ПРИБОР ДЛЯ АВТОМАТИЗИРОВАННОГО БЕСКЛЕТОЧНОГО ПОЛУЧЕНИЯ БЕЛКОВ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЛКОВ С ПРИМЕНЕНИЕМ ДАННОГО ПРИБОРА
DEVICES FOR AUTOMATIC CELL-FREE PRODUCTION OF PROTEINS AND METHODS FOR PROTEINS PRODUCTION USING THIS PRODUCT

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к автоматизированной системе бесклеточного получения белка и к способу получения белка с применением данной системы. Более конкретно, настоящее изобретение относится к автоматизированной системе бесклеточного получения белка, включающей: блок реакции экспрессии белка, содержащий реакционный сосуд, который включает множество диализных трубок, каждая из которых включает диализную мембрану и открыта сверху; блок контроля температуры реакции, сконфигурированный для нагревания или охлаждения реакционного сосуда; массив пипеток, включающий множество пипеток и сконфигурированный для набора или для слива растворов с помощью пипеток; блок движения массива пипеток, сконфигурированный для движения массива пипеток в направлении вверх и вниз, в прямом и в обратном направлении или в направлении влево и вправо, для того, чтобы перемещать растворы; блок очистки белка, включающий устройство применения магнитного поля; и блок закрепления многолуночного планшета, содержащий закрепленный в нем набор многолуночных планшетов, сконфигурированный для подачи растворов, которые используются для получения белка, и к способу получения белка с использованием данной системы.
Кроме того, более конкретно, настоящее изобретение относится к автоматизированной системе получения белка и к способу, с помощью которого можно синтезировать свободный от аффинной метки чистый белок и с помощью которого можно автоматизировано и быстро заменять раствор элюата, содержащий конечный очищенный белок с целевым буфером для хранения белка с помощью многостадийного диализа, и таким образом, можно автоматизировано и удобно получать множество белков в больших количествах.
Кроме того, настоящее изобретение относится к реакционному набору для автоматизированного бесклеточного получения белка, который включает набор многолуночных планшетов для хранения раствора, необходимого для получения белка, и диализную трубку, включающую диализную мембрану.
Уровень техники
Обычно способы получения рекомбинантных белков осуществляют с использованием различных клеточных линий, таких как Е. coli, дрожжевые и животные клетки. Эти способы включают трансформацию вектора, экспрессирующего рекомбинантый белок, в клеточную линию, культивирование клеточной линии для экспрессии целевого белка и лизис клеток для очистки целевого белка.
Этим способам необходим процесс отбора штамма по стабильной экспрессии рекомбинантного белка с последующим осуществлением ряда процессов, включающих культивирование клеток, разрушение клеток и очистку белка. Таким образом, эти способы требуют большие количества времени и усилий.
Кроме того, цитотоксические белки или мембранные белки трудно экспрессировать. Таким образом, в случае этих белков необходимо предпринять множество усилий, таких как подбор различных условий экспрессии. Поэтому существует проблема, которая заключается в том, что для получения одного белка необходимо потратить от нескольких дней до нескольких месяцев.
Для преодоления этой проблемы были разработаны бесклеточные способы экспрессии белка для экспрессии белка в реакционном сосуде, таком как пробирка, в течение короткого периода времени без использования клеток, а также были разработаны ассоциированные с этими способами продукты. Эти способы предназначены для экспрессии целевого белка без клеточной культуры. В этих способах используется вектор, содержащий ген-мишень, клеточный экстракт, полученный с помощью выделения/очистки после культивирования клеток, и раствор для экспрессии белка, включающий аминокислоты, трифосфат рибонуклеиновую кислоту, источник энергии и буфер. В этих способах ген, кодирующий целевой белок, транскрибируется в мРНК с помощью РНК-полимеразы, содержащейся в клеточном экстракте, и мРНК транслируется в белок с использованием рибосомы, тРНК и тому подобного, содержащихся в клеточном экстракте.
Бесклеточный способ экспрессии белка был коммерциализирован «Roche», «Promega» и другими. В данном способе матричная ДНК (например, экспрессирующий вектор, ПЦР-продукт и т.д.), способная экспрессировать белок, клеточный лизат и раствор для экспрессии, включающий аминокислоты, трифосфат рибонуклеиновые кислоты и источник энергии добавляют в пробирку, и затем дают возможность пройти реакции при подходящей температуре (30-40°С) в течение подходящего времени (1-3 часа) для экспрессии целевого белка. Данный способ предпочтителен по отношению к способу экспрессии белка с использованием клеток в том, что требуется значительно меньшее количество времени, а также могут экспрессироваться цитотоксические белки или мембранные белки.
Кроме того, были разработаны системы, способные продуцировать белки подходящим образом с помощью автоматизированного осуществления бесклеточной экспрессии белка.
Такие системы включают RTS (Система быстрой трансляции), разработанную «Roche». RTS может осуществлять бесклеточную экспрессию белка с высокой эффективностью. В данной системе диализная мембрана располагается на дне реакционного сосуда для предотвращения остановки реакции из-за истощения источника энергии и накопления ингибитора белкового синтеза, такого как фосфорная кислота, в ходе бесклеточной экспрессии белка. Для диализа данный реакционный сосуд помещают, по меньшей мере, в сосуд 10-кратного объема, содержащий раствор низкомолекулярных соединений для экспрессии с целью максимизации реакции. Как описано у Kim, D.-M. and Choi, C.-Y., Biotechnol. Prog., 12(5):645, 1996, данный принцип основан на принципе, согласно которому уровень экспрессии белка может быть повышен до 10 раз путем непрерывной замены раствора низкомолекулярных соединений для экспрессии, содержащего трифосфат рибонуклеиновую кислоту, аминокислоты и источник энергии, через диализную мембрану.
Однако данный способ имеет проблему, которая заключается в том, что также должен использоваться раствор низкомолекулярных соединений для экспрессии, имеющий объем, соответствующий, по меньшей мере, 10-кратному объему раствора для экспрессии, при этом общий объем реакционного сосуда становится больше и, таким образом, размер системы значительно повышается, когда одновременно в одной параллели необходимо синтезировать различные типы белков. Кроме того, система не автоматизирована и может осуществлять только функцию перемешивания реакционного раствора при определенной температуре. Таким образом, по окончании реакции должен быть осуществлен отдельный процесс, такой как очистка синтезированного белка.
Институт RIKEN (Япония) сконструировал крупномасштабную систему автоматизированной экспрессии белка, хотя подробная структура системы не была объяснена (Alexander Spirin & James R. Swartz, Cell-Free Protein Synthesis, p103, Fig 6.3B). Yaeta Endo et al. разработали бесклеточный способ экспрессии белка с использованием экстракта зародышей пшеницы и разработали автоматизированную систему на основе принципа, отличного от системы RTS. Кроме того, Yaeta Endo et al. смогли повысить выход белковой экспрессии путем разведения раствора для бесклеточной экспрессии белка раствором низкомолекулярных соединений для экспрессии и концентрированием разведения (US 2006/0257997 A1).
Однако вышеописанная автоматизированная система имеет проблемы, заключающиеся в том, что система является дорогостоящей из-за своей сложной структуры, в ней отсутствует функция очистки белка, как в системе RTS, и с помощью нее затруднительно получать несколько типов белков.
При этом образец, содержащий рекомбинантный белок, экспрессированный с помощью клеточной культуры или с помощью метода бесклеточной экспрессии, включает различные типы белков дополнительно к белку-мишени. Для того, чтобы легко очистить белок-мишень из данного образца используется технология прикрепления аффинной метки (гистидиновая метка). В данной технологии при введении в матричный ген последовательности, кодирующей гистидиновую метку, ее прикрепляют к С- или к N-концу белка, экспрессируемого с матричного гена, и белок-мишень может быть легко получен с высокой чистотой путем выделения/очистки белка с использованием аффинности между меткой и ионами металлов (ионы никеля, ионы кобальта и т.д.).
Однако аффинная метка, которая используется для очистки, может оказывать отрицательное воздействие на активность и структуру целевого белка. По этой причине для получения белков-мишеней для исследования белковой функции и в медицинских целях необходим способ удаления метки.
Авторы изобретения (Bioneer) разработали автоматизированную систему белкового синтеза «ExiProgen™» (Публикации корейских патентов No. 10-2011-0121588 и 10-2013-0023091) и связанный набор реактивов. Данную систему сконфигурировали для автоматизированного проведения бесклеточной реакции белковой экспрессии и очистки экспрессированного белка. В данной системе матричная ДНК и растворы, требуемые для реакции, могут автоматизированно смешиваться с целью автоматизированного осуществления реакции белковой экспрессии и могут поддерживаться при подходящей температуре реакции. Кроме того, все процессы, включающие синтез РНК из ДНК и экспрессию белка из РНК, могут поддерживаться при оптимальной температуре. Кроме того, для облегчения очистки целевого белка из смеси образца, содержащей экспрессированный белок, аффинную метку, такую как олигогистидин, присоединяют к белку-мишени, и в таком состоянии белок-мишень экспрессируют и автоматизировано очищают с использованием магнитных микросфер, включающих ионы металлов (ионы никеля, кобальта и т.д.). Вышеописанные «ExiProgen™» и набор реактивов могут одновременно экспрессировать и очищать различные типы белков, но имеются проблемы, заключающиеся в том, что из-за массовой экспрессии белка источник энергии истощается с течением времени, и экспрессия белка прекращается при накоплении ингибитора экспрессии белка, и, таким образом, конечный уровень экспрессированного белка низкий.
Для повышения уровня экспрессии белка одновременно должны поставляться раствор низкомолекулярных соединений для экспрессии, содержащий трифосфат рибоуклеиновые кислоты, аминокислоты и источник энергии и удаляться ингибиторы экспрессии белка. Для автоматизированного осуществления таких операций требуются новые типы реактора и система.
Авторы настоящего изобретения предприняли усилия для разработки системы и набора реактивов, которые могут преодолеть недостатки низкой эффективности экспрессии белка автоматического белкового синтезатора «ExiProgen™», и в то же время повысить уровень экспрессии целевого белка при этом с исключением необходимости повышения размера системы благодаря применению раствора низкомолекулярных соединений для экспрессии в 10-кратном количестве или более по отношению к количеству раствора для экспрессии. В результате авторы настоящего изобретения разработали систему, способную повышать уровень экспрессии целевого белка путем одновременного снабжения раствором низкомолекулярных соединений для экспрессии с помощью диализной мембраны в процессе реакции бесклеточной экспрессии белка и удаления ингибиторов экспрессии белка.
Было обнаружено, что система, разработанная авторами настоящего изобретения, обладает эффектом повышения эффективности экспрессии белка при автоматизированном снабжении в течение нескольких стадий, может автоматизировано очищать экспрессированный белок как в стандартной системе «ExiProgen™», и может автоматизировано заменять раствор целевого белка, который содержит высококонцентрированный элюат, на буфер для хранения целевого белка после очистки.
Кроме того, авторы настоящего изобретения обнаружили, что при получении белка с удаляемой аффинной меткой, используемой для очистки, чистый белок может быть получен при автоматизированном удалении аффинной метки во время очистки белка путем обработки протеазой, которая распознает и расщепляет специфичную аминокислотную последовательность белка, что завершает настоящее изобретение.
