СОЕДИНЕНИЕ САЛЬВИАНОЛОВОЙ КИСЛОТЫ Л, СПОСОБ ЕГО ПРИГОТОВЛЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ
SALVIANOLIC ACID L COMPOUND, METHOD OF THREOF PREPARATION AND APPLICATION

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Данное изобретение относится к области традиционной китайской медицины (ТКМ), а именно к новому виду соединения сальвианоловой кислоты.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Radix Salviae Miltiorrhizae (Китайское лекарственное сырье, далее именуемое "Danshen"), сухой корень Salvia miltiorrhiza Bge. (Fam. Labiatae), горький на вкус и немного охлажденный, действует на каналы сердца и печени и имеет функцию остановки боли путем удаления стаза, активизируя ток крови и снижая возбуждение, очищая сердце. На Danshen был проведен ряд современных фармакологических исследований, которые показали, что он способен расширять коронарную артерию, улучшая микроциркуляцию и защищая сердце, а также может ингибировать и устранять агрегацию тромбоцитов, повышая выносливость организма в условиях недостатка кислорода, а также способность к антигепатитной, антиопухолевой и антивирусной функции и т.д.
В 2001 г. Л.Н.Ли и др. в Институте фармакологии, Китайской академии медицинских наук и Пекинского объединенного медицинского колледжа [Бюллетень медицинского исследования, 2001, Том 30(7)], сообщили, что существует 13 водорастворимых биоактивных компонентов производных соединений фенолокислоты, извлеченных из Danshen или растений с таким же геном, включая сальвианоловую кислоту A, B, C, D, Е, F, G, Н, I, J, литоспермовую кислоту, розмариновую кислоту, изосальвианоловую кислоту C и т.д. К тому же, раскрывалось фармакологическое действие таких компонентов. Рена, Касиму и др. [Журнал Синьцзянского медицинского университета, 2002, Том 25(3)] сообщили о химической структуре сальвианоловой кислоты К.
Иностранные исследователи также изучали водорастворимые биоактивные компоненты Danshen. В 1999 году Университет Джорджа Вашингтона подал заявку и в итоге получил патент США относительно действия 13 производных соединений сальвианоловой кислоты на анти-ВИЧ интегразу и другие вирусы. Пришли к выводу, что Danshen является растительным сырьем с большим потенциалом, которое просто необходимо изучать далее.
Указанная сальвианоловая кислота Л данного изобретения является всего лишь новым соединением, найденным в Danshen в процессе обширного скрининга. До сегодняшнего дня еще не сообщалось о структуре и фармакологических эффектах данного соединения.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Целью данного изобретения является предоставить новое соединение сальвианоловой кислоты Л.
Следующей целью данного изобретения является предоставить фармацевтический препарат, содержащий сальвианоловую кислоту Л.
Третьей целью данного изобретения является предоставить способ приготовления сальвианоловой кислоты Л.
Четвертой целью данного изобретения является предоставить способ использования сальвианоловой кислоты Л при приготовлении медикамента для лечения сердечно-сосудистых заболеваний.
Данное изобретение относится к новому соединению, которое представлено общей формулой (I), как показано ниже, с фармацевтически приемлемыми солями, сольватами и гидролизуемыми эфирами:
1
13
Согласно данному изобретению, структура нового соединения фенолокислоты была определена физико-химическими свойствами, масс-спектрометрией с высоким разрешением (QFT-ESI), масс-спектрометрией с ионизацией электрораспылением (ESI-MS), H ЯМР, С-ЯМР, НУПП, gCOSY (корреляционной спектроскопией), дНМВС (гетероядерной многополосной корреляцией) и gHMQC (гетероядерной многоквантовой корреляцией).
Соединение по данному изобретению является бледно-желтоватой пудрой.
3
Соединение согласно данному изобретению демонстрирует положительный результат при тонкослойной хроматографии (ТСХ), реакции проявления цвета с FeCl, что говорит о том, что оно может быть фенольным соединением.
27
22
12
При масс-спектрометрии с высоким разрешением (QFT-ESI), которая показала пики квазимолекулярных ионов при м/з 537.1034, была подтверждена молекулярная формула CHO с ненасыщенной степенью Ω в 17.
При масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением (ESI-MS) пик молекулярных ионов соединения согласно данному изобретению при м/з 537 может вначале легко потерять 8-карбоксильную группу (-44), и образовать пик фрагментарных ионов при м/з 313,295 в соответствии с фрагментативной регулярностью сальвианоловой кислоты A.
Согласно данному изобретению, фрагментативная регулярность сальвианоловой кислоты A представлена следующим образом:
Понятно, что основные пики фрагментарных ионов при м/з 493, 313, 295 являются основными пиками ионов сальвианоловой кислоты A в ее масс-спектре. Таким образом, соединение данного изобретения имеет такую же структуру основной цепи, как и сальвианоловая кислота A.
1
Спектр протонного ядерного магнитного резонанса (Н-ЯМР) дает 1 сигнал метенильного протона, присоединенного к кислороду при δ 5.09 (1Н, dd, J=8.0, 4.5 Гц); 11 сигналов ароматического протона при δ 6.8 8 (1Н, d, J=8.5 Гц), δ 7.25 (1Н, d, J=8.5 Гц), δ 7.59 (1Н, d, J=16.0 Гц), δ 6.22 (1Н, d, J=16.0 Гц), δ 6.68 (1Н, s), δ 6.55 (2Н, d, J=8.0 Гц), δ 6.5 (1H, d, J=2.0 Гц), δ 6.69 (1H, d, J=8.0 Гц), δ 6.54 (1H, dd, J=8.5, 2.0 Гц), δ 7.92(1H, s); 2 сигнала алифатического протона при δ 3.01 (2Н, ddd, J=14.0, 8.0, 4.5 Гц).
13
Спектр ядерного магнитного резонанса углерода-13 (С-ЯМР) показал 27 сигналов углерода, включая 1 сигнал алифатического углерода при δ 39.6, 1 сигнал метенильного углерода, присоединенного к кислороду при δ 7 6.4, 3 сигнала карбонильного углерода при δ 170.1, δ 173.0, δ 175.1, и 22 сигнала углерода с двойной связью при δ 117.4, δ 117.8, δ 117.8, δ 118.2, δ 119.2, δ 120.2, δ 121.7, δ 123.7, δ 125.7, δ 126.6, δ 128.0, δ 128.8, δ 129.9, δ 130.9, δ 146.2, δ 146.5, δ 146.9, δ 147.4, δ 147.7, δ 147.8, δ 150.3, δ 150.9.
2
Спектр неискаженного усиления переносом поляризации (НУПП) показал, что в молекуле существует 1×CH, 12×CH и 14×C.
1
13
В свете химического сдвига и взаимного связывания ароматического протона в спектре Н-ЯМР, вместе с информацией, предоставленной спектром С-ЯМР, считается, что соединение данного изобретения имеет два 1,3,4-три-замещенных бензольных кольца, одно 1,2,3,4-тетра-замещенное бензольное кольцо, 1 двойную связь транс-формы и 1 единозамещенную двойную связь. Все это соответствует спектрометрическим характеристикам соединений сальвианоловой кислоты из Radix Salviae Miltiorrhizae.
Из вышесказанного следует, что соединение по данному изобретению, скорее всего, является соединением феноловой кислоты, демонстрируя структурные сходства с отмеченными соединениями сальвианоловой кислоты в Radix Salviae Miltiorrhizae.
1
13
По сравнению с предыдущим уровнем техники и соответствующими спектральными исследованиями, было выявлено, что соединение по данному изобретению имеет такие же спектральные свойства, как и сальвианоловая кислота A, за исключением того, что Н-ЯМР показал 2 пары протонов с двойной связью транс-формы в сальвианоловой кислоте A, и лишь 1 пару протона с двойной связью транс-формы и 1 протон с единозамещенной двойной связью в соединении по данному изобретению; а С-ЯМР показал на один карбонильный сигнал больше в соединении по данному изобретению, по сравнению с сальвианоловой кислотой A, причем C-1″ и C-8″ сдвигаются в сторону слабого поля на 8 м.д. и 6 м.д., соответственно. В результате, разница между соединением по данному изобретению и сальвианоловой кислотой A состоит в том, что C-1″ или C-8″ замещается карбоксильной группой. Для того чтобы далее подтвердить замещение C-1″ и C-8″, были проведены 2D-ЯМР исследования данного соединения, а результаты его спектроскопии ГМПК показали, что присутствует длительное связывание между H-7″ и C-9″, H-7″ и C-2″, H-7″ и C-2, а также H-7″ и C-6″. Таким образом, можно вычислить, что C-8″ было замещено карбоксильной группой в данном соединении.
Соответственно, по сравнению с предыдущим уровнем техники, соединение по данному изобретению является новым соединением сальвианоловой кислоты, получившим название «сальвианоловой кислоты Л».
Фактически, из-за изменений в конфигурации и конформации, которые произошли в данном соединении в процессе извлечения, соответствующие изменения также произошли бы с его спектральными данными, однако различные виды изомеров, произведенные при помощи конфигурационных и конформационных изменений, относятся к области защиты данного изобретения. Сальвианоловая кислота Л данного изобретения, согласно обычным техническим знаниям и существующему уровню техники, также может использоваться в форме ее фармацевтически приемлемых солей и сольватов. Указанные фармацевтически приемлемые соли сальвианоловой кислоты Л согласно данному изобретению включают обычные и фармацевтически приемлемые соли, полученные из неорганического или органического основания, произведенные при помощи обычного способа получения соли. К примерам таких солей относятся натриевая соль, калиевая соль, соль лития, магниевая соль, алюминиевая соль, кальциевая соль, цинковая соль, или соли, полученные в результате реакции с N, N'-дибензинэтилендиамином, хлорпрокаином, холином, диэтаноламином, этилендиамином, N-метил глюкозамином, прокаином и берберином. Нижеописанная сальвианоловая кислота Л включает сальвианоловую кислоту Л, представленную формулой (I) и ее фармацевтически приемлемыми солями, сольватами и гидролизуемыми эфирами.
Указанная сальвианоловая кислота Л данного изобретения должным образом вводится в форме лекарственного препарата, который может быть использован обычным образом при помощи одного или нескольких видов фармацевтически приемлемых носителей или вспомогательных веществ. К тому же, при возможности, указанная сальвианоловая кислота Л данного изобретения может быть введена в качестве сырьевого медикамента, желательно, чтобы активные компоненты прямо использовались как фармацевтический препарат. С точки зрения совместимости с другими компонентами и безопасности для пациента, носители должны быть фармацевтически приемлемыми. Таким образом, данное изобретение предлагает лекарственные препараты сальвианоловой кислоты Л, которые включают сальвианоловую кислоту Л по данному изобретению и один или несколько фармацевтически приемлемых носителей с использованием или без использования других терапевтических и/или профилактических компонентов. Такие препараты могут вводиться перорально, парентерально (включая подкожно в форме инъекций или таблеток резервуарного типа, внутрикожно, внутритекально, внутримышечно в форме капсулы и внутривенно), ректально и поверхностно, как, например, под язык. Однако наиболее подходящий способ введения зависит от заболевания пациента. Такие лекарственные препараты могут быть приготовлены индивидуально, а также любым способом, известным в области фармацевтики. Все эти способы включают этап объединения сальвианоловой кислоты Л по данному изобретению с носителем, который представляет один или несколько видов вспомогательных компонентов. В общем, указанные препараты по данному изобретению производятся следующим образом: однородное, плотное соединение сальвианоловой кислоты Л данного изобретения с жидкостью или измельченными твердыми носителями или их смесью для получения полуфабриката; при необходимости дальнейшее формирование указанного полуфабриката в желаемые препарат.
