СПОСОБ РАЗДЕЛЬНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ НЕОРГАНИЧЕСКОГО И ОРГАНИЧЕСКОГО МЫШЬЯКА В МОРЕПРОДУКТАХ
METHOD FOR SEPARATE DETERMINATION OF INORGANIC AND ORGANIC ARSENIC IN SEAFOOD

Изобретение относится к области оценки безопасности пищевой продукции, а именно к методам раздельного определения содержания в морепродуктах органического и неорганического мышьяка, и может быть использовано в процессе установления отдельных регламентов содержания этих форм мышьяка в рыбе и других морепродуктах.
В настоящее используются методы: определения общего мышьяка по ГОСТ 34141-2017 «Продукты пищевые, корма, продовольственное сырье. Определение мышьяка, кадмия, ртути и свинца методом масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой»; определение неорганического мышьяка по ГОСТ 34462-2018 «Продукты пищевые, продовольственное сырье и корма. Определение содержания неорганического мышьяка методом высокоэффективной жидкостной хроматографии - масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой». Данный метод основан на извлечении неорганического мышьяка из анализируемой пробы путем обработки ее раствором азотной кислоты и перекиси водорода и количественном определении с помощью ВЭЖХ-ИСП-МС системы.
Официально утвержденного способа раздельного определения органических и неорганических форм мышьяка в рыбе и морепродуктах в Российской Федерации в настоящее время нет.
Необходимость разработки метода обусловлено тем, что органические формы мышьяка вносят значительно больший вклад в общее потребление человеком мышьяка и являются менее токсичными, чем его неорганические формы, которые отнесены Международным агентством по исследованию рака (IARC) к канцерогенам первой группы (Group 1А) - к веществам, которые могут оказывать канцерогенное действие в любых концентрациях. Арсенобетаин не проявляет выраженного токсического действия. Вместе с тем, ряд органических форм мышьяка отнесены IARC ко второй группе канцерогенов (Group 2В), то есть к веществам, которые при определенных условиях могут оказывать канцерогенное воздействие на организм человека. Арсеносахара и арсенолипиды, в процессе метаболизма в организме, могут метилироваться и, таким образом, оказывать генотоксическое воздействие на организм и другие негативные эффекты, характерные для неорганических форм мышьяка. Раздельное определение органических и неорганических форм мышьяка и анализ их содержания будет способствовать решению вопроса о необходимости установления отдельных регламентов содержания этих форм мышьяка в рыбе и других морепродуктах.
Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому способу является метод раздельного количественного определения органических и неорганических форм мышьяка в морепродуктах с использованием атомно-абсорбционного спектрометра [Круглякова У.С., Багрянцева О.В., Евстратова А.Д., Малинкин А.Д., Гмошинский И.В., Хотимченко С.А. Раздельное количественное определение органических и неорганических форм мышьяка в морепродуктах//Анализ риска здоровью, 2018, №2, с. 112-118, DOI: 10.21668/health.risk/2018.2.13].
-4
3
Недостатком способа является невозможность раздельного определения органических и неорганических форм мышьяка во влажных образцах и недостаточная точность определения этих показателей в морепродуктах с высоким содержанием белка, а также низкий предел обнаружения мышьяка -3*10 мкг/см.
Технической задачей заявленного изобретения является создание способа, обеспечивающего раздельного определения органических и неорганических форм мышьяка во влажных образцах рыбы и других морепродуктов.
3
Техническим результатом предлагаемого способа является достижение большей степени воспроизводимости, стабильности и точности получаемых результатов (0,5 мкг/дм), при помощи метода твердофазной экстракции в сочетании с масс-спектрометрией с индуктивно-связанной плазмой с использованием квадрупольного масс-спектрометра с индуктивно-связанной плазмой, с диапазоном измерений от 3 до 256 атомных единиц массы (а.е.м.).
