Трансформированные эпителиальные клетки легких -продуценты микробной РНКазы (биназы)

Оригинальные исследования

63

ТРАНСФОРМИРОВАННЫЕ ЭПИТЕЛИАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ ЛЕГКИХ -ПРОДУЦЕНТЫ МИКРОБНОЙ РНКАЗЫ

Е.В. Дудкина 1, И. Сайн 2, В.В. Ульянова 1, Р. Шах Махмуд1, Г. Баррето 2, О.Н. Ильинская 1

1 Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань, Россия

2 Исследовательский институт сердца и легких им. Макса-Планка, Бад Наухайм, Германия

Transformed lung epithelial cells produce microbial RNAse

E.V. Dudkina 1, I. Singh 2, V.V. Ulyanova 1, R. Shah Mahmud1, G. Barreto 2, O.N. Ilinskaya 1

1 Kazan (Volga region) Federal University, Kazan, Russia

2 Max-Planck Institute for Heart and Lung Research, Bad Nauheim, Germany

На сегодняшний день одним из ведущих направлений в противоопухолевой терапии является создание систем адресной доставки лекарственных средств в очаги развития злокачественных новообразований. С использованием методов генной инженерии нами была создана новая экспрессионная система, где гены рибонуклеазы Bacillus pumilis — биназы, и сцепленного с ним гена внутриклеточного ингибитора Bacillus amyloliquefaciens — барстара, клонированы в вектор pCS2 + . Показана возможность экспрессии гена биназы в трансформированных эпителиальных клетках легких мыши. Полученная векторная конструкция обеспечит селективное цитотоксическое действие биназы на опухолевые клетки-мишени, обусловленное высоким уровнем экспрессии чужеродного белка в трансформированных клетках.

Ключевые слова: биназа, экспрессионная система, pCS2 + , MLE-12, секреция.

Злокачественные опухолевые заболевания находятся на втором месте после сердечно-сосудистых по количеству смертей и являются одной из основных причин смертности в мире. По данным ВОЗ, в 2012 году от злокачественных опухолей умерло более 8,2 млн человек [1]. Большая часть смертей зарегистрирована в развивающихся странах, для которых современные способы ранней диагностики и эффективного лечения злокачественных новообразований остаются малодоступными. В России от рака ежегодно умирает более 285 000 человек [2]. На сегодняшний день одним из ведущих направлений в противоопухолевой терапии является создание систем адресной доставки лекарственных средств в очаги злокачественных новообразований [3]. Предпосылкой к развитию данной тенденции послужила неэффективность фармацевтического лечения при традиционных способах введения препаратов, поскольку в этом случае действие лекарств является общим, проникая не только в органы-мишени, но и в другие ткани, где часто обладает нежелательными эффектами. При этом лечебная доза терапевтического средства значительно снижается, что вынуждает применять дозы, на несколько порядков превышающие необходимые [4].

Наиболее перспективным методом лечения онкологических заболеваний, отличающимся высокой степенью целевой направленности препарата, является генотерапия [5]. Данный вид лечения заключается во введении специальных терапевтических генетических конструкций в клетки организма. Доставку гена производят с помощью вирусных или невирусных систем, ex vivo или in vivo [5]. Подходы генной терапии основаны на многофакторности онкологических заболеваний [6], среди них различа-

е-mail: lenatimonina@rambler.ru

Today, the targeted drug delivery to tumors is one of the leading researches in anticancer therapy. Using gene engineering techniques the new expression system based on pCS2+ vector was created. Gene of Bacillus pumilis ribonuclease — binase, and gene of intracellular inhibitor of Bacillus amyloliquefaciens — barstar were cloned under promotor of cytomegalovirus. The possibility of binase's gene expression in transformed murine lung epithelial cells was shown. The new plasmid system provides selective cytotoxic action of binase against target tumor cells due to high expression level of foreign protein in transformed cells.

Key words: binase, expression system, pCS2 + , MLE-12, secretion.

