ПРОТИВОТУБЕРКУЛЕЗНОЕ СРЕДСТВО В ВИДЕ РАСТВОРА ДЛЯ ИНЪЕКЦИИ
TUBERCULOUS AGENT AS SOLUTION FOR INJECTION

Изобретение относится к области медицины, а именно к средствам, обладающим противотуберкулезным действием и используемым во фтизиатрии.
В нашей стране наблюдается увеличение случаев заболевания высококонтагинозной открытой (легочной) формой туберкулеза. Лечение туберкулеза осложняется способностью возбудителя туберкулеза изменяться в макроорганизме и в таком виде переживать неблагоприятные условия (возникновение Л-форм), что ведет к развитию лекарственной устойчивости к противотуберкулезным препаратам, а также к изменениям вирулентности с сохранением основного качества - патогенности. Для преодоления этой проблемы необходимо использовать во фтизиатрии новые противотуберкулезные препараты. В настоящее время препаратами 1 группы при лечении туберкулеза являются изониазид и рифампицин, обладающие высокой бактериостатической активностью в отношении микобактерий туберкулеза. Следует отметить, что несмотря на высокую активность этих препаратов по отношению к возбудителю туберкулеза они обладают рядом нежелательных побочных эффектов как аллергической, так и неаллергической природы. Так, для изониазида характерны такие побочные эффекты, как влияние на ЦНС (судороги, психические нарушения и др.), невриты, аллергические реакции. Для рифампицина можно выделить диспепсические нарушения, угнетение функции печени, аллергические реакции, а также развитие суперинфекции и быстрое развитие устойчивости микобактерий туберкулеза к рифампицину. Данные побочные эффекты могут носить угрожающий характер и являются показанием к отмене препарата.
Известна фармацевтическая композиция (изониазид для инъекции), обладающая противотуберкулезным действием, включающая изониазид и приемлемый для фармацевтики носитель, в качестве которого может быть использован растворитель (М.Д.Машковский. Лекарственные средства. - М.: Медицина, 1988, с.315-316). Основным недостатком такой композиции является быстрое развитие лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза, что снижает его эффективность.
Для повышения противотуберкулезной активности препаратов и снижения токсического действия изониазида предложено в композицию, включающую изониазид, в качестве приемлемого для фармацевтики носителя дополнительно включить фторурацил. Эта композиция может быть выполнена в виде раствора и введена как внутримышечно, так и внутривенно. В качестве носителя может быть использована вода, 0,9-5% растворы натрия хлорида и др. (патент RU №2211035, МПК А61К 31/455, 2003).
Для улучшения биофармацевтических свойств изониазида, пролонгирования его действия и снижения токсичности предлагается использовать такие полимеры, как: этилцеллюлозу, β-циклодекстрин, пектины и др. (Овчаренко Л.П. Исследование соединений включения веществ производных изоникотиновой кислоты с β-циклодекстринами. Автореф. дис. канд. фармац. наук. - Пятигорск, 1991, с.21; Туркенбаева К.А., Шипунова О.В., Кривцова А.Е. и др. О возможности лечения туберкулеза полимерным изониазидом пролонгированного действия // Пробл. туберкулеза, 1990, №3, с.32-35). Известна композиция для лечения туберкулеза на основе изониазида, химически связанного с декстраном, и подходящего водного растворителя (патент RU №2087146, 2143900, МПК А61К 31/455, 1997, 2000). Существенным недостатком этой системы является ограниченность только одним лекарственным веществом.
Модифицированные противотуберкулезные препараты, синтезированные на полимерных матрицах и оказывающие пролонгирующее действие, часто приводят к нежелательным последствиям - образованию доброкачественных опухолей. Это связано с тем, что полимеры синтезированных препаратов на полимерных матрицах существенно снижают действие других лекарственных средств, применяемых в комплексе с производными изониазида [А.А.Приймак, Г.Б.Соколова, А.М.Белькинд, А.И.Сливкин и др. Лабораторно-экспериментальные исследования // Пробл. туберкулеза, 1987, №1, с.53].
Известно новое действующее вещество - изоглюкозил, синтезированный на мономерной углеводной матрице с содержанием изониазида 46,5%. Исследования in vivo показали, что изоглюкозил проявляет высокую бактериостатическую активность в отношении штаммов микобактерий туберкулеза и характеризуется низкой токсичностью по сравнению с изониазидом [Сливкин А.И., Лапенко В.Л., Сироткина Г.Г. и др. Полимерная форма гидразида изоникотиновой кислоты // Человек и лекарство: Тез. докл. IV Рос. нац. конгр. (8-12 апреля, 2002 г.). - М., 2002, с.698].
