Активность ферментов энергообеспечения клеток в прогнозе эффективности вспомогательных репродуктивных технологий

13. Кишкун А. А. Руководство по лабораторным методам диагностики. М.: ГЭОТАР-Медиа; 2007. 405 с.

14. Januzzi J.L. et al. Troponin elevation in patients with heart failure: on Pehalf of the third Universal Definition of Myocardial Infarction GloPal Task Force: Heart Failure Section. Eur. Heart J. 2012: 30.

15. Березин А.Е. Сердечные тропонины как маркеры тяжести миокардиальной дисфункции и неблагоприятного прогноза у пациентов с сердечной недостаточностью. Укр. мед. часопис. 2013; 4: 102—7.

REFERENCES

1. Mareev V.Yu., Ageev F.T., Arutyunov G.P. et al. National guidelines RSC and OSSN for the diagnosis and treatment of chronic heart failure

2. Napalkov D.A., Seidova N.M., Sulimov V.A. Chronic heart failure: a shift of focus on the initial stage of the disease. Lechashchiy vrach. 2008; 4: 58—60.

3. Crook D., Smith H. Brain natriuretic peptide in heart failure: an improving prognosis? Eur. Heart J. 2005; 26: 1052—3.

4. Kupari M., Mikkola T.S., Turto H. et al. Vasoactive intestinal peptide-release from the heart and response in heart failure due to left ventricular pressure overload. Eur. J. Heart Failure. 2006; 8: 361—5.

5. Chen H.H., Schirger J.A., Cataliotti A. et al. Intart acute cardiorenal and humoral responsiveness folloving chronic suPcuteneous administration of the cardiac peptide BNP in experimental heart failure. Eur. J. Heart Failure. 2006; 8: 681—6.

6. Koch A., Zink S., Singer H. B-type natriuretic peptide in pediatric patients with congenital heart disease. Eur. Heart J. 2006; 27: 861-6.

7. Vel'kov V.V. C-reactive protein — the "golden marker" significant and irreplaceapie. "Diakon". 2005.

8. Napalkov D.A., Golovenko E.N., Sulimov V.A. On the prognostic value of cardiac troponin levels in patients with chronic heart failure. Lechashchiy vrach. 2009; 2: 14—6.

9. Del Carlo C.H., Pereira-Barretto A.C., Cassaro-Strunz C.M. et al. Cardiac troponin T for risk stratification in decompensated chronic heart failure. Arq. Bras. Cardiol. 2009; 92(5): 372—80.

10. Miller W.L., Hartman K.A., Burritt M.F. et al. Serial piomarker measurements in amPulatory patients with chronic heart failure: the importance of change over time. Circulation. 2007; 116(3): 249—57.

11. de Couto G., Ouzounian M., Liu P.P. Early detection of myocardial dysfunction and heart failure. Nat. Rev. Cardiol. 2010; 7(6): 334—44.

12. Ridker P. M., Rifai N., Pfeffer M. A. et al. Braunwald E. for the Cholesterol and Recurrent Events (CARE) Investigators: Inflammation, pravaststin, and the risk of coronary events after myocardial infarction in patients with average cholesterol levels. Circulation. 1998; 98: 839—44.

13. Kishkun A. A. Guidance on lafioratory methods for diagnosis. Moscow: GEOTAR-Media; 2007: 405.

14. Januzzi J.L. et al. Troponin elevation in patients with heart failure: on Pehalf of the third Universal Definition of Myocardial Infarction GloPal Task Force: Heart Failure Section. Eur. Heart J. 2012: 30.

15. Berezin A.E. Cardiac troponins as markers of the severity of myocardial dysfunction and poor prognosis in patients with heart failure. Ukr. med. chasopis. 2013; 4: 102—7.

Поступила 20.10.13 Received 20.10.13

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014 УДК 618.177-08-037-074

Пестряева Л.А., Нигматова Е.А., Шейко Л.Д., Маркова Т.В.

АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ ЭНЕРГООБЕСПЕЧЕНИЯ КЛЕТОК В ПРОГНОЗЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ ВСПОМОГАТЕЛЬНЫХ РЕПРОДУКТИВНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ

ФГБУ Уральский НИИ охраны материнства и младенчества Минздрава РФ, 620028, Екатеринбург

Проведен сравнительный анализ активности ферментов энергообеспечения клеток — сукцинатдегидрогеназы (СДГ) и а-глицерофосфатдегидрогеназы (а-ГФДГ) у женщин с нарушением фертильности с эффективностью результатов применения вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ). Обследованы 2 группы пациенток. Основную (1-ю) группу составили женщины с бесплодием (50 человек), направленные на проведение ВРТ. У 21 пациентки беременность в результате ВРТ наступила (1а группа), у 29 человек — не наступила (1б группа). Контрольную (2-ю) группу составили здоровые небеременные женщины сопоставимого возраста, имеющие детей (20 человек). Цитохимическое определение активности ферментов осуществляли по методу Р.П. Нарциссова. Подсчет гранул диформазана производили микроскопически, затем высчитывали средний цитохимический коэффициент. Исследование выявило достоверное снижение активности СДГ и а-ГФДГ в лимфоцитах периферической крови у женщин с бесплодием по сравнению с нормой. У пациенток 1б группы активность а-ГФДГ была достоверно ниже, чем 1а группы (с эффективной попыткой ВРТ).

Ключевые слова: бесплодие; вспомогательные репродуктивные технологии; клеточный энергообмен; сукцинат-дегидрогеназа; а-глицерофосфатдегидрогеназа; средний цитохимический коэффициент.

L.A. Pestriyayeva, E.A. Nigmatova, L.D. Sheiyko, T.V. Markova

THE ACTIVITY OF ENZYMES OF ENERGY SUPPLY OF CELLS IN PROGNOSIS OF EFFECTIVENESS OF AUXILIARY REPRODUCTIVE TECHNOLOGIES

The Ural research institute of mother and infancy health care of Minzdrav of Russia, 620028 Yekaterinburg, Russia

The comparative analysis was applied to activity of such enzymes of energy supply of cells as succinate dehydrogenase and a-glycerophosphate dehydrogenase in women with fertility disorders and effectiveness of results of application of auxiliary reproductive technologies. The examination was passed by two groups of female patients. The main group included women with barrenness (50 patients) referred to carrying out auxiliary reproductive technologies. The auxiliary reproductive technologies resulted in pregnancy in 21 female patients (group 1a) and no pregnancy occurred in 29 female patients (group 1b). The control group consisted of non pregnant women of comparative age and having children (20 female patients). The cytochemical detection

Для корреспонденции:

Пестряева Людмила Анатольевна. Адрес: 620028, г. Екатеринбург, ул. Репина, д. 1. E-mail: pestryaeval@yandex.ru.

of activity of enzymes was implemented according the R.P. Nartsissov technique. The count of granules of diformazan was made by microscopical technique. Then, the mean cytochemical coefficient was calculated. The study established a reliable decrease of activity of succinate dehydrogenase and a-glycerophosphate dehydrogenase in lymphocytes of peripheral blood in women with barrenness as compared with normal conditions. In female patients from group lb activity of a-glycerophosphate dehydrogenase was reliably lower than in group 1a (with effective attempt of auxiliary reproductive technologies).

Keywords: barrenness; auxiliary reproductive technologies; cell energy exchange; succinate dehydrogenase; a-glycero-phosphate dehydrogenase; mean cytochemical coefficient.

Введение. Бесплодие — серьезная социальная проблема, которая может явиться причиной потери интереса к жизни, работе, развития тяжелых психосексуальных расстройств. Восстановление репродуктивного здоровья женщины должно стать важным направлением деятельности службы здравоохранения. Последние годы ознаменовались значительными достижениями в области диагностики и лечения женского бесплодия. Это стало возможным благодаря фундаментальным исследованиям, которые позволили расшифровать основные механизмы регуляции репродуктивной системы женщины в норме и при разных формах ее нарушений. Функции организма беременной женщины направлены на создание и обеспечение оптимальных условий развития плода начиная с имплантации яйцеклетки и до рождения ребенка. В организме матери протекают разные компенсаторно-приспособительные реакции, которые обеспечивают рост плода. Значительно возрастают потребление кислорода и интенсивность основного обмена, которая после имплантации повышается на 15—20%. Основой всех адаптивных реакций являются изменения энергетического обмена, и именно обеспеченность или недостаток энергии определяет дальнейшую часть информационных, метаболических и структурных изменений в организме. Для формирующегося плода энергетический дисбаланс может иметь критическое значение.

