УСТРОЙСТВО ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИРОВАНИЯ СЕРДЕЧНОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ
DEVICE FOR RAPID DIAGNOSIS OF CARDIAC ACTIVITY

Область техники изобретения
Настоящее изобретение относится к иммуноанализу для выявления кардиомаркеров на ранних стадиях кардиального события, такого как инфаркт миокарда. В частности, изобретение представляет собой устройство для выявления диагностически релевантной комбинации двух маркеров крови уже в течение получаса при появлении симптомов острого инфаркта миокарда.
Уровень техники изобретения
Ежегодно около одного миллиона человек только в Соединенных Штатах страдают острым инфарктом миокарда (ОИМ), из которых 10% могут умереть в течение одного года в зависимости от степени тяжести заболевания и качества вмешательства. В любом случае, медицинская помощь, включая первичное чрескожное коронарное вмешательство и/или тромболитическую терапию, если необходимо, должна быть оказана по возможности незамедлительно. Было продемонстрировано, что сокращение продолжительности между началом боли за грудиной и реперфузией до менее чем четырех часов имеет решающее значение для снижения некроза миокарда и улучшения сердечной деятельности, снижая показатель 30-дневной смертности [Но Y.C. et al.: Crit. Care Med. 42 (2014) 1788-96]. Очень важна ранняя диагностика ОИМ, но чувствительность классической ЭКГ для диагностирования ОИМ у пациентов с болью в груди по ишемическому типу ненамного превышает 50% [The Merck Manual, 17-я редакция (1999), стр. 1673]. В этой связи кардиомаркеры крови имеют огромное значение. Для оценки повреждения миокарда использовались различные белки, которые просачиваются из поврежденных клеток миокарда в кровоток, включая миоглобин или энзимы, такие как аспартатаминотрансфераза, лактатдегидрогеназа или креатинфосфокиназа. В настоящее время это, главным образом, тропонины, которые были признаны достаточно специфичными для выявления повреждений миокарда. К сожалению, кардиотропонины, хотя и остаются повышенными в течение двух недель после события ОИМ, проявляются не сразу и хорошо могут быть замерены только через несколько часов после события ОИМ, т.е. первые моменты, когда правильный диагноз является наиболее критическим, освещены недостаточно. Поэтому целью настоящего изобретения является создание способа диагностики острого инфаркта миокарда путем выявления соответствующих маркеров крови. Было установлено, что сердечная форма белка, связывающего жирные кислоты (HFBP), является другим маркером ОИМ и, как правило, появляется в крови в течение, приблизительно, одного часа, и достигает пикового значения в течение, приблизительно, пяти часов в пределах события ОИМ [Tanaka Т. et al.: Clinical Biochemistry 24 (1991) 195-201; Van Nieuwenhoven F.A. et al.: Circulation 92 (1995) 2848-54], но диагностическая точность HFBP в качестве единственного маркера оказалась недостаточной в клинических условиях [Park S.Y. et al.: Clin. Neurol. Neurosurg. 115 (2013) 405-10]. Другой целью настоящего изобретения является создание способа диагностирования острого инфаркта миокарда путем обнаружения более одного маркера крови.
Еще одной целью настоящего изобретения является создание устройства для диагностики ОИМ, которое использует более одного маркера крови инфаркта миокарда.
Еще одной целью настоящего изобретения является создание устройства для оказания помощи в диагностике ОИМ в течение нескольких часов после события ОИМ.
Другие цели и преимущества настоящего изобретения будут представлены по мере описания.
