Определение содержания липогидропероксидов в липопротеинах сыворотки крови с использованием системы микропероксидаза-люминол

МЕДИКО-БМОЛОГИНЕСКИЕ ПРОБЛЕМЫ

Определение содержания липогидропероксидов в липопротеинах сыворотки крови с использованием системы микропероксидаза-люминол

Ю.О.Теселкин, И.В.Бабенкова

Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И.Пирогова,

НИИ фундаментальных и прикладных биомедицинских исследований, отдел медицинской биофизики, Москва

Увеличение содержания первичных продуктов пероксидного окисления липидов - липогидропероксидов - в апо-В-содержащих липопротеинах (апо-В ЛП) сыворотки крови человека может рассматриваться как один из признаков развития оксидативного стресса. Цель исследования - поиск оптимальных экспериментальных условий для хемилю-минесцентного определения содержания липогидропероксидов в апо-В ЛП сыворотки крови с помощью системы микропероксидаза-люминол. Обнаружено, что кинетика хемилюминесценции апо-В ЛП в системе микропероксидаза-люминол имела сложный характер. Установлено, что «быстрая» вспышка хемилюминесценции апо-В ЛП связана с разрушением входящих в их состав липидных гидропероксидов. Исследовано влияние экспериментальных условий, а также исходного уровня липидной пероксидации апо-В ЛП на хемилюминесценцию последних в системе микроперок-сидаза-люминол. Предлагаемый способ может быть использован для определения содержания липогидропероксидов в апо-В ЛП сыворотки крови.

Ключевые слова: пероксидное окисление липидов, липогидропероксиды, апо-В-содержащие липопротеины, хемилюминесценция

Detection of lipid hydroperoxides content in serum lipoproteins by the microperoxidase-luminol system

Yu.O.Teselkin, I.V.Babenkova

N.I.Pirogov Russian National Research Medical University,

Institute for Fundamental and Applied Biomedical Research, Department of Medical Biophysics, Moscow

The increase of content of lipid peroxidation primary products - lipid hydroperoxides - in human serum apo-B-containing lipoproteins (apo-B LP) can be considered as one of the signs of oxidative stress development. The aim of the investigation was to find optimal experimental conditions for the chemiluminescent detection of lipid hydroperoxides in human serum apo-B LP in the presence of the microperoxidase-luminol system. It was discovered that the kinetic of apo-B LP chemiluminescence in the presence of the microperoxidase-luminol system had a complex mechanism. It was established that «fast flash» of apo-B LP chemiluminescence was connected with destruction of lipid hydroperoxides which are a part of those lipoproteins. The influence of experimental conditions, as well as the initial degree of apo-B LP lipid peroxidation on the chemiluminescence in the microperoxidase-luminol system were investigated. The proposed method can be used to determine the lipid hydroperoxides content in serum apo-B LP.

Key words: lipid peroxidation, lipid hydroperoxides, apo-B-containing lipoproteins, chemiluminescence

И

звестно, что развитие многих патологических состояний организма человека сопровождается усилением образования активных форм кислорода и свободных радикалов, которые могут вызвать повреждение биологически

Для корреспонденции:

Теселкин Юрий Олегович, доктор биологических наук,

главный научный сотрудник отдела медицинской биофизики

НИИ фундаментальных и прикладных биомедицинских исследований

Российского национального исследовательского медицинского

университета им. Н.И.Пирогова

Адрес: 117997, Москва, ул. Островитянова, 1

Телефон: (495) 434-8192

E-mail: teselkin-box@mail.ru

Статья поступила 25.02.2011 г., принята к печати 14.09.2011 г.

важных молекул и в конечном итоге привести к гибели клетки [1]. Так, установлено, что процессы свободнорадикально-го окисления играют важную роль в патогенезе нейродеге-неративных, сердечно-сосудистых, онкологических, бронхо-легочных и других заболеваний [1-3]. В связи с этим одной из задач клинических исследований является оценка степени выраженности оксидативного стресса, которая позволяет более эффективно проводить различные лечебные мероприятия, в том числе антиоксидантную терапию.

