ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПИЩЕВОГО DHA-ФОСФОЛИПИДА В ОТНОШЕНИИ НАКОПЛЕНИЯ DHA И DPA В ГОЛОВНОМ МОЗГЕ НОВОРОЖДЕННЫХ
EFFICACY OF FOOD DHA-PHOSPHOLIPID FOR BRAIN DHA AND DPA ACCRETION IN NEONATES

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к применению DHA, переносимой фосфолипидами, для увеличения количества DPA или DHA и DPA в тканях и/или органах молодого млекопитающего. В частности, настоящее изобретение относится к применению детской смеси, содержащей переносимую фосфолипидами DHA, для увеличения количества DPA или DHA и DPA в тканях и/или органах молодого млекопитающего.
Уровень техники
Материнское молоко считается «золотым стандартом», когда речь идет о питании грудных детей. Однако случается, что по ряду причин мать не имеет возможности кормить грудью своего ребенка в количестве, достаточном для ежедневного обеспечения необходимым набором питательных веществ. Смеси для питания младенцев были разработаны, чтобы служить в качестве замены в тех ситуациях, когда грудное вскармливание является недостаточным, или же в тех случаях, если оно вообще не может быть реализовано на практике.
Одними из ингредиентов или компонентов, как правило, содержащимися на сегодняшний день в смесях для детского питания, являются длинноцепочечные полиненасыщенные жирные кислоты (LC-PUFA). Опубликованы многочисленные данные о пользе LC-PUFA для здоровья младенцев. Например, поскольку развивающийся мозг накапливает большое количество DHA во время дородового и послеродового развития, которое продолжается в течение первых 2 лет после рождения, потребление LC-PUFA, в частности DHA, важно для поддержания нормального физического развития мозга, глаз и нервов и, в особенности, у детей этой возрастной категории. Кроме того, DHA играет структурную и функциональную роль в сетчатке, и ее потребление способствует развитию зрительной системы у младенцев в возрасте до 12 месяцев. Поэтому, включение LC-PUFA в смеси для детского питания является желательным и часто поддерживается надзорными органами, контролирующими продукты питания (см. директиву комиссии ЕС 2006/141/EC).
Классами природных липидов, которые переносят большинство LC-PUFA в пищевых продуктах, являются триацилглицериды [«TAG»] и фосфолипиды [«PL»]. В зрелом грудном молоке человека, приблизительно 85% LC-PUFA присутствуют в виде триацилглицеридов, а 15% LC-PUFA присутствуют в виде фосфолипидов; большинство DHA в абсолютных цифрах встречается в триацилглицеридах вследствие подавляющего преобладания в молоке триацилглицеридов относительно фосфолипидов.
in vivo
После попадания в организм, PL-связанные LC-PUFA и TAG-связанные LC-PUFA расщепляются, всасываются, транспортируются к своим органам-мишеням и поглощаются различными тканями. Однако  метаболизм LC-PUFA, в частности, конкретные взаимодействия среди вводящих ненасыщенные связи и удлиняющих ферментов биосинтетических путей, включающих молекулы DHA, EPA и DPA, и их межмолекулярные превращения в тканях млекопитающих еще полностью не выяснены. Поэтому, значимость этих питательных веществ, содержащихся на детских смесях, может быть в настоящее время не в полной мере оценена и/или даже недооценена, несмотря на имеющиеся на настоящий момент данные. Кроме того, в настоящее время, как правило, законодательство запрещает включение фосфолипидов выше определенного порогового значения. Интерес был в основном направлен на DHA, EPA и АА, поскольку эти LC-PUFA были признаны, как играющие важную роль в поддержании роста и развитии младенцев. Кроме того, аналогичные LC-PUFA, такие как докозапентаеновая кислота (DPA) в очищенной форме, подходящей для детского питания, являются дорогими ингредиентами. В свете этих ограничений, наличие знаний о метаболических путях и распределении в тканях и органах для LC-PUFA, содержащихся в фосфолипидах, может быть полезным для использования в дальнейшей оптимизации смесей для детского питания в отношении содержания отдельных LC-PUFA и/или для подтверждения выгодности их применения и их пользы.
В WO 96/10922 раскрыта смесь жиров, и продукты питания, включающие указанную смесь жиров, которая содержит арахидоновую кислоту и докозагексаеновую кислоту, присутствующие в виде фосфолипидов, в определенном соотношении. В частности, раскрыта смесь жиров, основанная на животных и растительных, необязательно, включая микробные, маслах и/или жирах и лецитинах, содержащих длинноцепочечные полиненасыщенные жирные кислоты, отличающаяся тем, что арахидоновая кислота, присутствующая в жировой смеси в форме фосфолипидов, составляет от 0,2 до 3,0 мг на г общего жира, и докозагексаеновая кислота, присутствующая в виде фосфолипидов, составляет от 0,1 до 2,0 мг на г общего жира, и арахидоновая кислота и докозагексаеновая кислота, присутствующие в жировой смеси в форме триглицеридов, каждая составляет от 0,05 до 1,5 мас.% от суммы жирных кислот, присутствующих в форме триглицеридов.
et al.
14
14
14
Graf  (Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids 83 (2010) 89-96) показали, что перорально вводимая DHA достигает мозга у 2-, 4- и 10-недельных крыс. Кроме того, у 10-недельных крыс, ткани и органы, такие как печень, мозг, почки и передний увеальный тракт (сетчатка), накапливали в 2-3 раза больше радиоактивности из С-DHA после введения С-DHA-PC по сравнению с введением С-DHA-TAG.
В ЕР 2 110 027 А1 автора Nestec S.A. (WO 2009/121839 А1) раскрыта материнская диета, которая может соблюдаться женщинами в период беременности и лактации, и которая повышает уровень DHA у новорожденных, например, чтобы поддерживать развитие головного мозга и сетчатки новорожденного. Указанная композиция материнской диеты оказалась не только эффективной при введении непосредственно ребенку, но также была эффективной при введении матери. Указанный источник липидов включает, по меньшей мере, одну LC-PUFA, выбранную из группы, состоящей из арахидоновой кислоты, эйкозатриеновой кислоты, эйкозапентаеновой кислоты и докозапентаеновой, докозагексаеновой кислоты (DHA), которые могут находиться в форме, выбранной из группы, состоящей из фосфолипидов, фосфатидилхолина, фосфатидилэтаноламина, N-ацилфосфатидилэтаноламина, фосфатидилинозитола и фосфатидилсерина.
