СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПОЗИЦИИ, СОДЕРЖАЩЕЙ КОЛЛОИДНОЕ НАНОСЕРЕБРО ИЛИ НАНОЗОЛОТО (ВАРИАНТЫ)
METHOD FOR PREPARING COMPOSITION CONTAINING COLLOIDAL NANOSILVER OR NANOGOLD (VERSIONS)

Область техники
Настоящее изобретение относится к получению коллоидных соединений металла на мембране бактерий. Настоящее изобретение также относится к способам получения серебряных или золотых наночастиц при помощи биологического процесса. В частности, изобретение относится к применению пробиотических бактерий, таких как, но не ограничиваясь ими, Lactobacillus, в специфических условиях при получении наноосадков металлов, в частности наночастиц серебра или золота, с целью улучшения их противомикробного действия. Настоящее изобретение относится к дезинфицирующим продуктам, включая носитель, пропитанный композицией, содержащей коллоидное наносеребро или нанозолото, полученное указанным способом.
Уровень техники
Эффективные способы дезинфекции необходимы для обработки больших количеств загрязненных материалов, таких как вода, особенно бытовая и промышленная циркулирующие воды, а также водных потоков (например, используемых для обработки пищевых продуктов), содержащих микроорганизмы, которые не могут быть слиты или повторно использованы в необработанном виде по гигиеническим, технологическим или экологическим соображениям. Эффективные способы дезинфекции также необходимы для обработки поверхностей, таких как поверхности помещений, оборудования, контейнеров, систем для кондиционирования воздуха и т.п. Совместимые с окружающей средой способы дезинфекции чаще всего основаны на использовании активных кислородных соединений, таких как пероксид водорода или мономерные четвертичные соединения аммония.
Пероксид водорода представляет собой умеренно активное дезинфицирующее вещество с бактерицидными свойствами. Известно, что пероксид водорода, имеющий концентрацию 25 мг/л, ингибирует рост некоторых бактерий, однако эффективное снижение количества микробов даже при существенно более высокой концентрации пероксида водорода занимает много часов или требует дополнительного ультрафиолетового облучения. Однако применение последнего требует как дорогостоящего оборудования, так и существенных затрат на электричество. Поэтому при дезинфекции больших количеств загрязненных материалов, таких как вода, например, для обработки воды на станциях очистки сточных вод и их продукции, такие меры являются практически неадекватными и/или неэкономичными. Поэтому в данной области техники уже делались различные попытки преодолеть указанные недостатки.
3
В данной области техники хорошо известно, что ионы серебра и соединения на основе серебра высокотоксичны для микроорганизмов и поэтому оказывают сильное бактерицидное действие на многие общие виды бактерий, включая Escherichia coli. Было также доказано, что гибриды наночастиц серебра с амфифильными сверхразветвленными макромолекулами обеспечивают получение эффективных противомикробных поверхностных покрытий. Было установлено, что стабильные водные дисперсии наночастиц серебра в виде нетоксичных элементарных гидрозолей серебра оказывают сильное бактерицидное действие на Е. coli, при этом концентрация, составляющая 50 мкг/см, вызывает 100% ингибирование роста бактерий. Было установлено, что наночастицы серебра аккумулируются в бактериальных мембранах, каким-то образом взаимодействуя с определенными строительными элементами бактериальной мембраны, тем самым вызывая структурные изменения, разрушение и, наконец, гибель клетки. Отмечается, что поверхность бактерий полностью заряжается отрицательно на уровне биологических величин рН из-за диссоциации избыточного количества карбоксильных и иных групп в мембране. Было высказано предположение о том, что наночастицы серебра, внедренные в углеродную матрицу мембраны, вырабатывают поверхностный заряд благодаря своему движению и трению внутри матрицы, поэтому электростатические силы могут быть причиной взаимодействия наночастиц с бактериями. Более того, серебро проявляет тенденцию к более близкому сродству для взаимодействия с соединениями фосфора и серебра, содержащимися в мембране, а также в ДНК. Третьим возможным видом взаимодействия является высвобождение ионов серебра, которые могут еще более содействовать бактерицидному действию наночастиц серебра.
Было установлено, что некоторые виды микроорганизмов, например Lactobacillus sp. и грибок Fusarium oxysporum, биосорбируют Ag(I) на поверхность своих клеток и обезвреживают данный ион путем восстановления до Ag(0) либо действием редуктазы, либо челночными хинонами электрона или тем и другим.
В данной области техники уже известен нецитотоксичный противомикробный состав, включающий биологически стабилизированные наночастицы серебра, имеющие размер в диапазоне от 1 до 100 нм, и носитель, концентрация в котором указанных биологически стабилизированных наночастиц серебра составляет от 1 до 6 м.д.
Также известен способ получения коллоидного комплекса из серебра-биомолекулы, включающий:
- получение смеси биомолекулы, соли серебра и источника ионов галоида в одном растворе; и
- облучение смеси светом, имеющим длину волны в видимом диапазоне, при этом соль серебра и источник ионов галоида растворимы в воде; количества биомолекулы, соли серебра и источника ионов галоида таковы, что стадия облучения приводит к формированию коллоидных комплексов из серебра-биомолекул.
Также был описан способ получения коллоидных наночастиц металла, включающий обработку влажных грибков или экстракта грибков раствором ионов металла при температуре в интервале от 15 до 40°С в течение периода времени от 2 до 120 часов и разделение биомассы для получения коллоидных наночастиц металла.
Традиционные способы получения наночастиц серебра имеют ряд недостатков, таких как высокая производственная стоимость, образование существенного количества побочных продуктов или наличие верхнего предела концентрации получаемых наночастиц. Например, последний способ получения требует больших затрат времени и основан на использовании грибков, которые могут быть патогенными. Поэтому в данной области техники существует потребность в разработке надежного и недорогого способа получения наночастиц серебра, снижающего или предотвращающего образование побочных продуктов.
+
0
Был также исследован процесс биосорбции Ag(I) при помощи Lactobacillus, его рН зависимость в диапазоне рН от 2 до 6, и температурная зависимость в диапазоне от 10 до 60°С, а также механизм восстановления Ag до Ag при помощи Lactobacillus.
В данной области техники также известен способ получения наночастиц серебра биовосстановлением с использованием Aeromonas sp. в смеси с ионами серебра, аммиаком и гидроксидом натрия при 60°С в течение нескольких часов.
Указанные выше способы имеют недостатки, такие как необходимость использования повышенной температуры, кислотный рН или длительный инкубационный период либо недостаточная бактерицидная активность получаемых в результате наночастиц серебра.
Поэтому в данной области техники существует потребность получения наночастиц серебра или золота способом, свободным от вышеуказанных недостатков.
В данной области техники также существует потребность в разработке простого, безопасного для окружающей среды и воспроизводимого способа получения наночастиц серебра или золота с хорошими противомикробными свойствами.
В данной области техники также существует потребность в разработке соответствующего способа получения наночастиц серебра или золота, применимых для некоторых медицинских целей.
В данной области техники также известно, что коллоидальные формы металлов, отличных от золота или серебра, и соединения таких металлов имеют ценные свойства и применение. Например, коллоидальный субцитрат висмута, растворимый в воде, особенно при рН приблизительно от 3 до 8, использовался в течение десятилетий вместе с антибиотиками для лечения язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, а также инфекции Helicobacter pylori. Коллоидные формы ртути, неорганические соединения ртути и мази с металлической ртутью использовались местным способом для различных терапевтических целей, включая лечения инфекционной экземы или импетиго (соли ртути), лечения сифилиса (каломель), лечения псориаза (оксид ртути или хлористый меркураммоний). Коллоидные формы палладия и платины использовались в качестве катализаторов для различных химических реакций, включая органические восстановления, гидрогенолиз и т.п. Наночастицы платины в коллоидном виде также известны как противораковые агенты. Коллоидная медь, необязательно хелатированная салициловой кислотой, является сильным противовоспалительным агентом, при этом известно, что сублингвальные формы коллоидной меди или коллоидного цинка являются активными средствами от простуд и гриппа. Коллоидный цинк также способен оказывать особенно эффективное противовирусное действие. Во всех указанных различных областях существует постоянная потребность получения альтернативных физических форм коллоидных металлов или коллоидных соединений металлов с целью повышения их эффективности в соответствующих областях их применения.
Сущность изобретения
В самом широком смысле настоящее изобретение относится к применению бактерий для получения коллоидных соединений металлов на мембране бактерий и последующему применению бактерий с покрытием в качестве противомикробного агента. В частности, изобретение относится к:
- применению бактерий для получения коллоидных соединений металлов путем контакта указанных бактерий со смесью солей металлов и других солей при контролируемом рН, обеспечивающего выработку бактериями коллоидных соединений металлов на их мембране; и
- применению указанных бактерий с покрытием из соединений металлов на мембране в качестве противомикробного агента.
