Растворимый FAS-антигену больных раком толстой кишки

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНА ЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

0АЁ: 616.345-097

РАСТВОРИМЫЙ FAS-АНТИГЕН У БОЛЬНЫХ РАКОМ ТОЛСТОЙ КИШКИ

В.В. Пророков, Г.Х. Кусаинов, В.В. Делекторская,

А.Г. Перевощиков

Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН, г. Москва

Представлены данные сравнительного иммуноферментного исследования уровней растворимого Fas-антигена (sFas) в сыворотке крови 33 больных раком толстой кишки и у 60 практически здоровых людей (группа контроля). Частота выявления и уровень sFas в крови больных раком толстой кишки выше, чем в группе контроля. Не обнаружено корреляционной зависимости между уровнем sFas и полом, возрастом больных, размером опухоли, степенью ее инвазии и дифференцировки. Отмечена тенденция к повышению содержания sFas в сыворотке крови больных с увеличением распространенности опухолевого процесса. У больных с диссеминированным раком толстой кишки, характеризующимся наличием множественных метастазов в печени, среднее содержание sFas достоверно выше соответствующего показателя в контрольной группе.

Ключевые слова: рак толстой кишки, апоптоз.

SOLUTABLE FAS-ANTIGEN IN PATIENTS WITH COLON CANCER V.V Prorokov, GKh. Kusainov, VV Delektorskaya, A.G. Perevoshikov

N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center, RAMS, Moscow

Findings on a comparative immunoenzymatic study of solutable Fas-antigen (sFas) level in blood serum of 33 patients with colon cancer and in 60 healthy subjects (the control group) were presented. The sFas level in blood of colon cancer patients was found to be higher than that of the control group. No correlation between the sFas level and such parameters as sex and age of patients, tumor size, tumor invasion and differentiation were found. The sFas level in blood serum of the patients was tended to be increased with higher extent of cancer involvement. The median concentration of sFas was significantly higher in patients with disseminated colon cancer than in the control group.

Key words: colon cancer, apoptosis.

Ключевая роль в механизмах апоптоза принадлежит рецептору Fas и его лиганду - FasL. Fas/APO-1/CD95 - трансмембранный гликопротеин I типа, относящийся к семейству рецепторов TNF, - экспрессирован практически во всех типах нормальных клеток, а также в вирус-инфицированных и опухолевых клетках, FasL - преимущественно в активированных Т-лимфоцитах и натуральных киллерах [7, 10]. Взаимодействие на поверхности клеточной мембраны рецептора Fas с FasL или моноклональными антителами против Fas индуцирует апоптоз клетки-мишени.

Установлено, что рецептор Fas существует в мем-брано-связанной (FasR) и растворимой (sFas) формах. sFas, называемый рецептором-“ловушкой”,

продуцируется в результате альтернативного сплайсинга полноразмерной мРНК Fas и ингибирует цито-токсическое действие FasL. По мнению [4], повышенная экспрессия sFas различными типами клеток (в том числе и клетками опухолей) является одной из возможных причин их устойчивости к факторам, регулирующим Fas-опосредуемый апоптоз.

В литературе имеются данные о повышении уровня sFas в сыворотке крови больных опухолями различных локализаций и гистологических типов [2, 5, 6, 8]. Ряд авторов обнаружили тесную связь sFas с морфологическими особенностями опухоли и показателями выживаемости у больных меланомой [9], раком яичников [3], предстательной железы [1]. Однако при

раке толстой кишки исследования по определению количественного содержания sFas в сыворотке крови больных и изучению его связи с особенностями клинического течения и прогнозом заболевания ранее не проводились.

Цель исследования - анализ частоты выявления и количественного содержания sFas в сыворотке крови больных раком толстой кишки с учетом основных клинико-морфологических характеристик заболевания.

