Разработка экспериментальной модели целиакии in vivo

УДК 615.453.4

http://dx.doi.org/10.26787/nydha-2686-6838-2020-22-3-94-100

РАЗРАБОТКА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ МОДЕЛИ ЦЕЛИАКИИ

IN VIVO

Краснюк И. В., Тарасов В. В., Свистунов А.А

ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И. М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет),

г. Москва, Российская Федерация

DEVELOPMENT OF AN EXPERIMENTAL MODEL OF IN VIVO CELIAC DISEASE

Krasnyuk I.I., Tarasov V.V., Svistunov A.A.

First Moscow state medical university named after I.M. Sechenov, (Sechenov University),

Moscow, Russian Federation

Аннотация. В данной статье подробно описаны подходы к разработке модели целиакии in vivo для оценки специфической фармакологической активности тритикаин - альфа. Для исследования специфической активности тритикаина-альфа in vivo необходимо смоделировать целиакию на грызунах. Для этого предварительно у животных вызвали T-клеточный иммунный ответ на глютено-вые пептиды. Далее она группа животных принимала глютеновую диеты, в другая -безглютено-вую. Животных распределяли по группам случайным образом. Все гистологические изменения, полученные в ходе исследования аналогичны клиническим проявлениям целиакии человека, и, таким образом, эта экспериментальная модель целиакии имитирует развитие патологии заболевания у людей.

Ключевые слова; целиакия, тритикаин-альфа, специфическая фармакологическая активность.

Annotation. This article describes in detail the approaches to the development of an in vivo model of celiac disease to evaluate the specific pharmacological activity of triticain - alpha. To study the specific activity of triti-cain-alpha in vivo, it is necessary to simulate celiac disease in rodents. For this, a T-cell immune response to gluten peptides was first provoked in animals. Further, she group of animals adopted a gluten-free diet, in another -gluten-free. Animals were randomly assigned to groups. All histological changes obtained during the study are similar to the clinical manifestations of human celiac disease, and, thus, this experimental model of celiac disease imitates the development of the pathology of the disease in humans.

Keywords; celiac disease, triticain-alpha, specific pharmacological activity.

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

[1] Шумилов П. В., Мухина Ю.Г., Нетребенко О.К. и др. Современные представления о патогенетических механизмах целиакии: определяющая роль в клинических вариантах течения. Педиатрия. 2016, Том 95, №6. С. 110-119.

[2] Barone M.V., Troncone R., Auricchio S. Gliadin peptides as triggers of the proliferative and stress/innate immune response of the celiac small intestinal mucosa. International Journal of Molecular Sciences. 2014, 15(11):20518-37.

[3] Kupfer S.S. and Jabri B. Celiac Disease Pathophysiology. Gastrointestinal Endoscopy Clinics of North America. 2012, 22(4).

[4] [Meijer J.W.R., Wahab P.J., Mulder C.J.J. // Vir-chowsArch. - 2003. - V. 442. - P.124-128.].

REFERENCES

[1] Shumilov P.V., Mukhina Yu.G., Netrebenko O.K. and others. Modern ideas about the pathogenetic mechanisms of celiac disease: a decisive role in clinical variants of the course. Pediatrics. 2016, Volume 95, No.6. S. 110-119.

[2] Barone M.V., Troncone R., Auricchio S. Gliadin peptides as triggers of the proliferative and stress / innate immune response of the celiac small intestinal mucosa. International Journal of Molecular Sciences. 2014, 15 (11): 20518-37.

[3] Kupfer S.S. and Jabri B. Celiac Disease Pathophysiology. Gastrointestinal Endoscopy Clinics of North America. 2012, 22 (4).

[4] [Meijer J.W.R., Wahab P.J., Mulder C.J.J. // Vir-chowsArch. - 2003. - V. 442. - P.124-128.]._

[5] HayatM., Cairns A., Dixon M.F., O'Mahony S. // J. Clin. Pathophysiology - 2002. - V.55. - P.393— 395

[6] Tursi А., Brandimarte G. // J. Clin. Gastroenterol. - 2003. - V.36, N1. - P.13-17

Целиакия признана одной из наиболее часто встречающихся генетических болезней на планете. Данным заболеванием страдает 0,5-1% населения земного шара, отмечается неуклонный рост непереносимости глютена [1]. Потребление глютена такими пациентами приводит к иммуно-опосредованному повреждению кишечника, которое характеризуется кишечной проницаемостью, атрофией ворсин и воспалительной инфильтрацией собственной пластинки слизистой оболочки. Кишечная проницаемость при целиакии может возникать в результате ряда причин, одной из которых является высвобождение зону-лина, который разрушает плотные соединения в эпителиальном слое. Повышенная проницаемость кишечника при целиакии позволяет параклеточно переносить пептиды глютена к собственной пластинке слизистой оболочки, что приводит к презентации пептидов и последующей активации Т-клеток. Существует специфический набор пептидов, полученных из а-глиадина. Эти пептиды становятся более иммуногенными благодаря комплексооб-разованию с тканевой трансглутаминазой

