СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ КАРЦИНОМЫ ЯИЧНИКА ВЫСОКОЙ СТЕПЕНИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННОСТИ, ЧУВСТВИТЕЛЬНОЙ К BRCA-СПЕЦИФИЧНЫМ ПРЕПАРАТАМ
METHOD FOR DIAGNOSTICS OF HIGH-GRADE OVARIAN CARCINOMA SENSITIVE TO BRCA-SPECIFIC DRUGS

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии и молекулярной диагностике и может быть использовано для диагностики карциномы яичника высокой степени злокачественности, чувствительной к BRCA-специфичным препаратам.
Наиболее близким способом определения BRCAness, или HRDness - паттерна хромосомных аберраций, опосредованного дефицитом репарации ДНК по типу гомологичной рекомбинации, является способ, предложенный компанией Myriad [myChoice CDx test]. Способ основан на расчете показателя HRD (homologous recombination deficiency score), который представляет собой невзвешенную сумму трех показателей - LST (large-scale state transitions), TAI (telomeric allelic imbalance), LOH (loss-of-heterozygosity). Если сумма этих показателей больше 42, паттерн хромосомной нестабильности расценивается как HRDness (или HR-deficient) [Telli ML, Timms KM, Reid J, Hennessy B, Mills GB, Jensen KC, Szallasi Z, Barry WT, Winer EP, Tung NM, Isakoff SJ, Ryan PD, Greene-Colozzi A, Gutin A, Sangale Z, Iliev D, Neff C, Abkevich V, Jones JT, Lanchbury JS, Hartman AR, Garber JE, Ford JM, Silver DP, Richardson AL. Homologous Recombination Deficiency (HRD) Score Predicts Response to Platinum-Containing Neoadjuvant Chemotherapy in Patients with Triple-Negative Breast Cancer. Clin Cancer Res. 2016 Aug l;22(15):3764-73. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-15-2477. Epub 2016 Mar 8. PMID: 26957554; PMCID: РМС6773427].
Недостатком способа является сложность расчета показателя HRD и высокие требования к качеству гистологического материала. Тест основан на количественных характеристиках и не учитывает типичные для BRCA-подобных карцином дискретные молекулярные события.
Техническим результатом изобретения является индивидуализация системной терапии рака яичника за счет повышения точности определения BRCAness или HRDness - паттерна хромосомных аберраций с учетом дискретных молекулярных событий.
Указанный технический результат достигается в способе диагностики карциномы яичника высокой степени злокачественности, чувствительной к BRCA-специфичным препаратам, путем выявления феномена BRCAness, включающем исследование диагностического материала методом высокопроизводительного секвенирования с построением профилей хромосомной нестабильности, в котором исследуют опухолевые ткани яичника и нормальные ткани - лимфоциты периферической крови пациента, феномен BRCAness определяют сочетанием количественного показателя числа сегментов генома с потерей гетерозиготности не менее 22 и наличием не менее двух из трех следующих нарушений копийности по сравнению с нормальными тканями: увеличение копийности 8q24 с одновременной делецией 8р, выявление делеции 13q и/или наличия разрыва на длинном плече хромосомы 22 с утратой теломерного участка, при выявлении феномена BRCAness в спорадических карциномах яичника диагностируют карциному яичника высокой степени злокачественности, чувствительную к BRCA- специфичным препаратам.
Таким образом, заявляемый способ основан на комбинации качественных характеристик профиля хромосомной нестабильности (CNA- профиля) и количестве сегментов профиля, которые находятся в состоянии loss-of-heterozygosity. LOH - это феномен утраты гетерозиготности в опухолевой ткани в локусе, который находился в гетерозиготном состоянии в образце нормальной ткани конкретного пациента. В случае, если в CNA-профиле определяется не менее 22 сегментов в LOH и присутствуют два из трех дискретных CNA - увеличение копийности 8q24 в сочетании с делецией 8р, делеция 13q, делеция теломерного участка 22q, этот паттерн расценивается как BRCAness.
Способ иллюстрируется Фиг. 1-3, где:
на фиг. 1 - профиль хромосомной нестабильности (CNA), наблюдаемый в BRCA1-ассоциированной карциноме яичника высокой степени злокачественности;
на фиг. 2 - профиль хромосомной нестабильности (CNA), наблюдаемый в спорадической карциноме яичника высокой степени злокачественности;
на фиг. 3 - Kmeans-кластеринг числа сегментов хромосомного профиля. Желтым выделены образцы носителей наследственных мутаций BRCA1/BRCA2.
