Штамм Vibrio parahaemolyticus, используемый в качестве продуцента прямого термостабильного гемолизина (TDH)
STRAIN VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS, USED AS A PRODUCER OF DIRECT THERMOSTABLE HEMOLYSIN (TDH)

Предлагаемое изобретение относится к биотехнологии и микробиологии и может быть использовано для получения и изучения функциональных особенностей термостабильного прямого гемолизина (TDH) Vibrio parahaemolyticus, который необходим в лабораторной диагностике для получения сывороток и препаратов.
V. parahaemolyticus относится к патогенным для человека микроорганизмам рода Vibrio. Средой обитания V. parahaemolyticus является морская вода, а основным фактором передачи человеку служат инфицированные ими гидробионты. Парагемолигические вибрионы вызывают острые кишечные инфекции, гастроэнтериты, раневые инфекции.
Патогенность V. parahaemolyticus связывают с продукцией токсинов - гемолизинов: термостабильного прямого гемолизина (TDH - thermostable direct hemolysin) и TDH- родственного гемолизина (TRH - TDH-related hemolysin). Оба токсина имеют генетическое и иммунологическое родство и проявляют одинаковую биологическую активность: гемолитичность, энтеротоксичность, цитотоксичность в отношении различных типов клеток, кардиотоксичность, но различаются по термостабильности и спектру гемолитической активности. TDH и TRH практически в равной степени проявляют биологическую активность. Они вызывают лизис эритроцитов человека, барана, кур, телят, мышей и кроликов, но различаются спектром гемолитической активности. Большинство штаммов парагемолитических вибрионов продуцируют токсины в достаточно низких количествах, что затрудняет в лабораторных условиях дать количественную оценку гемолитической активности данных культур (1). Способность парагемолитических вибрионов к продукции TDH определяют на специальной среде Вагатцума, содержащей эритроциты человека или кролика, по наличию зон гемолиза (2). Данное свойство штаммов называют феноменом Канагава.
Штамм Vibrio parahaemolyticus КМ 2027 содержит ген прямого термостабильного гемолизина (TDH), лишен гена TDH-подобного гемолизина (TRH) и обладает высокой гемолитической и цитотоксической активностями.
Известен штамм V. parahaemolyticus КМ 187, применяемый в качестве тест-штамма (положительного контроля) при стандартизации оценки вирулентности парагемолитических вибрионов в тесте Канагава (3), при этом данный штамм обладает высокой гемолитической активностью, определяемой на среде Вагатцума, и используется в качестве тест-штамма (положительного контроля) при оценке способности парагемолитических вибрионов лизировать эритроциты в тесте Канагава.
Однако использование данного штамма, несмотря на его высокую гемолитическую активность, в качестве штамма-продуцента гемолизина TDH не предлагалось.
В качестве прототипа был выбран рекомбинантный штамм Е.coli К12 , содержащий плазмиду pJET2-TDH2 с генами штамма V. parahaemolyticus О3:К6, выделенного во время вспышки пищевого отравления в Чили (1).
Недостатком прототипа является то, что для синтеза прямого термостабильного гемолизина необходимо наличие микроорганизма-реципиента, обладающего определенными свойствами.
При этом способ получения плазмиды, содержащей гены штамма-продуцента, достаточно трудоемкий, длительный процесс, требующий дорогостоящего оборудования и квалификации персонала.
Технической задачей предлагаемого изобретения является разработка нового штамма V. parahaemolyticus КМ 2027, позволяющего продуцировать TDH-гемолизин для лабораторных исследований и создания диагностических препаратов.
Поставленная задача достигается получением штамма бактерий V. parahaemolyticus КМ 2027 (Государственная коллекция патогенных бактерий «Микроб»), используемого в качестве штамма-продуцента термостабильного прямого гемолизина (TDH).
Способ получения штамма
Штамм бактерий V. parahaemolyticus КМ 2027 получают путем селекции клонов штамма V. parahaemolyticus, отобранного из двухсот штаммов коллекции Ростовского противочумного института, образующих на кровяном агаре Вагатцума четкую зону гемолиза, у которых величина зоны гемолиза через 48 часов составила более 5 мм.
Наибольшую цитотоксическую активность на культуре клеток L-929 проявил штамм V. parahaemolyticus 958, выделенный от больного в 1974 году в г. Новороссийске (серогруппа О4:К12).
Затем путем селекции клеток данного штамма был получен клон V. parahaemolyticus, у которого величина зоны гемолиза составила 7 мм (фиг. 2).
На фиг. 2. представлены результаты опыта по отбору штаммов парагемолитических вибрионов по степени их гемолитической активности.
А - штамм V. parahaemolyticus КМ 2027. Величина зоны гемолиза - 7 мм.
