СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДВУХСЛОЙНОЙ БАРЬЕРНОЙ МЕМБРАНЫ ДЛЯ НАПРАВЛЕННОЙ КОСТНОЙ РЕГЕНЕРАЦИИ
METHOD OF PRODUCING DOUBLE-LAYER BARRIER MEMBRANE FOR DIRECTED BONE REGENERATION

Изобретение относится к области медицины, в частности, к регенеративной медицине и стоматологии, и может быть использовано для направленной костной регенерации при костно-пластических операциях.
В современной стоматологии и челюстно-лицевой хирургии восстановление поврежденной или утраченной костной ткани занимает особое место и наиболее актуально при имплантации и протезировании зубов. С необходимостью протезирования сталкивается порядка 90% населения, особенно после 45 лет, когда начинают ухудшаться процессы обмена кальция в организме. Помимо протезирования существенные проблемы возникают еще на стадии восстановления лунки после удаления зуба. Многочисленные клинические исследования показали, что при естественном заживлении раны после удаления зуба уменьшается размер лунки, количество костной ткани и ее форма.
В настоящее время существует достаточно много способов сохранения костной ткани челюсти после удаления зуба. Согласно литературным данным (Lang et al., 2012) ширина костной ткани или альвеолярного гребня в области удаленного зуба в течение 6 месяцев уменьшается по горизонтали на 3,8 мм, а по вертикали - до 1,24 мм. Анализ литературных данных по клиническим исследованиям показал, что после удаления зуба по истечении минимального периода заживления в 12 недель наименьшее изменение размера лунки происходит при имплантации биоматериала ксеногенного или аллогенного происхождения (Jambhekar et al., 2015), то время как, отсутствие биоматериала приводит к существенному уменьшения размера лунки за указанный период времени.
За последние десятилетия было разработано и предложено много методов восстановления костного дефекта, в том числе, и при введении ксеногенного или минерализованного костного биоматериала, который фиксировали барьерной мембраной (Froum et al., 2002). Показано, что метод направленной костной регенерации с использованием барьерных мембран достаточно эффективен для сохранения формы и размера костного дефекта (Wang, Tsao, 2007). При этом барьерная мембрана блокирует миграцию эпителия и фибробластов, препятствуя быстрому прорастанию нежелательной соединительной ткани.
На сегодняшний день у хирургов и исследователей-разработчиков особый интерес вызывают двухслойные мембраны для направленной костной регенерации за счет двойного механизма действия. Такая мембрана выполняет механическую функцию, стабилизируя кровяной сгусток, а также препятствует прорастанию эпителия и способствует формированию костной ткани (De Risi et al., 2015). Таким образом, использование двухслойной мембраны с комбинированными свойствами в настоящее время является самым перспективным способом восстановления костного дефекта после удаления зуба.
Для изготовления барьерной мембраны используют как биодеградируемые, так и небиодеградируемые полимерные материалы. Известен способ формирования барьерной мембраны на основе небиодеградируемого полимерного материала полиэтилентерефталата (ePTFE, Gore-Tex). Полиэтилентерефталат инертный биосовместимый полимер, основными химическими элементами которого, являются фтор и углерод. Полиэтилентерефталат препятствует прорастанию ткани и не вызывает его отторжения организмом (Usher, Wallace, 1958). В частности, мембрана Gore-Tex изготовлена на основе полиэтилентерефталата в виде двух слоев. Толщина одного из слоев составляет 1 мм с пористостью 90%. Этот слой предотвращает миграцию эпителия, стабилизирует рану и способствует образованию соединительной ткани (Scantlebury 1993). Второй слой, имеющий толщину 0,15 мм и пористость 30%, служит барьером к десенному клапану (Sigurdsson et al., 1994). Однако данная мембрана имеет ряд существенных недостатков, например, недостаточная проницаемость мембраны для питательных веществ, как следствие, нарушение питания окружающих тканей. Но главным недостатком мембран на основе небиодеградируемых полимеров является необходимость повторного хирургического вмешательства для их удаления, что может дополнительно приводить к осложнениям (Cortellini et al., 1990).
