о
Способ нерегламентированного замораживания клеток-предшественников периферической крови при температуре минус 80С под защитой диметилсульфоксида
METHOD FOR UNRESTRICTED FREEZING PERIPHERAL BLOOD PRECURSOR CELLS AT MINUS 80 °C UNDER PROTECTION OF DIMETHYLSULPHOXID

A
Изобретение относится к медицине - трансфузиологии, а именно к технологии криоконсервирования клеток-предшественников периферической крови (КППК) при температуре минус 80°С под защитой криоконсерванта на основе 10% диметилсульфоксида (10% ДМСО). Первоначально при температуре плюс 4°С проводят разбавление 100% раствора ДМСО до 10% концентрации. При тех же условиях проводят добавление криоконсерванта во взвесь аферезных ядросодержащих клеток с КППК, размещенными в криопакете, перемешивают, криопакет запаивают, маркируют и помещают в алюминиевый пенал-холдер. Осуществляют нерегламентированное многоэтапное замораживание клеточной взвеси от плюс 17÷ плюс 25°С до минус 80°С в электрических рефрижераторах с установленной температурой изотермической холодовой адаптации (T) в режиме трехступенчатой программы, на первом этапе которой биообъект выдерживают 10 мин при плюс 4°С, на втором этапе биообъект быстро переносят в морозильник с Та минус 28±1°С, t=25 мин., по завершении которого биообъект незамедлительно переносят в морозильник-хранилище с заданной температурой минус 80±2°С для окончательного замораживания и длительной криоконсервации КППК. Замороженные КППК отогревают покачиванием криопакета в водной среде при температуре плюс 38 плюс 43°С до достижения температуры в клеточной взвеси плюс 2 плюс 4°С. Изобретение позволяет повысить выход устойчивых к действию факторов криоповреждения клеток-предшественников периферической крови и их приживаемость при трансплантации реципиентам.
Способ нерегламентированного замораживания клеток-предшественников периферической крови при температуре минус 80°С под защитой диметилсульфоксида относится к медицине, в частности к трансфузиологии.
В нашей стране и за рубежом все активнее разрабатываются новые и совершенствуются известные способы сохранения КППК при отрицательных температурах для клинических целей. Достигнуты успехи в трансплантации криоконсервированных аутологичных, сингенных и аллогенных гемопоэтическихз стволовых клеток (ГСК). Клеточные взвеси активно используются при лечении лейкозов, апластической анемии, сепсиса, миелодиспластического синдрома, некоторых солидных опухолей, иммунных, радиационных поражений и других патологий у людей и животных. Ключевыми вопросами в криомедицине являются разработка и изучение новых нетоксичных или малотоксичных криоконсервантов, повышающих эффективность криоконсервирования клеток крови и костного мозга.
Несмотря на то, что замораживание и хранение в жидком азоте с контролируемой скоростью охлаждения являются стандартной процедурой для криоконсервации КППК, в трансфузиологии получили развитие технологии замораживания КППК при температуре минус 80°С в электрических рефрижераторах без контроля скорости охлаждения КППК под защитой 10% ДМСО (А.А. Цуцаева и соавт. Криоконсервирование клеточных суспензий. - Киев, Наук, думка. - 1983; Е.А. Гордиенко, Н.С. Пушкарь. Физические основы низкотемпературного консервирования клеточных суспензий. - Киев, Наук, думка, - 1994. - С. 68-76; Е.П. Сведенцов. Криоконсерванты для живых клеток. - Сыктывкар, 2010. - 80 с. (Коми научный центр УрО РАН) и др.).