Согласно одному из вариантов изобретение относится к получению металлических наноосадков пробиотическими и другими бактериями, которые могут быть использованы в качестве противомикробного агента в питьевой воде, в покрытиях поверхностей и других материалах.
Более конкретно, некоторые бактерии способны восстанавливать соли Ag(I) до коллоидного Ag(0), осаждающегося в виде нано-Ag частиц на поверхность клетки. Биомасса, покрытая коллоидным серебром или другим металлическим наноосадком, может быть легко отделена от водной фазы фильтрацией или центрифугированием, может быть промыта и ополоснута и подвергнута дальнейшей обработке с получением коллоидного продукта с сильными противомикробными свойствами как в виде (разбавленной) суспензии, так и при обработке в покрытиях.
Интересно, что группа пробиотических бактерий, т.е. бактерий, получаемых промышленным способом, благодаря целебному действию на здоровье человека при их наличии в пищеварительном тракте человека, демонстрирует данную способность образовывать наноосадки на поверхности своих клеток. Такие бактерии включают, но не ограничиваются ими, пробиотические штаммы Lactobacillus fermentum.
3
4
Добавляя специфическую комбинацию солей (AgNO, NHCl, NaOH и другие) к концентрированной клеточной культуре бактерий и контролируя рН, получают коллоидный продукт серебра с сильными противомикробными свойствами. Соли других металлов в комбинации с некоторыми бактериальными штаммами также вызывают образование наноосадков с подобными свойствами, что также входит в состав этого изобретения.
Регулируя отношение “масса серебра” к “массе биологических клеток” (Ag:CDW, где CDW = масса клеток в сухом состоянии), можно изменять реакционную способность и свойства конечного продукта коллоидного серебра, касающиеся размера коллоидных частиц, распределения коллоидных частиц и их прочих свойств.
Соединения коллоидного серебра, получаемые на поверхности бактерий, имеют очень широкий диапазон использования, включая, но не ограничиваясь ими: дезинфекция воды, использование в качестве дезинфицирующего агента в средствах для очистки, в качестве очищающего агента, состава в противомикробных покрытиях, для медицинских целей, лекарственных препаратов для людей, использование в текстильных изделиях, в мазях и смазочных средствах, в качестве катализатора и т.д.
Производственный процесс является прямым, экономически выгодным, имеет высокий выход и может быть легко обновлен, размер и распределение частиц могут быть проконтролированы, а противомикробная реакционная способность получаемого наносеребра превосходит другие коллоидные продукты серебра при очень низких (ч./млрд) концентрациях. Более того, такой продукт может быть обработан в различных видах: сухом, суспендированном виде или в виде “влажных” пеллет, он может входить в состав различных композиций. Конечный продукт не содержит остатков химических реагентов, поскольку он может быть промыт чистой водой без потери активности.
Пробиотические бактерии могут быть использованы для самых различных целей в здравоохранении и пищевой промышленности. Бактериальный продукт с покрытием из Ag особенно подходит для следующих видов применения:
- компонент дезинфицирующих чистящих средств (больницы, лаборатории, площадки для разведения животных и т.д.);
- использование в керамических фильтрах или иных фильтрах для дезинфекции воды, как питьевой воды, так и воды в плавательных бассейнах, воды для выращивания животных, воды для выращивания водных культур и пр.;
- использование в дезинфицирующих покрытиях: полимеры, текстильные волокна, металлы;
- подходит для использования в составе дезинфицирующих мазей для кожи, смазывающих средств и т.д.;
- использование для дезинфекции питьевой воды: развивающиеся страны, ранцы, самолеты и многое другое (простое добавление в виде капель), и
- борьба с патогенными микроорганизмами: Legionella, Cryprosporidium, Hepatitis, Herpes, Pseudomonas, Staphylococcus, различными видами бактерий, грибков и вирусов.
Другой целью настоящего изобретения является получение наночастиц золота и серебра высокого качества. Первый аспект настоящего изобретения касается разработки усовершенствованного биологического способа получения композиции, включающей коллоидные наночастицы золота и серебра, при этом указанный способ включает использование пробиотических бактерий, в частности, вида Lactobacillus, таких как Lactobacillus fermentum, и контакт указанной биомассы с водным раствором соли серебра (I) или соли золота (III). Настоящее изобретение основано на неожиданном открытии, заключающемся в том, что некоторые специфические параметры способа для получения наночастиц золота или серебра путем биовосстановления оказывают сильное влияние на эффективность их получения и характеристики получаемых наночастиц. В частности, специфические способы согласно настоящему изобретению оказывают сильное влияние на противомикробную активность получаемой композиции, включающей наночастицы серебра.
Другой аспект настоящего изобретения заключается в том, что композиция из наночастиц золота и серебра, полученная биовосстановлением в таких специфических условиях, может быть подвергнута дальнейшей обработке, например отделена от биомассы с сохранением или даже усилением ее активности или других соответствующих свойств, таких как стабильность при хранении. Альтернативно, последующая химическая обработка, например, при помощи окисляющих агентов, таких как пероксид или пер-соль, композиции из наночастиц золота и серебра, полученной биовосстановлением в таких специфических условиях, может даже усилить свойства получаемой композиции наночастиц.
Преимущество способа согласно настоящему изобретению также заключается в том, что размер и распределение получаемых наночастиц золота и серебра могут быть отрегулированы воспроизводимым образом.
0
0
Преимущество настоящего изобретения также заключается в том, что указанный способ обеспечивает получение результата с высокой степенью надежности за существенно более короткое время с низкими затратами и без вреда для окружающей среды путем снижения потребности в потенциально токсичных и/или дорогостоящих химикатах. В композиции, получаемой способом согласно изобретению, не остается никаких вредных остатков химических реагентов, в большой степени благодаря тому, что используемую биомассу получают из безвредных, например пробиотических, микроорганизмов. Поэтому преимущество настоящего изобретения заключается в том, что способ обеспечивает получение композиции, которая при использовании вместе с эукариотическими организмами не оказывает существенного влияния на такие организмы. Согласно специфическому варианту изобретение обеспечивает получение композиции с высокой противомикробной активностью, также действующей против морских микроорганизмов, существенно не воздействуя на эукариотические организмы. Дополнительное преимущество настоящего изобретения заключается в том, что изобретение позволяет получать композицию, имеющую высокую концентрацию наносеребра или нанозолота как таковых, а также включает наносеребро или нанозолото, по существу состоящее из серебра или золота в их металлическом состоянии соответственно, например, включает более приблизительно 95% Ag от общего содержания серебра или более приблизительно 95% Au от общего содержания золота соответственно.
Следующее преимущество настоящего изобретения заключается в том, что получаемый продукт или композиция могут быть легко и безопасно обработаны с сохранением или даже усилением их активности. Композиция может быть высушена либо иметь вид суспензии или влажных пеллет, она также может иметь различные формы, такие как аэрозоль или пропитка носителя, без ухудшения противомикробной активности благодаря стабильности частиц наносеребра.
Согласно очередному варианту настоящее изобретение относится к применению композиции коллоидального серебра, получаемой в соответствии с вышеописанным способом, в качестве альгицидного или гербицидного агента.
Определения
0
Используемые здесь для описания настоящего изобретения термины “наносеребро” или “нано-Ag” относятся к наночастицам металлического серебра (Ag). Согласно настоящему изобретению указанные наночастицы могут или не могут быть осаждены на биомассу. Размер таких наночастиц может варьировать приблизительно от 0,1 нм до 100 нм, например в диапазоне приблизительно от 0,5 нм до 5 нм. Гранулометрическое распределение таких наночастиц также может варьировать вокруг их среднего размера.
0
Используемые здесь для описания настоящего изобретения термины “нанозолото” или “нано-Au” относятся к наночастицам металлического золота (Au). Согласно настоящему изобретению указанные наночастицы могут или не могут быть осаждены на биомассу. Размер таких наночастиц может варьировать приблизительно от 0,1 нм до 100 нм, например в диапазоне приблизительно от 0,5 нм до 5 нм. Гранулометрическое распределение таких наночастиц также может варьировать вокруг их среднего размера.
Используемый здесь для описания настоящего изобретения термин “биомасса” относится к органическому материалу, состоящему или полученному из бактериальных видов, используемых для получения “наносеребра” или “нанозолота”.
Используемый здесь для описания настоящего изобретения термин “пробиотические бактерии” относится к бактериям, которые после введения в соответствующих количествах хозяину, такому как млекопитающее, морские виды (например, рыба) или человек, оказывают благоприятное воздействие на здоровье указанного хозяина.
+
Используемый здесь для описания настоящего изобретения термин “серебро(I)” или “Ag(I)” относится к одновалентным положительно заряженным ионам серебра или Ag.