Краткое изложение сущности изобретения
Настоящее изобретение представляет собой устройство для обнаружения маркеров острого инфаркта миокарда (ОИМ) в образце крови человека, указанное устройство включает смесь по меньшей мере двух антител или конъюгатов антител, вступающую в реакцию по меньшей мере с сердечным тропонином (СТ) и с сердечной формой белка, связывающего жирные кислоты (HFBP). Указанные маркеры предпочтительно включают СТ и HFBP, причем указанные конъюгаты антител одновременно вступают в реакцию с указанными маркерами, присутствующими в указанном образце крови, тем самым создают визуальный сигнал, если концентрация каждого из указанных маркеров превышает определенное заданное пороговое значение. Антитела или конъюгаты антител вступают в реакцию с указанными маркерами крови только после отделения плазмы крови от клеток крови; клетки крови не контактируют с указанными антителами, как известно специалисту, поскольку клетки крови сначала удаляются на предварительном фильтре; обычно плазма перемещается к антителу или конъюгату антитела для образования комплекса маркер-антитело или комплекса
конъюгата маркер-антитело, который создает визуальный сигнал либо сам, либо после реакции с дополнительными реагентами. Пороговое значение для каждого маркера определяется из распределения его концентрации в крови здорового населения. В одном из вариантов осуществления изобретения, указанное пороговое значение выше 95-го перцентиля в указанном распределении для каждого из маркеров. В другом варианте осуществления изобретения, указанное пороговое значение выше 99-го перцентиля в указанном распределении для каждого из маркеров. В предпочтительном варианте осуществления изобретения, указанное пороговое значение для каждого маркера ниже максимальной концентрации маркера в крови, которая не создает визуальный сигнал при вступлении в реакцию с указанными антителами или конъюгатами антител, если указанный маркер в образце один. В одном варианте осуществления устройства по данному изобретению, указанное пороговое значение для СТ составляет 0,5 нг/мл, а указанное пороговое значение для HFBP составляет 5 нг/мл. В другом варианте осуществления, указанное пороговое значение для СТ составляет около 1 нг/мл, а указанное пороговое значение для HFBP составляет около 10 нг/мл. В одном варианте осуществления, устройство по изобретению создает визуальный сигнал, если концентрация СТ в указанном образце крови составляет по меньшей мере 0,5 нг/мл и одновременно концентрация HFBP в указанном образце крови составляет по меньшей мере 5 нг/мл. В другом варианте осуществления, устройство по изобретению создает визуальный сигнал, если концентрации СТ и HFBP в указанном образце крови составляют по меньшей мере 1 нг/мл и 5 нг/мл, соответственно. В еще одном варианте осуществления, устройство по изобретению создает визуальный сигнал, если концентрации СТ и HFBP в указанном образце крови составляют по меньшей мере 1 нг/мл и 10 нг/мл, соответственно. Указанный тропонин может содержать белки, выбранные из тропонина-С, тропонина-I, тропонина-Т, комплекса указанных тропонинов или смеси, содержащей по меньшей мере два из указанных тропонинов. Предпочтительно, чтобы тропонин-I или тропонин-Т был использован в качестве кардиомаркера. Указанную смесь антител или конъюгатов антител обычно иммобилизуют в полосе иммуноанализа в устройстве по данному изобретению. Указанная полоса может быть частью устройства иммуноанализа, например, набора латерального проточного иммуноанализа. В одном из вариантов осуществления, указанное устройство иммуноанализа включает в себя ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay - твердофазный иммуносорбентный анализ). Указанную смесь антител или конъюгатов антител иммобилизуют в полосе иммуноанализа в виде одной узкой полоски, которая настроена на изменение цвета при наличии антигенов, а именно указанных маркеров крови ОИМ. Таким образом, указанный визуальный сигнал представляет собой изменение цвета указанной полоски, вызванное реакцией цветообразования маркера с конъюгатом антитела. В другом аспекте изобретения, указанная смесь антител или конъюгатов антител может быть иммобилизована в указанной полосе в виде нескольких узких полосок, которые различаются указанным заданным пороговым значением и создают визуальные сигналы при различных концентрациях указанных маркеров (различающихся по чувствительности). Устройство по изобретению может с успехом содержать контрольные полоски, демонстрирующие сравнительную интенсивность цвета либо до, либо после контакта с указанным образцом крови. Сравнительные полоски могут включать в себя антитела или конъюгаты антител, вступающие в реакцию с типовыми белками крови (альбумины, иммуноглобулины и др.), антитела или конъюгаты антител, конъюгированные таким образом и иммобилизованные в таком количестве, чтобы создать цветовой
