РЕАГЕНТ ДЛЯ ОЦЕНКИ ПРОДУКТА РАСЩЕПЛЕНИЯ ПЕРЕКРЕСТНОСШИТОГО ФИБРИНА И СПОСОБ ТАКОЙ ОЦЕНКИ
REAGENT FOR EVALUATING CROSS-CROSSLINKED FIBRIN SPLITTING PRODUCT AND METHOD OF SUCH EVALUATION

Область техники
[0001] Настоящее изобретение относится к реагенту для оценки продуктов расщепления перекрестносшитого фибрина под действием плазмина и к способам такой оценки.
Предшествующий уровень техники
[0002] Обнаружение продуктов расщепления перекрестносшитого фибрина (XDP) в крови указывает на растворение тромба. Оценка XDP широко применяется в диагностике синдромов диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови (DIC), при которых наблюдается системная активация свертывания крови и фибринолитическая активация. С другой стороны, такая оценка также применяется для исключения диагноза тромбоза глубокой вены (DVT) с локальным образованием внутрисосудистых тромбов и с ограниченной фибринолитической активацией, а поэтому диапазон оценок, необходимых для системы оценки XDP, имеет тенденцию к расширению от низкой концентрации до высокой концентрации.
[0003] Антитело, описанное в Патентном документе 1, известно как антитело, распознающее XDP. Поскольку это антитело не реагирует с фрагментами, не являющимися XDP (D-димером), то можно предположить, что такая оценка XDP является точной. Исходя из реактивности антитела и т.п. можно сделать вывод, что сайт распознавания антитела присутствует в D-домене и/или в E-домене XDP, имеющего связи E-D, а поэтому связь E-D является важным фактором для точной оценки XDP.
Список цитируемых документов
Патентный документ
[0004] [Патентный документ 1] WO 2011/125875.
Сущность изобретения
Техническая проблема
[0005] С другой стороны, авторами настоящего изобретения было обнаружено, что при оценке XDP с использованием антитела, имеющего свойства, описанные в патентном документе 1, может возникнуть проблема, связанная со специфичностью антител, специфически распознающих связь E-D, а именно, проблема, связанная с распознаванием и оценкой фибринового полимера и растворимого фибрина (SF), которые содержатся в образце и не имеют перекрестносшитой структуры на D-домене.
Поскольку вещества, такие как фибриновый полимер и SF имеют структуры, частично сходные со структурой XDP, но значительно отличаются по своему происхождению и свойствам, то может возникать серьезная проблема, связанная с получением ложноположительного результата из-за распознавания фибринового полимера и SF. Следовательно, необходимо провести дифференциацию продукта расщепления перекрестносшитого фибрина (XDP) от фибринового полимера и SF, и оценку такого продукта.
Решение проблемы
[0006] Авторами настоящего изобретения были проведены интенсивные исследования, в результате которых были обнаружены свойства антитела, позволяющее выявить различия между этими антителами. Более конкретно, авторами настоящего изобретения было обнаружено, что сайт распознавания антитела присутствует в E-домене, и что концентрация кальция играет важную роль в оценке XDP с использованием антитела.
Кальций представляет собой ион, который играет важную роль в свертывании крови, и сообщалось, что в D-домене присутствуют два сайта связывания с кальцием, а в E-домене присутствует один сайт связывания с кальцием. В результате, авторами настоящего изобретения было обнаружено, что поскольку кальций не присутствует в хелатном комплексе фибринового полимера, то структура фибринового полимера изменяется, а значит и реактивность также изменяется.
[0007] Настоящее изобретение относится:
[1] к реагенту для оценки продуктов расщепления перекрестносшитого фибрина (XDP) под действием плазмина, где указанный реагент для оценки включает:
1
3
(1) анти-XDP антитело, которое реагирует с XDP, но не реагирует с фибриногеном и с фрагментом X, фрагментом Y, фрагментом D и фрагментом E, которые представляют собой продукты расщепления фибриногена плазмином, и
(2) агент, образующий хелатный комплекс с кальцием; и
[2] к способу оценки продуктов расщепления перекрестносшитого фибрина (XDP) под действием плазмина, где указанный способ включает проведение реакции взаимодействия XDP с анти-XDP антителом в присутствии агента, образующего хелатный комплекс с кальцием.
Преимущественные эффекты изобретения
[0008] Настоящее изобретение позволяет проводить более точную оценку XDP.
Краткое описание чертежей
[0009] [Фиг. 1-A]. На Фиг. 1-A схематически представлена диаграмма, на которой показаны структуры a) фибриногена, b) фибринового мономера desAA и c) фибринового полимера.
[Фиг. 1-B]. На Фиг. 1-B схематически представлена диаграмма, на которой показана структура d) перекрестносшитого фибрина.
1
2
3
1
3
1
1
1
1
1
[Фиг. 1-C] На Фиг. 1-C схематически представлена диаграмма, на которой показаны структуры e) продуктов расщепления перекрестносшитого фибрина (DD/E), f) выделенного DD после диссоциации DD/E, g) выделенных фрагментов E и E после диссоциации DD/E, h) фрагмента E, i) фрагмента D, j) фрагмента D, k) D-E-D, и l) D-E.
