Analysis of interaction of plant genotype and strain Agrobacterium tumefaciens in breeding of potato resistance to Colorado potato beetle

ЭКОЛОГО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МОДЕЛИ

Д.И. Богомаз

Санкт-Петербургский

государственный

университет

Эффективность трансформации картофеля зависит от генотипа растения и штамма агробактерии. Генотипы с высокой регенерационной способностью обладают высокой способностью к трансформации. Показано, что трансгеноз гена Bt повышает устойчивость картофеля к колорадскому жуку, а трансгеноз гена ipt не влияет на устойчивость.

Ф Ключевые слова: агро-трансформация; картофель; устойчивость.

ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ГЕНОТИПОВ РАСТЕНИЯ И ШТАММА AGROBACTERIUM TUMEFACIENS ПРИ ПОЛУЧЕНИИ ФОРМ КАРТОФЕЛЯ,

УСТОЙЧИВЫХ К КОЛОРАДСКОМУ ЖУКУ

ВВЕДЕНИЕ

Разработка эффективных методов регенерации, изучение процессов морфогенеза in vitro особенно необходимо для важнейших сельскохозяйственных культур. Это обусловлено тем, что данные процессы лежат в основе фактически всех современных биотехнологических методов — будь то клональное микроразмножение, оздоровление посадочного материала, клеточная селекция или трансформация. Ранее в литературе многократно обсуждался вопрос о зависимости процессов регенерации in vitro от генотипа. Показано также, что и интенсивность трансформации определяется генотипом растения и зависит от штамма бактерии, с помощью которого осуществлен этот процесс. Однако работы, посвященные изучению взаимосвязи явлений трансформация-генотип растения—штамм бактерии, были выполнены в основном с использованием разнообразных штаммов агробактерий дикого типа [1, 3]. В настоящее время, когда в мировой практике стоит проблема получения трансгенных растений, устойчивых к абиотическим и биотическим факторам среды, все еще остаются нерешенными вопросы о роли сорта и коммерческих штаммов во всем их многообразии, в эффективности трансформации. Хорошо известно, что в результате трансформации даже в пределах одной пары сорт-штамм можно получить широкий круг изменчивости, как результат случайного встраивания Т-ДНК в геном растения. Поэтому для получения трансгенного растения с заданными свойствами необходимо иметь большое число трансгенных растений, среди которых возможно было бы провести направленный отбор. Все вышесказанное указывает на необходимость проведения исследований, направленных на выявление факторов, определяющих эффективность трансформации, к которым в первую очередь следует отнести подбор генотипа растения, штамма бактерии (вектора), а также условий и конкретных методов эксперимента, таких как питательная среда, тип экспланта. В наших предыдущих работах была изучена внутривидовая изменчивость сортов картофеля по регенерационной способности и влияние на данный признак условий культивирования [4].

Настоящее исследование посвящено изучению взаимодействия генотипа растения и штамма бактерии при получении растений, устойчивых к колорадскому жуку посредством трансформации геном Bt токсина (Bacillus thuringiensis) [5] и геном ipt (Agrobacterium tumefaciens) [6]. Показана зависимость между интенсивностью трансформации и штаммом агробактерии (вектором) использованным для трансформации.

В конкретные задачи исследования входило:

• изучение способности к трансформации у генотипов с различной регенерационной способностью;

• получение коллекция трансгенных растений, содержащих бактериальный ген Bt из Bacillus thuringiensis, ген из Agrobacterium tumefaciens-ipt, кодирующий ключевой фермент биосинтеза цитокининов;

• изучение морфологических изменений у трансгенных растений по сравнению с исходными формами;

• исследование уровня полевой устойчивости к колорадскому жуку трансгенных по гену Bt и гену ipt растений картофеля.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

В работе использованы сорта картофеля Solanum tuberosum, рекомендованные к возделыванию в Северо-Западном регионе — Невский, Елизавета, Чародей, Санте, Луговской, Рождественский (материал любезно предоставлен Северо-Западным НИИСХ). В работе также использовали растения табака (Nicotiana tabacum) в качестве негативного контроля при проведении ПЦР.

