Изменение показателей окислительного стресса при моделировании дефицита синтеза оксида азота (II) в митохондриях ткани легких у крыс

УДК 577.1:616.24-001

Изменение показателей окислительного стресса

синтеза

оксида азота (II) в митохондриях ткани легких у крыс

Д.В. Медведев, В.И. Звягина, О.М. Урясьев, Э.С. Бельских, С.В. Фалетрова

ФГБОУ ВО РязГМУ Минздрава России

Целью исследования стала оценка показателей окислительного стресса и антиоксидантной защиты при моделировании L-NAME индуцированного дефицита синтеза NO (II) в митохондриях ткани легкого крыс. Полученные результаты демонстрируют развитие окислительного стресса в митохондриях ткани легкого и указывают на снижение выработки NO (II) как на возможный фактор развития митохондриальной дисфункции.

Ключевые слова: L-NAME, оксид азота, лёгкие, окислительный стресс, митохондрии.

The changes in indices of oxidative stress in the simulation of deficiency of nitric oxide synthesis in the mitochondria of lung tissue of rats

D.V. Medvedev, V.I. Zvyagina, O.M. Uryasev, E.S. Belskikh, S.V. Faletrova

The aim of the study was to evaluate the indices of oxidative stress and antioxidant protection in modeling L-NAME induced NO (II) synthesis deficiency in mitochondria of lung tissue in rats. The results demonstrate the development of oxidative stress in mitochondria of lung tissue and indicate a decrease in NO (II) production as a possible factor in the development of mitochondrial dysfunction. Keywords: L-NAME, NO, lungs, oxidative stress, mitochondria.

при моделировании дефицита

Введение

В настоящее время активно обсуждается роль оксида азота (N0) (II) — низкомолекулярного регулятора, вовлеченного в широкий круг физиологических процессов [9]. Одним из наиболее изученных эффектов N0 является расслабление гладкой мускулатуры сосудистой стенки, приводящее к снижению артериального давления у человека и животных [9, 12]. В настоящее время продолжается активное изучение роли N0 в патогенезе заболеваний,

связанных с атеросклерозом, артериальной гипертензией и старением сосудистой стенки. Ряд исследователей сообщают, что нарушение синтеза N0 может обуславливать развитие не только сердечно-сосудистых заболеваний, но и легочной патологии, например эмфиземы [7]. Имеются результаты исследований, которые демонстрируют, что N0 может изменять белки в процессе посттрансляционной модификации посредством S-нитрозилирования с образованием S-нитрозотиолов, а S-нитрозилированные протеины способны влиять на легочный газообмен и вентиляцию [10].

Известно, что эмфизема является неотъемлемой частью патогенеза хронической обструктивной болезни легких — заболевания, в развитии которого особую роль играет усиленное хроническое воспаление [11]. Согласно результатам исследований важный вклад в изменение характера воспаления вносит окислительный стресс (ОС) — процесс, связанный с образованием избыточного количества активных форм кислорода (АФК) [6, 8]. Учитывая особенности структуры клеток организма человека, развитие ОС всегда будет затрагивать митохондрии — органеллы, использующие кислород в процессе клеточного дыхания, выполняющие как энергетические, так и регуляторные функции, в числе которых регуляция процессов апоптоза и клеточного старения. Гиперпродукция АФК в условиях ОС приводит к окислительной модификации белков митохондрий и нарушению их функционирования, что в свою очередь способно индуцировать процессы клеточного старения и апоптоза [13]. Это обуславливает актуальность изучения взаимосвязи между нарушением синтеза оксида азота и развитием окислительного стресса митохондрий клеток легких как одного из ключевых звеньев патогенеза усиленного хронического воспаления при ХОБЛ.

Цель исследования — оценить выраженность показателей окислительного стресса и антиоксидантной защиты митохондрий легкого в модели L-NAME индуцированного дефицита синтеза NO у крыс.

Материалы и методы

Исследование проводилось на 16 крысах линии Wistar мужского пола. Работа с животными осуществлялась в соответствии с Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (Страсбург, 1986), приказом Министерства здравоохранения и социального развития РФ от 23.08.2010 № 708н «Об утверждении правил лабораторной практики» и приказом Минздрава СССР от 12.08.1977 № 755 «О мерах по дальнейшему совершенствованию организационных форм работы с использованием экспериментальных животных». Крыс содержали в стандартных условиях вивария, в качестве пищи они получали корм «Чара» («Ассортимент-Агро», РФ), содержащий 0,7 % метио-нина-цистина в пересчете на сухое вещество, все витамины группы B, в том числе B6 — 28 мг/кг, B9 — 64 мг/кг, B12 — 0,13 мг/кг.

Животные были разделены на две группы: 1-я группа (п = 8) использовалась для создания модели дефицита NO. Этим животным ежедневно один раз в сутки в течение 7 дней внутрибрюшинно вводили 0,5 % Nш-нитро-L-аргинина метиловый эфир (L-NAME, Sigma-Aldrich, США), приготовленный на физиологическом растворе [14].

