ЛЕКАРСТВЕННЫЕ ЭКСТРАКТЫ РАСТЕНИЙ АМБРОЗИИ
MEDICINAL EXTRACTS OF AMBROSIA PLANTS

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЕ РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
[0001] Данное изобретение заявляет приоритет согласно заявке US 62/334124, поданной 1 июня 2016 года, и заявке US 62/217609, поданной 11 сентября 2015 года. Они включены в данный документ посредством ссылки в полном объеме.
ЗАЯВЛЕНИЕ ОТНОСИТЕЛЬНО ФИНАНСИРУЕМЫХ ГОСУДАРСТВОМ ИССЛЕДОВАНИЙ
[0002] Не применимо.
ССЫЛКА НА ПРИЛОЖЕНИЕ МИКРОФИШИ
[0003] Не применимо.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
[0004] Данное изобретение относится к области терапии рака и в частности к области фитоцевтических композиций для лечения рака.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0005] Терапевтические средства на основе растений были известны и
использовалась с древних времен и по-прежнему обеспечивают от 30 до 40% наших новых потенциальных лекарственных препаратов каждый год. Многообразие компонентов, содержащихся в растениях, является не до конца изученным, и считается, что глубокий биохимический анализ компонентов растений, встречающихся, например, в листьях, стеблях и т.п., может продолжать выявлять ценные терапевтические соединения для лечения различных заболеваний, таких как микробные инфекции или мигрени.
[0006] В последнее время наблюдается значительный интерес к поиску фотохимических свойств многих давно обнаруженных растений с целью определения их потенциальных фармацевтических преимуществ, в частности среди вторичных метаболитов. Помимо первичного метаболизма, необходимого для жизни, растения обладают вторичным метаболизмом, который генерирует соединения, которые способствуют их росту и развитию. Основной задачей вторичных метаболитов являются защитные механизмы для борьбы с животными, вредителями и патогенами. Эти соединения стали предметом большого интереса с точки зрения фармакологии.
[0007] Одним из таких семейств, представляющих интерес с точки зрения природной терапии, является семейство Астровые (или Сложноцветные). Это семейство имеет исключительное экологическое и экономическое значение, и встречается от полярных регионов до тропиков, колонизируя все доступные места обитания, хотя чаще всего встречается в засушливых районах. Астровые считается перспективным семейством растений в связи с количеством и разнообразием активных соединений, образующихся при вторичном метаболизме. Некоторые общеизвестные области применения семейства Астровые относятся к растительным продуктам, таким как чаи (ромашка, эхинацея) или ароматические смеси из сухоцветов (бархатцы). Тем не менее, существуют свидетельства того, что растения семейства Астровые содержат вторичные метаболиты, которые могут применяться при лечении многих заболеваний.
[0008] Рак является общим термином, часто используемым для обозначения любого из различных типов злокачественных новообразований (т.е. патологической ткани, которая за счет клеточной пролиферации растет быстрее, чем здоровая), большинство из которых проникают в окружающие ткани, могут метастазировать в несколько участков, с большой долей вероятности рецидивируют после попытки удаления и вызывают смерть без надлежащего лечения. Несмотря на то, что различные методы лечения рака, в том числе хирургическая вырезание, лучевая терапия и химиотерапия, являются доступными и широко используются в течение многих лет, рак остается одной из основных причин смерти в мире.
[0009] Рак вовлекает несколько важных сигнальных путей в пораженных клетках.
Баланс между пролиферацией и запрограммированной гибелью клеток у страдающего раком пациента нарушается, и в карциномах обнаруживаются определенные генетические нарушения апоптотических сигнальных путей, что приводит к развитию и прогрессированию опухоли. Большая работа в области исследований рака направлена на сигнальные пути, как средство остановки прогрессирования рака и лечения пациента.
[0010] Было показано, что многие природные соединения, встречающиеся в растениях, вызывают некоторые улучшения при лечении рака, побочных эффектах лечения рака и/или прогрессировании рака как такового. Тем не менее, существует потребность в поиске и разработке большего количества соединений растительного происхождения для лечения рака и для понимания того, каким образом они оказывают воздействие на сигнальные пути, с тем, чтобы данные соединения можно было комбинировать для более эффективного плана лечения.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0011] В данном документе предлагаются несколько фармацевтических соединений, экстрагированных из представителя растительного семейства Астровые, и способы применения этих соединений для лечения рака. Эти соединения доказали свою эффективность в отношении рака мочевого пузыря, рака предстательной железы, трижды негативного рака молочной железы (ТНРМЖ), обычного и химиорезистентного рака легких, а также рака поджелудочной железы в лабораторных моделях животных in vitro и in vivo. Кроме того, было показано, что данные соединения ингибируют образование первичных и вторичных сфер, что может привести к лечению и элиминации циркулирующих опухолевых клеток.
[0012] Данные соединения относятся к экстракту, полученному из органической фракции перспективных с фармацевтической точки зрения растений семейства Астровые, в том числе из Ambrosia maritima или Ambrosia hispida. Ambrosia maritima является очень ветвистой и имеет серо-опушенные ароматные листья, а также зеленые, плотные и жилистые, слегка бороздчатые стебли. Это растение может встречаться в основном в прибрежной полосе североафриканских государств Средиземноморья и вдоль илистых фунтов дамб канала Нила в Египте и Судане. Родиной Ambrosia hispida, также известной как Coastal Ragweed (амброзия прибрежная), является Северная Америка, главным образом север Мексики. Она тоже представляет собой древесное растение с серебристыми/серыми широкими листьями.
[0013] Многие исследования Ambrosia maritima показали, что она обладает некоторым фармакологическим действием. Исследование, проведенное Alard et al., показало, что ни после перорального введения 5 г/кг высушенных листьев этого растения в виде порошка или в виде метанольного экстракта, ни после включения в корм 50000 м.д. измельченных в порошок листьев в течение 4 недель не наблюдалось никаких признаков токсичности. Кроме того, мутагенный эффект не детектировался во время теста на мутагенность с использованием штаммов Salmonella typhimurium ТА97, ТА 98, ТА1538, ТА100 и ТА1535 (Alard 1991).
[0014] Было показано, что Ambrosia maritima убивает промежуточного хозяина
шистосомоза и фасциолеза (обе паразитарные инфекции) при концентрации, составляющей 3000 мг/л, в водных потоках (M.F. El-Sawy 1977 и 1986). Некоторые соединения в Ambrosia maritima обладают значительным цитотоксическим эффектом (Abdallah 1991) и антимикробной активностью (Badawy 2014). Кроме того, было продемонстрировано применение Ambrosia maritima в качестве релаксанта мышц кишечника, матки и кровеносных сосудов; для увеличения ежедневного диуреза; и снижения массы тела.
[0015] Ambrosia maritima и Ambrosia hispida содержат несколько соединений, обладающих потенциальными фармакологическими эффектами, таких как хлорамброзин, амброзин, дамсин, неоамброзин, фарнсерин, гимендин, гименин, стамонин-b, ангидрофрансерин, тритерпены, s-амирин, апигенин, кумарины, стерины, β-ситостерин, танин, эфирное масло, карвон, комфор, кариофиллен, цинеол, соли и другие сесквитерпеновые лактоны. Тем не менее, способы согласно данному изобретению ориентированы на применение сесквитерпеновых лактонов.
[0016] Сесквитерпеновые лактоны (СЛ) представляют собой соединения, содержащиеся в органической фракции растительного экстракта. СЛ в этом органическом экстракте чаще всего представляют собой бифункциональные сесквитерпеновые лактоны, и было обнаружено, что они специфически и ковалентно взаимодействуют с цистеиновыми боковыми цепями белков-мишеней в раковых клетках. α,β-Ненасыщенные кетонные фрагменты сесквитерпеновых лактонов растительного происхождения выполняют функцию акцепторов Михаэля в самопроизвольных реакциях с донорами Михаэля сульфгидрилов цистеинов белков в физиологических условиях. На Фиг. 1А изображен типовой бифункциональный сесквитерпеновый лактон со стрелками, указывающими на два акцепторных сайта Михаэля, которые обеспечивают возможность СЛ выполнять функцию сшивающего агента между двумя боковыми цепями цистеинов белков. Тем не менее, некоторые из СЛ, встречающихся в Ambrosia maritima, содержат два или более акцепторных сайтов Михаэля в одной молекуле. На Фиг. 1В изображены три других СЛ, встречающихся в экстрактах растений амброзия.
[0017] СЛ также представляют собой плейотропные соединения, которые обнаруживают более одной сигнальной молекулы внутри клетки и воздействуют на них, а также демонстрируют способность непосредственно связываться с различными белками с высокой аффинностью. Таким образом, терапевтический эффект образования ковалентных аддуктов на множественных белках-мишенях включает блокирование путей пролиферации раковых клеток (т.е. NF-κВ и STAT3) и активацию путей апоптотической элиминации клеток (т.е. каспаз 3, 7 и 6).