В работе использовали штаммы Agrobacterium tumefaciens, характеристики которых представлены в табл. 1. Штаммы любезно предоставлены проф. Онджеем M.(Institute of Molecular Biology, Czech Republic), проф. Шеллом Д. (Max Plank Institute, Germany) и проф. Шемякиным M. (Институт сельскохозяйственной биотехнологии, Mос-ква).

Для получения асептических эксплантов in vitro использовали клубни. В условиях ламинарного бокса поверхность клубня обрабатывали 70%-м спиртом в течение 5 минут, затем стерилизовали концентрированной перекисью водорода

Таблица 1

Характеристики штаммов A. tumefaciens, использованных в работе

Название штамма Гены устойчивости кселективным агентам Переносимые целевые трансгены Источник получения

pGV 385G Kmr npt II - Онджей M.

pGV 385G Tr4 npt II Ipt Онджей M.

pGV 385G/941 Kmr npt II - Шелл Д.

pGV 385G/941tf npt II Bt Шемякин М.

A4 tf Rijr npt II Bt Шемякин М.

20 минут или 15%-м раствором коммерческого препарата «Доместос» 30 минут и промывали стерильной дистиллированной водой. Далее осуществляли диссекцию клубня на диски диаметром 1,5 см и толщиной 5 мм.

Агробактериальную трансформацию картофеля проводили с использованием клубневых дисков в качестве эксплантов. Бактерии размножали следующим образом: в 20 мл среды для бактерий LB (Мани-атис) с антибиотиками (рифампицина 50 мкг/мл, канамицина 50 мкг/мл), добавляли 1,5—2 микробиологические петли биомассы агробактерий (106 бактерий) и инкубировали на качалке с круговым вращением частотой 200 об/мин и амплитудой 40 мм в течение 16 часов при температуре 24 °С. Инокуляцию осуществляли на 3—4 день культивирования эксплантов неразведенной суспензией агробактерий. Кокультивацию с бактерией проводили в течение суток на питательной среде МС [7] без гормонов (в случае использования штаммов с геном ipt) или МС с 3 мг/л фитогормона бензиламинопу-рин (БАП) для регенерации побегов (в случае остальных штаммов); далее экспланты помещали на ту же среду с канамицином в концентрации 100 мг/л и кла-фораном для подавления роста агробактерий в концентрации 500 мг/л. Для контроля использовали не-инокулированные экспланты. Через каждые 7 дней экспланты переносили на свежую среду с антибиотиками, уменьшая концентрацию клафорана к 3 пассажу до 100 мг/л. Регенерировавшие побеги отделяли и помещали на среду МС с канамицином в концентрации до 200 мг/л. Устойчивые к канами-цину побеги черенковали и помещали на среду МСО.

Часть вегетативного потомства растений-реге-нерантов использовали для выделения ДНК [8]. Для доказательства их трансгенной природы использовали метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Другую часть вегетативного потомства поддерживали в пробирках и далее (в случае позитивного результата ПЦР) переводили в полевые условия.

Для проведения ПЦР использовали праймеры к гену ^Ш, определяющему устойчивость трансгенных тканей к канамицину:

^атаалалаастАттсаастлталс;

^слсслталтАттсааслласлаас,

синтезированные компанией Синтол (Россия).

Объем реакционной смеси для ПЦР составлял 50 мкл. В ее состав входили 300 нг матричной ДНК, 2,5 и Taq полимеразы (БПекз М), буфер, предложенный фирмой-производителем фермента, 200 мкМ каждого бЫтР и 250 пкМ каждого праймера. ПЦР проводили по програм-

ме: 1 цикл — 5 мин 93 °C, 35 циклов — 5 сек 93 °C, 30 сек 50 °C, 45 сек 72 °C, 1 цикл — 5 мин 72 °C.

Электрофорез проводили в 1%-м агарозном геле с буфером ТВЭ или ТАЭ. В качестве маркера молекулярных весов использовали 100 bp ladder (Сиб-Энзим, Россия).

Оценку устойчивости полученных форм картофеля к колорадскому картофельному жуку проводили на базе Всероссийского Института биологической защиты растений (г. Краснодар), согласно «Методическим рекомендациям по изучению и оценке форм картофеля на устойчивость к колорадскому жуку» [9].

