Штамм Streptomyces tendae - продуцент противобактериального антибиотика ИНА 5812
STRAIN STREPTOMYCES TENDAE - PRODUCER OF ANTIBACTERIAL ANTIBIOTIC INA 5812

Область техники, к которой относится изобретение.
Изобретение относится к медицине и биотехнологической промышленности и касается нового штамма актиномицета, образующего противобактериальный антибиотик ИНА 5812.
Антибиотик ИНА S812 по химическому строению является новым природным линейно-циклическим гликопептидным соединением, обладающим высокими показателями антибактериальной активности в отношении грамположительных патогенов in vitro и химиотерапевтической эффективностью в лабораторных опытах in vivo при лечении стафилококкового сепсиса у белых мышей.
Предшествующий уровень техники
Известен штамм Streptomyces roseoflavous ИНА-Ас-5812 - продуцент антибиотика ИНА 5812 (1), принятый в качестве прототипа. Недостатком данного штамма является низкая антибиотическая активность - 10 мкг в 1 мл ферментационной жидкости.
Раскрытие изобретения
60
Сущность изобретения состоит в том, что получен новый штамм-продуцент антибиотика ИНА 5812 путем селекционного преобразования свойств почвенной культуры Streptomyces tendae (2) в результате последовательного многоступенчатого воздействия физических (УФ-, гамма-лучи Со) и химических (N-нитрозосоединения) мутагенов на споры исходной культуры и отбора высокоактивного мутантного штамма №3117 среди мутагенизированной популяции колоний актиномицета, выросших на селективном фоне устойчивости к гликопептидным антибиотикам ристомицину, эремомицину и блеомицину.
Полученный новый штамм Streptomyces tendae №3117 принят на национальное патентное депонирование в коллекции культур БРЦ ВКПМ НИЦ «Курчатовский институт»-ГосНИИгенетика под номером штамм ВКПМ Ас-1980.
Штамм Streptomyces tendae ВКПМ Ас-1980 обладает повышенной антибиотической активностью образования антибиотика ИНА 5812 (2500 мкг в 1 мл ферментационной жидкости) и характеризуется следующими таксономическими, культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками.
Таксономические, культурально-морфологические и физиологические признаки штамма Streptomyces tendae ВКПМ Ас-1980
Таксономические признаки. Длительность выращивания для изучения таксономических признаков (7-21) суток при температуре 28°С. Для засева диагностических сред используется споровый посевной материал десятидневной культуры штамма, выращенной на глицерин-ниратном агаре Линденбайна или на среде №2 Гаузе. Цвет определен по таблицам Бондарцева и Праузера.
Данные приведены в таблице №1.
Морфологические признаки. Гифы воздушного мицелия извилистые, цепочки спор извитые с редкими спиралями, поверхность спор гладкая.
Физиолого-биохимические свойства. Аэроб. Растет при (24-37)°С, оптимум роста 28°С и в диапазонах значений рН (5,0-10,0) оптимум роста при рН 7,0. Желатину разжижает. Молоко пептонизирует. Сахарозу инвертирует. Крахмал гидролизует. На клетчатке не растет. Восстанавливает нитраты до нитритов. Меланоидные пигменты не образует при росте на среде Треснера с пептоном и лимонно-кислым железом.
Использование источников углерода. При росте на средах с неорганическим источником азота хорошо утилизирует глюкозу, фруктозу, мальтозу; умеренно - сахарозу, арабинозу, лактозу; слабо использует сорбат, манит, раффинозу; не использует целлюлозу.
Антагонистические свойства. Streptomyces tendae ВКПМ Ас-1980 при испытании методом штриха на глюкозо-нитратном агаре №2 Гаузе подавляет рост грамположительных бактерий и дрожжеподобных грибов и не действует на грамотрицательные бактерии. Штамм фагоустойчив. Фаг в культуре отсутствует.
Хранение штамма. Штамм Streptomyces tendae ВКПМ Ас-1980 хранится в виде спор на стерильной почве с кварцевым песком или на зернах пшена, а также в виде зрелой культуры на агаровых средах под вазелиновым маслом.
Определение антибиотической активности в ферментационной жидкости
Антибиотическая активность штамма Streptomyces tendae ВКПМ Ас-1980 при глубинном культивирвании определяется луночным методом диффузии в агар (среда №2 Гаузе) с использованием в качестве теста микроорганизма Bacillus subtilis АТСС6633 и сравнением диаметров зон подавления бактериального роста образцами ферментационной жидкости с калибровочной кривой стандарта субстанции антибиотика ИНА 5812 (6,25-50 мкг/мл). Биологическая активность получаемой биосинтезом и химически очищенной субстанции антибиотика определяется трехдозным вариантом метода (ГФХ, стр. 949).
Streptomyces tendae ВКПМ Ас-1980 поясняется следующим примером.
Пример. Для получения спорового материала культуру Streptomyces tendae штамм ВКПМ Ас-1980 выращивают в течение 7 суток при 37°С на агаровой среде №2 Гаузе следующего состава, %
Триптон 0,3
Глюкоза 1,0
Пептон 0,5
Агар 3,0
NaCl 0,5
Вода водопроводная рН до стерилизации 7,0-7,2
Среда стерилизуется в течение 30 мин при давлении 0,6 атм и температуре 120°С.
Споровым материалом с мицелием засевают посевную жидкую питательную среду (100 мл в колбах Эрленмейера объемом 0,75 л) и культивируют при 28°С в течение 24-48 часов на круговой качалке со скоростью вращения 220-240 об/мин. Выросшим посевным мицелием засевают ферментационную питательную среду (100 мл колбах Эрленмейера объемом 0,75 л) следующего состава, %:
Соевая мука 3,0
Глюкоза 3,0
NaCl 0,3
3
CaCo 0,3
Вода водопроводная
рН до стерилизации 7,0-7,2
Стерилизация течение 30 мин при давлении 0,6 атм и температуре 120°С.
Количество посевного материала для инокуляции - (5-7)%
Ферментационное культивирование проводят при 28°С в течение 144 час на круговой качалке (скорость вращения 220-240 об/мин). Антибиотик ИНА 5812 накапливается в культуральной жидкости продуцента. Антибиотически активность штамма Streptomyces tendae ВКПМ Ас-1980, определенная биологическим методом диффузии в агар, составляет к окончанию ферментации 2500 мкг/мл. Выделение антибиотика проводят сорбционным методом, описанным в патенте РФ (1).
Таким образом, получен новый мутантный штамм Streptomyces tendae ВКПМ Ас-1980, отличающийся от известного по способности антибиотикообразования, которая в 200 раз превосходит активность продуцента-прототипа Streptomyces roseoflavus ИНА Ас-5812. (Таблица 2).
Использование нового штамма Streptomyces tendae ВКПМ Ас-1980 позволит значительно увеличить выход целевого продукта для детального и всестороннего экспериментального изучения его физико-химических и химиотерапевтических свойств.
Источники информации
1. Патент RU 2572341 от 11.2015 г.
2. Г.Ф. Гаузе, Т.П. Преображенская, М.А. Свешникова и др., «Определение актиномицетов», М., 1983, стр. 42.
(+++) - хороший; (++) - умеренный; (+) - слабый