Крысы 2-й группы (n = 8) служили контролем, им по аналогичной схеме вводили физиологический раствор.

Крыс выводили из эксперимента под эфирным рауш-наркозом путем обескровливания пересечением брюшной аорты. Крови давали свернуться, и получали сыворотку центрифугированием в течение 15 минут при 1000g. Кроме того, извлекали легкие. Отмывали их от крови в среде, содержащей 0,25 М сахарозы, 0,001 М ЭДТА и 0,05 М трис-буфер, рН 7,4. Затем навеску легкого массой 750 мг гомогенизировали в той же среде в соотношении 1:9 на гомогенизаторе Potter S (Sartorius, ФРГ). Полученный гомогенат подвергали дифференциальному центрифугированию сначала при 800g для осаждения неразрушенных клеток и ядер, затем при 14000g для осаждения митохондрий. Митохондриальную фракцию ресуспендировали в среде выделения, не содержащей ЭДТА. К суспензии митохондрий добавляли тритон X-100 для разрушения мембран [4].

В дальнейшем для анализа использовали:

— сыворотку крови, в которой определяли концентрацию и метаболитов NO;

— митохондриальную фракцию с разрушенными мембранами, где оценивали окислительную модификацию белков (ОМБ), концентрацию метаболитов NO, активность супероксиддисмутазы (СОД).

Перечисленные показатели измеряли спектрофотометри-чески. Концентрацию общего белка определяли методом Ло-ури с помощью коммерческого набора («Экосервис», РФ), концентрацию метаболитов NO — методом в модификации В.А. Метельской [3], активность СОД — по торможению реакции аутоокисления кверцетина [2]. Окислительную модификацию белков (ОМБ) оценивали методом R.L. Levine в модификации Е.Е. Дубининой [1], который основан на реакции взаимодействия карбонильных групп и иминогрупп окисленных аминокислотных остатков с 2,4-динитрофенил-гидразином с образованием 2,4-динитрофенилгидразонов, обладающих специфическим спектром поглощения в ультрафиолетовой и видимой областях спектра, затем анализировали резервно-адаптационный потенциал [5].

Статистическая обработка результатов проводилась с помощью программ Microsoft Office Excel 2007, StatSoft Statistica 8.0 и IBM SPSS Statistics 20. Соответствие выборок нормальному распределению проверяли посредством критерия Шапиро-Уилка. Для нормально распределенных выборок результаты представляли в виде среднего значения ± стандартного отклонения (M ± s), а если распределение отличалось от нормального — как медиана [первый квартиль; третий квартиль] (Me [Q1, Q3]). Равенство дисперсией в выборках оценивали с помощью теста Левена. Для нормально распределенных выборок с равными дисперсиями использовали критерий Стьюдента для попарного сравнения, а для множественных сравнений — однофактор-ный дисперсионный анализ и критерий Ньюмена-Кейлса.

В остальных случаях применяли критерий Манна-Уитни для попарного сравнения, для множественных сравнений — критерий Краскела-Уоллиса и непараметрический вариант критерия Ньюмена-Кейлса. Статистически значимыми считали отличия при вероятности нулевой гипотезы об отсутствии различий р < 0,05.

Развитие ОС в условиях моделирования дефицита синтеза N0 также подтверждалось приростом суммарной площади под кривой ОМБ, что отражало увеличение количества окисленно поврежденных белков, при этом дефицит синтеза N0 приводил к снижению резервно-адаптационного потенциала белков митохондрий.

Результаты и их обсуждение

На фоне введения L-NAME в сыворотке крови определялось достоверное снижение концентрации суммарных метаболитов N0 (таблица), что отражало процесс ингиби-рования активности эндотелиальной синтазы оксида азота, а также было зафиксировано снижение уровня метаболитов N0 в митохондриях легкого, вероятно, демонстрирующее снижение активности митохондриальной синтазы N0 .

Достоверный прирост активности СОД в группе животных, получавших L-NAME, по сравнению с группой контроля указывал на возросшую потребность митохондрий легких в антиоксидантной защите и развитие окислительного стресса (ОС).

Таблица

Концентрация метаболитов NO, активность митохондриальной СОД и площади под кривой спектра поглощения продуктов ОМБ митохондрий

L-NAME Физ. раствор

Концентрация метаболитов в плазме N0, мкмоль/л 35,48 ± 3,93 (p = 0,001) 56,74 ± 15,97

Концентрация белка, мг/мл 4,97 [4,66; 5,99] 4,97 [4,37; 5,57]

Концентрация метаболитов N0, мкмоль/г белка 34,56 ± 7,89 (p = 0,037010) 55,24 ± 18,73

Активность СОД, УЕ/ мг белка 10,10 ± 4,62 (p = 0,000985) 3,12 ± 2,10

Суммарная площадь под кривой, единиц оптической плотности/мг белка 8,92 [8,08; 9,59] (p = 0,046) 4,52 [3,61; 5,16]

Примечание: указаны только статистически значимые p (p < 0,05).

