СПОСОБ КОНТРОЛЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ КОРРЕКЦИИ НАРУШЕНИЙ МИКРОБИОЦЕНОЗА КИШЕЧНИКА
METHOD OF CONTROLLING EFFECTIVENESS OF CORRECTING INTESTINAL MICROBIOCENOSIS DISTURBANCES

Изобретение относится к области медицины, а именно к инфекционным болезням, в частности к способам контроля эффективности лечения больных с дисбиозом кишечника.
15
Исследованиями последних лет доказано, что частью общего гомеостаза организма является микроэкологическая система, которая включает в себя десятки и сотни разнообразных видов, общая численность которых достигает 10 клеток, что почти на 2 порядка больше собственных соматических клеток макроорганизма, причем около 60% всей микрофлоры заселяет различные ниши пищеварительного тракта (Н.И.Урсова, 2006).
Сегодня не вызывает сомнений огромное значение эубиоза желудочно-кишечного тракта в поддержании гомеостаза и нормального функционирования организма человека. Микробиоценоз кишечника во многом определяет состав флоры кожи и слизистых оболочек, кишечный дисбиоз создает благоприятные условия для формирования и развития целого ряда заболеваний и патологических состояний (Д.Д.Заболотная, 2007).
В настоящее время отмечается неуклонный рост заболеваний, связанных с нарушением биологического равновесия между макроорганизмом и разнообразными популяциями микробной флоры его отдельных органов и систем, сложившегося в процессе эволюции (В.Р.Гриценгер, 2005). К состояниям, которые могут быть обусловлены нарушением состава и функций кишечной микрофлоры относятся диарея, запор, колит, синдром мальабсорбции, гастрит, дуоденит, язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки; атеросклероз, сахарный диабет; ревматоидный артрит, другие поражения суставов и соединительной ткани; злокачественные новообразования желудка, толстой кишки; бронхиальная астма, дерматиты и другие аллергические заболевания; суперинфекция различной локализации, хронизация практически всех воспалительных заболеваний у детей и взрослых (А.И.Хавкин, 2004).
С современных позиций кишечный дисбиоз расценивается как патогенетическое звено формирования и развития хронических воспалительных заболеваний различных органов и систем, в связи с чем восстановлению нормального микробного биоценоза желудочно-кишечного тракта в комплексном лечении самой разнообразной патологии придается огромное значение наравне с традиционными направлениями.
В коррекции дисбактериозов кишечника в настоящее время наиболее изученным и в определенной степени практически реализованным направлением является применение биологических бактерийных препаратов на основе микроорганизмов - представителей нормальной микрофлоры человека, так называемых пробиотиков (Н.И.Урсова, 2006).
Критериями контроля эффективности проведенной коррекции нарушений микробиоценоза кишечника в отраслевом стандарте «Протокол ведения больных. Дисбактриоз кишечника» (Отраслевой стандарт 91500.11.0004-2003 «Протокол ведения больных. Дисбактриоз кишечника», утвержден приказом Минздрава России от 09.06.2003 г. №231), взятом нами за прототип, служат клинические признаки и показатели микрофлоры кишечника. Результат лечения оценивается по категориям: восстановление здоровья, улучшение состояния, стабилизация, прогрессирование.
Недостатками данного метода являются: 1) микробиологический критерий учитывается только в случае полного восстановления микробиоценоза кишечника и может применяться лишь при оценке эффективности лечения комплексом средств, так как при монотерапии каким-либо одним средством такого результата добиться практически невозможно; 2) не учитываются восстановление содержания отдельных видов кишечной микрофлоры и неполное ее восстановление; 3) улучшение состояния и стабилизация устанавливаются по клиническим субъективным и объективным признакам без учета изменений картины состояния микробной флоры кишечника, что невозможно при латентных формах дисбиоза кишечника; 4) отсутствует стандартизация проведения оценки эффективности коррекции дисбиоза кишечника и ее количественное выражение.
Новизной предложенного способа является определение эффективности коррекции дисбиоза кишечника на основе сравнения количественной оценки состояния микробиоценоза кишечника до и после проведенного курса лечения.