Публикации предшествующего уровня техники
Патентные документы
Патентный документ 1: Корейский патент с регистрационным номером 10-0385298 В1 (13 мая 2003 года)
Патентный документ 2: Корейский патент с регистрационным номером 10-0534558 B1 (1 декабря 2005 года)
Патентный документ 3: Корейский патент с регистрационным номером 10-0733712 B1 (23 июня 2007 года)
Патентный документ 4: Заявка на патент США No. 2006-0257997 A1 (16 ноября 2006 года)
Непатентные документы:
Cheolju Lee, et al., Development of High-Throughput Protein Production Technology, Ministry of Science and Technology, 17-30, 2005
Alexander Spirin & James R. Swartz, Cell-Free Protein Synthesis, p103, Fig 6.3B
Описание изобретения
Техническая проблема
Цель настоящего изобретения заключается в обеспечении автоматизированной системы бесклеточного получения белка, которая может повышать уровень экспрессии целевого белка с помощью автоматизированного и одновременного снабжения небольшим количеством раствора низкомолекулярных соединений для экспрессии через диализную мембрану в процессе реакции бесклеточной экспрессии белка и удаления ингибиторов экспрессии белка во время реакции, и в обеспечении способа получения белка с использованием данной системы.
Техническое решение
Для осуществления вышеописанной задачи в настоящем изобретении предлагается автоматизированная система бесклеточного получения белка, содержащая: блок реакции экспрессии белка, содержащий реакционный сосуд, который включает множество диализных трубок, каждая из которых включает диализную мембрану и открыта сверху; блок контроля температуры реакции, сконфигурированный для нагревания или охлаждения реакционного сосуда; массив пипеток, включающий множество пипеток и сконфигурированный для забора или для слива растворов с использованием пипеток; блок движения массива пипеток, сконфигурированный для движения массива пипеток в направлении вверх и вниз, в прямом и в обратном направлении или в направлении влево и вправо, для перемещения растворов; блок очистки белка, включающий устройство применения магнитного поля; и блок закрепления многолуночного планшета, содержащий закрепленный в нем набор многолуночных планшетов, сконфигурированный для подачи растворов, которые используются при получении белка.
В настоящем изобретении также предлагается способ автоматизированного бесклеточного получения белка, включающий стадии: (a) приготовления смеси бесклеточной экспрессии белка (S1); (b) экспрессии белка с использованием раствора низкомолекулярных веществ для экспрессии (S2); (c) очистки белка с использованием магнитных микросфер (S3); и (d) диализа очищенного белка с использованием буфера для хранения белка (S4).
В настоящем изобретении также предлагается способ автоматизированного бесклеточного получения белка, включающий стадии: (a) приготовления смеси бесклеточной экспрессии белка (S1); (b) экспрессии белка с использованием раствора низкомолекулярных веществ для экспрессии (S2); стадии (c') очистки чистого целевого белка без аффинной метки (S3'); и (d) диализа очищенного белка с использованием буфера для хранения белка (S4).
В настоящем изобретении также предлагается набор реактивов для автоматизированного бесклеточного получения белка, который содержит набор реактивов с многолуночным планшетом, содержащим индивидуальные отдельные лунки для хранения раствора, требующегося для бесклеточного получения белка, а также предлагается диализная трубка, включающую диализную мембрану.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 представляет собой схематическое изображение автоматизированной системы бесклеточного получения белка согласно настоящему изобретению.
Фиг. 2 представляет собой изображение в разрезе (a), перспективное изображение (b) и внутренний вид (c) диализной трубки согласно настоящему изобретению.
Фиг. 3 представляет собой перспективное изображение и внутренний вид первого реакционного сосуда согласно настоящему изобретению.
Фиг. 4 представляет собой перспективное изображение и внутренний вид второго реакционного сосуда согласно настоящему изобретению.
Фиг. 5 представляет собой перспективное изображение и внутренний вид третьего реакционного сосуда согласно настоящему изобретению.
Фиг. 6 представляет собой перспективное изображение и внутренний вид четвертого реакционного сосуда согласно настоящему изобретению.
Фиг. 7 представляет собой фронтальное изображение массива пипеток согласно настоящему изобретению.
Фиг. 8 представляет собой схема работы (А) автоматизированного способа бесклеточного получения белка согласно настоящему изобретению и перспективное изображение (В) набора многолуночных планшетов согласно настоящему изобретению.
Фиг. 9 представляет собой схему работы способа получения белка с использованием автоматизированной системы бесклеточного получения белка согласно настоящему изобретению.
Фиг. 10 представляет собой результаты анализа полученного согласно настоящему изобретению целевого белка на геле SDS-PAGE.
(А): М: Маркер размера белка Bioneer AccuLadder™ (низкомолекулярный); Е: экспрессированный образец AcGFP; Р: очищенный образец AcGFP; (В): М: Маркер размера белка Bioneer AccuLadder™ (низкомолекулярный); AcGFP: очищенный образец AcGFP; RFP: очищенный образец RFP; CAT: очищенный образец CAT; AcGFP (ПЦР-продукт): очищенный образец ПЦР-продукта AcGFP.
Фиг. 11 представляет собой результаты анализа SDS-PAGE и Вестерн-блот-анализа чистого целевого белка, не содержащего аффинную метку, полученного согласно настоящему изобретению.
(А): Результаты SDS-PAGE анализа TEV-AcGFP; М: Маркер размера белка Bioneer AccuLadder™ (низкомолекулярный); Е: образец экспрессированного AcGFP; Р: образец очищенного AcGFP; (В) сравнение образцов по присутствию или отсутствию гистидиновой метки; Контроль: TEV-AcGFP, очищенный с помощью метода очистки целевого белка с аффинной меткой; Без аффинной метки: образец TEV-AcGFP, очищенный с помощью метода очистки целевого белка, не содержащего аффинную метку.
Цифровые обозначения:
10: автоматизированная система бесклеточного получения белка
100: реакционный блок экспрессии белка
110: диализная трубка 111: верхняя структура
112: диализная мембрана 113: нижняя структура
114: эластичная трубка 120: первый реакционный сосуд
121а: отверстие диализной трубки
121b: отверстие для раствора низкомолекулярных веществ для экспрессии
122а: отверстие диализной трубки 122b: отверстие для диализного раствора
130: крышка первого реакционного сосуда 131: отверстие
132: пленка, предотвращающая выпаривание
140: второй реакционный сосуд
141а: отверстие диализной трубки
141b: отверстие для раствора низкомолекулярных веществ для экспрессии
150: крышка первого реакционного сосуда 151: отверстие
152: пленка, предотвращающая выпаривание
160: третий реакционный сосуд
161: сосуд для раствора низкомолекулярных веществ для экспрессии
162: крышка сосуда с раствором
163: вход 164: выход
165: насос-дозатор 166: многоканальный клапан
167: контейнер с раствором 168: контрольный клапан
169: контейнер для отходов 170: четвертый реакционный сосуд
171: сосуд для раствора низкомолекулярных веществ для экспрессии
172: крышка сосуда для раствора
173: прохождение раствора 174: реверсивный насос-дозатор 175: многоканальный клапан 176: контейнер для раствора
177: контейнер для отходов
180: блок контроля температуры реакции
190: устройство применения магнитного поля 191: магнит
192: блок крепления магнита 200, 200': набор многолуночных плашнетов
300: массив пипеток 310: пипетка
320: блок движения массива пипеток
400: блок очистки белка
S1-S4: автоматизированный способ бесклеточного получения белка
Лучший вариант осуществления изобретения
Если иное не определено, все технические и научные термины, использованные здесь, имеют те же смыслы, которые вкладываются в них обычным специалистом области, к которой принадлежит данное изобретение. Как правило, номенклатура, используемая в данном документе, и экспериментальные методы хорошо известны и традиционно используются в данной области.
В одном аспекте, настоящее изобретение относится к автоматизированной системе бесклеточного получения белка, содержащей: блок реакции экспрессии белка, содержащий реакционный сосуд, который включает множество диализных трубок, каждая из которых включает диализную мембрану и открыта сверху; блок контроля температуры реакции, сконфигурированный для нагревания или охлаждения реакционного сосуда; массив пипеток, включающий множество пипеток и сконфигурированный для всасывания или для слива растворов с использованием пипеток; блок движения массива пипеток, сконфигурированный для движения массива пипеток в направлении вверх и вниз, в прямом и в обратном направлении или в направлении влево и вправо для движения растворов; блок очистки белка, включающий устройство применения магнитного поля; и блок крепления многолуночного планшета, содержащий закрепленный в нем набор многолуночных планшетов, сконфигурированный для подачи растворов, которые используются для получения белка.
Каждая из диализных трубок содержит: цилиндрическую диализную мембрану, имеющую определенную длину; нижнюю структуру, встроенную на дне диализной мембраны и имеющую форму диска; и верхнюю структуру, встроенную сверху диализной мембраны и имеющую кольцевую структуру с тавровым профилем.
Каждая из диализных трубок дополнительно включает эластичные трубки, встроенные вокруг внешней периферической поверхности участков диализной мембраны, которые вступают в контакт с верхней структурой и с нижней структурой.
Реакционный сосуд дополнительно включает крышку реакционного сосуда, сконфигурированную для закрытия реакционного сосуда для предотвращения выпаривания раствора из диализных трубок, причем крышка реакционного сосуда имеет множество прорезей, которые позволяют вставлять пипетки диализные трубки.
Блок реакции экспрессии белка содержит: множество отверстий для диализных трубок, сформированных сверху и сконфигурированных для приема диализных трубок; и множество отверстий для раствора низкомолекулярных веществ для экспрессии для жидкостного сообщения с отверстиями диализных трубок.
Блок реакции экспрессии белка дополнительно содержит блок диализа белка, включающий: множество отверстий для диализных трубок, сформированных сверху и сконфигурированных для приема диализных трубок; и множество отверстий для диализного раствора, образованных по соседству с отверстиями диализных трубок, для жидкостного сообщения с отверстиями диализных трубок и сконфигурированных для приема буфера для хранения белка.
Блок реакции экспрессии белка содержит: открываемый/закрываемый выход, сконфигурированный так, чтобы дать возможность раствору вытекать из реакционного сосуда; контейнер для отходов, связанный с выходом так, чтобы было жидкостное сообщение с выходом; вход, сконфигурированный так, чтобы посредством него была возможность введения раствора в реакционный сосуд; насос-дозатор, сконфигурированный для подачи раствора на вход; и один или несколько контейнеров для растворов, связанных с насосом-дозатором.
Блок реакции экспрессии белка дополнительно включает многоканальный клапан, сконфигурированный так, чтобы одна его сторона была связана с насосом-дозатором, а другая его сторона имела жидкостное сообщение с любым выбранным контейнером среди контейнеров для растворов.
Блок реакции экспрессии белка содержит: канал для раствора, сконфигурированный так, чтобы дать возможность раствору подаваться или вливаться в реакционный сосуд или из реакционного сосуда; реверсивный насос-дозатор, связанный с каналом для раствора и сконфигурированный для подачи или вливания раствора в реакционный сосуд или из реакционного сосуда; один или несколько контейнеров для раствора, связанных с реверсивным насосом-дозатором; один или несколько контейнеров для отходов, связанных с реверсивным насосом-дозатором; и многоканальный клапан, сконфигурированный так, чтобы одна его сторона была связана с реверсивным насосом-дозатором, а другая его сторона была связана с контейнерами для растворов и с контейнерами для отходов, так чтобы любой выбранный контейнер из числа контейнеров для растворов или контейнеров для отходов имел жидкостное сообщение с реверсивным насосом-дозатором посредством многоканального клапана.
Массив пипеток содержит 1-96 пипеток, расположенных в 1-12 рядов согласно размеру реакционного сосуда и количеству пипеток и сконфигурирован так, чтобы у пипеток была возможность автоматически присоединяться или отсоединяться, и сконфигурирован для всасывания или сбрасывания целевого количества раствора.
