СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ГОРМОНОЗАВИСИМОСТИ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ У ПЕРВИЧНЫХ БОЛЬНЫХ МЕНОПАУЗАЛЬНОГО ВОЗРАСТА
METHOD FOR PREDICTION OF HORMONE DEPENDENCE OF BREAST CANCER IN PRIMARY MENOPAUSAL PATIENTS

Изобретение относится к медицине, в частности к онкологии, и эндокринологии, и может быть использовано для прогнозирования гормонозависимости рака молочной железы (РМЖ) у первичных больных менопаузального возраста.
РМЖ является гетерогенным заболеванием, различающимся по течению и чувствительности к проводимой терапии. Основными критериями для разделения этой патологии на определенные биологические типы служат морфологические, клинико-эпидемиологические и молекулярно-генетические признаки.
Известен способ прогнозирования гормонозависимости РМЖ, основанный на выявлении в опухоли рецепторов стероидных гормонов: эстрогенов (РЭ) и прогестерона (РП), присутствие которых свидетельствует о чувствительности опухоли к гормонотерапии (Hammond ME. et al., "American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for immunohistochemical testing of estrogen and progesterone receptors in breast cancer". Arch Pathol Lab Med. 2010, 134:e48-e72).
Недостатком способа является его инвазивность и отсутствие полной корреляции между наличием в опухоли РЭ и РП и эффективностью последующей гормональной терапии. Это заставляет расширять панель признаков, характеризующих биологические свойства РМЖ и, в частности, его гормонозависимость.
В качестве таких признаков были исследованы в том числе подтипы рецепторов эстрогенов - РЭα и РЭβ (Leitman DC. et al., "Regulation of specific target genes and biological responses by estrogen receptor subtype agonists". Curr Opin Pharmacol. 2010; 10(6):629-636), каждый из которых кодируется определенными, специфическими генами, что приводит к различным биологическим эффектам. Разрабатываются также методики, позволяющие дать генетическую характеристику биологических подтипов РМЖ. Так, исследование 21-генной шкалы риска (Oncotype DX, Genomic Health) позволило увеличить точность в предсказании чувствительности опухолей с наличием РЭ к адъювантной терапии.
Однако как методы определения подтипов рецепторов эстрогенов, так и анализ генетических шкал в силу их сложности и дороговизны в настоящий момент не могут быть использованы в клинической практике.
Известен способ прогнозирования гормонозависимости РМЖ, основанный на оценке таких признаков, как экспрессия в опухолевой ткани РЭ, РП и рецептора эпидермального фактора роста - HER2, индекса пролиферации - Ki67 и степени злокачественности - G (Perou С.M. "Molecular Stratification of Triple-Negative Breast Cancers". The Oncologist 2011, 16 Supplement 1:61-70). На основании этих признаков выделяют 5 подтипов РМЖ, основанных на позитивном (+) или негативном (-) значении РЭ, РП, HER2 и величине G:
Люминальный A: РЭ+, РП+, HER2-, G<3
Люминальный B (HER 2 - негативный): РЭ+, РП+, HER2-, G>3
Люминальный B (HER2 - позитивный): РЭ+, РП+, HER2+, G>3
Рецепторнегативный HER 2 - экспрессирующий: РЭ-, РП-, HER2+, G>3
Базальноподобный, трижды негативный: РЭ-0, РП-0, HER2-
Этот способ принят авторами за прототип.