Используемые здесь для описания настоящего изобретения термины “золото(I)” и “золото(III)” относятся к одновалентным и трехвалентным положительно заряженным ионам золота соответственно.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 иллюстрирует противомикробное действие обработки частицами наносеребра согласно одному из вариантов осуществления изобретения при различных концентрациях общего числа клеток и выживании Е. coli.
Фиг. 2 иллюстрирует спектр рентгеноструктурного анализа частиц наносеребра согласно одному из вариантов осуществления изобретения.
Фиг. 3 иллюстрирует действие отношения серебра к массе клеток в сухом состоянии во время получения частиц наносеребра согласно одному из вариантов осуществления изобретения на противомикробное действие указанных частиц против Salmonella typhimurium.
Фиг. 4 иллюстрирует спектр рентгеноструктурного анализа частиц наносеребра согласно другому варианту осуществления изобретения.
Подробное описание изобретения
Первый аспект настоящего изобретения относится к разработке простого способа получения композиции, содержащей коллоидное наносеребро или нанозолото, включающего стадию инкубирования пробиотических бактерий с водным раствором, содержащим по меньшей мере 4 мМ соли серебра или золота.
Согласно настоящему изобретению подходящие пробиотические бактерии принадлежат к родам, таким как, но не ограничиваясь ими, Lactobacillus, Bifidobacterium, Escherichia, Enterococcus, Saccharomyces и Bacillus. Пробиотические бактерии могут без ограничений принадлежать к одному или более следующих видов: Lactobacillus sakei, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus cripatus, Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium adolescentis, Escherichia coli Nissle, Saccharomyces boulardii, Streptococcus thermophilus, Enterococcus faecium, Bacillus licheniformis, Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Bacillus acidophilus, Bacillus pumilus, Bacillus polyfermenticus, Bacillus clausii, Bacillus laterosporus, Bacillus sporogenes, Bacillus coagulas и Bacillus polymyxa.
Для осуществления различных вариантов способа согласно настоящему изобретению может быть использована любая растворимая в воде соль серебра. В описании термин “соль серебра” также включает гидраты и другие сольваты таких солей серебра. Растворимая в воде соль серебра может быть определена здесь как соль серебра с растворимостью в воде, составляющей по меньшей мере 0,1 г/л при температуре осуществления способа согласно изобретению, например при комнатной температуре. Соль серебра может без ограничений представлять собой неорганическую соль серебра или органическую соль серебра, такую как, но не ограничиваясь ими, ацетат серебра, хлорид серебра, перхлорат серебра, хлорат серебра, бромид серебра, фторид серебра, лактат серебра, нитрат серебра, сульфат серебра или тартрат серебра.
Для осуществления различных вариантов способа согласно настоящему изобретению может быть использована любая растворимая в воде соль золота. В описании термин “соль золота” также включает гидраты и другие сольваты таких солей золота. Растворимая в воде соль золота может быть определена здесь как соль золота с растворимостью в воде, составляющей по меньшей мере 0,1 г/л при температуре осуществления способа согласно изобретению, например при комнатной температуре. Соль золота может без ограничений быть одновалентной или трехвалентной. Соль золота может без ограничений представлять собой неорганическую соль золота или органическую соль золота, или смешанную соль золота, такую как, но не ограничиваясь ими, хлорид золота (III), моногидрат тиомалята золота-натрия, бромид золота (III), иодид золота (III) и нитрат золота (III).
Согласно одному из вариантов осуществления настоящего изобретения первоначальная концентрация соли серебра или золота в инкубируемом водном растворе должна составлять по меньшей мере 4 мМ, например по меньшей мере 10 мМ или в качестве конкретного примера по меньшей мере 50 мМ.
2
3
2
+
+
Согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения указанный водный раствор может также включать дополнительные компоненты, способные влиять на поведение, в частности улучшать свойства полученной композиции. В этом отношении, в варианте осуществления настоящего изобретения с получением наносеребра описываемый способ может включать стадию инкубирования пробиотических бактерий (описанных выше) с водным раствором, включающим по меньшей мере 4 мМ соли серебра и дополнительно включающим аммиак и/или соль аммония. Соли аммония, применимые в этом варианте, включают, но не ограничиваются ими, хлорид аммония, нитрат аммония, фосфат аммония, сульфат аммония, карбонат аммония, формиат аммония и бромид аммония. Количество аммиака и/или соли аммония, используемое в этом варианте осуществления настоящего изобретения, предпочтительно должно быть достаточным для того, чтобы обеспечить формирование существенного количества комплекса серебро-аммиак или серебро-аммоний, такого как, но не ограничиваясь им, комплекс серебро(I)-аммиак в виде Ag(NH) и/или {Ag(NH)}. Согласно другому аспекту варианта осуществления настоящего изобретения инкубируемый водный раствор может также включать соответствующее количество гидроксида щелочного металла, такого как, но не ограничиваясь ими, гидроксид натрия или гидроксид калия. В соответствии с приведенным ниже описанием такое соответствующее количество может быть определено с учетом устанавливаемого подходящего диапазона рН.
Согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения описываемый способ включает стадию инкубирования пробиотических бактерий (описанных выше) с водным раствором, включающим по меньшей мере 4 мМ соли золота и дополнительно включающим соответствующее количество гидроксида щелочного металла, такого как, но не ограничиваясь ими, гидроксид натрия или гидроксид калия, в отсутствие аммиака и/или соли аммония.
Подходящие гидроксиды щелочных металлов, такие как, но не ограничиваясь ими, гидроксид натрия или гидроксид калия, могут быть добавлены к инкубационному водному раствору в концентрации, составляющей приблизительно до 1М. Инкубацию предпочтительно осуществляют при рН, составляющей по меньшей мере 8, например в диапазоне приблизительно от 8 до 12 либо, в качестве более конкретного варианта, в диапазоне приблизительно от 8 до 11.
Согласно одному из вариантов осуществления настоящего изобретения отношение массы серебра или массы золота к массе клеток в сухом состоянии (далее сокращенно CWD) пробиотических бактерий по меньшей мере составляет около 0,01, например по меньшей мере около 0,05 или по меньшей мере около 0,1. Согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения весовое соотношение Ag:CDW или Au/CDW составляет не более приблизительно 20, предпочтительно менее приблизительно 10, например менее 5.
Согласно одному из вариантов осуществления настоящего изобретения стадию инкубирования в этом способе осуществляют при температуре, составляющей приблизительно от 5°С до 45°С, предпочтительно при температуре, составляющей приблизительно от 15°С до 35°С, например при комнатной температуре.
Согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения стадия инкубирования в этом способе может быть осуществлена в течение периода времени, составляющего приблизительно от 1 секунды до 30 минут, например приблизительно от 5 секунд до 20 минут. Специалист в данной области техники способен определить путем минимальных экспериментов наиболее подходящий период времени для инкубирования в зависимости от других параметров процесса, таких как, но не ограничиваясь ими, концентрация соли серебра или золота, температура инкубирования, весовое соотношение Ag:CDW или Au/CDW, присутствие или отсутствие аммиака или соли аммония и т.п. Как принято в данной области техники, инкубирование может быть осуществлено при перемешивании в течение по меньшей мере части инкубационного периода.
2
3
2
2
Способ согласно настоящему изобретению может также включать стадию дальнейшей обработки получаемой композиции, содержащей коллоидные наночастицы серебра или золота. Такая дальнейшая обработка может включать одну или более стадий, таких как, но не ограничиваясь ими, отделение по меньшей мере части биомассы от наночастиц серебра или золота либо фракционирование биомассы путем механической, ферментативной и/или физико-химической обработки, например при помощи ультразвука. Все указанные способы отделения или фракционирования биомассы хорошо известны специалистам в данной области техники. Альтернативно или в дополнение к указанным способам, такая обработка может включать стадию химической обработки с целью стабилизации или даже улучшения определенных желаемых свойств получаемой композиции, включающей коллоидные наночастицы серебра или золота. В соответствии с конкретным вариантом такой химической обработки композиция из наночастиц серебра или золота согласно настоящему изобретению может быть обработана после инкубирования и необязательного удаления биомассы окислителем, таким как пероксид или пер-соль, с целью получения осадка наночастиц серебра или золота с улучшенной стабильностью и/или (относительно наносеребра) с более высокой противомикробной активностью. Согласно этому варианту осуществления настоящего изобретения подходящие органические и неорганические пероксиды включают, но не ограничиваются ими, пероксид водорода, перуксусную кислоту и т.п. Подходящие пер-соли, применимые в этом варианте осуществления настоящего изобретения, включают, но не ограничиваются ими, щелочные водорастворимые соли, способные формировать пероксид водорода при диссоциации, например при растворении таких солей в воде высвобождается ион пероксида. Подходящие примеры таких солей включают перкарбонаты, пербораты, персиликаты и перфосфаты, ассоциированные с катионом, таким как щелочной металл. Особенно предпочтительным является перкарбонат натрия, имеющий эмпирическую формулу 2NaCO·3НО. В подтверждение этого варианта осуществления настоящего изобретения специалист в данной области техники знает, что:
- такие пер-соли могут превосходить по дезинфекционной способности пероксид водорода;
- пероксид водорода является слабым дезинфицирующим средством и плохо проникает в бактерии;
при растворении пер-соли в воде и освобождении пероксида
водорода щелочная соль экстрагирует протон из освобожденного пероксида водорода, формируя ион гидропероксида, который в отличие от пероксида водорода является сильным дезинфицирующим средством и легко проникает в бактерии.
