СПОСОБЫ И КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНЫХ КЛЕТОК
METHODS AND COMPOSITIONS FOR OBTAINING GENETICALLY ENGINEERED CELLS

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
По настоящей заявке испрашивается приоритет на основании предварительной патентной заявки США № 62/543359, поданной 9 августа 2017 г. и озаглавленной «СПОСОБЫ И КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНЫХ КЛЕТОК», содержание которой включено в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме.
ЗАЯВЛЕНИЕ О ВКЛЮЧЕНИИ СПИСКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
Настоящая заявка подана со списком последовательностей в электронном формате. Список последовательностей подан в виде файла, имеющего название 735042010540SEQLIST.txt, который был создан 11 июля 2018 г. и имеет размер 35434 килобайт. Информация, заключенная в списке последовательностей, поданном в электронном формате, включена в настоящий документ в полном объеме.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Настоящее изобретение относится к способам получения T-клеток для клеточной терапии, композициям, получаемым данными способами, и к способам введения клеток субъектам. В частности, изобретение относится к получению сконструированных T-клеток, таких как клетки, экспрессирующие генно-инженерные рецепторы, например, генно-инженерные рецепторы антигенов, такие как сконструированные (рекомбинантные) TCR и химерные рецепторы антигенов (CAR), или другие рекомбинантные химерные рецепторы. Особенности способов включают получение более единообразного и/или предсказуемого T-клеточного продукта, и/или продукта с более низкой токсичностью по сравнению с другими способами. Предложенные способы включают инкубацию клеток в стимулирующих условиях для индукции размножения или пролиферации подобных наивным T-клеток относительно не подобных наивным T-клеток в стимулированной композиции, что, в свою очередь, может приводить к преимущественной трансдукции клеток, происходящих от подобных наивным T-клеток. Особенности способов также могут включать сокращение затрат, уменьшение количества этапов и расхода ресурсов в сравнении с другими способами.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Существуют различные способы получения клеток для терапевтического применения и введения клеток. Например, известны способы получения клеток, включая T-клетки, для инженерии и клеточной терапии, в том числе способы, включающие истощение или обогащение по определенным субпопуляциям клеток. Существует потребность в усовершенствованных способах, например, для уменьшения токсичности, связанной с введением при определенной адоптивной клеточной терапии, для усовершенствования производственного процесса, для облегчения введения и/или для уменьшения затрат или используемых ресурсов. Предложены способы, клетки, композиции, наборы и системы, удовлетворяющие эту потребность.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В настоящем документе предложены способы генной инженерии T-клеток, включающие инкубацию исходной композиции в стимулирующих условиях в течение 2-6 дней, при этом указанная исходная композиция содержит популяцию T-клеток, включающую подобные наивным T-клетки и не подобные наивным T-клетки, при этом стимулирующие условия включают присутствие стимулирующего реагента, способного активировать один или более внутриклеточных сигнальных доменов одного или более компонентов комплекса TCR и/или один или более внутриклеточных сигнальных доменов одной или более костимулирующих молекул, с получением стимулированной композиции, и введение нуклеиновой кислоты, кодирующей генно-инженерный рекомбинантный рецептор, в стимулированную композицию T-клеток, при этом введение проводят в течение по меньшей мере части периода инкубации.
В настоящем документе предложены способы генной инженерии T-клеток, включающие инкубацию исходной композиции в стимулирующих условиях в течение 2-6 дней, при этом указанная исходная композиция содержит популяцию T-клеток, включающую подобные наивным T-клетки и не подобные наивным T-клетки, при этом стимулирующие условия включают присутствие стимулирующего реагента, способного активировать один или более внутриклеточных сигнальных доменов одного или более компонентов комплекса TCR и/или один или более внутриклеточных сигнальных доменов одной или более костимулирующих молекул, с получением стимулированной композиции, и инкубацию исходной композиции в стимулирующих условиях проводят до, в процессе и/или после введения нуклеиновой кислоты, кодирующей генно-инженерный рекомбинантный рецептор. В некоторых вариантах осуществления инкубацию проводят в течение по меньшей мере 3 дней. В некоторых случаях инкубацию проводят в течение по меньшей мере 4 дней. В некоторых вариантах осуществления инкубацию проводят в течение по меньшей мере 5 дней. В некоторых вариантах осуществления инкубацию проводят в течение по меньшей мере 6 дней.
В настоящем документе предложены способы стимуляции T-клеток, включающие (a) инкубацию в стимулирующих условиях исходной композиции, содержащей T-клетки, включающие необходимое для инициации культуры количество подобных наивным T-клеток, или их подмножества CD8+ T-клеток, с получением стимулированной композиции; и (b) введение в стимулированную композицию клеток нуклеиновой кислоты, кодирующей генно-инженерный рекомбинантный рецептор, с получением данным способом произведенной композиции, содержащей T-клетки, экспрессирующие генно-инженерный рекомбинантный рецептор. В некоторых вариантах осуществления T-клетки включают подобные наивным T-клетки и не подобные наивным T-клетки, при этом стимулирующие условия предпочтительно индуцируют размножение или пролиферацию подобных наивным T-клеток в сравнении с не подобными наивным T-клетками в стимулированной композиции. В некоторых вариантах осуществления введение проводят в течение по меньшей мере части периода инкубации или проводят после инкубации.
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
В некоторых вариантах осуществления необходимое для инициации культуры количество подобных наивным T-клеток или их подмножества CD8+ T-клеток составляет от, или от примерно, 0,1×10 до 5×10, от, или от примерно, 0,1×10 до 4×10, от, или от примерно, 0,1×10 до 2×10, от, или от примерно, 0,1×10 до 1×10, от, или от примерно, 1×10 до 5×10, от, или от примерно, 1×10 до 4×10, от, или от примерно, 1×10 до 2×10, от, или от примерно, 2×10 до 5×10, от, или от примерно, 2×10 до 4×10 подобных наивным T-клеток или их подмножества CD8+ T-клеток. В некоторых случаях необходимое для инициации культуры количество подобных наивным T-клеток или их подмножества CD8+ T-клеток составляет по меньшей мере, или по меньшей мере примерно, или составляет, или составляет примерно, 0,5×10, 0,75×10, 1×10, 1,5×10, 2×10 или 4×10 подобных наивным T-клеток или их подмножества CD8+ T-клеток. В некоторых случаях необходимое для инициации культуры количество подобных наивным T-клеток или их подмножества CD8+ T-клеток составляет по меньшей мере, или по меньшей мере примерно, или составляет, или составляет примерно, 2×10 подобных наивным T-клеток или их подмножества CD8+ T-клеток.
8
8
Предложены способы стимуляции T-клеток, включающие инкубацию в стимулирующих условиях исходной композиции, содержащей T-клетки, включающие необходимое для инициации культуры количество подобных наивным T-клеток или их подмножества CD8+ T-клеток, составляющее от, или от примерно, 1×10 до 4×10 подобных наивным T-клеток или их подмножества CD8+ T-клеток, с получением стимулированной композиции. В некоторых аспектах T-клетки включают подобные наивным T-клетки и не подобные наивным T-клетки, при этом стимулирующие условия предпочтительно индуцируют размножение или пролиферацию подобных наивным T-клеток в сравнении с не подобными наивным T-клетками в стимулированной композиции.
8
В некоторых вариантах осуществления необходимое для инициации культуры количество подобных наивным T-клеток или их подмножества CD8+ T-клеток составляет по меньшей мере, или по меньшей мере примерно, или составляет, или составляет примерно, 2×10 подобных наивным T-клеток или их подмножества CD8+ T-клеток. В некоторых аспектах необходимое для инициации культуры количество представляет собой количество подобных наивным CD8+ T-клеток.
В некоторых из таких вариантов осуществления подобные наивным T-клетки или подобные наивным CD8+ T-клетки имеют на поверхности T-клеточный маркер активации, выбранный из группы, состоящей из CD45RA, CD27, CD28 и CCR7; и/или не имеют на поверхности маркер, выбранный из группы, состоящей из CD25, CD45RO, CD56, CD62L, KLRG1; и/или имеют низкую экспрессию CD95; и/или лишены внутриклеточной экспрессии цитокина, выбранного из группы, состоящей из IL-2, IFN-γ, IL-4, IL-10. В некоторых вариантах осуществления подобные наивным клетки или подобные наивным CD8+ клетки имеют на поверхности T-клеточный маркер активации, выбранный из группы, состоящей из CD45RA, CD27, CD28, и CCR7; и/или не имеют на поверхности маркер, выбранный из группы, состоящей из CD45RO, CD56, KLRG1; и/или имеют низкую экспрессию CD95. В некоторых вариантах осуществления подобные наивным T-клетки или подобные наивным CD8+ клетки представляют собой CD45RA+, CD27+, CCR7+, CD62- и/или CD45RO- клетки.
В некоторых из таких вариантов осуществления не подобные наивным T-клетки не имеют на поверхности T-клеточный маркер активации, выбранный из группы, состоящей из CD45RA, CD27, CD28, и CCR7; и/или имеют на поверхности маркер, выбранный из группы, состоящей из CD25, CD45RO, CD56, CD62L, KLRG1 и перфорина; и/или имеют внутриклеточную экспрессию цитокина, выбранного из группы, состоящей из IL-2, IFN-γ, IL-4, IL-10; и/или имеют высокую экспрессию CD95. В некоторых аспектах не подобные наивным T-клетки представляют собой CD45RA-, CD27-, CCR7-, CD62+ и/или CD45RO+ клетки.
В некоторых вариантах осуществления клетки исходной композиции не подвергали и не подвергают перед инкубацией этапу селекции на основе эндогенного T-клеточного поверхностного маркера, который позволяет различать подобные наивным и не подобные наивным T-клетки.
В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает введение генно-инженерного рекомбинантного рецептора в стимулированные клетки, с получением данным способом произведенной композиции, содержащей T-клетки, экспрессирующие генно-инженерный рекомбинантный рецептор. В некоторых случаях инкубацию композиции в стимулирующих условиях проводят до, в процессе и/или после введения нуклеиновой кислоты, кодирующей генно-инженерный рекомбинантный рецептор.
В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный рецептор способен связывать антиген-мишень, который связан с, специфичен для, и/или экспрессируется на клетке или ткани, связанной с заболеванием, нарушением или состоянием. В некоторых примерах заболевание, нарушение или состояние представляет собой инфекционное заболевание или нарушение, аутоиммунное заболевание, воспалительное заболевание или опухоль, или рак. В некоторых случаях антиген-мишень представляет собой опухолевый антиген. В некоторых вариантах осуществления антиген-мишень выбирают из интегрина αvβ6 (интегрина avb6), антигена созревания В-клеток (BCMA), карбоангидразы 9 (CAIX), Her2/neu (рецептора тирозинкиназы erbB2), L1-CAM, B7-H3, B7-H6, карбоангидразы 9 (CA9, также известной как CAIX или G250), раково-тестикулярного антигена, раково-тестикулярного антигена 1B (CTAG, также известного как NY-ESO-1 и LAGE-2), карциноэмбрионального антигена (CEA) и поверхностного антигена вируса гепатита B, антифолатного рецептора, циклина, циклина A2, лиганда 1 хемокина с мотивом C-C (CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD133, CD138, CD171, хондроитинсульфат протеогликана 4 (CSPG4), белка эпидермального фактора роста (EGFR), эпителиального гликопротеина 2 (EPG-2), эпителиального гликопротеина 40 (EPG-40), эфрина B2, рецептора эфрина A2 (EPHa2), erb-B2, erb-B3, erb-B4, димеров erbB, мутантного рецептора эпидермального фактора роста III типа (EGFR vIII), фолат-связывающего белка (FBP), подобного Fc-рецептору белка 5 (FCRL5; также известного как гомолог Fc-рецептора 5 или FCRH5), эмбрионального ацетилхолинового рецептора (эмбрионального AchR), фолат-связывающего белка (FBP), фолатного рецептора альфа, ганглиозида GD2, O-ацетилированного GD2 (OGD2), ганглиозида GD3, глипикана-3 (GPC3), связанного с G-белками рецептора 5D (GPRC5D), Her2/neu (рецептора тирозинкиназы erbB2), Her3 (erb-B3), Her4 (erb-B4), димеров erbB, человеческого высокомолекулярного антигена, связанного с меланомой (HMW-MAA), поверхностного антигена вируса гепатита B, человеческого лейкоцитарного антигена A1 (HLA-A1), человеческого лейкоцитарного антигена A2 (HLA-A2), рецептора альфа IL-22 (IL-22R-альфа), IL-13R-альфа2 (IL-13Rα2), рецептора домена киназной вставки (kdr), легкой цепи каппа, Lewis Y, L1-молекулы клеточной адгезии (L1-CAM), CE7 эпитопа L1-CAM, представителя A семейства 8 белков, содержащих богатые лейцином повторы (LRRC8A), Lewis Y, меланома-ассоциированного антигена (MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE-A10, мезотелина (MSLN), c-Met, мышиного цитомегаловируса (CMV), муцина 1 (MUC1), MUC16, лигандов представителя D группы 2 естественных киллеров (NKG2D), мелана A (MART-1), молекулы нейрональной клеточной адгезии (NCAM), онкоэмбрионального антигена, предпочтительно экспрессируемого антигена меланомы (PRAME), рецептора прогестерона, простатического специфического антигена, антигена простатических стволовых клеток (PSCA), простатического специфического мембранного антигена (PSMA), подобного тирозинкиназному рецептору рецептора-сироты 1 (ROR1), сурвивина, трофобластного гликопротеина (TPBG, также известного как 5T4), опухоль-ассоциированного гликопротеина 72 (TAG72), тирозиназа-зависимого белка 1 (TRP1, также известного как TYRP1 или gp75), тирозиназа-зависимого белка 2 (TRP2, также известного как допахром таутомераза, допахром дельта-изомераза или DCT), фолатного рецептора-α, 8H9, двойного антигена, гликопротеина 100 (gp100), рецептора фактора роста эндотелия сосудов (VEGFR), рецептора фактора роста эндотелия сосудов 2 (VEGF-R2), рецептора эстрогена, рецептора прогестерона, антигена опухоли Вильмса 1 (WT-1), специфического для патогена или экспрессируемого патогеном антигена, и антигена, связанного с универсальным маркером.
В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный рецептор представляет собой, или содержит, функциональный не-TCR антигенный рецептор, либо TCR или его антигенсвязывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный рецептор представляет собой химерный антигенный рецептор (CAR).
В некоторых из таких вариантов осуществления рекомбинантный рецептор содержит внеклеточный домен, содержащий антигенсвязывающий домен, необязательно, при этом антигенсвязывающий домен специфически связывает антиген-мишень. В некоторых случаях антигенсвязывающий домен представляет собой, или содержит, антитело, или фрагмент антитела, который, необязательно, представляет собой одноцепочечный фрагмент. В некоторых аспектах фрагмент содержит вариабельные области антитела, соединенные гибким линкером. В некоторых случаях фрагмент представляет собой scFv.
В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный рецептор дополнительно содержит спейсер и/или шарнирную область. В некоторых аспектах рекомбинантный рецептор содержит внутриклеточную сигнальную область. В некоторых примерах внутриклеточная сигнальная область содержит внутриклеточный сигнальный домен. В некоторых аспектах внутриклеточный сигнальный домен представляет собой, или содержит, основной сигнальный домен, сигнальный домен, способный индуцировать основной сигнал активации в T-клетке, сигнальный домен компонента T-клеточного рецептора (TCR) и/или сигнальный домен, содержащий иммунорецепторный тирозиновый активирующий мотив (ITAM). В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен представляет собой, или содержит, внутриклеточный сигнальный домен цепи CD3, необязательно, дзета-цепи CD3 (CD3ζ), или его сигнальный фрагмент.
В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный рецептор дополнительно содержит трансмембранный домен, расположенный между внеклеточным доменом и внутриклеточной сигнальной областью. В некоторых аспектах внутриклеточная сигнальная область дополнительно содержит костимулирующую сигнальную область. В некоторых вариантах осуществления костимулирующая сигнальная область содержит внутриклеточный сигнальный домен T-клеточной костимулирующей молекулы или его сигнальный фрагмент. В некоторых случаях костимулирующая сигнальная область содержит внутриклеточный сигнальный домен CD28, 4-1BB или ICOS, или его сигнальный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления CAR содержит scFv, специфичный для антигена, трансмембранный домен, цитоплазматический сигнальный домен из костимулирующей молекулы, который, необязательно, представляет собой, или содержит, 4-1BB, и цитоплазматический сигнальный домен из основной сигнальной ITAM-содержащей молекулы, который, необязательно, представляет собой, или содержит, сигнальный домен CD3-дзета, и, необязательно, дополнительно содержит спейсер между трансмембранным доменом и scFv; CAR содержит, в следующем порядке, scFv, специфичный для антигена, трансмембранный домен, цитоплазматический сигнальный домен из костимулирующей молекулы, который, необязательно, представляет собой, или содержит, сигнальный домен 4-1BB, и цитоплазматический сигнальный домен из основной сигнальной ITAM-содержащей молекулы, который, необязательно, представляет собой сигнальный домен CD3-дзета; или CAR содержит, в следующем порядке, scFv, специфичный для антигена, спейсер, трансмембранный домен, цитоплазматический сигнальный домен из костимулирующей молекулы, который, необязательно, представляет собой, или содержит, сигнальный домен 4-1BB, и цитоплазматический сигнальный домен из основной сигнальной ITAM-содержащей молекулы, который, необязательно, представляет собой, или содержит, сигнальный домен CD3-дзета.
В некоторых вариантах осуществления костимулирующая сигнальная область находится между трансмембранным доменом и внутриклеточной сигнальной областью.
В некоторых из таких вариантов осуществления стимулирующее условие включает инкубацию со стимулирующим реагентом, способным активировать T-клетки, CD4+ T-клетки и/или CD8+ T-клетки; способным индуцировать сигнал через комплекс TCR; и/или способным индуцировать пролиферацию T-клеток, CD4+ T-клеток и/или CD8+ T-клеток. В некоторых вариантах осуществления стимулирующее условие включает инкубацию со стимулирующим реагентом, способным активировать один или более внутриклеточных сигнальных доменов одного или более компонентов комплекса TCR и/или один или более внутриклеточных сигнальных доменов одной или более костимулирующих молекул. В некоторых случаях стимулирующий реагент включает основное средство, которое специфически связывает компонент комплекса TCR, необязательно, которое специфически связывает CD3. В некоторых вариантах осуществления основное средство представляет собой антитело или антигенсвязывающий фрагмент.
В некоторых примерах стимулирующее средство дополнительно включает вспомогательное средство, которое специфически связывает T-клеточную костимулирующую молекулу, необязательно, при этом костимулирующую молекулу выбирают из группы, состоящей из CD28, CD137 (4-1-BB), OX40 или ICOS. В некоторых вариантах осуществления основное средство представляет собой антитело или антигенсвязывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления основное и вспомогательное средства включают антитела, необязательно, при этом одно или более стимулирующих средств включают анти-CD3 антитело и анти-CD28 антитело.
В некоторых вариантах осуществления основное и/или вспомогательное средства находятся на поверхности твердой подложки. В некоторых случаях твердая подложка представляет собой, или содержит, гранулу. В некоторых вариантах осуществления гранула имеет диаметр, превышающий, или превышающий примерно, 3,5 мкм, но не более, чем примерно 9 мкм, или не более, чем примерно 8 мкм, или не более, чем примерно 7 мкм, или не более, чем примерно 6 мкм, или не более, чем примерно 5 мкм. В некоторых примерах гранула имеет диаметр, составляющий, или составляющий примерно, 4,5 мкм. В некоторых аспектах гранула имеет диаметр, такого, или примерно такого, размера, как лимфоцит или антигенпредставляющая клетка.
В некоторых вариантах осуществления гранула является инертной. В некоторых случаях гранула представляет собой, или имеет, полистирольную поверхность и, необязательно, имеет магнитное или суперпарамагнитное ядро.
В некоторых вариантах осуществления стимулирующее условие включает инкубацию клеток при соотношении гранул и клеток, составляющем от, или от примерно, 1:1 до 10:1, от, или от примерно, 1:1 до 8:1, от, или от примерно, 1:1 до 6:1, от, или от примерно, 1:1 до 4:1, от, или от примерно, 1:1 до 3:1, от, или от примерно, 2:1 до 4:1, от, или от примерно, 2:1 до 3:1, от, или от примерно, 1:1 до 2:1, от, или от примерно, 4:1 до 10:1, от, или от примерно, 4:1 до 8:1, от, или от примерно, 4:1 до 6:1, от, или от примерно, 6:1 до 10:1, от, или от примерно, 6:1 до 8:1, от, или от примерно, 8:1 до 10:1, от, или от примерно, 1:1 до 1:10, от, или от примерно, 1:1 до 1:8, от, или от примерно, 1:1 до 1:6, от, или от примерно, 1:1 до 1:4, от, или от примерно, 1:2 до 1:3. В некоторых примерах соотношение гранул и клеток составляет, или составляет примерно, 3:1. В некоторых вариантах осуществления соотношение гранул и клеток составляет, или составляет примерно, 1:1.
В настоящем документе предложены способы генной инженерии T-клеток, включающие инкубацию исходной композиции в стимулирующих условиях в течение 2-6 дней, при этом указанная исходная композиция содержит популяцию T-клеток, включающую подобные наивным T-клетки и не подобные наивным T-клетки, при этом стимулирующие условия включают присутствие стимулирующего реагента, включающего анти-CD3 антитело и вспомогательное средство, представляющее собой анти-CD28 антитело, которые присоединены к грануле, при этом соотношение гранул и клеток в процессе инкубации составляет от, или от примерно, 1:1 до 4:1; и введение нуклеиновой кислоты, кодирующей генно-инженерный рекомбинантный рецептор, в стимулированную композицию T-клеток, при этом введение проводят в течение по меньшей мере части периода инкубации.
В настоящем документе предложены способы генной инженерии T-клеток, включающие инкубацию исходной композиции в стимулирующих условиях в течение 2-6 дней, при этом указанная исходная композиция содержит популяцию T-клеток, включающую подобные наивным T-клетки и не подобные наивным T-клетки, при этом стимулирующие условия включают присутствие стимулирующего реагента, включающего анти-CD3 антитело и вспомогательное средство, представляющее собой анти-CD28 антитело, которые присоединены к грануле, при этом соотношение гранул и клеток в процессе инкубации составляет от, или от примерно, 1:1 до 4:1; и инкубацию исходной композиции в стимулирующих условиях проводят до, в процессе и/или после введения нуклеиновой кислоты, кодирующей генно-инженерный рекомбинантный рецептор.
В некоторых из таких вариантов осуществления T-клетки получены из биологического образца, необязательно, при этом биологический образец получен от субъекта-человека. В некоторых случаях биологический образец представляет собой, или содержит, образец цельной крови, образец лейкоцитарной пленки, образец мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК), образец не фракционированных T-клеток, образец лимфоцитов, образец белых клеток крови, продукт афереза или продукт лейкафереза.
В некоторых вариантах осуществления T-клетки включают CD4+ и/или CD8+ клетки. В некоторых вариантах осуществления T-клетки включают CD4+ и CD8+ T-клетки, и соотношение CD4+ и CD8+ T-клеток составляет от, или от примерно, 2:1 до, или до примерно, 1:5. В некоторых случаях соотношение CD4+ клеток и CD8+ клеток составляет, или составляет примерно, 1:1, 1:2, 2:1, 1:3 или 3:1. В некоторых вариантах осуществления подобные наивным T-клетки включают подобные наивным CD4+ T-клетки и/или подобные наивным CD8+ T-клетки.
В некоторых из таких вариантов осуществления подобные наивным T-клетки являются поликлональными. В некоторых случаях клональность подобных наивным T-клеток определяют путем клонального секвенирования, необязательно, секвенирования нового поколения или анализа спектротипов.
В некоторых вариантах осуществления наличие, количество, число или процентную долю подобных наивным T-клеток определяют методом проточной цитометрии.
В некоторых из таких вариантов осуществления стимулирующее условие не включает N-ацетилцистеин (NAC). В некоторых вариантах осуществления стимулирующее условие не включает IL-15 и/или IL-7. В некоторых вариантах осуществления стимулирующее условие приводит к, или индуцирует гибель не подобных наивным T-клеток или их субпопуляции. В некоторых аспектах стимулирующее условие приводит к индуцируемой активацией клеточной гибели (AICD) не подобных наивным T-клеток или их субпопуляции.
В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает добавление ДНКазы во время инкубации и/или к стимулированной композиции.
В некоторых вариантах осуществления инкубацию проводят в течение более чем, или примерно, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16 дней. В некоторых вариантах осуществления процентная доля клеток в стимулированной композиции, происходящих от подобных наивным T-клеток, возрастает более чем, или более чем примерно, в 1,5 раза, 2 раза, 3 раза, 4 раза, 5 раз, 6 раз, 7 раз, 8 раз, 9 раз, 10 раз, 50 раз, 100 раз в сравнении с процентной долей подобных наивным клеток в исходной композиции. В некоторых вариантах осуществления содержание в стимулированной композиции клеток, происходящих от подобных наивным T-клеток, относительно клеток, происходящих от не подобных наивным T-клеток, увеличивается более чем, или более чем примерно, в 1,5 раза, 2 раза, 3 раза, 4 раза, 5 раз, 6 раз, 7 раз, 8 раз, 9 раз, 10 раз, 50 раз, 100 раз в сравнении с содержанием подобных наивным T-клеток относительно не подобных наивным T-клеток в исходной композиции.
В некоторых случаях стимулированная композиция содержит более 75%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% клеток, которые произошли от подобных наивным T-клеток исходной композиции. В некоторых вариантах осуществления стимулированная композиция содержит менее 10% клеток, произошедших от не подобных наивным T-клеток. В некоторых примерах стимулированная композиция содержит менее 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5% или 0,1% клеток, произошедших от не подобных наивным T-клеток.
В некоторых вариантах осуществления из клеток в исходной композиции большая процентная доля подобных наивным T-клеток, в сравнении с не подобными наивным T-клетками, индуцируются к пролиферации и/или становятся активированными. В некоторых аспектах большая процентная доля T-клеток, которые были подобными наивным в исходной композиции, в сравнении с процентной долей T-клеток, которые были не подобными наивным в исходной композиции, делятся в день 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 после начала указанной инкубации. В некоторых случаях стимулирующие условия способны индуцировать пролиферацию большей процентной доли клеток популяции подобных наивным T-клеток человека, в сравнении с не подобными наивным T-клетками человека, в день 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 после начала инкубации в данных условиях.
EFF
CM
EM
EFF
CM
EM
В некоторых из таких вариантов осуществления не подобные наивным T-клетки выбирают из группы, состоящей из эффекторных T-клеток (T), T-клеток памяти, центральных T-клеток памяти (T), эффекторных T-клеток памяти (T), а также их сочетаний; или не подобные наивным T-клетки представляют собой множество T-клеток, включающее или состоящее из эффекторных T-клеток (T) и/или T-клеток памяти, при этом T-клетки памяти, необязательно, включают центральные T-клетки памяти (T) и/или эффекторные T-клетки памяти (T).
В некоторых вариантах осуществления процентная доля подобных наивным T-клеток в исходной композиции меньше, чем процентная доля сконструированных клеток в стимулированной композиции, происходящих от подобных наивным T-клеток в исходной композиции. В некоторых вариантах осуществления большая процентная доля клеток с введенной нуклеиновой кислотой представляют собой, или получены в результате пролиферации подобных наивным T-клеток в исходной композиции, в сравнении с не подобными наивным T-клетками в исходной композиции.
in vitro
ex vivo
В некоторых из таких вариантов осуществления введение выполняют путем трансдукции. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота представляет собой вирусный вектор. В некоторых случаях вирусный вектор представляет собой ретровирусный вектор. В некоторых аспектах вирусный вектор представляет собой лентивирусный вектор или гамма-ретровирусный вектор. В некоторых вариантах осуществления введение выполняют путем транспозиции транспозона, содержащего молекулу нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления содержание подобных наивным T-клеток относительно не подобных наивным T-клеток в стимулированной композиции возрастает более чем, или более чем примерно, в 1,5 раза, 2 раза, 3 раза, 4 раза, 5 раз, 6 раз, 7 раз, 8 раз, 9 раз, 10 раз, 50 раз, 100 раз в сравнении с содержанием подобных наивным T-клеток относительно не подобных наивным T-клеток в исходной композиции. В некоторых вариантах осуществления стимулированная композиция является более поликлональной или мультиклональной в сравнении с исходной композицией. В некоторых вариантах осуществления способ применяют  или .
В настоящем документе предложены произведенные композиции, полученные любым из способов, предложенных в настоящем документе. Также предложены фармацевтические композиции, содержащие описанные произведенные композиции. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция дополнительно содержит фармацевтический носитель.
В настоящем документе предложены способы лечения, включающие введение субъекту-млекопитающему произведенной композиции, полученной любым из описанных способов, или любой из описанных фармацевтических композиций. В некоторых вариантах осуществления клетки получают от субъекта, которому клетки будут введены.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В настоящем документе предложены способы инкубации (например, стимуляции) клеток в процессе получения клеток для адоптивной клеточной терапии, а также композиции и клетки, полученные данными способами. В некоторых вариантах осуществления клетки включают T-клетки, которые в некоторых аспектах экспрессируют генно-инженерные антигенные рецепторы. В некоторых вариантах осуществления генно-инженерные антигенные рецепторы включают генно-инженерные или рекомбинантные T-клеточные рецепторы (TCR) и функциональные не-TCR антигенные рецепторы, такие как химерные антигенные рецепторы (CAR).
В некоторых вариантах осуществления предложены способы инкубации (например, стимуляции) T-клеток. В известных способах используют анти-CD3 и анти-CD28 для стимуляции T-клеток. Однако используемые в настоящее время способы не направлены на получение конкретных целевых популяций клеток в процессе инкубации, и на получение более желательной популяции T-клеток и связанных с ними благоприятных результатов. Известные способы также не приводят к элиминации из исходной T-клеточной популяции в процессе инкубации нежелательной и конкретной T-клеточной популяции и связанных с ней неблагоприятных результатов. Более того, известные способы не разработаны для элиминации из T-клеточной популяции в процессе инкубации субпопуляции, которая будет использована для получения произведенной композиции, содержащей T-клетки, экспрессирующие генно-инженерный рекомбинантный рецептор. Известные способы также лишены таких преимуществ, как получение более унифицированной и/или предсказуемой популяции T-клеток, полезной для генной инженерии, введения доз и/или достижения клинического ответа.
В некоторых аспектах предложенные варианты осуществления относятся к способам получения в большем количестве более однородной и/или предсказуемой композиции T-клеток, в сравнении с другими способами стимуляции, и, в некоторых аспектах дополнительно имеет место сокращение или элиминация нежелательных популяций T-клеток, например, клеток, присутствие которых может придавать конечному продукту такую гетерогенность, что предсказание активности, эффективности и безопасности становится сложной задачей. В некоторых вариантах осуществления предложенные способы направлены на решение проблем, связанных с получением генно-инженерных T-клеток, в которых большое число, или большинство, таких генно-инженерных клеток происходят от не подобных наивным T-клеток. В некоторых аспектах недостаток персистенции, истощение и/или проблемы, связанные с токсичностью, могут иметь место при адоптивной T-клеточной терапии с использованием композиции, содержащей генно-инженерные клетки, происходящие от не подобных наивным T-клеток, и/или в которых процентная доля или число генно-инженерных клеток, происходящих от не подобных наивным T-клеток, превышает определенный порог. В некоторых вариантах осуществления способы, приводящие к получению композиции генно-инженерных T-клеток, которая обогащена клетками, происходящими от подобных наивным клеток, могут отличаться общим увеличением процентной доли здоровых клеток и/или клеток в композиции, которые характеризуются повышенной персистенцией, в сравнении с другими способами, при использовании которых композиция не настолько обогащена такими подобными наивным клетками.
Соответственно, в число способов получения генно-инженерных T-клеток для адоптивной терапии, предложенных в настоящем документе, входят способы с использованием условий, которые приводят к предпочтительному размножению или пролиферации, или генной инженерии, клеток, происходящих от подобных наивным T-клеток (или происходящих от CD27+, CD45RA+, CCR7+, CD62L- или CD45RO- T-клеток), в сравнении с клетками, происходящими от не подобных наивным T-клеток (или происходящими от CD27-, CD45RA-, CCR7-, CD62L+ или CD45RO+ T-клеток). В некоторых вариантах осуществления способы включают инкубацию T-клеток в исходной композиции, содержащей подобные наивным T-клетки, в стимулирующих условиях, которые предпочтительно приводят к получению стимулированной композиции, содержащей клетки, происходящие от подобных наивным T-клеток исходной композиции. В некоторых аспектах T-клеточная популяция содержит смесь из подобных наивным T-клеток и не подобных наивным T-клеток. В некоторых вариантах осуществления стимулирующие условия предпочтительно индуцируют ответ в не подобных наивным T-клетках, в сравнении с подобными наивным T-клетками. В некоторых случаях ответ включает предпочтительную активацию не подобных наивным T-клеток, что в некоторых вариантах осуществления может приводить к гибели клеток.
В некоторых вариантах осуществления способ включает инкубацию клеток в стимулирующих условиях, включая инкубацию со стимулирующим средством, способным активировать один или более внутриклеточных сигнальных доменов одного или более компонентов комплекса TCR и/или один или более внутриклеточных сигнальных доменов одной или более костимулирующих молекул. В некоторых случаях основное средство специфически связывает CD3 и/или костимулирующую молекулу, выбранную из группы, состоящей из CD28, CD137 (4-1-BB), OX40 или ICOS. Например, в некоторых вариантах осуществления основное средство представляет собой, или содержит, анти-CD3, и вспомогательное средство представляет собой, или содержит, анти-CD28. В некоторых случаях основное и вспомогательное средства включают антитела и/или находятся на поверхности твердой подложки. В некоторых примерах твердая подложка представляет собой гранулу.
В некоторых вариантах осуществления стимулирующее условие включает инкубацию клеток исходной композиции с таким стимулирующим реагентом, например, анти-CD3/анти-CD28 гранулами, в котором соотношение гранул и клеток составляет от, или от примерно, 1:1 до 10:1, от, или от примерно, 1:1 до 8:1, от, или от примерно, 1:1 до 6:1, от, или от примерно, 1:1 до 4:1, от, или от примерно, 1:1 до 3:1, от, или от примерно, 4:1 до 10:1, от, или от примерно, 4:1 до 8:1, от, или от примерно, 4:1 до 6:1, от, или от примерно, 6:1 до 10:1, от, или от примерно, 6:1 до 8:1, от, или от примерно, 8:1 до 10:1, от, или от примерно, 1:1 до 1:10, от, или от примерно, 1:1 до 1:8, от, или от примерно, 1:1 до 1:6, от, или от примерно, 1:1 до 1:4, от, или от примерно, 1:2 до 1:3. В некоторых конкретных примерах соотношение гранул и клеток составляет, или составляет примерно, 3:1. В некоторых случаях соотношение гранул и клеток составляет, или составляет примерно, 1:3.
Способы, как правило, дополнительно включают этапы генной инженерии стимулированной композиции T-клеток. Генную инженерию можно проводить, или начинать, на стимулированной композиции после, или в любой момент времени после, начала исходной инкубации, и/или одновременно с инкубацией. В некоторых вариантах осуществления клетки инкубируют с нуклеиновыми кислотами, кодирующими генно-инженерные молекулы, так что нуклеиновые кислоты вводятся в клетки, и генно-инженерные молекулы экспрессируются в клетках композиции, за счет этого получают произведенную композицию. К числу генно-инженерных молекул относятся белки, например, генно-инженерные антигенные рецепторы, включая химерные антигенные рецепторы (CAR), и другие рекомбинантные рецепторы, например, химерные рецепторы с лиганд-связывающими внеклеточными фрагментами и внутриклеточными сигнальными фрагментами.
Также предложены инициирующие культуру композиции, стимулированные композиции и произведенные композиции, используемые в получении, или полученные, описанными способами. Также предложены способы, включающие введение таких композиций и клеток субъектам, которые нуждаются в этом, включая пациентов, страдающих от рака. Также предложены наборы, включающие композиции и/или клетки, полученные любым из способов, описанных в настоящем документе.
Способы могут иметь преимущества и приводить к получению более желательного продукта. В некоторых вариантах осуществления предложенные способы позволяют использовать более унифицированный производственный процесс. В некоторых вариантах осуществления предложенные способы позволяют получать клетки, отличающиеся более однородной трансдукцией и/или размножением на более поздних стадиях инженерии клеток. В некоторых вариантах осуществления следствием более однородной трансдукции и/или размножения может являться T-клеточный продукт, который является более предсказуемым в процессе производства. В некоторых случаях T-клеточный продукт может быть разделен на более унифицированные дозы для введения субъекту. Такие особенности в некоторых контекстах могут уменьшать или предотвращать потенциальную токсичность и/или связанные последствия и симптомы у субъектов после адоптивной клеточной терапии.
Все публикации, включая патентные документы, научные статьи и базы данных, упомянутые в настоящей заявке, включены посредством ссылки в полном объеме и для всех целей в такой же степени, как если бы каждая отдельная публикация была индивидуально включена посредством ссылки. Если определение, приведенное в настоящем документе, противоречит, или иным образом не совпадает с определением, приведенным в патентах, патентных заявках, опубликованных патентных заявках и других публикациях, которые включены в настоящий документ посредством ссылки, определение, приведенное в настоящем документе, имеет преимущественную силу относительно определения в документах, которые включены в настоящий документ посредством ссылки.
Заголовки разделов, используемые в настоящем документе, служат исключительно организационным целям и не должны расцениваться как ограничивающие описанный объект изобретения.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На ФИГ. 1A-1D представлены результаты для CAR+ T-клеточных композиций, полученных нерасширенным и расширенным способами с использованием стимулирующего реагента на основе гранул (гранулы), стимулирующего реагента на основе гранул и инкубации в базальной среде (гранулы-базальная среда) или олигомерного стимулирующего реагента (олигомер). На ФИГ. 1A показана процентная доля CD4+ и CD8+ T-клеток, положительных как по CCR7, так и по CD27. На ФИГ. 1B показана процентная доля CCR7+CD27+ клеток для CD4+CAR+ T-клеток. На ФИГ. 1C показана процентная доля CCR7+CD27+ клеток для CD8+CAR+ T-клеток. На ФИГ. 1D показана процентная доля CCR7+CD27+ клеток, полученных от репрезентативного донора расширенным способом, в разные дни производственного процесса, включая активацию в день 1 (д1 AMAT), трансдукцию в день 2 (д2 XMAT), а также в разные моменты времени после начала культивирования (д4 INOC+2, д6 INOC+4, д7 INOC+5).
+
+
+
+
+
+
+
+
На ФИГ. 2A-2D представлены кривые выживаемости Каплана-Мейера для субъектов, разделенных на группы, которым вводили CAR T-клеточные композиции, содержащие процентную долю CCR7CD27 CAR T-клеток среди CD4 CAR T-клеток (ФИГ. 2A для выживаемости без прогрессирования, ФИГ. 2C для длительности ответа) и среди CD8 CAR T-клеток (ФИГ. 2B для выживаемости без прогрессирования, ФИГ. 2D для длительности ответа), которая была выше или ниже определенного порогового уровня.
На ФИГ. 3 показана T-клеточная клональность выделенных CD4+ и CD8+ T-клеточных композиций до инженерии (CMAT), а также CD4+ и CD8+ терапевтических CAR+ T-клеточных композиций после инженерии (применен индекс Шеннона).
I. Способ инкубации (например, стимуляции) T-клеток
В настоящем документе предложены способы инкубации (например, стимуляции) клеток в процессе получения клеток для адоптивной клеточной терапии, а также композиции и клетки, полученные данными способами. В некоторых вариантах осуществления клетки, как правило, включают T-клетки, которые в некоторых вариантах осуществления экспрессируют генно-инженерные антигенные рецепторы, такие как генно-инженерные или рекомбинантные T-клеточные рецепторы (TCR), и функциональные не-TCR антигенные рецепторы, такие как химерные антигенные рецепторы (CAR).
В некоторых вариантах осуществления предложен способ инкубации (например, стимуляции) T-клеток, включающий инкубацию в стимулирующих условиях исходной композиции, содержащей популяцию T-клеток, включающую подобные наивным T-клетки и не подобные наивным T-клетки, при этом указанная исходная композиция содержит необходимое для инициации культуры количество подобных наивным T-клеток или их подмножества CD8+ T-клеток, с получением стимулированной композиции. В некоторых аспектах стимулирующие условия предпочтительно индуцируют размножение или пролиферацию подобных наивным T-клеток в сравнении с не подобными наивным T-клетками в стимулированной композиции. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает введение в стимулированную композицию клеток нуклеиновой кислоты, кодирующей генно-инженерный рекомбинантный рецептор, с получением данным способом произведенной композиции, содержащей T-клетки, экспрессирующие генно-инженерный рекомбинантный рецептор. В некоторых аспектах введение проводят в течение по меньшей мере части периода инкубации или проводят после инкубации. В некоторых вариантах осуществления клетки исходной композиции не подвергали и не подвергают перед инкубацией этапу селекции на основе эндогенного T-клеточного поверхностного маркера, который позволяет различать подобные наивным и не подобные наивным T-клетки.
В некоторых вариантах осуществления предложенных способов введение нуклеиновой кислоты, кодирующей генно-инженерный рекомбинантный рецептор, проводят до, в процессе и/или после введения нуклеиновой кислоты, кодирующей генно-инженерный рекомбинантный рецептор. В некоторых вариантах осуществления способ включает инкубацию композиции в стимулирующих условиях до введения нуклеиновой кислоты, кодирующей генно-инженерный рекомбинантный рецептор. В некоторых случаях способ включает инкубацию композиции в стимулирующих условиях в процессе введения нуклеиновой кислоты, кодирующей генно-инженерный рекомбинантный рецептор. В некоторых вариантах осуществления способ включает инкубацию композиции в стимулирующих условиях после введения нуклеиновой кислоты, кодирующей генно-инженерный рекомбинантный рецептор.
В конкретных вариантах осуществления стимулирующее условие включает поверхность, такую как магнитная гранула, с присоединенными к ней одним или более средствами, которые связывают фрагмент на клеточной поверхности. В одном варианте осуществления к поверхности присоединены по меньшей мере анти-CD3 антитела. В другом варианте осуществления к поверхности присоединены анти-CD3 и/или анти-CD28 антитела. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере значительная часть по меньшей мере одной популяции T-клеток в исходной композиции удаляется после инкубации. В одном варианте осуществления соотношение клеток и гранул в стимулирующих условиях составляет от, или от примерно, 50:1 до примерно 5:1. В конкретных вариантах осуществления соотношение составляет от, или от примерно, 100:1 до примерно 1:1. В некоторых вариантах осуществления соотношение составляет от, или от примерно, 1:1 до 1:50. В конкретных вариантах осуществления соотношение составляет по меньшей мере примерно 40:1, 35:1, 30:1, 25:1, 20:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9 или 1:10. В одном конкретном варианте осуществления соотношение составляет примерно 3:1. В одном конкретном варианте осуществления соотношение составляет примерно 1:3.
В некоторых вариантах осуществления предложенных в настоящем документе способов условия культивирования предпочтительно индуцируют пролиферацию, стимуляцию и/или активацию не подобных наивным T-клеток в сравнении с подобными наивным T-клетками. В некоторых вариантах осуществления способы инкубации (например, стимуляции) приводят к получения желаемой произведенной композиции, состоящей из желаемого числа клеток, происходящих от подобных наивным T-клеток исходной композиции. В некоторых вариантах осуществления при использовании способа стимуляции T-клеток, описанного в настоящем документе, из клеток в исходной композиции большая процентная доля подобных наивным T-клеток, в сравнении с не подобными наивным T-клетками, индуцируются к пролиферации и/или становятся активированными. В некоторых аспектах стимулированная композиция, полученная способами стимуляции, описанными в настоящем документе, содержит менее 10% клеток, происходящих от не подобных наивным T-клеток. В некоторых примерах стимулированная композиция содержит менее 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5% или 0,1% клеток, происходящих от не подобных наивным T-клеток. В некоторых вариантах осуществления большая процентная доля T-клеток, которые были подобными наивным в исходной композиции, в сравнении с процентной долей T-клеток, которые были не подобными наивным в исходной композиции, делятся в день 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 после начала указанной инкубации. В некоторых случаях стимулирующие условия способа стимуляции T-клеток индуцируют клеточную гибель конкретных субпопуляций клеток. В конкретных примерах стимулирующие условия способа индуцируют активацию не подобных наивным T-клеток, тем самым вызывая индуцируемую активацией гибель клеток (AICD).
В одном аспекте способ предпочтительно приводит к активации не подобных наивным T-клеток исходной композиции, тем самым индуцируя клеточную гибель не подобных наивным T-клеток исходной композиции, за счет чего элиминируются T-клетки, происходящие от не подобных наивным клеток исходной композиции, из стимулированной композиции. В то же время, нужные клетки, которые остаются, например, те клетки, которые происходят от подобных наивным T-клеток исходной композиции, активируются, выживают и стимулируются к размножению, что приводит к получению популяции активированных клеток, из которой по меньшей мере значительная часть нежелательных субпопуляций T-клеток была элиминирована. Кроме того, условия инкубации (например, стимуляции), в способах, описанных в настоящем документе, приводят к восстановлению поликлональности популяции T-клеток в отношении экспрессируемых генов TCR, о чем свидетельствует анализ спектротипов или другие методы количественного определения клональности. В некоторых вариантах осуществления сигнатура клеток в произведенной композиции, происходящих от подобных наивным T-клеток исходной композиции, характеризуется экспрессией конкретных маркеров.
A. Исходная композиция
В предложенных способах инкубации (например, стимуляции) T-клеток способ включает инкубацию в стимулирующих условиях исходной композиции, содержащей популяцию T-клеток. В некоторых аспектах исходная композиция содержит популяцию T-клеток, например, включающую подобные наивным T-клетки и не подобные наивным T-клетки. В некоторых вариантах осуществления популяция T-клеток включает CD4+ и/или CD8+ клетки. В некоторых вариантах осуществления исходная композиция содержит необходимое для инициации культуры количество клеток. В некоторых случаях необходимое для инициации культуры количество клеток основано на количестве подобных наивным T-клеток или их подмножества CD8+ T-клеток в исходной композиции. В некоторых аспектах конкретные подмножества T-клеток, такие как подобные наивным T-клетки и/или не подобные наивным T-клетки, можно идентифицировать с использованием конкретных маркеров или сигнатур. В некоторых конкретных примерах экспрессию клеточных поверхностных маркеров используют для оценки и/или идентификации подмножеств T-клеток. В некоторых аспектах может быть охарактеризована клональность исходной композиции.
В некоторых аспектах композицию клеток, которые инкубируют и/или подвергают инженерии, например, исходную композицию, не подвергали и не подвергают предварительной селекции на подобные наивным T-клетки. В некоторых вариантах осуществления способ не включает положительную или отрицательную селекцию, или обогащение, подобных наивным клеток исходной композиции. В некоторых аспектах композицию клеток, которые стимулируют и/или подвергают инженерии, например, исходную композицию и/или стимулированную композицию, не подвергали и не подвергают такой селекции до инкубации (например, стимуляции). В некоторых вариантах осуществления клетки не подвергали и/или не подвергают до инкубации этапу селекции на основе уровня или наличия T-клеточного поверхностного маркера, позволяющего различать подобные наивным и не подобные наивным T-клетки, такого как CD27, CD28, CD45RA, CD45RO, CD56, CD62L, CD95, KLRG1 или CCR7. Например, в некоторых аспектах клетки в исходной композиции не подвергали селекции на основе экспрессии, или на основе поверхностной экспрессии, такого маркера, до инкубации в стимулирующих условиях. В некоторых аспектах клетки в стимулированной композиции не подвергают селекции на основе экспрессии, или на основе поверхностной экспрессии, такого маркера до генной инженерии, например, инкубации с нуклеиновой кислотой. В некоторых аспектах инкубацию исходной композиции проводят без селекции на основе поверхностной экспрессии маркера для обогащения по подобным наивным T-клеткам.
В некоторых вариантах осуществления способы включают меньшее количество этапов селекции в сравнении с другими способами, например, не включают селекцию подмножеств T-клеток, и, таким образом, являются более простыми и имеют преимущества сокращения затрат и/или расходования ресурсов в сравнении с многоэтапными способами селекции. В некоторых вариантах осуществления способы не включают обогащение на основе экспрессии маркеров, характерных для T-клеток памяти или их подмножеств и/или подобных наивным T-клеток. В некоторых аспектах композицию клеток, которые инкубируют (например, стимулируют), например, исходную композицию и/или стимулированную композицию, не подвергали и не подвергают такой селекции.
В некоторых примерах способы не включают положительную селекцию на основе маркера, характерного для не подобных наивным T-клеток, или позволяющего различать конкретные субпопуляции T-клеток, например, CD62L, CCR7, CD27, CD28, CD56, CD3, CD122, CD95, CD25, IL7-Rα и/или CD127. В некоторых примерах способы не включают положительную селекцию или обогащение на основе экспрессии CD62L, CCR7, CD27, CD28, CD56, CD3, CD122, CD95, CD25, IL7-Rα и/или CD127. В некоторых вариантах осуществления в способах не используют образцы или композиции, которые были обогащены или положительно отобраны на основе таких маркеров, или обогащены по конкретным подтипам клеток.
В некоторых вариантах осуществления способы не включают этапы селекции на основе аффинности, предназначенные для разделения или различения подобных наивным и не подобных наивным T-клеток. В некоторых примерах способы не включают положительную селекцию на основе маркера, характерного для подобных наивным или не подобных наивным клеток, или позволяющего отличать одни от других, такого как CD27, CD28, CD45RO, CD45RA, CD56, CCR7, CD95, KLRG1 и/или CD62L. В некоторых примерах способы не включают положительную селекцию или обогащение на основе экспрессии таких маркеров. В некоторых вариантах осуществления в способах не используют образцы или композиции, обогащенные или положительно отобранные на основе таких маркеров, или обогащенные по таким подтипам.
Клетки
В некоторых вариантах осуществления способы, предложенные в настоящем документе, включают один или более этапов получения исходной композиции клеток, в которой содержится необходимое для инициации культуры количество подобных наивным T-клеток, например, в связи со способом, включающим один или более этапов стимуляции, размножения, пролиферации и/или генной инженерии, например, трансдукции, клеток. Клетки, как правило, представляют собой эукариотические клетки, такие как клетки млекопитающих, и, как правило, представляют собой человеческие клетки. Исходная композиция может быть получена или создана различными способами, включающими выделение или селекцию клеток из биологического образца. В некоторых вариантах осуществления исходная композиция содержит CD4+ и/или CD8+ клетки из биологического образца, например, полученные или выделенные с использованием одного или более этапов выделения, селекции или обогащения. В некоторых конкретных примерах соотношение CD4+ клеток и CD8+ клеток в исходной культуре составляет, или составляет примерно, 1:1, 1:2, 2:1, 1:3 или 3:1. В некоторых вариантах осуществления исходная композиция, содержащая выделенные CD4+ и/или CD8+ T-клетки, содержит смесь подобных наивным T-клеток и не подобных наивным T-клеток.
В некоторых вариантах осуществления клетки исходной композиции получены из крови, костного мозга, лимфатических или лимфоидных органов, представляют собой клетки иммунной системы, например, клетки врожденной или приобретенной иммунной системы, в том числе из образцов, содержащих миелоидные или лимфоидные клетки, включая лимфоциты, как правило, T-клетки. Клетки, как правило, представляют собой первичные клетки, например, клетки, полученные непосредственно от субъекта и/или полученные от субъекта и замороженные. В некоторых вариантах осуществления клетки включают одно или более подмножеств T-клеток или клеток других типов, например, все T-клеточные популяции, CD4+ клетки, CD8+ клетки, а также их субпопуляции, которые отличаются функцией, состоянием активации, зрелостью, способностью к дифференциации, размножению, рециркуляции, локализации и/или персистенции, специфичностью в отношении антигенов, типом антигенного рецептора, присутствием в конкретном органе или компартменте, маркерами или профилем секреции цитокинов и/или степенью дифференциации. Для субъекта, который будет получать лечение, клетки могут быть аллогенными и/или аутологичными. Способы также включают доступные стандартные способы. В некоторых вариантах осуществления способы включают получение клеток от субъекта, их подготовку, обработку, культивирование и/или инженерию, как описано в настоящем документе, и повторное введение их тому же пациенту до или после криоконсервирования.
N
EFF
SCM
CM
EM
В число подтипов и субпопуляций T-клеток и/или CD4+, и/или CD8+, T-клеток входят наивные T-клетки (T), эффекторные T-клетки (T), T-клетки памяти и их подтипы, такие как стволовые T-клетки памяти (T), центральные T-клетки памяти (T), эффекторные T-клетки памяти (T) или окончательно дифференцированные эффекторные T-клетки памяти, опухоль-инфильтрирующие лимфоциты (TIL), незрелые T-клетки, зрелые T-клетки, хелперные T-клетки, цитотоксические T-клетки, мукозные инвариантные T-клетки (MAIT), исходно существующие и приобретенные регуляторные T-клетки (Treg), хелперные T-клетки, такие как TH1 клетки, TH2 клетки, TH3 клетки, TH17 клетки, TH9 клетки, TH22 клетки, фолликулярные хелперные T-клетки, альфа/бета T-клетки и дельта/гамма T-клетки. В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой регуляторную T-клетку (Treg). В некоторых вариантах осуществления клетка также содержит рекомбинантный FOXP3 или его вариант.
