Комбинация антитела CD19 с ингибитором BCL-2 и пути ее применения
COMBINATION OF CD19 ANTIBODY WITH BCL-2 INHIBITOR AND ITS APPLICATION METHODS

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к фармацевтической комбинации антитела к CD19 и ингибитора BCL-2 для лечения неходжкинской лимфомы, хронического лимфоцитарного лейкоза и/или острого лимфобластного лейкоза.
Уровень техники
В-клетки представляют собой лимфоциты, которые играют большую роль в гуморальном иммунном ответе. Они продуцируются в костном мозге большинства млекопитающих и составляют 5-15% циркулирующего пула лимфоцитов. Основной функцией В-клеток является образование антител к различным антигенам, и они являются важнейшим элементом адаптивной иммунной системы.
Вследствие их решающей роли в регуляции иммунной системы дисрегуляция В-клеток связана с целым рядом нарушений, таких как виды лимфомы и лейкоза. Такие нарушения включают неходжкинскую лимфому (NHL), хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL) и острый лимфобластный лейкоз (ALL).
NHL представляет собой гетерогенное злокачественное новообразование, происходящее из лимфоцитов. В Соединенных Штатах Америки (США) частота возникновения заболевания оценивается на уровне 65000/год, при этом смертность составляет примерно 20000 (American Cancer Society, 2006; и SEER Cancer Statistics Review). Заболевание может возникать у всех возрастных групп, обычно начало наблюдается у взрослых старше 40 лет с увеличением частоты возникновения заболевания с возрастом. NHL характеризуется клональной пролиферацией лимфоцитов, которые накапливаются в лимфатических узлах, крови, костном мозге и селезенке, хотя может быть вовлечен любой крупный орган. Современной системой классификации, применяемой патоморфологами и клиницистами, является классификация опухолей согласно Всемирной организации здравоохранения (WHO), которая разделяет NHL на новообразования из предшественников и зрелых В-клеток и Т-клеток. Для включения в клинические испытания в настоящее время PDQ разделяет NHL на индолентную или агрессивную формы. Группу индолентной формы NHL составляют в первую очередь фолликулярные подтипы, мелкоклеточная лимфоцитарная лимфома, MALT (лимфома лимфоидной ткани слизистых оболочек) и лимфома маргинальной зоны; индолентную форму имеют примерно 50% пациентов с впервые диагностированной В-клеточной NHL. К группе агрессивной формы NHL принадлежат пациенты с гистологическими диагнозами первичной диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфомы (DLBL, DLBCL или DLCL) (у 40% всех впервые диагностированных пациентов имеются диффузные крупные клетки), лимфомы Беркитта и лимфомы из клеток мантийной зоны. Клиническое течение NHL чрезвычайно изменчиво. Основным определяющим фактором клинического течения является гистологический подтип. Большинство индолентных типов NHL считаются неизлечимым заболеванием. Первоначально пациенты отвечают либо на химиотерапию, либо на терапию антителами, но у большинства из них происходит рецидив заболевания. Исследования, проведенные до настоящего времени, не продемонстрировали увеличения выживаемости при раннем вмешательстве. В случае пациентов без выраженных симптомов допустимо "наблюдать и выжидать", пока у пациента не появятся симптомы или темп развития заболевания не станет ускоряться. Со временем заболевание может трансформироваться в более агрессивную гистологическую форму. Медиана выживаемости составляет 8-10 лет, и пациенты с индолентной формой зачастую проходят 3 или больше курсов лечения за время фазы лечения своего заболевания. Традиционно первоначальное лечение пациента с выраженными симптомами индолентной формы NHL представляло собой комбинированную химиотерапию. Наиболее часто применяемые средства включают: циклофосфамид, винкристин и преднизон (CVP) или циклофосфамид, адриамицин, винкристин, преднизон (CHOP). Примерно 70%-80% пациентов будут отвечать на свою первоначальную химиотерапию, при этом продолжительность ремиссий составляет порядка 2-3 лет. В конечном итоге у большинства пациентов происходит рецидив. Открытие и клиническое применение антитела к CD20, ритуксимаба, обеспечило значительное улучшение ответа и увеличение показателя выживаемости. Современным стандартом лечения для большинства пациентов является ритуксимаб + CHOP (R-CHOP) или ритуксимаб + CVP (R-CVP). Интерферон одобрен для первоначального лечения NHL в комбинации с алкилирующими средствами, но имеет ограниченное применение в США. Было показано, что терапия ритуксимабом эффективна при нескольких типах NHL, и в настоящее время она одобрена в качестве терапии первой линии как при индолентной форме (фолликулярной лимфоме), так и при агрессивной форме NHL (диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфоме). Однако для применения моноклонального антитела (mAb) к CD20 есть значительные ограничения, включая первичную резистентность (50% частота ответа у пациентов с рецидивирующей индолентной формой), приобретенную резистентность (50% частота ответа при повторном лечении), редкий полный ответ (2% частота полного ответа у рецидивирующей популяции) и длительный характер рецидива. Наконец, многие В-клетки не экспрессируют CD20 и поэтому многие нарушения с участием В-клеток не поддаются лечению с применением терапии антителами к CD20.
Кроме NHL существует еще несколько типов лейкозов, которые являются результатом дисрегуляции В-клеток. Хронический лимфоцитарный лейкоз (также известный как "хронический лимфоидный лейкоз" или "CLL") представляет собой тип лейкоза взрослых, вызываемый аномальным накоплением В-лимфоцитов. При CLL злокачественные лимфоциты могут выглядеть как нормальные и зрелые, но они не способны эффективно справляться с инфекцией. CLL является наиболее распространенной формой лейкоза у взрослых. У мужчин вероятность развития CLL в два раза выше, чем у женщин. Однако ключевым фактором риска является возраст. Свыше 75% новых случаев заболевания диагностируют у пациентов старше 50 лет. Ежегодно диагностируют более 10000 случаев, а смертность составляет почти 5000 в год (American Cancer Society, 2006; и SEER Cancer Statistics Review). CLL представляет собой неизлечимое заболевание, но в большинстве случаев прогрессирует медленно. Многие люди с CLL ведут нормальную и активную жизнь в течение многих лет. Вследствие его медленного начала на ранней стадии CLL, как правило, не лечат, поскольку считается, что раннее вмешательство при CLL не увеличивает время выживаемости или не улучшает качество жизни. Вместо этого состояние контролируют в динамике. Виды первоначального лечения CLL варьируются в зависимости от точного диагноза и прогрессирования заболевания. Существуют десятки средств, применяемых для терапии CLL. Схемы комбинированной химиотерапии, такие как FCR (флударабин, циклофосфамид и ритуксимаб) и BR (ибрутиниб и ритуксимаб), эффективны как при впервые диагностированном CLL, так и при его рецидиве. Алло генную трансплантацию костного мозга (стволовых клеток) редко применяют в качестве терапии первой линии для CLL вследствие связанных с ней рисков.
Другим типом лейкоза является острый лимфобластный лейкоз (ALL), также известный как острый лимфоцитарный лейкоз. ALL характеризуется избыточной выработкой и непрерывным размножением злокачественных и незрелых белых клеток крови (также известных как лимфобласты) в костном мозге. "Острый" относится к недифференцированному, незрелому состоянию циркулирующих лимфоцитов ("бласты") и к тому, что заболевание прогрессирует быстро, при этом ожидаемая продолжительность жизни в отсутствие лечения составляет от нескольких недель до нескольких месяцев. ALL наиболее часто встречается в детском возрасте с пиком заболеваемости в 4-5 лет. Смертность от данного заболевания наиболее высока у детей в возрасте 12-16 лет. В настоящее время считается, что по меньшей мере 80% ALL в детском возрасте являются излечимыми. Ежегодно диагностируют до 4000 случаев заболевания, и смертность составляет почти 1500 в год (American Cancer Society, 2006; и SEER Cancer Statistics Review).
Молекула CD19 человека представляет собой структурно обособленный рецептор клеточной поверхности, экспрессируемый на поверхности В-клеток человека, включая без ограничения пре-В-клетки, В-клетки на ранней стадии развития (т.е. незрелые В-клетки), зрелые В-клетки на пути терминальной дифференцировки в плазмоциты и злокачественные В-клетки. CD19 экспрессируют большинство видов пре-В-клеточного острого лимфобластного лейкоза (ALL), неходжкинской лимфомы, В-клеточного хронического лимфоцитарного лейкоза (CLL), пролимфоцитарного лейкоза, злокачественного ретикулоэндотелиоза, общего острого лимфоцитарного лейкоза, а также некоторые виды острого лимфобластного лейкоза с нулевыми клетками (Nadler et al, J. Immunol., 131:244-250 (1983), Loken et al, Blood, 70:1316-1324 (1987), Uckun et al, Blood, 71:13-29 (1988), Anderson et al, 1984. Blood, 63:1424-1433 (1984), Scheuermann, Leuk. Lymphoma, 18:385-397(1995)). В свою очередь, экспрессия CD19 на плазмоцитах позволяет предположить, что он может экспрессироваться на опухолях из дифференцированных В-клеток, таких как множественная миелома, виды плазмоцитомы, опухоли Вальденстрема (Grossbard et al., Br. J. Haematol, 102:509-15(1998); Treon et al, Semin. Oncol, 30:248-52(2003)).
