Анализ параметров индивидуальной устойчивости лабораторных животных к гипоксии в интересах биологического моделирования нейропротекторного и антигипоксического действия лекарственных средств

Биомедицина • № 4, 2013, С. 149-157

Анализ параметров индивидуальной устойчивости лабораторных животных к гипоксии в интересах биологического моделирования нейропротекторного и антигипоксического действия лекарственных средств

Е.Б. Шустов, Н.Н. Каркищенко, В.Н. Каркищенко, Х.Х. Семенов

ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий ФМБА России», Московская область Контактная информация: Шустов Евгений Борисович, shustov-msk@mail.ru

Представлены статистические характеристики биологической модели острой гипобарической гипоксии на мелких лабораторных животных. Показано, что время жизни животных на критической высоте не подчиняется закономерностям нормального распределения и не может в полной мере отражать потребности фармакологии для оценки нейропротекторной и антигипоксической активности лекарственных средств. Высотный порог и бальная оценка индивидуальной устойчивости к гипоксии являются более адекватными (по статистическим характеристикам) маркерами устойчивости к гипоксии у биомоделей.

Ключевые слова: гипоксия, биологическое моделирование, антигипоксическая активность, статистические характеристики распределения.

Гипоксия как типовой патогенетический процесс, присущий основной массе заболеваний и патологических состояний человека, издавна является объектом научного изучения. Нейропротекторная и антигипоксическая активность лекарственных средств являются базовыми свойствами для широкой группы лекарственных средств (ноотропов, антиги-поксантов, антиоксидантов, блокаторов кальциевых каналов, цитопротекторов, актопротекторов, транквилизаторов, регуляторных пептидов и многих других). В связи с этим важное значение приобретает возможность корректной экстраполяции результатов различных

серий экспериментальных исследований на лабораторных животных, их популяционный перенос, возможность прямого сопоставления друг с другом, прогнозирование активности лекарственных средств с антигипоксическим действием у человека [1]. Статистически корректно это можно сделать, если анализируемые параметры состояния животных подчиняются закономерностям нормального распределения и исследуемая выборка может быть соотнесена с генеральной совокупностью животных (популяционный перенос). В то же время, сама по себе экстремальная гипоксия является тем дополнительно действующим

фактором, влияние которого отклоняет статистические характеристики маркерных функциональных показателей от нормального статистического распределения. Возникающий при этом методологический конфликт для своего устранения требует разработки специализированных биологических моделей для исследования экстремальной гипоксии и приводимых к нормальному статистическому распределению параметров оценки устойчивости животных к этому экстремальному фактору.

В публикуемой в этом номере журнала статье «Физиологическое обоснование требований к лабораторным моделям для оптимизации параметров скрининга антигипоксической активности с использованием критериев резистентности к экстремальной ги-поксической гипоксии» [4] нами было показано, что при создании биологических моделей экстремальной гипоксии у лабораторных животных необходимо формирование как минимум моделей двух типов:

• биологической модели с пониженной резистентностью нервной ткани к энергодефициту, не компенсируемому напряжением кислородтранспортной системы организма.

• биологической модели с проявлениями исходного напряжения и истощения регуляторных и энергопродуцирующих механизмов внецентральной локализации (нарушения функции печени, легких, сердца, кроветворных тканей, иммунитета).

Создание биологических моделей первого типа возможно путем направленной селекции низко устойчивой к

гипоксии части популяции мелких лабораторных животных (выведение и поддержание специальных линий). Исходно сниженная резистентность нервной ткани к энергодефициту у животных специальных линий делает их интересными моделями не только для испытания классических антигипоксантов, но и фармакомоделирования процессов восстановления после черепно-мозговых травм, острых или хронических нарушений мозгового кровообращения, нейроинфекций и нейроинтоксикаций, оперативных вмешательств на ЦНС, критической гипертермии (тепловые и солнечные удары).

В фармакологических исследованиях на низко устойчивых к гипоксии линиях животных должны изучаться препараты с антигипоксическим, антиоксидант-ным, ноотропным, противоастениче-ским, нейропротекторным действием, а также средства повышения физической работоспособности.

