Изменение активности кислой и щелочной фосфатаз в иммунокомпетентных органах - критерий оценки эффективности иммунобиологических препаратов

12. Resolution of the meeting of the public coordination council on pneumococcal infection and vaccination in Russia. Epidemiología i Vaccinoprofilaktika. [Epidemiology and Vaccinal Prevention]. 2016; 1: 43 - 47 (in Russian).

13. Mcintosh D.G. International experience with 7-valent pneumococcal conjugate vaccine. Pediarticheskaya pharmokologia [Pediatric pharmacology]. 2009; 6 (2): 8 - 11 (in Russian).

14. Kostinov M.P The new conjugate pneumococcal vaccine prevnar 13 - the effective protection of children against pneumococcal disease. Epidemiologia i Vaccinoprofilaktika. [Epidemiology and Vaccinal Prevention]. 2011; 6 (61): 99 - 107 (in Russian).

15.S hamsheva O.V., Uchaikin V.F., Medunitsyn N.V. Clinical vaccinology. Moscow: GEOTAR-Media; 2016 (in Russian).

16. Yasinsky A.A., Lytkina I.N., Mikheyeva I.V. On the issue of professional training of medical staff in the area of pediatric vaccine prophylaxis. Detskie infekcii. [Children Infections]. 2011; 10 (2): 35 - 39 (in Russian).

17. Epidemiologyand vaccinal prevention of pneumococcal infection. Methodical recommendations. MI 3.3.1.0027-11.2011 (in Russian).

18. Immunization with using pneumococcal polysaccharide vaccinefor the prevention of pneumococcal disease. Methodical recommendations. MI 3.3.1. 2008 (in Russian).

19. Letter of Ministry of Health of the Russian Federation from 08.06.2015 №24-2-2031252 «By the use of pneumococcal polysaccharide conjugate adsorbed vaccine» Health Information Gazette Samara region. 2015; 27: 5 - 8 (in Russian).

20. Kostinov M.P, Chuchalin A.G., edit. Manual of Clinical Immunology in respiratory medicine. Moscow: ATMO; 2016 (in Russian).

21. Zverev V.V., Semenov B.F., Khaitov R.M., edit. Vaccines and vaccination. National manual. Moscow: GEOTAR-Media; 2011 (in Russian).

22. Kostinov M.P, Pahomov D.V. Efficacy and Safety of the Vaccine Prevenar in Children and Adults at Risk. Epidemiologia i Vaccinoprofilaktika. [Epidemiology and Vaccinal Prevention]. 2010; 3 (52): 68 - 71 (in Russian).

Изменение активности кислой и щелочной фосфатаз в иммунокомпетентных органах - критерий оценки эффективности иммунобиологических препаратов

О.В. Юрьева (olga.yur1963@gmail.com), В.И. Дубровина (dubrovina-valya@mail.ru), А.В. Корнева, Т.П. Старовойтова, Т.А. Иванова, В.Б. Николаев, С.В. Балахонов

ФКУЗ «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора,

Резюме

Изучена динамика активности кислой фосфатазы и щелочной фосфатазы в тимусе и селезенке лабораторных мышей, иммунизированных препаратами клеточных стенок Francisella tularensis разных подвидов. Препараты клеточных стенок подвидов F. tularensis subsp. mediaasiatica А-61(385) и F. tularensis subsp. novicida В-399 A-Cole (386) стимулировали повышение активности кислой и щелочной фосфатазы в более ранние сроки (на 7 сутки) после иммунизации, чем остальные. Эти препараты также показали высокую протективную активность. На основании проведенного исследования можно заключить, что изучение динамики активности кислой и щелочной фосфатаз в иммунокомпетентных органах может служить одним из критериев оценки эффективности иммунобиологических препаратов.