Следовательно, антиген CD19 представляет собой мишень для иммунотерапии при лечении неходжкинской лимфомы (включая каждый из подтипов, описанных в данном документе), хронического лимфоцитарного лейкоза и/или острого лимфобластного лейкоза.
Были продемонстрированы некоторые средства терапии, направленные на CD19. Т-клетки, экспрессирующие химерный антигенный рецептор (CAR) к CD19, включающий как CD3-ζ, так и костимулирующий домен 4-ВВ, вводили пациентам с CLL на поздней стадии. Kalos et al., Т cells with Chimeric Antigen Receptors Have Potent Antitumor Effects and Can Establish Memory in Patients with Advanced Leukemia, Science Translational Medicine, vol. 3, no. 95 (10 августа 2011 г.), которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. В Sadelain et al., The promise and potential pitfalls of chimeric antigen receptors, Current Opinion in Immunology, Elsevier, vol. 21, no. 2, 2 апреля 2009 г., которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте, также описаны химерные антигенные рецепторы (CAR) к CD19. Однако ни Kalos et al., ни Sadelain et al. не описывают антитело, специфическое в отношении CD19, в комбинации с ингибитором BCL-2, как проиллюстрировано в данном документе.
Применение антитела к CD19 при видах лимфомы из неспецифических В-клеток обсуждается в WO 2007076950 (US 2007154473), обе из которых включены посредством ссылки во всей своей полноте, наряду с беглым упоминанием ибрутиниба в рамках длинного перечня потенциальных партнеров по комбинации, но в них не сообщается об антителе, проиллюстрированном в данном документе, и не предполагаются синергические эффекты комбинации при лечении неходжкинской лимфомы, хронического лимфоцитарного лейкоза и/или острого лимфобластного лейкоза, как проиллюстрировано в данном документе.
Применение антитела к CD19 при CLL, NHL и ALL описано в Scheuermann et al., CD19 Antigen in Leukemia and Lymphoma Diagnosis and Immunotherapy, Leukemia and Lymphoma, Vol. 18, 385-397 (1995), которая включена посредством ссылки во всей своей полноте, но в ней не предполагается комбинация, проиллюстрированная в данном документе.
Дополнительные антитела, специфические в отношении CD19, описаны в WO 2005012493 (US 7109304), WO 2010053716 (US 12/266999) (от Immunomedics); WO 2007002223 (US US 8097703) (от Medarex); WO 2008022152 (12/377251) и WO 2008150494 (от Xencor), WO 2008031056 (US 11/852106) (от Medimmune); WO 2007076950 (US 11/648505) (от Merck Patent GmbH); WO 2009/052431 (US 12/253895) (от Seattle Genetics) и WO 2010095031 (12/710442) (от Glenmark Pharmaceuticals), WO 2012010562 и WO 2012010561 (от International Drug Development), WO 2011147834 (от Roche Glycart) и WO 2012/156455 (от Sanofi), все из которых включены посредством ссылки во всей своей полноте.
Комбинации антител, специфических в отношении CD19, и других средств описаны в WO 2010151341 (US 13/377514) (от The Feinstein Institute); US 5686072 (от University of Texas) и WO 2002022212 (PCT/US01/29026) (от IDEC Pharmaceuticals), WO 2013/024097 (14/126928) (от MorphoSys AG) и WO 2013/024095 (14/127217) (от MorphoSys AG), все из которых включены посредством ссылки во всей своей полноте.
Определенные ингибиторы BCL-2 доступны коммерчески. VENCLEXTA™ (венетоклакс), также известный как GDC-0199, АВТ-199 и RG7601, представляет собой ингибитор BCL-2, показанный при лечении пациентов с хроническим лимфоцитарным лейкозом (CLL) с делецией 17р, выявленной с помощью одобренного FDA теста, которые прошли по меньшей мере одну предшествующую терапию. Венетоклакс описан в патентах США №№8546399 и 9174982, все из которых включены посредством ссылки во всей своей полноте.
Несмотря на последний прогресс в открытии и разработке противораковых средств, многие формы рака с участием опухолей, экспрессирующих CD19, все еще характеризуются неблагоприятным прогнозом. В связи с этим, существует потребность в улучшенных способах лечения таких форм рака.
Краткое описание
Ни в одном из документов предшествующего уровня техники, ни в их комбинации, не предполагаются синергические эффекты комбинации иллюстративного антитела и венетоклакса при лечении неходжкинской лимфомы, хронического лимфоцитарного лейкоза и/или острого лимфобластного лейкоза.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к синергической комбинации антитела, специфического в отношении CD19, и ингибитора BCL-2. Такие комбинации применимы при лечении В-клеточных злокачественных новообразований, таких как неходжкинская лимфома, хронический лимфоцитарный лейкоз и/или острый лимфобластный лейкоз.
Считается, что in vitro модели являются показателем того, как определенное соединение или комбинация соединений будут вести себя в ходе применения у людей.
Клетки МЕС-1 (DSMZ № АСС497) представляют собой клеточную линию хронического В-клеточного лейкоза. Клетки МЕС-1 в данной in vitro модели являются показателем того, как комбинация будет действовать при лечении хронического лимфоидного лейкоза (CLL) у людей.
Кроме того, при комбинировании соединений in vitro ожидается, что комбинация будет иметь только аддитивные эффекты. Неожиданно, авторы настоящего изобретения обнаружили, что комбинация конкретного антитела, специфического в отношении CD19, и венетоклакса опосредовала синергический уровень специфического лизиса клеток in vitro по сравнению с антителом и венетоклаксом по отдельности. В частности, авторы настоящего изобретения обнаружили, что комбинация MOR00208 и венетоклакса опосредовала синергический уровень специфического лизиса клеток in vitro у клеток МЕС-1 по сравнению с антителом и венетоклаксом по отдельности.
Подводя итог, комбинация иллюстративного антитела к CD19 и венетоклакса продемонстрировала синергическое поведение на моделях, соответствующих CLL. Поскольку CLL представляет собой нарушения, связанные с В-клетками и CD19 характеризуется высоким уровнем экспрессии на В-клетках, иллюстративная комбинация будет иметь такой же механизм действия и также должна демонстрировать синергическое поведение при лечении других нарушений, связанных с В-клетками, например, ALL и NHL.
Следовательно, комбинация иллюстративного антитела, специфического в отношении CD19, и венетоклакса должна быть эффективной при лечении неходжкинской лимфомы, хронического лимфоцитарного лейкоза и/или острого лимфобластного лейкоза у людей. Ожидаемая эффективность комбинации иллюстративного антитела, специфического в отношении CD19, и венетоклакса будет подтверждена в клинических испытаниях.
Так как механизм действия венетоклакса и других ингибиторов BCL-2 является аналогичным, поскольку их действие основано на ингибировании антиапоптотического белка В-клеточной лимфомы-2 (Bcl-2), что приводит к запрограммированной гибели клеток, считается, что синергическое действие также должно наблюдаться при лечении людей с неходжкинской лимфомой, хроническим лимфоцитарным лейкозом и/или острым лимфобластным лейкозом с помощью комбинации иллюстративного антитела к CD19 и ингибитора BCL-2, отличного от венетоклакса.
Поскольку иллюстративное антитело к CD19 и другие антитела к CD19 связывают CD19, полагают, что синергическое действие также должно наблюдаться при лечении людей с неходжкинской лимфомой, хроническим лимфоцитарным лейкозом и/или острым лимфобластным лейкозом с помощью комбинации любого антитела к CD19 и ингибитора BCL-2, например, венетоклакса.
Один аспект настоящего изобретения предусматривает комбинацию, где антитело, специфическое в отношении CD19, содержит область HCDR1 с последовательностью SYVMH (SEQ ID NO: 1), область HCDR2 с последовательностью NPYNDG (SEQ ID NO: 2), область HCDR3 с последовательностью GTYYYGTRVFDY (SEQ ID NO: 3), область LCDR1 с последовательностью RSSKSLQNVNGNTYLY (SEQ ID NO: 4), область LCDR2 с последовательностью RMSNLNS (SEQ ID NO: 5) и область LCDR3 с последовательностью MQHLEYPIT (SEQ ID NO: 6), и венетоклакса. В вариантах осуществления комбинация является синергической. В предпочтительных аспектах комбинацию применяют для лечения неходжкинской лимфомы, хронического лимфоцитарного лейкоза и/или острого лимфобластного лейкоза.
Описание графических материалов
На фигурах 1-3 показана цитотоксичность действия комбинации MOR00208 и венетоклакса на клеточную линию МЕС-1. Клетки МЕС-1 предварительно обрабатывали венетоклаксом в течение 24 часов.
На фигуре 4 показана аминокислотная последовательность вариабельных доменов MOR00208.
