Разбавитель для среднесрочного хранения спермы хряков

ЛИТЕРАТУРА

1. Влияние препарата Лактофильтрум, энтеросорбента СВ-2, их комплекса и Энротима 10 % на динамику показателей перекисного окисления липидов и гематологические показатели при гастроэнтеритах телят / С.С. Абрамов [и др.] II Ученые записки УО «ВГАВМ»: науч.-практ. журнал. Витебск: УО «ВГАВМ», 2009. Т. 45. Вып. 1. Ч. 1. С. 83-86.

2. Экологические проблемы ветеринарной медицины: монография / С.С. Абрамов, А.А. Мацинович, А.И. Ятусевич [и др.]. Витебск: УО «ВГАВМ», 2009. С. 256-257.

3. Карпуть, И.М. Витаминно-минеральный препарат селевит в повышении резистентности и профилактике гастроэнтеритов у телят / И.М. Карпуть, С.П. Борознов // Экологические проблемы патологии, фармакологии и терапии животных: материалы Меж-дунар. коорд. совещ., 19-23 мая 1997 г. / Всерос. науч.-исслед. вет. ин-т патологии, фармакологии и терапии. Воронеж, 1997. С. 318-319.

4. Козловский, А.Н. Использование пребиотика лактофильтрум при лечении больных абомазоэнтеритом телят / А.Н. Козловский, И.М. Карпуть, В.Н. Иванов // Ученые записки УО «ВГАВМ»: науч.-практ. журнал. Витебск: УО «ВГАВМ», 2008. Т. 44. Вып. 2. С. 29-30.

5. Кондрахин, И.П. Диагностика и терапия внутренних болезней животных / И.П. Кондрахин, В.И. Левченко. М.: Аквариум-принт, 2005. С. 695-700.

6. Лапина, В.А. Профилактика гастроэнтеритов телят / В.А. Лапина, Е.А. Бодяковская, Е.А. Панковец II Ветеринарная медицина Беларуси. 2004. № 3. С. 24 - 27.

7. Справочник врача ветеринарной медицины / А.И. Ятусевич [и др.]. Минск, 2007. С.137-138.

8. Шпаркович, М.В. Экофильтрум в терапии телят при диспепсии / М.В. Шпаркович, А.А. Белко // Материалы 3-й науч.-практ. конф. Международной ассоциации паразитоценологов, Витебск, 14-17 октября 2008 г. Витебск, 2008. С. 194196.

9. Шпаркович, М.В. Энтеросорбенты в комплексной терапии телят при абомазоэнтеритах / М.В. Шпаркович, А.А. Белко // Материалы 7-й междунар. науч.-практ. конф. Витебск, 2008. С. 27-29.

УДК 615.454.2

РАЗБАВИТЕЛЬ ДЛЯ СРЕДНЕСРОЧНОГО ХРАНЕНИЯ СПЕРМЫ ХРЯКОВ

Г.Ф. МЕДВЕДЕВ, Н.И. ГАВРИЧЕНКО УО «Белорусская государственная сельскохозяйственная академия» г. Горки, Могилевская обл., Республика Беларусь, 213407 А.И. БУДЕВИЧ

РУП «Научно-практический центр НАН Беларуси по животноводству» г. Жодино, Минская обл., Республика Беларусь, 222160

Введение. Разбавление спермы является важнейшим технологическим элементом искусственного осеменения (ИО), позволяющим дольше сохранять ее и эффективно использовать производителей. Несмотря на огромные достижения в мире в области разбавления и хранения спермы хряков, в Беларуси во многих предприятиях применяются среды для краткосрочного хранения (ГХЦ и ГХЦС). Эти среды, как и сама технология разбавления и расфасовки спермы, уже не в

полной мере отвечают современным требованиям к воспроизводству свиней.

В процессе разбавления спермы в нее добавляются многие ингредиенты, которые защищают сперматозоиды от температурного шока, к которому сперматозоиды хряка очень чувствительны, и это позволяет сохранять оплодотворяющую способность их до использования. Время хранения спермы хряка при температуре 17-18 0С может достигать двух недель [1]. При такой температуре в среде достаточно быстро накапливаются токсичные продукты. Требуется ограничение метаболизма сперматозоидов. Это может быть достигнуто химическим путем (введением в среду для разбавления веществ, связывающих ионы кальция), повышением вязкости среды и другими путями. Уменьшение рН также может быть полезным [2].

