МОДИФИЦИРОВАННЫЕ ГРАМПОЛОЖИТЕЛЬНЫЕ БАКТЕРИИ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
MODIFIED GRAM-POSITIVE BACTERIA AND THEIR APPLICATIONS

Область техники, к которой относится данное изобретение
Настоящее изобретение относится к микроорганизмам, например, к грамположительным бактериям с повышенной стрессоустойчивостью и улучшенными показателями, характеризующими их получение, обработку и хранение. В частности, данное изобретение относится к генетически модифицированным микроорганизмам, накапливающим внутри клетки трегалозу. Данное изобретение относится также к применению этих микроорганизмов в производстве пищевых продуктов и в медицине.
Уровень техники
Группа грамположительных бактерий характеризуется наличием одной плазматической мембраной, представляющей собой липидный бислой. К грамположительным относится множество родов палочковидных и сферических бактерий, в числе которых бифидобактерии и группа родов, вместе называемых молочнокислыми бактериями (LAB). Молочнокислые бактерии включают монофилетическую группу грамположительных, кислотоустойчивых, с низким содержанием GC-пар в ДНК, как правило, не образующих споры, микоаэрофильных палочек или кокков, которые имеют общие метаболические и физиологические особенности. Эти бактерии, обычно присутствующие в разлагающихся растениях и скисающих молочных продуктах, производят молочную кислоту, являющуюся конечным продуктом ферментативного превращения углеводов. Исторически это их свойство связало молочнокислые бактерии с ферментацией пищевых продуктов, поскольку закисление подавляет рост агентов, обусловливающих порчу пищи. Типичные молочнокислые бактерии Lactococcus lactis - это мезофильные, микроаэрофильные ферментирующие молочнокислые бактерии. В то время как эти бактерии широко используются для ферментации пищевых продуктов, особенно при производстве молочной продукции, все больший интерес вызывают возможности их применения в лекарственных средствах и нутрицевтиках, в качестве средств для лечения инфекций в полостях тела, например, вагинальных инфекций, или в качестве носителей для доставки биологически активных веществ. Во всех этих случаях требуются высоко жизнеспособные стартовые культуры либо фармацевтические или нутрицевтические композиции с высоким содержанием жизнеспособных бактерий. Однако L. lactis свойственно терять жизнеспособность в процессе хранения или в ходе обработки (например, при производстве сухого порошкового препарата, формовании таблеток и др.). Падение жизнеспособности еще более выражено, когда бактерий после лиофилизации подвергают такому дополнительному стрессу, как высокая кислотность среды или присутствие желчных солей.
Предлагалось несколько способов преодолеть эту проблему. Особенно интересно использование трегалозы. Трегалоза (α-D-глюкопиранозил-1,1-α-D-глюкопиранозид) - это не восстанавливающий дисахарид, который присутствует у множества различных организмов от бактерий до беспозвоночных. Трегалоза, иногда в сочетании с декстраном, часто используется в качестве добавляемого извне криоконсерванта. Экзогенная трегалоза действует как сахаридный матрикс (Conrad et al., 2000), проявляя свой защитный эффект особенно в процессе лиофилизации (замораживания-высушивания), когда она играет роль стеклообразующего агента. Кроме того, известно, что трегалоза - стрессовый метаболит; ее интенсивно изучали у грибов, в частности у Saccharomyces cerevisiae. Действительно, высокие концентрации трегалозы внутри клетки улучшают способность к хранению, в результате повышая жизнеспособность после криоконсервации. Однако важно подчеркнуть, что добавление трегалозы извне редко ведет к накоплению внутри микробных клеток - потому ли, что она не поглощается, или потому, что, попав в клетку, быстро метаболизируется.
Сообщалось (Termont et al., Appl Environ Microbiol 72:7694; 2006), что новосинтезированная трегалоза - при обусловленной плазмидой усиленной экспрессии генов otsA, кодирующего трегалозо-6-фосфат-синтазу, или otsB, кодирующего трегалозо-6 фосфат-фосфатазу, - накапливается внутри клеток L. lactis. Именно внутриклеточное накопление трегалозы, а не добавление ее извне защищает L. lactis от лизиса под действием компонентов желчи и гибели клеток из-за лиофилизации. Поскольку L. lactis необычайно чувствительны, защиту от лизиса желчью можно использовать как функциональный критерий внутриклеточного накопления трегалозы.
В работе Andersson et al. (J Biol Chem 276:42707; 2001) описывается новый путь утилизации трегалозы у L. lactis. Этот метаболический путь включает активность трегалозо-6-фосфат-фосфорилазы (trePP), которая превращает трегалозо-6-фосфат в β-глюкозо-1-фосфат и глюкозо-6-фосфат. Описывается также инсерционная инактивация этого фермента у L. lactis, в результате которой утрачивается способность бактериальной культуры к росту на трегалозе.
Для внутриклеточного накопления трегалозы в работе Carvalho et al. (Appl Environ Microbiol 77:4189; 2011) описывается способ, в котором используется плазмида, обеспечивающая усиленную экспрессию трегалозо-6-фосфат-фосфорилазы и β-фосфоглюкомутазы (pgmB) у L. lactis. Как отмечают эти авторы, поскольку у этих бактерий нет трегалозо-6-фосфат-фосфатазы, для обеспечения нужной активности использовали соответствующий ген otsB из пригодного для пищевого применения микроорганизма P. freudenreichii. Полученные в результате клетки проявляли повышенную устойчивость к холодовому шоку, тепловому шоку и кислой среде. Правда, в указанной работе отмечается, что по меньшей мере 67% продуцированной трегалозы обнаруживалось в культуральной среде. Следовательно, продуцированная трегалоза, по-видимому, не удерживается в достаточной степени или не накапливается внутри клетки.
Хотя эти процессы, несомненно, ведут к улучшению способности бактериальных клеток к хранению, остается настоятельная потребность в способах, которые могли бы улучшить способность к хранению у таких грамположительных бактерий, как молочнокислые бактерии и бифидобактерии - не только в тех случаях, когда эти бактерии используются для доставки биологически активных соединений в рамках медицинского применения, но также при их использовании в пищевой промышленности, например при производстве молочных продуктов.
В работе Lowes et al. 2006 (Oral Microbiol Immunol. 21(1): 21-7) описываются некоторые мутанты бактерий Streptococcus mutans, а именно мутанты по компоненту IIC фосфотрансферазной (PTS) системы, обозначенные PtcC. Бактерии S. mutans являются патогенными агентами, вызывающими зубной кариес, и авторы указанной работы изучают вариабельность генома S. mutans с точки зрения их патогенности. Утилизация углеводов β-глюкозидов может играть роль в патогенности и жизнеспособности S. mutans, и с этой точки зрения исследуются мутации PtcC. Авторы указанной работы не высказывали никаких предположений ни о роли PtcC во внутриклеточном накоплении трегалозы, ни о повышении стрессоустойчивости бактерий. Собственно, эти авторы изучают метаболизм β-глюкозидов, тогда как трегалоза является α-глюкозидом; мутанты PtcC непатогенных бактерий или какое бы то ни было их использование ими не рассматриваются.
Раскрытие изобретения
Внутриклеточная трегалоза может защитить такие микроорганизмы, как молочнокислые бактерии, например, Lactococcus lactis, от различных вредоносных агентов или неблагоприятных условий. Примерами таких факторов могут служить лизис под действием желчных кислот, который живые молочнокислые бактерии претерпевают в ходе перемещения по кишечнику, или стресс от воздействия отрицательной температуры и/или обезвоживания в ходе замораживания, высушивания, сушки распылением, лиофилизации, применяемых для консервирования молочнокислых бактерий.
Для того, чтобы обеспечить накопление трегалозы внутри бактериальных клеток, возможно реализовать лишь немногочисленный ряд подходов. В частности, используются плазмиды для усиленной экспрессии гомологичных или гетерологичныъх генов. Однако для применения при производстве фармацевтических или пищевых продуктов этот подход нежелателен.
В настоящем документе сообщается о новом подходе, который позволяет добиться внутриклеточного накопления трегалозы; он базируется на отсутствии активности специфичного к целлобиозе компонента IIC фосфотрансферазной системы (PtcC) у грамположительных бактерий, предпочтительно путем частичных или полных делеции, повреждения или инактивации гена, кодирующего эндогенный PtcC, так что утрачивается способность к образованию функционального продукта гена ptcC. Авторы данного изобретения обнаружили, что накопленная трегалоза со временем в некоторой степени покидает клетку через какой-то неизвестный и не идентифицированный механизм экспорта трегалозы и определяется в супернатанте. Обнаружено также, что, как ни странно, инактивация ptcC препятствует выходу трегалозы из клетки. Эти факты тем более неожиданны, что до сих пор не было данных, указывающих на связь PtcC с транспортом трегалозы, и не предполагалось, что он участвует в экспорте трегалозы, тем самым обусловливая ее выход из клетки и высвобождение в окружающую среду. Удивительно также, что известные и охарактеризованные системы транспорта трегалозы, по-видимому, не участвуют в этом высвобождении трегалозы.
В одном из своих аспектов данное изобретение относится к грамположительным бактериям, в частности к непатогенным грамположительным бактериям, предпочтительно - к молочнокислым бактериям или бифидобактериям, лишенным активности специфичного к целлобиозе компонента IIC фосфотрансферазной системы (PtcC).
В другом аспекте данного изобретения предлагаются грамположительные бактерии, в частности непатогенные грамположительные бактерии, предпочтительно - молочнокислые бактерии или бифидобактерии, лишенные активности PtcC, для применения в качестве лекарственного средства. Такие лекарственные средства могут, например, включать фармацевтические композиции, нутрицевтики, лечебные пищевые продукты или функциональные пищевые продукты, или пробиотики.
В другом аспекте данного изобретения предлагаются лекарственное средство, стартовая культура, пробиотическая композиция или пищевая добавка, в частности нелекарственная пробиотическая композиция или пищевая добавка, содержащие грамположительных бактерий, в частности непатогенных грамположительных бактерий, предпочтительно - молочнокислых бактерий или бифидобактерий, лишенных активности PtcC. Такая пищевая добавка может быть (не ограничиваясь перечисленным здесь) стартовой культурой, предпочтительно стартовой культурой для получения пищевого продукта. Соответственно, в близком к этому аспекте данного изобретения предлагается стартовая культура, предпочтительно стартовая культура для получения пищевого продукта, содержащая грамположительных бактерий, в частности непатогенных грамположительных бактерий, предпочтительно - молочнокислых бактерий или бифидобактерий, лишенных активности PtcC.
В другом аспекте данного изобретения предлагается применение грамположительных бактерий, предпочтительно - молочнокислых бактерий или бифидобактерий, лишенных активности PtcC, в качестве лекарственного средства, стартовой культуры, пробиотика и/или пищевой добавки, в частности в качестве нелекарственной стартовой культуры, пробиотика или пищевой добавки. Такая пищевая добавка может быть (не ограничиваясь перечисленным здесь) стартовой культурой для получения пищевого продукта. Соответственно, в близком к этому аспекте данного изобретения предлагается применение грамположительных бактерий, предпочтительно - молочнокислых бактерий или бифидобактерий, лишенных активности PtcC, в качестве стартовой культуры для получения пищевого продукта, в частности когда этот пищевой продукт является не лечебным пищевым продуктом.
В одном из аспектов данного изобретения предлагается способ получения пищевого продукта, включающий смешивание грамположительных бактерий, в частности непатогенных грамположительных бактерий, предпочтительно - молочнокислых бактерий или бифидобактерий, лишенных активности PtcC, или указанной пищевой добавки, или указанной стартовой культуры с субстратом, который может подвергнуться ферментации под действием грамположительных бактерий, предпочтительно молочнокислых бактерий или бифидобактерий. В конкретных воплощениях данного изобретения такой способ может также включать этап ферментации указанного субстрата. Также предлагается пищевой продукт, получаемый любым таким способом. Пищевой продукт может содержать пробиотики (без ограничений).
В другом аспекте данного изобретения предлагается способ получения лекарственного средства, например фармацевтической композиции, нутрицевтика, лечебного пищевого продукта или функционального пищевого продукт, или пробиотика, или получения пробиотической композиции или пищевой добавки, в частности нелекарственной пробиотической композиции или пищевой добавки, или получения стартовой культуры, предпочтительно стартовой культуры для получения пищевого продукта, включающий этапы: i) размножения грамположительных бактерий, в частности непатогенных грамположительных бактерий, предпочтительно - молочнокислых бактерий или бифидобактерий, лишенных активности PtcC, в среде, содержащей субстрат, который может подвергнуться ферментации под действием указанных грамположительных бактерий, предпочтительно молочнокислых бактерий или бифидобактерий, и ii) включение размноженных таким образом грамположительных бактерий, в частности непатогенных грамположительных бактерий, предпочтительно - молочнокислых бактерий или бифидобактерий, лишенных активности PtcC, в состав, соответственно, лекарственного средства или пробиотической композиции, или пищевой добавки или стартовой культуры. В объем данного изобретения входит, следовательно, применение грамположительных бактерий, в частности непатогенных грамположительных бактерий, предпочтительно - молочнокислых бактерий или бифидобактерий, лишенных активности PtcC, для получения лекарственного средства, например фармацевтической композиции или нутрицевтика, лечебного пищевого продукта или функционального пищевого продукта, или пробиотика, или для получения пробиотической композиции или пищевой добавки, в частности нелекарственной пробиотической композиции или пищевой добавки, или для получения стартовой культуры, предпочтительно стартовой культуры для получения пищевого продукта.
Авторы данного изобретения обнаружили, что грамположительные бактерии, в частности непатогенные грамположительные бактерии, например, молочнокислые бактерии и бифидобактерии, описанные в настоящем документе, не только способны к внутриклеточному накоплению трегалозы - даже независимо от источника углерода, но также обладают значительно повышенной устойчивостью к различным условиям, связанным с хранением и стрессом. Например, эти грамположительные бактерии более устойчивы к связанным с хранением манипуляциям, например, с высушиванием, замораживанием, сушкой распылением или лиофилизацией. Грамположительные бактерии по данному изобретению также гораздо лучше выживают - независимо от состояния питания или голодания - в желудочно-кишечном тракте, проявляя повышенную устойчивость к кислой среде и лизису под действием желчных кислот. Активность и показатели грамположительных бактерий, описанных в настоящем документе, более воспроизводимы - будь то в лекарственном качестве или в пищевой промышленности, чем известно по данным более ранних исследований. Следовательно, грамположительные бактерии, воплощающие принцип данного изобретения, предполагают возможность более жестких условий окружающей среды, а также биологическую устойчивость.
В одном из своих аспектов данное изобретение относится также к способу внутриклеточного накопления трегалозы у грамположительных бактерий, в частности у непатогенных грамположительных бактерий, предпочтительно у молочнокислых бактерий или бифидобактерий, включающий размножение грамположительных бактерий, в частности непатогенных грамположительных бактерий, предпочтительно молочнокислых бактерий или бифидобактерий, лишенных активности PtcC, предпочтительно путем частичной или полной делеции, разрушения или инактивации гена, кодирующего эндогенный PtcC, так что утрачивается способность к образованию функционального продукта гена ptcC, в среде, содержащей субстрат, который может подвергаться ферментации указанными грамположительными бактериями.
В другом своем аспекте данное изобретение относится к способу повышения стрессоустойчивости или улучшения тех свойств грамположительных бактерий (в частности, непатогенных грамположительных бактерий, предпочтительно молочнокислых бактерий или бифидобактерий), которые имеют отношение к производству, обработке и /или хранению, включающий модификацию этих грамположительных бактерий (в частности непатогенных грамположительных бактерий, предпочтительно молочнокислых бактерий или бифидобактерий), например лишение активности PtcC. Предпочтительно, стрессоустойчивость или те свойства, которые имеют отношение к производству, обработке и /или хранению, могут быть одним или более свойств, выбираемых из группы, включающей устойчивость к кислой среде, устойчивость к солям желчных кислот, устойчивость к нагреванию, устойчивость к соли, устойчивость к высушиванию, замораживанию, сушке распылением или лиофилизации, осмотическую устойчивость.
Предпочтительно у упомянутых выше грамположительных бактерий, в частности, непатогенных грамположительных бактерий, предпочтительно молочнокислых бактерий или бифидобактерий, без активности PtcC, ген, кодирующий эндогенный PtcC, частично или полностью делетирован, разрушен или инактивирован, так что отсутствует способность к образованию функционального продукт гена ptcC. Следует отметить, что такая делеция, повреждениеили инактивация могут быть нацелены, например, на кодирующую последовательность гена ptcC и/или на промотор, с которого экспрессируется ptcC.
В предпочтительных воплощениях данного изобретения у описанных в настоящем документе или используемых в изобретении грамположительных бактерий, в частности у непатогенных грамположительных бактерий, предпочтительно у молочнокислых бактерий или бифидобактерий, включающий размножение грамположительных бактерий, в частности непатогенных грамположительных бактерий, предпочтительно молочнокислых бактерий или бифидобактерий, лишенных активности PtcC, может отсутствовать активность трегалозо-6-фосфат-фосфорилазы (TrePP). Предпочтительно у таких грамположительных бактерий, в частности у непатогенных грамположительных бактерий, предпочтительно у молочнокислых бактерий или бифидобактерий, также не имеющих трегалозо-6-фосфат-фосфорилазной активности, ген, кодирующий эндогенную трегалозо-6-фосфат-фосфорилазу, частично или полностью делетирован, разрушен или инактивирован, так что отсутствует способность к образованию функционального продукта гена trePP. Следует отметить, что такая делеция, повреждение или инактивация могут быть нацелены, например, на кодирующую последовательность гена trePP и/или на промотор, с которого экспрессируется ген trePP. Авторы данного изобретения обнаружили, что, как ни удивительно, эти грамположительные бактерии, в частности непатогенные грамположительные бактерии, предпочтительно молочнокислые бактерии и бифидобактерии, не имеющие трегалозо-6-фосфат-фосфорилазной активности, накапливают трегалозу внутри клетки. В противоположность описанному в настоящем документе подходу в более ранних работах (WO 2006/018446) для того, предлагается обеспечить экспрессию гетерологичной трегалозо-6-фосфат-фосфатазы, например, кодируемой геном otsB. Более того, в упомянутой выше работе Carvalho et al. (2011) утверждается, что для внутриклеточного накопления трегалозы нужна усиленная экспрессия трегалозо-6-фосфат-фосфорилазы. Хотя такие молочнокислые бактерии, как Lactococcus lactis, могут утилизовать трегалозу, до сих пор не было описано штамма Lactococcus lactis, синтезирующего трегалозу. Не идентифицировано эндогенных генов трегалозо-6-фосфат-синтазы и трегалозо-6-фосфат-фосфатазы, которые считались необходимыми для образования трегалозы начиная с глюкозо-6-фосфата, имеющегося L. lactis.
В предпочтительных воплощениях данного изобретения у описанных в настоящем документе или используемых в изобретении грамположительных бактерий, в частности у непатогенных грамположительных бактерий, предпочтительно у молочнокислых бактерий или бифидобактерий без активности PtcC может иметь место сверхэкспрессия одного или более генов, обеспечивающих транспорт трегалозы, предпочтительно эндогенных, например, одного или более генов фосфотрансферазной системы, входящих в трегалозный оперон. Авторы данного изобретения обнаружили, что такая сверхэкспрессия - в противоположность естественной экспрессии, индуцированной трегалозой, еще более усиливает способность грамположительных бактерий, в частности непатогенных грамположительных бактерий, предпочтительно молочнокислых бактерий или бифидобактерий, накапливать и/или удерживать внутри клеток трегалозу.
В предпочтительных воплощениях данного изобретения у используемых в них грамположительных бактерий, в частности у непатогенных грамположительных бактерий, предпочтительно у молочнокислых бактерий или бифидобактерий без активности PtcC может содержаться функциональная гетерологичная трегалозо-6-фосфат-фосфатаза. Как выяснили авторы данного изобретения, экспрессия гетерологичной трегалозо-6-фосфат-фосфатазы усиливает накопление трегалозы. В предпочтительных воплощениях данного изобретения трегалозо-6-фосфат-фосфатаза является продуктом гена otsB, предпочтительно otsB из E.coli.
Итак, в некоторых воплощениях данного изобретения описанные в настоящем документе или используемые в изобретении грамположительные бактерии, в частности, непатогенные грамположительные бактерии, предпочтительно молочнокислые бактерии или бифидобактерии, без активности PtcC, могут дополнительно проявлять какое-либо одно, какие-либо два или три из следующих свойств: а) эти грамположительные бактерии содержат функциональную гетерологичную трегалозо-6-фосфат-фосфатазу; (b) у этих грамположительных бактерий отсутствует активность TrePP; (c) у этих грамположительных бактерий происходит сверхэкспрессия одного или более генов, обеспечивающих транспорт трегалозы. В предпочтительных воплощениях данного изобретения грамположительные бактерии без активности PtcC могут также проявлять свойство (b) или, более предпочтительно, могут дополнительно обладать свойствами (а) и (b), или еще более предпочтительно, проявлять также свойства (b) и (с), или, особенно предпочтительно, проявлять свойства также (a), (b) и (c).
В предпочтительных воплощениях данного изобретения описанные в настоящем документе или используемые в изобретении грамположительные бактерий, в частности, непатогенные грамположительные бактерии, предпочтительно молочнокислые бактерии или бифидобактерии, могут дополнительно содержать один или более гетерологичных генных продуктов. В некоторых предпочтительных воплощениях данного изобретения, особенно в тех, в которых описанные грамположительные бактерий, в частности, непатогенные грамположительные бактерии, предпочтительно молочнокислые бактерии или бифидобактерии, предназначены для медицинского применения, такие генные продукты могут быть профилактическим или терапевтическими генными продуктами или антигенами.
В некоторых воплощениях данного изобретения описанные в настоящем документе или используемые в изобретении грамположительные бактерий, в частности, непатогенные грамположительные бактерии, предпочтительно молочнокислые бактерии или бифидобактерии, или лекарственное средство, или пищевая добавка, или стартовая культура, или пробиотическая композиция могут быть высушенными, высушенными распылением, замороженными или лиофилизированными. Соответственно, в некоторых воплощениях данного изобретения любые из упомянутых выше способов для получения лекарственного средства или пищевой добавки, или стартовой культуры, или пробиотической композиции или для накопления трегалозы в клетках грамположительных бактерий, непатогенных грамположительных бактерий, предпочтительно у молочнокислых бактерий или бифидобактерий или для повышения стрессоустойчивости или свойств, существенных для производства, обработки и/или хранения грамположительных бактерий, непатогенных грамположительных бактерий, предпочтительно у молочнокислых бактерий или бифидобактерий, могут включать также высушивание, сушку распылением, замораживание или лиофилизацию грамположительных бактерий, в частности непатогенных грамположительных бактерий, предпочтительно молочнокислых бактерий или бифидобактерий, лекарственного средства, пищевой добавки, пробиотической композиции или стартовой культуры.
В некоторых воплощениях упомянутого выше способа для получения лекарственного средства или пищевой добавки, или стартовой культуры, или в некоторых воплощениях упомянутого выше способа - для накопления трегалозы в клетках грамположительных бактерий, в частности непатогенных грамположительных бактерий, предпочтительно молочнокислых бактерий или бифидобактерий, культуральная среда может содержать мальтозу или глюкозу, или комбинацию мальтозы и глюкозы в качестве источника углерода - предпочтительно, в качестве основного или даже единственного источника углерода. В некоторых воплощениях данного способа указанная культуральная среда практически не содержит добавляемой извне (экзогенной) трегалозы. Авторы данного изобретения обнаружили, что описанные в настоящем документе грамположительные бактерии, в частности, непатогенные грамположительные бактерии, предпочтительно молочнокислые бактерии или бифидобактерии, приобретают способность утилизовать такие источники углерода, как мальтоза или глюкоза, чтобы накапливать трегалозу внутри клетки. Соответственно, грамположительные бактерий, в частности, непатогенные грамположительные бактерии, предпочтительно молочнокислые бактерии или бифидобактерии, по данному изобретению можно выращивать предпочтительно на, например, мальтозе в качестве единственного источника углерода, которая дешевле трегалозы, но они будут накапливать внутри клетки трегалозу. Тем не менее, следует отметить, что в некоторых воплощениях данного изобретения культуральная среда может содержать добавляемую извне (экзогенную) трегалозу.
В некоторых предпочтительных воплощениях данного изобретения грамположительные бактерий, в частности, непатогенные грамположительные бактерии, могут быть, как подразумевается настоящим описанием, молочнокислыми бактериями, более предпочтительно представителями Lactococcus sp. или Lactobacillus sp.
В некоторых других предпочтительных воплощениях данного изобретения грамположительные бактерий, в частности, непатогенные грамположительные бактерии, могут быть, как подразумевается настоящим описанием, представителями Bifidobacterium sp.
Упомянутые выше и далее аспекты и предпочтительные воплощения данного изобретения описываются в нижеследующих разделах и в прилагаемой формуле изобретения. Объект данного изобретения согласно прилагаемой формуле изобретения включается таким образом в настоящее описание.
Краткое описание фигур
Фиг. 1. Накопление трегалозы внутри клетки возможно после инактивации trePP, после экспрессии otsB или сочетания того и другого.
Фиг. 2. Накопление экзогенной трегалозы в клетках L. lactis обеспечивает им защиту от лизиса под действием желчи: (A) - выживание; (B) содержание трегалозы.
Фиг. 3. Накопление и стабильность внутриклеточной трегалозы: (A) - выход трегалозы из клеток во времени; (B) - возрастание концентрации трегалозы в культуральном супернатанте.
Фиг. 4. Накопление и высвобождение трегалозы у различных штаммов, представленных в таблице 2. Бактерии находились в присутствии 100 мМ (A) или 500 мМ (B) трегалозы.