Ключевые слова: туляремия, клеточная стенка, фосфатаза, тимус, селезенка

Change in the Activity of Acidic and Alkaline Phosphatases in Immunocompetent Organs -a Criterion for Evaluating the Effectiveness of Immunobiological Preparations

O.V. Yurieva (olga.yur1963@gmail.com), V.I. Dubrovina (dubrovina-valya@mail.ru), A.V. Korneva, T.P. Starovoitova, T.A. Ivanova, V.B. Nikolaev, S.V. Balakhonov

Federal Budgetary Healthcare Facility «Irkutsk Antiplague Research Institute» of Federal Service for Surveillance on Consumer Rights

Protection and Human Wellbeing, adm@chumin.irkutsk.ru

Abstract

Dynamics of acidic and alkaline phosphatase activities was examined in thymus and spleen of laboratory mice immunized by cell wall preparations of Francisella tularensis of different subspecies. Cell wall preparations of two subspecies: F. tularensis subsp. mediaasiatica А-61(385) and F. tularensis subsp. novicida В-399 A-Cole (386) stimulated the rise of acidic and alkaline phosphatase activities in earlier time (7 days) after immunization than the others. It was correlated with their protective activity. On the basis of the results it is concluded that the studying of the acidic and alkaline phosphatase activities in immunocompetent organs can serve as one of the criteria for evaluation of efficiency of immunobiological preparations. Key words: Francisella tularensis, cell wall, phosphatase, thymus, spleen

Введение ное время персистировать в клетках макроорга-

Известно, что возбудитель туляремии является низма, вызывая хронизацию инфекционного про-внутриклеточным паразитом, способным длитель- цесса и рецидивы. Такая особенность F. tularensis

позволила предположить, что для формирования защитных механизмов к патогену при вакцинальном процессе ключевую роль играют реакции клеточного иммунитета, реактивность которого обусловлена не только изменением количества и соотношения субпопуляций иммунных клеток, но также изменением их функциональной активности.

Для исследования метаболизма активированных лимфоцитов определен ряд информативных биохимических показателей, среди которых не последнее место занимает активность кислой (КФ) и щелочной (ЩФ) фосфатаз [1].

Фосфатазы относят к классу гидролаз, катализирующих дефосфорилирование субстрата посредством разрушения сложноэфирных связей фосфорной кислоты. В результате этой реакции образуется фосфатный анион и дериват субстрата, подвергшегося гидролизу. Большинство фосфатаз имеют сравнительно широкую субстратную специфичность. Как правило, субстратами этих ферментов являются белки, но некоторые изоферменты катализируют дефосфорилирование липидов, сахаров и нуклеотидов. Фосфатазы присутствуют почти во всех органах и тканях организма и представлены широким изоферментным спектром. Наиболее хорошо изучены две группы фосфатаз - ЩФ и КФ. Оптимум рН для щелочной фосфатазы находится в интервале 8,6 - 10,1 в отличие от кислой фосфатазы, у которой рН диапазон в пределах 5,0 - 5,4.

КФ относится к группе фосфомоноэстераз, ее выявляют в клетках различных тканей и органов (макрофагах, гранулоцитах, остеокластах и др.). Установлено, что внутри фагоцитирующих клеток фермент локализуется в лизосомах моноцитов и первичных гранулах полиморфноядерных лейкоцитов. В связи с этим КФ в лабораторной диагностике служит лизосомальным маркером, а степень ее активности в фагоцитирующих клетках является показателем кислороднезависимого метаболизма [2]. В нейтрофилах КФ выявляется в миелобла-стах и промиелоцитах. По мере созревания клеток, активность фермента снижается и затем повышается при иммунизации, воспалительных процессах и аллергии [3, 4]. Некоторые авторы полагают, что высокая активность КФ характерна для Т-клеток. В клинических исследованиях, при изучении иммунного статуса, широко используется цитохимический метод определения субпопуляционного состава Т-лимфоцитов по характеру распределения КФ в цитоплазме [5].

ЩФ локализуется во вторичных специфических гранулах нейтрофилов. Фермент участвует как в де-фосфорилировании различных субстратов, так и в трансфосфорилировании (переносе фосфата с субстрата на другие молекулы). Активность ЩФ в нейтрофилах повышается при иммунизации и бактериальной инфекции [3]. Многие авторы полагают, что присутствие ЩФ в фагоцитирующих клетках необходимо для осуществления нормальной фагоцитарной функции лейкоцитов. Предполагают, что ЩФ

нарушая защитные структуры микроорганизма, делает его более уязвимым для действия факторов с более высокой бактерицидной активностью, таких как активные формы кислорода, пероксинитрит (ONOO-), лизоцим и др. [4, 6, 7].

