Способ получения флуоресцентных производных арабиногалактана
METHOD FOR PRODUCING FLUORESCENT DERIVATIVES OF ARABINOGALACTAN

Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа получения новых люминесцентно-меченых биополимеров на основе арабиногалактана, которые могут использоваться для визуализации клеточных мембран, а также для создания систем доставки лекарственных средств [S.A. Kuznetsova et al. Sulfated Derivatives of Arabinogalactan and Their Anticoagulant Activity. // Russ J Bioorg Chem 46, 1323-1329].
На сегодняшний день наиболее широко используемыми в качестве флуоресцентных меток являются производные флуоресцеина и родамина, поскольку они могут быть соответствующим образом возбуждены обычно используемыми источниками света, такими как аргоновый лазер (линии 488 нм и 514 нм) и ртутная дуговая лампа (линия 546 нм). Однако они обладают некоторыми нежелательными свойствами, которые могут препятствовать их использованию. Например, производные флуоресцеина могут быть фотообесцвечены с относительно высокой скоростью и демонстрировать рН-зависимое поглощение, которое приводит к значительному снижению флуоресценции при физиологическом значении рН 7 или ниже. Производные родамина относительно фотостабильны и проявляют нечувствительную к рН флуоресценцию по сравнению с производными флуоресцеина. Они проникают в клетки легче, чем производные флуоресцеина. В результате родамины широко используются в флуоресцентной микроскопии, в качестве флуоресцентных зондов и молекулярных маркеров в химии и биохимии, в проточной цитометрии и иммуноферментном анализе [Yuan-Qiang Sun et al. Rhodamine-Inspired Far-Red to Near-Infrared Dyes and Their Application as Fluorescence Probes // Angew. Chem. Int. Ed. 2012, 51, 7634-7636].
В настоящее время флуоресцирующие природные полимеры представляют интерес из-за их многообещающего применения в биомедицинском маркировании, отслеживании, визуализации и диагностике, особенно в системах доставки лекарств. Уникальной особенностью природных полимеров по сравнению с синтетическими является их способность к биодеградации. Сочетание полисахаридов или производных полисахаридов с флуоресцентными методами приводит к перспективным применениям их в биомедицинской области, экспериментальной медицине и биологии.
Среди полисахаридов для создания их флуоресцентных производных нашли применение декстран, хитозан, гепарин и др. Органические флуорофоры могут быть присоединены к полимерным цепям через ковалентные или нековалентные связи и способны флуоресцировать в большом диапазоне длин волн, в зависимости от их природы. Синтез флуоресцентных полимеров, как правило, осуществляется с использованием двух устоявшихся методов. Первый - через полимеризацию флуоресцентных мономеров, а второй - через прикрепление флуоресцентных фрагментов к полимерной основе за счет ковалентного связывания [В.Н. Серова и др. Спектрально-флуоресцентные характеристики родамина 6 Ж в модифицированных (со)полиметакрилатных матрицах. // Вестник Казанского технологического университета. 2012 15(6):111-113]. Для сохранения свойств природного полимера последний способ часто оказывается более полезным [Hun Min Lee et al. Simple Synthesis of Fluorophore Using Water-Soluble Chitosan Oligomer. // International Conference on Applied Mathematics, Simulation and Modelling (AMSM 2016). P 435-436].
Однако большинство флуоресцентно-меченных полимеров характеризуется низкими квантовыми выходами флуоресценции, что может быть связано с изменениями структуры молекул красителя, вызванными их ковалентным присоединением к макромолекулам полисахарида. В то же время флуоресцентные молекулы, используемые в качестве зондов, имеют квантовые выходы, начиная с 5%. Это обусловливает актуальность получения флуоресцентных полимеров путем нековалентного взаимодействия флуорофора с биомакромолекулами, например, за счет электростатического притяжения [СА. Силинг и др. Влияние кислотности среды на спектрально-флуоресцентные свойства растворов полишиффовых оснований на основе диаминов-флуорофоров. // Высокомолекулярные соединения. 1996 г. Серия А, т. 38, №7, с. 1222-1227], [Т.М. Акимкин и др. Спектральное изучение нековалентного взаимодействия тиакарбоцианиновых красителей с гиалуроновой кислотой. // Химия высоких энергий, 2011, том 45, №6, с. 553-558].