3
3
3
Требуемый технический результат достигается способом раздельного количественного определения органического и неорганического мышьяка в морепродуктах в отборе образцов, их обработке с получением гомогенизированного влажного или сухого образца, которые помещают в пробирки, проведении экстракции каждого образца раствором 3% по массе перекиси водорода в 0,055М соляной кислоте на деионизованной воде, на водяной бане с шейкером при температуре 95°С в течение 45 мин. с дополнительным ручным встряхиванием пробирки с образцом через каждые 10 мин., затем охлаждении до комнатной температуры, центрифугировании в течение 10 минут при 4000 об./мин в центрифуге с угловым ротором, затем перенесении супернатантов в полипропиленовые пробирки, с доведением деионизованной водой до объема 10 см, определении содержания общего мышьяка в 5 см отобранного образца супернатанта, разделении мышьяка на органическую и неорганическую фракции в 3 см оставшегося количества отобранного образца при помощи проведения твердофазной экстракции с использованием SPE-картриджей с сильной анионообменной неподвижной фазой, минерализации аликвот образцов фракций общего, органического и неорганического мышьяка, с дальнейшим определением количества общего мышьяка, а определение количества общего мышьяка, органического и неорганического мышьяка проводят на квадрупольном масс-спектрометре с индуктивно связанной плазмой ICP-MS автоматически.
Способ осуществляется следующим образом.
Подготовка образцов к анализу проводится с использованием или без использования сублимационной сушки. Влажные образцы морепродуктов после очистки от несъедобной части в количестве 50-100 г помещают в лабораторный измельчитель тканей и гомогенизируют в течение 2-3 минут при охлаждении камеры гомогенизатора льдом до состояния однородной пасты.
-1
Для получения сухих образцов морепродукты измельчают ножницами на кусочки размером 1-3 мм, взвешивают с точностью до ±0,01 г, помещают в чашку Петри, замораживают и подвергают вакуумной сублимационной сушке при температуре испарителя от минус 45 до минус 50°С. Сушка проводится в течение 24-36 часов до достижения постоянного остаточного давления в сушильной камере не выше 1,2*10 тор в течение часа и постоянной разности температур плиты сушильной камеры и высушиваемых образцов. За 2 часа до окончания процесса сушки температуру в камере повышают до +35°С для удаления остаточных количеств влаги из образцов. Высушенные образцы повторно взвешивают для определения влажности, после чего растирают в порошок в ступке.
3
3
Влажный образец массой 0,250 г или сухой образец массой 0,050 г взвешивают на аналитических весах с точностью ±0,001 г, вносят в стеклянную пробирку со шлифом №14 вместимостью 20 см, добавляют 10 см раствора для экстракции (3% по массе перекиси водорода в 0,055 М соляной кислоте на деионизованной воде) и помещают на водяную баню с шейкером при температуре 95°С на 45 минут. Для более полного извлечения мышьяка, образцы в ходе экстрагирования дополнительно перемешивают путем ручного встряхивания пробирки через каждые 10 минут.
3
3
3
Далее образцы охлаждают до комнатной температуры, помещают в центрифужные пробирки и центрифугируют в течение 10 минут при 4000 g в центрифуге с угловым ротором. Супернатанты переносят в полипропиленовые пробирки и доводят деионизованной водой до объема 10 см. По 5 см каждого образца супернатанта отбирали для определения содержания общего мышьяка. Из остатка отбирали по 3 см супернатанта для дальнейшего проведения твердофазной экстракции.
3
3
3
3
3
3
3
Неорганический мышьяк отделяется от органического мышьяка на SPE-картриджах с сильной анионообменной неподвижной фазой с массой сорбента 500 мг и объемом 6 см (одноразовых), установленных в вакуумную камеру для твердофазной экстракции (от 30 кПа до 90 кПа) при скорости элюирования: 2 см жидкости за 5 мин. Предварительно картриджи кондиционируют пропусканием 2 см метанола. Сорбентное уравновешивание картриджей выполняется пропусканием 2 см раствора, состоящего из равных объемов 40 мМ карбоната аммония и раствора для экстракции. Перед нанесением на картридж супернатант в количестве 3 см3 смешивают с 3 см3 40 мМ карбоната аммония. С помощью универсальной индикаторной бумаги определяется рН смеси, который должен был соответствовать 6,5±1,0. Забуференный раствор образца центрифугируют в течение 10 мин при 4000 об./мин, после чего его аликвоту 4 см наносят на предварительно сорбентно уравновешенные картриджи SPE, установленные в вакуумную камеру. После прохождения раствора через картридж (в течение 5 минут) его промывают 6 см 0,5 М уксусной кислоты и далее высушивают под вакуумом до полного высыхания. Объединенные растворы, прошедшие через картридж на данной стадии, представляют собой фракцию органического мышьяка. Сорбированную на картрижде фракцию далее элюируют 2,5 см 0,4 М соляной кислоты. В ходе элюирования удерживаемую на SPE-картриджах фракцию неорганического мышьяка (V) собирают в полипропиленовые пробирки с дальнейшим высушиванием под вакуумом в течение не менее 5 мин. Аликвоты экстракта образца продукта, и полученных фракций органического и неорганического мышьяка подвергают минерализации согласно ГОСТ 26929-9412.