1
2
n
Существенным отличием от ранее применяемых способов является то, что у больного до и после проведения курса лечения назначенным методом и средством определяют комплекс показателей микробиоценоза кишечника: содержание бифидобактерий, лактобактерий, кишечной палочки с нормальными свойствами, кишечной палочки с гемолитическими свойствами, кишечной палочки с лактозонегативными свойствами, энтерококков, сапрофитных стафилококков, золотистого стафилококка, клостридий, условно-патогенных бактерий, грибов рода Candida и рассчитывают индекс дисбиоза по формуле: , где ИД - индекс дисбиоза, П, П…П - определяемые показатели микробиоценоза кишечника, n - число определяемых показателей, и при достоверном уменьшении в результате проведенного лечения индекса дисбиоза по сравнению с исходными данными на 51-100% судят о наличии эффекта от используемого метода и средства, а при уменьшении индекса дисбиоза на 50% и менее делают вывод об отсутствии эффекта.

Способ контроля эффективности коррекции нарушений микробиоценоза кишечника исследовался на примере применения комплексного средства BION3. Биологически активная добавка к пище BION3 производится фирмой-изготовителем «Мерк Зельбстмедикацион ГмбХ», Германия, № госрегистрации 77.99.23.3.У.1020.2.06 от 09.02.2006, содержит в своем составе 12 витаминов: A, E, C, B1, B2, B6, B12, D3, биотин, фолиевую кислоту, никотинамид, пантотеновую кислоту, 7 минеральных веществ и микроэлементов: кальций (фосфат), железо, магний, йод, марганец, хром, молибден, селен, цинк, 3 пробиотические культуры: Lactobacillus gasseri, Bifidobacterium bifidum и Bifidobacterium longum. BION3 применяется для поддержания и восстановления здоровой кишечной микрофлоры, компенсации потерь электролитов, укрепления иммунной системы.
Исследование проводилось на 60 военнослужащих-мужчин в возрасте от 18 до 25 лет, находящихся в одинаковых условиях быта, питания и физических нагрузок, не подвергающихся воздействию профессиональных иммуносупрессивных факторов, из числа стационарных больных инфекционного отделения гарнизонного военного госпиталя (войсковой части 52236) г.Оренбурга. У всех пациентов в разной степени выраженности присутствовали субъективные и объективные признаки нарушения микробиоценоза кишечника: неустойчивость стула, диарея, запоры, ощущение дискомфорта или боли в животе, тошнота, неприятный привкус во рту, метеоризм. При микробиологическом обследовании кала у всех отобранных для исследования больных был выявлен дисбиоз кишечника 1-2 степени. Все обследованные были разбиты случайным методом на 2 группы по 30 человек, каждая из которых включала одинаковое число пациентов с 1-й и 2-й степенью нарушений микробиоценоза кишечника.
Пациенты контрольной группы (первая группа) в течение 1-го месяца в качестве лечения получали с учетом имеющихся показаний диету, общепринятыми курсами энтеросорбенты, пищеварительные ферменты, антидиарейные средства, витамины, спазмолитики и не получали препаратов содержащих пробиотики или пребиотики.

Больные основной группы (вторая группа) получали диету и монотерапию BION3 по 1 таблетке 1 раз в день внутрь в течение 1-го месяца.
По окончании курса лечения у пациентов обеих групп вновь произвели бактериологическое исследование кала для определения состояния микрофлоры кишечника.