Второй подход, связанный со снижением резистентности к гипоксии при избыточном напряжении и истощении регуляторных и энергопродуцирующих механизмов, может быть использован для подтверждения адекватности биологического моделирования патологических процессов (например, бронхо-обструктивных заболеваний, инфаркта миокарда, сердечной недостаточности, гепатитов, аутоиммунных поражений, радиационных поражений, поражений экотоксикантами). Проведение тестирования биологических моделей на индивидуальную устойчивость к гипоксическо-му воздействию до и после применения средств лечебно-профилактического или реабилитационного действия позволит объективизировать динамику патогене-

за (или саногенеза) и более качественно оценить эффективность новых лекарственных средств или новых медицинских технологий (включая клеточные технологии). В исследованиях, проводимых в рамках этого направления, целесообразно использовать линии лабораторных животных с высокой резистентностью к гипоксии, чтобы исключить влияние фактора низкой индивидуальной гипок-сической устойчивости на результат последующего тестирования.

В исследованиях на 10 линиях инб-редных мышей коллекционного фонда НЦБМТ[3] было показано, что по генетически детерминированной устойчивости к гипоксическому воздействию линии мышей могут быть разделены на три группы: с низкой (IOR/HabY, CC57WY, СВА^асУ, 101/НУ), средней (С3НАУ СВА/ХУ) и высокой (А^пУ, В10С^, C57BL/6У DBA/2Y) устойчивостью к гипоксии. Однако исследуемый признак (устойчивость к гипоксии по критерию времени жизни на критической высоте) обладает высокой вариабельностью как между животными разных линий, так и между особями внутри каждой линии (коэффициент вариации от 20 до 50%).

Для оценки антигипоксической активности лекарственных средств традиционно используется два подхода: оценка влияния препарата на среднегрупповые показатели индивидуальной гипоксической устойчивости, а также сдвиг в популяционной структуре устойчивости (изменение долей низко- средне- и высокоустойчивых животных). Как правило, первый подход используется для оценки однократного применения препарата, второй -курсового применения лекарственных средств.

Достаточно проблемным видится и выбор адекватного показателя гипокси-ческой устойчивости животных. В высотной физиологии таких показателей несколько: высотный порог, время жизни (для человека аналогом является резервное время пребывания на высоте до потери сознания), время поддержания позы (для человека аналогом является времясохранения деятельности). Дополнительным критерием устойчивости к гипоксии является стойкость гипокси-ческих изменений в постгипоксическом периоде, которые отражаются таким показателем, как время восстановления позы животного при спуске с высоты.

Целью настоящего исследования было изучение закономерностей статистического распределения различных показателей гипоксической устойчивости лабораторных животных - крыс различных линий, в том числе - при использовании лекарственных средств с нейропротекторным и антигипоксиче-ским действием.

При исследовании высотного порога лабораторные животные (крысы) поднимались в барокамере со скоростью 165 м/с до начальной площадки 9000 м (пороговая величина устойчивости для животных с наличием заболеваний или постоперационных состояний), пребывали на этой высоте 5 минут (300 секунд), и вновь поднимались со скоростью 165 м/с до следующей площадки на 1000 м выше, и так далее до фиксирования у животного агонального дыхания. Высота, на площадке которой было зафиксировано агональное дыхание, и является индивидуальным высотным порогом для данного животного. Однако, полученные таким образом данные являются дискретными, ступень повы-

шения порога - 1000 м, они не учитывают фактическое время жизни животных на пороговой высоте. Для перевода дискретной шкалы в непрерывную могут быть использованы 2 подхода: присвоение каждому временному промежутку (например, 100 секунд) пребывания на высоте балла (табл. 1) или использование дробной высотной шкалы, при которой целая часть равна высоте площадки в километрах, а дробная часть равна отношению длительности жизни на этой высоте в секундах к длительности площадки.

Таблица 1 Балльная оценка устойчивости к гипоксии по критерию высотного порога для крыс

Высота Время жизни, секунды

100 200 300

9000 1 2 3

10000 4 5 6

11000 7 8 9

12000 10 11 12

13000 13 14 15

14000 16 17 18

15000 19 20 21

Например, крыса прожила на площадке 13000 м 120 секунд при длительность площадки 300 секунд. Тогда высотный порог животного будет равен 13,4 км, а его устойчивость к гипоксии по высотному порогу будет равна 14 баллам. По граничному времени площадки на соответствующей высоте может быть оценена выживаемость животных как показатель популяционной устойчивости к гипоксии данного уровня (рис. 1).

