СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ К ВЫСОКОГОРНОМУ ОТЕКУ ЛЕГКИХ
METHOD OF FINDING PRONENESS TO HIGH-ALTITUDE PULMONARY EDEMA

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к способу определения предрасположенности к высокогорному отеку легких (HAPE). Оно, в частности, относится к аллельным вариантам гена iNOS (индуцируемой синтазы оксида азота), для которого была обнаружена связь с предрасположенностью к HAPE.
Уровень техники
Высокогорный отек легких (HAPE) является формой некардиагенного отека легких, который развивается приблизительно у 10% случайно выбранных альпинистов в течение 24 часов после быстрого подъема на высоту выше 4000 метров. Сходное явление обнаружено у жителя равнины, поднявшегося на высоту более 3000 м по различным причинам делового характера. Более высокий коэффициент заболеваемости, около 60%, был показан для субъектов, которые предрасположены к HAPE, как документировано при ранее выявленных случаях возникновения болезни (Houston CS et. al. 1960, Bartsch P et. al. 1997, 1990). HAPE может быть эффективно предотвращен профилактическим применением вазодилататоров или медленным подъемом. Тем не менее он остается наиболее частой причиной смерти, связанной с воздействием высокогорья во время военно-спортивного похода или при занятиях альпинизмом (Hackett PH et. al. 1990). Уровень смертности у альпинистов Гималаев был оценен как 50%, если немедленное лечение с кислородной поддержкой или быстрый спуск являются невозможными (Lobenhoffer HP et. al. 1982). Видимая разница в клинической картине и тяжести заболевания между расовыми и этническими группами вместе с семейными особенностями свидетельствуют о существовании достоверной наследственной предрасположенности к заболеванию.
Хотя знания факторов, оказывающих действие на развитие HAPE, до сих пор неполны, существуют экспериментальные данные о том, что чрезмерно усиленная гипоксическая легочная вазоконстрикция (HPV) играет при этом важную роль (Scherrer U et. al. 1996). Избыточное повышение легочного артериального давления было продемонстрировано инвазивным и неинвазивным измерением в высокогорье у людей с HAPE. Неравномерная вазоконстрикция в капиллярах иногда приводит к «капиллярному просачиванию», за которым следует формирование отека (Bartsch P et. al. 1991). Люди, подверженные заболеванию, демонстрируют усиленную реакцию со стороны легочных сосудов даже в течение кратковременного воздействия высокогорья. Лежащий в основе патофизиологический механизм такой чрезмерно усиленной HPV до сих пор неизвестен. Существуют, однако, доказательства, что эндогенный вазодилататор оксид азота (NO) модулирует сосудистую реактивность (Palmer RMJ et. al. 1987). Регуляцию сосудистого тонуса оксидом азота относят к действию промежуточных продуктов цГМФ-зависимого пути (Bellamy TC et. al. 2002).
Следующие исследования подчеркивают вовлеченность оксида азота в HAPE.
G
Оксид азота оказывает свой эффект главным образом через улучшение вентиляционно/перфузионного отношения и понижение альвеолярно-капиллярной разницы парциального давления кислорода повышением насыщения артериальной крови кислородом (Scherrer U et. al. 1996). Тем не менее, у здоровых волонтеров назначение антагониста синтеза оксида азота N-монометил-L-аргинина (L-NMMA) при гипоксии повышало давление в легочной артерии и сосудистое сопротивление, что напоминало эффекты, описанные при HAPE. Из-за этого оксид азота применялся в качестве ингаляционной терапии для лечения индивидуумов, пораженных HAPE (Anand IS et. al. 1998).