A
Недостатками таких технологий замораживания КППК являются: недостаточная технологичность, испытаны в лаборатории на стадии эксперимента, в качестве криоконсервантов используется 10% ДМСО с показателем поглощения (ПП) в УФ-диапазоне при длине волны 275 нм в пределах порядка 0,325 (что значит вещество токсичное), а дальнейшее разведение криоконсерванта сопряжено с риском контаминации биообъекта, разработаны технологии, где в качестве хладоагентов используются инфицированный тающий лед, дефицитный и опасный для здоровья жидкий азот или токсичные для организма обслуживающего персонала растворы этилового спирта-ректификата с заданной T (см. пат. РФ №2569834 A01N 1/02. «Способ криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток», опубл. 27.11. 2015 г., Бюл. №33; см. пат. РФ №2195111, A01N 1/02, «Способ криоконсервирования клеточных суспензий», опубл. 27.12.2002 г., Бюл. №36). (Е.П. Сведенцов. Криоконсерванты для живых клеток. - Сыктывкар, 2010. - 80 с. (Коми научный центр УрО РАН) и др.).
В качестве прототипа нами использована технология неконтролируемого замораживания образцов периферической крови при температуре минус 80°С (Uncontrolled-rate freezing and storage at - 80oC, with only 3.5% DMSO in cryoprotective solution for 109 autologous peripheral blood progenitor cell transplantations / P. Halle, O. Tournilhac, W. Knopinska-Posluzny et al. // Transfusion.- 2001.- Vol. 41.- P. 467-473). В работе дана оценка 109 аутологичных трансплантаций. Криоконсервант содержал 1% человеческого сывороточного альбумина, 2,5% гидроксиэтилкрахмала и 3,5% ДМСО с ПП в пределах 0,325 в конечной концентрации (это токсичное вещество). После смешивания криоконсерванта с суспензией КППК в равных пропорциях биообъект переносили непосредственно в камеру морозильника-хранилища при температуре минус 80°С. Продолжительность криоконсервации в среднем составляла 7 недель, способствовала успешному приживлению трансплантата из расчета средней величины на 1 кг массы тела: NC в среднем 6,34×108 (диапазон 0,02-38,3×108), CD34+ клеток (0,23-58,5×104), CFU-GM (1,38-405,7) и была сравнимой с той, которая была получена при стандартной процедуре контролируемого замораживания КППК. Подбор температуры замораживания КППК был подобран эмпирически лабораторным путем.
Недостатком такого способа замораживания КППК являются: способ не отработан для промышленного производства, недостаточно технологичен, использует ДМСО с ПП порядка 0,325, обеспечивает сохранность недостаточного количества полноценных консервированных КППК для трансплантации.
Техническим результатом предложенного решения является: повышение эффективности замораживания взвеси клеток-предшественников периферической крови с использованием криоконсерванта на основе диметилсульфоксида низкой токсичности и современных технических средств.
A
Этот результат достигается тем, что в способе нерегламентированного замораживания клеток-предшественников периферической крови при температуре минус 80°С под защитой диметилсульфоксида, включающем приготовление раствора криоконсерванта, добавление его с концентрацию взвеси аферезных клеток-предшественников периферической крови со стволовыми клетками в равных пропорциях, подготовку к замораживанию, включающую охлаждение взвеси с клетками-предшественниками периферической крови в камере охлаждения до температуры плюс 4°С и замораживание взвеси с клетками-предшественниками периферической крови в режиме трехступенчатой программы в электрических рефрижераторах с установленной на каждом этапе контрольной температурой изотермической холодовой адаптации, при этом в качестве криоконсерванта используют 10% раствор Dimethylsulfoxide («Sigma-Aldrich», France) высокой степени очистки (≥99,99%) с 1111 в пределах 0,200-0,220 при длине волны 275 нм, который в условиях гипотермии добавляют в ареактогенный раствор для инфузий из натрия хлорида 2,25 г и воды для инъекций до 250 мл в пластиковом контейнере до получения концентрации DMSO 10%, перемешивают при плюс 4°С, выпускают избыточный воздух и часть клеточной взвеси из криопакета, запаивают, маркируют, помещают в алюминиевый пенал-холдер и осуществляют нерегламентированное замораживание клеток-предшественников периферической крови в режиме трехступенчатой программы, на первом этапе которой биообъект выдерживают 10 мин при плюс 4°С, на втором этапе биообъект быстро переносят в морозильник с T минус 28±1°С, t=25 мин., по завершении которого биообъект незамедлительно переносят в морозильник-хранилище с заданной температурой минус 80±2°С для окончательного замораживания и длительной криоконсервации КППК. Замороженные КППК отогревают интенсивным покачиванием криопакета в водной среде при температуре плюс 38 ÷ плюс 43°С до достижения температуры в клеточной взвеси плюс 2 ÷ плюс 4°С.