ют: введение генов-супрессоров опухолевого роста; генов, обеспечивающих устойчивость к противоопухолевым средствам для проведения более активной химиотерапии; ингибирование доминантных генов; а также методы иммуностимуляции и введения генов пролекарств [5]. Генотерапия потенциально может обеспечить эффективную доставку чужеродного гена в клетки-мишени, а также его длительную экспрессию в них.

Одними из основных критериев для практического применения противоопухолевого средства являются его селективное действие по отношению к раковым клеткам и низкая иммуногенность препарата [7]. Поэтому особое внимание привлекают ферменты — рибонуклеазы (РНКазы), обладающие селективной цитотоксичностью по отношению к злокачественным клеткам. Наиболее известным представителем РНКаз животного происхождения является РНКаза овоцитов лягушки Rana pipiens — онконаза, достигшая III фазы клинических исследований в протоколе лечения мезотелиомы легких человека [8]. Препарат используется в комплексной терапии с противоопухолевым антибиотиком — доксорубицином [9].

Среди микробных РНКаз особое место занимает РНКаза Bacillus pumilis — биназа. Это фермент селективно ингибирует рост клеток, экспрессирующих ras, kit и AML-ETO онкогены, при этом не оказывая значимого токсического действия на нормальные клетки [10—12]. Кроме того, показано, что биназа не индуцирует поликлональный Т-клеточный ответ, что говорит о ее низкой иммуногенности [13]. Перечисленные свойства позволяют рассматривать биназу в качестве активного вещества потенциального противоракового препарата. Однако при введении чужеродных ферментов в живой организм они

Гены & Клетки Том IX, № 3, 2014

64

Оригинальные исследования

быстро утрачивают свою активность вследствие действия внутриклеточных протеаз и ряда других факторов, что, возможно, объясняет невысокие показатели клинических испытаний онконазы. В связи с этим очевидна необходимость защиты и пролонгации функционирования введенного фермента в организме.

В настоящей работе нами была создана векторная конструкция, на основе которой ген биназы на плаз-мидном векторе pСS2+ был введен в опухолевые клетки MLE-12 эпителия легких мыши. Экспрессия гена и секреция фермента подтверждены иммуно-блотингом. Биназа оказывала токсическое действие на линию трансформированных клеток легких без интернализации фермента [14]. В перспективе би-наза, экспрессирующаяся в эпителии легких, может адресно воздействовать на опухолевые клетки, не оказывая при этом токсического действия на здоровые клетки организма.

Материал и методы

Плазмиды и клетки

В работе были использованы: плазмида pMZ55, несущая полный ген РНКазы B. pumilis и сцепленный с ним ген внутриклеточного ингибитора B. amyloliquefaciens — барстара, сконструированная Знаменской с соавторами [15], и коммерческий вектор pCS2 + , обеспечивающий экспрессию биназы в клетках млекопитающих. Трансформированные клетки эпителия легких мыши (MLE-12) были получены из коллекции клеточных культур США (ATCC CRL-2110). Клетки выращивали при 37°С на стандартной среде DMEM (Invitrogen, США) с добавлением 5% телячьей сыворотки и пенициллина/ стрептомицина (по 100 ед.) в атмосфере 5% СО2. Химически компетентные клетки E. coli Top10 предоставлены компанией Invitrogen (США).

Создание генетической конструкции

Ген РНКазы и барстара амплифицировали с плазмиды pMZ55 с использованием двух пар праймеров Bin-For-EcoRI и Rnase-Brst-Rev-XhoI, содержащих сайты рестрикции XhoI и EcoRI, сконструированных сотрудниками лаборатории «Биоинженерии и биосинтеза ферментов» К(П)ФУ, производитель (Си-бЭнзим, Россия).