После минерализации в образцах определяют общее содержание мышьяка, содержание органического и неорганического мышьяка при помощи квадрупольного масс-спектрометра с индуктивно связанной плазмой ICP-MS Расчет концентраций мышьяка проводят с помощью программного обеспечения квадрупольного масс-спектрометра с индуктивно связанной плазмой ICP-MS автоматически, на основании параметров используемого метода и данных проведенной калибровки (Фиг. 1).
Расчет общего содержания мышьяка в образце проводят по формуле:
Х=[(C×V×K] /М, где Х - искомое содержание элемента, мкг/г (мг/кг);
3
С - концентрация элемента, определенная по калибровочному графику, мкг/дм, скорректированная на величину сигнала контрольной пробы (бланка), не содержащей образца;
3
V - объем пробы после минерализации, дм;
K - коэффициент разведения пробы;
М - навеска пробы, г.
Расчет содержания мышьяка в экстрактах и элюатах SPE проводят по формуле:
Х=[(C×V×K] /w, где
3
Х - искомое содержание элемента, мкг/см;
3
С - концентрация элемента, определенная по калибровочному графику, мкг/дм, скорректированная на величину сигнала контрольной пробы (бланка), не содержащей образца;
3
V - объем пробы после минерализации, дм;
K - коэффициент разведения пробы;
3
w - объем пробы, см.
Расчет содержания органически связанного (oAs) и неорганического (iAs) мышьяка в продукции проводят по формулам:
o
t
o
o
o
o
i
i
C=X×Xw/(Xw+XW)×(1-Z/100)
i
t
i
i
o
o
i
i
C=X×Xw/(Xw+Xw)×(1-Z/100), где
o
i
t
o/i
o/i
3
3
C/ - концентрация (содержание) органического/неорганического мышьяка в мг/кг, X - общее содержание мышьяка в сухом (сублимационно высушенном) или влажном образце продукции, X - содержание мышьяка в элюатах (SPE фракциях) органического/неорганического мышьяка в мкг/см, w - объем элюатов (SPE фракций) органического/неорганического мышьяка в см, Z - влажность образца (потери при сублимационном высушивании) в % по массе.
Примечание: множитель 1-Z/100 представляет собой поправку на влажность исходного образца при использовании для экстракции сухого образца. При использовании в экстракции влажного образца или образца сухих водорослей данная поправка не вносится (Z=0).
3
Нижний предел количественного определения мышьяка при использовании предлагаемого способа составляет 0,5 мкг/дм. Ошибка измерения не более 20%.
Сумма содержания органического и неорганического мышьяка в исследованных образцах совпадает с полученными результатами определения общего мышьяка вне зависимости от содержания в нем влаги.
Примеры выполнения способа.
Пример 1
Для определения содержания органических и неорганических форм мышьяка в морепродуктах были взяты образцы следующих видов рыб: скумбрии копченой, палтуса, морского окуня и трески свежемороженных.
Влажные образцы морепродуктов после очистки от несъедобной части в количестве 100 г помещали в измельчитель тканей и гомогенизировали в течение 3 минут при охлаждении камеры гомогенизатора льдом до состояния однородной пасты.
3
3
Образец массой 0,250 г взвешивали на аналитических весах с точностью ±0,001 г, вносили в стеклянную пробирку со шлифом №14 вместимостью 20 см, добавляли 10 см раствора для экстракции (3% по массе перекиси водорода в 0,055 М соляной кислоте на деионизованной воде) и помещали на водяную баню с шейкером при температуре 95°С на 45 минут. Для более полного извлечения мышьяка образцы дополнительно перемешивали путем ручного встряхивания пробирки через каждые 10 минут.
3
3
Далее образцы охлаждали до комнатной температуры, помещали в центрифужные пробирки и центрифугируют в течение 10 минут при 4000 об./мин. в центрифуге с угловым ротором. Супернатанты переносили в полипропиленовые пробирки и доводили деионизованной водой до объема 10 см. По 5 см каждого образца супернатанта отбирали для определения содержания общего мышьяка.