До настоящего времени, хотя женское молоко, как известно, содержат DPA, основное внимание в данной области было сфокусировано на повышении уровня DHA в головном мозге.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к применению пищевой DHA, содержащей фосфолипид (PL-DHA) (в производстве продукта), для увеличения количества DPA или количества DHA и DPA в тканях и/или органах молодого млекопитающего. В частности, настоящее изобретение относится к увеличению количества DPA или количества DHA и DPA в головном мозге или, более конкретно, в сером веществе головного мозга молодого млекопитающего. Более конкретно, увеличение DPA или количества DHA и DPA достигается в тканях и/или органах, которые содержат или состоят из богатой мембранами ткани, нервной ткани, ткани головного мозга, серого вещества коры головного мозга, серого вещества головного мозга, синаптосом, сетчатки, печени, головного мозга и/или глаз молодого млекопитающего, предпочтительно головного мозга, сетчатки и печени, более предпочтительно, головного мозга. Млекопитающим, предпочтительно, является младенец.
DPA представляет собой дорогостоящую LC-PUFA, которая изучена менее других LC-PUFA, таких как EPA, DHA, ARA или ALA. Растущее количество данных показывает, что DPA является важным компонентом, отвечающим за воспаление, познавательные процессы и сердечную деятельность в организме млекопитающего. Принимая во внимание то, что при употреблении PL-DHA это соединение может быть найдено в виде DPA в определенных органах и тканях у младенцев, в настоящее время, таким образом, стало возможным сделать более осознанный выбор не включать DPA или снизить содержание DPA в детских молочных смесях, зная, что содержание DPA в организме ребенка может быть достигнуто путем введения PL-DHA. Без необходимости использования дорогостоящих DPA-ингредиентов все еще можно увеличить содержание DPA в целевых органах и тканях у растущего ребенка. Этот эффект соблюдается даже в ситуации, когда DPA не в включена в схему питания при условии, что PL-DHA присутствует в формуле. Возможность включения PL-DHA в детские смеси вместо DPA позволяет производить менее дорогую детскую смесь.
Во всей заявке термины «DHA, содержащая фосфолипид» и PL-DHA будут использоваться взаимозаменяемо и означают, что одна или по меньшей мере одна цепь DHA химически связаны или этерифицированы фосфолипидной цепью, т.е. пищевая композиция содержит фосфолипиды, которые содержат DHA. В пищевых композициях по изобретению по меньшей мере часть фосфолипидов, присутствующих в композиции, таким образом, включает в себя DHA. В предпочтительном варианте осуществления пищевая DHA присутствует в положении sn-2 фосфолипидного носителя. В контексте настоящего изобретения термин «пищевая DHA, содержащая фосфолипид» уточняет, что PL-DHA является частью рациона или дополняет рацион молодого млекопитающего, таким образом, отличаясь от повышенного уровня DPA или DHA и DPA в тканях и органах млекопитающего, который является целью.
В предпочтительном варианте осуществления фосфолипид, присутствующий в пищевой композиции, является яичным фосфолипидом. Более предпочтительно, фосфолипид выбирают из группы, состоящей из фосфатидилхолина, фосфатидилсерина, фосфатидилэтаноламина, лизофосфатидилхолина, сфингомиелина, лизофосфатидилэтаноламина и фосфатидилинозитола. Предпочтительно, чтобы фосфолипид содержал по меньшей мере фосфатидилхолин, либо фосфолипид содержал смесь яичных фосфолипидов, содержащих фосфатидилхолин, в количестве от 60 до 80 масс.% по отношению к смеси фосфолипидов. Более предпочтительно, чтобы фосфолипид являлся частью смеси, в которой фосфатидилхолин присутствует в количестве от 65 до 75 масс. % по отношению к смеси фосфолипидов, наиболее предпочтительно, от 70 до 75 масс.%. Другие предпочтительные фосфолипиды включают фосфолипиды из масла криля, фосфолипиды из рыбьего жира и фосфолипиды, полученные из водорослей.
В свете информации о пользе для здоровья детей, в предпочтительном варианте осуществления пищевая DHA, содержащая фосфолипид, присутствует в смеси для детского питания. Предпочтительно, чтобы возраст младенца составлял от 0 до 36 месяцев, предпочтительно, от 0 до 24 месяцев, более предпочтительно, от 0 до 12 месяцев. Следовательно, в предпочтительном варианте осуществления пищевая DHA, содержащая фосфолипид, содержится в смеси для детского питания, которая адаптирована для питания детей в возрасте от 0 до 36 месяцев, предпочтительно, от 0 до 24 месяцев, более предпочтительно, от 0 до 12 месяцев или от 0 до 6 месяцев. В другом предпочтительном варианте осуществления детская смесь предназначена для недоношенных детей.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения количество DHA увеличивается по меньшей мере 1,5 раза, более предпочтительно, примерно в 2 раза, а количество DPA увеличивается по меньшей мере в 2 раза, предпочтительно, в 2-4 раза, предпочтительно, в 2-3 раза, более предпочтительно, в 2,8 раза.
В предпочтительном варианте осуществления количество DPA увеличивается по меньшей мере в 2 раза, предпочтительно, в 2-4 раза, предпочтительно, в 2-3 раза, более предпочтительно, в 2,8 раза в головном мозге молодого млекопитающего.
В предпочтительном варианте осуществления количество DPA увеличивается по меньшей мере в 2 раза, предпочтительно, в 2-4 раза, предпочтительно, в 2-3 раза, более предпочтительно, в 2,6 раза в печени молодого млекопитающего.
