Структура популяции Т-лимфоцитов костного мозга мыши и влияние на нее кортикостероидов

ИММУНОЛОГИЯ № 6, 2013

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013 УДК 612.419.112.94.06:577.17

А.Н. Митин, А.Д. Донецкова, Н.И. Шарова, В.В. Комогорова,

М.М. литвина, А-А. ярилин

структура популяции т-лимфоцитов костного мозга мыши и влияние на нее кортикостероидов

ФГБУ ГНЦ Институт иммунологии ФМБА России, 115478, г. Москва

Изучали особенности популяции Т-лимфоцитов костного мозга мыши в сопоставлении с Т-клетками вторичных лимфоидных органов. На долю Т-клеток приходится 2,4% количества кариоцитов костного мозга. Особенностью субпопуляционного состава Т-клеток костного мозга является преобладание (около 45%) субпопуляции CD8+ лимфоцитов. Впервые обнаружено высокое содержание (около 15%) в костном мозге YбТ-клеток. В популяции Т-клеток костного мозга содержание клеток памяти двукратно преобладает над количеством наивных клеток; соотношение концентрации центральных и эффекторных клеток памяти примерно равное. Процент недавних эмигрантов из тимуса среди Т-клеток костного мозга не отличается от такового во вторичных лимфоидных органах. Введение гидрокортизона приводит к увеличению численности Т-клеток костного мозга (преимущественно CD8+ клеток) на 2-е сутки. Это увеличение происходит почти исключительно за счет наивных Т-клеток. При этом регистрируется приток недавних эмигрантов из тимуса. Таким образом, костный мозг можно рассматривать как нишу Т-клеток памяти, что делает его важным объектом изучения процесса формирования протективной памяти при вакцинации. Под влиянием гидрокортизона популяция Т-лимфоцитов костного мозга пополняется наивными Т-клетками, и усиливается поступление в него Т-клеток непосредственно из тимуса.

Ключевые слова: костный мозг, Т-лимфоциты, Т-клетки памяти, наивные Т-клетки, Т-рецепторные эксцизи-онные кольца, гидрокортизон

Mitin A.N., Donetskova A.D., Sharova N.I., Komogorova V.V., Litvina M.M.,\Yarilin A.A.~|

STRUCTURE OF MOUSE BONE MARROW T-LYMPHOCYTE POPULATION AND CORTICOSTERIODS IMPACT ON IT

National Research Centre «Institute of Immunology» FMBA of Russia, 115478, Moscow

We studied particularity of mouse bone marrow T-lymphocyte population in comparison with T-cells of the secondary lymphoid organs. 2,4% of bone marrow karyocytes fall to the share of T-cells. The distinctive feature of T-cell subpopulation composition is the prevalence (about 45%) of CD8+ lymphocytes. For the first time high levels (about 15%) of YS^cells are detected in bone marrow. Memory T-cells twice prevail over naive T-cells in bone marrow; the ratio of central and effector memory T-cells is approximately equal. The percentage of recent thymic emigrants among bone marrow T-cells does not differ from that in secondary lymphoid organs. Hydrocortisone administration increases the number of T-cells in bone marrow (mainly CD8+ cells) on the second day. The increase is almost entirely due to the naive T-cells. Simultaneously the inflow of recent thymic emigrants is determined. Thus bone marrow can be considered as the niche of memory T-cells, which makes it an important object of study in protective memory formation during vaccination. Under the influence of hydrocortisone population of bone marrow T-lymphocytes is enriched by naive T-cells, including recent thymic emigrants.

Key words: bone marrow, T-lymphocytes, memory T-cells, naive T-cells, T-receptor excision circles, hydrocortisone

В последние годы костный мозг все больше представляется средоточием клеток памяти; он является основным хранилищем долгоживущих плзаматических клеток, в нем обнаружены В- и Т-клетки памяти. Т-клетки памяти костного мозга [1] представлены преимущественно CD8-субпопуляцией [2, 3]; они относятся как к центральным, так и к эффекторным клеткам памяти [3, 4].

