Локальная доставка генов VEGF и FGF2, стимулирующая регенерацию нерва

Список литературы

1. Ахтемийчук, Ю. Т. Архитектоника подвздошно-ободочной артерии в раннем периоде онтогенеза человека / Ю. Т. Ахтемийчук, Д. В. Проняев // Морфологические ведомости. - 2007. - № 1-2. -С.10-12.

2. Валишин, Э. С. Морфометрическая характеристика эндотелиоцитов кровеносного русла почки и двенадцатиперстной кишки у человека в пренатальном онтогенезе / Э. С. Валишин, О. Н. Еремеева // Морфологические ведомости. - 2009. - № 3-4. - С. 157-160.

3. Гайворонский, И. В. Ультраструктурные изменения сосудов гемомикроциркуляторного русла тощей кишки и нарушения всасывания углеводов и белков при портальной гипертензии / И. В. Гайворонский, В. П. Еременко // Морфология. - 1992. - Т. 102, № 2. - С. 86-98.

4. Елисеев, В. Г. Основы гистологии и гистологической техники / В. Г. Елисеев. - М. : Медицина, 1967. - 268 с.

5. Зенин, О. К. Морфометрическая характеристика бифуркаций аркад кишечника / О. К. Зенин, Ю. В. Довгялло, Г. С. Кирьякулов и др. // Biomedical and Biosocial Anthropology. - 2004. -№ 2.- С. 148-152.

6. Павлинов, Б. Г. Теоретические и прикладные аспекты учения о паравазальных соединительнотканных структурах / Б. Г. Павлинов, Н. Д. Широченко, В. А. Батухтин и др. // Морфология. -2000. - № 3. - С. 92.

7. Paris, S. Peculiar morphological aspects of the superior mesenteric artery and its branches / S Paris, P. Bordei, D. Iliescu et al. // XVII international symposium on morphological science. - Timisoara, 2002. - P. 195-196.

Никель Виктория Викторовна, кандидат медицинских наук, доцент кафедры анатомии и гистологии человека, ГБОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет им. профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого» Минздрава России, Россия, 660022, г. Красноярск, ул. Партизана Железняка, д. 1, тел.: (391) 220-14-09, е-таП: vica-nic@mail.ru.

Касимцев Альберт Александрович, доктор медицинских наук, профессор кафедры анатомии и гистологии человека, ГБОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет им. профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого» Минздрава России, Россия, 660022, г. Красноярск, ул. Партизана Железняка, д. 1, тел.: (391) 220-14-09, е-таП: reсtor@krasgmu.ru.

Ефремова Влада Петровна, кандидат медицинских наук, доцент кафедры анатомии и гистологии человека, ГБОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет им. профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого» Минздрава России, Россия, 660022, г. Красноярск, ул. Партизана Железняка, д. 1, тел.: (391) 220-14-09, е-таП: reсtor@krasgmu.ru.

Батухтина Наталья Петровна, кандидат медицинских наук, доцент кафедры анатомии и гистологии человека, ГБОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет им. профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого» Минздрава России, Россия, 660022, г. Красноярск, ул. Партизана Железняка, д. 1, тел.: (391) 220-98-49, е-mail: гейо^к^ти.т.

УДК 616.833.58-001-085+612.818.92 © С. И. Николаев, А.Р. Галлямов, Ю.А. Челышев, 2013

С.И. Николаев1, А.Р. Галлямов2, Ю.А. Челышев1

ЛОКАЛЬНАЯ ДОСТАВКА ГЕНОВ VEGF И FGF2, СТИМУЛИРУЮЩАЯ РЕГЕНЕРАЦИЮ НЕРВА*

:ГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет» Минздрава России 2ГАУЗ «Республиканская клиническая больница» Минздрава Республики Татарстан, г. Казань

* Работа поддержана государственным контрактом ФЦП Министерства образования и науки Российской Федерации № 16.512.11.2101.

В условиях преодоления диастаза в седалищном нерве крысы при помощи аутонервной вставки прямая однократная инъекция в нерв плазмидного вектора с комбинацией генов сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) и фактора роста фибробластов 2 (FGF2) поддерживает популяцию SlOO-иммунопозитивных (шванновских) клеток и стимулирует регенерацию миелиновых волокон.

Ключевые слова: периферический нерв, регенерация, генная терапия, VEGF, FGF2.

S.I. Nikolaev, A.R. Gallyamov, Yu.A. Chelyshev

THE LOCAL DELIVERY OF VEGF AND FGF2 GENES, STIMULATING

NERVE REGENERATION

The direct single injection in nerve of plasmid vector with VEGF and FGF2 genes may support the population of S100-immunoreactive (Schwann) cells and stimulate the regeneration of myelinative fibers on the model of rat sciatic nerve autograft.