[0018] Многие различные СЛ присутствуют в органическом экстракте Ambrosia maritima и Ambrosia hispida, в том числе амброзин, дамсин, неоамброзин, партенин, геленалин, трибромамброзин и т.п. В способах согласно данному изобретению предпочтительно применять весь спектр СЛ, встречающихся в органическом экстракте, для лечения. Тем не менее, можно выделить и очистить отдельные СЛ для лечения или синтезировать конкретные СЛ методами органической химии. Несмотря на то, что ожидается, что большинство раковых клеток будут поддаваться лечению всем спектром СЛ, встречающихся в органическом экстракте из растения амброзия, некоторым раковым заболеваниям также может пойти на пользу лечение отдельными СЛ или группой СЛ, встречающихся в органическом экстракте. Выделение отдельных СЛ из цельного экстракта может быть регулируемым, тем самым обеспечивая возможность комбинирования отдельных очищенных СЛ в соотношениях, которые обычно не встречаются в органическом экстракте.
[0019] В способах согласно данному изобретению растение Ambrosia maritima или Ambrosia hispida смешивают с органическим растворителем, таким как ацетонитрил, метанол, этанол, изопропанол, простой эфир, этилацетат, ацетон или их смеси, для экстракции СЛ. Предпочтительно применяют полярный органический растворитель.
[0020] Как правило, смесь растительной ткани и полярного органического растворителя выдерживают, тем самым обеспечивая возможность осуществления экстракции. В альтернативном варианте, растительная ткань может быть исчерпывающе экстрагирована полярным органическим растворителем в аппарате Сокслета или т.п.
[0021] Растительная ткань может быть свежей, замороженной или высушенной, и может быть в измельченной форме. Затем экстракт, как правило, отделяют от растительной ткани и удаляют растворитель из экстракта растворителя посредством сушки или осаждения и т.п. После удаления растворителя оставшийся первичный экстракт может быть дополнительно очищен с помощью известных методов, таких как эксклюзионная хроматография, ионообменная хроматография, ВЭЖХ, осаждение, кристаллизация, дополнительная экстракция растворителем и обращенно-фазовая хроматография и т.п.Оставшаяся растительная ткань может быть дополнительно экстрагирована с применением того же или другого растворителя.
[0022] На Фиг. 1C-D изображены хроматографические фингерпринты СЛ в органических экстрактах Ambrosia maritima (1С) и Ambrosia hispida (ID). Результатом обоих является аналогичный состав сесквитерпеновых лактонов, что свидетельствует о том, что в семействе Астровые имеется много растений, которые можно применять для фармацевтического препарата, описанного в данном документе.
[0023] Активный ингредиент или ингредиенты органического экстракта растительного материала можно применять в исходном виде или можно смешивать с известными фармацевтически приемлемыми носителями, разбавителями и/или вспомогательными веществами.
[0024] Например, могут быть получены желатиновые капсулы, содержащие высушенные органические и/или очищенные соединения экстракта, содержащие подходящую дозу активного ингредиента (ингредиентов). Необязательно, могут предоставляться пакеты, содержащие высушенный экстракт, для смешивания, например, с горячими жидкостями, для перорального приема. Экстракт также может быть объединен с твердыми носителями для прессования в гранулированные или таблетированные лекарственные формы, особенно со вспомогательными веществами с отсроченным высвобождением для приготовления гранулированных/таблетированных лекарственных форм для приема один раз в день. Другими фармацевтическими композициями могут быть жидкие или твердые носители и/или вспомогательные вещества, вводимые перорально.
[0025] Фармацевтически приемлемый носитель может также представлять собой нанобиологический носитель, такой как липопротеин высокой плотности, который будет специфически локализоваться и оказывать направленное воздействие на опухоль у пациента, страдающего раком. Также для такого направленного воздействия могут применяться антитела.
[0026] Также может быть возможным приготовление форм активных ингредиентов, не предназначенных для перорального введения, таких как лекарственные формы для ингаляционного, трансбуккального, сублингвального, назального, суппозиторного или парентерального введения.
[0027] Более конкретно, данное изобретение может включать одно или более из следующего:
[0028] - Композицию, содержащую органический экстракт Ambrosia maritima вместе с фармацевтически приемлемым носителем; органический экстракт Ambrosia maritima, который в 10, 100 или 1000, или более раз более стабилен, чем природная клеточная форма СЛ, согласно анализу сравнения с неочищенным клеточным экстрактом растительного материала; органический экстракт Ambrosia maritima, который является по меньшей мере в 100 раз более концентрированным, чем природная клеточная форма СЛ, предпочтительно в 1000 раз, или в 10000 раз, или лучше; любые из описанных в данном документе композиций, дополнительно содержащие фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество, буфер, хелатирующий агент или матрицу замедленного высвобождения, или их комбинации; любую из описанных в данном документе композиций в форме желатиновой капсулы, гранулированной форме или жидкой форме для перорального применения.
[0029] - Композицию, содержащую органический экстракт Ambrosia hispida вместе с фармацевтически приемлемым носителем; органический экстракт Ambrosia hispida, который в 10, 100 или 1 000, или более раз более стабилен, чем природная клеточная форма СЛ, согласно анализу сравнения с неочищенным клеточным экстрактом растительного материала; органический экстракт Ambrosia hispida, который является по меньшей мере в 100 раз более концентрированным, чем природная клеточная форма СЛ, предпочтительно в 1000 раз, или в 10000 раз, или лучше; любые из описанных в данном документе композиций, дополнительно содержащие фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество, буфер, хелатор или матрицу с отсроченным высвобождением, или их комбинации; любую из описанных в данном документе композиций в форме желатиновой капсулы, гранулированной форме или жидкой форме для перорального применения.
[0030] - Способ лечения рака, включающий введение эффективного количества любой из указанных выше композиций пациенту, страдающему раком; способ лечения трижды негативного рака молочной железы (ТНРМЖ), включающий введение эффективного количества описанной композиции пациенту, страдающему ТНРМЖ; способ лечения рака мочевого пузыря, включающий введение эффективного количества описанной композиции пациенту, страдающему раком мочевого пузыря; способ лечения рака легких, включающий введение эффективного количества описанной композиции пациенту, страдающему раком легких; способ лечения рака предстательной железы, включающий введение эффективного количества описанной композиции пациенту, страдающему раком предстательной железы.
[0031] - Способ получения описанной фармацевтической композиции, включающий измельчение Ambrosia maritima, экстрагирование органического растворимого компонента из указанной измельченной Ambrosia maritima и добавление фармацевтически приемлемого носителя к указанному органическому растворимому компоненту; способ получения фармацевтической композиции согласно данному изобретению, включающий измельчение Ambrosia maritima, экстрагирование органического растворимого компонента (компонентов) из указанного измельченного цельного растения, очистку экстрагированного органического растворимого соединения (соединений) и добавление фармацевтически приемлемого носителя к указанному очищенному органическому растворимому компоненту (компонентам).
[0032] - Способ получения описанной фармацевтической композиции, включающий измельчение Ambrosia hispida, экстрагирование органического растворимого компонента из указанной измельченной Ambrosia hispida и добавление фармацевтически приемлемого носителя к указанному органическому растворимому компоненту; способ получения фармацевтической композиции согласно данному изобретению, включающий измельчение Ambrosia hispida, экстрагирование органического растворимого компонента (компонентов) из указанного измельченного цельного растения, очистку экстрагированного органического растворимого соединения (соединений) и добавление фармацевтически приемлемого носителя к указанному очищенному органическому растворимому компоненту (компонентам).
[0033] Фармацевтическую композицию можно вводить ежедневно, 3-4 раза в неделю или раз в неделю. Продолжительность дозирования составляет по меньшей мере 6 недель, при этом предпочтительными диапазонами дозирования являются 6-12 недель, 8-10 недель или 9 недель. Предпочтительным является ежедневное лечение с пероральным введением в течение 6-12 недель, но в некоторых случаях продолжительность лечения может быть увеличена в зависимости от степени тяжести рака и его стадии.
[0034] В этом описании сущности изобретения приведены понятия, которые дополнительно описаны ниже в подробном описании. Данное описание не предназначено для идентификации ключевых или существенных признаков заявленного объекта изобретения, а также не предназначено для использования с целью ограничения объема заявленного объекта изобретения.
[0035] В контексте данного документа термин "растительный материал" относится к любой части или частям растения, взятым либо по отдельности, либо в группе, и не ограничивается листьями, цветами, корнями и стеблями.
[0036] В контексте данного документа термин "органический экстракт" относится к композиции, полученной путем приведения в контакт растительного материала с органическим растворителем согласно способам, описанным в данном документе. Данный термин охватывает неочищенные экстракты, полученные путем простой органической экстракции, а также неочищенные экстракты, которые были подвергнуты одной или более стадиям разделения и/или очистки, включая по сути очищенный и очищенный активный ингредиент (ингредиенты), а также концентраты или фракции, полученные из неочищенного экстракта путем подвержения неочищенного экстракта одной или более дополнительным стадиям экстракции, концентрирования, фракционирования, фильтрации, конденсации, дистилляции или другим стадиям очистки. Растительный экстракт может быть в жидкой форме, такой как раствор, концентрат или дистиллят, полужидкой форме, такой как гель или паста, или может быть в твердой форме, такой как гранулированная или порошкообразная форма. Растительный материал может быть свежим, высушенным, замороженным или в измельченной форме.
[0037] Термин "активный ингредиент" включает один или более активных ингредиентов (например, соединения, имеющие фармацевтическую эффективность в отношении по меньшей мере рака мочевого пузыря, предстательной железы и молочной железы, и возможно других заболеваний), выделяемых по меньшей мере из Ambrosia maritima и/или Ambrosia hispida, и возможно из других видов амброзии или даже других семейств растений. Он включает как синтетические (химические), так и натуральные (полученные из растений) формы активного ингредиента.