сигнал желаемой интенсивности при контакте с указанным образцом крови. Сравнительные полоски могут содержать цвет желаемой интенсивности, присутствующий в устройстве до вступления в контакт с указанным образцом, а также стабильный уже после контакта с указанным образцом. Указанный цвет желаемой интенсивности может соответствовать ожидаемому цветовому сигналу, созданному соответствующими концентрациями маркеров в образце крови. Набор сравнительных полосок позволяет оценить концентрацию кардиомаркеров в образце крови при сравнении визуального сигнала, созданного кардиомаркером крови или сочетанием маркеров, с набором сравнительных полосок.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения, предусмотрено устройство для обнаружения события ОИМ, включающее одну или несколько смесей антител, одновременно специфичных как для СТ, так и для HFBP, антитела или конъюгаты антител, иммобилизованные в полосе иммуноанализа в виде одной или нескольких узких полосок и вступающие в реакцию с кардиомаркерами СТ и HFBP по меньшей мере в одном образце крови, чтобы создать визуальный сигнал(ы), если концентрация каждого из указанных маркеров превышает определенное заданное пороговое значение, указанная полоса дополнительно содержит контрольные полоски, демонстрирующие сравнительные интенсивности цвета либо до, либо после контакта с указанным образцом крови, причем несколько указанных узких полосок в некоторых случаях вступают в реакцию с указанными маркерами в указанном образце крови с различными чувствительностями и создают указанные визуальные сигналы при различных концентрациях маркера. Устройство по изобретению обеспечивает оценку концентрации СТ и/или HFBP в указанном образце, основанную либо на сравнении интенсивностей указанного
сигнала(ов) с указанными сравнительными интенсивностями, либо на сравнении двух сигналов, соответствующих двум различным концентрациям маркера. По одному аспекту изобретения, оценка концентрации СТ и/или HFBP в указанном образце обеспечивает оценку времени, прошедшего между отбором образца и событием ОИМ. В одном примере устройства, согласно изобретению, указанное пороговое значение составляет 0,5 нг/мл для СТ и 10 нг/мл для HFBP для одной из указанных нескольких узких полосок, причем положительный сигнал указывает на то, что событие ОИМ произошло у донора указанного образца не менее одного часа назад. В другом примере устройства, согласно изобретению, указанное заданное пороговое значение составляет 1 нг/мл для СТ и 20 нг/мл для HFBP для одной из указанных нескольких узких полосок, причем положительный сигнал указывает на то, что событие ОИМ произошло у донора указанного образца не менее трех часов назад. В еще одном примере устройства, согласно изобретению, указанное заданное пороговое значение составляет 4 нг/мл для СТ и 80 нг/мл для HFBP для одной из указанных нескольких узких полосок, причем положительный сигнал указывает на то, что событие ОИМ произошло у донора указанного образца не менее девяти часов назад. Комбинированные сигналы нескольких "хорошо отлаженных" полосок обеспечивают более точные результаты. Например, устройство, согласно изобретению, может включать в себя полоску с пороговым значением 0,5 нг/мл для СТ и 10 нг/мл для HFBP, и другую полоску с пороговым значением 1 нг/мл для СТ и 20 нг/мл для HFBP, причем положительный сигнал в первой указанной полоске вместе с отрицательным сигналом во второй указанной полоске указывают на то, что событие ОИМ произошло в указанном донорском образце в период, примерно, от 3 до 6 часов тому назад.
Изобретение обеспечивает способ диагностики кардиального события, в частности ОИМ, включающий взятие образца крови пациента с подозрением на наличие такого события, например пациента, страдающего от боли в груди по ишемическому типу, и нанесение образца на устройство иммуноанализа, содержащее смесь по меньшей мере двух антител или конъюгатов антител, которая вступает в реакцию по меньшей мере с СТ и HFBP. В другом аспекте изобретения, берутся по меньшей мере два образца в два разных периода времени, причем оценки концентраций СТ и/или HFBP в указанных двух образцах повышают точность оценки времени события ОИМ.
