СПОСОБ И ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ДЕТЕКЦИИ МУТАЦИИ C.1934DUPG В ГЕНЕ ASXL1 ПРИ ГЕМОБЛАСТОЗАХ
METHOD AND TEST SYSTEM FOR DETECTING THE C.1934dupG MUTATION IN THE ASXL1 GENE IN HEMOBLASTOSIS

Данное изобретение относится к медицине (биотехнологиям), а именно к способу для осуществления детекции мутации c.1934dupG в гене ASXL1 при гемобластозах.
Техническим результатом настоящего изобретения является ускорение процесса определения мутации, поскольку, в сравнении с уже известными методами, требует меньшего количества этапов исследования.В том числе биоматериал (исследуемая ДНК) дополнительно не очищается после выделения из венозной крови и в связи с иным характером проведения исследования – ДНК вводится в меньшем объеме (5 нг/мкл).
Также изобретение повышает точность исследования мутации c.1934dupG в гене ASXL1 благодаря использованию двух линий контроля для сравнения собранных образцов ДНК – в контрольных лунках дополнительно находится контрольная ДНК и ДНК с 3% мутантной матрицей соответственно маркировке контрольных лунок для исследования ASXL1.
В отличие от других способов исследований, для данного способа происходит забор венозной крови вместо костного мозга, что делает процесс проще для медицинского персонала и менее болезненным для пациента.
Из уровня техники известно достаточное количество способов определения соматических мутаций, в которых используются различные инструменты для анализа уникальной нуклеотидной последовательности ДНК человека. Аналогами являются:
1. Секвенирование по Сэнгеру
Gelsi-Boyer V. Et al. Mutations of polycomb-associated gene ASXL1 in myelodysplastic syndromes and chronic myelomonocyticleukaemia //British journal of haematology. – 2009. – Т. 145. – №. 6. – С. 788-800.
Nie Y. B. et al. ASXL1 mutations in Chinese patients with essential thrombocythemia //Experimental and therapeutic medicine. – 2018. – Т. 15. – №. 5. – С. 4149-4156.
Данный метод широко распространен и предоставляет полную информацию о последовательности ДНК в исследуемом локусе и позволяет определять мутации denovo. Недостатком метода является то, что он отличается низкой производительностью, поскольку при анализе большого количества локусов он требует постановки отдельной реакции амплификации/очистки/секвенирования для каждого локуса индивидуально, что сказывается на его трудоемкости и стоимости анализа.
2. Анализ конформацииодноцепочечных фрагментов ДНК (SSCP)
Sallman D. et al. Prognostic impact of ASXL1 mutations in MDS and CMML. – 2015.
Указанный метод сложен в исполнении и трактовке результатов и позволяет получить лишь косвенную информацию о нуклеотидной последовательности, недостатком является то, что он не подлежит автоматизации.
3. Сравнительная геномная гибридизация
Brecqueville M. et al. Array comparative genomic hybridization and sequencing of 23 genes in 80 patients with myelofibrosis at chronic or acute phase //Haematologica. – 2014. – Т. 99. – №. 1. – С. 37.
Carbuccia N. et al. Mutations of ASXL1 gene in myeloproliferative neoplasms //Leukemia. – 2009. – Т. 23. – №. 11. – С. 2183-2186.
Данный метод может быть использован в научных целях, но требует высокой квалификации персонала и дорогостоящего оборудования, что препятствует его внедрению в повседневную лабораторную практику для диагностики.
4. Анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (RFLP)
Traina F. et al. Single nucleotide polymorphism array lesions, TET2, DNMT3A, ASXL1 and CBL mutations are present in systemic mastocytosis //PloS one. – 2012. – Т. 7. – №. 8. – С. e43090.
5. Конформационно-чувствительный гель-электрофорез (CSGE)
https://www.researchgate.net/publication/337943921_Mutational_analysis_of_CALR_using_conformational_sensitive_gel_electrophoresis_CSGE_in_BCR-ABL_negative_myeloproliferative_neoplasm_patients
Названные методы в классическом виде требуют постановки нескольких независимых реакций по числу анализируемых локусов.