[0038] Термин "выделенный" при использовании в отношении соединения или соединений, обладающих фармацевтической активностью, относится к форме активного ингредиента, которая относительно не содержит белков, нуклеиновых кислот, липидов, клеточной стенки, углеводов или других материалов, с которыми он связан в живом растении в природных условиях.
[0039] Термин "концентрированный" при использовании в отношении активного ингредиента относится к форме активного ингредиента, который обладает по меньшей мере 50% чистотой при анализе с помощью ВЭЖХ.
[0040] Термин "по сути очищенный" при использовании в отношении активного ингредиента относится к форме активного ингредиента, который обладает по меньшей мере 75% чистотой при анализе с помощью ВЭЖХ.
[0041] Термин "очищенный" при использовании в отношении активного ингредиента относится к форме соединения (соединений), которое обладает по меньшей мере 90% чистотой и предпочтительно обладает по меньшей мере 95, 98 или 99% чистотой при анализе с помощью ВЭЖХ.
[0042] Термины "терапия" и "лечение", взаимозаменяемо используемые в данном документе, относятся к вмешательству, выполненному с целью улучшения состояния здоровья у реципиента. Улучшение может быть субъективным или объективным и относится к уменьшению интенсивности связанных с ним симптомов, предотвращению развития или изменению патологии заболевания, расстройства или патологического состояния, подлежащего лечению. Таким образом, термины "терапия" и "лечение" используются в самом широком смысле и включают предотвращение (профилактику), ослабление, снижение и лечение болезни, расстройства или патологического состояния на разных стадиях. Данные термины также охватывают предотвращение ухудшения состояния реципиента (т.е. стабилизацию заболевания, расстройства или патологического состояния). Те, кто нуждаются в терапии/лечении, включают тех, у кого уже есть данное заболевание, расстройство или патологическое состояние, а также тех, кто предрасположен к данному заболеванию, расстройству или патологическому состоянию или подвержен риску их развития, и тех, у кого данное заболевание, расстройство или патологическое состояние должны быть предотвращены.
[0043] В контексте данного документа термин "субъект" или "пациент" относится к животному, нуждающемуся в лечении. В контексте данного документа термин "животное" относится к человеку и не относящемуся к человеку животному, включая, но не ограничиваясь ими, млекопитающих, птиц и рыб.
[0044] В контексте данного документа термин "эффективное количество" относится к количеству органического экстракта или СЛ, необходимому для предоставления пациенту биологической или значимой пользы, такой как биологический или медицинский ответ или улучшение, которого стремится добиться врач или другой специалист в области медицины. В одном аспекте термин "эффективное количество" предназначен для обозначения количества лекарственного средства, которое приведет к биологически значимому улучшению роста рака, симптома или заболевания у субъекта. Дозы, которые показывают высокие терапевтические показатели, являются предпочтительными. Эффективные количества могут варьироваться, как признано специалистами в данной области техники, в зависимости, например, от способа введения, лекарственной формы, включения дополнительных активных веществ, а также возраста, веса, чувствительности, типа рака и состояния здоровья субъекта.
[0045] В контексте данного документа термин "фитоцевтический" относится к обладающей терапевтическими свойствами композиции на растительной основе.
[0046] В контексте данного документа термин "'разрезание' протеазами" означает процессинг, созревание и активацию других белков (например, каспаз).
[0047] "Значительным процентным изменением" в отношении результатов визуализации считалось изменение, составляющее 10% и выше, при количественной оценке плотности пикселей для каждого спота в результатах анализа на микрочипе. Расчет любой разницы между контрольным и обработанным образцом, при этом любая разница, превышающая 10%, считается значительной.
[0048] В контексте данного документа слово в единственном числе при использовании в сочетании с термином "содержащий" в формуле изобретения или описании означает один или более одного, если только контекст не указывает на иное.
[0049] Термин "около" означает заявленную величину плюс или минус предел погрешности измерения или плюс или минус 10%, если метод измерения не указан.
[0050] Термин "или" в формуле изобретения используется для обозначения "и/или", если явно не указано, что он относится только к альтернативным вариантам, или если альтернативные варианты являются взаимоисключающими.
[0051] Термины "состоит из", "имеет", "включает" и "содержит" (и их варианты) являются неограничивающими глаголами-связками и обеспечивают возможность добавления других элементов при использовании в заявке.
[0052] Фраза "состоящий из" является ограничивающей и исключает все дополнительные элементы.
[0053] Фраза "состоящий по сути из" исключает дополнительные материальные элементы, но допускает включения нематериальных элементов, которые по сути не изменяют природу изобретения.
[0054] В данном документе используются следующие сокращения:
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
[0055] Фиг. 1А. Химическая структура типового СЛ амброзина со стрелками,
указывающими на точки реакции Михаэля.
[0056] Фиг. 1В. Химическая структура трех дополнительных типовых СЛ,
встречающихся в растениях амброзия.
[0057] Фиг. 1С.Хроматографические фингерпринты сесквитерпеновых лактонов,
экстрагированных из Ambrosia maritima.
[0058] Фиг. 1D. Хроматографические фингерпринты сесквитерпеновых лактонов,
экстрагированных из Ambrosia hispida.
[0059] На Фиг. 2А изображено связывание амброзина и ингибирование
субъединицы р65 Nf-каппа-В с нарушением взаимодействия Nf-каппа-В/ДНК.
[0060] На Фиг. 2В изображен другой вид связывания амброзина с докинг-доменом
ДНК NF-κВ в Cys 122 и Cys 207.
[0061] На Фиг. 2С изображено связывание амброзина (кластера сфер) с докинг-доменом ДНК NF-кВ в Cys 122 и Cys 207.
[0062] На Фиг. 2D изображен второй вид связывания сесквитерпенового лактона с NF-κВ Р65.
[0063] На Фиг. 3 изображен гель-электрофорез (вестерн-блоттинг), иллюстрирующий результаты ингибирования сесквитерпеновых лактонов (50 мкг/мл) важных рак-ассоциированных представителей семейства ErbB, а также экспрессию р65 во множественных клеточных линиях рака мочевого пузыря.
[0064] На Фиг. 4А изображено связывание одного из сесквитерпеновых лактонов (сфер) со STAT3 с нарушением его связывания с ДНК. Сесквитерпеновый лактон амброзин связывает Cys 251 и Cys 328. На Фиг. 4В изображен крупный план области связывания на Фиг. 4А.
[0065] На Фиг. 5А изображен сесквитерпеновый лактон амброзин, связывающий два гомодимера каспазы-7. Крупный план взаимодействия с симметричными боковыми цепями Cys 290 и Cys 290', ведущего к стабилизации гомодимера, изображен на Фиг. 5В.
[0066] На Фиг. 6А изображен сесквитерпеновый лактон, связывающий ГТФ-связывающий сайт ГТФаз семейства Rho. Крупный план этой связи, иллюстрирующий связывание СЛ с Cys 157 и Cys 18, изображен на Фиг. 6В.
[0067] На Фиг. 7 изображена концентрация клеток согласно анализу с применением MTS для различных рак-ассоциированных клеточных линий после воздействия различными концентрациями сесквитерпеновых лактонов, экстрагированных из растения Ambrosia maritima.
[0068] На Фиг. 8 изображена концентрация клеток согласно анализу с применением MTS для различных рак-ассоциированных клеточных линий после воздействия различными концентрациями сесквитерпеновых лактонов, экстрагированных из растения Ambrosia maritima.
[0069] На Фиг. 9 изображен фосфокиназный микрочип, который иллюстрирует воздействие 25 мкг/мл сесквитерпеновых лактонов, экстрагированных из Ambrosia maritima, на рак-ассоциированные сигнальные белки в клеточной линии UM-UC-6 рака мочевого пузыря и клеточной линии MCF7 рака молочной железы.
[0070] На Фиг. 10 изображена гистопатология рецепторов эпидермального фактора роста и Ki-67 у контрольных мышей, ксенотрансплантированных клетками UM-UC-6, и мышей, инъецированных клетками UM-UC-9, но обработанных с применением сесквитерпеновых лактонов, экстрагированных из Ambrosia maritima. Концентрация сесквитерпеновых лактонов составляла 100 мкг/доза.
[0071] На Фиг. 11А изображена гистопатология ортотопически инъецированных клеток SUM-159 рака молочной железы у контрольных мышей (вверху) и мышей, обработанных сесквитерпеновыми лактонами, экстрагированными из Ambrosia maritima.
[0072] На Фиг. 11В изображена гистопатология ортотопически инъецированных клеток MDA-MB-231 рака молочной железы у контрольных мышей (вверху) и мышей, обработанных сесквитерпеновыми лактонами, экстрагированными из Ambrosia maritima.
[0073] На Фиг. 11С изображены результаты для ортотопически инъецированных клеток MDA-MB-231 трижды негативного рака молочной железы, обработанных органическим экстрактом, содержащим все сесквитерпеновые лактоны из Ambrosia maritima, очищенными субфракциями, содержащими только амброзин, и очищенными субфракциями, содержащими только дамсин.
LUC
LUC
LUC
[0074] На Фиг. 12 изображены результаты взвешивания опухолей мышей, ксенотрансплантированных клеточными линиями РС-3, UM-UC-9 или UM-UC-10 рака мочевого пузыря с применением ежедневной обработки сесквитерпеновыми лактонами и без нее.