Тем не менее роль костного мозга в качестве ниши Т-клеток памяти, а также место Т-лимфоцитов костного мозга в структуре периферической лимфоидной ткани практически не изучено. Сделаны первые шаги к изучению взаимодействия этих Т-клеток с местными стромальными элементами, в частности мезенхимными стволовыми клетками [3, 5]. Не исследовано поведение костномозговых Т-клеток в условиях действия различных факторов, в частности стресса, хотя имеются данные об увеличении популяции Т-клеток костного мозга под влиянием гормонов стресса [6] и возможности вовлечения в связи с этим костного мозга в тимусзависимый иммунный ответ [7].

Цель данной работы состояла в характеристике субпопуляционной структуры Т-клеток костного мозга мыши, уточнении «возрастной» структуры их популяции - соотношения

Митин Александр Николаевич (Mitin Alexander Nikolaevich), mitin@inbox.ru

центральных и эффекторных Т-клеток памяти, присутствия наивных клеток, в частности недавних эмигрантов из тимуса, а также влияния на все эти показатели кортикостероидов.

Материалы и методы. Объектом исследования служили мыши линии C57BL/6, самки массой 18-20 г, полученные из питомника филиала ИБХ им. Шемякина и Овчинникова РАН. Мышам вводили гидрокортизона ацетат в дозе 125 мг/кг внутрибрюшинно однократно. Забой мышей (по 6 в опытной и контрольной группе) и исследование лимфоидных органов проводили через 1 и 2 сут после введения гидрокортизона. Контролем к каждому сроку наблюдения служили мыши соответствующего возраста и того же помета, что и опытные мыши.

Костный мозг получали из четырех берцовых костей, промывая их PBS под давлением с помощью шприца, далее обрабатывали аналогично суспензии клеток, полученной из селезенки. Селезенку и четыре лимфатических узла (два подмышечных и два подколенных) извлекали, освобождали от соединительной ткани, суспензировали в PBS с добавлением 1% BSA и 0,1% NaN3, удаляли эритроциты с помощью лизирующего буфера, дважды отмывали физиологическим раствором. Численность клеток в органе определяли путем подсчета в камере Горяева.

Для постановки иммуноферментного анализа клетки инкубировали с моноклональными антителами (АТ) в том же буфере в течение 30 мин при 4°С. Отмывали и сразу

- 314 -

КЛЕТОЧНАЯ ИММУНОЛОГИЯ

И

без фиксации анализировали на проточном цитометре. Учитывая минорность фракции yST-клеток, для уменьшения ошибки анализировали не менее 105 клеток, попадающих в гейт лимфоцитов. Использовали следующие комбинации моноклональных АТ фирмы eBioscience (США) (препараты для изотипических контролей той же фирмы): анти-CD3-APC (или анти-TcRgammadelta-APc) + анти-CD4-FITC + анти-CD8-PercP-cy5.5 + анти-CD44-PE + анти-CD62L-APC-eFluor780.

Количество Т-рецепторных эксцизионных колец (TREC - T-receptor excision circles), служащих мерой перестройки TcR и присутствия недавних эмигрантов из тимуса на периферии иммунной системы, осуществляли с помощью полимеразно-цепной реакции (ПЦР) по общепринятым методикам с некоторыми модификациями [1, 5]. 1 • 106 клеток в 100 мкл физиологического раствора использовали для выделения ДНК с помощью набора «Проба-НК» («ДНК-Технология», Россия). TREC определяли с помощью ПЦР В качестве стандарта использовали разведения синтезированных плазмид с известными концентрациями ДНК TREC и TCRA. ПЦР ставили в объеме 25 мкл по следующей программе: 1 цикл - 50°С 2 мин, 95°С 10 мин; 45 циклов - 95°С 15 с, 60°С 1 мин, использовали прибор “7300 Real-Time PCR System” (Applied Biosystems). Основными показателями содержания TREC служили индекс TREC/TCRA - отношение количества копий sjTREC (signal-joint TREC) к количеству копий TCRA (константный ген a-цепи Т-клеточного рецептора) и процент ТРЭК-содержащих Т-клеток.

Статистическую обработку данных по численности клеток проводили с помощью общепринятых методов вариационной статистики; результаты выражали в виде M ± SD, где М - средняя арифметическая, SD - стандартное отклонение. Достоверность различия сравниваемых величин оценивали с помощью /-критерия Стьюдента.

