Флуоресцентный способ прогнозирования эффективности химиотерапии у детей, больных острым лимфобластным лейкозом, путем определения концентраций аденозинтрифосфата в митохондриях
FLUORESCENT METHOD FOR CHEMOTHERAPY EFFICIENCY PREDICTION IN CHILDREN WITH ACUTE LYMPHOBLASTIC LEUKEMIA BY DETERMINATION OF ADENOSINE TRIPHOSPHATE CONCENTRATIONS IN MITOCHONDRIA

Изобретение относится к области биофизики, а именно к медицинской физике, и описывает способ прогнозирования эффективности химиотерапии у детей, больных острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ), в частности, прогнозирования рисков возникновения лекарственной резистентности при проведении химиотерапии у пациентов с ОЛЛ с помощью исследования свойств биологических жидкостей физическими методами. Способ включает в себя определение и оценку количественных уровней концентрации аденозинтрифосфата (АТФ), в клетках крови, методом лазерной конфокальной микроскопии, после получения курса химиотерапии пациентом. Изобретение может быть использовано в онкологии, в клинической лабораторной практике для индивидуального прогнозирования эффективности химиотерапии при лечении острых лимфобластных лейкозов у детей.
Известно изобретение «Способ прогнозирования эффективности химиотерапии у больных со злокачественными новообразованиями эпителиальных тканей» (патент РФ №2542505, 2013 г., G01N 33/49), содержащее сходный с используемым в заявляемом способе принцип выбора молекулярных маркеров химиочувствительности новообразований.
Недостатком этого способа является то, что с его помощью не представляется возможным производить работу с флуоресцентными маркерами, а именно обеспечивать их использование для определения концентраций АТФ в митохондриях клеток крови, что позволит производить оценку степени гепатотоксических эффектов и степени лекарственной резистентности, необходимых для индивидуализации химиотерапии (и ее эффективности) у пациентов.
+
За прототип изобретения выбран способ прогнозирования эффективности химиотерапии у больных со злокачественными опухолями эпителиальных тканей, включающий в себя исследование крови до и после лечения с количественным определением содержания CD50 антигена (Алясова А.В. Клинико-неврологические и клинико-иммунологические характеристики рака молочной железы: Автореф. дис. д.м.н., Иваново, 2004, 43 с.).
Описанный в прототипе способ осуществляется следующим образом: иммунофенотипирование мононуклеарных клеток периферической крови проводят с помощью метода непрямой иммунофлуоресценции. Для выделения мононуклеарных клеток периферической крови гепаринизированную кровь, разведенную на 1/3 средой 199, наслаивают на градиент фиколл-верографина (9 объемов крови на 3 объема градиента) и центрифугируют при 1700 об/мин в течение 40 минут при 20°С. Мононуклеарные клетки собирают из интерфазы, а затем трижды отмывают средой 199. При этом центрифугируют в течение 20 минут при 1200 об/мин.
6
На обезжиренное предметное стекло, предварительно покрытое парафилмом фирмы American Can Company, имеющим круглые перфорации диаметром 7 мм, наносят по 20-50 мкл поли-L-лизина Serva в концентрации 50 мкг/мл. Предметное стекло помещают на 30 минут в термостат при температуре 37°С. Затем его отмывают физиологическим раствором, забуференным 0,01 молярным фосфатным буфером рН 7,4. Суспензию клеток в концентрации 2-10 кл/мл наносят по 40 мкл в лунки на предметное стекло. Предметное стекло выдерживают 30 минут при 37°С во влажной камере. Затем не прикрепившиеся к стеклу клетки отсасывают пипеткой и наносят в лунки раствор моноклональных антител (МКА) объемом 40 мкл. В контрольных образцах клетки обрабатывают физиологическим раствором взамен МКА.
Вновь инкубируют стекла при 37°С во влажной камере в течение 30 минут, после чего отмывают их в пяти порциях физиологического раствора с фосфатным буфером рН 7,4. На отмытые клетки наслаивают по 40 мкл ФИТЦ-меченных фрагментов козьих антител против мышиных иммуноглобулинов производства НПК Препарат и стекла инкубируют на льду во влажной камере в течение 30 минут. Затем стекла промывают в пяти порциях физиологического раствора с фосфатным буфером рН 7,4, заливают 50%-ным глицерином в физиологическом растворе и препарат закрывают предметными стеклами. Просмотр препаратов проводят с помощью люминесцентного микроскопа ЛЮМАМ-И2. Учитывают свечение при увеличении объектива × 40-100, окуляра × 2,5-10. Люминесценцию клеточной поверхности регистрируют визуально. В препарате просчитывали 200-300 клеток. Учитывают общее количество клеток и антиген-положительных клеток. Затем подсчитывают относительное содержание антиген-положительных клеток.