Другим способом формирования мембраны является использование белков внеклеточного матрикса, в частности, коллагенов различных типов. Коллагеновые мембраны имеют ряд важных достоинств, таких как хорошая биосовместимость, способность к быстрой васкуляризации, низкая иммуногенность, а также высокая адгезивность для клеток (Klinger et al., 2014). Известен способ (Патент РФ 2367475) получения мембраны из коллагена, которая представляет собой пластины из коллагена типа I, полученные из перитонеальной оболочки телят или свиней и насыщенные сульфатированными гликозаминогликанами - гиалуроновой кислотой, хондроитин-6-сульфат, кератин сульфат, дерматан-сульфат. Способ получения этой мембраны заключается в нанесении пасты из коллагена типа II на поверхность из коллагена типа I с последующим сублимационным высушиванием, в результате чего образуется двухслойная структура, имеющая один плотный, а другой рыхлый губчатый слой.
Недостатком этого подхода является набухание мембраны при закрытии костного дефекта, что приводит к открытию раны и ее инфицированию, достаточно быстрой резорбции и потере механических функций еще до момента формирования костной ткани.
Известен способ формирования двухслойной мембраны на основе алифатических полиэфиров (Domalik-Pyzik et al., 2016). Для приготовления раствора 2,5 г поли-L-лактида растворяют в 30 мл хлороформа и 10 мл метанола. Слой из поли-L-лактида формируют методом электроспиннинга при следующих условиях: приложенное напряжение 28,2 кВ, обороты коллектора 330 rpm, расстояние между наконечником и коллектором 20 см, диаметр иглы 0,7 мм. Пористый слой из поликапролактона формируют методом лиофильной сушки. Для формирования мембраны предварительно получают растворы поликапролактона в уксусной кислоте в концентрации 1:20 г/мл and 1:40 г/мл. В стеклянную чашку Петри диаметром 10 см вносят по 20 мл каждого раствора. Затем образцы выдерживают 30 мин при -20°C с последующей лиофильной сушкой в течение 24 часов. На сформированный слой наносят пористый полилактидный слой и наносят 15 мл раствора поликапролактона в концентрации 1:40 г/мл, затем замораживают при -20°C в течение 30 мин и лиофилизируют в последующие 24 часа. Структуру сформированной таким образом мембраны исследовали методом сканирующей электронной микроскопии.
К недостаткам данного способа получения мембраны относят чрезмерно высокую пористость внешнего слоя, что ведет к возникновению инфицирования в результате проникновения бактерий через поры внешнего слоя.
Известен способ получения двухслойных барьерных мембран, который является наиболее близким по технической реализации к предлагаемому изобретению и поэтому выбран в качестве прототипа (заявка на изобретение ЕР 2404627). Поликапролактон растворяют в хлороформе до конечной концентрации раствора 0.1033 г/мл. Сополимер поли-D,L-лактида-гликолида растворяют в хлороформе до конечной концентрации раствора 0.25 г/мл. Растворы распыляют на металлическую сетку с размером ячеек 30 и 65 см под давлением 7 Бар. Распылительное отверстие для раствора поликапролактона составило 0.54 мм, для ПГЛ 0,64 мм. Для создания слоя были проведены два последовательных распыления за 1 минуту, которые впоследствии были удалены с сетки. Сплошную пленку на основе поликапролактона формируют методом полива из раствора в хлороформе в концентрации 0,1033 г/мл. Скорость испарения растворителя оценивали каждые 5 минут. После практически полного испарения растворителя на сплошную пленку из поликапролактона наносят методом электроспиннинга нанофибриллярный слой из полимеров. Морфологию каждого слоя оценивают методом сканирующей электронной микроскопии.
Недостатком данного способа являются неэффективность двухслойной барьерной мембраны, представляющей гидрофобный внутренний пористый слой с низкой скоростью деградации, который препятствует проникновению клеток внутрь мембраны и формированию новой костной ткани. Также главным недостатком всех указанных выше мембран является то, что оба слоя одинаковой площади и толщины, а также все эти мембраны требуют обязательной фиксации.