В любой момент процесса согласно изобретению твердая часть, включающая коллоидное наносеребро или нанозолото, может быть отделена от жидкой части любым способом, хорошо известным специалисту в данной области техники. Например, она может быть отделена центрифугированием и последующей декантацией жидкой фракции либо фильтрацией.
В способе согласно настоящему изобретению соль серебра или золота может быть по меньшей мере частично замещена солью меди при одновременном тщательном регулировании одного или более реакционных рабочих условий, таких как, но не ограничиваясь ими, рН, температура инкубирования, вид соли и концентрация соли. В способе согласно настоящему изобретению виды пробиотических бактерий также могут быть по меньшей мере частично замещены альтернативными организмами или бактериями при одновременном тщательном регулировании одного или более реакционных рабочих условий, таких как, но не ограничиваясь ими, рН, температура инкубирования, вид соли и концентрация соли (золота или серебра). Такие альтернативные бактерии могут быть выбраны из группы, включающей бактерии, которые обычно считаются безопасными для окружающей среды, более конкретно, бактерии, которые, как известно, имеют способность к биовосстановлению.
Несмотря на то что способ согласно настоящему изобретению в основном описан здесь относительно серебра и золота, он не ограничивается этими металлами, а, как указано в самом широком его выражении, также применим к другим металлам или соединениям металлов при условии, что одно или более реакционных рабочих условий, таких как, но не ограничиваясь ими, рН, температура инкубирования, вид соли и концентрация соли, адаптированы соответствующим образом. Такая адаптация входит в объем рутинных экспериментов для специалиста с учетом изложенных здесь общих положений. Металлы, представляющие особый интерес в рамках данного изобретения, включают цинк, ртуть, медь, палладий, платину и висмут.
Второй аспект настоящего изобретения касается противомикробного использования наносеребряной композиции, получаемой вышеописанным способом, основанного на неожиданном открытии, заключающемся в том, что эффективная концентрация такой наносеребряной композиции при противомикробной обработке может быть исключительно низкой, в зависимости от бактерий-мишеней, например около 0,5 м.д. или даже менее, например около 0,05 м.д. или даже менее, а также на открытии, заключающемся в том, что существенное снижение количества нежелательных бактерий может произойти в течение ограниченного периода времени, например не более чем в течение приблизительно 5 часов. Подходящие для этого аспекта настоящего изобретения бактерии-мишени включают широкий диапазон грамположительных и грамотрицательных микробов, таких как, но не ограничиваясь ими, Pseudomonas aeruginosa (например, штамм СМСМ-2-22), Pseudomonas cepacia, Enterobacter cloacae, Enterobacter agglomerans, Klebsiella pneumoniae (например, штамм ATCC-10031), Eschericia coli, Streptococcua faecalis (например, штамм ATCC-10541), Staphylococcus cohnii, Staphylococcus aureus (например, штамм IP 52154 или ATCC-6538), Bacillus subtilis (штамм ATCC-19659) (которые являются обычными больничными штаммами бактерий), Enterococcus facium, Enterococcus hirae, Thibacillus ferrooxidans (например, штамм ATCC-13661), Lactobacilli, Thermophilic bacilli, Trychophyton interdigitale (например, штамм ATCC-640), Clostridium sporogenes (штамм ATCC-3584), Clostridium perfringens (штамм ATCC-13124), Salmonella typhimurium, Listeria monocytogenes и т.п. Наносеребряная композиция согласно изобретению также способна проявлять активность против грибков, включая, например, Candida albicans (например, штамм APCC-2091), Mycobacterium smegmatis (например, штамм IP 7326), Aspergillus niger (например, штамм 218 IP), Penicillium verrucosum и т.п., а также способна проявлять антипаразитарную активность против, например, Schistosoma haematobium, Schistosoma mansoni и т.п.
Согласно конкретному варианту осуществления настоящего изобретения противомикробное (или противогрибковое, или противопаразитарное, или противовирусное) применение может иметь вид жидкой дезинфицирующей композиции, в которой наносеребряная композиция, полученная вышеописанными способами, может быть соединена со вторым противомикробным агентом или смесью таких агентов. Подходящие примеры второго противомикробного агента включают, но ограничиваются ими, пероксид водорода, четвертичные соли аммония, перуксусную кислоту, пер-соли (указанные выше при описании первого аспекта настоящего изобретения), а также их смеси в любых известных пропорциях. В частности, указанная комбинация способна обеспечить синергетическое действие противомикробной активности. Согласно конкретному варианту указанный второй противомикробный агент может представлять собой окислительный противомикробный агент, такой как, но не ограничиваясь ими, диоксид хлора, монохлорамин, гипохлорит, перманганат калия, йод или хлор. Жидкие дезинфицирующие композиции согласно этому варианту изобретения могут дополнительно включать один или более стабилизаторов, таких как, например, фосфорная кислота, азотная кислота, серная кислота, бромистоводородная кислота или борная кислота либо их смеси, задачей которых является регулирование рН композиции в рамках диапазона, подходящего для ее транспортировки и использования. Среди стабилизаторов из неорганической кислоты особенно предпочтительной является фосфорная кислота. На практике подходящее количество указанного кислотного стабилизатора обычно может быть добавлено к пероксиду водорода марки “коммерчески доступный”. Стабилизатор, необязательно используемый в изобретении, также может представлять собой органическую карбоновую кислоту, такую как винная кислота, лимонная кислота (или ее гидрат), бензойная кислота, пиколиновая кислота, никотиновая кислота и изоникотиновая кислота. Для этой цели могут быть также использованы смеси органических и неорганических кислот. Указанный стабилизатор (стабилизаторы), при его наличии, предпочтительно присутствует в количестве, эффективном для регулирования рН и/или длительной стойкости при хранении жидкой дезинфицирующей композиции. Такие дезинфицирующие жидкие композиции согласно изобретению могут также включать по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из поверхностно-активных веществ, ингибиторов коррозии и ароматизаторов (отдушек).
8
20
Подходящие поверхностно-активные вещества, которые могут быть использованы в дезинфицирующих композициях согласно настоящему изобретению, включают, например, но не ограничиваются ими, катионные, неионные, амфотерные и цвиттерионные поверхностно-активные вещества, предпочтительно ПАВ, подходящие для контакта с пищевыми продуктами или питьевой водой, в соответствующих дозах, а также смеси таких соединений. Потенциально применимым для этой цели является широкий ряд неионных поверхностно-активных веществ. Неограничивающие примеры анионных поверхностно-активных веществ включают, например, ПАВ, выбранные из группы, состоящей из полиэтоксилированных и/или полипропоксилированных гликолей, сложных моноэфиров С-С жирных кислот, монопальмитата сорбитана и т.п. Конкретные примеры подходящих амфотерных поверхностно-активных веществ включают 3-додециламинопропионат натрия, 3-додециламинопропансульфонат натрия, N-алкилтаурины и бетаины.
Дезинфицирующая композиция, включающая наносеребро, полученное способом согласно настоящему изобретению, может быть стабилизирована в биоматрице и может быть использована непосредственно или после дальнейшей вышеописанной обработки с целью обработки, очистки или обеззараживания среды. Например, частицы наносеребра могут быть диспергированы на то место, откуда должны быть удалены бактерии, или вокруг него любыми подходящими средствами или способами нанесения. Наносеребряный компонент композиции способен взаимодействовать с компонентами клеток бактерий, таким образом эффективно разрушая их и снижая общее количество клеток бактерий до приемлемого уровня.
Описанная выше содержащая наносеребро жидкая композиция может быть использована для очистки, обеззараживания, дезинфекции или стерилизации твердой поверхности либо какого-либо объема газа или жидкости. В том случае, если указанную жидкую композицию согласно настоящему изобретению используют в качестве дезинфицирующей или стерилизующей композиции (например, диспергируя ее в жидкость или газ), ее обычно применяют в соответствующих условиях, включая ее концентрацию и продолжительность использования, которые могут быть легко определены специалистом на основании стандартных знаний в области дезинфекции и стерилизации.