Key words: peripheral nerve, regeneration, gene therapy, VEGF, FGF2.

Введение. Доставка генов нейротрофических факторов в область повреждения считается одним из наиболее перспективных подходов к стимулированию нейрорегенерации [9, 11]. Работы по стимулированию посттравматической регенерации периферического нерва при помощи прямой генной терапии единичны [3, 6, 7]. В основном они реализованы с применением вирусных векторов, что не считается полностью безопасным из-за вероятности инсерционного мутагенеза, выраженного воспалительного и иммунного ответов и токсичности.

В качестве терапевтических генов в настоящей работе выбраны гены VEGF (vascular endothelial growth factor) и FGF2 (fibroblast growth factor 2). Оба фактора, кодируемые этими генами, рассматриваются как нейротрофические и одновременно ангиогенные, что имеет позитивное значение для поддержания процесса регенерации. В рамках прямой генной терапии эти гены доставляли по отдельности в область повреждения периферического нерва. Так, доставка плазмидного вектора с геном VEGF в область перерезки седалищного нерва крысы улучшала результаты регенерации и способствовала восстановлению функции [7]. Аллотрансплантация трансфицированных геном FGF2 шванновских клеток в составе силиконового кондуита, имплантируемого в 10 мм диастаз седалищного нерва крысы, поддерживала регенерацию миелиновых волокон [8]. На модели аутонервной вставки седалищного нерва крысы произведена оценка эффективности локального введения в область повреждения плазмиды pBud-VEGF-FGF2, экспрессирующей одновременно гены обоих факторов [1]. Прямое введение этой плазми-ды в центральный и периферический отрезки нерва, а также в саму аутонервную вставку, стимулирует регенерацию и восстановление двигательной функции. Однако при этом остаются неясными динамика количества миелиновых волокон, состояние и количество шванновских клеток.

Цель: оценить эффективность посттравматической регенерации седалищного нерва крысы в условиях прямого введения в область повреждения плазмидного вектора с комбинацией клонированных генов нейротрофических и одновременно ангиогенных факторов VEGF и FGF2.

Материалы и методы исследования. Эксперименты проведены на 17 белых лабораторных крысах обоего пола весом 200-250 г. Все процедуры с животными проводили в соответствии с правилами, рекомендованными Физиологической секцией Российского национального комитета по биологической этике. Животных содержали в стандартных условиях со свободным доступом к воде и корму. Крыс наркотизировали путем внутрибрюшинной инъекции хлоралгидрата (Sigma) (80 мг/мл, 0,4 мл на 100 г веса крысы).

В левом седалищном нерве на уровне середины бедра формировали диастаз длиной 5 мм, который преодолевали при помощи аутонервной вставки, забранной из этого же нерва. На каждый конец аутонервной вставки накладывали по два шва. Прооперированных животных разделили на две группы. В опытной группе животным через 7 суток после операции в три точки, в середине вставки, в центральном и периферическом отрезке нерва на расстоянии 2 мм от линии шва, с помощью шприца Hamilton (Sigma) инъецировали двухкассетную плазмиду pBud-VEGF-FGF2, экспрессирующую сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF) и фактор роста фибробластов 2 (FGF2) человека в количестве 10 мкг на физрастворе в объеме 5 мкл в каждую точку (30 мкг каждому животному). Животным контрольной подгруппы в тех же условиях инъецировали физраствор в аналогичном объеме.

Через 30 суток после операции под эфирным наркозом из периферического отрезка, прилежащего к вставке, забирали два фрагмента длиной по 5 мм. Из них проксимальный фрагмент фиксировали в 2,5 % глутаральдегиде и 2 % растворе четырехокиси осмия и заливали в эпон-аралдит. Дис-

тальный фрагмент периферического отрезка фиксировали в 10 % нейтральном формалине. Полутонкие поперечные срезы нерва, окрашенные метиленовым синим, использовали для подсчета количества миелиновых волокон во всей плоскости среза. Подсчет количества миелиновых волокон и иммунопо-зитивных (шванновских) клеток (SlOO-клеток) производили с оцифрованных изображений, полученных на микроскопе Leica DM-1000 (Германия) при увеличении объективов х 100 и х 40, соответственно. Срезы из периферического отрезка нерва толщиной 18 мкм изготавливали на криостате CRYO-STAR HM 560 и проводили пероксидазную иммуногистохимическую реакцию с моноклональными антителами против S100 (Millipore). При помощи флюоресцентной иммуногистохимии идентифицировали шванновские клетки с антителами против белка периферического миелина Р0 (Abcam) и низкоаффинного рецептора фактора роста нервов p75 (Santa Cruz). Ядра клеток дополнительно окрашивали DAPI (Sigma). Детали проведения иммуногистохимических реакций изложены ранее [2]. Срезы просматривали в конфокальном сканирующем микроскопе LSM 510-Meta (Carl Zeiss) (Германия). Результаты морфометрии подвергнуты статистической обработке с использованием метода анализа вариантов (ANOVA) и критерия Стьюдента (t).