Для метода 4 после проведения реакции амплификации требуется постановка рестрикции, затем проводится электрофоретическое разделение продуктов рестрикции. Если для каждого пациента необходимо исследование нескольких локусов, то метод становится трудоемким, использование различных рестриктаз увеличивает количество необходимых материалов, следовательно, стоимость. Метод 5 требует постановки параллельных реакций при анализе нескольких локусов у пациента и дает лишь косвенное представление о нуклеотидной последовательности анализируемых локусов. Он позволяет выявить только факт наличия/отсутствия мутации в образце, но не дает информации о ее нуклеотидной последовательности. Названные методы имеют условный потенциал для мультиплексирования, поскольку ограничивается 2-4 локусами.
6. Анализ кривых плавления высокого разрешения
Ibáñez M. et al. Rapid screening of ASXL1, IDH1, IDH2, and c-CBL mutations in de novo acute myeloid leukemia by high-resolution melting //The Journal of Molecular Diagnostics. – 2012. – Т. 14. – №. 6. – С. 594-601.
Данный метод широко используется для анализа мутаций, в том числе однонуклеотидных замен, но имеет ряд существенных ограничений: требует постановки параллельных реакций по числу анализируемых локусов, каждый амплифицируемый локус должен быть довольно коротким (около 100 п.н.), чтобы изменение одного нуклеотида в последовательности вносило существенный вклад в изменение кривой плавления высокого разрешения. Поэтому метод дает косвенное представление о нуклеотидной последовательности, для ее установления необходимо проведение дополнительного анализа, например, секвенирования по Сенгеру. При анализе конкретных мутаций на картину кривой плавления влияют полиморфизмы и другие мутации, локализованные в анализируемом локусе, что может приводить к затруднениям в интерпретации результатов анализа. Следовательно, недостатками метода являются его неточность и затруднительность процесса.
7. Гибридизация на олигонуклеотидных матрицах (биологических микрочипах).
Abdel-Wahab O. et al. ASXL1 mutations promote myeloid transformation through loss of PRC2-mediated gene repression //Cancer cell. – 2012. – Т. 22. – №. 2. – С. 180-193.
Основанный на гибридизации метод используется в высокопроизводительных платформах на основе биологических микрочипов. В технологии биологических микрочипов GeneChip (Affymetrix, США), используются аллель-специфичные зонды длиной 25 нуклеотидов, которые синтезируются непосредственно на подложке методом фотолитографии. Недостатком данного метода является сложность интерпретации полученных флуоресцентных изображений и высокая стоимость расходных материалов, что ограничивает применение данного метода в клинической практике.
8. ПЦР в реальном времени с использованием TaqMan проб
Wu X. et al. Tumor suppressor ASXL1 is essential for the activation of INK4B expression in response to oncogene activity and anti-proliferative signals //Cell research. – 2015. – Т. 25. – №. 11. – С. 1205-1218.
Указанный метод может быть использован для анализа мутаций, однако он имеет ограничения по мультиплексности анализа: в одной реакции возможна идентификация нескольких локусов, при этом их количество весьма ограничено, прежде всего числом каналов детекции в используемом приборе для ПЦР в реальном времени.
9. Денатурирующая высокоэффективная жидкостная хроматография (DHPLC).
Данный метод возможно использовать для анализа мутаций, но его недостатком является необходимость в дорогостоящем оборудовании и высококвалифицированном персонале.
10. Методы секвенирования следующего поколения (nextgenerationsequencing, NGS)
Ohgami R. S. et al. Next-generation sequencing of acute myeloid leukemia identifies the significance of TP53, U2AF1, ASXL1, and TET2 mutations //Modern Pathology. – 2015. – Т. 28. – №. 5. – С. 706-714.
Montes-Moreno S. et al. Clinical molecular testing for ASXL1 c. 1934dupG p. Gly646fs mutation in hematologic neoplasms in the NGS era //PloS one. – 2018. – Т. 13. – №. 9. – С. e0204218.
Указанный метод признан наиболее перспективным для проведения одновременного генотипирования большого количество генетических локусов с высокой аналитической чувствительностью. Недостатками метода являются то, что для его осуществления необходимо больше расходного материала, использование дорогостоящего оборудования и расходных материалов, которые доступны малому числу лабораторий, и высококвалифицированный персонал, поэтому лабораторной диагностики возможности метода сильно ограничены.
