КиРНК И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В СПОСОБАХ И КОМПОЗИЦИЯХ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ И/ИЛИ ПРОФИЛАКТИКИ ГЛАЗНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
KIRNA AND THEIR USE IN THE METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATMENT AND/OR PREVENTION OF EYE DISEASES

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
1
2
3
4
5
Глаукома определяется как процесс разрушения глазной ткани, вызванный постоянным повышением внутриглазного давления (ВГД) выше его нормальных физиологических пределов. При открытоугольной глаукоме повышение ВГД вызывает прогрессирующую оптическую нейропатию из-за потери ганглиозных клеток сетчатки, что в конечном итоге приводит к слепоте. При закрытоугольной глаукоме внезапное резкое повышение ВГД часто вызывает слепоту. Глаукома является второй ведущей причиной слепоты во всем мире, и заболеваемость возрастает во всем мире. Слепота при глаукоме вызвана дегенеративным процессом в сетчатке и зрительном нерве, но функционально ассоциирована с нарушениями баланса между секрецией и оттоком водянистой влаги (ВВ). ВВ секретируется клетками цилиарного тела, а отток может обеспечиваться по одному из двух путей: по трабекулярной сети и по увеосклеральному пути.
6
5,7
8
Современные методы лечения глаукомы не способны восстановить потерю зрения, вызванную глаукомой, а направлены на снижение ВГД. Было показано, что контроль ВДГ защищает от повреждения зрительного нерва при глаукоме. Для снижения ВГД в настоящее время используются пять классов лекарственных соединений: α-адренергические агонисты, β-адреноблокаторы, холинергические агонисты, простагландины и ингибиторы углерод-ангидразы. Если никакие из этих лекарственных соединений не дают эффекта снижения ВДГ, то для увеличения оттока ВВ может использоваться лазерная терапия трабекулярной сети. Последним терапевтическим средством является хирургическая процедура для создания нового маршрута оттока ВВ.
9,10,11
12
13
Современные методы лечения повышенного ВГД, ассоциированного с глаукомой, имеют относительно немного глазных побочных эффектов, но могут иметь системные побочные эффекты, если соединение попадает в кровоток. Методы лечения, лучше переносимые системно, такие как простагландины, имеют много проблем с местной переносимостью. Этот факт в совокупности с требуемой частотой инстилляций в целях поддержания адекватного уровня ВГД делает соблюдение режима лечения проблемой для пациентов. Несоблюдение метода лечения может не только способствовать развитию заболевания, но также может дать «эффект перезагрузки», вызывающий внезапное повышение ВГД, что может быть очень разрушительным для зрительного нерва.
12,14
15
16
Простагландины и бета-блокаторы являются предпочтительными агентами для снижения ВГД. Простагландины снижают ВГД очень эффективно и являются безопасными системно, но обладают несколькими глазными побочными эффектами, а именно, вызывают потемнение цвета радужки, рост ресниц, периокулярную пигментацию и гиперемию. Менее частыми глазными побочными эффектами этого класса лекарственных соединений являются внутриглазное воспаление, цистоидный макулярный отек и реактивация герпес-вирусных инфекций роговицы глаза. Аналоги простагландинов противопоказаны во время беременности из-за потенциального риска преждевременных родов.
17-19
20-23
Местное применение бета-блокаторов снижает ВГД за счет уменьшения продукции ВВ, а не за счет увеличения ее оттока. Нанесенные местно бета-блокаторы проникают в системный кровоток через эпителий конъюнктивы, слезные каналы, слизистую оболочку носа и желудочно-кишечный тракт, вызывая системные побочные реакции. В глазе адренергические рецепторы расположены на кровеносных сосудах, которые орошают цилиарное тело, и трабекулярной сети, где их основным эффектом является вазоконстрикция, хотя также было описано их участие в секреции водянистой влаги. Предшествующие исследования на глазах кроликов показали высокую плотность β-адренорецепторов в эпителии конъюнктивы, роговицы и отростков цилиарного тела, β-адренорецепторы также присутствуют в эндотелии роговицы, эпителии хрусталика, хориоидее и экстраокулярной мышце. Большинство β-адренергических рецепторов, обнаруженных в глазу, относятся к β2-типу.
24,25
26
27
28
29,30
24,31
РНК-интерференция (РНКи) представляет собой технологию, основанную на принципе, что малые, специфичные по последовательности, химически синтезированные двухцепочечные фрагменты РНК могут опосредовать деградацию конкретных матричных РНК (мРНК) в цитоплазме и, следовательно, селективно ингибировать синтез конкретных белков. Эта технология стала очень мощным инструментом для разработки новых соединений, направленных на блокирование и/или снижение аномальной деятельности заданных белков. Соединения на основе РНК-интерференции может быть рационально подобраны для блокирования экспрессии любого гена-мишени, включая гены, для которых невозможно найти традиционные низкомолекулярные ингибиторы. Примеры успешного использования РНК-интерференции в терапии включают ингибирование репликации ВИЧ-1 в клетках человека и нокдаун тау-белка и белка-предшественника аполипопротеина в животных моделях болезни Альцгеймера. Несмотря на то, что РНКи была открыта чуть более десяти лет назад, некоторые из этих соединений находятся уже на поздних стадиях клинических испытаний, а именно, RTP801 (Quark Pharmaceuticals, Fremont, PA, фаза II) для лечения возрастной макулярной дегенерации и ALN-RSV01 (Alnylam Pharmaceuticals, Cambridge, MA, фаза II) для лечения респираторно-синцитиального вируса. РНК-интерференция является очень привлекательным подходом для лечения хронических заболеваний, так как после прекращения лечения подавляемый белок должен повторно синтезироваться для восстановления своей биологической активности. Поэтому, эффекты соединений на основе РНК-интерференции в целом являются более длительными, чем у обычных методов лечения.
32
Глаз является относительно изолированным тканевым компартментом; эта особенность обеспечивает несколько преимуществ для использования терапии на основе киРНК. Местная доставка соединений в глаза ограничивает системное воздействие и уменьшает количество необходимого соединения. Это позволяет локальное подавление экспрессии гена и снижение вероятности широкого распространения подавления экспрессии вне глаза. Кроме того, иммунная система имеет ограниченный доступ к глазу; поэтому менее вероятно возникновение иммунного ответа на соединение.
Продолжая работу, описанную в WO2006/021817, авторы изобретения разработали киРНК SYL040012, указанную в SEQ ID NO: 2, которая представляет собой химически синтезированный, немодифицированный, двухцепочечный олигонуклеотид длиной 19 п.о. с выступающими дезоксидимидиновыми динуклеотидами на 3'-концах, способный избирательно подавлять синтез β2-адренергических рецепторов, показанный для лечения повышенного ВГД у пациентов с глазной гипертонией, открытоугольной глаукомой и другими связанными заболеваниями.
Соединение обладает доказанной эффективностью в отношении ингибирования экспрессии своей мишени в клеточных культурах и в отношении снижения ВГД у нормотензивных кроликов и в модели повышения ВГД у кроликов.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фигура 1: in vitro эффективность SYL040012 в клетках человека. (А) Динамика ингибирования ADRB2 в клетках человека: клетки BxPC3 и MDA-MB-231 трансфицировали либо 100 нМ SYL040012, либо 100 нМ киРНК с перетасованной случайным образом последовательностью, выделяли РНК, и экспрессию ADRB2 анализировали в различных временных точках после трансфекции. (В) Дозозависимое ингибирование ADRB2 в ответ на SYL040012 в клетках BxPC3: клетки BxPC3 трансфицировали увеличивающимися дозами SYL040012, и экспрессию ADRB2 анализировали через 48 ч после трансфекции. (C) Экспрессия семейства адренергических рецепторов в ответ на SYL040012. К клетками BxPC3 и MDA-MB-231 добавляли любое из 100 нМ SYL040012, киРНК с перетасованной последовательностью или носитель. * указывает на статистически достоверный уровень p<0,5 относительно нулевой временной точки.
Фигура 2: стабильность SYL040012 в биологических жидкостях. Стабильность SYL040012 оценивали у кроликов в водянистой влаге и сыворотке с помощью нативной ВЭЖХ в различных временных точках путем внесения в свежеполученные образцы обеих биологических жидкостей 20 мкМ раствора SYL040012 в PBS в нулевой временной точке. Результаты представлены в виде доли от исходного количества. Данные представлены в виде среднего ± среднеквадратичное отклонение для двух независимых анализов.
Фигура 3: снижение уровня eGFP в цилиарном теле после воздействия eGFP-киРНК. eGFP-трансгенные мыши получали три дозы по 160 мкг в день. Через 48 ч после последнего введения животных забивали, и глаза энуклеировали и подготавливали для флуоресцентной микроскопии. На левых панелях показаны полученные с помощью ДИК-микроскопии Номарского микрофотографии цилиарного тела животного, получавшего PBS (A), и животного, получавшего eGFP-киРНК (B). На средних панелях показаны микрофотографии, полученные с помощью флуоресцентной микроскопии, для животного, получавшего PBS (С), и животного, получавшего eGFP-киРНК (D). На правой панели показано слияние микрофотографий, полученных с помощью микроскопии Номарского и флуоресцентной микроскопии. NPE: непигментированный эпителий; PE: пигментированный эпителий.
Фигура 4: in vivo эффективность SYL040012 у кроликов. (А) Понижающий ВГД эффект SYL040012: две группы кроликов NZW получали либо SYL040012 (20 нмоль/день), либо PBS в течение 4 дней. ВГД оценивали через каждые два часа до 8 часов после каждого введения, такая же схема использовалась на 5-10 день, однако соединения не вводились. (В) Специфичность эффекта SYL040012: две группы кроликов NZW получали либо 100 нМ киРНК с перетасованной последовательностью, либо PBS. ВГД оценивали как описано выше. (С) Длительный понижающий ВГД эффект SYL040012: двум группам кроликов вводили либо 20 нмоль/день SYL040012, либо PBS, двумя сериями по четыре дня с интервалом между ними в три дня без введения соединения. ВГД оценивали, как описано выше, с 1-го по 13-й день. Показаны репрезентативные эксперименты.