Обычно можно использовать ряд стандартных фармацевтических технологий, чтоб получить лекарственный препарат по данному изобретению, используя сальвианоловую кислоту Л и лекарственные носители. К таким технологиям относится смешивание, гранулирование и прессование. Как известно специалистам в этой сфере, характеристики и формы фармацевтически приемлемых носителей или разбавителей зависят от следующих факторов: количества смешиваемых активных компонентов, способа введения и других известных факторов. Указанные фармацевтически приемлемые носители в рамках данного изобретения относятся ко всем типам органических или неорганических носителей, которые могут быть введены вместе с препаратом, например, наполнитель, смазка, связывающее вещество, вещество для улучшения распадаемости и покрывающее вещество, используемое для препаратов в твердой форме; или фармацевтические добавки, такие как краситель и подсластитель. Указанные фармацевтические носители могут быть выбраны из группы, состоящей из сахарных спиртов, таких как маннитол или сорбитол, пиросульфита натрия, бисульфита натрия, тиосульфата натрия, цистеин гидрохлорида, тиогликолевой кислоты, метионина, витамина С, двунатриевой ЭДТК, ЭДТА кальция-натрия, карбонатов, ацетатов, фосфатов одновалентных щелочных металлов или их водных растворов, хлористоводородной кислоты, уксусной кислоты, серной кислоты, фосфорной кислоты, аминокислоты, хлорида натрия, хлорида калия, лактата натрия, ксилитола, мальтозы, глюкозы, фруктозы, декстрана, глицина, крахмала, сахарозы, лактозы, маннитола, производных кремния, целлюлозы и ее производных, альгината, желатина, поливинилпирролидона (ПВП), глицерина, Твин-80, агара, карбоната кальция, поверхностно-активного вещества, ПЭГ, циклодекстрина, бета-циклодекстрина, фосфолипидных материалов, каолина, тальковой пудры, стеарата кальция, стеарата магния и т.д.
Вышеуказанный медицинский препарат может быть сформирован в любую фармацевтически приемлемую лекарственную форму, включая таблетки, такие как таблетки в сахарной оболочке, таблетки с пленочной оболочкой и таблетки с энтеросолюбильным покрытием; капсулы, такие как твердые и мягкие капсулы; растворы для перорального приема; таблетки для медленного растворения в щечном кармане; гранулы, гранулы, которые принимаются после растворения в кипятке; драже; порошки; пасты; пеллеты; суспензии; растворы; инъекции; свечи; пасты, такие как мази и пластыри; кремы; спреи; капли и повязки. Желательно, чтоб препараты были в лекарственной форме для перорального применения, как, например, в форме капсул, таблеток, растворов для перорального применения, гранул, драже, порошков, пеллетов и паст; а также в форме инъекций, как, например, инъекционные порошки, инъекции, переливания и т.д. Наиболее предпочтительно, чтоб препараты были в форме таблеток.
Среди таких предпочтительных препаратов, указанные препараты для перорального введения могут содержать обычно используемые вспомогательные вещества, связывающие вещества, наполнители, разбавители, таблетирующие вещества, смазки, вещества для улучшения распадаемости таблеток, красители, ароматизаторы и смачивающие вещества, а при необходимости на таблетки может быть нанесено покрытие.
Желательно, чтоб примеры указанных вспомогательных веществ включали лактозу, Д-маннитол, Д-сорбитол, крахмал (такой как альфа-крахмал), декстрин, кристаллическую целлюлозу, гидроксипропилцеллюлозу с низкой степенью замещения, натриевую карбоксиметилцеллюлозу, аравийскую камедь, амилопектин, легкую безводную кремниевую кислоту, синтетический силикат алюминия или алюмосиликат натрия и т.д. Предпочтительные примеры указанных смазочных материалов включают стеарат магния, стеарат кальция, тальковую пудру и силикагель и т.д.
Предпочтительные примеры указанных связывающих веществ включают альфа-крахмал, сахарозу, желатин, аравийскую камедь, метилцеллюлозу, карбоксиметилцеллюлозу, натрия карбоксиметилцеллюлозу, кристаллическую целлюлозу, сахар, Д-маннитол, трегалозу, декстрин, амилопектин, гидроксипропилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, пирролидон и т.д.
Предпочтительные примеры указанных веществ для улучшения распадаемости таблеток включают лактозу, сахар, крахмал, карбоксиметилцеллюлозу, кальция карбоксиметилцеллюлозу, аминоалкил натрий, натрия карбоксиметил крахмал, легкую безводную кремниевую кислоту, гидроксипропилцеллюлозу с низкой степенью замещения, и т.д.
Предпочтительные примеры указанных покрывающих веществ включают гидроксипропилметилцеллюлозу, гидроксипропилцеллюлозу, этилцеллюлозу, карбоксиметилцеллюлозу, поливиниловый спирт и т.д.
Предпочтительные примеры указанных красителей включают водорастворимые пищевые тартазиновые красители (пищевые красители, такие как пищевой красный №2 и №3, пищевой желтый №4 и №5, пищевой синий №1 и №2); нерастворимые в воде красочные лаки (такие как алюминиевая соль вышеуказанных водорастворимых пищевых тартазиновых красителей) и натуральные красители (такие как бета-каротин, хлорофилл и крокус) и т.д.
Предпочтительные примеры указанных подсластителей включают сахарин натрия, глицирретиновую кислоту, аспартам, стевиозид и т.д.
Обычный способ приготовления таблеток включает соединение сальвианоловой кислоты Л данного изобретения с одним или несколькими видами фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ и дальнейшее прессование или формирование. Помимо этого, сальвианоловая кислота по данному изобретению также может быть составлена как жидкие препараты для перорального применения, например, водорастворимые или маслорастворимые суспензии, растворы, эмульсии, сиропы и т.д. Сальвианоловая кислота Л данного изобретения может также быть приготовлена в форме сухого продукта, который перед употреблением смешивается с водой или другим подходящим носителем. Жидкие препараты такого типа также могут содержать обычные добавки, включая суспендирующие вещества такие как сорбитовый сироп, метилцеллюлозу, глюкозу/сироп, желатин, гидроксиэтилцеллюлозу, карбоксиметилцеллюлозу, гель стеарата алюминия или гидрогенизированный пищевой жир; эмульгирующие вещества, такие как лецитин, сорбитанмоноолеат или аравийская камедь; безводные носители (включая пищевое масло), такие как миндальное масло, фракционированное кокосовое масло, маслянистый эфир, пропиленгликоль или этанол; а также консерванты, такие как метилпарабен, нипазол и сорбиновую кислоту.
Парентерально вводимые препараты включают водные и безводные стерильные инъекции, и по желанию такие препараты могут содержать антиоксиданты, буферные вещества, бактериостатические средства, изотонические средства и т.д.; а также парентерально вводимые препараты включают водные и безводные стерильные суспензии, и по желанию такие препараты могут содержать суспендирующие вещества и загустители. Такие препараты могут храниться в сосуде с разовой и многоразовой дозировкой, как, например, в герметичных ампулах и флаконах; и могут храниться в леофилизированном состоянии и разводиться перед использованием стерильным жидким носителем, например, водой для инъекций.
Препараты с ректальным введением могут быть представлены суппозитариями с обычной суппозитарной основой, такой как масло какао, стеариновая кислота или другие глицериды или этиленгликоль.
Препараты местного действия, вводимые в полость рта, как, например, препараты для растворения в щечном кармане или под языком, включают пастилки, активный компонент которых включен в ароматизированную основу, такую как сахарозу и аравийскую камедь; а также пастилки, в которых активные компоненты содержатся в такой основе, как желатин и глицерин или сахароза и аравийская камедь.
Сальвианоловая кислота Л данного изобретения может быть сформирована в препараты резервуарного типа, и такие препараты с замедленным высвобождением могут быть введены путем имплантации (как, например, подкожной имплантации или внутримышечной имплантации) или внутримышечной инъекции. Таким образом, сальвианоловая кислота Л данного изобретения может быть приготовлена с использованием подходящих полимеров, водоотталкивающих материалов (например, эмульсия в приемлемом масле) или ионообменных смол, или же приготовлена в форме слаборастворимых производных, например, слаборастворимой соли.
Согласно общим техническим знаниям и известному уровню техники, медицинское действие, связанное с данным изобретением, включает профилактику и лечение определенных заболеваний или симптомов. Терапевтически эффективное количество сальвианоловой кислоты Л данного изобретения зависит от особенностей заболеваний и непосредственного состояния пациента, или же необходимо следовать указаниям врача. Обычно терапевтически эффективное количество для взрослых составляет от 0,02 до 5000 мг в день, желательно - от 1 до 1500 мг в день. Как сказано выше, такое количество может быть введено единоразово или несколькими дозами через определенные промежутки времени, например, дважды в день, трижды в день, четырежды в день и более. Указанный препарат по данному изобретению содержит 0,1-99% активного компонента по весу, желательно 30-95% по весу для таблеток и капсул; и желательно 3-50% по весу для жидких препаратов.
Данное изобретение осуществляется следующим образом:
а) извлечение: извлечение лекарственного сырья Radix Salviae Miltiorrhizae или смеси Radix Salviae Miltiorrhizae и другого лекарственного сырья с водой, добавление спирта для осаждения и получения надосадочного слоя, после чего надосадочный слой выпаривается для получения экстракта;
б) разделение: растворение экстракта, полученного на этапе (а), в воде, нанесение на макропористую абсорбирующую смолу и элюирование смолы водой для получения элюента, окисление элюента, нанесение окисленного элюента опять на макропористую абсорбирующую смолу, промывание смолы кислым водным раствором для удаления загрязнений, элюирование смолы этанолом для получения этанолового элюента, выпаривание этанолового элюента для получения экстракта;
в) очистка: нанесение экстракта, полученного на этапе (б), на колонку с силикагелем при помощи способа высушивания, изократическое элюирование с подвижной фазой хлороформа, метанола и муравьиной кислоты; сбор элюента; контроль за ходом процесса при помощи тонкослойной хроматографии, объединение аналогичных по характеристикам элюентов для получения сальвианоловой кислоты Л.
На этапе (а) указанное лекарственное сырье Radix Salviae Miltiorrhizae или смесь Radix Salviae Miltiorrhizae с другим лекарственным сырьем можно разделить на части для декоктирования, растереть на гранулы или порошок, желательно - разделить на части для декоктирования. Предпочтительно, чтоб корень Radix Salviae Miltiorrhizae использовался в форме указанного лекарственного сырья Radix Salviae Miltiorrhizae. Указанное другое лекарственное сырье относится к китайскому лекарственному сырью, известному профессионалам в этой сфере, которое совместимо с Radix Salviae Miltiorrhizae, желательно Radix Notoginseng, Radix Astragali и/или Radix Polygoni Multiflori.
На этапе (а) указанное извлечение водой происходит следующим образом: декоктирование лекарственного сырья в воде, объем которой превышает объем лекарственного сырья в 4-8 раз, желательно - в воде, объем которой превышает объем лекарственного сырья в 4 раза, в течение 1,5-3,5 часов, желательно - 2 часов, фильтрование; декоктирование остатка лекарственного сырья в воде, объем которой превышает объем лекарственного остатка в 3-6 раз, в течение 1-3 часов, желательно - в воде, объем которой превышает объем лекарственного остатка в 3 раза, в течение 1 часа, фильтрование; и объединение фильтрата, выпаривание фильтрата для получения экстракта с относительной плотностью 1,11-1,28 (80°С), желательно 1,2 (80°С).
Для того, чтобы образовать соль веществ фенолкислоты для более легкого отделения, на указанном этапе извлечения водой желательно использовать щелочной водный раствор, предпочтительно, чтоб такая щелочь была представлена как минимум одним веществом из группы, состоящей из бикарбоната натрия, карбоната натрия, гидроксида натрия, бикарбоната калия, карбоната калия и гидроксида калия, а более предпочтительно - бикарбонатом натрия или гидроксидом натрия. Указанный щелочной водный раствор является водным раствором бикарбоната натрия с концентрацией 0,30%-0,68% или водным раствором гидроксида натрия с концентрацией 0,0025%-0,004%, желательно - водным раствором бикарбоната натрия с концентрацией 0,45%.
На этапе (а) указанное осаждение спиртом происходит следующим образом: в экстракт для осаждения добавляется 95% этанол до тех пор, пока содержание этанола не составит 65%-70% (25°С), желательно - 70%, и отстаивается в течение 12-36 часов, желательно - 24 часов; выпаривание надосадочного слоя при помощи удаления этанола в условиях пониженного давления, и получение экстракта с относительной плотностью 1,30-1,38 (60°С), желательно - 1,37 (60°С).
Для того чтобы лучше удалить жирорастворимые загрязнения, извлечение спиртом желательно проводить перед этапом извлечения водой. На этапе извлечения спиртом выполняется дважды декоктирование 50-95% этанолом, объем которого в 5-8 раз превышает объем лекарственного сырья, каждый раз в течение 1-2 часов, фильтрование, удаление раствора для извлечения этанолом и извлечение лекарственного остатка при помощи вышеуказанного извлечения водой.