Подробное описание сущности изобретения
Авторы изобретения обнаружили, что одновременное выявление двух сердечных маркеров крови с использованием смеси антител или конъюгатов антител может исключить необходимость использования предыдущих способов, имеющих целью раннее подтверждение кардиального события в случае, например, боли в груди по ишемическому типу или при других симптомах. Изобретение представляет собой устройство экспресс-диагностирования сердечной деятельности, позволяющее быстро диагностировать пациента с подозрением на наличие кардиального события, в частности острого инфаркта миокарда (ОИМ), в течение наиболее критического периода, составляющего несколько часов с момента события. В одном аспекте, изобретение обеспечивает качественный латеральный проточный иммунохроматографический анализ, включающий смесь двух антител или конъюгатов антител, каждое из которых является специфичным для одного кардиомаркера и нацелено на одновременное выявление обоих маркеров при низких концентрациях, характерных для ранних стадий кардиального события, в то время как комбинированный сигнал
иммуноанализа, созданный обоими маркерами, при превышении определенного порогового уровня указывает на наличие события. В предпочтительном варианте осуществления изобретения, один из маркеров представляет собой сердечный тропонин (СТ), а другой представляет собой сердечную форму белка, связывающего жирные кислоты (HFBP). В одном варианте осуществления изобретения, HFBP выявляется примерно через полчаса после появления симптомов, тогда как уровни в это время составляют около 5 нг/мл (базовые уровни 95% здорового населения находятся в диапазоне 0,5-3,5), тогда как тропонин-I обнаруживается примерно через три часа после симптомов, когда его уровни превышают 1 нг/мл. Например, результаты клинических испытаний показали аддитивный эффект двух маркеров, причем каждый из них по отдельности был необнаруживаемым ниже определенной концентрации (обычно 1 нг/мл для тропонина и 5 нг/мл для HFBP), но оба вместе в тех же концентрациях обеспечивали истинно положительные результаты; в одном примере, 0,14 нг/мл тропонина или 4,92 нг/мл FABP не обнаруживался, а образец содержащий 0,14 нг/мл тропонина с 4,92 нг/мл HFBP стал обнаруживаться.
Применительно к "антителу" в описании изобретения, речь может идти как об антителе, так и о деривате антитела или конъюгате антитела, соответствующим аспектом которых является способность агента вступать в реакцию с антигеном, а именно с кардиомаркером. Смесь антител в устройстве или способе, согласно изобретению, может содержать более одного антитела против одного маркера; смесь может содержать антитела против нескольких форм маркера, например, против нескольких форм тропонина, или против нескольких эпитопов на одном и том же маркере. Разумеется, что устройство и способ, согласно изобретению, используют известные в данной области реакции, такие как реакции комплекса антитело-антиген с другим антителом или конъюгатом антитела, целью которых является получение как можно более сильного визуального сигнала. Например, в одном варианте осуществления изобретения, устройство включает два антитела для реакции с СТ и одно антитело для реакции с HFBP, а также два конъюгата антител для реакции с комплексами СТ и один конъюгат антитела для реакции с комплексами HFBP.
Согласно одному аспекту, анализ нацелен на качественное определение HFBP и тропонина I в образце цельной крови диагностируемого пациента, указанные маркеры обычно обнаруживаются в крови в течение 1 часа и в течение 4 часов, соответственно, после повреждения миокарда, при раздельном контроле, причем следует отметить, что существующая практика не основывается на обнаружении только HFBP.
Средства раздельного обнаружения HFBP и тропонина I были описаны; однако, изобретение объединяет две отдельные реакции в один эффект, который выражается в одном индикаторном сигнале. В важном аспекте изобретения, устройство, включающее в себя смесь антител или конъюгатов антител, специфичных для двух кардиомаркеров, одновременно обнаруживает комбинированные минимальные уровни кардиотропонина I и/или HFBP; в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения, указанные минимальные уровни могут быть едва различимы, если измеряются отдельно. Преимущественно, устройство по изобретению обеспечивает результаты через несколько минут, например от 10 до 15 минут; очень важно, что результаты могут быть получены в течение первых нескольких наиболее критических часов после кардиального события, в частности в течение четырех часов, например, в течение трех часов или в течение двух часов. Дело в том, что положительный результат при обнаружении повышенных уровней HFBP и СТ после предполагаемого кардиального события у пациента указывает на чрезвычайную ситуацию и предписывает госпитализацию пациента в больницу; новый подход к объединению обоих маркеров в одну линию упрощает интерпретацию практических результатов. Более того, общая линия теста для двух кардиомаркеров улучшает сенситивность теста, в котором комплексы большего количества антител или конъюгатов антител, таких как анти-HFBP и антитропонин I, способствуют интенсивности одной и той же полоски. Благодаря этому накопительному эффекту обнаруживается меньше маркеров в одной полоске, содержащей смесь антител, чем в двух отдельных полосках, содержащих раздельные антитела или конъюгаты антител. Однако, основным преимуществом нового устройства и способа является усредняющий эффект сочетания сигналов в критический период от одного до четырех часов после события ОИМ, что обеспечивает быстрые и надежные результаты практически в режиме онлайн.
