СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ГИСТОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ И КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ (ВАРИАНТЫ)
METHOD TO PRODUCE HISTOLOGICAL PREPARATIONS AND COMPOSITIONS FOR ITS REALISATION (VERSIONS)

Изобретение относится к медицине и биологии, в частности к гистологической технике, и может быть использовано для изготовления гистологических препаратов при проведении научных морфологических исследований в ВУЗах и НИИ медицинского и биологического профиля, а также в практической работе патологоанатомических отделений больниц и бюро судебно-медицинской экспертизы.
В настоящее время в нашей стране и за рубежом используется стандартный способ изготовления гистологических препаратов, который не изменился за последние 60 лет (Роскин Г.И. Микроскопическая техника. Изд.-во «Наука», М., 1951, 447 с., Семченко В.В., Барашкова С.А., Ноздрин В.П., Артемьев В.Н. Гистологическая техника - 3-е изд. - Омск - Орел, 2006. - 290 с.). Стандартная схема изготовления гистологических препаратов при использовании заливки в парафин обязательно включает следующие операции.
1. Фиксация гистологического материала (кусочков различных органов и тканей). Для фиксации чаще всего используют нейтральный или забуференный раствор формалина. Для определенных целей применяют в качестве фиксатора смесь Буэна, которая содержит насыщенный водный раствор пикриновой кислоты, формалина и уксусной кислоты в объемных соотношениях 15:5:1. Для выявления клеток крови и соединительной ткани используют фиксатор Максимова, включающий водные растворы двухлористой ртути, бихромата калия, сульфата натрия и формалин.
2. Промывка фиксированного материала в проточной воде.
3. Обезвоживание с помощью батареи спиртов возрастающей концентрации (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 96% и 100% этанол).
4. Пропитывание в хлороформе (или бензоле, толуоле).
5. Пропитывание в смеси хлороформа (или бензола, толуола) и парафина в термостате при 37 градусах.
6. Пропитывание расплавленным парафином в термостате при 56 градусах и заливка в парафин. Время экспозиции во всех предыдущих операциях зависят от размеров кусочков органов.
7. На микротоме изготовляют парафиновые срезы толщиной 5-7 мкм и монтируют их на предметные стекла.
8. Предметные стекла с парафиновыми срезами депарафинируют в 2-х порциях ксилола.
9. Стекла проводят через спирты нисходящей концентрации (100%, 96%, 70% этанол) до дистиллированной воды.
10. Окраска гематоксилином.
11. Экспозиция предметных стекол в водопроводной воде.
12. Окраска водным раствором эозина.
13. Быстрое обезвоживание (70%, 96%, 100% этанол).
14. Просветление в двух порциях ксилола и заключение в полистирол или биомаунт.
Стандартный способ изготовления гистологических препаратов имеет ряд существенных недостатков. В препаратах не выявляются тканевые гранулоциты (вышедшие из сосудистого русла в соединительную ткань базофильные и нейтрофильные лейкоциты). В гистологических срезах невозможно идентифицировать тучные клетки, гемопоэтические клетки на различных стадиях созревания, плазматические клетки и др. Фиксация кусочков органов в существующих аналогах с помощью формалина и последующая промывка в воде приводят к растворению многих структур клеток (зернистости базофильных гранулоцитов и тучных клеток, первичных гранул незрелых лейкоцитов и др.).
В предлагаемом изобретении все вышеперечисленные проблемы решены. Другим важным недостатком стандартного способа изготовления гистологических препаратов является очень большое количество операций и высокая потребность в этиловом спирте, который необходим для обезвоживания кусочков органов после промывки, перед окраской срезов и их обезвоживания после окраски.
Главная задача, на которую направлено предлагаемое изобретение, - резко повысить информативность гистологических препаратов, обеспечить выявление в срезах тканевых гранулоцитов, тучных клеток, клеток крови на различных стадиях созревания, наряду с тканевыми элементами эпителиальной, соединительной, мышечной и нервной тканей. Другой задачей является ускорение процесса изготовления препаратов путем резкого уменьшения количества операций и обеспечение очень большой экономии этилового спирта.
Поставленные задачи достигаются использованием новой композиции для фиксации и одновременной окраски кусочков органов и тканей. При погружении гистологического материала в оригинальную композицию наряду с фиксацией происходит одновременная окраска в кусочках тканевых структур всех типов тканей. Фиксированные и окрашенные объекты пропитывают бензолом или толуолом, смесью бензола или толуола и парафина в термостате при 37 градусах, расплавленным парафином в термостате при 56 градусах и заливают в парафин. Изготовляют парафиновые срезы толщиной 5-7 мкм, монтируют их на предметные стекла, депарафинируют в двух порциях ксилола, дифференцируют в смеси 96% этанола и ксилола в объемных соотношениях от 2:7 до 7:2, просветляют в двух порциях ксилола и заключают в полистирол или биомаунт. Новая композиция №1 для фиксации и одновременной окраски гистологического материала в кусочках имеет следующий качественный состав ингредиентов:
метанол, азур - 2, эозин-калий, лимонная кислота и гидрооксид лития. Количественный состав:
азур 2 - 1,8-2,2 г,
эозин-калий - 1,4-1,8 г,
лимонная кислота - 0,10-0,12 г,
гидрат окиси лития - 0,14-0,16 г,
метанол - 1 литр.