На фигуре 5 показана аминокислотная последовательность Fc-областей MOR00208.
На фигурах 6-8 показаны кривые показателя аддитивности Чоу-Талалая для MOR00208 и венетоклакса у клеточной линии МЕС-1.
3
3
На фигуре 9 MOR00208 в комбинации с АВТ-199 демонстрировало превосходящее снижение роста опухоли по сравнению с каждой из монотерапий на мышиной модели SCID с введенными s.c. клетками Toledo. Изображены средние значения группы ± стандартная ошибка среднего (SEM). Звездочки указывают на статистическую значимость времени удвоения размера опухоли при обработке комбинацией по сравнению с обработкой одним MOR0028 или соответственной обработкой одним АВТ-199: * р-значение <0,05, ** р-значение <0,01 и **** р-значение <0,0001. Обработку начинали после рандомизации при среднем объеме опухоли, составляющем 266 мм (123-406 мм), через 23 дня после инъекции опухоли. MOR00208 (11 мг/кг) вводили путем внутрибрюшинной инъекции (i.p.) два раза в неделю. АВТ-199 (20 или 40 мг/кг) вводили перорально (р.о.) ежедневно.
3
3
3
На фигуре 10 MOR00208 в комбинации с АВТ демонстрировало превосходящую медиану выживаемости по сравнению с каждой из монотерапий на мышиной модели SCID с введенными s.c. клетками Toledo. Кривые Каплана-Meйера отображают выживаемость от момента рандомизации до гуманной конечной точки (объем опухоли, составляющий 2000 мм). Обработку начинали после рандомизации при среднем объеме опухоли, составляющем 266 мм (123-406 мм), через 23 дня после инъекции опухоли. MOR00208 (11 мг/кг) вводили путем внутрибрюшинной инъекции (i.p.) два раза в неделю. АВТ-199 (20 или 40 мг/кг) вводили перорально (р.о.) ежедневно.
Подробное описание настоящего изобретения
"Синергическое действие", "синергизм" или "синергический" означают больше, чем ожидаемый аддитивный эффект комбинации. Применительно к in vitro исследованиям "синергическое действие", "синергизм" или "синергетический" эффект комбинации определяют в данном документе с помощью способов из Chou et al., Clarke et al. и/или Webb et al. См. Ting-Chao Chou, Theoretical Basis, Experimental Design, and Computerized Simulation of Synergism and Antagonism in Drug Combination Studies, Pharmacol Rev 58:621-681 (2006), которая включена посредством ссылки во всей своей полноте. Также см. Clarke et al., Issues in experimental design and endpoint analysis in the study of experimental cytotoxic agents in vivo in breast cancer and other models, Breast Cancer Research and Treatment 46:255-278 (1997), которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. Также см. Webb, J.L. (1963) Enzyme and Metabolic Inhibitors, Academic Press, New York, которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.
Термин "антитело" означает моноклональные антитела, включая любой изотип, такой как IgG, IgM, IgA, IgD и IgE. Антитело IgG состоит из двух идентичных тяжелых цепей и двух идентичных легких цепей, которые соединены дисульфидными связями. Каждая тяжелая и легкая цепь содержит константную область и вариабельную область. Каждая вариабельная область содержит три сегмента, называемых "областями, определяющими комплементарность" ("CDR") или "гипервариабельными областями", которые в первую очередь отвечают за связывание с эпитопом антигена. Их обозначают как CDR1, CDR2 и CDR3, нумеруя последовательно от N-конца. Более высококонсервативные фрагменты вариабельных областей за пределами CDR называются "каркасными областями". "Фрагмент антитела" означает фрагмент Fv, scFv, dsFv, Fab, Fab', F(ab')2 или другой фрагмент, который содержит по меньшей мере одну вариабельную область тяжелой цепи или вариабельную область легкой цепи, каждая из которых содержит CDR и каркасные области.
Белок Bcl-2 (В-клеточной лимфомы 2), кодированный у людей геном BCL2, является первоначальным членом семейства Bcl-2 регуляторных белков, которые регулируют гибель клеток (апоптоз), посредством или индуцирования (проапоптотические), или ингибирования (антиапоптотические) апоптоза. В NCBI Bcl-2 приведен под номером гена 596. Конкретно Bcl-2 считается важным антиапоптотическим белком и, таким образом, классифицируется как онкоген. Bcl-2 получил свое название от В-клеточной лимфомы 2, поскольку он является вторым членом из серии белков, первоначально описанных у видов фолликулярной лимфомы при хромосомных транслокациях с вовлечением хромосом 14 и 18. Ортологи (такие как Bcl2 у мышей) были идентифицированы у многочисленных млекопитающих, для которых доступны данные полного генома.
"Ингибиторы BCL-2" представляют собой класс лекарственных средств, которые функционируют путем ингибирования антиапоптотического белка В-клеточной лимфомы-2 (Bcl-2), что приводит к запрограммированной гибели клеток. К ингибиторам BCL-2 относится венетоклакс. Венетоклакс продается компаниями Abbvie и Genentech (торговое наименование VENCLEXTA™, также известен как GDC-0199, АВТ-199 и RG7601). В настоящее время венетоклакс заявлен для лечения пациентов с хроническим лимфоцитарным лейкозом (CLL) с делецией 17р, выявляемой с помощью одобренного FDA теста, которые прошли по меньшей мере одну предшествующую терапию. Формула венетоклакса представляет собой 4-(4-{[2-(4-хлорфенил)-4,4-диметил-1-циклогексен-1-ил]метил}-1-пиперазинил)-N-({3-нитро-4-[(тетрагидро-2Н-пиран-4-илметил)амино]фенил}сульфонил)-2-(1Н-пирроло[2,3-b]пиридин-5-илокси)бензамид и имеет следующую структуру:
"Венетоклакс", "АВТ" и "АВТ-199" используются в данном документе как синонимы.
Другие ингибиторы BCL-2 включают следующие.
Генасенс. Лекарственное средство на основе антисмыслового олигонукпеотида, генасенс (G3139), разработано Genta Incorporated для нацеливания на Bcl-2. Антисмысловая нить ДНК или РНК является не кодируют, ей и комплементарной кодирующей нити (которая является матрицей для образования РНК или белка соответственно). Антисмысловое лекарственное средство представляет собой короткую последовательность РНК, которая гибридизируется с мРНК и инактивирует ее, предотвращая образование белка. Пролиферацию клеток лимфомы человека (с транслокацией t(14;18)) можно было бы подавлять с помощью антисмысловой РНК, нацеленной на область старт-кодона мРНК Всl-2. In vitro исследования привели к идентификации генасенса, который комплементарен первым 6 кодонам мРНК Bcl-2. Он показал успешные результаты в испытаниях фазы I/II в отношении лимфомы. Крупномасштабное испытание фазы III началось в 2004 году. По состоянию на 2016 год лекарственное средство не было одобрено, и его разработчик прекратил свою деятельность.
АВТ-737 и АВТ-263. В середине 2000-х годов компания Abbott Laboratories разработала новый ингибитор Bcl-2, Bcl-xL и Bcl-w, известный как АВТ-737. Данное соединение является частью группы низкомолекулярных ингибиторов-миметиков ВН3 (SMI), которые нацеливаются на данные белки семейства Bcl-2, но не на А1 или Мсl-1. АВТ-737 превосходит предыдущие ингибиторы BCL-2 с учетом его более высокой аффинности в отношении Bcl-2, Bcl-xL и Bcl-w. In vitro исследования показали, что первичные клетки от пациентов с В-клеточными злокачественными новообразованиями чувствительны к АВТ-737. На животных моделях он увеличивает выживаемость, вызывает регрессию опухоли и излечивает высокий процент мышей. В доклинических исследованиях с использованием ксенотрансплантатов от пациентов АВТ-737 показал эффективность в лечении лимфомы и других видов рака крови. Вследствие его неблагоприятных фармакологических свойств АВТ-737 не подходит для клинических испытаний, при этом его производное АВТ-263 характеризуется аналогичной активностью в отношении клеточных линий мелкоклеточного рака легкого (SCLC) и оно вступило в клинические испытания.
"VH" относится к вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина антитела или фрагмента антитела. "VL" относится к вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина антитела или фрагмента антитела.
Термин "CD19" относится к белку, известному как СD19, имеющему следующие синонимы: В4, антиген CD19 В-лимфоцита, поверхностный антиген В4 В-лимфоцита, CVID3, антиген дифференцировки CD19, MGC12802 и поверхностный антиген Leu-12 Т-клетки.
CD19 человека имеет аминокислотную последовательность:
"MOR00208" представляет собой антитело к CD19. Аминокислотная последовательность вариабельных доменов представлена на фигуре 4. Аминокислотная последовательность Fc-областей тяжелой и легкой цепей MOR00208 представлена на фигуре 5. "MOR00208" и "XmAb 5574" используются как синонимы для описания антитела, показанного на фигурах 4 и 5. Антитело MOR00208 описано в заявке на патент США с порядковым номером 12/377251, которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.