Прототип имеет недостатки. Несмотря на большие достижения в области определения биологических особенностей РМЖ, на практике пациенты, отнесенные к гормонозависимым типам опухоли, т.е. к люминальному A и люминальному B (в частности, HER 2 - негативному), не всегда эффективно реагируют на гормонотерапию. Так, показано, что только 70%, а то и меньшая доля больных с РЭ+ и РП+ опухолями отвечают на антигормональные препараты и, напротив, гормонотерапия оказывается эффективной примерно у 20-30% больных, опухоли которых отнесены к рецепторнегативным. Так, в работе E.Alba и соавт. ("Chemotherapy (СТ) and hormonotherapy (НТ) as neoadjuvant treatment in luminal breast cancer patients: results from the GEICAM/2006-03, a multicenter, randomized, phase-II study". Oncology 2012; 23(12):3069-3074) показано, что в группе из 48 пациентов с люминальным A типом РМЖ неоадъювантная гормонотерапия была эффективна только у половины больных. В исследовании, в котором использовали неоадьювантную терапию гозерелином в сочетании с анастрозолом или тамоксифеном (Masuda N. et al., "Neoadjuvant anastrozole versus tamoxifen in patients receiving goserelin for premenopausal breast cancer (STAGE): a double-blind, randomised phase 3 trial". Lancet Oncol. 2012, 13(4):345-352) у больных в пременопаузе с РЭ+ и HER 2-негативными операбельными опухолями, полный или частичный эффект терапии был получен в 70,4% (69 из 98 пациенток) при применении гозерелина и анастрозола и в 50,5% (50 из 99 пациенток) на фоне терапии газорелин + тамоксифен. К недостаткам прототипа относится и необходимость инвазивного воздействия.
Это заставляет вести дальнейший поиск доступных критериев, позволяющих охарактеризовать биологический тип РМЖ и наиболее успешно проводить терапию этого заболевания. Ведя такой поиск представляется целесообразным основываться и на особенностях организма, оказывающих влияние на возникновение опухоли и ее течение.
В определенном отношении, интегральным показателем гормонально-метаболических нарушений может служить индекс массы тела (ИМТ), связь которого с возникновением и течением некоторых новообразований доказана многими исследованиями. Отмечено, что увеличение массы тела положительно коррелирует с заболеваемостью РМЖ в менопаузальном возрасте и отрицательно у молодых женщин. С другой стороны, в некоторых исследованиях показано, что пациентки, у которых отмечено повышение веса тела в менопаузе, с большей частотой являлись носительницами рецепторпозитивных опухолей (Vrieling A, "Adult weight gain in relation to breast cancer risk by estrogen and progesterone receptor status: a meta-analysis". Breast Cancer Res. Treat. 2010, 123(3):641-649).
Техническим результатом изобретения является расширение арсенала средств для прогнозирования гормонозависимости РМЖ у первичных больных менопаузального возраста, а также неинвазивность предлагаемого способа.
Указанный технический результат достигается тем, что в способе прогнозирования гормонозависимости рака молочной железы у первичных больных менопаузального возраста, согласно изобретению, исследуют микровязкость мембран эритроцитов венозной крови путем определения коэффициента эксимеризации пирена в липид/липидном слое и при его значениях более 1,7 усл.ед. прогнозируют гормонозависимость рака молочной железы.
Известно, что метаболический статус организма может быть охарактеризован на основании такого интегрального признака как свойства мембран эритроцитов, в частности их вязкости, которая зависит от содержания в мембране холестерина, фосфолипидов и белка и реагирует на изменения углеводного и липидного обмена. Текучесть и обратная ей величина - вязкость зависят от структуры мембраны и белок-липидных и липид-липидных взаимодействий в ней. Показано, что эритроциты реагируют изменением микровязкости мембран и на злокачественный рост. Повышение микровязкости липидного бислоя эритроцитарных мембран наблюдали при раке желудка и кишечника, снижение - при злокачественной лимфоме (Горошинская И.А. и др. "Изменение микровязкости мембран лимфоцитов и эритроцитов крови у онкологических больных". Вопросы мед химии 1999, 45, 1:53-57). С другой стороны, повышение текучести, т.е. снижение вязкости мембран, которое отмечено при увеличении ненасыщенности липидов плазмы, у больных РМЖ ассоциировалось с более благоприятным прогнозом (Корман Д.Б. и др. "Ненасыщенные липиды крови у больных раком молочной железы". Известия АН. Серия биологическая 1992, 2:206-214), хотя этот вопрос нельзя считать окончательно изученным. Действительно, при запущенных формах опухоли, напротив, отмечали повышение микровязкости мембран и снижение текучести.