LUC
[0075] На Фиг. 13 изображена гистопатология клеточной линии UM-UC-5 рака мочевого пузыря, ортотопически инъецированной в животных, и масса мочевого пузыря как для контрольных мышей, так и для мышей, обработанных органическим экстрактом сесквитерпеновых лактонов, экстрагированных из Ambrosia maritima, в дозе, составляющей 200 мкг/день.
LUC
[0076] На Фиг. 14 изображена гистопатология клеточной линии UM-UC-10 рака мочевого пузыря, ортотопически инъецированной в животных, и масса мочевого пузыря как для контрольных мышей, так и для мышей, обработанных органическим экстрактом сесквитерпеновых лактонов, экстрагированных из Ambrosia maritima, в дозе, составляющей 200 мкг/день.
[0077] Фиг. 15 иллюстрирует изображения сферических форм из различных клеточных линий рака мочевого пузыря, обработанных (правая колонка) сесквитерпеновыми лактонами или без обработки (левая колонка).
[0078] На Фиг. 16 изображен тест на образование сфер для вторичных сфер, полученных из UM-UC-9 и обработанных сесквитерпеновыми лактонами.
[0079] На Фиг. 17 изображен тест на образование сфер для третичных сфер, полученных из UM-UC-9 и обработанных сесквитерпеновыми лактонами.
50
[0080] На Фиг. 18 изображены результаты IC-экспериментов на клеточных линиях UM-UC-5 рака мочевого пузыря, обработанных сесквитерпеновыми лактонами, встречающимися в органическом экстракте Ambrosia maritima.
50
[0081] На Фиг. 19A-D изображены результаты IC-экспериментов на клеточных линиях рака мочевого пузыря, обработанных конкретными очищенными сесквитерпеновыми лактонами из органического экстракта Ambrosia maritima. Очищенными сесквитерпеновыми лактонами являются партенин, амброзин, дамсин и неоамброзин. Клеточными линиями рака мочевого пузыря являются UM-UC-17 (Фиг. 19А), UM-UC-9 (Фиг. 19В), UM-UC-15 (Фиг. 19С) и UM-UC-7 (Фиг. 19D).
50
50
50
[0082] На Фиг. 20А изображены результаты IC-экспериментов на клеточных линиях UM-UC-5 рака мочевого пузыря, обработанных сесквитерпеновыми лактонами, встречающимися в органическом экстракте Ambrosia hispida. На Фиг. 20В изображены результаты IC-экспериментов на клеточных линиях UM-UC-9 рака мочевого пузыря, обработанных сесквитерпеновыми лактонами, встречающимися в органическом экстракте Ambrosia hispida. На Фиг. 20С изображены результаты IC-экспериментов на клеточных линиях рака мочевого пузыря, обработанных очищенным амброзином из органического экстракта Ambrosia hispida.
50
[0083] На Фиг. 21А изображены результаты IC-экспериментов на клеточной линии SUM 159 рака молочной железы, а на Фиг. 21 В изображены результаты для клеточной линии MDA-MB-231 рака молочной железы, обработанной органическим экстрактом сесквитерпеновых лактонов, экстрагированных из Ambrosia maritima.
50
[0084] На Фиг. 22 изображены результаты IC-экспериментов на клеточной линии MDA-MB-231 рака молочной железы, обработанной конкретными очищенными сесквитерпеновыми лактонами из органического экстракта Ambrosia maritima. Очищенными сесквитерпеновыми лактонами являются партенин, амброзин, дамсин и неоамброзин.
50
[0085] На Фиг. 23 изображены результаты IC-экспериментов на клеточной линии MDA-MB-468 рака молочной железы, обработанной конкретными очищенными сесквитерпеновыми лактонами из органического экстракта Ambrosia maritima. Очищенными сесквитерпеновыми лактонами являются партенин, амброзин, дамсин и неоамброзин.
50
[0086] На Фиг. 24 изображены результаты IC-экспериментов на клеточной линии ВТ-474 рака молочной железы, обработанной конкретными очищенными сесквитерпеновыми лактонами из органического экстракта Ambrosia maritima. Очищенными сесквитерпеновыми лактонами являются партенин, амброзин, дамсин и неоамброзин.
50
50
[0087] На Фиг. 25А-В изображены результаты IC-экспериментов на клеточных линиях MDA-MB-231 (25А) и ВТ-20 (25В) рака молочной железы, обработанных сесквитерпеновыми лактонами, встречающимися в органическом экстракте Ambrosia hispida. На Фиг. 25C-D изображены результаты IC-экспериментов на клеточных линиях MDA-MB-231 (25С) и ВТ-20 (25D) рака молочной железы, обработанных очищенным амброзином из органического экстракта Ambrosia hispida.
50
[0088] На Фиг. 26А-В изображены эффективность и IC-эксперименты, выполненные на клеточных линиях SK-LU-1 (Фиг. 26А) и А549 (Фиг. 26В) рака легких.
50
[0089] На Фиг. 27 изображены эффективность и IC-эксперименты, выполненные на клеточных линиях ASPC-1 рака поджелудочной железы.
50
50
[0090] На Фиг. 28A-D изображены результаты IC-экспериментов на клеточной линии рака предстательной железы для различных очищенных субфракций (1 = партенин, 3 = амброзин, 4 = дамсин, 5 = неоамброзин) органического экстракта, где IC составляет 4,878 (28А), 2,715 (28В), 1,160 (28С) и 264,5 (28D). Концентрация выражена в мкмоль.
ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ РЕАЛИЗАЦИИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0091] В данном изобретении предлагаются соединения на основе растений и новые способы, относящиеся к их применению в лечении рака. В частности, для лечения различных раковых заболеваний применяется органический экстракт из растений Ambrosia maritima и/или Ambrosia hispida семейства Астровые. Было обнаружено, что одна конкретная группа компонентов в органическом экстракте, сесквитерпеновые лактоны, препятствует различным молекулярным сигнальным путям в прогрессировании рака и уменьшает опухоль (опухоли), тем самым обеспечивая эффективное лечение рака. Кроме того, органический экстракт можно комбинировать с другими противораковыми соединениями или терапевтическими средствами, которые направлены на другие сигнальные пути для более полного лечения.
[0092] Способы согласно данному изобретению включают любой из следующих вариантов реализации в любой комбинации (комбинациях) одного или более из них:
[0093] - Способ лечения рака, включающий введение пациенту, страдающему раком, эффективного количества композиции, содержащей органический экстракт Ambrosia maritima или Ambrosia hispida вместе с фармацевтически приемлемым носителем. В частности, раковыми заболеваниями являются рак мочевого пузыря, рак предстательной железы, трижды негативный рак молочной железы, рак легких и рак поджелудочной железы. Эффективное количество композиции вводят ежедневно в течение по меньшей мере 6 недель. Кроме того, органический экстракт, содержащий по меньшей мере один сесквитерпеновый лактон, не содержит белков, поэтому является менее пирогенным.
[0094] - Способ лечения рака, включающий введение пациенту, страдающему раком, эффективного количества композиции, содержащей сесквитерпеновые лактоны, экстрагированные из Ambrosia maritima или Ambrosia hispida, вместе с фармацевтически приемлемым носителем. В частности, раком является рак мочевого пузыря, рак предстательной железы или трижды негативный рак молочной железы, а эффективное количество композиции вводят ежедневно в течение по меньшей мере 6 недель.
[0095] - Способ уменьшения метастазирования рака, включающий введение пациенту, страдающему раком, эффективного количества композиции, содержащей сесквитерпеновые лактоны, экстрагированные из Ambrosia maritima или Ambrosia hispida, вместе с фармацевтически приемлемым носителем.
[0096] - Способ усиления ингибирования рецепторов семейства р65, STAT3, GPR30, EGFR, пути β-катенина и активности семейства Rho-ГТФаз у пациента, включающий введение пациенту эффективного количества композиции, содержащей сесквитерпеновые лактоны, экстрагированные из Ambrosia maritima или Ambrosia hispida, вместе с фармацевтически приемлемым носителем.
[0097] - Способ получения экстракта, содержащего сесквитерпеновые лактоны, для фармацевтического средства, включающий обработку растения Ambrosia maritima органическим растворителем, в котором по меньшей мере один указанный сесквитерпеновый лактон является растворимым, выпаривание органического растворителя с получением неочищенного экстракта, хроматографирование или пропускание неочищенного экстракта через хроматографическое разделение с применением второго органического растворителя для получения очищенного экстракта сесквитерпенового лактона (лактонов) и сбор фракций отдельного(ых) сесквитерпенового(ых) лактона (лактонов).
[0098] - Способ получения экстракта, содержащего сесквитерпеновые лактоны, для фармацевтического средства, включающий обработку растения Ambrosia hispida органическим растворителем, в котором по меньшей мере один указанный сесквитерпеновый лактон является растворимым, выпаривание органического растворителя с получением неочищенного экстракта, хроматографирование или пропускание неочищенного экстракта через хроматографическое разделение с применением второго органического растворителя для получения очищенного экстракта сесквитерпенового лактона (лактонов) и сбор фракций отдельного(ых) сесквитерпенового(ых) лактона (лактонов).