В предпочтительном варианте осуществления количество DPA увеличивается по меньшей мере в 2 раза, предпочтительно, в 2-4 раза, предпочтительно, в 2-3 раза, более предпочтительно, в 2,4 раза в сетчатке молодого млекопитающего.
В предпочтительном варианте осуществления количество DPA увеличивается по меньшей мере в 2 раза, предпочтительно, в 2-4 раза, предпочтительно, в 2-3 раза, более предпочтительно, в 2,8 раза в синаптосомах молодого млекопитающего.
В предпочтительном варианте осуществления увеличение количества DPA или DHA и DPA достигается за счет превращения из PL-DHA. Более предпочтительно, увеличение количества DPA происходит одновременно и/или наряду с и/или в результате повышения количества DHA.
Кроме того, настоящее изобретение относится к применению DHA, содержащей фосфолипид в качестве носителя (в производстве продукта), для повышения уровня DPA или DHA и DPA в головном мозге молодого млекопитающего.
Кроме того, настоящее изобретение относится к применению пищевой DHA, содержащей фосфолипид (в производстве продукта), для улучшения здоровья молодого млекопитающего, предпочтительно, младенца, путем увеличения количества DPA или DHA и DPA в тканях и/или органах указанного млекопитающего.
Настоящее изобретение также относится к применению пищевой DHA, содержащей фосфолипид (PL-DHA), в производстве питательной композиции для увеличения содержания DPA или DHA и DPA в тканях и/или органах молодого млекопитающего, предпочтительно, младенца. Изобретение также относится к композиции, применяемой для повышения количества DPA или DHA и DPA в тканях и/или органах молодого млекопитающего, предпочтительно, младенца, где указанная композиция содержит DHA, содержащую фосфолипид (PL-DHA). Предпочтительно, чтобы указанный младенец являлся недоношенным младенцем. Настоящее изобретение также относится к способу увеличения количества DPA или DHA и DPA в тканях и/или органах молодого млекопитающего, предпочтительно, младенца, в результате потребления молодым млекопитающим пищевой DHA, содержащей фосфолипид (PL-DHA). Предпочтительно, чтобы указанный младенец является недоношенным младенцем. В одном аспекте настоящее изобретение относится к (нетерапевтическому) способу поддержки здорового развития мозга молодого млекопитающего, причем указанный способ включает повышение количества DPA или DHA и DPA в тканях и/или органах молодого млекопитающего, в результате потребления молодым млекопитающим пищевой DHA, содержащей фосфолипид (PL-DHA).
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к применению биологически активной DHA, содержащей фосфолипид (в производстве продукта) для увеличения количества DPA или количества DHA и DPA в тканях и/или органах молодого млекопитающего, предпочтительно младенца. В частности, настоящее изобретение относится к увеличению количества DPA или количества DHA и DPA в сером веществе головного мозга молодого млекопитающего. Более конкретно, увеличение DPA или DHA и DPA достигается в тканях и/или органах, которые содержат или состоят из нервной ткани, ткани головного мозга, серого вещества коры головного мозга, серого вещества головного мозга, сетчатки, печени, головного мозга и/или глаз молодого млекопитающего. Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что добавление в рацион пищевой DHA, содержащей фосфолипиды, приводит к увеличению количества DHA в указанных тканях и органах (биологических мишенях), которое сопровождается повышением уровня DPA.
LC-PUFA являются важными компонентами детского питания. LC-PUFA играют важную роль в процессе быстрого развития детского мозга у млекопитающих и человека. Большое количество DHA накапливается в развивающемся головном мозге и сетчатке во время внутриутробного роста и раннего постнатального роста, в течение которого накопление DHA в тканях головного мозга продолжается на высоком уровне примерно до 2 лет. DHA является наиболее распространенной жирной кислотой омега-3 в головном мозге млекопитающих, составляя 8-14% от содержания жирных кислот в перинатальном периоде у приматов, включая человека. В организме человека DHA накапливается со скоростью, увеличивающейся с середины беременности, достигающей максимума в первые месяцы после рождения и сохраняющейся долго после достижения веса мозга плато, достигая плато в районе около 18 лет и оставаясь стабильной до конца жизни. После рождения, LC-PUFA выборочно включаются, удерживаются и концентрируются на высоком уровне в фосфолипидном бислое биологически активного мозга и в мембранах нервных клеток сетчатки. DHA составляет около 40% от общего количества жирных кислот в мембранах фоторецепторов в сетчатке, что делает ее одной из основных составляющих мембраны. Кроме того, LC-PUFA, включая DHA, влияют на функцию мембраны, дифференцировку фоторецепторов, активацию зрительного пигмента родопсина, активность ряда ферментов, функцию ионных каналов, а также на уровни и метаболизм нейромедиаторов и эйкозаноидов. У недоношенных детей поставка LC-PUFA преждевременно прерывается, и, поэтому, недоношенные дети подвергаются более высокому риску недостаточного накопления DHA в связи с прекращением плацентарного питания. Таким образом, LC-PUFA, в частности, DHA, поддерживают нормальное развитие мозга у детей младшего возраста наряду с поддержкой развития сетчатки и иммунной функции.
DPA, другой вид омега-3 LC-PUFA (обычно обозначаемая, как 22:5 (n-3)), является менее изученной, чем DHA и EPA, вследствие своего естественно низкого содержания в пищевых добавках, таких как яичный желток и масло криля, и более ограниченного предложения в чистом виде. Однако она участвует в ингибировании агрегации тромбоцитов, и существуют доказательства того, что DPA играет важную роль в процессах ранозаживления, способности эндотелиальных клеток к миграции и развитии тромбоза. Кроме того, DPA обладает транскрипционной активностью и снижает экспрессию липогенных генов, активность печеночных ферментов FAS и малеинового фермента. Также, DPA играет положительную роль в снижении экспрессии воспалительных генов и участвует в снижении активности холестерина (в частности, в снижении общего холестерина в плазме и холестерина липопротеинов низкой плотности) и значительно улучшает функции аорты (в частности, снижает напряженность аорты и усиливает расслабление аорты). Однако на сегодняшний день прямое включение DPA в качестве источника LC-PUFA в смеси для детского питания не поддерживается регулирующими органами. В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к применению пищевой DHA, содержащей фосфолипид, для улучшения здоровья молодого млекопитающего, предпочтительно, младенца, путем увеличения количества DPA или обеих DHA и DPA в тканях и/или органах указанного млекопитающего. В частности, улучшение здоровья по настоящему изобретению включает уменьшение воспаления, улучшение иммунологических реакций, снижение риска тромбоза, усиление процессов ранозаживления и/или снижение активности холестерина (в частности, снижение общего холестерина в плазме и холестерина липопротеинов низкой плотности) и значительное улучшение функции аорты (в частности, снижение напряженности аорты и усиление расслабления аорты).