Указанные недостатки обусловлены тем, что использование гидрофобных синтетических полимеров для приготовления внутреннего пористого слоя не обеспечивает необходимой и достаточной миграции клеток внутрь пористого слоя, а также сорбции крови и последующего формирования кровяного сгустка, являющегося центром формирования новой костной ткани. Наряду с этим, использование органических растворителей в процессе приготовления внутреннего пористого слоя не позволяет вводить дополнительные факторы, способствующие формированию сосудов. Также толщина и структура таких мембран не обеспечивают плотного и однородного прилегания к костной ткани.
Предлагаемое изобретение лишено указанных недостатков благодаря получению гидрофильного пористого слоя из природных полимеров, что обеспечивает миграцию клеток и возможность введения факторов ангиогинеза в процессе формирования пористого слоя. Гидрофильный пористый слой имеет площадь соизмеримую с размеров костного дефекта, благодаря чему хорошо фиксируется в лунке на уровне кортикальной кости. Гидрофобный внешний барьерный слой имеет большую площадь по сравнению с внутренним пористым слоем и меньшую толщину, позволяющую мембране плотно прилегать к кости.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является повышение эффективности и надежности структуры двухслойной барьерной мембраны для использования ее в дальнейшем в качестве основы при направленной костной регенерации и имеет ряд преимуществ, которые обусловлены следующими факторами:
- разная площадь внешнего и внутреннего слоя двухслойной барьерной мембраны, а также способность внутреннего пористого хитозанового слоя сжиматься при нагрузках и набухать при погружении в рану позволяют при необходимости непосредственно во время операции создать внутренний слой соответствующий дефекту кости, который при погружении полость дефекта создаст дополнительную фиксацию мембраны при этом размер внутреннего пористого гидрофильного слоя соизмерим с размером дефекта, что позволяет ему хорошо фиксироваться в дефекте костной ткани в то время как площадь внешнего слоя мембраны больше площади внутреннего слоя, что способствует выполнению защитных и барьерных функций двухслойной барьерной мембраны;
- толщина внешнего барьерного слоя существенно меньше общей толщины мембраны, что обеспечивает плотную прилегаемость мембраны к костной ткани за счет адгезии, а это позволяет не проводить дополнительного трудоемкого фиксирования мембраны;
- сочетание двух материалов для приготовления мембраны из двух слоев: внешнего гидрофобного - обеспечивающего защиту раны от инфицирования, внутреннего гидрофильного - способствующего сорбции крови, формированию кровяного сгустка и миграции клеток;
- использование хитозана для приготовления пористого слоя обеспечивает гидрофильность внутреннего слоя мембраны, а, следовательно, способствует миграции клеток;
- хитозановый пористый слой способствует сорбции крови, формированию кровяного сгустка внутри пористого слоя, а впоследствии формированию костной ткани;
- простота, доступность, воспроизводимость способа склеивания слоев двухслойной барьерной мембраны позволяет его реализовать в промышленном масштабе;
- сокращение сроков резорбции двухслойной барьерной мембраны после имплантации на рану за счет гидрофильности внутреннего пористого слоя.