Bin-For-EcoRI:

ATCGTGAATTCTTATTTATTTCATCAGAAGGTTATC

Rnase-Brst-Rev-XhoI:

GCTGATCTCGAGGGGTTTGTGTTTCCATATTG

Условия реакции: 94°C — 2 мин, 94°C — 15 с, 55°C — 30 с, 68°C — 90 с, всего — 30 циклов. Реакцию проводили с использованием термоциклера «Т3000» (Biometra, Германия). ПЦР-продукт, содержащий сайты рестрикции Xho I и Eco RI, и ДНК вектор pCS2+ гидролизовали рестриктазами Xho I и Eco RI (Invitrogen, США). Рестрикцию проводили при температуре 37°С в течение 8 ч. Количество ДНК вектора в реакции составляло 4—6 мкг, ПЦР-продукта — 500 нг. Рестриктазы инактивировали при температуре 80°С в течение 20 мин.

С целью очистки рестрицированного вектора плаз-мидную ДНК наносили на агарозный гель и выделяли из геля с использованием набора «PureLink Quick Gel Extraction kit» (Invitrogen, США). ПЦР продукт очищали «PureLink PCR Purification Kit» (Invitrogen,

США) в соответствии с инструкцией производителя. Продукт амплификации лигировали с вектором pСS2+ с использованием Т4 — лигазы (Thermo Scientific, США). Лигирование проводили при температуре 16°С в течение 6 ч. Лигазной смесью трансформировали компетентные клетки E.coli Top10.

Трансформация и анализ векторной ДНК

Компетентные клетки E. coli Top10 (Invitrogen, США) трансформировали лигазной смесью. К 50 мкл химически компетентных клеток добавляли 1/2 объема лигазной смеси. Клетки подвергали температурному шоку, выдерживая во льду в течение 30 мин, затем 90 с при 42°С, и снова во льду в течение 2 мин. Далее к клеткам добавляли 400 мкл среды LB, инкубировали в течение 1 ч при 37°С c аэрацией. Высевали на чашки с L-агаром и ампициллином, выращивали при 37°С 14—16 ч.

Для подтверждения встраивания клонируемого фрагмента в состав вектора pСS2+ плазмиды выделяли из рекомбинантных клонов E. coli Top10 с использованием «PureLink Quick Plasmid MiniPrep Kit» (Invitrogen, США) и анализировали с помощью ПЦР и рестрикционного анализа, как описано выше.

Трансфекция

Полученной генной конструкцией трансфицировали клетки MLE-12 и выращивали в течение 48 ч. Трансфекцию проводили с использованием «Ли-пофектамина 2000» (Invitrogen, США) согласно инструкции производителя. В качестве отрицательного контроля клетки трансфицировали вектором pСS2+ без вставки, положительным контролем служил вектор, экспрессирующий флуоресцентный белок GFP, меченый myc-полипептидом (Invitrogen, США).

После роста в течение 48 ч клетки собирали, промывали в PBS-буфере и центрифугировали на холоду при 1200 rpm 10 мин. Белки в супернатанте осаждали по стандартной методике [16]. Клеточный осадок ресуспензировали в 300 мкл лизирующего буфера (50 mM Трис-HCl, 150 mM NaCl, 15 mM ЭДТА, 0,4% Тритон Х-100, 0.2 mM Имидазол, 20 mM NaF, 0,5 mM Na3VO4, 40 мкг/мл PMSF, рН 7,4), разрушали ультразвуком (5 циклов по 10 с) и центрифугировали на холоду при 14 000 rpm 10 мин. Супернатант собирали для проведения электрофореза в ПААГ.

Электрофорез в ПААГ и вестерн блот

Электрофорез в 15% полиакриламидном геле проводили согласно стандартной методике, описанной Лэммли [17]. После разделения белков в ПААГ, белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану, центры связывания блокировали добавлением 5% сухого молока в буфере TBS. Мембрану инкубировали с первичными антителами против myc-белка (1:2000) (Santa Cruz, США) в течение ночи при 4°С. Не связавшиеся антитела отмывали, мембрану инкубировали с вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена. Детекцию иммунных комплексов проводили с использованием «Super Signal West Femto detection solutions» (Thermo Scientific, США) на гель-документаторе Luminescent Image Analyzer (Las 4000, Fujifilm, Япония).

