КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ МОДУЛИРОВАНИЯ ЭКСПРЕССИИ C9ORF72
COMPOSITIONS FOR MODULATING C9ORF72 EXPRESSION

Перечень последовательностей
Настоящая заявка подана вместе с перечнем последовательностей в электронном формате. Перечень последовательностей представлен в виде файла под названием BIOL0269WOSEQ_ST25.txt, созданного 15 апреля 2016 года, размером 104 Кб. Информация о перечне последовательностей в электронном формате в полном объеме включена в данный документ посредством ссылки.
Область изобретения
Предложены композиции и способы модулирования экспрессии мРНК и белка C9ORF72 в клетках и у животных. Указанные композиции и способы подходят для лечения, предупреждения, облегчения или замедления прогрессирования нейродегенеративных заболеваний, включая боковой амиотрофический склероз (ALS - amyotrophic lateral sclerosis), лобно-височную деменцию (FTD - frontotemporal dementia), синдром кортико-базальной дегенерации (CBD - corticobasal degeneration syndrome), атипический синдром паркинсонизма и оливопонтоцеребеллярную дегенерацию (OPCD - olivopontocerebellar degeneration).
Уровень техники
Боковой амиотрофический склероз (ALS) представляет собой неизлечимое нейродегенеративное заболевание, клинически характеризующееся прогрессирующим параличом, приводящим к смерти вследствие дыхательной недостаточности, обычно в течение двух-трех лет после возникновения симптома (Rowland and Shneider, N. Engl. J. Med., 2001, 344, 1688-1700). ALS является третьим по распространенности нейродегенеративным заболеванием в западном мире (Hirtz et al., Neurology, 2007, 68, 326-337), и в настоящее время не существует эффективных терапевтических способов лечения. Около 10% случаев являются наследственными по своей природе, при этом основная масса пациентов, у которых диагностировано указанное заболевание, классифицируется как спорадическая, поскольку болезнь возникает в популяции случайным образом (Chio et al., Neurology, 2008, 70, 533-537). На основании клинических, генетических и эпидемиологических данных растет понимание того, что ALS и лобно-височная деменция (FTD) представляют собой перекрывающийся, сплошной спектр заболевания, патологически характеризующийся наличием TDP-43-положительных включений в центральной нервной системе (Lillo and Hodges, J. Clin. Neurosci., 2009, 16, 1131-1135; Neumann et al., Science, 2006, 314, 130-133).
В настоящее время открыто множество генов, являющихся причиной классического наследственного ALS, например, SOD1, TARDBP, FUS, OPTN и VCP (Johnson et al., Neuron, 2010, 68, 857-864; Kwiatkowski et al., Science, 2009, 323, 1205-1208; Maruyama et al., Nature, 2010, 465, 223-226; Rosen et al., Nature, 1993, 362, 59-62; Sreedharan et al., Science, 2008, 319, 1668-1672; Vance et al., Brain, 2009, 129, 868-876). Проведенный недавно анализ генетических связей между родственниками с многочисленными случаями ALS, FTD и ALS-FTD позволил предположить, что существует важный локус указанного заболевания на коротком плече хромосомы 9 (Boxer et al., J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry, 2011, 82, 196-203; Morita et al., Neurology, 2006, 66, 839-844; Pearson et al. J. Nerol., 2011, 258, 647-655; Vance et al., Brain, 2006, 129, 868-876). Мутация в гене C9ORF72 является наиболее распространенной генетической причиной ALS и FTD. Мутация, вызывающая ALS-FTD, представляет собой экспансию крупного гексануклетоидного (GGGGCC) повтора в первом интроне гена C9ORF72 (Renton et al., Neuron, 2011, 72, 257-268; DeJesus-Hernandez et al., Neuron, 2011, 72, 245-256). Гаплотип-основатель, охватывающий ген C9ORF72, в большинстве случаев присутствует в связанной форме с указанной областью (Renton et al., Neuron, 2011, 72, 257-268). Указанный локус на хромосоме 9р21 обусловливает около половины случаев наследственного ALS и около четверти всех случаев ALS в группе из 405 финских пациентов (Laaksovirta et al, Lancet Neurol., 2010, 9, 978-985).
Гаплотип-основатель, охватывающий ген C9ORF72, в большинстве случаев присутствует в связанной форме с указанной областью.
В настоящее время не существует эффективных способов терапевтического лечения указанных нейродегенеративных заболеваний. Таким образом, цель настоящего изобретения заключается в обеспечении композиций и способов лечения указанных нейродегенеративных заболеваний.
Сущность изобретения
В некоторых вариантах реализации предложены способы, соединения и композиции для ингибирования экспрессии мРНК и белка C9ORF72 в клетках, тканях и у животных. В некоторых вариантах реализации предложены способы, соединения и композиции для снижения уровней мРНК и белка C9ORF72 в клетках, тканях и у животных. В некоторых вариантах реализации предложены антисмысловые соединения, направленные на нуклеиновую кислоту C9ORF72. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения представляют собой модифицированные олигонуклеотиды. В некоторых вариантах реализации модифицированные олигонуклеотиды являются одноцепочечными.
В некоторых вариантах реализации обеспечено снижение продуктов ассоциированной с повтором C9ORF72, не связанной с ATG трансляции (RAN-зависимой трансляции). В некоторых вариантах реализации изобретения продукты C9ORF72-ассоциированной RAN-зависимой трансляции представляют собой поли(глицин-пролин), поли(глицин-аланин) и поли(глицин-аргинин). В некоторых вариантах реализации предпочтительно сокращены некоторые варианты мРНК C9ORF72. В некоторых вариантах реализации предпочтительно сокращенные варианты мРНК C9ORF72 представляют собой варианты, процессированные из пре-мРНК, содержащей интрон 1. В некоторых вариантах реализации интрон 1 содержит экспансию гексануклеотидного повтора. В некоторых вариантах реализации предпочтительно сокращенный вариант мРНК C9ORF72 представляет собой патоген-ассоциированный вариант мРНК C9ORF72. В некоторых вариантах реализации патоген-асоциированный вариант мРНК C9ORF72 представляет собой NM_001256054.1 (SEQ ID NO: 1). В некоторых вариантах реализации экспансия гексануклеотидного повтора связана с C9ORF72-ассоциированным заболеванием. В некоторых вариантах реализации экспансия гексануклеотидного повтора связана с заболеванием, ассоциированным с экспансией гексануклеотидного повтора C9ORF72. В некоторых вариантах реализации экспансия гексануклеотидного повтора содержит по меньшей мере 30 повторов GGGGCC, более 30 повторов GGGGCC, более 100 повторов GGGGCC, более 500 повторов GGGGCC или более 1000 повторов GGGGCC. В некоторых вариантах реализации экспансия гексануклеотидного повтора ассоциирована с ядерными очагами. В некоторых вариантах реализации продукты C9ORF72-ассоциированной RAN-зависимой трансляции ассоциированы с ядерными очагами. В некоторых вариантах реализации продукты C9ORF72-ассоциированной RAN-зависимой трансляции представляют собой поли(глицин-пролин), поли(глицин-аланин) и поли(глицин-аргинин). В некоторых вариантах реализации композиции и способы, описанные в настоящем документе, пригодны для снижения уровней мРНК C9ORF72, уровней белка C9ORF72, продуктов RAN-зависимой трансляции C9ORF72 и ядерных очагов. В некоторых вариантах реализации композиции и способы, описанные в настоящем документе, пригодны для селективного сокращения патоген-ассоциированных вариантов мРНК C9ORF72. Подобные сокращения могут возникать в зависимости от времени или в зависимости от дозы.
Предложены также способы, пригодные для предупреждения, лечения, облегчения и замедления прогрессирования заболеваний, связанных с C9ORF72. В некоторых вариантах реализации указанные заболевания, связанные с C9ORF72, представляют собой нейродегенеративные заболевания. В некоторых вариантах реализации нейродегенеративное заболевание представляет собой боковой амиотрофический склероз (ALS), лобно-височную деменцию (FTD), синдром кортико-базальной дегенерации (CBD), атипический синдром паркинсонизма и оливопонтоцеребеллярную дегенерацию (OPCD).
Такие заболевания могут в совокупности иметь один или несколько факторов риска, причин или последствий. Некоторые факторы риска и причины развития нейродегенеративного заболевания и, в частности, ALS и FTD, включают генетическую предрасположенность и пожилой возраст.
В некоторых вариантах реализации изобретения способы лечения включают введение антисмыслового соединения против C9ORF72 индивидууму, нуждающемуся в этом. В некоторых вариантах реализации антисмысловое соединение представляет собой одноцепочечный модифицированный олигонуклеотид. В некоторых вариантах реализации одноцепочечный модифицированный олигонуклеотид комплементарен нуклеиновой кислоте C9ORF72.
Подробное описание изобретения
Следует понимать, что изложенное выше общее описание и следующее подробное описание являются лишь примерными и пояснительными, и не являются ограничивающими заявленное изобретение. В данном документе использование единственного числа включает множественное число, если специально не указано иное. В данном контексте термин «или» означает «и/или», если не указано иное. Кроме того, в данном контексте применение термина «и» означает «и/или», если не указано иное. Кроме того, использование термина «включающий», а также других форм, таких как «включает» и «включенный», не является ограничивающим. Также, такие термины как «элемент» или «компонент» охватывают как элементы и компоненты, содержащие одну единицу, так и элементы и компоненты, которые содержат более одной субъединицы, если специально не указано иное.
Соединения согласно настоящему изобретению включают разновидности описанных соединений, в которых один или более атомов водорода, углерода, азота, кислорода или серы заменен на стабильный изотоп того же элемента.
Названия разделов, используемые в настоящем документе, предназначены лишь для организационных целей, и их не следует толковать как ограничение описанного объекта изобретения. Все документы или фрагменты документов, цитируемые в настоящем изобретении, включая, но не ограничиваясь ими, патенты, патентные заявки, опубликованные патентные заявки, статьи, книги, монографии и учетные номера GENBANK, а также информацию об ассоциированной последовательности, получаемую посредством баз данных, таких как Национальный центр информации по биотехнологии (NCBI), и другие данные, указанные в в тексте настоящего описания, явным образом включены в настоящий документ посредством ссылки в отношении тех фрагментов документов, которые рассмотрены в настоящем документе, а также в полном объеме.
Определения
При отсутствии конкретных определений, номенклатура, используемая в связи с ними, а также в связи с приемами и методиками аналитической химии, синтетической органической химии, а также медицинской и фармацевтической химии, описанная в настоящем документе, является общеизвестной и общепринятой в данной области техники. Для химического синтеза и химического анализа могут быть использованы стандартные методы.
Если не указано иное, следующие термины имеют следующие значения:
2
2
3
«2'-O-метоксиэтил» (также 2'-МОЕ и 2'-ОСНСН-ОСН и МОЕ) относится к О-метоксиэтильной модификации в 2' положении фуранозного кольца. 2'-O-метоксиэтил-модифицированный сахар представляет собой модифицированный сахар.
«2'-МОЕ нуклеозид» (также 2'-O-метоксиэтил-нуклеозид) означает нуклеозид, содержащий модифицированный МОЕ фрагмент сахара.
«2'-замещенный нуклеозид» означает нуклеозид, содержащий отличный от Н или ОН заместитель в 2'-положении фуранозного кольца. В некоторых вариантах реализации 2'-замещенные нуклеозиды включают нуклеозиды с бициклическими сахарными модификациями.
«5-Метилцитозин» обозначает цитозин, модифицированный метильной группой, присоединенной в 5' положении. 5-Метилцитозин представляет собой модифицированное нуклеиновое основание.
«Вводят совместно» относится к совместному введению двух фармацевтических агентов любым способом, при котором фармакологические эффекты обоих проявляются у пациента одновременно. Совместное применение не требует, чтобы оба фармацевтических агента вводились в одной фармацевтической композиции, в одной лекарственной форме или одним способом введения. Эффекты обоих фармацевтических агентов не обязательно должны проявляться одновременно. Эффекты должны только перекрываться в промежутке времени и не обязательно должны иметь одинаковую продолжительность.
«Введение» означает обеспечение фармацевтическим агентом животного и включает, но не ограничивается этим, введение медицинским работником и самостоятельное введение.
«Улучшение» относится к уменьшению, замедлению, остановке или инвертированному течению по меньшей мере одного показателя тяжести состояния или заболевания. Степень тяжести показателей может быть определена субъективными или объективными показателями, которые известны специалистам в данной области техники.
«Животное» относится к человеку или животному, которое не является человеком, включая, но не ограничиваясь ими, мышей, крыс, кроликов, собак, кошек, свиней и приматов, включая, но не ограничиваясь ими, обезьян и шимпанзе.
«Антитело» относится к молекуле, характеризующейся специфическим взаимодействием с антигеном каким-либо образом, при этом антитело и антиген определены относительно друг друга. Антитело может относиться к целой молекуле антитела, или какому-либо ее фрагменту или области, такой как тяжелая цепь, легкая цепь, область Fab и область Fc.
«Антисмысловая активность» означает любую обнаруживаемую или поддающуюся измерению активность, обусловленную гибридизацией антисмыслового соединения с его нуклеиновой кислотой-мишенью. В неких вариантах реализации изобретения антисмысловая активность представляет собой уменьшение количества или экспрессии нуклеиновой кислоты-мишени или белка, кодируемого такой нуклеиновой кислотой-мишенью.
«Антисмысловое соединение» означает олигомерное соединение, которые способно гибридизоваться с целевой нуклеиновой кислотой посредством водородной связи. Примеры антисмысловых соединений включают одноцепочечные и двухцепочечные соединения, такие как антисмысловые олигонуклеотиды, миРНК, мшРНК, оцРНК и соединения на их основе.
«Антисмысловое ингибирование» означает снижение уровней целевой нуклеиновой кислоты в присутствии антисмыслового соединения комплементарного целевой нуклеиновой кислоте по сравнению с уровнями целевой нуклеиновой кислоты или в отсутствие антисмыслового соединения.
«Антисмысловые механизмы» представляют собой все те механизмы гибридизации соединения с целевой нуклеиновой кислотой, отличающиеся тем, что результат или эффект гибридизации или целевой деградации, или целевой занятости с сопутствующей остановкой клеточных механизмов, при участии, например, транскрипции или сплайсинга.
«Антисмысловой олигонуклеотид» означает одноцепочечный олигонуклеотид, содержащий последовательности, обеспечивающие гибридизацию соответствующему сегменту целевой нуклеиновой кислоты.
«Комплементарность основания» относится к способности спаривания конкретной пары нуклеиновых оснований антисмыслового олигонуклеотида с соответствующими нуклеиновыми основаниями в нуклеиновой кислоте-мишени (т.е. гибридизации), опосредованной уотсон-криковским, хугстиновским или обратным хугстиновским водородным связыванием между соответствующими нуклеиновыми основаниями.
«Бициклический сахар» означает фуранозное кольцо, модифицированное образованием мостика между двумя атомами. Бициклический сахар представляет собой модифицированный сахар.
«Бициклический нуклеозид» (также БНК) означает нуклеозид, содержащий фрагмент сахара, содержащий мостик, соединяющий два атома углерода сахарного кольца, в результате чего образуется бициклическая кольцевая система. В некоторых вариантах реализации, мостик соединяет 4'-углерод и 2'-углерод сахарного кольца.
«Антисмысловой транскрипт C9ORF72» означает транскрипты, полученные из некодирующей цепи (также антисмысловой цепи и матричной цепи) гена C9ORF72. Антисмысловой транскрипт C9ORF72 отличается от канонически транскрибированного «смыслового транскрипта C9ORF72», который образуется из кодирующей цепи (также смысловой цепи) гена C9ORF72. В некоторых вариантах реализации антисмысловой транскрипт C9ORF72 представляет собой SEQ ID NO: 18.
«Специфический ингибитор антисмыслового транскрипта C9ORF72» относится к любому агенту, способному специфически ингибировать экспрессию антисмыслового транскрипта C9ORF72 и/или продукты его экспрессии на молекулярном уровне. В данном контексте «специфический» означает снижение или ингибирование экспрессии антисмыслового транскрипта C9ORF72 без существенного снижения нецелевого транскрипта (например, специфический ингибитор антисмыслового транскрипта C9ORF72 снижает экспрессию антисмыслового транскрипта C9ORF72, но существенно не снижает экспрессию смыслового транскрипта C9ORF72). Специфические ингибиторы антисмыслового транскрипта C9ORF72 включают антисмысловые соединения, миРНК, аптамеры, антитела, пептиды, низкомолекулярные соединения и другие агенты, способные ингибировать экспрессию антисмыслового транскрипта C9ORF72 и/или продукты его экспрессии, такие как продукты RAN-зависимой трансляции, ассоциированной с антисмысловым транскриптом C9ORF72.
«Связанное с C9ORF72 заболевание» обозначает любое заболевание, связанное с любой нуклеиновой кислотой C9ORF72 или продуктом ее экспрессии. Такие заболевания могут включать нейродегенеративное заболевание. Такие нейродегенеративные заболевания могут включать ALS и FTD. В некоторых вариантах реализации заболевание, связанное с C9ORF72, вызвано (или ассоциировано с) экспансией гексануклеотидного повтора. В некоторых вариантах реализации экспансия гексануклеотидного повтора может содержать GGGGCC, GGGGGG, GGGGGC или GGGGCG, повторяющиеся по меньшей мере 30 раз, более 30 раз, более 100 раз, более 500 раз или более 1000 раз.
«Продукты C9ORF72-ассоциированной RAN-зависимой трансляции» означают аберрантные пептидные или дипептидные полимеры, транслированные посредством RAN-трансляции (т.е. ассоциированной с повтором и не зависимой от ATG трансляции). В некоторых вариантах реализации продукты C9ORF72- ассоциированной RAN-зависимой трансляции представляют собой любой из поли(глицин-пролина), поли(глицин-аланина) и поли(глицин-аргинина).
«Нуклеиновая кислота C9ORF72» означает любую нуклеиновую кислоту, кодирующую C9ORF72. Например, в некоторых вариантах реализации изобретения нуклеиновая кислота C9ORF72 включает последовательность ДНК, кодирующую C9ORF72, последовательность РНК, транскрибированную из ДНК, кодирующей C9ORF72, в том числе, геномной ДНК, содержащей интроны и экзоны (т.е. пре-мРНК), и последовательность мРНК, кодирующую C9ORF72. «мРНК C9ORF72» обозначает мРНК, кодирующую белок C9ORF72.
«Патоген-ассоциированный вариант мРНК C9ORF72» означает вариант мРНК C9ORF72, процессированный из варианта пре-мРНК C9ORF72, содержащего гексануклеотидный повтор. Пре-мРНК C9ORF72 содержит гексануклеотидный повтор, если транскрипция пре-мРНК начинается в области от сайта инициации экзона 1А к сайту инициации экзона 1В, например, с 1107 по 1520 нуклеотиды геномной последовательности (SEQ ID NO: 2, комплемент номера доступа GENBANKNT_008413.18, усеченной по нуклеозидам с 27535000 по 27565000). В некоторых вариантах реализации измеряют уровень патоген-ассоциированного варианта мРНК C9ORF72 для определения уровня пре-мРНК C9ORF72, содержащей гексануклеотидный повтор, в образце.
«Специфический ингибитор C9ORF72 «относится к любому агенту, способному специфически ингибировать экспрессию мРНК C9ORF72 и/или белка C9ORF72 на молекулярном уровне. Например, специфические ингибиторы C9ORF72 включают нуклеиновые кислоты (включая антисмысловые соединения), миРНК, аптамеры, антитела, пептиды, низкомолекулярные соединения и другие агенты, способные ингибировать экспрессию мРНК C9ORF72 и/или белка C9ORF72. Аналогичным образом, в некоторых вариантах реализации изобретения специфические ингибиторы C9ORF72 могут влиять на другие молекулярные процессы у животного.
«Кэп-структура» или «кэп-терминальный фрагмент» означает химические модификации, которые были сделаны на любом конце антисмыслового соединения.
3
«cEt» или «стерически затрудненный этил» означает бициклический нуклеозид, содержащий фрагмент сахара, содержащий мостик, соединяющий 4'-углерод и 2'-углерод, причем мостик имеет формулу: 4'-СН(СН)-O-2'.
3
«Нуклеозид со стерически затрудненным этилом» (также cEt нуклеозид) означает нуклеозид, содержащий бициклический фрагмент сахара, содержащий 4'-СН(СН)-O-2' мостик.
«Химически отличная область» означает область антисмыслового соединения, которая некоторым образом химически отличается от другой области того же антисмыслового соединения. Например, область, содержащая 2'-O-метоксиэтил-нуклеозиды, химически отличается от области, содержащей нуклеозиды без 2'-O-метоксиэтильных модификаций.
«Химерное антисмысловое соединение» означает антисмысловое соединение, которое имеет по меньшей мере две химически различные области, каждая позиция имеет множество субъединиц.
«Совместное введение» означает введение индивидууму двух или более фармацевтических агентов. Два или более фармацевтических агентов могут быть в одной фармацевтической композиции или могут быть в отдельных фармацевтических композициях. Каждый из двух или более фармацевтических агентов может быть введен таким же или другим способом введения. Совместное введение включает параллельное или последовательное введение.
«Комплементарность» означает способность к спариванию нуклеиновых оснований первой нуклеиновой кислоты и второй нуклеиновой кислоты.
«Включать», «включает» и «включающий» следует понимать как включение указанной стадии или элемента, или группы элементов или стадий, но не исключение любого другого элемента или стадии, или группы стадий или элементов.
«Смежные нуклеиновые основания» означают нуклеиновые основания, непосредственно примыкающие друг к другу.
«Конструирование» или «сконструированный для» относиться к процессу конструирования олигомерного соединения, которое специфически гибридизуется с выбранной молекулой нуклеиновой кислоты.
«Разбавитель» означает ингредиент в композиции, который не обладает фармакологической активностью, но необходим или желателен с фармацевтической точки зрения. Например, в препаратах, которые вводят парентерально, разбавитель может быть жидкостью, например, солевым раствором.
«Доза» означает количество указанного фармацевтического агента, обеспечиваемое за одно введение или за определенный период времени. В некоторых вариантах реализации доза может быть введена в виде одного, двух или более болюсов, таблеток или инъекций. Например, в определенных вариантах реализации, где необходимо подкожное введение, нужная доза требует объема, который не помещается в одной инъекции, поэтому для достижения желаемой дозы могут быть использованы две или более инъекций. В некоторых вариантах реализации изобретения фармацевтический агент вводят путем инфузии в течение длительного периода времени или непрерывно. Дозы могут быть указаны как количество фармацевтического агента в час, день, неделю, или месяц.
«Эффективное количество» в контексте модулирования активности или лечения или предупреждения состояния, означает введение данного количества фармацевтического агента субъекту, нуждающемуся в такой модуляции, лечении или профилактике, или в однократной дозе или как часть серии, которое является эффективным для модуляции данного эффекта, или для лечения или профилактики или улучшения данного состояния. Эффективное количество может варьировать среди индивидуумов в зависимости от здоровья и физического состояния индивидуума, подлежащего лечению, таксономической группы индивидуумов, подлежащих лечению, рецептуры композиции, оценки индивидуального состояния здоровья и других релевантных факторов.
«Эффективность» означает способность производить желаемый эффект.
«Экспрессия» включает в себя все функции, благодаря которым информация, закодированная в гене, преобразуется в структуры, присутствующие и функционирующие в клетке. Такие структуры включают, но не ограничиваются ими, продукты транскрипции и трансляции.
«Очаг» или «очаги» означает ядерное или цитоплазматическое тело, содержащее транскрипт C9ORF72. В некоторых вариантах реализации очаг содержит по меньшей мере один транскрипт C9ORF72. В некоторых вариантах реализации очаги C9ORF72 содержат транскрипты, содержащие любой из следующих гексануклеотидных повторов: GGGGCC, GGGGGG, GGGGGC и/или GGGGCG.
«Полностью комплементарный» или «100% комплементарный» означает, что каждое нуклеиновое основание первой нуклеиновой кислоты имеет комплементарное нуклеиновое основание во второй нуклеиновой кислоте. В некоторых вариантах реализации первая нуклеиновая кислота представляет собой антисмысловое соединение, а нуклеиновая кислота-мишень представляет собой вторую нуклеиновую кислоту.
«Гэпмер» означает химерное антисмысловое соединение, в котором внутренняя область, имеющая множество нуклеозидов, которые поддерживают расщепление РНКазой Н, располагается между внешними областями, имеющими один или более нуклеозидов, причем нуклеозиды, составляющие внутреннюю область, химически отличаются от нуклеозида или нуклеозидов, составляющих внешние области. Внутренняя область может быть описана как «гэп», а внешние области могут быть описаны как «крылья».
«Экспансия гексануклеотидного повтора» означает серию из шести оснований (например, GGGGCC, GGGGGG, GGGGCG или GGGGGC), повторяющуюся по меньшей мере дважды. В некоторых вариантах реализации экспансия гексануклеотидного повтора может быть расположена в интроне 1 нуклеиновой кислоты C9ORF72. В некоторых вариантах реализации патогенная экспансия гексануклеотидного повтора содержит по меньшей мере 30, более 30, более 100, более 500 или более 1000 повторов GGGGCC, GGGGGG, GGGGCG или GGGGGC в нуклеиновой кислоте C9ORF72 и ассоциирована с заболеванием. В некоторых вариантах реализации указанные повторы являются последовательными. В некоторых вариантах реализации указанные повторы прерваны 1 или более нуклеиновыми основаниями. В некоторых вариантах реализации экспансия гексануклеотидного повтора дикого типа содержит 23 или менее повторов GGGGCC, GGGGGG, GGGGCG или GGGGGC в нуклеиновой кислоте C9ORF72. В некоторых вариантах реализации указанные повторы являются последовательными. В некоторых вариантах реализации указанные повторы прерваны 1 или более нуклеиновыми основаниями.
«Гибридизация» означает соединение комплементарных молекул нуклеиновых кислот. В некоторых вариантах реализации комплементарные молекулы нуклеиновых кислот включают, но не ограничиваются ими, антисмысловое соединение и нуклеиновую кислоту-мишень. В некоторых вариантах реализации комплементарные молекулы нуклеиновых кислот включают, но не ограничиваются ими, антисмысловой олигонуклеотид и нуклеиновую кислоту-мишень.
«Идентификация животного, имеющего C9ORF72-ассоциированное заболевание» означает определение животного, которому поставлен диагноз C9ORF72-ассоциированного заболевания, или которое предрасположено к развитию C9ORF72-ассоциированного заболевания. Индивидуумы, предрасположенные к развитию C9ORF72-ассоциированного заболевания, включают тех, у кого присутствуют один или более факторов риска развития C9ORF72-ассоциированного заболевания, включая личный или семейный анамнез или генетическую предрасположенность к одному или более C9ORF72-ассоциированным заболеваниям. Такая идентификация может быть выполнена любым способом, включая оценку истории болезни человека и стандартными клиническими испытаниями или оценками, такими как генетическое тестирование.
«Непосредственно примыкающий» означает, что нет никаких промежуточных элементов между непосредственно примыкающими элементами.
«Индивидуум» означает человека или животное, не являющееся человеком, выбранное для лечения или терапии.
«Ингибирование C9ORF72» обозначает снижение уровня или экспрессии мРНК и/или белка C9ORF72. В некоторых вариантах реализации изобретения уровни мРНК и/или белка C9ORF72 ингибируются в присутствии антисмыслового соединения, нацеленного на C9ORF72, включая антисмысловой олигонуклеотид, нацеленный на C9ORF72, по сравнению с экспрессией мРНК и/или уровнями белка C9ORF72 в отсутствие антисмыслового соединения против C9ORF72, такого как антисмысловой олигонуклеотид.
«Ингибирование экспрессии или активности» означает снижение или блокаду экспрессии или активности и не обязательно говорит о полном прекращении экспрессии или активности.
«Межнуклеозидная связь» означает химическую связь между нуклеозидами.
«Связанные нуклеозиды» означают соседние нуклеозиды, связанные между собой межнуклеозидной связью.
2
2
2
2
2
2
«Заблокированная нуклеиновая кислота» или «ЗНК» или «ЗНК нуклеозид» означает, что мономеры нуклеиновой кислоты имеют мостик, соединяющий два атома углерода между 4' и 2' положениями сахарной части нуклеозида, тем самым образуя бициклический сахар. Примеры такого бициклического сахара включают, но не ограничиваются ими, А) α-L-метиленокси (4'-СН-O-2') ЗНК, (В) β-D-метиленокси (4'-СН-O-2') ЗНК, (С) этиленокси (4'-(СН)-O-2') ЗНК, (D) аминоокси (4'-СН-O-N(R)-2') ЗНК и (Е) оксиамино (4'-СН-N(R)-O-2') ЗНК, как показано ниже.
1
2
n
1
2
1
1
1
2
x
1
1
2
1
12
1
12
2
12
2
12
2
12
2
12
5
20
5
20
5
7
5
7
1
1
2
1
3
1
2
1
1
1
2
1
12
1
12
2
12
2
12
2
12
2
12
5
20
5
20
1
12
1
12
В данном контексте соединения ЗНК включают, но не ограничиваются ими, соединения, имеющие по меньшей мере один мостик между 4' и 2' положениями сахара, причем каждый из мостиков независимо содержит 1 или от 2 до 4 связанных групп, независимо выбранных из -[C(R)(R)]-, -C(R)=C(R)-, -C(R)=N-, -C(=NR)-, -C(=O)-, -C(=S)-, -O-, -Si(R)-, -S(=O)- и -N(R)-; где: x равен 0, 1 или 2; n равен 1, 2, 3 или 4; каждый R и R независимо представляет собой Н, защитную группу, гидроксилный радикал, С-С алкильный радикал, замещенный С-С алкильный радикал, С-С алкенильный радикал, замещенный С-С алкенильный радикал, C-C алкинильный радикал, замещенный С-С алкинильный радикал, С-С арильный радикал, замещенный С-С арильный радикал, гетероциклический радикал, замещенный гетероциклический радикал, гетероарильный радикал, замещенный гетероарильный радикал, С-С алициклический радикал, замещенный С-С алициклический радикал, галоген, OJ, NJJ, SJ, N, COOJ, ацильный радикал (С(=O)-Н), замещенный ацильный радикал, CN, сульфонильный радикал (S(=O)-J) или сульфоксильный радикал (S(=O)-J); и каждый J and J независимо представляет собой Н, С-C алкильный радикал, замещенный С-С алкильный радикал, С-С алкенильный радикал, замещенный С-С алкенильный радикал, С-С алкинильный радикал, замещенный С-С алкинильный радикал, С-С арильный радикал, замещенный С-С арильный радикал, ацильный радикал (С(=O)-Н), замещенный ацильный радикал, гетероциклический радикал, замещенный гетероциклический радикал, С-С аминоалкильный радикал, замещенный С-С аминоалкильный радикал или защитную группу.
1
2
n
1
2
n
1
2
1
1
2
1
2
2
2
2
3
2
2
2
2
1
2
1
1
2
1
12
Примеры 4'-2' мостиковых групп, входящих в определение ЗНК, включают, но не ограничиваются ими, одну из формул: -[C(R)(R)]-, -[C(R)(R)]-O-, -C(RR)-N(R)-О- или -C(RR)-O-N(R)-. Кроме того, другие мостиковые группы, входящие в определение ЗНК, представляют собой мостики 4'-СН-2', 4'-(СН)-2', 4'-(СН)-2', 4'-СН-O-2', 4'-(СН)-O-2', 4'-СН-O-N(R)-2' и 4'-СН-N(R)-O-2'-, где каждый R и R независимо представляет собой Н, защитную группу или C-С алкильный радикал.
2
2
2
2
2
2
2
Также в определение ЗНК согласно настоящему изобретению включены ЗНК, в которых 2'-гидроксильная группа рибозильного сахарного кольца соединена с 4' атомом углерода сахарного кольца, с образованием таким образом метиленоксильного мостика (4'-СН-O-2'), формируя бициклический фрагмент сахара. Мостик также может быть метиленовой группой (-СН-), соединяющей атом кислорода 2' и атом углерода 4', для которой используется термин метиленокси (4'-СН-O-2') ЗНК. Кроме того, в случае бициклического фрагмента сахара, содержащего группу этиленового мостика в данном положении, применяется термин этиленокси (4'-СНСН-O-2') ЗНК. α-L-метиленокси (4'-СН-O-2'), изомер метиленокси (4'-СН-O-2') ЗНК, также попадает под определение ЗНК в данном контексте.
«Несоответствие» или «некомплементарное нуклеиновое основание» относится к случаю, когда нуклеиновое основание первой нуклеиновой кислоты не способно связываться с соответствующим нуклеиновым основанием второй или нуклеиновой кислоты-мишени.
«Модифицированная межнуклеозидная связь» относится к замене или любому изменению природной межнуклеозидной связи (т.е. фосфодиэфирной межнуклеозидной связи).
«Модифицированное нуклеиновое основание» означает любое нуклеиновое основание, отличное от аденина, цитозина, гуанина, тимидина или урацила. «Немодифицированное нуклеиновое основание» означает пуриновые основания аденин (А) и гуанин (G), и пиримидиновые основания тимин (Т), цитозин (С) и урацил (U).
«Модифицированный нуклеозид» обозначает нуклеозид, содержащий независимо модифицированный фрагмент сахара и/или модифицированное нуклеиновое основание.
«Модифицированный нуклеотид» означает нуклеотид, содержащий независимо модифицированный фрагмент сахара, модифицированную межнуклеозидную связь и/или модифицированное нуклеиновое основание.
«Модифицированный олигонуклеотид» обозначает олигонуклеотид, содержащий по меньшей мере одну модифицированную межнуклеозидную связь, модифицированный сахар и/или модифицированное нуклеиновое основание.
«Модифицированный сахар» означает замещение и/или изменение любого из природных фрагментов сахаров.
«Мономер» означает одно звено олигомера. Мономеры включают, но не ограничиваются ими, нуклеозиды и нуклеотиды, природные или модифицированные.
«Мотив» означает конфигурацию из немодифицированных и модифицированных нуклеозидов в антисмысловом соединении.
«Природный фрагмент сахара» означает фрагмент сахара, находящийся в ДНК (2'-Н) или РНК (2'-ОН).
«Природная межнуклеозидная связь» означает 3'-5' фосфодиэфирную связь.
«Некомплементарное нуклеиновое основание» относится к паре нуклеиновых оснований нуклеиновых кислот, которые не образуют водородных связей друг с другом или иным образом не поддерживают гибридизацию.
«Нуклеиновая кислота» означает молекулы, состоящие из мономерных нуклеотидов. Нуклеиновая кислота включает, но не ограничивается ими, рибонуклеиновые кислоты (РНК), дезоксирибонуклеиновые кислоты (ДНК), одноцепочечные нуклеиновые кислоты, двуцепочечные нуклеиновые кислоты, малые интерферирующие рибонуклеиновые кислоты (миРНК) и микроРНК.
«Нуклеиновое основание» означает гетероциклический фрагмент, способный спариваться с основанием другой нуклеиновой кислоты.
«Комплементарность нуклеиновых оснований» означает нуклеиновое основание, способное спариваться с другим нуклеиновым основанием. Например, в ДНК аденин (А) комплементарен тимину (Т). Например, в РНК аденин (А) комплементарен урацилу (U). В некоторых вариантах реализации изобретения комплементарное нуклеиновое основание означает нуклеиновое основание антисмыслового соединения, способное спариваться с нуклеиновым основанием его нуклеиновой кислоты-мишени. Например, если нуклеиновое основание в определенном положении антисмыслового соединения способно к водородному связыванию с нуклеиновым основанием в определенном положении нуклеиновой кислоты-мишени, то это положение водородного связывания между олигонуклеотидом и нуклеиновой кислотой-мишенью считается комплементарным по этой паре нуклеиновых оснований.
«Последовательность нуклеиновых оснований» означает порядок смежных нуклеиновых оснований, независимый от любой модификации сахара, связи или нуклеинового основания.
«Нуклеозид» означает нуклеиновое основание, связанное с сахаром.
«Миметик нуклеозида» включает структуры, используемые для замены сахара или сахара и основания и необязательно связи в одном или нескольких положениях олигомерного соединения, например, такие как миметики нуклеозидов, содержащие морфолиновые, циклогексениловые, циклогексиловые, тетрагидропираниловые, бициклические или трициклические сахарные миметики, например, нефуранозные сахарные звенья. Миметик нуклеотида включает структуры, используемые для замены нуклеозида и связи в одном или более положениях олигомерного соединения, такие как, например, пептидные нуклеиновые кислоты или морфолины (морфолины, связанные -N(H)-C(=O)-O- или другой нефосфодиэфирной связью). Заменитель сахара пересекается с более широким термином нуклеозид-миметик, но предназначен для обозначения замены только сахарной части (фуранозного кольца). Тетрагидропираниловые кольца, представленные в настоящем документе, иллюстрируют пример заменителя сахара, в котором фуранозная группа сахара заменена тетрагидропираниловой кольцевой системой. «Миметик» относится к группам, которые заменяют сахар, нуклеиновое основание и/или межнуклеозидную связь. Как правило, миметик используют вместо сахара или комбинации сахара с межнуклеозидной связью, а нуклеиновое основание сохраняется для гибридизации с выбранной мишенью.
«Нуклеотид» означает нуклеозид, содержащий фосфатную группу, ковалентно связанную с сахарной частью нуклеозида.
«Нецелевой эффект» означает нежелательный или вредный биологический эффект, связанный с модуляцией экспрессии РНК или белка гена, отличного от нуклеиновой кислоты-мишени.
«Олигомерное соединение» или «олигомер» означает полимер из связанных мономерных субъединиц, которые способны к гибридизации с по меньшей мере областью молекулы нуклеиновой кислоты.
«Олигонуклеотид» означает полимер из связанных нуклеозидов, каждый из которых может быть модифицированным или немодифицированным, независимо друг от друга.
«Парентеральное введение» означает введение путем инъекций (например, болюсная инъекция) или инфузии. Парентеральное введение включает подкожное введение, внутривенное введение, внутримышечное введение, внутриартериальное введение, внутрибрюшинное введение или внутричерепное введение, например, интратекальное или интрацеребровентрикулярное введение.
«Пептид» означает, что молекула образуется путем связывания по меньшей мере двух аминокислот посредством амидных связей. Без ограничений, в данном контексте пептид относится к полипептидам и белкам.
«Фармацевтический агент» означает вещество, которое обеспечивает терапевтический эффект при введении индивидууму. Например, в некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловой олигонуклеотид, нацеленный на C9ORF72, представляет собой фармацевтический агент.
«Фармацевтически приемлемое производное» включает фармацевтически приемлемые соли, конъюгаты, пролекарства или изомеры соединений, описанных в настоящем документе.
«Фармацевтически приемлемые соли» обозначает физиологически и фармацевтически приемлемые соли антисмысловых соединений, т.е. соли, которые сохраняют желательную биологическую активность исходного олигонуклеотида и не вызывают нежелательных токсикологических эффектов.
«Тиофосфатная связь» означает связь между нуклеозидами, в которой фосфодиэфирная связь модифицирована путем замены одного из не образующих мостик атомов кислорода на атом серы. Тиофосфатная связь представляет собой модифицированную межнуклеозидную связь.
«Часть» означает определенное количество смежных (т.е. связанных) нуклеиновых оснований нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах реализации часть представляет собой определенное количество смежных нуклеиновых оснований нуклеиновой кислоты-мишени. В некоторых вариантах реализации часть представляет собой определенное количество смежных нуклеиновых оснований антисмыслового соединения.
«Предупреждать» или «предупреждение» относится к задержке или предотвращению появления или развития заболевания, расстройства или патологического состояния в течение периода времени от нескольких минут до дней, недель или месяцев, или на неопределенный срок.
«Пролекарство» означает терапевтический агент, который получен в неактивной форме, которая преобразуется в активную форму в организме или его клетках под действием эндогенных ферментов или других химических веществ или условий.