В заявке на патент США с порядковым номером 12/377251 антитело, названное 4G7 Н1.52 гибрид S239D/I332E/4G7 L1.155 (позже названное MOR00208), описано как представлено ниже:
Дополнительные антитела, специфические в отношении CD19, описаны в патенте США №7109304 (от Immunomedics), который включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте; заявке на патент США с порядковым №11/917750 (от Medarex), которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте; заявке на патент США с порядковым №11/852106 (от Medimmune), которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте; заявке на патент США с порядковым №11/648505 (от Merck Patent GmbH), которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте; патенте США №7968687 (от Seattle Genetics), который включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте; и заявке на патент США с порядковым №12/710442 (от Glenmark Pharmaceuticals), которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.
"Fc-область" означает константную область антитела, которая у людей может относиться к подклассу IgG1, 2, 3, 4 или другим подклассам. Последовательности Fc-областей человека доступны на IMGT, Human IGH C-REGIONs, www.imgt.org/IMGTrepertoire/Proteins/protein/human/IGH/IGHC/Hu_IGHCallgens.html (загружены 16 мая 2011 года).
"RefmAb33" представляет собой антитело со следующей аминокислотной последовательностью:
тяжелая цепь, включая Fc-область:
легкая цепь, включая Fc-область:
RefmAb33 специфично в отношении RSV и применяется в качестве изотипического контроля, поскольку оно имеет такую же Fc-область, что и MOR00208.
"Комбинация" означает более одного компонента, например, соединение, такое как антитело, и венетоклакс.
Настоящее изобретение также относится к комбинациям, фармацевтическим препаратам и фармацевтическим композициям, содержащим описанные комбинации. Два компонента комбинации по настоящему изобретению, например, антитело, специфическое в отношении CD19, и венетоклакс, можно вводить вместе, одновременно, отдельно или последовательно, как физически, так и во времени.
В настоящее время венетоклакс принимают перорально, и в настоящее время его вводят в виде дозы один раз в день. В настоящее время MOR00208 вводят внутривенно, и в настоящее время его вводят в виде дозы либо один раз в неделю, либо один раз в две недели.
Предпочтительно, чтобы введение обоих лекарственных средств обеспечивало возможность обоим лекарственным средствам одновременно проявлять активность у пациента. Например, когда MOR208 вводят в виде дозы один раз в неделю, а венетоклакс вводят в виде ежедневной дозы, тогда активное вещество обоих лекарственных средств присутствует у пациента в одно и то же время. В одном варианте осуществления венетоклакс вводят до введения и/или отдельно от введения антитела, специфического в отношении CD19, например MOR00208.
"Одновременно" означает, что два компонента вводят в определенный момент времени, при этом оба компонента (лекарственные средства) проявляют активность у пациента в одно и то же время. Под "синергизмом" подразумевается, что оба лекарственных средства проявляют активность у пациента в одно и то же время.
"Вводят вместе" может означать, что их вводят в одно и то же время.
Компоненты комбинации можно составлять в различные фармацевтические композиции. Фармацевтическая композиция включает активное средство, например, антитело, для терапевтического применения у людей. Фармацевтическая композиция может содержать приемлемые носители или вспомогательные вещества.
"Введенный" или "введение" включают без ограничения доставку с помощью впрыскиваемой формы, такой как, например, для внутривенного, внутримышечного, внутрикожного или подкожного пути введения, или для мукозального пути введения, например, в виде назального спрея или аэрозоля для ингаляции, или в виде принимаемых внутрь раствора, капсулы или таблетки.
"Терапевтически эффективное количество" соединения или комбинации относится к количеству, достаточному для излечения, облегчения или частичного прекращения клинических проявлений данного заболевания или нарушения и его осложнений. Количество, которое является эффективным для конкретной терапевтической цели, будет зависеть от тяжести заболевания или поражения, а также от массы тела и общего состояния субъекта. Будет понятно, что определение подходящей дозы можно осуществлять, используя обычные эксперименты, путем построения таблицы значений и тестирования различных точек в таблице; все из этих приемов находятся в пределах обычных навыков подготовленного врача или ученого-клинициста.
"Перекрестно конкурирует" означает способность антитела или другого связывающего средства препятствовать связыванию других антител или связывающих средств с CD19 в стандартном анализе конкурентного связывания. Способность или степень, с которой антитело или другое связывающее средство может препятствовать связыванию другого антитела или связывающей молекулы с CD19, и, следовательно, его способность перекрестно конкурировать в соответствии с настоящим изобретением, можно определять с применением стандартных анализов конкурентного связывания. В одном подходящем анализе используют технологию Biacore (например, с применением прибора BIAcore 3000 (Biacore, Уппсала, Швеция)), с помощью которого можно измерить степень взаимодействия с применением технологии на основе поверхностного плазмонного резонанса. В другом анализе для измерения перекрестной конкуренции используют подход на основе ELISA. Высокопроизводительный способ для "эпитоп-специфической сортировки" антител, основанный на их перекрестной конкуренции, описан в международной патентной заявке № WO 2003/48731.
Термин "эпитоп" предусматривает любую белковую детерминанту, способную к специфическому связыванию с антителом или иному взаимодействию с молекулой. Эпитопные детерминанты обычно состоят из химически активных поверхностных групп молекул, таких как боковые цепи аминокислот или углеводов или Сахаров, и они могут обладать специфическими характеристиками трехмерной структуры, а также специфическими характеристиками заряда. Эпитоп может быть "линейным" или "конформационным". Термин "линейный эпитоп" относится к эпитопу, у которого все точки взаимодействия между белком и взаимодействующей молекулой (такой как антитело), расположены линейно вдоль первичной аминокислотной последовательности белка (непрерывно). Термин "конформационный эпитоп" относится к эпитопу, в котором отдельно расположенные аминокислоты объединяются в трехмерную конформацию. В конформационном эпитопе точки взаимодействия расположены в аминокислотных остатках на белке, которые отделены друг от друга.
"Связывается с тем же эпитопом, что и" означает способность антитела или другого связывающего средства связываться с CD19 и иметь тот же эпитоп, что и иллюстративное антитело. Эпитопы для иллюстративного антитела и других антител к CD19 можно определять с применением стандартных методик картирования эпитопа. Методики картирования эпитопа, широко известные из уровня техники, включают Epitope Mapping Protocols в Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, New Jersey. Например, линейные эпитопы можно определять с помощью, например, одновременного синтеза большого количества пептидов на твердых подложках, причем данные пептиды соответствуют частям белковой молекулы, и осуществления взаимодействия пептидов с антителами, при этом пептиды остаются прикрепленными к подложкам. Такие методики известны из уровня техники и описаны, например, в патенте США №4708871; Geysen et al (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8:3998-4002; Geysen et al (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:78-182; Geysen et al, (1986) Mol. Immunol. 23:709-715. Аналогичным образом, конформационные эпитопы легко идентифицировать посредством способов определения пространственной конформации аминокислот, например, с помощью таких как водородно-дейтериевый обмен, рентгеновская кристаллография и двухмерный ядерный магнитный резонанс. См., например, Epitope Mapping Protocols выше. Антигенные области белков также можно идентифицировать с применением стандартных графиков антигенности и гидрофобности, таких как графики, рассчитанные с применением, например, программного обеспечения Omiga версии 1.0, доступного от Oxford Molecular Group. В данной компьютерной программе используется способ Hopp/Woods, Норр et al, (1981) Proc. Natl. Acad. Sci USA 78:3824-3828 для определения профилей антигенности и методика Kyte-Doolittle, Kyte et al, (1982) J. Mol. Biol. 157: 105-132 для построения графиков гидрофобности.
Варианты осуществления
Один аспект настоящего изобретения представляет собой комбинацию, содержащую антитело, специфическое в отношении CD19, и ингибитор BCL-2, для применения в лечении неходжкинской лимфомы, хронического лимфоцитарного лейкоза и/или острого лимфобластного лейкоза. В вариантах осуществления комбинация является синергической.
В данном документе комбинация иллюстративного антитела к CD19 и венетоклакса продемонстрировала синергическое поведение на in vitro моделях, соответствующих CLL. Поскольку CLL представляет собой нарушение, связанное с В-клетками, a CD19 характеризуется высоким уровнем экспрессии на В-клетках, иллюстративная комбинация должна иметь такой же механизм действия и также должна демонстрировать синергическое поведение при лечении других нарушений, связанных с В-клетками, например, ALL и NHL. Следовательно, комбинация иллюстративного антитела, специфического в отношении CD19, и венетоклакса должна быть эффективной при лечении неходжкинской лимфомы, хронического лимфоцитарного лейкоза и/или острого лимфобластного лейкоза у людей. Ожидаемая эффективность комбинации иллюстративного антитела, специфического в отношении CD19, и венетоклакса будет подтверждена в клинических испытаниях.
