ШТАММ ГРИБА ШИИТАКЕ Lentinula edodes GNA01 ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПЛОДОВЫХ ТЕЛ
SHIITAKE MUSHROOM STRAIN Lentinula edodes GNA01 FOR PRODUCING FRUIT BODIES

Область техники
Настоящее изобретение относится к штамму Lentinula Edodes. Более конкретно, настоящее изобретение относится к новому штамму грибов шиитаке [Lentinula Edodes (Berk.) Pegler] с новой морфологией и вкусом, определенному как Lentinula Edodes GNA01 (учетный номер: КССМ11135Р), и плодовому телу, полученному при культивировании указанного штамма.
Предшествующий уровень техники
Грибы шиитаке (также называемые pyogo, двойное название: Lentinula Edodes (Berk.) Pegler), принадлежащие к роду Lentinula, семейству Thcholomataceae, были впервые представлены научному миру английским ботаником Беркли после того, как он собрал их в Японии. Родиной грибов шиитаке являются Корея, Китай и Япония. В Корее грибы шиитаке имеют различные названия, например hyangsim, mago дубовый гриб, и они известны как один из трех известных съедобных грибов, наряду с сосновыми грибами и Sarcodon aspratus.
Грибы шиитаке размножаются и растут на мертвой древесине стволов или ветвей широколиственных пород деревьев, таких как дуб (например, желудевые деревья, монгольский дуб, корейский дуб), краснолистный граб, каштан и т.д., с весны до осени, но в настоящее время могут искусственно культивироваться. В отличие от других грибов грибы шиитаке выращивают при умеренных температурах (оптимально при 22~28°C до 32°C).
Грибы шиитаке обычно образуют обширный мицелий с пряжками. Эти виды грибов являются двудомными с тетраполярностью. Когда споры грибов прорастают, они производят гифы, называемые монокарионами, с одним ядром в каждом отделении. На каком-то этапе их роста два монокариона, относящихся к различным группам совместимости, сливаются, образуя дикарион (dikaryon) (гибридный штамм). Дикарион имеет коричневый цвет и затвердевает на свету, превращаясь в плодовое тело. Гифы грибов шиитаке растут, хотя и медленнее, чем гифы гриба вешенки, но достаточно хорошо на бревнах дубовых деревьев.
Плодовое тело, как показано на фиг.1 и 2, представляет собой гемиангиокарп и имеет ножку, соединенную с центром шляпки, откуда отходят пластинки. Шляпка бледная или темно-коричневая, в то время как ножка и пластинки имеют белесый цвет. Круглые шляпки могут иметь различный диаметр от менее чем 3 см и до более чем 10 см в зависимости от питательных веществ, окружающей среды и вида гриба. На ранней стадии развития плодового тела шляпка загибается внутрь, но по мере того как плодовое тело становится все больше, она уплощается. Грибы шиитаке имеют жесткие мясистое плодовое тело с характерным запахом, который становится сильнее после высушивания. Пластинки тонкие и белые, а ножка белая или коричневатая и при этом очень волокнистая.
В 1970-х было обнаружено, что лентинан, β-D-глюкан, полученные из грибов шиитаке, обладают противораковой активностью. С тех пор изучали фармацевтическую активность гриба шиитаке (Chihara и др., 1970; Tamura и др., 1997). Из питательных веществ в грибах шиитаке обнаружены неочищенные белки, гликолипиды, зола, углеводы, волокна и аминокислоты. В последние годы грибы шиитаке использовались для приготовления различных пищевых продуктов, закусок, ферментированных молочных напитков, супов, и т.д. (Ryu, 1998), и активно исследовались на наличие физиологически активных компонентов, обладающих противовоспалительными, антигипертоническими и антитромбозными эффектами (Ohnuma и др., 2000;.. Yaoita и др., 1998, 1999).