Объективную оценку степени выраженности оксидативного стресса дает определение накопления первичных продуктов пероксидного окисления липидов (ПОЛ) - липогидропероксидов (ЛГП), поскольку их распад с образованием ак-

тивных радикалов, способных индуцировать новые цепи окисления, является ключевым этапом в развитии липидной пероксидации. Существует много методов определения ЛГП в биологическом материале [4]. Один из перспективных способов определения содержания ЛГП в сыворотке крови основан на регистрации хемилюминесценции (ХЛ), возникающей при их взаимодействии с системой микроперокси-даза-изолюминол [5]. Указанный тест используется в сочетании с высокоэффективной жидкостной хроматографией, которая позволяет не только пространственно отделить ан-тиоксиданты сыворотки крови от гидропероксидов и тем самым устранить их ингибирующее влияние на ХЛ изолюми-нола, но и идентифицировать природу ЛГП. Однако, отвечая критериям высокой чувствительности и специфичности, этот способ вместе с тем достаточно трудоемок, требует проведения предварительной экстракции липидов из сыворотки крови, а также наличия сложной аппаратуры.

Показано, что основное количество ЛГП содержится в липопротеинах (ЛП) сыворотки крови, и в первую очередь в липопротеинах низкой и очень низкой плотности - апо-В-содержащих липопротеинах (апо-В ЛП) [6]. В связи с этим можно предположить, что пространственное отделение этих ЛП от антиоксидантов сыворотки крови (мочевой кислоты, аскорбиновой кислоты, альбумина, билирубина и др.), затрудняющих хемилюминесцентное определение ЛГП, с помощью более простых приемов, например осаждения апо-В ЛП в присутствии гепарина и ионов Са2+, позволит в значительной степени упростить хемилюминесцентный тест.

Цель исследования - поиск оптимальных условий для хемилюминесцентного определения содержания ЛГП в апо-В ЛП сыворотки крови.

Материалы и методы

Апо-В ЛП выделяли из сыворотки крови методом осаждения [7]. Для этого к 1 мл сыворотки крови последовательно добавляли 2,4 мл дистиллированной воды, 0,1 мл 0,25% раствора гепарина (около 140 МЕ/мг) и 0,5 мл 0,5 М раствора СаС12, перемешивали и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре. Затем образцы центрифугировали при 5000 д в течение 30 мин при 15°С. Надосадочную жидкость удаляли, а осадок промывали 2 мл 63 мМ раствора СаС12. Далее образцы центрифугировали при тех же условиях. Надосадочную жидкость снова удаляли. Осевшие апо-В ЛП суспензировали в 1 мл дистиллированной воды. Содержание белка в суспензиях апо-В ЛП определяли по методу О.Н.1^гу е! а1. [8].

Хемилюминесцентное определение содержания ЛГП в апо-В ЛП проводили в 0,1 М боратном буфере (рН 10). Реакционная среда общим объемом 4 мл содержала 15 мкг/мл микропероксидазы, 50 мкМ люминол, 0,1% тритон Х-100 (объемные проценты) и 0,120-350 мкг белка ЛП. Измерение ХЛ выполняли на хемилюминометре отечественного производства при температуре 37°С и постоянном перемешивании. Содержание ЛГП в апо-В ЛП рассчитывали по калибровочному графику, построенному по гидроперекиси трет-бутила и выражали в нмоль или мкмоль на 1 мг белка.

Си2+-индуцированное ПОЛ апо-В ЛП (190 мкг белка/мл) проводили при 37°С в фосфатном буфере (9,5 мМ КН2РО4,

40,5 мМ Na2HPO4, рН 7,4) в присутствии 12 мкМ CuSО 4 в течение 3 ч. Через определенные интервалы времени измеряли накопление продуктов липидной пероксидации - ЛГП и малонового диальдегида (МДА), рассчитывая разность между уровнем соответствующих продуктов в каждый интервал времени и исходным уровнем.

При проведении модельных экспериментов использовали сыворотку крови здоровых доноров (п = 20), при построении корреляции между содержанием ЛГП и МДА в апо-В ЛП -сыворотку крови больных сахарным диабетом 2 типа (п = 13) в возрасте 56-62 лет.