Ключевым звеном клеточной энергетики является митохондрия. Эта внутриклеточная органелла отвечает за наработку энергии в форме аденозинтрифосфата и участвует в регуляции механизмов апоптоза. Митохондрии производят более 90% энергии клетки путем окислительного фосфори-лирования. Образование энергии является результатом двух тесно связанных метаболических процессов: цикла Кребса (цикла трикарбоновых кислот) и дыхательной цепи передачи электронов, которая встроена во внутреннюю митохон-дриальную мембрану и состоит из серии пяти ферментов (I—V). В настоящее время известно, что многие на вид не связанные заболевания имеют в своей основе общие патологические механизмы, а именно митохондриальную дисфункцию, образование реактивных форм кислорода и накопление повреждений в митохондриальной ДНК. Дисфункция митохондрий может привести к цепному процессу, при котором повреждение их влечет за собой дополнительные трудности

для организма. Возможно, одной из причин некоторых форм бесплодия и последующих неудачных попыток ВРТ может быть нарушение энергообмена клеток, в основе которого лежит недостаточная функция митохондрий.

Цель работы — сопоставить активность ферментов энергообмена клеток у женщин с нарушением фертильности и оценить эффективность применения вспомогательных репродуктивных технологий.

Материалы и методы. Проведено проспективное, ко-гортное, сравнительное исследование. Для реализации поставленной задачи обследованы 2 группы пациенток. Основную (1-ю) группу составили 50 женщин с бесплодием различного генеза, обратившихся в научно-консультативную поликлинику ФГБУ НИИ ОММ с целью обследования и подготовки к ВРТ. По результатам ВРТ эта группа была разделена на 2 подгруппы: 1а — беременность наступила (21 человек), 1б — беременность не наступила (29 человек). Контрольную (2-ю) группу составили здоровые небеременные женщины, родившие одного ребенка или более (20 человек). Исследование проводилось на 11—15-й день менструального цикла в основной группе до начала проведения протокола стимуляции. Всем пациенткам были выполнены общие клинико-лабораторные исследования с целью исключения острых вирусных и бактериальных заболеваний. Критерием исключения явилась тяжелая соматическая патология. Проанализирован соматический и акушерский анамнез женщин, проведена оценка менструальной и репродуктивной функций. Возраст пациенток всех исследуемых групп был сопоставимым и составил 32,4±1,4 года в основной группе и 32,4±1,3 года в контрольной. Группы не различались по частоте выявления неблагоприятных социально-бытовых факторов и экстрагенитальной патологии.

Для оценки состояния клеточного энергетического обмена исследовали активность сукцинатдегидрогеназы (СДГ) и а-глицерофосфатдегидрогеназы (а-ГФДГ) в лимфоцитах периферической крови цитохимическим методом в модификации Р. П. Нарциссова. Исследования были выполнены до начала программы подготовки к проведению ВРТ. Материалом для исследования послужила капиллярная кровь. Использовались готовые тест-системы фирмы ООО "Поликом", Москва. Анализ изображения клетки выполняли с помощью

Рис. 1. Компьютерное изображение лимфоцитов, содержащих гранулы диформазана (реакция на СДГ) с нормальной (а) и пониженной (б) активностью фермента.

Здесь и на рис. 2: окраска 0,5% раствором метилового зеленого. Ув. микроскопа об. 100, ок. 10.

Рис. 2. Компьютерное изображение лимфоцитов, содержащих гранулы диформазана (реакция на а-ГФДГ) с нормальной (а) и пониженной (б) активностью фермента.