«Профилактически эффективное количество» означает такое количество фармацевтического агента, которое обеспечивает профилактический или превентивный эффект для животного.
«Область» определяют как фрагмент нуклеиновой кислоты-мишени, имеющий по меньшей мере одну идентифицируемую структуру, функцию или характеристику.
«Рибонуклеотид» означает нуклеотид, имеющий гидрокси-группу в 2' положении сахарной части нуклеотида. Рибонуклеотиды могут быть модифицированы с помощью любого из множества заместителей.
«Соли» означает физиологически и фармацевтически приемлемые соли антисмысловых соединений, т.е. соли, которые сохраняют требуемую биологическую активность исходного олигонуклеотида и не вызывают нежелательных токсикологических эффектов.
«Сегменты» определяют как меньшие или субфрагменты областей в составе нуклеиновой кислоты-мишени.
«Укороченные» или «усеченные» версии антисмысловых олигонуклеотидов представленные в настоящем документе имеющие один, два или более удаленных нуклеозида.
«Побочные эффекты» означают отличающиеся от желаемых физиологические ответы, приписываемые лечению. В некоторых вариантах реализации побочные эффекты включают, без ограничения, реакции в месте инъекции, аномалии функциональных проб печени, отклонения в функциях почек, гепатотоксичность, нефротоксичность, аномалии центральной нервной системы и миопатии.
«Одноцепочечный олигонуклеотид» означает олигонуклеотид, который не гибридизуется с комплементарной цепью. «Одноцепочечный модифицированный олигонуклеотид» означает модифицированный олигонуклеотид, который не гибридизуется с комплементарной цепью.
«Сайты» в данном контексте определяют как уникальные положения нуклеиновых оснований в нуклеиновой кислоте-мишени.
«Замедляет прогрессирование» означает ослабление развития указанного заболевания.
«Специфично гибридизуется» обозначает антисмысловое соединение, обладающее достаточной степенью комплементарности между антисмысловым олигонуклеотидом и нуклеиновой кислотой-мишенью, чтобы вызывать желаемый эффект, минимально или никак не влияния на нецелевые нуклеиновые кислоты в условиях, в которых специфическое связывание является желательным, т.е. в физиологических условиях в случае анализов in vivo и терапевтического лечения.
«Строгие условия гибридизации» или «жесткие условия» означают условия, при которых олигомерное соединение гибридизуется со своей целевой последовательностью, но с минимальным количеством других последовательностей.
«Субъект» означает человека или животного, не являющегося человеком, выбранного для лечения или терапии.
«Целевой» относится к белку, модуляция которого является желательной.
«Ген-мишень» означает ген, кодирующий белок-мишень.
«Нацеливание» или «нацеленный» означает процесс конструирования и выбора антисмыслового соединения, которое будет специфически гибридизоваться с целевой нуклеиновой кислотой и вызывать требуемый эффект.
«Целевая нуклеиновая кислота», «целевая РНК» и «целевой РНК транскрипт» и «нуклеиновые кислоты-мишени» означает нуклеиновую кислоту, способную стать мишенью для антисмысловых соединений.
«Область-мишень» означает фрагмент нуклеиновой кислоты-мишени, на который нацелено одно или более антисмысловых соединений.
«Сегмент-мишень» означает последовательность нуклеотидов нуклеиновой кислоты-мишени, на которую нацелено антисмысловое соединение. «5' сайт-мишень» относится к крайнему 5' нуклеотиду сегмента-мишени. «3' сайт-мишень» относится к крайнему 3' нуклеотиду сегмента-мишени.
«Терапевтически эффективное количество» означает количество фармацевтического агента, которое обеспечивает терапевтический эффект для индивидуума.
«Лечить» или «лечение», или «терапия» обозначает введение композиции с целью достижения изменения или облегчения заболевания или патологического состояния.
«Немодифицированные нуклеиновые основания» означает пуриновые основания: аденин (А) и гуанин (G), и пиримидиновые основания: тимин (Т), цитозин (С) и урацил (U).
«Немодифицированный нуклеотид» означает нуклеотид, состоящий из природных нуклеиновых оснований, фрагментов сахаров и межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах реализации изобретения немодифицированный нуклеотид представляет собой РНК нуклеотид (т.е. β-D-рибонуклеозид) или ДНК нуклеотид (т.е., β-D-дезоксирибонуклеозид).
«Сегмент крыла» означает множество нуклеозидов, модифицированных для придания олигонуклеотиду свойств, таких как усиленная ингибирующая активность, повышенная аффинность связывания с нуклеиновой кислотой-мишенью или устойчивость к разложению нуклеазами in vivo.
Некоторые варианты реализации изобретения
В некоторых вариантах реализации предложены композиции и способы снижения общей экспрессии мРНК и белка C9ORF72.
В некоторых вариантах реализации предложены композиции и способы для снижения патоген-ассоциированных вариантом мРНК C9ORF72.
В некоторых вариантах реализации предложены способы лечения, предупреждения, облегчения или замедления прогрессирования заболеваний, связанных с C9ORF72, у индивидуума, нуждающегося в этом. Предусмотрены также способы получения лекарственного средства для лечения, предупреждения или облегчения заболевания, связанного с C9ORF72. C9ORF72-ассоциированные заболевания включают нейродегенеративные заболевания. В некоторых вариантах реализации нейродегенеративное заболевание может представлять собой ALS или FTD. В некоторых вариантах реализации нейродегенеративное заболевание может быть наследственным или спорадическим.
В настоящем описании предложены следующие неограничивающие нумерованные варианты реализации:
Вариант реализации 1. Соединение, содержащее модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 12-30 связанных нуклеозидов и имеющий последовательность нуклеиновых оснований, содержащую по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19 или по меньшей мере 20 последовательных нуклеиновых оснований любой из последовательностей нуклеиновых оснований SEQ ID NO: 22-55.
Вариант реализации 2. Соединение по варианту реализации 1, отличающееся тем, что последовательность нуклеиновых оснований модифицированного олигонуклеотида по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 81%, по меньшей мере на 82%, по меньшей мере на 83%, по меньшей мере на 84%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 86%, по меньшей мере на 87%, по меньшей мере на 88%, по меньшей мере на 89%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или 100% комплементарна SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2.
Вариант реализации 3. Соединение по вариантам реализации 1 и 2, отличающееся тем, что модифицированный олигонуклеотид представляет собой одноцепочечный модифицированный олигонуклеотид.
Вариант реализации 4. Соединение по любому из вариантов реализации 1-3, отличающееся тем, что модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере одну модифицированную межнуклеозидную связь.
Вариант реализации 5. Соединение по варианту реализации 4, отличающееся тем, что по меньшей мере одна модифицированная межнуклеозидная связь представляет собой тиофосфатную межнуклеозидную связь.
Вариант реализации 6. Соединение по любому из вариантов реализации 4 и 5, отличающееся тем, что модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере одну фосфодиэфирную связь.
Вариант реализации 7. Соединение по варианту реализации 5, отличающееся тем, что каждая модифицированная межнуклеозидная связь представляет собой тиофосфатную межнуклеозидную связь.
Вариант реализации 8. Соединение по любому из вариантов реализации 1-7, отличающееся тем, что по меньшей мере один нуклеозид содержит модифицированное нуклеиновое основание.
Вариант реализации 9. Соединение по варианту реализации 8, отличающееся тем, что модифицированное нуклеиновое основание представляет собой 5-метилцитозин.
Вариант реализации 10. Соединение по любому из вариантов реализации 1-9, отличающееся тем, что по меньшей мере один нуклеозид модифицированного олигонуклеотида содержит модифицированный сахар.
Вариант реализации 11. Соединение по варианту реализации 10, отличающееся тем, что каждый нуклеозид модифицированного олигонуклеотида содержит модифицированный сахар.
Вариант реализации 12. Соединение по вариантам реализации 10 или 11, отличающееся тем, что по меньшей мере один модифицированный сахар представляет собой бициклический сахар.
2
2
1
6
1
6
Вариант реализации 13. Соединение по варианту реализации 12, отличающееся тем, что бициклический сахар содержит химический мостик между положениями 4' и 2' сахара, при этом указанный химический мостик выбран из: 4'-CH(R)-O-2' и 4'-(СН)-O-2', где R независимо представляет собой Н, C-С алкильный радикал и C-С алкоксильный радикал.
Вариант реализации 14. Соединение по варианту реализации 13, отличающееся тем, что химический мостик представляет собой 4'-CH(R)-O-2', и где R представляет собой метальный радикал.
Вариант реализации 15. Соединение по варианту реализации 13, отличающееся тем, что химический мостик представляет собой 4'-CH(R)-O-2', и где R представляет собой Н.
2
3
Вариант реализации 16. Соединение по варианту реализации 13, отличающееся тем, что химический мостик представляет собой 4'-CH(R)-O-2', и где R представляет собой -CH-О-СН.
Вариант реализации 17. Соединение по вариантам реализации 10 или 11, отличающееся тем, что по меньшей мере один модифицированный сахар содержит 2'-O-метоксиэтильную группу.
Вариант реализации 18. Соединение по любому из вариантов реализации 1-10 или 12-16, отличающееся тем, что модифицированный олигонуклеотид представляет собой гэпмер.
Вариант реализации 19. Соединение по варианту реализации 18, отличающееся тем, что гэпмер представляет собой любой из 3-8-7 МОЕ гэпмера, 3-10-7 МОЕ гэпмера, 4-8-6 МОЕ гэпмера, 4-10-6 МОЕ гэпмера, 6-10-4 МОЕ гэпмера, 6-8-4 МОЕ гэпмера, 7-8-3 МОЕ гэпмера или 7-10-3 МОЕ гэпмера.
Вариант реализации 20. Соединение по п. 5, отличающееся тем, что модифицированный олигонуклеотид содержит межнуклеозидные связи в любом из следующих паттернов: soossssssssssooooss, sooossssssssssoooss, sooooossssssssssoss, soooooossssssssssss, soooosssssssssooss, sooosssssssssoooss, sooooosssssssssoss, soosssssssssoooss, soooosssssssssoss, sosssssssssooooss или sooooosssssssssss, где,
s = тиофосфатная межнуклеозидная связь, и
о = фосфодиэфирная межнуклеозидная связь.
Вариант реализации 19. Композиция, содержащая соединение по любому из предыдущих вариантов реализации или его соль и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.
Вариант реализации 20. Композиция по варианту реализации 19, дополнительно содержащая специфический ингибитор антисмыслового транскрипта C9ORF72.
Вариант реализации 21. Композиция по варианту реализации 20, отличающаяся тем, что специфический ингибитор антисмыслового транскрипта C9ORF72 представляет собой антисмысловое соединение.
Вариант реализации 22. Композиция по варианту реализации 21, отличающаяся тем, что антисмысловое соединение представляет собой модифицированный олигонуклеотид.
Вариант реализации 23. Композиция по варианту реализации 22, отличающаяся тем, что модифицированный олигонуклеотид является одноцепочечным.
Вариант реализации 24. Композиция по вариантам реализации 22 или 23, отличающаяся тем, что модифицированный олигонуклеотид имеет последовательность нуклеиновых оснований, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100% комплементарна антисмысловому транскрипту C9ORF72.
Вариант реализации 25. Композиция по варианту реализации 24, отличающаяся тем, что антисмысловой транскрипт C9ORF72 имеет последовательность нуклеиновых оснований SEQ ID NO: 18.
Вариант реализации 26. Способ, включающий введение животному соединения или композиции по любому из предыдущих вариантов.
Вариант реализации 27. Способ по варианту реализации 26, отличающийся тем, что животное представляет собой человека.
Вариант реализации 28. Способ по вариантам реализации 26 и 27, отличающийся тем, что введение соединения обеспечивает предупреждение, лечение, облегчение или замедление прогрессирования заболевания, связанного с C9ORF72.
Вариант реализации 29. Способ по варианту реализации 28, отличающийся тем, что заболевание, связанное с C9ORF72, вызвано экспансией гексануклеотидного повтора.
Вариант реализации 30. Способ по варианту реализации 28, отличающийся тем, что заболевание, связанное с C9ORF72, представляет собой боковой амиотрофический склероз (ALS), лобно-височную деменцию (FTD), синдром кортико-базальной дегенерации (CBD), атипический синдром паркинсонизма и оливопонтоцеребеллярную дегенерацию (OPCD).
Вариант реализации 31. Способ по вариантам реализации 26-30, отличающийся тем, что введение обеспечивает уменьшение ядерных очагов.
Вариант реализации 32. Способ по вариантам реализации 26-31, отличающийся тем, что введение обеспечивает снижение экспрессии продуктов C9ORF72-ассоциированной RAN-зависимой трансляции.
Вариант реализации 33. Способ по варианту реализации 32, отличающийся тем, что продукты C9ORF72-ассоциированной RAN-зависимой трансляции представляют собой любой из поли(глицин-пролина), поли(глицин-аланина) и поли(глицин-аргинина).
Вариант реализации 34. Применение соединения или композиции по любому из вариантов реализации 1-33 для производства лекарственного средства для лечения нейродегенеративного расстройства.
Вариант реализации 35. Соединение, состоящее из модифицированного олигонуклеотида согласно следующей формуле или его соли:
Вариант реализации 36. Композиция, состоящая из натриевой соли модифицированного олигонуклеотида согласно следующей формуле:
Вариант реализации 37. Соединение, состоящее из модифицированного олигонуклеотида согласно следующей формуле или его соли:
Вариант реализации 38. Композиция, состоящая из натриевой соли модифицированного олигонуклеотида согласно следующей формуле:
Вариант реализации 39. Соединение, состоящее из модифицированного олигонуклеотида согласно следующей формуле или его соли:
Вариант реализации 40. Композиция, состоящая из натриевой соли модифицированного олигонуклеотида согласно следующей формуле:
Вариант реализации 41. Соединение, состоящее из модифицированного олигонуклеотида согласно следующей формуле или его соли:
Вариант реализации 42. Композиция, состоящая из натриевой соли модифицированного олигонуклеотида согласно следующей формуле:
Вариант реализации 43. Соединение или композиция по любому из вариантов реализации 1-25 или 35-42, отличающиеся тем, что указанное соединение или композиция может снижать экспрессию мРНК или белка человеческого C9ORF72 у млекопитающего.
Вариант реализации 44. Соединение или композиция по любому из вариантов реализации 1-25 или 35-42, отличающиеся тем, что соединение или композиция может облегчать по меньшей мере один симптом бокового амиотрофического склероза (ALS), лобно-височной деменции (FTD), синдрома кортико-базальной дегенерации (CBD), атипического синдрома паркинсонизма или оливопонтоцеребеллярной дегенерации (OPCD).
Вариант реализации 45. Соединение или композиция по варианту реализации 44, отличающиеся тем, что симптом ALS представляет собой любой из двигательного дефекта, тревожного расстройства и денервации.
Вариант реализации 46. Соединение или композиция по любому из вариантов реализации 1-25 или 35-42, отличающиеся тем, что соединение или композиция может вызывать отсрочку прогрессирования заболевания.
Вариант реализации 47. Соединение или композиция по любому из вариантов реализации 1-25 или 35-42, отличающиеся тем, что соединение или композиция может увеличивать продолжительность жизни.
Вариант реализации 48. Соединение или композиция по любому из вариантов реализации 1-25 или 35-42, отличающиеся тем, что соединение или композиция может уменьшать продукты C9ORF72-ассоциированной RAN-зависимой трансляции.
Вариант реализации 49. Соединение или композиция по любому из вариантов реализации 1-25 или 35-42, отличающиеся тем, что соединение или композиция может селективно снижать патоген-ассоциированные варианты мРНК C9ORF72.
Вариант реализации 50. Соединение или композиция по любому из вариантов реализации 1-25 или 35-42, отличающиеся тем, что соединение или композиция может сокращать ядерные очаги.
Вариант реализации 51. Соединение, состоящее из модифицированного олигонуклеотида согласно следующей формуле или его соли:
Вариант реализации 52. Способ, включающий введение животному соединения по варианту реализации 51.
Вариант реализации 53. Способ по варианту реализации 52, отличающийся тем, что животное представляет собой человека.
Вариант реализации 54. Способ по варианту реализации 53, отличающийся тем, что введение обеспечивает ингибирование C9ORF72.
Вариант реализации 55. Способ по варианту реализации 53, отличающийся тем, что введение обеспечивает предупреждение, лечение, облегчение или замедление прогрессирования заболевания, связанного с C9ORF72.
Вариант реализации 56. Способ по варианту реализации 55, отличающийся тем, что заболевание, связанное с C9ORF72, вызвано экспансией гексануклеотидного повтора.
Вариант реализации 57. Способ по варианту реализации 55, отличающийся тем, что заболевание, связанное с C9ORF72, представляет собой любое из бокового амиотрофического склероза (ALS), лобно-височной деменции (FTD), синдрома кортико-базальной дегенерации (CBD), атипического синдрома паркинсонизма или оливопонтоцеребеллярной дегенерации (OPCD).
Вариант реализации 58. Способ по варианту реализации 53, отличающийся тем, что введение обеспечивает сокращение ядерных очагов.
Вариант реализации 59. Способ по варианту реализации 53, отличающийся тем, что введение обеспечивает снижение экспрессии продуктов C9ORF72-ассоциированной RAN-зависимой трансляции.
Вариант реализации 60. Способ по варианту реализации 59, отличающийся тем, что продукты C9ORF72-ассоциированной RAN-зависимой трансляции представляют собой любой из поли(глицин-пролина), поли(глицин-аланина) и поли(глицин-аргинина).
Вариант реализации 61. Композиция, состоящая из натриевой соли модифицированного олигонуклеотида согласно следующей формуле:
Вариант реализации 62. Способ, включающий введение животному композиции по варианту реализации 60.
Вариант реализации 63. Способ по варианту реализации 62, отличающийся тем, что животное представляет собой человека.
Вариант реализации 64. Способ по варианту реализации 63, отличающийся тем, что введение обеспечивает ингибирование C9ORF72.
Вариант реализации 65. Способ по варианту реализации 62, отличающийся тем, что введение обеспечивает предупреждение, лечение, облегчение или замедление прогрессирования заболевания, связанного с C9ORF72.
Вариант реализации 66. Способ по варианту реализации 65, отличающийся тем, что заболевание, связанное с C9ORF72, вызвано экспансией гексануклеотидного повтора.
Вариант реализации 67. Способ по варианту реализации 65, отличающийся тем, что заболевание, связанное с C9ORF72, представляет собой любое из бокового амиотрофического склероза (ALS), лобно-височной деменции (FTD), синдрома кортико-базальной дегенерации (CBD), атипического синдрома паркинсонизма или оливопонтоцеребеллярной дегенерации (OPCD).
Вариант реализации 68. Способ по варианту реализации 63, отличающийся тем, что введение обеспечивает сокращение ядерных очагов.
Вариант реализации 69. Способ по варианту реализации 63, отличающийся тем, что введение обеспечивает снижение экспрессии продуктов C9ORF72-ассоциированной RAN-зависимой трансляции.
Вариант реализации 70. Способ по варианту реализации 69, отличающийся тем, что продукты C9ORF72-ассоциированной RAN-зависимой трансляции представляют собой любой из поли(глицин-пролина), поли(глицин-аланина) и поли(глицин-аргинина).
Антисмысловые соединения
Олигомерные соединения включают, но не ограничиваются ими, олигонуклеотиды, олигонуклеозиды, аналоги олигонуклеотидов, миметики олигонуклеотидов, антисмысловые соединения, антисмысловые олигонуклеотиды и миРНК. Олигомерное соединение может быть «антисмысловым» к нуклеиновой кислоте-мишени, что означает, что оно способно подвергаться гибридизации с нуклеиновой кислотой-мишенью посредством водородного связывания.
В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловое соединение содержит последовательность нуклеиновых оснований, которая, при написании в направлении от 5' к 3', содержит обратный комплемент целевого сегмента нуклеиновой кислоты-мишени, на которую она нацелена. В некоторых таких вариантах реализации антисмысловой олигонуклеотид содержит последовательность нуклеиновых оснований, которая при написании в 5'-3' направлении, содержит обратный комплемент целевого сегмента нуклеиновой кислоты-мишени, на которую она нацелена.
В некоторых вариантах реализации изобретения длина антисмыслового соединения, нацеленного на нуклеиновую кислоту C9ORF72, составляет 12-30 субъединиц. Другими словами, длина таких антисмысловых соединений составляет 12-30 связанных субъединиц. В других вариантах реализации изобретения антисмысловое соединение содержит 8-80,12-50, 15-30, 18-24, 19-22 или 20 связанных субъединиц. В некоторых вариантах реализации антисмысловые соединения имеют 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 или 80 связанных субъединиц в длину или количество в диапазоне, определенном любыми двумя из указанных выше значений. В некоторых вариантах реализации антисмысловое соединение представляет собой антисмысловой олигонуклеотид, и связанными субъединицами являются нуклеозиды.
В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые олигонуклеотиды, нацеленные на нуклеиновую кислоту C9ORF72, могут быть укороченными или усеченными. Например, одна субъединица может быть удалена с 5' конца (5' усечение), или же с 3' конца (3' усечение). В укороченном или усеченном антисмысловом соединении, нацеленном на нуклеиновую кислоту C9ORF72, две субъединицы могут быть удалены на 5' конце или, в качестве альтернативы, две субъединицы могут быть удалены на 3' конце антисмыслового соединения. В альтернативном варианте удаленные нуклеозиды могут быть рассеяны по всему антисмысловому соединению, например, в антисмысловом соединении с одним нуклеозидом, удаленным с 5' конца, и одним нуклеозидом, удаленным с 3' конца.
Если в удлиненном антисмысловом соединении присутствует одна дополнительная субъединица, то дополнительная субъединица может быть расположена на 5' или 3' конце антисмыслового соединения. При наличии двух или более дополнительных субъединиц, добавленные субъединицы могут быть расположены рядом друг с другом, например, в антисмысловом соединении, имеющем две субъединицы, добавленные на 5' конце (5' присоединение) или, в альтернативном варианте, на 3' конце (3' присоединение). В альтернативном варианте присоединенные субъединицы могут быть рассеяны по всему антисмысловому соединению, например, в антисмысловом соединении, имеющем одну субъединицу, присоединенную к 5' концу, и одну субъединицу, присоединенную к 3' концу.
Длина антисмыслового соединения, такого как антисмысловой олигонуклеотид, может быть увеличена или уменьшена, и/или могут быть введены некомплементарные основания без потери активности. Например, в Woolf et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7305-7309, 1992) ряд антисмысловых олигонуклеотидов длиной 13-25 нуклеиновых оснований был испытан на предмет способности индуцировать расщепление целевой РНК в модели инъекции ооцита. Антисмысловые олигонуклеотиды длиной 25 нуклеиновых оснований с 8 или 11 некомплементарными основаниями вблизи концов антисмысловых олигонуклеотидов были способны направлять специфическое расщепление целевой мРНК, хотя и в меньшей степени, чем антисмысловые олигонуклеотиды, которые не содержали никаких несоответствий. Аналогичным образом целевое специфическое расщепление было достигнуто с использованием антисмысловых олигонуклеотидов длиной 13 нуклеиновых оснований, включая те, которые имели 1 или 3 несоответствия.
Gautschi et al (J. Natl. Cancer Inst. 93: 463-471, March 2001) продемонстрировали способность олигонуклеотида, обладающего 100% комплементарностью мРНК bcl-2 и содержащего 3 рассогласованных основания по отношению к мРНК bcl-xL, уменьшать экспрессию как bcl-2, так и bcl-xL in vitro и in vivo. Кроме того, данный олигонуклеотид продемонстрировал высокую противоопухолевую активность in vivo.
Maher and Dolnick (Nuc. Acid. Res. 16: 3341-3358,1988) провели испытания серии тандемов антисмысловых олигонуклеотидов из 14 нуклеиновых оснований и антисмысловых олигонуклеотидов из 28 и 42 нуклеиновых оснований, состоящих из последовательности двух или трех тандемов антисмысловых олигонуклеотидов, соответственно, на их способность к блокированию трансляции ДГФР человека в анализе на ретикулоцитах кролика. Каждый из трех антисмысловых олигонуклеотидов длиной 14 нуклеиновых оснований по отдельности мог воспрепятствовать трансляции, хотя на более низком уровне, чем антисмысловые олигонуклеотиды длиной 28 или 42 нуклеиновых основания.
Мотивы антисмысловых соединений
В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения, нацеленные на нуклеиновую кислоту C9ORF72, содержат химически модифицированные субъединицы, организованные в паттерны или мотивы, для обеспечения таких свойств антисмысловых соединений, как повышенная ингибирующая активность, повышенная аффинность связывания с нуклеиновой кислотой-мишенью или устойчивость к расщеплению нуклеазами in vivo.
Как правило, химерные антисмысловые соединения содержат по меньшей мере одну область, модифицированную таким образом, чтобы придать повышенную устойчивость к разложению под действием нуклеаз, усиленное клеточное поглощение, повышенную аффинность связывания с целевой нуклеиновой кислотой, и/или повышенную ингибирующую активность. Второй химерный участок антисмыслового соединения может дополнительно служить в качестве субстрата для клеточной эндонуклеазы РНКазы Н, которая отщепляет нить РНК в дуплексе РНК:ДНК.
3
2
2
2
Антисмысловые соединения, имеющие гэпмерный мотив, представляют собой химерные антисмысловые соединения. В гэпмере внутренняя область, имеющая множество нуклеотидов, которые поддерживают расщепление РНКазой Н, расположена между внешними областями, имеющими множество нуклеотидов, химически отличающихся от нуклеозидов внутренней области. В случае антисмыслового олигонуклеотида, имеющего гэпмерный мотив, сегмент гэпа, как правило, служит в качестве субстрата для расщепления эндонуклеазой, в то время как сегменты крыльев содержат модифицированные нуклеозиды. В некоторых вариантах реализации изобретения области гэпмера различаются по типам фрагментов сахаров в составе каждой отдельной области. Типы фрагментов сахаров, которые используют для дифференциации областей гэпмера, в некоторых вариантах реализации могут включать β-D-рибонуклеозиды, β-D-дезоксирибонуклеозиды, 2'-модифицированные нуклеозиды (такие 2'-модифицированные нуклеозиды могут включать, среди прочего, 2'-МОЕ и 2'-O-СН) и модифицированные бициклическими сахарами нуклеозиды (такие модифицированные бициклическими сахарами нуклеозиды могут включать те, которые имеют мостик 4'-(СН)n-O-2', где n=1 или n=2, и 4'-СН-O-СН-2'). Предпочтительно, каждая отдельная область содержит одинаковые фрагменты сахаров. Мотив крыло-гэп-крыло часто описывают как «Х-Y-Z», в котором «X» представляет длину области 5' крыла, «Y» представляет длину гэпа, и «Z» представляет длину области У крыла. В данном контексте гэпмер, описанный как «Х-Y-Z», имеет такую конфигурацию, что сегмент гэп расположен непосредственно примыкающим к каждому из сегмента 5' крыла и сегмента 3' крыла. Таким образом, отсутствуют промежуточные нуклеотиды между сегментом 5' крыла и сегментом гэп или сегментом гэп и сегментом У крыла. Любое из антисмысловых соединений, описанных в данном документе, может иметь гэпмерный мотив. В некоторых вариантах реализации изобретения X и Z являются одинаковыми; в других вариантах реализации изобретения они являются различными. В предпочтительном варианте реализации изобретения длина Y составляет от 8 до 15 нуклеотидов. X, Y или Z могут составлять 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30 или более нуклеотидов. Таким образом, гэпмеры, описанные в настоящем документе, включают, но не ограничиваются ими, например, 5-10-5, 5-10-4, 4-10-4, 4-10-3, 3-10-3, 2-10-2, 5-9-5, 5-9-4, 4-9-5, 5-8-5, 5-8-4, 4-8-5, 5-7-5, 4-7-5, 5-7-4 или 4-7-4.
В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловое соединение содержит мотив «вингмера», который имеет конфигурацию крыло-гэп или гэп-крыло, т.е. конфигурацию X-Y или Y-Z, как описано выше для конфигурации гэпмера. Таким образом, конфигурации вингмера, описанные в настоящем документе, включают, но не ограничиваются ими, например, 5-10, 8-4, 4-12, 12-4, 3-14, 16-2, 18-1, 10-3, 2-10, 1-10, 8-2, 2-13, 5-13, 5-8 или 6-8.
В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения, нацеленные на нуклеиновую кислоту C9ORF72, содержат гэпмерный мотив 5-10-5.
В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения, нацеленные на нуклеиновую кислоту C9ORF72, содержат гэпмерный мотив 5-8-5.
В некоторых вариантах реализации антисмысловые соединения, нацеленные на нуклеиновую кислоту C9ORF72, содержат сахарные модификации в любом из следующих паттернов: eeekkdddddddkkeee, eekkddddddddkkeee, ekddddddddekekeee, kekeddddddddekeke и ekekddddddddkekee; где
e=2'-O-метоксиэтил-модифицированный нуклеозид,
d=2'-дезоксинуклеозид, и
k=cEt нуклеозид.
2
n
2
2
3
В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловое соединение, нацеленное на нуклеиновую кислоту C9ORF72, содержит суженный гэп-мотив. В некоторых вариантах реализации антисмысловой олигонуклеотид с суженным гэп, нацеленный на нуклеиновую кислоту C9ORF72, содержит сегмент гэп из 9, 8, 7 или 6 2'-дезоксинуклеотидов, расположенных непосредственно рядом и между сегментами крыльев из 5, 4, 3, 2 или 1 химически модифицированного нуклеозида. В некоторых вариантах реализации химическая модификация включает бициклический сахар. В некоторых вариантах реализации бициклический сахар содержит мостик от 4' к 2', выбранный из: мостика 4'-(СН)-O-2', где n равен 1 или 2; и 4'-СН-O-СН-2'. В некоторых вариантах реализации бициклический сахар содержит мостик 4'-СН(СН)-O-2'. В некоторых вариантах реализации химическая модификация включает не бициклический 2'-модифицированный фрагмент сахара. В некоторых вариантах реализации не бициклический 2'-модифицированный фрагмент сахара содержит 2'-O-метоксиэтильную группу или 2'-O-метильную группу.
Нуклеиновые кислоты-мишени, области-мишени и нуклеотидные последовательности
Нуклеотидные последовательности, которые кодируют C9ORF72 включают, без ограничения, следующие: комплемент номера доступа GENBANKNM_001256054.1 (включенной в настоящий документ как SEQ ID NO: 1), комплемент номера доступа GENBANKNT_008413.18, усеченной по нуклеиновым основаниям с 27535000 по 27565000 (включенной в настоящий документ как SEQ ID NO: 2), номер доступа GENBANKBQ068108.1 (включенная в настоящий документ как SEQ ID NO: 3), номер доступа GENBANKNM_018325.3 (включенная в настоящий документ как SEQ ID NO: 4), номер доступа GENBANKDN993522.1 (включенная в настоящий документ как SEQ ID NO: 5), номер доступа GENBANKNM_145005.5 (включенная в настоящий документ как SEQ ID NO: 6), номер доступа GENBANKDB079375.1 (включенная в настоящий документ как SEQ ID NO: 7), номер доступа GENBANKBU194591.1 (включенная в настоящий документ как SEQ ID NO: 8), идентификатор последовательности 4141_014_А (включенная в настоящий документ как SEQ ID NO: 9) и 4008_73_А (включенная в настоящий документ как SEQ ID NO: 10) и номер доступа GENBANKNW_001101662.1, усеченная по нуклеозидам с 8522000 по 8552000 (включенная в настоящий документ как SEQ ID NO: 11).
Следует понимать, что последовательность, изложенная в каждой SEQ ID NO в примерах, содержащихся в данном документе, является независимой от любой модификации фрагмента сахара, межнуклеозидной связи или нуклеинового основания. Следовательно, антисмысловое соединение, определяемое по SEQ ID NO, может независимо содержать одну или более модификаций фрагмента сахара, межнуклеозидной связи или нуклеинового основания. Антисмысловые соединения, описанные по номеру Isis (Isis №), указывают сочетание последовательности нуклеиновых оснований и мотива.
В некоторых вариантах реализации изобретения целевая область представляет собой структурно определенную область нуклеиновой кислоты-мишени. Например, целевая область может содержать 3' нетранслируемую область, 5' нетранслируемую область, экзон, интрон, экзон-интронное сочленение, кодирующую область, область инициации трансляции, область терминации трансляции или другую определенную область нуклеиновой кислоты. Структурно определенные области для C9ORF72 могут быть получены по номеру доступа из баз данных последовательностей, таких как NCBI, и такая информация включена в данное описание посредством ссылки. В некоторых вариантах реализации целевая область может охватывать последовательность от 5' сайта-мишени одного целевого сегмента в пределах области-мишени до 3' сайта-мишени другого целевого сегмента в пределах той же области-мишени.
Нацеливание включает определение по меньшей мере одного сегмента-мишени, с которым гибридизуется антисмысловое соединение, например, для достижения желаемого эффекта. В некоторых вариантах реализации изобретения желаемый эффект представляет собой снижение уровней мРНК нуклеиновой кислоты-мишени. В некоторых вариантах реализации изобретения желаемый эффект представляет собой снижение уровней белка, кодируемого нуклеиновой кислотой-мишенью, или фенотипическое изменение, связанное с нуклеиновой кислотой-мишенью.
Область-мишень может содержать один или более сегментов-мишеней. Множество сегментов-мишеней в области-мишени могут быть перекрывающимися. В альтернативном варианте они могут быть не перекрывающимися. В некоторых вариантах реализации изобретения сегменты-мишени в пределах области-мишени разделены не более чем около 300 нуклеотидами. В некоторых вариантах реализации целевые сегменты в пределах области-мишени разделены числом нуклеотидов, равным, равным около, не более чем, не более чем около 250, 200, 150, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 или 10 нуклеотидами в нуклеиновой кислоте-мишени, или находится в пределах, определяемых любыми двумя из предшествующих значений. В некоторых вариантах реализации изобретения сегменты-мишени в пределах области-мишени разделены не более чем или не более чем около 5 нуклеотидами в нуклеиновой кислоте-мишени. В некоторых вариантах реализации изобретения сегменты-мишени являются смежными. Предусмотрены области-мишени, определенные диапазоном, имеющим стартовую нуклеиновую кислоту, которая представляет собой любую из 5' сайта-мишени или 3' сайта-мишени, перечисленных в настоящем документе.
Подходящие сегменты-мишени могут быть расположены в пределах 5' UTR, кодирующей области, 3' UTR, интрона, экзона или соединения экзон/интрон. Сегменты-мишени, содержащие старт-кодон или стоп-кодон, также представляют собой подходящие сегменты-мишени. Подходящий целевой сегмент может специфически исключать некоторые структурно определенные области, такие как старт-кодон или стоп-кодон.
Определение пригодных сегментов-мишеней может включать сравнение последовательности нуклеиновой кислоты-мишени с другими последовательностями в геноме. Например, для идентификации областей сходства среди различных нуклеиновых кислот может быть использован алгоритм BLAST. Такое сравнение может предотвратить отбор последовательностей антисмыслового соединения, которые способны гибридизоваться неспецифическим образом с последовательностями, отличными от выбранной нуклеиновой кислоты-мишени (т.е. нецелевыми или побочными последовательностями).
Могут быть вариации в активности (например, определенной по процентному снижению уровней нуклеиновой кислоты-мишени) антисмысловых соединений внутри целевой области. В некоторых вариантах реализации изобретения снижение уровней мРНК C9ORF72 является индикатором ингибирования экспрессии C9ORF72. Снижение уровней белка C9ORF72 также указывает на подавление экспрессии мРНК-мишени. Уменьшение наличия очагов РНК с расширенным C9ORF72 является показателем ингибирования экспрессии C9ORF72. Кроме того, на ингибирование экспрессии C9ORF72 указывают фенотипические изменения. Например, улучшение двигательной функции и дыхания может быть показателем ингибирования экспрессии C9ORF72.
Гибридизация
В некоторых вариантах реализации гибридизация происходит между антисмысловым соединением, описанным в настоящем документе, и нуклеиновой кислотой C9ORF72. Наиболее общий механизм гибридизации включает участие водородной связи (например, уотсон-криковское, хугстиновское или обратное хугстиновское образование водородной связи) между комплементарными нуклеиновыми основаниями молекул нуклеиновой кислоты.
Гибридизация может происходить в различных условиях. Жесткие условия являются последовательность-зависимыми и определяются природой и составом гибридизуемых молекул нуклеиновых кислот.
Способы определения того, является ли последовательность специфически гибридизуемой с целевой нуклеиновой кислотой, хорошо известны в данной области техники. В некоторых вариантах реализации антисмысловые соединения, представленные в настоящем документе, являются специфически гибридизуемыми с нуклеиновой кислотой C9ORF72.
Комплементарность
Антисмысловое соединение и нуклеиновая кислота-мишень комплементарны друг другу, если достаточное количество нуклеиновых оснований антисмыслового соединения может образовывать водородную связь с соответствующими нуклеиновыми основаниями нуклеиновой кислоты-мишени, таким образом, что будет достигаться желательный эффект (например, антисмысловое ингибирование нуклеиновой кислоты-мишени, такой как нуклеиновая кислота C9ORF72).
Некомплементарные нуклеиновые основания между антисмысловым соединением и нуклеиновой кислотой C9ORF72 могут быть допустимыми при условии, что антисмысловое соединение сохраняет способность специфично гибридизоваться с нуклеиновой кислотой-мишенью. Кроме того, антисмысловое соединение может гибридизоваться с одним или несколькими сегментами нуклеиновой кислоты C9ORF72 таким образом, что промежуточные или смежные сегменты не участвуют в гибридизации (например, петлевая структура, рассогласование или структура шпильки).
В некоторых вариантах реализации антисмысловые соединения, представленные в настоящем изобретении, или определенные их части, являются или по меньшей мере на 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, или 100% комплементарны к нуклеиновой кислоте C9ORF72, области-мишени, сегменту-мишени или определенной ее части. Процент комплементарности антисмыслового соединения к нуклеиновой кислоте-мишени может быть определен с применением стандартных способов.
Например, антисмысловое соединение, в котором 18 из 20 нуклеиновых оснований антисмыслового соединения являются комплементарными к области-мишени, и поэтому будут специфически гибридизоваться, будут имеет 90 процентов комплементарности. В данном примере оставшиеся некомплементарные нуклеиновые основания могут быть расположены кластерно или вперемешку с комплементарными нуклеиновыми основаниями и не обязаны быть смежными друг с другом или комплементарными нуклеиновыми основаниям. Таким образом, антисмысловое соединение, длина которого составляет 18 нуклеиновых оснований, содержащее 4 (четыре) некомплементарных нуклеиновых основания, фланкированных двумя областями полной комплементарности с нуклеиновой кислотой-мишенью, обладает общей комплементарностью с нуклеиновой кислотой-мишенью 77,8%, и таким образом, входит в границы объема настоящего изобретения. Процент комплементарности антисмыслового соединения с областью нуклеиновой кислоты-мишени может быть определен с помощью программ BLAST (поисковые инструменты для основного локального выравнивания) и программ PowerBLAST, известных в данной области техники (Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403 410; Zhang and Madden, Genome Res., 1997, 7, 649 656). Процент гомологии, идентичность или комплементарность последовательностей, могут быть определены, например, программой Gap (висконсинский пакет анализа последовательностей, версия 8 для Unix, Genetics Computer Group, Висконсинский Университет, Мэдисон штат Висконсин), используя настройки по умолчанию, которые используют алгоритм Смита и Ватермана (Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482 489).