Далее настоящее изобретение будет описано более подробно.
Фиг. 1 иллюстрирует общую конфигурацию автоматизированной системы 10 бесклеточного получения белка согласно настоящему изобретению.
Согласно фиг. 1, автоматизированная система бесклеточного получения белка по настоящему изобретению содержит блок 100 реакции экспрессии белка, блок 180 контроля температуры реакции, массив пипеток 300, блок 320 движения массива пипеток, блок 400 очистки белка, и встроенный блок многолуночных планшетов, который можно оборудовать наборами многолуночных планшетов 200 и 200'.
Блок 100 реакции экспрессии белка представляет собой сосуд, имеющий множество гнезд, в которых могут располагаться диализные трубки 110, содержащие цилиндрическую диализную мембрану 112 и открытые сверху, так что их верхняя часть экспонирована из гнезд, и они располагаются на определенном расстоянии друг от друга в вертикальном и в горизонтальном направлениях. Сосуд может принимать раствор низкомолекулярных веществ для экспрессии или что-то подобное. Блок 100 реакции экспрессии белка содержит реакционный сосуд 120, 140, 160 или 170, сконфигурированный для добавления или удаления раствора низкомолекулярных веществ для экспрессии для контакта с внешней областью диализной мембраны 112.
Блок 180 контроля температуры реакции помещают под реакционным сосудом 120, 140, 160 или 170, и он служит для нагревания или охлаждения реакционного сосуда 120, 140, 160 или 170.
Массив пипеток 300 содержит множество пипеток 310, имеющих такое же расположение, что и множество диализных трубок 110, которые вставляются в блок 100 реакции экспрессии белка, и сконфигурирован для всасывания или для сброса раствора с помощью пипеток 310.
Блок 320 движения массива пипеток сконфигурирован для движения массива пипеток 300 в направлении вверх и вниз, в прямом и в обратном направлении или в направлении влево и вправо так, чтобы переносить раствор из блока реакции экспрессии белка, из набора многолуночных планшетов или т.п.
Блок 400 очистки белка содержит устройство применения магнитного поля 190, сконфигурированный для прикрепления целевого белка к магнитным микросферам с последующим прикреплением магнитных микросфер к стенке.
Устройство применения магнитного поля 190 содержит блок крепления магнита 192, содержащий встроенный магнит 191, которое служит для перемещения блока крепления магнита вверх или вниз для применения или удаления магнитного поля.
Кроме того, блок 180 контроля температуры реакции и устройство применения магнитного поля 190 могут быть сконструированы отдельно, или могут быть сконструированы для одновременного контроля в одном и том же положении. Другими словами, как представлено на чертежах, блок очистки белка 400 не предоставляется отдельно, а каждый из реакционных сосудов 120, 140, 160 и 170 может включать одновременно блок 100 реакции экспрессии белка и блок 400 очистки белка, и блок 180 контроля температуры реакции и устройство применения магнитного поля 190 могут передвигаться и помещаться под каждым реакционным сосудом.
Далее конфигурация диализной трубки 110 по настоящему изобретению будет подробно описана со ссылкой на фиг. 2.
Согласно фиг. 2, то диализная трубка 110 по настоящему изобретению содержит диализную мембрану 112, нижнюю структуру 113, верхнюю структуру 111 и эластичную трубку 114.
Диализная мембрана 112 придана цилиндрическая форма, имеющая определенный размер, и нижняя структура 113 имеет форму диска и вставляется в дно диализной мембраны. Кроме того, верхняя структура 111 представляет собой кольцевую структуру, имеющую тавровый профиль, вставляется в верхнюю часть диализной мембраны 112, и имеет отверстие, в которое можно вводить раствор.
Диализная трубка 110 предпочтительно включает эластичную трубку 114, расположенную вокруг внешней области диализной мембраны 112, которая вступает в контакт с верхней структурой 111 и нижней структурой 113 с целью повышения адгезии между ними.
Кроме того, верхняя структура 111 имеет диаметр больше, чем диаметр дна диализной трубки 110 так, что она может быть остановлена верхним концом отверстия диализной трубки 121а или 141а реакционного сосуда 120, 140, 160 или 170, когда диализная трубка 110 вставляется в отверстие для диализной трубки.
Более конкретно, для монтирования диализной трубки 110 по стандартному 96-луночному формату, верхняя структура 111 предпочтительно имеет диаметр 9 мм или менее, а диализная мембрана 112 предпочтительно имеет диаметр 6,37 мм или 7,62 мм.
В предшествующем уровне техники, диализная мембрана устанавливается внизу реакционного сосуда, тогда как в настоящем изобретении диализная мембрана 112 является цилиндрической по форме и, таким образом, имеет большую поверхность контакта с низкомолекулярным раствором для экспрессии, позволяя, таким образом, эффективно осуществить реакцию.
Далее конфигурация реакционных сосудов 120, 140, 160 и 170 по настоящему изобретению будет подробно описана со ссылкой на фиг. 3-6.
Фиг. 3-6 представляют различные воплощения реакционных сосудов 120, 140, 160 и 170 по настоящему изобретению. Конкретно, фиг. 3 представляет первый реакционный сосуд 120, способный принимать 16 диализных трубок; фиг. 4 представляет второй реакционный сосуд 140, способный принимать 48 диализных трубок; фиг. 5 представляет третий реакционный сосуд 160, способный принимать 96 диализных трубок; и фиг. 6 представляет четвертый реакционный сосуд 170, способный принимать 96 диализных трубок.
Первый реакционный сосуд 120 и второй реакционный сосуд 140 сконфигурированы так, что отверстие 121b или 141b для раствора низкомолекулярных веществ для экспрессии, способное принимать раствор низкомолекулярных веществ для экспрессии, сформировано для жидкостного сообщения с диализной трубкой. Третий реакционный сосуд 160 и четвертый реакционный сосуд 170 сконфигурированы так, что в них формируется область, способная принимать раствор низкомолекулярных веществ для экспрессии, а раствор низкомолекулярных веществ для экспрессии, буфер для хранения белка или т.п. могут туда подаваться или извлекаться оттуда с помощью насоса 165 или 174.
В соответствии с фиг. 3 теперь будет подробно описан первый реакционный сосуд 120.
В первом реакционном сосуде 120 формируется множество отверстий 121а для диализных трубок, в которые вставляется диализная трубка 110, и формируется множество отверстий 121b для раствора низкомолекулярных веществ для экспрессии, которые прилегают к отверстиям 121а диализных трубок и имеют жидкостное сообщение с отверстиями 121а диализных трубок. Предпочтительно, количество отверстий 121а диализных трубок составляет 16 так, что туда могут быть вставлены 16 диализных трубок 110.
Кроме того, первый реакционный сосуд 120 сконфигурирован так, что он делится на блок 100 реакции экспрессии белка, в который вставлены 8 диализных трубок 110 и в котором осуществляется экспрессия белка, и блок 122 диализа белка, который диализует очищенный белок относительно буфера для хранения белка.
Блок 122 диализа белка содержит: множество отверстий 122а для диализных трубок, в которые вставляется диализная трубка 110; и множество отверстий 122b для диализного раствора, которые сформированы по соседству с отверстиями 122а диализных трубок так, чтобы было жидкостное сообщение с отверстиями 122а диализных трубок и чтобы они были способны принимать буфер для хранения белка.
Кроме того, первый реакционный сосуд 120 дополнительно содержит крышку 130 первого реакционного сосуда с целью предотвращения выпаривания раствора в диализной трубке 110.
Крышка 130 первого реакционного сосуда имеет отверстия 131, сформированные для соответствия с отверстиями 121b для раствора низкомолекулярных веществ для экспрессии и с отверстиями 121а для диализных трубок, сформированных в реакционном сосуде 120. Кроме того, выше отверстий 131 установлена пленка 132, предотвращающая испарение с целью предотвращения испарения раствора из диализной трубки 110. Кроме того, области пленки 132 для предотвращения испарения, которые соответствуют отверстиям 121а для раствора низкомолекулярных веществ для экспрессии и отверстиям 121b для диализных трубок, могут быть надрезаны так, чтобы пипетки 310 могли быть легко туда вставлены. Эти области предпочтительно надрезаются в форме "+", без ограничения этим способом.
В соответствии с фиг. 4 будет подробно описан второй реакционный сосуд 140 по настоящему изобретению.
Второй реакционный сосуд 140 содержит множество отверстий 141а для диализных трубок, в которые вставляется диализная трубка, и содержит множество отверстий 141b для раствора низкомолекулярных веществ для экспрессии, которые прилегают к отверстиям 141а для диализных трубок так, чтобы было жидкостное сообщение с отверстиями 141а для диализных трубок. Предпочтительно, количество отверстий 141а для диализных трубок составляет 48 так, что туда могут быть вставлены 48 диализных трубок 110. В данном описании некоторые из отверстий для раствора низкомолекулярных веществ для экспрессии могут использоваться в качестве блока диализа белка.
Кроме того, второй реакционный сосуд 140 дополнительно содержит крышку 150 второго реакционного сосуда для предотвращения выпаривания раствора в диализной трубке 110.
Крышка 150 второго реакционного сосуда имеет отверстия 151, сформированные для соответствия с отверстиями 141b для раствора низкомолекулярных веществ для экспрессии и с отверстиями 141а для диализных трубок, сформированных во втором реакционном сосуде 140. Выше отверстий 151 устанавливается пленка 152, предотвращающая испарение, для предотвращения испарения раствора из диализной трубки 110. Кроме того, области пленки 152 для предотвращения испарения, которые соответствуют отверстиям 141а для раствора низкомолекулярных веществ для экспрессии и отверстиям 141b диализных трубок, могут быть надрезаны так, чтобы пипетки 310 могли быть легко туда вставлены. Эти области предпочтительно надрезаются в форме "+" без ограничения этим способом.
В соответствии с фиг. 5 будет подробно описан третий реакционный сосуд 160 по настоящему изобретению.
Третий реакционный сосуд 160 содержит: сосуд 161 с низкомолекулярным раствором для экспрессии, имеющий область, способную принимать раствор низкомолекулярных веществ для экспрессии или буфер для хранения белка; и крышку 162 сосуда с раствором, которая служит в качестве крышки сосуда 161 для раствора низкомолекулярных веществ для экспрессии и имеет отверстия для диализных трубок, в которые вставляется диализная трубка 110. Предпочтительно, количество отверстий диализных трубок составляет 96 так, что туда могут быть вставлены 96 диализных трубок 110.
Кроме того, третий реакционный сосуд 160 содержит вход 163, сконфигурированный для введения раствора низкомолекулярных веществ для экспрессии или для буфера для хранения белка, и выход 164, сконфигурированный для сброса раствора низкомолекулярных веществ для экспрессии или буфера для хранения белка после завершения реакции.
Вход 163 соединен с насосом-дозатором 165, с многоканальным клапаном 166 и, по меньшей мере, с одним контейнером 167 для раствора. Конкретно, с целью введения раствора низкомолекулярных веществ для экспрессии или буфера для хранения белка через вход 163, многоканальный клапан 166 соединяется, по меньшей мере, с одним из контейнеров 167 для раствора, и раствор низкомолекулярных веществ для экспрессии или буфер для хранения белка в контейнере 167 для раствора подается в третий реакционный контейнер 160 посредством насоса-дозатора 165.