Сущность изобретения заключается в совокупности существенных признаков, достаточной для достижения обеспечиваемого изобретением технического результата.
Существенными признаками предложенного способа, совпадающими с известными признаками, являются: А - приготовление криоконсерванта в камере охлаждения при плюс 4±1°С; Б - добавление криоконсерванта в концентрат клеток-предшественников периферической крови в равных пропорциях в условиях гипотермии плюс 4±1°С; В - многоэтапное замораживание взвеси с КППК от плюс 17÷ плюс 25°С до минус 80°С для окончательного замораживания и длительной криоконсервации КППК с использованием электрорефрижераторов с установленной контрольной температурой на каждом этапе замораживания.
Существенными отличительными признаками способа нерегламентированного замораживания КППК при температуре минус 80°С под защитой 10% DMSO являются: Г - низкая токсичность криоконсерванта: в известном способе использовали ДМСО с ПП порядка 0,325 (это вещество токсичное), в заявляемом способе используют раствор Dimethylsulfoxide («Sigma-Aldrich», France) высокой степени очистки (≥99,99%) с ПП порядка 0,200-0,220 (это очень чисто); в известном способе 100% ДМСО разбавляли 1% раствором человеческого альбумина с риском развития аллергических реакций в виде крапивницы, анафилактического шока и других жизнеугрожающих осложнений; в заявляемом способе ДМСО разводят аректогенным раствором для инфузий из натрия хлорида 2,25 г и воды для инъекций до 250 мл в пластиковом контейнере до получения концентрации DMSO 10%, который медленно добавляют в концентрат аферезных КППК в равных пропорциях, постоянно перемешивая в пластиковом криопакете, удаляют из него избыточный воздух и часть клеточной взвеси для лабораторных исследований, после чего криопакет герметизируют, маркируют и помещают в алюминиевый пенал-холдер. Д - осуществляют нерегламентированное замораживание, на первом этапе которого биообъект выдерживают 10 мин в электрическом холодильнике марки Sanyo MBR-506D с установленной температурой плюс 4±1°С, на втором этапе биообъект переносят в электроморозильник марки Sanyo MDF-U5411 с заданной ТА минус 28±1°С и выдерживают в этих условиях в течение 25 мин., на третьем этапе биообъект переносят в морозильник-хранилище марки Sanyo MDF-U53 с заданной температурой минус 80±2°С для окончательного замораживания и длительной криоконсервации КППК.
Способ нерегламентированного замораживания клеток-предшественников периферической крови при температуре -80оС под защитой DMSO заключается в следующем (пример выполнения):
- производят заготовку концентрата КППК. Концентрат КППК получают методом сепарации на аппарате Amicus в объеме от 80,0 до 150,0 (96,30±7,3) мл в стандартную эластичную полимерную упаковку, откуда закрытым способом переводят в пластиковые криопакеты;
- готовят криоконсервирующий раствор, для чего берут раствор Dimethylsulfoxide («Sigma-Aldrich», France) высокой степени очистки (≥99,99%) без запаха с ПП в пределах 0,200-0,220 и в условиях гипотермии плюс 4°С медленно добавляют его в плазмозамещающий ареактогенный раствор для инфузий из натрия хлорида 2,25 г и воды для инъекций до 250 мл в пластиковом контейнере до получения конечной концентрации DMSO 10%, постоянно перемешивая, герметизируют, маркируют и помещают его для охлаждения в электрический холодильник до температуры плюс 4°С;
- производят подготовку полученной клеточной взвеси к замораживанию: для этого охлажденный до температуры плюс 4°С 10% раствор DMSO медленно добавляют в концентрат аферезных КППК в равных пропорциях, постоянно перемешивая в пластиковом криопакете, удаляют из него избыточный воздух, разливают по пробиркам для криоконсервации по 1,5 мл в каждую, герметизируют, маркируют и через порт-луер берут пробу одноразовым шприцем для количественной и качественной оценки клеточного материала, криопакет помещают в алюминиевый пенал-холдер;
A
A
- производят нерегламентированное замораживание КППК от плюс 17÷ плюс 25°С до минус 80°С. Криобиологическую технологию осуществляют в режиме трехступенчатой программы в электрических рефрижераторах с установленной температурой изотермической холодовой адаптации (T), на первом этапе которого биообъект выдерживают 10 мин в электрическом холодильнике Sanyo MBR-506D с установленной температурой плюс 4±1°С, на втором этапе биообъект переносят в электроморозильник Sanyo MDF-U5411 с заданной T минус 28±1°С и выдерживают в этих условиях в течение 25 мин., на третьем этапе биообъект переносят в морозильник-хранилище Sanyo MDF-U53 с заданной температурой минус 80±2°С для окончательного замораживания и длительной криоконсервации КППК;
- замороженные КППК отогревают интенсивным покачиванием криопакета в водной среде при температуре плюс 38 ÷ плюс 43°С до достижения температуры в клеточной взвеси плюс 2 ÷ плюс 4°С.