В некоторых вариантах осуществления получение сконструированных клеток включает один или более этапов культивирования и/или подготовки. Клетки для инженерии могут быть выделены из образца, такого как биологический образец, например, клетки, полученные от, или извлеченные из, субъекта. В некоторых вариантах осуществления субъект, от которого получают клетки, является субъектом, который имеет заболевание или состояние, или нуждается в клеточной терапии, или который будет получать клеточную терапию. В некоторых вариантах осуществления субъект является человеком, который нуждается в конкретном терапевтическом вмешательстве, таком как адоптивная клеточная терапия, для которой клетки выделяют, обрабатывают и/или подвергают инженерии.
Соответственно, в некоторых вариантах осуществления клетки представляют собой первичные клетки, например, первичные человеческие клетки. Образцы включают ткани, жидкости и другие образцы, полученные непосредственно от субъекта, а также образцы, полученные после одного или более этапов обработки, такой как разделение, центрифугирование, генная инженерия (например, трансдукция вирусным вектором), промывание и/или инкубация. Биологический образец может представлять собой образец, полученный непосредственно из биологического источника, или образец, который был обработан. Биологические образцы включают, но без ограничения, жидкости организма, такие как кровь, плазма, сыворотка, цереброспинальная жидкость, синовиальная жидкость, моча и пот, образцы тканей и органов, включая обработанные образцы, полученные из них.
В некоторых аспектах образец, из которого клетки получают или выделяют, представляет собой кровь или полученный из крови образец, или представляет собой продукт, или получен путем, афереза или лейкафереза. Иллюстративные образцы включают цельную кровь, мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК), лейкоциты, костный мозг, тимус, биопсийный образец ткани, опухоль, клетки лейкоза, лимфомы, лимфатический узел, кишечную лимфоидную ткань, мукозную лимфоидную ткань, селезенку, другие лимфоидные ткани, печень, легкое, желудок, кишечник, толстую кишку, почку, поджелудочную железу, молочную железу, кость, предстательную железу, шейку матки, яички, яичники, миндалины или другие органы и/или клетки, полученные из них. Образцы включают, в контексте клеточной терапии, например, адоптивной клеточной терапии, образцы из аутологичных и аллогенных источников.
В некоторых вариантах осуществления клетки получают из клеточных линий, например, T-клеточных линий. В некоторых вариантах осуществления клетки получают из ксеногенного источника, например, от мыши, крысы, примата или свиньи.
В некоторых вариантах осуществления выделение клеток включает один или более этапов подготовки и/или не аффинного разделения клеток. В некоторых примерах клетки промывают, центрифугируют и/или инкубируют в присутствии одного или более реагентов, например, для удаления нежелательных компонентов, обогащения по желательным компонентам, лизиса или удаления клеток, чувствительных к конкретным реагентам. В некоторых примерах клетки разделяют на основе одного или более свойств, таких как плотность, адгерентность, размер, чувствительность и/или устойчивость к конкретным компонентам.
В некоторых примерах клетки из циркулирующей крови субъекта получают, например, путем афереза или лейкафереза. В некоторых аспектах образцы содержат лимфоциты, включая T-клетки, моноциты, гранулоциты, B-клетки, другие ядросодержащие белые клетки крови, эритроциты и/или тромбоциты, и в некоторых аспектах содержат клетки, отличные от эритроцитов и тромбоцитов.
++
++
В некоторых вариантах осуществления клетки крови, полученные от субъекта, промывают, например, для удаления фракции плазмы и для переноса клеток в соответствующий буфер или среду для последующих этапов обработки. В некоторых вариантах осуществления клетки промывают фосфатно-солевым буфером (PBS). В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор не содержит кальций и/или магний, и/или многие, или все, из двухвалентных катионов. В некоторых аспектах этап промывания проводят с использованием полуавтоматической «проточной» центрифуги (например, клеточного процессора Cobe 2991, Baxter) в соответствии с инструкциями производителя. В некоторых аспектах этап промывания проводят методом проточной фильтрации вдоль потока (TFF) в соответствии с инструкциями производителя. В некоторых вариантах осуществления клетки ресуспендируют в различных биосовместимых буферах после промывания, таких как, например, не содержащий Ca/Mg PBS. В конкретных вариантах осуществления компоненты образца клеток крови удаляют, и клетки непосредственно ресуспендируют в среде для культивирования.
В некоторых вариантах осуществления способы включают методы разделения на основе плотности, например, получение белых клеток крови из периферической крови путем лизиса эритроцитов и центрифугирования через градиент плотности перколла или фиколла.
В некоторых вариантах осуществления методы выделения включают разделение клеток разных типов на основе экспрессии или наличия в клетке одной или более конкретных молекул, таких как поверхностные маркеры, например, поверхностные белки, внутриклеточные маркеры или нуклеиновая кислота. В некоторых вариантах осуществления можно использовать любой известный метод разделения на основе таких маркеров. В некоторых вариантах осуществления разделение представляет собой разделение на основе аффинности или иммунной аффинности. Например, в некоторых аспектах выделение включает разделение клеток и клеточных популяций на основе клеточной экспрессии, или уровня экспрессии, одного или более маркеров, как правило, клеточных поверхностных маркеров, например, путем инкубации с антителом или связывающим партнером, специфически связывающим такие маркеры, за которой, как правило, следуют этапы промывания и отделения клеток, связанных с антителом или связывающим партнером, от клеток, не связанных с антителом или связывающим партнером.
Такие этапы разделения могут быть основаны на положительной селекции, при которой клетки, связавшиеся с реагентами, сохраняют для дальнейшего использования, и/или отрицательной селекции, при которой сохраняют клетки, не связавшиеся с антителом или связывающим партнером. В некоторых примерах обе фракции сохраняют для дальнейшего использования. В некоторых аспектах может быть особенно полезной отрицательная селекция, когда отсутствует антитело, специфически узнающее тип клеток в гетерогенной популяции, так что разделение лучше всего проводить на основе маркеров, экспрессируемых клетками, отличными от желательной популяции.
Разделение не обязательно должно приводить к 100% обогащению или удалению конкретных клеточных популяций или клеток, экспрессирующих конкретный маркер. Например, положительная селекция или обогащение для клеток конкретного типа, таких как те, которые экспрессируют маркер, означает увеличение числа или процентной доли таких клеток, но не обязательно приводит к полному отсутствию клеток, не экспрессирующих маркер. Аналогично, отрицательная селекция, удаление или истощение клеток конкретного типа, таких как те, которые экспрессируют маркер, означает уменьшение числа или процентной доли таких клеток, но не обязательно приводит к полному удалению всех таких клеток.
В некоторых примерах проводят несколько раундов этапов разделения, при этом положительно или отрицательно отобранную фракцию из одного этапа подвергают этапу разделения, например, последующей положительной или отрицательной селекции. В некоторых примерах один этап разделения может приводить к одновременному истощению клеток, экспрессирующих несколько маркеров, например, путем инкубации клеток с несколькими антителами или связывающими партнерами, каждый из которых специфичен для маркера, являющегося мишенью для отрицательной селекции. Аналогично, клетки нескольких типов могут быть одновременно положительно отобраны путем инкубации клеток с несколькими антителами или связывающими партнерами, специфичными для маркеров, экспрессируемых на клетках разных типов.
+
+
+
+
+
+
+
+
+
hi
+
Например, в некоторых аспектах конкретные субпопуляции T-клеток, таких как клетки, имеющие или экспрессирующие на высоких уровнях один или более поверхностных маркеров, например, CD28, CD62L, CCR7, CD27, CD127, CD4, CD8, CD56, CD45RA, CD95, и/или CD45RO T-клетки, выделяют методами положительной и отрицательной селекции.
+
+

Например, CD3, CD28 T-клетки можно положительно отбирать с использованием конъюгированных с анти-CD3/анти-CD28 магнитных гранул (например, DYNABEADS M-450 CD3/CD28 T Cell Expander).
+
high
В некоторых вариантах осуществления выделение проводят путем обогащения по конкретной клеточной популяции методом положительной селекции, или истощения конкретной клеточной популяции методом отрицательной селекции. В некоторых вариантах осуществления положительную или отрицательную селекцию проводят путем инкубации клеток с одним или более антителами или другими связывающими веществами, которые специфически связывают один или более поверхностных маркеров, экспрессируемых (маркер), или экспрессируемых на относительно высоком уровне (маркер), на положительно или отрицательно отбираемых клетках, соответственно.
+
+
+
+
+
+
В некоторых вариантах осуществления T-клетки выделяют из образца МКПК путем отрицательной селекции на маркеры, экспрессируемые на не T-клетках, таких как B-клетки, моноциты или другие белые клетки крови, такие как CD14 клетки. В некоторых аспектах этап селекции на CD4 или CD8 используют для разделения CD4 хелперов и CD8 цитотоксических T-клеток. Такие CD4 и CD8 популяции можно дополнительно сортировать на субпопуляции методом положительной или отрицательной селекции на маркеры, экспрессируемые, или экспрессируемые в относительно высокой степени, на клетках одной или более субпопуляций наивных T-клеток, T-клеток памяти и/или эффекторных T-клеток.
+
+
+
CM
CM
et al.
et al.
J Immunother.
В некоторых вариантах осуществления CD8 клетки дополнительно обогащают или истощают по наивным клеткам, центральным клеткам памяти, эффекторным клеткам памяти и/или центральным стволовым клеткам памяти, например, путем положительной или отрицательной селекции на основе поверхностных антигенов, ассоциированных с соответствующей субпопуляцией. В некоторых вариантах осуществления обогащение по центральным T-клеткам памяти (T) проводят для повышения эффективности, например, для повышения долгосрочной выживаемости, размножения и/или приживления после введения, что в некоторых аспектах является особенно сильным в таких субпопуляциях. Смотри Terakura  (2012) Blood. 1:72-82; Wang  (2012)  35(9):689-701. В некоторых вариантах осуществления объединение T-обогащенных CD8 T-клеток и CD4 T-клеток дополнительно повышает эффективность.
+
-
+
-
+
+
+
В вариантах осуществления T-клетки памяти присутствуют в обоих CD62L и CD62L подмножествах CD8 лимфоцитов периферической крови. МКПК можно обогащать или истощать по CD62LCD8 и/или CD62LCD8 фракциям, например, с использованием анти-CD8 и анти-CD62L антител.
CM
CM
CM
+
+
+
В некоторых вариантах осуществления обогащение по центральным T-клеткам памяти (T) основано на наличии, или высокой поверхностной экспрессии, CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD3 и/или CD127; в некоторых аспектах оно основано на отрицательной селекции на клетки, экспрессирующие, или в высокой степени экспрессирующие, CD45RA и/или гранзим B. В некоторых аспектах выделение CD8 популяции, обогащенной по T клеткам, проводят путем истощения по клеткам, экспрессирующим CD4, CD14, CD45RA, и положительной селекции, или обогащения, по клеткам, экспрессирующим CD62L. В одном аспекте обогащение по центральным T-клеткам памяти (T) проводят, начиная с отрицательной фракции клеток, отобранных на основе экспрессии CD4, которую подвергают отрицательной селекции на основе экспрессии CD14 и CD45RA, и положительной селекции на основе CD62L. В некоторых аспектах такие виды селекции проводят одновременно, и в других аспектах проводят последовательно, в любом порядке. В некоторых аспектах тот же этап селекции на основе экспрессии CD4, который используют для получения популяции или субпопуляции CD8 клеток, также используют для получения популяции или субпопуляции CD4 клеток, так что как положительную, так и отрицательную, фракции, полученные при разделении на основе CD4, сохраняют и используют в последующих этапах способа, необязательно, после одного или более дополнительных этапов положительной или отрицательной селекции.
+
В конкретном примере образец МКПК или другой образец белых клеток крови подвергают селекции на CD4 клетки, при этом сохраняют как отрицательную, так и положительную, фракции. Отрицательную фракцию затем подвергают отрицательной селекции на основе экспрессии CD14 и CD45RA или ROR1, и положительной селекции на основе маркера, характерного для центральных T-клеток памяти, такого как CD62L или CCR7, при этом положительную и отрицательную селекции проводят в любом порядке.
+
+
+
-
+
-
+
+
+
+
+
-
-
Хелперные CD4 T-клетки сортируют на наивные клетки, центральные клетки памяти и эффекторные клетки путем идентификации клеточных популяций, имеющих клеточные поверхностные антигены. CD4 лимфоциты можно получать стандартными методами. В некоторых вариантах осуществления наивные CD4 T лимфоциты представляют собой CD45RO, CD45RA, CD62L CD4 T-клетки. В некоторых вариантах осуществления центральные CD4 клетки памяти представляют собой CD62L и CD45RO клетки. В некоторых вариантах осуществления эффекторные CD4 клетки представляют собой CD62L и CD45RO клетки.
+
In vitro
In vivo
В одном примере для обогащения по CD4 клеткам методом отрицательной селекции коктейль моноклональных антител, как правило, включает антитела к CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR и CD8. В некоторых вариантах осуществления антитело или связывающий партнер связаны с твердой подложкой или матрицей, такой как магнитная гранула или парамагнитная гранула, что позволяет разделять клетки для положительной и/или отрицательной селекции. Например, в некоторых вариантах осуществления клетки и клеточные популяции разделяют или выделяют с использованием иммуно-магнитных (или аффино-магнитных) методов разделения (обзор приведен в Methods in Molecular Medicine, vol. 58: Metastasis Research Protocols, Vol. 2: Cell Behavior  and , p 17-25 под редакцией: S. A. Brooks and U. Schumacher © Humana Press Inc., Totowa, NJ).
В некоторых аспектах образец или композицию клеток, которые предстоит разделять, инкубируют с мелким, намагничиваемым или магнитно-чувствительным материалом, таким как магнитно-чувствительные частицы или микрочастицы, например, парамагнитные гранулы (например, такие как гранулы Dynalbeads или MACS). Магнитно-чувствительный материал, например, частица, как правило, непосредственно или опосредованно присоединен к связывающему партнеру, например, антителу, которое специфически связывает молекулу, например, поверхностный маркер, находящийся на клетке, клетках, или популяции клеток, которые желательно отделять, например, которые желательно подвергать отрицательной или положительной селекции.
et al.
В некоторых вариантах осуществления магнитная частица или гранула содержит магнитно-чувствительный материал, связанный со специфическим связывающим средством, таким как антитело или другой связывающий партнер. В некоторых аспектах можно использовать магнитно-чувствительные материалы, используемые в магнитных методах разделения. Подходящие магнитные частицы включают те, которые описаны в выданном Molday патенте США № 4452773 и в европейской патентной заявке EP 452342 B, которые включены в настоящий документ посредством ссылки. Другими примерами являются коллоидные частицы, такие как те, которые описаны в выданном Owen патенте США № 4795698 и в выданном Liberti  патенте США № 5200084.
Инкубацию, как правило, проводят в условиях, в которых антитела или связывающие партнеры, или молекулы, такие как вторичные антитела или другие реагенты, специфически связывающие такие антитела или связывающих партнеров, которые связаны с магнитной частицей или гранулой, специфически связывают клеточные поверхностные молекулы, если они находятся на клетках в образце.
В некоторых аспектах образец помещают в магнитное поле, и те клетки, с которыми связаны магнитно-чувствительные или намагничиваемые частицы, будут притягиваться к магниту и отделяться от немеченых клеток. Для положительной селекции сохраняют клетки, которые притягиваются к магниту; для отрицательной селекции сохраняют клетки, которые не притягиваются (немеченые клетки). В некоторых аспектах используют сочетание положительной и отрицательной селекции во время одного и того же этапа селекции, при этом положительные и отрицательные фракции сохраняют и дополнительно обрабатывают, или подвергают дополнительным этапам разделения.
В конкретных вариантах осуществления магнитно-чувствительные частицы покрыты первичными антителами или другими связывающими партнерами, вторичными антителами, лектинами, ферментами или стрептавидином. В конкретных вариантах осуществления магнитные частицы присоединяют к клеткам за счет покрытия первичными антителами, специфичными для одного или более маркеров. В конкретных вариантах осуществления клетки, а не гранулы, метят первичным антителом или связывающим партнером, а затем добавляют магнитные частицы, покрытые специфичным для клеточного типа вторичным антителом или другим связывающим партнером (например, стрептавидином). В конкретных вариантах осуществления покрытые стрептавидином магнитные частицы используют в сочетании с биотинилированными первичными или вторичными антителами.
В некоторых вариантах осуществления магнитно-чувствительные частицы оставляют присоединенными к клеткам, которые впоследствии будут инкубировать, культивировать и/или подвергать инженерии; в некоторых аспектах частицы оставляют присоединенными к клеткам, предназначенным для введения пациенту. В некоторых вариантах осуществления намагничиваемые или магнитно-чувствительные частицы удаляют с клеток. Методы удаления намагничиваемых частиц с клеток могут включать, например, использование конкурирующих немеченых антител, намагничиваемых частиц или антител, конъюгированных с расщепляемыми линкерами, и так далее. В некоторых вариантах осуществления намагничиваемые частицы являются биоразлагаемыми.
В некоторых вариантах осуществления селекцию на основе аффинности проводят методом магнитной сортировки активированных клеток (MACS) (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Системы магнитной сортировки активированных клеток (MACS) способны обеспечивать получение после селекции высокочистых клеток с присоединенными к ним намагничиваемыми частицами. В конкретных вариантах осуществления MACS действует в режиме, в котором нецелевые и целевые молекулы последовательно элюируются после наложения внешнего магнитного поля. То есть, клетки, присоединенные к намагничиваемым частицам, удерживаются на месте, в то время как не присоединенные клетки элюируются. Затем, после завершения этого первого этапа элюции, клетки, которые были удержаны в магнитном поле и не были элюированы, определенным образом высвобождаются так, что они могут быть элюированы и извлечены. В конкретных аспектах не целевые клетки метят и удаляют из гетерогенной популяции клеток.
В конкретных вариантах осуществления выделение или разделение проводят с использованием системы, устройства или прибора, которые выполняют один или более из этапов выделения, подготовки, разделения, обработки, инкубации, культивирования и/или формулирования клеток. В некоторых аспектах используют систему для выполнения каждого из этих этапов в закрытом или стерильном окружении, например, для сведения к минимуму ошибок, манипуляций пользователя и/или загрязнения. В одном примере система представляет собой систему, описанную в международной PCT публикации № WO2009/072003 или US 20110003380 A1.
В некоторых вариантах осуществления система или прибор выполняет один или более, например, все, из стадий выделения, обработки, инженерии и формулирования в интегрированной или автономной системе, и/или в автоматическом или программируемом режиме. В некоторых аспектах система или прибор включает компьютер и/или компьютерную программу, осуществляющие связь с системой или прибором, что позволяет пользователю программировать, контролировать, оценивать результаты и/или корректировать различные аспекты этапов обработки, выделения, инженерии и формулирования.
В некоторых аспектах разделение и/или другие этапы проводят с использованием системы CliniMACS (Miltenyi Biotec), например, для автоматизированного разделения клеток на клинически значимых уровнях в закрытой и стерильной системе. Компоненты могут включать встроенный микрокомпьютер, магнитный сепаратор, перистальтический насос и различные пережимные клапаны. В некоторых аспектах интегрированный компьютер контролирует все компоненты прибора и управляет системой для проведения повторяющихся процедур в стандартизированной последовательности. В некоторых аспектах ячейка магнитного разделения включает подвижный постоянный магнит и держатель для селекционной колонки. Перистальтический насос контролирует скорость потока через набор трубок и, совместно с пережимными клапанами, обеспечивает контролируемый поток буфера через систему и постоянную суспензию клеток.
В некоторых аспектах в системе CliniMACS используют связанные с антителами намагничиваемые частицы, которые подаются в стерильном апирогенном растворе. В некоторых вариантах осуществления после мечения клеток магнитными частицами клетки промывают для удаления избытка частиц. Затем мешок с клеточным препаратом соединяют с набором трубок, который, в свою очередь, соединен с мешком, содержащим буфер, и мешком для сбора клеток. Набор трубок состоит из предварительно соединенных стерильных трубок, включая пред-колонку и разделительную колонку, которые предназначены только для одноразового применения. После начала программы разделения система автоматически наносит клеточный образец на разделительную колонку. Меченые клетки удерживаются на колонке, в то время как немеченые клетки удаляются в серии этапов промывания. В некоторых вариантах осуществления клеточные популяции, используемые в способах, описанных в настоящем документе, являются немечеными и не удерживаются на колонке. В некоторых вариантах осуществления клеточные популяции, используемые в способах, описанных в настоящем документе, являются мечеными и удерживаются на колонке. В некоторых вариантах осуществления клеточные популяции, используемые в способах, описанных в настоящем документе, элюируются с колонки после снятия магнитного поля, и собираются в мешке для сбора клеток.
et al.
J Immunother.
et al.
et al.
J Immunother.
В конкретных вариантах осуществления разделение и/или другие этапы проводят с использованием системы CliniMACS Prodigy (Miltenyi Biotec). В некоторых аспектах система CliniMACS Prodigy оснащена блоком обработки клеток, который позволяет автоматизировать промывку и фракционирование клеток путем центрифугирования. Система CliniMACS Prodigy также может включать встроенную камеру и программное обеспечение для распознавания изображений, которые определяют оптимальную конечную точку фракционирования клеток, распознавая макроскопические слои исходного клеточного продукта. Например, периферическая кровь может быть автоматически разделена на эритроциты, белые клетки крови и слои плазмы. Система CliniMACS Prodigy также может включать встроенную камеру для культивирования клеток, которая выполняет протоколы культивирования клеток, такие как, например, клеточная дифференциация и размножение, антигенная нагрузка и долговременное культивирование клеток. Входные порты могут обеспечивать стерильное удаление и пополнение среды, и мониторинг клеток можно проводить с использованием встроенного микроскопа. Смотри, например, Klebanoff  (2012) 35(9): 651-660, Terakura  (2012) Blood.1:72-82 и Wang  (2012) 35(9):689-701.
et al.
Lab Chip
et al.
В некоторых вариантах осуществления клеточную популяцию, описанную в настоящем документе, собирают и обогащают (или истощают) методом проточной цитометрии, в котором клетки, окрашенные на несколько клеточных поверхностных маркеров, переносятся жидким потоком. В некоторых вариантах осуществления клеточную популяцию, описанную в настоящем документе, собирают и обогащают (или истощают) методом препаративной (FACS)-сортировки. В конкретных вариантах осуществления клеточную популяцию, описанную в настоящем документе, собирают и обогащают (или истощают) путем использования чипов микроэлектромеханических систем (MEMS) в сочетании с системой детекции на основе FACS (смотри, например, WO 2010/033140, Cho  (2010) 10:1567-1573; и Godin  (2008) J Biophoton. 1(5):355-376. В обоих случаях клетки можно метить несколькими маркерами, что позволяет выделять четко определенные подмножества T-клеток с высокой чистотой.
В некоторых вариантах осуществления антитела или связывающие партнеры метят одним или более детектируемыми маркерами для облегчения разделения при положительной и/или отрицательной селекции. Например, разделение может быть основано на связывании с флуоресцентно мечеными антителами. В некоторых примерах разделение клеток на основе связывания антител или других связывающих партнеров, специфичных для одного или более клеточных поверхностных маркеров, проводят в жидком потоке, например, методом активированной флуоресценцией сортировки клеток (FACS), в том числе, в препаративном масштабе (FACS) и/или с использованием чипов микроэлектромеханических систем (MEMS), например, в сочетании с проточно-цитометрической системой детекции. Такие способы позволяют одновременно проводить положительную и отрицательную селекцию на основе нескольких маркеров.
В некоторых вариантах осуществления способы получения включают этапы замораживания, например, криоконсервирования, клеток, либо до, либо после, выделения, инкубации и/или инженерии. В некоторых вариантах осуществления замораживание, с последующим этапом размораживания, позволяет удалять гранулоциты и, в некоторой степени, моноциты в клеточной популяции. В некоторых вариантах осуществления клетки суспендируют в растворе для замораживания, например, после этапа промывания для удаления плазмы и тромбоцитов. В некоторых аспектах можно использовать любой из различных известных растворов для замораживания и параметров. Один пример включает использование PBS, содержащего 20% ДМСО и 8% человеческого сывороточного альбумина (ЧСА), или другой подходящей среды для замораживания клеток. Затем суспензию разбавляют 1:1 средой так, что конечные концентрации ДМСО и ЧСА составляют 10% и 4%, соответственно. Затем клетки замораживают до -80°C со скоростью 1 в минуту и хранят в резервуаре-хранилище в паровой фазе жидкого азота.
a. Подобные наивным T-клетки
lo
В некоторых вариантах осуществления способ включает инкубацию исходной композиции, содержащей подобные наивным T-клетки или определенное пороговое количество подобных наивным T-клеток. В одном аспекте настоящих способов предложена исходная композиция, которая была оценена в отношении субпопуляций клеток на основе экспрессии различных маркеров, таких как CD27, CD28, CD56, CD62L, CD95, KLRG1, CD45RA или CD45RO, цитокинов (например, IL-2, IFN-γ, IL-4, IL-10), рецепторов цитокинов (например, CD25), перфорина, молекул адгезии (например, VLA-1, VLA-2, VLA-4, LPAM-1, LFA-1) и/или молекул хоминга (например, L-селектина), до инкубации (например, стимуляции). В некоторых вариантах осуществления для идентификации подобных наивным T-клеток можно использовать различные сигнатуры подобных наивным T-клеток. В некоторых вариантах осуществления можно оценивать экспрессию конкретных маркеров подобных наивным T-клеток. Например, в некоторых случаях подобные наивным T-клетки имеют на поверхности маркер, включая T-клеточные маркеры активации, выбранный из группы, состоящей из CD27, CD28, CD45RA, CD62L и CCR7. В некоторых аспектах подобные наивным T-клетки не имеют на поверхности CD56 и/или CD45RO. В некоторых аспектах подобные наивным T-клетки не имеют на поверхности CD45RO, и имеют на поверхности CD27, CD45RA и CCR7. В некоторых случаях подобные наивным T-клетки лишены внутриклеточной экспрессии цитокина, такого как IL-2, IFN-γ, IL-4 и/или IL-10. В некоторых дополнительных примерах подобные наивным T-клетки лишены экспрессии маркеров CD25 и/или перфорина. В некоторых случаях подобные наивным T-клетки представляют собой CD95 клетки.
in vitro
in vitro
in vitro
Для оценки экспрессии маркеров подобных наивным T-клеток способ в некоторых вариантах осуществления включает обнаружение маркеров путем проведения  анализа. В некоторых примерах  анализ представляет собой иммунный анализ, анализ с использованием аптамеров, гистологический или цитологический анализ, или анализ уровня экспрессии мРНК. В некоторых случаях используемый  анализ может представлять собой твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), иммуноблоттинг, иммунофенотипирование, иммунопреципитацию, радиоиммунный анализ (RIA), иммуноокрашивание, проточно-цитометрический анализ, поверхностный плазмонный резонанс (SPR), хемилюминесцентный анализ, иммунохроматографический анализ, анализ ингибирования или анализ авидности. В некоторых вариантах осуществления экспрессию маркеров подобных наивным T-клеток определяют методом секвенирования РНК.
in vitro
Подобные наивным T-клетки исходной композиции также можно оценивать на основании клональности T-клеток. В некоторых вариантах осуществления оценка клональности популяции T-клеток представляет собой оценку клонального разнообразия популяции T-клеток. В некоторых вариантах осуществления подобные наивным T-клетки являются поликлональными или мультиклональными. Поликлональность указанной исходной композиции T-клеток измеряют на основании широты ответа популяции на конкретный антиген. В некоторых аспектах исходную композицию можно оценивать путем измерения количества различных эпитопов, узнаваемых антиген-специфическими клетками. Это можно осуществлять с использованием стандартных методов получения и клонирования антиген-специфических T-клеток . В некоторых вариантах осуществления подобные наивным T-клетки являются поликлональными (или мультиклональными), без преобладания какой-либо одной клонотипической популяции в популяции подобных наивным T-клеток.
В контексте популяции T-клеток, такой как исходная композиция, в некоторых аспектах сигнатура поликлональности означает, что популяция T-клеток имеет множественную и широкую антигенную специфичность. В некоторых вариантах осуществления поликлональность означает, что популяция T-клеток имеет большее разнообразие репертуара TCR. В некоторых случаях разнообразие репертуара TCR возникает вследствие событий V(D)J рекомбинации, которые в некоторых случаях запускаются событиями селекции на собственные и чужеродные антигены. В некоторых вариантах осуществления популяция T-клеток, которая является разнообразной, или поликлональной, представляет собой популяцию T-клеток, в которой анализ указывает на наличие множества различных или отличающихся транскриптов или продуктов TCR, присутствующих в популяции. В некоторых вариантах осуществления популяция T-клеток, проявляющая высокую, или относительно высокую, клональность, представляет собой популяцию T-клеток, в которых репертуар TCR является менее разнообразным. В некоторых вариантах осуществления T-клетки являются олигоклональными, если анализ указывает на наличие нескольких, например, двух или трех, транскриптов или продуктов TCR в популяции T-клеток. В некоторых вариантах осуществления T-клетки являются моноклональными, если анализ указывает на наличие одного транскрипта или продукта TCR в популяции T-клеток.
В некоторых примерах клональность клеток в исходной композиции, таких как подобные наивным T-клетки, определяют путем клонального секвенирования, необязательно, секвенирования нового поколения или анализа спектротипов. В некоторых аспектах можно использовать методы секвенирования нового поколения с использованием геномной ДНК или кДНК из T-клеток для оценки репертуара TCR, включая последовательности, кодирующие определяющую комплементарность область 3 (CDR3). В некоторых вариантах осуществления можно использовать секвенирование целого транскриптома методом секвенирования РНК. В некоторых вариантах осуществления можно использовать методы секвенирования одиночной клетки.
В некоторых вариантах осуществления поликлональность можно оценивать или определять в анализе спектротипов (определение репертуара гипервариабельных областей Vβ, Vα, Vγ или Vδ цепей TCR). Популяцию T-клеток считают поликлональной, если профиль спектротипов Vβ для конкретного семейства Vβ, Vα, Vγ или Vδ TCR имеет несколько пиков, как правило, 5 или более преобладающих пиков, и, в большинстве случаев с гауссовым распределением. Поликлональность также можно определять путем создания и характеризации антиген-специфических клонов к интересующему антигену.
В некоторых вариантах осуществления способы оценки клональности могут включать различные особенности способов, описанные в международных патентных публикациях №№ WO2012/048341, WO2014/144495, WO2017/053902, WO2016044227, WO2016176322 и WO2012048340, каждая из которых включена в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме. В некоторых вариантах осуществления такие способы можно использовать для получения информации о последовательности интересующего целевого полинуклеотида, такого как TCR, в клетке. Целевые гены можно получать из геномной ДНК или мРНК клетки из образца или популяции клеток. Образец или популяция клеток может включать иммунные клетки. Например, для целевых молекул TCR гены, кодирующие цепи TCR, можно получать из геномной ДНК или мРНК иммунных клеток или T-клеток. В некоторых вариантах осуществления исходным материалом является РНК из T-клеток, состоящая из транскриптов генов, кодирующих цепь TCR.
et al.
В некоторых вариантах осуществления к клональности применяют индекс Шеннона в качестве порога для фильтрования клонов («скорректированная по Шеннону клональность»), смотри, Chaara  (2018) Front Immunol 9:1038).
В некоторых вариантах осуществления предложенные способы стимулируют, или приводят к увеличению поликлональности популяции T-клеток или их подмножества из исходной композиции. В некоторых вариантах осуществления предложенные способы стимулируют, или приводят к увеличению разнообразия популяции T-клеток или их подмножества из исходной композиции. В некоторых вариантах осуществления T-клетки, или их CD4 или CD8 подмножества, инкубированной или стимулированной композиции имеют редуцированную или сниженную клональность в сравнении с T-клетками, или их CD4 или CD8 подмножествами, в исходной композиции до применения способов. В некоторых вариантах осуществления степень клональности снижена более чем, или более чем примерно, в 2 раза, 3 раза, 4 раза, 5 раз, 6 раз, 7 раз, 8 раз, 9 раз, 10 раз или более.
В одном аспекте предложенных способов популяцию T-клеток в исходной композиции активируют или стимулируют для индукции апоптоза, как описано ниже в разделе, озаглавленном «Инкубация клеток», и за счет этого элиминации субпопуляции из популяции клеток. В то же время, желаемые клетки, которые остаются, например, подобные наивным клетки, активируют и стимулируют для размножения, с получением популяции активированных клеток, из которой по меньшей мере значительная часть нежелательных субпопуляций T-клеток (таких как не подобные наивным T-клетки) была элиминирована. Как упоминалось ранее, стимуляцию/активацию, описанную в настоящем документе, можно проводить для клеток, остающихся после воздействия непосредственно на популяцию клеток проапоптотических композиций. Более того, последующая стимуляция и активация, предложенная по настоящему изобретению, приводит к восстановлению в популяции T-клеток поликлональности в отношении экспрессируемых генов TCR, о чем свидетельствуют результаты анализа спектротипов или секвенирования.
Необходимое для инициации культуры количество
В аспектах предложенных способов исходная композиция содержит необходимое для инициации культуры количество для предпочтительной активации или размножения подобных наивным T-клеток. В некоторых случаях необходимое для инициации культуры количество включает, или определяется, или основано на числе подобных наивным T-клеток или их подмножества CD8+ T-клеток в композиции. Таким образом, в аспектах предложенного способа инкубацию (например, стимуляцию) проводят без учета общего количества или процентной доли не наивных T-клеток, при условии, что имеет место пороговое, или необходимое для инициации культуры, количество подобных наивным T-клеток в исходной композиции.
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
В некоторых вариантах осуществления предложенных в настоящем документе способов инкубации (например, стимуляции) клеток необходимое для инициации культуры количество подобных наивным T-клеток или их подмножества CD8+ T-клеток составляет от, или от примерно, 0,1×10 до 5×10, от, или от примерно, 0,1×10 до 4×10, от, или от примерно, 0,1×10 до 2×10, от, или от примерно, 0,1×10 до 1×10, от, или от примерно, 1×10 до 5×10, от, или от примерно, 1×10 до 4×10, от, или от примерно, 1×10 до 2×10, от, или от примерно, 2×10 до 5×10, от, или от примерно, 2×10 до 4×10 подобных наивным T-клеток. В некоторых случаях необходимое для инициации культуры количество подобных наивным T-клеток или их подмножества CD8+ T-клеток составляет по меньшей мере, или по меньшей мере примерно, или составляет, или составляет примерно, 0,5×10, 0,75×10, 1×10, 1,5×10, 2×10 или 4×10 подобных наивным T-клеток. В некоторых примерах необходимое для инициации культуры количество подобных наивным T-клеток или их подмножества CD8+ T-клеток составляет по меньшей мере, или по меньшей мере примерно, или составляет, или составляет примерно, 2×10 клеток.
8
8
8
В некоторых вариантах осуществления способов инкубации, предложенных в настоящем документе, в стимулирующих условиях, описанных в настоящем документе, исходная композиция, содержащая популяцию T-клеток, включающую подобные наивным T-клетки и не подобные наивным T-клетки, содержит необходимое для инициации культуры количество, составляющее от, или от примерно, 1×10 до 4×10 подобных наивным T-клеток или их подмножества CD8+ T-клеток. В некоторых вариантах осуществления способы приводят к получению стимулированной композиции, при этом стимулирующие условия предпочтительно индуцируют размножение или пролиферацию подобных наивным T-клеток в сравнении с не подобными наивным T-клетками в стимулированной композиции. В некоторых аспектах необходимое для инициации культуры количество подобных наивным T-клеток или их подмножества CD8+ T-клеток составляет по меньшей мере, или по меньшей мере примерно, или составляет, или составляет примерно, 2×10 клеток. В некоторых вариантах осуществления количество подобных наивным T-клеток и не подобных наивным T-клеток в исходной композиции являются примерно одинаковыми. В некоторых случаях необходимое для инициации культуры количество представляет собой количество наивных CD8+ T-клеток. В некоторых случаях для необходимого для инициации культуры количества не учитывают количество не подобных наивным T-клеток в исходной композиции. В некоторых аспектах необходимое для инициации культуры количество определяют на основании числа целевых не подобных наивным T-клеток в стимулированной композиции.
b. Не подобные наивным T-клетки
EFF
CM
EM
hi
В некоторых вариантах осуществления способ включает инкубацию исходной композиции, содержащей популяцию T-клеток, включающую подобные наивным T-клетки и не подобные наивным T-клетки. В некоторых вариантах осуществления не подобные наивным T-клетки включают эффекторные T-клетки (T), T-клетки памяти, центральные T-клетки памяти (T), эффекторные T-клетки памяти (T), а также их сочетания. В одном аспекте настоящих способов предложена исходная композиция, которая была оценена в отношении популяций клеток, экспрессирующих различные маркеры, такие как CD27, CD28, CD56, CD62L, CD95, KLRG1, CD45RA или CD45RO, цитокины (например, IL-2, IFN-γ, IL-4, IL-10), рецепторы цитокинов (например, CD25), перфорин, молекулы адгезии (например, VLA-1, VLA-2, VLA-4, LPAM-1, LFA-1) и/или молекулы хоминга (например, L-селектин), до инкубации (например, стимуляции). В некоторых вариантах осуществления для идентификации не подобных наивным T-клеток можно использовать различные сигнатуры не подобных наивным T-клеток. В некоторых вариантах осуществления можно оценивать экспрессию конкретных маркеров не подобных наивным T-клеток. Например, в некоторых случаях не подобные наивным T-клетки не имеют на поверхности маркер, включая T-клеточные маркеры активации, такие как CD27, CD28, CD45RA и CCR7; и в некоторых случаях не подобные наивным T-клетки имеют на поверхности маркер, включая CD62L. В некоторых аспектах не подобные наивным T-клетки имеют на поверхности CD56 и/или CD45RO. В некоторых аспектах не подобные наивным T-клетки имеют на поверхности CD45RO и не имеют на клеточной поверхности CD27, CD45RA и CCR7. В некоторых случаях не подобные наивным T-клетки имеют внутриклеточную экспрессию цитокинов, таких как IL-2, IFN-γ, IL-4 и/или IL-10. В некоторых дополнительных примерах не подобные наивным T-клетки имеют экспрессию маркеров CD25 и/или перфорина. В некоторых случаях не подобные наивным T-клетки представляют собой CD95 клетки.
in vitro
in vitro
in vitro
Для оценки экспрессии маркеров не подобных наивным T-клеток способ в некоторых вариантах осуществления включает обнаружение маркеров путем проведения  анализа. В некоторых примерах  анализ представляет собой иммунный анализ, анализ с использованием аптамеров, гистологический или цитологический анализ, или анализ уровня экспрессии мРНК. В некоторых случаях используемый  анализ может представлять собой твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), иммуноблоттинг, иммунофенотипирование, иммунопреципитацию, радиоиммунный анализ (RIA), иммуноокрашивание, проточно-цитометрический анализ, поверхностный плазмонный резонанс (SPR), хемилюминесцентный анализ, иммунохроматографический анализ, анализ ингибирования или анализ авидности. В некоторых вариантах осуществления экспрессию маркеров не подобных наивным T-клеток определяют методом секвенирования РНК.
in vitro
Не подобные наивным T-клетки исходной композиции также можно оценивать на основании клональности T-клеток. В некоторых вариантах осуществления не подобные наивным T-клетки являются моноклональными. Клональность указанной исходной композиции T-клеток измеряют на основании широты ответа популяции на конкретный антиген. В некоторых вариантах осуществления моноклональность означает, что популяция T-клеток имеет очень низкую степень разнообразия. В некоторых аспектах исходную композицию можно оценивать путем измерения количества различных эпитопов, узнаваемых антиген-специфическими клетками. Это можно осуществлять с использованием стандартных методов получения и клонирования антиген-специфических T-клеток . В некоторых вариантах осуществления не подобные наивным T-клетки демонстрируют преобладание одного паттерна реаранжировки генов TCR. В некоторых примерах клональность клеток в исходной композиции, таких как не подобные наивным T-клетки, определяют путем клонального секвенирования, необязательно, секвенирования нового поколения или анализа спектротипов.
В некоторых вариантах осуществления оценка клональности популяции T-клеток представляет собой оценку клонального разнообразия популяции T-клеток. В некоторых вариантах осуществления моноклональность популяции T-клеток означает, что популяция T-клеток имеет низкую степень разнообразия. В контексте популяции T-клеток, такой как исходная композиция, моноклональность означает, что популяция T-клеток имеет одну специфичность при определении в анализе спектротипов (определение репертуара гипервариабельных областей Vβ, Vα, Vγ или Vδ цепей TCR). Популяцию T-клеток считают моноклональной (или моноспецифической), если профиль спектротипов Vβ, Vα, Vγ, и/или Vδ для конкретного семейства Vβ, Vα, Vγ и/или Vδ TCR имеет один преобладающий пик. Анализ спектротипов позволяет различать реаранжированные гены вариабельной области конкретного размера, не последовательности. Таким образом, понятно, что один пик может представлять популяцию T-клеток, экспрессирующих любой из ограниченного числа реаранжированных генов вариабельной области TCR (Vβ, Vα, Vγ или Vδ), содержащий любой из 4 потенциальных нуклеотидов (аденин (a), гуанин (g), цитозин (c) или тимин (t)) или сочетание 4 нуклеотидов в соединительной области. В конкретных вариантах осуществления может быть желательно клонировать и секвенировать конкретную полосу для определения последовательности(ей) реаранжированного гена(ов) вариабельной области, присутствующей в полосе, соответствующей конкретной длине.
et al.
В некоторых вариантах осуществления способы оценки клональности могут включать различные особенности способов, описанные в международных патентных публикациях №№ WO2012/048341, WO2014/144495, WO2017/053902, WO2016044227, WO2016176322 и WO2012048340, каждая из которых включена в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме. В некоторых вариантах осуществления такие способы можно использовать для получения информации о последовательности интересующего целевого полинуклеотида, такого как TCR, в клетке. Целевые гены можно получать из геномной ДНК или мРНК клетки из образца или популяции клеток. Образец или популяция клеток может включать иммунные клетки. Например, для целевых молекул TCR гены, кодирующие цепи TCR, можно получать из геномной ДНК или мРНК иммунных клеток или T-клеток. В некоторых вариантах осуществления исходным материалом является РНК из T-клеток, состоящая из транскриптов генов, кодирующих цепь TCR. В некоторых вариантах осуществления к клональности применяют индекс Шеннона в качестве порога для фильтрования клонов («скорректированная по Шеннону клональность»), смотри, Chaara  (2018) Front Immunol 9:1038).
Соответственно, в число способов инкубации (например, стимуляции) T-клеток для получения сконструированных T-клеток для адоптивной терапии входят способы с использованием условий, которые предпочтительно индуцируют размножение и пролиферацию клеток, происходящих от подобных наивным T-клеток (или происходящих от CD45RA+ или CD45RO- T-клеток), в сравнении с клетками, происходящими от не подобных наивным T-клеток (или происходящими от CD45RA- или CD45RO+ T-клеток). В некоторых вариантах осуществления подобные наивным T-клетки представляют собой CD45RA+, CD45RO-, CD27+ и CCR7+ клетки. В некоторых вариантах осуществления не подобные наивным T-клетки представляют собой CD45RA-, CD45RO+, CD27- и CCR7- клетки. В некоторых вариантах осуществления способы включают инкубацию T-клеток в инициирующей культуру композиции в стимулирующих условиях, которые предпочтительно индуцируют размножение или пролиферацию подобных наивным T-клеток в сравнении с не подобными наивным T-клетками, с получением стимулированной композиции. С использованием предложенных способов оценку исходной композиции на основании маркеров и сигнатур, описанных выше, можно использовать в качестве части способа.
B. Инкубация клеток
В некоторых вариантах осуществления предложенные способы включают этапы культивации, инкубации, культивирования и/или генной инженерии клеток в исходной композиции, такой как исходная композиция, содержащая необходимое для инициации культуры количество подобных наивным T-клеток. Например, в некоторых вариантах осуществления предложены способы инкубации и/или инженерии необходимого для инициации культуры количества предложенных исходных композиций, в которых содержится пороговое число описанных подобных наивным T-клеток. Инкубацию и/или инженерию можно проводить в емкости для культивирования, такой как блок, камера, лунка, колонка, трубка, набор трубок, клапан, флакон, чашка для культивирования, мешок или другой контейнер для культивирования, или культивации, клеток.
В некоторых вариантах осуществления клетки инкубируют и/или культивируют до проведения, или одновременно с проведением, генной инженерии, в соответствии с любым из способов, описанных в разделе II. Этапы инкубации могут включать культивирование, культивацию, стимуляцию, активацию и/или выращивание. В некоторых вариантах осуществления композиции или клетки инкубируют в присутствии стимулирующих условий или стимулирующего средства. Такие условия включают условия, предназначенные для индукции пролиферации, размножения, активации и/или выживания клеток в популяции, для имитации воздействия антигена и/или для примирования клеток для генной инженерии, например, для введения рекомбинантного рецептора, например, CAR.
Условия могут включать одно или более из конкретной среды, температуры, содержания кислорода, содержания диоксида углерода, периода времени, средств, например, питательных веществ, аминокислот, антибиотиков, ионов и/или стимулирующих факторов, таких как цитокины, хемокины, антигены, связывающие партнеры, слитые белки, рекомбинантные растворимые рецепторы, а также любые другие средства, предназначенные для активации клеток.
В некоторых вариантах осуществления стимулирующие условия или средства включают одно или более средств, например, лиганд, который способен активировать внутриклеточный сигнальный домен комплекса TCR. В некоторых аспектах средство запускает или инициирует внутриклеточный сигнальный каскад TCR/CD3 в T-клетке. Такие средства могут включать антитела, например, те, которые специфичны для TCR, например, анти-CD3 антитела. В некоторых вариантах осуществления стимулирующие условия включают одно или более средств, например, лиганд, который способен стимулировать костимулирующий рецептор, например, анти-CD28 антитело. В некоторых вариантах осуществления такие средства и/или лиганды могут быть связаны с твердой подложкой, такой как гранула, и/или могут представлять собой один или более цитокинов. Необязательно, способ размножения может дополнительно включать этап добавления анти-CD3 и/или анти-CD28 антитела в среду для культивирования (например, в концентрации по меньшей мере примерно 0,5 нг/мл).
Предложенные способы, как правило, включают наличие, проектирование и/или использование стимулирующих условий, которые предпочтительно индуцируют размножение или пролиферацию подобных наивным, в сравнении с не подобными наивным, T-клеток, и/или которые предпочтительно не индуцируют размножение или пролиферацию не подобных наивным, в сравнении с подобными наивным, T-клеток. В некоторых аспектах условия включают использование средств, которые индуцируют такой активирующий сигнал, что только не подобные наивным T-клетки, присутствующие в композиции, становятся активированными так, что это приводит к клеточной гибели. Такие предпочтительные условия, как правило, используют на стадии, предваряющей введение нуклеиновых кислот, кодирующих сконструированные молекулы, такие как сконструированные антигенные рецепторы.
Условия включают, но без ограничения, условия, предназначенные для индукции пролиферации, размножения, активации и/или выживания клеток в популяции. В некоторых вариантах осуществления условия включают стимулирующий, например, активирующий, сигнал, достаточный для активации и/или индукции пролиферации или деления не подобных наивным T-клеток, или их подмножества. Для подобных наивным T-клеток, как правило, необходим минимальный сигнал через TCR/CD3 для достижения порога для активации, например, для достижения полной активации и вхождения в клеточный цикл. Этот минимальный сигнал, как правило, выше, чем сигнал, необходимый для индукции активации/вхождения в клеточный цикл не подобных наивным T-клеток и/или некоторых их подмножеств. Не подобным наивным T-клеткам, как правило, необходим намного более низкий уровень вовлеченности TCR/CD3 для активации и вхождения в клеточный цикл. В некоторых аспектах более сильные сигналы могут вызывать, или повышать, уровни индуцированной активацией клеточной гибели у не подобных наивным клеток или некоторых их подмножеств.
Таким образом, в некоторых вариантах осуществления, в которых композиция содержит популяцию подобных наивным и не подобных наивным T-клеток, и используют условия, индуцирующие активирующий сигнал ниже порога активации, необходимого для активации подобных наивным T-клеток, в основном не подобные наивным T-клетки будут становиться активированными и восприимчивыми к стимулирующим условиям, которые могут приводить к клеточной гибели. Например, в конкретных стимулирующих условиях клеточная гибель может возникать вследствие активации.
В некоторых аспектах стимулирующие условия являются такими, что активацией индуцируется клеточная гибель не подобных наивным клеток, в отличие от других условий, таких как стандартные условия. Таким образом, настоящее изобретение относится к способам элиминации по меньшей мере значительной части любой нежелательной субпопуляции T-клеток, например, не подобных наивным T-клеток исходной композиции. В случае предложенных способов значительная часть означает по меньшей мере 70% нежелательной субпопуляции клеток, например, не подобных наивным T-клеток исходной композиции. В конкретных вариантах осуществления значительная часть означает 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, и более, нежелательной субпопуляции клеток, например, не подобных наивным T-клеток исходной композиции. Элиминацию клеток, например, вследствие клеточной гибели не подобных наивным T-клеток, можно измерять с использованием разных методов, включая, но без ограничения, проточно-цитометрический анализ с использованием различных антител и/или тетрамеров пептид-MHC, а также функциональные анализы, такие как анализы пролиферации и высвобождения хрома.

В некоторых вариантах осуществления в исходную композицию добавляют фермент для удаления остаточных клеточных компонентов после элиминации клеток. Например, в некоторых иллюстративных вариантах осуществления к исходной композиции добавляют дезоксирибонуклеазу (ДНКазу) или рекомбинантную человеческую дезоксирибонуклеазу I (пульмозим). В некоторых аспектах стимулирующие условия включают использование дезоксирибонуклеазы (ДНКазы) или рекомбинантной человеческой дезоксирибонуклеазы I (пульмозима).
В некоторых случаях стимулирующие условия не включают использование компонентов для культивирования, которые добавляют для сохранения конкретных подмножеств T-клеток, например, не подобных наивным T-клеток. Таким образом, в некоторых случаях удаление компонентов из культуры в стимулирующих условиях может вносить вклад в элиминацию не подобных наивным T-клеток. В некоторых аспектах стимулирующие условия применяют, или применяют также, путем исключения или уменьшения концентрации реагентов для культивирования, которые, как известно или вероятно, уменьшают AICD, и/или которые стимулируют выживание более старых клеток, таких как не наивные клетки. В некоторых случаях стимулирующие условия не включают N-ацетилцистеин, или включают N-ацетилцистеин в более низком количестве или концентрации. В некоторых случаях стимулирующие условия не включают рекомбинантный IL-7 и/или рекомбинантный IL-15, или включают рекомбинантный IL-7 или IL-15 в более низком количестве или концентрации. В некоторых вариантах осуществления могут быть включены добавки для культивирования, которые дополнительно облегчают или стимулируют удаление не наивных клеток (например, токсина, связанного с CD45RO).
В конкретных вариантах осуществления периоды стимуляции и/или размножения могут составлять от 2 до 15 дней, от 2 до 12 дней, от 2 до 10 дней, от 2 до 8 дней, от 2 до 6 дней, от 2 до 4 дней, от 4 до 12 дней, от 4 до 10 дней, от 4 до 8 дней, от 4 до 6 дней, от 6 до 12 дней, от 6 до 10 дней, от 6 до 8 дней, от 8 до 12 дней, от 8 до 10 дней или от 10 до 12 дней. В некоторых вариантах осуществления клетки инкубируют в течение по меньшей мере 2 дней, 3 дней, 4 дней, 5 дней, 6 дней, 7 дней, 8 дней, 9 дней, 10 дней, 11 дней, 12 дней, 13 дней, 14 дней, или более 14 дней. В одном варианте осуществления предложенных способов смесь можно культивировать в течение периода времени от 30 минут до нескольких часов (примерно 3 часов) или до примерно 14 дней, или в течение любого промежуточного целого числа часов или минут. В другом варианте осуществления смесь можно культивировать в течение 21 дня. В одном варианте осуществления гранулы и T-клетки совместно культивируют в течение примерно восьми дней. В другом варианте осуществления гранулы и T-клетки совместно культивируют в течение по меньшей мере, или по меньшей мере примерно, 2-3 дней. В другом варианте осуществления гранулы и T-клетки совместно культивируют в течение по меньшей мере, или по меньшей мере примерно, 2 дней или по меньшей мере, или по меньшей мере примерно, 48 часов. В некоторых аспектах могут потребоваться несколько циклов стимуляции, так что время культивирования T-клеток может составлять 60 дней или более.
Инкубацию и/или инженерию можно проводить в емкости для культивирования, такой как блок, камера, лунка, колонка, трубка, набор трубок, клапан, флакон, чашка для культивирования, мешок или другой контейнер для культивирования, или культивации, клеток. В некоторых вариантах осуществления композиции или клетки инкубируют в присутствии стимулирующих условий или стимулирующего средства. Такие условия включают условия, предназначенные для индукции пролиферации, размножения, активации и/или выживания клеток в популяции, для имитации воздействия антигена и/или для примирования клеток для генной инженерии, например, для введения рекомбинантного рецептора.