Выход 164 соединен с контрольным клапаном 168 и с контейнером 169 для отходов. Когда раствор низкомолекулярных веществ для экспрессии или буфер для хранения белка необходимо ввести в третий реакционный сосуд 160, то контрольный клапан 168 закрыт, и в реакционном сосуде 160 проходит реакция раствора низкомолекулярных веществ для экспрессии или буфера для хранения белка, и через некоторое время прореагировавший раствор низкомолекулярных веществ для экспрессии или буфер для хранения белка извлекается в контейнер 169 для отходов путем открытия контрольного клапана 168.
Положение, в котором располагается выход 164, не ограничено, но выход 164 предпочтительно располагается под реакционным сосудом 160 так, чтобы раствор низкомолекулярных веществ для экспрессии сбрасывался в выход 164 под действием силы тяжести без необходимости применения отдельного насоса. Кроме того, нижняя поверхность реакционного сосуда 160 предпочтительно наклонена к выходу 164 так, чтобы раствор низкомолекулярных веществ для экспрессии легко оттуда вытекал. Кроме того, когда выход располагается на стенке реакционного сосуда, то насос также может там располагаться с целью сброса раствора.
В соответствии с фиг. 6, то будет подробно описан четвертый реакционный сосуд 170.
Четвертый реакционный сосуд 170 сконфигурирован также как и третий реакционный сосуд 160. Однако если раствор сбрасывается или вводится через выход 164 и вход 163, то канал для раствора 173 располагается в четвертом реакционном сосуде 170 так, чтобы раствор вводился или сбрасывался через одиночное отверстие.
На фиг. 6 показано, что канал для раствора располагается на дне, без ограничения указанным, и канал раствора может располагаться в любом положении для введения или сброса раствора.
Канал для раствора 173 связан с реверсивным насосом-дозатором 174, с многоканальным клапаном 175, с контейнером для отходов 177 и с контейнером для раствора 176. Многоканальный клапан 175 функционирует для связи контейнера для отходов 177, по меньшей мере, с одним из контейнеров для растворов 176. Кроме того, реверсивный насос-дозатор 174 представляет собой насос, способный вводить раствор в обоих направлениях.
Более конкретно, когда раствор низкомолекулярных веществ для экспрессии или раствор для хранения белка необходимо ввести в четвертый реакционный сосуд 170, многоканальный клапан 175 открыт и открыт один компонент, выбранный из числа контейнеров для растворов 176, а реверсивный насос-дозатор 174 вводит раствор низкомолекулярных веществ для экспрессии или буфер для хранения белка из контейнера для раствора 176 в четвертый реакционный контейнер 170. Напротив, когда раствор низкомолекулярных веществ для экспрессии или буфер для хранения белка следует сбросить из четвертого реакционного контейнера 170, то многоканальный клапан 175 открывает контейнер для отходов 177, и реверсивный насос-дозатор 174 сбрасывает прореагировавший раствор низкомолекулярных веществ для экспрессии или раствор для хранения белка из четвертого реакционного сосуда 170 в контейнер для отходов 177.
Даже в случае, когда реакционные контейнеры 120, 140, 160 или 170 имеют любую конфигурацию (любое из воплощений, представленных на фиг. 3-6), автоматически может осуществляться дополнительный процесс диализа для стабилизации очищенного белка. С использованием магнитных микросфер, которые связываются с аффинной меткой, белок присоединяется и промывается для удаления веществ, отличных от целевого белка. Затем для элюции прикрепленного целевого белка с магнитных микросфер добавляется элюирующий буфер, содержащий высокую концентрацию элюэнта. Необходимо проводить процесс удаления элюирующего буфера настолько быстро, насколько это возможно, и замену буфера очищенного белка на стабильный буфер, и данный процесс можно автоматически проводить либо с помощью массива пипеток 300, либо с помощью насоса 165, 174 и многоканального клапана 166, 175.
Далее будут подробно описаны эффекты реакционного сосуда 120, 140, 160 или 170 по настоящему изобретению.
Авторы настоящего изобретения попытались создать хорошую модель реакционного сосуда 120, 140, 160 или 170 с искомым количеством диализных трубок, содержащих встроенные диализные мембраны, которые могут быть вставлены в реакционный сосуд. Кроме того, авторы настоящего изобретения попытались создать блок реакции экспрессии белка, способный экспрессировать наиболее высокий уровень целевого белка с использованием минимального количества раствора низкомолекулярных веществ для экспрессии, и осуществить способ, который максимизирует уровень экспрессии белка при минимальном количестве раствора низкомолекулярных веществ для экспрессии с использованием способа добавления в несколько стадий раствора низкомолекулярных веществ для бесклеточной экспрессии белка.
Сообщалось, что если концентрацию продуктов реакции (ингибиторы реакции экспрессии), получаемых в ходе реакции экспрессии, уменьшать посредством диализной мембраны, то реакцию можно проводилась непрерывно. В данном документе сообщается, что для максимизации реакции следует использовать раствор низкомолекулярных веществ для экспрессии, соответствующий, по меньшей мере, 10-кратному объему реакционного раствора. Другими словами, для реакции экспрессии белка, имеющей объем 0,5 мл, требуется раствор низкомолекулярных веществ для экспрессии, имеющий объем 5 мл или более, и требуется реакционный сосуд, способный вместить данный объем. При использовании данного объема существует проблема, заключающаяся в увеличении размера реакционного сосуда для экспрессии белков, что приводит к увеличению размера автоматизированной системы.
В настоящем изобретении осуществлялись попытки преодолеть данную проблему путем добавления небольшого количества раствора низкомолекулярных веществ для экспрессии и замены его за несколько стадий.
Теоретически, если с представляет собой концентрацию ингибиторов реакции экспрессии, получаемых в течение реакции, v (мл) представляет собой объем реакционного раствора, и V (мл) представляет собой объем раствора низкомолекулярных веществ для экспрессии, то концентрация ингибиторов реакции экспрессии, оставшихся в реакционном растворе, при достижении полного равновесия посредством диализной мембраны составит . Если используется 9-кратный объем раствора низкомолекулярных веществ для экспрессии (V=9v), то концентрация ингибиторов реакции экспрессии, оставшихся в реакционном растворе, составит 0,1с, и, таким образом, реакция будет осуществляться при 10с до тех пор, пока концентрация не достигнет с.Например, если диализ осуществляется постадийно при V=v, то концентрация составит 0,5с в стадии 1, и, таким образом, реакция будет осуществляться при 2с до тех пор, пока концентрация не достигнет с. Если удаляют раствор низкомолекулярных веществ для экспрессии, который достиг концентрации с, и добавляют свежий раствор низкомолекулярных веществ для экспрессии, то концентрация также составит 0,5с в стадии 2, и, таким образом, реакция будет осуществляться при 2с до тех пор, пока концентрация не достигнет с. Если данный процесс повторить за 8 стадий, то реакция будет осуществляться при 10с, и, таким образом, будет получена концентрация белка, соответствующая 10-ти кратной. Таким образом, при использовании данного способа объем реакционного сосуда уменьшается до 1/9, и, таким образом, может быть уменьшен общий объем системы.
Данный способ замены раствора в течение нескольких стадий более эффективен в стадии диализа, которая является конечной стадией процесса получения белка. При условии, что концентрация первого элюата составляет с, объем реакционного раствора составляет v мл, и объем буфера составляет V мл, то концентрация конечного элюата, оставшегося в реакционном растворе, составляет . Если используется 9-кратный объем буфера (V=9v), то концентрация может достигать 0,1с. Например, если диализ осуществляют постадийно при V=v, то в стадии 1 будет достигнуто равновесие и, таким образом, концентрация будет равна 0,5с. При удалении буфера, который достиг концентрации 0,5с, и добавлении свежего буфера, концентрация будет достигать 0,25с в стадии 2, и достигнет 0,125с в стадии 3. Таким образом, диализ может осуществляться даже с 1/3 буфера при аналогичной концентрации.
Авторы настоящего изобретения изготовили блок 10 реакции экспрессии белка, способный экспрессировать белок-мишень на самом высоком возможном уровне посредством реакции экспрессии с минимальным количеством раствора низкомолекулярных веществ для экспрессии, путем конструирования реакционного сосуда 120, 140, 160 или 170, позволяющего осуществить постадийную замену раствора низкомолекулярных веществ для экспрессии. Таким образом, в настоящем изобретении предлагается автоматизированная система бесклеточного получения белка, способная очищать синтезированный белок, которая более компактна и приспособлена к выработке большего количества белка более эффективным образом по сравнению с предшествующим уровнем техники.
В соответствии с фиг. 7 будет описан массив пипеток 300 по настоящему изобретению.
Массив пипеток 300 представляет собой автоматизированный массив пипеток 300, который позволяет присоединять и отсоединять 1-96 пипеток 310 и может количественно набирать и сбрасывать желаемый объем раствора. В массиве пипеток 300, пипетки расположены в 1-12 рядов, каждый из которых состоит из 8 пипеток. Фиг. 8 представляет массив пипеток, в который могут быть вставлены 8 пипеток. Массив пипеток 300 перемещается с помощью блока 302 для перемещения массива пипеток в направлении вверх и вниз, в прямом и в обратном направлении или в направлении влево и вправо, и массив пипеток 300, а также блок 302 перемещения массива пипеток подробно описаны в корейской заявке на патент No. 10-1025135 и в публикации корейского патента No. 10-2011-0121588.
В соответствии с фиг. 8, будет описан способ автоматизированного бесклеточного получения белка и набор многолуночных планшетов 200 или 200' по настоящему изобретению.
Способ автоматизированного бесклеточного получения белка по настоящему изобретению включает стадии: (a) приготовления смеси для бесклеточной экспрессии белка (S1); (b) экспрессии белка с использованием раствора низкомолекулярных веществ для экспрессии (S2); (c) очистки белка с использованием магнитных микросфер (S3); и (d) диализа очищенного белка с использованием буфера для хранения белка (S4).
Кроме того, стадия (с) очистки белка с использованием магнитных микросфер (S3) представляет собой стадию очистки целевого белка с аффинной меткой и может заменяться на стадию (с') очистки чистого целевого белка без аффинной метки (S3').
Способ автоматизированного бесклеточного получения белка по настоящему изобретению предпочтительно осуществляют с помощью автоматизированной системы бесклеточного получения белка, описанной выше, без ограничения указанным.
В настоящем изобретении стадия (b) экспрессии белка может включать стадии: (i) введения раствора низкомолекулярных веществ для экспрессии; (ii) стимуляции экспрессии белка; и (iii) удаления раствора низкомолекулярных веществ для экспрессии.
В данном документе, раствор низкомолекулярных веществ для экспрессии может подаваться из набора многолуночных планшетов или из контейнера с раствором, и путем последовательного повторения стадий (i)-(iii) один или более раз может экспрессироваться большое количество белка.
В настоящем изобретении, стадия (c) очистки белка с использованием магнитных микросфер может включать стадии: (i) связывания экспрессированного белкового продукта с магнитными микросферами; (ii) введения раствора для промывки магнитных микросфер и применения/удаления магнитного поля для удаления примесей с магнитных микросфер; и (iii) выделения целевого белка из магнитных микросфер.
Когда стадию (с) очистки белка с использованием магнитных микросфер заменяют на стадию (с') очистки чистого целевого белка без аффинной метки (S3'), то стадия (с') может включать: (i) связывание экспрессированного белкового продукта с магнитными микросферами; (ii) удаление примесей из магнитных микросфер путем подачи на магнитные микросферы раствора для промывания и применения/удаления магнитного поля к магнитным микросферам; (iii) добавление протеазы и буфера для протеазной реакции; (iv) удаление аффинной метки с белка, связанного с магнитными микросферами; и (v) связывание протеазы с магнитными микросферами для выделения и извлечения целевого белка.