Результаты исследования и их обсуждение. К 30 суткам после операции с преодолением диастаза при помощи аутонервной вставки структура нерва восстанавливается. В участке периферического отрезка нерва, прилегающего к аутонервной вставке, присутствуют сформированные миелино-вые волокна разного диаметра с четким контуром миелиновой оболочки. Количество этих волокон у животных в группе с введением плазмиды pBud-VEGF-FGF2 существенно увеличивается (p < 0,05) по сравнению с контролем (табл. 1).

К 30 суткам после операции или к концу третьей недели после инъекции плазмиды количество S100+-клеток в периферическом отрезке нерва возрастает в 2,4 раза (p < 0,05) (табл. 1). Эти клетки, идентифицируемые как шванновские, являются ключевыми для обеспечения регенерации нервных волокон. В условиях повреждения нерва они активно продуцируют FGF2 для обеспечения нейротро-фической поддержки растущих аксонов [5]. Предполагается, что доставка в область повреждения гена FGF2 при помощи плазмидного вектора стимулирует процесс нейрорегенерации.

Таблица 1

Влияние прямой инъекции плазмиды pBud-VEGF-FGF2 на количество S100+-клеток и миелиновых волокон в поперечном срезе периферического отрезка седалищного нерва крысы _на 30 сутки после преодоления диастаза при помощи аутонервной вставки_

Экспериментальные группы Количество S100+-клеток

Контрольная (физраствор) 627,6 ± 59,01 1055,1 ± 40,48

Опытная (pBud-VEGF-FGF2) 1533,4 ± 132,50 4676,4 ± 336,81

При нейродегенерации в утративших контакт с аксоном миелинобразующих шванновских клетках угнетается синтез поздних маркеров миелина, таких, как белки MBP и P0, и эти клетки начинают экспрессировать маркеры миелиннеобразующих шванновских клеток, в том числе белок p75 (рис. 1). В нормальных условиях низкоаффинный рецептор фактора роста нервов (NGF), белок p75, экспрессируется преимущественно миелиннеобразующими шванновскими клетками. В поврежденном нерве через этот рецепторный вход поддерживается эффективная миелинизация аксонов [4]. Оказалось, что среди многочисленных функций данного сигнального пути функция стимулирования процесса ремиелинизации, например, при периферических невропатиях и травматических повреждениях нервов является одной из наиболее важных [10].

Рис. 1. P0- и р75-иммунопозитивные клетки в периферическом отрезке седалищного нерва крысы на расстоянии 7 мм от дистальной линии шва с аутонервной вставкой на 30 сутки после операции и однократной инъекции плазмиды pBud-VEGF-FGF2. P0 - флюоресцентный краситель TRITC (желтый цвет), P75 - флюоресцентный краситель Alexa 647 (красный цвет), ядра окрашены DAPI (синий цвет).

Конфокальная микроскопия. Увеличение х 400.

Заключение. В условиях преодоления диастаза длиной 5 мм в седалищном нерве крысы при помощи аутонервной вставки прямая однократная инъекция плазмидного вектора с комбинацией генов нейротрофических и одновременно ангиогенных факторов VEGF и FGF2 поддерживает популяцию шванновских клеток и стимулирует регенерацию миелиновых волокон. К 30 суткам эксперимента в условиях прямой генной терапии в периферическом отрезке нерва показано увеличение в 2,4 раза количества 8100+-иммунопозитивных (шванновских) клеток и существенное увеличение количества регенерирующих миелиновых волокон.

Список литературы

1. Масгутов, Р. Ф. Стимуляция посттравматической регенерации седалищного нерва крысы с помощью плазмиды, экспрессирующей сосудистый эндотелиальный фактор роста и основной фактор роста фибробластов / Р. Ф. Масгутов, И. И. Салафутдинов, А. А. Богов и др. // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. - 2011. - № 3. - С. 67-70.

2. Шаймарданова, Г. Ф. Посттравматические изменения структуры спинного мозга крысы при трансплантации мононуклеарных клеток крови пуповины человека, модифицированных генами VEGF и FGF2 / Г. Ф. Шаймарданова, Я. О. Мухамедшина, С. С. Архипова и др. // Морфология. -2011. - № 6. - С. 36-42.

3. Alrashdan, M. S. Effects of combining electrical stimulation with BDNF gene transfer on the regeneration of crushed rat sciatic nerve / M. S. Alrashdan, M. A. Sung, Y. K. Kwon et al. // Acta Neurochir (Wien). - 2011. - Vol. 153, № 10. - P. 2021-2029.