Фосфодиэстераза 5 является ключевым ферментом, ответственным за гидролиз цГМФ в легких. Для ингибиторов фосфодиэстеразы 5 была обнаружена способность подавлять легочную гипертензию, индуцированную гипоксией (Goldstein I et. al. 1998). Гипоксия уменьшает количество выдыхаемого оксида азота у альпинистов, подверженных HAPE, указывая на снижение продукции оксида азота в таких случаях (Busch et. al. 2001). Такое нарушение механизма синтеза оксида азота, приводящее к низкому уровню оксида азота, может быть рассмотрено как лежащее в основе патогенеза HAPE. Оксид азота синтезируется тремя изоферментами nNOS (нейрональная синтаза оксида азота, NOS1), iNOS (индуцируемая синтаза оксида азота NOS2) и eNOS (эндотелиальная синтаза оксида азота NOS3) (Mishel T et. al. 1997). Экспрессия NOS1 и NOS3 не регулируется, в то время как NOS2 экспрессируется после индукции. Помимо этого, наиболее вероятным звеном, дефект которого предположительно имеет место при HAPE, является eNOS (эндотелиальная синтаза оксида азота), в то время как индукция iNOS (индуцируемая синтаза оксида азота) представляется обязательной для немедленного восстановления общего резерва оксида азота (Xia Y et. al. 1998). Более того, устойчивые механизмы клеточной сигнализации, как правило, способствуют пополнению индуцируемых генов для немедленных ранних физиологических ответов. Можно предположить, что нарушение в iNOS, которое не допускает ее активацию, может препятствовать восстановлению сниженного уровня оксида азота у индивидуумов, которые подвержены HAPE, обусловленному гипоксией.
Нарушение в iNOS может возникать на генетическом уровне у пациентов с HAPE. В большом количестве случаев было обнаружено нарушение экспрессии этих генов полиморфизмами в генной последовательности (Qadar Pasha MA et. al. 2001). Поэтому всегда возможно, что полиморфизм в гене iNOS может нарушить его экспрессию и спровоцировать заболевание.
Принятые методики лечения HAPE
1. Терапия оксидом азота: оксид азота применялся в качестве ингаляционной терапии для лечения HAPE. Он оказывает свой эффект большей частью через улучшение вентиляционно/перфузионного соотношения и снижение альвеолярно-артериальной разницы парциального давления кислорода увеличением артериального насыщения кислородом.
Оксид азота вызывал улучшение артериальной оксигенации у субъектов с HAPE, которое сопровождалось изменением кровотока в легких от отечных сегментов и к неотечным сегментам, что приводит к выровненной/гомогенной вазоконстрикции во всех капиллярах. (Scherrer et. al., Anand et. al. 1998).
2. Быстрый спуск: быстрый спуск пациентов с HAPE не только предотвращает ухудшение, но положительно влияет на патогенез заболевания (Hackett et. al. 2001).
3. Портативные воздушные камеры (PACs): PACs в форме маленьких цилиндров, наполненных кислородом, часто применяют в качестве ингаляционной терапии при HAPE (Hackett et. al. 2001).
4. Генетическая предрасположенность: только одно исследование в данном контексте предполагает, что наследственная изменчивость гена эндотелиальной синтазы оксида азота (eNOS) и гена ангиотензинпревращающего фермента (АПФ) может предрасполагать индивидуума к HAPE (Droma Y et. al. 2002). Результаты следующие:
Контроль
Пациенты
Глу298Асп(eNOS)
9.8%
25.6%
В/А(eNOS)
6.9%
32.2%
I/D(АПФ)
4%
22%
Ограничения доступной терапии HAPE
1. У пациентов с HAPE не обнаружено однородного ответа на ингаляцию оксида азота. Более того, необходимая концентрация оксида азота изменяется с тяжестью заболевания. Иногда неадекватная ингаляция приводит к гипотензии или даже к септическому шоку у пациентов.
2. Немедленный спуск пациентов с HAPE часто остается невозможным из-за суровой погоды и труднопроходимой местности (Anand IS et. al. 1998, Hackett et. al. 2001).
3. Транспортировка PACs часто оказывается невыполнимой из-за проблем перегрузки. Улучшение условий заболевания часто является временным, потому что прекращение использования камеры приводит к ухудшению состояния пациента (Hackett et. al. 2001).
4. Описанный полиморфизм, связанный с HAPE, не является специфичным, но для него была показана связь с такими расстройствами, как диабет, заболевание коронарных артерий, гипертензия и инфаркт миокарда, когда наблюдается повышенное кровяное давление (Monti LD et. al., Via M et. al. 2003). Описанная разность частот аллелей оказывается аналогичной с другими заболеваниями. Следовательно, возможность аллельного вклада в болезнь может быть обусловлена другими патофизиологическими процессами, такими как гипертензия, которая вызывает усиление HAPE. Более того, исследование не включает коренных жителей высокогорья, население, спокойно проживающее в тех условиях, где возникает заболевание.