100

24, 52 43,5

ЫЧАМЕ Фт. раствор

Рисунок. Резервно-адаптационный потенциал митохондрий, полученных из ткани легкого (в процентах площади под кривой спектра поглощения продуктов спонтанной ОМБ относительно металл-зависимой ОМБ); p = 0,046

—-СЧС

Выводы

Введение неселективного ингибитора NO-синтаз L-NAME приводило к снижению концентрации метаболитов NO в сыворотке крови и в митохондриях гомоге-ната легких крыс. Дефицит синтеза NO сопровождался увеличением уровня окислительного повреждения белков и повышением активности СОД. Полученные изменения демонстрировали развитие окислительного стресса, повышение потребности в антиоксидантной защите митохондрий легких крыс и подтверждали, что нарушение выработки NO может служить предпосылкой развития митохондриальной дисфункции в ткани легких.

Литература

1. Дубинина Е.Е. Продукты метаболизма кислорода в функциональной активности клеток (жизнь и смерть, созидание и разрушение). Физиологические и клинико-биохимические аспекты. — СПб.,

2006. — С. 276-282.

2. Костюк В.А., Потапович А.И., Ковалева Ж.В. Простой и чувствительный метод определения активности супероксиддисмутазы, основанный на реакции окисления кверцетина // Вопросы медицинской химии. — 1990. — № 2. — С. 88-91.

3. Метельская В.А., Гуманова Н.Г. Скрининг-метод определения уровня метаболитов оксида азота в сыворотке крови // Клиническая лабораторная диагностика. — 2005. — № 6. — С. 15-18.

4. Прохорова М.И. Методы биохимических исследований (липидный и энергетический обмен). — Л.: Изд-во Ленинградского ун-та, 1986. — 327 с.

5. Фомина М.А., Абаленихина Ю.В. Способ комплексной оценки содержания продуктов окислительной модификации белков в тканях и биологических жидкостях: методические рекомендации. — Рязань:

РИО РязГМУ, 2014 — 60 с.

6. Inflammatory mechanisms in patients with chronic obstructive pulmonary disease / P.J. Barnes // J Allergy Clin Immunol. — 2016. — 138 (1). —

P. 16-27.

-—

7. Boe A.E. Nitric oxide prevents alveolar senescence and emphysema in a mouse model / Boe A.E. [et al] // PLoS One. — 2015. — 10(3). — P. 1-10.

8. Domej W. Oxidative stress and free radicals in COPD — implications and relevance for treatment / W. Domej, K. Oettl, W. Renner // Int J Chron Obstruct Pulmon Dis. — 2014. — 9. — P. 1207-24.

9. Feletou M. Nitric oxide: Orchestrator of endothelium-dependent responses / M. Feletou, R. Kohler, PM. Vanhoutte // Ann Med. — 2012. — 44. P. 694-716.

10. Haldar S.M. S-nitrosylation: integrator of cardiovascular performance and oxygen delivery / S.M. Haldar, J.S. Stamler // Journal of Clinical Investigation. —

2013. — 123. — P. 101-110.

11. Global Initiativa for Chronic Obstructive Lung Disease. 2017.

12. Huang P.L. Hypertension in mice lacking the gene for endothelial nitric oxide synthase / P.L. Huang [et al] // Nature. — 1995. — 377. — P. 239-242.

13. Lerner C.A. Mitochondrial redox system, dynamics, and dysfunction in lung inflammaging and COPD / C.A. Lerner, I.K. Sundar, I. Rahman // Int. J. Biochem. Cell Biol. Elsevier Ltd. — 2016. — 81. — P. 294-306.

14. Wang Z.Y. British Journal of Pharmacology / Z.Y. Wang, R. Hakanson. — 1995. — 116(5). — P. 2447-2450.

Сведения об авторах

Медведев Дмитрий Валериевич — ассистент кафедры биологической химии с курсом клинической лабораторной диагностики, ФДПО ФГБОУ ВО РязГМУ Минздрава России. meddmit@mail.ru. +79105668966.

Звягина Валентина Ивановна — канд. биол. наук, доцент кафедры биологической химии с курсом клинической лабораторной диагностики, ФДПО ФГБОУ ВО РязГМУ Минздрава России. vizvyagina@yandex.ru.

+79105632150.

Урясьев Олег Михайлович — д-р мед. наук, профессор, заведующий кафедрой факультетской терапии с курсами эндокринологии, клинической фармакологии, профессиональных болезней, ФГБОУ ВО РязГМУ Минздрава России. uryasev08@yandex.ru.

+79209536981.

Бельских Эдуард Сергеевич — ассистент кафедры факультетской терапии с курсами эндокринологии, клинической фармакологии, профессиональных болезней, ФГБОУ ВО РязГМУ Минздрава России. ed.bels@yandex.ru.

+79209796846.

Фалетрова Светлана Васильевна — ассистент кафедры факультетской терапии с курсами эндокринологии, клинической фармакологии, профессиональных болезней, ФГБОУ ВО РязГМУ Минздрава России. faletrova@yandex.ru.

+79106131747.