Статистическую обработку данных проводили согласно рекомендациям [10]. Рассчитывали процент эксплантов с каллусами и побегами in vitro, а также процент пораженных колорадским жуком тканей растений in vivo, и их доверительные интервалы. В работе использовали критерий %2, как критерий однородности для проверки согласия экспериментальных данных между собой.

Ранее в нашей лаборатории была охарактеризована регенерационная способность клубневых эксплантов различных сортов картофеля. Было показано, что сорт Невский характеризуется наибольшей регенерационной способностью, сорт Елизавета — умеренной регенерационной способностью; для сортов Луговской, Рождественский, Санте, Чародей характерна низкая регенерационная способность [4].

В экспериментах по трансформации мы использовали сорта картофеля как с высокой, так и с низкой регенерационной способностью. Основываясь на литературных данных [11], мы предполагали, что у сортов с минимальной способностью к регенерации с помощью трансформации геном ipt удастся максимально повысить этот показатель. Кроме того, согласно литературным данным, формы с повышенным уровнем цитоки-нинов обладают повышенной устойчивостью к биотическим и абиотическим факторам окружающей среды [12]. Поэтому в экспериментах по трансформации мы использовали штамм с геном ipt, с помощью которого в трансгенных растениях можно повысить уровень цитокининов. При трансформации штаммом с геном ipt регенерация и отбор трансформантов проводились на среде MS0 без добавления гормонов. В качестве селективного агента для отбора трансгенных растений в среды для регенерации добавляли канамицин, а для подавления роста бактерий — клафоран. Контрольные экспланты помещали на те же среды, но без обработки их суспензией агробактерий.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Получение трансгенных растений картофеля с генами Bt и ipt

Регенерация картофеля в контроле была практически полностью подавлена из-за присутствия канамицина в питательной среде. В различных вариантах опыта регенерация протекала с различной интенсивностью. В условиях эксперимента на экс-плантах всех сортов при трансформации использованными штаммами наблюдали высокий процент каллусообразования, который колебался в среднем от 40 до 90%. Наиболее важным в данных опытах является способность к регенерации побегов. В зависимости от штамма, которым была осуществлена трансформация, сорта значительно различались по регенерационной способности. Максимальной регенерационной способностью характеризовался сорт Невский (рис. 1). Процент побегообразования, например, при трансформации штаммом с геном, определяющим устойчивость к канамицину, достигал 100. Относительно высокий процент побегообразования также наблюдался у сортов Елизавета и Рождественский (см. рис. 1). Экспланты сортов Санта и Луговской формировали лишь единичные побеги при трансформации.

Таким образом, ранее проведенный нами отбор генотипов по регенерационной способности является важным этапом при подборе сортов для трансформации, особенно если целью экспериментов является получение максимального числа трансформированных растений. В литературе неоднократно отмечалось, что растительные клетки, компетентные к регенерации, оказываются компетентными и для трансформации [13].

Полученные в экспериментах по трансформации побеги были укоренены на среде МСО. В ходе укоренения и перенесения растений в условия теплицы и поля нам не удалось сохранить все трансгенные растения. Однако мы получили коллекцию растений, содержащих различные бактериальные гены (табл. 2). От 15 трансгенных растений получено клубневое потомство.

Для доказательства трансгенной природы полученных растений, кроме их предварительного отбора на селективных средах, проведена ПЦР с праймерами к гену ^Ш; цифрами обозначены исследованные трансгенные растения (рис. 2). В ходе реакции выявлен ПЦР фрагмент, соответствующий таковому в позитивном контроле (около 600 пн). В негативном контроле фрагмент не синтезировался. Данный эксперимент подтверждает трансгенную природу исследованных образцов.

1009080 і 706050 Н 403020-ЮН 0-

У

Ж

ї

Невский

/

Штаммы

ї

ї

£

100-

90-

80-

70-

60-

50-

40-

30-

20-

10-

0--

jf

I

f

Рождественский

/

<ь

&

ь

/

&

ї

Штаммы

100 Н

80

60-

40

20-

t

Я1

IL

JP Г-Р # <? jf

Елизавета

Штаммы

<#

'

<Ь

%

100-1

90 -

80-

70-

60-

50-

40-

зо-

20-

10-

0-

.У

&

<Г & /

*

f

Штаммы

Санте

Рис.1. Процент клубневых эксплантов сортов Невский, Рождественский, Елизавета, Санте, образующих каллусы и побеги при трансформации штаммами Agrobacterium tumefaciens:

Эксп. с калл. — экспланты с каллусами;  эксп. с поб. — экспланты с побегами.