Новизна изобретения состоит в обеспечении нового способа выявления предрасположенности к HAPE.
В другом аспекте новизна заключается в выявлении новой маркерной области гена iNOS.
В следующем аспекте новизна состоит в получении нового SNP в гене iNOS.
В другом аспекте новизна состоит в выявлении связи аллельных вариантов гена iNOS с HAPE.
Другая новинка состоит в обеспечении новых праймеров и датчиков амплификации, которые содержат новый одиночный нуклеотидный полиморфизм (SNP).
Задачи изобретения
Основной задачей изобретения является обеспечение способа выявления предрасположенности к HAPE, который устраняет ограничения, приведенные выше.
Другой задачей является обеспечение новых SNP в гене iNOS.
Другой задачей является получение новых праймеров и датчиков амплификации, которые содержат новые SNP.
Следующей задачей является выполнение корреляционного анализа аллельных вариантов между жителями равнины и пациентами с HAPE, так чтобы эта связь с заболеванием могла быть отмечена.
Раскрытие изобретения
Настоящее изобретение относится к способу выявления предрасположенности к HAPE. В частности, оно касается аллельных вариантов гена iNOS, который связан с предрасположенностью к HAPE. Нарушение механизма синтеза оксида азота приводит к низкому уровню оксида азота, описанному как ответственный за патогенез HAPE. Для гена iNOS была показана ответственность за продукцию оксида азота, тогда как ингибиторы продукции оксида азота увеличивают тяжесть HAPE. Настоящее изобретение включает способ выявления предрасположенности к HAPE в виде нового аллельного варианта гена iNOS в раскрытой области маркера, где была показана отрицательная связь с предрасположенностью к HAPE в популяции.
Краткое описание чертежей
11.2
Фиг. 1 - схематическое изображение локализации гена индуцируемой синтазы оксида азота iNOS: 17 cenq. Вертикальные линии показывают области экзонов (последовательность нуклеотидов ID № NT_010799 из Gene bank).
На фиг. 2 показан файл последовательности гомозиготного индивидуума с АА.
На фиг. 3 показан файл последовательности гомозиготного индивидуума с GG.
На фиг. 4 показан файл последовательности гетерозиготного индивидуума с AG.
На фиг. 5 показан файл последовательности гетерозиготного индивидуума с TC.
Другие и дальнейшие аспекты, признаки и преимущества настоящего изобретения станут ясными из дальнейшего описания предпочтительного варианта воплощения изобретения, приведенного для раскрытия. Альтернативные варианты воплощения изобретения могут быть представлены специалистами в данной области. Все подобные альтернативные варианты воплощения изобретения находятся в рамках данного изобретения.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к способам выявления предрасположенности к HAPE. Оно, в частности, относится к аллельным вариантам гена iNOS, для которого была обнаружена связь с предрасположенностью к HAPE.
I. Определение области маркера на гене iNOS
Принимая во внимание важные функции оксида азота в условиях высокогорья, iNOS, ген индуцируемой синтазы оксида азота был выбран в качестве подходящего гена для исследования.
II. Выбор объектов исследования
Клиническая выраженность HAPE была оценена по системе оценки острой горной болезни (AMS) озера Луис. Кратко, у пациентов оценивались пять симптомов: головная боль, гастроинтестинальные нарушения, усталость, слабость или оба, головокружение, нарушение мыслительной способности или оба и нарушения сна. Также оценивались изменения психического состояния, атаксия и периферические отеки. Каждый из этих симптомов оценивался между 0 и 3. Оценка 0 означала отсутствие симптомов; 1 - мягкие симптомы, 2 - умеренные симптомы и 3 - выраженные симптомы. Шкала HAPE представляла собой сумму из всех 8 симптомов, и пациент описывался с помощью шкалы HAPE>6 (Anand et. al. 1998). Жители равнины (LLs) были субъектами, которые только после введения на высокогорье как минимум трижды ни разу не обнаруживали ни одного из приведенных выше симптомов. Коренные жители высокогорья (HA) были постоянными жителями высокогорья с древних времен.