Предложенные способы, как правило, включают инкубацию (например, содержащих T-клетки исходных композиций) в стимулирующих условиях. В контексте стимуляции T-клеток стимулирующие условия, как правило, включают основное средство, способное к связыванию, лигированию, перекрестной сшивке и/или индукции активации через внутриклеточный сигнальный домен комплекса TCR или его компонент, такой как CD3. В некоторых вариантах осуществления стимулирующие условия включают основное средство, которое специфически связывает компонент комплекса TCR, и вспомогательное средство, которое специфически связывает T-клеточную костимулирующую молекулу. В некоторых конкретных примерах основное средство специфически связывает CD3, и/или костимулирующую молекулу выбирают из группы, состоящей из CD28, CD137 (4-1-BB), OX40 или ICOS.
В некоторых вариантах осуществления стимулирующие условия включают иммобилизованные анти-CD3 и анти-CD28 антитела, растворимые анти-CD3 антитела, производные таких антител и/или другие лиганды, которые связывают комплекс TCR/CD3 на T-клетках. В некоторых аспектах основное средство запускает или инициирует внутриклеточный сигнальный каскад TCR/CD3 в T-клетке. Такие средства могут включать связывающие партнеры, такие как естественные лиганды и/или антитела, включая антигенсвязывающие фрагменты антител, такие как те, которые специфичны для компонента TCR, такого как CD3. Иллюстративными анти-CD3 антителами являются BC3, OKT3 и G19-4.
В некоторых вариантах осуществления стимулирующие условия дополнительно включают инкубацию с вспомогательным средством, таким как средство, способное индуцировать T-клеточный костимулирующий сигнал в T-клетке, такой как сигнал, который в сочетании с основным сигналом (например, связыванием TCR/CD3) приводит к пролиферации и/или активации T-клеток. Иллюстративными вспомогательными средствами являются средства, которые специфически связывают, лигируют, перекрестно сшивают и/или индуцируют внутриклеточные события сигнализации через T-клеточную костимулирующую или вспомогательную молекулу, такую как CD28, CD137 (4-1-BB), OX40, ICOS, CD40, LFA-1, DAP10 и/или CD54. Средства включают антитела, в том числе их фрагменты, естественные лиганды и другие связывающие партнеры. В некоторых вариантах осуществления вспомогательное средство связывает CD28, например, анти-CD28 антитело, включая антигенсвязывающие фрагменты антитела. В некоторых аспектах средство представляет собой анти-CD28 антитело. Иллюстративными анти-CD28 антителами являются B-T3 и XR-CD28.
Staphylococcus
Staphylococcus
В некоторых вариантах осуществления связывающие партнеры или средства, которые специфически связывают конкретную молекулу, такую как T-клеточная стимулирующая или костимулирующая молекула, включают антитела, специфичные для таких молекул, включая антигенсвязывающие фрагменты антител. В некоторых аспектах антитело, например, анти-CD3 и/или анти-CD28 антитело, включают в концентрации, составляющей по меньшей мере, или примерно, 0,5 нг/мл. В некоторых аспектах средства включают один или более других связывающих партнеров для такой молекулы, таких как естественный связывающий партнер. Средства также могут включать естественные лиганды и комплексы, в том числе молекулы и/или комплексы на антигенпредставляющих клетках и/или суперантиген (энтеротоксин A  (SEA), энтеротоксин B  (SEB), токсин 1 синдрома токсического шока (TSST-1)), эндотоксин). Другими иллюстративными средствами являются средства, которые имитируют сигнализацию через основную или костимулирующую T-клеточную сигнальную молекулу, например, митоген, включая активатор PKC, форбол-миристат-ацетат (PMA), фитогемоагглютинин (PHA) и/или кальциевый ионофор, например, иономицин, липополисахарид (LPS), T-клеточный митоген и цитокины. В некоторых аспектах условия включают инкубацию с одним или более стимулирующими цитокинами или другими факторами, такими как IL-2 и/или IL-15. В некоторых аспектах концентрация цитокина составляет по меньшей мере примерно 10 единиц/мл.
В некоторых вариантах осуществления основные и вспомогательные (костимулирующие) средства связаны с твердой поверхностью или подложкой, такой как частица, например, гранула. В некоторых вариантах осуществления клетки могут инкубироваться, и/или вступать в контакт, со стимулирующим средством, способным активировать и/или вызывать размножение T-клеток. В некоторых аспектах основные и вспомогательные средства связаны с твердой поверхностью, такой как частица, например, гранула. В конкретных вариантах осуществления стимулирующее средство включает частицу, например, гранулу, которая конъюгирована или связана с одним или более средствами, например, биологическими молекулами, которые способны активировать и/или вызывать размножение клеток, например, T-клеток. В некоторых вариантах осуществления одно или более средств связаны с гранулой. В некоторых вариантах осуществления гранула является биосовместимой, то есть, состоит из материала, который подходит для биологического применения. В некоторых вариантах осуществления гранулы являются нетоксичными для культивируемых клеток, например, культивируемых T-клеток. В некоторых вариантах осуществления гранулы могут представлять собой любые частицы, способные присоединять средства таким образом, что это допускает взаимодействие между средством и клеткой.
В некоторых вариантах осуществления стимулирующее средство включает одно или более средств, способных активировать и/или вызывать размножение клеток, например, T-клеток, которые связаны или иным образом соединены с гранулой, например, с поверхностью гранулы. В конкретных вариантах осуществления гранула представляет собой неклеточную частицу. В конкретных вариантах осуществления гранула может включать коллоидную частицу, микросферу, наночастицу, магнитную гранулу или тому подобное. В некоторых вариантах осуществления гранулы представляют собой агарозные гранулы. В конкретных вариантах осуществления гранулы представляют собой сефарозные гранулы.
В конкретных вариантах осуществления стимулирующее средство включает гранулы, которые являются монодисперсными. В конкретных вариантах осуществления гранулы, которые являются монодисперсными, имеют распределение по размерам со стандартным отклонением между диаметрами, составляющим менее 5%.
В некоторых вариантах осуществления гранула содержит одно или более средств, например, средство, которое соединено, конъюгировано или связано (непосредственно или опосредованно) с поверхностью гранулы. В некоторых вариантах осуществления средство, предусмотренное в настоящем документе, может включать, но не ограничивается ими, РНК, ДНК, белки (например, ферменты), антигены, поликлональные антитела, моноклональные антитела, фрагменты антител, углеводы, липиды, лектины, или любую другую биологическую молекулу с аффинностью для желаемой мишени. В некоторых вариантах осуществления желаемой мишенью является T-клеточный рецептор и/или компонент T-клеточного рецептора. В конкретных вариантах осуществления желаемой мишенью является CD3. В конкретном варианте осуществления желаемой мишенью является костимулирующая молекула, например, CD28. Одно или более средств могут быть присоединены непосредственно или опосредованно к грануле различными способами. Соединение может быть ковалентным, нековалентным, электростатическим или гидрофобным, и может быть осуществлено различными методами присоединения, включая, например, химические методы, механические методы или ферментативные методы. В некоторых вариантах осуществления биологическая молекула (например, биотинилированное анти-CD3 антитело) может быть присоединена к грануле опосредованно, через другую биологическую молекулу (например, антитело против биотина), которая непосредственно связана с гранулой.
2
2
В некоторых вариантах осуществления одно или более из средств, присоединенных к грануле, представляют собой антитело. Антитело может включать поликлональное антитело, моноклональное антитело (включая полноразмерные антитела, которые имеют Fc-область иммуноглобулина), композиции антител с полиэпитопной специфичностью, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела), диатела и одноцепочечные молекулы, а также фрагменты антител (например, Fab, F(ab') и Fv). В некоторых вариантах осуществления стимулирующий реагент представляет собой фрагмент антитела (включающий антигенсвязывающий фрагмент), например, фрагмент Fab, Fab′-SH, Fv, scFv, или (Fab′). Следует понимать, что константные области любого изотипа можно использовать для антител, предусмотренных в настоящем документе, включая константные области IgG, IgM, IgA, IgD и IgE, и что такие константные области могут быть получены из любых антител человека или животных (например, мышей). В некоторых вариантах осуществления средство представляет собой антитело, которое связывает и/или узнает один или более компонентов T-клеточного рецептора. В конкретных вариантах осуществления средство представляет собой анти-CD3 антитело. В конкретных вариантах осуществления средство представляет собой антитело, которое связывает и/или узнает корецептор. В некоторых вариантах осуществления стимулирующий реагент представляет собой анти-CD28 антитело.
В некоторых вариантах осуществления гранула имеет диаметр более примерно 0,001 мкм, более примерно 0,01 мкм, более примерно 0,1 мкм, более примерно 1,0 мкм, более примерно 10 мкм, более примерно 50 мкм, более примерно 100 мкм или более примерно 1000 мкм; и не более, чем примерно 1500 мкм. В некоторых вариантах осуществления гранула имеет диаметр от примерно 1,0 мкм до примерно 500 мкм, от примерно 1,0 мкм до примерно 150 мкм, от примерно 1,0 мкм до примерно 30 мкм, от примерно 1,0 мкм до примерно 10 мкм, от примерно 1,0 мкм до примерно 5,0 мкм, от примерно 2,0 мкм до примерно 5,0 мкм или от примерно 3,0 мкм до примерно 5,0 мкм. В некоторых вариантах осуществления гранула имеет диаметр от примерно 3 мкм до примерно 5 мкм. В некоторых вариантах осуществления гранула имеет диаметр по меньшей мере, или по меньшей мере примерно, или примерно, 0,001 мкм, 0,01 мкм, 0,1 мкм, 0,5 мкм, 1,0 мкм, 1,5 мкм, 2,0 мкм, 2,5 мкм, 3,0 мкм, 3,5 мкм, 4,0 мкм, 4,5 мкм, 5,0 мкм, 5,5 мкм, 6,0 мкм, 6,5 мкм, 7,0 мкм, 7,5 мкм, 8,0 мкм, 8,5 мкм, 9,0 мкм, 9,5 мкм, 10 мкм, 12 мкм, 14 мкм, 16 мкм, 18 мкм или 20 мкм. В конкретных вариантах осуществления гранула имеет диаметр, составляющий, или составляющий примерно, 4,5 мкм. В конкретных вариантах осуществления гранула имеет диаметр, составляющий, или составляющий примерно, 2,8 мкм.
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
В некоторых вариантах осуществления гранулы имеют плотность более 0,001 г/см, более 0,01 г/см, более 0,05 г/см, более 0,1 г/см, более 0,5 г/см, более 0,6 г/см, более 0,7 г/см, более 0,8 г/см, более 0,9 г/см, более 1 г/см, более 1,1 г/см, более 1,2 г/см, более 1,3 г/см, более 1,4 г/см, более 1,5 г/см, более 2 г/см, более 3 г/см, более 4 г/см или более 5 г/см. В некоторых вариантах осуществления гранулы имеют плотность от примерно 0,001 г/см до примерно 100 г/см, от примерно 0,01 г/см до примерно 50 г/см, от примерно 0,1 г/см до примерно 10 г/см, от примерно 0,1 г/см до примерно 0,5 г/см, от примерно 0,5 г/см до примерно 1 г/см, от примерно 0,5 г/см до примерно 1,5 г/см, от примерно 1 г/см до примерно 1,5 г/см, от примерно 1 г/см до примерно 2 г/см или от примерно 1 г/см до примерно 5 г/см. В некоторых вариантах осуществления гранулы имеют плотность примерно 0,5 г/см, примерно 0,6 г/см, примерно 0,7 г/см, примерно 0,8 г/см, примерно 0,9 г/см, примерно 1,0 г/см, примерно 1,1 г/см, примерно 1,2 г/см, примерно 1,3 г/см, примерно 1,4 г/см, примерно 1,5 г/см, примерно 1,6 г/см, примерно 1,7 г/см, примерно 1,8 г/см, примерно 1,9 г/см, или примерно 2,0 г/см. В конкретных вариантах осуществления гранулы имеют плотность примерно 1,6 г/см. В конкретных вариантах осуществления гранулы, или частицы, имеют плотность примерно 1,5 г/см. В конкретных вариантах осуществления частицы имеют плотность примерно 1,3 г/см.
В конкретных вариантах осуществления множество гранул имеют однородную плотность. В конкретных вариантах осуществления однородная плотность означает, что стандартное отклонение плотности составляет менее 10%, менее 5% или менее 1% от средней плотности гранул.
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
В некоторых вариантах осуществления гранулы имеют площадь поверхности от примерно 0,001 м на каждый грамм частиц (м/г) до примерно 1,000 м/г, от примерно 0,010 м/г до примерно 100 м/г, от примерно 0,1 м/г до примерно 10 м/г, от примерно 0,1 м/г до примерно 1 м/г, от примерно 1 м/г до примерно 10 м/г, от примерно 10 м/г до примерно 100 м/г, от примерно 0,5 м/г до примерно 20 м/г, от примерно 0,5 м/г до примерно 5 м/г или от примерно 1 м/г до примерно 4 м/г. В некоторых вариантах осуществления частицы, или гранулы, имеют площадь поверхности от примерно 1 м/г до примерно 4 м/г.
В некоторых вариантах осуществления гранула содержит по меньшей мере один материал на поверхности, или рядом с поверхностью, гранулы, который может быть соединен, связан или конъюгирован со средством. В некоторых вариантах осуществления поверхность гранулы функционализирована, то есть, содержит функциональные группы, которые способны образовывать ковалентную связь со связывающей молекулой, например, полинуклеотидом или полипептидом. В конкретных вариантах осуществления гранула имеет экспонированные на поверхности карбоксильные, амино, гидроксильные, тозильные, эпокси и/или хлорметильные группы. В конкретных вариантах осуществления гранулы имеют экспонированные на поверхности агарозу и/или сефарозу. В конкретных вариантах осуществления поверхность гранулы содержит присоединенные стимулирующие реагенты, которые могут связывать или присоединять связывающие молекулы. В конкретных вариантах осуществления биологические молекулы представляют собой полипептиды. В некоторых вариантах осуществления гранулы имеют экспонированный на поверхности белок A, белок G или биотин.
В некоторых вариантах осуществления гранула реагирует на магнитное поле. В некоторых вариантах осуществления гранула представляет собой магнитную гранулу. В некоторых вариантах осуществления магнитная гранула является парамагнитной. В конкретных вариантах осуществления магнитная гранула является суперпарамагнитной. В конкретных вариантах осуществления гранулы не проявляют какие-либо магнитные свойства, когда на них не действует магнитное поле.
3
4
В конкретных вариантах осуществления гранула имеет магнитное ядро, парамагнитное ядро или суперпарамагнитное ядро. В некоторых вариантах осуществления магнитное ядро содержит металл. В некоторых вариантах осуществления металл может представлять собой, но без ограничения, железо, никель, медь, кобальт, гадолиний, марганец, тантал, цинк, цирконий или любые их сочетания. В конкретных вариантах осуществления магнитное ядро содержит оксиды металла (например, оксиды железа), ферриты (например, ферриты марганца, ферриты кобальта, ферриты никеля и так далее), гематит и металлические сплавы (например, CoTaZn). В некоторых вариантах осуществления магнитное ядро содержит одно или более из феррита, металла, металлического сплава, оксида железа или диоксида хрома. В некоторых вариантах осуществления магнитное ядро содержит элементарное железо или соединение железа. В некоторых вариантах осуществления магнитное ядро содержит одно или более из магнетита (Fe3O4), маггемита (γFe2O3) или грейгита (Fe3S4). В некоторых вариантах осуществления внутреннее ядро содержит оксид железа (например, FeO).
В конкретных вариантах осуществления гранула содержит магнитное, парамагнитное и/или суперпарамагнитное ядро, которое имеет оболочку, или покрытие, с функционализированной поверхностью. В некоторых вариантах осуществления покрытие может содержать материал, который может включать, но не ограничивается ими, полимер, полисахарид, диоксид кремния, жирную кислоту, белок, углевод, агарозу, сефарозу, или их сочетание. В некоторых вариантах осуществления полимер может представлять собой полиэтиленгликоль, поли(молочную-co-гликолевую кислоту), полиглутаральдегид, полиуретан, полистирол или поливиниловый спирт. В конкретных вариантах осуществления внешняя оболочка, или покрытие, содержит полистирол. В конкретных вариантах осуществления поверхность внешнего покрытия функционализирована.
В некоторых вариантах осуществления стимулирующий реагент включает гранулу, которая имеет ядро из оксида металла (например, ядро из оксида железа) и покрытие, при этом ядро из оксида металла содержит по меньшей мере один полисахарид (например, декстран), и при этом покрытие содержит по меньшей мере один полисахарид (например, аминодекстран), по меньшей мере один полимер (например, полиуретан) и диоксид кремния. В некоторых вариантах осуществления ядро из оксида металла представляет собой ядро из коллоидного оксида железа. В конкретных вариантах осуществления одно или более средств включают антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. В конкретных вариантах осуществления одно или более средств включают анти-CD3 антитело и анти-CD28 антитело. В некоторых вариантах осуществления стимулирующий реагент включает анти-CD3 антитело, анти-CD28 антитело и антитело против биотина. В некоторых вариантах осуществления стимулирующий реагент включает антитело против биотина. В некоторых вариантах осуществления гранула имеет диаметр от примерно 3 мкм до примерно 10 мкм. В некоторых вариантах осуществления гранула имеет диаметр от примерно 3 мкм до примерно 5 мкм. В конкретных вариантах осуществления гранула имеет диаметр примерно 3,5 мкм.
3
4
2
3
3
2
2
3
3
В некоторых вариантах осуществления стимулирующий реагент включает одно или более средств, которые присоединены к грануле, содержащей ядро из оксида металла (например, внутреннее ядро из оксида железа) и покрытие (например, защитное покрытие), при этом покрытие содержит полистирол. В конкретных вариантах осуществления гранулы представляют собой монодисперсные, суперпарамагнитные гранулы, имеющие суперпарамагнитное железное ядро, например, ядро, содержащее магнетит (FeO) и/или маггемит (γFeO), и полистирольное покрытие или оболочку. В некоторых вариантах осуществления гранула является не пористой. В некоторых вариантах осуществления гранулы имеют функционализированную поверхность, к которой присоединены одно или более средств. В конкретных вариантах осуществления одно или более средств ковалентно связаны с поверхностью гранул. В некоторых вариантах осуществления одно или более средств включают антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления одно или более средств включают анти-CD3 антитело и анти-CD28 антитело. В конкретных вариантах осуществления гранулы имеют плотность примерно 1,5 г/см и площадь поверхности от примерно 1 м/г до примерно 4 м/г. В конкретных вариантах осуществления гранулы представляют собой монодисперсные, суперпарамагнитные гранулы, которые имеют диаметр примерно 4,5 мкм и плотность примерно 1,5 г/см. В некоторых вариантах осуществления гранулы представляют собой монодисперсные, суперпарамагнитные гранулы, которые имеют средний диаметр примерно 2,8 мкм и плотность примерно 1,3 г/см.

При выделении разных T-клеточных популяций время воздействия частиц можно варьировать. Например, в одном предпочтительном варианте осуществления T-клетки выделяют путем инкубации с 3×28 гранулами, такими как DYNABEADS M-450 или Dynabeads CD3/CD28 CTS™, в течение периода времени, достаточного для положительной селекции нужных T-клеток. В одном варианте осуществления период времени составляет примерно 30 минут. В следующем варианте осуществления период времени составляет по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5 или 6 часов. В другом предпочтительном варианте осуществления период времени составляет 10-24 часа или более. В одном предпочтительном варианте осуществления период инкубации составляет 24 часа. При получении T-клеток от пациентов с раком использование более длительных периодов инкубации, например, 24 часа, может увеличивать выход клеток.
При связывании с поверхностью средства могут быть связаны с одной и той же поверхностью (то есть, в «цис» положении) или с отдельными поверхностями (то есть, в «транс» положении). Альтернативно, одно средство может быть связано с поверхностью, а другое средство может находиться в растворе. В одном варианте осуществления средство, обеспечивающее костимулирующий сигнал, связано с поверхностью, а средство, обеспечивающее основной активирующий сигнал, находится в растворе или связано с поверхностью. В предпочтительном варианте осуществления два средства иммобилизованы на гранулах, либо на одной и той же грануле, то есть, «цис», либо на отдельных гранулах, то есть, «транс». В качестве примера, средство, обеспечивающее основной активирующий сигнал, представляет собой анти-CD3 антитело, и средство, обеспечивающее костимулирующий сигнал, представляет собой анти-CD28 антитело; и оба средства совместно иммобилизованы на одной и той же грануле в эквивалентных молекулярных количествах. В одном варианте осуществления используют соотношение 1:1 для каждого антитела, связанного с гранулами, для размножения CD4+ T-клеток и роста T-клеток. В конкретных аспектах настоящего изобретения используют такое соотношение анти-CD3:CD28 антител, связанных с гранулами, что наблюдается увеличение размножения T-клеток в сравнении с размножением, наблюдаемым при использовании соотношения 1:1. В одном конкретном варианте осуществления наблюдается от, или от примерно, 0,5-кратного до примерно 3-кратного увеличения в сравнении с размножением, наблюдаемым при использовании соотношения 1:1. В одном варианте осуществления соотношение анти-CD3:CD28 антител, связанных с гранулами, находится в диапазоне от 100:1 до 1:100, включая все промежуточные целые значения. В одном аспекте настоящего изобретения с частицами связано больше анти-CD28 антитела, чем анти-CD3 антитела, то есть, соотношение анти-CD3:CD28 составляет менее единицы. В конкретных вариантах осуществления изобретения соотношение анти-CD28 антитела и анти-CD3 антитела, связанных с гранулами, составляет более 2:1. В одном конкретном варианте осуществления для антител, связанных с гранулами, используют соотношение анти-CD3:CD28, составляющее 1:200. В одном конкретном варианте осуществления для антител, связанных с гранулами, используют соотношение анти-CD3:CD28, составляющее 1:150. В одном конкретном варианте осуществления для антител, связанных с гранулами, используют соотношение анти-CD3:CD28, составляющее 1:100. В другом варианте осуществления для антител, связанных с гранулами, используют соотношение анти-CD3:CD28, составляющее 1:75. В следующем варианте осуществления для антител, связанных с гранулами, используют соотношение анти-CD3:CD28, составляющее 1:50. В другом варианте осуществления для антител, связанных с гранулами, используют соотношение анти-CD3:CD28, составляющее 1:45. В другом варианте осуществления для антител, связанных с гранулами, используют соотношение анти-CD3:CD28, составляющее 1:40. В другом варианте осуществления для антител, связанных с гранулами, используют соотношение анти-CD3:CD28, составляющее 1:35. В другом варианте осуществления для антител, связанных с гранулами, используют соотношение анти-CD3:CD28, составляющее 1:30. В другом варианте осуществления для антител, связанных с гранулами, используют соотношение анти-CD3:CD28, составляющее 1:25. В другом варианте осуществления для антител, связанных с гранулами, используют соотношение анти-CD3:CD28, составляющее 1:20. В другом варианте осуществления для антител, связанных с гранулами, используют соотношение анти-CD3:CD28, составляющее 1:15. В одном варианте осуществления для антител, связанных с гранулами, используют соотношение анти-CD3:CD28, составляющее 1:10. В другом варианте осуществления для антител, связанных с гранулами, используют соотношение анти-CD3:CD28, составляющее 1:5. В другом варианте осуществления для антител, связанных с гранулами, используют соотношение анти-CD3:CD28, составляющее 1:4. В другом варианте осуществления для антител, связанных с гранулами, используют соотношение анти-CD3:CD28, составляющее 1:3. В другом варианте осуществления для антител, связанных с гранулами, используют соотношение анти-CD3:CD28, составляющее 3:1.
В некоторых вариантах осуществления средство, например, антитело, добавляют в растворимой форме в культуру или композицию. В некоторых вариантах осуществления одно средство включают в растворимой форме, и другое средство включают связанным с твердой подложкой. В некоторых аспектах, когда два или более средств связаны с твердой подложкой(ами), два средства связаны с одной и той же подложкой или частицей, например, инкубацию проводят с анти-CD3/анти-CD28 гранулами, при этом гранулы содержат антитела, узнающие CD3 и CD28. В других аспектах два или более средств связаны с отдельными подложками, например, отдельными гранулами. Например, в некоторых аспектах анти-CD3 и анти-CD28 гранулы добавляют в культуру отдельно.
et al.,
Molecular Therapy
et al.,
Clin Immunol
et al.,
Nature Biotechnology
В некоторых вариантах осуществления условия культивирования включают искусственные антигенпредставляющие клетки. Например, в некоторых аспектах поверхность представляет собой искусственную антигенпредставляющую клетку, нагруженную средством или средствами, способными потенцировать сигнал через комплекс TCR, такими как анти-CD3 и/или анти-CD28 антитела. Иллюстративные антигенпредставляющие клетки представляют собой генетически модифицированные клетки, такие как миелоидные клетки (например, K562 или U937), сконструированные для экспрессии Fc-рецепторов, таких как среднеаффинные CD32 или высокоаффинные CD64 Fc-рецепторы. Такие клетки можно нагружать анти-CD3 и/или анти-CD28 антителами, узнаваемыми Fc-рецепторами, и инкубировать с T-клетками для обеспечения сигнала в культуре клеток. Иллюстративные искусственные АПК и их соотношения, а также способы их применения в условиях культивирования описаны, например, в публикациях Suhoski (2007) 15 5, 981-988; Thomas  (2002) 105(3): 259-72; Kim  22, 403-410 (2004). В некоторых вариантах осуществления условия культивирования включают антигенпредставляющие клетки, такие как МКПК, нагруженные антигеном, таким как антиген, узнаваемый комплексом TCR или другим рецептором на клетках, которые будут трансдуцированы, таких как T-клетки, специфичные для конкретного опухолевого антигена.
В некоторых вариантах осуществления предпочтительного размножения или пролиферации подобных наивным, в сравнении с не подобными наивным, T-клеток достигают за счет использования стимулирующих условий, предназначенных для индукции сигнала конкретной силы, например, силы стимулирующего или активирующего сигнала, которая выше определенного уровня, например, для индукции клеточной гибели не подобных наивным T-клеток. В некоторых аспектах более сильный сигнал индуцирует клеточную гибель не подобных наивным T-клеток исходной композиции, в то время как более слабый сигнал не индуцирует клеточную гибель не подобных наивным T-клеток исходной композиции и/или способствует выживанию не подобных наивным T-клеток, в сравнении с более сильным сигналом. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления более сильный сигнал предпочтительно активирует или вызывает клеточную гибель не подобных наивным T-клеток.
et al.,
В некоторых аспектах предпочтительного размножения или пролиферации подобных наивным, в сравнении с не подобными наивным, T-клеток достигают за счет конкретного соотношения гранул и клеток. В некоторых вариантах осуществления можно использовать любое стимулирующее условие, которое способствует размножению или выживанию подобных наивным T-клеток больше, чем не подобных наивным T-клеток. В некоторых вариантах осуществления стимулирующие условия включают инкубацию в присутствии реагентов-гранул, обеспечивающих основной и/или вспомогательный сигнал для T-клеточной активации, например, анти-CD3/анти-CD28 реагентов-гранул, присутствующих в количестве, которое благоприятно для пролиферации и/или выживания подобных наивным клеток, и/или которое предпочтительно вызывает индуцируемую активацией клеточную гибель (AICD) не подобных наивным клеток. В некоторых случаях такие реагенты-гранулы инкубируют с клетками при соотношении гранул и клеток, составляющем 1:1 или выше, что в некоторых аспектах может вызывать больше AICD и увеличивать процентную долю выживающих подобных наивным клеток, смотри, например, Kalamasz  J Immunother. (2004) 27(5):405-418 и патенты США №: 7977095 и 9528088. В одном варианте осуществления соотношение составляет от, или от примерно, 50:1 до примерно 5:1. В конкретных вариантах осуществления соотношение составляет от, или от примерно, 100:1 до примерно 1:1. В одном варианте осуществления соотношение составляет по меньшей мере примерно 45:1. В конкретных вариантах осуществления соотношение составляет по меньшей мере примерно 40:1, 35:1, 30:1, 25:1, 20:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1 или 1:1. В некоторых аспектах используют соотношение гранул и клеток, составляющее менее 5:1 или менее 3:1. В одном конкретном варианте осуществления соотношение составляет примерно 3:1.
В одном варианте осуществления предложенных способов соотношения гранула:клетка можно корректировать для достижения желаемого T-клеточного фенотипа. В одном конкретном варианте осуществления соотношения гранула:клетка можно варьировать для избирательного размножения или удаления подмножеств T-клеток. В одном варианте осуществления конкретное используемое соотношение гранула:клетка избирательно индуцирует клеточную гибель не подобных наивным T-клеток или клеток, происходящих от не подобных наивным T-клеток исходной композиции. В следующем варианте осуществления конкретное используемое соотношение гранула:клетка приводит к избирательному размножению подобных наивным T-клеток или клеток, происходящих от подобных наивным T-клеток. В некоторых вариантах осуществления можно использовать любое соотношение при условии, что имеет место желаемое размножение или удаление подмножеств T-клеток. Таким образом, композиции и способы, описанные в настоящем документе, можно использовать для размножения конкретных популяций T-клеток, или для удаления конкретных популяций T-клеток, что находит применение в самых разных иммунотерапевтических ситуациях, описанных в настоящем документе.
2
Также предложены стимулирующие условия, подходящие для способа инкубации (например, стимуляции) T-клеток. Условия, подходящие для культивирования T-клеток, включают соответствующую среду (например, OpTmizer™ (Gibco) или минимальную поддерживающую среду, или среду RPMI 1640, или X-vivo 15, (BioWhittaker)), которая может содержать факторы, необходимые для пролиферации и жизнеспособности, включая сыворотку (например, эмбриональную бычью или человеческую сыворотку), заменители сыворотки или интерлейкин-2 (IL-2), инсулин, или любые другие добавки для роста клеток. Среда может включать RPMI 1640, AIM-V, DMEM, MEM, α-MEM, F-12, X-Vivo 15 и X-Vivo 20, с добавленными аминокислотами и витаминами, либо без сыворотки, либо с добавлением соответствующего количества сыворотки (или плазмы) или заменителя сыворотки, или с добавлением определенного набора гормонов и/или цитокина(ов) в количестве, достаточном для роста и размножения T-клеток. Антибиотики, например, пенициллин и стрептомицин, включают только в экспериментальные культуры, но не в культуры клеток, которые предстоит вводить субъекту. Целевые клетки поддерживают в условиях, необходимых для роста, например, при соответствующей температуре (например, 37°C) и атмосфере (например, воздух плюс 5% CO).
В другом варианте осуществления время воздействия стимулирующих средств, таких как покрытые анти-CD3/анти-CD28 (то есть, 3×28) гранулы, можно изменять или корректировать для получения нужного T-клеточного фенотипа. Может быть желательным получение большей популяции хелперных T-клеток (TH), как правило, CD4+, в противоположность CD8+ цитотоксическим или регуляторным T-клеткам, поскольку размножение TH клеток может приводить к улучшению или восстановлению общей иммунной реакционной способности. При том, что многие специфические иммунные ответы опосредуются CD8+ антиген-специфическими T-клетками, которые могут непосредственно лизировать или уничтожать клетки-мишени, при большинстве иммунных ответов требуется помощь CD4+ T-клеток, которые экспрессируют важные иммунные регуляторные молекулы, такие как GM-CSF, CD40L и IL-2, например. Если предпочтительной является CD4-опосредованная помощь, способ, такой как описанный в настоящем документе, который позволяет сохранять или увеличивать соотношение CD4:CD8, может быть особенно полезен. Повышенные количества CD4+ T-клеток могут приводить к увеличению количества экспрессируемого клетками CD40L при введении пациентам, что потенциально улучшает различимость клеток-мишеней (улучшенная функция АПК). Аналогичные эффекты можно наблюдать при увеличении числа введенных инфузией клеток, экспрессирующих GM-CSF или IL-2, все из которых экспрессируются преимущественно CD4+ T-клетками. Аналогично, в некоторых вариантах применения может быть желательным использование популяции регуляторных T-клеток (например, Autoimmun Rev. 2002 August; 1(4):190-7; Curr Opin Immunol. 2002 December; 14(6):771-8), которые могут быть получены и размножены с использованием способов, описанных в настоящем документе. Альтернативно, в ситуациях, когда CD4-помощь нужна меньше, и необходимы повышенные количества CD8+ T-клеток, подходы XCELLERATE™, описанные в настоящем документе, также могут быть использованы, например, путем предварительного отбора на CD8+ клетки до стимуляции и/или культивирования. Такие ситуации могут иметь место, когда предпочтительно иметь повышенные уровни IFN-γ или повышенный цитолиз клеток-мишеней. Также можно модифицировать продолжительность и тип воздействия стимулирующих средств для размножения T-клеток с желаемым репертуаром TCR, например, экспрессирующих желаемые гены семейства Vβ.
В некоторых вариантах осуществления другие составляющие стимулирующих условий также включают одно или более из конкретной среды, температуры, содержания кислорода, содержание диоксида углерода, периода времени, средств, например, питательных веществ, аминокислот, антибиотиков, ионов и/или стимулирующих факторов, таких как цитокины, хемокины, антигены, связывающие партнеры, слитые белки, рекомбинантные растворимые рецепторы, а также любые другие средства, предназначенные для активации клеток.
in vitro
ex vivo
В некоторых вариантах осуществления клетки или композиции оценивают и/или корректируют во время этапов инкубации. Например, оценку и/или корректировку можно производить в любое время после начала инкубации или культивирования, например, во время инкубации. Оценка может включать проведение одного или более измерений для композиции или емкости, содержащей клетки, например, для оценки клеток в отношении скорости пролиферации, степени выживаемости, фенотипа, например, экспрессии одного или более поверхностных или внутриклеточных маркеров, таких как белки или полинуклеотиды, и/или для оценки композиции, или емкости, в отношении температуры, компонента(ов) среды, содержания кислорода или диоксида углерода, и/или наличия или отсутствия, или количества, или относительного количества, одного или более факторов, средств, компонентов и/или клеточных типов, включая подтипы. Оценка также может включать оценку в отношении показателя или предиктора токсического исхода, например, с использованием  или  систем, как описано в настоящем документе.
В некоторых аспектах оценку проводят в автоматическом режиме, например, с использованием устройства, описанного в настоящем документе, и/или планируют заранее для определения в конкретные моменты времени в процессе инкубации. В некоторых аспектах результат оценки указывает на то, что необходимо проводить корректировку.
Корректировка может включать корректировку любого фактора или параметра клеточной культуры, такого как температура, длительность (время) проведения каждой инкубации, или ее этапа, (продолжительность инкубации), подпитка клеток, добавление и/или удаление одного или более компонентов в инкубируемой композиции, например, среды или буфера, или их компонентов, средств, например, питательных веществ, аминокислот, антибиотиков, ионов и/или стимулирующих факторов, таких как цитокины, хемокины, антигены, связывающие партнеры, слитые белки, рекомбинантные растворимые рецепторы, или клеток, или типов клеток, или популяций клеток. В некоторых аспектах удаление или добавление различных компонентов, или другую корректировку, проводят в автоматическом режиме, например, с использованием устройства или системы, описанных в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления систему программируют так, что корректировка начинается автоматически на основании определенного результата промежуточной оценки. Например, в некоторых случаях систему или устройство программируют для проведения одной или более оценок в конкретные моменты времени; в таких случаях систему или устройство можно дополнительно программировать так, что конкретный результат такой оценки, например, конкретное соотношение двух типов клеток, инициирует конкретную корректировку, например, добавление клеток одного или более типов.
В некоторых аспектах корректировку проводят путем добавления или удаления таким способом, который не нарушает закрытую систему, содержащую клетки и композиции, например, при помощи входных и/или выходных клапанов, предназначенных для добавления или удаления компонентов с сохранением стерильности, таких, которые имеются в одном или более устройствах или системах, описанных в настоящем документе. Различные корректировки стимулирующих условий для достижения ответов и/или результатов в клетках конкретных типов описаны, например, в патенте США номер 8617884 и в публикации патентной заявки США № US 20030235908 A1.
В некоторых вариантах осуществления клетки инкубируют в течение, или в течение примерно, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 дней, или в течение, или в течение примерно, 1, 2, 3, 4 или более недель, либо в совокупности, либо до инженерии. В некоторых примерах инкубацию проводят в течение более, или примерно, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16 дней.
et al.,
et al.
et al.
et al.
В некоторых аспектах инкубацию проводят в соответствии с методами, которые описаны в патенте США № 6040177, выданном Riddell  публикациях Klebanoff  (2012) J Immunother. 35(9): 651-660, Terakura  (2012) Blood. 1:72-82 и/или Wang  (2012) J Immunother. 35(9):689-701.
В некоторых вариантах осуществления стимулирующие условия включают добавление питающих клеток, таких как неделящиеся мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) (например, так, что полученная популяция клеток содержит по меньшей мере примерно 5, 10, 20 или 40, или более, питающих клеток МКПК на каждый T-лимфоцит в исходной размножаемой популяции); и инкубацию культуры (например, в течение периода времени, достаточного для увеличения количества T-клеток). В некоторых аспектах неделящиеся питающие клетки могут представлять собой гамма-облученные питающие клетки МКПК. В некоторых вариантах осуществления МКПК облучают гамма-излучением в диапазоне примерно 3000-3600 рад для предотвращения деления клеток. В некоторых аспектах питающие клетки добавляют в среду для культивирования до добавления популяций T-клеток.
В некоторых вариантах осуществления стимулирующие условия включают температуру, подходящую для роста человеческих T-лимфоцитов, например, по меньшей мере примерно 25 градусов Цельсия, как правило, по меньшей мере примерно 30 градусов, и как правило, точно, или примерно, 37 градусов Цельсия. Необязательно, инкубация может дополнительно включать добавление неделящихся EBV-трансформированных лимфобластоидных клеток (LCL) в качестве питающих клеток. LCL могут быть облучены гамма-излучением в диапазоне примерно 6000-10000 рад. В некоторых аспектах питающие клетки LCL предоставляют в любом подходящем количестве так, что соотношение питающих клеток LCL и исходных T-лимфоцитов составляет по меньшей мере примерно 10:1.
in vitro
В вариантах осуществления антиген-специфические T-клетки, такие как антиген-специфические CD4+ и/или CD8+ T-клетки, получают путем стимуляции наивных или антиген-специфических T-лимфоцитов антигеном. Например, антиген-специфические T-клеточные линии или клоны можно получать к антигенам цитомегаловируса путем получения T-клеток от инфицированных субъектов и стимуляции клеток  тем же антигеном.
Инкубацию и/или инженери. можно проводить в емкости для культивирования, такой как блок, камера, лунка, колонка, трубка, набор трубок, клапан, флакон, чашка для культивирования, мешок или другой контейнер для культивирования, или культивации, клеток.
Также предложены инициирующие культуру композиции, используемые в способе, такие как композиции, содержащие T-клетки, например, человеческие первичные T-клетки, стимулирующие условия, например, различные средства в концентрациях/соотношениях, предназначенных для предпочтительной активации или размножения не наивных T-клеток.
В некоторых вариантах осуществления, когда клетки подвергают инженерии, например, для введения генно-инженерного антигенного рецептора, инкубацию в присутствии одного или более стимулирующих средств продолжают во время фазы инженерии.
Для стимуляции T-клеток или других целевых клеток можно использовать соотношения гранул и клеток в диапазоне от 1:500 до 500:1, включая любые промежуточные целые значения. В некоторых случаях соотношение гранул и клеток может зависеть от размера частиц в сравнении с целевой клеткой. Например, мелкие гранулы могут связывать лишь несколько клеток, в то время как более крупные гранулы могут связывать большое количество клеток. В конкретных вариантах осуществления соотношение клеток и частиц находится в диапазоне от 1:100 до 100:1, включая любые промежуточные целые значения, и в следующих вариантах осуществления соотношение составляет от 1:50 до 50:1, включая любые промежуточные целые значения. В другом варианте осуществления соотношение клеток и частиц, находящееся в диапазоне от 1:9 до 9:1, включая любые промежуточные целые значения, также можно использовать для стимуляции T-клеток. Соотношение анти-CD3- и анти-CD28-связанных частиц и T-клеток, которое приводит к стимуляции T-клеток, может варьироваться, как описано в настоящем документе, однако конкретные предпочтительные значения включают по меньшей мере 1:150, 1:125, 1:100, 1:75, 1:50, 1:40, 1:30, 1:20, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2,5, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1 и 15:1, с одним предпочтительным соотношением, составляющим по меньшей мере 1:1 частиц и T-клеток. В одном конкретном варианте осуществления предпочтительное соотношение гранул и клеток составляет 3:1. В некоторых случаях соотношение гранул и клеток составляет 1:3.
В следующих вариантах осуществления соотношение частиц и клеток может варьироваться в зависимости от дня стимуляции. Например, в одном варианте осуществления соотношение частиц и клеток составляет от 1:1 до 10:1 в первый день, и затем дополнительные частицы добавляют к клеткам каждый день или через день в течение вплоть до 10 дней, с конечным соотношением, составляющим от 1:1 до 1:10 (в расчете на количество клеток в день добавления). В другом варианте осуществления соотношение частиц и клеток составляет по меньшей мере примерно 1:2,5 в первый день, и дополнительные частицы добавляют к клеткам в день 5 с соотношением, составляющим примерно 1:10, 1:25, 1:50 или 1:100, в день 7 с соотношением, составляющим 1:10, 1:25, 1:50, или 1:100, и в день 9 с соотношением, составляющим 1:10, 1:25, 1:50 или 1:100. В одном конкретном варианте осуществления соотношение частиц и клеток составляет 1:1 в первый день стимуляции, и его доводят до 1:5 в третий и пятый дни стимуляции. В другом варианте осуществления частицы добавляют ежедневно или через день, с конечным соотношением, составляющим 1:1 в первый день и 1:5 в третий и пятый дни стимуляции. В другом варианте осуществления соотношение частиц и клеток составляет 2:1 в первый день стимуляции, и его доводят до 1:10 в третий и пятый дни стимуляции. В другом варианте осуществления частицы добавляют ежедневно или через день, с конечным соотношением, составляющим 1:1 в первый день и 1:10 в третий и пятый дни стимуляции. В некоторых аспектах различные другие соотношения могут быть подходящими для использования по настоящему изобретению. В частности, соотношения будут варьироваться в зависимости от размера частиц, а также от размера и типа клеток.
Один аспект настоящего изобретения относится к тому факту, что использование разных соотношений гранул (например, анти-CD3/анти-CD28 гранул) и клеток может приводить к разным результатам размножения антиген-специфических T-клеток. В частности, соотношения гранул и клеток можно варьировать для избирательного размножения или удаления антиген-специфических или подвергнутых воздействию антигена T-клеток (таких как клетки памяти, или эффекторнные или активированные клетки), в противоположность клеткам других типов, таким как наивные, или подобные наивным, T-клетки. В одном варианте осуществления конкретное используемое соотношение гранул и клеток приводит к избирательному удалению антиген-специфических T-клеток. В частности, соотношения гранул и клеток, такие как соотношения гранул и клеток, составляющие, или превышающие, 1:1, и/или более высокие соотношения гранул и клеток, такие как по меньшей мере, или примерно, 3:1, 5:1, 10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1, и выше, могут приводить к удалению антиген-специфических T-клеток. Без связи с конкретной теорией, считается, что антиген-специфические T-клетки сенсибилизированы для дальнейшей стимуляции. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления сила активирующего сигнала, поступающего в T-клетку за счет реагента или композиции, может влиять на размножение и/или гибель одного или более конкретных подмножеств T-клеток. В некоторых аспектах избирательное размножение T-клеток памяти (антиген-специфических T-клеток) может происходить с сигналами через TCR и/или корецепторы, которые являются слабыми в сравнении с другими; в то время как в некоторых вариантах осуществления избирательное удаление T-клеток памяти и/или других подвергнутых воздействию антигена T-клеток, с сохранением наивных клеток, может происходить после инкубации с реагентами, обеспечивающими поступление сигналов, которые являются относительно более сильными. В некоторых аспектах количество CD3/TCR (и CD28) рецепторов, связанных лигандами, среди прочих факторов, может определять или вносить вклад в определение силы сигнала. Таким образом, стимуляция с использованием высоких соотношений гранул и клеток в некоторых контекстах может обеспечивать высокую концентрацию стимулирующего антитела (то есть, «сильный» сигнал), приводя к избыточной стимуляции антиген-специфических T-клеток, что вызывает их гибель, либо вследствие апоптоза, либо за счет других механизмов. Таким образом, в этом отношении композиции гранул, описанные в настоящем документе, могут в некоторых контекстах и/или в случае конкретных композиций действовать в качестве проапоптотических композиций. В некоторых аспектах сигнал не должен быть слишком сильным, чтобы не приводить к гибели также и подобных наивным T-клеток, например, гибели, индуцируемой активацией. В некоторых вариантах осуществления пропорция стимулирующего реагента-гранул, например, реагента анти-CD3/анти-CD28 гранул, составляет менее 10:1.
Кроме того, в конкретных вариантах осуществления такой реагент или композицию, используемые в качестве проапоптотических условий, например, в отношении клеток конкретных типов (например, поверхность с присоединенным к ней средством, которое стимулирует молекулу на клеточной поверхности, например, композиции гранул, описанных в настоящем документе), используют для размножения оставшихся популяций клеток с целью их использования в разных иммунотерапевтических ситуациях, описанных в настоящем документе. В следующем варианте осуществления конкретное используемое соотношение гранул и клеток приводит к избирательному размножению подобных наивным T-клеток. Конкретное соотношение можно корректировать для достижения желаемого размножения конкретных T-клеток или удаления конкретных T-клеток. Таким образом, композиции и способы, описанные в настоящем документе, можно использовать для размножения конкретных популяций T-клеток в популяции исходной композиции, или для удаления конкретных популяций T-клеток в популяции исходной композиции, с целью применения в самых разных иммунотерапевтических ситуациях, описанных в настоящем документе.
Кроме того, в конкретных вариантах осуществления тот же реагент, или вещество, или композицию, используемую в качестве проапоптотической композиции, например, в отношении клеток конкретных типов (например, поверхность с присоединенным к ней средством, которое стимулирует молекулу на клеточной поверхности, например, композиции гранул, описанных в настоящем документе), используют для размножения оставшихся популяций клеток с целью их использования в разных иммунотерапевтических ситуациях, описанных в настоящем документе. Использование более низких соотношений гранул и клеток обеспечивает стимулирующий сигнал для антиген-специфических T-клеток, который не стимулирует их избыточно, а индуцирует быструю пролиферацию этих клеток. В следующем варианте осуществления конкретное используемое соотношение гранул и клеток приводит к избирательному размножению антиген-специфических T-клеток. В некоторых аспектах можно использовать любое соотношение при условии, что имеет место желаемое размножение или удаление клеток. Таким образом, композиции и способы, описанные в настоящем документе, можно использовать для размножения конкретных популяций T-клеток или для удаления конкретных популяций T-клеток, с целью применения в самых разных иммунотерапевтических ситуациях, описанных в настоящем документе.
С использованием определенных методологий может быть полезно поддерживать долгосрочную стимуляцию популяции T-клеток после начальной активации и стимуляции путем отделения T-клеток от стимула через период времени, составляющий от 2 до примерно 14 дней. Скорость пролиферации T-клеток контролируют периодически (например, ежедневно), например, путем определения размера или определения объема T-клеток, например, при помощи счетчика Культера. В этом отношении, покоящаяся T-клетка имеет средний диаметр примерно 6,8 микрон, и после начальной активации и стимуляции в присутствии стимулирующего лиганда средний диаметр T-клетки увеличивается до более 12 микрон ко дню 4, а затем начинает уменьшаться примерно ко дню 6. Когда средний диаметр T-клеток уменьшается до примерно 8 микрон, T-клетки можно повторно активировать и повторно стимулировать для индукции дальнейшей пролиферации T-клеток. Альтернативно, скорость пролиферации T-клеток и время для повторной стимуляции T-клеток можно определять путем анализа присутствия на клеточной поверхности таких молекул, как CD154, CD54, CD25, CD137, CD134, которые индуцируются на активированных T-клетках.
in vivo
Для индукции долгосрочной стимуляции популяции CD4+ и/или CD8+ T-клеток может быть необходимо повторно активировать и повторно стимулировать T-клетки стимулирующим средством, таким как анти-CD3 антитело и анти-CD28 антитело (например, B-T3, XR-CD28 (Diaclone,  France)), несколько раз для получения популяции CD4+ или CD8+ клеток, превосходящей по размеру от, или от примерно, 10 до примерно 1000 раз оригинальную T-клеточную популяцию. Например, в одном варианте осуществления настоящего изобретения T-клетки стимулируют, как описано, 2-3 раза. В следующих вариантах осуществления T-клетки стимулируют, как описано, 4 или 5 раз. С использованием настоящей методологии возможно получать T-клетки с повышенной поликлональностью, количество которых от, или от примерно, 100 до примерно 100000 раз превышает количество до стимуляции. Более того, T-клетки, размноженные способом по настоящему изобретению, секретируют на значительных уровнях цитокины (например, IL-2, IFN-γ, IL-4, GM-CSF и TNF-α) в супернатанты клеточных культур. Например, в сравнении с стимуляцией IL-2, CD4+ T-клетки, размноженные с использованием совместной стимуляции анти-CD3 и анти-CD28 антителами, секретируют большие количества GM-CSF и TNF-α в среду для культивирования. Эти цитокины можно очищать из супернатантов клеточных культур, или супернатанты можно использовать непосредственно для поддержания клеток в культуре. Аналогично, T-клетки, размноженные способом по настоящему изобретению, совместно с супернатантом клеточных культур и цитокинами можно вводить субъекту для поддержания роста клеток .
in vivo
В одном варианте осуществления стимуляцию T-клеток проводят, например, анти-CD3 и анти-CD28 антителами, совместно иммобилизованными на гранулах (гранулы 3×28), в течение периода времени, достаточного для возвращения клеток в состояние покоя (с низким уровнем, или без, пролиферации) (примерно 8-14 дней после начальной стимуляции). Затем стимулирующий сигнал удаляют от клеток, клетки промывают и обратно вводят инфузией пациенту. Клетки в конце фазы стимуляции становятся «супериндуцируемыми» при использовании способов по настоящему изобретению, о чем свидетельствует их способность реагировать на антигены, а также способность этих клеток к проявлению фенотипа, подобного фенотипу клеток памяти, как продемонстрировано в примерах. Соответственно, после повторной стимуляции, либо экзогенной, либо антигеном  после инфузии, активированные T-клетки демонстрируют сильный ответ, характеризующийся уникальными фенотипическими свойствами, такими как устойчивая экспрессия CD154, повышенное продуцирование цитокинов и так далее.
В следующих вариантах осуществления настоящего изобретения клетки, такие как T-клетки, объединяют с покрытыми, или конъюгированными с, средством гранулами, затем клетки отделяют, после чего клетки культивируют. В альтернативном варианте осуществления до проведения культивирования покрытые, или конъюгированные с, средством гранулы и клетки не разделяют, а культивируют совместно. В следующем варианте осуществления гранулы и клетки сначала концентрируют за счет применения силы, что приводит к лигированию клеточных поверхностных маркеров, за счет чего индуцируется стимуляция клеток и/или поляризация активирующего сигнала.
4
9

В качестве примера, когда T-клетки являются целевой клеточной популяцией, молекулы клеточной поверхности могут быть лигированы при создании контакта парамагнитных гранул, с которыми связаны анти-CD3 и анти-CD28 антитела (гранулы 3×28), с подготовленными T-клетками. В одном варианте осуществления клетки (например, 10-10 T-клеток) и гранулы (например, DYNABEADS M-450 CD3/CD28 T парамагнитные гранулы в соотношении 1:1) объединяют в буфере, предпочтительно PBS (не содержащем двухвалентные катионы, такие как кальций и магний). В некоторых аспектах можно использовать любую концентрацию клеток. Например, клетки-мишени могут быть очень редкими в образце и составлять лишь 0,01% от образца, или весь образец (то есть, 100%) может представлять собой интересующие клетки-мишени. Соответственно, любое количество клеток предусмотрено в контексте настоящего изобретения. В конкретных вариантах осуществления может быть желательно значительно уменьшать объем, в котором частицы и клетки смешивают вместе (то есть, увеличивать концентрацию клеток), для обеспечения максимального контакта клеток и частиц. Например, в одном варианте осуществления используют концентрацию примерно 2 миллиарда клеток/мл. В другом варианте осуществления используют концентрацию более 100 миллионов клеток/мл. В следующем варианте осуществления используют концентрацию клеток, составляющую 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 миллионов клеток/мл. В еще одном варианте осуществления используют концентрацию клеток, составляющую 75, 80, 85, 90, 95 или 100 миллионов клеток/мл. В следующих вариантах осуществления можно использовать концентрации, составляющие 125 или 150 миллионов клеток/мл. Использование высоких концентраций может приводить к увеличению выхода клеток, активации клеток и размножения клеток. Кроме того, использование высоких концентраций клеток позволяет более эффективно захватывать клетки, которые могут слабо экспрессировать интересующие антигены-мишени, например, CD28-отрицательные T-клетки. Такие популяции клеток могут иметь терапевтическую ценность, и их может быть желательно получать. Например, использование высокой концентрации клеток позволяет более эффективно производить отбор CD8+ T-клеток, которые обычно имеют более слабую экспрессию CD28.
6
5
6
В связанном варианте осуществления может быть желательно использовать более низкие концентрации клеток. При значительном разбавлении смеси T-клеток и частиц взаимодействие между частицами и клетками сводится к минимуму. Это позволяет отбирать клетки, экспрессирующие в большом количестве нужные антигены, связывающиеся с частицами. Например, CD4+ T-клетки экспрессируют CD28 на более высоком уровне и более эффективно захватываются и стимулируются, чем CD8+ T-клетки, при низких концентрациях. В одном варианте осуществления используемая концентрация клеток составляет примерно 5×10/мл. В других вариантах осуществления используемая концентрация может составлять от, или от примерно, 1×10/мл до примерно 1×10/мл, включая любое промежуточное значение.