Представленные в данном документе данные о том, что содержащая фосфолипид пищевая DHA преобразуется в DPA в различных тканях и органах младенцев или молодых млекопитающих, указанных в данном документе, могут быть использованы для представления более полной картины полезного действия содержащей фосфолипиды пищевой DHA. Кроме того, понимание того, что у новорожденных млекопитающих DHA превращается в DPA, обеспечивает преимущество в том, что это конкретное соединение не обязательно включать в детские смеси для достижения известных эффектов на здоровье, так как в настоящее время накапливается все больше информации о том, что уровень DPA будет увеличиваться за счет добавления DHA.
В предпочтительном варианте осуществления, фосфолипидом, который включает в себя пищевую DHA, является яичный фосфолипид. Более предпочтительно, чтобы фосфолипид был выбран из группы, состоящей из фосфатидилхолина, фосфатидилсерина, фосфатидилэтаноламина, лизофосфатидилхолина, сфингомиелина, лизофосфатидилэтаноламина и фосфатидилинозитола, предпочтительно, фосфатидилхолина или любой смеси указанных яичных фосфолипидов, но по меньшей мере содержащей фосфатидилхолин. Пищевая DHA, содержащая фосфолипид по изобретению, подходит для использования в детской смеси. Преимуществом использования яичных фосфолипидов является их превосходная усвояемость вследствие природных эмульгирующих свойств, присущих яичным фосфолипидам. Другие предпочтительные фосфолипиды включают получаемые из или присутствующие в масле криля, рыбьем жире и/или выделенные или получаемые из водорослей.
В предпочтительном варианте осуществления пищевая DHA состоит из смеси двух или нескольких, трех или нескольких, четырех или нескольких, или пяти или нескольких различных фосфолипидов. Предпочтительно, чтобы фосфолипидная смесь содержала по меньшей мере 60 масс.%, более предпочтительно, по меньшей мере 65 масс.%, наиболее предпочтительно, по меньшей мере 70 масс.% фосфатидилхолина в расчете на общий вес фосфолипидов. Предпочтительно, чтобы указанная смесь фосфолипидов (содержащая DHA) содержала по меньшей мере 70-75 масс.% фосфатидилхолина. Она может дополнительно включать в себя следующие дополнительные фосфолипиды в указанных количествах: 15-20 масс.% фосфатидилэтаноламина; 3-4 масс.% лизофосфатидилхолина; 2-3 масс.% сфингомиелина; 1-2 масс.% лизофосфатидилэтаноламина; и 2-3 масс.% фосфатидилинозитола. В альтернативном варианте осуществления указанная смесь фосфолипидов содержит по меньшей мере 70-75 масс.% фосфатидилхолина и дополнительно включает в себя следующие дополнительные фосфолипиды в указанных количествах: 20-25 масс.% фосфатидилэтаноламина, 0,5-2 масс.% фосфатидилинозитола и 2-8 масс.% кардиолипина.
В предпочтительном варианте осуществления пищевая DHA содержит фосфолипид, то есть связана с фосфолипидом. В более предпочтительном варианте осуществления пищевая DHA присутствует в положении sn-2 фосфолипидного носителя по настоящему изобретению.
После гидролиза DHA, этерифицированной фосфолипидным носителем, она может быть полноценно участвовать в нормальных метаболических процессах. Панкреатическая липаза гидролизует триацилглицериды в положениях sn-1 и sn-3, что соответствует сохранению преимущественно насыщенных sn-2 жирных кислот грудного молока после всасывания, в то время как кишечные фосфолипазы у крыс гидролизуют положение sn-2 оставляя преимущественно насыщенное положение sn-1 нетронутым. Позиционная специфичность гидролиза глицеролипидов в кишечнике гарантирует, что образующийся после всасывания фосфолипид будет иметь неслучайное распределение жирных кислот, несмотря на случайную перетасовку гидролизованных жирных кислот. Позиционная специфичность может иметь метаболическое значение в последующем обмене веществ, поскольку жирные кислоты включаются в мембраны, окисляются или выводятся на кожу. После повторной сборки в триглицериды, фосфолипиды и холестерино- и жирорастворимые сложные эфиры витаминов в энтероцитах, поглощенные липиды образуют липопротеиновые частицы, что позволяет их перенос в кровь для распределения по различным тканям.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения количество DHA увеличивается примерно в 2 раза, предпочтительно, в 1,9 раза в головном мозге молодого млекопитающего. Дополнительно или в качестве альтернативы, количество DPA увеличивается в 2-4 раз, предпочтительно, в 2-3 раза, более предпочтительно, 2,8 раза в головном мозге молодого млекопитающего.