В некоторых вариантах реализации антисмысловые соединения, предложенные в настоящем документе, или их определенные части полностью комплементарны (т.е. на 100% комплементарны) нуклеиновой кислоте-мишени или определенной ее части. Например, антисмысловое соединение может быть полностью комплементарно нуклеиновой кислоте C9ORF72 или ее области-мишени, или ее сегменту-мишени, или ее последовательности-мишени. В данном контексте «полностью комплементарный» означает, что каждое нуклеиновое основание антисмыслового соединения способно точно спариваться с соответствующими нуклеиновыми основаниями нуклеиновой кислоты-мишени. Например, антисмысловое соединение длиной 20 нуклеиновых оснований является полностью комплементарным к последовательности-мишени, длина которой составляет 400 нуклеиновых оснований при условии, что в нуклеиновой кислоте-мишени присутствует соответствующая часть длиной 20 нуклеиновых оснований, которая является полностью комплементарной к антисмысловому соединению. Полностью комплементарный может также использоваться в отношении определенной части первой и/или второй нуклеиновой кислоты. Например, часть длиной 20 нуклеиновых оснований антисмыслового соединения длиной 30 нуклеиновых оснований может быть «полностью комплементарной» к последовательности-мишени длиной 400 нуклеиновых оснований. Часть длиной 20 нуклеиновых оснований олигонуклеотида длиной 30 нуклеиновых оснований полностью комплементарна к последовательности-мишени, если последовательность-мишень содержит соответствующую часть длиной 20 нуклеиновых оснований, причем каждое нуклеиновое основание комплементарно к части антисмыслового соединения длиной 20 нуклеиновых оснований. В то же время, полноразмерное антисмысловое соединение длиной 30 нуклеиновых оснований может быть или не быть полностью комплементарным к последовательности-мишени, в зависимости от того, будут ли остальные 10 нуклеиновых оснований антисмыслового соединения также комплементарными к последовательности-мишени.
Некомплементарное нуклеиновое основание может располагаться на 5' конце или 3' конце антисмыслового соединения. В альтернативном варианте некомплементарное нуклеиновое основание или нуклеиновые основания могут быть внутри антисмыслового соединения. При наличии двух или более некомплементарных нуклеиновых оснований, они могут быть смежными (т.е. связанными) или не смежными. В одном варианте реализации изобретения некомплементарное нуклеиновое основание расположено в сегменте крыла гэпмера антисмыслового олигонуклеотида.
В некоторых вариантах реализации антисмысловые соединения, которые содержат точно или до 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 нуклеиновых оснований в длину, содержат не более 4, не более 3, не более 2 или не более 1 некомплементарного нуклеинового основания(-ий) относительно нуклеиновой кислоты-мишени, такой как нуклеиновая кислота C9ORF72, или ее определенной части.
В некоторых вариантах реализации антисмысловые соединения, которые содержат точно или до 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеиновых оснований в длину, содержат не более 6, не более 5, не более 4, не более 3, не более 2 или не более 1 некомплементарного нуклеинового основания(-ий) относительно нуклеиновой кислоты-мишени, такой как нуклеиновая кислота C9ORF72, или ее определенной части.
Антисмысловые соединения, представленные в данном документе, включают также те, которые являются комплементарными части нуклеиновой кислоты-мишени. В данном контексте «часть» относится к некоторому количеству смежных (т.е., связанных) нуклеиновых оснований в пределах области или сегмента нуклеиновой кислоты-мишени. «Часть» также может относиться к определенному количеству смежных нуклеиновых оснований антисмыслового соединения. В некоторых вариантах реализации антисмысловые соединения комплементарны части целевого сегмента из по меньшей мере 8 нуклеиновых оснований. В некоторых вариантах реализации антисмысловые соединения комплементарны части целевого сегмента из по меньшей мере 9 нуклеиновых оснований. В некоторых вариантах реализации антисмысловые соединения комплементарны части целевого сегмента из по меньшей мере 10 нуклеиновых оснований. В некоторых вариантах реализации антисмысловые соединения комплементарны части целевого сегмента из по меньшей мере 11 нуклеиновых оснований. В некоторых вариантах реализации антисмысловые соединения комплементарны части целевого сегмента из по меньшей мере 12 нуклеиновых оснований. В некоторых вариантах реализации антисмысловые соединения комплементарны части целевого сегмента из по меньшей мере 13 нуклеиновых оснований. В некоторых вариантах реализации антисмысловые соединения комплементарны части целевого сегмента из по меньшей мере 14 нуклеиновых оснований. В некоторых вариантах реализации антисмысловые соединения комплементарны части целевого сегмента из по меньшей мере 15 нуклеиновых оснований. Также предусмотрены антисмысловые соединения, которые комплементарны части сегмента-мишени длиной по меньшей мере 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более нуклеиновых оснований или с длиной в интервале, определенном любыми двумя из этих значений.
Идентичность
Антисмысловые соединения, представленные в настоящем документе, также могут иметь определенный процент идентичности конкретной нуклеотидной последовательности, SEQ ID NO, или соединению, представленному конкретным номером Isis, или его части. В данном контексте антисмысловое соединение идентично последовательности, описанной в данном документе, если оно обладает такой же способностью к спариванию с нуклеиновыми основаниями. Например, РНК, которая содержит урацил вместо тимидина в описанной последовательности ДНК, считалась бы идентичной последовательности ДНК, поскольку и урацил, и тимидин спариваются с аденином. Также предусматриваются укороченные и удлиненные версии антисмысловых соединений, описанных в данном документе, а также соединения, содержащие неидентичные основания относительно антисмысловых соединений, представленных в данном документе. Неидентичные основания могут быть смежными по отношению друг к другу или рассеянными по всему антисмысловому соединению. Процент идентичности антисмыслового соединения вычисляют согласно количеству оснований с идентичным спариванием оснований относительно последовательности, с которой его сравнивают.
В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения или их части являются по меньшей на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичными одному или более антисмысловым соединениям или SEQ ID NO, или их частей, описанных в данном документе.
В некоторых вариантах реализации фрагмент антисмыслового соединения сравнивают с равной по длине части нуклеиновой кислоты-мишени. В некоторых вариантах реализации сравнивают часть из 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 нуклеиновых оснований с равной по длине частью нуклеиновой кислоты-мишени.
В некоторых вариантах реализации часть антисмыслового олигонуклеотида сравнивают с равной по длине частью нуклеиновой кислоты-мишени. В некоторых вариантах реализации сравнивают часть из 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 нуклеиновых оснований с равной по длине частью нуклеиновой кислоты-мишени.
Модификации
Нуклеозид представляет собой комбинацию основание-сахар. Нуклеиновое основание (также известное как основание) - часть нуклеозида, обычно представляющая собой фрагмент гетероциклического основания. Нуклеотиды представляют собой нуклеозиды, которые дополнительно содержат фосфатную группу, ковалентно связанную с сахарной частью нуклеозида. Для тех нуклеозидов, которые содержат пентофуранозильный сахар, фосфатная группа может быть связана с 2', 3' или 5' гидроксильной группой сахара. Олигонуклеотиды образуются посредством ковалентного связывания смежных нуклеозидов друг с другом с образованием линейного полимерного олигонуклеотида. В пределах структуры олигонуклеотида, фосфатные группы обычно называют образующими межнуклеозидные связи олигонуклеотида.
Модификации антисмысловых соединений включают замены или модификации межнуклеозидных связей, фрагментов сахаров или нуклеиновых оснований. Модифицированные антисмысловые соединения зачастую предпочтительны по сравнению с нативными формами за счет желаемых свойств, таких как, например, улучшенное клеточное поглощение, повышенная аффинность связывания с нуклеиновой кислотой-мишенью, повышенная стабильность в присутствии нуклеаз или повышенная ингибирующая активность.
Химически модифицированные нуклеозиды также могут быть использованы для повышения аффинности связывания укороченного или усеченного антисмыслового олигонуклеотида с его нуклеиновой кислотой-мишенью. Следовательно, сопоставимые результаты часто могут быть получены с помощью более коротких антисмысловых соединений, которые имеют такие химически модифицированные нуклеозиды.
Модифицированные межнуклеозидные связи
Природная межнуклеозидная связь РНК и ДНК представляет собой 3'-5' фосфодиэфирную связь. Антисмысловые соединения, содержащие одну или более модифицированных, т.е., неприродных межнуклеозидных связей, часто предпочтительны по сравнению с антисмысловыми соединениями, содержащими природные межнуклеозидные связи, благодаря желательным свойствам, например, таких как улучшенное клеточное поглощение, повышенная аффинность к нуклеиновым кислотам-мишеням и повышенная устойчивость в присутствии нуклеаз.
Олигонуклеотиды, имеющие модифицированные межнуклеозидные связи, включают межнуклеозидные связи, которые сохраняют атом фосфора, а также межнуклеозидные связи, которые не имеют атома фосфора. Иллюстративные фосфорсодержащие межнуклеозидные связи включают, но не ограничиваются ими, фосфодиэфиры, фосфотриэфиры, метилфосфонаты, фосфорамидаты и тиофосфаты. Способы получения фосфорсодержащих и не содержащих фосфор связей являются хорошо известными.
В некоторых вариантах реализации антисмысловые соединения, направленные на нуклеиновую кислоту C9ORF72, содержат одну или более модифицированных межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах реализации модифицированные межнуклеозидные связи рассеяны по всему антисмысловому соединению. В некоторых вариантах реализации изобретения модифицированные межнуклеозидные связи представляют собой тиофосфатные связи. В некоторых вариантах реализации изобретения каждая межнуклеозидная связь антисмыслового соединения представляет собой тиофосфатную межнуклеозидную связь. В некоторых вариантах реализации антисмысловые соединения, направленные на нуклеиновую кислоту C9ORF72, содержат по меньшей мере одну фосфодиэфирную связь и по меньшей мере одну тиофосфатную связь.
В некоторых вариантах реализации антисмысловые соединения, направленные на нуклеиновую кислоту C9ORF72, содержат межнуклеозидные связи в любом из следующих паттернов: soooossssssssssooss, sooosssssssssooss, soosssssssssooss и sosssssssssoooss; где
s = тиофосфатная межнуклеозидная связь, и
о = фосфодиэфирная межнуклеозидная связь.
Модифицированные фрагменты сахаров
1
2
1
2
1
1
Антисмысловые соединения согласно настоящему изобретению необязательно могут содержать один или более нуклеозидов, в которых сахарная группа модифицирована. Такие нуклеозиды с модифицированным сахаром могут придавать антисмысловым соединениями повышенную устойчивость к нуклеазам, повышенную аффинность связывания или некоторые другие полезные биологические свойства. В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеозиды содержат химически модифицированные фрагменты рибофуранозного кольца. Примеры химически модифицированных рибофуранозных колец включают, не ограничиваясь ими, добавление групп заместителей (включая 5' и 2' группы заместителей, соединение мостиком негеминальных кольцевых атомов с образованием бициклических нуклеиновых кислот (БНК), замену атома кислорода в рибозильном кольце на S, N(R) или C(R)(R) (R, R и R, каждый независимо, представляют собой Н, С-С алкил или защитную группу) и их комбинации. Примеры химически модифицированных сахаров включают 2'-F-5'-метил-замещенный нуклеозид (см. международную заявку РСТ WO 2008/101157, опубликованную 8/21/08, где представлены другие описанные 5',2'-бис-замещенные нуклеозиды) или замену атома кислорода рибозильного кольца на S с дополнительным замещением в 2'-положении (см. опубликованную заявку на патент США US 2005-0130923, опубликованную 16 июня 2005 года), или в альтернативном варианте с 5'-замещением БНК (см. международную заявку РСТ WO 2007/134181, опубликованную 11/22/07, где ЗНК замещена, например, 5'-метальной или 5'-винильной группой).
3
2
3
2
2
2
2
3
1
10
3
2
2
2
3
2
2
m
n
2
m
n
2
1
2
2
m
n
1
m
n
1
10
Примеры нуклеозидов, имеющих модифицированные фрагменты сахаров, включают, но не ограничиваясь ими, нуклеозиды, содержащие 5'-винильные, 5'-метильные (R или S), 4'-S, 2'-F, 2'-ОСН, 2'-ОСНСН, 2'-OCHCHF и 2'-О(СН)ОСН группы заместителей. Заместитель в 2' положении также может быть выбран из аллила, амино, азидо, тио, О-аллила, O-C-С алкила, OCF, OCHF, O(СН)SCH, О(СН)-O-N(R)(R), О-СН-C(=О)-N(R)(R) и O-СН-C(=O)-N(R)-(СН)-N(R)(R), где каждый R, R и R независимо представляет собой Н или замещенный или незамещенный C-C алкил.
2
2
2
2
3
2
3
3
3
2
3
2
3
2
1
1
2
3
2
2
В данном контексте «бициклические нуклеозиды» относятся к модифицированным нуклеозидам, содержащим бициклический фрагмент сахара. Примеры бициклических нуклеиновых кислот (БНК) включают, но не ограничиваясь ими, нуклеозиды, содержащие мостик между 4' и 2' атомами рибозильного кольца. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения, представленные в данном документе, содержат один или более БНК нуклеозидов, при этом мостик содержит одну из формул: 4'-(СН)-O-2' (ЗНК); 4'-(СН)-S-2'; 4'-(СН)-O-2' (ЭНК); 4'-СН(СН)-O-2' и 4'-СН(СНОСН)-O-2' (и их аналоги, см. патент США 7399845, выданный 15 июля 2008 года); 4'-С(СН)(СН)-O-2' (и их аналоги, см. PCT/US2008/068922, опубликованную как WO 2009/006478 8 января 2009 года); 4'-СН-N(OCH)-2' (и их аналоги, см. PCT/US2008/064591, опубликованную как WO/2008/150729 11 декабря 2008 года); 4'-СН-O-N(CH)-2' (см. опубликованную заявку на патент США US 2004-0171570, опубликованную 2 сентября 2004 года); 4'-СН-N(R)-O-2', где R представляет собой Н, С-С алкил или защитную группу (см. патент США 7427672, выданный 23 сентября 2008 года); 4'-СН-С(Н)(СН)-2' (см. Chattopadhyaya et al., J. Org. Chem., 2009, 74, 118-134); и 4'-СН-C(=СН)-2' (и их аналоги, см. PCT/US2008/066154, опубликованную как WO 2008/154401 8 декабря 2008 года).
Дополнительные бициклические нуклеозиды описаны в опубликованной литературе (см., например: Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129(26) 8362-8379; Frieden et al., Nucleic Acids Research, 2003, 21, 6365-6372; Elayadi et al., Curr. Opinion Invens. Drugs, 2001, 2, 558-561; Braasch et al., Chem. Biol, 2001, 8, 1-7; Oram et al., Curr. Opinion Mol. Ther., 2001, 3, 239-243; Wahlestedt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2000, 97, 5633-5638; Singh et al., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456; Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630; Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222; Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039; патенты США №: 7399845; 7053207; 7034133; 6794499; 6770748; 6670461; 6525191; 6268490; публикации патентов США №: US2008-0039618; US 2007-0287831; US 2004-0171570; заявки на патент США, серийные номера: 12/129154; 61/099844; 61/097787; 61/086231; 61/056564; 61/026998; 61/026995; 60/989574; международные заявки WO 2007/134181; WO 2005/021570; WO 2004/106356; и международные заявки РСТ №: PCT/US2008/068922; PCT/US2008/066154; и PCT/US2008/064591). Каждый из указанных бициклических нуклеозидов может быть получен с одной или более стереохимическими конфигурациями сахара, включая, например, α-L-рибофуранозу и β-D-рибофуранозу (см. международную заявку РСТ PCT/DK98/00393, опубликованную 25 марта 1999 года как WO 99/14226).
В данном контексте «моноциклические нуклеозиды» относятся к нуклеозидам, содержащим модифицированные фрагменты сахаров, которые не являются бициклическими фрагментами сахаров. В некоторых вариантах реализации изобретения фрагмент сахара или аналог фрагмента сахара нуклеозида может быть модифицирован или замещен в любом положении.
В данном контексте «4'-2' бициклический нуклеозид» или «4' к 2' бициклический нуклеозид» относится к бициклическому нуклеозиду, содержащему фуранозное кольцо, содержащее мостик, соединяющий два атома углерода фуранозного кольца, соединяющий 2' атом углерода и 4' атом углерода сахарного кольца.
a
b
n
a
b
a
a
a
2
x
a
a
b
1
12
1
1
2
12
2
12
2
12
2
12
5
20
5
20
5
7
5
7
1
1
2
1
3
1
2
1
1
В некоторых вариантах реализации изобретения бициклические фрагменты сахаров нуклеозидов БНК включают, но не ограничиваются ими, соединения, имеющие по меньшей мере один мостик между 4' и 2' атомами углерода пентофуранозильного фрагмента сахара, включая, без ограничения, мостики, содержащие 1 или от 1 до 4 связанных групп, независимо выбранных из-[C(R)(R)]-, -C(R)=C(R)-, -C(R)=N-, -C(=NR)-, -C(=О)-, -C(=S)-, -O-, -Si(R)-, -S(=О)- и -N(R)-; где: x равен 0, 1 или 2; n равен 1, 2, 3 или 4; каждый R и R независимо представляет собой Н, защитную группу, гидроксил, C-C алкил, замещенный С-С алкил, С-С алкенил, замещенный С-С алкенил, С-С алкинил, замещенный С-С алкинил, С-С арил, замещенный С-С арил, гетероциклический радикал, замещенный гетероциклический радикал, гетероарил, замещенный гетероарил, С-С алициклический радикал, замещенный С-С алициклический радикал, галоген, OJ, NJJ, SJ, N, COOJ, ацил (С(=О)-Н), замещенный ацил, CN, сульфонил (S(=О)-J) или сульфоксил (S(=О)-J); и
1
2
1
12
1
12
2
12
2
12
2
12
2
12
5
20
5
20
1
12
1
12
каждый J и J независимо представляет собой Н, С-С алкил, замещенный С-С алкил, С-С алкенил, замещенный С-С алкенил, С-С алкинил, замещенный С-С алкинил, С-С арил, замещенный С-С арил, ацил (С(=О)-Н), замещенный ацил, гетероциклический радикал, замещенный гетероциклический радикал, С-С аминоалкил, замещенный С-С аминоалкил или защитную группу.
a
b
n
a
b
n
a
b
a
b
2
2
2
2
3
2
2
2
2
1
12
В некоторых вариантах реализации изобретения мостик бициклического фрагмента сахара представляет собой -[C(R)(R)]-, -[C(R)(R)]-O-, -C(RR)-N(R)-O- или -C(RR)-O-N(R)-. В некоторых вариантах реализации изобретения мостик представляет собой 4'-СН-2', 4'-(СН)-2', 4'-(СН)-2', 4'-СН-O-2', 4'-(СН2)-O-2', 4'-СН-O-N(R)-2' и 4'-СН-N(R)-O-2'-, где каждый R независимо представляет собой Н, защитную группу или С-С алкил.
2
2
В некоторых вариантах реализации изобретения бициклические нуклеозиды дополнительно определяют по изомерной конфигурации. Например, нуклеозид, содержащий мостик 4'-(СН)-O-2', может быть в α-L конфигурации или в β-D конфигурации. Ранее α-L-метиленокси β'-СН-O-2') БНК были внедрены в антисмысловые олигонуклеотиды, которые демонстрировали антисмысловую активность (Frieden et al., Nucleic Acids Research, 2003, 21, 6365-6372).
2
2
2
2
2
2
3
2
2
2
3
2
3
1
12
В некоторых вариантах реализации изобретения бициклические нуклеозиды включают нуклеозиды, имеющие 4'-2' мостик, где такие мостики включают, без ограничения, α-L-4'-(СН)-O-2', β-D-4'-СН-O-2', 4'-(СН)-O-2', 4'-СН-O-N(R)-2', 4'-СН-N(R)-O-2', 4'-СН(СН)-O-2', 4'-СН-S-2', 4'-СН-N(R)-2', 4'-СН-СН(СН)-2' и 4'-(СН)-2', где R представляет собой Н, защитную группу или С-С алкил.
В некоторых вариантах реализации изобретения бициклические нуклеозиды имеют формулу:
где:
Вх представляет собой фрагмент гетероциклического основания;
a
b
c
2
c
2
c
2
2
c
2
c
c
2
-Q-Q-Q- представляет собой -СН-N(R)-СН-, -C(=O)-N(R)-СН-, -СН-O-N(R)-, -СН-N(R)-O- или -N(R)-O-СН;
c
1
12
R представляет собой C-C алкил или аминозащитную группу; и
а
b
Т и T, каждый независимо, представляют собой Н, гидрокси-защитную группу, группу конъюгата, реакционноспособную фосфорную группу, фосфорный фрагмент или ковалентное присоединение к среде подложки.
В некоторых вариантах реализации изобретения бициклические нуклеозиды имеют формулу:
где:
Вх представляет собой фрагмент гетероциклического основания;
а
b
Т и T, каждый независимо, представляют собой Н, гидрокси-защитную группу, группу конъюгата, реакционноспособную фосфорную группу, фосфорный фрагмент или ковал ентное присоединение к среде подложки;
a
1
6
2
6
2
6
1
6
2
6
2
6
Z представляет собой C-С алкил, С-С алкенил, С-С алкинил, замещенный C-С алкил, замещенный С-С алкенил, замещенный С-С алкинил, ацил, замещенный ацил, замещенный амид, тиол или замещенный тиол.
c
c
d
c
3
c
e
c
d
c
d
e
1
6
1
6
c
В одном варианте реализации изобретения каждая из замещенных групп независимо является моно или полизамещенной группами заместителей, выбранными из галогена, оксо, гидроксила, OJ, NJJ, SJ, N, OC(=X)J и NJC(=X)NJJ, где каждый J, J и J независимо представляет собой Н, C-С алкил или замещенный C-С алкил, и X представляет собой О или NJ.
В некоторых вариантах реализации изобретения бициклические нуклеозиды имеют формулу:
где:
Вх представляет собой фрагмент гетероциклического основания;
а
b
Т и T, каждый независимо, представляют собой Н, гидрокси-защитную группу, группу конъюгата, реакционноспособную фосфорную группу, фосфорный фрагмент или ковал ентное присоединение к среде подложки;
b
1
6
2
6
2
6
1
6
2
6
2
6
Z представляет собой C-С алкил, С-С алкенил, С-С алкинил, замещенный C-С алкил, замещенный С-С алкенил, замещенный С-С алкинил или замещенный ацил (С(=O)-).
В некоторых вариантах реализации изобретения бициклические нуклеозиды имеют формулу:
где:
Вх представляет собой фрагмент гетероциклического основания;
а
b
Т и T, каждый независимо, представляют собой Н, гидрокси-защитную группу, группу конъюгата, реакционноспособную фосфорную группу, фосфорный фрагмент или ковал ентное присоединение к среде подложки;
d
1
6
1
6
2
6
2
6
2
6
2
6
R представляет собой C-С алкил, замещенный C-С алкил, С-С алкенил, замещенный С-С алкенил, С-С алкинил или замещенный С-С алкинил;
a
b
c
d
1
6
1
6
2
6
2
6
2
6
2
6
1
6
1
6
1
6
1
6
каждый q, q, q и q независимо представляет собой Н, галоген, C-С алкил, замещенный C-С алкил, С-С алкенил, замещенный С-С алкенил, С-С алкинил или замещенный С-С алкинил, C-С алкоксил, замещенный C-С алкоксил, ацил, замещенный ацил, C-С аминоалкил или замещенный C-С аминоалкил;
В некоторых вариантах реализации изобретения бициклические нуклеозиды имеют формулу:
где:
Вх представляет собой фрагмент гетероциклического основания;
а
b
Т и T, каждый независимо, представляют собой Н, гидрокси-защитную группу, группу конъюгата, реакционноспособную фосфорную группу, фосфорный фрагмент или ковалентное присоединение к среде подложки;
a
b
e
f
1
12
1
12
2
12
2
12
2
12
2
12
1
12
1
12
j
j
j
2
j
j
k
3
j
j
k
j
j
k
j
k
j
k
j
k
q, q, q и q, каждый независимо, представляют собой водород, галоген, С-C алкил, замещенный С-С алкил, С-С алкенил, замещенный С-С алкенил, С-С алкинил, замещенный С-С алкинил, С-С алкокси, замещенный С-С алкокси, OJ, SJ, SOJ, SOJ, NJJ, N, CN, C(=O)OJ, C(=O)NJJ, C(=O)J, O-C(=O)NJJ, N(H)C(=NH)NJJ, N(H)C(=O)NJJ или N(H)C(=S)NJJ;
e
f
g
h
или q и q вместе представляют собой =C(q)(q);
g
h
1
12
1
12
q и q, каждый независимо, представляют собой Н, галоген, С-С алкил или замещенный С-С алкил.
2
Описаны синтез и получение бициклических нуклеозидов аденина, цитозина, гуанина, 5-метилцитозина, тимина и урацила, имеющих мостик 4'-СН-O-2', а также их олигомеризация и свойства распознавания нуклеиновых кислот (Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630). Описан также синтез бициклических нуклеозидов в WO 98/39352 и WO 99/14226.
2
2
Были также получены аналоги различных бициклических нуклеозидов, которые имеют 4'-2' мостиковые группы, такие как 4'-СН-O-2' и 4'-СН-S-2' (Kumar et al, Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222). Описано также получение
олигодезоксирибонуклеотидных дуплексов, содержащих бициклические нуклеозиды, для применения в качестве субстратов для полимераз нуклеиновых кислот (Wengel et al., WO 99/14226). Кроме того, в данной области техники описан синтез 2'-амино-БНК, нового конформационно ограниченного высокоаффинного аналога олигонуклеотида (Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039). Кроме того, ранее были получены 2'-амино- и 2'-метиленамино БНК, и была описана термостабильность их дуплексов с комплементарными нитями РНК и ДНК.
В некоторых вариантах реализации изобретения бициклические нуклеозиды имеют формулу:
где:
Вх представляет собой фрагмент гетероциклического основания;
а
b
Т и T, каждый независимо, представляют собой Н, гидрокси-защитную группу, группу конъюгата, реакционноспособную фосфорную группу, фосфорный фрагмент или ковалентное присоединение к среде подложки;
i
j
k
l
1
12
1
12
2
12
2
12
2
12
2
12
1
12
1
12
j
j
j
2
j
j
k
3
j
j
k
j
j
k
j
k
j
k
j
k
каждый q, q, q и q независимо представляет собой Н, галоген, С-С алкил, замещенный С-С алкил, С-С алкенил, замещенный С-С алкенил, С-С алкинил, замещенный С-С алкинил, С-С алкоксил, замещенный С-С алкоксил, OJ, SJ, SOJ, SOJ, NJJ, N, CN, C(=O)OJ, C(=O)NJJ, C(=O)J, O-C(=O)NJJ, N(H)C(=NH)NJJ, N(H)C(=O)NJJ или N(H)C(=S)NJJ; и
i
j
l
k
g
h
g
h
1
12
1
12
q и q или q и q вместе представляют собой =C(q)(q), где q и q, каждый независимо, представляют собой Н, галоген, С-С алкил или замещенный С-С алкил.
2
3
2
Описан один карбоциклический бициклический нуклеозид, имеющий мостик 4'-(СН)-2', и мостик из аналога алкенила 4'-СН=СН-СН-2' (Freier et al., Nucleic Acids Research, 1997, 25(22), 4429-4443 и Albaek et al., J. Org. Chem., 2006, 71, 7731-7740). Описан также синтез и получение карбоциклических бициклических нуклеозидов вместе с их олигомеризацией и биохимическими исследованиями (Srivastava et al, J. Am. Chem. Soc. 2007, 129(26), 8362-8379).
2
2
2
2
2
3
2
2
2
3
2
3
В некоторых вариантах реализации изобретения бициклические нуклеозиды включают, но не ограничиваются ими, (А) α-L-метиленокси (4'-СН-O-2') БНК, (В) β-D-метиленокси (4'-СН-O-2') БНК, (С) этиленокси (4'-(СН)2-O-2') БНК, (D) аминоокси (4'-СН-O-N(R)-2') БНК, (Е) оксиамино (4'-СН-N(R)-O-2') БНК, (F) метил(метиленокси) (4'-СН(СН)-O-2') БНК (также называемый стерически затрудненным этилом или cEt), (G) метилентио (4'-СН-S-2') БНК, (Н) метиленамино (4'-СН-N(R)-2') БНК, (I) метилкарбоциклическую (4'-СН-СН(СН)-2') БНК, (J) пропиленкарбоциклическую (4'-(СН)-2') БНК и (K) винил-БНК, как показано ниже.
1
6
1
6
где Вх представляет собой фрагмент основания, а R независимо представляет собой Н, защитную группу, C-С алкил или C-С алкокси.
В данном контексте термин «модифицированный тетрагидропирановый нуклеозид» или «модифицированный ТГП нуклеозид» означает нуклеозид, имеющий шестичленный тетрагидропирановый «сахар», заменивший пентофуранозильный остаток в обычных нуклеозидах, и он может быть упомянут как заменитель сахара. ТГП-модифицированные нуклеозиды включают, но не ограничиваются ими, те, которые в данной области техники называют гекситоловой нуклеиновой кислотой (ГНК), анитоловой нуклеиновой кислотой (АНК), манитоловой нуклеиновой кислотой (МНК) (см. Leumann, Bioorg. Med. Chem., 2002, 10, 841-854) или фтор-ГНК (F-ГНК), имеющие тетрагидропирановую кольцевую систему, как показано ниже.
В некоторых вариантах реализации выбраны заменители сахара, имеющие формулу:
где:
Вх представляет собой фрагмент гетероциклического основания;
3
4
3
4
3
4
Т и Т, каждый независимо, представляют собой межнуклеозидную линкерную группу, связывающую аналог тетрагидропиранового нуклеозида с олигомерным соединением, или один из Т и Т представляет собой межнуклеозидную линкерную группу, связывающую аналог тетрагидропиранового нуклеозида с олигомерным соединением или олигонуклеотидом, а другой из Т и Т представляет собой Н, гидроксил-защитную группу, связанную группу конъюгата или 5' или 3'-концевую группу;
1
2
3
4
5
6
7
1
6
1
6
2
6
2
6
2
6
2
6
q, q, q, q, q, q и q, каждый независимо, представляют собой Н, C-С алкил, замещенный C-С алкил, С-С алкенил, замещенный С-С алкенил, С-С алкинил или замещенный С-С алкинил; и
1
2
1
2
1
3
1
1
2
3
1
2
1
1
2
3
1
6
один из R и R представляет собой водород, а другой выбран из галогена, замещенного или незамещенного алкокси, NJJ, SJ, N, OC(=X)J, OC(=X)NJJ, NJC(=Х)NJJ и CN, где X представляет собой О, S или NJ, и каждый J, J и J независимо представляет собой Н или C-С алкил.
1
2
3
4
5
6
7
1
2
3
4
5
6
7
1
2
3
4
5
6
7
1
2
1
2
1
2
1
2
В некоторых вариантах реализации изобретения каждый q, q, q, q, q, q и q представляет собой H. В некоторых вариантах реализации изобретения по меньшей мере один из q, q, q, q, q, q и q отличен от H. В некоторых вариантах реализации изобретения по меньшей мере один из q, q, q, q, q, qи q представляет собой метил. В некоторых вариантах реализации изобретения предложены ТГП нуклеозиды, в которых один из R и R представляет собой F. В некоторых вариантах реализации изобретения R представляет собой фтор, a R представляет собой Н; R представляет собой метокси, a R представляет собой Н, и R представляет собой метоксиэтокси, a R представляет собой Н. В некоторых вариантах реализации изобретения заменители сахара содержат кольца, имеющие более 5 атомов и более одного гетероатома. Например, описаны нуклеозиды, содержащие морфолинофрагменты сахаров, и их применение в олигомерных соединениях (см., например: Braasch et al., Biochemistry, 2002, 41, 4503-4510; и патенты США 5698685; 5166315; 5185444; и 5034506). В данном контексте термин «морфолино» означает заменитель сахара, имеющий следующую формулу:
В некоторых вариантах реализации изобретения морфолиновые фрагменты могут быть модифицированными, например, введением или модификацией различных заместителей, по сравнению с упомянутой выше структурой морфолино. Такие заменители сахара в данном контексте называют «модифицированными морфолино».
2
Предложены также комбинации модификаций, без ограничения, такие как 2'-F-5'-метил-замещенные нуклеозиды (см. международную заявку РСТ WO 2008/101157, опубликованную 8/21/08, где описаны другие 5', 2'-бис-замещенные нуклеозиды) и замену рибозильного кольцевого атома кислорода на S с дополнительным замещением в 2'-положении (см. опубликованную заявку на патент США US 2005-0130923, опубликованную 16 июня 2005 года) или в альтернативном варианте с 5'-замещением бициклической нуклеиновой кислоты (см. международную заявку РСТ WO 2007/134181, опубликованную 11/22/07, где 4'-СН-O-2' бициклический нуклеозид дополнительно замещен в 5' положении 5'-метальной или 5'-винильной группой). Описан также синтез и получение карбоциклических бициклических нуклеозидов вместе с их олигомеризацией и биохимическими исследованиями (см., например, Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc. 2007, 129(26), 8362-8379).
В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения содержат один или более модифицированных циклогексенильных нуклеозидов, которые представляют собой нуклеозиды, имеющие шестичленный циклогексенил вместо пентофуранозильного остатка в природных нуклеозидах. Модифицированные циклогексенильные нуклеозиды включают, но не ограничиваются ими, нуклеозиды, описанные в данной области техники (см., например, параллельную опубликованную заявку РСТ WO 2010/036696, опубликованную 10 апреля, 2010, Robeyns et al., J. Am. Chem. Soc., 2008,130(6), 1979-1984; Horváth et al., Tetrahedron Letters, 2007, 48, 3621-3623; Nauwelaerts et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129(30), 9340-9348; Gu et al., Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 2005, 24(5-7), 993-998; Nauwelaerts et al., Nucleic Acids Research, 2005, 33(8), 2452-2463; Robeyns et al., Acta Crystallographica, Section F: Structural Biology and Crystallization Communications, 2005, F61(6), 585-586; Gu et al, Tetrahedron, 2004, 60(9), 2111-2123; Gu et al., Oligonucleotides, 2003, 13(6), 479-489; Wang et al., J. Org. Chem., 2003, 68, 4499-4505; Verbeure et al., Nucleic Acids Research, 2001, 29(24), 4941-4947; Wang et al., J. Org. Chem., 2001, 66, 8478-82; Wang et al., Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 2001, 20(4-7), 785-788; Wang et al., J. Am. Chem., 2000, 122, 8595-8602; опубликованную заявку РСТ WO 06/047842; и опубликованную заявку РСТ WO 01/049687; полное содержание каждой из которых включено в данный документ посредством ссылки). Некоторые модифицированные циклогексенильные нуклеозиды имеют формулу X.
где независимо для каждого указанного по меньшей мере одного циклогексенильного нуклеозидного аналога формулы X:
Вх представляет собой фрагмент гетероциклического основания;
3
4
3
4
3
4
Т и Т, каждый независимо, представляют собой межнуклеозидную линкерную группу, которая связывает циклогексенильный нуклеозидный аналог с антисмысловым соединением, или один из Т и Т представляет собой межнуклеозидную линкерную группу, которая связывает тетрагидропирановый нуклеозидный аналог с антисмысловым соединением, а другой из Т и Т представляет собой Н, гидроксил-защитную группу, связанную группу конъюгата или 5'-или 3'-концевую группу; и
1
2
3
4
5
6
7
8
9
1
6
1
6
2
6
2
6
2
6
2
6
q, q, q, q, q, q, q, q и q, каждый независимо, представляют собой Н, C-С алкил, замещенный C-С алкил, C-С алкенил, замещенный С-С алкенил, С-С алкинил, замещенный С-С алкинил или другие группы-заместители сахара.
В данной области техники известны также многие другие моноциклические, бициклические и трициклические кольцевые системы, и они подходят в качестве заменителей сахара, которые могут быть использованы для модификации нуклеозидов для внедрения в олигомерные соединения, предложенные в данном документе (см., например, обзорную статью: Leumann, Christian J. Bioorg. & Med. Chem., 2002,10, 841-854). Такие кольцевые системы могут быть подвергнуты различным дополнительным замещениям для дополнительного повышения их активности.
2
n
m
3
2
n
2
2
n
3
2
n
2
n
2
2
3
2
n
2
n
3
2
1
12
3
3
3
3
2
3
2
2
3
2
В данном контексте «2'-модифицированный сахар» означает фуранозильный сахар, модифицированный в 2' положении. В некоторых вариантах реализации изобретения такие модификации включают заместители, выбранные из: галогенидов, включая, но не ограничиваясь ими, замещенный и незамещенный алкокси, замещенный и незамещенный тиоалкил, замещенный и незамещенный аминоалкил, замещенный и незамещенный алкил, замещенный и незамещенный аллил и замещенный и незамещенный алкинил. В некоторых вариантах реализации изобретения 2' модификации выбраны из заместителей, включающих, но не ограничиваясь ими: O[(СН)O]CH, O(СН)NH, O(СН)CH, O(СН)F, 0(СН)ONH, OCHC(=O)N(H)CH и О(СН)ON(СН)CH], где n и m равны от 1 до около 10. Другие 2' группы заместителей также могут быть выбраны из: С-С алкила, замещенного алкила, алкенила, алкинила, алкарила, аралкила, О-алкарила или О-аралкила, SH, SCH, OCN, CI, Br, CN, F, CF, OCF, SOCH, SOCH, ONO, NO, N, NH, гетероциклоалкила, гетероциклоалкарила, аминоалкиламино, полиалкиламино, замещенного силила, РНК расщепляющей группы, репортерной группы, интеркалятора, группы для улучшения фармакокинетических свойств или группы для улучшения фармакодинамических свойств антисмыслового соединения, и других заместителей с подобными свойствами. В некоторых вариантах реализации модифицированные нуклеозиды содержат 2'-МОЕ боковую цепь (Baker et al., J. Biol. Chem., 1997, 272, 11944-12000). Такие 2'-MOE замещения описаны как улучшающие аффинность связывания по сравнению с немодифицированными нуклеозидами и с другими модифицированными нуклеозидами, такими как 2'- O-метил, О-пропил и О-аминопропил. Было показано, что олигонуклеотиды, имеющие 2'-МОЕ заместитель, являются антисмысловыми ингибиторами экспрессии генов с перспективными возможностями для применения in vivo (Martin, Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504; Altmann et al., Chimia, 1996, 50, 168-176; Altmann et al., Biochem. Soc. Trans., 1996, 24, 630-637; и Altmann et al., Nucleosides Nucleotides, 1997, 16, 917-926).
В данном контексте «2'-модифицированный» или «2'-замещенный» относится к нуклеозиду, содержащему сахар, содержащий заместитель в 2' положении, отличный от Н или ОН. 2'-модифицированные нуклеозиды включают, но не ограничиваются ими, бициклические нуклеозиды, в которых мостик, соединяющий два атом углерода сахарного кольца, соединяет 2' атом углерода и другой атом углерода сахарного кольца; и
1
10
3
2
2
3
2
2
3
2
2
m
n
2
m
n
m
n
1
10
нуклеозиды с немостиковыми 2' заместителями, такими как аллил, амино, азидо, тио, О-аллил, O-C-C алкил, -OCF, О-(СН)-O-СН, 2'-О(СН)SCH, О-(СН)-O-N(R)(R), or О-СН-C(=O)-N(R)(R), где каждый R и R независимо представляет собой Н или замещенный или незамещенный C-С алкил. 2'-модифицированные нуклеозиды могут также содержать другие модификации, например в других позициях сахара и/или нуклеинового основания.
В данном контексте «2'-F» относится к нуклеозиду, содержащему сахар, содержащий группу фтора в 2' положении сахарного кольца.
3
3
В данном контексте «2'-ОМе» или «2'-ОСН», «2'-O-метил» или «2'-метокси» относятся к нуклеозиду, содержащему сахар, содержащий группу -ОСН в 2' положении сахарного кольца.
2
2
3
2
2
3
В данном контексте «МОЕ» или «2'-МОЕ», или «2'-OCHCHOCH», или «2'-O-метоксиэтил» относится к нуклеозиду, содержащему сахар, содержащий группу -ОСНСНОСН в 2' положении сахарного кольца.