+
+
В результате проведенных исследований было показано, что изменение содержания CD50 клеток является устойчивым признаком, позволяющим прогнозировать исход заболевания. Снижение уровня этой популяции по окончании лечения не менее чем в 1,2-1,6 раза, по сравнению с ее содержанием перед 1 курсом ПХТ, особенно на фоне угнетения иммунологической реактивности, свидетельствует о неэффективности проводимой терапии, возможности развития рецидива заболевания в ближайшие 4-5 месяцев или прогрессирования процесса на фоне введения цитостатиков. Напротив, в случаях повышения в процессе лечения исходно сниженного количества CD50 клеток отмечалось развитие стойкой ремиссии болезни.
Несовершенство этого способа заключается в недостаточной его автоматизации, а именно, в осуществлении ручным способом подсчета клеток и антиген-положительных клеток, что может приводить к ошибкам в интерпретации результатов эксперимента. Другим недостатком способа является невозможность непосредственного мониторинга рисков возникновения гепатотоксичности и лекарственной резистентности у пациентов.
Задачей предлагаемого изобретения является создание флуоресцентного способа прогнозирования эффективности химиотерапии у больных с острыми лимфобластными лейкозами, обладающего высокой степенью автоматизации ключевых этапов эксперимента, а также обеспечение возможности непосредственного мониторинга рисков возникновения гепатотоксичности и лекарственной резистентности у пациентов.
Поставленная задача решается тем, что во флуоресцентном способе прогнозирования эффективности химиотерапии у детей, больных острым лимфобластным лейкозом, путем определения концентраций аденозинтрифосфата в митохондриях, при котором производят забор крови до и после химиотерапии, выделяют флуоресцентный макро-биомаркер эффективности химиотерапии, согласно изобретению макро-биомаркером является концентрация аденозинтрифосфата в митохондриях клеток крови, которую определяют автоматизировано, с помощью лазерного конфокального микроскопа, путем регистрации интенсивности флуоресценции макро-биомаркера для непосредственного мониторинга рисков возникновения гепатотоксичности и лекарственной резистентности у пациентов.
Заявленный способ основан на использовании определения концентрации АТФ методом лазерной конфокальной микроскопии, который начинается с обработки образца после формирования кровяного сгустка (не ранее чем через 30 минут и не более 3 часов после забора крови). Для максимального разделения сыворотки и клеточного осадка используется режим центрифугирования 2000 об/мин в течение 10 минут при комнатной температуре.
Сыворотка отбирается по 1 мл в криовиалы объемом (1,0-2,0) мл. Пробы хранятся в штативах с крышками, при -80°С до выполнения анализа. При заданном температурном режиме хранения количество жизнеспособных мононуклеарных клеток превышает 25 млн.
При выполнении анализа образцы размораживаются при комнатной температуре. В ламинарном шкафу, при помощи 0,5 мл и 1-мл механических пипеток периферической крови образцы переносятся в маркированные пробирки типа Фалькон объемом 10 мл.
Проба разводится стерильным 0,2 молярным фосфатно-солевым буфером (ФСБ) из расчета 5:1. Уровень рН доводится до 7,8. Образцы центрифугируются на скорости 4000 оборотов в минуту в течение 10 минут при температуре 4°С. Аккуратно удаляется жидкая фаза пипеткой и добавляется 5 мл ФСБ к осадку. Пипеткой объемом 1 мл, осадок разводится в ФСБ и доливается буфер до 5 мл, далее смесь перемешивается. Далее следует дважды повторить процедуру отмывки (центрифугирование образца, удаление жидкой фазы, добавление буфера) при указанных параметрах.
Для выделения митохондрий необходимо выполнить следующую последовательность действий:
1) Выделить МНК на феколе клетки для культивирования, затем произвести лизис эритроцитов в течение 15 минут в пропорции 1 к 10 в натрий-фосфатном буфере PBS, затем произвести одну отмывку клеток, для чего произвести центрифугирование в течение 10 мин со скоростью 1500 оборотов в минуту.
2
2) Произвести окрашивание митотрекером красным (MitoTracker Red 580). Использовать на 10 мл - 40 мкл красителя, далее инкубировать 20 минут при 37 градусах в CO инкубаторе, после инкубации произвести центрифугирование и 1 отмывку в PBS в течение 10 мин на скорости 1500 оборотов в минуту.