В предпочтительном варианте осуществления количество DPA увеличивается по меньшей мере в 2 раза, более предпочтительно, в 2-4 раза, предпочтительно, в 2-3 раза, более предпочтительно, в 2,8 раза в головном мозге молодого млекопитающего при использовании PL-связанной DHA по сравнению с (соответствующим количеством) TAG-связанной DHA. В предпочтительном варианте осуществления количество DPA увеличивается по меньшей мере в 2 раза, более предпочтительно, в 2-4 раза, предпочтительно, в 2-3 раза, более предпочтительно, в 2,6 раза в печени молодого млекопитающего при использовании PL-связанной DHA по сравнению с (соответствующим количеством) TAG-связанной DHA. В предпочтительном варианте осуществления количество DPA увеличивается по меньшей мере в 2 раза, более предпочтительно, в 2-4 раза, предпочтительно, в 2-3 раза, более предпочтительно, в 2,4 раза в сетчатке молодого млекопитающего при использовании PL-связанной DHA по сравнению с (соответствующим количеством) TAG-связанной DHA. В предпочтительном варианте осуществления количество DPA увеличивается по меньшей мере в 2 раза, более предпочтительно, в 2-4 раза, предпочтительно, в 2-3 раза, более предпочтительно, в 2,8 раза в синаптосомах молодого млекопитающего при использовании PL-связанной DHA по сравнению с (соответствующим количеством) TAG-связанной DHA.
В предпочтительном варианте осуществления, увеличение количества DPA достигается за счет превращения из пищевой DHA. Более предпочтительно, увеличение количества DPA происходит одновременно и/или наряду с и/или в результате увеличения DHA.
В предпочитаемой варианте осуществления пищевая DHA, содержащая фосфолипид, присутствует в полноценной композиции PUFA омега-6, содержащей полиненасыщенные жирные кислоты омега-3 и омега-6, предпочтительно, в весовом соотношении омега-6:омега-3 PUFA, составляющем по меньшей мере 2:1.
Композиция, содержащая пищевую DHA, содержащую фосфолипид, предпочтительно, содержит линолевую кислоту (LA) и альфа-линоленовую кислоту (ALA), предпочтительно, в весовом соотношении LA:ALA, составляющем по меньшей мере 2:1, более предпочтительно, от 6:1 до 16:1.
Композиция, содержащая пищевую DHA, содержащую фосфолипид, предпочтительно содержит по меньшей мере 0,1 масс.%, предпочтительно, по меньшей мере 0,2 масс.%, более предпочтительно, по меньшей мере 0,25 масс.%, еще более предпочтительно, по меньшей мере 0,50 масс.% омега-3 PUFA в расчете на общее содержание жира. Содержание омега-3, предпочтительно, не превышает 10 масс.%, более предпочтительно, не превышает 5 масс.% от общего содержания жира. В предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере 50%, более предпочтительно, по меньшей мере 75%, наиболее предпочтительно, по меньшей мере 90% всей DHA в композиции представлено в виде PL-DHA.
В предпочтительном варианте осуществления пищевая DHA, содержащая фосфолипид, присутствует в детской смеси. В одном варианте осуществления, детская смесь дополнена DHA, содержащей фосфолипид. Предпочтительно, чтобы возраст младенца составлял от 0 до 36 месяцев, предпочтительно, от 0 до 24 месяцев, более предпочтительно, от 0 до 12 месяцев. Следовательно, в предпочтительном варианте осуществления пищевая DHA, содержащая фосфолипид, содержится в смеси для детского питания, которая предназначена для кормления детей в возрасте от 0 до 36 месяцев, предпочтительно, от 0 до 24 месяцев, более предпочтительно, от 0 до 12 месяцев или даже от 0 до 6 месяцев. В другом предпочтительном варианте осуществления детская смесь специально разработана и/или подходит для недоношенных детей. В одном варианте осуществления младенец нуждается в повышенном уровне DPA в ткани и/или органах, описанных выше в данном документе. В одном варианте осуществления младенец имеет физиологически приемлемый уровень DHA в этих тканях и/или органах. В одном варианте осуществления младенец подвергается риску или страдает от нарушения уровня DPA в ткани и/или органах, описанных выше в данном документе.
В предпочтительном варианте осуществления пищевая DHA, содержащая фосфолипид, присутствует в детской смеси, имеющей энергетическую ценность 60-70 ккал/100 мл, дополнительно содержащей соответствующие количества белков, жиров и углеводов.
Предпочтительно, чтобы детская смесь включала на 100 ккал питательных веществ следующие макро- и микроэлементы: от 1,8 до 3,0 г белка, общее содержание жира, предпочтительно, находящееся в пределах от 4,4 до 6,0 г, из которых линолевая кислота составляет, предпочтительно, по меньшей мере 300 мг или 300-1200 мг, а альфа-линоленовая кислота, предпочтительно, составляет по меньшей мере 50 мг, предпочтительно, чтобы соотношение линолевой и альфа-линоленовой кислот находилось в пределах от 5:1 до 15:1, предпочтительно, чтобы суммарное содержание лауриновой и миристиновой кислот от общего содержания жира составляло от 10 до 30 масс.%, предпочтительно, прмерно 20 масс.%, предпочтительно, чтобы уровень транс-жирных кислот составлял примерно 2-4 масс.% от общего содержания жира, и эруковая кислота, предпочтительно, присутствовала в количестве от примерно 0,5 до 2 масс.% или примерно 1 масс.% от общего содержания жира в смеси для детского питания.
Весовое соотношение сывороточного белка относительно общего суммарного количества остальных белков в смеси для детского питания, предпочтительно, составляет 60:40 или превышает 0,6. Белок молочной сыворотки может присутствовать в интактной или гидролизованной форме.
В предпочтительном варианте осуществления смесь для детского питания имеет содержание углеводов в диапазоне от 9 до 14 г на 100 ккал питательных веществ, из которых, предпочтительно, лактоза присутствует в количестве по меньшей мере 4,5 г на литр готовой к употреблению смеси или, в альтернативном варианте, более 85 масс.% от общего содержания углеводов.
В предпочтительном варианте осуществления, смесь для детского питания по настоящему изобретению содержит фосфолипиды в количестве не более 2 г/л в готовой к употреблению смеси или не более 300 мг на 100 ккал.
Кроме того, настоящее изобретение относится к применению фосфолипида в качестве носителя пищевой DHA для повышения уровня DPA или DHA и DPA в головном мозге молодого млекопитающего, где указанным молодым млекопитающим, предпочтительно, является младенец, имеющий риск или страдающий от снижения уровня DPA в ткани и/или органах.