1
1＋2
[Фиг. 2-A] На Фиг. 2-A представлена хроматограмма, иллюстрирующая результаты фракционирования смеси человеческого D и человеческого E на колонке с Superdex200 HR.
1
3
[Фиг. 2-B] На Фиг. 2-B представлена хроматограмма, иллюстрирующая результаты фракционирования смеси человеческого D и человеческого E на колонке с Superdex200 HR.
1
1＋2
1＋2
[Фиг. 3-A] На Фиг. 3-A представлена хроматограмма, иллюстрирующая результаты фракционирования смеси бычьего D (bD1) и человеческого E (hE) на колонке с Superdex200 HR.
1
1＋2
1＋2
[Фиг. 3-B] На Фиг. 3-B представлена хроматограмма, иллюстрирующая результаты фракционирования смеси овечьего D (oD1) и человеческого E (hE) на колонке с Superdex200 HR.
2+
[Фиг. 4] На Фиг. 4 представлен график, иллюстрирующий результаты, полученные посредством реакции взаимодействия человеческого DD/E или человеческого комплекса D-E-D с иммобилизованным антителом MIF-220 и их детектирования с помощью ELISA для оценки влияния иона Ca или EDTA.
Описание вариантов осуществления изобретения
1
3
[0010] Реагент для оценки и способ оценки согласно изобретению отличаются тем, что в них используются: (1) анти-XDP антитело, которое реагирует с продуктами расщепления перекрестносшитого фибрина (XDP) плазмином, но не реагирует с фибриногеном и с фрагментом X, фрагментом Y, фрагментом D и фрагментом E, которые представляют собой продукты расщепления фибриногена плазмином, и (2) агент, образующий хелатный комплекс с кальцием, где реакцию взаимодействия XDP с анти-XDP антителом осуществляют в присутствии агента, образующего хелатный комплекс с кальцием.
[0011] Используемый здесь термин «продукты расщепления перекрестносшитого фибрина плазмином (перекрестносшитый фибрин также называется «стабилизированным фибрином»)» также означает «димер D», «димер D-D» или «комплекс DD/E», а мономер DD/E означает наименьшее звено и его полимер (полимер DD/E, например, DXD/YY, YXY/DXXD и DXXY/YXXD).
[0012] «Анти-XDP антитело»
Анти-XDP антитело, используемое в настоящем изобретении:
(1) реагирует с XDP,
(2) не реагирует с фибриногеном, и
1
3
(3) не реагирует ни с одним из продуктов расщепления фибриногена плазмином, то есть, с фрагментом X, фрагментом Y, фрагментом D и фрагментом E, а предпочтительно,
1
2
(4) не реагирует ни с одним из фрагментов, полученных посредством диссоциации мономера DD/E, то есть, с фрагментом DD, фрагментом Eи фрагментом E.
В качестве анти-XDP антитела, используемого в настоящем изобретении, может служить антитело, которое распознает трехмерную структуру, вновь образующуюся на стороне E-домена посредством сборки E-домена и D-домена.
per se
2
[0013] Анти-XDP антитело, используемое в настоящем изобретении, может быть получено известным методом. Таким антителом может быть моноклональное антитело (MoAb) или поликлональное антитело (PoAb), при условии, что оно будет обладать нужной реактивностью, но предпочтительным является моноклональное антитело. В качестве антитела может быть использовано антитело  или фрагмент антитела, содержащий антигенсвязывающий сайт, например, Fab, Fab', F(ab'), Fv или т.п. Эти фрагменты антитела могут быть получены путем гидролиза антитела протеазой стандартным методом и стандартными методами разделения и очистки белка.
[0014] В качестве антигена для получения анти-XDP антитела, используемого в настоящем изобретении, может служить, например, мономер DD/E или полимер DD/E. Примером полимера DD/E может служить димер, тример, тетрамер или пентамер. Если такой полимер крупнее гексамера, то он становится менее растворимым в воде. Антиген может быть получен из фибриногена известным методом. Альтернативно, антиген может быть получен путем его выделения у человека или т.п. или методом генной инженерии. Кроме того, может быть использован коммерчески доступный продукт.
1
3
1
2
[0015] Анти-XDP антитело, используемое в настоящем изобретении, может быть получено путем подтверждения его способности реагировать с XDP; с фибриногеном; с продуктами расщепления фибриногена плазмином, то есть, с фрагментом X, с фрагментом Y, с фрагментом D и с фрагментом E, и с фрагментом DD, фрагментом Eи фрагментом E, полученными посредством диссоциации мономера DD/E, с применением метода иммунологического анализа, описанного ниже в примерах.