микровидеографического комплекса открытого типа пятого поколения (Испания) SCA., фирмы Microptik S.L. Подсчет гранул диформазана производили в 100 лимфоцитах по методике Нахласа и соавт. в модификации Р.П. Нарциссова. Затем по формуле, предложенной Кеплоу в модификации Astaldi и Verga (1957), высчитывали средний цитохимический коэффициент (СЦК), отражающий соотношение популяций лимфоцитов с различной активностью фермента:

СЦК=1а+2б+3в+4г/100 (в усл. ед.),

где а, б, в, г — число подсчитанных лимфоцитов с определенным количеством гранул диформазана; 1, 2, 3, 4 — коэффициенты, соответствующие количеству гранул диформазана в клетке (1 — до 10 гранул, 2 — до 20 гранул, 3 — до 30 гранул, 4 — до 40 гранул и выше); 100 — общее количество лимфоцитов.

Статистический анализ полученных данных выполнен с помощью электронных таблиц Microsoft Office Excel и пакета прикладных программ Statistica for Windows 7.0 фирмы StatSoft Inc. (США). Количественные признаки тестированы на соответствие их нормальному распределению критерием Колмогорова—Смирнова. Описательная статистика включала расчет средней величины с учетом стандартной ошибки средней (M±m). Равенство выборочных средних проверяли по /-критерию Стьюдента. Разницу считали достоверной при р < 0,05.

Результаты и обсуждение. Исследование цитохимической активности митохондриальных ферментов в лимфоцитах периферической крови выявило достоверные различия между показателями контрольной и основной групп. Активность ферментов СДГ и а-ГФДГ у пациенток основной группы была достоверно ниже, чем контрольной (рис. 1, 2). Среднее содержание гранул диформазана в лимфоцитах крови у пациенток с бесплодием составляло 13,7 ± 0,64 ед., в контрольной группе — 20,62 ± 1,12 ед.; p < 0,001 (реакция на СДГ), 7,28±0,68 и 11,8 ± 0,95 ед.; p < 0,01 (реакция на а-ГФДГ) соответственно. СЦК по СДГ составил 1,63 ± 0,10 усл. ед., по а-ГФДГ — 1,01 ± 0,04 усл. ед. в основной группе, в контрольной группе — 3,11 ± 0,14 и 2,03 ± 0,13 усл. ед. соответственно (p<0,001). При сопоставлении показателей активности ферментов клеточного энергообмена у пациенток 1а и 1б групп было выявлено достоверное различие по активности а-ГФДГ: в 1а группе СЦК составил 1,04 ± 0,07 усл. ед., во 1б группе — 0,88 ± 0,04 усл. ед. (p<0,05). Показатели активности СДГ достоверно не различались между этими группами.

Проведенное исследование показало, что у женщин с нарушением фертильности имеются метаболические нарушения, которые выражаются в значительном (почти двукратном) снижении активности ферментов клеточного энер-

гообмена СДГ и а-ГФДГ. У пациенток с неэффективной попыткой применения ВРТ активность а-ГФДГ была изначально достоверно ниже, чем у пациенток с эффективной попыткой ВРТ. Как известно, а-ГФДГ способствует проникновению кодегидрогеназ в интактные митохондрии, тем самым увеличивает число функционально активных митохондрий и улучшает метаболические процессы в клетке. Значительное угнетение активности этого фермента на фоне выраженного снижения активности СДГ неблагоприятно отражается на способности организма женщины к зачатию и вынашиванию беременности и снижает эффективность применения ВРТ.

Выводы. 1. Выявлено достоверное снижение активности митохондриальных дегидрогеназ у женщин с нарушением фертильности по сравнению с нормой.

2. Показана высокая диагностическая эффективность изучения ферментативной активности лимфоцитов в прогнозе эффективности ВРТ.

3. Наиболее неблагоприятным вариантом нарушения клеточного энергообмена в прогнозе эффективности ВРТ является сочетанное снижение активности СДГ и а-ГФДГ.

ЛИТЕРАТУРА

1. Карпищенко А.И. Медицинские лабораторные технологии. Санкт-Петербург: Интермедика; 1998; т. 1: 298—306.