Способы получения модифицированных сахаров хорошо известны специалистам в данной области техники. Некоторые иллюстративные патенты США, которые описывают получение таких модифицированных сахаров, включают, без ограничения, патенты США: 4981957; 5118800; 5319080; 5359044; 5393878; 5446137; 5466786; 5514785; 5519134; 5567811; 5576427; 5591722; 5597909; 5610300; 5627053; 5639873; 5646265; 5670633; 5700920; 5792847 и 6600032 и международную заявку PCT/US 2005/019219, поданную 2 июня 2005 года и опубликованную как WO 2005/121371 22 декабря 2005 года, полное содержание каждого из которых включено в данный документ посредством ссылки.
В данном контексте «олигонуклеотид» относится к соединению, содержащему множество связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации изобретения один или более из множества нуклеозидов являются модифицированными. В некоторых вариантах реализации изобретения олигонуклеотид содержит один или более рибонуклеозидов (РНК) и/или дезоксирибонуклеозидов (ДНК).
В нуклеотидах, имеющих модифицированные фрагменты сахаров, фрагменты нуклеиновых оснований (природные, модифицированные или их комбинации) сохраняются для гибридизации с соответствующей нуклеиновой кислотой-мишенью.
3
3
В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения содержат один или более нуклеозидов, имеющих модифицированные фрагменты сахаров. В некоторых вариантах реализации изобретения модифицированный фрагмент сахара представляет собой 2'-МОЕ. В некоторых вариантах реализации 2'-МОЕ модифицированные нуклеозиды расположены в гэпмерном мотиве. В некоторых вариантах реализации изобретения модифицированный фрагмент сахара представляет собой бициклический нуклеозид, имеющий мостиковую группу (4'-СН(СН)-O-2'). В некоторых вариантах реализации изобретения (4'-СН(СН)-O-2') модифицированные нуклеозиды расположены в крыльях гэпмерного мотива.
Композиции и способы составления фармацевтических композиций
Антисмысловые олигонуклеотиды могут быть смешаны с фармацевтически приемлемыми активными или инертными веществами для получения фармацевтических композиций или составов. Композиции и способы составления фармацевтических композиций зависят от множества критериев, включая, но не ограничиваясь ими, способ введения, тяжесть заболевания или дозу, подлежащую введению.
Антисмысловое соединение, к нуклеиновой кислоте C9ORF72, могут быть использованы в фармацевтических композициях путем объединения антисмыслового соединения с подходящим фармацевтически приемлемым разбавителем или носителем. Фармацевтически приемлемый разбавитель включает фосфатно-солевой буферный раствор (PBS). PBS представляет собой разбавитель, подходящий для применения в композициях, доставляемых парентерально. Соответственно, в одном из вариантов реализации в способах, описанных в настоящем документе, используют фармацевтическую композицию, содержащую антисмысловое соединение, направленное на нуклеиновую кислоту C9ORF72, и фармацевтически приемлемый разбавитель. В некоторых вариантах реализации фармацевтически приемлемый разбавитель представляет собой PBS. В некоторых вариантах реализации антисмысловое соединение представляет собой антисмысловой олигонуклеотид.
Фармацевтические композиции, содержащие антисмысловые соединения, включают любые фармацевтически приемлемые соли, сложные эфиры или соли таких сложных эфиров или любой другой олигонуклеотид, который, при введении животному, включая человека, способен обеспечить (прямо или косвенно) биологически активный метаболит или его остаток. Соответственно, например, настоящее описание относится также к фармацевтически приемлемым солям антисмысловых соединений, пролекарствам, фармацевтически приемлемым солям таких пролекарств и к другим биоэквивалентам. Пригодные фармацевтически приемлемые соли включают, но не ограничиваются ими, соли натрия и калия.
Пролекарство может включать внедрение дополнительных нуклеозидов с одного или обоих концов антисмыслового соединения, которые расщепляются в организме под действием эндогенных нуклеаз с образованием активного антисмыслового соединения.
Сопряженные антисмысловые соединения
Антисмысловые соединения могут быть ковалентно связаны с одним или более фрагментом или конъюгатом, которые усиливают активность, клеточное распределение или клеточное поглощение полученных антисмысловых олигонуклеотидов. Типичные сопряженные группы включают фрагменты холестерина и липидные фрагменты. Дополнительные сопряженные группы включают сахара, фосфолипиды, биотин, феназин, соль фолиевой кислоты, фенантридин, антрахинон, акридин, флуоресцеины, родамины, кумарины, и красители.
Антисмысловые соединения могут также быть модифицированными, чтобы иметь одну или более стабилизирующих групп, которые обычно присоединяются к одному или обоим концам антисмысловых соединений для улучшения свойств, таких как, например, устойчивость к нуклеазам. Стабилизирующие группы включают кэпирующие структуры. Такие концевые модификации защищают антисмысловое соединение с концевой нуклеиновой кислотой от разрушения под действием экзонуклеаз и могут способствовать доставке и/или локализации внутри клетки. Кэп может быть расположен на 5'-конце (5'-кэп) или на 3'-конце (3'-кэп), или может находиться на обоих концах. Кэпирующие структуры хорошо известны в данной области техники и включают, например, инвертированные дезокси кэпы с удаленными нуклеиновыми основаниями. Дополнительные 3' и 5'-стабилизирующие группы, которые могут быть использованы для кэпирования одного или обоих концов антисмыслового соединения для придания устойчивости к нуклеазам, включают группы, описанные в WO 03/004602 опубликованном 16 января 2003 года.
Клеточная культура и лечение антисмысловыми соединениями
Влияние антисмысловых соединений на уровень, активность или экспрессию нуклеиновых кислот C9ORF72 может быть испытано in vitro на различных типах клеток. Различные типы клеток, используемые для таких анализов, имеются в продаже у коммерческих поставщиков (например, Американская коллекция типов культур (АТСС), Manassus, VA; Zen-Bio, Inc., Research Triangle Park, штат Северная Каролина; Clonetics Corporation, Уолкерсвиль, штат Мэриленд) и культивируются согласно инструкциям производителей с применением коммерчески доступных реагентов (например, Invitrogen Life Technologies, Карлсбад, штат Калифорния). Иллюстративные клеточные типы включают, но не ограничиваются ими, клетки HepG2, клетки Нер3В, и первичные гепатоциты.
Тестирование антисмысловых олигонуклеотидов in vitro
В данном документе описаны способы обработки клеток антисмысловыми олигонуклеотидами, которые могут быть модифицированы соответствующим образом для обработки другими антисмысловыми соединениями.
В целом, клетки обрабатывают антисмысловыми олигонуклеотидами, когда клетки достигают приблизительно 60-80% конфлуентности в культуре.
Реагент, используемый для введения антисмысловых олигонуклеотидов в культивируемые клетки, включает катионный липидный трансфекционный реагент Липофектин (Invitrogen, Карлсбад, штат Калифорния). Антисмысловые олигонуклеотиды смешивают с LIPOFECTIN в OPTI-MEM 1 (Invitrogen, Карлсбад, штат Калифорния), чтобы достичь желаемой конечной концентрации антисмыслового олигонуклеотида и концентрации LIPOFECTIN, которая обычно варьирует в интервале 2-12 мкг/мл на 100 нМ антисмыслового олигонуклеотида.
Другой реагент, используемый для введения антисмысловых олигонуклеотидов в культивируемые клетки, включает Липофектамин (Invitrogen, Карлсбад, штат Калифорния). Антисмысловой олигонуклеотид смешивают с LIPOFECTAMINE в среде OPTI-MEM 1 со сниженным содержанием сыворотки (Invitrogen, Карлсбад, штат Калифорния), чтобы достичь желаемой концентрации антисмыслового олигонуклеотида и концентрации LIPOFECTAMINE, которая обычно варьирует в интервале 2-12 мкг/мл на 100 нМ антисмыслового олигонуклеотида.
Другая технология, используемая для введения антисмысловых олигонуклеотидов в культивируемые клетки, включает электропорацию.
Клетки обрабатывают антисмысловыми олигонуклеотидами стандартными способами. Клетки обычно собирают через 16-24 часов после обработки антисмысловым олигонуклеотидом, после чего уровни РНК или белков нуклеиновых кислот-мишеней измеряют методами, известными в данной области техники и описанными в настоящем документе. Как правило, если обработку проводят в нескольких повторениях, данные представляют как среднее значение для многократных обработок.
Концентрация используемого антисмыслового олигонуклеотида варьирует от одной линии клеток к другой. Способы определения оптимальной концентрации антисмыслового олигонуклеотида для конкретной клеточной линии хорошо известны в данной области техники. Антисмысловые олигонуклеотиды обычно используют в концентрациях от 1 нМ до 300 нМ, при трансфекции с использованием LIPOFECTAMINE. Антисмысловые олигонуклеотиды используют в более высоких концентрациях в диапазоне от 625 до 20000 нМ при трансфекции с использованием электропорации.
Выделение РНК
Анализ РНК может быть проведен на общей клеточной РНК или поли(А)+ мРНК. Способы выделения РНК хорошо известны в данной области техники. РНК получают с использованием способов, хорошо известных в данной области техники, например, с использованием реагента TRIZOL (Invitrogen, Карлсбад, штат Калифорния) по рекомендуемым протоколам производителя.
Анализ ингибирования целевых уровней или экспрессии
Ингибирование уровней или экспрессии нуклеиновой кислоты C9ORF72 может быть проанализировано различными способами, известными в данной области техники. Например, уровни нуклеиновой кислоты-мишени могут быть количественно определены, например, нозерн-блоттингом, конкурентной полимеразной цепной реакцией (ПНР) или количественной ПЦР в реальном времени. Анализ РНК может быть проведен на общей клеточной РНК или поли(А)+ мРНК. Способы выделения РНК хорошо известны в данной области техники. Нозерн-блоттинг также является общепринятым в данной области техники. Количественная ПЦР в реальном времени может быть удобно выполнена с помощью имеющихся в продаже систем обнаружения последовательностей ABI PRISM 7600, 7700, или 7900 производства компании PE-Applied Biosystems, Фостер-Сити, штат Калифорния, и используемых в соответствии с инструкциями производителя.
Анализ уровней РНК мишени методом количественной ПЦР в реальном времени
Количественное определение уровней целевой РНК может быть проведено путем количественной ПЦР в реальном времени с использованием систем обнаружения последовательностей ABI PRISM 7600, 7700 или 7900 (PE-Applied Biosystems, Фостер-Сити, штат Калифорния) в соответствии с инструкциями производителя. Способы количественной ПЦР в реальном времени хорошо известны в данной области техники.
Перед проведением ПЦР в реальном времени, выделенную РНК подвергают реакции с обратной транскриптазой (ОТ), которая производит комплементарную ДНК (кДНК), в дальнейшем используемую в качестве субстрата для ПЦР-амплификации в реальном времени. Реакции ОТ и ПЦР в реальном времени выполняются последовательно в одной и той же ячейке с образцом. Реагенты для ОТ и ПЦР в реальном времени приобретали у компании Invitrogen (Карлсбад, штат Калифорния). Реакции ОТ и ПЦР в реальном времени проводят способами, хорошо известными специалистам в данной области техники.
Количества гена-мишени (или РНК), полученные путем ПЦР в реальном времени, нормализуют с использованием либо уровня экспрессии гена, экспрессия которого постоянна, такого как циклофилин А, или на основе количественной оценки суммарной РНК с использованием реагента RIBOGREEN (Invitrogen, Inc. Карлсбад, штат Калифорния). Экспрессию циклофилина А определяют количественно с помощью ПЦР в реальном времени, проводя ее одновременно с мишенью, мультиплексно или отдельно. Общую РНК количественно определяют с помощью реагента для количественного определения РНК RIBOGREEN (Invetrogen, Inc. Юджин, штат Орегон). Способы количественного определения РНК с использованием RIBOGREEN изложены в in Jones, L.J., et al., (Analytical Biochemistry, 1998, 265, 368-374). Для измерения флуоресценции RIBOGREEN используют прибор CYTOFLUOR 4000 (РЕ Applied Biosystems).
Зонды и праймеры конструируют для гибридизации с нуклеиновой кислотой C9ORF72. Способы конструирования зондов и праймеров для ПЦР в реальном времени хорошо известны в данной области техники, и могут включать использование программного обеспечения, такого как PRIMER EXPRESS (Applied Biosystems, Фостер-Сити, штат Калифорния).
Анализ уровней белка
Антисмысловое ингибирование нуклеиновых кислот C9ORF72 может быть оценено путем измерения уровней белка C9ORF72. Уровни белка C9ORF72 могут быть оценены или количественно измерены различными способами, хорошо известными в данной области техники, такими как иммунопреципитация, вестерн-блоттинг (иммуноблоттинг), иммуноферментный анализ (ELISA), количественный анализ белка, анализ активности белка (например, анализ активности каспазы), иммуногистохимия, иммуноцитохимия или сортировка флуоресцентно-активированных клеток (FACS). Антитела, нацеленные на мишень, могут быть идентифицированы и получены из различных источников, таких как каталог антител MSRS (Aerie Corporation, Бирмингем, штат Мичиган) или могут быть получены традиционными способами получения моноклональных или поликлональных антител, хорошо известных в данной области техники. Антитела, пригодные для обнаружения C9ORF72 мышей, крыс, обезьян и человека, являются коммерчески доступными.
Тестирование антисмысловых соединений in vivo
Антисмысловые соединения, например, антисмысловые олигонуклеотиды, испытывали на животных с целью оценки их способности ингибировать экспрессию C9ORF72 и производить фенотипические изменения, такие как улучшение двигательной функции и дыхания. В некоторых вариантах реализации двигательную функцию измеряли посредством оценки способности удерживания на вращающемся барабане, прочности сжатия, залезания на шест, теста «открытое поле», балансировки на бревне, анализа отпечатков задних лап у животного. В некоторых вариантах реализации дыхание измеряли с помощью общего плетизмографа, измерений сопротивления инвазии и податливости у животного. Тестирование быть проведено на здоровых животных или в экспериментальных моделях заболеваний. Для введения животным антисмысловые олигонуклеотиды составляли в композицию с фармацевтически приемлемым разбавителем, таким как фосфатно-солевой буферный раствор (PBS) или искусственная спинномозговая жидкость (aCSF). Введение включает парентеральные способы введения, такие как интраперитонеальный, внутривенный и подкожный, а также центральные способы введения, такие как интрацеребровентрикулярный или интратекальный. Расчет дозы и частоты введения антисмыслового олигонуклеотида известен специалистам в данной области техники и зависит от таких факторов, как способ введения и масса тела животного. После периода лечения с помощью антисмысловых олигонуклеотидов, РНК выделяют из ткани ЦНС или СМЖ и измеряют изменения экспрессии нуклеиновой кислоты C9ORF72.
Направленное воздействие на C9ORF72
Антисмысловые олигонуклеотиды, описанные в настоящем документе, могут гибридизоваться с нуклеиновой кислотой C9ORF72 на любой стадии процессинга РНК. Например, в настоящем документе описаны антисмысловые олигонуклеотиды, которые комплементарны пре-мРНК или зрелой мРНК. Кроме того, антисмысловые олигонуклеотиды, описанные в настоящем документе, могут гибридизоваться с любым элементом нуклеиновой кислоты C9ORF72. Например, в настоящем документе описаны антисмысловые олигонуклеотиды, которые комплементарны экзону, интрону, 5' UTR, 3' UTR, области повтора, экспансии гексануклеотидного повтора, границе сплайсинга, экзон: экзонной границе сплайсинга, экзонному сайленсеру сплайсинга (ESS), экзонному энхансеру сплайсинга (ESE), экзону 1а, экзону 1b, экзону 1с, экзону 1d, экзону 1е, экзону 2, экзону 3, экзону 4, экзону 5, экзону 6, экзону 7, экзону 8, экзону 9, экзону 10, экзону 11, интрону 1, интрону 2, интрону 3, интрону 4, интрону 5, интрону 6, интрону 7, интрону 8, интрону 9 или интрону 10 нуклеиновой кислоты C9ORF72.
В некоторых вариантах реализации антисмысловые олигонуклеотиды, описанные в настоящем документе, гибридизуются со всеми вариантами C9ORF72. В некоторых вариантах реализации антисмысловые олигонуклеотиды, описанные в настоящем документе, селективно гибридизуются с некоторыми вариантами C9ORF72. В некоторых вариантах реализации антисмысловые олигонуклеотиды, описанные в настоящем документе, селективно гибридизуются с вариантами C9ORF72, содержащими экспансию гексануклеотидного повтора. В некоторых вариантах реализации антисмысловые олигонуклеотиды, описанные в настоящем документе, селективно гибридизуются с вариантами пре-мРНК, содержащими гексануклеотидный повтор. В некоторых вариантах реализации варианты пре-мРНК C9ORF72, содержащие экспансию гексануклеотидного повтора, включают SEQ ID NO: 1-3 и 6-10. В некоторых вариантах реализации такая экспансия гексануклеотидного повтора содержит по меньшей мере 24 повтора любого из GGGGCC, GGGGGG, GGGGGC или GGGGCG.
В некоторых вариантах реализации антисмысловые олигонуклеотиды, описанные в настоящем документе, ингибируют экспрессию всех вариантов C9ORF72. В некоторых вариантах реализации антисмысловые олигонуклеотиды, описанные в настоящем документе, ингибируют экспрессию всех вариантов C9ORF72 в равной степени. В некоторых вариантах реализации антисмысловые олигонуклеотиды, описанные в настоящем документе, предпочтительно ингибируют экспрессию одного или более вариантов C9ORF72. В некоторых вариантах реализации антисмысловые олигонуклеотиды, описанные в настоящем документе, предпочтительно ингибируют экспрессию вариантов C9ORF72, содержащих экспансию гексануклеотидного повтора. В некоторых вариантах реализации антисмысловые олигонуклеотиды, описанные в настоящем документе, селективно ингибируют экспрессию вариантов пре-мРНК, содержащих гексануклеотидный повтор. В некоторых вариантах реализации антисмысловые олигонуклеотиды, описанные в настоящем документе, селективно ингибируют экспрессию патоген-ассоциированных вариантов мРНК C9ORF72. В некоторых вариантах реализации варианты пре-мРНК C9ORF72, содержащие экспансию гексануклеотидного повтора, включают SEQ ID NO: 1-3 и 6-10. В некоторых вариантах реализации такая экспансия гексануклеотидного повтора содержит по меньшей мере 24 повтора любого из GGGGCC, GGGGGG, GGGGGC или GGGGCG. В некоторых вариантах реализации экспансия гексануклеотидного повтора образует ядерные очаги. В некоторых вариантах реализации антисмысловые олигонуклеотиды, описанные в настоящем документе, пригодны для сокращения ядерных очагов. Ядерные очаги могут быть сокращены в отношении процента клеток с такими очагами, а также в отношении количества очагов на одну клетку.
Селективное ингибирование некоторых патогенных ассоциированных вариантов.
В некоторых примерах, представленных в настоящем документе, набор праймеров и зондов RTS3905 обнаруживает вариант мРНК (например, NM_001256054.1), процессированный из варианта пре-мРНК, содержащего гексануклеотидный повтор. Вариант мРНК, процессированный из варианта пре-мРНК, содержит гексануклеотидный повтор (т.е. «патоген-ассоциированный вариант мРНК C9ORF72»). Пре-мРНК содержит гексануклеотидный повтор, если транскрипция пре-мРНК начинается в области от сайта инициации экзона 1А к сайту инициации экзона 1 В, например, с 1107 по 1520 нуклеотиды геномной последовательности (SEQ ID NO: 2, комплемент номера доступа GENBANKNT_008413.18, усеченной по нуклеозидам с 27535000 по 27565000). В указанной области были сконструированы олигонуклеотиды для селективного воздействия на вариант пре-мРНК, содержащий гексануклеотидный повтор. RTS3905 обеспечивает возможность измерения продукта мРНК (т.е. патоген-ассоциированного варианта мРНК C9ORF72) варианта пре-мРНК, содержащего гексануклеотидный повтор, и, следовательно, обеспечивает возможность измерения снижения варианта пре-мРНК, содержащего гексануклеотидный повтор.
Особенности C9ORF72
Антисмысловые олигонуклеотиды, описанные в настоящем документе, могут гибридизоваться с любым вариантом C9ORF72 в любом состоянии процессинга в любом элементе гена C9ORF72. Например, антисмысловые олигонуклеотиды, описанные в настоящем документе, могут гибридизоваться с экзоном, интроном 5' UTR, 3' UTR, областью повтора, экспансией гексануклеотидного повтора, границей сплайсинга, экзон: экзонной границей сплайсинга, экзонным сайленсером сплайсинга (ESS), экзонным энхансером сплайсинга (ESE), экзоном 1а, экзоном 1b, экзоном 1с, экзоном 1d, экзоном 1е, экзоном 2, экзоном 3, экзоном 4, экзоном 5, экзоном 6, экзоном 7, экзоном 8, экзоном 9, экзоном 10, экзоном 11, интроном 1, интроном 2, интроном 3, интроном 4, интроном 5, интроном 6, интроном 7, интроном 8, интроном 9 или интроном 10. Например, антисмысловые олигонуклеотиды могут быть направлены на любой из экзонов, описанных ниже в таблицах 1-5 для различных вариантов C9ORF72, описанных ниже. Антисмысловые олигонуклеотиды, описанные в настоящем документе, также могут быть направлены на варианты, не описанные ниже, и такие варианты описаны в GENBANK. Кроме того, антисмысловые олигонуклеотиды, описанные в настоящем документе, также могут быть направлены на элементы, отличные от экзонов, и такие элементы описаны в GENBANK.
Некоторые показания
В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения предложены способы лечения индивидуума, включающие введение одной или более фармацевтических композиций, описанных в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации индивидуум страдает нейродегенеративным заболеванием. В некоторых вариантах реализации индивидуум имеет риск развития нейродегенеративного заболевания, включая, но не ограничиваясь ими, ALS или FTD. В некоторых вариантах реализации у индивидуума идентифицировано C9ORF72-ассоциированное заболевание. В некоторых вариантах реализации в настоящем документе предложены способы профилактического снижения экспрессии C9ORF72 у индивидуума. Некоторые варианты реализации включают лечение индивидуума, нуждающегося в этом, путем введения индивидууму терапевтически эффективного количества антисмыслового соединения к нуклеиновой кислоте C9ORF72.
В некоторых вариантах реализации введение терапевтически эффективного количества антисмыслового соединения, направленного на нуклеиновую кислоту C9ORF72, сопровождается мониторингом уровней C9ORF72 у индивидуума для определения реакции индивидуума на введение антисмыслового соединения. Реакцию индивидуума на введение антисмыслового соединения врач может использовать для определения объема и продолжительности терапевтического вмешательства.
В некоторых вариантах реализации введение антисмыслового соединения, направленного на нуклеиновую кислоту C9ORF72, приводит к снижению экспрессии C9ORF72 на по меньшей мере 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 99%, или на значение в диапазоне между любыми двумя из указанных значений. В некоторых вариантах реализации введение антисмыслового соединения, направленного на нуклеиновую кислоту C9ORF72, приводит к улучшению двигательной функции и дыхания у животного. В некоторых вариантах реализации введение антисмыслового соединения к C9ORF72 обеспечивает улучшение двигательной функции и дыхания на по меньшей мере 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 99%, или на значение в диапазоне между любыми двумя из указанных значений.
В некоторых вариантах реализации фармацевтические композиции, содержащие антисмысловое соединение, направленное на C9ORF72, используют для получения лекарственного средства для лечения пациента, страдающего или предрасположенного к нейродегенеративному заболеванию, включая ALS и FTD.
Некоторые комбинированные терапии
В некоторых вариантах реализации одну или более фармацевтических композиций, описанных в настоящем документе, вводят совместно с одним или более другими фармацевтическими агентами. В некоторых вариантах реализации такой один или более других фармацевтических агентов предназначены для лечения того же заболевания, расстройства или патологического состояния, что и одна или более фармацевтических композиций, описанных в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации такой один или более других фармацевтических агентов предназначены для лечения другого заболевания, расстройства или патологического состояния, чем одна или более фармацевтических композиций, описанных в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации такой один или более других фармацевтических агентов предназначены для лечения нежелательного побочного эффекта одной или более фармацевтических композиций, описанных в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации одну или более фармацевтических композиций, описанных в настоящем документе, вводят совместно с другим фармацевтическим агентом для лечения нежелательного побочного эффекта указанного другого фармацевтического агента. В некоторых вариантах реализации одну или более фармацевтических композиций, описанных в настоящем документе, вводят совместно с другим фармацевтическим агентом для обеспечения комбинированного эффекта. В некоторых вариантах реализации одну или более фармацевтических композиций, описанных в настоящем документе, вводят совместно с другим фармацевтическим агентом для обеспечения синергетического эффекта.
В некоторых вариантах реализации одну или более фармацевтических композиций, описанных в настоящем документе, и один или более других фармацевтических агентов вводят одновременно. В некоторых вариантах реализации одну или более фармацевтических композиций, описанных в настоящем документе, и один или более других фармацевтических агентов вводят в разное время. В некоторых вариантах реализации одну или более фармацевтических композиций, описанных в настоящем документе, и один или более других фармацевтических агентов получают вместе в составе одной лекарственной формы. В некоторых вариантах реализации одну или более фармацевтических композиций, описанных в настоящем документе, и один или более других фармацевтических агентов получают по отдельности.
В некоторых вариантах реализации фармацевтические агенты, которые могут быть совместно введены с фармацевтической композицией, описанной в настоящем документе, включают рилузол (рилутек), лиорезал (лиорезал) и декспрамипексол.
В некоторых вариантах реализации фармацевтические агенты, которые могут быть введены совместно со специфическим ингибитором C9ORF72, описанным в настоящем документе, включают, но не ограничиваются им, дополнительный ингибитор C9ORF72.
В некоторых вариантах реализации фармацевтические агенты, которые могут быть введены совместно со специфическим ингибитором C9ORF72, описанным в настоящем документе, включают, но не ограничиваются ими, специфический ингибитор антисмыслового транскрипта C9ORF72. В некоторых вариантах реализации специфический ингибитор антисмыслового транскрипта C9ORF72 представляет собой антисмысловое соединение. В некоторых вариантах реализации антисмысловое соединение представляет собой модифицированный олигонуклеотид. В некоторых вариантах реализации модифицированный олигонуклеотид является одноцепочечным.
В некоторых вариантах реализации совместно вводимый фармацевтический агент вводят до введения фармацевтической композиции, описанной в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации совместно вводимый фармацевтический агент вводят после введения фармацевтической композиции, описанной в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации совместно вводимый фармацевтический агент вводят одновременно с фармацевтической композицией, описанной в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации доза совместно вводимого фармацевтического агента является такой же, как доза, которая была бы введена в случае отдельного введения совместно вводимого фармацевтического агента. В некоторых вариантах реализации доза совместно вводимого фармацевтического агента ниже, чем доза, которая была бы введена в случае отдельного введения совместно вводимого фармацевтического агента. В некоторых вариантах реализации доза совместно вводимого фармацевтического агента выше, чем доза, которая была бы введена в случае отдельного введения совместно вводимого фармацевтического агента.
В некоторых вариантах реализации совместное введение второго соединения усиливает эффект первого соединения, так что указанное совместное введение соединений приводит к получению более высокого эффекта, чем эффект от введения только первого соединения. В других вариантах реализации совместное введение приводит к получению эффектов, которые являются аддитивными для эффектов указанных соединений при введении по отдельности. В некоторых вариантах реализации совместное введение приводит к получению эффектов, которые являются сверхаддитивными для эффектов указанных соединений при введении по отдельности. В некоторых вариантах реализации первое соединение представляет собой антисмысловое соединение. В некоторых вариантах реализации второе соединение представляет собой антисмысловое соединение.
Некоторые композиции сравнения
В некоторых вариантах реализации соединения, описанные в настоящем документе, являются более переносимыми, чем ISIS 576816, ISIS 576974, ISIS 577061, ISIS 577065 и/или ISIS 577083. ISIS 576816, ISIS 576974, ISIS 577061, ISIS 577065 и ISIS 577083 были выбраны в качестве соединений сравнения, поскольку они демонстрируют высокие уровни дозозависимого снижения мРНК C9ORF72 в различных исследованиях, описанных в WO2014/062691. Таким образом, ISIS 576816, ISIS 576974, ISIS 577061, ISIS 577065 и ISIS 577083 предположительно являются высокоэффективными и сильнодействующими соединениями. Кроме того, ISIS 577065, ISIS 577056 и ISIS 576816, описанные в WO 2014/062691, являются структурно родственными соединениям, описанным в настоящем документе. Например, ISIS 577065 имеет 16 нуклеиновых оснований, перекрывающихся с ISIS 801287; ISIS 577056 имеет 16 нуклеиновых оснований, перекрывающихся с ISIS 806679; ISIS 576816 имеет 18 нуклеиновых оснований, перекрывающихся с ISIS 802473 (18-мер); и ISIS 576816 имеет 18 нуклеиновых оснований, перекрывающихся с ISIS 802459.
В некоторых вариантах реализации ISIS 576816, 5-10-5 МОЕ гэпмер, имеющий последовательность (от 5' к 3') GCCTTACTCTAGGACCAAGA (включенную в настоящий документ как SEQ ID NO: 21), где каждая межнуклеозидная связь представляет собой тиофосфатную связь, каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин, и каждый из нуклеозидов 1-5 и 16-20 содержит 2'-O-метоксиэтильную группу, который ранее был описан в WO2014/062691, включенной в настоящий документ посредством ссылки, представляет собой соединение сравнения. ISIS 576816 обеспечивает среднюю оценку FOB 7,00 в испытании острой переносимости у мышей (см. пример 3, представленный ниже). Некоторые соединения, описанные в настоящем документе, обеспечивают более низкую оценку FOB в аналогичном испытании острой переносимости у мышей (см. пример 2, представленный ниже), включая ISIS 801287, ISIS 806679, ISIS 802473 и ISIS 802459. Таким образом, некоторые соединения, описанные в настоящем документе, являются более переносимыми, чем соединение сравнения ISIS 576816.
В некоторых вариантах реализации ISIS 576974, 5-10-5 МОЕ гэпмер, имеющий последовательность (от 5' к 3') GGGACACTACAAGGTAGTAT (включенную в настоящий документ как SEQ ID NO: 56), где каждая межнуклеозидная связь представляет собой тиофосфатную связь, каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин, и каждый из нуклеозидов 1-5 и 16-20 содержит 2'-O-метоксиэтильную группу, который ранее был описан в WO 2014/062691, включенной в настоящий документ посредством ссылки, представляет собой соединение сравнения. ISIS 576974 обеспечивает среднюю оценку FOB 5,67 в испытании острой переносимости у мышей (см. пример 3, представленный ниже). Некоторые соединения, описанные в настоящем документе, обеспечивают более низкую оценку FOB в аналогичном испытании острой переносимости у мышей (см. пример 2, представленный ниже), включая ISIS 801287, ISIS 806679, ISIS 802473 и ISIS 802459. Таким образом, некоторые соединения, описанные в настоящем документе, являются более переносимыми, чем соединение сравнения ISIS 576974.
В некоторых вариантах реализации ISIS 577061, 5-10-5 МОЕ гэпмер, имеющий последовательность (от 5' к 3') TACAGGCTGCGGTTGTTTCC (включенную в настоящий документ как SEQ ID NO: 57), где каждая межнуклеозидная связь представляет собой тиофосфатную связь, каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин, и каждый из нуклеозидов 1-5 и 16-20 содержит 2'-O-метоксиэтильную группу, который ранее был описан в WO 2014/062691, включенной в настоящий документ посредством ссылки, представляет собой соединение сравнения. ISIS 577061 обеспечивает среднюю оценку FOB 7,00 в испытании острой переносимости у мышей (см. пример 3, представленный ниже). Некоторые соединения, описанные в настоящем документе, обеспечивают более низкую оценку FOB в аналогичном испытании острой переносимости у мышей (см. пример 2, представленный ниже), включая ISIS 801287, ISIS 806679, ISIS 802473 и ISIS 802459. Таким образом, некоторые соединения, описанные в настоящем документе, являются более переносимыми, чем соединение сравнения ISIS 577061.
В некоторых вариантах реализации ISIS 577065, 5-10-5 МОЕ гэпмер, имеющий последовательность (от 5' к 3') CCCGGCCCCTAGCGCGCGAC (включенную в настоящий документ как SEQ ID NO: 58), где каждая межнуклеозидная связь представляет собой тиофосфатную связь, каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин, и каждый из нуклеозидов 1-5 и 16-20 содержит 2'-O-метоксиэтильную группу, который ранее был описан в WO 2014/062691, включенной в настоящий документ посредством ссылки, представляет собой соединение сравнения. ISIS 577065 обеспечивает среднюю оценку FOB 6,00 в испытании острой переносимости у мышей (см. пример 3, представленный ниже). Некоторые соединения, описанные в настоящем документе, обеспечивают более низкую оценку FOB в аналогичном испытании острой переносимости у мышей (см. пример 2, представленный ниже), включая ISIS 801287, ISIS 806679, ISIS 802473 и ISIS 802459. Таким образом, некоторые соединения, описанные в настоящем документе, являются более переносимыми, чем соединение сравнения ISIS 577065.
В некоторых вариантах реализации ISIS 577083, 5-10-5 МОЕ гэпмер, имеющий последовательность (от 5' к 3') GGTAACTTCAAACTCTTGGG (включенную в настоящий документ как SEQ ID NO: 59), где каждая межнуклеозидная связь представляет собой тиофосфатную связь, каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин, и каждый из нуклеозидов 1-5 и 16-20 содержит 2'-O-метоксиэтильную группу, который ранее был описан в WO 2014/062691, включенной в настоящий документ посредством ссылки, представляет собой соединение сравнения. ISIS 577083 обеспечивает среднюю оценку FOB 7,00 в испытании острой переносимости у мышей (см. пример 3, представленный ниже). Некоторые соединения, описанные в настоящем документе, обеспечивают более низкую оценку FOB в аналогичном испытании острой переносимости у мышей (см. пример 2, представленный ниже), включая ISIS 801287, ISIS 806679, ISIS 802473 и ISIS 802459. Таким образом, некоторые соединения, описанные в настоящем документе, являются более переносимыми, чем соединение сравнения ISIS 577083.
В некоторых вариантах реализации ISIS 577056, 5-10-5 МОЕ гэпмер, имеющий последовательность (от 5' к 3') AATCTTTATCAGGTCTTTTC (включенную в настоящий документ как SEQ ID NO: 60), где каждая межнуклеозидная связь представляет собой тиофосфатную связь, каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин, и каждый из нуклеозидов 1-5 и 16-20 содержит 2'-O-метоксиэтильную группу, который ранее был описан в WO 2014/062691, включенной в настоящий документ посредством ссылки, представляет собой соединение сравнения. ISIS 577056 обеспечивает среднюю оценку FOB 6,5 в испытании острой переносимости у мышей (см. пример 3, представленный ниже). Некоторые соединения, описанные в настоящем документе, обеспечивают более низкую оценку FOB в аналогичном испытании острой переносимости у мышей (см. пример 2, представленный ниже), включая ISIS 801287, ISIS 806679, ISIS 802473 и ISIS 802459. Таким образом, некоторые соединения, описанные в настоящем документе, являются более переносимыми, чем соединение сравнения ISIS 577056.
Некоторые терапевтические средства для лечения людей
Антисмысловые олигонуклеотиды к человеческому C9ORF72, описанные в настоящем документе, представляют собой терапевтические средства для лечения людей. Были изучены различные параметры активности, эффективности и/или переносимости. Такие параметры включают in vitro ингибирование экспрессии общей РНК C9ORF72, in vitro ингибирование экспрессии патоген-ассоциированного варианта РНК C9ORF72, in vitro эффект дозы (IC50), in vivo ингибирование общей или патогенной РНК и/или белка у трансгенных животных, несущих трансген человеческого C9ORF72 в релевантных тканях (например, головном мозге и/или спинном мозге), переносимость у мышей, переносимость у крыс и/или переносимость у приматов. Маркеры переносимости, которые могут быть измерены, включают химические параметры крови и плазмы, химические параметры СМЖ, массу тела и органов, общие наблюдения и/или поведенческие тесты, и/или биохимические маркеры, такие как GFAP и/или AIF1. Может быть измерена острая или долговременная переносимость.
Некоторые композиции
1. ISIS 801287
В некоторых вариантах реализации ISIS 801287 характеризуется как 4-8-6 МОЕ гэпмер, имеющий последовательность (от 5' к 3') GCCCCTAGCGCGCGACTC (включенную в настоящий документ как SEQ ID NO: 33), где каждый из нуклеозидов 1-4 и 13-18 представляет собой 2'-O-метоксиэтилрибозный модифицированный нуклеозид, и каждый из нуклеозидов 5-12 представляет собой 2'-дезоксинуклеозид, где межнуклеозидные связи между нуклеозидами 2 и 3, 3 и 4, 13 и 14, 14 и 15, и 15 и 16 представляют собой фосфодиэфирные связи, и межнуклеозидные связи между нуклеозидами 1 и 2, 4 и 5, 5 и 6, 6 и 7, 7 и 8, 8 и 9, 9 и 10, 10 и 11, 11 и 12, 12 и 13, 16 и 17, и 17 и 18 представляют собой тиофосфатные связи, и где каждый цитозин представляет собой 5'-метилцитозин.
В некоторых вариантах реализации ISIS 801287 описан следующей химической записью: Ges mCeo mCeo mCes mCds Tds Ads Gds mCds Gds mCds Gds mCeo Geo Aeo mCes Tes mCe; где
A = аденин,
mC = 5'-метилцитозин
G = гуанин,
T = тимин,
e = 2'-O-метоксиэтилрибозный модифицированный сахар,
d = 2'-дезоксирибозный сахар.
s = тиофосфатная межнуклеозидная связь, и
о = фосфодиэфирная межнуклеозидная связь.
В некоторых вариантах реализации ISIS 801287 описан следующей химической структурой, или его соль:
В некоторых вариантах реализации натриевая соль ISIS 801287 описана следующей химической структурой:
2. ISIS 806679
В некоторых вариантах реализации ISIS 806679 характеризуется как 6-10-4 МОЕ гэпмер, имеющий последовательность (от 5' к 3') GGTTAATCTTTATCAGGTCT (включенную в настоящий документ как SEQ ID NO: 49), где каждый из нуклеозидов 1-6 и 17-20 представляет собой 2'-O-метоксиэтилрибозный модифицированный нуклеозид, и каждый из нуклеозидов 7-16 представляет собой 2'-дезоксинуклеозид, где межнуклеозидные связи между нуклеозидами 2 и 3, 3 и 4, 4 и 5, 5 и 6, 6 и 7, и 17 и 18 представляют собой фосфодиэфирные связи, и межнуклеозидные связи между нуклеозидами 1 и 2, 7 и 8, 8 и 9, 9 и 10, 10 и 11, 11 и 12, 12 и 13, 13 и 14, 14 и 15, 15 и 16, 16 и 17, 18 и 19, и 19 и 20 представляют собой тиофосфатные связи, и где каждый цитозин представляет собой 5'-метилцитозин.
В некоторых вариантах реализации ISIS 806679 описан следующей химической записью: Ges Geo Тео Тео Aeo Aeo Tds mCds Tds Tds Tds Ads Tds mCds Ads Gds Geo Tes mCes Те; где
A = аденин,
mC = 5'-метилцитозин
G = гуанин,
T = тимин,
е = 2'-O-метоксиэтилрибозный модифицированный сахар,
d = 2'-дезоксирибозный сахар.
s = тиофосфатная межнуклеозидная связь, и
о = фосфодиэфирная межнуклеозидная связь.