1
1
1
2
1
2
1
2
1
2+
2+
2+
[0016] Для анти-XDP антитела, использумого в настоящем изобретении и реагирующего с реконструированным комплексом D-E-D [D-E-D: см. k) на фигуре 1-C], полученным путем смешивания фрагмента E и/или фрагмента E(то есть, либо фрагмента E, либо фрагмента E, либо смеси фрагмента E и фрагмента E) с фрагментом D, и реагирующего с мономером DD/E, предпочтительно, подтвердить влияние концентрации иона Ca. Более конкретно, предпочтительно подтвердить, что концентрация иона Ca не оказывает существенного влияния на способность реагировать с мономером DD/E и на реакцию взаимодействия с реконструированным комплексом D-E-D, и что такое влияние значительно снижается в том случае, когда величина концентрации иона Ca ниже определенной величины (или величины в присутствии агента, образующего хелатный комплекс с кальцием, такого как EDTA).
2+
[0017] Значительное структурное различие между мономером DD/E и реконструированным комплексом D-E-D заключается в том, что мономер DD/E имеет поперечные связи между D-D. Комплекс D-E-D не имеет поперечных связей между D-D и может рассматриваться как наименьшее звено, характеризующее, например, продукты расщепления фибринового полимера. Следовательно, в случае анти-XDP антитела, где концентрация иона Ca значительно влияет на его способность реагировать с комплексом D-E-D, даже если в образце присутствуют продукты расщепления фибринового полимера, не имеющие поперечных связей между D-D, то способность реагировать с продуктами расщепления фибринового полимера может существенно снижаться в присутствии агента, образующего хелатный комплекс с кальцием, а способность реагировать с мономером DD/E сохраняется, что позволяет проводить более точную оценку XDP.
[0018] «Способ оценки и реагент для оценки»
В способе оценки согласно изобретению может быть применен известный метод иммунологической оценки, за исключением использования вышеупомянутого анти-XDP антитела, где реакцию взаимодействия XDP с анти-XDP антителом проводят в присутствии агента, образующего хелатный комплекс с кальцием. Так, например, способ оценки может включать стадию получения образаца, который может содержать XDP и анти-XDP антитело; стадию контактирования образца с анти-XDP антителом в присутствии агента, образующего хелатный комплекс с кальцием, с получением иммунологического комплекса; и стадию анализа иммунологического комплекса или сигнала, происходящого от этого иммунологического комплекса. Более конкретно, могут быть проведены нефелометрический иммуноанализ (TIA), иммуноферментный анализ (EIA), радиоиммуноанализ (RIA), метод аглютинации с использованием латекса, флуоресцентный иммуноанализ, иммунохроматография и т.п.
[0019] В анализе на свертывание крови, в качестве антикоагулянта обычно используют цитрат натрия. Специалисты Японской Ассоциации врачей клинической лаборатории также рекомендуют использовать цитрат натрия в качестве антикоагулянта в анализах на свертывание крови, и хорошо известно, что соли EDTA являются неподходящими для проведения анализов на свертывание крови. Это обусловлено тем, что в анализах, таких как оценка активированного парциального тромбопластинового времени (APTT), протромбинового времени (PT) или т.п., полученные величины превышают величины, полученные с использованием лимонной кислоты, и это указывает на то, что эти соли оказывают значительное влияние на результаты анализа и являются неподходящими для точной оценки.
[0020] Агентом, образующим хелатный комплекс с кальцием, является вещество, которое образует координационные связи с ионом металла, в результате чего в центре молекулы образуются ионы металла типа «сэндвича», и соединение, способное координировать ионы кальция, может быть использовано в настоящем изобретении.
В качестве агента, образующего хелатный комплекс с кальцием, который может быть использован в настоящем изобретении, могут служить, например, хелатообразующие агенты типа аминополикарбоновых кислот, хелатообразующие агенты типа ароматических или алифатических карбоновых кислот, хелатообразующие агенты аминокислотного типа, хелатообразующие агенты типа эфиров карбоновых кислот, хелатообразующие агенты типа фосфоновых кислот, хелатообразующие агенты типа оксикарбоновых кислот, хелатообразующие агенты типа полимерных электролитов (включая олигомерный электролит), многоатомные спирты, азотсодержащие хелатообразующие агенты, такие как диметилглиоксим или т.п., серусодержащие хелатообразующие агенты, такие как тиогликолевая кислота или т.п. или т.д.
[0021] Эти хелатобразующие агенты могут иметь любую форму. В случае кислотного хелатобразующего агента, такой агент может иметь форму свободной кислоты или соли, такой как соль натрия, соль калия, соль аммония или т.п. Кроме того, они могут иметь форму гидролизуемого производного сложного эфира.
[0022] Примерами хелатообразующих агентов типа аминополикарбоновых кислот могут служить этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA), этилендиаминдиуксусная кислота, гидроксиэтилэтилендиаминтриуксусная кислота (HEDTA), дигидроксиэтилэтилендиаминтетрауксусная кислота (DHEDDA), нитрилотриуксусная кислота (NTA), гидроксиэтилиминодиуксусная кислота (HIDA), β-аланиндиуксусная кислота, циклогександиаминтетрауксусная кислота, нитрилотриуксусная кислота, иминодиуксусная кислота, N-(2-гидроксиэтил)иминодиуксусная кислота, диэтилентриаминпентауксусная кислота, N-(2-гидроксиэтил)этилендиаминтриуксусная кислота, гликолевый эфир диаминтетрауксусной кислоты, глутаминовая кислота-диуксусная кислота, аспарагиновая кислота-диуксусная кислота, метилглициндиуксусная кислота, иминодиянтарная кислота, сериндиуксусная кислота, гидроксииминодиянтарная кислота, дигидроксиэтилглицин, аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота, а их соли и производные, такие сложные эфиры или т.п.