Таким образом, в ходе экспериментов выявлена изменчивость среди сортов картофеля по способности к трансформации. Кроме того, показана зависимость эффективности трансформации от штамма бактерии (см. рис.1). В экспериментах, проведенных в нашей лаборатории, ранее уже было показано, что характер и интенсивность трансформации зависят от штамма агробактерии [13]. К такому же выводу пришли и другие исследователи [14]. Однако в ранних экспериментах были использованы агробактери-альные штаммы с плазмидами дикого типа. В наших экспериментах использованы штаммы, несущие

плазмиды с различными бактериальными генами. Тем не менее результаты повторились — интенсивность трансформации определяется не только генотипом растения, но и штаммом бактерии.

Анализ трансгенных линий картофеля с генами Bt и ipt на устойчивость к колорадскому картофельному жуку

Линии картофеля, трансгенность которых была доказана с использованием селективной среды и методом ПЦР, были переведены в условия in vivo.

Таблица 2

Трансгенные растения картофеля, полученные на основе агробактериальной трансформации

Сорт Трансгены Количество линий

Невский NptII 4

Bt 2

Ipt 2

Чародей Bt 1

Ipt 3

Елизавета Nptll 1

Bt 2

Из клубней на опытном поле Всероссийского НИИ биологической защиты растений (г. Краснодар), были выращены растения картофеля, которые анализировали на устойчивость к колорадскому жуку в следующие сроки учета: 31.05; 10.06; 17.06; 24.06; 01.07; 09.07; 16.07. В качестве контроля использовали исходные сорта.

На контрольных растениях личинки и взрослые особи жука появлялись к стадии бутонизации и начинали повреждать ткани растения. Степень повреждения увеличивалась в течение вегетации растений, и к концу цветения растения повреждались полностью. По степени устойчивости к колорадскому жуку различались как трансгенные растения, так и исходные сорта. Например, контрольные растения сорта Невский характеризовались большей по сравнению с растениями других сортов устойчивостью, однако к последним срокам учета растения сорта Невский также оказались пораженными. Следует отметить, что согласно биологии развития жука, на территории Ленинградской области, которая относится к

четвертой (наиболее северной) зоне обитания колорадского жука, массовый выход жука из почвы смещен в среднем на полтора месяца относительно территорий, на которых расположен исследовательский полигон (первая климатическая зона расселения). Поэтому на территории Ленинградской области пик агрессивности колорадского жука приходится на более поздние сроки. Исходя из того, что на территории Краснодарского края первые атаки колорадского жука растения сорта Невский выдерживают, в условиях Ленинградской области можно ожидать достаточно высокой устойчивости этого сорта. Таким образом, сорт Невский можно признать относительно устойчивым к колорадскому жуку в агроклиматических условиях Ленинградской области, что подтверждается данными [15, 16].

Растения трансгенные только по одному селективному гену прі II, определяющему устойчивость к канамицину, были проанализированны в тех же условиях на устойчивость к колорадскому жуку (рис. 3). По сравнению с контролем трансгенные растения с геном ирШ начинали поражаться значительно раньше, а одно из них уже на стадии бутонизации. В момент цветения одна линия была поражена полностью.

Трансгенные растения с геном Еї, полученные на основе сорта Невский, характеризовались повышенной устойчивостью к колорадскому жуку (см. рис. 3). Так, растения одной из линий показали устойчивость, превосходящую уровень устойчивости контрольных форм, статистически достоверно по всем срокам учета. Даже в условиях Краснодарского края поражение свыше 30% было выявлено только в самый последний срок учета. Таким образом, выявленную трансгенную линию Невский-Еї1 можно считать устойчивой для условий Ленинградской области.