Фигура 5: эффективность SYL040012 в кроличьей модели высокого внутриглазного давления, индуцированного избыточным пероральным введением воды. (А) Зависимость ответа ВГД от дозы SYL040012: животным вводили либо SYL040012 в одной из следующих дозировок: 10, 20, 40 или 60 нмоль/глаз/день, либо PBS на протяжении четырех дней. Через 120 мин после введения последней дозы, глазную гипертонию индуцировали избыточным пероральным введением воды. ВГД оценивали одновременно с введением последней дозы, за 60 мин и непосредственно перед избыточным пероральным введением воды и всего 10 раз с 25-минутным интервалом между измерениями после избыточного перорального введения воды. Данные представляют собой средние значения ± стандартная ошибка среднего (SEM) для двух животных на группу. (В) Специфичность SYL040012 в отношении ВГД: животным вводили либо 40 нмоль/глаз/день SYL040012, либо киРНК с перетасованной последовательностью, либо PBS, как указано выше. Пероральное избыточное введение воды и измерения ВГД проводили, как указано в (А). Данные представляют собой средние значения ± SEM для 12 животных для SYL040012; 11 животных для PBS и 2 животных для киРНК с перетасованной последовательностью. (C) Снижение уровня ADRB2 у животных, получавших SYL040012. Животные получали соединения, как указано в (В), и сразу после последнего измерения ВГД животных забивали, энуклеировали глаза и выделяли роговицу, слезные железы и цилиарное тело. Выделяли тотальную РНК, и экспрессию ADRB2 анализировали с помощью ПЦР в реальном времени. Данные представляют собой средние значения ± SEM для 3 животных на группу. Статистическую достоверность вычисляли путем сравнения каждой структуры из обработанного глаза с противоположным глазом, который обрабатывали PBS с использованием непарного t-теста Стьюдента, и она составляла ***p<0,001.
Фигура 6: кривые зависимости ВГД от доз А и В SYL040012. А. Изменения ВГД у 12 здоровых субъектов в ответ на повторяющееся введение дозы А SYL040012; B. Изменения ВГД в подгруппе субъектов, которые показывали снижение ВГД более чем на 20% при дозе А SYL040012 (n=5). C: Изменения ВГД у 12 здоровых субъектов в ответ на многократное введение дозы В SYL040012. Данные представляют собой среднее ± SEM для 12 субъектов в (А) и (С) и 5 субъектов в (В). Статистическую достоверность вычисляли с помощью двустороннего ANOVA для повторных измерений, и для последующих парных сравнений были сделаны поправки Бонферрони, и она составляла: ***p<0,001; **p<0,01 и *p<0,05.
Фигура 7: молекулы киРНК по изобретению. На данной фигуре показаны последовательности олигонуклеотидов для молекул киРНК, охватываемых настоящим изобретением.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к способам, композициям и дозировкам, которые снижают ВГД глаза, включающим SYL040012, молекулу 19-нуклеотидной двухцепочечной РНК с дезокситимидиновыми динуклеотидами, выступающими на 3'-концах. Композиции по настоящему изобретению включают SYL040012 в солевом растворе, таком как PBS, и фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, которые позволяет ее инстилляцию на глаз, а именно, в виде глазных капель. Дозировки по изобретению включают ежедневную инстилляцию глазных капель в объеме между примерно 30 мкл и примерно 40 мкл, включающем между примерно 0,6 мг и 0,9 мг SYL040012.
Настоящее изобретение относится к способам, композициям и дозировкам, которые снижают ВГД глаза. Композиции по изобретению включают молекулы коротких интерферирующих нуклеиновых кислот (киНК), которые снижают экспрессию гена адренергического рецептора бета-2 (ADRB2), что, как указывалось ранее, снижает выработку внутриглазной жидкости в передней камере глаза. Композиции по изобретению могут использоваться в изготовлении лекарственного препарата для лечения глазных заболеваний, проявляющихся повышением ВГД, таких как глаукома, инфекции, воспаления, увеит и диабетическая ретинопатия. Способы по изобретению включают введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества одной или нескольких киНК по изобретению по эффективной схеме дозирования.
Композиции по изобретению включают молекулы коротких интерферирующих нуклеиновых кислот (киНК), которые снижают или ингибируют экспрессию адренергического рецептора бета-2 (ADRB2), гена, связанного с производством внутриглазной жидкости, т.е. водянистой влаги. Настоящее изобретение охватывает композиции и способы применения коротких интерферирующих нуклеиновых кислот (киНК), включающих, но не ограниченных ими, молекулы коротких интерферирующих РНК (киРНК), двухцепочечных РНК (дцРНК) и коротких шпилечных РНК (кшРНК), способных опосредовать РНК-интерференцию в отношении гена-мишени, ADRB2. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения киНК, используемые в способах по настоящему изобретению, являются дцРНК. киНК по изобретению могут быть немодифицированными или химически модифицированными.
Способы по изобретению включают введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества киНК по изобретению. В предпочтительных вариантах осуществления способы по изобретению обеспечивают длительное снижение ВГД по сравнению с длительностью снижения ВГД, являющейся результатом введения коммерчески доступных препаратов, таких как Ксалатан, Трусопт и Тимофтол.
Способы по изобретению также включают введение одной или нескольких киНК по изобретению в комбинации с одним или несколькими другими терапевтическими препаратами, которые снижают ВГД, включая, но не ограничиваясь этим, коммерчески доступные препараты.
Способы по изобретению также включают введение композиции по настоящему изобретению посредством инстилляции на поверхность глаза. Когда киРНК вводят непосредственно в глаз, обычно вводят киРНК в количестве от примерно 0,01 мг до примерно 100 мг на каждый глаз в день, от примерно 0,04 мг до примерно 80 мг на каждый глаз в день, от примерно 0,04 мг до примерно 20 мг на каждый глаз в день, от примерно 0,08 мг до примерно 10 мг на каждый глаз в день, от примерно 0,08 мг до примерно 1,2 мг на каждый глаз в день, от примерно 0,3 мг до примерно 0,9 мг на каждый глаз в день или от примерно 0,08 мг до примерно 0,9 мг на каждый глаз в день.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к способам, композициям и дозировкам, которые снижают ВГД глаза. Композиции по изобретению включают молекулы коротких интерферирующих нуклеиновых кислот (киНК), которые снижают экспрессию гена бета-адренергического рецептора 2 (ADRB2), что, как указано выше, снижает продукцию водянистой влаги в передней камере глаза. Композиции по изобретению могут использоваться в изготовлении лекарственного средства для лечения глазного заболевания, проявляющегося повышением ВГД, такого как глаукома. Способы по изобретению включают введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества одной или нескольких киНК по изобретению по эффективной схеме дозирования
Подбор киНК
киНК по изобретению предназначены для модулирования активности за счет снижения или ингибирования экспрессии ADRB2, влияя, таким образом, на ВГД. В одном варианте осуществления изобретения снижение или ингибирование экспрессии гена-мишени уменьшает выработку внутриглазной жидкости, например, водянистой влаги. Номером доступа для ADRB2, указанного гена-мишени, в GenBank является NM_000024.
Используемый в настоящем документе термин «киНК» по изобретению относится к двухцепочечному олигонуклеотиду, способному опосредовать расщепление мРНК-мишени с помощью РНК-интерференции. Он является более предпочтительным чем «киРНК», чтобы избежать путаницы, учитывая, что обычной практикой в данной области является включение в структуру молекулы модифицированных неканонических оснований и, иногда, дезоксирибонуклеотида, включая одноцепочечные тимидиновые выступающие концы двухцепочечного участка.
Ген является «мишенью» киНК по изобретению, когда, например, молекула киНК избирательно снижает или ингибирует экспрессию гена. Фраза «избирательно снижает или ингибирует», используемая в данном документе, включает в себя киНК, которые снижают экспрессию одного гена, а также те, которые снижают экспрессию более чем одного гена. В тех случаях, когда киНК снижают экспрессию более чем одного гена, экспрессия гена, который является мишенью, снижается по меньшей мере примерно в два раза, примерно в три раза, примерно в четыре раза, примерно в пять раз, примерно в десять раз, примерно в двадцать пять раз, примерно в пятьдесят раз или примерно в сто раз относительно любого другого гена. В альтернативном варианте, ген является мишенью киНК, когда киНК гибридизуется в жестких условиях с транскриптом гена. киНК могут быть проверены либо in vitro или in vivo на способность специфично действовать на ген.
Для последовательности киНК по изобретению выбирают короткий фрагмент последовательности мРНК гена-мишени (например, 19-40 нуклеотидов в длину). В одном варианте осуществления изобретения киНК является киРНК. В предпочтительных вариантах осуществления критерии выбора фрагмента последовательности мРНК гена-мишени в качестве потенциальной молекулы киРНК включают: (1) последовательность из мРНК гена-мишени, которая отстоит по меньшей мере на 50-100 нуклеотидов от 5'- или 3'-конца нативной молекулы мРНК, (2) последовательность из мРНК гена-мишени, которая имеет содержание G/C-нуклеотидов в диапазоне от 30% до 70%, наиболее предпочтительно около 50%, (3) последовательность из мРНК гена-мишени, которая не содержит повторяющихся последовательностей (например, AAA, CCC, GGG, UUU, AAAA, CCCC, GGGG, UUUU), (4) последовательность из мРНК гена-мишени, которая доступна в мРНК, и (5) последовательность из мРНК гена-мишени, которая является уникальной для гена-мишени. Фрагмент последовательности из мРНК гена-мишени может соответствовать одному или нескольким критериям, перечисленным выше. В вариантах осуществления, где фрагмент из мРНК гена-мишени соответствует не всем вышеперечисленным критериям, исходная последовательность может быть изменена таким образом, чтобы киРНК соответствовала большему числу критериев, чем фрагмент мРНК гена-мишени. В предпочтительных вариантах осуществления киРНК имеет содержание G/C ниже 60% и/или не имеет повторяющихся последовательностей.
В одном конкретном варианте осуществления изобретения участок киНК, который комплементарен области-мишени, является полностью комплементарным области-мишени. В другом конкретном варианте осуществления изобретения участок киНК, который комплементарен области-мишени, не полностью комплементарен области-мишени. киНК со вставками, делециями и точечными мутациями относительно последовательности-мишени также охвачены настоящим изобретением. Таким образом, идентичность последовательностей может быть рассчитана с помощью алгоритмов сравнения и выравнивания последовательностей, известных в данной области (см. Gribskov and Devereux, Sequence Analysis Primer, Stockton Press 1991, и ссылки в ней), и вычисления различий в процентах между нуклеотидными последовательностями с помощью, например, алгоритма Смита-Уотермана, реализованного в программе BESTFIT с использованием параметров по умолчанию (например, от University of Wisconsin Genetic Computing Group). Более 90%, 95% или 99% идентичности последовательностей между киНК и участком гена-мишени является предпочтительным. В альтернативном варианте, комплементарность между киНК и нативной молекулой РНК может быть определена функционально путем гибридизации. Последовательность киНК по изобретению способна гибридизоваться с участком транскрипта гена-мишени в жестких условиях (например, в 400 мМ NaCl, 40 мМ PIPES рН 6,4, 1 мМ EDTA, при 50°С или 70°С в течение 12-16 часов с последующей промывкой). Последовательность киНК по изобретению также могут быть определена функционально по своей способности снижать или ингибировать экспрессию гена-мишени. Способность киНК влиять на экспрессию генов может быть определена эмпирически либо in vivo, либо in vitro.