Изобретение будет далее описано и проиллюстрировано следующими примерами.
Примеры
Были получены конъюгаты антител, обеспечивающие цветную реакцию с СТ, HFBP или человеческим сывороточным альбумином, в частности антитропонин I, анти-HFBP и анти-HSA (anti Human Serum Albumin - антитела к сывороточному альбумину человека). Конъюгаты антител применялись для иммобилизации в узких полосках, на полосах капиллярных ложе, сконфигурированных на иммобилизацию
конъюгатов антител. Были использованы полосы для подготовки устройств латерального проточного иммуноанализа (далее LFID). Иммобилизуя ряд конъюгатных количеств/концентраций (объемы определенных концентраций, которые должны быть нанесены на полосу для иммобилизации конъюгата, соответствующие различным общим количествам цветобразующих реагентов в полоске), и посредством взаимодействия полосок с рядом образцов, содержащих различные концентрации антигена, для всех антигенов были определены необходимые количества реагентов для желаемой интенсивности сигнала. Были определены следующие пороговые количества/концентрации: количество антитропонина I для обнаружения 1 нг/мл тропонина I в образце и количество aHTH-FABP-3 для обнаружения 5 нг/мл HFBP в образце, пороговые количества, соответствующие максимальной величине, обеспечивающей неразличимый цветовой сигнал. Образцы, включающие 3 нг/мл тропонина-I или 15 мг/мл HFBP, обеспечили при одинаковых условиях достаточно яркие цветовые полоски. Анти-HSA применялся в таком количестве, чтобы обеспечить сильный сигнал (примерно в 10 раз сильнее, чем 3 нг/мл тропонина-I с тропониновой полоской) и служить в качестве контроля того, что LFID в принципе работает. Смесь конъюгатов антител была подготовлена путем смешивания указанного порогового количества антитропонина I и указанного порогового количества FABP-3.
Было подготовлено девять LFID, все из которых содержали контрольную полоску HSA (Human Serum Albumin - сывороточный альбумин человека); три содержали пороговое количество для обнаружения 1 нг/мл тропонина-I, три содержали пороговое количество для обнаружения 5 нг/мл HFBP, и еще три содержали полоску со смешанными конъюгатами антител, включающими указанные
пороговые количества антитропонина-I и анти-HFBP. Образец человеческой крови от здорового донора (с очень низкими уровнями кардиомаркеров) был разделен на три порции: тропонин-1 был добавлен в первую порцию до концентрации 1 нг/мл, HFBP был добавлен во вторую порцию до концентрации 5 нг/мл, и оба маркера были добавлены в концентрациях 1 и 5 нг/мл, соответственно, в третью порцию. Каждую порцию наносили на LFIDs, включающие соответствующее антитело. Различимые сигналы появились (+) или не появились (-) в устройствах, как показано в Таблице 1.
Таблица 1
Наличие (+) или отсутствие (-) видимого сигнала в девяти устройствах. Три устройства содержали анти-СТ, следующие три устройства содержали анти-HFBP, и еще три содержали смесь антител; образец крови, содержащий 1 нг/мл добавленного тропонина-I, был нанесен на устройства с анти-СТ; образец крови, содержащий 5 нг/мл HFBP был нанесен на устройства с анти-HFBP; образец крови, содержащий 1 нг/мл добавленного тропонина-I и 5 нг/мл добавленного HFBP, был нанесен на устройства со смесями.
С - контроль, М - кардиомаркер.
В таблице показаны достоверные результаты, полученные с устройств (в трех экземплярах). Концентрации 1 и 5 нг/мл двух маркеров, соответственно, относятся к очень ранней стадии 25 кардиального события. Таблица показывает, что устройство по изобретению может предоставить релевантную информацию, способствующую ранней диагностике ОИМ.
Хотя данное изобретение и описано с точки зрения некоторых конкретных примеров, возможны многие модификации и вариации. Поэтому предполагается, что в рамках приложенной формулы изобретения, указанное изобретение может быть реализовано иначе, чем конкретно описано.