Стабильность и агрегационная способность водорастворимых белков скелетных мышц нерестовой кеты

Известия ТИНРО

2003 Том 134

ТЕХНОЛОГИЯ ОБРАБОТКИ ГИДРОБИОНТОВ

УДК 597-1.05

М.В.Орлова, С.В.Леваньков, Е.В.Якуш

СТАБИЛЬНОСТЬ И АГРЕГАЦИОННАЯ СПОСОБНОСТЬ ВОДОРАСТВОРИМЫХ БЕЛКОВ СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦ НЕРЕСТОВОЙ КЕТЫ

На основании исследования процессов агрегации и денатурации дана сравнительная оценка стабильности водорастворимых белков скелетных мышц кеты в зависимости от степени выраженности нерестовых изменений. Показано, что независимо от степени выраженности нерестовых изменений исследуемых объектов водорастворимые белки скелетных мышц характеризуются идентичностью поведения в условиях, вызывающих денатурационные процессы. Установлено, что исходное состояние объекта определяет как конформационную стабильность белков, так и степень их конформационных и денатурационных изменений и приводит к образованию систем, имеющих различия в свойствах, характеризующих межбелковые взаимодействия. Установлено, что состояние белков, в большей степени приближенное к нативному, в результате агрегационных и денатурацион-ных процессов подвержено более глубоким изменениям. Показано, что переход белков в нерастворимое агрегированное состояние препятствует значительным делокализованным изменениям конформаций белковых молекул, уменьшая таким образом их способность спонтанно денатурировать в процессах реагентной и температурной обработок.

Orlova M.V., Levan'kov S.V., Yakush E.V. Stability and aggregation ability of water-soluble protein from skeletal muscles of spawning chum salmon // Izv. TINRO. — 2003. — Vol. 134. — P. 289-297.

On the results of investigation the aggregation and denaturation processes, the stability of water-soluble protein of spawning chum salmon skeletal muscles was comparatively estimated. Processes of heat and reagent denaturation were studied by the means of ultraviolet fluorescence.

The stability dependence on a degree of spawning changes of fish was determined. However, for any degree of the spawning changes, the water-soluble proteins of skeletal muscles had identical behavior in requirements initiating denaturing processes. The initial state of object defined both conformation stability of protein and their conformation and denaturing changes, and predestined properties of the systems formed in dependence on interproteinaceous interactions.

The physicochemical parameters of the aggregation processes under influence of low concentration of denaturating agents and temperature were investigated. The water-soluble proteins aggregation kinetic parameters at the conditions of denaturat-ing treatment were compared with the parameters of the aggregation of native protein agglomerates. So far as conversion of proteins in insoluble aggregation state prevents from delocalized changes of protein molecules conformations, it reduces the ability of proteins to denature spontaneously under either reagent or heat treatment.

There is concluded, that the proteins being in the state with greater degree of native properties were subjected to more penetrating changes in the result of aggregation and denaturation processes. On the basis of the data obtained on a quantitative assessment of efficiency of aggregation and denaturation processes for water-soluble protein of the objects with different spawning changes, the general conditions of raw material heat treatment were specified.

Денатурация является основным направлением изменения нативной структуры и свойств белков, если технология изготовления продукции включает температурную обработку (производство консервов, формованной продукции, кулинарных изделий и т.п.). Денатурация белков под действием температуры — главный процесс, предопределяющий состояние и свойства конечного продукта. Важная роль в этом принадлежит водорастворимым белкам, в особенности при реализации технологий переработки целых мышц или стабилизированных непромытых фаршей (Jebsen, 1962).

Изменения свойств сырья при этом будут зависеть от степени и глубины не только денатурационных изменений белков, но и сопутствующих, и постдена-турационных процессов (Konosu et al. , 1965; Von Hippel , Wang , 1965). К ним относятся изменения молекулярных параметров (размер и форма молекул, конфигурационные изменения), оптических свойств (двойное лучепреломление, мутность и светорассеяние, спектры поглощения и флуоресценции), электрохимических свойств и, безусловно, изменения характера межбелковых взаимодействий, проявляющиеся в протекании спонтанных процессов ассоциации и агрегации белков (Shimizu et al., 1976).