Гены & Клетки Том IX, № 3, 2014

Оригинальные исследования

65

Зимограмма

Оценку каталитической активности фермента проводили путем разделения белков в 15% полиакриламидном геле по модифицированной методике Лэммли [17], в качестве субстрата в разделяющий гель добавляли дрожжевую РНК (Sigma-Aldrich, США) в концентрации 7 мг/мл. После электрофоретического разделения белков, гель отмывали по 10 мин в буфере I (10 мM Tрис-HCl, 20% изопропанол, pH 7,5), буфере II (10 мM Tрис-HCl, pH 7,5) и буфере III (100 мM Tрис-HCl, pH 7,5). Окрашивание гелей проводили в 0,2% растворе толуидинового синего (Sigma-Aldrich, США).

Результаты и обсуждение

клонирования была подтверждена ПЦР (рис. 2), рестрикцией (рис. 3) и секвенированием полученной векторной конструкции, сборка фрагментов которой выявила наличие полноразмерного гена биназы (http://www.uniprot.org/uniprot/P00649) и барстара (http://www.uniprot.org/uniprot/P11540). Размер ПЦР-продукта, созданных векторных конструкций, совпадал с ампликоном pMZ55, что подтверждает наличие вставки в составе вектора pCS2+ (рис. 2). Рестрикция векторных конструкций эндонуклеазами EcoRI и XhoI, имеющими по одному сайту рестрикции, показала наличие двух полос на электрофорезе, соответствующих размеру клонируемого гена и вектора (рис. 3). Ген РНКазы в составе вектора pCS2 + мечен myc-белком, позволяющим детектировать биназу анти-myc антителами.

Гены рибонуклеазы Bacillus pumilus — биназы и сцепленного с ним гена внутриклеточного ингибитора B. amyloliquefaciens — барстара были клонированы в вектор pCS2 + , способный экспрессироваться в клетках млекопитающих. На первом этапе с помощью ПЦР гены РНКазы и барстара были амплифици-рованы с плазмиды pMZ55 с использованием двух пар праймеров Bin-For-EcoRI и Rnase-Brst-Rev-XhoI, несущих сайты рестрикции EcoRI и XhoI (рис. 1). Плазмида pMZ55 была сконструирована Знаменской с соавторами [15] с целью эффективной экспрессии биназы в клетках B. subtilis. Ампликон, полученный с плазмиды pMZ55, и вектор pCS2+ рестрициро-вали по сайтам EcoRI и XhoI с образованием липких концов. Полученные фрагменты лигировали, лигазной смесью трансформировали компетентные клетки E. coli Тор 10. Отбор клонов проводили на питательной среде с ампициллином. Успешность

К- 1 2 М

п.о.

*----3000

Рис. 2. ПЦР полученной векторной конструкции, выделенной из клонов E. coli Top10 после трансформации: 1—5 — векторные конструкции клонов E. coli Top10; К(-) — отрицательный контроль; К(+) — положительный контроль (амплификация с плазмиды pMZ55);

M — ДНК маркер «100 bp plus»

Рис. 1. Амплификация гена биназы и сцепленного с ним гена барстара с плазмиды pMZ55 с использованием двух пар праймеров Bin-For-EcoRI и Rnase-Brst-Rev-XhoI:

1, 2 — ПЦР-продукт с pMZ55; К(-) — отрицательный контроль; M — ДНК маркер «100 bp plus»

Рис. 3. Рестрикция готовых векторных конструкций, выделенных из клонов E. coli Top10:

1, 3, 5, 7 — гидролиз векторных конструкций эндонуклеазой XbaI; 2, 4, 6, 8 — гидролиз векторных конструкций эндонуклеазами EcoRI и XhoI;

9 — нерестрицированный вектор pCS2 + ;

M — ДНК маркер «1 kb plus»