Определение содержания МДА в апо-В ЛП, полученных из сыворотки крови больных, а также в апо-В ЛП, подвергнутых Си2+-индуцированному ПОЛ, выполняли с помощью флуоресцентного метода [9] с добавлением в инкубационную среду 20 мкл 0,04 М раствора 2,6-ди-трет-бутил-4-метилфенола в этаноле. Калибровочный график строили по МДА, полученному при кислотном гидролизе 1,1,3,3-тетра-этоксипропана. Содержание МДА в апо-В ЛП выражали в нмоль на 1 мг белка.

Результаты исследования обработаны методами вариационной статистики и представлены как средняя величина ± стандартная ошибка средней.

Результаты исследования и их обсуждение

При добавлении микропероксидазы к боратному буферу, содержащему люминол в качестве молекулы-мишени, подвергающейся свободнорадикальному окислению, развивалось яркое свечение (рис. 1, кривая А), максимальная интенсивность которого выходила за пределы регистрации. Это свечение постепенно затухало, и через 6 мин его уровень существенно не отличался от фонового. Введение в реакционную среду на 7-й минуте суспензии апо-В ЛП приводило к развитию двухфазной кинетики ХЛ: сначала регистрировали «быструю» вспышку продолжительностью 1-1,5 мин, затем - более длительную «медленную» вспыш-

X

0 2 4 6 8 10

Время, мин

Рис. 1. Кинетики ХЛ системы микропероксидаза-люминол в присутствии апо-В ЛП (А) и гидроперекиси трет-бутила (Б).

Стрелкой 1 отмечен момент добавления микропероксидазы к смеси люминола и тритона Х-100 в боратном буфере, стрелкой 2 - апо-В ЛП или гидроперекиси трет-бутила. Состав реакционной среды: люминол - 50 мкМ, тритон Х-100 - 0,1%, микропероксидаза -15 мкг/мл, апо-В ЛП - 30 мкг белка/мл, гидроперекись трет-бутила -0,25 нмолей, 0,1 М боратный буфер (рН 10).

ку. При введении в систему вместо апо-В ЛП в качестве контроля дистиллированной воды ХЛ не развивалась. Не наблюдали развития ХЛ и при добавлении в нее 0,05-1 мл сыворотки крови. Более того, в присутствии сыворотки крови уровень фонового свечения даже уменьшался. При введении в систему гидроперекиси трет-бутила развивалась ХЛ, которая по времени совпадала с «быстрой» вспышкой ХЛ апо-В ЛП (рис. 1, кривая Б).

Ранее Т.^аока и F.Tabata [10] было показано, что при добавлении органических гидропероксидов к системе микро-пероксидаза-люминол регистрируемый хемилюминесцент-ный сигнал зависит только от концентрации гидроперекис-ных групп и не зависит от структуры гидропероксидов. Это позволяет предположить, что в случае ХЛ апо-В ЛП «быстрая» вспышка связана с разрушением ЛГП, входящих в их состав. В свою очередь, «медленная» вспышка, по-видимому, обусловлена последующим ПОЛ липидов апо-В ЛП, которое индуцируют образующиеся при разрушении ЛГП радикалы. Что касается первой вспышки, то механизм ее возникновения не вполне ясен. Возможно, она связана с разрушением гидроперекисей, содержащихся в исходном препарате люминола.

Для выбора оптимальных условий регистрации «быстрой» вспышки ХЛ апо-В ЛП в системе микропероксидаза-люминол были изучены различные концентрационные зависимости. На рис. 2а представлена зависимость амплитуды «быстрой» вспышки ХЛ апо-В ЛП от концентрации тритона Х-100. В отсутствие детергента уровень свечения был невысоким. С увеличением концентрации тритона Х-100 интенсивность ХЛ повышалась. Максимальное свечение наблюдали при концентрации детергента 0,1%. При дальнейшем повышении концентрации тритона Х-100 интенсивность ХЛ несколько понижалась. Повышение интенсивности ХЛ апо-В ЛП в присутствии тритона Х-100 можно объяснить солюбилизацией липидов, входящих в состав ЛП, и увеличением доступности ЛГП для микро-пероксидазы.