Очевидно, что фосфатазы, наряду с другими ферментами, поддерживают антимикробный потенциал иммунокомпетентных клеток. В связи с чем, данные о степени активности КФ и ЩФ в клетках и органах иммунной системы могут быть рассмотрены в качестве косвенного показателя при изучении иммуногенных свойств иммунобиологических препаратов, в том числе кандидатных вакцин.

Цель настоящей работы - изучение действия антигенных препаратов F. tularensis разных подвидов на активность кислой и щелочной фосфатаз в иммунокомпетентных органах лабораторных мышей.

Материалы и методы

В исследовании использовали беспородных белых мышей обоего пола весом 18 - 20 г. Работа с животными проводилась в соответствии с требованиями «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных», утвержденных приказом МЗ СССР от 12.08.1977 г № 755 и Приложения к Приказу Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации от 23 августа 2010 г. № 708н.

Для иммунизации животных были использованы антигенные препараты, полученные при помощи лизиса раствором мочевины c последующим дифференциальным центрифугированием клеточных стенок (КС) F. tularensis разных подвидов: из вакцинного штамма F. tularensis subsp. holarctica 15 НИИЭГ (ЛД50 для белых мышей - 2 х 106 м.к.) -2 опытная группа; трех вирулентных штаммов живых культур: F. tularensis subsp. holarctica 306 (250) (ЛД50 для белых мышей - 1 м.к.) - 3 группа; F. tularensis subsp. mediaasiatica А-61(385) (ЛД50 для белых мышей - 1 м.к.) - 4 группа; F. tularensis subsp. novicida В-399 A-Cole (386) из музея живых культур Иркутского научно-исследовательского противочумного института (ЛД50 для белых мышей -1 м.к.) - 5 группа. В качестве контроля (1 опытная группа) использовали мышей, которым вводили физиологический раствор.

Активность кислой и щелочной фосфатазы определяли в суспензиях тимуса и селезенки экспериментальных животных по методу А. Боданского [8]. В качестве субстрата использовали 0,5% раствор -глицерофосфата в цитратном буфере pH 5,0 для определения кислой фосфатазы и Трис-HCl буфере pH 8,9 для щелочной фосфатазы. Оптическую плотность продукта реакции измеряли на фотометре при длине волны 405 нм. Активность фосфатаз выражали в условных единицах на 5 х 106 клеток. В качестве положительного контроля использовали стандартный раствор щелочной фосфатазы фирмы «Serva».

Статистическая обработка данных осуществлялась при помощи стандартного пакета прикладных программ Statistica, версия 6.1 (Copyright©StatSoft, 1пс 19842001, ИПЧИ 31415926535897) с использованием t-критерия Стьюдента для независимых выборок с поправкой Бонферрони. Данные представлены в виде среднего арифметического (М) ± среднее квадратичное отклонение Различия считали достоверными при уровне значимости р < 0,01.

Результаты и обсуждение

В настоящем исследовании выявлены отличия в динамике активности КФ и ЩФ в тимусе и селезенке мышей, иммунизированных антигенными препаратами КС F. tularensis разных подвидов.

В исследуемых органах животных, иммунизированных КС штаммов F. tularensis subsp. mediaasiatica А-61(385) и F. tularensis subsp. novicida В-399 А-Со1е (386) активность КФ значительно повышалась к 7 суткам, а к 14 суткам снижалась до значения сопоставимого с контролем. В тимусе и селезенке животных, иммунизированных КС вакцинного штамма F. tularensis subsp. holarctica 15 НИИЭГ и F. tularensis subsp. holarctica 306 (250) исследуемый показатель на 7 сутки оставался на уровне контроля, а к 14 суткам значительно возрастал (рис. 1, 2). К 21 суткам активность КФ в исследуемых группах снижалась до уровня контроля.