Гены & Клетки Том IX, № 3, 2014

66

Оригинальные исследования

Сконструированная векторная система была трансфицирована в клетки MLE-12. В качестве положительного контроля использовали векторную систему, экспрессирующую ген флуоресцентного белка GFP. Высокая интенсивность флуоресценции маркерного белка подтвердила успешность проведенной трансфекции. Результаты экспрессии гена биназы показали, что вестерн блот анализ с применением антител против myc удостоверяет наличие ферментного белка в супернатанте трансформированных клеток (рис. 4). Отсутствие биназы в клеточном лизате MLE-12 подтверждает факт, что белок секретировался в среду. Отметим, что как отрицательный (лиофилизированный препарат биназы), так и положительный (GFP-myc tag белок) контрольные варианты свидетельствуют о достоверности полученных данных (рис. 4).

Размер детектируемого продукта составил 25 кДа, что, вероятно, говорит о взаимодействии антител с димерной формой биназы. Стандартная масса мономерной биназы 12 кДа, однако, мы не выявили соответствующую мономерную полосу на вестерн блоте (рис. 4). Поскольку детекцию осуществляли антителами к myc, ген которого встроен в плазмиду pCS2+ до структурного гена биназы, экспрессирующийся полипептид метит одну молекулу биназы. Вероятно, димеризация белка происходит на стадии трансляции, что мешает myc присоединиться к мономеру и затрудняет его детекцию в данной системе. На сегодняшний день многие авторы сообщают о возможности димеризации РНКазы B. pumilus. Хотя доказательства димеризации базируются на исследованиях кристаллической структуры фермента [18, 19], при высоких концентрациях белка образование димеров может происходить и в растворе [19, 20]. С целью подтверждения полученных результатов, а также для исключения возможности секреции мономера биназы совместно с ингибитором барстаром, нами была проведена качественная оценка каталитической активности фер-

мента в полиакриламидном геле. Было показано, что биназа расщепляет РНК и образует зоны гидролиза, соответствующие молекулярной массе 12 и 25 кДа. Те же данные были получены для лиофилизирован-ного препарата биназы, что говорит о наличии у белка димерной формы (рис. 5).

Отметим, что трансфицированные клетки MLE-12 сохраняют жизнеспособность: после 48 ч роста уровень апоптических клеток в культуре не превышает 15%, так же, как и в исходных клетках (рис. 6).

Таким образом экспериментально продемонстрирована возможность экспрессии гена микробной РНКазы в эпителиальных клетках легких мыши. Вестерн-блот анализом с помощью анти-myc антител, в среде был детектирован иммунный комплекс с молекулярной массой 25 кДа, указывающий на обнаружение димерной формы биназы, поскольку именно РНКаза в составе вектора pCS2+ была мечена полипептидом myc (см. рис. 4). Возможность димеризации фермента была подтверждена методом зимографии, который выявил наличие двух зон гидролиза РНК, соответствующих ферменту с молекулярной массой 12

М 1 2 3 4 5

72 кДа 55 кДа

44 кДа 34 кДа

24 кДа

17 кДа

Рис. 4. Детекция биназы методом вестерн блотта с использованием анти myc-антител:

1 — вектор pCS2+ без вставки; 2 — векторная система, экспрессирующая флуоресцентный белок GFP-myc; 3 — клеточный лизат MLE-12;

4 — супернатант MLE-12;

5 — лиофилизированный препарат биназы;

М — ДНК маркер

Рис. 5. Определение РНКазной активности в полиакриламидном геле методом зимографии:

1 — лиофилизированный препарат биназы;

2 — супернатант MLE-12;

М — белковый маркер «PageRuler»

Рис. 6. Визуализация апоптических изменений популяции клеток MLE-12 спустя 48 ч роста после трансфекции (А) и без транфекции (Б]

Гены & Клетки Том IX, № 3, 2014

Оригинальные исследования

67

и 25 кДа (см. рис. 5). Таким образом, мы обнаружили также мономер биназы, обладающий каталитической активностью и описанный в ряде работ как классическая РНКаза B. pumilus [21].