MW 1 ;

И жЯ

І фшш +»* & ♦ am  1

ЮОЬр р.с. п.с. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

ladcr

Рис. 2. Результат ПЦР на матрице ДНК трансгенных растений картофеля с праймерами к гену ирШ.

% поражения

% поражения

% поражения

Сроки учета

Рис. 3. Динамика поражения колорадским жуком трансгенных растений на основе сорта Невский, полученных при трансформации обеззаруженным вектором

Устойчивость трансгенных растений сорта Невский с геном 1р/ была заметно ниже, чем в контроле (см. рис. 3).

Контрольные растения сорта Елизавета характеризовались сравнительно низкой устойчивостью к колорадскому картофельному жуку. Растения линии, трансформированные обеззаружен-

ным вектором, обладали, как и исходный сорт, низкой устойчивостью к патогену. Трансгенные растения с геном В/, полученные на основе этого сорта, как и в случае В/ растений сорта Невский, характеризовались сравнительно высокой устойчивостью к колорадскому жуку (рис. 4).

Для сорта Чародей отмечена та же тенденция: растения с геном В/ являлись сравнительно устойчивыми к патогену, трансгенные растения с геном 1р/ были заметно чувствительнее к колорадскому жуку (рис. 5).

В целом, трансгенные растения всех проанализированных сортов с геном В/, характеризовались повышенной устойчивостью к колорадскому жуку: так, многие линии (потомство единичных трансгенных растений) показали устойчивость, превосходящую уровень устойчивости контрольных форм статистически достоверно по всем срокам учета. Кроме того, среди устойчивых растений оказалось и одно растение, трансформированное «обеззаруженным штаммом».

Группа линий, представленная трансгенными растениями с геном синтеза цитокинина гр/, характеризовалась низкой устойчивостью к колорадскому жуку. Таким образом, наши результаты не подтверждают литературные данные [12] о том, что повышение уровня цитокинина в растении влечет за собой повышение устойчивости растения к насекомым. Возможно, в условиях, исследуемых нами, избыточный синтез цитокинина и стимулируемые им эффекты приводили к повышенной нагрузке на метаболический аппарат растения и отвлечению биохимических ресурсов последнего от реакций, направленных на защиту

% поражения

Сроки учета

Рис. 4. Динамика поражения колорадским жуком трансгенных растений на основе сорта Елизавета

% поражения

Рис. 5. Динамика поражения колорадским жуком трансгенных растений картофеля на основе сорта Чародей

растения. Фенотипически трансформированные растения не отличались от растений исходного сорта.

Итак, в работе выявлена изменчивость среди сортов картофеля по способности к трансформации. Показано, что сорта с максимальной регенерационной способностью обладают и максимальной способностью к трансформации. Кроме того, показана зависимость трансформации от штамма бактерии.

Получена коллекция трансгенных растений. На основе трех сортов были получены трансгенные линии растений, достоверно различающиеся по устойчивости к патогену. Пять трансгенных линий проявили себя как сравнительно устойчивые. Среди них были линии, трансгенные по гену Bt, и линия, трансформированная обеззаружен-ным вектором.

ВЫВОДЫ

1. Показана зависимость между интенсивностью трансформации и штаммом агробактерии (вектором), использованным для трансформации.

2. Подтверждена гипотеза о том, что генотипы с высокой регенерационной способностью обладают высокой способностью к трансформации.

3. Получена коллекция трансгенных растений, содержащих бактериальный ген Bt из Bacillus thuringiensis, ген из Agrobacterium tumefaciens — ipt, кодирующий ключевой фермент биосинтеза цитокининов — изопентенилфос-

фотрансферазу и ген npt II, продукт которого придает устойчивость к антибиотику канамицину. Среди трансгенных растений не выявлено морфологических изменений по сравнению с исходными сортовыми формами.

4. Подтверждено, что мероприятия по транс-генозу гена Bt повышают уровень полевой устойчивости картофеля к колорадскому жуку независимо от уровня исходной устойчивости сорта.

5. Показано, что трансгеноз гена ipt , кодирующего ключевой фермент биосинтеза цитокини-нов — изопентенилфосфотрансферазу, не приводит к повышению полевой устойчивости исходных сортов к колорадскому жуку.