Статистическую обработку результатов определения уровня TREC проводили, используя методы непараметрического анализа. Исследованные количественные показатели представляли в виде Ме (L—H), где Ме - медиана, L - нижний квартиль, Н - верхний. Для сопоставления двух групп

Таблица 1

Субпопуляционный состав Т-клеток костного мозга; эффект гидрокортизона

I

Костный мозг

15%

Селезенка

2%

Лимфоузлы

1%

48%

37%

37%

40%

61%

59%

I

Костный мозг

I CD4+8-

Селезенка

CD4-8+

Лимфоузлы

49%

] CD62Ll0/-44hi Ш CD62lJ0/-44l0/-

Рис. 1. Соотношение субпопуляций Т-лимфоцитов, охарактеризованных по фенотипам CD4/CD8 (а) и CD62L/CD44 (б) в костном мозге (I), селезенке (II) и лимфатических узлах (III).

Во врезках - обозначения фенотипов по часовой стрелке начиная с 12 ч.

по количественным признакам использовали Н-критерий Манна-Уитни. Различие групп полагали статистически значимым при p < 0,05.

Таблица 3

содержание TREc и недавних эмигрантов из тимуса в костном мозге и вторичных лимфоидных органах мышей; влияние гидрокортизона

Исследованный

материал

CD4+8-

CD4-8+

CD4'8'

Интактный костный мозг

2-е сутки после введения гидрокортизона

33,7 ± 1,6 43,2 ± 4,0

31,6 ± 0,2* 58,1 ± 1,5*

13,5 ± 1,4

6,8 ± 0,9*

Примечание. Здесь и в табл. 2: данные представлены в процентах от количества Т-клеток, M± SD, * -p < 0,05, ** -p < 0,01.

Таблица 2

соотношение наивных Т-клеток и Т-клеток памяти в популяции Т-клеток костного мозга; эффект гидрокортизона

Исследованный материал CD62Lhi44‘° NT CD62Lhi44“ CM CD62Llo44hi EM

Интактный костный мозг 26,3 ± 2,3 20,9 ± 2,2 28,6 ± 3,5

2-е сутки после 38,6 ± 1,2** 8,3 ± 1,9** 12,3 ± 2,2**

введения гидрокортизона

Примечание. NT (naive T) - наивные Т-клетки; CM (central memory) - центральные клетки памяти; EM (effector memory) - эф-фекторные клетки памяти.

Орган sjTREC/TCRA, -10'3 Процент TREC-содержащих Т-клеток

Костный мозг:

интактный 0,72

1-е сутки после введения гидрокортизона 1,56*

2-е сутки после введения гидрокортизона 2,37*

Лимфатические узлы:

интактные 14,42

1-е сутки после введения гидрокортизона 44,02*

Селезенка:

интактная 6,32

1-е сутки после введения гидрокортизона 9,61

2-е сутки после введения гидрокортизона 12,26*

П р и м е ч а н и е . Представлены медианы; в скобках верхний квартили; * - p < 0,05.

нижнии и

- 315 -

ИММУНОЛОГИЯ № 6, 2013

Рис. 2. Гистограмма распределения клеток по фенотипам CD4/CD8 в суммарной популяции Т-клеток костного мозга (а) и у5-фракции (б).

а

Изменение численности фракций СОЗ+-клеток костного мозга после введения гидрокортизона

Изменение численности фракций CD+3-клеток лимфоузлов после введения гидрокортизона

Рис. 3. Влияние инъекции гидрокортизона на структуру популяции Т-клеток костного мозга (а) и лимфатические узлы (б).

Здесь и на рис. 4: * — достоверные отличия относительно контроля (p < 0,05).

Результаты и обсуждение. Характеристика Т-клеток костного мозга интактных мышей. При микроскопическом исследовании суспензии костного мозга процент лимфоцитов составил 33% содержания всех кариоцитов. По данным цитофлюорометрического анализа содержание Т-лимфоцитов (СБ3+-клеток) в интактном костном мозге составило 2,4% количества кариоцитов (1,4 • 106 на четыре берцовые кости). Данные оценки коэкспрессиии молекул CD4 и CD8, отражающей субпопуляционную структуру Т-лимфоцитов, представлены в сопоставлении с аналогичными данными для вторичных лимфоидных органов в табл. 1 и иллюстрированы в сопоставлении с данными для вторичных лимфоидных органов на рис. 1, а. В костном мозге преобладают CD4-CD8+-клетки: на их долю приходится половина Т-клеток костного мозга. Соотношение CD4+/CD8+ составляет 0,78 против 1,41 в лимфатических узлах. Обращает на себя внимание очень высокое (15%) содержание CD4-CD8-клеток. При оценке экспрессии ySTCR установили, что практически все CD4-CD8-клетки представляют собой

yST-клетки. Гистограммы распределения CD4+- и CD8+-клеток в популяции у5Т-клеток представлены на рис. 2. Таким образом, уже на уровне субпопуляционного анализа выявляется своеобразие популяции Т-клеток костного мозга, состоящее в преобладании CD8+ Т-клеток и присутствии значительного количества у5Т-клеток.