В дополнение к киНК, которые специфичны только к одному гену, для направленного воздействия на гомологичные области нескольких генов могут использоваться вырожденные последовательности киНК. В WO 2005/045037 описан подбор молекул киНК, которые специфичны к таким гомологичным последовательности, например, путем включения неканонических пар оснований, например, несоответствий и/или несовпадающих пар оснований, что может обеспечить дополнительные последовательности-мишени. В тех случаях, когда обнаружены несоответствия, могут использоваться неканонические пары оснований (например, несоответствия и/или несовпадающие основания) для создания молекул киНК, мишенями которых является несколько последовательностей генов. В неограничивающем примере неканонические пары оснований, такие как UU- и СС-пары оснований, используются для создания молекул киНК, способных к направленному действию на последовательности различных мишеней, гомологичных по последовательности. Поэтому, одним из преимуществ использования киНК по изобретению является возможность подбора одной киНК, включающей последовательность нуклеиновой кислоты, комплементарную нуклеотидной последовательности, которая является консервативной у гомологичных генов. При таком подходе одна киНК может использоваться для ингибирования экспрессии более чем одного гена, вместо использования нескольких молекул киНК, для специфичного воздействия на различные гены.
Предпочтительные молекулы киНК по изобретению являются двухцепочечными. В одном варианте осуществления изобретения двухцепочечные молекулы киНК содержат тупые концы. В другом варианте осуществления изобретения двухцепочечные молекулы киНК содержат выступающие нуклеотиды (например, выступающие концы из 1-5 нуклеотидов, предпочтительно из 2 нуклеотидов). В конкретном варианте осуществления изобретения выступающие нуклеотиды находятся на 3'-концах. В другом конкретном варианте осуществления изобретения выступающие нуклеотиды находятся на 5'-концах. Любой тип нуклеотида может быть частью выступающего конца. В одном варианте осуществления изобретения выступающий нуклеотид или нуклеотиды являются рибонуклеиновыми кислотами. В другом варианте осуществления изобретения выступающий нуклеотид или нуклеотиды являются дезоксирибонуклеиновыми кислотами. В предпочтительном варианте осуществления изобретения выступающий нуклеотид или нуклеотиды являются тимидиновыми нуклеотидами. В другом варианте осуществления изобретения выступающий нуклеотид или нуклеотиды являются модифицированными или неклассическими нуклеотидами. Выступающий нуклеотид или нуклеотиды могут иметь неклассические межнуклеотидные связи (например, отличные от фосфодиэфирной связи).
В предпочтительных вариантах осуществления изобретения композиции киНК по изобретению подобраны для специфичного действия на SEQ ID NO: 1. Дополнительные варианты осуществления изобретения относятся к киНК, определенным в SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 и 6. В другом варианте осуществления изобретения, предпочтительной киНК по изобретению является SEQ ID NO: 2 (SYL040012). Этой предпочтительной киНК, SYL040012, является молекула 19-нуклеотидной немодифицированной двухцепочечной РНК с выступающими динуклеотидами на 3'-концах, содержащими дезокситимидиновые основания, как показано на фиг. 7.
Синтез киНК
киНК, подобранные способами, описанными выше, могут быть синтезированы любым способом, известным в данной области техники. РНК предпочтительно химически синтезировать с использованием соответствующим образом защищенных рибонуклеозид-фосфорамидитов и обычного ДНК/РНК-синтезатора. Кроме того, киРНК могут быть получены из коммерческих источников синтеза олигоРНК, включающих, но не ограниченных ими, Proligo (Hamburg, Germany), Dharmacon Research (Lafayette, CO, USA), Glen Research (Sterling, VA, USA), ChemGenes (Ashland, MA, USA), and Cruachem (Glasgow, UK), Qiagen (Germany), Ambion (USA) и Invitrogen (Scotland). В альтернативном варианте молекулы киНК по изобретению могут быть экспрессированы в клетках путем трансфекции клеток векторами, содержащими обратную комплементарную киНК последовательность под контролем промотора. После экспрессии киНК может быть выделена из клетки с помощью методик, хорошо известных в данной области техники.
В вариантах осуществления изобретения, в которых киРНК является двухцепочечной РНК (дцРНК), если получены одноцепочечные молекулы РНК, необходима стадия отжига. Кратко, объединяют 30 мл 50 мМ раствора каждого РНК-олигонуклеотида в 100 мМ ацетате калия, 30 мМ HEPES-КОН, pH 7,4, 2 мМ ацетате магния. Затем раствор инкубируют в течение 1 мин при 90°С, центрифугируют в течение 15 секунд и инкубируют в течение 1 часа при 37°С.
В вариантах осуществления изобретения, в которых киРНК представляет собой короткую шпилечную РНК (кшРНК), две цепи молекулы киРНК могут быть соединены линкерной областью (например, нуклеотидным линкером или не-нуклеотидным линкером).
5.3 Химическая модификация киНК
киНК по изобретению могут содержать один или несколько модифицированных нуклеотидов и/или не-фосфодиэфирных связей. Химические модификации, хорошо известные в данной области техники, способны повышать стабильность, доступность и/или поглощение клетками киНК. Специалисту будет известно о других видах химических модификаций, которые могут быть включены в молекулы РНК (обзор типов модификаций см. в международных публикациях WO 031070744, WO 2005/045037 или WO 2008/104978).
В одном варианте осуществления изобретения могут использоваться модификации, чтобы обеспечить повышенную устойчивость к деградации или повышенное поглощение. Примеры таких модификаций включают фосфоротиоатные межнуклеотидные связи, 2'-О-метилрибонуклеотиды (особенно на смысловой цепи двухцепочечной киРНК), 2'-дезоксифторрибонуклеотиды, 2'-дезоксирибонуклеотиды, нуклеотиды с «универсальным основанием», 5-С-метилнуклеотиды и включение инвертированного дезоксинуклеотида с удаленным азотистым основанием (в общем см. GB 2406568).
В другом варианте осуществления изобретения модификации могут использоваться для повышения стабильности киРНК или для усиления специфичности. Модификации включают химическую сшивку двух комплементарных нитей киРНК, химическую модификацию 3'- или 5'-конца цепи киРНК, модификацию сахара, модификации нуклеиновых оснований и/или модификации каркасной цепи, 2'-фтор-модифицированные рибонуклеотиды и 2'-дезоксирибонуклеотиды (в общем см. международную публикацию WO 2004/029212).
В другом варианте осуществления изобретения модификации могут использоваться, чтобы увеличить или уменьшить сродство к комплементарным нуклеотидам в мРНК-мишени и/или в комплементарной цепи киНК (в общем см. международную публикацию WO 2005/044976). Например, немодифицированный пиримидиновый нуклеотид может быть замещен на 2-тио, 5-алкинил, 5-метил или 5-пропинилпиримидин. Кроме того, немодифицированный пурин может быть замещен 7-деаза, 7-алкил или 7-алкенилпурином.
33
В другом варианте осуществления изобретения, когда киНК представляет собой двухцепочечную киРНК, 3'-концевые выступающие нуклеотиды заменены дезоксирибонуклеотидами, см., например, Elbashir et al..
Демонстрация терапевтической полезности
Композиции и способы по настоящему изобретению предпочтительно тестируют in vitro, а затем in vivo, на желаемую терапевтическую активность перед использованием в организме человека. Например, методы анализа in vitro, которые могут использоваться, чтобы определить, показано ли применение конкретного терапевтического протокола, включают методы анализа на клеточных культурах in vitro, в которых перспективную киНК вводят в клетки (например, клетки непигментированного ресничного эпителия кролика (NPE), клетки ресничного эпителия человека (OMDC) или клетки почки эмбриона человека (HEK293)) in vitro, и наблюдают влияние такого воздействия на клетки, например, снижение или ингибирование экспрессии гена-мишени.
Соединения для использования в терапии могут быть проверены в подходящих животных модельных системах до начала испытаний на человеке, включающих, но не ограниченных ими, кроликов, крыс, мышей, кур, коров, обезьян, хомяков и т.д. Например, новозеландский кролик является предпочтительным стандартом в экспериментальных платформах, предназначенных для изучения ВГД. Они просты в обращении и имеют крупные глаза, похожие по размеру на орган человека. Кроме того, существующее оборудование для измерения внутриглазного давления не подходит для использования у животных с небольшими глазами, такими как мыши или крысы. Наконец, кролики имеют ВГД, которое может быть снижено до 40% от его обычного (или до введения лекарств) показателя с использованием коммерческого местного гипотензивного лекарственного препарата. Таким образом, несмотря на возможность создания модели глаукомы у кроликов (например, хирургическим блокированием эписклеральных вен или искусственной окклюзией трабекулярной сети), обычно специалисты в данной области предпочитают модели, в которых глазные структуры остаются нетронутыми.
Терапевтические способы
Настоящее изобретение охватывает способы лечения, предупреждения или контроля глазного заболевания, ассоциированного с повышенным ВГД у пациента (например, у млекопитающего, в особенности, у человека), включающие введение эффективного количества одной или нескольких киНК по изобретению. В конкретном варианте осуществления изобретения, заболеванием, подлежащем лечению, предупреждению или контролю, является глаукома. Любой тип глаукомы, который ассоциирован с ВГД, можно лечить с помощью способов по настоящему изобретению, включая, но не ограничиваясь ими, открытоугольную глаукому (например, первичную открытоугольную глаукому, пигментную глаукому и эксфолиативную глаукому, глаукому низкого давления), глаукому закрытого угла (также известную клинически как закрытоугольная глаукома, узкоугольная глаукома, глаукома с зрачковым блоком и глаукома с цилиарным блоком) (например, острую закрытоугольную глаукому и хроническую закрытоугольную глаукому), глаукому при аниридии, врожденную глаукому, ювенильную глаукому, вызываемую ношением линз глаукому, неоваскулярную глаукому, посттравматическую глаукому, вызываемую стероидами глаукому, глаукому при синдроме Стерджа-Вебера и вызываемую увеитом глаукому.