На этапе (б) указанная колонка макропористой смолы может быть представлена неполярной или слабо-полярной смолой, например АВ-8, HPD450, HPD700, D101, D4020 или Х5, желательно АВ-8. Массовая доля лекарственного сырья по отношению к макропористой абсорбирующей смоле составляет 5:1-1:1, желательно 4:1. Колонка смолы промывается водой, объем которой в 8-15 раз превышает объем слоя, желательно превышает объем слоя в 12 раз, в результате чего получается водный элюент.
Соляная кислота добавляется в водяной элюент, чтоб установить его показатель рН на отметку 2,2-3,5, желательно 3,0. Указанный кислый элюент опять подают в колонку макропористой абсорбирующей смолы, причем массовая доля лекарственного сырья по отношению к макропористой абсорбирующей смоле составляет 5:1-1:1, желательно 4:1; колонка промывается соляной кислотой с показателем рН 2,2-3,5, желательно 3,0, до тех пор, пока растворитель станет практически бесцветным. Далее используется в 3-8 раз больше 50%-95% этанола, чтоб промыть колонку, желательно - в 4 раза больше 95% этанола, и элюент выпаривается для получения экстракта без запаха спирта.
На этапе (в) экстракт, выпаренный на этапе (б), растворяется в органическом растворителе, желательно метаноле, смешивается с хроматографическим силикагелем, и желательно, чтоб вес добавленного хроматографического силикагеля с размером частиц 200-300 меш равнялся весу экстракта. Хорошо перемешанный образец наносится на хорошо наполненную колонку с силикагелем, желательно, чтоб нанесенный силикагель имел размер ячеек 200-300 меш, колонка элюируется подвижной фазой хлороформ:метанол:муравьиная кислота (объемное соотношение: 90:10:3-40:10:0.5), желательно хлороформ:метанол:муравьиная кислота (объемное соотношение: 85:15:3). Такое элюирование может быть изократическим элюированием (пропорция элюента неизменна) или градиентным элюированием (пропорция элюента изменяется со временем). При этом градиентное элюирование может регулироваться в соответствии с полярностью собираемого вещества, используя общие знания в этой области, например, полярность элюента может постепенно увеличиваться. Для того, чтобы точно контролировать процесс элюирования, предпочтительно применять ТСХ с растворителем хлороформ:метанол:муравьиная кислота (объемное соотношение: 50:10:2).
Элюенты с аналогичными характеристиками объединяются для получения сальвианоловой кислоты Л.
Для достижения лучшего эффекта разделения, в качестве устройства для разделения можно использовать препаративную жидкостную хроматографию. Например, сальвианоловая кислота Л готовится при следующих условиях разделения:
полупрепаративная жидкостная хроматография Waters Delta prep 4000, колонка: Agilent Zorbax XDB-C18 (21.2×150 мм, 5 мкм), подвижная фаза: ацетонитрил: 0,1% водного раствора муравьиной кислоты (15: 85), скорость потока: 20 мл/мин., длина волны детектирования: 280 нм.
Как показал тест на фармакодинамическое воздействие, способность сальвианоловой кислоты удалять свободные радикалы намного больше, чем у витамина C (см. Таблицу 3, Фиг.9). Более того, сальвианоловая кислота по данному изобретению имеет намного большую восстановительную способность, чем витамин С (см. Фиг.10). Сальвианоловая кислота Л по данному изобретению имеет антиоксидантные свойства и способна захватывать свободные радикалы. Следовательно, сальвианоловая кислота Л по данному изобретению может быть приготовлена в форме медикамента, который обладает функциями захвата свободных радикалов и имеет профилактичиское антиоксидантное действие.
-5
-4
-3
Помимо того, данное изобретение также относится к применению указанной сальвианоловой кислоты Л при приготовлении медикаментов для лечения сердечно-сосудистых заболеваний. К указанным сердечно сосудистым заболеваниям относятся: вазодилатационная дисфункция, вызванная гипоксией; повреждение нервных клеток in vitro, вызванное кислородной недостаточностью, глюкозной недостаточностью и состоянием чрезмерного окисления; и острая ишемия миокарда. Как показал тест на фармакодинамическое воздействие данного изобретения, лиофилизированный порошок сальвианоловой кислоты Л может вызвать некоторый сдвиг вправо вазоконстрикционной кривой норэпинефрина, однако без значительного отличия. Лиофилизированный порошок сальвианоловой кислоты Л значительно повысил вазодилатационный эффект на сосудистое кольцо при гипоксии при концентрации ГКН ((10, 10, 10 моль/л) (P<0.05)). Это иллюстрирует то, что сальвианоловая кислота Л играет значительную роль в облегчении вазодилатационной дисфункции, вызванной гипоксией (см. Таблицы 7-8 и Фиг.11-12).
Сальвианоловая кислота Л по данному изобретению имеет обширное фармакологическое действие на сердечно-сосудистую систему, включая уменьшение повреждения эндотелия сосудов, вызванное ишемией или гипоксией, активацию сосудистой эндотелиальной гиперплазии, облегчение повреждения миокардиальных клеток, вызванного ишемией или гиперплазией, развитие устойчивости к атеросклерозу, подавление агрегации тромбоцитов и противодействие тромбообразованию. Более того, сальвианоловая кислота Л способна расширять коронарную артерию, усиливая коронарный кровоток и предотвращая повреждения, вызванные церебральной ишемией.
Как показал тест на фармакодинамическое воздействие данного изобретения, сальвианоловая кислота по данному изобретению оказывает значительный положительный эффект на поврежденные нервные клетки in vitro, когда такое повреждение вызвано кислородной недостаточностью, глюкозной недостаточностью и перекисью водорода, и способна повышать коэффициент выживаемости клеток, а также имеет функцию защиты нервных клеток от кислородной недостаточности, глюкозной недостаточности и положения чрезмерного окисления (см. Таблицы 12-15). К тому же сальвианоловая кислота Л по данному изобретению способствует лечению острой ишемии миокарда (см. Таблицы 16-17).
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фиг.1 иллюстрирует масс-спектрограмму с высоким разрешением сальвианоловой кислоты Л.
Фиг.2 иллюстрирует масс-спектрограмму с ионизацией электрораспылением сальвианоловой кислоты Л.
1
3
Фиг.3 иллюстрирует Н-ЯМР диаграмму сальвианоловой кислоты Л при 500 МГц, используя CDOD.
13
3
Фиг.4 иллюстрирует С-ЯМР диаграмму сальвианоловой кислоты Л при 125 МГц, используя CDOD.
3
Фиг.5 иллюстрирует диаграмму неискаженного усиления переносом поляризации для сальвианоловой кислоты Л при 125 МГц, используя CDOD.
3
Фиг.6 иллюстрирует диаграмму корреляционной спектроскопии (gCOSY) сальвианоловой кислоты Л при 500 Мгц, используя CDOD.
3
Фиг.7 иллюстрирует диаграмму гетероядерной многополосной корреляции (дНМВС) сальвианоловой кислоты Л при 500 Мгц, используя CDOD.
3
Фиг.8 иллюстрирует диаграмму гетероядерной многоквантовой корреляции (gHMQC) сальвианоловой кислоты Л при 500 Мгц, используя CDOD.
Фиг.9 иллюстрирует способность тестируемого вещества захватывать свободные радикалы.
Фиг.10 иллюстрирует восстановительную способность сальвианоловой кислоты Л по сравнению с витамином C.
Фиг.11 иллюстрирует воздействие лиофилизированного порошка сальвианоловой кислоты Л на сужение сосудов.
Фиг.12 иллюстрирует воздействие лиофилизированного порошка сальвианоловой кислоты Л на расширение сосудов.
Фиг.13 иллюстрирует электрокардиограмму (ЭКГ) после лечения гипофиза питуитрином, где A) - это нормальная ЭКГ контрольной группы, B) - это ЭКГ контрольной группы на 15-й секунде после введения питуитрина, а C) - это ЭКГ контрольной группы на 30-й секунде после введения питуитрина.
ПРИМЕРЫ
Благоприятное воздействие сальвианоловой кислоты Л по данному изобретению, связанное с антиоксидантным действием и захватом свободных радикалов, далее иллюстрируется конкретными экспериментальными данными.
Если не указано иначе, обозначения % и ‰ в рамках данного изобретения означают массовое соотношение.
Пример 1. Приготовление сальвианоловой кислоты Л
Части Дан Шень (Danshen) для декоктирования были помещены в экстрактор. Вода (содержащая 0,45% бикарбоната натрия), объем которой в 4 раза превышал объем лекарственного сырья, была добавлена в экстрактор для декоктирования в течение 2 часов, после чего отфильтрована. Остаток лекарственного вещества продолжали декоктировать в воде, объем которой в 3 раза превышал объем лекарственного остатка, в течение 1 часа и отфильтровали, фильтрат объединили и выпарили для получения экстракта с относительной плотностью 1,2 (80°С). В экстракт добавляли 95% этанол для осаждения до тех пор, пока окончательное содержание этанола не составило 70% (25°С), и оставили отстаиваться на 12 часов или более. Этанол извлекли в условиях пониженного давления для получения экстракта с относительной плотностью 1,37 (60°С).
Полученный выше экстракт развели водой и нанесли на колонку макропористой абсорбирующей смолы АВ-8, и колонку элюировали водой, объем которой в 12 раз превысил объем слоя, после чего получили водный элюент. Уровень рН водного элюента откорректировали при помощи соляной кислоты до уровня РН 3,0. Подкисленный водный элюент опять нанесли на колонку макропористой абсорбирующей смолы АВ-8. Кислый водный раствор с показателем рН 3,0 был использован для промывания колонки до тех пор, пока элюент стал практически бесцветным. Далее 95% этанол объемом, в 4 раза превышающим объем слоя, использовали для элюирования и получения элюента, после чего элюент выпаривали до получения густого экстракта без запаха спирта. Полученный экстракт развели метанолом, добавили хроматографический силикагель с размером частиц в 200-300 меш и перемешали, причем вес добавленного хроматографического силикагеля равнялся весу экстракта. Перемешанный образец нанесли на хорошо наполненную колонку с силикагелем, и колонку элюировали подвижной фазой хлороформ:метанол:муравьиная кислота (в объемном соотношении 85:15:3). ТСХ использовалась для контроля всего процесса элюирования, и элюенты с аналогичными характеристиками были объединены для получения сальвианоловой кислоты Л.
Используя масс-спектрометрию с высоким разрешением (QFT-ESI), был установлен пик квазимолекулярных ионов [М-Н]+м/з 537.1034.
Таблица 1
Данные по <sup>l</sup>H (500М, CD<sub>3</sub>OD) и <sup>13</sup>С-ЯМР (125М, CD<sub>3</sub>OD) относительно сальвианоловой кислоты Л
№
δ<sub>H</sub>
δc
H-H COSY
C-H COSY
1
-
128.0
H-5, H-8
2
-
128.8
H-6, H-7, H-7″
3
-
146.2
H-5
4
-
150.9
H-5, H-6
5
6.88 (1H, d, J=8.5 Гц)
117.8
H-6
6
7.25 (1H, d, J=8.5 Гц)
121.7
H-5
H-7
7
7.59 (1H, d, J=16.0 Гц)
147.4
H-8
H-6
8
6.22 (1H, d, J=16.0 Гц)
117.4
H-7
9
-
170.1
H-7, H-8
1'
-
130.9
H-2′, H-5′, H-8′, H-7′
2′
6.68 (1H, s)
119.2
H-6′, H-7″
3′
-
146.9
H-5′
4′
-
147.8
H-2″, H-5′, H-6′
5′
6.55 (1H, d, J=8.0 Гц)
117.8
6′
6.55 (1H, d, J=8.0 Гц)
123.7
H-2′
7′
3.01 (1H, ddd, J=14.0, 8.0, 4.5 ГЦ)
39.6
H-8′
H-2′
8′
5.09 (1H, dd, J=8.0, 4.5 Гц)
76.4
H-7′
H-7′
9′
-
175.11
H-7′, H-8′
1″
-
129.9
H-2″
2
Спектр НУПП показал, что в молекуле было 1×CH, 12×CH и 14×С.
