Способ морфометрической оценки прогноза течения диффузной B-крупноклеточной лимфомы по индексу доли опухолевых клеток, экспрессирующих pSTAT3 и pAKT1 в лимфатических узлах
METHOD FOR MORPHOMETRIC ESTIMATION OF THE PROGNOSIS OF THE COURSE OF DIFFUSE LARGE B-CELL LYMPHOMA BY THE INDEX OF THE PROPORTION OF TUMOUR CELLS EXPRESSING PSTAT3 AND PAKT1 IN LYMPH NODES

Изобретение относится к медицине, в частности к гематологии и может быть использовано для прогнозирования течения диффузной В-крупноклеточной лимфомы (ДВККЛ) с помощью метода морфометрического подсчета относительного количества опухолевых клеток, экспрессирующих белки pSTAT3 и pAKT1 после иммуногистохимического (ИГХ) окрашивания гистологических срезов и последующего расчета индекса доли (ИД) pSTAT3 и pAKT1 позитивно маркированных неопластических клеток в лимфоузлах.
Целью изобретения является разработка способа морфометрической оценки прогноза течения ДВККЛ по индексу доли pSTAT3 и pAKT1 позитивных опухолевых клеток в лимфатических узлах.
ДВККЛ является наиболее распространенным вариантом лимфопролиферативных заболеваний и составляет 30-40% от всех неходжкинских лимфом. Нозология объединяет группу лимфоидных неоплазий с различными морфологическими, иммунофенотипическими, генетическими характеристиками. Заболевание гетерогенно по течению, эффективности лечения и выживаемости пациентов [Diffuse large B-cell lymphoma: optimizing outcome in the context of clinical and biologic heterogeneity / L.H. Sehn, D.G. Randy // Blood. - 2015. - Vol. 125, №1. - P. 22-32].
Стандартом лечения первой линии признана иммунохимиотерапия по протоколу R-CHOP. Ее применение позволило увеличить выживаемость больных ДВККЛ до 60%. Однако у 40% обследуемых наблюдается резистентность к данному виду терапии или рецидив/прогрессия заболевания. Эта группа пациентов имеет крайне низкую общую выживаемость, в связи с чем, значение приобретает поиск молекулярных факторов, прогнозирующих биологическое поведение опухоли.
Известно, что в патогенез ДВККЛ вовлечены сигнальные пути JAK/STAT3 и PI3K/AKT/mTOR. Степень экспрессии ключевых молекул (pSTAT3 и pAKT1) этих путей может влиять на биологическое поведение неопластических клеток [Diffuse large B-cell lymphoma treatment approaches in the molecular era / M. Roschewski, L.M. Staudt, W.H. Wilson et al. // Nat Rev Clin Oncol. - 2014. - Vol. 11, №1. - P. 12-23]. Рядом авторов установлено, что гиперэкспрессия белков pSTAT3 и pAKT1 ассоциирована с неблагоприятными клинико-лабораторными показателями пациентов с ДВККЛ, неудачами терапии по протоколу R-CHOP [The impact of activated p-AKT expression on clinical outcomes in diffuse large B-cell lymphoma: A clinicopathological study of 262 cases / J.Y. Hong, M.E. Hong, M.K. Choi et al. // Annals of Oncology. - 2014. - Vol. 25. - P. 182-188; STAT3, tumor microenvironment, and microvessel density in diffuse large В cell lymomas / R. Tamma, G. Ingravallo, F. Gaudio et al. // Leukemia & Lymphoma. - 2020. - Vol. 61, №3. - Р. 567-574].
Близким техническим решением к предлагаемому изобретению является исследование выраженности белков pSTAT3 и pAKT1 при ДВККЛ, проведенное китайскими учеными [Expression and significance of leptin receptor, p-STAT3 and p-AKT in diffuse large B-cell lymphoma / S. Lin, Y. Li, X. Xiaoming, R. Wenwen // Acta Histochem. - 2014. - Vol. 116. - P. 126-130]. Данное исследование позволяет визуализировать pSTAT3 и pAKT1 позитивные опухолевые клетки в исследуемом материале с помощью ИГХ анализа. Оценить интенсивность окрашивания (категория А: от 0 до 3 баллов) и долю экспрессирующих pSTAT3 и pAKT1 опухолевых клеток (категория В: 4-7 баллов) в препаратах с помощью бальной шкалы.
Основными отличиями работы китайских коллег от предложенного нами способа являются, во-первых, то, что при оценке относительного содержания (доли) позитивно окрашенных опухолевых клеток не использовался морфометрический метод; во-вторых, пороговое значение экспрессии изучаемых белков установлено с помощью менее точной, чем ROC-анализа бальной шкалы; в-третьих, не проводился расчет индекса доли исследуемых клеток. Следовательно, представленный образец сравнения не позволяет точно оценить соотношение pSTAT3 и pAKT1 позитивных опухолевых клеток в лимфатических узлах.
Способа морфометрической оценки прогноза течения ДВККЛ по индексу доли, экспрессирующих pSTAT3 и pAKTl злокачественных клеток в гистологических срезах лимфаузлов не существует.
В процессе проведения патентно-информационного поиска не выявлено источников, порочащих новизну предлагаемого изобретения. Заявляемое изобретение разработано в лаборатории патоморфологии ФГБУН «КНИИГ и ПК ФМБА России» в соответствии с планом научно-исследовательской работы.