В данном документе, суспензия магнитных микросфер, раствор для промывания магнитных микросфер, буфер для элюции белка или буфер протеазной реакции могут подаваться из набора многолуночных планшетов, и стадия (ii) удаления примесей с магнитных микросфер путем подачи на магнитные микросферы раствора для промывания может быть повторена один или более раз.
В настоящем изобретении стадия (d) диализа очищенного белка с использованием буфера для хранения белка может включать: (i) добавление буфера для хранения белка в отверстие для диализного раствора; и (ii) удаление буфера для элюции белка или буфера протеазной реакции из диализной трубки.
В данном документе буфер для хранения белка может подаваться из набора многолуночных планшетов или из контейнера с раствором, и стадия (i) введения буфера для хранения белка в отверстие для диализного раствора и стадия (ii) удаления буфера для элюции белка или буфера протеазной реакции из диализной трубки могут последовательно повторяться один или более раз.
В другом аспекте, настоящее изобретение относится к набору реактивов для автоматизированного бесклеточного получения белка. Набор реактивов для автоматизированного бесклеточного получения белка включает: набор многолуночных планшетов, включающий индивидуальные отдельные блоки лунок для хранения раствора, требующиеся для бесклеточного получения белка.
Кроме того, набор многолуночных планшетов включает раствор, требующийся для бесклеточного получения белка. В данном документе, требуемый раствор может представлять собой какой-либо, выбранный из числа буфера для хранения белка, стерильной дистиллированной воды, суспензии с магнитными микросферами, раствора для промывания магнитных микросфер, буфера для элюции белка, раствора низкомолекулярных веществ для экспрессии, буфера протеазной реакции, растворов, содержащих липосомы или мицеллы для синтеза мембранных белков и т.д., без ограничения перечисленным. Любой специалист в данной области может приготовить раствор для бесклеточного синтеза и очистки белка. Набор многолуночных планшетов сконфигурирован так, что вид раствора и блока лунок сильно варьируют в зависимости от цели бесклеточного синтеза белка и очистки.
Кроме того, набор реактивов для автоматизированного бесклеточного получения белка может дополнительно включать диализную трубку, содержащую диализную мембрану.
Кроме того, раствор низкомолекулярных веществ для экспрессии или буфер для хранения белка может подаваться из контейнера для раствора 167 или 176, и в данном случае его можно повторно добавлять с помощью насоса и можно отбрасывать с помощью контейнера для отходов 169 или 177 после завершения реакции.
Кроме того, магнитные микросферы, которые используются для очистки белка, могут представлять собой магнитные микросферы, связанные с белком посредством ионов двухвалентных металлов, таких как ионы никеля или кобальта.
Настоящее изобретение также предназначено для получения целевого белка при размещении диализных трубок 110 в блоке реакции экспрессии белка 100 автоматизированной системы бесклеточного получения белка 10, введения смеси для экспрессии белка в диализные трубки, периодического добавления раствора низкомолекулярных веществ для экспрессии во внешнее пространство диализных трубок 10, для осуществления непрерывного протекания бесклеточной экспрессии белка, затем очистки автоматически экспрессированного белка в блоке автоматической очистки белка 400, обеспечении устройством для применения магнитного поля 190 с использованием магнитных микросфер, которые связываются с аффинной меткой, и диализе раствора очищенного белка с помощью буфера для хранения белка в блоке 22 для диализа белка.
Кроме того, набор многолуночных планшетов 200, 200', который используется в настоящем иобретении, включает первый набор многолуночных планшетов 200 и второй набор многолуночных планшетов 200'.
Первый набор многолуночных планшетов 200 включает: множество блоков лунок А, В, С, D, Е и F, каждый из которых состоит из двух соседних рядов; и пленку (не показано), покрывающую верх множества блоков лунок А, В, С, D, Е и F. Второй набор многолуночных планшетов 200' включает: множество блоков лунок G, Н, I, J, K и L, каждый из которых состоит из двух соседних лунок; и пленку (не показано), покрывающую верх множества блоков лунок G, Н, I, J, K и L.
Хотя каждый из наборов многолуночных планшетов 200 и 200' включает блок лунок, состоящий из двух соседних рядов, описанных выше, он может быть поделен на пространства, в которых хранятся растворы, согласно количеству реакционных сосудов и пипеток, которые могут там располагаться.
Кроме того, набор многолуночных планшетов 200 или 200' включает низкомолекулярный раствор для экспрессии, требующийся для экспрессии белка, суспензию магнитных микросфер, требующуюся для очистки белка, раствор для промывания магнитных микросфер, буфер для хранения белка и т.д.
Более конкретно, растворы, требующиеся для очистки белка, могут включать суспензию магнитных микросфер для присоединения целевого белка, промывочный раствор для удаления белков, отличных от целевого белка, с магнитных микросфер, элюирующий буфер для открепления целевого белка от магнитных микросфер, буфер протеазной реакции, требующийся для удаления аффинной метки с целевого белка, буфер для хранения белка, стерильную дистиллированную воду, раствор низкомолекулярных веществ для экспрессии, раствор для синтеза мембранных белков и т.д.
Раствор, который вводится в блок лунок каждого из наборов с многолуночными планшетами 200 и 200', может варьировать согласно назначению.
При использовании в данном документе термин «ДНК-матрица» относится к цепи нуклеиновой кислоты, которая реплицируется, при получении новой ДНК или РНК посредством ДНК- или РНК-полимеризации с использованием ДНК-полимеразы или РНК-поимеразы. ДНК-матрица может представлять собой ДНК в циклической форме или в линейной форме. Предпочтительно, циклическая ДНК может представлять собой плазмидную ДНК, а линейная ДНК может представлять собой ПЦР-продукт, без ограничения перечисленным.
В способе по настоящему изобретению ДНК-матрица может быть легко получена в виде последовательности ДНК, включающей последовательность гена целевого белка и последовательность сайта расщепления ферментом, в векторе, который может экспрессировать белок в стандартном способе рекомбинантных ДНК, известном специалистам в данной области.
В способе по настоящему изобретению белок, экспрессированный с матрицы, может экспрессироваться в одном из следующих порядков: целевой белок - сайт расщепления ферментом - сайт расщепления ферментом - аффинная метка или аффинная метка - сайт расщепления белка - целевой белок. Сайт расщепления ферментом расщепляется протеазой при этом аффинная метка отделяется от целевого белка, в результате чего может быть получен только целевой белок.
При использовании в данном документе, термин «аффинная метка» означает партнер по слиянию, включающий вещество, обладающее способностью связываться со специфичным лигандом. Афинная метка, как правило, используется для очистки белка.
2+
2+
2+
В способе по настоящему изобретению аффинная метка может представлять собой (i) β-галактозидазу, глутатион-S-трансферазу (GST), имеющую селективную аффинность к субстрату, (ii) белок А, имеющий селективную аффинность к IgG, или (iii) полигистидин, имеющий аффинность к металлу, такому как Cu, Ni или Со. Предпочтительно, аффинная метка может представлять собой гистидин или цистеин, но не ограничиваясь ими.
В способе по настоящему изобретению могут использоваться магнитные микросферы.
В настоящем изобретении аффинная метка может быть легко вставлена путем выбора вектора для генной экспрессии, содержащего вставленную туда аффинную метку, и путем клонирования туда целевого белка. Примеры векторов, содержащих аффинную метку, включают, в частности, pBIVT («Bioneer», Корея), pIVEX («Roche», Германия), рЕТ (Novagen, Германия), pK7, pQE, и т.д.
В настоящем изобретении при выборе экспрессирующего вектора, не содержащего аффинной метки, к матрице может быть добавлена нуклеотидная последовательность, экспрессирующая аффинную метку, и аффинная метка может быть получена методами рекомбинантных ДНК.
При использовании в данном документе, термин «клеточный лизат» относится к лизату, полученному лизисом высокого давления после культивирования клеток, и включает РНК-полимеразу, требуемую для экспрессии мРНК и белка, клеточных составляющих, таких как рибосомы и т.д. Клетки могут быть животными клетками, микробными клетками или растительными клетками. Предпочтительно, клетки могут представлять собой клетки Е. coli, без ограничения указанным.
В способе по настоящему изобретению «раствор для экспрессии» представляет собой добавку, включающую аминокислоты, требуемые для транскрипции и трансляции, источник энергии, буфер и т.д. В настоящем изобретении данный термин используется взаимозаменяемо с термином «раствор для экспрессии белка». Раствор для экспрессии смешивают с матрицей и клеточным лизатом и используют для синтеза белка.
При использовании в данном документе, термин «раствор низкомолекулярных веществ для экспрессии» означает раствор трифосфатов рибонуклеиновых кислот, аминокислот и источника энергии, которые требуются для бесклеточной экспрессии белка, то есть для транскрипции и трансляции. Термин «смесь для экспрессии белка» означает раствор, который содержит клеточный лизат, раствор для экспрессии, буфер и тому подобное, и в котором осуществляется экспрессия белка. Термин «ДНК-матрица» означает экспрессирующий вектор или ПЦР-продукт, то есть экспрессируемый промотор, терминатор и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая белок.
При использовании в данном документе, термин «протеаза» означает фермент, обладающий способностью распознавать и расщеплять специфичную аминокислоту на белке с получением аминокислот или пептидов. Данный термин может использоваться взаимозаменяемо с эндопептидазой.
В способе по настоящему изобретению протеаза используется для распознавания сайта расщепления ферментом в целевом белке и для удаления аффинной метки. Конкретно, может использоваться протеаза 3С человеческого риновируса, протеаза TEV (вируса гравировки табака), фактор Ха, тромбин, бычья энтерокиназа или тому подобные, которые могут селективно распознавать и расщеплять по сайту расщепления ферментом без расщепления целевого белка. Предпочтительно, но без ограничения, используется протеаза TEV.
При использовании в данном документе, термин «сайт расщепления ферментом» относится к конкретной аминокислотной последовательности в белке, которая распознается и расщепляется протеазой.
В способе по настоящему изобретению последовательность сайта расщепления ферментом может варьировать в зависимости от типа выбранного фермента. Например, сайт расщепления протеазой 3С человеческого риновируса может представлять собой 'Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln↓Gly-Pro'; Т протеазой EV (вирус гравировки табака) - 'Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln↓Gly'; фактором Ха - 'Ile-Glu-Gly-Arg↓', тромбина - 'Leu-Val-Pro-Arg↓Gly-Ser'; и бычьей энтерокиназы - 'Asp-Asp-Asp-Asp-Lys↓', без ограничения перечисленным (символ '↓' означает сайт расщепления ферментом).
В настоящем изобретении способ синтеза аффинно-меченного целевого белка может представлять собой автоматизированный бесклеточный способ для синтеза аффинно-меченного белка, причем способ включает стадии: (S10) добавления раствора низкомолекулярных веществ для экспрессии к смеси матрицы, клеточного лизата и раствора для экспрессии белка в диализную трубку; (S20) поддержания смеси в реакционном сосуде для индукции реакции синтеза белка и стимуляции экспрессии белка; (S30) удаления раствора низкомолекулярных веществ для экспрессии; (S40) смешивания суспензии магнитных микросфер и раствора для промывания магнитных микросфер в многолуночном планшете для уравновешивания магнитных микросфер; (S50) внесенияе экспрессированного белкового продукта в набор многолуночных планшетов и последующее добавление туда приготовленных магнитных микросфер; (S60) применения магнитного поля к блоку лунок стадии (S50), и удаление смеси веществ, отличных от целевого белка, связанного с магнитными микросферами; (S70) введения раствора для промывания в блок ячеек стадии (S60), и удаления магнитного поля для устранения примесей, отличных от целевого белка, связанного с магнитными микросферами; (S80) применения магнитного поля при добавлении буфера для элюции белка с получением раствора, содержащего белок-мишень, отделенный от магнитных микросфер; (S90) осуществления диализа путем введения раствора, содержащего белок-мишень, в диализную пробирку и введение буфера для хранения белка в блок диализа белка; и (S100) удаления буфера для элюции белка.