[0099] Сесквитерпеновые лактоны (СЛ) в способах согласно данному изобретению могут использоваться для оказания направленного воздействия на различные специфичные для рака сигнальные пути. Приведенные ниже примеры демонстрируют воздействие СЛ на пути пролиферации раковых клеток (т.е. NF-κВ и STAT3) и активацию путей апоптотической элиминации клеток (т.е. каспаз 3, 7 и 6), и их взаимодействия с рецепторами, сопряженными с G-белком. Тем не менее, ожидается, что СЛ могут также оказывать воздействие на другие сигнальные пути, и не следует истолковывать примеры как ограничивающие механизмы, с помощью которых СЛ оказывает воздействие на рак.
[00100] После того, как было определено доказательство правильности концепции воздействия СЛ на различные специфичные для рака сигнальные пути, для доказательства эффективности была проведена серия экспериментов in vitro с использованием клеточных линий рака мочевого пузыря, клеточных линий рака молочной железы и клеточных линий рака предстательной железы.
[00101] Известны не все сигнальные пути, принимающие участие в канцерогенезе, росте и прогрессировании рака. Таким образом, следующие примеры предназначены только для иллюстрации и чрезмерно не ограничивают объем прилагаемой формулы изобретения. Кроме того, несмотря на то, что использовалось ограниченное число клеточных линий рака, предполагается, что методы лечения согласно данному изобретению будут пригодными для лечения большинства раковых заболеваний, как по отдельности, так и в комбинации с другими методами лечения.
МЕТОД ЭКСТРАКЦИИ
[00102] Вкратце, в экстракции применяется органический растворитель, такой как метанол, этанол и любые растворители на основе углерода. Цельный органический экстракт сушат и химически фракционируют хлороформом. Конечным этапом является объединение лучших фракций и выпаривание хлороформа. Затем конечный продукт можно применять для лечения.
[00103] Более конкретно, метод экстракции Ambrosia maritima может быть следующим:
[00104] 1) Высушенное цельное растение Ambrosia maritima измельчают в порошок с помощью обычных способов.
[00105] 2) Измельченное в порошок растение приводят в контакт с органическим растворителем или комбинацией органических растворителей и оставляют контактировать в течение заданного промежутка времени с переходом СЛ в высушенном растении в органическую фазу.
[00106] 3) Затем органический растворитель (растворители) отделяют от высушенного растительного материала.
[00107] 4) Органический экстракт сушат с помощью любых известных в данной области техники способов.
[00108] 5) Высушенный экстракт химически фракционируют хлороформом и фракциями с высоким содержанием необходимых объединенных СЛ.
[00109] 6) Хлороформ выпаривают, оставляя высушенные фармацевтически активные компоненты.
[00110] 7) Различные концентрации активных компонентов используют для обработки различных клеточных линий рака.
[00111] Эти же стадии экстракции могут быть выполнены для Ambrosia hispida и других растений семейства Астровые.
[00112] Могут применяться другие методы экстракции, подходящие для органических растворимых компонентов. Например, такие методы включают водные двухфазные системы, экстрагирование кислотой/основанием и т.п. Для подготовки растения к экстракции данное растение должно быть высушено на воздухе без воздействия тепла, а затем может быть дополнительно обработано посредством циклов замораживания-оттаивания и/или механически лизировано посредством замораживания и оттаивания перед экстракцией и т.п.
[00113] Перед применением активный ингредиент или ингредиенты органического экстракта растительного материала можно комбинировать с другими активными ингредиентами, но предпочтительно применять по отдельности. Активный ингредиент или ингредиенты органического экстракта растительного материала можно применять в исходном виде или можно смешивать с известными фармацевтически приемлемыми носителями, разбавителями и/или вспомогательными веществами.
[00114] Например, могут быть получены желатиновые капсулы, содержащие высушенный органический экстракт, содержащий подходящую дозу активного ингредиента (ингредиентов). Необязательно, могут предоставляться пакеты, содержащие высушенный экстракт, для смешивания, например, с горячими жидкостями, для перорального приема. Экстракт также может быть объединен с твердыми носителями для прессования в таблетированные лекарственные формы, особенно с наполнителями с отсроченным высвобождением для приготовления таблетированной или любой лекарственной формы, которая будет вводиться перорально один раз в день.
[00115] Также может быть возможным приготовление форм активных ингредиентов, не предназначенных для перорального введения, таких как лекарственные формы для ингаляционного, трансбуккального, сублингвального, назального, суппозиторного или парентерального введения.
[00116] Вышеуказанный экстракт является значительно более стабильным, чем природный продукт, даже в жидкой форме, и особенно при объединении с буфером и хелатирующим агентом. Он также является значительно более концентрированным, чем природная форма, тем самым обеспечивая эффективность без необходимости потребления огромных количеств растительного материала. Кроме того, дозировку намного легче регулировать с помощью концентрированного, частично очищенного или очищенного материала.
[00117] Также использовали ТСХ и ВЭЖХ для дополнительной очистки активного ингредиента (ингредиентов), подлежащего дальнейшему изучению, и для определения его эффективности, хотя эта работа продолжается. Удаление некоторых компонентов из органического экстракта посредством дополнительной стадии очистки может привести к меньшему количеству побочных эффектов. Ambrosia maritima и Ambrosia hispida являются амброзией, которая известна своими аллергенными эффектами. Таким образом, очистка органического экстракта приведет к снижению иммунного ответа у людей. В некоторых вариантах реализации изобретения очищенный материал из органического экстракта Ambrosia maritima и Ambrosia hispida может служить для улучшения способности прерывать сигнальные пути в раковых клетках и повышать стабильность экстрагированного материала.
ПУТЬ NF-КАППА В
[00118] Общие молекулярные механизмы роста рака включают:
[00119] - Самодостаточность в усилении и ослаблении механизмов ингибирования роста
[00120] - Снижение апоптотического порога
[00121] - Улучшенные ангиогенные свойства
[00122] - Способность проникать в локальную ткань и метастазировать в разные места
[00123] Известно, что на каждый из этих клеточных процессов влияет путь NF-κB. NF-κB представляет собой белковый комплекс, широко используемый эукариотическими клетками в качестве регулятора генов, которые регулируют пролиферацию клеток и жизнестойкость клеток. В клетках млекопитающих семейство NF-κВ состоит из пяти представителей: Re1A (р65), Re1B, c-Re1, р50/р105 (NF-κB1) и p100 (NF-κB2). В большинстве основных состояний комплексы NF-κВ находятся в неактивной форме преимущественно за счет взаимодействия с ингибитором белков семейства кВ (IκВ). Тем не менее, рак представляет собой заболевание, имеющее разнообразные этиологии, которые скрывают различные пораженные клетки-мишени, поэтому проявляет очень сложный характер. В раковых клетках пролиферация и гомеостаз сильно изменены. Таким образом, в комплексах NF-κВ быстро начинает наблюдаться неправильная регуляция. В связи с этим, во многих различных типах опухолей человека наблюдается NF-κВ с неправильной регуляцией: то есть NF-κВ является конститутивно активным. Одной из важных областей исследований рака является направленное воздействие на конститутивно активный NF-κВ в раковых клетках.
[00124] Органические экстракты, содержащие сесквитерпеновые лактоны из Ambrosia maritima, испытывали с целью определения воздействия, в случае его наличия, на путь NF-κВ. Исходя из вычислительных методов докинг-анализа, существовал потенциальный сайт связывания. Вестерн-блоттингом был подтвержден сайт связывания, где наблюдалось ингибирование р65 (Re1A) в течение 30 минут после обработки клеток.
[00125] На Фиг. 2A-D изображено предсказание связывания одного сесквитерпенового лактона, амброзина, с NF-κВ/ДНК-связывающим доменом. Стрелка на Фиг. 2А показывает, что амброзин (кластер сфер) может связываться с NF-κВ с нарушением его связывания с ДНК (спиральная структура в центре диаграммы) на субъединице Р65. Ожидается, что из-за двух сайтов реакции Михаэля этот сесквитерпеновый лактон будет связываться с Cys 122 и Cys 207 на структуре NF-κВ, как изображено на Фиг. 2 В и 2С. Связываясь с одним или обоими посредством селективного связывания, амброзин блокирует эти цистеины, и NF-кВ перестает быть доступным в качестве фактора транскрипции для связывания ДНК, тем самым замедляя прогрессирование опухоли.
[00126] Способность сесквитерпенового лактона блокировать связывание NF-кВ/ДНК испытывали с применением четырех клеточных линий рака мочевого пузыря: UM-UC-6 (Н.В. Grossman, Онкологический центр им. М.Д. Андерсона Техасского университета), UM-UC-9 (Н.В. Grossman, Онкологический центр им. М.Д. Андерсона Техасского университета), UM-UC-10 (Н.В. Grossman, Онкологический центр им. М.Д Андерсона Техасского университета), SW-780 (АТСС).
[00127] На Фиг. 3 изображены результаты гель-электрофореза для 50 мкг/мл сесквитерпеновых лактонов, экстрагированных из Ambrosia maritima, в клеточных линиях UM-UC-6, UM-UC-9, UM-UC-10 и SW-780. Сесквитерпеновые лактоны ингибировали EGFR, HER-2, HER-3 во всех четырех клеточных линиях рака мочевого пузыря. Особое значение имеет ингибирование HER-2. HER-2 является одним из транскрипционных генов-мишеней р65 NF-κВ. Его ингибирование посредством добавления органического экстракта, содержащего сесквитерпеновые лактоны, подтверждает способность нарушать связывание NF-κВ/ДНК и обосновывает предлагаемый механизм на Фиг. 2. Таким образом, СЛ ингибируют рецепторы семейства EGFR.
