СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ДНК
METHOD OF DNA SEPARATION

Изобретение относится к области нано-биотехнологии и может быть использован для выделения дезоксирибонуклеиновой кислоты (далее по тексту - ДНК) из различных биологических объектов.
Известен способ выделения ДНК с применением фенол-хлороформной смеси [1]. Недостатком способа [1] является высокая токсичность применяемых веществ, трудоемкость процедуры выделения, времязатратность (2-3 дня).
Известен способ выделения ДНК с использованием хелатирующего реагента - ионообменной смолы Челекс-100 (Chelex-100) [2]. Недостатком является низкое качество выделенного по способу [2] препарата ДНК из-за наличия посторонних примесей (продуктов лизиса клеток), невозможность выделения ДНК из костных и мышечных тканей, загрязнение препарата ДНК продуктами лизиса клеток (белки, липиды).
Наиболее близким по существу заявляемого способа, прототипом, является способ выделения ДНК с применением геномагнитных нанозахватчиков (GMNC), основанный на связывании молекул ДНК с ДНК-зондом сорбента [3].
Недостатком прототипа является ограниченность области применения способа [3] при необходимости выделения ДНК из широкого спектра различных биологических объектов (крови, слюны, волос), как это бывает, например, при проведении судебно-медицинской экспертизы. Низкое количество выделенной ДНК из костной и мышечной тканей, ногтевых пластин также ограничивает применение прототипа.
Целью предлагаемого изобретения является расширение перечня используемых для выделения ДНК биологических объектов, повышение производительности работы по выделению ДНК, повышение качества и количества выделенного образца ДНК, упрощение, сокращение продолжительности процедуры выделения, удешевление процесса.
3
4
Цели достигают тем, что получают наночастицы оксида железа FeO. Наночастицы модифицируют путем присоединения к ним молекул хитозана. Готовят суспензию из наночастиц, проводят измельчение исследуемого биологического объекта, заливают его лизирующим буфером, инкубируют. Получают клеточный лизат. К лизату добавляют наночастицы, инкубируют, разделяют на фракции в виде осадка и надосадка, удаляют надосадок, к осадку добавляют элюирующий буферный раствор, перемешивают. Получают суспензию. Суспензию разделяют на фракции в виде осадка и надосадка, отбирают надосадок. Надосадок содержит выделенный препарат ДНК.
3
4
3
3
w
3
4
3
4
3
4
2
5
2
Заявляемый способ осуществляют, например, следующим образом. Отбирают пробу исследуемого биологического объекта, например костную ткань. Пробу измельчают, например костную ткань, - до порошкообразного состояния. Измельченную пробу помещают в чистую пробирку для ДНК-анализа, например - пробирку типа Эппендорф. Известным методом [4] получают наночастицы оксида железа (FeO) и с использованием этих наночастиц готовят сорбент для выделения ДНК. Для этого в чистой посуде готовят ацетатный буферный раствор 0,015 М, например состава (0,5Н СНСООН, 0,5Н CHCOONa, рН 3,6-5,6). В подготовленном буферном растворе растворяют хитозан, например, с молекулярной массой (M=5.0×10) и степенью деацитилирования 94.50%, добиваясь конечной концентрации хитозана 0,5 мг/мл. Затем в полученный буферный раствор хитозана добавляют ранее полученные наночастицы (FeO), добиваясь конечной концентрации наночастиц (FeO) 0,5 мг/мл, и получают взвесь модифицированных хитозаном наночастиц в ацетатном буферном растворе. Взвесь наночастиц в пробирке подвергают воздействию ультразвуковых колебаний и разбивают агрегировавшие наночастицы. Взвесь наночастиц подвергают воздействию ультразвуковых колебаний трижды по 3 мин. В перерывах между периодами воздействия ультразвуком взвесь наночастиц отстаивают в течение 2 мин. Ультразвук используют, например, частотой 20-22 кГц, при интенсивности колебаний не менее 22 кВт/м. Под воздействием ультразвука взвесь наночастиц становится гомогенной (однородной). В однородную взвесь наночастиц по каплям добавляют раствор щелочи, например 10% водный раствор NaOH, доводят водородный показатель (рН) взвеси до 8-9 единиц. При этом наночастицы начинают заметно оседать на дно сосуда. Процесс оседания контролируют визуально. Затем процесс осаждения наночастиц продолжают, например с помощью центрифугирования при 1000 об/мин в течение 3 мин. Под действием центробежной силы происходит разделение взвеси на две фазы: образуются осадок (модифицированные хитозаном наночастицы FeO) и надосадок (супернатант - ацетатный буферный раствор). Супернатант удаляют и осадок промывают, например, дистиллированной водой. Для этого к осадку добавляют дистиллированную воду (dHO) в количестве, покрывающем поверхность осадка. Взбалтывая сосуд, например - пробирку, промывают наночастицы. Затем наночастицы осаждают, например, с помощью центрифугирования 1000 об/мин в течение 3 мин, и удаляют дистиллированную воду. Описанным образом повторно проводят процедуру промывания осажденных наночастиц дистиллированной водой. Отмытые наночастицы осаждают, например с помощью центрифугирования при 1000 об/мин в течение 3 мин, удаляют надосадочную жидкость, к осадку добавляют 0,015 М ацетатный буфер (рН 5,0).