В некоторых вариантах реализации ISIS 806679 описан следующей химической структурой, или его соль:
В некоторых вариантах реализации натриевая соль ISIS 806679 описана следующей химической структурой:
3. ISIS 802473
В некоторых вариантах реализации ISIS 802473 характеризуется как 4-8-6 МОЕ гэпмер, имеющий последовательность (от 5' к 3') GCCTTACTCTAGGACCAA (включенную в настоящий документ как SEQ ID NO: 47), где каждый из нуклеозидов 1-4 и 13-18 представляет собой 2'-O-метоксиэтилрибозный модифицированный нуклеозид, и каждый из нуклеозидов 5-12 представляет собой 2'-дезоксинуклеозид, где межнуклеозидные связи между нуклеозидами 2 и 3, 3 и 4, 13 и 14, 14 и 15, и 15 и 16 представляют собой фосфодиэфирные связи, и межнуклеозидные связи между нуклеозидами 1 и 2, 4 и 5, 5 и 6, 6 и 7, 7 и 8, 8 и 9, 9 и 10, 10 и 11, 11 и 12, 12 и 13, 16 и 17, и 17 и 18 представляют собой тиофосфатные связи, и где каждый цитозин представляет собой 5'-метилцитозин.
В некоторых вариантах реализации ISIS 802473 описан следующей химической записью: Ges mCeo mCeo Tes Tds Ads mCds Tds mCds Tds Ads Gds Geo Aeo mCeo mCes Aes Ae; где
A = аденин,
mC = 5'-метилцитозин
G = гуанин,
T = тимин,
e = 2'-O-метоксиэтилрибозный модифицированный сахар,
d = 2'-дезоксирибозньш сахар.
s = тиофосфатная межнуклеозидная связь, и
о = фосфодиэфирная межнуклеозидная связь.
В некоторых вариантах реализации ISIS 802473 описан следующей химической структурой, или его соль:
В некоторых вариантах реализации натриевая соль ISIS 802473 описана следующей химической структурой:
4. ISIS 802459
В некоторых вариантах реализации ISIS 802459 характеризуется как 3-10-7 МОЕ гэпмер, имеющий последовательность (от 5' к 3') GCCTTACTCTAGGACCAAGA (включенную в настоящий документ как SEQ ID NO: 21), где каждый из нуклеозидов 1-3 и 14-20 представляет собой 2'-O-метоксиэтилрибозный модифицированный нуклеозид, и каждый из нуклеозидов 4-13 представляет собой 2'-дезоксинуклеозид, где межнуклеозидные связи между нуклеозидами 2 и 3, 3 и 4, 14 и 15, 15 и 16, 16 и 17, и 17 и 18 представляют собой фосфодиэфирные связи, и межнуклеозидные связи между нуклеозидами 1 и 2, 4 и 5, 5 и 6, 6 и 7, 7 и 8, 8 и 9, 9 и 10, 10 и 11, 11 и 12, 12 и 13, 13 и 14, 18 и 19, и 19 и 20 представляют собой тиофосфатные связи, и где каждый цитозин представляет собой 5'-метилцитозин.
В некоторых вариантах реализации ISIS 802459 описан следующей химической записью: Ges mCeo mCeo Tds Tds Ads mCds Tds mCds Tds Ads Gds Gds Aeo mCeo mCeo Aeo Aes Ges Ae; где
A = аденин,
mC = 5'-метилцитозин
G = гуанин,
T = тимин,
e = 2'-O-метоксиэтилрибозный модифицированный сахар,
d = 2'-дезоксирибозный сахар.
s = тиофосфатная межнуклеозидная связь, и
о = фосфодиэфирная межнуклеозидная связь.
В некоторых вариантах реализации ISIS 802459 описан следующей химической структурой, или его соль:
В некоторых вариантах реализации натриевая соль ISIS 802459 описана следующей химической структурой:
ПРИМЕРЫ
Неограничивающее описание и включение посредством ссылки
Хотя некоторые соединения, композиции и способы, описанные в данном документе, были описаны в соответствии с некоторыми вариантами реализации изобретения, следующие примеры служат только для иллюстрации соединений, описанных в настоящем документе, и не подразумевают его ограничения. Каждая ссылка, упоминаемая в настоящей заявке, включена в данный документ посредством ссылки в полном объеме.
Пример 1: Антисмысловые олигонуклеотиды, направленные на человеческий C9ORF72
Антисмысловые олигонуклеотиды в представленной ниже таблице были сконструированы как МОЕ гэпмеры. Центральный сегмент гэп каждого гэпмера содержит 2'-дезоксинуклеозиды и окружен сегментами крыльев с 5' конца и 3' конца, содержащими нуклеозиды, каждый из которых содержит группу 2'-МОЕ. Конкретный мотив каждого гэпмера указан в представленной ниже таблице, обозначенный тремя числами, разделенными дефисами. Числа означают количество нуклеозидов в 5'-крыле, гэп и 3'-крыле, соответственно. Все остатки цитозина в каждом олигонуклеотиде представляют собой 5-метилцитозины. Межнуклеозидные связи в гэпмерах представляют собой смешанные тиофосфатные и фосфодиэфирные связи. Межнуклеозидные связи для каждого гэпмера представлены в колонке «Связь», где «о» означает фосфодиэфирную связь, и «s» означает тиофосфатную связь.
Каждый антисмысловой олигонуклеотид, перечисленный в следующей таблице, нацелен на человеческую геномную последовательность C9ORF72, обозначенную в настоящем документе как SEQ ID NO: 2 (комплемент номера доступа GENBANKNT_008413.18, усеченной по нуклеозидам с 27535000 по 27565000). «Сайт инициации» обозначает самый крайний 5' нуклеозид, на который направлен гэпмер в геномной последовательности человека. «Сайт терминации» обозначает самый крайний 3' нуклеозид, на который направлен гэпмер в геномной последовательности человека.
Пример 2: Переносимость антисмысловых олигонуклеотидов, направленных на человеческий C9ORF72, у мышей
Антисмысловые олигонуклеотиды, описанные выше, испытывали на мышах для оценки переносимости олигонуклеотидов. Мышам С57/В16 дикого типа вводили однократную ICV дозу 700 мкг антисмыслового олигонуклеотида, указанного в следующей таблице. Каждая экспериментальная группа состояла из 4 мышей. Через 3 часа после инъекции каждую мышь оценивали по 7 различным критериям. 7 критериев представляют собой: (1) мышь была бодрой, бдительной и отзывчивой; (2) мышь стояла или сгибалась без раздражителя; (3) мышь выполняла любое движение без раздражителя; (4) мышь демонстрировала движение вперед после того, как ее подняли; (5) мышь демонстрировала любое движение после того, как ее подняли; (6) мышь реагировала на щипок за хвост; (7) ровное дыхание. Для каждого из 7 различных критериев, каждой мыши начисляли балл 0, если она отвечала критерию, или 1 если она не отвечала ему. После оценки всех 7 критериев суммировали промежуточные оценки для каждой мыши, а затем усредняли для каждой группы. Например, если мышь была бодрой, бдительной и отзывчивой через 3 часа после ICV введения дозы 700 мкг, и соответствовала всем остальным критериям, она получала суммарный балл 0. Если другая мышь не была бодрой, бдительной и отзывчивой через 3 часа после ICV введения дозы 700 мкг, но соответствовала всем остальным критериям, она получала суммарный балл 1. Результаты представлены в виде среднего балла по каждой экспериментальной группе.
Пример 3: Переносимость олигонуклеотидов из WO 2014/062691
Олигонуклеотиды, описанные в WO 2014/062691, испытывали в исследовании острой переносимости на мышах. Группы по 3 мыши С57/В16 дикого типа лечили и анализировали так, как описано в примере 2. Испытанные олигонуклеотиды включали те, которые перечислены в следующей таблице, которые представляют собой 5-10-5 МОЕ гэпмеры с полностью тиофосфатным скелетом, и каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин. Представлены сайты инициации и терминации SEQ ID NO: 2, на которую направлен каждый олигонуклеотид. В следующей таблице результаты представлены в виде среднего балла по каждой экспериментальной группе. Полученные результаты демонстрируют, что ISIS 576816, ISIS 576974, ISIS 577061, ISIS 577065, ISIS 577083 и ISIS 577056 переносятся неудовлетворительно.
Пример 4: Антисмысловое ингибирование варианта мРНК человеческого C9ORF72 в клетках HepG2
Антисмысловые олигонуклеотиды, описанные выше, испытывали на их влияние на мРНК C9ORF72 in vitro. Культивированные клетки HepG2 с плотностью 20000 клеток на лунку обрабатывали электропорацией с антисмысловым олигонуклеотидом. После периода обработки длительностью около 24 часов, РНК выделяли из клеток и уровни мРНК C9ORF72 измеряли методом количественной ПЦР в реальном времени. Использовали набор праймеров и зондов человека RTS3905 (прямая последовательность GGGTCTAGCAAGAGCAGGTG, обозначенная в настоящем документе как SEQ ID NO: 12; обратная последовательность GTCTTGGCAACAGCTGGAGAT, обозначенная в настоящем документе как SEQ ID NO: 13; последовательность зонда TGATGTCGACTCTTTGCCCACCGC, обозначенная в настоящем документе как SEQ ID NO: 14 - набор праймеров и зондов TAQ-man). RTS3905 обеспечивает обнаружение варианта мРНК (например, NH_001256054.1), процессированный из варианта пре-мРНК, содержащего гексануклеотидный повтор. Вариант мРНК, процессированный из варианта пре-мРНК, содержащий гексануклеотидный повтор, в настоящем документе представляет собой «патоген-ассоциированный вариант мРНК C9ORF72». Пре-мРНК содержит гексануклеотидный повтор, если транскрипция пре-мРНК начинается в области от сайта инициации экзона 1А к сайту инициации экзона 1 В (обычно с 1107 по 1520 нуклеотиды геномной последовательности: SEQ ID NO: 2, комплемент номера доступа GENBANKNT_008413.18, усеченной по нуклеозидам с 27535000 по 2756500. Следовательно, олигонуклеотиды, сконструированные в данной области, селективно направлены на вариант пре-мРНК, содержащий гексануклеотидный повтор. RTS3905 обеспечивает возможность измерения продукта мРНК (т.е. патоген-ассоциированного варианта мРНК C9ORF72) варианта пре-мРНК, содержащего гексануклеотидный повтор, и, следовательно, обеспечивает возможность измерения снижения варианта пре-мРНК, содержащего гексануклеотидный повтор. Уровни патоген-ассоциированного варианта мРНК C9ORF72 нормализовали к общему содержанию РНК в клетке по результатам измерения с помощью RIBOGREEN, затем нормализованные уровни варианта мРНК сравнивали с аналогичным показателем в клетках, не обработанных антисмысловым олигонуклеотидом.
Пример 5: Дозозависимое антисмысловое ингибирование варианта мРНК человеческого C9ORF72

50
Антисмысловые олигонуклеотиды, описанные выше, испытывали в различных дозах на клетках HepG2. Клетки помещали на планшет с плотностью 20000 клеток на лунку и обрабатывали электропорацией с антисмысловым олигонуклеотидом. После периода обработки длительностью около 16 часов или 24 часов, РНК выделяли из клеток и уровни мРНК C9ORF72 измеряли методом количественной ПЦР в реальном времени. Для измерения патоген-ассоциированного варианта мРНК C9ORF72 использовали набор праймеров и зондов RTS3905 человеческого C9ORF72. Уровни патоген-ассоциированного варианта мРНК C9ORF72 корректировали в соответствии с общим содержанием РНК, измеренным с помощью RIBOGREEN. Полумаксимальную ингибирующую концентрацию (IC) каждого олигонуклеотида рассчитывали на основании ингибирования уровней мРНК варианта, наблюдаемого для каждой отдельной дозы антисмыслового олигонуклеотида.
Пример 6: Антисмысловое ингибирование C9ORF72 кросс-реактивными в отношении человека и резуса антисмысловыми олигонуклеотидами в клетках LLC-МK2
Антисмысловые олигонуклеотиды, описанные выше, которые являются полностью кросс-реактивными с нуклеиновой кислотой C9ORF72 резуса, испытывали на их влияние на мРНК C9ORF72 резуса in vitro. Культивированные клетки LLC-MK2 резуса с плотностью 20000 клеток на лунку обрабатывали электропорацией с антисмысловым олигонуклеотидом. После периода обработки длительностью около 24 часов, РНК выделяли из клеток и уровни мРНК C9ORF72 измеряли методом количественной ПЦР в реальном времени. Использовали набор праймеров и зондов RTS3750 (прямая последовательность TGTGACAGTTGGAATGCAGTGA, обозначенная в настоящем документе как SEQ ID NO: 15; обратная последовательность GCCACTTAAAGCAATCTCTGTCTTG, обозначенная в настоящем документе как SEQ ID NO: 16; последовательность зонда TCGACTCTTTGCCCACCGCCA, обозначенная в настоящем документе как SEQ ID NO: 17 - набор праймеров и зондов TAQ-man) для измерения уровней общей мРНК C9ORF72. RTS3750 нацелен на экзон 2 транскриптов мРНК и, следовательно, обеспечивает возможность измерения всех транскриптов мРНК. Уровни мРНК C9ORF72 корректировали в соответствии с общим содержанием РНК, измеренным с помощью RIBOGREEN, затем нормализованные уровни варианта мРНК сравнивали с аналогичным показателем в клетках, не обработанных антисмысловым олигонуклеотидом.
Пример 7: Дозозависимое антисмысловое ингибирование мРНК человеческого C9ORF72 в LLC-MK2
Антисмысловые олигонуклеотиды, описанные выше, испытывали в различных дозах на клетках LLC-MK2. Клетки помещали на планшет с плотностью 20000 клеток на лунку и обрабатывали электропорацией с антисмысловым олигонуклеотидом. После периода обработки длительностью около 16 часов или 24 часов, РНК выделяли из клеток и уровни мРНК C9ORF72 измеряли методом количественной ПЦР в реальном времени. Использовали набор праймеров и зондов RTS3750 для измерения уровней общей мРНК C9ORF72. Уровни мРНК C9ORF72 корректировали в соответствии с общим содержанием РНК, измеренным с помощью RIBOGREEN, затем нормализованные уровни варианта мРНК сравнивали с аналогичным показателем в клетках, не обработанных антисмысловым олигонуклеотидом.
Пример 8: Антисмысловое ингибирование мРНК человеческого C9ORF72 в модели трансгенных мышей
Антисмысловые олигонуклеотиды, описанные выше, испытывали в двух трансгенных линиях мышей ВАС, обозначенных в настоящем документе как С9В41 и С9В183, каждая из которых экспрессирует усеченный человеческий ген C9ORF72, содержащий экзоны 1-5. Усеченные гены C9ORF72 в мышиных линиях С9В41 и С9В183 содержат 110 и 450 гексануклеотидных повторов, соответственно. Каждой мыши в каждой экспериментальной группе вводили 350 мкг антисмыслового олигонуклеотида, затем анализировали уровни экспрессии РНК человеческого C9ORF72 с помощью ОТ-ПЦР. Определяли также реакцию на дозу.
Пример 9: Антисмысловое ингибирование мРНК C9ORF72 в фибробластах пациента
50
50
Антисмысловые олигонуклеотиды, описанные выше, испытывали на их влияние на мРНК C9ORF72 in vitro. Антисмысловые олигонуклеотиды, перечисленные в представленной ниже таблице, добавляли на планшет с последующим добавлением фибробластов пациента F09-152 с плотностью 20000 клеток на лунку. Конечные концентрации антисмысловых олигонуклеотидов после добавления клеток указаны в следующей таблице. Через 30 секунд встряхивания клетки обрабатывали электропорацией, затем переносили в культуральный планшет с покрытием Primaria. Через 16 часов выделяли РНК из клеток и измеряли уровни общей мРНК C9ORF72 (т.е. мРНК, начинающейся с экзона 1А, и мРНК, начинающейся с экзона 1В) и уровни патогенной ассоциированной мРНК (см. пример 4), с помощью ОТ-кПЦР. Использовали набор праймеров и зондов человека RTS 3750 (см. пример 6) и RTS3905 (см. пример 4) для определения общей мРНК C9ORF72 и патоген-ассоциированной мРНК C9ORF72, соответственно. Уровни общей мРНК C9ORF72 и патоген-ассоциированной мРНК C9ORF72 нормализовали к общему содержанию РНК в клетке, измеренному с помощью RIBOGREEN, затем нормализованные уровни мРНК сравнивали с аналогичным показателем в клетках, не обработанных антисмысловым олигонуклеотидом. Результаты представлены в следующей таблице. Запись «н.о.« означает, что показатель не определяли. Значения IC, указанные как «н. о.», не определяли, поскольку мишень не была в достаточной степени ингибирована для определения IC. Результаты демонстрируют, что все олигонуклеотиды, перечисленные ниже, ингибируют патоген-ассоциированный вариант мРНК C9ORF72. Олигонуклеотиды, которые специфически не нацелены на повторяющийся вариант пре-мРНК, ингибировали патоген-ассоциированную мРНК C9ORF72 и общую мРНК C9ORF72. Олигонуклеотиды, которые специфически нацелены на повторяющийся вариант пре-мРНК, селективно ингибировали патоген-ассоциированную мРНК C9ORF72.
Пример 10: Антисмысловое ингибирование мРНК человеческого C9ORF72 в модели трансгенных мышей
Антисмысловые олигонуклеотиды, описанные выше, испытывали в трансгенной линии мышей ВАС С9В41 (см. пример 8), которая экспрессирует человеческий ген C9ORF72, содержащий область промотора в экзоне 5 и 110 гексануклеотидных повторов. Каждая экспериментальная группа состояла из 2-3 мышей. Каждой мыши вводили однократную ICVB дозу 350 мкг антисмыслового олигонуклеотида, указанного в следующей таблице, или PBS. Через две недели мышей усыпляли и анализировали уровни экспрессии человеческого патоген-ассоциированного варианта мРНК C9ORF72 и/или общей мРНК C9ORF72 человека с помощью ОТК-кПЦР, как описано в примере 9. Анализ уровней патоген-ассоциированного варианта мРНК C9ORF72 не проводили для олигонуклеотидов, которые специфически не нацелены на повторяющийся вариант пре-мРНК C9ORF72. Результаты в представленных ниже таблицах демонстрируют средние процентные нормализованные уровни мРНК C9ORF72 человека относительно нормализованного среднего значения для группы, обработанной PBS.
Пример 11: Дозозависимое антисмысловое ингибирование мРНК человеческого C9ORF72 в модели трансгенных мышей
Антисмысловые олигонуклеотиды, описанные выше, испытывали в двух трансгенных линиях мышей ВАС, С9В41 и С9В183, каждая из которых экспрессирует усеченный человеческий ген C9ORF72, содержащий экзоны 1-5. Усеченные гены C9ORF72 в мышиных линиях С9В41 и С9В183 содержат 110 и 450 гексануклеотидных повторов, соответственно (см. пример 8). Каждая экспериментальная группа состояла из 2-4 мышей. Каждой мыши вводили однократную ICVB дозу 30 мкг, 100 мкг, 300 мкг или 700 мкг антисмыслового олигонуклеотида, указанного в следующей таблице, или PBS. Через две недели мышей усыпляли и анализировали уровни экспрессии человеческого патоген-ассоциированного варианта мРНК C9ORF72 и/или общей мРНК C9ORF72 человека с помощью ОТК-кПЦР, как описано в примере 9. Результаты в представленных ниже таблицах демонстрируют средние процентные нормализованные уровни мРНК C9ORF72 человека относительно нормализованного среднего значения для группы, обработанной PBS. Значение 100 или более означает, что антисмысловой олигонуклеотид не снижает мРНК или увеличивает количество мРНК.
Пример 12: Переносимость антисмысловых олигонуклеотидов, направленных на человеческий C9Orf72, у мышей
Мышам С57/В16 дикого типа вводили однократную ICV дозу 700 мкг антисмыслового олигонуклеотида, указанного в следующей таблице, как описано в примере 2. Каждая экспериментальная группа состояла из 4 мышей. Через 8 недель после инъекции мышей оценивали по 7 различным критериям. Критерии представляют собой: (1) мышь была бодрой, бдительной и отзывчивой; (2) мышь стояла или сгибалась без раздражителя; (3) мышь выполняла любое движение без раздражителя; (4) мышь демонстрировала движение вперед после того, как ее подняли; (5) мышь демонстрировала любое движение после того, как ее подняли; (6) мышь реагировала на щипок за хвост; (7) ровное дыхание. Для каждого из 7 критериев, каждой мыши начисляли балл 0, если она отвечала критерию, и 1 если она не отвечала ему. После оценки всех 7 критериев суммировали промежуточные оценки для каждой мыши, а затем усредняли для каждой экспериментальной группы. Результаты представлены в следующей таблице.
Животных усыпляли спустя 8 недель. У каждого животного извлекали кору головного мозга и спинной мозг и проводили ОТ-ПЦР. Определяли уровни экспрессии аллогенного воспалительного фактора (AIF1) как меру воспаления. Определяли также уровни экспрессии глиофибриллярного кислого белка (GFAP) как меру активации глиальных клеток. Результаты, нормализованные Gpadh, представлены относительно контроля с PBS (1,0) в следующей таблице. «Н.о.» означает, что данные отсутствуют, поскольку эксперимент не проводили. Звездочка означает, что соответствующий результат является средним для 1-3 мышей.
Пример 13: Переносимость антисмысловых олигонуклеотидов, направленных на человеческий C9Orf72, у крыс
Крысы Спрага-Доули разделяли на группы по 4 или 6 крыс. Каждой крысе в каждой группе крыс вводили однократную интратекальную (IT) дозу 3 мг олигонуклеотида, указанного в следующей таблице. Через 3 часа и через 8 недель после IT дозы у каждой крысы оценивали движение 7 различных частей тела. 7 частей тела представляют собой (1) хвост крысы; (2) положение задней части тела крысы; (3) задние конечности крысы; (4) задние лапы крысы; (5) передние лапы крысы; (6) положение передней части тела крысы; (7) голова крысы. Для каждой из 7 различных частей тела крысы, каждой крысе начислялся балл 0, если часть тела двигалась, или 1, если она была парализована. После оценки всех 7 частей тела суммировали промежуточные оценки для каждой крысы, а затем усредняли для каждой группы. Например, если у крысы хвост, голова и все остальные оцениваемые части тела двигались через 3 часа после IT дозы 3 мг, она получала суммарный балл 0. Например, если у другой крысы хвост не двигался через 3 часа после IT дозы 3 мг, но все остальные оцениваемые части тела двигались, она получала суммарный балл 1. Крысы, которым вводили физраствор, как правило, получали 0 баллов. Баллы в верхней части диапазона свидетельствуют об острой токсичности. Результаты представлены в следующей таблице как средний балл для каждой экспериментальной группы.
Животных усыпляли спустя 8 недель. У каждого животного извлекали кору головного мозга и спинной мозг и проводили ОТ-ПЦР. Определяли уровни экспрессии AIF1 как меру воспаления. Определяли также уровни экспрессии GFAP как меру активации глиальных клеток. Звездочка означает, что соответствующий результат является средним для 2-3 мышей. Результаты, нормализованные по Gapdh, представлены относительно контроля с PBS (1,0) в следующей таблице.
Пример 14: Переносимость антисмысловых олигонуклеотидов, направленных на человеческий C9ORF72, у приматов, не являющихся человеком
Самкам яванских макак (2-6 кг) вводили 3 дозы по 35 мг антисмыслового олигонуклеотида на 1, 14 и 28 день посредством интратекальной болюсной инъекции (1 мл медленного болюса, затем 0,25 мл с усилием). Каждая экспериментальная группа содержала четыре обезьяны. Через две недели после последней дозы животных усыпляли и проводили ОТ-ПЦР на различных тканях ЦНС. Определяли уровни экспрессии AIF1 как меру воспаления и уровни экспрессии GFAP как меру активации глиальных клеток. В следующей таблице представлены результаты, нормализованные по GADPH, относительно контроля с PBS (1,0) для ISIS №801287, 802459 и 806679.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  ИОНИС ФАРМАСЬЮТИКАЛЗ, ИНК.
<120>  КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ МОДУЛИРОВАНИЯ ЭКСПРЕССИИ C9ORF72
<130>  BIOL0269WO
<150>  62/148,691
<151>  2015-04-16
<150>  62/232,941
<151>  2015-09-25
<150>  62/239,400
<151>  2015-10-09
<160>  60
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  3339
<212>  DNA
<213>  homo sapiens
<400>  1
acgtaaccta cggtgtcccg ctaggaaaga gaggtgcgtc aaacagcgac aagttccgcc       60
cacgtaaaag atgacgcttg gtgtgtcagc cgtccctgct gcccggttgc ttctcttttg      120
ggggcggggt ctagcaagag caggtgtggg tttaggagat atctccggag catttggata      180
atgtgacagt tggaatgcag tgatgtcgac tctttgccca ccgccatctc cagctgttgc      240
caagacagag attgctttaa gtggcaaatc acctttatta gcagctactt ttgcttactg      300
ggacaatatt cttggtccta gagtaaggca catttgggct ccaaagacag aacaggtact      360
tctcagtgat ggagaaataa cttttcttgc caaccacact ctaaatggag aaatccttcg      420
aaatgcagag agtggtgcta tagatgtaaa gttttttgtc ttgtctgaaa agggagtgat      480
tattgtttca ttaatctttg atggaaactg gaatggggat cgcagcacat atggactatc      540
aattatactt ccacagacag aacttagttt ctacctccca cttcatagag tgtgtgttga      600
tagattaaca catataatcc ggaaaggaag aatatggatg cataaggaaa gacaagaaaa      660
tgtccagaag attatcttag aaggcacaga gagaatggaa gatcagggtc agagtattat      720
tccaatgctt actggagaag tgattcctgt aatggaactg ctttcatcta tgaaatcaca      780
cagtgttcct gaagaaatag atatagctga tacagtactc aatgatgatg atattggtga      840
cagctgtcat gaaggctttc ttctcaatgc catcagctca cacttgcaaa cctgtggctg      900
ttccgttgta gtaggtagca gtgcagagaa agtaaataag atagtcagaa cattatgcct      960
ttttctgact ccagcagaga gaaaatgctc caggttatgt gaagcagaat catcatttaa     1020
atatgagtca gggctctttg tacaaggcct gctaaaggat tcaactggaa gctttgtgct     1080
gcctttccgg caagtcatgt atgctccata tcccaccaca cacatagatg tggatgtcaa     1140
tactgtgaag cagatgccac cctgtcatga acatatttat aatcagcgta gatacatgag     1200
atccgagctg acagccttct ggagagccac ttcagaagaa gacatggctc aggatacgat     1260
catctacact gacgaaagct ttactcctga tttgaatatt tttcaagatg tcttacacag     1320
agacactcta gtgaaagcct tcctggatca ggtctttcag ctgaaacctg gcttatctct     1380
cagaagtact ttccttgcac agtttctact tgtccttcac agaaaagcct tgacactaat     1440
aaaatatata gaagacgata cgcagaaggg aaaaaagccc tttaaatctc ttcggaacct     1500
gaagatagac cttgatttaa cagcagaggg cgatcttaac ataataatgg ctctggctga     1560
gaaaattaaa ccaggcctac actcttttat ctttggaaga cctttctaca ctagtgtgca     1620
agaacgagat gttctaatga ctttttaaat gtgtaactta ataagcctat tccatcacaa     1680
tcatgatcgc tggtaaagta gctcagtggt gtggggaaac gttcccctgg atcatactcc     1740
agaattctgc tctcagcaat tgcagttaag taagttacac tacagttctc acaagagcct     1800
gtgaggggat gtcaggtgca tcattacatt gggtgtctct tttcctagat ttatgctttt     1860
gggatacaga cctatgttta caatataata aatattattg ctatctttta aagatataat     1920
aataggatgt aaacttgacc acaactactg tttttttgaa atacatgatt catggtttac     1980
atgtgtcaag gtgaaatctg agttggcttt tacagatagt tgactttcta tcttttggca     2040
ttctttggtg tgtagaatta ctgtaatact tctgcaatca actgaaaact agagccttta     2100
aatgatttca attccacaga aagaaagtga gcttgaacat aggatgagct ttagaaagaa     2160
aattgatcaa gcagatgttt aattggaatt gattattaga tcctactttg tggatttagt     2220
ccctgggatt cagtctgtag aaatgtctaa tagttctcta tagtccttgt tcctggtgaa     2280
ccacagttag ggtgttttgt ttattttatt gttcttgcta ttgttgatat tctatgtagt     2340
tgagctctgt aaaaggaaat tgtattttat gttttagtaa ttgttgccaa ctttttaaat     2400
taattttcat tatttttgag ccaaattgaa atgtgcacct cctgtgcctt ttttctcctt     2460
agaaaatcta attacttgga acaagttcag atttcactgg tcagtcattt tcatcttgtt     2520
ttcttcttgc taagtcttac catgtacctg ctttggcaat cattgcaact ctgagattat     2580
aaaatgcctt agagaatata ctaactaata agatcttttt ttcagaaaca gaaaatagtt     2640
ccttgagtac ttccttcttg catttctgcc tatgtttttg aagttgttgc tgtttgcctg     2700
caataggcta taaggaatag caggagaaat tttactgaag tgctgttttc ctaggtgcta     2760
ctttggcaga gctaagttat cttttgtttt cttaatgcgt ttggaccatt ttgctggcta     2820
taaaataact gattaatata attctaacac aatgttgaca ttgtagttac acaaacacaa     2880
ataaatattt tatttaaaat tctggaagta atataaaagg gaaaatatat ttataagaaa     2940
gggataaagg taatagagcc cttctgcccc ccacccacca aatttacaca acaaaatgac     3000
atgttcgaat gtgaaaggtc ataatagctt tcccatcatg aatcagaaag atgtggacag     3060
cttgatgttt tagacaacca ctgaactaga tgactgttgt actgtagctc agtcatttaa     3120
aaaatatata aatactacct tgtagtgtcc catactgtgt tttttacatg gtagattctt     3180
atttaagtgc taactggtta ttttctttgg ctggtttatt gtactgttat acagaatgta     3240
agttgtacag tgaaataagt tattaaagca tgtgtaaaca ttgttatata tcttttctcc     3300
taaatggaga attttgaata aaatatattt gaaattttg                            3339
<210>  2
<211>  30001
<212>  DNA
<213>  homo sapiens
<400>  2
caaagaaaag ggggaggttt tgttaaaaaa gagaaatgtt acatagtgct ctttgagaaa       60
attcattggc actattaagg atctgaggag ctggtgagtt tcaactggtg agtgatggtg      120
gtagataaaa ttagagctgc agcaggtcat tttagcaact attagataaa actggtctca      180
ggtcacaacg ggcagttgca gcagctggac ttggagagaa ttacactgtg ggagcagtgt      240
catttgtcct aagtgctttt ctacccccta cccccactat tttagttggg tataaaaaga      300
atgacccaat ttgtatgatc aactttcaca aagcatagaa cagtaggaaa agggtctgtt      360
tctgcagaag gtgtagacgt tgagagccat tttgtgtatt tattcctccc tttcttcctc      420
ggtgaatgat taaaacgttc tgtgtgattt ttagtgatga aaaagattaa atgctactca      480
ctgtagtaag tgccatctca cacttgcaga tcaaaaggca cacagtttaa aaaacctttg      540
tttttttaca catctgagtg gtgtaaatgc tactcatctg tagtaagtgg aatctataca      600
cctgcagacc aaaagacgca aggtttcaaa aatctttgtg ttttttacac atcaaacaga      660
atggtacgtt tttcaaaagt taaaaaaaaa caactcatcc acatattgca actagcaaaa      720
atgacattcc ccagtgtgaa aatcatgctt gagagaattc ttacatgtaa aggcaaaatt      780
gcgatgactt tgcaggggac cgtgggattc ccgcccgcag tgccggagct gtcccctacc      840
agggtttgca gtggagtttt gaatgcactt aacagtgtct tacggtaaaa acaaaatttc      900
atccaccaat tatgtgttga gcgcccactg cctaccaagc acaaacaaaa ccattcaaaa      960
ccacgaaatc gtcttcactt tctccagatc cagcagcctc ccctattaag gttcgcacac     1020
gctattgcgc caacgctcct ccagagcggg tcttaagata aaagaacagg acaagttgcc     1080
ccgccccatt tcgctagcct cgtgagaaaa cgtcatcgca catagaaaac agacagacgt     1140
aacctacggt gtcccgctag gaaagagagg tgcgtcaaac agcgacaagt tccgcccacg     1200
taaaagatga cgcttggtgt gtcagccgtc cctgctgccc ggttgcttct cttttggggg     1260
cggggtctag caagagcagg tgtgggttta ggaggtgtgt gtttttgttt ttcccaccct     1320
ctctccccac tacttgctct cacagtactc gctgagggtg aacaagaaaa gacctgataa     1380
agattaacca gaagaaaaca aggagggaaa caaccgcagc ctgtagcaag ctctggaact     1440
caggagtcgc gcgctagggg ccggggccgg ggccggggcg tggtcggggc gggcccgggg     1500
gcgggcccgg ggcggggctg cggttgcggt gcctgcgccc gcggcggcgg aggcgcaggc     1560
ggtggcgagt gggtgagtga ggaggcggca tcctggcggg tggctgtttg gggttcggct     1620
gccgggaaga ggcgcgggta gaagcggggg ctctcctcag agctcgacgc atttttactt     1680
tccctctcat ttctctgacc gaagctgggt gtcgggcttt cgcctctagc gactggtgga     1740
attgcctgca tccgggcccc gggcttcccg gcggcggcgg cggcggcggc ggcgcaggga     1800
caagggatgg ggatctggcc tcttccttgc tttcccgccc tcagtacccg agctgtctcc     1860
ttcccgggga cccgctggga gcgctgccgc tgcgggctcg agaaaaggga gcctcgggta     1920
ctgagaggcc tcgcctgggg gaaggccgga gggtgggcgg cgcgcggctt ctgcggacca     1980
agtcggggtt cgctaggaac ccgagacggt ccctgccggc gaggagatca tgcgggatga     2040
gatgggggtg tggagacgcc tgcacaattt cagcccaagc ttctagagag tggtgatgac     2100
ttgcatatga gggcagcaat gcaagtcggt gtgctcccca ttctgtggga catgacctgg     2160
ttgcttcaca gctccgagat gacacagact tgcttaaagg aagtgactat tgtgacttgg     2220
gcatcacttg actgatggta atcagttgtc taaagaagtg cacagattac atgtccgtgt     2280
gctcattggg tctatctggc cgcgttgaac accaccaggc tttgtattca gaaacaggag     2340
ggaggtcctg cactttccca ggaggggtgg ccctttcaga tgcaatcgag attgttaggc     2400
tctgggagag tagttgcctg gttgtggcag ttggtaaatt tctattcaaa cagttgccat     2460
gcaccagttg ttcacaacaa gggtacgtaa tctgtctggc attacttcta cttttgtaca     2520
aaggatcaaa aaaaaaaaag atactgttaa gatatgattt ttctcagact ttgggaaact     2580
tttaacataa tctgtgaata tcacagaaac aagactatca tataggggat attaataacc     2640
tggagtcaga atacttgaaa tacggtgtca tttgacacgg gcattgttgt caccacctct     2700
gccaaggcct gccactttag gaaaaccctg aatcagttgg aaactgctac atgctgatag     2760
tacatctgaa acaagaacga gagtaattac cacattccag attgttcact aagccagcat     2820
ttacctgctc caggaaaaaa ttacaagcac cttatgaagt tgataaaata ttttgtttgg     2880
ctatgttggc actccacaat ttgctttcag agaaacaaag taaaccaagg aggacttctg     2940
tttttcaagt ctgccctcgg gttctattct acgttaatta gatagttccc aggaggacta     3000
ggttagccta cctattgtct gagaaacttg gaactgtgag aaatggccag atagtgatat     3060
gaacttcacc ttccagtctt ccctgatgtt gaagattgag aaagtgttgt gaactttctg     3120
gtactgtaaa cagttcactg tccttgaagt ggtcctgggc agctcctgtt gtggaaagtg     3180
gacggtttag gatcctgctt ctctttgggc tgggagaaaa taaacagcat ggttacaagt     3240
attgagagcc aggttggaga aggtggctta cacctgtaat gccagagctt tgggaggcgg     3300
aggcaagagg atcacttgaa gccaggagtt caagctcaac ctgggcaacg tagaccctgt     3360
ctctacaaaa aattaaaaac ttagccgggc gtggtgatgt gcacctgtag tcctagctac     3420
ttgggaggct gaggcaggag ggtcatttga gcccaagagt ttgaagttac cgagagctat     3480
gatcctgcca gtgcattcca gcctggatga caaaacgaga ccctgtctct aaaaaacaag     3540
aagtgagggc tttatgattg tagaattttc actacaatag cagtggacca accacctttc     3600