Динамика активности ЩФ в тимусе и селезенке коррелировала с динамикой активности КФ. Так, в суспензии исследуемых органов животных, иммунизированных КС F. tularensis subsp. mediaasiatica А-61(385) и F. tularensis subsp. novicida В-399 А-Со1е (386) активность ЩФ заметно возрастала к 7 суткам, в то время как у остальных

групп она незначительно превышала показатели в контроле (рис. 3, 4). На 14 сутки активность ЩФ в тимусе и селезенке животных, иммунизированных КС 4 и 5 экспериментальных групп снижалась, в то время как во 2 и 3 группах возрастала, особенно значительно у животных, иммунизированных препаратом КС вакцинного штамма F. tularensis sudsp. holarctica 15 НИИЭГ (см. рис. 3, 4). К 21 суткам активность ЩФ в суспензии тимуса и селезенки у всех групп животных снижалась до уровня контрольного значения или ниже.

Таким образом, все экспериментальные препараты КС F. tularensis активировали КФ и ЩФ в тимусе и селезенке лабораторных мышей. Однако, в двух группах животных, иммунизированных КС F. tularensis subsp. mediaasiatica А-61(385) и КС F. tularensis subsp. novicida В-399 А-Со1е (386) повышение активности КФ и ЩФ в исследуемых органах наблюдалось в наиболее ранние сроки (7 сутки), чем у других (14 сутки).

Как известно, 7 сутки вакцинального процесса играют ключевую роль в развитии протективного потенциала макроорганизма. В связи с чем, выявленное в ходе экспериментов повышение фос-фатазной активности в иммунокомпетентных органах на 7 сутки после иммунизации КС F. tularensis является важным звеном в цепи метаболических процессов, определяющих формирование резистентности макроорганизма к возбудителю. Это предположение было подтверждено при изучении протективной активности экспериментальных препаратов КС F. tularensis. Кроме того, ранее было установлено, что КС F. tularensis subsp. mediaasiatica А-61(385) индуцирует синтез грану-лоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ), а КС подвида F. tularensis subsp. novicida

Рисунок 1.

Динамика активности КФ в суспензии тимуса лабораторных мышей, иммунизированных антигенными препаратами F. tularensis разных подвидов

Примечание: 1 - контроль; 2 - вакцинный штамм F. tularensis subsp. holarctica 15 НИИЭГ; 3 - F. tularensis subsp. holarctica 306

Рисунок 2.

Динамика активности КФ в суспензии селезенки лабораторных мышей, иммунизированных антигенными препаратами F. tularensis разных подвидов

Примечание: 1 - контроль; 2 - вакцинный штамм F. tularensis subsp. holarctica 15 НИИЭГ; 3 - F. tularensis subsp. holarctica 306

Рисунок 3.

Динамика активности ЩФ в суспензии тимуса лабораторных мышей, иммунизированных антигенными препаратами F. tularensis разных подвидов

Примечание: 1 -4 -

контроль; 2 - вакцинный штамм F. tularensis subsp. holarctica 15 НИИЭГ; 3 - F. tularensis subsp. holarctica 306

ы 9

Шап 112 гранулоцитарно-макрофагального коло-ниестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) у лабораторных мышей [9].

Следует отметить, что полученные нами данные согласуются с результатами исследований других авторов. Показано, что входящий в состав клеточных стенок липополисахарид некоторых микроорганизмов стимулирует фагоцитарную активность клеток, которая коррелирует с активностью КФ и ЩФ [10]. Также установлено, что реализация защитных функций полиморфноядерных лейкоцитов

определена мобилизацией внутриклеточных структур, так называемых гранул, в состав которых входят фосфатазы [3]. Антигены, в том числе липополи-сахаридные стимулируют накопление нейтрофилов в маргинальной зоне селезенки, в которой они приобретают способность к взаимодействию с В-лимфоцитами [11, 12]. Макрофаги в селезенке также представляют собой депо лизосомальных ферментов, в том числе фосфатаз. Выявленное в ходе экспериментов повышение фосфатазной активности в селезенке мышей под влиянием КС ту-

Рисунок 4.