Кроме того, настоящее изобретение относится к применению пищевой DHA, содержащей фосфолипид, для улучшения здоровья или поддержания роста и развития молодого млекопитающего, предпочтительно, младенца, путем увеличения количества DPA или обеих DHA и DPA в тканях и/или органах указанного молодого млекопитающего.
Настоящее изобретение дополнительно относится к применению пищевой DHA, содержащей фосфолипид, в качестве биологически активной пищевой добавки для увеличения количества DPA или ДНА и DPA в тканях и/или органах молодого млекопитающего, предпочтительно, младенца.
Определения
Термин «яичный фосфолипид» в данном документе относится к фосфолипидам, которые естественным образом присутствуют в яйцах и, в частности, в яичных желтках. Эти фосфолипиды легко выделяются из яиц или яичных желтков с использованием мягкого способа экстракции этанолом и коммерчески доступны на рынке для использования в детском питании. Предпочтительные фосфолипиды, получаемые из яиц, включают фосфатидилхолин, фосфатидилсерин, фосфатидилэтаноламин, лизофосфатидилхолин, сфингомиелин, лизофосфатидилэтаноламин и фосфатидилинозитол. Яичный фосфолипид, предпочтительно, относится к фосфолипидной смеси, содержащей значительное количество фосфатидилхолина (РС).
Термин «DHA», сокращение для докозагексаеновой кислоты, в данном описании относится к пищевой длинноцепочечной полиненасыщенной омега-3 жирной кислоте LC-PUFA с углеродной цепью из 22 атомов и 6 двойными связями, присутствующими в ней, имеющей краткое название 22:6 (n-3) в номенклатуре жирных кислот.
Термин «DPA», сокращение для докозапентаеновой кислоты, в данном описании относится к пищевой длинноцепочечной полиненасыщенной омега-3 жирной кислоте LC-PUFA с углеродной цепью из 22 атомов и 5 двойными связями, присутствующими в ней, имеющей краткое название 22:5 (n-3) в номенклатуре жирных кислот.
Термин «младенец» в данном описании относится к человеку, имеющему возраст от 0 до 36 месяцев, предпочтительно, от 0 до 24 месяцев, более предпочтительно, от 0 до 12 месяцев, наиболее предпочтительно, от 0 до нескольких месяцев. В одном варианте осуществления младенец, предпочтительно, является недоношенным младенцем.
Примеры
Химические соединения
C-DHA была получена авторами изобретения с использованием опубликованных способов (Le, P. M.,
2007. Biosynthetic production of universally (13)C-labelled polyunsaturated fatty acids as reference materials for natural health product research. Anal Bioanal Chem 389: 241-249) и этерифицирована липидами различных классов с помощью Avanti Polar Lipids (
). TAG-трейсер (TAG-
C-DHA) имел
С-DHA в положении sn-2 с немеченной кислотой 16:0 в положениях sn-1 и sn-3. Трейсером для PL являлся фосфатидилхолин (PC) с
С-DHA в положении sn-2 и немеченой кислотой 16:0 в положении sn-1 (PC-
C-DHA). Растворители для экстракции липидов из тканей были ВЭЖХ-качества от Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, US) или от Burdick&Jackson (Muskegon, MI, US).
13
13
13
13
13
et al.
Alabaster, AL,US
Животные и рацион
Общее исследование и все процедуры, связанные с живыми поросятами, были одобрены институтским комитетом по уходу и работе с животными (IACUC) в Корнельском университете. Свиноматок (гибрид Йоркшир-Ландрас) скрещивали с хэмпширскими кабанами. После рождения поросят оставляли со свиноматками по меньшей мере на 48 часов. Двадцать поросят 2-4-дневного возраста отбирали для исследования на основе следующих критериев: вес (около 2,0 кг), пол (10 самцов и 10 самок), здоровье (активный и визуально здоровый, и не самое мелкое животное в помете) и по свиноматке. Поросятам присваивали уникальный идентификатор из сочетания номера и цвета, а затем их перевозили в Отдел исследований и обучения для крупных животных (LARTU), Корнельского университета.
В месте проведения исследования поросят размещали в отдельных клетках из нержавеющей стали и сразу по прибытии переводили на единую полностью сбалансированную коммерчески доступную смесь-заменитель молока для молодых сельскохозяйственных животных.
Состав жирных кислот в смеси представлен в таблице 1. DHA присутствует в количестве 0,02 масс.% и немного в большем количестве, но по-прежнему на низком уровне - в PL (0,11 масс.%). Данные для TAG, PL и связанной с ними DHA представлены в таблице 2 в пересчете на порцию в 500 мл. Как и в человеческом грудном молоке и детских смесях, общая энергия от жира составляла около 47%, и из этого преимущественно за счет TAG - 94%. Несмотря на низкую концентрацию DHA в TAG и PL, преобладающее содержание TAG над PL поставляло 73% DHA по сравнению с 27%, поставляемыми PL, опять же аналогично человеческому молоку и молоку других млекопитающих.
<b>Таблица 1</b><b>Состав жирных кислот смеси для питания поросят (заменитель молока) в масс.%.</b>
Насыщ. FA
Разветвленные/CLA
Мононенасыщ. FA
18:2 n-6
20:2 n-6
20:3 n-6
20:4 n-6
22:4 n-6
18:3n-3
20:3 n-3
22:5 n-3
22:6 n-3
TAG
42,3
0,67
41,14
14,12
0,57
0,10
0,25
0,10
0,53
0,12
0,04
0,02
PL
55,8
2,90
28,71
7,35
0,34
0,95
2,63
0,12
0,69
0,00
0,38
0,11
<b>*показатель жира жвачных животных. FA=жирная кислота</b>
<b>Таблица 2 </b><b>Распределение липидов и DHA в заменителе молока для поросят</b>
TAG
PL
FA (г) на 500 мл
23,9
1,6
Приблизительная энергетическая ценность от FA (%)
43
4
% FA
94
6
DHA (мг) на 500 мл
4,8
1,8
% DHA
73
27
Свежую смесь давали через каждые 6 часов в течение первой недели и через каждые 8 часов после этого через индивидуальные воронки. Все поросята имели свободный доступ к свежей воде. Расход смеси для каждой группы ежедневно регистрировали в течение первой недели, чтобы гарантировать, что они здоровы, и на каждый третий день после этого. Вес тела поросят измеряли и записывали каждый день в течение первой недели, и на каждый третий день после этого. Комфортные условия, включая подстилку, контакты с другими поросятами, положительный контакт с человеком и резиновые игрушки, все было предоставлено. Композиция жирных кислот из заменителя молока (молочная смесь для поросят) приведена в таблице 1.