Предлагаемый способ основан на обследовании 114 первичных (т.е. до начала специфической терапии) больных РМЖ. Из них 72 пациентки находились в состоянии менопаузы, а у 42 имелся сохраненный менструальный цикл. Оценку вязкости мембран эритроцитов проводили за 1-2 дня до операции.
Все больные были подвергнуты хирургическому лечению, в удаленной опухоли иммуногистохимически в целях сравнения с полученными до операции сведениями о микровязкости эритроцитарных мембран определяли уровень РЭ, РП, экспрессию HER-2/neu и показатель степени злокачественности G. В группу рецепторположительных относили опухоли, уровень РЭ и РП в которых был ≥7 баллов по Allred (O. Brouckaert et al. "A critical review: why assessment of steroid hormone receptors in breast cancer should be quantitative". Ann. Oncol. 2013, 24(1): 47-53). Люминальный A и люминальный B (HER2 - негативный) типы различались только по величине степени злокачественности G (см. выше и Hammond ME. et al. "American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists Guideline Recommendations for Immunohistochemical Testing of Estrogen and Progesterone Receptors in Breast Cancer?". J Oncol Pract. 2010; 6(4):195-197).
В результате исследования выяснилось (см. табл.1), что вязкость мембран эритроцитов различается в зависимости от типа РМЖ. В частности, она повышается в бел/лип и, в особенности, лип/лип слоях мембраны по мере утраты гормонозависимости, что находит отражение в снижении коэффициента эксимеризации (КЭ) пирена. При этом разница в величине КЭ пирена в лип/лип слое между менопаузальными пациентами с трижды-негативным и люминальным A типами опухолей была статистически достоверной.
Таблица 1
Вязкость мембран эритроцитов у больных с различным рецепторным фенотипом опухолей молочной железы
Группы
Состояние репродуктивной функции
Число больных
КЭ пирена бел/лип слоя (усл.ед.)
КЭ пирена лип/лип слоя (усл.ед.)
ИМТ, усл.ед.
Люм. A (РЭ+, РП+, HER2<2, G<3)
Сохраненный менстр. цикл
16
1,04±0,07
1,8±0,1
25,16±1,16
Менопауза
21
1,01±0,06
1,8±0,07
28,6±0,8
Люм. B (РЭ+, РП+, HER2<2, G≥3)
Сохраненный менстр. цикл
10
0,95±0,09
1,45±0,2
23,6±1,74
Менопауза
8
1,03±0,05
1,49±0,15
27,8±1,6
Люм. B (РЭ+, РП+, HER2≥2, G≥3)
Сохраненный менстр. цикл
8
0,8±0,13
1,6±0,15
24,1±1,1
Менопауза
6
0,9±0,05
1,46±0,22
29,2±2,3
РЭ<7, РП<7, HER2>1 и G≥3
Сохраненный менстр. цикл
6
1,1±0,1
1,42±0,2
25,8±1,2
Менопауза
10
1,03±0,6
1,40±0,2
26,6±1,8
Трижды-негативный вариант РМЖ
Сохраненный менстр. цикл
7
0,91±0,1
1,45±0,15
23,5±1,2
Менопауза
11
0,97±0,07
1,3±0,2*
29,2±1,6
* Разница достоверна в сравнении с менопаузальными больными с люминальным - A вариантом опухолей
Повышение вязкости мембран эритроцитов по мере утраты опухолью гормонозависимости подтверждается и при определении доли больных с пониженным КЭ пирена в группах с различным содержанием РЭ и РП. Ориентируясь на медиану КЭ пирена, которая в бел/лип слое равнялась 1,0 усл.ед., а в лип/лип - 1,7 усл.ед., установили, что у больных с рецепторпозитивным типом опухоли вязкость мембран эритроцитов была повышена (т.е. КЭ пирена был ниже медианы) в репродуктивном возрасте в бел/лип слое в 50% и в лип/лип слое также в 50% наблюдений, в то время как в менопаузальном возрасте эти показатели были заметно ниже и равны, соответственно, 35,7% и 39%. С другой стороны, при рецепторнегативных опухолях количество больных репродуктивного возраста с повышенной вязкостью мембран эритроцитов в бел/лип слое также составило 50%, но в лип/лип слое возросло в большей степени (до 70%), а в группе менопаузальных больных соответствующие показатели оказались равны 34,6% и 61,5%.