taaataccaa tcagggaaga gatggttgat tttttaacag acgtttaaag aaaaagcaaa     3660
acctcaaact tagcactcta ctaacagttt tagcagatgt taattaatgt aatcatgtct     3720
gcatgtatgg gattatttcc agaaagtgta ttgggaaacc tctcatgaac cctgtgagca     3780
agccaccgtc tcactcaatt tgaatcttgg cttccctcaa aagactggct aatgtttggt     3840
aactctctgg agtagacagc actacatgta cgtaagatag gtacataaac aactattggt     3900
tttgagctga tttttttcag ctgcatttgc atgtatggat ttttctcacc aaagacgatg     3960
acttcaagta ttagtaaaat aattgtacag ctctcctgat tatacttctc tgtgacattt     4020
catttcccag gctatttctt ttggtaggat ttaaaactaa gcaattcagt atgatctttg     4080
tccttcattt tctttcttat tctttttgtt tgtttgtttg tttgtttttt tcttgaggca     4140
gagtctctct ctgtcgccca ggctggagtg cagtggcgcc atctcagctc attgcaacct     4200
ctgccacctc cgggttcaag agattctcct gcctcagcct cccgagtagc tgggattaca     4260
ggtgtccacc accacacccg gctaattttt tgtattttta gtagaggtgg ggtttcacca     4320
tgttggccag gctggtcttg agctcctgac ctcaggtgat ccacctgcct cggcctacca     4380
aagagctggg ataacaggtg tgacccacca tgcccggccc attttttttt tcttattctg     4440
ttaggagtga gagtgtaact agcagtataa tagttcaatt ttcacaacgt ggtaaaagtt     4500
tccctataat tcaatcagat tttgctccag ggttcagttc tgttttagga aatactttta     4560
ttttcagttt aatgatgaaa tattagagtt gtaatattgc ctttatgatt atccaccttt     4620
ttaacctaaa agaatgaaag aaaaatatgt ttgcaatata attttatggt tgtatgttaa     4680
cttaattcat tatgttggcc tccagtttgc tgttgttagt tatgacagca gtagtgtcat     4740
taccatttca attcagatta cattcctata tttgatcatt gtaaactgac tgcttacatt     4800
gtattaaaaa cagtggatat tttaaagaag ctgtacggct tatatctagt gctgtctctt     4860
aagactatta aattgataca acatatttaa aagtaaatat tacctaaatg aatttttgaa     4920
attacaaata cacgtgttaa aactgtcgtt gtgttcaacc atttctgtac atacttagag     4980
ttaactgttt tgccaggctc tgtatgccta ctcataatat gataaaagca ctcatctaat     5040
gctctgtaaa tagaagtcag tgctttccat cagactgaac tctcttgaca agatgtggat     5100
gaaattcttt aagtaaaatt gtttactttg tcatacattt acagatcaaa tgttagctcc     5160
caaagcaatc atatggcaaa gataggtata tcatagtttg cctattagct gctttgtatt     5220
gctattatta taaatagact tcacagtttt agacttgctt aggtgaaatt gcaattcttt     5280
ttactttcag tcttagataa caagtcttca attatagtac aatcacacat tgcttaggaa     5340
tgcatcatta ggcgattttg tcattatgca aacatcatag agtgtactta cacaaaccta     5400
gatagtatag cctttatgta cctaggccgt atggtatagt ctgttgctcc taggccacaa     5460
acctgtacaa ctgttactgt actgaatact atagacagtt gtaacacagt ggtaaatatt     5520
tatctaaata tatgcaaaca gagaaaaggt acagtaaaag tatggtataa aagataatgg     5580
tatacctgtg taggccactt accacgaatg gagcttgcag gactagaagt tgctctgggt     5640
gagtcagtga gtgagtggtg aattaatgtg aaggcctaga acactgtaca ccactgtaga     5700
ctataaacac agtacgctga agctacacca aatttatctt aacagttttt cttcaataaa     5760
aaattataac tttttaactt tgtaaacttt ttaatttttt aacttttaaa atacttagct     5820
tgaaacacaa atacattgta tagctataca aaaatatttt ttctttgtat ccttattcta     5880
gaagcttttt tctattttct attttaaatt ttttttttta cttgttagtc gtttttgtta     5940
aaaactaaaa cacacacact ttcacctagg catagacagg attaggatca tcagtatcac     6000
tcccttccac ctcactgcct tccacctcca catcttgtcc cactggaagg tttttagggg     6060
caataacaca catgtagctg tcacctatga taacagtgct ttctgttgaa tacctcctga     6120
aggacttgcc tgaggctgtt ttacatttaa cttaaaaaaa aaaaaagtag aaggagtgca     6180
ctctaaaata acaataaaag gcatagtata gtgaatacat aaaccagcaa tgtagtagtt     6240
tattatcaag tgttgtacac tgtaataatt gtatgtgcta tactttaaat aacttgcaaa     6300
atagtactaa gaccttatga tggttacagt gtcactaagg caatagcata ttttcaggtc     6360
cattgtaatc taatgggact accatcatat atgcagtcta ccattgactg aaacgttaca     6420
tggcacataa ctgtatttgc aagaatgatt tgttttacat taatatcaca taggatgtac     6480
ctttttagag tggtatgttt atgtggatta agatgtacaa gttgagcaag gggaccaaga     6540
gccctgggtt ctgtcttgga tgtgagcgtt tatgttcttc tcctcatgtc tgttttctca     6600
ttaaattcaa aggcttgaac gggccctatt tagcccttct gttttctacg tgttctaaat     6660
aactaaagct tttaaattct agccatttag tgtagaactc tctttgcagt gatgaaatgc     6720
tgtattggtt tcttggctag catattaaat atttttatct ttgtcttgat acttcaatgt     6780
cgttttaaac atcaggatcg ggcttcagta ttctcataac cagagagttc actgaggata     6840
caggactgtt tgcccatttt ttgttatggc tccagacttg tggtatttcc atgtcttttt     6900
tttttttttt ttttttgacc ttttagcggc tttaaagtat ttctgttgtt aggtgttgta     6960
ttacttttct aagattactt aacaaagcac cacaaactga gtggctttaa acaacagcaa     7020
tttattctct cacaattcta gaagctagaa gtccgaaatc aaagtgttga caggggcatg     7080
atcttcaaga gagaagactc tttccttgcc tcttcctggc ttctggtggt taccagcaat     7140
cctgagtgtt cctttcttgc cttgtagttt caacaatcca gtatctgcct tttgtcttca     7200
catggctgtc taccatttgt ctctgtgtct ccaaatctct ctccttataa acacagcagt     7260
tattggatta ggccccactc taatccagta tgaccccatt ttaacatgat tacacttatt     7320
tctagataag gtcacattca cgtacaccaa gggttaggaa ttgaacatat ctttttgggg     7380
gacacaattc aacccacaag tgtcagtctc tagctgagcc tttcccttcc tgtttttctc     7440
ctttttagtt gctatgggtt aggggccaaa tctccagtca tactagaatt gcacatggac     7500
tggatatttg ggaatactgc gggtctattc tatgagcttt agtatgtaac atttaatatc     7560
agtgtaaaga agcccttttt taagttattt ctttgaattt ctaaatgtat gccctgaata     7620
taagtaacaa gttaccatgt cttgtaaaat gatcatatca acaaacattt aatgtgcacc     7680
tactgtgcta gttgaatgtc tttatcctga taggagataa caggattcca catctttgac     7740
ttaagaggac aaaccaaata tgtctaaatc atttggggtt ttgatggata tctttaaatt     7800
gctgaaccta atcattggtt tcatatgtca ttgtttagat atctccggag catttggata     7860
atgtgacagt tggaatgcag tgatgtcgac tctttgccca ccgccatctc cagctgttgc     7920
caagacagag attgctttaa gtggcaaatc acctttatta gcagctactt ttgcttactg     7980
ggacaatatt cttggtccta gagtaaggca catttgggct ccaaagacag aacaggtact     8040
tctcagtgat ggagaaataa cttttcttgc caaccacact ctaaatggag aaatccttcg     8100
aaatgcagag agtggtgcta tagatgtaaa gttttttgtc ttgtctgaaa agggagtgat     8160
tattgtttca ttaatctttg atggaaactg gaatggggat cgcagcacat atggactatc     8220
aattatactt ccacagacag aacttagttt ctacctccca cttcatagag tgtgtgttga     8280
tagattaaca catataatcc ggaaaggaag aatatggatg cataaggtaa gtgatttttc     8340
agcttattaa tcatgttaac ctatctgttg aaagcttatt ttctggtaca tataaatctt     8400
atttttttaa ttatatgcag tgaacatcaa acaataaatg ttatttattt tgcatttacc     8460
ctattagata caaatacatc tggtctgata cctgtcatct tcatattaac tgtggaaggt     8520
acgaaatggt agctccacat tatagatgaa aagctaaagc ttagacaaat aaagaaactt     8580
ttagaccctg gattcttctt gggagccttt gactctaata ccttttgttt ccctttcatt     8640
gcacaattct gtcttttgct tactactatg tgtaagtata acagttcaaa gtaatagttt     8700
cataagctgt tggtcatgta gcctttggtc tctttaacct ctttgccaag ttcccaggtt     8760
cataaaatga ggaggttgaa tggaatggtt cccaagagaa ttccttttaa tcttacagaa     8820
attattgttt tcctaaatcc tgtagttgaa tatataatgc tatttacatt tcagtatagt     8880
tttgatgtat ctaaagaaca cattgaattc tccttcctgt gttccagttt gatactaacc     8940
tgaaagtcca ttaagcatta ccagttttaa aaggcttttg cccaatagta aggaaaaata     9000
atatctttta aaagaataat tttttactat gtttgcaggc ttacttcctt ttttctcaca     9060
ttatgaaact cttaaaatca ggagaatctt ttaaacaaca tcataatgtt taatttgaaa     9120
agtgcaagtc attcttttcc tttttgaaac tatgcagatg ttacattgac tgttttctgt     9180
gaagttatct ttttttcact gcagaataaa ggttgttttg attttatttt gtattgttta     9240
tgagaacatg catttgttgg gttaatttcc tacccctgcc cccatttttt ccctaaagta     9300
gaaagtattt ttcttgtgaa ctaaattact acacaagaac atgtctattg aaaaataagc     9360
aagtatcaaa atgttgtggg ttgttttttt aaataaattt tctcttgctc aggaaagaca     9420
agaaaatgtc cagaagatta tcttagaagg cacagagaga atggaagatc aggtatatgc     9480
aaattgcata ctgtcaaatg tttttctcac agcatgtatc tgtataaggt tgatggctac     9540
atttgtcaag gccttggaga catacgaata agcctttaat ggagctttta tggaggtgta     9600
cagaataaac tggaggaaga tttccatatc ttaaacccaa agagttaaat cagtaaacaa     9660
aggaaaatag taattgcatc tacaaattaa tatttgctcc cttttttttt ctgtttgccc     9720
agaataaatt ttggataact tgttcatagt aaaaataaaa aaaattgtct ctgatatgtt     9780
ctttaaggta ctacttctcg aacctttccc tagaagtagc tgtaacagaa ggagagcata     9840
tgtacccctg aggtatctgt ctggggtgta ggcccaggtc cacacaatat ttcttctaag     9900
tcttatgttg tatcgttaag actcatgcaa tttacatttt attccataac tattttagta     9960
ttaaaatttg tcagtgatat ttcttaccct ctcctctagg aaaatgtgcc atgtttatcc    10020
cttggctttg aatgcccctc aggaacagac actaagagtt tgagaagcat ggttacaagg    10080
gtgtggcttc ccctgcggaa actaagtaca gactatttca ctgtaaagca gagaagttct    10140
tttgaaggag aatctccagt gaagaaagag ttcttcactt ttacttccat ttcctcttgt    10200
gggtgaccct caatgctcct tgtaaaactc caatatttta aacatggctg ttttgccttt    10260
ctttgcttct ttttagcatg aatgagacag atgatacttt aaaaaagtaa ttaaaaaaaa    10320
aaacttgtga aaatacatgg ccataataca gaacccaata caatgatctc ctttaccaaa    10380
ttgttatgtt tgtacttttg tagatagctt tccaattcag agacagttat tctgtgtaaa    10440
ggtctgactt aacaagaaaa gatttccctt tacccaaaga atcccagtcc ttatttgctg    10500
gtcaataagc agggtcccca ggaatggggt aactttcagc accctctaac ccactagtta    10560
ttagtagact aattaagtaa acttatcgca agttgaggaa acttagaacc aactaaaatt    10620
ctgcttttac tgggattttg ttttttcaaa ccagaaacct ttacttaagt tgactactat    10680
taatgaattt tggtctctct tttaagtgct cttcttaaaa atgttatctt actgctgaga    10740
agttcaagtt tgggaagtac aaggaggaat agaaacttaa gagattttct tttagagcct    10800
cttctgtatt tagccctgta ggattttttt tttttttttt ttttttggtg ttgttgagct    10860
tcagtgaggc tattcattca cttatactga taatgtctga gatactgtga atgaaatact    10920
atgtatgctt aaacctaaga ggaaatattt tcccaaaatt attcttcccg aaaaggagga    10980
gttgcctttt gattgagttc ttgcaaatct cacaacgact ttattttgaa caatactgtt    11040
tggggatgat gcattagttt gaaacaactt cagttgtagc tgtcatctga taaaattgct    11100
tcacagggaa ggaaatttaa cacggatcta gtcattattc ttgttagatt gaatgtgtga    11160
attgtaattg taaacaggca tgataattat tactttaaaa actaaaaaca gtgaatagtt    11220
agttgtggag gttactaaag gatggttttt ttttaaataa aactttcagc attatgcaaa    11280
tgggcatatg gcttaggata aaacttccag aagtagcatc acatttaaat tctcaagcaa    11340
cttaataata tggggctctg aaaaactggt taaggttact ccaaaaatgg ccctgggtct    11400
gacaaagatt ctaacttaaa gatgcttatg aagactttga gtaaaatcat ttcataaaat    11460
aagtgaggaa aaacaactag tattaaattc atcttaaata atgtatgatt taaaaaatat    11520
gtttagctaa aaatgcatag tcatttgaca atttcattta tatctcaaaa aatttactta    11580
accaagttgg tcacaaaact gatgagactg gtggtggtag tgaataaatg agggaccatc    11640
catatttgag acactttaca tttgtgatgt gttatactga attttcagtt tgattctata    11700
gactacaaat ttcaaaatta caatttcaag atgtaataag tagtaatatc ttgaaatagc    11760
tctaaaggga atttttctgt tttattgatt cttaaaatat atgtgctgat tttgatttgc    11820
atttgggtag attatacttt tatgagtatg gaggttaggt attgattcaa gttttcctta    11880
cctatttggt aaggatttca aagtcttttt gtgcttggtt ttcctcattt ttaaatatga    11940
aatatattga tgacctttaa caaatttttt ttatctcaaa ttttaaagga gatcttttct    12000
aaaagaggca tgatgactta atcattgcat gtaacagtaa acgataaacc aatgattcca    12060
tactctctaa agaataaaag tgagctttag ggccgggcat ggtcagaaat ttgacaccaa    12120
cctggccaac atggcgaaac cccgtctcta ctaaaaatac aaaaatcagc cgggcatggt    12180
ggcggcacct atagtcccag ctacttggga ggatgagaca ggagagtcac ttgaacctgg    12240
gaggagaggt tgcagtgagc tgagatcacg ccattgcact ccagcctgag caatgaaagc    12300
aaaactccat ctcaaaaaaa aaaaaagaaa agaaagaata aaagtgagct ttggattgca    12360
tataaatcct ttagacatgt agtagacttg tttgatactg tgtttgaaca aattacgaag    12420
tattttcatc aaagaatgtt attgtttgat gttattttta ttttttattg cccagcttct    12480
ctcatattac gtgattttct tcacttcatg tcactttatt gtgcagggtc agagtattat    12540
tccaatgctt actggagaag tgattcctgt aatggaactg ctttcatcta tgaaatcaca    12600
cagtgttcct gaagaaatag atgtaagttt aaatgagagc aattatacac tttatgagtt    12660
ttttggggtt atagtattat tatgtatatt attaatattc taattttaat agtaaggact    12720
ttgtcataca tactattcac atacagtatt agccacttta gcaaataagc acacacaaaa    12780
tcctggattt tatggcaaaa cagaggcatt tttgatcagt gatgacaaaa ttaaattcat    12840
tttgtttatt tcattacttt tataattcct aaaagtggga ggatcccagc tcttatagga    12900
gcaattaata tttaatgtag tgtcttttga aacaaaactg tgtgccaaag tagtaaccat    12960
taatggaagt ttacttgtag tcacaaattt agtttcctta atcatttgtt gaggacgttt    13020
tgaatcacac actatgagtg ttaagagata cctttaggaa actattcttg ttgttttctg    13080
attttgtcat ttaggttagt ctcctgattc tgacagctca gaagaggaag ttgttcttgt    13140
aaaaattgtt taacctgctt gaccagcttt cacatttgtt cttctgaagt ttatggtagt    13200
gcacagagat tgttttttgg ggagtcttga ttctcggaaa tgaaggcagt gtgttatatt    13260
gaatccagac ttccgaaaac ttgtatatta aaagtgttat ttcaacacta tgttacagcc    13320
agactaattt ttttattttt tgatgcattt tagatagctg atacagtact caatgatgat    13380
gatattggtg acagctgtca tgaaggcttt cttctcaagt aagaattttt cttttcataa    13440
aagctggatg aagcagatac catcttatgc tcacctatga caagatttgg aagaaagaaa    13500
ataacagact gtctacttag attgttctag ggacattacg tatttgaact gttgcttaaa    13560
tttgtgttat ttttcactca ttatatttct atatatattt ggtgttattc catttgctat    13620
ttaaagaaac cgagtttcca tcccagacaa gaaatcatgg ccccttgctt gattctggtt    13680
tcttgtttta cttctcatta aagctaacag aatcctttca tattaagttg tactgtagat    13740
gaacttaagt tatttaggcg tagaacaaaa ttattcatat ttatactgat ctttttccat    13800
ccagcagtgg agtttagtac ttaagagttt gtgcccttaa accagactcc ctggattaat    13860
gctgtgtacc cgtgggcaag gtgcctgaat tctctataca cctatttcct catctgtaaa    13920
atggcaataa tagtaatagt acctaatgtg tagggttgtt ataagcattg agtaagataa    13980
ataatataaa gcacttagaa cagtgcctgg aacataaaaa cacttaataa tagctcatag    14040
ctaacatttc ctatttacat ttcttctaga aatagccagt atttgttgag tgcctacatg    14100
ttagttcctt tactagttgc tttacatgta ttatcttata ttctgtttta aagtttcttc    14160
acagttacag attttcatga aattttactt ttaataaaag agaagtaaaa gtataaagta    14220
ttcactttta tgttcacagt cttttccttt aggctcatga tggagtatca gaggcatgag    14280
tgtgtttaac ctaagagcct taatggcttg aatcagaagc actttagtcc tgtatctgtt    14340
cagtgtcagc ctttcataca tcattttaaa tcccatttga ctttaagtaa gtcacttaat    14400
ctctctacat gtcaatttct tcagctataa aatgatggta tttcaataaa taaatacatt    14460
aattaaatga tattatactg actaattggg ctgttttaag gctcaataag aaaatttctg    14520
tgaaaggtct ctagaaaatg taggttccta tacaaataaa agataacatt gtgcttatag    14580
cttcggtgtt tatcatataa agctattctg agttatttga agagctcacc tacttttttt    14640
tgtttttagt ttgttaaatt gttttatagg caatgttttt aatctgtttt ctttaactta    14700
cagtgccatc agctcacact tgcaaacctg tggctgttcc gttgtagtag gtagcagtgc    14760
agagaaagta aataaggtag tttattttat aatctagcaa atgatttgac tctttaagac    14820
tgatgatata tcatggattg tcatttaaat ggtaggttgc aattaaaatg atctagtagt    14880
ataaggaggc aatgtaatct catcaaattg ctaagacacc ttgtggcaac agtgagtttg    14940
aaataaactg agtaagaatc atttatcagt ttattttgat agctcggaaa taccagtgtc    15000
agtagtgtat aaatggtttt gagaatatat taaaatcaga tatataaaaa aaattactct    15060
tctatttccc aatgttatct ttaacaaatc tgaagatagt catgtacttt tggtagtagt    15120
tccaaagaaa tgttatttgt ttattcatct tgatttcatt gtcttcgctt tccttctaaa    15180
tctgtccctt ctagggagct attgggatta agtggtcatt gattattata ctttattcag    15240
taatgtttct gaccctttcc ttcagtgcta cttgagttaa ttaaggatta atgaacagtt    15300
acatttccaa gcattagcta ataaactaaa ggattttgca cttttcttca ctgaccatta    15360
gttagaaaga gttcagagat aagtatgtgt atctttcaat ttcagcaaac ctaatttttt    15420
aaaaaaagtt ttacatagga aatatgttgg aaatgatact ttacaaagat attcataatt    15480
tttttttgta atcagctact ttgtatattt acatgagcct taatttatat ttctcatata    15540
accatttatg agagcttagt atacctgtgt cattatattg catctacgaa ctagtgacct    15600
tattccttct gttacctcaa acaggtggct ttccatctgt gatctccaaa gccttaggtt    15660
gcacagagtg actgccgagc tgctttatga agggagaaag gctccatagt tggagtgttt    15720
tttttttttt ttttaaacat ttttcccatc ctccatcctc ttgagggaga atagcttacc    15780
ttttatcttg ttttaatttg agaaagaagt tgccaccact ctaggttgaa aaccactcct    15840
ttaacataat aactgtggat atggtttgaa tttcaagata gttacatgcc tttttatttt    15900
tcctaataga gctgtaggtc aaatattatt agaatcagat ttctaaatcc cacccaatga    15960
cctgcttatt ttaaatcaaa ttcaataatt aattctcttc tttttggagg atctggacat    16020
tctttgatat ttcttacaac gaatttcatg tgtagaccca ctaaacagaa gctataaaag    16080
ttgcatggtc aaataagtct gagaaagtct gcagatgata taattcacct gaagagtcac    16140
agtatgtagc caaatgttaa aggttttgag atgccataca gtaaatttac caagcatttt    16200
ctaaatttat ttgaccacag aatccctatt ttaagcaaca actgttacat cccatggatt    16260
ccaggtgact aaagaatact tatttcttag gatatgtttt attgataata acaattaaaa    16320
tttcagatat ctttcataag caaatcagtg gtctttttac ttcatgtttt aatgctaaaa    16380
tattttcttt tatagatagt cagaacatta tgcctttttc tgactccagc agagagaaaa    16440
tgctccaggt tatgtgaagc agaatcatca tttaaatatg agtcagggct ctttgtacaa    16500
ggcctgctaa aggtatagtt tctagttatc acaagtgaaa ccacttttct aaaatcattt    16560
ttgagactct ttatagacaa atcttaaata ttagcattta atgtatctca tattgacatg    16620
cccagagact gacttccttt acacagttct gcacatagac tatatgtctt atggatttat    16680
agttagtatc atcagtgaaa caccatagaa taccctttgt gttccaggtg ggtccctgtt    16740
cctacatgtc tagcctcagg actttttttt ttttaacaca tgcttaaatc aggttgcaca    16800
tcaaaaataa gatcatttct ttttaactaa atagatttga attttattga aaaaaaattt    16860
taaacatctt taagaagctt ataggattta agcaattcct atgtatgtgt actaaaatat    16920
atatatttct atatataata tatattagaa aaaaattgta tttttctttt atttgagtct    16980
actgtcaagg agcaaaacag agaaatgtaa attagcaatt atttataata cttaaaggga    17040
agaaagttgt tcaccttgtt gaatctatta ttgttatttc aattatagtc ccaagacgtg    17100
aagaaatagc tttcctaatg gttatgtgat tgtctcatag tgactacttt cttgaggatg    17160
tagccacggc aaaatgaaat aaaaaaattt aaaaattgtt gcaaatacaa gttatattag    17220
gcttttgtgc attttcaata atgtgctgct atgaactcag aatgatagta tttaaatata    17280
gaaactagtt aaaggaaacg tagtttctat ttgagttata catatctgta aattagaact    17340
tctcctgtta aaggcataat aaagtgctta atacttttgt ttcctcagca ccctctcatt    17400
taattatata attttagttc tgaaagggac ctataccaga tgcctagagg aaatttcaaa    17460
actatgatct aatgaaaaaa tatttaatag ttctccatgc aaatacaaat catatagttt    17520
tccagaaaat acctttgaca ttatacaaag atgattatca cagcattata atagtaaaaa    17580
aatggaaata gcctctttct tctgttctgt tcatagcaca gtgcctcata cgcagtaggt    17640
tattattaca tggtaactgg ctaccccaac tgattaggaa agaagtaaat ttgttttata    17700
aaaatacata ctcattgagg tgcatagaat aattaagaaa ttaaaagaca cttgtaattt    17760
tgaatccagt gaatacccac tgttaatatt tggtatatct ctttctagtc tttttttccc    17820
ttttgcatgt attttcttta agactcccac ccccactgga tcatctctgc atgttctaat    17880
ctgctttttt cacagcagat tctaagcctc tttgaatatc aacacaaact tcaacaactt    17940
catctataga tgccaaataa taaattcatt tttatttact taaccacttc ctttggatgc    18000
ttaggtcatt ctgatgtttt gctattgaaa ccaatgctat actgaacact tctgtcacta    18060
aaactttgca cacactcatg aatagcttct taggataaat ttttagagat ggatttgcta    18120
aatcagagac cattttttaa aattaaaaaa caattattca tatcgtttgg catgtaagac    18180
agtaaatttt ccttttattt tgacaggatt caactggaag ctttgtgctg cctttccggc    18240
aagtcatgta tgctccatat cccaccacac acatagatgt ggatgtcaat actgtgaagc    18300
agatgccacc ctgtcatgaa catatttata atcagcgtag atacatgaga tccgagctga    18360
cagccttctg gagagccact tcagaagaag acatggctca ggatacgatc atctacactg    18420
acgaaagctt tactcctgat ttgtacgtaa tgctctgcct gctggtactg tagtcaagca    18480
atatgaaatt gtgtctttta cgaataaaaa caaaacagaa gttgcattta aaaagaaaga    18540
aatattacca gcagaattat gcttgaagaa acatttaatc aagcattttt ttcttaaatg    18600
ttcttctttt tccatacaat tgtgtttacc ctaaaatagg taagattaac ccttaaagta    18660
aatatttaac tatttgttta ataaatatat attgagctcc taggcactgt tctaggtacc    18720
gggcttaata gtggccaacc agacagcccc agccccagcc cctacattgt gtatagtcta    18780
ttatgtaaca gttattgaat ggacttatta acaaaaccaa agaagtaatt ctaagtcttt    18840
tttttcttga catatgaata taaaatacag caaaactgtt aaaatatatt aatggaacat    18900
ttttttactt tgcattttat attgttattc acttcttatt tttttttaaa aaaaaaagcc    18960
tgaacagtaa attcaaaagg aaaagtaatg ataattaatt gttgagcatg gacccaactt    19020
gaaaaaaaaa atgatgatga taaatctata atcctaaaac cctaagtaaa cacttaaaag    19080
atgttctgaa atcaggaaaa gaattatagt atacttttgt gtttctcttt tatcagttga    19140
aaaaaggcac agtagctcat gcctgtaaga acagagcttt gggagtgcaa ggcaggcgga    19200
tcacttgagg ccaggagttc cagaccagcc tgggcaacat agtgaaaccc catctctaca    19260
aaaaataaaa aagaattatt ggaatgtgtt tctgtgtgcc tgtaatccta gctattccga    19320
aagctgaggc aggaggatct tttgagccca ggagtttgag gttacaggga gttatgatgt    19380
gccagtgtac tccagcctgg ggaacaccga gactctgtct tatttaaaaa aaaaaaaaaa    19440
aaaatgcttg caataatgcc tggcacatag aaggtaacag taagtgttaa ctgtaataac    19500
ccaggtctaa gtgtgtaagg caatagaaaa attggggcaa ataagcctga cctatgtatc    19560
tacagaatca gtttgagctt aggtaacaga cctgtggagc accagtaatt acacagtaag    19620
tgttaaccaa aagcatagaa taggaatatc ttgttcaagg gacccccagc cttatacatc    19680
tcaaggtgca gaaagatgac ttaatatagg acccattttt tcctagttct ccagagtttt    19740
tattggttct tgagaaagta gtaggggaat gttttagaaa atgaattggt ccaactgaaa    19800
ttacatgtca gtaagttttt atatattggt aaattttagt agacatgtag aagttttcta    19860
attaatctgt gccttgaaac attttctttt ttcctaaagt gcttagtatt ttttccgttt    19920
tttgattggt tacttgggag cttttttgag gaaatttagt gaactgcaga atgggtttgc    19980
aaccatttgg tatttttgtt ttgtttttta gaggatgtat gtgtatttta acatttctta    20040
atcattttta gccagctatg tttgttttgc tgatttgaca aactacagtt agacagctat    20100
tctcattttg ctgatcatga caaaataata tcctgaattt ttaaattttg catccagctc    20160
taaattttct aaacataaaa ttgtccaaaa aatagtattt tcagccacta gattgtgtgt    20220
taagtctatt gtcacagagt cattttactt ttaagtatat gtttttacat gttaattatg    20280
tttgttattt ttaattttaa ctttttaaaa taattccagt cactgccaat acatgaaaaa    20340
ttggtcactg gaattttttt tttgactttt attttaggtt catgtgtaca tgtgcaggtg    20400
tgttatacag gtaaattgcg tgtcatgagg gtttggtgta caggtgattt cattacccag    20460
gtaataagca tagtacccaa taggtagttt tttgatcctc acccttctcc caccctcaag    20520
taggccctgg tgttgctgtt tccttctttg tgtccatgta tactcagtgt ttagctccca    20580
cttagaagtg agaacatgcg gtagttggtt ttctgttcct ggattagttc acttaggata    20640
atgacctcta gctccatctg gtttttatgg ctgcatagta ttccatggtg tatatgtatc    20700
acattttctt tatccagtct accattgata ggcatttagg ttgattccct gtctttgtta    20760
tcatgaatag tgctgtgatg aacatacaca tgcatgtgtc tttatggtag aaaaatttgt    20820
attcctttag gtacatatag aataatgggg ttgctagggt gaatggtagt tctattttca    20880
gttatttgag aaatcttcaa actgcttttc ataatagcta aactaattta cagtcccgcc    20940
agcagtgtat aagtgttccc ttttctccac aaccttgcca acatctgtga ttttttgact    21000
ttttaataat agccattcct agagaattga tttgcaattc tctattagtg atattaagca    21060
ttttttcata tgctttttag ctgtctgtat atattcttct gaaaaatttt catgtccttt    21120
gcccagtttg tagtggggtg ggttgttttt tgcttgttaa ttagttttaa gttccttcca    21180
gattctgcat atccctttgt tggatacatg gtttgcagat atttttctcc cattgtgtag    21240
gttgtctttt actctgttga tagtttcttt tgccatgcag gagctcgtta ggtcccattt    21300
gtgtttgttt ttgttgcagt tgcttttggc gtcttcatca taaaatctgt gccagggcct    21360
atgtccagaa tggtatttcc taggttgtct tccagggttt ttacaatttt agattttacg    21420
tttatgtctt taatccatct tgagttgatt tttgtatatg gcacaaggaa ggggtccagt    21480
ttcactccaa ttcctatggc tagcaattat cccagcacca tttattgaat acggagtcct    21540
ttccccattg cttgtttttt gtcaactttg ttgaagatca gatggttgta agtgtgtggc    21600
tttatttctt ggctctctat tctccattgg tctatgtgtc tgtttttata acagtaccct    21660
gctgttcagg ttcctatagc cttttagtat aaaatcggct aatgtgatgc ctccagcttt    21720
gttctttttg cttaggattg ctttggctat ttgggctcct ttttgggtcc atattaattt    21780
taaaacagtt ttttctggtt ttgtgaagga tatcattggt agtttatagg aatagcattg    21840
aatctgtaga ttgctttggg cagtatggcc attttaacaa tattaattct tcctatctat    21900
gaatatggaa tgtttttcca tgtgtttgtg tcatctcttt atacctgatg tataaagaaa    21960
agctggtatt attcctactc aatctgttcc aaaaaattga ggaggaggaa ctcttcccta    22020
atgaggccag catcattctg ataccaaaac ctggcagaga cacaacagaa aaaagaaaac    22080
ttcaggccaa tatccttgat gaatatagat gcaaaaatcc tcaacaaaat actagcaaac    22140
caaatccagc agcacatcaa aaagctgatc tactttgatc aagtaggctt tatccctggg    22200
atgcaaggtt ggttcaacat acacaaatca ataagtgtga ttcatcacat aaacagagct    22260
aaaaacaaaa accacaagat tatctcaata ggtagagaaa aggttgtcaa taaaatttaa    22320
catcctccat gttaaaaacc ttcagtaggt caggtgtagt gactcacacc tgtaatccca    22380
gcactttggg aggccaaggc gggcatatct cttaagccca ggagttcaag acgagcctag    22440
gcagcatggt gaaaccccat ctctacaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaatta gcttggtatg    22500
gtgacatgca cctatagtcc cagctattca ggaggttgag gtgggaggat tgtttgagcc    22560
cgggaggcag aggttggcag cgagctgaga tcatgccacc gcactccagc ctgggcaacg    22620
gagtgagacc ctgtctcaaa aaagaaaaat cacaaacaat cctaaacaaa ctaggcattg    22680
aaggaacatg cctcaaaaaa ataagaacca tctatgacag acccatagcc aatatcttac    22740
caaatgggca aaagctggaa gtattctcct tgagaaccgt aacaagacaa ggatgtccac    22800
tctcaccact ccttttcagc atagttctgg aagtcctagc cagagcaatc aggaaagaga    22860
aagaaagaaa gacattcaga taggaagaga agaagtcaaa ctatttctgt ttgcaggcag    22920
tataattctg tacctagaaa atctcatagt ctctgcccag aaactcctaa atctgttaaa    22980
aatttcagca aagttttggc attctctata ctccaacacc ttccaaagtg agagcaaaat    23040
caagaacaca gtcccattca caatagccgc aaaacgaata aaatacctag gaatccagct    23100
aaccagggag gtgaaagatc tctatgagaa ttacaaaaca ctgctgaaag aaatcagaga    23160
tgacacaaac aaatggaaat gttctttttt aacaccttgc tttatctaat tcacttatga    23220
tgaagatact cattcagtgg aacaggtata ataagtccac tcgattaaat ataagcctta    23280
ttctctttcc agagcccaag aaggggcact atcagtgccc agtcaataat gacgaaatgc    23340
taatattttt cccctttacg gtttctttct tctgtagtgt ggtacactcg tttcttaaga    23400
taaggaaact tgaactacct tcctgtttgc ttctacacat acccattctc tttttttgcc    23460
actctggtca ggtataggat gatccctacc actttcagtt aaaaactcct cctcttacta    23520
aatgttctct taccctctgg cctgagtaga acctagggaa aatggaagag aaaaagatga    23580
aagggaggtg gggcctggga agggaataag tagtcctgtt tgtttgtgtg tttgctttag    23640
cacctgctat atcctaggtg ctgtgttagg cacacattat tttaagtggc cattatatta    23700
ctactactca ctctggtcgt tgccaaggta ggtagtactt tcttggatag ttggttcatg    23760
ttacttacag atggtgggct tgttgaggca aacccagtgg ataatcatcg gagtgtgttc    23820
tctaatctca ctcaaatttt tcttcacatt ttttggtttg ttttggtttt tgatggtagt    23880
ggcttatttt tgttgctggt ttgttttttg tttttttttg agatggcaag aattggtagt    23940
tttatttatt aattgcctaa gggtctctac tttttttaaa agatgagagt agtaaaatag    24000
attgatagat acatacatac ccttactggg gactgcttat attctttaga gaaaaaatta    24060
catattagcc tgacaaacac cagtaaaatg taaatatatc cttgagtaaa taaatgaatg    24120
tatattttgt gtctccaaat atatatatct atattcttac aaatgtgttt atatgtaata    24180
tcaatttata agaacttaaa atgttggctc aagtgaggga ttgtggaagg tagcattata    24240
tggccatttc aacatttgaa cttttttctt ttcttcattt tcttcttttc ttcaggaata    24300
tttttcaaga tgtcttacac agagacactc tagtgaaagc cttcctggat caggtaaatg    24360
ttgaacttga gattgtcaga gtgaatgata tgacatgttt tcttttttaa tatatcctac    24420
aatgcctgtt ctatatattt atattcccct ggatcatgcc ccagagttct gctcagcaat    24480
tgcagttaag ttagttacac tacagttctc agaagagtct gtgagggcat gtcaagtgca    24540
tcattacatt ggttgcctct tgtcctagat ttatgcttcg ggaattcaga cctttgttta    24600
caatataata aatattattg ctatctttta aagatataat aataagatat aaagttgacc    24660
acaactactg ttttttgaaa catagaattc ctggtttaca tgtatcaaag tgaaatctga    24720
cttagctttt acagatataa tatatacata tatatatcct gcaatgcttg tactatatat    24780
gtagtacaag tatatatata tgtttgtgtg tgtatatata tatagtacga gcatatatac    24840
atattaccag cattgtagga tatatatatg tttatatatt aaaaaaaagt tataaactta    24900
aaaccctatt atgttatgta gagtatatgt tatatatgat atgtaaaata tataacatat    24960
actctatgat agagtgtaat atatttttta tatatatttt aacatttata aaatgataga    25020
attaagaatt gagtcctaat ctgttttatt aggtgctttt tgtagtgtct ggtctttcta    25080
aagtgtctaa atgatttttc cttttgactt attaatgggg aagagcctgt atattaacaa    25140
ttaagagtgc agcattccat acgtcaaaca acaaacattt taattcaagc attaacctat    25200
aacaagtaag tttttttttt ttttttgaga aagggaggtt gtttatttgc ctgaaatgac    25260
tcaaaaatat ttttgaaaca tagtgtactt atttaaataa catctttatt gtttcattct    25320
tttaaaaaat atctacttaa ttacacagtt gaaggaaatc gtagattata tggaacttat    25380
ttcttaatat attacagttt gttataataa cattctgggg atcaggccag gaaactgtgt    25440
catagataaa gctttgaaat aatgagatcc ttatgtttac tagaaatttt ggattgagat    25500
ctatgaggtc tgtgacatat tgcgaagttc aaggaaaatt cgtaggcctg gaatttcatg    25560
cttctcaagc tgacataaaa tccctcccac tctccacctc atcatatgca cacattctac    25620
tcctacccac ccactccacc ccctgcaaaa gtacaggtat atgaatgtct caaaaccata    25680
ggctcatctt ctaggagctt caatgttatt tgaagatttg ggcagaaaaa attaagtaat    25740
acgaaataac ttatgtatga gttttaaaag tgaagtaaac atggatgtat tctgaagtag    25800
aatgcaaaat ttgaatgcat ttttaaagat aaattagaaa acttctaaaa actgtcagat    25860
tgtctgggcc tggtggctta tgcctgtaat cccagcactt tgggagtccg aggtgggtgg    25920
atcacaaggt caggagatcg agaccatcct gccaacatgg tgaaaccccg tctctactaa    25980
gtatacaaaa attagctggg cgtggcagcg tgtgcctgta atcccagcta cctgggaggc    26040
tgaggcagga gaatcgcttg aacccaggag gtgtaggttg cagtgagtca agatcgcgcc    26100
actgcacttt agcctggtga cagagctaga ctccgtctca aaaaaaaaaa aaaatatcag    26160
attgttccta cacctagtgc ttctatacca cactcctgtt agggggcatc agtggaaatg    26220
gttaaggaga tgtttagtgt gtattgtctg ccaagcactg tcaacactgt catagaaact    26280
tctgtacgag tagaatgtga gcaaattatg tgttgaaatg gttcctctcc ctgcaggtct    26340
ttcagctgaa acctggctta tctctcagaa gtactttcct tgcacagttt ctacttgtcc    26400
ttcacagaaa agccttgaca ctaataaaat atatagaaga cgatacgtga gtaaaactcc    26460
tacacggaag aaaaaccttt gtacattgtt tttttgtttt gtttcctttg tacattttct    26520
atatcataat ttttgcgctt cttttttttt tttttttttt tttttttcca ttatttttag    26580
gcagaaggga aaaaagccct ttaaatctct tcggaacctg aagatagacc ttgatttaac    26640
agcagagggc gatcttaaca taataatggc tctggctgag aaaattaaac caggcctaca    26700
ctcttttatc tttggaagac ctttctacac tagtgtgcaa gaacgagatg ttctaatgac    26760
tttttaaatg tgtaacttaa taagcctatt ccatcacaat catgatcgct ggtaaagtag    26820
ctcagtggtg tggggaaacg ttcccctgga tcatactcca gaattctgct ctcagcaatt    26880
gcagttaagt aagttacact acagttctca caagagcctg tgaggggatg tcaggtgcat    26940
cattacattg ggtgtctctt ttcctagatt tatgcttttg ggatacagac ctatgtttac    27000
aatataataa atattattgc tatcttttaa agatataata ataggatgta aacttgacca    27060
caactactgt ttttttgaaa tacatgattc atggtttaca tgtgtcaagg tgaaatctga    27120
gttggctttt acagatagtt gactttctat cttttggcat tctttggtgt gtagaattac    27180
tgtaatactt ctgcaatcaa ctgaaaacta gagcctttaa atgatttcaa ttccacagaa    27240
agaaagtgag cttgaacata ggatgagctt tagaaagaaa attgatcaag cagatgttta    27300
attggaattg attattagat cctactttgt ggatttagtc cctgggattc agtctgtaga    27360
aatgtctaat agttctctat agtccttgtt cctggtgaac cacagttagg gtgttttgtt    27420
tattttattg ttcttgctat tgttgatatt ctatgtagtt gagctctgta aaaggaaatt    27480
gtattttatg ttttagtaat tgttgccaac tttttaaatt aattttcatt atttttgagc    27540
caaattgaaa tgtgcacctc ctgtgccttt tttctcctta gaaaatctaa ttacttggaa    27600
caagttcaga tttcactggt cagtcatttt catcttgttt tcttcttgct aagtcttacc    27660
atgtacctgc tttggcaatc attgcaactc tgagattata aaatgcctta gagaatatac    27720
taactaataa gatctttttt tcagaaacag aaaatagttc cttgagtact tccttcttgc    27780
atttctgcct atgtttttga agttgttgct gtttgcctgc aataggctat aaggaatagc    27840
aggagaaatt ttactgaagt gctgttttcc taggtgctac tttggcagag ctaagttatc    27900
ttttgttttc ttaatgcgtt tggaccattt tgctggctat aaaataactg attaatataa    27960
ttctaacaca atgttgacat tgtagttaca caaacacaaa taaatatttt atttaaaatt    28020
ctggaagtaa tataaaaggg aaaatatatt tataagaaag ggataaaggt aatagagccc    28080
ttctgccccc cacccaccaa atttacacaa caaaatgaca tgttcgaatg tgaaaggtca    28140
taatagcttt cccatcatga atcagaaaga tgtggacagc ttgatgtttt agacaaccac    28200
tgaactagat gactgttgta ctgtagctca gtcatttaaa aaatatataa atactacctt    28260
gtagtgtccc atactgtgtt ttttacatgg tagattctta tttaagtgct aactggttat    28320