Терапевтические методы с использованием киРНК, направленных на определенные гены-мишени, как ожидается, будут полезны в виде местных глазных капель, содержащих низкомолекулярные соединения, путем увеличении продолжительности времени, в течение которого наблюдается эффект, тем самым позволяя более редкое введение препарата и лучшее соблюдение пациентом схемы лечения.
В предпочтительных вариантах осуществления изобретения киНК, используемые в терапевтических способах по изобретению, снижают или ингибируют экспрессию генов, которые влияют на ВГД, таких как адренергический рецептор бета-2. В других предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения, киНК, используемые в терапевтических способах по изобретению, направлены на SEQ ID NO: 1. В конкретном предпочтительном варианте осуществления изобретения, киНК имеет от 21 до 30 нуклеотидов в длину и содержит последовательность SEQ ID NO: 3. Особенно предпочтительной является SYL040012 с SEQ ID NO: 2, не имеющей модификаций, то есть без неканонических оснований, и содержащая выступающие TT-динуклеотиды на обоих 3'-концах.
В предпочтительных вариантах осуществления изобретения, способы по настоящему изобретению обеспечивают устойчивое снижение ВГД, которое длится дольше, чем 8, 10, 12 или 14 часов, более предпочтительно в течение нескольких дней (например, в течение 2 дней, 3 дней, 4 дней или 5 дней) после последнего введения киНК. В таких вариантах осуществления, эффект (то есть, снижение ВГД) введенных киНК по изобретению длится дольше, чем продолжительность снижения ВГД, которая является результатом введения коммерчески доступных препаратов (например, Ксалатана, Трусопта и Тимофтола). киНК по изобретению, которые обеспечивают длительное снижение ВГД, можно вводить по такой схеме, чтобы ВГД непрерывно снижалось без ежедневного введения киНК. В конкретном варианте осуществления, схема лечения может включать в себя последовательные циклы с введением препарата (например, одна доза киНК ежедневно в течение четырех дней) и без введения препарата (например, 3 или 4 дня без лечения), все еще вызывая постоянное снижение ВГД.
В одном варианте осуществления изобретения единственный тип киНК вводят в терапевтических способах по изобретению. В другом варианте осуществления изобретения киНК по изобретению вводят в комбинации с другой киНК по изобретению и/или с одним или несколькими другими терапевтическими агентами (не киНК), полезными для лечения, профилактики или контроля глазного заболевания, ассоциированного с повышенным ВГД. Термин «в комбинации с» не ограничен введением терапевтических агентов точно в одно и то же время, а скорее означает, что киНК по изобретению и другой агент вводят пациенту последовательно и в течение временного интервала, так чтобы польза комбинации была выше, чем польза от их введения иным образом. Например, каждый терапевтический агент можно вводить одновременно или последовательно в любом порядке в различные моменты времени; однако, если не вводить соединения одновременно, то их следует вводить достаточно близко по времени, так чтобы обеспечить желаемый терапевтический эффект. Каждый терапевтический агент можно вводить отдельно, в любой подходящей форме и любым подходящим способом.
Дозировка
В контексте настоящего документа «эффективное количество» относится к такому количеству киНК по изобретению, которое достаточно для лечения или контроля глазного заболевания, связанного с повышенным ВГД и предпочтительно к количеству, достаточному для снижения ВГД. Для лечения повышенного ВГД у человека, предпочтительно снижать внутриглазное давление, так чтобы ВГД находилось между примерно 14 и 20 мм рт. ст. Однако любое снижение ВГД по сравнению с ВГД до лечения является предпочтительным при введении соединений по настоящему изобретению отдельно или в комбинации с другим подходящим терапевтическим средством (например, изобретение предусматривает снижение ВГД более чем примерно на 5%, примерно на 10%, примерно на 25%, примерно на 30%, примерно на 35%, примерно на 40%, примерно на 50% или примерно на 60% от ВГД до лечения). В некоторых вариантах осуществления изобретения соединения по изобретению могут вызвать снижение ВГД, которое составляет от примерно 1% до примерно 99%, от примерно 5% до примерно 90%, от примерно 10% до примерно 80%, от примерно 20% до примерно 50% или от примерно 25% до примерно 45% от ВГД до лечения. Предпочтительно, чтобы снижение ВГД составляло от примерно 25% до примерно 30%. Терапевтически эффективное количество может также относиться к количеству киНК, достаточному, чтобы задержать или минимизировать возникновение глазного заболевания, ассоциированного с ВГД. Терапевтически эффективное количество может также относиться к количеству терапевтического агента, которое обеспечивает терапевтический эффект при лечении или контроле глазного заболевания, ассоциированного с повышенным ВГД. Кроме того, терапевтически эффективное количество в отношении киНК по изобретению означает такое количество терапевтического агента отдельно или в комбинации с другими терапевтическими средствами, которое обеспечивает терапевтический эффект при лечении или контроле глазного заболевания, ассоциированного с повышенным ВГД. Используемый в связи с количеством киРНК по изобретению, термин может охватывать количество, которое улучшает общую терапию, снижает или устраняет нежелательные эффекты, или увеличивает терапевтическую эффективность или имеет синергетическое действие с другим терапевтическим агентом. Лечение с использованием киНК индивидуально или в комбинации должно привести к ВГД примерно 14-20 мм рт. ст. Однако любое снижение ВГД по сравнению с ВГД до лечения является предпочтительным (например, снижение ВГД больше чем на 5%, 10%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50% или 60% от ВГД до лечения).
Терапевтическим эффектом при лечении или контроле глазного заболевания, ассоциированного с повышенным ВГД, является длительное снижение ВГД, вызванное лечением. Чем более длительно снижение, тем меньше вероятность внезапных резких повышений ВГД, возникающих, когда наступает время введения следующей дозы. Это считается значительным улучшением терапевтической эффективности. В некоторых вариантах осуществления изобретения лечение с использованием киНК индивидуально или в комбинации может привести к снижению ВГД, поддерживаемому от примерно 2 дней до примерно 7 дней, от примерно 2 до примерно 6 дней и от примерно 2 дней до примерно 4 дней. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения снижение поддерживается от примерно 2 дней до примерно 3 дней, предпочтительно в течение 3 дней.
Следовательно, в некоторых вариантах осуществления изобретения введение соединений по изобретению приводит к предупреждению, защите от или снижению повреждения зрительного нерва, вызванного «эффектом перезагрузки» ВГД, когда наступает время введения следующей дозы в случаях плохого соблюдения пациентами графиков лечения.
Эффективное количество и схема лечения для композиции по изобретению могут быть определены стандартными методами исследований. Например, доза композиции, которая будет эффективна для лечения, профилактики или контроля заболевания, может быть определена путем введения композиции животной модели, такой как, например, животные модели, раскрытые в данном документе, например, модель на белых новозеландских кроликах или известные специалистам в данной области техники. Кроме того, для того чтобы определить оптимальные диапазоны доз, необязательно, могут использоваться анализы in vitro. В альтернативном варианте, дозировка для индивидуума может быть определена титрованием дозы до достижения эффективного уровня.
Выбор предпочтительного эффективного количества для использования в дозировках может быть определен (например, с помощью клинических испытаний) специалистом в данной области с учетом нескольких факторов, которые должны быть известны любому специалисту в данной области техники. Такие факторы включают в себя заболевание, подлежащее лечению или профилактике, симптомы заболевания, массу тела пациента, иммунный статус пациента и другие факторы, известные специалистам в данной области, влияющие на правильность вводимых фармацевтических композиций.
Точная доза для применения в составе будет также зависеть от способа введения и серьезности заболевания, и должна быть определена в соответствии с решением лечащего врача и состоянием каждого пациента.
Когда киРНК вводят непосредственно в глаз, обычно киНК вводят в количестве от примерно 0,01 мг до примерно 100 мг на глаз в день, от примерно 0,04 мг до примерно 80 мг на глаз в день, от примерно 0,04 мг до примерно 20 мг на глаз в день, от примерно 0,08 мг до примерно 10 мг на глаз в день, от примерно 0,08 мг до примерно 1,2 мг на глаз в день, от примерно 0,3 до примерно 0,9 мг на глаз в день или от примерно 0,08 мг до примерно 0,9 мг на глаз в день. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения киРНК по изобретению вводят в количестве от примерно 0,08 мг до примерно 0,9 мг на глаз в день, от примерно 0,3 мг до примерно 0,9 мг, от примерно 0,3 мг до примерно 0,6 мг и наиболее предпочтительно от примерно 0,6 мг до примерно 0,9 мг на глаз в день. В предпочтительном варианте осуществления изобретения киРНК по изобретению находятся в солевом растворе, таком как PBS. В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения, киРНК по изобретению является SYL040012, и ее вводят в указанных выше дозах. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения эти дозы можно вводить один раз в день, два раза в день, три раза в день или четыре раза в день, и введение в каждый глаз будет проходить ежедневно, через день, раз в неделю, два раза неделю, три раза в неделю, раз в две недели или раз в месяц. В некоторых вариантах осуществления изобретения указанные выше дозы могут вводиться в одно и то же время каждый день или в разное время каждый день. Учитывая то, что патологии, характеризующиеся повышенным IOP, такие как глаукома, имеют хронический характер, в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения введение киНК по изобретения является также постоянным. В альтернативных вариантах осуществления изобретения, когда увеличение ВГД пациентов является временным, композиции по изобретению должны вводиться пока сохраняется патологическое состояние.
Составы и пути введения
киНК по изобретению могут быть составлены в виде фармацевтических композиций любым из обычных методов, известных в данной области (см., например, Alfonso, G. et al., 1995, in: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing, Easton PA, 19th ed.). Составы, содержащие одну или несколько киНК для использования в способах по изобретению, могут находиться в различных формах и могут зависеть от различных факторов, индивидуальных для каждого пациента (например, типа и серьезности расстройства, типа вводимой киНК, возраста, массы тела, ответа на лечение и прошлой истории болезни пациента), числа и типа киНК в составе, формы композиции (например, жидкой, полужидкой или твердой формы), схемы лечения (например, вводится ли терапевтический агент на протяжении лечения один раз в день, несколько раз в день или раз в несколько дней, и/или способа введения).