Задачей изобретения является создание лекарственного средства на базе изоглюкозила, у которого токсическое побочное действие сведено к минимуму, что позволит расширить ассортимент противотуберкулезных препаратов.
Технический результат заключается в высокой терапевтической эффективности и низкой токсичности.
Технический результат достигается тем, что предложено использовать для лечения туберкулеза противотуберкулезное средство в виде раствора для инъекции, включающее действующее начало, в качестве которого содержит 1-изоникотил-2-глюкозилгидразона дигидрат (изоглюкозил) в концентрации от 0,1% до 10% и приемлемый для фармацевтики носитель - воду для инъекции.
50
Изоглюкозил - производное изониазида, синтезированное на основе мономерной матрицы углеводного типа, - является противотуберкулезным соединением, его активность in vitro не уступает активности изониазида. Токсичность изоглюкозила значительно ниже токсичности изониазида (в 24 раза по показателю ЛД). Изоглюкозил способен на 12 часов дольше, чем изониазид, сохраняться на бактериостатическом уровне.
Широта терапевтического действия изоглюкозила в 15 раз выше изониазида при отсутствии негативных явлений, таких как острая и хроническая токсичность, эмбриотоксичность, тератоксичность, гепатотоксичность, характерных для изониазида. Изоглюказил обладает пролонгированным свойством, в связи с чем кратность его введения может быть сокращена вдвое.
12
17
3
6
2
ДЕЙСТВУЮЩЕЕ ВЕЩЕСТВО - Изоглюкозил (1-изоникотил-2-глюкозилгидразона дигидрат) - белый с кремовым оттенком порошок без запаха, устойчив на воздухе. Растворим в воде, мало растворим в спирте 95% и спирте метиловом, практически нерастворим в хлороформе. CHNO·2HO, мол.масса 335,3.
Структурная формула:
Вода для инъекций (ФС 42-2619-97)
Бесцветная прозрачная жидкость без запаха и вкуса, рН 5,0-6,8.
На фиг.1 изображен спектр поглощения 0,003% раствора изоглюкозила; на фиг.2 - общая технологическая схема изготовления раствора для инъекций; на фиг.3 - результаты определения стабильности 1%-ного раствора изоглюкозила для инъекций в процессе хранения при (20±2)°С; на фиг.4 - результаты определения стабильности 1% раствора методом "ускоренного старения" при (40±1)°С.
Для построения спектра поглощения и установления удельного показателя поглощения изоглюкозила готовили серии растворов с содержанием изоглюкозила 0,003%.
Точную навеску изоглюкозила (0,15 г) растворяли при нагревании на водяной бане в 100 мл воды очищенной (воды для инъекций). Из полученного раствора отбирали 2 мл, переносили в мерную колбу на 100 мл и доводили до метки водой очищенной.
Измеряли оптическую плотность спектрофотометрическим методом в УФ-области на спектрофотометре марки СФ-26, в кюветах с толщиной рабочего слоя 10 мм. Проводили 7 параллельных опытов.
Оптическую плотность 0,003% раствора измеряли в интервале длин волн 220-350 нм. Спектр поглощения изоглюкозила представлен на фиг.1. Максимальную оптическую плотность наблюдали при длине волны 261±2 нм.
Удельный показатель поглощения рассчитывали по формуле:
1см
где E - удельный показатель поглощения;
D - оптическая плотность;
С - концентрация раствора изоглюкозила, %.
Спектр поглощения 0,003% раствора изоглюкозила показан на фиг.1.
Среднее значение удельного показателя поглощения изоглюкозила рассчитывали по формуле:
cp.1см
где E - удельный показатель поглощения;
n - количество измерений.
Полученное среднее значение показателя поглощения изоглюкозила составило 130.
Для количественного определения изоглюкозила в субстанции точную навеску (0,1 г) изоглюкозила помещали в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяли в воде очищенной и доводили тем же растворителем до метки (раствор А).
Раствор А, объемом 1 мл, переносили в мерную колбу на 100 мл, доводили водой очищенной до метки (раствор Б). Оптическую плотность раствора Б измеряли на спектрофотометре марки СФ-26 в кювете с толщиной рабочего слоя 10 мм при длине волны 261 нм.