[5] HayatM., Cairns A., Dixon M.F., O'Mahony S. // J. Clin. Pathophysiology - 2002 .-- V.55. - P.393— 395

[6] Tursi A., Brandimarte G. // J. Clin. Gastroenterol. - 2003. - V.36, N1. - P.13-17

способствует развитию воспаления кишечника при целиакии [1,2]

Чтобы понять, как врождённый иммунный ответ, а также адаптивный иммунный ответ на глютен могут сочетаться при проявлении целиакии, необходимо разработать in vivo модели заболевания. В настоящий момент все разработанные in vivo модели целиакии являются не полными, не отражают всего патогенеза и поэтому не подходят для скрининга препаратов для лечения данного заболевания. Таким образом необходимо разработать модель целиакии in vivo для дальнейшей разработки методики определения специфической фармакологической активности тритикаин - альфа.

Материалы и методы исследования.

1.Выделение глиадина. Пшеничную муку (1 г.) ресуспендировали в 10 мл 10% NaCl, перемешивали в течение 15 мин. и затем центрифугировали при 3500 об/мин. в течение 15 мин. Осадок ресуспендировали в 10 мл. 10% NaCl, центрифугировали при 3500 об/мин. в течение 15 мин и процедуру повторяли ещё раз. Далее осадок экстрагировали в 10 мл 70 % спирта этилового и центрифугировали в течение 5 мин, как описано выше. Супернатант собирали и фильтровали через бумажный фильтр. Фильтрат лиофилизировали.

2.Иммунизация животных. Для получения антител к глиадину мышей иммунизировали подкожно 20 мышей C57B1/6 введением 200 мкг глиадина, эмульгированного в полном адъюванте Фрейнда (FCA) в течение пяти недель для последующего выделения антител.

1 неделя: подкожное введение 200 мкг

глиадина, эмульгированного в FCA.

2 неделя: подкожное введение 200 мкг

глиадина, эмульгированного в IFA.

Введение коклюшного токсина (КТ) (50 мкг/мл) в объёме 200 мкл.

3 неделя:подкожное введение 200 мкг глиадина, эмульгированного в ША.

4 неделя:подкожное введение 200 мкг глиадина, эмульгированного в ША.

5 неделя:подкожное введение 200 мкг глиадина, эмульгированного в ША.3.

3. Выделение антител к глиадину. На шестой неделе проводили эвтаназию иммунизированных мышей путём цервикаль-ной дислокации.

4. Антиген-специфичная активация Т-лимфоцитов. Для активации лимфоцитов двадцати мышам линии С57В1/ 6 вводили подкожно 200 мкг глиадина, эмульгированного в полном адъюванте Фрейнда. Через два часа внутрибрюшинно вводили коклюшный токсин (КТ) в объёме 200 нг на животного для усиления активации иммунного ответа. Повторное введение КТ осуществлялось спустя 48 часов.

5.Выделени е_активированных_Т-

лимфоцитов. Через 10 дней после иммунизации мышей забивали путём цервикаль-ной дислокации, селезёнку извлекали и переносили в флакон с физиологическим раствором. Селезёнки гомогенизировали в гомогенизаторе Поттера в 15 мл RPMI-1640 с аланил-глутамином. Клеточную суспензию центрифугировали при 500§. 15 мин. К осаждённым клеткам добавляли по 25 мл буфера для лизиса эритроцитов и центрифугировали 15 мин. при 500§. Ре-суспендировали осаждённые клетки в 20 мл среды RPMI-1640 и пропускали через фильтр 40 нм (BDFalcon). Подсчет количества живых клеток проводили в камере Го-ряева.

6. Выделение культуры перитонеальных макрофагов. Перитонеальная полость мыши представляет собой идеальное место для сбора макрофагов. Количество макрофагов в брюшине оценивается примерно 1 х 106 макрофагов на мышь. Выделение перитонеальных макрофагов у двадцати мышей линии С57В1/6 проводилось после эвтаназии путём цервикальной

дислокации. Перитонеальный смыв осуществляли внутрибрюшинным введением раствора гепарина в физиологическом растворе по 2 мл на животное. Пропускали через фильтр 40 нм (BD Falcon) для удаления неклеточных элементов. Полученный смыв макрофагов центрифугировали при 500g. 15 мин., при комнатной температуре. К осаждённым клеткам добавляли 25 мл буфера для лизиса эритроцитов и центрифугировали 15 мин. при 500g. Ресуспенди-ровали осаждённые клетки в 20 мл среды RPMI-1640 и пропускали через фильтр 40 нм (BD Falcon). Подсчет количества живых клеток провели в камере Горяева.