III. Извлечение геномной ДНК из лейкоцитов
Геномную ДНК извлекали из крови применением метода высаливания. Лизис красных кровяных клеток в присутствии соли сопровождался обработкой лизирующим ядра буфером (NLB). Белки осаждали, и извлечение ДНК достигалось в этаноле (Miller SA et. al. 1988).
IV. Идентификация аллельных вариантов гена iNOS
Новый полиморфизм по изобретению.
В качестве первого шага по настоящему изобретению заявители осуществили ПЦР-амплификацию области маркера гена iNOS применением самостоятельно разработанных олигонуклеотидных праймеров (Gene bank номер доступа NT_010799). Секвенирование очищенных продуктов ПЦР обнаруживало новый одиночный нуклеотидный полиморфизм в интроне 7 человеческого гена iNOS. Поэтому было очевидно, что существует до этого неизвестный аллель или подтип человеческого гена iNOS.
Настоящее изобретение включает последовательность аллельных вариантов человеческого гена iNOS, содержащую последующий новый одиночный нуклеотидный полиморфизм в сравнении с человеческой генной последовательностью iNOS в базе данных.
К примеру, нуклеотидная последовательность аллельных вариантов человеческого гена iNOS (SEQ ID NO:1), имеющая полиморфный участок, приведенный в таблице 1, может быть-
5'CAGCGGAGTGATGGCAAGCACGACTTCCGGGTGTGGAATGCTCAGCTCATCCGCTATGCTGGCTACCAGATGCCAGATGGCAGCATCAGAGGGGACCCGCCAACGTGGAATTCACTCAGGTACCCGGCCCAGCCTCAGCC
A*/G
CCGGCCATTGGGGCGGGGAGCCCCGTGGTGAGCGAGTGACAGAGTGGAGCCCAGAGGAGACACGCAGCCCGGGCTTACAGACTCACAGGGCCCGTCTTGTTCCCCAGCTGTGCATC3'
В приведенной последовательности SNP* показан жирным шрифтом.
Таблица 1
Измененный участок
Основное изменение
Тип мутации
19480
A/G
Транзиция
V. Ассоциативный анализ с заболеванием
Анализ SNP у 42 коренных жителей высокогорья, 39 человек контрольной группы HAPE и 18 пациентов с HAPE обнаружил три генотипа, названных AA, AG и GG. Распределение аллелей суммировано в таблице 2.
Таблица 2
Объекты исследования
A
G
Контрольная группа HAPE (n=39)
0.35
0.65
пациенты с HAPE (n=18)
0.58
0.42
Коренные жители высокогорья (n=42)
0.18
0.82
Частота G аллеля была обнаружена в следующем порядке: коренные жители высокогорья > контрольная группа HAPE > субъекты с HAPE. Биостатистический анализ показал достоверную связь G аллеля с высокогорной адаптацией и А аллеля с заболеванием, как указано в таблице 3.
В этом документе отношение шансов (OR) и 95% доверительный интервал был применен как мера силы связи между генотипной комбинацией и заболеванием. Величина Р<0,05 была принята статистически достоверной.
Таблица 3
Тип связи
Величинаχ<sup>2</sup>
Величина Р
Отношение шансов
95% CI (доверительный интервал)
Относительный риск
пациенты с HAPE и контрольная группа HAPE
10.63
0.001
2.56
1.45-4.54
1.66(1.21-2.27)
пациенты с HAPE и коренные жители высокогорья
33.96
<0.001
6.29
3.30-12.01
3.22(2.05-5.06)
контрольная группа HAPE и коренные жители высокогорья
7.42
0.006
-
-
-
Синтаза оксида азота для своей реакции синтезирования оксида азота нуждается в кислороде, который выступает в качестве кофактора реакции. Кислород связывает домен оксигеназы в iNOS и содействует синтезу оксида азота. В условиях гипоксии недостаток кислорода может привести к снижению продукции оксида азота, при этом любая модификация в домене оксигеназы, которая изменяет активность фермента таким образом, что он не нуждается в кислороде или нуждается в меньшем количестве кислорода, может способствовать нормализации продукции оксида азота. Оксид азота улучшает оксигенацию гемоглобина, и нормальная продукция оксида азота может улучшить механизмы действия акклиматизации, следовательно, любое нарушение в домене оксигеназы может быть благоприятно для продукции оксида азота. В настоящем изобретении новый SNP, найденный в интроне 7, представлен рядом с доменом оксигеназы гена NOS2, который соединяет экзон 7 с экзоном 16. Очень возможно, что SNP, обнаруженный в неслучайном распределении поблизости SNP, вносит свой вклад в заключительное воздействие на продукцию оксида азота геном NOS2.