Проведенный дисперсионный анализ показал, что на значения высотного порога не оказывают существенного влияния факторы линейности животных

100 100

9 10 11 12 13 14

высота, км

Рис. 1. Выживаемость крыс (площадка 300 секунд) на различных высотах.

(нелинейные, линии WAG, Wistar, коэффициент детерминации модели D=0,03, p=0,33) и их пола (самки, самцы, коэффициент детерминации модели D=0,06, p=0.29).

Статистические характеристики высотного порога для крыс представлены в табл. 2. Обращает на себя внимание, что статистические характеристики высотного порога для животных соответствуют основным требованиям нормального распределения (среднее значение, мода и медиана распределения близки друг другу, параметры эксцесса и асимметричности в пределах нормативных значений). Представленная на рис. 2 частотная кривая распределения значений показателя высотного порога подтверждает соответствие этого параметра нормальному статистическому распределению. Следовательно, результаты, полученные при исследовании гипоксической устойчивости крыс по критерию высотного порога, могут быть соотнесены с генеральной совокупностью животных, для них возможно прямое соотнесение результатов различных серий исследований, в том числе при исследованиях антигипоксической активности лекарственных средств. Статистическая обработка этого показателя любыми методами, в том числе - пара-

метрическими, является корректной. Для высотного порога характерна низкая вариативность показателя (коэффициент вариации 5%), что отражает популяционную стабильность показателя.

Таблица 2 Статистические параметры распределения значений высотного порога для крыс

Статистический параметр Значение

Среднее, км 12,78718

Стандартная ошибка, км 0,076846

Медиана, км 13

Мода, км 13

Стандартное отклонение, км 0,678685

Дисперсия выборки,км 0,460613

Эксцесс -0,62224

Асимметричность -0,01619

Интервал,км 2,9

Минимум,км 11,3

Максимум, км 14,2

Коэффициент вариации 0,053075

Счет 78

Исходя из критериев S-образного шкалирования, границами диапазонов устойчивости к гипоксии являются точки перегиба кумулятивной кривой. Следовательно, животные, высотный порог которых менее 12 км, будут относится к низко устойчивым к гипоксии, от 12 до 13,5 км - к среднеустойчивым, более 13,5 км - высоко устойчивым животным. Для популяции здоровых крыс структура высотной устойчивости будет иметь следующий вид: до 10% крыс будут иметь низкую устойчивость, около 15% - высокую, остальные 75% - среднюю устойчивость к гипоксии.

11 11,5 11,9 12 12,5 13 13,5 14 14,5 15

Высотный порог, км

Частота Кумуляция

Рис. 2. Частотные кривые распределения значений высотного порога.

При исследовании антигипоксиче-ской активности лекарственных средств в случае высокой антигипоксической активности должно отмечаться повышение высотного порога и увеличение доли высокоустойчивых животных при снижении доли низко устойчивых. При умеренной антигипоксической активности могут или умеренно повышаться среднегрупповые значения высотного порога, или незначительно меняться соотношения между подгруппами животных по уровню устойчивости к гипоксии.

Для проверки этого предположения была выполнена оценка влияния на крыс внутрибрюшинного введения ноотроп-ного препарата пирацетама в дозе 120 мг/кг, для которого антигипоксическая активность давно известна и прямо вытекает из молекулярных механизмов его действия [2]. Полученные результаты выявили у пирацетама в исследованной дозе умеренную антигипоксическую активность, которая проявилась в повышении среднегруппового значения высотного порога с 12,8 до 13,2 км (103% от контроля), повышении доли высокоустойчивых животных с 14 до 29% при практически не измененной доле низкоустойчивых животных (изменение с 7 до 5%, не достоверно). Бальная оценка высотной устойчивости живот-

ных изменилась с 12,22 до 13,65 баллов (112%). Таким образом, умеренное ан-тигипоксическое действие пирацетама проявляется на среднеустойчивой к гипоксии группе и ведет к перераспределении 15% животных из среднеустойчивых в высокоустойчивую группу. Более низкая доза пирацетама (100 мг/кг) при однократном введении не оказали влияния на высотный порог у крыс.

Второй подход к оценке индивидуальной устойчивости животных к экстремальной гипоксии связан с комплексным учетом основных показателей: время жизни (ВЖ), время поддержания позы (ВПП), время восстановления позы (ВВП), фиксируемых при барокамерном подъеме животных на критическую высоту (для крыс - 11500 м).