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
Для раздельного определения органического и неорганического мышьяка в образцах из остатка супернатанта отбирали по 3 см для дальнейшего проведения твердофазной экстракции на SPE-картриджах с сильной анионообменной неподвижной фазой с массой сорбента 500 мг и объемом 6 см (одноразовых), установленных в вакуумную камеру для твердофазной экстракции (от 30 кПа до 90 кПа) при скорости элюирования: 2 см жидкости за 5 мин. Предварительно картриджи кондиционировали пропусканием 2 см метанола. Сорбентное уравновешивание картриджей выполняли пропусканием 2 см раствора, состоящего из равных объемов 40 мМ карбоната аммония и раствора для экстракции. Перед нанесением на картридж супернатант в количестве 3 см смешивали с 3 см 40 мМ карбоната аммония. С помощью универсальной индикаторной бумаги определяется рН смеси, соответствовал 6,5±1,0. Забуференный раствор образца центрифугировали в течение 10 мин при 4000 об./мин, после чего его аликвоту 4 см наносили на предварительно сорбентно уравновешенные картриджи SPE, установленные в вакуумной камере. После прохождения раствора через картридж (в течение 5 минут) его промывали 6 см 0,5 М уксусной кислоты и далее высушивали под вакуумом до полного высыхания. Объединенные растворы, прошедшие через картридж на данной стадии, представляют фракцию органического мышьяка. Сорбированную на картрижде фракцию далее элюировали 2,5 см 0,4 М соляной кислоты. В ходе элюирования удерживаемую на SPE-картриджах фракцию неорганического мышьяка (V) собирали в полипропиленовые пробирки с дальнейшим высушиванием под вакуумом в течение не менее 5 мин.
Аликвоты экстракта образца продукта, и полученные фракции органического и неорганического мышьяка подвергали минерализации согласно ГОСТ 26929-9412.
После минерализации в образцах определяли общее содержание мышьяка, содержание органического и неорганического мышьяка при помощи квадрупольного масс-спектрометра с индуктивно связанной плазмой ICP-MS Расчет концентраций мышьяка проводили с помощью программного обеспечения квадрупольного масс-спектрометра с индуктивно связанной плазмой ICP-MS автоматически, на основании параметров используемого метода и данных проведенной калибровки (Фиг. 1).
Расчет общего содержания мышьяка в образце проводили по приведенной в описании способа формуле с учетом значений калибровочного графика.
Полученные результаты отражены в таблице 1.
Пример 2
Определение органических и неорганических форм мышьяка проводили аналогично примеру 1, за исключением того, что в качестве образцов использовались морепродукты: креветки, крабы, мидии, кальмары. Полученные результаты представлены в табл. 2
Пример 3
Содержание органических и неорганических форм мышьяка в сухих водорослях проводили аналогично примеру 1, за исключение взятых образцов: капуста морская (сибуки), капуста морская (доширак), водоросли фукус сублимированные.
-1
Для получения сухих образцов водоросли измельчали ножницами на кусочки размером 1-3 мм, взвешивали с точностью до ±0,01 г, помещали в чашку Петри, замораживали и подвергали вакуумной сублимационной сушке при температуре испарителя минус 45°С.Сушка проводилась в течение 36 часов до достижения постоянного остаточного давления в сушильной камере не выше 1,2*10 тор в течение часа и постоянной разности температур плиты сушильной камеры и высушиваемых образцов. За 2 часа до окончания процесса сушки температуру в камере повышали до +35°С для удаления остаточных количеств влаги из образцов. Высушенные образцы повторно взвешивали для определения влажности, после чего растирали в порошок в ступке.
Расчет концентраций мышьяка проводили с помощью программного обеспечения квадрупольного масс-спектрометра с индуктивно связанной плазмой ICP-MS автоматически, на основании параметров используемого метода и данных проведенной калибровки (Фиг. 1).
Расчет общего содержания мышьяка в образце проводили по приведенной в описании способа формуле с учетом значений калибровочного графика.
Полученные результаты представлены в табл. 3
3
Положительным эффектом предлагаемого способа разделения органических и неорганических форм мышьяка на SPE-картриджах с сильной анионообменной неподвижной фазой с дальнейшей детекцией при помощи квадрупольного масс-спектрометра с индуктивно связанной плазмой ICP-MS является то, что данный способ обеспечивает высокую степень воспроизводимости, стабильности и точности определения количества органических и неорганических форм мышьяка в рыбе и морепродуктах с различной степенью влажности. Нижний предел обнаружения мышьяка при использовании данного метода составляет 0,5 мкг/дм.