Содержание изоглюкозила рассчитывали по формуле:
,
где Х - содержание изоглюкозила, %;
D - оптическая плотность;
1см
E - удельный показатель поглощения, 130;
1
2
W, W - разведения, мл;
а - точная навеска изоглюкозила, г;
2
b - раствор Б, взятый для разведения W, мл.
Для количественного определения изоглюкозила в растворе 0,3 мл 1% раствора изоглюкозила помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл, добавляли часть воды очищенной, перемешивали и этим же растворителем доводили до метки, перемешивали. Оптическую плотность раствора измеряли на спектрофотометре марки СФ-26 в кювете с толщиной рабочего слоя 10 мм при длине волны 261 нм. Содержание изоглюкозила рассчитывали по формуле (3).
Хроматографию в тонком слое сорбента использовали при проведении теста идентификации изоглюкозила, а также подтверждения стабильности состава раствора в процессе хранения.
Хроматографирование выполняли на пластинах «Silufol UF-254» восходящим способом в трех системах растворителей: диметилформамид-метанол-хлороформ (0,25:1:9); хлороформ-метанол-водный раствор аммиака 25% (10:2,5:0,2); этанол-хлороформ-водный раствор аммиака 25% (5:5:1,5).
На дно хроматографической камеры помещали подвижную фазу для образования слоя глубиной 0,5 см, камеру закрывали и выдерживали для насыщения парами растворителя 30 минут. На линию старта подготовленной хроматографической пластины наносили исследуемый водный раствор изоглюкозила и раствор стандартного образца в воде очищенной.
Подсушивали подготовленные хроматографические пластины на воздухе и вносили в хроматографическую камеру с разными системами растворителей. По окончании выдержки хроматографические пластины вынимали из камеры, высушивали на воздухе для удаления растворителей, детекцию зон адсорбции проводили в УФ-свете.
Изготовление раствора изоглюкозила для инъекций осуществляли, руководствуясь основными положениями статьи ГФ XI изд. (1989, вып.2).
Общая технологическая схема изготовления раствора для инъекций представлена на фиг.2.
Раствор для наполнения ампул готовят в асептических условиях. В стерильной мерной посуде в части свежеперегнанной воды для инъекций растворяли изоглюкозил. Этой же водой доводили раствор до метки. Раствор фильтровали через стерильный стеклянный фильтр и проверяли на отсутствие механических включений.
Ампулы одинаковой вместимостью (5 мл) вскрывали (с помощью бруска наносят насечку и отламывают кончик капилляра).
С помощью шприца осуществляли наружную и внутреннюю мойку ампул водой очищенной, имеющей температуру 50-60°С.
Для сушки и стерилизации ампул их помещали в сушильный шкаф с температурой 200°С.
Ампулы на 5 мл наполняли с помощью шприца раствором, учитывая при этом фактический объем наполнения - 5,5 мл раствора в каждой ампуле.
Запайку ампул осуществляли способом оттяжки капилляра.
Раствор в ампулах стерилизовали при (120±1)°С 8 мин.
Оценка качества инъекционного раствора в ампулах.
Органолептический контроль - прозрачность, цветность. На отсутствие механических включений ампулы просматривали на белом и черном фоне в свете рефлекторной лампы. Осуществляли качественный и количественный анализ раствора.
Для определения срока годности 1% раствор изоглюкозила для инъекций в ампулах хранили в условиях комнатной температуры и методом "ускоренного старения" при температуре (40±1)°С. Результаты изучения стабильности раствора представлены на фиг.3, 4.
Выводы: 1% раствор изоглюкозила для инъекций стабилен при температуре 20°С в течение одного года (срок наблюдения).
Экспериментальный срок стабильности при 40°С - 46 суток, в пересчете на 20°С - 2 года.
Оценку острого токсического действия препарата проводили согласно методическим указаниям по изучению острого токсического действия фармакологических веществ («Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ», М., 2000, с.18-24).
19 линейным гибридам мышам-самцам препарат вводили внутривенно в дозах 1,5-2-4-5 г/кг; 19 линейным мышам-самкам - в дозах 1,5-2-2,5-5 г/кг.
Показано, что мыши переносили препарат в указанных дозах без летального эффекта и даже без признаков интоксикации и каких-либо изменений поведенческих реакций.