STAT3
[00128] Нормальные клеточные ответы на цитокины, факторы роста и другие полипептидные лиганды опосредуются семейством латентных цитоплазматических факторов транскрипции, называемых переносчиками сигнала и активаторами транскрипции (STAT). Аберрантный STAT3 приводит к индукции клеточных и биологических процессов, включая пролиферацию, дифференцировку, выживание, развитие, воспаление, инвазию и метастазы при раке.
[00129] Было показано, что многие злокачественные опухоли человека содержат конститутивно активный STAT3, который способствует многим клеточным и биологическим процессам в раковых клетках.
[00130] Посредством направленного воздействия и ингибирования ДНК-связывающего домена STAT3 можно ингибировать транскрипционную активность STAT3. Физическое взаимодействие 8ТАТ3/ДНК-связывающего домена с консенсусной ДНК-связывающей последовательностью в промоторной области чувствительных генов является очень важным шагом для функционирования STAT3. Нарушение ДНК-белковых взаимодействий с помощью сесквитерпеновых лактонов обладает потенциалом ингибирования 8ТАТ3-зависимой транскрипции гена, блокируя его опухолестимулирующую активность.
[00131] На Фиг. 4А-В изображен предлагаемый механизм, посредством которого экстрагированные сесквитерпеновые лактоны могут связывать Cys 328 и Cys 251 на ДНК-связывающем домене STAT3. Эта связь блокирует связывание ДНК и нарушает транскрипцию, тем самым замедляя рост рака.
[00132] С помощью протеинкиназных микрочипов было установлено, что все из STAT3, STAT5 и STAT6 подвержены воздействию обработки клеток СЛ, экстрагированными из Ambrosia maritima. Проведение большего количества испытаний покажет, что СЛ могут нарушать связывание 8ТАТ3/ДНК.
СТАБИЛЬНОСТЬ КАСПАЗЫ
[00133] Апоптоз или контролируемая гибель клеток происходит в ответ на многие различные стимулы окружающей среды или из-за болезненных состояний. Во время апоптоза морфологические и биохимические изменения вызывают нарушение клеточных процессов и разрушение клеточных компартментов. Дефектный апоптоз является основным причинным фактором развития и прогрессирования рака. Кроме того, способность опухолевых клеток избегать участия в апоптозе может играть значительную роль в их устойчивости к традиционным схемам лечения.
ц
асп
[00134] Одной из наиболее консервативных биохимических особенностей апоптотической гибели клеток является активация каспаз. Каспазы (истеинил-артат-специфические протеазы) представляют собой семейство высокоспецифических протеаз, которые играют ключевую роль в апоптотической гибели клеток. Каспазы группируются как инициаторы или эффекторы апоптоза, в зависимости от того, где они вступают в процесс гибели клеток. Инициирующие каспазы присутствуют в виде мономеров (т.е. неактивных проформ), которые должны димеризоваться для полной активации, тогда как эффекторные каспазы присутствуют в виде димерных зимогенов, которые должны процессироваться для полной активации. После активации эффекторные каспазы расщепляют другие субстраты зимогена белка в клетке с активацией каскада активированной каспазы и апоптотического процесса.
[00135] Каспаза-3 и каспаза-7 являются основными апоптотическими исполнительными протеазами и непосредственно расщепляют большинство белков, которые подвергаются протеолизу во время апоптоза. Гомодимеры эффекторной каспазы-3 и каспазы-7 активируются 2-мя "разрезаниями" протеазами с образованием активной тетрамерной формы с цепями длиной 20 кДа и 10 кДа. Стабилизация этого тетрамера способствует апоптозу.
[00136] СЛ могут стабилизировать тетрамерную структуру посредством образования ковалентной связи по молекулярной оси симметрии второго порядка. На Фиг. 5А изображен амброзин, связывающий два гомодимера каспазы-7 в Cys 290 и Cys 290'. Крупный план этой связи изображен на Фиг. 5В. Взаимодействие амброзина с тетрамером в этих молекулярных моделях было подтверждено с помощью вычислительных методов докинга.
[00137] Без СЛ-стабилизации активированных тетрамеров каспазы-3 и каспазы-7 данные тетрамеры разваливались и подвергались протеолизу в течение 15-30 минут, тем самым нарушая процедуру апоптоза. В случае наличия СЛ-связи тетрамеры в течение неопределенного времени сохраняют стабильность в активной форме, а апоптоз протекает, как обычно.
СОПРЯЖЕННЫЙ С G-БЕЛКОМ РЕЦЕПТОР 30 (GPR30)
[00138] Эффекты всех гормонов, включая стероиды, такие как эстроген, опосредуются специфическими рецепторами, которые распознают и связывают гормон, передающий эту информацию в нижележащие эффекторы. В опухолях трижды негативного рака молочной железы (ТНРМЖ) рецептор эстрогена а (РЭ-α) и рецепторы прогестерона не экспрессируются, а ген Her/2neu экспрессируется недостаточно. Это затрудняет лечение, поскольку большинство химиотерапий оказывают направленное воздействие на один из трех рецепторов, поэтому этот класс рака молочной железы является не чувствительным к эндокринной терапии. Смертность пациентов, страдающих ТНРМЖ, вдвое превышает показатель смертности от РЭ-α-положительных опухолей. Следовательно, существует острая необходимость в разработке инновационной фармакологической таргетной терапии для пациентов, страдающих ТНРМЖ.
[00139] В последние годы в большом количестве отчетов описывались мембраноассоциированные рецепторы эстрогенов, сходные с классическими ядерными рецепторами эстрогенов или отличающиеся от них. Гипотетически эти рецепторы опосредуют аспекты клеточной функции эстрогенов, включая традиционную геномную (транскрипционную) сигнализацию, а также новую негеномную (быструю) сигнализацию.
[00140] Эстрадиол, или точнее 17β-эстрадиол, представляет собой половой гормон человека и стероидный, а также основной женский половой гормон. Большинство негеномных событий быстрой сигнализации 17β-эстрадиола обусловлены сопряженным с G-белком рецептором 30 (GPR30). GPR30 экспрессируется на высоком уровне и широко распространен в ТНРМЖ, и связан с высоким показателем рецидивов и смертности при ТНРМЖ. Связывание GPR30 с 17β-эстрадиолом увеличивает пролиферацию клеток ТНРМЖ. Для лечения ТНРМЖ необходимы сильные ингибиторы, связывающие, оказывающие направленное воздействие на GPR30 и ингибирующие его с блокированием этого рецептора от связывания с его лигандом.
[00141] Молекулярный докинг, общий вычислительный инструмент для расчета аффинности связывания, а также предсказания режима и сайтов связывания, проводили относительно способности СЛ связываться с рецептором GPR30 и препятствовать поступлению 17β-эстрадиола. Молекулярный докинг, предсказывающий связывание сесквитерпеновых лактонов с GPR30 в Cys-205 и Cys-130. Подобно связыванию двух цистеиновых остатков на STAT3, ожидается, что СЛ будут связывать оба этих сайта с GPR30 и предотвратят докинг 17β-эстрадиола. На практике это уменьшит пролиферацию клеток ТНРМЖ.
[00142] Кроме того, семейство Rho ГТФаз представляет собой семейство небольших (~21 кДа) сигнальных G-белков. Семейство Rho ГТФаз человека включает CDC42, Rho А и Rac1. Эти белки выполняют функцию регуляции миграции клеток, эндоцитоза и хода клеточного цикла в нормальных клетках. Дисрегуляция этих крайне важных регуляторных белков посредством взаимодействия с онкобелковым продуктом Dbl приводит к трансформации онкогенных клеток. Расчеты молекулярного докинга дают веские основания предполагать, что сесквитерпеновые лактоны растительного происхождения могут специфически тесно связываться с ГТФ-связывающим сайтом семейства Rho ГТФаз, тем самым вытесняя ГТФ и инактивируя фермент (Фиг. 6А и 6В). Это эффективно блокирует пролиферацию и миграцию клеток рака мочевого пузыря, предстательной железы и молочной железы после обработки сесквитерпеновыми лактонами.
РЕЗУЛЬТАТЫ IN VITRO
[00143] Эксперименты in vitro проводились с использованием множественных клеточных линий рака мочевого пузыря и предстательной железы, которые показаны в Таблице 1.
[00144] СЛ в различных концентрациях добавляли к клеточным линиям и сводили результаты в таблицу через 48 часов. Для концентраций СЛ ниже 0,08% применяли ДМСО для растворения соединений.
[00145] Сначала испытывали жизнеспособность клеток посредством анализа пролиферации клеток с применением MTS и концентраций СЛ, экстрагированных из Ambrosia maritima, составляющих 50, 100 и 200 мкг/мл, результаты чего изображены на Фиг. 7. Все клеточные линии продемонстрировали значительное снижение жизнеспособности клеток в клетках, обработанных СЛ, по сравнению с контрольными клетками, обработанными ДМСО. Концентрация ДМСО, применяемая для растворения СЛ и в контроле, не превышала 0,08%.
[00146] В отношении множественных клеточных линий рака мочевого пузыря испытывали более низкие концентрации СЛ (10, 25 и 50 мкг/мл), которые испытывали на эффективность. На Фиг. 8 изображены эти результаты. При пониженных концентрациях сесквитерпеновых лактонов клетки реагировали проявлением более низкой жизнеспособности при MTS-анализе даже при самой низкой концентрации, составляющей 10 мкг/мл. На Фиг. 9 изображен фосфокиназный микрочип, который иллюстрирует воздействие 25 мкг/мл СЛ на рак-ассоциированные сигнальные белки в клеточной линии UM-UC-6 рака мочевого пузыря и клеточной линии MCF7 рака молочной железы.