В предпочтительном варианте осуществления изобретения композиции по изобретению вводят в виде глазных капель, доставляемых непосредственно в глаз. Глазные капли могут быть доставляться в объеме от примерно 10 мкл до примерно 100 мкл на каплю, более предпочтительно от примерно 20 мкл до примерно 50 мкл на каплю и наиболее предпочтительно от примерно 30 мкл до примерно 33 мкл на каплю. В дополнительном предпочтительном варианте осуществления изобретения глазные капли доставляются в объеме около 40 мкл. В предпочтительном варианте осуществления композиция по изобретению включает в себя SYL040012 в приемлемом растворе, таком как PBS. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения SYL040012 вводят один раз в день в виде глазных капель в концентрации от примерно 7,5 мг/мл до примерно 22,5 мг/мл, предпочтительно от примерно 15 мг/мл до 22,5 мг/мл.
Эти композиции могут принимать форму водных и неводных растворов, суспензий, эмульсий, микроэмульсий, водных и неводных гелей, кремов, таблеток, пилюль, капсул, порошков, препаратов с замедленным высвобождением и т.п. киНК по изобретению также могут быть инкапсулированы в средстве доставки (включающем, но не ограниченном ими, липосомы, микросферы, микрочастицы, наночастицы, наносферы, биологически разлагаемые полимеры, гидрогели, циклодекстрины, поли(молочную-со-гликолевую) кислоту (PLGA)) или находиться в комплексе с полиэтиленимином и его производными (например, производными полиэтиленгликоль-полиэтиленимин-N-ацетилгалактозамином (ПЭИ-ПЭГ-GAL) или полиэтиленимин-полиэтиленгликоль-три-N-ацетилгалактозамином (ПЭИ-ПЭГ-Trigal)). Предпочтительные композиции по изобретению представляют собой водные растворы, в частности, предпочтительными являются солевые растворы, такие как PBS с pH диапазоне от примерно 7,0 до примерно 7,4, предпочтительно с pH 7,2±0,5.
В композиции по настоящему изобретению могут быть включены фармацевтические носители, переносчики, вспомогательные вещества или разбавители, включающие, но не ограниченные ими, воду, солевые растворы, предпочтительно буферные солевые растворы, масла (например, вазелиновое, животное, растительное или синтетическое масла), крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рис, муку, мел, силикагель, стеарат натрия, моностеарат глицерина, тальк, хлорид натрия, сухое обезжиренное молоко, глицерин, пропиленгликоль, этанол, биополимеры (например, карбопол, гиалуроновые кислоты, полиакриловую кислоту и т.д.), декстрозу, усилители проницаемости (например, жирные кислоты, сложные эфиры жирных кислот, жирные спирты и аминокислоты) и гидрофильные полимеры (например, поликарбофил и поливинилпирролидон) и т.п. Композиция, при желании, может также содержать незначительные количества смачивающих или эмульгирующих агентов или рН-буферные агенты.
Подходящие липофильные растворители или носители включают жирные масла, такие как кунжутное масло, или синтетические эфиры жирных кислот, такие как этилолеат, или триглицериды, или липосомы. Необязательно, суспензия может также содержать подходящие стабилизаторы или агенты, которые повышают растворимость соединений, позволяя получение высококонцентрированных растворов.
В предпочтительных вариантах осуществления, композиции по изобретению составлены в виде раствора, предпочтительно буферного солевого раствора, такого как PBS или гель, для местного введения в глаз, например, в виде глазных капель. В таких вариантах осуществления изобретения композиции могут представлять собой катионные эмульсии и/или могут содержать биополимеры, включая, но не ограничиваясь ими, поли(лактид-со-гликолид), карбопол, гиалуроновые кислоты и полиакриловую кислоту.
В конкретном предпочтительном варианте осуществления композиции по изобретению составлены в растворе, таком как, фосфатно-солевой буфер (PBS), который, необязательно, может также содержать один или несколько фармацевтически приемлемых разбавителей и/или вспомогательных веществ, таких как хлорид бензалкония, что позволит инстилляции на поверхность роговицы глаза в виде глазных капель, предпочтительно от примерно 30 мкл до примерно 33 мкл. В таких предпочтительных вариантах осуществления изобретения доза составляет от примерно 0,6 мг до примерно 0,9 мг на глаз в день, предпочтительно вводимая один раз в день.
киНК по настоящему изобретению также могут быть введены в состав в сочетании с другими терапевтическими соединениями, которые снижают ВГД (например, коммерчески доступными препаратами).
Наборы
Соединения киНК по изобретению также могут быть представлены в наборах, которые включают дозатор с отверстием для подачи определенных доз соединения киНК в капле заданного объема. В предпочтительном варианте соединениями киНК по изобретению являются киНК, направленные против SEQ ID NO: 1. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения дозаторы в наборе по изобретению обеспечивают композицию, содержащую SYL040012. В другом варианте осуществления изобретения набор может содержать серию одноразовых дозаторов, например, для использования в течение одного месяца, в этом конкретном случае набор будет содержать 30 одноразовых дозаторов. Объем капли может находиться в диапазоне от приблизительно 50 мкл до приблизительно 100 мкл. Дозатор может быть одноразовым и может содержать от примерно 1 мг до примерно 2 мг соединений киНК по изобретению и, необязательно, также содержать один или несколько фармацевтически приемлемых разбавителей и, необязательно, одно или несколько вспомогательных веществ. Композиция, содержащаяся в дозаторе, может иметь концентрацию от примерно 15 мг/мл до примерно 22,5 мг/мл соединения киНК по изобретению. В альтернативном варианте дозатор может быть разработан для использования в течение одного месяца или более длительного периода времени, и содержащийся в нем объем соответственно увеличится, чтобы обеспечить эквивалентное количество доз. Наборы по изобретению могут также содержать инструкции, указывающие, что дозировка соединения киНК от примерно 0,6 мг до примерно 0,9 мг в 1 капле должна быть нанесена на каждый глаз. В инструкциях может быть дополнительно указано, что капли следует закапывать в каждый глаз один раз в день, два раза в день, три раза в день или четыре раза в день, и что закапывание в каждый глаз будет проходить ежедневно, через день, раз неделю, два раза в неделю, три раза в неделю, раз в две недели или раз в месяц.
Содержание всех опубликованных статей, книг, справочников и тезисов, приведенных в данном документе, тем самым включено путем ссылки в полном объеме для более исчерпывающего описания состояния области, к которой относится изобретение.
Поскольку в описанном выше объекте изобретения могут быть сделаны различные изменения без отступления от объема и сущности настоящего изобретения, предполагается, что все объекты, содержащиеся в приведенном выше описании или определенные в прилагаемой формуле изобретения, следует интерпретировать как описательные и иллюстративные в отношении настоящего изобретения. Модификации и вариации настоящего изобретения возможны в свете вышеизложенных идей.
ПРИМЕРЫ
ПРИМЕР 1: in vitro анализ SYL040012
Культивирование клеток и трансфекции
2
2
2
Клетки BxPC3 и MDA-MB-231 были получены от Американской ассоциации коллекций культур (Роквиль, Мериленд, США) и культивировались в культуральной среде (среде RPMI-1640 с 10% 10% FBS (клетки BxPC3) и среде DMEM с 10% FBS (клетки MDA-MB-231) в увлажненном инкубаторе в атмосфере 5% СО/95% воздуха при 37°С. Для трансфекции клетки высевали с плотностью 106000 клеток/см для линии BXPC3 и 200000 клеток/см для линии MDA-MB-231. Когда клеточные культуры достигли примерно 90% конфлюентности, клетки трансфицировали 100 нМ SYL040012 с помощью Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Пасли, Великобритания). Эффективность трансфекции оценивали путем определения количества флуоресцирующего в красном спектре олигонуклеотида Block-it-Alexa fluor (Invitrogen, Pasley, Великобритания), присутствующего внутри клетки в контрольных культурах через 24 ч после трансфекции.
Выделение РНК и ПЦР в реальном времени
Тотальную РНК выделяли из клеточных культур или тканей с использованием набора экстракции РНК, RNeasy (Invitrogen, Калифорния, США). 4 мкг тотальной РНК использовали в реакции обратной транскрипции с использованием набора High-Capacity cDNA Archive (Applied Biosystems, Inc., Фостер Сити, Калифорния, США) в соответствии с инструкциями изготовителя.
ПЦР в реальном времени проводили с использованием системы детекции Stepone plus (Applied Biosystems). 500 нанограммов каждого образца амплифицировали в TaqMan 2X Universal Master Mix при следующих условиях: 95°C в течение 10 мин, с последующими 40 циклами 95°C в течение 15 с и 60°C в течение 1 мин. Все реакции амплификации с помощью ПЦР в реальном времени (qRT-PCR) проводили в трипликатах и повторяли в пяти независимых экспериментах, всегда включая контроли обратной транскрипции и контроли, в которых отсутствовала матрица.
Уровни мРНК ADRB2 были проанализированы с помощью qRT-PCR в различных временных точках после трансфекции 100 нМ SYL040012 (24, 48 и 72 часа) в соответствии с вышеописанным протоколом. Количественные данные по гену ADRB2 нормализовали по экспрессии HPRT1 в клетках и тканях кролика и по экспрессии GAPDH в клетках человека, которые служили в качестве положительного контроля амплификации.
Анализ жизнеспособности клеток
Жизнеспособность клеток оценивали МТТ-способом и анализировали в различных временных точках (24, 48 и 72 часа) после трансфекции клеток MDA-MB-231 и BxPC3 с использованием Cell Titer 96 Aqueous Non Radioactive Cell Proliferation Assay kit (Promega, Мангейм, Германия), следуя инструкциям изготовителя.
In vitro анализ эффективности, специфичности и безопасности SYL040012
Уровни мРНК ADRB2 были проанализированы с помощью qRT-PCR в различных временных точках (24, 48 и 72 часа) после трансфекции клеточных культур BxPC3 или MDA-MB-231 либо 100 нМ SYL040012, либо киРНК с перетасованной последовательностью. Наблюдалось снижение, которое варьировало в пределах 50-70% от базальных уровней мРНК ADRB2 в зависимости от временной точки (фигура 1А). В обеих клеточных линиях максимальный эффект SYL040012 наблюдался через 24 часа после трансфекции, в этой временной точке снижение по мРНК ADRB2 составляло приблизительно 50% от базальных уровней. В клетках BxPC3 базальные уровни ADRB2 восстанавливались приблизительно через 72 ч после трансфекции, тогда как в клетках MDA-MB-231 уровни мРНК в этой точке оставались ниже базального линии. Трансфекция РНК с перетасованной последовательностью не меняла уровни ADRB2, показывая, что эффект SYL040012 является специфичным.