При нанесении дезинфицирующей жидкой, содержащей наносеребро композиции согласно изобретению, на твердую поверхность предпочтительным является нанесение, в целях безопасности, готового к использованию разбавленного состава, полученного в результате смешивания подходящего количества концентрированной композиции с водой, а затем увлажнение указанной твердой поверхности разбавленным составом, полученным за время, в течение которого происходит полное увлажнение твердой поверхности (что, как известно специалисту, может зависеть от пористости поверхности).
Как известно специалистам в данной области техники, предпочтительное количество используемой дезинфицирующей, жидкой, содержащей наносеребро композиции широко варьирует в зависимости от вида и количества микроогранизмов, присутствующих на твердой поверхности или присутствующих в обрабатываемой жидкости или газе.
Что касается вышеуказанного использования жидких, содержащих наносеребро композиций согласно изобретению в качестве дезинфицирующего средства, более конкретно могут быть рекомендованы следующие способы нанесения:
- погружение обрабатываемого продукта в указанную содержащую наносеребро композицию;
- разбрызгивание дезинфицирующей композиции на обрабатываемую твердую поверхность; и
- введение дезинфицирующей (разбавленной или концентрированной) композиции в обрабатываемую воду (в частности, в воду плавательного бассейна, воду от промышленных процессов, сточную воду и т.п.).
Поэтому дезинфицирующие жидкие, содержащие наносеребро композиции согласно настоящему изобретению, особенно применимы для:
(а) дезинфекции и санитарной обработки больничных и лабораторных помещений, промышленных помещений (таких как молочные фермы, сыроварни, солодовни, пивные заводы, установки для получения минеральной воды, вина, спиртных напитков, фруктовых и овощных соков; теплицы; коровники, птичники и конюшни; линии для упаковки пищевых продуктов, напитков или фармацевтических препаратов; внутренние помещения летательных аппаратов и судов) и содержимого таких помещений, особенно оборудования или инструментов в таких помещениях;
(b) стерилизации асептических загороженных помещений, таких как инкубаторы для выхаживания преждевременно родившихся животных или выращивания аксенических животных;
(с) борьбы с Legionella в системах для кондиционирования воздуха;
(d) дезинфекции и санитарной обработки контейнеров для хранения (особенно силосов) и линий для подачи жидких или твердых продуктов, таких как пищевые продукты (сахар, чай, кофе, зерна, напитков) и корма для животных;
(е) дезинфекции и санитарной обработки плавательных бассейнов и другого бальнеологического оборудования (в таком случае композиция предпочтительно не содержит поверхностно-активных веществ);
(f) дезинфекции систем для получения, транспортировки и хранения питьевой воды (например, в колодцах или контейнерах для хранения), при этом композиция предпочтительно не содержит поверхностно-активных веществ; и
(g) защиты выращиваемых на открытом воздухе культур (таких как зерновые культуры, томаты, плантации бананов, гидропонные культуры, включая witloof, семена, мелкие клубни и т.п.), благодаря их бактерицидным, фунгицидным, противовирусным и противопаразитарным свойствам.
Высокая и селективная противомикробная активность композиции из наносеребра, получаемой способом согласно настоящему изобретению, находит широкое применение как в быту, так и в промышленности, включая, но не ограничиваясь ими, дезинфекция воды, предотвращение роста водорослей в воде, использование в качестве очищающего средства и формирование противомикробных покрытий, например, для медицинских целей или обработки питательных или других продуктов для людей или животных (особенно при отсутствии минимального действия эукариотических клеток или организмов), для противомикробной защиты текстильных продуктов, в качестве ингредиента медицинских препаратов, предназначенных для предотвращения инфекционного или микробного загрязнения обнаженных тканей, таких как, но не ограничиваясь ими, кремы, мази или лосьоны, либо в качестве катализаторов в химических или иных процессах превращения. Каждый из вышеуказанных видов применения может быть осуществлен с использованием наносеребра в суспензии, а также после введения наносеребра в полимеры и/или иные виды покрытий.
Третий аспект настоящего изобретения относится к получению металлических наноосадков пробиотическими и другими бактериями, которые, как неожиданно выяснилось, могут быть использованы в качестве альгицидного агента (например, против Chlorella vulgaris, но не ограничиваясь ею) в питьевой воде, воде для аквариумов, прудов или плавательных бассейнов либо в других резервуарах со свежей или соленой водой, в полимерах и красках, в поверхностных покрытиях и других материалах для защиты от слабого загрязнения (эстетический аспект) или сильного загрязнения (загрязнение материалов). Четвертый аспект настоящего изобретения относится к получению металлических наноосадков пробиотическими и другими бактериями, которые, как неожиданно выяснилось, могут оказывать гербицидное действие против некоторых двудольных или однодольных растений либо действие против низших растений, таких как мох, как в разбавленном виде в воде, так и при дальнейшей механической, ферментной и/или физико-химической обработке. Выбор соответствующих растений для этой цели не является критическим параметром настоящего изобретения. Подходящие растения для этой цели включают, среди прочих, двудольные растения, такие как табак (Nicotiana tabacum), ряска (Lamna sp.), соя (Glycine max), яблоня, сахарная свекла, Arabidopsis thaliana, люцерна, петуния, хлопчатник, морковь, сельдерей, капуста, огурец, перец, канола, томат, картофель, чечевица, лен, брокколи, боб, салат, сурепка, цветная капуста, шпинат, брюссельская капуста, артишок, горошек, окра, тыква, капуста кормовая, капуста листовая, чай, кофе и Selaginella lepidophylla. Они также включают однодольные растения, такие как рис Oryza sativa, кукуруза, ячмень, маис, подсолнечник (Helianthus annuus), пшеница, овес, просо, сорго, амарант, лук, аспарагус и сахарный тростник.
Вышеперечисленные аспекты настоящего изобретения особенно применимы в следующих областях:
- ингибирование роста водорослей в аквариумной воде, в системах распределения питьевой воды для животных и людей, в системах распределения воды для садоводства, в прудах, в плавательных бассейнах, в фильтрационных системах для обработки воды из прудов или плавательных бассейнов, а также в оросительных системах различных видов;
- ингибирование роста водорослей на поверхностях, включая поверхности, находящиеся в контакте с водой, такие как корпусы судов;
- использование в красках, полимерах или покрытиях для предотвращения роста водорослей на поверхностях, включая рост водорослей на поверхностях более высокоорганизованных организмов, таких как растения;
- ингибирование роста мха или других нежелательных растений как однодольных, так и двудольных путем нанесения на листья, стволы, цветы или корневые системы коллоидного серебра, например коллоидного серебра, полученного при помощи пробиотических бактерий и осажденного на них согласно вышеописанному способу получения; и
- ингибирование роста определенных растений или сорняков на поверхностях, включающее нанесение покрытий или какое-либо иное воздействие на такие поверхности коллоидного серебра, например коллоидного серебра, полученного при помощи пробиотических бактерий и осажденного на них согласно вышеописанному способу получения.
Следующие примеры приведены в качестве иллюстрации некоторых вариантов способа и дезинфицирующих композиций согласно настоящему изобретению, никоим образом не ограничивая их.
Пример 1 - получение наносеребра
600
Культуру Lactobacillus fermentum Beijerinck 1901 AL (ATCC 11976, LMG 8900, из кишечника 8-дневного кормящегося грудью ребенка) размножают в бульоне MRS (изготавливается для коммерческих целей Oxoid, Basingstoke, United Kingdom) в микроаэробных условиях при 37°С в течение 15 часов. Клетки собирают из MRS центрифугированием при 3000 g в течение 10 минут при 15°С и промывают 2 раза миллиQ водой, затем вновь суспендируют в миллиQ воде до конечной оптической плотности, составляющей 1,5, при 600 нм (OD). К клеточной суспензии добавляют гидроксид натрия из 1 N маточного раствора NaOH таким образом, чтобы конечная концентрация составляла 0,05 N NaOH и 0,10 N NaOH соответственно.
3
4
Готовят маточный раствор Ag(I) из 425 мг AgNO и 225 мг NHCl в 50 мл миллиQ воды. Один объем приготовленного маточного раствора Ag(I) добавляют к десяти объемам клеточных суспензий с 0,05 и 0,10 N NaOH соответственно. Полученным смесям позволяют инкубироваться при видимом свете и температуре 25°С в условиях несильного перемешивания (100 оборотов вибратора в минуту) в течение 30 минут. Получают 5,0 мМ конечного раствора Ag(0) (535 мг Ag(0)/л), осажденного на биомассе Lactobacillus fermentum, называемого в данном описании “наносеребром” или “нано-Ag”. Клетки Lactobacillus fermentum с покрытием подвергают центрифугированию и трижды промывают миллиQ водой с целью удаления остатков среды роста и других добавок путем повторного центрифугирования, декантирования и повторного суспендирования композиции в свежей миллиQ воде. После этого концентрацию нано-Ag доводят до конечной величины. Затем композицию либо разбавляют миллиQ водой, либо концентрируют центрифугированием при 3000 g и повторно суспендируют в миллиQ воде согласно потребностям конечного пользователя.