В настоящем изобретении способ синтеза свободного от аффинной метки чистого целевого белка может представлять собой автоматизированный бесклеточный способ для синтеза свободного от аффинной метки белка, причем способ включает стадии: (S10) добавления раствора низкомолекулярных веществ для экспрессии к смеси матрицы, клеточного лизата и раствора для экспрессии белка в диализную трубку; (S20) поддержания смеси в реакционном сосуде для индукции реакции синтеза белка и стимуляции экспрессии белка; (S30) удаления раствора низкомолекулярных веществ для экспрессии; (S40) смешивания суспензии магнитных микросфер и раствора для промывания магнитных микросфер в многолуночном планшете для уравновешивания магнитных микросфер; (S50) внесения экспрессированного белкового продукта в набор многолуночных планшетов и последующего добавления туда приготовленных магнитных микросфер; (S60) применения магнитного поля к блоку лунок стадии (S50), и удаления смеси веществ, отличных от целевого белка, связанного с магнитными микросферами; (S70) введения раствора для промывания в блок ячеек стадии (S60), и удаление магнитного поля для удаления примесей, отличных от целевого белка, связанного с магнитными микросферами; (S80') добавления буфера для протеазной реакции к блоку лунок, содержащих целевой белок, связанный с магнитными микросферами, для отделения аффинной метки, связанной с микросферами, от целевого белка и связывания протеазы с магнитными микросферами для отделения таким образом целевого белка; (S90) осуществления диализа путем введения раствора, содержащего белок-мишень, в диализную трубку и введения буфера для хранения белка в блок диализа белка; и (S100) удаления буфера элюции белка (фиг. 9).
В примере настоящего изобретения готовили ДНК-матрицу, клеточный лизат, раствор для экспрессии, раствор низкомолекулярных веществ для экспрессии, фермент TEV для удаления аффинной метки и реакционный раствор, который требуется для получения белка, суспензию магнитных микросфер, буфер для промывания магнитных микросфер, буфер для элюции белка и буфер для хранения белка. Белки получали с использованием автоматизированной системы бесклеточного получения белка по настоящему изобретению и с использованием вышеописанных примеров.
В приготовлении способа получения по настоящему изобретению все реакции за исключением стадии приготовления смеси для бесклеточной экспрессии белка осуществляли автоматически с помощью автоматизированной системы бесклеточного получения белка.
С помощью автоматизированной системы бесклеточного получения белка синтезировали AcGFP в шести реакционных лунках с заменой раствора низкомолекулярных веществ для экспрессии в течение нескольких стадий. На фиг. 10А видно, что на основании анализа приготовленного белка на 12% геле SDS-PAGE можно отметить, что уровень экспрессии белка повышался по мере последовательной замены раствора низкомолекулярных веществ для экспрессии. Кроме того, было показано, что с использованием различных матриц могли быть получены различные белки (фиг. 10В).
При этом при использовании в качестве матрицы гена AcGFP, содержащего последовательность, которая расщепляется TEV, получали белок способом с удалением аффинной метки. В результате, как показано на ФИГ. 11, образец, очищенный путем удаления гистидиновой метки, имел размер меньше, чем размер экспрессированного образца, и не детектировался с помощью антитела (Abeam) для гистидиновой метки.
ПРИМЕРЫ
Далее по тексту настоящее изобретение будет описано более подробно с отсылкой на примеры. Для специалиста в данной области будет очевидно, что эти примеры приведены исключительно для иллюстративных целей и не должны трактоваться как ограничивающие или изменяющие рамки настоящего изобретения.
Пример 1: Приготовление ДНК-матрицы
1-1: Приготовление плазмидной ДНК
В настоящем изобретении, для бесклеточного получения белка использовали гены AcGFP, CAT, RFP и TEV-AcGFP. Эти гены использовали для подтверждения получения белка с помощью автоматизированной системы бесклеточного получения белка, и специалисту в данной области очевидно, что настоящее изобретение может применяться к любым белкам, которые получают с помощью способов бесклеточного получения белка.
Каждый из генов синтезировали с помощью генного синтеза (NBiochem. Biophys. Res. Commun. 1998, 248, 200-203). Каждый из синтезированных генов обрабатывали ферментом рестрикции и затем клонировали в вектор pBIVT для бесклеточной экспрессии, содержащий гистидиновую метку («Bioneer», Корея). При этом TEV-AcGFP конструировали так, что он включал последовательность (Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln↓Gly), которая расщепляется TEV, между гистидиновой меткой и целевым белком.
Примеры экспрессирующих векторов, которые могут использоваться в настоящем изобретении, включают, в частности, pBIVT («Bioneer», Корея), pIVEX («Roche», Германия), рЕТ («Novagen», Германия), pK7, pQE, и т.д.
В частности, обработку ферментами рестрикции и клонировали осуществляли следующим образом.
Для обработки синтезированного генного продукта с помощью фермента рестрикции, в каждую пробирку помещали и смешивали 1 мкл NdeI («Bioneer», Корея), 1 мкл SalI («Bioneer», Корея), 2 мкл 10Х буфера AccuCut™ («Bioneer», Корея), 10 мкл синтезированного генного продукта и 6 мкл стерильной дистиллированной воды и затем инкубировали при 37°С в течение 3 часов. Для обработки экспрессирующего вектора с помощью фермента рестрикции, в каждую пробирку помещали и смешивали, 1 мкл NdeI («Bioneer», Корея), 1 мкл Sail («Bioneer», Корея), 2 мкл 10Х буфера AccuCut™ («Bioneer», Корея), 10 мкл экспрессирующего вектора и 6 мкл стерильной дистиллированной воды и затем инкубировали при 37°С в течение 3 часов. Из каждого из продуктов реакции, обработанных с помощью фермента рестрикции, ДНК очищали с использованием набора реактивов для экстракции ДНК из геля «Accuprep Gel Extraction» («Bioneer», Корея).
Затем в каждую пробирку помещали и смешивали 5 мкл 2 × буфера для быстрого лигирования («Promega», США), 1 мкл Т4 ДНК-лигазы («Promega», США), 3 мкл синтезированного генного продукта, обработанного ферментом рестрикции, и 1 мкл вектора, обработанного ферментом рестрикции, и затем инкубировали при 16°С в течение 1 часа. Затем 10 мкл инкубированного реакционного раствора добавляли к 100 мкл компетентных клеток Е. coli, выдерживали на льду в течение 30 минут, инкубировали при 42°С в течение 90 секунд, а затем выдерживали на льду в течение 5 минут. Реакционный раствор высевали на чашку со средой LB, содержащей канамицин, и затем инкубировали при 37°С в течение 16 часов.
260/280
Белые колонии собирали и инкубировали в 10 мл жидкой среды LB в течение примерно 16 часов, после этого раствор центрифугировали для удаления надосадочной жидкости, и плазмидную ДНК очищали из осадка с помощью набора реактивов для очистки плазмидной ДНК «AccuPrep plasmid DNA prep» («Bioneer», Корея). Очищенную ДНК секвенировали для подтверждения того, является ли корректным ген, синтезированный с помощью каждого из способов синтеза генов. Для получения ДНК, которую использовали для синтеза белка, инкубировали соответствующую колонию и очищали плазмидную ДНК таким же образом, как описано выше. Плазмидная ДНК при измерении спектрофотометром (Shimazu, Япония) имела чистоту (А) 1,8-2,0.
1-2: Получение продукта ПНР
Для создания продукта ПЦР использовали набор «ExiProgen™ ProXpress PCR Template Kit» («Bioneer», Корея).
Конкретно, для амплификации гена-мишени готовили набор праймеров, имеющих перекрывающиеся последовательности на 5'- и 3'-концах, и осуществляли первичную ПЦР с использованием образца (геномная ДНК, Т-вектор и т.д.), содержащего ген-мишень в качестве матрицы. В реакции ПЦР использовали премикс «AccuPower ProFi Taq PCR Premix», поставляемый с набором. Условия ПЦР-реакции были следующими: исходная денатурация при 94°С в течение 5 мин, и затем 30 клов, каждый из которых состоял из 94°С в течение 30 сек, 58°С в течение 30 сек и 72°С в течение 1 мин, с последующей конечной протяжкой при 72°С в течение 5 мин. Продукт первичной ПЦР очищали с использованием набора реактивов «AccuPrep Gel Extraction» («Bioneer», Корея).
Для синтеза ПЦР-фрагмента для белкового синтеза использовали первичный ПЦР-продукт в качестве матрицы вторичной перекрывающейся ПЦР. ПЦР-реакцию осуществляли путем добавления кассетного набора и набора праймеров, предоставляемого с набором реактивов, при этом условия ПЦР-реакции были следующими: денатурация при 94°С в течение 5, и затем 30 циклов, каждый из которых состоял из 94°С в течение 1 мин, 48°С в течение 1 мин и 72°С в течение 1 мин, с последующей конечной протяжкой при 72°С в течение 5 мин. Вторичный ПЦР-продукт очищали с помощью набора реактивов «AccuPrep Gel Extraction kit» («Bioneer», Корея).
Пример 2: Получение клеточного лизата
600
600
Вначале клетки Е. coli (BL21(DE3); «Novagen», США) культивировали в ферментере на 350 л (2× YT среда) при 37°С. При поглощении (OD) 0,6, добавляли 1 мМ IPTG для экспрессии Т7 РНК-полимеразы, а при поглощении (OD) 3-3,5, останавливали культивирование и собирали клетки с помощью центрифугирования и хранили при -50°С.
2
100 г собранных клеток Е. coli промывали с использованием 500 мл буфера для промывки (10 мМ Tris(oAc) pH 8,2, 14 мМ Mg(oAc), 60 мМ K(ОАс), 1 мМ DTT (дитиотреитол), 0,05% (об./об.) 2-меркаптоэтанол (2-МЕ)), и затем центрифугировали (при 3000 об/мин в течение 30 мин). Эту процедуру повторяли 4 раза.
После отмывки клетки Е. coli взвешивали и добавляли в буфер и диспергировали в нем (10 мМ Tris(oAc) pH 8,2, 14 мМ Mg(oAc)2, 60 мМ K(ОАс), 1 мМ DTT (дитиотреитол)), причем буфер имел объем, соответствующий 1,1-кратной массе клеток. Затем клетки лизировали с использованием гомогенизатора клеток (Pressure Cell Homogeniser, «Stansted Fluid Power») под постоянным давлением (280 фунт/кв. дюйм).
Клеточный лизат центрифугировали при 16000 об/мин при 4°С в течение 30 минут, и собирали надосадочную жидкость. Затем, буфер (10 мМ Tris(oAc) pH 8,2, 14 мМ Mg(oAc)2, 60 мМ K(ОАс), 1 мМ DTT (дитиотреитол)) добавляли к надосадочной жидкости в количестве 3 мл на 10 мл клеточного лизата, и добавляли туда 26,7 г/мл креатинкиназы. Затем раствор инкубировали при 37°С в течение 80 минут, для получения предварительно культивированного раствора. Затем предварительно культивированный раствор центрифугировали (11000 об/мин, 20 мин, 4°С), для получения клеточного лизата. Клеточный лизат хранили при -70°С до применения.