-1
-2
-3
-10
Микробиоценоз кишечника исследовался по методике Эпштейн-Литвак Р.В. и Вильшанской Ф.Л. Сбор материала производился следующим образом: непосредственно после утреннего стула (обследуемый испражнялся на продезинфицированное судно) кал больного в количестве около 1 г отбирался в стерильную стандартную одноразовую посуду (бакпечатку) и доставлялся в лабораторию в течение 1-2 часов после дефекации. Посуда с доставленным материалом взвешивалась на аптечных весах, от полученного значения отнималась масса бакпечатки, высчитывалась масса кала, затем рассчитывалось, какое количество стерильного физраствора следовало добавить для получения разведения 1:10. Для приготовления разведений кала использовались стерильные стеклянные лабораторные пробирки. В процессе приготовления разведения кала биоматериал тщательно растирался о стенки сосуда для получения равномерной взвеси. 1 мл взвеси из емкости с разведением кала 1:10(10) стерильной пипеткой с широким концом переносился в пробирку с 9 мл стерильного физраствора, в результате чего получали разведение 10. После тщательного перемешивания содержимого в пробирке 1 мл взвеси из нее переносился в следующую пробирку с 9 мл стерильного физраствора, соответственно в ней получалось разведение 10. Таким же образом продолжали разведение кала в ряде пробирок с 9 мл стерильного физраствора до получения разведения 10, используя для приготовления каждого следующего разведения новую стерильную пипетку. Из полученных разведений делали посевы на питательные среды.
7
8
9
10
Посев для учета бифидобактерий проводился из разведений кала 10, 10, 10, 10. Опустив пипетку до дна пробирки, сеяли 1 мл взвеси соответствующего разведения в высокий столбик (не менее 10 мл). Среду Блаурока перед посевом предварительно регенерировали нагреванием, для чего ее держали на кипящей водяной бане в течение 35-40 минут, а затем охлаждали в холодной воде. После посева пробирки помещали в термостат при температуре 37°. Первые мазки из полужидкой среды Блаурока окрашивали по Грамму и микроскопировали через сутки, окончательный просмотр делали через трое суток. Грамположительные довольно крупные палочки с бифуркацией или булавовидными окончаниями идентифицировали как бифидобактерии. При наличии в мазках таких микроорганизмов определяли наибольшее разведение кала, из которого они выросли.
5
6
7
Посев для учета лактобактерий производился из разведений 10, 10, 10 на лактоагар в чашках Петри. Засеянную среду помещали в термостат при +37°C на 24 часа. Выросшие колонии лактобактерий В мазках, окрашенных по Грамму, лактобактерий определялись в виде грамположительных неспоровых небольших по размеру палочек, образующих цепочки. Фиксировали наибольшее разведение кала, из которого выросли лактобактерий.
3
5
8
Посев для выделения грамотрицательных палочек производился на среды Эндо, Плоскирева, Левина и 3% кровяной агар. Посев осуществлялся из разведений 10, 10, 10 по 0,1 мл на чашки Петри, материал растирался стерильным шпателем.
Через сутки подсчитывали лактозоположительные и лактозоотрицательные колонии. После постановки теста на оксидазу из каждой группы морфологически однородных микроорганизмов отвивали по 1-3 оксидазоотрицательных колонии на среды Симмонса и Клигера. Оксидазоотрицательные, лактозоположительные и отрицательные по Симмонсу микроорганизмы отсевали на пестрый ряд для дальнейшей идентификации по общепринятому методу для выявления эшерихий.
Остальные (оксидазоположительные и оксидазоотрицательные) микроорганизмы, выделенные на этих средах, идентифицировали на принадлежность их к определенному семейству.
На кровяном агаре производили учет морфологически различных колоний с гемолитическими свойствами, подсчитывая их процент от общего количества выделенных микроорганизмов этого семейства.
3
4
5
Выделение стафилококков производили на желточно-солевом агаре в чашках Петри, на которые засевали по 0,1 мл взвеси из разведений 10, 10, 10.
Через сутки инкубации учитывали колонии с золотистым пигментом и характерным радужным венчиком вокруг колонии (за счет выработки фермента лецитиназы). У этих стафилококков выявляли способность ферментировать манит в анаэробных условиях. По наличию всех этих признаков выделенные кокки относили к виду S. aureus. Определяли наибольшее разведение кала, из которого выделен золотистый стафилококк.
4
5
6
Выделение энтерококков производили в чашках Петри на селективной среде энтерококкагар, на которую засевали по 0,1 мл взвеси из разведений 10, 10, 10. Выросшие колонии микроскопировали, определяя характерную морфологию клеток в препаратах, окрашенных по Граму. В сомнительных случаях определяли признаки Шермана, характерные для энтерококков (рост на средах с 40% желчи и 6,5% хлористого натрия, резистентность к нагреванию в течение 30 минут при +60°C и редукция метиленовой сини), и проводили пробу на каталазу.