Фиг. 5. Инактивация ptcC предотвращает (в солевой среде M9; A) или задерживает (в 0,5%-ной желчи; B) высвобождение внутриклеточной трегалозы.
Фиг. 6. Накопление экзогенной трегалозы в клетках L. lactis обеспечивает им защиту от лизиса под действием желчи. (A) - высвобождение внутриклеточной трегалозы во времени; (B) - выживание в 0,5%-ной желчи во времени.
Фиг. 7. Штаммы без активности трегалозо-6-фосфат-фосфорилазы (trePP KO) - как дикого типа по ptcC, так и ptcC KO - способны превращать глюкозу или мальтозу во внутриклеточную трегалозу.
Фиг. 8. Повышенное выживание бактерий в процессе прохождения кишечника свиньи как натощак (А; животные без пищи в течение 24 часов), так и при потреблении корма без ограничений (В).
Фиг. 9. Накопление трегалозы после образования биомассы.
Фиг. 10. Мальтоза способствует внутриклеточному накоплению трегалозы.
Фиг. 11. Превращение мальтозы во внутриклеточную трегалозу в процессе или после образования биомассы.
Осуществление изобретения
В данном документе слова, употребляемые в единственном числе, также включают и множественное число, если из контекста не следует с очевидностью иное.
Выражения «содержащий», «содержит» в настоящем документе употребляются как синонимы выражениям «включающий», «включает» и подразумевают открытое множество, не исключая дополнительных, не упомянутых здесь членов, элементов или этапов способа. Следует учесть, что в настоящем документе выражения «содержащий», «содержит», «включающий», «включает» включают понятие «состоящий из»/«состоит из», а также «в основном состоит из», «состоящий в основном из».
Когда численные диапазоны обозначаются конечными точками, это означает, что подразумеваются все численные значения и части внутри данного диапазона, равно как и указанные конечные точки.
Выражения «около» и «приблизительно» в настоящем документе, относящиеся к измеримым величинам (какому-либо показателю, количеству, промежутку времени и проч.) означают, что включаются отклонения +/-20% или менее, предпочтительно +/-10% или менее, более предпочтительно +/-5% или менее, еще более предпочтительно +/-1% или менее от указанного значения, постольку, поскольку такие отклонения допустимы в данном изобретении. Следует учесть, что то значение, при котором стоят слова «около» или «приблизительно», является само по себе определенным и предпочтительным в данном описании. Выражения «один или более» или «по меньшей мере один», например, один или более или по меньшей мере один член (члены) какой-либо группы членов, ясны сами по себе в контексте конкретных примеров, однако эти выражения охватывают помимо прочего любой из указанных членов, или любые два или более из указанных членов, например, любые ≥3, ≥4, ≥5, ≥6 или ≥7 и т.д. из указанных членов вплоть до всего числа указанных членов.
Все цитируемые в настоящем описании источники полностью включаются в данный документ путем отсылки.
Все используемые в описании данного изобретения термины, включая технические и научные термины, употребляются в настоящем документе в значениях, известных рядовому специалисту в данной области техники. Далее для лучшего понимания идеи данного изобретения в настоящий документ включены определения терминов.
Ниже различные аспекты данного изобретения описываются более подробно. Каждый из описанных таким образом аспектов можно сочетать с любым другим аспектом или аспектами данного изобретения, если явно не указано противоположного. В частности, любой признак, указанный как предпочтительный или дающий преимущество, можно сочетать с любым другим признаком (признаками), указанными как предпочтительные или дающие преимущество.
В настоящем описании ссылки на «одно из воплощений данного изобретения» или на «воплощение данного изобретения» означают, что какой-либо конкретный признак, структура или отличительная особенность, описанные в связи с данным воплощением, включается в по меньшей мере одно воплощение данного изобретения. Таким образом, выражения «в одном из воплощений данного изобретения» или «в одном воплощении данного изобретения», в разных местах настоящего описания, могут относиться к одному и тому же воплощению, но не обязательно. Кроме того, конкретные признаки, структуры или отличительные особенности могут сочетаться любым подходящим образом в одном или более воплощений данного изобретения, что для специалиста в данной области техники должно быть ясно из настоящего описания. Также, в то время как некоторые из описанных в настоящем документе воплощений данного изобретения включают одни признаки, содержащиеся в других воплощениях, но не включают другие из этих признаков, подразумевается, что сочетания признаков из различных воплощений данного изобретения входят в объем изобретения, составляют различные его воплощения, что должно быть ясно специалисту в данной области техники. Например, любые из заявленных в прилагаемой формуле изобретения воплощений данного изобретения могут использоваться в любом сочетании.
В нижеследующем описании осуществления данного изобретения, имеются ссылки на прилагаемые иллюстрации, образующие часть настоящего документа, в которых только графическим путем представлены конкретные воплощения данного изобретения, в форме которых оно может быть осуществлено на практике. Следует учесть, что можно использовать и другие воплощения данного изобретения и что возможны структурные или логические изменения, не означающие отход от объема данного изобретения. Нижеследующее описание осуществления данного изобретения не следует понимать как ограничивающее его объем, который определяется прилагаемой формулой изобретения.
Стандартные литературные источники, в которых излагаются основные принципы технологии рекомбинантной ДНК, включают следующие работы: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, ed. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel et al., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York, 1992 (with periodic updates) (“Ausubel et al. 1992”); Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press: San Diego, 1990. Основные принципы микробиологических подходов излагаются, например, в работе Davis, B. D. et al., Microbiology, 3rd edition, Harper & Row, publishers, Philadelphia, Pa. (1980).
Авторы данного изобретения обнаружили, что трегалоза в некоторой степени выходит из клеток через до сих пор не идентифицированный или не предполагавшийся механизм экспорта трегалозы и может быть выявлена в супернатанте. Авторы данного изобретения обнаружили также, что, как ни странно, при повреждении ptcC высвобождение трегалозы не происходит.
Описанные в настоящем документе грамположительные бактерии, предпочтительно молочнокислые бактерии или бифидобактерии, не имеющие активности специфичного к целлобиозе компонента IIC фосфотрансферазной (PTS) системы (PtcC).
В одном из аспектов настоящего изобретения грамположительные бактерии, предпочтительно молочнокислые бактерии или бифидобактерии, используются в качестве лекарственного средства, например, для применения при лечении. В другом аспекте данного изобретения предлагается лекарственное средство, содержащее грамположительные бактерии, предпочтительно молочнокислые бактерии или бифидобактерии, не имеющие активности PtcC. Также описывается применение грамположительных бактерий, предпочтительно молочнокислых бактерий или бифидобактерий, не имеющих активности PtcC, для производства лекарственного средства. Такое лекарственное средство может быть представлено. например фармацевтической композицией, нутрицевтическим, пробиотическим, лечебным или функциональным пищевым продуктом.
В другом аспекте данного изобретения предлагается применение грамположительных бактерий, предпочтительно молочнокислых бактерий или бифидобактерий, не имеющих активности PtcC, в качестве пробиотической или пищевой добавки, более конкретно - не лечебной пробиотической или пищевой добавки. В близком аспекте данного изобретения предлагается применение грамположительных бактерий, предпочтительно молочнокислых бактерий или бифидобактерий, не имеющих активности PtcC, в качестве стартовой культуры, предпочтительно стартовой культуры для получения пищевого продукта, в частности не лечебного пищевого продукта.
В другом аспекте данного изобретения предлагается пробиотическая или пищевая добавка, в частности не лечебная пробиотическая или пищевая добавка, содержащая грамположительные бактерии, предпочтительно молочнокислые бактерии или бифидобактерии, не обладающие активностью PtcC. В близком аспекте данного изобретения предлагается стартовая культура, предпочтительно стартовая культура для получения пищевого продукта, в частности не лечебного пищевого продукта, причем указанная стартовая культура содержит грамположительные бактерии, предпочтительно молочнокислые бактерии или бифидобактерии, не обладающие активностью PtcC.
В настоящем документе термин «грамположительные бактерии» имеет свое общепринятое значение, известное в данной области техники. Как указывается далее, грамположительные бактерии можно идентифицировать путем окрашивания по Граму: при обработке красителем кристаллвиолетом (кристаллическим фиолетовым) они становятся фиолетовыми.
В одном из предпочтительных воплощений данного изобретения используемые грамположительные бактерии являются непатогенными - в том смысле, что, будучи введены пациенту, они не причиняют вреда или не вызывают отрицательных эффектов.
В настоящем документе термин «молочнокислые бактерии» относится к грамположительным бактериям, которые являются непатогенными в том смысле, что, будучи введены пациенту, они не причиняют вреда или не вызывают отрицательных эффектов, и которые предпочтительно принадлежат к родам Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Streptococcus, Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Oenococcus, Sporolactobacillus, Tetragenococcus, Vagococcus и Weisella. Более предпочтительно, чтобы используемые по данному изобретению бактерии принадлежали к видам рода Lactococcus, например, это могут быть (не ограничиваясь перечисленным здесь) Lactococcus lactis, Lactococcus garvieae, Lactococcus piscium, Lactococcus plantarum и Lactococcus raffinolactis, и любые их подвиды и штаммы. Наиболее предпочтительным видом рода Lactococcus в контексте данного изобретения является Lactococcus lactis, и любые его подвиды и штаммы, например (не ограничиваясь перечисленным здесь), Lactococcus lactis ssp. cremoris, Lactococcus lactis ssp. hordniae, Lactococcus lactis ssp. lactis, Lactococcus lactis ssp. bv. diacetylactis. Также предпочтительными формами Lactococcus lactis могут быть Lactococcus lactis ssp. cremoris или Lactococcus lactis ssp. lactis, более предпочтительны Lactococcus lactis ssp. cremoris, включая любые его штаммы, например, Lactococcus lactis ssp. cremoris SK11, Lactococcus lactis ssp. cremoris MG1363 или Lactococcus lactis ssp lactis IL1403. Также предпочтительными молочнокислыми бактериями могут быть представители рода Enterococcus sp., предпочтительно Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium и любые их подвиды и штаммы, например, (не ограничиваясь проиведенным здесь примером) Enterococcus faecium, штамм LMG15709.
Бифидобактерии - это род грамположительных анаэробных бактерий, представляющих собой неподвижные палочки, часто ветвящиеся на концах. Используемые по данному изобретению бифидобактерии могут включать B. adolescentis, B. angulatum, B. animalis, B. asteroides, B. bifidum, B. boum, B. breve, B. catenulatum, B. choerinum, B. coryneforme, B. cuniculi, B. denticolens, B. dentium, B. gallicum, B. gallinarum, B. indicum, B. infantis, B. inopinatum, B. lactis, B. longum, B. magnum, B. merycicum, B. minimum, B. pseudocatenulatum, B. pseudolongum, B. pullorum, B. ruminantium, B. saeculare, B. subtile, B. suis, B. thermacidophilum, B. thermophilum. Предпочтительными по данному изобретению бифидобактериями являются B. adolescentis, B. bifidum, B. breve, B. infantis, B. longum. Следует учесть, что включены также все подвиды и штаммы бифидобактерий.
В настоящем документе термин «специфичный к целлобиозе компонент IIC системы PTS», обозначаемый “ptcC” или “PtcC”, относится к компоненту фосфотрансферазной системы. Фосфотрансферазная система участвует в катализе переноса фосфорильной группы от фосфоенолпирувата на поступающие сахара-субстраты с их переходом через клеточную мембрану. PtcC - это трансмембранный компонент специфичной к целлобиозе фосфотрансферазной (PTS) системы. До сих пор об участии PtcC в транспорте трегалозы речи не было, не говоря уже о «вытекании» трегалозы из клеток грамположительных бактерий, предпочтительно молочнокислых бактерий или бифидобактерий. Для примера, нуклеотидная последовательность гена ptcC и аминокислотная последовательность кодируемого ею белка Lactococcus lactis ssp. cremoris MG1363 представлена последовательностями SEQ ID NO: 7 и 8, соответственно (регистрационные номера в Genbank NC_009004.1 (region 430271-431608) и YP_001031790.1, соответственно). В одном из воплощений данного изобретения обозначение ptcC в настоящем документе относится к гену с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 7 или же белку с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 8, соответственно, или же к нуклеиновой кислоте, кодирующей SEQ ID NO: 8.
В еще одном воплощении данного изобретения используемое в настоящем документе обозначение ptcC относится к гену с нуклеотидной последовательностью или к белку с аминокислотной последовательностью, которые по меньшей мере на 75% идентичны последовательностям SEQ ID NO: 7 и 8, соответственно, например, идентичной по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или более процентов. В другом воплощении данного изобретения используемое в настоящем документе обозначение PtcC относится к белку, по меньшей мере на 75% идентичен последовательности SEQ ID NO: 8, например, идентичен на по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или более процентов. В другом воплощении данного изобретения используемое в настоящем документе обозначение ptcC относится к гену с нуклеотидной последовательностью, которая по меньшей мере на 55% идентична последовательности SEQ ID NO: 7, например, идентична на по меньшей мере 60%, 65%, 70% или более процентов. В другом воплощении данного изобретения используемое в настоящем документе обозначение ptcC относится к белку с аминокислотной последовательностью, которая по меньшей мере на 45% идентична последовательности SEQ ID NO: 8, например, идентична на по меньшей мере 50%, 55%, 60%, 65%, 70% или более процентов. В другом воплощении данного изобретения используемое в настоящем документе обозначение PtcC относится к белку, который по меньшей мере на 45% идентичен последовательности SEQ ID NO: 8, например, идентичен на по меньшей мере 50%, 55%, 60%, 65%, 70% или более процентов. Предпочтительно описанные выше последовательности относятся к функциональному белку PtcC или кодируют его. В другом воплощении данного изобретения используемое в настоящем документе обозначение ptcC относится к последовательности молочнокислых бактерий, ортологичной последовательностям SEQ ID NO: 7 и 8. Предпочтительно идентичность последовательностей, о которой говорится в этом абзаце, в частности, применима тогда, когда грамположительные бактерии являются молочнокислыми бактериями, более предпочтительно представителями Lactococcus sp., еще более предпочтительно - Lactococcus lactis (не ограничиваясь приведенным здесь примером).
Для примера, нуклеотидная последовательность гена ptcC и аминокислотная последовательность кодируемого ею белка Bifidobacterium bifidum PRL2010 представлена последовательностями, регистрационные номера которых в Genbank NC_014638.1 (REGION 2033198..2034538, COMPLEMENT) и YP_003971775.1; Bifidobacterium longum subsp. longum KACC 91563 регистрационные номера Genbank NC_017221.1 (REGION 2316679..2317218) и YP_005588251.1; и Bifidobacterium breve UCC2003 регистрационные номера Genbank CP000303.1 (REGION 2379064..2380443, CJMPLEMENT) и ABE96554.1.
В еще одном воплощении данного изобретения используемое в настоящем документе обозначение ptcC относится к гену с нуклеотидной последовательностью или к белку с аминокислотной последовательностью, которые по меньшей мере на 75%, например по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или более процентов идентичны нуклеиновой кислоте или последовательности белка ptcC Bifidobacterium bifidum PRL2010, или Bifidobacterium longum subsp. longum KACC 91563, или Bifidobacterium breve UCC2003, определяемых указанными выше регистрационными номерами Genbank соответственно. Предпочтительно описанные выше последовательности относятся к функциональному белку PtcC или кодируют его. В другом воплощении данного изобретения используемое в настоящем документе обозначение ptcC относится к последовательности Bifidobacterium, ортологичной последовательностям pttcC указанных видов Bifidobacterium. Предпочтительно идентичность последовательностей, о которой говорится в этом абзаце, в частности, применима тогда, когда грамположительные бактерии являются бифидобактериями (не ограничиваясь приведенным здесь примером).
Специалистам в данной области техники должно быть ясно, что компонент IIC фосфотрансферазной (PTS) системы многих других грамположительных бактерий можно без труда найти в базе данных Genbank Nucleotide, например, путем поиска на “PTS system IIC component” или как-либо аналогично, при желании в сочетании с названием родового (например, “Lactococcus”, “Lactobacillus”, “Leuconostoc”, “Enterococcus”, “Bifidobacterium и др.) или видового (например, “Lactococcus lactis”, “Lactococcus garvieae”, “Lactococcus piscium”, “Lactococcus plantarum”, “Lactococcus raffinolactis”, “Enterococcus faecalis”, “Enterococcus faecium”, “Bifidobacterium adolescentis”, “Bifidobacterium bifidum”, “Bifidobacterium breve”, “Bifidobacterium lactis”и др.) названия нужных грамположительных бактерий, или путем поиска на “PTS system IIC component” или как-либо аналогично по аннотированным полногеномным последовательностям таких бактерий. Если нужные последовательности еще не включены в доступные базы данных, их не сложно определить путем стандартных молекулярно-биологических методов, основанных на гомологии последовательностей.
Методы сравнении последовательностей и определения их идентичности хорошо известны в данной области техники. Для примера идентичность последовательностей в процентах относится к выраженной в процентах доле одинаковых участков в сравниваемых нуклеотидных или аминокислотных последовательностях после их выравнивания. Выравнивание и определение идентичности в процентах можно осуществить и рассчитать с помощью различных программ и алгоритмов, известных в данной области техники. Предпочтительные алгоритмы выравнивания последовательностей включают BLAST (Altschul, 1990; доступен, например, на сайте Национального центра биотехнологической информации (NCBI)) и Clustal (см. обзор Chenna, 2003; доступен, например, на сайте Европейского института биоинформатики (EBI)). Предпочтительно, BLAST применяется для расчета идентичности в процентах между двумя последовательностями, например алгоритм “Blast 2 sequences” описанный в работе Tatusova, Madden, 1999 (FEMS Microbiol Lett 174: 247-250), например, с использованием опубликованных стандартных настроек по умолчанию или других подходящих настроек (например, для алгоритма BLASTN штраф за открытие пробела = 5, штраф за расширение пробела = 2, штраф за несовпадение = -2, приз за совпадение = 1, пробела x_перенос= 50, ожидание = 10.0, параметр word size («длина слова») = 28; или для алгоритма BLASTP: матрица = Blosum62 штраф за открытие пробела = 11, штраф за расширение пробела = 1, ожидание = 10.0, параметр word size («длина слова») = 3).
Активность PtcC можно определить, например, опосредованно путем секвенирования гена. Таким путем можно легко установить частичные или полные делеции, разрывы или инактивирующие мутации.
В настоящем документе выражение «лишенный/не имеющий/без активности PtcC» означает, что активности PtcC нет или практически нет. Далее для лучшего понимания, это активность PtcC менее 20% от активности PtcC грамположительных бактерий, предпочтительно молочнокислых бактерий или бифидобактерий, дикого типа. Например, активность PtcC менее 15%, предпочтительно менее 10%, более предпочтительно менее 5%, еще более предпочтительно менее 1% от активности PtcC бактерий дикого типа. Как указывалось ранее, наиболее предпочтительно, когда активность PtcC не определяется или полностью либо практически отсутствует.
В настоящем документе термин «лекарственное средство/медикамент» включает также понятия «лекарство», «лекарственный препарат», «лечебное медикаментозное средство» и другие термины, употребляемые в области медицины для обозначения препарата, обладающего лечебным или профилактическим действием.
В настоящем документе термин «лечение/лечить» относится и к терапевтическому воздействию, и к профилактическим или превентивным мероприятиям, когда нужно предотвратить или замедлить (ослабить) нежелательные физиологические изменения или нарушения. Термины «лечение», «лечебное воздействие» и т.п. в настоящем документе также включают ослабление или ликвидацию начавшего развиваться заболевания или состояния либо ослабление характерных симптомов такого заболевания или состояния. В настоящем документе эти термины также охватывают - в зависимости от состояния индивида - предотвращение начала заболевания или состояния либо симптомов, связанных с заболеванием или состоянием, включая снижение степени тяжести заболевания или состояния либо связанных с ним симптомов до ощутимого поражения, обусловленным эти заболеванием или состоянием. Такое предотвращение или ослабление заболевания или состояния до обусловленного им поражения организма относится к введению веществ или композиций по данному изобретению индивиду, у которого на момент введения нет поражения, обусловленного этим заболеванием или состоянием. Термин «профилактика» также охватывает предотвращение возобновления или рецидивов заболевания или состояния либо связанных с ним симптомов, например после периода улучшения.
В настоящем документе термин «нутрицевтик»/«нутрицевтический» охватывает пищевые продукты и блюда, способствующие здоровью и обладающие положительным эффектом с медицинской точки зрения. Нутрицевтики съедобны, и человек может потреблять их как пищу непосредственно, но предпочтительно принимать их как дополнение к рациону или пищевые добавки, например в форме таблетки вроде тех, которые продаются в магазинах здорового питания, или в виде ингредиентов твердых съедобных продуктов, более предпочтительно - в форме пищевых продуктов, прошедших технологическую обработку, например зерновых и хлебных изделий, соевого творога (тофу), выпечки, мороженого, картофельных чипсов, сушек и сухариков, сыра и проч., а также жидких продуктов, например таких напитков, как молоко, газированная вода, спортивные напитки и фруктовые соки. Особенно предпочтительные технологии для производства нутрицевтиков предполагают использование растворителей только естественного происхождения. Предпочтительно в нутрицевтиках относительно высокое содержание способствующих здоровью веществ. Нутрицевтики можно смешивать друг с другом, чтобы усилить их оздоровляющие эффекты.
В отличие от нутрицевтиков так называемые лечебные пищевые продукты не предназначены для общего потребления, и они не продаются в обычных магазинах. К лечебным продуктам не относятся пищевые продукты, которые включаются в здоровый рацион для снижения риска заболеваний, например, продукты с пониженным содержанием жиров или соли, или те продукты. которые способствуют снижению массы тела. Лечебные продукты назначает врач, если у пациента имеются какие-либо специфические потребности в питании, как часть комплексного лечения определенного заболевания или для улучшения общего состояния; такие продукты следует принимать под медицинским контролем. На этикетке продукта указывается, что он предназначен для применения при определенном расстройстве или состоянии. Примером лечебных продуктов являются различные по питательным качествам продукты, предназначенные для целенаправленной питательной поддержки больных с хроническими воспалительными процессами. В этих продуктах активными ингредиентами служат, например, одно или более веществ, описанных в настоящем документе. К функциональным пищевым продуктам относятся пищевые продукты, включаемые в здоровый рацион для снижения риска заболеваний, например, продукты с пониженным содержанием жиров или соли, или продукты, способствующие уменьшению массы тела.

В настоящем документе термин «пробиотик» относится к бактериям, способствующим поддержанию естественного равновесия микроорганизмов (микрофлоры) в просвете кишечника. У человека в норме желудочно-кишечный тракт содержит пробиотические бактерии, что противодействует размножению вредных бактерий и улучшает состояние пищеварительной системы. Наиболее обширную группу пробиотиков в кишечнике составляют молочнокислые бактерии. В настоящем документе термин «пробиотическая композиция» означает композицию, предпочтительно съедобную, которая содержит пробиотик. В настоящем документе термин «пробиотическая композиция» может употребляться вместо термина «добавка к рациону» (и наоборот). Согласно данному в настоящем документе определению, пробиотическая композиция может использоваться как добавка к пище и напиткам и как фармацевтическая композиция для энтерального или парентерального применения, которая может быть твердой, например, в форме капсул или таблеток, либо жидкой, например в форме суспензии или раствора. Такие композиции могут включать (не ограничиваясь перечисленным здесь) напитки (например, Actimel, Yakult, DanActive…), йогурты (в том числе питьевые), творог, сливки, сметана и проч. Таким образом. следует принять во внимание, что пробиотики или пробиотические композиции могут иметь медицинское либо немедицинское применение.
Термин «стартовая культура» относится к микробиологическим культурам, которые реально осуществляют ферментацию. Эти культуры обычно состоят из среды для культивирования, например, зерна, семян или питательной жидкости, заселенных микроорганизмами, используемыми для ферментации. В настоящем документе термин «стартовая культура» относится предпочтительно к стартовым культурам с высокой плотностью. Соответственно, термин «стартовая культура» может относиться к композиции, содержащей живые микроорганизмы, способные вызвать или осуществить ферментацию органического вещества, при необходимости после культивирования в отдельной стартовой среде для получения культуры с высокой плотностью. Или же стартовая культура может быть высушенной, в частности путем сушки распылением, замороженной или лиофилизированной.
Как отмечалось выше, авторы настоящего изобретения обнаружили, что в отсутствие трегалозо-6-фосфат-фосфорилазы (trePP) усиливается накопление трегалозы внутри клеток грамположительных бактерий, предпочтительно молочнокислых бактерий или бифидобактерий. В противоположность этому ранее считалось, что для внутриклеточного накопления трегалозы существенно присутствие гетерологичной трегалозо-6-фосфат-фосфатазы и/или гетерологичной трегалозо-6-фосфат-синтазы, например, otsB и otsA, соответственно.
В одном из своих воплощений данное изобретение относится к описанным в настоящем документе грамположительным бактериям, предпочтительно молочнокислым бактериям или бифидобактериям, не обладающим активностью трегалозо-6-фосфат-фосфорилазы.
