Штамм культуры корня растения шлемник байкальский (Scutellaria baicalensis Georgi), депонированный в Коллекции генетически трансформированных корней растений при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук, под обозначением Sc. baic.-1 - продуцент байкалина и вогонозида
ROOT CULTURE STRAIN OF THE BAIKAL SKULLCAP (SCUTELLARIA BAICALENSIS GEORGI), DEPOSITED IN THE COLLECTION OF GENETICALLY TRANSFORMED PLANT ROOTS AT THE FEDERAL STATE BUDGETARY ESTABLISHMENT OF THE INSTITUTE OF PLANT PHYSIOLOGY NAMED AFTER TIMIRYAZEV OF THE RUSSIAN ACADEMY OF SCIENCES, UNDER DESIGNATION SC.BAIC.-1 - PRODUCER OF BAIKALIN AND VOGONOZIDA

Область применения.
Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и может использоваться в фармацевтической, косметологической промышленности и для различных биотехнологических исследований.
Уровень техники.
В народной медицине Китая лечебные свойства корня шлемника байкальского известны более 4000 лет. Его использовали для лечения самых разных заболеваний: гепатита, лейкемии, бессонницы, гипертонии, кровотечений и воспалительных реакций различного происхождения. Особенное внимание в настоящее время уделяется вогонозиду, поскольку он обладает избирательным действием на раковые клетки (X-m.Chen, Y. Bai, Y-j. Zhong, X-l. Xie, H-w. Long, Y. Yang, S-g. Wu, Q. Jia, X-h. Wang, 'Wogonin has multiple anti-cancer effects by regulating c-Myc/SKP2/Fbw7a and HDAC1/HDAC2 pathways and inducing apoptosis in human lung adenocarcinoma cell line A549', PLoS ONE 2013, 8, doi:10.1371/journal.pone.0079201).
Высокая активность флавонов связана с их быстрым прохождением через клеточную мембрану и, соответственно, с большей доступностью для клетки (J-y. Dai, J-l. Yang, С. Li, 'Transport and metabolism of flavonoids from Chinese herbal remedy Xiaochaihu-tang across human intestinal Caco-2 cell monolayers', Acta Pharmacol. Sin. 2008, 29, 1086-1093).
Наибольшее содержание биологически активных веществ содержится в корнях 3-5-летних растений, что значительно удлиняет сроки получения подходящего для медицинского использования сырья. Кроме того, существует угроза сокращения общего ареала обитания шлемника из-за антропогенного воздействия и изменения климата (N. Joshee, A. Tascan, F. Medina-Bolivar, P. Parajuli, A.M. Rimando, D.A. Shannon, J.W. Adelberg, 'Scutellaria: biotechnology, phytochemistry and its potential as a commercial medicinal crop', Biotechnology for medicinal plants 2013, 69-99).
Несмотря на перспективность использования культивируемых in vitro корней, содержание флавонов в культуре hairy roots (бородатые корни) значительно меньше, чем в корнях дикорастущего шлемника (I.N. Kuzovkina, А.V. Guseva, М.Yu. Vdovitchenko, D. , E. , 'Flavones in genetically transformed Scutellaria baicalensis roots and induction of their synthesis by elicitation with methyljasmonate', Russian journal of plant physiology 2005, 52, 77-82).
В связи с этим перед исследователями встает задача получения более высокопродуктивных культур, что может быть выполнено с привлечением биохимических и молекулярных подходов.
Известен штамм культуры корня шлемника байкальского Sc. baic. (Kovacs Gy., Kuzovkina I.N., Szoeke E, Kursinszki L. HPLC determination of flavonoids in hairy root cultures of Scutellaria baicalensis Georgi. Chromatographia 2004, 60:81-85). Этот штамм продуцирует комплекс фенольных соединений с высокой физиологической активностью.
Задача изобретения.
Задачей настоящего изобретения является создание нового штамма культуры корня растения шлемник байкальский (Scutellaria baicalensis Georgi) - продуцента байкалина и вогонозида со стабильными ростовымя параметрами, устойчивым синтезом байкалина и вогонозида и отсутствием сезонной зависимости его получения.
Решение задачи.
Поставленная задача решается созданием нового штамма культуры корня растения шлемник байкальский (Scutellaria baicalensis Georgi), депонированного в Коллекции генетически трансформированных корней растений при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте физиологии растений Российской академии наук, под обозначением Sc. baic.-l - продуцент байкалина и вогонозида.
Новизной настоящего изобретения является то, что впервые получен штамм культуры корня растения шлемник байкальский (Scutellaria baicalensis Georgi) - продуцент байкалина и вогонозида со стабильными ростовыми параметрами, устойчивым синтезом байкалина и вогонозида и отсутствием сезонной зависимости его получения.
Техническим результатом настоящего избретения является то, что в результате проведенной генетической трансформации получена новая растительная система - штамм культуры корня растения шлемник байкальский (Scutellaria baicalensis Georgi), способный к стабильному круглогодичному росту в условиях in vitro и к синтезу значительно большего количества байкалина и вогонозида, чем содержание этих веществ в медленно растущих и трудно возобновляемых корнях целого растения шлемник байкальский.
Перечень иллюстративных материалов.
Фиг. 1 - характеристика культуры корня заявляемого штамма.
А - динамика роста заявляемого штамма.
В - дзменение содержания основных флавонов заявляемого штамма.
С - изменение содержания белка в течение цикла культивирования в заявляемом штамме.
Д - динамика изменения активности эндогенной (3-глюкуронидазы в течение цикла культивирования в заявляемом штамме.