Аналогичным образом проанализировали «возрастную» структуру популяции Т-клеток костного мозга, т. е. соотношение наивных Т-клеток и разновидностей Т-клеток памяти. Данные отражены также в сопоставлении с вторичными лимфоидными органами в табл. 2 и на рис. 1, б. В отличие от вторичных лимфоидных органов, в которых наивные Т-клетки составляют основную фракцию Т-лимфоцитов, в костном мозге на их долю приходится примерно четвертая часть Т-клеток. Процент клеток памяти (CD44hi-клеток), напротив, в костном мозге выше, чем во вторичных лимфоидных органах, при равном соотношении центральных и эффекторных клеток памяти. Соотношение «возрастных» фракций (CD62L/CD44) Т-клеток в субпопуляциях CD4+ и CD8+ практически идентично.

Очевидно, что биологический смысл экспрессии молекул CD62L и CD44 на yST-клетках иной, чем на арТ-клетках, и буквально распространять на них представления о наивных клетках и клетках памяти некорректно. Тем не менее приводим данные об экспрессии на этих клетках вышеупомянутых молекул: в популяции у5Т-лимфоцитов определяется около 40% CD62Lhi- и 70% CD44hi-клеток.

Учитывая присутствие наивных Т-клеток в костном мозге, мы проверили возможность попадания в него новообразованных клеток непосредственно из тимуса. Для этого мы определяли присутствие в Т-клетках костного мозга TREC, служащих маркерами недавних эмигрантов из тимуса. TREC обнаружили в клетках костного мозга в количестве на порядок меньшем, чем во вторичных лимфоидных органах (табл. 3), однако при пересчете на количество CD3+ Т-клеток (т. е. при расчете количества недавних эмигрантов из тимуса) эта разница нивелировалась.

Влияние инъекций гидрокортизона на структуру популяции костного мозга. Гидрокортизон избран в качестве агента, способного повлиять на популяцию Т-клеток костного мозга; кроме того, эффект этого гормона представляет значительный интерес, поскольку он часто используется в качестве медикаментозного средства и является ключевым фактором стресса.

Под действием гидрокортизона (2-е сутки после инъекции) процентное содержание лимфоцитов в костном мозге несколько снижается. Абсолютное содержание Т-клеток при этом даже возрастает с 1,4 до 2,4 млн на четыре берцовые кости; процентное содержание (от количества лимфоцитов) повышается с 5 до 15%. Таким образом, инъекция гидрокортизона повреждая какие-то иные популяции лимфоцитов, способствует повышению содержания в костном мозге Т-клеток. В наибольшей степени прирост количества клеток под влиянием гидрокортизона затрагивает субпопуляцию cD8+ Т-клеток (в 2,4 раза; CD4+ Т-клеток - в 1,7 раза) (рис. 3). В лимфатических узлах и селезенке в тех же условиях наблюдали значительное (в 35-40 раз в лимфоузлах и в 4-5 раз в селезенке) снижение содержания обеих основных субпопуляций Т-клеток.

Прирост количества Т-лимфоцитов в костном мозге происходит исключительно за счет фракции CD62LhiCD441°: их содержание повышается ко 2-м суткам после введения гидрокортизона в 2,6 раза, тогда как содержание CD44hi клеток

- 316 -

КЛЕТОЧНАЯ ИММУНОЛОГИЯ

а

б

Изменение численности фракций СОЗ+-клеток костного мозга после введения гидрокортизона по экспрессии CD44 и CD62L

Изменение численности фракций СОЗ+-клеток лимфоузлов после введения гидрокортизона по экспрессии CD44 и CD62L