Буфер, в котором суспендируют клетки, может представлять собой любой буфер, подходящий для клеток конкретного типа. При использовании клеток определенных типов буфер может содержать другие компоненты, например, 1-5% сыворотки, необходимые для поддержания целостности клеток во время процесса. В другом варианте осуществления клетки и гранулы можно объединять в среде для культивирования клеток. Клетки и гранулы можно смешивать, например, путем вращения, встряхивания или использования любых средств для смешивания, в течение периода времени от одной минуты до нескольких часов. Затем проводят концентрацию гранул и клеток в контейнере за счет применения силы, например, помещая контейнер в магнитное поле. Среду и несвязанные клетки удаляют, а клетки, связанные с гранулами или другой поверхностью, промывают, например, прокачивая через перистальтический насос, а затем ресуспендируют в среде, подходящей для культивирования клеток.
2
В одном варианте осуществления настоящего изобретения смесь можно культивировать в течение периода времени от 30 минут до нескольких часов (примерно 3 часов) или до примерно 14 дней, или в течение любого промежуточного целого числа часов или минут. В другом варианте осуществления смесь можно культивировать в течение 21 дня. В одном варианте осуществления гранулы и T-клетки совместно культивируют в течение примерно восьми дней. В другом варианте осуществления гранулы и T-клетки совместно культивируют в течение 2-3 дней. Как описано выше, может быть желательно использовать несколько циклов стимуляции, так что время культивирования T-клеток может составлять 60 дней или более. Условия, подходящие для культивирования T-клеток, включают соответствующую среду (например, минимальную поддерживающую среду или среду RPMI 1640, или X-vivo 15, (BioWhittaker)), которая может содержать факторы, необходимые для пролиферации и жизнеспособности, включая сыворотку (например, эмбриональную бычью или человеческую сыворотку) или интерлейкин-2 (IL-2), инсулин, или любые другие добавки для роста клеток. Среда может включать RPMI 1640, AIM-V, DMEM, MEM, α-MEM, F-12, X-Vivo 15 и X-Vivo 20, с добавленными аминокислотами и витаминами, либо без сыворотки, либо с добавлением соответствующего количества сыворотки (или плазмы), или с добавлением определенного набора гормонов и/или цитокина(ов) в количестве, достаточном для роста и размножения T-клеток. Антибиотики, например, пенициллин и стрептомицин, включают только в экспериментальные культуры, но не в культуры клеток, которые предстоит вводить субъекту. Целевые клетки поддерживают в условиях, необходимых для роста, например, при соответствующей температуре (например, 37°C) и атмосфере (например, воздух плюс 5% CO).
В одном варианте осуществления настоящего изобретения соотношения гранула:клетка можно корректировать для достижения желаемого T-клеточного фенотипа. В одном конкретном варианте осуществления соотношения гранула:клетка можно варьировать для избирательного размножения или удаления антиген-специфических T-клеток (памяти). В одном варианте осуществления конкретное используемое соотношение гранула:клетка приводит к избирательному удалению антиген-специфических T-клеток. В следующем варианте осуществления конкретное используемое соотношение гранула:клетка приводит к избирательному размножению антиген-специфических T-клеток. В некоторых аспектах можно использовать любое соотношение при условии, что имеет место желаемое размножение или удаление антиген-специфических T-клеток. Таким образом, композиции и способы, описанные в настоящем документе, можно использовать для размножения конкретных популяций T-клеток, или для удаления конкретных популяций T-клеток, что находит применение в самых разных иммунотерапевтических ситуациях, описанных в настоящем документе.
В другом варианте осуществления время воздействия стимулирующих средств, таких как покрытые анти-CD3/анти-CD28 антителами (то есть, 3×28) гранулы, можно изменять или корректировать для получения нужного T-клеточного фенотипа. Альтернативно, желаемую популяцию T-клеток можно отбирать с использованием любых методов селекции до стимуляции. Может быть желательным получение большей популяции хелперных T-клеток (TH), как правило, CD4+, в противоположность CD8+ цитотоксическим или регуляторным T-клеткам, поскольку размножение TH клеток может приводить к улучшению или восстановлению общей иммунной реакционной способности. При том, что многие специфические иммунные ответы опосредуются CD8+ антиген-специфическими T-клетками, которые могут непосредственно лизировать или уничтожать клетки-мишени, при большинстве иммунных ответов требуется помощь CD4+ T-клеток, которые экспрессируют важные иммунные регуляторные молекулы, такие как GM-CSF, CD40L и IL-2, например. Если предпочтительной является CD4-опосредованная помощь, способ, такой как описанный в настоящем документе, который позволяет сохранять или увеличивать соотношение CD4:CD8, может быть особенно полезен. Повышенные количества CD4+ T-клеток могут приводить к увеличению количества экспрессируемого клетками CD40L при введении пациентам, что потенциально улучшает различимость клеток-мишеней (улучшенная функция АПК). Аналогичные эффекты можно наблюдать при увеличении числа введенных инфузией клеток, экспрессирующих GM-CSF или IL-2, все из которых экспрессируются преимущественно CD4+ T-клетками. Аналогично, в некоторых вариантах применения может быть желательным использование популяции регуляторных T-клеток (например, Autoimmun Rev. 2002 August; 1(4):190-7; Curr Opin Immunol. 2002 December; 14(6):771-8), которые могут быть получены и размножены с использованием способов, описанных в настоящем документе. Альтернативно, в ситуациях, когда CD4-помощь нужна меньше, и необходимы повышенные количества CD8+ T-клеток, подходы XCELLERATE™, описанные в настоящем документе, также могут быть использованы, например, путем предварительного отбора на CD8+ клетки до стимуляции и/или культивирования. Такие ситуации могут иметь место, когда предпочтительно иметь повышенные уровни IFN-γ или повышенный цитолиз клеток-мишеней. Также можно модифицировать продолжительность и тип воздействия стимулирующих средств для размножения T-клеток с желаемым репертуаром TCR, например, экспрессирующих желаемые гены семейства Vβ.

При выделении разных T-клеточных популяций время воздействия частиц можно варьировать. Например, в одном предпочтительном варианте осуществления T-клетки выделяют путем инкубации с 3×28 гранулами, такими как DYNABEADS M-450, в течение периода времени, достаточного для положительной селекции нужных T-клеток. В одном варианте осуществления период времени составляет примерно 30 минут. В следующем варианте осуществления период времени составляет по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5 или 6 часов. В другом предпочтительном варианте осуществления период времени составляет 10-24 часа или более. В одном предпочтительном варианте осуществления период инкубации составляет 24 часа. При получении T-клеток от пациентов с раком использование более длительных периодов инкубации, например, 24 часа, может увеличивать выход клеток.
in vivo
В конкретных вариантах осуществления суммарные периоды стимуляции и/или размножения могут составлять от 2 до 15 дней, от 2 до 12 дней, от 2 до 10 дней, от 2 до 8 дней, от 2 до 6 дней, от 2 до 4 дней, от 4 до 12 дней, от 4 до 10 дней, от 4 до 8 дней, от 4 до 6 дней, от 6 до 12 дней, от 6 до 10 дней, от 6 до 8 дней, от 8 до 12 дней, от 8 до 10 дней или от 10 до 12 дней, все диапазоны являются включающими. В некоторых вариантах осуществления клетки инкубируют и/или инкубируют со стимулирующим реагентом (например, частицей, описанной в настоящем документе) в течение по меньшей мере, или по меньшей мере примерно, 2 дней, 3 дней, 4 дней, 5 дней, 6 дней, 7 дней, 8 дней, 9 дней, 10 дней, 11 дней, 12 дней, 13 дней, 14 дней или более 14 дней. Если стимуляцию T-клеток проводят в течение более коротких периодов времени, популяция T-клеток может не увеличиться в количестве, может не значительно увеличиться в количестве, может уменьшиться в количестве или может остаться в прежнем количестве, однако популяция будет содержать более жизнеспособные и здоровые активированные T-клетки, которые могут продолжать пролиферировать  и/или более достоверно воспроизводить естественный пул эффекторных T-клеток. Например, если стимуляцию T-клеток проводят в течение более коротких периодов времени, популяция T-клеток может содержать большую процентную долю и/или пропорцию наивных или подобных наивным T-клеток, или сконструированных T-клеток, в сравнении с параллельным процессом, в котором стимуляцию T-клеток проводят в течение более длительного периода времени. В некоторых вариантах осуществления более короткий период времени можно характеризовать как общее время инкубации, в некоторых вариантах осуществления общее время инкубации со стимулирующим средством, которое составляет менее, или менее примерно, 6 дней, менее, или менее примерно, 5 дней, менее, или менее примерно, 4 дней, менее, или менее примерно, 3 дней или менее, или менее примерно, 2 дней. Поскольку доступность помощи со стороны T-клеток часто является ограничивающим фактором при выработке антител в ответ на белковые антигены, возможность избирательно размножать или избирательно вводить инфузией богатые CD4+ клетками популяции T-клеток субъекту является очень ценной. Дополнительная польза таких обогащенных популяций является очевидной, поскольку активированные хелперные T-клетки, которые узнают антигены, представляемые B-лимфоцитами, обеспечивают два типа стимулов, физический контакт и продуцирование цитокинов, что приводит к пролиферации и дифференциации B-клеток.
В некоторых случаях стимулирующие условия не включают компоненты культуры клеток или средства, которые добавляют для сохранения конкретных подмножеств T-клеток, например, не подобных наивным T-клеток. Таким образом, в некоторых случаях удаление компонентов или средств из культуры в стимулирующих условиях может способствовать элиминации не подобных наивным T-клеток. В некоторых вариантах осуществления стимулирующие условия не включают средства, такие как N-ацетилцистеин, который может быть использован для модуляции и/или точной корректировки интенсивности сигнализации TCR/CD3. В некоторых аспектах такие средства удаляют, или уменьшают их количества/пропорции, для увеличения силы активирующего сигнала. В некоторых аспектах стимулирующие условия применяют, или применяют также, путем исключения или уменьшения концентрации реагентов для культивирования, которые, как известно или вероятно, уменьшают AICD, и/или которые стимулируют выживание более старых клеток, таких как не наивные клетки. В некоторых случаях стимулирующие условия не включают N-ацетилцистеин, или включают N-ацетилцистеин в более низком количестве или концентрации. В некоторых случаях стимулирующие условия не включают рекомбинантный IL-7 и/или рекомбинантный IL-15, или включают рекомбинантный IL-7 или IL-15 в более низком количестве или концентрации. В некоторых вариантах осуществления могут быть включены добавки для культивирования, которые дополнительно облегчают или стимулируют удаление не наивных клеток (например, токсина, связанного с CD45RO).
C. Стимулированная композиция
Также предложена стимулированная композиция, полученная описанными способами инкубации (например, стимуляции). В некоторых вариантах осуществления клетки стимулированной композиции дополнительно подвергают инженерии, например, для введения генно-инженерного антигенного рецептора, после инкубации исходной композиции. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает инкубацию в присутствии одного или более стимулирующих средств во время фазы инженерии.
in vitro
Клетки стимулированной композиции, которые не подверглись апоптозу при использовании способов инкубации (например, стимуляции), описанных в настоящем документе, могут иметь повышенную поликлональность указанной оставшейся популяции T-клеток, измеренную на основании широты ответа популяции на конкретный антиген. Восстановление или увеличение поликлональности можно определять на основании широты ответа на конкретный интересующий антиген, например, путем измерения числа разных эпитопов, узнаваемых антиген-специфическими клетками. Это можно осуществлять с использованием стандартных методов получения и клонирования антиген-специфических T-клеток .
В некоторых вариантах осуществления предложенных в настоящем документе способов условия культивирования предпочтительно индуцируют размножение, пролиферацию и/или выживание не подобных наивным T-клеток, в сравнении с подобными наивным T-клетками. Предпочтительное размножение, пролиферация, и/или выживание первого типа или популяции клеток, в сравнении со вторым типом или популяцией клеток, означает, что относительное размножение, пролиферация и/или выживание больше в случае первого типа или популяции клеток, чем в случае второго типа. Эта ситуация может включать сценарий, в котором процентная доля первого типа или популяции клеток, которые размножились, пролиферировали и/или выжили, является большей, и/или что степень (например, общая или средняя степень для клеток популяции или типа), до которой клетки размножились, пролиферировали и/или выжили, является большей в случае клеток первой популяции или типа, чем в случае второй.
В некоторых вариантах осуществления предпочтительное размножение, пролиферацию и/или выживание выражают путем сравнения процентной доли подобных наивным клеток в исходной композиции с процентной долей сконструированных клеток в стимулированной композиции, которые произошли от подобных наивным клеток в оригинальной исходной композиции. В некоторых примерах процентная доля сконструированных клеток в стимулированной композиции, которые произошли от подобных наивным клеток в оригинальной исходной композиции, как правило, является большей в стимулирующих условиях, описанных в настоящем документе. Например, в одном варианте осуществления процентная доля клеток в стимулированной композиции, которые произошли от подобных наивным клеток в оригинальной исходной композиции, превышает процентную долю наивных клеток в инициирующей культуру композиции. В одном аспекте исходная композиция (или T-клетки в ней) содержит, или содержит примерно, 70% подобных наивным T-клеток и 30% не подобных наивным T-клеток, при этом более 50%, например, по меньшей мере 70%, сконструированных клеток в полученной стимулированной композиции происходят от подобных наивным клеток в исходной композиции. В некоторых случаях использование других условий, например, стимуляции средством(ами), индуцирующим сильный сигнал через комплекс TCR, привело бы к меньшему количеству, чем 50%, например, составляющему, или составляющему примерно 5-10% от клеток в стимулированной композиции, происходящих от не подобных наивным клеток. В некоторых вариантах осуществления стимулирующие условия индуцируют сильный сигнал, который вызывает индуцируемую активацией клеточную гибель не подобных наивным T-клеток исходной композиции.
В некоторых вариантах осуществления процентная доля подобных наивным T-клеток, или клеток, происходящих от подобных наивным T-клеток исходной композиции, в стимулированной композиции увеличена более чем, или более чем примерно, в 1,5 раза, 2 раза, 3 раза, 4 раза, 5 раз, 6 раз, 7 раз, 8 раз, 9 раз, 10 раз, 50 раз, 100 раз, в сравнении с исходной композицией. В некоторых случаях соотношение клеток, происходящих от подобных наивным T-клеток исходной композиции, и клеток, происходящих от не подобных наивным T-клеток исходной композиции, или соотношение подобных наивным T-клеток и не подобных наивным T-клеток в стимулированной композиции увеличено более чем, или более чем примерно, в 1,5 раза, 2 раза, 3 раза, 4 раза, 5 раз, 6 раз, 7 раз, 8 раз, 9 раз, 10 раз, 50 раз, 100 раз в сравнении с соотношением подобных наивным T-клеток и не подобных наивным T-клеток в исходной композиции. В некоторых вариантах осуществления стимулированная композиция содержит более 75%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% клеток, происходящих от подобных наивным T-клеток исходной композиции.
В некоторых вариантах осуществления при использовании способа стимуляции T-клеток, описанного в настоящем документе, из клеток в исходной композиции большая процентная доля подобных наивным T-клеток, в сравнении с не подобными наивным T-клетками, индуцируются к пролиферации и/или становятся активированными. В некоторых аспектах стимулированная композиция, полученная способами стимуляции, описанными в настоящем документе, содержит менее 10% клеток, происходящих от не подобных наивным T-клеток. В некоторых случаях стимулированная композиция содержит менее 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5% или 0,1% клеток, происходящих от не наивных T-клеток. В некоторых вариантах осуществления большая процентная доля T-клеток, которые были подобными наивным в исходной композиции, в сравнении с процентной долей T-клеток, которые были не подобными наивным в исходной композиции, делятся в день 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, или 10 после начала указанной инкубации. В некоторых случаях стимулирующие условия индуцируют гибель клеток. В конкретных примерах стимулирующие условия способа индуцируют активацию не подобных наивным T-клеток, тем самым вызывая индуцируемую активацией гибель клеток (AICD).
В некоторых вариантах осуществления способ включает стимулирующие условия, способные индуцировать пролиферацию большей процентной доли клеток в популяции подобных наивным T-клеток, в сравнении с не подобными наивным T-клетками, в день 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 после начала инкубации в данных условиях.
В некоторых вариантах осуществления стимулирующие условия приводят к получению стимулированной композиции, при этом стимулирующие условия предпочтительно индуцируют размножение подобных наивным T-клеток, с получением целевого количества T-клеток в стимулированной композиции, происходящих от подобных наивным T-клеток исходной композиции. В некоторых вариантах осуществления стимулированную композицию дополнительно корректируют для достижения предпочтительного соотношения CD4:CD8 T-клеток. В некоторых случаях конкретные клеточные популяции можно удалять из стимулированной композиции для достижения предпочтительного соотношения CD4:CD8 клеток.
В некоторых вариантах осуществления стимулирующие условия, например, в которых инкубируют исходные композиции, предпочтительно индуцируют размножение, пролиферацию и/или выживание подобных наивным T-клеток или их подмножества, в сравнении с не подобными наивным T-клетками или их подмножеством. В некоторых аспектах стимулирующие условия сильно активируют не подобные наивным T-клетки исходной композиции, за счет этого активируя клеточную гибель, особенно не подобных наивным T-клеток исходной композиции. В некоторых аспектах это предпочтительно способствует выживанию подобных наивным T-клеток. В некоторых аспектах такие стимулирующие условия приводят к уменьшению уровня токсичности и/или связанного с токсичностью исхода(ов) или симптома(ов) после введения субъектам клеток и композиций, полученных данными способами.
Был ли конкретный ответ индуцирован, или предпочтительно индуцирован, в одной популяции в сравнении с другой популяцией, можно определять множеством способов. Например, была ли клетка индуцирована для вхождения в клеточный цикл, можно определять методами проточной цитометрии, включая те, в которых используют красители и другие средства, такие как CFSE и другие хелатирующие агенты, для оценки клеточного деления, с последующей оценкой методом проточной цитометрии, оценкой включения меченого тритием (H3) тимидина и аналогичных средств, и/или подсчетом количества клеток. Сравнения можно проводить путем оценки различных чистых тестируемых популяций, сравнивая отдельно популяции наивных и не наивных T-клеток в конкретных условиях. Активацию можно определять, например, на основании секреции различных цитокинов и/или повышающей регуляции или экспрессии различных маркеров активации, включая CD25, CD69, и/или размера клеток (например, на основании данных прямого светорассеяния при измерении методом проточной цитометрии). Выживание и/или апоптоз можно оценивать разными методами, включая методы проточной цитометрии, включение различных красителей, в том числе пропидия иодида, и окрашивание, например, окрашивание аннексином V и аналогичными средствами.
В некоторых вариантах осуществления процентная доля подобных наивным T-клеток в исходной композиции меньше, чем процентная доля T-клеток в стимулированной композиции, происходящих от подобных наивным T-клеток в исходной композиции. В некоторых вариантах осуществления способы, предложенные в настоящем документе, приводят к получению большей процентной доли клеток с введенной нуклеиновой кислотой, которые представляют собой, или получены в результате пролиферации подобных наивным T-клеток в исходной композиции, в сравнении с не подобными наивным T-клетками в исходной композиции. Различные варианты корректировки стимулирующих условий, способствующие ответам и/или результатам для конкретных типов клеток, раскрыты, например, в патенте США номер 8617884 и в публикации патентной заявки США № US 20030235908 A1.
lo
В некоторых вариантах осуществления стимулированная композиция содержит клетки, которые экспрессируют, или происходят от клеток, которые экспрессируют, конкретные маркеры подобных наивным T-клеток. Например, стимулированная композиция, полученная предложенными способами, происходит от популяций клеток, которые имеют на поверхности T-клеточный маркер активации, выбранный из группы, состоящей из CD27, CD28, CD45RA, и CCR7. В некоторых случаях стимулированная композиция, полученная предложенными способами, происходит от популяций клеток, которые не имеют на поверхности T-клеточный маркер активации, такой как CD62L. В некоторых аспектах клетки стимулированной композиции представляют собой, или происходят от клеток, которые не имеют на поверхности CD56 и/или CD45RO. В некоторых конкретных вариантах осуществления стимулированная композиция, полученная предложенными способами, происходит от популяций клеток, которые представляют собой CD27+, CD45RA+, CD45RO- и CCR7+ клетки. В некоторых случаях клетки стимулированной композиции представляют собой или происходят от клеток, которые лишены внутриклеточной экспрессии цитокина, такого как IL-2, IFN-γ, IL-4 и/или IL-10. В некоторых дополнительных примерах клетки стимулированной композиции представляют собой или происходят от клеток, которые лишены экспрессии маркеров CD25 и/или перфорина. В некоторых случаях клетки стимулированной композиции представляют собой или происходят от клеток, которые представляют собой CD95 клетки.
lo
В некоторых случаях стимулированная композиция содержит клетки, которые происходят от по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80% или по меньшей мере 90% T-клеток, имеющих на поверхности T-клеточный маркер активации, такой как CD27, CD28, CD45RA и CCR7, и не имеют на поверхности CD62L. В некоторых вариантах осуществления стимулированная композиция содержит клетки, которые происходят от по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80% или по меньшей мере 90% T-клеток, не имеющих на поверхности CD56 и/или CD45RO. В некоторых аспектах стимулированная композиция содержит клетки, которые происходят от по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80% или по меньшей мере 90% T-клеток, не имеющих на поверхности CD45RO и имеющих на клеточной поверхности CD27, CD45RA и CCR7. В некоторых примерах стимулированная композиция содержит клетки, которые происходят от по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80% или по меньшей мере 90% T-клеток, лишенных внутриклеточной экспрессии цитокина, такого как IL-2, IFN-γ, IL-4, IL-10. В некоторых аспектах стимулированная композиция содержит клетки, которые происходят от по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80% или по меньшей мере 90% T-клеток, лишенных экспрессии маркеров CD25 и/или перфорина. В некоторых случаях стимулированная композиция содержит клетки, которые происходят от по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80% или по меньшей мере 90% T-клеток, представляющих собой CD95 клетки.
in vitro
В конкретных вариантах осуществления стимулированная композиция является более поликлональной, или мультиклональной, в сравнении с исходной композицией. В некоторых вариантах осуществления стимулированная композиция является более разнообразной в сравнении с исходной композицией. В некоторых вариантах осуществления это увеличение поликлональности представляет собой смещение от моно- к олигоклональности, или к поликлональности T-клеточной популяции, при определении на основании профиля спектротипов Vβ, Vα, Vγ, или Vδ по меньшей мере одного гена семейства Vβ, Vα, Vγ, или Vδ. Стимуляция и активация оставшихся клеток, которые выжили, размножились, пролиферировали при использовании предложенных способов, может приводить к увеличению поликлональности указанных оставшихся T-клеток стимулированной композиции, измеренной на основании широты ответа популяции на конкретный антиген. Восстановление или увеличение поликлональности стимулированной композиции можно определять на основании широты ответа на конкретный интересующий антиген, например, путем измерения числа разных эпитопов, узнаваемых антиген-специфическими клетками. Это можно осуществлять с использованием стандартных методов получения и клонирования антиген-специфических T-клеток .
II. Способы генной инженерии клеток
in vitro
ex vivo
В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает введение генно-инженерного рекомбинантного рецептора, например, химерного рецептора, такого как химерный антигенный рецептор (CAR), в стимулированную композицию T-клеток, с получением произведенной композиции, содержащей T-клетки, экспрессирующие генно-инженерный рекомбинантный рецептор. В некоторых случаях инкубацию исходной композиции в стимулирующих условиях проводят до, в процессе и/или после введения нуклеиновой кислоты, кодирующей генно-инженерный рекомбинантный рецептор. В некоторых примерах введение выполняют путем трансдукции. В некоторых вариантах осуществления предложенные способы приводят к получению стимулированной композиции клеток, которые могут быть однородно трансдуцированы. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота представляет собой вирусный вектор. В некоторых случаях вирусный вектор представляет собой ретровирусный вектор. В некоторых примерах вирусный вектор представляет собой лентивирусный вектор или гамма-ретровирусный вектор. В некоторых вариантах осуществления способ, включающий введение нуклеиновой кислоты, применяют  или .
Таким образом, способы, предложенные в настоящем документе, включают один или более этапов подготовки клеток для генной инженерии. В конкретных вариантах осуществления один или более этапов включают выделение клеток из биологического образца, стимуляцию исходной композиции клеток и подготовку композиции клеток к генной инженерии. Также предложены популяции таких клеток, композиции, содержащие такие клетки и/или обогащенные по таким клеткам, например, в которых клетки, экспрессирующие рекомбинантный рецептор, например, химерный рецептор, составляют по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, или более, процентов от общего количества клеток в композиции, или клеток определенного типа, таких как T-клетки или CD8+ или CD4+ клетки. В число композиций входят фармацевтические композиции и препараты для введения, например, для адоптивной клеточной терапии. Также предложены способы инженерии, получения или создания таких клеток, способы введения клеток и композиций субъектам, например, пациентам, и способы обнаружения, отбора, выделения или разделения таких клеток. Таким образом, предложены генно-инженерные клетки, экспрессирующие рекомбинантные рецепторы, например, CAR.
В некоторых вариантах осуществления клетки содержат одну или более нуклеиновых кислот, введенных методами генной инженерии, и, вследствие этого, экспрессируют рекомбинантные или генно-инженерные продукты таких нуклеиновых кислот. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновые кислоты являются гетерологичными, то есть, обычно не присутствующими в клетке, или клеточном образце, например, полученными из другого организма или клетки, например, обычно не встречающимися в клетке, которую подвергают инженерии, и/или в организме, из которого получена клетка. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновые кислоты являются неприродными, то есть, нуклеиновые кислоты не встречаются в природе, включая нуклеиновые кислоты, содержащие химерные комбинации нуклеиновых кислот, кодирующих разные домены из клеток множества разных типов.
A. Генная инженерия
1. Рекомбинантные антигенные рецепторы
В некоторых вариантах осуществления предложены сконструированные клетки, такие как T-клетки, которые экспрессируют CAR со специфичностью для конкретного антигена (или маркера, или лиганда), такого как антиген, экспрессируемый на поверхности клеток конкретного типа. В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой полипептид. В некоторых вариантах осуществления он представляет собой углевод или другую молекулу. В некоторых вариантах осуществления антиген избирательно экспрессируется или избыточно экспрессируется на клетках, связанных с заболеванием или состоянием, например, опухолевых или патогенных клетках, в сравнении нормальными или не являющимися мишенями клетками или тканями. В других вариантах осуществления антиген экспрессируется на нормальных клетках и/или экспрессируется на сконструированных клетках.
В конкретных вариантах осуществления рекомбинантный рецептор, такой как химерный рецептор, содержит внутриклеточную сигнальную область, включающую цитоплазматический сигнальный домен (также взаимозаменяемо называемый внутриклеточным сигнальным доменом), такую как цитоплазматическая (внутриклеточная) область, которая способна индуцировать основной активирующий сигнал в T-клетке, например, компонент цитоплазматического сигнального домена T-клеточного рецептора (TCR) (например, цитоплазматического сигнального домена дзета-цепи CD3 (CD3ζ), или его функционального варианта или сигнальной области), и/или которая содержит иммунорецепторный тирозиновый активирующий мотив (ITAM).
В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор также содержит внеклеточный лиганд-связывающий домен, который специфически связывает лиганд (например, антиген). В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор представляет собой CAR, который содержит внеклеточный узнающий антиген домен, специфически связывающий антиген. В некоторых вариантах осуществления лиганд, такой как антиген, представляет собой белок, экспрессируемый на поверхности клеток. В некоторых вариантах осуществления CAR представляет собой TCR-подобный CAR, и антиген представляет собой процессированный пептидный антиген, такой как пептидный антиген внутриклеточного белка, который, как и в случае с TCR, узнается на клеточной поверхности в контексте молекулы главного комплекса гистосовместимости (MHC).
et al.,
et al.
et al.,
et al.,
et al.
et al.
et al.,
Иллюстративные антигенные рецепторы, включая CAR, а также способы конструирования и введения таких рецепторов в клетки, включают те, которые описаны, например, в публикациях международных патентных заявок с номерами WO2000/14257, WO2013/126726, WO2012/129514, WO2014031687, WO2013/166321, WO2013/071154, WO2013/123061, публикациях патентных заявок США с номерами US2002131960, US2013287748, US20130149337, патентах США №№ 6451995, 7446190, 8252592, 8339645, 8398282, 7446179, 6410319, 7070995, 7265209, 7354762, 7446191, 8324353 и 8479118, и Европейской патентной заявке с номером EP2537416, и/или те, которые описаны в публикациях Sadelain  Cancer Discov. 2013 April; 3(4): 388-398; Davila  (2013) PLoS ONE 8(4): e61338; Turtle  Curr. Opin. Immunol., 2012 October; 24(5): 633-39; Wu  Cancer, 2012 March 18(2): 160-75. В некоторых аспектах антигенные рецепторы включают CAR, описанные в патенте США № 7446190, и те, которые описаны в публикации международной патентной заявки № WO/2014055668 A1. Примеры CAR включают CAR, раскрытые в любой из вышеуказанных публикаций, таких как WO2014031687, US 8339645, US 7446179, US 2013/0149337, патент США № 7446190, патент США № 8389282, Kochenderfer , 2013, Nature Reviews Clinical Oncology, 10, 267-276 (2013); Wang  (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701; и Brentjens  Sci Transl Med. 2013 5(177). Смотри также WO2014031687, US 8339645, US 7446179, US 2013/0149337, патент США № 7446190 и патент США № 8389282.
В некоторых вариантах осуществления CAR сконструирован со специфичностью для конкретного антигена (или маркера, или лиганда), такого как антиген, экспрессируемый на клетках конкретного типа, являющихся мишенью при адоптивной терапии, например, маркер рака и/или антиген, предназначенный для вызывания демпфирующей реакции, например, антиген, экспрессируемый на нормальных или не связанных с заболеванием клетках. Таким образом, CAR, как правило, содержит в его внеклеточной части одну или более антигенсвязывающих молекул, например, один или более антигенсвязывающих фрагментов, доменов или частей, или один или более вариабельных доменов антитела, и/или молекул антитела. В некоторых вариантах осуществления CAR содержит антигенсвязывающий фрагмент, или фрагменты, молекулы антитела, такой как одноцепочечный фрагмент антитела (scFv), полученный из вариабельной области тяжелой (VH) и вариабельной области легкой (VL) цепей моноклонального антитела (мАт).
В некоторых вариантах осуществления антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, экспрессируется на клетках в виде части рекомбинантного рецептора, такого как антигенный рецептор. В число антигенных рецепторов входят функциональные не-TCR антигенные рецепторы, такие как химерные антигенные рецепторы (CAR). Как правило, CAR, содержащий антитело или антигенсвязывающий фрагмент, который проявляет TCR-подобную специфичность в отношении комплексов пептид-MHC, также можно называть TCR-подобными CAR. В некоторых вариантах осуществления специфичный для комплекса MHC-пептид внеклеточный антигенсвязывающий домен TCR-подобного CAR связан с одним или более внутриклеточными сигнальными компонентами, в некоторых аспектах через линкеры и/или трансмембранный домен(ы). В некоторых вариантах осуществления такие молекулы, как правило, могут имитировать или аппроксимировать сигнал через естественный антигенный рецептор, такой как TCR, и, необязательно, сигнал через такой рецептор в сочетании с костимулирующим рецептором.
В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный рецептор, такой как химерный рецептор (например, CAR), содержит лиганд-связывающий домен, который связывает, например, специфически связывает, антиген (или лиганд). В число антигенов, являющихся мишенями химерных рецепторов, входят антигены, экспрессируемые в контексте заболевания, состояния или типа клеток, которые являются мишенью при адоптивной клеточной терапии. В число заболеваний и состояний входят пролиферативные, неопластические и злокачественные заболевания и нарушения, включая рак и опухоли, в том числе гематологические формы рака, формы рака иммунной системы, такие как лимфомы, лейкозы и/или миеломы, например B, T, и миелоидные лейкозы, лимфомы и множественные миеломы.
В некоторых вариантах осуществления антиген (или лиганд) представляет собой полипептид. В некоторых вариантах осуществления он представляет собой углевод или другую молекулу. В некоторых вариантах осуществления антиген (или лиганд) избирательно экспрессируется или избыточно экспрессируется на клетках, связанных с заболеванием или состоянием, например, опухолевых или патогенных клетках, в сравнении нормальными или не являющимися мишенями клетками или тканями. В других вариантах осуществления антиген экспрессируется на нормальных клетках и/или экспрессируется на сконструированных клетках.
В некоторых вариантах осуществления CAR содержит антитело, или антигенсвязывающий фрагмент (например,scFv), которое специфически узнает антиген, например, интактный антиген, экспрессируемый на поверхности клетки.
В конкретных вариантах осуществления антиген представляет собой интегрин αvβ6 (интегрин avb6), антиген созревания В-клеток (BCMA), B7-H3, B7-H6, карбоангидразу 9 (CA9, также известную как CAIX или G250), раково-тестикулярный антиген, раково-тестикулярный антиген 1B (CTAG, также известный как NY-ESO-1 и LAGE-2), карциноэмбриональный антиген (CEA), циклин, циклин A2, лиганд 1 хемокина с мотивом C-C (CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD133, CD138, CD171, хондроитинсульфат протеогликан 4 (CSPG4), белок эпидермального фактора роста (EGFR), мутантный рецептор эпидермального фактора роста III типа (EGFR vIII), эпителиальный гликопротеин 2 (EPG-2), эпителиальный гликопротеин 40 (EPG-40), эфрин B2, рецептор эфрина A2 (EPHa2), рецептор эстрогена, подобный Fc-рецептору белок 5 (FCRL5; также известный как гомолог Fc-рецептора 5 или FCRH5), эмбриональный ацетилхолиновый рецептор (эмбриональный AchR), фолат-связывающий белок (FBP), фолатный рецептор альфа, ганглиозид GD2, O-ацетилированный GD2 (OGD2), ганглиозид GD3, гликопротеин 100 (gp100), глипикан-3 (GPC3), связанный с G-белками рецептор 5D (GPRC5D), Her2/neu (рецептор тирозинкиназы erbB2), Her3 (erb-B3), Her4 (erb-B4), димеры erbB, человеческий высокомолекулярный антиген, связанный с меланомой (HMW-MAA), поверхностный антиген вируса гепатита B, человеческий лейкоцитарный антиген A1 (HLA-A1), человеческий лейкоцитарный антиген A2 (HLA-A2), рецептор альфа IL-22 (IL-22Rα), рецептор альфа 2 IL-13 (IL-13Rα2), рецептор домена киназной вставки (kdr), легкую цепь каппа, L1-молекулу клеточной адгезии (L1-CAM), CE7 эпитоп L1-CAM, представителя A семейства 8 белков, содержащих богатые лейцином повторы (LRRC8A), Lewis Y, меланома-ассоциированный антиген (MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE-A10, мезотелин (MSLN), c-Met, мышиный цитомегаловирус (CMV), муцин 1 (MUC1), MUC16, лиганды представителя D группы 2 естественных киллеров (NKG2D), мелан A (MART-1), молекулу нейрональной клеточной адгезии (NCAM), онкоэмбриональный антиген, предпочтительно экспрессируемый антиген меланомы (PRAME), рецептор прогестерона, простатический специфический антиген, антиген простатических стволовых клеток (PSCA), простатический специфический мембранный антиген (PSMA), подобный тирозинкиназному рецептору рецептор-сироту 1 (ROR1), сурвивин, трофобластный гликопротеин (TPBG, также известный как 5T4), опухоль-ассоциированный гликопротеин 72 (TAG72), тирозиназа-зависимый белок 1 (TRP1, также известный как TYRP1 или gp75), тирозиназа-зависимый белок 2 (TRP2, также известный как допахром таутомераза, допахром дельта-изомераза или DCT), рецептор фактора роста эндотелия сосудов (VEGFR), рецептор фактора роста эндотелия сосудов 2 (VEGFR2), антиген опухоли Вильмса 1 (WT-1), специфический для патогена или экспрессируемый патогеном антиген, или антиген, связанный с универсальным маркером, и/или биотинилированные молекулы, и/или молекулы, экспрессируемые HIV, HCV, HBV или другими патогенами. В некоторых вариантах осуществления антигены, являющиеся мишенями для рецепторов, включают антигены, ассоциированные с B-клеточными злокачественными новообразованиями, например, любые из целого ряда известных B-клеточных маркеров. В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой, или включает, CD20, CD19, CD22, ROR1, CD45, CD21, CD5, CD33, Ig-каппа, Ig-лямбда, CD79a, CD79b или CD30.
В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой, или включает, специфический для патогена или экспрессируемый патогеном антиген. В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой вирусный антиген (такой как вирусный антиген из HIV, HCV, HBV и так далее), бактериальные антигены и/или паразитарные антигены.
В некоторых вариантах осуществления антиген антигенсвязывающего домена представляет собой CD19. В некоторых вариантах осуществления scFv содержит VH и VL, полученные из антитела, или фрагмента антитела, специфического для CD19. В некоторых вариантах осуществления антитело, или фрагмент антитела, которое связывает CD19, представляет собой мышиное антитело, такое как FMC63 и SJ25C1. В некоторых вариантах осуществления антитело, или фрагмент антитела, представляет собой человеческое антитело, например, описанное в публикации патента США № US 2016/0152723.
et al
Leucocyte typing III
H
L
H
L
L
H
В некоторых вариантах осуществления scFv получен из FMC63. FMC63 представляет собой мышиное моноклональное IgG1 антитело, полученное против клеток Nalm-1 и -16, экспрессирующих CD19 человека (Ling, N. R., . (1987). . 302). Антитело FMC63 содержит CDRH1 и H2 с последовательностями SEQ ID NO: 38, 39, соответственно, и CDRH3 с последовательностью SEQ ID NO: 40 или 54; а также CDRL1 с последовательностью SEQ ID NO: 35, CDRL2 с последовательностью SEQ ID NO: 36 или 55, и CDRL3 с последовательностью SEQ ID NO: 37 или 34. Антитело FMC63 содержит вариабельную область тяжелой цепи (V), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 41, и вариабельную область легкой цепи (V), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 42. В некоторых вариантах осуществления svFv содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую CDRL1 с последовательностью SEQ ID NO: 35, CDRL2 с последовательностью SEQ ID NO: 36 и CDRL3 с последовательностью SEQ ID NO: 37; и/или вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDRH1 с последовательностью SEQ ID NO: 38, CDRH2 с последовательностью SEQ ID NO: 39 и CDRH3 с последовательностью SEQ ID NO: 40. В некоторых вариантах осуществления scFv содержит вариабельную область тяжелой цепи FMC63, приведенную в SEQ ID NO: 41, и вариабельную область легкой цепи FMC63, приведенную в SEQ ID NO: 42. В некоторых вариантах осуществления вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи связаны линкером. В некоторых вариантах осуществления линкер имеет последовательность SEQ ID NO: 56. В некоторых вариантах осуществления scFv содержит, в следующем порядке, V, линкер и V. В некоторых вариантах осуществления scFv содержит, в следующем порядке, V, линкер и V. В некоторых вариантах осуществления svFc кодируется нуклеотидной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 57, или последовательностью, которая имеет по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 57. В некоторых вариантах осуществления scFv содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 43, или последовательность, которая имеет по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 43.
et al
Leucocyte typing III
H
L
H
L
L
H
В некоторых вариантах осуществления scFv получен из SJ25C1. SJ25C1 представляет собой мышиное моноклональные IgG1 антитело, полученное против клеток Nalm-1 и -16, экспрессирующих CD19 человека (Ling, N. R., . (1987). . 302). Антитело SJ25C1 содержит CDRH1, H2 и H3 с последовательностями SEQ ID NO: 47-49, соответственно, и CDRL1, L2 и L3 с последовательностями, приведенными в SEQ ID NO: 44-46, соответственно. Антитело SJ25C1 содержит вариабельную область тяжелой цепи (V), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 50, и вариабельную область легкой цепи (V), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 51. В некоторых вариантах осуществления svFv содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую CDRL1 с последовательностью SEQ ID NO: 44, CDRL2 с последовательностью SEQ ID NO: 45 и CDRL3 с последовательностью SEQ ID NO: 46; и/или вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDRH1 с последовательностью SEQ ID NO: 47, CDRH2 с последовательностью SEQ ID NO: 48 и CDRH3 с последовательностью SEQ ID NO: 49. В некоторых вариантах осуществления scFv содержит вариабельную область тяжелой цепи SJ25C1 с последовательностью SEQ ID NO: 50 и вариабельную область легкой цепи SJ25C1 с последовательностью SEQ ID NO: 51. В некоторых вариантах осуществления вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи связаны линкером. В некоторых вариантах осуществления линкер имеет последовательность SEQ ID NO: 52. В некоторых вариантах осуществления scFv содержит, в следующем порядке, V, линкер и V. В некоторых вариантах осуществления scFv содержит, в следующем порядке, V, линкер и V. В некоторых вариантах осуществления scFv содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 53, или последовательность, которая имеет по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 53.
В некоторых вариантах осуществления антиген антигенсвязывающего домена представляет собой BCMA. В некоторых вариантах осуществления scFv содержит VH и VL, полученные из антитела, или фрагмента антитела, специфического для BCMA. В некоторых вариантах осуществления антитело, или фрагмент антитела, которое связывает BCMA, представляет собой, или содержит, VH и VL из антитела, или фрагмента антитела, описанного в публикациях международных патентных заявок с номерами WO 2016/090327 и WO 2016/090320.
В некоторых вариантах осуществления антиген антигенсвязывающего домена представляет собой GPRC5D. В некоторых вариантах осуществления scFv содержит VH и VL, полученные из антитела, или фрагмента антитела, специфического для GPRC5D. В некоторых вариантах осуществления антитело, или фрагмент антитела, которое связывает GPRC5D, представляет собой, или содержит, VH и VL из антитела, или фрагмента антитела, описанного в публикациях международных патентных заявок с номерами WO 2016/090329 и WO 2016/090312.
В некоторых вариантах осуществления CAR содержит TCR-подобное антитело, такое как антитело, или антигенсвязывающий фрагмент (например,scFv), которое специфически узнает внутриклеточный антиген, такой как опухоль-ассоциированный антиген, представленный на клеточной поверхности в виде комплекса MHC-пептид. В некоторых вариантах осуществления антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, которое узнает комплекс MHC-пептид, может быть экспрессировано на клетках в виде части рекомбинантного рецептора, такого как антигенный рецептор. В число антигенных рецепторов входят функциональные не-TCR антигенные рецепторы, такие как химерные антигенные рецепторы (CAR). В целом, CAR, содержащий антитело, или антигенсвязывающий фрагмент, которое проявляет TCR-подобную специфичность, направленную против комплексов пептид-MHC, также можно называть TCR-подобным CAR.
+
+
Термин «главный комплекс гистосовместимости» (MHC) означает белок, как правило, гликопротеин, содержащий полиморфный пептид-связывающий сайт, или связывающую канавку, который в некоторых случаях способен образовывать комплекс с пептидными антигенами полипептидов, включая пептидные антигены, процессированные аппаратом клетки. В некоторых случаях молекулы MHC могут быть экспонированы или экспрессированы на клеточной поверхности, в том числе в виде комплекса с пептидом, то есть, комплекса MHC-пептид, для представления антигена в конформации, узнаваемой антигенным рецептором на T-клетках, таким как TCR или TCR-подобное антитело. Как правило, молекулы MHC класса I представляют собой гетеродимеры, имеющие проходящую через мембрану α-цепь, в некоторых случаях с тремя α-доменами, и нековалентно связанный β2-микроглобулин. Как правило, молекулы MHC класса II состоят из двух трансмембранных гликопротеинов, α и β, оба из которых, как правило, проходят через мембрану. Молекула MHC может включать эффективную часть MHC, которая содержит антигенсвязывающий сайт, или сайты, для связывания пептида и последовательности, необходимые для узнавания соответствующим антигенным рецептором. В некоторых вариантах осуществления молекулы MHC класса I доставляют пептиды из цитозоля к клеточной поверхности, где комплекс MHC-пептид узнается T-клетками, как правило, CD8 T-клетками, но в некоторых случаях CD4+ T-клетками. В некоторых вариантах осуществления молекулы MHC класса II доставляют пептиды из везикулярной системы к клеточной поверхности, где они обычно узнаются CD4 T-клетками. Как правило, молекулы MHC кодируются группой связанных локусов, которые имеют общее название H-2 у мыши и человеческий лейкоцитарный антиген (HLA) у человека. Таким образом, как правило, MHC человека также можно называть человеческим лейкоцитарным антигеном (HLA).
Термин «комплекс MHC-пептид», или «комплекс пептид-MHC», или его вариации, относится к комплексу или ассоциации пептидного антигена и молекулы MHC, например, как правило, за счет нековалентных взаимодействий пептида в связывающей канавке, или щели, молекулы MHC. В некоторых вариантах осуществления комплекс MHC-пептид присутствует или экспонируется на поверхности клеток. В некоторых вариантах осуществления комплекс MHC-пептид может специфически узнаваться антигенным рецептором, таким как TCR, TCR-подобный CAR, или их антигенсвязывающие фрагменты.
В некоторых вариантах осуществления пептид, такой как пептидный антиген или эпитоп, из полипептида может связываться с молекулой MHC, например, для узнавания антигенным рецептором. Как правило, пептид получен из, или имеет в основе фрагмент, большей по размеру биологической молекулы, такой как полипептид или белок. В некоторых вариантах осуществления пептид, как правило, имеет длину от примерно 8 до примерно 24 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления пептид имеет длину от, или от примерно, 9 до 22 аминокислот для узнавания в комплексе MHC класса II. В некоторых вариантах осуществления пептид имеет длину от, или от примерно, 8 до 13 аминокислот для узнавания в комплексе MHC класса I. В некоторых вариантах осуществления после узнавания пептида в контексте молекулы MHC, например, комплекса MHC-пептид, антигенный рецептор, такой как TCR или TCR-подобный CAR, продуцирует, или инициирует, активирующий сигнал для T-клетки, который индуцирует T-клеточный ответ, такой как T-клеточная пролиферация, продуцирование цитокинов, цитотоксический T-клеточный ответ или другой ответ.
В некоторых вариантах осуществления TCR-подобное антитело, или антигенсвязывающий фрагмент, может быть получено (смотри, например, опубликованные патентные заявки США №№ US 2002/0150914; US 2003/0223994; US 2004/0191260; US 2006/0034850; US 2007/00992530; US20090226474; US20090304679; и международную PCT публикацию № WO 03/068201).
В некоторых вариантах осуществления антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывает комплекс MHC-пептид, можно получать путем иммунизации хозяина эффективным количеством иммуногена, содержащего комплекс MHC-пептид. В некоторых случаях пептид комплекса MHC-пептид представляет собой эпитоп антигена, способного связываться с MHC, такого как опухолевый антиген, например, универсальный опухолевый антиген, антиген миеломы или другой антиген, описанный ниже. В некоторых вариантах осуществления эффективное количество иммуногена затем вводят хозяину для вызывания иммунного ответа, при этом иммуноген сохраняет свою трехмерную форму в течение периода времени, достаточного для вызывания иммунного ответа против представленного в трехмерной форме пептида в связывающей канавке молекулы MHC. Сыворотку, полученную от хозяина, затем анализируют для определения того, были ли получены нужные антитела, узнающие представленный в трехмерной форме пептид в связывающей канавке молекулы MHC. В некоторых вариантах осуществления полученные антитела можно оценивать для подтверждения того, что антитело способно отличать комплекс MHC-пептид от отдельной молекулы MHC, отдельного интересующего пептида, а также от комплекса MHC с посторонним пептидом. Затем можно выделять нужные антитела.
et al
J Mol. Recogn
В некоторых вариантах осуществления антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывает комплекс MHC-пептид, можно получать методами с использованием библиотеки дисплея антител, такой как библиотека дисплея антител в фаге. В некоторых вариантах осуществления можно получать библиотеки дисплея в фаге мутантных Fab, scFv или других форм антител, например, в которых члены библиотеки имеют мутантные один или более остатков области CDR или областей CDR. Смотри, например, опубликованные патентные заявки США №№ US20020150914, US2014/0294841; и Cohen CJ. . (2003) . 16:324-332.
2
H
В настоящем документе термин «антитело» используется в самом широком смысле и охватывает поликлональные и моноклональные антитела, включая интактные антитела и функциональные (антигенсвязывающие) фрагменты антител, в том числе антигенсвязывающие (Fab) фрагменты, фрагменты F(ab’), фрагменты Fab’, фрагменты Fv, рекомбинантные фрагменты IgG (rIgG), вариабельные области тяжелой цепи (V), способные специфически связывать антиген, одноцепочечные фрагменты антител, в том числе одноцепочечные вариабельные фрагменты (scFv), и однодоменные фрагменты антител (например, sdAb, sdFv, нанотело). Термин охватывает сконструированные и/или иным образом модифицированные формы иммуноглобулинов, такие как интратела, пептитела, химерные антитела, полностью человеческие антитела, гуманизированные антитела и гетероконъюгатные антитела, мультиспецифические, например, биспецифические, антитела, диатела, триатела и тетратела, тандемные ди-scFv, тандемные три-scFv. Если нет иных указаний, термин «антитело» следует понимать, как охватывающий функциональные фрагменты антител. Термин также охватывает интактные или полноразмерные антитела, включая антитела любого класса или подкласса, в том числе IgG и его подклассов, IgM, IgE, IgA и IgD.
2
В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающие белки, антитела и их антигенсвязывающие фрагменты специфически узнают антиген, узнаваемый полноразмерным антителом. В некоторых вариантах осуществления тяжелая и легкая цепи антитела могут быть полноразмерными, или могут представлять собой антигенсвязывающий фрагмент (Fab, F(ab’), Fv или одноцепочечный фрагмент Fv (scFv)). В других вариантах осуществления константную область тяжелой цепи антитела выбирают из, например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD и IgE, в частности, выбирают из, например, IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, более конкретно, IgG1 (например, IgG1 человека). В другом варианте осуществления константную область легкой цепи антитела выбирают из, например, каппа или лямбда, в частности, каппа.
2
H
H
В число предложенных антител входят фрагменты антител. Термин «фрагмент антитела» означает молекулу, отличную от интактного антитела, которая содержит часть интактного антитела, связывающую антиген, который связывает интактное антитело. Примеры фрагментов антител включают, но не ограничиваются ими, Fv, Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’); диатела; линейные антитела; вариабельные области тяжелой цепи (V), одноцепочечные молекулы антител, такие как scFv и однодоменные V антитела; а также мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител. В конкретных вариантах осуществления антитела представляют собой одноцепочечные фрагменты антител, содержащие вариабельную область тяжелой цепи и/или вариабельную область легкой цепи, такие как scFv.
H
L
H
L
H
L
L
H
et al.
et al.,
et al.,
Термин «вариабельная область», или «вариабельный домен», означает домен тяжелой или легкой цепи антитела, который участвует в связывании антитела с антигеном. Вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи (V и V, соответственно) естественного антитела, как правило, имеют сходные структуры, при этом каждый домен содержит четыре консервативные каркасные области (FR) и три области CDR. (Смотри, например, Kindt  Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman и Co., page 91 (2007). Отдельного домена V или V может быть достаточно для придания специфичности связывания антигена. Кроме того, антитела, которые связывают конкретный антиген, могут быть выделены с использованием домена V или V из антитела, связывающего антиген, для скрининга библиотеки комплементарных доменов V или V, соответственно. Смотри, например, Portolano  J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson  Nature 352:624-628 (1991).
Однодоменные антитела представляют собой фрагменты антител, содержащие весь вариабельный домен тяжелой цепи, или его часть, или весь вариабельный домен легкой цепи, или его часть, антитела. В конкретных вариантах осуществления однодоменное антитело представляет собой человеческое однодоменное антитело. В некоторых вариантах осуществления CAR содержит домен тяжелой цепи антитела, который специфически связывает антиген, такой как маркер рака или клеточный поверхностный антиген являющихся мишенью клеток или пораженных болезнью тканей, например, клеток опухоли или раковых клеток, такой как любой из антигенов-мишеней, описанных в настоящем документе или известных в данной области.
Фрагменты антитела можно получать разными методами, включая, но без ограничения, протеолитическое расщепление интактного антитела, а также продуцирование рекомбинантными клетками-хозяевами. В некоторых вариантах осуществления антитела представляют собой полученные рекомбинантными методами фрагменты, такие как фрагменты, содержащие конструкции, не встречающиеся в природе, например, конструкции с двумя или более областями или цепями антител, связанными синтетическими линкерами, например, пептидными линкерами, и/или конструкции, которые не могут быть получены ферментативным расщеплением естественного интактного антитела. В некоторых вариантах осуществления фрагменты антитела представляют собой scFv.
«Гуманизированное» антитело представляет собой антитело, в котором все, или практически все, аминокислотные остатки CDR получены из не принадлежащих человеку CDR, и все, или практически все, аминокислотные остатки FR получены из FR человека. Гуманизированное антитело, необязательно, может содержать по меньшей мере часть константной области антитела, полученную из человеческого антитела. «Гуманизированная форма» не принадлежащего человеку антитела означает вариант не принадлежащего человеку антитела, которое было подвергнуто гуманизации, как правило, для уменьшения иммуногенности у человека, при этом с сохранением специфичности и аффинности исходного не принадлежащего человеку антитела. В некоторых вариантах осуществления некоторые остатки FR в гуманизированном антителе заменены соответствующими остатками из не принадлежащего человеку антитела (например, антитела, из которого происходят остатки CDR), например, для восстановления или повышения специфичности или аффинности антитела.