Пример 2. Приготовление сальвианоловой кислоты Л
Части Дан Шень (Danshen) и Sanqi для декоктирования были помещены в экстрактор. Вода (содержащая 0,45% бикарбоната натрия), объем которой в 6 раз превышал объем лекарственного сырья, была добавлена в экстрактор для декоктирования в течение 3 часов, после чего отфильтрована. Остаток лекарственного вещества продолжали декоктировать в воде, объем которой в 5 раз превышал объем лекарственного остатка, в течение 2 часов и отфильтровали, фильтрат объединили и выпарили для получения экстракта с относительной плотностью 1,25 (80°С). В экстракт добавили 95% этанол для осаждения до тех пор, пока окончательное содержание этанола не составило 68% (25°С), и оставили отстаиваться на 12 часов или более. Этанол извлекли в условиях пониженного давления для получения экстракта с относительной плотностью 1,32 (60°С).
Полученный выше экстракт развели водой и нанесли на колонку макропористой абсорбирующей смолы АВ-8, и колонку элюировали водой, объем которой в 12 раз превысил объем слоя, после чего получили водный элюент. Уровень рН водного элюента откорректировали при помощи соляной кислоты до уровня рН 2,5. Подкисленный водный элюент опять нанесли на колонку макропористой абсорбирующей смолы АВ-8. Кислый водный раствор с показателем рН 3,0 был использован для промывания колонки до тех пор, пока элюент стал практически бесцветным. Далее 95% этанол объемом, в 5 раз превышающим объем слоя, использовали для элюирования и получения элюента, после чего элюент выпаривали до получения густого экстракта без запаха спирта. Полученный экстракт развели метанолом, добавили хроматографический силикагель с размером частиц в 200-300 меш и перемешали, причем вес добавленного хроматографического силикагеля равнялся весу экстракта. Перемешанный образец нанесли на хорошо наполненную колонку с силикагелем, и колонку элюировали подвижной фазой хлороформ:метанол:муравьиная кислота (в объемном соотношении 85:15:3). ТСХ использовали для контроля всего процесса элюирования, и элюенты с аналогичными характеристиками были объединены для получения сальвианоловой кислоты Л.
Используя масс-спектрометрию с высоким разрешением (QFT-ESI), был установлен пик квазимолекулярных ионов [М-Н]+м/з 537.1027.
Таблица 2
Данные по <sup>1</sup>Н (500М, CD<sub>3</sub>OD) и <sup>13</sup>С-ЯМР (125М, CD<sub>3</sub>OD) относительно сальвианоловой кислоты Л
№
δ<sub>Н</sub>
δс
H-H COSY
C-H COSY
1
-
128.0
H-5, H-8
2
-
128.8
H-6, H-7, H-7″
3
-
146.2
H-5
4
-
150.9
H-5, H-6
5
6.88 (1Н, d, J=8.5 Гц)
117.8
H-6
6
7.24 (1Н, d, J=8. 5 Гц)
121.8
H-5
H-7
7
7.58 (1Н, d, J=16.0 Гц)
147.4
H-8
H-6
8
6.20 (1Н, d, J=16.0 Гц)
117.4
H-7
9
-
170.1
H-7, H-8
1′
-
130.9
H-2′, H-5′, H-8′, H-7′
2′
6.68 (1H, s)
119.1
H-6′, H-7′
3′
-
146.9
H-5′
4′
-
147.8
H-2′, H-5′, H-6′
5′
6.54 (1Н, d, J=8.0 Гц)
117.8
6′
6.54 (1H, d, J=8.0 Гц)
123.7
H-2′
7′
2.97 (1H, ddd, J=14.0, 8.0, 4.0 Гц)
39.6
H-8′
H-2′
8′
5.05 (1H, dd, J=8.0, 4.0
76.4
H-7′
H-7′
9′
-
175.2
H-7′, H-8′
1′
-
129.8
H-2″
2′
6.56 (1H, s)
120.1
H-6″, H-7″
3′
-
147.7
H-2″, H-5″
4′
-
150.3
H-6″, H-2″
5′
6.67 (1H, d, J=8.5 Гц)
118.2
6′
6.48 (1H, d, J=8.5 Гц)
126.7
H-2″, H-7″
7′
7.90(1H, s)
146.5
8′
-
125.7
H-7″
9′
-
173.0
H-7″, H-8″
2
Спектр НУПП показал, что в молекуле было 1×СН, 12×CH и 14×С.
Пример 3. Приготовление сальвианоловой кислоты Л
Части Дан Шень (Danshen) для декоктирования были помещены в экстрактор. 85% этанол объемом, в 6 раз превышающим объем лекарственного сырья, добавили в экстрактор и дважды декоктировали, оба раза в течение 2-х часов, после чего отфильтровали. Раствор этанола для извлечения был удален. Остаток лекарственного вещества декоктировали в воде (содержащей 0,45% бикарбоната натрия), объем которой в 4 раза превысил объем лекарственного остатка, в течение 2 часов, и отфильтровали. После этого остаток лекарственного вещества продолжили декоктировать в воде, объем которой в 3 раза превышал объем лекарственного остатка, в течение 1 часа, и отфильтровали. Фильтраты объединили и выпарили для получения экстракта с относительной плотностью 1,2 (80°С). В экстракт добавили 95% этанол для осаждения до тех пор, пока окончательное содержание этанола не составило 70% (25°С), и оставили отстаиваться на 12 часов или более. Этанол извлекли в условиях пониженного давления для получения экстракта с относительной плотностью 1,37 (60°С). Полученный выше экстракт развели водой и нанесли на колонку макропористой абсорбирующей смолы АВ-8, и колонку элюировали водой, объем которой в 12 раз превышает объем слоя, после чего получили водный элюент. Уровень рН водного элюента откорректировали при помощи соляной кислоты до уровня РН 3,0. Подкисленный водный элюент опять нанесли на колонку макропористой абсорбирующей смолы АВ-8. Кислый водный раствор с показателем рН 3,0 был использован для промывания колонки до тех пор, пока элюент не стал практически бесцветным. Далее 95% этанол объемом, в 4 раза превышающим объем слоя, использовали для элюирования и получения элюента, после чего элюент выпаривали до получения густого экстракта без запаха спирта.
Полученный экстракт развели метанолом, добавили хроматографический силикагель с размером частиц в 200-300 меш и перемешали, причем вес добавленного хроматографического силикагеля равнялся весу экстракта. Перемешанный образец поместили на хорошо наполненную колонку с силикагелем, и колонку элюировали подвижной фазой хлороформ:метанол:муравьиная кислота (в объемном соотношении 85:15:3). ТСХ использовали для контроля всего процесса элюирования, и элюенты с аналогичными характеристиками были объединены для получения сальвианоловой кислоты Л.
Пример 4. Приготовление таблеток сальвианоловой кислоты Л
Состав:
сальвианоловая кислота Л
100 г
микрокристаллическая целлюлоза 50 г лактоза
50 г
крахмал
51 г
натрия карбоксиметил крахмал
12 г
безводный этанол ПВП 5%
необходимое количество
стеарат магния
3 г
Вышеуказанный состав предназначен для приготовления 1000 таблеток.
Процесс приготовления
1. Грануляция
Сальвианоловая кислота Л и другие вспомогательные вещества, перечисленные в составе, были просеяны через 100-ячеечное сито. В соответствии с дозировкой, указанной в составе, сальвианоловая кислота Л, микрокристаллическая целлюлоза, крахмал и натрия карбоксиметил крахмал были хорошо перемешаны, используя соответствующий градиентный способ. Необходимое количество безводного этанола ПВП 5% использовали для производства мягких материалов, гранулировали при помощи 14-ячеечного сита и высушивали при температуре 50-60°С в течение 1 часа. Добавили стеарат магния в соответствии с дозировкой, указанной в составе, чтоб просеять гранулы через 14-ячеечное сито.
2. Прессование таблеток
Полученные гранулы для приготовления таблеток прессовали при помощи специального ромбовидного штамповочного устройства.
Пример 5. Приготовление капсул сальвианоловой кислоты Л
Состав:
Сальвианоловая кислота Л
100 г
Крахмал
200 г
Натрия карбоксиметил крахмал
12 г
Безводный этанол ПВП 5%
необходимое количество
Стеарат магния
3 г
Вышеуказанный состав предназначен для приготовления 1000 капсул.
Процесс приготовления:
1. Грануляция
Сальвианоловая кислота Л и другие вспомогательные вещества, перечисленные в составе, были просеяны через 100-ячеечное сито. В соответствии с дозировкой, указанной в составе, сальвианоловая кислота Л, крахмал и натрия карбоксиметил крахмал были хорошо перемешаны, используя эквивалентный ступенчатый способ. Необходимое количество безводного этанола ПВП 5% использовали для производства мягких материалов, гранулировали при помощи 14-ячеечного сита и высушивали при температуре 50-60°С в течение 1 часа. Добавили стеарат магния в соответствии с дозировкой, указанной в составе, чтоб просеять гранулы через 14-ячеечное сито.
2. Капсулирование
Полученные гранулы поместили в капсулы.
Пример 6. Приготовление инъекций сальвианоловой кислоты Л
Состав:
Сальвианоловая кислота
Л 100 г
Маннитол
100 г
Вода для инъекций
до 2500 мл
Вышеуказанный состав предназначен для приготовления 1000 единиц.
Процесс приготовления
Сальвианоловую кислоту растворили в 1000 мл воды для инъекций и перемешали до получения однородного раствора. Маннитол растворили в 500 мл воды для инъекций и добавили в вышеуказанный раствор сальвианоловой кислоты Л, перемешали до получения однородного раствора, в который добавили 0,5 г активированного угля, перемешивая при постоянной температуре в течение 20 минут, и профильтровали. Уровень рН фильтрата откорректировали до показателя 4,5-5,0, развели водой для инъекций до получения 2500 мл, профильтровали в стерильных условиях, расфасовали для получения продукта.
Пример 7. Приготовление лиофилизированного порошка сальвианоловой кислоты Л
Состав:
Сальвианоловая кислота Л
100 г
Маннитол
100 г
Вода для инъекций
2000 мл
Вышеуказанный состав предназначен для приготовления 1000 единиц.
Процесс приготовления
Сальвианоловую кислоту Л и маннитол взвесили и растворили в 1500 мл воды для инъекций, перемешивая, после чего в раствор добавили 0,5 г активированного угля для обесцвечивания путем помешивания в течение 20 минут, раствор профильтровали через фильтровальную пленку с микроотверстиями (0,45 мкм), чтоб удалить уголь, и развели водой для инъекций до объема 2000 мл. Получившийся раствор профильтровали в стерильных условиях, расфасовали и лиофилизировали для получения продукта.
ПРИМЕРЫ ФАРМАКОДИНАМИЧЕСКОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ
Пример фармакодинамического воздействия 1. Функция сальвианоловой кислоты Л, направленная на захват свободных радикалов
Существует мнение, что свободные радикалы являются видом высокоактивных веществ. Они могут успешно вырабатываться во время обменных процессов клеток. Из-за своего прямого или косвенного окисляющего воздействия свободные радикалы в значительной степени принимают участие в физиологических и патологических процессах. Если свободные радикалы содержатся в излишке, они всегда путем окисления атакуют макромолекулы организма, такие как нуклеиновые кислоты, белки, сахариды, жиры и т.д. Из-за денатурирования окислением, перекрестного сшивания и нарушения таких веществ свободные радикалы повреждают клеточную структуру и функцию, что приводит к разрушению ткани и дегенеративным изменениям тела. Как было доказано многими исследованиями, свободные радикалы способствуют развитию патологических процессов многих заболеваний, включая сердечно-сосудистые заболевания, некоторые виды рака, возрастную катаракту и дегенерацию желтого пятна, некоторые виды воспаления и различные типы заболеваний нервных клеток.
Структурный химический анализ показал: соединения сальвианоловой кислоты являются донорами фенольно-гидроксильной группы, имеющими структурную основу для антиоксидантного действия. В таком исследовании использовали модель реакции захвата свободных радикалов с 1.1-дифенил-2-пикрил-гидразилом (ДППГ), чтоб пронаблюдать действие сальвианоловой кислоты Л, направленное на захват свободных радикалов.
1. Реагенты и оборудование
Сальвианоловая кислота Л с чистотой более 95%, предоставленная Академией группы Tasly г.Тяньцзинь, была приготовлена в соответствии с способом, описанным в примере 1.
Витамин C и ДППГ были приобретены у компании "SIGMA Inc.". Спектрофотометр для ультрафиолетового диапазона (UV-1800) был приобретен у компании "Rayleigh Analytical Instrument Co., Ltd." г.Пекин.