Описан общий подход к получению флуоресцентных полисахаридов на основе флуоресцеина [Charles G. Glabe et al. // Analytical Biochemistry. Volume 130, Issue 2, 15 April 1983, Pages 287-294]. При получении флуоресцентных полисахаридов для их активации предлагается использовать цианогенбромид. Однако этот реагент очень токсичен. Цианогенбромид летуч и легко абсорбируется через кожу или желудочно-кишечный тракт. Следовательно, токсическое воздействие может произойти при вдыхании, физическом контакте или проглатывании.
r
Известен способ получения меченого окисленного декстрана, который включает проведение реакции флуоресцентного красителя с активированным окисленным декстраном с последующей очисткой конечного продукта от примесей путем ультрафильтрации [RU 2426545. Опубликовано: 20.08.2011 Бюл. №23. Способ получения флуоресцентных производных декстранов]. В качестве флуоресцентного красителя используют флуоресцеин, в качестве активирующего реагента - 1,1'-карбонилдиимидазол. Очистку конечного продукта от примесей проводят путем ультрафильтрации на мембранных фильтрах Vivaflow 200 с параметром сепарации 10 кДа для декстрана и ПАД M=60 кДа, и 5 кДа для декстрана и ПАД Mr=35 кДа. Процесс включает 27 циклов полного концентрирования. Степень очистки контролируют спектрофотометрически. Проверку чистоты осуществляют методом капиллярного электрофореза.
Недостатки способа: длительность и многостадийность процесса, использование дорогостоящего активирующего реагента - 1,1'-карбонилдиимидазола. Поскольку относительная молекулярная масса нативного декстрана достигает сотен миллионов дальтон, то возникает необходимость проведения гидролиза нативного декстрана для получения препарата с заданным молекулярно-массовым распределением.
В последнее время синтезированы различные флуоресцентные производные хитозана (природного полимера, состоящего из 1,4-связанные N-ацетил-D-глюкозамин и D-глюкозамин субъединиц). Большая часть подходов для синтеза меченой красителем молекулярной системы хитозана из-за его низкой растворимости была разработана с использованием химических реагентов и путем ковалентного присоединения флуорофоров по аминогруппе биополимера, таких как флуоресцеин изотиоцианат, родамин В изотиоцианат.
В способе для получения хитозана меченного родамин В изотиоцианатом [Odette Ma et al. Precise derivatization of structurally distinct chitosans with rhodamine В isothiocyanate. // Carbohydrate Polymers 72 (2008) 616-624] хитозан растворяют в уксусной кислоте в течение 18 часов, к раствору хитозана добавляют равный объем безводного метанола с последующим перемешиванием в течение 3 часов, далее при комнатной температуре в течение 18 часов в темноте проводят процесс присоединение к биополимеру родамин В изотиоцианата. В конце периода мечения родамин В изотиоцианатом - хитозаны осаждают добавлением растворов гидроксида натрия, многократно промывают деионизированной водой и сублимируют.
Недостатки способа: технологическая сложность, заключающаяся в длительности как процесса растворения хитозана в уксусной кислоте, так и присоединения к нему флуорофора, необходимость контроля степени протонирования хитозана, использование токсичного метанола, проведение процесса без доступа света.
Известно получение флуоресцентного хитозана химической модификацией хитозана флуоресцеин изотиоцианатом в диметилсульфоксиде. Способ трудоемок и длителен, в синтезе используют токсичный триэтиламин. Для очистки продукта реакции применяется диализ, фракционирование хроматографией на колонке с биогелем [В.И. Горбач, И.М. Ермак. Липосомы как носители сульфатированных полисахаридов из морских водорослей для их доставки в организм. // Здоровье. Медицинская экология. Наука 3 (70) - 2017].
Описан способ получения меченного флуоресцеин изотиоцианатом олигомера хитозана, который состоит из β-(1,4)-2-амидо-2-дезокси-D-глюкана и β-(1,4)-2-ацетоамидо-2 -дезокси-D-глюкана (ацетилглюкозамина). Производные были синтезированы путем реакции аминных групп в олигомере с изотиоцианатными группами флуоресцеин изотиоцианата в этаноле [Hun Min Lee et al. Simple Synthesis of Fluorophore Using Water-Soluble Chitosan Oligomer. // International Conference on Applied Mathematics, Simulation and Modelling (AMSM 2016). Р.435-436].