2. Мамендолиева Н.М., Шищенко В.М., Фурсова З.К., Сидельни-кова В.М., Левантовская И.Н. Особенности ферментативной активности лейкоцитов у женщин с привычным невынашиванием в анамнезе. Здравоохранение Казахстана. 1996; 3: 30—3.

3. Сидельникова В.М. Привычная потеря беременности. М.: Триада-Х; 2005.

4. Синичихин С.П., Лечиева Э.У. Прогностичекое значение определения перед родами ферментативной активности лимфоцитов у беременных женщин. Вестник государственного медицинского университета. 2008; 2: 68—70.

5. Синичихин С.П., Черкасов Н.С., Коколина В.Ф. Способ прогнозирования состояния новорожденных детей. Патент РФ, № 2265850 (Россия).

6. Синичихин С.П., Синичихина М.Е., Навзурова Э.У, Лечиева Е.В., Пахилова Е.В. Возможности использования иммунологических и морфологических методов исследования в акушерстве и перинатологии. Дальневосточный государственный медицинский университет. 2008; 3: 37—41.

7. Хундирякова Н.В., Захарченко М.В., Захарченко А.В., Вишневский Е.Л., Мюллер М.Н. и др. Активность сукцинатдегидроге-назы в лимфоцитах крови как показатель состояния организма и способ контроля лечения. Пущино: Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН. 2007.

8. Чабанова Е.Б. Клинико-лабораторные эффекты янтарной кислоты и биофлавоноидов в комплексной терапии фетоплацен-

тарной недостаточности при невынашивании беременности: Автореф. дис ... канд. мед. наук. Томск; 2011.

REFERENCES

1. Karpishchenko A.I. Medical laboratory technology. St. Petersburg: Intermedika; 1998; vol. 1: 298—306.

2. Mamendolieva N.M., Shishchenko V.M., Fursova Z.K., Levantovs-kaya I.N. Features of the enzymatic activity of leukocytes in women with recurrent pregnancy loss and history. 1996; 3: 30—3.

3. Sidel'nikova V. Habitual loss of pregnancy. Moscow: Triada-X; 2005.

4. Sinichikhin S.P., Lechieva E.U Prognostichekoe value determination before the birth of the enzymatic activity of lymphocytes in pregnant women. Vestnikgosudarstvennogo meditsinskogo universiteta. 2008; 2: 68—70.

5. Sinichikhin S.P., Cherkasov N.S., Kokolina V.F. A method of predicting the state of infants. Patent № 2265850.

6. Sinichikhin S.P., Sinichikhin M.E., Navzurova E.U., Lechieva E.V., Pakhilova E.V. Possibilities of using immunological and morphological methods of research in obstetrics and perinatology. Dalne-vostochnyy gosudarstvennyy meditsinskiy universitet. 2008; 3: 37— 41.

7. Khundiryakova N.V., Zakharchenko M.V., Zakharchenko A.V., Vishnevskiy E.L., Myuller M.N. et al. Succinate dehydrogenase activity in peripheral blood lymphocytes as an indicator of the state of the body and the way to control treatment. Pushchino: Institute of Theoretical and Experimental Biophysics, Russian Academy of Sciences. 2007.

8. Chabanova E. B. Clinical and laboratory effects of .succinic acid and bioflavonoids in the treatment of placental insufficiency in miscarriage: Diss. Tomsk; 2011.

Поступила 29.11.13 Received 29.11.13

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014

УДК 616.94-053.2-02:616.12-007.2-053.1-089]-076.5

Субботовская А.И., Кривошапкина А.А., Шилова А.Н., Струнин О.В., Козырева В.С., Ефимов А.А., Корнилов И.А.