Навеску ранее приготовленного анализируемого биологического объекта, например измельченную пробу костной ткани в 5 г, помещают в пробирку и заливают лизирующим буферным раствором, например, состава: 0,1 М Трис-HCl, 0,1 М ЭДТА, 0,1 М NaCl, 0,5% N-лаурилсаркозил Na и протеиназы K (ph 6-7, 20-25°С). Лизирующий раствор перемешивают (суспендируют) с измельченной пробой и получают суспензию, содержащую лизирующий буферный раствор и пробу костной ткани. Суспензию инкубируют, например, в течение 25-35 мин. После инкубации пробирку с суспензией подвергают воздействию постоянного магнитного поля, например, помещая пробирку на стандартный лабораторный магнитный штатив. Под действием постоянного магнитного поля происходит разделение суспензии на две фазы: осадок - клеточный лизат и надосадок - ацетатный буферный раствор. Образовавшийся надосадок удаляют и получают осадок - клеточный лизат, содержащий фракцию препарата ДНК из пробы.
3
4
3
4
3
4
К клеточному лизату добавляют ранее приготовленный сорбент FeO в 0,015 М ацетатном буферном растворе, например, в количестве 20 мкл взвеси модифицированных наночастиц на 1 мл клеточного лизата. Взвесь перемешивают (суспендируют), например, автоматической пипеткой. Затем перемешанную взвесь инкубируют в течение 30 мин, при температуре в диапазоне плюс 15-30°С. Пробирку с взвесью подвергают воздействию постоянного магнитного поля, например, путем помещения пробирки на стандартный лабораторный магнитный штатив. Под воздействием магнитного поля происходит разделение суспензии на две фазы: осадок - сорбент FeO со связавшимися с ним молекулами ДНК и надосадок - лизирующий буферный раствор. Надосадок (супернатант) удаляют, а к осадку приливают отмывочный (элюирующий) буферный раствор, например, состава: 10 мМ трис-HCl, рН 7,4; 100 мМ NaCl; 1 мМ ЭДТА. Смесь перемешивают, например, автоматической пипеткой, затем пробирку помещают на стандартный лабораторный магнитный штатив, где под действием постоянного магнитного поля происходит разделение суспензии на две фазы: осадок - сорбент наночастиц FeO и надосадок - элюирующий буферный раствор с молекулами ДНК. Надосадок отбирают в чистые емкости, например пробирки типа Эппендорф. Отобранный надосадок является конечным продуктом - раствором, содержащим выделенный препарат ДНК. Выделенный препарат ДНК в растворе применяют по назначению, например для постановки реакции амплификации.
2
Вышеописанным путем ДНК выделяют также из мышечных тканей, роговых тканей животных, ногтевых пластин, биологических объектов на предметах-носителях - марле, бумаге, синтетических тканях, крови различного состояния, спермы, волос, ногтевых пластин. Выделение ДНК из роговых тканей животных, ногтевых пластин проводится так же, как из костной ткани: перед процедурой выделения необходимо измельчить биологический объект. Однако для экстракции ДНК с предметов-носителей необходимо предварительно сделать смыв биологического материала. Для этого предмет-носитель (марля, бумага, синтетические ткани) размером 1×1 см помещают в 1 мл дистиллированной воды (dHO) и инкубируют при температуре плюс 56-70°С, получают смыв биологического материала. Затем отделяют предмет-носитель и работают со смывом по описанному выше методу.