2. Экспериментальные способы
Общий объем реакционной смеси составил 2 мл. 1 мл испытуемых растворов с разными концентрациями в 80% метаноле (объем/объем) добавили в 100 мкм метанолового раствора ДППГ, перемешали до однородной массы и позволили раствору реагировать в течение 20 минут при 25°С в темноте. Поглощательная способность реакционного раствора измерялась при 517 нм. В этом исследовании витамин С рассматривался как положительный контроль. Степень захвата свободных радикалов рассчитывалась по следующему уравнению:
образец
контроль
контроль
Уровень захвата свободных радикалов (%)=[1-A/А/А]×100%,
образец
контроль
где A означает поглощательную способность испытуемых образцов, а А означает поглощательную способность просто контроля.
3. Результаты эксперимента
Таблица 3 и Фиг.9 показывают уровни захвата свободных радикалов ДППГ сальвианоловой кислотой Л и витамином С при разных концентрациях. Сальвианоловая кислота Л продемонстрировала намного более высокий уровень захвата свободных радикалов по сравнению с витамином С.
Таблица 3
Сравнение уровня захвата свободных радикалов ДППГ сальвианоловой кислотой Л и витамином С при разных концентрациях
Образец (мкг /мл)
0.314
0.625
1.25
2.5
5
Сальвианоловая кислота Л
5.41±0.74
12.95±2.42
25.21±1.82
44.19±3.70
83.17±4.12
Витамин С
3.42±0.42
7.06±1.88
13.82±1.83
29.39±5.92
55.34±7.21
Пример фармакодинамического воздействия 2. Определение восстановительной способности сальвианоловой кислоты Л
В некоторой степени потенциал профилактического антиоксидантного действия представлен восстановительной способностью лекарства. Было проведено исследование восстановительной способности сальвианоловой кислоты по данному изобретению.
1. Реагенты и оборудование
Сальвианоловая кислота Л с чистотой более 95%, предоставленная Академией группы Tasly г.Тяньцзинь, была приготовлена в соответствии с способом, описанным в примере 1.
Чистый для анализа гексациано-железо-кислый калий был приобретен на Фабрике химических реагентов №1 г.Тяньцзинь. Чистая для анализа трихлоруксусная кислота была приобретена у компании "Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.". Чистый для анализа хлорид железа был приобретен у компании "Fengchuan Chemical Reagent Science and Technology Co., Ltd.", г.Тяньцзинь.
Витамин C был приобретен у компании "SIGMA Inc.". Спектрофотометр для ультрафиолетового диапазона (UV-1800) был приобретен у компании "Rayleigh Analytical Instrument Co., Ltd.", г.Пекин.
Центрифуга с охлаждением (Z323K) была приобретена у компании "HEMMLE", Германия.
2. Способы эксперимента
0,5 мл 200 мМ-го фосфатного буфера (рН 6,8), содержащего разные концентрации сальвианоловой кислоты Л и 1,0% раствора гексациано-железо-кислого калия, всосали и охлаждали на ледяной бане после нагревания на водяной бане (50°С) в течение 20 минут. 0,5 мл раствора трихлоруксусной кислоты (10%) добавили и центрифугировали при 1000 г/мин в течение 10 минут. 1,0 мл полученного надосадочного слоя собрали и добавили в него 1,0 мл дистиллированной воды и 0,2 мл раствора хлорида железа (0,1%), оставили постоять на 10 минут и измерили поглощательную способность при 700 нм. Тем временем провели контрольный опыт. Витамин C - это сильный восстановитель, который в данном исследовании выполняет роль положительного контроля. Восстановительная способность образца определяется путем вычитания показателя поглощательной способности обычного контроля из поглощательной способности испытуемого образца. Таким образом, это говорит о более высокой поглощательной способности и большей восстановительной способности.
3. Результаты эксперимента
Как показано на Фиг.10, оба вещества имели поглощательную способность, зависящую от концентрации, а восстановительная способность сальвианоловой кислоты Л была намного больше такой способности витамина C.
Определение компонентов и приготовление экстракта №1 и экстракта №2, используемых в нижеприведенных примерах фармакодинамического воздействия 3-5.
Все материалы, использованные в эксперименте, были предоставлены Институтом ТСМ Академии группы Tasly г.Тяньцзинь. Содержание экстракта №1 представлено 6,825 г лекарственного сырья, а содержание экстракта №2 представлено 4,162 г лекарственного сырья.
Процесс приготовления
Процесс приготовления экстракта №1
Смесь 89,8% по весу Radix Salviae Miltiorrhizae (Китайское название: Danshen) и 9,6% по весу Radix notoginseng (Китайское название: Sanqi) была дважды извлечена с водой (содержащей 0,45% бикарбоната натрия): в 5 раз больше по объему воды, в течение 2 часов, и в 4 раза больше по объему воды, в течение 1 часа, последовательно. 95% этанол (объем/объем) был добавлен для выпаривания раствора для извлечения водой путем обратного тока. Было проведено осаждение этанолом до тех пор, пока окончательное содержание этанола в растворе для извлечения этанолом не составило 70%. После отстаивания на протяжении одной ночи собрали надосадочный слой и выпаривали для получения экстракта №1.
Процесс приготовления экстракта №2
Смесь 89,8% по весу Radix Salviae Miltiorrhizae (Китайское название: Danshen) и 9,6% по весу Radix notoginseng (Китайское название: Sanqi) была дважды извлечена с водой: в 5 раз больше воды в течение 2 часов, и в 4 раза больше воды в течение 1 часа, последовательно. 95% этанол (объем/объем) использовали для выпаривания раствора для извлечения водой путем обратного тока. Было проведено осаждение этанолом до тех пор, пока окончательное содержание этанола в растворе для извлечения этанолом не составило 70%. После отстаивания на протяжении одной ночи собрали надосадочный слой и выпаривали для получения экстракта №2.
Сальвианоловую кислоту приготовили при помощи способа, описанного в примере 1 данного изобретения.
Способ определения
Аналитические условия были следующими: хроматографическая колонка Waters 2695 HPLC, Agilent Zorbax SB-C18 (4.6 мм×250 мм, 5 мкм), 0,02% раствор фосфорной кислоты использовали в качестве подвижной фазы A и 80% (объем/объем) раствор ацетонитрила, содержащий 0,02% фосфорной кислоты, использовался в качестве подвижной фазы В, градиентное элюирование провели согласно нижеследующей Таблице 4, скорость потока составила 1 мл/мин, длина волны детектирования: 280 нм, температура колонки: 30°С, и время записи составило 50 минут.
Таблица 4
Линейное градиентное элюирование с подвижными фазами
Время (мин)
Подвижная фаза A
Подвижная фаза B
0
90
10
8
78
22
15
74
26
35
61
39
40
90
10
50
90
10
Содержание каждого компонента в экстрактах №1 и №2 представлено в нижеследующих таблицах 5 и 6.
Таблица 5
Содержание каждого компонента в экстракте №1
Компонент
Содержание (%)
Примечания
Протокатеховый альдегид
0.33
Наивысший пик
Danshensu
0.30
Сальвианоловая кислота A
0.17
Сальвианоловая кислота В
0.30-0.76
Сальвианоловая кислота Л
0.43-0.49
Таблица 6
Содержание каждого компонента в экстракте №1
Компонент
Содержание (%)
Примечания
Протокатеховый альдегид
0.14
Danshensu
0.10
Сальвианоловая кислота А
0.12
Сальвианоловая кислота В
3.5
Сальвианоловая кислота Л
0
Пример фармакодинамического воздействия 3. Действие лиофилизированного порошка сальвианоловой кислоты Л на изолированную грудную аорту крыс
Материалы для проведения эксперимента
1. Материалы и реагенты для проведения испытания: лиофилизированный порошок сальвианоловой кислоты Л был предоставлен Институтом ТСМ Академии группы Tasly г.Тяньцзинь. Норэпинефрина цитрат (НА) и ацетилхолин (АЦХ) были приобретены у компании "Sigma Inc.", номер партии 1377511 44908131. Сырьевые материалы для приготовления раствора Кребса включают: хлорид калия, хлорид натрия, первичный кислый фосфат калия, бикарбонат натрия, сульфат магния, глюкозу и хлорид кальция.
2. Основное оборудование: ванна для изолированных тканей MedLab и система сбора данных Medlab-U/8C произведены компанией "Medease Science and Technology Co., Ltd." г.Нанкин. Другие приспособления включают датчик напряжения, супертермостатическую баню с цифровым управлением SC-15, аналитические весы, водоочиститель и кислородный цилиндр.
3. Подопытные животные: крысы Спрага-Доули мужского и женского пола с подходящей массой тела, предоставленные компанией "Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd." г.Пекин, сертификат №SCXK (Jing) 2007-0001. Все крысы получали специальный рацион для крыс (произведенной компанией "Keaoxieli Diet Co., Ltd." г.Пекин) и воду из под крана в камере для кормления животных при температуре 20-25°С с поддержанием освещения в течение 12 часов.
Способы эксперимента
1. Определение дозы введения
Доза лиофилизированного порошка сальвианоловой кислоты Л была установлена на основе фармакодинамических испытаний сальвианоловых кислот. В каждом исследовании доза составляла 0,1 мг/мл.
3
2
4
4
2
6
12
6
Раствор Кребса (моль/л): NaCl (120), NaHCO (25), KHPO (1.2), MgSO (1.2), KCl (4.5), CaCl (1.25), CHO (глюкоза 11.1)
KCl: 100 мкл раствора KСl (3 моль/л) добавляли каждый раз (окончательная концентрация составила 60 ммоль/л).
-4
NA: 10 моль/л (окончательная концентрация 10-6 моль/л), разведение всего с 4 градиентами.
-3
АСН: 10 моль/л (конечная концентрация 10-5 моль/л), разведение всего с 4 градиентами.
2. Разделение по группам
Крысы получали свободный рацион и были произвольно разделены по группам в соответствии с лекарственным препаратом, получаемым в день. В каждой группе было по 8 крыс, и было обнаружено 4 сосудистых кольцах у каждой крысы. В этом исследовании крысы были разделены на 3 группы: нормальная группа, экспериментальная группа с гипоксией и сальвианоловой кислотой Л+экспериментальная группа с гипоксией.
3. Способы эксперимента
-7
-6
-5
-4
-5
-4
-3
-2
Крысы получали свободный рацион и были произвольно разделены по группам в соответствии с лекарственным препаратом, получаемым в день, и в каждой группе было по 8 крыс. Всем крысам вывихнули шейный позвонок и сразу вскрыли грудную клетку, чтоб извлечь грудную аорту. При температуре 0°С грудную аорту поместили в раствор Кребса с кислородной продувкой, где была удалена соединительная ткань, и грудная аорта была преобразована в сосудистое кольцо с диаметром около 2 мм, и сосудистое кольцо было аккуратно помещено в изолированную ванну с постоянной температурой 37°C. В ванну задували кислород, и к ней был присоединен датчик напряжения и многоканальный регистратор физиологических состояний. Базальное напряжение составило 2 г, сосудистое кольцо отстаивали в течение 45 мин - 1 часа, а раствор Кребса заменяли с интервалом 15 минут. После отстаивания сосудистое кольцо было обработано раствором хлорида калия в течение 2 0 мин и элюировано. После 15 минут отстаивания сосудистое кольцо было опять обработано раствором хлорида калия, чтоб достичь физиологически предельного показателя сужения сосудов. Далее добавили НА в условиях разных градиентных уровней (10, 10, 10, 10 моль/л), чтоб пронаблюдать сужение сосудов. После достижения наивысшего значения показатель был закреплен на фазе плато. Далее добавили АЦХ в условиях различных градиентных уровней (10, 10, 10, 10 моль/л), чтоб пронаблюдать расширение сосудов. Во время добавления НА и АЦХ раствор Кребса нельзя менять.
В экспериментальной группе с гипоксией подачу кислорода приостановили на 20 мин после двойной предыдущей обработки раствором хлорида калия. Тем временем лиофилизированный порошок сальвианоловой кислоты Л или раствор Кребса в одинаковом количестве добавили в баню, после чего добавили НА и АЦХ в условиях разных градиентных уровней. Раствор Кребса нельзя заменять от момента начала гипоксии до момента последнего добавления окончательной концентрации АЦХ.