[0023] Хелатообразующими агентами типа ароматических или алифатических карбоновых кислот могут быть, например, глиоксиловая кислота, щавелевая кислота, малоновая кислота, янтарная кислота, глутаровая кислота, адипиновая кислота, пимелиновая кислота, себациновая кислота, азелаиновая кислота, итаконовая кислота, аконитовая кислота, пировиноградная кислота, глюконовая кислота, пиромеллитовая кислота, бензополикарбоновая кислота, циклопентантетракарбоновая кислота, салициловая кислота, ацетилсалициловая кислота, гидроксибензойная кислота, аминобензойная кислота (включая антраниловую кислоту), фталевая кислота, фумаровая кислота, тримеллитовая кислота, галловая кислота и гексагидрофталевая кислота, и их соли и производные.
[0024] Примерами хелатообразующих агентов аминокислотного типа могут быть глицин, серин, аланин, лизин, цистин, цистеин, этионин, тирозин и метионин и их соли и производные.
[0025] Примерами хелатообразующих агентов типа эфира карбоновой кислоты могут быть соли эфира карбоновой кислоты, такие как карбоксиметилтартроновая кислота (СМТ) и карбоксиметилоксиянтарная кислота (CMOS), карбоксиметилтартронат, карбоксиметилоксисукцинат, оксидисукцинат, моносукцинат винной кислоты и дисукцинат винной кислоты и их соли и производные.
[0026] Примерами хелатообразующих агентов типа фосфоновой кислоты могут быть иминодиметилфосфоновая кислота, алкилдифосфоновая кислота, 1-гидроксиэтан-1,1-дифосфоновая кислота и фитиновая кислота, и их соли и производные.
[0027] Примерами хелатообразующих агентов типа оксикарбоновых кислот могут быть яблочная кислота, лимонная кислота, гликолевая кислота, глюконовая кислота, гептоновая кислота, винная кислота и молочная кислота, и их соли и производные.
[0028] Примерами хелатообразующих агентов типа полимерного электролита (включая олигомерный электролит) могут быть полимер акриловой кислоты, полимер малеинового ангидрида, полимер α-гидроксиакриловой кислоты, полимер итаконовой кислоты, сополимер, состоящий из двух или более мономеров, входящих в состав этих полимеров; и полимер эпоксиянтарной кислоты.
[0029] Примерами многоатомных спиртов могут быть этиленгликоль, пирокатехол, пирогаллол, бисфенол и дубильная кислота и их производные.
[0030] В частности, предпочтительными являются этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA), щавелевая кислота, лимонная кислота, винная кислота, глюконовая кислота, нитрилотриуксусная кислота (NTA), этилендиамин, диэтилентриаминопентауксусная кислота (DTPA), дигидроксиэтиленглицин, триэтаноламин, гидроксиэтилендиаминтетрауксусная кислота, карбоксиметилтартроновая кислота (СМТ), карбоксиметилоксиянтарная кислота (CMOS), BAPTA, бицин, CyDTA, GEDTA (EGTA), HIDA, IDA, NTPO, TTHA, TPEN, бипиридин, фенантролин, порфирин, краун-эфир и т.п.
[0031] Эти хелатообразующие агенты могут быть использованы отдельно или в виде комбинации из двух или более соединений.
[0032] Содержание хелатообразующего агента может быть соответствующим образом выбрано с учетом его способности образовывать хелатные комплексы. В способе оценки согласно изобретению, концентрация агента, образующего хелатный комплекс с кальцием, в реакционной системе взаимодействия XDP и анти-XDP антитела, предпочтительно, составляет от 0,01 до 30 ммоль/л, более предпочтительно, от 0,2 до 30 ммоль/л, а еще более предпочтительно, от 0,2 до 2 ммоль/л, во время реакции антиген-антитело в случае, например, EDTA. Нижний предел концентрации EDTA не имеет конкретных ограничений, при условии, что он составляет 0,001 ммоль/л или более. В соответствии с этим, такая величина составляет, предпочтительно, 0,002 ммоль/л или более, более предпочтительно, 0,005 ммоль/л или более, еще более предпочтительно, 0,01 ммоль/л или более, еще более предпочтительно, 0,02 ммоль/л или более, 0,05 ммоль/л или более, а наиболее предпочтительно, 0,02 ммоль/л или более. Концентрация EDTA не имеет верхнего предела и может быть соответствующии образом выбрана самим специалистом, но предпочтительной концентрацией EDTA является концентрация, находящаяся в пределах, не влияющих на реакцию анти-XDP антитела. Каждый нижний предел и каждый верхний предел, упомянутые выше, могут быть произвольно объединены, если это необходимо.