В настоящем документе термин «трегалозо-6-фосфат-фосфорилаза» (trePP или TrePP) относится к ферменту, фосфорилирующему трегалозо-6-фосфат, предпочтительно - к ферменту, который катализирует реакцию, предпочтительно обратимую реакцию, взаимодействия α,α-трегалозо-6-фосфата и фосфата с образованием глюкозо-6-фосфата и
β-D-глюкозо-1-фосфата (или в обратном направлении). Синонимами термина «трегалозо-6-фосфат-фосфорилаза» являются, например, такие названия этого фермента, как трегалозо-6-фосфат:фосфат-β-D-глюкозилтрансфераза и α,α-трегалозо-6-фосфат:фосфат- β-D- глюкозилтрансфераза. Для примера нуклеиновая кислота, кодирующая трегалозо-6-фосфат-фосфорилазу, и аминокислотная последовательность этого белка у Lactococcus lactis ssp. cremoris MG1363 представлены последовательностями SEQ ID NO: 1 и 2, соответственно (регистрационные номера Genbank NC_009004.1 (REGION 449195-451504) и YP_001031805.1, соответственно). В одном из воплощений данного изобретения употребляемое в настоящем документе обозначение trePP относится к гену с нуклеотидной последовательностью или к белку с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1 и 2, соответственно, или с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:2. В другом воплощении данного изобретения употребляемое в настоящем документе обозначение trePP относится к гену с нуклеотидной последовательностью или к белку с аминокислотной последовательностью, идентичной последовательностям SEQ ID NO:1 и 2, соответственно, по меньшей мере на 75%, например на по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или более процентов. В другом воплощении данного изобретения употребляемое в настоящем документе обозначение trePP подразумевает белок, который по меньшей мере на 75% идентичен SEQ ID NO: 2, например, по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или более процентов. Предпочтительно описанные выше последовательности относятся к функциональному белку trePP или кодируют его. В другом воплощении данного изобретения употребляемое в настоящем документе обозначение trePP относится к ортологу последовательностей SEQ ID NO: 1 и 2 грамположительных бактерий, предпочтительно молочнокислых бактерий или бифидобактерий.
Активность трегалозо-6-фосфаьт-фосфорилазы можно определить впрямую либо опосредованно. Одним из путей опосредованного определения активности trePP является определение нуклеотидной последовательности соответствующего гена. При этом можно легко идентифицировать делеции, разрывы или инактивирующие мутации. Чтобы определить активность TrePP впрямую, можно измерять поглощение субстрата или образование продуктов фосфорилазной реакции (например, субстрата, т.е. трегалозо-6-фосфата, или продуктов - глюкозо-6-фосфата и β-D-глюкозо-1-фосфата), которое можно сочетать с предварительным мечением метаболитов. Определение субстрата и продуктов реакции можно осуществлять также путем анионообменной хроматографии, как описано, например, в работе Andersson et al. 2001 (см. выше). В настоящем документе выражения «отсутствие активности TrePP», «не имеющий активности TrePP» или «без активности TrePP» и т.п. означают, что активность трегалозо-6-фосфат-фосфорилазы совершенно или в основном отсутствует. Как указывается далее, активность TrePP составляет менее 20% от активности TrePP у грамположительных бактерий, предпочтительно молочнокислых бактерий или бифидобактерий, дикого типа. Например, активность TrePP составляет менее 15%, предпочтительно менее 10%, более предпочтительно менее 5%, еще боде предпочтительно менее активности TrePP дикого типа. Как указывалось ранее, наиболее предпочтительно, когда активность TrePP не выявляется, в основном или полностью отсутствует.
Авторы данного изобретения обнаружили, что присутствие гетерологичной трегалозо-6-фосфат-фосфатазы и/или гетерологичной трегалозо-6-фосфат-синтазы может также усилить внутриклеточное накопление трегалозы. В одном из своих воплощений данное изобретение относится к описанным в настоящем документе грамположительным бактериям, предпочтительно молочнокислым бактериям или бифидобактериям, содержащим функциональную гетерологичную трегалозо-6-фосфат-фосфатазу. В другом воплощении данного изобретения описанные в настоящем документе грамположительные бактерии, предпочтительно молочнокислые бактерии или бифидобактерии, содержат функциональную гетерологичную трегалозо-6-фосфат-синтазу. В еще одном воплощении данного изобретения описанные в настоящем документе грамположительные бактерии, предпочтительно молочнокислые бактерии или бифидобактерии, содержат функциональную гетерологичную трегалозо-6-фосфат-синтазу и функциональную гетерологичную трегалозо-6-фосфат-фосфатазу. В одном из предпочтительных воплощений данного изобретения трегалозо-6-фосфат-синтаза является otsA, предпочтительно otsA из E. coli. В другом предпочтительном воплощении данного изобретения трегалозо-6-фосфат-фосфатаза является otsB, предпочтительно otsB из E. coli.
Особенно предпочтительна геномная интеграция трегалозо-6-фосфат-фосфатазы и/или синтазы; такая интеграция описана в заявках на Европейский патент №№ 11168495.7 и 11173588.2. Эти заявки описывают двухцистронные экспрессионные системы и полностью включаются в настоящий документ путем отсылки. Предпочтительно, чтобы ген трегалозо-6-фосфат-фосфатазы, предпочтительно otsB, и/или трегалозо-6-фосфат-синтазы, предпочтительно otsA, располагались как второй цистрон «позади» эндогенного гена usp45.
В данном контексте «содержит» предпочтительно относится к грамположительным бактериям, предпочтительно молочнокислым бактериям или бифидобактериям, в которых экспрессируется определенный генный продукт, то есть в указанных грамположительных бактериях, предпочтительно молочнокислых бактериях или бифидобактериях образуется функциональный или активный белок.
В настоящем документе термин «трегалозо-6-фосфат-фосфатаза» относится к ферменту, дефосфорилирующему (отщепляющему фосфатную группу) трегалозо-6-фосфат, предпочтительно к ферменту, катализирующему реакцию образования фосфата и трегалозы из трегалозо-6-фосфата. Трегалозо-6-фосфат-фосфатаза принадлежит к семейству гидролаз моноэфиров фосфорной кислоты. Синонимами названию «трегалозо-6-фосфат-фосфатаза» являются, например, «α,α-трегалозо-6-фосфат-фосфогидролаза», «трегалозо-6-фосфат-фосфогидролаза» и «трегалозо-6-фосфатаза». Для примера нуклеиновая кислота и последовательность белка трегалозо-6-фосфат-фосфатазы E. coli (т.е. otsB) представлены последовательностями SEQ ID NO: 3 и 4, соответственно (регистрационные номера Genbank X69160.1 (положения нуклеотидов 675-1475) and P31678.2, соответственно). В одном из воплощений данного изобретения употребляемое в настоящем документе название «трегалозо-6-фосфат-фосфатаза» относится к гену или белку с нуклеотидной или аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3 и 4, соответственно, или с нуклеотидной последовательностью, кодирующей SEQ ID NO: 4. В другом воплощении данного изобретения употребляемое в настоящем документе название «трегалозо-6-фосфат-фосфатаза» относится к гену с нуклеотидной последовательностью или к белку с аминокислотной последовательностью, идентичной последовательностям SEQ ID NO:3 и 4, соответственно, по меньшей мере на 75%, например, по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или более процентов. В другом воплощении данного изобретения употребляемое в настоящем документе название «трегалозо-6-фосфат-фосфатаза» подразумевает белок, который по меньшей мере на 75% идентичен SEQ ID NO: 4, например, по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или более процентов. Предпочтительно описанные выше последовательности относятся к функциональной трегалозо-6-фосфат-фосфатазе или кодируют ее. В другом воплощении данного изобретения употребляемое в настоящем документе название «трегалозо-6-фосфат-фосфатаза» относится к ортологу последовательностей SEQ ID NO: 3 и 4 грамположительных бактерий, предпочтительно молочнокислых бактерий или бифидобактерий.
В настоящем документе термин «трегалозо-6-фосфат-синтаза» относится к ферменту, дефосфорилирующему (отщепляющему фосфатную группу) трегалозо-6-фосфат, предпочтительно к ферменту, катализирующему реакцию образования трегалозо-6-фосфата из глюкозо-6-фосфата и уридиндифосфат-глюкозы. Трегалозо-6-фосфат-синтаза принадлежит к семейству гликозилтрансфераз. Синонимами названию «трегалозо-6-фосфат-синтаза» являются, например, «трегалозофосфат-уридиндифосфат-гликозилтрансфераза», «фосфотрегалоза-уридиндифосфат-трансглюкозилаза», «уридиндифосфоглюкоза-фосфат-глюкозилтрансфераза» и α,α-трегалозо-6-фосфат-синтаза». Для примера нуклеиновая кислота и последовательность белка трегалозо-6-фосфат-синтазы E. coli (т.е. otsA) представлены последовательностями SEQ ID NO: 5 и 6, соответственно (регистрационные номера Genbank X69160.1 (положения нуклеотидов 1450-2874) и P31677.3, соответственно). В одном из воплощений данного изобретения употребляемое в настоящем документе название «трегалозо-6-фосфат-синатаза» относится к гену или белку с нуклеотидной или аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 5 и 6, соответственно, или с нуклеотидной последовательностью, кодирующей SEQ ID NO: 6. В другом воплощении данного изобретения употребляемое в настоящем документе название «трегалозо-6-фосфат-синтаза» относится к гену с нуклеотидной последовательностью или к белку с аминокислотной последовательностью, идентичной последовательностям SEQ ID NO: 5 и 6, соответственно, по меньшей мере на 75%, например, по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или более процентов. В другом воплощении данного изобретения употребляемое в настоящем документе название «трегалозо-6-фосфат-синатаза» подразумевает белок, который по меньшей мере на 75% идентичен SEQ ID NO: 6, например, по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или более процентов. Предпочтительно описанные выше последовательности относятся к функциональной трегалозо-6-фосфат-синтазе или кодируют ее. В другом воплощении данного изобретения употребляемое в настоящем документе название «трегалозо-6-фосфат-фосфатаза» относится к ортологу последовательностей SEQ ID NO: 5 и 6 грамположительных бактерий, предпочтительно молочнокислых бактерий или бифидобактерий.
По данному изобретению грамположительные бактерии, предпочтительно молочнокислые бактерии или бифидобактерии, не имеющие активности PtcC и/или трегалозо-6-фосфат-фосфатазы (TrePP) и при необходимости содержащие гетерологичные гены или генные продукты, например трегалозо-6-фосфат-синтазу или фосфатазу или гетерологичные гены или генные продукты профилактического и/или лечебного назначения, могут быть получены любым известным в данной области методом, будь то молекулярно-биологические методы или высокопроизводительный скрининг природных вариантов или вариантов. полученных в результате случайного мутагенеза, вызванного химическими агентами или излучением. (Высокопроизводительный скрининг на trePP KO можно осуществить, используя отсутствие роста бактериальных штаммов, дефектных по trePP, на трегалозе, или путем высокопроизводительного скрининга и биоинформационного анализа ортологов trePP или иными методами). (Базовую информацию по рекомбинантным методам и генетическим манипуляциям с молочнокислыми бактериями см., например, в работах “Genetics and Biotechnology of Lactic Acid Bacteria”, eds. Gasson & de Vos, Blackie Academic & Professional, 1994 и “Genetics of Lactic Acid Bacteria”, eds. Wood & Warner, Springer, 2003.) В одном из воплощений данного изобретения у грамположительных бактерий, предпочтительно молочнокислых бактерий или бифидобактерий, был полностью или частично делетирован, разрушен или инактивирован ген, кодирующий эндогенный PtcC и/или TrePP, и/или промоторы, необходимые для экспрессии trePP и/или ptcC, так что эти бактерии были не способны к образованию функциональных генных продуктов ptcC и/или trePP. Методы разрушения гена известны в данной области техники. К примеру, эндогенный ген ptcC и/или trePP можно инактивировать путем полного или частичного удаления кодирующей области (нокаут) или же полного или частичного удаления или мутации области промотора. Также ген ptcC и/или trePP может быть инактивирован путем инсерции (нокин), разрывающей кодирующую последовательность. Например, можно вводить стоп-кодоны, преждевременно останавливающие транскрипцию, или мутации, связанные со сдвигом рамки считывания. Можно также вызвать мутирование гена ptcC и/или trePP путем введения одной или более миссенс- или нонсенс-мутаций, так чтобы функциональные PtcC и/или TrePP более не могли образовываться, то есть чтобы активность PtcC и/или trePP полностью или в основном отсутствовала. Следует учесть, что сюда входят и спонтанные мутации.
Авторы данного изобретения также обнаружили, что усиленная экспрессия одного или более переносчиков трегалозы еще более увеличивает внутриклеточное накопление трегалозы и/или ее удерживание в клетках грамположительных бактерий, предпочтительно молочнокислых бактерий и бифидобактерий. Соответственно, в одном из своих воплощений данное изобретение относится к описанным в настоящем документе грамположительным бактериям, предпочтительно молочнокислым бактериям или бифидобактериям, со сверхэкспрессией, предпочтительно конститутивной сверхэкспрессией, одного или более генов, кодирующих переносчики трегалозы. В одном из предпочтительных воплощений данного изобретения указанные переносчики трегалозы являются эндогенными переносчиками трегалозы грамположительных бактерий, предпочтительно молочнокислых бактерий или бифидобактерий. В другом предпочтительном воплощении данного изобретения указанные переносчики трегалозы являются эндогенными переносчиками трегалозы в составе трегалозного оперона грамположительных бактерий, предпочтительно молочнокислых бактерий или бифидобактерий. В еще одном воплощении данного изобретения указанные переносчики трегалозы являются эндогенными переносчиками трегалозы фосфотрансферазной системы (PTS) в составе трегалозного оперона грамположительных бактерий, предпочтительно молочнокислых бактерий или бифидобактерий. В одном из предпочтительных воплощений данного изобретения описанная в настоящем документе усиленная экспрессия одного или более переносчиков трегалозы достигается путем инсерции 5'-промотора в ген одного или более переносчиков, так чтобы промотор оказывается функционально связан с последовательностью (последовательностями), кодирующими переносчик. Термин «функционально связанный» относится к такому расположению элементов «бок о бок», когда их взаимоотношение позволяет им функционировать так, как им предназначено. Промотор, функционально связанный с кодирующей последовательностью, встроен таким образом, что экспрессия кодирующей последовательности достигается в условиях, подходящих промоторной последовательности. В одном из воплощений данного изобретения указанный промотор является сильным. В другом воплощении данного изобретения указанный промотор является конститутивным. В еще одном воплощении данного изобретения указанный промотор является эндогенным промотором грамположительных бактерий, предпочтительно молочнокислых бактерий или бифидобактерий. Подходящие промоторы можно найти, например, в публикации WO 2008/084115, которая полностью включается в настоящий документ. В частности, для описанной в настоящем документе усиленной экспрессии переносчиков трегалозы особенно подходят промоторы, перечисленные в таблице 12 WO 2008/084115. Наиболее предпочтителен промотор PhIIA (т.е. промотор HU-подобного ДНК-связывающего белка). Соответственно, в одном из предпочтительных воплощений данного изобретения промотор PhIIA встраивается «перед» (в направлении 5'-конца) кодирующей областью эндогенного переносчика (переносчиков) трегалозы в составе трегалозного оперона грамположительных бактерий, предпочтительно молочнокислых бактерий или бифидобактерий. В одном из воплощений данного изобретения промотор PhIIA имеет последовательность SEQ ID NO: 13, соответствующую промотору PhIIA Lactococcus lactis ssp. cremoris MG1363. В другом воплощении данного изобретения промотор PhIIA имеет последовательность, по меньшей мере на 75% идентичную последовательности SEQ ID NO: 13, например, по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или более идентичную последовательности SEQ ID NO: 13. В другом воплощении данного изобретения указанный PhIIA является ортологом последовательности SEQ ID NO: 13 грамположительных бактерий, предпочтительно молочнокислых бактерий или бифидобактерий.
Для примера, обсуждаемые в настоящем документе переносчики трегалозы представлены принадлежащими Lactococcus lactis ssp. cremoris MG1363 нуклеиновой кислотой и аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 9 и 10, соответственно (регистрационные номера Genbank NC_009004.1 (REGION 446937-447422) и YP_001031803.1, соответственно), и/или последовательностями SEQ ID NO: 11 и 12, соответственно (регистрационные номера Genbank NC_009004.1 (REGION 447563-449128) и YP_001031804.1, соответственно. В одном из воплощений данного изобретения обсуждаемые в настоящем документе сверхэкспрессирующиеся переносчики трегалозы относятся к гену или белку с нуклеотидной или аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 9 и 10, соответственно, и/или SEQ ID NO: 11 и 12, соответственно, или к нуклеиновой кислоте, кодирующей SEQ ID NO: 10 и/или SEQ ID NO: 12. В другом воплощении данного изобретения обсуждаемые в настоящем документе сверхэкспрессирующиеся переносчики трегалозы относятся к гену или белку с нуклеотидной или аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 75% идентичной последовательностям SEQ ID NO: 9 и 10, соответственно, и/или SEQ ID NO: 11 и 12, соответственно, например, по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или более процентов. В другом воплощении данного изобретения обсуждаемые в настоящем документе сверхэкспрессирующиеся переносчики трегалозы соответствуют белку, который по меньшей мере на 75% идентичен SEQ ID NO: 10 и/или SEQ ID NO: 12, например, по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или более процентов. Предпочтительно описанные выше последовательности относятся к (а) функциональным сверхэкспрессирующимся, предпочтительно конститутивным, белкам-переносчикам (или кодируют их). В другом воплощении данного изобретения обсуждаемые в настоящем документе (конститутивные) сверхэкспрессирующиеся переносчики являются ортологами последовательностей SEQ ID NO: 9 и 10 и/или SEQ ID NO: 11 и 12 грамположительных бактерий, предпочтительно молочнокислых бактерий или бифидобактерий.
Описанные в настоящем документе грамположительные бактерии, предпочтительно молочнокислые бактерии и бифидобактерии, проявляют повышенную способность переносить воздействие различных вредоносных или стрессогенных факторов окружающей среды и условий хранения, например, интенсивного высушивания, сушки распылением, замораживания или лиофилизации, а также повышенную устойчивость к жестким условиям в желудочно-кишечном тракте (например, кислую среду и присутствие солей желчных кислот). Таким образом, грамположительные бактерии, предпочтительно молочнокислые бактерии и бифидобактерии, по данному изобретению особенно хорошо подходят для введения пациентам, поскольку демонстрируют повышенную выживаемость в желудочно-кишечном тракте. Эти грамположительные бактерии. предпочтительно молочнокислые бактерии и бифидобактерии, также можно использовать для доставки белков в организм пациента. Соответственно, в одном и своих воплощений данное изобретение относится к грамположительным бактериям, предпочтительно молочнокислым бактериям и бифидобактериям, которые, как описано в настоящем документе, содержат один или более гетерологичных генных продуктов, предпочтительно один или более генных продуктов и/или антигенов профилактического и/или лечебного назначения. Доставка биологически активных полипептидов описана, например, в публикациях WO 97/14806, WO 00/23471, WO 01/02570, WO 02/090551, WO 2005/111194, WO 2007/025977, WO 2007/063075, WO 2007/128757, WO 2008/071751, WO 2008/090223, WO 2004/046346 и WO 2010/034844. Предпочтительно, описанные в настоящем документе гетерологичные гены интегрированы в бактериальный геном. Особенно предпочтительный метод интегрирования описан в заявках на Европейский патент №№ 11168495.7 11173588.2, которые полностью включаются в настоящий документ путем отсылки. В частности, встраивание в ДНК гетерологичных генов по данному изобретению возможно с использованием полицистронной системы (например, из двух, трех или более цистронов), когда гетерологичный ген является вторым (или третьим, или четвертым и т.д.) геном в природном (эндогенном) локусе, предпочтительно опероне. При этом экспрессия гетерологичного гена регулируется природным (эндогенным) промотором.
В настоящем документе термин «антиген» относится, как правило, к веществам, вызывающим иммунный ответ, включая гуморальный иммунный ответ/или клеточный иммунный ответ, и способным связываться с продуктом иммунного ответа, например с антителами. В настоящем документе под антигеном подразумевается также агент, вызывающий иммунную толерантность, например, это может быть аутоантиген (включая ауто- и аллоантигены) или аллерген. Соответственно, в одном из предпочтительных примеров по данному изобретению для того, чтобы антиген вызывал у индивида физиологический ответ, его иммунная система должна быть действующей. В настоящем документе под антигеном понимается также аутоантигены, которые у здорового индивида не вызывают иммунный ответ, но при аутоиммунных заболеваниях, когда в организме отсутствует способность отличать «свои» структуры (вплоть до субмолекулярного уровня) от «чужих», аутоантигены вызывают иммунный ответ, направленный против собственных клеток и тканей. Любое заболевание, приводящее к такому аномальному иммунному ответу, называют аутоиммунным. Соответственно, в настоящем документе термин «антиген» охватывает также белки (физиологически активные), которые в здоровом организме не вызывают иммунного ответа, но индуцируют иммунный ответ у индивидов с генетически обусловленным дефицитом (отсутствием) указанного белка. Кроме того, в настоящем документе термин «антиген» охватывает также аллергены, которые в здоровом организме не вызывают иммунного ответа, но индуцируют иммунный ответ у индивидов с аллергическими заболеваниями.
Антиген - в указанном для настоящего документа значении этого термина - может происходить из любого полипептида, иммунный ответ на который был бы терапевтически полезным для индивида (человека или животного), например антиген может происходить из патогенного агента, например вируса, прокариотического организма (например, бактерий) или эукариотического организма; из нефизиологичного белка (например. белка, происходящего из раковой ткани), из аллергена (например, в случае возникновения иммунной толерантности) и проч. Антиген также может быть продуктом метаболизма белка. Например, антиген может быть полисахаридом, липидом, или иным веществом. Описанные в настоящем документе сильные промоторы могут служить для экспрессии ферментов, необходимых для синтеза или сборки указанных полисахаридов, липидов или иных веществ.
Выражение «генный продукт, имеющий профилактическое и/или лечебное назначение», пептид или белок, относится, как правило, к пептиду, полипептиду или белку, которые, будучи введены человеку или животному, не вызывают иммунного ответа, направленного против самого этого продукта (то есть не являются вакциногенными) и способны давать профилактический и/или лечебный эффект. Таким образом, профилактический и/или лечебный эффект такого пептида, полипептида или белка должен быть непосредственно сопряжен с его собственной природной биологической функцией, в связи с которой и достигается конкретный эффект в организме индивида, то есть профилактический и/или лечебный эффект не обусловлен иммуногенным или иммунопротективным действием антигена в организме индивида. Таким образом, не вакциногенный пептид, полипептид или белок, оказывающий профилактическое и/или лечебное действие, должен в той форме, в которой он экспрессируется, обладать биологической активностью или, по меньшей мере, должен превращаться в биологически активную форму по высвобождении из клетки, в которой он экспрессируется. Предпочтительно, такая биологически активная форма указанного пептида. полипептида или белка характеризуется вторичной, а также предпочтительно третичной конформацией, идентичной или близкой к природной конфигурации.
Предпочтительно генный продукт, имеющий профилактическое и/или лечебное назначение, полипептид или белок, также не является патогенным и токсичным. В одном из предпочтительных воплощений данного изобретения генный продукт, имеющий профилактическое и/или лечебное назначение, полипептид или белок, может иметь животное (включая человека) происхождение, предпочтительно соответствуя тому же таксону, что и индивид (человек или животное), которому он должен быть введен.
Примеры (не ограничивающие объем изобретения) подходящих генных продуктов (полипептидов или белков), имеющих профилактическое и/или лечебное значение, включают вещества, способные действовать местно или системно, например способные вызывать эндокринную активность, влияющую на метаболизм (локальный или в масштабах всего организма) и/или способные регулировать активность клеток, принадлежащих к иммуногемопоэтической системе, и/или способные влиять на жизнеспособность, клеточный рост и дифференцировку различных нормальных или неопластических клеток организма или на иммунную регуляцию или на индукцию острой фазы воспалительной реакции на повреждение или инфекцию, и/или способные усиливать или вызывать устойчивость к инфекции клеток и тканей, опосредованную хемокинами, воздействующими на рецепторы клеток-мишеней, или пролиферацию эпителиальных клеток, или способствовать заживлению ран, и/или способные модулировать экспрессию или продукцию веществ в клетках организма. Конкретные примеры таких пептидов, полипептидов или белков включают (не ограничиваясь перечисленным здесь) инсулин, гормон роста, пролактин, кальцитонин, лютеинизирующий гормон, гормоны паращитовидной железы, соматостатин, тиреотропный гормон, вазоактивный кишечный полипептид, цитокины (например, интерлейкины IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, любой из интерлейкинов с IL-14 по IL-32, в частности IL-27, факторы GM-CSF, M-CSF, SCF, IFNs, EPO, G-CSF, LIF, OSM, CNTF, GH, PRL, цитокины семейства фактора некроза опухолей, например TNFα, TNFα, лиганды CD40, CD27 или FAS, цитокины семейства интерлейкина-1, цитокины семейства фактора роста фибробластов, факторы роста, происходящие из тромбоцитов, трансформирующие факторы роста и факторы роста нервов, цитокины семейства фактора роста эпидермиса, цитокины, родственные инсулину и проч. Или же полипептид с активностью, имеющей профилактическое и/или лечебное значение, может быть рецептором или антагонистом указанных выше активных полипептидов, имеющих профилактическое и/или лечебное значение. Или же полипептид с активностью, имеющей профилактическое и/или лечебное значение, может быть антителом, например, нейтрализующим антителом, или подобным им агентом. Другие примеры таких подходящих полипептидов перечислены, например в публикации WO 96/11277, стр. 14, строки 1-30, включенная в настоящий документ путем отсылки; в публикации WO 97/14806, стр. 12, строка 1 - стр. 13, строка 27, включенная в настоящий документ путем отсылки; или в патенте США № 5,559,007, колонка 8, строка 31 - колонка 9, строка 9, включенная в настоящий документ путем отсылки. Например, указанным не вакциногенным пептидом, полипептидом или белком с активностью, имеющей профилактическое и/или лечебное значение, может быть интерлейкин-10 (IL-10), более предпочтительно hIL-10, глюкагон-подобный пептид-1 (GLP-1), более предпочтительно hGLP-1, глюкагон-подобный пептид -2 (GLP-2), более предпочтительно hGLP-2, факторы группы трилистника (TFF, например TFF1, 2 и/или 3), или PYY, более предпочтительно hPYY.