Сперматозоид подобен осмометру и способен к изменениям в размере в зависимости от концентрации среды, в которой находится [3, 4]. Плазма спермы хряков имеет осмотическое давление приблизительно 325 миллиосмомолей (депрессия - 0,602 0С) [5], и предполагается, что это физиологически идеальное осмотическое давление.

Однако сперматозоиды сохраняют достаточно высокую активность в некотором диапазоне изменения осмотического давления, причем без снижения оплодотворяющей способности. На диапазон толерантности оказывают влияние рН и присутствующие в среде вещества.

Глюкоза используется сперматозоидами как источник энергии. Этот сахар понижает электропроводность среды, защищает сперматозоиды от потери отрицательного электрического заряда и агглютинации. Повышается вязкость среды и устойчивость к развитию гнилостных микроорганизмов, что благоприятно отражается на выживаемости сперматозоидов [6, 7].

В чистых солевых средах сперматозоиды обладают высокой подвижностью, но сроки сохранения ее непродолжительны. В состав сред соли включаются в таких пропорциях, чтобы вместе с другими веществами создать нужное осмотическое давление и рН, уменьшить скорость биохимических реакций в сперматозоидах при температурах выше 0 0С [7].

Для спермы хряка среды для разбавления основываются на трис-буфере и цитратном буфере. Натрия цитрат обладает хелатными свойствами, связывает ионы кальция и тяжелых металлов. Однако он в большей мере необходим для создания соответствующего осмотического давления и рН, так как введение трилона Б в полной мере обеспечивает связывание ионов кальция. В средах для хранения спермы хряка при комнатных температурах трилон Б является одним из наиболее важных компонентов [6-8].

Натрия гидрокарбонат в большей мере необходим для усиления буферных свойств разбавителя и контроля рН.

При хранении в сперме развиваются микроорганизмы. Попадают они в момент мануального получения спермы. При определенных обстоятельствах они могут находиться в препуции и на слизистой пениса. Некоторые компоненты, входящие в состав сред, создают условия

315

для роста микроорганизмов, и это приводит к выработке вредных для сперматозоидов продуктов метаболизма, которые могут непосредственно воздействовать на сперматозоиды. Более того, при использовании такой спермы происходит инфицирование осемененных самок. В результате возможно уменьшение процента плодотворных осеменений и увеличение эмбриональной смертности или выкидышей.

Большинство микроорганизмов, находящихся в сперме, не является патогенными. Поэтому нет прямой корреляции между оплодотворяе-мостью и общим количеством присутствующих в сперме микроорганизмов. Но некоторые их виды, если присутствуют в чрезмерно больших количествах, способны снизить выживаемость сперматозоидов. Это тем более вероятно, что сперма хряка не подвергается сильному охлаждению, которое может замедлить размножение их, но не останавливает его.

Для сперматозоидов некоторых видов животных относительно безвредными оказались стрептоцид белый растворимый и ряд антибиотиков: пенициллин и стрептомицин, тилозин, гентамицин, линкомицин и спектиномицин (линкоспектин), полимиксин, неомицин и др.

Антибиотики могут быть скомбинированы так, чтобы обладать широким спектром воздействия на микроорганизмы и быть безвредными для сперматозоидов. В последнее время наиболее широко используется комбинация антибиотиков, рекомендованная в США Certified Semen Services (CSS). Эта комбинация включает гентамицина сульфат, линко-спектин и тилозин [9]. В разбавители для спермы хряков могут дополнительно включать пенициллин и стрептомицин [10].

Эффективность комплекса антибиотических веществ выше при включении в разбавитель для спермы производителей с невысокой плодовитостью.

Цель работы - разработать состав разбавителя для хранения спермы хряков при температуре 17-18 0С в течение трех или более суток.

Материал и методика исследований. В составе известных сред для разбавления спермы хряка обязательным компонентом является глюкоза. В среды для краткосрочного хранения (ГХЦ, BTS и др.) глюкоза включается в больших количествах, чем в среды для среднесрочного хранения (Zorlesko, Zorpva, Androhep и др.).