ПРОТОЧНАЯ ЦИТОМЕТРИЯ В ДИАГНОСТИКЕ СЕПСИСА У ДЕТЕЙ 1-ГО ГОДА ЖИЗНИ С ВРОЖДЕННЫМИ ПОРОКАМИ СЕРДЦА, ОПЕРИРОВАННЫХ В УСЛОВИЯХ ИСКУССТВЕННОГО КРОВООБРАЩЕНИЯ

ФГБУ "Новосибирский научно-исследовательский институт патологии кровообращения им. акад. Е.Н. Мешалкина" Минздрава России, 630050, Новосибирск

Цель исследования — оценить чувствительность и специфичность CD64-индекса и относительного количества HLA-DR+моноцитов в диагностике сепсиса у детей 1-го года жизни после оперативной коррекции врожденных пороков сердца в условиях искусственного кровообращения (ИК). Для определения CD64-индекса использовали набор Leuko64 (Beckman Coulter, США); относительное количество HLA-DR+моноцитов измеряли с помощью комбинации моно-клональных антител CD14-APC, HLA-DR-PacificBlue, CD45-KrOr на проточном цитофлюориметре Navios (Beckman Coulter, США). В результате проведенного исследования выявили: CD64-индекс в группе с сепсисом (подтвержденным или предполагаемым) составил 2,29 (1,96:3,32), что статистически значимо выше (p=0,001), нежели в группе без сепсиса. Статистически значимых различий концентрации С-реактивного белка в сыворотке крови (p=0,123), абсолютного количества лейкоцитов в периферической крови (p=0,128), относительного количества HLA-DR+^оноцитов (р=0,789) не обнаружили. Показано, что значение СD64-индекса более 2 повышает риск развития сепсиса в 9,4 раза и может быть использовано в качестве диагностического критерия сепсиса (AUC=0,895) c чувствительностью 80% и специфичностью 90%. Отрицательная прогностическая значимость CD64-индекса и содержания прокальцитонина в отношении развития сепсиса у детей 1-го года жизни, оперированных в условиях ИК, составила 74 и 76%%, положительная — 77 и 64% соответственно.

Ключевые слова: сепсис; CD64; прокальцитонин; HLA-DR^-моноциты; врожденные пороки сердца. A.I. Subbotovskaya, A.A. Krivoshapkina, A.N. Shilova, O.V. Strunin, V.S. Kozyreva, A.A. Efimov, I.A. Kornilov

THE FLOW CYTOMETRY IN DIAGNOSTIC OF SEPSIS IN CHILDREN OF FIRST YEAR OF LIFE WITH CONGENITAL HEART DISEASE AND OPERATED IN CONDITIONS OF ARTIFICIAL CIRCULATION

The study was organized to evaluate sensitivity and specificity of CD64 index and relative amount of HLA-DR+ monocytes in diagnostic of sepsis in children offirst year of life after surgery correction if congenital heart disease in conditions of artificial circulation. To detect CD64 index the kit Leuko64 (Beckman Coulter, USA) was applied. The relative amount of HLA-DR+ monocytes was measured by flow cytofluorimeter Navios (Beckman Coulter, USA) using combination of monoclonal antibodies CD14-APC, HLA-DR-PacificBlue, CD45-KrOr. The results of study established that CD64 index in the group with confirmed or supposed sepsis consisted 2.29 (1.96:3.32) that statistically is reliably higher (p=0.001) than in group without sepsis. The study established no statistically reliable differences in concentration of C-reactive protein in blood serum (p-0.123), absolute amount of leukocytes in peripheral blood (p=0.128), relative amount of HLA-DR+ monocytes (p=0.789). It is demonstrated that value of CD64 index higher than 2.00 increases the risk of development of sepsis up to 9.4 times and can be used as a diagnostic criterion of sepsis (AUC=0.895) with sensitivity up to 80% and specificity up to 90%. The negative prognostic significance of CD64 index and content ofprocalcitonin in relation to development of sepsis in children of first year of life operated in conditions of artificial circulation amounted to 74%% and 76%% and 77% and 64%% in case of positive prognostic significance correspondingly.

Keywords: sepsis; CD64; procalcitonin; HLA-DR+ monocytes; congenital heart disease.

Для корреспонденции:

Субботовская Анна Игоревна, мл. науч. сотр. Адрес: 630050, Новосибирск, ул. Речкуновская, 15. E-mail: asubbotovskaya@gmail.com