Материал и методы

Обследовали 33 больных аденокарциномой толстой кишки (16 мужчин и 17 женщин) в возрасте 3572 лет (средний возраст - 58,3 ± 10,4 года). Длительность заболевания от появления жалоб до начала специального лечения составила 7,4 ± 5,6 мес. Стадия А по классификации Dukes диагностирована у 9, В - у 11, С - у 27 и D - у 6 больных. Из 33 больных 20 пациентам проведено хирургическое, 13 - комбинированное лечение с применением предоперационной лучевой терапии. В качестве контроля sFas использовали образцы сыворотки крови 60 практически здоровых людей (30 мужчин и 30 женщин) в возрасте 1970 лет (средний возраст - 61,3 ± 8,6 года).

Кровь для определения концентрации sFas у больных раком толстой кишки до начала лечения и у практически здоровых людей брали натощак из локтевой вены с 800 до 900 часов утра. После свертывания крови пробирки центрифугировали при 500хg в течение 10 мин, сыворотку отбирали и хранили при -20 оС до проведения исследования. Концентрацию sFas определяли иммуноферментным методом с использованием моноклональных антител против Fas SA-8 (IgG1(k); (8,8 ± 0,6) х 107, которые сорбировали на планшетах (Linbro) в 0,05 М карбонатном буфере (рН 9,6) в концентрации 5,0 мкг/мл в течение ночи при 4оС. Для инактивации свободных центров связывания планшеты инкубировали с 1 % раствором бычьего сывороточного альбумина (БСА) в фосфатносолевом буфере (PBS) (рН 7,2) 1 ч при 37оС. Затем в планшеты вносили сыворотки. В качестве положительного контроля в каждый планшет вносили последовательные двукратные разведения полноразмерного рекомбинантного Fas от 40,0 до 0,15 нг/мл. Планшеты инкубировали 1,5 ч при 37оС. После инкубации планшеты 6 раз интенсивно

промывали раствором PBS, содержащим 0,1 % Tween 20 («Sigma», США) (буфер для отмывки). Процедуру отмывки далее повторяли после каждой стадии теста. После отмывки в планшеты вносили биотинилированные моноклональные антитела против Fas SA-7 (IgG 1(K); (9,52 ± 1,4) x 108 в концентрации 12 мкг/мл в буфере для отмывки, содержащем 0,1 % БСА. Планшеты с биотинилированными антителами инкубировали 2 ч при 37оС или ночь при 4оС. Затем в планшеты вносили раствор стрептави-дин-пероксидазы («Amersham») в рабочем разведении в буфере для отмывки. Планшеты инкубировали 1 ч при 37оС. Далее в планшеты вносили свежеприготовленный раствор 0,04 % ортофенилендиамина в 50 мМ цитрат-фосфатном буфере (рН 5,0), содержащем 0,03 % перекиси водорода. Планшеты инкубировали 15-20 мин при комнатной температуре до развития окраски. Реакцию останавливали добавлением в каждую лунку 50 мкл 10 % серной кислоты, оптическую плотность измеряли при длине волны 492 нм на спектрофотометре MR 700 Microplate Reader («Dynatech Labs»). Концентрацию sFas определяли по калибровочной кривой, соответствующей каждому планшету.

Математический анализ полученных результатов проводили с использованием пакета статистических программ SAS.

Результаты и обсуждение

Частота выявления sFas в сыворотке крови практически здоровых людей составила 37 %, показатели его количественного содержания варьировали в пределах 0,5-0,9 нг/мл, а средний уровень составил 0,7 ± ±0,1 нг/мл. Нами не обнаружено корреляционной зависимости между частотой выявления, уровнем sFas, полом и возрастом в контрольной группе. sFas в концентрации 0,6-4,2 нг/мл был обнаружен в образцах сыворотки крови 24 (73 %) больных раком толстой кишки. Среднее содержание sFas (2,1 ± 1,1 нг/мл) было выше соответствующего показателя в группе контроля, однако различия не достигали статистической достоверности.