2
3
4
Дрожжеподобные грибки выделяли из разведений фекалий 10, 10, 10 путем посева по 0,1 мл материала на среду кандидаагар.
Через 48 часов инкубации при температуре +37°C выросшие колонии микроскопировали, предварительно окрасив мазки метиленовым синим, отмечая морфологию клеток, типичную для дрожжеподобных грибков, таким образом устанавливая их наличие в соответствующих разведениях кала больного.
Оценку результатов бактериологического исследования фекалий производили, сопоставляя полученные данные наибольшего разведения кала, в котором выделены соответствующие микроорганизмы, с показателями относительной нормы.
Для количественной оценки результатов исследования применялась предложенная нами бальная шкала определения степени отклонения от нормы каждого исследуемого показателя состояния микробиоценоза кишечника по представленной ниже таблице №1.
Таблица 1
Распределение значений основных показателей микробиоценоза кишечника больных XT по шкале отклонения от нормы.
Показатель состояния микробиоценоза кишечника
Степень отклонения, баллы
0
0,5
1
2
3
Бифидобактерии КОЕ/г, log
9-10
8
7
6
5 и ниже
Лактобактерий КОЕ/г, log
7-8
6
5
4
3 и ниже
Кишечная палочка с нормальными свойствами КОЕ/г, log
7-8
6 или 9
5 или 10
4 или 11
3 и ниже или 12 и выше
Кишечная палочка гемолизирующая КОЕ/г, log
0
1-2
3-4
5
6 и выше
Кишечная палочка лактозонегативная КОЕ/г, log
0-4
5
6
7
8 и выше
Энтерококки КОЕ/г, log
5-8
9
10
11
12 и выше
Стафилококки (сапрофитный, эпидермальный) КОЕ/г, log
3-4
5
6
7
7 и выше
Стафилококк золотистый КОЕ/г, log
0
1
2
3-4
5 и выше
Клостридии КОЕ/г, log
0-3
4
5
6
7 и выше
Условно-патогенные бактерии КОЕ/г, log
0-3
4
5
6
7 и выше
Грибы рода Candida КОЕ/г, log
0-3
4
5
6
7 и выше
1
2
n
Рассчитав сумму всех показателей микробиоценоза данного пациента, выраженных в баллах, и разделив ее на количество показателей, получим индекс дисбиоза (ИД) по следующей формуле: , где ИД - индекс дисбиоза, П, П…П - определяемые показатели микробиоценоза кишечника, n - число определяемых показателей. Для удобства и упрощения расчета ИД можно принимать во внимание только те показатели микрофлоры кишечника, которые имеют отклонения от нормы.
В каждой группе обследованных были определены средние ИД до и после курса лечения, полученные значения ИД представлены в таблице №2
Таблица 2
Средние значения ИД в группах обследованных до и после лечения.
Показатель оценки состояния микробиоценоза кишечника
Первая группа (контроль) M±m(n=30)
Вторая (основная группа) M±m(n=30)
До лечения
После лечения
До лечения
После лечения
ИД
0,97±0,04
0,92±0,04
0,98±0,04
0,37±0,02*
Примечание: * р<0,05 по сравнению с группой контроля

Как видно из таблицы №2, обе группы были сопоставимы по ИД до проведения лечения. После проведенного курса терапии BION3 ИД достоверно уменьшился во второй (основной группе) по сравнению с контрольной группой и с исходными данными. Степень улучшения ИД составила 62%, что говорит о хорошем терапевтическом эффекте BION3. В контрольной группе уменьшение ИД недостоверное, составило 5% от исходного уровня, что соответствует неудовлетворительному терапевтическому эффекту.