Однако грибы шиитаке, в отличие от других грибов, имеют один урожайный период длительностью в 4~5 лет, и исследования селекции грибов шиитаке требуют больших расходов. В этих условиях исследования по разработке вариантов грибов шиитаке главным образом проводились в Научно-исследовательском центре лесных грибов при поддержке Национальной лесной коллективной федерации, а также в Корейском Институте Леса в Корее.
Вывели весьма ограниченное число вариантов корейского гриба шиитаке, и ни один из них не превосходил своими свойствами японские варианты. Существует потребность в новых вариантах грибов шиитаке. Поскольку Международная Конвенция по Охране Новых Сортов Растений Международного Союза по Охране Новых Сортов Растений (УПОВ) была применена для грибов шиитаке, начиная с 2008 года, за использование японского или китайского вариантов необходимо платить отчисления.
Таким образом, существует острая необходимость в разработке нового варианта грибов шиитаке, который по общим свойствам превосходил бы известные варианты, в том числе японские и китайские грибы.
Краткое описание изобретения
Техническая проблема
С учетом указанных выше проблем, возникших в предшествующем уровне техники, авторы настоящего изобретения проводили исследования по разработке нового штамма грибов шиитаке, что привело к настоящему изобретению.
Целью настоящего изобретения является создание нового варианта грибов шиитаке, которые, в целом, по форме близки к шарообразной, причем и ножка, и шляпка включены в сферу или сферообразную форму.
Еще одной целью настоящего изобретения является создание нового варианта гриба шиитаке, который не только обладает характерным запахом гриба шиитаке, но также имеет сладкий вкус.
Еще одной целью настоящего изобретения является создание нового варианта грибов шиитаке, которые имеют более плотную мякоть, чем обычные грибы шиитаке, и которые могут храниться в два раза дольше и вырастают до размеров в два или более раз превышающих обычные грибы шиитаке, без открытия шляпки.
Еще одной целью настоящего изобретения является создание нового варианта грибов шиитаке, которые имеют белесый вид поверхности плодового тела и, следовательно, превосходят обычные грибы шиитаке с точки зрения коммерческой ценности.
Еще одной целью настоящего изобретения является создание нового варианта грибов шиитаке, которые устойчивы к погоде, в частности, к высоким и низким температурам, и, следовательно, могут выращиваться круглый год.
Указанные выше и другие задачи, свойства и другие преимущества настоящего изобретения будут более понятны из следующего подробного описания.
Техническое решение
Указанные выше цели могут быть достигнуты за счет предоставления нового штамма грибов шиитаке Lentinula edodes (Berk.) Pegler GNA01. Этот штамм была депонирован в Корейском Центре Культур Микроорганизмов 23 ноября 2010 года (учетный номер №: KCCM11135P).
Кроме того, настоящее изобретение предлагает плодовое тело гриба шиитаке, выращенное из штамма по п.1.
В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения плодовое тело по форме напоминает шар с отсутствием дифференциации на шляпку и ножку.
В другом предпочтительном варианте плодовое тело имеет сладкий вкус.
В другом предпочтительном варианте осуществления плодовое тело имеет белесый вид его поверхности.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления плодовое тело является аспорогенным.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления новый штамм размножается путем диссоциации части ткани плодового тела.
Полезные эффекты
Свойствами нового штамма грибов шиитаке по настоящему изобретению являются следующие.
Во-первых, гриб шиитаке по настоящему изобретению не имеет отдельных шляпки и ножки и в целом напоминает по форме шар, причем и шляпка, и ножка интегрированы в шар или шарообразную форму.
В отличие от обычных грибов шиитаке с характерным запахом, новый штамм грибов шиитаке по настоящему изобретению имеет сладкий вкус, а также характерный запах.
Дополнительно, новый штамм грибов шиитаке по настоящему изобретению имеет более плотную мякоть, чем обычные грибы шиитаке, и могут храниться в два раза дольше, и вырастают до размеров, превосходящих на два или более раз обычные грибы шиитаке, без открытия из шляпки.