Агрегация — процесс, который реально влияет на структурно-механические свойства будущего продукта. Изучение процессов агрегации позволяет планировать свойства будущего продукта на основе знаний о составе и свойствах агрегатов, кинетических параметрах их образования и соотношении этих параметров для различных белков, составляющих сложную систему (Shimizu, Nishi-oka, 1974).

Агрегационные процессы имеют значение не только при разработке и планировании технологических регламентов. Интерес исследователей к ним велик также в связи с ролью агрегации в процессах кристаллизации и фолдинга белков (Курганов, Топчиева, 1998; Птицын, 1998), в разработке методов ренатура-ции белков и ферментов (Курганов, 1998), поиске новых, в том числе синтетических, соединений, обладающих шаперонной активностью (Mitraki et al., 1991; Курганов, 2002).

Цель данной работы — на основании исследования процессов агрегации и денатурации охарактеризовать стабильность водорастворимых белков скелетных мышц кеты в зависимости от степени выраженности нерестовых изменений.

В качестве объекта исследования нами использована нерестовая кета приморской популяции с различной степенью выраженности брачных изменений.

Осеннюю кету, выловленную в районе нерестовой р. Аввакумовка (Приморский край, Ольгинский район), разделяли на две группы: группа I — рыба со слабовыраженными брачными признаками, выловлена в море перед заходом в реку; группа II — рыба с текучими гонадами, с ярко выраженными нерестовыми изменениями, выловлена на расстоянии 0,5-1,0 км от устья (Орлова и др., 2003).

Для экстракции водорастворимых белков использовали 5 мМ раствор ЭДТА с добавкой 5 мМ меркаптоэтанола, рН 6,8-7,0; соотношение экстрагент: мышечная ткань — 5: 1. Однократная экстракция в данных условиях не приводит к количественному извлечению водорастворимых белков, но обеспечивает качественный состав и соотношения основных белков экстракта, характерные для мышцы в целом (Орлова и др., наст. сб.).

Спектры флуоресценции записывали на приборе RF-5000 (Shimadzu, Япония) при длинах волн экстинкции (^Ex) 260-290 нм. Спектры ультрафиолетовой флуоресценции регистрировали в автоматическом режиме при ширине щели экстинкции 3-10 нм и эмиссии 5-15 нм.

Концентрацию белка в растворах определяли по поглощению в УФ-спект-ре при длинах волн 260 и 280 нм. Для расчетов использовали формулу Варбур-га-Христиана (Warburg, Christian, 1941; Layne, 1957). УФ-спектры регистрировали на приборе Hitachi 330 (Япония).

Агрегационные процессы в растворах белков изучали методом определения кажущейся оптической плотности растворов на приборе КФК-2-УХЛ (Россия) при длине волны 400 нм, толщине кюветы 1 см.

В качестве основного метода регистрации конфигурационных и делокализо-ванных изменений белков использовали метод собственной ультрафиолетовой флуоресценции (УФФ), чувствительность которого позволяет фиксировать даже самые незначительные изменения пространственной структуры белка (Турове-ров и др., 1975; Уверский, Нарижнева, 1998). Для анализа УФФ-спектров определяли следующие характеристики: длину волны максимума эмиссии — ^Em (max), интенсивность флуоресценции — Amax, интенсивность сигнала при ^Em 320 нм — A320 и ^Em 360 нм — A360, полуширину сигнала — W^2h — как интервал длин волн, соответствующих половине высоты сигнала.

Степень денатурационных изменений белков оценивали сравнивая положение сигнала эмиссии спектра УФФ белка. Для количественной характеристики степени денатурации использовали отношение величин эмиссии спектра УФФ, соответствующих длинам волн эмиссии при 320 и 360 нм (параметр А = = А320/А360) (Туроверов, Щелчков, 1970).

Для определения доли денатурированного белка применяли формулу Туро-верова-Щелчкова (Туроверов и др., 1975).

Для оценки степени изменения характеристик УФФ-спектров вследствие денатурации водорастворимые белки нерестовой кеты подвергали денатурирующему воздействию растворов мочевины различных концентраций (рис. 1). Концентрацию мочевины увеличивали ступенчато до тех пор, пока не стабилизировались значения основных параметров УФФ-спектров. В зависимости от степени выраженности нерестовых изменений рыбы стабилизация характеристик спектров водорастворимых белков наблюдалась при концентрациях мочевины не менее 4,0-4,5 М, а при концентрации 8,0 М практически все параметры достигали предельных значений (табл. 1).

