
проявляют жизнеспособность по меньшей мере 70%; и
проявляют экспрессию более или равную 90% CD90, CD166, CD73 и CD105; и
проявляют экспрессию менее или равную 10% CD14, CD34, CD45 и HLA-DR менее или равную 10%; и
не имеют хромосомных аберраций; и
проявляют способность дифференцироваться в остеобласты, адипоциты и хондроциты; и
d. суспендирование мезенхимальных стволовых клеток, выделенных на этапе (c7), в подходящей среде для транспортировки и хранения при 2-8°C, для получения композиции, содержащей функциональные мезенхимальные стволовые клетки, причем указанная подходящая среда для транспортировки и хранения при 2-8°C представляет собой изотоническую среду, содержащую 6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-карбоновую кислоту от 0,25 до 1 мМ.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что криопротективная среда этапа (а) содержит фетальную бычью сыворотку и от 5% до 10% ДМСО.
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что криопротективная среда согласно этапу (а) представляет собой свободную от компонентов животного происхождения бессывороточную безбелковую среду, содержащую 5% или 10% ДМСО.
4. Способ по любому из пп. 1-3, отличающийся тем, что этап (b) включает криоконсервацию образца мезенхимальных стволовых клеток костного мозга со скоростью 1°C/мин от -70°C до -90°C в течение по меньшей мере 25 часов перед хранением образца в жидком азоте.
5. Способ по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что изотоническая среда, содержащая 6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-карбоновую кислоту от 0,25 мМ до 1 мМ, представляет собой свободную от компонентов животного происхождения бессывороточную безбелковую среду.
+
+
2+
+
+
2+
6. Способ по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что изотоническая среда, содержащая 6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-карбоновую кислоту от 0,25 мМ до 1 мМ, содержит смесь от 1:9 до 9:1 (об/об) первой композиции, содержащей Na 130 мМ, K 4 мМ, Ca 1,35 мМ, хлорид 109 мМ и лактат 16 мМ, со второй композицией, содержащей Na 159 мМ, K 5 мМ, Mg 0,8 мМ, хлорид 77 мМ, дигидроген фосфат 28 мМ, цитрат 10 мМ и ацетат 32 мМ с добавкой 5 мМ глюкозы и сывороточного альбумина человека от 0,1% до 0,5%.
6
7. Композиция, содержащая популяцию по меньшей мере 0,5×10 мезенхимальных стволовых клеток и 6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-карбоновую кислоту от 0,25 мМ до 1 мМ, получаемая согласно способу по пп. 1-6, причем указанные мезенхимальные стволовые клетки сохраняют в течение по меньшей мере 72 часов в течение гипотермической транспортировки при температуре 2-8°С функциональность свежих мезенхимальных стволовых клеток, включая
демонстрирование адгезии к пластику;
проявление жизнеспособности по меньшей мере 70%;
проявление экспрессии более или равной 90% CD90, CD 166, CD73 и CD105;
проявление экспрессии менее или равной 10% CD14, CD34, CD45 и HLA-DR менее или равной 10%;
отсутствие хромосомных аберраций; и
проявление способности дифференцироваться в остеобласты, адипоциты и хондроциты.
8. Применение композиции по п. 7 в качестве лекарственного средства.
9. Применение композиции по п. 7 в аутологичном или аллогенном лечении костно-суставных заболеваний, аутоиммунных заболеваний и сердечно-сосудистых заболеваний.
6
6
10. Применение по любому из пп. 8 или 9, отличающееся тем, что указанную композицию вводят при плотности клеток от 1×10 до 10×10 клеток/мл и от 0,5 до 90 миллионов клеток.
11. Применение по любому из пп. 9 или 10, отличающееся тем, что костно-суставные заболевания выбраны из группы, состоящей из остеохондроза, остеоартрита, повреждений мениска и ревматоидного артрита.
12. Применение по любому из пп. 9 или 10, отличающееся тем, что аутоиммунные заболевания выбраны из группы, состоящей из красной волчанки, болезни «трансплантат против хозяина» и системной склеродермии.
13. Применение по любому из пп. 9 или 10, отличающееся тем, что сердечно-сосудистые заболевания выбраны из группы, состоящей из периферической сосудистой недостаточности, инфаркта миокарда, инсульта и ишемии.