Дополнительно, новый штамм грибов шиитаке по настоящему изобретению демонстрирует белесый вид поверхности плодового тела и, следовательно, превосходит обычные грибы шиитаке с точки зрения коммерческой ценности.
Кроме того, новый штамм грибов шиитаке по настоящему изобретению является устойчивым к погодным условиям, в частности, к высоким и низким температурам, и, следовательно, может выращиваться круглый год.
Краткое описание графических фигур
Фиг.1 представляет собой фотографию обычных грибов шиитаке в процессе роста.
Фиг.2 представляет собой фотографию, показывающую общую морфологию обычного гриба шиитаке, показанного на фиг.1 после сбора урожая, и его продольное сечение.
Фиг.3 представляет собой фотографию гриба шиитаке нового штамма по настоящему изобретению (Lentinula edodes (Berk.) Pegler GNA01) в процессе роста.
Фиг.4 представляет собой фотографию, показывающую общую морфологию гриба шиитаке нового штамма Lentinula edodes (Berk.) Pegler GNA01, показанного на фиг.3 после сбора урожая, и его поперечное сечение.
Предпочтительно воплощение
Чтобы детально объяснить настоящее изобретение, а также проинструктировать специалистов в данной области по выполнению настоящего изобретения, насколько возможно использованы термины, широко распространенные в этой области. Термины, которые авторы настоящего изобретения, по необходимости, выбирают для описания конкретных моментов, не должны быть истолкованы в простом значении самих слов, но в контексте фразы или предложения, где они употреблены.
Теперь следует сослаться на прилагаемые чертежи и предпочтительные варианты осуществления для объяснения настоящего изобретения.
Однако настоящее изобретение не ограничивается приведенными здесь воплощениями и может быть реализовано в другой модальности. В описании для обозначения одинаковых или подобных компонентов используются одинаковые ссылки.
Согласно первому аспекту настоящее изобретение направлено на создание нового штамма шиитаке Lentinula edodes (Berk.) Pegler GNA01, способного производить плодовое тело, морфологически напоминающее по форме шар, где нет дифференциации на ножку и шляпку.
Новый штамм грибов шиитаке Lentinula edodes (Berk.) Pegler GNA01 (учетный номер: KCCM11135P) по настоящему изобретению может производить плодовое тело, напоминающее по форме шар или шарообразную форму с отсутствием дифференциации на ножку и шляпку.
Все известные до сих пор грибы шиитаке, независимо от их вариантов, имеют шляпки и ножки. В противоположность этому новый штамм Lentinula edodes (Berk.) Pegler GNA01 по настоящему изобретению образует шар или шарообразную форму, в котором нельзя различить шляпку и ножку. Плодовые тела шарообразной формы превосходят обычные грибы шиитаке с точки зрения ощущения еды, а также вкуса и аромата. В частности, новый штамм гриба шиитаке в дополнение к характерному запаху имеет сладкий вкус. Кроме того, новый штамм грибов шиитаке демонстрирует белесый вид поверхности плодового тела и, таким образом, более ценен с коммерческой точки зрения.
Новый штамм по изобретению разработали путем скрещивания монокариотических штаммов грибов шиитаке. Как будет изложено подробно, два монокариотических штамма скрещивают друг с другом с образованием первичного гибридного штамма, который затем подвергают обратному скрещиванию с одним материнским монокариотическим штаммом с получением вторичного гибридного штамма. Первичный и вторичный гибридные штаммы снова скрещивают с получением нового штамма по настоящему изобретению. Поскольку филогенетические отношения между грибами шиитаке не установлены, невозможно определить филогенетическое положение нового штамма. Однако принимая во внимание морфологические, физиологические и культурные свойства, новый штамм, полученный путем гибридизации монокариотических штаммов грибов шиитаке, определен как Lentinula edodes (Berk.) Pegler GNA01. Описание морфологических, физиологических и культурных свойств нового штамма будет дано ниже.