[0033] Кальций представляет собой ион, который играет важную роль в свертывании крови, и сообщалось, что в D-домене присутствуют два сайта связывания с кальцием, а в E-домене присутствует один сайт связывания с кальцием. В результате, авторами настоящего изобретения было обнаружено, что поскольку кальций не присутствует в хелатном комплексе фибринового полимера, то структура фибринового полимера изменяется, что также приводит к изменению реактивности.
[0034] Реагент для оценки согласно изобретению по своей структуре может быть аналогичен структуре известных иммунологических реагенов для оценки, за исключением того, что этот реагент содержит анти-XDP антитело и агент, образующий хелатный комплекс с кальцием. Помимо анти-XDP антитела и агента, образующего хелатный комплекс с кальцием, могут быть соответствующим образом добавлены, например, буфер, сенсибилизатор, поверхностно-активное вещество, неорганическая соль и т.п.
[0035] Реагент может иметь форму двухкомпонентной системы, состоящей из первого реагента и второго реагента, либо такой реагент имеет форму, состоящую из одного реагента. Двухкомпонентная система, состоящая из первого реагента и второго реагента, является предпочтительной с точки зрения точности оценки и т.п., где реагент для оценки, полученный методом аглютинации на латексе, описан ниже.
Первый реагент состоит из буфера, а второй реагент состоит из латексных частиц, сенсибилизированных антителом, и в этот реагент могут быть соответствующим образом добавлены, например, сенсибилизатор, поверхностно-активное вещество, неорганическая соль и т.п. Предпочтительным примером может служить реагент, состоящий из первого реагента, состоящего из буфера, сенсибилизатора и неорганической соли, и второго реагента, состоящего из латексных частиц, сенсибилизированных антителом. Агент, образующий хелатный комплекс с кальцием, может быть добавлен либо в первый реагент, либо во второй регент, или в оба этих реагента, но предпочтительно, чтобы он был добавлен в первый реагент.
Концентрация агента, образующего хелатный комплекс с кальцием, в реагенте варьируется в зависимости, например, от состава реагента, порядка добавления, объема и т.п., и предпочтительно, чтобы такая концентрация превышала пределы концентраций для реакционной системы взаимодействия XDP с анти-XDP антителом.
Примеры
[0036] Настоящее изобретение более подробно проиллюстрировано на нижеследующих примерах, которые не ограничивают объема изобретения.
[0037] «Пример 1: Получение продуктов расщепления фибрина/фибриногена»
Продукты расщепления перекрестносшитого фибрина (XDP) имеют структуру (DD/E)n, где n в DD/E связаны прямой связью, DD/E представляет собой наименьшее звено, а n равно целому числу. В нижеследующих примерах, XDP (n≥2) представлены как полимерный XDP, а XDP (n=1) представлен как DD/E. Полимерные XDP и DD/E получали, в основном, как описано Stephanie A. Olexa и Andrei Z. Budzynski (1978), Circulation, Suppl. 58, 119, и Olexa et al. (1979), Biochim. Biophys. Acta 576, 39-50. Бычий тромбин (Mochida Pharmaceutical Co., Ltd.) и хлорид кальция добавляли к человеческому фибриногену (Enzyme Research Laboratories), и реакцию осуществляли при 37°C в течение 2 часов для превращения фибриногена в фибрин. Этот фибрин центрифугировали для отделения фибрина от некоагулируемых веществ. Фибрин уравновешивали в буфере Трис-HCl (pH 7,8), содержащем хлорид кальция. Человеческий плазмин (Chromogenix) добавляли в суспензию при 37°C. Реакцию расщепления прекращали путем добавления апротинина к суспензии, и эту суспензию пропускали через колонку с лизин-сефарозой для удаления плазмина из фильтрата. Фильтрат представляет собой смесь полимерного XDP и DD/E, молекулярные массы которых отличаются друг от друга. Фильтрат наносили на колонку с Сефакрилом S-300 (S-300), уравновешенную буфером Трис-HCl (pH 7,5), содержащим хлорид кальция (раствор A), и продукт фракционировали с помощью хроматографии на молекулярных ситах с использованием раствора А в качестве проявителя. Полученные фракции подвергали электрофорезу в ДСН-ПААГ и вестерн-блот-анализу для идентификации и отделения полимерной фракции XDP и фракции DD/E.
1
3
1
3
[0038] При получении продуктов расщепления человеческого фибриногена (X, Y, D и E), после добавления хлорида кальция к человеческому фибриногену (Enzyme Research Laboratories) снова добавляли человеческий плазмин (Chromogenix), и реакцию проводили при 37°C в течение 2 часов. Затем реакцию прекращали путем добавления апротинина (Pentapharm.). После прекращения реакции, продукт наносили на колонку с Сефакрилом S-300 (S-300), уравновешенную буфером Трис-HCl (pH 7,5) и фракционаровали с помощью гель-фильтрации с получением фрагмента X, фрагмента Y, фрагмента D и фрагмента E.