Данные табл. 1 свидетельствуют, что в результате денатурации водорастворимых белков скелетных мышц нерестовой кеты происходит резкое снижение величины максимума эмиссии — в 1,86 раза для кеты группы I и в 1,51 раза для кеты группы II. Длина волны максимума излучения смещается в сторону более длинных волн в среднем на 22,2 нм. Изменение ширины сигнала на высоте, соответствующей половине максимума излучения, составляет 15,2 нм для кеты группы I (с 59,6 до 74,8 нм) и 11,6 нм (с 62,0 до 73,6) для кеты группы II. Наиболее заметно снижение параметра А (А = А320/А360) — с 1,33 до 0,42 для кеты группы I и с 1,34 до 0,54 для кеты группы II.

Наблюдаемые для белков разных групп сырья различия характеристик спектров УФФ свидетельствуют, с одной стороны, о более высокой степени нативно-сти водорастворимых белков скелетных мышц кеты группы I по сравнению с белками кеты группы II (Туроверов, Щелчков, 1970). С другой стороны, конечные величины приведенных показателей свидетельствуют о протекании денатураци-онных процессов, приводящих к различному состоянию белков кеты обеих групп (Черницкий, Мажуль, 1970). Вероятнее всего, различия УФФ-характеристик обнаруживаются вследствие локализованных конформационных изменений белков, в результате чего пространственное окружение триптофанилов белков различ-

но (Эфтннк, 1998). Это подтверждается различиями в общей агрегационной способности денатурированных водорастворимых белков скелетных мышц нерестовой кеты и кинетике их агрегации.

. 500

ч

о»

I 450

е

> 400

и о

§ 350

ш ^

о

00 300 250

Концентрация мочевины, M Концентрация мочевины, M

Рис. 1. Изменение УФФ-характеристик водорастворимых белков нерестовой кеты: 1 — группа I; 2 — группа II в процессе денатурации в растворах мочевины

Fig. 1. Changing ultraviolet fluorescence characteristics of water-soluble proteins of spawning chum salmon skeletal muscle: 1 — group I; 2 — group II during denaturation under urea solutions treatment

Таблица 1

Характеристики спектров УФФ водорастворимых белков скелетных мышц нерестовой кеты в исходном и денатурированном состоянии

Table 1

Ultraviolet fluorescence spectrums of water-soluble proteins of spawning chum salmon skeletal muscle in initial and denaturation states

Характеристика спектров УФФ Исходное Объект (группа) I Денатурированное и его состояние II Исходное Денатурированное

А , отн. ед. max' (max), нм W1/2h, нм A /A 320' 360 534 ±8 332,8 ± 1,2 59,8±0,3 1,33±0,02 287±4 355,6± 1,6 75,2±0,2 0,42 387±6 332,8±1,2 61,8±0,2 1,34 ±0,01 256± 4 355,6±1,6 73,4±0,6 0,54

Нами установлено, что для водорастворимых белков мышечных тканей нерестовой кеты характерна хорошо известная для белков способность к агрегации под действием низких концентраций денатурирующих агентов — мочевины или гуанидинхлорида фе Yuong е! а1., 1993; Еронина и др., 2001).

В случае водорастворимых белков нерестовой кеты мы наблюдали агрегацию белков в интервале концентраций мочевины 1-3 М при температуре 25 0С (рис. 2).

Привлекает внимание тот факт, что в 1 М мочевине (при минимальной концентрации денатурирующего агента, рис. 2, а) кривые агрегации водорастворимых белков кеты обеих групп имеют одинаковый профиль на участке, предше-

ствующем насыщению, которое наступает для обоих образцов практически в одно и то же время (т.е. к 70-й мин эксперимента). При увеличении концентрации денатурирующего агента до 2 М (рис. 2, б) кривая агрегации белков кеты группы I достигает области насыщения значительно ранее кривой агрегации белков кеты группы II (45,0 мин против 62,5 мин) вследствие непропорционального увеличения начальных скоростей агрегации водорастворимых белков кеты исследуемых групп. Абсолютные значения оптической плотности растворов при этом выше, чем в случае процесса в 1 М растворе мочевины, что свидетельствует о более полной агрегации в обоих исследуемых образцах.