В связи с низкой растворимостью хитозана для перевода его в водорастворимое состояние данный способ включает дополнительную операцию - получение водорастворимого олигомера хитозана путем кислотного или ферментативного гидролиза исходного хитозана. Это увеличивает продолжительность процесса получения, меченного флуоресцеин изотиоцианатом хитозана, что является существенным недостатком этого способа.
Известен способ получения флуоресцентного гепарина. Флуоресцентно-меченый гепарин был подготовлен для изучения влияния гепарина на взаимодействие между биомакромолекулами или клетками с помощью флуоресцентного зонда. Флуоресцентный гепарин получают путем взаимодействия частично N-десульфированного гепарина и 5-изотиоцианатофлуоресцеин в карбонатном буфере при перемешивании в течение 3 часов. Флуоресцентный гепарин выделяют из реакционной массы на колонке с сефадексом. Для выделения и очистки флуоресцеинилтиокарбамоильного производного частично N-десульфатированного гепарина использут диализ и лиофилизацию.
Недостатки способа: многостадийность и длительность процесса; использование большого числа реагентов и методов для очистки целевого флуоресцентного гепарина; необходимость фракционирования гепарина и предварительное проведение операции частичного N-десульфатирования в среде токсичного пиридина [Hideki Uchiyama and Kinzo Nagasawa. Preparation of Biologically Active Fluorescent Heparin Composed of Fluorescein-Labeled Species and Its Behavior to Antithrombin III. //1 Biochem. 89, 185-192 (1981)].
Наиболее близким к предлагаемому способу является «Способ получения производных хитозана для визуализации клеточных мембран и создания систем доставки лекарств с повышенной мукоадгезией» [RU 2697872, 21.08.2019]. Для этого хитозан сначала ацилируют капроновым ангидридом, затем алкилируют в присутствии глицидилтриметиламмоний хлорида с последующим диализом и лиофильной сушкой продукта, затем присоединяют флуоресцеин изотиоцианат. Полученное производное хитозана имеет структуру поликатиона. Флуоресцеин изотиоцианат - отрицательно заряженный флуоресцентный краситель, который является флуоресцентной пробой для биологических экспериментов. Недостатками способа являются длительность и многостадийность процесса синтеза и очистки флуоресцентного производного хитозана, использование токсичного метанола, кроме того хитозан имеет низкую растворимость в воде.
Задачей изобретения является разработка простого, удобного и экологичного способа присоединения флуоресцентного красителя к биополимеру, а так же повышение эффективности, экологичности синтеза флуоресцентных водорастворимых производных биополимеров, повышение достоверности визуализации, снижение длительности синтеза флуоресцентных водорастворимых производных биополимеров.
4
+
Технический результат достигается за счет того, что при реализации способа получения флуоресцентных производных арабиногалактана на первой стадии родаминовый краситель перемешивают с катионитом в NF-форме при комнатной температуре в течение 1 часа. Затем отделяют водный раствор и многократно промывают катионит дистиллированной водой до бесцветных промывных вод. Далее добавляют к катиониту сульфатированный арабиногалактан в виде аммониевой соли и перемешивают при комнатной температуре 30 мин, фильтруют, испаряют воду при 50-60°С. Твердый остаток промывают этанолом.
От прототипа предлагаемый нами способ отличается:
1) природой полисахарида: в прототипе - малорастворимый в воде хитозан, в заявляемом способе для получения флуоресцентного производного использовалась аммониевая соль сульфатированного арабиногалактана, выделенного из лиственницы сибирской. Полифункциональность, водорастворимость и мембранотропность арабиногалактана являются явными преимуществами по сравнению с другими синтонами (хитозан, декстран, гепарин), использующимися для синтеза биологически активных флуоресцентных коньюгатов. Сульфатированный арабиногалактан обладает антикоагулянтной и гиполипидемической активностью, является потенциальным гепариноидом, а также самостоятельным антимикробным агентом имеет большие перспективы по сравнению с другими матрицами вследствие того, что этот модифицированный биополимер практически нетоксичен, хорошо растворим в воде, а наследование наноструктурированной морфологии исходного арабиногалактана позволяет сохранить его иммуномодуляторные и трансмембранные свойства в синтезе новых физиологически активных полимеров, в том числе фармацевтических и медицинских препаратов [21-28];
2) упрощением способа за счет уменьшения числа стадий и использования для введения в структуру полисахарида (сульфатированного арабиногалактана) флуоресцентного красителя методом ионного обмена;
3) природой флуоресцентной метки (в прототипе - флуоресцеин изотиоцианат, в заявляемом - способе родамин В - флуоресцентный краситель, преимущества которого перед производными флуоресцеина заключаются в том, он относительно фотостабилен, проявляет нечувствительную к рН флуоресценцию и проникает в клетки легче, чем производные флуоресцеина).