При анализе частоты выявления и количественного содержания sFas в зависимости от пола достоверных различий не обнаружено. У мужчин, больных раком толстой кишки, частота выявления sFas,

В.В. ПРОРОКОВ, Г.Х. КУСАИНОВ, В.В. ДЕЛЕКТОРСКАЯ А.Г ПЕРЕВОЩИКОВ

Таблица

Уровень sFas в сыворотке крови больных раком толстой кишки

Частота Концентрация sFas, нг/мл

Критерий выявления sFas, % Пределы колебаний M ± m

Стадия заболевая по Dukes:

A (9) 56 0,8-2,9 1,4 ± 0,7

B (11) 82 0,6-3,0 1,7 ±1,1

C (7) 57 1,0-3,2 1,9 ± 0,9

D (6) 100 2,4-4,7 3,4 ± 0,8

Степень дифференцировки

опухоли: 75 1,3-3,2 2,1 ± 0,8

низкая (4) 69 0,6-4,4 2,1 ± 1,2

умеренная(23) 83 1,0-4,7 2,0 ± 1,4

высокая

Степень инвазии опухоли:

Р2 (5) 60 1,0-4,4 2,2 ± 1,5

Рз (6) 83 0,8-4,7 2,2 ± 2,0

Р4 (22) 73 0,6-3,2 2,1 ± 1,1

Метастазы в регионарных лимфатических узлах: отсутствуют (23) 74 0,6-4,4 1,9 ± 1,2

имеются (10) 70 1,0-4,7 2,6 ± 1,7

Примечание: в скобках - количество больных.

составила 69 %, уровень его колебался от 0,6 до

4.7 нг/мл и в среднем составил 2,5 ± 1,2 нг/мл. У женщин sFas выявлялся несколько чаще (76 % наблюдений), при этом его уровень равнялся 0,6-3,2 нг/мл, в среднем - 1,7 ± 0,9 нг/мл. Также не выявлено корреляционной связи между содержанием sFas в сыворотке крови больных, их возрастом и длительностью заболевания.

Частота выявления и средний уровень sFas в крови больных раком толстой кишки не зависели от размеров опухоли. Из 16 образцов сыворотки крови больных с размерами опухоли до 5 см sFas выявлен в 11 (69 %) наблюдениях, его концентрация варьировала в пределах 0,6-4,4 нг/мл, а среднее содержание равнялось 2,1 ± 1,9 нг/мл. Уровень sFas у больных с размерами опухоли 5 см и более колебался от 0,6 до

4.7 нг/мл и в среднем составил 2,0 ± 1,7 нг/мл, а частота выявления sFas в данной группе - 77 %.

Анализ полученных данных показал, что среднее содержание sFas в сыворотке крови больных раком толстой кишки повышается по мере увеличения распространенности опухолевого процесса, однако различия между показателями в группах статистически не достоверны (таблица). Следует отметить, что sFas

был обнаружен у всех больных раком толстой кишки в стадии D, причем в наиболее высоких концентрациях. Средний уровень sFas в этой группе достоверно выше этого показателя в контроле (р<0,05).

Как известно, степень дифференцировки опухоли является одним из важных факторов клинического течения и прогноза рака толстой кишки. Нами не обнаружено зависимости между концентрацией sFas и степенью дифференцировки новообразования (таблица). Следует отметить более высокую частоту выявления sFas в образцах сыворотки крови больной раком толстой кишки высокой степени дифференцировки.

По глубине инвазии (согласно Международной классификации ТЫМР) больные, включенные в настоящее исследование, были разделены на следующие группы: Р2 - опухоль с инвазией в мышечный слой, Р3 - опухоль прорастает все слои стенки кишки и Р4 - опухоль выходит за пределы кишечной стенки. Частота выявления и средний уровень sFas у больных не зависели от степени инвазии рака толстой кишки (таблица).

Наиболее часто sFas выявлялся у пациентов со степенью инвазии опухоли Р3. Отмечена тенденция к снижению содержания sFas в сыворотке крови с уве-

личением степени инвазии опухоли. Необходимо отметить более высокий средний уровень sFas в сыворотке крови больных с наличием метастазов в регионарных лимфоузлах по сравнению с показателями в группе пациентов без поражения лимфатического аппарата, однако эти различия статистически не достоверны (таблица).