Введение соединений и отбор проб
13
13
На 16-й день жизни 16 здоровых поросят разделяли на две группы, равноценные по полу, весу и возрасту, но в остальном распределенные случайным образом. Группе «PC» перорально вводили PC-C-DHA; группе TG вводили TG-C-DHA. Четверых наименьших по размену поросят использовали в качестве контроля естественного содержания изотопных элементов, и они не получали соединения, но во всем остальном с ними обращались также, как и с другими группами.
13
13
13
13
3
3
2
Дозы соединений получали, добавляя раствор РС-С-DHA или TAG-C-DHA в CHCl примерно в 1 мл очищенного оливкового масла и удаляя CHCl при слабом нагревании в токе сухого N в течение 4 часов. Полученное оливковое масло аккуратно выливали на поверхность нескольких мл разведенной смеси для поросят и обрабатывали ультразвуком до получения гомогенного раствора. Полученную меченую смесь разделяли на аликвоты по 1-2 мл гравиметрически и перорально вводили поросятам, с последующими несколькими промывками флаконов, содержащих меченую смесь, в начале кормления. Были приняты меры для гарантии того, что вся меченая смесь и промывки, составляющие в общей сложности до 10 мл, были проглочены поросенком. Поросята затем получали свое нормальное питание - 500 мл заменителя молока, которые они обычно потребляли полностью. Дозы для поросят соответствовали примерно 20 мг С-DHA, доставляемой в PC, и 86 мг С-DHA, доставляемой в TAG.
Через шесть дней после дозирования и на первый день после 20 дней введения смеси все поросята были подвергнуты эвтаназии путем обескровливания под анестезией. Кровь для анализа жирных кислот, собирали в пробирки с ЭДТА и центрифугировали для получения красных кровяных клеток. Несколько мм серого вещества на внешней поверхности коры головного мозга быстро собирали при аутопсии. Этот участок был немедленно использовали для получения синаптосом, а остальные серое вещество мгновенно замораживали для анализа жирных кислот. Также собирали сетчатку, сердце, печень, двуглавую мышцу бедра и почки, и все ткани мгновенно замораживали и хранили при -80°С до проведения анализа.
Синаптосомы получали с использованием Syn-PER Synaptic Protein Extraction Reagent (Thermo Scientific, Waltham, MA, US) в соответствии с инструкциями изготовителя. Вкратце, 1 мл Syn-PER Reagent добавляли к примерно 100 мг образца ткани мозга. Образцы гомогенизировали, и гомогенат центрифугировали при
в течение 10 минут. Супернатант собирали и центрифугировали при
в течение 20 минут. Синаптосомы получали в виде осадка, и немедленно выделяли липиды.
1200 g15000 g
Выделение и анализ липидов
et al.
The influence of maternal early to mid-gestation nutrient restriction on long chain polyunsaturated fatty acids in fetal sheep.
A rapid method of total lipid extraction and purification.
3
Общие липиды экстрагировали из образцов серого вещества и белого вещества головного мозга, синаптосомного осадка, печени, сердца и всей сетчатки, которые одновременно расщепляли и получали FAME (метиловые эфиры жирных кислот) с использованием одностадийного способа, подробно описанного ранее (Zhou, Y., 2008.  Lipids 43: 525-531). В случае плазмы и эритроцитов для выделения общих липидов использовали способ Bligh and Dyer, и FAME получали с использованием 14% BF в метаноле (Bligh, E., and W. Dyer. 1959.  Can J Biochem Physiol 37: 911-917). Известное количество свежеприготовленной гептадекановой кислоты в хлороформе (99% чистоты, Sigma Chemical) добавляли в качестве внутреннего стандарта в образцы ткани непосредственно перед выделением. FAME растворяли в гептане и хранили при -20°С до анализа.
Анализ FAME проводили с использованием Hewlett Packard 5890 series II GC-FID с колонкой ВРХ 70 (
, внутренний диаметр
, пленка 0,25 мкм; фирма Hewlett Packard, Palo Alto, СА, U.S.A.) и Н
в качестве газа-носителя. Количественные профили рассчитывали с использованием внутреннего стандарта и равного веса смеси FAME для получения коэффициентов отклика для каждой жирной кислоты.
2
60 м0,32 мм
Анализ
С-DHA
13
Трейсерный анализ
С-DHA выполняли на смесях FAME с использованием условий ГХ-колонки аналогичных используемым для количественного анализа, подробно описанным ранее (Goodman, K. J., and J. T. Brenna. 1992.
. Anal Chem 64: 1088-1095). Инструментарием для трейсерного анализа является газовый хроматограф Agilent 6890, соединенный с входом пламенной печи, а также с масс-спектрометром для определения соотношения изотопов Thermo Scientific 253 (IRMS). FAME, элюируемые с GC, сжигают до CO
, высушивают и вводят в IRMS. Обработку данных проводят как описано ранее (Wijendran, V.,
2002.
Pediatr Res 51: 265-272). Изотопные соотношения в стандартном высокоточном обозначении, δ
C, описанном ранее (Goodman, K. J., and J. T. Brenna. 1992), превращают в долю
. Для каждой жирной кислоты, среднее соотношение изотопов в контрольной группе вычитали из средних изотопных соотношений для обогащенных групп, получая обогащение по фракции атома, которое впоследствии преобразовывали в % дозы, который отражает появление трейсера в конкретном пуле образцов. Главным результатом является относительное сравнение % дозы, появляющегося в сером веществе головного мозга для TAG и PL, соответственно. Общий % дозы, обнаруживаемый в печени и сетчатке, был вычислен непосредственно из их соответствующих весов. Общую меченую DHA оценивали в сером веществе головного мозга и красных кровяных клетках. Относительное количество серого вещества в головном мозге принимали за 60% на основе данных изображений мозга человека (Miller, A. K., R. L. Alston, and J. A. Corsellis. 1980.