VI. Диагностические наборы
Изобретение далее включает диагностические наборы, содержащие один или более аллельных специфических олигонуклеотидов, как описано в SEQ ID 2 и 3. Часто наборы содержат одну или более пар аллель-специфических олигонуклеотидов, гибридизующихся с разными формами полиморфизма. В некоторых наборах аллель-специфические олигонуклеотиды иммобилицированы на субстрате. К примеру, такой субстрат может включать аллель-специфические нуклеотидные зонды для выявления по меньшей мере полиморфизма, показанного в таблице 1. Необязательные дополнительные компоненты в наборе включают, например, ферменты рестрикции, обратную транскриптазу или полимеразу, субстрат нуклеозидов трифосфатов, средства, примененные при маркировке (к примеру, конъюгат фермента авидина и субстрат фермента и хромоген, если маркировкой является биотин), и подходящие буферы для обратной транскрипции, PCR или реакций гибридизации. Обычно набор также содержит инструкции по выполнению метода.
VII. Векторы нуклеиновых кислот
Вариантные гены могут экспрессироваться в экспрессирующем векторе, в котором вариантный ген функционально связан с природным или другим промотором. Обычно промотор является эукариотическим промотором для экспрессии в клетке млекопитающих. Последовательности, регулирующие транскрипцию, обычно включают гетерологичный промотор и, по необходимости, ген-усилитель, который распознается хозяином. Выбор подходящего промотора, к примеру, trp, lac, phage промоторов, промоторов гликолитических энзимов и промоторов тРНК, зависит от выбранного хозяина. Коммерчески доступные векторы экспрессии также могут быть использованы. Подходящие клетки хозяева включают бактерии, такие как E.coli, дрожжи, мицелиальные грибы, клетки насекомых, клетки млекопитающих, обычно бессмертные, к примеру, клеточные линии мыши, CHO, человека и обезьяны и их производные. Предпочтительные клетки хозяева способны обрабатывать продукты вариантных генов для создания подходящих зрелых полипептидов.
Изобретение далее касается трансгенных животных, отличных от человека, способных к экспрессии экзогенного вариантного гена или достигших формирования трансгена, в котором клонированный вариантный ген инактивирован введением положительного маркера выбора. Трансген затем вводят в эмбриональную стволовую клетку, где он подвергается гомологичной рекомбинации с эндогенным вариантным геном. Предпочтительными животными являются мышь и другие грызуны. Такие животные обеспечивают применимые системы лекарственного скрининга.
Таким образом, основное воплощение настоящего изобретения относится к способу выявления предрасположенности к высокогорному отеку легких (HAPE), указанный способ включает следующие шаги:
(a) выбор объектов исследования путем мониторинга симптомов, ассоциированных с высокогорным отеком легких,
(b) выделение у исследуемых объектов геномной ДНК из лейкоцитов обычными методами,
(с) амплификация интрона 7 гена iNOS человека SEQ ID № 1 путем разработки и синтеза Прямых и Обратных олигопептидных праймеров SEQ ID №2 и SEQ ID №3, соответственно,
(d) идентификация численно нового одиночного нуклеотидного полиморфизма (SNP) сравнением с уже существующей последовательностью гена iNOS человека,
(e) скрининг популяции коренных жителей высокогорья (коренные жители HA), коренных жителей равнины (контрольная группа HAPE) и жителей равнины пациентов с HAPE на предмет одиночного нуклеотидного полиморфизма с применением описанных выше праймеров SEQ ID №2 (прямой праймер) и SEQ ID №3 (обратный праймер),
(f) подсчет последовательностей AA, AG и GG генотипов в популяциях согласно стадии (e) для установления связи генотипов с высокогорным отеком легких, и
(g) прогнозирование и статистический анализ различий распределения аллельных вариантов (AA, AG и GG генотипов) в популяциях, где GG генотип в 19480 позиции свидетельствует о низком риске высокогорного отека легких, и AA генотип в 19480 позиции свидетельствует о высоком риске заболевания.