После операции больные, у которых одновременно с первичной опухолью были выявлены множественные метастазы в печени (стадия D), отказались от дальнейшего лечения. Пациенты, которым было проведено радикальное хирургическое лечение, находились под наблюдением в течение 3-24 мес. За этот период локальный рецидив выявлен у 2, множественные метастазы в печени - у 2, множественные метастазы в легких - у 1 больного. У больных раком толстой кишки с развившимся локальным рецидивом sFas в сыворотке крови до начала лечения обнаружен не был. В образцах сыворотки крови больных с генерализацией опухолевого процесса в сроки 68 мес после проведенного лечения уровень sFas был равен 1,4, 2,9 и 4,7 нг/мл. Из 16 больных, находившихся под наблюдением в течение 3-12 мес после лечения и не имевших признаков рецидива и метастазов, sFas обнаружен в сыворотке крови 13 пациентов, при этом уровень его колебался от 0,6 до 3,2 нг/мл, в среднем составлял 1,9 ± 1,0 нг/мл. У 3 из 7 больных без признаков рецидива и метастазов в сроки наблюдения до 24 мес был выявлен sFas, а его значения были наиболее низкими среди обследованных пациентов -0,8-1,0 нг/мл.

Таким образом, частота выявления и уровень sFas в сыворотке крови больных раком толстой кишки выше, чем у практически здоровых людей. Концентрация sFas достоверно не связана с полом, возрастом больных, длительностью и стадией заболевания, а также каждым из показателей системы ТММР в отдельности. Показана тенденция к повышению кон-

центрации sFas в сыворотке крови больных с увеличением распространенности опухолевого процесса, при этом у больных с диссеминированным процессом среднее содержание sFas достоверно выше этого показателя в контроле. Полученные результаты позволяют предполагать наличие связи между экспрессией sFas и патогенетическими механизмами рака толстой кишки.

ЛИТЕРАТУРА

1. Furuya Y., Nagakawa O., Fuse H. Prognostic significance of serum soluble Fas level and its change during regression and progression of advanced prostate cancer // Endocr. J. 2003. Vol.50, № 5. P. 629-633.

2. Hara T., Tsurumi H., Takemura M. et al. Serum soluble Fas level determines clinical symptoms and outcome of patients with aggressive non-Hodgkin’s lymphoma // Am. J. Hematol. 2000. Vol. 64, № 4. P. 257-261.

3. Hefler L., Mayerhofer K., Nardi A. et al. Serum soluble Fas levels in ovarian cancer // Obstet. Gynecol. 2000. Vol. 96, № 1. P 65-69.

4. Konno R., Takano T., Sato S., Yajima A. Serum soluble Fas level as prognostic factor in patients with gynecological malignancies // Clin. Cancer Res. 2000. Vol. 6, № 9. P. 35763580.

5. Lee S.H., Shin M.S., Lee H.S. et al. Expression of Fas and Fas-related molecules in human hepatocellular carcinoma // Hum. Pathol. 2001. Vol. 32, № 3. P. 250-256.

6. Mitsiades N., Poulaki V, Tseleni-Balafouta S. et al. Thyroid carcinoma cell are resistant to Fas-mediated apoptosis but sensitive tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand // Cancer Res. 2000. Vol. 60, № 15. P. 4122-4129.

7. Nagata S. Fas and Fas ligand: a death factor and its receptor // Adv. Immunol. 1994. Vol. 57. P. 129-144.

8. Sheen-Chen S.M., Chen H.S., Eng H.L., Chen W.J. Circulating soluble Fas in patients with breast cancer // World J. Surg. 2003. Vol. 27, № 1. P. 10-13.

9. Ugurel S., Rappl G., Tilgen W., Reinhold U. Increased soluble CD95 (sFas/CD95 ) serum level correlates with poor prognosis in melanoma patients // Clin. Cancer Res. 2001. Vol. 7, № 5. P. 1282-1286.

10. Vlaeminck-Guillem V., d’Herbomez-Boidein M., Decoulx M., Wemeau J.L. Apoptosis and the thyroid: the Fas pathway // Presse-Med. 2001. Vol. 30, № 2. P. 74-80.

Поступила 31.01.04