Таблица 2
Доля лиц со сниженным коэффициентом эксимеризации пирена, т.е. с повышенной микровязкостью эритроцитарных мембран, среди больных репродуктивного и менопаузального возраста - носительниц рецепторпозитивных и рецепторнегативных опухолей
Группы
Состояние репродуктивной функции
Число больных в группе
Доля пациенток с КЭ пирена в бел/лип слое <1,0 усл.ед.
Доля пациенток с КЭ пирена в лип/лип слое <1,7 усл.ед.
РЭ≥7, РП≥7
Сохраненный менстр. цикл
27
50%
50%
Менопауза
28
35,7%
39%
РЭ<7, РП<7
Сохраненный менстр. цикл
10
50%
70%
Менопауза
26
34,6%
61,5%
Трижды-негативные
Сохраненный менстр. цикл
7
57%
71,4%
Менопауза
11
45%
81,8%
Наиболее значимое повышение вязкости мембран эритроцитов в лип/лип слое отмечено в группе больных с трижды-негативными (гормононезависимыми) опухолями, где доля больных с уровнем КЭ пирена ниже медианы составила 71,4% у больных репродуктивного возраста и 81,8% для пациентов в менопаузе (табл.2).
Таблица 3
Вязкость мембран эритроцитов у пациентов с различным содержанием в опухоли рецепторов эстрогенов
Группы
Состояние репродуктивной функции
Число больных в группе
КЭ пирена в бел/лип слое (усл.ед.)
КЭ пирена в лип/лип слое (усл.ед.)
P
РЭ=8 баллам
Сохраненный менстр. цикл
27
0,95±0,05
1,65±0,08
Менопауза
41
0,99±0,03
1,83±0,08
РЭ=7 баллам
Сохраненный менстр. цикл
5
0,93±0,16
1,70±0,2
Менопауза
5
1,08±0,2
1,7±0,2
РЭ≥6 баллов
Сохраненный менстр. цикл
9
0,94±0,14
1,4±0,19
Менопауза
25
1,03±0,05
1,53±0,08
<0,02*
*p в сопоставлении с группой больных менопаузального возраста содержанием РЭ в опухоли на уровне 8 баллов.
Если сопоставить данные по КЭ пирена только с уровнем РЭ, то подтверждается достоверное снижение вязкости мембран эритроцитов в лип/лип слое у пациенток менопаузального возраста с рецепторпозитивными новообразованиями (табл.3).
Таблица 4
Коэффициенты корреляции по Спирмену между содержанием рецепторов в опухоли и величиной коэффициента эксимеризации (КЭ) пирена в липид/липидном слое эритроцитарных мембран
Группы
Сопоставляемые показатели
Число Больных
Коэф. корр.
P
Все больные
КЭ лип/лип и РЭ
112
0,25
0,007
КЭ лип/лип и РП
112
0,19
0,03
С сохраненным менстр. циклом
КЭ лип/лип и РЭ
41
0,19
0,23
КЭ лип/лип и РП
41
0,2
0,2
В менопаузе
КЭ лип/лип и РЭ
71
0,3
0,09
КЭ лип/лип и РП
71
0,23
0,03
Имеется и определенная зависимость между показателем вязкости мембран эритроцитов в лип/лип слое и степенью злокачественности (G). Это можно видеть при сопоставлении значений КЭ пирена в лип/лип слое у пациентов с люминальным A и люминальным B типами опухолей, различающихся только по величине G (см. табл.1).