Зависимость интенсивности ХЛ апо-В ЛП в системе ми-кропероксидаза-люминол от концентрации люминола представлена на рис. 2б. С увеличением концентрации люминола интенсивность ХЛ повышалась и достигала постоянного уровня при концентрации 25 мкМ. При дальнейшем повышении концентрации люминола интенсивность свечения не изменялась. Что касается влияния микропероксидазы на ХЛ

200

а

ф

- 150

100

50

_1_

_1_

100 200 300

Апо-В ЛП, мкг белка

400

200 г

150 -

100 -

50 -

0 -

0,2 0,3 0,4 0,5 Гидроперекись трет-бутила, нмоль

Рис. 3. Зависимость интенсивности ХЛ системы микропероксидаза-люминол от содержания апо-В ЛП (а) и гидроперекиси трет-бутила (б) в пробе.

б

а

0

0

3,5 3,0

[2,5

)

' 2,0

¡1,5

Г 1,0 0,5 0,0

70 60

50 i

си

о

40 j¡ 30 ¡

X

<

20 ¿I

2

10 0

Время, ч

Рис. 4. Накопление ЛГП и МДА в процессе Си2+-индуцированной липидной пероксидации апо-В ЛП. 1 - накопление ЛГП; 2 - накопление МДА.

апо-В ЛП, то при увеличении концентрации фермента в широких пределах (2,5-40 мкг/мл) интенсивность «быстрой» вспышки свечения оставалась неизменной.

В дальнейшем для регистрации ХЛ апо-В ЛП использовали условия, которые описаны в разделе «Материалы и методы». При этих условиях зависимость амплитуды «быстрой» вспышки ХЛ апо-В ЛП от их содержания в модельной системе имела линейный характер (рис. 3, а). Изменение амплитуды ХЛ гидроперекиси трет-бутила от ее содержания в модельной системе также описывалось линейной зависимостью (рис. 3, б), которая была использована для количественного определения содержания ЛГП в апо-В ЛП.

Для подтверждения того, что регистрируемая «быстрая» вспышка ХЛ обусловлена разрушением ЛГП в составе апо-В ЛП и отражает их количество, были проведены модельные эксперименты. Как видно из рис. 4, Си2+-индуцированное ПОЛ апо-В ЛП сопровождалось однонаправленным увеличением содержания в них ЛГП, измеренных с помощью регистрации «быстрой» вспышки ХЛ, и МДА.

В настоящее время в клинических исследованиях для оценки относительного содержания ЛГП в сыворотке крови наиболее часто используется тест с тиобарбитуровой кислотой [9]. При этом концентрацию ЛГП выражают через кон-

1,6 1,2 1,0 0,8

1 0,6

1 0,4 с" ^ 0,2

0,0

_1_

<хъ

r = +0,91

_1_

J

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 2,0 МДА, нмоль/мг белка

Рис. 5. Взаимосвязь между содержанием ЛГП и МДА в апо-В ЛП сыворотки крови больных сахарным диабетом 2 типа.

центрацию МДА. Нами было проведено изучение корреляции между уровнем ЛГП в апо-В ЛП сыворотки крови, измеренным с помощью системы микропероксидаза-люми-нол, и уровнем МДА. Объектом исследования служили апо-В ЛП сыворотки крови больных сахарным диабетом 2 типа. Обнаружено, что у обследованной группы больных значения уровней ЛГП и МДА в апо-В ЛП находились в пределах 0,55-1,47 и 0,6-1,75 нмоль/мг белка соответственно (рис. 5), а коэффициент корреляции между ними был равен +0,91 (р < 0,001). Средние значения исследованных показателей составили 0,83 ± 0,07 нмоль/мг белка для ЛГП и 0,93 ± 0,09 нмоль/мг белка для МДА. Таким образом, обнаружено хорошее соответствие между содержанием ЛГП и МДА в апо-В ЛП сыворотки крови у этих больных. В то же время обращает на себя внимание тот факт, что в модельном эксперименте содержание ЛГП в окисленных апо-В ЛП было существенно выше, чем содержание МДА. Это, по-видимому, связано с тем, что при Си2+-индуцированном окислении апо-В ЛП идет процесс интенсивной пероксидации различных липидов с образованием соответствующих ЛГП, однако далеко не все из них распадаются с образованием МДА. В отличие от модельного эксперимента, in vivo регуляция процесса ПОЛ в апо-В ЛП и других липидсодержащих объектах осуществляется при участии физиологической ан-тиоксидантной системы. Вследствие этого больших различий между значениями измеряемых показателей не наблюдается.

