СПОСОБ ЭКСТРАКОРПОРАЛЬНОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ООЦИТОВ КОРОВ
METHOD FOR EXTRACORPOREAL CULTIVATION OF OOCYTES IN COWS

Изобретение относится к области репродуктивных биотехнологий, конкретно к способам культивирования животных клеток, и может быть использовано для получения зрелых яйцеклеток коров in vitro, компетентных к дальнейшему развитию, получению эмбрионов - интактных, клонированных, трансгенных, а также для выделения линий эмбриональных стволовых клеток.
Одной из задач в области клеточных репродуктивных технологий в животноводстве является создание эффективных систем для культивирования незрелых ооцитов, извлеченных из яичников животных - доноров после убоя. Разработаны методы культивирования незрелых ооцитов в питательных средах для завершения процесса созревания. Например, после забоя коров извлекают яичники, выделяют из них ооциты, по морфологическим критериям выделяют незрелые, культивируют в питательной среде до стадии дозревания и проводят оплодотворение [1].
Немаловажным аспектом в описанных процедурах является повышение точности определения степени зрелости ооцитов. В частности, было предложено использовать для этой цели краситель ВСВ (brilliant cresyl blue), который реагирует на внутриклеточную активность глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы (G6PDH). Высокая активность фермента G6PDH в растущих ооцитах приводит к обесцвечиванию ВСВ, чего не наблюдается в ооцитах, завершивших фазу роста в организме животного [2]. Данный способ и был выбран в качестве прототипа.
Основным недостатком известных методик является небольшая относительная доля ооцитов, способных к дальнейшему развитию в эмбрионы.
Задачей предлагаемого изобретения была разработка способа экстракорпорального культивирования, обеспечивающего заметное увеличение количества ооцитов, созревших до состояния, пригодного для оплодотворения.
Решение поставленной задачи было найдено в виде способа, согласно которому фазу роста ооцитов, выделенных из коров после убоя, оценивают методом окрашивания бриллиантовым кристаллическим голубым (ВСВ), отделяют не завершившие рост ооциты, культивируют их в среде ТС-199, содержащей 20% бычьей сыворотки, 50 нг/мл бычьего пролактина, 0.55 мг/мл лактата кальция, 0.23 мг/мл пирувата натрия, 1.27 мг/мл HEPES, 50 мкг/мл гентамицина и клетки гранулезы в концентрации 1 млн/мл в течение 15 ч, затем ооциты перемещают в другую среду, содержащую кроме выше упомянутых компонентов хорионический гонадотропин человека в концентрации 10 м.ед/мл, и культивируют еще 15 ч.
Были проведены следующие эксперименты. Из полученных на мясокомбинате яичников коров выделяли ооцит-кумулюсные комплексы путем аспирации содержимого фолликулов диаметром 3-6 мм. Затем морфологически оцененные ооциты в течение 90 минут подвергали воздействию раствора 26µМ ВСВ (В-5388, Sigma) в среде Дюльбекко и разделяли окрашенные ооциты (завершившие фазу роста) и без окраски (растущие).
Полученные описанным выше приемом ооциты, не завершившие фазу роста, разделили на две группы: контрольную и опытную. Ооциты контрольной группы культивировали согласно способу, описанному в прототипе [2], а именно, группами по 15-20 штук помещали в покрытые минеральным маслом капли объемом 200 мкл среды ТС-199, содержащей 20% бычьей сыворотки, 50 нг/мл бычьего пролактина, 0.55 мг/мл лактата кальция, 0.23 мг/мл пирувата натрия, 1.27 мг/мл HEPES, 50 мкг/мл гентамицина и клетки гранулезы в концентрации 1 млн/мл. Опыт проводили в течение 24 ч при температуре 38.5°C в атмосфере с 5% углекислого газа при 90% влажности.
Ооциты опытной группы обрабатывали согласно заявляемому способу, а именно, сначала культивировали в указанной выше среде в течение 15 часов, затем переносили в среду, которая кроме указанных компонентов содержала хорионический гонадотропин человека в количестве 10 м.ед/мл, и культивировали в течение 15 ч при тех же условиях.
Для проверки возможности эмбрионального развития все ооциты оплодотворяли спермой быков и помещали в капли объемом 25 мкл синтетической среды эмбрионов (mSOF) +20 г/л буфера BSA. Культивирование эмбрионов проводили под минеральным маслом в атмосфере 5% углекислого газа, 5% кислорода и 90% азота. Для мониторинга развития эмбрионов на 5-й и 8-й день после оплодотворения оценивали, соответственно, выход морул и бластоцист.
Результаты описанных сравнительных испытаний приведены в таблице. Хорошо видно, что объект изобретения показывает значительное преимущество перед прототипом. Количество эмбрионов, разделившихся до 8-16 клеток в опытном варианте, превышает аналогичный показатель в контроле примерно на четверть, а доля зародышей, достигших стадии бластоцисты - более чем вдвое.
Технический результат изобретения заключается в существенном повышении доли ооцитов, созревших в процессе экстракорпорального культивирования и компетентных к эмбриональному развитию, и их способности к развитию до стадии бластоцисты после оплодотворения in vitro.
Источники информации
1. Патент РФ №2410063 от 04.06.2009.
2. В. Heleil., Т. Kuzmina, N. Novikova, Н. Torner and Н. Alm // Effect of prolactin on Developmental Competence of Bovine Oocytes Selected by Brilliant Cresyl Blue Staining / Journal of Reproduction and Infertility. - 2010, №1, p. 1-7.