4. Cosgaya, J. M. The neurotrophin receptor p75NTR as a positive modulator of myelination / J. M. Cosgaya, J. R. Chan, E. M. Shooter // Science. - 2002. - № 298. - P. 1245-1248.

5. Duobles, T. S100beta and fibroblast growth factor-2 are present in cultured Schwann cells and may exert paracrine actions on the peripheral nerve injury / T. Duobles, T. S. Lima, B. F. Levy et al. // Acta Cir Bras. - 2008. - Vol. 23, № 6. - P. 555-560.

6. Esaki, S. Hepatocyte growth factor incorporated into herpes simplex virus vector accelerates facial nerve regeneration after crush injury / S. Esaki, J. Kitoh, S. Katsumi et al. // Gene Ther. - 2011. - Vol. 18, № 11. - P. 1063-1069.

7. Fu, C. Favorable effect of local VEGF gene injection on axonal regeneration in the rat sciatic nerve / C. Fu, G. Hong, F. Wang // J. Huazhong Univ. Sci. Technolog. Med. Sci. - 2007. - Vol. 27, № 2. -P.186-189.

8. Haastert, K. The effects of FGF-2 gene therapy combined with voluntary exercise on axonal regeneration across peripheral nerve gaps / K. Haastert, Z. Ying, C. Grothe et al. // Neurosci Lett. - 2008. -Vol. 443, № 3. - P. 179-183.

9. Mason, M. R. Gene therapy for the peripheral nervous system: a strategy to repair the injured nerve / M. R. Mason, M. R. Tannemaat, M. J. Malessy et al. // Curr. Gene. Ther. - 2011. - Vol. 11, № 2. -P. 75-89.

10. Notterpek, L. Neurotrophins in myelination: a new role for a puzzling receptor / L. Notterpek // Trends in Neurosciences. - 2003. - Vol. 26, № 5. - P. 232-234.

11. Zhang, F. Gene transfer with DNA strand technique and peripheral nerve injuries / F. Zhang, W. C. Lineaweaver // J. Long Term. Eff. Med. Implants. - 2002. - Vol. 12, № 2. - P. 85-96.

Николаев Станислав Игоревич, аспирант кафедры гистологии, цитологии и эмбриологии, ГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет» Минздрава России, Республика Татарстан, 420012, г. Казань, ул. Бутлерова, д. 49, тел.: (843) 292-76-19, е-таП: chelyshev-kzn@yandex.ru.

Галлямов Алмаз Рафаэлевич, врач, ГАУЗ «Республиканская клиническая больница» МЗ Республики Татарстан, Республика Татарстан, 420064, г. Казань, ул. Оренбургский тракт, д. 138, тел.: (843) 269-42-95, е-таЛ: rkbrt.ru.

Челышев Юрий Александрович, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой гистологии, цитологии и эмбриологии, ГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет» Минздрава России, Республика Татарстан, 420012, г. Казань, ул. Бутлерова, д. 49, тел.: (843) 292-76-19, е-таП: chelyshev-kzn@yandex.ru.

УДК 612.014.4:611.441

© О.И. Новакова, С.В. Котельникова, А.В. Котельников, 2013

О.И. Новакова1, С.В. Котельникова2, А.В. Котельников2

СЕЗОННЫЕ ОСОБЕННОСТИ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ ТИРОЦИТОВ

У ЖИВОТНЫХ РАЗНОГО ПОЛА

:ГБОУ ВПО «Астраханская государственная медицинская академия» Минздрава России 2ФГБОУ ВПО «Астраханский государственный технический университет»

Изучено влияние различных сезонов года на функциональное состояние щитовидной железы. Вариационная кривая высоты тироцитов характеризуется правосторонней асимметрией у животных обоего пола. При этом наибольшие сезонные отличия отмечались у самцов при переходе от зимы к весне, а у самок - от весны к лету. Наибольших значений высота фолликулярного эпителия в пике кривой распределения у самцов достигает зимой, а наименьших - осенью, в то время как у самок напротив максимум вариационной кривой максимально смещен влево зимой, а вправо - в весенний период. Половые отличия в функционировании щитовидной железы отмечаются во все сезоны года, кроме весны.

Ключевые слова: щитовидная железа, высота тироцитов, сезоны, пол животного.

O.I. Novakova, S.V. Kotelnikova, A.V. Kotelnikov

SEASONAL FEATURES OF FUNCTIONAL STATUS THYROCYTES ANIMALS

OF DIFFERENT SEX

The effect of different seasons on the functional state of the thyroid gland was studied. The variation curve of the height of thyrocytes was characterized by right-sided asymmetry in animals of both sexes. The greatest seasonal difference was observed in males at the transition from winter to spring and females from spring to summer. The greatest value of the height of the follicular epithelium at the peak of the distribution curve of males reaching the winter and the lowest - in the autumn while in females, in contrast the maximum variation of the curve maximum was shifted to the