Результаты были статистичски проанализированы при помощи критерия Стъюдента.
Результаты испытания
1. Влияние на сужение сосудов
Как показали результаты, хотя лиофилизированный порошок сальвианоловой кислоты Л не имел значительного воздействия на сужение сосудов, по сравнению с нормальной группой в условиях данного испытания, наблюдался очевидный сдвиг вправо кривой сосудистого напряжения. Данные приведены в Таблице 7.
Воздействие лиофилизированного порошка сальвианоловой кислоты Л на сужение сосудов показано на фиг.11.
2. Влияние на расширение сосудов
Как показали результаты, по сравнению с нормальной группой расширение сосудов было значительно слабее (Р<0.01) при 4 градиентных уровнях АЦХ в экспериментальной группе с гипоксией в условиях данного испытания, притом что не наблюдалось значительного различия между группой с сальвианоловой кислотой и нормальной группой. По сравнению с экспериментальной группой с гипоксией расширение сосудов было значительно сильнее (Р<0.05) при 3 градиентных уровнях АЦХ в группе с сальвианоловой кислотой Л. Это говорит о том, что в группе с сальвианоловой кислотой Л могла в значительной степени уменьшиться дисфункция расширения сосудов, связанная с гипоксией. Данные приведены в Таблице 8.
Влияние лиофилизированного порошка сальвианоловой кислоты Л показано на фиг.12.
Выводы по эксперименту:
-5
-4
-3
Лиофилизированный порошок сальвианоловой кислоты Л в какой-то степени способствовал сдвигу вправо вазоконстрикционной кривой НА, однако существенного отличия не наблюдалось. Гипоксия в течение 20 минут может привести к существенному снижению градиентного расширения сосудистого кольца, вызванного АЦХ, в экспериментальной группе (Р<0.01), что приводит к возникновению диастолической дисфункции. И наоборот, лиофилизированный порошок сальвианоловой кислоты Л существенно усилил расширение аноксического сосудистого кольца при трех градиентных уровнях АЦХ (10, 10, 10 моль/л) (Р<0.05). Было подтверждено, что сальвианоловая кислота Л имеет значительное положительное воздействие на дисфункцию расширения сосудов, вызванную гипоксией. На что следует обратить внимание:
1. При приготовлении раствора Кребса хлорид кальция и глюкозу не добавляли до полного введения других веществ, чтоб предотвратить помутнение. Раствор Кребса нельзя долго хранить при комнатной температуре во избежание образования хлопьевидного осадка. Окончательно раствор Кребса был приготовлен в необходимое время.
2. Аорта сердца была максимально извлечена в ледяную ванну; и необходимо сократить повреждения, причиненные оборудованием; аорта сердца должна быть извлечена достаточно близко к сосудистой арке с целью предотвращения снижения сосудистой активности.
3. Кислород был откачен в форме небольшого пузырька, который должен быть как можно меньше; слишком крупные пузырьки могут повлиять на датчик напряжения, приводя к искажению данных.
Пример фармакодинамического воздействия 4. Защитное действие лиофилизированного порошка сальвианоловой кислоты Л и ее экстракта на нервные клетки in vitro
Материалы для проведения эксперимента
2
1. Основное оборудование: максимально чистое рабочее место было предоставлено компанией «Antai Cleaning Equipment Inc."; инкубатор CО с постоянной температурой от Heraeus, Германия; ИФА-ридер, приобретенный у компании " BIO-RAD Inc.", США; плоский вибростенд, приобретенный у производителя экспериментального оборудования "Jiangsu Guangming", и инвертированный биологический микроскоп, приобретенный у компании " OLYMPUS", Япония.
2. Основные реагенты: модифицированная по способу Дульбекко среда Игла с высоким содержанием глюкозы и модифицированная по способу Дульбекко среда Игла без содержания глюкозы, приготовленные компанией «GIBCO"; трипсин был приобретен у компании "SIGMA"; фетальная бычья сыворотка была приобретена у "РАА"; МТТ и ДМСО были приобретены у "SIGMA", а набор для тестирования на ЛДГ был приобретен в Институте биоинженерии Цзянчен г.Нанкин.
3. Одноразовые материалы: 96-луночные культуральные микропланшеты были приготовлены "CORNING".
4. Клеточный штамм: РС12. Способы эксперимента:
1. МТТ-способ
а) МТТ добавили в 96-луночный культуральный микропланшет с 20 мкл в каждой лунке и на 4 часа оставили для проведения реакции в инкубаторе;
б) сняли надосадочный слой, после чего добавили 150 мкл ДМСО в каждую лунку и встряхивали на плоском вибростенде в течение 10 мин;
в) поглощательная способность каждой лунки была измерена при помощи ИФА-ридера при длине волны 570 нм, чтоб измерить коэффициент выживаемости клетки.
Коэффициент выживаемости клетки %=(показатель за один день для группы, которой вводился медикамент / показатель за один день для отрицательной контрольной группы) Х100%.
2. Определение активности ЛДГ
Испытание по определению проводилось в соответствии с указаниями набора для тестирования на ЛДГ, предоставленного Институтом биоинженернии Цзянчен г.Нанкин. Подробное пошаговое описание представлено в Таблице 9.
Таблица 9
Подробное пошаговое описание процесса определения активности ЛДГ
пустышка (В)
Стандартный раствор (S)
Испытуемый образец (U)
Контрольный образец (С)
Вода высшей степени очистки (мкл)
2.5+5
2.5
2.5
Стандартный раствор (мкл)
5
Образец (мкл)
5
5
Матричная жидкость (мкл)
12.5
12.5
12.5
12.5
Кофермент (мкл)
2.5
Хорошо смешали, инкубировали при температуре 37°C в течение 15 минут
2,4-динитрофенилгидразин
12.5
12.5
12.5
12.5
Хорошо смешали, инкубировали при температуре 37°C в течение 15 минут
0.4 мМ NaOH
125
125
125
125
Инкубировали при комнатной температуре в течение 3-4 минут с поглощательной способностью в 440 нм
U
C
S
B
S
Активность ЛДГ (ед./л)=(ОД-ОД)/(ОД-ОД)×C×N×1000,
U
C
В
S
S
где ОД представляет поглощательную способность испытуемого образца, ОД представляет поглощательную способность контрольного образца, ОД представляет поглощательную способность пустышки, OД представляет поглощательную способность стандартного раствора, C представляет стандартную концентрацию в 2 ммоль/л, N представляет кратное число разведения образца перед определением.
Результаты эксперимента:
1. Создание модели повреждения перекисью водорода
4
4
а) Клетки РС12 на экспоненциальной фазе роста в хорошем состоянии дважды были промыты фосфатно-солевым буферным раствором, после чего добавили 0,25% дигестивный раствор трипсина, чтоб провести усвоение при температуре 37°С в течение примерно 1 минуты. Эта реакция была завершена при помощи добавления культуральной среды с содержанием сыворотки крови; после чего центрифугировали и ресуспендировали и определили количество клеток, чтоб приготовить суспензию с плотностью клеток 2×10-4×10 клеток/мл.
2
б) Полученная клеточная суспензия была засеяна в 96-луночный микропланшет с 180 мкл в каждой лунке (n=3) и инкубирована при постоянной температуре инкубатора CO при 37°С в течение 24 часов.
2
2
в) Разделение по группам и обработка: было образовано 4 группы: пустая контрольная группа (Фосфатно-соляной буферный раствор), контрольная группа с растворителем (ДМСО), экспериментальная группа (HO) и положительная контрольная группа (Эдаравон).
2
2
Пустая контрольная группа: только добавление ФСБР. Контрольная группа с растворителем: добавление 0,1% ДМСО. Экспериментальная группа: концентрация перекиси водорода (НО) находилась приблизительно на уровне 0,25 мМ, 0,5 мМ и 1 мМ, время реакции - 1 час.
Положительная контрольная группа: Эдаравон (2 мкг/мл) добавляется как положительный медикамент и оставляется на 6 часов, добавляется 0,5 мМ перекиси водорода для повреждения на 1 час и заменяется только что приготовленной культуральной средой Игла в модификации Дульбекко+10%ФБС, 200 мкл на лунку.
г) Активность клетки была определена по МТТ-способу.
Таблица 10
Создание модели повреждения перекисью водорода
Группа
Конечнаяконцентрация
Коэффициентвыживаемости (%)
Пустая контрольная группа
0
100±5.65
Контрольная группа с растворителем
0.1% ДМСО
93.45±5.21
Экспериментальная группа
0.2 5 мМ H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>
84.83±7.65
0.5 мМ H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>
40.31±4.63##
1 мМ H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>
34.36+±6.15##
Положительная контрольная группа
2 мкг/мл (Эдаравон)
53.54±3.66*
*: по сравнению с экспериментальной группой с 0.5 мМ H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> (Р<0.05), ##: по сравнению с контрольной группой с растворителем (Р<0.01).
2
2
2
2
Как показано в Таблице 10, коэффициент выживаемости клеток РС12 составил 40%, а коэффициент угнетения 60% после обработки 0.5 мМ НО в течение 1 часа. Модель повреждения перекисью водорода была представлена клетками РС12, обработанными 0.5 мМ HO в течение 1 часа.
2. Создание модели недостаточности кислорода-глюкозы (НКГ)
4
4
а) Клетки РС12 на экспоненциальной фазе роста в хорошем состоянии были дважды промыты фосфатно-солевым буферным раствором, после чего добавили 0,25% дигестивного раствора трипсина для проведения усвоения при 37°С в течение примерно 1 мин. Эта реакция была прекращена при помощи добавления культуральной среды с содержанием сыворотки крови; после чего центрифугировали и ресуспендировали и определили количество клеток, чтоб приготовить суспензию с плотностью клеток 2×10-4×10 клеток/мл.
2
б) Полученная клеточная суспензия была засеяна в 96-луночный микропланшет с 180 мкл в каждой лунке (n=3) и инкубирована при постоянной температуре инкубатора CO при 37°С в течение 24 часов.
в) Разделение по группам и обработка: было образовано 3 группы: пустая контрольная группа (нормоксия+0.1% ДМСО), экспериментальная группа (НКГ+0.1% ДМСО, кислородно-глюкозная недостаточность) и положительная контрольная группа (Эдаравон).
2
Экспериментальная группа: клетка в культуральном микропланшете культивировалась с модифицированной по способу Дульбекко средой Игла, не содержащей глюкозы, которая была помещена в гипоксическую камеру; начали отмерять 0,5 часа, когда О% был меньше чем 2,6, и далее переместили в обычный инкубатор. Определение провели после периода инкубации.
2
Положительная контрольная группа: Эдаравон (мкг/мл) использовали как положительный медикамент. Медикамент добавили и выдерживали в течение 6 часов, и далее заменили средой, не содержащей глюкозу, 180 мкл на лунку. Медикамент добавили еще раз, поместили в гипоксическую камеру, начали отмерять 0,5 часа, когда О% был меньше чем 2,6, и далее переместили в обычный инкубатор. Определение провели после периода инкубации.
г) Активность клетки была определена по МТТ-способу.
Таблица 11
Создание модели кислородно-глюкозной недостаточности
Группа
Конечная концентрация
Коэффициент выживаемости(%)
Пустая контрольная группа
0.1% ДМСО
100+6.66
Экспериментальная группа
0.1% ДМСО
42.59+3.06##
Положительная контрольная группа
2 мкг/мл (Эдаравон)
48.50+1.81*
*: Р<0.05, по сравнению с экспериментальной группой;
##: Р<0.01, по сравнению с пустой контрольной группой.
2
Как показано в Таблице 11, коэффициент выживаемости клеток РС12, поврежденных вследствие кислородно-глюкозной недостаточности, составил всего 42%, а коэффициент угнетения - 58%. Таким образом, модель кислородно-глюкозной недостаточности в данном исследовании такова: модифицированная по способу Дульбекко среда Игла, не содержащая глюкозы, была выбрана для культивирования клеток, помещена в гипоксическую камеру, начали отмерять 0,5 часа, когда О% был меньше чем 2,6, и далее переместили в обычный инкубатор. Определение провели после периода инкубации.
2
2
3. Действие медикамента на клеточный коэффициент выживаемости клетки РС12, поврежденной HO.