Композиция №2 проще в изготовлении и включает смесь имеющихся в продаже реагентов: эозина-метиленового синего типа Лейшмана в растворе, эозина-метиленового синего по Май-Грюнвальду в растворе, лимонной кислоты, гидрооксида лития. Количественный состав ингредиентов:
Смесь эозина-метиленового синего типа Лейшмана в растворе и эозина-метиленового синего по Май-Грюнвальду в растворе в объемных соотношениях от 5:1 до 3:1 - 1 литр,
лимонная кислота - 0,10-0,12 г,
гидрат окиси лития - 0,16-0,18 г.
В описанных композициях фиксирующими и красящими свойствами обладают метаноловые растворы азура 2 и эозина, а также смесь эозина-метиленового синего типа Лейшмана и по Май-Грюнвальду. Введение в композицию лимонной кислоты и гидрооксида лития обеспечивает необходимую концентрацию водородных ионов композиции.
Предлагаемое изобретение отличается от аналогов изменением порядка и количеством операций при изготовлении гистологических препаратов. Прежде всего, процесс окраски кусочков органов и тканей совмещен во времени с фиксацией путем погружения в композицию, что позволяет резко повысить информативность гистологических препаратов всех типов тканей (фиг.1 (увеличение 100×10, 8 тучных клеток в передней брюшной стенке белой крысы); фиг.2 (увеличение 100×10, 2 тучных клеток в эндомизии поперечно-полосатой мышечной ткани); фиг.3 (увеличение 100×10, нейрон головного мозга кошки); фиг.4 (увеличение 4×10, поперечный срез передней брюшной стенки белой крысы). Предлагаемое изобретение позволяет сократить количество операций по сравнению с существующими аналогами: исключены промывка кусочков органов и тканей после фиксации, обезвоживание в батарее спиртов от 50% до 100%, проведение стекол с парафиновыми срезами через 100%, 96% и 70% спирты и дистиллированную воду после депарафинирования, окраска срезов и их обезвоживание.
Краткое описание чертежей различных тканей, полученных с помощью предлагаемого изобретения.
Фиг.1. Увеличение 100×10. 8 тучных клеток в передней брюшной стенке белой крысы.
Фиг.2. Увеличение 100×10. 2 тучных клетки в эндомизии поперечно-полосатой мышечной ткани.
Фиг.3. Увеличение 100×10. Нейрон головного мозга кошки.
Фиг.4. Увеличение 4×10. Поперечный срез передней брюшной стенки белой крысы.
Для осуществления предлагаемого изобретения необходимо приобрести (если их нет в лаборатории) следующие красители и химические вещества: азур 2, эозин-калий, метанол, лимонную кислоту, гидрооксид лития или эозин-метиленовый синий типа Лейшмана в растворе, эозин-метиленовый синий по Май-Грюнвальду в растворе. Если нет в лаборатории, следует приобрести бензол, ксилол, этанол, парафин. Необходимо заранее приготовить смесь бензол-парафин, смесь этанола и ксилола в объемном соотношении 2:7. Заранее готовят композицию №1 для фиксации и окраски следующим образом. В стеклянную емкость отмеривают 1 л метанола, всыпают 2 г азура и перемешивают стеклянной палочкой. Затем в эту же емкость всыпают 1,6 г эозина-калия и также перемешивают. После этого стеклянную емкость с указанными красителяими помещают в термостат с температурой 56 градусов на 2 часа. Затем в ту же емкость всыпают и перемешивают 0,11 г лимонной кислоты и 0,15 г гидрооксида лития. Помещают на 1 час в термостат с температурой 56 градусов. Для приготовления композиции №2 растворы Лейшмана и Май-Грюнвальда смешивают в стеклянной емкости в объемном соотношении 4:1 (800 мл Лейшмана и 200 мл Май-Грюнвальда). В емкость всыпают 0,11 г лимонной кислоты и перемешивают стеклянной палочкой. Затем добавляют навеску 0,17 г гидрооксида лития и перемешивают. Емкость с вышеуказанными компонентами помещают на 2 часа в термостат с температурой 56 градусов.
Перед употреблением композиции №1 и №2 должны быть охлаждены до температуры +2-+6 градусов. При этой температуре проводится фиксация и окраска взятого для исследования гистологического материала. Размеры кусочков, рекомендуемые для исследования предлагаемым изобретением, такие же, как в существующих аналогах: толщина 5 мм при значительно большей длине.
1. Продолжительность фиксации - окраски гистологического материала в композициях №1 и №2 составляет 1-2 суток.
2. Пропитывание фиксированных и окрашенных кусочков в 5 порциях бензола: 1-я - 5 мин, 2-я - 10 мин, 3-я - 30 мин, 4-я - 45 мин, 5-я - 60 мин.
3. Пропитывание смесью бензола и парафина в термостате при температуре 37 градусов в течение 3 часов.
4. Пропитывание в трех порциях расплавленного парафина в термостате при температуре 56 градусов: 1-я - 30 мин, 2-я - 45 мин, 3-я - 60 мин.
5. Заливка в парафин.
6. Изготовление парафиновых срезов на микротоме толщиной 5-7 мкм и монтирование их на предметные стекла.
7. Депарафинирование в двух порциях ксилола по 5 минут в каждой.
8. Дифференцировка срезов в смеси этанола и ксилола в соотношении 2:7 в течение 2-3 мин.
9. Просветление в ксилоле (две порции по 5 мин).
10. Заключение в полистирол или биомаунт.
Предлагаемый способ можно использовать для обработки биопсийного материала, только время экспозиции в каждой операции будет сокращено в десятки раз.