2
Как указывалось выше, в воплощениях данного изобретения полипептид, обладающий профилактической и/или лечебной активностью, может быть антителом, например нейтрализующим антителом, или подобным ему веществом. Описанные в настоящем документе такие антитела могут быть полноразмерными молекулами или их функциональными фрагментами (например, Fab), гибридным (слитым) белком или белком-мультимером. В одном из предпочтительных воплощений данного изобретения один или более гетерологичных генов кодируют антитело или функциональный фрагмент молекулы антитела. В настоящем документе термин «функциональный» относится к фрагменту молекулы антитела, сохраняющей его функцию, то есть способность связываться с определенным антигеном. В настоящем документе термин «антитело» включает (но не ограничивается перечисленным здесь) обычные антитела, гибридные антитела, доменные антитела (dAb), би-, три- и полиспецифичные антитела, би-, три- и поливалентные антитела, однодоменные антитела (VHH), наноантитела, фрагменты Fab, Fab', F(ab') scFv, Fv, dAb, Fd, диантитела, триантитела, одноцепочечные антитела, однодоменные антитела, одиночные вариабельные домены антитела.
2
L
H
L
H
В контексте данного изобретения термин «антитело» употребляется применительно к иммуноглобулинам - природным либо частично или полностью сконструированным. Поскольку антитела можно различным образом модифицировать, термин «антитело» следует считать охватывающим любую специфически связывающуюся молекулу или вещество, содержащее связывающий домен с определенной специфичностью связывания партнера (другой молекулы, являющейся мишенью первой). Таким образом, этот термин охватывает фрагменты, производные функциональные эквиваленты и гомологи антител, а также одноцепочечные антитела, бифункциональные антитела, бивалентные антитела, однодоменные антитела, VHH, наноантитела, фрагменты Fab, Fab', F(ab'), scFv, Fv, dAb, Fd, диантитела, триантитела и верблюжьи антитела, включая любые полипептиды, содержащие природный либо полностью или частично сконструированный иммуноглобулиновый связывающий домен. Сюда включаются также гибридные молекулы, содержащие иммуноглобулиновый связывающий домен или его эквивалент, соединенный («слитый») с другим полипептидом. Термин «антитело» также охватывает любой полипептид или белок, имеющий связывающий домен, который является антительным связывающим доменом или его гомологом, например, имитаторы антител. Примерами антител являются изотипы антител и их изотипические подклассы, включая IgG (IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgG4), IgA, IgD, IgM и IgE. Для специалистов в данной области техники важно, что данное изобретение относится к фрагментам антител, включающим антигенсвязывающий домен, например, VHH, наноантитела Fab, scFv, Fv, dAb, Fd, диантитела и триантитела. В одном из своих воплощений данное изобретение относится к грамположительным бактериям или описанным в настоящем документе рекомбинантным нуклеиновым кислотам, в которых один экзогенный ген кодирует легкую цепь (V) антитела или ее функциональный фрагмент, а другой экзогенный ген кодирует тяжелую цепь (V) антитела или ее функциональный фрагмент, более предпочтительно - в которых функциональным фрагментом является Fab. В одном из воплощений данного изобретения экзогенный ген, кодирующий V или ее функциональный фрагмент, при транскрипции сопряжен с 3'-концом экзогенного гена, кодирующего V или ее функциональный фрагмент.
В одном из воплощений данного изобретения описанные в настоящем документе нейтрализующие антитела по меньшей мере частично или полностью подавляют (нейтрализуют) биологическую активность молекул-мишеней, например, цитокина или хемокина, или токсина. В настоящем документе термины «нейтрализация», «нейтрализовать» означают, что подавляется или уменьшается биологическая активность цитокина или токсина, определенная in vivo или же in vitro методами, известными в данной области техник, как, например, те, которые подробно описаны в разделе «Примеры». В частности, подавление или уменьшение биологической активности можно определять c помощью экспериментально вызванного колита у лабораторных животных или путем измерения содержания молекул-мишеней в образцах крови или иной ткани. В настоящем документе термины «нейтрализация», «нейтрализовать» означают, что биологическая активность цитокина или токсина, измеренная in vivo или же in vitro, подавляется или уменьшается по меньшей мере на 10% или более, предпочтительно по меньшей мере на 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% и еще более предпочтительно на 100%.
Предпочтительно указанные антитела или их функциональные фрагменты подавляют биологический эффект цитокинов, выбираемых из следующего перечня: интерлейкины IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-12 (или его субъединицы IL-12p35 и IL12p40), IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-21, IL-23 (или его субъединица IL-23p19), IL-27, IL-32 (и продукты его вариантов сплайсинга), IFN (α, β, γ) и TNFα. Или же эти цитокины могут ингибироваться путем связывания молекул, не являющихся антителами. Предпочтительно, указанные связывающие молекулы являются растворимыми рецепторами цитокинов, например, gp130, или связываются с рецепторами указанных цитокинов, например, IL-2R (CD25, CD122, CD132), IL-12R (β1, β2), IL15R, IL-17R, IL-23R или IL-6R, не вызывая сигнал к воспалительной реакции. Предпочтительно, указанные связывающие молекулы являются нейтрализующими хемокинами, выбираемыми из следующего перечня: MIF, MIP-1α, MCP-1, RANTES и эотаксин. Предпочтительно указанные связывающие молекулы снимают блокировку иммунной активации путем связывания с молекулами костимуляции из следующего перечня: CD3/CD28, HVEM, B7.1/B7.2, CD40/CD40L(CD154), ICOS/ICOSL, OX40/X40L, CD27/CD27L(CD70), CD30/CD30L(CD153) и 41BB/41BBL. Предпочтительно указанные связывающие молекулы снимают блокировку воспалительной реакции путем связывания с молекулами адгезии из следующего перечня: I-CAM1, интегрин α4 и интегрин α4β7. Предпочтительно указанные связывающие молекулы обладают эффектом костимуляции с CD3, CTLA4 и/или PD1 и могут играть роль их агонистов. Предпочтительно указанные связывающие молекулы нейтрализуют активность Т-клеток или В-клеток путем целенаправленного связывания таких мишеней, как CD25, CD20, CD52, CD95, BAFF, APRIL и/или IgE. Предпочтительно указанные связывающие молекулы снимают блокировку воспалительной реакции путем связывания с ферментами из семейства матриксных металлопротеиназ (MMP). Предпочтительно указанные связывающие молекулы обладают антиангиогенным эффектом, например нейтрализуя активность αvβ3/α5β1 и IL-8. В другом предпочтительном воплощении данного изобретения указанные связывающие молекулы или антитела (или их функциональные фрагменты) способны нейтрализовать биологический эффект TNFα, IL-12, IFNγ, IL-23 или IL-17.
Примеры (не ограничивающие объем данного изобретения) описанных в настоящем документе антител или связывающих молекул, которые можно использовать как продукты гетерологичных генов у грамположительных бактерий, предпочтительно молочнокислых бактерий или бифидобактерий, включают:
- антитела против α-фактора некроза опухолей (TNFα), фрагменты антител против TNFα, однодоменные (вариабельный домен) антитела против TNFα, растворимый рецептор TNF или доминантно-негативный вариант TNFα;
- антитела против интерлейкина-12 (IL-12), фрагменты антител против IL-12, однодоменные (вариабельный домен) антитела против IL-12, растворимый рецептор IL-12, доминантно-негативный вариант IL-12 или IL-12 dAb;
- антитела против интерлейкина-12p35 (IL-12p35), фрагменты антител против IL-12p35, однодоменные (вариабельный домен) антитела против IL-12p35, растворимый рецептор IL-12p35, доминантно-негативный вариант IL-12p35 или IL-12p35 dAb;
- антитела против интерлейкина-12p40 (IL-12p40), фрагменты антител против IL-12p40, однодоменные (вариабельный домен) антитела против IL-12p40, растворимый рецептор доминантно-негативный вариант IL-12p40 or IL-12p40 dAb;
- антитела против интерлейкина-23 (IL-23), фрагменты антител против IL-23, однодоменные (вариабельный домен) антитела против IL-23, растворимый рецептор IL-23, доминантно-негативный вариант IL-23 или IL-23 dAb;
- антитела против интерлейкина-23p19 (IL-23p19), фрагменты антител против IL-23p19, однодоменные (вариабельный домен) антитела против IL-23p19, растворимый рецептор IL-23p19, доминантно-негативный вариант IL-23p19 или IL-23p19 dAb;
- антитела против γ-интерферона (IFNγ), фрагменты антител против IFNγ, однодоменные (вариабельный домен) антитела против IFNγ, растворимый рецептор IFNγ, доминантно-негативный вариант IFNγ;
- антитела против интерлейкина-17 (IL-17), фрагменты антител против IL-17 однодоменные (вариабельный домен) антитела против IL-17, растворимый рецептор IL-17, доминантно-негативный вариант IL-17 или IL-17 dAb; и
- антитела против моноцитарного хемотаксического фактора-1 (MCP-1), фрагменты антител против MCP-1 однодоменные (вариабельный домен) антитела против МСР-1, растворимый рецептор MCP-1, доминантно-негативный вариант MCP-1 или MCP-1 dAb.
В одном из предпочтительных воплощений данного изобретения указанными антителами является антигенсвязывающий фрагмент Fab. Fab-фрагменты хорошо известны в данной области техники. Для сведения напомним, что Fab-фрагмент - это область молекулы антитела, которая связывается с антигеном. Она состоит из одного константного домена и одного вариабельного каждой из легких и тяжелых цепей.
В одном из воплощений данного изобретения Fab-фрагмент представляет собой cA2 Fab антитела против фактора некроза опухолей (TNF) (для которого нуклеотидная последовательность и соответствующая аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой и легкой цепей описаны в патенте США 6,790,444, обозначенные как SEQ ID NO: 4 и 5 (тяжелая цепь) и SEQ ID NO: 2 и 3 (легкая цепь), соответственно) или CDP870 Fab антитела против TNF (для которого нуклеотидная последовательность и соответствующая аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой и легкой цепей описаны в публикации WO 01/94585, обозначенные как SEQ ID NO: 114 и 115 (тяжелая цепь) и SEQ ID NO: 112 и 13 (легкая цепь), соответственно).
Для специалиста в данной области техники важно, что эти антитела, будучи функциональными фрагментами антител, в частности Fab-фрагментами, состоят из различных индивидуальных полипептидов, которые могут быть ковалентно связаны дисульфидными мостиками. В частности, тяжелые цепи и легкие цепи кодируются отдельными индивидуальными кодирующими последовательностями.
Соответственно, в одном из воплощений данного изобретения описанные в настоящем документе гетерологичные гены кодируют антигены и/или нейтрализующие антитела или их функциональные фрагменты или варианты и/или пептиды с активностью, имеющей профилактическое и/или лечебное значение, полипептиды или белки, причем указанные антигены способны вызывать иммунный ответ, предпочтительно протективный иммунный ответ или иммунную толерантность, у человека или животного, и/или указанные генные продукты, имеющие профилактическое или лечебное значение, полипептиды или белки способны вызывать профилактический и/или лечебный эффект у человека или животного.
В одном из своих воплощений данное изобретение относится к описанным в настоящем документе грамположительным бактериям, предпочтительно молочнокислым бактериям или бифидобактериям, или к применению описанных в настоящем документе грамположительных бактерий, предпочтительно молочнокислых бактерий или бифидобактерий, в виде препаратов, пригодных для хранения. В частности, в одном из своих воплощений данное изобретение относится к описанным в настоящем документе грамположительным бактериям, предпочтительно молочнокислым бактериям или бифидобактериям, которые заморожены, высушены или лиофилизированы, подвергнуты сушке распылением или хранятся в среде.
Как пояснялось ранее, данное изобретение также относится к композициям, содержащим описанные в настоящем документе грамположительные бактерии, предпочтительно молочнокислые бактерии или бифидобактерии, или содержащим грамположительные бактерии, предпочтительно молочнокислые бактерии или бифидобактерии, для описанного здесь применения. Такая композиция может быть фармацевтической композицией. В другом своем воплощении данное изобретение относится к композициям или фармацевтическим композициям для применения при лечении или для применения в качестве лекарственного средства, нутрицевтика, лечебного пищевого продукта, функционального пищевого продукта, пробиотической композиции, пищевой добавки или стартовой культуры. В еще одном своем воплощении данное изобретении относится к применению таких композиций или фармацевтических композиций в качестве лекарственного средства, нутрицевтика, лечебного пищевого продукта, функционального пищевого продукта, пробиотика, пищевой добавки, стартовой культуры или для получения лекарственного средства, нутрицевтика, лечебного пищевого продукта, функционального пищевого продукта, пробиотика, пищевой добавки, стартовой культуры.
При применении по данному изобретению описанные в настоящем документе медицинские композиции, например, фармацевтические препараты, нутрицевтики, лечебные или функциональные пищевые продукты или пробиотики, предпочтительно содержат терапевтически эффективное количество грамположительных бактерий, предпочтительно молочнокислых бактерий или бифидобактерий, по данному изобретению и фармацевтически приемлемый носитель, то есть одно или более веществ-носителей и/или дополнительных компонентов, например забуферивающих агентов, носителей, эксципиентов, стабилизирующих агентов и проч. Выражение «фармацевтически приемлемый» употребляется в настоящем документе в общепринятом в данной области техники смысле и означает, что компонент совместим с остальными ингредиентами фармацевтической композиции и не вреден для того, кто его принимает.
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
В одном из воплощений данного изобретения предлагаемая фармацевтическая композиция содержит терапевтически эффективное количество описанных в настоящем документе грамположительных бактерий, предпочтительно молочнокислых бактерий или бифидобактерий. Термин «терапевтически эффективное количество» относится к такому количеству обладающего лечебным действием вещества или композиции, которое эффективно для лечения данного заболевания или расстройства у индивида, например, человека или животного, то есть для достижения желаемого местного или системного эффекта и эффективности. Для примера терапевтически эффективное количество бактерий может составлять по меньшей мере одну бактерию, или по меньшей мере 10 бактерий, или по меньшей мере 10 бактерий, или по меньшей мере 10 бактерий, или по меньшей мере 10 бактерий, или по меньшей мере 10 бактерий, или по меньшей мере 10 бактерий, или по меньшей мере 10 бактерий, или по меньшей мере 10 бактерий, или по меньшей мере 10 бактерий, или по меньшей мере 10 бактерий, или по меньшей мере 10 бактерий, или по меньшей мере 10 бактерий, или по меньшей мере 10 бактерий, или по меньшей мере 10 бактерий, или по меньшей мере 10 бактерий или более клеток-хозяев, например бактерий, например в одно- или многократной дозе. Грамположительные бактерии, предпочтительно молочнокислые бактерии или бифидобактерии, по данному изобретению можно вводить индивиду сами по себе или в сочетании с одним или более активных веществ. Последнее может быть введено до либо после введения грамположительных бактерий, предпочтительно молочнокислых бактерий или бифидобактерий, по данному изобретению или одновременно с ними.
Предпочтительно, описанные в настоящем документе грамположительные бактерии, предпочтительно молочнокислые бактерии или бифидобактерии, или композиция, содержащая эти грамположительные бактерии, предпочтительно молочнокислые бактерии или бифидобактерии, предлагается в виде единичной лекарственной формы, например, таблеток, капсул, клизм или дозированных аэрозолей; таким образом пациент, например, человек или животное, получает единичную дозу.
Активные ингредиенты по данному изобретению можно вводить пациенту, например, человеку или животному, от 1 до 6 раз в сутки - столько, сколько нужно для желаемой активности. Суточную дозу можно вводить за один раз (однократно раз в день) или разделять ее на две или более меньших дозы, вводимые в одно и то же время или в разное время суток, так чтобы в сумме получалась определенная суточная доза. Предпочтительно активный ингредиент вводят один или два раза в сутки, например, одну дозу можно принимать утром, а другую - позже в течение дня.
Во всех вариантах данного изобретения суточную поддерживающую дозу дают пациенту в течение периода времени, желательного для данного индивида по клиническим показаниям, например от 1 дня до нескольких лет (например, на протяжении всей оставшееся жизни млекопитающего); например, от около 2 или 3, или 5 дней, 1или 2 недель, или 1 месяца или долее и/или, например, до около 5 лет, 1 года, 6 месяцев, 1 месяца, 1 недели, трех или пяти дней. В типичном случае суточную поддерживающую дозу вводят в течение около 3-5 дней или от около 1 недели до около 1 года. Другие компоненты жидких препаратов могут включать консерванты, неорганические соли, кислоты, основания, буферные растворы, питательные вещества, витамины или иные фармацевтические ингредиенты.
В настоящем документе под пациентом - человеком или животным - понимается индивид (человек или животное), нуждающийся в терапии или лечении, включающем введение указанному индивиду (человеку или животному) терапевтически эффективного количества грамположительных бактерий, предпочтительно молочнокислых бактерий или бифидобактерий, как предлагается по данному изобретению. Указанное животное является предпочтительно теплокровным, более предпочтительно позвоночным, еще более предпочтительно - млекопитающим, например домашним животным, сельскохозяйственным животным, животным, содержащимся в зоопарке или используемым в спортивных занятиях, домашним питомцем и лабораторным животным, включая, например собак, кошек, морских свинок, кроликов, крыс. мышей, лошадей, коров и другой крупный рогатый скот, приматов(например, человекообразных и низших обезьян, орангутанов и шимпанзе; представителей семейства собачьих, например собак и волков; представителей семейства кошачьих, например, кошек, львов и тигров; представителей семейства лошадиных, например лошадей, ослов и зебр; мясомолочный скот, например коров, свиней и овец; другие копытные, например олени и жирафы; грызуны, наприер мыши, крысы, хомяки и морские свинки; и проч. Как правило, термины «пациент» или «индивид» можно употреблять как синонимы, в частности, применительно к животным, предпочтительно теплокровным, более предпочтительно - позвоночным, еще более предпочтительно млекопитающим, еще более предпочтительно приматам, конкретно - к человеку и другим животным, млекопитающим и приматам. Предпочтительными пациентами являются люди.
Примеры (не ограничивающие объем изобретения) заболеваний человека или животных, которые подлежат лечению введением описанных в настоящем документе грамположительных бактерий, предпочтительно молочнокислых бактерий или бифидобактерий, у которых при необходимости экспрессируются пептиды, полипептиды или белки, имеющие профилактическое и/или лечебное значение, включают (не ограничиваясь перечисленным здесь), например, воспалительные заболевания кишечника, в том числе болезнь Крона и язвенный колит (лечатся, например, с помощью интерлейкинов - IL-lra или IL-10 или IL-27 или пептидов Trefoil); аутоиммунные заболевания, в том числе (но не ограничиваясь перечисленным здесь) диабет типа 1, псориаз, ревматоидный артрит, красную волчанку (лечатся с помощью, например, интерлейкинов IL-lra или IL-10, или IL-27 или соответствующих аутоантигенов); аллергические заболевания, в том числе (но не ограничиваясь перечисленным здесь) астму, пищевую аллергию (лечатся с помощью соответствующих аллергенов); целиакию (лечится с помощью глютеновых аллергенов и/или интерлейкина-27); неврологические расстройства, в том числе (но не ограничиваясь перечисленным здесь) болезнь Альцгеймера, паркинсонизм и боковой амиотрофический склероз (лечатся с помощью нейротрофического фактора мозга и цилиарного нейротрофического фактора; рак (лечится при помощи, например, интерлейкина-1, колониестимулирующих факторов или интерферона-W); остеопороз (лечится, например, с помощью трансформирующего фактора роста f3); диабет (лечится, например, инсулином); сердечнососудистые заболевания (лечатся, например, с помощью тканевого активатора плазминогена); атеросклероз (лечится, например, с помощью цитокинов и антагонистов цитокинов); гемофилию (лечится, например, с помощью фактороы свертывания крови); дегенеративные поражения печени (лечатся, например, с помощью фактора роста гепатоцитов или α-интерферона); заболевания легких, например муковисцидоз (лечится, например, с помощью α-антитрипсина); ожирение; инфекционные заболевания, вызываемые такими патогенными агентами, как, например, вирусы или бактерии (лечатся с помощью каких-либо из упомянутых выше композиций или антигенов); и др.
Грамположительные бактерии, предпочтительно молочнокислые бактерии или бифидобактерии, по данному изобретению можно также использовать для лечения инфекционных заболеваний. В одном из воплощений данного изобретения для лечения заболевания, связанного с клостридиями, предпочтительно заболевания, связанного с Clostridium dificile (CDAD), предлагается пассивная иммунизация антителами, нейтрализующими токсин, локально продуцируемыми и секретируемыми грамположительными бактериями, предпочтительно молочнокислыми бактериями или бифидобактериями, по данному изобретению. Заболевания, связанные с Clostridium dificile, обусловлены действием двух экзотоксинов, продуцируемых этими бактериями: токсин А (энтеротоксин; см., например, в Genbank нуклеотидную последовательность NC_009089.1, REGION 795843..803975 или аминокислотную последовательность YP_001087137.1) и токсин В (цитотоксин; см., например, в Genbank нуклеотидную последовательность NC_009089.1, REGION: 787393..794493 или аминокислотную последовательность YP_001087135.1).Оба токсина представляют собой белки с высокой молекулярной массой, которые связываются с поверхностью эпителиальных клеток кишечника, где происходит их интернализация и они катализируют гликозилирование цитоплазматических белков Rho, что ведет к гибели клеток, воспалению и поносу. Эти токсины также способствуют вирулентности C. difficile и распространению этих бактерий в кишечнике, хемотаксису и активации нейтрофилов. Сами по себе клостридии не проникают в ткань и не вызывают ее повреждения. Нейтрализация токсинов C. difficile антителами блокирует механизм действия этих патогенных микроорганизмов, уменьшается их способность к успешной жизнедеятельности в кишечнике и сводится к минимуму их влияние на кишечную микрофлору, что позволяет той нормализоваться. Преимуществами такого подхода к лечению инфекции C. difficile являются быстрое выздоровление, меньшее рецидивирование и снижение давления отбора на устойчивость к антибиотикам нормальной кишечной микрофлоры. Соответственно, в одном из предпочтительных воплощений данного изобретения описанные в настоящем документе в грамположительных бактериях, предпочтительно молочнокислых бактериях или бифидобактериях, также содержатся, экспрессируются, продуцируются и/или секретируются нейтрализующие антитела, направленные против Clostridium, предпочтительно Clostridium dificile, токсина А и/или токсина В, причем каждый их этих токсинов предпочтительно имеет указанную выше последовательность. Специалисту в данной области техники ясно, что помимо полноразмерных антител можно использовать описанные в настоящем документе различные функциональные фрагменты или варианты антител и модифицированные антитела.
Для специалистов в данной области техники также важно, что перечисленные в настоящем документе заболевания служат только для примера и их упоминание ни в коей мере не означает ограничения использования грамположительных бактерий, предпочтительно молочнокислых бактерий или бифидобактерий, как здесь предлагается, для лечения этих конкретных заболеваний. Специалистам в данной области техники ясно, что описанные в настоящем документе грамположительные бактерии. предпочтительно молочнокислые бактерии или бифидобактерии, можно использовать для экспрессии в принципе любых желаемых экспрессионных продуктов, предпочтительно полипептидов, которые могут иметь лечебное значение в отношении не только упомянутых в настоящем документе заболеваний, но и различных других заболеваний или состояний человека и животных. Следовательно, коль скоро в отношении данного расстройства выбран или определен подходящий экспрессионный продукт, предпочтительно полипептид, например, антиген и/или генный продукт, полипептид или белок, имеющий профилактическое и/или лечебное значение, специалист в данной области техники сможет с помощью описанных в настоящем документе реагентов добиться его экспрессии, выделить и доставить в организм пациента.
Грамположительные бактерии, предпочтительно молочнокислые бактерии или бифидобактерии, по данному изобретению могут быть суспендированы в фармацевтическом препарате для введения человеку или животному, страдающему от заболевания, подлежащего предлагаемому лечению. такие фармацевтические препараты включают (не ограничиваясь перечисленным здесь) живые клетки-хозяева и среду, пригодную для введения человеку или животному. Рекомбинантные клетки-хозяева могут быть лиофилизированными в присутствие обычных эксципиентов, например, лактозы, других сахаров, стеаратов, карбонатов и/или сульфатов щелочных и/или щелочноземельных металлов (например, стеарата магния, карбоната натрия и сульфата натрия), каолина, диоксида кремния, отдушек и ароматизаторов.
Лиофилизированные таким образом грамположительные бактерии, предпочтительно молочнокислые бактерии или бифидобактерии, по данному изобретению могут быть получены в форме капсул, таблеток, гранул и порошков, которые можно принимать перорально.
Или же грамположительные бактерии, предпочтительно молочнокислые бактерии или бифидобактерии, по данному изобретению могут быть получены в форме водной суспензии в подходящей среде или лиофилизированные бактерии можно суспендировать в подходящей среде непосредственно перед применением, причем указанная среда включает упомянутые в настоящем документе эксципиенты и другие эксципиенты, например, глюкозу, глицин и сахаринат натрия.
Для перорального применения могут быть составлены лекарственные формы. устойчивые к среде внутри желудка; такие лекарственные формы могут также включать соединения, обеспечивающие контролируемое высвобождение грамположительных бактерий, предпочтительно молочнокислых бактерий или бифидобактерий, и тем самым - контролируемое высвобождение продуцируемого ими желаемого белка. Например, эти лекарственные формы для перорального применения (включая таблетки, пастилки, гранулы, порошки) могут иметь покрытие из тонкого слоя эксципиента (обычно доля этого используются полимеры, производные целлюлозы и/или липофильные вещества), который устойчив к растворению или разрушению во внутрижелудочной среде, так что препарат может без ущерба для себя миновать желудок, но в кишечнике такое покрытие исчезает (разрушается, растворяется, поглощается), обеспечивая выход активного ингредиента.