0,7 < 0,6 £ 0,5 | 0,4 £ 0,3

О

т 0,2

0

< 0,5

jí о

£ 0,4

0

= 0,3

к

го

1 0,2

0

0 10 20 30 40 50

Время, мин

В

Рис. 2. Агрегация водорастворимых белков нерестовой кеты в 1 (а), 2 (б) и 3 (в) М растворах мочевины. Приведены фрагменты кривых агрегации до достижения насыщения

Fig. 2. Aggregation of water-soluble proteins of spawning chum salmon in 1 (а), 2 (б) and 3 (в) M urea solutions. The fragment of aggregation curve preceding saturation is shown

Физико-химические константы агрегации, полученные в результате анализа завершающей фазы процесса агрегации (без учета начальных участков кинетических кривых, включающих лаг-период), приведены в табл. 2.

Дальнейшее увеличение концентрации денатурирующего агента (рис. 2, в) приводит к такому же эффекту различия скоростей агрегации и к еще большей разнице времени достижения насыщения (25,0 мин для кеты группы I и 52,5 мин — для кеты группы II). При этом абсолютное значение кажущейся оптической плотности растворов обоих образцов практически не отличается от таковых в случае использования 1 М раствора мочевины. Видимо, процесс агрегации уравновешивается процессом растворения агрегатов, который сопровождается денатурацией (см. рис. 1). Отсутствие агрегации водорастворимых белков в растворах 4 М мочевины, по-видимому, является следствием преимущественного разрушения белковых агрегатов и ассоциатов и в значительной степени солюбилизации денатурированных белков.

По-разному агрегируют водорастворимые белки скелетных мышц нерестовой кеты изучаемых образцов в условиях температурного воздействия. Отме-

.......

...........

тим, что при температуре 20-25 °С не происходит изменений характеристик УФФ-спектров и не наблюдается агрегация водорастворимых белков мышечных тканей нерестовой кеты обеих групп.

Таблица 2

Физико-химические характеристики агрегации водорастворимых белков скелетных мышц нерестовой кеты в растворах мочевины

Table 2

Physicochemical characteristics of aggregation of spawning chum salmon water-soluble proteins in urea solutions

Показатель агрегации

Концентрация раствора мочевины, M 123 Объект (группа) I II I II I II

Предельное значение кажущегося

оптического поглощения А.., AU 0,534 0,422 0,921 0,819 0,711 0,453

Константа скорости агрегации k1,

мин

Начальная скорость агрегации V0, ед. оптической плотности/мин (AU/мин)_

0,013 0,010 0,0236 0,011 0,0341 0,016 0,0068 0,0042 0,0217 0,0088 0,0239 0,0072

При температуре 35 0С даже при нагревании до 2,5 ч практически не происходит изменений длины волны эмиссии, полуширины сигнала, но параметр А (А320/А360) уменьшается с 1,29 до 1,16 для кеты группы I и с 1,29 до 1,05 для кеты группы II, что свидетельствует о протекании конформационных перестроек или изменении характера межбелковых взаимодействий.

Вследствие этого мы наблюдали агрегацию белков кеты обеих групп (рис. 3, а). Профили кривых агрегации на участке, предшествующем области насыщения, были похожи на наблюдавшиеся под действием растворов мочевины, но характеризовались отсутствием заметного лаг-периода, что находит отражение в изменении кинетических характеристик процесса агрегации (табл. 3). Основное количество белка агрегировало в течение 40 мин экспозиции растворов при указанной температуре. В дальнейшем при нагревании дольше указанного времени отмечено дополнительное количество агрегировавшего белка. Общее количество агрегировавшего белка в обоих образцах экстрактов больше, чем при агрегировании в присутствии 1 М мочевины.