Для оценки того, имеет ли снижение уровней ADRB2 эффект на жизнеспособность клеток, проводили МТТ-анализ в тех же временных точках, как указанные выше. SYL040012 не вызывала никакого значительного эффекта на жизнеспособнось клеток во времени (таблица 1). Этот результат указывает, что снижение мРНК ADRB2 в ответ на SYL040012 не вызывает клеточную токсичность.
Таблица 1Жизнеспособность MDA-MB-231 и BXPC3 клеток после воздействия либо 100 нМ SYL040012, либо 100 нМ перетасованной последовательности, либо PBS. Жизнеспособность клеток анализировали с помощью МТТ-анализа через 24, 42 и 72 ч после обработки 100 нМ SYL040012, той же дозой киРНК с перетасованной последовательностью или носителем. Данные представляют собой среднее ± SEM для трех независимых экспериментов
Время (ч)
MDA-MB-231
BxPC3
Перетасованная последовательность
контроль
Перетасованная последовательность
контроль
24
96,39±5,41
107,13±2,43
100,00±12,54
113,22±8,20
108,62±24,19
100,00±13,79
48
105,70±0,63
101,71± 2,96
100,00±1,59
97,15±0,16
107,29±2,74
100,00±3,22
72
105,86±12,56
112,87±9,18
100,00±7,08
99,75±15,62
101,33±2,96
100,00±5,57
22
Соединения на основе РНК-интерференции зависят от активности эндогенного механизма РНК-интерференции. Одним из недостатков РНК-интерференции является то, что эта эндогенная система может насыщаться при добавлении большого количества экзогенных молекул РНК. С целью оценки влияния различных доз SYL040012, клетки BXPC3 трансфицировали, увеличивая дозу SYL040012 (от 0,001 до 100 нМ). Тотальную РНК выделяли через 24 часа после трансфекции и уровни мРНК ADRB2 определяли с помощью ПЦР в реальном времени (фигура 1B). Статистически значимое снижение уровней ADRB2 наблюдается при дозе 0,5 нМ. Максимальный эффект отмечался в ответ на дозу 10 нМ. Никаких существенных различий не наблюдалось между концентрациями 10 и 100 нМ. С использованием этих данных было вычислено значение 50%-ой ингибирующей концентрации (IC50), составляющее 9,2 нМ.
Специфичность соединения к его мишени имеет решающее значение для уменьшения побочных эффектов в клинических условиях. Авторы изобретения проанализировали эффект SYL040012 на рецепторы адренергического семейства для анализа его влияния на мРНК белков, структурно связанных с ADRB2. Уровни мРНК адренергических рецепторов ADRB2, ADRB1 и ADRA1B были оценены в клетках BXPC3 после обработки SYL040012. На фигуре 1С показано, что SYL040012 может избирательно снижать уровни мРНК ADRB2 без существенного влияния на уровни мРНК ADRB1 или ADRA1B.
ПРИМЕР 2: исследования стабильности
Способы
Стабильность SYL040012 в кроличьей сыворотке и внутриглазной жидкости оценивали двумя способами: способом нативной HPLC для измерения количества дуплексной РНК путем отделения двухцепочечной РНК от негибридизированных одноцепочечных молекул и способом денатурирующей IEX-HPLC для оценки чистоты обеих одноцепочечных молекул в дуплексе и обнаружения потенциальных результатов деградации для оценки стабильности отдельных цепей. Дополнительные тесты, такие как внешний вид, рН и УФ-спектр, были проведены в соответствии с действующими изданиями фармакопей Европы и США.
Стабильность SYL040012
Соединения РНК очень легко разрушается РНКазами, по этой причине стабильность соединения оценивали в его носителе (PBS), а также в сыворотке и внутриглазной жидкости кролика.
Результаты исследования стабильности лекарственного препарата SYL040012 при инкубации в течение до 24 часов при температуре 37°С в сыворотке и внутриглазной жидкости кролика показаны на фигуре 2. Эти результаты показывают, что во внутриглазной жидкости кролика время полужизни SYL040012 превышает 24 часа, тогда как время полужизни в сыворотке кролика составляет меньше 30 мин.
ПРИМЕР 3: биораспределение киРНК в глазах GFP-мышей
Способы
Для исследования использовали взрослых самцов мышей C57BL/6-TG(ACTbEGFP) в возрасте приблизительно 8 недель. Мышей содержали в группах в комнате с контролируемой температурой, 12-часовым циклом свет/темнота и свободным доступом к пище и воде.
34
Глаза 6-8-недельных взрослых eGFP-трансгенных мышей обрабатывали дозой 11,2 нмоль/день eGFP-киРНК в течение трех последовательных дней. Эта модель подробно описана в литературе, и животные широко экпрессируют белок eGFP, который легко обнаружить с помощью флуоресценции. Последовательностью-мишенью, используемой для РНК-интерференции, была следующая последовательность: EGFP 5'-GGCTACGTCCAGGAGCGCACC-3'. Через 48 ч после последнего введения, животных умерщвляли, и оба глаза собирали и обрабатывали для флуоресцентной микроскопии.
Биораспределение киРНК в мышах, трансгенных по зеленому флуоресцентному белку (GFP)
Первым важным шагом в любом интерференционном исследовании является оптимизация условий доставки киРНК in vivo. Способность обнаруживать фенотипические изменения или потерю функции в популяции-мишени зависит от эффективности, с которой киРНК доставляется в ткань-мишень.
Для того чтобы исследовать, может ли киРНК проходить через роговицу и поступать в переднюю камеру глаза, киРНК, специфичную к зеленому флуоресцентному белку, анализировали на eGFP-трансгенных мышах. Применение киРНК, специфично подобранной к eGFP, снижало флуоресценцию в отростках цилиарного тела и трабекулярной сети по сравнению с необработанными мышами (фигура 3). Этот результат указывает на то, что, с одной стороны, киРНК может достигнуть передней камеры глаза, а, с другой стороны, будучи там, поглощается клетками отростков цилиарного тела и способна снижать экспрессию целевого гена.
ПРИМЕР 4: эффективность in vivo
Животные
Для всех экспериментов использовали взрослых самцов новозеландских белых кроликов (NZW) (Granja San Bernardo, Испания и Charles River Laboratories) в возрасте приблизительно 10 недель. Животных содержали по одному в стандартных клетках в комнате с контролируемой температурой, 12-часовым циклом свет/темнота и свободным доступом к пище и воде. Животные проходили базовое обследование офтальмолога на неделе перед началом и в конце каждого исследования. Исследовали следующие параметры: раздражение/воспаление век, продукцию слезы, размер зрачка, внешний вид роговицы и раздражение/воспаление конъюнктивы.
Со всеми животными обращались в соответствии с заявлением ARVO по использованию животных в офтальмологических и зрительных исследованиях.
Измерение ВГД
ВГД измеряли с помощью аппланационного тонометра TONO-PEN AVIA™ после местного анестетика Colircusi (0,4%-й тетракаин + 0,4%-й оксибупрокаин, Alcon) на роговице, чтобы избежать дискомфорта животных. Каждое измерение проводили в трипликатах, и приводили средние результаты.
Модель гипертонии, вызванной избыточным пероральным потреблением воды
За четыре дня до начала каждого исследования проводили пять измерений ВГД с 2-часовым интервалом между измерениями. После этого животных разделяли по экспериментальным группам, рандомизируя животных в соответствии со значениями ВГД. Соединения инстиллировали в глаз один раз в день в течение 4 дней в дозировке объемом 40 мкл на глаз, содержащей 20 нмоль киНК в PBS. PBS использовали в качестве отрицательного контроля. В течение первых трех дней приема регистрировали измерения базального ВГД до введения тестируемого объекта или носителя. ВГД измеряли 4 раза после введения с 2-часовым интервалом.
На четвертый день исследования, регистрировали измерения базального ВГД до введения и через 1 и 2 часа после введения. В этот момент индуцировали гипертонию посредством перорального введения воды (60 мл/кг) голодающим в течение ночи животным. После этого измеряли ВГД в общей сложности 10 раз с 25-минутным интервалом между измерениями. После последнего измерения, животных умерщвляли передозировкой пентобарбитала, и собирали основные глазные структуры и хранили в буфере RNAlater до использования.
In vivo эффективность SYL040012
В качестве первого шага для демонстрации in vivo эффективности SYL040012, новозеландских белых кроликов обрабатывали тремя продуктами, которые в настоящее время представляют собой лечение первой линии при глаукоме: Трусопт (дорзоламид), Ксалатан (латанопрост) и Тимофтол (тимолол). По одной капле (40 мкл) каждого из соединений закапывали в глаза трех отдельных групп кроликов в течение четырех последовательных дней. Измерения ВГД проводили каждый час в течение 8 часов, начиная через один час после последнего введения. Все соединения вызвали снижение ВГД на 20-35%, в зависимости от соединения, и этот эффект длился около 6 часов (данные не показаны). Эти эксперименты подтвердили пригодность этой животной модели вследствие ее способности реагировать на регуляторы ВГД.
Для оценки влияния SYL040012 на ВГД, новозеландским белым кроликам инстиллировали либо по 0,3 мг в день SYL040012, либо PBS в течение 4 дней подряд, в виде одной капли 40 мкл в день. На фиг. 4А показано, что наблюдается снижение ВГД на 21,81% ± 1,55% по сравнению с контрольной группой, которой инстиллировали носитель. Эффект SYL040012 на ВГД обнаруживался через два дня лечения, и значения оставались ниже базального уровня приблизительно в течение двух дней после последнего применения. Специфичность эффекта оценивали, проводя такой же эксперимент с введением перетасованной последовательности вместо соединения. Результаты, представленные на фиг. 4B, показывают, что киРНК с перетасованной последовательностью не оказывает никакого влияния на ВГД, таким образом, эффект SYL040012 был специфичным.
Среднее время эффекта SYL040012 вычисляли как разность между половиной максимального времени восстановления и временем, при котором достигалась половина максимального эффекта на ВГД. Результаты этих вычислений приведены в таблице 3 и иллюстрируют разницу в среднем времени эффекта SYL040012 (91,6 ч) по сравнению с Ксалатаном™ (5,36 ч) и Трусоптом™ (4,75 ч).