Тестировали клетки МЕС-1 (DSMZ №АСС497), клеточную линию хронического В-клеточного лейкоза. Клетки МЕС-1 в данной in vitro модели являются показателем того, как комбинация будет действовать при лечении хронического лимфоидного лейкоза (CLL) у людей. Значения показателя Чоу указывают на явный синергизм комбинации MOR00208 и венетоклакса при специфическом лизисе клеток МЕС-1 по сравнению с MOR00208 и венетоклаксом по отдельности.
Подводя итог, комбинация иллюстративного антитела к CD19 и венетоклакса продемонстрировала синергическое поведение на моделях, соответствующих CLL.
Следовательно, комбинация иллюстративного антитела, специфического в отношении CD19, и венетоклакса должна быть эффективной при лечении неходжкинской лимфомы, хронического лимфоцитарного лейкоза и/или острого лимфобластного лейкоза у людей.
Поскольку механизмы действия венетоклакса и других ингибиторов BCL-2 являются аналогичными, полагают, что синергическое действие также должно наблюдаться при лечении людей с неходжкинской лимфомой, хроническим лимфоцитарным лейкозом и/или острым лимфобластным лейкозом с помощью комбинации иллюстративного антитела к CD19 и ингибитора BCL-2, отличного от венетоклакса.
Поскольку иллюстративное антитело к CD19 и другие антитела к CD19 связывают CD19, полагают, что синергическое действие также должно наблюдаться при лечении людей с неходжкинской лимфомой, хроническим лимфоцитарным лейкозом и/или острым лимфобластным лейкозом с помощью комбинации любого антитела к CD19 и ингибитора белка В-клеточной лимфомы-2 (Bcl-2), где антитело к CD19 представляет собой, например, описанное в заявке на патент США с порядковым номером 12/377251 (от Хenсоr), WO 2005012493, WO 2010053716 (от Immunomedics); WO 2007002223 (от Medarex); WO 2008022152 (от Хenсоr); WO 2008031056 (от Medimmune); WO 2007/076950 (от Merck Patent GmbH); WO 2009/052431 (от Seattle Genetics) и WO 2010095031 (от Glenmark Pharmaceuticals), все из которых включены посредством ссылки во всей их полноте.
В вариантах осуществления антитело, специфическое в отношении CD19, предусматривает антитело, которое перекрестно конкурирует с антителом, содержащим область HCDR1 с последовательностью SYVMH (SEQ ID NO: 1), область HCDR2 с последовательностью NPYNDG (SEQ ID NO: 2), область HCDR3 с последовательностью GTYYYGTRVFDY (SEQ ID NO: 3), область LCDR1 с последовательностью RSSKSLQNVNGNTYLY (SEQ ID NO: 4), область LCDR2 с последовательностью RMSNLNS (SEQ ID NO: 5) и область LCDR3 с последовательностью MQHLEYPIT (SEQ ID NO: 6).
В вариантах осуществления антитело, специфическое в отношении CD19, предусматривает антитело, которое связывается с тем же эпитопом, что и антитело, содержащее область HCDR1 с последовательностью SYVMH (SEQ ID NO: 1), область HCDR2 с последовательностью NPYNDG (SEQ ID NO: 2), область HCDR3 с последовательностью GTYYYGTRVFDY (SEQ ID NO: 3), область LCDR1 с последовательностью RSSKSLQNVNGNTYLY (SEQ ID NO: 4), область LCDR2 с последовательностью RMSNLNS (SEQ ID NO: 5) и область LCDR3 с последовательностью MQHLEYPIT (SEQ ID NO: 6).
В вариантах осуществления антитело, специфическое в отношении CD19, содержит область HCDR1 с последовательностью SYVMH (SEQ ID NO: 1), область HCDR2 с последовательностью NPYNDG (SEQ ID NO: 2), область HCDR3 с последовательностью GTYYYGTRVFDY (SEQ ID NO: 3), область LCDR1 с последовательностью RSSKSLQNVNGNTYLY (SEQ ID NO: 4), область LCDR2 с последовательностью RMSNLNS (SEQ ID NO: 5) и область LCDR3 с последовательностью MQHLEYPIT (SEQ ID NO: 6).
В вариантах осуществления антитело, специфическое в отношении CD19, характеризуется цитотоксической активностью. В вариантах осуществления антитело, специфическое в отношении CD19, содержит константную область, характеризующуюся активностью индуцирования ADCC. В вариантах осуществления антитело, специфическое в отношении CD19, индуцирует ADCC.
В вариантах осуществления антитело, специфическое в отношении CD19, индуцирует ADCC и содержит область HCDR1 с последовательностью SYVMH (SEQ ID NO: 1), область HCDR2 с последовательностью NPYNDG (SEQ ID NO: 2), область HCDR3 с последовательностью GTYYYGTRVFDY (SEQ ID NO: 3), область LCDR1 с последовательностью RSSKSLQNVNGNTYLY (SEQ ID NO: 4), область LCDR2 с последовательностью RMSNLNS (SEQ ID NO: 5) и область LCDR3 с последовательностью MQHLEYPIT (SEQ ID NO: 6).
В вариантах осуществления антитело, специфическое в отношении CD19, содержит область HCDR1 с последовательностью SYVMH (SEQ ID NO: 1), область HCDR2 с последовательностью NPYNDG (SEQ ID NO: 2), область HCDR3 с последовательностью GTYYYGTRVFDY (SEQ ID NO: 3), область LCDR1 с последовательностью RSSKSLQNVNGNTYLY (SEQ ID NO: 4), область LCDR2 с последовательностью RMSNLNS (SEQ ID NO: 5) и область LCDR3 с последовательностью MQHLEYPIT (SEQ ID NO: 6), и константную область, характеризующуюся активностью индуцирования ADCC.
В вариантах осуществления антитело, специфическое в отношении CD19, содержит вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью  и вариабельный домен легкой цепи с последовательностью
В определенных вариантах осуществления указанное антитело содержит константный домен тяжелой цепи с последовательностью
В вариантах осуществления антитело, специфическое в отношении CD19, содержит константный домен легкой цепи с последовательностью
В вариантах осуществления ингибитор BCL-2 представляет собой венетоклакс.
В вариантах осуществления компоненты комбинации, антитело, специфическое в отношении CD19, и венетоклакс, вводят отдельно. В одном варианте осуществления венетоклакс вводят до введением антитела, специфического в отношении CD19.
В вариантах осуществления компоненты комбинации вводят в определенный момент времени, при этом оба компонента (лекарственных средства) проявляют активность у пациента в одно и то же время. Под "синергизмом" подразумевается, что оба лекарственных средства проявляют активность у пациента в одно и то же время. В вариантах осуществления компоненты комбинации вводят вместе, одновременно, отдельно или последовательно, как физически, так и во времени. В вариантах осуществления компоненты комбинации вводят одновременно.
В вариантах осуществления комбинация представляет собой фармацевтическую композицию. В вариантах осуществления композиция содержит приемлемый носитель. В вариантах осуществления комбинацию вводят в эффективном количестве.
Один аспект настоящего изобретения предусматривает антитело, специфическое в отношении CD19, содержащее область HCDR1 с последовательностью SYVMH (SEQ ID NO: 1), область HCDR2 с последовательностью NPYNDG (SEQ ID NO: 2), область HCDR3 с последовательностью GTYYYGTRVFDY (SEQ ID NO: 3), область LCDR1 с последовательностью RSSKSLQNVNGNTYLY (SEQ ID NO: 4), область LCDR2 с последовательностью RMSNLNS (SEQ ID NO: 5) и область LCDR3 с последовательностью MQHLEYPIT (SEQ ID NO: 6), для лечения неходжкинской лимфомы, хронического лимфоцитарного лейкоза и/или острого лимфобластного лейкоза, где указанное антитело применяют в синергетической комбинации с венетоклаксом.
Один аспект настоящего изобретения предусматривает антитело, специфическое в отношении CD19, содержащее область HCDR1 с последовательностью SYVMH (SEQ ID NO: 1), область HCDR2 с последовательностью NPYNDG (SEQ ID NO: 2), область HCDR3 с последовательностью GTYYYGTRVFDY (SEQ ID NO: 3), область LCDR1 с последовательностью RSSKSLQNVNGNTYLY (SEQ ID NO: 4), область LCDR2 с последовательностью RMSNLNS (SEQ ID NO: 5) и область LCDR3 с последовательностью MQHLEYPIT (SEQ ID NO: 6), для лечения неходжкинской лимфомы, хронического лимфоцитарного лейкоза и/или острого лимфобластного лейкоза, где указанное антитело применяют в комбинации с венетоклаксом. В одном варианте осуществления указанное антитело вводят в комбинации с венетоклаксом. В другом варианте осуществления указанное антитело применяют в комбинации с венетоклаксом, где указанное антитело и венетоклакс вводят отдельно. В дополнительных вариантах осуществления указанное антитело вводят до венетоклакса. В дополнительных вариантах осуществления венетоклакс вводят до указанного антитела.