1+2
1
2
1+2
1
2
1
3
При получении фракции DD (DD) и фракции E (смеси E и E:E), предварительно полученную фракцию DD/E оставляли в растворе 3 моль/л мочевины - 50 ммоль/л лимонной кислоты (pH 5,5) на 4 часа при 37°C. Эту фракцию наносили на колонку с Сефарозой CL-6B, уравновешенную раствором 50 ммоль/л буфера Трис-HCl (pH 7,4)- 28 ммоль/л цитрата натрия - 0,1 моль/л хлорида натрия, и проявляли раствором. Полученные фракции подвергали электрофорезу в ДСН-ПААГ и вестерн-блот-анализу для идентификации и отделения фрагмента DD, фрагмента E и фрагмента E. Бычий и овечий DD/E и D также получали аналогичным образом. Человеческий D получали как описано Varadi A. and Scheraga H.A., Biochemistry 25: 519-28, 1986. Схематические диаграммы фракций представлены на Фигурах 1-A - 1-C.
[0039] Фракции, в основном, суспендировали в 50 ммоль/л буфера Трис (pH 8,0), содержащего 0,9% NaCl (далее называемого TBS). Чистоту каждого продукта расщепления подтверждали с помощью вестерн-блот-анализа и ВЭЖХ в восстанавливающих/невосстанавливающих условиях, и содержание белка в каждой фракции определяли по коэффициенту экстинкции молекулы на 280 нм (Sakurai et Al., Journal of the Japanese Society for Laboratory Hematology, 16:128-135，2015).
[0040] «Пример 2: Получение моноклонального антитела»
1
3
Моноклональное антитело получали с использованием человеческого DD/E в качестве иммуногена как описано Kohler и Milstein, Nature 256: 495-7, 1975. Супернатанты культуры гибридом, клонированных путем лимитирующего разведения, распределяли по 96-луночному микропланшету, иммобилизованному антителом против мышиного IgG. Было отобрано антитело (MIF-220), которое реагировало с DD/E, но не реагировало с фибриногеном и с продуктами расщепления фибриногена (X, Y, D и E).
[0041] «Пример 3: Анализ эпитопа для антитела MIF-220»
(1) Анализ на реакцию с продуктами расщепления фибрина/фибриногена с помощью ELISA
Раствор антитела MIF-220 распределяли по 96-луночному микропланшету и оставляли на 1 час или более при комнатной температуре. Микропланшет промывали 0,1 моль/л фосфатного буфера (pH 7,0), содержащего 0,05% монолаурата полиоксиэтилен (20)-сорбитана (далее обозначаемого T-PBS), и блокировали буфером T-PBS, содержащим 0,3% альбумин бычьей сыворотки (BSA). Различные антигены распределяли по всем лункам, и микропланшет оставляли на 1 час при комнатной температуре. Микропланшет промывали T-PBS. Антитело против человеческого фибриногена, меченное пероксидазой, 5000-кратно разводили буфером T-PBS, содержащим 0,3% BSA, и раствор оставляли на 1 час при комнатной температуре. После промывки T-PBS добавляли реагент TMB (3,3',5,5'-тетраметилбензидин), и сигнал измеряли на 450 нм. В результате было установлено, что антитело реагировало с антигеном при оптической плотности, превышающей 0,2. Результаты представлены в Таблице 1-A.
[0042] [Таблица 1-A]
OD (450 нм)
Фракция
Сокращение
ELISA-сигнал(OD 405 нм)
Фибриноген
Fbg
0,08
Продукты расщепленияфибриногена
Х
0,06
Y
0,05
D<sub>1</sub>
0,04
E<sub>3</sub>
0,04
Продукты расщепления фибрина
XDP
2,22
DD/E
1,85
Продукты диссоциации DD/E
DD
0,11
E<sub>1＋2</sub>
0,04
Реконструированный продукт DD и E
DD+E<sub>1＋2</sub>
0,68
1
3
1＋2
1＋2
[0043] Антитело MIF-220 реагировало с XDP (с полимерным XDP и с DD/E), но не реагировало с фибриногеном и с продуктами его расщепления, X, Y, D, и E. Кроме того, оно не реагировало с выделенными DD и E, полученными посредством диссоциации DD/E мочевиной, но реагировало со смесью DD и E (реконструированным продуктом).
[0044] (2) Вестерн-блот-анализ
1+2
1
3
Фибриноген, полимерный XDP, DD/E, DD, E, X, Y, D и E подвергали электрофорезу в ДСН-полиакриламидном геле (ПААГ), и после их переноса на поливинилиденфторидную (PVDF) мембрану оценивали способность антитела MIF-220 или антитела против человеческого фибриногена реагировать с каждым антигеном.
[0045] Реакционная способность антитела с этими антигенами была оценена с помощью вестерн-блот-анализа в невосстанавливающих условиях, и было обнаружено, что антитело MIF-220 не реагирует ни с одним из этих антигенов. Кроме того, вестерн-блот-анализ, также проведенный в отсутствии ДСН, показал, что антитело MIF-220 не реагирует ни с одним из вышеупомянутых антигенов.