2
2
Технический результат достигается тем, что в известном способе получения двухслойной барьерной мембраны для направленной костной регенерации, который включает известные и общие с заявленным новым способом признаки, используют растворение поликапролактона в хлороформе и получение методом электроспиннинга внутреннего пористого слоя двухслойной барьерной мембраны, для получения внешнего сплошного слоя поликапролактон растворяют в хлороформе и выливают на подложку, после практически полного испарения хлороформа на сплошной слой переносят пористый слой, полученный методом электроспиннинга. В предлагаемом способе получают двухслойную барьерную мембрану с гидрофильным пористым слоем, причем для получения гидрофильного пористого слоя хитозан (средняя мл. масса, Sigma) растворяют в 1% растворе уксусной кислоты (Вектон) до конечной концентрации 2 мг/мл, замораживают при -20°C в течение 24 часов, сушат в лиофилизаторе в течение 24 часов, после удаления растворителя получается пористая мембрана толщиной 1 мм, с размером пор 50-100 мкм и площадью 10×10 мм причем для получения сплошного полимерного слоя поли-L-лактид-гликолид (85/15) (η=3,13 дл/г, Purac) растворяют в хлороформе до конечной концентрации 30 мг/мл, и в количестве 1 мл наносят равномерно на покровное стекло размером 25×25 мм, оставляют сушиться на 20 минут, а затем переносят ранее приготовленный гидрофильный пористый хитозановый слой в центр подсушенного раствора полимера, равномерно распределенного по поверхности покровного стекла, оставляют сушиться на воздухе на 24 часа, открепляют от стекла и стерилизуют в атмосфере озона в течении 1,5 ч. При этом в процессе создания двухслойной барьерной мембраны диаметр пор гидрофильного хитозанового слоя оценивают с помощью сканирующей электронной микроскопии, а прочность двухслойной мембраны оценивают методом механического растяжения.
Результаты проведенных исследований поясняются следующими примерами.
Наиболее предпочтительный вариант осуществления предлагаемого изобретения описан в примере 1. В пределах сущности и объема изобретения возможны другие варианты способа приготовления двухслойной барьерной мембраны, охватываемые приводимой формулой изобретения.
Пример 1.
2
В частном случае осуществления предлагаемого изобретения получают двухслойную барьерную мембрану для направленной костной регенерации. Схема предлагаемой мембраны представлена на рис. 1. Предварительно получают гидрофильный пористый хитозановый слой. Для этого хитозан (средняя молекулярная масса, Sigma) растворяют в 1% растворе уксусной кислоты (Вектон) до конечной концентрации раствора 2%, полученный раствор вносят в полистирольную чашку площадью 15×15 мм в количестве достаточном для того, чтобы высота раствора в чашке составляла 1-1.5 мм. Раствор в полистирольной чашке оставляют при -20°C на 24 часа. После полного замораживания раствора хитозана, форму переносят в лиофилизатор на 24 часа до полного удаления раствора уксусной кислоты. После испарения замороженной фазы раствора уксусной кислоты на его месте образуются поры. Внешний вид мембраны представлен на рис. 2. Диаметр пор оценивают с помощью сканирующего электронного микроскопа (JSM 7001F, Jeol, Япония). Результаты сканирующей электронной микроскопии гидрофильного пористого хитозанового слоя представлены на Рис. 3 (увел. 2000х). Толщина пористого хитозанового слоя составляет 1 мм, размер пор 50-100 мкм.
2
2
Для получения сплошного гидрофобного барьерного слоя поли(L-лактид-гликолид) (Purac) растворяют в хлороформе до конечной концентрации раствора 30 мг/мл и равномерно наносят 1 мл готового раствора на покровное стекло размером 25×25 мм. По истечении 20 минут, не дожидаясь полного испарения хлороформа, на покровное стекло с подсушенным раствором полимера накладывают гидрофильный пористый слой хитозана размером 10×10 мм. Благодаря пористой структуре гидрофильного хитозанового слоя раствор полимера проникает в приграничный слой пористого хитозанового слоя и обеспечивает прочное склеивание двух слоев после испарения хлороформа. Структуру двухслойной барьерной мембраны анализировали методом сканирующей электронной микроскопии. Согласно этим, данным внешний полимерный гидрофобный слой двухслойной барьерной мембраны имеет сплошную структуру, внутренний гидрофильный хитозановый слой имеет толщину 1 мм, размер пор данного слоя варьируется в диапазоне 50-100 мкм (Рис. 2).
т
р
р
Оценку механических свойств двухслойных барьерных мембран проводят на универсальной испытательной машине INSTRON 5943 при одноосном растяжении. В процессе испытания определяют следующие механические характеристики: предел текучести σ, МПа, прочность при растяжении σ, МПа, относительное удлинение при разрыве ε, %, модуль упругости Е, МПа. Полученные результаты представлены в таблице 1.