Работа осуществлена при финансовой поддержке фонда CRDF и Министерства Образования РФ, грант ST-012-0.

Литература

1. Horsch R.B., Klee H.J., Stachel S., Winans S.C., Nester E.W., Rogers S.G., Fraley R.T. Analysis of Agrobacterium tumefaciens virulence mutants in leaf discs. // Proc. Natl. Acad. Set. — 1986. — Vol. 83, N 3. — P 2571-2575.

2. Close T.J., Rogowsky P.M.,Kado C.I., WinansS.C., Yanofsky M.F., NesterE.W. Dual control of Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid virulence genes.// J. Bacteriol. — 1987. — Vol. 169, N 11.— P 5113-5118.

3. Jin S., Komari Т., Gordon M.P., Nester E.W. Genes responsible for the supervirulence phenotype of Agrobacterium tumefaciens A281 // J. Bacteriol. — 1987. — Vol. 169, N 10. — P 4417-4425.

4. Богомаз Д.И. Характеристика регенерационной способности сортов картофеля, перспективных и рекомендованных для возделывания на Северо-Западе России // Сб.: Биотехнология — возрождению сельского хозяйства в России в XXI веке. — 2001. — С. 14-17.

5. Otten L, Canaday J., Gerard J.C., Fournier P., Crouzet P., Paulus F. Evolution of agrobacteria and their Ti plasmids — a review// Mol. Plant-Microbe Interact. — 1992. — Vol. 5, N 4. — P 279-287.

6. Bosch D., Schipper B., van der Kleij H., de Maagd R.A., Stiekema W.J. Recombinant Bacillus thuringiensis crystal proteins with new properties: possibilities for resistance management // Bio. Technology. — 1994. — Vol. 12. — P 915-918.

7. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Plant Phisiol. — 1962 — Vol. 15, P 473-97.

8. Maniatis T., Fritsch F.F., Sambrook J. Molecular cloning. A Laboratory Manual. — Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1982 — 479 p.

9. Шапиро И.Д., Вилкова Н.А., Фасулати С.Р., Иващенко Л.С. Методические рекомендации по изучению и оценке форм картофеля на устойчивость к колорадскому жуку. — М., 1993.— 48 c.

10. Лакин Г.Ф. Биометрия. — М.: Высшая школа, 1990. — 352 с.

11. Ondrey M., Macas J., Kostrica P. Potato transgenosis by T-DNA

morphoregulatory genes // Rostlina vyroba. — 1993. —

39(11). — P 1065-1074.

12. Smigocki A., Neal J.W. Jr., McCanna I., Douglass L. Cytokinin-mediated insect resistance in Nicotiana plants transformed with the ipt gene//Plant Mol. Biol. — 1993. — Vol. 2. — P 325-335.

13. Лутова Л.А., Павлова З.Б., Иванова М.М. Агробактериальная трансформация как способ изменения гормонального метаболизма у высших растений // Генетика. — 1998. — Т. 34, № 2. — С. 165-182.

14. Yanofsky M., Montoya A., Knauf V., Lowe В., Gordon M., Nester E. Limited-host-range plasmid of Agrobacterium tumefaciens: molecular and genetic analyses of transferred DNA//J. Bacteriol. — 1985. — Vol. 163, N 1. — P 341-348.

15. Злотников М.Д. Возможный ареал распространения и сроки развития колорадского жука в Европейской части СССР //Тр. ВИЗРа. — 1967. — Т. 27. — С. 68-74.

16. Саулич А.Х. Сезонное развитие насекомых и возможность их расселения//Изд-во Санкт-Петербургского университета, 1999. — С. 117-121.

Analysis of interaction of plant genotype and strain Agrobacterium tumefaciens in breeding of potato resistance to Colorado potato beetle

Bogomaz D.I.

Department of Genetics and Breeding, St.-Petersburg State University

SUMMARY: Efficiency of potato transformation depends on plant genotype and bacterial strain. Genotypes with high regeneration ability have high transformation ability. It is shown, that transgenosis of Bt gene increases potato resistance to collorado potato beetle, transgenosis of ipt gene does not influence on resistance.

^8? KEY WORDS: potato; transformation; resistance.