В ней преобладают CD8+-raeTra; необычным является высокий процент у5Т-клеток (факт, обнаруженный нами впервые). В отличие от популяций Т-клеток вторичных лимфоидных органов Т-клетки костного мозга являются средоточием преимущественно Т-клеток памяти. Однако под влиянием гидрокортизона наблюдается приток в костный мозг наивных Т-клеток, в том числе непосредственно из тимуса. На основании наших и литературных данных можно представить участие Т-клеток костного мозга в иммунных процессах таким образом:

• являясь средоточием Т-клеток памяти, костный мозг активно вовлекается во вторичный иммунный ответ, который в значительной степени разворачивается на его территории; очевидно, ему принадлежит важная роль в реализации вакцинных процессов;

• в условиях действия глюкокортикоидов, в частности при стрессе, костный мозг, обогащаясь наивными Т-клетками, может стать участником первичного иммунного ответа;

• с учетом высокого содержания в костном мозге у5Т-клеток, функция которых многообразна, хотя однозначно не определена, костный мозг может выполнять комплекс функций, связанных с этими клетками.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ; проект № 11-04-01741-а.

Рис. 4. Влияние инъекции гидрокортизона на содержание наивных Т-клеток и Т-клеток памяти в популяции Т-клеток костного мозга (а) и лимфатических узлов (б).

практически не меняется (рис. 4). Сказанное в равной степени относится к CD4+ и CD8+ Т-клеткам. Действие гидрокортизона на у5Т-клетки выражено менее четко (некоторое повышение содержания на 1-е сутки после инъекции). Во вторичных лимфоидных органах в тех же условиях происходит резкое снижение содержания всех фракций Т-клеток, в наибольшей степени наивных Т-клеток с фенотипом CD62LhiCD44l0.

Вероятнее всего, увеличение численности Т-клеток в костном мозге под влиянием гидрокортизона можно связать с притоком в него наивных Т-клеток. Одним из источников наивных Т-клеток может служить тимус. В связи с этим мы определяли влияние гидрокортизна на содержание в костном мозге недавних эмигрантов из тимуса, несущих TREC. Выявили 2-кратное усиление поступления недавних эмигрантов из тимуса в костный мозг на 2-е сутки после введения ги-дрокортиозна; примерно в такой же степени (в 2-3 раза) гидрокортизон усиливал приток TREc в лимфатические узлы и селезенку (см. табл. 3).

Таким образом, введение гидрокортизона повышает содержание в костном мозге Т-лимфоцитов за счет усиления притока наивных Т-лимфоцитов, включая недавние эмигранты из тимуса, особенно тех, что относятся к субпопуляции cD8+.

Суммируя все сказанное, необходимо выделить важнейшие особенности популяции Т-клеток костного мозга. Эта популяция прежде всего не столь мала, как ранее считали.

ЛИТЕРАТУРА

7. Зимин Ю.И., Хаитов Р.М. Миграция Т-лимфоцитов в костный мозг в начальный период стресс-реакции. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1975; 80 (12): 68-70.

REFERENCES

1. Broers A., Meijerink J., van Dongen J. et al. Quantification of newly developed T cells in mice by real-time quantitative PCR of T-cell receptor rearrangement excision circles. Exp. Hematol. 2002; 30: 745-50.

2. Di Rosa F., Pabst R. The bone marrow: a nest for migratory memory T cells. Trends Immunol. 2005; 26: 360-6.

3. Zhao E., Xu H., Wang L., Kryczek I., Wu K., Hu Y., Wang G., Zou W. Bone marrow and the control of immunity. Cell. Mol. Immunol. 2012; 9: 11-9.

4. Dygai A.M., Shakhov V.P., Mikhlenko A.V., Goldberg E.D. Role of glucocorticoids in the regulation of bone marrow hemopoiesis in stress reaction. Biomed. and Pharmacother. 1991; 45: 9-14.

5. DouekD.C., McFarlandR.D., Keiser P.H. et al. Changes in thymic function with age and during the treatment of HIV infection. Nature. 1998; 396: 690-5.

6. Di Rosa F. T-lymphocyte interaction with stromal, bone and hematopoietic cells in the bone marrow. Immunol. Cell. Biol. 2009; 87: 20-9.

7. Zimin Y.I., Khaitov R.M. T-lymphocyte migration into the bone marrow in the initial period of stress reaction. Bulletin of experimental biology and medicine. 1975; 80 (12): 68-70 (in Russian).

Поступила 23.05.13

- 317