tttctttggc tggtttattg tactgttata cagaatgtaa gttgtacagt gaaataagtt    28380
attaaagcat gtgtaaacat tgttatatat cttttctcct aaatggagaa ttttgaataa    28440
aatatatttg aaattttgcc tctttcagtt gttcattcag aaaaaaatac tatgatattt    28500
gaagactgat cagcttctgt tcagctgaca gtcatgctgg atctaaactt tttttaaaat    28560
taattttgtc ttttcaaaga aaaaatattt aaagaagctt tataatataa tcttatgtta    28620
aaaaaacttt ctgcttaact ctctggattt cattttgatt tttcaaatta tatattaata    28680
tttcaaatgt aaaatactat ttagataaat tgtttttaaa cattcttatt attataatat    28740
taatataacc taaactgaag ttattcatcc caggtatcta atacatgtat ccaaagtaaa    28800
aatccaagga atctgaacac tttcatctgc aaagctagga ataggtttga cattttcact    28860
ccaagaaaaa gttttttttt gaaaatagaa tagttgggat gagaggtttc tttaaaagaa    28920
gactaactga tcacattact atgattctca aagaagaaac caaaacttca tataatacta    28980
taaagtaaat ataaaatagt tccttctata gtatatttct ataatgctac agtttaaaca    29040
gatcactctt atataatact attttgattt tgatgtagaa ttgcacaaat tgatatttct    29100
cctatgatct gcagggtata gcttaaagta acaaaaacag tcaaccacct ccatttaaca    29160
cacagtaaca ctatgggact agttttatta cttccatttt acaaatgagg aaactaaagc    29220
ttaaagatgt gtaatacacc gcccaaggtc acacagctgg taaaggtgga tttcatccca    29280
gacagttaca gtcattgcca tgggcacagc tcctaactta gtaactccat gtaactggta    29340
ctcagtgtag ctgaattgaa aggagagtaa ggaagcaggt tttacaggtc tacttgcact    29400
attcagagcc cgagtgtgaa tccctgctgt gctgcttgga gaagttactt aacctatgca    29460
aggttcattt tgtaaatatt ggaaatggag tgataatacg tacttcacca gaggatttaa    29520
tgagacctta tacgatcctt agttcagtac ctgactagtg cttcataaat gctttttcat    29580
ccaatctgac aatctccagc ttgtaattgg ggcatttaga acatttaata tgattattgg    29640
catggtaggt taaagctgtc atcttgctgt tttctatttg ttctttttgt tttctcctta    29700
cttttggatt tttttattct actatgtctt ttctattgtc ttattaacta tactctttga    29760
tttattttag tggttgtttt agggttatac ctctttctaa tttaccagtt tataaccagt    29820
ttatatacta cttgacatat agcttaagaa acttactgtt gttgtctttt tgctgttatg    29880
gtcttaacgt ttttatttct acaaacatta taaactccac actttattgt tttttaattt    29940
tacttataca gtcaattatc ttttaaagat atttaaatat aaacattcaa aacaccccaa    30000
t                                                                    30001
<210>  3
<211>  1031
<212>  DNA
<213>  homo sapiens
<400>  3
attcccggga tacgtaacct acggtgtccc gctaggaaag agaggtgcgt caaacagcga       60
caagttccgc ccacgtaaaa gatgacgctt ggtgtgtcag ccgtccctgc tgcccggttg      120
cttctctttt gggggcgggg tctagcaaga gcaggtgtgg gtttaggaga tatctccgga      180
gcatttggat aatgtgacag ttggaatgca gtgatgtcga ctctttgccc accgccatct      240
ccagctgttg ccaagacaga gattgcttta agtggcaaat cacctttatt agcagctact      300
tttgcttact gggacaatat tcttggtcct agagtaaggc acatttgggc tccaaagaca      360
gaacaggtac ttctcagtga tggagaaata acttttcttg ccaaccacac tctaaatgga      420
gaaatccttc gaaatgcaga gagtggtgct atagatgtaa agttttttgt cttgtctgaa      480
aagggagtga ttattgtttc attaatcttt gatggaaact ggaatgggga tcgcagcaca      540
tatggactat caattatact tccacagaca gaacttagtt tctacctccc acttcataga      600
gtgtgtgttg atagattaac acatataatc cggaaaggaa gaatatggat gcataaggaa      660
agacaagaaa aatgtccaga agattatctt agaaggcaca gagagaatgg aagatcaggg      720
tcagagtatt attccaatgc ttactggaga agtgattcct gtaatggaaa ctgctttcct      780
ctatgaaatt cccccgggtt cctggaggaa atagatatag gctgatacag ttacccaatg      840
atggatgaat attgggggac cgcctggtca ttgaaaggct ttcttttctc caggaaagaa      900
atttttttcc ttttccataa aaagcttggg aatggaagac aacaattccc attctttttt      960
tgcgttccac ccctatgtga caacagaaat ttttggggaa acaacaacga aaaaatttta     1020
tcccgcgcgc a                                                          1031
<210>  4
<211>  3244
<212>  DNA
<213>  homo sapiens
<400>  4
gggcggggct gcggttgcgg tgcctgcgcc cgcggcggcg gaggcgcagg cggtggcgag       60
tggatatctc cggagcattt ggataatgtg acagttggaa tgcagtgatg tcgactcttt      120
gcccaccgcc atctccagct gttgccaaga cagagattgc tttaagtggc aaatcacctt      180
tattagcagc tacttttgct tactgggaca atattcttgg tcctagagta aggcacattt      240
gggctccaaa gacagaacag gtacttctca gtgatggaga aataactttt cttgccaacc      300
acactctaaa tggagaaatc cttcgaaatg cagagagtgg tgctatagat gtaaagtttt      360
ttgtcttgtc tgaaaaggga gtgattattg tttcattaat ctttgatgga aactggaatg      420
gggatcgcag cacatatgga ctatcaatta tacttccaca gacagaactt agtttctacc      480
tcccacttca tagagtgtgt gttgatagat taacacatat aatccggaaa ggaagaatat      540
ggatgcataa ggaaagacaa gaaaatgtcc agaagattat cttagaaggc acagagagaa      600
tggaagatca gggtcagagt attattccaa tgcttactgg agaagtgatt cctgtaatgg      660
aactgctttc atctatgaaa tcacacagtg ttcctgaaga aatagatata gctgatacag      720
tactcaatga tgatgatatt ggtgacagct gtcatgaagg ctttcttctc aatgccatca      780
gctcacactt gcaaacctgt ggctgttccg ttgtagtagg tagcagtgca gagaaagtaa      840
ataagatagt cagaacatta tgcctttttc tgactccagc agagagaaaa tgctccaggt      900
tatgtgaagc agaatcatca tttaaatatg agtcagggct ctttgtacaa ggcctgctaa      960
aggattcaac tggaagcttt gtgctgcctt tccggcaagt catgtatgct ccatatccca     1020
ccacacacat agatgtggat gtcaatactg tgaagcagat gccaccctgt catgaacata     1080
tttataatca gcgtagatac atgagatccg agctgacagc cttctggaga gccacttcag     1140
aagaagacat ggctcaggat acgatcatct acactgacga aagctttact cctgatttga     1200
atatttttca agatgtctta cacagagaca ctctagtgaa agccttcctg gatcaggtct     1260
ttcagctgaa acctggctta tctctcagaa gtactttcct tgcacagttt ctacttgtcc     1320
ttcacagaaa agccttgaca ctaataaaat atatagaaga cgatacgcag aagggaaaaa     1380
agccctttaa atctcttcgg aacctgaaga tagaccttga tttaacagca gagggcgatc     1440
ttaacataat aatggctctg gctgagaaaa ttaaaccagg cctacactct tttatctttg     1500
gaagaccttt ctacactagt gtgcaagaac gagatgttct aatgactttt taaatgtgta     1560
acttaataag cctattccat cacaatcatg atcgctggta aagtagctca gtggtgtggg     1620
gaaacgttcc cctggatcat actccagaat tctgctctca gcaattgcag ttaagtaagt     1680
tacactacag ttctcacaag agcctgtgag gggatgtcag gtgcatcatt acattgggtg     1740
tctcttttcc tagatttatg cttttgggat acagacctat gtttacaata taataaatat     1800
tattgctatc ttttaaagat ataataatag gatgtaaact tgaccacaac tactgttttt     1860
ttgaaataca tgattcatgg tttacatgtg tcaaggtgaa atctgagttg gcttttacag     1920
atagttgact ttctatcttt tggcattctt tggtgtgtag aattactgta atacttctgc     1980
aatcaactga aaactagagc ctttaaatga tttcaattcc acagaaagaa agtgagcttg     2040
aacataggat gagctttaga aagaaaattg atcaagcaga tgtttaattg gaattgatta     2100
ttagatccta ctttgtggat ttagtccctg ggattcagtc tgtagaaatg tctaatagtt     2160
ctctatagtc cttgttcctg gtgaaccaca gttagggtgt tttgtttatt ttattgttct     2220
tgctattgtt gatattctat gtagttgagc tctgtaaaag gaaattgtat tttatgtttt     2280
agtaattgtt gccaactttt taaattaatt ttcattattt ttgagccaaa ttgaaatgtg     2340
cacctcctgt gccttttttc tccttagaaa atctaattac ttggaacaag ttcagatttc     2400
actggtcagt cattttcatc ttgttttctt cttgctaagt cttaccatgt acctgctttg     2460
gcaatcattg caactctgag attataaaat gccttagaga atatactaac taataagatc     2520
tttttttcag aaacagaaaa tagttccttg agtacttcct tcttgcattt ctgcctatgt     2580
ttttgaagtt gttgctgttt gcctgcaata ggctataagg aatagcagga gaaattttac     2640
tgaagtgctg ttttcctagg tgctactttg gcagagctaa gttatctttt gttttcttaa     2700
tgcgtttgga ccattttgct ggctataaaa taactgatta atataattct aacacaatgt     2760
tgacattgta gttacacaaa cacaaataaa tattttattt aaaattctgg aagtaatata     2820
aaagggaaaa tatatttata agaaagggat aaaggtaata gagcccttct gccccccacc     2880
caccaaattt acacaacaaa atgacatgtt cgaatgtgaa aggtcataat agctttccca     2940
tcatgaatca gaaagatgtg gacagcttga tgttttagac aaccactgaa ctagatgact     3000
gttgtactgt agctcagtca tttaaaaaat atataaatac taccttgtag tgtcccatac     3060
tgtgtttttt acatggtaga ttcttattta agtgctaact ggttattttc tttggctggt     3120
ttattgtact gttatacaga atgtaagttg tacagtgaaa taagttatta aagcatgtgt     3180
aaacattgtt atatatcttt tctcctaaat ggagaatttt gaataaaata tatttgaaat     3240
tttg                                                                  3244
<210>  5
<211>  761
<212>  DNA
<213>  homo sapiens
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (693)..(693)
<223>  n is a, c, g, or t
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (722)..(722)
<223>  n is a, c, g, or t
<400>  5
cacgaggctt tgatatttct tacaacgaat ttcatgtgta gacccactaa acagaagcta       60
taaaagttgc atggtcaaat aagtctgaga aagtctgcag atgatataat tcacctgaag      120
agtcacagta tgtagccaaa tgttaaaggt tttgagatgc catacagtaa atttaccaag      180
cattttctaa atttatttga ccacagaatc cctattttaa gcaacaactg ttacatccca      240
tggattccag gtgactaaag aatacttatt tcttaggata tgttttattg ataataacaa      300
ttaaaatttc agatatcttt cataagcaaa tcagtggtct ttttacttca tgttttaatg      360
ctaaaatatt ttcttttata gatagtcaga acattatgcc tttttctgac tccagcagag      420
agaaaatgct ccaggttatg tgaagcagaa tcatcattta aatatgagtc agggctcttt      480
gtacaaggcc tgctaaagga ttcaactgga agctttgtgc tgcctttccg gcaagtcatg      540
tatgctccat atcccaccac acacatagat gtggatgtca atactgtgaa gcagatgcca      600
ccctgtcatg aacatattta taatcagcgt agatacatga gatccgagct gacagccttc      660
tggagagcca cttcagaaga agacatggct cangatacga tcatctacac tgacgaaagc      720
tntactcctg atttgaatat ttttcaagat gtcttacaca g                          761
<210>  6
<211>  1901
<212>  DNA
<213>  homo sapiens
<400>  6
acgtaaccta cggtgtcccg ctaggaaaga gaggtgcgtc aaacagcgac aagttccgcc       60
cacgtaaaag atgacgcttg atatctccgg agcatttgga taatgtgaca gttggaatgc      120
agtgatgtcg actctttgcc caccgccatc tccagctgtt gccaagacag agattgcttt      180
aagtggcaaa tcacctttat tagcagctac ttttgcttac tgggacaata ttcttggtcc      240
tagagtaagg cacatttggg ctccaaagac agaacaggta cttctcagtg atggagaaat      300
aacttttctt gccaaccaca ctctaaatgg agaaatcctt cgaaatgcag agagtggtgc      360
tatagatgta aagttttttg tcttgtctga aaagggagtg attattgttt cattaatctt      420
tgatggaaac tggaatgggg atcgcagcac atatggacta tcaattatac ttccacagac      480
agaacttagt ttctacctcc cacttcatag agtgtgtgtt gatagattaa cacatataat      540
ccggaaagga agaatatgga tgcataagga aagacaagaa aatgtccaga agattatctt      600
agaaggcaca gagagaatgg aagatcaggg tcagagtatt attccaatgc ttactggaga      660
agtgattcct gtaatggaac tgctttcatc tatgaaatca cacagtgttc ctgaagaaat      720
agatatagct gatacagtac tcaatgatga tgatattggt gacagctgtc atgaaggctt      780
tcttctcaag taagaatttt tcttttcata aaagctggat gaagcagata ccatcttatg      840
ctcacctatg acaagatttg gaagaaagaa aataacagac tgtctactta gattgttcta      900
gggacattac gtatttgaac tgttgcttaa atttgtgtta tttttcactc attatatttc      960
tatatatatt tggtgttatt ccatttgcta tttaaagaaa ccgagtttcc atcccagaca     1020
agaaatcatg gccccttgct tgattctggt ttcttgtttt acttctcatt aaagctaaca     1080
gaatcctttc atattaagtt gtactgtaga tgaacttaag ttatttaggc gtagaacaaa     1140
attattcata tttatactga tctttttcca tccagcagtg gagtttagta cttaagagtt     1200
tgtgccctta aaccagactc cctggattaa tgctgtgtac ccgtgggcaa ggtgcctgaa     1260
ttctctatac acctatttcc tcatctgtaa aatggcaata atagtaatag tacctaatgt     1320
gtagggttgt tataagcatt gagtaagata aataatataa agcacttaga acagtgcctg     1380
gaacataaaa acacttaata atagctcata gctaacattt cctatttaca tttcttctag     1440
aaatagccag tatttgttga gtgcctacat gttagttcct ttactagttg ctttacatgt     1500
attatcttat attctgtttt aaagtttctt cacagttaca gattttcatg aaattttact     1560
tttaataaaa gagaagtaaa agtataaagt attcactttt atgttcacag tcttttcctt     1620
taggctcatg atggagtatc agaggcatga gtgtgtttaa cctaagagcc ttaatggctt     1680
gaatcagaag cactttagtc ctgtatctgt tcagtgtcag cctttcatac atcattttaa     1740
atcccatttg actttaagta agtcacttaa tctctctaca tgtcaatttc ttcagctata     1800
aaatgatggt atttcaataa ataaatacat taattaaatg atattatact gactaattgg     1860
gctgttttaa ggcaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a                         1901
<210>  7
<211>  562
<212>  DNA
<213>  homo sapiens
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (166)..(166)
<223>  n is a, c, g, or t
<400>  7
agacgtaacc tacggtgtcc cgctaggaaa gagagatatc tccggagcat ttggataatg       60
tgacagttgg aatgcagtga tgtcgactct ttgcccaccg ccatctccag ctgttgccaa      120
gacagagatt gctttaagtg gcaaatcacc tttattagca gctacntttt gcttactggg      180
acaatattct tggtcctaga gtaaggcaca tttgggctcc aaagacagaa caggtacttc      240
tcagtgatgg agaaataact tttcttgcca accacactct aaatggagaa atccttcgaa      300
atgcagagag tggtgctata gatgtaaagt tttttgtctt gtctgaaaag ggagtgatta      360
ttgtttcatt aatctttgat ggaaactgga atggggatcg cagcacatat ggactatcaa      420
ttatacttcc acagacagaa cttagtttct acctcccact tcatagagtg tgtgttgata      480
gattaacaca tataatccgg aaaggaagaa tatggatgca taaggaaaga caagaaaatg      540
tccagaagat tatcttagaa gg                                               562
<210>  8
<211>  798
<212>  DNA
<213>  homo sapiens
<400>  8
gggctctctt ttgggggcgg ggtctagcaa gagcagatat ctccggagca tttggataat       60
gtgacagttg gaatgcagtg atgtcgactc tttgcccacc gccatctcca gctgttgcca      120
agacagagat tgctttaagt ggcaaatcac ctttattagc agctactttt gcttactggg      180
acaatattct tggtcctaga gtaaggcaca tttgggctcc aaagacagaa caggtacttc      240
tcagtgatgg agaaataact tttcttgcca accacactct aaatggagaa atccttcgaa      300
atgcagagag tggtgctata gatgtaaagt tttttgtctt gtctgaaaag ggagtgatta      360
ttgtttcatt aatctttgat ggaaactgga atggggatcg cagcacatat ggactatcaa      420
ttatacttcc acagacagaa cttagtttct acctcccact tcatagagtg tgtgttgata      480
gattaacaca tataatccgg aaaggaagaa tatggatgca taaggaaaga caagaaaatg      540
tccagaagat tatcttagaa ggcacagaga gaatggaaga tcagggtcag agtattattc      600
caatgcttac tggagaagtg attcctgtaa tgggactgct ttcatctatg aaatcacaca      660
gtgttcctga agaaatagat atagctgata cagtactcca tgatgatgat atttggtgac      720
agctgtcatg aaaggctttc ttctcaagta ggaatttttt cttttcataa aagctgggat      780
gaagccagat tcccatct                                                    798
<210>  9
<211>  169
<212>  DNA
<213>  homo sapiens
<400>  9
aaacagcgac aagttccgcc cacgtaaaag atgatgcttg gtgtgtcagc cgtccctgct       60
gcccggttgc ttctcttttg ggggcggggt ctagcaagag cagatatctc cggagcattt      120
ggataatgtg acagttggaa tgcggtgatg tcgactcttt gcccaccgc                  169
<210>  10
<211>  176
<212>  DNA
<213>  homo sapiens
<400>  10
aaaacgtcat cgcacataga aaacagacag acgtaaccta cggtgtcccg ctaggaaaga       60
gaggtgcgtc aaacagcgac aagttccgcc cacgtaaaag atgacgcttg atatctccgg      120
agcatttgga taatgtgaca gttggaatgc agtgatgtcg actctttgcc caccgc          176
<210>  11
<211>  30001
<212>  DNA
<213>  macaca mulatta
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (26113)..(26155)
<223>  n is a, c, g, or t
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (28797)..(29186)
<223>  n is a, c, g, or t
<400>  11
aatctctaag caattttttg gggaagaaag aattgcaatt agggcatacg tgtagatcag       60
atggtcttcg gtatatccaa cgacaaagaa aaggtgggag gtttcgttaa aaaagagaaa      120
tgttacatag tacttttaga gaaaattcac tggcactatt aagggtctga ggagctggta      180
agtttcaatt ggtgagtgat ggtggtagat aaaattagag ctgcagcagg tcatttcagc      240
aactatcaga taaaactggt ctcaggtcac aacgggcagt ttcagcagct agacttgaaa      300
gaattacact gcgggagcaa tgtcatttgt cctgcatgct tttctacccc ctacccccac      360
ttttttagtt gggtataaca agaacgaccc aaattgtatg atcaactttc acaaagcata      420
gaacagtagg aaaagggtct gtttctgcag aagatgtaga cgttgagagc cattttatgt      480
atttatttct ccctttcttc atcggtgaat gattaaaatg ttctgtatga tttttagtga      540
tgagaaaggt taaacgccac tcatctgtag taagtgtaat ctacacactt gcagaccaaa      600
aggcataagg tttaaaaaac ctttgttttt ttacacatca aacagagtgg tataaatgct      660
actcatctgt agtaagtgaa atctatacac ctgcagacca acgacgcaag gtttcaaaaa      720
tctttgtgtt ttttacacat caaacagaat ggtacatttt tcaaaagttt aaaaaaaaaa      780
aaaatccaca tatcacaact agcaaaaatg acattcccca gtgtgaaaat catgcttgag      840
agaattctta catgtaaagg caaaattgca gtgactttac aagggacctg gggattcccg      900
cccacagtgt ggagctgtcc cctaccaggg tttgcggcgg agttttgaat gtacttaaca      960
gtgtctcacg gtaaaaacaa aacttcatcc accaaatatt tgttgagcgc ccactgcctg     1020
ccaagcacaa acaaaaccat tcaaaaccac gaaatcgtct gcactttctc cggatccagc     1080
agcctctgcg attaaggttt gcacacgcta ttgcgccaac gctcctccag agcgcgtctt     1140
aagataaaag aatgggacaa gttgcccctc cccctttcac gggcctcgtg cgtcaacgtc     1200
atcgcatata gaaaacacac agacgtaacc tacggtgtcc cgctaggaaa gagaggcgcg     1260
tcaaacagcg acaagttccg cccacgtaaa agatgacgct tggtgcgtca gccgtccctg     1320
ctgcccggtt ccttctctct gggggcgggg cctggctaga gcaggtgtgg gtttaggagg     1380
tgtgtgtttt tgtttttcct accctctccc ctctacttgc tctcacagta ctcgctgagg     1440
gtgaacaaga aaagacctga taaagattaa ccagaagaaa acaaagaggg aaacaactgc     1500
agcctgtagc gggctctgga gcttaagaga ggcgcgctag gcgccgggcc gtgggcgtgg     1560
tcggggcggg gtcgggccag gggcggggct gcggttgcgg tccctgcgcc cgcggcggcg     1620
gcggcggcgg cagcggaggc gcaggcggtg gcgagtgggt gagtgaagag gcggcgtcct     1680
ggcgggtgtc tgtttggcgt ccggttgccg ggaagagacg cgggtagcag ccggggctct     1740
cctcagagct cgacacattt ttactttccc tctcgtttct ctgaccgaag tcgggtgtcc     1800
ggctttcgcc tctagcgact ggtggaattg cctgcatctg ggccccgggc ttcgcggcgg     1860
cgcagggacg agggatggga atctggcctc ttcctcgctt tcccgcccgc agtgcgctgc     1920
cccagctgtc tccttcccgg ggacctgctg ggagcgctgc cgctacagac tcgagagaaa     1980
ggagcctcgg gcactgagag gcctcgcccg ggggaaggcc ggagggcggg cggcgggcgg     2040
cgagcggctc ctgcggacca agtctgggtt ctctgggaac ccgagacggt ccctgatggc     2100
gaggagatca tgcggggtgc tatgggggtg tggagacgtc tgcagaattt tagcccaagc     2160
ttctaaggag tgctgatgac ttgcatatga gggcagcaat gccagtcggt gtactcccta     2220
ttctgtggga catgatgtgg ttgcttcaca gctccgagat gacacagact tgcttaaagg     2280
aagtgaccat tgtgacttgg gcatcacttg actgatggta atcagttgca gacagaagtg     2340
cacagattac atgtctgtgt ccacactgga tcagtctggc cacgaggaac accacaggct     2400
ttgtattgag aaacaggagg gaggtcctgc actttcccag gaggggtggc cctttcagat     2460
gcaatcgaga ttgttaggct ctggtagagt ggttgcctgg ttgtggcagt tggcaaattc     2520
ctattcaaac tgttgccgtg cgtcaccagt taacaacaag ggtacacgat ctgtctggca     2580
ttacttctac tttgtacaaa ggatcaaaaa tactgttaga tatgattttt ctcagacttt     2640
gggaaacttt taacgtaatc tgtgaatatc acagaagcaa gactgtcata tagaggatat     2700
taataacctg gagtcagaat acttgaaata tggtgtcatt tgacacgggc tctgttatca     2760
ccacctttgc caagcccttt cacttgagga aaaccctcaa tcagttggaa actgcctcat     2820
gctgacagta catctgaaac aaaaacgaga gtagttacca cattccagat tgttcactaa     2880
ggcagcattt atctgctcca ggaaaacatt acaagcaact tatgaagttg ataaaatatt     2940
ttgtttggct atgttggtac tccaaaagtt gctttcagag aaacaaagta aaccaaggag     3000
gacttctgtt gttcacgtct gcccttgggc tctattctac gttaattagg tagttcccag     3060
gaggactaga ttagcctacc tattgtctga gaaacttgga tctgtgagaa atggccagat     3120
agtgatacga acttcacctc ccagtctttc ctgatgttta agattgagaa agtgttgtga     3180
actttctggt gctgtaagca gttcactgtc cttaaagtgg tcctgggcag ctcctgttgt     3240
ggaaagtgga ccgatttagg attctgcttg gctttggact gggagaaaat aaactgcatg     3300
gttacaagta ttgagagcca agttggagaa ggtggcttac acctataatg ccagagcctt     3360
aggaggcagg ggcaagagga tcactggaag tcaggagttc aagcccaacc tgggcagcct     3420
agaccctgtc tctacaaaaa attaaaaact tagccgggcg cggtggtgtg cacctgtagt     3480
cctagctact tgggaggctg aggcaggagg gtcttttgag cccaggagtt tgaagttaca     3540
gggagctatg atcctgccag tgcactccag cctggatggc aaaacgagac cctgtctcta     3600
aaaaacaaga agtgagggct ttatgatcgt agaaattttg cttacaatag cagtggacca     3660
accacctttc taaataccaa tcagggaaga catagttgat ttttaacaaa catttaaaga     3720
aaaagcaaaa cctcaaactt agcactctac taacagtttt agccgatgct aattaaggta     3780
atcatgtctg catatatggg attactttca gaaagtgtat tgggaaacct ctcatgaacc     3840
ctgtgcaacc ctgagcaagc caccgtctca ctcagtttga atcttggctt ccctcaaaag     3900
actctgtggc taatgtttgg taactctctg gagtagccag cactgcatgt acataggata     3960
ggtacataaa acaattattg gttttgagct gatttttttc agctgcattt gcgtgtatgg     4020
atttttctca ccaaagacaa tgacttcaag tgttaataaa ataattgtac agctctccta     4080
attatacttc tctgtaacat ttcatttctc agactatttc ttttggtagg atttaaaact     4140
aaacaattca gtatgatctt tgttcttcat tttctttctt attctttttt ttttcgagac     4200
agagtctccc tctgttgtgc catctcagcc cattgcaacc tccgccacct gggttcaagt     4260
gattctcctg cctcagcctc ctgagtagct gggattacag gtgcccgcca ccacacctac     4320
ctaatttttt gtatttttag tagaggcggg gtttcaccat gttggctagg ctggtcttaa     4380
actcctgacc tcagatgatc cacctgcctc ggcctcccaa agagctggga tgataggcgt     4440
gacccaccat gcccgcccca ttttttttct tattctgtta ggagtgagag tgtaactagc     4500
agtctataat agttcaattt tcacaacgtg gtaaaaattt tccctgtaat tcaacgagat     4560
tttgcttcag ggctcagttc tgttttagga aatactttta ttttcagttt gatgatgaaa     4620
tattagagtt gtgatattgc ctttatgatt acctaccttt ttaacctaaa agaatgaaag     4680
aaaaatatgt ttacagtata attgtatggt tgcgtgttaa cttaattcat tatgttggcc     4740
tccagtttgc tgttgttcgt tatgacagca gtagtgtcat taccatttca attcagatta     4800
cattcctgta tttgatcatt gtaaactgat tgcttaaatt gtattaaaaa cagtggatat     4860
tttaaacaag ctgtactgct tatatccagt gctgtctcct aagactatta aattgatata     4920
acatatttaa aagtaaatat ttcctaaatg aatttttgaa attaaaaata cacgtgttaa     4980
aactgtcttt gtgttcaacc atttctgtac gtacttagag ttaactgttt tgccaggctc     5040
tgtatgccta ctcataatgt gataaaagca ctcatctaat gctctataaa tagaagtcag     5100
tgctttccat cagactgaac actcttggca agatgtggat aaaattattt aagtaaaatt     5160
gtttactttg tcatacattt acagatcaaa tgttagctcc caaagcaatc atatggcaaa     5220
gataggcata tcataatttg cctattagct gctttgtatt gctattatga tagatttcac     5280
agttttagat ctgcttagat gaaaatgtaa ttctttttac tgtcagtctt agatataagt     5340
cttcaattat agtacagtca cacattgctt aggaatgcat cattaggcga ttttgtcatt     5400
atgcaaacat catagagtat acttacataa acctatatag tacagccttt acgtacgtag     5460
gccatatggt atagtctatt gctcctaggc tacaaatctg tacagctgtt actgtactga     5520
atactataga cagttgtaac acagtggtat ttatttatct aaatatatcc aaacatagaa     5580
aaggtacagt taaagtatgg tataaaaaat aatgatatac ctatataggc cacttaccgt     5640
gaatggagct tgcaggacta gaagttgctc tgggtgagtc agtaagtaag tggtgaatga     5700
atgtgaaggc ctagaacatt actgtacaca ctgtagactt tataaacaca gtatgcttaa     5760
gctacaccaa atttatcttt acagtttttc ttcaataaaa aattaatgtg aacctactat     5820
aactttttaa ctttgtaaac tttttaattt tttaactttt aaaatactta gcttgaaaca     5880
caaacacgca tagctataca aaaatatttt ttctttatat ccttattcta gaagcttttt     5940
cctattttta actttttttt ttttacttgt tagtcgtttt tgttaaaaac taaaacacac     6000
acactttcac ctaagcatag acaggattag gatcatcagt ttcactccct tccacctcac     6060
tgccttccac ctccacatct tgtcccactg gaacgttttt agggggaata acacacatgt     6120
agctgtcacc tgctatgata acagtgcttt ctgttgaata cctcctgaag gacctgcctg     6180
aggctgtttt acatttaact taaaaaaaaa aataagtaga aggagtacac tctaaaataa     6240
caataaaagg tatagtctag tgaatacata aaccagcaac atagtagttt attatcaagt     6300
gttgtatact gtaataattg tatgtgctat actttaaatg acttgaaaaa ttgtactaag     6360
accttatgat ggttacagtg tcactaaggc gatagcatat tttcaggtcc attgtaatct     6420
aatgggacca ccatcatata tgcagtccac cattgactga aatgttacat ggtacgtaac     6480
tgtatttgca agaatgattt gttttacatt aatatcacat aggatgtacc tttttagagt     6540
gatatgttta tgtggattaa gatgtacaag tggagcaagg ggacaagagc ccttggttct     6600
gtcttggatg tgagctttta tgctcttctc atcatgtctg ttttcttatt aaattcaaag     6660
gcttggacag gccctattta gcccttgttt tctatgtgtt ctaaataact aaagctttta     6720
aattctagcc atttagtgga gaactctctt tgcaatggta aaatgctgta ttggtttctt     6780
gactagcata ttaaatatat ttatctttgt cttgatattt caatgtcatt ttaaacatca     6840
ggattgggct ttagtattct catacccaga gagttcactg aggatacagg actgtttgcc     6900
cattttttgt tatggctcca gacttgtggt atttcgatgt cttttttttt tttttttttt     6960
tttaaccttt tagcagcttt aaagtatttc tgttgttagg tgttgtatta cttttctaag     7020
attactgtaa caaagcacca caaactgagt ggctttaaac aacagcaatt tattctctca     7080
caattctaga agctagaagt ccgaaatgga agtgttgatg gggcatgatc ctcaaaagag     7140
agaagactct ttccttgcct cttcctggct tctggtggtt accagcaatc ctgagcgttc     7200
ctttcttgct tcgtagtttc agcagtccag tatctgcctt ttgtcttcac atggatgtct     7260
accccttgtc tctgtgtctc cagatctctc tccttataaa cacagaagtt actggattag     7320
gccccactct aatccagtat gaccccattt taacacgatt acacctattt ctaaataagg     7380
tcacattcac atataccaag ggttaggaat tgagcatatc ttttgcaggg acacaattca     7440
acccacaagt gtcagtctct agctgagcct ttcccttcct ggttttctcc tttttagttg     7500
ctgtgggtta ggggccaaat ctccagtcat actagacttg cacatggact ggagatttgg     7560
gaatactgcg ggtctattct atgagcttta gtatgtaaca tttaatatca gtgtaaagaa     7620
gccatttttt cagttcacta tttctttgaa tttcttaatg tatgccctga atataagtaa     7680
caagttacta tgtctcataa aatgatcata tcaacaaaca tttaatgtgc acctactgtg     7740
ctagttgaat gtctttatcc tgataggaga taacaggctt ccgcatcttt gacttaagag     7800
gacaaaccaa gtatgtctga atcatttggg gttttgatgg atatctttaa attgctgaac     7860
ctaatcattg gttttatatg tcattgttta gatatctcag gagcatttgg ataatgtgac     7920
agttggaatg cagtgatgtc gactctttgc ccaccgccat ctccagctgt tgccaagaca     7980
gagattgctt taagtggtga atcaccttta ttagcagcta cttttgctta ctgggacaat     8040
attcttggtc ctagagtaag gcacatttgg gctccaaaga cagaacaggt acttctcagt     8100
gatggagaaa taacttttct tgccaaccac actctaaatg gagaaatcct tcgaaatgca     8160
gagagtggtg ctatagatgt aaagtttttt gtcttgtctg aaaagggagt gattattgtt     8220
tcattaatct ttgatggaaa ctggaatggg gatcgcagca catacggact atcaattata     8280
cttccacaga cagaacttag tttctacctc ccacttcata gagtgtgtgt tgatagatta     8340
acacatataa tccggaaagg aagaatatgg atgcataagg taagtgattt ttcagcttat     8400
taatcatgtt aacctatctt ttgaaagctt attttctgat acatataaat cttattttta     8460
aattatatgc agtgaacatc aaacaataga tattatttat tttgcattta tcctgttaga     8520
tacaaataca tctggtctga tgcctgtcat cttcatatta actgtggaag gtaggaaatg     8580
gtagctccac attacagatg aaaagctaaa gcttaaacaa atgcagaaac ttttagatcc     8640
tggattcttc ttgggagcct ttgactctaa taccttttgt ttccctttca ttgcacaatc     8700
ctgtctttcg cttactacta tgtgtaagta taacagttca aaaaaatagt ttcataagct     8760
gttggttatg tagcctttgg tctctttaac ctctttgcca agttcccagg ttcataaaat     8820
gaggaggttg aaccgcatgg ttcccaagag aattcctttt aattttacag aaattattgt     8880
tttccccgaa gtcctatagt tcaatatata atgatattta catttcagta tagttttggc     8940
atatctaaag aacacattaa gttctccttc ctgtgttcca gtttgatact aacctggaag     9000
tccattaagc attaccaatt ttaaaaggct tttgcccaat agtaaggaaa aataatatct     9060
tttaaaagaa taatttttta ctatgtttgc aggcttactt ccttttttct cacattatga     9120
aactcttaaa atcaggagaa tcttttaaac atcataatgt ttaatttgaa aagtgcaagt     9180
cattcttttc ctttttgaaa ctatgcagat gttacattga ctattttctg tgaagttatc     9240
ttttttttcc ctgcagaata aagggtgttt tgattttatt ttgtgttgtt tataagaaca     9300
tacattcgtt gggttaattt cctgcccctg cccccgtttt ttccctaaag tagaaagtat     9360
ttttcttgtg aactaaatta ctacacaaga acatgtctat tgaaaaataa gtatcaaaat     9420
gttgtgggtt gtttttttaa ataaattctt tcttgctcag gaaagacaag aaaatgtcca     9480
gaagattatc ttagaaggca cagagagaat ggaagatcag gtatatgcag attgcatact     9540
gtcaaatatt attctcatgg catgtatctg tgtaaagttg atggctacat ttgtgaaggc     9600
cttggggaca tacagagtaa gccttaatgg agcttttatg gaggtgtaca gaataaacta     9660
gaggaagatt tccatatctt agacctgaag agttaaatca gtaaacaaag gaaaatagta     9720
attgcatcta caaattaata tttgctccct ttttttttct gtttgaacag aataaatttt     9780
ggataacttg ttactagtaa aaaatttaaa aattgtctgt gatatgttct ttaaggtact     9840
acttctcgaa ctttttccta gaagtagctg taacaggagg agagcatatg tacccctaag     9900
gtatctgggg tataggccca tgtccaaaca atatttcttt taagtcttgt gttgtatctt     9960
taagactcat gcaatttaca ttttattcca tgatataact attttaatat taaaatttgt    10020
cagtgatatt tcttaccctc tcctctagga aaatgtgcca tgtttatact ttggctttga    10080
gtgcccctga ggaacagaca ctagagtttg agaagcatgg ttacacaggc gtggcttccc    10140
ctgcagaaat taagtacaga ctatttcagt gtaaagcaga gaagttcttt tgaaggggaa    10200
tctccagtga agaaagggtt cttcactttt acttccattt cctcttgagg gtgaccctca    10260
ttgctccttg taaaactccg atattttaaa catggctgtt ttgctttcct ctggttcttt    10320
ttaacatgag tgagacagat gatactttaa aaagtaattt taaaaaaaag tgttaaaata    10380
tatggccata atgcagaacc ctatgctgtg atctccttta ccaaattgtt gtgtttgtac    10440
ttttgtagat agctttccag tccagagaca gttattctgt gtaaaggtct gactcaacaa    10500
gaaaagattt ccctttaccc aaagaatgcc agtctttatt tgctggtcaa taagcagggt    10560
ccccaggaaa ggggtaactt tcaccaccct ctaacccact ggttattagt aaactaatta    10620
agtagactta tctcaagatg aggaaactta aaaccaagta aaattctgct tttactggga    10680
ttttattttt tgaaaccaga aacgtttact taagttgact actattaatg aattttggtc    10740
tctcttttaa gtactcttct taaaaatgtt atcctactgc tgagaagttc aagtttgaga    10800
agtacaagga ggaatagaaa cttgagagat tttctttttc ttttagagcc tcttctgtat    10860
ttagccctgt aggaattttt tttttccccc aagattcttc ttcgtgaaaa ggaggagttg    10920
ccttttgatt gagttcttgc aaatctcaca acgactttat tttgaacaat actgtttggg    10980
gatgatgcat gagtctgaaa caacttcagt tgtagctgtc atctgataaa attgcttcac    11040
agggaaggaa atttagcacg gatctagtca ttattcttgt tagattgaat gtgttaatca    11100
taattgtaaa caggcatgat aattattact ttaaaaactg aaaacagtga atagttagtt    11160
gtggaggtta ctaaagcatg atttttttaa aataaaactt tcagcatttt gcaaatatgc    11220
atatggttta ggatagaact tccagaggta gcatcacatt taaattctca agcaacttag    11280
taatacgagg ctctgaaaaa ctggttaaag ttactccaga aatggccctg ggtctgacag    11340
acattctaac ttaaagatgc atatgaagac tttgaataaa atcatttcat atgaagacat    11400
tgaataaaat catttcataa aataagtgag gaaaaacaac tactattgaa ttcatcttaa    11460
tgtatgattt taaaaatatg tttagctaaa aattcataga catttgacaa tttcgtttat    11520
atctcaaaaa gttgacttac ccaagttgat cacaaaactg atgagactgg tggtggtagt    11580
gaataaatga gggaccaccc atatttgaga cactttacat ttgtgatgtg ttatactgaa    11640
ttttcagttt gattctataa actaccaatt tcaaaattac aatttcaagg tgtaataagt    11700
agtggtatta tcttgaaata ggtctaaagg gaacttttct gttttaaaat attcttaaac    11760
tatatgtgct gattttgatt tgcatttggg tagattatac tcttatgaat cggggggctg    11820
ggtattgatt caggttttcc ttacctattt ggtaaggatt tcaaagtctt tttgtgcttg    11880
attttcctcg tttttaaata tgaaacatat tgatgacttt taattaacaa atgtttttat    11940
ctcgaataaa ttttaaagga gatcttttct aaaagaggta tgatgactta attattgcat    12000
ataacaataa atgagaaacc agtgattcca tactctctaa agaataaaag tgagctttag    12060
gcccaggcat ggtggctcat gcctgtaatc ccagcacttt ggaaggccga ggcaggcgga    12120
tcacctgagg tcaggaattc gacaccagcc tggccaaatg gcaaaaccct gtctctacta    12180
caaatacaaa aattagctgg gcatggtggc agcccctata gtcccagcta cttggaagac    12240
tgagacagga gagtcactcg aacccgagag gcagaggttg cagtaagctg aaatcacacc    12300
attgcactcc agcctgggca acaagagcaa aactccgtct caaaaaaaaa aaaaaaaaaa    12360
aaaaagaata aaagtgagct ttggattgcg tataaatcct ttagacaagt agtagacttg    12420
tttgatactg tgtttgaaca aattacaaag tattttcatc aaagaatgtt attgtttgct    12480
gttattttta ttttttattg cccagcttct ctcatattca ttatgtgatt ttcttcactt    12540
catgttactt tattgtgcag ggtcagagta ttattccaat gcttactgga gaagtgattc    12600
ctgtaatgga actgctttca tctatgaaat cacacagtgt tcctgaagaa atagatgtaa    12660
gtttttatat ttttaaatga gagcaattat accctttatc agttttttgg ggttatatta    12720
ttattatgta tattattaat attctaattt taatactaag cacttcgtcg tacgtactat    12780
ccacatgcag tattagccac ttgaacagat aagcacacac aaaatcctgg attttatggc    12840
ataacagagg catttttgat cagtgatgac aaaactaaat ttattttgtt tatttcacta    12900
cttttataat tcctaaaagt gggaggatcc cagctcttat aggagcaatt aatatttaat    12960
gcagtacctt ttgaaacaaa actgtgtgcc aaagcagtaa ccattaatgg aagttgactt    13020
atagtcacaa atttagtttc cttaatcatt tgttgaggat gttttgaatc acacactatg    13080
agtgttaaga gatatcttta ggacactatt cttgttgttt tattgtcatt taggttagtc    13140
tcctgtctga cagctcagaa gaggaagttg ttcttgtaaa aattgtttac acaacctgat    13200
tgaccagctt tcacatttgt tcttctgaaa gctgatggta gtgcacagat tgttttatgg    13260