Динамика активности ЩФ в суспензии селезенки лабораторных мышей, иммунизированных антигенными препаратами F. tularensis разных подвидов

Примечание: 1 - контроль; 2 - вакцинный штамм F. tularensis subsp. holarctica 15 НИИЭГ; 3 - F. tularensis subsp. holarctica 306

ляремийного микроба может быть связано с активацией фагоцитирующих клеток.

В тимусе повышение активности КФ при иммунизации, по данным ряда авторов, является показателем повышения пролиферативной активности предшественников Т-лимфоцитов. Полагают, что КФ макрофагов тимуса участвует в негативной селекции Т-клеток [13, 14]. Тем не менее, как уже отмечалось выше, высокую активность КФ некоторые авторы связывают с популяциями зрелых Т-лимфоцитов непосредственно [5]. Ряд исследователей наблюдали повышение активности ЩФ в эндотелии мелких вен и капилляров тимуса на ранних этапах иммунизации (5 - 7 сутки после введения антигена), что коррелировало с усилением миграции Т-лимфоцитов в периферические иммунные структуры [15, 16].

Очевидно, что фосфатазы, функционирующие в органах и клетках иммунной системы, участвуют в ключевых процессах, определяющих формирование иммунного статуса и протективного потенциала макроорганизма.

На основании полученных нами и другими исследователями данных можно заключить, что

изучение динамики активности КФ и ЩФ в тимусе и селезенке иммунизированных животных может быть использовано в качестве одного из методов оценки функциональной активности иммунокомпетентных органов и клеток при изучении иммуногенных свойств антигенных препаратов.

Выводы

1. Экспериментальные препараты КС F. tularensis индуцируют активность КФ и ЩФ в тимусе и селезенке мышей.

2. Препараты КС F. tularensis subsp. mediaasiatica А-61(385) и F. tularensis subsp. novicida В-399 А-Со1е (386) стимулируют повышение активности КФ и ЩФ в более ранние сроки (7 сутки) после иммунизации, чем другие исследованные препараты, что коррелирует с их высокой имму-ногенной активностью.

3. Изучение динамики активности КФ и ЩФ в им-мунокомпетентных органах может служить критерием оценки иммуногенных свойств антигенных препаратов.

Литература

1. Основы клинической иммунологии. Чепель Э. Перевод с англ. 5-е издание. Москва: «ГЭОТАР-Медиа»; 2008.

2. Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Мешкова Р.Я. Клиническая иммунология и аллергология с основами общей иммунологии. Москва: «ГЭОТАР-Медиа»; 2011.

3. Новикова И.А., Ходулеева С.А. Клиническая и лабораторная гематология. Минск: «Высшая школа»; 2013.

4. Федотова Г.Г., Киселева Р.Е. Изменение активности щелочной и кислой фосфатазы лейкоцитов в развитии неспецифического воспаления в легких. Успехи современного естествознания. 2007; 8: 123 - 124.

5. Лабораторные методы исследования в клинике. Меньшиков В.В. , ред. Москва. Медицина; 1987.

6. Шубич Ф.Г., Нагоев Б.С. Щелочная фосфатаза лейкоцитов в норме и патологии. Москва. Медицина; 1980.

7. Шестопалов А.В., Овсянников В.Г., Алексеева Н.С. Структурно-Цитохимические критерии активации нейтрофилов в ответ на острую висцеральную боль. Кубанский научный медицинский вестник. 2009; 5 (110): 148 - 152.

8. Bodansky A. Determination of serum phosphatase. Factors influencing the accuracy of determination. J. biol. Chem. 1933; 101: 93 - 104.

9. Корнева А.В., Николаев В.Б., Ястремская К.Ю., Марков Е.Ю., Войткова В.В., Соловьев С.Ю. и др. Результаты изучения иммуногенной активности клеточных оболочек Francisella. tularensis разных подвидов. Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. 2015; 1: 63 - 67.