В настоящее время способность к димеризации показана для многих РНКаз: панкреатической РНКа-зы А [22], рибонуклеазы семенников быка (BS-РНКазы) [23], РНКазы L [24] и других. Однако лишь одна из них, РНКаза семенников быка (BS-РНКаза) является природным димером [23]. Для биназы образование димеров обнаружено в кристаллах [18], однако, возможность димеризации фермента в растворе также не исключается [19].

Известно, что обработка клеток MLE-12 биназой в концентрации 100 нМ приводит к гибели 50% трансформированной клеточной популяции эпителия легких уже в первые 24 ч инкубации, возможно, расщепляя РНК в составе онкогена Tag и запуская апоптоз [14]. Также можно предположить, что би-наза связывается с мембранными белками — участниками сигнальных путей, либо разрушает определенную доступную РНК в клетках, приводя в итоге к гибели клеток. Так, для fa't-экспрессирующих клеток показано, что разрушение мРНК ^/t-онкогена — необходимый этап проявления дальнейших цитотоксических свойств фермента [12]. Однако, для клеток MLE-12 показано, что биназа в основном индуцирует их гибель практически без проникновения, через взаимодействие с поверхностными структурами [14]. Рассматривая трансфицированные клетки, необходимо помнить, что они защищены от цитотоксического действия секретируемой биназы барстаром, экспрессирующимся на трансфицирующей плазмиде pCS2 + . Действительно, нами было показано, что клетки секретировали в среду биназу, однако оставались жизнеспособными (см. рис. 6).

ЛИТЕРАТУРА:

1. Ferlay J., Shin H.R., Bray F. et al. Estimates of worldwide burden of cancer in 2008: GLOBOCAN 2008. Int. J. Cancer 2010; 127: 2893-917.

2. Чиссов В.И., Александрова Л.М., Бутенко А.В. Научные основы и перспективы развития клинической онкологии. Вестник Росздравнадзора 2010; 4: 68-71.

3. orchilin V.P. Recent approaches to intracellular delivery of drugs and DNA and organelle targeting. Annu. Rev. Biomed. Eng. 2006; 8: 343-75.

4. Rawat A., Vaidya B., Khatri K. et al. Targeted intracellular delivery of therapeutics: an overview. Pharmazie 2007; 62(9): 643-58.

5. Seth P. Vector-mediated cancer gene therapy. Cancer Biol. Ther. 2005; 4(5): 512-7.

6. Vogelstein B., Kinzler K.W. Cancer genes and the pathways they control. Nat. Med. 2004; 10: 789-99.

7. Chirino A.J., Ary M.L., Marshall S.A. Minimizing the immunogenicity of protein therapeutics. Drug Discovery Today 2004; 9(2): 82-90.

8. Saxena S.K., Shogen K., Ardelt W. Onconase and its therapeutic potential. Lab. Med. 2003; 34: 380-7.

9. Porta C., Paglino C., Mutti L. Ranpirnase and its potential for the treatment of unresectable malignant mesothelioma. Biologics 2008; 2(4): 601-9.

10. Makarov A.A., Ilinskaya O.N. Cytotoxic ribonucleases: molecular weapons and their targets. FEBS Lett. 2003; 540: 15-20.

11. Makarov A.A., Kolchinsky A., Ilinskaya O.N. Binase and other microbial RNases as potential anticancer agents. Bioessays. 2008; 30(8): 781-90.

12. Mitkevich V.A., Petrushanko I.Y., Spirin P.V. et al. Sensitivity of acute myeloid leukemia Kasumi-1 cells to binase toxic action depends on the expression of KIT and АML1-ETO oncogenes. Cell Cycle 2011; 10(23): 4090-97.

13. Зеленихин П.В., Черепнев Г.В., Керн Ф. и соавт. Биназа не индуцирует поликлональный Т-клеточный ответ. Доклады академии наук 2006; 407(3): 1-3.

14. Cabrera Fuentes H.A., Kalacheva N.V., Mukhametshina R.T. et al. Binase penetration into alveolar epithelial cells does not induce cell death. Biomed. Khim. 2012; 58: 272-80.