6
5
5
5
4
9
5
5
6
5
5
5
4
8
4
4
Пример 1. Пациент К., 20 лет, из первой группы, поступил на стационарное лечение в инфекционное отделение войсковой части 52236 с диагнозом: Дисбиоз кишечника 2 степени, история болезни №3535. Жалобы на жидкий стул до 4-5 раз в день, чувство дискомфорта в животе. В анамнезе частые (2 раза в год и более) ангины, в том числе осложненные паратонзиллярным абсцессом, по поводу которых неоднократно продолжительное время получал антибиотики. Микробиологический анализ кала: бифидобактерии - 10 КОЕ/г, лактобактерии - 10 КОЕ/г, кишечная палочка с нормальными свойствами - 10 КОЕ/г, кишечная палочка с гемолитическими свойствами - 10 КОЕ/г, кишечная палочка с лактозонегативными свойствами - 10 КОЕ/г, энтерококки - 10 КОЕ/г, сапрофитные стафилококки - 10 КОЕ/г, золотистый стафилококк - 0, условно-патогенные бактерии - 0, клостридии - 0, грибы рода Candida - 10 КОЕ/г. ИД=0,72. В течение месяца получал диету, энтеросорбенты, пищеварительные ферменты, антидиарейные средства, витамины. По истечении месяца самочувствие прежнее, сохраняются жидкий стул и дискомфорт в животе. Бактериологический анализ кала после лечения: бифидобактерии - 10 КОЕ/г, лактобактерий - 10 КОЕ/г, кишечная палочка с нормальными свойствами - 10 КОЕ/г, кишечная палочка с гемолитическими свойствами - 10 КОЕ/г, кишечная палочка с лактозонегативными свойствами - 10 КОЕ/г, энтерококки - 10 КОЕ/г, сапрофитные стафилококки - 10 КОЕ/г, золотистый стафилококк - 0, условно-патогенные бактерии - 0, клостридии - 0, грибы рода Candida - 10 КОЕ/г. ИД=0,59. Уменьшился по сравнению с исходными данными на 18%, что свидетельствует о неудовлетворительном терапевтическом эффекте и необходимости изменения лечения. При оценке лечения по прототипу - стабилизация состояния.
7
5
5
7
3
3
5
4

9
8
5
7
3
4
4
Пример 2. Больной З., 21 год, из второй группы. Направлен в инфекционное отделение с подозрением на кишечную инфекцию, история болезни №3447. До этого неоднократно находился на стационарном лечении в кожно-венерологическом отделении по поводу рецидивирующего фурункулеза, получал длительно антибиотики. Жалобы на периодические приступообразные боли в животе, вздутие живота, учащенный до 6 раз в сутки жидкий стул иногда со слизью, субфебрильную температуру. Микробиологический анализ кала: бифидобактерии - 10 КОЕ/г, лактобактерии - 10 КОЕ/г, кишечная палочка с нормальными свойствами - 10 КОЕ/г, кишечная палочка с гемолитическими свойствами - 0, кишечная палочка с лактозонегативными свойствами - 0, энтерококки - 10 КОЕ/г, сапрофитные стафилококки - 10 КОЕ/г, золотистый стафилококк - 10 КОЕ/г, вульгарный протей - 10 КОЕ/г, клостридии - 0, грибы рода Candida - 10 КОЕ/г. Диагноз: Дисбиоз кишечника 2 степени. ИД=0,69. В течение 1-го месяца получал BION3. В результате лечения нормализовались стул и температура, прекратились боли в животе и метеоризм. Исследование кишечной микрофлоры после проведенной терапии: бифидобактерии - 10 КОЕ/г, лактобактерии - 10 КОЕ/г, кишечная палочка с нормальными свойствами - 10 КОЕ/г, кишечная палочка с гемолитическими свойствами - 0, кишечная палочка с лактозонегативными свойствами - 0, энтерококки - 10 КОЕ/г, сапрофитные стафилококки - 10 КОЕ/г, золотистый стафилококк - 0, вульгарный протей - 10 КОЕ/г, клостридии - 0, грибы рода Candida - 10 КОЕ/г. ИД=0,18. Уменьшение ИД достоверное, составило 74%, что соответствует хорошему терапевтическому эффекту. При оценке лечения по прототипу - улучшение состояния.