Таким образом, в некоторых вариантах осуществления химерный антигенный рецептор, включая TCR-подобный CAR, содержит внеклеточный фрагмент, содержащий антитело или фрагмент антитела. В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент включает scFv. В некоторых аспектах химерный антигенный рецептор содержит внеклеточный фрагмент, содержащий антитело, или фрагмент, и внутриклеточную сигнальную область. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточная сигнальная область содержит внутриклеточный сигнальный домен. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен представляет собой, или содержит, основной сигнальный домен, сигнальный домен, способный индуцировать основной активирующий сигнал в T-клетке, компонент сигнального домена T-клеточного рецептора (TCR) и/или сигнальный домен, содержащий иммунорецепторный тирозиновый активирующий мотив (ITAM).
H
L
et al
Clin. Cancer Res
В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный рецептор, такой как CAR, например, его фрагмент антитела, дополнительно содержит спейсер, который может представлять собой, или включать, по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина, либо ее вариант или модифицированную версию, например, шарнирную область, например, шарнирную область IgG4, и/или C1/C, и/или область Fc. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный рецептор дополнительно содержит спейсер и/или шарнирную область. В некоторых вариантах осуществления константная область, или ее часть, происходит из IgG человека, например, IgG4 или IgG1. В некоторых аспектах часть константной области служит в качестве спейсерной области между узнающим антиген компонентом, например, scFv, и трансмембранным доменом. Спейсер может иметь длину, которая обеспечивает повышенную способность клетки к реагированию после связывания антигена, в сравнении с ситуацией в отсутствие спейсера. В некоторых примерах спейсер имеет длину, составляющую, или составляющую примерно, 12 аминокислот, или имеет длину не более 12 аминокислот. Иллюстративные спейсеры включают те, которые имеют по меньшей мере примерно 10-229 аминокислот, примерно 10-200 аминокислот, примерно 10-175 аминокислот, примерно 10-150 аминокислот, примерно 10-125 аминокислот, примерно 10-100 аминокислот, примерно 10-75 аминокислот, примерно 10-50 аминокислот, примерно 10-40 аминокислот, примерно 10-30 аминокислот, примерно 10-20 аминокислот или примерно 10-15 аминокислот, включая любое целое значение между конечными точками указанных диапазонов. В некоторых вариантах осуществления область спейсера содержит примерно 12 аминокислот или менее, примерно 119 аминокислот или менее, или примерно 229 аминокислот или менее. Иллюстративные спейсеры включают отдельный шарнир IgG4, шарнир IgG4, связанный с доменами CH2 и CH3, или шарнир IgG4, связанный с доменом CH3. Иллюстративные спейсеры включают, но без ограничения, те, которые описаны в Hudecek . (2013) ., 19:3153 или публикации международной патентной заявки с номером WO2014031687. В некоторых вариантах осуществления спейсер имеет последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 1, и кодируется последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления спейсер имеет последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах осуществления спейсер имеет последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 4.
В некоторых вариантах осуществления константная область, или фрагмент, происходит из IgD. В некоторых вариантах осуществления спейсер имеет последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 5. В некоторых вариантах осуществления спейсер имеет аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, или более, идентичности последовательности с любой из SEQ ID NO: 1, 3, 4 и 5. В некоторых вариантах осуществления спейсер имеет последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 23-31. В некоторых вариантах осуществления спейсер имеет аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, или более, идентичности последовательности с любой из SEQ ID NO: 27-31, 58, 59.
Домен узнавания антигена, как правило, связан с одним или более внутриклеточными сигнальными компонентами, такими как сигнальные компоненты, которые имитируют активацию через комплекс антигенного рецептора, такой как комплекс TCR, в случае CAR, и/или сигнал через другой клеточный поверхностный рецептор. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий компонент (например, антитело) связан с одной или более трансмембранными и внутриклеточными сигнальными областями. В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен слит с внеклеточным доменом. В одном варианте осуществления используют трансмембранный домен, который естественным образом связан с одним из доменов в рецепторе, например, CAR. В некоторых случаях трансмембранный домен выбирают, или модифицируют путем замены аминокислот, чтобы избежать связывания таких доменов с трансмембранными доменами тех же самых, или иных, поверхностных мембранных белков для минимизации взаимодействий с другими составляющими рецепторного комплекса.
В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен получают из естественного или из синтетического источника. В некоторых аспектах, если источник является естественным, домен происходит из любого связанного с мембраной или трансмембранного белка. Трансмембранные области включают те, которые получены из (то есть, содержат по меньшей мере трансмембранную область(и)) альфа, бета или дзета-цепи T-клеточного рецептора, CD28, CD3 эпсилон, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD 16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137, CD 154. Альтернативно, в некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен является синтетическим. В некоторых аспектах синтетический трансмембранный домен преимущественно содержит гидрофобные остатки, такие как лейцин и валин. В некоторых аспектах триплет фенилаланин, триптофан и валин будет присутствовать на каждом конце синтетического трансмембранного домена. В некоторых вариантах осуществления связь осуществляется через линкеры, спейсеры и/или трансмембранный домен(ы).
В число внутриклеточных сигнальных областей входят те, которые имитируют или аппроксимируют сигнал через естественный антигенный рецептор, сигнал через такой рецептор в сочетании с костимулирующим рецептором и/или сигнал только через костимулирующий рецептор. В некоторых вариантах осуществления имеется короткий олиго- или полипептидный линкер, например, линкер длиной от 2 до 10 аминокислот, например, линкер, содержащий остатки глицина и серина, например, дуплет глицин-серин, который является связывающим звеном между трансмембранным доменом и цитоплазматическим сигнальным доменом CAR.
Рецептор, например, CAR, как правило, содержит по меньшей мере один внутриклеточный сигнальный компонент, или компоненты. В некоторых вариантах осуществления рецептор содержит внутриклеточный компонент комплекса TCR, такой как цепь CD3 TCR, который опосредует T-клеточную активацию и цитотоксичность, например, дзета-цепь CD3. Таким образом, в некоторых аспектах ROR1-связывающее антитело связано с одним или более сигнальными модулями клетки. В некоторых вариантах осуществления сигнальные модули клетки включают трансмембранный домен CD3, внутриклеточные сигнальные домены CD3 и/или другие трансмембранные домены CD. В некоторых вариантах осуществления рецептор, например, CAR, также содержит часть одной или более дополнительных молекул, таких как Fc-рецептор γ, CD8, CD4, CD25 или CD16. Например, в некоторых аспектах CAR содержит химерную молекулу из CD3-дзета (CD3-ζ) или Fc-рецептора γ и CD8, CD4, CD25 или CD16.
В некоторых вариантах осуществления после связывания CAR цитоплазматический домен, или внутриклеточная сигнальная область, CAR активирует по меньшей мере одну из нормальных эффекторных функций, или ответов, иммунной клетки, например, T-клетки, сконструированной для экспрессии CAR. Например, в некоторых контекстах CAR индуцирует такую функцию T-клетки, как цитолитическая активность или T-хелперная активность, например, секрецию цитокинов или других факторов. В некоторых вариантах осуществления используют укороченный фрагмент компонента внутриклеточной сигнальной области антигенного рецептора или костимулирующей молекулы вместо интактной иммуностимулирующей цепи, например, если он передает сигнал эффекторной функции. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточные сигнальные области, например, содержащие внутриклеточный домен или домены, содержат цитоплазматические последовательности T-клеточного рецептора (TCR), и в некоторых аспектах также цитоплазматические последовательности корецепторов, которые в естественном контексте действуют согласованно с таким рецептором, инициируя передачу сигнала после связывания антигенного рецептора, и/или любое производное или вариант таких молекул, и/или любую синтетическую последовательность, обладающую такой же функциональной способностью.
В контексте естественного TCR для полной активации, как правило, требуется не только сигнализация через TCR, но также и костимулирующий сигнал. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления для стимуляции полной активации в CAR также включают компонент для генерирования вспомогательного или костимулирующего сигнала. В других вариантах осуществления CAR не содержит компонент для генерирования костимулирующего сигнала. В некоторых аспектах дополнительный CAR экспрессируется в той же клетке и обеспечивает компонент для генерирования вспомогательного или костимулирующего сигнала.
В некоторых аспектах описано, что T-клеточная активация опосредуется цитоплазматическими сигнальными последовательностями двух видов: теми, которые инициируют антиген-зависимую основную активацию через TCR (основные цитоплазматические сигнальные последовательности), и теми, которые действуют независимым от антигена образом, обеспечивая вспомогательный или костимулирующий сигнал (вспомогательные цитоплазматические сигнальные последовательности). В некоторых аспектах CAR содержит один или оба из таких сигнальных компонентов.
В некоторых аспектах CAR содержит основную цитоплазматическую сигнальную последовательность, которая регулирует основную активацию комплекса TCR. Основные цитоплазматические сигнальные последовательности, которые действуют стимулирующим образом, могут содержать сигнальные мотивы, которые известны как иммунорецепторные тирозиновые активирующие мотивы, или ITAM. Примеры ITAM-содержащих основных цитоплазматических сигнальных последовательностей включают те, которые получены из TCR или CD3-дзета, FcR-гамма или FcR-бета. В некоторых вариантах осуществления цитоплазматическая сигнальная молекула(ы) в CAR содержит(ат) цитоплазматический сигнальный домен, его часть или последовательность из CD3-дзета.
В некоторых вариантах осуществления CAR содержит сигнальную область и/или трансмембранную часть костимулирующего рецептора, такого как CD28, 4-1BB, OX40, DAP10 и ICOS. В некоторых аспектах один и тот же CAR содержит как сигнальную область, так и костимулирующие компоненты.
В некоторых вариантах осуществления сигнальная область включена в один CAR, в то время как костимулирующий компонент предоставляется другим CAR, узнающим другой антиген. В некоторых вариантах осуществления CAR включает активирующий или стимулирующий CAR и костимулирующий CAR, оба из которых экспрессируются на одной клетке (смотри WO2014/055668).
В конкретных вариантах осуществления внутриклеточная сигнальная область содержит трансмембранный и сигнальный домен CD28, связанные с внутриклеточным доменом CD3 (например, CD3-дзета). В некоторых вариантах осуществления внутриклеточная сигнальная область содержит химерные костимулирующие домены CD28 и CD137 (4-1BB, TNFRSF9), связанные с внутриклеточным доменом CD3-дзета.
В некоторых вариантах осуществления CAR содержит один или более, например, два или более, костимулирующих доменов и активирующий домен, например, основной активирующий домен, в цитоплазматической части. Иллюстративный CAR содержит внутриклеточные компоненты CD3-дзета, CD28 и 4-1BB.
В некоторых случаях CAR называют CAR первого, второго и/или третьего поколения. В некоторых аспектах CAR первого поколения представляет собой CAR, который при связывании антигена обеспечивает исключительно индуцированный цепью CD3 сигнал; в некоторых аспектах CAR второго поколения представляет собой CAR, который обеспечивает такой сигнал и костимулирующий сигнал, например, CAR, содержащий внутриклеточный сигнальный домен из костимулирующего рецептора, такого как CD28 или CD137; в некоторых аспектах CAR третьего поколения представляет собой CAR, который содержит несколько костимулирующих доменов из разных костимулирующих рецепторов.
H
В некоторых вариантах осуществления химерный антигенный рецептор содержит внеклеточный фрагмент, содержащий антитело, или фрагмент, описанное в настоящем документе. В некоторых аспектах химерный антигенный рецептор содержит внеклеточный фрагмент, содержащий антитело, или фрагмент, описанное в настоящем документе, и внутриклеточный сигнальный домен. В некоторых вариантах осуществления антитело, или фрагмент, включает scFv или однодоменное V антитело, и внутриклеточный домен содержит ITAM. В некоторых аспектах внутриклеточный сигнальный домен включает сигнальный домен дзета-цепи CD3 (CD3ζ). В некоторых вариантах осуществления химерный антигенный рецептор содержит трансмембранный домен, находящийся между внеклеточным доменом и внутриклеточной сигнальной областью.
В некоторых аспектах трансмембранный домен содержит трансмембранный фрагмент CD28. Внеклеточный домен и трансмембранный домен могут быть связаны непосредственно или опосредованно. В некоторых вариантах осуществления внеклеточный домен и трансмембранный домен связаны спейсером, таким как любой из спейсеров, описанных в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления химерный антигенный рецептор содержит внутриклеточный домен T-клеточной костимулирующей молекулы, например, между трансмембранным доменом и внутриклеточным сигнальным доменом. В некоторых аспектах T-клеточная костимулирующая молекула представляет собой CD28 или 4-1BB.
В некоторых вариантах осуществления CAR содержит антитело, например, фрагмент антитела, трансмембранный домен, который представляет собой, или содержит, трансмембранный фрагмент CD28, или его функциональный вариант, и внутриклеточный сигнальный домен, содержащий сигнальный фрагмент CD28, или его функциональный вариант, и сигнальный фрагмент CD3-дзета, или его функциональный вариант. В некоторых вариантах осуществления CAR содержит антитело, например, фрагмент антитела, трансмембранный домен, который представляет собой, или содержит, трансмембранный фрагмент CD28, или его функциональный вариант, и внутриклеточный сигнальный домен, содержащий сигнальный фрагмент 4-1BB, или его функциональный вариант, и сигнальный фрагмент CD3-дзета, или его функциональный вариант. В некоторых таких вариантах осуществления рецептор также содержит спейсер, содержащий фрагмент молекулы Ig, такой как молекула Ig человека, например, шарнир Ig, например, шарнир IgG4, например, спейсер, содержащий только шарнир.
В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен рецептора, например, CAR, представляет собой трансмембранный домен человеческого CD28, или его вариант, например, трансмембранный домен человеческого CD28 из 27 аминокислот (регистрационный №: P10747.1), или представляет собой трансмембранный домен, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 8, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, или более, идентичности последовательности с SEQ ID NO: 8; в некоторых вариантах осуществления содержащий трансмембранный домен фрагмент рекомбинантного рецептора содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 9, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере, или примерно, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, или более, идентичности последовательности с ней.
В некоторых вариантах осуществления химерный антигенный рецептор содержит внутриклеточный домен T-клеточной костимулирующей молекулы. В некоторых аспектах T-клеточная костимулирующая молекула представляет собой CD28 или 4-1BB.
В некоторых вариантах осуществления внутриклеточная сигнальная область содержит внутриклеточный костимулирующий сигнальный домен человеческого CD28, или его функциональный вариант, или фрагмент, например, его домен из 41 аминокислоты и/или такой домен с заменой LL на GG в положениях 186-187 естественного белка CD28. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен может содержать аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 10 или 11, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, или более, идентичности последовательности с SEQ ID NO: 10 или 11. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточная область содержит внутриклеточный костимулирующий сигнальный домен 4-1BB, или его функциональный вариант, или фрагмент, например, цитоплазматический домен из 42 аминокислот человеческого 4-1BB (регистрационный № Q07011.1), или его функциональный вариант, или фрагмент, например, аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 12, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, или более, идентичности последовательности с SEQ ID NO: 12.
В некоторых вариантах осуществления внутриклеточная сигнальная область содержит цепь человеческого CD3, необязательно, стимулирующий сигнальный домен CD3-дзета, или его функциональный вариант, например, цитоплазматический домен из 112 ак изоформы 3 человеческой CD3ζ (регистрационный №: P20963.2), или сигнальный домен CD3-дзета, описанный в патенте США № 7446190 или патенте США № 8911993. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточная сигнальная область содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 13, 14 или 15, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, или более, идентичности последовательности с SEQ ID NO: 13, 14 или 15.
H
H
H
H
H
В некоторых аспектах спейсер содержит лишь шарнирную область IgG, например, лишь шарнир IgG4 или IgG1, например, содержащий только шарнир спейсер с последовательностью SEQ ID NO: 1. В других вариантах осуществления спейсер представляет собой шарнир Ig, например, шарнир IgG4, связанный с доменами C2 и/или C3. В некоторых вариантах осуществления спейсер представляет собой шарнир Ig, например, шарнир IgG4, связанный с доменами C2 и C3, например, с последовательностью SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах осуществления спейсер представляет собой шарнир Ig, например, шарнир IgG4, связанный только с доменом C3, например, с последовательностью SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления спейсер представляет собой, или содержит, богатую остатками глицин-серин последовательность или другой гибкий линкер, такой как известные гибкие линкеры.
2. Химерные рецепторы аутоантител (CAAR)
В некоторых вариантах осуществления в число рекомбинантных рецепторов, экспрессируемых сконструированными клетками, используемыми в сочетании с предложенными способами, вариантами применения, изделиями и композициями, входит химерный рецептор аутоантитела (CAAR). В некоторых вариантах осуществления CAAR является специфическим для аутоантитела. В некоторых вариантах осуществления клетка, экспрессирующая CAAR, такая как T-клетка, сконструированная для экспрессии CAAR, может быть использована для специфического связывания и уничтожения экспрессирующих аутоантитела клеток, но не клеток, экспрессирующих нормальные антитела. В некоторых вариантах осуществления CAAR-экспрессирующие клетки могут быть использованы для лечения аутоиммунного заболевания, связанного с экспрессией собственных антигенов, такого как аутоиммунные заболевания. В некоторых вариантах осуществления CAAR-экспрессирующие клетки могут быть направлены на B-клетки, которые в конечном итоге продуцируют аутоантитела и экспонируют аутоантитела на их клеточных поверхностях, что делает эти B-клетки специфическими для заболевания мишенями при терапевтическом вмешательстве. В некоторых вариантах осуществления CAAR-экспрессирующие клетки могут быть использованы для эффективного таргетирования и уничтожения патогенных B-клеток при аутоиммунных заболеваниях путем таргетирования вызывающих заболевание B-клеток за счет антиген-специфического химерного рецептора для аутоантител. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный рецептор представляет собой такой CAAR, который описан в публикации патентной заявки США № US 2017/0051035.
В некоторых вариантах осуществления CAAR содержит связывающий аутоантитело домен, трансмембранный домен и внутриклеточную сигнальную область. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточная сигнальная область содержит внутриклеточный сигнальный домен. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен представляет собой, или содержит, основной сигнальный домен, сигнальный домен, способный индуцировать основной активирующий сигнал в T-клетке, компонент сигнального домена T-клеточного рецептора (TCR) и/или сигнальный домен, содержащий иммунорецепторный тирозиновый активирующий мотив (ITAM). В некоторых вариантах осуществления внутриклеточная сигнальная область содержит вспомогательную или костимулирующую сигнальную область (вспомогательные внутриклеточные сигнальные области).
В некоторых вариантах осуществления связывающий аутоантитело домен содержит аутоантиген или его фрагмент. Выбор аутоантигена может зависеть от типа аутоантитела, являющегося мишенью. Например, аутоантиген может быть выбран, поскольку он узнает аутоантитело на клетке-мишени, такой как B-клетка, связанная с конкретным болезненным состоянием, например, аутоиммунным заболеванием, таким как опосредованное аутоантителом аутоиммунное заболевание. В некоторых вариантах осуществления аутоиммунное заболевание включает обыкновенную пузырчатку (PV). Иллюстративные аутоантигены включают десмоглеин 1 (Dsg1) и Dsg3.
3. Множественное таргетирование
Sci. Transl. Medicine,
В некоторых вариантах осуществления клетки, используемые в сочетании с предложенными способами, вариантами применения, изделиями и композициями, включают клетки, применяемые в стратегии множественного таргетирования. В некоторых вариантах осуществления клетки экспрессируют многоцепочечные химерные антигенные рецепторы (CAR) или экспрессируют два или более генно-инженерных рецепторов на клетке, каждый из которых узнает эпитоп разных антигенов и, как правило, каждый содержит отличающийся внутриклеточный сигнальный компонент. Такие стратегии множественного таргетирования описаны, например, в публикации международной патентной заявки № WO 2014055668 A1 (в которой описаны сочетания активирующих и костимулирующих CAR, например, направленных на два разных антигена, присутствующих отдельно на нецелевых, например, нормальных клетках, но присутствующих совместно лишь на клетках, связанных с заболеванием или состоянием, которое предстоит лечить) и публикации Fedorov et al., 5(215) (2013) (в которой описаны клетки, экспрессирующие активирующий и ингибирующий CAR, такие как те, в которых активирующий CAR связывает один антиген, экспрессируемый как на нормальных или не связанных с заболеванием клетках, так и на клетках, связанных с заболеванием или состоянием, которое предстоит лечить, и ингибирующий CAR связывает другой антиген, экспрессируемый только на нормальных клетках или клетках, которые не нуждаются в лечении).
Например, в некоторых вариантах осуществления клетки содержат первый генно-инженерный антигенный рецептор (например, CAR или TCR), который способен индуцировать активирующий или стимулирующий сигнал в клетке, как правило, после специфического связывания с антигеном, узнаваемым первым рецептором, например, первым антигеном. В некоторых вариантах осуществления клетка дополнительно содержит второй генно-инженерный антигенный рецептор (например, CAR или TCR), например, химерный костимулирующий рецептор, который способен индуцировать костимулирующий сигнал в иммунной клетке, как правило, после специфического связывания со вторым антигеном, узнаваемым вторым рецептором. В некоторых вариантах осуществления первый антиген и второй антиген являются одинаковыми. В некоторых вариантах осуществления первый антиген и второй антиген являются разными.
В некоторых вариантах осуществления первый и/или второй генно-инженерный антигенный рецептор (например, CAR или TCR) способен индуцировать активирующий сигнал в клетке. В некоторых вариантах осуществления рецептор содержит внутриклеточный сигнальный компонент, содержащий ITAM или ITAM-подобные мотивы. В некоторых вариантах осуществления активация, индуцируемая первым рецептором, включает передачу сигнала или изменение белковой экспрессии в клетке, приводящее к инициации иммунного ответа, например фосфорилирование ITAM и/или инициацию опосредованного ITAM каскада передачи сигнала, образование иммунного синапса и/или кластеризацию молекул вблизи связанного рецептора (например, CD4 или CD8, и так далее), активацию одного или более факторов транскрипции, таких как NF-κB и/или AP-1, и/или индукцию генной экспрессии таких факторов, как цитокины, пролиферацию и/или выживание.
В некоторых вариантах осуществления первый и/или второй рецептор содержат внутриклеточные сигнальные домены или области костимулирующих рецепторов, например, CD28, CD137 (4-1BB), OX40 и/или ICOS. В некоторых вариантах осуществления первый и второй рецепторы содержат внутриклеточные сигнальные домены костимулирующих рецепторов, которые являются разными. В одном варианте осуществления первый рецептор содержит костимулирующую сигнальную область CD28, и второй рецептор содержит костимулирующую сигнальную область 4-1BB, или наоборот.
В некоторых вариантах осуществления первый и/или второй рецептор содержат как внутриклеточный сигнальный домен, содержащий ITAM или ITAM-подобные мотивы, так и внутриклеточный сигнальный домен костимулирующего рецептора.
В некоторых вариантах осуществления первый рецептор содержит внутриклеточный сигнальный домен, содержащий ITAM или ITAM-подобные мотивы, и второй рецептор содержит внутриклеточный сигнальный домен костимулирующего рецептора. Костимулирующий сигнал в сочетании с активирующим сигналом, индуцированным в той же клетке, приводит к иммунному ответу, например, сильному и стойкому иммунному ответу, например, повышенной экспрессии гена, секреции цитокинов и других факторов, и опосредованным T-клетками эффекторным функциям, таким как уничтожение клеток.
В некоторых вариантах осуществления ни связывание одного только первого рецептора, ни связывание одного только второго рецептора, не индуцирует сильный иммунный ответ. В некоторых аспектах при связывании только одного рецептора клетка становится толерантной или не реагирующей на антиген, или ингибированной, и/или не начинает пролиферировать или секретировать факторы, или выполнять эффекторные функции. Однако в некоторых таких вариантах осуществления, если связано несколько рецепторов, например при взаимодействии с клеткой, экспрессирующей первый и второй антигены, достигается нужный ответ, такой как полная иммунная активация или стимуляция, например, о чем свидетельствует секреция одного или более цитокинов, пролиферация, персистенция и/или выполнение иммунной эффекторной функции, такой как цитотоксическое уничтожение клетки-мишени.
В некоторых вариантах осуществления два рецептора индуцируют, соответственно, активирующий и ингибирующий сигнал в клетке, так что связывание одного из рецепторов с его антигеном активирует клетку или индуцирует ответ, но связывание второго ингибирующего рецептора с его антигеном индуцирует сигнал, который подавляет или демпфирует этот ответ. Примерами являются сочетания активирующего CAR и ингибирующего CAR, или iCAR. Может быть использована, например, такая стратегия, в которой активирующий CAR связывает антиген, экспрессируемый при заболевании или состоянии, но который также экспрессируется на нормальных клетках, и ингибирующий рецептор связывает отдельный антиген, который экспрессируется на нормальных клетках, но не на клетках, связанных с заболеванием или состоянием.
В некоторых вариантах осуществления стратегию множественного таргетирования используют в случае, когда антиген, связанный с конкретным заболеванием или состоянием, экспрессируется на не связанной с заболеванием клетке и/или экспрессируется на самой генно-инженерной клетке, либо временно (например, после стимуляции в связи с генной инженерией), либо постоянно. В таких случаях за счет необходимости связывания двух отдельных, и с отдельной специфичностью, антигенных рецепторов можно повышать специфичность, избирательность и/или эффективность.
В некоторых вариантах осуществления несколько антигенов, например, первый и второй антигены, экспрессируются на клетке или ткани, связанной с целевым заболеванием или состоянием, например, на раковой клетке. В некоторых аспектах клетка или ткань, связанная с заболеванием или состоянием, представляет собой множественную миелому или клетку множественной миеломы. В некоторых вариантах осуществления один или более из нескольких антигенов, как правило, также экспрессируется на клетке, которая не должна быть мишенью при клеточной терапии, например, на нормальной или не связанной с заболеванием клетке или ткани и/или на самих генно-инженерных клетках. В таких вариантах осуществления за счет необходимости связывания нескольких рецепторов для достижения ответа в клетке можно повышать специфичность и/или эффективность.
4. T-клеточный рецептор
В некоторых вариантах осуществления также предложены генно-инженерные клетки, такие как T-клетки, экспрессирующие T-клеточный рецептор (TCR), или его антигенсвязывающий фрагмент, который узнает пептидный эпитоп или T-клеточный эпитоп полипептида-мишени, такого как антиген опухолевого, вирусного или аутоиммунного белка.
В некоторых вариантах осуществления «T-клеточный рецептор», или «TCR», представляет собой молекулу, содержащую вариабельные цепи α и β (также известные как TCRα и TCRβ, соответственно) или вариабельные цепи γ и δ (также известные как TCRγ и TCRδ, соответственно), или их антигенсвязывающие фрагменты, которая способна к специфическому связыванию с пептидом, связанным с молекулой MHC. В некоторых вариантах осуществления TCR имеет форму αβ. Как правило, TCR, существующие в формах αβ и γδ, в целом, имеют аналогичную структуру, но экспрессирующие их T-клетки могут иметь отличающееся анатомическое расположение или разные функции. TCR встречается на поверхности клеток или в растворимой форме. Как правило, TCR встречается на поверхности T-клеток (или T-лимфоцитов), где он обычно отвечает за узнавание антигенов, связанных с молекулами главного комплекса гистосовместимости (MHC).
Если нет иных указаний, термин «TCR» должен охватывать все TCR, а также их антигенсвязывающие фрагменты или антигенсвязывающие части. В некоторых вариантах осуществления TCR является интактным или полноразмерным TCR, включая TCR в форме αβ или форме γδ. В некоторых вариантах осуществления TCR представляет собой антигенсвязывающий фрагмент, который меньше, чем полноразмерный TCR, но который связывает конкретный пептид, связанный с молекулой MHC, например, связывает комплекс MHC-пептид. В некоторых случаях антигенсвязывающий фрагмент, или фрагмент TCR, может содержать лишь часть структурных доменов полноразмерного или интактного TCR, но все еще способен связывать пептидный эпитоп, например, комплекс MHC-пептид, который связывает полноразмерный TCR. В некоторых случаях антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельные домены TCR, например, вариабельную α-цепь и вариабельную β-цепь TCR, достаточные для образования связывающего сайта для связывания специфического комплекса MHC-пептид. Как правило, вариабельные цепи TCR содержат определяющие комплементарность области, участвующие в узнавании пептида, MHC и/или комплекса MHC-пептид.
et al.,
et al.,
et al.,
В некоторых вариантах осуществления вариабельные домены TCR содержат гипервариабельные петли, или определяющие комплементарность области (CDR), которые, как правилами играют главную роль в узнавании и связывании, а также специфичности в отношении, антигена. В некоторых вариантах осуществления CDR в TCR, или их сочетания, образуют все, или практически все, из антигенсвязывающих сайтов конкретной молекулы TCR. Различные CDR в вариабельной области цепи TCR обычно разделены каркасными областями (FR), которые, в целом, имеют меньшую вариабельность среди молекул TCR в сравнении с CDR (смотри, например, Jores  Proc. Nat’l Acad. Sci. U.S.A. 87:9138, 1990; Chothia  EMBO J. 7:3745, 1988; смотри также Lefranc  Dev. Comp. Immunol. 27:55, 2003). В некоторых вариантах осуществления CDR3 является основной CDR, ответственной за связывание антигена или специфичность, или является наиболее важной среди трех CDR в вариабельной области конкретного TCR для узнавания антигена и/или для взаимодействия с процессированной пептидной частью комплекса пептид-MHC. В некоторых контекстах CDR1 альфа-цепи может взаимодействовать с N-концевой частью определенных антигенных пептидов. В некоторых контекстах CDR1 бета-цепи может взаимодействовать с C-концевой частью пептида. В некоторых контекстах CDR2 вносит наибольший вклад, или является основным CDR, ответственным за взаимодействие с, или узнавание MHC-части комплекса MHC-пептид. В некоторых вариантах осуществления вариабельная область β-цепи может содержать дополнительную гипервариабельную область (CDR4 или HVR4), которая, как правило, участвует в связывании суперантигена, но не в узнавании антигена (Kotb (1995) Clinical Microbiology Reviews, 8:411-426).
et al.,
В некоторых вариантах осуществления TCR также может содержать константный домен, трансмембранный домен и/или короткий цитоплазматический «хвост» (смотри, например, Janeway  Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 3rd Ed., Current Biology Publications, p. 4:33, 1997). В некоторых аспектах такая цепь TCR может иметь один N-концевой вариабельный домен иммуноглобулина, один константный домен иммуноглобулина, трансмембранную область и короткий цитоплазматический «хвост» на C-конце. В некоторых вариантах осуществления TCR связан с инвариантными белками комплекса CD3, вовлеченными в медиацию передачи сигнала.
et al.,
В некоторых вариантах осуществления цепь TCR содержит один или более константных доменов. Например, внеклеточный фрагмент конкретной цепи TCR (например, α-цепи или β-цепи) может содержать два иммуноглобулин-подобных домена, таких как вариабельные домены (например, Vα или Vβ; как правило, аминокислоты 1-116 по системе нумерации Kabat Kabat  «Sequences of Proteins of Immunological Interest», US Dept. Health and Human Services, Public Health Service National Institutes of Health, 1991, 5th ed.), и константный домен (например, константный домен α-цепи или Cα, как правило, положения 117-259 в цепи по системе нумерации Kabat или константный домен β-цепи, или Cβ, как правило, положения 117-295 в цепи по системе нумерации Kabat), вблизи клеточной мембраны. Например, в некоторых случаях внеклеточный фрагмент TCR, образованный двумя цепями, содержит два проксимальных по отношению к мембране константных домена и два дистальных по отношению к мембране вариабельных домена, при этом каждый из вариабельных доменов содержит области CDR. Константный домен TCR может содержать короткие соединительные последовательности, в которых остаток цистеина образует дисульфидную связь, тем самым связывая две цепи TCR. В некоторых вариантах осуществления TCR может иметь дополнительный остаток цистеина в каждой из α и β цепей, так что TCR содержит две дисульфидные связи в константных доменах.
В некоторых вариантах осуществления цепи TCR содержат трансмембранный домен. В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен заряжен положительно. В некоторых случаях цепь TCR содержит цитоплазматический «хвост». В некоторых случаях структура позволяет TCR связываться с другими молекулами, такими как CD3 и его субъединицы. Например, TCR, содержащий константные домены с трансмембранной областью, может закреплять белок в клеточной мембране и связываться с инвариантными субъединицами сигнального аппарата или комплекса CD3. Внутриклеточные «хвосты» сигнальных субъединиц CD3 (например, цепей CD3γ, CD3δ, CD3ε и CD3ζ) содержат один или более иммунорецепторных тирозиновых активирующих мотивов, или ITAM, которые участвуют в сигнализации комплекса TCR.
В некоторых вариантах осуществления TCR может представлять собой гетеродимер из двух цепей α и β (или, необязательно, γ и δ) или он может представлять собой одноцепочечный конструкт TCR. В некоторых вариантах осуществления TCR представляет собой гетеродимер, содержащий две отдельные цепи (цепи α и β или цепи γ и δ), которые связаны, например, дисульфидной связью или дисульфидными связями.
В некоторых вариантах осуществления TCR может быть получен из известной последовательности(ей) TCR, таких как последовательности цепей Vα,β, для которых легко доступна практически полноразмерная кодирующая последовательность. Можно использовать методы получения полноразмерных последовательностей TCR, включая последовательности V-цепей, из клеточных источников. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновые кислоты, кодирующие TCR, могут быть получены из различных источников, например методом амплификации в полимеразной цепной реакции (ПЦР) кодирующих TCR нуклеиновых кислот, находящихся внутри, или выделенных из, конкретной клетки или клеток, или методом синтеза общеизвестных последовательностей ДНК TCR.
in vivo
В некоторых вариантах осуществления TCR получают из биологического источника, например, из клеток, например, из T-клеток (например, цитотоксических T-клеток), T-клеточных гибридом или другого общедоступного источника. В некоторых вариантах осуществления T-клетки могут быть получены из  выделенных клеток. В некоторых вариантах осуществления TCR представляет собой прошедший тимусную селекцию TCR. В некоторых вариантах осуществления TCR представляет собой неоэпитоп-рестрицированный TCR. В некоторых вариантах осуществления T-клетки могут представлять собой культивируемую T-клеточную гибридому или клон. В некоторых вариантах осуществления TCR или его антигенсвязывающий фрагмент, или его антигенсвязывающую часть, можно получать путем синтеза на основании информации о последовательности TCR.
В некоторых вариантах осуществления TCR получают из TCR, идентифицированного или выбранного при скрининге библиотеки TCR-кандидатов против полипептидного антигена-мишени, или его эпитопа, являющегося мишенью для T-клеток. Библиотеки TCR могут быть получены путем амплификации репертуара Vα и Vβ из T-клеток, полученных от субъекта, включая клетки, присутствующие в МКПК, селезенке или другом лимфоидном органе. В некоторых случаях T-клетки могут быть амплифицированы из опухоль-инфильтрирующих лимфоцитов (ОИЛ). В некоторых вариантах осуществления библиотеки TCR могут быть получены из CD4+ или CD8+ клеток. В некоторых вариантах осуществления TCR могут быть амплифицированы из T-клеточного источника от нормального или здорового субъекта, то есть библиотеки нормальных TCR. В некоторых вариантах осуществления TCR могут быть амплифицированы из T-клеточного источника от больного субъекта, то есть библиотеки связанных с заболеванием TCR. В некоторых вариантах осуществления используют вырожденные праймеры для амплификации генного репертуара Vα и Vβ, например методом ОТ-ПЦР в образцах, таких как T-клетки, полученные от людей. В некоторых вариантах осуществления библиотеки scTv могут быть собраны из библиотек наивных Vα и Vβ, в которых амплифицированные продукты клонируют или собирают так, чтобы они были разделены линкером. В зависимости от источника субъекта и клеток библиотеки могут быть специфическими для аллелей HLA. Альтернативно, в некоторых вариантах осуществления библиотеки TCR могут быть получены путем мутагенеза или диверсификации исходной, или каркасной, молекулы TCR. В некоторых аспектах TCR подвергают направленной эволюции, например, путем мутагенеза, например, цепи α или β. В некоторых аспектах изменяют конкретные остатки в областях CDR TCR. В некоторых вариантах осуществления выбранный TCR может быть модифицирован методом созревания аффинности. В некоторых вариантах осуществления антиген-специфические T-клетки могут быть отобраны, например, путем скрининга для оценки активности CTL в отношении пептида. В некоторых аспектах TCR, например, находящийся на антиген-специфических T-клетках, может быть отобран, например, на основании активности связывания, например, конкретной аффинности или авидности для антигена.
et al.
et al.
et al.
et al.
В некоторых вариантах осуществления TCR, или его антигенсвязывающий фрагмент, представляет собой TCR, который был модифицирован или сконструирован. В некоторых вариантах осуществления используют методы направленной эволюции для получения TCR с измененными свойствами, например, с более высокой аффинностью для конкретного комплекса MHC-пептид. В некоторых вариантах осуществления направленную эволюцию осуществляют методами дисплея, включая, но без ограничения, дрожжевой дисплей (Holler  (2003) Nat Immunol, 4, 55-62; Holler  (2000) Proc Natl Acad Sci USA, 97, 5387-92), фаговый дисплей (Li  (2005) Nat Biotechnol, 23, 349-54), или T-клеточный дисплей (Chervin  (2008) J Immunol Methods, 339, 175-84). В некоторых вариантах осуществления подходы с использованием дисплея включают конструирование или модификацию, известного, исходного или эталонного TCR. Например, в некоторых случаях можно использовать TCR дикого типа в качестве матрицы для получения мутантного TCR, в котором один или более остатков областей CDR являются мутантными, и выбирают мутанты с желательным измененным свойством, например, с более высокой аффинностью для нужного антигена-мишени.
et al.
В некоторых вариантах осуществления пептиды полипептида-мишени для использования в получении или создании интересующего TCR, известны или могут быть с легкостью идентифицированы. В некоторых вариантах осуществления пептиды, подходящие для использования в получении TCR, или антигенсвязывающих фрагментов, можно определять на основании наличия HLA-рестрицированного мотива в интересующем полипептиде-мишени, таком как полипептид-мишень, описанный ниже. В некоторых вариантах осуществления пептиды идентифицируют с использованием доступных компьютерных моделей предсказания. В некоторых вариантах осуществления для предсказания связывающих сайтов MHC класса I такие модели включают, но без ограничения, ProPred1 (Singh and Raghava (2001) Bioinformatics 17(12):1236-1237), и SYFPEITHI (смотри Schuler  (2007) Immunoinformatics Methods in Molecular Biology, 409(1): 75-93 2007). В некоторых вариантах осуществления MHC-рестрицированный эпитоп представляет собой HLA-A0201, который экспрессируется у примерно 39-46% всех представителей белой европеоидной расы и, таким образом, является подходящим вариантом антигена MHC для использования в получении TCR или другой молекулы, связывающей MHC-пептид.
et al.
Можно использовать HLA-A0201-связывающие мотивы и сайты расщепления для протеасом и иммунопротеасом, полученные с использованием компьютерных моделей предсказания. Для предсказания сайтов связывания MHC класса I такие модели включают, но без ограничения, ProPred1 (описанную более подробно в публикации Singh and Raghava, ProPred: prediction of HLA-DR binding sites. BIOINFORMATICS 17(12):1236-1237 2001), и SYFPEITHI (смотри Schuler  SYFPEITHI, Database for Searching and T-Cell Epitope Prediction, в: Immunoinformatics Methods in Molecular Biology, vol 409(1): 75-93 2007).
В некоторых вариантах осуществления TCR, или его антигенсвязывающий фрагмент, может представлять собой получаемый рекомбинантными методами естественный белок, или его мутантную форму, у которой было изменено одно или более свойств, например, характеристики связывания. В некоторых вариантах осуществления TCR может быть получен от одного из различных видов животных, таких как человек, мышь, крыса или другое млекопитающее. TCR может быть связан с клеткой или находиться в растворимой форме. В некоторых вариантах осуществления для целей предложенных способов TCR находится в связанной с клеткой форме, экспрессируемой на поверхности клетки.
В некоторых вариантах осуществления TCR представляет собой полноразмерный TCR. В некоторых вариантах осуществления TCR представляет собой антигенсвязывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления TCR представляет собой димерный TCR (дTCR). В некоторых вариантах осуществления TCR представляет собой одноцепочечный TCR (оцTCR). В некоторых вариантах осуществления дTCR или оцTCR имеют структуры, описанные в WO 03/020763, WO 04/033685, WO 2011/044186.
В некоторых вариантах осуществления TCR содержит последовательность, соответствующую трансмембранной последовательности. В некоторых вариантах осуществления TCR не содержит последовательность, соответствующую цитоплазматической последовательности. В некоторых вариантах осуществления TCR способен к образованию комплекса TCR с CD3. В некоторых вариантах осуществления любой из TCR, включая дTCR или оцTCR, может быть связан с сигнальными доменами, результатом чего является активный TCR на поверхности T-клетки. В некоторых вариантах осуществления TCR экспрессируется на поверхности клеток.
В некоторых вариантах осуществления дTCR содержит первый полипептид, в котором последовательность, соответствующая последовательности вариабельной области α-цепи TCR, слита с N-концом последовательности, соответствующей внеклеточной последовательности константной области α-цепи TCR, и второй полипептид, в котором последовательность, соответствующая последовательности вариабельной области β-цепи TCR, слита с N-концом последовательности, соответствующей внеклеточной последовательности константной области β-цепи TCR, при этом первый и второй полипептиды связаны дисульфидной связью. В некоторых вариантах осуществления связь может соответствовать естественной межцепочечной дисульфидной связи, имеющейся в естественном димерном αβ TCR. В некоторых вариантах осуществления межцепочечные дисульфидные связи отсутствуют в естественном TCR. Например, в некоторых вариантах осуществления один или более остатков цистеина могут быть включены во внеклеточные последовательности константной области пары полипептидов дTCR. В некоторых случаях может быть желательной как естественная, так и не естественная, дисульфидная связь. В некоторых вариантах осуществления TCR содержит трансмембранную последовательность для закрепления в мембране.
В некоторых вариантах осуществления дTCR содержит α-цепь TCR, содержащую вариабельный α-домен, константный α-домен и первый мотив димеризации, связанный с C-концом константного α-домена, и β-цепь TCR, содержащую вариабельный β-домен, константный β-домен и второй мотив димеризации, связанный с C-концом константного β-домена, при этом первый и второй мотивы димеризации с легкостью взаимодействуют, с образованием ковалентной связи между аминокислотой в первом мотиве димеризации и аминокислотой во втором мотиве димеризации, соединяя вместе α-цепь TCR и β-цепь TCR.
et al.
et al.
et al.
В некоторых вариантах осуществления TCR представляет собой оцTCR. Как правило, оцTCR может быть получен с использованием способов, известных специалистам в данной области, смотри, например, Soo Hoo, W. F.  PNAS (USA) 89, 4759 (1992); Wülfing, C. and Plückthun, A., J. Mol. Biol. 242, 655 (1994); Kurucz, I.  PNAS (USA) 90 3830 (1993); международные опубликованные PCT заявки №№ WO 96/13593, WO 96/18105, WO99/60120, WO99/18129, WO 03/020763, WO2011/044186; а также Schlueter, C. J.  J. Mol. Biol. 256, 859 (1996). В некоторых вариантах осуществления оцTCR содержит введенную не естественную дисульфидную межцепочечную связь для облегчения связывания цепей TCR (смотри, например, международную опубликованную PCT заявку № WO 03/020763). В некоторых вариантах осуществления оцTCR представляет собой не связанный дисульфидной связью укороченный TCR, в котором гетерологичные лейциновые «застежки», слитые с его C-концами, обеспечивают связывание цепей (смотри, например, международную опубликованную PCT заявку № WO99/60120). В некоторых вариантах осуществления оцTCR содержит вариабельный домен α-цепи TCR, ковалентно связанный с вариабельным доменом β-цепи TCR через пептидный линкер (смотри, например, международную опубликованную PCT заявку № WO99/18129).
В некоторых вариантах осуществления оцTCR содержит первый сегмент, состоящий из аминокислотной последовательности, соответствующей вариабельной области α-цепи TCR, второй сегмент, состоящий из аминокислотной последовательности, соответствующей вариабельной области β-цепи TCR, слитый с N-концом аминокислотной последовательности, соответствующей внеклеточной последовательности константного домена β-цепи TCR, и последовательность линкера, связывающую C-конец первого сегмента с N-концом второго сегмента.
В некоторых вариантах осуществления оцTCR содержит первый сегмент, состоящий из последовательности вариабельной области α-цепи, слитой с N-концом внеклеточной последовательности константного домена α-цепи, и второй сегмент, состоящий из последовательности вариабельной области β-цепи, слитой с N-концом внеклеточной константной и трансмембранной последовательности β-цепи, и, необязательно, последовательность линкера, связывающую C-конец первого сегмента с N-концом второго сегмента.
В некоторых вариантах осуществления оцTCR содержит первый сегмент, состоящий из последовательности вариабельной области β-цепи TCR, слитой с N-концом внеклеточной последовательности константного домена β-цепи, и второй сегмент, состоящий из последовательности вариабельной области α-цепи, слитой с N-концом внеклеточной константной и трансмембранной последовательности α-цепи, и, необязательно, последовательность линкера, связывающую C-конец первого сегмента с N-концом второго сегмента.
В некоторых вариантах осуществления линкер оцTCR, который связывает первый и второй сегменты TCR, может представлять собой любой линкер, способный к образованию одной полипептидной цепи, с сохранением при этом специфичности связывания TCR. В некоторых вариантах осуществления последовательность линкера может, например, иметь формулу -P-AA-P-, где P представляет собой пролин и AA представляет собой аминокислотную последовательность, в которой аминокислоты представляют собой глицин и серин. В некоторых вариантах осуществления первый и второй сегменты образуют пару, так что их последовательности вариабельных областей ориентированы для такого связывания. Таким образом, в некоторых случаях линкер имеет достаточную длину для создания пространства между C-концом первого сегмента и N-концом второго сегмента, или наоборот, но он является не слишком длинным для блокирования уменьшения связывания оцTCR с лигандом-мишенью. В некоторых вариантах осуществления линкер может содержать от, или от примерно, 10 до 45 аминокислот, например, 10-30 аминокислот или 26-41 аминокислотных остатков, например, 29, 30, 31 или 32 аминокислоты. В некоторых вариантах осуществления линкер имеет формулу -PGGG-(SGGGG)5-P-, где P представляет собой пролин, G представляет собой глицин и S представляет собой серин (SEQ ID NO: 23). В некоторых вариантах осуществления линкер имеет последовательность GSADDAKKDAAKKDGKS (SEQ ID NO: 24).
В некоторых вариантах осуществления оцTCR содержит ковалентную дисульфидную связь, соединяющую остаток области константного домена α-цепи иммуноглобулина с остатком области константного домена β-цепи иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления межцепочечная дисульфидная связь в естественном TCR отсутствует. Например, в некоторых вариантах осуществления один или более остатков цистеина могут быть включены во внеклеточные последовательности константных областей первого и второго сегментов полипептида оцTCR. В некоторых случаях может быть желательной как естественная, так и не естественная, дисульфидная связь.
В некоторых вариантах осуществления дTCR или оцTCR, содержащих введенные межцепочечные дисульфидные связи, естественные дисульфидные связи отсутствуют. В некоторых вариантах осуществления один или более естественных остатков цистеина, образующих естественные межцепочечные дисульфидные связи, заменены на другой остаток, например, на серин или аланин. В некоторых вариантах осуществления введенная дисульфидная связь может быть образована за счет мутации остатков, отличных от цистеина, в первом и втором сегментах на цистеин. Иллюстративные не естественные дисульфидные связи TCR описаны в международной опубликованной PCT заявке № WO2006/000830.
-5
-12
В некоторых вариантах осуществления TCR, или его антигенсвязывающий фрагмент, имеет аффинность с равновесной константной связывания для антигена-мишени, составляющей от, или от примерно, 10 до 10 M, включая все промежуточные отдельные значения и диапазоны. В некоторых вариантах осуществления антиген-мишень представляет собой комплекс MHC-пептид или лиганд.
В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота или нуклеиновые кислоты, кодирующие TCR, например, цепи α и β, могут быть амплифицированы ПЦР, клонированы или подвергнуты другим соответствующим процедурам и клонированы, в подходящий экспрессионный вектор или векторы. Экспрессионный вектор может представлять собой любой подходящий рекомбинантный экспрессионный вектор, и может быть использован для трансформации или трансфекции любого подходящего хозяина. Соответствующие векторы включают векторы, предназначенные для размножения или наращивания, или для экспрессии, или и того, и другого, например, плазмиды и вирусы.
В некоторых вариантах осуществления вектор может представлять собой вектор серии pUC (Fermentas Life Sciences), серии pBluescript (Stratagene, LaJolla, Calif.), серии pET (Novagen, Madison, Wis.), серии pGEX (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) или серии pEX (Clontech, Palo Alto, Calif.). В некоторых случаях также можно использовать векторы на основе бактериофагов, такие как λG10, λGT11, λZapII (Stratagene), λEMBL4 и λNM1149. В некоторых вариантах осуществления можно использовать растительные экспрессионные векторы, которые включают pBI01, pBI101.2, pBI101.3, pBI121 и pBIN19 (Clontech). В некоторых вариантах осуществления животные экспрессионные векторы включают pEUK-Cl, pMAM и pMAMneo (Clontech). В некоторых вариантах осуществления используют вирусный вектор, например, ретровирусный вектор.
В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные экспрессионные векторы могут быть получены с использованием стандартных методов рекомбинантных ДНК. В некоторых вариантах осуществления векторы могут содержать регуляторные последовательности, такие как последовательности инициации транскрипции и трансляции, и кодоны терминации, которые специфичны для типа хозяина (например, бактерий, грибов, растений или животных), в которого предстоит вводить вектор, по мере необходимости и с учетом того, является ли вектор ДНК-содержащим или РНК-содержащим вектором. В некоторых вариантах осуществления вектор может содержать неприродный промотор, функционально связанный с нуклеотидной последовательностью, кодирующей TCR или антигенсвязывающий фрагмент (или другую связывающую MHC-пептид молекулу). В некоторых вариантах осуществления промотор может представлять собой невирусный промотор или вирусный промотор, такой как промотор цитомегаловируса (CMV), промотор SV40, промотор RSV и промотор, присутствующий в длинном концевом повторе вируса мышиных стволовых клеток. Также предусмотрены и другие известные промоторы.
В некоторых вариантах осуществления для получения вектора, кодирующего TCR, цепи α и β амплифицируют методом ПЦР из суммарной кДНК, выделенной из T-клеточного клона, экспрессирующего интересующий TCR, и клонируют в экспрессионный вектор. В некоторых вариантах осуществления цепи α и β клонируют в один и тот же вектор. В некоторых вариантах осуществления цепи α и β клонируют в разные векторы. В некоторых вариантах осуществления созданные цепи α и β вводят в ретровирусный, например, лентивирусный, вектор.
B. Нуклеиновые кислоты и векторы
Также предложены один или более полинуклеотидов (например, молекул нуклеиновой кислоты), кодирующих рекомбинантные рецепторы, векторы для генной инженерии клеток для экспрессии рецепторов и способы получения генно-инженерных клеток. В некоторых аспектах рекомбинантный рецептор представляет собой, или содержит, химерный антигенный рецептор (CAR). В некоторых аспектах рекомбинантный рецептор представляет собой, или содержит, T-клеточный рецептор (TCR), например, трансгенный TCR.
В некоторых случаях нуклеотидная последовательность, кодирующая рекомбинантный рецептор, например, химерный антигенный рецептор (CAR), содержит сигнальную последовательность, которая кодирует сигнальный пептид. Неограничивающие иллюстративные примеры сигнальных пептидов включают, например, сигнальный пептид альфа-цепи GMCSFR с последовательностью SEQ ID NO: 26, кодируемый нуклеотидной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 25, или сигнальный пептид альфа-цепи CD8 с последовательностью SEQ ID NO: 18.
В некоторых случаях, когда молекулы нуклеиновой кислоты кодируют две или более разных полипептидных цепей, каждая из полипептидных цепей может быть кодирована отдельной молекулой нуклеиновой кислоты. Например, предложены две отдельные нуклеиновые кислоты, и каждая может быть индивидуально перенесена или введена в клетку для экспрессии в клетке.
Genetic Vaccines and Ther.
et al.