Пример 3: Получение раствора для экспрессии и раствора низкомолекулярных веществ для экспрессии
4
3
Раствор для экспрессии, который добавляют для бесклеточной экспрессии белка, готовили путем смешивания друг с другом 114 мМ HEPES-KOH (pH 7,5), 2,4 мМ АТР, каждый 1,7 мМ из СТР, GTP и UTP, 2 мМ DTT, 90 мМ K(Glu), 80 мМ NH(OAc), 12 мМ Mg(OAc), 68 г/мл фолиновой кислоты (L-5-формил-5,6,7,8-тетрагидрофолиевой кислоты), смесь аминокислот 2,5 мМ, 2% PEG 8000 и 67 мМ креатин фосфат. Кроме того, раствор низкомолекулярных веществ для экспрессии готовили путем смешивания раствора для экспрессии, обработанной DEPC деионизованной воды и 5% NaN в соотношении 46,7:52,3:1.
Раствор для экспрессии и раствор для экспрессии низкомолекулярных веществ хранили при -20°С до применения.
Пример 4: Получение раствора для удаления аффинной метки фермента TEV и реакционного раствора
4-1: Получение экспрессирующего вектора и создание штамма
Синтезировали ген TEV, оптимизированный по кодонам Е. coli. Ген, синтезированный способом синтеза генов (Lo-Chun Au et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 248(1):200, 1998), содержал последовательность гистидиновой метки в 5`-области фермента TEV. 10 мкл синтезированного гена, 1 мкл Nde I («Bioneer», Korea), 1 мкл XhoI («Bioneer», Корея), 2 мкл 10Х буфера AccuCut™ («Bioneer», Корея), и 6 мкл стерильной дистиллированной воды помещали и смешивали в каждой пробирке и затем инкубировали при 37°С в течение 3 часов, с получением таким образом генного фрагмента. При этом обрабатывали pCold (TaKaRa, Япония) с использованием фермента и условий, описанных выше. Каждую ДНК очищали с помощью набора «Accuprep Gel Extraction kit» («Bioneer», Корея).
3 мкл очищенного фрагмента гена TEV и 1 мкл вектора смешивали с 5 мкл 2× буфера для быстрого лигирования («Promega», США) и с 1 мкл Т4 ДНК-лигазы (Promega, США), и затем лигировали друг с другом при 16°С в течение 1 часа.
Затем, 10 мкл продукта лигирования добавляли к 100 мкл компетентных клеток DH-5а, держали на льду в течение 30 минут, инкубировали при 42°С в течение 90 секунд и затем держали на льду в течение 5 минут так, чтобы лигированный вектор был вставлен в клетки. Затем клетки высевали на чашку со средой LB, содержащей 100 мкг/мл амипициллина и статично культивировали при 37°С в течение 16 часов.
Культивированные белые колонии собирали, культивировали в течение 16 часов со встряхиванием в 10 мл жидкой среды LB, содержащей амипициллин, после чего центрифугировали. Надосадочную жидкость удаляли, и экспрессирующий вектор pCold-TEV, содержащий вставленный в него ген TEV, очищали из осадка с использованием набора реактивов «AccuPrep plasmid DNA prep kit» («Bioneer», Корея).
1 мкл приготовленного выше экспрессирующего вектора pCold-TEV добавляли к 100 мкл BL21(DE3) компетентных клеток. Затем клетки держали на льду в течение 30 минут, инкубировали при 42°С в течение 90 секунд и затем держали на льду в течение 5 минут так, чтобы экспрессирующий вектор был вставлен в клетки. Затем клетки рассевали на чашки с LB, содержащие 100 мкг/мл ампициллина, и статически культивировали при 37°С в течение 16 часов для получения экспрессирующего штамма.
4-2: Клеточная культура
600
Экспрессирующий штамм TEV, полученный как описано выше, культивировали в среде LB на уровне 3 мл, 100 мл и 2 л при температуре 37°С, с получением посевного материала. Полученный посевной материал добавляли к 70 л среды LB, и затем культивировали при температуре 37°С. При оптической плотности (OD) 0,4, к клеткам добавляли 0,1 мМ IPTG, которые затем культивировали при температуре 18°С в течение 16 часов. Затем клетки извлекали центрифугированием.
4-3: Очистка фермента TEV
100 г бактериальных клеток добавляли и равномерно суспендировали в 1000 мл буфера для лизиса клеток (20 мМ Tris HCl (pH 8), 1 мМ PMSF (Фенил Метил Сульфонил Фторид), 1 мМ 2-меркаптоэтанол (2-МЕ)), и затем лизировали с помощью клеточного гомогенизатора (Pressure Cell Homogeniser, «Stansted Fluid Power») при постоянном давлении (280 фунтов/кв. дюйм).
Клеточный лизат центрифугировали (11000 об/мин, 30 мин, 4°С). Надосадочную жидкость добавляли к 40% 5% сульфата стрептомицина и затем центрифугировали (11000 об/мин, 15 мин., 4°С) для удаления нуклеиновой кислоты.
2
4
2
4
Сульфат аммония добавляли в количестве, соответствующем 0,314 объема собранного клеточного лизата с последующим центрифугированием (11000 об/мин, 15 мин, 4°С), после чего собирали осадок. Осадок суспендировали в 200 мл буфера для Ni-содержащей колонки (50 мМ NaHPO pH 8, 300 мМ NaCl, 10 мМ Имидазол), добавляли к диализной трубке (10 кДа, Dialysis Tubing, «Sigma», США) и затем диализовали (12 ч, 4°С) против 50-кратного объема буфера для Ni-содержащей колонки для удаления примесей. Раствор в диализной трубке центрифугировали (11000 об/мин, 20 мин, 4°С), и надосадочную жидкость собирали и затем добавляли к колонке, набитой Ni-агарозной смолой (GE Healthcare). Затем белок-содержащий элюат собирали с помощью элюирующего буфера для Ni-содержащей колонки (50 мМ NaHPO pH 8, 300 мМ NaCl, 500 мМ имидазол).
Белковый элюат добавляли в ту же пробирку, что описано выше, диализовали (12 ч, 4°С) против 100-кратного объема буфера для DEAE-колонки (20 мМ Tris HCl рН8, 50 мМ KCl, 0,5 мМ EDTA, 1 мМ 2-меркаптоэтанол (2-МЕ)), с последующим центрифугированием (11000 об/мин, 20 мин, 4°С), и собирали надосадочную жидкость. Надосадочную жидкость прогоняли через колонку, набитую DEAE-смолой («GE Healthcare»). Так как белок TEV не связывается со смолой DEAE, то собирали раствор, не связанный со смолой, и добавляли в диализную трубку (10 кДа, Dialysis Tubing, «Sigma», США), и диализовали против 50-кратного объема буфера для хранения TEV (50 мМ Tris HCl pH 7,6, 1 мМ EDTA, 1% Trinton Х-100, 50% глицерин), с последующим центрифугированием. И, наконец, собранный фермент TEV хранили при -20°С до использования.
4-4: Получение реакционного раствора для фермента TEV
Готовили раствор (50 мМ HEPES-KOH (рН7,5), 100 мМ NaCl, 10 мМ имидазол, 5 мМ 2-меркаптоэтанол (2-МЕ), 0,5 мМ EDTA, 1 мМ DTT и 10% (об./об.) глицерин) для реакции фермента TEV. Раствор для удаления аффинной метки из целевого белка хранили при -20°С до применения.
Пример 5: Получение суспензии магнитных частиц и раствора для отмывки
5-1: Получение суспензии магнитных частиц
Магнитные частицы, используемые для очистки белков, представляли собой частицы магнитного железа (Fe), покрытые кремнием и комплексированные никелем (Ni) на завершающей стадии. В качестве магнитных частиц использовали кремниевые магнитные частицы Ni-NTA («Bioneer», Korea). Суспензию магнитных частиц получали суспендированием магнитных частиц в 20% этаноле для получения 10% взвеси.
5-2: Получение раствора для отмывки магнитных частиц
Готовили отмывочные растворы, необходимые для очистки белков. В частности получали раствор I для отмывки магнитных частиц (50 мМ HEPES-KOH, 300 мМ NaCl, 10 мМ имидазола, 5 мМ 2-меркаптоэтанола (2-МЕ), и 10% (об./об.) глицерина).
Далее для удаления аффинной метки готовили и использовали раствор II для отмывки магнитных частиц (50 мМ HEPES-KOH, 100 мМ NaCl, 10 мМ имидазол, 5 мМ 2-меркаптоэтанол (2-МЕ), 0,5 мМ EDTA, 1 мМ DTT, и 10% (об./об.) глицерин).
Растворы для очистки магнитных частиц использовали при 4°С до применения.
Пример 6: Приготовление буфера для элюции белков и буфера для хранения белков
6-1: Приготовление буфера для элюции белков
Готовили буфер для элюции белков, требуемый для очистки белков. В частности готовили буфер для элюции белков (50 мМ HEPES-KOH, 300 мМ NaCl, 1 М имидазол, 5 мМ 2-меркаптоэтанол (2-МЕ), и 10% (об./об.) глицерина). Раствор хранили при 4°С до использования.
6-2: Получение буфера для хранения белков
После очистки целевого белка готовили буфер для хранения белков. В частности, использовали буфер для хранения белка (50 мМ Tris-Cl (pH 7.6), 100 мМ NaCl, 1 мМ DTT, 0,1 мМ EDTA, 0,05% (об./об.) NaN3, и 50%(об./об.) глицерина). Раствор хранили при 4°С до использования.
Пример 7: Получение белка с помощью автоматизированной системы бесклеточного получения белка
(1) Стадия получения смеси для бесклеточной экспрессии белка
Смесь для бесклеточной экспрессии белка получали таким же образом.
Диализные трубки, внутреннюю и внешнюю область которых промывали дистиллированной водой, вставляли в отверстия для диализных трубок реакционных сосудов в блоке реакции экспрессии белка и в блоке диализа белка, и затем каждую трубку блока диализа белка наполняли 0,5 мл стерильной дистиллированной воды.
Затем при комнатной температуре растворяли матричную ДНК, клеточный лизат и раствор экспрессии, и вводили и смешивали в диализных трубках блока реакции экспрессии белка.
(2) Стадия экспрессии белка с помощью раствора низкомолекулярных веществ для экспрессии
Раствор для экспрессии низкомолекулярных веществ может быть поставлен вместе с набором многолуночных планшетов или контейнером для раствора, а способ экспрессии может быть изменен в соответствии с количеством образцов следующим образом.
А. 24 (или меньшее количество) образцов
Экспрессия белка осуществляется с помощью первого или второго реакционного сосуда, показанного на фиг. 3 или 4, при этом раствор низкомолекулярных веществ для экспрессии поставляется в наборе многолуночных планшетов.