Способ осуществляется следующим образом
В исследование включено 100 больных с впервые установленным диагнозом ДВККЛ, получавших терапию 1 линии по схеме R-CHOP. Возраст обследуемых варьировал от 24 до 83 лет. Количество мужчин и женщин было сопоставимым (49 мужского пола и 51 женского). В качестве материала использовали архивные образцы тканей (парафиновые блоки) лимфоузлов, из которых приготавливали гистологические срезы толщиной 2-3 мкм на ротационном микротоме Sakura Accu-Cut SRM™ 200 (Япония). Для идентификации и визуализации pSTAT3 и pAKT1 антиген-позитивных опухолевых клеток в исследуемом материале использовали ИГХ метод. Иммунореактивность первичных антител pSTAT3 (phosphor Ser473, GeneTex, США), pAKT1 (phosphor Ser473, GeneTex, США) выявляли с помощью вторичных антител коньюгированных с пероксидазой, входящей в набор реактивов EnVISION+ («Dako»). Постановку ИГХ реакции осуществляли по стандартной методике в соответствии с протоколом систем визуализаций «Dako». Морфометрическую оценку относительного содержания опухолевых клеток, экспрессирующих STAT3 и pAKT1, выполняли на световом микроскопе «AxioScope.Al» фирмы «Carl Zeiss Microscopy GmbH» со встроенной фото- и видеокамерой с помощью программного обеспечения анализа изображений, с окулярами х10, объективом х100. Исследования проводили в 10 полях зрения для каждого образца. Исходя из полученных результатов, вычисляли относительное содержание STAT3 и pAKT1 позитивных опухолевых клеток по формулам:
где:
1
S - доля pSTAT3 положительных клеток в лимфатическом узле, %
1
D - среднее количество STAT3 позитивных клеток в 10 полях зрения
n - общее количество клеток в 10 полях зрения
где:
2
S - доля pAKT1 позитивных клеток в лимфатическом узле, %
2
D - среднее количество pAKT1 положительных клеток в 10 полях зрения
n - общее количество клеток в 10 полях зрения
Индекс доли (ИД) у каждого пациента определяли по формуле, %:
С помощью ROC-анализа установлено пороговое значение индекса доли опухолевых клеток, экспрессирующих белки pSTAT3 и pAKT1, соответствующее 70%. Данный показатель позволил стратифицировать пациентов в группы с разным течением заболевания. У 58 обследованных зарегистрировано благоприятное течение ДВККЛ (ИД<70%), у 42 больных - неблагоприятное (ИД≥70%).
Результаты исследований представлены в примерах, подтверждающих возможность заявляемого способа прогнозировать течение ДВККЛ по индексу доли антиген-позитивных неопластических клеток, экспрессирующих белки pSTAT3 и pAKT1 в гистологических срезах лимфоузлов.
Пример 1.
1
2
1
1
1
2
2
2
Больная Е., 58 лет, поступила в гематологическое отделение ФГБУН «КНИИГиПК ФМБА России» в 28.06.2017 года. Диагноз при поступлении: диффузная В-крупноклеточная лимфома. Клиническая характеристика: слабость, потливость, одышка, головные боли, периодическая субфибрильная температура. Регистрировалась IVA стадия заболевания, группа риска по международному прогностическому индексу - промежуточная высокая. Через два дня (01.07.2017 г.) была выполнена лимфаденэктомия шейного лимфоузла. Проведено ИГХ исследование гистологических срезов операционного материала по стандартной методике. С помощью морфометрического исследования определена доля pSTAT3 и pAKT1 позитивных клеток (S и S соответственно) и рассчитан ИД. Установленная величина S получена в ходе следующего расчета: S=153/227 × 100%. S=67%. Величина S рассчитана по формуле: S=89/445 × 100%. S=20%. ИД составил: (67%+20%)/2=43,5%.
В результате лечения пациентке было проведен курс химиотерапии по схеме R-CHOP (6 циклов). Достигнута полная ремиссия, которая сохраняется по настоящее время. Таким образом, у больной отмечалось благоприятное течение ДВККЛ при ИД<70% опухолевых клеток.
Пример 2.
1
2
1
1
1
2
2
2
Больной М., 64 года, поступил в гематологическое отделение ФГБУН «КНИИГиПК ФМБА России» в 17.08.2015 года. Диагноз при поступлении: диффузная В-крупноклеточная лимфома. Клиническая характеристика: периодическая субфебрильная температура, обильное ночное потоотделение, увеличение паховых лимфоузлов. Регистрировалась IVB стадия, группа риска согласно международного прогностического индекса - промежуточная высокая. Через три дня (20.08.2015 г.) была выполнена лимфаденэктомия пахового лимфоузла. Проведено ИГХ исследование гистологических срезов операционного материала по стандартной методике. С помощью морфометрического исследования определена доля pSTAT3 и pAKT1 положительных клеток (S и S соответственно) и рассчитан ИД. Установленная величина S получена в ходе следующего расчета: S=345/515 × 100%. S=67%. Величина S рассчитана по формуле: S=344/368 х 100%. S=93%. ИД составил: (67%+93%)/2=80%.
После лимфаденэктомии больному проведен курс химиотерапии по стандартному протоколу R-CHOP (4 цикла), достигнута стабилизация. Однако заболевание имело агрессивное течение, клинико-гематологического улучшения не наступило. Спустя 8 месяцев после операции пациент умер. Таким образом, у пациента зарегистрировано неблагоприятное течение заболевания (ИД≥70%).
Заявляемое изобретение дает при использовании положительный результат, заключающийся в возможности по индексу доли pSTAT3 и pAKT1 позитивных опухолевых клеток в лимфоузле прогнозировать течение ДВККЛ. При значении ИД менее 70% прогнозируют благоприятное течение болезни, а при равном или более 70% - неблагоприятный исход заболевания. Предлагаемый способ информативен, может быть использован в гематологических и патологоанатомических отделениях, патоморфологических лабораториях в качестве дополнительного критерия при прогнозировании течения ДВККЛ.