Вторым по важности компонентом является натрия цитрат трехза-мещенный двухводный (пятиводный). Содержание его, напротив, выше в средах для среднесрочного и долгосрочного хранения.

Третий обязательный компонент - трилон Б (Di-sodium EDTA) в наибольшем количестве содержится в ГХЦ разбавителе (3,7 г/л), тогда как в трех названных разбавителях для среднесрочного хранения спермы содержание его колеблется в очень узких пределах (2,32,4 г/л).

И последний обязательный компонент - натрия гидрокарбонат включен практически во все разбавители в количестве 1,2-1,25 г/л и только в Zorpva в количестве 1,75 г/л.

Другие компоненты (лимонную кислоту, трис-буфер) включают в разбавители, в которых очень низкое содержание глюкозы (Zorlesko,

316

2о1^а). Буфер HEPES включают редко, иногда в комбинации с бычьим сывороточным альбумином. Эти компоненты значительно изменяют консистенцию и электростатические свойства разбавителя и способствуют более длительному сохранению подвижности и предупреждают раннюю акросомную реакцию сперматозоидов.

Учитывая составы различных разбавителей, их физико-химические свойства, мы провели теоретические расчеты, определили качественный и количественный состав разбавителя, в который включили: глюкозу, натрий лимоннокислый трехзамещенный двухводный, трилон Б, натрий гидрокарбонат, буфер HEPES и бычий сывороточный альбумин. Из расчета на 1 л в разбавитель вносили смесь антибиотиков в дистиллированной воде 10 мл (в 1 мл гентамицина 25 мг, линкоспек-тина 75 мг, неомицина 5 тыс. ЕД, бензилпенициллина 50 тыс. ЕД и стрептомицина 50 мг).

После приготовления разбавителя определяли его осмотическое давление и рН. Осмотическое давление среды определяли методом криоскопии. Так как в состав разбавителя был включен бычий сывороточный альбумин, который должен храниться при температуре 5 °С, а остальные - при комнатной температуре, то после приготовления его хранили при температуре 17-18 0С и в холодильнике при температуре 5 оС.

Внешние свойства, осмотическое давление и рН определяли сразу же после приготовления и через 7 дней. Готовили по отдельности три образца разбавителя и разделяли на две равные части для хранения при различной температуре.

Для изучения активности сперматозоидов после разбавления спермы хряка экспериментальной средой и хранения ее в течение 5 дней был проведен эксперимент.

Работа выполнена в лаборатории кафедры биотехнологии и ветеринарной медицины и на пункте искусственного осеменения свиней СПК «Вихра».

Сначала готовили два образца среды по 250 мл. Приготовление разбавителя спермы осуществлено следующим образом. Все компоненты, кроме антибиотиков, взвешивались на лабораторных весах с соблюдением стерильности (дважды, для каждого образца разбавителя в отдельности) и переносили в стерильные плоскодонные колбы на 500 мл. Воду стерилизовали в водяной бане, затем охлаждали до 25 °С и отмеривали мерной стерильной колбой вместимостью 250 мл и затем выливали в колбы с компонентами разбавителя. Антибиотические вещества растворяли в стерильной дистиллированной воде с таким расчетом, чтобы в 2,5 мл раствора содержалось необходимое количество их для каждого образца разбавителя.

В СПК «Вихра» в эксперименте использована сперма девяти хряков, в том числе шести - белорусской черно-пестрой породы, двух - крупной белой и одного - йоркшира. Сперму получали мануальным способом в один и тот же день. Все процедуры: получение спермы, разбавление и ежедневное определение активности сперматозоидов в оставленных для хранения образцах спермы выполнены специалистами комплекса.

317

Использованы эякуляты объемом от 150 до 350 мл. Концентрация сперматозоидов определена визуальным способом. Разбавляли все эякуляты 1:1. Основную часть эякулятов разбавляли ГХЦС разбавителем, а 25 мл из каждого эякулята разбавляли испытуемым разбавителем. Приготовленные порции разбавленной спермы по 50 мл хранили в стерильных стеклянных флаконах вместимостью 100 мл. Флаконы после помещения в них спермы закрывали стерильной пергаментной бумагой. Сперма, разбавленная ГХЦС разбавителем, хранилась в полиэтиленовых флаконах, используемых для осеменения свиноматок. Температура хранения спермы - 18 оС.