Пример 2 - XRD анализ наносеребра
Рентгеноструктурный (XRD) анализ биомассы с частицами серебра, полученной в примере 1, а затем высушенной при 30°С, осуществляют на дифрактометре Siemens D5000 при помощи оптических приборов Брэгга-Брентано (выпускаются для коммерческих целей Siemens, Munich, Germany). Рентгеновские лучи исходят из медной рентгеновской трубки мощностью 1,6 kW (40 kV, 40 mA). Измерения осуществляют между 25 и 90 градусами 2-тета с продолжительность шага 1,6 сек и величиной шага 0,05 градуса. Полученный спектр (не представлен) показывает наличие рентгенограммы металлического серебра и оксида натрия. Последний представляет собой остаток гидроксида натрия, используемого при получении наносеребра.
Пример 3 - EDX анализ наносеребра
Рентгеноспектральный анализ на основе метода энергетической дисперсии (EDX) сухой биомассы с наносеребром, полученной в примере 1 и дополнительно высушенной при 30°С, осуществляют при помощи сканирующего электронного микроскопа JSM6100 с детектором EDX (выпускается JEOL USA, Inc.) с разрешением, соответствующим падающей энергии, составляющей 20,0 keV. Результаты анализа представлены в таблице 1 (как весовые %, так и атомные %) и отчетливо показывают присутствие в основном органического вещества (из-за высокого содержания углерода и кислорода) и серебра, общее содержание которых составляет около 91 мас.% от сухого вещества. Остальной высушенный продукт состоит из следовых элементов Ca, Mg, Si, P, S и Cl, в основном из-за минеральных остатков высушенной биологической матрицы.
Таблица 1
Элемент
Весовой %
Атомный %
C
55,90±0,28
69,18±0,16
O
26,21±0,08
24,35±0,15
Na
4,97±0,02
3,21±0,00
Mg
0,85±0,06
0,52±0,04
Si
0,19±0,06
0,10±0,03
P
1,64±0,04
0,79±0,02
S
0,22±0,01
0,11±0,01
Cl
0,31±0,03
0,13±0,014
Ag
8,51±0,20
1,17±0,03
Ca
1,22±0,18
0,45±0,07
Пример 4 - противомикробная активность наносеребра на твердой среде для выращивания Escherichia coli
3
2
2
100 Мл суспензии серебра с концентрацией Ag, составляющей 5 мМ, осажденного на биомассу Lactobacillus fermentum, полученную в примере 1, высевают на отвержденную среду для выращивания для того, чтобы культивировать Escherichia coli (агар Luria Bertani). В качестве контроля 100 мл раствора 5 мМ AgNO в стерильной миллиQ воде с 0,1 N NaOH высевают на такую же среду для выращивания. Такая методика согласуется с общим количеством, составляющим 0,05 мг Ag на чашку агара или 11 мг Ag на м общей площади поверхности. Данный эксперимент повторяют с удвоенными последними концентрациями, т.е. с 0,11 мг Ag на чашку агара или 22 мг Ag на м общей площади поверхности.
3
Высевая такие суспензии серебра, на отвержденную среду для выращивания наносят гомогенный слой Ag(I)NO или нано-Ag соответственно.
6
2
2
1
6
1
2
2
6
2
2
3
После такой предварительной обработки отвержденной среды для выращивания в предварительно обработанные чашки для агара высевают 100 мкл 2х10КОЕ/мл суспензии Escherichia coli в физиологическом растворе (8,5 г NaCl/л в стерильной воде). Затем чашки инкубируют в течение 24 часов при 30°С и подсчитывают количество колоний. Полученные результаты проиллюстрированы на фиг.1. При концентрациях нано-Ag, составляющих 11 мг Ag/м и 22 мг Ag/м, на обработанной твердой среде для выращивания жизнеспособные клетки Е. coli не обнаружены (<предел обнаружения (D.L.)=1x10КОЕ/мл). Таким образом, обработка нано-Ag при указанных концентрациях приводит к снижению количестве клеток Е. coli с 2х10КОЕ/мл до менее чем 1х10КОЕ/мл (D.L.). При концентрациях Ag(I)NO, составляющих 11 мг Ag/м и 22 мг Ag/м, происходит существенное снижение количестве клеток Е. coli с 2х10КОЕ/мл до 4х10КОЕ/мл и 1х10КОЕ/мл соответственно.
6
В качестве контроля суспензии Е. coli с концентрацией, составляющей с 2х10КОЕ/мл, высевают на необработанную среду для выращивания, т.е. без Ag, и на такую же среду для выращивания, обработанную 100 μл стерильной мQ воды только с Lactobacillus fermentum ATCC 11976, при такой же концентрации, как и при обработке Ag, но без нано-Ag. При общем подсчете количества клеток ингибирующего действия не наблюдается. Следовательно, ингибирующее действие по отношению к нано-Ag и Ag(I) объясняется обработкой Ag, а не методикой обработки или штаммами Lactobacillus, используемыми в данном эксперименте.
Пример 5 - противомикробная активность в суспензии относительно различных патогенных бактерий
Исследуют выживание патогенных культур Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus и Listeria monocytogenes, разбавленных в физиологических растворах, имеющих различные концентрации (0 мг/л, 0,10 мг/л, 1,0 мг/л, 10 мг/л и 50 мг/л) композиции нано-Ag, полученной в примере 1. Нано-Ag наносят в физиологическом растворе, содержащем живую культуру одной из вышеуказанных патогенных бактерий. Физиологический раствор, содержащий 8,5 г NaCl на 1 л воды, получают таким образом, чтобы его осмотический потенциал был нейтральным по отношению к бактериальным клеткам, таким образом не убивая их благодаря осмотическому воздействию. Контрольные обработки включают использование бактериальной культуры в физиологическом растворе при отсутствии нано-Ag.
Готовят маточный раствор 100 мг нано-Ag/л в мQ воде и добавляют его к бактериальным культурам, разбавленным в физиологическом растворе в количествах, подходящих для получения конечных концентраций нано-Ag, указанных в таблице 2.
4
5
Обработку повторяют по отдельности для каждого вида вышеуказанных патогенных бактерий, при этом “бактериальная культура” представляет собой разбавленный жидкий бульон с видами бактерий в экспоненциальной фазе роста, разбавленный в физиологическом растворе до конечной концентрации клеток, составляющей 10-10КОЕ/мл. Каждую обработку проводят дважды. Инкубирование осуществляют в стерильных, закрытых пробками пробирках, которые инкубируют при встряхивании при 37°С в течение 72 часов. После инкубирования по 100 мкл из каждой пробирки высевают на твердую среду для роста из триптаза-соевого агара (TSA) и подсчитывают количество колоний. Полученные результаты представлены в таблице 2 для различных исследуемых патогенных микроорганизмов.
Таблица 2
Концентрация нано-Ag(мг Ag/л)
Патогенный микроорганизм (КОЕ/мл)
E.coli
S.aureus
Salmonella
Listeria
0
1,1х10<sup>2</sup>
1,3х10<sup>2</sup>
1,0х10<sup>3</sup>
1,5х10<sup>1</sup>
0,10
4,6х10<sup>1</sup>
1
5
1,0х10<sup>1</sup>
1,0
0
0
0
2
10
2
0
0
0
50
0
0
0
0
Из таблицы 2 очевидно, что концентрация, равная 1 мг/л нано-Ag, полученного в примере 1, является достаточной для снижения количества жизнеспособных клеток E.coli, S.aureus и S. typhimurium в течение 72 часов до концентрации клеток <10 КОЕ/мл (т.е. ниже предела обнаружения). Существенная гибель клеток уже наблюдается при концентрации, равной 0,10 мг/л. Что касается Listeria, снижение концентрации жизнеспособных клеток ниже предела обнаружения происходит при 10 мг/л нано-Ag. Таким образом, может быть сделан вывод о том, что нано-Ag, полученное в примере 1, при концентрациях, равных 1,0 мг/л или менее в жидких клеточных суспензиях, действует как сильный противомикробный агент, существенно и эффективно убивающий жизнеспособные патогенные бактерии в жидкости.
Пример 6 - противомикробная активность нано-Ag в суспензии в сочетании с Artemia franciscana
R
5
Стерильную искусственную морскую воду (Instant Ocean, выпускаемую Aquarium Systems USA) получают в миллиQ воде путем автоклавирования. Обработке подвергают по 20 мл аликвотных долей стерильной искусственной морской воды в 50-мл пробирках Falcon. Каждая обработка (в тройном экземпляре) включает использование 20 аксенических Artemia nauplii в 20 мл искусственной морской воды в сочетании с 10КОЕ/мл (колониеобразующие единицы) Vibrio campbellii LMG21363 и/или нано-Ag, полученного в примере 1, с конечной концентрацией, представленной в таблице 3. Таким образом инкубируют патогенную бактерию V. campbellii вместе с ее огранизмом-хозяином Artemia franciscana.