[0046] «Пример 4: Способность антитела MIF-220 реагировать с комплексом D-E-D»
1
(1) Анализ, проводимый посредством реконструирования связи E-D (на реакцию с D и E)
1
1+2
3
1
1+2
Человеческий D и человеческий E или человеческий E, суспендированные в TBS, смешивали и подвергали реакции при 37°C в течение 30 минут для реконструирования связи E-D, а затем фракционировали на колонке с Superdex 200 HR (GE Healthcare) для сравнения времени удерживания DD/E, D и Е. Кроме того, способность реагировать с антителом оценивали с помощью ELISA. Фракции, происходящие от животных других видов, также оценивали аналогичным образом.
[0047] Результаты ELISA-анализа на способность антитела MIF-220 реагировать с комплексом D-E-D представлены в Таблице 1-B.
1
1+2
3
1
1+2
1
3
Антитело MIF-220 не реагировало ни с одним из D, E и E, но реагировало со смесью Dи Е (с реконструированным продуктом). Однако, антитело MIF-220 не реагировало со смесью D и E (с реконструированным продуктом).
[0048] [Таблица 1-В]
OD (450 нм)
Фракция
Сокращение
ELISA-сигнал(OD 405 нм)
Продукты расщепления фибриногена
D<sub>1</sub>
0,00
E<sub>3</sub>
0,00
Продукты расщепления фибрина
DD/E
1,63
Продукты диссоциации DD/E
E<sub>1＋2</sub>
-0,05
Реконструированный продукт DD и E
D<sub>1</sub>+E<sub>1＋2</sub>
1,68
D<sub>1</sub>+E<sub>3</sub>
0,01
1
1+2
1
1
3
[0049] Смесь человеческого D и человеческого Е фракционировали на колонке с Superdex 200 HR, в результате чего наблюдались новые пики A и B как показано на Фигуре 2-A. Время удерживания пика A приблизительно соответствовало времени удерживания DD/E, а время удерживания пика B имело промежуточное значение между временем удерживания DD/E и D. С другой стороны, такой новый пик не наблюдался для смеси человеческого D и человеческого Е, как показано на Фигуре 2-В.
1
1+2
[0050] (2) Способность человеческого, бычьего или овечьего D реагировать с человеческим Е
1
1+2
Результаты ELISA-анализа антитела MIF-220 реагировать с DD/E различных млекопитающих или анализа на способность человеческого, бычьего или овечьего Dреагировать с человеческим Е представлены в Таблице 2.
1+2
1
Антитело MIF-220 реагировало с человеческим DD/E, но не реагировало с бычьим или овечьим DD/E. С другой стороны, при смешивании человеческого E с человеческим, бычьим или овечьим D, антитело MIF-220 реагировало с любой смесью. В Таблице, добавленная буква «h» означает человеческие антигены, добавленная буква «b» означает бычьи антигены, а добавленная буква «o» означает овечьи антигены.
[0051] [Таблица 2]
OD (450 нм)
MIF-220
Человеческий D<sub>1</sub>+Человеческий E<sub>1＋2</sub>
hDD/E
1,83
hD<sub>1</sub>
0,09
hE<sub>1＋2</sub>
0,09
hD<sub>1</sub>+E<sub>1＋2</sub>
1,85
Бычий D<sub>1</sub>+Человеческий E<sub>1＋2</sub>
bDD/E
0,03
bD<sub>1</sub>
0,03
hE<sub>1＋2</sub>
0,09
bD<sub>1</sub>+hE<sub>1＋2</sub>
0,45
Овечий D<sub>1</sub>+Человеческий E<sub>1＋2</sub>
oDD/E
0,02
oD<sub>1</sub>
0,03
hE<sub>1＋2</sub>
0,09
oD<sub>1</sub>+hE<sub>1＋2</sub>
1,30
1
1＋2
1
1＋2
[0052] Результаты, полученные путем фракционирования смеси бычьего D и человеческого E или смеси овечьего Dи человеческого E на колонке с Superdex200 HR, представлены на Фигурах 3-A и 3-B.
1
1+2
1＋2
1
Как и в случае смеси человеческого D и человеческого E (Фигура 2-A), наблюдалось два новых пика, соответствующих пикам A и B, и было подтверждено, что человеческий E и бычий или овечий D, помимо того, что они отличаются у животных различных видов, образуют комплекс D-E-D.
[0053] «Пример 5: Анализ на кальций-зависимую реактивность с DD/E и с комплексом D-E-D»
2+
После суспендирования 0,3 мкг/мл человеческого DD/E или человеческого комплекса D-E-D, полученного как пик A на Фигуре 2-A, в буфере (концентрация Ca: 2 ммоль/л; и концентрация EDTA: 0,2 ммоль/л), DD/E или человеческий комплекс D-E-D подвергали реакции взаимодействия с иммобилизованным антителом MIF-220, и такую реакцию детектировали с помощью ELISA. Результаты представлены на Фигуре 4.
2+
2+
2+
[0054] Концентрация Ca и концентрация EDTA не оказывали существенного влияния на реактивность с человеческим DD/E. С другой стороны, реактивность с комплексом D-E-D была почти такой же, как и реактивность с DD/E при концентрации Ca 2 ммоль/л, но реактивность с комплексом D-E-D значительно снижалась при концентрации Ca менее, чем 2 ммоль/л, причем, такая реактивность была почти на нулевом уровне при концентрации EDTA 0,2 ммоль/л или более.