Лекарственная форма может быть составлена и изготовлена таким образом, чтобы обеспечить медленное высвобождение грамположительных бактерий, предпочтительно молочнокислых бактерий или бифидобактерий, (и при необходимости продуцируемого ими генного продукта, имеющего профилактическое и/или лечебное значение), например, в виде таблеток или капсул с контролируемым высвобождением, постепенным высвобождением, замедленным высвобождением, постоянным действием. Эти лекарственные формы, как правило, содержат обычно применяемые и хорошо известные в данной области техники эксципиенты, например, липофильные, полимерные, целлюлозные, нерастворимые, набухающие эксципиенты. Препараты с контролируемым высвобождением можно использовать для доставки в организм в других локализациях, включая кишечник, толстую кишку, бронхи и биологическую адгезию или подъязычное применение (то есть через слизистую полости рта). В тех случаях, когда композиции по данному изобретению должны вводиться ректально или вагинально, фармацевтические препараты включают суппозитории и кремы. При этом клетки-хозяева суспендированы в смеси обычных эксципиентов, включающей также липиды. Все упомянутые выше препараты хорошо известны в данной области техники о описаны, например, в следующих работах: Hansel et al. (1990, Pharmaceutical dosage forms and drug delivery systems, 5th edition, William and Wilkins); Chien 1992, Novel drug delivery system, 2nd edition, M. Dekker); Prescott et al. (1989, Novel drug delivery, J. Wiley & Sons); Cazzaniga et al., (1994, Oral delayed release system for colonic specific delivery, Int. J. Pharm.i08:7').
Для ректального применения предпочтительны клизмы. Здесь термин «клизма» употребляется для обозначения жидких препаратов, предназначенных для введения в прямую кишку. Такой препарат обычно предлагается в виде емкостей, содержащих одну дозу, и включает одно или более активных веществ, растворенных или диспергированных в воде, глицерине или полиэтиленгликоле (макроголе) или иных подходящих растворителях.
В одном из предпочтительных воплощений данного изобретения предлагаются капсулы с желудочно-резистентной (кишечно-растворимой) оболочкой, содержащие стабилизированные лиофилизированные, высушенные или подвергнутые сушке распылением жизнеспособные грамположительные бактерии, предпочтительно молочнокислые бактерии или бифидобактерии, описанные в настоящем документе, отличающиеся тем, что эти жизнеспособные грамположительные бактерии, предпочтительно молочнокислые бактерии или бифидобактерии, стабилизированы с использованием не гидроскопичного агента. В настоящем документе термин «не гидроскопичный агент» включает любой обычно используемый при составлении фармацевтических композиций эксципиент, у которого при относительной влажности окружающей среды RH 40% равновесная влажность возрастает не более чем на около 8% (масса/масса), предпочтительно не более чем на около 7%, (масса/масса), более предпочтительно не более чем на около 6%, например, на около 1-5% (масса/масса), более предпочтительно 2% (масса/масса) или менее. Негидроскопичный агент может быть многоатомным спиртом, например, маннитом, мальтитом, изомальтитом (многоатомный сахар) или солью фосфорной кислоты, например, безводным двухосновным фосфатом кальция, гидрофосафтом кальция или, например, сахаром, скажем сахарозой.
Капсулы, используемые для упомянутых выше препаратов, обычно выбирают из группы, состоящей из желатиновых, крахмальных, гидроксипропилметилцеллюлозных (HPMC) капсул и т.п.; в частности, используются капсулы из HPMC. Для доставки живых бактерий в кишечник кишечнорастворимые (желудочно-устойчивые) капсулы по данному изобретению должны быть стабильны при низких рН (до 5,5) и ускоренно растворяться при более высоких рН (выше 5,5). Оптимальное высвобождение активного ингредиента достигается, когда капсулы разрушаются при рН около 6,8 в пределах 1 часа. Так, в другом воплощении данного изобретения капсулы покрыты кишечнорастворимым полимером, что обеспечивает стабильность капсул при рН ниже 5,5 и растворение при рН выше 5,5; в частности, при рН выше 6,0; в особенности быстрое растворение при рН около 6,8.
Кишечнорастворимый полимер, используемый для покрытия капсул обычно состоит из пленкообразующего полимерного вещества, которое растворимо при рН выше 5,5, в частности при рН выше 6,0. Пленкообразующие полимеры, пригодные для использования по данному изобретению, обычно выбирают из группы, состоящей из производных целлюлозы, сополимеров акриловой кислоты, сополимеров малеиновой кислоты (малеинового ангидрида), производных поливинила, шеллака и проч.; в частности сополимеров акриловой кислоты, выбираемых из группы, состоящей из сополимера акриловой кислоты и стирола, сополимера акриловой кислоты и метилакрилата, сополимера метакриловой кислоты и метилакрилата, сополимера акриловой кислоты, стирола и бутилакрилата, сополимера метакриловой кислоты и метилметакрилата, например эудрагита (Eudragit L100, Eudragit S или Eudragit S100; приведены торговые названия имеющихся в продаже продуктов фирмы Röhm Pharma, Германия), сополимера метакриловой кислоты и этилакрилата, например Eudragit L100-55 (приведено торговое название имеющегося в продаже продукта фирмы Röhm Pharma, Германия), сополимер метилкарилата. метакриловой кислоты и октилакрилата и т. п.; в особенности пленкообразующий полимер по данному изобретению состоит из сополимера метакриловой кислоты и метилметакрилата.
Перед высушиванием, сушкой распылением или лиофилизацией в бактериальную биомассу добавляют комбинацию различных стабилизирующих веществ. Эта комбинация стабилизирующих веществ, содержащая гидролизат крахмала, соль глутаминовой кислоты и\или многоатомный спирт повышает выживаемость и стабильность высушенных, подвергнутых сушке распылением или лиофилизированных грамположительных бактерий, предпочтительно молочнокислых бактерий или бифидобактерий.
Препараты и капсулы, описанные в настоящем документе, можно использовать в качестве лекарственного средства, нутрицевтика, пищевой добавки, функционального пищевого продукта, лечебного пищевого продукта, стартовой культуры и/или пробиотической композиции.
Таким образом, в одном из предпочтительных воплощений данного изобретения описанные в настоящем документе грамположительные бактерии, предпочтительно молочнокислые бактерий или бифидобактерии, или фармацевтические композиции, содержащие эти грамположительные бактерии, предпочтительно молочнокислые бактерий или бифидобактерии, можно вводить в организм человека или животного через слизистую оболочку, например ротовой полости, носовой полости, прямой кишки, влагалища или бронхов, используя любой из реализуемых на современном уровне данной области техники конкретных путей. Дозировка грамположительных бактерий, предпочтительно молочнокислых бактерий или бифидобактерий, при введении в организм человека или животного может варьировать в зависимости от ряда факторов, включая тип бактерий и нужного гена, который они несут, типа и степени тяжести подлежащего лечению заболевания и пути введения. Таким образом нельзя указать точную дозировку для каждого из воплощений данного изобретения, но для специалиста в данной области техники не составит труда определить ее, базируясь на настоящем изобретении. Дозировка может быть определена в каждом отдельном случае путем измерения концентрации в сыворотке крови белка, имеющего профилактическое и/или лечебное значение, после введения заранее известного количества клеток, используя хорошо известные в данной области техники методы, например, твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) или систему Biacore (см. раздел «Примеры»). Анализ кинетических параметров и времени жизни введенного рекомбинантного белка даст достаточную информацию, позволяющую определить диапазон эффективных дозировок грамположительных бактерий, предпочтительно молочнокислых бактерий или бифидобактерий по данному изобретению.
В одном из воплощений данного изобретения в связи с экспрессией антигена в грамположительных бактериях, предпочтительно молочнокислых бактериях или бифидобактериях, предлагается также вакцина. Предпочтительно этот антиген способен вызывать иммунный ответ и может использоваться в качестве вакцины у человека и животных. Термин «вакцина» в настоящем документе обозначает фармацевтически приемлемую композицию, которая, будучи введена в эффективном количестве пациенту (человеку или животному) способна индуцировать образование антител против содержащегося в ней иммуногена и/или вызывает защитный иммунитет у данного индивида. Вакцина по данному изобретению содержит описанные в настоящем документе грамположительные бактерии, предпочтительно молочнокислые бактерии или бифидобактерии, при необходимости трансформированные нуклеиновой кислотой или векторами, содержащими последовательность, кодирующую данный антиген, и при необходимости другие эксципиенты. Такие вакцины могут содержать также адъювант, то есть вещество или композицию, усиливающую иммунный ответ на антиген. Адъюванты включают (не ограничиваясь перечисленным здесь) полный адъювант Фрейнда, сапонин, неорганические гели (например, гидроксида алюминия), поверхностно-активные вещества (например, лизолецитин), многоатомные спирты, проксанолы (плюроники), полианионы, пептиды, масла или эмульсии углеводородов и такие потенциально полезные и фармацевтически приемлемые для человека адъюванты, как БЦЖ (бацилла Кальметта-Герена) и Corynebacterium parvum.
В одном из своих аспектов данное изобретение относится к способу лечения или терапии, включающему введение нуждающемуся в том индивиду грамположительных бактерий, предпочтительно молочнокислых бактерий или бифидобактерий, или содержащих их композиций, предпочтительно лечебной и/или профилактической фармацевтической композиции.
Как говорилось выше, композиция по данному изобретению, содержащая грамположительные бактерии, предпочтительно молочнокислые бактерий или бифидобактерии, может быть стартовой культурой, пробиотической композицией или пищевой добавкой. Соответственно, в одном из своих аспектов данное изобретение относится к стартовой культуре, пробиотической композиции или пищевой добавке, содержащей описанные в настоящем документе грамположительные бактерии, предпочтительно молочнокислые бактерий или бифидобактерии.
Стартовая культура может быть в жидком, сухом прессованном, замороженном или высушенном виде, включая лиофилизированные и высушенные распылением или в псевдоожиженном слое, или замороженные, или концентрированные путем лиофилизации формы. Соответственно, в одном из своих воплощений данное изобретение относится к описанной в настоящем документе стартовой культуре - высушенной, прошедшей сушку распылением, замороженной или лиофилизированной. Упаковка культуры может проводиться в вакууме или в атмосфере, например, азота, углекислого газа и др. Например, стартовую культуру можно изготовлять и транспортировать в запаянных емкостях, предпочтительно апирогенно; тара может быть изготовлена из подходящего твердого, неэластичного или гибкого пластика или и иного материала. В таком виде культуру доставляют к месту ферментации и добавляют к органическому материалу, подлежащему ферментации, или при необходимости вначале культивируют в отдельной стартовой среде для получения культуры с высокой плотностью.
Помимо грамположительных бактерий, предпочтительно молочнокислых бактерий или бифидобактерий, по данному изобретению стартовая культура может также содержать забуферивающие агенты и питательные вещества, стимулирующие рост культуры (например, ассимилируемые углеводы или источник азота), или консерванты (например, криопротекторы) или, при желании, другие носители, например, молочный порошок или сахара.
Стартовая культура может быть чистой культурой, то есть содержать биомассу одного изолята грамположительных бактерий, предпочтительно молочнокислых бактерий или бифидобактерий, по данному изобретению, а именно клон, происходящий в принципе от одной клетки. В другом воплощении данного изобретения стартовая культура может быть совместной, то есть содержать более одного штамма грамположительных бактерий, предпочтительно молочнокислых бактерий или бифидобактерий, по данному изобретению, и при необходимости содержать дополнительные микроорганизмы - другие бактерии или дрожжи.
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
Предпочтительно, чтобы стартовая культура или культура с высокой плотностью содержала по меньшей мере 10 колониеобразующих единиц (КОЕ) одной или более грамположительных бактерий, предпочтительно молочнокислых бактерий или бифидобактерий, по данному изобретению, например, по меньшей мере 10 КОЕ/г, по меньшей мере 10 КОЕ/г, например, по меньшей мере 10 КОЕ/г, по меньшей мере 10 КОЕ/г, например, по меньшей мере 10 КОЕ/г, по меньшей мере 10 КОЕ/г, например, по меньшей мере 10 КОЕ/г, по меньшей мере 10 КОЕ/г, например, по меньшей мере 10 КОЕ/г, по меньшей мере 10 КОЕ/г или по меньшей мере 10 КОЕ/г.
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
Как правило, стартовая культура или культура с высокой плотностью добавляется в стартовую среду или в органический материал или субстрат, подлежащий ферментации, в концентрации жизнеспособных клеток одного или более бактериальных штаммов (и при необходимости одного или более штаммов дрожжей), составляющей по меньшей мере 10 (КОЕ) одного или более бактериальных штаммов (и при необходимости одного или более штаммов дрожжей) по данному изобретению, например, по меньшей мере 10КОЕ/г, по меньшей мере 10 КОЕ/г, например, по меньшей мере 10 КОЕ/г, по меньшей мере 10 КОЕ/г, например, по меньшей мере 10 КОЕ/г, по меньшей мере 10 КОЕ/г, например, по меньшей мере 10 КОЕ/г, по меньшей мере 10 КОЕ/г, например, по меньшей мере 10 КОЕ/г, по меньшей мере 10 КОЕ/г или по меньшей мере 10 КОЕ/г органического материала, среды или субстрата.
В одном из своих воплощений данное изобретение относится к описанной выше стартовой культуре для получения пищевого продукта, или к пищевой добавке, или к пробиотической композиции, или к лекарственному средству, содержащим грамположительные бактерии, предпочтительно молочнокислые бактерий или бифидобактерии, у которых отсутствует активность компонента IIC специфичной к целлобиозе фосфотрансферазной системы (PTS). В одном из предпочтительных воплощений данного изобретения ген, кодирующий эндогенный PtcC, частично или полностью делетирован, разрушен или инактивирован, так что образование функционального продукта гена ptcC невозможно, как описывается в настоящем документе. В другом воплощении данного изобретения грамположительные бактерии, предпочтительно молочнокислые бактерий или бифидобактерии, в стартовой культуре или в пищевой добавке, или в пробиотической композиции. или в лекарственном средстве содержат функциональную гетерологичную трегалозо-6-фосфат-фосфатазу (например, otsB) и/или функциональную гетерологичную трегалозо-6-фосфат-синтазу (например, otsA), как описано в настоящем документе.
В другом своем воплощении данное изобретение относится к описанной выше стартовой культуре или к пищевой добавке, или к пробиотической композиции, или к лекарственному средству, в которых в грамположительных бактериях, предпочтительно молочнокислых бактериях или бифидобактериях отсутствует активность трегалозо-6-фосфат-фосфорилазы (TrePP). В одном из предпочтительных воплощений данного изобретения ген, кодирующий эндогенную трегалозо-6-фосфат-фосфорилазу (TrePP), частично или полностью делетирован, разрушен или инактивирован, так что образование функционального продукта гена TrePP невозможно, как описывается в настоящем документе.
В другом своем воплощении данное изобретение относится к описанной выше стартовой культуре или к пищевой добавке, или к пробиотической композиции, или к лекарственному средству, в которых в грамположительных бактериях, предпочтительно молочнокислых бактериях или бифидобактериях сверхэкспрессируется, предпочтительно конститутивно, один или более генов, кодирующих переносчик трегалозы, предпочтительно эндогенный переносчик трегалозы, как описано в настоящем документе.
В еще одном своем воплощении данное изобретение относится к описанной выше стартовой культуре или к пищевой добавке, или к пробиотической композиции, или к лекарственному средству, в которых в грамположительных бактериях, предпочтительно молочнокислых бактериях или бифидобактериях, экспрессируется один или более гетерологичных генных продуктов, предпочтительно одни или более генных продуктов, обладающих профилактическим и/или лечебным эффектом, как описано в настоящем документе.
В одном из воплощений данного изобретения описанная в настоящем документе стартовая культура, пищевая добавка или пробиотическая композиция является высушенной, замороженной или прошедшей сушку распылением, или лиофилизированной.
Как указывалось выше, в одном из своих аспектов данное изобретение относится к применению описанных в настоящем документе грамположительных бактерий, предпочтительно молочнокислых бактерий или бифидобактерий для получения пробиотической композиции, стартовой культуры, предпочтительно для получения пищевой добавки или для применения при получении пищевого продукта или для получения лекарственного средства. В другом своем аспекте данное изобретение относится к применению стартовой культуры или пробиотической композиции в качестве пищевой добавки или для получения пищевого продукта.
В настоящем документе термин «пищевая добавка» относится к грамположительным бактериям, предпочтительно молочнокислым бактериям или бифидобактериям, предпочтительно включенных в состав композиции, которая может добавляться к пище или корму человека или животного, пригодных к потреблению без дальнейшей модификации или же после дальнейшей модификации, например полной или частичной ферментации указанных пищи или корма или частичной или полной ферментации одного или более компонентов этих пищи или корма. К примеру (не ограничивающему объем изобретения) грамположительные бактерии, предпочтительно молочнокислые бактерий или бифидобактерии, по данному изобретению или композиции по данному изобретению, например, описанные в настоящем документе стартовые культуры, можно использовать в молочной промышленности, в частности для получения ферментированных молочных продуктов, известных также под названием кисломолочных продуктов. В результате ферментации увеличивается срок хранения продукта, а также улучшается его вкус и способность перевариваться. Примеры таких пищевых продуктов включают (не ограничиваясь перечисленным здесь) сыр, йогурт, сметану, пахту, ацидофилин и др.
В одном из своих аспектов данное изобретение также относится к способу получения описанных в настоящем документе лекарственного средства, пищевой добавки, пробиотической композиции или стартовой культуры, причем указанная стартовая культура предпочтительно является стартовой культурой для получения пищевого продукта и этот способ включает этапы:
i) размножение описанных в настоящем документе грамположительных бактерий, предпочтительно молочнокислых бактерий или бифидобактерий, в среде, содержащей субстрат, который может подвергаться ферментации указанными грамположительными бактериями, предпочтительно молочнокислыми бактериями или бифидобактериями, и
ii) включение размноженных таким образом грамположительных бактерий, предпочтительно молочнокислых бактерий или бифидобактерий, в состав лекарственного вещества, пищевой добавки, пробиотической композиции или стартовой культуры, соответственно.
Методы размножения грамположительных бактерий, предпочтительно молочнокислых бактерий или бифидобактерий, а также среды и субстраты, способные подвергаться ферментации грамположительными бактериями, предпочтительно молочнокислыми бактериями или бифидобактериями, хорошо известны в данной области техники. В одном из воплощений данного изобретения составление лекарственного средства, пищевой добавки, пробиотической композиции или стартовой культуры включает получение указанных продуктов в виде жидкой культуры, жидкой культуры высокой плотности, замороженной или высушенной формы, включая формы, полученные в результате концентрирования путем высушивания, сушки распылением, сушки в псевдоожиженном слое, замораживания или лиофилизации. Предпочтительно указанное получение включает высушивание, сушку распылением, замораживание или лиофилизацию.
В другом своем аспекте данное изобретение относится также к способу получения пищевого продукта, включающему этап смешивания описанных в настоящем документе грамположительных бактерий, предпочтительно молочнокислых бактерий или бифидобактерий, пищевой добавки, пробиотической композиции или стартовой культуры с субстратом, способным подвергаться ферментации указанными грамположительными бактериями, предпочтительно молочнокислыми бактериями или бифидобактериями. Вещество субстрат, как правило, представляет собой источник углерода, предпочтительно углевод или сахар. Углеводы, способные подвергаться ферментации грамположительными бактериями, предпочтительно молочнокислыми бактериями или бифидобактериями, включают (не ограничиваясь перечисленным здесь) моносахариды или дисахариды, например, глюкозу, фруктозу, галактозу, сахарозу, лактозу, мальтозу, трегалозу, целлобиозу и др. В одном из воплощений данного изобретения указанный способ получения пищевого продукта включает следующие этапы:
i) получение грамположительных бактерий, предпочтительно молочнокислых бактерий или бифидобактерий, пищевой добавки, пробиотической композиции или стартовой культуры, как описано в настоящем документе;
ii) получение субстрата или композиции, предпочтительно нетоксичной или съедобной, содержащей субстрат, способный подвергаться ферментации грамположительными бактериями, предпочтительно молочнокислыми бактериями или бифидобактериями;
iii) смешивание описанных в настоящем документе грамположительных бактерий, предпочтительно молочнокислых бактерий или бифидобактерий, пищевой добавки, пробиотической композиции или стартовой культуры с субстратом или композицией;
iv) при необходимости размножение указанных грамположительных бактерий, предпочтительно молочнокислых бактерий или бифидобактерий, и/или ферментация указанного субстрата (вещества или композиции) указанными грамположительными бактериями, предпочтительно молочнокислыми бактериями или бифидобактериями.
В одном из своих аспектов данное изобретение относится также к пищевому продукту, который получен (или может быть получен) впрямую или опосредованно способами, описанными в настоящем документе.
Как говорилось выше, грамположительные бактерии, предпочтительно молочнокислые бактерий или бифидобактерии, по данному изобретению накапливают внутри клеток трегалозу. Соответственно, в одном из своих аспектов данное изобретение относится также к способу для внутриклеточного накопления трегалозы грамположительными бактериями, предпочтительно молочнокислыми бактериями или бифидобактериями, причем накапливаемая трегалоза присутствует в культуральной среде либо добавляется извне или экзогенно; этот способ включает этап размножения грамположительных бактерий, предпочтительно молочнокислых бактерий или бифидобактерий, по данному изобретению в среде, содержащей субстрат, который может подвергаться ферментации указанными грамположительными бактериями, предпочтительно молочнокислыми бактериями или бифидобактериями. В одном из воплощений данного изобретения способ для внутриклеточного накопления трегалозы в грамположительных бактериях, предпочтительно молочнокислых бактериях или бифидобактериях, включает следующие этапы:
i) получение грамположительных бактерий, предпочтительно молочнокислых бактерий или бифидобактерий, или стартовой культуры, как описано в настоящем документе;
ii) получение субстрата или композиции, предпочтительно нетоксичной или съедобной, содержащей субстрат, способный подвергаться ферментации грамположительными бактериями, предпочтительно молочнокислыми бактериями или бифидобактериями;
iii) смешивание описанных в настоящем документе молочнокислых бактерий или стартовой культуры с субстратом или композицией;
iv) при необходимости размножение указанных грамположительных бактерий, предпочтительно молочнокислых бактерий или бифидобактерий, и/или ферментация указанных субстрата или композиции указанными грамположительными бактериями, предпочтительно молочнокислыми бактериями или бифидобактериями.
Грамположительные бактерии, предпочтительно молочнокислые бактерий или бифидобактерии, по данному изобретению предпочтительно проявляют повышенную устойчивость к стрессу, а также отличаются улучшенными параметрами, характеризующими их получение, обработку и/или хранение. Соответственно, в одном из своих аспектов данное изобретение относится к способу для повышения устойчивости к стрессу или улучшения параметров, характеризующих получение, обработку и/или хранение грамположительных бактерий, предпочтительно молочнокислых бактерий или бифидобактерий, включающий модификацию грамположительных бактерий, предпочтительно молочнокислых бактерий или бифидобактерий, например, лишение активности PtcC. В одном из воплощений данного изобретения ген, кодирующий эндогенный ptcC, частично или полностью делетирован, разрушен или инактивирован, так что отсутствует способность к образованию функционального продукта гена ptcC. Предпочтительно устойчивость к стрессу и параметры, характеризующие получение, обработку и/или хранение указанных бактерий представлены одним или более признаков, выбираемых из группы, включающей устойчивость к кислой среде, устойчивость к солям желчных кислот, устойчивость к теплу, устойчивость к соли, устойчивость к высушиванию, сушке распылением, замораживанию или лиофилизации и осмоустойчивость.
В одном из своих воплощений данное изобретение относится к любому из описанных в настоящем документе способов, в которых грамположительные бактерии, предпочтительно молочнокислые бактерии или бифидобактерии, содержат функциональную гетерологичную трегалозо-6-фосфат-фосфатазу (например, otsB) и/или функциональную гетерологичную трегалозо-6-фосфат-синтазу (например, otsA), как это описано в настоящем документе.
В другом своем воплощении данное изобретение относится к любому из описанных в настоящем документе способов, в которых у грамположительных бактерий, предпочтительно молочнокислых бактерий или бифидобактерий, отсутствует активность трегалозо-6-фосфат фосфорилазы (TrePP). В одном из предпочтительных воплощений данного изобретения ген, кодирующий эндогенную TrePP, частично или полностью делетирован, разрушен или инактивирован, так что отсутствует способность к образованию функционального продукта гена TrePP, как это описано в настоящем документе.
В еще одном своем воплощении данное изобретение относится к любому из описанных в настоящем документе способов, в которых у грамположительных бактерий, предпочтительно молочнокислых бактерий или бифидобактерий, сверхэкспрессируется один или более генов, кодирующих переносчик трегалозы, предпочтительно эндогенный переносчик трегалозы, как описано в настоящем документе.
В еще одном своем воплощении данное изобретение относится к любому из описанных в настоящем документе способов, в которых у грамположительных бактерий, предпочтительно молочнокислых бактерий или бифидобактерий, экспрессируется один или более гетерологичных генных продуктов, предпочтительно один или более генных продуктов, обладающих профилактическим и/или лечебным эффектов, как описано в настоящем документе.
В одном из своих воплощений данное изобретение относится к любому из описанных в настоящем документе способов, включающих также этап высушивания, замораживания, сушки распылением или лиофилизации грамположительных бактерий, предпочтительно молочнокислых бактерий или бифидобактерий, лекарственного средства, пищевой добавки, пробиотической композиции или стартовой культуры по данному изобретению.