8
6
5
9
3
5
4
4

10
8
5
7
3
4
Пример 3. Больной Т., 19 лет, из второй группы. Находился на стационарном лечении в инфекционном отделении с диагнозом: Пищевая токсикоинфекция, гастроэнтеритический вариант, средней тяжести, история болезни №3171. По окончании курса лечения сохранялась неустойчивость стула, чередование оформленного стула с жидким вплоть до водянистого до 5-6 раз в день, слабость, непостоянные спастические боли внизу живота. В посевах на дизгруппу патогенной микрофлоры не выделено. Бактериологический анализ кала: бифидобактерии - 10 КОЕ/г, лактобактерии - 10 КОЕ/г, кишечная палочка с нормальными свойствами - 10 КОЕ/г, кишечная палочка с гемолитическими свойствами - 0, кишечная палочка с лактозонегативными свойствами - 0, энтерококки - 10 КОЕ/г, сапрофитные стафилококки - 10 КОЕ/г, стрептококк гемолитический - 10 КОЕ/г, цитробактер - 10 КОЕ/г, клостридии - 0, грибы рода Candida - 10 КОЕ/г. Выставлен диагноз: Дисбиоз кишечника 2 степени, обусловленный условно-патогенной флорой и гемолитическим стрептококком. ИД=0,5. Проведен месячный курс лечения BION3, после которого самочувствие нормализовалось, боли в животе прекратились, стул стал устойчиво оформленным. Бактериологический анализ кала после лечения: бифидобактерии - 10 КОЕ/г, лактобактерии - 10 КОЕ/г, кишечная палочка с нормальными свойствами - 10 КОЕ/г, кишечная палочка с гемолитическими свойствами - 0, кишечная палочка с лактозонегативными свойствами - 0, энтерококки - 10 КОЕ/г, сапрофитные стафилококки - 10 КОЕ/г, стрептококк гемолитический - 0, цитробактер - 0, клостридии - 0, грибы рода Candida - 10 КОЕ/г. ИД=0,14. Уменьшение достоверное на 72%, терапевтический эффект хороший. При оценке лечения по прототипу - улучшение состояния.
Преимущества заявляемого способа заключаются в следующем:
1) микробиологический критерий учитывается при всех вариантах эффекта от коррекции дисбиоза кишечника, в том числе и при неполном восстановлении кишечной микрофлоры, и может применяться при оценке эффективности лечения как комплексом средств, так и при монотерапии; 2) учитываются восстановление содержания отдельных видов кишечной микрофлоры и неполное ее восстановление; 3) возможна оценка улучшения состояния микробиоценоза кишечника без учета клинических объективных и субъективных данных, в первую очередь при латентных формах дисбиоза кишечника; 4) предлагается стандартизация проведения оценки эффективности коррекции дисбиоза кишечника и ее количественное выражение; 5) простота в исполнении.
Практическое применение предложенный способ может найти в оценке эффективности пробиотиков и других средств при различных формах и степени тяжести дисбиоза кишечника с целью определения оптимальных показаний для их назначения и длительности курса лечения, подбора наиболее эффективного сочетания препаратов разного направления действия, а также быть включенным в качестве критерия оценки эффективности лечения нарушений микробиоценоза кишечника в отраслевой стандарт «Протокол ведения больных. Дисбактриоз кишечника».
Литература
1. Гиценгер В.Р. Дисбиозы и их корекциия: Учебное пособие / В.Р.Гиценгер, Т.В.Хайбекова, А.А.Пославская и др. - Саратов, 2005. - 80 с.
2. Заболотная Д.Д. Состояние микробиоценоза кишечника у больных хроническим тонзиллитом / Д.Д.Заболотная, К.Г.Селезнев, Е.С.Лаврентьева // Журнал вушних, носових i горлових хвороб. - Киiв: Просвiта, 2007. - №3-с. - С.101.
3. Отраслевой стандарт 91500.11.0004-2003 «Протокол ведения больных. Дисбактериоз кишечника», утвержден приказом МЗ РФ от 09.06.2003 №231.
4. Урсова Н.И. Дисбактериозы кишечника у детей / Н.И.Урсова. - М.: Компания Боргез, 2006. - 239 с.
5. Хавкин А.И. Нарушения микроэкологии кишечника. Принципы коррекции / А.И.Хавкин. - М., 2004. - 40 с.