Traffic
В некоторых вариантах осуществления, таких как те, в которых полинуклеотид содержит первую и вторую нуклеотидные последовательности, кодирующие последовательности, кодирующие каждую из разных полипептидных цепей, могут быть функционально связаны с промоторами, которые могут быть одинаковыми или разными. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты может содержать промотор, управляющий экспрессией двух или более разных полипептидных цепей. В некоторых вариантах осуществления такие молекулы нуклеиновой кислоты могут быть мультицистронными (бицистронными или трицистронными, смотри, например, патент США № 6060273). В некоторых вариантах осуществления единицы транскрипции могут быть сконструированы в виде бицистронной единицы, содержащей IRES (внутренний участок связывания рибосомы), который делает возможной совместную экспрессию генных продуктов с матрицы с одним промотором. Альтернативно, в некоторых случаях один промотор может управлять экспрессией РНК, которая содержит в одной открытой рамке считывания (ORF) два или три гена, отделенные друг от друга последовательностями, кодирующими саморасщепляемый пептид (например, последовательностями 2A) или сайт узнавания протеазы (например, фурина). Таким образом, ORF кодирует один полипептид, который, либо в процессе (в случае 2A), либо после трансляции, разделяется на отдельные белки. В некоторых случаях пептид, такой как T2A, может вызывать пропуск рибосомой (проскок рибосомы) синтеза пептидной связи на C-конце элемента 2A, что приводит к разделению между концом последовательности 2A и следующим далее по ходу транскрипции пептидом (смотри, например, de Felipe.  2:13 (2004) и de Felipe  5:616-626 (2004)). Известны различные элементы 2A. Примеры последовательностей 2A, которые могут быть использованы в способах и системах, раскрытых в настоящем документе, включают, без ограничения, последовательности 2A из вируса ящура (F2A, например, SEQ ID NO: 22), вируса ринита A лошадей (E2A, например, SEQ ID NO: 21), вируса Thosea asigna (T2A, например, SEQ ID NO: 6 или 17) и тешовируса-1 свиней (P2A, например, SEQ ID NO: 19 или 20), как описано в публикации патента США № 20070116690.

et al.,
В некоторых вариантах осуществления можно, в определенных случаях, использовать внешние маркерные гены в сочетании с терапевтическими сконструированными клетками для создания возможности обнаружения или селекции клеток и в некоторых случаях также для стимуляции самоуничтожения клеток. Иллюстративные суррогатные маркеры могут включать укороченные формы полипептидов клеточной поверхности, например, укороченные формы, которые являются нефункциональными и не передают, или не способны передавать, сигнал, или сигнал, обычно передаваемый полноразмерной формой полипептида клеточной поверхности, и/или не подвергаются, или не способны подвергаться, интернализации. Иллюстративные укороченные полипептиды клеточной поверхности включают укороченные формы рецепторов факторов роста или других рецепторов, такие как укороченный рецептор 2 человеческого эпидермального фактора роста (tHER2), укороченный рецептор эпидермального фактора роста (tEGFR, иллюстративная последовательность tEGFR приведена в SEQ ID NO: 7 или 16) или простатический специфический мембранный антиген (PSMA), или его модифицированная форма. tEGFR может содержать эпитоп, узнаваемый антителом цетуксимабом (эрбитукс) или другим терапевтическим анти-EGFR антителом, или связывающей молекулой, которые могут быть использованы для идентификации или селекции клеток, которые были сконструированы конструктом tEGFR и кодируемым экзогенным белком, и/или для элиминации или отделения клеток, экспрессирующих кодируемый экзогенный белок. Смотри патент США № 8802374 и публикацию Liu  Nature Biotech. 2016 April; 34(4): 430-434). В некоторых аспектах маркер, например, суррогатный маркер, содержит весь или часть (например, укороченную форму) CD34, NGFR, CD19 или укороченный CD19, например, укороченный не принадлежащий человеку CD19, или рецептор эпидермального фактора роста (например, tEGFR).
E. coli
В некоторых вариантах осуществления маркер представляет собой, или содержит, флуоресцентный белок, например, зеленый флуоресцентный белок (GFP), усиленный зеленый флуоресцентный белок (EGFP), такой как суперсворачиваемый GFP (sfGFP), красный флуоресцентный белок (RFP), такой как tdTomato, mCherry, mStrawberry, AsRed2, DsRed или DsRed2, голубой флуоресцентный белок (CFP), сине-зеленый флуоресцентный белок (BFP), усиленный синий флуоресцентный белок (EBFP) и желтый флуоресцентный белок (YFP), а также их варианты, включая видовые варианты, мономерные варианты и кодон-оптимизированные и/или усиленные варианты флуоресцентных белков. В некоторых вариантах осуществления маркер представляет собой, или содержит, фермент, такой как люцифераза, ген lacZ из , щелочная фосфатаза, секретируемая эмбриональная щелочная фосфатаза (SEAP), хлорамфеникол-ацетилтрансфераза (CAT). Иллюстративные светоизлучающие репортерные белки включают люциферазу (luc), β-галактозидазу, хлорамфеникол-ацетилтрансферазу (CAT), β-глюкуронидазу (GUS) или их варианты.
В некоторых вариантах осуществления маркер представляет собой селективный маркер. В некоторых вариантах осуществления селективный маркер представляет собой, или содержит, полипептид, придающий устойчивость к экзогенным средствам или лекарственным средствам. В некоторых вариантах осуществления селективный маркер представляет собой ген устойчивости к антибиотику. В некоторых вариантах осуществления селективный маркер, представляющий собой ген устойчивости к антибиотику, придает устойчивость к антибиотику клетке млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления селективный маркер представляет собой, или содержит, ген устойчивости к пуромицину, ген устойчивости к гигромицину, ген устойчивости к бластицидину, ген устойчивости к неомицину, ген устойчивости к генетицину или ген устойчивости к зеоцину, или его модифицированную форму.
et al.,

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая маркер, функционально связана с полинуклеотидом, кодирующим последовательность линкера, например, последовательность расщепляемого линкера, например, T2A. Например, маркер и, необязательно, последовательность линкера, могут быть любыми из тех, которые описаны в PCT публикации № WO2014031687. Например, маркер может представлять собой укороченный EGFR (tEGFR), который, необязательно, связан с последовательностью линкера, такой как последовательность расщепляемого линкера T2A. Иллюстративный полипептид укороченного EGFR (например,tEGFR) содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 7 или 16, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, или более, идентичности последовательности с SEQ ID NO: 7 или 16. В некоторых примерах укороченный рецептор эпидермального фактора роста (EGFRt), например, с последовательностью SEQ ID NO: 7 или 16, в некоторых случаях может быть совместно экспрессирован с интересующим трансгеном (CAR или TCR) в трансдуцированных клетках (смотри, например, патент США № 8802374). EGFRt может содержать эпитоп, узнаваемый антителом цетуксимабом (эрбитукс) или другим терапевтическим анти-EGFR антителом, или связывающей молекулой, которые можно использовать для идентификации или селекции клеток, которые были сконструированы конструктом EGFRt и другим рекомбинантным рецептором, таким как химерный антигенный рецептор (CAR), и/или для элиминации или селекции клеток, экспрессирующих рецептор. Смотри патент США № 8802374 и публикацию Liu  Nature Biotech. 2016 April; 34(4): 430-434).
Также предложены векторы или конструкты, содержащие такие нуклеиновые кислоты и/или полинуклеотиды. В некоторых вариантах осуществления векторы или конструкты содержат один или более промоторов, функционально связанных с нуклеиновой кислотой, кодирующей рекомбинантный рецептор, для управления ее экспрессией. В некоторых вариантах осуществления промотор функционально связан с одной, или более чем одной, молекулами нуклеиновой кислоты, или полинуклеотидами. Таким образом, также предложены векторы, такие как те, которые содержат любой из полинуклеотидов, предложенных в настоящем документе.
В некоторых случаях вектор представляет собой вирусный вектор, такой как ретровирусный вектор, например, лентивирусный вектор или гамма-ретровирусный вектор. Также предложены композиции, содержащие такие векторы, или сочетание векторов. В некоторых вариантах осуществления набор, или сочетание, векторов используют совместно для конструирования клеток. В некоторых вариантах осуществления первый и второй векторы в наборе вводят одновременно или последовательно, в любом порядке в клетку для конструирования.
В некоторых вариантах осуществления векторы включают вирусные векторы, например, ретровирусный или лентивирусный, невирусные векторы или транспозоны, например, систему транспозонов «спящая красавица», векторы, полученные из обезьяньего вируса 40 (SV40), аденовирусов, аденоассоциированного вируса (AAV), лентивирусные векторы или ретровирусные векторы, такие как гамма-ретровирусные векторы, ретровирусный вектор, полученный из вируса мышиного лейкоза Молони (MoMLV), вируса миелопролиферативной саркомы (MPSV), вируса мышиных эмбриональных стволовых клеток (MESV), вируса мышиных стволовых клеток (MSCV), вируса некроза селезенки (SFFV) или аденоассоциированного вируса (AAV).
C. Векторы и способы генной инженерии
Хорошо известны различные методы введения генно-инженерных компонентов, например, рекомбинантных рецепторов, например, CAR или TCR. Иллюстративные методы включают методы переноса нуклеиновых кислот, кодирующих рецепторы, с использованием вирусной, например, ретровирусной или лентивирусной, трансдукции, транспозонов и электропорации. В некоторых вариантах осуществления экспрессию поверхностного гликана оценивают в композиции клеток, которые были собраны до, в течение, или сразу после процесса инженерии. В некоторых вариантах осуществления экспрессию поверхностного гликана оценивают и сравнивают между композициями клеток на соответствующих стадиях процесса введения генно-инженерных компонентов. В некоторых вариантах осуществления композиции конструируют или конструировали для экспрессии того же рекомбинантного рецептора, но разными методами введения генетического материала.
В некоторых вариантах осуществления перенос генов осуществляют, сначала стимулируя клетку, например, путем объединения ее со стимулом, индуцирующим такой ответ, как пролиферация, выживание и/или активация, например, измеряемый на основе экспрессии цитокина или маркера активации, с последующей трансдукцией активированных клеток и размножением их в культуре до количеств, достаточных для клинического применения.
et al.
et al.
Exp Hematol
,
et al.
Mol Ther Nucl Acids,
et al.,
Trends Biotechnol.
В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные нуклеиновые кислоты переносят в клетки с использованием рекомбинантных инфекционных вирусных частиц, таких как, например, векторы, полученные из обезьяньего вируса 40 (SV40), аденовирусов, аденоассоциированного вируса (AAV). В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные нуклеиновые кислоты переносят в T-клетки с использованием рекомбинантных лентивирусных векторов или ретровирусных векторов, таких как гамма-ретровирусные векторы (смотри, например, Koste  Gene Therapy doi: 10,1038/gt.2014.25 (2014); Carlens . 28(10): 1137-46 (2000); Alonso-Camino  2, e93 (2013); Park , November 29(11): 550-557 (2011). В некоторых вариантах осуществления вирус представляет собой аденоассоциированный вирус (AAV).
BioTechniques
Human Gene Therapy
et al. Virology
et al.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
Cur. Opin. Genet. Develop
В некоторых вариантах осуществления ретровирусный вектор содержит последовательность длинного концевого повтора (LTR), например, ретровирусный вектор, полученный из вируса мышиного лейкоза Молони (MoMLV), вируса миелопролиферативной саркомы (MPSV), вируса мышиных эмбриональных стволовых клеток (MESV), вируса мышиных стволовых клеток (MSCV), вируса некроза селезенки (SFFV). Большинство ретровирусных векторов получены из мышиных ретровирусов. В некоторых вариантах осуществления ретровирусы включают те, которые получены из клеток любых птиц или млекопитающих. Ретровирусы, как правило, являются амфотропными, это означает, что они способны инфицировать клетки-хозяева нескольких видов, включая человека. В одном варианте осуществления ген, который будет экспрессироваться, заменяет последовательности ретровирусных генов gag, pol и/или env. Были описаны различные иллюстративные ретровирусные системы (смотри, например, патенты США №№ 5219740; 6207453; 5219740; Miller and Rosman, , 7:980-990 (1989); Miller, A. D. , 1:5-14 (1990); Scarpa , 180:849-852 (1991); Burns  90:8033-8037 (1993); и Boris-Lawrie and Temin, ., 3:102-109 (1993).
et al.,
J. Immunother.,
et al.
Blood
et al.,
Methods Mol Biol
et al.,
Методы лентивирусной трансдукции известны. Иллюстративные методы описаны, например, в публикациях Wang  35(9): 689-701 (2012); Cooper . 101:1637-1644 (2003); Verhoeyen ., 506: 97-114 (2009); и Cavalieri  Blood., 102(2): 497-505 (2003).
et al,
PLoS ONE
et al.
Gene Therapy
et al. Hum Gene Ther
et al.
Molec Ther Nucl Acids
et al.
Methods Mol Biol
Nature
et al.,
Mol. Cell Biol.,
В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные нуклеиновые кислоты переносят в T-клетки методом электропорации (смотри, например, Chicaybam 8(3): e60298 (2013) и Van Tedeloo 7(16): 1431-1437 (2000)). В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные нуклеиновые кислоты переносят в T-клетки методом транспозиции (смотри, например, Manuri 21(4): 427-437 (2010); Sharma 2, e74 (2013); и Huang  506: 115-126 (2009)). Другие методы введения и экспрессии генетического материала в иммунных клетках включают трансфекцию с фосфатом кальция (например, как описано в Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York. N.Y.), слияние протопластов, опосредованную катионными липосомами трансфекцию; бомбардировку микрочастицами вольфрама (Johnston, , 346: 776-777 (1990)); и совместное осаждение ДНК с фосфатом стронция (Brash  7: 2031-2034 (1987)).
Другие подходы и векторы для переноса нуклеиновых кислот, кодирующих рекомбинантные продукты, описаны, например, в публикации международной патентной заявки № WO2014055668 и патенте США № 7446190.
de novo
et al,
Methods Mol Biol
et al.,
Chimeric Antigen Receptor Therapy for Cancer Annual Review of Medicine,
В некоторых вариантах осуществления клетки, например, T-клетки, могут быть трансфицированы либо в процессе, либо после размножения, например, T-клеточным рецептором (TCR) или химерным антигенным рецептором (CAR). Эту трансфекцию для введения гена желаемого рецептора можно выполнять, например, с использованием любого подходящего ретровирусного вектора. Затем популяцию генетически модифицированных клеток можно освобождать от начального стимула (стимула CD3/CD28, например), с последующей стимуляцией стимулом второго типа, например, через  введенный рецептор). Этот стимул второго типа может включать антигенный стимул в форме молекулы пептид/MHC, когнатного (перекрестно связывающегося) лиганда генетически введенного рецептора (например, естественного лиганда CAR) или любого лиганда (такого как антитело), который непосредственно связывается в пределах каркаса нового рецептора (например, за счет узнавания константных областей в рецепторе). Смотри, например, Cheadle . 907:645-66 (2012); или Barrett Vol. 65: 333-347 (2014).
В некоторых случаях можно использовать вектор, который не нуждается в том, чтобы клетки, например, T-клетки, были активированными. В некоторых таких случаях клетки могут быть отобраны и/или трансдуцированы до активации. Таким образом, клетки могут быть сконструированы до или после культивирования клеток, и в некоторых случаях одновременно, или в течение по меньшей мере части процесса культивирования.
in vivo
in vivo
et al.,
Mol. and Cell Biol.,
et al.,
Human Gene Therapy
et al.
et al.,
В некоторых аспектах клетки дополнительно подвергают инженерии для стимуляции экспрессии цитокинов или других факторов. В число дополнительных нуклеиновых кислот, например, генов для введения, входят те, которые повышают эффективность терапии, например, за счет стимуляции жизнеспособности и/или функции клеток, в которые их переносят; гены маркера для селекции и/или оценки клеток, например, для оценки выживания или локализации ; гены для повышения безопасности, например, позволяющие проводить отрицательную селекцию клеток , как описано в публикациях Lupton S. D.  11:6 (1991); и Riddell  3:319-338 (1992); смотри также публикации PCT/US91/08442 и PCT/US94/05601 авторов Lupton , в которых описано применение бифункциональных селективных слитых генов, полученных в результате слияния доминантно положительного селективного маркера с отрицательным селективным маркером. Смотри, например, Riddell  патент США № 6040177 в колонках 14-17.
D. Признаки произведенной композиции
В конкретных вариантах осуществления способы, предложенные в настоящем документе, позволяют получать или создавать композицию клеток, содержащую генно-инженерные клетки, например, произведенную композицию. В конкретных вариантах осуществления произведенная композиция представляет собой композицию клеток, которую получают с использованием некоторых, или всех стадий для получения генно-инженерных клеток. В конкретных вариантах осуществления произведенную композицию получают способом получения генно-инженерных клеток из исходной клеточной композиции. В конкретных вариантах осуществления способ включает один или более этапов активации, трансдукции или трансфекции, размножения и/или сбора клеток, таких как клетки, которые были получены из исходной клеточной композиции. В конкретных вариантах осуществления произведенная клеточная композиция содержит клетки, которые были подвергнуты генной инженерии. В конкретных вариантах осуществления клетки произведенной композиции были проведены через все стадии способа генной инженерии.
В некоторых вариантах осуществления произведенная композиция содержит клетки, содержащие одну или более нуклеиновых кислот, введенных методами генной инженерии, и, вследствие этого, экспрессирующие рекомбинантные или генно-инженерные продукты таких нуклеиновых кислот. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновые кислоты являются гетерологичными, то есть, обычно не присутствующими в клетке или образце, полученном из клетки, например, полученными из другого организма или клетки, например, обычно не встречающимися в клетке, которую подвергают инженерии, и/или в организме, из которого получена клетка. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновые кислоты не являются естественными, например, нуклеиновая кислота не встречается в природе, включая нуклеиновую кислоту, содержащую химерные сочетания нуклеиновых кислот, кодирующих разные домены, из клеток нескольких разных типов.
В некоторых вариантах осуществления произведенная композиция содержит клетки, которые были подвергнуты генной инженерии. В конкретных вариантах осуществления произведенная клеточная композиция содержит генно-инженерные T-клетки. В некоторых вариантах осуществления генно-инженерные T-клетки включают генно-инженерные CD4+ T-клетки и генно-инженерные CD8+ T-клетки. В конкретных вариантах осуществления произведенная композиция содержит, или включает, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99%, по меньшей мере 99,5%, по меньшей мере 99,9% или 100%, или примерно 100%, генно-инженерных T-клеток. В конкретных вариантах осуществления генно-инженерные клетки экспрессируют рекомбинантный рецептор. В конкретных вариантах осуществления произведенная композиция содержит, или включает, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99%, по меньшей мере 99,5%, по меньшей мере 99,9% или 100%, или примерно 100% T-клеток, экспрессирующих рекомбинантный рецептор. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный рецептор представляет собой TCR или CAR. В конкретных вариантах осуществления рекомбинантный рецептор представляет собой CAR.
III. Композиции и препараты
В настоящем документе предложены композиции, или препараты, содержащие клетки, полученные способами инкубации (например, стимуляции), описанными в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления композиции и способы, описанные в настоящем документе, можно использовать для элиминации по меньшей мере части популяций клеток, таких как не подобные наивным T-клетки, из популяции клеток. Также предложены композиции, содержащие популяции клеток, которые более не содержат нежелательные клетки, или содержат значительно меньшее количество нежелательных клеток в стимулированной композиции, например, клеток, происходящих от не подобных наивным T-клеток, и варианты их применения. Композиции и способы, предложенные в настоящем документе, также используют для избирательного размножения популяции клеток, из которой были удалены нежелательные субпопуляции, с целью использования в лечении. В настоящем документе также предложена произведенная, или обогащенная, стимулированная композиция, полученная любым из способов стимуляции T-клеток, описанных в настоящем документе.
В некоторых вариантах осуществления клетки, полученные с использованием любых способов инкубации (например, стимуляции), описанных в настоящем документе, например, клетки, полученные генной инженерией с рекомбинантным рецептором (например, CAR-T-клетки), предложены в виде композиций, включая фармацевтические композиции и препараты, такие как композиции стандартной лекарственной формы, содержащие клетки для введения в конкретной дозе или ее части. Фармацевтические композиции и препараты, как правило, содержат один или более необязательных фармацевтически приемлемых носителей или эксципиентов. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое средство.
В некоторых вариантах осуществления композицию клеток получают, или производят, для целей клеточной терапии. В некоторых вариантах осуществления клеточная композиция представляет собой фармацевтическую композицию или препарат. Такие композиции могут быть использованы в соответствии с предложенными способами, например, для оценки при их выпуске с целью применения в предотвращении или лечении заболеваний, состояний и нарушений, или в способах обнаружения, диагностики и прогнозирования.
Термин «фармацевтический препарат» означает препарат, находящийся в такой форме, которая обеспечивает эффективную биологическую активность активного ингредиента, содержащегося в препарате, и которая не содержит какие-либо дополнительные компоненты, являющиеся неприемлемо токсичными для субъекта, которому будет введен препарат. В некоторых вариантах осуществления способы, предложенные в настоящем документе, могут быть использованы для сравнения поверхностной экспрессии гликана в клеточных композициях, состоящих из таких же генно-инженерных клеток, но в разных фармацевтических препаратах.
«Фармацевтически приемлемый носитель» означает ингредиент в фармацевтическом препарате, отличный от активного ингредиента, который является нетоксичным для субъекта. Фармацевтически приемлемый носитель включает, но без ограничения, буфер, эксципиент, стабилизатор или консервант. В конкретных вариантах осуществления способы, предложенные в настоящем документе, могут быть использованы для сравнения поверхностной экспрессии гликана в клеточных композициях, состоящих из таких же сконструированных клеток, но с разными фармацевтически приемлемыми носителями.
В некоторых вариантах осуществления T-клеточный терапевтический препарат, такой как сконструированные T-клетки (например, CAR T-клетки), формулируют с фармацевтически приемлемым носителем. В некоторых аспектах выбор носителя частично определяется конкретной клеткой и/или способом введения. Соответственно, существуют различные подходящие препараты. Например, фармацевтическая композиция может содержать консерванты. Подходящие консерванты могут включать, например, метилпарабен, пропилпарабен, бензоат натрия и бензалкония хлорид. В некоторых аспектах используют смесь двух или более консервантов. Консерванты, или их смеси, как правило, присутствуют в количестве от примерно 0,0001% до примерно 2% по массе от общей массы композиции. Носители описаны, например, в сборнике Remington's Pharmaceutical Sciences 16-е издание, Osol, A. Ed. (1980). Фармацевтически приемлемые носители, как правило, являются нетоксичными для реципиентов в используемых дозах и концентрациях, и включают, но без ограничения, буферы, такие как фосфат, цитрат и другие органические кислоты; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как октадецилдиметилбензил аммония хлорид; гексаметэтония хлорид; бензалкония хлорид; бензэтония хлорид; фенол, бутил или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; катехол; резорцинол; циклогексанол; 3-пентанол и м-крезол); низкомолекулярные (менее примерно 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, такие как ЭДТА; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексы металлов (например, комплексы Zn-белок) и/или неионные сурфактанты, такие как полиэтиленгликоль (ПЭГ).
В некоторых аспектах в композиции включают буферные средства. Подходящие буферные средства включают, например, лимонную кислоту, цитрат натрия, фосфорную кислоту, фосфат калия, а также разные другие кислоты и соли. В некоторых аспектах используют смесь двух или более буферных средств. Буферные средства, или их смеси, как правило, присутствуют в количестве от примерно 0,001% до примерно 4% по массе от общей массы композиции. Способы получения вводимых фармацевтических композиций известны. Иллюстративные способы описаны более подробно, например, в сборнике Remington: Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21-е издание (1 мая 2005 г.).
Препараты могут включать водные растворы. Препарат или композиция также может содержать более одного активного ингредиента, полезного для предотвращения конкретного нарушения, заболевания или состояния с помощью клеток, в том числе, один или более активных ингредиентов, активности которых дополняют активность клеток, и/или соответствующие активности не оказывают взаимного негативного влияния. Такие активные ингредиенты предпочтительно присутствуют в сочетании в количествах, которые эффективны для намеченной цели. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция дополнительно содержит другие фармацевтически активные средства или лекарственные средства, такие как химиотерапевтические средства, например, аспарагиназа, бусульфан, карбоплатин, цисплатин, даунорубицин, доксорубицин, фторурацил, гемцитабин, гидроксимочевина, метотрексат, паклитаксел, ритуксимаб, винбластин, винкристин и так далее.
В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит клетки в количествах, эффективных для лечения или предотвращения заболевания или состояния, таких как терапевтически эффективные или профилактически эффективные количества. В некоторых вариантах осуществления терапевтическую или профилактическую эффективность контролируют путем периодической оценки получающих лечение субъектов. В случае повторных введений в течение нескольких дней или более, в зависимости от состояния, лечение повторяют до тех пор, когда достигается желаемое подавление симптомов заболевания. Однако и другие режимы дозирования могут быть полезны и могут быть определены. Нужную дозу можно доставлять путем одиночного болюсного введения композиции, путем нескольких болюсных введений композиции или путем введения композиции непрерывной инфузией.
in vivo
ex vivo
in vitro
Клетки могут быть сформулированы для введения с использованием стандартных методов введения, препаратов и/или устройств. Предложены препараты и устройства, такие как шприцы и флаконы, для хранения и введения композиций. Применительно к клеткам, введение может быть аутологичным или гетерологичным. Например, иммунореактивные клетки или клетки-предшественники могут быть получены от одного субъекта и введены тому же самому субъекту или другому, совместимому, субъекту. Полученные из периферической крови иммунореактивные клетки или их потомство (например, полученное ,  или ) можно вводить локализованной инъекцией, в том числе введением через катетер, системной инъекцией, локализованной инъекцией, внутривенной инъекцией или парентеральным введением. При введении терапевтической композиции (например, фармацевтической композиции, содержащей генетически модифицированные иммунореактивные клетки) она, как правило, будет сформулирована в стандартной инъекционной лекарственной форме (такой как раствор, суспензия, эмульсия).
Препараты включают препараты для перорального, внутривенного, внутрибрюшинного, подкожного, легочного, чрескожного, внутримышечного, интраназального, трансбуккального, подъязычного или суппозиторного введения. В некоторых вариантах осуществления средство или клеточные популяции вводят парентерально. Используемый в настоящем документе термин «парентеральное» введение включает внутривенное, внутримышечное, подкожное, ректальное, вагинальное и внутрибрюшинное введение. В некоторых вариантах осуществления средство или клеточные популяции вводят субъекту с использованием периферической системной доставки путем внутривенной, внутрибрюшинной или подкожной инъекции.
В некоторых вариантах осуществления предложены композиции в виде стерильных жидких препаратов, например, изотонических водных растворов, суспензий, эмульсий, дисперсий или вязких композиций, которые в некоторых аспектах могут быть забуферены до выбранного значения pH. Жидкие препараты, как правило, готовить легче, чем гели, другие вязкие композиции и твердые композиции. Кроме того, жидкие композиции несколько удобнее для введения, особенно путем инъекции. Вязкие композиции, с другой стороны, могут быть сформулированы в пределах подходящего диапазона вязкости для обеспечения более длительных периодов контакта с конкретными тканями. Жидкие или вязкие композиции могут содержать носители, которые могут представлять собой растворитель или диспесионную среду, содержащие, например, воду, солевой раствор, фосфатно-солевой буфер, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль, жидкий полиэтиленгликоль), а также их соответствующие смеси.
Стерильные инъекционные растворы могут быть получены путем включения клеток в растворитель, например, в виде смеси с соответствующим носителем, разбавителем или эксципиентом, таким как стерильная вода, физиологический солевой раствор, глюкоза, декстроза, или тому подобное. Композиции также могут быть лиофилизированными. Композиции могут содержать вспомогательные вещества, такие как увлажняющие, диспергирующие или эмульгирующие средства (например, метилцеллюлоза), поддерживающие pH буферные средства, гелеобразующие или повышающие вязкость добавки, консерванты, ароматизаторы, красители, и тому подобное, в зависимости от пути введения и желаемого препарата. В некоторых аспектах можно обращаться к стандартным руководствам для приготовления соответствующих препаратов.
Можно добавлять различные добавки, повышающие стабильность и стерильность композиций, включая противомикробные консерванты, антиоксиданты, хелатирующие агенты и буферы. Предотвращение действия микроорганизмов можно обеспечивать за счет различных антибактериальных и противогрибковых средств, например, парабенов, хлорбутанола, фенола, сорбиновой кислоты и тому подобного. Пролонгированной абсорбции инъекционной фармацевтической формы можно добиваться за счет использования средств, замедляющих абсорбцию, например, моностеарата алюминия и желатина.
in vivo
Препараты, используемые для  введения, как правило, являются стерильными. Стерильности можно добиваться, например, путем фильтрования через мембраны для стерилизации фильтрованием.
Для предотвращения или лечения заболевания соответствующая доза может зависеть от типа заболевания, которое предстоит лечить, типа средства или средств, типа клеток или рекомбинантных рецепторов, степени тяжести и течения заболевания, от того, вводят ли средство или клетки с профилактической или терапевтической целью, от предыдущей терапии, клинической истории субъекта и его ответа на средство или клетки, а также от решения лечащего врача. В некоторых вариантах осуществления композиции предпочтительно вводят субъекту однократно или в серии процедур.
Также предложены способы использования и варианты применения клеток и композиций, таких как те, которые присутствуют в произведенной композиции, описанной в настоящем документе, в лечении заболеваний, состояний и нарушений, при которых экспрессируется антиген, узнаваемый рекомбинантным рецептором (например, CAR). В настоящем документе также предложены способы лечения, включающие введение субъекту произведенной, или обогащенной произведенной, композиции, полученной любым описанным способом инкубации (например, стимуляции). В некоторых вариантах осуществления способ включает получение генно-инженерных T-клеток с использованием любых способов, описанных в настоящем документе, и введение генно-инженерных T-клеток, полученных способами, описанными в настоящем документе.
Предложены способы введения сконструированных клеток и композиций, а также применения таких сконструированных клеток и композиций для лечения или предотвращения заболеваний, состояний и нарушений, включая рак. В некоторых вариантах осуществления клеточная терапия представляет собой, или включает, введение клеток, таких как иммунные клетки, например, T-клетки, которые направлены на молекулу, экспрессируемую на поверхности лезии, такой как опухоль или рак. Предложенные способы и варианты применения включают способы и варианты применения для адоптивной клеточной терапии. В некоторых вариантах осуществления способы включают введение сконструированных клеток, или композиции, содержащей клетки, такие как клетки из описанной произведенной композиции, в ткань или клетку субъекта, такого как страдающий от, или имеющий риск развития, или предположительно страдающий от, заболевания, состояния или нарушения. В некоторых вариантах осуществления клетки, популяции и композиции вводят субъекту, имеющему конкретное заболевание или состояние, которое предстоит лечить, например, методом адоптивной клеточной терапии, такой как адоптивная T-клеточная терапия. В некоторых вариантах осуществления клетки или композиции вводят субъекту, такому как субъект, страдающий от, или имеющий риск развития, заболевания или состояния, для облегчения одного или более симптомов заболевания или состояния, например, для уменьшения опухолевой нагрузки при форме рака, при которой экспрессируется антиген, узнаваемый сконструированными T-клетками.
В некоторых аспектах заболевание или состояние, которое подвергают лечению, может быть любым из тех, при которых экспрессия антигена связана с, характерна для заболевания, и/или происходит на клетке или ткани, связанной с заболеванием, нарушением или состоянием, и/или вовлечена в этиологию заболевания, состояния или нарушения, например, вызывает, усугубляет или иным образом участвует в таком заболевании, состоянии или нарушении. Иллюстративные заболевания и состояния могут включать заболевания или состояния, связанные со злокачественностью или трансформацией клеток (например, рак), аутоиммунное или воспалительное заболевание, или инфекционное заболевание, например, вызываемое бактериальным, вирусным или иным патогеном. Иллюстративные антигены, включающие антигены, ассоциированные с различными заболеваниями и состояниями, которые могут быть подвергнуты лечению, описаны выше. В конкретных вариантах осуществления иммуномодулирующий полипептид и/или рекомбинантный рецептор, например, химерный антигенный рецептор или TCR, специфически связывает антиген, ассоциированный с заболеванием или состоянием. В некоторых вариантах осуществления субъект имеет заболевание, нарушение или состояние, необязательно, рак, опухоль, аутоиммунное заболевание, нарушение или состояние, или инфекционное заболевание.
В некоторых вариантах осуществления заболевание, нарушение или состояние включает опухоли, ассоциированные с разными формами рака. В некоторых вариантах осуществления рак может представлять собой любую форму рака в организме субъекта, например, но без ограничения, рак, поражающий голову и шею, молочную железу, печень, толстую кишку, яичник, предстательную железу, поджелудочную железу, головной мозг, шейку матки, кости, кожу, глаза, мочевой пузырь, желудок, пищевод, брюшину или легкие. Например, можно использовать противораковое средство для лечения рака толстого кишечника, рака шейки матки, рака центральной нервной системы, рака молочной железы, рака мочевого пузыря, анальной карциномы, рака головы и шеи, рака яичника, рака эндометрия, мелкоклеточного рака легкого, немелкоклеточной карциномы легкого, нейроэндокринного рака, карциномы мягких тканей, рака полового члена, рака предстательной железы, рака поджелудочной железы, рака желудка, рака желчного пузыря или рака пищевода. В некоторых случаях рак может представлять собой рак крови. В некоторых вариантах осуществления заболевание, нарушение или состояние представляет собой опухоль, такую как солидная опухоль, лимфома, лейкоз, опухоль кроветворных органов, метастатическая опухоль, или рак или опухоль другого типа. В некоторых вариантах осуществления заболевание, нарушение или состояние выбирают из рака толстой кишки, легкого, печени, молочной железы, предстательной железы, яичников, кожи, меланомы, кости, рака головного мозга, рака яичника, эпителиальных форм рака, почечноклеточного рака, аденокарциномы поджелудочной железы, карциномы шейки матки, колоректального рака, глиобластомы, нейробластомы, саркомы Юинга, медуллобластомы, остеосаркомы, синовиальной саркомы и/или мезотелиомы.
В число заболеваний, состояний и нарушений входят опухоли, включая солидные опухоли, злокачественные новообразования крови и меланомы, и включая локализованные и метастатические опухоли, инфекционные заболевания, такие как инфекция, вызываемая вирусом или другим патогеном, например, HIV, HCV, HBV, CMV, HPV, паразитарные заболевания, а также аутоиммунные и воспалительные заболевания. В некоторых вариантах осуществления заболевание, нарушение или состояние представляет собой опухоль, рак, злокачественное новообразование или другое пролиферативное заболевание или нарушение. Такие заболевания включают, но не ограничиваются ими, лейкоз, лимфому, например, острый миелоидный (или миелогенный) лейкоз (AML), хронический миелоидный (или миелогенный) лейкоз (CML), острый лимфоцитарный (или лимфобластный) лейкоз (ALL), хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), волосатоклеточный лейкоз (HCL), мелколимфоцитарную лимфому (SLL), лимфому из клеток мантийной зоны (MCL), лимфому из клеток маргинальной зоны, лимфому Беркитта, лимфому Ходжкина (HL), неходжкинскую лимфому (NHL), анапластическую крупноклеточную лимфому (ALCL), фолликулярную лимфому, рефрактерную фолликулярную лимфому, диффузную крупноклеточную B-клеточную лимфому (DLBCL) и множественную миелому (MM); B-клеточное злокачественное новообразование выбирают из острого лимфобластного лейкоза (ALL), ALL взрослых, хронического лимфобластного лейкоза (CLL), неходжкинской лимфомы (NHL) и диффузной крупноклеточной B-клеточной лимфомы (DLBCL).
В некоторых вариантах осуществления заболевание или состояние представляет собой инфекционное заболевание или состояние, такое как, но без ограничения, вирусная, ретровирусная, бактериальная и вызываемая простейшими инфекция, иммунодефицит, инфекция, вызываемая цитомегаловирусом (CMV), вирусом Эпштейна-Барр (EBV), аденовирусом, BK полиомавирусом. В некоторых вариантах осуществления заболевание или состояние представляет собой аутоиммунное или воспалительное заболевание или состояние, такое как артрит, например, ревматоидный артрит (RA), диабет I типа, системная красная волчанка (SLE), воспалительное заболевание кишечника, псориаз, склеродермия, аутоиммунное заболевание щитовидной железы, болезнь Грэйвса, болезнь Крона, рассеянный склероз, астма и/или заболевание или состояние, связанное с получением трансплантата.
В некоторых вариантах осуществления антиген, ассоциированный с заболеванием или нарушением, выбирают из группы, состоящей из тирозинкиназного рецептора-сироты ROR1, антигена созревания В-клеток (BCMA), карбоангидразы 9 (CAIX), tEGFR, Her2/neu (рецептора тирозинкиназы erbB2), L1-CAM, CD19, CD20, CD22, мезотелина, CEA, поверхностного антигена вируса гепатита B, антифолатного рецептора, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, эпителиального гликопротеина 2 (EPG-2), эпителиального гликопротеина 40 (EPG-40), рецептора эфрина A2 (EPHa2), Her2/neu (рецептора тирозинкиназы erb-B2), Her3 (erb-B3), Her4 (erb-B4), димеров erbB, мутантного рецептора эпидермального фактора роста III типа (EGFR vIII), фолат-связывающего белка (FBP), FCRL5, подобного Fc-рецептору белка 5 (FCRL5; также известного как гомолог Fc-рецептора 5 или FCRH5), эмбрионального ацетилхолинового рецептора, ганглиозида GD2, ганглиозида GD3, связанного с G-белками рецептора 5D (GPCR5D), HMW-MAA, IL-22R-альфа, IL-13R-альфа 2, рецептора домена киназной вставки (kdr), легкой цепи каппа, представителя A семейства 8 белков, содержащих богатые лейцином повторы (LRRC8A), Lewis Y, L1-молекулы клеточной адгезии (L1-CAM), меланома-ассоциированного антигена (MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, предпочтительно экспрессируемого антигена меланомы (PRAME), сурвивина, TAG72, B7-H6, рецептора альфа 2 IL-13 (IL-13Ra2), CA9, GD3, HMW-MAA, CD171, G250/CAIX, человеческого лейкоцитарного антигена A1 (HLA-A1), MAGE A1, HLA-A2, NY-ESO-1, PSCA, фолатного рецептора-α, CD44v6, CD44v7/8, интегрина αvβ6 (интегрина avb6), 8H9, NCAM, рецепторов VEGF, 5T4, эмбрионального AchR, лигандов представителя D группы 2 естественных киллеров (NKG2D), CD44v6, двойного антигена, раково-тестикулярного антигена, мезотелина, мышиного CMV, муцина 1 (MUC1), MUC16, антигена простатических стволовых клеток (PSCA), NKG2D, раково-тестикулярного антигена 1B (CTAG, также известного как NY-ESO-1 и LAGE-2), MART-1, гликопротеина 100 (gp100), онкоэмбрионального антигена, ROR1, трофобластного гликопротеина (TPBG, также известного как 5T4), TAG72, VEGF-R2, карциноэмбрионального антигена (CEA), Her2/neu, рецептора эстрогена, рецептора прогестерона, эфрина B2, CD123, c-Met, GD-2, O-ацетилированного GD2 (OGD2), CE7, антигена опухоли Вильмса 1 (WT-1), циклина, циклина A2, лиганда 1 хемокина с мотивом C-C (CCL-1), CD138, специфического для патогена антигена и антигена, связанного с универсальным маркером, и/или биотинилированных молекул, и/или молекул, экспрессируемых HIV, HCV, HBV или другими патогенами.
В некоторых вариантах осуществления антиген или лиганд представляет собой опухолевый антиген или маркер рака. В некоторых вариантах осуществления антиген или лиганд представляет собой, или включает, интегрин αvβ6 (интегрин avb6), антиген созревания В-клеток (BCMA), B7-H3, B7-H6, карбоангидразу 9 (CA9, также известную как CAIX или G250), раково-тестикулярный антиген, раково-тестикулярный антиген 1B (CTAG, также известный как NY-ESO-1 и LAGE-2), карциноэмбриональный антиген (CEA), циклин, циклин A2, лиганд 1 хемокина с мотивом C-C (CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD133, CD138, CD171, хондроитинсульфат протеогликан 4 (CSPG4), белок эпидермального фактора роста (EGFR), мутантный рецептор эпидермального фактора роста III типа (EGFR vIII), эпителиальный гликопротеин 2 (EPG-2), эпителиальный гликопротеин 40 (EPG-40), эфрин B2, рецептор эфрина A2 (EPHa2), рецептор эстрогена, подобный Fc-рецептору белок 5 (FCRL5; также известный как гомолог Fc-рецептора 5 или FCRH5), эмбриональный ацетилхолиновый рецептор (эмбриональный AchR), фолат-связывающий белок (FBP), фолатный рецептор альфа, ганглиозид GD2, O-ацетилированный GD2 (OGD2), ганглиозид GD3, гликопротеин 100 (gp100), глипикан-3 (GPC3), связанный с G-белками рецептор 5D (GPRC5D), Her2/neu (рецептор тирозинкиназы erbB2), Her3 (erb-B3), Her4 (erb-B4), димеры erbB, человеческий высокомолекулярный антиген, связанный с меланомой (HMW-MAA), поверхностный антиген вируса гепатита B, человеческий лейкоцитарный антиген A1 (HLA-A1), человеческий лейкоцитарный антиген A2 (HLA-A2), рецептор альфа IL-22 (IL-22Rα), рецептор альфа 2 IL-13 (IL-13Rα2), рецептор домена киназной вставки (kdr), легкую цепь каппа, L1-молекулу клеточной адгезии (L1-CAM), CE7 эпитоп L1-CAM, представитель A семейства 8 белков, содержащих богатые лейцином повторы (LRRC8A), Lewis Y, меланома-ассоциированный антиген (MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE-A10, мезотелин (MSLN), c-Met, мышиный цитомегаловирус (CMV), муцин 1 (MUC1), MUC16, лиганды представителя D группы 2 естественных киллеров (NKG2D), мелан A (MART-1), молекулу нейрональной клеточной адгезии (NCAM), онкоэмбриональный антиген, предпочтительно экспрессируемый антиген меланомы (PRAME), рецептор прогестерона, простатический специфический антиген, антиген простатических стволовых клеток (PSCA), простатический специфический мембранный антиген (PSMA), подобный тирозинкиназному рецептору рецептор-сироту 1 (ROR1), сурвивин, трофобластный гликопротеин (TPBG, также известный как 5T4), опухоль-ассоциированный гликопротеин 72 (TAG72), тирозиназа-зависимый белок 1 (TRP1, также известный как TYRP1 или gp75), тирозиназа-зависимый белок 2 (TRP2, также известный как допахром таутомераза, допахром дельта-изомераза или DCT), рецептор фактора роста эндотелия сосудов (VEGFR), рецептор фактора роста эндотелия сосудов 2 (VEGFR2), антиген опухоли Вильмса 1 (WT-1), специфический для патогена или экспрессируемый патогеном антиген, или антиген, связанный с универсальным маркером, и/или биотинилированные молекулы, и/или молекулы, экспрессируемые HIV, HCV, HBV или другими патогенами.
de novo
В некоторых вариантах осуществления заболевание или состояние представляет собой B-клеточное злокачественное новообразование. В некоторых вариантах осуществления B-клеточное злокачественное новообразование представляет собой лейкоз или лимфому. В некоторых аспектах заболевание или состояние представляет собой острый лимфобластный лейкоз (ALL), ALL взрослых, хронический лимфобластный лейкоз (CLL), неходжкинскую лимфому (NHL) или диффузную крупноклеточную B-клеточную лимфому (DLBCL). В некоторых случаях заболевание или состояние представляет собой NHL, такую как, или включая, NHL, которая представляет собой агрессивную NHL, диффузную крупноклеточную B-клеточную лимфому (DLBCL), NOS ( и переродившуюся из медленно растущей), первичную медиастинальную крупноклеточную B-клеточную лимфому (PMBCL), В-крупноклеточную лимфому, богатую Т-клетками/гистиоцитами (TCHRBCL), лимфому Беркитта, лимфому из клеток мантийной зоны (MCL) и/или фолликулярную лимфому (FL), необязательно, фолликулярную лимфому стадии 3B (FL3B). В некоторых аспектах рекомбинантный рецептор, такой как CAR, специфически связывает антиген, ассоциированный с заболеванием или состоянием, или экспрессируемый в клетках, окружающих лезию, связанную с B-клеточным злокачественным новообразованием. В некоторых вариантах осуществления антигены, являющиеся мишенями рецепторов, включают антигены, ассоциированные с B-клеточным злокачественным новообразованием, например, любой из целого ряда известных B-клеточных маркеров. В некоторых вариантах осуществления антиген, являющийся мишенью рецептора, представляет собой CD20, CD19, CD22, ROR1, CD45, CD21, CD5, CD33, Ig-каппа, Ig-лямбда, CD79a, CD79b или CD30.
В некоторых вариантах осуществления заболевание или состояние представляет собой миелому, такую как множественная миелома. В некоторых аспектах рекомбинантный рецептор, такой как CAR, специфически связывает антиген, ассоциированный с заболеванием или состоянием, или экспрессируемый в клетках, окружающих лезию, связанную с множественной миеломой. В некоторых вариантах осуществления антигены, являющиеся мишенями рецепторов, включают антигены, ассоциированные с множественной миеломой, такие как GPRC5d или BCMA.
В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой специфический для патогена или экспрессируемый патогеном антиген. В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой вирусный антиген (такой как вирусный антиген из HIV, HCV, HBV и так далее), бактериальные антигены и/или паразитарные антигены.
В некоторых вариантах осуществления иммунные клетки экспрессируют T-клеточный рецептор (TCR) или другой антигенсвязывающий рецептор. В некоторых вариантах осуществления иммунные клетки экспрессируют рекомбинантный рецептор, такой как трансгенный TCR или химерный антигенный рецептор (CAR). В некоторых вариантах осуществления клетки являются аутологичными для субъекта. В некоторых вариантах осуществления клетки являются аллогенными для субъекта.
et al.
Nat Rev Clin Oncol.
et al.
Nat Biotechnol.
et al.
Biochem Biophys Res Commun
et al.
PLoS ONE
Способы введения сконструированных клеток для адоптивной клеточной терапии известны и могут быть использованы в сочетании с предложенными способами и композициями. Например, методы адоптивной T-клеточной терапии описаны, например, в публикации патентной заявки США № 2003/0170238, авторов Gruenberg ; патенте США № 4690915, выданном Rosenberg; публикации Rosenberg (2011) 8(10):577-85). Смотри, например, Themeli , (2013)  31(10): 928-933; Tsukahara , (2013) 438(1): 84-9; Davila , (2013)  8(4): e61338.
В некоторых вариантах осуществления клеточную терапию, например, адоптивную T-клеточную терапию, осуществляют путем аутологичного переноса, при котором клетки выделяют и/или иным образом получают от субъекта, которому предстоит получать клеточную терапию, или из образца, полученного от такого субъекта. Таким образом, в некоторых аспектах клетки получают от субъекта, например, пациента, который нуждается в лечении, и клетки после выделения и обработки вводят тому же субъекту.
В некоторых вариантах осуществления клеточную терапию, например, адоптивную T-клеточную терапию, осуществляют путем аллогенного переноса, при котором клетки выделяют и/или иным образом получают от субъекта, иного, чем субъект, которому предстоит получать, или который в итоге получает, клеточную терапию, например, первого субъекта. В таких вариантах осуществления клетки затем вводят другому субъекту, например, второму субъекту, относящемуся к тому же биологическому виду. В некоторых вариантах осуществления первый и второй субъекты генетически идентичны. В некоторых вариантах осуществления первый и второй субъекты имеют генетическое сходство. В некоторых вариантах осуществления у второго субъекта экспрессируются молекулы того же класса или супертипа HLA, что и у первого субъекта.
В конкретных вариантах осуществления клетки, или отдельные популяции подтипов клеток, вводят субъекту в диапазоне количеств от примерно одного миллиона до примерно 100 миллиардов клеток, и/или количество клеток в расчете на килограмм массы тела, такое как, например, от 1 миллиона до примерно 50 миллиардов клеток (например, примерно 5 миллионов клеток, примерно 25 миллионов клеток, примерно 500 миллионов клеток, примерно 1 миллиард клеток, примерно 5 миллиардов клеток, примерно 20 миллиардов клеток, примерно 30 миллиардов клеток, примерно 40 миллиардов клеток, или в диапазоне, определяемом любыми двумя из перечисленных значений), например, от примерно 10 миллионов до примерно 100 миллиардов клеток (например, примерно 20 миллионов клеток, примерно 30 миллионов клеток, примерно 40 миллионов клеток, примерно 60 миллионов клеток, примерно 70 миллионов клеток, примерно 80 миллионов клеток, примерно 90 миллионов клеток, примерно 10 миллиардов клеток, примерно 25 миллиардов клеток, примерно 50 миллиардов клеток, примерно 75 миллиардов клеток, примерно 90 миллиардов клеток, или в диапазоне, определяемом любыми двумя из перечисленных значений), и в некоторых случаях от примерно 100 миллионов клеток до примерно 50 миллиардов клеток (например, примерно 120 миллионов клеток, примерно 250 миллионов клеток, примерно 350 миллионов клеток, примерно 450 миллионов клеток, примерно 650 миллионов клеток, примерно 800 миллионов клеток, примерно 900 миллионов клеток, примерно 3 миллиарда клеток, примерно 30 миллиардов клеток, примерно 45 миллиардов клеток) или любое промежуточное значение в данных диапазонах, и/или в расчете на килограмм массы тела. Дозы могут варьироваться в зависимости от характерных особенностей заболевания или нарушения и/или пациента, и/или других видов лечения.
8
8
6
8
6
6
7
7
8
В некоторых вариантах осуществления, например, когда субъект является человеком, доза включает менее примерно 5×10 всех экспрессирующих рекомбинантный рецептор (например, CAR) клеток, T-клеток или мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК). В некоторых вариантах осуществления например, когда субъект является человеком, доза включает менее примерно 1×10 всех экспрессирующих рекомбинантный рецептор (например, CAR) клеток, T-клеток или мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК), например, в диапазоне от примерно 1×10 до 1×10 таких клеток, например, всего 2×10, 5×10, 1×10, 5×10 или 1×10 таких клеток, или в диапазоне между любыми двумя вышеуказанными значениями.
5
8
5
8
5
8
5
7
5
7
5
7
5
6
5
6
5
6
6
8
6
8
6
8
6
7
6
7
6
7
6
6
6
6
6
8
6
8
6
8
6
7
6
7
6
7
6
6
6
8
6
8
6
8
6
7
6
7
6
7
7
8
7
8
7
8
7
7
7
7
7
8
7
8
7
8
7
7
7
8
7
8
7
8
8
8
8
8
8
8
В некоторых вариантах осуществления доза генно-инженерных клеток составляет от, или от примерно, 1×10 до 5×10 суммарных CAR-экспрессирующих T-клеток, от 1×10 до 2,5×10 суммарных CAR-экспрессирующих T-клеток, от 1×10 до 1×10 суммарных CAR-экспрессирующих T-клеток, от 1×10 до 5×10 суммарных CAR-экспрессирующих T-клеток, от 1×10 до 2,5×10 суммарных CAR-экспрессирующих T-клеток, от 1×10 до 1×10 суммарных CAR-экспрессирующих T-клеток, от 1×10 до 5×10 суммарных CAR-экспрессирующих T-клеток, от 1×10 до 2,5×10 суммарных CAR-экспрессирующих T-клеток, от 1×10 до 1×10 суммарных CAR-экспрессирующих T-клеток, от 1×10 до 5×10 суммарных CAR-экспрессирующих T-клеток, от 1×10 до 2,5×10 суммарных CAR-экспрессирующих T-клеток, от 1×10 до 1×10 суммарных CAR-экспрессирующих T-клеток, от 1×10 до 5×10 суммарных CAR-экспрессирующих T-клеток, от 1×10 до 2,5×10 суммарных CAR-экспрессирующих T-клеток, от 1×10 до 1×10 суммарных CAR-экспрессирующих T-клеток, от 1×10 до 5×10 суммарных CAR-экспрессирующих T-клеток, от 1×10 до 2,5×10 суммарных CAR-экспрессирующих T-клеток, от 2,5×10 до 5×10 суммарных CAR-экспрессирующих T-клеток, от 2,5×10 до 2,5×10 суммарных CAR-экспрессирующих T-клеток, от 2,5×10 до 1×10 суммарных CAR-экспрессирующих T-клеток, от 2,5×10 до 5×10 суммарных CAR-экспрессирующих T-клеток, от 2,5×10 до 2,5×10 суммарных CAR-экспрессирующих T-клеток, от 2,5×10 до 1×10 суммарных CAR-экспрессирующих T-клеток, от 2,5×10 до 5×10 суммарных CAR-экспрессирующих T-клеток, от 5×10 до 5×10 суммарных CAR-экспрессирующих T-клеток, от 5×10 до 2,5×10 суммарных CAR-экспрессирующих T-клеток, от 5×10 до 1×10 суммарных CAR-экспрессирующих T-клеток, от 5×10 до 5×10 суммарных CAR-экспрессирующих T-клеток, от 5×10 до 2,5×10 суммарных CAR-экспрессирующих T-клеток, от 5×10 до 1×10 суммарных CAR-экспрессирующих T-клеток, от 1×10 до 5×10 суммарных CAR-экспрессирующих T-клеток, от 1×10 до 2,5×10 суммарных CAR-экспрессирующих T-клеток, от 1×10 до 1×10 суммарных CAR-экспрессирующих T-клеток, от 1×10 до 5×10 суммарных CAR-экспрессирующих T-клеток, от 1×10 до 2,5×10 суммарных CAR-экспрессирующих T-клеток, от 2,5×10 до 5×10 суммарных CAR-экспрессирующих T-клеток, от 2,5×10 до 2,5×10 суммарных CAR-экспрессирующих T-клеток, от 2,5×10 до 1×10 суммарных CAR-экспрессирующих T-клеток, от 2,5×10 до 5×10 суммарных CAR-экспрессирующих T-клеток, от 5×10 до 5×10 суммарных CAR-экспрессирующих T-клеток, от 5×10 до 2,5×10 суммарных CAR-экспрессирующих T-клеток, от 5×10 до 1×10 суммарных CAR-экспрессирующих T-клеток, от 1×10 до 5×10 суммарных CAR-экспрессирующих T-клеток, от 1×10 до 2,5×10 суммарных CAR-экспрессирующих T-клеток или от 2,5×10 до 5×10 суммарных CAR-экспрессирующих T-клеток.