Б - штамм V. parahaemolyticus, содержащий гены гемолизина TDH, но обладающий меньшей гемолитической активностью. Величина зоны гемолиза - 3 мм.
В - штамм V. parahaemolyticus, не содержащий генов TDH. На фото показано отсутствие зоны гемолиза.
Таким образом, исходя из данных, представленных на фото, видно, что штамм V. parahaemolyticus КМ 2027 имеет большую зону гемолиза, что свидетельствует об увеличении продукции гемолизина.
При проверке цитотоксических свойств на культуре клеток отмечены изменения морфологии и гибель эукариотических клеток L-929, Нер2 иМсСоу (см. фиг. 3).
На фиг. 3,Г представлены исходные (неповрежденные) эукариотические клетки культур клеток - клетки ровные, окрулые; монослой ровный.
На фиг. 3,Д показаны эукариотические клетки, проинкубированные со штаммом V. parahaemolyticus КМ 2027. На фото видны разрушенные клетки, клетки с измененной морфологией, что характерно для действия гемолизина парагемолитических вибрионов.
Следовательно, на фиг. 3 показано, что штамм V. parahaemolyticus КМ 2027 обладает продукцией прямого термостабильного гемолизина (TDH), что проявляется изменением морфологии культур клеток и их гибелью.
Следующим этапом осуществляют выращивание штамма для получения термостабильного прямого гемолизина TDH.
Для получения препарата TDH-токсина штамм-продуцент V. parahaemlyticus КМ 2027 культивируют при 37°С в бульоне Вагатцума. Культуру, выращенную в питательной жидкой среде, центрифугируют при 10000 об/мин 20 минут на холоду. Культуральную жидкость переносят в колбу 500 мл и обеззараживают добавлением мертиолята натрия 1:10000 с экспозиией 2 часа при +4°С.
После этого выделяют и очищают препарат, для этого к обеззараженной культуральной жидкости штамма-продуцента V. parahaemlyticus КМ 2027 добавляют сульфат аммония (СА) до концентрации 150 мМ и Трис-HCl рН - 7.0 до 50 мМ. Очистку токсина проводят на FPLC Pathfinder Duoflow Bio-Rad. Культуральную жидкость наносят на колонку с матрицей для ХОФ (хроматография в обращенной фазе) Butyl Toyopaerl 650 М. Промывают буфером 150 мМ СА и 50 мМ Трис-HCl рН - 7.0. Токсин элюируют снижающимся градиентом СА от 150 до 0 мМ. Фракции, содержащие токсин (их отбирают по гемолитической активности), объединяют и наносят на колонку UNO-Q6 Bio-Rad, уравновешенную 50 мМ Трис-HCl рН - 7,0, промывают, токсин элюируют повышающимся градиентом хлорида калия от 0 до 1 М. Фракции, содержащие токсин, объединяют, диализуют против забуференного физиологического раствора рН - 7.2 измеряют количество белка методом Лоури. Полученный препарат содержит не менее 100 мкг/мл белка.
Данный штамм V. parahaemolyticus был депонирован под № КМ 2027 в Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» (ГКПБ «Микроб»).
Культурально-морфологические признаки
В мазках из агаровых и бульонных культур, окрашенных по Граму, клетки парагемолитических вибрионов имеют вид грамотрицательных полиморфных палочек. Подвижные (при выращивании в 0,3% агаре с 3% NaCl наблюдается помутнение столбика агара). Спор и капсул не образуют.
На твердых питательных средах (1,5% агаре Мартена с 3% NaCl, рН 7,6±0,2) вибрионы образуют колонии округлой формы, гладкие, полупрозрачные, размером 2-2,5 мм в диаметре, с ровным краем при выращивании при 37°С в течение 18-24 часов.
На жидких питательных средах (бульон Мартена с 3% NaCl, рН 7,6±0,2) дает равномерное помутнение, растет на средах с NaCl от 2% до 8%, не растет в 1% пептонной воде без NaCl.
Физиолого-биохимические свойства
Ферментирует и окисляет глюкозу на среде Хью-Лейфсона, расщепляет арабинозу, маннозу, 7анит, не активен по отношению к лактозе, сахарозе, целлобиозе, салицину. Обладает цитохромоксидазой, нитратредуктазой, лизин- и орнитиндекарбоксилазой при отсутствии аргининдигидролазы и β-галактозидазы, образует индол, не продуцирует сероводород, расщепляет мочевину. На среде Вагатцума лизирует эритроциты человека.
Оптимальные показатели температуры и рН среды культивирования V. parahaemolyticus - 37°С, рН 7,6±0,2. Для оптимального роста необходимо наличие в среде культивирования 3% NaCl.