Способ осуществляют следующим образом:
ДНК, полученную из архивных опухолевых тканей яичника и соответствующей нормальной ткани (например, лимфоцитов периферической крови), подвергают стандартной процедуре пробоподготовки для NGS: фрагментации ДНК, репарации концов и полиаденилированию, лигированию адаптеров и амплификации. 2 мкг готовых библиотек обогащают с использованием панели биотинилированных зондов, покрывающих геном через каждые 50 Kb. Для получения сырых данных, пригодных для построения профиля CNA, необходимо секвенировать ДНК-библиотеки с глубиной не менее 100Х. Первичные данные массивного параллельного секвенирования подвергают биоинформатической обработке с использованием существующего набора программных инструментов GATK [Genome Analysis ToolKit]. В частности, геном опухоли делится на сегменты, утратившие или не утратившие гетерозиготное состояние (LOH). Гетерозиготные локусы при этом определяются на основе анализа соответствующей данной опухоли нормальной (конститутивной) ДНК [Van der Auwera, G.A. and O'Connor, B.D., 2020. Genomics in the Cloud: Using Docker, GATK, and WDL in Terra]. Каждый сегмент характеризуется следующими характеристиками: 1) длина сегмента (в Mb), 2) количество гетерозиготных нуклеотидов в сегменте, 3) средняя нормализованная копийность сегмента, 4) MAF (minor allele fraction) - средняя фракция тех аллелей в опухоли, которые подвергаются делеции. После сегментирования генома анализ дополняется собственным алгоритмом выявления определяющих BRCAness молекулярных характеристик. Подсчитывают количество сегментов генома, находящихся в статусе LOH. Сегмент считается LOH, если его MAF ниже порогового значения (cutoff). Пороговое значение определяется как среднее между центрами при кластеризации всех сегментов рассматриваемого образца на два кластера по значению MAF. Пороговое значение ограничено сверху и не может превышать 0.4.
Для отработки собственного алгоритма определения BRCAness были использованы архивные образцы опухолевых тканей яичника, которые были получены от пациенток, подвергавшихся стандартной предоперационной терапии схемой паклитаксел и карбоплатин. Информативные CNA-профили были получены для 51 пациентки, 13 из которых были носителями наследственных дефектов BRCA1/BRCA2. BRCAl/2-ассоциированные карциномы были использованы для дефиниции BRCAness (Фиг. 1, 2) как по определению характеризующиеся этим паттерном. Все образцы (п=51) были разделены по количеству сегментов с LOH с помощью функции kmeans на три кластера: центр между первым и вторым кластером составил 22 сегмента и был принят как пороговое значение для определения BRCAness; при этом все образцы BRCAl/2-ассоциированных карцином попали во второй и третий кластеры (Фиг. 3). Далее, путем построения круговых диаграмм и дендрограммы для значений MAF, были обнаружены отдельные CNA, комбинация которых могла использоваться для дискриминации BRCAness и не-BRCAness профилей, а именно: увеличение копийности 8q24 в сочетании с делецией 8р, делеция 13q, делеция теломерного участка 22q. Таким образом, BRCAness была определена как сочетание числа сегментов в статусе LOH>/=22 и двух из трех вышеупомянутых хромосомных нарушений.
Способ подтверждается следующими клиническими примерами.
Пример 1. Пациентка Р., 59 лет, проходила лечение в онкологическом центре с диагнозом рак яичников (c)T3cNxM0, стадия FIGO ШС,гистологическое заключение: тубоовариальная карцинома высокой степени злокачественности. Наследственные мутации BRCA1/2 у пациентки не обнаружены. В неоадъювантном режиме она получила 6 курсов химиотерапии стандартной схемой «паклитаксел и карбоплатин» (ТСЬР): достигнут частичный клинический ответ по критериям RECIST. При гистологическом исследовании степень лечебного патоморфоза по критериям [Bohm et al., 2015] была оценена как CRS1 (минимальный регресс) в яичнике и CRS3 (полный регресс) в большом сальнике. Пациентке была выполнена оптимальная циторедуктивная операция; в адъювантном режиме было проведено еще два курса ТСbР (последний - 17.04.2020). Последнее наблюдение датируется 13.04.2021: пациентка находится в клинической ремиссии. Таким образом, на основании длительного бесплатинового интервала (12 месяцев), объективного ответа по RECIST и полного патоморфоза очагов в большом сальнике этот случай был отнесен в группу «хорошего ответа» на первую линию химиотерапии. При ретроспективном молекулярном исследовании опухолевого материала был определен HRD score, как предложено [Telli et al., 2016]: он составил 64 (что является признаком дефицита гомологичной репарации - фенотипа, ассоциированного с хорошим ответом на платиносодержащую терапию). Профиль CNA в соответствии с предложенными нами критериями был расценен как BRCAness (наличие нестабильности хромосомы 8: делеция 8р с увеличением копийности 8q24; делеция BRCA2- содержащего сегмента 13q, высокое общее количество делеций равномерно распределенных участков хромосом). Фенотип BRCAness также является предиктором более высокой чувствительности к платиносодержащей терапии.