Проводят следующие испытания:
5
- Artemia franciscana + 10КОЕ/мл Vibrio campbellii
5
- Artemia franciscana + 10КОЕ/мл Vibrio campbellii + 100 мг нано-Ag/л
5
- Artemia franciscana + 10КОЕ/мл Vibrio campbellii + 10 мг нано-Ag/л
5
- Artemia franciscana + 10КОЕ/мл Vibrio campbellii + 1,0 мг нано-Ag/л
5
- Artemia franciscana + 10КОЕ/мл Vibrio campbellii + 0,1 мг нано-Ag/л
- Artemia franciscana + 0,10 мг нано-Ag/л
- Artemia franciscana + 100 мг нано-Ag/л
- Artemia franciscana + 10 мг нано-Ag/л
- Artemia franciscana + 1,0 мг нано-Ag/л и
- Artemia franciscana + 0,10 мг нано-Ag/л.
Через 48 часов инкубирования концентрацию V. campbellii в стерильной искусственной морской воде с Artemia franciscana определяют чашечным методом на специфической среде для роста Vibrio. Средние результаты обработки представлены ниже в таблице 3 (где D.L. означает предел обнаружения).
Таблица 3
Концентрациянано-Ag (мг Ag/л)
Выживание патогенных бактерий Vibrio campbellii
0
1,0х10<sup>5 </sup>КОЕ/мл
0,10
3,0х10<sup>2 </sup>КОЕ/мл
1,0
<10<sup>1 </sup>КОЕ/мл (D.L.)
10
<10<sup>1 </sup>КОЕ/мл (D.L.)
100
<10<sup>1 </sup>КОЕ/мл (D.L.)
Кроме того, следует отметить, что при концентрациях, составляющих 0,10 и 1,0 мг/л нано-Ag, не происходит существенного влияния на уровень выживания (80%) Artemia franciscana по сравнению с необработанными контрольными образцами. Это означает, что при данных концентрациях нано-Ag, полученный согласно примеру 1, не оказывает токсического или ингибирующего действия на более высокоорганизованные организмы.
Пример 7 - определение эффективной продолжительности контакта для проявления противомикробной активности
Целью данного испытания является определение подходящей продолжительности контакта композиции из нано-Ag согласно примеру 1 с патогенными культурами бактерий Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus и Listeria monocytogenes, разбавленных в физиологических растворах, для получения эффективной противомикробной активности при концентрациях, составляющих 0,1 и 1,0 мг/л Ag соответственно.
Данными концентрациями нано-Ag воздействуют на бактериальные культуры в физиологическом растворе (8,5 г NaCl в 1 л воды), полученном таким образом, чтобы его осмотический потенциал был нейтральным по отношению к бактериальным клеткам, таким образом не убивая их благодаря осмотическому воздействию. Контрольная обработка включает использование бактериальной культуры в физиологическом растворе без композиции из нано-Ag.
Готовят маточный раствор 100 мг нано-Ag/л в мQ воде и добавляют его к бактериальным культурам (таким же образом, как и в примере 5) в физиологическом растворе в количествах, подходящих для получения нужных конечных концентраций нано-Ag.
Инкубирование (в двойном экземпляре) осуществляют в стерильных, закрытых пробками пробирках путем встряхивания при 37°С, после чего подсчитывают количество клеток при различной продолжительности контакта (взятие замеров). При каждом взятии замеров по 100 мкл из каждой пробирки высевают на твердую среду для роста из триптаза-соевого агара (TSA) и подсчитывают количество колоний. Результаты, полученные через 15 часов, 16 часов, 17 часов, 18 часов и 40 часов соответственно, представлены ниже в таблице 4 (где ND означает “необнаруживаемый”, т.е. ниже предела обнаружения).
Пример 8 - получение композиций из наносеребра при различных весовых отношениях серебра к биомассе клеток в сухом состоянии
3
3
3
Готовят маточный раствор серебра (I) в жидком аммиаке (28 об.% NHOв воде) с конечной концентрацией, составляющей 425 г AgNO/л (= 50 мМ AgNO). Культуру Lactobacillus fermentum получают таким же способом, как и в примере 1.
2,8 г (во влажном состоянии) центрифугированных пеллет клеток повторно суспендируют в 3 различных количествах (50 мл, 100 мл и 1 л) миллиQ воды для получения реакционных смесей, обозначаемых буквами А, В и С соответственно.
Затем в каждую пробирку добавляют NaOH из 1 N маточного раствора NaOH в миллиQ воде для получения нормальности, составляющей 0,10 N NaOH в вышеуказанной суспензии.
После этого маточный раствор серебра (I) добавляют следующим образом:
- Реакционная смесь А: 0,24 мл маточного раствора серебра (I) добавляют для получения конечной концентрации, составляющей 1,30 г Ag/л (или 12 мМ) Ag. Почти сразу же происходит реакция осаждения (коричнево-красноватый осадок) на 56 г/л биомассы (во влажном состоянии). При среднем соотношении центрифугированной массы в сухом состоянии, составляющем от 10 до 30%, получают отношение массы серебра к массе клеток в сухом состоянии, составляющее от 1:4 до 1:12.
- Реакционная смесь В: 2,4 мл маточного раствора серебра (I) добавляют для получения конечной концентрации, составляющей 5,78 г Ag/л (55 мМ) Ag. Почти сразу же происходит реакция осаждения (коричнево-красноватый осадок) на 28 г/л биомассы (во влажном состоянии). Поскольку соотношение центрифугированной массы в сухом состоянии в среднем составляет 10-30%, получают отношение массы серебра к массе клеток в сухом состоянии, составляющее от 2:1 до 0,7:1. рН во время данное реакции составляет 11,6.
- Реакционная смесь С: 2,4 мл маточного раствора серебра (I) добавляют для получения конечной концентрации, составляющей 5,78 г Ag/л (55 мМ) Ag. Почти сразу же происходит реакция осаждения на 2,8 г/л биомассы (во влажном состоянии). Поскольку соотношение центрифугированной массы в сухом состоянии в среднем составляет 10-30%, получают отношение массы серебра к массе клеток в сухом состоянии, составляющее от 20:1 до 7:1.
Реакционную смесь оставляют на 30 минут, а затем собирают полученную композицию из нано-Ag.
Полученный осадок из нано-Ag центрифугируют вместе с биомассой при 3000 g в течение 10 минут при 15°С, а затем дважды промывают миллиQ водой, удаляя весь остаточный аммиак и другие растворимые в воде компоненты, используемые в технологическом процессе. После этого очищенный продукт из пеллет нано-Ag подвергают анализу (пример 9) или еще больше разбавляют в миллиQ воде до соответствующих концентраций нано-Ag для дальнейшего исследования.
Пример 9 - XRD анализ нано-Ag, полученного при отношении массы серебра к биомассе клеток в сухом состоянии, равном 0,7:1
XRD анализ биомассы с частицами серебра, полученной при отношении массы серебра к биомассе клеток в сухом состоянии, равном 0,7:1 согласно примеру 8, а затем высушенной в печи при 100°С в течение 24 часов, осуществляют в соответствии с примером 2. В данном спектре XRD может быть определена только рентгенограмма металлического серебра. Поскольку можно смело утверждать, что кристаллическое следовые элементы, содержащиеся в высушенном продукте в количестве менее 5 мас.%, не могут быть определены при помощи XRD, можно сделать приблизительный вывод о том, что по меньшей мере 95% серебра, определенного при помощи XRD, находится в состоянии Ag(0).
Пример 10 - последующая обработка наносеребра Н
О
2
2
2
2
2
2
2
2
Промытые пеллеты нано-Ag, полученные согласно примеру 1 или примеру 8, подвергают последующей обработке 30% (об.) НО в воде. Для этого шарики суспендируют в НО в количестве до 6 г Ag/л НО (30%). Получают более устойчивые осадки. Затем суспензию полученных осадков дополнительно разбавляют в миллиQ воде для получения соответствующих концентраций нано-Ag для дальнейших исследований.
Пример 11 - противомикробные свойства нано-Ag после обработки Н
О
или без нее
2
2
2
2
Составы нано-Ag получают согласно примеру 8 при различных весовых отношениях серебра к биомассе клеток в сухом состоянии, составляющих 7:1, 1:10 и 0,7:1 соответственно (образцы обозначены буквами А, В и С соответственно). Кроме того, препараты нано-Ag, полученные при весовом отношении серебра к биомассе клеток в сухом состоянии, равном 7:1, дополнительно обрабатывают НО, как в примере 10, получая четвертый образец, обозначенный буквой D.