Серологические свойства
Не агглютинируется холерными диагностическими сыворотками О-, RO-, Инаба, Огава, моноварными вибрионными сыворотками других (О2-О83) О-сероваров. Агглютинируется диагностическими сыворотками О:4 и К:12.
Пример 1
Подтверждение и идентификация препарата термостабильного прямого гемолизина (TDH), полученного из штамма V. parahaemolyticus КМ 2027
Для идентификации и анализа препарата термостабильного прямого гемолизина (TDH) V. parahaemolyticus используют метод MALDI-ToF масс-спектрометрии с использованием масс-спектрометра Autoflex speed III Bruker Daltonics (Германия) с программным обеспечением Biotyper.
Приготовление раствора матрицы
В качестве матрицы используют α-циано-4-гидроксикоричную кислоту.
Во-первых, готовят 5% раствор трифторуксусной кислоты. Для этого смешивают 950 мкл высокоочищенной воды для масс-спектрометрии и 50 мкл чистой трифторуксусной кислоты. Полученный раствор перемешивают. Затем к 500 мкл 5% раствора трифторуксусной кислоты добавляют 500 мкл чистого ацетонитрила. Получившуюся смесь растворителей (OS) используют для приготовления матрицы. При необходимости OS можно хранить при комнатной температуре (+22-25°С) несколько недель.
Во-вторых, 2,5 мг α-циано-4-гидроксикоричной кислоты (НССА) смешивают с 250 мкл OS. Перемешивают несколько минут на вортексе при комнатной температуре (+22 - +25°С) до полного растворения. Готовую матрицу можно хранить при комнатной температуре несколько недель.
В эппендорфе смешивают 1 мкл препарата токсина и 10 мкл раствора матрицы. На мишень для масс-спектрометрии наносят полученную смесь. Высушивают на воздухе. Для получения четких пиков соотношение препарата токсина и матрицы составляет 1:10.
Снятие белковых спектров
Снятие белковых спектров проводят в программе Flex Control в диапазоне 2000-20000 m/z, а их обработку в программе Flex Analysis. При масс-спектрометрии препарата термостабильного прямого гемолизина (TDH) V. parahaemolyticus выявляются масс-пики с m/z 2452±5, 4911±7, 7517±5, 8602±5, которые соответствуют масс-пикам полученного токсина TDH (фиг. 1).
На фиг. 1 показаны масс-пики препаратов TDH-токсина парагемолитических вибрионов, полученных из штамма-продуцента V. parahaemolyticus КМ 2027, выявленные методом масс-спекрометрического анализа. Видны пики с m/z 2452±5, 4911±7, 7517±5, 8602±5, которые соответствуют масс-пикам полученного токсина TDH.
Пример 2
Применение полученного препарата для изготовления иммунных сывороток
Для получения иммунных кроличьих сывороток используют беспородных кроликов обоего пола в возрасте 8-10 месяцев, массой 2,5-3 кг.
Препатат TDH-токсина V. parahaemolyticus КМ 2027 вводят по 0,3 мл и 0,3 мл полного адъюванта Фрейнда подкожно в холку на 1-й, 7-й, 14-й, 24-й день иммунизации. Пробное взятие крови у кроликов проводят на 7-й, 14-й, 24-й и 31 день. Обескровливание животных проводят на 33 день от начала иммунизации. Титры антител полученных сывороток проверяют в реакции преципитации по Оухтерлони и в ДОТ-ИФА. Полученные сыворотки содержат антитела к TDH-токсину V. parahaemolyticus.
Использование предлагаемого изобретения позволяет с помощью нового штамма V. parahaemolyticus КМ 2027 получать высокоактивный препарат прямого термостабильного гемолизина - TDH, который дает возможность наиболее полно осуществлять изучение функциональных особенностей препарата гемолизина V. parahaemolyticus с применением в лабораторной практике для получения иммунных сывороток и диагностических препаратов, направленных на выявление острых кишечных инфекций, вызванных V. parahaemolyticus.
Источники информации
1. Bechlars S.,  D.А.,  K., Dieckmann R., Strauch E.,. Kubick S. Cell-free synthesis of functional thermostable direct hemolysins of Vibrio parahaemolyticus // Toxicon. - 2013. - Vol. 76. - P. 132-142.
2. Park K.-S., Iida Т., Yamaichi Y. et al. Genetic characterization of DNA region containing the trh and ure genes of Vibrio parahaemolyticus // Infect. Immun. - 2000. - Vol. 68, No. 10. - P. 5742-5748.
3. Рыковская О.А., Смоликова Л.M., Монахова Е.В., Чемисова О.С, Подойницына О.А., Голенищева Е.Н и др. Коллекция представителей вида Vibrio parahaemolyticus: фенотипические и генотипические характеристики // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. - №6 - 2014. - с. 3-8