Рис. 3. Температурная агрегация водорастворимых белков нерестовой кеты при 35 °С

Fig. 3. Heat aggregation of water-soluble proteins of spawning chum salmon at 35 оС

Таблица 3

Физико-химические характеристики тепловой агрегации водорастворимых белков

скелетных мышц нерестовой кеты

Table 3

Physicochemical characteristics of heat aggregation of spawning chum salmon water-soluble proteins

Показатель агрегации 35 I Температура, °С 55 Объект (группа) II I II

Предельное значение кажущегося оптического поглощения АПт, Аи Константа скорости агрегации Ц, мин-1 Начальная скорость агрегации У0, ед. оптической плотности/мин (Аи/мин) 0,605 0,0459 0,0253 0,481 0,0233 0,0112 1,442 0,2248 0,3237 0,819 0,3805 0,3226

При нагревании образцов до температуры 55 0С (рис. 3, б) процесс агрегации белков обеих групп кеты имел схожий характер, но насыщение достигалось в течение 5,0-5,5 мин нагревания, хотя и в дальнейшем отмечалось некоторое увеличение кажущейся оптической плотности (мутности) растворов, которое было более выражено для белков нерестовой кеты группы I. В данном эксперименте процесс агрегации, как и в предыдущем случае, не сопровождался изменением характеристик УФФ-спектров белков. Все изменения параметров спектров УФФ, свидетельствующие о значительных делокализованных изменениях белков, наблюдались на стадии практически полной агрегации. Так, было отмечено снижение интенсивности сигнала УФФ только по истечении 40 мин экспозиции растворов, а минимальное значение (в 1,87 раза для кеты группы I и 1,24 раза для белков кеты группы II) было зафиксировано только после 1 ч нагревания. К этому времени изменяются и остальные параметры УФФ-спектров. Таким образом, только после достаточно полной агрегации в результате продолжительного температурного воздействия денатурационные процессы начинают заметно проявлять себя. При этом оценка степени денатурационных изменений на основании сравнения изменений параметров сигналов УФФ-спект-ров позволяет сделать вывод, что их глубина составляет величины не более 50 % для водорастворимых белков мышечных тканей нерестовой кеты группы II и 25 % — группы I.

При более высоких температурах нагревания (до 80 0С) скорость агрегации возрастает еще более, и практически полная агрегация белка (раствор абсолютно непрозрачный) наступает уже через 0,5-0,75 мин после достижения в системе температуры 80 0С. Однако изменения параметров УФФ-спектров, свидетельствующие о денатурации, наблюдаются только к 20-й мин нагревания при данной температуре.

Так, интенсивность сигнала УФФ уменьшается для кеты обеих групп в 1,4 раза; полуширина сигнала изменяется на 8,8 нм (62,8-71,6) для кеты группы I и на 10 нм (63,6-73,6) для кеты группы II; длина волны максимума эмиссии смещается с 334,4 до 340,8 нм для обеих групп; величина параметра А (А320/А360) уменьшается с 1,27 до 0,98 для кеты группы I и с 1,28 до 0,82 для кеты группы II.

На рис. 4 приведены данные сравнительного анализа степени денатурации водорастворимых белков под действием растворов мочевины и температуры. Они свидетельствуют о том, что наиболее выраженные изменения параметров спектров ультрафиолетовой флуоресценции наблюдаются в растворах мочевины высоких концентраций, т.е. в случаях, когда обрабатываемые белки не агрегируют.

водорастворимые белки кеты группы I

| | водорастворимые белки кеты группы II

Рис. 4. Сравнение изменений параметров УФФ-спектров водорастворимых белков нерестовой кеты под действием растворов мочевины

Fig. 4. The comparison of water-soluble proteins of spawning chum salmon ultraviolet fluorescence spectrums parameters changing under urea solutions

Очевидно, переход белков в нерастворимое агрегированное состояние препятствует значительным делокализованным изменениям конформаций белковых молекул, уменьшая тем самым их способность спонтанно денатурировать в процессах реагентной и температурной обработок.

Вероятно, эффект устойчивости наступает в результате стабилизации конфигурации частично денатурированных молекул, препятствуя спонтанной денатурации (Птицын, 1998).

Таким образом, установлено, что вне зависимости от степени выраженности нерестовых изменений исследуемых объектов водорастворимые белки скелетных мышц характеризуются идентичностью поведения в условиях, вызывающих денатурационные процессы. Однако исходное состояние объекта определяет как конформационную стабильность белков, так и степень их конформационных и денатурационных изменений и приводит к образованию систем, имеющих различия в свойствах, характеризующих межбелковые взаимодействия. Белки кеты группы I, состояние которых в большей степени соответствует нативному, в результате агрегационных и денатурационных процессов подвергаются более глубоким изменениям. Это выражается большими величинами относительных изменений параметров спектров УФФ

меньше, чем в случае водорастворимых белков группы I. При высоких температурах (выше 80 0С) динамика и глубина денатурационных процессов не зависит от группы сырья.