Авторы настоящей заявки обнаружили, что грамположительные бактерии, предпочтительно молочнокислые бактерий или бифидобактерии, по данному изобретению способны к трегалозы внутри клетки, когда трегалоза извне не добавляется. Предпочтительно грамположительные бактерии, предпочтительно молочнокислые бактерий или бифидобактерии, по данному изобретению могут размножаться в среде, в которую при необходимости экзогенная трегалоза не добавляется, но тем не менее накапливать трегалозу внутри клетки. Соответственно, в одном из своих воплощений данное изобретение относится к описанным в настоящем документе способам, включающим этап поддержания культуры или размножения грамположительных бактерий, предпочтительно молочнокислых бактерий или бифидобактерий, в среде, в которой отсутствует или практически отсутствует трегалоза, или в среде, в которой нет или практически нет добавленной извне или экзогенной трегалозы. Предпочтительно такая среда может содержать другой источник углерода, способный подвергаться ферментации, например, (но не ограничиваясь перечисленным здесь) мальтозу и/или глюкозу.
Соответственно, в одном из своих воплощений данное изобретение относится к любому из описанных в настоящем документе способов, в которых грамположительные бактерии, предпочтительно молочнокислые бактерий или бифидобактерии, по данному изобретению поддерживаются в культуре или размножаются в среде, содержащей субстрат, способный подвергаться ферментации указанными грамположительными бактериями, предпочтительно молочнокислыми бактериями или бифидобактериями, причем указанный субстрат содержит мало (например, меньше оптимального количества), не содержит или практически не содержит трегалозы. Или же данное изобретение относится к любому из описанных в настоящем документе способов, в которых грамположительные бактерии, предпочтительно молочнокислые бактерий или бифидобактерии, по данному изобретению поддерживаются в культуре или размножаются в среде, содержащей субстрат, способный подвергаться ферментации указанными грамположительными бактериями, предпочтительно молочнокислыми бактериями или бифидобактериями, причем указанный субстрат содержит мальтозу. В одном из своих предпочтительных воплощений данное изобретение относится к любому из описанных в настоящем документе способов, в которых грамположительные бактерии, предпочтительно молочнокислые бактерий или бифидобактерии, по данному изобретению поддерживаются в культуре или размножаются в среде, содержащей субстрат, способное подвергаться ферментации указанными грамположительными бактериями, предпочтительно молочнокислыми бактериями или бифидобактериями, причем указанный субстрат содержит мальтозу и содержит мало (например, меньше оптимального количества), не содержит или практически не содержит трегалозы.
В настоящем документе выражение «среда, не содержащая или практически не содержащая трегалозы или добавленной извне или экзогенной трегалозы» относится к среде, в которой трегалоза отсутствует или присутствует лишь в очень малом количестве. Предпочтительно количество или концентрация трегалозы в такой среде слишком низкая, чтобы указанные бактерии могли использовать трегалозу в качестве единственного источника углерода. В одном из воплощений данного изобретения указанная среда содержит менее 100 мМ, предпочтительно менее 50 мМ, более предпочтительно менее 25 мМ, например менее 15 мМ, менее 10 мМ, менее 5 мМ, менее 2 мМ или менее 1 мМ. В другом воплощении данного изобретения указанная среда содержит менее 2% (масса/масса) или менее 2% (объем/масса) трегалозы. предпочтительно менее 1% (масса/масса) или менее 1% (объем/масса) трегалозы, более предпочтительно менее 0,5% (масса/масса) или менее 0,5% (объем/масса) трегалозы, например, менее 0,3, менее 0,2, менее 0,1, менее 0,05 или менее 0,01% (масса/масса или объем/масса) трегалозы. В другом воплощении данного изобретения указанная среда содержит менее 20% трегалозы от суммарного количества источников углерода или ферментируемых углеводов, предпочтительно менее 10%, более предпочтительно менее 5%, например, менее 3%, менее 2% или менее 1%.
В другом своем аспекте данное изобретение относится к использованию описанных в настоящем документе грамположительных бактерий, предпочтительно молочнокислых бактерий или бифидобактерий, для накопления трегалозы внутри клеток указанных грамположительных бактерий, предпочтительно молочнокислых бактерий или бифидобактерий. В одном из предпочтительных воплощений данное изобретение относится к использованию описанных в настоящем документе грамположительных бактерий, предпочтительно молочнокислых бактерий или бифидобактерий, для накопления трегалозы внутри клеток указанных грамположительных бактерий, предпочтительно молочнокислых бактерий или бифидобактерий, в отсутствие или практически в отсутствие трегалозы. В другом воплощении данное изобретение относится к использованию описанных в настоящем документе грамположительных бактерий, предпочтительно молочнокислых бактерий или бифидобактерий, для накопления трегалозы внутри клеток указанных грамположительных бактерий, предпочтительно молочнокислых бактерий или бифидобактерий, когда они поддерживаются в культуре или размножаются на мальтозе, предпочтительно в качестве единственного или практически единственного источника углерода.
Как говорилось выше, грамположительные бактерии, предпочтительно молочнокислые бактерий или бифидобактерии, по данному изобретению проявляют повышенную устойчивость к различным стрессовым факторам окружающей среды, а также отличаются улучшенными параметрами, характеризующими их получение, обработку и/или хранение. Соответственно, в одном из своих аспектов данное изобретение относится к использованию описанных в настоящем документе грамположительных бактерий, предпочтительно молочнокислых бактерий или бифидобактерий, для повышения стрессоустойчивости или для улучшения параметров, характеризующих получение, обработку и/или хранение указанных грамположительных бактерий, предпочтительно молочнокислых бактерий или бифидобактерий. В другом своем аспекте данное изобретение относится к способу для повышения устойчивости к стрессу или улучшения параметров, характеризующих получение, обработку и/или хранение грамположительных бактерий, предпочтительно молочнокислых бактерий или бифидобактерий, включающий получение грамположительных бактерий, предпочтительно молочнокислых бактерий или бифидобактерий, как описано в настоящем документе.
В одном из воплощений данного изобретения стрессоустойчивость выбирают из группы, включающей устойчивость к кислой среде, устойчивость к солям желчных кислот, устойчивость к теплу, устойчивость к соли, устойчивость к холоду, осмоустойчивость, предпочтительно выбирают из устойчивости к кислой среде или солям желчных кислот, более предпочтительно из устойчивости солям желчных кислот. В другом воплощении данного изобретения параметры, характеризующих получение, обработку и/или хранение выбирают из группы, включающей высушивание, замораживание, лиофилизацию, сушку распылением или хранение в среде, предпочтительно замораживание или лиофилизацию, более предпочтительно - лиофилизацию.
Далее аспекты и воплощения данного изобретения комментируются описанными ниже примерами, которые не ограничивают объем изобретения.
Примеры
В таблице 1 предлагается обзор генетических модификаций штаммов, описанных в настоящем документе, за исключением штаммов, данные о которых представлены на фиг. 4 - они перечислены в таблице 2.
Таблица 1
Штамм
a) Трегалозный оперон
b) ptcC
c) otsB
d) thyA
e) Переносимый ген
Трегалоза PTS I/II
TrePP
sAGX0037
дт (Ptre>>PTS)
дт
дт
-
KO (генная замена)
PhllA>>hIL-10 (thyA локус)
sAGX0085
дт (Ptre>>PTS)
дт
дт
-
KO (генная замена)
PhllA>>hTFF1 (thyA локус)
sAGX0137
дт (Ptre>>PTS)
дт
дт
usp45>> мутантный otsB
KO (генная замена)
PhllA>>hIL-10 (thyA локус)
sAGX0139
дт (Ptre>>PTS)
дт
дт
usp45>>otsB
KO (генная замена)
PhllA>>hIL-10 (thyA локус)
sAGX0147
Дт (Ptre>>PTS)
KO
дт
usp45>> мутантный otsB
KO (генная замена)
PhllA>>hIL-10 (thyA локус)
sAGX0148
Дт (Ptre>>PTS)
KO
дт
usp45>>otsB
KO (генная замена)
PhllA>>hIL-10 (thyA локус)
sAGX0167
PhllA>>PTS
KO
дт
usp45>>otsB
KO (генная замена)
PhllA>>hIL-10 (thyA локус)
sAGX0169
Дт (Ptre>>PTS)
KO
дт
-
KO (генная замена)
PhllA>>hTFF-1 (thyA локус)
sAGX0248
Дт (Ptre>>PTS)
KO
KO (стоп-кодон )
-
дт
-
sAGX0272
Дт (Ptre>>PTS)
KO
Дт
-
дт
-
sAGX0309
PhllA>>PTS
KO
Дт
-
KO (генная делеция)
usp45>>CDP870 анти-TNF
sAGX0319
KO
KO
Дт
-
KO (генная делеция)
usp45>>CDP870 анти-TNF
sAGX0346
PhllA>>PTS
KO
KO (стоп-кодон )
usp45>>otsB
KO (генная делеция)
-
sAGX0347
PhllA>>PTS
KO
KO (генная делеция)
usp45>>otsB
KO (генная делеция)
-
sAGX0354
PhllA>>PTS
KO
KO (стоп-кодон )
usp45>>otsB
KO (генная делеция)
gapB>>CDP870 анти-TNF
Обзор генетических модификаций штаммов, описанных в настоящем документе. Указано следующее: а) структура трегалозного оперона, а именно: предшествует ли промотор нативного трегалозного оперона (Ptre) PTS-переносчикам трегалозы (Ptre>>PTS) и делетирован trePP (KO) или нет (дикий тип - дт); b) структура гена ptcC: дикий тип (дт), инактивирован (KO) путем инсерции стоп-кодона или делеции гена; c) отсутствие (-) или присутствие функционально неактивной (мутантной) otsB или otsB дикого типа, инсерция в локусе thyA после промотора thyA (PthyA>>otsB) или инсерция как второго цистрона после гена usp45 (usp45>>otsB); d) структура гена thyA: дикий тип (дт) или инактивирован (KO) путем делеции гена или инсерции переносимого гена (генная замена); e) отсутствие (-) или природа и структура переносимых генов uidA, hIL-10 или анти-TNF CDP870, встраиваемых в локус thyA под контролем промотора hllA (PhllA>>) или встраиваемых после (в сторону 3'-конца ДНК) генов usp45 или gapB (usp45>>; gapB>>). Все штаммы происходят от L. lactis MG1363.
Таблица 2
Штамм
Инактивированный ген
Идентификационный номер инактивированного гена
Инактивированный белок-продукт
sAGX0241
pmrB
4799106
белок помпа оттока множественной лекарственной устойчивости
sAGX0242
celB
4796591
компонент IICспецифичной кцеллобиозе фосфотрансферазной системы
sAGX0245
araJ
4796972
предполагаемая пермеаза оттока арабинозы
sAGX0246
ptcB
4797109
компонент IIB специфичной к целлобиозе фосфотрансферазной системы
sAGX0247
ptcA
4798642
компонент IIA специфичной к целлобиозе фосфотрансферазной системы
sAGX0248
ptcC
4796893
компонент IIC специфичной к целлобиозе фосфотрансферазной системы
sAGX0249
msmK
4797024
АТФ-связывающий переносчик сахаров
sAGX0250
llmg_0453
4797778
фермент IIABC фосфотрансферазной системы, специфичной к сахарозе (трегалозный оперон)
sAGX0251
llmg_0454
4797093
компонент IIABC фосфотрансферазной системы, специфичной к бета-глюкозидам (трегалозный оперон)
sAGX0252
llmg_0489
4796717
пермеаза системы транспорта сахаров
sAGX0253
llmg_0490
4796719
пермеаза системы транспорта сахаров
sAGX0255
malG
4798664
пермеаза мальтозы семейства переносчиков АВС malG
sAGX0256
malF
4798442
пермеаза системы транспорта мальтозы malF
sAGX0257
malE
4798313
белок, связывающий субстрат, переносчика мальтозы семейства АВС
sAGX0258
lplB
4798767
белок, связывающий субстрат, переносчика сахаров семейства АВС
sAGX0259
lplC
4796680
пермеаза сахаров семейства АВС
sAGX0260
lplA
4797636
белок, связывающий субстрат, переносчика сахаров семейства АВС
sAGX0261
bglP
4797495
Фосфотрансферазная система, фермент IIABC, специфичный к бета-глюкозидам
sAGX0262
llmg_1104
4798113
белок экспорта лекарств
sAGX0265
tagG
4798685
пермеаза тейхоевой кислоты семейства переносчиков АВС
Обзор штаммов, составленный для идентификации механизма выхода трегалозы. Были получены штаммы, дефицитные по trePP, чтобы могло происходить накопление трегалозы и у которых инактивирован набор генов, взятых из функциональных категорий (транспорт и метаболизм углеводов» кластеров ортологических групп http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/cogtik.cgi?gi=20494&cog=G (откуда взята номенклатура генов и белков). Указаны регистрационные номера инактивированных генов, а также инактивированные белки-продукты.
Инактивация генов осуществляли путем прямой рекомбинации олигонуклеотидов, введения стоп-кодонов в рамку считывания соответствующих генов-мишеней. Все штаммы происходят от L. lactis MG1363.
ПРИМЕР 1. Внутриклеточное накопление трегалозы после инактивации trePP
Экспериментальная часть
Штаммы выращивали в течение ночи (А) или в течение 24 часов (В) в 50 мл среды GM17T+500 мМ трегалозы при температуре 30°C, клетки собирали путем центрифугирования и определяли содержание трегалозы: эквиваленты 10 мл культуры, выросшей за ночь, промывали 3 раза карбонатным буферным раствором (0,25 М), после чего определяли массу клеточного осадка (влажную массу). Клетки подвергали лизису в 1 мл карбонатного буфера (0,25 М), используя гранулы Lysing Matrix В и гомогенизатор MP Fasprep-24 ((MP Biomedicals; скорость движения 6 м/с, продолжительность обработки 40 секунд). Супернатант от лизированных клеток отделяли путем центрифугирования и нагревали при температуре 99°C в течение 30 минут. Клеточные обломки удаляли путем центрифугирования, в супернатанте определяли концентрацию трегалозы, используя набор для определения трегалозы (K-TREH 010/10, Megazyme, Ирландия). Вкратце, анализ состоит в следующем. В образцах трегалоза гидролизуется под действием трегалазы с образованием D-глюкозы; высвободившаяся D-глюкоза фосфорилируется за счет аденозин-5'-трифосфата (АТР) под действием гексокиназы с образованием глюкозо-6-фосфата и аденозин-5'-дифосфата (ADP). Под действием глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы глюкозо-6-фосфат окисляется при участии никотинамид-адениндинуклеотидфосфата (NADP+) с образованием глюконат-6-фосфата и восстановленной формы никотинамид-адениндинуклеотидфосфата (NADPH). Количество образовавшегося в результате этой реакции NADPH стехиометрично количеству D-глюкозы и, следовательно, количеству трегалозы. Количество NADPH определяют, измеряя прирост поглощения при 340 нм (в сравнении с оптической плотностью при 340 нм до добавления трегалозы). Значения концентрации трегалозы рассчитывали, используя серийные разведения стандартного раствора трегалозы и выражали как число миллиграммов на 1 грамм влажной массы клеточного осадка.
Результаты
Внутриклеточное накопление трегалозы возможно после инактивации trePP, после экспрессии otsB или после того и другого вместе, как показано на фиг. 1. На фиг. 1 (A) видно, что штаммы дикого типа по TrePP (sAGX0037 and sAGX0137) не накапливают трегалозу. У штамма sAGX0147, полученного из sAGX0137 и содержащего нефункциональный мутантный otsB, активности trePP нет, и происходит накопление трегалозы. У штамма sAGX0139, полученного путем инсерции otsB sAGX0037 дикого типа, также происходит накопление трегалозы. При сочетании otsB и инактивации trePP (sAGX0148) имеет место умеренное возрастание накопления трегалозы, которое значительно усиливается при инсерции сильного конститутивного промотора PhllA (описанного в публикации WO 2008/084115) перед обоими генами фосфотрансферазной системы (PTS) трегалозного оперона L. lactis (sAGX0167).
На Фиг. 1 (B) показано, что штамм дикого типа по TrePP sAGX0085 не способен накапливать трегалозу. Инактивация (KO) trePP (sAGX0169) открывает возможность накопления трегалозы.
Из фиг. 1 очевидно, что штаммы дикого типа по TrePP не накапливают трегалозу. Повреждение гена trePP (делеция, а также точковая мутация) делает возможным накопление трегалозы. У штамма sAGX0147 ген otsB мутантный, нефункциональный, а у штаммов sAGX0169, sAGX0309 и sAGX0319 ген otsB отсутствует. У штамма sAGX0169, у которого в локусе thyA присутствует ген hTFF1, нет никаких генетических изменений, за исключением разрыва trePP. Накопление трегалозы для штамма с инактивацией (КО) trePP KO в свете ранее известного в данной области техники можно счесть неожиданным, поскольку оно критически зависит от трегалозо-6-фосфат-фосфатазы (otsB или его аналог). Такое явление у L. lactis не было описано и его не приходилось ожидать, поскольку оно должно мешать метаболизму трегалозы, превращая трегалоз-6-фосфат в инертную внутриклеточную трегалозу. Однако авторы данного изобретения наблюдали указанное явление у L. lactis. Инактивацию TrePP можно осуществить путем генной делеции, как это было сделано в настоящей работе, или путем введения стоп-кодона, или путем мутации со сдвигом рамки считывания, или мутации промотора, или выявления и использования спонтанной мутации, приводящей к утрате функции trePP. Накопление трегалозы возможно, когда otsB присутствует как таковой (sAGX0139) или в сочетании с инактивацией trePP (sAGX0148), или в сочетании с инсерцией сильного конститутивного промотора PhllA перед обоими генами фосфотрансферазной системы (PTS) (PhllA>>trePTC) в трегалозном опероне L. lactis (sAGX0167). Предпочтительным положение otsB, использовавшимся в настоящей работе, является положение второго цистрона позади природного гена usp45 в конфигурации, описанной в заявках на Европейский патент №№ 11168495.7 и 11173588.2 (usp45>>rpmD>>otsB, где rpmD - межгенная область, предшествующая rpmD).
ПРИМЕР 2. Накопление экзогенной трегалозы обеспечивает защиту от лизиса под действием желчи
Экспериментальная часть
Штаммы выращивали в течение ночи в 50 мл среды GM17T или среды GM17T+500 мМ трегалозы при температуре 30°C; клетки собирали путем центрифугирования и ресуспендировали в 25 мл 0,9%-ного раствора хлорида натрия. Брали образцы и определяли число колониеобразующих единиц (КОЕ), высевая подходящие разведения (начальные). В момент времени T0 добавляли 25 мл 1%-ной бычьей желчи в 0,9%-ном NaCl и клеточную суспензию инкубировали в течение 8 часов при температуре 37°C. Брали образцы в моменты времени T0, 1, 2, 4, 6 и 8 часов. Определяли КОЕ, высевая подходящие разведения (фиг. 2 A), содержание трегалозы (фиг. 2 B) практически так же, как описано в ПРИМЕРЕ 1.
Результаты
Накопление трегалозы внутри клетки защищает ее от лизиса под действием желчи, а потеря внутриклеточной трегалозы совпадает со снижением устойчивости к такому лизису. Таким образом, «утечка» трегалозы ставит под удар продолжительную стабильность в присутствии желчи.
На Фиг.2 показано, что накопление экзогенной трегалозы в клетках L. lactis обеспечивает им защиту от лизиса под действием желчи. Высвобождение внутриклеточной трегалозы ограничивает этот защитный эффект во времени. У клеток L. lactis, накапливающих трегалозу (sAGX0167 + трегалоза, sAGX0309 + трегалоза и sAGX0319+ трегалоза), то есть растущих в присутствии 500мМ трегалозы, как здесь описано (фиг. 2 B), наблюдается существенная относительно продолжительная защита от лизиса под действием желчи, пропорциональная концентрации трегалозы внутри клетки по сравнению с клеткам L. lactis без внутриклеточной трегалозы (sAGX0167, предварительное культивирование без трегалозы). Снижение выживания в присутствии 0,5% бычьей желчи (фиг. 2А) совпадает с высвобождением внутриклеточной трегалозы (фиг. 2B).
ПРИМЕР 3. Накопление экзогенной трегалозы внутри клетки обеспечивает защиту от лизиса под действием желчи
Экспериментальная часть
Клетки собирали путем центрифугирования и ресуспендировали в солевой среде 1xM9. Брали образцы и определяли концентрацию трегалозы в моменты времени T0, 1, 2 и 4 часа, практически так же, как описано в ПРИМЕРЕ 1. Данные иллюстративны для всех штаммов дикого типа (дт) по ptcC.
Результаты
Накопившаяся внутри клетки трегалоза в некоторой степени «вытекает» из нее через пока не идентифицированный и не предполагаемый механизм выхода трегалозы и ее можно обнаружить в супернатанте.
На Фиг. 3 показано, что трегалоза может накапливаться внутри клетки в результате синтеза de-novo и путем поглощения из культуральной среды (sAGX0167 выращивали в присутствие 500 мМ трегалозы, как показано на фиг. 1). Как синтезированная de-novo, так и экзогенная накопленная клеткой трегалоза потом выходит и нее. На фиг. 3В видно, что потеря внутриклеточной трегалозы приводит к увеличению концентрации трегалозы в культуральном супернатанте (на этой фигуре концентрация трегалозы представлена в миллиграммах на 10 миллилитров культуры, чтобы можно было сравнивать концентрацию трегалозы внутри и вне клеток).
ПРИМЕР 4. Накопление трегалозы и ее потеря клетками различных штаммов, перечисленных в таблице 2
Экспериментальная часть
Штаммы, представленные в таблице 2, выращивали в среде GM17, дополненной трегалозой - 100 мМ (фиг. 4А) или 500 мМ (фиг. 4B). Клетки собирали и ресуспендировали в забуференной среде M9 (Difco). Определяли содержание трегалозы внутри клеток в моменты времени T0, 2, 4 и 8 часов. У всех штаммов, за исключением sAGX0248 (ptcC KO), наблюдалось сходное высвобождение трегалозы (см. фиг. 3).
Результаты
В базе данных COG (раздел «Транспорт и метаболизм углеводов») были выбраны 20 переносчиков олигосахаридов L. lactis MG1363 и их гены были разрушены путем прямой рекомбинации олигонуклеотидов при инактивации trePP (sAGX0272; требуется для накопления трегалозы) (таблица 2; фиг. 4). Высвобождение трегалозы удавалось нивелировать только при разрушении ptcC.
Вряд ли возможно предсказать, какие из генов, перечисленных в таблице 2, участвуют в высвобождении трегалозы. Повреждение какого-либо одного из генов переносчиков фосфотрансферазной системы, присутствующих в трегалозном опероне (llmg_0453; llmg_0454) не влияет на поглощение иди высвобождение трегалозы. При повреждении гена ptcC (кодирующего компонент IIC фосфотрансферазной системы, специфичной к целлобиозе) высвобождение трегалозы из клеток падает - следовательно, трегалоза выходит из клетки при участии PtcC. Повреждение celB (компонента IIC фосфотрансферазной системы, специфичной к целлобиозе) не влияет на поглощение или высвобождение трегалозы. Повреждение ptcC при инактивации trePP полностью предотвращает высвобождение трегалозы.
ПРИМЕР 5. Накопление и высвобождение трегалозы у разных штаммов, представленных в таблице 2
Экспериментальная часть
Штаммы выращивали в течение ночи в среде GM17T+500 мМ трегалозы при температуре 30°C; клетки собирали путем центрифугирования и ресуспендировали в равном объеме среды 1хМ9 (Фиг. 5А) или в 0,5%-ном растворе бычьей желчи в 0,9%-ном хлориде натрия (фиг. 5В) и инкубировали в течение 24 часов при температуре 37°C . Брали образцы в моменты времени T0, 1, 2, 4, 6, 8, 12 и 24 часа. Определяли содержание трегалозы внутри клеток, как описано в ПРИМЕРЕ 1.
Результаты
При сочетании инактивации ptcC (инсерция стоп-кодона или делеция гена) и PhllA>>trePTC (конститутивно высокий уровень экспрессии переносчика трегалозы) возможно значительное поглощение трегалозы и ее полное удержание внутри клетки.
Фиг. 5 демонстрирует, что инактивация ptcC предотвращает (в солевой среде M9; фиг. 5А) или задерживает (в 0,5%-ной желчи; фиг. 5В) высвобождение внутриклеточной трегалозы. Присутствие сильного конститутивного промотора PhllA (как описано в публикации WO 2008/084115, которая включается в настоящий документ путем отсылки) перед обоими генами фосфотрансферазной системы в трегалозном опероне L. lactis восстанавливает способность накапливать экзогенную трегалозу до таковой штамма сравнения (см. также фиг. 4).
ПРИМЕР 6. Накопление экзогенной трегалозы обеспечивает защиту от лизиса под действием желчи
Экспериментальная часть
Штаммы выращивали в течение ночи в среде GM17T+500 мМ трегалозы при температуре 30°C; клетки собирали путем центрифугирования и ресуспендировали в половине объема 0,9%-ного раствора хлорида натрия. Брали образцы и определяли число колониеобразующих единиц (КОЕ), высевая подходящие разведения (начальные). В момент времени T0 добавляли половину объема 1%-ной бычьей желчи в 0,9%-ном растворе NaCl и инкубировали в течение 8 часов при температуре 37°C. Брали образцы в моменты времени T0, 1, 2, 4, 6, 8, 12 и 24 часа. Определяли содержание трегалозы (практически так же, как в ПРИМЕРЕ 1; см. фиг. 6А) и КОЕ, высевая (только 0-8 часов) подходящие разведения; для графического изображения (фиг. 6В) брали процентное отношение к начальным значениям (Т0).
Результаты
Усиленная способность накапливать трегалозу внутри клетки ведет к повышению устойчивости к воздействию желчи.