5
5
5
6
6
6
7
7
7
8
8
8
В некоторых вариантах осуществления доза генно-инженерных клеток содержит по меньшей мере, или по меньшей мере примерно, 1×10 CAR-экспрессирующих клеток, по меньшей мере, или по меньшей мере примерно, 2,5×10 CAR-экспрессирующих клеток, по меньшей мере, или по меньшей мере примерно, 5×10 CAR-экспрессирующих клеток, по меньшей мере, или по меньшей мере примерно, 1×10 CAR-экспрессирующих клеток, по меньшей мере, или по меньшей мере примерно, 2,5×10 CAR-экспрессирующих клеток, по меньшей мере, или по меньшей мере примерно, 5×10 CAR-экспрессирующих клеток, по меньшей мере, или по меньшей мере примерно, 1×10 CAR-экспрессирующих клеток, по меньшей мере, или по меньшей мере примерно, 2,5×10 CAR-экспрессирующих клеток, по меньшей мере, или по меньшей мере примерно, 5×10 CAR-экспрессирующих клеток, по меньшей мере, или по меньшей мере примерно, 1×10 CAR-экспрессирующих клеток, по меньшей мере, или по меньшей мере примерно, 2,5×10 CAR-экспрессирующих клеток, или по меньшей мере, или по меньшей мере примерно, 5×10 CAR-экспрессирующих клеток.
5
8
5
7
6
7
5
6
7
8
5
8
5
7
6
7
5
8
5
7
6
7
В некоторых вариантах осуществления клеточная терапия включает введение дозы, содержащей количество клеток, составляющее от, или от примерно, 1×10 до 5×10 суммарных экспрессирующих рекомбинантный рецептор клеток, суммарных T-клеток, или суммарных мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК), от, или от примерно, 5×10 до 1×10 суммарных экспрессирующих рекомбинантный рецептор клеток, суммарных T-клеток, или суммарных мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК), или от, или от примерно, 1×10 до 1×10 суммарных экспрессирующих рекомбинантный рецептор клеток, суммарных T-клеток, или суммарных мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК), включая все значения диапазонов. В некоторых вариантах осуществления клеточная терапия включает введение дозы, содержащей количество клеток, составляющее по меньшей мере, или по меньшей мере примерно, 1×10 суммарных экспрессирующих рекомбинантный рецептор клеток, суммарных T-клеток, или суммарных мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК), например, по меньшей мере, или по меньшей мере примерно, 1×10, по меньшей мере, или по меньшей мере примерно, 1×10, по меньшей мере, или по меньшей мере примерно, 1×10 таких клеток. В некоторых вариантах осуществления число относится к общему количеству CD3+ или CD8+, в некоторых случаях, также экспрессирующих рекомбинантный рецептор (например, CAR+) клеток. В некоторых вариантах осуществления клеточная терапия включает введение дозы, содержащей количество клеток, составляющее от, или от примерно, 1×10 до 5×10 CD3+ или CD8+ суммарных T-клеток, или CD3+ или CD8+ экспрессирующих рекомбинантный рецептор клеток, от, или от примерно, 5×10 до 1×10 CD3+ или CD8+ суммарных T-клеток, или CD3+ или CD8+ экспрессирующих рекомбинантный рецептор клеток, или от, или от примерно, 1×10 до 1×10 CD3+ или CD8+ суммарных T-клеток, или CD3+ или CD8+ экспрессирующих рекомбинантный рецептор клеток, включая все значения диапазонов. В некоторых вариантах осуществления клеточная терапия включает введение дозы, содержащей количество клеток, составляющее от, или от примерно, 1×10 до 5×10 суммарных CD3+/CAR+ или CD8+/CAR+ клеток, от, или от примерно, 5×10 до 1×10 суммарных CD3+/CAR+ или CD8+/CAR+ клеток, или от, или от примерно, 1×10 до 1×10 суммарных CD3+/CAR+ или CD8+/CAR+ клеток, включая все значения диапазонов.
В некоторых вариантах осуществления T-клетки дозы включают CD4+ T-клетки, CD8+ T-клетки или CD4+ и CD8+ T-клетки.
6
8
6
8
7
7
7
7
8
8
7
8
7
7
7
8
7
7
7
7
8
8
В некоторых вариантах осуществления, например, когда субъект является человеком, доза CD8+ T-клеток, входящая в дозу, содержащую CD4+ и CD8+ T-клетки, составляет от примерно 1×10 до 5×10 суммарных экспрессирующих рекомбинантный рецептор (например, CAR) CD8+ клеток, например, в диапазоне от примерно 5×10 до 1×10 таких клеток, 1×10, 2,5×10, 5×10, 7,5×10, 1×10 или 5×10 таких клеток, или в диапазоне между любыми двумя вышеуказанными значениями. В некоторых вариантах осуществления пациенту вводят несколько доз, и каждая из доз, или суммарная доза, может находиться в пределах вышеуказанных значений. В некоторых вариантах осуществления вводят дозу клеток, составляющую от, или от примерно, 1×10 до 0,75×10 суммарных экспрессирующих рекомбинантный рецептор CD8+ T-клеток, от 1×10 до 2,5×10 суммарных экспрессирующих рекомбинантный рецептор CD8+ T-клеток, от, или от примерно, 1×10 до 0,75×10 суммарных экспрессирующих рекомбинантный рецептор CD8+ T-клеток, включая все значения диапазонов. В некоторых вариантах осуществления вводят дозу клеток, составляющую, или составляющую примерно, 1×10, 2,5×10, 5×10 7,5×10, 1×10 или 5×10 суммарных экспрессирующих рекомбинантный рецептор CD8+ T-клеток.
В некоторых вариантах осуществления дозу клеток, например, экспрессирующих рекомбинантный рецептор T-клеток, вводят субъекту в одной дозе или вводят только один раз в течение двух недель, одного месяца, трех месяцев, шести месяцев, 1 года или более.
В некоторых аспектах фармацевтические композиции и препараты предложены в виде композиций стандартной лекарственной формы, содержащих количество клеток для введения в конкретной дозе или ее части. В некоторых вариантах осуществления предложенные способы позволяют получать клетки в предсказуемые сроки для дозирования, в сравнении с другими способами инкубации (например, стимуляции) клеток. В некоторых случаях дозу клеток для введения определяют на основании количества подобных наивным клеток в исходной композиции. В некоторых вариантах осуществления доза, содержащая клетки, полученные с использованием способа, включающего более короткий период стимуляции (например, в некоторых вариантах осуществления период инкубации составляет, или составляет примерно, 2 дня, 3 дня, 4 дня, 5 дней или 6 дней инкубации клеток со стимулирующим средством), может быть ниже, чем доза, содержащая клетки, полученные способом, включающим более длительный период стимуляции. В некоторых вариантах осуществления доза, содержащая клетки, полученные с использованием способа, включающего более короткий период стимуляции, может содержать большую процентную долю, или пропорцию, подобных наивным клеток, и может содержать меньшее суммарное количество клеток в сравнении с дозой, содержащей клетки, полученные с использованием способа, включающего более длительный период стимуляции.
+
+
В некоторых вариантах осуществления дозу клеток можно вводить путем введения нескольких композиций, или растворов, например, первой и второй или, необязательно, большего количества, каждая из которых содержит некоторую дозу клеток. В некоторых аспектах несколько композиций, каждая из которых содержит разные популяции и/или подтипы клеток, вводят отдельно или независимо, необязательно, в течение определенного периода времени. Например, популяции или подтипы клеток могут включать CD8 и CD4 T-клетки, соответственно, и/или CD8+- и CD4+-обогащенные популяции, соответственно, например, CD4+ и/или CD8+ T-клетки, отдельно включающие клетки, подвергнутые генной инженерии для экспрессии рекомбинантного рецептора. В некоторых вариантах осуществления введение дозы включает введение первой композиции, содержащей дозу CD8+ T-клеток или дозу CD4+ T-клеток, и введение второй композиции, содержащей другую дозу CD4+ T-клеток и CD8+ T-клеток.
В некоторых вариантах осуществления введение композиции или дозы, например, введение нескольких клеточных композиций, включает раздельное введение клеточных композиций. В некоторых аспектах раздельное введение выполняют одновременно или последовательно, в любом порядке. В некоторых вариантах осуществления доза включает первую композицию и вторую композицию, и первую композицию и вторую композицию вводят с интервалом 0-12 часов, с интервалом 0-6 часов или с интервалом 0-2 часа. В некоторых вариантах осуществления начало введения первой композиции и начало введения второй композиции выполняют с интервалом не более 2 часов, не более 1 часа или не более 30 минут, не более 15 минут, не более 10 минут или не более 5 минут. В некоторых вариантах осуществления начало и/или завершение введения первой композиции и завершение и/или начало введения второй композиции выполняют с интервалом не более 2 часов, не более 1 часа или не более 30 минут, не более 15 минут, не более 10 минут или не более 5 минут.
В некоторых случаях первая композиция, например, первая композиция дозы, содержит CD4+ T-клетки. В некоторых случаях первая композиция, например, первая композиция дозы, содержит CD8+ T-клетки. В некоторых вариантах осуществления первую композицию вводят до введения второй композиции.
В некоторых вариантах осуществления доза, или композиция, клеток имеет определенное, или целевое, соотношение CD4+ клеток, экспрессирующих рекомбинантный рецептор, и CD8+ клеток, экспрессирующих рекомбинантный рецептор, и/или соотношение CD4+ клеток и CD8+ клеток, необязательно, составляющее примерно 1:1, или находящееся в диапазоне от примерно 1:3 до примерно 3:1, например, примерно 1:1. В некоторых аспектах введение композиции, или дозы, с целевым или желаемым соотношением разных клеточных популяций (например, соотношением CD4+:CD8+ или соотношением CAR+CD4+:CAR+CD8+, составляющим, например, 1:1) включает введение клеточной композиции, содержащей одну из популяций, с последующим введением отдельной клеточной композиции, содержащей другую из популяций, при этом введение проводят при, или при примерно, целевом или желаемом соотношении. В некоторых аспектах введение дозы, или композиции, клеток при определенном соотношении приводит к повышенному размножению, персистенции и/или противоопухолевой активности терапевтических T-клеток.
В некоторых вариантах осуществления субъект получает несколько доз, например, две или более доз, или несколько последовательных доз, клеток. В некоторых вариантах осуществления субъекту вводят две дозы. В некоторых вариантах осуществления субъект получает следующую дозу, например, вторую дозу, введенную через примерно 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или 21 день после первой дозы. В некоторых вариантах осуществления несколько последовательных доз вводят после первой дозы, например, дополнительную дозу или дозы вводят после введения следующей дозы. В некоторых аспектах число клеток, вводимых субъекту в дополнительной дозе, является таким же, или аналогичным количеству в первой дозе и/или следующей дозе. В некоторых вариантах осуществления дополнительная доза или дозы превышают предшествующие дозы.
В некоторых аспектах размер первой и/или следующей дозы определяют на основании одного или более критериев, таких как ответ субъекта на предшествующее лечение, например, химиотерапию, болезненная нагрузка у субъекта, например, опухолевая нагрузка, масса, размер или величина, или степень, или тип метастазов, стадия заболевания и/или вероятность или частота случаев развития у субъекта токсических последствий, например, СВЦ, синдрома активации макрофагов, синдрома лизиса опухоли, нейротоксичности и/или иммунного ответа хозяина против вводимых клеток и/или рекомбинантных рецепторов.
В некоторых аспектах период времени между введением первой дозы и введением следующей дозы составляет от примерно 9 до примерно 35 дней, от примерно 14 до примерно 28 дней или от 15 до 27 дней. В некоторых вариантах осуществления введение следующей дозы производят в момент времени не более чем через примерно 14 дней после, и менее чем примерно 28 дней после, введения первой дозы. В некоторых аспектах период времени между первой и следующей дозой составляет примерно 21 день. В некоторых вариантах осуществления дополнительную дозу или дозы, например, последующие дозы, вводят после введения следующей дозы. В некоторых аспектах дополнительную следующую дозу или дозы вводят через по меньшей мере примерно 14, и менее чем примерно 28, дней после введения предшествующей дозы. В некоторых вариантах осуществления дополнительную дозу вводят менее чем через примерно 14 дней после предшествующей дозы, например, через 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или 13 дней после предшествующей дозы. В некоторых вариантах осуществления дозы не вводят менее чем через примерно 14 дней после предшествующей дозы и/или дозы не вводят более чем через примерно 28 дней после предшествующей дозы.
В некоторых вариантах осуществления доза клеток, например, экспрессирующих рекомбинантный рецептор клеток, включает две дозы (например, двойную дозу), включающие первую дозу T-клеток и следующую дозу T-клеток, при этом введение одной или обеих из первой дозы и второй дозы представляет собой введение разделенной дозы T-клеток.
В некоторых вариантах осуществления клетки вводят в виде части дополнительной комбинированной терапии, например, одновременно, или последовательно, в любом порядке, с другим терапевтическим вмешательством, например, с использованием антитела или сконструированной клетки, или рецептора, или средства, такого как цитотоксическое или терапевтическое средство. Например, в некоторых вариантах осуществления противораковое средство или иммуномодулирующее средство можно использовать в комбинированной терапии с адоптивной клеточной терапией сконструированными клетками, экспрессирующими рекомбинантный рецептор, например, CAR. В некоторых контекстах клетки вводят совместно с другим терапевтическим средством достаточно близко по времени, так что клеточные популяции усиливают эффект одного или более дополнительных терапевтических средств, или наоборот. В некоторых вариантах осуществления клетки вводят до введения одного или более дополнительных терапевтических средств. В некоторых вариантах осуществления клетки вводят после введения одного или более дополнительных терапевтических средств.
В некоторых вариантах осуществления одно или более дополнительных терапевтических средств включают цитокин, такой как IL-2, например, для повышения персистенции. В некоторых вариантах осуществления способы включают введение химиотерапевтического средства. В некоторых вариантах осуществления одно или более дополнительных терапевтических средств включают одно или более лимфодеплеционных средств, например, до или одновременно с началом введения сконструированных клеток. В некоторых вариантах осуществления лимфодеплеционная терапия включает введение фосфамида, такого как циклофосфамид. В некоторых вариантах осуществления лимфодеплеционная терапия может включать введение флударабина. В некоторых вариантах осуществления флударабин исключен при лимфодеплеционной терапии. В некоторых вариантах осуществления лимфодеплеционную терапию не применяют.
В некоторых вариантах осуществления способы включают введение субъекту прекондиционирующего средства, например, лимфодеплеционного или химиотерапевтического средства, такого как циклофосфамид, флударабин, или их сочетания, до начала клеточной терапии. Например, субъекту можно вводить прекондиционирующее средство по меньшей мере за 2 дня до, например, по меньшей мере за 3, 4, 5, 6 или 7 дней до, начала клеточной терапии. В некоторых вариантах осуществления субъекту вводят прекондиционирующее средство не более чем за 7 дней до, например, не более чем за 6, 5, 4, 3 или 2 дня до, начала клеточной терапии.
2
2
2
2
2
2
2
2
В некоторых вариантах осуществления субъект получает прекондиционирующее средство циклофосфамид в дозе от, или от примерно, 20 мг/кг до 100 мг/кг, например, от, или от примерно, 40 мг/кг до 80 мг/кг. В некоторых аспектах субъект получает прекондиционирующее средство циклофосфамид в дозе, или дозе примерно, 60 мг/кг. В некоторых вариантах осуществления циклофосфамид можно вводить в одной дозе или можно вводить в нескольких дозах, например, ежедневно, через день или раз в три дня. В некоторых вариантах осуществления циклофосфамид вводят один раз в сутки в течение одного или двух дней. В некоторых вариантах осуществления, когда лимфодеплеционное средство представляет собой циклофосфамид, субъекту вводят циклофосфамид в дозе от, или от примерно, 100 мг/м до 500 мг/м, например, от, или от примерно, 200 мг/м до 400 мг/м, или от 250 мг/м до 350 мг/м, включая все значения диапазонов. В некоторых случаях субъекту вводят примерно 300 мг/м циклофосфамида. В некоторых вариантах осуществления циклофосфамид можно вводить в одной дозе или можно вводить в нескольких дозах, например, ежедневно, через день или раз в три дня. В некоторых вариантах осуществления циклофосфамид вводят ежедневно, например, в течение 1-5 дней, например, от 3 до 5 дней. В некоторых случаях субъекту вводят примерно 300 мг/м циклофосфамида ежедневно в течение 3 дней, до начала проведения клеточной терапии.
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
В некоторых вариантах осуществления, когда лимфодеплеционное средство представляет собой флударабин, субъекту вводят флударабин в дозе от, или от примерно, 1 мг/м до 100 мг/м, например, от, или от примерно, 10 мг/м до 75 мг/м, от 15 мг/м до 50 мг/м, от 20 мг/м до 40 мг/м или от 24 мг/м до 35 мг/м, включая все значения диапазонов. В некоторых случаях субъекту вводят примерно 30 мг/м флударабина. В некоторых вариантах осуществления флударабин можно вводить в одной дозе или можно вводить в нескольких дозах, например, ежедневно, через день или раз в три дня. В некоторых вариантах осуществления флударабин вводят ежедневно, например, в течение 1-5 дней, например, от 3 до 5 дней. В некоторых случаях субъекту вводят примерно 30 мг/м флударабина ежедневно в течение 3 дней, до начала проведения клеточной терапии.
2
2
В некоторых вариантах осуществления лимфодеплеционное средство включает сочетание средств, например, сочетание циклофосфамида и флударабина. Таким образом, сочетание средств может включать циклофосфамид в любой дозе или с любой схемой введения, например, как описано выше, и флударабин в любой дозе или с любой схемой введения, например, как описано выше. Например, в некоторых аспектах субъекту вводят 60 мг/кг (~2 г/м) циклофосфамида и 3-5 доз 25 мг/м флударабина до введения первой или следующей дозы.
Клетки можно вводить любыми подходящими способами. Клетки вводят в определенном режиме дозирования для достижения терапевтического эффекта, например, уменьшения опухолевой нагрузки. Дозы и введение могут частично зависеть от схемы введения иммуномодулирующего соединения, которое может быть введено до, после и/или одновременно с началом применения T-клеточной терапии. Различные схемы дозирования при T-клеточной терапии включают, но не ограничиваются ими, однократные и многократные введения в течение различных периодов времени, болюсное введение и импульсную инфузию.
IV. Наборы и изделия
Также предложены изделия, такие как наборы и устройства, для введения клеток субъектам в соответствии с предложенными способами для адоптивной клеточной терапии, а также для хранения и введения клеток и композиций, таких как описанные исходные композиции или произведенные композиции.
В некоторых вариантах осуществления предложен набор, включающий композиции, описанные выше, и инструкции по применению. В некоторых вариантах осуществления предложены наборы, включающие композицию, содержащую терапевтически эффективное количество любых из сконструированных клеток, стимулированных в соответствии с любым из способов, описанных в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления предложены наборы, включающие композицию, содержащую терапевтически эффективное количество любых из сконструированных клеток, описанных в настоящем документе, и инструкции по введению их субъекту для лечения заболевания или состояния. В некоторых аспектах инструкции предназначены для селекции или обогащения клеток, экспрессирующих антигенный рецептор, содержащий антигенсвязывающий домен, специфически узнаваемый стимулирующим реагентом, из популяции клеток. В некоторых случаях инструкции предназначены для размножения клеток, экспрессирующих антигенный рецептор, содержащий антигенсвязывающий домен, специфически узнаваемый стимулирующим реагентом, из популяции клеток.
В некоторых вариантах осуществления набор дополнительно включает инструкции по введению субъекту, с целью лечения заболевания или состояния, сконструированных клеток, стимулированных с использованием способов, описанных в настоящем документе, в комбинированной терапии для лечения заболевания или состояния. В некоторых примерах набор дополнительно включает терапевтическое средство. В некоторых вариантах осуществления терапевтическое средство представляет собой иммуномодулирующее средство, цитотоксическое средство, противораковое средство или радиотерапевтическое средство.
Также предложены изделия. В некоторых вариантах осуществления изделия включают любые из сконструированных клеток, композиции, полинуклеотиды, наборы полинуклеотидов, композицию, содержащую набор полинуклеотидов, векторы, набор векторов, композицию, содержащую набор векторов, или наборы, предложенные в настоящем документе.
Изделия или наборы включают один или более контейнеров, как правило, несколько контейнеров, упаковочный материал и этикетку, или вкладыш в упаковку, находящуюся на, или связанную с контейнером или контейнерами и/или упаковкой, как правило, содержащую инструкции по введению клеток субъекту. Наборы и изделия могут включать контейнер и этикетку, или вкладыш в упаковку, находящуюся на, или связанную с контейнером.
В некоторых вариантах осуществления контейнеры содержат клетки, предназначенные для введения, например, одну или несколько стандартных доз клеток. Изделие, как правило, включает несколько контейнеров, каждый из которых содержит стандартную дозу клеток. Стандартная доза может представлять собой количество, или число, клеток для введения субъекту в первой дозе, или удвоенное число (или более) клеток для введения в первой, или любой одной или более из следующих доз. Она может представлять собой самую низкую дозу, или самую низкую возможную дозу, клеток, которую можно вводить субъекту в сочетании со способом введения. В некоторых вариантах осуществления стандартная доза представляет собой минимальное число клеток, или минимальное число эталонных единиц, или целевых эталонных единиц, или эталонных единиц в эталонном диапазоне, которое было бы введено в одной дозе любому субъекту, имеющему конкретное заболевание или состояние, или любому субъекту в соответствии со способами, описанными в настоящем документе.
Подходящие контейнеры включают, например, бутыли, флаконы, шприцы, мешки для в/в введения растворов, и так далее. Контейнеры могут быть выполнены из различных материалов, таких как стекло или пластик. В некоторых вариантах осуществления контейнер содержит композицию, которая может быть сама по себе, или в сочетании с другой композицией, эффективна для лечения, предотвращения и/или диагностирования состояния. В некоторых вариантах осуществления контейнер имеет стерильный порт доступа. Иллюстративные контейнеры включают мешки для вводимых внутривенно растворов, флаконы, включая флаконы с пробками, прокалываемыми иглой для инъекций, или бутыли, или флаконы для перорально вводимых средств. Этикетка, или вкладыш в упаковку, может указывать, что композицию используют для лечения заболевания или состояния. Изделие может дополнительно включать вкладыш в упаковку, указывающий, что композиции можно использовать для лечения конкретного состояния. Альтернативно или дополнительно, изделие может дополнительно включать другой, или такой же, контейнер, содержащий фармацевтически приемлемый буфер. Оно может дополнительно включать другие материалы, например, другие буферы, разбавители, фильтры, иглы и/или шприцы.
В конкретных вариантах осуществления контейнеры представляют собой мешки, например, гибкие мешки, такие как те, которые подходят для инфузии клеток субъектам, например, гибкие пластиковые или ПВХ мешки, и/или мешки для в/в введения растворов. В некоторых вариантах осуществления мешки являются герметизируемыми и/или могут быть стерилизованы для обеспечения стерильности раствора и стерильной доставки клеток и композиций. В некоторых вариантах осуществления контейнеры, например, мешки, имеют емкость, составляющую, или составляющую примерно, или составляющую по меньшей мере, или составляющую по меньшей мере примерно, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500 или 1000 мл, например, от, или от примерно, 10 и до, или до примерно, 100 или от, или от примерно, 10 и до, или до примерно, 500 мл, включая все значения диапазонов. В некоторых вариантах осуществления контейнеры, например, мешки, выполнены и/или изготовлены из материала, который является стабильным, и/или обеспечивает стабильное хранение и/или поддержание клеток при одной или более из разных температур, например, при температурах охлаждения, например, ниже чем, или ниже чем примерно, или при, или при примерно, -20°C, -80°C, -120°C, 135°C и/или температурах, подходящих для криоконсервирования, и/или других температурах, например, температурах, подходящих для размораживания клеток, и температуре тела, например, при, или при примерно 37°C, например, для размораживания, например, в месте нахождения субъекта или проведения лечения, например, у кровати, непосредственно перед лечением.
Контейнеры могут быть выполнены из различных материалов, таких как стекло или пластик. В некоторых вариантах осуществления контейнер имеет один или более портов, например, стерильных портов доступа, например, для подключения трубки или канюлирования к одной или более трубкам, например, для внутривенной или другой инфузии и/или для соединения с целью переноса в, и из других контейнеров, таких как емкости для культивирования и/или хранения клеток, или другие контейнеры. Иллюстративные контейнеры включают инфузионные мешки, мешки для внутривенного введения растворов, флаконы, включая флаконы с пробками, прокалываемыми иглой для инъекций.
Изделие может дополнительно включать вкладыш в упаковку, или этикетку, с одной или более частями идентифицирующей информации и/или инструкциями по применению. В некоторых вариантах осуществления информация или инструкции указывают, что содержимое может, или должно, быть использовано для лечения конкретного состояния или заболевания, и/или предоставляют инструкции для этого. Этикетка, или вкладыш в упаковку, может указывать, что содержимое изделия предназначено для использования в лечении заболевания или состояния. В некоторых вариантах осуществления этикетка, или вкладыш в упаковку, предоставляет инструкции по лечению субъекта, например, субъекта, от которого были получены клетки, способом, включающим введение первой и одной или более следующих доз клеток, например, в соответствии с любым из вариантов осуществления предложенных способов. В некоторых вариантах осуществления инструкции описывают введение, в первой дозе, одной стандартной дозы, например, содержимого одного отдельного контейнера в изделии, с последующей одной или более следующими дозами в указанный момент времени или в пределах определенного временного окна и/или после обнаружения наличия или отсутствия, или количества, или уровня одного или более факторов или результатов у субъекта.
В некоторых вариантах осуществления инструкции описывают введение одной или более стандартных доз субъекту.
В некоторых вариантах осуществления этикетка или вкладыш в упаковку, или упаковка, содержит идентифицирующую информацию, указывающую конкретного субъекта, от которого были получены клетки и/или которому должны быть введены клетки. В случае аутологичного переноса идентификационная информация субъекта, от которого были получены клетки, является такой же, как идентификационная информация субъекта, которому будут введены клетки. Таким образом, идентификационная информация может указывать, что клетки должны быть введены конкретному пациенту, например, тому, от кого были исходно получены клетки. Такая информация может находиться на упаковочном материале и/или этикетке в виде штрих-кода или другого кодируемого идентификатора, или может указывать имя и/или другие идентификационные характеристики субъекта.
В некоторых вариантах осуществления изделие включает один или более, как правило, несколько, контейнеров, содержащих композиции, содержащие клетки, например, их отдельные стандартные дозы, и также включает один или более дополнительных контейнеров с содержащейся в них композицией, которая содержит дополнительное средство, такое как цитотоксическое или иное терапевтическое средство, например, которое следует вводить в сочетании с клетками, например, одновременно или последовательно, в любом порядке. Альтернативно или дополнительно, изделие также может включать другой или такой же контейнер, содержащий фармацевтически приемлемый буфер. Оно также может включать другие материалы, например, другие буферы, разбавители, фильтры, трубки, иглы и/или шприцы.
Используемый в настоящем документе термин «вкладыш в упаковку» означает инструкции, обычно включаемые в коммерческие упаковки терапевтических препаратов, которые содержат информацию о примерных показаниях к использованию, дозах, введении, комбинированной терапии, противопоказаниях и/или предостережениях, относящихся к применению таких терапевтических препаратов.
V. Определения
Если нет иных указаний, все относящиеся к данной области термины, системы обозначений и другие технические и научные термины или терминология, используемые в настоящем документе, должны иметь то же значение, которое им обычно придают специалисты в области, к которой относится заявленный объект изобретения. В некоторых случаях термины с общепринятыми значениями определены в настоящем документе для ясности и/или для доступной ссылки, и включение таких определений в настоящий документ не обязательно должно означать их существенное отличие от общепринятых в данной области определений.
Используемый в настоящем документе термин «субъект» относится к млекопитающему, такому как человек или другое животное, и, как правило, относится к человеку. В некоторых вариантах осуществления субъект, например, пациент, которому вводят иммуномодулирующие полипептиды, сконструированные клетки или композиции, является млекопитающим, как правило, приматом, таким как человек. В некоторых вариантах осуществления примат является обезьяной или человекообразной обезьяной. Субъект может быть мужчиной или женщиной, и может иметь любой возраст, включая младенца, ребенка, подростка, взрослого или пожилого субъектов. В некоторых вариантах осуществления субъект является млекопитающим, отличным от приматов, например, грызуном.
Используемый в настоящем документе термин «лечение» (и его грамматические вариации, такие как «лечить» или «лечебный») означает полное или частичное облегчение или ослабление заболевания или состояния, или нарушения, или симптома, неблагоприятного эффекта или исхода, или связанного с ними фенотипа. Желаемые эффекты лечения включают, но без ограничения, предотвращение развития или рецидива заболевания, ослабление симптомов, уменьшение любых прямых или косвенных патологических последствий заболевания, предотвращение метастазирования, уменьшение скорости прогрессирования заболевания, ослабление или временное облегчение болезненного состояния, а также ремиссию или более благоприятный прогноз. Термины не подразумевают полное исцеление заболевания или полное устранение любого симптома, или эффект(ы) на все симптомы или исходы.
При использовании в настоящем документе «отсрочка развития заболевания» означает откладывание, создание препятствия, замедление, торможение, стабилизацию, подавление и/или отсрочку развития заболевания (такого как рак). Эта отсрочка может иметь различную протяженность во времени, в зависимости от истории заболевания и/или получающего лечение индивидуума. Очевидно, что достаточная или значительная отсрочка может, по сути, включать предотвращение, поскольку у индивидуума не развивается заболевание. Например, поздняя стадия рака, такая как развитие метастазов, может быть отсрочена.
Используемый в настоящем документе термин «предотвращение» включает обеспечение профилактики в отношении развития или рецидива заболевания у субъекта, который может быть предрасположен к заболеванию, но заболевание у него еще не было диагностировано. В некоторых вариантах осуществления предложенные клетки и композиции используют для отсрочки развития заболевания или замедления прогрессирования заболевания.
Используемый в настоящем документе термин «подавление» функции или активности означает ослабление функции или активности относительно в остальном таких же условий, за исключением интересующего условия или параметра, или, альтернативно, относительно другого состояния. Например, клетки, подавляющие рост опухоли, уменьшают скорость роста опухоли в сравнении со скоростью роста опухоли в отсутствие клеток.
«Эффективное количество» средства, например, фармацевтического препарата, клеток или композиции, в контексте введения означает количество, эффективное, в необходимых дозах/количествах и в течение необходимых периодов времени, для достижения желаемого результата, такого как терапевтический или профилактический результат.
«Терапевтически эффективное количество» средства, например, фармацевтического препарата или сконструированных клеток, означает количество, эффективное, в необходимых дозах и в течение необходимых периодов времени, для достижения желаемого терапевтического результата, например, для лечения заболевания, состояния или нарушения, и/или фармакокинетического или фармакодинамического эффекта лечения. Терапевтически эффективное количество может варьироваться в зависимости от таких факторов, как болезненное состояние, возраст, пол и масса тела субъекта, а также вводимые иммуномодулирующие полипептиды или сконструированные клетки. В некоторых вариантах осуществления предложенные способы включают введение иммуномодулирующих полипептидов, сконструированных клеток или композиций в эффективных количествах, например, терапевтически эффективных количествах.
«Профилактически эффективное количество» означает количество, эффективное, в необходимых дозах и в течение необходимых периодов времени, для достижения желаемого профилактического результата. Как правило, но не обязательно, поскольку профилактическую дозу используют для субъектов до развития, или на ранней стадии развития, заболевания, профилактически эффективное количество будет меньшим, чем терапевтически эффективное количество.
Термин «фармацевтический препарат» означает препарат, находящийся в такой форме, которая обеспечивает эффективную биологическую активность активного ингредиента, содержащегося в препарате, и которая не содержит какие-либо дополнительные компоненты, являющиеся неприемлемо токсичными для субъекта, которому будет введен препарат.
«Фармацевтически приемлемый носитель» означает ингредиент в фармацевтическом препарате, отличный от активного ингредиента, который является нетоксичным для субъекта. Фармацевтически приемлемый носитель включает, но без ограничения, буфер, эксципиент, стабилизатор или консервант.
et al.
При использовании в настоящем документе заявление, что положения нуклеотидов или аминокислот «соответствуют» положениям нуклеотидов или аминокислот в раскрытой последовательности, например, приведенной в списке последовательностей, относится к положениям нуклеотидов или аминокислот, идентифицированным при выравнивании с раскрытой последовательностью для достижения максимальной идентичности при использовании стандартного алгоритма выравнивания, такого как алгоритм GAP. Путем выравнивания последовательностей можно идентифицировать соответствующие остатки, например, с использованием консервативных и идентичных аминокислотных остатков в качестве руководства. Как правило, для идентификации соответствующих положений аминокислотные последовательности выравнивают для достижения соответствия наивысшего порядка (смотри, например: Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New.Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; и Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; Carrillo (1988) SIAM J Applied Math 48: 1073).
При использовании в настоящем документе форма единственного числа существительных включает соответствующую форму множественного числа, если из контекста явно не следует иное. Например, «один» означает «по меньшей мере один» или «один или более». Понятно, что аспекты и вариации, описанные в настоящем документе, включают «состоящие» и/или «состоящие практически из» аспекты и вариации.
В тексте настоящей заявки различные аспекты заявленного объекта изобретения представлены в формате диапазона. Следует понимать, что описание в формате диапазона использовано исключительно для удобства и краткости, и не должно восприниматься как негибкое ограничение объема заявленного объекта изобретения. Соответственно, описание диапазона следует понимать, как специально раскрывающее все возможные поддиапазоны, а также отдельные числовые значения в данном диапазоне. Например, если указан диапазон значений, понятно, что каждое промежуточное значение между верхним и нижним пределом данного диапазона, а также любое другое заявленное или промежуточное значение в данном указанном диапазоне, входит в объем заявленного объекта изобретения. Верхние и нижние пределы этих меньших по размеру диапазонов могут независимо быть включены в меньшие диапазоны, и также входят в объем заявленного объекта изобретения, с учетом любого специально исключенного предела в заявленном диапазоне. Если указанный диапазон включает одно или оба из этих пределов, диапазоны, исключающие один или оба из этих включенных пределов, также включены в заявленный объект изобретения. Это правило применимо независимо от широты диапазона.
Используемый в настоящем документе термин «примерно» относится к обычному диапазону погрешности для соответствующего значения, хорошо известному специалистам в данной области. В настоящем документе использование термина «примерно» применительно к значению или параметру включает (и описывает) варианты осуществления, которые направлены на это значение или параметр как таковые. Например, описание со ссылкой на «примерно X» включает описание «X». В конкретных вариантах осуществления «примерно» указанное значение означает значение в пределах ±25%, ±20%, ±10%, ±5%, ±1%, ±0,1% или ±0,01% от указанного значения.
В настоящем документе «композиция» означает любую смесь двух или более продуктов, веществ или соединений, включая клетки. Она может представлять собой раствор, суспензию, жидкость, порошок, пасту, водный, не водный состав или любое их сочетание.
В настоящем документе заявление, что клетка или популяция клеток является «положительной» по конкретному маркеру, означает поддающееся обнаружению наличие на, или в, клетке конкретного маркера, как правило, поверхностного маркера. При ссылке на поверхностный маркер термин означает наличие экспрессии маркера на поверхности, что определяют методом проточной цитометрии, например, путем окрашивания антителом, которое специфически связывает маркер, и обнаружения указанного антитела, при этом окрашивание может быть обнаружено методом проточной цитометрии на уровне, существенно превышающем уровень окрашивания, определяемый при проведении такой же процедуры с изотипическим контролем при в остальном идентичных условиях, и/или на уровне, практически аналогичном уровню для клетки, которая, как известно, содержит данный маркер, и/или на уровне, существенно превышающем уровень для клетки, которая, как известно, не содержит данный маркер.
В настоящем документе заявление, что клетка или популяция клеток является «отрицательной» по конкретному маркеру, означает отсутствие значительного поддающегося обнаружению наличия на, или в, клетке конкретного маркера, как правило, поверхностного маркера. При ссылке на поверхностный маркер термин означает отсутствие экспрессии маркера на поверхности, что определяют методом проточной цитометрии, например, путем окрашивания антителом, которое специфически связывает маркер, и обнаружения указанного антитела, при этом окрашивание не может быть обнаружено методом проточной цитометрии на уровне, существенно превышающем уровень окрашивания, определяемый при проведении такой же процедуры с изотипическим контролем при в остальном идентичных условиях, и/или на уровне, значительно более низком, чем уровень для клетки, которая, как известно, содержит данный маркер, и/или на уровне, практически аналогичном уровню для клетки, которая, как известно, не содержит меркер.
Используемый в настоящем документе термин «вектор» означает молекулу нуклеиновой кислоты, способную распространять другую нуклеиновую кислоту, с которой она связана. Термин включает вектор в качестве структуры самореплицируемой нуклеиновой кислоты, а также вектор, встроенный в геном клетки-хозяина, в которую он был введен. Некоторые векторы способны управлять экспрессией нуклеиновых кислот, с которыми они функционально связаны. В настоящем документе такие векторы называют «экспрессионными векторами».
Термины «клетка-хозяин», «линия клеток-хозяев» и «культура клеток-хозяев» используются взаимозаменяемо и относятся к клеткам, в которые была введена экзогенная нуклеиновая кислота, включая потомство таких клеток. Клетки-хозяева включают «трансформанты» и «трансформированные клетки», которые включают первичную трансформированную клетку и полученное от нее потомство, независимо от количества пересевов. Потомство может не быть полностью идентичным исходной клетке по содержанию нуклеиновой кислоты, и может содержать мутации. Мутантное потомство, имеющее ту же функцию или биологическую активность, которые были использованы при скрининге или селекции исходной трансформированной клетки, также включено в настоящее изобретение.
VI. Иллюстративные варианты осуществления
В число предлагаемых вариантов осуществления входят следующие:
1. Способ генной инженерии T-клеток, включающий:
(a) инкубацию исходной композиции в стимулирующих условиях в течение 2-6 дней, при этом указанная исходная композиция содержит популяцию T-клеток, включающую подобные наивным T-клетки и не подобные наивным T-клетки, при этом стимулирующие условия включают присутствие стимулирующего реагента, способного активировать один или более внутриклеточных сигнальных доменов одного или более компонентов комплекса TCR и/или один или более внутриклеточных сигнальных доменов одной или более костимулирующих молекул, с получением стимулированной композиции, и
(b) введение нуклеиновой кислоты, кодирующей генно-инженерный рекомбинантный рецептор, в стимулированную композицию T-клеток, при этом введение проводят в течение по меньшей мере части периода инкубации.
2. Способ генной инженерии T-клеток, включающий:
(a) инкубацию исходной композиции в стимулирующих условиях в течение 2-6 дней, при этом указанная исходная композиция содержит популяцию T-клеток, включающую подобные наивным T-клетки и не подобные наивным T-клетки, с получением стимулированной композиции, и
(b) введение нуклеиновой кислоты, кодирующей генно-инженерный рекомбинантный рецептор, в стимулированную композицию T-клеток, при этом введение проводят в течение по меньшей мере части периода инкубации.
3. Способ по варианту осуществления 2, при этом стимулирующие условия включают инкубацию исходной композиции со стимулирующим реагентом, способным активировать один или более внутриклеточных сигнальных доменов одного или более компонентов комплекса TCR и/или один или более внутриклеточных сигнальных доменов одной или более костимулирующих молекул.
4. Способ генной инженерии T-клеток, включающий инкубацию исходной композиции в стимулирующих условиях в течение 2-6 дней, при этом указанная исходная композиция содержит популяцию T-клеток, включающую подобные наивным T-клетки и не подобные наивным T-клетки, при этом:
стимулирующие условия включают присутствие стимулирующего реагента, способного активировать один или более внутриклеточных сигнальных доменов одного или более компонентов комплекса TCR и/или один или более внутриклеточных сигнальных доменов одной или более костимулирующих молекул, с получением стимулированной композиции, и
инкубацию исходной композиции в стимулирующих условиях проводят до, в процессе и/или после введения нуклеиновой кислоты, кодирующей генно-инженерный рекомбинантный рецептор.
5. Способ по любому из вариантов осуществления 1-4, при этом инкубацию проводят в течение по меньшей мере 3 дней.
6. Способ по любому из вариантов осуществления 1-4, при этом инкубацию проводят в течение по меньшей мере 4 дней.
7. Способ по любому из вариантов осуществления 1-4, при этом инкубацию проводят в течение по меньшей мере 5 дней.
8. Способ по любому из вариантов осуществления 1-4, при этом инкубацию проводят в течение по меньшей мере 6 дней.
9. Способ стимуляции T-клеток, включающий:
(a) инкубацию в стимулирующих условиях исходной композиции, содержащей T-клетки, включающие необходимое для инициации культуры количество подобных наивным T-клеток, или их подмножества CD8+ T-клеток, с получением стимулированной композиции; и
(b) введение в стимулированную композицию клеток нуклеиновой кислоты, кодирующей генно-инженерный рекомбинантный рецептор, с получением данным способом произведенной композиции, содержащей T-клетки, экспрессирующие генно-инженерный рекомбинантный рецептор.
10. Способ по варианту осуществления 9, при этом T-клетки включают подобные наивным T-клетки и не подобные наивным T-клетки, при этом стимулирующие условия предпочтительно индуцируют размножение или пролиферацию подобных наивным T-клеток в сравнении с не подобными наивным T-клетками в стимулированной композиции.
11. Способ по варианту осуществления 9 или варианту осуществления 10, при этом введение проводят в течение по меньшей мере части периода инкубации или проводят после инкубации.
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
12. Способ по любому из вариантов осуществления 9-11, при этом необходимое для инициации культуры количество подобных наивным T-клеток или их подмножества CD8+ T-клеток составляет от, или от примерно, 0,1×10 до 5×10, от, или от примерно, 0,1×10 до 4×10, от, или от примерно, 0,1×10 до 2×10, от, или от примерно, 0,1×10 до 1×10, от, или от примерно, 1×10 до 5×10, от, или от примерно, 1×10 до 4×10, от, или от примерно, 1×10 до 2×10, от, или от примерно, 2×10 до 5×10, от, или от примерно, 2×10 до 4×10 подобных наивным T-клеток или их подмножества CD8+ T-клеток.
8
8
8
8
8
8
13. Способ по любому из вариантов осуществления 9-12, при этом необходимое для инициации культуры количество подобных наивным T-клеток или их подмножества CD8+ T-клеток составляет по меньшей мере, или по меньшей мере примерно, или составляет, или составляет примерно, 0,5×10, 0,75×10, 1×10, 1,5×10, 2×10 или 4×10 подобных наивным T-клеток или их подмножества CD8+ T-клеток.
8
14. Способ по любому из вариантов осуществления 9-13, при этом необходимое для инициации культуры количество подобных наивным T-клеток или их подмножества CD8+ T-клеток составляет по меньшей мере, или по меньшей мере примерно, или составляет, или составляет примерно, 2×10 подобных наивным T-клеток или их подмножества CD8+ T-клеток.
8
8
15. Способ стимуляции T-клеток, включающий инкубацию в стимулирующих условиях исходной композиции, содержащей T-клетки, включающие необходимое для инициации культуры количество подобных наивным T-клеток или их подмножества CD8+ T-клеток, составляющее от, или от примерно, 1×10 до 4×10 подобных наивным T-клеток или их подмножества CD8+ T-клеток, с получением стимулированной композиции.
16. Способ по варианту осуществления 15, при этом T-клетки включают подобные наивным T-клетки и не подобные наивным T-клетки, при этом стимулирующие условия предпочтительно индуцируют размножение или пролиферацию подобных наивным T-клеток в сравнении с не подобными наивным T-клетками в стимулированной композиции.
8
17. Способ по варианту осуществления 15 или варианту осуществления 16, при этом необходимое для инициации культуры количество подобных наивным T-клеток или их подмножества CD8+ T-клеток составляет по меньшей мере, или по меньшей мере примерно, или составляет, или составляет примерно, 2×10 подобных наивным T-клеток или их подмножества CD8+ T-клеток.
18. Способ по любому из вариантов осуществления 1-17, при этом необходимое для инициации культуры количество представляет собой количество подобных наивным CD8+ T-клеток.
19. Способ по любому из вариантов осуществления 1-18, при этом подобные наивным T-клетки или подобные наивным CD8+ T-клетки:
имеют на поверхности T-клеточный маркер активации, выбранный из группы, состоящей из CD45RA, CD27, CD28 и CCR7; и/или
не имеют на поверхности маркер, выбранный из группы, состоящей из CD25, CD45RO, CD56, CD62L, KLRG1; и/или
имеют низкую экспрессию CD95; и/или
лишены внутриклеточной экспрессии цитокина, выбранного из группы, состоящей из IL-2, IFN-γ, IL-4, IL-10.
20. Способ по любому из вариантов осуществления 1-19, при этом подобные наивным клетки или подобные наивным CD8+ клетки:
имеют на поверхности T-клеточный маркер активации, выбранный из группы, состоящей из CD45RA, CD27, CD28 и CCR7; и/или
не имеют на поверхности маркер, выбранный из группы, состоящей из CD45RO, CD56, KLRG1; и/или
имеют низкую экспрессию CD95.
21. Способ по любому из вариантов осуществления 1-20, при этом подобные наивным T-клетки или подобные наивным CD8+ клетки представляют собой CD45RA+, CD27+, CCR7+ и/или CD45RO- клетки.
22. Способ по любому из вариантов осуществления 1-17 и 16-21, при этом не подобные наивным T-клетки:
не имеют на поверхности T-клеточный маркер активации, выбранный из группы, состоящей из CD45RA, CD27, CD28 и CCR7; и/или
имеют на поверхности маркер, выбранный из группы, состоящей из CD25, CD45RO, CD56, CD62L, KLRG1 и перфорина; и/или
имеют внутриклеточную экспрессию цитокина, выбранного из группы, состоящей из IL-2, IFN-γ, IL-4, IL-10; и/или
имеют высокую экспрессию CD95.
23. Способ по любому из вариантов осуществления 1-14 и 16-22, при этом не подобные наивным T-клетки представляют собой CD45RA-, CD27-, CCR7- и/или CD45RO+ клетки.
24. Способ по любому из вариантов осуществления 1-23, при этом клетки исходной композиции не подвергали и не подвергают перед инкубацией этапу селекции, основанной на эндогенном T-клеточном поверхностном маркере, который позволяет различать подобные наивным и не подобные наивным T-клетки.
25. Способ по любому из вариантов осуществления 15-24, дополнительно включающий введение генно-инженерного рекомбинантного рецептора в стимулированные клетки,
с получением данным способом произведенной композиции, содержащей T-клетки, экспрессирующие генно-инженерный рекомбинантный рецептор.
26. Способ по варианту осуществления 25, при этом инкубацию композиции в стимулирующих условиях проводят до, в процессе и/или после введения нуклеиновой кислоты, кодирующей генно-инженерный рекомбинантный рецептор.
27. Способ по любому из вариантов осуществления 1-14 и 25-26, при этом рекомбинантный рецептор способен связывать антиген-мишень, который связан с, специфичен для, и/или экспрессируется на клетке или ткани, связанной с заболеванием, нарушением или состоянием.
28. Способ по варианту осуществления 27, при этом заболевание, нарушение или состояние представляет собой инфекционное заболевание или нарушение, аутоиммунное заболевание, воспалительное заболевание или опухоль, или рак.
29. Способ по варианту осуществления 27 или варианту осуществления 28, при этом антиген-мишень представляет собой опухолевый антиген.
30. Способ по любому из вариантов осуществления 27-29, при этом антиген-мишень выбирают из интегрина αvβ6 (интегрина avb6), антигена созревания В-клеток (BCMA), карбоангидразы 9 (CAIX), Her2/neu (рецептора тирозинкиназы erbB2), L1-CAM, B7-H3, B7-H6, карбоангидразы 9 (CA9, также известной как CAIX или G250), раково-тестикулярного антигена, раково-тестикулярного антигена 1B (CTAG, также известного как NY-ESO-1 и LAGE-2), карциноэмбрионального антигена (CEA) и поверхностного антигена вируса гепатита B, антифолатного рецептора, циклина, циклина A2, лиганда 1 хемокина с мотивом C-C (CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD133, CD138, CD171, хондроитинсульфат протеогликана 4 (CSPG4), белка эпидермального фактора роста (EGFR), эпителиального гликопротеина 2 (EPG-2), эпителиального гликопротеина 40 (EPG-40), эфрина B2, рецептора эфрина A2 (EPHa2), erb-B2, erb-B3, erb-B4, димеров erbB, мутантного рецептора эпидермального фактора роста III типа (EGFR vIII), фолат-связывающего белка (FBP), подобного Fc-рецептору белка 5 (FCRL5; также известного как гомолог Fc-рецептора 5 или FCRH5), эмбрионального ацетилхолинового рецептора (эмбрионального AchR), фолат-связывающего белка (FBP), фолатного рецептора альфа, ганглиозида GD2, O-ацетилированного GD2 (OGD2), ганглиозида GD3, глипикана-3 (GPC3), связанного с G-белками рецептора 5D (GPRC5D), Her2/neu (рецептора тирозинкиназы erbB2), Her3 (erb-B3), Her4 (erb-B4), димеров erbB, человеческого высокомолекулярного антигена, связанного с меланомой (HMW-MAA), поверхностного антигена вируса гепатита B, человеческого лейкоцитарного антигена A1 (HLA-A1), человеческого лейкоцитарного антигена A2 (HLA-A2), рецептора альфа IL-22 (IL-22R-альфа), IL-13R-альфа2 (IL-13Rα2), рецептора домена киназной вставки (kdr), легкой цепи каппа, Lewis Y, L1-молекулы клеточной адгезии (L1-CAM), CE7 эпитопа L1-CAM, представителя A семейства 8 белков, содержащих богатые лейцином повторы (LRRC8A), Lewis Y, меланома-ассоциированного антигена (MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE-A10, мезотелина (MSLN), c-Met, мышиного цитомегаловируса (CMV), муцина 1 (MUC1), MUC16, лигандов представителя D группы 2 естественных киллеров (NKG2D), мелана A (MART-1), молекулы нейрональной клеточной адгезии (NCAM), онкоэмбрионального антигена, предпочтительно экспрессируемого антигена меланомы (PRAME), рецептора прогестерона, простатического специфического антигена, антигена простатических стволовых клеток (PSCA), простатического специфического мембранного антигена (PSMA), подобного тирозинкиназному рецептору рецептора-сироты 1 (ROR1), сурвивина, трофобластного гликопротеина (TPBG, также известного как 5T4), опухоль-ассоциированного гликопротеина 72 (TAG72), тирозиназа-зависимого белка 1 (TRP1, также известного как TYRP1 или gp75), тирозиназа-зависимого белка 2 (TRP2, также известного как допахром таутомераза, допахром дельта-изомераза или DCT), фолатного рецептора-α, 8H9, двойного антигена, гликопротеина 100 (gp100), рецептора фактора роста эндотелия сосудов (VEGFR), рецептора фактора роста эндотелия сосудов 2 (VEGF-R2), рецептора эстрогена, рецептора прогестерона, антигена опухоли Вильмса 1 (WT-1), специфического для патогена или экспрессируемого патогеном антигена, и антигена, связанного с универсальным маркером.
31. Способ по любому из вариантов осуществления 1-14 и 25-30, при этом рекомбинантный рецептор представляет собой, или содержит, функциональный не-TCR антигенный рецептор или TCR, или его антигенсвязывающий фрагмент.
32. Способ по любому из вариантов осуществления 1-14 и 25-30, при этом рекомбинантный рецептор представляет собой химерный антигенный рецептор (CAR).
33. Способ по любому из вариантов осуществления 1-14 и 25-32, при этом рекомбинантный рецептор содержит внеклеточный домен, содержащий антигенсвязывающий домен, необязательно, при этом антигенсвязывающий домен специфически связывает антиген-мишень.
34. Способ по варианту осуществления 33, при этом антигенсвязывающий домен представляет собой, или содержит, антитело, или фрагмент антитела, который, необязательно, представляет собой одноцепочечный фрагмент.
35. Способ по варианту осуществления 33, при этом фрагмент содержит вариабельные области антитела, соединенные гибким линкером.
36. Способ по варианту осуществления 34 или варианту осуществления 35, при этом фрагмент представляет собой scFv.
37. Способ по любому из вариантов осуществления 1-14 и 25-36, при этом рекомбинантный рецептор дополнительно содержит спейсер и/или шарнирную область.
38. Способ по любому из вариантов осуществления 1-14 и 25-37, при этом рекомбинантный рецептор содержит внутриклеточную сигнальную область.
39. Способ по варианту осуществления 38, при этом внутриклеточная сигнальная область содержит внутриклеточный сигнальный домен.
40. Способ по варианту осуществления 39, при этом внутриклеточный сигнальный домен представляет собой, или содержит, основной сигнальный домен, сигнальный домен, способный индуцировать основной сигнал активации в T-клетке, сигнальный домен компонента T-клеточного рецептора (TCR) и/или сигнальный домен, содержащий иммунорецепторный тирозиновый активирующий мотив (ITAM).