Контрольная группа характеризовалась следующими значениями показателей (табл. 3). Особенности статистического распределения показателей (частотный анализ) представлены на рис. 3.

Таблица 3

Статистические характеристики чувствительности к гипоксии животных

контрольной группы

Статистический параметр ВПП ВЖ ВВП

Среднее 8,90625 95,55208 23,17708

Стандартная ошибка 0,258656 2,64056 0,919214

Медиана 10 95 20

Мода 10 110 20

Стандартное отклонение 2,534304 25,8721 9,006424

Дисперсия выборки 6,422697 669,3657 81,11568

Эксцесс 0,010361 3,047795 -0,3459

Асимметричность -0,32845 0,734026 0,244251

Интервал 10 170 45

Минимум 5 40 0

Максимум 15 210 45

Коэффициент вариации 0,284553 0,270764 0,388592

Счет 96 96 96

so

-io ---------------------------------------------------------------------------------------------

секунды

------ВПП -------ВВП

ВЖ

4o so so loo 12o 14o iso iso

секунды

Рис. З. Кривые частотного распределения значений показателей индивидуальной устойчивости животных к гипоксии.

Анализ рис. З показывает, что применяемое гипоксическое воздействие является экстремальным. Об этом свидетельствуют резкий обрыв значений времени первого падения и времени

жизни животных в области более высоких значений, характеризующих устойчивость животных, дополнительный локальный максимум на кривой времени жизни в области низких значений. Асимметрия распределения времени восстановления позы в сторону более высоких значений, также отражающая низкую гипоксическую устойчивость.

Так как кривые распределения этих показателей (ВПП, ВЖ, ВВП) далеки от кривой нормального распределения, обычные статистические методы обработки результатов (оценка достоверности различий, корреляционный, регрессионный и мультифакторый анализы) к этим показателям не могут быть применены. В связи с этим для статистической обработке результатов исследований в условиях гипоксического воздействия нами были использованы методы дисперсионного факторного анализа и ранговой корреляции по Спирмену, не зависящие от вида статистического распределения анализируемых показателей. Матрица корреляционных связей между этими показателями у контрольных животных в условиях гипоксии представлена в табл.4.

Таблица 4 Матрица корреляционных связей показателей устойчивости к гипоксическому воздействию

N=96 ВПП ВЖ ВВП

ВПП 1

ВЖ -0,07337 1

ВВП 0,027022 0,090422 1

Корреляционный анализ показывает, что параметры устойчивости животных к гипоксическому воздействию (ВПП, ВЖ, ВВП) являются не зависимыми

друг от друга. Для оценки индивидуального уровня гипоксической устойчивости может быть использован балльный метод шкалирования, основанный на характеристиках кривых распределения анализируемых параметров (табл. 5). С учетом того, что традиционно значимость времени жизни оценивается исследователями выше (а многие вообще не учитывают остальные показатели), для этого показателя вводится весовой коэффициент 2. Оценка индивидуальной устойчивости животных к гипоксии проводится путем присвоения баллов экспериментально полученным данным с учетом весовых коэффициентов и их суммирования.

Частотная кривая распределения интегрального показателя индивидуальной устойчивости к гипоксии (ИУГ) представлена на рис. 4.

ИУГ

35

6 7 8 9 10 12 14 15 16 18 20

баллы

Рис. 4. Частотное распределение значений показателя индивидуальной устойчивости к гипоксии животных без применения средств фармакологической коррекции.

Анализ рис. 4 показывает, что частотная кривая распределения значений показателя ИУГ близка к кривой нормального распределения, и, следовательно, этот показатель может быть использован как интегральный показатель устойчивости лабораторных животных к гипобариче-ской гипоксии. При этом точки перегиба частотной кривой позволяют статисти-

Таблица 5

Балльные шкалы оценки показателей индивидуальной гипоксической устойчивости

лабораторных животных

Показа- тель Баллы Весовой коэффици- ент

1 2 3 4 5

ВПП, с До 5 6-9 10 11-14 15 и более 1

Вж, с До 60 61-80 81-100 101-120 121 и более 2

ВВП, с 41 и более 31-40 21-30 11-20 10 и менее 1

чески корректно произвести распределение животных на подгруппы по уровню устойчивости к гипоксии: до 9 баллов включительно - низкая устойчивость к гипоксии (17% наблюдений), от 10 до 14 баллов включительно - средняя устойчивость к гипоксии (63% наблюдений), 15 и более баллов - повышенная устойчивость к гипоксии (20% наблюдений).