Значение вязкости мембран эритроцитов в лип/лип слое, как потенциального критерия в определении гормонозависимости РМЖ у больных в менопаузе, подтверждается достоверной положительной линейной (коэффициент корреляции с РЭ=0,28 и с РП=0,24; в обоих случаях p<0,05) и непараметрической взаимосвязью (табл.4) этого показателя с содержанием рецепторов в опухолевой ткани.
В дополнение выяснилось, что определенный вклад во взаимоотношения, складывающиеся между рецепторным фенотипом опухоли и микровязкостью эритроцитарных мембран, вносит и величина индекса массы тела (ИМТ). В частности, установлена тенденция к снижению вязкости мембран эритроцитов в лип/лип слое, выражавшаяся в повышении КЭ пирена у больных в менопаузе с более высоким ИМТ (табл.5). Так, среднее значение КЭ пирена в лип/лип слое у больных с ИМТ>25%, опухоли которых характеризовались высоким уровнем РЭ (≥7 баллов), составило 1,83±0,07 усл.ед. (что указывает на снижение микровязкости) и только 35% больных из этой группы имели КЭ ниже 1,7 усл.ед. В то же время у больных с рецепторнегативными опухолями и величиной ИМТ<25% эти показатели равнялись соответственно 1,36±0,2 усл.ед и 85%. Это согласуется и с представлением о связи повышенного веса тела с развитием рецепторпозитивных опухолей у женщин менопаузального возраста (V. Forte et al. "Obesity, Diabetes, the Cardiorenal Syndrome, and Risk for Cancer". Cardiorenal Med 2012; 2:143-162, Ligibel JA, Strickler HD. "Obesity and its impact on breast cancer: tumor incidence, recurrence, survival and possible interventions". Am Soc Clin Oncol Educ Book. 2013, 52-59).
Хотя при корреляционном анализе установить наличие достоверных связей между ИМТ и вязкостью эритроцитарных мембран не удалось, полученные результаты указывают на то, что в менопаузе у больных раком молочной железы с P+ новообразованиями снижение вязкости мембран эритроцитов в лип/лип слое чаще сочеталось с повышенным ИМТ, что расценивается нами как дополнительный признак, указывающий на вероятную гормонозависимость опухоли.
Таблица 5
Вязкость мембран эритроцитов у больных РМЖ в менопаузе в сопоставлении с уровнем рецепторов в опухоли и индексом массы тела
Группа
Число больных
ИМТ, усл.ед. (по группам)
ИМТ, усл.ед.
КЭ пирена вбел/лип слое (усл.ед.)
Доля 6-х с КЭ пирена в бел/лип слое <1,0 усл.ед.
КЭ пирена в лип/лип слое (усл.ед.)
Доля 6-х с КЭ пирена в лип/лип слое <1,7 усл.ед.
РЭ<7
7
<25
22,5±1,0
1,17±0,1
14%
1,36±0,2
85%
17
≥25
30,2±0,9
1,0±0,07
41%
1,6±0,1
53%
РЭ>7
12
<25
22,4±0,5
0,99±0,2
42%
1,78±0,5
50%
34
≥25
30,1±0,5
1,0±0,04
35%
1,83±0,0
35%
* Различия с группой пациентов с РЭ в опухолях <7 баллов и ИМТ <25% статистически достоверны.
В совокупности полученные данные дают возможность заключить, что повышение у менопаузальных больных с рецепторпозитивными опухолями молочной железы коэффициента эксимеризации пирена в липид/липидном слое мембран эритроцитов выше 1,7 усл.ед., отражающее снижение микровязкости клеточных мембран, может рассматриваться как новый внеопухолевый критерий прогнозирования гормонозависимости РМЖ.
Способ осуществляют следующим образом.