3) Произвести выделение митохондрий, для чего осадок МНК суспендировать в гипотонической среде (10 MMTrisHCl, рН 7,6) в течение 7 мин; осмотический шок останавливать добавлением 0,25 М сахарозы. Суспензию центрифугировать 10 мин при 600 об/мин, супернатант сохранить, а осадок вторично подвергнуть осмотическому шоку и снова центрифугировать. Супернатанты объединить и центрифугировать 20 мин при 12000 об/мин для осаждения митохондрий. Осадок митохондрий суспендировать в среде, содержащей 0,25 М сахарозу, 2 мМ ЭДТА, KCl 10 мМ, MgCl2, 1 мМ цистеин 0,05%, рН 7,4.
4) Произвести инкубацию с клетками (1,2,3 сутки), для чего использовать 500 мл суспензии митохондрий на 3 мл культивируемой среды (1 млн клеток на 1 мл). Далее лизировать образцы (суспензии митохондрий) в течение двух часов при температуре - 80°С. Пробу (суспензии митохондрий) разморозить при комнатной температуре, добавить до 5 мл ФСБ и центрифугировать на скорости 4000 об/мин в течение 4 минут при комнатной температуре. Удалить жидкую фазу пипеткой. Для количественного определения АТФ в клетках использовать ATPBioluminescentAssayKit (BAK). Пипеткой добавить в лунки 96-и луночного плоскодонного культурального планшета ТРР по 0,1 мл исследуемого образца, маркировать лунки планшета. Согласно инструкции производителя BAK подготовить люминицентный реагент, и в объеме 0,1 мл смешать с образцом в лунке. Для каждой серии эксперимента приготовить контрольный образец (смесь стандарта АТФ из BAK и ATPAssayMix из BAK в пропорции 1:1 объемом 0,1 мкл), а также образцы калибровочных кривых согласно инструкции BAK.
После подготовительных процедур используется 96-и луночный плоскодонный культуральный планшет ТРР. Механической пипеткой подготовленные образцы помещаются в лунки планшета в объеме 0,1 мл, и делается отметка соответствия об их размещении в лабораторном журнале. Согласно инструкции BAK готовится люминесцентный реагент, который в объеме 0,1 мл смешивается с образцом в лунке. Для каждой серии эксперимента подготавливается контрольный образец (смесь стандарта АТФ из BAK и ATPAssayMix из BAK в пропорции 1:1 объемом 0,1 мкл), а также образцы для построения калибровочной кривой, согласно инструкции BAK. Далее значение интенсивности люминесценции регистрируется с помощью детектора конфокального микроскопа. Детекция проводится в спектре свечения люцеферина желтого (в видимом диапазоне ~ 500-700 нм) с ожидаемым максимумом около 536 нм. Для анализа каждой лунки данные снимаются в нескольких точках. Для построения калибровочной кривой используются стандарты в разной степени разведения и без него. После построения калибровочных кривых берутся пробы пациентов с тяжелыми клиническими проявлениями НПР, где проводятся измерения степени интенсивности люминесценции АТФ с помощью лазерного конфокального микроскопа. На основании полученных спектральных данных о пиковой средней величине интенсивности рассчитывалась концентрация АТФ (мг/мл) по формуле:
exp
st
st
Где In - интенсивность свечения образца, In - интенсивность свечения стандарта, [АТФ] - концентрация АТФ в стандарте бралась равной 0.1 мг/мл
По результатам подсчитанной концентрации АТФ делается прогностический вывод об эффективности проводимой химиотерапии посредством взятия нормы концентрации АТФ для здоровой функционирующей клетки (1,04±0.14 мг/мл), при которой осуществляется лекарственный транспорт и не наблюдается риска развития гепатотоксических эффектов в данный момент терапии. Концентрация АТФ в клетке более (0,8±0,112) сигнализирует о наступлении апоптоза клетки. Потери АТФ в клетке более 70% (0,312±0,042) сигнализируют о некрозе клеток.
Таким образом, в заявляемом способе, включающем исследование крови до и после лечения, определяют и используют значение концентрации макро-биологического маркера - АТФ в митохондриях клеток крови пациентов, что позволяет произвести прогноз риска возникновения гепатотоксичности и лекарственной резистентности пациентов, оценив, таким образом, эффективность проводимой химиотерапии в нужный момент времени.