Очень важным является вопрос о влиянии антиоксидан-тов на ХЛ сыворотки крови и апо-В ЛП в системе микро-пероксидаза-люминол. При введении в систему сыворотки крови нами не было зарегистрировано хемилюминесцент-ного сигнала, как при добавлении апо-В ЛП. Этот результат, вероятно, связан с ингибированием свечения антиок-сидантами сыворотки крови. Так, Y.Yamamoto et al. [5] обнаружили ингибирующее влияние некоторых антиоксидан-тов плазмы крови человека - мочевой кислоты, аскорбата, а-токоферола, у-токоферола - на фоновую ХЛ ЛГП плазмы крови в системе микропероксидаза-изолюминол. В наших экспериментах определение ЛГП проводилось в апо-В ЛП сыворотки крови, полученных методом осаждения [7]. Эта процедура позволяет отделить апо-В ЛП от водорастворимых антиоксидантов сыворотки крови. Между тем нельзя исключить, что жирорастворимые антиоксиданты -токоферолы, каротиноиды, коэнзим Q10, входящие в состав апо-В ЛП [11], могут занижать интенсивность «быстрой» вспышки ХЛ и, следовательно, определяемое содержание ЛГП. Однако анализ полученных в настоящей работе результатов позволяет прийти к выводу, что влияние жирорастворимых антиоксидантов на ХЛ апо-В ЛП в системе ми-кропероксидаза-люминол является, по-видимому, несущественным. В пользу данного предположения свидетельствует то, что зависимость «быстрой» вспышки ХЛ апо-В ЛП от их концентрации была линейной. Увеличение в системе количества ЛП, а вместе с ними и жирорастворимых антиоксидантов, должно было бы привести к частичному ингибированию свечения и нарушению линейности. Кроме того, косвенным подтверждением этого предположения может также служить высокий коэффициент корреляции между содержанием ЛГП и МДА в апо-В ЛП сыворотки крови у больных сахарным диабетом.

2

Заключение

Подобраны экспериментальные условия для хемилюми-несцентного способа определения содержания ЛГП в апо-В ЛП сыворотки крови с помощью системы микропероксида-за-люминол. Полученные результаты показывают, что описанный тест адекватно отражает уровень липидной перокси-дации в апо-В ЛП сыворотки крови человека. Кроме того, он обладает рядом преимуществ перед уже существующими способами определения ЛГП. В частности, для подготовки образцов не требуется проведения экстракции липидов из ЛП, их длительного ультрацентрифугирования или нагревания на кипящей водяной бане, во время которых ЛП подвергаются дополнительному окислению.

Исследование выполнено в рамках перспективного направления развития «Профилактика, диагностика и лечение заболеваний, связанных с нарушением кровообращения и гипоксией» Российского национального исследовательского медицинского университета им. Н.И.Пирогова

Литература

1. Valko M., Leibfritz D., Moncol J. et al. Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease // Int. J. Biochem. Cell. Biol. 2007. V.39. №1. P.44-84.

2. Valko M., Rhodes C.J., Moncol J. et al. Free radicals, metals and antioxidants in oxidative stress-induced cancer // Chem. Biol. Interact. 2006. V.160. №1. P.1-40.

3. Chung K.F., Marwick J.A. Molecular mechanisms of oxidative stress in airways and lungs with reference to asthma and chronic obstructive pulmonary disease // Ann. N.Y. Acad. Sci. 2010. V.1203. P.85-91.

4. Арутюнян А.В., Дубинина Е.Е., Зыбина Н.Н. Методы оценки свободнора-дикального окисления и антиоксидантной системы организма: Метод. рекоменд. / Под ред. В.Х.Хавинсона. СПб.: ИКФ «Фолиант», 2000.

5. Yamamoto Y., Brodsky M.H., Baker J.C., Ames B.N. Detection and characterization of lipid hydroperoxides at picomole levels by high-performance liquid chromatography // Anal. Biochem. 1987. V.160. №1. P.7-13.