Таким образом, благодаря данным отличительным признакам, за счет сокращения стадий и применения простого метода ионного обмена удалось добиться эффективности процесса присоединения флуоресцентного красителя к биополимеру, получить флуоресцентные водорастворимые, малотоксичные производные биополимера арабиногалактана, обладающие достаточным для визуализации квантовым выходом за счет нековалентного связывания флуорофора с макромолекулекулой полисахарида.
Способ осуществляют следующим образом.
Процесс включает три стадии.
Первая стадия - сульфатирование арабиногалактана проводят по методике, описанной в патенте [RU 2521649, опубл. 10.07.2014].
4
+
Вторая стадия - закрепление на катионите КУ-2-8 в NH-форме флуоресцентного красителя родамина В.
Третья стадия - введение в структуру сульфатированного полисахарида флуорофора - родамина В.
Способ подтверждается конкретными примерами. Пример 1.
Арабиногалактан производства ООО «Химия древесины» (Иркутск, Россия) под наименованием препарата «ФиброларС» выделенный из древесины лиственницы сибирской (Larix sibirica Ledeb.) сульфатируют по методике, описанной в патенте [RU 2521649, опубл. 10.07.2014]. Процесс сульфатирования проводят при температуре 80°С в течение 2 часов. По окончании процесса сульфатирования выделяют продукт, содержащий 8,2% серы.
4
+
Для закрепления на катионите КУ-2-8, находящегося в NH-форме, родаминового красителя (родамина В) к 5 мл набухшего катионита добавляют 0,1 г соответствующего красителя в 30 мл воды и перемешивают смесь при комнатной температуре в течение 1 часа. Отделяют от катионита водный раствор, модифицированный катионит промывают многократно порциями воды по 20-30 мл до бесцветных промывных вод, далее модифицированный родаминовым красителем катионит перемешивают с водным раствором 0,3 г сульфатированного арабиногалактана (содержание серы 8,2% (масс.)) в 20 мл воды при комнатной температуре в течение 30 мин. Водный раствор сульфатированного арабиногалактана с присоединенным к нему родамином В отделяют от катионита фильтрованием, упаривают при температуре 50-60°С, образовавшийся твердый остаток промывают этанолом для удаления неприсоединившегося к полисахариду красителя до бесцветных промывных этанольных растворов. Получают 0,25 г водорастворимого целевого продукта с квантовым выходом 17±2%.
Примеры 2,3. Аналогично примеру 1, отличие в содержании серы в сульфатированном арабиногалактане (см. таблицу). В зависимости от условий проведения процесса сульфатирования получают сульфатированный арабиногалактан, содержащий 10,1÷12,8% (масс.) серы. Сульфатированный арабиногалактан, содержащий 10,1% серы (пример 2) получают при сульфатировании арабиногалактана при температуре 80°С в течение 3 часов; содержащий 12,8% серы (пример 3) - при 90°С в течение 2 часов. При сульфатировании арабиногалактана, с увеличением как продолжительности процесса, так и температуры больше, чем 90-100°С, содержание серы в сульфатированном арабиногалактане увеличивается незначительно, но процесс сопровождается большей степенью деполимеризации исходного и сульфатированного арабиногалактана. С увеличением содержания серы происходит незначительный рост квантового выхода.
Таким образом, путем присоединения флуоресцентного красителя к сульфатированному арабиногалактану с использование простого метода ионного обмена синтезированы флуоресцентные водорастворимые производные арабиногалактана, обладающие необходимым для визуализации квантовым выходом. Все образцы, полученные в результате синтеза, выполняют поставленную задачу в исследуемом диапазоне изменения содержания серы в исходном сульфатированном арабиногалактане.