Один аспект настоящего изобретения предусматривает синергическую комбинацию антитела, специфического в отношении CD19, содержащего область HCDR1 с последовательностью SYVMH (SEQ ID NO: 1), область HCDR2 с последовательностью NPYNDG (SEQ ID NO: 2), область HCDR3 с последовательностью GTYYYGTRVFDY (SEQ ID NO: 3), область LCDR1 с последовательностью RSSKSLQNVNGNTYLY (SEQ ID NO: 4), область LCDR2 с последовательностью RMSNLNS (SEQ ID NO: 5) и область LCDR3 с последовательностью MQHLEYPIT (SEQ ID NO: 6), и венетоклакса для лечения неходжкинской лимфомы, хронического лимфоцитарного лейкоза и/или острого лимфобластного лейкоза. В вариантах осуществления неходжкинская лимфома выбрана из группы, состоящей из фолликулярной лимфомы, мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы, лимфомы лимфоидной ткани слизистых оболочек, лимфомы маргинальной зоны, диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфомы, лимфомы Беркитта и лимфомы из клеток мантийной зоны.
В вариантах осуществления неходжкинская лимфома представляет собой фолликулярную лимфому. В вариантах осуществления неходжкинская лимфома представляет собой мел ко клеточную лимфоцитарную лимфому. В вариантах осуществления неходжкинская лимфома представляет собой лимфому лимфоидной ткани слизистых оболочек. В вариантах осуществления неходжкинская лимфома представляет собой лимфому маргинальной зоны. В вариантах осуществления неходжкинская лимфома представляет собой диффузную крупно клеточную В-клеточную лимфому. В вариантах осуществления неходжкинская лимфома представляет собой лимфому Беркитта. В вариантах осуществления неходжкинская лимфома представляет собой лимфому из клеток мантийной зоны.
В вариантах осуществления комбинация предназначена для лечения хронического лимфоцитарного лейкоза. В вариантах осуществления комбинация предназначена для лечения острого лимфобластного лейкоза.
Другой аспект предусматривает способ лечения неходжкинской лимфомы, хронического лимфоцитарного лейкоза и/или острого лимфобластного лейкоза у индивидуума, нуждающегося в этом, при этом способ предусматривает введение антитела, специфического в отношении CD19, и ингибитора BCL-2. В вариантах осуществления способа антитело, специфическое в отношении CD19, содержит область HCDR1 с последовательностью SYVMH (SEQ ID NO: 1), область HCDR2 с последовательностью NPYNDG (SEQ ID NO: 2), область HCDR3 с последовательностью GTYYYGTRVFDY (SEQ ID NO: 3), область LCDR1 с последовательностью RSSKSLQNVNGNTYLY (SEQ ID NO: 4), область LCDR2 с последовательностью RMSNLNS (SEQ ID NO: 5) и область LCDR3 с последовательностью MQHLEYPIT (SEQ ID NO: 6). В вариантах осуществления способа антитело предусматривает иллюстративное антитело, специфическое в отношении CD19. В вариантах осуществления способа ингибитор BCL-2 представляет собой венетоклакс.
Другой аспект предусматривает применение антитела, специфического в отношении CD19, где указанное антитело содержит область HCDR1 с последовательностью SYVMH (SEQ ID NO: 1), область HCDR2 с последовательностью NPYNDG (SEQ ID NO: 2), область HCDR3 с последовательностью GTYYYGTRVFDY (SEQ ID NO: 3), область LCDR1 с последовательностью RSSKSLQNVNGNTYLY (SEQ ID NO: 4), область LCDR2 с последовательностью RMSNLNS (SEQ ID NO: 5) и область LCDR3 с последовательностью MQHLEYPIT (SEQ ID NO: 6), при производстве лекарственного препарата для лечения неходжкинской лимфомы, хронического лимфоцитарного лейкоза и/или острого лимфобластного лейкоза в синергической комбинации с венетоклаксом.
Примеры
Пример 1. Цитотоксичность в отношении клеток МЕС-1 при применении MOR00208 и венетоклакса по отдельности и в комбинации
Материалы
Тестируемые клеточные линии: клетки МЕС-1 (DSMZ № АСС497). Условия культивирования для клеточных линий применяли в соответствии с инструкциями производителя. Среда для культивирования клеток: Среда Дульбекко, модифицированная по способу Исков (IMDM), Invitrogen, №по кат.: 31980; RPMI1640, Invitrogen, № по кат.: 31870; GlutaMAX, Invitrogen, №по кат.: 35050; FCS: Sigma, № по кат.: F7524, № партии: 111М3396. NK: RPMI1640, с GlutaMAX, Invitrogen, №по кат.: 31870, 10% FCS; Biocoll: Biochrome AG, № по кат.: L6115, №партии: 0034D; набор для выделения клеток NK с помощью технологии MACS: Miltenyi Biotec, № по кат.: 130-092-657, №партии: 5150402327; венетоклакс: Selleck Chem., № по кат.: S8048, № партии: S804803; FCS: Sigma, № по кат.: F7524, № партии: 111М3396; и RefmAb33 (антитело к RSV) с такой же Fc-областью, что и у MOR00208.
Способы
6
Цитотоксический потенциал MOR00208 и венетоклакса по отдельности и в комбинации тестировали на клеточной линии МЕС-1 (CLL). Лизис клеток-мишеней измеряли с применением следующих параметров: обработка одним венетоклаксом при концентрациях 3 мкМ, 6,5 мкМ и 10 мкМ; обработка одним MOR00208 при концентрациях 0,01 пМ, 0,1 пМ, 1 пМ, 10 пМ, 100 пМ и 10 нМ, и обработка комбинацией перечисленных концентраций венетоклакса и MOR00208. В качестве контролей применяли следующее: RefmAb33, клетки NK по отдельности, клетки МЕС-1 по отдельности или DMSO. В группе обработки одним венетоклаксом, а также в группе обработки комбинацией MOR00208 + венетоклакс клетки-мишени предварительно обрабатывали венетоклаксом или DMSO-контролем в течение 24 часов с последующим удалением погибших клеток до проведения анализа ADCC. Набор для удаления погибших клеток применяли для удаления клеток, которые подвергались лизису под действием цитотоксического эффекта венетоклакса. Набор для удаления погибших клеток использовали для имитации удаления погибших клеток, которое также происходит in vivo, и для предотвращения ложноотрицательного воздействия погибших клеток на последующий анализ ADCC. Для анализа ADCC клетки-мишени подсчитывали и окрашивали с применением CFSE при конечной концентрации, составляющей 1 мкг/мл. В случае контрольной группы, т.е. клеток-мишеней, обработанных DMSO, соотношение клетки-эффекторы: клетки-мишени (Е:Т) регулировали до 2:1, т.е. 1×10Е6/мл клеток-эффекторов (клетки NK) и 5×10Е5/мл клеток-мишеней (клетки МЕС-1). В случае группы обработки одним венетоклаксом, а также в случае группы обработки комбинацией MOR00208 + венетоклакс число клеток-мишеней снижалось в зависимости от наблюдаемых цитотоксических эффектов венетоклакса во время 24-часовой обработки, при этом число клеток-эффекторов поддерживалось постоянным при 1×10/мл. Анализы ADCC проводили следующим образом: применяя 96-луночные планшеты, добавляли по 100 мкл суспензии клеток-мишеней МЕС-1 на лунку, а затем по 100 мкл суспензии клеток-эффекторов NK на лунку. Суспензии смешанных клеток центрифугировали и ресуспендировали в среде, содержащей 100 мкл антитела, или соответствующем контрольном растворе. Антитела разбавляли средой до концентрации в диапазоне 10 нМ - 0,01 пМ (соответствует 1,5 мкг/мл - 1,5 пг/мл). Анализы ADCC инкубировали в течение 2 часов в СO2-инкубаторе при 37°С. После 10 минут инкубации на льду в каждую лунку добавляли 50 мкл раствора DAPI (конечная концентрация 1 мкг/мл) и инкубировали в течение дополнительных 10 минут на льду. Измерения ADCC проводили на приборе BD FACSVerse. Погибшие клетки-мишени идентифицировали как DAPI-положительные клетки.
Данные
Чтобы определить цитотоксический потенциал комбинации MOR00208 и венетоклакса суммарно проводили три независимых эксперимента. Отдельные таблицы с исходными данными для всех трех экспериментов показаны в таблицах 1-6. Отдельные кривые ADCC в зависимости от дозы для всех трех экспериментов показаны на фигурах 1-3. Кривые среднего (+/-SEM) показателя аддитивности во всех трех экспериментах для каждой концентрации венетоклакса показаны на фигурах 6-8.
Эксперимент 1
Эксперимент 2
Эксперимент 3
Расчет синергизма
Расчеты показателя аддитивности (CI) выполняли с целью определения синергического действия комбинации иллюстративного антитела к CD19 и венетоклакса по сравнению с MOR00208 и венетоклаксом по отдельности. Такие расчеты приведены в Ting-Chao Chou, Theoretical Basis, Experimental Design, and Computerized Simulation of Synergism and Antagonism in Drug Combination Studies, Pharmacol Rev 58:621-681 (2006), которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте, и Chou ТС, Talalay Р, Quantitative analysis of dose-effect relationships: the combined effects of multiple drugs or enzyme inhibitors. Adv Enzyme Regul 22: 27-55 (1984), которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. Способы Чоу-Талалая осуществляли с применением метода изоболограмм с показателем аддитивности (CI).