Для анализа влияния SYL040012 в динамике, группа кроликов получала два цикла из четырех введений соединения один раз в день в дозе 0,3 мг/день, отделенных друг от друга трехдневным периодом, свободным от лекарств. На фигуре 4C показано, что наблюдалось снижение ВГД на 19,29+0,89%, и это снижение ВГД сохранялось в динамике. Снижение ВГД наблюдалось после второго введения примерно до 48 ч после последнего применения, включая свободный от лекарств период. Тот факт, что SYL040012 способна поддерживать снижение уровня ВГД в этой животной модели даже при отсутствии введения соединения в интервале до 72 часов, является очень привлекательным. При использовании коммерческих препаратов длительное снижение ВГД зависит от постоянного применения препаратов. Эта особенность позволяет предположить, что SYL040012 может защитить от возможного повреждения зрительного нерва, вызванного «эффектом перезагрузки» ВГД в случае плохого соблюдения пациентом схемы лечения.
ПРИМЕР 5: эффективность in vivo на животной модели с глазной гипертонией
35-38
38
Для оценки снижающего ВГД эффекта SYL040012 в условиях, более близких к патологическому состоянию, наблюдаемому при глаукоме, использовали модель избыточного потребления воды на новозеландских белых кроликах. Эта модель была ранее описана несколькими авторами. Главное преимущество этой модели над другими экспериментальными моделями глазной гипертонии состоит в том, что можно избежать введения раздражающих веществ или методов, травматичных для глаз, оставляя глазные структуры нетронутыми. Это позволяет глазу нормально реагировать на тестируемые лекарственные соединения.
Первый эксперимент представлял собой подбор диапазона доз, в котором четыре различные дозы SYL040012 (0,15, 0,3, 0,6 и 0,9 мг на глаз в день) вводили в общей сложности 3 раза: за 48, 24 и 2 часа до индукции гипертонии. Все обработки применялись на обоих глазах, а ВГД измеряли до индукции гипертонии и каждые 20 минут до 120 минут после перорального избыточного потребления воды. Двусторонний ANOVA-анализ для повторных измерений результатов показал статистически значимый эффект как на время (р<0,001), так и на обработку (р<0,0001), но без взаимодействия между этими факторами. Различия между каждой дозой и PBS были проанализированы с помощью одностороннего ANOVA с ретроспективным тестом Даннетта. На фигуре 5А показано, что SYL040012 обеспечивает существенную защиту в отношении роста ВГД при всех протестированных дозах (р<0,01 по сравнению с физиологическим раствором во всех случаях). Максимальное среднее значение ΔВГД (ВГД после введения воды - ВГД до введения воды) у животных, получавших SYL040012 составляло 6,6 мм рт. ст., 8,2 мм рт.ст., 4,8 мм рт. ст. и 4,3 мм рт. ст. для доз 0,15, 0,30, 0,60 и 0,90 мг/день/глаз, соответственно, относительно максимальной ΔВГД у контрольных животных (обработанных носителем), составляющей 15,55 мм рт.ст.
Для того чтобы подтвердить эффективность и специфичность SYL040012 на ВГД большая группа животных получала фиксированную дозу 0,3 мг/день в течение четырех последовательных дней. Как видно из фигуры 5В, введение воды вызывало увеличение ВГД приблизительно на 7 мм рт. ст. в течение первого часа после индукции гипертонии у животных, получавших PBS. Двусторонний ANOVA-анализ для повторных измерений результатов показывает значительный эффект как на время, так и на обработку (р<0,0001 в обоих случаях), но отсутствие взаимодействия между этими факторами. Дальнейший анализ был выполнен с помощью одностороннего ANOVA с ретроспективным тестом Даннетта для одиночных сравнений. Результаты этого анализа показывают, что воздействие SYL040012 значительно снижало величину ΔВГД в течение первого часа по сравнению с обработанными PBS животными (р<0,05 относительно PBS). Эффект SYL040012 был специфичным, поскольку воздействие киРНК с перетасованной последовательностью не оказывало никакого влияния на ВГД (р>0,05 относительно PBS).
Для дальнейшего подтверждения того, что наблюдаемое снижение ВГД было отражением соответствующего уменьшения уровней мРНК ADRB2, были проанализированы соответствующие ткани. Животных, получавших воздействие, как описано выше, умерщвляли сразу после последнего измерения ВГД, удаляли глаза и выделяли роговицу, слезную железу и цилиарное тело. Выделяли тотальную РНК, и экспрессию ADRB2 анализировали с помощью ПЦР в реальном времени, как описано выше. Как можно видеть из фигуры 5С, значительное снижение уровней мРНК ADRB2 наблюдалось как в цилиарном теле, так и в слезной железе.
ПРИМЕР 6: SYL040012 у людей
Субъекты
В исследование были приняты тридцать здоровых добровольцев, которые имели ВГД ниже 21 мм рт. ст., остроту зрения по Снеллену 20/25 или выше, и кому по меньшей мере было 18 лет. Все субъекты завершили исследование согласно протоколу. Среднее ± стандартное отклонение демографических параметров испытуемых приведены в таблице 1. Комплексный медицинский осмотр и обследование глаз проводили до приема в исследование, чтобы гарантировать пригодность субъектов для участия в исследовании.
План исследования
Одноцентровое, параллельное, контролируемое, открытое клиническое исследование фазы I было разработано для оценки безопасности, переносимости и биодоступности SYL040012, вводимой в виде глазных капель. Дополнительной целью исследования было определение влияния различных доз SYL040012 на ВГД. Во всех случаях препарат закапывали только в один случайно выбранный глаз; другой глаз оставался без воздействия и служил в качестве контроля переносимости глазами лечения и безопасности. Состояние обоих глаз контролировалось слепым методом.
Схема лечения
Чтобы свести к минимуму риск побочных эффектов, и в соответствии с Руководством по стратегии выявления и смягчения рисков за первое клиническое испытание исследуемых лекарственных средств на человеке (EMEA/CHMP/SWP/28367/07), фазу вмешательства разделяли на два интервала. 1-й интервал начинался с инстилляции разовой дозы SYL040012 одному субъекту, за которым наблюдали в течение 72 часов. Переносимость оценивали через 24, 48 и 72 часа после инстилляции; при соответствии критериям переносимости через 72 часа после инстилляции, соединение вводили следующему субъекту. Такую же процедуру повторяли для каждого нового субъекта, пока соединение не было введено шести субъектам. Хорошую переносимость и, таким образом, возможность включения следующего добровольца определяли как отсутствие токсичности 3-го или более высокого класса в соответствии с Общими терминологическими критериям для побочных эффектов v3.0 scale.14. Безопасность и переносимость оценивали до начала 2-го интервала.
Во 2-м интервале SYL040012 вводили ежедневными инстилляциями в течение 7 дней подряд. В этом интервале исследовали две дозы, каждую из которых вводили 12 субъектам. По соображениям безопасности, первая группа из трех субъектов получила низкую дозу (600 мкг) SYL040012; по достижении описанного ранее критерия переносимости соединение вводили остальным субъектам, которым была назначена эта доза. Такую же процедуру выполняли для высокой дозы (900 мкг).
Все субъекты получали лечение в Отделе клинических исследований больницы, который гарантирует соблюдение протоколов. В таблице 2 показана блок-схема.
Измерения ВГД
В 1-м интервале ВГД измеряли через 1, 2, 4, 48 и 72 часа после инстилляции с использованием тонометрии Гольдмана у сидящих субъектов. Во 2-м интервале кривые ВГД определяли перед первым инстилляцией (скрининг) и после 4 дней лечения. В обоих случаях ВГД измеряли в 9:00, 12:00, 15:00, 18:00 и 21:00 часов. ВГД измеряли также каждый раз, когда оценивали переносимость в 1-м и 2-м интервалах, за 1 час до и после инстилляции. Измерения, проведенные за пределами кривой ВГД, осуществляли в первой половине дня между 9:00 и 12:00.
Статистический анализ
Местную переносимость глазом и конъюнктивой после обработки SYL040012 оценивали путем анализа появления и частоты глазных побочных эффектов через 72 часа после инстилляции для 1-го интервала и через 24 часа после последней инстилляции в течение 2-го интервала. Были проведены сравнения между глазами (с введенным соединением относительно глаза, в который не вводили соединение) с помощью теста хи-квадрат. Анализ одиночных ежедневных значений ВГД после одной инстилляции был проведен путем сравнения значений, полученных после инстилляции SYL040012, с базальным значением, полученным при скрининге. Статистическую значимость оценивали парным тестом Стьюдента. Эффект SYL040012 на ВГД в течение 2-го интервала оценивали путем сравнения кривой ВГД, полученной на 4-й день, с кривой, полученной при скрининге. Статистическую значимость определяли с помощью двустороннего дисперсионного анализа (ANOVA) для повторных измерений, используя воздействие и время суток в качестве переменных и ВГД в качестве повторного измерения, с последующим ретроспективным тестом Бонферрони, чтобы оценить значимость в каждой временной токе. Другие параметры (клинический анализ, острота зрения, длительность заболевания) были проанализированы с помощью парного t-теста Стьюдента или тест Вилкоксона в зависимости от соответствия условий, необходимых для использования каждого из этих статистических тестов. P<0,05 считалась значимой.
Результаты: эффект SYL040012 на ВГД
39
Никаких существенных различий в ВГД не было отмечено между значениями, полученными при скрининге, и результатами, полученными после одной инстилляции SYL040012. Во 2-м интервале введение SYL040012 по схеме с многократным введением в течение 7-дневного периода снижало значения ВГД у 15 из 24 здоровых субъектов независимо от используемой дозы. Доза SYL040012 600 мкг вызывала общее статистически значимое снижение ВГД после 4 дней введения; ретроспективный анализ данных показал достоверный эффект SYL040012 на измерения, полученные в 15:00 часов (фиг. 6А). Пять добровольцев, которые получали эту дозу, показали среднее снижение значений ВГД более 20% на 4-й день по сравнению со значениями на момент скрининга. Авторы изобретения провели отдельный анализ в этой подгруппе и нашли общий статистически значимый эффект на ВГД; ретроспективный анализ показал, что различия были статистически значимыми во всех исследуемых временных точках (фиг. 6В). Следует отметить, что базальные значения ВГД у этих пяти субъектов были выше, чем базальные значения ВГД у других субъектов (16,2±2,9 мм рт. ст. относительно 14,9±2,8 мм рт. ст. соответственно). О таком повышенном ответе при более высоких значениях ВГД сообщалось и для других лекарственных средств против глаукомы.