7. Культивирование кокультуры активированных T-лимфоцитов и перитонеальных макрофагов. Для получения воспалительных лимфоцитов, специфичных к белкам глиадина, получали кокультуру активированных T-лимфоцитов и перитонеальных макрофагов. Для этого выделенные активированные T-лимфоциты разводили полной средой RPMI-1640 до концентрации 2 х 106 клеток на мл. Для создания кокультуры в конечный объём добавляли тотально перитонеальные макрофаги. Для стимуляции клеток использовали 2 мкг/мл глиадина, 2,5 мкг/мл ConA, 10 нг TNFa и 10 нг IFN-y.

8. Адоптивный перенос реактивных T-лимфоцитов в мышей-реципиентов. Перенос клеток осуществлялся в самцов мышей С57В1/6 путём внутрибрюшинной инъекции. Мышам вводили по 2 х 107 клеток на мышь. Для активации лимфоцитов по воспалительном пути мышей содержали на глютеновом питании (пшеница).

Результаты и обсуждения. Большинство современных моделей заболеваний животных с нарушенной регулятор-ной функцией Т-клеток основаны на дефиците CD4+/CD25+ Т-клеток (Treg). Дефицит Treg приводит к полиорганным воспалительным заболеваниям, при этом наиболее сильно поражаются поверхности слизистой оболочки, прежде всего, кишечника. Это объясняется узнаванием

микробных антигенов в слизистых оболочках эффекторными Т-клетками. Показано, что при переносе Т-клеток лимфопе-ническим мышам - способствует индукции антиген-специфического иммунитета и самопроизвольному развитию органо-специфического аутоиммунного заболевания. Поэтому мы предположили, что распознавание пищевого глютена переносимыми глиадином сенсибилизированными CD4+ Т-клетками будет стимулировать дуоденит/энтерит у мышей-реципиентов. Для блокирования противовоспалительного фенотипа лимфоцитов и ремиссии активацию лимфоцитов проводили с использованием Ш^у, ТОТа. Ш^у активирует макрофаги, которые, в свою очередь, сек-ретируют ТОТ-а и матриксные металло-протеиназы (ММР), такие как ММР-12 и ММР-13, повреждающие энтероциты и плотные межклеточные контакты. В

Объем проводимого вмешательства для

(П=

кишечных миофибробластах как TNF-a, так и IFN-y стимулируют экспрессию про-теолитических MMP-1 и MMP-3. Такое высвобождение и активация MMP индуцирует протеолиз внеклеточного матрикса, что приводит к изменению структуры кишечника, наблюдаемой при целиакии [3]. Суть исследования специфической активности тритикаина-альфа заключается в расщеплении экзогенных пептидов глютена и, тем самым, блокированию начального этапа иммунологического каскада целиакии.

В исследовании использовано 30 самцов мышей C57B1/6 (возраст 7-8 недель, масса 18-20 г). Животных распределяли по группам случайным образом (таблица 1).

Во время эксперимента осуществляли ежедневное наблюдение за животными. Все животные оставались живы.

Таблица 1

отработки методики индукции целиакии =10)

Группа Диета Животных Манипуляции

Здоровые - 1Q С -

Целиакия Безглютеновая диета 1Q С Перенос Кокульту-рыТ-лимфоцитов/макро-фагов, антител к глютену

Целиакия Глютеновая диета 1Q С

Гистологическое исследование применяли для уточнения или исключения клинического диагноза, а также для оценки тяжести патологического процесса, его динамики и ответа на терапию. Наиболее интенсивно патологические изменения проявляются во втором и третьем сегменте двенадцатиперстной кишки. Основные гистологические особенности целиакии включают уплощение, притупление или исчезновение кишечных ворсинок, гиперплазию крипт, дегенерацию энтероцитов, интраэпите-лиальный лимфоцитоз, и интенсивную лимфоплазмацитарную инфильтрацию собственной пластинки слизистой

оболочки. В случаях умеренной активности заболевания атрофия может не быть выраженной или отсутствовать, тогда основным патологическим маркером остается повышенная лимфоцитарная инфильтрация эпителиальной ткани. Гиперплазия крипт подразумевает увеличение их числа, удлинение, расширение пролиферативной зоны крипты, и выраженное увеличение числа митозов. Энтероциты при целиакии демонстрируют неспецифические изменения, включая ослабление щеточной каемки, кубическую метаплазию, вакуолизацию, цито-плазматическую базофилию, потерю полярности и базальной ядерной