В - байкалеин;
W - вогонин;
BG - байкалин;
WG - вогонозид.
Фиг. 2 ВЭЖХ-хроматограмма метанольного экстракта заявляемого штамма.
А - на первой неделе культивирования.
В - на девятой неделе культивирования.
С - на стадии деградации культуры корня заявляемого штамма.
Штамм Sc. baic.- получают следующим образом.
0,5 г инокулята штамма культуры корня шлемника байкальского - Sc. Baic. помещают в колбы объемом 100 мл, содержащие 40 мл среды Гамборга, и культивируют в течение 21 дня. После этого подросшие корни переносят в колбы объемом 300 мл с 80 мл среды Гамборга. На 35-й, 49-й день культивирования осуществляют отделение кончиков корней и в колбы производят долив среды до объема 120 и 150 мл соответственно. Всего культивируют 70 суток в темноте при температуре 23°С на качалке с частотой 90 об/мин. Отбор проб для определения флавонов осуществляют каждую неделю в течение всего цикла культивирования. Для ВЭЖХ-анализа лиофильно высушенную биомассу измельчают в ступке, отбирают навеску 20 мг и переносят ее в 10 мл стеклянную пробирку с завинчивающейся крышкой, добавляют 2 мл метанола и выдерживают 4 часа в ультразвуковой бане FS14H (Fisher scientific, United States) при 25°C. Затем экстракт фильтруют через шприцевой PTFE фильтр с размером пор 40 мкм (Econofilters, Agilent, USA) в 2-мл мерную колбу и доводят объем до метки. Результаты ВЭЖХ-анализа представлены в Таблице 1, Фиг. 1 и Фиг. 2. Разделение флавонов проводят на хроматографе Shimadzu LC-20 Prominence с диодно-матричным детектором Shimadzu SPD20MA и колонкой Zorbax С-18 (150×4,6 мм, размер частиц фазы 5 мкм). В качестве подвижной фазы используют смесь растворителей - ацетонитрил (растворитель А) и 0,1% трифторуксусную кислоту (растворитель В). При разделении использовуют режим с градиентной и изократической составляющими: 0 минут - 20% А, 4 минуты - 55% А, 14 минут - 55% А, 16 минут - 20% А. Скорость потока составляет 1 мл/мин, температура колонки 24°С; объем пробы - 20 мкл. Детектирование проводят при λ=276 нм. Пики флавоноидов идентифицируют при помощи сравнения их УФ-спектров и времен удерживания с соответствующими параметрами стандартов хроматографически чистых байкалина, вогонозида, байкалеина и вогонина фирмы AppliChem (Германия). Хроматограммы обрабатывают в программе «LabSolutions». Содержание исследуемых флавонов определяют с помощью калибровочных кривых, построенных в диапазоне концентраций 2-235 мкг/мл (таблица 1). Уравнение калибровочных кривых имеет вид у=а×х х, где х - масса стандарта (мкг), у - соответствующая площадь пика по результатам ВЭЖХ, а - коэффициент пропорциональности. Абсолютное содержание исследуемых флавонов в пересчете на грамм сухой массы корней определяют по следующей формуле:
С=S/(a*m*1000), где С - содержание флавона в навеске сухого материала (мг/г), m - масса сухого материала (г), S - площадь пика i-го флавона на хроматограмме, а - коэффициент пропорциональности из уравнения калибровочной кривой.
Статистическую обработку данных проводят с помощью компьютерной программы Microsoft Excel. В тексте приведены средние арифметические величины параметров. Бары на диаграмме соответствуют максимальным величинам доверительных интервалов при 95%-ном уровне вероятности по t-критерию Стьюдента. Все эксперименты проводят не менее чем в трехкратной повторности.
Результаты изобретения.
Как следует из анализа хроматограмм ВЭЖХ, содержание байкалина значительно увеличивается в течение первых четырех недель - 28 суток и становится преобладающим. Затем преобладающим на большей части культивирования, за исключением стадии деградации, является вогонозид.
Таким образом, достигнута поставленная задача настоящего изобретения - создание нового штамма культуры корня растения шлемник байкальский (Scutellaria baicalensis Georgi) - продуцента байкалина и вогонозида со стабильными ростовымя параметрами (индекс роста 82), устойчивым синтезом байкалина и вогонозида и отсутствием сезонной зависимости их получения.
Кроме того, появилась возможность регулирования получения различных флавонов во время культивирования в зависимости от необходимой потребности.
Паспорт
коллекционного штамма культуры культуры корня растения шлемник байкальский
(Scutellaria baicalensis Geogi)
1. Наименование штамма: Sc.baic-1
2. Видовая принадлежность: (Scutellaria baicalensis Geogi).
3. Происхождение: штамм культуры культуры корня растения шлемник байкальский Sc.baic.
4. Культурально-морфологическая характеристика: плагиотропно растущие и интенсивно ветвящиеся корни.
5. Условия культивирования:
а) среда Гамборга (без фитогормонов);
б) условия выращивания 23°С, 90 об/мин, погруженная культура.
в) процедура пересева - отделение кончиков корней через 35-42 дня; на 40 мл питательной среды - 500 мг экспланта.
г) консервация на агаризованной питательной среде при температуре 18°С.
6. Контроль контаминации: бактерии и грибы не обнаружены.
7. Контроль видовой идентичности: синтез видоспецифичных фенольных соединений: байкалина и вогонозида.
8. Область применения: физиология растений, биотехнология, генная инженерия, фармацевтическая промышленность и косметология.
9. Коллекции: коллекция генетически трансформированных корней растений при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте физиологии растений им. К.А.Тимирязева Российской академии наук.