Заявляемый способ позволяет значительно быстрее, по сравнению с аналогами [1, 2], выделить ДНК - процедура выделения ДНК занимает не более 1,5 часов для самых сложных объектов. Выход продукта по заявляемому способу составляет до 200 нг (нанограмм) ДНК из 5 г костного порошка. У прототипа - не более. 150 нг из 5 г костного порошка. То есть заявляемый способ позволяет увеличить выход выделяемого препарата ДНК не менее чем в 1,5 раза. Заявляемый способ позволяет выделить ДНК из биологических материалов, например мышечной ткани, рогов, шерсти животных, ногтевых пластин, неприменимых для извлечения ДНК по способу-прототипу [3].
260
280
Спектрофотометрически опреденная степень очистки ДНК, например от примесей - белков и липидов по величине отношения длин волн А/А, составляет 1,8-2,0. Это соответствует общепринятому стандарту чистоты ДНК, то есть выделенный заявляемым способом препарат чист.
Заявляемый способ - безопасный, применяемые при выделении ДНК компоненты абсолютно безвредны для человека. Способ позволяет выполнять выделение ДНК из широкого спектра биологических объектов, недоступных для прототипа и аналогов, то есть обладает расширенной областью применения. Перечисленные результаты применения заявляемого способа подтверждают его новизну. Заявляемый способ выделения ДНК - осуществимый с применением стандартных технических устройств и оборудования в промышленном производстве продуктов питания, в деятельности организаций здравоохранения, полиции, животноводства. Это соответствует предъявляемому к изобретениям критерию «промышленная применимость»,
Предлагаемый способ выделения ДНК необходим специалистам различных областей, опирающимся в своей работе на данные молекулярно-генетического анализа, например диагностической медицине при определении заболеваний по образцу ДНК (гепатит, ВИЧ, наследственные заболевания), судебно-медицинской экспертизе, ветеринарии, сельском хозяйстве.
Приведенный пример применения предлагаемого изобретения показывает его полезность, например, для диагностики заболеваний людей в медицине и сельскохозяйственных животных - в ветеринарии. Применение предлагаемого способа выделения ДНК существенно расширяет перечень объектов, используемых для извлечения нуклеиновых кислот, например при производстве судебно-медицинской экспертизы.
Предлагаемое изобретение удовлетворяет критериям новизны, так как при определении уровня техники не обнаружено средство, которому присущи признаки, идентичные (то есть совпадающие по исполняемой ими функции и форме выполнения этих признаков) всем признакам, перечисленным в формуле изобретения, включая характеристику назначения.
Заявляемый способ выделения ДНК имеет изобретательский уровень, поскольку не выявлены технические решения, имеющие признаки, совпадающие с отличительными признаками данного изобретения, и не установлена известность влияния отличительных признаков на указанный технический результат.
Заявленное техническое решение можно реализовать в промышленном производстве аналитического и диагностического оборудования, в деятельности организаций пищевой промышленности, здравоохранения, животноводства, правоохранительных органов посредством использования известных стандартных технических устройств и оборудования. Это соответствует критерию «промышленная применимость», предъявляемому к изобретениям.
ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ ИСТОЧНИКИ
1. Mathew C.G. The isolation of high molecular weight eukaryotic DNA [Текст] / C.G.Mathew// Nucleic Acids (Methods in Molecular Biology, volume 2). - 1984. - pp.31-34.
2. Walsh P.S. Chelex100 as a Medium for Simple Extraction of DNA for PCR-Based Typing From Forensic Material [Текст] / P.S. Walsh, D.A. Metzger // BioTechniques. - 1991. - pp.506-513. Patent Nos. US 5,494,647/A/.
3. Xiaojun Z. Collection of Trace Amounts of DNA/mRNA Molecules Using Genomagnetic Nanocapturers [Текст] / Z. Xiaojun, T-D.Rovelyn, W.Kemin, T.Weihong // Analytical Chemistry. - Vol.75, №14, 15.07.2003, pp.3476-3483 (ПРОТОТИП).
4. Губин С.П. Магнитные наночастицы: методы получения, строения и свойства [Текст] С.П.Губин, Ю.А.Кошкаров // Успехи химии 74(6), 2005. - С.539-568.