Сегодня в генотерапии наиболее эффективным методом доставки генетического материала считается трансдукция, при которой чужеродная ДНК упаковывается в вирусную частицу, а перенос генов осуществляется путем нормальной вирусной инфекции, обеспечивающей эффективность и селективность экспрессии гена [25]. Несмотря на основное преимущество вирусной доставки - высокой эффективности, этот способ остается малоизученным и небезопасным, ввиду высокой имунногенности вирусных векторов, а также риска возникновения мутаций. Кроме того, вирусные частицы обладают малой емкостью, ограничивающей возможности генотерапии [5, 25]. Невирусные системы безопасны, но, возможно, менее перспективны ввиду низкой эффективности трансфекции in vivo [5]. Результаты данных экспериментов свидетельствуют о перспективности исследования новой экспрессионной системы на основе вектора pCS2 + , поскольку введение полученной векторной конструкции в опухоли обеспечит экспрессию чужеродного белка в группе трансфицированных клеток, и соответственно, селективное цитотоксическое действие биназы на близлежащие нетранфицированные опухолевые клетки, причем, сами клетки-продуценты будут защищены от токсического действия фермента внутриклеточным ингибитором - барстаром.

Благодарности

Работа выполнена в рамках государственной программы повышения конкурентоспособности Казанского (Приволжского) Федерального Университета среди ведущих мировых научнообразовательных центров и поддержана грантом РНФ № 14-14-00522.

15. Znamenskaya L.V., Vershinina O.A., Vershinina V.I. et al. Expression of the genes for guanyl-specific ribonucleases from Bacillus intermedius and Bacillus pumilus is regulated by the two component signal transduction system PhoP-PhoR in B. subtilis. FEMS Microbiology Letters 1999; 173: 217-22.

16. Sagar A.J., Pandit M.W. Denaturation studies on bovine pancreatic ribonuclease/ Effect of trichloroacetic acid. Biochim. Biophys. Acta 1983; 743: 303-9.

17. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 1970; 227: 680-85.

18. Polyakov K.M., Lebedev A.A., Okorokov A.L. et al. The structure of substrate-free microbial ribonuclease binase and of its complexes with 3'-GMP and sulfate ions. Acta Cryst. D Biol. Crystallogr. 2002; 58: 744-50.

19. Mitkevich V.A., Schulga A.A., Trofimov A.A. et al. Structure and functional studies of the ribonuclease binase Glu43Ala/Phe81Ala mutant. Acta Cryst. D Biol. Crystallogr. 2013; 69: 991-96.

20. Poliakov K.M., Goncharuk D.A., Trofimov A.A. et al. X-ray diffraction and biochemical studies of W34F mutant ribonuclease binase. Mol. Biol. (Russia) 2010; 44: 922-28.

21. Schulga A.A., Nurkiyanova K.M., Zakharyev V.M., et al. Cloning of the gene encoding RNase binase from Bacillus intermedius 7P. Nucleic Acids Res. 1992; 20: 2375.

22. Arnold U., Leich F., Neumann P. et al. Crystal structure of RNase A tandem enzymes and their interaction with the cytosolic ribonuclease inhibitor. FEBS J. 2011; 278: 331-40.

23. Gotte G., Mahmoud Helmy A., Ercole C. et al. Double domain swapping in bovine seminal RNase: formation of distinct N-and C-swapped tetramers and multimers with increasing biological activities. PloS One 2012; 7: e46804.

24. Garvie C.W., Vasanthavada K., Xiang Q. Mechanistic insights into RNase L through use of an MDMX-derived multi-functional protein domain. Biochim. Biophys. Acta 2013; 1834: 1562-71.

25. Flotte T.R. Gene therapy progress and prospects: recombinant adeno-assotiated virus (rAAV) vectors. Gene Ther. 2004; 11(10): 805-10.

Поступила: 12.08.2014

Гены & Клетки Том IX, № 3, 2014