Литература

Еронина Т.Б., Чеботарева H.A., Ливанова Н.Б., Курганов Б.И. Агрегация белка в присутствии гуанидинхлорида // Биохимия. — 2001. — Т. 66, вып. 4. — С. 555-562.

Курганов Б.И. Кинетика тепловой агрегации белков // Биохимия. — 1998. — Т. 63, вып. 3. — С. 430-432.

Курганов Б.И. Кинетика агрегации белков. Количественная оценка шаперонной активности в тестах, основанных на подавлении агрегации белков // Биохимия. — 2002. — Т. 67, вып. 4. — С. 492-507.

Курганов Б.И., Топчиева И.Н. Рефолдинг белков с участием искусственных шаперонов // Биохимия. — 1998. — Т. 63, вып. 4. — С. 491-499.

Орлова М.В., Леваньков С.В., Якуш Е.В. Экстракция водорастворимых белков скелетных мышц нерестовой кеты // Наст. сб.

Орлова М.В., Чибиряк Л.М., Леваньков С.В., Якуш Е.В. Технохимическая характеристика нерестовой кеты // Хранение и переработка сельхозсырья. — 2003. — № 1. — С. 24-27.

Птицын О.Б. Стабильность и фолдинг белков // Биохимия. — 1998. — Т. 63, вып. 4. — С. 435-443.

Туроверов К.К., Хайтлина С.Ю., Пинаев Г.П. Флуоресцентные свойства и определение содержания нативного актина в его препаратах // Биохимия. — 1975. — Т. 40, вып. 2. — С. 316-322.

Туроверов К.К., Щелчков Б.В. Исследование тепловой денатурации белков с помощью двухволнового метода регистрации изменений спектра их ультрафиолетовой флуоресценции // Биофизика. — 1970. — Т. 15, вып. 6. — С. 965-972.

Уверский В.Н., Нарижнева Н.В. Влияние природных лигандов на структурные свойства и конформационную стабильность белков // Биохимия. — 1998. — Т. 63, вып. 4. — С. 500-515.

Черницкий Е.А., Мажуль В.М. Исследование конформационных переходов сывороточного альбумина в кислой области люминесцентным методом // Биофизика. — 1970. — Т. 15, вып. 3. — С. 408-415.

Эфтинк М.Р. Использование флуоресцентных методов для изучения разворачивания белков // Биохимия. — 1998. — Т. 63, вып. 3. — С. 327-337.

De Yuong L.R., Dill K.A., Fink A.L. Aggregation and denaturation of apomyoglobin in aqueous urea solutions // Biochemistry. — 1993. — Vol. 32 , № 15. — P. 3877-3886.

Jebsen J.W. Proteins in fish muscle // Fish in nutrition / Ed. by E.Heen and R.Kreuzer. — L.: Fishing news (Books) Ltd., 1962.

Konosu S., Hamori G., Pechere J.F. Carp myogens of white and red muscles. Properties and amino acid composition of the main low-molecular weight components of white muscle // Biochem. J. — 1965. — Vol. 96. — P. 98-112.

Layne E. Proteinbestimmung über UV-Extinktion (280/260 nm) // Meth. Enzy-mol. — 1957. — Vol. 3. — P. 447-454.

Mitraki A., Haase-Pettingell C., King J. Protein Refolding // ACS Symposium Ser. 470. — Wash.: American Chemical Society, 1991. — P. 35-49.

Shimizu Y., Karata S., Nishioka F. Extractability of proteins for fish skeletal muscle at low ionic strength // Bull. Jap. Soc. Sci. Fish. — 1976. — Vol. 42, № 9. — P. 1025-1031.

Shimizu Y., Nishioka F. Species variations in heat coagulation properties of fish actomyosin-sarcoplasmatic proteins systems // Bull. Jap. Soc. Sci. Fish. — 1974. — Vol. 40, № 3. — P. 267-270.

Von Hippel P.H., Wang K.-Y. On the conformational stability of globular proteins // J. Biol. Chem. — 1965. — Vol. 240. — P. 3909-3923.

Warburg O., Christian W. Isolierung und Kristallisation des Gärungsferments Eno-lase // Biochem. Z. — 1941. — Vol. 310. — P. 384-421.

Поступила в редакцию 24.04.03 г.