Фосфокиназный микрочип показывает, что клетка, обработанная СЛ в концентрации, составляющей 25 мкг/мл, в течение трехчасовой обработки вызывала ингибирование важных сигнальных и энергетических белков, которые важны для выживаемости раковых клеток, таких как AMPK, TOR, beta-Cat и т.п. Результаты, полученные с помощью фосфокиназного микрочипа, также важны тем, что они подтверждают предлагаемые предсказания связывания на Фиг. 2 и далее.
РЕЗУЛЬТАТЫ IN VIVO
[00147] Тридцати мышам NOD-SCID подкожно инъецировали 1 млн. клеток UM-UC-6. Через неделю после инъекции и после образования опухоли начинали ежедневное лечение с применением 4 мкг/г СЛ. Животных умерщвляли через 6 недель после начала ежедневной обработки. Гистопатология ксенотрансплантированных обработанных и контрольных животных, демонстрирующая количество рецептора эпидермального фактора роста (EGFR) и Ki-67, показана на Фиг. 10. EGFR играет важную роль в прогрессировании рака, a Ki-67 свидетельствует о митотической активности. Здесь, EGFR и Ki-67 у обработанных животных были меньше. Это свидетельствует о том, что прогрессирование рака ингибируется ежедневной обработкой СЛ, а также наблюдается меньшая митотическая активность и меньшая пролиферация рака.
[00148] Проводили дополнительные эксперименты in vivo для трех клеточных линий рака молочной железы, которые ортотопически инъецировали мышам. Ортотопическая инъекция клеток рака молочной железы является эффективной моделью для изучения всех аспектов роста рака. Один миллион клеток из каждой линии MDA-MB-231, SUM-159 и MDA-MB-468 инъецировали в жировое тело молочной железы мышей с образованием опухолей. После того, как опухоли образовались, их обрабатывали СЛ-содержащим органическим экстрактом Ambrosia maritima в дозе, составляющей 200 мкМ общего количества СЛ/животное в день.
[00149] На Фиг. 11А-В изображена гистопатология области опухоли у мышей, обработанных СЛ, экстрагированными из Ambrosia maritima, в сравнении с контрольными животными для клеточных линий SUM-159 и MDA-MB-231. Эти результаты показали, что размер опухоли у животных, получавших СЛ, меньше чем у контрольных.
[00150] На Фиг. ПС изображены результаты уровня экспрессии HER2 и р65 у ксенотрансплантированных животных с клеточной линией MDA-MB-231 трижды негативного РМЖ и соответствующая столбчатая диаграмма, которая показывает ингибирование у контрольных животных и животных, обработанных органическим экстрактом СЛ, очищенным экстрактом только амброзина и очищенным экстрактом только дамсина. Наибольшее снижение экспрессии HER2 и р65 наблюдалось при применении органического экстракта СЛ, но значительное улучшение также наблюдалось при лечении только амброзином и дамсином. Таким образом, эти компоненты могут быть индивидуально очищены от органической фракции СЛ, а затем объединены в качестве потенциального лечения.
LUC
LUC
[00151] Также было проведено сравнение размера опухоли для трех различных клеточных линий, меченных люциферазой, и результаты показаны на Фиг. 12. В этой серии экспериментов, линии РС-3 и UM-UC-9 LUC инъецировали подкожно, тогда как линии UM-UC-10 инъецировали в мочевой пузырь мышей NOD/SCID. До этого всех животных ежедневно обрабатывали в течение 6 недель, тем не менее доза СЛ составляла 100 мкг/животное. Животных умерщвляли через 6 недель обработки и оценивали живой вес опухолей для изучения воздействия СЛ на рост опухоли. Как видно на Фиг. 12, наблюдалось значительное уменьшение размера опухоли для всех трех клеточных линий по сравнению с необработанными мышами. Уровень достоверности различий составлял по меньшей мере 95% для всех трех клеточных линий. Эти результаты показывают, что СЛ являются потенциальными фармацевтическими соединениями для лечения рака.
LUC
LUC
[00152] Фиг. 13 иллюстрирует гистопатологию линии UM-UC-5, ортотопически инъецированной в животных, обработанных органическим экстрактом СЛ в дозе, составляющей 200 мкг/день. У контрольного животного EGFR и Ki-67 (к антителу человека) окрашивали опухоль, с другой стороны, у обработанного животного опухоль уменьшалась. Те же результаты были обнаружены у животного, ортотопически инъецированного линией UM-UC-10, как видно на Фиг. 14.
[00153] Аналогичные результаты были получены в клеточных линиях рака предстательной железы и трижды негативного рака молочной железы.
ОБРАЗОВАНИЕ СФЕР
[00154] В дополнение к экспериментам in vitro и in vivo также испытывали способность предотвращать образование сфер посредством применения СЛ.
[00155] Сферообразующие тесты широко использовались для ретроспективного выявления стволовых клеток, исходя из их подтвержденной способности оценивать самообновление и дифференцировку на уровне одиночных клеток in vitro. Изучалось воздействие СЛ на раковые клетки-предшественники (стволовые клетки), сферообразующие тесты проводили на клетках после обработки СЛ.
[00156] Фиг. 15 иллюстрирует изображения клеточных сфер для клеточных линий UM-UC-9 и 5637 рака мочевого пузыря, которые были обработаны с применением 25 мкг/мл СЛ и не были обработаны. При этой концентрации наблюдалось снижение образования сфер клеточной линии UM-UC-9. Таким образом, как и ожидалось, UM-UC-9 демонстрировала меньшее сферообразование, чем клеточные линии 5637.
[00157] Клетки UM-UC-9 также высевали в планшеты с низкой адгезией поверхности с применением среды Mammocult (Stem Cell Technologies, Inc.) и инкубировали в течение 7 дней с образованием первичных сфер. Затем образованные первичные сферы собирали и разрушали, затем с плотностью, составляющей около 200 клеток/лунку, высевали в 96-луночный планшет с низкой адгезией поверхности. На следующий день клетки обрабатывали различными концентрациями СЛ и через 7 дней анализировали образование вторичных (2-ых) сфер. Вторичные сферы характерны для популяции опухолей-предшественников. Как проиллюстрировано на Фиг. 16, СЛ в концентрациях, составляющих 25, 50 и 100 мкг/мл, значительно уменьшали образование вторичных сфер по сравнению с контролем, обработанным ДМСО. В случае каждой концентрации СЛ наблюдалось полное ингибирование вторичных сфер.
[00158] Также испытывали образование третичных сфер, и результаты показаны на Фиг. 17. Снова образование сфер ингибировалось. Путь β-катенина также является потенциальной мишенью для ингибирования опухолевых сфер с помощью СЛ.
[00159] Способность уменьшать или ингибировать образование сфер является еще одним свидетельством фармакологических преимуществ СЛ при лечении рака.
IN VITRO ИССЛЕДОВАНИЯ ЗАВИСИМОСТИ ДОЗА-ЭФФЕКТ
50
[00160] MTS применяли для оценки IC (концентрации лекарственного средства, вызывающей 50% ингибирование необходимой активности) для СЛ в различных клеточных линиях рака мочевого пузыря, предстательной железы, молочной железы, легких и поджелудочной железы.
50
50
[00161] Клеточная линия рака мочевого пузыря: Клеточную линию UM-UC-5 рака мочевого пузыря испытывали с применением экстрактов Ambrosia maritima. Клетки высевали в 96-луночный планшет с плотностью, составляющей 1000 клеток/лунку и 2000 клеток/лунку. Как проиллюстрировано на Фиг. 18, IC для 1000 клеток/лунку составляла 2,273 мкг/мл, а IC для 2000 клеток/лунку составляла 5,709 мкг/мл.
50
50
[00162] Затем проводили MTS-анализ для оценки различных IC множественных клеточных линий. Очистку проводили для разделения органического экстракта СЛ на различные компоненты. Микромолярные дозы, вместо микрограмм, определяемые молекулярной массой различных СЛ, партенина, амброзина, дамсина и неоамброзина, испытывали in vitro. В идеале, при лечении лекарственными средствами, предпочтительными являются микромолярные массы, находящиеся в диапазоне от 10 до 15. Каждую клеточную линию высевали с плотностью, составляющей 1000 клеток/лунку, и результаты IC показаны на Фиг. 19A-D и в Таблице 2.
50
50
[00163] Как и ожидалось, исходя из других экспериментов, амброзин и дамсин имели лучшие результаты IC. Даже в UM-UC-9, которая является клеточной линией мышечно-инвазивного рака мочевого пузыря, IC была значительно ниже целевого уровня, составляющего 10 мкМ, для лечения лекарственными средствами.
[00164] Хотя неоамброзин продемонстрировал наименьшую эффективность среди этих четырех СЛ, он все же может найти применение в способах лечения, использующих цельный экстракт или в комбинации с другими СЛ.
50
[00165] Из обзора результатов СЛ, которые испытывали на их IC, можно сделать вывод, что различные клеточные линии рака мочевого пузыря различным образом отвечали на различные СЛ. Таким образом, различные клеточные линии, проверенные на рак мочевого пузыря, имеют разные степени чувствительности.