У пациентов с РМЖ выделяют мембраны эритроцитов и определяют вязкость этих мембран, используя флуоресценцию пирена. Вязкость оценивают по коэффициенту эксимеризации (КЭ) пирена, т.е. по отношению интенсивности флуоресценции эксимеров (димеров) пирена на волне 470 нм к показателю флуоресценции его мономеров на волне 370 нм. Избранными волнами возбуждения были 285 нм [для оценки микровязкости мембран зон белок-липидных (б/л) контактов] и 340 нм [в целях изучения микровязкости липид/липидного (л/л) слоя мембраны]. Определение вязкости проводится на спектрофлуориметре (MPF-4 «Hitachi»). Если КЭ в липид/липидном слое более 1,7 усл.ед. прогнозируют гормонозависимость РМЖ.
Способ иллюстрируется следующими клиническими примерами.
Пример 1. Пациентка К.В.Н., 64 лет, прооперирована по поводу опухоли левой молочной железы, стадия T1cN1M0. Гистологическое исследование выявило инвазивную протоковую карциному молочной железы с инфильтрацией жировой клетчатки, степень злокачественности (G) - 2, опухолевый узел 1,5 см в наибольшем измерении, депозиты в 1 из 6 лимфатических узлов. Исследование микровязкости мембран эритроцитов: КЭ пирена в лип/лип слое 2,48 усл.ед. (КЭ более 1,7 усл.ед., то есть микровязкость снижена) - прогнозируют гормонозависимость РМЖ. Результат подтверждается при последующем иммуногистохимическом исследовании HER2 - 1+, РЭ - 8 баллов, РП - 8 баллов.
Пример 2. Пациентка Ч.Л.И., 59 лет, прооперирована по поводу опухоли левой молочной железы, стадия T2N0M0. Гистологическое исследование выявило инвазивную дольковую карциному G3, опухолевый узел 2,5 см в наибольшем измерении, 5 лимфатических узлов без вторичных изменений. Исследование микровязкости мембран эритроцитов: КЭ пирена в лип/лип слое 2,16 усл.ед. (КЭ более 1,7 усл.ед. - микровязкость снижена) - прогнозируют гормонозависимость РМЖ; последующее иммуногисто-химическое исследование ткани опухоли: HER2 - 1+, РЭ - 8 баллов, РП - 8 баллов.
Пример 3. Пациентка Р.И.Г., 52 лет, прооперирована по поводу опухоли левой молочной железы, стадия T2N0M0. Гистологическое исследование выявило инвазивную протоковую карциному in situ солидного строения молочной железы, степень злокачественности (G) - 3, опухолевый узел 2,2 см в наибольшем измерении, 9 исследованых лимфатических узлов без депозитов. Исследование микровязкости мембран эритроцитов: КЭ пирена в лип/лип слое - 0,85 усл. ед. (КЭ менее 1,7 усл.ед. - микровязкость повышена) - прогнозируют отсутствие гормонозависимости; последующее иммуногистохимическое исследование ткани опухоли подтверждает отсутствие гормонозависимости: HER2 - 3+, РЭ - 0 баллов, РП - 0 баллов.
Пример 4. Пациентка Л.Т.Н., 55 лет, прооперирована по поводу опухоли правой молочной железы, стадия T1N0M0. Гистологическое исследование выявило инвазивную протоковую карциному молочной железы, степень злокачественности (G) - 3, с внутрипротоковым компонентом плоского и микропапиллярного типа, опухолевый узел 0,9 см в наибольшем измерении, 7 исследованных лимфатических узлов без депозитов. Анализ микровязкости мембран эритроцитов: КЭ пирена в лип/лип слое 1,42 усл.ед. (микровязкость повышена); последующее иммуногистохимическое исследование ткани опухоли: HER2 - 3+, РЭ - 0 баллов, РП - 0 баллов.
Исследования показали, что коэффициент эксимеризации пирена в зоне липид/липидных контактов у менопаузальных больных с рецепторпозитивными опухолями молочной железы меньше 1,7 усл.ед. говорит о худшем прогнозе в отношении чувствительности к гормонотерапии.
Предлагаемый способ позволяет расширить арсенал средств для прогнозирования гормонозависимости РМЖ и может служить дополнительным и не требующим взятия ткани новообразования предиктором гормонозависимости РМЖ у первичных больных менопаузального возраста.