ggagtcttga ttctcagaaa tgaaggcagt gtgttatatt gaatccagac ttcagaaaac    13320
ttgtatatta aaagtgtttt ttcaacacta tgttatagcc agactaattt ttttattttt    13380
ttgatgcatt ttagatagct gatacagtac tcaatgatga tgatattggt gacagttgtc    13440
atgaaggctt tcttctcaag taagaatttt tcttttcata aaacctggat gaagcatatg    13500
ttcacctatg acaagatttg gaaggaagaa aataacagac tgtctactta gattgttcta    13560
gggacaacat tgcatatttg aattgttgct taaatttgtg ttatttttca ttcgttatat    13620
ttctataata tatttgatgt tattccattt gctatttaaa gaaactgagt ttccatattt    13680
cccagacaag aaatcatggc cccttgcttg attctggttt cttgttttac ttctcattaa    13740
agctaaaaga accctttcaa attaagttgt actgtagatg aacttaagtt atttaggcct    13800
agaaaaaaaa aattcatatt tatactgatc tttttccatc cagcagtgga gtttagtact    13860
taagagtttg tgcccttaaa ccagactccc tgggttaatg ctgtgtacct gtgggcaagg    13920
tccctgaatt ctctatacac ctatttcctc atctgtaaaa tggcaataat aataatagta    13980
cctaatgtat agagttgtta taagcattga gtaagataaa taatataaag cacttagaac    14040
agtgcctgga acataagaac acttaataat agctaacatt ttctatttac atttcttcta    14100
aggaaaaggt taacagaaat agccaatatt tgttcagtgc ctacatgtta gttcctatac    14160
taagtgcttt acatgtatta tcttatattc tattttaatg tttcttcaca gttgcagatt    14220
atcatgaaat tttatttttt aaaaaagaga agtaaaagga taaagtattc acttttatgt    14280
ccacagtctt ttcctttagg ctcatgatgg agtatcagag gcatgaatgt gtttaaccta    14340
agagccttaa tggcttgaat cagaagcact ttagtcctgt atctgttcag tgtcagcctt    14400
tcaaacatca ttttaaatcc catttgactt taagtaaatc acttaatctc tctacatgtc    14460
aatttcttca gctataaaat gatggtattt caataaataa atacattaat taaatgatat    14520
tttacaaact aattgggctg ttttaaggct caataagaaa atttctgtga aaggtctcta    14580
gcaaatgtag ggttctatac aaataaaaga taacattatg cttatatctt cggtgtttat    14640
catgcaaagc tcttctgagt tttttgaaga gctcacctac tattttttgt ttttagtttg    14700
ttaaattgtt ttataggcaa tgtttttaat ctgttttctt taacttacag tgccatcagc    14760
tcacacttgc aaacctgtgg ctgttccgtt gtagtaggta gcagtgcaga gaaagtaaat    14820
aaggtagttt attttataat ctagcaaatg atttgactct ttaagactga tgatatatca    14880
tggattgtca tttaaatggt aggttgcaat taaaatgatc taatagtata aggaggcaat    14940
gtaatctcat cgaattgctg agacaacttg tggcaacagt gagtttgaaa taaagtgaat    15000
aggagtcatt tatcagttta ttttgataac ttgtaaatac cagtgtcaga tgtgtataaa    15060
tggttttgag aatatattaa aatcaggtat ttaaaaaaac actattcttc tatttcccaa    15120
tgtaatcttt aacaaatctg aaggtagtca tgtactttcg gtactagttc tgaagaaatg    15180
ttatttgttt attcatcttg atttcattgt cttggctttc cttctaaatc tatcccttct    15240
tgggagctat tgggattaag tggtcattga tgattatact ttattcagta atgtttctga    15300
ccctttcctt cagtgctact tgagttaata aaggattaat gaacagttac atttccaagc    15360
attagctaat aaactaaagg attttgcact tttcttcact gaccattagt taaaaacagt    15420
tcagagataa gtacatgtat ctttcaattc tagcaaacct aattttttaa aagaagtttt    15480
acataggaaa tatgttggaa atgattattt actttacaaa gatattcata atttattttt    15540
tctgtaacta gctactttgt atatttacat gagccttaat ttatcaaaat tatatttctc    15600
atataaccat ttatgagagc ttagtattcc tctgtcatta tattgcgtct acggactagt    15660
gatcttacta cttctgttac ctcgaacaag tggcttcccg tctgtgacct ccaaagccgt    15720
aggttccaca gagtgactgc tgagctgctt tatgaaggga gaaaggctcc atagttgggt    15780
ttttggtttt gcttttgttt ttgtttttaa catttttcct atcctccatc ctcttgaggc    15840
agagtagctt accttttatc ttgttttaat ttgagaaaga agttgccact gctctagatt    15900
gaaaaccact gctttaacat aataactctg aatatggttt gaatttcaag atagtgacat    15960
gcctttttat ttttactaat agagctgtag gtcgaatatt attagatttc taaaccccac    16020
ccaatgacct ccttatttta aatcaaattt aataattaat tatcttctta ttggaggatc    16080
tggacattct ttgatgtttc ttacaatgaa tttcacatgt agacccacta aacagaagtt    16140
ataaaggttc catggtcaaa taagtctgag aaagtctgca tattatataa ttcacctaaa    16200
gagtcacagt atgtacccaa atgttaaagg ttttgagatg ccatacagta aatttaccaa    16260
gcattttcta aatttatttg accacagaat ccctatttta agcaacaact gttatatccc    16320
ataggttcca ggtgactaaa gaatacttat tgcttaggat atgttttatt gataataaca    16380
attaaaatgt cagatatctt tcataagcag atcagtggtc tttttaaaac tttgtatttt    16440
aatgctaaaa tcttttcttt tgtagatagt cagaacatta tgcctttttc tgactgcagc    16500
agagagaaaa tgctccaggt tatgtgaagc agaatcatca tttaaatatg agtcagggct    16560
ctttgtacag ggcctgctaa aggtatagtt tctacttatc acaagggaaa ccaattttct    16620
aaaatcattt ttgagactct ttgtagacaa atattaaata ttagcattta atgtatctca    16680
tattgacatg cccagtgact gacttccttt gcacagttct gcgcatagac tatatgtctt    16740
atggatttat agttagtatc atcagtgtaa caccatagaa taccctttgt tttccaggtg    16800
ggtccctgta cctacatgtc tagcatcagg tgttgttttt tttttttttt tttaaaacat    16860
atgcttaaat caggttgcac atctaaaata agatcatttc tttttaacta aatagatttg    16920
aattttattg aaaaaaattt taaaacatct ttaagaagca tataggattt aagcagttac    16980
tatgtatgtg tactaaaata tatatatatt cctaaatata tattcctata tataatatat    17040
gtatttctat atataatata tattagaaaa aacttagagt tttctttcat ttgagtctac    17100
tgttcaagga gcaaaacaga gaaatgtaaa ttagcaatta tttacaataa ttaaagggaa    17160
gaaagttgtt caccttgttg gatctattat tgttgtttta attatagtcc caagacgtga    17220
agaaatagct ttcctaatgg ttatgtgatt gtctcatagt gactactttc ttgaggatgt    17280
agccacagca aaatgaaatt taaaaaattt aaaaattgtt gcaaataaaa gttatattag    17340
gcttttgtgc aatttcaata atgtgctgct atgaactcag aatgatagta tttaaatata    17400
gaaactagtt aaaggaaaca cagtttctat ttgagttata caaatctgta aattagaact    17460
tctcctgtta aggcattata aagtgcttaa tacttttgtt tcctcagcac cctctcattt    17520
aattatataa ttttagctct gaaagggacc tataccagat gtgtagagga aatttcaaaa    17580
ctatgatcta atgaaaaaat atttaatagt tctccatgca aatacaaatt atatagtttt    17640
ctggaaaata cctttgacat tatacaaaga tgattatcac agcattataa tagtgaaaaa    17700
atggaaatag cctctttctt ctgttctgtt cacagcatat ggcacagtac ctcatatgca    17760
gtaggttatt atgacctggt aactggctcc cccaactgat taggaaagaa gtaaatttgt    17820
tatttataaa aatacgtgtt cattgagatg catagaataa ttaagaaatt aaaagacact    17880
tgtaatttca aatccagtga atacccactg ttaatatttg gcatatctct ttctagtctt    17940
tttttccctt ttgcatgtat tttctttaag actcccaccc ccactggatc atctctgcat    18000
attctaatct gcttttttca cagcagattc taagcctttt tgcatatcaa cacaaacttc    18060
aacaacttca tctttagatg ctaaataatg aattcatttt tatttactta accactttct    18120
ttggatgctc aggttattct gatgttttgc cattaaaacc aatgctatac tgaacacttc    18180
tgtcactaaa acttgaacac actcatgaat aatttcttag gataaatttt tagagatgga    18240
tttgctaaat caaagaccat tttttaaaaa ttgaaaaaca attatatcgt ttggcatgta    18300
agacagtaca ttttcctttt attttgacag gattcaactg gaagctttgt gctgcctttc    18360
cggcaagtca tgtatgctcc atatcccacc acacacatag atgtggatgt caatactgtg    18420
aagcagatgc caccctgtca tgaacatatt tataatcagc gtagatacat gagatccgag    18480
ctgacagcct tctggagagc cacttcagaa gaagacatgg ctcaggatac gatcatctac    18540
actgacgaaa gctttactcc tgatttgtac gtaatgctct gcgtgctggt actgtagtca    18600
agcaatatga aactgtgtct tttatgaata aaaacaaaac agaagttgca ttcaaaaaga    18660
aagaaatatt actagcagaa ttatgcttga agaaacattt aatcaagcat ttttttctta    18720
aatgttcttc tttttccata cgattgtgtt taccctaaaa taagtaagat taacccttaa    18780
agtgaatatt taactatttg tttaataaat atatattgag ctcctaagca ctgttctagg    18840
tactgggctt aatagtggct aaccacacag ctccagcccc tacattgcat atagtctatt    18900
gtataagtta ctgaatggac ttactaacaa aaccagagaa gtaattctaa gtcttttttt    18960
tcttgacata tgaatataaa atacaacaaa actggtaaaa tatattaata gagcattctt    19020
ttactttgca ttttatattg ttactcactt cgtatttaag aaaaacagtc tgatcaggaa    19080
attcaaaagg aaaagtaatg ataattaatt gagcatagac ccaacttgaa aagaaaaaaa    19140
aggatgatga taaatctata atcctaaaac cctaagtaaa cacttaaatg atgttctgaa    19200
atcaggaaaa gaattatagt atatttttgt ggttctcttt tattagttga aaaaaggcac    19260
agtagctcat gcctataaga acagagcttt gggattccaa ggcaggcaga tcacttgagg    19320
ccaggagttc cagaccagcc tgggcaacat agtgaaaccc catctctaca aaaataaaaa    19380
agaattagtt gaatgtgttt ctgtgtgcct ataatcctag ctattcagaa agctgaggca    19440
ggaggatctc ttgagcccag gagtttgagg ttacatggag ttatgatgtg ccagtgtact    19500
ccagcctgcg ggacaatgag actctgtctt gttaaaaaaa aaagtgcttg gaataatgtt    19560
tggcatatag aaggtaacaa cagtaaatgt taactgtaat aacccaggta taagtgtgta    19620
aggtgataga aaaattgggg caaacaaccc tgacctgtgt ctctacagaa taagtttgag    19680
ttgaggcaac agacatgtgg agcaccagta attacacact aaatgttaac caaaagcgtt    19740
gaatagtaac atcttattca agggaccccc agccttatat atctcaaggt gcagaaagat    19800
gacttaatat aggacccatt ttttccgagt tctccagagt ttttattggt tcttgagaaa    19860
gtagtggggg aattgtttta gaaaatgaat tggtcaaact gaaattccat gtcagtaagt    19920
ttttacatat tggtaaattt tgatagacat gtagaagttt tctaattaat ctgcgccttg    19980
aaacattttc ctttttccta aagtgcttag tattttttcc cttttttgat tggttgcttg    20040
ggagcttttt tgaggaaatt tagtgaactg cagaatgagt ttgcaaccat ttagtatttt    20100
tgttttgtgt tttagaggag gtatgtgtat tttaacattt cttaatcatt tttagccagc    20160
tatgtttgtt ttgctgattg acaaactata attaaacagc tattctcatt ttgctgatca    20220
tgacaaagta atatcctgaa tttttaaatt ttgcatccag ctctaaattt tctaaatttt    20280
ctaaacataa aattgttcaa aaaatagtat ttttagccac tagattgtgt gttgttaagt    20340
ctgttgtcac agactcattt tacttttcag tgtgtgtttt tacatgttaa ttatgtttgt    20400
catttttaat tttaactttt taaaataatt ccagtcactg ccaaaacatg aaaaattggt    20460
cactggaaat ttttttttta acttttattt taggttcatg tgtacatgtg caggtttgtt    20520
atacaggtaa attgcgtgtc gtgagggttt ggtgtaccca ggtaataagg gtagtaccca    20580
ataggtagtt ttttgatcct tacccttctc ccacccttct ttcaccctcg agtaggcctt    20640
ggtgttgctg tttccttctt tgtgtccatg tgtactcaat ggttagctcc tacttagaag    20700
tgagaacatg cggtatttgg ttttctgttc ctggattagt tcactcagga taatggcctc    20760
tagctccatc tgttttttat ggctgcatag tattccatgg tgtatatgta tcatgttttc    20820
tttatccagt ctaccattga tagacattta ggttgattct ctgtctttac tatcatgaat    20880
agcgctgtga tgaacatata cacatgcatg tgtccttatg gtggaacaat ttgtattcct    20940
ttaagtatat acagaataat ggggttgcta gggtgaatgg tagttctatt gtaagttatt    21000
tgtgaaatct tcaaactgct tttcacaata gctaaactaa tttacagtcc caccagcagt    21060
gtataagtgt tcccttttct ccacaacctt gccaacatgt tattttttta cttttcaata    21120
ataggcattc ctagagaatt gatttgcaat tctctaatga ttagtgatat tgagcatttt    21180
ttcgtatgct ttttagctgt gtgtatatat tcttttgaaa aatgttaatg tcctttgccc    21240
agtttgtaat ggggttgttt gtttttgctt gttaattaaa gttccttcca gattctggat    21300
atccctttgt cagatgcgtg gtttgcagat atttttctcc ccttgtgtag gttgtctttt    21360
tactctgttg atagtttctt ttgccgggca ggagctcatt aggtctcatt tgtgtttgtt    21420
tttgttgcag ttgcttttgg cgtcttcatc ataaaatctg tgccagggcc tatgtccaga    21480
atggtatttc ctagtttgtc ttccagggtt tttacaattt tagattttac gtttatgtct    21540
ttaatccgtc ttgagttgat taaggaaggg gtccagtttc actctaattc ctatggctaa    21600
caattatccc agcaccattt attgaatacg gagtcctttc cccattgctt gtttttgtca    21660
attttgttga agatctgatg gttgtaggtg ctatgtggct ttatttcttg gctctctatt    21720
ctccactggt ctgtctgttt ttataccagt accctgctgt taaggttcct atagcctttt    21780
agtataaggt cggctaatgt gatgcctcca gctttgttct ttttgcttag gattgctttg    21840
gctatttggg ctcctttttg gttccatatt aattttaaaa tagttttttc tagttttgtg    21900
aagaatgtca ttgatagttt agaggaatag cgttgaatct gtagattgct ttgggcaaat    21960
ggccatttta acaatattga ttcttcctat ctatgaacat ggaatgtttt tccatgtgtt    22020
tgtgtcatct ctttatacct gatgtataaa gaaaaaccag tattattgct actcaatctg    22080
ttccaaaaaa ttgaggagga ggaactcttc cctaatgaga ccggcttcct tctgatacca    22140
aaacctggca gagatacaac agaaaaaaga aaacttcagg ccaatatcct tgatgaatat    22200
agatgcaaaa atcctcaaca aaatactagc aaccaaatcc agcagtacgt caaaaagcta    22260
atctacttta agtaggcttt atccctggga tgcaaggttg gttcaacata cacaaatcaa    22320
taagtgtgat tcatcacata aacagagcta aaaacaaaaa ccacaagatt atctcaatag    22380
gtgcagaaaa ggctttcaat acaatttaac atccttcatg ttaaaaacct tcagtaggtc    22440
aggtgcagtg actcacacct gtaatcccag cactttggga ggccaaggcg gacgtatatc    22500
ttaagcccag gagttcaaga ccagcctagg cagcatggtg aaaccccatc tctacaggaa    22560
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa agcttaatat ggcggcatgc acctatagtc    22620
ccagctactc aggaggttga ggtgggagga ttgcttgagc ccaggaggca gaggttgcag    22680
cgagctgaga tcgtgccact gcactccaac ctgggcaata aagtgagacc ctgtctcaaa    22740
aagaaaaaca aaaataatcc taaaccaact aggcattgaa ggaatatgcc tcaaaaaaat    22800
aagaaccatc tatgacagac ccacagccaa tatcttacca aatgggcaaa agctggaagt    22860
attctccttg agaaccgtaa caagacaagg atacacactc tcatccctcc ttttcagcat    22920
agttctggaa gtcctcgcca gagcagtcag gaaagagaaa gaaagaaaag gcattcagat    22980
aggaagagaa gaagtcaaac tatttctgtt tgcaggcagt ataattctat acctagaaaa    23040
tgccatagtt tctgcccaga agctcctaca tctgttaaaa atttcagcaa agttttagca    23100
ttgtctgtat tccaacagct tccagggtga gagtgaaatc aggaacacag tcccgttcac    23160
aatagccgca aaaagaataa aataccttgg aatccagcta accagggagg tgaaacatct    23220
ctacgagaat tacaaaacgc tgctgaaaga aatcagagat gacacaaaca aatggaaatg    23280
ttgtttttaa caccttgctt tatctaattc acttataact aagatattca ttcagtggaa    23340
caggtataat aagaccactc gacttaaata taagccttat tctctttcca gagcccaaga    23400
aggggcacta tcagtgccca gtcaataatg ataaaatgct gatatttttc ccctttactg    23460
tttctttctt ctgtagtgtg gtacactcat ttcttaagat tagaaaactt gacctacctt    23520
cctgtttgct tctacacacc cccattctct ttttttgcca ctccggtcag gtataggatg    23580
atccctacca cttttagtta aaacctcctt cccttattaa atgttctctt accactctgg    23640
cctgagtaga acctagggaa aatggaagag aaaagatgaa agggaggtgg gggctgggaa    23700
gggaatagtc ttgtttgtgt gtttgcttta gcacctacta tatcctaggt gctgtgttag    23760
gcacacatta ttttaagtgg ccattatatt gctacatctc actctggtca ttgccaaggt    23820
aggtagtact ttcttggata gttggttcat gttacttata ggtggtggac ttgttgaggc    23880
aaccccaatg gataatcatc tgagtgtgtt ctctaatctc agatttttct tcatattttt    23940
tggtttgttt tggtttttga tggtggtggt tgtgtgctta tttttgttgc tggcttgttt    24000
ttttgttttg tttttgatat ggcaagaatt ggtagtttta tttattaatt gcctaagggt    24060
ctctactttt tttaaaagat gagagtacta aaatagattg ataggtacat acataccttt    24120
atgggggact gcttatattc cttagagaaa aaaattactt attagcctga caaacaccag    24180
taaaatgtaa atatatccgt gagtaaataa atgaatgtat gctttgtatc tccaaatata    24240
tacatctata ttcttacaaa tatgttttta tgtaatacca atttataaga acttaaaatg    24300
ttggctcaag tgagggatgg tggaaagtag cattatatag ccatttcaac atttgaactt    24360
ttttcttcat tttcttcttt tcttcaggaa tatttttcaa gatgtcttac acagagacac    24420
tctagtgaaa gccttcctgg atcaggtaaa tgttgaactt gagattgtca gagtgaatga    24480
tatgacatgt tttctttttt aatatatctt acaatgcctg ttctctctct ctatatatat    24540
atatttatat atttccctgg atcatgcccc agagttctgc tgagcaattg cagttaagtt    24600
agttacacta cagttctcac aagagtctgt gaggggatgt caggtgcatc attacattgg    24660
atgcctcttg tcctagattt atgtttcggg aattcagacc tatgtttaca atataataaa    24720
tattgttgct gccttttaca gataaaataa taagatataa acttgaccac aactactgtt    24780
ttttgaaaca tagagttcat ggtttacatg tatcaaagtg aaatctgagt tagcttttac    24840
agatataata tatacatata tatatcctac aatgcttgta ctatatatgt agtacaagta    24900
tatatatgtg tgtgtgtgtg tgtatatata ttatggcact gtagtatata tatgtttata    24960
tgttaaaaaa tatataaata tatgttacat atttaacata aacatatata catatatgtt    25020
aaatatataa catatactct atatatgaca aatagagtat aatatatatt tttatttttt    25080
atatatatat aaaacatgat agaattaaga attaagtcct aatctgtttt attaggtgct    25140
ttttgtagtg ttcagtcttt ctaaagtgtc taaatgattt ttccttttga cttattaatg    25200
gggaagagcc tctatattaa caattaaggc tgcagcattg attacttcaa acaacaaaca    25260
ttttaattca agcattaacc tataactcaa gtaagttttt tttttttttt ttttgagaaa    25320
gggaggttgt ttatttgcct gaattgagtc aaaaatattt ttgaaacatc atgtactcat    25380
ttaaatgata acatctttat tgtttcattc ttttaaaaaa tatctactta attacacagt    25440
tgaaggaaat tgtagattat atggaactta tttcttaata tattacagtt ttgttataat    25500
aacattctgg ggatcaggcc aggaaactgt gtcatagata aagctttgaa ataatgagat    25560
ccttatgttt actagaaatt ttggattgag atctatgtgg tctgtgacat attgcaaagt    25620
tcaaggaaaa ttcgtaggca tggaatttct caaactgaaa atccctccca ctgtccacct    25680
catcacatgc acacattcta ctcttaccca cccactccac cccttgcaaa agtacagata    25740
tatgaatgtc tcaaaaccat gggctcatct tctagaagct tcaatgttat ttgaagattt    25800
gggcagagga agttaagaaa tatgaaatag cttacatatg agttttaata gtgaaacaaa    25860
catggatgta ttctgaagta gaatgcaaaa tttgagtgca tttttttttt tttgagactg    25920
agtctggctc tgtcgcccag gctggagtgc agtggccgga tctcagctca ctgcaagctc    25980
cacctcccgg gtttacgcca ttctcctgcc tcagcctccc gagtagctgg gaccacaggc    26040
gcccgccact tcgcccggct agtttgtttg tattttttag tagagatggg gtttcaccgt    26100
gttagccagg gannnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnccatt    26160
gagtgcattt ttaaagataa atcagaaaac ttcgaaaaac tatcagattg gccggacatg    26220
gtggcttatg cctgtaatcc tagcactttg ggaggctgag gtgggtggat cacgaggtca    26280
ggagatcgag accatcctgc caacatggtg aaaccccatc tctactaagt atacaaaaat    26340
tagctgggcg tgacagcacg tgcctgtaat cccagctact tgggaggctg aggcaggaga    26400
atcgcttgaa cccgggaggt ggaggttgca gtgagtcaag atcacaccac tgcacttcag    26460
cttggtgaca gagctagact ccatatcaaa aaaaaaaaaa aaaaaaagaa gtcagattgt    26520
tcctacaccc agtgcttcta taccacactc ctactagggg gcatcagtgg aaatggttaa    26580
ggagatgttt agtgtgtatt gtctgccaag cactgttaac actgtcctag aaacattgct    26640
gtacaagtag aatgtgagca aattatgtat tgaaatggtt cctctccctg caggtctttc    26700
agctgaaacc tggcttatct ctcaggagta ctttccttgc acagttttta cttgtccttc    26760
acagaaaagc cttgacacta ataaaatata tagaagatga tacgtgagta caactcctac    26820
atggaggaaa aaccttttgt acgttgtttt ttgttttatt tcctttgtac attttctgta    26880
tcataatttt tgcttttttt tttttttttt ttttctccat tactttcagg cagaagggaa    26940
aaaagccctt taaatctctt cggaacctga agatagacct tgatttaaca gcagagggcg    27000
atcttaacat aataatggct ctggctgaga aaattaaacc aggcctacac tcttttatct    27060
ttggaagacc tttctacact agtgtacaag aacgagatgt tctaatgact ttttaaatgt    27120
gtaacttaat aagcctattc catcacaatc gtgatcgctg ctaaagtagc tcggtggtgt    27180
ggggaaacat tcccctggat catactccag agctctgctc ggcagttgca gttaagttag    27240
ttacactaca gttctcacaa gagtctgtga ggggatgtca ggtgcatcat tacattggat    27300
gtctcttttc ctagatttat gcttttggga tacagaccta tgtttacaat ataataggta    27360
ttattgctgt cttttaaata tataataata ggatataaac ttgaccacaa ctgctgtttt    27420
tttgaaatat atgattcatg gtttacatgt attaaggtga aatccgagtt cgcttttaca    27480
gatattagtt gactttctat cttttggcat tctttggtgt gtggaattac tgtaatactt    27540
ctgcaatcaa ctgaaaatta gagcctttaa atgatttcag ttccacagaa agaaagtgag    27600
cttcaacata ggataagctt tagaaagaga attgatcaag cagatgttta attggaattg    27660
attattagat cctgctttgt ggatttagcc ctcgggattc agtctgtaga aatgtctgat    27720
agttctctat agtccctgct catggtgaac cacagttagg atgttttgtt tgttttattg    27780
ttgttgctat tgttgatgtt ctatatagtt gagctctata aaaggaaatt gtattttatg    27840
ttttagtagt tgttgccaac tttttaaatt aattttcatt atttttgagc caaattgaaa    27900
tgtgcacctc ctgtgccttt tttttccttg gaaaatcgaa ttacttggaa gaagttcaga    27960
tttcactggt cagtcgtttt catcttgttt tcttcttgca gagtcttacc atgtacctgc    28020
tttggcaatc attgtaactc tgagattata aaatgcatta gagaatatat taactaataa    28080
gatctttttt ttcaggaaca gaaaatagtt ccttgagtac ttccttctta catttctgcc    28140
catgtttttg aagttgttgc catttgcctg caataggcta taaggaatag caggagaaat    28200
tttactgaag tgctattttt ctaggtgcta ctttggcaga gctaagtggt ctgtttcttt    28260
tgtttcctta atgcgtttgg accattttgc tggctgtaaa ataactgatt aatataattc    28320
taacacaata ttgacattgt agtgtacaca aacacaaata ttttatttaa aactggaagt    28380
aacataaaag ggaaaatata tttataagaa aggaataaag gtaatagagc tcttctgtcc    28440
cccagccacc aaatttacac aacaaaatca tatgttctaa tgtgaaaggt cataatagct    28500
ttcccatcat taatcagaaa gatgtggcag cttgattttt tagacaaccc ctgaactaga    28560
tgactgttgt actgtagctc agtcatttaa aaaatatata aatactatct cgtagtgtcc    28620
catactatgt tttttacatg atagattctt atttaagtgc taactggtta ttttctttgg    28680
ctggtttatt gtactgttat atagaatgta agttgtacag tgaaataagt tattaaagca    28740
tgtgtaaaca ttgttatata tcttttctcc tagatggaga attttgaata aaatatnnnn    28800
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn    28860
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn    28920
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn    28980
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn    29040
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn    29100
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn    29160
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnagaa gactaattga tcatatcact atgattctca    29220
aagaagaacc aaaacttcat ataatactac aaatatgaga tagttacttc tgtagtatat    29280
ttctgtaatg ctacaggtta aacaggtcac tcttatataa cactattttg attttgatgt    29340
agaattgcac aaattgatat ttcttctatg atctgtaggg tatagcttaa agtagcaaaa    29400
acagtccacc acctccagtt aacacacagt aacactatgg gactagtatt attatttcca    29460
ttttacaaag gaggaaacta aagcttaaag atgtgtaata tacagcccaa ggtcacacag    29520
ctggtaaagg tagatttcat cccagacagt tacagtcatt gccgtgggca cagctcctaa    29580
cttattaact ccatgtaact ggtactcagt ttagttgaat tgaaaggaga gtagggaagc    29640
aggtctgttt gcactattca gagcccaagt gtgaatccct gctgtgctgc ttggagaagt    29700
tacttaacct atgcaaggtt cattttttaa atatttgaaa cggaatgata atacatactt    29760
caccagtggg tttaatgaga ccttataaga tcgttagttc agtacctgac cagtgcttca    29820
taaatgcttt ttcatccaat ctgacaatct ctagcttgta attggggcat ttagaacatt    29880
taatatgatt attggcatgg taggttaaag ttgtcatctt gctgttttct ctttgttctt    29940
ttttctcctt tcttttggat ttttttttaa ttttactgtg tcttctctgt tgtcttatta    30000
a                                                                    30001
<210>  12
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
<220>
<223>  Primer
<400>  12
gggtctagca agagcaggtg                                                   20
<210>  13
<211>  21
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
<220>
<223>  Primer
<400>  13
gtcttggcaa cagctggaga t                                                 21
<210>  14
<211>  24
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
<220>
<223>  Probe
<400>  14
tgatgtcgac tctttgccca ccgc                                              24
<210>  15
<211>  22
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
<220>
<223>  Primer
<400>  15
tgtgacagtt ggaatgcagt ga                                                22
<210>  16
<211>  25
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
<220>
<223>  Primer
<400>  16
gccacttaaa gcaatctctg tcttg                                             25
<210>  17
<211>  21
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
<220>
<223>  Probe
<400>  17
tcgactcttt gcccaccgcc a                                                 21
<210>  18
<211>  783
<212>  DNA
<213>  Homo sapiens
<400>  18
gcctctcagt acccgaggct cccttttctc gagcccgcag cggcagcgct cccagcgggt       60
ccccgggaag gagacagctc gggtactgag ggcgggaaag caaggaagag gccagatccc      120
catcccttgt ccctgcgccg ccgccgccgc cgccgccgcc gggaagcccg gggcccggat      180
gcaggcaatt ccaccagtcg ctagaggcga aagcccgaca cccagcttcg gtcagagaaa      240
tgagagggaa agtaaaaatg cgtcgagctc tgaggagagc ccccgcttct acccgcgcct      300
cttcccggca gccgaacccc aaacagccac ccgccaggat gccgcctcct cactcaccca      360
ctcgccaccg cctgcgcctc cgccgccgcg ggcgcaggca ccgcaaccgc agccccgccc      420
cgggcccgcc cccgggcccg ccccgaccac gccccggccc cggccccggc cccggccccg      480
gcccctagcg cgcgactcct gagttccaga gcttgctaca ggctgcggtt gtttccctcc      540
ttgttttctt ctggttaatc tttatcaggt cttttcttgt tcaccctcag cgagtactgt      600
gagagcaagt agtggggaga gagggtggga aaaacaaaaa cacacacctc ctaaacccac      660
acctgctctt gctagacccc gcccccaaaa gagaagcaac cgggcagcag ggacggctga      720
cacaccaagc gtcatctttt acgtgggcgg aacttgtcgc tgtttgacgc acctctcttt      780
cct                                                                    783
<210>  19
<400>  19
000
<210>  20
<400>  20
000
<210>  21
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
<220>
<223>  Synthetic oligonucleotide
<400>  21
gccttactct aggaccaaga                                                   20
<210>  22
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
<220>
<223>  Synthetic oligonucleotide
<400>  22
ccggccccta gcgcgcgact                                                   20
<210>  23
<211>  19
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
<220>
<223>  Synthetic oligonucleotide
<400>  23
cggcccctag cgcgcgact                                                    19
<210>  24
<211>  19
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
<220>
<223>  Synthetic oligonucleotide
<400>  24
ccggccccta gcgcgcgac                                                    19
<210>  25
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
<220>
<223>  Synthetic oligonucleotide
<400>  25
ccctagcgcg cgactcctga                                                   20
<210>  26
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
<220>
<223>  Synthetic oligonucleotide
<400>  26
cccctagcgc gcgactcctg                                                   20
<210>  27
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
<220>
<223>  Synthetic oligonucleotide
<400>  27
gcccctagcg cgcgactcct                                                   20
<210>  28
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
<220>
<223>  Synthetic oligonucleotide
<400>  28
ggcccctagc gcgcgactcc                                                   20
<210>  29
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
<220>
<223>  Synthetic oligonucleotide
<400>  29
cggcccctag cgcgcgactc                                                   20
<210>  30
<211>  18
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
<220>
<223>  Synthetic oligonucleotide
<400>  30
cctagcgcgc gactcctg                                                     18
<210>  31
<211>  18
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
<220>
<223>  Synthetic oligonucleotide
<400>  31
ccctagcgcg cgactcct                                                     18
<210>  32
<211>  18
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
<220>
<223>  Synthetic oligonucleotide
<400>  32
cccctagcgc gcgactcc                                                     18
<210>  33
<211>  18
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
<220>
<223>  Synthetic oligonucleotide
<400>  33
gcccctagcg cgcgactc                                                     18
<210>  34
<211>  18
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
<220>
<223>  Synthetic oligonucleotide
<400>  34
ggcccctagc gcgcgact                                                     18
<210>  35
<211>  18
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
<220>
<223>  Synthetic oligonucleotide
<400>  35
cggcccctag cgcgcgac                                                     18
<210>  36
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
<220>
<223>  Synthetic oligonucleotide
<400>  36
aggctgcggt tgtttccctc                                                   20
<210>  37
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
<220>
<223>  Synthetic oligonucleotide
<400>  37
caggctgcgg ttgtttccct                                                   20
<210>  38
<211>  19
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
<220>
<223>  Synthetic oligonucleotide
<400>  38
ggctgcggtt gtttccctc                                                    19
<210>  39
<211>  19
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
<220>
<223>  Synthetic oligonucleotide
<400>  39
aggctgcggt tgtttccct                                                    19
<210>  40
<211>  19
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
<220>
<223>  Synthetic oligonucleotide
<400>  40
caggctgcgg ttgtttccc                                                    19
<210>  41
<211>  18
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
<220>
<223>  Synthetic oligonucleotide
<400>  41
gctgcggttg tttccctc                                                     18
<210>  42
<211>  18
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
<220>
<223>  Synthetic oligonucleotide
<400>  42
ggctgcggtt gtttccct                                                     18
<210>  43
<211>  18
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
<220>
<223>  Synthetic oligonucleotide
<400>  43
aggctgcggt tgtttccc                                                     18
<210>  44
<211>  18
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
<220>
<223>  Synthetic oligonucleotide
<400>  44
caggctgcgg ttgtttcc                                                     18
<210>  45
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
<220>
<223>  Synthetic oligonucleotide
<400>  45
tctgtctttg gagcccaaat                                                   20
<210>  46
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
<220>
<223>  Synthetic oligonucleotide
<400>  46
ctgcgatccc cattccagtt                                                   20
<210>  47
<211>  18
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
<220>
<223>  Synthetic oligonucleotide
<400>  47
gccttactct aggaccaa                                                     18
<210>  48
<211>  18
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
<220>
<223>  Synthetic oligonucleotide
<400>  48
tctgtctttg gagcccaa                                                     18
<210>  49
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
<220>
<223>  Synthetic oligonucleotide
<400>  49
ggttaatctt tatcaggtct                                                   20
<210>  50
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
<220>
<223>  Synthetic oligonucleotide
<400>  50
tggttaatct ttatcaggtc                                                   20
<210>  51
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
<220>
<223>  Synthetic oligonucleotide
<400>  51
ctggttaatc tttatcaggt                                                   20
<210>  52
<211>  18
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
<220>
<223>  Synthetic oligonucleotide
<400>  52
gttaatcttt atcaggtc                                                     18
<210>  53
<211>  18
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
<220>
<223>  Synthetic oligonucleotide
<400>  53
ggttaatctt tatcaggt                                                     18
<210>  54
<211>  18
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
<220>
<223>  Synthetic oligonucleotide
<400>  54
tggttaatct ttatcagg                                                     18
<210>  55
<211>  18
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
<220>
<223>  Synthetic oligonucleotide
<400>  55
ctagcgcgcg actcctga                                                     18
<210>  56
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
<220>
<223>  Synthetic oligonucleotide
<400>  56
gggacactac aaggtagtat                                                   20
<210>  57
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
<220>
<223>  Synthetic oligonucleotide
<400>  57
tacaggctgc ggttgtttcc                                                   20
<210>  58
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
<220>
<223>  Synthetic oligonucleotide
<400>  58
cccggcccct agcgcgcgac                                                   20
<210>  59
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
<220>
<223>  Synthetic oligonucleotide
<400>  59
ggtaacttca aactcttggg                                                   20
<210>  60
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
<220>
<223>  Synthetic oligonucleotide
<400>  60
aatctttatc aggtcttttc                                                   20
<---