Neuropathol Appl Neurobiol 6: 119-132). Для красных кровяных клеток объем крови оценивали как 8,5% от массы тела, и гематокрит составлял около 35%. Для синаптосом серого вещества не пытались оценить общее количество и нормализовали % дозы до самого высокого найденного значения. Во всех случаях ориентировочные массы относятся к обоим экспериментальным группам и отменяются в расчетах первичных и вторичных результатов и, таким образом, не влияют на конечные результаты.
13
13
High sensitivity tracer detection using high-precision gas chromatography-combustion isotope ratio mass spectrometry and highly enriched [U-13C]-labeled precursors
et al.
Efficacy of dietary arachidonic acid provided as triglyceride or phospholipid as substrates for brain arachidonic acid accretion in baboon neonates.
Variation with age in the volumes of grey and white matter in the cerebral hemispheres of man: measurements with an image analyser.
2
13201 C
Статистика
Первичным результатом является относительный % дозы DHA из PC и TAG. Первичным результатом является относительный % дозы
С-DHA, найденный в сером веществе головного мозга в группах, получавших
С-DHA относительно TAG-
С-DHA. % дозы в двух группах введения тестировали на эквивалентность с помощью однофакторного дисперсионного анализа с р<0,05 считающимся значимой.
13
13
13
Вторичные результаты
Общие немеченые жирные кислоты в различных пулах сравнивались попарно в двух группах введения и существенно не отличались, и, поэтому, были объединены. Поскольку эти две группы кормили одной смесью и ухаживали за ними одинаково за исключением введения нескольких мг соединений, не ожидали никаких различий, возникающих от содержания.
Относительный % дозы
C-DHA для синаптосом, сетчатки и печени сравнивали на сходство с первичным результатом. Относительное (относительно питания) количество общей DHA, поставляемой в TAG и PL, рассчитывали исходя из определения относительного количества немеченой DHA в смеси на 500 мл питания.
13
Результаты
Поросята уже давно использовались в качестве принятой модели питания детей из-за своего метаболизма сходного с человеком и использовались в многочисленных исследованиях по изучению аспектов доставки LC-PUFA из TAG относительно PL. Кроме того, свинья в общем считается хорошей моделью развития головного мозга человека, потому что она является одним из немногих экспериментальных животных с всплеском роста мозга, похожим на этот процесс у человека, и она является крупным нежвачным всеядным животным.
Поросята в обеих группах введения росли с одинаковыми темпами и достигли по существу одинакового конечного веса 9,4±0,3 кг и 9,1±0,4 кг для групп введения фосфатидилхолина (PC) и триацилглицерида (TAG), соответственно. Изотопные контрольные группы были преднамеренно выбраны как наиболее мелкие животные и росли параллельно с другими группами, начиная с веса тела меньше примерно на 6% и заканчивая весом, меньшим примерно на 12%. Ожидается, что эти животные дадут точные оценки исходных изотопных отношений, которые применяются одинаково для обеих экспериментальных групп.
13
13
13
Метка C была обнаружена только для DHA и 22:5n-3 (DPAn-3) среди всех жирных кислот. Наибольший % дозы (около 0,4%) был обнаружен в сером веществе коры головного мозга животных, которым вводили C-DHA-PC. Содержание C-DHA при введении TAG-соединения составляло около половины этого значения, таким образом диетический PC оказался в 1,9 раза более эффективен для доставки DHA в развивающийся мозг поросенка, чем TAG. Результаты для синаптосом серого вещества соответствовали относительным величинам. Отношение относительного накопления меченой DHA было в 1,7 раза выше для PC, чем для TAG.
Преобразованный продукт DPA n-3 был помечен ниже 0,05% дозы при введении PC и менее половины от этого при введении TAG. Удивительно, но относительная эффективность PC над TAG существенно отличалась с соотношением примерно 2,8 для серого вещества коры головного мозга, и для синаптосом серого вещества превосходство PC над TAG сохранялось таким же 2,8-кратным.
13
13
13
13
13
Печень удерживала 6,8% от дозы PC-С по сравнению с 3,5% от дозы TAG через 6 дней после введения. Относительная эффективность составила 1,9 аналогично с серым веществом и синаптосомами. Содержание C-DHA в печени было примерно в 20 раз выше чем в сером веществе. Удивительно, но содержание DPAn-3 было значительно повышено, с количеством в печени для PC в 2,6- раза превышающим количество для TAG. В сером веществе, количество C-DHA было примерно в 8 раз выше, чем С-DPA, тогда как в печени количество С-DHA было в 40 раз выше.
13
В случае сетчатки, относительная эффективность PC над TAG составляла 2,2-раза для DHA, и удивительно, достоверно отличалась примерно в 2,4 раза для DPAn-3, аналогично и в соответствии с результатами для других исследованных тканей. Аналогично мозгу, но в отличие от печени, C-DHA было 6,3 раза больше, чем DPAn-3, что еще раз позволяет предположить, что превращение происходит вне печени и, возможно, в сетчатке. Опять же, TAG превалирует в качестве источника DHA для сетчатки.
Данные, представленные в настоящем документе, показывают конверсию DHA в
С-22:5n-3, а также параллельно преимущество для использования PL-связанной DHA. Метки не было найдено в 20:5n-3, что можно было бы ожидать, если 18:3n-3 удлинялась с меченым ацетатом, и не было найдено никаких доказательств присутствия метки в других жирных кислотах, позволяя предположить, что ацетат не является фактором в превращении DHA в DPA. Эти соображения позволяют предположить, что метка в 22:5n-3 не переходит через ацетат.
13