Пример 1: Выделение и морфологические свойства нового штамма грибов шиитаке
1. Формирование гибридного штамма первого поколения
Sammyungjin Research Institute L26, из научно-исследовательского института, расположенного в провинции Fujian, Китая и Kyoungwon 9015 (939) использовали в качестве материнских штаммов для получения нового штамма по настоящему изобретению.
(1) Выделение единичных спор
Шляпки гриба шиитаке из штамма L26 и Kyoungwon 9015 (939) помещали в соответствующие чашки Петри и через 24 часа споры, выпавшие на чашки Петри, собирали, разбавляли до нужной концентрации стерильной водой и рассевали на чашках с картофельным агаром. Первичные гифы, пророщенные путем культивирования спор при температуре 25°C, разделяли, используя зубочистки, с последующей инокуляцией гиф в соответствующие чашки с картофельным агаром. Указанные чашки с картофельным агаром инкубировали при 25°C в течение 14 дней, после чего гифы отделяли от чашек и наблюдали образование пряжек под микроскопом. Только гифы без пряжек хранили в 10% растворе глицерина и хранили в холодильнике до использования в экспериментах.
(2) Гибридизация
Чисто отделенные единичные споры грибов шиитаке (монокариотические) засевали в чашки с картофельным агаром и инкубировали при 25°C в течение 14 дней. Для использования в гибридизации отбирали гифы, которые хорошо росли и были в избыточном количестве в мицелии. Выбранные монокариотические мицелии, то есть мицелии, выращенные на чашках с картофельным агаром, разрезали на кружочки диаметром 1 см. Один единственный гиф (монокариотический) и еще один единственный гиф (монокариотический) инокулировали на расстоянии 3 см друг от друга в свежую чашку картофельного агара, которую затем инкубировали при 25°C в течение 15~20 дней в инкубаторе. Гифы разделяли и наблюдали с помощью микроскопии формирование пряжек. Выбор был сделан из штаммов, в которых сформировались пряжки.
(3) Культивирование первого поколения гибридного штамма
Дубовые опилки, опилки белой березы и пшеничные отруби смешивали в соотношении 3:1:1, и смеси позволяли иметь содержание воды 62%. 850 мл флакон для культивирования грибов, заполняли 580 г смеси. Стержень с диаметром 2 см выдвигали в центре входа в бутылку из верхней к нижней части, чтобы сформировать путь, проходящий через смесь с последующей стерилизацией при 105°C в течение 70 мин при атмосферном давлении, а затем автоклавированием при 121°C в течение 110 мин при высоком давлении. После охлаждения бутылок до 17°C, выбранные штаммы инокулировали и выращивали при 22°C в течение 50 дней в темноте. Среду переносили в камеру частичного затемнения (browning chamber) и перфорировали один или несколько раз, чтобы регулировать содержание воды. После завершения в течение 60 дней среду переносили в камеру размножения, погружали в воду и подвергали проращиванию и культивированию при 17~23°C при влажности 85%~90%.
2. Формирование гибридного штамма второго поколения
(1) Выделение монокариотических гиф
Единичные споры выделяли из плодовых тел культивируемого первого поколения гибридного штамма и обрабатывали таким же образом, как описано выше, с получением монокариотических гиф, которые затем хранили в холодильнике до использования в экспериментах.
2) Гибридизация
Чисто изолированные монокариотические гифы L26 и монокариотические гифы первого поколения гибридного штамма скрещивали таким же образом, как описано выше, с получением второго гибридного штамма.
(3) Выращивание штамма второго поколения
Гибридный штамм 2-го поколения культивировали таким же образом, как описано для штамма первого поколения.