6. Zamburlini A., Maiorino M., Barbera P et al. Direct measurement by single photon counting of lipid hydroperoxides in human plasma and lipoproteins // Anal. Biochem. 1995. V.232. №1. P.107-113.

7. Berenson G.S., Srinivasan S.R., Pargaonkar P.S. et al. Simplified primary screening procedure for detection of hyperlipidemias in healthy individuals // Clin. Chem. 1972. V.18. №12. P.1463-1467.

8. Lowry O.H., Rosenbrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent // J. Biol. Chem. 1951. V.193. №1. P.265-275.

9. Гаврилов В.Б., Гаврилова А.Р., Мажуль Л.М. Анализ методов определения продуктов перекисного окисления липидов в сыворотке крови по тесту с тиобарбитуровой кислотой // Вопр. мед. химии. 1987. Т.33. №1. С.118-122.

10. I waoka T., Tabata F. Chemiluminescent assay of lipid peroxide in plasma using cytochrome c heme peptide // FEBS Lett. 1984. V.178. №1. P.47-50.

11. Halliwell B. Oxidation of low-density lipoproteins: questions of initiation, propagation, and the effect of antioxidants // Am. J. Clin. Nutr. 1995. V.61 (3 Suppl.). P.670S-677S.

Информация об авторе:

Бабенкова Ирина Владимировна, кандидат медицинских наук,

научный сотрудник отдела медицинской биофизики

НИИ фундаментальных и прикладных биомедицинских исследований

Российского национального исследовательского

медицинского университета им. Н.И.Пирогова

Адрес: 117997, Москва, ул. Островитянова, 1

Телефон: (495) 434-3576

из жизни университета

Лекция профессора И.Н.Попова

Кафедра медицинской биофизики медико-биологического факультета совместно с НИИ фундаментальных и прикладных биомедицинских исследований Российского национального исследовательского медицинского университета им. Н.И.Пирогова в рамках научного сотрудничества между ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И.Пирогова и НИИ антиоксидантной терапии (Берлин, Германия) организовала лекцию проф. И.Н.Попова, одного из руководителей этого института. Лекция состоялась 8 сентября на кафедре медицинской биофизики. Тема лекции - «Антиокислительный гомеостаз и его оценка с помощью хемилюминесцентных методов».

В своем выступлении проф. И.Н.Попов отметил, что различные оксиданты, к которым относятся свободные радикалы, активные формы кислорода и азота, постоянно образуются в организме человека и животных в ходе ферментативных и неферментативных реакций. В норме регуляция продукции оксидантов в тканях и органах осуществляется антиоксидантной системой. Нарушение баланса между оксидантами и антиоксидантами в пользу первых приводит к развитию оксида-тивного стресса, играющего важную роль в патогенезе многих заболеваний.

Для оценки состояния антиоксидантной системы проф. И.Н.Поповым были разработаны специальные методики, позволяющие определять антиоксидантную активность биологических жидкостей, а также приборы для проведения этих исследований (например, фотохемилюминометры). Основной принцип, который положен в основу большинства созданных приборов, - регистрация хемилюминесценции.

В своей лекции И.Н.Попов привел примеры применения разработанных им методик и приборов для оценки общей антиоксидантной активности плазмы крови пациентов с различными заболеваниями и вклада в нее отдельных антиоксидан-тов. Проведенные исследования показывают, что антиоксидантная активность плазмы крови и других биологических жидкостей может использоваться в качестве одного из критериев оценки функционального состояния антиоксидантной системы и эффективности применения антиоксидантной терапии. Много внимания в исследованиях И.Н.Попова уделяется изучению антиоксидантных свойств биологически активных добавок к пище, лекарственных препаратов, экстрактов лекарственных растений, соков и пищевых продуктов.

Результатом визита проф. И.Н.Попова была разработка программы дальнейшего научного сотрудничества между РНИМУ им. Н.И.Пирогова и НИИ антиоксидантной терапии. В частности, обсуждались вопросы стажировки молодых специалистов.

Ю.О.Теселкин, главный научный сотрудник отдела медицинской биофизики НИИ ФПБИ РНИМУ им. Н.И.Пирогова