4
4
а) Клетки РС12 на экспоненциальной фазе роста в хорошем состоянии были дважды промыты фосфатно-солевым буферным раствором, после чего добавили 0,25% дигестивного раствора трипсина для проведения усвоения при 37°С в течение примерно 1 мин. Эта реакция была прекращена при помощи добавления культуральной среды с содержанием сыворотки крови; после чего центрифугировали и ресуспендировали и определили количество клеток, чтоб приготовить суспензию с плотностью клеток 2×10-4×10 клеток/мл.
2
б) Полученная клеточная суспензия была засеяна в 96-луночный микропланшет с 180 мкл в каждой лунке (n=3) и инкубирована при постоянной температуре инкубатора CO при 37°С в течение 24 часов.
2
2
в) Разделение по группам и обработка: было образовано 5 групп: пустая контрольная группа (ФСБР), контрольная группа с растворителем (ДМСО или этилацетат), экспериментальная группа (HO), положительная контрольная группа (Эдаравон) и группа, получающая медикамент.
2
2
Экспериментальная группа: 0.5 мМ перекиси водорода (HO) использовали для обработки в течение 1 часа.
Положительная контрольная группа: Эдаравон (2 мкг/мл), используемый в качестве положительного медикамента, добавили к клетке и оставили на 6 часов, после чего добавили 0.5 мМ перекиси водорода для повреждения на 1 час и заменили на только что приготовленную культуральную среду Игла в модификации Дульбекко+10%ФБС.
2
2
Группа, получающая медикамент: после того, как клетка была засеяна в культуральный микропланшет, разные испытуемые медикаменты с разной концентрацией добавляли и оставляли на 6 часов (20 мкл на лунку), после чего добавляли 0.5 мМ HO для повреждения в течение 1 часа и далее заменяли на только что приготовленную культуральную среду Игла в модификации Дульбекко+10%ФБС.
г) Надосадочный слой собрали (20 мкл на лунку) для определения активности ЛДГ.
д) Активность клетки в микропланшете была определена по МТТ-способу.
Таблица 12
Действие медикамента на клеточный коэффициент выживаемости клетки РС12, поврежденной H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>.
Группа
Конечная концентрация
Коэффициент выживаемости (%)
Контрольная группа с растворителем (ДМСО)
0.1% ДМСО
100±0.66
0.01% ДМСО
100±0.48
0.001% ДМСО
100±0.4
Контрольная группа с растворителем (этилацетат)
0.1% этилацетат
100±0.86
0.01% этилацетат
100±1.38
0.001% этилацетат
100±0.96
Экспериментальнаягруппа (0.5 мМ H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>+ДМСО)
0.5 мМ H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>+0.1% ДМСО
47.32±1.15##
0.5 мМ H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>+0.01% ДМСО
43.65±3.0##
0.5 мМ H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>+0.001% ДМСО
40.67±3.61##
Экспериментальная группа (0.5 мМ H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>+этилацетат)
0.5 мМ H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>+0.1% этилацетат
38.45±2.15##
0.5 мМ H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>+0.01% этилацетат
39.28±1.75##
0.5 мМ H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>+0.001% этилацетат
39.65±1.84##
Положительная контрольная группа (Эндаравон)
2 мкг/мл
58.18±2.64**
0.2 мкг/мл
44.2±6.11
0.02 мкг/мл
47.6±2*
Группа, получающая медикамент (экстракт №1 сальвианоловой кислоты Л)
2 мкг/мл
50.65±5.65
0.2 мкг/мл
44.75±4.56
0.02 мкг/мл
43.2±1.6
Группа, получающая медикамент (экстракт №2 сальвианоловой кислоты Л)
2 мкг/мл
40.09±2.39
0.2 мкг/мл
43.23±5.72
0.02 мкг/мл
44.67±6.42
Группа, получающая медикаментжелтоватый порошок: сальвианоловая кислота Л)
2 мкг/мл
48.34±0.25
0.2 мкг/мл
44.89±0.48
0.02 мкг/мл
47.2±0.8*
*: Р<0.05, по сравнению с экспериментальной группой (0.5 мМ Н<sub>2</sub>О<sub>2</sub>+ДМСО);
**: Р<0.01, по сравнению с экспериментальной группой (0.5 мМ Н<sub>2</sub>О<sub>2</sub>+ДМСО);
##: Р<0.01, по сравнению с контрольной группой с растворителем (ДМСО).
2
2
2
2
Концентрация медикамента была соответственно приготовлена с 0,1%, 0,01% и 0,001% ДМСО, что нужно сравнить с контрольной группой с растворителем, имеющей соответствующую концентрацию. При этом группу, получающую медикамент, сравнили с экспериментальной группой (0.5 мМ HO+этилацетат), а экспериментальную группу (HO+этилацетат) сравнили с контрольной группой с растворителем (этилацетат).
Таблица 13
Воздействие медикамента на активность ЛДГ клеток РС12, поврежденных H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>
Группа
Конечная концентрация
активность ЛДГ (ед./л)
Контрольная группа с растворителем (ДМСО)
0.1% ДМСО
325.71±11.42
0.01% ДМСО
348.5±16.33
0.001% ДМСО
374.16±3.81
Контрольная группа с растворителем (этилацетат)
0.1% этилацетат
313.9±16.33
0.01% этилацетат
329.97±16.34
0.001% этилацетат
342.29±30.13
Экспериментальнаягруппа (0.5 мМ H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>+ДМСО)
0.5 мМ H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>+0.1% ДМСО
608.5±16.33#*
0.5 мМ H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>+0.01% ДМСО
599.55±0##
0.5 мМ H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>+0.001% ДМСО
617.45±16.33##
Экспериментальная группа (0.5 мМ H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>+этилацетат)
0.5 мМ H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>+0.1% этилацетат
596.95±33.08##
0.5 мМ H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>+0.01% этилацетат
590.74±31.43##
0.5 мМ Н<sub>2</sub>О<sub>2</sub>+0.001% этилацетат
610.81±11.55##
Положительная контрольная группа (Эдаравон)
2 мкг/мл
523.49±5.17**
0.2 мкг/мл
568.23±11.55**
0.02 мкг/мл
532.44±11.55**
Группа, получающая медикамент (экстракт №1 сальвианоловой кислоты Л)
2 мкг/мл
465.32±32.68*
0.2 мкг/мл
416.11±63.91**
0.02 мкг/мл
483.22±21.92**
Группа, получающая медикамент (экстракт №2 сальвианоловой кислоты Л)
2 мкг/мл
487.70±11.55**
0.2 мкг/мл
407.16±34.66**
0.02 мкг/мл
559.28±27.82
Группа, получающая медикамент (желтоватый порошок: сальвианоловая кислота Л)
2 мкг/мл
487.70±72.51
0.2 мкг/мл
474.27±71.96*
0.02 мкг/мл
550.336±25.83
*: Р<0.05, по сравнению с экспериментальной группой (0.5 мМ H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>+ДМСО);
**: Р<0.01, по сравнению с экспериментальной группой (0.5 мМ H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>+ДМСО);
##: Р<0.01, по сравнению с контрольной группой с растворителем (ДМСО).
2
2
2
2
При этом группу, получающую медикамент, сравнили с экспериментальной группой (0.5 мМ HO+этилацетат), а экспериментальную группу (HO+этилацетат) сравнили с контрольной группой с растворителем (этилацетат).
4. Воздействие медикамента на коэффициент выживаемости клеток РС12 с недостаточностью кислорода-глюкозы
4
4
а) Клетки РС12 на экспоненциальной фазе роста в хорошем состоянии дважды промыли ФСБР, после чего добавили 0,25% дигестивного раствора трипсина для проведения усвоения при 37°С в течение примерно 1 мин. Эта реакция была прекращена при помощи добавления культуральной среды с содержанием сыворотки крови; после чего центрифугировали и ресуспендировали и определили количество клеток, чтоб приготовить суспензию с плотностью клеток 2×10-4×10 клеток/мл.
2
б) Полученная клеточная суспензия была засеяна в 96-луночный микропланшет с 180 мкл в каждой лунке (n=3) и инкубирована при постоянной температуре инкубатора CO при 37°С в течение 24 часов.
в) Разделение по группам и обработка: было образовано 4 группы: пустая контрольная группа (нормоксия+0.1%ДМСО), экспериментальная группа (НКГ+ДМСО, кислородно-глюкозная недостаточность), положительная контрольная группа (Эдаравон) и группа, получающая медикамент.
2
Экспериментальная группа: культуральная среда для клеток в микропланшете была заменена на модифицированную по способу Дульбекко среду Игла без содержания глюкозы, поместили в гипоксическую камеру и начали отмерять 0,5 часа, когда О% стал ниже 2,6 и потом переместили в обычный инкубатор для культивирования на протяжении одной ночи.
2
Положительная контрольная группа: Эдаравон (2 мкг/мл) использовали в качестве положительного медикамента. Медикамент добавили и оставили на 6 часов, после чего культуральную среду заменили на модифицированную по способу Дульбекко среду Игла (180 мкл на лунку). Медикамент добавили еще раз, поместили в гипоксическую камеру, начали отмерять 0,5 часа, когда О% был меньше 2,6 и потом переместили в обычный инкубатор для культивирования на протяжении одной ночи.
2
Группа, получающая медикамент: медикамент с разными концентрациями добавляли и оставляли на 6 часов, культуральную среду заменили на модифицированную по способу Дульбекко среду Игла (180 мкл на лунку). Медикамент добавили еще раз, поместили в гипоксическую камеру, начали отмерять 0,5 часа, когда О% был меньше 2,6 и потом переместили в обычный инкубатор для культивирования на протяжении одной ночи.
г) Полученный надосадочный слой собрали на следующий день в размере 20 мкл на лунку и использовали далее для определения активности ЛДГ.
д) Активность клетки была определена по МТТ-способу.
Таблица 14
Воздействие медикамента на коэффициент выживаемости клетки РС12 с кислородно-глюкозной недостаточностью
Группа
Конечная
Коэффициент
концентрация
выживаемости (%)
Пустая контрольная группа (Нормоксия+ДМСО)
0.1% ДМСО
100±0.27
0.01% ДМСО
100±0.68
0.001% ДМСО
100±0.77
Пустая контрольная группа (Нормоксия+этилацетат)
0.1% этилацетат
100±1.07
0. 01% этилацетат
100±0.45
0.001% этилацетат
100±1.02
Экспериментальная группа (НКГ+этилацетат)
0.1% этилацетат
29.19±1.65##
0.01% этилацетат
30.15±1.47##
0.001% этилацетат
31.26±2.08##
Экспериментальная группа (НКГ+ДМСО)
0.1% ДМСО
26.65±1.17###
0.01% ДМСО
31.75±0.77##
0.001% ДМСО
38.54±1.75##
Положительная контрольная группа (НКГ+Эдаравон)
2 мкг/мл
39.99±0.55**
0.2 мкг/мл
36.37±2.52*
0.02 мкг/мл
44.75±1.02**
Лечебная группа (Экстракт №1сальвианоловой кислоты Л)
2 мкг/мл
42.35±1.75**
0.2 мкг/мл
40.1310.34**
0.02 мкг/мл
34.33±0.9
Лечебная группа (Экстракт №2 сальвианоловой кислоты Л)
2 мкг/мл
40.58±2.79*
0.2 мкг/мл
46.6±2.42**
0.02 мкг/мл
46.83±1.5**
Лечебная группа (желтоватый порошок: сальвианоловая кислота Л)
2 мкг/мл
35.96±1.44
0.2 мкг/мл
36.68±2.72*
0.02 мкг/мл
47.74±1.72**
*: Р<0.05, по сравнению с экспериментальной группой (НКГ+ДМСО); **: Р<0.01, по сравнению с экспериментальной группой (НКГ+ДМСО); ##: Р<0.01, по сравнению с пустой контрольной группой (Нормоксия+ДМСО).
При этом группу, получающую медикамент, сравнили с пустой контрольной группой (НКГ+этилацетат), а экспериментальную группу (НКГ+этилацетат) сравнили с пустой контрольной группой (Нормоксия+ДМСО).