В условиях фармакологической коррекции значения показателей ВПП и ВВП в основном не выходят за пределы диапазонов, указанных в таблице 5. В отдельных случаях ВПП может превышать 60 секунд, а ВВП практически быть равным нулю. В таких случаях показатели получают оценку в 10 баллов. Показатель времени жизни на высоте 11500 мв условиях фармакологической коррекции увеличивается до 500 и более секунд (рис.5).

ВЖ

30

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500

секунды

Рис. 5. Частотная кривая распределения показателя «Время жизни на высоте» для лабораторных животных в условиях фармакологической коррекции гипоксии.

Анализ рисунка показывает, что левые (начальные и центральные участки кривой, до 160 с) соответствуют закономерностям нормального распределения, а правые участки (более 160 с) представляют собой отрезок монотонного равномерного снижения. Для этого участка необходимо предусмотреть дополнительную бальную шкалу оценки времени жизни на высоте в условиях фармакологической коррекции:

От 161 до 200 секунд - 6 баллов, от 201 до 300 секунд - 7 баллов, от 301 до 350 секунд - 8 баллов, от 351 до 400 секунд - 9 баллов, более 400 с - 10 баллов.

Таблица 6 Влияние пирацетама на показатели индивидуальной устойчивости животных к гипоксии

Показатель Контроль Пирацетам

Время поддержания позы, с 8,9 ± 0,3 12,7 ± 0,8

Время жизни на высоте, с 96 ± 3 252 ± 34

Время восстановления позы,с 23 ± 1 21 ± 10

Индивидуальная устойчивость к гипоксии, баллы 12,2 ± 0,3 24,9 ± 2,1

В соответствии с разработанными шкалами бальных оценок были обработаны значения, полученные при тестировании индивидуальной устойчивости к гипоксии крыс при внутри-брюшинном введении пирацетама в дозе 120 мг/кг (табл. 6).

Заключение

Статистический анализ показателей, отражающих различные подходы к оценке индивидуальной чувствительности лабораторных животных к острой гипобарической гипоксии, показал, что оценка высотного порога переносимости гипоксии и комплексная оценка индивидуальной устойчивости к гипоксии с нормированием по предложенным бальным шкалам приближаются по параметрам к нормальному распределению и являются предпочтительными (по сравнению с временем жизни животных на критической высоте) в исследованиях с применением фармакологических средств с нейро-протекторным и антигипоксическим действием.

Список литературы

1. Методические рекомендации по экспериментальному изучению препаратов, предлагаемых для клинического изучения в качестве ан-тигипоксических средств / под ред. Л.Д. Лукьяновой. М. 1990. 18 с.

2. Новиков В.В., Шустов Е.Б., Горан-чук В.В. Коррекция функциональных состояний при экстремальных воздействиях. СПб: Наука. 1998. 544 с.

3. Семенов Х.Х., Каркищенко Н.Н., Казакова Л.Х., Бескова Т.Б., Луш-никова З.С., Егорова И.Ю., Матве-енко Е.Л. Межлинейные различия в чувствительности к острой гипо-барической гипоксии у инбредных мышей коллекционного фонда // Биомедицина. 2013. №1. С. 78-82.

4. Шустов Е.Б., Каркищенко Н.Н., Каркищенко В.Н., Ганапольский В.П., Ржепецкая М.К. Физиологическое обоснование требований к лабораторным моделям для оптимизации параметров скрининга антиги-поксической активности с использованием критериев резистентности к экстремальной гипоксической гипоксии // Биомедицина. 2013. №4.

Analysis of individual tolerance parameters of laboratory animals to hypoxia in biological modeling neuroprotective and antihypoxant action of medicines

E.B. Shustov, N.N. Karkischenko, V.N. Karkischenko, Kh.Kh. Semenov

Presents the statistical characteristics of the biological model of acute hypobaric hypoxia in small laboratory animals. It is shown that the lifetime of the animals at a critical height does not obey the laws of the normal distribution and do not fully reflect the needs of pharmacology for the evaluation of the neuroprotective and antihypoxant activity of medicines. High-altitude threshold and a points-based assessment of individual resistance to hypoxia are more adequate (according to the statistical characteristics) markers of resistance to hypoxia of biomodels.

Key words: hypoxia, biological modeling, antihypoxant activity, statistical characteristics of the distribution.