На Фиг. 6 показано, что накопление экзогенной трегалозы внутри клеток L. lactis обеспечивает им защиту от лизиса под действием желчи. Высвобождение внутриклеточной трегалозы (A) совпадает со снижением выживания в 0,5%-ной желчи (B). Инактивация ptcC продлевает присутствие трегалозы внутри клеток и соответственно также улучшает временные параметры устойчивости к воздействию желчи.
ПРИМЕР 7. Штаммы без активности TrePP способны превращать глюкозу или мальтозу во внутриклеточную трегалозу. У штаммов без активности trePP мальтоза стимулирует поглощение трегалозы
Экспериментальная часть
Штаммы выращивали в течение ночи в указанных средах. Трегалозу определяли практически так, как описано в ПРИМЕРЕ 1.
Результаты
Штаммы без активности трегалозо-6-фосфат-фосфорилазы (TrePP KO) для накопления трегалозы обретали способность использовать такие источники углерода, как глюкоза или мальтоза. Ранее в данной области техники не было описано, что трегалоза может накапливаться внутри клеток в среде MM17T, то есть когда единственным источником углерода является мальтоза.
На Фиг. 7 показано, что штаммы без активности трегалозо-6-фосфат-фосфорилазы (TrePP KO как дикого типа по ptcC, так и без активности ptcC) способны превращать глюкозу или мальтозу во внутриклеточную трегалозу (столбики 1 и 2, столбики 5 - 8). У штаммов без активности трегалозо-6-фосфат-фосфорилазы мальтоза усиливает поглощение трегалозы из среды и накопление ее внутри клетки (столбики 9 и 10).
Штаммы без активности трегалозо-6-фосфат-фосфорилазы (TrePP KO) накапливают трегалозу, когда растут:
1. С глюкозой в качестве источника углерода (среда GM17T; столбики 1 и 2)
2. С глюкозой в качестве источника углерода и внеклеточной трегалозой (среда GM17T + 500 мМ трегалозы; столбики 3 и 4)
3. С мальтозой в качестве источника углерода (среда MM17T; столбики 5 и 6)
4. С глюкозой и мальтозой в качестве источника углерода (среда GM M17T; столбики 7 и 8)
5. С мальтозой в качестве источника углерода и внеклеточной трегалозой (среда MM17T + 500 мМ трегалозы; столбики 9 и 10).
ПРИМЕР 8. Выживание после лиофилизации
Экспериментальная часть
Таблица 3 (А): Растущую в оптимизированных условиях культуру (200 л; ферментационная среда, не содержащая животного белка) концентрировали в 10 раз путем ультрафильтрации и диафильтрапции и ресуспендировали в концентрированной криозащитной смеси (как описано в публикации WO 2010/124855). Для суспензии бактерий определяли КОЕ (на 1 мл). Суспензию клеток разливали в кюветы для анализа, взвешивали их и подвергали лиофилизации. Для оценки жизнеспособности лиофилизированные порции подходящего веса разводили в нужном объеме очищенной воды и определяли КОЕ на 1 мл.
Таблица 3 (В): Суточную («ночную») культуру (20 л; среда GM17T + 500 мМ трегалозы) концентрировали в 100 раз путем центрифугирования и ресуспендировали в концентрированной криозащитной смеси (как описано в публикации WO 2010/124855). Для суспензии бактерий определяли КОЕ (на 1 мл). Суспензию клеток разливали во флаконы (объем содержимого 2,5 мл). Для оценки жизнеспособности лиофилизированное содержимое 2,5-миллилитровых флаконов разводили в 2,5 мл очищенной воды и определяли КОЕ на 1 мл. Определяли жизнеспособность как процентное отношение КОЕ до и после лиофилизации. Для двух независимо полученных партий (sAGX0167 и sAGX0309) выживание после лиофилизации составило >100%.
11
Полученные в результате лиофилизации порошки (A) и (B) затем смешивали с подходящими эксципиентами для стандартизации КОЕ/г. sAGX0037, sAGX0167 и sAGX0309 расфасовывали в капсулы из гидроксипропилметилцеллюлозы (HPMC) в количестве не менее 1,2×10КОЕ на одну капсулу. Капсулы обматывали целлюлозной пленкой и покрывали сополимером метакриловой кислоты и этилакрилата, что давало кишечнорастворимую оболочку для прицельной доставки в тонкий кишечник и толстую кишку.
Трегалозу определяли практически так же, как описано в ПРИМЕРЕ 1.
Результаты
Как показано в таблице 3, у штаммов, которые способны накапливать трегалозу, наблюдается значительно повышенная устойчивость к стрессу, обусловленному высушиванием, происходящим при лиофилизации.
Таблица 3
Штамм
КОЕ\мл биологической рецептуры
КОЕ/мл лиофилизата
Содержание трегалозы
Выживание
sAGX0037exp. 1
A
1,60×10<sup>11</sup>
1,26×10<sup>11</sup>
n/a
79 %
sAGX0037exp. 2
1,50×10<sup>11</sup>
1,47×10<sup>11</sup>
n/a
98 %
sAGX0037exp. 3
1,40×10<sup>11</sup>
1,02×10<sup>11</sup>
n/a
73 %
sAGX0037exp. 4
1,50×10<sup>11</sup>
1,26×10<sup>11</sup>
n/a
84 %
sAGX0085exp. 1
2,00×10<sup>11</sup>
1,40×10<sup>11</sup>
n/a
70 %
sAGX0085exp. 2
1,60×10<sup>11</sup>
1,42×10<sup>11</sup>
n/a
89 %
sAGX0167exp. 1
B
1,14×10<sup>11</sup>
1,21×10<sup>11</sup>
16,29 мг/г влажной массы
106 %
sAGX0309exp. 1
1,21×10<sup>11</sup>
1,45×10<sup>11</sup>
16,72 мг/г влажной массы
120 %
ПРИМЕР 9. Выживание в процессе прохождения кишечника свиньи
Экспериментальная часть
Свиньям (самкам) с массой тела >150 кг хирургическим путем устанавливали канюли в проксимальном участке двенадцатиперстной кишки и в проксимальном участке толстой кишки. В дуоденальную канюлю вводили лиофилизированные препараты sAGX0037 и sAGX0167 в капсулах. Через канюлю в толстой кишке брали образцы кишечного содержимого чрез 0, 2, 4, 6, 8 и 10 часов после указанного введения. В этих образцах определяли жизнеспособность как процентное отношение живых (КОЕ) и суммарно живых и мертвых (анализ с использованием количественной полимеразной цепной реакции) клеток L.lactis . Полученные данные представлены в таблице 4.
Результаты
У штаммов, способных накапливать трегалозу, наблюдалось значительно лучшее выживание в толстом кишечнике свиньи независимо от состояния пищеварительного тракта (натощак или нет). Таблицы 4 и 8 демонстрируют, что по сравнению с лиофилизированным sAGX0037 в капсулах (таблица 4, часть A), лиофилизированные sAGX0167 в капсулах (которые предварительно культивировали в условиях для накопления трегалозы внутри клеток; таблица 4, часть B) характеризуются лучшим выживанием в процессе прохождения свиного кишечника как у особей, не получавших пищи в течение 24 часов (фиг. 8А), так и у особей, имевших в своем распоряжении корм без ограничения (фиг. 8В).
Таблица 4
Момент времени
sAGX0037
sAGX0167
Значение p
Натощак
T0
-
-
T2
8,5%
45,1%
0,033
T4
3,0%
30,9%
0,001
T6
4,5%
24,8%
0,044
T8
1,9%
10,7%
0,176
T10
0,0%
13,2%
Не натощак
T0
-
-
T2
-
-
T4
0,0%
89%
0,001
T6
0,0%
66%
0,173
T8
0,0%
25%
0,203
ПРИМЕР 10. Трегалоза может накапливаться после наращивания биомассы
Экспериментальная часть
Указанные штаммы выращивали в течение ночи (16 часов) в среде GM17T при температуре 30°C и собирали клетки путем центрифугирования (15 минут при 4000 об/мин). Осадок бактериальных клеток ресуспендировали в свежей среде GM17T + 500 мМ трегалозы и инкубировали. Внутриклеточное содержание трегалозы определяли в моменты времени T=0, 1, 2 и 4 часа, как описано в ПРИМЕРЕ 1.
Результаты
На Фиг. 9 показано, что трегалоза может накапливаться внутри бактериальных клеток после образования биомассы, когда бактерий инкубируют на протяжении какого-то времени. На фиг. 9 видно, что это наблюдалось только у штаммов без активности трегалозо-6-фосфат фосфорилазы (trePP KO): сравните sAGX0090 с другими штаммами; для этого не требуется инсерция или делеция гена (sAGX0169). Дополнительное присутствие otsB (sAGX0167, sAGX0346, sAGX0354, sAGX0360) способствует накоплению трегалозы.
ПРИМЕР 11. Мальтоза может способствовать накоплению трегалозы внутри клеток
Экспериментальная часть
Указанные штаммы выращивали в течение ночи (16 часов) при температуре 30°C в следующих средах: GM17T +/- 500 мМ трегалозы, GM17T + 0,5% мальтозы (GMM17T) + 500 мМ трегалозы или M17T + 0,5% мальтозы (MM17T) + 500 мМ трегалозы. Клетки собирали путем центрифугирования (15 минут при 4000 об/мин). Внутриклеточное содержание трегалозы определяли, как описано в ПРИМЕРЕ 1.
Результаты
На Фиг. 10 показано, что мальтоза способствует внутриклеточному накоплению трегалозы в суточных культурах.
ПРИМЕР 12. Мальтоза может превращаться во внутриклеточную трегалозу в ходе наращивания биомассы или после него
Экспериментальная часть
Указанные штаммы выращивали в течение ночи (16 часов) при температуре 30°C в среде GM17T(на фиг. 11 обозначено ON GM17T). Клетки собирали путем центрифугирования (15 минут при 4000 об/мин) и ресуспендировали в среде M17T + 0,5% мальтозы (MM17T) и инкубировали в течение 8 часов (на фиг. 11 - ON GM17T > 8h MM17T). Или же указанные штаммы культивировали в течение ночи в среде ММ17Т (на фиг. 11 - ON MM17T). Внутриклеточное содержание трегалозы определяли в моменты времени T=0, 1, 2 и 4 часа, как описано в ПРИМЕРЕ 1.
Результаты
На Фиг. 11 показано, что мальтоза может превращаться во внутриклеточную трегалозу в ходе роста биомассы или после него.
СОКРАЩЕНИЯ
ADP
Аденозин-5'-дифосфат
анти-TNF
Антитела, распознающие фактор некроза опухолей
ATP
Аденозин-5'-трифосфат
celB
Компонент IIC фосфотрансферазной системы, специфичной к целлобиозе
КОЕ
Колониеобразующая единица
COG
Кластеры ортологических групп белков
eno
Ген енолазы (фосфопируват-гидратазы) (идентификационный номер 4797432)
gapB
Ген глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы(идентификационный номер 4797877)
ID
Идентификационный номер (гена)
GM17
Среда M17 производства фирмы Oxoid + глюкоза 0,5%
GM17T
Среда M17 производства фирмы Oxoid + глюкоза 0,5% + тимидин 0,2 мМ
GMM17T
Среда M17 производства фирмы Oxoid + глюкоза 0,5%+ мальтоза 0,5% + тимидин 0,2 мМ
hIL-10
Человеческий интерлейкин -10
HPMC
Гидроксипропилметилцеллюлоза
hTFF-1
Человеческий Trefoil фактор-1
KO
Нокаут; делеция, замена, повреждение гена
M
Мальтоза 0,5%
M17
Среда M17 производства фирмы Oxoid
M9
Солевая среда M9 производства фирмы Difco
MM17
Среда M17 производства фирмы Oxoid + мальтоза 0,5%
MM17T
Среда M17 производства фирмы Oxoid + мальтоза 0,5% + тимидин 0,2 мМ
n/a
Не применимо
NADP<sup>+</sup>
Никотинамид-аденин-динуклеотидфосфат
NADPH
Никотинамид-аденин-динуклеотидфосфат восстановленный
ODx
Оптическая плотность х нм (длина волны)
otsA
Фермент А метаболического пути синтеза трегалозы, участвующий в осморегуляции, Escherichia coli; трегалозо-6-фосфат-синтаза
otsB
Фермент В метаболического пути синтеза трегалозы, участвующий в осморегуляции, Escherichia coli; трегалозо-6-фосфат-фосфатаза
otsBA
Элемент сопряженной экспрессии otsB и otsA
pgmB
β-Фосфоглюкомутаза (идентификационный номер гена 4797271)
PhllA
Промотор гена HU-подобного ДНК-связывающего белка (идентификационный номер гена 4797353)
ptcC
Компонент IIC фосфотрансферазной системы, специфичной к целлобиозе
Ptre
Промотор трегалозного оперона
PTS
Фосфотрансферазная система
rpmD
Межгенная область перед геном белка L30 рибосомы 50 S
T
Тимидин 0,2 мМ
thyA
Ген тимидин-синтазы (идентификационный номер 4798358)
TNF
Фактор некроза опухолей
trePP
Трегалозо-6-фосфат-фосфорилаза (идентификационный номер гена 4797140)
trePTC
Гипотетические гены фосфотрансфераз трегалозного оперона L. lactis (llmg_0453 and llmg_0454; идентификационные номера 4797778 и 4797093, соответственно)
TX
Момент времени Х часов
uidA
Ген бета-D-глюкуронидазы Escherichia coli
usp45
Не идентифицированный ген белка с молекулярной массой 45 кДа (идентификационный номер 4797218)
дт
Дикий тип
ww
Влажная масса клеточного осадка
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> ИНТРЕКСОН АКТОБИОТИКС Н.В.
<120> МОДИФИЦИРОВАННЫЕ ГРАМПОЛОЖИТЕЛЬНЫЕ БАКТЕРИИ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
<130> AGX-032-PCT
<150> 11182643.4
<151> 2011-09-23
<160> 13
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 2310
<212> DNA
<213> Lactococcus lactis
<400> 1
atgactgata aagattggat gatccaatat gacaaacaag aagtagggaa gcgttcttat 60
gggcaagaat ctttaatgtc attgggaaat ggttatttag ggcttcgtgg ggcgcctttg 120
tgggcaactt gttcggataa tcattatccg ggactctatg tcgcaggggt ctttaatcac 180
acaagtacag aagttgcagg tcatgatgtt atcaacgaag atatggtcaa ttggccaaat 240
ccacaattga ttaaggttta tattgataat gaattggttg acttcgaggc agcaattgag 300
aaaaattctt cgattgattt caaaaatgga ttgcaaattg agagctataa tgtcagttta 360
gccaagggag gtttgacttt agtgaccaca aaatttgttg atcccatcca ttttcacgat 420
tttgggttcg ttggagaaat catcgctgat ttttctggaa aattgcgaat agaaactttt 480
attgatggtt cggtattgaa tcaaaatgtt gaacgctatc gggcttttga cagcaaagaa 540
tttgaagtga ctcaaattgc tgatggactt ttggtggcaa aaactagaac gacggacata 600
gaattagcag ttgcgactaa aacttattta aatggtcagc cattgaaaaa agtagaatct 660
ggaaattctg aaatttttaa agaatccatt gaagttgatt tactaaaaaa ccaagaagtt 720
cagtttgaaa aatcgattgt tattgctagt tcttatgaaa ccaaaaaccc tgttgaattt 780
gtgctgacag aactggcagc aacttctgtc agtaaaattc aggaaaataa tgcaaattat 840
tgggagaaag tatggcagga tggcgatatt gtcatcgaat ctgatcatgc ggatttgcaa 900
agaatggtgc gaatgaatat tttccatatt cgccaagcgg cacaacacgg tgctaatcag 960
tttttagatg cgtccgtagg ttcgcgtgga ttgactggtg aaggttatcg aggacatatt 1020
ttctgggatg aaatttttgt tctaccttat tatgcggcga atgaaccaga aacagcgcgt 1080
gatttgcttt tgtaccgaat caatcgattg actgctgcac aggaaaatgc aaaggttgat 1140
ggagaaatag gggcaatgtt tccttggcaa tccggcttaa ttggggatga acaggcacaa 1200
tttgttcatt tgaatacagt aaataatgaa tgggaaccag ataatagtcg ccgtcaaaga 1260
catgtcagct tagctattgt ttacaatctg tggatttact tacagctgac agatgatgaa 1320
agtattttga ctgacggtgg actggatttg ctcgttgaaa ccacgaagtt ttggttaaac 1380
aaagcagaat tgggaagtga tagccgctat catatcgctg gtgtcatggg tcctgatgaa 1440
tatcatgagg cttatccagg gcaagaaggt ggtatttgcg ataatgctta tacgaatttg 1500
atgctgactt ggcagttaaa ttggctgaca gagctgtcag tgaaaggttt tgaaattcca 1560
gcagatttgc ttgaagagtc acaaaaggtt cgggaaaatc tttatttaga tattgatgag 1620
aatggtgtga ttgcccaata tgctaagtat tttgagctta aagaagttga ttttgcagct 1680
tatgaagcaa aatatggcga tattcatcgg attgaccgtt tgatgaaggc tgagggaatt 1740
tcgcctgacg aatatcaagt ggctaaacaa gctgatacct tgatgttaat gtacaatttg 1800
ggtcatgaac atgtgatcaa attggtcaaa caattaggtt atgagctacc caaaaattgg 1860
ttgaaagtta atcgtgatta ttatcttgca cgaactgtcc atggttcaac gacatctcgt 1920
ccagtttttg ctgggattga tgtcaaattg ggtgattttg atgaagcgct tgacttttta 1980
atcactgcga ttggaagtga ttactatgat attcaaggcg gaaccacggc cgaaggggtt 2040
cacattgggg tcatgggaga aacacttgaa gtgattcaaa atgaatttgc cggtttgaca 2100
ctacgcgatg gatacttttc aattgctccg catttaccaa aaagttggac caaattgaaa 2160
ttcagtcaaa ttttcaaagg ttgtcaagtg gaaattttga ttgaaaaagg tcaattatta 2220
ctgacagctt catcagactt gctgattaaa gtttatgatg aggaagttca gttaaaagca 2280
ggagtacaag ctaattttga tttaaaataa 2310
<210> 2
<211> 769
<212> PRT
<213> Lactococcus lactis
<400> 2
Met Thr Asp Lys Asp Trp Met Ile Gln Tyr Asp Lys Gln Glu Val Gly
1                5                   10                  15
Lys Arg Ser Tyr Gly Gln Glu Ser Leu Met Ser Leu Gly Asn Gly Tyr
20                  25                  30
Leu Gly Leu Arg Gly Ala Pro Leu Trp Ala Thr Cys Ser Asp Asn His
35                  40                  45
Tyr Pro Gly Leu Tyr Val Ala Gly Val Phe Asn His Thr Ser Thr Glu
50                  55                  60
Val Ala Gly His Asp Val Ile Asn Glu Asp Met Val Asn Trp Pro Asn
65                  70                  75                  80
Pro Gln Leu Ile Lys Val Tyr Ile Asp Asn Glu Leu Val Asp Phe Glu
85                  90                  95
Ala Ala Ile Glu Lys Asn Ser Ser Ile Asp Phe Lys Asn Gly Leu Gln
100                  105                 110
Ile Glu Ser Tyr Asn Val Ser Leu Ala Lys Gly Gly Leu Thr Leu Val
115                 120                 125
Thr Thr Lys Phe Val Asp Pro Ile His Phe His Asp Phe Gly Phe Val
130                 135                 140
Gly Glu Ile Ile Ala Asp Phe Ser Gly Lys Leu Arg Ile Glu Thr Phe
145                 150                 155                 160
Ile Asp Gly Ser Val Leu Asn Gln Asn Val Glu Arg Tyr Arg Ala Phe
165                 170                 175
Asp Ser Lys Glu Phe Glu Val Thr Gln Ile Ala Asp Gly Leu Leu Val
180                 185                 190
Ala Lys Thr Arg Thr Thr Asp Ile Glu Leu Ala Val Ala Thr Lys Thr
195                 200                 205
Tyr Leu Asn Gly Gln Pro Leu Lys Lys Val Glu Ser Gly Asn Ser Glu
210                 215                 220
Ile Phe Lys Glu Ser Ile Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gln Glu Val
225                 230                 235                 240
Gln Phe Glu Lys Ser Ile Val Ile Ala Ser Ser Tyr Glu Thr Lys Asn
245                 250                 255
Pro Val Glu Phe Val Leu Thr Glu Leu Ala Ala Thr Ser Val Ser Lys
260                 265                 270
Ile Gln Glu Asn Asn Ala Asn Tyr Trp Glu Lys Val Trp Gln Asp Gly
275                 280                 285
Asp Ile Val Ile Glu Ser Asp His Ala Asp Leu Gln Arg Met Val Arg
290                 295                 300
Met Asn Ile Phe His Ile Arg Gln Ala Ala Gln His Gly Ala Asn Gln
305                 310                 315                 320
Phe Leu Asp Ala Ser Val Gly Ser Arg Gly Leu Thr Gly Glu Gly Tyr
325                 330                 335
Arg Gly His Ile Phe Trp Asp Glu Ile Phe Val Leu Pro Tyr Tyr Ala
340                 345                 350
Ala Asn Glu Pro Glu Thr Ala Arg Asp Leu Leu Leu Tyr Arg Ile Asn
355                 360                 365
Arg Leu Thr Ala Ala Gln Glu Asn Ala Lys Val Asp Gly Glu Ile Gly
370                 375                 380
Ala Met Phe Pro Trp Gln Ser Gly Leu Ile Gly Asp Glu Gln Ala Gln
385                 390                 395                 400
Phe Val His Leu Asn Thr Val Asn Asn Glu Trp Glu Pro Asp Asn Ser
405                 410                 415
Arg Arg Gln Arg His Val Ser Leu Ala Ile Val Tyr Asn Leu Trp Ile
420                 425                 430
Tyr Leu Gln Leu Thr Asp Asp Glu Ser Ile Leu Thr Asp Gly Gly Leu
435                 440                 445
Asp Leu Leu Val Glu Thr Thr Lys Phe Trp Leu Asn Lys Ala Glu Leu
450                 455                 460
Gly Ser Asp Ser Arg Tyr His Ile Ala Gly Val Met Gly Pro Asp Glu
465                 470                 475                 480
Tyr His Glu Ala Tyr Pro Gly Gln Glu Gly Gly Ile Cys Asp Asn Ala
485                 490                 495
Tyr Thr Asn Leu Met Leu Thr Trp Gln Leu Asn Trp Leu Thr Glu Leu
500                 505                 510
Ser Val Lys Gly Phe Glu Ile Pro Ala Asp Leu Leu Glu Glu Ser Gln
515                 520                 525
Lys Val Arg Glu Asn Leu Tyr Leu Asp Ile Asp Glu Asn Gly Val Ile
530                  535                540
Ala Gln Tyr Ala Lys Tyr Phe Glu Leu Lys Glu Val Asp Phe Ala Ala
545                 550                 555                 560
Tyr Glu Ala Lys Tyr Gly Asp Ile His Arg Ile Asp Arg Leu Met Lys
565                 570                 575
Ala Glu Gly Ile Ser Pro Asp Glu Tyr Gln Val Ala Lys Gln Ala Asp
580                 585                 590
Thr Leu Met Leu Met Tyr Asn Leu Gly His Glu His Val Ile Lys Leu
595                 600                 605
Val Lys Gln Leu Gly Tyr Glu Leu Pro Lys Asn Trp Leu Lys Val Asn
610                 615                 620
Arg Asp Tyr Tyr Leu Ala Arg Thr Val His Gly Ser Thr Thr Ser Arg
625                630                  635                 640
Pro Val Phe Ala Gly Ile Asp Val Lys Leu Gly Asp Phe Asp Glu Ala
645                 650                 655
Leu Asp Phe Leu Ile Thr Ala Ile Gly Ser Asp Tyr Tyr Asp Ile Gln
660                 665                 670
Gly Gly Thr Thr Ala Glu Gly Val His Ile Gly Val Met Gly Glu Thr
675                 680                 685
Leu Glu Val Ile Gln Asn Glu Phe Ala Gly Leu Thr Leu Arg Asp Gly
690                 695                 700
Tyr Phe Ser Ile Ala Pro His Leu Pro Lys Ser Trp Thr Lys Leu Lys
705                 710                 715                 720
Phe Ser Gln Ile Phe Lys Gly Cys Gln Val Glu Ile Leu Ile Glu Lys
725                 730                 735
Gly Gln Leu Leu Leu Thr Ala Ser Ser Asp Leu Leu Ile Lys Val Tyr
740                 745                 750
Asp Glu Glu Val Gln Leu Lys Ala Gly Val Gln Ala Asn Phe Asp Leu
755                 760                 765
Lys
<210> 3
<211> 801
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 3
gtgacagaac cgttaaccga aacccctgaa ctatccgcga aatatgcctg gttttttgat 60
cttgatggaa cgctggcgga aatcaaaccg catcccgatc aggtcgtcgt gcctgacaat 120
attctgcaag gactacagct actggcaacc gcaagtgatg gtgcattggc attgatatca 180
gggcgctcaa tggtggagct tgacgcactg gcaaaacctt atcgcttccc gttagcgggc 240
gtgcatgggg cggagcgccg tgacatcaat ggtaaaacac atatcgttca tctgccggat 300