3. Формирование нового штамма Lentinula edodes (Berk.) Pegler GNA01
(1) Выделение монокариотических гиф
Единичные споры выделяли из плодовых тел культивируемого гибридного штамма второго поколения и обрабатывали таким же образом, как описано выше, с получением монокариотических гифов, которые затем хранили в холодильнике до использования в экспериментах.
(2) Гибридизация
Чисто изолированные монокариотические гифы гиф 1-го и 2-го гибридных штаммов скрещивали таким же образом, как описано выше, с целью выбрать штамм с пряжками, который идентифицировали как Lentinula edodes (Berk.) Pegler GNA01.
(3) Культивирование Lentinula edodes (Berk.) Pegler GNA01
Lentinula edodes (Berk.) Pegler GNA01 культивировали таким же образом, как описано для штамма первого поколения.
4. Выбор нового штамма гриба шиитаке
Среди плодовых тел первичный выбор делали из тех, которые были превосходны с точки зрения морфологии, цвета и блеска, размера и вкуса. Затем, плодовое тело, которое морфологически было почти полностью сферическим, с плотной, но не слишком жесткой консистенцией, и демонстрировало белесый вид всей поверхности плодовых тел, выбирали снова и штамм депонировали на хранение в Корейском Центре Культур Микроорганизмов 23 ноября 2010 (учетный номер: KCCM11135P).
5. Морфологические особенности Lentinula edodes (Berk.) Pegler GNA01
Lentinula edodes (Berk.) Pegler GNA01 выглядит как шар, не имеющий ни шляпки, ни ножки. Поскольку новый штамм не имеет ни шляпки ни ножки, он не способен открывать шляпку. Грибы вырастают в два раза больше типичных грибов шиитаке с весом до 150 г. Ткань гриба Lentinula edodes (Berk.) Pegler GNA01 является мягкой, упругой и белой, сладкой на вкус, с характерным ароматом. Ощущение от еды является очень хорошим, потому что они хорошо жуются. Тело Lentinula edodes (Berk.) Pegler GNA01 тверже, чем у обычных грибов шиитаке, и плодоношение имеет белесый вид на всей поверхности, что повышает коммерческую ценность плодового тела Lentinula edodes (Berk.) Pegler GNA01. Так как штамм Lentinula edodes (Berk.) Pegler GNA01 является аспорогенным, распространение грибов осуществляется путем диссоциации ткани плодового тела.
Пример 2: Физиологические свойства Lentinula edodes (Berk.) Pegler GNA01
(1) Оптимальная температура для роста гиф
Мицелий, выращенный на чашках с картофельном агаром, нарезали на кружочки диаметром 10 мм, инокулировали в центр соответствующей МСМ чашки с агаром и культивировали при различных температурах в течение 14 дней. Измерения выросшего мицелия указывали температуру роста в диапазоне от 5°C до 29°C, с оптимальной температурой 17~23°C в дневных условиях и 5~10°C в ночных условиях.
(2) Оптимальная кислотность для роста гиф
Для исследования оптимальной активности роста гиф, pH 25 мл бульона пептон-дрожжевого экстракта с глюкозой доводили от 4 до 8. После стационарного культивирования в течение 14 дней, высушенные мицелии взвешивали, показывая, что кислотность для роста гиф варьирует в диапазоне от 4,5 до 8, при оптимальном pH, примерно 6,5.
Пример 3: Выращивание нового штамма Lentinula edodes (Berk.) Pegler GNA01
1. Приготовление среды
(1) Сырье
опилки широколиственных деревьев (дуб)
Опилки широколиственных деревьев, доступные для культивирования Lentinula edodes (Berk.) Pegler GNA01 представляют собой стружки размером 5 мм или меньше, со свежим и ярким цветом. Опилки содержат от 14 до 18% воды, и имеют pH около 8,0 и общее содержание азота от 0,3% или более. Содержание кадмия строго ограничено стандартом или меньше. Желуди с 12 лет до 15 лет является предпочтительным. Предпочтительный диаметр варьирует от 12 до 15 см. Опилки, предпочтительно, состоят из 60% стружек с размером 3~5 мм, 30% стружек с размером 2~3 мм, и 10% стружек с размером от 1 до 2 мм.