Ниже представлены еще два описания клинических случаев, для которых при анализе опухолевых тканей продемонстрирована дискордантность между HRD score (наиболее близкий аналог) и заявляемым способом диагностики карциномы яичника высокой степени злокачественности, чувствительной к BRCA-специфичным препаратам путем определения BRCA-подобного профиля.
Конкордантность результатов между HRD score по [Telli et al., 2016] и заявляемым способом, включающем определение BRCAness в спорадических карциномах яичника, составила 35/38 (92%).
Пример 2. Пациентка И., 66 лет, проходила лечение в диагностическом центре с диагнозом рак яичников (c)T3cNxM1/(p)T3cNxM1 (метастатическое поражение легких, плевры, печени), стадия по FIGO IVB, гистологическое заключение: тубоовариальная карцинома высокой степени злокачественности. Наследственные мутации BRCA1/2 не обнаружены. В неоадъювантном режиме получила 4 курса химиотерапии стандартной схемой «паклитаксел и карбоплатин» (TCbP): достигнут частичный клинический ответ по критериям RECIST, при гистологическом исследовании степень лечебного патоморфоза по критериям [ et al., 2015] была оценена как CRS2 (умеренный регресс). Пациентке была выполнена оптимальная циторедуктивная операция; еще два курса TCbP было проведено в адъювантном режиме (последний - 09.09.2019). В январе 2020 года было установлено прогрессирование (появление метастазов в печени, карциноматоз брюшины, увеличение размеров очагов в легких и наддиафрагмальных лимфоузлов). На основании короткого бесплатинового интервала (4 месяца) пациентка была отнесена нами в неблагоприятную клиническую группу (группа «плохого ответа»). В ходе ретроспективного молекулярного анализа опухолевой ткани был определен HRD score, как предложено [Telli et al., 2016]: он составил 56 баллов, что формально соответствует дефициту гомологичной репарации. В соответствии с предложенными нами критериями профиль хромосомной нестабильности в этой опухоли был расценен как не-BRCAness (отсутствие типичной нестабильности длинного плеча хромосомы 8). Данный профиль является предиктором плохого ответа на платиносодержащую терапию.
Пример 3. Пациентка К., 43 года, проходила лечение в онкологическом центре с диагнозом рак яичников (c)T3cN0M1 (метастазы в мягких тканях брюшной стенки), стадия FIGO IVB, гистологическое заключение: серозная карцинома высокой степени злокачественности. Наследственные мутации BRCA1/2 не обнаружены. В неоадъювантном режиме получила 4 курса химиотерапии стандартной схемой TCbP: достигнут частичный клинический ответ по критериям RECIST, при гистологическом исследовании резидуальной карциномы степень лечебного патоморфоза по критериям [ et al., 2015] была оценена как CRS1 (минимальный регресс) в яичнике и CRS2 (умеренный регресс) в большом сальнике. Пациентке была выполнена оптимальная циторедуктивная операция; в послеоперационном периоде проведено еще 4 курса TCbP (последний - 31.01.2020). Последнее наблюдение датируется 01.07.2021: пациентка находится в ремиссии по основному заболеванию. На момент проведения молекулярного анализа бесплатиновый интервал составлял более 12 месяцев, что, в сочетании с объективным ответом по RECIST, позволило отнести данный случай в благоприятную клиническую группу (группа «хорошего ответа»). Величина HRD score составила 36 (ниже формального порога 42); нами профиль хромосомной нестабильности был расценен как BRCAness (типичная нестабильность хромосомы 8 с утратой 8р и увеличением копийности 8q24, делеция 13q, разрыв на 22q). Профиль BRCAness является предиктором хорошего ответа на платиносодержащую терапию.