50
[00166] Аналогичные испытания проводили с органическим экстрактом из Ambrosia hispida. На Фиг. 20А-С изображены результаты испытаний IC клеточных линий UM-UC-5 и UM-UC-9 рака мочевого пузыря с применением цельного экстракта и с применением только амброзина, очищенного от органического экстракта.
[00167] Клеточные линии рака молочной железы: Опухоли с недостаточной экспрессией рецептора эстрогена, рецептора прогестерона и меньшей экспрессией HER2 идентифицируются как трижды негативный рак молочной железы (ТНРМЖ). Опухоли ТНРМЖ дополнительно подразделяются на молекулярные подтипы, включая опухоли с низкой экспрессией клаудина, которые в дополнение к особенностям эпителиально-мезенхимальных переходов имеют сходные свойства со стволовыми клетками. Подтип, богатый интерфероном, представляет опухоли с лучшим прогнозом дальнейшего течения болезни, чем обычный базальноподобный подтип.
50
50
[00168] Несколько клеточных линий ТНРМЖ испытывали in vitro и обрабатывали серийными концентрациями СЛ, экстрагированных из Ambrosia maritima, с определением IC. Результаты IC-экспериментов для клеточных линий SUM-159 (базальной, с низкой экспрессией клаудина) и MDA-MB-231 (базальной, с низкой экспрессией клаудина) показаны на Фиг. 21А-В. СЛ продемонстрировали эффективность в ингибировании трижды негативного рака молочной железы при различных концентрациях СЛ. Результаты обобщены в Таблице 3.
50
[00169] IC очищенных СЛ, партенина, амброзина, дамсина и неоамброзина, также испытывали в отношении клеточной линии MDA-MB-231 (Фиг. 22), клеточной линии MDA-MB-468 (базальный подтип, нормальный) (Фиг. 23) и клеточной линии ВТ-474 (Фиг. 24), клеточной линии инвазивной протоковой карциномы (люминальный подтип В). Результаты обобщены в Таблице 4.
[00170] Как и в результатах испытаний с клетками рака мочевого пузыря, данные клеточные линии были чувствительными к различным СЛ. Наибольшая чувствительность наблюдалась при применении неоамброзина, однако партенин также был эффективным в отношении ВТ-474.
50
50
[00171] Аналогичные испытания проводили с органическим экстрактом из Ambrosia hispida. На Фиг. 25А-В изображены результаты IC-экспериментов на клеточных линиях MDA-MB-231 (25А) и ВТ-20 (25 В) рака молочной железы, обработанных сесквитерпеновыми лактонами, встречающимися в органическом экстракте Ambrosia hispida. На Фиг. 25C-D изображены результаты IC-экспериментов на клеточных линиях MDA-MB-231 и ВТ-20 рака молочной железы, обработанных очищенным амброзином из органического экстракта Ambrosia hispida.
50
[00172] Как и ожидалось, различные клеточные линии имели различную чувствительность к экстрактам СЛ. Неожиданно, обе клеточные линии рака молочной железы имели более высокую IC благодаря очищенному амброзину. Это может быть связано с различной молекулярной активностью в разных клеточных линиях.
50
50
[00173] Клеточные линии рака легких: Испытания эффективности и IC также проводили на клеточных линиях рака легких. SK-LU-1 представляет собой клеточную линию аденокарциномы легкого, а А549 представляет собой клеточную линию карциномы легкого. Эти клеточные линии обрабатывали различными сесквитерпеновыми лактонами, а среднее значение эффективности трех обработок показано на Фиг. 26А-В. IC рассчитывается в микромолярном выражении.
50
[00174] Клеточная линия рака поджелудочной железы: Одну клеточную линию AsPC-1 рака поджелудочной железы (асцитный метастаз) обрабатывали различными СЛ в микромолярной концентрации. Результаты IC изображены на Фиг. 27.
50
50
[00175] На Фиг. 28A-D изображены результаты IC-экспериментов на клеточной линии рака предстательной железы для различных очищенных субфракций (1 = партенин, 3 = амброзин, 4 = дамсин, 5 = неоамброзин) органического экстракта, где IC составляет 4,878 (Фиг. 28А), 2,715 (Фиг. 28В), 1,160 (Фиг. 28С) и 264,5 (Фиг. 28D). Концентрация выражена в мкмоль. Как и ожидалось, некоторые из субфракций оказывали воздействие на клеточную линию в гораздо большей степени, чем другие.
ЭКСПЕРИМЕНТ ПО СЕКВЕНИРОВАНИЮ С ПРИМЕНЕНИЕМ БРОМУРИДИНА
[00176] Равновесный уровень конкретной РНК в клетке представляет собой баланс между скоростями ее продуцирования и деградацией. Знание относительного вклада синтеза и деградации РНК в равновесный уровень конкретных транскриптов имеет решающее значение для лучшего понимания механизмов регуляции этих транскриптов. Таким образом, когда стимулы окружающей среды или стресс меняют клеточный гомеостаз, равновесные уровни определенной РНК меняются. Затем это изменение может быть использовано для определения того, является ли последующая экспрессия генов результатом изменения синтеза, устойчивости РНК или того и другого.
[00177] Таким образом, РНК раковых клеток можно секвенировать и сравнивать с нормальными клетками, чтобы увидеть, где наблюдается более или менее (т.е. измененная) РНК. Это может помочь привести к генам или белкам, которые могут вызвать рак.
[00178] Общим методом мониторинга изменений РНК является мечение новой РНК с применением бромуридина, затем выделение РНК, чтобы увидеть, где образовалась новая РНК. Секвенирование с применением бромуридина хорошо известно в данной области техники.
[00179] Этот метод использовали для мониторинга РНК в линиях раковых клеток UM-UC-9 (мочевого пузыря) и ВТ-20 (молочной железы) для определения уровня формирующейся транскрипции в геноме после обработки СЛ. Обе клеточные линии обрабатывали цельной органической фракцией разом или очищенным амброзином из органической фракции в разных дозах в течение 3,5 часов. Затем РНК метили с применением бромуридина в течение получаса и секвенировали для определения уровня формирующейся транскрипции в геноме.
[00180] Затем анализировали целевые признаки, которые затрагивались в их транскрипции при обработке. Некоторые из этих признаков напрямую связаны с прогрессированием рака и пролиферацией, когда обработка органической фракцией или очищенным амброзином приводила к дерегуляции генов посредством их транскрибирования на более низком уровне, чем контроль.
[00181] После обработки органической фракцией или очищенным амброзином в разных дозах гены, которые оказывали воздействие на путь апоптоза, путь активных форм кислорода, в том числе жизненно важные для прогрессирования рака, активировались. Таким образом, СЛ и амброзин способны уменьшать, если не останавливать, некоторые из этих путей и замедлять или уменьшать прогрессирование рака.
[00182] Данное изобретение иллюстрируется примерами и описанием с использованием экстрактов из растений martima и hispida. Тем не менее, это лишь пример, и данное изобретение может широко применяться к любому растению амброзия. Кроме того, ожидается, что любые СЛ, встречающиеся в этих растениях, будут демонстрировать некоторый уровень цитотоксичности при лечении рака. Вышеприведенные примеры предназначены только для иллюстрации и чрезмерно не ограничивают объем прилагаемой формулы изобретения.
[00183] Следующие ссылки включены в настоящее описание в полном объеме посредством ссылки.
[00184] Tackholm, Vivi. (1974).  flora of Egypt. 2e издание, Каирский университет, Египет.
[00185] Sherif, A.F. and M.F. El-Sawy, (1977). Field trials of the Molluscicidal action of Ambrosia maritima (Damesisa). Bull. High Inst. Puplic Health Alex. 7:1-4.
[00186] El Sawy MF, El Hamd ZMS, Loutfy NF, El Masry S and Abdel Gualil MZ (1986): J of the Egypt. Society of Parasitology, 16:1, cc. 57-64.
[00187] Abdallah, O.M.; Ali, A.A. and Itokawa, H. (1991). "Cytotoxic activity of Sesquiterpene lactones isolated from Ambrosia maritima". Pharmazie, 46(6):472.
[00188] Badawy, M.; Abdelgaleil, S.A.M.; Suganuma, T. and Fuji, M. (2014). "Antibacterial and biochemical activity of Pesudoguaianolide Sesquiterpene isolated from Ambrosia maritima against plant pathogenic bacteria". Plant protect. Sci. 50 (2):64-69.
[00189] Alard, F.; Stievenart, C; Vanparys, L. and Geerts, S. (1991). Drug and Chemical Toxicol. l4(4):353-373.
[00190] Basseres, D.S. and Baldwin, A.S. (2006). Nuclear factor-κВ Kinase pathways in oncogenic initiation and progression. Oncogene. 25: 6817-6830.
[00191] Yue, P. and Turkson, J. (2009). Targeting STAT3 in cancer: how successful are we? Expert Opin Investig Drugs. 18(1):45-56.
[00192] Mackenzie, S.H.; Clay Clark, A. (2012). Death by caspase dimerization. Adv Exp Med Biol.: 747: doi: 10.1007/978-1-4614-3229-6_4.
[00193] Girgert, R.; Emons, G. and Grundker, C. (2014). Inhibition of GPR30 by estriol prevents growth stimulation of triple-negative breast cancer cells by 17β-estradiol. BMC cancer. 14:935.
[00194] William, D; Foulk, M.B.; Smith, M.D.; Ian E. S. and Jorge S. (2010). N Engl J Med 363; 1938.