1
3
1+2
1+2
[0055] В этих анализах было показано, что моноклональное антитело MIF-220, полученное с использованием человеческого DD/E в качестве иммуногена, представляло собой антитело, распознающее структуру, характерную для XDP:(DD/E)n, поскольку антитело MIF-220 реагировало с продуктами расщепления перекрестносшитого фибрина XDP, но не реагировало с фибриногеном и с продуктами расщепления фибриногена (X, Y, D и E). На основании того факта, что если DD/E (e на Фигуре 1-C), представленный как наименьшее звено XDP, диссоциировался с образованием DD (f на Фигуре 1-C) и E (g на Фигуре 1-C), то реактивность с каждым из DD и E утрачивалась, и на основании того факта, что антитело MIF-220 не реагировало ни с антигеном XDP, ни с продуктами расщепления фибриногена, на что указывал вестерн-блот-анализ, можно сделать вывод, что антитело MIF-220 представляет собой антитело, распознающее трехмерную структуру, образованную связью E-D.
1+2
1
3
3
3
1
[0056] Olexa и др. сообщали, что при смешивании DD и E, связь E-D образовывалась снова, и был получен реконструированный DD/E. В этом исследовании было обнаружено, что при использовании D вместо DD, связь E-D могла быть реконструирована аналогичным образом (Фигура 2-A). При сравнении времени удерживания с временем удерживания DD/E, было обнаружено, что пики A и B, представленные на Фигуре 2-A, имели структуры D-E-D (k на Фигуре 1-C) и D-E (l на Фигуре 1-C), соответственно. С другой стороны, эти же авторы сообщали, что E не связывался с DD, и в этом исследовании, связь E-D не наблюдалась, как показано на Фигуре 2-B (как показано для h на Фигуре 1-C, поскольку A-узел и B-узел не существуют в E, то даже при смешивании E с D, комплекс D-E-D и комплекс D-E не образуются, и таким образом, смесь не реагирует с антителом MIF-220).
1
1+2
1
1+2
1+2
1
[0057] Для того, чтобы определить, какая из областей, то есть, D-область или E-область включает эпитоп для антитела MIF-220, реконструирование связи E-D оценивали с использованием человеческого, бычьего и овечьего DD/E; человеческого, бычьего и овечьего D и человеческого Е. Поскольку комплекс D-E-D образовывался в любой комбинации человеческого, бычьего и овечьего Dи человеческого E (Фигура 2-A, Фигура 3-A и Фигура 3-B), то было подтверждено, что связь E-D не зависит от вида. Однако, поскольку антитело MIF-220 реагирует со смесью человеческого E и человеческого, бычьего или овечьего D, но не реагирует с бычьим или овечьим DD/E, то было показано, что человеческая Е-область играет важную роль в реакции с антителом MIF-220 (Таблица 2). Исходя из этих результатов можно сделать вывод, что антителом MIF-220 является антитело, которое распознает трехмерную структуру, вновь образованную на человеческой Е-области под действием тромбина и связи E-D.
2+
[0058] Способность DD/E и комплекса D-E-D реагировать с антителом MIF-220 в присутствии Ca была почти идентичной в одном и том же количестве белка, но способность реагировать с комплексом D-E-D резко снижалась по сравнению со способностью реагировать с DD/E в присутствии EDTA. Как показано на e и k на Фигуре 1-C, различия между DD/E и D-E-D заключались в перекрестносшитой структуре между D и D, и было предположено, что более сильное связывание Ca в Ca-связывающем сайте, по сравнению с комплексом D-E-D, обусловлено перекрестным сшиванием.
В настоящем изобретении, хелатообразующий агент может быть использован в двух стадиях. Так, например, если лимонная кислота или т.п. используется в качестве хелатообразующего агента, необходимого во время забора крови, то для забора крови может быть использован другой хелатообразующий агент, отличающийся от этого агента, либо может быть использован тот же самый хелатообразующего агент в другой концентрации во время оценки XDP. В частности, было обнаружено, что специфичность антитела может быть повышена, и точная оценка станет возможной при добавлении хелатообразующего агента в реагент для снижения влияния кальция.
[0059] DD/E представляет собой наименьшее звено, составляющее XDP (d на Фигуре 1-B и e на Фигуре 1-C), а комплекс D-E-D представляет собой наименьшую структуру, характеризующую продукты расщепления фибринового полимера (c на Фигуре 1-A). При этом считается, что антитело может быть применено в клинических целях для детектирования XDP посредством ингибирования способности антитела MIF-220 реагировать с комплексом D-E-D.
Промышленное применение
[0060] Реагент для оценки и способ оценки согласно изобретению могут быть применены, например, для оценки продуктов расщепления перекрестносшитого фибрина (XDP) плазмином, и такой реагент и способ могут быть применены в качестве диагностического маркера диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови (DIC).
Хотя настоящее изобретение описано со ссылкой на конкретные варианты осуществления изобретения, однако, в эти варианты могут быть введены различные изменения и модификации, не выходящие за рамки объема, сформулированного в прилагаемой формуле изобретения.