Пипетка вводит раствор низкомолекулярных веществ для экспрессии из набора многолуночных планшетов в отверстие для раствора низкомолекулярных веществ для экспрессии в реакционном сосуде блока реакции экспрессии белка. Здесь объем отверстия для раствора низкомолекулярных веществ для экспрессии соответствует примерно 2,5-3 объемам каждой смеси для экспрессии белка. Нагревали блок контроля температуры реакции, помещенный под блоком реакции экспрессии белка, (26~38°С), и вставляли в отверстие для раствора низкомолекулярных веществ для экспрессии пипетку для периодического перемешивания раствора. В данном процессе источник энергии и тому подобное в растворе низкомолекулярных веществ для экспрессии вводили в смесь через диализную мембрану диализной трубки, содержащей смесь для экспрессии белка, и удаляли ингибиторы экспрессии белка в смеси через диализную мембрану для стимуляции экспрессии белка. Через 3 часа пипетка всасывала раствор низкомолекулярных веществ для экспрессии из отверстия для раствора низкомолекулярных веществ для экспрессии и сбрасывала набранный раствор в контейнер для отходов, и затем вводила в отверстие реакционного сосуда для раствора низкомолекулярных веществ для экспрессии свежий раствор низкомолекулярных веществ для экспрессии, подаваемый из набора многолуночных планшетов. Процесс замены раствора низкомолекулярных веществ для экспрессии в течение множества стадий может быть повторен 5-6 раз.
В. 24 (или большее количество) образцов
Экспрессию белка осуществляли с использованием третьего или четвертого реакционных сосудов, представленных на фиг. 5 или 6, при этом низкомолекулярный раствор для экспрессии подавался в контейнер для раствора.
Раствор низкомолекулярных веществ для экспрессии подавался из контейнера для раствора в контейнер для раствора низкомолекулярных веществ для экспрессии через входное отверстие, соединенное с реакционным сосудом. При этом объем раствора низкомолекулярных веществ для экспрессии составляет 10-20 объемам смеси для экспрессии белка. Блок контроля температуры реакции, расположенный под блоком реакции экспрессии белка, нагревали до (26~38°С) в течение примерно 16-20 часов. Источник энергии и тому подобное в смеси для экспрессии белка вводили в смесь через диализную мембрану диализной трубки, и удаляли ингибиторы экспрессии белка в смеси через диализную мембрану для стимуляции экспрессии белка.
После окончания экспрессии белка, раствор низкомолекулярных веществ для экспрессии отбрасывали в контейнер для отходов через выходное отверстие. Эта стадия введения и удаления раствора низкомолекулярных веществ для экспрессии может быть повторена один или несколько раз.
(3) Стадия очистки белка с помощью магнитных частиц
Суспензия магнитных частиц, раствор для отмывки магнитных частиц и буфер для элюции белка, требуемые для очистки белка доставляются в набор многолуночных планшетов.
А. Очистка целевого белка, меченного аффинной меткой
Пипетка перемещает суспензию магнитных частиц из набора многолуночных планшетов в набор многолуночных планшетов блока очистки белка, и затем перемешивает суспензию с раствором для отмывки магнитных частиц. Магнитные частицы прикрепляются к стенке набора многолуночных планшетов с помощью устройства для применения магнитного поля блока очистки белка, после чего удаляется раствор для отмывки магнитных частиц.
С помощью пипеток смесь для экспрессии белков из диализной трубки перемещается в набор многолуночных планшетов содержащий магнитные частицы, после чего перемешивается с магнитными частицами. В этом способе, целевой белок, меченный гистидином, связывается с дивалентными ионами на поверхности магнитных частиц. Магнитные частицы, связанные с целевым белком, прикрепляются к стенке набора многолуночного планшета с помощью устройства применения магнитного поля, и затем примеси отделяются от них.
Раствор для отмывки магнитных частиц вводят в лунку, содержащую магнитные частицы, связанные с целевым белком, и затем с помощью пипетки перемешивается для суспендирования магнитных частиц. В этом процессе белок без гистидиновой метки, связанный с магнитными частицами, отделяется от магнитных частиц. Затем магнитные частицы прикрепляются к стенке набора многолуночного планшета с помощью устройства для применения магнитного поля, после чего удаляется отмывочный раствор, содержащий примеси. Этот процесс может быть повторен 6-8 раз.
После окончания отмывки, в лунку, содержащую магнитные частицы, связанные с целевым белком, вводят буфер для элюции белков и затем перемешивают с помощью пипетки. В этом процессе целевой белок отделяется от магнитных частиц и переходит в раствор. Магнитные частицы прикрепляются к стенке набора многолуночных планшетов с помощью устройства для применения магнитного поля, после чего отбирается раствор с элюированным целевым белком. Раствор с извлеченным белком перемещается в диализную трубку, расположенную в блоке диализа белков.
В. Очистка целевого белка без аффинной метки
Пипетка перемещает суспензию магнитных частиц из набора многолуночных планшетов в набор многолуночных планшетов блока очистки белка, после чего перемешивает суспензию с раствором для отмывки магнитных частиц. Магнитные частицы прикрепляются к стенке набора многолуночного планшета с помощью устройства для применения магнитного поля блока очистки белка, после чего раствор для отмывки магнитных частиц удаляется.
С помощью пипетки смесь для экспрессии белка из диализной трубки перемещается в набор многолуночных планшетов содержащий магнитные частицы, после чего перемешивается с магнитными частицами. В этом способе целевой белок, меченный гистидином, связывает дивалентные ионы на поверхности магнитных частиц. Магнитные частицы, связанные с целевым белком, прикрепляются к стенке набора многолуночного планшета с помощью устройства применения магнитного поля, после чего удаляются примеси.
Раствор для отмывки магнитных частиц вводят в лунку, содержащую магнитные частицы, связанные с целевым белком, и затем смешивают с помощью пипетки для суспендирования магнитных частиц. В этом процессе белок без гистидиновой метки отделяют от магнитных частиц. Затем магнитные частицы прикрепляют к стенке набора многолуночных планшетов с помощью устройства для применения магнитного поля, после чего удаляют отмывочный раствор, содержащий примеси. Этот процесс может быть повторен 6-8 раз.
После окончания отмывки, в лунку, содержащую магнитные частицы, связанные с целевым белком, вводили смесь фермента TEV/реакционного буфера и затем перемешивают с помощью пипетки. Лунку нагревали при 30°С в течение 1 часа с помощью блока контроля температуры реакции, расположенного под блоком очистки белка. В этом процессе, целевой белок отделяется от аффинной метки и, следовательно, отделяется от магнитных частиц в раствор. Раствор содержит целевой фермент без аффинной метки вместе с ферментом TEV. Магнитные частицы прикрепляются к стенке набора многолуночного планшета с помощью устройства для применения магнитного поля, и затем раствор, содержащий целевой белок, связывается со свежими магнитными частицами. В этом процессе меченный гистидином фермент TEV связывается с магнитными частицами, а целевой белок оказывается в надосадочной жидкости, не будучи связанным с магнитными частицами.
После этого магнитные частицы, связанные с ферментом TEV, прикрепляли к стороне набора многолуночных планшетов с помощью устройства для применения магнитного поля, после чего отбирали конечный раствор с целевым белком и перемещали в диализную трубку, расположенную в блоке диализа белка.
(4) Стадия диализа с буфером для хранения белков
Буфер для хранения белка может быть внесен в набор многолуночных планшетов или в контейнер для раствора, а способ экспрессии может быть изменен в соответствии с количеством образцов следующим образом.
А. 24 (или меньшее количество) образцов
Диализ осуществляли с помощью первого или второго реакционного раствора, показанных на фиг. 3 или 4, при этом буфер для хранения белка вносится в набор многолуночных планшетов.
Пипетка переносит буфер хранения белка набора многолуночных планшетов в отверстие реакционного сосуда для диализного раствора, расположенного в блоке диализа белка. При этом объем буфера соответствует примерно 2 объемам каждого раствора для целевого белка. Блок контроля температуры реакции, расположенный под блоком диализа белка, охлаждается (4~8°С), а пипетка периодически перемешивает раствор в отверстии для диализного раствора. В этом процессе, буфер элюции белка, содержащийся в растворе целевого белка, заменяли буфером для хранения белков через диализную мембрану в диализной трубке. Через 3 часа буфер для хранения белка забирали с помощью пипетки из диализного отверстия и сбрасывали буфер в контейнер для отходов, после чего свежий буфер для хранения белка из набора многолуночных планшетов вводили в отверстие реакционного сосуда для диализного раствора. Эта многостадийная замена буфера для хранения белков может быть повторена 5-6 раз.
В. 24 (или большее количество) образцов
Диализ осуществляли с помощью третьего или четвертого реакционного сосуда, показанного на фиг. 5 или 6, при этом буфер для хранения белка вносили в набор много луночных планшетов.
Буфер для хранения белка переносили из контейнера для раствора в диализный сосуд через входное отверстие, соединенное с реакционным сосудом. При этом объем буфера для хранения белка соответствует 10-20 объемам раствора целевого белка. Блок контроля температуры реакции, расположенный под блоком диализа белка охлаждается (4~8°С) в течение около 16-20 часов. В этом процессе, буфер элюции белка, содержащийся в растворе целевого белка, заменяли буфером для хранения белков через диализную мембрану в диализной трубке. Эта стадия замены буфера для элюции белка с помощью буфера для хранения белков во множестве стадий может быть повторена один или несколько раз.
Пример 8: Анализ уровня экспрессии белка, полученного автоматизированной системой бесклеточного получения белка
Уровень экспрессии белка, полученного с помощью автоматизированной системы бесклеточного получения белка по способу Примера 7, анализировали с помощью SDS-PAGE и вестерн-блоттинга.
С помощью автоматизированной системы бесклеточного получения белка по настоящему изобретению, получали AcGFP в 6 лунках, при этом раствор низкомолекулярных веществ для экспрессии заменяли в течение нескольких стадий. В результате, как видно на фиг. 10А, демонстрирующей результаты анализа 12% SDS-PAGE геля, уровень экспрессии белка, повышался по мере замены раствора низкомолекулярных веществ в течение нескольких стадий.
В дополнение к AcGFP, могут быть получены другие белки, такие как CAT, RFP и AcGFP (продукт ПЦР) (фиг. 10В).
Белок получали способом удаления аффинной метки, с использованием в качестве матрицы включенной в ген AcGFP последовательности, которую расщепляет TEV. В результате, как показано на фиг. 11А, размер очищенного образца без гистидиновой метки (Р) был меньше, чем экспрессированного образца (Е). Также проводили вестерн-блоттинг с использованием антитела к гистидиновой метке (Abcam), который показал, что в очищенном образце гистидиновая меткиа не детектируется (фиг. 11В).
Промышленная применимость
Система для автоматизированного бесклеточного получения белка по настоящему изобретению обладает преимуществами, которые заключаются в том, что система может автоматически экспрессировать и очищать целевой белок, а полученный белок может быть сразу же использован, поскольку он может быть диализован против буфера для хранения белка.
В способе получения белка по настоящему изобретению источник энергии и т.п., требуемый для экспрессии белка, может вноситься при замене раствора низкомолекулярных веществ для экспрессии в течение нескольких стадий, а целевой белок может быть получен в количестве вплоть до пяти раз большем, чем полученный обычным способом бесклеточного получения белка периодического действия. Кроме того, чистый целевой белок может быть получен путем удаления ненужной аффинной метки с помощью протеазы при очистке целевого белка с помощью магнитных частиц. Таким образом, согласно настоящему изобретению, при получении белков для промышленных, медицинских и исследовательских целей, возможно получить чистые белки, свободные от искусственной последовательности, которая может оказать негативное воздействие на активность и структуру белков.
Хотя настоящее изобретение подробно описано со ссылкой на специфические особенности, для специалиста в данной области будет очевидно, что это описание является всего лишь предпочтительным воплощением и не ограничивает сферу применения настоящего изобретения. Таким образом, реальная сфера применения настоящего изобретения будет определяться прилагаемой формулой изобретения или ее эквивалентами.