После замораживания КППК известным способом в режиме Та минус 28±1°С, t=25 мин количество МКЦ (миелокариоцитов) составляло 89,85±7,8%, мононуклеаров (в т.ч. бласты, промиелоциты, миелоциты, лимфоцитф, моноциты) - 82,3±11,8%, из них жизнеспособных (устойчивых к витальному красителю) - 87,5±19,8%, CD34+клеток - 73,93±17,6%, КОЕс (колониеобразующих единиц) - 54,2±2,7%, КлОЕ (кластерообразующих единиц) - 30,60±16,5%.
После замораживания КППК предлагаемым способом в режиме Та минус 28±1°С, t=25 мин количество МКЦ (миелокариоцитов) составляло 89,85±7,8%, мононуклеаров (в т.ч. бласты, промиелоциты, миелоциты, лимфоцитф, моноциты) - 82,3±11,8%, из них жизнеспособных (устойчивых к витальному красителю) - 87,5±19,8%,
CD34+клеток - 73,93±17,6%, КОЕс (колониеобразующих единиц) - 54,2±2,7%, КлОЕ (кластерообразующих единиц) - 30,60±16,5%.
Сравнительный анализ результатов криоконсервирования КППК, замороженных известным и заявляемым способами предоставлен в табл.1.
Примечание: выделенные жирным петитом цифры имеют p<0,05 к известному способу замораживания КППК.
Использование технического решения «Способ нерегламентированного замораживания клеток-предшественников периферической крови при температуре минус 80°С под защитой диметилсульфоксида» по сравнению с прототипом позволяет повысить сохранность клеток-предшественников периферической крови, жизнеспособность при криоконсервации благодаря тому, что в качестве криоконсерванта используют 10% Dimethylsulfoxide («Sigma-Aldrich», France) высокой степени очистки (≥99,9%) с ПП в пределах 0,200-0,220, который разбавляют в плазмозамещающем ареактогенном растворе для инфузий из натрия хлорида 2,25 г и воды для инъекций (заменитель 1% альбумина и аутоплазмы), что позволяет снизить токсичность криоконсервирующего раствора и риски посттрансфузионных осложнений. Использование современных лицензионных электрических рефрижераторов иностранного производства (Франции) позволяет повысит технологичность процесса нерегламентированного замораживания, провести охлаждение биообъектов согласно контрольных режимов температуры холодовой адаптации, повысить в конечном итоге получение более качественного продукта.
При использовании фондов научно-технической литературы эквивалентных решений не обнаружено, что подтверждает новизну предлагаемого способа криоконсервирования КППК.
Использование простых приемов и доступного оборудования подтверждает промышленную применимость.
Неочевидность и оригинальный подход к решению проблемы подтверждает изобретательский уровень.
Исследования выполнены на базе лаборатории клеточных технологий ФГБУН «Кировский НИИ гематологии и переливания крови ФМБА России».