Другое воплощение настоящего изобретения относится к олигонуклеотидным праймерам, способным к амплификации интрона 7 гена iNOS человека, выбранным из группы, включающей
(a) 5'CAG CGG AGT GAT GGC AAG CAC GAC 3'(SEQ ID №2), который является прямым праймером, и
(b) 5'GAT GCA CAG CTG GGG AAC AAG ACG 3'(SEQ ID №3), который является обратным праймером.
Также другое воплощение настоящего изобретения относится к олигонуклеотидным праймерам, содержащим один или более полиморфных участков, выбранных из группы, включающей
(a) 5'CAG CGG AGT GAT GGC AAG CAC GAC 3'(SEQ ID №2), который является прямым праймером, и
(b) 5'GAT GCA CAG CTG GGG AAC AAG ACG 3'(SEQ ID №3), который является обратным праймером.
Далее другие воплощения настоящего изобретения относятся к аллельным вариантам, где аллельные варианты гена iNOS имеют AA, AG и GG генотипы.
Диагностический набор для выявления SNP генотипов, свидетельствующих о предрасположенности к высокогорному отеку легких (HAPE), содержит следующие праймеры и пробы:
(a) 5'CAG CGG AGT GAT GGC AAG CAC GAC 3'(SEQ ID №2), который является прямым праймером, и
(b) 5'GAT GCA CAG CTG GGG AAC AAG ACG 3'(SEQ ID №3), который является обратным праймером.
Еще одно воплощение настоящего изобретения относится к праймерам, подходящим для амплификации участка гена iNOS, содержащего один или более полиморфных участков, упомянутые праймеры включают:
(a) 5'CAG CGG AGT GAT GGC AAG CAC GAC 3'(SEQ ID №2), который является прямым праймером, и
(b) SEQ ID3:5'GAT GCA CAG CTG GGG AAC AAG ACG 3'(SEQ ID №3), который является обратным праймером.
Другое воплощение настоящего изобретения относится к векторам нуклеиновых кислот, содержащим аллельные варианты гена iNOS.
Следующие примеры приводятся для иллюстрации настоящего изобретения и не должны быть истолкованы как ограничивающие объем настоящего изобретения.
Примеры
Пример 1
Идентификация гена маркера:
Принимая в рассмотрение важные функции оксида азота в условиях высокогорья, iNOS, индуцируемая синтаза оксида азота, была выбрана как ген-кандидат для исследования.
Пример 2
Выбор объектов исследования:
Клиническая выраженность HAPE была оценена по системе оценки острой горной болезни (AMS) озера Луис. Кратко, у пациентов оценивали пять симптомов: головная боль, гастроинтестинальные нарушения, усталость, слабость или оба, головокружение, нарушение мыслительной способности или оба и нарушения сна. Изменения психического состояния, атаксия и периферические отеки также оценивались. Каждый из этих симптомов оценивались между 0 и 3. Оценка 0 означала отсутствие симптомов, 1 - мягкие симптомы, 2 - умеренные симптомы и 3 - выраженные симптомы. Шкала HAPE представляла собой сумму из всех 8 симптомов, и пациент описывался с помощью шкалы HAPE>6 (Anand et. al. 1998). Жители равнины (LLs) были объектами, которые только после введения на высокогорье как минимум трижды ни разу не обнаруживали ни одного из приведенных выше симптомов. Коренные жители высокогорья (HA) были постоянными жителями HA с древних времен.