Ниже приводятся подписи к Рис. 1-3, представленные в примере 1.
Рис. 1. Схема двухслойной барьерной мембраны
Рис. 2. Внешний вид двухслойной барьерной мембраны
Рис. 3. Сканирующая электронная микроскопия двухслойной барьерной мембраны
Пример 2.
В частном случае осуществления предлагаемого изобретения получают двухслойную барьерную мембрану для направленной костной регенерации. Предварительно получают гидрофильный пористый хитозановый слой. Для этого хитозан (средняя молекулярная масса, Sigma) растворяют в 1% растворе уксусной кислоты (Вектон) до конечной концентрации раствора 2%, полученный раствор вносят в полистирольную чашку в количестве достаточном для того, чтобы высота раствора в чашке составляла 1 мм. Раствор в полистирольной чашке оставляют при -20°C на 24 ч. После полного замораживания раствора хитозана, форму переносят в лиофилизатор на 24 часа до полного удаления раствора уксусной кислоты. После испарения замороженной фазы раствора уксусной кислоты на его месте образуются поры. Диаметр пор оценивают с помощью сканирующего электронного микроскопа (JSM 7001F, Jeol, Япония). Полученные результаты морфологии гидрофильного пористого хитозанового слоя представлены на Рис. 3 (увел. 2000х). Толщина хитозанового слоя составляет 1 мм, размер пор 50-100 мкм.
2
2
Для получения сплошного гидрофобного барьерного слоя поли-L-лактид-капролактона (85/15) (η=1,66 дл/г, Purac) растворяют в хлороформе до конечной концентрации раствора 30 мг/мл и равномерно наносят 1 мл готового раствора на покровное стекло размером 25×25 мм. По истечении 20 минут, не дожидаясь полного испарения хлороформа, на покровное стекло с подсушенным раствором полимера накладывают гидрофильный пористый слой хитозана размером 10×10 мм. Благодаря пористой структуре гидрофильного хитозанового слоя раствор полимера проникает в приграничный слой пористого хитозанового слоя и обеспечивает достаточно прочное склеивание двух слоев после испарения хлороформа. Структуру двухслойной барьерной мембраны анализировали методом сканирующей электронной микроскопии.
т
р
p
Оценку механических свойств двухслойных барьерных мембран проводят на универсальной испытательной машине INSTRON 5943 при одноосном растяжении. В процессе испытания определяют следующие механические характеристики: предел текучести σ, МПа, прочность при растяжении σ, МПа, относительное удлинение при разрыве ε, %, модуль упругости Е, МПа. Полученные результаты представлены ниже в таблице 2.
Пример 3.
2
В частном случае осуществления предлагаемого изобретения получают двухслойную барьерную мембрану, содержащую трикальцийфосфат, для направленной костной регенерации. Предварительно получают гидрофильный пористый хитозановый слой. Для этого хитозан (средняя молекулярная масса, Sigma) растворяют в 1% растворе уксусной кислоты (Вектон) до конечной концентрации раствора 2%, затем в полученный раствор вносят 10 масс. % трикальцийфосфата (Sigma), полученный раствор вносят в полистирольную чашку площадью 15×15 мм в количестве достаточном для того, чтобы высота раствора в чашке составляла 1-1,5 мм. Раствор в полистирольной чашке оставляют при -20°C на 24 часа. После полного замораживания раствора хитозана, форму переносят в лиофилизатор на 24 часа до полного удаления раствора уксусной кислоты. После испарения замороженной фазы раствора уксусной кислоты на его месте образуются поры. Внешний вид мембраны представлен на рис. 2. Диаметр пор оценивают с помощью сканирующего электронного микроскопа (JSM 7001F, Jeol, Япония). Результаты сканирующей электронной микроскопии гидрофильного пористого хитозанового слоя представлены на Рис. 3 (увел. 2000х). Толщина пористого хитозанового слоя составляет 1 мм, размер пор 50-100 мкм.