Внутрибрюшинное введение мышам и крысам препарата в дозах до 3 г/кг гибели не вызывало. Одиночная гибель отмечалась у животных, получавших препарат при дозах 3,5 г/кг и выше. Картина отравления животных при внутрибрюшинном введении существенно не отличалась. Гибель наступала у мышей через 1,5-2,5 ч, у крыс - через 2,0-2,5 ч. При вскрытии выживших животных через 10 суток после однократного введения препарата никаких патологических изменений во внутренних органах обнаружено не было.
Для сравнения токсичности проводили аналогичные опыты с изониазидом. Гибель от изониазида наступала через 40-90 минут.
Средние смертельные дозы препарата для мышей и крыс при внутрибрюшном введении равнялись 6200 мг/кг и 6000 мг/кг соответственно.
Таким образом, средняя смертельная доза препарата для мышей в 32 раза, а для крыс в 16 раз выше таковой изониазида.
Изучение хронической токсичности проводилось на белых беспородных крысах (123 самца и самок) с начальной массой 250-270 г. Животные были разделены на три группы: 1-я группа - контрольная, 2-я и 3-я - опытные. В каждой группе было по 41 крысе. Препарат вводили внутрибрюшинно в физиологическом растворе в объеме 1 мл на 100 г массы тела 7 дней в неделю в течение 6 месяцев. Дозы: 80 мг/кг (предполагаемая терапевтическая доза) и 1000 мг/кг массы тела (1/3 максимально нелетальной дозы препарата). Контрольным - в равном объеме физиологический раствор.
Для оценки токсических свойств препарата использовали физиологические, гематологические, биохимические, морфологические методы исследования, характеризующие функции различных органов и систем организма. Анализ функционального состояния органов и систем по рекомендованным методам проводили до введения препарата (фон), затем через 1, 2, 4, 6 месяцев после начала введения и спустя 1 месяц после отмены препарата. Кровь брали из подъязычной вены.
Было установлено: клинические характеристики (поведение, общее состояние, результаты гематологических и биохимических исследований) не отличались от таковых у контрольной группы; макроскопических и гистологических изменений внутренних органов не обнаружено.
Эффективность противотуберкулезного препарата оценивали в опыте на морских свинках массой тела 350-400 г. Животных (80 голов) заражали 2-недельной культурой МБТ штамма H37Rv подкожно, в правую паховую область в дозе 0,01 мг.
Зараженных животных разделили на 6 групп: 1-я и 2-я группы получали изониазид в дозах 25 и 75 мг/кг. Животные 3-й, 4-й и 5-й групп получали препарат в дозах 50, 150 и 100 мг/кг, вводимый ежедневно внутримышечно, в физиологическом растворе. Контрольная (6-я группа) препаратов не получала.
Гибель животных контрольной группы началась через 6 недель после заражения. Животные опытных групп, получивших препарат, хорошо прибавляли в весе, язв на месте заражения у них не наблюдали. У животных, получавших изониазид, отмечена повышенная возбудимость.
После введения препарата в течение 2 месяцев в дозе 50 мг/кг во внутренних органах и регионарных лимфатических узлах зараженных туберкулезом морских свинок не обнаруживается возбудителей заболевания.
Для обоснования эффективности лечебного эффекта и безопасности применения проведено определение его концентраций в биологических жидкостях и тканях организма морских свинок. Параллельные исследования проведены с изониазидом.
Опыты проведены на 24 интактных морских свинках массой 200-300 г. Препарат и изониазид вводили однократно в мышцу бедра животных в дозах 50 и 25 мг/кг соответственно. Через 1, 6, 14 и 24 ч после введения препарата животных забивали и брали на исследование кровь и ткани органов. В качестве тест-культуры использовали музейный штамм МБТ H37Rv. Полученные данные свидетельствуют, что препарат хорошо всасывается (через 24 часа после введения препарата его концентрация соответствует 0,47 мкг/мл, а изониазида не достигает уровня МПК). В ткани легкого через 6, 14 и 24 ч после введения препарат обнаруживается в значительно более высоких концентрациях, чем изониазид. Препарат способен на 12 ч дольше, чем изониазид, сохраняться в крови морских свинок на бактериостатическом уровне. Отмечается более высокая его концентрация в ткани легкого в течение 24 ч. Динамика его содержания в тканях печени и мозга обеспечивает более низкую нейро- и гепатотоксичность по сравнению с изониазидом.