Пример 3
Извлечение геномной ДНК из лейкоцитов:
Геномную ДНК извлекали из крови применением метода высаливания. Лизис красных кровяных клеток в присутствии соли сопровождался обработкой лизирующим ядра буфером (NLB). Белки осаждали и ДНК извлекали из лейкоцитов периферической крови применением модификации процедуры высаливания. Концентрацию ДНК определили измерением оптической плотности образца при длине волны 260 нм (Miller SA et. al. 1988).
Пример 4
Идентификация аллельных вариантов гена iNOS:
В примере описана идентификация аллельных вариантов гена iNOS путем ПЦР и секвенирования применением конкретных олигонуклеотидных праймеров по изобретению. ДНК затем амплифицировали полимеразной цепной реакцией с применением олигонуклеотидных праймеров:
(a) 5'CAG CGG AGT GAT GGC AAG CAC GAC 3'(SEQ ID №2) и
(b) 5'GAT GCA CAG CTG GGG AAC AAG ACG 3'(SEQ ID №3).
Полимеразная цепная реакция проводилась с применением следующих условий:
шаг 1 94єС в течение 4 мин,
шаг 2 94єС в течение 30 секунд,
шаг 3 62,5єС в течение 30 секунд,
шаг 4 72єС в течение 45 секунд,
шаг 5 34 раза шаг 2,
шаг 6 72єС в течение 10 мин.
ПЦР выполнялась в Perkin Elmer GeneAmp PCR System 9600. Эта реакция синтезировала фрагмент ДНК 258bp при анализе с помощью электрофореза в 2% агарозном геле. Продукт ПЦР очищался от защиты вырезанием из агарозного геля применением Amersham Pharmacia gel extraction kit (Amersham), и оба участка продуктов ПЦР были напрямую рассортированы применением терминатора краски химического анализа в ABI Prism 377 автоматического ДНК секвенатора. Продукт PCR был идентичным генной последовательности iNOS человека за исключением нового единичного изменения пары оснований, упомянутого в таблице 1.
Пример 5
Нуклеотидная последовательность аллельных вариантов гена iNOS:
Последовательность нуклеотидов в аллельных вариантах iNOS получали применением способа, описанного в примере 1 -
A*G
5'CAG CGG AGT GAT GGC AAG CAC GAC TTC CGG GTG TGG AAT GCT CAG CTC ATC CGC TAT GCT GGC TAC CAG ATG CCA GAT GGC AGC ATC AGA GGG GAC CCT GCC AAC GTG GAA TTC ACT CAG GTA CCC GGC CCA GCC TCA GCC CC GGC CAT TGG GGC GGG GAG CCC CGT GGT GAG CGA GTG ACA GAG TGG AGC CCA GAG GAG ACA CGC AGC CCG GGC TTA CAG ACT CAC AGG GCC CGT CTT GTT CCC CAG CTG TGC ATC3'.
В описанной последовательности SNP* показана жирным шрифтом.
Пример 6
G аллель связан с адаптацией, и А аллель ассоциируется с заболеванием:
Способ, описанный в примере 4, применяли к серии образцов ДНК, полученных от коренных жителей высокогорья, контрольной группы HAPE и пациентов с HAPE. Высоко достоверная связь G аллеля с высокогорной адаптацией и А аллеля с заболеванием была прослежена. Результаты суммированы в таблице 4.
Таблица 4
Тип связи
Величинаχ<sup>2</sup>
Величина Р
Отношение шансов
95% CI (доверительный интервал)
Относительная частота
пациенты с HAPE и контрольная группа HAPE
10.63
0.001
2.56
1.45-4.54
1.66(1.21-2.27)
пациенты с HAPE и коренные жители высокогорья
33.96
<0.001
6.29
3.30-12.01
3.22(2.05-5.06)
контрольная группа HAPE и коренные жители высокогорья
7.42
0.006
-
-
-
Таким образом, люди с генотипом GG имеют низкий риск, и таковые с АА генотипом имеют высокий риск HAPE, сохранение чего можно ожидать также и для других популяций.
Пример 7
Векторы нуклеиновых кислот, содержащие варианты последовательностей iNOS:
Векторы и клетки хозяева, трансформированные с аллельными вариантами гена iNOS, содержащими один или более полиморфных участков, как приведено в таблице 1, могут быть приготовлены, например, как подробно описано ниже.