Уравнение медианного эффекта
a
u
a
u
a
u
Уравнение медианного эффекта моделирует эффект ингибитора (такого как лекарственное средство) в виде F/F=(D/D50)^m, где D представляет собой дозу, F и F представляют собой часть системы, находящуюся под воздействием и ненаходящуюся под воздействием дозы D (F+F=1); D50 представляет собой дозу, оказывающую медианный эффект (например, IC50, ED50, LD50). Константа т определяет форму кривой доза-эффект. Авторы настоящего изобретения применяли GraphPad Prism для выполнения расчета нелинейной регрессии для оценки параметров т и D50.
Метод изоболограмм с показателем аддитивности (CI)
1
x1
2
x2
Метод изоболограмм с показателем аддитивности (CI) обеспечивает количественную оценку синергизма между лекарственными средствами. Показатель аддитивности (CI) оценивали на основании данных доза-эффект при обработке одним лекарственным средством и комбинацией лекарственных средств. Значение CI меньше 1 указывает на синергизм; CI=1 указывает на аддитивный эффект; и CI>1 указывает на антагонизм. Взаимодействие лекарственных средств (синергизм или антагонизм) тем более выражены, чем больше значение CI отличается от 1. Формально показатель аддитивности (CI) при обработке комбинацией лекарственных средств определяется как CI=D/D+D/D. Здесь D1 и D2 представляют собой дозы лекарственного средства 1 и лекарственного средства 2 из комбинации соответственно; a Dx1, и Dx2 представляют собой дозы при обработке только одним лекарственным средством 1 и лекарственным средством 2, которые будут приводить к тому же эффекту, что и эффект комбинации. Дозы Dx1 и Dx2 нужно оценивать на основании данных доза-эффект при обработках одним лекарственным средством. По существу, уравнение медианного эффекта подгоняли к данным для каждого лекарственного средства. Из уравнения медианного эффекта лекарственного средства авторы настоящего изобретения оценивали дозу (т.е. D), необходимую для получения эффекта (т.е. Fa, Fu). Чем дальше точка лежит от линии аддитивности, чем больше разница между 1 и ее CI, тем сильнее эффект (синергизм или антагонизм).
Результаты
Кривые среднего (+/-SEM) показателя аддитивности во всех трех экспериментах для каждой концентрации венетоклакса показаны на фигурах 6-8. Значения показателя аддитивности указывают на явный синергизм комбинации MOR00208 и венетоклакса при специфическом лизисе клеток МЕС-1 по сравнению с MOR00208 и венетоклаксом по отдельности. Очень низкие дозы MOR00208 оказывают слабый эффект в иллюстративных анализах ADCC лизиса клеток или не оказывают эффекта. Соответственно, значения CI при очень низких дозах MOR00208 показывали значение на уровне 1 или немного выше, при этом данное значение представляет только активность венетоклакса. При концентрациях MOR00208, при которых MOR00208 отдельно демонстрирует нормальную активность лизиса клеток, явный синергизм показан с помощью значений CI меньше 1, которые представляют активность MOR00208 и венетоклакса. Самую высокую концентрацию MOR00208, проиллюстрированную в данном документе, получали в продолжающихся клинических испытаниях, в которых MOR00208 вводят в виде дозы 12 мг/кг один раз в неделю. Соответственно, полагают, что иллюстративная in vitro модель предсказывает активность у людей. Следовательно, комбинация MOR00208 и венетоклакса также должна демонстрировать синергическое поведение при лечении неходжкинской лимфомы (NHL), хронического лимфоидного лейкоза (CLL) и острого лимфобластного лейкоза (ALL) у людей.
Следует понимать, что описание, конкретные примеры и данные с указанием иллюстративных вариантов осуществления приведены в качестве иллюстрации и не предназначены для ограничения настоящего изобретения. Различные изменения и модификации в пределах настоящего изобретения станут очевидными для специалиста в данной области техники из обсуждения, раскрытия и данных, содержащихся в данном документе, и поэтому считаются частью настоящего изобретения.
Пример 2. Эффективность воздействия MOR00208 в комбинации с АВТ-199 на модель подкожного ксенотрансплантата из клеток лимфомы человека у мышей SCID
Положительное воздействие на эффективность MOR00208 пребывания в комбинации с венетоклаксом (АВТ-199) дополнительно изучали на мышиной модели SCID с подкожными опухолями из клеток лимфомы человека TOLEDO. Оценивали рост опухоли и смертность.
Материалы и способы
2
Клеточную линию Toledo и среду для культивирования приобретали и получали от Oncodesign. Опухолевые клетки выращивали в виде монослоя при 37°С в увлажненной атмосфере (5% СO, 95% воздуха). Среда для культивирования представляла собой RPMI 1640, содержащую 2 мМ L-глутамина (номер в каталоге: BE12-702F, Lonza, Вервье, Бельгия), дополненную 10% фетальной бычьей сыворотки (номер в каталоге: Р30-1506, Lonza), HBSS (номер в каталоге: BE10-543F), глюкозой (номер в каталоге: G8769, Sigma, Франция), Hepes (номер в каталоге: ВЕ17-737Е, Lonza) и пируватом натрия (номер в каталоге: ВЕ13-115Е, Lonza). Клетки прикреплялись к пластиковым матрасам. Для применения в экспериментах опухолевые клетки открепляли от культурального матраса посредством 5-минутной обработки трипсином-версеном (номер в каталоге: ВЕ02-007Е, Lonza) в среде Хэнкса без кальция или магния (номер в каталоге: BE10-543F, Lonza) и нейтрализовали добавлением полной среды для культивирования. Клетки подсчитывали в гемоцитометре и их жизнеспособность оценивали посредством анализа исключения с 0,25% трипанового синего.
6
3

Опухоли индуцировали посредством подкожной инъекции 10×10 клеток Toledo в 200 мкл RPMI 1640, содержащей матригель (50:50, объем : объем, номер в каталоге: 356237, BD Biosciences, Франция), в правый бок мышей SCID. В D23, когда опухоли достигали среднего объема 256±68 мм, 60 мышей рандомизировали в соответствии с их индивидуальным объемом опухоли в 6 групп из 10 животных каждая с применением программного обеспечения Vivo Manager (Biosystemes, Кутернон, Франция). Статистический тест (дисперсионный анализ, ANOVA) проводили для проверки однородности групп. MOR208 инъецировали внутрибрюшинно (IP) в брюшную полость мышей. Комбинацию веществ вводили посредством искусственного питания (перорально, РО) через желудочный зонд.
Схему обработки начинали в D23 следующим образом.
Животные из группы 1 получали ежедневно РО введение PEP и одну IP инъекцию PBS два раза в неделю.
Животные из группы 2 получали ежедневно РО введение АВТ-199 из расчета 20 мг/кг/введение
Животные из группы 3 получали ежедневно РО введение АВТ-199 из расчета 40 мг/кг/введение.
Животные из группы 4 получали одну IP инъекцию MOR208 из расчета 11 мг/кг/инъекция в D23, D27, D30, D34, D37 и D41, а затем однократную IP инъекцию MOR208 из расчета 11 мг/кг/инъекция в D48 (два раза в неделю).
Животные из группы 5 получали ежедневно РО введение АВТ-199 из расчета 20 мг/кг/введение в комбинации с IP инъекциями MOR208 из расчета 11 мг/кг/инъекция в D23, D27, D30, D34, D37 и D41 и в D48, D51, D55 и D58.
Животные из группы 6 получали ежедневно РО введение АВТ-199 из расчета 40 мг/кг/введение в комбинации с двумя циклами из одной IP инъекции MOR208 из расчета 11 мг/кг/инъекция в D23, D27, D30, D34, D37 и D41 и в D48, D51, D55 и D58.

Все данные исследования, включая измерения массы тела животных, регистрацию клинических показателей и смертности, а также обработку планировали и регистрировали в базе данных Vivo Manager (Biosystemes, Дижон, Франция). Жизнеспособность и поведение регистрировали каждый день. Массу тела и объем опухоли измеряли два раза в неделю. Длину и ширину опухоли измеряли два раза в неделю с помощью штангенциркуля и объем опухоли оценивали по формуле:
Результаты
Обработка комбинацией MOR00208 и АВТ-199 при дозе 20 и 40 мг/кг приводила к превосходящему и статистически значимому ингибированию роста клеток лимфомы Toledo по сравнению со схемами контроля средой-носителем и обеими монотерапиями. Противоопухолевый эффект MOR00208 в комбинации с АВТ-199 был еще более выраженным, когда анализировали выживаемость мышей от момента рандомизации до гуманной конечной точки (объем опухоли, составляющий 2000 мм3). Медиана выживаемости и соответственное увеличение продолжительности жизни в группах обработки комбинацией являлись превосходящими по сравнению с соответственными монотерапиями. Дополнительное определение характеристик эффекта комбинации отнесло результат комбинации MOR00208 к разряду потенцирования, поскольку эффект комбинации больше суммы соответственных монотерапий (фигура 9, таблица 7, фигура 10, таблица 8).