Для определения оплодотворяющей способности спермы, разбавленной испытуемым разбавителем, в РСУП СГЦ «Вихра» организовано проведение опыта.

В лаборатории кафедры 1 -3 раза в месяц готовился разбавитель и доставлялся на предприятие. Всего было приготовлено 8 л разбавителя. Каждый образец разбавителя (1 л) использовался для разбавления спермы 1-3 хряков. В течение октября 2010 г. - февраля 2011 г. использовано 7 эякулятов пяти хряков белорусской крупной белой породы, 10 эякулятов девяти хряков белорусской черно-пестрой породы, 2 эякулята хряков породы ландрас, 3 эякулята хряков дюрок и 1 эякулят йоркшира.

Сперму получали мануальным способом. Оценку спермы по подвижности (активности) сперматозоидов определяли под микроскопом общепринятым способом. Концентрацию сперматозоидов в сперме определяли визуальным способом. Разбавляли сперму 1:1, за исключением одного эякулята (1: 2).

Результаты исследований и их обсуждение. Приготовленный разбавитель по внешнему виду абсолютно прозрачный, слегка опалес-цирующий раствор, проявляющий определенную вязкость. На протяжении срока хранения при обеих температурах внешние свойства его не изменялись.

Во всех трех пробах (до разделения) осмотическое давление колебалось от 325 до 350 миллиосмомолей (в среднем 339 миллиосмомо-лей). В конце срока хранения отклонение от начального значения составляло 13-20 миллиосмомолей, а в среднем показатель оставался практически неизменным (332 миллиосмомолей).

Сразу же после приготовления величина рН разбавителя колебалась от 6,7 до 7,1 (в среднем 6,9). При хранении разбавителя в холодильнике величина рН практически не изменилась, а при комнатной температуре снизилась на 0,15. Однако уменьшение рН может быть полезным.

Внешние свойства разбавителя не изменялись и в последующем в течение длительного времени (около 6 месяцев). Очевидно, можно предполагать, что устойчиво сохранялись и его бактериостатические свойства при температуре 5 оС и при комнатных температурах.

В эксперименте по определению выживаемости сперматозоидов при использовании испытуемого разбавителя установлено, что объем эякулятов хряков черно-пестрой породы колебался от 250 до 350 мл,

318

крупной белой - 150 и 200 мл, йоркшира - 300 мл. Во всех случаях начальная подвижность сперматозоидов оценена в 7 баллов. После разбавления спермы оценка была проведена повторно и каких-либо заметных изменений в подвижности сперматозоидов не было зарегистрировано.

В течение трех суток активность сперматозоидов во всех образцах спермы оценивалась не ниже 6 баллов. Однако сперма хряка черно-пестрой породы 10059, разбавленная ГХЦС разбавителем, уже через 48 ч была непригодна для использования. В образце спермы, разбавленной испытуемым разбавителем, активность сперматозоидов не ниже 6 баллов сохранялась в течение 96 ч.

В сперме двух хряков черно-пестрой породы, двух - крупной белой и йоркшира, разбавленной испытуемой средой, около 60 % сперматозоидов сохраняли подвижность в течение 120 ч. После разбавления ГХЦС средой в сперме этих хряков такая подвижность сохранялась в течение 72 ч (1 хряк), 96 (2 хряка) и 120 ч (2 хряка).

В сперме трех хряков черно-пестрой породы, разбавленной испытуемой средой, сохранялась нормальная подвижность только в течение 72 ч, что на 1-2 суток меньше, чем в контроле. Во всех этих случаях сперму разбавляли разбавителем первого образца.

Анализируя результаты эксперимента, следует указать на то, что во всех случаях, когда сперма, разбавленная испытуемым разбавителем, не сохраняла в течение 5 суток стандартной активности, эякуляты были большого объема - 250-350 мл. Но для длительного хранения спермы (в течение 5-10 суток или более) рекомендуется использовать только лучшую часть эякулятов - 80-150 мл.