gcgattgcgc gtgatattag cgtgcaactg catacagtca tcgctcagta tcccggcgcg 360
gagctggagg cgaaagggat ggcttttgcg ctgcattatc gtcaggctcc gcagcatgaa 420
gacgcattaa tgacattagc gcaacgtatt actcagatct ggccacaaat ggcgttacag 480
cagggaaagt gtgttgtcga gatcaaaccg agaggtacca gtaaaggtga ggcaattgca 540
gcttttatgc aggaagctcc ctttatcggg cgaacgcccg tatttctggg cgatgattta 600
accgatgaat ctggcttcgc agtcgttaac cgactgggcg gaatgtcagt aaaaattggc 660
acaggtgcaa ctcaggcatc atggcgactg gcgggtgtgc cggatgtctg gagctggctt 720
gaaatgataa ccaccgcatt acaacaaaaa agagaaaata acaggagtga tgactatgag 780
tcgtttagtc gtagtatcta a 801
<210> 4
<211> 266
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 4
Met Thr Glu Pro Leu Thr Glu Thr Pro Glu Leu Ser Ala Lys Tyr Ala
1                5                  10                   15
Trp Phe Phe Asp Leu Asp Gly Thr Leu Ala Glu Ile Lys Pro His Pro
20                  25                  30
Asp Gln Val Val Val Pro Asp Asn Ile Leu Gln Gly Leu Gln Leu Leu
35                  40                  45
Ala Thr Ala Ser Asp Gly Ala Leu Ala Leu Ile Ser Gly Arg Ser Met
50                  55                  60
Val Glu Leu Asp Ala Leu Ala Lys Pro Tyr Arg Phe Pro Leu Ala Gly
65                  70                  75                  80
Val His Gly Ala Glu Arg Arg Asp Ile Asn Gly Lys Thr His Ile Val
85                  90                  95
His Leu Pro Asp Ala Ile Ala Arg Asp Ile Ser Val Gln Leu His Thr
100                 105                 110
Val Ile Ala Gln Tyr Pro Gly Ala Glu Leu Glu Ala Lys Gly Met Ala
115                 120                 125
Phe Ala Leu His Tyr Arg Gln Ala Pro Gln His Glu Asp Ala Leu Met
130                 135                 140
Thr Leu Ala Gln Arg Ile Thr Gln Ile Trp Pro Gln Met Ala Leu Gln
145                 150                 155                 160
Gln Gly Lys Cys Val Val Glu Ile Lys Pro Arg Gly Thr Ser Lys Gly
165                 170                 175
Glu Ala Ile Ala Ala Phe Met Gln Glu Ala Pro Phe Ile Gly Arg Thr
180                 185                 190
Pro Val Phe Leu Gly Asp Asp Leu Thr Asp Glu Ser Gly Phe Ala Val
195                 200                 205
Val Asn Arg Leu Gly Gly Met Ser Val Lys Ile Gly Thr Gly Ala Thr
210                 215                 220
Gln Ala Ser Trp Arg Leu Ala Gly Val Pro Asp Val Trp Ser Trp Leu
225                 230                 235                 240
Glu Met Ile Thr Thr Ala Leu Gln Gln Lys Arg Glu Asn Asn Arg Ser
245                 250                 255
Asp Asp Tyr Glu Ser Phe Ser Arg Ser Ile
260                 265
<210> 5
<211> 1425
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 5
atgagtcgtt tagtcgtagt atctaaccgg attgcaccac cagacgagca cgccgccagt 60
gccggtggcc ttgccgttgg catactgggg gcactgaaag ccgcaggcgg actgtggttt 120
ggctggagtg gtgaaacagg gaatgaggat cagccgctaa aaaaggtgaa aaaaggtaac 180
attacgtggg cctcttttaa cctcagcgaa caggaccttg acgaatacta caaccaattc 240
tccaatgccg ttctctggcc cgcttttcat tatcggctcg atctggtgca atttcagcgt 300
cctgcctggg acggctatct acgcgtaaat gcgttgctgg cagataaatt actgccgctg 360
ttgcaagacg atgacattat ctggatccac gattatcacc tgttgccatt tgcgcatgaa 420
ttacgcaaac ggggagtgaa taatcgcatt ggtttctttc tgcatattcc tttcccgaca 480
ccggaaatct tcaacgcgct gccgacatat gacaccttgc ttgaacagct ttgtgattat 540
gatttgctgg gtttccagac agaaaacgat cgtctggcgt tcctggattg tctttctaac 600
ctgacccgcg tcacgacacg tagcgcaaaa agccatacag cctggggcaa agcatttcga 660
acagaagtct acccgatcgg cattgaaccg aaagaaatag ccaaacaggc tgccgggcca 720
ctgccgccaa aactggcgca acttaaagcg gaactgaaaa acgtacaaaa tatcttttct 780
gtcgaacggc tggattattc caaaggtttg ccagagcgtt ttctcgccta tgaagcgttg 840
ctggaaaaat atccgcagca tcatggtaaa attcgttata cccagattgc accaacgtcg 900
cgtggtgatg tgcaagccta tcaggatatt cgtcatcagc tcgaaaatga agctggacga 960
attaatggta aatacgggca attaggctgg acgccgcttt attatttgaa tcagcatttt 1020
gaccgtaaat tactgatgaa aatattccgc tactctgacg tgggcttagt gacgccactg 1080
cgtgacggga tgaacctggt agcaaaagag tatgttgctg ctcaggaccc agccaatccg 1140
ggcgttcttg ttctttcgca atttgcggga gcggcaaacg agttaacgtc ggcgttaatt 1200
gttaacccct acgatcgtga cgaagttgca gctgcgctgg atcgtgcatt gactatgtcg 1260
ctggcggaac gtatttcccg tcatgcagaa atgctggacg ttatcgtgaa aaacgatatt 1320
aaccactggc aggagtgctt cattagcgac ctaaagcaga tagttccgcg aagcgcggaa 1380
agccagcagc gcgataaagt tgctaccttt ccaaagcttg cgtag 1425
<210> 6
<211> 474
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 6
Met Ser Arg Leu Val Val Val Ser Asn Arg Ile Ala Pro Pro Asp Glu
1                5                  10                   15
His Ala Ala Ser Ala Gly Gly Leu Ala Val Gly Ile Leu Gly Ala Leu
20                   25                  30
Lys Ala Ala Gly Gly Leu Trp Phe Gly Trp Ser Gly Glu Thr Gly Asn
35                   40                  45
Glu Asp Gln Pro Leu Lys Lys Val Lys Lys Gly Asn Ile Thr Trp Ala
50                  55                  60
Ser Phe Asn Leu Ser Glu Gln Asp Leu Asp Glu Tyr Tyr Asn Gln Phe
65                  70                  75                  80
Ser Asn Ala Val Leu Trp Pro Ala Phe His Tyr Arg Leu Asp Leu Val
85                  90                   95
Gln Phe Gln Arg Pro Ala Trp Asp Gly Tyr Leu Arg Val Asn Ala Leu
100                 105                 110
Leu Ala Asp Lys Leu Leu Pro Leu Leu Gln Asp Asp Asp Ile Ile Trp
115                 120                 125
Ile His Asp Tyr His Leu Leu Pro Phe Ala His Glu Leu Arg Lys Arg
130                 135                 140
Gly Val Asn Asn Arg Ile Gly Phe Phe Leu His Ile Pro Phe Pro Thr
145                 150                 155                 160
Pro Glu Ile Phe Asn Ala Leu Pro Thr Tyr Asp Thr Leu Leu Glu Gln
165                 170                 175
Leu Cys Asp Tyr Asp Leu Leu Gly Phe Gln Thr Glu Asn Asp Arg Leu
180                 185                 190
Ala Phe Leu Asp Cys Leu Ser Asn Leu Thr Arg Val Thr Thr Arg Ser
195                 200                 205
Ala Lys Ser His Thr Ala Trp Gly Lys Ala Phe Arg Thr Glu Val Tyr
210                 215                 220
Pro Ile Gly Ile Glu Pro Lys Glu Ile Ala Lys Gln Ala Ala Gly Pro
225                 230                 235                 240
Leu Pro Pro Lys Leu Ala Gln Leu Lys Ala Glu Leu Lys Asn Val Gln
245                 250                 255
Asn Ile Phe Ser Val Glu Arg Leu Asp Tyr Ser Lys Gly Leu Pro Glu
260                 265                 270
Arg Phe Leu Ala Tyr Glu Ala Leu Leu Glu Lys Tyr Pro Gln His His
275                 280                 285
Gly Lys Ile Arg Tyr Thr Gln Ile Ala Pro Thr Ser Arg Gly Asp Val
290                 295                 300
Gln Ala Tyr Gln Asp Ile Arg His Gln Leu Glu Asn Glu Ala Gly Arg
305                 310                 315                 320
Ile Asn Gly Lys Tyr Gly Gln Leu Gly Trp Thr Pro Leu Tyr Tyr Leu
325                 330                 335
Asn Gln His Phe Asp Arg Lys Leu Leu Met Lys Ile Phe Arg Tyr Ser
340                 345                 350
Asp Val Gly Leu Val Thr Pro Leu Arg Asp Gly Met Asn Leu Val Ala
355                 360                 365
Lys Glu Tyr Val Ala Ala Gln Asp Pro Ala Asn Pro Gly Val Leu Val
370                 375                 380
Leu Ser Gln Phe Ala Gly Ala Ala Asn Glu Leu Thr Ser Ala Leu Ile
385                 390                 395                 400
Val Asn Pro Tyr Asp Arg Asp Glu Val Ala Ala Ala Leu Asp Arg Ala
405                 410                 415
Leu Thr Met Ser Leu Ala Glu Arg Ile Ser Arg His Ala Glu Met Leu
420                 425                 430
Asp Val Ile Val Lys Asn Asp Ile Asn His Trp Gln Glu Cys Phe Ile
435                 440                 445
Ser Asp Leu Lys Gln Ile Val Pro Arg Ser Ala Glu Ser Gln Gln Arg
450                 455                 460
Asp Lys Val Ala Thr Phe Pro Lys Leu Ala
465                 470
<210> 7
<211> 1338
<212> DNA
<213> Lactococcus lactis
<400> 7
atgaacaatt ttattcaaaa caaaatcatg cctccaatga tgaaattttt gaatacccgt 60
gcagtcacgg caatcaaaaa tggtatgatt tatcctatcc catttatcat tattggttca 120
gtattcttga ttcttggtca actgccattc caagcaggac aagacttcat gaacaaaatc 180
aaattgggcc cactcttttt acaaattaat aatgcttcat ttggtattat ggctttgctt 240
gccgtgttcg gtattgctta cgcttgggtt cgagatgcag gttatgaagg agtacccgct 300
ggtttaacag gtgtcattgt tcacatcttg ttgcaaccag acacaatcca tcaagtaaca 360
agtgttactg acccaactaa aacatcaaca gcatttcaag taggtggtgt cattgaccga 420
gcttggttag gtgggaaagg gatggttctc tcaatcatcg ttggactctt agtaggttgg 480
atttacactg gctttatgcg tcggaacatc acaatcaaaa tgccagaaca agttccagaa 540
aacgttgccg catcatttac ttcacttgta cctgcaggag caatcattac aatggctggt 600
gtggttcatg gaatcacaac gattggcttc aacacaactt tcattgagtt agtttataaa 660
tggattcaaa caccattgca acacgtgact gacggtccgg ttggggtctt cgttattgcc 720
tttatgccag tatttatctg gtggttcggt gttcacggag cgacaatcat tggtgggatt 780
atgggaccat tgcttcaagc aaactctgct gacaatgctg ctctctacaa agcaggacat 840
cttagcctgt caaatggcgc ccatatcgtt actcaatcat ttatggacca atacttgaca 900
gttactggtt ctggtttgac cattggtttg gttatcttcc tcttagtgag tgcaaaatca 960
gttcaaggta aaactttagg acgaatggaa attggacctg cagtattcaa tatcaacgaa 1020
cctattctgt ttggacttcc tatcgttttg aatccaattc ttgctattcc atttatcttg 1080
gctccgttga tttcaggaat tttgacttac ttagtgattt atctaggaat cattccacca 1140
tttaatggtg cctatgttcc ttggacaacc cctgcggtct tgtcaggata tctagtaggt 1200
ggctggcaag gtatggtttg gcaaattatt attcttgctt tgaccacagt tctctattgg 1260
ccatttgcca aagcttatga caatattctt ctgaaagaag aagctgaaac agaagctgga 1320
attaatgctg ccgaataa 1338
<210> 8
<211> 445
<212> PRT
<213> Lactococcus lactis
<400> 8
Met Asn Asn Phe Ile Gln Asn Lys Ile Met Pro Pro Met Met Lys Phe
1                5                  10                  15
Leu Asn Thr Arg Ala Val Thr Ala Ile Lys Asn Gly Met Ile Tyr Pro
20                  25                   30
Ile Pro Phe Ile Ile Ile Gly Ser Val Phe Leu Ile Leu Gly Gln Leu
35                  40                  45
Pro Phe Gln Ala Gly Gln Asp Phe Met Asn Lys Ile Lys Leu Gly Pro
50                   55                 60
Leu Phe Leu Gln Ile Asn Asn Ala Ser Phe Gly Ile Met Ala Leu Leu
65                  70                  75                  80
Ala Val Phe Gly Ile Ala Tyr Ala Trp Val Arg Asp Ala Gly Tyr Glu
85                 90                   95
Gly Val Pro Ala Gly Leu Thr Gly Val Ile Val His Ile Leu Leu Gln
100                 105                 110
Pro Asp Thr Ile His Gln Val Thr Ser Val Thr Asp Pro Thr Lys Thr
115                 120                 125
Ser Thr Ala Phe Gln Val Gly Gly Val Ile Asp Arg Ala Trp Leu Gly
130                 135                 140
Gly Lys Gly Met Val Leu Ser Ile Ile Val Gly Leu Leu Val Gly Trp
145                 150                 155                 160
Ile Tyr Thr Gly Phe Met Arg Arg Asn Ile Thr Ile Lys Met Pro Glu
165                 170                 175
Gln Val Pro Glu Asn Val Ala Ala Ser Phe Thr Ser Leu Val Pro Ala
180                 185                 190
Gly Ala Ile Ile Thr Met Ala Gly Val Val His Gly Ile Thr Thr Ile
195                 200                 205
Gly Phe Asn Thr Thr Phe Ile Glu Leu Val Tyr Lys Trp Ile Gln Thr
210                 215                 220
Pro Leu Gln His Val Thr Asp Gly Pro Val Gly Val Phe Val Ile Ala
225                 230                 235                 240
Phe Met Pro Val Phe Ile Trp Trp Phe Gly Val His Gly Ala Thr Ile
245                 250                 255
Ile Gly Gly Ile Met Gly Pro Leu Leu Gln Ala Asn Ser Ala Asp Asn
260                 265                 270
Ala Ala Leu Tyr Lys Ala Gly His Leu Ser Leu Ser Asn Gly Ala His
275                 280                 285
Ile Val Thr Gln Ser Phe Met Asp Gln Tyr Leu Thr Val Thr Gly Ser
290                 295                 300
Gly Leu Thr Ile Gly Leu Val Ile Phe Leu Leu Val Ser Ala Lys Ser
305                 310                 315                 320
Val Gln Gly Lys Thr Leu Gly Arg Met Glu Ile Gly Pro Ala Val Phe
325                 330                 335
Asn Ile Asn Glu Pro Ile Leu Phe Gly Leu Pro Ile Val Leu Asn Pro
340                 345                 350
Ile Leu Ala Ile Pro Phe Ile Leu Ala Pro Leu Ile Ser Gly Ile Leu
355                 360                 365
Thr Tyr Leu Val Ile Tyr Leu Gly Ile Ile Pro Pro Phe Asn Gly Ala
370                 375                 380
Tyr Val Pro Trp Thr Thr Pro Ala Val Leu Ser Gly Tyr Leu Val Gly
385                 390                 395                 400
Gly Trp Gln Gly Met Val Trp Gln Ile Ile Ile Leu Ala Leu Thr Thr
405                 410                 415
Val Leu Tyr Trp Pro Phe Ala Lys Ala Tyr Asp Asn Ile Leu Leu Lys
420                 425                 430
Glu Glu Ala Glu Thr Glu Ala Gly Ile Asn Ala Ala Glu
435                 440                 445
<210> 9
<211> 486
<212> DNA
<213> Lactococcus lactis
<400> 9
atgtttggaa taggaaaaaa gaaagaattg agagatgata aaagccttta tgctccagtt 60
tctggggaag ttatcaacct ttcaacagtc aacgaccccg tattttcaaa aaagataatg 120
ggagacgggt tcgcggttga gccaaaagaa aataaaattt ttgccccagt ttctgcaaaa 180
gtaactttgg ttcaaggaca tgcaattggt tttaaacgtg ctgatggctt agatgtactt 240
ttacatcttg gaattgatac agtagctctt aaaggtcttc attttaaaat caaggtcaaa 300
gttgatgata ttgtcaatgg tggtgatgag cttggaagcg ttgattgggc acagattgaa 360
gctgcaggtt tagataaaac gacaatggtt atctttacaa atacaaaaga taaactctct 420
gagttcaatg tcaattatgg accagctact tctggaagtg aacttggtaa ggcaagtgtt 480
aaataa 486
<210> 10
<211> 161
<212> PRT
<213> Lactococcus lactis
<400> 10
Met Phe Gly Ile Gly Lys Lys Lys Glu Leu Arg Asp Asp Lys Ser Leu
1                5                  10                   15
Tyr Ala Pro Val Ser Gly Glu Val Ile Asn Leu Ser Thr Val Asn Asp
20                   25                 30
Pro Val Phe Ser Lys Lys Ile Met Gly Asp Gly Phe Ala Val Glu Pro
35                 40                  45
Lys Glu Asn Lys Ile Phe Ala Pro Val Ser Ala Lys Val Thr Leu Val
50                  55                  60
Gln Gly His Ala Ile Gly Phe Lys Arg Ala Asp Gly Leu Asp Val Leu
65                  70                  75                   80
Leu His Leu Gly Ile Asp Thr Val Ala Leu Lys Gly Leu His Phe Lys
85                  90                  95
Ile Lys Val Lys Val Asp Asp Ile Val Asn Gly Gly Asp Glu Leu Gly
100                 105                 110
Ser Val Asp Trp Ala Gln Ile Glu Ala Ala Gly Leu Asp Lys Thr Thr
115                 120                 125
Met Val Ile Phe Thr Asn Thr Lys Asp Lys Leu Ser Glu Phe Asn Val
130                 135                 140
Asn Tyr Gly Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Leu Gly Lys Ala Ser Val
145                 150                 155                  160
Lys
<210> 11
<211> 1566
<212> DNA
<213> Lactococcus lactis
<400> 11
atggcaaatt attcacaact tgcgacagaa attatcgcaa atgtaggtgg cgctgagaat 60
gtcacaaaag ttattcactg tatcactcgt cttcgtttta ccttgaaaga caaagataaa 120
gcagatacgg cggcgattga agccttacct ggtgtcgctg gagctgttta taactcaaac 180
ttgaatcaat atcaagtagt tattggacaa gctgtagaag atgtttatga cgaggttgtt 240
gaacagcttg gagattcagt tgttgatgaa gatgcaacgg cgcaagcact tgctgcaaca 300
gcaccggcta gtggtaaaaa acaaaatcca attgttcatg ctttccaagt ggttattggg 360
acaattacag gttcgatgat tccaattatt ggtttacttg cggctggtgg gatgattaat 420
ggattattaa gtatctttgt taaaggaaat cgtttaattg aagtgattga ccctgcaagt 480
tcaacttacg tcattatctc aactctagca atgacaccat tttatttctt acctgtttta 540
gtaggatttt cagcagcaaa acaattagca cctaaagata ctgttttaca atttattggt 600
gctgctgttg gtggtttcat gattaatcca gggattacta acttggtaaa tgctcatgtt 660
ggaacaaatg cggccggtaa aaatgttgtt gttgaagcag cagctccagt agcaaatttc 720
cttggagtca cttttaatac aagttatttt ggaattccgg ttgctttgcc aagttatgct 780
tatacaattt tcccaatcat tgtggcggta gcaatcgcta aacctttgaa tgcttggttg 840
aaaaaggttt taccacttgc cttgcgtcca attttccaac cgatgattac tttcttcatc 900
actgcttcaa tcattttact cttggtcggt cctgttattt caacaatttc atctggtttg 960
tcattcgtta ttgaccatat cttgtcatta aacttaggga ttgcaagtat tatcgtcggt 1020
ggtttgtatc aatgtttggt tatatttggt ttgcactggt tggttgtacc acttatttca 1080
caagagttgg cagcaacagg agcaagctca cttaatatga ttgttagctt cacaatgctt 1140
gcgcaaggag ttggtgcctt gactgtcttc tttaaatcta aaaaagctga ccttaaagga 1200
ctttctgctc cagctgccat ttcggctttt tgtggagtaa ctgaacctgc catgtacgga 1260
attaacttga aatatgttcg cgtcttcatc atgtcttcaa ttggtgcagc aattggtgct 1320
gggattgccg gatttggtgg cttacaaatg tttggatttt cagggtcatt gattagtttt 1380
cctaacttta tctctaatcc attgacgcat catgcacctg cgggtaactt aatgctcttc 1440
tggattgcca ctgcggtatg tgctgttgcc actttcttat tagtttggtt ctttggttac 1500
aaggatactg atgtcatggg acaaggagtt gaacaaaaaa atgcatttaa ggatgctgta 1560
aaataa 1566
<210> 12
<211> 521
<212> PRT
<213> Lactococcus lactis
<400> 12
Met Ala Asn Tyr Ser Gln Leu Ala Thr Glu Ile Ile Ala Asn Val Gly
1                5                  10                   15
Gly Ala Glu Asn Val Thr Lys Val Ile His Cys Ile Thr Arg Leu Arg
20                  25                  30
Phe Thr Leu Lys Asp Lys Asp Lys Ala Asp Thr Ala Ala Ile Glu Ala
35                  40                  45
Leu Pro Gly Val Ala Gly Ala Val Tyr Asn Ser Asn Leu Asn Gln Tyr
50                  55                  60
Gln Val Val Ile Gly Gln Ala Val Glu Asp Val Tyr Asp Glu Val Val
65                  70                  75                  80
Glu Gln Leu Gly Asp Ser Val Val Asp Glu Asp Ala Thr Ala Gln Ala
85                  90                  95
Leu Ala Ala Thr Ala Pro Ala Ser Gly Lys Lys Gln Asn Pro Ile Val
100                 105                 110
His Ala Phe Gln Val Val Ile Gly Thr Ile Thr Gly Ser Met Ile Pro
115                 120                 125
Ile Ile Gly Leu Leu Ala Ala Gly Gly Met Ile Asn Gly Leu Leu Ser
130                 135                 140
Ile Phe Val Lys Gly Asn Arg Leu Ile Glu Val Ile Asp Pro Ala Ser
145                 150                 155                 160
Ser Thr Tyr Val Ile Ile Ser Thr Leu Ala Met Thr Pro Phe Tyr Phe
165                 170                 175
Leu Pro Val Leu Val Gly Phe Ser Ala Ala Lys Gln Leu Ala Pro Lys
180                 185                 190
Asp Thr Val Leu Gln Phe Ile Gly Ala Ala Val Gly Gly Phe Met Ile
195                 200                 205
Asn Pro Gly Ile Thr Asn Leu Val Asn Ala His Val Gly Thr Asn Ala
210                 215                 220
Ala Gly Lys Asn Val Val Val Glu Ala Ala Ala Pro Val Ala Asn Phe
225                 230                 235                 240
Leu Gly Val Thr Phe Asn Thr Ser Tyr Phe Gly Ile Pro Val Ala Leu
245                 250                 255
Pro Ser Tyr Ala Tyr Thr Ile Phe Pro Ile Ile Val Ala Val Ala Ile
260                 265                 270
Ala Lys Pro Leu Asn Ala Trp Leu Lys Lys Val Leu Pro Leu Ala Leu
275                 280                 285
Arg Pro Ile Phe Gln Pro Met Ile Thr Phe Phe Ile Thr Ala Ser Ile
290                 295                 300
Ile Leu Leu Leu Val Gly Pro Val Ile Ser Thr Ile Ser Ser Gly Leu
305                 310                 315                 320
Ser Phe Val Ile Asp His Ile Leu Ser Leu Asn Leu Gly Ile Ala Ser
325                 330                 335
Ile Ile Val Gly Gly Leu Tyr Gln Cys Leu Val Ile Phe Gly Leu His
340                 345                 350
Trp Leu Val Val Pro Leu Ile Ser Gln Glu Leu Ala Ala Thr Gly Ala
355                 360                 365
Ser Ser Leu Asn Met Ile Val Ser Phe Thr Met Leu Ala Gln Gly Val
370                 375                 380
Gly Ala Leu Thr Val Phe Phe Lys Ser Lys Lys Ala Asp Leu Lys Gly
385                 390                 395                 400
Leu Ser Ala Pro Ala Ala Ile Ser Ala Phe Cys Gly Val Thr Glu Pro
405                 410                 415
Ala Met Tyr Gly Ile Asn Leu Lys Tyr Val Arg Val Phe Ile Met Ser
420                 425                 430
Ser Ile Gly Ala Ala Ile Gly Ala Gly Ile Ala Gly Phe Gly Gly Leu
435                 440                 445
Gln Met Phe Gly Phe Ser Gly Ser Leu Ile Ser Phe Pro Asn Phe Ile
450                 455                 460
Ser Asn Pro Leu Thr His His Ala Pro Ala Gly Asn Leu Met Leu Phe
465                 470                 475                 480
Trp Ile Ala Thr Ala Val Cys Ala Val Ala Thr Phe Leu Leu Val Trp
485                 490                 495
Phe Phe Gly Tyr Lys Asp Thr Asp Val Met Gly Gln Gly Val Glu Gln
500                 505                 510
Lys Asn Ala Phe Lys Asp Ala Val Lys
515                 520
<210> 13
<211> 107
<212> DNA
<213> Lactococcus lactis
<400> 13
aaaacgcctt aaaatggcat tttgacttgc aaactgggct aagatttgct aaaatgaaaa 60
atgcctatgt ttaaggtaaa aaacaaatgg aggacatttc taaaatg 107
<---