41. Способ по варианту осуществления 40, при этом внутриклеточный сигнальный домен представляет собой, или содержит, внутриклеточный сигнальный домен цепи CD3, необязательно, дзета-цепи CD3 (CD3ζ), или его сигнальный фрагмент.
42. Способ по любому из вариантов осуществления 38-41, при этом рекомбинантный рецептор дополнительно содержит трансмембранный домен, расположенный между внеклеточным доменом и внутриклеточной сигнальной областью.
43. Способ по любому из вариантов осуществления 38-42, при этом внутриклеточная сигнальная область дополнительно содержит костимулирующую сигнальную область.
44. Способ по варианту осуществления 43, при этом костимулирующая сигнальная область содержит внутриклеточный сигнальный домен T-клеточной костимулирующей молекулы или его сигнальный фрагмент.
45. Способ по варианту осуществления 43 или варианту осуществления 44, при этом костимулирующая сигнальная область содержит внутриклеточный сигнальный домен CD28, 4-1BB или ICOS, или его сигнальный фрагмент.
46. Способ по любому из вариантов осуществления 43-45, при этом костимулирующая сигнальная область находится между трансмембранным доменом и внутриклеточной сигнальной областью.
47. Способ по любому из вариантов осуществления 1-46, при этом стимулирующее условие включает инкубацию со стимулирующим реагентом, способным активировать T-клетки, CD4+ T-клетки и/или CD8+ T-клетки; способным индуцировать сигнал через комплекс TCR; и/или способным индуцировать пролиферацию T-клеток, CD4+ T-клеток и/или CD8+ T-клеток.
48. Способ по любому из вариантов осуществления 1-47, при этом стимулирующее условие включает инкубацию со стимулирующим реагентом, способным активировать один или более внутриклеточных сигнальных доменов одного или более компонентов комплекса TCR и/или один или более внутриклеточных сигнальных доменов одной или более костимулирующих молекул.
49. Способ по варианту осуществления 47 или варианту осуществления 48, при этом стимулирующий реагент включает основное средство, которое специфически связывает компонент комплекса TCR, необязательно, которое специфически связывает CD3.
50. Способ по варианту осуществления 49, при этом стимулирующее средство дополнительно включает вспомогательное средство, которое специфически связывает T-клеточную костимулирующую молекулу, необязательно, при этом костимулирующую молекулу выбирают из группы, состоящей из CD28, CD137 (4-1-BB), OX40 или ICOS.
51. Способ по любому из вариантов осуществления 47-50, при этом основное и вспомогательное средства включают антитела, необязательно, при этом одно или более стимулирующих средств включают анти-CD3 антитело и анти-CD28 антитело.
52. Способ по варианту осуществления 50 или варианту осуществления 51, при этом основное и/или вспомогательное средства находятся на поверхности твердой подложки.
53. Способ по варианту осуществления 52, при этом твердая подложка представляет собой, или содержит, гранулу.
54. Способ по варианту осуществления 53, при этом гранула имеет диаметр, превышающий, или превышающий примерно, 3,5 мкм, но не более, чем примерно 9 мкм, или не более, чем примерно 8 мкм, или не более, чем примерно 7 мкм, или не более, чем примерно 6 мкм, или не более, чем примерно 5 мкм.
55. Способ по варианту осуществления 53 или варианту осуществления 54, при этом гранула имеет диаметр, составляющий, или составляющий примерно, 4,5 мкм.
56. Способ по любому из вариантов осуществления 53-55, при этом гранула имеет диаметр, такого, или примерно такого, размера, как лимфоцит или антигенпредставляющая клетка.
57. Способ по любому из вариантов осуществления 53-56, при этом гранула является инертной.
58. Способ по любому из вариантов осуществления 53-57, при этом гранула представляет собой, или имеет, полистирольную поверхность и, необязательно, имеет магнитное или суперпарамагнитное ядро.
59. Способ по любому из вариантов осуществления 53-58, при этом стимулирующее условие включает инкубацию клеток при соотношении гранул и клеток, составляющем от, или от примерно, 1:1 до 10:1, от, или от примерно, 1:1 до 8:1, от, или от примерно, 1:1 до 6:1, от, или от примерно, 1:1 до 4:1, от, или от примерно, 1:1 до 3:1, от, или от примерно, 2:1 до 4:1, от, или от примерно, 2:1 до 3:1, от, или от примерно, 1:1 до 2:1, от, или от примерно, 4:1 до 10:1, от, или от примерно, 4:1 до 8:1, от, или от примерно, 4:1 до 6:1, от, или от примерно, 6:1 до 10:1, от, или от примерно, 6:1 до 8:1, от, или от примерно, 8:1 до 10:1, от, или от примерно, 1:1 до 1:10, от, или от примерно, 1:1 до 1:8, от, или от примерно, 1:1 до 1:6, от, или от примерно, 1:1 до 1:4, от, или от примерно, 1:2 до 1:3.
60. Способ генной инженерии T-клеток, включающий:
(a) инкубацию исходной композиции в стимулирующих условиях в течение 2-6 дней, при этом указанная исходная композиция содержит популяцию T-клеток, включающую подобные наивным T-клетки и не подобные наивным T-клетки, при этом стимулирующие условия включают присутствие стимулирующего реагента, включающего анти-CD3 антитело и вспомогательное средство, представляющее собой анти-CD28 антитело, которые присоединены к грануле, при этом соотношение гранул и клеток в процессе инкубации составляет от, или от примерно, 1:1 до 4:1; и
(b) введение нуклеиновой кислоты, кодирующей генно-инженерный рекомбинантный рецептор, в стимулированную композицию T-клеток, при этом введение проводят в течение по меньшей мере части периода инкубации.
61. Способ генной инженерии T-клеток, включающий инкубацию исходной композиции в стимулирующих условиях в течение 2-6 дней, при этом указанная исходная композиция содержит популяцию T-клеток, включающую подобные наивным T-клетки и не подобные наивным T-клетки, при этом:
стимулирующие условия включают присутствие стимулирующего реагента, включающего анти-CD3 антитело и вспомогательное средство, представляющее собой анти-CD28 антитело, которые присоединены к грануле, при этом соотношение гранул и клеток в процессе инкубации составляет от, или от примерно, 1:1 до 4:1; и
инкубацию исходной композиции в стимулирующих условиях проводят до, в процессе и/или после введения нуклеиновой кислоты, кодирующей генно-инженерный рекомбинантный рецептор.
62. Способ по варианту осуществления 59, при этом соотношение гранул и клеток составляет, или составляет примерно, 3:1.
63. Способ по варианту осуществления 59, при этом соотношение гранул и клеток составляет, или составляет примерно, 1:1.
64. Способ по любому из вариантов осуществления 1-63, при этом T-клетки получены из биологического образца, необязательно, при этом биологический образец получен от субъекта-человека.
65. Способ по варианту осуществления 64, при этом биологический образец представляет собой, или содержит, образец цельной крови, образец лейкоцитарной пленки, образец мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК), образец не фракционированных T-клеток, образец лимфоцитов, образец белых клеток крови, продукт афереза или продукт лейкафереза.
66. Способ по любому из вариантов осуществления 1-65, при этом T-клетки включают CD4+ и/или CD8+ клетки.
67. Способ по любому из вариантов осуществления 1-66, при этом T-клетки включают CD4+ и CD8+ T-клетки, и соотношение CD4+ и CD8+ T-клеток составляет от, или от примерно, 2:1 до, или до примерно, 1:5.
68. Способ по варианту осуществления 55, при этом соотношение CD4+ клеток и CD8+ клеток составляет, или составляет примерно, 1:1, 1:2, 2:1, 1:3 или 3:1.
69. Способ по любому из вариантов осуществления 1-68, при этом подобные наивным T-клетки включают подобные наивным CD4+ T-клетки и/или подобные наивным CD8+ T-клетки.
70. Способ по любому из вариантов осуществления 1-69, при этом подобные наивным T-клетки являются поликлональными.
71. Способ по варианту осуществления 70, при этом клональность подобных наивным T-клеток определяют путем клонального секвенирования, необязательно, секвенирования нового поколения или анализа спектротипов.
72. Способ по любому из вариантов осуществления 1-71, при этом наличие, количество, число или процентную долю подобных наивным T-клеток определяют методом проточной цитометрии.
73. Способ по любому из вариантов осуществления 1-72, при этом стимулирующее условие не включает N-ацетилцистеин (NAC).
74. Способ по любому из вариантов осуществления 1-72, при этом стимулирующее условие не включает IL-15 и/или IL-7.
75. Способ по любому из вариантов осуществления 1-72, при этом стимулирующее условие приводит к, или индуцирует гибель не подобных наивным T-клеток или их субпопуляции.
76. Способ по любому из вариантов осуществления 1-75, при этом стимулирующее условие приводит к индуцируемой активацией клеточной гибели (AICD) не подобных наивным T-клеток или их субпопуляции.
77. Способ по любому из вариантов осуществления 1-76, дополнительно включающий добавление ДНКазы во время инкубации и/или к стимулированной композиции.
78. Способ по любому из вариантов осуществления 1-77, при этом инкубацию проводят в течение более чем, или примерно, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16 дней.
79. Способ по любому из вариантов осуществления 1-78, при этом процентная доля клеток в стимулированной композиции, происходящих от подобных наивным T-клеток, возрастает более чем, или более чем примерно, в 1,5 раза, 2 раза, 3 раза, 4 раза, 5 раз, 6 раз, 7 раз, 8 раз, 9 раз, 10 раз, 50 раз, 100 раз в сравнении с процентной долей подобных наивным клеток в исходной композиции.
80. Способ по любому из вариантов осуществления 1-79, при этом содержание в стимулированной композиции клеток, происходящих от подобных наивным T-клеток, относительно клеток, происходящих от не подобных наивным T-клеток, увеличивается более чем, или более чем примерно, в 1,5 раза, 2 раза, 3 раза, 4 раза, 5 раз, 6 раз, 7 раз, 8 раз, 9 раз, 10 раз, 50 раз, 100 раз в сравнении с содержанием подобных наивным T-клеток относительно не подобных наивным T-клеток в исходной композиции.
81. Способ по любому из вариантов осуществления 1-80, при этом стимулированная композиция содержит более 75%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% клеток, которые произошли от подобных наивным T-клеток исходной композиции.
82. Способ по любому из вариантов осуществления 1-81, при этом стимулированная композиция содержит менее 10% клеток, произошедших от не подобных наивным T-клеток.
83. Способ по любому из вариантов осуществления 1-82, при этом стимулированная композиция содержит менее 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5% или 0,1% клеток, произошедших от не подобных наивным T-клеток.
84. Способ по любому из вариантов осуществления 1-83, при этом из клеток в исходной композиции большая процентная доля подобных наивным T-клеток, в сравнении с не подобными наивным T-клетками, индуцируются к пролиферации и/или становятся активированными.
85. Способ по любому из вариантов осуществления 1-84, при этом большая процентная доля T-клеток, которые были подобными наивным в исходной композиции, в сравнении с процентной долей T-клеток, которые были не подобными наивным в исходной композиции, делятся в день 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 после начала указанной инкубации.
86. Способ по любому из вариантов осуществления 1-85, при этом стимулирующие условия способны индуцировать пролиферацию большей процентной доли клеток популяции подобных наивным T-клеток человека, в сравнении с не подобными наивным T-клетками человека, в день 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 после начала инкубации в данных условиях.
EFF
CM
EM
EFF
CM
EM
87. Способ по любому из вариантов осуществления 1-86, при этом: (i) не подобные наивным T-клетки выбирают из группы, состоящей из эффекторных T-клеток (T), T-клеток памяти, центральных T-клеток памяти (T), эффекторных T-клеток памяти (T), а также их сочетаний; или (ii) не подобные наивным T-клетки представляют собой множество T-клеток, включающее или состоящее из эффекторных T-клеток (T) и/или T-клеток памяти, при этом T-клетки памяти, необязательно, включают центральные T-клетки памяти (T) и/или эффекторные T-клетки памяти (T).
88. Способ по любому из вариантов осуществления 1-87, при этом:
процентная доля подобных наивным T-клеток в исходной композиции меньше, чем процентная доля сконструированных клеток в стимулированной композиции, происходящих от подобных наивным T-клеток в исходной композиции.
89. Способ по любому из вариантов осуществления 1-14 и 25-88, при этом большая процентная доля клеток с введенной нуклеиновой кислотой представляют собой, или получены в результате пролиферации подобных наивным T-клеток в исходной композиции, в сравнении с не подобными наивным T-клетками в исходной композиции.
90. Способ по любому из вариантов осуществления 1-14 и 25-89, при этом введение выполняют путем трансдукции.
91. Способ по любому из вариантов осуществления 1-14 и 25-90, при этом нуклеиновая кислота представляет собой вирусный вектор.
92. Способ по варианту осуществления 91, при этом вирусный вектор представляет собой ретровирусный вектор.
93. Способ по варианту осуществления 91 или варианту осуществления 92, при этом вирусный вектор представляет собой лентивирусный вектор или гамма-ретровирусный вектор.
94. Способ по любому из вариантов осуществления 1-14 и 25-89, при этом введение выполняют путем транспозиции транспозона, содержащего молекулу нуклеиновой кислоты.
in vitro
ex vivo
95. Способ по любому из вариантов осуществления 1-94, который применяют  или .
96. Произведенная композиция, полученная способом по любому из вариантов осуществления 1-83.
97. Фармацевтическая композиция, содержащая произведенную композицию по варианту осуществления 96.
98. Фармацевтическая композиция по варианту осуществления 97, дополнительно содержащая фармацевтический носитель.
99. Способ лечения, включающий введение субъекту-млекопитающему произведенной композиции, полученной способом по любому из вариантов осуществления 1-95, или фармацевтической композиции по варианту осуществления 97 или варианту осуществления 98.
100. Способ по варианту осуществления 99, при этом клетки получают от субъекта, которому клетки будут введены.
VII. Примеры
Следующие примеры приведены исключительно в иллюстративных целях и не должны ограничивать объем настоящего изобретения.
Пример 1: Оценка маркеров подобных наивным клеток в композициях сконструированных T-клеток, содержащей CAR+ T-клетки.
Сконструированные композиции первичных T-клеток, содержащие T-клетки, экспрессирующие химерные антигенные рецепторы (CAR), получали параллельно двумя способами, в которых использовали стимулирующий реагент, состоящий из парамагнитных покрытых полистиролом гранул с присоединенными анти-CD3 и анти-CD28 антителами, для активации T-клеток перед проведением трансдукции вирусным вектором. В обоих способах клетки были сконструированы лентивирусной трансдукцией для экспрессии одного и того же анти-BCMA CAR. CAR содержал антигенсвязывающий домен scFv, специфичный для BCMA, трансмембранную область CD28, костимулирующую сигнальную область 4-1BB и полученный из CD3-дзета внутриклеточный сигнальный домен. Способы отличались продолжительностью процесса и условиями для размножения клеток. Полученные T-клеточные композиции оценивали в отношении клеточных поверхностных маркеров.
6
6
6
В обоих способах отдельные композиции CD4+ и CD8+ клеток отбирали из МКПК, выделенных из лейкаферезного образца от донора-человека, и отобранные клеточные композиции замораживали. Затем отдельные композиции CD4+ и CD8+ T-клеток размораживали и смешивали жизнеспособные CD4+ T-клетки с жизнеспособными CD8+ T-клетками в соотношении 1:1. Примерно 300×10 T-клеток (150×10 CD4+ и 150×10 CD8+ T-клеток) смешанной исходной клеточной композиции стимулировали путем инкубации клеток в течение 18-30 часов в присутствии гранул с конъюгированными анти-CD3/анти-CD28 антителами при соотношении гранул и клеток, составляющем 1:1, в бессывороточной среде. Среда также содержала рекомбинантные IL-2, IL-7 и IL-15. После стимуляции клетки промывали и ресуспендировали в бессывороточной среде, содержащей добавки, а также рекомбинантные IL-2, IL-7 и IL-15.
В одном способе (далее в настоящем документе называемом «нерасширенным») клетки из стимулированной клеточной композиции затем трансдуцировали лентивирусным вектором, кодирующим анти-BCMA CAR, путем спинокуляции. После спинокуляции клетки промывали и ресуспендировали в бессывороточной среде, содержащей рекомбинантные IL-2, IL-7 и IL-15. Клетки ресуспендированной композиции инкубировали при температуре примерно 37,0°C в инкубаторе. Через примерно 96 часов после начала стимуляции клетки дважды промывали в магнитном поле для удаления конъюгированных с анти-CD3/анти-CD28 антителами парамагнитных гранул, и формулировали в растворе, содержащем 10% ДМСО. Сформулированную клеточную композицию переносили в мешок или флакон и хранили при температуре примерно -80°C.
6
6
В другом способе (далее в настоящем документе называемом «расширенным») после инкубации примерно 100×10 жизнеспособных клеток из стимулированной клеточной композиции концентрировали в бессывороточной среде, содержащей рекомбинантные IL-2, IL-7 и IL-15. Клетки трансдуцировали лентивирусным вектором, кодирующим тот же анти-BCMA CAR, описанный выше, путем спинокуляции при примерно 1600 g в течение 60 минут. После спинокуляции клетки ресуспендировали в бессывороточной среде, содержащей рекомбинантные IL-2, IL-7 и IL-15, и инкубировали в течение примерно 18-30 часов при температуре примерно 37°C. Затем клетки культивировали для размножения путем переноса в биореактор (например, качающийся биореактор) в примерно 500 мл иллюстративной бессывороточной среды, содержащей IL-2, IL-7 и IL-15 в концентрации, удвоенной относительно той, которую использовали во время этапов инкубации и трансдукции. После достижения установленной плотности жизнеспособных клеток начинали перфузию, при этом среду заменяли методом полунепрерывной перфузии с постоянным перемешиванием. Клетки культивировали на следующий день в биореакторе до достижения пороговой плотности клеток примерно 3×10 клеток/мл, что как правило, происходило через 6-7 дней размножения. Конъюгированные с анти-CD3 и анти-CD28 антителами парамагнитные гранулы удаляли из клеточной композиции под воздействием магнитного поля. Затем клетки собирали, формулировали и замораживали, как описано выше.
T-клеточные композиции, полученные расширенным и нерасширенным способами конструирования, окрашивали антителами, узнающими поверхностные маркеры, включая CD4, CD8, CCR7 и CD27, и количественно определяли методом проточной цитометрии. Процентные доли CD4+CAR+ и CD8+CAR+ T-клеток, положительных при окрашивании как на CCR7, так и на CD27, представлены на ФИГ. 1A. На ФИГ. 1B и ФИГ. 1C показаны процентные доли CCR7+CD27+ клеток для CD4+CAR+ T-клеток или CD8+CAR+ T-клеток, соответственно, в полученной T-клеточной композиции, в сравнении с процентной долей CCR7+CD27+ клеток в исходной композиции до инкубации с стимулирующим реагентом (CMAT), представляющим собой конъюгированные с анти-CD3/анти-CD28 антителами гранулы. Как показано, большая процентная доля CCR7+CD27+ наблюдалась в T-клеточных композициях, полученных нерасширенным способом конструирования, в сравнении с расширенным способом конструирования.
Дополнительный анализ клеток, полученных расширенным способом из клеток репрезентативного донора, в различные дни на протяжении процесса производства, в том числе, во время активации (AMAT), трансдукции (XMAT) или в разные моменты времени после начала культивирования (inoc +2, inoc +4 или inoc +5), показал, что размножение клеток связано с более дифференцированным фенотипом, что определяли на основании уменьшенной процентной доли CCR7+ CD27+ клеток (ФИГ. 1D).
Пример 2: Связь подобного наивному фенотипа клеток с ответом донора на CAR-экспрессирующие T-клетки
Получали иллюстративные терапевтические T-клеточные композиции, содержащие аутологичные T-клетки, экспрессирующие химерный антигенный рецептор (CAR), специфичный для CD19. Анти-CD19 CAR содержал анти-CD19 scFv, полученный из мышиного антитела (вариабельная область получена из FMC63), полученный из иммуноглобулина спейсер, трансмембранный домен, полученный из CD28, костимулирующую область, полученную из 4-1BB, и внутриклеточный сигнальный домен CD3-дзета.
+
+
+
+
+
+
Для получения клеточных композиций для введения аутологичные клетки получали от субъектов путем лейкафереза. Лейкаферезные образцы обрабатывали способом для получения CAR-экспрессирующих клеток. Способ включал промывание клеток с использованием автоматизированной системы для промывания и основанную на иммунной аффинности селекцию для очистки CD4 и CD8 T-клеток, с получением двух композиций, обогащенных по CD8 (среди которых, в среднем, 99% клеток, с интерквартильной широтой (IQR) 98-100%, представляли собой CD8 клетки) и CD4 (среди которых, в среднем, 99% клеток, с IQR 99-100%, представляли собой CD4 клетки) клеткам, соответственно.
+
+
+
+
+
6
6
+
6
6
Клетки обогащенных по CD4 и CD8 композиций активировали анти-CD3/анти-CD28 парамагнитными гранулами, а затем отдельно подвергали лентивирусной трансдукции вектором, кодирующим анти-CD19 CAR с костимулирующим доменом 4-1BB. Трансдуцированные популяции затем отдельно инкубировали в присутствии стимулирующих реагентов для размножения клеток. Размноженные CD8 и CD4 клетки отдельно формулировали, криоконсервировали и хранили до введения. Для сведения к минимуму вариаций между партиями и/или клеточными композициями, полученными от разных пациентов, например, теми, которые имели характерные для разных пациентов особенности параметров, являющихся показателями клеточного здоровья, клетки поддерживали в постоянных объемах для всех партий. Клеточные продукты имели узкий диапазон концентраций жизнеспособных клеток (на основании результатов оценки клеточных композиций для одной группы субъектов, CD8: среднее количество 31×10 клеток/мл, IQR 28-40×10 клеток/мл, N=38; CD4: среднее количество 35×10 клеток/мл, IQR 31-40×10, N=36).
+
de novo
Терапевтическую CAR T-клеточную композицию, описанную выше, вводили субъектам с рецидивирующей или рефрактерной (R/R) агрессивной неходжскинской лимфомой (NHL) в клиническом исследовании. В частности, группе взрослых людей с R/R NHL, включая диффузную крупноклеточную B-клеточную лимфому (DLBCL),  или переродившуюся из медленно растущей лимфомы (NOS), B-клеточную лимфому высокой степени злокачественности (включая «double/triple hit»), DLBCL, переродившуюся из хронического лимфоцитарного лейкоза (CLL) или лимфом из клеток маргинальной зоны (MZL), первичную медиастинальную крупноклеточную B-клеточную лимфому (PMBCL) и фолликулярную лимфому стадии 3b (FLG3B), вводили композиции анти-CD19 CAR-экспрессирующих T-клеток. Результаты отдельно оценивали для основной подгруппы субъектов в полной группе (за исключением субъектов с плохим общим состоянием (ECOG 2), имеющих DLBCL, переродившуюся из лимфом из клеток маргинальной зоны (MZL), и/или хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL, Рихтера), и за исключением субъектов с первичной медиастинальной крупноклеточной B-клеточной лимфомой (PMBCL) и фолликулярной лимфомой стадии 3b (FLG3B) (основная группа)). Основная группа включала субъектов с DLBCL, NOS и переродившейся фолликулярной лимфомой (tFL) или B-клеточной лимфомой высокой степени злокачественности («double/triple hit») или B-клеточной лимфомой высокой степени злокачественности с перестройками MYC и BCL2 и/или BCL6, с гистологией DLBCL («double/triple hit») и с общим состоянием по шкале Восточной объединенной группы онкологов (ECOG PS), соответствующим 0 или 1. Анализ в данной временной точке, представленный в данном примере, основан на оценке в общей сложности 91 субъекта в полной группе (88 (65 из основной группы), у которых оценивали ответ, и 91 субъекта (67 из основной группы), у которых оценивали безопасность), которым вводили анти-CD19 CAR-экспрессирующие клетки.
+
+
+
+
+
+
7
8
Криоконсервированные клеточные композиции, содержащие анти-CD19 CAR-экспрессирующие клетки, размораживали перед внутривенным введением. Терапевтическую дозу T-клеток вводили в виде определенной клеточной композиции путем отдельного введения сформулированной CD4 CAR клеточной популяции и сформулированной CD8 CAR популяции, которые вводили в целевом соотношении примерно 1:1. Субъектам вводили однократную или двойную дозу CAR-экспрессирующих T-клеток (каждую отдельную дозу путем отдельных инфузий CD4 CAR-экспрессирующих T-клеток и CD8 CAR-экспрессирующих T-клеток, соответственно) следующим образом: одну дозу уровня дозы 1 (DL1), содержащую 5×10 суммарных CAR-экспрессирующих T-клеток, или одну дозу уровня дозы 2 (DL2), содержащую 1×10 суммарных CAR-экспрессирующих T-клеток. В некоторых случаях субъектам вводили двойную дозу DL1, при этом каждую дозу вводили с интервалом примерно четырнадцать (14) дней, с введением в день 1 и день 14, включая одного субъекта, который случайно получил две дозы DL2 в схеме с введением двух доз, вследствие ошибки дозирования. Уровень доз и целевые количества подмножеств T-клеток вводимой композиции в случае DL1 и DL2 приведены в Таблице E1. В основной группе 34 субъектам вводили DL1, и 27 субъектам вводили DL2.
<b>Таблица E1. Целевой уровень дозы и количество T-клеток подмножеств для клеточных композиций, содержащих анти-CD19 CAR T-клетки</b>
Уровень дозы
Доза хелперных T-клеток (T<sub>H</sub>)(CD4<sup>+</sup>CAR<sup>+</sup>)
Доза цитотоксических T-клеток (T<sub>C</sub>)(CD8<sup>+</sup>CAR<sup>+</sup>)
Суммарная доза T-клеток(CD3<sup>+</sup> CAR<sup>+</sup>)
1
25×10<sup>6</sup>
25×10<sup>6</sup>
50×10<sup>6</sup>
2
50×10<sup>6</sup>
50×10<sup>6</sup>
100×10<sup>6</sup>
В Таблице E2 показаны общие результаты оценки ответа и безопасности для полной группы и основной группы при двух уровнях доз. Показатель частоты объективных ответов (ЧОО) составлял 74%, включая 52% субъектов, у которых был отмечен полный ответ (ПО). Частота случаев синдрома высвобождения цитокинов (СВЦ) любой степени составляла 35%, с 1% тяжелых случаев СВЦ; и частота случаев нейротоксичности (НТ) любой степени составляла 19%, с 1% тяжелых случаев НТ.
<b>Таблица E2. Показатели ответа и безопасности после введения CAR</b><sup><b>+</b></sup><b> клеток</b>
<b>ПОЛНАЯ</b>
<b>ОСНОВНАЯ</b>
<b>Все уровни дозы</b>
<b>Все уровни дозы</b><sup><b>a</b></sup>
<b>DL1</b>
<b>DL2</b>
Наилучший общий ответ (НОО), n<sup>b</sup>
88
65
34
27
ЧОО, % (95% ДИ)
74 (63,83)
80(68, 89)
77 (59,89)
82 (62, 94)
ПО, % (95% ДИ)
52 (41,63)
55(43, 68)
47 (30, 65)
63 (42, 81)
Безопасность, n<sup>c</sup>
91
67
34
29
Любой СВЦ, % (95% ДИ)
35 (25, 46)
36 (24, 48)
41 (25, 59)
24 (10, 44)
тСВЦ (степень 3-4), % (95% ДИ)
1 (0, 6)
1 (0, 8)
38 (0, 15)
0
Любая НТ, % (95% ДИ)
19 (11,28)
21 (12, 33)
24 (11, 41)
17 (6, 36)
тНТ (степень 3-4), % (95% ДИ)
12 (6, 21)
15 (7, 26)
21 (9, 38)
7 (1, 23)
a
Четыре пациента, получавших DL1D (уровень дозы 1, схема с введением двух доз) с одинаковыми результатами.
b
Включены пациенты с ПЗ, смертельным исходом или проведенным через 28 дней сканированием для рестадирования заболевания. Для одного пациента отсутствуют результаты сканирования для рестадирования.
c
Включены все субъекты, получившие по меньшей мере одну дозу соответствующего препарата CAR-экспрессирующих клеток за 28 дней до сбора данных или до смерти.
A. Связь между клеточными характеристиками анти-CD19 CAR-экспрессирующих T-клеток и ответом
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
in vivo
P
P
Оценивали связь между определенными фенотипическими характеристиками CAR T-клеток в терапевтических композициях и параметрами, связанными с клиническими ответами. Корреляции между фенотипом клеток памяти в композиции и функцией транслировались в наблюдаемую положительную корреляцию между композицией подмножеств центральных клеток памяти и пиков  размножения CAR клеток (ρ=0,42, =0,002), а также выживания без прогрессирования (ВБП) (оценка выживаемости по Каплану-Мейеру, =0,0164). На ФИГ. 2A-2D представлены кривые выживаемости Каплана-Мейера для субъектов, получавших CAR T-клеточные композиции, разделенных на группы, которым вводили композиции с частотой встречаемости CCR7CD27 CAR T-клеток среди CD4 CAR T-клеток (ФИГ. 2A для выживаемости без прогрессирования, ФИГ. 2C для длительности ответа) и среди CD8 CAR T-клеток (ФИГ. 2B для выживаемости без прогрессирования, ФИГ. 2D для длительности ответа), которая была выше или ниже определенного порогового уровня. Установлено, что большее количество CCR7CD27 клеток памяти в композиции коррелировало с более длительным выживанием без прогрессирования.
Пример 3: Оценка клональности T-клеток с использованием секвенирования и аналитических методов
Композиции T-клеток оценивали на относительное содержание T-клеточных клонов методом одноклеточного секвенирования пар T-клеточных рецепторов (TCR) до и после генной инженерии для экспрессии химерного антигенного рецептора (CAR).
+
+
+
+
+
+
+
Аутологичные T-клетки получали из лейкаферезных образцов от субъектов путем основанной на иммунной аффинности селекции для очистки CD4 и CD8 T-клеток, с получением двух композиций, обогащенных по CD8 и CD4+ T-клеткам, соответственно. Клетки обогащенных по CD4 и CD8 композиций активировали анти-CD3/анти-CD28 парамагнитными гранулами, а затем отдельно подвергали лентивирусной трансдукции вектором, кодирующим анти-CD19 CAR. Анти-CD19 CAR содержал анти-CD19 scFv, полученный из мышиного антитела (вариабельная область получена из FMC63), полученный из иммуноглобулина спейсер, трансмембранный домен, полученный из CD28, костимулирующую область, полученную из 4-1BB, и внутриклеточный сигнальный домен CD3-дзета. Затем трансдуцированные популяции отдельно инкубировали в присутствии стимулирующих реагентов для размножения клеток. Размноженные композиции CD8 и CD4 клеток, содержащие CAR-экспрессирующие T-клетки, отдельно формулировали, криоконсервировали и хранили.
et al.
Оценивали T-клеточную клональность выделенных CD4+ и CD8+ T-клеточных композиций до инженерии (CMAT), а также терапевтических CD4+ и CD8+ CAR+ T-клеточных композиций после инженерии, способом, описанным выше. Для оценки T-клеточной клональности клетки подвергали одноклеточному секвенированию αβ-TCR, в целом, как описано в WO2016044227, WO2016176322 и WO2012048340. На основании одноклеточного секвенирования генов TCR с использованием штрих-кодов определяли T-клеточную клональность и разнообразие идентифицированных клонов в клеточной популяции. В некоторых случаях использовали индекс Шеннона в качестве порогового значения для фильтрования клонов («скорректированная по Шеннону клональность»), что позволяет сохранять связи между образцами, устраняя присущий образцам шум. Смотри, Chaara  (2018) Front Immunol 9:1038).
На ФИГ. 3 показана клональность каждого образца после применения индекса Шеннона. Как показано на ФИГ. 3, клональность CD4 и CD8 клеток отличалась у T-клеточных композиций до и после геной инженерии, при этом сконструированные CAR+ T-клеточные композиции имели сниженную клональность в сравнении с T-клетками в композициях до начала процесса инженерии клеток.
-
-
Терапевтические CD4+ и CD8+ CAR+ T-клеточные композиции после генной инженерии сортировали методом проточной цитометрии на основе экспрессии фактора, являющегося показателем апоптоза, например, поверхностного окрашивания аннексином V (аннексин V-), или расщепления каспазы 3 (признак не апоптотических клеток), а также на основе экспрессии различных поверхностных маркеров, включая CD45RA, CCR7, CD27, CD4 и CD8. Фенотип клеток коррелировал со степенью клональности клеток. Было установлено, что, как в CD4+, так и в CD8+, терапевтических CAR+ T-клеточных композициях наличие отрицательных по маркеру апоптоза клеток, которые представляли собой CCR7/CD27 клетки, положительно коррелировало в высокой степени с клональностью клеток в композиции. Аналогично, наличие отрицательных по маркеру апоптоза клеток, которые представляли собой CCR7+ или CCR7+/CD27+ клетки, отрицательно коррелировало с клональностью клеток в каждой из CD4+ и CD8+ терапевтических CAR+ T-клеточных композиций. Эти результаты согласуются с тем фактом, что клональность клеток может обратно коррелировать с наличием менее дифференцированных подобных наивным клеток, которые определяют по присутствию CCR7 и/или CD27.
Объем настоящего изобретения не должен быть ограничен конкретными раскрытыми вариантами осуществления, которые предложены, например, для иллюстрации различных аспектов изобретения. Различные модификации описанных композиций и способов станут очевидными из приведенного в настоящем документе описания и изложенных идей. Такие вариации могут быть осуществлены на практике без отклонения от объема и сущности изобретения и должны входить в объем настоящего изобретения.
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ
<b>№</b>
<b>ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ</b>
<b>ОПИСАНИЕ</b>
1
ESKYGPPCPPCP
спейсер (шарнир IgG4) (ак)
<i>Homo sapiens</i>
2
GAATCTAAGTACGGACCGCCCTGCCCCCCTTGCCCT
спейсер (шарнир IgG4) (нт)
<i>Homo sapiens</i>
3
ESKYGPPCPPCPGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
спейсер шарнир-CH3 <i>Homo sapiens</i>
4
ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
спейсер шарнир-CH2-CH3 <i>Homo sapiens</i>
5
RWPESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPECPSHTQPLGVYLLTPAVQDLWLRDKATFTCFVVGSDLKDAHLTWEVAGKVPTGGVEEGLLERHSNGSQSQHSRLTLPRSLWNAGTSVTCTLNHPSLPPQRLMALREPAAQAPVKLSLNLLASSDPPEAASWLLCEVSGFSPPNILLMWLEDQREVNTSGFAPARPPPQPGSTTFWAWSVLRVPAPPSPQPATYTCVVSHEDSRTLLNASRSLEVSYVTDH
IgD-шарнир-Fc <i>Homo sapiens</i>
6
LEGGGEGRGSLLTCGDVEENPGPR
T2A, искусственная
7
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFM
tEGFR, искусственная
8
FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV
CD28 (аминокислоты 153-179 в последовательности с регистрационным № P10747) <i>Homo sapiens</i>
9
IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV
CD28 (аминокислоты 114-179 в последовательности с регистрационным № P10747) <i>Homo sapiens</i>
10
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
CD28 (аминокислоты 180-220 в P10747) <i>Homo sapiens</i>
11
RSKRSRGGHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
CD28 (LL на GG) <i>Homo sapiens</i>
12
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
4-1BB (аминокислоты 214-255 в Q07011.1) <i>Homo sapiens</i>
13
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
CD3-дзета <i>Homo sapiens</i>
14
RVKFSRSAEPPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
CD3-дзета <i>Homo sapiens</i>
15
RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
CD3-дзета <i>Homo sapiens</i>
16
RKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFM
tEGFR, искусственная
17
EGRGSLLTCGDVEENPGP
T2A, искусственная
18
MALPVTALLLPLALLLHA
сигнальный пептид CD8-альфа
19
GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP
P2A
20
ATNFSLLKQAGDVEENPGP
P2A
21
QCTNYALLKLAGDVESNPGP
E2A
22
VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP
F2A
23
PGGG-(SGGGG)5-P-, где P представляет собой пролин, G представляет собой глицин и S представляет собой серин
линкер
24
GSADDAKKDAAKKDGKS
линкер
25
atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatccca
сигнальная последовательность альфа-цепи GMCSFR
26
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP
сигнальная последовательность альфа-цепи GMCSFR
27
Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro
Шарнир
28
ELKTPLGDTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCP
Шарнир
29
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro
Шарнир
30
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
Шарнир
31
Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
Шарнир
32
Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
Шарнир
33
Glu Val Val Val Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
Шарнир
34
QQGNTLPYT
FMC63 LC-CDR3
35
RASQDISKYLN
FMC63 CDR L1
36
SRLHSGV
FMC63 CDR L2
37
GNTLPYTFG
FMC63 CDR L3
38
DYGVS
FMC63 CDR H1
39
VIWGSETTYYNSALKS
FMC63 CDR H2
40
YAMDYWG
FMC63 CDR H3
41
EVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS
FMC63 VH
42
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEIT
FMC63 VL
43
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS
FMC63 scFv
44
KASQNVGTNVA
SJ25C1 CDR L1
45
SATYRNS
SJ25C1 CDR L2
46
QQYNRYPYT
SJ25C1 CDR L3
47
SYWMN
SJ25C1 CDR H1
48
QIYPGDGDTNYNGKFKG
SJ25C1 CDR H2
49
KTISSVVDFYFDY
SJ25C1 CDR H3
50
EVKLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIYPGDGDTNYNGKFKGQATLTADKSSSTAYMQLSGLTSEDSAVYFCARKTISSVVDFYFDYWGQGTTVTVSS
SJ25C1 VH
51
DIELTQSPKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKPLIYSATYRNSGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNVQSKDLADYFCQQYNRYPYTSGGGTKLEIKR
SJ25C1 VL
52
GGGGSGGGGSGGGGS
Линкер
53
EVKLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIYPGDGDTNYNGKFKGQATLTADKSSSTAYMQLSGLTSEDSAVYFCARKTISSVVDFYFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKPLIYSATYRNSGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNVQSKDLADYFCQQYNRYPYTSGGGTKLEIKR
SJ25C1 scFv
54
HYYYGGSYAMDY
FMC63 HC-CDR3
55
HTSRLHS
FMC63 LC-CDR2
56
GSTSGSGKPGSGEGSTKG
Линкер
57
gacatccagatgacccagaccacctccagcctgagcgccagcctgggcgaccgggtgaccatcagctgccgggccagccaggacatcagcaagtacctgaactggtatcagcagaagcccgacggcaccgtcaagctgctgatctaccacaccagccggctgcacagcggcgtgcccagccggtttagcggcagcggctccggcaccgactacagcctgaccatctccaacctggaacaggaagatatcgccacctacttttgccagcagggcaacacactgccctacacctttggcggcggaacaaagctggaaatcaccggcagcacctccggcagcggcaagcctggcagcggcgagggcagcaccaagggcgaggtgaagctgcaggaaagcggccctggcctggtggcccccagccagagcctgagcgtgacctgcaccgtgagcggcgtgagcctgcccgactacggcgtgagctggatccggcagccccccaggaagggcctggaatggctgggcgtgatctggggcagcgagaccacctactacaacagcgccctgaagagccggctgaccatcatcaaggacaacagcaagagccaggtgttcctgaagatgaacagcctgcagaccgacgacaccgccatctactactgcgccaagcactactactacggcggcagctacgccatggactactggggccagggcaccagcgtgaccgtgagcagc
Последовательность, кодирующая scFv
58
X1PPX2PX1 представляет собой глицин, цистеин или аргининX2 представляет собой цистеин или треонин
Шарнир
59
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
Шарнир
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> JUNO THERAPEUTICS, INC.
BONYHADI, Mark L.
<120> СПОСОБЫ И КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНЫХ КЛЕТОК
<130> 735042010540
<140> Еще не определено
<141> Наряду с этим
<150> 62/543,359
<151> 2017-08-09
<160> 59
<170> FastSEQ для Windows версии 4.0
<210> 1
<211> 12
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Спейсер (шарнир IgG4)
<400> 1
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1               5                  10
<210> 2
<211> 36
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Спейсер (шарнир IgG4)
<400> 2
gaatctaagt acggaccgcc ctgcccccct tgccct                           36
<210> 3
<211> 119
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Спейсер шарнир-CH3
<400> 3
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Gly Gln Pro Arg
1               5                  10                  15
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
20                  25                  30
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
35                  40                  45
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
50                  55                  60
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
65                  70                  75                  80
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
85                  90                  95
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
100                 105                 110
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
115
<210> 4
<211> 229
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Спейсер шарнир-CH2-CH3
<400> 4
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1               5                  10                  15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20                  25                  30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35                  40                  45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50                  55                  60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65                  70                  75                  80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85                  90                  95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100                 105                 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115                 120                 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130                 135                 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145                 150                 155                 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165                 170                 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180                 185                 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195                 200                 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210                 215                 220
Leu Ser Leu Gly Lys
225
<210> 5
<211> 282
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<220>
<223> IgD-шарнир-Fc
<400> 5
Arg Trp Pro Glu Ser Pro Lys Ala Gln Ala Ser Ser Val Pro Thr Ala
1               5                  10                  15
Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala
20                  25                  30
Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys
35                  40                  45
Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro
50                  55                  60
Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Tyr Leu Leu Thr Pro Ala Val Gln
65                  70                  75                  80
Asp Leu Trp Leu Arg Asp Lys Ala Thr Phe Thr Cys Phe Val Val Gly
85                  90                  95
Ser Asp Leu Lys Asp Ala His Leu Thr Trp Glu Val Ala Gly Lys Val
100                 105                 110
Pro Thr Gly Gly Val Glu Glu Gly Leu Leu Glu Arg His Ser Asn Gly
115                 120                 125
Ser Gln Ser Gln His Ser Arg Leu Thr Leu Pro Arg Ser Leu Trp Asn
130                 135                 140
Ala Gly Thr Ser Val Thr Cys Thr Leu Asn His Pro Ser Leu Pro Pro
145                 150                 155                 160
Gln Arg Leu Met Ala Leu Arg Glu Pro Ala Ala Gln Ala Pro Val Lys
165                 170                 175
Leu Ser Leu Asn Leu Leu Ala Ser Ser Asp Pro Pro Glu Ala Ala Ser
180                 185                 190
Trp Leu Leu Cys Glu Val Ser Gly Phe Ser Pro Pro Asn Ile Leu Leu
195                 200                 205
Met Trp Leu Glu Asp Gln Arg Glu Val Asn Thr Ser Gly Phe Ala Pro
210                 215                 220
Ala Arg Pro Pro Pro Gln Pro Gly Ser Thr Thr Phe Trp Ala Trp Ser
225                 230                 235                 240
Val Leu Arg Val Pro Ala Pro Pro Ser Pro Gln Pro Ala Thr Tyr Thr
245                 250                 255
Cys Val Val Ser His Glu Asp Ser Arg Thr Leu Leu Asn Ala Ser Arg
260                 265                 270
Ser Leu Glu Val Ser Tyr Val Thr Asp His
275                 280
<210> 6
<211> 24
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> T2A
<400> 6
Leu Glu Gly Gly Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp
1               5                  10                  15
Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg
20
<210> 7
<211> 357
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> tEGFR
<400> 7
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1               5                  10                  15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly
20                  25                  30
Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe
35                  40                  45
Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala
50                  55                  60
Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu
65                  70                  75                  80
Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile
85                  90                  95
Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu
100                 105                 110
Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala
115                 120                 125
Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu
130                 135                 140
Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr
145                 150                 155                 160
Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys
165                 170                 175
Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly
180                 185                 190
Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu
195                 200                 205
Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys
210                 215                 220
Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu
225                 230                 235                 240
Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met
245                 250                 255
Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala
260                 265                 270
His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val
275                 280                 285
Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His
290                 295                 300
Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro
305                 310                 315                 320
Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala
325                 330                 335
Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly
340                 345                 350
Ile Gly Leu Phe Met
355
<210> 8
<211> 27
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<220>
<223> CD28
<300>
<308> UniProt P10747
<309> 1989-07-01
<400> 8
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1               5                  10                  15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20                  25
<210> 9
<211> 66
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<220>
<223> CD28
<300>
<308> UniProt P10747
<309> 1989-07-01
<400> 9
Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn
1               5                  10                  15
Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu
20                  25                  30
Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly
35                  40                  45
Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe
50                  55                  60
Trp Val
65
<210> 10
<211> 41
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<220>
<223> CD28
<300>
<308> UniProt P10747
<309> 1989-07-01
<400> 10
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1               5                  10                  15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20                  25                  30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35                  40
<210> 11
<211> 41
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<220>
<223> CD28
<400> 11
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1               5                  10                  15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20                  25                  30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35                  40
<210> 12
<211> 42
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<220>
<223> 4-1BB
<300>
<308> UniProt Q07011.1
<309> 1995-02-01
<400> 12
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1               5                  10                  15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20                  25                  30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35                  40
<210> 13
<211> 112
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<220>
<223> CD3-дзета
<400> 13
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1               5                  10                  15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20                  25                  30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35                  40                  45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50                  55                  60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65                  70                  75                  80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85                  90                  95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100                 105                 110
<210> 14
<211> 112
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<220>
<223> CD3-дзета
<400> 14
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Glu Pro Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1               5                  10                  15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20                  25                  30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35                  40                  45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50                  55                  60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65                  70                  75                  80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85                  90                  95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100                 105                 110
<210> 15
<211> 112
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<220>
<223> CD3-дзета
<400> 15
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly
1               5                  10                  15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20                  25                  30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35                  40                  45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50                  55                  60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65                  70                  75                  80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85                  90                  95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100                 105                 110
<210> 16
<211> 335
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> tEGFR
<400> 16
Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu
1               5                  10                  15
Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile
20                  25                  30
Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe
35                  40                  45
Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr
50                  55                  60
Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn
65                  70                  75                  80
Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg
85                  90                  95
Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile
100                 105                 110
Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val
115                 120                 125
Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp
130                 135                 140
Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn
145                 150                 155                 160
Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu
165                 170                 175
Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser
180                 185                 190
Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu
195                 200                 205
Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln
210                 215                 220
Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly
225                 230                 235                 240
Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro
245                 250                 255
His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr
260                 265                 270
Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His
275                 280                 285
Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro
290                 295                 300
Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala
305                 310                 315                 320
Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met
325                 330                 335
<210> 17
<211> 18
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> T2A
<400> 17
Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro
1               5                  10                  15
Gly Pro
<210> 18
<211> 18
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Сигнальный пептид CD8-альфа
<400> 18
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1               5                  10                  15
His Ala
<210> 19
<211> 22
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> P2A
<400> 19
Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
1               5                  10                  15
Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 20
<211> 19
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> P2A
<400> 20
Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn
1               5                  10                  15
Pro Gly Pro
<210> 21
<211> 20
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> E2A
<400> 21
Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser
1               5                  10                  15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 22
<211> 22
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> F2A
<400> 22
Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val
1               5                  10                  15
Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210> 23
<211> 10
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Линкер
<220>
<221> ПОВТОР
<222> (5)...(9)
<223> SGGGG повторяется 5 раз
<400> 23
Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Pro
1               5                  10
<210> 24
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Линкер
<400> 24
Gly Ser Ala Asp Asp Ala Lys Lys Asp Ala Ala Lys Lys Asp Gly Lys
1               5                  10                  15
Ser
<210> 25
<211> 66
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Сигнальная последовательность альфа-цепи GMCSFR
<400> 25
atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60
atccca                                                            66
<210> 26
<211> 22
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Сигнальная последовательность альфа-цепи GMCSFR
<400> 26
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1               5                  10                  15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro
20
<210> 27
<211> 12
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Шарнир
<400> 27
Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro
1               5                  10
<210> 28
<211> 61
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Шарнир
<400> 28
Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr His Thr Cys Pro Arg Cys Pro
1               5                  10                  15
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu
20                  25                  30
Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro
35                  40                  45
Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
50                  55                  60
<210> 29
<211> 12
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Шарнир
<400> 29
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro
1               5                  10
<210> 30
<211> 12
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Шарнир
<400> 30
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1               5                  10
<210> 31
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Шарнир
<400> 31
Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1               5
<210> 32
<211> 10
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Шарнир
<400> 32
Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1               5                  10
<210> 33
<211> 14
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Шарнир
<400> 33
Glu Val Val Val Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1               5                  10
<210> 34
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> FMC63 LC-CDR3
<400> 34
Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr
1               5
<210> 35
<211> 11
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> FMC63 CDR L1
<400> 35
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn
1               5                  10
<210> 36
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> FMC63 CDR L2
<400> 36
Ser Arg Leu His Ser Gly Val
1               5
<210> 37
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> FMC63 CDR L3
<400> 37
Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly
1               5
<210> 38
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> FMC63 CDR H1
<400> 38
Asp Tyr Gly Val Ser
1               5
<210> 39
<211> 16
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> FMC63 CDR H2
<400> 39
Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser
1               5                  10                  15
<210> 40
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> FMC63 CDR H3
<400> 40
Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly
1               5
<210> 41
<211> 120
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> FMC63 VH
<400> 41
Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1               5                  10                  15
Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr
20                  25                  30
Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35                  40                  45
Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
50                  55                  60
Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65                  70                  75                  80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85                  90                  95
Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210> 42
<211> 107
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> FMC63 VL
<400> 42
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1               5                  10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr
100                 105
<210> 43
<211> 245
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> FMC63 scFv
<400> 43
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1               5                  10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Ser Thr Ser Gly
100                 105                 110
Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Lys
115                 120                 125
Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser
130                 135                 140
Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser
145                 150                 155                 160
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile
165                 170                 175
Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu
180                 185                 190
Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn
195                 200                 205
Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr
210                 215                 220
Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
225                 230                 235                 240
Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 44
<211> 11
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> SJ25C1 CDR L1
<400> 44
Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala
1               5                  10
<210> 45
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> SJ25C1 CDR L2
<400> 45
Ser Ala Thr Tyr Arg Asn Ser
1               5
<210> 46
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> SJ25C1 CDR L3
<400> 46
Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr Thr
1               5
<210> 47
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> SJ25C1 CDR H1
<400> 47
Ser Tyr Trp Met Asn
1               5
<210> 48
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> SJ25C1 CDR H2
<400> 48
Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys
1               5                  10                  15
Gly
<210> 49
<211> 13
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> SJ25C1 CDR H3
<400> 49
Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr
1               5                  10
<210> 50
<211> 122
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> SJ25C1 VH
<400> 50
Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
1               5                  10                  15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe
50                  55                  60
Lys Gly Gln Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Gln Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85                  90                  95
Ala Arg Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp
100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210> 51
<211> 108
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> SJ25C1 VL
<400> 51
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1               5                  10                  15
Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn
20                  25                  30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Ser Ala Thr Tyr Arg Asn Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val Gln Ser
65                  70                  75                  80
Lys Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr
85                  90                  95
Thr Ser Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100                 105
<210> 52
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Линкер
<400> 52
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1               5                  10                  15
<210> 53
<211> 245
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> SJ25C1 scFv
<400> 53
Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
1               5                  10                  15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe
50                  55                  60
Lys Gly Gln Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Gln Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85                  90                  95
Ala Arg Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp
100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115                 120                 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser
130                 135                 140
Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Val Thr Cys
145                 150                 155                 160
Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys
165                 170                 175
Pro Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Ser Ala Thr Tyr Arg Asn
180                 185                 190
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
195                 200                 205
Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val Gln Ser Lys Asp Leu Ala Asp Tyr Phe
210                 215                 220
Cys Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr Thr Ser Gly Gly Gly Thr Lys
225                 230                 235                 240
Leu Glu Ile Lys Arg
245
<210> 54
<211> 12
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> FMC63 HC-CDR3
<400> 54
His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr
1               5                  10
<210> 55
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> FMC63 LC-CDR2
<400> 55
His Thr Ser Arg Leu His Ser
1               5
<210> 56
<211> 18
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Линкер
<400> 56
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr
1               5                  10                  15
Lys Gly
<210> 57
<211> 735
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность, кодирующая scFv
<400> 57
gacatccaga tgacccagac cacctccagc ctgagcgcca gcctgggcga ccgggtgacc 60
atcagctgcc gggccagcca ggacatcagc aagtacctga actggtatca gcagaagccc 120
gacggcaccg tcaagctgct gatctaccac accagccggc tgcacagcgg cgtgcccagc 180
cggtttagcg gcagcggctc cggcaccgac tacagcctga ccatctccaa cctggaacag 240
gaagatatcg ccacctactt ttgccagcag ggcaacacac tgccctacac ctttggcggc 300
ggaacaaagc tggaaatcac cggcagcacc tccggcagcg gcaagcctgg cagcggcgag 360
ggcagcacca agggcgaggt gaagctgcag gaaagcggcc ctggcctggt ggcccccagc 420
cagagcctga gcgtgacctg caccgtgagc ggcgtgagcc tgcccgacta cggcgtgagc 480
tggatccggc agccccccag gaagggcctg gaatggctgg gcgtgatctg gggcagcgag 540
accacctact acaacagcgc cctgaagagc cggctgacca tcatcaagga caacagcaag 600
agccaggtgt tcctgaagat gaacagcctg cagaccgacg acaccgccat ctactactgc 660
gccaagcact actactacgg cggcagctac gccatggact actggggcca gggcaccagc 720
gtgaccgtga gcagc                                                  735
<210> 58
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Шарнир
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (1)...(1)
<223> Xaa1 представляет собой глицин, цистеин или аргинин
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (4)...(4)
<223> Xaa4 представляет собой цистеин или треонин
<400> 58
Xaa Pro Pro Xaa Pro
1               5
<210> 59
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Шарнир
<400> 59
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1               5                  10                  15
<---