е) Активность ЛДГ
Таблица 15
Воздействие медикамента на активность ЛДГ клеток РС12 с кислородно-глюкозной недостаточностью (НКГ)
Группа
Конечная концентрация
Активность ЛДГ (ед./л)
Пустая контрольная группа (Нормоксия+ДМСО)
0.1% ДМСО
21.08±5.17
0.01% ДМСО
24.01±7.31
0.001% ДМСО
22.01±11.55
Пустая контрольная группа (Нормоксия+этилаце тат)
0.1% этилацетат
23.96±10.33
0.01% этилацетат
20.78±5.17
0.001% этилацетат
22.37±7.31
Экспериментальная группа (НКГ+этилацетат)
0.1% этилацетат
46.35±11.55##
0.01% этилацетат
42.39±5.17##
0.001% этилацетат
58.92±10.33**
Экспериментальная группа(НКГ+ДМСО)
0.1% ДМСО
49.22±5.17##
0.01% ДМСО
40.27±5.17##
0.001% ДМСО
62. 64±14.61##
Положительная контрольная группа (НКГ+Эдаравон)
2 мкг/мл
31.32±5.17**
0.2 мкг/мл
22.37±5.17**
0.02 мкг/мл
40.27±5.17*
Группа, получающая медикамент (экстракт №1 сальвианоловой кислоты Л)
2 мкг/мл
31.32±5.17**
0.2 мкг/мл
44.74±10.33
0.02 мкг/мл
80.54±30.13
Группа, получающая медикамент (экстракт №2 сальвианоловой кислоты Л)
2 мкг/мл
102.91±25.83
0.2 мкг/мл
31.32±5.17*
0.02 мкг/мл
67.11±5.17
Группа, получающая медикамент (желтоватый порошок: сальвианоловая кислота Л)
2 мкг/мл
40.27±5.17*
0.2 мкг/мл
31.32±11.55
0.02 мкг/мл
53.69±29.23
*: Р<0.05, по сравнению с экспериментальной группой (НКГ+ДМСО);**: Р<0.01, по сравнению с экспериментальной группой (НКГ+ДМСО);##: Р<0.01, по сравнению с пустой контрольной группой (Нормоксия+ДМСО).
При этом, группу, получающую медикамент, сравнили с пустой контрольной группой (НКГ+этилацетат), а экспериментальную группу (НКГ+этилацетат) сравнили с пустой контрольной группой (Нормоксия+этилацетат).
Выводы:
2
2
Результаты эксперимента: при обработке лиофилизированным порошком сальвианоловой кислоты Л при дозировке 0,02 мкг/мл коэффициент клеточного выживания клеток РС12, поврежденных HO, составил 47% (P<0.05); а при дозировке 0,2 мкг/мл активность ЛДГ составила 474 (P<0.05). Что касается экстракта №1 сальвианоловой кислоты Л при дозировке 0,02, 0,2 и 2 мкг/мл, активность ЛДГ составила 483(Р<0.01), 416 (Р<0.01) и 465 (Р<0.05), соответственно; а для экстракта №2 сальвианоловой кислоты Л при дозировке 0,2 и 2 мкг/мл активность ЛДГ составила (P<0.01) и 488 (P<0.01), соответственно, по сравнению с экспериментальной группой, у них обоих наблюдался эффект снижения активности ЛДГ.
2
2
При обработке лиофилизированным порошком сальвианоловой кислоты Л при дозировке 0,02 и 0,2 мкг/мл уровень выживаемости клеток с НКГ составил 48% (Р<0.01) и 37% (Р<0.05), соответственно. Что касается экстракта №1 сальвианоловой кислоты Л при дозировке 0,2 и 2 мкг/л, уровень выживаемости составил 40% (Р<0.01) и 42% (Р<0.01), соответственно; а для экстракта №2 сальвианоловой кислоты Л при дозировке 0,02, 0,2 и 2 мкг/мл уровень выживаемости составил 47% (Р<0.01), 47% (Р<0.01) и 41% (Р<0.05), соответственно. При обработке лиофилизированным порошком сальвианоловой кислоты Л при дозировке 2 мкг/мл активность ЛДГ составила 40 (Р<0.05). Более того, что касается экстракта №1 сальвианоловой кислоты Л при дозировке 2 мкг/мл активность ЛДГ составила 31 (Р<0.01), а для экстракта №2 сальвианоловой кислоты Л при дозировке 0,2 мкг/мл активность ЛДГ составила 31 (Р<0.05). Как показал эксперимент, лиофилизированный порошок сальвианоловой кислоты Л имеет значительный положительный эффект не только на нейронное повреждение in vitro, вызванное НКГ или HO, но и на коэффициент выживаемости клеток. Таким образом, было подтверждено, что сальвианоловая кислота Л имеет функцию защиты нервных клеток в условиях кислородной недостаточности, глюкозной недостаточности и переокисления.
Пример фармакодинамического воздействия 5. Защитное действие лиофилизированного порошка сальвианоловой кислоты Л и экстрактов на экспериментальную острую ишемию миокарда у крыс
Материалы для проведения эксперимента
1. Материалы и реагенты для испытания: инъекция питуитрина (Пит) произведена компанией "Xinbai Pharmaceutical Co., Ltd." г.Нанкин, код партии №070302. Физраствор произведен компанией "Tian'an Pharmaceutical Co., Ltd.", г.Тяньцзинь, номер партии №200605241, спецификация: 500 мл/флакон.
2. Основное оборудование: 8-канальный регистратор физиологических состояний MedLab произведен компанией "Medease Science and Technology Co., Ltd." г.Нанкин.
3. Животные: крысы Спрага-Доули мужского и женского пола с подходящей массой тела, предоставленные компанией "Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd." г.Пекин, сертификат №SCXK (Jing) 2007-0001. Все крысы получали специальный рацион для крыс (произведенной компанией "Keaoxieli Diet Co., Ltd." г.Пекин) и воду из под крана в камере для кормления животных при температуре 20-25°С с поддержанием освещения в течение 12 часов.
Способы эксперимента:
1. Определение дозы введения
Содержание экстракта №1 составило 6,825 г лекарственного сырья, а экстракта №2 - 4,162 г лекарственного сырья. Как для экстракта №1, так и для экстракта №2 было создано две групп с высокой и низкой дозой: 1,086 г лекарственного сырья/кг и 0,543 г лекарственного сырья/кг соответственно. После преобразования дозы лекарственного сырья доза для введения лиофилизированного порошка сальвианоловой кислоты Л для группы с высокой дозой экстракта 1 составила 4,67 мг/кг и 2,33 мг/кг для группы с низкой дозой. В экстракте №2 не было обнаружено сальвианоловой кислоты Л.
Доза введения лиофилизированного порошка сальвианоловой кислоты Л составил 10,0 мн/кг и 5,0 мг/кг.
2. Разделение по группам
2.1 Скрининговое исследование животных
Перед проведением формальных испытаний крысам ввели через хвостовую вену питуитрин (Пит) (1 ед./кг). Были записаны результаты нормальной ЭКГ и ЭКГ через 5 минут после инъекции, чтоб пронаблюдать повышение точки J и аномалию волны Т. Животные с аномальной ЭКГ перед инъекцией или те, которые были нечувствительны к Пит, далее не принимали участие в эксперименте.
2.2 Разделение животных по группам
Подходящих крыс разделили на 7 групп: (1) экспериментальная контрольная группа, (2) группа с низкой дозой экстракта №1 Danshen (группа А), (3) группа с высокой дозой экстракта №1 Danshen (группа Б), (4) группа с низкой дозой экстракта №2 Danshen (группа В), (5) группа с высокой дозой экстракта №2 Danshen (группа Г), (6) группа с низкой дозой лиофилизированного порошка сальвианоловой кислоты Л (группа Д), (7) группа с высокой дозой лиофилизированного порошка сальвианоловой кислоты Л (группа Е).
3. Способы эксперимента
Крысы СД (половина особей мужского пола, половина - женского) были произвольно разделены на группы, по 8 животных в каждой группе. Крысы в лечебных группах каждый день получали водные суспензии разного образца, а крысы в экспериментальной контрольной группе получали одинаковый объем физраствора. Всем животным последовательно вводили указанные вещества в течение 7 дней. Через 40 минут после конечного введения крысам вводили анестезию и подсоединяли приборы для считывания нормальной ЭКГ в II отведениях. Питуитрин (Пит) вводили с постоянной скоростью при дозировке 1 ед./кг массы тела через хвостовую вену в течение примерно 10 секунд. Изменения ЭКГ регистрировались на 0-й, 5-й, 10-й, 15-й, 30-й, 45-й секунде, 1-й, 2-й, 3-й, 4-й, 5-й, 10-й и 15-й минуте после введения. Различия между предварительной и последующей инъекцией Пит каждой группе, а также между лечебной группой и экспериментальной контрольной группой были подвергнуты сравнению, чтоб проанализировать изменения в точке J и волне T, и данные были проанализированы при помощи критерия Стъюдента.
Результаты эксперимента 1
Воздействие на точку J
Как показали результаты, по сравнению с экспериментальной контрольной группой, степень повышения точки J на ЭКГ в группе Е (группа с высокой дозой лиофилизированного порошка сальвианоловой кислоты Л) была меньше на 15-й с, 30-й с и 45-й с в случае острой ишемии миокарда, вызванной питуитрином, и разница имела статистическое значение при текущих условиях эксперимента (Р<0.05). По сравнению с экспериментальной контрольной группой, степень повышения точки J на ЭКГ в группе Б (группа с высокой дозой экстракта №1 Danshen) была меньше на 15-й с, и разница имела статистическое значение (Р<0.05). Однако, по сравнению с экспериментальной контрольной группой, другие группы не продемонстрировали значительных отличий ни в одной временной точке. Данные представлены в Таблице 16.
2. Воздействие на Т волну
Как показывают результаты, по сравнению с экспериментальной контрольной группой, степень повышения волны T на ЭКГ в группе Е (группа с высокой дозой лиофилизированного порошка сальвианоловой кислоты Л) была меньше на 15-й с и 30-й с, и такая разница имела статистическое значение в условиях данного эксперимента (P<0.05). Аналогичным образом, по сравнению с экспериментальной контрольной группой, степень повышения волны T на ЭКГ в группе Б (группа с высокой дозой экстракта №1 Danshen) была меньше на 15-ой с, и такое отличие имело статистическое значение (P<0.05). Однако, по сравнению с экспериментальной контрольной группой, другие группы не продемонстрировали значительных отличий ни в одной временной точке. Данные представлены в Таблице 17.
Выводы
По сравнению с экспериментальной контрольной группой, степень повышения точки J на ЭКГ и волны T в группе Е (группа с высокой дозой лиофилизированного порошка сальвианоловой кислоты Л) была меньше на 15-й с и 30-й с, и такое отличие имело статистическое значение (Р<0.05). По сравнению с экспериментальной контрольной группой, и точка J, и волна Т на 15-й секунде значительно снизились в группе Б (группа с высокой дозой экстракта №1 Danshen) (Р<0.05).
По сравнению с экспериментальной контрольной группой, другие группы не продемонстрировали значительного снижения точки J и волны Т ни в одной временной точке. Как показывают результаты, по данному исследованию лиофилизированный порошок сальвианоловой кислоты Л (10 мг/кг) и экстракт №1, содержащий сальвианоловую кислоту в концентрации 4,67 мг/кг, противодействуют острой ишемии миокарда; однако не наблюдалось противодействия острой ишемии миокарда со стороны экстракта №2, не содержащего сальвианоловой кислоты Л, использованного в экспериментальной дозировке.
На что следует обратить внимание:
1. Определение точки J: соединение конечной части комплекса QRS с сегментом ST.
2. По причине того, что питуитрин способен сужать коронарный сосуд, внутривенная инъекция питуитрина может вызвать ишемию миокарда у нормальных крыс, что приводит к очевидному повышению как точки J, так и волны T на ЭКГ. Положение точки J в группе, получающей медикамент, в значительной степени восстановилось, и волна Т постепенно значительно уменьшилась до нормального уровня после введения испытуемого медикамента, что говорит об антагонистическом действии медикамента на острую ишемию миокарда, вызванную сужением коронарного сосуда из-за питуитрина. Обычно считается, что медикамент, имеющий терапевтический эффект либо на аномалию I фазы (вызванную питуитрином на 0-45-й секунде) или аномалию II фазы (вызванную питуитрином на 45-й с - 15-й мин), противодействует ишемии миокарда.
3. Во время эксперимента должен использоваться питуитрин такого же серийного номера во избежание воздействия единицы активности медикамента на результаты эксперимента. Питуитрин необходимо вводить с интервалом в более чем 2 часа, чтоб предотвратить развитие устойчивости к медикаменту. Желательно, чтоб выбранные животные использовались через сутки.