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> MorphoSys AG
<120> Комбинации и их применение
<130> MS255
<150>
<151>
<160> 15
<170> BiSSAP 1.0
<210> 1
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетическая конструкция
<400> 1
Ser Tyr Val Met His
1               5
<210> 2
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетическая конструкция
<400> 2
Asn Pro Tyr Asn Asp Gly
1               5
<210> 3
<211> 12
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетическая конструкция
<400> 3
Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Thr Arg Val Phe Asp Tyr
1               5                   10
<210> 4
<211> 16
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетическая конструкция
<400> 4
Arg Ser Ser Lys Ser Leu Gln Asn Val Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr
1               5                   10                   15
<210> 5
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетическая конструкция
<400> 5
Arg Met Ser Asn Leu Asn Ser
1               5
<210> 6
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетическая конструкция
<400> 6
Met Gln His Leu Glu Tyr Pro Ile Thr
1               5
<210> 7
<211> 556
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<220>
<223> CD19
<400> 7
Met Pro Pro Pro Arg Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Leu Thr Pro Met
1               5                   10                   15
Glu Val Arg Pro Glu Glu Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp
20                   25                  30
Asn Ala Val Leu Gln Cys Leu Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln
35                   40                  45
Gln Leu Thr Trp Ser Arg Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys Leu
50                   55                  60
Ser Leu Gly Leu Pro Gly Leu Gly Ile His Met Arg Pro Leu Ala Ile
65                   70                  75                  80
Trp Leu Phe Ile Phe Asn Val Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr Leu
85                   90                  95
Cys Gln Pro Gly Pro Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr
100                  105                110
Val Asn Val Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp
115                  120                125
Leu Gly Gly Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro
130                  135                140
Ser Ser Pro Ser Gly Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp Ala
145                  150                155                  160
Lys Asp Arg Pro Glu Ile Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Leu Pro Pro
165                  170                175
Arg Asp Ser Leu Asn Gln Ser Leu Ser Gln Asp Leu Thr Met Ala Pro
180                  185                190
Gly Ser Thr Leu Trp Leu Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser
195                  200                205
Arg Gly Pro Leu Ser Trp Thr His Val His Pro Lys Gly Pro Lys Ser
210                  215                220
Leu Leu Ser Leu Glu Leu Lys Asp Asp Arg Pro Ala Arg Asp Met Trp
225                  230                235                  240
Val Met Glu Thr Gly Leu Leu Leu Pro Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala
245                  250                255
Gly Lys Tyr Tyr Cys His Arg Gly Asn Leu Thr Met Ser Phe His Leu
260                  265                270
Glu Ile Thr Ala Arg Pro Val Leu Trp His Trp Leu Leu Arg Thr Gly
275                  280                285
Gly Trp Lys Val Ser Ala Val Thr Leu Ala Tyr Leu Ile Phe Cys Leu
290                  295                300
Cys Ser Leu Val Gly Ile Leu His Leu Gln Arg Ala Leu Val Leu Arg
305                  310                315                  320
Arg Lys Arg Lys Arg Met Thr Asp Pro Thr Arg Arg Phe Phe Lys Val
325                  330                335
Thr Pro Pro Pro Gly Ser Gly Pro Gln Asn Gln Tyr Gly Asn Val Leu
340                  345                350
Ser Leu Pro Thr Pro Thr Ser Gly Leu Gly Arg Ala Gln Arg Trp Ala
355                  360                365
Ala Gly Leu Gly Gly Thr Ala Pro Ser Tyr Gly Asn Pro Ser Ser Asp
370                  375                380
Val Gln Ala Asp Gly Ala Leu Gly Ser Arg Ser Pro Pro Gly Val Gly
385                  390                395                  400
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Glu Gly Tyr Glu Glu Pro Asp Ser Glu Glu
405                  410                415
Asp Ser Glu Phe Tyr Glu Asn Asp Ser Asn Leu Gly Gln Asp Gln Leu
420                  425                430
Ser Gln Asp Gly Ser Gly Tyr Glu Asn Pro Glu Asp Glu Pro Leu Gly
435                  440                445
Pro Glu Asp Glu Asp Ser Phe Ser Asn Ala Glu Ser Tyr Glu Asn Glu
450                  455                460
Asp Glu Glu Leu Thr Gln Pro Val Ala Arg Thr Met Asp Phe Leu Ser
465                  470                475                  480
Pro His Gly Ser Ala Trp Asp Pro Ser Arg Glu Ala Thr Ser Leu Gly
485                  490                495
Ser Gln Ser Tyr Glu Asp Met Arg Gly Ile Leu Tyr Ala Ala Pro Gln
500                  505                510
Leu Arg Ser Ile Arg Gly Gln Pro Gly Pro Asn His Glu Glu Asp Ala
515                  520                525
Asp Ser Tyr Glu Asn Met Asp Asn Pro Asp Gly Pro Asp Pro Ala Trp
530                  535                540
Gly Gly Gly Gly Arg Met Gly Thr Trp Ser Thr Arg
545                  550                555
<210> 8
<211> 450
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Тяжелая цепь RefMab33
<400> 8
Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1               5                   10                   15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ala
20                   25                  30
Gly Met Ser Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35                   40                  45
Trp Leu Ala Asp Ile Trp Trp Asp Asp Lys Lys His Tyr Asn Pro Ser
50                   55                  60
Leu Lys Asp Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65                   70                  75                  80
Val Leu Lys Val Thr Asn Met Asp Pro Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85                   90                  95
Cys Ala Arg Asp Met Ile Phe Asn Phe Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln
100                  105                110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115                  120                125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130                  135                140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145                  150                155                  160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165                  170                175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180                  185                190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195                  200                205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210                  215                220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225                  230                235                  240
Pro Asp Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245                  250                255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260                  265                270
Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275                  280                285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg
290                  295                300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305                  310                315                  320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Glu Glu
325                  330                335
Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340                  345                350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355                  360                365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370                  375                380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met
385                  390                395                  400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405                  410                415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420                  425                430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435                  440                445
Gly Lys
450
<210> 9
<211> 213
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Легкая цепь RefMab33
<400> 9
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                   15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Arg Val Gly Tyr Met
20                   25                  30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35                   40                  45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50                   55                  60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65                   70                  75                  80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser Gly Tyr Pro Phe Thr
85                   90                  95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100                  105                110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115                  120                125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130                  135                140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145                  150                155                  160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165                  170                175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180                  185                190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195                  200                205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 10
<211> 121
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетическая конструкция
<400> 10
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1               5                   10                   15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20                   25                  30
Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35                   40                  45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50                   55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Ser Ser Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                   70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85                   90                  95
Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Thr Arg Val Phe Asp Tyr Trp Gly
100                  105                110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                  120
<210> 11
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 11
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                   15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Gln Asn Val
20                   25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35                   40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Asn Ser Gly Val Pro
50                   55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile
65                   70                  75                  80
Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Met Gln His
85                   90                  95
Leu Glu Tyr Pro Ile Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                  105                110
<210> 12
<211> 330
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> synthetic construct
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr  20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser  35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser  50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85                  90                  95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100                 105                 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Asp Val Phe Leu Phe Pro Pro 115                 120                 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130                 135                 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp
145                 150                 155                 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu  165                 170                 175
Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val  180                 185                 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195                 200                 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Glu Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly  210                 215                 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225                 230                 235                 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr  245                 250                 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn  260                 265                 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe  275                 280                 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn  290                 295                 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305                 310                 315                 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys  325                 330
<210> 13
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 13
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1               5                   10                   15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20                   25                  30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35                   40                  45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50                   55                  60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65                   70                  75                  80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85                   90                  95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100                  105
<210> 14
<211> 451
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 14
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20                   25                  30
Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35                   40                  45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50                   55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Ser Ser Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                   70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85                   90                  95
Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Thr Arg Val Phe Asp Tyr Trp Gly
100                  105                110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115                  120                125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130                  135                140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145                  150                155                  160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165                  170                175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180                  185                190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195                  200                205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210                  215                220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225                  230                235                  240
Gly Pro Asp Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245                  250                255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260                  265                270
Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275                  280                285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe
290                  295                300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305                  310                315                  320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Glu
325                  330                335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340                  345                350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355                  360                365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370                  375                380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385                  390                395                  400
Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405                  410                415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420                  425                430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435                  440                445
Pro Gly Lys
450
<210> 15
<211> 219
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 15
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Gln Asn Val
20                   25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35                   40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Asn Ser Gly Val Pro
50                   55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile
65                   70                  75                  80
Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Met Gln His
85                   90                  95
Leu Glu Tyr Pro Ile Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                  105                110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115                  120                125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130                  135                140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145                  150                155                  160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165                  170                175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180                  185                190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195                  200                205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210                  215
<---