Изобретение осуществляется с помощью тест-системы, которая схематично иллюстрируется фигурой.
В основе разрабатываемой тест-системы лежит исследование ДНК из венозной крови при помощи амплификатора для ПЦР в реальном времени. Разработка представляет собой набор реагентов для исследования и процесс, состоящий из 3 последовательных этапов:
1. Денатурация – разделение цепей ДНК;
2. Отжиг – присоединение праймера к матрице ДНК;
3. Синтез ДНК-цепи на праймере – увеличение копий матрицы ДНК для последующей детекции.
Заявляемый способ содержит этапы, на которых:
1. Осуществляют забор венозной периферической крови в вакуумные пробирки (для гематологический исследований с К2/К3-ЭДТА, 6-10 мл.) средним медицинским персоналом (процедурной медсестрой) у пациентов;
2. Вакуумную пробирку с венозной кровью пациента в течение 4 часов доставляют в ПЦР-лабораторию при медицинском учреждении с соблюдением стандартных правил холодной цепи;
3. В лаборатории проводят процедуру выделения генетического материала с использованием стандартных наборов для выделения ДНК из периферической крови и последующую амплификацию, которая после сравнения с контрольными образцами должна будет подтвердить наличие заданной тест-системой мутации c.1934dupG в гене ASXL1, либо должна будет дать отрицательный результат;
4. Эксплуатация осуществляют при температуре 15-27 °С, при относительной влажности воздуха не более 60 %;
5. Размораживание всех реагентов в холодильнике происходит при температуре 4-6 °С;
Встряхивание смеси после добавления ДНК-полимеразы запрещено.
Требования к условиям хранения и транспортировки реагентов, в составе разрабатываемой тест-системы: -20 °С при относительной влажности воздуха 20-90 % в зип-пакете, допускается использование аккумуляторов холода для транспортировки.
Заявляемая тест-система состоит из поликарбонатного планшета для ПЦР на 96 лунок, оптически прозрачных, с нанесенной маркировкой и крышкой. В лунках планшетов находится смесь для реакции под слоем парафина. В лунках контрольных образцов дополнительно находится контрольная ДНК и ДНК с 3% мутантной матрицы соответственно маркировке контрольных лунок для исследования ASXL1.
Заявляемая тест-система на 40 исследований с одной повторностью должна обеспечивать следующий состав реакционной смеси (в одной лунке):
1. Отрицательный и положительный образцы для внутреннего контроля исследования – 1 мкл с концентрацией 5 нг/мкл – только для контрольных лунок;
2. Деионизированная вода, свободная от ДНКаз – 11,7 мкл;
3. Буферный раствор (50 мМ Трис-НCl, рН 8.5, 250 мМ KCl) – 2,5 мкл;
4. Нуклеотиды (дАТФ, дТТФ, дЦТФ и дГТФ) – 2,5 мкл;
5. Хлорид магния (MgCl2) – 2,5 мкл;
6. ДНК-полимераза –0,3 мкл;
7. Праймеры для отжига на матрице ДНК пациента – 1 мкл прямого праймера, 1 мкл обратного праймера.
Тест-систему используют следующим образом:
1.1 Берут планшет для исследования мутации c.1934dupG в гене ASXL1 и снимают с него крышку.
1.2 Добавляют выделенную из периферической крови ДНК пациентов одинаковой концентрации (2-5 нг/мкл) в количестве 1 мкл на слой парафина, используя отдельный наконечник для каждого пациента. ДНК одного пациента добавляют в одну лунку 9G и одну лунку 8G соответственно.
1.3 Закрывают планшет оптически прозрачной пленкой для запечатывания ПЦР-планшетов.
1.4 Устанавливают планшет в амплификатор для ПЦР в реальном времени.
1.5 Устанавливают в амплификаторе программу для амплификации (см. таблицу 1) и выбирают канал FAM для детекции флуоресценции.