ориентации. Повреждения эпителия при целиакии могут лежать от небольших морфологических изменений со слабой лимфоцитарной инфильтрацией до крайне выраженной атрофии и уплощения эпителия с грубыми некротическими изменениями, кроме того, они могут быть неравномерными по длине кишки и не коррелировать с тяжестью клинического течения. Поэтому для стандартизированной оценки патологических изменений используется классификация Ма^^ ОЬе^иЬег, включающая три типа повреждения эпителия: 0 -соответствует морфологически нормальному эпителию, Ма^-ОЬе^иЬег; 1 (минимальный) -увеличению числа межэпителиальных лимфоцитов (МЭЛ) до более, чем 30 клеток на 100 энтероцитов при сохранении нормальной структуры эпителия, а Ма^-ОЬе^иЬег; 2 (средний) - появлению гипертрофии и углубления крипт при выраженной лимфоцитарной инфильтрации (МЭЛ>30) и в отсутствии атрофии ворсинок.

Последний, продвинутый тип Ма^-ОЬе^иЬег 3 характеризуется гипертрофией крипт, МЭЛ>30 и наличием атрофии ворсинок, и разделяется на три подтипа: 3а - слабая атрофия ворсинок, 3Ь - сильная атрофия и 3с - тотальная атрофия и уплощение эпителия.

Терминальной стадией целиакии признается полное нарушение структуры кишечного эпителия со снижением числа крипт, тотальной атрофией ворсинок и верхнего слоя эпителия вообще, с грубыми фибротическими изменениями, отложением коллагена, истончением, разрывами или исчезновением базальной мембраны, и возможным развитием злокачественных новообразований. Пато-морфологический отчет, таким образом, должен включать оценку гиперплазии

крипт, атрофии ресничек и подсчет относительного числа МЭЛ, которые являются равно значимыми диагностическими критериями. В норме содержание МЭЛ не превышает 30 клеток на 100 энтероцитов, а отношение длина ворсинки/глубина крипты составляет не менее 2:1

Гистологическое описание производилось после биопсий тонкого кишечника животных контрольных и экспериментальных групп. Глютенсодержащую диету давали мышам в течение 15 дней, чтобы вызвать атрофию ворсин и гиперплазию крипты, в то время как у мышей, которых содержали на безглютеновой диете, не было обнаружено никаких отклонений. Это было подтверждено мор-фометрической оценкой отношения высоты ворсинки к глубине крипты (рисунок 1-5). Кроме того, у этих мышей были повреждены апикальные энтероциты и плотные соединения. Диарея, вздутие живота, а также выпадение волос наблюдались у 20% мышей из группы, получавших глютеновое питание (Целиакия).

На 15 сутки в слизистой тонкой кишки обнаруживается выраженная лимфо-плазмацитарная инфильтрация, утолщение и укорочение ворсинок. Для прослеживания динамики поражения кишечника проводили забой животных на 4, 6 и 15 сутки. При вскрытии у мышей у всех животных отмечалось воспаление тонкого кишечника. В слизистой тонкой кишки обнаруживается выраженная лимфо-плазмацитарная инфильтрация, утолщение и укорочение ворсинок.

Атрофия слизистой оболочки носит при целиакии гиперрегенераторный характер и проявляется, наряду с укорочением и утолщением ворсинок, удлинением (гиперплазией) крипт [4]

1 *

Рисунок 1-Лимфо-плазмацитарная инфильтрация, утолщение и укорочение вор-

Рисунок 2 - Выраженное укорочение ворсин, а также их атрофия, воспалительная инфильтрация слизистой, количество МЭЛ 40 на 100 эпителиальных клеток, дистрофические изменения эпителиальных клеток ворсин.

Рисунок 3 - Наиболее выраженная воспалительная инфильтрация слизистой, количество МЭЛ 50 на 100 эпителиальных клеток. Более выраженная атрофия и

Рисунок 4 -Интенсивная воспалительная инфильтрация слизистой и ее отек, количество МЭЛ 50 на 100 эпителиальных клеток. Атрофия ворсин и значительное

Рисунок 5- Воспалительная инфильтрация слизистой и ее отек, количество МЭЛ

40 на 100 эпителиальных клеток. Атрофия ворсин и укорочение крипт.

Для диагностики целиакии важное [5]. Воспалительная инфильтрация слизи-значение имеет изменение отношения вы- стой оболочки представлена межэпители-соты ворсинки к глубине крипты, которое альной лимфоидной (МЭЛ) инфильтра-в норме у человека составляет не менее 2:1 цией (30 на 100 эпителиальных клеток в

норме у человека) и лимфоплазмацитар-ная инфильтрация собственной пластинки слизистой оболочки [6]

Все гистологические изменения, полученные в ходе исследования

аналогичны клиническим проявлениям целиакии человека, и, таким образом, эта экспериментальная модель целиакии имитирует развитие патологии заболевания у людей