Вариантные гены могут экспрессироваться в экспрессирующем векторе, в котором вариантный ген функционально связан с природным или другим промотором. Обычно промотор является эукариотическим промотором для экспрессии в клетке млекопитающих. Последовательности, регулирующие транскрипцию, обычно включают гетерологичный промотор и, по необходимости, ген-усилитель, который распознается хозяином. Выбор подходящего промотора, к примеру, trp, lac, phage, гликолитических ферментов и тРНК, зависит от выбранного хозяина. Также могут быть использованы коммерчески доступные векторы экспрессии. Подходящие клетки-хозяева включают бактерии, такие как E.coli, дрожжи, мицелиальные грибы, клетки насекомых, клетки млекопитающих, обычно бессмертные, к примеру, клеточные линии мыши, CHO, человека и обезьяны и их производные. Предпочтительные клетки-хозяева способны обрабатывать продукты вариантных генов для создания подходящих зрелых полипептидов.
Преимущества настоящего изобретения
Настоящее изобретение добавляет следующие пункты к лечению HAPE.
1. Ген индуцируемой синтазы оксида азота как новый маркер для исследований HAPE.
2. Новые последовательности праймеров, ответственных за амплификацию продуктов ПЦР, содержащих новые SNP.
3. Новые SNP (19480 A/G), которые могут быть использованы в дальнейших исследованиях связей.
4. Достоверная связь дикого типа аллеля (А) с заболеванием (таблицы 2 и 3).
5. Достоверная связь мутантного аллеля (G) с адаптацией (таблицы 2 и 3).
6. Достоверное различие между последовательностью аллелей в отношении коренных жителей высокогорья и контрольной группой HAPE (таблицы 2 и 3).
7. Присутствие G аллеля предрасполагает индивидуума к уменьшению шансов на развитие заболевания.
8. Это может помочь индивидуумам принимать решение о посещении высокогорья, основываясь на различных доводах.
Предоставленная ниже последовательность представляет собой информацию для SEQ ID Nos. 1, 2 и 3.
Перечень последовательностей
Главная информация
Лицо, подающее заявку: CSIR
Название изобретения: Способ выявления предрасположенности к высокогорному отеку легких
Номер последовательностей: 03
Адрес корреспондента: Institute of genonics and integrative biology, CSIR, Delhi University Campus, Mall Road-110007,India.
Телефон:+91-19-27666156 Факс: +91-11-27667471
Информация о последовательности ID NO: 1
1. Характеристики последовательности:
1. Длина: 258 п.о.
2. Тип: ДНК
A*G
5'CAG CGG AGT GAT GGC AAG CAC GAC TTC CGG GTG TGG AAT GCT CAG CTC ATC CGC TAT GCT GGC TAC CAG ATG CCA GAT GGC AGC ATC AGA GGG GAC CCT GCC AAC GTG GAA TTC ACT CAG GTA CCC GGC CCA GCC TCA GCC CC GGC CAT TGG GGC GGG GAG CCC CGT GGT GAG CGA GTG ACA GAG TGG AGC CCA GAG GAG ACA CGC AGC CCG GGC TTA CAG ACT CAC AGG GCC CGT CTT GTT CCC CAG CTG TGC ATC3'.
3. Организм: Homo sapiens (человек)
4. Непосредственный источник: PCR (ПЦР)
5. Имя/Ключ: Область маркера
6. Последовательность ID#1
Информация о последовательности ID NO: 2
Характеристики последовательности:
1. Длина: 24 п.о.
Тип: ДНК
5'CAG CGG AGT GAT GGC AAG CAC GAC 3'
Организм: искусственная последовательность
Непосредственный источник: синтетический
Имя/Ключ: Синтетический олигопептид
Последовательность ID#2
Информация о последовательности ID NO: 3
Характеристики последовательности:
Длина: 24 п.о.
Тип: ДНК
5'GAT GCA CAG CTG GGG AAC AAG ACG 3'
Организм: искусственная последовательность
Непосредственный источник: синтетический
Имя/Ключ: Синтетический олигопептид
Последовательность ID#3
Список использованной литературы