ПРИМЕР 7: лечение глазной гипертонии или открытоугольной глаукомы у взрослых: двойное слепое, плацебо-контролируемое, мультидозовое исследование эффективности
Пациенты
Всего было привлечено 80 мужчин и женщин с хорошим или относительно хорошим общим состоянием здоровья по оценке исследователя, старше 18 лет, имеющих предшествующую историю или с только поставленным диагнозом повышенного ВГД (>21 мм рт. ст.), имеющих или не имеющих открытоугольную глаукому в обоих глазах. Для включения в данное исследование они должны иметь нормальный результат, или результат, типичный для открытоугольной глаукомы по следующим исследованиям для обоих глаз:
- Исследование поля зрения 24-2 или эквивалент (тест поля зрения Хамфри 24-2 алгоритм SITA, около 5 минут на каждый глаз).
- Оптическая когерентная томография (ОКТ).
- Лучшая скорректированная острота зрения ≥0,5 (20/40) по таблице Снеллена, или ≤0,3 logMAR.
- Тест Ширмера (слезотечение).
- Фундускопия.
Основная цель данного исследования состоит в определении переносимости лекарственного средства поверхностью глазного яблока (роговицей и конъюнктивой) и его эффект на внутриглазное давление после ежедневного введения SYL040012 в течение 14 дней лечения.
Вторичные цели включают оценку местной переносимости после каждой дозы, системной переносимости (эффект на лабораторные показатели, физическое состояние, жизненно важные показатели и электрокардиограмму) и изменения (если таковые имеются) глазного дна или остроты зрения, возможно, связанные с исследуемым продуктом.
Базовый период
В течение 30 дней до первого введения исследуемого продукта субъектов регистрировали для получения права на участие в лечебном периоде клинического исследования. Если препарат против глаукомы требует выведения, этот срок может быть увеличен. Допускается временное назначение препарата против глаукомы, требующего короткое время выведения. Если на начало базового периода пациент находится на препарате против глаукомы со сроком выведения, составляющим несколько недель (см. Европейское сообщество исследования глаукомы, примечание к блок-схеме исследования), исследователь может назначить другой препарат против глаукомы с коротким временем выведения, чтобы избежать того, чтобы глаза находились без препарата для снижения ВГД в течение нескольких недель.
Период лечения
В 1-й день субъектов случайным образом распределяли по группам 80 мкг SYL040012, 300 мкг SYL040012, 900 мкг SYL040012 или плацебо в соотношении 1:1:1:1 для введения в глазных каплях.
Субъекты приходили каждый день (включая праздничные дни и выходные дни) для введения исследуемого продукта и обследований. Субъекты получали 1 дозу исследуемого препарата один раз в день в оба глаза в течение 14 дней.
Последующий визит
Окончательная оценка будет сделана в последующий визит, который пройдет с 4 по 7 день после последнего введения исследуемого продукта (начиная с 96 часов после последнего введения [4 дня]+3 дня).
Для определения влияния SYL040012 на ВГД пациентов, 24-часовую кривую измерений ВГД получают с использованием тонометра Гольдмана за день до начала лечения, так и на 14-й день. Временные точки подгоняют до классического графика измерений кривой ВГД (09:00, 12:00, 15:00 и 18:00 и в 9:00 на следующий день). Кроме того, одиночные измерения ВГД проводят в 1-й, 7-й и 15-й день, а также при последующем контрольном визите, который состоится на 4-7 день после последнего введения препарата.
Ссылки, цитируемые в тексте
1. Quigley H. Glaucoma. Lancet 2011;377: 1367-1377.
2. Weinreb RN, Khaw PT. Primary open-angle glaucoma. Lancet 2004;363:1711-1720.
3. Glaucoma is the second leading cause of blindness globally. Bulletin of the World Health Organization 2004;82:811-890.
4. Varma R, Lee PP, Goldberg I, Kotak S. An assessment of the health and economic burdens of glaucoma. Am J Ophthalmol 152:515-522.
5. Khaw PT, Shah P, Elkington AR. Glaucoma-1: diagnosis. BMJ 2004;328:97-99.
6. Caprioli J, Varma R. Intraocular pressure: modulation as treatment for glaucoma. Am J Ophthalmol 152:340-344 e342.
7. Heijl A, Leske MC, Bengtsson B, Hyman L, Hussein M. Reduction of intraocular pressure and glaucoma progression: results from the Early Manifest Glaucoma Trial. Arch Ophthalmol 2002;120: 1268-1279.
8. Khaw PT, Shah P, Elkington AR. Glaucoma-2: treatment. BMJ 2004;328: 156-158.
9. Han JA, Frishman WH, Wu Sun S, Palmiero PM, Petrillo R. Cardiovascular and respiratory considerations with pharmacotherapy of glaucoma and ocular hypertension. Cardiol Rev 2008;16:95-108.
10. Aim A, Camras CB, Watson PG. Phase III latanoprost studies in Scandinavia, the United Kingdom and the United States. Surv Ophthalmol 1997;41 Suppl 2:S105-110.
11. Servat JJ, Bernardino CR. Effects of common topical antiglaucoma medications on the ocular surface, eyelids and periorbital tissue. Drugs Aging 28:267-282.
12. De Natale R, Le Pen C, Berdeaux G. Efficiency of glaucoma drug regulation in 5 European countries: a 1995-2006 longitudinal prescription analysis. J Glaucoma 20:234-239.
13. Kass MA, Heuer DK, Higginbotham EJ, et al. The Ocular Hypertension Treatment Study: a randomized trial determines that topical ocular hypotensive medication delays or prevents the onset of primary open-angle glaucoma. Arch Ophthalmol 2002;120:701-713; discussion 829-730.
14. Singh K, Shrivastava A. Medical management of glaucoma: principles and practice. Indian J Ophthalmol; 59 Suppl:S88-92.
15. Gupta SK, Agarwal R, Galpalli ND, et al. Comparative efficacy of pilocarpine, timolol and latanoprost in experimental models of glaucoma. Methods Find Exp Clin Pharmacol 2007;29(10):665-71.
16. Servat JJ, Bernardino CR. Effects of common topical antiglaucoma medications on the ocular surface, eyelids and periorbital tissue. Drugs Aging; 28(4):267-82.
17. Han JA, Frishman WH, Wu Sun S, Palmiero PM, Petrillo R. Cardiovascular and respiratory considerations with pharmacotherapy of glaucoma and ocular hypertension. Cardiol Rev 2008;16:95-108.
18. Nieminen T, Lehtimaki T, Maenpaa J, Ropo A, Uusitalo H, Kahonen M. Ophthalmic timolol: plasma concentration and systemic cardiopulmonary effects. Scand J Clin Lab Invest 2007;67:237-245.
19. Zimmerman TJ. Topical ophthalmic beta blockers: a comparative review. J Ocul Pharmacol 1993;9:373-384.
20. Wax MB, Molinoff PB. Distribution and properties of beta-adrenergic receptors in human iris-ciliary body. Invest Ophthalmol Vis Sci 1987;28:420-430.
21. Elena PP, Denis P, Kosina-Boix M, Saraux H, Lapalus P. Beta adrenergic binding sites in the human eye: an autoradiographic study. J Ocul Pharmacol 1990;6:143-149.
22. Elena PP, Kosina-Boix M, Moulin G, Lapalus P. Autoradiographic localization of beta-adrenergic receptors in rabbit eye. Invest Ophthalmol Vis Sci 1987;28: 1436-1441.
23. Trope GE, Clark B. Beta adrenergic receptors in pigmented ciliary processes. Br J Ophthalmol 1982;66:788-792.
24. Lu PY, Xie F, Woodle MC. In vivo application of RNA interference: from functional genomics to therapeutics. Adv Genet 2005;54: 117-142.
25. Lopez-Fraga M, Martinez T, Jimenez A. RNA interference technologies and therapeutics: from basic research to products. BioDrugs 2009;23:305-332.
26. Behlke MA. Progress towards in vivo use of siRNAs. Mol Ther 2006; 13(4):644-70.
27. Lu S, Cullen BR. Adenovirus VA1 noncoding RNA can inhibit small interfering RNA and MicroRNA biogenesis. J Virol 2004;78(23): 12868-76.
28. Miller VM, Gouvion CM, Davidson BL, Paulson HL. Targeting Alzheimer's disease genes with RNA interference: an efficient strategy for silencing mutant alleles. Nucleic Acids Res 2004;32(2):661-8.
29. Nguyen QD, Schachar RA, Nduaka CI, et al. Phase 1 dose-escalation study of a siRNA targeting the RTP801 gene in age-related macular degeneration patients. Eye (Lond) 2012.
30. DeVincenzo J, Lambkin- Williams R, Wilkinson T, et al. A randomized, double-blind, placebo-controlled study of an RNAi-based therapy directed against respiratory syncytial virus. Proc Natl Acad Sci U S A 2010;107(19):8800-5.
31. Behlke MA. Progress towards in vivo use of siRNAs. Mol Ther 2006; 13:644-670.
32. Campochiaro PA. Potential applications for RNAi to probe pathogenesis and develop new treatments for ocular disorders. Gene Ther 2006;13:559-562.
33. Elbashir SM, Lendeckel W, Tuschl T. RNA interference is mediated by 21- and 22-nucleotide RNAs. Genes Dev 2001;15: 188-200.
34. Ma DF, Tezuka H, Kondo T, et al. Differential tissue expression of enhanced green fluorescent protein in 'green mice'. Histol Histopathol 2010;25:749-754.
35. Gupta SK, Agarwal R, Galpalli ND, Srivastava S, Agrawal SS, Saxena R. Comparative efficacy of pilocarpine, timolol and latanoprost in experimental models of glaucoma. Methods Find Exp Clin Pharmacol 2007;29:665-671.
36. Hariton C, Marce D, Debon C. Transitory models of experimentally induced intraocular pressure changes in the rabbit. A reappraisal. J Pharmacol Methods 1990;24:79-88.
37. Bonomi L, Tomazzoli L, Jaria D. An improved model of experimentally induced ocular hypertension in the rabbit. Invest Ophthalmol 1976;15:781-784.
38. Santafe J, Martinez de Ibarreta MJ, Segarra J, Melena J. The effect of topical diltiazem on ocular hypertension induced by water loading in rabbits. Gen Pharmacol 1999;32:201-205.
39. Yoshida K, Tanihara H, Hiroi K, Honda Y. Prognostic factors for hypotensive effects of isopropyl unoprostone in eyes with primary open-angle glaucoma. Jpn J Ophthalmol 1998;42(5):417-23.