При проведении опыта по определению оплодотворяющей способности спермы, разбавленной разрабатываемым разбавителем, величина полученных эякулятов колебалась от 150 до 500 мл. У хряков крупной белой породы объем эякулятов составил в среднем 300 мл (200500 мл), черно-пестрой породы - 275 мл (150-500 мл), ландрас -300 мл (200-400 мл), дюрок - 330 мл (300-400 мл) и йоркшира - 300 мл. Четыре эякулята делили на две части и разбавляли сперму стандартным ГХЦС разбавителем и испытуемым разбавителем. Остальные эякуляты разбавляли полностью испытуемым разбавителем. Сперму хранили при температуре 17-18 оС.

В течение 2 дней хранения сперма использована для осеменения 24 свиноматок, в течение 3 дней - 13 свиноматок и в течение 4 дней -9 свиноматок. Из 46 осемененных свиноматок результаты известны по 39 животным. Повторно было осеменено 6 свиноматок, в том числе 5 осемененных спермой, сохраняемой в течение 2 дней, и одна - после осеменения спермой, сохраняемой в течение 4 дней. Разбавленная сперма со сроком хранения 5-7 дней не использовалась, так как точная оценка ее по подвижности сперматозоидов в эти сроки путем применения специальных красителей из-за их отсутствия не проводилась.

В среднем оплодотворяемость свиноматок после осеменения испытуемым разбавителем составила 85 %. Такой же была и оплодотворяе-мость свиноматок, осемененных спермой, разбавленной стандартным

разбавителем. При использовании сохраняемой в течение 4 дней спермы оплодотворяемость не снижалась (87,5 %).

Заключение. Испытан состав разбавителя для спермы хряков, в состав которого включены глюкоза, натрий лимоннокислый трехзаме-щенный двухводный, трилон Б, натрий гидрокарбонат, буфер HEPES и бычий сывороточный альбумин, а в качестве санирующих веществ -смесь антибиотиков гентамицина 25 мг, линкоспектина 75 мг, неоми-цина 5 тыс. ЕД, бензилпенициллина 50 тыс. ЕД и стрептомицина 50 мг (из расчета на 1 л).

Сперма хряков различных пород, разбавленная таким разбавителем, сохраняла стандартную оплодотворяющую способность при хранении в течение 4 суток.

ЛИТЕРАТУРА

1. Arthurs Veterinary Reproduction and Obstetrics / David E. Noakes, Timothy J. Parkinson, C.W. Gary. England. Eighth Edition. 2001. W.B. Saunders Comp. Ltd. 868 р. (Reprinted 2007).

2. The artificial insemination and Embryo transfer of dairy and beef cattle (including information pertaining to goats, sheep, horses, swine, and other animals): a handbook and laboratory manual for students, herd operators, and persons involved in genetic development / Jere R. Mitchell, Gordon A. Doak. Copyright 2004 by Pearson Education, Inc. 387. P. 327331.

3. Drevius, L.O. Osmotic swelling of mammalian spermatozoa / L.O. Drevius, H. Eriksson // Expt. Cell Ress. 1966. 42:136-156.

4. Хантер, Р.Х.Ф. Физиология и технология воспроизводства домашних животных / Р.Х.Ф. Хантер. М.: Колос, 1984. 320 с.

5. Сердюк, С.И. Искусственное осеменение в промышленном свиноводстве / С.И. Сердюк. М.: Колос, 1977. 160 с.

6. Salisbury, G.W. Physiology of Reproduction and Artificial Insemination of Cattle / G.W. Saliabury, N. L. Van Demark. Freeman & Company 1st ed. San Francisco, 1961. 639 p.

7. Милованов, В.К. Биология воспроизведения и искусственное осеменение животных / В.К. Милованов. М.: Сельхозгиз, 1962. 696 с.

8. Foote, R.H. Tris and other organic buffers for the conservation of semen of various species / R. H. Foote // Animal Reproduction and Artificial Insemination. 99-105. Edagricole, Bologna. 1972.

9. The artificial insemination and Embryo transfer of dairy and beef cattle (including information pertaining to goats, sheep, horses, swine, and other animals): a handbook and laboratory manual / Herman. Mitchell. Doak. Interstate publishers, INC. 1994, 352 p. (114 p.).

10. Veterinary Reproduction and Obstetrics. Ninth Edition / Edited by David E. Noakes, Timothy J. Parkinson, Gary C.W. England. 2009. W.B. Saunders Elsevier. Ltd. 950 р.