Таблица 1
Этап
Температура
Длительность
Число циклов
Плавление
95<sup>о</sup>С
5 минут
1
Денатурация
94<sup>о</sup>С
30 секунд
45
Отжиг праймеров
60<sup>о</sup>С
45 секунд
Элонгация
72<sup>о</sup>С
45 секунд
1.6 По окончанию программы анализируют эффективность амплификации нормальной и мутантной матрицы у каждого из пациентов путем расчёта показателя FC (см. таблицу 2 условные обозначения и расчёты к таблице 2), сопоставляя его с усредненным значением FC для контролей, полученным в эксперименте. Мутация считается обнаруженной при превышении FC образца доверительного интервала (CI) в сумме со средним значением FC для ряда FC контролей, полученных в текущем эксперименте, который предполагает настройку лабораторного оборудования при использовании контрольных линий тест-системы.
Условные обозначения и расчёты к таблице 2.
8G Ct – пороговый цикл амплификации, определенный амплификатором для образца в лунке 8G
9G Ct – пороговый цикл амплификации, определенный амплификатором для образца в лунке 9G
ΔCt – разница значений пороговых циклов для 9G Ct и 8G t
ΔCt WT – разница значений пороговых циклов для 9G Ct и 8G t для лунок с контролем дикого типа (WT)
ΔCt 3% ASXL1 c.1934dupG – разница значений пороговых циклов для 9G Ct и 8G t для лунок с контролем с 3% мутантной матрицы
ΔΔCt (WT-3%) – разница между значениями ΔCt WT и ΔCt 3% ASXL1 c.1934dupG
ΔΔCt (WT-3%)
FC – показатель эффективности амплификации, рассчитанный как -2
Средний FC – рассчитанный для ряда FC контролей показатель, представляющий собой среднее арифметическое для ряда полученных FC контролей.
Односторонний доверительный интервал для FC (CI) – рассчитываемый показатель для значений FC контролей, в который не будет попадать значение образца, не несущего мутацию, с вероятностью 0,95. Значения для образца, превышающие сумму одностороннего доверительного интервала и среднего значения FC контролей при текущем запуске амплификатора, трактуются как факт наличия мутации в образце.
ΔCt = 9G Ct – 8G Ct
ΔCtWT = 9GWTCt – 8GWTCt
ΔCt 3% ASXL1 c.1934dupG = 9GCt 3% ASXL1 c.1934dupG – 8GCt 3% ASXL1 c.1934dupG
ΔΔCt (WT-3%) = ΔCtWT–ΔCt 3% ASXL1 c.1934dupG
ΔΔCt (WT-3%)
FC (WT-3%) = -2^
CI = Средний FC (WT-3%) – (1.645xSDFC (WT-3%)),
где SD – среднеквадратическое отклонение для ряда FC контролей.
Таблица 2. Пример расчётов FC (CI = 3.35)
Референс в текущем эксперименте (усредненный)
Образец
9G Ct
8G Ct
ΔCt
ΔΔCt (wt-образец)
FC (wt - образец)
wt
42
34.412
7.588
0
1
3 %
30.451
26.697
3.754
-3.834
14.26
Значения, полученные для образцов
Образец 1
31.738
28.194
3.544
-4.044
16.49
Образец 2
31.866
27.241
4.625
-2.963
7.79
Образец 3
33.206
28.273
4.933
-2.655
6.29
Образец 4
26.815
23.546
3.269
-4.319
19.95
Средний FC + CI = 14.26 + 3.35 = 17,61
Значение FC для образца 4 превышает сумму среднего FC контролей и доверительный интервал, следовательно, образец 4 положителен по мутации c.1934dupG в гене ASXL1.
1.7 Делают вывод о наличии или отсутствии мутации c.1934dupG в гене ASXL1 у пациента.
1.8 Завершают работу и утилизируют планшет как медицинские отходы класса «Б».
Изобретение также способствует упрощению и делает способ доступнее для лабораторий, не оборудованных секвенаторами ДНК – из-за чего изобретение подходит более широкому кругу лабораторий.
Упрощению процесса способствует то, что использование тест-системы не требует высококвалифицированного персонала для осуществления забора биоматериала и непосредственного проведения исследования.