Опилки белой березы
Среда для культивирования грибов шиитаке обычно содержит сахар в качестве органического источника углерода. Вместо сахара применяют опилки белой березы в количестве 20% по настоящему изобретению.
Пшеничные отруби
Пшеничные отруби содержат белки в количестве 13,5%, сырой жир в количестве 3,8%, сырую клетчатку в количестве 10,4%, доступные углеводы в количестве 55,40%, золу в количестве 4,8% и воду в количестве 12,1%. Кроме того, пшеничные отруби содержат витамин B1 в количестве 7,9 мг/кг и 16 аминокислот с содержанием глутаминовой кислоты, равным 46%.
(2) Соотношение компонентов в среде
Дубовые опилки, опилки белой березы и пшеничные отруби смешивали в соотношении 3:1:1 (об/об/об).
(3) Смешивание
Высушенное сырье смешивают с водой в течение 2 часов при содержании воды в смеси, равном 60~62%. Полученную среду предпочтительно используют в течение 4 часов после приготовления.
2. Заправка (заполнение)
Полипропиленовый конверт для культивирования с размерами: высота 60 см × ширина 18 см × толщина 0,055 мм заполняют средой на высоту 42 см, с общей массой 3,0 кг ~ 3,2 кг. Верхнюю часть заполненного конверта запечатывают, используя капсулу и затем ватную пробку.
3. Стерилизация
Стерилизацию проводили при 105°C в течение 70 мин при атмосферном давлении и затем при 121°C в течение 110 минут (эффективное время стерилизации) под высоким давлением.
4. Охлаждение
Среду охлаждали до 17°C в стерильной охлаждающей камере, хранящейся при 7°C.
5. Инокуляция
В среде формировали пустоту путем погружения перфоратора в центр среды. Штамм-инокулум вводили в количестве 10 г на конверт в пустоту, а затем закрывали ватной пробкой.
6. Культивирование
Индивидуальные конверты устанавливали в культуральных платах и инкубировали при 22°C в течение 50 дней в условиях хорошей вентиляции воздуха. Атмосферу поддерживали на уровне влажности 60% с содержанием диоксида углерода 1200 м.д. или менее. Условия темноты обеспечивали в течение всего роста штамма.
7. Частичное затемнение
После перевода в камеру для частичного затемнения (browning chamber), конверт перфорировали один или несколько раз, чтобы отрегулировать содержание воды. Процедуру продолжали в течение 60 дней. Количество отверстий может зависеть от содержания воды так, что масса может быть уменьшена до, приблизительно, 30%, от массы заправленной среды. Как правило, первую перфорацию проводят около 10 дней после переноса в камеру, и другая перфорация может быть проведена в зависимости от содержания воды.
8. Управление разведением
Через 60 дней после выдерживания в камере, среды перемещали камеры для разведения и подвергали процессу погружения. Предпочтительно, температуру воды для процесса погружения доводят до температуры около 10°C, ниже комнатной температуры перед погружением сред в воду на 8 часов. Дополнительно вода предпочтительно имеет pH 6,5. По окончании погружения в воду среды размещали на столе, чтобы грибы могли плодоносить. Камеры разведения выдерживались при оптимальной температуре 17~23°C в дневных условиях и 5~10°C в ночных условиях, при влажности 85%~90% в ранней стадии плодоношения гриба и 60% на этапе сбора урожая. Как правило, урожай можно получить через 15 дней после погружения в воду.
Хотя предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения раскрыты для иллюстративных целей, специалистам в данной области техники будет понятно, что возможны различные модификации, дополнения и замены без отклонения от объема и сущности изобретения, раскрытых в прилагаемой формуле изобретения.