СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИИ ОШИБОК СПАРИВАНИЯ ДНК

1. Количественный способ для определения, обладает ли обследуемый человек нарушенной функцией репарации ошибочно спаренных оснований ДНК, включающий а) получение экстракта ядерных белков из образца, полученного из организма обследуемого человека, б) получение экстрактов ядерных белков с нормальной функцией ММR и дефектной функцией ММR в качестве положительного и отрицательного контроля, соответственно, в) смешивание в отдельных сосудах каждого ядерного экстракта с, по меньшей мере, одним гетеродуплексным ДНК-субстратом, включающим ошибочно спаренные основания, г) выполнение анализа репарации ошибочно спаренных оснований указанного образца и контрольных экстрактов ядерных белков и указанных субстратов, и д) определение, способен ли ядерный экстракт, полученный из указанного образца, к репарации указанного ДНК-субстрата.
2. Способ по п. 1, в котором указанный образец включает нормальные клетки, полученные из конститутивных тканей.
3. Способ по п. 2, в котором указанные нормальные клетки представляют собой фибробласты.
4. Способ по п. 2, в котором указанные нормальные клетки представляют собой клетки, полученные из крови.
5. Способ по п. 1, в котором указанный субстрат получен из плазмиды с последовательностью SEQID NO:1.
6. Способ по п. 5, в котором указанный субстрат дополнительно включает нуклеотидную последовательность, которая выбрана из группы, состоящей из последовательностей SEQID NO:2 и SEQIDNO:3.
7. Способ по п. 6, в котором указанный ядерный экстракт с дефектной функцией ММR получен из линии клеток, которая выбрана из группы, состоящей из линии клеток НСТ116 и LоVо.
8. Способ по п. 7, в котором общее количество ядерного экстракта в каждом сосуде находится в диапазоне от 50 до 500 мкг, предпочтительно от 50 до 200 мкг, более предпочтительно от 75 до 100 мкг.
9. Количественный способ для выявления гена репарации ошибочно спаренных оснований с дефектной функцией, включающий
а) получение экстракта ядерных белков из образца, полученного из организма обследуемого человека,
б) получение экстрактов ядерных белков с нормальной функцией ММR и дефектной функцией ММR в качестве положительного и отрицательного контроля, соответственно,
в) смешивание по меньшей мере одного экстракта ядерных белков с дефектной функцией ММR с указанным ядерным экстрактом, полученным из указанного образца,
г) смешивание в отдельных сосудах каждого ядерного экстракта, полученного на стадиях а-в с, по меньшей мере, одним гетеродуплексным ДНК-субстратом, включающим ошибочно спаренные основания,
д) выполнение анализа репарации ошибочно спаренных оснований с указанном образцом и контрольными экстрактами ядерных белков и указанным субстратом, и
е) выявление указанного дефектного гена путем определения, способен ли ядерный экстракт указанного образца к репарации указанного субстрата и комплементации указанного ядерного экстракта с дефектной функцией ММR.
10. Способ по п. 9, в котором указанный образец включает нормальные клетки, полученные из конститутивной ткани.
11. Способ по п. 10, в котором указанные нормальные клетки представляют собой фибробласты.
12. Способ по п. 10, в котором указанные нормальные клетки представляют собой клетки, полученные из крови.
13. Способ по п. 9, в котором указанный субстрат получен из плазмиды с последовательностью SEQID NO:1.
14. Способ по п. 13, в котором указанный субстрат дополнительно включает нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQID NO:2 и SEQID NO:3.
15. Способ по п. 9, в котором указанный ядерный экстракт с дефектной функцией ММR получен из линии клеток, выбранных из группы, состоящей из линии клеток НСТ116 и LоVо.
16. Способ по п. 15, в котором общее количество ядерного экстракта в каждом сосуде находится в диапазоне от 50 до 500 мкг, предпочтительно от 50 до 200 мкг, более предпочтительно от 75 до 100 мкг.
17. Способ диагностики у обследуемого человека синдрома Линча путем выявления дефектного гена репарации ошибочно спаренных оснований ДНК с помощью способа по любому из пп. 9-16, при котором указанный образец представляет собой клинический образец, полученный из конститутивной ткани обследуемого человека.
18. Набор для применения в способе по любому из пп. 1-17, который содержит, по меньшей мере, один гетеродуплексный ДНК-субстрат, включающий ошибку спаривания оснований, по меньшей мере, один ядерный экстракт с дефектной функцией ММR, и ядерный экстракт с нормальной функцией ММR в качестве положительного контроля.
19. Набор по п. 18, в котором указанный ядерный экстракт с дефектной функцией ММR получен из линии клеток с дефицитом ММR, связанным с МLH1, МSН2 или МSН6.
20. Набор по п. 19, который содержит, по меньшей мере, два ядерных экстракта с дефектной функцией ММR.
22. Набор по п. 20, в котором указанные ядерные экстракты с дефектной функцией ММR получены из линий клеток с дефектом ММR, связанным с МLH1 или МSН2/МSН6, соответственно.
22. Набор по п. 21, в котором указанные ядерные экстракты с дефектной функцией ММR получены из клеток НСТ116 и LоVо, соответственно.
23. Набор по п. 22, который дополнительно содержит дополнительные реагенты, необходимые для выполнения анализа ММR.
24. Набор по п. 23, который дополнительно содержит 10x ММR буфер, состоящий из 200 мМ Трис-НСl рН 7,6, 400 мМ КСl, 50 мМ МgСl2,10 мМ глутатиона, 500 Мг/мл БСА, 1 мМ каждого дНТФ и 15 мМ АТФ; и СТОП-раствор для анализа ММR, состоящий из 42 мМ ЭДТА, 1,2% СДС, 50,4 мкг/мл протеиназы К.
25. Набор по п. 23, который содержит реагенты для осветления образца, например ТЭ буфер, фенол/хлороформ/изоамиловый спирт и хлороформ; для осаждения указанного образца, например NаСl и этиловый спирт; и для выявления репарации, например РНКазу А и рестриктазы ВglW и Есо31l с буфером и загрузочной краской.