2
2
Для получения сплошного гидрофобного барьерного слоя поли(L-лактид-гликолид) (Purac) растворяют в хлороформе до конечной концентрации раствора 30 мг/мл и равномерно наносят 1 мл готового раствора на покровное стекло размером 25×25 мм. По истечении 20 минут, не дожидаясь полного испарения хлороформа, на покровное стекло с подсушенным раствором полимера накладывают гидрофильный пористый слой хитозана размером 10×10 мм. Благодаря пористой структуре гидрофильного хитозанового слоя раствор полимера проникает в приграничный слой пористого хитозанового слоя и обеспечивает прочное склеивание двух слоев после испарения хлороформа. Структуру двухслойной барьерной мембраны анализировали методом сканирующей электронной микроскопии. Согласно этим, данным внешний полимерный гидрофобный слой двухслойной барьерной мембраны имеет сплошную структуру, внутренний гидрофильный хитозановый слой имеет толщину 1 мм, размер пор данного слоя варьируется в диапазоне 50-100 мкм.
Список используемой литературы
Ларионов Е.В., Иванов С.Ю., Солодкий В.Г. Мембрана для использования при направленной регенерации тканей, Патент РФ 2367475, публикация патента: 20.09.2009
Benic G.I., Haemmerle C.H.F. 2014. Horizontal bone augmentation by means of guided bone regeneration. Periodontol. 2000 (66): 13-40.
Cortellini P., Pini Prato G.P., Baldi C., Clauser C. 1990. Guided tissue regeneration with different materials. Int. J. Period. Rest. Dent. 10: 137-51.
De RisiV., Clementini M., Vittorini G., Mannocci A., De Sanctis M. 2015. Alveolar ridge preser vation techniques: a systematic review and meta-analysis of histological and histomorphometrical data. Clin. Oral Impl. Res. 26(1): 50-68.
Froum S., Cho S.C., Rosenberg E., Rohrer M., Tarnow D. 2002. Histological comparison of healing extraction sockets implanted with bioactive glass or demineralized freeze-dried bone allograft: a pilot study. J. Periodontol. 73(1): 94-102.
Hoornaert A., Layrolle P., Sohier J. Bone regeneration membrane and method for forming a bone regeneration membrane. Patent EP 2404627, 11.01.2012
Jambhekar S., Kernen F., Bidra A.S. 2015. Clinical and histologic outcomes of socket grafting after flapless tooth extraction: a systematic review of randomized controlled clinical trials. J. Prosthet. Dent. 113(5): 371-382.
Klinger A., Asad R., Shapira L., Zubery Y. 2010. In vivo degradation of collagen barrier membranes exposed to the oral cavity. Clin. Oral Impl. Res. 21: 873-876.
Lang N.P., Pun L., Lau KY, Li K.Y. Wong M. 2012. A systematic review on survival and success rates of implants placed immediately into fresh extraction sockets after at least 1 year. Clin. Oral Impl. Res. 23(s5): 39-66.
Owens, K.W.; Yukna, R.A. 2001. Collagen membrane resorption in dogs: A comparative study. Implant Dent. 10: 49-58.
Scantlebury Т.V. 1993. 1982-1992: A decade of technology development for guided tissue regeneration. J. Periodontol. 64: 1129-1137.
Sigurdsson T.J., Hardwick R., Bogle G.C., Wikesjo U.M.E. 1994. Peirodontal repair in dogs: space provision by reinforced ePTFE membranes enhances bone and cementum regeneration in large supraalveolar defects. J. Periodontol: 65: 350-356.
Thoma D.S., Villar C.C., Cochran D.L.,  Jung R.E. 2012. Tissue integration of collagen-based matrices: An experimental study in mice. Clin. Oral Impl. Res. 23: 1333-1339.
Usher F.C., Wallace S.A. 1958. Tissue reaction to plastics, a comparison of nylon, Orlon, Dacron, Teflon and Marlex. Arch Surg. 76: 997-999.
Wang H.L., Tsao Y.P. 2007. Mineralized bone allograft-plug socket augmentation: Rationale and technique. Impl. Dent. 16(1): 33-41.