4
Для того чтобы оценить действие данного весового отношения серебра к биомассе клеток в сухом состоянии на противомикробную активность продуктов нано-Ag, готовят клеточную суспензию, содержащую 1х10КОЕ/мл Salmonella typhimurium, в стерильном физиологическом растворе и распределяют ее по различным пробиркам. В эти же пробирки добавляют образцы А, В, С и D до получения в каждой пробирке конечной концентрации, составляющей 0,05 мг/л (или 50 м.д.) нано-Ag.
3
2
2
В качестве контрольных образцов бактериальные культуры инкубируют AgNO в количестве 0,05 м.д., а также без серебра. Пробирки закрывают пробками и инкубируют при встряхивании при 37°С в двойном экземпляре. Через 4,5 часов инкубирования отбирают образцы, осуществляют ряд разбавлений в физиологическом растворе, а после высевания на среду TSA чашки инкубируют при 37°С в течение ночи, для того чтобы определить общее количество Salmonella. Результаты таких подсчетов представлены на фиг.3 в виде среднего количества клеток и стандартного отклонения двух независимых дублей. После 4,5 часов инкубирования наблюдается существенное снижение количества бактерий в присутствии 0,05 м.д. нано-Ag, полученного описанным в примере 8 способом. Результаты, представленные на фиг. 3, показывают, что чем выше весовое отношение серебра к биомассе клеток в сухом состоянии, тем ниже противомикробная активность полученного нано-Ag. Обработка продукта нано-Ag НО также существенно повышает его противомикробную активность.
Пример 12 - определение размера частиц наносеребра при помощи просвечивающей электронной микроскопии (ТЭМ)
2
2
Для того чтобы получить тонкие срезы для анализа при помощи ТЭМ, пеллеты бактерий фиксируют в 0,1 М какодилатного буфера (рН 7,4), содержащего 2,5% глютаральдегида и 2% формальдегида, и заключают их в 3% низкоплавкую агарозу (от Difco Laboratories, Detroit, Michigan, USA). Затем полученные образцы фиксируют в 1% тетроксиде осмия. Между и после стадий фиксирования образцы промывают дистиллированной водой. После этого образцы дегидратируют в этаноле с возрастающей концентрацией и, наконец, в безводном оксиде пропилена. После внедрения в среду Epon-Spurr блоки образцов обрезают при помощи устройства для обрезания ТМ60 (от Reichert-Jung A.G., Vienna, Austria), получая переднюю поверхность размером 0,5х1 мм - 1х2 мм, и нарезают сверхтонкие срезы в золоте, чтобы матировать интерференцию серебра в цветовой диапазон, при помощи микротома Ultracut (от Reichert-Jung A.G., Vienna, Austria). Срезы переносят на pioloform и покрытые углеродом медные решетки (200 меш). После этого тонкие срезы окрашивают 2% уранилацетатом, а затем цитратом свинца, для того чтобы определить ультраструктуру клеток. Используемые химические вещества и решетки выпускает Agar Scientific (Stansed, United Kingdom). Изображения получают при помощи просвечивающего электронного микроскопа EM208S (от FEI, Eindhoven, the Netherlands), работающем при 80 kV.
Были получены ТЭМ-изображения (не представлены) частиц наносеребра, полученных из реакционных смесей А, В и С, описанных в примере 8. Полученные изображения подтверждают, что сферические частицы наносеребра были получены в составе в виде осадков на поверхности бактериальных клеток и в суспензии между биомассой.
2
- Размеры частиц нано-Ag, полученных из реакционной смеси А (соотношение 1:10): диаметр 35 измеренных наночастиц варьируется от 3,3 нм до 72 нм, при этом средний диаметр составляет 14 нм; площадь поверхности частиц варьируется от 6,4 до 2,996 нм, и поэтому сферичность варьируется от 0,14 до 0,97.
2
- Размеры частиц нано-Ag, полученных из реакционной смеси В (соотношение 1:1): диаметр 202 измеренных наночастиц варьируется от 3 нм до 116 нм, при этом средний диаметр составляет 15 нм; площадь поверхности частиц варьируется от 6 до 4,805 нм, и поэтому сферичность варьируется от 0,12 до 0,96.
2
- Размеры частиц нано-Ag, полученных из реакционной смеси С (соотношение 10:1): диаметр 56 измеренных наночастиц варьируется от 3,3 нм до 56 нм, при этом средний диаметр составляет 16 нм; площадь поверхности частиц варьируется от 6,4 до 1,841 нм, и поэтому сферичность варьируется от 0,15 до 0,95.
Пример 13 - получение коллоидного нанозолота
3
Готовят маточный раствор золота(III) в миллиQ воде с конечной концентрацией, составляющей 7,5 г AuCl/л. Культуру Lactobacillus fermentum получают таким же способом, как и в примере 1.
Центрифугированные влажные пеллеты массой 2,5 г во влажном состоянии добавляют к 100 мл миллиQ воды.
NaOH добавляют из 1 N маточного раствора NaOH в миллиQ воде для получения нормальности вышеуказанной суспензии, составляющей 0,10 N NaOH.
3
После этого к полученной суспензии добавляют 10 мл маточного раствора золота(III) для получения конечной концентрации, составляющей 75 мг Au(III)/100 мл, в виде AuCl-Au (3,8 мМ Au). Осаждение Au(0) на 2,5 г/100 мл биомассы (во влажном состоянии) завершается в течение 4 часов. Поскольку соотношение центрифугированной массы в сухом состоянии в среднем составляет 10-30%, получают отношение массы золота к массе клеток в сухом состоянии, составляющее от 1:3 до 1:10.
Реакции дают возможность продолжаться в течение 4 часов, после чего собирают частицы нанозолота. Полученный пурпурный осадок центрифугируют при 3000 g в течение 10 минут при 15°С и 2 раза промывают миллиQ водой, удаляя растворимые в воде компоненты из технологического процесса.
Пример 14 - XRD анализ нанозолота
0
XRD анализ биомассы с частицами золота из примере 13, высушенной в печи при 100°С в течение 24 часов, осуществляют на дифрактометре Siemens D5000 при помощи оптических приборов Брэгга-Брентано в соответствии с примером 2. Полученный спектр, представленный на фиг.4, показывает наличие рентгеновских дифракционных пиков только Au.
Пример 15 - эффективность биоосаждения и восстановления на биомассе при различных отношениях массы серебра к биомассе клеток в сухом состоянии
Для того чтобы оценить влияние биомассы на биовосстановление частиц Ag(I) до Ag(0), определяют восстановление на биомассе и в растворе при различных отношениях Ag:CDW.
Получают составы серебра при различных отношениях Ag:CDW в соответствии с описанием, приведенным в примере 8. Через 4 часа инкубирования массы Ag(I) и после ее фракционирования на растворимую фазу (в растворе) и осажденную фазу (на биомассе) путем центрифугирования при 7000 g в течение 10 минут определяют процентную величину восстановления серебра. Полученные результаты представлены ниже в таблице 5.
Таблица 5
Образец(отношение Ag:CDW)
Мг Ag/л в растворе
Мг Ag/л в биомассе
Общее восстановление
А (1:10)
76
1295
100%
В (1:1)
819
5308
100%
С: Ag:CDW = 10:1
1612
4844
100%
0
Из приведенных результатов понятно, что восстановление серебра в виде ассоциированных с биомассой частиц выше при более низких соотношениях Ag:CDW. Например, соотношение Ag:CDW, составляющее 1:10, обеспечивает приемлемое восстановление Ag(I) (около 95%) из Ag в растворе при биовосстановлении.
Пример 16 - Альгицидные свойства состава наносеребра без последующей обработки пероксидом водорода
Состав наносеребра получают в соответствии с описанием, приведенным в примере 8, при соотношении массы серебра к биомассе клеток в сухом состоянии, составляющем 1:4.
Для того чтобы оценить альгицидное действие данного состава, пробирки, содержащие 10 мл среды BG11 (описанной Stanier et al. в Bacteriol. Rev. (1971) 35:171-205), инокулируют 0,5 мл активно растущей жидкой культурой BG11 Chlorella vulagris и инкубируют при 20°С, 65% относительной влажности и 1000 люкс (16 часов/день). Рост оценивают через 2 недели при помощи спектрофотометрического измерения. Различные концентрации состава серебра, варьирующиеся от 20 мг Ag/л до 0,01 мг Ag/л, исследуют в пробирках в расчете на дозы. Величина MIC представляет собой самую низкую исследуемую концентрацию, при которой наблюдается полное ингибирование роста организмов. Было установлено, что величина MIC данного состава наносеребра, ингибирующего Chlorella vulgaris, составляет 0,125 мг Ag/л.